(57)【要約】本発明は、ガン治療、特にはガン患者の任意の療法に対する応答を予測するための方法に関する。本発明は、患者を分類するための予測マーカーとして有用な遺伝子又は遺伝子産物を提供する。診断ツール、テストキット及び組成物並びに本発明の方法におけるその使用も開示する。本発明は、NAD(P)H：キノン酸化還元酵素1 (NQO1)の使用に基づいたものであり、ある治療、特には、エピルビシンを用いたアントラサイクリン系アジュバント化学療法から除外したほうがよい患者の同定及び分類を可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の遺伝的背景に基づいてガン治療を選択するための方法であり、
突然変異若しくは非機能性NAD(P)H：キノン酸化還元酵素1 (NQO1)遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在を、化学療法を開始する前に健康な細胞又は腫瘍細胞を含む患者から採取したサンプルから判別し、前記NQO1遺伝子は、ヌクレオチド配列に変化を有している工程と、
正常又は機能性NQO1遺伝子を有し、あるガン治療により治療する群と、突然変異又は非機能性NQO1遺伝子を有し、前記ガン治療から除外したほうがよい別の群との少なくとも2つの群に患者を分類する工程を含む方法。
【請求項２】
ホモ接合、ヘミ接合又はその他の遺伝子若しくはゲノム変化による、患者から採取したサンプルにおける正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在が、患者を前記ガン治療から除外したほうがよいことを示す、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
NQO1遺伝子が、非機能性NQO1遺伝子に至る1つ以上のヌクレオチドの変化を有する、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
NQO1遺伝子が、C．609C＞Tアレル又はNQO1＊2多型を含む、NCBI配列ID：J03934．1又はSEQ ID NO：4に記載のrefSNP ID：rs1800566におけるポリヌクレオチド配列の609位でのシトシンからチミンへの置換に対応し、コードされた遺伝子産物における187位でのプロリンからセリンへのアミノ酸変化(P187S)に至る、ヌクレオチド配列における変化を有する、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
ホモ接合、ヘミ接合又はその他の遺伝子若しくはゲノム変化により、腫瘍細胞中のNQO1遺伝子が非機能性である又は正常な遺伝子若しくは遺伝子産物が不在である、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
ヌクレオチド配列における変化が、NCB1配列ID：J03934．1若しくはSEQ ID NO：4に記載のrefSNP ID：rs1800566のポリヌクレオチド配列の609位又は前記ポリヌクレオチド配列における、同様の機能的影響に至る1つ以上のヌクレオチドのその他の変化と連鎖不均衡の状態にある、請求項3から5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
2つのc．609C＞Tアレルが患者に存在し、患者がc．609C＞Tアレルのホモ接合保因者であること及び患者をガン治療から除外したほうがよいことを示す、請求項4に記載の方法。
【請求項８】
1つのc．609C＞Tアレルが腫瘍中に存在し、もう一方のアレルが欠損している又は不活性であり、腫瘍細胞がc．609C＞Tアレルについてヘミ接合であること及び患者をガン治療から除外したほうがよいことを示す、請求項4に記載の方法。
【請求項９】
ヌクレオチド位置c．609におけるヌクレオチドを同定し、
c．609位に2つのTアレルが存在するなら突然変異又は非機能性NQO1遺伝子を有する群に、c．609位に存在するアレルの1つがCであるなら、正常又は機能性NQO1遺伝子を有する群に患者を分類することを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項１０】
ガン治療が化学療法を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
化学療法が、トポイソメラーゼII阻害剤を含む化学療法剤を用いて行われる、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
トポイソメラーゼII阻害剤が、アムサクリン、ミトキサントロン、ピロキサントロン、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、エピポドフィロトキシン誘導体又はこれらの誘導体を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
アントラサイクリンが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、エピルビシン又はこれらの誘導体を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ガン治療が、エピルビシンを用いたアントラサイクリン系アジュバント化学療法を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
ガン治療が早期治癒的治療を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
ガン治療が転移性ガンの治療を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
患者がガン又は悪性腫瘍を患っている、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
前記ガン又は悪性腫瘍が、乳癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、すい臓癌、胃癌、結腸直腸癌、大腸癌、非ホジキンリンパ腫、頭頸部癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、軟部組織肉腫又は小児腫瘍を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
患者が転移性ガン又は悪性腫瘍を患っている、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
ガン又は悪性腫瘍が乳癌である、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
前記ガン治療から除外したほうがよい患者の群に属する患者が、c．609C＞Tアレル若しくはNQO1遺伝子のNQO1＊2多型若しくは同様の機能的影響に至る、前記ポリヌクレオチド配列における1つ以上のヌクレオチドのその他の変化についてホモ接合である乳癌患者又はc．609C＞Tアレル若しくはNQO1＊2多型若しくは同様の機能的影響に至る、前記ポリヌクレオチド配列における1つ以上のヌクレオチドのその他の変化についてヘミ接合の腫瘍細胞を有する患者であり、前記ガン治療がアントラサイクリン系アジュバント化学療法である、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
前記ガン治療から除外したほうがよい患者の群に属する患者が、c．609C＞Tアレル又はNQO1＊2多型又はNQO1遺伝子の同様の機能的影響に至る1つ以上のヌクレオチドのその他の変化についてヘテロ接合である乳癌患者であり、ガンがp53免疫陽性腫瘍を含み、前記ガン治療はアントラサイクリン系アジュバント化学療法である、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
前記ガン治療が、エピルビシンを用いたアントラサイクリン系アジュバント化学療法である、請求項1に記載の方法。
【請求項２４】
突然変異若しくは非機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在を、患者由来であり、患者が受け継いだ遺伝子型又は腫瘍の遺伝子型を表すDNA、RNA、タンパク質又はこれらのフラグメントを含むサンプルから判別する、請求項1に記載の方法。
【請求項２５】
前記の判別が、遺伝子型同定方法、表現型同定方法又はDNA、RNA若しくはアミノ酸に基づいたいずれの方法も含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子型同定方法が、単一ヌクレオチド多型(SNP)を検出する又は遺伝子型同定する技法を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子型同定方法が、NQO1遺伝子におけるc．609C＞Tアレル又はNQO1＊2多型の同定を含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
表現型同定方法が、NQO1遺伝子における多型又はその他の遺伝子若しくはゲノム変化によるNQO1遺伝子産物の欠損の検出を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２９】
表現型同定方法が、ホモ接合、ヘミ接合又はその他の遺伝子若しくはゲノム変化によるNQO1遺伝子産物におけるP187S突然変異又はNQO1遺伝子産物の不在を同定することを含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
ガン又は悪性腫瘍を患っている患者を治療するための方法であり、
患者から採取したサンプルから、突然変異若しくは非機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在を判別し、
遺伝子型同定の結果に基づいて前記患者にとって適当な療法を決定することを含み、正常又は機能性NQO1遺伝子が不在の場合、患者はあるガン治療から除外される方法。
【請求項３１】
患者の遺伝的背景に基づいてガン治療を選択するための、臨床試験計画を最適化するための方法であり、
患者から採取したサンプルから、突然変異若しくは非機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在を判別し、
少なくとも2つの群に患者を分類することを含み、正常又は機能性NQO1遺伝子を有する群はあるガン治療で治療し、突然変異又は非機能性NQO1遺伝子を有する別の群は前記ガン治療から除外したほうがよい方法。
【請求項３２】
患者の遺伝的背景に基づいて転移性ガンを治療するための、ガン治療を選択するための方法であり、
健康な細胞又は腫瘍細胞を含む患者から採取したサンプルから、突然変異若しくは非機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在を判別し、前記NQO1遺伝子は、ヌクレオチド配列に変化を有する工程と、
正常又は機能性NQO1遺伝子を有し、あるガン治療により治療する群と、突然変異又は非機能性NQO1遺伝子を有し、前記ガン治療から除外したほうがよい別の群との少なくとも2つの群に患者を分類する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガン治療、特にはガン治療を選択し、任意の治療に対する患者の応答を予測するための方法に関する。本発明は、患者を分類するための予測マーカーとして有用な遺伝子又は遺伝子産物を提供する。本発明は、NAD(P)H：キノン酸化還元酵素(NQO1)多型の検出に基づいたものであり、ある治療、特には、エピルビシンを用いたアントラサイクリン系アジュバント化学療法から除外したほうがよい患者の同定及び分類を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
ガンは、疾患又は障害の1つであり、細胞の分裂は制御されず、細胞は、隣接する組織へと湿潤によって直接的に増殖する又は転移により離れた部位へと移植性転移するかのいずれかによって拡散することができる。ガンは、外科的手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、モノクローナル抗体治療、これらの治療の組み合わせ又はその他の方法により治療可能である。治療は、腫瘍の位置及び悪性度、病期並びに患者の全身状態に応じて選択する。一般に、これらの慣用の方法を用いてガン患者を効果的に治療することができるが、例外もあり、現在の治療法の一部には効果がないことが知られている又は患者の生活の質を損ねる重篤な副作用を誘発しさえすることもある。
【０００３】
現在、化学療法への応答を予測する、臨床利用できる腫瘍因子はない。例えば、乳癌の腫瘍マーカーからは、患者に特定の治療が適しているか否かについての情報が具体的にはわからない。現在、治療は、可能な限り早く行われることを目的としており、治癒だけが目的ではない。個々のガン治療の予後を改善するために、任意の治療レジメンが有効な患者と有効でない患者の集合を同定できる新しいバイオマーカーが強く求められている。 
【０００４】
乳癌は、世界でも女性に最も一般的なガンのタイプであり、第2位の死因である。患者の予後は、腫瘍のステージ、悪性度、HER2 (ERBB2)及びホルモン受容体の状態に左右され、これらの要素を用いて腫瘍を分類し、各患者に個別の治療レジメンを選択する(Goldhirsch et al．，2001)。これらの要素の中でも、ホルモン受容体の状態とHER2表現だけが、内分泌療法及びトラスツズマブを用いたモノクローナル抗体免疫療法による治療への応答の改善をそれぞれ予測できる。化学療法への応答を予測できる腫瘍因子が強く求められている。つい最近、HER2の増幅が、アントラサイクリン系化学療法への臨床的応答性に関連することが示唆された(Pritchard et al．，2006)。
【０００５】
NAD(P)H：キノン酸化還元酵素(NQO1、NAD(P)Hメナジオン酸化還元酵素、DT−ジアホラーゼ)は、スーパーオキシドの捕捉(Siegel et al．，2004)、脂溶性抗酸化物質の維持、毒性のキノンから毒性が低く排泄可能なハイドロキノンへの還元(Beyer et al．，1996; Siegel et al．， 1997; Winski et al．，2001)、重要な腫瘍抑制因子タンパク質であるp53の安定化(Anwar et al．，2003; Asher et al．，2001; Asher et al．，2002a; Asher et al．，2002b)を含む、酸化ストレス及び発ガンに対する細胞の保護に関係したフェーズII解毒酵素である。NQO1欠乏マウスは、p53誘導及びアポト−シスの低下並びに化学的に誘発させた腫瘍への高い罹患率を示す(Iskander et al．，2005; Long et al．，2000)。更に、このようなマウスの免疫反応 (Iskander et al．，2006)及びNF−κB機能(Ahn et al．，2006)は損なわれている。p53経路は、発ガンに対する既知の細胞防御メカニズムで最も重要であり、ヒトのガンの殆どが、p53遺伝子の突然変異を伴い、この突然変異が機能不全又は欠損タンパク質を生み出す(Kastan 2007)。
【０００６】
NQO1遺伝子の正常型は、多型NQO1＊1と表される。NQO1＊2多型は、NQO1＊1とは、以下の点で異なっている。NQO1＊2アレルは、タンパク質の187位でのプロリンからセリンへの変化(Pro187Ser)をコ−ドしているcDNA (NCBI配列ID：J03934．1、refSNP ID：rs1800566)の609位(C609T)でのシトシンからチミンへの置換を表している。多型では人口の4〜20％がホモ接合であり、民族によって異なる(Kelsey et al．，1997; Nioi et al．，2004)。C．609C＞Tアレルのホモ接合保因者は、測定可能なNQO1活性を有していない。腫瘍への罹患率とNQO1遺伝子における多型又はその遺伝子産物との相関関係については記載があるが、特定のガン又は腫瘍治療法への応答を予測するための方法については、現在まで示されていない。NQO1＊3多型は、正常型NQO1遺伝子とは、ヌクレオチド残基465がシトシンからチミンに変化している(c．465＞T)点で異なり、その結果、アミノ酸残基139がアルギニンからトリプトファンに変わる(R139W)。NQO1＊3多型は、極めて稀である。
【０００７】
NQO1＊2ホモ接合の個体は、ベンゼンによる血液毒性への感受性が高く、その結果、急性非リンパ性白血病に罹患しやすく(Garte et al，2005; Rothman et al．，1997)、ガン、特に白血病に罹患するリスクが高い(Krajinovic et al．，2002a; Larson et al．，1999; Naoe et al．，2000; Smith et al．，2001; Wiemels et al．，1999)。NQO1＊2変異体も、小児急性リンパ性白血病の治療を受けている小児における再発又は死亡のリスクの高さに関連している(Krajinovic et al．， 2002b)。NQO1＊2多型が、急性骨髄性白血病の患者における寛解導入療法への応答に関係していることが示唆されている(Barragan et al．2007)。更に、最近のメタアナリシスのデ−タは、NQO1遺伝子型が、民族性及び喫煙状況に応じて、肺癌、膀胱癌及び結腸直腸癌の罹患率に影響することを示唆している(Chao et al．，2006)。幾つかの研究は、NQO1の状態と乳癌のリスクとの関連性にも取り組んでいるが(Fowke et al．， 2004; Menzel et al．，2004; Sarmanova et al．，2004)、決定的な結論に達するには不十分な段階である。乳癌における全生存率に対する有意な影響は、いまだに確認されていない(Goode et al．，2002)。Goldbergら(1998)及びFlemingら(2002)は、NQO1遺伝子のマイトマイシンC (MMC)応答に対する役割について研究している。Rossら(2000)は、NQO1の酵素としての役割について精査し、NQO1遺伝子の制御及び機能を定義している。Shiら(1999)は、NQO1＊2多型の分析方法について述べている。
【０００８】
WO2005／119260は、特定の遺伝子産物(例えば、NQO1)の発現レベルを化学療法の開始前と開始後に測定することにより、乳癌患者の化学療法への応答をモニタする方法を開示している。発現レベルの変化を用いて、化学療法の効果を見積もる。腫瘍サンプルから得た遺伝子の発現レベルを測定することにより、特定の組織における特定の状態でのガン治療の進展がわかる。この方法は定量的であり、発現レベルにおける変化を測定するには幾つかのサンプルを必要とする。US20010034023は、薬剤の処理に関連した遺伝子における違い、例えばNQO1の違いを、ある疾患に罹患した患者に行う薬剤治療を選択する際に利用する方法を開示している。WO2005／098037、WO2004058153、WO2006035273及びUS2003158251は、NQO1遺伝子のマーカーとしての使用について記載している。WO02052044は、薬物代謝に関連した遺伝子の変異の同定方法を開示している。WO2005／024067は、乳癌のリスクを層別化するための遺伝子解析を開示している。
【０００９】
現在では、第1選択として一般に施される療法が、その療法を受けたかなりの数の患者に有効でないことが認められている。有効で治癒効果のある治療を施すのが遅れると、患者に不要な痛みや不快感を与え、死に至ることさえある。また、社会にとっても費用効率がよくない。費用が高いのに効果のない治療がおそらくは有効でなく、代替の治療レジメンが必要な患者を早い段階で同定及び分類するための方法が、より費用効率が高い治癒的治療を提供するために早急に必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第2005／119260号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第20010034023号明細書
