(57)【要約】本発明は、Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ１（ＪＮＫ１タンパク質をコードする遺伝子の発現の調節を介する処置に敏感な疾患または障害を処置および診断するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、被験体において肥満症、糖尿病および代謝症候群を処置する方法も提供する。本発明の方法は、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物の必要のある被験体へのそのような投与を包含する。このアンチセンス化合物は、配列番号：８７、８９、９０および９１に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースレベルを低下する必要のある被験体においてグルコースレベルを低下する方法であって、該被験体に、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与することによって、グルコースレベルを低下する工程を包含する、方法。
【請求項２】
脂質レベルを低下する必要のある被験体において脂質レベルを低下する方法であって、該被験体に、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与することによって、脂質レベルを低下する工程を包含する、方法。
【請求項３】
前記脂質レベルが、トリグリセリドもしくはコレステロールまたはそれらの組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
代謝症候群を処置する必要のある被験体において代謝症候群を処置する方法であって、該被験体に、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与することによって、代謝症候群を処置する工程を包含する、方法。
【請求項５】
前記投与することによる工程が、体重、トリグリセリドレベルもしくはグルコースレベルまたはそれらの組み合わせを低下する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
肥満症を処置する必要のある被験体において肥満症を処置する方法であって、該被験体に、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与することによって、肥満症を処置する工程を包含する、方法。
【請求項７】
前記投与することによる工程が、代謝率を増加し、体重もしくは脂肪量またはそれらの組み合わせを減少する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
糖尿病を処置する必要のある被験体において糖尿病を処置する方法であって、該被験体に、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与することによって、糖尿病を処置する工程を包含する、方法。
【請求項９】
前記投与が、肥満症、グルコースレベル、脂質レベルの低下または代謝率もしくはインスリン感度の増加あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらす、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
糖尿病が、２型糖尿病である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
被験体において糖尿病を処置する方法であって、該被験体に、血糖降下薬およびＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を含んでいる薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
被験体において糖尿病を処置する方法であって、該被験体に、血糖降下薬およびＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
前記投与することによる工程が、グルコースレベルを低下するか、もしくはインスリン感度を改善するか、またはその両方を行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記血糖降下薬が、インスリンまたはインスリンアナログ、ビグアナイド、メグリチニド、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素またはアルファ−グルコシダーゼインヒビターである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記血糖降下薬が、ビグアナイドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ビグアナイドが、メトホルミンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記血糖降下薬が、メグリチニドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記メグリチニドが、ナテグリニドまたはレパグリニドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記血糖降下薬が、チアゾリジンジオンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記チアゾリジンジオンが、ナテグリニドピオグリタゾン、ロシグリタゾンまたはトログリタゾンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記血糖降下薬が、ロシグリタゾンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
血中グルコースレベルを低下し、そして体重を維持するか、または減少する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記血糖降下薬が、アルファ−グルコシダーゼインヒビターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記アルファ−グルコシダーゼインヒビターが、アカルボースまたはミグリトールである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記血糖降下薬が、スルホニル尿素である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
被験体において肥満症または代謝症候群を処置する方法であって、該被験体に、脂質低下薬およびＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を含んでいる薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
被験体において代謝症候群の肥満症を処置する方法であって、該被験体に、脂質低下薬およびＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
前記脂質低下薬が、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターまたはコレステロール吸収インヒビターである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記脂質低下薬が、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターが、スタチンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記スタチンが、アトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチンまたはロスバスタチンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記脂質低下薬が、コレステロール吸収インヒビターである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記コレステロール吸収インヒビターが、エゼチミブである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記肥満症が、精神治療薬を用いる処置によって誘導される、請求項７に記載の方法。
【請求項３５】
投与が、前記精神治療薬の送達と同時である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記精神治療薬が、オランザピンまたはリスペリドンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
投与が、前記精神治療薬のＣＮＳ作用に影響を及ぼさずに、代謝率の上昇もしくは脂肪過多の減少またはその両方をもたらす、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記血糖降下薬およびアンチセンス化合物が、同時に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項３９】
前記投与が、腸管外投与を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記腸管外投与が、皮下投与または静脈内投与を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記アンチセンス化合物が、配列番号：８７、８９、９０または９１に対して少なくとも８０％の相補性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記アンチセンス化合物が、配列番号：８７、８９、９０または９１に対して少なくとも９０％の相補性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記アンチセンス化合物が、配列番号：８７、８９、９０または９１に対して少なくとも９５％の相補性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記アンチセンス化合物が、配列番号：８７、８９、９０または９１に対して１００％の相補性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記アンチセンス化合物が、１２〜３０ヌクレオシド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記アンチセンス化合物が、１８〜２４ヌクレオシド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記アンチセンス化合物が、１９〜２２ヌクレオシド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記アンチセンス化合物が、２０ヌクレオシド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記アンチセンス化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記アンチセンス化合物が、少なくとも１つの改変された糖部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記改変された糖部分が、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記アンチセンス化合物が、少なくとも１つの改変されたヌクレオシド間結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
前記アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記アンチセンス化合物が、少なくとも１つの改変された核酸塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
前記アンチセンス化合物の各シトシンが、５−メチルシトシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
前記アンチセンス化合物が、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
前記アンチセンス化合物が、ギャップが広いアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５個の２’−ＭＯＥヌクレオチドのウイングセグメント間に位置する１０個の２’−デオキシヌクレオチドのギャップセグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本願は、配列表とともに電子的様式で出願されている。この配列表は、２００７年８月６日に作成されたＢＩＯＬ００８９ＷＯＳＥＱ．ｔｘｔという名称のファイルとして提供され、そのファイルのサイズは、６４Ｋｂである。この配列表の電子的様式における情報は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＪＮＫ遺伝子によってコードされる酵素であるＪｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫタンパク質）のレベルを検出し、調節するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肥満症、２型糖尿病および関連する合併症の有病率の急速な上昇は、世界的に大きな健康問題である。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙ（ＮＨＡＮＥＳ）の２００１年から２００４年までのデータによると、米国の成人の約３分の２が、過体重であり、ほぼ３分の１が、肥満である。過体重および肥満症は、世界中で見られるが、これらの病気の米国における有病率は、先進国の中でも高い順位である。過体重とは、基準と比べて過剰な体重のことを指す。この過剰な体重は、筋肉、骨、脂肪および／または体内水分に由来し得る。肥満症とは、異常に高い割合の体脂肪を有することを特に指す。肥満の個体では、健常な体重の個体と比較して、すべての原因による死亡リスクが１０〜５０パーセント高い。この高リスクのほとんどは、心臓血管が原因によるものである。肥満症は、健常な体重の個体に対して、米国人口において１年あたり約１１２，０００の過剰死亡と関連している。肥満症は、糖尿病、冠状動脈心疾患、高い血中コレステロール、脳卒中、高血圧症、胆嚢疾患、変形性関節症、睡眠時無呼吸および他の呼吸器の問題ならびにいくつかの型の癌（乳房、結腸直腸、子宮内膜および腎臓）に対する公知の危険因子である。
【０００４】
糖尿病は、低インスリン産生もしくはインスリン抵抗性またはその両方から生じ得る不十分なインスリン作用に起因する高血糖症を特徴とする障害である。さらに、長期間の高血糖症に起因する糖毒性（ｇｌｕｃｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は、その疾患を増悪する組織依存性のインスリン抵抗性を誘導する。慢性高血糖症は、心臓疾患、網膜症、腎症およびニューロパシーをはじめとした糖尿病関連合併症に対する主要な危険因子でもある。糖尿病および肥満症（現在、時折集合的に「糖尿肥満（ｄｉａｂｅｓｉｔｙ）」といわれることがある）は、肥満症が糖尿病の病態を増悪すると知られており、糖尿病患者の６０％超が肥満であるという点で相関する。ほとんどのヒト肥満症は、インスリン抵抗性およびレプチン抵抗性と関連する。肥満症は、糖尿病自体よりもインスリン作用に対して大きな影響力を有し得る。
【０００５】
糖尿病、肥満症、代謝症候群および他の疾患ならびにグルコースおよび／もしくは脂質の代謝ならびに／またはそれらの調節不全（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に関連する状態に対する有効な処置法が必要とされている。本発明は、この必要性を満たし、同様に関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与することによって、被験体においてグルコースレベルを低下する方法を提供する。異なる実施形態において、本発明はまた、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与することによって、被験体において脂質レベルを低下する方法も提供する。さらなる実施形態では、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与することによって被験体において代謝症候群を処置する方法もまた、本発明によって提供される。
【０００７】
さらに異なる実施形態において、本発明はまた、被験体において肥満症、糖尿病および代謝症候群を処置する方法も提供する。本発明の方法は、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物の必要のある被験体へのそのような投与を包含する。
【０００８】
本発明はまた、血糖降下薬およびＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与することによって、被験体において糖尿病を処置する方法を提供する。特定の実施形態において、被験体において糖尿病を処置する方法は、血糖降下薬およびＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を含んでいる薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０００９】
脂質低下薬およびＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与することによって、被験体において糖尿病、糖尿病および／または代謝症候群を処置する方法もまた提供される。ある特定の実施形態において、被験体において糖尿病を処置する方法は、脂質低下薬およびＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を含んでいる薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【００１０】
配列番号：８７、８９、９０および９１に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、特許請求される方法の実施に有用なアンチセンス化合物もまた、提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
定義
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。特定の定義が提供されない限り、本明細書中に記載される分析化学、有機合成化学ならびに医薬品化学および製薬化学に関連して利用される命名法ならびにそれらの手順および手法は、当該分野で周知であり、かつ、当該分野で通常使用されているものである。標準的な手法は、化学合成、化学分析、薬学的な調製物、処方物および送達ならびに被験体の処置に使用され得る。ある特定のそのような手法および手順は、例えば、“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”ＳａｎｇｖｉおよびＣｏｏｋ編，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９９４；および“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０に見られ；これらは、任意の目的で本明細書によって参考として援用される。本明細書中の開示全体を通じて参照されるすべての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、ＧＥＮＢＡＮＫ配列、ウェブサイトならびに他の公開されたものは、認められる場合に、別段述べられない限り、それらの全体が参考として援用される。本明細書中の用語について複数の定義が存在する場合は、この項における定義を優先する。ＵＲＬまたは他のそのような識別子もしくはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変化し得る上、インターネット上の特定の情報は、無くなり得るが、インターネットを検索することによって、同等の情報を探し出すことができることが理解される。それらに対する参照は、そのような情報が利用可能であり、公然と広まっていることを証明している。
【００１２】
「肥満症」は、除脂肪体重に関して過剰に多量の体脂肪または脂肪組織と定義される。その体脂肪の量（または脂肪過多）は、全身の脂肪の分布と脂肪組織蓄積のサイズの両方についての関連を包含する。体脂肪の分布は、皮下脂肪の測定、ウエストとヒップの周囲長比または超音波、コンピュータ断層撮影もしくは磁気共鳴画像などの手法によって推定され得る。Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎによれば、３０以上のボディマス指数（ＢＭＩ）を有する個体が肥満と考えられる。
【００１３】
インスリン抵抗性は、正常量のインスリンが、脂肪、筋肉および肝臓細胞から正常なインスリン応答をもたらすのに不適当な状態である。脂肪細胞におけるインスリン抵抗性は、蓄積されたトリグリセリドの加水分解を起こし、それによって、血漿中の遊離脂肪酸が増加する。筋肉におけるインスリン抵抗性は、グルコースの取り込みを減少させるのに対し、肝臓におけるインスリン抵抗性は、グルコースの貯蔵を減少させ、その両方が、血糖を上昇させる働きをもたらす。インスリン抵抗性に起因したインスリンおよびグルコースの高い血漿レベルによって、しばしば代謝症候群および２型糖尿病が引き起こされる。
【００１４】
「２型糖尿病」（以前にＩＩ型真性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、肥満症関連糖尿病または成人発症型糖尿病と呼ばれていた２型真性糖尿病としても知られる）は、主にインスリン抵抗性、相対的なインスリン欠損および高血糖症を特徴とする代謝障害である。
【００１５】
耐糖能試験は、どれくらい迅速にグルコースが血中からクリアランスされるかを測定するためのグルコースの投与である。この試験は、糖尿病、インスリン抵抗性および時折、反応性低血糖症について試験するために通常使用される。通常の試験が、技術的に経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）であるので、グルコースは、経口的に投与されることが最も多い。
【００１６】
「代謝率」とは、消費されるエネルギーの量のことをいう。基礎代謝率（ＢＭＲとしても知られる）は、吸収後の状態（消化器系が活動していないことを意味し、ヒトでは約１２時間の絶食が必要である）において中間的な穏やかな環境での安静時に消費されるエネルギーの量である。この状態におけるエネルギーの放出は、重要な臓器（例えば、心臓、肺、脳および残りの神経系、肝臓、腎臓、生殖器、筋肉ならびに皮膚）が機能するためだけに十分である。ＢＭＲは、年齢および除脂肪体重の喪失に伴って低下する。心臓血管の運動および筋肉量の増加は、ＢＭＲを上昇させ得る。疾病、以前に消費された食物および飲料、環境温度ならびにストレスレベルが、その人のエネルギー消費のすべてに影響を及ぼし得、また、ガス分析によって明らかにされるその人のＢＭＲに影響を及ぼし得る。それは、その人が絶対安静時であるが、覚醒しているときに測定される。正確なＢＭＲ測定には、その人の交感神経系が刺激されていないことが要求される。基礎代謝率は、非常に制限された環境下で測定される。それほど厳しくない条件下で測定される、より一般的な測定および密接な関係がある測定は、安静時代謝率（ＲＭＲ）である。「代謝的（性）」および「代謝」は、当該分野で周知の用語であり、一般に、生体内で起きる生化学的なプロセスの全範囲を包含する。代謝障害としては、高血糖症、前糖尿病、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、肥満症、インスリン抵抗性および代謝症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
本明細書中で使用されるとき、用語「処置」および「処置する」とは、上記疾患または状態の変化または改善をもたらす本発明の組成物の投与のことをいう。予防、回復および／または処置は、上記疾患または状態の経過を変化させるために、一定間隔でか、またはその疾患もしくは状態の発症前に、複数回用量の投与を必要とし得る。さらに、単一の薬剤が、状態または疾患の予防、回復および処置の各々のために単一の個体において連続的または同時に使用され得る。
【００１８】
本明細書中で使用されるとき、用語「医薬品」（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、脂質低下薬または血糖降下薬を含む）とは、被験体に投与されたときに治療的な利益をもたらす物質のことをいう。ある特定の実施形態において、ＪＮＫ１に対して標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬品である。
【００１９】
「治療有効量」は、被験体に治療的な利益をもたらす医薬品の量を意味する。ある特定の実施形態において、ＪＮＫ１核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物の治療有効量は、被験体においてＬＤＬ−Ｃを減少させる量である。
【００２０】
「薬学的組成物」は、被験体への投与に適した物質の混合物を意味する。薬学的組成物は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせ、アンチセンスオリゴヌクレオチドと非アンチセンス医薬品との組み合わせならびに滅菌水溶液または当該分野で公知の他の標準的な薬学的添加剤の存在を含み得る。
【００２１】
「投与する」は、医薬品または組成物を被験体に提供することを意味し、投与としては、医療専門家による投与および自己投与が挙げられるがこれらに限定されない。同時投与は、動物への２つ以上の医薬品の投与である。その２つ以上の医薬品は、単一の薬学的組成物中のものであり得るか、または、別個の薬学的組成物中のものであり得る。２つ以上の医薬品の各々は、同じ投与経路または異なる投与経路によって投与され得る。同時投与は、並行した投与、併用した投与または連続的な投与を包含する。
【００２２】
本明細書中で使用されるとき、用語「被験体」とは、薬学的組成物が投与される動物（ヒトが挙げられるがこれに限定されない）のことをいう。動物としては、ヒトまたは非ヒト動物（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタおよび非ヒト霊長類（サルおよびチンパンジーが挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられる。
【００２３】
「腸管外投与」は、注射または注入による投与を意味する。腸管外投与としては、皮下投与、静脈内投与または筋肉内投与が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
持続時間とは、活性またはイベントが継続する期間のことをいう。ある特定の実施形態において、処置の持続時間は、医薬品の用量が投与される期間である。
【００２５】
「皮下投与」は、皮膚の直下への投与を意味する。「静脈内投与」は、静脈への投与を意味する。
【００２６】
用量は、単回投与において提供される医薬品の特定の量を意味する。ある特定の実施形態において、１用量は、２以上のボーラス、錠剤または注射で投与され得る。例えば、ある特定の実施形態において、皮下投与が望まれる場合、所望の用量は、単一注射によって容易に適応されない体積を必要とする。そのような実施形態では、２回以上の注射を使用して、その所望の用量を達成することができる。ある特定の実施形態において、被験体における注射部位反応を最小にするために、２回以上の注射で１用量が投与され得る。剤形は、医薬品が提供される形態である。ある特定の実施形態において、剤形は、凍結乾燥されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいるバイアルである。ある特定の実施形態において、剤形は、再構成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいるバイアルである。
【００２７】
「代謝症候群」は、代謝性起源の脂質および非脂質の心臓血管危険因子のクラスター化を特徴とする状態を意味する。ある特定の実施形態において、代謝症候群は、以下の因子のうちのいずれか３つが存在することによって同定される：男性では１０２ｃｍ超または女性では８８ｃｍ超のウエスト周囲長；少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬの血清トリグリセリド；男性では４０ｍｇ／ｄＬ未満または女性では５０ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬ−Ｃ；少なくとも１３０／８５ｍｍＨｇの血圧；および少なくとも１１０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖。これらの決定因子は、診療において容易に測定可能である（ＪＡＭＡ，２００１，２８５：２４８６−２４９７）。
【００２８】
本明細書中で使用されるとき、主要な危険因子という用語は、特定の疾患または状態に対する高リスクに関与する因子のことをいう。ある特定の実施形態において、冠状動脈心疾患に対する主要な危険因子としては、喫煙、高血圧症、低ＨＤＬ−Ｃ、冠状動脈心疾患の家族歴および年齢が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
「ＣＨＤ危険因子」は、ＣＨＤリスク等価物および主要な危険因子を意味する。
【００３０】
「冠状動脈心疾患（ＣＨＤ）」は、血液および酸素を心臓に供給する小血管の狭小化を意味し、これは、アテローム性動脈硬化症の結果であることが多い。
【００３１】
「冠状動脈心疾患リスクの低下」は、被験体が冠状動脈心疾患を発症する可能性の低下を意味する。ある特定の実施形態において、冠状動脈心疾患リスクの低下は、１つ以上のＣＨＤ危険因子の改善、例えば、ＬＤＬ−Ｃレベルの低下によって判断される。
【００３２】
「アテローム性動脈硬化症」は、大動脈および中型の動脈に影響を及ぼす動脈の硬化を意味し、脂肪性沈着物の存在を特徴とする。その脂肪性沈着物は、「アテローム」または「プラーク」と呼ばれており、これらは、主に、コレステロールおよび他の脂肪、カルシウムおよび瘢痕組織からなり、動脈の裏打ちを損傷する。
【００３３】
「冠状動脈心疾患の病歴」は、被験体または被験体の家族のメンバーの病歴における臨床的に明らかな冠状動脈心疾患の発症を意味する。
【００３４】
「早発性冠状動脈心疾患」は、５０歳より前の冠状動脈心疾患の診断を意味する。
【００３５】
「スタチン不耐性個体」は、スタチン治療の結果として、クレアチンキナーゼの増加、肝臓機能試験での異常、筋痛または中枢神経系副作用のうちの１つ以上を経験する個体を意味する。
【００３６】
「有効性」は、所望の作用をもたらす能力を意味する。例えば、脂質低下治療の有効性は、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＩＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃ、ＡｐｏＢ、リポタンパク質（ａ）またはトリグリセリドのうちの１つ以上の濃度の減少であり得る。
【００３７】
「許容可能な安全性プロファイル」は、臨床的に許容可能な限度内の副作用パターンを意味する。
【００３８】
「副作用」は、所望の作用以外の、処置に関与し得る生理反応を意味する。ある特定の実施形態において、副作用としては、注射部位反応、肝臓機能試験での異常、腎機能の異常、肝臓毒性、腎臓毒性、中枢神経系の異常および筋障害が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、血清中のアミノトランスフェラーゼレベルの上昇は、肝臓毒性または肝臓機能の異常を示唆し得る。例えば、ビリルビンの増加は、肝臓毒性または肝臓機能の異常を示唆し得る。
【００３９】
「注射部位反応」は、被験体における注射部位の皮膚の炎症または異常な発赤を意味する。
【００４０】
「個体の服薬遵守」は、推奨される治療または処方された治療に対する被験体によるアドヒアランスを意味する。
【００４１】
「脂質低下治療」は、被験体において１つ以上の脂質を減少させるために被験体に提供される治療的なレジメンを意味する。ある特定の実施形態において、脂質低下治療は、被験体においてＡｐｏＢ、総コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＩＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃ、トリグリセリド、低密度ＬＤＬ粒子およびＬｐ（ａ）のうちの１つ以上を減少させるために提供される。
【００４２】
「脂質低下剤」は、個体において脂質の低下を達成するために被験体に提供される医薬品を意味する。例えば、ある特定の実施形態において、脂質低下剤は、ＡｐｏＢ、ＬＤＬ−Ｃ、総コレステロールおよびトリグリセリドのうちの１つ以上を減少させるために被験体に提供される。
【００４３】
「ＬＤＬ−Ｃ目標」は、脂質低下治療後に望まれるＬＤＬ−Ｃレベルを意味する。
【００４４】
「服薬遵守（Ｃｏｍｐｌｙ）」は、推奨される治療に対する被験体によるアドヒアランスを意味する。
【００４５】
「推奨される治療」は、疾患の処置、回復または予防のために、医療専門家が推奨する治療的なレジメンを意味する。
【００４６】
「低ＬＤＬレセプター活性」は、血流中の臨床的に許容可能なＬＤＬ−Ｃレベルを維持するために十分高くないＬＤＬレセプター活性を意味する。
【００４７】
「心臓血管アウトカム」は、主な有害心臓血管イベントの発生を意味する。
【００４８】
「心臓血管アウトカムの改善」は、主な有害心臓血管イベントまたはそのリスクの発生の減少を意味する。主な有害心臓血管イベントの例としては、死亡、再梗塞、脳卒中、心原性ショック、肺浮腫、心拍停止および心房リズム障害が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
「心臓血管アウトカムの代用マーカー」は、心臓血管イベントまたはそのリスクの間接的な指標を意味する。例えば、心臓血管アウトカムの代用マーカーとしては、頸動脈内膜中膜厚（ＣＩＭＴ）が挙げられる。心臓血管アウトカムの代用マーカーの別の例としては、アテロームサイズが挙げられる。アテロームサイズは、血管内超音波（ＩＶＵＳ）によって測定され得る。
【００５０】
「ＨＤＬ−Ｃの増加」は、被験体における経時的な血清ＨＤＬ−Ｃの増加を意味する。
【００５１】
「脂質低下」は、被験体における経時的な１つ以上の血清脂質の減少を意味する。
【００５２】
「治療的な生活様式の変更」は、コレステロールを低下させるためおよび心臓疾患発症のリスクを低下させるために意図された食餌様式および生活様式の変更を意味し、それらとしては、食餌から摂取される１日の総カロリー、総脂肪、飽和脂肪、多価不飽和脂肪、一不飽和脂肪、炭水化物、タンパク質、コレステロール、不溶性繊維に関する推奨ならびに身体活動に関する推奨が挙げられる。
【００５３】
「スタチン」は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの活性を阻害する医薬品を意味する。
【００５４】
「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター」は、酵素ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの阻害を介して作用する医薬品を意味する。
【００５５】
「コレステロール吸収インヒビター」は、食餌から得られる外来性コレステロールの吸収を阻害する医薬品を意味する。
【００５６】
「ＬＤＬアフェレーシス」は、血中からＬＤＬ−Ｃを除去するアフェレーシスの形態を意味する。代表的には、被験体の血液を静脈から取り出し、赤血球と血漿とに分離する。その血漿からＬＤＬ−Ｃを濾過して除去した後、その血漿および赤血球を個体に戻す。
【００５７】
「ＭＴＰインヒビター」は、酵素ミクロソームトリグリセリド移入タンパク質を阻害する医薬品を意味する。
【００５８】
「低密度リポタンパク質−コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）」は、低密度リポタンパク質粒子内に保持されているコレステロールを意味する。血清（または血漿）中のＬＤＬ−Ｃの濃度は、代表的には、ｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌの単位で定量化される。「血清ＬＤＬ−Ｃ」および「血漿ＬＤＬ−Ｃ」は、それぞれ血清中および血漿中のＬＤＬ−Ｃを意味する。
【００５９】
「超低密度リポタンパク質−コレステロール（ＶＬＤＬ−Ｃ）」は、超低密度リポタンパク質粒子に関連するコレステロールを意味する。血清（または血漿）中のＶＬＤＬ−Ｃの濃度は、代表的には、ｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌの単位で定量化される。「血清ＶＬＤＬ−Ｃ」および「血漿ＶＬＤＬ−Ｃ」は、それぞれ血清中または血漿中のＶＬＤＬ−Ｃを意味する。
【００６０】
「中間低密度リポタンパク質−コレステロール（ＩＤＬ−Ｃ）」は、中間密度リポタンパク質に関連するコレステロールを意味する。血清（または血漿）中のＩＤＬ−Ｃの濃度は、代表的には、ｍｇ／ｍＬまたはｎｍｏｌ／Ｌの単位で定量化される。「血清ＩＤＬ−Ｃ」および「血漿ＩＤＬ−Ｃ」は、それぞれ血清中または血漿中のＩＤＬ−Ｃを意味する。
【００６１】
「非高密度リポタンパク質−コレステロール（非ＨＤＬ−Ｃ）」は、高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質に関連するコレステロールを意味し、それらとしては、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−ＣおよびＩＤＬ−Ｃが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６２】
「高密度リポタンパク質−Ｃ（ＨＤＬ−Ｃ）」は、高密度リポタンパク質粒子に関連するコレステロールを意味する。血清（または血漿）中のＨＤＬ−Ｃの濃度は、代表的には、ｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌの単位で定量化される。「血清ＨＤＬ−Ｃ」および「血漿ＨＤＬ−Ｃ」は、それぞれ血清中または血漿中のＨＤＬ−Ｃを意味する。
【００６３】
「総コレステロール」は、すべてのタイプのコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ＩＤＬ−ＣおよびＶＬＤＬ−Ｃが挙げられるがこれらに限定されない）を意味する。血清（または血漿）中の総コレステロールの濃度は、代表的には、ｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌの単位で定量化される。
【００６４】
「リポタンパク質（ａ）」または「Ｌｐ（ａ）」は、ＬＤＬ−Ｃ、アポリポタンパク質（ａ）粒子およびアポリポタンパク質Ｂ−１００粒子を含むリポタンパク質粒子を意味する。
【００６５】
「ＡｐｏＡ１」は、血清中のアポリポタンパク質−Ａ１タンパク質を意味する。血清中のＡｐｏＡ１の濃度は、代表的には、ｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌの単位で定量化される。
【００６６】
「ＡｐｏＢ：ＡｐｏＡ１比」は、ＡｐｏＢ濃度とＡｐｏＡ１濃度との比を意味する。
【００６７】
「ＡｐｏＢ含有リポタンパク質」は、タンパク質成分としてアポリポタンパク質Ｂを有する任意のリポタンパク質を意味し、それは、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびリポタンパク質（ａ）を包含すると理解される。
【００６８】
「小ＬＤＬ粒子」は、他のＬＤＬ粒子よりも小さいサイズかつ高い密度を特徴とするＬＤＬ粒子のサブクラスを意味する。ある特定の実施形態において、中間ＬＤＬ粒子の直径は、２３〜２７ｎｍである。ある特定の実施形態において、大ＬＤＬ粒子の直径は、２１．２〜２３ｎｍである。ある特定の実施形態において、小ＬＤＬ粒子の直径は、１８〜２１．２ｎｍである。ある特定の実施形態において、粒径は、核磁気共鳴解析によって測定される。
【００６９】
「小ＶＬＤＬ粒子」は、他のＶＬＤＬ粒子よりも小さいサイズかつ高い密度を特徴とするＶＬＤＬ粒子のサブクラスを意味する。ある特定の実施形態において、大ＶＬＤＬ粒子の直径は、６０ｎｍを超える。ある特定の実施形態において、中ＶＬＤＬ粒子の直径は、３５〜６０ｎｍである。ある特定の実施形態において、小ＶＬＤＬ粒子の直径は、２７〜３５ｎｍである。ある特定の実施形態において、粒径は、核磁気共鳴解析によって測定される。
【００７０】
「トリグリセリド」は、グリセロールのトリエステルである脂質を意味する。「血清トリグリセリド」は、血清中に存在するトリグリセリドを意味する。「肝臓トリグリセリド」は、肝臓組織に存在するトリグリセリドを意味する。
【００７１】
「血清脂質」は、血清中のコレステロールおよびトリグリセリドを意味する。
【００７２】
「高い総コレステロール」は、脂質低下治療が推奨される被験体における総コレステロールの濃度を意味し、それらとしては、「高いＬＤＬ−Ｃ」、「高いＶＬＤＬ−Ｃ」、「高いＩＤＬ−Ｃ」および「高い非ＨＤＬ−Ｃ」が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態において、２００ｍｇ／ｄＬ未満、２００〜２３９ｍｇ／ｄＬおよび２４０ｍｇ／ｄＬ超の総コレステロール濃度が、それぞれ望ましい高境界値および高さと考えられる。ある特定の実施形態において、１００ｍｇ／ｄＬ、１００〜１２９ｍｇ／ｄＬ、１３０〜１５９ｍｇ／ｄＬ、１６０〜１８９ｍｇ／ｄＬおよび１９０ｍｇ／ｄＬ超のＬＤＬ−Ｃ濃度は、それぞれ最適、最適近く／最適超、高境界線、高いおよび非常に高いと考えられる。
【００７３】
「高いトリグリセリド」は、脂質低下治療が推奨される血清中または肝臓中のトリグリセリドの濃度を意味し、それとしては、「高い血清トリグリセリド」および「高い肝臓トリグリセリド」が挙げられる。ある特定の実施形態において、１５０〜１９９ｍｇ／ｄＬ、２００〜４９９ｍｇ／ｄＬおよび５００ｍｇ／ｄＬ以上の血清トリグリセリド濃度は、それぞれ高境界線、高いおよび非常に高いと考えられる。
【００７４】
「高い小ＬＤＬ粒子」は、脂質低下治療が推奨される被験体中の小ＬＤＬ粒子の濃度を意味する。
【００７５】
「高い小ＶＬＤＬ粒子」は、脂質低下治療が推奨される被験体中の小ＶＬＤＬ粒子の濃度を意味する。
【００７６】
「高いリポタンパク質（ａ）」は、脂質低下治療が推奨される被験体中のリポタンパク質（ａ）の濃度を意味する。
【００７７】
「低ＨＤＬ−Ｃ」は、脂質低下治療が推奨される被験体中のＨＤＬ−Ｃの濃度を意味する。ある特定の実施形態において、低ＨＤＬ−Ｃが、非ＨＤＬ−Ｃの増加および／またはトリグリセリドの増加によって併発するとき、脂質低下治療が推奨される。ある特定の実施形態において、４０ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬ−Ｃ濃度が、低いと考えられる。ある特定の実施形態において、５０ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬ−Ｃ濃度が、低いと考えられる。
【００７８】
「ＡｐｏＢ」は、アポリポタンパク質Ｂ−１００タンパク質を意味する。血清（または血漿）中のＡｐｏＢの濃度は、代表的には、ｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌの単位で定量化される。「血清ＡｐｏＢ」および「血漿ＡｐｏＢ」は、それぞれ血清中または血漿中のＡｐｏＢを意味する。
【００７９】
「ＬＤＬ／ＨＤＬ比」は、ＬＤＬ−ＣとＨＤＬ−Ｃとの比を意味する。
【００８０】
「酸化ＬＤＬ」または「Ｏｘ−ＬＤＬ−Ｃ」は、フリーラジカルへの曝露後に酸化されたＬＤＬ−Ｃを意味する。
【００８１】
「高いＬＤＬ−Ｃレベルを有する個体」は、医療専門家が認識しているガイドラインに従って、治療的な介入が推奨されるレベルに近いかまたはそれより高いＬＤＬ−Ｃレベルを有すると医療専門家（例えば、医師）によって同定された被験体を意味する。そのような被験体は、ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させる「処置の必要がある」とも考えられ得る。
【００８２】
「高いａｐｏＢ−１００レベルを有する個体」は、医療専門家が認識しているガイドラインに従って、治療的な介入が推奨されるレベルに近いかまたはそれより低いａｐｏＢ−１００レベルを有すると同定された被験体を意味する。そのような被験体は、ａｐｏＢ−１００レベルを低下させる「処置の必要がある」とも考えられ得る。
【００８３】
「高いＬＤＬ−Ｃレベルの処置」は、高いＬＤＬ−Ｃレベルを有する被験体への、ＪＮＫ１核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物の投与を意味する。
【００８４】
「アテローム性動脈硬化症の処置」は、医師の評価に基づいて、アテローム性動脈硬化症を有するか、または有する可能性がある被験体への、ＪＮＫ１核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物の投与を意味する。「アテローム性動脈硬化症の予防」は、医師の評価に基づいて、アテローム性動脈硬化症に罹患しやすい被験体への、ＪＮＫ１核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物の投与を意味する。
【００８５】
本明細書中で使用されるとき、用語「調節」とは、調節前の機能または活性のレベルと比べたときの機能または活性の撹乱のことをいう。例えば、調節としては、遺伝子発現における変化、すなわち、増加（刺激または誘導）または減少（阻害または低下）のいずれかが挙げられる。さらなる例として、発現の調節としては、プレｍＲＮＡプロセシングのスプライス部位の選択を乱すことが挙げられ得る。
【００８６】
本明細書中で使用されるとき、用語「発現」とは、遺伝子のコードされる情報が、細胞内に存在して細胞内で作動する構造に変換される機能および工程のすべてのことをいう。そのような構造としては、転写および翻訳の産物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
「アンチセンス阻害」は、標的核酸に対して相補的なアンチセンス化合物の非存在下における標的核酸レベルと比べて、そのアンチセンス化合物の存在下における標的核酸レベルの低下を意味する。
【００８８】
本明細書中で使用されるとき、用語「標的」とは、調節が望まれるタンパク質のことをいう。
【００８９】
本明細書中で使用されるとき、用語「標的遺伝子」とは、標的をコードする遺伝子のことをいう。
【００９０】
「標的化する」は、標的核酸または標的核酸分子内のヌクレオチドの特定の領域に特異的にハイブリダイズして所望の作用を誘導するアンチセンス化合物の設計および選択のプロセスを意味する。
【００９１】
「標的化された」は、所望の作用を誘導するために、標的核酸または標的核酸分子内のヌクレオチドの特定の領域へのアンチセンス化合物の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有することを意味する。ある特定の実施形態において、所望の作用は、標的核酸の減少である。そのようなある特定の実施形態において、所望の作用は、ＪＮＫ１ｍＲＮＡの減少である。
【００９２】
本明細書中で使用されるとき、用語「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、「標的ＲＮＡ転写物」、「核酸標的」および「標的をコードする核酸分子」とは、発現または活性がアンチセンス化合物によって調節され得る任意の核酸分子のことをいう。標的核酸としては、標的をコードするＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡまたはそれらの一部が挙げられるがこれらに限定されない）およびそのようなＲＮＡから得られるｃＤＮＡならびにｍｉＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、標的核酸は、その発現が特定の障害もしくは疾患状態と関連する細胞内の遺伝子（またはその遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）または感染性物質由来の核酸分子であり得る。
【００９３】
「ＪＮＫ１核酸」は、ＪＮＫ１をコードする任意の核酸を意味する。例えば、ある特定の実施形態において、ＪＮＫ１核酸としては、ＪＮＫ１をコードするＤＮＡ配列、ＪＮＫ１をコードするＤＮＡから転写されたＲＮＡ配列およびＪＮＫ１をコードするｍＲＮＡ配列が挙げられるがこれらに限定されない。「ＪＮＫ１ｍＲＮＡ」は、ＪＮＫ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。
【００９４】
本明細書中で使用されるとき、用語「５’標的部位」とは、特定のアンチセンス化合物の５’のほとんどのヌクレオチドに対して相補的な標的核酸のヌクレオチドのことをいう。
【００９５】
本明細書中で使用されるとき、用語「３’標的部位」とは、特定のアンチセンス化合物の３’のほとんどのヌクレオチドに対して相補的な標的核酸のヌクレオチドのことをいう。
【００９６】
本明細書中で使用されるとき、用語「標的領域」とは、１つ以上のアンチセンス化合物が相補的である標的核酸の一部のことをいう。
【００９７】
本明細書中で使用されるとき、用語「標的セグメント」とは、標的核酸内の領域の小さい部分または一部分のことをいう。
