(57)【要約】本発明は、非消化性ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含む栄養組成物及び医薬組成物並びにそれらの使用方法に関する。特に、本発明は、バクテリア毒素により引き起こされる病気を予防し又は処置することにおいてＧＯＳ種を使用する方法に関する。コレラ毒素ファミリーメンバーの付着及び／若しくは摂取に関連する又は当該付着及び／若しくは摂取により引き起こされる急性又は慢性疾患の処置又は予防の為の栄養組成物又は医薬組成物の製造のために、５以上、好ましくは６以上の重合度を有するＧＯＳの使用方法が提供される。ＧＭ１へのコレラ毒素（Ｃｔｘ）結合を阻害することができるＧＯＳ画分を提供する方法及びそれにより得られる画分も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含む組成物であって、５以上、好ましくは６以上の重合度を有するＧＯＳ種が、該組成物中に存在する全ＧＯＳ種の合計乾燥重量に対し３０重量％（ｗ％）超の量で存在する上記組成物。
【請求項２】
β結合ガラクトシル残基、特にはβ（１−４）及び／又はβ（１−６）結合されたものを含むＧＯＳ種を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該組成物中に存在する全ＧＯＳ種が、該組成物の乾燥重量に対し少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも６０重量％、より好ましくは少なくとも７０重量％を占める、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
該組成物の乾燥重量に対し、少なくとも４０重量％の量で５の重合度を有するＧＯＳ及び／又は少なくとも１０重量％の量で６以上の重合度を有するＧＯＳを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含む組成物であって、該組成物中の該ＧＯＳ種の乾燥重量に基づき、５以上の重合度を有するＧＯＳ種の割合が、５未満の重合度を有するＧＯＳ種を超えて存在する上記組成物。
【請求項６】
該組成物が、単糖及び／又は二糖、特にはガラクトース及び／又はグルコース及び／又はラクトースを本質的に含まない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
該組成物中に存在する全ＧＯＳ種の合計乾燥重量に対し少なくとも１５重量％の、６の重合度を有するＧＯＳ種を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
食品グレード非消化性シアル化オリゴ糖（ＳＯＳ）、好ましくは３’−シアリルラクトースなどの乳由来のＳＯＳをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
コレラ毒素（Ｃｔｘ）がＧＭ１に結合することを抑制することができるＧＯＳ画分を提供する方法であって、
−種々の重合度を有するガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の混合物を用意すること；
−任意的に該ＧＯＳ混合物から遊離ラクトースを除去すること；
−該（ラクトース不含の）ＧＯＳ混合物を陽イオン交換樹脂に適用すること；
−水移動相を用いてＧＯＳを重合度の増大と共に段階的に溶出すること及び分離した溶出画分を集めること；
−ＧＭ１に結合するＣｔｘに対する抑制効果について夫々の溶出画分を分析すること；及び
−ＧＭ１に結合するＣｔｘを抑制することができる１以上の画分を選択すること、
の工程を含む上記方法。
【請求項１０】
種々の重合度を有するＧＯＳの該混合物を用意することが、乳清透過物又はラクトースをβガラクトシダーゼを用いた酵素的トランスガラクトシデーションに付すこと含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
種々の重合度を有するＧＯＳの該混合物が、市販のＧＯＳ混合物、好ましくは商品名ＶｉｖｉｎａｌＧＯＳ（商標）として市販されるＧＯＳ混合物を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法により得られる、ＧＭ１へのコレラ毒素（Ｃｔｘ）の結合を抑制することができるＧＯＳ画分。
【請求項１３】
コレラ毒素ファミリーメンバーの付着及び／若しくは摂取に関連する又は当該付着及び／若しくは摂取により引き起こされる急性又は慢性疾患の処置又は予防の為の栄養組成物又は医薬組成物の製造のために、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物又は請求項１２に記載のＧＯＳ画分を使用する方法。
【請求項１４】
コレラ毒素ファミリーメンバーにより引き起こされる急性又は慢性疾患、特には下痢性疾患の予防又は処置の為の栄養組成物又は医薬組成物の製造のための請求項１３に記載の使用方法。
【請求項１５】
該コレラ毒素ファミリーメンバーが、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅコレラ毒素（Ｃｔｘ−Ｂ）又は毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ−Ｂ）である、請求項１３又は１４に記載の使用方法。
【請求項１６】
コレラ毒素ファミリーメンバーの摂取に関連する又は当該摂取により引き起こされる急性又は慢性疾患の処置及び／又は予防を、そのような処置を必要とするヒトを含む哺乳類において行う方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物又は請求項１２に記載のＧＯＳ画分の治療的に有効な量を該哺乳類に投与することを含む上記方法。
【請求項１７】
該疾患が、毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）により引き起こされるコレラ又は下痢性疾患である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非消化性ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含む栄養組成物及び医薬組成物並びにそれらの使用方法に関する。特に、細菌毒素により引き起こされる病気を予防し、弱めあるいは処置することにおけるＧＯＳ種の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ毒素による腸内感染は、ほぼ２００年間、発展途上国を苦しめてきた。Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅは、糞口経路を通じて、最も一般的には汚染した水の消費及び、より低い程度で、食物の消費によって、伝染される（W.H.O. Cholera, 2004. Wkly Epidemiol Rec 2005;80(31):261-8）。免疫低下した及び栄養不良の個体において、Ｖｉｂｒｉｏは、胃防壁を通って生き抜きそして最終的には小腸に定着する（Tamplin et al., Appl Environ Microbiol 1990;56(6):1977-80）。アジアの津波及び米国におけるハリケーン・カトリーナの結果としての最近のコレラの発生は、疾病管理の重要性をさらに説明する。
【０００３】
しかしながら、コレラ毒素に対する予防薬は無く、そして処置が無い場合、致死率は３０〜５０％に達しうる。２種類の経口コレラワクチン（ＯＣＶ）を用いてある程度の成功が成されたが、それらは病原性株Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ｏ１３９に対しては無効である。さらに、毒素産生をするＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ株が多剤耐性を有するという発見は、処置及び管理戦略としての抗生物質の使用に対して重要な暗示を有する。明らかに、コレラ及び関連する病気と闘う為の代替技術を開発することの緊急性がある。
【０００４】
標的細胞の細胞表面上の受容体としてのガングリオシド（酸性スフィンゴ糖脂質）に結合し及び該毒素−受容体複合体の続く内部移行により標的細胞に侵入する多くの細菌毒素がある。これらのうちで最もよく知られたものは、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅにより産生されるエンテロトキシンであるコレラ毒素（Ｃｔｘ）であり、そして、その特異的細胞表面受容体は、モノシアロガングリオシド  ｇａｌ（β１−３）ｇａｌＮＡｃ（β１−４）[シアル酸（α２−３）]ｇａｌ（β１−４）ｇｌｃ（β）１−セラミド（ＧＭ１）として同定された。
【０００５】
コレラ毒素は、５つの同一のＢサブユニット（Ｃｔｘ−Ｂ）のリング構造及び１つのＡサブユニット（Ｃｔｘ−Ａ）からなるＡＢ５六量体会合体である。多くの他の細菌毒素と同じように、触媒活性がＣｔｘ−Ａに存する一方で、受容体が結合すること及び該標的細胞への該毒素の輸送が、該Ｃｔｘ−Ｂ五量体により媒介される。Ｂサブユニットの膜ＧＭ１への結合は、該毒素におけるコンフォメーション変化を誘発し、毒性Ａサブユニットを含む六量体会合体の該標的細胞への進入を結果すると考えられる。
【０００６】
細胞機能の多くの局面の制御に関与する、ＧＴＰ加水分解タンパク質グループのメンバーであるＧαｓに対して、該ＡサブユニットはＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を示す（Shah BH. Exp Mol Med 1999;31(2):89-94）。Ｇαｓは、アデニレートシクラーゼの活性を制御し、及び、該宿主細胞中のｃＧＭＰの濃度を決定する。次に該Ａサブユニットは、ＧｓのαサブユニットをＡＤＰリボシル化し、生来のＧＴＰａｓｅ活性をノックアウトする。結果的に、該刺激はスイッチオフされることができず、そして、アデニレートシクラーゼはｃＡＭＰを産生することを継続し、該カスケードは作動した状態を維持する。普通は、Ｃｔｘが不在の場合、オン−オフ機構は、腸内アデニレートシクラーゼの刺激に応答して、該細胞により要求されたときに、Ｇαｓが活性化されることを確保する。それ故に、この系は普通は、その機能を果たすのに十分高いｃＧＭＰ濃度を維持する（Faruque et al., Mol Biol Rev 1998;62(4):1301-14）。Ｇαｓの、制御されないＡＤＰリボシル化は、高水準のｃＧＭＰが蓄積することを最終的に引き起こすアデニレートシクラーゼ活性の継続的な増加を結果する。腸内において、ｃＧＭＰ水準は、ナトリウム及び塩化物のトランスポーターに影響し、膜浸透ポテンシャルにおけるイオン不均衡及び破壊を引き起こす。結果として起こる、塩化物イオン及び重炭酸イオンの小腸内腔への大規模な流出は、受動的浸透によって、それを有する大量の水を引き出す。