【特許文献３】国際公開第2005／098037号パンフレット
【特許文献４】国際公開第2004058153号パンフレット
【特許文献５】国際公開第2006035273号パンフレット
【特許文献６】米国特許出願公開第2003158251号明細書
【特許文献７】国際公開第02052044号パンフレット
【特許文献８】国際公開第2005／024067号パンフレット
【非特許文献１】Goldhirsch， A．， Glick， J．H．， Gelber， R．D．， Coates， A．S． & Senn， H．J． Meeting highlights： International Consensus Panel on the Treatment of Primary Breast Cancer． Seventh International Conference on Adjuvant Therapy of Primary Breast Cancer． J． Clin． Oncol． 19， 3817−3827 (2001)．
【非特許文献２】Pritchard， K．I．， et al． HER2 and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy． N． Engl． J． Med． 354， 2103−11 (2006)．
【非特許文献３】Siegel， D．， et al． NAD(P)H ：quinone oxidoreductase 1 ： role as a superoxide scavenger． MoI． Pharmacol． 65， 1238−1247 (2004)．
【非特許文献４】Beyer， R．E．， et al． The role of DT−diaphorase in the maintenance of the reduced antioxidant form of coenzyme Q in membrane systems． Proc． Nat． Acad． Sci． USA 93， 2528−2532 (1996)．
【非特許文献５】Siegel， D．， Bolton， E． M．， Burr， J．A．， Liebler， D． C． & Ross， D． The reduction of alpha− tocopherolquinone by human NAD(P)H： quinone oxidoreductase： the role of alpha− tocopherolhydroquinone as a cellular antioxidant． MoI． Pharmacol． 52， 300−305 (1997)．
【非特許文献６】Winski， S．L．， et al． Relationship between NAD(P)H ：quinone oxidoreductase 1 (NQOl) levels in a series of stably trans fected cell lines and susceptibility to antitumor quinones． Biochem． Pharmacol． 61， 1509−1516 (2001)．
【非特許文献７】Anwar， A．， et al． Interaction of human NAD(P)H ：quinone oxidoreductase 1 (NQOl) with the tumor suppressor protein p53 in cells and cell−free systems． J． Biol． Chem． 278， 10368−10373 (2003)．
【非特許文献８】Asher， G．， Lotem， J．， Cohen， B．， Sachs， L． & Shaul， Y． Regulation of p53 stability and p53−dependent apoptosis by NADH quinone oxidoreductase 1． Proc． Nat． Acad． Sci． USA 98， 1188−1193 (2001)．
【非特許文献９】Asher， G．， Lotem， J．， Kama， R．， Sachs， L． & Shaul， Y． NQOl stabilizes p53 through a distinct pathway． Proc． Nat． Acad． Sci． USA 99， 3099−3104 (2002a)．
【非特許文献１０】Asher， G．， Lotem， J．， Sachs， L．， Kahana， C． & Shaul， Y． Mdm−2 and ubiquitin− independent p53 proteasomal degradation regulated by NQOl． Proc． Nat． Acad． Sci． USA 99， 13125−13130 (2002b)．
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【非特許文献１２】Long， D．J．， 2nd， et al． NAD(P)H ：quinone oxidoreductase 1 deficiency increases susceptibility to benzo(a)pyrene−induced mouse skin carcinogenesis． Cancer Res． 60， 5913−5915 (2000)．
【非特許文献１３】Iskander， K．， Li， J．， Han， S．， Zheng， B． & Jaiswal， A．K． NQOl and NQO2 regulation of humoral immunity and autoimmunity． J． Biol． Chem． 281， 30917−30924 (2006)．
【非特許文献１４】Ahn， K．S．， Sethi， G．， Jain， A．K．， Jaiswal， A．K． & Aggarwal， B．B． Genetic deletion of NAD(P)H ：quinone oxidoreductase 1 abrogates activation of nuclear factor−kappaB， IkappaBalpha kinase， c−Jun N−terminal kinase， Akt， p38， and p44／42 mitogen− activated protein kinases and potentiates apoptosis． J． Biol． Chem． 281， 19798−19808 (2006)．
【非特許文献１５】Kastan， M B． Wild−Type p53： Tumors Can't Stand It． Cell; 128：837−40 (2007)．
【非特許文献１６】Kelsey， K．T．， et al． Ethnic variation in the prevalence of a common NAD(P)H quinone oxidoreductase polymorphism and its implications for anti−cancer chemotherapy． Br． J． Cancer 76， 852−854 (1997)．
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【非特許文献１９】Rothman， N．， et al． Benzene poisoning， a risk factor for hematological malignancy is associated with the NQOl 609C−−＞T mutation and rapid fractional excretion of chlorzoxazone． Cancer Res． 57， 2839−2842 (1997)．
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【非特許文献２１】Larson， R． A．， et al． Prevalence of the inactivating 609C−−＞T polymorphism in the NAD(P)H： quinone oxidoreductase (NQOl) gene in patients with primary and therapy−related myeloid leukemia． Blood 94， 803−807 (1999)．
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【非特許文献２７】Chao， C， Zhang， Z．F．， Berthiller， J．， Boffetta， P． & Hashibe， M． NAD (P)H ：quinone oxidoreductase 1 (NQOl) Prol87Ser polymorphism and the risk of lung， bladder， and colorectal cancers： a meta−analysis． Cancer Epidemiol． Biomarkers Prev． 15， 979−987 (2006)．
【非特許文献２８】Fowke， J．H．， et al． Oral contraceptive use and breast cancer risk： modification by NAD(P)H ：quinone oxoreductase (NQOl) genetic polymorphisms． Cancer Epidemiol． Biomarkers Prev． 13， 1308−1315 (2004)．
【非特許文献２９】Menzel， H． J．， et al． Association of NQOl polymorphism with spontaneous breast cancer in two independent populations． Br． J． Cancer 90， 1989−1994 (2004)．
【非特許文献３０】Sarmanova， J．， et al． Breast cancer： role of polymorphisms in biotransformation enzymes． Eur． J． Hum． Genet． 12， 848−854 (2004)．
【非特許文献３１】Goode， EX．， et al． Effect of germ−line genetic variation on breast cancer survival in a population−based study． Cancer res． 62， 3052−7 (2002)．
【非特許文献３２】Goldberg et al． Role of a DT−diaphorase mutation in the response of anal canal carcinoma to radiation， 5−fluorouracil， and mitomycin C． Int． J． Radiat． Oncol． Biol． Phys． 42： 331−334 (1998)
【非特許文献３３】Fleming et al． Clinical significance of a NAD(P)H： quinine oxidoreductase 1 polymorphism in patients with disseminated peritoneal cancer receiving intraperitoneal hyperthermic chemotherapy with mitomycin C． Pharmacogenetics 12： 31−37 (2002)．
【非特許文献３４】Ross et al． NAD(P)H ：quinone oxidoreductase 1 (NQOl)： chemoprotection， bioactivation， gene regulation and genetic polymorphisms． Chem． Biol． Interact． 129： 77−97 (2000)．
【非特許文献３５】Shi et al． High throughput genotyping for the detection of a single nucleotide polymorphism in NAD(P)H quinine oxidoreductase (DT diaphorase) using TaqMan probes． MoI． Pathol． 52： 295−299 (1999)．
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、任意の治療が最も有効な患者及び任意の治療から除外したほうがよい患者の同定が可能なバイオマーカーを用いることによる、改良された個別化された治療を目的としている。これらの予測マーカーは極めて有益であり、効果のない治療による副作用や費用を大幅に低減し、それに代わる、より有効な治療の迅速な提示を可能にする。
【００１２】
本発明は、突然変異若しくは非機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在に基づいて、患者を任意の治療レジメンから除外したほうがよいか否かを判断することが可能であるとの驚くべき発見に基づいたものである。特に、c．609C＞Tアレル又はNQO1＊2多型とも称され、コードされた遺伝子産物におけるプロリンからセリンへの変化 (P187S)に至る、ホモ接合の、ポリヌクレオチド配列（NCBI配列ID：J03934．1、Ref SNP IDS：rs1800566）における609位でのシトシンからチミンへの置換が、乳癌患者における、特にはエピルビシンを用いたアントラサイクリン系アジュバント化学療法(FEC)後の生存率不良に関連していることが示された。患者又は腫瘍が正常な又は機能性遺伝子産物を産生できなくなる、1つ以上のヌクレオチドの変更、欠失、挿入若しくは置換等のその他の変異又は後成的な変化も、あるガン治療から除外したほうが良い患者の同定に用いることができる。NQO1の多型とガンとの関連性は以前から知られていたが、本発明の発明者の結果は、任意の治療レジメンから除外したほうがよい患者群のスクリーニングにおける、NQO1多型の予後の予測における重要性を初めて実証した。本発明の方法は、化学療法、特にはアントラサイクリン系化学療法を開始する前に遺伝子型を同定することにより、患者にこの療法が有効か否かを判断することを可能にする。NQO1遺伝子に変異がある患者は、上記の療法では効果は得られず、容態が悪化することさえある。
【００１３】
本発明は、患者の遺伝的背景に基づいてガン治療を選択する方法に関し、その患者から採取したサンプルから突然変異若しくは非機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在を検出することにより、患者を少なくとも2つの群、つまりあるガン治療で治療する群と、そのガン治療から除外したほうがよい群とに分類することができる。後者の群の患者には、代替の治療を考えることができる。
【００１４】
本発明は、患者の遺伝的背景に基づいてガン治療を選択する方法に関し、この方法は、突然変異若しくは非機能性NAD(P)H：キノン酸化還元酵素1 (NQO1)遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在を、化学療法を開始する前に健康な細胞又は腫瘍細胞を含む患者から採取したサンプルから判別し、ここで前述のNQO1遺伝子は、ヌクレオチド配列に変化を有している工程と、正常又は機能性NQO1遺伝子を有し、あるガン治療により治療する群と、突然変異又は非機能性NQO1遺伝子を有し、前述のガン治療から除外したほうがよい別の群との少なくとも2つの群に患者を分類する工程を含む。
【００１５】
本発明は、ホモ接合、ヘミ接合又はその他の遺伝子若しくはゲノム変化による、患者から採取したサンプルにおける正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在が、その患者を前述のガン治療から除外したほうがよいことを示す方法に関する。代替の治療を考えることができる。
【００１６】
本発明は、NQO1遺伝子が、1つ以上のヌクレオチドの変化を有する結果、非機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物が生じる方法に関する。
【００１７】
本発明は、NQO1遺伝子が、C．609C＞Tアレル又はNQO1＊2多型を含む、NCBI配列ID：J03934．1又はSEQ ID NO：4に記載のrefSNP ID：rs1800566におけるポリヌクレオチド配列の609位でのシトシンからチミンへの置換に対応し、コードされた遺伝子産物における187位でのプロリンからセリンへのアミノ酸変化(P187S)に至る、ヌクレオチド配列における変化を有する方法に関する。
【００１８】
本発明は、ホモ接合、ヘミ接合又はその他の遺伝子若しくはゲノム変化により、腫瘍細胞中のNQO1遺伝子が非機能性である又は正常な遺伝子若しくは遺伝子産物が不在である方法に関する。
【００１９】
本発明は、ヌクレオチド配列における変化が、NCB1配列ID：J03934．1若しくはSEQ ID NO：4に記載のrefSNP ID：rs1800566のポリヌクレオチド配列の609位又は前述のポリヌクレオチド配列における、同様の機能的影響に至る1つ以上のヌクレオチドのその他の変化と連鎖不均衡の状態にある方法にも関する。
【００２０】
本発明は、2つのc．609C＞Tアレルが患者に存在し、患者がc．609C＞Tアレルのホモ接合保因者であること及び患者をガン治療から除外したほうがよいことを示す方法にも関する。
【００２１】
本発明は、1つのc．609C＞Tアレルが腫瘍中に存在し、もう一方のアレルが欠損している又は不活性であり、腫瘍細胞がc．609C＞Tアレルについてヘミ接合であること及び患者をガン治療から除外したほうがよいことを示す方法にも関する。
【００２２】
本発明は、ヌクレオチド位置c．609におけるヌクレオチドを同定し、c．609位に2つのTアレルが存在するなら突然変異又は非機能性NQO1遺伝子を有する群に、c．609位に存在するアレルの1つがCであるなら、正常又は機能性NQO1遺伝子を有する群に患者を分類することを含む方法にも関する。
【００２３】
前述の正常又は機能性遺伝子及びその遺伝子産物の存在又は不在は、遺伝子産物におけるP187S変化につながるNQO1遺伝子におけるc．609C＞Tアレル又はNQO1＊2多型のインビトロでの検出によって示されるような、DNA若しくはRNAを含むポリヌクレオチド又は問題となるタンパク質若しくはポリペプチドの検出に基づいた多数の検出方法を用いて判断することができる。ヒトゲノムについてより多くの情報が蓄積されつつあり、患者のゲノムのゲノムが既に解明され使用可能であることが予測できることから、特定のタイプのガンに罹患した患者の既知の遺伝子型に基づいて、治療を決定することができる。
【００２４】
正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の存在は、アントラサイクリン系アジュバント化学療法が患者にほぼ間違いなく有効であることを示す。2つのc．609C＞Tアレルの存在は(ホモ接合性)は、アントラサイクリン系アジュバント化学療法に応答を示さないこと又は治療が有害になりさえすることを示す。このことは、腫瘍のヘミ接合性にもあてはまり、ヘミ接合では、ヘテロ接合性の消失、後成的メカニズムによる不活性化又は体細胞突然変異によりアレルの1つが腫瘍中で失われる。腫瘍中にc．609C＞Tアレルが1つ存在し、もう一方のアレルが欠損している又は不活性であることは、腫瘍細胞がc．609C＞Tアレルについてヘミ接合であること及び患者を治療から除外したほうがよいことを示す。ヘテロ接合性は、機能性の低下を引き起こし得る。
【００２５】