【００９８】
本明細書中で使用されるとき、用語「相補性」とは、核酸塩基が別の核酸塩基と塩基対を形成する能力のことをいう。例えば、ＤＮＡにおいては、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）と相補的である。例えば、ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）は、ウラシル（Ｕ）と相補的である。ある特定の実施形態において、相補的な核酸塩基とは、その標的核酸の核酸塩基と塩基対を形成することができるアンチセンス化合物の核酸塩基のことをいう。例えば、アンチセンス化合物のある特定の位置に存在する核酸塩基が、標的核酸のある特定の位置に存在する核酸塩基と水素結合することができる場合、そのオリゴヌクレオチドとその標的核酸との間の水素結合の位置は、その核酸塩基対において相補的であると考えられる。
【００９９】
本明細書中で使用されるとき、用語「非相補的核酸塩基」とは、別の核酸塩基と水素結合を形成しないか、または別段ハイブリダイゼーションを支援しない核酸塩基のことをいう。
【０１００】
本明細書中で使用されるとき、用語「相補的」とは、オリゴマー化合物が塩基対の形成を介して別のオリゴマー化合物または核酸とハイブリダイズする能力のことをいう。ある特定の実施形態において、各分子内に十分な数の対応する位置が、アンチセンス化合物と標的とが互いに対をなすことによってそれらの間に安定な会合を可能にし得る核酸塩基で占められているとき、アンチセンス化合物およびその標的は、互いに相補的である。オリゴマー化合物が会合を保持する能力を排除せずに、ミスマッチを含むことが可能であることを当業者は認識している。ゆえに、最大約２０％のミスマッチした（すなわち、標的の対応ヌクレオチドに対して相補的な核酸塩基ではない）ヌクレオチドを含み得るアンチセンス化合物が、本明細書中に記載される。好ましくは、アンチセンス化合物は、約１５％以下の、より好ましくは多くとも約１０％の、最も好ましくは多くとも５％のミスマッチを含むか、またはミスマッチを含まない。残りのヌクレオチドは、相補的な核酸塩基であるかまたは別段ハイブリダイゼーションを破壊しない核酸塩基（例えば、ユニバーサル塩基）である。当業者は、本明細書中に提供される化合物が、標的核酸に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％相補的であることを認識し得る。
【０１０１】
本明細書中で使用されるとき、用語「ミスマッチ」とは、相補的なオリゴマー化合物内で相補的でない核酸塩基のことをいう。
【０１０２】
本明細書中で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」は、相補的なオリゴマー化合物の（例えば、アンチセンス化合物とその標的核酸との）対形成を意味する。特定のメカニズムに限定されないが、対形成の最も通常のメカニズムは、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）の間の水素結合（ワトソン−クリック水素結合、フーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合であり得る）を含む。例えば、中性の塩基アデニンは、水素結合の形成を介して対形成する中性の核酸塩基チミジンおよびウラシルに対して相補的な核酸塩基である。中性の塩基グアニンは、中性の塩基シトシンおよび５−メチルシトシンに対して相補的な核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、様々な状況下で起き得る。
【０１０３】
本明細書中で使用されるとき、用語「特異的にハイブリダイズする」とは、オリゴマー化合物が別の核酸部位にハイブリダイズするよりも高い親和性で１つの核酸部位にハイブリダイズする能力のことをいう。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２つ以上の標的部位に特異的にハイブリダイズする。
【０１０４】
本明細書中で使用されるとき、「設計する」または「に対して設計された」とは、選択された核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴマー化合物を設計するプロセスのことをいう。
【０１０５】
「一部（部分）」は、規定数の連続した（すなわち連結された）、標的核酸の核酸塩基を意味する。ある特定の実施形態において、一部は、規定数の連続した、標的核酸の核酸塩基である。ある特定の実施形態において、一部は、規定数の連続した、アンチセンス化合物の核酸塩基である。
【０１０６】
本明細書中で使用されるとき、用語「オリゴマー化合物」とは、２つ以上の亜構造を含んでいて、核酸分子のある領域にハイブリダイズすることができる重合体の構造のことをいう。ある特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、アンチセンス化合物である。ある特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、キメラオリゴヌクレオチドである。
【０１０７】
本明細書中で使用されるとき、用語「アンチセンス化合物」とは、それがハイブリダイズする標的核酸分子に対して少なくとも部分的に相補的なオリゴマー化合物のことをいう。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的核酸の発現を調節する（増加または減少させる）。アンチセンス化合物としては、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチドアナログ、オリゴヌクレオチド模倣物およびこれらのキメラの組み合わせである化合物が挙げられるが、これらに限定されない。その結果として、すべてのアンチセンス化合物が、オリゴマー化合物であるのに対して、すべてのオリゴマー化合物が、アンチセンス化合物であるわけではない。
【０１０８】
本明細書中で使用されるとき、用語「オリゴヌクレオチド」とは、複数の連結されたヌクレオチドを含むオリゴマー化合物のことをいう。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドが改変されている。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、天然に存在するおよび／または天然に存在しない、核酸塩基、糖および共有結合性のヌクレオチド間結合から構成され、非核酸結合体をさらに含み得る。
【０１０９】
「オリゴヌクレオシド」は、ヌクレオシド間結合がリン原子を含まないオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１１０】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の対応領域へのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【０１１１】
「モチーフ」は、アンチセンス化合物中の改変されていないヌクレオシドおよび改変されたヌクレオシドのパターンを意味する。
【０１１２】
「キメラアンチセンス化合物」は、少なくとも２つの化学的に異なる領域（各領域が複数のサブユニットを有する）を有するアンチセンス化合物を意味する。
【０１１３】
本明細書中で使用されるとき、用語「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）」とは、中央の領域（「ギャップ」）および中央の領域の各側に存在する領域（「ウイング（ｗｉｎｇ）」）を含んでいるキメラオリゴマー化合物のことをいい、ここで、そのギャップは、各ウイングの改変とは異なる少なくとも１つの改変を含む。そのような改変としては、核酸塩基の改変、単量体結合の改変および糖の改変ならびに改変なし（非改変）が挙げられる。ギャップ領域は、一般にＲＮアーゼＨ切断を助ける。
【０１１４】
本明細書中で使用されるとき、用語「ヌクレオシド」は、核酸塩基および糖を含んでいるグリコシルアミンを意味する。ヌクレオシドとしては、天然に存在するヌクレオシド、脱塩基のヌクレオシド、改変ヌクレオシドならびに模倣物塩基および／または模倣物糖基を有するヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本明細書中で使用されるとき、用語「ヌクレオチド」とは、糖に共有結合的に連結されているリン酸基を有する、核酸塩基および糖を含んでいるグリコサミン（ｇｌｙｃｏｓｏｍｉｎｅ）のことをいう。ヌクレオチドは、種々の置換基のいずれかで改変され得る。
【０１１６】
本明細書中で使用されるとき、用語「核酸塩基」とは、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの塩基部分のことをいう。核酸塩基は、別の核酸の塩基に水素結合することができる任意の原子または原子群を含み得る。
【０１１７】
本明細書中で使用されるとき、用語「モノマー」とは、オリゴマーの単一ユニットのことをいう。モノマーとしては、ヌクレオシドおよびヌクレオチド（天然に存在するかまたは改変されているかは関係ない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本明細書中で使用されるとき、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、そのヌクレオチドの糖部分の２’位に水素を有するヌクレオチドを意味する。デオキシリボヌクレオチドは、種々の置換基のいずれかで改変され得る。
【０１１９】
本明細書中で使用されるとき、用語「リボヌクレオチド」は、そのヌクレオチドの糖部分の２’位にヒドロキシを有するヌクレオチドを意味する。リボヌクレオチドは、種々の置換基のいずれかで改変され得る。
【０１２０】
「改変されていないヌクレオチド」は、天然に存在する核酸塩基、糖部分およびヌクレオシド間結合から構成されているヌクレオチドを意味する。ある特定の実施形態において、改変されていないヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−リボヌクレオシド）またはＤＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド）である。
【０１２１】
「改変されたヌクレオチド」は、独立して、改変された糖部分、改変されたヌクレオシド間結合または改変された核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。「改変されたヌクレオシド」は、独立して、改変された糖部分または改変された核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。
【０１２２】
「ヌクレオシド間結合」は、隣接するヌクレオシド間の共有結合を意味する。
【０１２３】
「天然に存在するヌクレオシド間結合」は、３’から５’へのホスホジエステル結合を意味する。
【０１２４】
「改変されたヌクレオシド間結合」は、天然に存在するヌクレオシド間結合からの置換および／または任意の変更を意味する。
【０１２５】
「改変された糖部分」は、天然の糖部分からの置換および／または任意の変更を意味する。本開示の目的で、「天然の糖部分」は、ＤＮＡに見られる糖部分（２’−Ｈ）またはＲＮＡに見られる糖部分（２’−ＯＨ）である。
【０１２６】
「改変された核酸塩基」は、アデニン、シトシン、グアニン、チミジンまたはウラシル以外の任意の核酸塩基を意味する。「改変されていない核酸塩基」は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を意味する。
【０１２７】
「天然の糖部分」は、ＤＮＡに見られる糖部分（２’−Ｈ）またはＲＮＡに見られる糖部分（２’−ＯＨ）を意味する。
【０１２８】
「２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分」は、２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３（２’−Ｏ−メトキシエチルまたは２’−ＭＯＥ）置換基を有する２’−置換フラノシル環を意味する。
【０１２９】
「２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド」は、２’−Ｏ−メトキシエチル改変糖部分を含んでいるヌクレオチドを意味する。
【０１３０】
「二環式の核酸糖部分」は、２つのジェミナルでない環原子を架橋することによって改変されたフラノシル環を意味する。
【０１３１】
「プロドラッグ」は、内因性の酵素または他の化学物質および／もしくは条件の作用によって体内またはその細胞内で活性型（すなわち、薬物）に変換される不活性型で調製されている治療薬を意味する。
【０１３２】
「薬学的に許容可能な塩」は、アンチセンス化合物の生理的および薬学的に許容可能な塩、すなわち、親オリゴヌクレオチドの所望の生物学的活性を保持していて、かつ、それに対して望ましくない毒物学的な作用を付与しない塩を意味する。
【０１３３】
「キャップ構造」または「末端のキャップ部分」は、アンチセンス化合物のいずれかの末端に組み込まれた化学的改変を意味する。
【０１３４】
概要
本発明の文脈において、用語「Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ」、「ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ」および「ＪＮＫ１タンパク質」は、以下のタンパク質のことをいう。すなわち、ＡＰ−１のＪｕｎサブユニットのアミノ末端の（Ｎ末端の）部分をリン酸化することが実際に知られており、そして、アミノ酸配列に基づいてＪＮＫ１タンパク質と暫定的に同定されているが、さらに、またはあるいは、実際のところ、転写に関与すると知られていない他の転写因子（例えば、ＡＴＦ２）またはキナーゼ基質のいずれかに結合し、そして／またはそれらのいずれかをリン酸化するタンパク質のことをいう（Ｄｅｒｉｊａｒｄら、Ｃｅｌｌ，１９９４，７６，１０２５；Ｋａｌｌｕｎｋｉら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９４，８，２９９６；Ｇｕｔｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９６，７５，２７６０）。
【０１３５】
ＡＰ−１は、真核細胞またはウイルスに見られる、関連するヘテロ二量体の転写因子複合体のファミリーの１つのメンバーである（Ｔｈｅ  ＦＯＲ  ａｎｄ  ＪＵＮ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ，Ａｎｇｅｌ  ａｎｄ  Ｈａｉｒｌｉｋｅ，Ｅｄｓ．，ＣＢＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９４；Ｂｏｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３８，１３８６；Ａｎｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２，１６６）。２つの比較的よく特徴付けられたＡＰ−１サブユニットは、ｃ−Ｆｏｒおよびｃ−Ｊｕｎである；これらの２つのタンパク質は、それぞれｃ−ｆｏｒおよびｃ−ｊｕｎ癌原遺伝子の産物である（Ｔｈｅ  ＦＯＳ  ａｎｄ  ＪＵＮ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ中のＲａｈｍｓｄｏｒｆ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １３およびＲａｐｐら、Ｃｈａｐｔｅｒ  １６，Ａｎｇｅｌ  ａｎｄ  Ｈｅｒｒｌｉｃｈ，Ｅｄｓ．，ＣＢＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９４）。
【０１３６】
タンパク質のリン酸化は、細胞外のシグナルの細胞への伝達において重要な役割を果たす。代表的なＭＡＰキナーゼ経路が知られており、文献に列挙されている（例えば、Ｃａｎｏら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９５，２０，１１７  Ｃｏｂｂら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０，１４８４３；Ｓｅｇｅｒら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１９９５，９，７２６；Ｃａｎｏら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９５，２０，１１７を参照のこと）。
【０１３７】
上記のシグナル伝達経路の１つは、ＭＡＰキナーゼＪｕｎ  Ｎ末端キナーゼ１（ＪＮＫ１）およびＪｕｎ  Ｎ末端キナーゼ２（ＪＮＫ２）を含み、これらは、ｃ−Ｊｕｎのアミノ末端部分上の特異的部位（セリン６３およびセリン７３）のリン酸化に関与する。これらの部位のリン酸化は、ＡＰ−１が転写を活性化する能力を増強する（Ｂｉｎｅｔｒｕｙら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５１，１２２；Ｓｍｅａｌら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５４，４９４）。ＪＮＫ１およびＪＮＫ２に加えて、最初にｐ４９３Ｆ１２キナーゼと命名された（Ｍｏｈｉｔら、Ｎｅｕｒｏｎ，１９９４，１４，６７）ＪＮＫ３（Ｇｕｔｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９６，１５，２７６０）をはじめとした他のＪＮＫファミリーメンバーも報告されている。
【０１３８】
最近の研究では、ＪＮＫは培養細胞においてインスリン作用を妨害し、また、ＪＮＫは遊離脂肪酸および炎症性サイトカインによって活性化され；その両方が、２型糖尿病の発症と関係すると示唆された。従って、ＪＮＫは、肥満症およびインスリン抵抗性のメディエーターであり得る（Ｈｉｒｏｓｕｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４２０：３３３−３３６）。
【０１３９】
ＪＮＫまたはｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）グループのセリン／トレオニンタンパク質キナーゼのファミリーであり、種々の生理学的機能に関与する。それらは、熱ショック、照射、低酸素、ケモトシキン（ｃｈｅｍｏｔｏｘｉｎ）、過酸化物およびいくつかのサイトカインをはじめとした細胞ストレスを引き起こす様々な刺激に応答して活性化される（Ｂｅｎｎｅｔｔら、２００３；Ｂｏｇｏｙｅｖｉｔｃｈら、２００４）。肥満症はまた、機械的な変化、過剰な脂質蓄積、細胞内のエネルギーの流れの異常および養分利用能の変化ならびにサイトカインの血漿レベルの変化に起因して細胞ストレスを引き起こす（Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，２００５；Ｏｚｃａｎら、２００４；Ｗａｅｔｚｉｇ  ａｎｄ  Ｈｅｒｄｅｇｅｎ，２００５）。遺伝的に肥満の（ｏｂ／ｏｂ）マウスと食餌誘発性肥満の（ＤＩＯ）マウスの両方における肝臓、脂肪および筋肉中のＪＮＫ活性のほうがそれぞれのコントロールよりも高い（Ｈｉｒｏｓｕｍｉら、２００２；Ｏｚｃａｎら、２００４）。
【０１４０】
肥満症は、慢性疾患と考えられている。肥満症に関連する３０を超える重大な医学的関心事が存在する。代謝症候群は、循環器疾患および糖尿病に対するリスクを高める医学的障害の組み合わせである。高血圧、高トリグリセリド、低ＨＤＬおよび肥満症をはじめとした症状は、いくつかの個体において同時に見られる傾向がある。代謝性症候群は、クラスター化された様式で多数の人々に影響を及ぼす。いくつかの研究では、米国における有病率は、人口の最大２５％と計算されている。代謝症候群は、他の様々な名称（例えば、（代謝性）シンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群、Ｒｅａｖｅｎ症候群またはＣＨＡＯＳ）で知られている。
【０１４１】
本発明は、ＪＮＫ１をコードする核酸を標的化し、被験体においてＪＮＫ１レベルを低下させるように機能するアンチセンス化合物の発見に一部基づく。
【０１４２】
糖尿病、肥満症、代謝症候群および他の疾患ならびにグルコース代謝および／または脂質代謝および／またはそれらの調節不全に関連する他の疾患および状態に対する有効な処置が必要とされている。糖尿病の処置に対する市場において、ある特定の化合物は、この疾患の処置に対する非常に望ましくない副作用である体重増加を誘導することが知られている。ゆえに、糖尿病と肥満症の両方を処置する潜在能力を有する化合物が、現在の処置に対して著しい改善をもたらし得る。
【０１４３】
インスリン抵抗性（ｒｅｓｉｓｔｅｎｃｅ）と肥満症の両方におけるＪＮＫ１の役割が同定されており、ＪＮＫ１は、糖尿病、肥満症および代謝症候群をはじめとした一連の代謝性の疾患および状態に対する治療的な標的として本明細書中で提示される。ゆえに、ＪＮＫ１を標的化する化合物および組成物ならびに代謝性の疾患および状態を処置するための方法が本明細書中で提供される。代謝性の状態は、代謝的な機能の変化または障害を特徴とする。
【０１４４】
本発明によれば、ＪＮＫ１タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが提供される。本発明のある特定のオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１タンパク質をコードするＪＮＫ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡまたはＪＮＫ１遺伝子のうちの選択されたＤＮＡ部分に直接結合することによって、その発現および／またはＪＮＫ１タンパク質に対する１つ以上の基質のリン酸化を調節するように設計されている。本発明のオリゴヌクレオチドを含んでいる薬学的組成物および１つ以上の転移性のイベントを調節する方法を含む本発明のオリゴヌクレオチドを使用する様々な方法もまた、本明細書中に提供される。
【０１４５】
被験体においてＪＮＫ１発現を調節するための方法、化合物および組成物が本明細書中に提供される。ある特定の実施形態において、被験体においてＪＮＫ１のレベル、発現および／または活性を低下させるための方法、化合物および組成物が提供される。ある特定の実施形態において、ＪＮＫ１の発現、活性および／または核酸レベルの低下は、被験体の肝臓組織および脂肪組織において生じる。ある特定の実施形態において、被験体は、動物である。ある特定の実施形態において、その動物は、ヒトである。
【０１４６】
グルコース代謝および／もしくは脂質代謝ならびに／またはそれらの調節不全と関連する疾患もしくは状態を処置、予防および／または回復するための方法、化合物ならびに組成物が本明細書中に提供される。ある特定の実施形態において、その方法、化合物および組成物は、糖尿病、肥満症および代謝症候群を処置、予防および／または回復するためのものである。ある特定の実施形態において、その方法、化合物および組成物は、高コレステロール血症、混合型異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症を発症するリスク、冠状動脈心疾患、冠状動脈心疾患の病歴、早発型冠状動脈心疾患、冠状動脈心疾患に対する１つ以上の危険因子、ＩＩ型糖尿病、異脂肪血症を伴うＩＩ型糖尿病、異脂肪血症、高トリグリセリド血症、高脂血症、高脂肪酸血症（ｈｙｐｅｒｆａｔｔｙａｃｉｄｅｍｉａ）、肝脂肪変性、非アルコール性脂肪性肝炎または非アルコール性脂肪肝疾患を処置、予防および／または回復するためのものである。ある特定の実施形態では、そのような方法、化合物および組成物を使用して、糖尿病の続発症（網膜症、ニューロパシー、心臓血管の合併症および腎症が挙げられるがこれらに限定されない）を処置するか、遅くするか、予防するか、遅延させるか、または寛解させる。
【０１４７】
血糖の制御または耐性を改善するための方法、化合物および組成物が本明細書中に提供される。ある特定の実施形態において、その方法、化合物および組成物は、インスリン感度を改善するためのものである。グルコースレベルを低下させるための方法、化合物および組成物もまた提供される。ある特定の実施形態において、そのようなグルコースレベルは、血液、血漿および／または血清中のグルコースレベルであり得る。ある特定の実施形態において、そのようなグルコースレベルは、満腹時または空腹時のグルコースレベルであり得る。
【０１４８】
脂質を減少させるための方法、化合物および組成物もまた提供される。被験体においてトリグリセリドレベルを低下させるための方法、化合物および組成物もまた提供される。ある特定の実施形態において、そのようなトリグリセリドレベルは、血漿トリグリセリドレベルである。ある特定の実施形態において、そのようなトリグリセリドレベルは、肝臓トリグリセリドレベルである。肝脂肪変性を改善するための方法もまた提供される。コレステロールレベルを低下させるための方法、化合物および組成物もまた提供される。ある特定の実施形態において、そのようなコレステロールレベルは、血漿コレステロールレベルである。
【０１４９】
代謝性遺伝子および／または脂質生成遺伝子の発現を調節するための方法、化合物および組成物もまた提供される。ある特定の実施形態において、代謝性遺伝子および／または脂質生成（ｌｉｐｇｅｎｉｃ）遺伝子を下記の表３５に列挙した。ある特定の実施形態において、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２、ＦＡＳ、ＳＣＤ１およびＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、ＲＢＰ４、Ｇ６ＰアーゼならびにＰＫＣεのうちの１つ以上の発現レベルが低下する。ある特定の実施形態において、レベルは、約３０％〜約７０％低下する。脂質生合成を減少させるための方法、化合物および組成物もまた提供される。ある特定の実施形態において、そのような代謝性遺伝子または脂質生成遺伝子の発現を低下させることによって、脂質生合成を低下させる。ある特定の実施形態において、ＡＲβ３、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２およびＰＰＡＲαの発現レベルを上昇させる。ある特定の実施形態において、レベルは、最大約７０％上昇する。そのような方法は、ＪＮＫ１をコードする核酸に標的化されたアンチセンス化合物を被験体に投与する工程を包含する。ある特定の実施形態において、そのような方法は、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物の投与を包含する。ある特定の実施形態において、その化合物は、組成物で投与される。ある特定の実施形態において、その被験体は、動物である。ある特定の実施形態において、その動物は、ヒトである。ある特定の実施形態において、上記アンチセンス化合物が投与され、レベルが調節される被験体は、上に列挙された疾患または障害のうちの１つ以上を有する。ある特定の実施形態において、上記アンチセンス化合物が投与され、レベルが低下される被験体は、肥満症、高コレステロール血症、混合型異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈心疾患、糖尿病、ＩＩ型糖尿病、異脂肪血症を伴うＩＩ型糖尿病、異脂肪血症、高トリグリセリド血症、高脂血症、高脂肪酸血症、肝脂肪変性、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬ）を有する。
【０１５０】
ある特定の実施形態において、上記アンチセンス化合物が投与される被験体は、高いグルコースレベル、トリグリセリドレベルもしくはコレステロールレベルまたはそれらの任意の組み合わせを有する。ある特定の実施形態において、そのようなグルコースレベルは、血液、血漿および／または血清中のグルコースレベルであり得る。ある特定の実施形態において、そのようなグルコースレベルは、満腹時または空腹時のグルコースレベルであり得る。ある特定の実施形態において、そのようなグルコースレベルは、満腹時または空腹時の血中グルコースレベルである。ある特定の実施形態において、そのようなトリグリセリドレベルは、血漿トリグリセリドレベルである。ある特定の実施形態において、そのようなトリグリセリドレベルは、肝臓トリグリセリドレベルである。ある特定の実施形態において、そのようなコレステロールレベルは、血漿コレステロールレベルである。ある特定の実施形態では、投与によって、グルコースレベル、トリグリセリドレベルまたはコレステロールレベルが低下する。ある特定の実施形態において、被験体は、動物である。ある特定の実施形態において、その動物は、ヒトである。
【０１５１】
被験体において血清グルコースレベル、血清トリグリセリドレベルまたは血漿コレステロールレベルを低下させるための方法もまた提供され、その方法は、高い血清グルコースレベル、血清トリグリセリドレベルまたは血漿コレステロールレベルを有する被験体を選択する工程およびＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物をその個体に投与する工程、さらに血清グルコースレベル、血清トリグリセリドレベルまたは血漿コレステロールレベルをモニターする工程を包含する。ある特定の実施形態において、その個体は、動物である。ある特定の実施形態において、その個体は、ヒトである。
【０１５２】
被験体において、糖尿病、肥満症または代謝症候群あるいはグルコース代謝および／もしくは脂質代謝ならびに／またはそれらの調節不全に関連する別の疾患もしくは状態を処置するため、予防するため、および／または寛解させるための方法がさらに提供される。そのような方法は、糖尿病、肥満症または代謝症候群あるいはグルコース代謝および／もしくは脂質代謝に関連する他の疾患または状態と診断される被験体を選択する工程、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物をその個体に投与する工程、および糖尿病、肥満症もしくは代謝症候群または他の関連する疾患もしくは状態に関連する因子をモニターする工程を包含する。
【０１５３】
代謝率を上昇させる方法がさらに提供される。体重増加を減少させるための方法もまた提供される。精巣上体脂肪パッド重量を低下させるための方法もまた提供される。全身の脂肪量を減少させるための方法もまた提供される。そのような方法は、ＪＮＫ１をコードする核酸に標的化されたアンチセンス化合物を被験体に投与する工程を包含する。ある特定の実施形態において、そのような方法は、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物の投与を包含する。ある特定の実施形態において、その化合物は、組成物で投与される。ある特定の実施形態において、その被験体は、動物である。ある特定の実施形態において、その動物は、ヒトである。ある特定の実施形態において、上記アンチセンス化合物が投与され、代謝率が上昇され、そして／または体重もしくは脂肪量が減少する被験体は、上に列挙された疾患または障害のうちの１つ以上を有する。ある特定の実施形態において、上記アンチセンス化合物が投与され、代謝率が上昇され、そして／または体重もしくは脂肪量が減少する被験体は、肥満症、糖尿病または代謝症候群を有する。
【０１５４】
個体および被験体という用語が、本明細書中で交換可能に使用されること、本明細書中で提供される方法のいずれかが、被験体または被験体にとって有用であり得ること、および、被験体または個体が、動物、特にヒトであり得ることが理解される。
【０１５５】
本明細書中に提供される方法のいずれかは、血清グルコースレベルもしくは血漿グルコースレベル、血清トリグリセリドレベルもしくは血漿トリグリセリドレベルまたは血清コレステロールレベルもしくは血漿コレステロールレベルをモニターする工程をさらに包含し得る。
【０１５６】
上述の方法のいずれかにおいて、上記アンチセンス化合物の投与は、腸管外投与を包含し得る。その腸管外投与は、皮下投与または静脈内投与をさらに包含し得る。
【０１５７】
本明細書中に提供される化合物、組成物または方法のいずれかにおいて、上記アンチセンス化合物は、配列番号：８７、８９、９０または９１に対して少なくとも（ｌｅａｓｔ）８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の相補性を有し得る。あるいは、上記アンチセンス化合物は、配列番号：８７、８９、９０または９１に対して１００％の相補性を有し得る。
【０１５８】
本明細書中に提供され、記載される方法のいずれかにおいて使用されるアンチセンス化合物は、８〜８０サブユニット長、１２〜５０サブユニット長、１２〜３０サブユニット長、１５〜３０サブユニット長、１８〜２４サブユニット長、１９〜２２サブユニット長または２０サブユニット長であり得る。さらに、記載される方法のいずれかにおいて使用されるアンチセンス化合物は、８〜８０ヌクレオチド長、１２〜５０ヌクレオチド長、１２〜３０ヌクレオチド長、１５〜３０ヌクレオチド長、１８〜２４ヌクレオチド長、１９〜２２ヌクレオチド長または２０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１５９】
提供される化合物、組成物および方法のいずれかにおいて、上記アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。さらに、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、キメラであり得る。そのキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。そのギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５個の２’−ＭＯＥヌクレオチドのウイングセグメント間に位置する１０個の２’−デオキシヌクレオチドのギャップセグメントを含み得る。
【０１６０】
提供される化合物、組成物および方法のいずれかにおいて、上記アンチセンス化合物は、少なくとも１つの改変されたヌクレオシド間結合を有し得る。さらに、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり得る。各シトシンは、５−メチルシトシンであり得る。
【０１６１】
肥満症および代謝症候群を処置するための化合物は、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された１２〜３０核酸塩基のアンチセンス化合物であり得る。その化合物は、配列番号：８７、８９、９０または９１のいずれかに対して少なくとも７０％〜１００％の相補性を有し得る。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。そのギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５個の２’−ＭＯＥヌクレオチドのウイングセグメント間に位置する１０個の２’−デオキシヌクレオチドのギャップセグメントを含み得る。
【０１６２】
上記アンチセンス化合物は、少なくとも１つの改変されたヌクレオシド間結合を有し得る。さらに、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり得る。各シトシンは、５−メチルシトシンであり得る。
【０１６３】
肥満症の遺伝型マウスモデルと食餌型マウスモデルの両方をＪＮＫ１ＡＳＯで処置した。ＪＮＫ１ＡＳＯ処置によって、肝臓組織と脂肪組織の両方において顕著かつ特異的にＪＮＫ１の遺伝子発現が低下し、それによって、これらの組織においてＪＮＫ１活性の劇的な低下がもたらされた。その処置によって、肝臓毒性または他の副作用を引き起こさずに、ＢＷ（すなわち体重増加）、脂肪組織重量および全身の脂肪量がコントロールと比べて減少し、そして代謝率が上昇した。その処置によって、顕著に、満腹時および空腹時の血漿グルコースレベルおよび血漿インスリンレベルが低下し、耐糖能およびインスリン抵抗性が改善され、肝脂肪変性が改善され、そして、血漿コレステロールレベルが低下した。これらのデータから、２つの主な代謝性組織においてＡＳＯを用いたＪＮＫ１の発現および活性の特異的な阻害が、これらのモデルにおいて脂肪過多および関連する代謝障害を改善したことが示唆される。
【０１６４】
処置によって、食餌効率も改善された。さらに、ＡＳＯ処置マウスにおける代謝率の上昇が、間接的な熱量測定によって確認された。定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析によって、これらのマウスのＢＡＴ中のＡＲβ３とＵＣＰ１（げっ歯類において異化および食物燃焼に関与する２つの重要な遺伝子）の両方の遺伝子発現の増加が見出された。ＰＰＡＲα、ＵＣＰ２およびＵＣＰ３の発現の増加ならびにＡＣＣ２の発現の減少は、肝臓またはＷＡＴのいずれかにも見られ、これによって、代謝率の上昇の知見に対するさらなる裏付けがもたらされた。さらに、脂質生成遺伝子の発現が広範かつ著明に減少したことおよび２つの重要な脂肪分解性遺伝子であるＨＳＬおよびＡＴＧＬの発現が変化しないことが、ＷＡＴにおいて見られ、このことから、この組織においてＪＮＫ１発現の減少とともに、脂質生合成が減少し、脂肪分解が変化しないことが示唆される。肝臓における脂肪酸の新規合成に関与する２つの重要な遺伝子であるＡＣＣ１およびＦＡＳの発現の著明な減少もまた検出された。さらに、脂肪酸の酸化の増加および脂肪酸の新規合成の減少が、ＪＮＫ１ＡＳＯでトランスフェクトされた肝細胞において直接証明された。まとめると、これらのデータから、ＡＳＯ処置マウスにおけるＢＷまたはＢＷ増加の減少および脂肪過多の減少が、食物燃焼／代謝率の上昇および脂質生合成の減少に起因し得ることが証明される。
【０１６５】
ＪＮＫ１活性のアンチセンス減少によって、肝臓ＴＧ量が減少し、肝脂肪変性が改善される。さらに、血漿コレステロールレベルが、改善される。これらの変化は、肝臓のＵＣＰ２遺伝子およびＰＰＡＲα遺伝子の発現の増加ならびにＡＣＬ、ＡＣＣ１およびＦＡＳをはじめとした重要な肝臓の脂質生成遺伝子の発現の減少を伴うものであった。いずれの理論にも拘束されないが、これらの遺伝子発現の変化は、酸化に対するＴＣＡサイクルおよび電子伝達鎖へのクエン酸の迂回の増加、ならびにコレステロールおよび脂肪酸を合成するためのアセチル−ＣｏＡを生成するクエン酸の分解の減少（ＡＣＬによるもの）を示唆する。ゆえに、ＪＮＫ１ＡＳＯ処置マウスにおける肝脂肪変性および血漿コレステロールレベルの改善は、肝臓の基質の酸化の増加および肝臓の脂質生合成の減少に起因し得る。ＪＮＫ１ＡＳＯでトランスフェクトされた肝細胞における、ステロール新規合成および脂肪酸新規合成の減少ならびに脂肪酸酸化の上昇を示したインビトロ研究から、さらなる裏付けがもたらされる。さらに、ＪＮＫ１ＡＳＯ処置マウスにおける肝臓のＡｐｏＢ１００の発現の減少が見出された。肝臓のＡｐｏＢ１００の発現の減少により、肝臓のコレステロールの合成および排出の減少に起因して、高脂血症の様々なモデルにおいて血漿コレステロールレベルが低下する。
【０１６６】
肝臓および脂肪のみにおいてＡＳＯによってＪＮＫ１発現が特異的に減少したことによって、インスリン感度が著明に改善され、血漿グルコースレベルおよび血漿インスリンレベルが正常化され、そして、ＩＴＴおよびＧＴＴ中のグルコース排出（ｅｘｃｕｒｓｉｏｎ）が低下した。この正の作用は、肝臓のＧＫおよびＧＳの発現の増加ならびに肝臓のＧ６ＰアーゼおよびＰＫＣεの発現の減少ならびにＷＡＴにおけるＲＢＰ４の発現の減少を伴ったことが見出された。ＧＫは、血液から取り込まれるグルコースからの肝臓のグルコース−６−リン酸（さらに解糖またはグリコーゲン合成に使用される）合成に対する律速酵素であるのに対し、Ｇ６Ｐアーゼは、グルコース−６−リン酸（糖新生または糖原病のいずれか由来である）を分解して、血液中にグルコースを放出することによる、肝臓のグルコース排出に対する最後の「ゲート」である。ＧＳは、主な基質としてグルコース−６−リン酸を使用するグリコーゲン合成に対する律速酵素である。これらの遺伝子発現の変化から、ＪＮＫ１発現のアンチセンス減少によって、肝臓のインスリン感度および全身のインスリン感度までもが改善され、肝臓のグルコース排出を阻害しつつ肝臓において血糖の利用および／または貯蔵が促進されることにより、血糖レベルおよびインスリンレベルが改善されることが示唆される。インスリンに応答したＩＲＳ１Ｓｅｒ３０２／３０７のリン酸化の減少およびＡｋｔＳｅｒ４７３のリン酸化の増加を示すＪＮＫ１ＡＳＯ処置マウスにおけるインスリンシグナル伝達活性の改善から、ＪＮＫ１発現のアンチセンス減少がインスリン感度を改善するとさらに証明される。
【０１６７】
２型糖尿病、高脂血症および脂肪肝疾患に密接に関連する肥満症は、世界中に蔓延している。ＪＮＫ１は、代謝およびエネルギーホメオスタシスにおいて重要な役割を果たし、肝臓および脂肪におけるその発現のアンチセンス減少が、遺伝的にレプチンを欠損しているマウスと食餌誘発性肥満のマウスの両方において、代謝率を上昇させ、そして、肝脂肪変性、高コレステロール血症およびインスリン感度の改善を伴って体重および脂肪過多を改善する。ゆえに、ＪＮＫ１は、肥満症および関連する代謝障害を処置するために有用な治療的な標的である。
【０１６８】
ゆえに、本明細書中に提供されるアンチセンス化合物は、糖尿病、肥満症および代謝症候群をはじめとした多くの代謝性の状態を処置するために有用である。そのような処置は、臨床的に望ましい結果をもたらす治療的なレジメンを包含する。その臨床的に望ましい結果は、グルコース代謝と関係し得る。例えば、本明細書中に提供されるアンチセンス化合物および方法は、血糖の制御または耐性を改善するためおよびそのような必要のある被験体においてインスリン感度を改善するために有用である。本明細書中に提供されるアンチセンス化合物および方法はまた、血漿レジスチンレベルを低下させる必要のある被験体において血漿レジスチンレベルの低下に有用である。本明細書中に提供されるアンチセンス化合物および方法はまた、グルコースレベルを低下する必要のある被験体におけるグルコースレベルの低下にも有用である。上記化合物および方法は、血液、血漿および／または血清中のグルコースレベルを低下させるために特に有用である。上記化合物および方法は、満腹時と空腹時の両方のグルコースレベルを低下させるために有用である。そのような臨床成績は、例えば、糖尿病、特にＩＩ型糖尿病、肥満症および代謝症候群をはじめとした、グルコース代謝およびインスリン抵抗性に関連する疾患ならびに障害において望ましい。ゆえに、本明細書中に提供されるアンチセンス化合物および方法は、そのような疾患および障害の処置に有用である。
【０１６９】
臨床的に望ましい結果は、脂質代謝にも関係し得る。例えば、本明細書中に提供されるアンチセンス化合物および方法は、脂質、特に血清脂質を減少させる必要のある被験体において脂質を減少させるためにも有用である。脂質の減少は、脂質生合成（ｌｉｐｏｇｅｎｉｓｉｓ）の減少および特に脂質生成遺伝子（ＡＣＣ１、ＡＣＣ２、ＦＡＳ、ＳＣＤ１およびＤＧＡＴ１が挙げられるがこれらに限定されない）の減少から生じ得る。特に、上記アンチセンス化合物および方法は、トリグリセリドレベルおよびコレステロールレベルを低下させる必要のある被験体においてそれらのレベルを低下させるために有用である。上記化合物および方法は、血漿トリグリセリドレベルおよび血漿コレステロールレベルを低下させるために特に有用である。上記化合物および方法はまた、肝臓トリグリセリドレベルを低下させるためにも特に有用である。さらに、本明細書中に提供されるアンチセンス化合物および方法はまた、肝脂肪変性を改善するためにも有用である。上記化合物および方法はまた、代謝率を上昇させ、そして、体重増加を減少させるためにも特に有用である。上記化合物および方法はまた、精巣上体脂肪パッド重量および全身の脂肪量を減少させるためにも特に有用である。そのような臨床成績は、脂質の疾患および障害ならびにグルコース代謝およびインスリン抵抗性の疾患および障害（例えば、糖尿病、代謝症候群、肥満症、高コレステロール血症、混合型異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈心疾患、糖尿病、ＩＩ型糖尿病、異脂肪血症を伴うＩＩ型糖尿病、異脂肪血症、高トリグリセリド血症、高脂血症、高脂肪酸血症、肝脂肪変性、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を含む）において望ましいものである。ＮＡＦＬＤは、過剰なアルコールの使用（例えば、２０ｇ／日を超えるアルコール消費）に起因するものではない、肝臓の脂肪性の炎症を特徴とする状態である。ある特定の実施形態において、ＮＡＦＬＤは、インスリン抵抗性および代謝症候群に関連する。ＮＡＳＨは、過剰なアルコール使用に起因するものではない、肝臓内の脂肪組織および線維組織の炎症および蓄積を特徴とする状態である。ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤの極端な型である。ゆえに、本明細書中に提供されるアンチセンス化合物および方法は、そのような疾患および障害の処置に有用である。
【０１７０】
高レベルの血糖およびトリグリセリドは、糖尿病、肥満症および代謝症候群の発症に対する主要な危険因子と認識されている。高い血中グルコースレベルまたは高いトリグリセリドレベルはまた、アテローム性動脈硬化症の発症および進行における危険因子と考えられる。アテローム性動脈硬化症は、冠状動脈心疾患、脳卒中または末梢血管疾患に導きうる。従って、高いレベルの血糖およびトリグリセリドを減少させるための医薬品が、本明細書中に提供される。
【０１７１】
代謝症候群は、代謝起源の脂質および非脂質の心臓血管の危険因子のクラスター化を特徴とする状態である。ある特定の実施形態において、代謝症候群は、以下の因子のうちのいずれか３つが存在することによって同定される：男性では１０２ｃｍ超または女性では８８ｃｍ超のウエスト周囲長；少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬの血清トリグリセリド；男性では４０ｍｇ／ｄＬ未満または女性では５０ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬ−Ｃ；少なくとも１３０／８５ｍｍＨｇの血圧；および少なくとも１１０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖。これらの決定因子は、診療において容易に測定可能である（ＪＡＭＡ，２００１，２８５：２４８６−２４９７）。従って、本明細書中に提供される化合物および方法を使用して、代謝症候群に対する１つ以上の危険因子を示している個体を処置することができる。特に、本明細書中に提供される化合物および方法を使用して、体重を減少させることにより、おそらくウエスト周囲長の減少および空腹時グルコースレベルの低下を達成することができる。
【０１７２】
本明細書中で例証されるように、ＪＮＫ１に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、インスリン抵抗性、高血糖症おび高脂血症を示す糖尿病および肥満症の動物モデルに投与することによって、ＪＮＫ１のアンチセンス阻害、血漿グルコースレベルおよび血漿トリグリセリドレベルの低下ならびに肝臓トリグリセリドの減少がもたらされた。トリグリセリドの減少はまた、脂質生成遺伝子の減少も伴った。特に、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２、ＦＡＳ、ＳＣＤ１およびＤＧＡＴ１の発現が減少された。従って、高血糖症および高脂血症の実験モデルにおいて、ＪＮＫ１のアンチセンス阻害によって、グルコースレベルおよびトリグリセリドレベルの低下ならびに脂質生合成の減少がもたらされることが証明された。従って、ＪＮＫ１核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物の投与を介して脂質生合成、血中グルコースレベルおよびトリグリセリドレベルを減少させる方法が、本明細書中に提供される。血中グルコースレベルおよびトリグリセリドレベルは、糖尿病、肥満症および代謝症候群の発症に対する危険因子と考えられる。従って、糖尿病、肥満症および代謝症候群を処置するための方法、予防するための方法および／または回復させるための方法、ならびに、関連障害を処置するための方法、予防するための方法および／または回復させるための方法もまた、本明細書中に提供される。肝脂肪変性などの高い肝臓トリグリセリドを特徴とする状態を処置するための方法もまた本明細書中に提供される。
【０１７３】
ある特定の徴候
ある特定の実施形態において、本発明は、被験体を処置する方法を提供し、その方法は、本発明の１つ以上の薬学的組成物を投与する工程を包含する。ある特定の実施形態において、その個体は、糖尿病、肥満症、代謝症候群および／または関連障害（高コレステロール血症、混合型異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症を発症するリスク、冠状動脈心疾患、冠状動脈心疾患の病歴、早発型冠状動脈心疾患、冠状動脈心疾患に対する１つ以上の危険因子、ＩＩ型糖尿病、異脂肪血症を伴うＩＩ型糖尿病、異脂肪血症、高トリグリセリド血症、高脂血症、高脂肪酸血症、肝脂肪変性、非アルコール性脂肪性肝炎または非アルコール性脂肪肝疾患が挙げられるがこれらに限定されない）を有する。
【０１７４】
