(57)【要約】  生理活性物質を癌および腫瘍細胞へ送達するためのリポソームの使用および生理活性物質を送達するためのリポソームを形成する特異的脂質の組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を含有するリポソーム組成物であって、
a) i)プロトン化したときに実質的に混和性であり、頭部基と疎水性の尾部とを有し、両性イオン性脂質である、第一の脂質と、
ii) プロトン化したときに第一の脂質と実質的に不混和性であり、滴定可能な帯電した頭部基と疎水性の尾部とを有する、第二の脂質と
によって形成される、少なくとも2つの脂質相分離ドメイン、
b) 前記第一の脂質または第二の脂質の少なくとも一部と適合する尾部を有し、PEGと結合している第三の脂質、および
c) 抗原またはマーカーと結合することができかつ第四の脂質の頭部基に結合したターゲッティングリガンドであって、前記第四の脂質が、前記第一の脂質または第二の脂質の少なくとも一部と適合し、PEGと結合している前記第三の脂質の尾部と適合しない尾部を有している、ターゲッティングリガンド
を含んでなり、
前記リポソーム組成物が、特定環境に曝されるとき、前記ターゲッティングリガンドと結合した第四の脂質から、PEGと結合している前記第三の脂質を、脂質相分離によって側方分離し、
該脂質相分離により、前記ターゲッティングリガンドを、一層酸性の環境に露出する、リポソーム組成物。
【請求項２】
前記特定環境が酸性の環境である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
組成物リポソームの相転移温度が37℃を上回る、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
前記生理活性物質が、化学療法剤、放射性核種、ヌクレオチド断片およびペプチド断片からなる群から選択されるものである、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、pH約6.3〜約6.7である環境中にあるとき、ターゲッティングリガンドを露出する、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原または受容体が非癌細胞よりも癌細胞において一層高濃度に発現するものである、請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
前記ターゲッティングリガンドが抗体またはその断片である、請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
前記ターゲッティングリガンドが抗体断片であり、前記脂質相分離によって、リポソーム膜の物理的表面におけるリガンドと結合した脂質から、PEGと結合した脂質を物理的に分離する、請求項1に記載の組成物。
【請求項９】
請求項1に記載のリポソーム組成物の薬学上有効量を哺乳類に投与することを含んでなる、哺乳類における悪性腫瘍の治療方法。
【請求項１０】
前記哺乳類がヒトである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記リポソームが中性pHにおいて負電荷を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
生理活性物質の蓄積を、酸性の環境を有する細胞に隣接して増加させる方法であって、
請求項1に記載の組成物を投与し、前記脂質相分離によりターゲッティングリガンドを一層酸性の環境に露出することを含んでなり、
前記リポソームが、酸性の環境に移動し、前記ターゲッティングリガンドを前記酸性の環境に露出し、特異的にターゲット細胞に結合し、該ターゲット細胞によって取り込まれ、封入された生理活性物質を、後期のエンドソームまたはリソソームコンパートメントの酸性の環境中に放出する、方法。
【請求項１３】
前記第一の脂質がDPPCであり、前記第二の脂質がDSPSである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一の脂質がDPPCであり、前記第二の脂質がDSPSであり、0〜5%のコレステロールが前記組成物に含まれる、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
前記リポソームを注射によって投与する、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
前記リポソームが、pH約6.7〜約6.5で選択的に腫瘍細胞と結合するように調製されている、請求項12に記載の方法。
【請求項１７】
前記リポソームが、pH約6未満の環境で生理活性物質を放出するように調製されている、請求項12に記載の方法。
【請求項１８】
生理活性物質を含有する組成物であって、
a) 一定のpHで相分離する液相分離ドメインを有する、アニオン性リポソーム、
b) 腫瘍細胞上の抗原またはマーカーに結合することができかつ脂質の頭部基に結合した、ターゲッティングリガンド
を含んでなり、
脂質相分離により、前記ターゲッティングリガンドを環境に露出する、組成物。
【請求項１９】
前記リポソームが、第一の脂質および第二の脂質を少なくとも有するものであり、前記第一の脂質および第二の脂質がそれぞれ、頭部基と疎水性の尾部とを有し、少なくとも2種類の脂質の尾部が両方ともプロトン化されたとき、実質的に混和性ではなく、かつ2つ以上の脂質相分離ドメインを形成する、請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
前記リポソームが、前記第一または第二の脂質の少なくとも一部と適合する尾部を有する、ポリエチレングリコールに結合した脂質をさらに含んでなる、請求項18に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、リポソームを低pHの環境に曝した後、膜の平面上のターゲッティングリガンドと結合した脂質から、PEGと結合した脂質を側方に分離する、請求項18に記載の組成物。
【請求項２２】
生理活性物質を含有するリポソーム組成物であって、
a) i) プロトン化したときに実質的に混和性であり、頭部基と疎水性の尾部とを有し、両性イオン性脂質である、第一の脂質と、
ii) プロトン化したときに第一の脂質と実質的に不混和性であり、滴定可能な帯電した頭部基と疎水性の尾部とを有する、第二の脂質と
によって形成される、少なくとも2つの脂質相分離ドメイン、
b) 抗原またはマーカーを結合することができかつ第三の脂質の頭部基に結合したターゲッティングリガンドであって、前記第三の脂質が、前記第一の脂質または第二の脂質の少なくとも一部と適合する尾部を有する、ターゲットリガンド
を含んでなり、
前記リポソーム組成物が、特定環境に曝されるとき、脂質相分離によって側方分離し、
該脂質相分離により、ターゲッティングリガンドを一層酸性の環境に露出する、リポソーム組成物。
【請求項２３】
前記第二の脂質が静電的に帯電しているとき、前記第一の脂質および第二の脂質が互いにその不混和性が低下し、前記脂質相分離ドメインの形成が減少する、請求項1に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、2006年10月6日に出願された米国仮出願第60/828523号に基づき、かつその優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、一般的には、治療用送達系およびリポソーム組成物の分野に関する。さらに、本発明は、生理活性物質を送達することができる、リポソームを形成する特異的脂質の組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
