(57)【要約】  本発明は、果実、例えばリンゴ、から一種以上のポリフェノールを抽出する方法に、および該抽出物の、心臓血管病、結腸癌および消化器系健康における処置または予防における使用に関する。
2010500333.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
果実から一種以上のポリフェノールを抽出する方法であって、
（ａ）果実の外被を除去する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた果実を凍結乾燥または凍結させる工程、
（ｃ）所望により、前記工程（ｂ）で得られた、前記凍結乾燥または凍結させた材料を粉末化する工程、
（ｄ）前記工程（ｂ）または工程（ｃ）で得られた材料を一回以上の溶剤抽出サイクルにかける工程、
その後、所望により、
（ｅ）前記工程（ｄ）で得られた液体抽出物から一種以上のポリフェノールを単離する工程、
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記果実がリンゴである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記果実が「レッド−カットスルー」リンゴである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記一種以上のポリフェノールがエピカテキンを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ａ）が、好適な溶剤、例えばエタノール、メタノールまたはアセトンを使用する洗浄工程を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｃ）が、従来のフードプロセッサー中で、液体窒素の存在下で粉末化することを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｄ）における抽出溶剤が水である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記水が脱気された水である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記水が、温度６５℃〜８０℃（例えば７０℃〜７５℃、例えば７３℃〜７５℃）に加熱される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記水が、１ｂａｒより高い圧力（例えば２〜５ｂａｒ、例えば４ｂａｒ）にある、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
リンゴから一種以上のポリフェノールを単離する方法であって、
（ａ）リンゴの天然ワックス外被を除去する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で得られたリンゴを凍結乾燥または凍結させる工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた、凍結乾燥または凍結させた材料を粉末化する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた材料を一回以上の、溶剤が水である溶剤抽出サイクルにかける工程、
（ｅ）前記工程（ｄ）から生じる水を蒸発させる工程、
（ｆ）前記工程（ｅ）から調製された粗製抽出物から、単離されたポリフェノールを、エタノールで溶離させるクロマトグラフィー処理により分離する工程、
（ｇ）前記エタノールを蒸発させて、単離されたポリフェノールを得る工程、
を含んでなる、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により得られる、ポリフェノール含有抽出物。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリフェノール含有抽出物を含んでなる、食品着色剤。
【請求項１４】
心臓血管病または結腸癌の予防または治療に使用する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリフェノール抽出物。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリフェノール抽出物の、心臓血管病または結腸癌の予防または治療に使用する薬剤の製造における使用。
【請求項１６】
心臓血管病または結腸癌を治療または予防する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリフェノール抽出物の投与を含んでなる、方法。
【請求項１７】
心臓血管病または結腸癌の予防または治療に使用する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリフェノール抽出物を含んでなる、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンゴ等の果実から一種以上のポリフェノールを抽出する方法、および抽出物の、心臓血管病、結腸癌および消化器系健康における処置または予防における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓血管病（ＣＶＤ）および癌は、世界的な、２種類の主要な死の原因である。
【０００３】
ＣＶＤは罹患率および死亡率を高める主な原因であり、ヨーロッパ連合では年間１６９兆ユーロを費やし（Ｌｅａｌら  （２００６）  Ｅｕｒ．  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．  ２７（１３）：  １６１０−９）、米国では、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎが、７，１３０万人の米国人が一種以上の形態のＣＶＤを有すると見積もっている。
【０００４】
世界保健機関によれば、世界中で毎年約７．６百万（または１３％）の人々が癌で死亡している。特に、肺、胃、肝臓、結腸および乳房の癌が、これらの死の半分以上を占めている。
【０００５】
疫学的証拠により、果実や野菜が豊富な食事は、これらの慢性的病気に対する重大な保護効果を与えることが示されている。この保護効果の多くは、ポリフェノールと呼ばれる、果実や野菜に共通して見られる植物性化学物質の大区分に帰せられる。
【０００６】
ポリフェノールは、それらの、アレルゲン、ウイルス、および発癌物質に対する体の反応を変化させる能力を立証する強力な実験的証拠により、天然の生物学的応答調節剤と呼ばれている。ポリフェノールは、抗アレルギー、抗炎症、抗菌および抗癌活性を示す。さらに、ポリフェノールは、強力な酸化防止剤として作用し、酸化性およびフリーラジカル性損傷を防止し、酸化性ストレスに関連する様々な病気を防止するのに役立つ。
【０００７】
しかし、大部分の人々は、ポリフェノールにより与えられる健康上の有益性を得るのに十分な量を消費していないことが推定されている。例えば、米国における現在の平均的な毎日のエピカテキン摂取量は、提案されているＣＶＤの危険性を下げるのに必要な投与量の２〜４分の１である。（Ｇｕら（２００４）  Ｊ  Ｎｕｔｒ  １３４（３）：６１３−７、ＰｒｉｏｒおよびＧｕ（２００５）  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６（１８）：  ２２６４−８０）。その結果、食事による摂取量を増加することが、重要な健康上の目標として掲げられている。
【０００８】
リンゴは、重要なポリフェノールの供給源であり、提案されているＣＶＤの危険性を下げるのに必要な投与量の約１０％を与えることができる（上記Ｇｕら（２００４））。しかし、ポリフェノールの濃度および分布は、それぞれの種類で劇的に変動する（表１参照）。事実、最近の多くのデザート用リンゴは、ポリフェノール含有量が１０００ｍｇ／ｋｇ未満である。
【０００９】
さらに、リンゴの加工により、ポリフェノール含有量が影響を受けることが分かっている。例えば、リンゴジュースを抽出する時、総ポリフェノールの９５％が絞り滓の中に残ることがある。より重要なことに、ジュース中のプロシアニジン収率が最も低い（３２％）（ＧｕｙｏｔおよびＭａｒｎｅｔ（２００３）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５１（２１），６２４０−６２４７）。
【発明の概要】
【００１０】
従って、本発明の目的は、リンゴ等の果実からポリフェノールを単離するための改良された方法を提供することである。