【０００７】
ＡＢ５毒素のクラスは、配列相同性及び受容体トロピズムに基づき、ファミリーへと細分されうる。コレラ毒素並びにＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシンＬＴ及びＬＴ−ＩＩは両方とも構造的に関連する。両方の毒素のＢサブユニットは、ＧＭ１を含む多くの糖脂質のオリゴ糖部分に対する高い親和性を有する。コレラ毒素又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの熱不安定性エンテロトキシンのいずれかの、腸を内張りする上皮細胞の表面に存在するＧＭ１への付着は、水様下痢の誘発を結果する一連の最初の段階である。コレラがより重度であるが、両方とも、重度の脱水の結果として死をもたらしうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ及び毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉの病原性細菌毒素に関連する疾患の予防的及び／又は治療的処置において有効である組成物を提供することである。特に、本発明者らは、細菌毒素を標的とすることがバクテリア株の薬剤耐性を回避することが出来るとの基礎的な考えと伴に、コレラ毒素のその受容体ＧＭ１への付着のインヒビターとして役立つ化合物を同定することに着手した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
驚くべきことに、非消化性の食品グレードオリゴ糖調製物の或る画分が、Ｃｔｘ−Ｂがその天然の受容体に結合することの非常に効率的なインヒビターであることが分かった。より特には、ＧＯＳ五糖（本明細書においてＤＰ５ともいう）及びＧＯＳ六糖（ＤＰ６）を含む、５以上の重合度を有するガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）に富む画分が標的細胞上のＧＭ１へＣｔｘが結合することを防ぐことにより、有効な抗Ｃｔｘ−Ｂ付着性物質であると分かった。
【００１０】
それ故に、本発明は、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含む組成物に関し、ここで５以上、好ましくは６以上の重合度を有するＧＯＳ種は、該組成物に存在する全ＧＯＳ種の合計乾燥重量に対し３０重量％（ｗ％）超の量で存在する。コレラ毒素ファミリーメンバーの付着及び／若しくは摂取に関連する又は当該付着及び／若しくは摂取により引き起こされる急性又は慢性疾患の処置又は予防の為の栄養組成物又は医薬組成物の製造の為に、５以上、好ましくは６の重合度を有するＧＯＳを使用する方法も提供される。
【００１１】
他の局面において、本発明は、ＧＯＳ混合物から、Ｃｔｘ抑制活性を有するＧＯＳ画分の単離の為の分画方法を提供する。該方法により得られるＧＯＳ画分及び該画分の抗Ｃｔｘ−Ｂ付着性物質としての使用方法も提供される。
【００１２】
多量のＧＯＳ  ＤＰ５及び／又はＤＰ６の種を含む組成物、例えば、医薬組成物若しくは栄養組成物又はそれらの濃厚物も提供される。
【００１３】
ＧＯＳは、可溶性食物繊維と考えられうる非消化性炭水化物の群に属する。なぜなら、それらは、生化学的基準及び栄養学的／生理学的基準の両方を含む、一般に認められている食物繊維の定義に合うからである（Food Industry ad hoc Working Group on Dietary Fibre (1994) Int. Food Ingred., 1, 46-49）。ＧＯＳは、ヒトの腸内のビフィドバクテリア及び乳酸バクテリアの増殖を促進することができ及び、従って、ヒトの健康を増進することができるので、ＧＯＳは高まる関心を受けている。ＧＯＳは、腸の健康を改善するプレバイオティクスとして特徴付けられるだけでなく、大腸がんリスクを減少するとも示された。ＧＯＳのあり得る抗腫瘍活性は、大腸内でＧＯＳから生成される物質のひとつであるブチレートのあり得る抗腫瘍作用によって説明されうる。
【００１４】
ＧＯＳは、基質としての精製された乳清Ｄ−ラクトース画分を用いて酵素的に製造されることができる（Wallenfels et al., Adv Carbohydr Chem, (1961). 16: p. 239-98）。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅからのβ−ガラクトシダーゼ酵素は、ラクトースに対するトランスガラクトシル触媒活性を有し、還元末端でグルコース分子に連結された１〜７ガラクトース単位から構成される二糖〜八糖、すなわち（ガラクトース）ｎグルコース、ここでｎは１〜７である、の形成を結果する（Matsumoto et al., Galactooligosaccharides., in Oligosaccharides: production, propeties and applications., T.Nakakuki, Editor. 1995, Gordon and Breach Science Publishers.: Shizuoka, Japan. p. 90-106）。しかしながら、酵素的な合成は、しばしば不純物を含むＧＯＳ混合物を生成する。例えば、市販のシロップＶｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳ（商標）は、５９％ｗ・ｗ−１だけのＧＯＳを、残る４１％を占めるラクトース、グルコール及びガラクトースとともに含む。Ｖｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳに存在するＧＯＳ種のうち、二糖（ＤＰ２）及び三糖（ＤＰ３）が最も豊富であり、全ＧＯＳ種の合計乾燥重量に対して、夫々約３３重量％及び約３９重量％を表す。ＤＰ４及びＤＰ５は、約１８重量％及び約７重量％を表す。６以上の重合度を有するＧＯＳ種は、Ｖｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳ中のＧＯＳ種の約３重量％だけを表す。他の市販入手可能なＧＯＳ混合物は、より低い分子量のＧＯＳ種に同様に富み、特にはＧＯＳ二糖及び三糖に富む。本明細書以下に開示されるとおり、本発明者らは、乳清に由来するＧＯＳ種の複雑な混合物の分画方法を開発した。グルコース及びガラクトースの除去に続き、該混合物は、イオン交換クロマトグラフィーにより分離された。これは、異なるＧＯＳ種特性を有する、すなわちＧＯＳ三糖、四糖、五糖及び六糖（本明細書において夫々ＤＰ３、ＤＰ４、ＤＰ５及びＤＰ６といわれる）の相対的存在量において異なる、１５の画分を結果する。画分番号の増加に伴い、ＤＰ５及びＤＰ６存在量が段階的な様式で減少し、ＤＰ３及びＤＰ４における同時の増加に伴う、と示され、主にＤＰ６−ＤＰ５を含有する画分からＤＰ４−ＤＰ３含有画分へのシフトを示す。
【００１５】
競合的ＥＬＩＳＡ試験が実施され、ここで該ＧＯＳ画分が、ＧＭ１へのＣｔｘ−Ｂサブユニットの結合を抑制するそれらの能力について評価された。これは、ＧＯＳ五糖（ＤＰ５）及び六糖（ＤＰ６）に比較的富み且つＤＰ３及びＤＰ４の低い相対的存在量を有するＧＯＳ画分が、Ｃｔｘ付着の特に強力なインヒビターであることを明らかにした。語「比較的富む」は、分画されていない出発物質と比較して、該存在量が増加されていることを指すために意味される。
【００１６】
活性ＧＯＳ画分は、該画分に存在するＧＯＳ種の合計乾燥重量に対して１５重量％以上のＤＰ６を含む画分を含むそれらを包含し、該ＥＬＩＳＡ試験における少なくとも１５ｍｇ／ｍｌに対応した。さらに、ＤＰ５は、存在する全ＧＯＳ種に対して少なくとも４０重量％の量で該活性画分に存在した。理論にとらわれることを望まないで、夫々の画分の抑制定数と、マススペクトロメトリーデータを用いて決定された夫々の画分の組成との間の統計的相関は、ＤＰ６が、分画されたＶｉｖｉｎａｌＧＯＳの最も適当な抑制成分であることを示唆する。しかしながら、該活性画分に存在する他のＧＯＳ種も同様に、該観察された活性の一部又は全部を説明しうる。
【００１７】
それ故に、本発明は、１つの局面において、コレラ毒素ファミリーメンバーの付着及び／若しくは摂取に関連する又は当該付着及び／若しくは摂取により引き起こされる急性又は慢性疾患の処置又は予防の為の栄養組成物又は医薬組成物の製造の為に、ＧＯＳ  ＤＰ５−６（又はさらに高い重合度でありうる）を使用する方法を提供する。該栄養組成物又は医薬組成物は、コレラ毒素ファミリーメンバーにより引き起こされる急性又は慢性疾患、特には下痢性疾患の予防又は処置に適当である。一つの実施態様において、該疾患は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅコレラ毒素（Ｃｔｘ−Ｂ）又は毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ−Ｂ）により引き起こされる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】陽イオン交換精製されたＧＯＳ画分番号とＧＯＳ三糖、四糖、五糖及び六糖（ＤＰ３、ＤＰ４、ＤＰ５及びＤＰ６としてそれぞれ示される）の相対的存在量との間の相関を示す図である。
【図２】Ｃｔｘ−ＨＲＰのＧＯＳ画分２抑制を示す図である。
【図３】ＧＯＳ画分２用量応答を示す図である。
【図４Ａ】ＧＭ１に結合するＣｔｘ−ＨＲＰに対するＧＯＳ画分１〜１５の抑制活性を示す図である。
【図４Ｂ】ＧＭ１に結合するＣｔｘ−ＨＲＰに対するＧＯＳ画分１〜１５の抑制活性を示す図である。