高コレステロール血症は、高い血清コレステロールを特徴とする状態である。高脂血症は、高い血清脂質を特徴とする状態である。高トリグリセリド血症は、高いトリグリセリドレベルを特徴とする状態である。非家族性高コレステロール血症は、単一の遺伝子変異の結果ではない高いコレステロールを特徴とする状態である。多遺伝子性（Ｉｓ  ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ）高コレステロール血症は、種々の遺伝因子の影響から生じる高いコレステロールを特徴とする状態である。ある特定の実施形態において、多遺伝子性高コレステロール血症は、脂質の食餌性摂取によって増悪し得る。家族性高コレステロール血症（ＦＨ）は、ＬＤＬ−レセプター（ＬＤＬ−Ｒ）遺伝子の変異、ＬＤＬ−Ｃの著明な増加および早発性のアテローム性動脈硬化症を特徴とする常染色体優性の代謝障害である。個体が、以下の基準のうちの１つ以上を満たすとき、家族性高コレステロール血症の診断がなされる。すなわち、：２つの変異したＬＤＬ−レセプター遺伝子を確認する遺伝子検査；１つの変異したＬＤＬ−レセプター遺伝子を確認する遺伝子検査；５００ｍｇ／ｄＬを超える血清ＬＤＬ−コレステロールが未処置であることの書類上の履歴（ｄｏｃｕｍｅｎｔ  ｈｉｓｔｏｒｙ）；１０歳未満での腱および／または皮膚の黄色腫；または、ヘテロ接合性の家族性高コレステロール血症に一致して、脂質低下治療前に両親が高い血清ＬＤＬ−コレステロールを示していたこと。ホモ接合性の家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）は、母系と父系の両方のＬＤＬ−Ｒ遺伝子の変異を特徴とする状態である。ヘテロ接合性の家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）は、母系または父系のいずれかのＬＤＬ−Ｒ遺伝子の変異を特徴とする状態である。混合型異脂肪血症は、高い血清コレステロールおよび高い血清トリグリセリドを特徴とする状態である。糖尿病性異脂肪血症または異脂肪血症を伴うＩＩ型糖尿病は、ＩＩ型糖尿病、低いＨＤＬ−Ｃ、高い血清トリグリセリドおよび高い低密度ＬＤＬ粒子を特徴とする状態である。
【０１７５】
血中グルコースレベルもしくはトリグリセリドレベルを低下させるための方法、または、高いグルコースレベルもしくはトリグリセリドレベルに苦しんでいる被験体に、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与することによって肥満症もしくは代謝症候群を処置するための方法が、一実施形態におけるものである。別の実施形態において、血中グルコースレベルまたはトリグリセリドレベルを低下させる方法は、血中グルコースレベルまたはトリグリセリドレベルを低下させる必要のある被験体を選択する工程およびその個体に、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与する工程を包含する。さらなる実施形態において、肥満症および代謝症候群の発症のリスクを低下させる方法は、高い血中グルコースレベルまたはトリグリセリドレベルおよび肥満症または代謝症候群を発症する１つ以上の追加の指標リスクを有する被験体を選択する工程、およびその個体に、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物を投与する工程を包含する。
【０１７６】
一実施形態において、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物の投与は、被験体の血清中のグルコースレベルまたはトリグリセリドレベルをモニターして、そのアンチセンス化合物の投与に対する被験体の応答を測定することを伴う。上記アンチセンス化合物の投与に対する被験体の応答は、治療的な介入の量および持続時間を決定するために、医師が使用する。
【０１７７】
アテローム性動脈硬化症は、冠状動脈心疾患、脳卒中または末梢血管疾患に導きうる。高い血中グルコースレベルまたは高いトリグリセリドレベルは、アテローム性動脈硬化症の発症および進行において危険因子と考えられる。従って、一実施形態において、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物が、アテローム性動脈硬化症を有する被験体に投与される。さらなる実施形態において、ＪＮＫ１核酸に対して標的化された治療有効量のアンチセンス化合物が、アテローム性動脈硬化症に罹患しやすい被験体に投与される。アテローム性動脈硬化症は、通例のイメージング手法（例えば、頸動脈内膜中膜厚（ｃａｒｏｔｉｄ  ｉｎｔｉｍｏｍｅｄｉａｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を明らかにする超音波イメージング手法）を介して直接評価される。従って、アテローム性動脈硬化症の処置および／または予防は、通例のイメージング手法を介してアテローム性動脈硬化症をモニターすることをさらに包含する。一実施形態において、ＪＮＫ１核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物の投与は、例えば、頸動脈内膜中膜厚の減少によって示唆されるようなアテローム性動脈硬化症の重症度の低下に導く。
【０１７８】
コレステロール、リポタンパク質およびトリグリセリドの測定は、被験体から回収された血清または血漿を使用して得られる。血清サンプルまたは血漿サンプルを得る方法は、コレステロール、トリグリセリドおよび他の血清マーカーの解析のために血清サンプルを調製する方法のような、通例の方法である。
【０１７９】
血糖またはトリグリセリドを低下させるおおよそ侵襲性である治療が必要である場合に、個体に対する治療的な介入の必要性は、医師が決定することができる。本明細書中の方法の実施は、冠状動脈心疾患リスクを判定するためおよび代謝症候群を診断するために、本明細書中に列挙される疾患または状態のいずれかの処置に使用される医師に対するガイドラインを策定しているＮＣＥＰまたは他の実体が提供する任意の変更されたガイドラインに適用され得る。
【０１８０】
一実施形態において、ＪＮＫ１核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物の投与は、腸管外投与である。腸管外投与は、静脈内投与または皮下投与であり得る。従って、別の実施形態において、ＪＮＫ１核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物の投与は、静脈内投与または皮下投与である。投与は、ＪＮＫ１核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物の反復投与を包含し得る。
【０１８１】
ある特定の実施形態において、ＪＮＫ１に対して標的化されたアンチセンス化合物を含んでいる薬学的組成物は、治療において使用するためのものである。ある特定の実施形態において、その治療は、被験体における血糖、血清トリグリセリドまたは肝臓トリグリセリドの減少である。ある特定の実施形態において、その治療は、高コレステロール血症、混合型異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症を発症するリスク、冠状動脈心疾患、冠状動脈心疾患の病歴、早発型冠状動脈心疾患、冠状動脈心疾患に対する１つ以上の危険因子、ＩＩ型糖尿病、異脂肪血症を伴うＩＩ型糖尿病、異脂肪血症、高トリグリセリド血症、高脂血症、高脂肪酸血症、肝脂肪変性、非アルコール性脂肪性肝炎または非アルコール性脂肪肝疾患の処置である。さらなる実施形態において、その治療は、ＣＨＤリスクの低下である。ＣＨＤリスクに相当するものとは、冠状動脈心疾患に対する高リスクを付与する臨床上のアテローム硬化性疾患の指標のことをいい、それらとしては、臨床上の冠状動脈心疾患、症候性の頸動脈疾患、末梢動脈疾患および／または腹部の大動脈瘤が挙げられる。ある特定の場合、その治療は、アテローム性動脈硬化症の予防である。ある特定の実施形態において、その治療は、冠状動脈心疾患の予防である。
【０１８２】
ある特定の実施形態において、ＪＮＫ１に対して標的化されたアンチセンス化合物を含んでいる薬学的組成物は、血糖、血清トリグリセリドまたは肝臓トリグリセリドを減少させるための薬物の調製のために使用される。ある特定の実施形態において、ＪＮＫ１に対して標的化されたアンチセンス化合物を含んでいる薬学的組成物は、冠状動脈心疾患リスクを低下させるための薬物の調製のために使用される。ある特定の実施形態において、ＪＮＫ１に対して標的化されたアンチセンス化合物は、高コレステロール血症、混合型異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症を発症するリスク、冠状動脈心疾患、冠状動脈心疾患の病歴、早発型冠状動脈心疾患、冠状動脈心疾患に対する１つ以上の危険因子、ＩＩ型糖尿病、異脂肪血症を伴うＩＩ型糖尿病、異脂肪血症、高トリグリセリド血症、高脂血症、高脂肪酸血症、肝脂肪変性、非アルコール性脂肪性肝炎または非アルコール性脂肪肝疾患を処置するための薬物の調製のために使用される。
【０１８３】
ある特定の併用療法
ある特定の実施形態において、本発明の１つ以上の薬学的組成物は、１つ以上の他の医薬品と共投与される。ある特定の実施形態において、そのような１つ以上の他の医薬品は、本発明の１つ以上の薬学的組成物と同じ疾患または状態を処置するために設計される。ある特定の実施形態において、そのような１つ以上の他の医薬品は、本発明の１つ以上の薬学的組成物と異なる疾患または状態を処置するために設計される。ある特定の実施形態において、そのような１つ以上の他の医薬品は、本発明の１つ以上の薬学的組成物の望まれない作用を処置するために設計される。ある特定の実施形態において、本発明の１つ以上の薬学的組成物は、他の医薬品の望まれない作用を処置する別の医薬品と共投与される。ある特定の実施形態において、本発明の１つ以上の薬学的組成物および１つ以上の他の医薬品は、同じ時に投与される。ある特定の実施形態において、本発明の１つ以上の薬学的組成物および１つ以上の他の医薬品は、異なる時に投与される。ある特定の実施形態において、本発明の１つ以上の薬学的組成物および１つ以上の他の医薬品は、単一の製剤において一緒に調製される。ある特定の実施形態において、本発明の１つ以上の薬学的組成物および１つ以上の他の医薬品は、別々に調製される。
【０１８４】
ある特定の実施形態において、ＪＮＫ１核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物を含んでいる薬学的組成物と共投与され得る医薬品としては、血糖降下薬および血糖降下治療薬が挙げられる。いくつかの実施形態において、血糖降下薬は、ＰＰＡＲアゴニスト（ガンマ、デュアルまたはｐａｎ）、ジペプチジルペプチダーゼ（ＩＶ）インヒビター、ＧＬＰ−１アナログ、インスリンもしくはインスリンアナログ、インスリン分泌促進剤、ＳＧＬＴ２インヒビター、ヒトアミリンアナログ、ビグアナイド、アルファ−グルコシダーゼインヒビター、メグリチニド（ｍｅｇｌｉｔｉｎｉｄｅ）、チアゾリジンジオンまたはスルホニル尿素である。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、上記グルコース低下治療薬は、ＧＬＰ−１アナログである。いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−１アナログは、エキセンディン（ｅｘｅｎｄｉｎ）−４またはリラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）である。
【０１８６】
他の実施形態において、上記グルコース低下治療薬は、スルホニル尿素である。いくつかの実施形態において、スルホニル尿素は、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリドまたはグリクラジドである。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、上記グルコース低下薬は、ビグアナイドである。いくつかの実施形態において、ビグアナイドは、メトホルミンであり、いくつかの実施形態では、メトホルミン単独での処置後に観察される乳酸アシドーシスと比べて、乳酸アシドーシスを増加させずに血中グルコースレベルが低下する。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、上記グルコース低下薬は、メグリチニドである。いくつかの実施形態において、メグリチニドは、ナテグリニドまたはレパグリニドである。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、上記グルコース低下薬は、チアゾリジンジオンである。いくつかの実施形態において、チアゾリジンジオンは、ピオグリタゾン、ロシグリタゾンまたはトログリタゾンである。いくつかの実施形態において、ロシグリタゾン単独での処置によって観察された体重増加よりも多くない体重増加で血中グルコースレベルが低下する。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、上記グルコース低下薬は、アルファ−グルコシダーゼインヒビターである。いくつかの実施形態において、アルファ−グルコシダーゼインヒビターは、アカルボースまたはミグリトール（ｍｉｇｌｉｔｏｌ）である。
【０１９１】
ある特定の実施形態において、共投与される血糖降下薬は、ＩＳＩＳ１１３７１５である。
【０１９２】
ある特定の実施形態において、グルコース低下治療は、治療的な生活様式の変更である。
【０１９３】
ある特定のそのような実施形態において、上記血糖降下薬は、本発明の薬学的組成物の投与の前に投与される。ある特定のそのような実施形態において、上記グルコース低下剤は、本発明の薬学的組成物の投与の後に投与される。ある特定のそのような実施形態において、上記グルコース低下剤は、本発明の薬学的組成物と同じ時に投与される。ある特定のそのような実施形態において、共投与されるグルコース低下剤の用量は、上記グルコース低下剤が単独で投与される場合に投与される用量と同じである。ある特定のそのような実施形態において、共投与されるグルコース低下剤の用量は、上記グルコース低下剤が単独で投与される場合に投与される用量よりも少ない。ある特定のそのような実施形態において、共投与されるグルコース低下剤の用量は、上記グルコース低下剤が単独で投与される場合に投与される用量よりも多い。
【０１９４】
ある特定の実施形態において、ＪＮＫ１核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物を含んでいる薬学的組成物と共投与され得る医薬品としては、抗肥満症薬剤が挙げられる。そのような抗肥満症治療薬は、血糖降下薬について上に記載したように投与され得る。
【０１９５】
ＪＮＫ１核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物を、注射を介して投与する方法がさらに提供され、その方法は、注射部位において局所的にステロイドを投与する工程をさらに包含する。
【０１９６】
ある特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物と共投与され得る医薬品としては、脂質低下剤が挙げられる。ある特定のそのような実施形態において、本発明の薬学的組成物と共投与され得る医薬品としては、アトルバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチンおよびエゼチミブが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定のそのような実施形態において、その脂質低下剤は、本発明の薬学的組成物の投与の前に投与される。ある特定のそのような実施形態において、その脂質低下剤は、本発明の薬学的組成物の投与の後に投与される。ある特定のそのような実施形態において、その脂質低下剤は、本発明の薬学的組成物と同じ時に投与される。ある特定のそのような実施形態において、共投与される脂質低下剤の用量は、その脂質低下剤が単独で投与される場合に投与される用量と同じである。ある特定のそのような実施形態において、共投与される脂質低下剤の用量は、その脂質低下剤が単独で投与される場合に投与される用量よりも少ない。ある特定のそのような実施形態において、共投与される脂質低下剤の用量は、その脂質低下剤が単独で投与される場合に投与される用量よりも多い。
【０１９７】
ある特定の実施形態において、共投与される脂質低下剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターである。ある特定のそのような実施形態において、そのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターは、スタチンである。ある特定のそのような実施形態において、そのスタチンは、アトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチンおよびロスバスタチンから選択される。
【０１９８】
ある特定の実施形態において、共投与される脂質低下剤は、コレステロール吸収インヒビターである。ある特定のそのような実施形態において、コレステロール吸収インヒビターは、エゼチミブである。
【０１９９】
ある特定の実施形態において、共投与される脂質低下剤は、共製剤化されたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターおよびコレステロール吸収インヒビターである。ある特定のそのような実施形態において、その共製剤化された脂質低下剤は、エゼチミブ／シンバスタチンである。
【０２００】
ある特定の実施形態において、共投与される脂質低下剤は、ミクロソームトリグリセリド移入タンパク質インヒビター（ＭＴＰインヒビター）である。
【０２０１】
ある特定の実施形態において、共投与される脂質低下剤は、ＡｐｏＢに対して標的化されたオリゴヌクレオチドである。
【０２０２】
ある特定の実施形態において、共投与される医薬品は、胆汁酸捕捉剤である。ある特定のそのような実施形態において、その胆汁酸捕捉剤は、コレスチラミン、コレスチポールおよびコレセベラム（ｃｏｌｅｓｅｖｅｌａｍ）から選択される。
【０２０３】
ある特定の実施形態において、共投与される医薬品は、ニコチン酸である。ある特定のそのような実施形態において、そのニコチン酸は、即時放出型ニコチン酸、持続放出型ニコチン酸および徐放型ニコチン酸から選択される。
【０２０４】
ある特定の実施形態において、共投与される医薬品は、フィブリン酸である。ある特定のそのような実施形態において、フィブリン酸は、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、クロフィブラート、ベザフィブレートおよびシプロフィブレート（ｃｉｐｒｏｆｉｂｒａｔｅ）から選択される。
【０２０５】
本発明の薬学的組成物と共投与され得る医薬品のさらなる例としては、コルチコステロイド（プレドニゾンが挙げられるがこれに限定されない）；免疫グロブリン（静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）が挙げられるがこれに限定されない）；鎮痛剤（例えば、アセトアミノフェン）；抗炎症剤（非ステロイド性抗炎症性薬物（例えば、イブプロフェン、ＣＯＸ−１インヒビターおよびＣＯＸ−２インヒビター）が挙げられるがこれらに限定されない）；サリチレート；抗生物質；抗ウイルス剤；抗真菌剤；抗糖尿病薬（例えば、ビグアナイド、グルコシダーゼインヒビター、インスリン、スルホニル尿素およびチアゾリデンジオン）；アドレナリン性変更因子（ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）；利尿剤；ホルモン（例えば、アナボリックステロイド、アンドロゲン、エストロゲン、カルシトニン、プロゲスチン、ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｎ）および甲状腺ホルモン）；免疫調節剤（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）；筋肉弛緩剤；抗ヒスタミン剤；骨粗鬆症薬剤（例えば、ビホスホネート、カルシトニンおよびエストロゲン）；プロスタグランジン、抗悪性腫瘍剤；精神治療薬；鎮静薬；有毒オーク（ｐｏｉｓｏｎ  ｏａｋ）またはドクウルシ（ｐｏｉｓｏｎ  ｓｕｍａｃ）の生成物；抗体；およびワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０６】
ある特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物は、脂質低下治療とともに投与され得る。ある特定のそのような実施形態において、脂質低下治療は、治療的な生活様式の変更である。ある特定のそのような実施形態において、脂質低下治療は、ＬＤＬアフェレーシスである。
【０２０７】
ある特定の実施形態において、肥満症は、薬物誘導性である。特定の実施形態において、肥満症は、精神療法の薬物または薬剤を用いる処置によって誘導される。ある特定の精神療法の薬剤、すなわち、非定型抗精神病薬の治療的な使用によって、代謝性異常のリスクが上昇し得、そして、その使用は、一般に体重増加および耐糖能障害を伴う。抗精神病の治療後に体重が増加した患者のパーセンテージは、使用される抗精神病薬剤に応じて最大８０％に達し得、３０％以上が肥満症を発症する。関連する医学的な合併症とともに、そのような代謝性異常は、服薬遵守しない患者のパーセンテージを増加させ、その結果、再発のリスクを増加させる。
【０２０８】
ＪＮＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドが代謝率およびインスリン感度を増加させる能力ならびに脂肪過多および体重増加を減少させる能力に起因して、これらの化合物は、抗精神病薬剤を用いる処置に関連する代謝性異常を減少させるために投与され得る。ある特定の実施形態において、ＪＮＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、精神治療薬の治療的な使用に伴う代謝性異常を減少させる方法で送達される。そのような体重増加を誘導する抗精神病薬剤としては、クロザピン、オランザピン、アリピプラゾール、リスペリドンおよびジプラシドンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０９】
ある特定の実施形態において、上記ＪＮＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記精神治療薬の送達と同時に送達される。あるいは、送達は、同じ製剤においてであり得るか、または別々に投与され得る。ある特定の実施形態において、上記ＪＮＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、肥満症誘導薬物または肥満症誘導薬剤による処置が終わった後に投与される。特定の実施形態において、上記ＪＮＫ１アンチセンス化合物の投与は、上記精神治療薬のＣＮＳ作用に影響を及ぼさずに、代謝率の上昇もしくは脂肪過多の減少またはその両方をもたらす。
【０２１０】
ある特定の実施形態において、ＪＮＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｃｕｌｅｏｔｉｄｅ）は、同じ製剤または別個の製剤で、他の抗肥満症薬物または抗肥満症薬剤と併用して投与される。ある特定の実施形態において、その抗肥満症薬剤は、ＣＮＳベースのもの（例えば、シブトラミンであるがこれに限定されない）またはＧＬＰ−１ベースのもの（例えば、リラグルチドであるがこれに限定されない）である。
【０２１１】
アンチセンス化合物
ＪＮＫ１、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３タンパク質を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドが本明細書中に提供される。そのような調節は、肥満症および代謝症候群などの様々な障害または疾患の処置、軽減または予防にとって望ましい。そのような阻害は、そのような疾患もしくは障害である傾向があると疑われる動物またはそのような疾患もしくは障害である傾向があると知られる動物において、そのような疾患または障害の発症の予防または調節にとってさらに望ましい。
【０２１２】
ＪＮＫ１タンパク質の発現を調節する方法が、本明細書中に提供され、その方法は、ＪＮＫ１タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドと動物とを接触させる工程を包含する。これらの方法はまた、そのような発現および活性化に関連する状態の診断にも有用である。
【０２１３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してＪＮＫ１媒介性の活性を阻害する工程を包含する方法もまた、本明細書中に提供される。これらの方法は、本発明のオリゴヌクレオチドを使用するものであり、治療的に有用であり、かつ臨床研究および診断ツールとして有用であると考えられている。体重増加の減少、精巣上体脂肪パッド重量の減少、全身の脂肪量の減少、代謝率の上昇、満腹時血漿グルコースの減少、空腹時血漿グルコースの減少、満腹時血漿インスリンの減少、空腹時血漿インスリンの減少、耐糖能の改善、インスリン抵抗性の改善、肝脂肪変性の改善、血漿コレステロールの減少、血漿トランスアミナーゼの減少またはそれらの組み合わせを含む、状態を処置するためか、予防するためか、または回復させるために核酸からＪＮＫ１の発現を阻害するための方法が提供される。
【０２１４】
調節が望まれるタンパク質をコードするＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の機能のアンチセンス調節において、オリゴヌクレオチドが本明細書中で使用され、それによって、そのようなタンパク質の量が最終的に制御される。そのｍＲＮＡ標的とアンチセンスオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって、ｍＲＮＡの正常な役割が妨害され、細胞におけるその機能の調節が引き起こされる。妨害されるｍＲＮＡの機能としては、生体機能のすべて（例えば、タンパク質翻訳のための部位へのそのＲＮＡの移動、そのＲＮＡからのタンパク質の実際の翻訳、そのＲＮＡのスプライシングによって１つ以上のｍＲＮＡ種が得られること、およびそのＲＮＡが関与し得る独立した触媒活性でさえも）が挙げられる。ｍＲＮＡ機能のそのような妨害作用の全体が、タンパク質発現の調節であり、ここで、調節は、そのタンパク質の発現の増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかである。本発明の文脈において、阻害が、遺伝子発現の調節の好ましい形態である。
【０２１５】
アンチセンス攻撃に対して特定の遺伝子を標的化することが、好ましい。本発明の文脈において、関連核酸に対するオリゴヌクレオチドの標的化は、多段階プロセスである。そのプロセスは、調節されるべき機能を有する核酸配列の同定から出発する。これは、例えば、その発現が特定の障害または疾患状態に関連する細胞の遺伝子（またはその遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）または感染性物質由来の外来性の核酸であり得る。本発明において、その標的は、過剰増殖性障害に関連する、細胞の遺伝子である。標的化プロセスはまた、オリゴヌクレオチド相互作用によって、所望の作用、すなわちタンパク質の発現の検出または調節をもたらすこの遺伝子内の部位の決定を包含する。いったん標的部位が同定されると、その標的に十分に相補的な、すなわち、十分に、かつ十分な特異性でハイブリダイズして所望の作用を付与する、オリゴヌクレオチドが選択される。一般に、アンチセンス調節のために標的化され得る遺伝子の領域は、５つ存在する：５’非翻訳領域（本明細書中以後、「５’−ＵＴＲ」）、翻訳開始コドン領域（本明細書中以後、「ｔＩＲ」）、オープンリーディングフレーム（本明細書中以後、「ＯＲＦ」）、翻訳終止コドン領域（本明細書中以後、「ｔＴＲ」）および３’非翻訳領域（本明細書中以後、「３’−ＵＴＲ」）。当該分野で公知であるように、これらの領域は、以下の順序（左から右に、５’から３’）：５’−ＵＴＲ、ｔＩＲ、ＯＲＦ、ｔＴＲ、３’−ＵＴＲで代表的なメッセンジャーＲＮＡ分子に配置される。当該分野で公知であるように、いくつかの真核生物の転写物は、直接翻訳されるが、多くのＯＲＦは、「イントロン」として知られる１つ以上の配列を含み、そのイントロンは、それが翻訳される前に転写物から切り取られる；ＯＲＦの発現部分（切り取られない部分）は、「エキソン」と呼ばれている（Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，１９８３，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．４１１−４１５）。さらに、多くの真核生物のＯＲＦは、１０００ヌクレオチド長以上であるので、ＯＲＦを、例えば、５’ＯＲＦ領域、中央のＯＲＦ領域および３’ＯＲＦ領域に細分することがしばしば好都合である。いくつかの場合において、ＯＲＦは、インビボでのいくつかの機能的意義に起因して標的化され得る１つ以上の部位を含む。後者のタイプの部位の例としては、遺伝子内のステムループ構造（例えば、米国特許第５，５１２，４３８号を参照のこと）およびプロセシングされていないｍＲＮＡ分子ではイントロン／エキソンスプライス部位が挙げられる。
【０２１６】
本発明の文脈内で、１つの好ましい遺伝子内の部位は、その遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンを含んでいる領域である。当該分野で公知であるように、翻訳開始コドンは、代表的には５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子では５’−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンは、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」または「ＡＵＧ開始コドン」とも呼ばれる。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧまたは５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、そして５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧは、インビボにおいて機能することが示されている。さらに、５’−ＵＵＵは、インビトロにおいて翻訳開始コドンとして機能する（Ｂｒｉｇｓｔｏｃｋら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，１９９０，４，４５；Ｇｅｌｂｅｒｔら、Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９０，１６，１７３；Ｇｏｌｄ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒｍｏ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，１９８７，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、Ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐ．１３０３）。従って、各場合におけるイニシエーターアミノ酸が、代表的にはメチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物）であるにも関わらず、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は、多くのコドン配列を包含し得る。様々なアミノ末端配列を有する関連ポリペプチドを作製するために、真核生物および原核生物の遺伝子が、２つ以上の代替の開始コドンを有し得、それらのうちのいずれか１つが、特定の細胞型もしくは組織において、または特定の条件セットの下で、翻訳開始に優先的に利用され得ることもまた、当該分野で公知である（Ｍａｒｋｕｓｓｅｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９５，１２１，３７２３；Ｇａｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９５，５５，７４３；ＭｃＤｅｒｍｏｔｔら、Ｇｅｎｅ，１９９２，１１７，１９３；Ｐｅｒｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，２６６，１２５３６；Ｆｒｅｎｃｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，１９８９，６３，３２７０；Ｐｕｓｈｐａ−Ｒｅｋｈａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０，２６９９３；Ｍｏｎａｃｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９，３４７；ＤｅＶｉｒｇｉｌｉｏら、Ｙｅａｓｔ，１９９２，８，１０４３；Ｋａｎａｇａｓｕｎｄａｒａｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９２，１１７１，１９８；Ｏｌｓｅｎら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１９９１，５，１２４６；Ｓａｕｌら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９０，５６，３１１７；Ｙａｏｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７，７０９０；Ｒｏｇｅｒｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９０，９，２２７３）。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」とは、そのようなコドンの配列に関係なく、ＪＮＫ１タンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するためにインビボにおいて使用されるコドンのことをいう。遺伝子の翻訳終止コドン（または「終止コドン」）は、３つの配列、すなわち、５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡである）のうちの１つを有し得ることもまた当該分野で公知である。用語「開始コドン領域」および「翻訳開始領域」とは、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）に、連続した約２５〜約５０ヌクレオチドを含むｍＲＮＡまたは遺伝子の一部のことをいう。同様に、用語「終止コドン領域」および「翻訳終止領域」とは、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）に、連続した約２５〜約５０ヌクレオチドを含むｍＲＮＡまたは遺伝子の一部のことをいう。
【０２１７】
１．本発明のオリゴヌクレオチド：本発明は、１つ以上のＪＮＫ１タンパク質のアンチセンス調節において使用するために、オリゴヌクレオチドを使用する。本発明の文脈において、用語オリゴヌクレオチドとは、リボ核酸またはデオキシリボ核酸のオリゴマーまたはポリマーのことをいう。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合性の糖間の（骨格）結合から構成されるオリゴヌクレオチドならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを包含する。その特性（例えば、細胞の取り込みの増大、標的への結合の増大およびヌクレアーゼの存在下における安定性の増大）が望ましいので、しばしば、そのような改変または置換されたオリゴヌクレオチドが天然型よりも好ましい。
【０２１８】
オリゴヌクレオチドは、一般にヌクレオチドとして知られる繰り返し単位のポリマーである。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは約８〜約３０ヌクレオチドを含む。改変されていない（天然に存在する）ヌクレオチドは、３つの構成要素：（１）窒素含有複素環式塩基と、これが窒素原子の１つで連結されている（２）５−ペントフラノシル糖および（３）その糖の５’または３’炭素原子の１つとエステル化しているリン酸を有する。第１のヌクレオチドのリン酸が、オリゴヌクレオチド鎖内に組み込まれるとき、そのリン酸は、３’−５’リン酸エステル結合を介して、第２の隣接したヌクレオチドの隣接した糖にエステル化される。改変されていないオリゴヌクレオチドの「骨格」は、（２）および（３）、すなわち、第１のヌクレオチドの糖の５’炭素と第２の隣接したヌクレオチドの３’炭素との間のホスホジエステル結合によって共に連結された糖からなる。「ヌクレオシド」は、（１）核酸塩基と（２）糖との組み合わせであり、（３）リン酸部分は存在しない（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８０，４−７頁）。オリゴヌクレオチドの骨格は、特定の順序で連続した塩基を位置づける；このひと続きの塩基の表記（慣習的に５’から３’への順序で記載される）は、ヌクレオチド配列として知られている。
【０２１９】
オリゴヌクレオチドは、特定の核酸との特異的なハイブリダイゼーションをもたらすのに十分な同一性および数のヌクレオチド配列を含み得る。遺伝子のセンス鎖の一部に特異的にハイブリダイズするそのようなオリゴヌクレオチドは、通常、アンチセンスと記載される。本発明の文脈において、ハイブリダイゼーションは、相補的なヌクレオチド間の水素結合（ワトソン−クリック水素結合、フーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合であり得る）を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合を形成することによって対を形成する相補的な核酸塩基である。相補的とは、２つのヌクレオチド間で正確に対を形成する能力のことをいう。例えば、オリゴヌクレオチドのある特定の位置に存在するヌクレオチドが、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の同じ位置に存在するヌクレオチドと水素結合することができる場合、そのオリゴヌクレオチドおよびそのＤＮＡまたはＲＮＡは、その位置において互いに相補的であると考えられる。各分子における十分な数の対応位置が、互いと水素結合することができるヌクレオチドで占められているとき、そのオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、互いに相補的である。核酸二重鎖の内部における特定のパートナー核酸塩基間での塩基対の形成に起因して、オリゴヌクレオチドは、その標的配列と特異的にハイブリダイズすることができる。天然に存在する核酸塩基のうち、グアニン（Ｇ）は、シトシン（Ｃ）に結合し、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）に結合する。Ａに対するパートナーとしてＵ（ＲＮＡ）とＴ（ＤＮＡ）が等価であることに加えて、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびゲンチオビオシルＨＭＣ（Ｃ等価物）および５−ヒドロキシメチルウラシル（Ｕ等価物）をはじめとした他の天然に存在する核酸塩基等価物が知られている。さらに、パートナー特異性を保持している合成核酸塩基が、当該分野で公知であり、それらとしては、例えば、Ｃに対するパートナー特異性を保持している７−デアザ−グアニンが挙げられる。従って、その標的配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力は、標的オリゴヌクレオチドにおけるパートナー核酸塩基に対する特異性に有意に影響を及ぼさないオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列における核酸塩基への任意の化学的改変によって変化しない。オリゴヌクレオチドが、特異的にハイブリダイズすることができるためにその標的ＤＮＡ配列に対して１００％相補的である必要はないことが当該分野において理解されている。インビボアッセイまたは治療的な処置の場合およびインビトロアッセイの場合（そのアッセイが行われる条件下）において、特異的結合が望まれる条件下、すなわち、生理学的条件下において、オリゴヌクレオチドと非標的配列との非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在するとき、そのオリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズすることができる。
【０２２０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、研究試薬、診断補助薬および治療薬として、通常使用される。例えば、すぐれた特異性で遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の機能を解明するために、例えば、生物学的経路の様々なメンバーの機能を区別するために、しばしば当業者によって使用される。ゆえに、この特異的な阻害性作用は、当業者によって研究用途に利用されている。オリゴヌクレオチドの特異性および感度もまた、治療用途のために当業者によって利用されている。
【０２２１】
結合の改変：本発明に対して想定されるいくつかの好ましい改変オリゴヌクレオチドの特定の例としては、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式の糖間結合を含むものが挙げられる。ホスホロチオエートを有するオリゴヌクレオチド、ならびに、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格を有するオリゴヌクレオチドが、最も好ましい（ここで、天然のホスホジエステル骨格は、Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２と表される）。モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ，米国特許第５，０３４，５０６号）。ＮＲ−Ｃ（＊）−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（＊）−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ−Ｃ（＊）、Ｃ（＊）−ＮＲ−ＣＨ２−ＣＨ２およびＣＨ２−Ｃ（＊）−ＮＲ−ＣＨ２骨格を有するオリゴヌクレオチドが、さらに好ましく、ここで、「＊」は、ＯまたはＳを表す（アミド骨格として知られる；１９９２年１１月２６日公開のＤｅＭｅｓｍａｅｋｅｒら、ＷＯ  ９２／２０８２３）。他の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格であるペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格をポリアミド骨格で置き換え、ここで、その核酸塩基は、ポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７；米国特許第５，５３９，０８２号）。
【０２２２】
核酸塩基の改変：本発明のオリゴヌクレオチドは、さらに、またはあるいは、核酸塩基の改変または置換を含み得る。本明細書中で使用されるとき、「改変されていない」または「天然の」核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を包含する。改変された核酸塩基は、天然の核酸において稀にかまたは一過性に見られる核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびゲンチオビオシルＨＭＣ、ならびに合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニンおよび２，６−ジアミノプリンを包含する（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８０，７５−７７頁；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８７，１５，４５１３）。
【０２２３】
糖の改変：改変オリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の置換された糖部分を含み得る。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のもの：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含み、ここで、上記アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換されているか、または置換されていない、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が、特に好ましく、ここで、ｎおよびｍは、１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のもの：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的な特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的な特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。好ましい改変としては、アルコキシアルコキシ基、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）が挙げられる（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）。さらに好ましい改変としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２が挙げられる。
【０２２４】
他の好ましい改変としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の改変もまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置において、特に、３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’結合したオリゴヌクレオチド上の糖の３’位において、および５’末端ヌクレオチドの５’位において、行われ得る。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣物も有し得る。そのような改変された糖構造の調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；および同第５，７００，９２０号（これらの各々が、本明細書中で参考として援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２５】
他の改変：同様の改変が、オリゴヌクレオチド上の他の位置において、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位において、行われ得る。オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端は、例えば、脂肪親和性部分（この直後のパラグラフを参照のこと）、インターカレート剤（１９９６年１０月１７日公開のＫｕｙａｖｉｎら、ＷＯ９６／３２４９６；１９８９年５月（Ｃａｎ）３０日発行のＮｇｕｙｅｎら、米国特許第４，８３５，２６３号）またはヒドロキシアルキル基（Ｈｅｌｅｎｅら、１９９６年１０月３１日公開のＷＯ９６／３４００８）の化学的な結合体化の点として機能するために改変され得る。
【０２２６】
本発明のオリゴヌクレオチド内の他の位置を使用して、１つ以上のエフェクター基と化学的に結合し、オリゴヌクレオチド結合体を形成することができる。「エフェクター基」は、特定の化学的または生物学的な機能を行うことができる化学部分である。そのようなエフェクター基の例としては、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的な特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドおよび同様の特性を有する他の置換基の薬力学的な特性を改善するための基が挙げられるが、これらに限定されない。種々の化学的リンカーを使用して、エフェクター基を本発明のオリゴヌクレオチドに結合体化することができる。例として、Ｃｏｏｋらに対する米国特許第５，５７８，７１８号では、誘導体化されることによって、リボフラノシル位か、ヌクレオシドの塩基の位置か、またはヌクレオシド間結合上に、さらなる基をさらに含めることができるアルキルチオリンカーを結合する方法が開示されている。オリゴヌクレオチドを様々なエフェクター基に結合体化するさらなる方法は、当該分野で公知である；例えば、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２６）Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９４を参照のこと。
【０２２７】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の好ましいさらなる改変または代替の改変は、オリゴヌクレオチドの細胞の取り込みを増大させる１つ以上の脂肪親和性部分をそのオリゴヌクレオチドに化学的に結合することを含む。そのような脂肪親和性部分は、そのオリゴヌクレオチド上のいくつかの異なる位置においてそのオリゴヌクレオチドに連結され得る。いくつかの好ましい位置としては、３’末端ヌクレオチドの糖の３’位、５’末端ヌクレオチドの糖の５’位および任意のヌクレオチドの糖の２’位が挙げられる。プリン核酸塩基のＮ６位もまた、脂肪親和性部分を本発明のオリゴヌクレオチドに連結するために利用され得る（Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８７，１５，４５１３）。そのような脂肪親和性部分としては、コレステリル部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９，８６，６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３．２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０，１１１；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７）、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９）またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９）あるいは、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３）が挙げられるがこれらに限定されない。脂肪親和性部分を含むオリゴヌクレオチドおよびそのようなオリゴヌクレオチドを調製するための方法は、米国特許第５，１３８，０４５号、同第５，２１８，１０５号および同第５，４５９，２５５号に開示されている。