【００１１】
本発明の第一の態様によれば、果実から一種以上のポリフェノールを抽出する方法であって、
（ａ）果実の外被（ｃｏａｔｉｎｇ）を除去する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた果実を凍結乾燥または凍結させる工程、
（ｃ）所望により、前記工程（ｂ）で得られた、凍結乾燥または凍結させた材料を粉末化する工程、
（ｄ）前記工程（ｂ）または工程（ｃ）で得られた材料を一回以上の溶剤抽出サイクルにかける工程、
その後、所望により、
（ｅ）前記工程（ｄ）で得られた液体抽出物から一種以上のポリフェノールを単離する工程、
を含んでなる、方法が提供される。
【００１２】
本発明の一実施態様においては、リンゴからポリフェノール含有量画分を調製する方法であって、
（ａ）リンゴの天然ワックス外被を除去する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で得られたリンゴを凍結乾燥または凍結させる工程、
その後、所望により
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた、凍結乾燥または凍結させた材料を粉末化する工程、
を含んでなる、方法が提供される。
【００１３】
本発明の別の実施態様においては、リンゴから一種以上のポリフェノールを単離する方法であって、
（ａ）リンゴの天然ワックス外被を除去する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で得られたリンゴを凍結乾燥または凍結させる工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた、凍結乾燥または凍結させた材料を粉末化する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた粉末化された材料を一回以上の溶剤抽出サイクルにかける工程、
その後、所望により、
（ｅ）前記工程（ｄ）で得られた液体抽出物を遠心分離する工程、
を含んでなる、方法が提供される。
【００１４】
本発明の一実施態様においては、果実はリンゴである。別の実施態様においては、果実は、「レッド−カットスルー」リンゴである。無論、用語「レッド−カットスルー」は、この分野で良く知られている、赤い果肉を有するリンゴを意味する。
【００１５】
本明細書で使用する用語「ポリフェノール」は、分子１個あたり２個以上のフェノール基が存在することを特徴とする化学物質の一群を意味する。一実施態様においては、ポリフェノールは、フラボノイドの亜群を包含する。
【００１６】
５０００を超える天然のフラボノイドが、様々な植物から確認されている。これらの物質は、それらの化学構造に応じて分類することができ、様々な亜綱に分類することができる。一実施態様では、フラボノイドとしては、
（ａ）下記式（Ｉ）に示す化学的骨格を有するフラボノン（例えばヘスペレチン、ナリンゲニン、エリオジクチオル）、
【化１】
2010500333.tif 000003
（ｂ）下記式（ＩＩ）に示す化学的骨格を有するイソフラボノン（例えばゲニステイン、ダイドゼイン、グリシテイン）、
【化２】
2010500333.tif 000004
（ｃ）下記式（ＩＩＩ）に示す化学的骨格を有するフラボン（例えばルテオリン、アピゲニン、タンゲリチン）、
【化３】
2010500333.tif 000005
（ｄ）下記式（ＩＶ）に示す化学的骨格を有するフラボノール（例えばクェルセティン、ケムフェロール、ミリセチン、イソラムネチン、パチポドール、ラムナジン）、
【化４】
2010500333.tif 000006
（ｅ）下記式（Ｖ）に示す化学的骨格を有するフラバン−３−オール（例えばカテキン、ガロカテキン、エピカテキン、エピガロカテキン）、
【化５】
2010500333.tif 000007
（ｆ）下記式（ＶＩ）に示す化学的骨格を有するフラバン−３，４−ジオール、
【化６】
2010500333.tif 000008
（ｇ）下記式（ＶＩＩ）に示す化学的骨格を有するジヒドロフラバノール、
【化７】
2010500333.tif 000009
（ｈ）下記式（ＶＩＩＩ）に示す化学的骨格を有するアントシアニジン（例えばシアニジン、デルフィニジン、マルビニジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン）、
【化８】
2010500333.tif 000010
（ｉ）下記式（ＩＸ）に示す化学的骨格を有するアントシアニン、
【化９】
2010500333.tif 000011
式中、ｓｕｇａｒはグルコース、アラビノース、ガラクトース、等から選択することができる。
【００１７】
本発明の一実施態様においては、フラボノイドは、プロアントシアニジンを包含する。プロアントシアニジンは、フラバン−３−オール小単位から構成されたバイオポリマーである。重合体は、主として４および８位置および４および６位置を通して結合される。別の実施態様では、プロアントシアニジンは、４，８結合した重合体であり、下記式（Ｘ）に示す構造を有する。
【化１０】
2010500333.tif 000012
【００１８】
本発明の一実施態様においては、フラボノイドとしては、アントシアニジン、プロアントシアニジン、フラバノール、フラボノール、フラボン、フラバノンおよびイソフラボンが挙げられる。別の実施態様においては、フラボノイドは、フラバノールおよびプロアントシアニジンを包含する。
【００１９】
本発明の一実施態様においては、フラバン−３−オールは、下記式（Ｖ）ａに示す構造を有する。
【化１１】
2010500333.tif 000013
式中、Ｒ１は水素またはＯＨ基を表す。
【００２０】
本発明の一実施態様においては、フラバン−３−オールは、下記式（Ｖ）ｂに示す構造を有する。
【化１２】
2010500333.tif 000014
式中、Ｒ１は上に規定した通りである。
【００２１】
上記式（Ｖ）ｂの、Ｒ１が水素を表す化合物は、エピカテキンと呼ばれ、上記式（Ｖ）ｂの、Ｒ１がＯＨ基を表す化合物は、エピガロカテキンと呼ばれる。
【００２２】
本発明の一実施態様においては、フラバン−３−オールは、下記式（Ｖ）ｃに示す構造を有する。
【化１３】
2010500333.tif 000015
式中、Ｒ１は上に規定した通りである。
【００２３】
上記式（Ｖ）ｃの、Ｒ１が水素を表す化合物は、カテキンと呼ばれ、上記式（Ｖ）ｃの、Ｒ１がＯＨ基を表す化合物は、ガロカテキンと呼ばれる。
【００２４】
本発明の一実施態様においては、アントシアニジンは、下記式（ＶＩＩＩ）ａに示す構造を有するシアニジンを包含する。
【化１４】
2010500333.tif 000016
【００２５】
本発明の一実施態様においては、フラボノイドは、下記式（ＶＩＩＩ）ｂに示す構造を有するデルフィニジンを包含する。
【化１５】
2010500333.tif 000017
【００２６】
本発明の一実施態様においては、プロアントシアニジンは、下記式（Ｘ）ａに示す構造を有する。
【化１６】
2010500333.tif 000018
式中、Ｒ１は上に規定した通りであり、ｎ＝２〜３０である。
【００２７】
本発明の一実施態様においては、ｎ＞１０（即ち１１〜３０）である。別の実施態様においては、上記式（ＩＶ）の化合物は、分子量が１０００を超える。さらに別の実施態様においては、上記式（ＩＶ）の化合物は、分子量が＞１０００で、＜９０００（例えば＞３０００で、＜９０００）である。
【００２８】
プロアントシアニジンは、プロシアニジンおよびプロデルフィニジンの亜群を包含し、酸加水分解により、これらの物質は、それぞれシアニジンおよびデルフィニジンを生成する。
【００２９】
本発明の一実施態様においては、本発明の方法により抽出される一種以上のポリフェノールは、エピカテキン（即ち、上記式（Ｖ）ｂの、Ｒ１が水素を表す化合物）を含んでなる。
【００３０】
工程（ａ）において、外被を除去（例えば、リンゴの天然ワックス外被を除去）することにより、有利には、その後に続く工程（ｄ）での溶剤抽出の際の発泡が少なくなる。一実施態様においては、この除去は、好適な溶剤、例えばエタノール、メタノールまたはアセトン、を使用する洗浄工程を含んでなる。次いで、天然ワックスは、得られたワックス／溶剤抽出混合物から蒸留により回収することができ、化粧品の原料として有利に使用できる。
【００３１】
