(57)【要約】  本発明は、ファージディスプレイ法を用いることによって発見された、ＶＡＰ−１（血管接着タンパク質−１）に結合する新規ペプチドに関する。本発明は、ＶＡＰ−１リガンドとして有用であるペプチドにも関係する。このようなペプチドは、個体に存在する天然タンパク質の一部を構成している。本発明は、特に、白血球表面タンパク質中のペプチド鎖であって、該ペプチド鎖が、ＶＡＰ−１分子のリガンドとして有用であり、それによって白血球の血管内皮への結合を促進するペプチド鎖に関する。さらに、本発明は、インビボでＶＡＰ−１を標的とするための医薬および診断用の組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＣＶＫＷＲＧＶＶＶＣ（配列番号１）またはＣＷＳＦＲＮＲＶＬＣ（配列番号２）を有するペプチド。
【請求項２】
少なくとも４個のアミノ酸が、請求項１記載のペプチドのアミノ酸配列に相同性を示すペプチド。
【請求項３】
個体に存在する天然タンパク質の一部を構成している、単離されたペプチドであって、該ペプチドが、請求項１記載のペプチドであるか、または、少なくとも４個のアミノ酸が、請求項１記載のペプチドのアミノ酸配列に相同性を示すペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが、白血球表面タンパク質の一部を構成しているペプチドである請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが、ＳｉｇｌｅｃもしくはＡＤＡＭ群、または、ＣＤ５８糖タンパク質に属しているタンパク質の一部を構成しているペプチドである請求項３または４記載のペプチド。
【請求項６】
Ｓｉｇｌｅｃタンパク質がＳｉｇｌｅｃ−９である請求項５記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＣＡＲＬＳＬＳＷＲＧＬＴＬＣＰＳ（配列番号３）を有するペプチドである請求項６記載のペプチド。
【請求項８】
Ｓｉｇｌｅｃタンパク質がＳｉｇｌｅｃ−１０である請求項５記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＣＡＴＬＳＷＶＬＱＮＲＶＬＳＳＣ（配列番号４）を有するペプチドである請求項８記載のペプチド。
【請求項１０】
ＡＤＡＭタンパク質がＡＤＡＭ２８である請求項５記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＣＬＥＮＦＳＫＷＲＧＳＶＬＳＲＲＣ（配列番号５）を有するペプチドである請求項１０記載のペプチド。
【請求項１２】
インビボでＶＡＰ−１酵素を標的とするための診断用の組成物であって、該組成物が、該酵素に結合するための能力を有する、ラベル化されたペプチドを含み、そして、ペプチドが、請求項１〜１１のいずれかで定義されるか、または、該ペプチドの修飾物である組成物。
【請求項１３】
インビボで、ＶＡＰ−１に関連した、哺乳動物の疾患または症状を診断するための方法であって、該方法が、哺乳動物に請求項１２記載の組成物を投与すること、およびラベルを検出することを含む方法。
【請求項１４】
炎症の位置が検出される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＶＡＰ−１酵素の活性を調節するための使用のための医薬組成物であって、該組成物が、
ｉ）請求項１〜１１のいずれかで定義されるペプチドもしくは該ペプチドの修飾物、または
ii）請求項１〜１１のいずれかで定義されるペプチドもしくは該ペプチドの修飾物であって、該ペプチドが、さらに、治療的に活性な薬剤に結合されているペプチド
を含む組成物。
【請求項１６】
治療的に活性な薬剤がナノ粒子に組み込まれている請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
治療的に活性な薬剤がＶＡＰ−１阻害剤である請求項１５または１６記載の組成物。
【請求項１８】
ＶＡＰ−１に関連した、哺乳動物の疾患もしくは症状の治療または予防のための方法であって、該方法が、哺乳動物に請求項１５〜１７のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ファージディスプレイ法を用いることによって発見された、新規ペプチドに関する。該ペプチドは、ＶＡＰ−１（血管接着タンパク質−１）に結合する。本発明はまた、ＶＡＰ−１リガンドとして有用であり、かつ個体中に生じる天然タンパク質の一部を形成するペプチドに関する。さらに、本発明は、インビボにおいてＶＡＰ−１を標的とするための医薬および診断用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景を説明するために本明細書中で使用される文献および他の資料、ならびに特には、実施に関するさらなる詳細を提供するための事例は、参考文献として組み入れられる。