【０２２８】
本発明はまた、オリゴヌクレオチド内の特定に位置に関してキラル的に実質的に純粋なオリゴヌクレオチドも包含する。キラル的に実質的に純粋なオリゴヌクレオチドの例としては、少なくとも７５％のＳｐまたはＲｐであるホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド（Ｃｏｏｋら、米国特許第５，５８７，３６１号）およびキラル的に実質的に純粋な（ＳｐまたはＲｐ）アルキルホスホネート、ホスホアミデートまたはホスホトリエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（Ｃｏｏｋ，米国特許第５，２１２，２９５号および同第５，５２１，３０２号）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２９】
キメラオリゴヌクレオチド：本発明はまた、キメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドも包含する。本発明の文脈において、「キメラ」オリゴヌクレオチドまたは「キメラ」は、２つ以上の化学的に異なる領域（各々、少なくとも１つのヌクレオチドから構成されている）を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、代表的には、少なくとも１つの領域を含み、ここで、そのオリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドに対して、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増大、細胞の取り込みの増大および／または標的核酸に対する結合親和性の増大を付与するように改変される。そのオリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質として機能し得る。例としては、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。ゆえに、ＲＮアーゼＨの活性化によって、ＲＮＡ標的が切断されることにより、遺伝子発現のアンチセンス阻害の効率が大幅に増大する。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、そして必要であれば、当該分野で公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション手法によって、通例のとおり検出され得る。例としては、そのような「キメラ」は、「ギャップマー」、すなわち、オリゴヌクレオチドの中央の部分（「ギャップ」）が、例えば、ＲＮアーゼＨに対する基質として働き、そして、５’部分および３’部分（「ウイング」）が、標的ＲＮＡ分子に対してより高い親和性を有するが、ヌクレアーゼ活性を助けることができない（例えば、２’−フルオロ−または２’−メトキシエトキシ−置換されている）ような様式で改変されているオリゴヌクレオチドであり得る。他のキメラとしては、「ウイングマー（ｗｉｎｇｍｅｒ）」、すなわち、オリゴヌクレオチドの５’部分が、例えば、ＲＮアーゼＨに対する基質として働くのに対し、その３’部分は、標的ＲＮＡ分子に対してより高い親和性を有するが、ヌクレアーゼ活性を助けることができない（例えば、２’−フルオロ−または２’−メトキシエトキシ−置換されている）か、または逆もまた同じであるような様式で改変されているオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０２３０】
合成：本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の手法を介して便利かつ通例のとおり作製され得る。そのような合成のための装置は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）をはじめとしたいくつかの供給メーカーによって販売されている。さらに、またはあるいは、当該分野で公知のそのような合成のための他の任意の手段が使用され得る。同様の手法を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化された誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製することも知られている。
【０２３１】
特定の改変オリゴヌクレオチドの合成に関する教示は、以下の米国特許または係属中の特許出願（これらの各々は、通常、本願とともに譲渡されている）：米国特許第５，１３８，０４５号および同第５，２１８，１０５号、ポリアミン結合体化オリゴヌクレオチドに関する特許；米国特許第５，２１２，２９５号、キラルなリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製用のモノマーに関する特許；米国特許第５，３７８，８２５号および同第５，５４１，３０７号、改変された骨格を有するオリゴヌクレオチドに関する特許；米国特許第５，３８６，０２３号、骨格が改変されたオリゴヌクレオチドおよび還元カップリングを介したその調製に関する特許；米国特許第５，４５７，１９１号、３−デアザプリン環系に基づく改変核酸塩基およびその合成方法に関する特許；米国特許第５，４５９，２５５号、Ｎ−２置換プリンに基づく改変核酸塩基に関する特許；米国特許第５，５２１，３０２号、キラルなリン結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するためのプロセスに関する特許；米国特許第５，５３９，０８２号、ペプチド核酸に関する特許；米国特許第５，５５４，７４６号、β−ラクタム骨格を有するオリゴヌクレオチドに関する特許；米国特許第５，５７１，９０２号、オリゴヌクレオチドを合成するための方法および材料に関する特許；米国特許第５，５７８，７１８号、アルキルチオ基を有するヌクレオシドに関する特許であって、そのような基が、そのヌクレオシドの種々の位置のいずれかにおいて結合している他の部分に対するリンカーとして使用され得る特許；米国特許第５，５８７，３６１号および同第５，５９９，７９７号、高キラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドに関する特許；米国特許第５，５０６，３５１号、２’−Ｏ−アルキルグアノシンおよび２，６−ジアミノプリン化合物をはじめとした関連化合物を調製するためのプロセスに関する特許；米国特許第５，５８７，４６９号、Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに関する特許；米国特許第５，５８７，４７０号、３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに関する特許；１９９３年６月２９日発行の米国特許第５，２２３，１６８号および同第５，６０８，０４６号、この両方は結合体化された４’−デスメチルヌクレオシドアナログに関する特許；米国特許第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号、骨格が改変されたオリゴヌクレオチドアナログに関する特許；ならびに１９９５年２月３日出願の米国特許出願番号０８／３８３，６６６および米国特許第５，４５９，２５５号、とりわけ、２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドを合成する方法に関する特許、特許出願に見られる。
【０２３２】
５−メチル−シトシン：２’−メトキシエトキシ−改変オリゴヌクレオチドでは、５−メチル−２’−メトキシエトキシ−シトシン残基を以下のとおり使用し、調製する。２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］：５−メチルウリジン（リボシルチミン，Ｙａｍａｓａ，Ｃｈｏｓｈｉ，Ｊａｐａｎから商業的に入手可能）（７２．０ｇ，０．２７９Ｍ）、炭酸ジフェニル（９０．０ｇ，０．４２０Ｍ）および炭酸水素ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に加えた。その混合物を撹拌しながら加熱還流して、発生する二酸化炭素ガスを制御された様式で放出させた。１時間後、わずかに暗い色の溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップ状物をジエチルエーテル（２．５Ｌ）に撹拌しながら注ぎ込んだ。その生成物は、ゴム状物を形成した。上記エーテルをデカントし、残渣を最少量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶解した。その溶液を新しいエーテル（２．５Ｌ）に注ぎ込むことにより、硬いゴム状物が得られた。上記エーテルをデカントし、そのゴム状物を真空オーブン内で乾燥させる（２４時間、１ｍｍＨｇにおいて６０？Ｃ）ことにより、固体が得られ、その固体を淡褐色の粉末に粉砕した（５７ｇ，８５％粗収率）。その材料をさらなる反応のために使用した。２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン：２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ，０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ホウ酸塩（２３１ｇ，０．９８Ｍ）および２−メトキシエタノール（１．２Ｌ）を２Ｌステンレス鋼圧力容器に加え、予め１６０？Ｃに加熱しておいた油浴に入れた。４８時間１５５−１６０？Ｃに加熱した後、その容器を開け、その溶液を乾燥するまで蒸発させ、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で倍散した。残渣を熱アセトン（１Ｌ）に懸濁した。不溶性塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄し、濾液を蒸発させた。残渣（２８０ｇ）をＣＨ３ＣＮ（６００ｍＬ）に溶解し、蒸発させた。０．５％Ｅｔ３ＮＨを含んでいるＣＨ２Ｃｌ２／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）中にシリカゲルカラム（３ｋｇ）を満たした。上記残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）に溶解し、シリカ（１５０ｇ）上に吸着させた後、上記カラム上に充填した。上記生成物を充填溶媒とともに溶出することにより、１６０ｇ（６３％）の生成物が得られた。２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン：２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ，０．５０６Ｍ）をピリジン（２５０ｍＬ）と共蒸発させ、乾燥した残渣をピリジン（１．３Ｌ）に溶解した。塩化ジメトキシトリチルの第１アリコート（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、その混合物を室温で１時間撹拌した。塩化ジメトキシトリチルの第２アリコート（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、その反応物をさらに１時間撹拌した。次いで、メタノール（１７０ｍＬ）を加えることにより、反応を停止させた。ＨＰＬＣは、約７０％の生成物が存在していることを示した。溶媒を蒸発させ、ＣＨ３ＣＮ（２００ｍＬ）で倍散させた。残渣をＣＨＣｌ３（１．５Ｌ）に溶解し、２×５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３および２×５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして蒸発させた。２７５ｇの残渣が得られた。充填され、０．５％Ｅｔ３ＮＨを含んでいるＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で溶出される３．５ｋｇのシリカゲルカラムにおいて、上記残渣を精製した。純粋な分画を蒸発させることにより、１６４ｇの生成物が得られた。不純な分画から約２０ｇがさらに得られたことにより、合計１８３ｇ（５７％）が得られた。３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン：２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ，０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦおよび１８８ｍＬのピリジンから調製された７５０ｍＬの３：１混合物）および無水酢酸（２４．３８ｍＬ，０．２５８Ｍ）を併せ、室温で２４時間撹拌した。ＭｅＯＨを加えてｔｌｃサンプルをまずクエンチすることによって、上記反応物をｔｌｃでモニターした。その反応が完了した（ｔｌｃで判断）とき、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、その混合物を３５？Ｃで蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ３（８００ｍＬ）に溶解し、２×２００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムおよび２×２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。その水層を２００ｍＬのＣＨＣｌ３で逆抽出した。併せた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させることにより、１２２ｇの残渣が得られた（約９０％生成物）。その残渣を３．５ｋｇのシリカゲルカラムにおいて精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を使用して溶出した。純粋な生成分画を蒸発させることにより、９６ｇを得た（８４％）。３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン：３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ，０．１４４Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（７００ｍＬ）に溶解することによって、第１の溶液を調製し、置いておいた。トリエチルアミン（１８９ｍＬ，１．４４Ｍ）を、ＣＨ３ＣＮ（１Ｌ）中のトリアゾール（９０ｇ，１．３Ｍ）の溶液に加え、−５？Ｃに冷却し、頭上式の撹拌機を使用して０．５時間撹拌した。０−１０？Ｃに維持されたその撹拌溶液に、ＰＯＣｌ３を３０分間にわたって滴下し、得られた混合物をさらに２時間撹拌した。第１の溶液を、後の溶液に４５分間にわたって滴下した。得られた反応混合物を冷室に一晩保管した。その反応混合物から塩を濾過し、溶液を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し、不溶性の固体を濾過により除去した。その濾液を１×３００ｍＬのＮａＨＣＯ３および２×３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃに倍散することにより、表題化合物を得た。２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン：ジオキサン（５００ｍＬ）およびＮＨ４ＯＨ（３０ｍＬ）中の３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ，０．１４１Ｍ）の溶液を室温で２時間撹拌した。そのジオキサ���溶液を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２×２００ｍＬ）と共沸した。その残渣をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解し、２リットルのステンレス鋼圧力容器に移した。ＮＨ３ガスで飽和されたメタノール（４００ｍＬ）を加え、その容器を２時間１００？Ｃに加熱した（薄層クロマトグラフィすなわちｔｌｃは完全な変換を示した）。その容器の内容物を乾燥するまで蒸発させ、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で１回洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させることにより、８５ｇ（９５％）の表題化合物を得た。Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン：２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ，０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶解し、撹拌しながら安息香酸無水物（３７．２ｇ，０．１６５Ｍ）を加えた。３時間撹拌した後、ｔｌｃは、反応が約９５％完了していることを示した。溶媒を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）と共沸した。その残渣をＣＨＣｌ３（７００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２×３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして蒸発させることにより、残渣（９６ｇ）を得た。その残渣を、０．５％Ｅｔ３ＮＨを含んでいるＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を溶出溶媒として使用する１．５ｋｇシリカカラムにおけるクロマトグラフィに供した。その純粋な生成分画を蒸発させることにより、９０ｇ（９０％）の表題化合物を得た。Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト：Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ，０．１０Ｍ）をＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）に溶解した。窒素雰囲気下で撹拌しながら、テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）および２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）−亜リン酸塩（４０．５ｍＬ，０．１２３Ｍ）を加えた。得られた混合物を室温で２０時間撹拌した（ｔｌｃは、その反応が９５％完了していることを示した）。その反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１×３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（３×３００ｍＬ）で抽出した。その水性洗浄物をＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）で逆抽出し、その抽出物を併せ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。得られた残渣を、溶出溶媒としてＥｔＯＡｃ￥ヘキサン（３：１）を使用する１．５ｋｇのシリカカラムにおけるクロマトグラフィに供した。純粋な分画を併せることにより、９０．６ｇ（８７％）の表題化合物を得た。２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト  以下のパラグラフに記載されるように、２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても当該分野で知られる］を調製する。環外アミンを、アデノシンおよびシチジンの場合はベンゾイル部分で、そして、���アノシンの場合はイソブチリルで保護することを除いて、上記のチミジン（５−メチルウリジン）と同様に、アデノシン、シチジンおよびグアノシンのヌクレオシドアミダイトを調製する。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン  Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（Ｐｒｏ．Ｂｉｏ．Ｓｉｎｔ．，Ｖａｒｅｓｅ，Ｉｔａｌｙ，１００．０ｇ，０．４１６ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（０．６６ｇ，０．０１３ｅｑ，０．００５４ｍｍｏｌ）を、力学的に撹拌しながらアルゴン雰囲気下で外界温度の乾燥ピリジン（５００ｍｌ）に溶解した。ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５．８ｇ，１１９．０ｍＬ，１．１ｅｑ，０．４５８ｍｍｏｌ）を一度に加えた。その反応物を外界温度で１６時間撹拌した。ＴＬＣ（Ｒｆ０．２２，酢酸エチル）は、反応が完了していることを示唆した。その溶液を減圧下で粘稠な油状物に濃縮した。これをジクロロメタン（１Ｌ）と飽和炭酸水素ナトリウム（２×１Ｌ）とブライン（１Ｌ）との間で分離させた。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で粘稠な油状物に濃縮した。その油状物を酢酸エチルおよびエチルエーテルの１：１混合物（６００ｍＬ）に溶解し、その溶液を−１０℃に冷却した。得られた結晶性の生成物を濾過により回収し、エチルエーテル（３×２００ｍＬ）で洗浄し、そして乾燥する（４０℃，１ｍｍＨｇ，２４時間）ことにより、１４９ｇ（７４．８％）の白色固体を得た。ＴＬＣおよびＮＭＲは、純粋な生成物と一致した。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン
２Ｌステンレス鋼不撹拌圧力反応器において、テトラヒドロフラン中のボラン（１．０Ｍ，２．０ｅｑ，６２２ｍＬ）を加えた。換気フードにおいて、手動で撹拌しながら、水素ガスの発生が納まるまでエチレングリコール（３５０ｍＬ，過剰）をはじめは慎重に加えた。手動で撹拌しながら、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１４９ｇ，０．３１１ｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（０．０７４ｇ，０．００３ｅｑ）を加えた。その反応器を密閉し、１６０℃の内部温度が達成されるまで油浴中で加熱し、次いで、１６時間維持した（１００ｐｓｉｇ未満の圧力）。その反応容器を外界温度まで冷却し、開けた。ＴＬＣ（所望の生成物に対してＲｆ０．６７およびａｒａ−Ｔ副生成物に対してＲｆ０．８２，酢酸エチル）から、生成物への約７０％の変換が示唆された。さらに副生成物が形成されることを回避するために、その反応を停止させ、温水浴（４０〜１００℃）中、減圧下で（１０〜１ｍｍＨｇ）濃縮し、エチレングリコールを除去するためにより極端な条件を使用した［あるいは、低沸点溶媒が無くなったら、残存している溶液を酢酸エチルと水との間で分離させることができる。生成物は有機相に存在する］。残渣をカラムクロマトグラフィ（２ｋｇのシリカゲル、酢酸エチル−ヘキサン類勾配１：１〜４：１）で精製した。適切な分画を併せ、取り出し（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）、乾燥することにより、白色の砕けやすい泡沫状物（８４ｇ，５０％）、混入出発物質（１７．４ｇ）および純粋な再利用可能な出発物質２０ｇとして得た。回収されたあまり純粋ではない出発物質に基づく収率は、５８％であった。ＴＬＣおよびＮＭＲは、９９％純粋な生成物と一致した。
【０２３３】
２’−Ｏ−（［２−フタルイミドキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン（２０ｇ，３６．９８ｍｍｏｌ）をトリフェニルホスフィン（１１．６３ｇ，４４．３６ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシフタルイミド（７．２４ｇ，４４．３６ｍｍｏｌ）と混合した。次いで、それを４０？Ｃ、高真空下で２日間、Ｐ２Ｏ５で乾燥した。その反応混合物にアルゴンを流し、乾燥ＴＨＦ（３６９．８ｍＬ，Ａｌｄｒｉｃｈ，確かに密閉されたビン）を加えることにより、透明な溶液になった。その反応混合物にジエチル−アゾジカルボキシレート（６．９８ｍＬ，４４．３６ｍｍｏｌ）を滴下した。次の一滴が加えられる前に、生じる深紅呈色が、ちょうど広がるように、添加の速度を維持する。その添加が完了した後、その反応物を４時間撹拌した。その時までには、ＴＬＣは反応の完了を示した（酢酸エチル：ヘキサン，６０：４０）。その溶媒を真空下で蒸発させた。得られた残渣をフラッシュカラムに入れ、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出することにより、２’−Ｏ−（［２−フタルイミドキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジンを白色泡沫状物として得た（２１．８１９ｇ，８６％）。
【０２３４】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ（ｆｏｒｍａｄｏｘｉｍｉｎｏｏｘｙ））エチル］−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（［２−フタルイミドキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン（３．１ｇ，４．５ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（４．５ｍＬ）に溶解し、−１０？Ｃ〜０？Ｃにおいてメチルヒドラジン（３００ｍＬ，４．６４ｍｍｏｌ）を滴下した。１時間後、その混合物を濾過し、その濾液を氷冷ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、併せた有機相を水、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。その溶液を濃縮することにより、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）チミジンが得られ、次いで、それをＭｅＯＨ（６７．５ｍＬ）に溶解した。これにホルムアルデヒド（２０％水溶液，ｗ／ｗ，１．１ｅｑ．）を加え、得られた混合物を１時間撹拌した。溶媒を真空下で除去した；残渣をクロマトグラフィに供することにより、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジンを白色泡沫状物として得た（１．９５ｇ，７８％）。
【０２３５】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン（１．７７ｇ，３．１２ｍｍｏｌ）を乾燥ＭｅＯＨ（３０．６ｍＬ）中の１Ｍ  ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）の溶液に溶解した。不活性な雰囲気下の１０？Ｃのこの溶液にシアノホウ水素化ナトリウム（０．３９ｇ，６．１３ｍｍｏｌ）を加えた。その反応混合物を１０？Ｃで１０分間撹拌した。その反応容器を氷浴から取り出し、室温で２時間撹拌した後、その反応物をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中の５％ＭｅＯＨ）でモニターした。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％，１０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、乾燥するまで蒸発させた。残渣を、ＭｅＯＨ中の１Ｍ  ＰＰＴＳの溶液（３０．６ｍＬ）に溶解した。ホルムアルデヒド（２０％ｗ／ｗ，３０ｍＬ，３．３７ｍｍｏｌ）を加え、その反応混合物を室温で１０分間撹拌した。反応混合物を氷浴中で１０？Ｃに冷却し、シアノホウ水素化ナトリウム（０．３９ｇ，６．１３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１０？Ｃで１０分間撹拌した。１０分後、その反応混合物を氷浴から取り出し、室温で２時間撹拌した。その反応混合物に、５％ＮａＨＣＯ３（２５ｍＬ）溶液を加え、酢酸エチル（２×２５ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、乾燥するまで蒸発させた。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィで精製し、ＣＨ２Ｃｌ２中の５％ＭｅＯＨで溶出することにより、白色泡沫状物として５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジンを得た（１４．６ｇ，８０％）。
【０２３６】
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
トリエチルアミントリヒドロフルオリド（３．９１ｍＬ，２４．０ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦおよびトリエチルアミン（１．６７ｍＬ，１２ｍｍｏｌ，乾燥，ＫＯＨで維持）に溶解した。次いで、トリエチルアミン−２ＨＦのこの混合物を、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン（１．４０ｇ，２．４ｍｍｏｌ）に加え、室温で２４時間撹拌した。反応をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中の５％ＭｅＯＨ）でモニターした。溶媒を真空下で除去し、残渣をフラッシュカラムに入れ、ＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ＭｅＯＨで溶出することにより、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジンを得た（７６６ｍｇ，９２．５％）。
【０２３７】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ｍｇ，２．１７ｍｍｏｌ）を、４０？Ｃにおいて一晩高真空下にてＰ２Ｏ５で乾燥した。次いで、それを無水ピリジン（２０ｍＬ）と共蒸発させた。得られた残渣をアルゴン雰囲気下でピリジン（１１ｍＬ）に溶解した。その混合物に、４−ジメチルアミノピリジン（２６．５ｍｇ，２．６０ｍｍｏｌ）、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８８０ｍｇ，２．６０ｍｍｏｌ）を加え、すべての出発物質が消えるまで、その反応混合物を室温で撹拌した。ピリジンを真空下で除去し、残渣をクロマトグラフィに供し、そしてＣＨ２Ｃｌ２（数滴のピリジンを含む）中の１０％ＭｅＯＨで溶出することにより、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノ−オキシエチル）−５−メチルウリジンを得た（１．１３ｇ，８０％）。
【０２３８】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（１．０８ｇ，１．６７ｍｍｏｌ）をトルエン（２０ｍＬ）と共蒸発させた。残渣に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾニド（０．２９ｇ，１．６７ｍｍｏｌ）を加え、４０？Ｃにおいて一晩高真空下にてＰ２Ｏ５で乾燥した。次いで、その反応混合物を無水アセトニトリル（８．４ｍＬ）に溶解し、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−テトライソプロピルホスホルアミダイト（２．１２ｍＬ，６．０８ｍｍｏｌ）を加えた。その反応混合物を不活性な雰囲気下において外界温度で４時間撹拌した。その反応の進行をＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル１：１）でモニターした。溶媒を蒸発させ、次いで、残渣を酢酸エチル（７０ｍＬ）に溶解し、５％ＮａＨＣＯ３水溶液（４０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。得られた残渣をクロマトグラフィ（溶離剤として酢酸エチル）に供することにより、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］を泡沫状物として得た（１．０４ｇ，７４．９％）。
【０２３９】
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
以下のパラグラフに記載されるように、２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても当該分野で知られる］を調製する。アデノシン、シチジンおよびチミジンのヌクレオシドアミダイトを同様に調製する。
【０２４０】
Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］
ジアミノプリンリボシドの選択的な２’−Ｏ−アルキル化によって、２’−Ｏ−アミノオキシエチルグアノシンアナログを得ることができる。数グラムの量のジアミノプリンリボシドをＳｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ（Ｂｅｒｌｉｎ）から購入して、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを少量の３’−Ｏ−異性体とともに得ることができる。２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを溶解し、そしてアデノシンデアミナーゼで処理することによって２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）グアノシンに変換することができる（ＭｃＧｅｅ，Ｄ．Ｐ．Ｃ，Ｃｏｏｋ，Ｐ．Ｄ．，Ｇｕｉｎｏｓｓｏ，Ｃ．Ｊ．，ＷＯ９４／０２５０１Ａ１  ９４０２０３）。標準的な保護手順によって、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンおよび２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを得て、これらを還元することにより、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンが得られるはずである。前述のように、ヒドロキシル基を、光延反応を介してＮ−ヒドロキシフタルイミドに置換し、そして、保護されたヌクレオシドを従来どおり亜リン酸化する（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔｅｄ）ことにより、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］を得ることができる。
【０２４１】
生物学的等価物：本発明の化合物は、任意の薬学的に許容可能な塩、エステルもしくはそのようなエステルの塩、または、ヒトを含む動物に投与されたときに生物学的に活性な代謝産物またはその残基を（直接的または間接的に）提供することができる他の任意の化合物を包含する。従って、例えば、本開示は、本発明のオリゴヌクレオチドの「プロドラッグ」および「薬学的に許容可能な塩」、そのようなプロドラッグの薬学的に許容可能な塩ならびに他の生物学的等価物にも関する。
【０２４２】
オリゴヌクレオチドプロドラッグ：さらに、またはあるいは、本発明のオリゴヌクレオチドは、「プロドラッグ」型で送達されるように調製され得る。用語「プロドラッグ」は、内因性の酵素もしくは他の化学物質の作用および／または条件によって、体内またはその細胞内で活性型（すなわち、薬物）に変換される不活性型で調製される治療薬を示している。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンは、Ｇｏｓｓｅｌｉｎらに対する１９９３年１２月９日公開のＷＯ９３／２４５１０に開示されている方法に従って、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として調製される。
【０２４３】
薬学的に許容可能な塩：用語「薬学的に許容可能な塩」とは、本発明のオリゴヌクレオチドの生理的および薬学的に許容可能な塩：すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持していて、望まれない毒物学的な作用を付与しない塩のことをいう。
【０２４４】
薬学的に許容可能な塩基付加塩は、金属またはアミン（例えば、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミン）を用いて形成される。陽イオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適当なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミンおよびプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅら、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１を参照のこと）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、その遊離酸型を十分な量の所望の塩基と接触させることによって調製され、それにより従来の様式で塩が生成される。その遊離酸型は、その塩の型を酸と接触させ、その遊離酸を従来の様式で単離することによって再生され得る。その遊離酸型は、ある特定の物理的特性（例えば、極性溶媒における溶解性）がそれぞれの塩の型といくらか異なるが、別途、それらの塩は、本発明の目的でそのそれぞれの遊離酸と等価である。本明細書中で使用されるとき、「薬学的付加塩」は、本発明の組成物の構成要素のうちの１つの酸型の薬学的に許容可能な塩を包含する。これらは、そのアミンの有機酸塩または無機酸塩を包含する。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。他の適当な薬学的に許容可能な塩は当業者に周知であり、それらとしては、種々の無機酸および有機酸の塩基性塩（例えば、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸）との塩基性塩；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホもしくはホスホ酸（ｓｕｌｆｏ  ｏｒ  ｐｈｏｓｐｈｏ  ａｃｉｄｓ）またはＮ−置換スルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸またはイソニコチン酸との塩基性塩；ならびに、アミノ酸（例えば、天然においてタンパク質の合成に関与する２０個のアルファ−アミノ酸）、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸との塩基性塩、およびフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸（ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｏｎｉｃ）酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−または３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成を伴う））との塩基性塩、あるいは他の酸有機化合物（例えば、アスコルビン酸）との塩基性塩が挙げられる。化合物の薬学的に許容可能な塩はまた、薬学的に許容可能な陽イオンを用いて調製され得る。適当な薬学的に許容可能な陽イオンは、当業者に周知であり、それらとしては、アルカリ陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオンおよび４級アンモニウム陽イオンが挙げられる。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。
【０２４５】
オリゴヌクレオチドにとって、薬学的に許容可能な塩の好ましい例としては、（ａ）陽イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン（例えば、スペルミンおよびスペルミジン）など）を用いて形成される塩；（ｂ）無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）を用いて形成される酸付加塩；（ｃ）有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸など）を用いて形成される塩；および（ｄ）元素陰イオン（例えば、塩素、臭素およびヨウ素）から形成される塩が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４６】
本発明の例示的な有用性：本発明のオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）と特異的にハイブリダイズする。本発明のオリゴヌクレオチドは、キットに組み込まれ得る治療的化合物、診断ツールまたは研究試薬として、ならびに、精製および細胞産物の調製において、ならびに当業者が認識する他の方法において、利用され得る。
【０２４７】
アッセイおよび診断への応用：本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、細胞または組織サンプル中のＪＮＫ１タンパク質に特異的な核酸の存在を検出することができる。例えば、放射標識オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５’末端において３２Ｐ標識することによって調製され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｐｇ  １０．５９）。次いで、放射標識オリゴヌクレオチドを、ＪＮＫ１タンパク質のメッセージＲＮＡを含む（従ってＪＮＫ１タンパク質を含む）と疑われる細胞または組織サンプルと接触させ、そして、そのサンプルを洗浄することによって、未結合オリゴヌクレオチドを除去する。サンプル中に残存している放射能は、結合しているオリゴヌクレオチドの存在を示唆するものであり（それはそのオリゴヌクレオチドに相補的な核酸の存在を示唆するものでもある）、その放射能は、シンチレーションカウンターまたは他の通例の手段を使用して、定量化され得る。このようにして、これらのタンパク質をコードする核酸の発現は、検出される。
【０２４８】
本発明の放射標識オリゴヌクレオチドを使用して、組織のオートラジオグラフィを行うことにより、研究目的、診断目的または治療目的で、ＪＮＫ１タンパク質の局在性、分布および定量を決定することもできる。そのような研究では、通例のオートラジオグラフィ手順に従って、組織切片を放射標識オリゴヌクレオチドで処理し、上に記載したように洗浄し、次いで、写真用のエマルジョンに曝露する。現像すると、そのエマルジョンは、ＪＮＫ１タンパク質遺伝子を発現している領域に対して銀粒子の像をもたらす。銀粒子を定量化することによって、これらのタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の発現の検出が可能になり、これらの領域に対するオリゴヌクレオチドの標的化が可能になる。
【０２４９】
放射標識する代わりにフルオレセインまたは他の蛍光タグに結合体化された本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、ＪＮＫ１タンパク質核酸の発現の蛍光検出に対する類似のアッセイを開発することができる。そのような結合体化は、蛍光的に標識されたアミダイトまたはコントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）カラムを使用して、固相合成中に通例のとおり達成される。フルオレセイン標識アミダイトおよびＣＰＧは、例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡから入手可能である。オリゴヌクレオチドを標識する他の手段は、当該分野で公知である（例えば、Ｒｕｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２６：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ａｇｒａｗａｌ，ｅｄ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９４中のＣｈａｐｔｅｒ  ６，１６７−１８５頁）。
【０２５０】
ＪＮＫ１タンパク質の発現の有無を検出するためのキットもまた、作製され得る。そのようなキットは、適切な遺伝子、すなわち、ＪＮＫ１タンパク質をコードする遺伝子に対して標的化されたオリゴヌクレオチドを備えている。適切なキットおよびアッセイの形式（例えば、「サンドイッチ」アッセイ）は、当該分野で公知であり、本発明のオリゴヌクレオチドを用いて使用するために容易に適応させることができる。ＪＮＫ１タンパク質をコードする核酸と本発明のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の手段によって検出され得る。そのような手段としては、本オリゴヌクレオチドへの酵素の結合体化、本オリゴヌクレオチドの放射標識または他の任意の適当な検出システムが挙げられ得る。
【０２５１】
タンパク質精製：本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ポリペプチド配列および生化学的な特性に関して互いに似ている一連のＪＮＫタンパク質を正常に発現している細胞からの特定のＪｕｎキナーゼタンパク質の精製にも有用である。例として、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３タンパク質を発現している細胞からのＪＮＫ１タンパク質の精製は、まずそのような細胞を、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３の発現を阻害するオリゴヌクレオチドおよび／またはＪＮＫ１の発現を増加させるオリゴヌクレオチドで処理することによって容易になり得る。なぜなら、そのような処理によって、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３に対するＪＮＫ１の相対比が上昇するからである。結果として、そのように処理された細胞から調製された抽出物中の生化学的に似ている（従って、混入しそうな）ＪＮＫ２およびＪＮＫ３タンパク質の量が減少するので、その後の精製工程からのＪＮＫ１の収率が改善される。
【０２５２】
生物学的に活性なオリゴヌクレオチド：本発明はまた、培養細胞、単離された組織および器官ならびに動物への、生物学的活性を有するオリゴヌクレオチドの投与にも関する。
「生物学的活性を有する」とは、そのオリゴヌクレオチドが、培養細胞、単離された組織もしくは器官および／または動物において１つ以上の遺伝子の発現を調節するように機能することを意味する。そのような調節は、当該分野で公知の種々のメカニズムにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって達成され得、そのメカニズムとしては、転写の停止；ＲＮＡプロセシング（キャッピング、ポリアデニル化およびスプライシング）および運搬に対する影響；標的核酸の細胞内分解の促進；ならびに翻訳の停止が挙げられるがこれらに限定されない（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，１９９６  ６，８５５）。
【０２５３】
ヒト以外の動物では、本発明の組成物および方法を使用して、動物における１つ以上の遺伝子の機能を研究することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、神経細胞死におけるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプターの役割を研究するためにラットに全身投与され、タンパク質キナーゼＣ−ａの生物学的役割を調査するためにマウスに全身投与され、そして不安における神経ペプチドＹ１レセプターの役割を調べるためにラットに全身投与された（それぞれ、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６３．２６０；Ｄｅａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９４，９１，１１７６２；およびＷａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２５９，５２８）。関連タンパク質の複雑なファミリーが調べられている場合、「アンチセンスノックアウト」（すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全身性投与による遺伝子の阻害）が、そのファミリーの特定のメンバーを調べるために最も正確な手段であり得る（一般に、Ａｌｂｅｒｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１９９４，１５，２５０を参照のこと）。