無論、凍結乾燥または凍結工程（ｂ）は、典型的には当業者に公知の手順を含んでなる。例えば、凍結乾燥は、直径２５ｍｍ未満に予備凍結させたリンゴ全体を−１８℃で真空乾燥させ、水を蒸気として確実に除去する。この工程により、有利なことに、全体的な作物構造およびサイズが保存されると共に、得られるポリフェノールの一体性が維持される。
【００３２】
凍結した試料により与えられる利点は、氷の結晶が生成することであり、これによって細胞構造が壊われ、ポリフェノールが確実に、容易に放出される。従って、凍結は、抽出工程の効率を改良する。さらに、凍結乾燥により、他の乾燥方法、例えば加熱炉、空気または熱的乾燥、と比較して、カテキンおよびエピカテキン分子の利用可能性が高くなる。
【００３３】
粉末化工程（ｃ）は、当業者には公知の手順を含んでなる。例えば、小規模の粉末化は、従来のフードプロセッサーで行うことができる。大規模粉末化技術も、類似の手法を使用することができ、一般的に、再水和を防止するために、（例えば不活性雰囲気、例えば窒素雰囲気、を使用するか、または掃気により）湿った空気を排除する必要がある。粉末化により、ポリフェノールの分解を引き起こすことがある酸化（例えばポリフェノールオキシダーゼによる）を防止することができ、後に続く抽出工程を強化する小粒子径も得られる。別の実施態様おいては、粉末化を液体窒素の存在下で行い、後に続く工程（ｄ）における抽出サイクルの際に材料がふやけるのを防止する。工程（ｃ）で得られた粉末化されたリンゴは、一般的にその後に続く溶剤抽出サイクルに有益な粒子径、好適には１〜２５ｍｍ、を有する。本発明のこの態様には、ポリフェノールの分解を引き起こす酵素処理を必要としない、という重大な利点がある。
【００３４】
工程（ｄ）における抽出サイクルは、典型的には、連続式水平向流抽出装置、またはバッチ式抽出装置（溶剤抽出および複数の溶剤による抽出、および下流における溶剤回収を伴う）、または向流垂直カラム抽出装置（下流の液体−液体抽出遠心分離とワイプドフィルム蒸発装置を伴う）、または好適な設計の半連続式回転ドラム真空フィルターまたは遠心分離デカンターで行う。無論、向流抽出装置は、当業者には良く知られており、連続式またはバッチ式の向流抽出装置でよい。
【００３５】
工程（ｄ）は、典型的には、メタノール、エタノール、水、アセトンおよびそれらのいずれかの混合物を包含する、一種以上の抽出装置溶剤が関与する。これらの溶剤は、植物酵素を変性させるのに役立ち、従って、残留酵素活性の問題を排除する。
【００３６】
本発明の一実施態様においては、抽出溶剤は水である。別の実施態様においては、水を蒸留、脱イオン、脱気、および温度６５℃〜８０℃（例えば７０℃〜７５℃、例えば７３℃〜７５℃）に加熱することができる。抽出溶剤として水を使用することにより、例えば得られる食品にその水を、除去せずに、直接使用することができ、他の溶剤と異なり、環境に影響を全く及ぼさない、という非常に大きな利点が得られる。脱気した水を使用することにより、得られるポリフェノールの分解を通常引き起こす（ポリフェノールの収率を５０％まで下げる）オキシダーゼを抑制するという利点が得られる。この問題に対する以前の対策は、オキシダーゼを抑制する特殊な試剤を配合することであったが、この手法は、オキシダーゼが抑制されるだけで、排除されず、さらに、それらの試剤を、下流における使用（例えば食品における）の前に除去する必要がある場合があるので、その成果は限られている。７０℃より上に加熱された水の使用には、抽出物を同時に滅菌し（滅菌は７３℃より上で起こる）、単一サイクルでポリフェノールを９５％抽出するという利点がある。
【００３７】
本発明の一実施態様においては、１ｂａｒより高い圧力（例えば２〜５ｂａｒ、例えば４ｂａｒ）における溶剤抽出工程に水を使用する。高圧下で水を供給することにより、抽出処理に関連する背圧を克服する利点が得られる。
【００３８】
本発明の一実施態様では、抽出溶剤は、有利なことに単一サイクルでポリフェノールの９５％を抽出できるメタノールである。
【００３９】
別の実施態様においては、抽出溶剤は、メタノールよりも環境に好ましいアセトンである。
【００４０】
本発明の一実施態様においては、抽出サイクル（ｄ）は、複数の個別段階、好適には３段階を含んでなる。
【００４１】
本発明の一実施態様においては、溶剤抽出サイクルの第一段階は、メタノール５０〜１００％および水０〜５０％、好適にはメタノール６０〜９０％および水１０〜４０％、例えばメタノール８０％および水２０％を含んでなる抽出溶剤を使用する。この段階は、工程（ｃ）で得た粉末化されたリンゴから残留カテキンおよびエピカテキン分子を抽出するのに役立つ。
【００４２】
本発明の一実施態様においては、粉末化されたリンゴは、第一段階の前に加水分解し、これによってグリコシド結合を破壊する。低分子量ポリフェノールは、糖結合していないポリフェノールとしてのみ存在するので、この加水分解工程は、低分子量ポリフェノールには必要ない。
【００４３】
本発明の一実施態様においては、溶剤抽出サイクルの第二段階が、エタノール０〜７５％および水２５〜１００％、好適にはエタノール４０〜６０％および水４０〜６０％、例えばエタノール５０％および水５０％を含んでなる溶剤を使用する。この段階は、高分子量オリゴマーおよびポリマーをリンゴバイオマスから回収するのを支援する。
【００４４】
本発明の一実施態様においては、抽出の第二段階の前に水洗することができる。例えば、抽出バイオマスを、典型的には向流抽出装置中、水で洗浄し、その後の段階における抽出に先立つ予備段階として、材料を膨潤させることができる。この段階により、有利なことに、抽出による重合体収率が増加する。
【００４５】
本発明の一実施態様においては、抽出サイクルの第三段階が、アセトン５０〜１００％および水０〜５０％、好適にはアセトン６０〜８０％および水２０〜４０％、例えばアセトン７０％および水３０％を含んでなる抽出溶剤を使用する。
【００４６】
別の実施態様においては、抽出サイクルが、一つの連続的な段階を含んでなることができる。この場合、抽出サイクルは、抽出溶剤の組合せを順次使用するように配置することができる。その結果、抽出順序は、メタノール８０％、水２０％、メタノール５０％水５０％、およびアセトン７５％水２５％になる。連続的配置は、大規模バイオマス全体により好適であるのに対し、バッチ式抽出は小規模処理量および試験的量に、より適している。
【００４７】
溶剤抽出サイクルにより、抽出液体および可溶性リンゴパルプが製造される。一実施態様では、溶剤抽出サイクルを、好適には３回繰り返す。別の実施態様では、可溶性リンゴパルプを抽出工程から回収し、当業者には良く知られている方法、例えば噴霧乾燥、熱乾燥、凍結乾燥、等、により乾燥させ、脱水したリンゴ繊維として、好適には熱密封したアルミニウムホイルバッグまたは容器中に包装することができる。
【００４８】
本発明の一実施態様においては、単離工程（ｅ）は、当業者には公知の手順による遠心分離を含んでなる。一実施態様では、抽出液を、３０００〜９０００ｇで１５〜３０分間遠心分離する。これによって、残留する固体リンゴパルプを全て抽出液から分離し、その後に続く濾過工程の前に、バルクバイオマス材料を除去することができる。
【００４９】
本発明の一実施態様においては、遠心分離により得られる上澄み液を限外濾過にかける。これによって、様々な分子量のポリフェノールが選択的に濾過されるという利点が得られる。
【００５０】
本発明の一実施態様においては、低分子量ポリフェノール、例えば分子量が６００未満である分子、を分離する。この実施態様により、溶剤、ポリフェノール単量体、例えばエピカテキンおよびカテキン（分子量＝２９０）、ポリフェノール二量体（分子量＝５８０）、単糖および二糖、例えばフルクトースおよびスクロース（分子量＝３４２）を含んでなる濾液が得られる。
【００５１】
別の実施態様においては、分子量が３００未満である分子を分離することにより、溶剤およびポリフェノール単量体、例えばエピカテキンおよびカテキン（分子量＝２９０）、を含んでなる濾液が得られる。
【００５２】
本発明の一実施態様においては、残留溶剤を、例えば不活性ガス（例えば窒素）の存在下で、一または多段階蒸発工程により除去し、凝縮により回収し、循環使用する。別の実施態様においては、溶剤を酢酸エチルで洗浄し、最終的な分離段階の前の後処理用に、単量体および二量体が水相溶液中に確実に残るようにする。
【００５３】
従って、この方法により、それぞれ水溶液で、２種類の単離物が得られる。一実施態様においては、第一の単離物が低分子量ポリフェノールを含んでなり、第二の単離物が高分子量ポリフェノール、例えば分子量が６００を超える分子、を含んでなる。
【００５４】
別の実施態様においては、単離物を両方共、真空下、温度３０℃未満、例えば２０℃未満で乾燥させ、所望により凍結乾燥させる。