【０００３】
ＶＡＰ−１は、いくつかの独特の特性を有するヒト内皮細胞接着分子であり、この特性により他の炎症関連接着分子と区別される。ＶＡＰ−１は、独特のかつ限定された発現パターンを有し、リンパ球の血管内皮への結合を媒介する（Salmi, M.およびJalkanen, S., Science 257: 1407-1409 (1992)）。炎症は、皮膚、消化管および炎症性滑膜への白血球の侵入を媒介する、血管内皮細胞の表面へのＶＡＰ−１の上方調節を誘導する（Salmi, M.およびJalkanen, S., Science 257: 1407-1409 (1992); Salmi, M.ら、J. Exp. Med 178: 2255-2260 (1993); Arvilommi, A.ら、Eur. J. Immunol 26: 825-833 (1996); Salmi, M.ら、J. Clin. Invest. 99: 2165-2172 (1997):（Salmi, M.およびJalkanen, S., J. Exp. Med. 183: 569-579 (1996); J. Exp. Med 186: 589-600 (1997)）。ＶＡＰ−１の最も興味深い特徴の１つは、モノアミン酸化酵素活性を含む細胞外触媒ドメインである（Smith, D.J.ら、J. Exp. Med 188: 17-27 (1998)）。
【０００４】
ヒトＶＡＰ−１  ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定は、それが、銅含有アミン酸化酵素（Ｅ．Ｃ．１．４．３．６）と称されるクラスの酵素と相同性を有する膜貫通型タンパク質をコードしていることを明らかにした。酵素アッセイは、ＶＡＰ−１が、タンパク質の細胞外ドメインに存在するモノアミン酸化酵素（ＭＡＯ）活性を有していることを示している（Smith, D.J.ら、J. Exp. Med. 188: 17-27 (1998)）。したがって、ＶＡＰ−１は、エクト型酵素である。ＶＡＰ−１  ＭＡＯ活性の分析は、ＶＡＰ−１が、セミカルバジド感受性アミン酸化酵素（ＳＳＡＯ）と呼ばれる膜結合性のＭＡＯのクラスに属していることを示した。これらは、アミノ酸配列、補因子、基質特異性および特定の阻害剤に対する感受性によって、広く分布しているミトコンドリアＭＡＯ−ＡおよびＢフラビンタンパク質とは区別される。しかしながら、特定の基質ならびに阻害剤は、ＳＳＡＯおよびＭＡＯ活性の両方に共通である。
【０００５】
血液から組織への白血球の輸送は、微生物に対する通常の免疫応答を引き起こすための必須条件であるだけでなく、悪性形質転換した細胞に対する免疫学的監視のためにも必要である。通常、白血球は、白血球上および内膜上両方の多くの活性化および接着分子を含む、多段階の管外遊出のカスケードを利用して血液を離れる。ＶＡＰ−１は、ローリング、堅固な接着および炎症部位への白血球の様々な部分集合の移動を補助する内皮分子の１つである（Salmi, M.およびS. Jalkanen. 2005. Nat. Rev. Immunol. 5: 760-771）。ＶＡＰ−１は、過酸化水素およびアンモニウムも生成する反応において、対応するアルデヒドへのアミンの酸化性脱アミノ化を触媒する酵素である、セミカルバジド感受性アミン酸化酵素に属する。白血球輸送におけるＶＡＰ−１の接着の役割は、機能阻害ｍＡｂｓまたは酵素阻害剤を使用して、インビトロおよびインビボの炎症モデルにおいて様々に阻害され得る（Salmi, M.およびS. Jalkanen. 2005. Nat. Rev. Immunol. 5: 760-771）。抗ＶＡＰ−１抗体は、ＶＡＰ−１の酵素活性を阻害せず、そして、酵素阻害剤は、ｍＡｂによって規定されるＶＡＰ−１の表面エピトープを変更しない（Koskinen, K., P.J. Vainio, D.J. Smith, M. Pihlavisto, S. Yla-Herttuala, S. JalkanenおよびM.Salmi. 2004. Blood 103: 3388-3395; Bonder, C., M.G. Swain, L.D. Zbytnuik, M.U. Norman, J. Yamanouchi, P. Santamaria, M. Ajuebor, M. Salmi, S. JalkanenおよびP. Kubes. 2005. Immunity 23: 153-163）。したがって、ＶＡＰ−１は、従来型の接着分子（ｍＡｂで規定されるエピトープ）として、および酵素（表面に掲示されている、白血球のアミンと反応することによって）として働くことにより、白血球の管外遊出に関係していると考えられている（Salmi, MおよびS. Jalkanen, 2005. Nat. Rev. Immunol. 5: 760-771）。
