(57)【要約】  本発明は、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）由来のアルドラーゼ遺伝子のプロモーター及びその用途に係り、さらに詳しくは、配列番号１の塩基配列で表わされるラクトバチルス・カゼイ由来のアルドラーゼ遺伝子のプロモーター、前記プロモーターを含有する発現ベクター及び前記発現ベクターで形質転換された微生物に関する。本発明によるプロモーターを含有する発現ベクターで形質転換された微生物は、目的タンパク質を菌体表面に効果的に発現可能であることから、ワクチン伝達体などとして有用である。
2010521984.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・カゼイ由来のアルドラーゼ遺伝子のプロモーター。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする請求項１に記載のプロモーター。
【請求項３】
請求項１に記載のプロモーター及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターで形質転換された微生物。
【請求項５】
請求項１に記載のプロモーター、ポリガンマーグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子が連結されている微生物表面発現ベクター。
【請求項６】
前記目的タンパク質は抗原であることを特徴とする請求項５に記載の微生物表面発現ベクター。
【請求項７】
前記ポリガンマーグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子はｐｇｓAであることを特徴とする請求項５に記載の微生物表面発現ベクター。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物表面発現ベクターで形質転換された微生物。
【請求項９】
前記微生物は乳酸菌であることを特徴とする請求項８に記載の微生物。
【請求項１０】
請求項８に記載の形質転換された微生物を培養することを特徴とする目的タンパク質を微生物表面に発現させる方法。
【請求項１１】
次の段階を含む微生物ワクチンの製造方法：
（ａ）請求項６に記載の微生物表面発現ベクターで形質転換された微生物を培養して、微生物の表面に抗原を表現発見する段階；及び
（ｂ）前記抗原が表面に発現した微生物を回収する段階。
【請求項１２】
前記微生物は乳酸菌であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）由来のアルドラーゼ遺伝子のプロモーター及びその用途に係り、さらに詳しくは、配列番号１の塩基配列で表わされるラクトバチルス・カゼイ由来のアルドラーゼ遺伝子のプロモーター、前記プロモーターを含有する発現ベクター及び前記発現ベクターで形質転換された微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品微生物のうち最も重要な微生物群である乳酸菌は、多種多様な食品に利用されるにつれて安全性が立証された（ＧＲＡＳ：generally recognized as safe）微生物であり、プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾンなどを有していることから遺伝子導入のためのベクターの開発が可能であり、また、当業界において汎用される方法による形質転換が容易であり、食用選択マーカー遺伝子も確保されていることから食用に使用する上で最適な菌株であると言える。また、乳酸菌は腸内有害菌抑制作用及び整腸作用、血中コレステロール減少機能、栄養学的価値増進、病原体感染抑制作用、肝硬変改善作用、抗癌作用、老化抑制作用、大食細胞活性化を通じた免疫増強作用などの効能を有している。
【０００３】