【０２５４】
本発明の組成物および方法はまた、１つ以上の核酸を用いて全体的または部分的に処置可能な疾患または障害を、有する（すなわち、罹患している）か、または有する傾向があると知られているか、または有する傾向があると疑われる、ヒトを含む動物における治療的な用途も有する。用語「治療的な用途」は、予防的、対症的および治癒的な用途を包含すると意図され、ここで、本発明のオリゴヌクレオチドを、インビボまたはエキソビボにおいて動物細胞と接触させる。エキソビボにおいて動物細胞と接触させるとき、治療的な用途は、１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドで処理した後にそのような細胞を動物に組み込むことを含む。
【０２５５】
治療的な用途では、ＪΝＫ１タンパク質の発現または活性を調節することによって処置または予防され得る疾患または障害を有すると疑われる動物は、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドを投与することによって処置される。本発明のオリゴヌクレオチドは、有効量のオリゴヌクレオチドを適当な薬学的に許容可能なキャリア（例えば、希釈剤）に加えることによって、薬学的組成物として利用され得る。当業者は、ウイルス、真菌および代謝性の疾患に関わる遺伝子の発現を調節することができるアンチセンス、三重鎖（ｔｒｉｐｌｅｘ）および他のオリゴヌクレオチド組成物を同定している。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに安全に投与されてきたものであり、いくつかの臨床試験が、現在進行中である。従って、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特にヒトを処置するための処置レジメンにおいて有用であるように構成され得る有用な治療的手段であり得ることが、確立されている。以下の米国特許は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する、対症的な方法、治療的な方法および他の方法を示している。米国特許第５，１３５，９１７号は、ヒトインターロイキン−１レセプターの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供している。米国特許第５，０９８，８９０号は、ｃ−ｍｙｂ癌遺伝子に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびある特定の癌性状態に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド治療に関するものである。米国特許第５，０８７，６１７号は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて癌患者を処置するための方法を提供している。米国特許第５，１６６，１９５号は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のオリゴヌクレオチドインヒビターを提供している。米国特許第５，００４，８１０号は、単純ヘルペスウイルスＶｍｗ６５  ｍＲＮＡとハイブリダイズすることができ、そして複製を阻害することができるオリゴマーを提供している。米国特許第５，１９４，４２８号は、インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供している。米国特許第５，００４，８１０号は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれを使用する方法を提供している。米国特許第５，２８６，７１７号は、癌遺伝子の一部に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供している。米国特許第５，２７６，０１９号および米国特許第５，２６４，４２３号は、細胞内での外来性の核酸の複製を妨害するために使用されるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドアナログに関するものである。米国特許第４，６８９，３２０号は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的な抗ウイルス剤としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドに関するものである。米国特許第５，０９８，８９０号は、ヒトｃ−ｍｙｂ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に対して相補的なオリゴヌクレオチドを提供している。米国特許第５，２４２，９０６号は、潜在型のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染症の処置に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供している。
【０２５６】
本明細書中で使用されるとき、用語「疾患、状態または障害」は、正常な生理学的機能を損なっている生物体または部分の任意の異常な状態；例えば（ｉｓｕｃｈ  ａｓ）肥満症および代謝症候群を包含する。本明細書中で使用されるとき、用語「予防」は、ある状態または疾患の発生または発症を、数時間から数日、好ましくは、数週から数ヶ月の期間にわたって遅延させるか、または未然に防ぐことを意味する。本明細書中で使用されるとき、用語「回復」は、ある状態または疾患の重症度の少なくとも１つの指標を減じることを意味する。その指標の重症度は、当業者に公知の主観的または客観的な基準によって決定され得る。本明細書中で使用されるとき、「処置」は、上記疾患または状態の変化または改善をもたらす本発明の組成物の投与を意味する。予防、回復および／または処置は、上記状態または疾患の経過を変化させるために、一定間隔で、または、ある物質（例えば、アレルゲン）への曝露の前に、多用量の投与を必要とし得る。さらに、ある状態または疾患の連続的または同時的な、予防、回復および処置の各々のために、単一の個体において単一の薬剤が使用され得る。用語「１つ以上の核酸で全体的または部分的に処置可能な疾患または障害」とは、本明細書中に定義されるような疾患または障害のことをいい、その制御、調節もしくは処置、ならびに／またはそれらからの治療的、治癒的、対症的および／もしくは予防的な緩和は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を介して提供され得る。
【０２５７】
薬学的組成物：本発明のオリゴヌクレオチドを含んでいる薬学的組成物の製剤およびそれらの連続的な投与は、当業者の技術範囲内であると考えられる。
【０２５８】
治療的な考慮：通常、治療的な適用では、患者（すなわち、疾患または障害を有するかまたは罹患しやすい、ヒトを含む動物）は、その患者の年齢および処置される障害または疾患状態の重症度に応じて、０．０１」ｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、薬学的に許容可能なキャリア中の１つ以上のオリゴヌクレオチドを本発明に従って投与される。さらに、その処置レジメンは、特定の疾患または障害の性質、その重症度およびその患者の全般的な状態に応じて変化し得る期間にわたって継続され得、１日１回から２０年毎に１回までに及び得る。本発明の文脈において、用語「処置レジメン」は、治療的、対症的および予防的な様式を包含すると意味される。処置後、患者は、その患者の状態の変化およびその障害または疾患状態の症状の軽減についてモニターされる。その患者がその時点の投与量レベルに有意に応答しない場合、核酸の投与量を増加することができるか、またはその障害もしくは疾患状態の症状の軽減が観察されるか、またはその障害もしくは疾患状態が除去される場合、その用量を減少することができる。
【０２５９】
投薬は、重症度および処置される疾患状態の反応性に左右され、処置クールは、数日から数ヶ月、または治癒が達成されるまで、もしくは疾患状態の減少が達成されるまで継続する。最適な投薬スケジュールは、患者の体内の薬物の蓄積の測定値から算出され得る。当業者は、最適な投薬量、投薬方法および反復頻度を容易に決定することができる。最適な投薬量は、個別のオリゴヌクレオチドの相対的な作用強度に応じて変化し得、通常、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であると見出されたＥＣ５０に基づいて推定され得る。一般に、投薬量は、０．０１」ｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重であり、１日、１週間、１ヶ月もしくは１年に１回以上または２〜２０年毎に１回、投与され得る。最適な投薬スケジュールを使用して、特定の投与様式を介して投与される治療有効量のオリゴヌクレオチドが送達される。
【０２６０】
用語「治療有効量」とは、本発明の目的で、望ましくない副作用（例えば、毒性、刺激またはアレルギー性反応）なく、意図される目的を達成するのに有効なオリゴヌクレオチド含有薬学的組成物の量のことをいう。個別の必要性は変化し得るが、薬学的組成物の有効量に対する最適な範囲の決定は、当該分野の技術範囲内である。ヒトへの用量は、動物試験から外挿され得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０中のＫａｔｏｃｓら、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２７）。一般に、当業者によって調整され得る薬学的組成物の有効量を提供するために必要な投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態、生理的状態、体重、疾患または障害のタイプおよび程度、処置の頻度、同時的な治療（もしあれば）の性質ならびに所望の作用の性質および範囲に応じて変化する（Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎら、Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９６中のＮｉｅｓら、Ｃｈａｐｔｅｒ  ３）。
【０２６１】
本明細書中で使用されるとき、用語「高リスク個体」は、ある疾患または障害が発生または再発しやすいという通常の確率よりも有意に高い確率を有すると、例えば個体もしくは家族歴または遺伝子検査を介して判断された被験体のことを指すと意味される。高リスク個体に対する処置レジメンの技術として、その個体は、その疾患または障害の発生または再発を予防するために予防的に処置され得る。用語「予防的に有効な量」は、疾患または障害の発生または再発の予防として観察される効果をもたらす薬学的組成物の量のことを指すと意味される。薬学的組成物の予防的に有効な量は、代表的には、活性な薬剤を欠いている第２の薬学的組成物が同様の状態である個体に投与されるときに観察される効果と比較した効果によって決定される。
【０２６２】
処置が成功した後、疾患状態の再発を防止するために患者が維持療法を受けることが望ましく、ここで、本核酸は、１日に１回以上から２０年毎に１回、０．０１」ｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲の維持用量で投与される。例えば、自己免疫性状態または炎症状態に陥りやすいことが知られているか、またはそのように疑われる個体における場合、予防的な効果は、１日に１回以上から２０年毎に１回、０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲の予防用量の投与によって達成され得る。類似の様式において、被験体は、いくつかの医学的処置、例えば、その個体への細胞、組織または器官の移植に起因する移植片対宿主病の結果として、生じると予想される炎症状態にそれほど影響されなくなり得る。
【０２６３】
いくつかの場合において、処置レジメンの有効性を増大させるために、他の従来の治療的な様式とともに本発明のオリゴヌクレオチドで患者を処置することがより有効であり得る。処置レジメンは、治療的、対症的および予防的な様式を包含する。例えば、患者は、従来の化学療法剤、特に、腫瘍および癌の処置に使用される化学療法剤で処置され得る。そのような化学療法剤の例としては、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン、マホスファミド（ｍａｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソ尿素（ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素（ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホルアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、トリメトレキサート、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）が挙げられるがこれらに限定されない。一般に、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１５ｔｈ  Ｅｄ．，ｐｐ．１２０６−１２２８，Ｂｅｒｋｏｗら、Ｅｄｓ．，Ｒａｈａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９８７）を参照のこと。そのような化学療法剤は、本発明の化合物とともに使用されるとき、個別に使用され得るか（例えば、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）、連続的に使用され得るか（例えば、ある期間にわたる５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチドの後のＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド）、または１つ以上のそのような他の化学療法剤とともに使用され得る（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチドまたは５−ＦＵ、放射線治療およびオリゴヌクレオチド）。
【０２６４】
本発明の別の好ましい実施形態において、第１のＪＮＫ１タンパク質に対して標的化された第１のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは第２のＪＮＫタンパク質に対して標的化された第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかのオリゴヌクレオチドを個別に使用するときに達成され得る程度よりも広い程度にするために、第１のアンチセンスオリゴヌクレオチドを第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに使用する。本発明の様々な実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドによって標的化されている第１および第２のＪＮＫタンパク質は、同一のＪＮＫタンパク質であるか、異なるＪＮＫタンパク質であるか、または同じＪＮＫタンパク質の異なるアイソフォームである。
【０２６５】
薬学的組成物：オリゴヌクレオチドの非腸管外投与用の薬学的組成物は、緩衝液、希釈剤および他の適当な添加剤も含み得る滅菌水溶液を含み得る。オリゴヌクレオチドと有害に反応しない非腸管外投与に適した薬学的に許容可能な有機または無機キャリア物質が使用され得る。適当な薬学的に許容可能なキャリアとしては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘稠性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。その薬学的組成物は、滅菌され得、所望であれば、薬学的組成物のオリゴヌクレオチドと有害に反応しない補助剤（例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響するための塩、緩衝液、着色料着香料および／または芳香族の物質など）と混合され得る。水性懸濁液の形態での薬学的組成物は、その懸濁液の粘度を上昇させる物質（例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランが挙げられる）を含み得る。必要に応じて、そのような懸濁液は、安定剤も含み得る。
【０２６６】
本発明の一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、直腸様式を介して投与される。特に、直腸投与用の薬学的組成物としては、泡沫、溶液（浣腸）および坐剤が挙げられる。成人用の直腸坐剤は、通常、片方または両方の末端が細くなっており、代表的には、各々約２ｇの重さであり、乳児用の直腸坐剤は、通常の基剤であるカカオバターが使用されるとき、代表的には約２分の１の重さである（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０中のＢｌｏｃｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８７）。
【０２６７】
本発明の好ましい実施形態において、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、経口送達を介して投与される。経口投与用の薬学的組成物としては、散剤または顆粒剤、水もしくは非水性媒質中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ剤、トローチ剤、錠剤あるいはＳＥＣ（軟弾性カプセルまたは「カプレット」）が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、キャリア物質または結合剤は、そのような薬学的組成物に望ましく加えられ得る。そのような薬学的組成物の使用は、本オリゴヌクレオチドを消化管の粘膜に曝露させるために消化管に送達する作用を有する。従って、本薬学的組成物は、胃の極端なｐＨから本オリゴヌクレオチドを保護する際、または、特定の粘膜部位への本オリゴヌクレオチドの送達を最適にするように本オリゴヌクレオチドを経時的に放出する際に有効な材料を含み得る。耐酸性の錠剤、カプセルおよびカプレットに対する腸溶コーティングは、当該分野で公知であり、代表的には、アセテートフタレート、プロピレングリコールおよびソルビタンモノオレエートが挙げられる。
【０２６８】
食餌性送達用の薬学的組成物を作製するための様々な方法は、当該分野で周知である。
一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０中の、Ｎａｉｒｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８３；Ｂｌｏｃｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８７；Ｒｕｄｎｉｃら、Ｃｈａｐｔｅｒ  ８９；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ９０；およびＬｏｎｇｅｒら、Ｃｈａｐｔｅｒ  ９１を参照のこと。本発明のオリゴヌクレオチドは、不活性で無毒性の薬学的に許容可能なキャリア（賦形剤）を使用して、習慣的な薬学的組成物（例えば、錠剤、コーティングされた錠剤、丸剤、顆粒剤、エアロゾル、シロップ剤、エマルジョン、懸濁液および溶液）に公知の様式で組み込まれ得る。治療的に活性な化合物は、各場合において、混合物全体の約０．５重量％〜約９５重量％の濃度で、すなわち、記載した投与量の範囲を達成するのに十分な量で、存在するべきである。本薬学的組成物は、例えば、活性な化合物を薬学的に許容可能なキャリアで希釈する（適切な場合は、乳化剤および／または分散剤を使用する）ことによって調製され、例えば、希釈剤として水が使用される場合は、有機溶媒を補助溶媒として使用することができる（適切な場合）。薬学的組成物は、適切なとき、さらなる薬学的に許容可能なキャリアを使用して従来の様式で製剤化され得る。従って、本組成物は、さらなる賦形剤（例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム））を用いて従来の手段によって調製され得る。錠剤は、当該分野で周知の方法によってコーティングされ得る。その調製物は、適切なとき、着香料、着色料および／または甘味剤も含み得る。
【０２６９】
便利に単位剤形で存在し得る薬学的組成物は、製薬業界において周知の従来の手法に従って調製され得る。そのような手法は、薬学的に許容可能なキャリアと活性成分とを会合させる工程を含む。通常、本薬学的組成物は、液体賦形剤もしくは微粉化された固体賦形剤またはその両方と活性成分とを一様かつ密接に会合させ、次いで、必要であれば、その生成物を成形することによって調製される。
【０２７０】
経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、各々が所定の量の活性成分を含んでいる別々の単位（例えば、カプセル、カシェ剤または錠剤）として；散剤または顆粒剤として；水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として；または水中油型エマルジョンまたは油中水型液体エマルジョンとして存在し得る。錠剤は、必要であれば１つ以上の副成分とともに、圧縮または成形によって作製され得る。圧縮された錠剤は、必要に応じて結合剤、潤滑剤、不活性な希釈剤、保存剤、界面活性剤または分散剤と混合されている、自由流動型（例えば、散剤または顆粒剤）の活性成分を適当な機械において圧縮することによって調製され得る。成形された錠剤は、不活性な液体の希釈剤で湿らせた、粉末化された化合物の混合物を適当な機械で成型することによって作製され得る。その錠剤は、必要に応じてコーティングされ得るか、または切り目を入れられ得、そして、その中の活性成分の持続放出または徐放をもたらすように製剤化され得る。腸管外投与用、髄腔内投与用もしくは脳室内投与用またはコロイド分散系用の薬学的組成物は、緩衝液、希釈剤および他の適当な添加剤も含み得る滅菌水溶液を含み得る。
【０２７１】
浸透促進剤：本発明のオリゴヌクレオチドを含んでいる薬学的組成物はまた、そのオリゴヌクレオチドの食餌性の送達を促進するために浸透促進剤を含み得る。浸透促進剤は、５つの広いカテゴリー、すなわち、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、界面活性剤および非界面活性剤のうちの１つに属するように分類され得る（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８，９１−１９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７：１）。
【０２７２】
脂肪酸：浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、レシンレエート（ｒｅｃｉｎｌｅａｔｅ）、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロールとしても知られる）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸（ａｒｉｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノ−およびジ−グリセリドならびにそれらの生理的に許容可能な塩（すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩など）が挙げられる（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，９２頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７．１；Ｅｌ−Ｈａｒｉｒｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１）。
【０２７３】
胆汁酸塩：胆汁の生理学的な役割としては、脂質および脂肪溶解性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎら、Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９６中のＢｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３８，９３４−９３５頁）。様々な天然の胆汁酸塩およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。従って、胆汁酸塩は、胆汁の天然に存在する成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを包含する。
【０２７４】
キレート剤：キレート剤は、ＤＮアーゼインヒビターとしても働くという追加の利点を有し、キレート剤としては、ジエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸およびホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９およびベータ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられるが、これらに限定されない（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，９２頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１；Ｂｕｕｒら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３）。
【０２７５】
界面活性剤：界面活性剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，９２頁）；および全フッ素置換化合物（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ）エマルジョン（例えば、ＦＣ−４３）（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
【０２７６】
非界面活性剤：非界面活性剤としては、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，９２頁）；ならびに非ステロイド性の抗炎症剤（例えば、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾン）（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１）が挙げられる。
【０２７７】
キャリア化合物：本明細書中で使用されるとき、「キャリア化合物」とは、核酸またはそのアナログのことをいい、これは、不活性である（すなわち、それ自体は生物学的活性を有しない）が、インビボプロセス、例えば、生物学的に活性な核酸の分解または循環からの除去の促進によって生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させる核酸として認識されている。核酸およびキャリア化合物の共投与（代表的には、後者の物質が過剰）は、共通のレセプターに対するキャリア化合物と核酸との間での競合におそらく起因して、肝臓、腎臓または他の循環外の（ｅｘｔｒａｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ）貯蔵器に回収される核酸の量の実質的な減少をもたらし得る。例えば、肝臓組織における部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドの回収は、ポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジル酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）または４−アセトアミド−４’−イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と共投与されるときに減少する（Ｍｉｙａｏら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５；Ｔａｋａｋｕｒａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７）。
【０２７８】
薬学的に許容可能なキャリア：キャリア化合物とは対照的に、「薬学的に許容可能なキャリア」（賦形剤）は、動物に１つ以上の核酸を送達するための薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤または他の任意の薬理学的に不活性なビヒクルである。薬学的に許容可能なキャリアは、液体または固体であり得、また、核酸および所与の薬学的組成物の他の成分と組み合わされるときに、所望の嵩、コンシステンシーなどを提供するために、計画された投与様式を考慮に入れて選択される。代表的な薬学的に許容可能なキャリアとしては、結合材（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、硬化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これらに限定されない。経口的に投与される剤形のための徐放経口送達系および／または腸溶コーティングは、米国特許第４，７０４，２９５号；同第４，５５６，５５２号；同第４，３０９，４０６号；および同第４，３０９，４０４号に記載されている。
【０２７９】
種々の追加成分：本発明の組成物は、当該分野で確立された使用レベルで、薬学的組成物中に従来見られる他の補助成分をさらに含み得る。従って、例えば、本組成物は、適合可能で、薬学的に活性な材料（例えば、鎮痒剤、収斂剤、局所麻酔剤または抗炎症剤）をさらに含み得るか、または本発明の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化する際に有用な材料（例えば、色素、着香料、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤および安定剤）をさらに含み得る。しかしながら、そのような材料は、添加されるとき、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨害するべきでない。
【０２８０】
コロイド分散系：本発明のオリゴヌクレオチドを患者に導入する方法に関係なく、コロイド分散系は、本オリゴヌクレオチドのインビボにおける安定性を増大させ、そして／または本オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織または細胞型に対して標的化する送達ビヒクルとして使用され得る。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質ベースの系（水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいコロイド分散系は、インビトロおよびインビボにおいて生理活性物質のための細胞送達ビヒクルとして使用され得る人工膜ベシクルである、複数のリポソームである（Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，６８２；Ｂｌｕｍｅ  ａｎｄ  Ｃｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，１９９４，２３，１１９；Ｃｈｏｎｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，６９８）。０．２〜０．４μｍの範囲のサイズである大型の単層ベシクル（ＬＵＶ）が、大型高分子を含んでいるかなりの割合の水性緩衝液を被包することができると示されている。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンは、その水性物の内部に被包され得、生物学的に活性な形態で脳細胞に送達され得る（Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９８１，６，７７）。リポソームの組成物は、通常、脂質、特にリン脂質、特に高相転移温度リン脂質の組み合わせであり、通常、１つ以上のステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。リポソーム生成に使用される脂質の例としては、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシドおよびガングリオシドが挙げられる。ジアシルホスファチジルグリセロールが特に有用であり、ここで、その脂質部分は、１４〜１８個の炭素原子、特に１６〜１８個の炭素原子を含んでおり、そして飽和である（その１４〜１８個の炭素原子鎖内に二重結合を有しない）。例示的なリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【０２８１】
リポソームを含むコロイド分散系の標的化は、受動的または能動的であり得る。受動的標的化は、洞様毛細血管を含む器官内の細網内皮系の細胞に分配するために、リポソームの天然の傾向を利用するものである。対照的に、能動的標的化は、局在性について天然に存在する部位以外の器官および細胞型への分配を達成するために、特定のリガンド（例えば、ウイルスタンパク質コート（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），１９９３，９０，８４７４）、モノクローナル抗体（またはその適当な結合部分）、糖、糖脂質またはタンパク質（またはその適当なオリゴペプチドフラグメント））をリポソームに結合することによるか、または、組成物および／もしくはリポソームのサイズを変化させることによるリポソームの改変を含む。標的化されたコロイド分散系の表面は、種々の方法で改変され得る。リポソームの標的化送達系の場合では、脂質二重層との密接な会合において標的化リガンドを維持するために、脂質群をそのリポソームの脂質二重層に組み込むことができる。様々な結合基が、脂質鎖を標的化リガンドに結合させるために使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドの送達が望まれる細胞上に主に見られる特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）送達が望まれる細胞によって主に発現されている特定の細胞レセプターが結合する、ホルモン、成長因子またはその適当なオリゴペプチドフラグメント、あるいは（２）標的化される細胞上に主に見られる抗原性のエピトープと特異的に結合する、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体またはその適当なフラグメント（例えば、Ｆａｂ；Ｆ（ａｂ’）２）であり得る。２つ以上の生理活性物質（例えば、オリゴヌクレオチドおよび従来の薬物；２つのオリゴヌクレオチド）が、単一のリポソーム内で組み合わせられ得、そして、単一のリポソームによって送達され得る。コロイド分散系の内容物の細胞間の安定性および／または標的化を増大させる薬剤をコロイド分散系に付加することも可能である。
【０２８２】
投与の手段：本発明は、動物への投与を意図されたオリゴヌクレオチドを含んでいる組成物を提供する。
【０２８３】
腸管外送達：消化管を介する様式以外の様式での動物への本発明のオリゴヌクレオチドの投与。腸管外薬学的組成物を調製および投与する手段は、当該分野で公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０中のＡｖｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８４，１５４５−１５６９頁を参照のこと）。腸管外の送達手段としては、以下の例示的な例が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８４】
哺乳動物の眼の硝子体液に薬物を直接送達するための硝子体内注射は、米国特許第５，５９１，７２０号（その内容が本明細書によって参考として援用される）に記載されている。眼用の調製物を調製し、投与する手段は、当該分野で公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０中のＭｕｌｌｉｎｓら、Ｃｈａｐｔｅｒ  ８６，１５８１−１５９５頁を参照のこと）。
【０２８５】
様々な非ヒト哺乳動物へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの静脈内投与は、Ｉｖｅｒｓｅｎによって説明されている（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅら、Ｅｄｓ．，ＣＢＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９３中のＣｈａｐｔｅｒ  ２６，４６１−４６９頁）。腹腔内手段を介した非ヒト哺乳動物へのオリゴヌクレオチドの全身性送達もまた、報告されている（Ｄｅａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（Ｕ．Ｓ．Ａ），１９９４，９１，１１７６６）。
【０２８６】
管状器官または管状組織（例えば、動脈、静脈、尿管または尿道）の隔離された部分に薬物を直接送達するための腔内薬物投与は、そのような器官または組織の管腔に関する疾患または状態を有する患者を処置するために望まれ得る。このオリゴヌクレオチドの投与様式を達成するために、カテーテルまたはカニューレが、適切な手段によって外科的に導入される。例えば、左総頸動脈を処置するために、外側の頸動脈を介してそれにカニューレを挿入する。処置が求められている管状器官または管状組織の一部を隔離した後、本発明のオリゴヌクレオチドを含んでいる組成物が、そのカニューレまたはカテーテルを介してその隔離されたセグメントに注入される。約１〜約１２０分間のインキュベーション（この間に、オリゴヌクレオチドがその管の内腔の細胞によって取り込まれる）の後、その注入カニューレまたは注入カテーテルを取り外し、そのセグメントの隔離をもたらしていた結紮糸を除去することによって、管状器官または管状組織内の流れを回復させる（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９３，９０，８４７４）。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、生体適合性マトリックス（例えば、ヒドロゲル材料）と組み合わされ得、インビボにおいて脈管組織に直接適用され得る（１９９７年１月１４日発行のＲｏｓｅｎｂｅｒｇら、米国特許第５，５９３，９７４号）。
【０２８７】
患者の脳に薬物を直接送達するための脳室内薬物投与は、脳に関する疾患または状態を有する患者を処置するために望まれ得る。このオリゴヌクレオチドの投与様式を達成するために、ヒト患者の脳室内にシリコンカテーテルを外科的に導入し、そしてそれを腹部領域に外科的に埋め込まれた皮下注入ポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に接続する（Ｚｉｍｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８４，４４，１６９８；Ｓｈａｗ，Ｃａｎｃｅｒ，１９９３，７２（１１Ｓｕｐｐｌ．），３４１６）。そのポンプは、本オリゴヌクレオチドを注射するため、および外部のプログラミングデバイスの助けによって正確な投与量の調節および投薬スケジュールの変更を可能にするために使用される。そのポンプの貯蔵容量は、１８〜２０ｍＬであり、注入速度は、０．１ｍＬ／ｈ〜１ｍＬ／ｈの範囲であり得る。毎日から毎月の範囲の投与頻度および投与される薬物の用量（０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲）に応じて、そのポンプの貯蔵器は、３〜１０週間隔で詰め替えられ得る。ポンプの詰め替えは、そのポンプの自己密封式隔壁の経皮的穿刺によって達成される。
【０２８８】
患者の脊柱に薬物を導入するための髄腔内薬物投与は、中枢神経系の疾患を有する患者を処置するために望まれ得る。このオリゴヌクレオチド投与経路を達成するために、シリコンカテーテルをヒト患者のＬ３−４腰部脊柱間空（ｌｕｍｂａｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅ）内に外科的に埋め込み、それを上腹部領域に外科的に埋め込まれた皮下注入ポンプに接続する（Ｌｕｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｔｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９３，２７，９１２；Ｅｔｔｉｎｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ，１９７８，４１，１２７０；Ｙａｉｄａら、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．，１９９５，５９，１９３）。そのポンプは、本オリゴヌクレオチドを注射するため、および外部のプログラミングデバイスの助けによって正確な投与量の調節および投薬スケジュールの変更を可能にするために使用される。そのポンプの貯蔵容量は、１８〜２０ｍＬであり、注入速度は、０．１ｍＬ／ｈ〜１ｍＬ／ｈの範囲であり得る。毎日から毎月の範囲の薬物投与頻度および投与される薬物の用量（０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲）に応じて、そのポンプの貯蔵器は、３〜１０週間隔で詰め替えられ得る。ポンプの詰め替えは、そのポンプの自己密封式隔壁の１回の経皮的穿刺によって達成される。中枢神経系内部のオリゴヌクレオチドの分布、安定性および薬物動態は、公知の方法によって追跡され得る（Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９９３，９０，４６６５）。
【０２８９】
この方法を介して脳または脊柱以外の領域にオリゴヌクレオチドを送達することを達成するために、シリコンカテーテルは、例えば肝臓に送達するための肝臓の動脈に皮下注入ポンプを接続するように構成される（Ｋｅｍｅｎｙら、Ｃａｎｃｅｒ，１９９３，７１，１９６４）。注入ポンプはまた、オリゴヌクレオチドの全身性送達を達成するために使用され得る（Ｅｗｅｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，５２，３００５；Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９６，６２，１９４）。
【０２９０】
薬物を含んでいる薬学的組成物を局所的に適用する上皮性送達および経皮的送達は、それぞれ、局所的な真皮によって吸収される薬物を投与するためか、または、その下に存在する組織によるさらなる浸透および吸収のために、使用され得る。薬剤を調製し、局所的に投与する手段は、当該分野で公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０中のＢｌｏｃｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８７，１５９６−１６０９頁を参照のこと）。
【０２９１】
膣送達は、局所的な処置を提供し、初回通過代謝、消化性酵素による分解および潜在的な全身性副作用を回避する。この投与様式は、膣が通常の生育場所である病原生物、例えば、腟トリコモナスに対して標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して好ましい。別の実施形態において、受胎およびそれに続く妊娠の確率を高めるために、精子特異的抗体をコードする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドをこの投与様式によって送達することができる。膣坐剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０中のＢｌｏｃｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８７，１６０９−１６１４頁）または局所軟膏を使用して、この送達様式を達成することができる。
【０２９２】
膀胱内送達は、局所的な処置を提供し、初回通過代謝、消化性酵素による分解および潜在的な全身性副作用を回避する。しかしながら、この方法は、患者および熟練スタッフの尿道カテーテル処置を必要とする。それにもかかわらず、この投与様式は、尿生殖管に侵入し得る病原生物（例えば、Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）に対して標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドにとって好ましい。
【０２９３】
食餌性送達：動物の消化管の一部への直接的または別の方法での投与。用語「消化管」とは、食物の消化および吸収、そして、食物の残渣の排泄において機能する、動物における管状の通路（口から肛門にかけて通っている）ならびに、その一部またはセグメントのいずれかもしくはすべて（例えば、口腔、食道、胃、小腸および大腸ならびに結腸）ならびにそれらの複合部分（例えば、胃腸管）のことをいう。従って、用語「食餌性送達」は、いくつかの投与経路（経口投与、直腸投与、内視鏡的投与および舌下／頬側投与が挙げられるがこれらに限定されない）を包含する。これらの投与様式に共通して必要なことは、消化管の一部または全部にわたる吸収およびそのように投与された核酸の効率的な粘膜浸透に対する必要性である。
【０２９４】
頬側／舌下投与：経口粘膜を介する薬物の送達は、多くの場合において経口送達を介するよりも速く薬物の血漿濃度が上昇するなどのいくつかの望ましい特徴を有する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０中のＨａｒｖｅｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３５，７１１頁）。さらに、口からの静脈排出路が、上大静脈へ通じているので、この経路はまた、肝臓による迅速な初回通過代謝を迂回する。これら両方の特徴が、ニトログリセリンに対する選択様式である舌下経路に寄与する（Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎら、Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９６中のＢｅｎｅｔら、Ｃｈａｐｔｅｒ  １，７頁）。
【０２９５】
内視鏡的投与：内視鏡検査は、消化管内部への直接的な薬物送達のために使用され得る。例えば、内視鏡的逆行性胆嚢管膵管造影（ＥＲＣＰ）は、広範な胃鏡検査を利用するものであり、胆管および膵管への選択的な接近が可能である（Ｈｉｒａｈａｔａら、Ｇａｎ  Ｔｏ  Ｋａｇａｋｕ  Ｒｙｏｈｏ，１９９２，１９（１０  Ｓｕｐｐｌ．），１５９１）。しかしながら、この手技は、患者にとって不快なものであり、非常に熟練したスタッフが必要である。
【０２９６】
直腸投与：また、経口経路によって投与される薬物は、下部腸内経路によって、すなわち、肛門を通じて直腸または下部腸に、投与され得ることが多い。直腸坐剤、停留浣腸または直腸カテーテルが、この目的で使用され得、それらは、別途患者の服薬遵守が達成しにくいときに（例えば、小児および老人への適用の場合または患者が嘔吐もしくは意識不明のとき）、好ましい。直腸投与は、経口経路よりも迅速に高い血中濃度がもたらされ得るが、逆もまた真であり得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０中のＨａｒｖｅｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３５，７１１頁）。直腸から吸収される薬物の約５０％が肝臓に迂回するので、この経路による投与は、初回通過代謝に対する可能性を有意に低下する（Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎら、Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９６中のＢｅｎｅｔら、Ｃｈａｐｔｅｒ  １）。
【０２９７】
経口投与：投与の好ましい方法は、経口送達であり、経口送達は、代表的には、全身性の循環に到達するために最も便利な経路である。消化管からの吸収は、一般に適用可能である因子、例えば、吸収のための表面積、吸収部位への血流、薬物の物理的状態および吸収部位における薬物の濃度によって支配される（Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎら、Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９６中のＢｅｎｅｔら、Ｃｈａｐｔｅｒ  １，５−７頁）。薬物の経口バイオアベイラビリティを制限し得る重要な因子は、「初回通過効果」の程度である。例えば、いくつかの物質は、その肝臓の取り込みが非常に迅速なので、吸収されたその物質の一部分しか末梢血に入らない（Ｖａｎ  Ｂｅｒｇｅ−Ｈｅｎｅｇｏｕｗｅｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１９７７，７３．３００）。本発明の組成物および方法は、核酸の取り込みを改善することによって、例えば、肝臓の取り込み系が飽和するようにして、そのように投与された核酸のかなりの部分が末梢循環に到達することができるようになることによって、そのような初回通過効果を少なくとも部分的に回避する。さらに、またはあるいは、肝臓の取り込み系は、活性な核酸の投与の前に１つ以上の不活性なキャリア化合物で飽和させられる。