【０００６】
ＶＡＰ−１活性を阻害するための様々な方法が開示されている。例えば、国際公開第９３／２５５８２号パンフレットは、ＶＡＰ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体を開示している。国際公開第２００３／０９３３１９号パンフレットは、ヒト化抗ＶＡＰ−１モノクローナル抗体について記載している。
【０００７】
あるいは、ＶＡＰ−１は、阻害剤として小分子を用いることによって拮抗され得る。特許文献、国際公開第２００２／０２０２９０号パンフレット、国際公開第２００２／００２５４１号パンフレット、国際公開第２００３／００６００３号パンフレットおよび国際公開第２００５／０８０３１９号パンフレットは、ＶＡＰ−１活性を調節する特異的なＶＡＰ−１  ＳＳＡＯ阻害剤として有用である、特定のヒドラジノ化合物を開示している。これらの化合物は、急性および慢性の炎症性の症状または疾患の他にも炭水化物代謝、脂肪細胞の分化もしくは機能の異常および平滑筋細胞機能の異常に関連する疾患、ならびに様々な血管疾患の治療に有用であると記載されている。
【０００８】
国際公開第２００６／１２８９５１号パンフレットは、ＶＡＰ−１に結合可能なペプチドであって、７〜９個のアミノ酸の配列を有し、かつ少なくとも１つのリジン残基が配列の中央部分に位置しているペプチドへの、小分子阻害剤の結合を開示している。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の目的は、ＶＡＰ−１リガンドを明確にすることである。ファージライブラリの使用により、ＶＡＰ−１結合ペプチドの構造が明らかとなった。特異的に結合するファージ挿入断片が配列決定され、そして、アミノ酸配列がタンパク質データバンクと比較された。最も重要な標的タンパク質のより長鎖のペプチドがまた、それらのＶＡＰ−１への結合能力に関して試験された。該目的は、特には、白血球の表面タンパク質中のペプチド鎖の位置を特定することであって、該ペプチド鎖は、ＶＡＰ−１分子のリガンドとして作用し、それによって白血球の血管内皮への結合を促進する。
【００１０】
本発明の別の目的は、ＶＡＰ−１のインビボでの位置を診断するのに有用な診断用の組成物を提供することである。アミン酸化酵素の正確な位置に関する知識は、様々な治療方法およびその他の手段を、アミン酸化酵素が存在する組織へと特異的に向けるために特に有用であろう。
【００１１】
さらなる目的は、該ＶＡＰ−１を特異的に標的とする担体を有する医薬組成物を提供することである。担体に結合された治療的に活性な薬剤は、ＶＡＰ−１によって影響をうける組織の正確な局所治療に有用であり、そして、該医薬組成物は、したがって、ＶＡＰ−１に関連した疾患または症状の正確な局所治療または予防を目的としている。
【００１２】
したがって、ある局面では、本発明は、アミノ酸配列ＣＶＫＷＲＧＶＶＶＣ（配列番号１）またはＣＷＳＦＲＮＲＶＬＣ（配列番号２）を有する新規ペプチドに関する。
【００１３】
別の局面では、本発明は、少なくとも４個のアミノ酸が、アミノ酸配列ＣＶＫＷＲＧＶＶＶＣ（配列番号１）またはＣＷＳＦＲＮＲＶＬＣ（配列番号２）を有するペプチドのアミノ酸配列に相同性を示すペプチドに関する。
【００１４】
３番目の局面では、本発明は、個体に存在する天然タンパク質の一部を構成しているペプチドであって、該ペプチドが、ＣＶＫＷＲＧＶＶＶＣ（配列番号１）もしくはＣＷＳＦＲＮＲＶＬＣ（配列番号２）であるか、または、少なくとも４個のアミノ酸が、ペプチドＣＶＫＷＲＧＶＶＶＣ（配列番号１）もしくはＣＷＳＦＲＮＲＶＬＣ（配列番号２）のアミノ酸配列に相同性を示すペプチドに関する。
【００１５】
４番目の局面では、本発明は、インビボでＶＡＰ−１酵素を標的とするための診断用の組成物であって、該組成物が、ラベル化されたペプチドであって、該ペプチドが、上記で定義されるか、またはその修飾物であるペプチドを含む組成物に関する。
【００１６】
５番目の局面によれば、本発明は、ＶＡＰ−１に関連した、哺乳動物の疾患または症状をインビボで診断するための方法であって、該方法が、哺乳動物に本発明の組成物を投与すること、および、ラベルを検知することを含む方法に関する。
【００１７】
６番目の局面によれば、本発明は、ＶＡＰ−１酵素の活性を調節するための使用のための医薬組成物であって、該組成物が、
ｉ）上記で定義されるか、もしくは修飾されたペプチド、または
ii）上記で定義されるか、もしくは修飾されたペプチドであって、該ペプチドがさらに治療的に活性な薬剤に結合されているペプチド
を含む組成物に関する。
【００１８】
