(57)【要約】  処理された生物学的サンプルからの蛍光信号を自動式顕微鏡で検出および分析する光学的手段。【選択図】  図１
2010500574.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
当該スライドに記録された電子的に照会可能なデータを含むと共に当該スライド上に生物学的サンプルを有するスライドを準備する段階と、
上記電子的に照会可能なデータを上記スライドから読取る段階と、
上記生物学的サンプルが自動式顕微鏡により如何に走査されるべきかを、上記電子的に照会可能なデータから決定する段階と、
上記スライドに記録された上記電子的に照会可能なデータにより指定される様式にて、上記スライドを自動式顕微鏡により走査する段階と、
上記走査から、上記生物学的サンプルの状態を表す試験結果を決定する段階とを備えて成る、方法。
【請求項２】
スライド載荷台と、少なくともひとつの対物レンズと、画像捕捉手段と、所定プロトコルに従い当該自動式顕微鏡を操作するプログラム可能手段と、分析結果を提供するプログラム可能手段とを備えて成る自動式顕微鏡を配備する段階と、
自身上にサンプルと照会可能データとを含む顕微鏡スライドを配備する段階であって、上記照会可能データは上記サンプルの分析に対するプロトコルに関する情報を提供するという段階と、
上記データを照会する段階と、
上記スライドを上記スライド載荷台上で位置決めする段階と、
上記照会可能データ中に符号化された上記分析プロトコルに従い、上記顕微鏡により上記サンプルを分析する段階と、
上記顕微鏡により、上記サンプルを表す分析結果を提供する段階とを備えて成る、顕微鏡分析のための方法。
【請求項３】
前記顕微鏡により前記サンプルを分析する前記段階は、ひとつ以上の特定可能なプロトコルを備えるデータベースからのデータを照会することにより特定されたプロトコルを獲得する段階を備えて成る、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記顕微鏡により前記サンプルを分析する前記段階は、上記顕微鏡により、上記サンプルに対し、または、該サンプル内に包含される焦点面に対して焦点合わせする段階を備えて成る、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記顕微鏡により前記サンプルを分析する前記段階は、上記サンプルの画像を獲得する段階を備えて成る、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記画像を獲得する前記段階は、
低倍率を有するレンズを用いて画像走査を行う段階と、
上記低倍率走査の一部分を、高倍率を有するレンズを使用して画像を走査するために選択する段階と、
上記高倍率にて画像走査を行う段階と、
上記高倍率走査を最適化する段階とを備えて成る、請求項５記載の方法。
【請求項７】
（ａ）スライド載荷台と、少なくともひとつの対物レンズと、少なくとも一枚の顕微鏡スライドを自身内に含む少なくともひとつのスライド・カセットと、所定プロトコルに従い当該自動式顕微鏡を操作するプログラム可能手段と、分析結果を提供するプログラム可能手段とを備えて成る自動式顕微鏡を配備する段階と、
（ｂ）複数の顕微鏡スライドであって、各々が自身上にサンプルと照会可能データとを含む複数の顕微鏡スライドを配備する段階であって、上記複数のスライドは上記スライド・カセットの内のひとつ以上のスライド・カセット内に含まれ、上記照会可能データは上記サンプルの分析に対するプロトコルに関する情報を提供するという段階と、
（ｃ）上記顕微鏡載荷台へとスライドを搬送するに適した位置へと第１カセットを搬送する段階と、
（ｄ）上記第１カセットから第１スライドを上記顕微鏡載荷台へと搬送する段階と、
（ｅ）上記第１スライド上に見出されるデータを照会する段階と、
（ｆ）上記スライド載荷台上で上記第１スライドを位置決めする段階と、
（ｇ）上記照会可能データ中に符号化された上記分析プロトコルに従い、上記顕微鏡により上記第１スライド上の上記サンプルを分析する段階と、
（ｈ）上記顕微鏡により、上記第１スライド上の上記サンプルを表す分析結果を提供する段階と、
（ｉ）分析されるべき別のスライドが上記第１カセット内に残存するなら、段階（ｄ）〜（ｈ）を反復する段階と、
（ｊ）別のカセットが残存するなら、段階（ｃ）〜（ｉ）を反復する段階とを備えて成る、
高スループットの顕微鏡分析のための方法。
【請求項８】
前記顕微鏡により前記サンプルを分析する前記段階は、ひとつ以上の特定可能なプロトコルを備えるデータベースからのデータを照会することにより特定されたプロトコルを獲得する段階を備えて成る、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記顕微鏡により前記サンプルを分析する前記段階は、上記顕微鏡により、上記サンプルに対し、または、該サンプル内に包含される焦点面に対して焦点合わせする段階を備えて成る、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記顕微鏡により前記サンプルを分析する前記段階は、上記サンプルの画像を獲得する段階を備えて成る、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記画像を獲得する前記段階は、
低倍率を有するレンズを用いて画像走査を行う段階と、
上記低倍率走査の一部分を、高倍率を有するレンズを使用して画像を走査するために選択する段階と、
上記高倍率にて画像走査を行う段階と、
上記高倍率走査を最適化する段階とを備えて成る、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
スライド載荷台と、少なくともひとつの対物レンズと、画像捕捉手段と、所定プロトコルに従い当該自動式顕微鏡を操作するプログラム可能手段と、分析結果を提供するプログラム可能手段とを備えて成る自動式顕微鏡を使用する顕微鏡分析のための方法に対し、コンピュータにより実行可能な命令のプログラムを具現するコンピュータ可読記憶媒体であって、
上記プログラムは、
顕微鏡スライド上のデータであって、該照会可能データは上記スライド上に含まれたサンプルの分析のためのプロトコルに関する情報を提供するというデータを照会するための一群の命令と、
上記スライドを上記スライド載荷台上で位置決めするための一群の命令と、
上記照会可能データ中に符号化された上記分析プロトコルに従い、上記顕微鏡により上記サンプルを分析するための一群の分析命令と、
上記顕微鏡により、上記サンプルを表す分析結果を提供するための一群の命令とを備えて成る、
コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１３】
顕微鏡スライド上のサンプルを分析するためのひとつ以上の特定可能なプログラム化プロトコルを備えるデータベースを更に備えて成る、請求項１２記載の記憶媒体。
【請求項１４】
前記分析命令群は、前記データベースからのデータを照会することにより特定されたプロトコルを獲得するための命令を備えて成る、請求項１３記載の記憶媒体。
【請求項１５】
前記分析命令群は、前記顕微鏡により、前記サンプルに対し、または、該サンプル内に包含される焦点面に対して焦点合わせするための命令を備えて成る、請求項１２記載の記憶媒体。
【請求項１６】
前記分析命令群は、前記サンプルの画像を獲得するための命令を備えて成る、請求項１２記載の記憶媒体。
【請求項１７】
前記画像を獲得するための前記命令は、
低倍率を有する顕微鏡レンズを用いて画像走査を行うための命令と、
上記低倍率走査の一部分を、高倍率を有する顕微鏡レンズを使用して画像を走査するために選択するための命令と、
上記高倍率にて画像走査を行うための命令と、
上記高倍率走査を最適化するための命令とを備えて成る、請求項１６記載の記憶媒体。
【請求項１８】
スライド載荷台と、少なくともひとつの対物レンズと、少なくとも一枚の顕微鏡スライドを自身内に含む少なくともひとつのスライド・カセットと、所定プロトコルに従い当該自動式顕微鏡を操作するプログラム可能手段と、分析結果を提供するプログラム可能手段とを備えて成る自動式顕微鏡を使用する高スループットの顕微鏡分析のための方法に対し、コンピュータにより実行可能な命令のプログラムを具現するコンピュータ可読記憶媒体であって、
上記プログラムは、
（ａ）上記顕微鏡載荷台へとスライドを搬送するに適した位置へと第１カセットを搬送するための一群の命令と、