コ−ドされた遺伝子産物のアミノ酸配列のアミノ酸の1つを変化させ、この変化によりNQO1機能が影響を受ける、NQO1遺伝子におけるヌクレオチド置換を1つ有する患者の群は、前述のガン治療から除外したほうがよく、前述のガン治療には化学療法が含まれる。
【００２６】
本発明は、化学療法が化学療法剤を用いて行われ、この薬剤がトポイソメラーゼII阻害剤を含む方法に関する。トポイソメラーゼII阻害剤は、アムサクリン、ミトキサントロン、ピロキサントロン、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、エピポドフィロトキシン誘導体及びこれらの誘導体を含む。アントラサイクリンは、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、エピルビシン及びこれらの誘導体を含む。本方法は、治療又はガン治療がアントラサイクリン系アジュバント化学療法、特にはエピルビシン又はその誘導体を用いたアントラサイクリン系アジュバント化学療法を含む場合に特に有用である。
【００２７】
本発明は、ガン治療が、早期治癒的治療(early curative therapy)を含み得る方法に関する。早期治癒的治療とは、治療が必要な患者に施される最初の療法である治療を意味している。本発明は、ガン治療が、転移性ガンの治療を含む方法に関する。
【００２８】
本方法は、原発性腫瘍又は転移性腫瘍のいずれかを含むガン又は悪性腫瘍を患っている患者の応答の予測に用いることができ、前述のガン又は悪性腫瘍は、乳癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、すい臓癌、胃癌、結腸直腸癌、大腸癌、非ホジキンリンパ腫、頭頸部癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、軟部組織肉腫又は小児腫瘍である。前述の悪性ガンは、アントラサイクリン系アジュバント化学療法で治療することができる。本方法は、乳癌を患っている患者の応答の予測に特に有用である。
【００２９】
本方法は、c．609C＞Tアレル若しくはNQO1遺伝子のNQO1＊2多型若しくは同様の機能的影響に至る、前述のポリヌクレオチド配列における1つ以上のヌクレオチドのその他の変化についてホモ接合である乳癌患者又はc．609C＞Tアレル若しくはNQO1＊2多型若しくは同様の機能的影響に至る、前述のポリヌクレオチド配列における1つ以上のヌクレオチドのその他の変化についてヘミ接合の腫瘍細胞を有する患者に特に有用である。これらの場合、患者を、エピルビシンでのアントラサイクリン系アジュバント化学療法を用いた治療計画から除外したほうがよい。
【００３０】
本方法が有利な患者群の1つが、c．609C＞Tアレル又はNQO1＊2多型又はNQO1遺伝子の同様の機能的影響に至る1つ以上のヌクレオチドのその他の変化についてヘテロ接合である乳癌患者であり、ガンはp53免疫陽性腫瘍を含み、前述のガン治療はアントラサイクリン系アジュバント化学療法である。
【００３１】
本発明の方法は、インビトロの方法に関し、DNA又はRNAを含む、患者の細胞若しくは組織サンプル又はインビトロサンプル溶解物から単離及び精製されたポリヌクレオチド配列又はそのフラグメント、あるいは患者の細胞若しくは組織サンプル又はインビトロサンプル溶解物から単離及び精製されたタンパク質又はそのフラグメントは、それ自体が既知の技法によって同定される。サンプルは、患者から採取した、その患者が受け継いだ遺伝子型、患者の表現型又は腫瘍の遺伝子型を表すDNA、RNA、タンパク質及びこれらのフラグメントを含む。
【００３２】
本発明の方法は、慣用の遺伝子型同定方法及び表現型同定方法並びにDNA、RNA又はアミノ酸に基づいたいずれの方法も含む。DNA又はRNAに基づいた有用な遺伝子型同定方法は、制限酵素断片長多型PCR (restriction fragment length polymorphism PCR：RFLP−PCR)、1本鎖DNA高次構造多型(single strand conformation polymorphism：SSCP)、アレル特異的ハイブリダイゼ−ション、プライマ−伸長法、アレル特異的オリゴヌクレオチド・ライゲーション又はシークエンシング等の単一ヌクレオチド多型(single nucleotide polymorphism：SNP)を検出する及び遺伝子型同定する技法を含む。本発明の方法は、NQO1遺伝子におけるc．609C＞Tアレル又はNQO1＊2多型の同定を含む、DNA又はRNA配列の特異性に基づいた遺伝子型同定方法を応用する。
【００３３】
本発明の方法は、NQO1遺伝子における多型又はその他の遺伝子若しくはゲノム変化によるNQO1遺伝子産物の欠損の検出を含む表現型同定方法を応用する。本発明の方法は、NQO1遺伝子産物におけるP187S突然変異の同定に基づいた表現型同定方法を応用する。本発明は、ガンを患っている患者により効果的な治療を提供する方法に関し、正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在は、患者をあるガン治療から除外することを示す。
【００３４】
本発明は、ガン又は悪性腫瘍を患っている患者を治療するための方法に関し、患者から採取したサンプルから、突然変異若しくは非機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在を判別し、遺伝子型同定の結果に基づいて前述の患者にとって適当な療法を決定することを含み、正常又は機能性NQO1遺伝子が不在の場合、患者はあるガン治療から除外される。
【００３５】
本発明は、患者の遺伝的背景に基づいてガン治療を選択するための、臨床試験計画を最適化するための方法に関し、患者から採取したサンプルから、突然変異若しくは非機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在を判別し、少なくとも2つの群に患者を分類することを含み、正常又は機能性NQO1遺伝子を有する群はあるガン治療で治療し、突然変異又は非機能性NQO1遺伝子を有する別の群は、前述のガン治療から除外したほうがよい。
【００３６】
本発明は、患者の遺伝的背景に基づいて転移性ガンを治療するためのガン治療を選択するための方法に関し、健康な細胞又は腫瘍細胞を含む患者から採取したサンプルから、突然変異若しくは非機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性NQO1遺伝子遺伝子産物の不在を判別し、ここで前述のNQO1遺伝子は、ヌクレオチド配列に変化を有する工程と、患者を少なくとも2つの群に分類する工程を含み、正常又は機能性NQO1遺伝子を有する群はあるガン治療で治療し、突然変異又は非機能性NQO1遺伝子を有する別の群は、前述のガン治療から除外したほうがよい。。
【００３７】
患者は、原発腫瘍を治癒させるためのガン治療を既に受けていることがある。健康な細胞又は腫瘍細胞を含む患者から採取したサンプルから突然変異若しくは非機能性NQO1遺伝子の存在又は正常若しくは機能性NQO1遺伝子の不在を判別する遺伝子型同定は、転移の検出前に行なわれている場合がある。判別を化学療法の開始前に行い、アントラサイクリン系化学療法等の意図している治療が患者に有効か否かを判断する。治療と治療との間の時間枠は、最高数年の差で異なり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
以下において、本発明を、添付の図面を参照しながら実施形態を用いてより詳細に説明する。
【図１ａ】図１は、乳癌、特にp53免疫組織化学法及びアジュバントFEC療法状況によって層別化された亜群間において、NQO1＊2遺伝子型が累積生存率の低下と関連していることを実証している。選択された複数の患者群におけるNQO1＊2 (P187S)遺伝子型のカプラン・マイヤー生存曲線を比較したものが示されている。n＝症例数、p＝ログランク検定のp値、CS5y＝5年間の追跡調査後の累積生存率(信頼区間はカッコ内に記載)。曲線横の表示は、NQO1 (P187S)遺伝子型を示す。PP＝正常なNQO1についてホモ接合である株：NQO1 001 (NQO1＊1)、PS＝ヘテロ接合変異体NQO1 003、SS＝機能性NQO1を欠損しているLBL51 (NQO1＊2)。図１ａは、家族性及び非選択乳癌患者の両方を含む全有効症例における、最初の乳癌診断からの全生存率を示す。細胞株において見られる検出可能なNQO1タンパク質のレベルと矛盾することなく(図5a)、NQO1ヘテロ接合体の生存曲線は、野生型ホモ接合体のものと極めて類似していた。統計的検出力を最大化するために、野生型ホモ接合体(PP)及びヘテロ接合体(PS)患者は、後続の分析においてまとめられた。
【図１ｂ】内分泌療法を受けた患者における全生存率を示す。FEC療法を受けた患者はこの群から除外されている。
【図１ｃ】p53免疫陽性腫瘍を有する患者における全生存率を示す。
【図１ｄ】p53免疫陰性腫瘍を有する患者における全生存率を示す。
【図１ｅ】アジュバントFEC療法を受けた患者における全生存率を示す。
【図１ｆ】非アントラサイクリン系治療を受けた患者又は治療を受けていない患者における全生存率を示す。
【図２ａ】図２は、NQO1遺伝子型及びp53の状態が、培養ヒト細胞においてエピルビシンへの感受性に影響を与えることを実証している。図２ａは、MTT様AlamarBlueアッセイによって測定された、NQO1を過剰発現しているMCF7DT9及びベクターコントロ−ルMCF7neo6細胞株の増殖活性を示す。細胞は、段階的に濃度を上げたエピルビシンで72時間にわたって処理された。MCF7DT9は、MCF7neo6細胞よりもエピルビシンに対して有意に感受性が高かった(p<0．001)。
【図２ｂ】MCF7DT9及びMCF7neo6細胞のSytox green／Hoechst生死判別試験を示す。生存能を、蛍光顕微鏡検査により、72時間のエピルビシン処理後に評価した。MCF7DT9細胞株では、より多くの死細胞が観察される(100及び200 ng／mlのエピルビシンでの処理後に著しく多い(それぞれp＝0．05、p＝0．015))
【図２ｃ】正常なNQO1についてホモ接合であるB細胞リンパ芽球細胞株：NQO1 001 (NQO1＊1、PP)、ヘテロ接合変異体NQO1 003 (PS)、機能性NQO1を欠損しているLBL51 (NQO1＊2、SS)の、段階的に濃度を上げたエピルビシンでの48時間の処理での増殖活性を示す。NQO1＊1細胞は、NQO1＊2よりもエピルビシンに対して感受性が高く(25 ng／ml及びそれより多い用量のエピルビシンでの処理後、有意に感受性が高い(それぞれ25 ng／ml：p＝0．003、50 ng／ml：p＝0．01、250 ng／ml：p＝0．005、500 ng／ml：p＝0．0001)。
【図２ｄ】B細胞リンパ芽球細胞株の、エピルビシンによる48時間の処理でのSytox green／Hoechst生死判別試験を示す。25 ng／mlのエピルビシンでの処理後、NQO1＊1細胞では、死細胞の数が有意に多かった(p＝0．02)。
【図２ｅ】エピルビシンでの処理(100 ng／ml)後、指定の時間で回収したMCF7DT9及びneo6細胞溶解物におけるPARP切断のウェスタンブロット解析を示す。
【図２ｆ】機能性NQO1の欠損が、エピルビシン誘発性のPARP切断を低下させること及びNQO1＊1 (P／P)正常細胞が、NQO1を欠損している細胞より高いp53、p21初期レベルを有していることを示す。エピルビシンでの処理(100 ng／ml)後、指定の時間で回収したB細胞リンパ芽球細胞溶解物のウェスタンブロット解析。
【図３ａ】図３は、p53が、腫瘍壊死因子α(TNF)ではなくエピルビシンによって誘発されたNQO1媒介細胞死に影響することを実証している。図３ａは、段階的に用量を上げたTNFによる72時間の処理後に測定された、MCF7細胞の増殖活性を示す。MCF7DT9は、neo6細胞よりもTNF (20 ng／ml)に対して有意に感受性が高い(p＝0 ．008)。
【図３ｂ】pEFIRES−NQO1 (EFNQ13)又はpSUPER−NQO1 (NQ12)をトランスフェクトさせたU2OS−p53DD細胞におけるNQO1発現レベルの免疫ブロット分析である。
【図３ｃ】(pEFIRES−NQO1を安定的にトランスフェクトさせた) NQO1を過剰発現しているU2OS−p53DD細胞の、テトラサイクリンがある場合(p53DD発現抑止)とない場合(p53DD発現)の、48時間にわたる段階的に濃度をあげたエピルビシンに応答しての増殖活性を示す。
【図３ｄ】pSUPER−NQO1 (shRNAプラスミド)をトランスフェクトさせたU2OS−p53DD細胞のエピルビシンに応答しての48時間の処理後の増殖活性を示す。
【図３ｅ】(pEFIRES−NQO1を安定的にトランスフェクトさせた) NQO1を過剰発現しているU2OS−p53DD細胞の、テトラサイクリンがある場合(p53DD発現抑止)とない場合(p53DD発現)の、TNFに応答しての72時間の処理後の増殖活性を示す。
【図３ｆ】pSUPER−NQO1 (shRNAプラスミド)をトランスフェクトさせたU2OS−p53DD細胞の、TNFに応答しての72時間の処理での増殖活性を示す。
【図３ｇ】p53欠乏乳癌細胞株MDA MB157 (NQO1＊1、PP)及びMDA MB231 (NQO1＊2、SS)の、段階的に濃度を上げたエピルビシンによる処理に応答しての増殖活性を示す。
【図３ｈ】p53欠乏乳癌細胞株MDA MB231−NQO1の、段階的に濃度を上げたエピルビシンによる処理に応答しての増殖活性を示す。
【図３ｉ】p53欠乏乳癌細胞株MDA MB157 (NQO1＊1、PP)、MDA MB231 (NQO1＊2、SS)及びMDA MB231−NQO1 (i)の、段階的に濃度を上げたTNFによる処理に応答しての72時間の処理での増殖活性を示す。NQO1高機能細胞は、TNF処理に対して有意に感受性が高い(10及び20 ng／mlのTNFでの処理後i：p<0．0001。k：10 ng／mlのTNFでの処理後、p＝0．024)。
【図３ｋ】p53欠乏乳癌細胞株MDA MB157 (NQO1＊1、PP)、MDA MB231 (NQO1＊2、SS)及びMDA MB231−NQO1 (i)の、段階的に濃度を上げたTNFによる処理に応答しての72時間の処理での増殖活性を示す。NQO1高機能細胞は、TNF処理に対して有意に感受性が高い(10及び20 ng／mlのTNFでの処理後i：p<0．0001。k：10 ng／mlのTNFでの処理後、p＝0．024)。
【図４ａ】図４は、NF−κB経路の活性、ヒト乳癌細胞株の様々な処理に対する応答、腫瘍のエピルビシン及びTNFに対する応答に関係する経路の図式モデルを示す。図４ａは、メトトレキサートではなくエピルビシンが、DNAの損傷応答を誘発することを示す。MCF7neo6及びDT9細胞を、メトトレキサートで異なる時間にわたって処理し(又は陽性対照としてのエピルビシンでの24時間にわたる処理)、指定の時間で回収した。DNA損傷応答に関わるタンパク質：γ−H2AX、p53(及びp53−Ser15−P)及びp21について、免疫ブロット分析を行った。
【図４ｂ】TNFとエピルビシンとの併用処理により、NQO1＊2 p53mut乳癌細胞において増殖が活性化されることを示す。MDA MB231及びMCF7 DT9細胞を、TNF (10 ng／ml)若しくはエピルビシン(50 ng／ml)のいずれか又は両方で処理した。増殖活性を、72時間の処理後に測定した。
【図４ｃ】エピルビシン及びTNFによるNQO1が関連した細胞死の誘発並びにNQO1及び／又はp53の欠陥が乳癌の治療への応答に与える相対的な影響の図式モデルである。NQO1はp53を安定化し、NQO1＊1及びp53wtの遺伝子背景においてエピルビシン及びTNF誘発性のアポトーシスを強化する。NQO1又はp53の機能の消失(×印がついた記号)は、インビトロにおける、エピルビシン及びTNFに対する処理応答の低下、NF−κBシグナル伝達障害、処理後のp53依存性及び非依存性細胞死の低下につながる。実線の矢印は、細胞死に寄与する機能的経路を表し、停止線を有する実線は、生存と増殖を促進する経路を表し、破線は、不活性経路を表す。経路の下の狭くなったり幅広くなっている横枠は、それぞれ、細胞死の低下並びに記載のp53欠陥とNQO1欠陥との組み合わせに関連した、上昇すると思われる酸化ストレス及びゲノム不安定性を示す。平行なp53経路とNF−κB経路との間には、機能的なクロストークもある(Janssens et al．， 2006)(詳細については本発明の詳細な説明を参照のこと)
【図４ｄ】NF−κB／p65の核移行が、エピルビシン(100 ng／ml)、TNF (10 ng／ml)又はこれらの組み合わせに応答して、MCF7neo6及びDT9細胞において、処理後の指定の時点で誘発されることを示す。NQO1過剰発現MCF7DT9細胞における、併用処理後に特に強化される核局在に留意すること。
【図４ｅ】NF−κB経路が、アジュバント化学療法の開始前であっても乳癌患者群において活性化されることを示す。NκkBのp65サブユニットについての免疫組織化学染色;左から右に向かって：正常なヒト乳房組織、湿潤性腺管癌、コメド型非湿潤性癌及び乳房の湿潤性腺管癌。後者2つの腫瘍におけるp65の核選択的な染色と対照的な、正常な乳房及び最初の癌におけるp65の細胞質局在性に留意すること。乳房組織の代表的な写真を示す。
【図５ａ】ヒト細胞株におけるNQO1タンパク質についての免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。左側の上から下に向かって乳癌細胞株：MDA−MB157 (PP)、MCF−7 (PS)及びMDA−MB231 (SS);右側はリンパ芽球様細胞株：NQO1 002 (PP)、LBL47 (PS)及びLBL51 (SS)。SSホモ接合細胞株のどちらにおいてもNQO1発現は観察されない。
【図５ｂ】NQO1 PSヘテロ接合体では、p53免疫陽性腫瘍を有する患者において生存率が低下することを実証している。PP、PS及びSSは、NQO1 P187S遺伝子型を示す。n＝有効症例数;p (傾向)＝NQO1＊2アレルの数の上昇に比例して生存率が悪化する線形傾向の有意性(SPSS 12．0を用いて実行されるようなカプラン・マイヤー傾向検定)。
【図６】NQO1＊2ホモ接合患者の乳癌転移後の生存率は低いことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
省略記号
NQO1              NAD(P)H：キノン酸化還元酵素1
PP                  正常型NQO1についてホモ接合：NQO1 (NQO1＊1)
PS                  ヘテロ接合変異体NQO1：NQO1＊2
SS                  NQO1＊2についてホモ接合(機能性NQO1の欠損)
【００４０】
定義
特に記載がない限り、本発明において用いる用語は、医学及びガン研究において一般的に用いられる意味を有する。しかしながら、一部の用語を若干異なった形で用いることもあり、一部の用語に関しては、特許を目的とした正しい解釈のために説明を加えたほうがよい。従って、一部の用語を以下にてより詳細に説明する。
【００４１】
「患者の遺伝的背景に基づいて」という表現は、患者の遺伝子地図が既知である又はサンプルから決定されることを意味する。特に、NQO1遺伝子の配列が既知である又は決定される。
【００４２】