７番目の局面によれば、本発明は、ＶＡＰ−１に関連した、哺乳動物の疾患もしくは症状の治療または予防のための方法であって、該方法が、哺乳動物に本発明の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】ファージディスプレイライブラリより選択される２つのペプチドは、ＶＡＰ−１に結合する。ファージは、組換えＶＡＰ−１で被覆されたウェルを用いて選択された。特異的に結合されたファージは、ウェルから低ｐＨで溶出され、そして、細菌がこれらのファージを用いて感染させられた。３回および４回のパンニング法の後、ランダムに選択されたファージクローンが、配列分析された。同じペプチドをコードしているクローンの数が、かっこ内に示されている。
【図１Ｂ】ファージディスプレイライブラリより選択される２つのペプチドは、ＶＡＰ−１に結合する。ＶＡＰ−１に結合するファージ由来の配列に一致する、ビオチン化された合成ペプチドは、ＶＡＰ−１に結合した。結合されたペプチドは、ストレプトアビジン共役二次試薬を用いて検出された。結果は、３回の独立した実験かつそれぞれの実験における３つのウェルからの平均±ＳＥＭである。**Ｐ＜０．０１。
【図２】Ｓｉｇｌｅｃ−１０のアミノ酸配列（Ｐ３）およびＳｉｇｌｅｃ−９のアミノ酸配列（Ｐ５）に一致する、２つのより長鎖のペプチドは、ＶＡＰ−１に結合する。マイクロタイターウェルは、１μｇ／ｍＬのＶＡＰ−１または対照としてのＢＳＡで被覆され、そして、図中に示されている濃度のペプチドが、これらのウェル中でインキュベートされた。ビオチン化ペプチドの結合が、ストレプトアビジン共役二次試薬を用いて検出された。結果は、３回の独立した実験かつそれぞれの実験における３つのウェルからの平均±ＳＥＭである。**Ｐ＜０．０１。
【図３Ａ】Ｓｉｇｌｅｃ−１０は、ＶＡＰ−１のカウンター受容体である。ＥＬＩＳＡが、組換えＶＡＰ−１がＳｉｇｌｅｃ−１０−Ｉｇ−キメラに結合するかどうかを試験するために使用された。Ｓｉｇｌｅｃ−１０−Ｉｇ−キメラは、抗ヒトＩｇＧ抗体を介してマイクロタイターウェルへ固定された。１μｇ／ｍＬのＶＡＰ−１が、これらのウェル中でインキュベートされ、そして、ＶＡＰ−１の結合が、ビオチン化された抗ＶＡＰ−１抗体、ＴＫ−８−１８および２二次抗体、ＨＲＰ共役ストレプトアビジンを用いて測定された。結果は、それぞれ３つのウェルを使用する３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭである。
【図３Ｂ】Ｓｉｇｌｅｃ−１０は、ＶＡＰ−１のカウンター受容体である。フローサイトメトリーが、組換えＶＡＰ−１のＳｉｇｌｅｃ−１０を発現している細胞への結合を検出するために使用された。２０μｇ／ｍＬのＶＡＰ−１が、３×１０5個のＳｉｇｌｅｃ−１０を発現している細胞またはモックトランスフェクト対照細胞とともにインキュベートされ、そして、結合が、ポリクローナル抗ＶＡＰ−１抗体およびＦＩＴＣ共役二次抗体を用いて測定された。結果は、２回の独立した実験からの、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の平均±ＳＥＭである。
【図３Ｃ】Ｓｉｇｌｅｃ−１０は、ＶＡＰ−１のカウンター受容体である。Ｓｉｇｌｅｃ−１０を発現している細胞の、ＶＡＰ−１を発現している細胞への結合。ＶＡＰ−１を発現している細胞および対照細胞が、９６穴組織培養プレート中に植えつけられ、そして、コンフルエンスまで増殖された。Ｓｉｇｌｅｃ−１０を発現している細胞は、蛍光色素を用いてラベル化され、そして、ＶＡＰ−１を発現している細胞および対照細胞が植え付けられているウェル中でインキュベートされた。結合は、蛍光光度計を用いて検出された。結果は、それぞれ２つのウェルを使用する７回の独立した実験からの、蛍光強度（ＦＩ）の平均±ＳＥＭである。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。
【図４】ＶＡＰ−１およびＳｉｇｌｅｃ−１０の間の相互作用は、抗ＶＡＰ−１抗体のＶＡＰ−１への結合を妨げる。ＶＡＰ−１を発現している細胞および対照細胞が、初めに、ヒトＩｇ（ｈＩｇ）またはＳｉｇｌｅｃ−１０−Ｉｇのどちらかとともにインキュベートされ、そしてその後、抗ＶＡＰ−１ｍＡｂまたは陰性対照ｍＡｂを用いて染色された。細胞はその後、フローサイトメトリーによって分析された。抗ＶＡＰ−１ｍＡｂを用いて陽性に染色された細胞の割合が、左上の象限に示されている。
【図５】ＶＡＰ−１およびＳｉｇｌｅｃ−１０の間の相互作用は、ＶＡＰ−１またはＳｉｇｌｅｃ−１０のどちらかを発現している細胞の表面上のシアリン酸に依存しない。ＶＡＰ−１を発現している細胞および対照細胞が、９６穴組織培養プレート中に植えつけられ、そして、コンフルエンスに達せられた。いくつかのＶＡＰ−１を発現している細胞および対照細胞およびＳｉｇｌｅｃ−１０を発現している細胞が、シアリン酸を除去するためにシアリダーゼを用いて処理された。シアリダーゼ処理後、Ｓｉｇｌｅｃ−１０を発現している細胞が、蛍光色素を用いてラベル化され、そして、ＶＡＰ−１を発現している細胞および対照細胞が植えつけられているウェル中でインキュベートされた。結合は、蛍光光度計を用いて検出された。結果は、それぞれ２つのウェルを使用する４回の独立した実験からの、蛍光強度（ＦＩ）の平均±ＳＥＭである。