（ｂ）上記第１カセットから第１スライドを上記顕微鏡載荷台へと搬送するための一群の命令と、
（ｃ）顕微鏡スライド上のデータであって、該照会可能データは上記スライド上に含まれたサンプルの分析のためのプロトコルに関する情報を提供するというデータを照会するための一群の命令と、
（ｄ）上記スライドを上記スライド載荷台上で位置決めするための一群の命令と、
（ｅ）上記照会可能データ中に符号化された上記分析プロトコルに従い、上記顕微鏡により上記サンプルを分析するための一群の分析命令と、
（ｆ）上記顕微鏡により、上記サンプルを表す分析結果を提供するための一群の命令と、
（ｇ）分析されるべき別のスライドが上記第１カセット内に残存するか否かを決定し、もしそうであれば、（ｂ）〜（ｆ）における上記命令を反復するための一群の命令と、
（ｈ）別のカセットが残存するか否かを決定し、もしそうであれば、（ａ）〜（ｇ）における上記命令を反復するための一群の命令とを備えて成る、
コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１９】
顕微鏡スライド上のサンプルを分析するためのひとつ以上の特定可能なプログラム化プロトコルを備えるデータベースを更に備えて成る、請求項１８記載の記憶媒体。
【請求項２０】
前記分析命令群は、前記データベースからのデータを照会することにより特定されたプロトコルを獲得するための命令を備えて成る、請求項１９記載の記憶媒体。
【請求項２１】
前記分析命令群は、前記顕微鏡により、前記サンプルに対し、または、該サンプル内に包含される焦点面に対して焦点合わせするための命令を備えて成る、請求項１８記載の記憶媒体。
【請求項２２】
前記分析命令群は、前記サンプルの画像を獲得するための命令を備えて成る、請求項１８記載の記憶媒体。
【請求項２３】
前記画像を獲得するための前記命令は、
低倍率を有するレンズを用いて画像走査を行うための命令と、
上記低倍率走査の一部分を、高倍率を有するレンズを使用して画像を走査するために選択するための命令と、
上記高倍率にて画像走査を行うための命令と、
上記高倍率走査を最適化するための命令とを備えて成る、請求項２２記載の記憶媒体。
【請求項２４】
当該スライドに記録された電子的に照会可能なデータを含むと共に当該スライド上に生物学的サンプルを有するスライドを準備する段階と、
上記電子的に照会可能なデータを上記スライドから読取る段階と、
上記生物学的サンプルが自動式顕微鏡により如何に走査されるべきかを、上記電子的に照会可能なデータから決定する段階と、
上記スライドに記録された上記電子的に照会可能なデータにより指示される様式にて、上記スライドを自動式顕微鏡により走査する段階と、
上記走査から、上記生物学的サンプルを表す試験結果を決定する段階とを備えて成る、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に関する相互参照
本出願は、２００６年８月４日に出願された米国仮出願第６０／８２１，５５７号の優先権の特典を主張するものであり、該出願は言及したことにより全体的に本明細書中に援用される。
発明の背景
本明細書において引用される全ての文献およびそれらの言及文献は、付加的もしくは代替的な詳細、特徴および／または技術的背景の教示に対して適切である場合、言及したことにより本明細書中に援用される。
発明の分野
本発明は概略的に、生物学的構造用の蛍光タグを用いる斯かる生物学的構造の自動的顕微鏡式検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
習用の光学的顕微鏡検査法は概略的に、生物学的サンプルが固着された顕微鏡スライドと、細胞、核などの如き関心構造の吟味において斯かる生物学的サンプルの各個別領域に焦点を合わせるべく使用される単一の対物レンズとを採用する。上記対物レンズを通して視認される画像の寸法は、該対物レンズの倍率および開口数に依存する。上記顕微鏡スライド上の試料は上記対物レンズに関して手動的に移動され、複数の視野に帰着する。各視野において上記対物レンズを通して視認される関心構造は分析され、画像詳細が記録される。画像は、カメラによる捕捉により記憶され得る。上記複数の視野は、上記サンプルを全体として特性解析するために用いられる。当然乍ら斯かる処理は、試料の完全な概観を必要とする一切の用途に対して時間が掛かることがあり得る。
【０００３】
顕微鏡検査法においては、分解能、コントラスト、焦点深度、作動距離、倍率、同焦点性、および、同中心性などの多くの要因が対処されねばならない。分解能は、画像中における２つの点を２つの点として区別する能力である。分解能は、サンプルにおける特定形状を決定して区別するために重要である。分解能は、倍率と共に減少することがあり、且つ、典型的には対物レンズの開口数に関連する。コントラストもまた、画像の評価において必要とされる。コントラストは、画像中における最も明るい点と最も暗い点との間の差であり、すなわち、各回折次数に対するゼロ次の相対強度である。十分なコントラストがなければ、画像は、良くても“平坦”に見え、または、最悪の場合には視認不能となり得る。習用的にコントラストは手動顕微鏡においては集光レンズ・ダイヤフラムにより制御される。焦点深度とは、焦点における画像の深さを指している。対物レンズの開口数が変化するにつれ且つ対物レンズの作動距離が変化するにつれて焦点深度は変化する（対物レンズの作動距離が増大するにつれて、焦点深度は増大する）。焦点深度は重要である、と言うのも、焦点深度の外側の試料内の物体は検出されないからである。作動距離とは、対物レンズの前部から試料平面までの距離を指している。対物レンズが交換されたとき（特に対物レンズが異なる開口数を有するとき）、作動距離ならびに焦点は変化し得る。概略的に、対物レンズが試料により阻害されないように、作動距離を十分に適切に維持することが重要である。対物レンズが交換されたときに焦点に留まりつつある試料である同焦点性、および、視野の中央における物体であって、どの対物レンズが使用されているかに関わらずに視野の中央に留まるという物体であるという同中心性もまた、概略的に好適である。
【０００４】
サンプルの顕微鏡的分析を支援する多くの方法が知られている。たとえば限定的なものとしてで無く、一定の染料は一定の細胞構造に対する親和力を有することは知られている。故に斯かる染料は、斯かる構造の更なる明示を助力することにより分析を支援すべく使用され得る。
【０００５】
細胞および組織の蛍光顕微鏡検査法は、当業界において公知である。細胞を蛍光試薬により処理して細胞を画像化することは、当業界において公知である。顕微鏡において複数の蛍光細胞を画像化すると共に、これらの細胞において生ずる空間分布および時間的変化に関する情報を抽出する方法が開発された。これらの方法の幾つか、および、それらの用途は、非特許文献１に記述されている。これらの方法は、細胞中における蛍光レポータ分子の分布、量および生化学的環境の空間的および時間的に高い分解能での画像化測定に対して数個の試料を調製すべく設計かつ最適化されてきた。（習用の反射顕微鏡は散乱された照明光を用いて画像を形成するが、）蛍光信号の検出は、放出された蛍光を用いて画像を形成する落射蛍光顕微鏡によるものとされ得る。落射蛍光顕微鏡の励起光は、サンプル中の蛍光タグを励起して該蛍光タグに蛍光を放出させるべく用いられる。落射蛍光顕微鏡の利点は、問題となる生物学的構造に対して蛍光分子が選好的に付着することで、問題となる斯かる生物学的構造の識別が許容される如く、サンプルが調製され得ることである。
【０００６】
蛍光顕微鏡検査法において使用されるひとつの蛍光染料は、ＤＮＡに対して強力に結合する蛍光着色剤であるＤＡＰＩすなわち４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールである［ＣＡＳ番号：［２８７１８−９０−３］；ＳＭＩＬＥＳ構造：ＮＣ（Ｃ２＝ＣＣ１＝Ｃ（Ｃ＝Ｃ２）Ｃ＝Ｃ（Ｃ３＝ＣＣ＝Ｃ（Ｃ（Ｎ）＝Ｎ）Ｃ＝Ｃ３）Ｎ１）＝Ｎ］。ＤＡＰＩは無傷の細胞膜を通過することから、それは生きている固定細胞を着色すべく使用され得る。ＤＡＰＩは紫外光により励起される。二本鎖のＤＮＡに対して結合されたとき、その吸収最大値は約３５８ｎｍであり、且つ、その発光最大値は約４６１ｎｍである。ＤＡＰＩはＲＮＡに対しても結合するが、それほど強く蛍光的ではない。ＲＮＡに対して結合されたとき、その発光は約４００ｎｍへとシフトする。ＤＡＰＩの青色発光は、単一サンプルにおいて複数の蛍光着色剤を使用せんとする顕微鏡使用者に対して好都合である。ＤＡＰＩと、フルオレセインなどの緑色蛍光分子および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または、テキサスレッドなどの赤色蛍光着色剤との間に蛍光の重なり合いは殆どない。他の生物学的構造を検出するためには、他の蛍光染料が用いられる。