「多型部位(polymorphic site、polymorphism site、polymorphism)」は、任意の配列における、違いが生じる遺伝子座又は位置である。「多型(polymorphism)」は、ある集合における2つ以上の遺伝子型の発生又はある遺伝子(アレル)内の位置のことである。「多型座(polymorphic locus)」は、マーカー又は基準アレルから違いが生じる部位のことである。「複数の多型座(polymorphic loci)」という表現は、2つ以上のマーカー又は2つ以上の基準アレルから違いが生じる部位を意味する。好ましい多型部位は、少なくとも2つのアレルを有し、選択された集合においてそれぞれ1％より高い頻度、より好ましくは10％又は20％より高い頻度で生じる。多型部位は、核酸配列内の既知の位置であってもよく、あるいは以下に記載の方法を用いて存在を確認してもよい。多型は、遺伝子のコード領域及び非コード領域の両方において起こり得る。多型座は、1塩基対ほど小さいこともある。複数の多型座には、単一ヌクレオチド多型部位(single nucleotide polymorphism site：SNP)、制限酵素断片長多型、タンデム反復数(variable number of tandem repeat：VNTR)、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純配列反復及びAlu等の挿入配列が含まれる。最初に同定されたアレル型を、任意で「基準型」又は「基準アレル」とし、その他のアレル型を、代替型又は「変異アレル」とする。選択された集合内で最も高い頻度で生じるアレル型は、野生型と称されることもある。二倍体生物は、アレル型についてホモ接合又はヘテロ接合である。アレルが2つの多型は2つの型を有する。アレルが3つの多型は、3つの型を有する。
【００４３】
本発明の目的上、用語「多型位置(polymorphic position)」、「多型部位」、「多型座」及び「多型アレル(polymorphic allele)」は、同意義であると解釈され、少なくとも1つ以上の個体を含む集合及び／又は染色体における、ある場所を占める1種以上のヌクレオチドを有すると同定された配列のその位置として定義される。ポリヌクレオチド配列は、1つ以上の複数の多型座を有し得る又は有し得ない。
【００４４】
本願において、「連鎖(linkage)」とは、遺伝子、アレル、遺伝子座又は遺伝子マーカーが、同一染色体上のその位置の結果として一緒に受け継がれる傾向を表す。連鎖は、2つの遺伝子、アレル、遺伝子座又は遺伝子マーカー間での組み換えの割合により測定することができる。概して、集団遺伝学において用いられるところの「連鎖」とは、同一染色体上で複数の遺伝子座が近接していることから、2つ以上の非対立性の遺伝子又は配列が共遺伝することを意味しており、この結果、減数分裂後に、非連鎖遺伝子について予測される50％よりも高い頻度で関連したままで残る。
【００４５】
本願において、用語「遺伝子型(genotype)」とは、DNAサンプル、遺伝子及び／又は染色体の多型座に存在する特定のアレルを含むことを意図している。「遺伝子型」は、通常は特定の状況に関連した1つの遺伝子又は幾つかの遺伝子又はある遺伝子の領域、すなわち特定の表現型に関わる遺伝子座に関する生物の遺伝的構造として定義される。遺伝子の領域は、単一ヌクレオチド多型の場合、1つのヌクレオチドほどに小さいことがある。
【００４６】
「遺伝子型同定(genotyping)」とは、バイオアッセイにより個体の遺伝子型を決定する過程を意味する。配列特異的遺伝子型同定法(sequence specific genotyping method)とは、DNA、RNA又はアミノ酸配列の特異性に基づいた全ての方法を意味する。このような配列特異的遺伝子型同定法の例には、以下に限定されるものではないが、制限酵素断片長多型PCR (RFLP−PCR)、SSCP、アレル特異的ハイブリダイゼーション、プライマー伸長法、アレル特異的オリゴヌクレオチド・ライゲーション又はシークエンシング等の単一ヌクレオチド多型(SNP)を検出する及び遺伝子型同定する技法が含まれる。遺伝子型の同定は、以下の技法：制限断片長分析、シークエンシング、マイクロシークエンシング・アッセイ、ハイブリダイゼーション、インベーダ・アッセイ、遺伝子チップ・ハイブリダイゼーション・アッセイ、オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ、ライゲーションRCA (rolling circle amplification)法、5´ヌクレアーゼ・アッセイ、ポリメラーゼ・プルーフリーディング法、アレル特異的PCR、フライト質量分析計(MALDI−TOF)のマトリクス支援レーザー脱離イオン化時間、リガーゼ連鎖反応アッセイ、酵素増幅電子的形質導入(enzyme−amplified eletronic transduction)、単一塩基対伸長法(single base pair extension assay)及び配列デ−タを読むことの1種以上も含み得る。「単一ヌクレオチド多型(SNP)」は、ゲノム配列の1つのヌクレオチド(A、T、C又はG)が変化したとき起こるDNA配列変異であり、この変異は大体、100〜300塩基毎に1回起こる。単一ヌクレオチド多型は通常、1つのヌクレオチドから別のヌクレオチドへの多型部位での置換により起こる。
【００４７】
NQO1多型の存在は、多型を検出するためのいずれの既知の方法によっても調べることができる。このような方法には、上記のシークエンシングに基づいた方法、ハイブリダイゼーションに基づいた方法及びプライマー伸長法が含まれる。
【００４８】
「表現型」とは、生物の観察可能な形質のことである。本願において、用語「ハプロタイプ」とは、DNAサンプル、遺伝子及び／又は染色体の2つ以上の多型座にわたる遺伝子型の組み合わせを含むことを意図しており、これらの遺伝子型は密接に連鎖している。「ハプロタイプ」とは、一緒に遺伝されやすい、同じ染色体上に近接して位置しているアレルの組である。遺伝子型の組み合わせは、1つの単位として一緒に受け継がれることがあり、その他のハプロタイプ及び／又はその他のDNAサンプル、遺伝子及び／又は染色体の遺伝子型に対して「連鎖不均衡」の状態になる場合がある。
【００４９】
本願において、用語「連鎖不均衡」とは、ある集合における2つのアレル間での関連の程度の尺度を意味する。例えば、あるサンプルにおいて、2つのアレルが特定の2つの遺伝子座で、2つの遺伝子座において予測される既知のアレル頻度及び組み換え割合よりも高い頻度で発生する場合、これら2つのアレルは「連鎖不均衡」の状態にあると表現される。
【００５０】
本願において、用語「遺伝子型アッセイ」及び「遺伝子型の決定」並びに「遺伝子型を同定する」という表現、つまり用語「遺伝子型」の動詞としての使用は、同意義であることが意図されており、DNAサンプル、遺伝子及び／又は染色体における特定の多型座又は特定の複数の多型座のアレルを同定するためのアッセイのことである。このようなアッセイは、単一塩基伸長反応(single base extension reaction)、1つ以上の多型座にわたって増幅を行うDNA増幅反応を利用し得る、又は1つ以上の多型座にわたってシークエンシングを行う単純なものである。遺伝子型同定については、当該分野において多数の方法が知られており、これらのアッセイの多くが本願において記載又は言及されている。
【００５１】
「単一ヌクレオチド多型」(SNP)は、単一のヌクレオチドによって占められる多型座にて生じ、この多型座は、アレル配列間で変異が起こる部位である。この部位は通常、アレルの高度に保存された配列(例えば、集合の1／100未満又は1／1000の構成要素において異なる配列)によって先行及び追随されている。単一ヌクレオチド多型は通常、多型座における1つのヌクレオチドから別のヌクレオチドへの置換により生じる。転移は、あるプリンが別のプリン又はあるピリミジンが別のピリミジンに置き換わることである。転換は、プリンがピリミジンに又はピリミジンがプリンに置き換わることである。単一ヌクレオチド多型は、基準アレルに対してのヌクレオチドの欠失又は挿入からも生じることがある。典型的には、多型座は、基準塩基以外の塩基によって占められている。例えば、基準アレルが塩基「T」をある多型部位に有する場合、改変アレルはC、G又はAをその多型座に有することができる。アミノ酸配列を変えることにより、「SNP」は、コードされたタンパク質の機能を変える。SNPの発見により、変異体の生化学分析及び、変異体の特性を解析したり様々な形態のタンパク質と直接的に相互作用する医薬化合物をスクリーニングするためのアッセイの開発が促進される。SNP (サイレントSNPを含む)は、転写又は転写後レベルで遺伝子制御も変化させ得る。SNP (サイレントSNPを含む)は、特定の状況において多型の存在又は不在を検出する、特定のDNA、RNA又はタンパク質を用いた診断器具の開発も可能にする。
【００５２】
「アレル」は、染色体上の特定の遺伝子座の任意の遺伝子の1つ以上の代替型として定義される。異なるアレルにより、遺伝形質における差が生まれる。二倍体細胞又は生物において、アレル対の構成要素(すなわち、任意の遺伝子の2つのアレル)は、相同染色体対上の対応する位置(座)を占め、これらのアレルが遺伝的に同じなら、この細胞又は生物は、特定の遺伝子について「ホモ接合」であり、もしこれらのアレルが遺伝的に異なっているなら、この細胞又は生物は「ヘテロ接合」であると呼ばれる。「遺伝子」をあるヌクレオチド配列の断片にすぎないと考えるなら、アレルは、その配列における特定の位置での考えられ得る代替ヌクレオチドのそれぞれとなる。
【００５３】
「ポリヌクレオチド配列」は、1本鎖又は2本鎖のいずれかの形態のDNA又はRNAである。ポリヌクレオチド配列は、天然、合成又は半合成であるが、典型的には、PCRを含む合成又は半合成手段によって調製される。本願において、「ポリヌクレオチド」とは、核酸を含む分子のことである。例えば、ポリヌクレオチドは、5´及び3´非翻訳配列、シグナル配列を伴う又は伴わないコード領域、分泌タンパク質コード領域を含む完全長のcDNA配列、随伴するプロモータ及び転写終結配列を伴う又は伴わないゲノム配列のヌクレオチド配列並びに核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメイン及び変異体を含む。更に、本願において、「ポリペプチド」とは、定義されたようなポリヌクレオチドから生成される、翻訳されたアミノ酸配列を有する分子のことである。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドは、いずれのポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドからも構成することができ、非修飾RNA若しくはDNA又は修飾RNA若しくはDNAであってよい。例えば、ポリヌクレオチドは、1本鎖及び2本鎖DNA、1本鎖及び2本鎖領域の混合物であるDNA、1本鎖及び2本鎖RNA、1本鎖及び2本鎖領域の混合物であるRNA、1本鎖、より典型的には2本鎖の又は1本鎖及び2本鎖領域の混合物であるDNA並びにRNAを含むハイブリッド分子から構成される。加えて、ポリヌクレオチドは、RNA若しくはDNA又はRNAとDNAとの両方を含む3本鎖領域から構成することができる。ポリヌクレオチドは、1つ以上の修飾塩基又は安定化その他を目的として修飾したDNA若しくはRNA骨格も含み得る。
【００５５】
本発明のポリペプチドは、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合、すなわちペプチドアイソスターによって互いに連結されたアミノ酸から構成することができ、遺伝子によりコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。ポリペプチドを、自然な工程(翻訳後プロセシング等)又は当該分野で周知の化学修飾技法により修飾してもよい。このような修飾は、基礎的な教科書、より詳しいモノグラフ、大量の研究文献において詳しく説明されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端を含むポリペプチドのどの場所でも生じ得る。当然のことながら、任意のポリペプチドにおける幾つかの部位で、同じ種類の修飾が同じ又は異なる程度で存在し得る。また、任意のポリペプチドが多種類の修飾を含んでいてもよい。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐していてもよく、分岐を伴う又は伴わない環状であってもよい。環状、分岐及び分岐環状ポリペプチドは、翻訳後の自然な工程から生じる又は合成法によって形成される。修飾には、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、ジメチル化、共有結合架橋の形成、システイン生成、ピログルタメート生成、ホルミル化、ガンマ・カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイレーション(selenoylation)、硫酸化、アルギニン化等のトランスファーRNA媒介のタンパク質へのアミノ酸の追加及びユビキチン化が含まれる(例えば、Proteins−structure and molecular properties， 2nd Ed．， T． E． Creighton， W． H． Freeman and Company， New York (1993); Postranslational covalent modification of proteins， B． C． Johnson， Ed．， Academic Press， New York， pgs． 1−12 (1983); Seifter et al．， Meth Enzymol 182：626− 646 (1990); Rattan et al．， Ann NY Acad Sci 663：48−62 (1992)を参照のこと)。
【００５６】
オリゴヌクレオチド・プローブを、特定のターゲット配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖の相補的配列にハイブリッド形成するように設計することもでき、DNA増幅反応におけるように、単体で用いても対で用いてもよいが、本発明の1つ以上の多型座を必ず含む。
【００５７】
本願において、用語「ヌクレオチド」、「塩基」及び「核酸」は同意義であることが意図されている。用語「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸分子」及び「核酸セグメント」は、同意義であることが意図されている。
【００５８】
ハイブリダイゼ−ション・プローブは、塩基特異的に核酸の相補鎖に結合するオリゴヌクレオチドであり、本発明のNQO1遺伝子内の1つ以上の多型座のアレルを同定するように設計されている。プローブは、好ましくは、考えられ得る変異ヌクレオチドのいずれかによって占められた少なくとも1つの多型座を含む。比較を目的として、本発明は、少なくとも1つの多型座に基準ヌクレオチドを含むプローブも含む。ヌクレオチド配列を、アレルのコード配列又は、適用可能な場合は、アレルのコード配列の相補体に対応させることができる。
【００５９】
本願において、用語「プライマー」とは、適切な条件下でのテンプレートによるDNA合成の開始点として作用する1本鎖オリゴヌクレオチドのことである。このようなDNA合成反応は、アデニン、グアニン、シトシン及びチミン又はウラシルヌクレオチドに対応する4つの異なるヌクレオシドトリホスフェート(例えば、ホスホルアミデートの形態)の全て並びに適当な緩衝液中のDNA若しくはRNAポリメラーゼ又は逆転写酵素等の重合剤を含む慣用の方法で適温にて行うことができる。あるいは、このようなDNA合成反応は、単一のヌクレオシドしか利用しなくともよい(例えば、一塩基対伸長法の場合)。プライマ−の適切な長さは、そのプライマーの用途に依存するが、典型的には、約10〜約30ヌクレオチドである。短いプライマー分子は、一般に、テンプレートと十分に安定したハイブリッド錯体を形成するのに低温を必要とする。プライマーは、テンプレートの配列を正確に反映する必要はないが、テンプレートとハイブリッド形成するに十分なだけ相補的でなくてはならない。用語「プライマー部位(primer site)」は、プライマーがハイブリッド形成するターゲットDNAの領域のことである。プライマー対(primer pair)という用語は、増幅するDNA配列の5´末端とハイブリッド形成する5´(上流)プライマーと、増幅する配列の3´末端の相補体とハイブリッド形成する3´(下流)プライマーを含むプライマー対のことである。
【００６０】
本発明のSNP又は方法によって検出、診断、同定、治療、予防及び／又は改善され得る代表的な疾患又は悪性腫瘍には、以下の非限定的疾患及び障害が含まれる：乳癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、すい臓癌、胃癌、結腸直腸癌、大腸癌、非ホジキンリンパ腫、頭頸部癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、軟部組織肉腫、小児腫瘍、アントラサイクリン等のDNA切断剤で治療可能なその他のガン及び悪性腫瘍。
【００６１】
「患者を治療から除外したほうがよい」という表現は、一般に用いられるある特定の治療が無効である患者を初期段階で同定し、患者の遺伝子型、治療への応答にあわせたテーラーメイドの代替療法で治療し、患者に苦痛を伴う、場合によっては有害となる治療を受けさせなくてもよいことを意味する。つまり、ある治療が有効ではない又は治療が有害となる患者を同定する。
【００６２】
全てではないとしても、ほとんどのヒト遺伝子は多様な型で生じ、少なくともどこかしらが異なっている。ヒト遺伝子における異種性は、一つには、長い時間の間にゲノムに起こった小さな、致命的ではない突然変異から生じたと信じられている。例えば、遺伝子の代替型における違いは、その遺伝子によってコードされたタンパク質のアミノ酸配列における違いとして現れる。ちょっとしたアミノ酸配列の違いが、タンパク質の安定性、反応性又は基質特異性を変える。遺伝子の代替型における違いは、遺伝子の発現の度合いに影響を与えることもある。しかしながら、ヒト遺伝子において生じる異種性の多くは、特定の表現型と相関関係にないようである。既知の異種性には、例えば、単一ヌクレオチド多型(単一のヌクレオチド残基に違いを有する遺伝子の代替型)が含まれる。その他の既知の多型には、ある遺伝子の大部分の配列が多くの配列の違いを示すもの及びある遺伝子の一部の存在又は不在によって異なるものが含まれる。
【００６３】
本発明は、特定の治療に対する応答に関連した、新規のSNPを提供する。本願で開示のSNPは、ヒトにおける診断、規定の治療についてのスクリーニング及び応答の評価に有用である。更に、SNP及びコ−ドされたその産物の機能性は、有用な診断ツールである。
【００６４】
本発明の特定のSNPアレルは、正常若しくは機能性遺伝子又は遺伝子産物の欠損に関連した、任意のガン治療に対する有害反応と関連づけることができる。
【００６５】
本発明は、ガン治療への応答を予測する個別のSNP並びに前述のマーカー遺伝子と関連した遺伝領域におけるSNP及びハプロタイプの組み合わせを提供する。治療戦略を選択する又はある治療から患者を除外するのに有用なSNPをスクリーングする方法を提供する。本発明は、予測マーカーの存在又は不在と、治療への応答との間の新規の関連性を同定するためのSNPを提供する。本発明は、本願で開示したSNPに基づいた新規の組成物及び方法を提供する。また、本発明は、既知ではあるが従来は関連付けされていなかったSNPを、治療への応答に関わる方法において用いる新規の方法を提供する。本発明の特定のSNPアレルは、治療への陰性応答又は陽性応答のいずれかに関連づけることができる。
【００６６】
当業者なら、ポリヌクレオチドがDNA又はRNAであることがすぐにわかる。DNAは核酸分子であり、2本鎖分子である。遺伝子は、1本鎖上の特定の部位（相補鎖上の対応する部位も含む）のDNAである。SNP位置、SNPアレル又はヌクレオチド配列を規定するにあたって、核酸分子の1本鎖上の特定の部位のアデニン、チミン(ウラシル)、シトシン又はグアニンに言及することで、その核酸分子の相補鎖上の対応する部位の(それぞれ)チミン(ウラシル)、アデニン、グアニン又はシトシンも規定することになる。従って、どちらの鎖に言及しても、特定のSNP位置、SNPアレル又はヌクレオチド配列に言及することができる。プローブ及びプライマーは、どちらかの鎖にハイブリッド形成するように設計することができ、本願で開示のSNP遺伝子型同定法は一般に、両方の鎖をターゲットにしている。明細書全体を通し、SNP位置の同定において、便宜上、言及しているのは概してタンパク質コード化鎖のほうである。