【図６】ＶＡＰ−１およびＳｉｇｌｅｃ−１０の間の相互作用は、ＶＡＰ−１の酵素活性を変化させる。ＣＨＯ−ＶＡＰ−１細胞溶解物が、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−Ｉｇ−キメラとともに、または、対照とともにインキュベートされ、そして、酵素活性が、放射化学的方法を用いて測定された。２回の独立した実験からの、平均活性±ＳＥＭが示されている。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義：
用語「治療」または「治療すること」とは、疾患もしくは症状の完全な治癒、ならびに該疾患もしくは症状の改善もしくは緩和をも含むと理解されるものとする。
【００２１】
用語「予防（prevention）」とは、完全な予防、予防（prophylaxis）、ならびに個体の該疾患または症状を発症する危険性を低下させることをも含むと理解されるものとする。
【００２２】
用語「哺乳動物」とは、ヒトまたは動物の被験個体を指す。
【００２３】
用語「治療的に活性な薬剤」とは、本明細書中では、いかなる幾何異性体、立体異性体、ジアステレオマー、ラセミ体または異性体の混合物、および化合物の薬学的に許容され得るいかなる塩をも網羅すると理解されるものとする。
【００２４】
好ましいペプチド：
本発明は、ＣＸ８Ｃ挿入断片であって、Ｘはいかなるアミノ酸でもよく、かつ、Ｃがシステインである挿入断片を掲示しているペプチドライブラリを用いて行われたファージディスプレイの研究に基づく。システインユニットは、環状ペプチドを提供するための硫黄架橋を形成する。使用されたファージベクターはｆＵＳＥ５であって、ｆｄファージ誘導体である。ペプチドの遺伝子配列は、ｐIII表面タンパク質の遺伝子に結合されており、したがって、ファージｐIII表面タンパク質は、融合タンパク質である。
【００２５】
増幅された一次ライブラリは、標的タンパク質ＶＡＰ−１と相互作用させられた。特異的に結合したファージが細菌中で増幅され、そして、ファージが沈殿された。特異的に結合したファージの挿入断片が配列決定され、そして、アミノ酸配列がタンパク質データベースと比較された。
【００２６】
配列決定は、ＶＡＰ−１に特異的に結合する２つのペプチド、ＣＶＫＷＲＧＶＶＶＣ（配列番号１）およびＣＷＳＦＲＮＲＶＬＣ（配列番号２）を与えた。下記に示される結果に基づいて、本発明者らは、ＶＡＰ−１への特異的な結合は、これらの特異的な配列のみに限定されないと考えている。代わりに、少なくとも４個のアミノ酸、好ましくは５、６、７、８または９個のアミノ酸が、ペプチドＣＶＫＷＲＧＶＶＶＣ（配列番号１）もしくはＣＷＳＦＲＮＲＶＬＣ（配列番号２）のアミノ酸配列に相同性を示す全てのペプチド。
【００２７】
ＶＡＰ−１リガンドは、個体に存在する天然タンパク質の一部を構成しているペプチドであって、該ペプチドが、ＣＶＫＷＲＧＶＶＶＣ（配列番号１）もしくはＣＷＳＦＲＮＲＶＬＣ（配列番号２）であるか、または、少なくとも４個のアミノ酸が、ペプチドＣＶＫＷＲＧＶＶＶＣ（配列番号１）もしくはＣＷＳＦＲＮＲＶＬＣ（配列番号２）のアミノ酸配列に相同性を示すペプチドであり得る。
【００２８】
天然タンパク質は、好ましくは、白血球表面タンパク質である。
【００２９】
天然タンパク質の特に好ましい群は、例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−９もしくはＳｉｇｌｅｃ−１０などのＳｉｇｌｅｃ群；または、ＡＤＡＭ２８などのＡＤＡＭ群；または、ＣＤ５８糖タンパク質である。
【００３０】
特に興味深いペプチドは、Ｓｉｇｌｅｃ−９タンパク質の一部であるＣＡＲＬＳＬＳＷＲＧＬＴＬＣＰＳ（配列番号３）；Ｓｉｇｌｅｃ−１０タンパク質の一部であるＣＡＴＬＳＷＶＬＱＮＲＶＬＳＳＣ（配列番号４）；およびＡＤＡＭ２８タンパク質の一部であるＣＬＥＮＦＳＫＷＲＧＳＶＬＳＲＲＣ（配列番号５）である。
【００３１】
好ましいラベル：
診断用の組成物において、ラベルは、インビボにおける使用に適した、検出可能な、いかなるラベルでもあり得る。したがって、ラベルは、例えば蛍光ラベル、またはより好ましくは、放射性同位体であってもよい。
【００３２】
好ましい医薬組成物：