【図５】ＤＰ６の用量及びＣｔｘ−ＨＲＰの抑制の間の相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のさらなる局面はガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含む抗付着性組成物に関し、ここで５以上、好ましくは６以上の重合度を有するＧＯＳ種が、該組成物中に存在する全ＧＯＳ種の合計乾燥重量に対し、３０重量％（ｗ％）超、好ましくは少なくとも３５重量％、より好ましくは少なくとも４０重量％の量で存在する。一つの実施態様において、該組成物は、該組成物中に存在する全ＧＯＳ種の合計乾燥重量に対し、少なくとも１０重量％（ｗ％）、好ましくは少なくとも１５重量％、より好ましくは少なくとも２０重量％の量で、６の重合度を有するＧＯＳを含む。代替的に又は付加的に、組成物は、該組成物中に存在する全ＧＯＳ種の合計乾燥重量に対し、少なくとも１５重量％（ｗ％）、好ましくは少なくとも２０重量％、より好ましくは少なくとも３０重量％の量で、５の重合度を有するＧＯＳを含む。
【００２０】
本発明に従う組成物は、該ＧＯＳ種に加えて他の成分、例えば希釈剤、キャリア及び／又は栄養的及び／又は医薬的価値のある化合物を含みうる。組成物は、濃厚なＧＯＳ組成物であってもよく、例えば該組成物中に存在する全ＧＯＳ種が、該組成物の該乾燥重量に対し、少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも６０重量％、より好ましくは少なくとも７０重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％又は９９重量％さえなどを占める。さらに、組成物中のＤＰ５及びＤＰ６の上記相対的百分率は、高い値まで増加することができる。もっぱらＧＯＳ  ＤＰ５及び／又はＤＰ６から本質的になる組成物も意図される。すなわち、存在するＧＯＳ種が、ＧＯＳ  ＤＰ５だけからなる、ＧＯＳ  ＤＰ６だけからなる、又はＧＯＳ  ＤＰ５及びＤＰ６の混合物からなる組成物が提供される。
【００２１】
上記データは、分画自体が、別の方法では市販のＧＯＳ配合物において薄められている特定のＧＯＳ種、すなわちＧＯＳ五糖及び六糖を濃厚にすることによりＣＴｘ結合の抑制の有効性を増加したことを説明する。すなわち、該方法は、プレバイオティック特性、栄養価のある特性及び／又は生物学的特性を有さない低分子量炭水化物を除去する迅速且つ有効な手段を提供する。活性な炭水化物、特にはＧＯＳ  ＤＰ５及び／又はＤＰ６の濃厚化は、単位（乾燥）重量当たりより高い（Ｃｔｘ抗付着性）活性を有する組成物を調製することを許す。そのような組成物は、コレラ毒素ファミリーメンバーの付着及び／若しくは摂取に関連する又は当該付着及び／若しくは摂取により引き起こされる急性又は慢性疾患の処置又は予防の為の医薬配合物又は栄養配合物の製造において有利に用いられる。
【００２２】
ＤＰ６に富むＧＯＳ画分のＥＣ５０を決定する為の用量応答研究は、３０〜４２ｍｇ／ｍｌのＤＰ６についてのＥＣ５０値を明らかにした。ＥＣ５０は、特異的な結合の半分について競合する、インヒビターの濃度をいい、及び、ＩＣ５０値と同じである。ＥＣ５０値が相対的ＤＰ６含有量に相関することは、ＤＰ６について約５ｍｇ／ｍｌのＥＣ５０値を示唆する。
【００２３】
従って、一つの実施態様において、該抗付着性組成物は、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも０．７％、より好ましくは少なくとも１．０％のＧＯＳ六糖を含む。例えば、該組成物は、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも７ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ／ｍｌのＧＯＳ六糖を含む液体組成物である。
【００２４】
哺乳類細胞への病原体付着のインヒビターとしてのオリゴ糖の種々の種類の使用方法が前に記載された。例えば、Ｌｅａｃｈらは、可溶性で一価のグロボトリオースの、尿路病原性Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの付着及びコロニー形成を妨げる能力を開示する（Antimicrob Agents Chemother. 2005 September; 49(9): 3842-3846）。
【００２５】
国際公開第２００５／０２７６６号パンフレットは、哺乳類細胞への病原体付着のインヒビターとしてのいくつかのオリゴ糖の使用方法を開示する。試験された化合物は、ナイトレートを除去する為に限外ろ過により精製された、市販で得られたＧＯＳ（Ｖｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳ；ｖＧＯＳ）及びペクチンのオリゴ糖を含んだ。ＧＯＳ分画は実施されなかった。ｖＧＯＳは、試験の結果、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＶＴＥＣ（Ｏ１５７：Ｈ７）の一つの株の付着の抑制において陽性であった。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａもその毒素も、国際公開２００５／０２７６６号パンフレットにおいて言及されていない。
【００２６】
米国特許第６，２２４，８９１号明細書は、ＧＢ３（中性糖脂質、ＣＤ７７としても知られるグロボトリアオシルセラミド  Ｇｂ３（α−Ｄ−Ｇａｌ（１→４）β−Ｄ−Ｇａｌ（１→４）β−Ｄ−Ｇｌｃ（１→Ｏ−セラミド））を細胞表面で発現するそれら細胞へ結合する志賀様毒素（ＳＬＴ）のインヒビターとしてのαＧａｌ（１→４）βＧａｌサブユニットを含むα−ガラクトースオリゴ糖の多価誘導体の使用方法を記載する。ＳＬＴは、病原性Ｅ．ｃｏｌｉにより産生される。ＳＴＡＲＦＩＳＨは、ＳＬＴの結合を阻止する為に開発された特異的な合成オリゴ価インヒビターに与えられた名前である。それは、擬似５回対称を有して構築された合成分子である。該コアは、官能性を持たせたグルコース分子であり、その中にスペーサーが接ぎ合わされており、そして、該スペーサーの先端で、志賀様毒素により認識されるオリゴ糖に相当する２つの同一の三糖が置かれる。米国特許第６，２４４，８９１号明細書のオリゴ糖構造は、ＧＯＳ六糖に関するものでなく、且つ、抗Ｃｔｘ付着性物質として有効でない。ＳＬＴ受容体（ガングリオシド  Ｇｂ３）とＣｔｘ−受容体（ガングリオシド  ＧＭ１）との間の構造的な違いを考慮すれば、これは驚くべきことでない。
【００２７】
五糖及び六糖ＧＯＳ構造を含むＧＯＳ種の混合物を含む組成物は、当技術分野で知られている。
【００２８】
国際公開第２００５／００３３２９号パンフレットは、２０〜３５％ｗ／ｖの二糖、２０〜３５％ｗ／ｖの三糖、１５〜２５％ｗ／ｖの四糖及び１０〜２０％ｗ／ｖの五糖の混合物、及び腸壁への病原体又は毒素の付着を防ぐ為の医薬の調製の為にそれらを使用する方法を開示する。
【００２９】
国際公開第２００４／０５２１２１号パンフレットは、炎症性腸疾患及び関連する疾患を制御する為にＧＯＳ及びＦＯＳオリゴ糖を含む栄養組成物に関する。例となる組成物は、２〜６の糖単位を有するＧＯＳを含む。好ましいものは、０〜３０重量％、より好ましくは２〜１０重量％、さらにより好ましくは７重量％の５糖を含む組成物について示される。同様の好ましいものが、国際公開第２００４／０８９１１５号パンフレット及び国際公開第２００５／０３５７８１号パンフレットにおいて表される。
【００３０】
Ｔｚｏｒｔｚｉｓらは、粉末組成物の合計乾燥重量に対し、９．９％の二糖、２３．１％の三糖、１１．５５％の四糖及び１０．４５％の五糖を含むＧＯＳ混合物のプレバイオティック能力を評価した（2005, The Journal of Nutrition, Vol. 135, pages 1726-1731）。該混合物はインビトロの腸モデル系においていくつかのバクテリアの付着を強力に抑制した。この効果は二糖画分に起因した。
【００３１】
明らかに、５以上、好ましくは６以上の重合度を有するＧＯＳ種が、３０重量％（ｗ％）超の量で存在するところの本発明に従う組成物は、当技術分野において開示も示唆もされていない。本明細書に開示されたようなコレラ毒素ファミリーメンバーの摂取又は結合に対するＤＰ５及び／又はＤＰ６の強力な抑制効果は、従来技術から導かれ得ない。
【００３２】
コレラ毒素作用に対する効果を有するオリゴ糖の開示だけが、Ｉｄｏｔａらによるものであり（Biotech. Biochem, 59(3), 417-419(1995)）、ここにおいて、３−シアリルラクトース（ヒト乳中に相当量存在する）が、ウサギ腸内でコレラ毒素により誘発された流体貯留のインヒビターとして同定される。
【００３３】
総合すると、高分子量ＧＯＳ種が、コレラ毒素の結合を抑制することができるとの本発見は、先行文献に開示も示唆もされていない。
【００３４】
上記から明白であろうとおり、好ましい組成物は、比較的高い存在量のＧＯＳ五糖及び／又は六糖を有する。一つの実施態様において、本発明は、ＧＯＳ六糖を富化された組成物を提供する。表現「富化」は、該組成物が、該特定の目的を有する何らかの手段により処理又は加工されて、該所望のＧＯＳ種の濃度を増すことを指すために意味される。これは、組成物の全体の濃度を介してよく及び／又は所望のＧＯＳ五糖及び／又は六糖以外の構造物の除去を介してよい。例えば、該組成物中に存在する個々のＧＯＳ構造物（例えば、異なる重合度を有するＧＯＳ種）の合計量に対し、該組成物は、少なくとも７、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１５（ｗ／ｗ）％の、６の重合度を有するＧＯＳを含む。一つの実施態様において、ＧＯＳ  ＤＰ５〜６は、全部のＧＯＳ構造物の重量に基づき、約１５から最大で約１００％、例えば２０％〜１００％、２５％〜９０％、３５％〜９５％、４０％〜６０％、５０％〜７５％、２５〜１００％、３５〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７５〜１００％に相当する。
【００３５】
組成物は好ましくは、比較的低い存在量のＧＯＳ三糖を有する。例えば、該組成物中に存在する個々のＧＯＳ構造物の合計量のうち、該組成物は、１０（ｗ／ｗ）％未満、好ましくは７（ｗ／ｗ）％未満、より好ましくは５（ｗ／ｗ）％未満の、３の重合度を有するＧＯＳを含む。一つの実施態様において、ＧＯＳ組成物は本質的にＧＯＳ三糖が無い。