乳酸菌において有用な外来タンパク質を産生するためには、高効率のプロモーター（van der Vossen et al., Appl. Environ. Microbial., 53:2452, 1987; Koivula et al., Appl. Environ. Microbial., 57:333, 1991; Pascalle et al., Appl. Environ. Microbial., 62:3662, 1996）を確保する必要があるが、これまでの乳酸菌ゲノムに関する研究は満足のいくレベルまで進んでいないのが現状である。これまで、乳酸菌のゲノムは、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum NCC 2705）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis V583）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum WFCS1）に対してしかゲノム塩基配列が解読できていないのが現状であり、現在、様々な種の乳酸菌のゲノム解読研究がなされており、また、これまで乳酸菌から分離されたプロモーターとしては、ストレブトコッカス・サーモフィラスＡ０５４、ラクトコッカス・ラクチスＭＧ１６１４、ラクトコッカス・クレモリスＷｇ２のゲノム由来の常時発現プロモーター（Slos et al., Appl. Environ. Microbial., 57:1333,1991; Koivula et al., Appl. Environ. Microbial., 57:333, 1991; van der Vossen et al., Appl. Environ. Microbial., 53:2452, 1987）だけが知られている。
【０００４】
近年、米国及びヨーロッパにおいて乳酸菌を用いた生ワクチンの開発、有用なホルモン剤の腸内運搬体に関する研究及びこのための効率的な遺伝資源の確保と乳酸菌用導入ベクターの開発に関する研究が進んでいる。特に、乳酸菌に含有されている多量の構成成分である非メチル化したＣｐＧＤＮＡ、リポタイコ酸、ペプチドグリカンなどが免疫アジュバントとしての役割を果たすことが知られているため、乳酸菌のワクチン伝達体としての有用性が高く評価されている。また、乳酸菌は胆汁酸及び胃酸に抵抗性を示して腸までの抗原伝達が可能であるため、腸内粘膜免疫を誘導することができるという点で多くの長所を有している（Seegers, Trends Biotechnol., 20:508, 2002）。
【０００５】
しかしながら、乳酸菌をワクチン伝達体として使用するためには、疾病予防用抗体生成のための抗原タンパク質を菌体の内部または外部に提示して抗原抗体反応が円滑になされるようにする技術の開発が必要であり、実際にＨＰＶ（Human papilloma virus）のＬ１タンパク質が内部発現される乳酸菌を用いた抗体誘導能確認（Aires et al., Appl. Environ. Microbiol., 72:745, 2006）及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）の乳酸菌分泌発現菌株を用いた疾病治療効能確認（Steidler et al., Nat. Biotechnol., 21:785, 2003）などに加えて、乳酸菌がワクチン伝達体として適していることを究明した種々の研究結果が発表されている。
【０００６】
上述したように、目的タンパク質を発現する乳酸菌に対する様々な用途開発と学問的研究が盛んになされているが、これまでは発現される目的タンパク質の発現量が不十分であるという問題点と、誘導性発現プロモーターを用いたときに体内投与時の持続的な発現が不可能になる恐れがあるという問題点がある。
【０００７】
一方、本発明者らは、バチルス（Bacillus subtilis var. Chungkookjang）属菌株由来のポリガンマーグルタミン酸の合成複合体遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）を新たな表面発現母体として活用して、外来タンパク質を微生物の表面に効果的に発現させる新規なベクターと前記ベクターで形質転換された微生物の表面に目的タンパク質を発現させる方法を開発している（大韓民国特許登録第０４６９８００号公報）。
【０００８】
そこで、本発明者らは、前記特許文献に記載の表面発現母体を用いて抗原または抗原決定基を乳酸菌において安定的に高発現させることのできるベクターが開発される限り、抗原は乳酸菌の表面に露出されるため、人体に親和性があり、且つ、効率的に免疫反応を誘導可能なワクチンの製造が可能であろうと判断し、目的タンパク質を乳酸菌において高発現させることのできるプロモーターを選別する過程を行った結果、従来、使用していたプロモーターに比べて、アルドラーゼ遺伝子のプロモーターを用いる場合、遺伝子発現が２．５倍以上向上することを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【０００９】