ペプチドそれ自体が、治療に用いられてもよいが、それらの修飾型が好ましいと考えられている。非修飾のペプチドは、インビボにおいて迅速なタンパク質分解を受けることが知られており、生物学的バリアを貫通することへの困難性、貧弱な化学的安定性、低い水溶性を有するかもしれず、そして、体循環において短すぎる半減期を有しているかもしれない。このような欠点を克服するために、ペプチドは、例えば、化学的に修飾され得るか、または、プロドラッグとして投与され得る。単語「修飾」とは、ペプチドのプロドラッグをもまた含むと理解されるものとする。インビボ使用のためのペプチドの修飾は、当該技術分野において広く公知である。例えば、R OliyaiおよびVJ Stella, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1993, 32: 521-44を参照のこと。
【００３３】
ペプチドに結合された治療的に活性な薬剤は、任意の薬剤とすることができる。最も好ましくは、治療的に活性な薬剤は、ＶＡＰ−１阻害剤またはＶＡＰ−１基質であり、特にはＶＡＰ−１阻害剤である。もし、例えば、ペプチド自体がＶＡＰ−１阻害剤である場合、結合された治療的に活性な薬剤もまた、ＶＡＰ−１阻害剤である。
【００３４】
薬剤分子は、適切なカップリング基を用いることによるなどの公知の方法でペプチドに結合されることができる。そのような基は、例えば、アミノ、イミノ、アミド、イミド、チオ、カルボニル、カルボキシルなどの基、および該基の誘導体であり得る。１つの適切な特異的な結合基の例として、ドキソルビシンをペプチドにカップリングさせるのに使用されている、１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルビジイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシニミドを挙げることができる（W Arapら、Science Vol. 279, 16 Jan 1998, pp. 377-380）。必要ならば、リンカー基がまた、例えばペプチドおよび前述のカップリング基の間に、そうしなければ立体障害またはその他の理由により困難であろうカップリングを容易にするために、挿入され得る。このようなリンカーは、当該技術分野において広く公知である。その最も単純な形として、リンカーは適切な長さの炭化水素鎖であり得る。
【００３５】
別の選択肢によれば、薬剤分子は、粒子、特にはリポソームまたはナノ粒子、特には、薬物分子を制御された速度で遊離する能力を有する高分子ナノ粒子などのビヒクルに組み込むことができる。したがって、薬剤分子のペプチドへの結合は、薬剤分子が直接ペプチドに結合してはいないが、その代わりにビヒクルを介してペプチドに結合しているというこの選択肢をも含むと理解されるものとする。
【００３６】
ナノ粒子に組み込まれた、修飾されたペプチドおよび薬剤の組み合わせが、好ましいと考えられる。
【００３７】
アミン酸化酵素阻害剤に反応性の疾患または症状：
その治療または予防が、ＶＡＰ−１酵素を阻害することによって恩恵を得るであろう疾患または症状の群の例として、炎症性疾患または症状；炭水化物代謝に関連した疾患；脂肪細胞の分化もしくは機能における異常または平滑筋細胞機能における異常に関連した疾患および血管疾患を挙げることができる。しかしながら、疾患または症状はこれらの群に制限されない。
【００３８】
一実施態様によれば、炎症性疾患または症状は、結合組織の炎症性疾患または症状、例えば、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節炎、変形性関節症（osteoarthritis）もしくは変形性関節症（degenerative joint disease）、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、ベーチェット病、再発性多発性軟骨炎、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、全身性硬化症、好酸球性筋膜炎、多発性筋炎および皮膚筋炎、リウマチ性多発性筋痛、脈管炎、側頭動脈炎、結節性多発性動脈炎、ウェグナー肉芽腫症、混合結合組織病、もしくは若年性関節リウマチなどであり得るが、これらに制限はされない。
【００３９】
別の実施態様によれば、該炎症性疾患または症状は、胃腸の炎症性疾患または症状、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群（痙攣性結腸）、肝臓の繊維性疾患、口腔粘膜の炎症（口内炎）、もしくは再発性アフタ性口内炎などであるが、これらに制限はされない。
【００４０】
３番目の実施態様によれば、該炎症性疾患または症状は、中枢神経系炎症性疾患または症状、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、もしくは虚血性脳卒中に関連した虚血性再灌流障害などであるが、これらに制限はされない。
【００４１】