【０００７】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）においては、他の形式の蛍光材料が用いられる。ＦＩＳＨ法は、蛍光タグを使用して染色体構造を検出する。斯かるタグは、特異的な染色体および特異的な染色体領域に対して指向され得る。斯かる技術は、染色体の異常性および遺伝子マッピングを特定すべく使用され得る。たとえば染色体２１に対するＦＩＳＨプローブによれば、トリソミー２１を有する細胞、すなわち、ダウン症候群の原因である余分な染色体２１を備えた細胞の識別が許容される。多色式ＤＮＡプローブを備えるＦＩＳＨキットは市販されている。たとえば、アボット・ラボラトリズ社（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のＶｙｓｉｓ部により販売されているＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎ（登録商標）多色式ＤＮＡプローブ・キットは、羊水サンプル中における染色体１３、１８、２１、ＸおよびＹの異常性に対し、中期細胞および静止核内の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を介した試験管内での診断試験に対して設計されている。ＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎ（登録商標）検定（ＣＥＰ１８、Ｘ、Ｙ−アルファサテライト、ＬＳＩ１３および２１）多色式プローブパネルは、ＣＥＰ１８／Ｘ／Ｙプローブを使用して染色体１８、ＸおよびＹのセントロメア領域におけるアルファサテライト配列を検出し、且つ、ＬＳＩ１３／２１プローブを使用して１３ｑ１４領域および２１ｑ２２．１３〜２１ｑ２２．２領域を検出する。ＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎキットは、高リスクの妊娠と推定される対象者における羊水から獲得された中期細胞および静止核における蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを介して染色体１３、１８、２１、ＸおよびＹを特定して計数するために有用である。各タグにより発光される色の組み合わせは、通常的な染色体数が在るかトリソミーが在るかを決定すべく用いられる。
【０００８】
同様の趣旨で、アボット・ラボラトリズ社のＶｙｓｉｓ部によるＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（登録商標）キットは、膀胱癌があると推測される血尿症の対象者からの尿試料における蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを介して染色体３、７、１７に対する異数性と９ｐ２１遺伝子座の喪失とを検出することにより、膀胱癌の発生および進行に伴う染色体異常を検出すべく設計される。上記ＵｒｏＶｙｓｉｏｎキットは、染色体３、７、９および１７上の特異領域と相同のＤＮＡプローブ配列の４色の４種のプローブ混合物から成る。上記ＵｒｏＶｙｓｉｏｎプローブ混合物は、染色体計数プローブ（ＣＥＰ）としてのＣＥＰ３であるＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ、ＣＥＰ７であるＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、ＣＥＰ１７であるＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ、および、領域特異的プローブ（ＬＳＩ９ｐ２１）であるＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄから成る。
【０００９】
手動式の顕微鏡検査法の面倒なプロセスを克服すべく、本発明者を含む多数の研究者は、顕微鏡スライドまたは（多重ウェル・プレートの如き）他のサンプル保持デバイス上の生物学的サンプルの複数の画像視野を捕捉かつ分析するための自動式顕微鏡検査システムを提案している。斯かるシステムは、顕微鏡分析の効率を相当に改善し且つサンプルの顕微鏡分析に影響する主観的な入力の幾つかを排除する可能性を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】なし
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】アメリカン・サイエンティスト（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ）８０（１９９２）、第３２２〜３３５頁にけるテイラー等（Ｔａｉｌｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．）による論文
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
自動式顕微鏡検査法には多数の困難性が伴う。たとえば、手動式顕微鏡検査法において実施される多くの機能は、人間の目および脳の制御下における漠然とした方法論により左右される。これらの機能の各々は、必要な明瞭性を以てスライドが吟味されるのを許容すべく対処される必要がある。更に、習用的な手動式顕微鏡検査法において行われる分析の多くは、先行する経験に基づく人間の理由付けを伴う。たとえば顕微鏡使用者は多くの場合、実際の生物学的構造からアーチファクトもしくは誤処理サンプルを識別し得るが、それを言葉で示すことを要求されたときに斯かる判断に対する根拠を表現することは困難である。更に自動式顕微鏡検査法は、自動式デバイスであって、スライドを取扱う機能、研究されるべき生物学的構造を解釈すると共に該解釈を実施するためのプロトコルを読み取る機能、対物レンズに関してスライドを調節する機能、斯かる生物学的構造に対してスライド上の多くの領域を検索する機能、スライド上にて関心構造が存在する領域を決定する機能、構造からの所望信号を無関係の信号から処理する機能、各信号を解釈する機能などを有するという自動式デバイスを必要とする。
【００１３】
本発明者等は、複数のサンプルの自動式顕微鏡検査法を実施する際のこれらの要件および関連要件であって、高スループットの顕微鏡分析において使用され得る如き要件を認識し、且つ、本明細書においてはこれらの要件に対処した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
各実施例においては、以下のものが包含される：
【００１５】
第１に、
（ａ）スライド載荷台と、少なくともひとつの対物レンズと、画像捕捉手段と、所定プロトコルに従い当該自動式顕微鏡を操作するプログラム可能手段と、分析結果を提供するプログラム可能手段とを備えて成る自動式顕微鏡を配備する段階と、
（ｂ）自身上にサンプルと照会可能データとを含む顕微鏡スライドを配備する段階であって、上記照会可能データは上記サンプルの分析に対するプロトコルに関する情報を提供するという段階と、
（ｃ）上記データを照会する段階と、
（ｄ）上記スライドを上記スライド載荷台上で位置決めする段階と、
（ｅ）上記照会可能データ中に符号化された上記分析プロトコルに従い、上記顕微鏡により上記サンプルを分析する段階と、
（ｆ）上記顕微鏡により、上記サンプルを表す分析結果を提供する段階とを備えて成る顕微鏡分析のための方法である。
【００１６】
第２に、
（ａ）スライド載荷台と、少なくともひとつの対物レンズと、少なくとも一枚の顕微鏡スライドを自身内に含む少なくともひとつのスライド・カセットと、所定プロトコルに従い当該自動式顕微鏡を操作するプログラム可能手段と、分析結果を提供するプログラム可能手段とを備えて成る自動式顕微鏡を配備する段階と、
（ｂ）複数の顕微鏡スライドであって、各々が自身上にサンプルと照会可能データとを含む複数の顕微鏡スライドを配備する段階であって、上記複数のスライドは上記スライド・カセットの内のひとつ以上のスライド・カセット内に含まれ、上記照会可能データは上記サンプルの分析に対するプロトコルに関する情報を提供するという段階と、