《技術的課題》
本発明の主たる目的は、目的遺伝子の発現上昇を誘導するラクトバチルス・カゼイ由来のプロモーターを提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記プロモーター及び目的タンパク質をコードする遺伝子が連結されていることを特徴とする発現ベクターを提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記発現ベクターで形質転換された微生物及び前記形質転換された微生物を用いて目的タンパク質を製造する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、前記形質転換された微生物を用いて微生物ワクチンを製造する方法を提供することにある。
【００１３】
《技術的解決方法》
前記目的を達成するために、本発明は、目的遺伝子の発現上昇を誘導するラクトバチルス・カゼイ由来のアルドラーゼ遺伝子のプロモーターを提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記プロモーターの末端に目的遺伝子が連結されていることを特徴とする発現ベクター及び前記発現ベクターで形質転換された微生物を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、前記プロモーター、ポリガンマーグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子が連結されている微生物表面発現ベクター及び前記表面発現ベクターで形質転換された微生物を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、前記形質転換された微生物を培養することを特徴とする目的タンパク質を微生物表面に発現させる方法を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、前記微生物表面発現ベクターで形質転換された微生物を培養することを特徴とする微生物ワクチンの製造方法を提供する。
【００１８】
本発明の他の特徴及び具現例は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から一層明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ラクトバチルス・カゼイのゲノムからアルドラーゼ遺伝子のプロモーターを得る方法を示すものである。
【図２】アルドラーゼ遺伝子のプロモーターを用いて構築されたアミラーゼの乳酸菌表面発現用ベクターのマップである。
【図３】アミラーゼ酵素活性度（ｕｎｉｔ／ｍｌ／ＯＤ６００）の測定を通じて乳酸菌成長期間中のプロモーターによる発現度合いを比較して示すものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、一観点において、ラクトバチルス・カゼイ由来のアルドラーゼ遺伝子のプロモーターに関するものである。
【００２１】
本発明においては、アルドラーゼ遺伝子のプロモーターを得るために、ＰＣＲ方法によりラクトバチルス・カゼイ由来のアルドラーゼ遺伝子のプロモーターを増幅し、遺伝子クローニング技術を用いてラクトバチルス・カゼイ由来の４００ｂｐのプロモーター（配列番号１）を分離している。本発明のアルドラーゼ遺伝子のプロモーターは、ラクトバチルス・カゼイに存在するアルドラーゼ遺伝子の発現を誘導するプロモーターである。一般的に、プロモーターは、ＲＮＡ重合酵素が結合して転写開始を誘導する部分を含み、プロモーターの塩基配列によってＲＮＡの合成度合いが決定されるため、プロモーターによって遺伝子の発現強度が異なることがある。
【００２２】
本発明のプロモーターによる発現誘導能力を測定するために、前記プロモーターを含む発現ベクターと既存のｌｄｈまたはｓｌｐＡプロモーターを含む発現ベクターにそれぞれα−アミラーゼ遺伝子を挿入し、前記製作されたベクターを用いてラクトバチルス・カゼイを形質転換させた後、各プロモーターにより発現誘導されてコーディングされたアミラーゼの酵素活性を測定した結果、本発明によるアルドラーゼ遺伝子のプロモーターを含む形質転換体においてアミラーゼ酵素活性が最も高いことが示され、この結果から、本発明によるプロモーターによる発現誘導の強度が既存の両プロモーターに比べて強いということを確認した。
【００２３】