【００３６】
本明細書において提供されるＧＯＳ組成物中のＧＯＳ三糖の相対的存在量は、５０（ｗ／ｗ）％未満、好ましくは４５（ｗ／ｗ）％未満、より好ましくは４０（ｗ／ｗ）％未満でありうる。
【００３７】
さらなる局面において、該組成物は、単糖及び／又は二糖、特にはガラクトース及び／又はラクトースが本質的に無い。ラクトースは、β−ガラクトシダーゼを用いて加水分解されてグルコース及びガラクトースを形成することができる。これらの単糖は、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて除去されることができる。
【００３８】
好ましい実施態様において、本発明の組成物は、６の重合度を有するβ−結合ガラクトシル残基、特にはβ（１−４）及び／又はβ（１−６）結合されたものを有するＧＯＳ六糖を含む。β結合ＧＯＳ六糖は、例えば、基質としての乳清ラクトースから、バクテリアのβ−ガラクトシダーゼを用いて酵素的に産生されるＧＯＳ混合物から入手されうる。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅからのβ−ガラクトシダーゼは、ラクトースに対するトランスガラクトシル触媒活性を有し、１〜７のβ結合ガラクトシル単位から構成される二糖〜八糖を含むＧＯＳ混合物の形成を結果する。そのような混合物は、「トランスガラクトオリゴ糖」、ＴＧＯＳ又はＴＯＳと略記される、として当技術分野で知られてもいる。
【００３９】
市販のＧＯＳ調製物は、本発明の組成物を製造する為に有利に用いられうる。本発明の実施にとっての、ＧＯＳ  ＤＰ５及び／又はＤＰ６の特に適当な源は、Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ  Ｆｏｏｄｓ  Ｄｏｍｏ（商標）、オランダ、からの商品名ＶｉｖｉｎａｌＧＯＳ（商標）として市販されるガラクトオリゴ糖を含む、市販で入手できるプレバイオティック（prebiotic）材料である。
【００４０】
個々のＧＯＳ構造物は、当技術分野で既知の方法により、ＧＯＳ種の混合物から分離され及び単離されうる。例えば、ナノろ過が、Ｇｏｕｌａｓ，Ａ．Ｋ．らに記載されたとおりに用いられうる（Journal of menbrane science, 2002. 209(1):p. 321.）。好ましい実施態様において、ＧＯＳ混合物は、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分画される。より好ましくは、陽イオン交換樹脂の対イオンはカリウム（Ｋ＋）である。本明細書において例示されるように、商品名ＵｎｉＢｅａｄ  ＵＢＫ−５３０（三菱化成工業株式会社、東京、日本）で市販される陽イオン交換樹脂が、抗Ｃｔｘ付着活性を有さないＧＯＳ混合物の、抗Ｃｔｘ付着活性を有する画分への分画に特に適する。
【００４１】
それぞれの画分における重合度は、当技術分野において既知の種々の分析技術、例えば、パルスドアンペロメトリック検出を伴う高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）若しくはマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析又は組合せでの使用など、を用いて決定されることができる。
【００４２】
さらなる局面において、本発明は、抗Ｃｔｘ付着活性を有するＧＯＳ画分を提供する方法であって、
−さまざまな重合度を有するガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の混合物を用意すること；
−（任意的に）該ＧＯＳ混合物の遊離ラクトースを単糖（グルコース及びガラクトース）へ転化することにより遊離ラクトースを除去すること；
−該（ラクトースの無い）ＧＯＳ混合物を陽イオン交換樹脂に適用すること；
−水移動相を用いてＧＯＳ種を重合度の増大と共に段階的に溶出すること及び異なる重合度を有するＧＯＳを夫々含む別個の溶出画分を集めること；
−ＧＭ１に結合するＣｔｘに対する抑制効果について夫々の溶出画分を分析すること；及び、
−ＧＭ１に結合するＣｔｘを抑制することができる１以上の画分を選ぶこと、
の工程を含む上記方法を提供する。
【００４３】
該陽イオン交換樹脂は好ましくはＵｎｉｂｅａｄ  ＵＢＫ−５３０又はその機能的同等物であり、より好ましくはカリウム型のＵｎｉｂｅａｄ  ＵＢＫ−５３０又はその機能的同等物である。
【００４４】
欧州特許出願公開第１３５２９６７号明細書は、ガラクトースをガラクトシダーゼと混合すること、ＧＯＳの生成を結果すること、陽イオン交換樹脂を用いて該混合物を３つの異なる画分に分離することによりＧＯＳを調製する方法について報告する。しかしながら、本発明の方法と対照的に、それは、ＧＯＳ混合物の、重合度の増大を有するＧＯＳ種を含む個々の画分への段階的な溶出／分画を含まない。むしろ、欧州特許出願公開第１３５２９６７号明細書の方法は、ラクトース由来のＧＯＳを分離し及び濃厚にすることを目的とし、及び全てのＧＯＳ種は第２の画分中に溶出する。
【００４５】
本発明に従い、Ｃｔｘ結合に対する抑制効果は、当技術分野で既知の方法、例えばホースラディッスペルオキシダーゼを結合したＣｔｘ（Ｃｔｘ−ＨＲＰ）を用いたＧＭ１−競合的酵素連結免疫吸着アッセイ（ＧＭ１−ＥＬＩＳＡ）を用いて容易に測定される。好ましくは、該選択された画分（群）は、該画分（群）の不在下において観察されるＧＭ１へのＣｔｘの結合の、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは９０〜９９％のような少なくとも８０％を抑制することができる。
【００４６】
上記で記載された方法により得られる抗付着性ＧＯＳ画分も提供される。任意的に、得られた該ＧＯＳ画分は濃厚にされ及び／又は精製されて、例えばＧＯＳ六糖などの抗Ｃｔｘ付着性ＧＯＳ構造物の濃度をさらに増加してよい。例えば、パン酵母がこの目的の為に用いられうる。
【００４７】
さまざまな重合度を有するガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の混合物を用意する段階は例えば、乳清透過物（whey permeate）又はラクトースを、β−ガラクトシダーゼを用いた酵素的トランスガラクトシデーション（transgalactosidation）に付すことを含む。
【００４８】
代替的に、さまざまな重合度を有するガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の該混合物は、市販のＧＯＳ混合物、例えば商品名Ｖｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳとして市販されるＧＯＳシロップを含む。
【００４９】
本発明の組成物は、上記で記載された方法により得られる抗Ｃｔｘ付着特性を有するＧＯＳ画分として存在してよく又は当該ＧＯＳ画分を含んでよい。
【００５０】
本発明の組成物はさらに、ＧＯＳ以外の非消化性オリゴ糖を包含する他の有益な成分を含みうる。コレラ毒素がその受容体に結合するのを、食品グレード非消化性シアル化オリゴ糖（ＳＯＳ）が抑制することができることが示されている。一つの実施態様において、本発明は、ＧＯＳ五糖及び／又は六糖を含み、さらに食品グレードＳＯＳを含む組成物を提供する。（非消化性シアル化オリゴ糖）−ＳＯＳは、天然の源、例えば卵黄又は乳製品などから単離されうる。約１７％のＳＯＳ及び約６８％のタンパク質を含む、めんどり卵黄由来の市販入手可能なシアリルオリゴ糖混合物Ｓｕｎｓｉａｌ  Ｅ（商標）が用いられることができる。
【００５１】
一つの実施態様において、該組成物は、乳、特には牛乳に由来するＳＯＳを含む。５つのシアリルオリゴ糖が牛乳中に同定され、そのうち６’−シアリルラクトサミン及び３’−シアリルラクトースが最も豊富であった（S. Marin-Sosa et al., (2003). J. Dairy Sci. 86:52-59）。
【００５２】
ＳＯＳの構造は、本明細書において活性な抗Ｃｔｘ付着性物質として同定されたＧＯＳ種とは著しく異なることが注目される。
【００５３】
コレラ毒素（Ｃｔｘ）及び／又は熱不安定性エンテロトキシンにより引き起こされる急性又は慢性疾患、特には下痢性疾患の予防又は処置の為の栄養組成物又は医薬組成物の製造の為に、ＧＯＳ五糖及び／若しくは六糖を使用する方法又は本明細書上記で記載された方法により得られるＧＯＳ画分を使用する方法も提供される。
【００５４】
コレラ毒素ファミリーメンバー、特にはその五量体Ｂサブユニットの、その受容体ＧＭ１への結合のインビトロ抑制の為に、ＧＯＳ五等及び／又は六糖を使用する方法又は本明細書上記で記載された方法により得られるＧＯＳ画分を使用する方法も提供される。
【００５５】
本発明の薬剤、栄養組成物又は医薬組成物は医薬的に許容可能なキャリアを任意的に含みうる。さらに、本発明に従い、ＧＭ１により媒介されるバクテリア毒素の摂取に依存する、哺乳類における急性又は慢性のバクテリア関連の腸の疾患を管理する為、例えば処置、予防又は改善する為に、哺乳類細胞への病原体付着を抑制する為の、同時の、別個の又は逐次の使用の為の組み合わせられた医薬調製物も提供される。
【００５６】
本発明の組成物は任意的に、慣用の食物添加物、例えば乳化剤、安定剤、甘味料、香味剤、着色剤、保存料、封鎖剤（cheating  agent）、透過剤、バッファー又はｐＨ調製の為の剤、酸味料、増粘剤、テクスチャライザー（texturiser）などを含む。
【００５７】
医薬組成物及び栄養サプリメント（dietary  supplement）は、都合の良い用量形態での軟質ゲル、小袋、粉、シロップ、液体懸濁物、エマルジョン及び溶液の形態で提供されうる。ソフトカプセル中において、該活性成分は好ましくは適当な液体、例えば脂肪油、パラフィン油又は液体ポリエチレングリコールなどに溶解され又は懸濁される。任意的に、安定剤が添加されうる。
【００５８】
本発明の組成物中に組み込まれるＧＯＳ五糖／六糖又は活性ＧＯＳ画分の量は、本発明の組成物の形態、例えば消費の準備ができた粉又は組成物など、に依存しうる。従って、本発明に従う組成物に含まれるＧＯＳ五糖及び／若しくは六糖又は活性ＧＯＳ画分の適当な量は、該組成物の合計重量に対し、最大で約２〜１００重量％、例えば約５〜約９５重量％、例えば約１５〜約９０重量％の範囲にある。