【００５５】
本発明の一実施態様においては、リンゴから一種以上のポリフェノールを単離する方法であって、
（ａ）リンゴの天然ワックス外被を除去する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で得られたリンゴを凍結乾燥または凍結させる工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた、凍結乾燥または凍結させた材料を粉末化する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた材料を一回以上の、溶剤が水である溶剤抽出サイクルにかける工程、
（ｅ）前記工程（ｄ）において生じる水を蒸発させる工程、
（ｆ）前記工程（ｅ）において調製された粗製抽出物から、単離されたポリフェノールを、エタノールで溶離させるクロマトグラフィー処理により分離する工程、
（ｇ）エタノールを蒸発させ、単離されたポリフェノールを得る工程
を含んでなる、方法を提供する。
【００５６】
本発明の第二の態様により、上記の方法により得られるポリフェノール含有抽出物を提供する。
【００５７】
本発明の方法により、レッド−カットスルーリンゴからポリフェノールを抽出することにより、ポリフェノール比率が高い（例えばエピカテキンが１８％を超える）濃赤色抽出物が得られる。抽出物中のポリフェノールは、承認されている食品着色剤（シアニジンＥ１６３ａ）であるアントシアニジンとして固定されていると、考えられる。この食品着色剤は、２．５ｍｇ／ｋｇ体重のレベルで使用することが承認されており、本発明の方法は、シアニジンを１ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で提供する。従って、本発明の一実施態様においては、本発明のポリフェノール含有抽出物を含んでなる天然食品着色剤を提供する。ポリフェノール抽出物を食品着色剤として使用することにより、二つの重大な利点、即ち安全な食品着色および高レベルの有益なポリフェノール、が得られる。
【００５８】
＜処理の方法＞
ポリフェノールは、数多くの健康上の有益性を示すことが立証されている。例えば、疫学的研究は、高フラボノイド摂取量が、ＣＶＤの危険性低下につながることを示唆しており（Ａｒｔｓら（２００１）  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  １２（６）：６６８−６７５、Ｓｅｓｓｏら、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ７７：１４００−８、Ｍｉｎｋら（２００７）  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ８５（３）：８９５−９０９）、これは、フラボノイドの、ヒトの内皮機能を改良し、血小板凝固を抑制する能力の結果であろう（Ｋｅｅｎら（２００５）  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ８１（上記）：２９８Ｓ−３０３Ｓ、Ｖｉｔａ  Ｊ  Ａ（２００５）  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ８１（上記）：２９２Ｓ−７Ｓ、Ｈｅｐｔｉｎｓｔａｌｌら（２００６）Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１９７−２０５）。
【００５９】
従って、本発明の別の態様においては、心臓血管病または結腸癌の予防または治療に使用するための、上に規定するポリフェノール抽出物を提供する。
【００６０】
別の態様においては、心臓血管病または結腸癌の予防または治療に使用するための薬剤の製造における、上に規定するポリフェノール抽出物の使用を提供する。
【００６１】
本発明のさらに別の態様においては、上に規定するポリフェノール抽出物の投与を含んでなる、心臓血管病または結腸癌の予防または治療方法を提供する。
【００６２】
本発明のさらに別の態様においては、心臓血管病または結腸癌の予防または治療に使用するための、ポリフェノール抽出物を含んでなる薬学的組成物を提供する。
【００６３】
本発明の別の態様においては、心臓血管病の予防または治療に使用するための、一種以上の低分子量ポリフェノールを含んでなるポリフェノール抽出物を提供する。
【００６４】
本発明の別の態様においては、心臓血管病の予防または治療に使用するための薬剤の製造における、一種以上の低分子量ポリフェノールを含んでなるポリフェノール抽出物の使用を提供する。
【００６５】
本発明のさらに別の態様においては、一種以上の低分子量ポリフェノールを含んでなるポリフェノール抽出物の投与を含んでなる、心臓血管病の治療または予防方法を提供する。
【００６６】
本発明のさらに別の態様においては、心臓血管病の治療または予防に使用するための、一種以上の低分子量ポリフェノールを含んでなるポリフェノール抽出物を含んでなる薬学的組成物を提供する。
【００６７】
別の態様においては、結腸癌の予防または治療に使用するための、一種以上の高分子量ポリフェノールを含んでなるポリフェノール抽出物を提供する。
【００６８】
別の態様においては、結腸癌の予防または治療に使用するための薬剤の製造における、一種以上の高分子量ポリフェノールを含んでなるポリフェノール抽出物の使用を提供する。
【００６９】
本発明のさらに別の態様においては、一種以上の高分子量ポリフェノールを含むポリフェノール抽出物の投与を含んでなる、結腸癌の治療または予防方法を提供する。
【００７０】
本発明のさらに別の態様においては、結腸癌の予防または治療に使用するための、一種以上の高分子量ポリフェノールを含んでなるポリフェノール抽出物を含んでなる薬学的組成物を提供する。
【００７１】
無論、本明細書で使用する用語「治療」および「治療する」は、症状、例えば病気または障害、と戦うための患者の管理および監督を意味する。この用語は、患者を苦しめている特定の症状に対する治療、例えば症状または合併症を軽減する、病気、障害または症状の進行を遅らせる、症状および合併症を軽減または緩和する、および／または病気、障害または症状を治癒または排除する、ならびに症状を防止するための活性化合物の投与、の全てを包含し、防止は、病気、症状、または障害と戦うための患者の管理および監督として理解し、症状または合併症の開始を阻止するための活性化合物の投与を包含する。治療すべき患者は、好ましくは哺乳動物とりわけ人間であるが、動物、例えば犬、猫、牛、羊、馬および豚も包含することができる。
【００７２】
また、無論、本明細書における「ポリフェノール抽出物」への言及は、本発明の方法によりリンゴから抽出される一種以上のポリフェノールを包含する。この用語は、粗製抽出物から（例えばクロマトグラフィー分離により）精製されていてよい、単離されたポリフェノールを包含することも意図している。
【００７３】
＜組合せ治療＞
多くの病気は、治療で、同時に投与されるか、または順次投与される２種類以上の薬剤を使用して治療される。従って、本発明のポリフェノール抽出物を、上に記載する病気の一種を別の病気と組み合わせるか、あるいは病気の治療で通常使用される他の確立された治療に対する補助として行うか、またはそれと併用する治療方法で使用することも、本発明の範囲内に入る。一実施態様においては、上に記載するポリフェノール抽出物を、一種以上の別の治療薬剤との組合せで含んでなる薬学的組成物を提供する。
【００７４】
同様に、本発明のポリフェノール抽出物を、上に記載する病気の一種類の治療に通常使用する他の治療的に活性な化合物と組み合わせて、病気用の薬剤の製造に使用することも本発明の範囲内に入る。
【００７５】
組合せ治療は、当業者が必要または好都合と考える全ての方法で行うことができ、本発明の目的には、組合せで使用する化合物の順序、量、反復または相対的な量に関する制限は、全く考えていない。
【００７６】
＜組成物＞
一実施態様においては、本発明の方法により得られるポリフェノール抽出物は、他のプレバイオティック試剤、例えば単糖、二糖および多糖類、との組合せで使用することができる。従って、本発明の別の態様においては、一種以上の高分子量ポリフェノールおよび一種以上の単糖、二糖または多糖を有するポリフェノール抽出物を含んでなるプレバイオティック組成物を提供する。好適な糖類は、下記式（ＸＩ）に示す構造を有するオリゴフルクトースである。
【化１７】
2010500333.tif 000019
式中、ｎは、典型的には２〜１４、好適には２〜１０、例えば２〜８である。
【００７７】