脂質粒子は、実質的に任意の生物学的材料と複合体を形成することができる。この能力により、これらの脂質粒子を生理活性物質の送達系として用いることができる。脂質複合体は多数の薬物療法に用いられており、これらの送達系が有望な結果を示している1つの分野は癌治療の分野である。癌治療を成功させかつ効率的にするには、生理活性物質を腫瘍または癌細胞にターゲッティングする必要がある。
【０００４】
幾つかの場合には、薬剤キャリヤーが腫瘍間隙内で局在化された後にのみ、癌ターゲッティングリガンドはキャリヤーの癌細胞への結合を高め、薬剤バイオアベイラビリティーを増加させる細胞インターナリゼーションに介在する必要がある。Kirpotin, D. B., et al.,「長期循環脂質ナノ粒子の抗体ターゲッティングは腫瘍局在化を増加させないが、動物モデルのインターナリゼーションを増加させる」, Cancer Res., 66(13): 6732-6740 (2006)。他の場合には、血流での循環中に、腫瘍結合リガンドによるキャリヤー表面の「修飾」が、宿主の免疫および網内細胞(RES)系との望ましくない相互作用を活性化しうる。その結果、血流からキャリヤーが速やかに除去され、腫瘍に吸収される投与量が低くなり、健康な臓器に薬剤キャリヤーが蓄積し、治療薬内容物が放出されることによって健康な細胞が殺され、毒性が高くなる可能性がある。Allen, T.M.,「抗癌療法におけるリガンドをターゲットとする治療薬」, Nature Cancer Rev., 2: 750-763 (2002)。
【０００５】
したがって、生理活性物質を送達するための改良リポソームが依然として求められている。また、腫瘍および癌細胞にターゲッティングすることができる改良リポソームが依然として求められている。さらに、網内細胞および免疫系による認識を最小限とすることができる改良リポソームが求められている。本発明が向けられるのは、とりわけこれらの要求に対してである。
【発明の概要】
【０００６】
すなわち、本発明は、循環中にターゲッティングリガンドを「隠蔽し」(または「遮蔽し」、リポソームが癌細胞の近傍にある場合にリポソームが(酸性)腫瘍間隙に遊出した後にターゲッティングリガンドを「露出させる」ようにすることができるリポソームに関する。これらのリポソームは、免疫反応の毒性の問題を効果的に扱うことができる。本発明は、血流中を長時間循環することができかつ腫瘍間隙内に蓄積した後に腫瘍によって吸収され、免疫およびRES系によって余り識別されずに固形腫瘍癌細胞において内在化することができる種類のリポソームを包含する。これらのリポソームは、イン・ビボでの腫瘍細胞中で高い腫瘍蓄積と高い薬剤バイオアベイラビリティーとを示しうる。一つの態様によれば、リポソームは、イオン化可能な「ドメイン形成」(「筏」形成)性の剛性脂質を含んでいてもよく、腫瘍間隙の酸性pH(例えば、6.7)環境に応じて脂質相で分離されたドメインを形成する。リポソーム膜は剛性脂質とPEG化脂質とから構成され、血液循環時間を増加するようにすることができる。さらに、剛性脂質(それぞれがラメラ形成性である)のドメイン形成特性を利用することができるので、PEG化によって、開発したリポソームのpH感受性の阻害を回避しうる。
【０００７】
腫瘍ターゲッティングリガンドは、脂質相分離がpH=6.7で起こった後、選択的に1種類のドメインに分かれる「筏」形成脂質の頭部基に接合させることができる。リポソームはまた、形成後に上記ドメインに選択的に分かれないPEG化脂質も含んでいる。例えば、約7.4の生理学的pH(例えば、血液循環における)では、脂質は帯電することができ、リポソーム膜を構成する脂質は膜の平面上で「混合」されかつ一般に均質であり、PEG化脂質はリポソーム膜中に均一に分布されることにより、表面に接合した腫瘍ターゲッティングリガンドを適切に「遮蔽」(例えば、立体的に隠蔽)する。pHを低下させると、分離した脂質ドメインが形成され、それらのいくつかでは腫瘍ターゲッティングリガンドがクラスター形成し、PEG化脂質はそれらから除外される。その結果、表面に接合したリガンドを選択的に露出することができる。
【０００８】
直接的環境のpHによっては「隠蔽」または「露出」されるターゲッティングリガンドを有するリポソームを用いると、リポソームが腫瘍間隙に遊出した後に、イン・ビボで癌細胞によって内在化されるリポソームの比率は、転移性の血管化腫瘍を構成する癌細胞中で劇的に増加しうる。これによって、投与量を低下させ、腫瘍に吸収される投与量を高めることができ、毒性を低くすることができる。
【０００９】
本発明のこれらの特徴および他の特徴および利点は、下記の好ましい態様の詳細な説明を添付の図面に関連して読むことにより、当業者には一層明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】環境のpHが一層酸性になったときに凝集する、pH調整可能なドメイン形成脂質の概略図である。
【図２】環境のpHによって表面に接合したターゲッティングリガンドを「隠蔽」または「露出」する、pH調整可能なドメイン形成脂質の概略図である。
【図３】様々なpHレベルにおける、PEG化脂質0.01モル%を含むビオチン化リポソームの、ストレプトアビジンで被覆したマイクロビーズへの結合の程度を示すグラフである。
【図４】様々なpHレベルにおける、PEG化脂質0.25モル%を含むビオチン化リポソームの、ストレプトアビジンで被覆したマイクロビーズへの結合の程度を示すグラフである。
【図５】様々なpHレベルにおける、PEG化脂質0.5モル%を含むビオチン化リポソームの、ストレプトアビジンで被覆したマイクロビーズへの結合の程度を示すグラフである。
【図６】様々なpHレベルにおける、PEG化脂質0.75モル%を含むビオチン化リポソームの、ストレプトアビジンで被覆したマイクロビーズへの結合の程度を示すグラフである。
【図７】様々なpHレベルにおける、PEG化脂質1.0モル%を含むビオチン化リポソームの、ストレプトアビジンで被覆したマイクロビーズへの結合の程度を示すグラフである。
【図８】様々なpHレベルにおける、PEG化脂質1.5モル%を含むビオチン化リポソームの、ストレプトアビジンで被覆したマイクロビーズへの結合の程度を示すグラフである。
【図９】PEGと結合した脂質の「有効長さ」がターゲッティングリガンドの大きさより長いときに、環境のpHによって表面に接合したターゲッティングリガンドを「隠蔽」または「露出」するpH調整可能なドメイン形成脂質がターゲットに特異的に結合することができないことを示す概略図である。
【図１０】総脂質の0.1〜1.5モル%の範囲の脂質組成物に関し、pH 7.4およびpH 6.5の間のビオチン化リポソームの結合について分数増加率の計算値を示す表である。
【図１１】ドメイン形成におけるDSPS脂質のプロトン化によるｐＨの効果を示す、示差走査熱量計データーから得たサーモグラフである。
【図１２】等モル量のDPPCおよびDSPSから構成されるリポソームによる、5日間にわたるpHに応じたカルセイン保持率を示すグラフである。
【００１１】