本発明は、他の観点において、前記アルドラーゼ遺伝子のプロモーターと目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクター及び前記発現ベクターで形質転換された微生物に関するものである。
【００２４】
発現ベクターは、通常、転写を可能にするプロモーター、プロモーターの下流に目的タンパク質を発現する遺伝子、微生物内において自己複製して増幅可能な遺伝子及び目的とするベクターを選別するための抗生物質の選択マーカー遺伝子が最小限に必要であり、目的遺伝子を除く前記遺伝子はベクターのバックボーン及び選択された宿主によって異なりうる。ベクターの製作に際して、前記最小限に必要な遺伝子は当業者にとって周知であり、遺伝子発現条件及び目的によって容易に選択することができる。通常、前記ベクターのバックボーンとしては、ｐＷＶ０１、ｐＡＭβ１の複製起点を持ったものなどを使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
目的遺伝子だけではなく、調節部位をさらに含む遺伝子発現を目的とするベクターまたはＤＮＡ配列を適した宿主細胞に挿入するために様々な方法及び手段を使用することができる。例えば、形質転換(transformation)、トランスフェクション、接合（conjugation）、原形質体融合法及びカルシウムフォスフェイト沈殿法などの生化学的方法や、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）デキストラン、またはエレクトロポレーションなどの物理的な方法を使用することができる。
【００２６】
発現ベクターを適切な宿主細胞に導入した後、当業界に周知の技術を用いて形質転換体だけを選別することができる。すなわち、抗生物質を含む宿主の生長に適した選択培地を用いて目的遺伝子を発現可能なベクターを含有する形質転換体を選別することができる。
【００２７】
前記「目的タンパク質」または「外来タンパク質」とは、前記タンパク質を発現する形質転換された宿主細胞には通常存在しないタンパク質を意味する。例えば、乳酸菌においてウィルス由来または腫瘍由来のタンパク質を人為的に発現するように操作した場合、前記タンパク質を外来タンパク質または目的タンパク質と称する。
【００２８】
本発明は、さらに他の観点において、前記アルドラーゼ遺伝子のプロモーター、ポリガンマーグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子が連結されている微生物表面発現ベクター及び前記表面発現ベクターで形質転換された微生物に関するものである。
【００２９】
前記プロモーターの下流には表面発現母体であるポリガンマーグルタミン酸合成酵素複合体の遺伝子が含まれるが、前記表面発現母体はベクターのＤＮＡ配列上においてプロモーターと目的遺伝子との間に位置する。前記表面発現母体の遺伝子はアミノ酸にコーディングされた後には目的タンパク質の前半部に連結されて発現されたタンパク質が細胞膜の脂質と結合するように誘導する作用をするため、目的タンパク質が表面発現されるのに決定的な役割を果たす。前記表面発現母体の遺伝子をプロモーター及び目的遺伝子と連結する方法としては、ＰＣＲ、制限酵素切断及びライゲーション法など当業者により容易に実施可能な通常の技術を使用することができる。
【００３０】
本発明のプロモーターによって発現されて宿主の表面に展示される目的タンパク質は、酵素、抗体、抗原、吸着タンパク質または付着タンパク質であってもよく、より好ましくは、抗原であってもよい。
【００３１】
前記目的タンパク質または抗原は、好ましくは、感染性微生物、免疫疾患由来の抗原または腫瘍由来の抗原、例えば、真菌性病原体、バクテリア、寄生虫、腸内寄生虫、ウィルスまたはアレルギー誘発物質などを含むことができるが、これらに限定されるものではない。さらに詳しくは、前記抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウィルスのヘマグルチニンまたは核タンパク質、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶのｇｐ１２０またはその断片、ＨＩＶのｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、ジャガイモ粉状そうか病菌（Spongospora subterranea）抗原、ビブリオ症抗原、サルモネラ菌抗原、肺炎球菌（Pneumococcus）抗原、ＲＳＶ(Respiratory syncytial