（ｃ）上記顕微鏡載荷台へとスライドを搬送するに適した位置へと第１カセットを搬送する段階と、
（ｄ）上記第１カセットから第１スライドを上記顕微鏡載荷台へと搬送する段階と、
（ｅ）上記第１スライド上に見出されるデータを照会する段階と、
（ｆ）上記スライド載荷台上で上記第１スライドを位置決めする段階と、
（ｇ）上記照会可能データ中に符号化された上記分析プロトコルに従い、上記顕微鏡により上記第１スライド上の上記サンプルを分析する段階と、
（ｈ）上記顕微鏡により、上記第１スライド上の上記サンプルを表す分析結果を提供する段階と、
（ｉ）分析されるべき別のスライドが上記第１カセット内に残存するなら、段階（ｄ）〜（ｈ）を反復する段階と、
（ｊ）別のカセットが残存するなら、段階（ｃ）〜（ｉ）を反復する段階とを備えて成る、
高スループットの顕微鏡分析のための方法である。
【００１７】
第３に、
スライド載荷台と、少なくともひとつの対物レンズと、画像捕捉手段と、所定プロトコルに従い当該自動式顕微鏡を操作するプログラム可能手段と、分析結果を提供するプログラム可能手段とを備えて成る自動式顕微鏡を使用する顕微鏡分析のための方法に対し、コンピュータにより実行可能な命令のプログラムを具現するコンピュータ可読記憶媒体であって、
上記プログラムは、
ａ）顕微鏡スライド上のデータであって、該照会可能データは上記スライド上に含まれたサンプルの分析のためのプロトコルに関する情報を提供するというデータを照会するための一群の命令と、
ｂ）上記スライドを上記スライド載荷台上で位置決めするための一群の命令と、
ｃ）上記照会可能データ中に符号化された上記分析プロトコルに従い、上記顕微鏡により上記サンプルを分析するための一群の分析命令と、
ｄ）上記顕微鏡により、上記サンプルを表す分析結果を提供するための一群の命令とを備えて成る、
コンピュータ可読記憶媒体である。
【００１８】
第４に、
スライド載荷台と、少なくともひとつの対物レンズと、少なくとも一枚の顕微鏡スライドを自身内に含む少なくともひとつのスライド・カセットと、所定プロトコルに従い当該自動式顕微鏡を操作するプログラム可能手段と、分析結果を提供するプログラム可能手段とを備えて成る自動式顕微鏡を使用する高スループットの顕微鏡分析のための方法に対し、コンピュータにより実行可能な命令のプログラムを具現するコンピュータ可読記憶媒体であって、
上記プログラムは、
ａ）上記顕微鏡載荷台へとスライドを搬送するに適した位置へと第１カセットを搬送するための一群の命令と、
ｂ）上記第１カセットから第１スライドを上記顕微鏡載荷台へと搬送するための一群の命令と、
ｃ）顕微鏡スライド上のデータであって、該照会可能データは上記スライド上に含まれたサンプルの分析のためのプロトコルに関する情報を提供するというデータを照会するための一群の命令と、
ｄ）上記スライドを上記スライド載荷台上で位置決めするための一群の命令と、
ｅ）上記照会可能データ中に符号化された上記分析プロトコルに従い、上記顕微鏡により上記サンプルを分析するための一群の分析命令と、
ｆ）上記顕微鏡により、上記サンプルを表す分析結果を提供するための一群の命令と、
ｇ）分析されるべき別のスライドが上記第１カセット内に残存するか否かを決定し、もしそうであれば、（ｂ）〜（ｆ）における上記命令を反復するための一群の命令と、
ｈ）別のカセットが残存するか否かを決定し、もしそうであれば、（ａ）〜（ｇ）における上記命令を反復するための一群の命令とを備えて成る、
コンピュータ可読記憶媒体である。
【００１９】
第５に、
当該スライドに記録された電子的に照会可能なデータを含むと共に当該スライド上に生物学的サンプルを有するスライドを準備する段階と、
上記電子的に照会可能なデータを上記スライドから読取る段階と、
上記生物学的サンプルが自動式顕微鏡により如何に走査されるべきかを、上記電子的に照会可能なデータから決定する段階と、
上記スライドに記録された上記電子的に照会可能なデータにより指示される様式にて、上記スライドを自動式顕微鏡により走査する段階と、
上記走査から、上記生物学的サンプルを表す試験結果を決定する段階とを備えて成る方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の実施例における各ステップの概観を与えるフローチャートである。
【図２】本発明の実施例における各ステップの詳細を与えるフローチャートである。
【図３】本発明の実施例における各ステップの詳細を与えるフローチャートである。
【図４】本発明の実施例における各ステップの詳細を与えるフローチャートである。
【図５】本発明の実施例における各ステップの詳細を与えるフローチャートである。
【図６】本発明の実施例における各ステップの詳細を与えるフローチャートである。
【図７】本発明の実施例における各ステップの詳細を与えるフローチャートである。
【図８】本発明の実施例における各ステップの詳細を与えるフローチャートである。
【図９】本発明の実施例における各ステップの詳細を与えるフローチャートである。
【図１０】本発明の実施例における各ステップの詳細を与えるフローチャートである。
【図１１】本発明の実施例における各ステップの詳細を与えるフローチャートである。
【図１２】本発明の実施例における各ステップの詳細を与えるフローチャートである。
【図１３】本発明の実施例における各ステップの詳細を与えるフローチャートである。
【図１４】本発明の実施例である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
図１を参照すると、本発明の実施例の主要な概略的フローチャートが開示される。図１は、複数のスライド上の各サンプルの自動的な読み取りおよび分析を協働して実現する種々の演算モジュールの概観を示している。斯かるスライドの集合は、研究設定または診断設定において生じ得る。多数のスライドが、本明細書に開示される自動的方法により好適に検証かつ分析される。生物学的試料、細胞もしくは組織の調製物、および、同様の研究対象物は、本発明の上記方法による顕微鏡分析に対する対象物の非限定的な例を構成する。本明細書においてこれらは概略的に、“サンプル”または“試料”と称される。共通して、各サンプルは顕微鏡分析を支援する標識を含む。多くの場合、斯かる標識は蛍光標識である。更に、サンプルはひとつより多い蛍光標識を含むこともあり、その場合に各標識は、特定の区別可能な蛍光特性、特に区別可能な励起および発光波長を有する。斯かるサンプルの適切な顕微鏡分析を行うために、該サンプルを照射する光線内には適切な励起フィルタが載置されるか、または、異なる波長の複数のレーザ源の内のひとつのレーザ源が選択され、且つ、サンプルと、カメラもしくは荷電結合素子（ＣＣＤ）の如き画像捕捉デバイスとの間には対応する発光フィルタが載置される。斯かるサンプルの自動顕微鏡分析を統御する処置において、コンピュータもしくは同様の制御デバイスは、検証されるべき各プローブの性質を記述する利用可能情報を有さねばならない。この必要情報を含むサンプル識別情報、ならびに、付加的なサンプル識別子は、バーコードもしくは縞状配列の如き照会可能な符号手段を用いて、各スライド上に符号化され得る。上記照会可能符号はスライドが顕微鏡内に位置されるときに読み取られ、且つ、対応情報は上記コンピュータもしくは制御デバイスに対して通信される。
【００２２】
図１に見られる如く顕微鏡の載荷台上の所定位置に一旦装填されたなら（１５）、特定のスライドに対する分析は、該スライド上に存在するバーコードを読み取ることにより開始される（２０）。上記バーコードは、実施されるべき顕微鏡分析の性質を表す情報を含む。多様な分析プロトコルに対する詳細は、上記コンピュータもしくは制御デバイスによる参照のためにデータベース内に記憶される。スライドのバーコードが一旦読み取られたなら、該バーコード中に符号化された情報に従い、データベース（ＤＢ）内の正しい実験プロトコルが特定される（２５）。顕微鏡の操作を制御すべくこの情報が今や利用可能とされると、連続する一連の操作であって、焦点合わせを調整し、且つ、開始するための低倍率から実際の分析のための高倍率まで変更する調節などを含め、適切な画像を提供するために走査されるべきスライド上の領域を最適化するという一連の操作が実施される（ステップ３０、３５、４０、４５および５０を参照）。このプロトコルに包含された種々のモジュールを好首尾に実施すると、図１において“試験結果”と表された結果が提供される（５５）。図１に示された残りのループは、所定のカセットにおいて最後のスライドが検証されたか否かの決定（６５および８５）、および、最後のカセット内のスライドが分析されたか否かの決定（７０および８０）に関する。最後のカセットが検証されたとき、顕微鏡の操作は終了する（７５）。