定義
特に断らない限り、本明細書で用いられる総ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されているのと同じ意味を有する。本発明の目的のために、下記の用語を定義する。
【００１２】
本明細書において、「癌」という用語は、不適当な細胞増殖の疾患を表し、腫瘍組織体が生命維持に必要な臓器の機能を弱めるときには一層明らかである。正常組織生長を記載するコンセプトは悪性組織に応用可能であり、これは、正常および悪性組織は単細胞のレベルおよび組織のレベルのいずれであっても同様の増殖特性を共有しうるからである。
【００１３】
本明細書において、「アニオン性リポソーム」という用語は、アニオン性の下記に定義されるあらゆるリポソームを包含することを意味する。リポソームは、生理学的pHで存在するときにはアニオン性として測定される。リポソーム自体は、アニオン性として測定される存在であることに留意すべきである。イン・ビボでの環境中に存在する本発明のリポソームの電荷および/または構造は、正確には測定されていない。しかしながら、本発明によれば、本発明のアニオン性リポソームは、それ自身がアニオン性の少なくとも幾つかの脂質を用いて産生される。リポソームは完全にアニオン性脂質から構成される必要はないが、十分な量のアニオン性脂質から構成され、リポソームが形成されて生理学的pHのイン・ビボ環境に置かれるときにはリポソームは初期には負電荷を有するものでなければならない。
【００１４】
本明細書において、「pH感受性」脂質とは、頭部基(head group)の正味電荷(net charge)を変化させる能力が、少なくとも部分的には周囲環境のpHによって変化する脂質を表す。
【００１５】
本明細書において、「生理活性物質」とは、生物学的系に影響を及ぼす分子を表す。これらには、タンパク質、核酸、治療薬、ビタミンおよびその誘導体、ウイルス画分、リポ多糖類、細菌画分、およびホルモンが挙げられる。特に興味深い他の薬剤は、化学療法薬であり、癌患者の治療および管理に用いられる。このような分子は、一般的には増殖防止薬、細胞毒性薬、および免疫抑制薬として特徴付けられ、タキソール、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンカアルカロイド、アクチノマイシンおよびエトポシドのような分子が挙げられる。
【００１６】
本発明において、「有効量」とは、望ましくない細胞増殖を阻害する、例えば腫瘍細胞増殖のような望ましくない細胞生長を防止しまたは現存する細胞増殖を減少させるのに必要なまたは十分な量を表す。有効量は、当該技術分野における当業者に知られている因子によって変化させることができ、これには細胞増殖の型、投与の様式および計画、被験者の大きさ、細胞増殖の重篤性が挙げられる。当該技術分野における当業者であれば、このような因子を考えることができ、有効量に関して決定することができるであろう。
【００１７】
本明細書において、「リポソーム」とは、内部の水性空間を取り囲む外部の脂質二重または多重層膜を含んでなる閉鎖構造を表す。特に、本発明のリポソームは、脂質二重層間にその内容物が陥入している花瓶様構造(vase-like structure)を形成する。リポソームは、任意の生理活性物質を細胞に送達する目的で封入するのに用いることができる。
【００１８】
下記の略号が本明細書で用いられる: PEG:ポリエチレングリコール、mPEG:メトキシ末端ポリエチレングリコール、Chol:コレステロール、DTPA:ジエチレンテトラミン五酢酸、DPPC:ジパルミトイルホスファチジルコリン、DSPA:ジステアロイルホスファチジン酸、およびDSPS:ジステアロイルホスファチジルセリン。
【本発明を実施するための具体的態様】
【００１９】
本発明のある態様においては、生理活性物質を効率的に送達することができる、安定な構造を形成する特異的組成のpH感受性リポソームを包含する。さらに詳細には、リポソームは1種類以上の生理活性物質を含むことができ、これを哺乳類宿主に投与してその内容物をターゲット細胞または腫瘍細胞に効果的に送達しかつターゲッティングすることができる。リポソームは生理活性物質を送達し、この薬剤をある環境に隔離しかつ別の環境で選択的に露出させることができる。具体的には、pH調整したドメイン形成膜を用いることによって、調整可能な剛性-リポソームは、腫瘍中に遊出した後、他の状態では「隠蔽されている」腫瘍ターゲッティングリガンドを効率的に「露出させる」ことができる。
【００２０】
上記態様の1側面によれば、腫瘍または固形腫瘍を構成する癌細胞にターゲッティングリガンドを一層効率的かつ選択的に露出させる機構として、pH調整したリポソームを用いる。ドメイン形成脂質を含むpH調整可能なリポソーム膜の平面および側面図である図1に示されるように、ドメイン形成脂質の滴定可能なアニオン性の頭部基中の静電反発が支配的である(負電荷)ときには、脂質膜表面は生理学的pH(左)では均質である(混合されている)ように見える。酸性pH(例えば、腫瘍間隙6.7)(右)では、負に帯電した頭部基のプロトン化により炭化水素の尾部中のファン・デル・ヴァールス引力が支配的となり、脂質分離およびドメイン形成が起こる。一般に、「筏」または「ドメイン」仮説下では、図1に示されるように、膜におけるリン脂質の長い飽和炭化水素鎖は、不飽和炭化水素鎖を有する脂質をも含む膜平面において、相分離する(整然とした相ドメインに凝集する)。
【００２１】
リポソーム組成物
本発明の一つの態様によれば、生理活性物質を腫瘍細胞にターゲッティングするためのpH感受性リポソーム組成物は、
a) i) プロトン化したときに実質的に混和性(miscible)であり、頭部基(head group)と疎水性の尾部(hydrophobic tail)を有し、両性イオン性脂質である、第一の脂質、
ii) プロトン化したときに第一の脂質と実質的に不混和性(immiscible)であり、滴定可能な帯電した頭部基と疎水性の尾部とを有する、第二の脂質
によって形成される、少なくとも2つの脂質相分離ドメイン(lipid phase separated domain)、
b) 抗原またはマーカーを結合することができかつ第三の脂質の頭部基に結合したターゲッティングリガンドであって、上記第三の脂質が、第一の脂質または第二の脂質の少なくとも一部と適合する尾部を有する、ターゲッティングリガンド
を含んでなり、
リポソーム組成物が、特定環境に曝されるとき、脂質相の分離によって側方分離し(laterally separate)、上記脂質相の分離により、ターゲッティングリガンドを一層酸性の環境に露出させる。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、生理活性物質を含むリポソーム組成物は、
a) i) プロトン化したときに実質的に混和性であり、頭部基と疎水性の尾部とを有し、両性イオン性脂質である、第一の脂質、
ii) プロトン化したときに第一の脂質と実質的に不混和性であり、滴定可能な(titratable)帯電した頭部基と疎水性の尾部とを有する、第二の脂質
によって形成される、少なくとも2つの脂質相分離ドメイン、
b) 第一の脂質または第二の脂質の少なくとも一部と適合する尾部を有し、PEGと結合している第三の脂質、および