virus)抗原、ヘモフィルス・インフルエンザ(Hemophilus influenza)外膜タンパク質、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)抗原、ヘリコバクター・ピロリ菌(Helicobacter pylori)のウレアーゼ、ナイセリア・メニンジャイティディス(Neisseria meningitidis)のピリン、ナイセリア・ゴノレア(N. gonorrhoeae)のピリン、メラノーマ関連タンパク質(melanoma associated antigens: ＴＲＰ２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＨＳＰ−７０、β‐ＨＣＧ）、ＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−−３５、または−４５から由来のＥ１、Ｅ２、Ｅ６及びＥ７を含むヒトパピローマウイルス(Human papilloma virus)の抗原、ＣＥＡ腫瘍抗原、正常または変異したｒａｓタンパク質、正常または変異したｐ５３、Ｍｕｃ１、ｐＳＡなどを含み、また、コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス(Haemophilus)、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、脳炎、耳下腺炎、百日咳、水痘、肺炎(pneumococcal pneumonia)、小児麻痺、狂犬病、風疹、破傷風、結核、アディソン病(Addison's disease)、免疫反応誘発物質、アレルギー誘発物質、固形腫瘍及び血液腫瘍を含む癌、後天性免疫欠乏症、腎臓、心臓、膵臓、肺、骨、肝などの移植拒否時に関与する因子などから由来する当業界に周知の抗原及び自己免疫を誘発する抗原などを含むことができる。
【００３２】
この明細書において、「宿主」または「微生物」とは、プロバイオティックのグラム陽性菌である乳酸菌を意味し、一般的なプロバイオティック微生物の選別基準には、（ｉ）ヒト由来の微生物であること、（ii）胆汁、酸、酵素及び酸素に安定的であること、（iii）腸内粘膜に付着する能力があること、（iv）消化器官内においてコロニーを形成可能な能力があること、（ｖ）抗バクテリア性物質を産生可能であること、及び（vi）効能や安定性が証明可能であることなどの条件が含まれている。前記条件を基に、乳酸菌は、人体内における生長が親和的であり、しかも、無害菌であることが明らかである。このため、乳酸菌を宿主とする形質転体を人体に適用して疾病の予防または治療のための遺伝子伝達またはタンパク質伝達などの用途に使用する場合、菌株を使用する通常のワクチン製造方法とは異なり、菌株の非毒性化または無毒性化の段階が求められない。
【００３３】
本発明において、前記微生物は、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属及びビフィドバクテリウム属を含むことができる。代表的に、ラクトバチルス属は、ラクトバチルス・アシドフィルス(L. acidophilus)、ラクトバチルス・カゼイ(L. casei)、ラクトバチルス・プランタラム(L. plantarum)、ラクトバチルス・ファーメンタム(L. ferementum)、ラクトバチルス・デルブリュッキィ(L. delbrueckii)、ラクトバチルス・ジョンソニ(L. johnsonii LJI)、ラクトバチルス・ロイテリ(L. reuteri)及びラクトバチルス・ブルガリクス(L. bulgaricus)などを宿主として使用することができ、ストレプトコッカス属は、ストレプトコッカス・サーモフィラス(S. thermophilus)などを宿主として使用することができ、ビフィドバクテリウム属は、ビフィドバクテリウム・インファンティス(B. infantis)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(B. bifidum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(B. longum)、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム(B. psuedolongum)、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(B. breve)、ビフィドバクテリウム・ラクティスBb-12(B. lactis Bb-12)及びビフィドバクテリウム・アドレッセンティス(B. adolescentis)などを宿主として使用することができ、より好ましくは、ラクトバチルス属である。