【００５９】
投与されるべき本発明の組成物の量及び投与計画は、投与の目的及び様式、年齢、性別、体重及び健康全般並びに個々の対象の状態、並びに対象の症状の重症度を含む種々の関連要因を踏まえて決定される。本発明に従う組成物が食料又は飲料の形態で供給されるとき、ＧＯＳ六糖の適当な一人前の分量は、約１ｍｇ〜約２０ｇ、好ましくは約１０ｍｇ〜約１０ｇ、より好ましくは約１０ｍｇ〜約１ｇでありうる。もし医薬の形態で提供されるならば、本発明の抗Ｃｔｘ付着性ＧＯＳの適当な一日の用量は、最大で約２５０ｍｇ、好ましくは最大で約１５０ｍｇ、より好ましくは最大で約１００ｍｇ、及び任意的に約１ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲である。
【００６０】
医薬又は栄養サプリメントの形態は、医薬の技術分野において既知の慣用の配合手順により、すなわち、該活性物質を、可食の医薬的に許容可能な固体又は液体のキャリア及び／又は賦形剤、例えばフィラー、例えばセルロース、ラクトース、スクロール、マンニトール、ソルビトール及びカルシウムホスフェートなど、並びにバインダー、例えばデンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）など、と一緒に混合することにより作成されていよい。任意の添加物は、潤滑剤及びフローコンディショナー（flow  conditioner）、例えばケイ酸、二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム／カルシウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）希釈剤、崩壊剤、例えばデンプン、カルボキシメチルデンプン、架橋ＰＶＰ、寒天、アルギン酸及びアルギネート、着色剤、香味剤、及び溶融剤などを包含する。染料又は顔料が、例えば目的の同定の為又は活性成分の異なる用量を示す為に、錠剤又は糖衣錠コーティング（dragee  coating）に添加されうる。
【００６１】
任意的に、本発明に従う組成物は、栄養的に完全であり得る、すなわち、ビタミン、ミネラル、微量元素並びに窒素、炭水化物及び脂肪酸の源を、それらがビタミン、ミネラル、炭水化物、脂肪酸、タンパク質及び同様物の一日に要求される量の本質的に全てを供給する単独栄養源として用いられるように、含みうる。従って、本発明の組成物は、栄養的にバランスの取れた完全な食事の形で提供されてよく、例えば経口又は経管食事法に適当であり得る。
【００６２】
代替的に、本発明の組成物は、食事の一部として、すなわち栄養サプリメントとして、例えば健康飲料の形態で、提供されうる。本発明の組成物を、低カロリー食事代用物又は他の栄養製品の形態で提供することが望まれうる。この場合、食事代用物又は他の栄養製品は好ましくは、低脂肪、すなわち、該組成物の合計カロリー含有量に対して、約１０％未満の脂肪又は実質的に脂肪が無い、すなわち、脂肪により約２．５％未満が与えられる、例えば約２％脂肪など、である。適当には、低カロリー食事代用物の１回の分量は、約１０００ｃａｌ未満、及び好ましくは約２００ｃａｌ〜約５００ｃａｌのカロリー値を有するであろう。
【００６３】
本発明の適当な組成物、例えば適当な低カロリー栄養製品は、ソフトドリンク、例えばジュース、スムージー又は大豆に基づく飲料などを包含してよく、又は乳製品バー（dairy  bars）、スープ、朝食シリアル、ミューズリー、キャンディー、タブ（tab）、クッキー、ビスケット、スプレッド、調製粉乳、前調製粉乳（pre-infant  formula）、離乳食、菓子、ケーキ、クラッカー、例えばライスクラッカーなど、及び乳製品、例えばミルクセーキ、ヨーグルトドリンク、発酵乳などの任意の食品中に分散されうる。
【００６４】
本発明の組成物は任意的に、慣用の食品添加物、例えば乳化剤、安定化剤、甘味料、香味剤、着色剤、保存料、キレート化剤、透過剤、バッファー又はｐＨ調整のための剤、酸味料、増粘剤、テクスチャライザーなどのいずれかなどを含む。
【００６５】
本発明の更なる局面において、本発明のＧＯＳ画分又は組成物の、食品添加物としての使用方法も提供される。
【００６６】
本発明に従う適当な製品フォーマットは、溶液、消費準備のできた組成物、例えば飲む準備のできた組成物、インスタントドリンク、液状の食べ物、例えばソフトドリンク、ジュース、スポーツ飲料、乳飲料、ミルクセーキ、ヨーグルト飲料又はスープなどを包含する。本発明のさらなる実施態様において、本発明の組成物は、濃厚物、粉、顆粒、例えば、発泡性顆粒、これは、水又は他の液体、例えば乳又はフルーツジュースなどにより希釈されて、消費準備のできた組成物、例えば飲む準備のできた組成物又はインスタントドリンクを産出する、の形態において製造され及び販売されうる。
【００６７】
本発明の組成物は、ヒトの投与及び特には胃腸管の任意の部分における投与に適当な任意の形態であってよい。本発明の組成物の腸内投与、及び好ましくは経口投与、及び管又はカテーテルを通じた投与は、本発明により覆われる。
【００６８】
本発明の組成物は、医療専門家の監督下で投与されてよく、又は自己投与されてよい。
【００６９】
本発明に従うＧＯＳ五糖／六糖を組み込む医薬組成物若しくは栄養組成物又は食料又は飲料は、誰によっても安全に消費されることができる。それらは特に、コレラ毒素ファミリーの毒素に関連する疾患、状態及び症状の危険性があると理解されるいずれのもの、例えば免疫不全及び／又は栄養失調の個体にとって推奨される。
【００７０】
本発明の一つの実施態様において、本発明は、コレラ毒素ファミリーメンバー、例えばＣｔｘ又はＬＴなどの摂取に関連する又は当該摂取により引き起こされる疾患の処置及び／又は予防を、そのような処置の必要があるヒトを含む哺乳類において行う方法であって、本発明に従うＧＯＳ五糖／六糖又は活性ＧＯＳ画分の有効量を該哺乳類に投与することを含む上記方法に関する。本明細書において用いられるときに、語「有効量」は、所望の治療効果、例えば毒素作用に関連する急性症状を処置し及び／又は予防することなど、特には腸内における流体貯留を達成する為に有効な量をいう。
【００７１】
本発明の他の実施態様において、哺乳類細胞への、例えば腸又は腸上皮の哺乳類細胞へのコレラ毒素付着を抑制する方法が提供される。
【００７２】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明の組成物の製造方法に関し、ここで、そのような方法は、本発明の組成物の成分と医薬的に又は栄養的に許容可能な賦形剤とを親密に混合することを含む。そのような方法は当技術分野における当業者によく知られている。
【００７３】
本発明の全ての組成物の有用性は、例えば本明細書上記で記載されたとおりの指示における標準的な臨床試験において、例えば本発明の１以上の抗Ｃｔｘ付着性ＧＯＳ画分を用いて、約１ｇ〜１５ｇの範囲内で、例えば約１０ｇで、哺乳類に対して、及び標準的な動物モデルにおいて観察されうる。該組成物により提供される、急性又は慢性コレラ毒素関連腸疾患を特徴付ける症状における軽減は、例えばウサギ腸系蹄における実験的コレラモデルを用いた標準的動物試験において観察されうる（Leitch et al., J Infect Dis. 1967 Jun;117(3):197-202）。
【００７４】
図面の簡単な説明
図１：陽イオン交換精製されたＧＯＳ画分番号とＧＯＳ三糖、四糖、五糖及び六糖（ＤＰ３、ＤＰ４、ＤＰ５及びＤＰ６とそれぞれ示される）の相対的存在量との間の相関。実験の詳細については、実施例１を参照されたい。
図２：Ｃｔｘ−ＨＲＰのＧＯＳ画分２抑制。ｎ＝６。Ｐ＝０．０００は、このＧＭ１に連関されたＥＬＩＳＡにおけるＧＯＳ画分２とＣｔｘ−ＨＲＰとの間の相互作用が非常に有意なものであることを示す。ｌｏｇ変換された結合Ｃｔｘ−ＨＲＰ値から計算された分散分析。実験の詳細については実施例２を参照されたい。
図３：ＧＯＳ画分２用量応答。ｎ＝６。global  ｒ２＝０．９２５は、強く適合したシグモイド応答を示す。ｌｏｇＥＣ５０とＥＣ５０値との間の差異は、有意差があるとはいえないと分かり（Ｐ＝０．９４１１）、それ故に、帰無仮説は棄却された。
図４：ＧＭ１へ結合するＣｔｘ−ＨＲＰに対するＧＯＳ画分１〜１５の抑制活性。夫々の画分のＧＯＳ種含有量については、図１を参照されたい。パネルＡ：１００ｍｇ・ｍｌ−１対１０ｎｇ・ｍｌ−１Ｃｔｘ−ＨＲＰの抑制。ｎ＝６。大きなｒ２値は、変動の７３．５６％が、ＧＯＳ画分間の種組成における差異により引き起こされることを示す。パネルＢ：１００ｍｇ・ｍｌ−１ＧＯＳ画分１〜１５対２０ｎｇ・ｍｌ−１Ｃｔｘ−ＨＲＰの抑制。ｎ＝６。大きなｒ２値は、変動の７４．１４％が、ＧＯＳ画分間の種組成における差異により引き起こされることを示す。
図５：ＤＰ６の用量及びＣｔｘ−ＨＲＰの抑制の間の相関。ｎ＝６。Ｐ＝０．２７４８は、適合されたシグモイド用量応答曲線の夫々の間に統計的な差異はないことを示す。さらに、Ｃｔｘ−ＨＲＰの濃度は、ＤＰ６の有効性に影響しない。ＤＰ６値は、ｌｏｇスケールに変換された。Ｒ２＝０．８５１６及びＥＣ５０＝５．１０％ＤＰ６。
【実施例１】
【００７５】
陽イオン交換クロマトグラフィー及びＨＩＬＩＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いた「食品グレード」ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の精製及び特徴づけ
【００７６】
乳清に由来する酵素的に製造されたガラクトオリゴ糖は、還元末端でグルコース分子に連結された１〜７のガラクトース単位から構成される二糖〜七糖からなる。この複雑なＧＯＳ混合物は、非消化性健康増進性オリゴ糖と、製品の発熱量（calorific  value）を単に増加する低分子量糖とを含む市販製品の例である。この例は、この例は、準実験規模でグルコース及びガラクトースをクロマトグラフ的に除去する為に、ナトリウム型の陽イオン交換樹脂の使用を記載する。得られたオリゴ糖画分は、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）と組み合わせられた親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を用いて、成功裏に特徴づけされ及びプロファイルされた。