【０２９８】
以下の実施例で本発明を説明するが、以下の実施例は、本発明を限定する意図はない。当業者は、本明細書中に記載される特定の物質および手順に対する多くの均等物を認識するか、または通例の実験によって確かめることができる。そのような均等物は、本発明の範囲内であると考えられる。
【実施例】
【０２９９】
（実施例１：オリゴヌクレオチドの合成）
一般的な合成手法：ヨウ素を使用する酸化を含む標準的なホスホルアミダイト化学を使用して、自動ＤＮＡ合成装置においてオリゴヌクレオチドを合成した。β−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに向けて、ホスファイト結合の段階的なチオ化のために、標準的な酸化瓶をアセトニトリル中の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドの０．２Ｍ溶液で置換した。
【０３００】
２’−Ｏ−メチル−（２’−メトキシ−としても知られる）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成は、上に示された手順に従って、標準的なホスホルアミダイトを２’−Ｏ−メチルβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイト（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）に置き換え、そして、テトラゾールおよび塩基のパルス送達後の待ち工程を３６０秒まで長くした。
【０３０１】
この手順のわずかな改変によって、そして本質的には、１９９５年２月３日出願の米国特許出願番号０８／３８３，６６６（本願と同じ譲受人に譲渡されている）に開示されている手順に従って、同様に２’−Ｏ−プロピル−（２’−プロポキシ−としても知られる）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを調製する。
【０３０２】
５’−ジメトキシトリチル−３’−ホスホルアミダイトを使用して、本発明の２’−フルオロ−ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成し、そして、１９９５年２月３日出願の米国特許出願番号０８／３８３，６６６および１９９６年１０月８日発行の米国特許第５，４５９，２５５号（両方とも、本願と同じ譲受人に譲渡されている）に開示されているように調製する。ホスホルアミダイト化学および標準的なＤＮＡ合成プロトコルのわずかな改変を使用して（すなわち、室温においてメタノールアンモニアを使用して脱保護を達成した）、２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドを調製した。
【０３０３】
Ｍａｒｔｉｎら（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）の方法に本質的に従って２’−メトキシエトキシオリゴヌクレオチドを合成した。合成を簡単にするために、２’−メトキシエトキシオリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドであり、２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３シトシンは、５−メチルシトシンであり、それらは、以下に記載する手順に従って合成した。
【０３０４】
本質的には米国特許第５，５３９，０８２号および同第５，５３９，０８３号（両方ともが（１）１９９６年７月２３日発行であり、（２）本願と同じ譲受人に譲渡されている）に記載されているように、ＰＮＡアンチセンスアナログを調製する。
【０３０５】
精製：それらのオリゴヌクレオチドを、コントロールドポアガラスカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から切断し、５５？Ｃにおいて１８時間濃水酸化アンモニウム中で脱保護した後、２．５容積のエタノールを含む０．５Ｍ  ＮａＣｌから２回沈殿させることによって精製した。２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸緩衝液，ｐＨ７．０において分析のゲル電気泳動を行った。電気泳動から、オリゴデオキシヌクレオチドおよびそれらのホスホロチオエートアナログが８０％超の完全長材料であることを判定した。
【０３０６】
（実施例２：ヒト腫瘍細胞におけるＪＮＫ  ｍＲＮＡ発現のオリゴヌクレオチド媒介性の阻害に対するアッセイ）
潜在的なＪＮＫ調節オリゴヌクレオチドの活性を評価するために、ヒト肺癌腫細胞株Ａ５４９（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤＮｏ．ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）細胞または実施例に示されるような他の細胞株を生育し、そして、オリゴヌクレオチドまたは以下に詳述するようなコントロール溶液で処理した。回収後、細胞抽出物を調製し、特定のＪＮＫ  ｍＲＮＡレベルまたはＪＮＫタンパク質レベルについて調べた（すなわち、それぞれノーザンアッセイまたはウエスタンアッセイ）。すべての場合において、「％発現」とは、未処理細胞（またはオリゴヌクレオチドを欠いているコントロール溶液で処理された細胞）に対する、オリゴヌクレオチドで処理された細胞におけるＪＮＫ特異的シグナルの量のことをいう。
【０３０７】
ノーザンアッセイ：各ＪＮＫタンパク質のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブを使用することによって、各ＪＮＫタンパク質のｍＲＮＡ発現を測定した。ＪＮＫ１、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３に特異的な核酸プローブは、それぞれ実施例３、４および５に記載される。当該分野で周知の手段によって、それらのプローブを放射標識した（例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ，Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，３−１１から２−３−４４および４−１７から４−１８頁；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ２６：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ａｇｒａｗａｌ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９４中のＲｕｔｈ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ６，１６７−１８５頁；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｅｄｓ．中のＣｈａｐｔｅｒ  １０，１０．１−１０．７０頁を参照のこと）。等しいＲＮＡのローディングを確かめるため、およびＪＮＫ転写物のレベルをＧ３ＰＤＨシグナルに関して正規化するために、そのブロットを剥がし、３２Ｐ標識グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）プローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で再探索した。
【０３０８】
Ａ５４９細胞をＴ−７５フラスコ内で８０−９０％コンフルエントまで生育した。この時点で、その細胞を１０ｍＬの培地（ＤＭＥＭ）で２回洗浄した後、２０」ｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（すなわち、１：１（ｗ／ｗ）ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＤＯＴＭＡ＝Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ（ｄｉｏｌｅｙｏｘｙ））プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド；ＤＯＰＥ＝ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）を含む５ｍＬのＤＭＥＭを加えた。オリゴヌクレオチドを最終濃度４００ｎＭとなるように１０μＭ原液から加え、その２つの溶液を、フラスコを回旋することによって混合した。コントロールとして、オリゴヌクレオチドで処理したサンプルと同じ条件下かつ同じ時間にわたって、オリゴヌクレオチドを含まないＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭで細胞を処理した。３７℃にて４時間後、その培地を、１０％血清を含んでいる新鮮ＤＭＥＭと置き換えた。細胞を１８時間回復させた。次いで、当該分野で公知の手法に従って、全細胞ＲＮＡをグアニジニウム中で抽出し、ゲル電気泳動に供し、そしてフィルターに転写した（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｅｄｓ．中のＣｈａｐｔｅｒ  ７，７．１−７．８７頁およびＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ，Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，２−２４から２−３０および４−１４から４−２９頁を参照のこと）。代表的には、フィルターを、ハイブリダイゼーション緩衝液（２５ｍＭ  ＫＰＯ４，ｐＨ７．４；５×ＳＳＣ；５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１００」ｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび５０％ホルムアミド）中で、目的の特定のＪＮＫ遺伝子に特異的なプローブと一晩ハイブリダイズした（Ａｌａｈａｒｉら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９３，２１，４０７９）。この後、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄し、０．２５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲフィルムに曝露することによって、ハイブリダイズしているバンドを可視化し、そして、本質的には製造者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）の指示に従ってＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭを使用して定量化した。
【０３０９】
ウエスタンアッセイ：Ａ５４９細胞を生育し、そして上に記載したようにオリゴヌクレオチドで処理した。当該分野で公知の手段によって、細胞を溶解し、タンパク質抽出物を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、そして、ニトロセルロースフィルターに転写した（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｅｄｓ．中のＣｈａｐｔｅｒ  １８，１８．３４，１８．４７−１８．５４および１８．６０−１８．７５頁を参照のこと）。適切なＪＮＫタンパク質を特異的に認識する１次抗体を使用することによって、各ＪＮＫタンパク質の量を測定した。各ＪＮＫタンパク質に特異的な１次抗体は、適切な実施例に記載されている。当該分野で周知の手段によって、１次抗体を検出し（例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，１０−３３から１０−３５頁；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｅｄｓ．中のＣｈａｐｔｅｒ  １８，１８．１−１８．７５および１８．８６−１８．８８頁を参照のこと）、そして、本質的に製造者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）の指示に従ってＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭを使用して定量化した。
【０３１０】
ＪＮＫタンパク質のレベルは、それらの対応するキナーゼ活性のレベルを測定することによっても定量化することができる。そのようなキナーゼアッセイは、ゲルにおいてインサイチュで実施され得るか（Ｈｉｂｉら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１９９３，７，２１３５）または細胞抽出物からの免疫沈降後に実施され得る（Ｄｅｒｉｊａｒｄら、Ｃｅｌｌ，１９９４，７６，１０２５）。そのようなアッセイのための基質および／またはキットは、例えば、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から市販されている。
【０３１１】
（実施例３：ＪＮＫ１発現のオリゴヌクレオチド媒介性阻害）
ＪＮＫ１オリゴヌクレオチド配列：表１に、ＪＮＫ１ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするように設計された一連のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列ならびにそれらの対応するＩＳＩＳ番号および配列番号を列挙する。標的遺伝子であるＪＮＫ１のヌクレオチド座標（ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅ）および遺伝子標的領域もまた含まれている。そのヌクレオチド座標は、遺伝子座名「ＨＵＭＪＮＫ１」であるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２６３１８（配列番号：８７）から得られたものである（Ｄｅｒｉｊａｒｄら、Ｃｅｌｌ，１９９４，７６，１０２５の図１（Ａ）もまた参照のこと）。遺伝子標的領域に対する省略形は、以下のとおりである：５’−ＵＴＲ、５’非翻訳領域；ｔＩＲ、翻訳開始領域；ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム；３’−ＵＴＲ、３’非翻訳領域。表１に示される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合で接続されており、２’位は改変されていない（すなわち、２’−デオキシである）。なお、上記オリゴヌクレオチド標的の座標位置および遺伝子標的領域は、ＪＮＫ１の関連アイソフォームをコードするｍＲＮＡ内で変化し得る以下のサブセクションＧを参照のこと）。
【０３１２】
ＩＳＩＳ番号１２５４８（配列番号：１７）および１２５５１（配列番号：２０）の全長オリゴヌクレオチド配列は、ヒトＪＮＫ１ｍＲＮＡへのハイブリダイズに加えて、「ｐ５４？」という名称のストレス活性化タンパク質キナーゼ（Ｋｙｒｉａｋｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６９，１５６）をコードするＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のｍＲＮＡの５’末端にハイブリダイズする。具体的には、ＩＳＩＳ１２５４８（配列番号：１７）は、遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＤ」であるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２７１２９（配列番号：８８）の塩基４９８−５１７にハイブリダイズし、ＩＳＩＳ１２５５１（配列番号：２０）は、同じ配列の塩基８０３−８２２にハイブリダイズする。
【０３１３】
ＪＮＫ１特異的プローブ：ＪＮＫ１配列（表２）由来の一連のオリゴヌクレオチドの生物学的活性についての最初のスクリーニングにおいて、ＪＮＫ１のｃＤＮＡクローン（Ｄｅｒｉｊａｒｄら、Ｃｅｌｌ，１９９４，７６，１０２５）を放射標識し、そして、ノーザンブロットにおいてＪＮＫ１特異的プローブとして使用した。しかしながら、あるいは、表１のオリゴヌクレオチドの１つ以上が、検出可能に標識され、ＪＮＫ１特異的プローブとして使用される。
【０３１４】
【表１】
2010500290.tif 000002
ＪＮＫ１オリゴヌクレオチドの活性：一連のＪＮＫ１特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのスクリーニングからのデータ（表２）は、以下の結果を示唆する。ＪＮＫ１ｍＲＮＡレベルの少なくとも５０％の阻害レベルによって反映されるような、このアッセイにおいて活性を示すオリゴヌクレオチドとしては、ＩＳＩＳ番号１１９８２、１１９８３、１１９８５、１１９８７、１２４６３、１２４６４、１２５３８、１２５３９、１２５４８、１２５４９、１２５５０、１２５５２、１２５５３、１２５５４、１２５５５、１２５５６および１２５５７（それぞれ配列番号：５、６、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５および２６）が挙げられる。従って、これらのオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１発現を調節するための本発明の好ましい実施形態である。このアッセイにおいてＪＮＫ１ｍＲＮＡの少なくとも８０％の阻害レベルを示すオリゴヌクレオチドとしては、ＩＳＩＳ番号１１９８２、１２５３９、１２４６４、１２５４８、１２５５４および１２４６４（それぞれ、配列番号：５、１４、１６、１７および２３）が挙げられる。従って、これらのオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１発現を調節するための本発明のより好ましい実施形態である。
【０３１５】
ＩＳＩＳ１２５３９（配列番号：１６）によるＪＮＫ１ｍＲＮＡ発現の阻害の時間経過を表３に示す。４時間にわたるＩＳＩＳ１２５３９での処理の後、ＪＮＫ１の阻害レベルは、約８５％より高く（ｔ＝０ｈ）、ｔ＝４ｈでは約９５％阻害に上昇し、その後、約８０％以上（ｔ＝１２および４８ｈ）または６０％以上（ｔ＝７２ｈ）のままであった。
【０３１６】
【表２】
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【０３１７】
【表３】
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さらなるＪＮＫ１オリゴヌクレオチド：ＪＮＫ１特異的オリゴヌクレオチドについての結果（表２）から、ＪＮＫ１発現を調節するために最も活性なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのうちの１つが、ＩＳＩＳ１２５３９（配列番号：１６）であることが示唆される。表４に詳述されるように、このオリゴヌクレオチドに基づいてさらなるオリゴヌクレオチドを設計することにより、上に記載した知見を確認し、拡張させた。
【０３１８】
オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ番号１４３２０（配列番号：２７）および１４３２１（配列番号：２８）は、それぞれＩＳＩＳ１２５３９（配列番号：１６）に対する２’−デオキシ−ホスホロチオエートセンス鎖コントロールおよびスクランブルコントロールである。ＩＳＩＳ番号１５３４６および１５３４７は、ＩＳＩＳ１２５３９に対応する「ギャップマー」である；両方ともが、２’−メトキシエトキシ「ウイング」（ＩＳＩＳ１５３４６の場合はホスホロチオエート結合およびＩＳＩＳ１５３４７の場合はホスホジエステル結合を有する）および標的ｍＲＮＡ分子に対するＲＮアーゼＨ活性を支援するように設計された中央の２’−デオキシ「ギャップ」を有する。同様に、ＩＳＩＳ番号１５３４８〜１５３５０は、ＩＳＩＳ１２５３９に対応する「ウイングマー」であり、５’または３’の２’−メトキシエトキシＲＮアーゼＨ抵抗性「ウイング」および標的ＪＮＫ１ｍＲΝＡに対するＲＮアーゼＨ活性を支援するように設計された３’または５’（それぞれ）の２’−デオキシ「ウイング」を有する。
【０３１９】
ＩＳＩＳ１２５３９（配列番号：１６）の化学的に改変された誘導体を、１００ｎＭおよび４００ｎＭの濃度における、本明細書中に記載されるノーザンアッセイにおいて試験し、そのデータ（表５）から、以下の結果が示唆される。４００ｎＭでは、２’−非改変オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１２５３９に対して、両方の「ギャップマー」（ＩＳＩＳ番号１５３４６および１５３４７）が、少なくとも約８８％阻害のＪＮＫ１ｍＲＮＡ発現の阻害を達成した。同様に、４つの「ウイングマー」（ＩＳＩＳ番号１５３４８〜１５３５１）は、少なくとも約６０〜７０％の阻害のＪＮＫ１発現の阻害を達成した。
【０３２０】
【表４】
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【０３２１】
【表５】
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ＪＮＫ１オリゴヌクレオチドに対する用量依存的反応および配列依存的反応：ＩＳＩＳ１２５３９（配列番号：１６）に対する用量依存的反応を証明するために、様々な濃度（すなわち、５０、１００、２００および４００ｎＭ）のＩＳＩＳ１２５３９を、Ａ５４９細胞においてＪＮＫ１ｍＲＮＡレベルに対するそれらの効果について試験した（表６）。ＩＳＩＳ１２５３９の特異性を証明するために、さらに２つのコントロールオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１４３２０，配列番号：２７，センスコントロールおよびＩＳＩＳ１４３２１，配列番号：２８，スクランブルコントロール；表４もまた参照のこと）もＡ５４９細胞に適用した。その結果（表６）から、ＩＳＩＳ１２５３９に対するＡ５４９細胞の反応が、ほぼ線形の様式で用量に依存していることが証明される。対照的に、コントロールオリゴヌクレオチドは両方とも、ＪＮＫ１ｍＲＮＡレベルに対していかなる一貫した反応ももたらさなかった。
【０３２２】
ウエスタンアッセイ：ＪＮＫ１ｍＲＮＡに対して標的化されたオリゴヌクレオチドの、ＪＮＫ１タンパク質レベルに対する効果を評価するために、以下の例外および／または改変とともに本質的には実施例２において上に記載したようにウエスタンアッセイを行った。ＪＮＫ１に特異的に結合する１次抗体（カタログ番号ｓｃ−４７４−Ｇ）をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から購入した（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ；他のＪＮＫ１特異的抗体は、ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ；およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪから市販されている）。この実験では、細胞を生育し、最初２０時間、３００ｎＭのオリゴヌクレオチドで処理し、次いで４時間、２００ｎＭのオリゴヌクレオチドで処理した。ｔ＝４８ｈに、ノーザン解析およびウエスタン解析のためにアリコートを取り出し、新鮮培地をその細胞に加えた。解析用のアリコートをｔ＝７２ｈでも採取した。上に記載したノーザンアッセイおよびウエスタンアッセイを使用して、ｔ＝４８ｈおよびｔ＝７２ｈのサンプルを解析した。
【０３２３】
【表６】
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データ（表７）から以下の結果が示唆される。このアッセイにおいて、ｔ＝４８ｈにおいて、＞約７０％から約１００％までのｍＲＮＡ％阻害のレベルを示すオリゴヌクレオチドとしては、ＩＳＩＳ番号１２５３９（ホスホロチオエート結合）、１５３４６および１５３４７（「ギャップマー」）ならびに１５３４８および１５３５１（５’「ウイングマー」）が挙げられる（配列番号：１６）。このアッセイにおいてＪＮＫ１ｍＲＮＡの≧約９０％から約１００％までのｍＲＮＡ阻害のレベルを示すオリゴヌクレオチドとしては、ＩＳＩＳ番号１２５３９、１５３４５および１５３４６が挙げられる（配列番号：１６）。試験されたオリゴヌクレオチドは、ほぼ類似したレベルのＪＮＫ１タンパク質阻害を示した；ＩＳＩＳ番号１２５３９、１５３４６−１５３４８および１５３５１は、≧約４０％のタンパク質阻害レベルを達成し、ＩＳＩＳ番号１２５３９、１５３４６および１５３４７は、≧約５５％のタンパク質阻害レベルを達成した。
【０３２４】
ｔ＝７２ｈにおいて、＞約７０％から約１００％までのｍＲＮＡ％阻害レベルを示すオリゴヌクレオチドとしては、ＩＳＩＳ番号１２５３９（ホスホロチオエート結合）、１５３４６および１５３４７（「ギャップマー」）ならびに１５３４８（５’「ウイングマー」）が挙げられる（配列番号：１６）。本アッセイ中のこの点においてＪＮＫ１ｍＲＮＡの≧約９０％から約１００％までのｍＲＮＡ阻害レベルを示すオリゴヌクレオチドとしては、ＩＳＩＳ番号１２５３９および１５３４６が挙げられる（配列番号：１６）。総合して、試験されたオリゴヌクレオチドは、本アッセイ中のこの点において高いレベルのＪＮＫ１タンパク質阻害を示した。完全に２’−メトキシエトキシ改変されたＩＳＩＳ１５３４５を除いて、表７中のオリゴヌクレオチドのすべてが、≧約４０％タンパク質阻害を達成した。ＩＳＩＳ番号１２５３９、１５３４６−１５３４８および１５３５１は、≧約６０％のタンパク質阻害レベルを達成し、ＩＳＩＳ番号１２５３９、１５３４６および１５３４７は、≧約７０％のタンパク質阻害レベルを達成した。
【０３２５】
【表７】
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ＪＮＫ１アイソフォームに特異的なオリゴヌクレオチド：ＪＮＫ１の最初の報告（Ｄｅｒｉｊａｒｄら、Ｃｅｌｌ，１９９４，７６，１０２５）の後、ＪＮＫ１の関連アイソフォームをコードするｃＤＮＡがクローニングされ、そしてそれらのヌクレオチド配列が決定された（Ｇｕｐｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６，１５，２７６０）。ＪＮＫ１のポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＪＮＫ１−ａ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２６３１８（配列番号：８７），遺伝子座名「ＨＵＭＪＮＫ１」）に加えて、さらなるアイソフォームとしては、ＪＮＫ１−ａ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８２２（配列番号：８９），遺伝子座名「Ｕ３４８２２」）、ＪＮＫ１−β１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００４（配列番号：９０），遺伝子座名「ＨＳＵ３５００４」）およびＪＮＫ１−β２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００５（配列番号：９１），遺伝子座名「ＨＳＵ３５００５」）が挙げられる。おそらく選択的ｍＲＮＡスプライシングから生じるＪＮＫ１の４つのアイソフォームは、各々、異なる転写因子または一連の転写因子と相互作用し得る（Ｇｕｐｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６，１５，２７６０）。以下に詳述されるように、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１のある特定のメンバーまたは一連のこれらのアイソフォームに特異的である。
【０３２６】
ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−ａ２をコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおいて、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２６３１８（配列番号：８７））のヌクレオチド（ｎｔ）６３１−６６５およびＪＮＫ１−ａ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８２２（配列番号：８９））のｎｔ６２５−６５９は、配列番号：６３として以下に示される配列を有するのに対し、ＪＮＫ１−β１およびＪＮＫ１−β２をコードするｍＲＮＡのＯＲＦでは、ＪＮＫ１−β１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００４（配列番号：９０））のｎｔ６３１−６６５およびＪＮＫ１−β２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００５（配列番号：９１））のｎｔ６２６−６６０は、配列番号：６４として示される配列を有する。例示目的で、互いに対してアラインメントされた配列番号：６３および６４を示す（垂直の記号「｜」は、両方の配列において同一である塩基を示す）：
【０３２７】
【化１】
2010500290.tif 000009
このａとｂのＪＮＫ１アイソフォームの間の相違に起因して、配列番号：６３の逆相補から得られるアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号：６５、以下を参照のこと）を使用することにより、ＪＮＫ１−β１およびＪＮＫ１−β２の発現に著しい影響を及ぼさずにＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−ａ２の発現を調節することができる。同様の様式において、配列番号：６４の逆相補から得られるアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号：６６、以下を参照のこと）を選択し、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することにより、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−ａ２の発現に著しい影響を及ぼさずにＪＮＫ１−β１およびＪＮＫ１−β２の発現を調節することができる。例として、配列番号：６６ではなく配列番号：６５から得られる配列を有するオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−ａ２をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるが、ＪＮＫ１−β１およびＪＮＫ１−β２をコードするｍＲＮＡには特異的にハイブリダイズすることができない。
【０３２８】
【化２】
2010500290.tif 000010
さらなる例として、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−ａ２をコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおいて、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２６３１８（配列番号：８７））のｎｔ６６８−７１１およびＪＮＫ１−ａ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８２２（配列番号：８９））のｎｔ６６２−７０５は、配列番号：６７として以下に示される配列を有するのに対し、ＪＮＫ１−β１およびＪＮＫ１−β２をコードするｍＲＮＡのＯＲＦでは、ＪＮＫ１−β１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００４（配列番号：９０））のｎｔ６６８−７１１およびＪＮＫ１−β２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００５（配列番号：９１））のｎｔ６６３−７０６は、配列番号：６８として以下に示される配列を有する。例示目的で、以下のとおり互いとアラインメントされた配列番号：６７および６８を示す：
【０３２９】
【化３】
2010500290.tif 000011
このａとｂのＪＮＫ１アイソフォームの間の相違に起因して、配列番号：６７の逆相補から得られるアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号：６９、以下を参照のこと）は、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−ａ２をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができ、そして、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、使用することにより、ＪＮＫ１−β１およびＪＮＫ１−β２の発現に著しい影響を及ぼさずにＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−ａ２の発現を調節することができる。同様の様式において、配列番号：６８の逆相補から得られるアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号：７０、以下を参照のこと）は、ＪＮＫ１−β１およびＪＮＫ１−β２をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができ、そして、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、使用することにより、ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−ａ２の発現に著しい影響を及ぼさずにＪＮＫ１−β１およびＪＮＫ１−β２の発現を調節することができ、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、使用することにより、ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−ａ２の発現に著しい影響を及ぼさずにＪＮＫ１−β１およびＪＮＫ１−β２の発現を調節することができる：
【０３３０】
【化４】
2010500290.tif 000012
ＪＮＫ１アイソフォームのカルボキシル末端部分の場合において、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１は、ＪＮＫ１−β１と同一性を共有する；同様に、ＪＮＫ１−ａ２およびＪＮＫ１−β２は、同一のカルボキシ末端部分を有する。これらのアイソフォームのアミノ酸配列における実質的な相違（ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−β１中の５アミノ酸が、ＪＮＫ１−ａ２およびＪＮＫ１−β２中の４８アミノ酸で置換されている）は、読み枠を移動させるヌクレオチド配列のわずかな相違から生じる。具体的には、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−β１をコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおいて、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２６３１８（配列番号：８７））およびＪＮＫ１−β１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００４（配列番号：９０））のｎｔ１１４４−１１７５は、配列番号：７１として以下に示される配列を有するのに対し、ＪＮＫ１−ａ２およびＪＮＫ１−β２をコードするｍＲＮＡのＯＲＦでは、ＪＮＫ１−ａ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８２２（配列番号：８９））のｎｔ１１３８−１１６４およびＪＮＫ１−β２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００５（配列番号：９１））のｎｔ１１３９−１１６５は、配列番号：７２として以下に示される配列を有する。例示目的で、配列番号：７１および７２を、互いとアラインメントして示す（ダッシュＡ−」は、示されている配列中に存在しない塩基を示し、太字の塩基は、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−β１のＯＲＦに対する終止コドンを示している）：
【０３３１】
【化５】
2010500290.tif 000013
このＪＮＫ１アイソフォームの間の相違に起因して、配列番号：７１の逆相補から得られるアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号：７３、以下を参照のこと）は、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−β１をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができ、そして、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、使用することにより、ＪＮＫ１−ａ２およびＪＮＫ１−β２の発現に著しい影響を及ぼさずにＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−β１の発現を調節することができる。同様の様式において、配列番号：７２の逆相補から得られるアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号：７４、以下を参照のこと）は、ＪＮＫ１−ａ２およびＪＮＫ１−β２をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができ、そして、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、使用することにより、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−β１の発現に著しい影響を及ぼさずにＪＮＫ１−ａ２およびＪＮＫ１−β２の発現を調節することができる：
【０３３２】
【化６】
2010500290.tif 000014
好ましい実施形態において、そのようなアイソフォーム特異的オリゴヌクレオチド（例えば、上に記載されたもの）は、メトキシエトキシ「ギャップマー」または「ウイングマー」であり、ここで、ＲＮアーゼＨ感受性の「ギャップ」または「ウイング」は、上のアンチセンス配列、すなわち、配列番号：６５、６６、６９、７０、７３および７４における同一でない領域を重複するように位置している。
【０３３３】
（実施例４：ＪＮＫ２発現のオリゴヌクレオチド媒介性阻害）
ＪＮＫ２オリゴヌクレオチド配列：表８に、ＪＮＫ２ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列ならびにそれらの対応するＩＳＩＳ番号およびその配列番号を列挙する。標的遺伝子のヌクレオチド座標および遺伝子標的領域もまた含まれている。そのヌクレオチド座標は、遺伝子座名「ＨＵＭＪＮＫ２」であるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３１９５１（配列番号：９２）から得られたものである（Ｓｌｕｓｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，１４，８３７６の図１（Ａ）およびＫａｌｌｕｎｋｉら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９４，８，２９９６もまた参照のこと）。遺伝子標的領域に対する省略形は、以下のとおりである：５’−ＵＴＲ、５’非翻訳領域；ｔＩＲ、翻訳開始領域；ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム；３’−ＵＴＲ、３’非翻訳領域。表８に示される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合で接続されており、２’位は改変されていない（すなわち、２−デオキシである）。なお、上記オリゴヌクレオチド標的の座標位置および遺伝子標的領域は、ＪＮＫ２の関連アイソフォームをコードするｍＲＮＡ内で変化し得る（以下のサブセクションＧを参照のこと）。
【０３３４】
ＩＳＩＳ番号１２５６２（配列番号：３３）の全長オリゴヌクレオチド配列は、ヒトＪＮＫ２ｍＲＮＡへのハイブリダイズに加えて、「ｐ５４ａ２」という名称のストレス活性化タンパク質キナーゼ（Ｋｙｒｉａｋｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６９，１５６）をコードするＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のｍＲＮＡのＯＲＦにハイブリダイズする。具体的には、ＩＳＩＳ１２５６２（配列番号：３３）は、遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＢ」であるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２７１１２（配列番号：９３）の塩基６４９−６６８にハイブリダイズする。従って、このオリゴヌクレオチドは、ラットのインビトロ、すなわち、培養細胞もしくは動物全体から得られる組織において、またはラットのインビボにおいて、ｐ５４ａ２タンパク質キナーゼの役割を調査するための本発明の好ましい実施形態である。
【０３３５】
ＪＮＫ２特異的プローブ：ＪＮＫ２配列（表９）由来の一連のオリゴヌクレオチドの生物学的活性についての最初のスクリーニングにおいて、ＪＮＫ２のｃＤＮＡクローン（Ｋａｌｌｕｎｋｉら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９４，８，２９９６）を放射標識し、そして、ノーザンブロットにおいてＪＮＫ２特異的プローブとして使用した。しかしながら、あるいは、表８のオリゴヌクレオチドの１つ以上が、検出可能に標識され、ＪＮＫ２特異的プローブとして使用される。
【０３３６】
ＪＮＫ２オリゴヌクレオチドの活性：一連のＪＮＫ２特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのスクリーニングからのデータ（表９）は、以下の結果を示唆する。ＪＮＫ２ｍＲＮＡレベルの少なくとも５０％の阻害レベルによって反映されるような、このアッセイにおいて活性を示すオリゴヌクレオチドとしては、ＩＳＩＳ番号１２５５８、１２５５９、１２５６０、１２５６３、１２５６４、１２５６５、１２５６６、１２５６７、１２５６８、１２５６９および１２５７０が挙げられる（それぞれ配列番号：２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０および４１）。従って、これらのオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ２発現を調節するための本発明の好ましい実施形態である。このアッセイにおいてＪＮＫ２ｍＲＮＡの少なくとも８０％の阻害レベルを示すオリゴヌクレオチドとしては、ＩＳＩＳ番号１２５５８、１２５６０、１２５６５、１２５６７、１２５６８および１２５６９が挙げられる（それぞれ配列番号：２９、３１、３６、３８、３９および４０）。従って、これらのオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ２発現を調節するための本発明のより好ましい実施形態である。
【０３３７】
ＩＳＩＳ１２５６０（配列番号：３１）によるＪＮＫ２ｍＲＮＡ発現の阻害の時間経過を表１０に示す。４時間にわたるＩＳＩＳ１２５６０での処理の後、ＪＮＫ２の阻害レベルは、少なくとも約１２時間にわたって約８０％以上であり、少なくともおよそｔ＝４８ｈまで約６０％以上であった。
【０３３８】
【表８】
2010500290.tif 000015
【０３３９】
【表９】
2010500290.tif 000016
【０３４０】
【表１０】
2010500290.tif 000017
さらなるＪＮＫ２オリゴヌクレオチド：ＪＮＫ２特異的オリゴヌクレオチドについての結果（表９）から、ＪＮＫ２発現を調節するために最も活性なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのうちの１つが、ＩＳＩＳ１２５６０（配列番号：３１）であることが示唆される。表１１に詳述されるように、このオリゴヌクレオチドに基づいてさらなるオリゴヌクレオチドを設計することにより、上に記載した知見を確認し、拡張させた。
【０３４１】
オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ番号１４３１８（配列番号：４２）および１４３１９（配列番号：４３）は、それぞれＩＳＩＳ１２５６０（配列番号：３１）に対する２’−デオキシ−ホスホロチオエートセンス鎖コントロールおよびスクランブルコントロールである。ＩＳＩＳ番号１５３５３および１５３５４は、ＩＳＩＳ１２５６０に対応する「ギャップマー」である；両方ともが、２’−メトキシエトキシ「ウイング」（ＩＳＩＳ１５３５３の場合はホスホロチオエート結合およびＩＳＩＳ１５３５４の場合はホスホジエステル結合を有する）および標的ｍＲＮＡ分子に対するＲＮアーゼＨ活性を支援するように設計された中央の２’−デオキシ「ギャップ」を有する。同様に、ＩＳＩＳ番号１５３５５〜１５３５８は、ＩＳＩＳ１２５６０に対応する「ウイングマー」であり、５’または３’の２’−メトキシエトキシＲＮアーゼＨ抵抗性「ウイング」および標的ＪＮＫ２ｍＲΝＡに対するＲＮアーゼＨ活性を支援するように設計された３’または５’（それぞれ）の２’−デオキシ「ウイング」を有する。
【０３４２】
ＩＳＩＳ１２５６０（配列番号：３１）の化学的に改変された誘導体を１００ｎＭおよび４００ｎＭの濃度において本明細書中に記載されるノーザンアッセイにおいて試験し、そのデータ（表１２）から、以下の結果が示唆される。４００ｎＭでは、２’−非改変オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１２５６０に対して、両方の「ギャップマー」（ＩＳＩＳ番号１５３５３および１５３５４）が、ＪＮＫ２ｍＲＮＡ発現の約８０％阻害を達成した。同様に、４つの「ウイングマー」（ＩＳＩＳ番号１５３５５〜１５３５８）は、ＪＮＫ２発現の７０〜９０％阻害を達成した。
【０３４３】
ＪＮＫ２オリゴヌクレオチドに対する用量依存的反応および配列依存的反応：ＩＳＩＳ１２５６０（配列番号：３１）に対する用量依存的反応を証明するために、様々な濃度（すなわち、５０、１００、２００および４００ｎＭ）のＩＳＩＳ１２５６０を、Ａ５４９細胞においてＪＮＫ２ｍＲＮＡレベルに対するそれらの効果について試験した（表１３）。ＩＳＩＳ１２５６０の特異性を証明するために、さらに２つのコントロールオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１４３１８、配列番号：４２，センスコントロールおよびＩＳＩＳ１４３１９、配列番号：４３，スクランブルコントロール；表１１もまた参照のこと）もＡ５４９細胞に適用した。その結果（表１２）から、ＩＳＩＳ１２５３９に対するＡ５４９細胞の反応が、ほぼ線形の様式で用量に依存していることが証明される。対照的に、コントロールオリゴヌクレオチドは両方とも、ＪＮＫ２ｍＲＮＡレベルに対していかなる一貫した反応ももたらさなかった。
【０３４４】
【表１１】
2010500290.tif 000018
【０３４５】
【表１２】
2010500290.tif 000019
【０３４６】
【表１３】
2010500290.tif 000020
ウエスタンアッセイ：ＪＮＫ２ｍＲＮＡに対して標的化されたオリゴヌクレオチドの、ＪＮＫ２タンパク質レベルに対する効果を評価するために、本質的には上の実施例２および３に記載されたようにウエスタンアッセイを行った。ＪＮＫ２に特異的に結合する１次抗体を、例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ；Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ；ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ；またはＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪから購入する。
【０３４７】
ＪＮＫ２アイソフォームに特異的なオリゴヌクレオチド：ＪＮＫ２の最初の報告（Ｓｌｕｓｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ，１９９４，１４，８３７６；Ｋａｌｌｕｎｋｉら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９４，８，２９９６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＨＳＵ０９７５９（配列番号：９４），遺伝子座名「Ｕ０９７５９（配列番号：９４）」）の後、ＪＮＫ２の関連アイソフォームをコードするｃＤＮＡがクローニングされ、そしてそれらのヌクレオチド配列が決定された（Ｇｕｐｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６，１５，２７６０）。ＪＮＫ２のポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＪＮＫ２−ａ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３１９５１（配列番号：９２），遺伝子座名「ＨＵＭＪＮＫ２」）に加えて、さらなるアイソフォームとしては、ＪＮＫ２−ａ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８２１（配列番号：９５），遺伝子座名「ＨＳＵ３４８２１」）、ＪＮＫ２−β１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００２（配列番号：９６），遺伝子座名「ＨＳＵ３５００２」）およびＪＮＫ２−β２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００３（配列番号：９７），遺伝子座名「ＨＳＵ３５００３」）が挙げられる。おそらく選択的ｍＲＮＡスプライシングから生じるＪＮＫ２の４つのアイソフォームは、各々、異なる転写因子または一連の転写因子と相互作用し得る（Ｇｕｐｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６，７５，２７６０）。以下に詳述されるように、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ２のある特定のメンバーまたは一連のこれらのアイソフォームに特異的である。