c) 抗原またはマーカーを結合することができかつ第四の脂質の頭部基に結合したターゲッティングリガンドであって、上記第四の脂質が、第一の脂質または第二の脂質の少なくとも一部と適合し、PEGと結合している第三の脂質の尾部と適合しない尾部を有する、ターゲッティングリガンド
を含んでなり、
リポソーム組成物が、特定環境に露出されるとき、脂質相の分離によって、ターゲッティングリガンドと結合した第四の脂質から、PEGと結合している第三の脂質を側方に分離し、脂質相分離により、ターゲッティングリガンドを一層酸性の環境に露出させる。一例では、第一の脂質の1つは、ある型の尾部を有する両性イオン性脂質であり、第二の脂質の1つは、異なる型の尾部とともに滴定可能な頭部基を有する脂質である。その他の脂質を組成物に組込むこともできると理解される。
【００２３】
一つの態様によれば、リポソームはPEGをコーティングしたリポソームの表面に結合したターゲッティングリガンドを含むことができる。ターゲッティングリガンドは、残基の性質によってはリポソーム脂質表面成分に直接結合することによってまたは短いスペーサーアームまたは接続鎖(tether)を介してリポソームに結合することができる。様々な方法が、分子、例えば親和性残基(affinity残基)を脂質小胞の表面に結合させるのに利用可能である。1つの方法では、ターゲッティングリガンドを後述する実施例に記載のカップリング反応によって脂質にカップリングさせてターゲッティングリガンド-脂質接合体を形成させ、この接合体を脂質の溶液に加えてリポソームを形成させる。もう一つの実証的方法では、ターゲッティングリガンドの共有結合の目的で活性化した小胞形成脂質をリポソームに組込む。形成したリポソームをターゲッティングリガンドに露出させ、ターゲッティングリガンドを活性化脂質へ結合させる。当該技術分野における当業者であれば、過度の実験を行うことなくターゲッティングリガンドをリポソームに結合する方法を選択することができる。
【００２４】
別の態様によれば、組成物は、ターゲッティングリガンドを癌細胞に対して選択的に露出させることができる(図2)。例えば、ターゲッティングリガンドは、生理学的(中性)pHで組成物内の隣接するPEGと結合した脂質による立体障害を有し、組成物は血流中を循環することができる(図2, 左)。リポソーム組成物が典型的には低めのpHを有する腫瘍細胞に隣接する環境に遭遇したときには、リポソーム脂質膜は脂質で分離されたドメインを形成し、隣接するPEGと結合した脂質は、リガンドと結合した脂質が優先的に仕切る脂質ドメインとは異なる、脂質ドメインを優先的に仕切り、ターゲッティングリガンドが腫瘍細胞に露出される(図2, 右)。次いで、露出したターゲッティングリガンドは腫瘍細胞に結合し、生理活性物質を送達することができる。
【００２５】
組成物に用いるのに適したリポソームとしては、主として小胞形成脂質から構成されるものが挙げられる。このような小胞形成脂質は、(a) リン脂質によって例示されるように、水中で二重層小胞を自発的に形成することができ、または(b) 脂質二重層に安定に組込まれ、疎水性残基は二重層膜の内部の疎水性領域と接触し、その頭部基残基は膜の外側の極性表面に向けて配置される。この態様を有する適当な多くの脂質は、2本の炭化水素鎖、典型的にはアシル鎖と極性または帯電した頭部基とを有する型のものである。様々な合成脂質および天然に生じる脂質、例えば、DPPCおよびDSPS(およびDSPA)のようなリン脂質であって、2本の炭化水素鎖は典型的には少なくとも16個の炭素原子の長さであるものがある。この型の小胞形成脂質は、好ましくは2本の炭化水素鎖、典型的にはアシル鎖と極性または帯電した頭部基とを有するものである。
【００２６】
pH感受性リポソームを選択して、詳述する程度の流動性または剛性を得、血清中のリポソームの安定性を調整し、ターゲッティング接合体の挿入に有効な条件を調整し、結合のためのリガンド露出の割合を調整し、リポソームに閉じ込められた生理活性物質の放出割合を調整することができる。一層剛性の脂質二重層またはゲル相二重層を有するリポソームは、比較的剛性の脂質、例えば約39℃を上回る比較的高い相転移温度を有する脂質を組込むことによって得られる。剛性の、すなわち、飽和脂質は、脂質二重層における一層大きな膜剛性に寄与する。コレステロールのような他の脂質成分も、脂質二重層構造における膜剛性に寄与することが知られている。対照的に、脂質流動性は、比較的流動性の脂質、典型的には、相対的に低流動性の液相からゲル結晶性相への転移温度、例えば、作業温度(例えば、体温)以下での脂質相を有するものを組込むことによって達成することができる。
【００２７】
これらのリポソームは、pH値の減少に応じて膜の平面において相分離し、結合リガンドのpHによって制御される露出を生じ、ターゲッティングを制御する滴定可能なドメイン形成脂質を含むことができる。一つの態様によれば、リポソームは、2種類の脂質(いずれもTg>37℃)であって、1種類は両性イオン性の剛性脂質(例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン, DPPC, Tg = 41℃)であり、他成分はpH値の減少に応じて膜の平面で相分離を誘発する「滴定可能なドメイン形成」剛性脂質(例えば、ジステアロイルホスファチジルセリン, DSPS, Tg = 68℃)である。生理学的pH (7.4)では、「ドメイン形成」剛性脂質 (DSPS) の脂質−頭部基は帯電しており、静電反発がDSPS脂質中で優性であり、リポソーム膜は一層混合しかつ均質となり、リガンドと結合した脂質の結合に対するPEGと結合した脂質による立体障害を生じ、カプセル封入された内容物が安定に保持されると思われる。
【００２８】
脂質相分離(lipid phase-separation)は、ドメイン形成脂質の頭部基に滴定可能な電荷を導入することによって調整することができる。ドメイン形成脂質の頭部基のイオン化の程度は、pHを用いて頭部基の静電反発と炭化水素鎖のファン・デル・ヴァールス引力とのバランスを調整することによって制御することができる。相分離を行ってドメインを形成する一層長い炭化水素鎖脂質を選択して、頭部基が滴定可能な酸性残基(例えば、ホスファチジルセリン)を有するようにすることができる。中性pHでは、これらの脂質の頭部基は負に帯電して、ドメインの近接と形成を妨げている。pHが低下すると、頭部基が徐々にプロトン化して静電反発が極小になり、脂質ドメインが形成される。
【００２９】
一つの態様によれば、本明細書に開示されたリポソームの１つは、負に帯電した頭部基を有することができ、かつPEGと結合した鎖を有することができる。腫瘍間隙のpHにおけるドメイン形成 (あるいは側方脂質分離：lateral lipid-separation)によれば、リガンドと結合した脂質が優先的には仕切らない脂質ドメインにおける、PEGと結合した脂質の側方への凝集によってターゲッティングリガンド「露出」させうる。生理学的pH(循環中)では、脂質は帯電しており、リポソーム膜は「混合」されてターゲッティングリガンドが「隠蔽」されることがある。酸性の腫瘍間隙pH(6.7-6.5)では、ドメイン形成脂質はますますプロトン化(非イオン化)され、クラスター形成したプロトン化脂質の脂質ドメインが生じてターゲッティングリガンドが露出させうる。一つの態様によれば、脂質のpK値を約4〜約7とすることができる。
【００３０】