【００２３】
図１に示された如くｄａｔａｂｒｉｄｇｅアプリケーションは、実行されつつある他の処理と並行してファイル取扱いのためのシステム・サービスとして実行が開始される（ステップ５）。斯かるサービスは図１３に示された如き方法であり、その場合に該サービスは、各パラメータと、該アプリケーションが実行される環境との設定を含んで開始される（ステップ３００）。図１３の方法において、ＩＫｏＤａｔａＢｒｉｄｇｅ．ｅｘｅ．ｃｏｎｆｉｇにより提供され得る如き設定ファイル（ステップ３０５）が読み取られる（ステップ３１０）。必須条件が満足されなければ、アプリケーション・イベント・ログの如きファイル内にはエラーが記録され（ステップ３２０）、且つ、処理は作動停止される（ステップ３２５）。ソース・フォルダの存在の如き必須条件が満足される（ステップ３１５）なら、作動停止が要求されるまでループは実施される（ステップ３３５）。上記ループを開始させると、ログ・ファイルは、たとえば“．ｔｘｔ”ファイルなどのファイルのリストに対して質問される（ステップ３４０）。各ファイルが見出された（ステップ３４５）なら、別のループが開始され（ステップ３５０）、その場合には“．ｎｖｃ”形式ファイルの如き対応ファイルに対する更なるチェックが実施される。対応ファイルの存在は次に、斯かる“．ｎｖｃ”ファイル内の成功カウントの読み取りに繋がり、且つ、オリジナル・ファイル内のエントリのスキップを引き起こす（ステップ３６０）。たとえば“．ｔｘｔ”ファイルなどのオリジナル・ファイルからのエントリの読み取り（ステップ３６５）の後、完了マーカが見出されるか否かに関する質問が実施され（ステップ３７０）、すると直ちに、テキスト・ファイルが削除される（ステップ３７５）。更なるファイルの照会が行われ（ステップ３８０）、その結果、“．ｔｘｔ”ファイルの如き見出された各ファイルに対して開始された上記ループの戻りおよび継続が行われる（ステップ３５０）。もし更なるファイルが見出されないならば（ステップ３８０）、上記システムは代替的経路（ステップ３８５、３８５’）により示された如く、たとえば“．ｃｏｎｆｉｇ”の如き設定ファイル内で指定された時間に基づき活動休止とされる（ステップ３３０）。活動休止期間（ステップ３３０）が完了する結果、作動停止されたループへの戻りおよび継続が開始される（ステップ３３５）。ステップ３７０において完了マーカの見出しが不首尾であれば、ステップ４２５においては特定の命令がトリガされて実行される。その実行が好首尾であれば（ステップ４０５）、ステップ３６５に見られる如く、たとえば“．ｔｘｔファイル”などからのエントリの読み取りが再開される。ステップ４２５の命令の実行においてステップ４０５にて不成功なら、アプリケーション・イベント・ログの如きログ・ファイルにエントリが記録され（ステップ４１０）、エラー形式およびカウントが質問され（ステップ４１５）、且つ、ステップ４３０にては再試行カウントが可能的にインクリメントされ、４２５の実行ステップに戻る。ステップ４１５において検証される如く命令のエラーもしくは再試行カウントが十分に多い結果、ステップ４２０における如きスキャナ・アプリケーションに対して通知が行われ、且つ、“．ｔｘｔ”ファイルの如き別のファイルに対するループの継続のためにステップ３５０に戻る。“．ｎｖｃ”ファイルの如き対応ファイルが存在しない場合（ステップ３５５）、ゼロを含むファイルが作成され（ステップ４００）、その後、ステップ３６５から継続して、上記で実施された如く処理が行われる。ステップ３４５で見出されたファイルが存在しないと、たとえばデータベース・ログ・フォルダなどのフォルダからファイル・リストが読み取られ（ステップ３９０）、各ファイルに対して上記リストの質問が行われる。ファイルが何ら見出されなければ、上記サービスはステップ３３０に示された如く活動休止モードに置かれ、または、各ファイルが見出されたなら上記処理はステップ３５０におけるファイル・ループに戻る。
【００２４】
図１に戻ると、バーコードまたは他の電子的に読取可能な目印を有するスライドは、複数のスロットを有するカセット内へと装填され（ステップ１０）、各スライドはそこから獲得され得る。次に、分析のためのスライドは自動式顕微鏡内へと装填される（ステップ１５）。上記バーコードまたは他の電子的に読取可能な目印が読み取られ（ステップ２０）、データベースを参照することで、該スライド上で要求される処理の形式（たとえば、要求されるアプリケーションの形式）が決定される（ステップ２５）。上記自動式顕微鏡は次に、要求された処理に基づきサンプル内の関心物体を検出する多数の段階の実行を模索する。
【００２５】
先ず、上記サンプルは対物レンズに関して焦点合わせされる。焦点合わせは、焦点が達成され得るスライド縁部の如き既知の基準点を用いて行われ得る。斯かる焦点合わせは図７に示された如き方法とされ得、その場合、幾つかのパラメータが焦点外状況のフラグを立てるならばｚ範囲における焦点深度が再定義され（ステップ１１）、または、再定義しない（ステップ１９、終了）。図７に記述された方法において、スライドはたとえば１００ミリ秒の時的間隔に亙る照会に対して露光され（ステップ１２）、ビニング・モードは相当の領域を覆うべく設定され、たとえば４×４に設定される（ステップ１３）。照会スポットは次に、スライドの頂部中央縁部の如きスライド縁部上の基準点に設定される（ステップ１４）。次に自動焦点が実施されることで、Ｚ基点（Ｚｂａｓｅ）、すなわちスライド縁部の頂面における如きＺ軸に沿う基点が決定される（ステップ１６）。上記Ｚ基点から、焦点深度に２５を乗算した積だけ離間した如きｚ焦点の上限値が定義され（ステップ１７）、且つ、ｚ焦点の下限値が定義される（ステップ１８）。
【００２６】
図１に戻ると、焦点合わせの後、所定アルゴリズムに基づいて走査領域が決定される（ステップ３５）。たとえば図２は、スライド上のバーコードもしくは他の電子的に読取可能な目印に基づく２つの異なるＦＩＳＨ系試験、すなわちＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎ（２２）およびＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（２３）に基づく走査領域定義に対する２つの異なる方式を示している（ステップ２１）。斯かる試験はサンプルを装着する様式が異なり、ＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎサンプルはスライド上に塗沫標本として載置されると共に、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎスライドに対してサンプルは滴下された球状塊として適用される。
【００２７】
図２に示された如く、もしＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎ試験が表されたなら（２２）、走査領域はステップ２４にてスライド上の全体的走査可能領域として定義されることで、スライド上の塗沫標本の位置が決定される。図示された様に、たとえば２７にて示される如く、スライドの垂直軸心に沿う順序に従う可能的候補の迅速検出に対しては、低倍率の視野滞在（“探査滞在”）が行われる。次に、孤立した可能的候補の照会が、高倍率により実施され得る（“吟味モード”）。
【００２８】