【０３４８】
ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−ａ２およびＪＮＫ２−ａ１をコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおいて、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−ａ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３１９５１（配列番号：９２））のヌクレオチド（ｎｔ）６８９−７４８およびＪＮＫ２−ａ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８２１（配列番号：９５））のｎｔ６７５−７３４は、配列番号：７５として以下に示される配列を有するのに対し、ＪＮＫ２−β１およびＪＮＫ２−β２をコードするｍＲＮＡのＯＲＦでは、ＪＮＫ２−β１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００２（配列番号：９６））のｎｔ６５３−７１２およびＪＮＫ２−β２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００３（配列番号：９７））のｎｔ６６５−７２４は、配列番号：７６として以下に示される配列を有する。例示目的で、配列番号：７５および７６を、互いとアラインメントして示す（垂直の記号「｜」は、両方の配列において同一である塩基を示す）：
【０３４９】
【化７】
2010500290.tif 000021
このａおよびｂのＪＮＫ２アイソフォームの間の相違に起因して、配列番号：７５の逆相補から得られるアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号：７７、以下を参照のこと）は、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−ａ２およびＪＮＫ２−ａ１と特異的にハイブリダイズすることができ、そして、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、使用することにより、ＪＮＫ１−β１およびＪＮＫ１−β２の発現に著しい影響を及ぼさずにＪＮＫ２／ＪＮＫ２−ａ２およびＪＮＫ２−ａ１の発現を調節することができる。同様の様式において、配列番号：７６の逆相補から得られるアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号：７８、以下を参照のこと）は、ＪＮＫ２−β１およびＪＮＫ２−β２と特異的にハイブリダイズすることができ、そして、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、使用することにより、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−ａ２およびＪＮＫ２−ａ１の発現に著しい影響を及ぼさずにＪＮＫ２−β１およびＪＮＫ２−β２の発現を調節することができる。例として、配列番号：７８ではなく配列番号：７７から得られる配列を有するオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−ａ１およびＪＮＫ１−ａ２をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるが、ＪＮＫ２−β１およびＪＮＫ２−β２をコードするｍＲＮＡには特異的にハイブリダイズすることができない：
【０３５０】
【化８】
2010500290.tif 000022
ＪＮＫ２アイソフォームのカルボキシル末端部分の場合において、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−ａ２は、ＪＮＫ１−β２と同一性を共有する；同様に、ＪＮＫ２−ａ１およびＪＮＫ２−β１は、同一のカルボキシ末端部分を有する。これらのアイソフォームのアミノ酸配列における実質的な相違（ＪＮＫ２−ａ２およびＪＮＫ２−β２中の５アミノ酸が、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−ａ２およびＪＮＫ２−β２中の４７アミノ酸で置換されている）は、読み枠を移動させるヌクレオチド配列のわずかな相違から生じる。具体的には、ＪＮＫ２−ａ１およびＪＮＫ１−β１をコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおいて、ＪＮＫ２−ａ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８２１（配列番号９５））のｎｔ１１６４−１１９８およびＪＮＫ２−β１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００２（配列番号９６））のｎｔ１１４２−１１７６は、配列番号７９として以下に示される配列を有するのに対し、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−ａ２およびＪＮＫ２−β２をコードするｍＲＮＡのＯＲＦでは、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−ａ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３１９５１（配列番号：９２））のｎｔ１１７８−１２０７およびＪＮＫ２−β２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００３（配列番号：９７））のｎｔ１１５４−１１８３は、配列番号：８０として以下に示される配列を有する。例示目的で、配列番号：７９および８０を、互いとアラインメントして示す（ダッシュ「−」は、示されている配列に存在しない塩基を示し、太字の塩基は、ＪＮＫ２−ａ１およびＪＮＫ２−β１のＯＲＦに対する終止コドンを示している）：
【０３５１】
【化９】
2010500290.tif 000023
このＪＮＫ２アイソフォームの間の相違に起因して、配列番号：７９の逆相補から得られるアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号：８１、以下を参照のこと）は、ＪＮＫ２−ａ１およびＪＮＫ２−β１をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができ、そして、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、使用することにより、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−ａ２およびＪＮＫ２−β２の発現に著しい影響を及ぼさずにＪＮＫ２−ａ１およびＪＮＫ２−β１をコードするｍＲＮＡの発現を調節することができる。同様の様式において、配列番号：８０の逆相補から得られるアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号：８２、以下を参照のこと）は、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−ａ２およびＪＮＫ２−β２をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができ、そして、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、使用することにより、ＪＮＫ２−ａ１およびＪＮＫ２−β１の発現に著しい影響を及ぼさずにＪＮＫ２／ＪＮＫ２−ａ２およびＪＮＫ２−β２をコードするｍＲＮＡの発現を調節することができる。例として、ＩＳＩＳ１２５６４（配列番号：３５）は、配列番号：８１ではなく配列番号：８２に対応するので、それは、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−ａ２およびＪＮＫ２−β２をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができ、また、それを選択し、使用することにより、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−ａ２およびＪＮＫ２−β２をコードするｍＲＮＡの発現を調節することができるが、ＪＮＫ２−ａ１およびＪＮＫ２−ａ１をコードするｍＲＮＡに対してはそのようなことはできない：
【０３５２】
【化１０】
2010500290.tif 000024
好ましい実施形態において、そのようなアイソフォーム特異的オリゴヌクレオチド（例えば、上に記載されたもの）は、メトキシエトキシ「ギャップマー」または「ウイングマー」であり、ここで、ＲＮアーゼＨ感受性の「ギャップ」または「ウイング」は、上のアンチセンス配列、すなわち、配列番号：７７、７８、８１および８２において同一でない領域を重複するように位置している。
【０３５３】
実施例５：ＪＮＫ３発現のオリゴヌクレオチド媒介性阻害
Ａ．ＪＮＫ３オリゴヌクレオチド配列：表１４に、ＪＮＫ３ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列ならびにそれらの対応するＩＳＩＳ番号および配列番号を列挙する。標的遺伝子のヌクレオチド座標および遺伝子標的領域もまた含まれている。そのヌクレオチド座標は、遺伝子座名「ＨＳＵ０７６２０」であるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０７６２０（配列番号：９８）から得られたものである（Ｍｏｈｉｔら、Ｎｅｕｒｏｎ，１９９４，１４，６７の図４（Ａ）もまた参照のこと）。遺伝子標的領域に対する省略形は、以下のとおりである：５’−ＵＴＲ、５’非翻訳領域；ｔＩＲ、翻訳開始領域；ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム；３’−ＵＴＲ、３’非翻訳領域。なお、上記オリゴヌクレオチド標的の座標位置および遺伝子標的領域は、ＪＮＫ３の関連アイソフォームをコードするｍＲＮＡ内で変化し得る（以下のサブセクションＤを参照のこと）。
【０３５４】
表１４に示される配列を有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合で接続されており、「ギャップマー」である。具体的には、３’および５’末端の６ヌクレオチドは、２’−メトキシエトキシ改変されており、それらは、表１４において太字で示されているのに対し、中央の８ヌクレオチドの２’位は改変されていない（すなわち、２’−デオキシである）。
【０３５５】
ＩＳＩＳ番号１６６９２、１６６９３、１６７０３、１６７０４、１６７０５、１６７０７および１６７０８（それぞれ、配列番号：４６、４７、５６、５７、５８、６０および６１）の全長オリゴヌクレオチド配列は、ヒトＪＮＫ３ｍＲＮＡへのハイブリダイズに加えて、「ｐ５４β」という名称のストレス活性化タンパク質キナーゼ（Ｋｙｒｉａｋｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６９，１５６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２７１２８（配列番号：９９），遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＣ」をコードするＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする。さらに、１６６９２、１６６９３、１６６９５、１６７０３、１６７０４、１６７０５、１６７０７および１６７０８（それぞれ、配列番号：４６、４７、４９、５６、５７、５８、６０および６１）の全長オリゴヌクレオチド配列は、「ｐ４５９３Ｆ１２ＳＡＰキナーゼ」という名称のマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼストレス活性化タンパク質をコードするＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来のｍＲＮＡ（Ｍａｒｔｉｎら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，１９９６，３５，４７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３５２３６（配列番号：１００），遺伝子座名「ＭＵＳＭＡＰＫ」）に特異的にハイブリダイズする。従って、これらのオリゴヌクレオチドは、ｐ５４βおよびｐ４５９３Ｆ１２ＳＡＰタンパク質キナーゼの役割をそれぞれラットまたはマウスにおいて、インビトロ（すなわち、培養細胞もしくは動物全体から得られる組織）またはインビボで調査するための本発明の好ましい実施形態である。これらのＧｅｎＢａｎｋエントリーに対して定義されているようなこれらのオリゴヌクレオチドに対する標的遺伝子ヌクレオチド座標および遺伝子標的領域を、表１５に詳述する。
【０３５６】
ＪＮＫ３特異的プローブ：ＪＮＫ３配列由来の一連のオリゴヌクレオチドの、生物学的活性についての最初のスクリーニングにおいて、ＪＮＫ３のｃＤＮＡクローン（Ｄｅｒｉｊａｒｄら、Ｃｅｌｌ，１９９４，７６，１０２５）を放射標識し、そして、ノーザンブロットにおいてＪＮＫ３特異的プローブとして使用した。しかしながら、あるいは、表１４のオリゴヌクレオチドの１つ以上が、検出可能に標識され、ＪＮＫ３特異的プローブとして使用される。
【０３５７】
ウエスタンアッセイ：ＪＮＫ３ｍＲＮＡに対して標的化されたオリゴヌクレオチドの、ＪＮＫ３タンパク質レベルに対する影響を評価するために、本質的には実施例２〜４において上に記載したようにウエスタンアッセイを行う。ＪＮＫ３に特異的に結合する１次抗体を、例えば、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｖｉｃｔｏｒｉａ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）またはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入する。
【０３５８】
【表１４】
2010500290.tif 000025
【０３５９】
【表１５】
2010500290.tif 000026
ＪＮＫ３アイソフォームに特異的なオリゴヌクレオチド：ＪＮＫ３の２つのアイソフォームが報告されている。ＪＮＫ３−ａ１が、最初にクローニングされ、（Ｍｏｈｉｔら、Ｎｅｕｒｏｎ，１９９５，１４，６７）によって「ｐ４９３Ｆ１２キナーゼ」と命名された。続いて、ＪＮＫ３の関連アイソフォームをコードする２つのｃＤＮＡが、クローニングされ、それらのヌクレオチド配列が決定された（Ｇｕｐｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６，７５，２７６０）。それらのアイソフォームを、本明細書中でＪＮＫ３−ａ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８２０（配列番号：１０１），遺伝子座名「ＨＳＵ３４８２０」）およびＪＮＫ３−ａ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８１９（配列番号：１０２），遺伝子座名「ＨＳＵ３４８１９」）と命名する。おそらく選択的ｍＲＮＡスプライシングから生じるＪＮＫ３の２つのアイソフォームは、各々、異なる転写因子または一連の転写因子と相互作用し得る（Ｇｕｐｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６，７５，２７６０）。以下に詳述されるように、本発明のある特定のオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ３のこれらのアイソフォームの各々に特異的である。
【０３６０】
ＪＮＫ３−ａ１とＪＮＫ−ａ２とは、カルボキシル末端部分が異なる。これらのアイソフォームのアミノ酸配列の実質的な相違（ＪＮＫ３−ａ１中の５アミノ酸が、ＪＮＫ３−ａ２中の４７アミノ酸で置換されている）は、読み枠を移動させるヌクレオチド配列のわずかな相違から生じる。具体的には、ＪＮＫ３−ａ１，をコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおいて、ＪＮＫ３−ａ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８２０（配列番号：１０１））のヌクレオチド（ｎｔ）１３２５−１３６２は、配列番号：８３として以下に示される配列を有するのに対し、ＪＮＫ３−ａ２をコードするｍＲＮＡのＯＲＦでは、ＪＮＫ３−ａ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８１９（配列番号：１０２））のｎｔ１３０１−１３３３は、配列番号：８４として以下に示される配列を有する。例示目的で、配列番号：８３および２０２を、互いとアラインメントして示す（垂直の記号「｜」は、両方の配列において同一である塩基を示し；ダッシュ「−」は、示されている配列に存在しない塩基を示し：そして太字の塩基は、ＪＮＫ３−ａ１のＯＲＦに対する終止コドンを示している）：
【０３６１】
【化１１】
2010500290.tif 000027
このＪＮＫ３アイソフォームの間の相違に起因して、配列番号：８３の逆相補から得られるアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号：８５、以下を参照のこと）は、ＪＮＫ３−ａ１をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができ、そして、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、使用することにより、ＪＮＫ３−ａ２の発現に著しい影響を及ぼさずにＪＮＫ３−ａ１の発現を調節することができる。同様の様式において、配列番号：８４の逆相補から得られるアンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号：８６、以下を参照のこと）は、ＪＮＫ３−ａ２をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができ、そして、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、使用することにより、ＪＮＫ３−ａ１の発現に著しい影響を及ぼさずにＪＮＫ３−ａ２の発現を調節することができる：
【０３６２】
【化１２】
2010500290.tif 000028
好ましい実施形態において、そのようなアイソフォーム特異的オリゴヌクレオチド（例えば、上に記載されたもの）は、メトキシエトキシ「ギャップマー」または「ウイングマー」であり、ここで、ＲＮアーゼＨ感受性の「ギャップ」または「ウイング」は、上のアンチセンス配列、すなわち、配列番号：８５および８６において同一でない領域を重複するように位置している。
【０３６３】
ＪＮＫ３オリゴヌクレオチドの活性：２’−メトキシエトキシ「ギャップマー」オリゴヌクレオチドであるＪＮＫ３特異的ホスホロチオエート（表１４）を、ＪＮＫ３ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼす能力についてＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてスクリーニングした（Ｂｉｅｄｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９７３，３３，２６４３）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、種々のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫｓ；例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，１４５６０を参照のこと）を発現する。本質的には以前に報告されているように（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１，３１７９１；Ｊａｌａｖａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９０，５０，３４２２）細胞をＤＭＥＭ中で生育し、実施例２に記載したように２００ｎＭの濃度のオリゴヌクレオチドで処理した。コントロール培養物を、オリゴヌクレオチドを含んでいないＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭのアリコートで処理した。
【０３６４】
その結果を表１６に示す。少なくとも４５％のＪＮＫ３ｍＲＮＡレベルの阻害レベルを示すオリゴヌクレオチドとしては、ＩＳＩＳ番号１６６９２、１６６９３、１６６９４、１６６９５、１６６９６、１６６９７、１６７０２、１６７０３、１６７０４、１６７０５および１６７０６（それぞれ、配列番号：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５５、５６、５７、５８および５９）が挙げられる。これらのオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ３発現を調節するための本発明の好ましい実施形態である。このアッセイにおいてＪＮＫ３ｍＲＮＡを少なくとも６０％阻害するオリゴヌクレオチドとしては、ＩＳＩＳ番号１６６９３、１６７０２、１６７０３および１６７０４（それぞれ、配列番号：４７、５５、５６および５７）が挙げられる。従って、これらのオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ３発現を調節するための本発明のより好ましい実施形態である。
【０３６５】
【表１６】
2010500290.tif 000029
（実施例６：ラットＪＮＫタンパク質をコードする遺伝子に対して標的化されたオリゴヌクレオチド）
動物モデルにおいてＪＮＫタンパク質の役割を研究するために、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのＪＮＫ１、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３をコードする遺伝子に対して標的化されたオリゴヌクレオチドを調製した。これらのオリゴヌクレオチドは、２’−メトキシエトキシ、ホスホジエステル／２’−ヒドロキシル、ホスホロチオエート／２’−メトキシエトキシ、ホスホジエステル「ギャップマー」であり、ここで、すべてのシトシン残基は、５−メチルシトシン（ｍ５ｃ）である。本開示の方法に従って、これらのアンチセンス化合物を合成した。ある特定のこれらのオリゴヌクレオチドは、本明細書中に示されるような他の種由来のＪＮＫ遺伝子にもさらに特異的にハイブリダイズすることができる。使用した細胞株が、ラットＡ１０大動脈平滑筋細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４７６）であり、使用したプローブが、ラットＪＮＫ１、ＪＮＫ２またはＪＮＫ３に特異的であったこと以外は、本質的には先の実施例に記載した方法に従って、この実施例において説明されるオリゴヌクレオチドを、ラットＪＮＫ  ｍＲＮＡレベルを調節する能力について試験した（下を参照のこと）。本質的には（Ｃｉｏｆｆｉら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９７，５１，３８３）によって説明されているように、Ａ１０細胞を生育し、オリゴヌクレオチドで処理した。
【０３６６】
ＪＮＫ１：表１９に、ヒトタンパク質ＪＮＫ１に相同な、「ｐ５４？」または「ＳＡＰＫ？」という名称のストレス活性化タンパク質キナーゼをコードするＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来の核酸（Ｋｙｒｉａｋｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６９，１５６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２７１２９（配列番号：８８），遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＤ」）に特異的にハイブリダイズすることができるように設計されたＩＳｌＳ番号２１８５７〜２１８７０（それぞれ、配列番号：１１１〜１２４）の一連のオリゴヌクレオチドの配列および構造を記載している。表１９において、太字の残基は、２’−メトキシエトキシ−残基であり（他は２’−デオキシ−である）；「Ｃ」残基は、２’−メトキシエトキシ−５−メチル−シトシンであり、「Ｃ」残基は、５−メチル−シトシンであり；「ｏ」は、ホスホジエステル結合を示しており；そして「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を示している。標的遺伝子座標は、遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＤ」であるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２７１２９（配列番号：８８）からのものである。
【０３６７】
【表１９】
2010500290.tif 000030
これらのアンチセンス化合物を、ノーザンアッセイを介して（ＪＮＫ１）および（ＪＮＫ２）ｍＲＮＡのレベルを調節する能力についてＡ１０細胞において試験した。ヒト遺伝子とラット遺伝子との配列同一性が高いことに起因して、放射標識された、ヒトＪＮＫ１（実施例３）ｃＤＮＡおよびヒトＪＮＫ２（実施例４）ｃＤＮＡは、ラットホモログに対する特異的なプローブとして機能した。
【０３６８】
結果を表２０に示す。ＩＳｌＳ番号２１８５７〜２１８７０（それぞれ、配列番号：１１１〜１２４）は、ラットＪＮＫ１ｍＲＮＡレベルの７０％〜９０％阻害を示した。これらのオリゴヌクレオチドは、ラットＪＮＫ１発現を調節するための本発明の好ましい実施形態である。このアッセイにおいて少なくとも９０％の阻害レベルを示すオリゴヌクレオチドとしては、ＩＳＩＳ番号２１８５８、２１８５９、２１８６０、２１８６１、２１８６２、２１８６４、２１８６５、２１８６６および２１８６７（それぞれ、配列番号：１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１８、１１９、１２０および１２１）が挙げられる。従って、これらのオリゴヌクレオチドは、ラットＪＮＫ１発現を調節するための本発明のより好ましい実施形態である。さらなる研究（下記）において使用するために、ＩＳＩＳ２１８５９（配列番号：１１３）を選択した。
【０３６９】
上記オリゴヌクレオチドのうちの２つであるＩＳＩＳ番号２１８６１および２１８６７（それぞれ、配列番号：１１５および１２１）は、ＪＮＫ１とＪＮＫ２の両方を調節する能力を示した。用語「Ｐａｎ」が、免疫学の文献において、例えばタンパク質のすべてのアイソフォームまたは細胞型のすべてのサブタイプを認識する抗体のことを指すために使用されているので、上記のようなオリゴヌクレオチドは、本明細書中で「Ｐａｎ  ＪＮＫ」アンチセンス化合物と呼ばれる。このＰａｎ  ＪＮＫオリゴヌクレオチドを以下で詳細に記述する。
【０３７０】
表Ｒ−１に記載されているオリゴヌクレオチドのいくつかは、ラットＪＮＫ１をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができることに加えて、他の種由来のＪＮＫ１をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることもできる。ＩＳＩＳ２１８５９（配列番号：１１３）は、ヒトＪＮＫ１ａ１およびＪＮＫ１β１をコードするｃＤＮＡ（すなわち、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２６３１８（配列番号：８７）およびＵ３５００４（配列番号：９０））の塩基４〜２３に対して相補的である。ＩＳＩＳ２１８６２（配列番号：１１６）は、ヒトＪＮＫ１ａ１およびＪＮＫ１β１のｃＤＮＡ（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２６３１８（配列番号：８７）およびＵ３５００４（配列番号：９０））の塩基２９４〜３１３、ヒトＪＮＫ１Ｂ２のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３５００５（配列番号：９１））の塩基２８９〜３０８およびヒトＪＮＫ１ａ２のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８２２（配列番号：８９））の塩基２８８〜３０７に対して相補的である。最後に、ＩＳＩＳ２１８６５は、ヒトＪＮＫ１ａ１のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２６３１８（配列番号：８７））の塩基６５４〜６７３およびヒトＪＮＫ１ａ２のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８２２（配列番号：８９））の塩基６４８〜６６７に対して相補的である。これらのオリゴヌクレオチドを、実施例３に記載した方法に従って、ヒトＪＮＫ１遺伝子のｍＲＮＡレベルを調節する能力について試験する。
【０３７１】
【表２０】
2010500290.tif 000031
ＪＮＫ２：表２１に、「ｐ５４ａ」または「ＳＡＰＫａ」という名称のストレス活性化タンパク質キナーゼをコードするＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のストレス活性化タンパク質キナーゼをコードする核酸（Ｋｙｒｉａｋｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６９，１５６）に特異的にハイブリダイズすることができるように設計されたＩＳＩＳ番号１８２５４〜１８２６７（それぞれ、配列番号：１２５〜１３８）の一連のオリゴヌクレオチドの配列および構造を記載している。３つのコントロールオリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ番号２１９１４〜２１９１６（それぞれ、配列番号：１３９〜１４１）の構造もまた、この表に示す。ｐ５４ａの２つのアイソフォームが報告されている：「ｐ５４ａ１」（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２７１１２（配列番号：９３），遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＡ」）および「ｐ５４ａ２」（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２７１１１（配列番号：１０４），遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＢ」）。ＩＳＩＳ１８２５７（配列番号：１２８）を除いて、表２１に記載されているオリゴヌクレオチドは、ｐ５４ａ１またはｐ５４ａ２のいずれかをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。ＩＳＩＳ１８２５７は、ｐ５４ａ２をコードする核酸（すなわち、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２７１１２（配列番号：９３），遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＢ」）に特異的にハイブリダイズすることができる。表２１において、太字の残基は、２’−メトキシエトキシ−残基であり（他は２’−デオキシ−である）；「Ｃ」残基は、２’−メトキシエトキシ−５−メチル−シトシンであり、「Ｃ」残基は、５−メチル−シトシンであり；「ｏ」は、ホスホジエステル結合を示しており；そして「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を示している。標的遺伝子座標は、遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＢ」であるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２７１１２（配列番号：９３）からのものである。
【０３７２】
【表２１】
2010500290.tif 000032
【０３７３】
【表２２】
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前に記載したようにプローブとして放射標識ヒトＪＮＫ２ｃＤＮＡを使用して、ｐ５４ａ（ＪＮＫ２）ｍＲＮＡのレベルを調節する能力についてこれらのアンチセンス化合物をＡ１０細胞において試験した。結果を表２２に示す。ラットＪＮＫ２ｍＲＮＡレベルの≧約６０％から約１００％の阻害レベルを示すオリゴヌクレオチドとしては、ＩＳＩＳ番号１８２５４、１８２５５、１８２５７、１８２５８、１８２５９、１８２６０および１８２６５（それぞれ、配列番号：１２５、１２６、１２８、１２９、１３０、１３１および１３６）が挙げられる。これらのオリゴヌクレオチドは、ラットＪＮＫ２発現を調節するための本発明の好ましい実施形態である。このアッセイにおいて少なくとも８０％のラットＪＮＫ１ｍＲＮＡの阻害レベルを示すオリゴヌクレオチドとしては、ＩＳＩＳ番号１８２５４、１８２５５、１８２５８および１８２５９（それぞれ、配列番号：１２５、１２６、１２９および１３０）が挙げられる。従って、これらのオリゴヌクレオチドは、ラットＪＮＫ２発現を調節するための本発明のより好ましい実施形態である。さらなる研究（下記）において使用するために、ＩＳＩＳ１８２５９（配列番号：１３０）を選択した。
【０３７４】
用量反応：ラットＪＮＫ１に対して標的化されたオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ２１８５９；配列番号：１１３）およびＪＮＫ２に対して標的化されたオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１８２５９；配列番号：１３０）ならびにノーザンアッセイを使用して、用量反応研究を行った。その結果（表２３）から、オリゴヌクレオチド濃度に対応した効果の増大が示され、ＩＳＩＳ番号２１８５９および１８２５９（それぞれ、配列番号：１１３および１３０）が、それぞれＪＮＫ１およびＪＮＫ２をコードするｍＲＮＡのレベルを特異的に調節することが確認される。
【０３７５】
【表２３】
2010500290.tif 000034
ＪＮＫ３：表２４に、ヒトタンパク質ＪＮＫ３に相同な、「ｐ５４β」という名称のストレス活性化タンパク質キナーゼをコードするＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来の核酸（Ｋｙｒｉａｋｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３６９，１５６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２７１２８（配列番号：９９），遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＣ」）に特異的にハイブリダイズすることができるように設計されたＩＳｌＳ番号２１８９９〜２１９１２（それぞれ、配列番号：１４２〜１５５）の一連のオリゴヌクレオチドの配列および構造を記載している。表２４において、太字の残基は、２’−メトキシエトキシ−残基であり（他は２’−デオキシ−である）；「Ｃ」残基は、２’−メトキシエトキシ−５−メチル−シトシンであり、「Ｃ」残基は、５−メチル−シトシンであり；「ｏ」は、ホスホジエステル結合を示しており；そして「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を示している。標的遺伝子座標は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２７１２８（配列番号：９９），遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＣ」からのものである。このオリゴヌクレオチドを、本質的には先の実施例に記載した方法に従ってラットＪＮＫ３ｍＲＮＡレベルを調節する能力について試験する。
【０３７６】
表２４に記載されているオリゴヌクレオチドのいくつかは、ラットＪＮＫ３をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができることに加えて、ヒトおよびＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）由来のＪＮＫ３をコードする核酸にも特異的にハイブリダイズすることができる。表２５にこれらの関係性を示す。これらのオリゴヌクレオチドを、実施例５に記載した方法に従ってヒトＪＮＫ遺伝子のｍＲＮＡレベルを調節する能力について試験する。
【０３７７】
【表２４】
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【０３７８】
【表２５】
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１ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８２０（配列番号：１０１），遺伝子座名「ＨＳＵ３４８２０」（Ｍｏｈｉｔら、Ｎｅｕｒｏｎ，１９９５，１４，６７およびＧｕｐｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６，１５，２７６０もまた参照のこと）
２ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３４８１９（配列番号：１０２），遺伝子座名「ＨＳＵ３４８１９」（Ｇｕｐｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６，１５，２７６０もまた参照のこと）。
ｐ４５９３Ｆ１２ＭＡＰＫ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３５２３６（配列番号：１００），遺伝子座名「ＭＵＳＭＡＰＫ」（Ｍａｒｔｉｎら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，１９９６，３５，４７もまた参照のこと）としても知られる。
【０３７９】
Ｐａｎ  ＪＮＫオリゴヌクレオチド：本発明のある特定のオリゴヌクレオチドは、２つ以上のＪＮＫタンパク質を調節することができ、本明細書中で「Ｐａｎ  ＪＮＫ」オリゴヌクレオチドと呼ばれる。例えば、ＩＳＩＳ番号２１８６１および２１８６７（それぞれ、配列番号：１１５および１２１）は、ＪＮＫ１とＪＮＫ２の両方を調節する能力が証明された（表２０）。そのようなオリゴヌクレオチドは、いくつかのＪＮＫタンパク質の同時の調節が望まれるときに有用である。
【０３８０】
ヒトＰａｎ  ＪＮＫオリゴヌクレオチドを表２６に記載する。これらのオリゴヌクレオチドは、ヒトＪＮＫ１ａ１、ＪＮＫ１ａ２、ＪＮＫ２ａ１およびＪＮＫ２ａ２をコードする核酸において、同一に保存されている配列（すなわち、配列番号：１５６、１５８、１５９、１６０および１６１）または２塩基以上のミスマッチが生じている配列（配列番号：１５７）に対して相補的であるように設計されている。表２６に記載されているオリゴヌクレオチドを、実施例３および４に記載されている方法およびアッセイを使用し、Ａ５４９細胞において、ＪＮＫ１およびＪＮＫ２のｍＲＮＡレベルを調節する能力について評価する。
【０３８１】
そのような共通の配列が、調節することが望まれるＪＮＫ遺伝子間で１つ以上の塩基の違いを含んでいる場合、ヒポキサンチン（イノシン）を、そのような塩基の違いに対応するオリゴヌクレオチドの位置に組み込むことができる（「ヒポキサンチン」は、ヌクレオシドイノシンに対応する塩基に対して当該分野で認められている用語である；しかしながら、本明細書中では、用語「イノシン」は、ヌクレオチド配列に関する米国およびＰＣＴの規則に従って使用される）。当該分野で公知であるように、イノシン（Ｉ）は、種々の核酸塩基と水素結合することができるので、ハイブリダイゼーションの目的で「ユニバーサル」塩基として働く。例えば、１つのイノシン置換を有する配列番号：１５７の誘導体である配列を有するオリゴヌクレオチド（ＴＡＧＧＡＩＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴＧＡＴＣ、配列番号：１６２）は、ヒトＪＮＫ１ａ１、ＪＮＫ１ａ２、ＪＮＫ２ａ１およびＪＮＫ２ａ２をコードする核酸にミスマッチの塩基なしで結合すると予測される。別の例として、１つのイノシン置換を有する配列番号：１６の誘導体である配列を有するオリゴヌクレオチド（ＧＧＴＴＧＣＡＩＴＴＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡ、配列番号：１６３）は、ＪＮＫ１ａ１、ＪＮＫ１ａ２、ＪＮＫ２ａ１およびＪＮＫ２ａ２に加えて、ヒトＪＮＫ３ａ１およびＪＮＫ３ａ２をコードする核酸にミスマッチの塩基なしで結合すると予測される。そのようなオリゴヌクレオチドを、実施例３、４および５に記載した方法およびアッセイを使用し、Ａ５４９細胞においてＪＮＫ１およびＪＮＫ２ｍＲＮＡレベルを調節する能力ならびにＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＪＮＫ３ｍＲＮＡレベルを調節する能力について評価する。
【０３８２】
【表２６】
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（実施例９：ヒトＪＮＫ１およびＪＮＫ２に対して標的化されたオリゴヌクレオチドの、ＴＮＦａ誘導性ＪＮＫ活性に対する効果）
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を、３７℃／５％ＣＯ２において４時間、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＪ中のＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＪを含むオリゴヌクレオチドとともにインキュベートした。次いで、その培地を１％ＦＢＳ／ＥＧＭ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  ＭＤ）に置き換え、３７℃／５％ＣＯ２において２４時間インキュベートした。細胞を５ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦａで１５分間処理した後、溶解した。溶解産物（タンパク質に対して正規化）を、固定化されたＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ融合タンパク質（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）＋３２Ｐ−ＡＴＰとともにインキュベートすることによってＪＮＫ活性を測定した。ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎビーズを洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を加えた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを使用して、リン酸化ｃ−Ｊｕｎを可視化した。
【０３８３】
コントロールオリゴヌクレオチドと比べて、ＪＮＫ１オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１５３４６（配列番号：１６；１００ｎＭ濃度）は、ＴＮＦａ誘導性ＪＮＫ活性を約７０％阻害した。ＪＮＫ２オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１５３５３（配列番号：３１；１００ｎＭ）は、ＴＮＦａ誘導性ＪＮＫ活性を約５５％阻害した。５０ｎＭの各オリゴヌクレオチドを組み合わせたものは、ＴＮＦａ誘導性ＪＮＫ活性を約６８％阻害し、１００ｎＭの各オリゴヌクレオチドを組み合わせたものは、ＴＮＦａ誘導性ＪＮＫ活性を約８３％阻害した。
【０３８４】
（実施例１２：ＪＮＫファミリーメンバーを標的化しているアンチセンスオリゴヌクレオチドによる炎症性応答の阻害）
ＪＮＫは、種々の細胞応答および病態の重要なメディエーターとして意味づけられている。ＪＮＫは、環境ストレス（例えば、照射、熱ショック、浸透圧ショックまたは成長因子離脱）ならびに炎症性サイトカインによって活性化され得る。
【０３８５】
実施例３〜５に記載されたＪＮＫファミリーメンバーのいずれかを標的化しているアンチセンスオリゴヌクレオチドを、合成し、実施例１におけるように精製し、そして炎症性応答の阻害時における活性について評価する。そのような阻害は、炎症細胞による炎症促進分子の産生の減少または浸潤細胞もしくは炎症細胞（それらのうち最も重要なのは、リンパ球、好中球、マクロファージおよび単球である）の増殖の減弱において明らかとなる。オリゴヌクレオチドを合成した後、最適な組織培養条件または細胞培養条件を使用して、適切なモデル系においてそのオリゴヌクレオチドを試験する。リンパ球、好中球、単球およびマクロファージを含む炎症細胞を、エレクトロポレーションの方法によって上記アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する。簡潔には、細胞（ＰＢＳ中の５×１０６細胞）を、ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ６００（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、２００Ｖ、１０００ｕＦにおけるエレクトロポレーションによってオリゴヌクレオチドでトランスフェクトする。最初のスクリーニングにむけて、１０μＭオリゴヌクレオチドを用いて細胞をエレクトロポレーションし、そして２４時間後にＲＮＡを回収する。オリゴヌクレオチドを含まないコントロールを、同じエレクトロポレーション条件に供する。
【０３８６】
次いで、ＲＮＥＡＳＹ７キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を使用して全細胞ＲＮＡを単離する。ＲＩＢＯＱＵＡＮＴＴＭキットおよび鋳型セットを製造者の指示（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従って使用して、ＲＮアーゼプロテクション実験を行う。
【０３８７】
実施例２に記載したＬ１ＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭプロトコルを使用して、接着細胞（例えば、内皮細胞およびＡ５４９細胞）をトランスフェクトする。ＪＮＫ  ｍＲＮＡ発現の低下をノーザン解析によって測定し、タンパク質発現を、ウエスタンブロット解析によって測定する（両方とも実施例１に記載されている）。ベースラインの効果および非特異的な効果を立証するために、ミスマッチ配列を含むネガティブコントロールオリゴヌクレオチドを使用する。
【０３８８】
ノーザン解析またはウエスタン解析によって炎症性サイトカインの発現レベルを測定することによって、または、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）手法によってサイトカイン分泌を測定することによって、炎症性応答の程度を測定する。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、当該分野において標準的であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｐｐ．１１．２．１−１１．２．２２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１に見られる。
【０３８９】
炎症性応答の程度はまた、ノーザンブロット解析またはウエスタンブロット解析の方法によって、既知の最初期遺伝子の発現を測定することによっても決定される。さらに炎症性応答に対して、アポトーシスのレベルは、実施例１０に記載されるようなフローサイトメトリーによって測定される。
【０３９０】
（実施例１３：ＪＮＫファミリーメンバーを標的化しているアンチセンスオリゴヌクレオチドによる線維症の阻害）
肺線維症は、肺における炎症性および線維増殖性の変化ならびにその間質におけるコラーゲンの過剰な蓄積を特徴とする。肺への最初の損傷だけでなく、線維性プロセスの進行にも作用する、免疫細胞および炎症細胞の肺への動員も増加する。
【０３９１】