別の態様によれば、本明細書で開示したリポソームの脂質の1つは、負に帯電した頭部基を有することができ、かつPEGと結合した鎖を有することができる。PEGと結合した鎖は、血流中にあるときには、ターゲッティングリガンドの他の細胞への固定の可能性を減少させることができる。この態様によれば、リポソームは、エンドソーム/リソソームの酸性pHに応じてドメインの形成を誘発するイオン化可能な「ドメイン形成」(「筏」形成)剛性脂質を含んでなる。エンドソーム/リソソームpHでのドメイン形成(あるいは側方脂質分離)は、恐らくはドメインの「縁」における「脂質パッキング」の欠陥により、封入された内容物の放出を引き起こしうる。生理学的pH (例えば、循環中)では、脂質は帯電しておりまたリポソーム膜は「混合」されていることがあるので、内容物は漏れ出る可能性はない。酸性の後期エンドソーム/リソソームpH(4.5-4.0)では、メイン形成脂質はますますプロトン化(非イオン化)し、クラスター形成したプロトン化脂質の脂質ドメインが生じて、封入された内容物の放出を引き起こしうる。一つの態様によれば、脂質のpK値を約3〜約5とすることができる。
【００３１】
別の態様によれば、本明細書で開示したリポソームは、さらに安定剤を含みまたは高pHの水相を有することがある。安定剤の例は、親水性の治療様式の保持をさらに促進する目的で水相に組込まれるリン酸緩衝液、不溶性の金属結合ポリマー、樹脂ビーズ、金属結合性分子またはハロゲン結合性分子である。さらに、リポソームは、ターゲット細胞によるエンドサイトーシスを促進する目的で分子を含んでなることもある。
【００３２】
リポソームは、さらに剛性の脂質二重層を有することができ、これは、比較的剛性の脂質を組込むことによって達成することができる。例えば、高めの相転移温度を有する脂質は、さらに剛性となりやすい。さらに、飽和脂質は、脂質二重層の膜剛性を一層大きくするのに寄与することができる。コレステロールのような他の脂質成分は、流動性の脂質二重層構造の膜剛性に寄与することも知られている。
【００３３】
別の態様によれば、リポソームは、剛性脂質(例えば、DPPCおよびDSPS)、PEGと結合した脂質、およびコレステロールまたはコレステロール/ステロール誘導体を含んでなることができる。一つの態様によれば、ジパルミトイル尾部を有するビオチンと結合した脂質およびジステアロイル尾部を有するPEGと結合した脂質を含み、腫瘍間隙のpHに対応する弱酸性条件で活性化するように調整することができる滴定可能なDSPSドメイン形成脂質を含むリポソームが開発された。両方の脂質成分(いずれもラメラ形成性)が長い飽和の剛性炭化水素鎖であるが長さが異なるものを有するときには、ドメイン形成が潜在的に起こる可能性がある。pH調整したドメイン形成膜の使用は、腫瘍中にリポソームが遊出した後に、他の場合には「隠蔽された」腫瘍ターゲッティングリガンドを効率的に露出させる調整可能な剛性リポソームを作成する機構であることが分かっている。
【００３４】
別の態様によれば、DPPC:DSPSの比は約4:1〜約1:2の範囲とすることができ、コレステロール含量は約0-5モル%の範囲とすることができ、DSPE-PEG (2000MW) は総脂質の約0.75〜1.00モル%以下で総脂質の0.25モル%を上回るようにすることができ、ビオチン化脂質は総脂質の1〜2モル%以下とすることができる。一例では、DPPC (16:0)、DSPS (18:0)および5モル%コレステロールおよび0.1-1.5モル%PEG (200MW)を有する剛性リポソームを、様々なpH値で37℃にてPBS中でインキュベーションした。
【００３５】
ターゲッティングリガンド
リポソームは、所望により細胞表面受容体、抗原および他の類似化合物と相互作用し、特異的細胞個体群に対する所望なターゲット結合特性を獲得するための抗体または抗体断片、小さなエフェクター分子のような表面基を含むように調製することができる。このようなリガンドは、ターゲッティング分子で誘導体形成した脂質または予め形成したリポソームにおいてターゲッティング分子で誘導体形成することができる極性頭の化学基を有する脂質を包含させることによってリポソームに包含させることができる。あるいは、ターゲッティング残基は、予め形成したリポソームをリガンド-ポリマー−脂質接合体と共にインキュベーションすることによって予め形成したリポソームに挿入することができる。一つの態様によれば、親和性分子は、抗体の断片であるよりはむしろ完全な抗体であることができる。抗体工学の進歩は抗体断片の開発により免疫原性応答を減少させることを可能とするが、一層小さな断片(Fab', scFv)を除けば、腫瘍結合摂取および保持は完全な抗体と比較して減少する可能性がある。これらの相互作用は、イン・ビボでの毒性に寄与しうる。循環中に抗体を「隠蔽」しかつ癌細胞の附近(酸性腫瘍間隙中)でのみターゲッティングリガンドを「露出」するように調整されるこれらのリポソームは、毒性の問題を効果的に扱うことができかつ抗体断片の低結合性アビディティの問題を減じることができる。完全な抗体を用いることによって、腫瘍細胞とリポソームとの接着を向上させることが可能である。
【００３６】
脂質は、小胞形成脂質の頭部基または小胞形成脂質の頭部基に既に結合した短分子(スペーサーアームまたは接続鎖(tether))にターゲッティングリガンドを共有結合することによってリガンドで誘導体形成することができる。選択したリガンドを選択した脂質頭部基に結合させるには、多種多様な手法がある。例えば、Allen, T. M., et al., Biochemicia et Biophysica Acta 1237:99-108 (1995); Zalipsky, S., Bioconjugate Chem., 4(4):296-299 (1993); Zalipsky, S., et al., FEBS Lett. 353:71-74 (1994); Zalipsky, S., et al., Bioconjugate Chemistry, 705-708 (1995); Zalipsky, S., 「ステルスリポソーム(Stealth Liposomes)」(D. Lasic and F. Martin監修) 第9章, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1995)を参照されたい。上記手法の内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【００３７】
例えば、リポソームはターゲッティングリガンドを含み、これはマーカーまたはターゲットに特異的かつ高親和性で結合することができる。一例では、ターゲットは上皮増殖因子受容体ファミリー(EGFR)であることができ、これは固形腫瘍の癌治療のための通常のターゲットである。さらに、ターゲッティングリガンドは、固形腫瘍細胞上にマーカーを結合することができるポリペプチドまたは多糖類エフェクター分子であることができる。本発明で好適な親和性残基は、現在および将来の文献に見出すことができる。
【００３８】
他のターゲッティングリガンドは当業者には周知であり、別の態様によれば、リガンドは上皮腫瘍細胞へ結合親和性を有するものであり、これはさらに好ましくは細胞によってインターナライズされる(internalized)。このようなリガンドは、増殖因子受容体の細胞外ドメインに結合することが多い。癌細胞表面上の典型的受容体(エピトープ)としては、表皮増殖因子受容体 (EGFR)、葉酸受容体、トランスフェリン受容体 (CD71)、ErbB2および癌胎児性抗原 (CEA)が挙げられる。Fransson, et al., 「逆ゲノミクスによる乳癌および膵臓癌細胞での腫瘍関連抗原のインターナリゼーションのプロファイリング」, Cancer Letters 208, 235-242 (2004)。