別の実施態様においては、本発明のポリフェノール抽出物は、様々な単糖、二糖および多糖を与える従来のリンゴ抽出物との組合せで使用することができる。
【００７８】
ポリフェノールを、他のプレバイオティック試剤または従来のリンゴ抽出物との組合せで使用する場合、これらの成分は、順次または同時に、いずれかの都合の良い経路で投与することができる。この組合せには、マイクロフローラを刺激する利点があり、これによって消化管の健康、消化管機能、カルシウム吸収および免疫応答を改良すると共に、結腸癌の危険性をさらに下げるのに役立つ（上記Ｒｉｏｓら）。
【００７９】
本発明の一態様において、本発明は、ポリフェノール抽出物および／または上記の組合せ（以下、本発明の組成物と呼ぶ）を含んでなる剤形を提供する。
【００８０】
本発明の組成物は、都合の良いことに、単独でも、あるいは薬学的に許容され得るキャリヤーまたは添加剤との組合せでも投与できる。本発明の組成物は、従来の技術、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に開示されている技術、により、薬学的に許容され得るキャリヤーまたは希釈剤ならびに他の公知の佐剤および添加剤と共に処方することができる。
【００８１】
好適な薬学的キャリヤーとしては、不活性固体希釈剤または充填材、無菌水溶液および各種の有機溶剤がある。固体キャリヤーの例は、ラクトース、白土、スクロース、シクロデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸およびセルロースの低級アルキルエーテルである。液体キャリヤーの例は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレンおよび水である。
【００８２】
同様に、キャリヤーまたは希釈剤は、この分野で公知のいずれかの徐放性材料、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを単独で、またはワックスと混合して包含することができる。本発明の組成物および薬学的に許容され得るキャリヤーを組み合わせることにより形成される薬学的組成物は、開示される投与経路に好適な様々な剤形で容易に投与される。処方物は、薬学の分野で公知の方法により、単位剤形で都合良く与えることができる。
【００８３】
従って、別の態様においては、心臓血管病の治療で使用するための、一種以上の低分子量ポリフェノールを有するポリフェノール抽出物、または薬学的に許容され得る塩、もしくはそれらのプロドラッグ、および一種以上の薬学的に許容され得るキャリヤー、添加剤、または希釈剤を含んでなる剤形を提供する。
【００８４】
従って、別の態様においては、結腸癌の治療で使用するための、一種以上の高分子量ポリフェノールを有するポリフェノール抽出物、または薬学的に許容され得る塩、もしくはそれらのプロドラッグ、および一種以上の薬学的に許容され得るキャリヤー、添加剤、または希釈剤を含んでなる剤形を提供する。
【００８５】
剤形は、いずれかの好適な経路、例えば経口、直腸内、経鼻、肺、局所的（バッカルおよび舌下を包含する）、経皮、槽内、腹腔内、膣内および非経口（皮下、筋肉内、胞膜内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、静脈内および皮内を包含する）経路、により投与するように処方することができ、経口経路が好ましい。無論、好ましい経路は、治療すべき患者の一般的な症状および年齢、治療すべき症状の性質、および選択された活性成分によって異なる。
【００８６】
局所使用には、本発明の化合物を含むスプレー、クリーム、軟膏、ゼリー、ジェル、吸入薬、皮膚貼剤、植込剤、懸濁剤の溶液、等が考えられる。この用途には、局所用途は、含嗽剤および洗口剤を含むものとする。
【００８７】
経口投与用の組成物としては、固体剤形、例えば硬質または軟質カプセル、錠剤、糖剤、トローチ剤、散剤、顆粒剤、および液体剤形、例えば予め決められた量の本発明の組成物をそれぞれ含み、好適な添加剤を包含することができる、水剤、乳剤、水性または油性懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤が挙げられる。経口使用を意図する組成物は、公知のいずれかの方法により調製することができ、そのような組成物は、薬学的に洗練された、舌に快い製剤を与えるために、甘味料、着香料、着色剤、および保存剤からなる群から選択された一種以上の試剤を含むことができる。
【００８８】
水性懸濁剤は、本発明の組成物を、水性懸濁剤の製造に好適な添加剤との混合物で含むことができる。そのような添加剤は、懸濁化剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムであり、分散剤または湿潤剤は、天然リン脂質、例えばレシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物、例えばポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、例えばヘプタデカエチル−エンオキシセタノール、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと、脂肪酸および無水ヘキシトールに由来する部分エステルの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートでよい。水性懸濁剤は、一種以上の着色剤、一種以上の着香料、および一種以上の甘味料、例えばスクロースまたはサッカリン、も含むことができる。
【００８９】
油性懸濁剤は、本発明の組成物を植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはやし油、あるいは鉱油、例えば液体パラフィン、中に懸濁させることにより、処方することができる。油性懸濁剤は、粘稠化剤、例えばみつろう、硬質パラフィンまたはセチルアルコール、を含むことができる。甘味料、例えば上記の甘味料、および着香料を加え、舌に快い経口製剤を製造することができる。これらの組成物は、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、の添加により保存することができる。
【００９０】
水を加えることにより水性懸濁剤を調製するのに好適な分散性粉末および顆粒により、本発明の組成物が、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および一種以上の保存剤との混合物で得られる。好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤は、すでに上に記載した材料により代表される。これらの材料は、緩衝剤、例えばクエン酸塩およびリン酸塩緩衝剤、炭酸塩、例えば重炭酸塩、例えば重炭酸ナトリウムまたはアンモニウム、およびソリン酸（ｓｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、例えばクエン酸または酸性クエン酸塩、から形成される発泡剤も含むことができる。他の添加剤、例えば甘味料、着香料、および着色剤も存在できる。
【００９１】
本発明の薬学的組成物は、水中油型乳剤の形態にあってもよい。油相は、植物油、例えばオリーブ油または落花生油、あるいは鉱油、例えば液体パラフィン、またはそれらの混合物でよい。好適な乳化剤は、天然ガム、例えばアカシアガムまたはトラガカントガム、天然リン脂質、例えば大豆、レシチン、および脂肪酸および無水ヘキシトールに由来するエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、および該部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、でよい。乳剤は、甘味料および着香料も含むことができる。
【００９２】
シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味料、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロース、で処方することができる。そのような処方物は、粘滑剤、保存剤および着香料および着色剤も含むことができる。薬学的組成物は、無菌の注射できる水性または油脂性懸濁剤の形態にあってもよい。この懸濁剤は、公知の方法により、上記の好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して処方することができる。無菌の注射できる製剤は、無毒性の非経口投与可能な希釈剤または溶剤に入れた無菌の注射できる溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオールに入れた溶液、でよい。使用可能な許容されるビヒクルおよび溶剤としては、水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、無菌の固定された油が、溶剤または懸濁化媒体として都合良く使用される。この目的には、合成モノまたはジグリセリドを使用する全ての穏やかな固定油を使用できる。さらに、脂肪酸、例えばオレイン酸、は注射剤の調製に使用される。