４番目の実施態様によれば、該炎症性疾患または症状は、肺の炎症性疾患または症状、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患もしくは成人呼吸促進症候群などであるが、これらに制限はされない。
【００４２】
５番目の実施様態によれば、該炎症性疾患または症状は、皮膚の炎症性疾患または症状、例えば、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、バラ色ひこう疹、扁平苔癬もしくは毛孔性紅色ひこう疹などであるが、これらに制限はされない。
【００４３】
６番目の実施様態によれば、該炎症性症状は、組織損傷に関連しているか、または臓器移植もしくは他の外科的手術に起因する。
【００４４】
７番目の実施様態によれば、該炭水化物代謝に関連した疾患は、例えば、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、血管性網膜症、網膜症、腎症、ネフローゼ症候群、多発性神経障害、単神経障害、自律性ニューロパシー、足部潰瘍または関節障害などの疾患であるが、これらに制限はされない。
【００４５】
８番目の実施様態によれば、脂肪細胞の分化もしくは機能または平滑筋細胞機能における異常に関する該疾患は、例えば、アテローム性動脈硬化症または肥満などの疾患であるが、これらに制限はされない。
【００４６】
９番目の実施様態によれば、血管疾患は、例えば、アテローム性動脈硬化症、非アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、末梢動脈閉塞症、閉塞性血栓性血管炎（バーガー病）またはレーノー病および現象などの疾患であるが、これらに制限はされない。
【００４７】
本発明の目的のために、本発明で開示された化合物もしくはそれらの異性体、異性体混合物またはそれらの薬学的に許容しうる塩は、様々な経路によって投与することができる。例えば、投与は、非経口、皮下、静脈内、関節内、包膜内、筋肉内、腹腔内もしくは皮内注射によって、または、経皮、口内、口腔粘膜、眼内の経路によって、または、吸入によってなされ得る。代わりに、または同時に、投与は、経口経路によってなされ得る。特に好ましいのは、経口投与である。適切な経口製剤は、例えば、従来型のまたは徐放性の錠剤およびゼラチンカプセルを含む。
【００４８】
化合物の必要とされる用量は、治療される特定の疾患または症状、症状の深刻度、治療期間、投与経路および使用される特定の化合物によって異なるであろう。
【００４９】
したがって、典型的な用量は、約０．１マイクログラム／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１．０マイクログラム／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ体重の間の用量範囲である。本発明の化合物は、毎日１回の服用で投与されてもよく、また、毎日の総用量が、一日あたり２回、３回もしくは４回の用量に分けられて投与されてもよい。
【００５０】
本発明は、以下の非制限的な実験の部によって、明確に説明されるであろう。
【実施例】
【００５１】
実験の部
材料および方法：
抗体およびその他の試薬
モノクローナル抗体ＴＫ８−１８およびＪＧ２．１０ならびにヒトＶＡＰ−１に対するポリクローナル抗体が使用された。ストレプトアビジン−ＨＲＰ共役体は、ＢＤバイオサイエンス（サンノゼ、カリフォルニア、ＵＳＡ）より、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）およびＦＩＴＣ共役抗ウサギＩｇＧは、シグマ（セントルイス、ミズーリ、ＵＳＡ）より、アレクサ（Alexa）４８８共役抗ＦＩＴＣ、アレクサ５４６共役抗ラットＩｇＧおよびプロロング  アンタイフェイド  ゴールド（Prolong Antifade Gold）は、モレキュラー  プローブス（ユージーン、オレゴン、ＵＳＡ）より得た。ＣＦＳＥは、インビトロジェンより、そして、ＢＭケミルミネッセンスＥＬＩＳＡ基質は、ロッシュ（バーゼル、スイス）より得た。セミカルバジドおよびクロルジリンは、シグマより購入された。
【００５２】
ファージディスプレイスクリーニング