図２に更に示される如く、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎスライド２８に関し、可能的候補の吟味は、多数のステップを採用し得る。ステップ２９にては、サンプルと相互作用するＤＡＰＩの如き標識からの蛍光信号を選択的に決定するフィルタが設定される。ステップ３１にて露光値は事前定義値に設定され、且つ、カメラのビニング・モード（別個の複数のピクセルの併合）は４×４の如き事前定義レベルに設定され（ステップ３２）、スライドの適切な走査が許容される。次に、スライド上の箇所の固定的なｚ位置であって、たとえば全体的なｚ移動範囲の中央に設定されたｚ位置の読取値を許容すべく、Ｚモータが位置決めされる。たとえば、整列箇所の２、８、１１および５に示された如く、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎスライド２８上の事前記録位置の読取りが行われる（ステップ３４）。たとえば位置１、２および３を包含する位置決定視野の如きスライド２８上の事前プログラム箇所領域の照会が行われ（３６）、ステップ３６にては、斯かる事前プログラム視野におけるＤＡＰＩ信号の画像化が行われ、且つ、各位置における平均ピクセル値が決定される。ステップ３７にては、ステップ３８／３９、４１／４２および４３／４４にて反復される如く、各々の事前プログラム位置決定視野に対し、最大の平均ピクセル値（上限）を有する位置が選択される。最大の平均ピクセル値を有すると識別された各位置を用いて、囲繞境界が定義される（ステップ４６）。その様に定義された囲繞境界内において、次に、（たとえば円形などの）定義された境界の中央から開始し、渦巻きがひとつずつ外側となるにつれて順序番号が増加するという低倍率の視野視察系列が割当てられる（ステップ４７）。
【００２９】
図１に戻ると、ステップ４０にては、次に低倍率走査が実施される。斯かる低倍率走査は、図３に示された個別ステップを伴い得る。ステップ４９において、倍率はたとえば１０Ｘの倍率を有する対物レンズなどの低い値に設定される。次に、ステップ５１にては、たとえば図５に示された方法を用いて、対物レンズの再現精度の如き品質管理尺度、または、他の形態の品質検査基準が決定され得る。
【００３０】
対物レンズ再現精度は、図５に示された如き方法の実施例を用いて決定され得る。先ず、各走査領域を走査すべく使用される夫々の倍率レベル（たとえば、１３９に示された如く１０Ｘもしくは１００Ｘ）に対してビニング・モードが設定される。たとえばビニング・モードは、図５に示された如く、２×２（１４１）、または代替的に４×４（１４２）に設定され得る。１４３にて示された如く、対物レンズをたとえば１０Ｘなどの適切な倍率に設定し、幾つかの可能的な関心特定形状を含むと決定された事前定義位置に対して照会が行われる１４４。自動焦点および自動露光が実施されてひとつの画像が捕捉され（ステップ１４６）、且つ、たとえば、光学的勾配の如き勾配を決定することにより少なくとも一個の特定形状が識別される（ステップ１４７）。ステップ１４８にて特定形状が決定されなければ、低倍率の視野は更に下方移動され、ステップ１４６の自動焦点および自動露光が反復される。ステップ１４８にて特定形状が決定されたなら、ステップ１４９にては倍率が確認され、事前定義された同焦点性オフセットを適用して関心特定形状が中心合わせされ（ステップ１５２）、且つ、ステップ１５３にて対物レンズ倍率はたとえば１００Ｘへと変更される。再び自動焦点および自動露光が実施され（ステップ１５４）、且つ、勾配が使用されて関心特定形状が見出される（ステップ１５５）。次に、孤立した上記特定形状の回りに、相関整合のためのテンプレートが生成され得る（ステップ１５７）。次に対物レンズは最初の対物レンズおよび位置にもう一度変更され、画像が捕捉され、且つ、相関に基づいて先の画像からオフセットが決定される（ステップ１５９）。オフセットが容認可能であり（ステップ１６１）、且つ、オフセットが３回の如き複数の連続的回数に対して容認可能であれば（ステップ１６２）、対物レンズ再現精度試験は終了される（ステップ１６４）。連続的である所定の最大回数の試みにおいて上記容認可能性がオフセット容認可能性に到達しなければ（ステップ１６３）、対物レンズが変更されて元の位置に戻される（ステップ１５８）。１４８にて特定形状が見出されなければ、低倍率視野がひとつだけ下方移動され（１５１）、且つ、流れはステップ１４６へと継続する。
【００３１】
図３に戻ると、ステップ５１にて対物レンズ再現精度が確認された後、画像処理スレッドが生成される（ステップ５２）。同時的処理として、上記画像処理スレッドは先ず初期化され（ステップ７３）、且つ、待ち行列における画像処理ジョブを待機した後で（ステップ７４）、画像は保存される（ステップ７６）。各画像は次に処理されると共に、所定アルゴリズムに従い、候補核が選択され、且つ、候補核目標物の各々のｘ−ｙ位置が決定される（ステップ７７）。決定された各ｘ−ｙ位置から、視野毎の核の個数を最大化すべく、且つ、斯かる核候補を訪れるために必要な高倍率視野の総数を最小化すべく、使用されるべき高倍率に基づいて照会戦略が設定される（ステップ７８）。各画像の受信時に、上記スレッドが終了されるべきか否かの決定が為され（ステップ７９）、そうでなければ画像処理は継続し（ステップ７４）、且つ、もし終了が決定されたなら（ステップ８１）、たとえば示された如きＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎまたはＵｒｏＶｙｓｉｏｎなどの試験選別プロトコルに基づき（ステップ８３）、各視野は必要な情報を提供する様式でソートされる。たとえば、ＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎ試験に関しては（ステップ８２）、高倍率視野のリストが当該視野内の核の個数に基づいてソートされ得る（ステップ８６）と共に、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ試験に関しては（ステップ８４）、その視野内の最大の核サイズに基づいて高倍率視野のリストがソートされ得（ステップ８７）、終了が追随する（ステップ８８）。
【００３２】
次に図３のステップ５３に移ると、上記で論じた如き画像処理スレッドの生成（ステップ５２）の後で、システムは画像の獲得に対して設定される。先ず、画像化のために必要なディスク空間などのパラメータがチェックされ、且つ、（たとえば照明などの）光源が起動される。サンプルは次に、事前決定された視察系列順序により低倍率視野の吟味を以て視察される（ステップ５４）。これと併せて、たとえば核タグを決定するＤＡＰＩフィルタなどのフィルタが達成され得ると共に、ビニング・モードは適切な分解能に対して調節される（ステップ５６）。次に、低倍率の対物レンズは、たとえば図１０に記述された如き方法により調節される（ステップ５７）。
【００３３】
図１０には、低倍率焦点を調節する方法が示される。先ず、低倍率視野が系列順序における第１の低倍率視野であるか否かが決定される（ステップ２３２）。ステップ２３６にて、上記低倍率視野が系列順序における第１の低倍率視野であるなら、“スライド縁部上の検出焦点”から発見されるｚ焦点範囲を取入れたデータベースを使用する内挿により、上記低倍率視野におけるｚ範囲、および、可能であれば頂縁部から底縁部までのｚ差（２３４）が再計算され（２３３）、可能でない（ステップ２３７）ならば終了される（ステップ１８６）。上記低倍率視野が上記系列順序における第１の低倍率視野でなければ、可能的な関心構造の近傍視野が所定数に設定される（ステップ２３９）と共に各近傍視野は低倍率で照会される（ステップ２４１）ことで、有効なｚ焦点値を以て一個以上の近傍視野が在るか否かが決定され（ステップ２４４）、もしそうであれば、全てのｚ焦点値の平均値が取られ（ステップ２４７）、もしそうでなければ、拡張される近傍視野が無くなるまで（２４３）近傍視野の個数もしくはサイズが拡張され（ステップ２４３）、且つ、フラグ（２３７）が送信されて処理列が完了される（１８６）。
【００３４】
図３に戻ると、ステップ５８にては自動焦点および自動露光が実施される。次にビニング・モードは、示された如くたとえば１×１へと変更され得（ステップ５９）、たとえばＤＡＰＩ画像が獲得され得る（ステップ７１）。関心物体を明示すべく使用される例えばＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎ試験の如き試験に依存し（７２）、斯かる物体を明示すべく他の顕微鏡パラメータへと変更する必要があり得る。たとえば、サンプルから発する信号のフィルタリングを変更し（ステップ６１）、且つ、サンプルの露光値を変更する（ステップ６２）必要があり得る。画像が一旦獲得されたなら（ステップ６３）、それは上記で論じられた処理スレッドを用いて処理され得る（６４）と共に、全ての候補が位置決定され（ステップ６６）かつ視野の各々が照会された（ステップ６７）なら、画像処理スレッドは終了される（ステップ８１）。
【００３５】