【００３９】
生理活性物質
一つの態様によれば、生理活性物質のリポソームカプセル封入は、癌細胞における用法のバイオアベイラビリティーを高める。この態様においては、リポソームを用いて生理活性物質をカプセル封入し(例えば、癌治療用法)、癌細胞に治療様式を効率的に放出することによって、腫瘍細胞で毒性を起こさせることができる。例えば、pH感受性リポソームの使用によって、癌細胞によるエンドサイトーシス時に治療様式(therapeutic modalities)を後期エンドソームまたはリソソームコンパートメント(late endosomal or lysosomal compartment))に一層完全に放出することができる。
【００４０】
リポソームはリン脂質膜剛性を有し、血液循環中のリポソームにおける生理活性物質の保持を向上させることができる。PEGと結合した脂質の添加もリポソームクリアランスを減少させて、腫瘍におけるリポソーム蓄積を増加させる。例えば、一つの態様としては、長い循環時間を後期エンドソームまたはリソソームにおける内容物の放出と組み合わせた剛性膜を有するpH感受性リポソームが挙げられる。他の型のpH感受性リポソームとしては、相分離と帯電膜上のドメイン形成を引き起こすことができる表面での帯電した滴定可能なペプチドを挙げることができる。
【００４１】
本発明は、生理活性物質を送達することができる新規なリポソーム構造にも関する。例えば、本発明は、改良されたリポソーム処方物と核酸を提供し、これは高レベルの遺伝子発現とタンパク質産生を生じることができる。さらに、ターゲットを合わせたα-粒子エミッターはターゲットとした癌治療の治療薬として特に有望であり、リポソームによって送達することができる。本発明で好適な生理活性物質は当該技術分野で当業者には明らかであり、過度の実験を行うことなく検討を行うことができる。
【００４２】
このようなリポソームを有する好適な生理活性物質としては、下記の治療活性、すなわち、抗関節炎、抗不整脈、抗菌、抗コリン作動性、凝固防止、抗利尿、解毒薬、抗癲癇、抗真菌、抗炎症、代謝拮抗、抗偏頭痛、抗寄生生物、解熱、抗発作、抗血清、鎮痙、鎮痛、麻酔、β-遮断、生物応答修正、骨代謝調節、循環器、利尿、酵素、生殖能力増強、増殖促進、止血、ホルモン、ホルモン抑制、高カルシウム血症緩和、低カルシウム血症緩和、低血糖緩和、高血糖緩和、免疫抑制、免疫増強、筋弛緩、神経伝達、副交感神経作動性、交感神経作動性血漿伸張(plasma extending)、血漿拡張(plasma expanding)、向精神性、血栓崩壊性、および血管拡張を有する天然および合成化合物が挙げられるが、これらに限定されない。一実例では、取り込まれた薬剤は細胞毒性薬であり、すなわち細胞に有害なまたは毒性効果を有する薬剤である。
【００４３】
リポソーム組成物の投与
リポソームは転移性癌および他の炎症性の種類の疾病の治療のための薬剤送達キャリヤーとして用いることができ、ワクチン、遺伝子治療などのための送達ビヒクルとしても用いることができる。本発明は、現在アジュバントで体験されている効果的送達、抗原-免疫応答の増強および望ましくない外来免疫応答の低下が可能な効果的なワクチンビヒクルをも提供する。本発明によるリポソームは、任意の好適な方法で投与する目的で処方することができる。したがって、本発明は、その範囲内にヒトまたは獣医学で使用する目的で処方した少なくとも1種類のリポソーム化合物を含んでなる医薬組成物を包含する。他の投与経路は、当該技術分野の当業者には知られており、本発明のリポソームを投与するのに容易に用いることができる。
【００４４】
本発明の別の態様によれば、個体に空リポソームを予備投与して、網内臓器を飽和して、リポソームに封入された治療薬の投与時に非腫瘍特異的脾臓および肝摂取を減少させることを含んでなる方法を包含する。
【００４５】
使用および応用においては、リポソームを用いて、生理活性物質を血管化した(固形)腫瘍のターゲット細胞または癌細胞へ選択的に送達することができる。例えば、発生した脈管構造を有する転移性腫瘍への薬剤送達では、選択的腫瘍蓄積およびリポソームの保持は主としてそれらの粒度によって変わり(EPR効果)、適切な腫瘍に吸着される用量を生じ、腫瘍間隙中へのリポソーム遊出後に癌細胞の特異的ターゲッティングの「スイッチを入れる」ことによってさらに増強することができる。
【００４６】
本発明のリポソームは、ボーラス注射または連続輸液による非経口投与用に処方することができる。注射用処方物は、アンプルでの単位投与形態でまたは防腐剤を加えた複数用量容器で提示することができる。組成物は、油性または水性ビヒクルの懸濁液、溶液またはエマルションのような形態をとることができ、懸濁剤、安定剤および/または分散剤のような処方剤を含むことができる。あるいは、活性成分は、粉末形態として、使用前に例えば、滅菌した発熱物質を含まない水のような適当なビヒクルで再構成することができる。
【００４７】
本発明の一つの態様は、生理活性物質を投与する方法を包含し、該方法は、リポソームを選択することを含んでなり、リポソームは、第一の剛性脂質および第二の剛性脂質であって、それぞれが頭部基と疎水性の尾部とを有し、プロトン化したときにこれらの脂質は特に混和性ではない、第一の剛性脂質および第二の剛性脂質を少なくとも含んでなり、かつ第一または第二の脂質の少なくとも一部と適合する側鎖を有するポリエチレングリコールと結合した脂質を含んでなり、ここで、第一の脂質は両性イオン性脂質であり、第二の脂質は滴定可能な頭部基を有し、組成物は一定のpKaでターゲッティングリガンドを「露出」しかつ一定の低めのpKa値で閉じ込められた生理活性物質を放出するのに適しており、少なくとも第一の剛性脂質および第二の剛性脂質、およびポリエチレングリコールと結合した脂質を有するリポソーム組成物を用意し、該組成物と生理活性物質とを組合せ、生理活性物質がリポソーム組成物内にあるように治療用リポソームを用意し、治療用リポソームが一定の低めのpKa値において、封入された生理活性物質を放出し、治療用リポソームを患者に投与する、方法を包含する。
【００４８】
本発明によるリポソームは、任意の好適な方法で処方することができる。したがって、本発明は、その範囲内にヒトまたは獣医学で用いる目的で処方された少なくとも1種類のリポソーム化合物を含んでなる医薬組成物を包含する。このような組成物は、生理学的に許容可能なキャリヤーまたは賦形剤と共に、所望により補助的医薬と共に用いる目的で提示することができる。通常のキャリヤーを、本発明で用いることもできる。
【００４９】
免疫応答の克服
免疫原性を克服するため、本発明の一つの態様によれば、リポソームを特定の生物で用いるためにPEGと結合した脂質で修飾する。もう一つの態様によれば、一つの方法は、リポソームの外部膜表面を選択的に特定のターゲット細胞と結合する分子でコーティングすることも含んでなる。これらの分子またはターゲッティング剤は、抗体、ペプチド、遺伝子工学処理した分子、またはそれらの断片でよい。
【００５０】