げっ歯類ブレオマイシン（ＢＬ）誘導性肺線維症モデルでは、条件に対するいくつかのマーカーのいずれかを測定することによって肺における線維症の阻害を決定する。ＢＬ誘導性モデルは、当該分野において広く認められており、例えば、Ｔｈｒａｌｌ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ中のＢｌｅｏｍｙｃｉｎ，ｐｐ．７７７−８３６，Ｅｄｓ．Ｐｈａｎ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ  Ｔｈｒａｌｌ，Ｒ．Ｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５およびＧｉｒｉ，Ｓ．Ｎ．ら、Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ中のＭｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ｐｐ．２３１−２９２，Ｅｄｓ．Ｐｈａｎ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ  Ｔｈｒａｌｌ，Ｒ．Ｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５に見られる。
【０３９２】
実施例３〜５に記載されているＪＮＫファミリーメンバーのいずれかを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成し、実施例１におけるように精製し、そして、肺線維症を予防する能力または阻害する能力について評価する。これらの線維性のマーカーとしては、サイトカインおよびケモカイン（例えば、ＴＮＦａ、インターロイキン−８およびインターロイキン−６）をはじめとした様々な炎症性メディエーターの放出、プロテアーゼおよびメタロプロテイナーゼの数の増加、活性酸素種（ＲＯＳ）の発生、浮腫、出血、ならびに好中球およびマクロファージによって支配される細胞浸潤が挙げられる。
【０３９３】
オリゴヌクレオチドを合成した後、最適な条件を使用して、げっ歯類ＢＬ誘導性肺線維症モデルにおいて上記オリゴヌクレオチドを試験する。マウスにブレオマイシン（０．１２５Ｕ／マウス）または食塩水を気管内投与した後、２週間にわたってアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｉ．ｐ．）で処置する。２週間後、マウスを屠殺し、生化学的解析、病理組織学的解析および免疫組織化学的解析を行う。
【０３９４】
生化学的解析および免疫組織化学的解析は、実施例１２に記載されるような、ノーザン解析もしくはウエスタン解析による炎症性サイトカインの発現レベルの測定または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）手法によるサイトカイン分泌の測定を含む。ＢＬ処置肺における線維性病変の存在について、ならびに線維性の表現型を有する細胞の存在および数について、当該分野で標準的な（ｓｔａｎｄａｒｅｄ）方法によって病理組織学的解析を行う。
【０３９５】
（実施例１４：ＪＮＫファミリーメンバーを標的化しているアンチセンスオリゴヌクレオチドによる化学療法剤に対する感作）
癌の化学療法薬に対する抵抗性の操作もまた、ＪＮＫファミリーメンバーを標的化しているアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することによって達成され得る。実施例３〜５に記載したＪＮＫファミリーメンバーのいずれかを標的化しているアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成し、実施例１におけるように精製し、そして、化学療法剤の作用に対して細胞を感作する能力について評価する。感作は、処置後にアポトーシスを起こしている標的細胞数の増加によって明らかとなる。オリゴヌクレオチドを合成した後、最適な組織培養条件または細胞培養条件を使用して、適切なモデル系においてそのオリゴヌクレオチドを試験する。処置レジメンにおいて、細胞を１つ以上の化学療法剤とともに本発明の化合物で処理し、ここで、その化学療法剤は、個別に使用され得るか（例えば、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）、連続的に使用され得るか（例えば、ある期間にわたる５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチドの後のＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド）、または１つ以上の他のそのような化学療法剤とともに使用され得る（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチドまたは５−ＦＵ、放射線治療およびオリゴヌクレオチド）。
【０３９６】
非接着細胞に対する処理は、エレクトロポレーションの方法によるものである。簡潔には、上記化学療法剤による処理の前、処理中、処理後に、ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ６００（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、２００Ｖ、１０００ｕＦにおけるエレクトロポレーションによって、細胞（ＰＢＳ中の５×１０６細胞）をオリゴヌクレオチドでトランスフェクトする。最初のスクリーニングにむけて、１０μＭオリゴヌクレオチドを用いて細胞をエレクトロポレーションし、そして２４時間後にＲＮＡを回収する。オリゴヌクレオチドまたは化学療法剤を含まないコントロールを、同じエレクトロポレーション条件に供する。
【０３９７】
次いで、ＲＮＥＡＳＹ７キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を使用して全細胞ＲＮＡを単離する。ＲＩＢＯＱＵＡＮＴＴＭキットおよび鋳型セットを製造者の指示（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従って使用して、ＲＮアーゼプロテクション実験を行う。
【０３９８】
実施例２に記載したＬ１ＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭプロトコルを使用して、接着細胞（例えば、内皮細胞およびＡ５４９細胞）をトランスフェクトする。ＪＮＫ  ｍＲＮＡ発現の低下をノーザン解析によって測定し、タンパク質発現を、ウエスタンブロット解析によって測定する（両方とも実施例１に記載されている）。ベースラインの効果および非特異的な効果を立証するために、ミスマッチ配列を含むネガティブコントロールオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【０３９９】
アポトーシスおよびそれによる感作の程度を、実施例１０に記載したようなフローサイトメトリーによって測定する。
【０４００】
（実施例１５：異種間オリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ１０１７５９を使用するヒトＪＮＫ２発現のオリゴヌクレオチド媒介性阻害）
さらなる実施形態において、ラットＪＮＫ２標的に対して設計されたＩＳＩＳ１８２５９（配列番号：１３０）に化学的改変を行い、そのオリゴヌクレオチドをヒト細胞株において活性について調査した。
【０４０１】
改変オリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ１０１７５９は、ＩＳＩＳ１８２５９と同一の塩基および糖の組成を有し、リンカー組成のみが異なる。ＩＳＩＳ１０１７５９は、全体にわたってホスホロチオエート結合を含む。この２つのオリゴヌクレオチドの比較を以下に示す。
【０４０２】
【化１３】
2010500290.tif 000038
両方のオリゴヌクレオチドが、以下の塩基配列５’−ＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧ−３’を有し、太字の残基は、２’−メトキシエトキシ−残基であり（他は２’−デオキシ−である）；「Ｃ」残基は、２’−メトキシエトキシ−５−メチル−シトシンであり、「Ｃ」残基は、５−メチル−シトシンであり；「Ｏ」は、ホスホジエステル結合を示し；そして「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を示す。
【０４０３】
ＩＳＩＳ１８２５９は、表２１に記述されている（ｄｉｌｅｎｅａｔｅｄ）ように遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＢであるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２７１１２（配列番号：９３）からの標的遺伝子座標１２０１−１２２０（本明細書中で配列番号：１６８として援用される）に対して設計されたが、この同じ配列は、遺伝子座名「ＨＵＭＪＮＫ２」であるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３１９５１（配列番号：９２）のヒトＪＮＫ２の座標１２４８−１２６５（本明細書中で配列番号：１６７として援用される）に対してその２０核酸塩基のうちの１８核酸塩基とも相補的である。ＩＳＩＳ１８２５９（および、ＩＳＩＳ１８２５９と同じ塩基配列を有するので１０１７５９）とヒト遺伝子との相補性の領域を太字で示す
【０４０４】
【化１４】
2010500290.tif 000039
。実際に、ヒトＪＮＫ２遺伝子と相補的でないのは、このオリゴヌクレオチドの３’末端におけるたった２核酸塩基である。
【０４０５】
３つのヒト細胞株を使用して、ＩＳＩＳ１０１７５９（配列番号：１３０）を、そのヒトＪＮＫ２ＲＮＡレベルを低下させる能力について試験した。この３つの研究に対するコントロールオリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ１０１７６０（配列番号：１６６；７塩基ミスマッチ）であった。このコントロールオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｅｄ）は、ＩＳＩＳ１０１７５９と同じ糖およびリンカー配列ならびに核酸塩基配列
【０４０６】
【化１５】
2010500290.tif 000040
を有しており、ここで、太字の残基は、２’−メトキシエトキシ−残基であり（他は２’−デオキシ−である）；「Ｃ」残基は、２’−メトキシエトキシ−５−メチル−シトシンであり、「Ｃ」残基は、５−メチル−シトシンであり；そして「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を示す。
【０４０７】
ＨｕＶＥＣ細胞におけるヒトＪＮＫ２の阻害
ＨｕＶＥＣ細胞：
ヒト臍静脈内皮（ｅｎｄｏｔｈｉｌｉａｌ）細胞株ＨｕＶＥＣをＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。ＨｕＶＥＣ細胞を、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ栄養補助剤（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）が補充されたＥＢＭ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で通例のとおり培養した。細胞が９０％コンフルエンスに達したときにトリプシン処理および希釈によって通例のとおり継代し、１５継代まで維持した。細胞を１００ｍｍディッシュに播種し、３７℃／５％ＣＯ２（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３８７２）において一晩インキュベートした。
【０４０８】
ノーザンブロッティングまたは他の解析にむけて、細胞を１００ｍｍプレートまたは他の標準的な組織培養プレート上に播種し、そして、適切な容積の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理する。
アンチセンス化合物を用いたＨｕＶＥＣ細胞の処理：
細胞が７０％培養密度に達したときに、細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。１０ｃｍディッシュ内で生育された細胞に対して、細胞を５ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、次いで、３μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）／１００ｎＭオリゴヌクレオチド／ｍｌ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１を含んでいる５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１で処理した。他のオリゴヌクレオチド濃度に対して、上記オリゴヌクレオチド／Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ比（ｒａｔｉｏｎ）を一定に保った。処理の４〜７時間後に、培地を新鮮培地で置き換えた。オリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後に細胞を回収した。
【０４０９】
本発明に従って、ＨｕＶＥＣ細胞を１００ｎＭのＩＳＩＳ１０１７５９またはコントロールオリゴヌクレオチドで処理し、そしてヒトＪＮＫ２のｍＲＮＡレベルを０〜７２時間にわたってモニターし、ノーザン解析によって定量化した。そのデータを表２９に示す。
【０４１０】
【表２９】
2010500290.tif 000041
このデータから、ラットＪＮＫ２オリゴヌクレオチドが、ヒトＨｕＶＥＣ細胞においてヒトＪＮＫ２の発現を減少させることができ、そして７２時間までにはその発現が回復し始めたことが明らかである。
【０４１１】
ＨｅＬａ細胞におけるヒトＪＮＫ２の阻害
ＨｅＬａ細胞：
ヒト子宮頸部上皮腺癌細胞株であるＨｅＬａをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＨｅＬａ細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む最小必須培地（Ｅａｇｌｅ）ならびに１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、０．１ｍＭ可欠アミノ酸および１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム，９０％；ウシ胎児血清，１０％を含むように調整されたＥａｒｌｅ’ｓ  ＢＳＳ中で、３７℃の温度において通例のとおり培養した。細胞を１００ｍｍディッシュに播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
【０４１２】
ノーザンブロッティングまたは他の解析にむけて、細胞を１００ｍｍプレートまたは他の標準的な組織培養プレート上に播種し、そして、適切な容積の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理する。
【０４１３】
アンチセンス化合物を用いたＨｅＬａ細胞の処理：
細胞が７０％培養密度に達したときに、細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。１０ｃｍディッシュ内で生育された細胞に対して、細胞を５ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、次いで、３μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）／１００ｎＭオリゴヌクレオチド／ｍｌ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１を含んでいる５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１で処理した。他のオリゴヌクレオチド濃度に対して、上記オリゴヌクレオチド／Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ比を一定に保った。処理の４〜７時間後に、培地を新鮮培地で置き換えた。オリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後に細胞を回収した。
【０４１４】
本発明に従って、ＨｅＬａ細胞を１０、５０または２００ｎＭのＩＳＩＳ１０１７５９またはコントロールオリゴヌクレオチドで処理し、そしてヒトＪＮＫ２のｍＲＮＡレベルをノーザン解析によって定量化した。そのデータを表３０に示す。
【０４１５】
【表３０】
2010500290.tif 000042
このデータから、ラットＪＮＫ２オリゴヌクレオチドが、ヒトＨｅＬａ細胞においてヒトＪＮＫ２の発現を用量依存的様式で減少させることができたことが明らかである。ＨｅＬａ細胞を、５０および２００ｎＭのトランスフェクション試薬であるリポフェクトアミンのみでも処理したところ、発現の減少は観察されなかった。
【０４１６】
Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるヒトＪＮＫ２の阻害
Ｊｕｒｋａｔ細胞：
ヒトＪｕｒｋａｔ細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、２０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）が補充されたＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で通例のとおり培養した。過剰の細胞を含んでいる培地を吸引し、そして新しい培地で再び満たすことによって通例のとおり細胞を継代した。
【０４１７】
エレクトロポレーションにむけて、細胞を２８×１０６細胞／ｍＬに希釈し、そして１ｍｍエレクトロポレーションキュベットに入れた。６ミリ秒間、１６０ボルトにおいて１〜２０μＭのオリゴヌクレオチドで処理することによって、エレクトロポレーションを行う。次いで、エレクトロポレーションされたサンプル全体を１００ｍｍプレート内の５ｍＬの１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ  １６４０中に入れる。次いで、プレートを３７℃／５％ＣＯ２に一晩放置する。
【０４１８】
次いで、各サンプルを１５ｍＬのコニカルチューブに移し、そして１２００ｒｐｍで５分間遠沈した後、上清を吸引した。次いで、細胞を５ｍＬのＰＢＳ中に懸濁した後、１２００ｒｐｍで５分間、２回目の遠心分離を行い、その後、上清を吸引した。次いで、細胞を洗浄し、溶解した。溶解工程の後、本明細書中の他の実施例に記載されているようにＲＮＥＡＳＹキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を使用して全細胞ＲＮＡを単離した。
【０４１９】
本発明に従って、１、５または２０μＭのＩＳＩＳ１０１７５９またはコントロールオリゴヌクレオチドを用いたエレクトロポレーションによりＪｕｒｋａｔ細胞を処理し、そして、ヒトＪＮＫ２のｍＲＮＡレベルをノーザン解析によって定量化した。そのデータを表３１に示す。
【０４２０】
【表３１】
2010500290.tif 000043
このデータから、ラットＪＮＫ２オリゴヌクレオチドが、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞においてヒトＪＮＫ２の発現を用量依存的様式で減少させることができたことが明らかである。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、試薬単独（オリゴヌクレオチドなし）でもエレクトロポレーションしたところ、発現の減少は観察されなかった。
【０４２１】
代謝障害に対してのＪＮＫ１の標的化
（実施例１６：肥満症のｏｂ／ｏｂモデルにおけるインビボ研究）
レプチンは、脂肪によって産生される、食欲を制御するホルモンである。ヒトと非ヒト動物の両方では、このホルモンが欠損していると肥満症に至る。ｏｂ／ｏｂマウスは、肥満症および高血糖症をもたらすレプチン遺伝子内の変異を有する。そのため、これらのマウスは、肥満症および代謝症候群の調査ならびにこれらの状態を処置するために設計された処置に対する有用なモデルである。ｏｂ／ｏｂマウスは、ｄｂ／ｄｂマウスよりも高いインスリンの血中濃度を有し、ｄｂ／ｄｂマウスよりも高血糖性が低く、レプチンレセプターに変異を有する。本発明に従って、肥満症および糖尿病のｏｂ／ｏｂモデルにおいて本発明のオリゴマー化合物を試験する。
【０４２２】
７週齢の雄Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ−Ｌｅｐ  ｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を食塩水群（ｎ＝６）と、オリゴヌクレオチドコントロール群（ｎ＝６）と処置群（ｎ＝６）とに分けた。すべての動物に１０〜１５％の脂肪量を含む餌を６週間与えた。オリゴヌクレオチドコントロール群および処置群には、６週間にわたって１週間に２回、コントロールオリゴヌクレオチドまたは処置オリゴヌクレオチドのいずれかの２５ｍｇ／ｋｇの皮下注射を投与した。食塩水群には、同じ注射スケジュールで食塩水の注射を投与した。この研究におけるコントロールオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫをコードする核酸に対して標的化されていない、２０ヌクレオシド長のキメラオリゴヌクレオチドであった（
【０４２３】
【化１６】
2010500290.tif 000044
配列番号：１０７，（Ｉｓｉｓ番号１４１９２３）。処置オリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１ポリペプチドをコードする核酸に対して標的化されている２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチドである。ＪＮＫ１ポリペプチドをコードする核酸は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｌ２７１２９（配列番号：８８）．１；配列番号：８８に実質的に類似しているヌクレオシド配列を有する。オリゴヌクレオチド化合物はまた、１核酸塩基のみのミスマッチを含む状態で、マウスＪＮＫ１ポリペプチドをコードする核酸に対して標的化されている。この核酸は、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１６７００．２；配列番号．１０６と実質的に類似している。この処置オリゴは、
【０４２４】
【化１７】
2010500290.tif 000045
，配列番号：１１４（Ｉｓｉｓ番号１０４４９２）という核酸塩基配列を含んでいる。オリゴヌクレオチド化合物はまた、２核酸塩基のみのミスマッチを含む状態でヒトＪＮＫ１ポリペプチドをコードする核酸に対して標的化されている。この核酸は、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｌ２６３１８（配列番号：８７）、Ｕ３４８２２（配列番号：８９）、Ｕ３５００４（配列番号：９０）またはＵ３５００５（配列番号：９１）と実質的に類似している；それぞれ配列番号：８７、８９、９０および９１。
【０４２５】
その処置期間中、１週間あたりの食餌摂取をモニターし、また、同様に体重の変化もモニターした。処置期間中のある特定の時点において、体組成、血液生化学、代謝率、インスリン抵抗性および経口耐糖能も測定した。標的ｍＲＮＡレベルは組織学的、生化学的および分子生物学なパラメータであるので、処置期間後に、マウスを屠殺し、肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）および白色脂肪組織（ＷＡＴ）における標的ｍＲＮＡレベルを評価した。別段述べられない限り、ＲＮＡの単離および標的ｍＲＮＡの発現レベルの定量は、本発明の他の実施例によって説明されているように行う。
【０４２６】
ｍＲＮＡレベル
ＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）中で組織をホモジネートした後、塩化セシウム勾配を用いて遠心分離することによって、全ＲＮＡを単離した。次いで、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行うことにより、遺伝子発現を解析した。
【０４２７】
肝臓、白色脂肪組織および褐色脂肪（ａｄｉｐｉｏｓｅ）組織における、ＪＮＫ２ではなくＪＮＫ１のｍＲＮＡレベルは、食塩水群およびオリゴヌクレオチドコントロール群と比べて、処置群において減少した（肝臓では８０％減少、ＷＡＴでは８０％減少そしてＢＡＴでは７８％減少）。食塩水群とオリゴヌクレオチドコントロール群との間には、ＪＮＫ１ｍＲＮＡレベルに有意差はなかった。さらに、処置群と、食塩水群と、オリゴヌクレオチドコントロール群との間には、ＪＮＫ２ｍＲＮＡレベルの有意差はなかった。従って、本処置化合物は、ｍＲＮＡ発現を低下させる際に、ＪＮＫ２よりもＪＮＫ１に対して特異的である。
【０４２８】
ＪＮＫ１活性アッセイおよびウエスタン免疫ブロッティング解析
上記のことに対応して、ＪＮＫ１に対して産生された抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用する免疫沈降によってＪＮＫ活性を測定したところ、ＪＮＫ活性は低下した。ＪＮＫ１ＡＳＯは、肝臓、ＷＡＴおよびＢＡＴにおいてそれぞれ９５％超、８０％および６５％のＪＮＫ１活性の低下をもたらした。
【０４２９】
食餌効率、体重および脂肪
コントロール群と比べて処置群では、食餌効率が改善された（食餌摂取体積あたりの体重の変化）。処置群の食餌効率は、０．０５２±０．００２６であり、コントロールオリゴヌクレオチド群は、０．０６０±０．００２であった。処置群はまた、約２０％の体重増加の減少も示したことから、代謝率の上昇が示唆される。精巣上体脂肪パッド重量（３．８ｇ  対  ４．５ｇ）および全身の脂肪量（３１．６％  対  ３５．５％）もまた減少した。オリゴヌクレオチドコントロール群よりも高いＶＯ２を反映するように、処置群の代謝率が上昇したことが間接的な熱量測定によって確認された（ＶＯ２は、コントロール群よりも、暗期において＞７％（７％超）および明期において２３％以上増加した）。
【０４３０】
グルコースおよびインスリンレベル
処置群に対する満腹時および空腹時の血漿グルコースレベルおよび血漿インスリンレベルが、コントロール群よりも改善された（表３２を参照のこと）。処置の６週間後に、グルコースレベルは、完全に正常化され、インスリンレベルは、５０％超低下した（表３２）ことから、高いインスリン感作（ｓｅｎｓｉｔａｚａｔｉｏｎ）が証明された。血漿グルコースレベルは、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００，Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｃ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して測定され、そしてインスリンレベルは、（Ｗｉｎｄｈａｍ，ＮＨ）製のＡｌｐｃｏインスリン特異的ＥＬＩＳＡキットを使用して測定される。
【０４３１】
【表３２】
2010500290.tif 000046
データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５〜６）として表されている。いずれかのコントロール群と比べたとき、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１。
【０４３２】
このＡＳＯによるインスリン感作効果を確かめるために、満腹および空腹のマウスにおいて、耐糖能試験（ＯＧＴＴ）とインスリン抵抗性試験（ＩＴＴ）の両方を行った。マウスに、グルコースまたはインスリンのいずれかの腹腔内注射を行い、そして血中グルコースレベルおよび血中インスリンレベルを、インスリン負荷またはグルコース負荷の前および１５、２０または３０分間隔で最大２時間、測定する。Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、血中グルコースレベルを測定した。
【０４３３】
コントロール群と比べて、処置群に対するインスリン抵抗性および経口耐糖能は、改善された。医療行為における耐糖能試験は、どれくらい迅速に血中からグルコースがクリアランスされるかを測定するためのグルコースの投与であり、この試験は、糖尿病、インスリン抵抗性および時折、反応性低血糖症に対して試験するために用いられる。実施例１６のマウスの経口ブドウ糖負荷試験の結果を表３３に示す。
【０４３４】
【表３３】
2010500290.tif 000047
グルコース負荷に応答して、ＪＮＫアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された動物は、耐糖能の改善を示す。３０分の時点におけるピークの血漿グルコースレベルは、コントロールよりも４０％超低く、その後のグルコースの減少は、コントロールよりも小さかった。グルコース排出に対するＡＵＣは、ＪＮＫアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ）で処置された後に有意に減少したことから、アンチセンスによるＪＮＫの阻害が耐糖能を改善したと示唆される。この結果から、グルコースは、ＪＮＫアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置されたマウスの血中からのほうがコントロール群よりも一層迅速にクリアランスされることが示唆される。さらに、ＯＧＴＴ中に、ＡＳＯ処置群においてコントロールよりも著しく低いレベルの血漿インスリンが観察された（５ｎｇ／ｍｌのＪＮＫ  ＡＳＯ処置  対  ２３ｎｇ／ｍｌの食塩水処置）。
【０４３５】
インスリン抵抗性試験も行った。ＪＮＫアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された動物においてインスリン注射した後に、グルコース低下の速度および規模が増大した。ＡＵＣは、ＪＮＫアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与によって、食塩水処置コントロールと比べて約５０％減少する。これらのデータから、ＪＮＫ１ＡＳＯによるＪＮＫ１発現の減少によって、インスリン感度が著しく改善されたことが証明される。
【０４３６】
これらのデータ（ｄａｔｅ）から、アンチセンスによるＪＮＫの阻害が、耐糖能およびインスリン感度を改善し、ゆえに、ＪＮＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、グルコース不耐性および／もしくはインスリン抵抗性の障害またはそれに関連する障害（例えば、肥満症、代謝症候群、糖尿病および高血糖症）を処置するため、予防するため、および／または寛解させるために有用であることが示唆される。
【０４３７】
肝脂肪変性
ＡＳＯ処置が肝脂肪変性を改善したかを調べるために、肝臓のＴＧ含有量と組織学の両方を解析した。
【０４３８】
ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、肝臓ＴＧ含有量は、ＪＮＫ  ＡＳＯで処置された群のほうがコントロールよりも４０％超低いことが見出された（１２０ｍｇ／ｇ  対  ２００ｍｇ／ｇ）。Ｈ＆Ｅ染色とオイルレッドＯ染色の両方による組織学検査から、ＪＮＫ１ＡＳＯ処置マウスにおいて肝脂肪変性の著しい改善が確認された（コントロールよりも脂肪滴が小さく少なかった）。さらに、組織学検査は、ＡＳＯに関連する肝臓損傷のいかなる徴候も明らかにしなかった。むしろ、肝脂肪変性の改善は、血漿ＡＬＴ測定および血漿ＡＳＴ測定（１３３．２±１０．１Ｕ／Ｌ  ＡＬＴ  対  ３１１．５±２１．１および１１３．２±８．２  Ｕ／Ｌ  ＡＳＴ  対  １８７．８±１４．６）から評価されるように肝臓機能の改善を伴った。
【０４３９】
肝脂肪変性に加えて、処置群に対する血漿トランスアミナーゼレベルおよび血漿コレステロールレベルが、コントロール群よりも改善された。
【０４４０】
満腹状態のｏｂ／ｏｂマウスでは、ＪＮＫ１ＡＳＯによる６週間の処置によって、血漿総コレステロールレベルがコントロールと比べて４０％低下した。リポタンパク質プロファイル解析から、ＪＮＫ１ＡＳＯ処置によって、３つすべての主要なリポタンパク質画分（すなわち、ＶＬＤＬ−、ＬＤＬ−およびＨＤＬ−コレステロール）中のコレステロール含有量が減少したことが確認された。
【０４４１】
血漿トリグリセリド、総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、遊離脂肪酸およびトランスアミナーゼを通例の臨床分析装置（例えば、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）によって測定する。Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）からのトリグリセリドＧＰＯアッセイを使用して、組織トリグリセリドレベルを測定する。肝臓トリグリセリドレベルは、肝脂肪変性または肝臓からの脂質のクリアランスを評価するために使用する。
【０４４２】
肝脂肪変性はまた、オイルレッドＯ染色（通常、脂質の沈着を可視化するために用いられる）で染色された凍結肝臓組織切片、ならびに、それぞれ核および細胞質を可視化するヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色された凍結肝臓組織切片の通例の組織学的な解析によっても評価される。Ｈ＆Ｅ染色では、ｏｂ／ｏｂマウス由来の肝臓サンプル、精巣上体ＷＡＴサンプルおよび肩甲骨間ＢＡＴサンプルを、１０％緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンろうに包埋する。オイルレッドＯ染色では、肝臓サンプルを包埋媒質中に回収する。複数の隣接する４μｍ切片に切断し、それをスライドガラスの上に載せた。脱水した後、その切片を染色した。組織学的切片の像を解析した。
【０４４３】
代謝性遺伝子の発現
脂質代謝、コレステロール生合成、脂肪酸酸化、脂肪酸貯蔵、糖新生およびグルコース代謝に関与する発現遺伝子に対する標的阻害の効果について、処置を受けたｏｂ／ｏｂマウスを処置期間の終わりにさらに評価した。簡潔には、各目的遺伝子の公開配列を使用して作製されるプライマー−プローブセットを使用する、本明細書中の他の実施例に記載されているようなリアルタイムＰＣＲによって、肝臓ならびに白色脂肪組織および褐色脂肪組織におけるｍＲＮＡレベルを定量化した。観察結果は、１）ＢＡＴにおいてアドレノセプター．ベータ．３のｍＲＮＡレベルの＞２倍の上昇およびＵＣＰ１のｍＲＮＡの＞１．２倍の上昇；２）ＷＡＴにおいてＡＣＣ１、ＡＣＣ２、ＦＡＳ、ＳＣＤ１、ＤＧＡＴ−１およびＤＧＡＴ−２のｍＲＮＡレベルの３０〜６０％の低下；および３）肝臓においてＡＣＣ１、ＦＡＳおよびＧ６ＰアーゼのｍＲＮＡレベルの＞５５％の低下ならびにＵＣＰ２とＰＰＡＲ．アルファ．の両方のｍＲＮＡレベルの＞２倍の上昇を示した（表３５を参照のこと）。
【０４４４】
これらのデータから、このモデルでは、ＡＳＯによるＪＮＫ１発現の特異的な減少によって、食物燃焼の増加および脂質生合成の減少がもたらされることが示唆される。従って、ＪＮＫ１は、全身の代謝において重要な役割を果たし、そして、主要な代謝性組織におけるＪＮＫ１の治療的な阻害によって、肥満症および代謝症候群に対する臨床的有用性がもたらされ得るとみられる。
【０４４５】
（実施例１７：肥満症の食餌誘導型モデル（ＤＩＯ）におけるインビボ研究）
ＪＮＫ１発現のアンチセンス抑制の代謝性効果をさらに確認するために、ＤＩＯマウスもＪＮＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した。
【０４４６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統は、高脂血症誘導性動脈硬化巣の形成に感受性があると報告されている。従って、これらのマウスに高脂肪食餌を与え、そしてそのマウスを以下の研究で用いることによって、食餌誘発性肥満症のモデルにおけるｍＲＮＡ発現に対するＪＮＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を評価した。
【０４４７】
６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、５８ｋｃａｌ％の脂肪を含む食餌（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ  Ｄ１２３３０，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）を１５週間与えることにより、肥満症およびインスリン抵抗性（ｒｅｓｉｓｔｅｎｃｅ）を誘導した。次いで、その動物を様々な群（ｎ＝６）に分け、そして、２５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの用量の、ＪＮＫ１ＡＳＯもしくはコントロールＡＳＯまたは食塩水で７週間にわたって１週間に２回処置した。ＪＮＫ１ｍＲＮＡの２つの異なる領域を標的化する２つのＪＮＫ１処置オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｓ）を使用した。それらの処置オリゴヌクレオチドは、配列番号：１１４，Ｉｓｉｓ番号１０４４９２または
【０４４８】
【化１８】
2010500290.tif 000048
，配列番号：１０８，ＩＳＩＳ番号２５６４６３の核酸塩基配列を共有する。その各々を同じ用量で与えた。コントロールオリゴヌクレオチドは、上に記載されたものと同じである。処置オリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１ポリペプチドをコードする核酸に対して標的化された２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチドである。ＪＮＫ１ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号８７、８９、９０、９１と実質的に類似しているヌクレオシド配列を有する。
【０４４９】
処置中、１週間あたりの食餌摂取およびＢＷをモニターし、また、体組成および他の代謝性の測定を行った（以下を参照のこと）。本研究の終わりに、動物を屠殺した。心臓穿刺により血液サンプルを回収し、組織を解剖し、重量測定し、次いで、さらなる解析のために保存した。
【０４５０】
ｍＲＮＡレベル
ＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）中で組織をホモジネートした後、塩化セシウム勾配を用いて遠心分離することによって、全ＲＮＡを単離した。次いで、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行うことにより、遺伝子発現を解析した。ＤＩＯマウスでは、１０４４９２での処置によって、肝臓、ＷＡＴおよびＢＡＴにおいてＪＮＫ１ｍＲＮＡがそれぞれ７８％、６６％および７０％減少した。ＩＳＩＳ２５６４６３での処置により、これらの組織において同様のＪＮＫ１発現の減少がもたらされた。
【０４５１】
血漿グルコースレベルおよび血漿インスリンレベル
インスリンＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｗｉｎｄｈａｍ，ＮＨ）を用いて、血漿インスリンを測定した。生化学分析装置（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００，Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｃ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、血漿グルコースを測定した。
【０４５２】
ＪＮＫ１ＡＳＯでの処置により、満腹状態と空腹状態の両方において、血漿グルコースレベルおよび血漿インスリンレベルがコントロールと比べて低下した（表３４を参照のこと）。処置によって、ＤＩＯマウスにおけるグルコースレベルおよびインスリンレベルの完全な正常化がもたらされたことから、ｏｂ／ｏｂモデルにおいて示されたインスリン感度の改善が確認された。
【０４５３】
【表３４】
2010500290.tif 000049
データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５〜６）として表されている。いずれかのコントロール群と比べたとき、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１。
【０４５４】
肝脂肪変性の改善
生化学分析装置（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００，Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｃ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、血漿トランスアミナーゼ（ＡＳＴおよびＡＬＴ）活性を測定した。先に報告されているように（Ｄｅｓａｉら、２００１）肝臓トリグリセリド（ＴＧ）を測定した。
【０４５５】
血漿ＡＬＴ活性および血漿ＡＳＬ活性によって評価されるように、ＤＩＯマウスではＪＮＫ１ＡＳＯ処置により、肝臓毒性を引き起こすことなく肝臓ＴＧ含有量が４０％超低下した。
【０４５６】
血漿コレステロールレベル
生化学分析装置（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００，Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｃ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、総コレステロールおよびＦＦＡ濃度を測定した。
【０４５７】
６週間のＪＮＫ１ＡＳＯでの処置により、満腹状態のＤＩＯマウスにおける血漿総コレステロールレベルがコントロールと比べて約３５％低下した。
【０４５８】
ｏｂ／ｏｂおよびＤＩＯモデルにおけるＡＳＯ処置による血漿コレステロールレベルの低下が、肝臓の合成および分泌が低下したことによって引き起こされたか否かを調査するために、マウス初代肝細胞をＪＮＫ１ＡＳＯで処理し、次いで、ステロールへの［１４Ｃ］−アセテートの取り込みを測定することによって新規ステロール合成を測定した。ＪＮＫ１ＡＳＯがトランスフェクトされた肝細胞は、コントロールと比べて、新規ステロール合成の１３％の減少を示した。さらに、遺伝子発現解析から、ＪＮＫ１ＡＳＯで処置されたマウスの肝臓のＡｐｏＢ１００  ｍＲＮＡレベルがコントロールに対して有意に低下したことが見出された。ＡｐｏＢ１００発現の減少は、げっ歯類およびいくつかの他の種において血漿コレステロールレベルを低下させると十分に証明されている。ゆえに、いかなる理論にも拘束するわけではないが、血漿コレステロールレベルの低下は、少なくとも部分的に、肝臓のコレステロール排出の減少に起因し得る。
【０４５９】
食餌効率、体重および脂肪
ＤＩＯマウスでは、２つのＪＮＫ１オリゴヌクレオチドのいずれかで処置しても食物摂取はコントロールと比べて変化しなかった。ＪＮＫ１ＡＳＯでの処置によってＢＷが１０％超減少し、これはコントロールと有意差があった。両方のＪＮＫ１ＡＳＯ処置群は、除脂肪体重が変化せずに、精巣上体脂肪組織重量が３５％超減少し、体脂肪量のパーセンテージが２０％超減少した。
【０４６０】
間接的熱量測定（Ｏｘｙｍａｘ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）を用いて２４時間にわたって代謝率を測定した。ＪＮＫ１ＡＳＯ処置マウスは、コントロールよりも高いＶＯ２を有した（暗期において約１２％以上および明期において約４％以上）。
【０４６１】
代謝性遺伝子の発現
ＤＩＯマウスにおける代表的な代謝性遺伝子の発現を解析した。ｏｂ／ｏｂマウスにおいて見られたのと同様の変化が、ＤＩＯマウスモデルでも見られた。さらに、コントロールに対して、ＷＡＴにおけるＵＣＰ２とＵＣＰ３の両方の発現の約７０％増加がＪＮＫ１処置ＤＩＯマウスにおいて見られた（表３５を参照のこと）ことから、ＪＮＫ１発現の減少は、脂質生合成を阻害するだけでなく、代謝率も増加させるとさらに示唆される。
【０４６２】
新規脂肪酸合成および新規ステロール合成の減少ならびに脂肪酸酸化の増加
先に報告されているように（Ｊｉａｎｇら、２００５；Ｙｕら、２００５）脂肪酸およびステロールへの［１４Ｃ］アセテートの取り込みを測定することによって、トランスフェクトされたマウス肝細胞におけるそれぞれ新規脂肪酸合成および新規ステロール合成を測定した。報告されているように（Ｃｈｏｉら、２００７；Ｓａｖａｇｅら、２００６；Ｙｕら、１９９７；Ｙｕら、２００５）［１４Ｃ］オレエートの、酸可溶性産物およびＣＯ２への酸化を測定することによって、脂肪酸の酸化を測定した。
【０４６３】
ＪＮＫ１ＡＳＯによる遺伝子発現の変化が、機能的な効果を変えたかを確認するために、マウス初代培養肝細胞をＪＮＫ１ＡＳＯでトランスフェクトし、脂肪酸の酸化および新規脂肪酸合成を測定した。インビボにおいて見られた遺伝子発現の変化と一致して、コントロールよりもＪＮＫ１ＡＳＯトランスフェクト細胞のほうが、脂肪酸の酸化の割合は、約３５％以上高かったのに対し、新規脂肪酸合成は、約２０％低かった。
【０４６４】
インスリンシグナル伝達の改善
上の実施例１６におけるインスリン抵抗性試験および耐糖能試験において見られたインスリン感度の増加、ならびに、実施例１６と１７の両方における満腹時／空腹時のグルコースおよびインスリンの測定の裏付けとして、機構的なインスリンシグナル伝達アッセイを行った。ＪＮＫ１発現の低下に起因するインスリン感度の増大は、ＤＩＯマウス（ＪＮＫ１ＡＳＯまたはコントロールＡＳＯで処置され、インスリンで負荷されたマウス）由来のＷＡＴと肝臓の両方においていくつかの重要なインスリンシグナル伝達酵素の活性を解析することによって確かめられた。
【０４６５】
ＤＩＯマウスを、３７．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの用量のＪＮＫ１ＡＳＯまたはコントロールＡＳＯで、３週間にわたって１週間に２回処置した。次いで、そのマウスを一晩絶食させ、そして、２Ｕ／ｋｇ  ＢＷのインスリンまたはビヒクルのボーラスｉ．ｐ．注射を行った。次いで、その動物を屠殺し、肝臓および精巣上体ＷＡＴを回収し、そしてそれをさらなる解析のために液体Ｎ２中で急速凍結させた。予め清浄にされていた脂肪または肝臓ホモジネート中に含まれる等量の全タンパク質を、還元条件下において勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で分離し、次いで、ＰＶＤＦ膜に転写した。次いで、そのブロットを、Ａｋｔ、Ｓｅｒｉｎｅ４７３−リン酸化Ａｋｔ（ｐＡｋｔＳｅｒ４３７）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）またはＳｅｒ３０２／３０７−リン酸化ＩＲＳ１（ｐＩＲＳ１Ｓｅｒ３０２／３０７）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）に対する１次抗体とともにインキュベートした。次いで、ＨＲＰ結合体化２次抗体およびＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することにより、シグナルを検出した。
【０４６６】
コントロールＡＳＯ処置マウス由来の両方の組織と比べてＪＮＫ１ＡＳＯ処置マウス由来の両方の組織において、ｐＩＲＳＳｅｒ３０２／３０７のレベルの低下が、基本条件下（インスリン負荷なし）だけでなく、インスリン負荷後においても見られた。ｐＩＲＳＳｅｒ３０２／３０７の低下が、下流のインスリンシグナル伝達活性を増加させたか否かを評価するために、ＷＡＴにおけるｐＡｋｔＳｅｒ４７３のレベルを解析した。インスリン負荷後に、コントロールよりも一層高いｐＡｋｔＳｅｒ４７３のレベルが、ＪＮＫ１ＡＳＯ処置マウスにおいて見られたが、その基礎レベルは、ＪＮＫ１ＡＳＯ処置マウスにおいて低かった；後者は、おそらく、これらのマウスにおける低い血漿インスリンレベルに起因した。これらのデータから、ＡＳＯによるＪＮＫ１発現の減少は、インスリンシグナル伝達活性を改善することが示唆され、このことは、負荷試験において検出されたインスリン感度の増大、ならびに、満腹時／空腹時のグルコースおよびインスリンの測定値の増加を少なくとも部分的に裏付ける。
【０４６７】
統計解析
示される値は、１処置あたり、３回のインビトロまたは５〜６回のインビボにおける独立した測定の平均値±ＳＥＭを表している。処置群間の統計的有意差は、Ｔｕｋｅｙ  ＨＳＤ多重比較または両側スチューデントｔ検定を用いる１元配置分散分析を使用して決定した。Ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。
【０４６８】
【表３５】
2010500290.tif 000050
定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて解析を行った。全ＲＮＡを、２５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷのＪＮＫ１ＡＳＯもしくはコントロールＡＳＯまたは食塩水で６週間にわたって１週間に２回処置されたｏｂ／ｏｂマウスの組織から単離した。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５〜６）として表されている。いずれかのコントロール群と比べたとき、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１。
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月15日(2009.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010500290000001.app
【国際調査報告】
2010500290.tif 000051
2010500290.tif 000052