【００９３】
別の実施態様においては、ポリフェノール抽出物を乾燥、例えば噴霧乾燥または温度３０℃未満で、例えば２０℃未満で、真空下で乾燥、および所望により凍結乾燥させ、固体剤形に処方することができる。
【００９４】
錠剤は、活性成分を、錠剤の製造に好適な、無毒性の薬学的に許容され得る添加剤との混合物で含むことができる。これらの添加剤は、例えば不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム、造粒および崩壊剤、例えばコーンスターチまたはアルギン酸、結合剤、例えばデンプン、ゼラチンまたはアカシア、および潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク、でよい。
【００９５】
錠剤は、被覆しなくても、あるいは公知の技術により被覆し、胃腸管中における崩壊および吸収を遅延させ、それによって、長期間の持続作用を与えてもよい。
【００９６】
経口使用する処方物は、活性成分を不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン、と混合する硬質ゼラチンカプセルとして、あるいは活性成分を水または油媒体、例えば落花生油、液体パラフィン、またはオリーブ油、と混合する軟質ゼラチンカプセルとして形成することもできる。
【００９７】
非経口投与用の剤形としては、無菌の水性および非水性の注射できる溶液、分散液、懸濁液ならびに無菌の、使用前に無菌の注射できる溶液または懸濁液に再構成する粉末がある。そのような水性溶液は、必要であれば適宜緩衝し、液体希釈剤を先ず十分な食塩水またはグルコースで等張にすべきである。水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に好適である。使用する無菌水性媒体は、すべて、当業者には公知の標準的な技術により容易に入手できる。デポ注射できる処方物も本発明の範囲内に入る。
【００９８】
化合物を直腸内投与するための組成物は、坐剤の形態にあってもよい。これらの組成物は、本発明の組成物を、常温では固体であるが、直腸内温度では液体になり、従って直腸内で融解し、本発明の組成物を放出する、好適な非刺激性添加剤と混合することにより、調製することができる。そのような材料としては、例えばココアバターおよびポリエチレングリコールがある。
【００９９】
本発明の化合物またはそれらの組成物は、一般的に、意図する結果を達成するのに有効な量で、例えば処置する特定の病気を治療または防止するのに有効な量で使用する。これらの化合物は、治療的に投与し、治療上の有益性を達成することができる。治療上の有益性とは、治療している、原因となる障害の根絶または緩和および／または原因となる障害に関連する機構の一つ以上を根絶または緩和することを意味する。治療上の有益性は、改善が見られるか、否かに関係なく、病気の進行を止めること、または遅延させることも含む。
【０１００】
正確な投与量は、投与の頻度および様式、処置している患者の性別、年齢、体重および一般的な症状、処置している症状の性質および重度、および同時に処置すべき病気、その他の、当業者には明らかなファクターによって異なる。有効投与量は、当業者が十分に決定することができる。
【０１０１】
ポリフェノール抽出物を、同じ病気状態に対して活性な第二治療試剤と併用する場合、各化合物の投与量は、該化合物を単独で使用する場合の量とは異なる場合がある。適切な投与量は、当業者が容易に決定できる。
【０１０２】
別の態様において、本発明は、ポリフェノール抽出物および／または上記の組合せを含んでなる、食用組成物、例えば飲料、例えば果実ジュース、スポーツドリンク、ヨーグルトドリンク、ミルクドリンク、茶、等、または固体食品、例えば食品スナックバー、例えばフルーツバー、ナッツバーおよび穀類バー、穀類、デザート、チョコレート（例えばミルクおよびダーク）バー等を提供する。
【０１０３】
一実施態様においては、食用組成物は、他の栄養、例えばビタミン、ミネラル、およびプレバイオティック、例えばオリゴフルクトースおよびリンゴ繊維、およびプロバイオティックをさらに含んでなることができる。
【０１０４】
一実施態様では、食用組成物は、上に規定する液体剤形として処方する。別の実施態様では、液体剤形は、粘稠化剤、等張化剤および緩衝剤をさらに含んでなることができる。
【０１０５】
好適な等張化剤の例としては、特定強度の溶液、例えば等張溶液、を与えるのに使用できる砂糖および塩化ナトリウムがある。好適な緩衝剤の例としては、クエン酸塩およびリン酸塩がある。
【０１０６】
別の実施態様においては、食品が、上記のポリフェノール抽出物を含んでなる。本発明のさらに別の態様においては、ポリフェノール抽出物を、一つ以上の成分、例えば乾燥果実、ナッツおよび穀類、と混合することができる。
【０１０７】
従って、別の態様においては、一種以上の低分子量ポリフェノールを含むポリフェノール抽出物を含んでなる、心臓血管病の予防または治療に使用するための食用組成物を提供する。
【０１０８】
別の態様においては、心臓血管病の予防または治療に使用するための薬剤の製造における、一種以上の低分子量ポリフェノールを含むポリフェノール抽出物を含んでなる、上記の食用組成物を提供する。
【０１０９】
本発明のさらに別の実施態様においては、一種以上の低分子量ポリフェノールを含むポリフェノール抽出物を含んでなる、上に規定する食用組成物の投与を含んでなる、心臓血管病の治療または予防方法を提供する。
【０１１０】
従って、別の態様においては、結腸癌の予防または治療に使用するための、一種以上の高分子量ポリフェノールを含むポリフェノール抽出物を含んでなる、上に規定する食用組成物を提供する。
【０１１１】
別の態様においては、結腸癌の予防または治療に使用するための薬剤の製造における、一種以上の高分子量ポリフェノールを含むポリフェノール抽出物を含んでなる、上に規定する食用組成物を提供する。
【０１１２】
本発明のさらに別の態様においては、一種以上の高分子量ポリフェノールを含むポリフェノール抽出物を含んでなる、上に規定する食用組成物の投与を含んでなる、結腸癌の治療または予防方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】本発明の方法の配置を図式的に示す。
【図２】溶剤抽出温度のエピカテキン抽出に対する影響の分析結果を示す。
【図３】溶剤抽出温度のエピカテキン抽出に対する影響の分析結果を示す。
【図４】溶剤抽出温度のエピカテキン抽出に対する影響の分析結果を示す。
【図５】溶剤抽出温度のエピカテキン抽出に対する影響の分析結果を示す。
【図６】溶剤抽出温度のエピカテキン抽出に対する影響の分析結果を示す。
【図７】溶剤抽出温度のエピカテキン抽出に対する影響の分析結果を示す。
【図８】溶剤抽出温度のエピカテキン抽出に対する影響の分析結果を示す。
【図９】溶剤抽出温度のエピカテキン抽出に対する影響の分析結果を示す。
【図１０】溶剤抽出温度のエピカテキン抽出に対する影響の分析結果を示す。
【図１１】溶剤抽出温度のエピカテキン抽出に対する影響の分析結果を示す。
【図１２】溶剤抽出温度のエピカテキン抽出に対する影響の分析結果を示す。
【図１３】溶剤抽出温度のエピカテキン抽出に対する影響の分析結果を示す。
【図１４】メタノール抽出分析の結果を示す。
【図１５】メタノール抽出分析の結果を示す。
【図１６】エタノール抽出分析の結果を示す。
【図１７】エピカテキン抽出物による心臓血管研究の結果を示す。
【図１８】
【実施例】
【０１１４】
ここで本発明を下記の非限定的な例により説明する。
＜一般的な手順＞
約６ｇの凍結乾燥させたリンゴをビーカー中で秤量し、重量を記録した。これに脱イオンし、蒸留し、脱気した水１５ｍｌを加え、高粘度のペーストを形成し、次いで脱イオンし、脱気した水で部分的に満たした抽出セルに、このペーストを移した。残りのセル容積を水で満たし、密封し、抽出物装置（図１に示す）の加熱炉中に入れた。約４ｂａｒの安定した圧力に達するまで、水をポンプ供給した。次いで、加熱炉を所望の温度に設定し、３０分間平衡化してから、試料採取工程を開始した。