例えば、卵巣および乳癌細胞の腫瘍ターゲッティングおよびインターナリゼーションを行うため、上記のような癌細胞の表面で過剰発現する抗原をターゲッティングする市販の抗体であるヘルセプチン(Herceptin)でコーティング(免疫標識)することができる。ヘルセプチンは、原則的には卵巣、乳房、肝臓、結腸、前立腺および他の癌細胞をターゲッティングする他の抗体を用いることもできるという予想を証明する目的で選択される。ターゲット細胞は、癌細胞または任意の他の望ましくない細胞であってよい。このような癌細胞の例は、卵巣癌、乳癌またはそれらの転移性細胞に見られるものである。リポソームの特定臓器または組織に対する積極的ターゲッティングは、脂質に腫瘍関連抗原、レクチンまたはそれに結合したペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体または抗体断片を組込むことによって行うことができる。
【００５１】
生理活性物質はリポソームに隔離されているので、ターゲット設定した送達は、ペプチドおよび他のリガンドを添加することによって、多量の薬剤と結合して送達するこれらのリポソームの能力を弱めることなく行われる。リガンドは、簡単かつ新規な方法でリポソームに添加される。最初に、脂質を目的とする生理活性物質と混合する。次いで、リガンドを脂質のあるものの頭部基に化学的に接合し、またはリガンドと結合した脂質をリポソームに直接添加する。
【００５２】
予め形成したリポソームに積極的に装填する必要がある他の生理活性物質については、予め形成したリポソームに生理活性物質を装填する前またはその後にターゲッティングリガンドを用いるリポソームの修飾を行うことができる。
【００５３】
リポソームの調製
リポソームは、Lasic, D. D.,「リポソーム、物理学から応用へ」, Elsevier,アムステルダム(1993年)に詳細に記載されているような様々な手法によって調製することができ、上記文献の手法は、引用することにより本明細書の一部とされる。本発明の裏付けのために調製されたリポソームの特定例は、本明細書において記載されている。典型的には、リポソームは、簡単な脂質−フィルム水和法によって形成することができる。この手順では、適当な有機溶媒に溶解した上記の種類のリポソーム形成脂質の混合物を容器中で蒸発させて薄いフィルムを形成させ、次いでこれを水性媒質によって被覆する。脂質フィルム水和物の粒度は、約0.1〜10ミクロンである。
【００５４】
形成後に、リポソームをサイジングする。リポソームの1つの一層効果的なサイジングの方法は、0.03〜0.2ミクロン、典型的には約0.05、0.08、0.1または0.2ミクロンの範囲の選択された均一な細孔径を有する一連のポリカーボネート膜を介してリポソームの水性懸濁液を押し出すことを含んでいる。膜の細孔径は、この膜を通して押し出すことによって生成したリポソームの最大細孔径におおよそ対応し、詳細にはこの調製物は同一膜を通して2回以上押出される。均質化法も、リポソームの粒度を100nm以下にダウンサイジングするのに有用である。本発明の一態様によれば、リポソームは細孔径が0.1μmのポリカーボネートフィルターを通して押出され、約120nmの近似的範囲の粒径を有するリポソームを生じる。
【００５５】
生理活性物質のリポソームへの組込み
選択した生理活性物質は、脂質フィルムを薬剤の水溶液で水和することによる水溶性化合物の受動エントラップメント、薬剤を含む脂質フィルムを水和することによる親油性化合物の受動エントラップメント、および内側/外側リポソームpHグラディエントに対するイオン化可能な薬剤の装填などの標準的方法によってリポソームに組込むことができる。逆相蒸発リポソーム調製(reverse evaporation phase liposome preparation)のような他の方法も好適である。
【００５６】
別の態様によれば、ターゲット細胞に感受性を有する治療用リポソーム組成物の処方方法を包含する。この方法は、予備形成したリポソームから構成されるリポソーム処方物を選択し、ここで、リポソームは、少なくとも第一の脂質および第二の脂質であって、それぞれが頭部基と疎水性の尾部とを有し、両者がプロトン化したときにこれらの脂質は特に混和性ではないものを含んでなり、ある型の尾部を有するPEGと結合した脂質を含んでなり、かつ、封入された生理活性物質を有しており；極性の頭部基と、PEGと結合した脂質とは別の型の疎水性の尾部とを有する脂質、および脂質の頭部基に結合したターゲッティングリガンドから構成されるターゲッティング接合体を、複数のターゲッティング接合体から選択し；リポソーム処方物と選択したターゲッティング接合体とを組み合わせて治療用のターゲット細胞pH感受性リポソーム組成物を形成することを含む。
【００５７】
キット
本発明は、本発明のリポソーム内の試薬を送達することができるリポソーム構造体を含むキットを包含する。このようなキットは、使用者が目的とする生物学的試薬を添加する準備のできたリポソーム構造体を含んでいてもよい。キットは、リポソーム製剤およびリポソーム構造体に添加するための1種類以上の特異的な生物活性試薬をも含んでいてもより。本発明のもう一つのキットは、リポソーム構造体のセットであって、それぞれが特異的な生物活性試薬を含み、一緒にまたは順次に投与したときに、特定の疾患または症状の治療に特に適しているものを含んでなる。
【実施例】
【００５８】
例１
ドメイン形成脂質を含むPEG化脂質を含み、腫瘍間隙pHと同様の条件で活性化するように調整されたビオチン化リポソーム (1モル%DPPE-ビオチン)を製造した。DPPC (16:0)、DSPS (18:0) (1:1モル比)、および5%コレステロールおよび0.1-1.5モル%DSPE-PEG (2000MW)からなる合成リポソームを、様々なpH値で37℃のPSB中でインキュベーションした。
【００５９】
例２
ストレプトアビジンで被覆した磁性マイクロビーズに対する剛性ビオチン化リポソームの結合 (図3、4、5、6、7、8、黒印)を、リポソームの循環中の血液のpHに近似したpH 7.4からリポソームが腫瘍中に遊出した後の腫瘍間隙のpHに相当するpH 6.5までの様々なpH値で評価した。結合したリポソームの程度を(総脂質の)0.1〜1.5モル%の範囲のリポソーム組成物におけるPEGと結合した脂質の様々な量について評価し、図3、4、5、6、7、8の白抜き印によって示されるビオチンなしの同一リポソーム(プレインリポソーム)とも比較した。ビオチン化リポソームでは、ビオチンと結合した脂質の量を総脂質の1モル%の一定に保持した(図3は0.1モル%、図4は0.25モル%、図5は0.5モル%、図6は0.75モル%、図7は1.0モル%および図8は1.5モル%のPEGと結合した脂質を含むリポソームを示す)。リポソーム膜をローダミンで標識し、リポソームを磁性ビーズに結合させ、10回の連続的な磁性分離とPBSによる洗浄の後、磁性ビーズをTriton-X 100を含む新鮮なPBS (pH=7.4)中でインキュベーションし、結合した脂質を放出させ、次いでその蛍光強度を測定することによって定量した。結合中のインキュベーション環境のpHの減少に伴う蛍光強度の増加は、親和性マーカーまたはターゲットリガンドが低めのpH環境で露出したことを示していた。
【００６０】
0.25-0.75モル%の範囲のPEGと結合した脂質の比率については、特異的結合効果は生理学的pH=7.4と腫瘍間隙pH=6.7の狭いpH値内で急激な変化を示している(図4、5、6)。表1または図10は、式(I6.5-I7.4)/I7.4x100を用いて総てのPEGと結合した脂質組成物についてpH 7.4とpH 6.5の間で計算した増加率を示している。ターゲットリガンドとしてビオチンと結合した脂質を含むリポソームについてのpH 7.4とpH 6.5の間の結合の最大増加は、0.5モル%のPEGと結合した脂質について観察され、49%と測定された(表1または図10)。