使用される試験プロトコル（たとえば８２、８３、８４のＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎもしくはＵｒｏＶｙｓｉｏｎ）に依存して、処理された各画像は、たとえば、ＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎ試験に関しては視野における核の個数に基づき複数の高倍率視野のリストをソートし（ステップ８６）、且つ、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ試験に関しては視野内の最大の核サイズに基づき高倍率視野のリストをソートする（ステップ８７）ことにより、所定様式で取扱われる。もし全ての候補が位置決定されるのでは無く（ステップ６６）、且つ、視野の各々が照会されるので無ければ（ステップ６７）、走査領域は再定義され得る（ステップ６８、６９）。
【００３６】
走査領域の再定義は図８の方法によるものとされ得、その場合には中心点が選択され、其処から、図１４に示された順序の如き渦巻き状の走査技術が実施される。斯かる渦巻き状の走査は、ステップ１８１の式により定義され得る。斯かる方法にてステップ１７９においては、垂直中心線に沿い走査された各視野における核の個数Ｎｙを獲得する。ステップ１８２にては、重み付けされた平均値を用いて上記中心のｙ座標Ｃｙを計算する。引き続きステップ１８３にて、スライドの垂直中央軸心が位置するｘ座標Ｃｘを計算する。次にステップ１８４にて、スライドの幅と同様の直径を有する走査領域を（Ｃｘ，Ｃｙ）の回りに定義する。最後にステップ１８５にて、終了（ステップ１８７）の前に、円の内側の低倍率視野の各々に対して走査順序番号を割当てる。順序番号は領域の中心から開始し、渦巻き状に外方に進むにつれて増加する。該番号は、既に走査された領域を省かねばならない。
【００３７】
低倍率走査領域が一旦定義され（図１のステップ３５）、且つ、サンプルが低倍率で走査されたなら（図１のステップ４０）、高倍率での走査が実施され得る（図１のステップ４５）。
【００３８】
高倍率走査は、図４に示された如き方法を採用し得る。対物レンズは高倍率に設定され、且つ、カメラ利得を最高利得に設定する（ステップ８９）。次に、高倍率に対する画像処理スレッド（ステップ９１）は、先ず初期化し（ステップ１２９）、待ち行列における画像処理ジョブを待機し（ステップ１３１）、画像を保存し（ステップ１３２）、（ＤＡＰＩおよびＦＩＳＨ画像の如き）一群の画像を処理し（ステップ１３３）、高倍率視野の確率マップを更新し（ステップ１３４）、たとえば核などの関心目標物を分類し（ステップ１３６）、且つ、適切であれば最後にスレッドを終了し（ステップ１３７／１２４）て１２６に継続することにより、生成される。ステップ１３４における高倍率視野の確率マップの更新は、図１２のフローチャートに示された方法によるものとされ得る。
【００３９】
示された如く、ステップ３００にては、（ＤＡＰＩ物体の如き）物体が（ＦＩＳＨ物体の如き）他の関心物体を有する確率に関する入力、および、各高倍率視野に対する物体の個数に関する入力が提供される。次に、各高倍率視野においてＦＩＳＨ信号を有するＤＡＰＩ物体の如く、他の関心物体を伴う関心信号の個数の期待値の計算が在る（ステップ３０５）。次に、各高倍率視野はＤＡＰＩ物体の如き有用な物体の個数に従いソートされ（ステップ３１０）、ＤＡＰＩ物体の如き有用な物体の最大数を有する高倍率視野が走査され、且つ、低倍率視野に対するＤＡＰＩ物体の如き有用な物体の確率が調節される（ステップ３１５）。ステップ３２０においては、高倍率視野の各々において（たとえばＦＩＳＨ信号を有するＤＡＰＩ物体などの）所望信号を有する物体の個数の期待値が計算される。
【００４０】
たとえば、ＦＩＳＨ信号を有するＤＡＰＩ物体に関する高倍率視野の確率マップが決定され得る。最小限の時間内で十分な個数の有用なＤＡＰＩ物体を見出すために走査されるべき視野の個数を減少するために、上記高倍率視野内に含まれた物体の個数に基づき、高倍率走査のためにＤＡＰＩ物体がソートされ得る。良好なＦＩＳＨ信号を有するＤＡＰＩ物体（すなわち、最大数の有用なＤＡＰＩ物体を含む物体）が更にソートされることで、高倍率分析に必要な時間が減少され得る。ＦＩＳＨ物体を有すべく適切に処理された高倍率視野に対する確率がｐ＝ｍ／ｎであると仮定すると、ＤＡＰＩ物体がＦＩＳＨ物体を含むことが見出される毎に、上記確率はｐ＝（ｍ＋１）／（ｎ＋１）となるべく処理され得る。また、ＤＡＰＩ物体がＦＩＳＨ物体を含むことが見出される毎に、確率をｐ＝ｍ／（ｎ＋１）と調節する。その場合、各高倍率視野における有用な物体の個数の期待値は、ＤＡＰＩ物体の個数と上記確率との乗積である。物体の個数の最大の期待値を有する高倍率視野が、走査されるべく選択され得る。ｐの値は、典型的なスライド上での実験により統計的に求められ得ることを銘記されたい。固定されたｐとするなら、各物体がＦＩＳＨ信号を有するか否かに関わらず、該物体が確率調節に関して適切な影響要因を有し得る如く、ｍ（もしくはｎ）の値は慎重に選択される必要がある。
【００４１】
使用され得るＤＡＰＩ／ＦＩＳＨシステムに対するアルゴリズムの擬似コードは、以下に示される：
１．最初の低倍率視野の品質指標を、ｐｉ＝ｍｉ／ｎｉ＝ｐ＝ｍ／ｎとする。
２．各高倍率視野における物体の個数の期待値を計算し、それらをソートする。
３．物体の最大の期待個数を有する高倍率視野を選択する。
４．物体の期待個数がＮｍｉｎ未満であれば、停止する。
５．選択された高倍率視野を走査して分析する。
６．上記高倍率視野における各物体に対し、それがＦＩＳＨ信号を含むか否かを判断する。ｎｉ＝ｎｉ＋１とする。もし上記物体がＦＩＳＨ信号を含むなら、ｍｉ＝ｍｉ＋１である。
７．十分な個数の有用なＤＡＰＩ物体が見出されたら、停止する。
８．新たな視野品質指標ｐｉ＝ｍｉ／ｎｉを計算する。
９．現在の低倍率視野内で残りの高倍率視野における視野品質指標に基づいて物体の個数の期待値を更新する。
１０．残りの高倍率視野をソートし、３．に行く。
【００４２】
ｍおよびｎから適切な値を選択することにより、多数の走査方策を達成し得る。高倍率走査アプリケーションに対し、上記アルゴリズムは、ＦＩＳＨ信号の無い物体が在る視野を断念し得ることが望ましいこともある。その様にするために、ｍおよびｎに対して小さな値を選択しても良い（たとえば、ｍ＝１、ｎ＝２とし；または、視野の断念を更に迅速としたいならばｍ＝０．５、ｎ＝１とする）。Ｎｍｉｎは、たとえば＝０．２〜０．３と選択され得る。
【００４３】
ステップ１３６における核の分類に関し、分類は、たとえば図１１のＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎ／ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（２０９、２１１、２１２）の如き、採用される特定の試験プロトコルにより指定され得る。たとえば、ＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎ試験スライド上の核がカウントされつつあるとき、ＦＩＳＨチャネルの内の任意のチャネルにおけるドット・カウントがカウント可能フラグを含まないか否か（ステップ２１３）という単純な決定は、提案された核ドットがカウントされるべきであるか（２１６）カウントされるべきでないか（２１４）を決定すべく使用され得る。同様に、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ試験スライド上の核がカウントされつつあるとき、チャネル・カウントは核の分類に関して使用され得る。たとえば、３つのチャネルなどである複数のチャネルの内の２つ以上のチャネルが２個より多いドットを有する（２１７）なら、異常分類（２２３）が与えられ得、または、最初の３つのチャネルが２個のドットを有し且つ最後の（たとえばｇｏｌｄの）チャネルがゼロ個のドットを有する（２１９）なら、異常の分類（２２６）が与えられ得る一方、最初の３つのチャネルが２個のドットを有し且つ最後の（たとえばｇｏｌｄの）チャネルが２個のドットを有する（２２１）なら、正常の分類（２２７）が確保され得る。上記複数のチャネルにおけるひとつのチャネルのみが２個より多いドットを有する（２１８）なら分類は単一利得とされ（２２４）得る一方、最初の３つのチャネルにおける少なくとも２つのチャネルが１個より多いドットを有し且つｇｏｌｄにおいてはゼロ個のドットであるなら、ｇｏｌｄはゼロの分類（２２８）もしくは未分類（２２９）が行われ得る。核の各々を分類したなら、分類処理は終了され得る（２３１）。