【００６７】
本発明に記載の変異ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質には、当該分野で既知のペプチド／ポリペプチド／タンパク質(当該分野で既知のタンパク質とは、「野生型」、「基準」又は「正常」タンパク質と言い換えることもできる)の対応するアミノ酸配列とは異なる、少なくとも1つのアミノ酸残基を含むペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はこれらのフラグメントが含まれる。このような変異ペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、本発明によって開示のタンパク質コード化SNP位置での非同義ヌクレオチド置換によるコドン変化から生じる(すなわち、ミスセンス変異)。本発明の変異ペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、ナンセンス変異(すなわち、未成熟終止コドンを生成するSNP、終止コドンを消滅させることによりリードスルー突然変異を起こすSNP）によって又は別の形で構造、機能／活性、タンパク質の発現に変化を起こさせる本発明によって開示のいずれのSNP(調節領域(例えば、プロモータ若しくはエンハンサ)のSNP等)、イントロンにおけるSNP、エクソン／イントロン境界のSNP等の別の若しくは異常スプライシングにつながるSNPによっても起きる。本願において、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は同じ意味で使用される。
【００６８】
患者若しくは腫瘍による正常若しくは機能性遺伝子産物の産生をできなくさせる1つ以上のヌクレオチドのその他の変異(変化、欠失、挿入、置換等)又は後成的変化も、ガン治療から除外したほうがよい患者の同定に用いることができる。例えばメチル化による後成的変化により、たとえ遺伝子型が正常であっても遺伝子の不活性化が起こり得る。
【００６９】
「突然変異」遺伝子又は遺伝子産物及び「非機能性」遺伝子又は遺伝子産物とは、遺伝子又は遺伝子産物が、ホモ接合、ヘミ接合又はその他の遺伝子若しくはゲノム変化(機能性アレルの欠損、体細胞突然変異、後成的変化等)により機能不全であることを意味する。「突然変異遺伝子」又は「非機能性遺伝子」は、突然変異を起こしている又は変化若しくは突然変異により生じ、変異による又はその結果として起こる突然変異の新しい遺伝形質を意味し、突然変異とは、生物の遺伝子又は染色体のDNA内での突然の構造的変化であり、野生型ではみられない新しい特性又は形質の発生に至る。遺伝子又は遺伝子産物が「突然変異又は非機能性」である場合、これは遺伝子又は遺伝子産物の、機能する能力が低下したことを意味する。「突然変異若しくは非機能性」遺伝子又は遺伝子産物は、遺伝子産物の欠損を意味することもある。
【００７０】
本発明において、NQO1遺伝子は、1つ以上のヌクレオチドの変化を有し、その結果、非機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物となる。好ましい実施形態において、NQO1遺伝子は、C．609C＞Tアレル又はNQO1＊2多型を含む、NCBI配列ID：J03934．1又はSEQ ID NO：4に記載のrefSNP ID：rs1800566におけるポリヌクレオチド配列の609位でのシトシンからチミンへの置換に対応し、コードされた遺伝子産物における187位でのプロリンからセリンへのアミノ酸変化(P187S)に至る、ヌクレオチド配列における変化を有する。
【００７１】
「正常な遺伝子産物」、「正常な機能性遺伝子産物」又は「正常又は機能性遺伝子産物」とは、正常又は機能性遺伝子によってコードされたタンパク質又はポリペプチドを意味し、機能性が完全に維持されていることを特徴とする。本発明において、機能性とはNQO1タンパク質のそれであり、以下に記載の方法で測定可能な活性によって特徴付けられる。NQO1遺伝子の正常型を、多型NQO1＊1とする
【００７２】
本発明において、患者を、Tアレルがc．609位の両方のアレルに存在するなら突然変異又は非機能性NQO1遺伝子を有する群、c．609位に存在するアレルの一方がCであるなら正常又は機能性NQO1遺伝子を有する群に分類する。
【００７３】
前述の正常又は機能性遺伝子及びその遺伝子産物の存在又は不在は、遺伝子産物におけるP187S変化につながるNQO1遺伝子におけるc．609C＞Tアレル又はNQO1＊2多型のインビトロでの検出によって示されるような、DNA若しくはRNAを含むポリヌクレオチド又は問題となるタンパク質若しくはポリペプチドの検出に基づいた多数の検出方法を用いて判断することができる。
【００７４】
NQO1における多型は、極めて少量であるタンパク質又はタンパク質の完全なる欠損に至ることが知られているため、そのタンパク質又はその活性を検出することにより、潜在的な患者をスクリーニングすることができる。c．609C＞Tアレルのホモ接合保因者(NQO1＊2と称されることが多い)は測定可能なNQO1タンパク質又はタンパク質活性を有しておらず、ユビキチンプロテアソーム経路を介したその素早い代謝回転により、NQO1 P187Sタンパク質が極めて低レベルであることを反映していると知られている(Siegel et al．， 1999; 2001)。従って、ある人間の遺伝子型は、NQO1タンパク質又はその活性の存在又は不在を検出することによって間接的に判別することができる。NQO1活性は、例えば、BeallらのCancer Res． 54：3196−3201 (1994) 、SiegelらのMol． Pharmacol， 44：1128−1134 (1993)、SiegelらのCancer Res．， 50：7293−7300 (1990)に記載の基質を用いて測定することができる。
【００７５】
従って、タンパク質の検出及びその活性測定により、タンパク質を含むサンプルから、患者を特定の治療から除外したほうがよいか否かを判断するための有用な方法が得られる。サンプルにおけるNQO1タンパク質のレベル低下又は完全なる欠損は、NQO1タンパク質に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いた免疫ブロット又は免疫組織化学法等の方法により判定することもできる。
【００７６】
用語「正常な機能性遺伝子産物の欠損」とは、遺伝子によってコードされたタンパク質若しくはポリペプチドが不在である又は上記のような正常なタンパク質若しくは酵素の機能を有していないことを意味している。本発明において、コードされたタンパク質が正常なNQO1タンパク質の機能性を有さない又はコードされたタンパク質が全く存在しないという効果を及ぼすのが、1つ以上のSNPを有する突然変異遺伝子である。NQO1タンパク質の機能性の消失は、間違ったmRNAの形成を引き起こす又は細胞による急速な破壊につながるヌクレオチド変異によって引き起こされ得る。
【００７７】
NQO1＊2多型の存在(ヘテロ接合)は、インビトロでの治療への応答の低さを示唆する。NQO1＊2多型の2つのアレルの存在は(ホモ接合性)、インビトロ及びガン患者において治療に応答がないこと又は治療が有害な効果さえ及ぼすことを示唆する。
【００７８】
「ヘテロ接合性」とは、生物がヘテロ接合体であること又は相同染色体のそれぞれにおける遺伝子位置を占める異なるアレルがある場合に、ある遺伝子座又は遺伝子においてヘテロ接合であることを意味している。つまり、ある形質について2つの異なるアレルを有する個体のことである。二倍数生物においては、2つの異なるアレルをその生物の両親から受け継ぐ。例えば、ヘテロ接合の個体は、アレル組み合わせPpを有し得る。本発明において、ヘテロ接合性とは、例えば、 NQO1＊2多型の1つのアレルの存在が、NQO1機能性の低下に至ることを意味する。本発明において、c．609C＞Tの第2のアレルの欠損により、腫瘍細胞においてヘテロ接合性が失われる場合があり(ヘテロ接合性の消失)、細胞はc．609C＞Tについてヘミ接合となる。本発明において、ヘテロ接合変異体(PS)は、NQO1：NQO1＊2のアレル組み合わせを意味する。
【００７９】
「ホモ接合性」とは、生物が、2つの対応する相同染色体上に、任意の形質に影響を与える遺伝子の２つの同じアレルを有している場合に、特定の遺伝子座においてホモ接合であると称されることを意味している(例えば、P及びpが、同じ遺伝子の考えられ得る異なるアレルを表す場合、遺伝子型はPP又はppである)。このような細胞又はこのような生物は、ホモ接合体と称される。ホモ接合優性遺伝子型は、特定の遺伝子座が2つの優性アレルを有しているときに生じる(例えば、PP)。ホモ接合劣性遺伝子型は、特定の遺伝子座が2つの劣性アレルを有しているときに生じる(例えば、pp)。純血種又は純粋種の生物は、ホモ接合である。例えば、ホモ接合の個体は、PP又はppのアレル組み合わせを有する。全てのホモ接合アレルは、アロ接合又はオート接合のいずれかである。本発明において、正常型についてホモ接合(PP)とは、NQO1遺伝子座がNQO1：NQO1のアレル組み合わせを有することを意味しており、NQO1＊1と表される。本発明において、変異体についてホモ接合(SS)とは、機能性NQO1が欠損していることを意味し、NQO1＊2と表される。本発明において、ホモ接合性とは、例えば、NQO1＊2多型の2つのアレルの存在により、NQO1機能性がほとんどなくなる又は消失することを意味する。
【００８０】
「ヘミ接合」とは、遺伝子のアレル又は染色体セグメントを通常の2つでなく1つしか有していない二倍数生物のことである。「ヘミ接合体」とは、ゲノムが任意の遺伝子座に1つしかアレルを含まない細胞又は生物のことである。本発明において、ヘミ接合性とは、例えば、NQO1＊2多型の1つのアレルの存在により、NQO1機能性がほとんどなくなる又は消失することを意味する。本発明において、腫瘍のヘミ接合性は、ヘテロ接合性の消失(loss of heterozygosity：LOH)、もう一方のアレルの不活性化、後成的メカニズム又は体細胞突然変異による不活性化により起こり得る。腫瘍にc．609C＞Tアレルが1つ存在し、もう一方のアレルが欠損している又は不活性であることは、腫瘍細胞がc．609C＞Tアレルについてヘミ接合であり、患者を治療から除外したほうがよいことを示す。
【００８１】
「化学療法」とは、特定の化学物質を用いたガンの治療又は悪性細胞及び組織に対して選択的に破壊的である薬剤を意味する。主に、ガンの治療に用いられる細胞毒性がある薬剤のことを示す。その非腫瘍学的使用において、この用語は、抗生物質を意味することもある(感染症の化学療法)。つまり、「化学療法」とは、ウィルス又はその他の微生物等の疾患の原因となるものに対して選択的に毒性を示す化学物質又は薬剤を用いた疾患の治療も意味する。「細胞分裂阻害化学療法剤(cytostatic chemotherapy agent)」のその他の用途は、多発性硬化症及び関節リウマチ等の自己免疫疾患の治療、肝炎等のウィルス性慢性感染症の治療並びに移植による拒絶反応の抑制である。概して、ほとんどの化学療法剤は、有糸分裂(細胞分裂)を阻害することにより作用し、分裂の早い細胞を効果的に狙っている。これらの薬剤は細胞に損傷を与えることから、細胞毒性と称される。「細胞分裂阻害化学療法剤」は、「細胞分裂阻害剤」とも称される。一部の薬剤は、細胞のアポトーシス(いわゆる、「細胞自殺」)を引き起こす。
【００８２】
「化学療法」は、細胞分裂に影響を与えることから、高い細胞増殖率を有する腫瘍(急性骨髄性白血病、ホジキン病を含むリンパ腫等)は、「化学療法」への感受性がより高く、これはかなりの割合のターゲット細胞が常に細胞分裂を起こしているからである。化学療法剤の大多数は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、植物性アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤に分類することができる。これらの薬剤は全て、細胞分裂又はDNA合成及び機能になんらかの形で影響を及ぼす。細胞分裂阻害剤の一部は期に特異的である。すなわち、細胞周期の特定の期においてのみ細胞分裂を阻害する。
【００８３】
今日使用されている化学療法剤の投与については、多数の方策がある。「化学療法」は、治癒を目的として施されることも、延命又は症状の緩和を目的としていることもある。集学的治療(combined modality chemotherapy)とは、放射線療法又は外科手術等のその他のガン治療と併用して薬剤を用いることである。現在、ほとんどのガンが、この方式で治療される。併用化学療法(combination chemotherapy)は、多数の異なる薬剤を併用して患者を治療することを伴う同様の手法である。これらの薬剤は、その作用機序及び副作用において異なる。最大の利点は、どれか1つの薬剤に対する耐性が発現するのを最小限にできることである。
【００８４】
「早期治癒的治療」は、疾患の早期段階に治癒を意図して施される療法又は治療が必要な患者に最初に施される治療を含む。早期治癒的治療は、DNA切断及び／又はアポト−シス反応を引き起こすモダリティを含む。このようなモダリティには、トポイソメラーゼ阻害剤(トポイソメラーゼ阻害剤II等)を含む化学療法剤を用いて行われる化学療法が含まれる。
【００８５】
「アジュバント化学療法(adjuvant chemotherapy)」とは、原発腫瘍がなんらかの方法で除去された後に用いられるガン化学療法を意味する。術後治療としての「アジュバント化学療法」は、ガンの存在を示す根拠がほとんどなくても、再発のリスクがある場合に用いることができる。「アジュバント化学療法」は、実際に腫瘍が発現した場合に、耐性が発現する可能性を低下させるのに役立つ。身体の別の部位に広がったガン細胞を死滅させるのにも有用である。新たに増殖する腫瘍の分裂は早く、感受性が非常に高いことから有効であることが多い。「緩和的化学療法(palliative chemotherapy)」は、治癒を意図してはいないが、腫瘍量を低下させ、平均余命を長引かせるためだけに施される。これらのレジメンについては概して、より良好な毒性プロフィールが期待される。
【００８６】
ほとんどの化学療法レジメンでは、患者が治療に耐えられることを要する。患者が化学療法を受けられるか否か又は用量の減量が必要か否かを判断するために、パフォーマンス・ステータスを指標として用いることが多い。
【００８７】
「併用化学療法」とは、異なる薬剤を同時に組み合わせてその有効性を増強することを意味する。「導入化学療法(induction chemotherapy)」は、その他の手段では治療できない進行ガンの患者に対する初期治療としての薬剤療法の使用を意味する。「ネオアジュバント化学療法(neoadjuvant chemotherapy)」は、その他のモダリティによる治療前に腫瘍量を低下させるための、限局性のガンの患者に対して行う化学療法の初期使用を意味する。つまり、この術前治療は、初期化学療法が、原発腫瘍を縮小させることで局所治療(外科手術又は放射線療法)の破壊性を抑える、つまりより効果的にすることを意図されたものであることを意味している。「局所化学療法(regional chemotherapy)」は、特にガンに関しての、局所潅流として行われる化学療法を意味している。「代替の治療(alternative therapy)」は、患者の特定のガンの治療に用いられる別の細胞分裂阻害剤、内分泌物質、治療又は生物学的治療である。
【００８８】
トポイソメラーゼは、DNAのトポロジーを維持する必須酵素である。タイプI又はタイプIIトポイソメラーゼの阻害は、正しいDNA超コイル化を乱すことにより、DNAの転写と複製の両方を妨げる。「トポイソメラーゼ阻害剤」は、トポイソメラーゼ酵素(トポイソメラーゼI及びII)の作用を妨げるように設計された化学療法剤であり、トポイソメラーゼ酵素とは、正常な細胞周期において、DNA鎖のリン酸ジエステル骨格の切断及び再結合を触媒することにより、DNA構造における変化を制御している酵素である。
【００８９】
「トポイソメラーゼ阻害剤」は、ガン化学療法のターゲットとなっている。トポイソメラーゼ阻害剤は細胞周期のライゲーション工程を阻止し、トポイソメラーゼI及びII阻害剤は、正しいDNA超コイル化を乱すことによりDNAの転写と複製を妨げていると考えられている。一般的に処方されるトポイソメラーゼ阻害剤の種類は、フルオロキノロンである。トポイソメラーゼI阻害剤の例には、イリノテカン及びトポテカンが含まれる。トポイソメラーゼII阻害剤の例には、アムサクリン、ミトキサントロン、ピロキサントロン、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、エトポシド、テニポシド、エトポシドホスフェート等のエピポドフィロトキシン誘導体が含まれる。
【００９０】
トポイソメラーゼII阻害剤である「アントラサイクリン」も、おそらくは反応性酸化ラジカルの生成により、DNAの切断及び染色体の損傷を引き起こす。アントラサイクリンには、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、アクラルビシン又はエピルビシンが含まれる。特に、ドキソルビシン及びエピルビシンは、広スペクトルの細胞分裂阻害剤であることから、化学療法において広く用いられている。
【００９１】
「乳癌治療」において用いられる「細胞分裂阻害剤」には、例えば、ドキソルビシン又はエピルビシン等のアントラサイクリン、フルオロウラシル、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、シクロホスファミド、ドセタキセル又はパクリタキセル等のタキサン、ビンクリスチン、ビンデシン又はビノレルビン等のビンカアルカロイドが含まれる。最も一般的な細胞分裂阻害剤の組み合わせには、例えば、CMF及びCAF／FEC(シクロホスファミド＋ドキソルビシン／エピルビシン＋5−フルオロウラシル)が含まれる。
【００９２】
腫瘍タンパク質53としても知られる「p53」は、細胞周期を調節する転写因子であることから、腫瘍抑制因子として機能する。p53タンパク質は通常、多種多様なストレス、特に放射線照射、酸化ストレス又はその他の要因により引き起こされるDNAの損傷から生じるストレスに対する細胞応答において中心的な役割を果たす。ストレスにより一旦活性化されると、p53は細胞周期を停止させる(細胞増殖の終了)又はプログラムされた細胞死(アポト−シス)を促進する(Kastan 2007)。用語「p53欠陥(p53−defective)」は、p53をコードしている遺伝子が機能していない又は不完全である又は欠陥を有する又は遺伝子全体が欠損していることを意味する。つまり、「p53欠陥」とは、生物が正しくp53を発現しないことを意味する。
【００９３】
用語「免疫陽性(immunopositive)」は、サンプルが免疫組織化学法において陽性であることを意味する。免疫組織化学法とは、抗体が生体組織において抗原に特異的に結合する原理を利用した、組織片の細胞内でのタンパク質の局在を検出する方法であり、組織の異なる部位におけるバイオマーカーの分布及び局在を理解するために用いられる。免疫組織化学染色は、ガンの診断及び治療において広く用いられている。特定の分子マーカーは、特定のガンの種類に特有である。本発明において、「p53免疫陽性」サンプルを、免疫組織化学法においてp53抗体を用いて検出しており、免疫組織化学法における陽性の結果について言及している。「p53免疫陽性(p53 immunopositiviy)」とは、欠陥p53を意味する。突然変異したp53は、本来なら分解されるべきなのに分解されないため、p53免疫陽性となる。つまり、欠陥のある遺伝子産物が細胞内に蓄積され、免疫組織化学分析によって検出することができる。用語「免疫陰性(immunonegative)」は、サンプルが免疫組織化学法において陰性であることを意味する。用語「p53免疫陰性(p53 immunonegative」は、サンプルが陰性である又はp53抗体で検出した場合に発現の程度が非常に低いことを意味している。p53は迅速に分解されるため蓄積されず、免疫組織化学法によって容易に検出できないこと意味している。