【００７７】
１．材料と方法
【００７８】
１．１．化学物質
全ての溶液は、超高純度ミリＱ水を用いて調製された。用いられた市販のガラクトオリゴ糖混合物ＶｉｖｉｎａｌＧＯＳ（商標）は、７３％ｗ・ｗ−１乾燥物質（このうち５７％ｗ・ｗ−１はガラクトオリゴ糖であった；２３％ｗ・ｗ−１は無水ラクトースであった；１９％ｗ・ｗ−１は無水グルコースであった及び０．９％ｗ・ｗ−１はガラクトースであった）の典型的な組成を有した（Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ  Ｆｏｏｄｓ  Ｄｏｍｏ、ズウォレ、オランダ）。ＨＰＬＣ標準曲線生成のための標準は、分析グレードＤ−（＋）−グルコース一水和物及びβ−ラクトース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．（ジリンガム、ドーセット州、英国）から購入された）であった。ＨＰＬＣグレードＭｅＯＨ及びＨ２Ｏは、Ｒａｔｈｂｕｒｎｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，（ピーブルシャー、スコットランド）から購入され、ＮＨ４ＡＣはＢＤＨ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、プール、英国）から購入された。マルトヘプタノース、マルトヘキサノース、マルトペンタノース、マルトテトラオース、ラフィノース、ラクトース及びグルコースは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ジリンガム、ドーセット州、英国）から購入された。分画されたＧＯＳ粉は、ＵＢＫ−５３０陽イオン交換樹脂（三菱化成工業株式会社、東京、日本）により製造された。２−ＡＢ（２−アミノベンズアミド）標識化グルコースホモポリマー（ＧＨＰ）ラダーが、Ｌｕｄｇｅｒ  Ｌｔｄ（アビンドン、オックスフォードシャー州、英国）から購入された。最初に、全てのオリゴ糖が、Ｈ２Ｏに溶解されて１０ｍｇ・ｍｌ−１とされ、そして次に、注入前にさらに希釈された。
【００７９】
１．２．β−ガラクトシダーゼによるＶｉｖｉｎａｌＧＯＳ（商標）のラクトース加水分解
ＶｉｖｉｎａｌＧＯＳからのラクトースの除去は、グルコース及びガラクトース及び三糖〜七糖の間の分離を改善する為に実施された。該反応において、ラクトースは加水分解されてグルコースとガラクトースとを形成する。これらの単糖は、陽イオン交換において高い親和性により保持される。この目的の為に、ＶｉｖｉｎａｌＧＯＳ（商標）は、陽イオン交換精製の前に、β−ガラクトシダーゼ調製物Ｍａｘｉｌａｃｔ（商標）Ｌ５０００により前処理された。最初に、３０％溶液ｗ・ｗ−１のＶｉｖｉｎａｌＧＯＳ（商標）が調製され、そして、１Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．５に調整された。４０℃への加熱後、０．９％のＭａｘｉｌａｃｔが該ＶｉｖｉｎａｌＧＯＳ（商標）に添加され、そして、４時間インキュベートされた。処理後、該溶液は４．５へとｐＨ調整され、そして、該ラクターゼを不活性化するために１０分間１００℃で加熱された。沈殿した酵素は、１９，０００ＲＰＭで６０分間、遠心により除去された。得られたラクトースの無いＶｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳ溶液が、陽イオン交換実験において用いられた。
【００８０】
１．３．ＶｉｖｉｎａｌＧＯＳ（商標）の実験規模（preparative  scale）陽イオン交換クロマトグラフィー精製
本技術は、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら（Method for producing galactooligosaccharides, E.P. Office, Editor. 1987）から採用された。簡潔に言うと、Ｎａ型樹脂Ｕｎｉｂｅａｄ  ＵＢＫ−５３０が選択された（三菱化成工業株式会社、東京、日本）。２０００ｍｌのＵＢＫ−５３０樹脂が水和され、そして、微粒子（fines）が、製造者の指示に従い除去された。その後、該樹脂は、Ｎａ＋イオンとＫ＋イオンとを交換する為に、１Ｍ  ＫＣｌ溶液により１２時間、振とうしている水浴中で、２０℃で処理された。
【００８１】
該カラムは、内径０．０５ｍｍ及び長さ１ｍを有するホウケイ酸ガラスから構成された。このガラスカラムは、アクリルプラスチックサーモスタットジャケット（Pharmacia  XK-50/100  カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、バッキンガムシャー州、英国）により囲まれていた。追加のテフロン（登録商標）管が、該カラムの周囲にまかれて、熱交換体として作用した。該カラムは、Ｈａａｋｅ  Ｍｏｄｅｌ  ＦＥ循環水浴（Ｈａａｋｅ、英国）により加熱された。試料は、パルスフリーの３−ピストンポンプモジュール（Ｍｏｄｅｌ  Ｃ−６０１、ビュッヒ、スイス）を用いて該樹脂を通じてポンプ送りされた。該カラムから分離された炭水化物は、示差屈折計（Ｇｉｌｓｏｎ  ｍｏｄｅｌ  １３２  ＲＩ  検出器（Ａｎａｃｈｅｍ、ベッドフォードシャー州、英国））（夫々の実験の最初で溶出液によりパージされた）を用いて検出された。
【００８２】
試料装填に先立ち、溶出に用いられたイオン交換樹脂、カラム、ＶｉｖｉｎａｌＧＯＳ（商標）及び水を含む全ての装置が、平衡を確保する為に、６０分間にわたり５５℃に加熱された。合計で、２０００ｍｌのＵＢＫ−５３０樹脂のうち１８００ｍｌが、該カラムに装填された。最初に、脱塩水が、１ｍｌ・分−１でポンプ送りされて、該樹脂への圧力ショックを回避する為に、徐々に１５ｍｌ・分−１最終流量へと増した。全ての溶出物は、使用の前にヘリウムを用いて脱ガスされた。Ｍａｘｉｌａｃｔ  Ｌ５０００による前処理に続き、１５０ｍｌの３０％ｗ・ｗ−１ラクトース不含のＶｉｖｉｎａｌＧＯＳ（商標）溶液が、１５ｍｌ・分−１でカラムに注入された。これより高い濃度は、分離パターンにおいて乱れを生じた。このカラムの空隙容量は、６７５ｍｌであり、又は、該炭水化物が溶出し始めるまでに４５分であった。分離された炭水化物を含む溶出液は、さらに炭水化物がＲＩ検出器（Ｍｏｄｅｌ  ２１２８  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ、Ｂｉｏ−ｒａｄ、ハートフォードシャー州、英国）により検出されなくなるまで、画分に分毎に集められた。
【００８３】
１．４．実験規模陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたＶｉｖｉｎａｌＧＯＳ純度の高性能陰イオン交換クロマトグラフィー測定
イオン交換クロマトグラフィーの間に集められた画分が、ガラクトオリゴ糖についてＳｌｅｇｔｅらにより開発されたプロトコル（"Determination of trans-Galactooligosaccharides in Selected Food Products by Ion Exchange Chromatography: Collaborative Study". Journal of AOAC International, 2002. 85 Part 2: p. 417-423）に従い、パルスドアンペロメトリック検出を伴う高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）（Ｄｉｏｎｅｘ  ｃｏｒｐ．，カリフォルニア州、米国）を用いて分析された。簡潔に言うと、スルホン化エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン粒子の２５０×４ｍｍ内径ガードカラムを有する、薄皮のＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１陰イオン交換樹脂カラムが用いられた。移動相は、５００ｍＭ酢酸ナトリウムを有する、（Ａ）１２．５ｍＭ  ＮａＯＨ、（Ｂ）１２５ｍＭ  ＮａＯＨ、及び（Ｃ）１２５ｍＭ  ＮａＯＨの勾配であった。分析の為の溶出勾配は、ｄｅ  Ｓｌｅｇｔｅらにより以前に報告されたとおりに実施された。２０μＬの夫々の試料が、室温で、１ｍｌ・分−１の流量で、注入され及び分析された。
【００８４】
１．５．親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）
ＺＩＣ（商標）−ＨＩＬＩＣ、ＰＥＥＫ  Ｃｏｌｕｍｎ、１５０×２．１ｍｍ  ５μｍが、該カラムからの固定相「出血」が特に低いと示されたので、選択された（ＳｅＱｕａｎｔ  ＡＢ、ウーメオ、スウェーデン）。両性イオンＺＩＣ（商標）−ＨＩＬＩＣ固定相が、多孔性シリカに付けられた。該分離は、弱い静電相互作用に重ねられた親水性分画機構により達成される。他の分析パラメーターは：１μＬ注入体積、２１４ｎｍのＵＶ検出、及び３１分実行時間であった。ＧＯＳ画分の一つが、２０、３０、４０、５０及び６０℃で分析された。全てさらなるクロマトグラフィーの実行は６０℃でのものであった。ＡＣＮ：Ｈ２ＯよりもＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏのより高い濃度において、ＧＯＳ画分を溶解することが可能なので、アセトニトリルでなくむしろメタノールが用いられた。。１００％Ｈ２Ｏ中に炭水化物を注入することは、該溶媒が固定相へと分画することを許容せず、結果的に、該試料は、分離無しの栓（plug）として溶出された。移動相は、Ｈ２Ｏ中の９５％ＭｅＯＨ−５ｍＭ  ＮＨ４ＡＣから構成された。勾配実験は、該時間を変えた。この中で勾配ポンプをプログラムすることにより５０：５０  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ濃度。５％の低い水含有量は、適当な水和を維持する為及び固定相と移動相の間の静電相互作用を改善する為に用いられた。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００ＨＰＬＣシステムは、接続された（online）脱気剤を有するＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズキャピラリーポンプ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ストックポート、英国）、ＵＶ検出器、自動サンプラー、及びＤｉｏｎｅｘ  ＣＳ  １４  陽イオン交換ガード（４ｍｍ×５０ｍｍ）から構成された。流量は１００から２００μｌ・分−１へと変化し、及び、２１４ｎｍが、該ＵＶ検出器により監視された。