【０１１５】
水を一定速度で３０分間流した後、試料を２時間にわたって採取し、ＨＰＬＣにより分析した。次いで、溶液中の（−）−エピカテキン濃度を計算し、ある範囲にわたる抽出の速度を査定するのに使用した。
【０１１６】
＜ＨＰＬＣ方法＞
カラム  Ｗａｔｅｒｓ  ＲＰ１８（Ｃ１８固定相４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ粒子径）
Ｇｒａｄカラム  Ｗａｔｅｒｓ  ＲＰ１８（４．６×５０ｍｍ、３．５μｍ粒子径）
加熱炉温度３０℃
二元移動相  
成分Ａ  酢酸２％を含む水
成分Ｂ  酢酸０．１％を含むメタノール
【０１１７】
【表１】
2010500333.tif 000020
【０１１８】
例１  エピカテキン抽出に対する溶剤抽出温度の影響
抽出分析は、表２に示すように、６種類の異なった温度で行った。
【表２】
2010500333.tif 000021
【０１１９】
（Ａ）２０℃における抽出
リンゴ粉末１０．００１ｇを水１００ｍｌと共にビーカーに入れ、良く混合し、密封フィルムで覆い、２時間放置した。次いで、得られた溶液１  ｍｌを、０．４５μｍシリンジフィルターを通して濾過し、２ｍｌ自動試料採取装置バイアルに入れ、これにエピカテキン（Ｓｉｇｍａから入手）の社内標準溶液５０μｌを加えた。クロマトグラフィーの結果を図２に示し、溶液を１回分析し、エピカテキン８２５．２８ｍｇ／ｋｇリンゴ粉末の濃度を得た。
【０１２０】
（Ｂ）５０℃における抽出
リンゴ粉末６．１３７ｇを、上記の「一般的な手順」に従って抽出した。次いで、それぞれの得られた溶液１ｍｌを、０．４５μｍシリンジフィルターを通して濾過し、２ｍｌ自動試料採取装置バイアルに入れ、これにエピカテキン（Ｓｉｇｍａから入手）の社内標準溶液５０μｌを加えた。結果を表３に示す。
【０１２１】
【表３】
2010500333.tif 000022
【０１２２】
５０℃抽出の累積結果を図３に示し、クロマトグラフィーの結果を図４に示す。
【０１２３】
この分析の結果から、リンゴ粉末１グラムあたりエピカテキン２．０１ｍｇが得られた（２００７．８５ｍｇ／ｋｇに等しい）。
【０１２４】
試料（ｇ）        ｍｇ／ｇ          ｍｇ／ｋｇ
５０℃          ６．１３７        ２．０１        ２００７．８５
【０１２５】
（Ｃ）７５℃における抽出
リンゴ粉末６．５９５ｇを、上記の「一般的な手順」に従って抽出した。次いで、それぞれの得られた溶液１ｍｌを、０．４５μｍシリンジフィルターを通して濾過し、２ｍｌ自動試料採取装置バイアルに入れ、これにエピカテキン（Ｓｉｇｍａから入手）の社内標準溶液５０μｌを加えた。結果を表４に示す。
【０１２６】
【表４】
2010500333.tif 000023
【０１２７】
７５℃抽出の累積結果を図５に示し、クロマトグラフィーの結果を図６に示す。
【０１２８】
この分析の結果から、リンゴ粉末１グラムあたりエピカテキン２．７９ｍｇが得られた（２７９０．０２ｍｇ／ｋｇに等しい）。
【０１２９】
試料（ｇ）        ｍｇ／ｇ          ｍｇ／ｋｇ
７５℃          ６．５９５        ２．７９          ２７９０．０２
【０１３０】
（Ｄ）１００℃における抽出
リンゴ粉末６．０９６２ｇを、上記の「一般的な手順」に従って抽出した。次いで、それぞれの得られた溶液１ｍｌを、０．４５μｍシリンジフィルターを通して濾過し、２ｍｌ自動試料採取装置バイアルに入れ、これにエピカテキン（Ｓｉｇｍａから入手）の社内標準溶液５０μｌを加えた。結果を表５に示す。
【０１３１】
【表５】
2010500333.tif 000024
【０１３２】
１００℃抽出の累積結果を図７に示し、クロマトグラフィーの結果を図８に示す。
【０１３３】
この分析の結果から、リンゴ粉末１グラムあたりエピカテキン２．６８ｍｇが得られた（２６８０．７１ｍｇ／ｋｇに等しい）。
【０１３４】
試料（ｇ）        ｍｇ／ｇ            ｍｇ／ｋｇ
１００℃          ６．０９６２        ２．６８          ２６８０．７１
【０１３５】
（Ｅ）１２５℃における抽出
リンゴ粉末６．２０３８ｇを、上記の「一般的な手順」に従って抽出した。次いで、それぞれの得られた溶液１ｍｌを、０．４５μｍシリンジフィルターを通して濾過し、２ｍｌ自動試料採取装置バイアルに入れ、これにエピカテキン（Ｓｉｇｍａから入手）の社内標準溶液５０μｌを加えた。結果を表６に示す。
【０１３６】
【表６】
2010500333.tif 000025
【０１３７】
クロマトグラフィーの結果を図９に示す。
この分析の結果から、リンゴ粉末１グラムあたりエピカテキン２．０７ｍｇが得られた（２０７０．２１ｍｇ／ｋｇに等しい）。
【０１３８】
試料（ｇ）        ｍｇ／ｇ            ｍｇ／ｋｇ
１２５℃        ６．２０３８        ２．０７          ２０７０．２１
【０１３９】
（Ｆ）１５０℃における抽出
リンゴ粉末６．６６５１ｇを、上記の「一般的な手順」に従って抽出した。次いで、それぞれの得られた溶液１ｍｌを、０．４５μｍシリンジフィルターを通して濾過し、２ｍｌ自動試料採取装置バイアルに入れ、これにエピカテキン（Ｓｉｇｍａから入手）の社内標準溶液５０μｌを加えた。結果を表７に示す。
【０１４０】
【表７】
2010500333.tif 000026
【０１４１】
１００℃抽出の累積結果を図１０に示し、クロマトグラフィーの結果を図１１に示す。
この分析の結果から、リンゴ粉末１グラムあたりエピカテキン０．３７ｍｇが得られた（３７１．００ｍｇ／ｋｇに等しい）。
【０１４２】
試料（ｇ）        ｍｇ／ｇ            ｍｇ／ｋｇ
１５０℃        ６．６６５１        ０．３７          ３７１．００
【０１４３】
（Ｇ）結果の概要
抽出物（Ａ）〜（Ｆ）のそれぞれから得たデータを図１２にまとめて示し、特定の温度における見掛け上の抽出速度を比較する。図１３は、エピカテキン抽出に対する各抽出温度の効率を示す（ピーク効率は８３％であった）。図１３から、７５℃を超えると、抽出物されるエピカテキンの総濃度が低下することが分かる。この効率低下は、高温におけるエピカテキンからカテキンへの異性化（エピマー化）により引き起こされる可能性がある。
【０１４４】
例２  抽出物中のカテキンの検出
高温でエピカテキンがカテキンに異性化される可能性を試験するために、エピカテキン０．６８８  ｍｇ／ｍｌの試験溶液を調製し、下記のように処理した。エピカテキン９５０μｌを自動試料採取装置バイアルに移し、窒素で掃気し、密封した。次いで、このバイアルを冷却し、密封を除去し、社内標準５０μｌを加えてから分析した。試験は、５０、７５、１００および１２５℃で１５および３０分間行った。バイアルが、発生するであろう圧力に耐えられないので、試験は１５０℃では行わなかった。
【０１４５】
エピカテキンおよびカテキンの濃度を、各試験溶液に対して測定し、表８に示す。
【０１４６】
【表８】
2010500333.tif 000027
【０１４７】
１００℃を超える温度における（−）−エピカテキンの急速な異性化は、これらの温度がさらなる研究には不安定であること、および試料を高温で維持する全体的な時間は、可能な限り短くすべきであることを示唆している。
【０１４８】
例３  メタノール抽出物分析
三重の抽出を、リンゴ粉末約１ｇに対してメタノールで、上記の「一般的な手順」により抽出して行った。リンゴ試料は、６０ｍｌ遠心分離管の中に秤量し、メタノール２５ｍｌを加えた。試料を振とうし、５５℃に設定した加熱炉中に２０分間入れて抽出させ、接触を最大限にするために、試料を５分ごとに再振とうした。抽出後、試料を加熱炉から取り出し、３０分間冷却させた。次いで、各溶液１ｍｌを、０．４５μｍシリンジフィルターを通して濾過し、２ｍｌ自動試料採取装置バイアルに入れ、これに社内標準溶液５０μｌを加えた。結果を表９に示す。
【０１４９】
【表９】
2010500333.tif 000028
【０１５０】
クロマトグラフィーの結果を図１４に示す。
【０１５１】