【００９４】
「p53免疫陽性ヘテロ接合(p53 immunopositive heterozygous)」とは、c．609C＞Tアレル又はNQO1遺伝子の多型についてヘテロ接合である患者が欠陥p53を有していること及び患者が、免疫組織化学分析において免疫陽性と検出されることを意味している。
【００９５】
本方法を、転移性ガンを治療するためのガン治療の選択に使用することができるという表現は、悪性のガンを患っている患者の転移を検出し、本発明の方法を用いて、有効なガン治療を決定することを意味する。患者が、原発腫瘍を治癒させるためのガン治療を既に受けている場合もある。突然変異若しくは非機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在を健康な細胞又は腫瘍細胞を含む患者のサンプルから判別する遺伝子型の同定を行う。判別は化学療法の開始前に行い、アントラサイクリン系化学療法等の意図している療法が患者に有効か否かを判断する。治療と治療との間の時間枠は、最高数年の差で異なり得る。
【００９６】
本発明は、突然変異若しくは非機能性遺伝子の存在又は正常つまり野生型遺伝子若しくはNQO1遺伝子産物をコードしている機能性遺伝子の不在に基づいて、患者をある治療から除外したほうがよいか否かを判断することが可能であるとの驚くべき発見に基づいたものである。つまり、本発明は、NQO1遺伝子産物の低下若しくは欠損又はNQO1遺伝子の欠乏により、治療後の生存率不良が予測されるという発見に関する。本発明の方法は、患者のサンプルから、突然変異又は非機能性NQO1遺伝子の存在、あるいは正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在、あるいはNQO1遺伝子の特定の多型変異体又は遺伝子産物を検出することを含む。検出は、いずれの配列特異的遺伝子型同定法、表現型同定法、DNA、RNA又はアミノ酸に基づいた方法も含む。機能性遺伝子又は遺伝子産物が欠損していることを識別可能な方法である限り、正確な検出法であるか否かは重要ではない。
【００９７】
正常又は機能性NAD(P)H：キノン酸化還元酵素1 (NQO1)の不在は、患者又は腫瘍が機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物を欠損しているという事実及び／又は患者又は腫瘍が正常又は機能性NQO1遺伝子産物を産生できないという事実によるものである。
【００９８】
本発明により、一般的に適用されるガン治療から除外して、代替の治療レジメンで直接的に治療したほうがよいガン患者の分類が著しく改善される。本発明は、NQO1＊2遺伝子型を有し、アントラサイクリン治療から除外したほうがよい患者を同定するのに特に有用である。NQO1多型は、NQO1タンパク質発現のレベルに影響を及ぼし、NQO1＊2ホモ接合の患者は、安定したNQO1タンパク質の産生ができない。本方法は、p53免疫陽性腫瘍を含むガンを患い、あるガン治療から除外したほうがよいNQO1＊2ヘテロ接合の患者を同定するのに特に有用である。
【００９９】
本発明の方法は特に、化学療法、特にはアントラサイクリン系化学療法の開始前の遺伝子型同定により、患者に前述の療法が有効か否かの判断を可能にする。NQO1遺伝子変異を有する患者に前述の治療は有効ではなく、容態が悪化することさえある。前述のNQO1多型は、患者の健康な細胞及び腫瘍細胞の両方から検出することができる。遺伝子型同定の結果は、再発ガン又は悪性腫瘍、転移性ガン、新たに検出された原発性悪性ガンの治療に利用することができる。遺伝子型同定は、患者がガン又は悪性腫瘍をまだ患っていなくとも行うことができる。患者の健康な細胞で行ったNQO1遺伝子型同定は、健康な細胞又は腫瘍細胞が、機能性NQO1タンパク質を、ガン又は悪性腫瘍の進行中に、考えられ得るガン治療のいずれかの段階で産生可能か否かを示す。
【０１００】
１つの実施例は、NQO1機能性を検出するための少なくとも1つの基質試薬又は患者から採取したサンプルにおけるNQO1遺伝子産物の存在又は不在を検出するための少なくとも1つの抗体を含むテストキットである(例えば、患者が受け継いだ遺伝子型又は腫瘍の遺伝子型を表す、サンプルにおける酵素NQO1又は酵素NQO1の活性の存在又は不在)。本発明は、患者をある治療から除外したほうがよいか否かを判断するための診断ツールに利用することができ、患者から採取したサンプルから、NQO1遺伝子の突然変異若しくは非機能性遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいはNQO1遺伝子の正常若しくは機能性遺伝子又は遺伝子産物の不在を識別可能な少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む。このポリヌクレオチドは、NQO1をコードしている配列又はそのフラグメントに相補的である。このツールは、適合する補助試薬と、デバイス（ガラス、プラスチック、ニトロセルロ−ス、ナイロン、ポリアクリル酸及びシリコンから成る群から選択された材料から構成される膜、フィルタ、スライド、プレート、チップ、ディッシュ、マイクロウェル等の固形支持体を含む、試薬、標識、緩衝液、基準サンプル、増幅手段、シークエンシング手段、洗浄剤、生化学試薬、検出手段、デバイスを含む）と使用説明書も含む。あるいは、前述の診断ツールは、サンプルにおけるNQO1機能性を検出するための少なくとも1つの基質試薬又はサンプルにおけるNQO1遺伝子産物に特異的な少なくとも1つの抗体と、適合する補助試薬と、デバイスとを含み、前述の正常若しくは機能性遺伝子又は遺伝子産物の不在を表す結果は、患者をある治療から除外したほうがよいことを示す。
【０１０１】
別の実施例は、本発明の方法において有用な予測マーカー組成物であり、NQO1遺伝子の突然変異若しくは非機能性遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいはNQO1遺伝子の正常若しくは機能性遺伝子又は遺伝子産物の不在を患者のサンプルから識別可能な少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む。このポリヌクレオチドは、NQO1をコードしている配列又はそのフラグメントに相補的である。組成物は、適合する補助試薬及びデバイスも含む。あるいは、前述の診断ツールは、サンプルにおけるNQO1機能性を検出するための少なくとも1つの基質試薬又はサンプルにおけるNQO1遺伝子産物に特異的な少なくとも1つの抗体と、適合する補助試薬とデバイスとを含む。前述の予測マーカー組成物は、患者をある治療から除外したほうが否かを判断するのに有用である。
【０１０２】
別の実施例は、NQO1遺伝子をコードしているポリヌクレオチド配列若しくはそのフラグメント又は基質試薬又はNQO1遺伝子産物に特異的な抗体の、突然変異若しくは非機能性遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性遺伝子又は遺伝子産物の不在の検出における使用であり、突然変異若しくは非機能性遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性遺伝子又は遺伝子産物の不在は、患者を前述のガン治療から除外したほうがよいことを示す。
【０１０３】
別の実施例は、本発明の方法に従って患者をある治療から除外したほうがよいか否かを判断するためのマーカー組成物であり、組成物は、突然変異若しくは非機能性NQO1遺伝子の存在又は正常若しくは機能性NQO1遺伝子の不在を検出するための、NQO1をコードしている配列若しくはそのフラグメントに相補的な少なくとも１つのポリヌクレオチド又は少なくとも1つの基質試薬又は患者から採取したサンプルからNQO1遺伝子の遺伝子産物を検出する抗体を含む、あるい基質試薬又はNQO1遺伝子の遺伝子産物に特異的な抗体と、適合可能な補助試薬とデバイスとを含む。
【０１０４】
NQO1及びその遺伝子産物の使用に関連した好ましい実施形態
本発明は、NQO1＊2遺伝子型を、治療、好ましくはガン治療、より好ましくは乳癌治療を選択する際の予後因子又は予測因子として初めて開示する。本発明は、突然変異若しくは非機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の存在、あるいは正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物の不在に基づいて、患者を任意のガン治療から除外したほうがよいか否かを判断することが可能であるとの驚くべき発見に基づいたものである。特に、c．609C＞Tアレル又はNQO1＊2多型とも称され、コードされた遺伝子産物におけるプロリンからセリンへの変化 (P187S)に至る、ホモ接合の、ポリヌクレオチド配列（NCBI配列ID：J03934．1、Ref SNP IDS：rs1800566）における609位でのシトシンからチミンへの置換が、ガン患者、好ましくは乳癌患者における、特にはエピルビシンを用いたアントラサイクリン系アジュバント化学療法(FEC)後の生存率不良に関連していることが示された。患者の遺伝的背景に基づいてガン治療を選択する本方法により、正常若しくは機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物を有し、あるガン治療で治療する群と、突然変異若しくは非機能性NQO1遺伝子又は遺伝子産物を有し、そのガン治療から除外したほうがよい群との少なくとも２つの群に患者を分類することが可能になる。本発明の方法は、化学療法、特にはアントラサイクリン系化学療法を開始する前の遺伝子型同定により、患者にこの療法が有効か否かを判断することを可能にする。NQO1遺伝子に変異がある患者は、上記の治療が有効ではなく、容態が悪化することさえある。
【０１０５】
ホモ接合NQO1＊2と、乳癌患者における特にエピルビシンを用いたアントラサイクリン系アジュバント化学療法後の生存率の不良との関連性が示された。NQO1＊2ホモ接合性は、エピルビシン治療及びp53免疫陽性腫瘍と組み合わさると、予後の不良を示す独立した、高度に有意な予測因子であると判明した。
【０１０６】
現在、乳癌における化学療法への耐性を予測する、認められた因子はない。治療、好ましくはアジュバント化学療法のパフォ−マンスを最適化するために、個々の患者に最適な治療レジメンを選択するのに役立つ新規の予測因子が必要とされている。本発明は、このような有用な予測マーカーである、患者をある治療から除外したほうがよいか否かを判断するためのスクリーニング法において使用する遺伝子変異体NQO1＊2を同定する。NQO1＊2ホモ接合性と、乳癌の有害転帰及び高い転移能との間の高度に有意な関連性が認められた。
【０１０７】
遺伝学的及び臨床的観察結果は、エピルビシンに対する応答が何処であったかのインビトロでの研究により機能的な面でバリデートし、機構的な面で裏付けられる。一貫して、NQO1欠乏NQO1＊2細胞(SS)は、NQO1高機能細胞(NQO1＊1)よりもエピルビシンに対する耐性が高く、高レベルのNQO1により、細胞はエピルビシン処理に対して感受性が高くなった。
【０１０８】
総合すると、臨床的及び機能的な発見は、NQO1＊2ホモ接合乳癌ではエピルビシン及び細胞毒性が低く、治療、好ましくはアジュバント化学療法(特に、エピルビシン系)を受けた患者の生存率が劇的に低下することを示唆した。このような患者において、NQO1遺伝子型は、治療の予測因子となる。NQO1の状態を用いて、その他のタイプの悪性腫瘍についても予測情報を得ることができる。本発明においては、P187Sをコードするタンパク質に至るc．609C＞Tアレルを有するNAD(P)H：キノン酸化還元酵素1 (NQO1)遺伝子を、予測マーカーとして用いる。本発明の好ましい実施形態において、本方法は、突然変異の存在、あるいは正常若しくは機能性遺伝子又は遺伝子産物（転写、翻訳産物を含む）の不在を検出することを含む。本発明は、遺伝子型同定法及び表現型同定法に基づいたものであり、DNA、RNA若しくはアミノ酸配列の特異的な測定又は機能性に基づいた技法を応用している。このような配列特異的な遺伝子型同定法の例には、以下に限定されるものではないが、制限酵素断片長多型PCR (RFLP−PCR)、SSCP、アレル特異的ハイブリダイゼーション、プライマー伸長法、アレル特異的オリゴヌクレオチド・ライゲーション又はシークエンシング等の単一ヌクレオチド多型(SNP)を検出する及び遺伝子型同定する技法が含まれる。WO 91／13075に記載されている、DNAポリメラーゼをSNPの同定に応用しているいわゆるミニ・シークエンシング法(minisequencing method)も、SNPの同定に逆転写酵素を応用している方法と同様に用いることができる。
【０１０９】
悪性腫瘍又はガンは、乳癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、すい臓癌、胃癌、結腸直腸癌、大腸癌、非ホジキンリンパ腫、頭頸部癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、軟部組織肉腫、小児腫瘍から選択することができる。好ましくは、ガンは乳癌である。本方法は、上記のガン及び悪性腫瘍との関連において有用であり、アントラサイクリン系アジュバント化学療法等、DNA切断剤もこれらのガン及び悪性腫瘍の治療に用いられる。
【０１１０】
サンプルは、実質的にどんなサンプルであってもよい。患者が受け継いだ遺伝子型又は腫瘍の遺伝子型を表す限り、サンプルのタイプは重要ではない。サンプルは、どの細胞から得てもよい。サンプルは腫瘍細胞、組織、体液であってよく、核酸、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は転写物を含む。このようなサンプルには、治療対象である患者から単離した組織、生検・解剖サンプル等の組織が含まれる又は組織学的な目的で採取された凍結切片、保存サンプル、血液、血漿、血清、痰、便、涙、粘液、毛髪、皮膚等が含まれる。サンプルは、患者の組織由来の外植片並びに初代及び／又は形質転換細胞培養物も含む。
【０１１１】
本発明の実施形態において、治療は、DNA切断を引き起こす及び／又はアポトーシス反応を誘発するモダリティ又は治療を含み、より好ましくは、DNA切断を引き起こす及び／又はアポトーシス反応を誘発するモダリティは、化学療法である。好ましくは、化学療法は、トポイソメラーゼII阻害剤若しくはその誘導体を含む化学療法剤又はDNA切断を引き起こすいずれの薬剤若しくはその誘導体を用いて行われる。このような化学療法剤の例には、以下に限定されるものではないが、アムサクリン、ミトキサントロン、ピロキサントロン、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、エトポシド、テニポシド、エトポシドホスフェート等のエピポドフィロトキシン誘導体を含むトポイソメラーゼII阻害剤が含まれる。アントラサイクリンの例には、以下に限定されるものでないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、エピルビシンが含まれる。最も好ましくは、治療は、エピルビシンを用いたアントラサイクリン系アジュバント化学療法を含む。
【０１１２】
ある療法への応答を予測し、個々の患者にとって最適な治療レジメンを選択するのに役立つ新規の予測因子が強く必要とされている。従って、本発明は、ガン治療、特には個々の患者にとって最適な治療レジメンを選択するための方法に関する。治療、好ましくはアジュバント化学療法のパフォーマンスを最適化するために、個々の患者に最適な治療レジメンを選択するのに役立つ新規の予測因子が必要とされている。
【０１１３】
本発明の概要を説明してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することでより容易に理解できる。以下の実施例は、説明のためのものであり、本発明を限定することを意図したものではない。
【実施例１】
【０１１４】
材料及び方法
患者及び対照
883人のフィンランド人家族性乳癌患者の大集団、884人と886人の2つの独立した非選択乳癌患者群及び698人の地理的に一致した健康な女性対照群において、生殖細胞系列NQO1コドン187遺伝子型c．609C＞Tを調べた。非選択群は、収集期間中に乳癌であると診断された患者を代表する。
【０１１５】
過去に記載されたように(Eerola et al．， 2000)ヘルシンキ大学中央病院(Helsinki University Central Hospital)で集められた家族性乳癌の群は、全部で883人の湿潤性乳癌患者を含む。そのうちの389人は、フィンランド・ガン登録(Cancer Registry)及び病院の記録によって確認された、発症する可能性が高い家系(発端者を含め、家族内に乳癌又は卵巣癌の1親等又は2親等の血縁者が3人以上いる)であり、494人の非血縁型乳癌症例は、罹患した1親等の血縁者を1人だけ報告した。BRCA1及びBRCA2変異は、全ての高リスク家族及び家族内に2人の発症者がいる306人(61．9％)から、全コード領域及びエクソン・イントロン境界を、タンパク質トランケーション・テスト(protein truncation test：PTT)及び変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(denaturing gradient gel electrophoresis：DGGE)を用いて又は過去に記載されたように(Vahteristo et al．， 2001)スクリーニングすることにより除外されている。
【０１１６】
研究対象となった非選択乳癌患者884人の第1群は、1997〜1998年及び2000年にヘルシンキ大学中央病院のガン科で集められ、収集期間中に連続して新たにガンだと診断された全乳癌症例の79％を占める(Kilpivaara et al．， 2005; Syrjakoski et al．， 2000)。これらの非選択患者のうち全部で40人が、非湿潤性乳癌を患っており、分析から除外された。
【０１１７】
886人の連続して新たに湿潤性乳癌であると診断された患者から成る第2の非選択群は(家系による選択がされていない)は、2001年10月31日から2004年2月29日までヘルシンキ大学中央病院において集められ、収集期間中に外科で治療を受けたこのような患者全ての87％を占める。組織病理学的データは、2つの非選択サンプル群(n＝1757)及び家族性乳癌群(n＝1045)の患者から入手可能な全ての原発性湿潤性乳房腫瘍(対側の腫瘍を含む)についての病理報告から収集された。この研究におけるデータセットは、腫瘍組織像、悪性度、エストロゲン受容体(ER)及びプロゲステロン受容体(PgR)の状態、p53免疫組織化学的発現、腫瘍直径(T)、結節状態(N)、遠隔転移(M)についての情報を含む。p53免疫組織化学的発現データは、病理報告から得た又は、可能な場合は、過去に記載されたような(Tommiska et al．， 2005)腫瘍組織マイクロアレイ(tumor tissue microarray：TMA)の免疫組織化学染色によって調べられた。p53免疫陽性は(細胞の＞20％の染色レベルを陽性とした)、事実上、同じスコアにそれぞれ到達した2人の病理学者によって調べられた。TMAデータは、664の家族性腫瘍と、571の非選択腫瘍から得られ、それぞれ、材料における全てのp53発現データの87％、66％を占めた。アジュバント化学療法、放射線療法、内分泌療法についての情報は、患者の記録から収集された。
【０１１８】
データセットは、(最初に）乳癌と診断された時の年齢及び全生存期間(日数)も含む。追跡調査の期間は、32〜2958日にわたった(メジアン：1860、平均：1778、SD：505)。診断時の年齢は、22〜96歳にわたった(メジアン：55．5、平均：56．6、SD：12．0)。正規母集団におけるアレル及び遺伝子型頻度は、同じ地理的領域から集められた698人の健康な女性対照群において求められた。