【００３４】
本発明においては、前記プロモーターと表面発現母体であるｐｇｓＡが連結された塩基配列を含み、目的遺伝子としてα−アミラーゼ遺伝子を発現可能な発現ベクター（ｐＤＴ１−ＰｇｓＡＬ−アミラーゼ）を製作し、前記発現ベクターをラクトバチルス・カゼイに導入してアミラーゼを発現する形質転換体を製造した。
【００３５】
本発明の向上された遺伝子発現能力を有するプロモーターにより発現される目的タンパク質は菌体の表面に発現され、このため、本発明の形質転換された微生物はワクチンとして使用することができる。
【００３６】
本発明は、さらに他の観点において、前記表面発現ベクターで形質転換された乳酸菌を利用することを特徴とする微生物ワクチンの製造方法に関するものである。
【００３７】
ワクチンは、疾病に対する予防を目的に生有機物を用いて免疫システムを刺激するのに使われる薬剤である。免疫活性化とは、有機体内において抗体生成、Ｔ−リンパ球の刺激、または他の免疫細胞（例えば、大食細胞）を刺激して抗原を効率よく除去するための過程を意味する。上記に関する詳しい免疫学の概観は当業界において通常の技術を持った者にとって容易に理解できるであろう（Barrett, J.T., Textbook of Immunology, 1983）。
【００３８】
抗原を発現する形質転換された微生物ワクチンの投与対象は哺乳動物であってもよく、より好ましくは、ヒトであってもよい。
【００３９】
前記ワクチン組成物の製造は、標準的な技術を用いて行うことができ、投与者に適した投与量は遺伝子生成物の抗原性によって変わり、存在するワクチンの典型的な免疫反応を誘導するのに十分な量であればよく、日常的な実験過程を経て必要量を容易に判断することができる。典型的な初期のワクチン容量は体重１ｋｇ当たりに抗原０．００１〜１ｍｇであり、好ましいレベルの保護を提供するために、必要に応じて、増量したり、複数の投与量を使用する。上記の量は、当該技術分野に属する専門家により決定可能であり、製剤化方法、投与方式、投与者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性などの要因によっても種々に処方可能である。
【００４０】
ワクチンが抗体を効果的に生成するためには、抗原性物質がワクチン処理された対象の抗体−生成メカニズムが実現できるように体内に放出される必要がある。このため、免疫反応のためには遺伝子産物の微生物運搬体が体内に優先的に導入されなければならない。本発明の形質転換体において提示される抗原による好適な反応を刺激するためには、静脈注射、筋肉注射、皮下注射などの投与方法が採用可能であるが、経口投与、胃挿入によりまたは噴霧剤の形態で腸または肺に直接的に投与することが好ましい。
【００４１】
ワクチン組成物を投与者に経口投与するためには、凍結乾燥形態、例えば、カプセル形態で提供されることが有用である。前記カプセルは、Eudragate Ｓ、Eudragate Ｌ、セルローズアセテート、セルローズフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルローズを含む腸溶被覆により提供される。前記カプセル類は、それ自体として使用したり、投与する前に懸濁液のように凍結乾燥物質を再構成して使用することもできる。再構成は、形質転換された微生物の生存に適したｐＨの緩衝液において行うことが効果的である。胃酸から前記形質転換された微生物及びワクチンを保護するために毎回ワクチン投与前に重炭酸ナトリウム製剤を投与することが有用でありうる。選択的に、ワクチンは、非経口投与、鼻内投与または乳腺内投与用に製造可能である。
【００４２】
本発明のプロモーターを含み、抗原として作用可能な目的タンパク質を発現する遺伝子を含有している形質転換された乳酸菌は、消化器官内粘膜においてコロニーを形成しながら目的とする効能を発現することができる。目的とする形質転換性質を維持し、円滑なコロニー形成のためにベクター内選択抗生物質を同時に投与することができ、上記の手段によって形質転換体が分裂する過程において発生することのある目的としないベクターを持たない乳酸菌の発生を制御することができる。上記の選別方法は、当業界における通常の技術により容易に行うことができ、前記過程において使用可能な選択抗生物質は、発現ベクター内に含まれている抗生物質遺伝子によって異なる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を持った者にとって自明である。