【００８５】
１．６．糖を分析する為のエレクトロスプレーイオン化質量分析
特定の操作パラメーターを含むイオン化及び検出の説明が、修正された製造者説明書に従い記載される（Bruker Daltonics microTOF instrument、Bruker Daltonics、ブレーメン、ドイツ）。
【００８６】
２．結果
【００８７】
２．１．陽イオン交換分画されたＧＯＳ
陽イオン交換方法は、Ｍａｔｕｓｍｏｔｏら（１２）から、Ｒｏｙａｌ  Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ  ＦｏｏｄｓのＪ．ｄｅ  Ｓｌｅｇｔｅとの個人的な情報交換を受けて修正された。以前に、対イオンＮａ＋、Ｋ＋及びＣａ２＋が、どれがラクトース、ガラクトース及びグルコースからのＧＯＳの最もきれいな分離を与えるかを決定する為に、試験された。ＵＢＫ−５３０樹脂のカリウム型は、ＶｉｖｉｎａｌＧＯＳ（商標）に関して最もよい結果を与え、そしてそれ故に、さらなる実験の為に選ばれた（未発表のデータ）。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤは、それぞれの１分の分画について、、オリゴ糖組成を決定する為に用いられた。最初の画分は、高濃度のＧＯＳを含んだ。ＩＥＸカラムから集められた夫々の逐次の画分にともなう、高分子量ガラクトオリゴ糖からグルコース及びガラクトースへの、組成における変化があった。ＵＢＫ−５３０樹脂は、圧縮に対する優れた抵抗性を示し、糖は有機溶媒無しでも溶出され、そして、該カラムは注入の間で平衡化を要求せず、それ故に、準連続的な精製が達成された。
【００８８】
２．２．ＧＯＳ画分番号１〜１５の間の分析及び比較
６０℃±０．５℃に加熱されたカラムを用いて、２００μｌ・分−１の流量及び、水中の９５％ＭｅＯＨ−５ｍＭ  ＮＨ４ＡＣから水中の５０％ＭｅＯＨ−５ｍＭ  ＮＨ４ＡＣへの２５分における勾配は、部分的に、ＧＯＳ画分１〜１５の組成を解明した。ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ  ｖ３．２ソフトウェアにおけるソフトウェア積分特徴を用いて、ＤＰ３、続いてＤＰ４、ＤＰ５、ＤＰ６及びＤＰ７として同定された糖の群の夫々の下の面積を積分することが可能である。
【００８９】
夫々の糖の抽出されたイオン交換クロマトグラムを積分することにより、夫々の画分中の二糖、三糖、四糖、五糖、六糖及び七糖についての存在量値を計算することが可能であった。しかしながら、オリゴ糖はその源における同じ効率でイオン化しないことが示されており（Harvey, D.J., Rapid communications in mass spectrometry: RCM, 1993. 7(7): p.614）、従って、相対的存在量の形においてデータを表現することが、質量分析において一般的な方法である（Lamari, et al., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2003. 793(1): p. 15-36）。個々の糖が同じ効率でイオン化しないならば又はそれどころか六糖（ＤＰ６）が不十分にイオン化するならば、百分率における相対的イオン化存在量は、画分間の比較をするときに、この効果を減少する。例えば、もし画分Ｘ中の全ての炭水化物富化物の合計存在量が加えられ且つ百分率が夫々のＤＰについて計算されるならば、個々のＤＰ（例えば全ＤＰ３）存在量は、形成された全イオンに対してプロットされる。図１は、画分番号に対する三糖、四糖、五糖、六糖及び七糖の相対的存在量のグラフのプロットである。画分番号とＤＰ６存在量との間の線形回帰は、０．９５８の相関係数を与え、これら２つの変数の間に強い関係があることを示す。２つの変数が関連しないとき、１０回超の反復により０．９より大きい、計算されたｒ値を得る可能性は、＜０．００１である。ＤＰ５存在量は、０．７２０の係数を有する画分番号にも逆相関する。
【実施例２】
【００９０】
実施例２：コレラ毒素のその受容体への結合に対する、ガラクトオリゴ糖による抑制
【００９１】
この実施例において、ＧＭ１へコレラ毒素が結合することを抑制する為に実施例１において得られたガラクトオリゴ糖画分の能力が、競合的ＥＬＩＳＡを用いて測定された。ＧＯＳからのどの構造が、ＣｔｘのＧＭ１天然受容体への結合を抑制することにおいて最も有効であるかを明らかにする為に、生物活性又はＥＣ５０値が、実施例１のＨＩＬＩＣ−ＥＳＩ−ＭＳ実験からの構造的情報と関連付けられる。天然受容体ＧＭ１は、コレラ毒素についての最高の有効性を有すると示されているので、それがモデル糖として用いられた。
【００９２】
１．  材料と方法
【００９３】
１．１  化学物質
分析グレードＤ−（＋）−グルコース一水和物、β−ラクトース、ウシ脳から単離されたモノシアロガングリオシド−ＧＭ１、ＴＷＥＥＮ（商標）２０、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び硫酸（Ｈ２ＳＯ４）は全て、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（ジリンガム、ドーセット州、英国）から購入された。ホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が、Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ（ベージングストーク、ハンプシャー州、英国）から、タブレット形態で購入され、そして、カルシウム及びマグネシウムが除かれた以外は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ及びＶｏｇｔの元の配合（１９５４）に一致させられた。夫々のタブレットは、製造者の指示に従い蒸留水中に希釈された。ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合されたＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ毒素Ｂサブユニット（Ｌｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カリフォルニア州、米国、により製造された）は、Ｑｕａｄｒａｔｅｃｈ  Ｌｔｄ、サリー州、英国、により輸入され、及び同社から購入された。ガラクトオリゴ糖は、Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ  Ｆｏｏｄｓ  Ｄｏｍｏ（ズウォレ、オランダ）からの贈り物であり、そして、使用の前に陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製され及び分画された。全ての溶液は、超高純度ＭｉｌｌｉＱ水を用いて調製された。
【００９４】
１．２  抑制性ＧＭ１と関連付けられたＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート（Ｆ９６  Ｍａｘｉｓｏｒｐ；  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ラフバラ、英国）が、１６０ｍＭのＮａＣｌ及び９ｍＭのリン酸カリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．２）（ＰＢＳ）中に１ウェル当たり１００μｌの５００ｎｇ・ｍｌ−１の溶解されたガングリオシドＧＭ１と伴に、室温で、一晩、インキュベートされた。付着していないガングリオシドは、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにより３回該ウェルを洗浄することにより除去された。該プレート表面上のさらなる結合部位は、２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳ溶液の２００μｌにより、室温で一晩、該ウェルをインキュベートすることによりブロックされ、次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳにより３回洗浄された。
【００９５】
試験溶液は、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中に調製された；夫々、Ｃｔｘ−Ｂ５ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合物の５、１０及び１５ｎｇ／ｍｌからなり、室温で２時間、潜在的インヒビターと伴に予備インキュベートされた。夫々の試験溶液の２００μＬの添加後、プレートは、室温で２時間、インキュベートされた。結合していない毒素は、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳにより３回洗浄する事により、除去された。以下の工程が次に、ＧＭ１に結合した毒素を明らかにした：（１）室温で１５分間の新鮮に作成された（ＴＭＢ）溶液（５００μｌのＤＭＳＯ中の１ｍｇのＴＭＢ、５０ｍｌの０．１Ｍクエン酸カリウムバッファー及び５μｌの３０％過酸化水素）の１００μｌとのインキュベーション。ＴＭＢは、ベンジジンについての非発がん性代用物であり、ペルオキシダーゼ基質として用いられた。該基質は、色味において薄い青である可溶性の最終産物を生成し、そして、２ＭのＨ２ＳＯ４による停止後に４５０ｎｍで分光光度測定装置（Ｇｅｎｉｏｓ、Ｔｅｃａｎ  ＵＫ  Ｌｔｄ、サッチャム、英国）により読まれた。
【００９６】