【０１１９】
遺伝子型同定
非選択患者の第1群及び対照群からのDNAサンプルの遺伝子型同定を、AmplifluorＴＭ蛍光遺伝子型同定剤を用いて行った(K−Biosciences， Cambridge， UK， http：／／www．kbioscience．co．uk)。最初の分析において明確なアレルコールが得られなかったサンプルには、以下に説明のRFLPアッセイで再度、遺伝子型同定を行った。精度管理のため、全部で228のサンプル(全症例の8．9％)を両方の遺伝子型同定法を用いて遺伝子型同定し、100％の一致(228中228)をみた。
【０１２０】
第2の非選択患者群及び家族性患者群について、制限酵素断片長多型(RFLP)アッセイを用いて遺伝子型同定を行った。NQO1 c．609C＞T RFLPアッセイについては、NQO1＊2アレルについて特異的な1つのHinf1制限酵素部位を含む、279bp・PCR単位複製配列を設計した。酵素製造業者(New England Biolabs， Beverly， MA， USA， http：／／www．neb．com／)の指示に沿った消化の後、NQO1＊2アレルを含むPCR産物を、標準2％アガロースゲル上で容易に区別可能な152塩基対と127塩基対のフラグメントに切断した。野生型の単位複製配列は完全なままである。単位複製配列を形成するために用いたプライマーは、5'−CCT GAG GCC TCC TTA TCA GA−3' (順方向) (SEQ ID NO：1)及び5'−AGG CTG CTT GGA GCA AAA TA−3' (リバ−ス) (SEQ ID NO：2)であった。
【０１２１】
統計解析
臨床的及び生物学的変数を、単変量解析によって関連性について試験した。独立変数を、カイ二乗検定で比較した。生存率の単変量解析は、カプラン・マイヤー生存曲線を計算し、患者群をログランク検定及びブレスロー検定を用いて比較することにより行われた。偶発腫瘍(診断とサンプル収集との間が6ヶ月未満)だけを生存率分析に含めた。NQO1遺伝子型と予後との関係を特徴づけるために、生存率分析を、全非選択患者群に加えて、組織病理学的特徴(p53免疫陽性、腋窩リンパ節転移、ホルモン受容体の状態)及び抗ガン治療のタイプに基づいた症例亜群において行った。患者別の全生存率に加えて、転移するまでの時間、再発するまでの時間及び一般的な無病生存率(転移、再発又は新しい原発性癌までの時間)の腫瘍特異的なカプラン・マイヤー分析を、上述のパラメータを用いて行った。生存率分析をするための十分な追跡時間があることから、これらの生存率分析を、家族性患者群及び第1非選択患者群において行った。研究材料における生存率のバイアスを排除するために、偶発腫瘍(診断からサンプル収集まで6ヶ月未満)だけを、生存率分析に用いた。両側乳癌の場合は、追跡調査を、最初の原発性湿潤性乳癌から行い、致命的事象又は追跡調査の終了まで継続した。二次性腫瘍については無視した。p値は全て両側であり、p値<0．05を有意と見なした。デ−タを、ウィンドウズ版SPSS v12．0．1を用いて分析した(SPSS Inc．， Chicago， IL， USA)。生存率分析に使用できるサンプルセットは、表3に詳細に記載されている。
【０１２２】
いくつかの変数及びそれらの相互作用項の生存率に対する影響を調べるために、コックス比例ハザード回帰モデル(Cox's proportional hazards regression model)を、ステップワイズ法により構築し、SPSS v12のフォワード条件付きアルゴリズムにより実行した。簡単に説明すると、アルゴリズムでは、調査対象集合における死亡率を説明するための最適な予後因子の組み合わせを選択しようとする。出発点として、アルゴリズムは、利用可能な変数のプールから始めるが、モデルにおいてはゼロ共変量である。各段階にて、アルゴリズムは、どのステップワイズ入れ換えがモデルを最も改善するかに基づいて、利用可能な変数のプールから共変量を加える又はモデルから既存の共変量を除外する。これを、アルゴリズムが、これ以上ステッワイズ入れ換えをしてもモデルに統計学的に有意な改善がなされなくなる共変量の組み合わせに到達するまで繰り返す。ハザード比は、各共変量について与えられる。
【０１２３】
乳癌の予後因子におけるNQO1＊2ホモ接合性の独立比例ハザード比を評価するために、コックスの比例ハザードモデルを、相互作用項を用いずに構築した。加えて、相互作用項を用いた2つの比例ハザードモデルを構築した。1つは、臨床病理学的因子だけに基づいたモデルであり、もう一方は、患者に施した抗ガン治療のタイプについての情報を含んだモデルである。これらの分析に含めた変数及び相互作用項は、表4に記載されている。
【０１２４】
細胞培養
実験において用いた細胞株は、患者から採取したp53野生型(wt)不死化B細胞リンパ芽球(NQO1 001 (PP)、NQO1 003 (PS)、LBL51 (SS)、p53wt乳癌細胞株MCF7neo6 (PS)、MCF7DT9 (PSだが、NQO1を過剰発現するように遺伝操作されている(Siemankovski et al． 2000)、p53突然変異MDA MB−157 (PP)、MDA MB−231 (SS)、U2OS骨肉腫細胞を発現するドミナントネガティブp53 (p53DD)を含んでいた。全ての細胞株を、37℃にて加湿大気下(5％ CO2)で維持した。細胞培養に用いた試薬は全て、GIBCO (Gibco Invitrogen Cell Culture， USA)から得た。MCF7 neo6及びDT9乳癌細胞は、M．Briehlの好意により提供され、過去に記載されたようにして培養された(Siemankowski et al．， 2000)。患者由来のB細胞リンパ芽球細胞株は、エプスタイン・バー・ウィルス形質転換(Epstein−Barr virus transformation)により不死化された。細胞株を、10％血清、100Uペニシリン及び100μg／mlストレプトマイシンを補充したRPMIにおいて培養した。U2OS骨肉腫細胞を発現しているドミナントネガティブp53 (p53DD)を(Mailand et al．， 2000)、10％血清、100Uペニシリン及び100μg／mlストレプトマイシン、G418、ピューロマイシン及びテトラサイクリンを補充したDMEMで培養した。MDA MB−157及びMDA MB−231乳癌細胞を、10％血清、100Uペニシリン及び100μg／mlストレプトマイシンを補充したDMEMで培養した。
【０１２５】
プラスミド
用いたプラスミドは、野生型ヒトNQO1をコードしているpEFIRES−NQO1 (EFNQ13、MDA MB−231−NQO1)及びベクタ−コントロ−ルのためのpEFIRES−empty (EFI6、MDA MB−231−empty)、NQO1 shRNAを発現しているpSUPER−NQO1 (NQ12)及びpSUPER−empty (ZEO6) [Gad Asher， Weizmann Institute of Science， Israel (Asher et al．， 2005から得た]。
【０１２６】
トランスフェクション
1．5E6個の細胞を、トランスフェクションの前日に10 cmのディッシュに播種した。トランスフェクションは、FuGENE 6 (Roche， Switzerland)を用いて、製造業者のプロトコルに従って行われた。トランスフェクションから24時間後、細胞を新しいディッシュに、単細胞クローンが増殖できる程度の異なる低濃度で移し、選択試薬Zeocinを適用した。クローンを、12日後に取り出し、分析した。
【０１２７】
エピルビシン、メトトレキサート及びTNF処理
エピルビシンを、Pharmacia (Farmorubicin， Pharmacia Corporation， Chicago， Ill， USA)から得た。濃度2 mg／kgのストック水溶液を4℃で遮光して維持し、細胞処理の直前に、培地中で適当な濃度にまで希釈した。メトトレキサート(MTX， Sigma Chemicals)を弱アルカリ化させたPBS中に溶解させ、ストック濃度10 mMで凍結保存した。hTNFα(Roche Applied Science， Indianapolis， IN， USA)を、使用直前に適当な培地中で希釈した。最終濃度1μMのシクロヘキシミドをTNF処理の3時間前に全ての細胞(MCF7を除く)に添加した。
【０１２８】
細胞増殖及び生存能
エピルビシン及びTNFが細胞生存率に与える影響を、増殖アッセイ及び生死判別試験を用いて分析した。増殖活性は、製造業者のプロトコルに従って(BioSource International， Camarillo， CA)、MTT様AlamarBlueアッセイにより評価した。細胞を96ウェルプレートに均一に播種し、24時間後に段階的に濃度を上げたエピルビシンで処理した。指定の時点でAlamar Blueを添加し、4時間後、Versamax分光光度計を用いて、570及び630 nmで吸収を測定した。各処理を3重に行い、各実験を少なくとも2回繰り返した。細胞生存能を、エピルビシン処理後の指定の時点で、剥落細胞、付着細胞を回収することにより測定した。細胞を遠心分離により回収し、対応する培地に再懸濁させた。死細胞はSYTOX green (Cambrex， USA)で染色し、総細胞量はHoechst染色により評価した。生存能は、蛍光顕微鏡法でSYTOX陽性細胞の割合(％)を数えることにより求められた。実験は2重に行い、1回繰り返された。
【０１２９】
細胞溶解物及びウェスタンブロット解析
浮遊及び付着細胞を、処理後の指定の時点で回収し、PBSで1回洗浄し、溶解緩衝液で溶解させた(Lukas et al．， 1998)。細胞溶解物を、免疫ブロット法により、p53、p21、NQO1 (全てSanta Cruz Biotechnology， Inc．， Santa Cruz， CA， USAから入手)、PARP (BD Biosciences PharMingen， San Diego， CA， USA)、αチューブリン(Sigma， Sigma−Aldrich， St． Louis， MO， USA)、Mcm7 (DCS−141)についての抗体及びSer15−p53 (Cell Signaling)及びSer139−γ−H2AX (Upstate)についてのリン酸化部位特異的抗体を用いて分析した。細胞溶解物は、3回の独立した実験から得られた。代表的な免疫ブロットを示す。
【０１３０】
免疫蛍光法及び免疫組織化学法
NF−κB／p65サブユニットの核移行を、ウサギのNF−κB／p65抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc．，Santa Cruz，CA，USA)を用いて検出した。NF−κBについての組織染色を、ウサギのモノクローナル抗体(Abcam， Cambridge， UK)を用いて行った。免疫染色法のプロトコルの詳細については、Codorny−Servat et al． (2006)及びJenkins et al． (2007)を参照のこと。
【実施例２】
【０１３１】
NQO1＊2遺伝子型は乳癌のリスクと関連していない
NQO1遺伝子型を、2534人の乳癌患者及び698人の健康な対照において調べた。乳癌患者群及び対照群における平均的な遺伝子型頻度は、66．7％のNQO1＊1 (PP)、30．3％のヘテロ接合変異体(PS)及び3．0％のNQO1＊2 (SS)であった。遺伝子型及びアレル頻度は、対照群、乳癌患者、乳癌の家族歴又は診断時の年齢によって層別化された患者亜群において同様であった(表5)。患者の経口避妊薬の使用は、NQO1＊2による乳癌のリスクに影響しなかった(遺伝子型頻度：770人の経口避妊薬使用患者では68．2％ (PP)、28．6％ (PS)、3．2％ (SS)であるのに対し、経口避妊薬を全く使用していない673人の患者では66．0％ (PP)、30．3％ (PS)、3．7％ (SS))。また、ホルモン補充療法も影響しなかった。遺伝子型の違いとどの組織病理学的パラメータとの間にも、p53免疫陽性(p53突然変異を示唆)がNQO1＊2ホモ接合体においてより一般的であるということ以外(わずかに有意なp値(表1))、関連性は観察されなかった。
【実施例３】
【０１３２】
NQO1遺伝子型は乳癌生存率に影響する
カプラン・マイヤー生存率分析は、NQO1＊2ホモ接合乳癌患者のほうが、その他の遺伝子型の患者よりも生存率が低いことを示しており、5年の累積生存率(cumulative survival：CS5y)は、ホモ接合乳癌患者が65％なのに対して、その他の遺伝子型では87％であった(p＝0．0017)(図1a)。ヘテロ接合患者の生存曲線は、野生型ホモ接合体の生存曲線に近かった。亜群の分析により、NQO1＊2遺伝子型と関連した低生存率が、p53免疫組織化学分析が陽性であった患者において極めて顕著(CS5y 20％ SS対73％ PP／PS、p＝0．001)であることが判明し、p53が低い症例では、NQO1遺伝子型は、生存率に影響を与えなかった(図1c、d)。同様の影響が、アジュバント化学療法を受けた患者で見られたが(CS5y 40％ SS対81％ PP／PS、p＝0．001)、非治療群、内分泌療法群では見られなかった(図1b、f、表6も参照のこと)。エストロゲン及びプロゲステロン受容体の状態は、NQO1＊2ホモ接合性が患者の転帰に与える効果に影響しなかった(データは記載せず)。
【０１３３】
アジュバント化学療法のタイプを考慮すると、NQO1＊2ホモ接合性が、FEC (5−フルオロウラシル(5−FU)、エピルビシン、シクロホスファミド)療法群における生存率に最も劇的な影響を与えた(CS5y 17％ SS対75％ PP／PS、p<0．0001)(図1e)。このような影響は、非アントラサイクリン、特にCMF (シクロホスファミド、メトトレキサート、5−FU；CS5y 75％ (SS)対86％ (PP／PS)、p＝0．5691、n＝193)で治療した患者では観察されなかった。ただし、これは統計学的手法だけでは除外できない(SSホモ接合体についての95％ C．I． 33％−100％)。全ての亜群についての5年間の累積生存率のデータを表6に示す。全生存率と矛盾することなく、NQO1＊2ホモ接合性は、同じ亜群における短い無転移生存率とも関連していた(表6)。
【実施例４】
【０１３４】
FEC療法を受けたNQO1＊2ホモ接合患者は予後不良である
多変量コックス比例ハザード分析において、NQO1＊2遺伝子型、p53免疫組織化学分析における陽性及びFEC療法間の相互作用が、高度に有意な独立予後因子として浮上した(表2)。NQO1＊2ホモ接合性とp53免疫染色との相互作用のリスク比は、p53免疫染色の独立予後値について補正した後であっても、腫瘍のサイズ(T)、リンパ節転移(N)、遠隔転移(M)のリスク比に匹敵していた。一方、NQO1＊2ホモ接合性とFEC療法との相互作用(p<0．001、R．R． 12．69)は、その他の因子よりもはるかに大きく総ハザードに寄与した。興味深いことに、p53の状態を考慮すると、より高い予後値(R．R． 13．61、95％ C．I． 3．86−47．94、p<0．001)が観察された。これは、一方のNQO1＊2ホモ接合性とp53免疫陽性との相互作用、もう一方のNQO1＊2ホモ接合性とFEC療法との相互作用が、NQO1＊2患者における乳癌生存率に影響を与えるあるメカニズムの一部であることを示唆している。
【実施例５】
【０１３５】
NQO1が培養ヒト細胞におけるエピルビシンへの感受性を増強する
エピルビシン系アジュバント化学療法後の生存率が、NQO1の状態に強く影響されると仮定して、エピルビシン誘発性細胞死及び関係する経路をインビトロで分析した。p53野生型のNQO1ヘテロ接合(PS)乳癌細胞株MCF7に、NQO1を安定的にトランスフェクトさせ、ベクターコントロ−ル細胞株MCF7neo6 (Siemankowski et al．， 2000)よりもはるかに高いNQO1活性のNQO1過剰発現細胞株MCF7DT9とした。NQO1の過剰発現により、増殖活性の用量依存的な低下によって表されるように、エピルビシン処理に対する感受性が上昇した(図2a)。増殖の抑制に調和して、MCF7DT9細胞の細胞生存能は、ベクターコントロ−ルMCF7neo6細胞と比較して、エピルビシンでの処理後、著しく低かった(図2b)。
【０１３６】
次に、異なるNQO1遺伝子型の乳癌患者から樹立したEBV−不死化B細胞リンパ芽球様細胞株におけるエピルビシンへの応答を分析した。増殖活性は、48時間の処理後の測定において、エピルビシンの濃度が上昇に応じて低下していた(図2c)。ホモ接合NQO1＊2 (SS)リンパ芽球(LBL51)は、ホモ接合NQO1＊1 (PP)細胞(NQO1 001)よりもエピルビシンに対する感受性が低く、ヘテロ接合PS細胞(NQO1 003)は、中間の感受性を示した。これに対応して、48時間の処理後の死細胞の量は、ホモ接合PP NQO1高機能細胞においてのほうが、ヘテロ接合PS又はホモ接合SS細胞のいずれかにおけるよりも高かった(図2d)。
【０１３７】
エピルビシンにより誘発された細胞死を、MCF7 (図2e)及びリンパ芽球細胞抽出物(図2f)の両方におけるポリ(ADP−リボ−ス)ポリメラ−ゼ(PARP)切断の免疫ブロット分析により更にモニタした。PARP切断は、高いNQO1レベルの細胞株(MCF7DT9及びNQO1 001)において最も顕著であり、検出不可能なNQO1の細胞(LBL51)において不在であり、生死判別試験における発明者の発見を裏付けている。
【実施例６】
【０１３８】
NQO1＊2 (SS)細胞におけるp53／p21経路の過渡的不全
NQO1は、腫瘍抑制タンパク質p53を、20Sプロテアソームを介したユビキチン非依存性分解から保護する(Asher et a．， 2001; 2002a; 2002b)。これらの発見に矛盾することなく、無処理のNQO1＊1リンパ芽球(NQO1 001)におけるp53レベルは、NQO1ヘテロ接合又はSSホモ接合患者の細胞におけるよりも高かった(図2f)。更に、p21 (p53の転写ターゲット)は、初期ではNQO1＊1細胞においてより豊富であり、NQO1正常細胞におけるp53転写活性が全体としてより高いことを示唆している。エピルビシンに応答して、p53の存在量は上昇し、処理から24時間で3つ全ての細胞株において同様のレベルに達し(図2f)、DNA損傷後のmdm2のp53からの脱共役によるp53のNQO1非依存性安定化を反映していると思われる(Lavin et al．， 2006)。
【実施例７】
【０１３９】
腫瘍壊死因子α(TNF)でなくエピルビシンによって誘発されたNQO1媒介細胞死におけるp53の役割
NQO1のp53安定化への検出可能ではあるが劇的ではない寄与は、NQO1の欠乏が、付加的なメカニズムにより全体的な生存効果に寄与するのではないかということを示唆した。NQO1を過剰発現しているMCF7DT9細胞がMCF7neo6細胞よりもTNFに対してより感受性が高いこと(Siemankowski et al．， 2000)及び乳癌患者のTNFの血漿中の濃度が高いことを考え合わせ(Perik et al．， 2006)、TNFへの応答が、このような臨床的に関連した付加的な経路を表しているのではないかと本発明者らは考えた
【０１４０】
p53及びNQO1の、エピルビシン対TNF誘発性のNQO1媒介細胞死における役割を明らかにするために、p53のドミナントネガティブ突然変異のテトラサイクリン抑制性発現を含むp53DD−U2OS細胞(NQO1＊1、PP)(p53DD)に、NQO1を過剰発現させるpEFIRES−NQO1を(EFNQ13)又はNQO1の基底発現をノックダウンするpSUPER−NQO1を(NQ12)トランスフェクトさせた(図3b)。NQO1の過剰発現(EFNQ13)により、エピルビシンへの感受性は増大したが、NQO1のノックダウンは、細胞応答を低下させた。ただし、p53が機能性である場合に限る(図3c、d)。対照的に、TNFでの処理後は、NQO1レベルが、p53の機能性に関わらず、U2OS由来細胞株における応答を決定し(図3e、f)、NQO1過剰発現細胞における応答の向上と、NQO1ノックダウン細胞における応答の低下に至った。