【００６１】
トライ・アンド・エラーを用いるターゲッティングリガンドの分子の大きさ(長さ)(結合残基がリポソームの物理表面から伸びている距離として定義される)によっては、脂質組成物に含まれなければならないPEGと結合した脂質の比率はpH 7.4〜6.5の間の特異的結合の増加を最大とする。様々なpH値での最大結合の条件を最適にするため、イオン化した滴定可能な脂質のpKaを調整した。
【００６２】
詳細には、PEG化脂質の低いモル比(上記具体例については0.25%〜0.75モル%)では、PEG鎖は恐らく「マッシュルーム」型になっており、その「有効」サイズはビオチンのサイズに匹敵するので、ドメイン形成時にはクラスター形成したビオチン分子を利用して結合することができる。高モル比のPEG化脂質(上記実施例に示されるように1%および1.5モル%)では、PEG鎖は徐々に「有効長さ」を伸ばし、(図9に示されるように)グラフト化ビオチンより「高く」なるので、ドメインが形成した後であっても(比較的小さなドメインサイズについて)、ビオチンのターゲットへの結合が伸びたPEG鎖によって「妨げられた」ままである(図9) de Gennes, P. G. 「界面に結合したポリマーのコンホメーション」, Macromolecules 13, 1069-1075 (1980)。これらの結果は、低PEGグラフト化密度(0.25、0.5および0.75モル%)では、リポソーム結合はpH依存性であり、pHの減少と共に増加する。pHは、(アニオン性脂質の選択的プロトン化による)リポソーム膜内の横方向の脂質相分離とドメイン形成を決定する。形成した脂質ドメインは、PEGと結合した脂質をリガンドと結合した脂質から引き離し、リポソームの物理表面上のPEG鎖の有効長さがターゲッティングリガンドの長さより有意に長くなければ、リガンド特異的ターゲッティングを行うことができる。特定の脂質組成物(等モルのDPPCとDSPSの脂質)については、最も敏感なpH依存性の結合挙動が0.5モル%のPEG化リポソームによって示され、pH 7.4とpH 6.5の間では結合が49%増加する。極めて低いPEGグラフト化密度(0.1モル%)では、適切でない立体障害がリポソーム表面を被覆しきれないポリマー鎖によって提供されるので、いずれのpH値でも広汎に結合する(図9)。高めのPEGグラフト化密度(1.0%および1.5モル%、それぞれ図7および図8)では、この実施例で用いたターゲッティングリガンドより長いPEG鎖の有効長さが伸張するため、pH依存性の結合応答は失われる。
【００６３】
例３
示差走査熱量分析法(DSC)を用いたが、この方法は脂質膜の相分離の直接的証拠を提供することができるからである。図11は、同一のリポソーム組成物 (5モル%コレステロールおよび2モル%DSPE-PEGを有する等モルDPPCおよびDSPS)の60℃/時の速度で行った熱走査を示している。pHが7.4から4.0に低下すると、高温側の熱転移による寄与が観察された。低めのpH値における熱転移が高くなることは、クラスター形成した(プロトン化) DSPS脂質(高いTgを有する)が多い脂質相とDSPS脂質が少ない(またはDPPC脂質が一層多い、図11)相の形成が増加することを示唆している。これらの結果は、(帯電した頭部基を有する1つの脂質の種類を有する)異なる炭化水素鎖の長さを有する脂質を含む膜では、脂質混合またはドメイン形成は 滴定可能な脂質での静電反発の程度に影響するpHによって制御されることを示している。
【００６４】
例４
カプセル封入された蛍光内容物、具体的には本実施例ではカルセインの等モル比のDPPCおよびDSPSから構成されるPEG化リポソームからの放出を、カルセイン消光効率測定によって検討した。脂質フィルムを、55mMカルセインを含む1mlリン酸緩衝液(pH 7.4, PBSと等張)で水和した。閉じ込められなかったカルセインは、Sephadex G-50カラム(長さ11cm)を用いてサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって室温で除去し、リン酸緩衝液 (1mM EDTA, pH = 7.4)で溶出した。リポソームからカルセインの放出を評価するため、自己消光性濃度のカルセイン (55mM)を含むリポソームを、様々なpH値のリン酸緩衝液中にて37℃で経時的にインキュベーションした。インキュベーションのための脂質の濃度は0.20μM/mlであった。
【００６５】
リポソームおよび周囲溶液中のその希釈液からのカルセインの放出は、自己消光の除去により蛍光が増加した。カルセイン放出は、リン酸緩衝液(1mM EDTA, pH 7.4)を含むセルに一定量のリポソーム懸濁液を加えることによって様々な時点で測定した。Triton-X 100を添加した前後のカルセイン蛍光(ex: 495nm, em: 515 nm)をFluoromax-2分光蛍光計(Horiba Jobin Yvon, ニュージャージー)を用いて測定し、Triton-X 100の添加前後の蛍光強度の比として定義される消光効率の計算に用いた。経時的に保持される内容物の比率は、下記のようにして計算した。
カルセイン保持率(%) = [(Qt - Qmin)/(Qmax - Qmin)] x 100
上記式中、Qtはカルセイン相当する時点tでの消光効率であり、QmaxはSECによりリポソームを分離した直後の室温におけるリン酸緩衝液 (pH 7.4)での最大カルセイン消光効率であり、Qminは1に等しい最小消光効率である。
【００６６】
図12は、PBS中にて37℃でインキュベーションした等モル量のDPPCおよびDSPS (5モル%コレステロールと2モル% PEG化脂質を有する)から構成されるリポソームによるpH{pH 7.4 (●)、pH 5.5 (○), pH 5.0 (▼), pH 4.0 (▽)}の変化によるカルセインの保持率を示す。図5は、5日間にわたる内容物放出を示す。誤差バーは、2種類のリポソーム製剤の反復測定の標準偏差に対応し、2試料/製剤/時点である。インキュベーションの最初の10分間の内容物保持の初期降下は、恐らくはカプセル封入された溶液と取り囲んでいる溶液との浸透圧と温度の差によるものである。最初の10分後、カプセル封入された内容物はリポソームに安定に保持され、後期エンドソームのリソソーム値に相当する酸性のpH = 4で効果的に放出され、これらのリポソームは、特異結合およびエンドソームインターナリゼーションの後にその治療担持物を効果的に放出することができることを示している。
【００６７】
好ましい態様および添付図の上述の詳細な説明は、例示と説明のためにのみ提示したものである。それらは網羅的であることを意味するものではなく、本発明の範囲および精神を制限しようとするものでもない。態様は、本発明の原理およびその実際の応用を最もよく説明する目的で選択し、記載した。当業者であれば、本発明の範囲および精神から離反することなく本明細書に開示された発明に対して多くの変更を行うことができることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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