【００４４】
特に、下記の実施例においては、目的遺伝子としてアミラーゼ遺伝子だけを例示しているが、これに制限されるものではないということは当業者にとって自明であると言える。
【００４５】
《実施例１：ラクトバチルス・カゼイ由来のアルドラーゼ遺伝子のプロモーターの確保》
ラクトバチルス・カゼイＡＴＣＣ３９３からアルドラーゼ遺伝子のプロモーター部位に相当する４００ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲ方法を通じて得た。
【００４６】
ラクトバチルス・カゼイを基本培地であるＭＲＳ培地（１％のカゼインハイドロライセイト、１．５％の酵母抽出物、２％のデクストロース、０．２％のアンモニウムクエン酸、０．５％のソジウムアセテート、０．０１％のマグネシウムサルフェイト、０．０５％のマンガンサルフェイト及び０．２％のジポタシウムフォスフェイト、Acumedia Manufacturers, Inc.）において培養し、培養されたラクトバチルス１０９個の菌体を破砕して得られた溶液をＰＣＲの鋳型として使用した。遺伝子クローニング時にベクター内挿入が容易になるようにＨｉｎｄＩＩＩとＮａｅＩの切断部位がプライマー（配列番号２及び配列番号３）の各末端に位置するように製作し、上記のプライマーを用いてＰＣＲを行った結果、総長４１５ｂｐ（配列番号１）の増幅産物を得、ＰＣＲ増幅産物はｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター(Promega Co., USA)にクローニングして塩基配列を分析した（図１）。
【００４７】
配列番号２：5’-aag ctt aat acc cac tta ttg-3’
配列番号３：5’-gcc ggc cat gta gat atc ctc-3’
【００４８】
《実施例２：アルドラーゼ遺伝子のプロモーターを用いたアミラーゼ表面発現ベクターの構築》
アルドラーゼ遺伝子のプロモーターにより発現誘導されるアミラーゼの発現ベクターを製造するために、大腸菌及びラクトバチルス・カゼイにおいて複製可能なＲｅｐＡを複製起点として有するベクターにラクトバチルス・カゼイ由来のアルドラーゼ遺伝子のプロモーターを挿入した後、前記プロモーターの下流にバチルス（Bacillus subtilis var. Chungkookjang）由来の表面発現母体であるｐｇｓＡを導入し、ｐｇｓＡのカルボキシ末端に目的遺伝子を挿入可能なＢａｍＨＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトを追加してアルドラーゼ遺伝子のプロモーターを含むｐＤＴ１−ＰｇｓＡベクターを製作した。前記ｐｇｓＡ遺伝子は、大韓民国特許登録第０４６９８００号公報に開示されたものを使用した。なお、前記ベクターを維持するための選別マーカーとしてエリスロマイシン抵抗性遺伝子を選択した（図２）。
【００４９】
α−アミラーゼ遺伝子を得るためにストレプトコッカス・ボビス（ＡＴＣＣ７００４１０）由来のゲノムを鋳型として使用し、配列番号４及び配列番号５のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００５０】
配列番号４：5’-tct gga tcc gat gaa caa gtg tca atg-3’
配列番号５：5’-cag tta tct aga tta ttt tag ccc atc-3’
【００５１】
その結果、細胞外α−アミラーゼの分泌シグナルである３９個のＮ−末端アミノ酸部位を除く残りの７０３個のアミノ酸を暗号化する配列を有し、両末端にＢａｍＨＩとＸｂａＩ制限酵素部位をそれぞれ含む２、１３０ｂｐサイズのＤＮＡ遺伝子断片を得た。
【００５２】
α−アミラーゼ遺伝子含有ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＸｂａＩにより切断してｐＪＴ１−ＰｇｓＡベクターのＰｇｓＡＣ末端に連結することにより、乳酸菌宿主に形質転換した場合、ＰｇｓＡ−α−アミラーゼ接合タンパク質を菌体外部に表面発現可能な発現ベクターｐＤＴ１−ＰｇｓＡ−アミラーゼを完成した（図２）。
【００５３】
《実施例３：α−アミラーゼ表面発現ベクターによる形質転換体の製造》