図１４で得られた（−）−エピカテキンピークのスペクトルを解析し、データ収集波長２８０±１０ｎｍで記録されなかった他の物質の共溶離があったか、否かを決定した。このピークの拡大を図１５に示す。これらの２つのスペクトルは、定量に使用した（−）−エピカテキン標準により生じるピークと同一であることが分かった。これは、主要ピークおよび肩部が非常に類似した材料から構成されていることを示唆しており、これが、この肩部が、エピカテキンの（＋）異性体であろうことの証拠である。スペクトル中に他の痕跡が無いことは、クロマトグラムのこの点で他の材料が共溶離していないことを示している。
【０１５２】
例４  クロマトグラムによるポリフェノールの単離
小規模試験を、Ｃ１８−Ｅ  ＳＰＥ材料および２種類の市販イオン交換樹脂、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−１６およびＰｕｒｏｌｉｔｅ  ＭＮ１００を使用して行った。
【０１５３】
水１０ｍｌ中にエピカテキン９．１８ｍｇ（０．９１８ｍｇ／ｍｌ）を含む試験溶液を、３種類の試験吸着材（ｓｏｒｂｅｎｔ）各１ｇを含むカラムに付けた。水後処理をエピカテキンの存在に関して査定し、ＸＡＤ−１６は０．２６１ｍｇ／ｍｌを含んでいることが分かったが、これは、カラムに付けた全量の中で、７１．６％だけが保持されていることを示している。ＭＮ１００およびＣ１８は、処理した水の中にエピカテキンが存在しないことを示した。次いで、試験吸着材のそれぞれをエタノールで溶離させ、溶剤を分析し、回収されたエピカテキンの量を測定した。
【０１５４】
ＸＡＤ−１６溶離液は、エピカテキン５．２２ｍｇを含み、吸着材に付けた総量の中の、合計７．８３ｍｇ（８５．３％）を与えることが分かった。離れた１．３５ｍｇ（１６．５％）は回収されなかった。
【０１５５】
ＭＮ１００溶離液は、エピカテキン４．３７ｍｇを含み、吸着材に付けた総量の中の、合計４．３７ｍｇ（４７．６％）を与えることが分かった。離れた４．８１ｍｇ（５２．４％）は回収されなかった。
【０１５６】
Ｃ１８溶離液は、エピカテキン９．０３ｍｇを含み、吸着材に付けた総量の中の、合計９．０３ｍｇ（９８．４％）を与えることが分かった。離れた０．１５ｍｇ（５２．４％）は回収されなかった。
【０１５７】
上記のことから、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−１６またはＣ１８−Ｅを使用できるが、ＸＡＤ−１６を使用する場合、同じ試料装填特性を達成するのに、遙かに大きな床体積が必要であることが分かる。上記のことから、および生成物回収率および試料装填量を最大限にするためには、Ｃ１８−Ｅが、表１０に示すように、水溶液からポリフェノールを単離する最良の特性を有することが分かった。
【０１５８】
【表１０】
2010500333.tif 000029
【０１５９】
Ｃ１８による抽出の累積結果を図１６に示す。
【０１６０】
例５  エタノール抽出分析
７部分のリンゴ粉末（約５０ｇ）を４：１比のエタノールで、５０℃で抽出した。集めたエタノールをガラス繊維フィルターを通して濾過し、蒸発させ、入手できる固体の材料を集めた。合計３７７．３ｇのリンゴ粉末を、エタノール１５０５ｇ、比４：１を使用して抽出した。
【０１６１】
蒸発工程の際、ある量の固体材料が溶液から析出するのが見られ、この材料を溶液の遠心分離により回収した。集めた材料、白色の粘着性固体１４．６ｇを分析し、痕跡量のポリフェノールを含むことが分かったが、これは、恐らく痕跡量のエタノールが材料中に捕獲された結果であろう。
【０１６２】
残りのエタノールを真空下、６０℃で回収し、粘着性の赤色半固体材料、重量２８．９  ｇ、が回収された。この材料は、予想とは異なり、粉末状の固体であった。これは恐らく、この最終的な蒸発物が残留エタノール、ある量の水、脂質およびタンパク質を、ポリフェノールと共に含むためであろう。これらの好ましくない物質をフェノールから除去するために、この固体を、Ｃ１８−Ｅ  ＳＰＥ管を通過できるように、水に再溶解させ、ポリフェノール濃度が高い画分を回収した。
【０１６３】
最終的な蒸発物を水に溶解させた時、不溶性材料の層が見られ、濾過および乾燥させた時、この材料は、痕跡量のフェノールを含む固体であることが分かった。水抽出物をＣ１８−Ｅに通した時、その水を分析し、エピカテキンを含まないことが分かった。Ｃ１８−Ｅを、床体積の４倍のエタノールで溶離させた。エタノールを蒸発させることにより、赤色粉末１．９７６ｇが得られ、これは、分析により、エピカテキン１８．３％を含むことが分かった。
【０１６４】
粉末に至る工程の際に抽出物を何度も操作しているので、この工程を、異なった画分を集めずに繰り返し、できる限り直接、生成物を集めることにした。
【０１６５】
従って、下記の工程を行った。
１）凍結乾燥させたリンゴ粉末３３８ｇを２．５Ｌガラスビンに入れ、エタノール１０４５ｇ（３：１の比）で、６０℃で１５分間抽出した。
２）得られた混合物を高温で真空濾過し、エタノールを回収した。ある量のエタノールをまだ含んでいるリンゴ粉末を、抽出ビン中に戻し、密封した。
３）集めた抽出液を５０％蒸発させ、不溶性の材料を全て除去した。
４）残りの体積を初期レベルの約１５％にさらに下げ、一晩貯蔵した。
５）次いで、回収したエタノールをリンゴ粉末に加え、再度３：１の比で常温で一晩抽出した。
６）一晩浸漬に続いて、工程２〜４を繰り返した。
７）２種類の濃縮したエタノール抽出液を一つに合わせ、粘着性の赤色半固体が得られるまで蒸発させた。
８）この粘着性固体に高温（５０℃）の脱気した水４００ｍｌを加え、ポリフェノールを溶解させた。
９）水溶液を冷却し、濾過して不溶性の材料（脂肪）を全て除去した。
１０）使用に先立ち、４本のＣ１８−Ｅ、２０ｇギガ管（ｇｉｇａ  ｔｕｂｅｓ）を製造業者の指示に従って調製した。Ｃ１８床を先ずエタノールで湿潤させ、次いで床体積の４倍の水２４０ｍｌで交換し、吸着材を調整した。
１１）水溶液をＣ１８管を通して処理し、ポリフェノール濃度が高い画分を溶液から除去してから、床を水で洗浄し、結合していない材料を全て除去した。
１２）次いで、吸着材床をエタノール２４０ｍｌで溶離させ、集めた。
１３）エタノールを蒸発乾固させ、固体の「粉末」を集めた。
１４）２〜５ｍｇの試料を、そのエピカテキン含有量に関して分析した。
【０１６６】
最初のリンゴ粉末３３８ｇから合計６．７５７ｇの、エピカテキン含有量が１２．１％である赤色粉末が得られた。回収された固体は、初期リンゴ粉末材料の２％になる。乾燥リンゴ粉末のｍｇ／ｋｇ当量に換算すると、回収された固体は２４２７．１ｍｇ／ｋｇの値になる。
【０１６７】
リンゴ粉末１ｇおよびメタノール１０ｍｌを使用する比較抽出液は、４６６３ｍｇ／ｋｇの数値を与えた。上記の低い回収数値がエピカテキンのエタノールに対する低い溶解度によるものか、否かを試験するために、１０、２０および３０：１ｗ／ｗを使用して一連の試験を行った。この結果を表１１に示す。
【０１６８】
【表１１】
2010500333.tif 000030
【０１６９】
表１１のデータは、エピカテキンの、エタノールに対する溶解度が、メタノールに対するよりも低いが、その比を増加することにより、同等の溶解度、従って、より高い収率を達成できることを示している。
【０１７０】
例６  エピカテキン抽出物による心臓血管研究
１０名の健康な志願者を募集し、本発明の方法により得たエピカテキン抽出物の、血管音、従って、心臓血管機能を改善する手段としての効果を試験した。５名の志願者にプラセボフルーツ飲料を与え、５名の志願者に同じ試験飲料であるが、１ｍｇ／ｋｇ体重（（−）−エピカテキン単位に対して）を加えたものを与えた。血管音は、非侵襲的デジタル血量測定法により得た反射率およびデジタル体積パルスの連続的な、試験者に依存しない、自動分析に対するアルゴリズムにより連続的に定量した。データは、相対的剛性計数ＳＩ  （ｍ／ｓ）として表し、血管の年齢と相関させた。パルス波、指髄（ｆｉｎｇｅｒ  ｐｕｌｐ）を通した赤色および赤外光の透過率により測定した。第一導関数の局所的最小値を決定し、それによって、対応するパルスの変わり目（＝変曲点）を求めた。反射率は、変わり目（＝変曲点）後の第三〜第七データ点の平均から計算した。
【０１７１】
図１７および１８は、２．５時間試験の結果を示す。これらの図は、抽出物を含む試験飲料を消費する群（ｎ＝１０）の動脈剛性計数（ＳＩ、図１７）および血管年齢（図１８）が、比較群と比較した時、統計的に改善された（即ち減少した）ことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010500333.tif 000037
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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