【００４４】
画像処理スレッドの生成（ステップ９１）の後、図４に示された方法を採用する高倍率での走査（図１のステップ４５）は、たとえば上記にて図５に関して論じられた如く、対物レンズ再現精度試験（９２）を処理し得る。ディスク空間および照明の如き顕微鏡のパラメータが再び実施され（ステップ９３）、且つ、停止条件がチェックされる（９４）。
【００４５】
停止条件のチェック（９４）は、たとえばＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎまたはＵｒｏＶｙｓｉｏｎなどの採用されつつある特定の試験プロトコルに依存し得る（１６６、１６７、１６８；図６を参照）。
【００４６】
たとえば、もしＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎ（１６７）なら、全体的な走査領域が走査されたか否かの決定（１６９）が行われ得ると共に、もしそうであれば、停止条件が設定され（１７３）、且つ、処理は終了される（１７４）。他方、全体的な走査領域が為されていないとの決定が行われたなら（１６９）、高倍率で収集された核の合計は、５００以上である如き閾値と比較され得る（１７１）。この閾値が満足されているなら、停止条件が満足されていると決定され得る（１７３）。上記閾値が満足されていることは見出されず、且つ、全ての細胞範疇における核の最大数が（５０以上である如き）所定の最小閾値より大きいと決定されるなら（１７２）、停止条件は同様に満足されていると決定され得る（１７３）。それが所定の最小閾値より小さいなら、停止条件は未だ満足されていないと決定され得る（１７６）。
【００４７】
採用された特定プロトコルがＵｒｏＶｙｓｉｏｎであるなら（１６８）、全体的な走査領域が走査されたか否かの決定が為され得（１７７）、もしそうであれば、停止条件が満足されており、もしそうでなければ、停止条件を満足すべく別のパラメータが求められる（１７３）。たとえば、停止条件が満足されている（１７３）ことの条件として、高倍率にて収集された核の合計が、ユーザ指定の値より大きいこと（１７８）とし得る（もしそうでなければ、停止条件は満足されていない１７６）。
【００４８】
図４に戻ると、サンプルに対して実施された試験の形式（たとえば、ＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎ（ステップ９６））は、高倍率走査のステップ（図１のステップ４５）に影響し得る。たとえば、ＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎが上記試験であるなら（ステップ９６）、次に最大である期待個数の核を有する高倍率視野を走査のために選択（ステップ１３８）し得る一方、斯かる試験が採用されていなければ、上記リストにおける次の高倍率視野が走査され得る（ステップ９７）。上記処理においては、たとえば５０番目毎の高倍率視野にて照明タイマをリセットするなどして、顕微鏡の各パラメータを定期的に調節することが必要であり得る（ステップ９８）。画像を撮る前に、画像処理待ち行列が利用可能であることを確認することが好適である（ステップ９９）。適切なフィルタが設定される必要があり得（ステップ１０２）、シャッタはオンに設定され（ステップ１０３）、且つ、高倍率視野が入力される（ステップ１０１）。次に、適切な照会波長に対する露光時間が、ビニング・モードの設定により見積もられ得る（ステップ１０４）。自動露光および自動焦点を調節した後（ステップ１０６）、見出された焦点位置および露光値にてＤＡＰＩ画像の如き画像が撮られ得る（ステップ１０７）。同中心性オフセットを決定することにより同中心性が確認されるべきであり（ステップ１０８）、もし上記オフセットが大きすぎるなら（ステップ１０９）、対物レンズは低倍率と高倍率との間で転回され（ステップ１２７）、チェック処理は反復され、または、最後の高倍率視野に到達したと決定されたなら（ステップ１２３）、画像処理スレッドは終了される（ステップ１２４）。上記オフセットが大きすぎなければ、ＤＡＰＩマスクの如き他のマスクが採用され得ると共に、同中心性オフセットが更新される（ステップ１１１）。たとえば９枚などの一群の画像を必要とした後、最適に焦点合わせされた平面が決定され得（ステップ１１２）、更に、ＦＩＳＨ信号を検出するためのフィルタの如きフィルタが設定され（ステップ１１３）、且つ、露光時間が再計算されてビニング・モードが設定される（ステップ１１４）。最適に焦点合わせされた平面上の自動露光が行われ得（ステップ１１６）、次に、画像群を生成する所望数のフィルタが完了する（ステップ１１９）まで、ビニング・モードを新たな値に設定して露光を適用する（ステップ１１７）ことにより、上記フィルタが設定されたＦＩＳＨ信号などの一群の画像の信号が獲得される（ステップ１１８）。次に画像獲得デバイスのシャッタがＯＦＦに設定され得（ステップ１２１）、獲得された画像は画像処理スレッドへと送られ（ステップ１２２）、最後の高倍率視野が照会されたことを決定した後（ステップ１２３）、画像処理スレッドは終了される（ステップ１２４）。図６に関して上述された如き停止条件のチェック（図１のステップ５０）時における高倍率走査の完了（ステップ１２６）によれば、自動式顕微鏡が試験結果を生成することが促進され得る（図１のステップ５５）。
【００４９】
図９には、ＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎまたはＵｒｏＶｙｓｉｏｎ試験（１８８、１８９、１９１）に関する試験結果（図１のステップ５５）を決定する代表的な自動的方法が示される。ＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎ試験（１８９）に関して描かれた如く、各蛍光標識剤（ＣＥＰ対ＬＳＩ）は、斯かる標識剤に対する目標染色体領域への結合に関して分析される。たとえばＣＥＰに関しては（１９３）、Ｘ、Ｙおよび１８のドット・カウントが決定され（ステップ１９６）、且つ、ＬＳＩに関しては（１９４）、染色体１３および２１にに関するドット・カウントが獲得される（ステップ１９７）。決定されたドット・カウントは次に、ＣＥＰ標識化（２０１）またはＬＳＩ標識化（２０２）に対する可能的な結果のデータベースに対して突き合わされる（ステップ１９８）。獲得されたドット・カウントが有効なＣＥＰ標識化に対する可能的なドット・カウント結果と一致するなら（２０１）、一致した出力は試験結果として送られる。但し、獲得されたドット・カウントが有効なＣＥＰ標識化に対する可能的なドット・カウント結果と一致しなければ、一致しない理由は少なすぎる核の分析に起因するか否かが決定され（ステップ１９９）、もしそうであれば試験結果出力は“５０個未満の核画像”として送られ（２０６）、且つ、もしそうでなければ試験結果は“再吟味を推奨”として送られる（２０４）。試験結果は２０８にて終了される。
【００５０】
図１に戻ると、試験結果の生成（ステップ５５）の後に、照会されたスライドは降荷され（ステップ６０）、且つ、そのスライドが上記カセット内の最後のスライドでなければ（ステップ６５、７０）、該カセットから新たなスライドが装填される（ステップ８５）。もしそれが上記カセット内の最後のスライドなら（ステップ７０）、次のカセットが利用可能であれば該カセットが装填され得（ステップ８０）、または、利用可能でなければ操作は終了され得る（ステップ７５）。
【００５１】
好適実施例に関する陳述
本発明は好適実施例に関して記述されたが、当業者であれば、本発明に対しては添付の各請求項により定義された本発明の精神または有効範囲から逸脱せずに種々の変更および／または改変が為され得ることを容易に理解し得よう。付加的もしくは代替的な詳細、特徴および／または技術的背景の教示に対して適切な場合、本明細書において引用された全ての文献は言及したことにより本明細書中に援用される。
【符号の説明】
【００５２】
２７  ＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎスライド
２８  ＵｒｏＶｙｓｉｏｎスライド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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