α−アミラーゼ表面発現ベクターｐＤＴ１−ＰｇｓＡ−アミラーゼによりラクトバチルス・カゼイを形質転換した後、形質転換体内にα−アミラーゼ遺伝子を含むベクターが存在するかどうかを確認するために、下記のＰＣＲ方法を行った。形質転換菌体を回収して水で洗浄した後、これを鋳型として用いてプラスミドに含まれているエリスロマイシン抵抗性遺伝子の内部部位にアニールされるプライマー（配列番号６及び配列番号７）を用いてＰＣＲを行うことにより、目的とするベクターが存在する場合に得られる１、１５６ｂｐサイズのＰＣＲ産物により確認した。
【００５４】
配列番号６：5'-gtg tgt tga tag tgc agt atc-3'
配列番号７：5'-ccg tag gcg cta ggg acc tct tta gc-3'
【００５５】
また、形質転換体内に導入されたベクターにおける遺伝子の正常的な発現の有無は、α−アミラーゼの実施例４に記述されている酵素活性測定法により確認した。
【００５６】
《実施例４：アミラーゼ活性測定を通じたプロモーター強度の比較》
新規なアルドラーゼ遺伝子のプロモーターの発現誘導の強度を既存のｌｄｈプロモーター及びｓｌｐＡプロモーターと比較した。各プロモーターにはレポーター遺伝子としてアミラーゼ遺伝子を連結してアミラーゼ発現量に比例する酵素活性度測定を通じて各プロモーターの発現誘導の度合いを比較した。
【００５７】
プロモーター強度を比較するための既存のベクターは、それぞれ、ｌｄｈプロモーターによりアミラーゼが発現されるｐＪＴ１−ＰｇｓＡＬ−アミラーゼ（大韓民国登録特許第０５７８３９５号公報）と、ｓｌｐＡプロモーターによりアミラーゼが発現されるｐＢＴ−ＰｇｓＡＬ−アミラーゼ（大韓民国特許出願第１０−２００６−００８８９９５号公報）であり、上記の両ベクターはｐＤＴ１−ＰｇｓＡＬ−アミラーゼと同じ構造を有するが、プロモーター部位だけが異なるという特徴を有していた。
【００５８】
乳酸菌の菌体表面に発現されたアミラーゼの酵素活性は、活性測定用キット（Kikkoman Co., Tokyo, Japan）とＮ３−Ｇ５−β−ＣＮＰ（２−クロロ−４−ニトロフェニル６５−アジド−６５−デオキシ−β−マルトペンタオシド）を基質として用いて測定した。
【００５９】
培養液を遠心分離して回収した菌体をＰＢＳ溶液により２回洗浄した後、１００μＬの同じ緩衝溶液に懸濁し、４００μＬの基質溶液に混合して３７℃において１０分間酵素反応を誘導し、８００μＬの反応停止溶液を添加して反応を終了し、分光光度計を用いて４００ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素１ユニットは３７℃において１分間反応させてＮ３−Ｇ５−β−ＣＮＰが４００ｎｍにおいて吸光度を示すＣＮＰ（２−クロロ−４−ニトロフェノール）１μｍｏｌｅが生成されるのに必要とされる酵素の量として定義した。
【００６０】
各ベクターで形質転換されたラクトバチルス・カゼイを培養するためには、エリスロマイシン（SIGMA-ALDRICH Co.）を最終濃度１６μｇ／ｍｌを含むＭＲＳ培地を使用し、３Ｌ発酵器に２．０Ｌの培地を入れて本培養を実施した。本培養開始後に５時間が経過した時点から４時間おきに培養液を回収して、生菌数、アミラーゼ活性測定を行った。培養過程中のｐＨ補正にはＮａＯＨを使用した。
【００６１】
その結果、アルドラーゼ遺伝子のプロモーターを用いた場合、ｌｄｈプロモーターに比べて２．０〜２．５倍、ｓｌｐＡプロモーターに比べて１５０〜１８０倍高いアミラーゼ活性を示すことを確認することができ、これより、アルドラーゼ遺伝子のプロモーターの強度がｌｄｈ及びｓｌｐＡに比べて強力であることが分かる（図３）。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上、詳述したように、本発明は、目的タンパク質を乳酸菌において高発現可能なラクトバチルス・カゼイ由来のアルドラーゼプロモーター及び前記プロモーターを用いた発現用ベクターを提供する効果がある。前記ベクターは、目的タンパク質を表面発現させる遺伝子を含有しているため、前記ベクターを用いた形質転換体においては目的タンパク質を効果的に菌体表面に発現させることができて乳酸菌をワクチン伝達体として活用することができる。
【００６３】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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