全ての実験は、４回実施され、０、０．９７、１．９５、３．９０、７．８１、１５．６２、３１．２５及び６２．５ｎｇ・ｍｌ−１の毒素ペルオキシダーゼ複合物の標準曲線に対して検証された。３０ｎｇ・ｍｌ−１Ｃｔｘ−ＨＲＰのストック溶液が調製され、そして、全てのプレートを通じて対照として、アッセイ内の変動係数又は吸光度ドリフト及びアッセイ安定性を測定する為に、用いられた。未知の吸光度の読み取り及び続くＥＣ５０値は、該標準曲線から計算され、そして、Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ，カリフォルニア州、米国））により比較された。分散分析が、Ｍｉｎｉｔａｂ（商標）ｖｅｒｓｉｏｎ１４（Ｍｉｎｔａｂ  Ｌｔｄ、コベントリ、英国）を用いて計算された。
【００９７】
吸光度読み取りのそれぞれのセットの統計的な平均は、抑制されず且つ結果的に固定化ＧＭ１表面に結合することができたコレラの濃度を計算する為に用いられた。より高い吸光度読み取りは、抑制されていないコレラのより大きい濃度を示し、及び／又は、乏しいインヒビター性能を示した。エラーバーは、反復実験の異なる日での、実際の抑制されていないＣｔｘ−ＨＲＰの平均の標準誤差を反映する。
【００９８】
２．結果
【００９９】
２．１  Ｃｔｘ−ＨＲＰのＧＭ１−ＥＬＩＳＡへの結合のＧＯＳ画分による抑制
図２は、Ｃｔｘ−ＨＲＰの夫々異なる濃度での、結合したＣｔｘ−ＨＲＰの濃度とＧＯＳ画分番号２の容量との間の交互作用プロットを示す。ＧＯＳ画分番号２が例として選ばれたが、同様の抑制水準が典型的に、画分１〜９について、測色応答において目に見える減少を伴い、少なくとも１２．５ｍｇ・ｍｌ−１の糖を伴うＣｔｘ−ＨＲＰの全ての３つの濃度で観察された。低濃度のＧＯＳでのより大きなエラーバーは、反復の間の部分的な抑制及び／又は低濃度での弱い親和性により引き起こされる。さらに、結合したＣｔｘ−ＨＲＰの濃度及び用量ＧＯＳ画分２及び用量Ｃｔｘ−ＨＲＰの間の２要因分散分析は、ＧＯＳ用量が該抑制に影響することを裏付ける（Ｐ＜０．００１）。加えて、記述統計Ｒ２（η２又はイータ二乗）は、“用量Ｃｔｘ−ＨＲＰ”及び“用量ＧＯＳ”の平均の間の差異に起因する、全体分散（overall  variation）の部分を表す。９８．４３％のＲ２は、変動の大部分が、群を定義し（すなわち増加する濃度）及びさらに結合Ｃｔｘ−ＨＲＰとＧＯＳ画分２濃度との間の関係を強める処理に起因することを意味する。大きなＦ値は、“用量ＧＯＳ”及び“結合したＣｔｘ−ＨＲＰ”の平均値の間の変動（variation）が、偶然に観察されるものだろうより大きいことを意味し、さらに“用量ＧＯＳ”が結合Ｃｔｘ−ＨＲＰに影響するという概念を支持する。
【０１００】
いずれのインヒビターも無い、全てのＧＯＳ画分２の実験における結合Ｃｔｘ−ＨＲＰの平均濃度は、４．２５、８．３１及び２１．９０ｎｇ・ｍｌ−１であり、計算されたときの５、１０、２０ｎｇ・ｍｌ−１ではなかった。しかしながら、これらの変動は、アッセイ内及びアッセイ間の係数の限度内である（示されていない）。さらに、画分間で、ゼロインヒビター値におけるわずかな差異もあり、それ故に、画分間で比較をする為に、ＥＣ５０値が計算されそして曲線間で比較された。Ｐｒｉｓｍ（商標）ｖ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ、カリフォルニア州、米国）が、Ｃｔｘ−ＨＲＰ濃度をｎｇ・ｍｌ−１から百分率抑制に変換する為に、及び、インヒビター値をｌｏｇスケール上に正規化するために用いられた。Ｐｒｉｓｍ（商標）は、シグモイド用量応答曲線又は３−パラメーターロジスティックを適合させた（図３）。この方法で正規化することは、ｙ軸を、定義により、垂直に０から１００％へ延ばす；それ故に、最小値及び最大値の正確度が必須であった。Ｐｒｉｓｍは、夫々の濃度のＣｔｘ−ＨＲＰでの用量応答曲線も比較し、ＥＣ５０値が統計的に差異がないことを発見した（Ｐ＝０．９４１１、Ｆ，０．０６１）。これは、図３において示されるとおりＣｔｘ−ＨＲＰの量に関係なく、ＧＯＳ画分２が、同等の有効性でＣｔｘ−ＨＲＰを有効に抑制したことを示す。もしＣｔｘ−ＨＲＰの濃度が、２０ｎｇ・ｍｌ−１を超えて増加されたならば、この状況は変化するようである。反対に、このアッセイは、ペルオキシダーゼ基質標準曲線の直線性及び最大半量結合が１５ｎｇ・ｍｌ−１又は０．１５３ｎＭであると見積もられるとの観察により制約される[３４]。ＥＣ５０は、０．９２５３のＲ２を有する密接に適合されたシグモイド曲線により、３０．７７ｍｇ・ｍｌ−１として計算された。
【０１０１】
画分１〜１０の間で、ＥＣ５０値は最小限に変化した、特には、３０．７７ｍｇ・ｍｌ−１のＧＯＳ画分２と４２．１０ｍｇ・ｍｌ−１のＧＯＳ画分８のＥＣ５０値を比較されたい。Ｃｔｘ−ＨＲＰ  ＥＣ５０値は、画分９〜１５について得られなかった。なぜなら、いずれの完全抑制も観察されず、又、シグモイド用量応答曲線が不十分に適合したからである。それ故に、画分間の有効性を比較する為に、１００ｍｇ・ｍｌ−１ＧＯＳ画分による最大の抑制が選択された。興味深いことに、ＧＯＳ画分番号１１〜１５は、より大きな標準誤差バーを伴うプロットを作ったが、これはＣｔｘ−ＨＲＰへの非特異的結合又はより弱い親和性により引き起こされているようである。この観察にもかかわらず、１０ｎｇ・ｍｌ−１（０．１０２ｎＭ）Ｃｔｘ−ＨＲＰ抑制及び夫々のＧＯＳ画分の間の１要因ＡＮＯＶＡ分析は、Ｐ＜０．０００１で、画分間に統計的な差異があることを明らかにする（図４Ａ）。画分１〜８は夫々、９１．８４％及び８９．０５％Ｃｔｘ−ＨＲＰの間で抑制する。この百分率抑制と、１００ｍｇ・ｍｌ−１ＧＯＳ画分２と一緒にインキュベートされたときの、結合Ｃｔｘ−ＨＲＰの実際の濃度とを比較すると、該値は低く（０．６２１ｎｇ・ｍｌ−１）、９５％信頼限界０．３７４〜０．８６８ｎｇ・ｍｌ−１を伴う。さらに、１００ｍｇ・ｍｌ−１で、ＩＥＸ画分２が、Ｃｔｘ−ＨＲＰの９５．６７％〜８９．９５％の間で抑制するであろうことの９５％確実性、９５％の機会（95%  of  the  time）、がある。
【０１０２】
図４Ｂは同様に、２０ｎｇ・ｍｌ−１（０．２０４ｎＭ）Ｃｔｘ−ＨＲＰ抑制と１００ｍｇ・ｍｌ−１での夫々のＧＯＳ画分とを比較する。該抑制値はやはり、０ｍｇ・ｍｌ−１インヒビターによる結合Ｃｔｘ−ＨＲＰに対して表された。ＧＯＳ画分１〜７は、９２％抑制の最小値を与えるが、画分１０〜１５は、反復間でより高い標準偏差を伴い、６６％未満、Ｃｔｘ−ＨＲＰを抑制する。前記のとおり、２０ｎｇ・ｍｌ−１Ｃｔｘ−ＨＲＰ抑制と夫々のＧＯＳ画分との間の１要因ＡＮＯＶＡ分析は、Ｐ＜０．０００１で画分間で統計的な差異があることを明らかにする。Ｃｔｘ−ＨＲＰの種々の濃度の間の抑制における最大の差異は、ＧＯＳ画分の間で観察された影響との比較において小さい。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、夫々の画分のＧＯＳ種プロファイルの間の差異が明らかにされた。ＨＩＬＩＣ−ＥＳＩ−ＭＳは夫々の画分における重合度の間の差異を直接に測定し、そして、ＤＰ６及びＤＰ５の濃度は、逐次の画分番号とともに減少するが、ＤＰ３及びＤＰ４の濃度は増加することを示した。数学的モデル及び統計的技術を用いて、質量における変化及び生物学的有効性における変化の間の相関が調査された。
【０１０３】
２．２  ＧＯＳ画分及びＧＯＳ組成によるＣｔｘ−ＨＲＰの抑制の間の比較
図１は、実施例１に記載されたとおりの陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離された夫々の画分の間のＧＯＳプロファイルにおける変化を示す。ＤＰ６の存在量は、Ｃｔｘ抗付着活性と密接に相関するとみられたので、結合したＣｔｘ−ＨＲＰの平均が、夫々の画分においてＧＯＳ  ＤＰ６（六糖）の相対的存在量に対してプロットされた（図５）。該相関は指数関数的減衰関係に従った；さらに、ｌｏｇスケール（片対数プロット）において該ＤＰ６濃度を表すことはシグモイド的散布図を結果する。Ｐｒｉｓｍソフトウェアは次に、該データを、抑制Ｃｔｘ−ＨＲＰの点において正規化する為に及びシグモイド用量応答曲線を適合させてＣｔｘ−ＨＲＰの夫々の濃度についてのＥＣ５０値を計算する為に用いられた。前述のとおり、ＥＣ５０は、特異的な結合の半分について競合するインヒビターの濃度をいい、ＩＣ５０値と同じである。夫々の曲線ＥＣ５０値についての９５％信頼区間は重なり合い、そしてさらに、ｌｏｇＥＣ５０値の間に統計的な差異はない。該ＥＣ５０値は、５．１％の大域的な計算された数字（global  calculated  figure）を伴い、４．４０、５．１１及び６．２５％ＤＰ６相対的存在量であると計算された。この類似はさらに、ＧＯＳの有効性が、用いられたＣｔｘ−ＨＲＰ濃度にわたり類似であることを裏付けた。重要なことに、夫々のＧＯＳ画分の生物学的活性が、１００ｍｇ・ｍｌ−１の濃度で測定され、そしてそれ故に、夫々の画分間の主要な差異は、相対的な糖の存在量及びすなわち組成である。
【０１０４】
３．結論
ＧＯＳ画分１〜８は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてコレラ毒素に対して、高水準の抑制を一貫して示す。ＨＩＬＩＣ−ＥＳＩ−ＭＳからの夫々のＧＯＳ画分のＧＯＳ種プロファイルは、ＥＬＩＳＡにおける結合Ｃｔｘの濃度に対して相関し、そして、０．９２５の大域的（global）Ｒ２値で、最も適当な抑制リガンドとしてのＤＰ６構造物を明らかにした。本明細書上記において実施例１は、ＤＰ６存在量が、夫々の画分とともに段階的な様式で、ＧＯＳ画分１の２３％からＧＯＳ画分１０の９％及びＧＯＳ画分１６の０％へと減少することを示す。また、ＤＰ５存在量は抑制活性と相関すると見える。ＤＰ３及びＤＰ４の同時の増加が観察され、主にＤＰ６〜ＤＰ４を含有する画分からＤＰ４〜ＤＰ３を含有する画分へのシフトを示唆する。高い全体ＧＯＳ画分濃度が、十分にＣｔｘ−ＨＲＰを抑制するのに十分高いＤＰ６濃度を維持する為に重要であり得る。これは、なぜ分画されていないＧＯＳが如何なる場合もＣｔｘを抑制しないのかを説明しうる（ＧＯＳ画分０；図４Ａ及びＢ）。それ故に、分画それ自身が、特定のＧＯＳ種、すなわち市販のＧＯＳ配合物中に別なふうに薄められているＧＯＳ五糖及び六糖を濃厚にすることにより、有効性を増加した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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