【０１４１】
NQO1及びp53の異なる役割は、乳癌細胞MDA−MB157 (NQO1＊1、PP)及びMDA−MB231 (NQO1＊2、SS)(共に野生型p53を欠く)においても観察され、これらの細胞はNQO1遺伝子型が異なるにも関わらず、同様の応答をエピルビシンに対して示した(図3g)。MDA−MB231におけるNQO1の再導入は、エピルビシンへの応答に影響を与えなかった(図3h)。対照的に、NQO1高機能MDA−MB157細胞は、TNFに対してより良好に応答し、p53とは独立して機能するTNF誘発性経路と一貫している(図3i及び3k)。
【０１４２】
エピルビシン、TNF及びこれらの組み合わせによる治療がNF−κB経路に与える影響を調査するために、発明者は、MCF7細胞におけるNF−κBサブユニットp65の細胞局在を調べた(図4a)。NF−κBシグナル経路の活性化を示す核移行が、各治療後に検出された。しかしながら、併用治療は、単独の治療レジメンよりもより長時間にわたる賦活効果を有していた。
【０１４３】
示唆されている、乳癌患者におけるTNFの血清レベル上昇に基づき(Perik et al． 2006; Berberoglu et al． 2004)、乳癌患者群において(n＝80)、NF−κB経路がアクティブか否かを腫瘍の免疫組織化学染色を用いて調べた。実際に、発明者は、アジュバント化学療法を開始する前であるにも関わらず、調査した腫瘍の約25％にp65の核局在を検出した(図4b)。対照的に、健康な対照から得た組織では、細胞質にだけ局在が見られた。これらの結果は、何らかの内因性NF−κB活性化刺激が治療前にかなりの数の症例に存在し、この付加的な経路を臨床的に関連性の高いものにしていることを示している。
【実施例８】
【０１４４】
エピルビシン／TNF併用処理はp53突然変異NQO1欠乏乳癌細胞の増殖を阻害しないNQO1及びp53の状態が異なる、別個の治療を受けた患者における臨床転帰の違いから、発明者は、培養細胞における応答について幾つかの検証可能な予測を行った。最初に、メトトレキサート(CMF)治療患者において、NQO1の状態と生存率との間に関連性がないとすると(表6)、発明者は、エピルビシンと異なり、メトトレキサートは、p53・p21及び／又はTNF・NF−κB経路を活性化しないと仮説をたてた。この予測と一致して、メトトレキサートは、細胞死誘発NF−κBメカニズムを活性化させるのではなく、阻害することが知られている(Majumdar et al．， 2001)。また、MCF7細胞株を用いた本発明の発明者による実験は、エピルビシン治療と比較して、p53／p21経路の全体的な応答性の低さと、NQO1の発現が低い細胞と高い細胞との間に違いがないことを示した(図4a)。
【０１４５】
第2に、突然変異p53及びNQO1＊2 (SS)遺伝子型を有する乳癌細胞は(死亡リスクが最も高いNQO1＊2 (SS)遺伝子型とp53免疫陽性とを有する患者群を厳密に模している(表2))は、エピルビシンとTNFとの併用処理にさえ耐性であると考えた。実際、p53野生型NQO1発現MCF7細胞は、エピルビシン単独、TNF単独又はエピルビシンとTNFとの併用処理に応答して増殖の低下を示したのに対し、p53突然変異NQO1＊2 MDA−MB231細胞の増殖は、どちらの単独処理においても若干、抑制されたにすぎなかった。最も重要なことに、エピルビシンとTNFとの同時処理は、阻害を行わなかっただけでなく、これらのp53／NQO1二重欠陥細胞の増殖を若干刺激さえしており(図4b)、臨床データを裏付けている。
【実施例９】
【０１４６】
NQO1＊2ホモ接合患者は乳癌転移後の生存率が低い
アントラサイクリン併用化学療法は、転移性乳癌の治療として最も効果的で広く用いられているレジメンである(Fossati et al． 1998， A'Hern et al． 1993)。NQO1＊2により、アントラサイクリンへの細胞耐性が臨床的に有意なレベルで付与されるなら、転移性乳癌のNQO1＊2ホモ接合患者において生存率の低下が予測される。実際、SSホモ接合患者の、転移が診断されたあとの生存率は低く、図6において、転移性乳癌であると診断されたあとの227人の患者の5年間の生存率を表すカプラン・マイヤー生存曲線によって示されるとおりである。このサンプルセットは、実施例1に記載の転移性乳癌の患者を全て含む。
【実施例１０】
【０１４７】
NQO1遺伝子及びその遺伝子産物の使用
本発明は、NQO1＊2遺伝子型の、ガン治療、特には乳癌における予後因子及び予測因子としての使用を、偶発腫瘍における綿密な統計学的アプローチを用いて初めて開示する。乳癌への罹患率、腫瘍の臨床的及び組織病理学的特徴並びに患者の全生存率及び無転移生存率に対するその影響を、十分な統計的検出力を得るのに十分なサイズの、広範囲にわたる、性状が十分にわかっているサンプルセットを用いて分析した。更に、インビトロでの機能面についての分析を行って、遺伝学的及び臨床病理学的発見をバリデート及び機構的な面で裏づけた。
【０１４８】
994人の乳癌患者における、特にエピルビシンを用いたアントラサイクリン系アジュバント化学療法(FEC)後のホモ接合NQO1＊2と生存率の不良との関連性(5年間の累積生存率0．17、95％ C．I． 0．00−0．47、p<0．0001)が示された。NQO1＊2ホモ接合性は、FEC療法及びp53免疫陽性腫瘍と組み合わさると、予後の不良を示す独立した、高度に有意な予測因子であると判明した(死亡の相対リスク13．61、95％ CI 3．86−47．94、p<0．0001)。更に、患者由来のNQO1＊2ホモ接合乳癌細胞及びリンパ芽球において、エピルビシン及びTNFに対する応答が損なわれた。ホモ接合NQO1＊2細胞におけるアポトーシス不全のモデルが提示され、p53及びTNF／NF−κB媒介のアポトーシスの不全並びにエピルビシン及びTNF誘発性細胞毒性の低下を特徴としており、アントラサイクリン系化学療法がふさわしい患者のNQO1遺伝子型同定が推奨される。
【０１４９】
NQO1＊2ホモ接合性と乳癌の予後不良、高い転移の可能性との間に、高度に有意な関連性が発見された。特に、NQO1＊2では、エピルビシンを用いたアントラサイクリン系アジュバント化学療法(FEC)後の生存率がたった17％と予測され、最も控えめな予測でも(上側95％信頼区間)、FEC療法群において、NQO1＊2ホモ接合体についての5年間の累積生存率は、その他の遺伝子型での67％(下側95％信頼区間)に対して47％に過ぎず、劇的な差を示している。NQO1＊2は、p53免疫陽性腫瘍を有する患者における生存率の低さにも関連しており、5年間の累積生存率は20％である。
【０１５０】
遺伝学的及び臨床的観察結果を、4つの相補的細胞培養モデルについてのインビトロ研究(エピルビシン及びTNFに対する応答を、遺伝子型同定された患者から得た遺伝子操作したガン細胞及び非悪性細胞株において分析した)により機能的な面でバリデートし、機構的な面で裏付けた。一貫して、NQO1欠乏NQO1＊2細胞(SS)は、NQO1高機能細胞(NQO1＊1)よりもエピルビシンに対する耐性が高く、高レベルのNQO1により、細胞はエピルビシン及びTNF処理に対してより感受性が高くなった。特に、NQO1は、TNF媒介細胞死をヒト乳癌・肉腫細胞株において高める。
【０１５１】
入手可能な文献及び本発明の結果に基づき、NQO1が、おそらくは少なくとも3通りのメカニズムによりエピルビシン治療の転帰に影響を与えると言えそうである。つまり、p53腫瘍抑制因子、TNF／NF−κB経路及び反応性酸素種(reactive oxygen species：ROS)の直接的な解毒化である(図4c)。NQO1のTNF／NF−κBカスケードにおける役割は機構的にはまだわかっていないが、p53関連機能は、NQO1媒介の、20Sプロテオソームを介した「デフォルトでの分解(degradation by default)」からのp53の保護を反映しているようである(Asher et al， 2001; 2002a; 200b)。26Sプロテオソームを介したMDM2／ユビキチン媒介のp53の分解とは異なり、「デフォルトでの分解」には、p53の改変を必要としない(Asher et al．， 2005)。このことは、機能性NQO1を欠損した細胞における、基底より低いレベルのp53につながり(Asher et al．， 2001)、後にMDM2経路のNQO1非依存性の優勢効果によってマスクされる、本発明の実験におけるp53／p21に対するNQO1の影響の遷移的な性質を説明している。重要な点は、エピルビシン処理されたNQO1欠乏細胞において観察される、野生型p53の一時的な不足さえ、インビトロでのガン細胞生存率を上昇させ、これがエピルビシン系化学療法後の患者の生存率の低さと相関していることである。
【０１５２】
本発明の簡略化された機能モデルは、乳癌細胞においてエピルビシンへの応答に異なった形で影響を与えるいくつかの考えられ得る状況を大筋で提示している(図4c)。エピルビシンへの細胞応答は、p53とNQO1の両方が正常である場合に最も好ましい(最大限のガン細胞死を引き起こす)。あまり顕著ではないがそれでもプラスである効果が、NQO1又はp53欠乏で見られ、並行した細胞死経路におけるこの2種類のタンパク質の部分的にリンクし、部分的に相互に独立した役割と一致している(図4c)。重要な点は、p53とNQO1の両方の同時の欠乏は、エピルビシン処理に対する細胞応答及び乳癌患者の生存率に有害と見られることである。この組み合わせは、2種類のアポトーシス促進経路を無効にするだけでなく、ガン細胞の生存率を上昇させる及び／又はこのような治療に耐性のある腫瘍の進行を促進しさえする可能性がある(図1。表6も参照のこと)。このような悪影響は、機能不全のp53及びNQO1により損傷したDNAに高度に耐えるようになった細胞における、エピルビシンによって誘発されたDNA損傷により増幅されるゲノムの不安定さの上昇を反映していると思われる。ガン細胞生存率の上昇に寄与していると思われる別のメカニズムは、DNA損傷により誘発されるATMキナーゼ及びNEMO (NF−κBの上流調節因子)に応答する、NF−κB経路のp53及びNQO1非依存性分岐路の(アポトーシス促進性ではなく)生存率促進効果である(Kovalenko et al．， 2006)。また、p53は、NF−κBのこれらの抗アポトーシス及び増殖誘発能を転写段階で抑制する(Janssens et al．， 2006)。最後になったが、野生型p53 (Sablina et al．， 2005)及びNQO1 (導入部を参照のこと)の両方の抗酸化機能は、ガン細胞における高い酸化ストレス条件下にあって間違いなく重要であり、これらの解毒作用が両方とも欠けると、より顕著なROS誘発性のDNA損傷、遺伝子不安定性の上昇、更なるガン進行に至る可能性がある(図4c)。p53が異常であるときNQO1が特に必要であるという事実は、p53免疫陽性腫瘍を有する患者は、この患者がNQO1ヘテロ接合(PS)であるときに、NQO1野生型ホモ接合体と比べて低い生存率を示すという概念からも明らかである(追加図面S1b)。やむおえなく単純化され、一部推測の域を出ないとはいえ、このモデル(詳細については図4cを参照のこと)は、臨床及び実験データに一致している。
【０１５３】
総合すると、臨床的及び機能的な発見は、NQO1＊2ホモ接合乳癌におけるエピルビシン及びTNF誘発性細胞毒性の低下と、その結果としての治療、好ましくはアジュバント化学療法(特にはエピルビシン系)をうけた患者における生存率の劇的な低下を示唆した。このことは、世界人口レベルでかなりの数の患者に影響をあたえ得る。白人の約4％、アジア人の20％もが、NQO1＊2についてホモ接合だからである(Kelsey et al．， 1997; Nioi et al．， 2004)。毎年、100万人を越える乳癌の症例が世界中で診断されており(Parkin et al．， 2005)、かなりの割合の患者がアントラサイクリン系の治療に適している。このような患者において、NQO1遺伝子型が、治療の予測因子となる。NQO1の状態を用いて、その他のタイプの悪性腫瘍についても予測的な情報を得ることができる。エピルビシンに類似した形でDNA切断を引き起こす及び／又はアポトーシス反応を誘発するその他のモダリティで治療する患者における、予測因子候補としてのNQO1の価値を研究する。
【０１５４】
本発明においては、P187Sをコードするタンパク質に至るc．609C＞Tアレルを有するNAD(P)H：キノン酸化還元酵素1 (NQO1)遺伝子を、予測マーカーとして用いる。本発明の好ましい実施形態において、本方法は、突然変異の存在、あるいは正常若しくは機能性遺伝子又は遺伝子産物（転写、翻訳産物を含む）の不在を検出することを含む。本発明は、遺伝子型同定法及び表現型同定法に基づいたものであり、DNA、RNA若しくはアミノ酸配列の特異的な測定又は機能性に基づいた技法を応用している。このような配列特異的な遺伝子型同定法の例には、以下に限定されるものではないが、制限酵素断片長多型PCR (RFLP−PCR)、SSCP、アレル特異的ハイブリダイゼーション、プライマー伸長法、アレル特異的オリゴヌクレオチド・ライゲーション又はシークエンシング等の単一ヌクレオチド多型(SNP)を検出する及び遺伝子型同定する技法が含まれる。WO 91／13075に記載されている、DNAポリメラーゼをSNPの同定に応用しているいわゆるミニ・シークエンシング法も、SNPの同定に逆転写酵素を応用している方法と同様に用いることができる。
【０１５５】
NQO1における多型は、極めて少量である酵素又は酵素の完全なる欠損に至ることが知られているため、その活性を用いて潜在的な患者をスクリーニングすることができる。c．609C＞Tアレルのホモ接合保因者(NQO1＊2と称されることが多い)は測定可能なNQO1活性を有しておらず、ユビキチンプロテアソーム経路を介したその素早い代謝回転により、NQO1 P187Sタンパク質が極めて低レベルであることを反映していると知られている(Siegel et al．， 1999; 2001)。従って、ある人間の遺伝子型は、NQO1活性のレベルの測定による表現型の決定を通して間接的に同定することができる。NQO1活性は、例えば、BeallらのCancer Res． 54：3196−3201 (1994) 、SiegelらのMol． Pharmacol．， 44：1128−1134 (1993)、SiegelらのCancer Res．， 50：7293−7300 (1990)に記載の基質を用いて測定することができる。実際、AZQは、Beall et al．， Mol． Pharmacol． 48：499−504 (1995)、Ross et al．， Cancer Metastasis Rev．， 12：83−101 (1993)のいずれも示し損ねた。
【０１５６】
従って、活性測定により、タンパク質を含むサンプルから、患者を特定の治療から除外したほうがよいか否かを判断するための有用な方法が得られる。サンプルにおけるNQO1酵素のレベル低下又は完全なる欠損は、NQO1タンパク質に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いた免疫ブロット等の方法により判定することができる。
【０１５７】
表1：NQO1遺伝子型に沿った非選択乳房腫瘍の組織病理学的特徴付けP値をSS (NQO1＊2)ホモ接合体及びその他の遺伝子型について計算した。nsは統計学的に有意でないp値を示す。セル値が5以下である場合、フィッシャーの正確確率検定(Fisher's exact test)をカイ二乗検定の代わりに用いた。上皮内癌の症例は分析から除外した。省略記号：T、腫瘍直径;N、結節状態;M、遠隔転移;ER、エストロゲン受容体;PgR、プロゲステロン受容体;P53 ICH、p53免疫組織化学分析結果
【０１５８】
【表１】
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【０１５９】
表2：NQO1遺伝子型、p53免疫組織化学分析結果(IHC)及びFEC療法の状態の相互作用が多変量生存率分析において独立した予後因子として浮上
乳癌における予測因子の最適化されたコックス比例ハザードモデル：(a)アジュバント化学療法を考慮せず;(b)アジュバント化学療法のタイプを追加。2つの変数間の相互作用を含む。結果における変数は全て2値であり分類別である(表4を参照のこと)。RRは、このモデルの中での、特徴について陽性である患者における追跡調査期間中の任意の時点での平均死亡リスク比を表す。相互作用項について陽性とするには、患者はその成分の全てについて陽性でなくてはならない。欠測値がある患者は分析から除外されている。有効症例のn＝685。省略記号：FEC、5−フルオロウラシル (5−FU) + エピルビシン + シクロホスファミド;T、腫瘍直径;N、結節状態;M、遠隔転移;ER、エストロゲン受容体;PgR、プロゲステロン受容体;P53 ICH、p53免疫組織化学分析結果
【０１６０】
【表２】
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【０１６１】
表3：生存率分析で用いたサンプルセットの記述統計
サンプルセットの総数(NQO1 P187S遺伝子型の偶発腫瘍及び入手可能な十分な追跡調査データ)は994であった。省略記号：FEC、5−フルオロウラシル (5−FU) + エピルビシン + シクロホスファミド;CMF、シクロホスファミド + メトトレキサート + フルオロウラシル5−FU
【０１６２】
【表３】
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【０１６３】
表4：多変量コックス比例ハザード分析に含まれる変数
これらの変数は全てコックス回帰最適化アルゴリズムに使用可能であった。表2に示したように、最終モデルにおいて、最適化処理後の最良適合モデルに残る変数のみを示す。省略記号：FEC、5−フルオロウラシル (5−FU) + エピルビシン + シクロホスファミド;T、腫瘍直径;N、結節状態;M、遠隔転移;ER、エストロゲン受容体;PgR、プロゲステロン受容体;P53 ICH、p53免疫組織化学分析結果
【０１６４】
【表４】
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【０１６５】
表5：サンプルセット及び年齢群によるNQO1 P187S遺伝子型頻度
遺伝子型頻度を、症例の対照群と亜群との間で独立性のカイ二乗検定を用いて比較した。nsは有意でないp値(関連性なし)を示す。
【０１６６】
【表５】
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【０１６７】
表6：治療及びp53免疫組織化学分析結果によって層別化した亜群における全生存率及び無転移生存率統計
FEC療法を受けた患者は内分泌療法系亜群から除外されている。5年間の追跡調査後の累積生存率についての信頼区間を、SS (NQO1＊2)ホモ接合体対その他の(PP／PS)遺伝子型のログランク検定のp値と共に示す。
【０１６８】
【表６】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図２ａ】
2010511380.tif 000014
【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図３ａ】
2010511380.tif 000020
【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図３ｈ】
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【図３ｉ】
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【図３ｋ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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