ファージディスプレイスクリーニングは、ＣＸ８Ｃ挿入断片（Ｘはいかなるアミノ酸でもよく、かつ、Ｃがシステインである）を掲示しているペプチドライブラリを用いて行われた。組換えヒトＶＡＰ−１（１００マイクログラム／ｍＬ  ＴＢＳ）が、ヌンク  マキシソープ９６穴プレート（Nunc Maxisorp 96-well plates）（フィッシャー  サイエンティフィック）上に、４℃で終夜、被覆された。非特異的結合部位は、ＴＢＳ／３％ＢＳＡで２時間室温でブロックされ、そして、ＴＢＳで３回洗浄された。ファージライブラリ溶液（３×１０9ＴＵ、ＴＢＳ／１％ＢＳＡ中）が、ウェル中で２時間室温でインキュベートされた。その後、ウェルは、ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで、非結合ファージを除くために洗浄された。特異的に結合されたファージは、ウェルから低ｐＨ緩衝液によって溶出され、そして、Ｋ９１ｋａｎ大腸菌を感染させるために使用された。細菌中でのファージの増幅の後、それらは、ポリエチレングライコールとの沈殿によって精製された。さらにあと３回のパンニング法が、より少量のＶＡＰ−１がマイクロタイターウェル上に被覆され（５マイクログラムおよび１マイクログラム）、そして、ファージライブラリがウェル上で室温で１時間のみインキュベートされた以外は同じ方法で実施された。コロニー配列決定のためには、１マイクロリッターのアリコートが、１５ｐｍｏｌ／マイクロリッターのフォーワードプライマー５'−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡＣＣＧＡＴＡＣＡＡＴ−３'（配列番号６）およびリバースプライマー５'−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧＡＴＣＴ−３'（配列番号７）を用いたＰＣＲに使用された。ＰＣＲの条件は、９６℃で５分間、９２℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で６０秒間および７２℃で４分間であって、そして、３５サイクルが行われた。精製されたＰＣＲ生成物の１マイクロリッターのアリコートが、５ｐｍｏｌ／マイクロリッターのどちらか１つのプライマーを用いた配列決定のために採取された。
【００５３】
インビトロ結合アッセイ
ペプチドのＶＡＰ−１への結合。ＶＡＰ−１および陰性対照としてのＢＳＡは、ヌンク  マキシソープ９６穴ＥＬＩＳＡプレートのウェルに、４℃で終夜、固定され、ＰＢＳ／３％ＢＳＡで、１時間３７℃でブロックされ、そして、ビオチン化されたペプチド（１０マイクログラム／ｍＬまたは１００マイクログラム／ｍＬ）ともに２時間室温でインキュベートされた。ウェルは、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄され、ＨＲＰ共役ストレプトアビジンとともに１時間室温でインキュベートされ、そして、洗浄後、ＢＭケミルミネッセンスＥＬＩＳＡ基質が加えられた。発光は、照度計（テーカンウルトラ（Tecan Ultra）、テーカン、チューリッヒ、スイス）を用いて計測された。
【００５４】
ＶＡＰ−１に結合するＳｉｇｌｅｃ  １０−Ｆｃキメラ。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体が、ヌンク  マキシソープのウェル上に、４℃で終夜、被覆された。ＰＢＳ／２％ＢＳＡでブロックされた後、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−Ｉｇ−キメラ（１マイクログラム／ｍＬ）が、そのＦｃ−テイルを介して２時間室温で、ウェルへ固定され、そしてその後、組換えＶＡＰ−１（１マイクログラム／ｍＬおよび５マイクログラム／ｍＬ）が、２時間室温でウェル中でインキュベートされた。ウェルをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ビオチン化された抗ヒトＶＡＰ−１抗体（ＴＫ−８−１８）がウェル中で、１時間室温でインキュベートされ、そしてその後、ウェルは、ＨＲＰ共役ストレプトアビジンとともに１時間室温でインキュベートされた。ウェルを洗浄した後、ＢＭケミルミネッセンスＥＬＩＳＡ基質がウェルに加えられ、そして、発光がテーカン照度計を用いて計測された。
【００５５】
細胞ベースのアッセイ。初めに、ＣＨＯ−Ｓｉｇｌｅｃ−１０遺伝子導入体およびモック対照が、培養フラスコから、短時間のトリプシン−ＥＤＴＡ処理によって分離され、そして、ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ＦＣＳを用いて１回洗浄された。３×１０5のＣＨＯ−Ｓｉｇｌｅｃ−１０またはＣＨＯ−モック細胞が、２０マイクログラム／ｍＬの組換えＶＡＰ−１とともに２時間４℃でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞は、ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ＦＣＳを用いて１回洗浄され、そして、ポリクローナル抗ＶＡＰ−１抗体（１：１０００）とともに、１時間４℃でインキュベートされた。細胞は１回洗浄され、そして、ＦＩＴＣ共役抗ウサギＩｇＧ（１：１０００）（シグマ、セントルイス、ミゾーリ、ＵＳＡ）二次抗体とともに、１時間４℃でインキュベートされた。その後、アレクサ４８８共役抗ＦＩＴＣ抗体が、シグナルを増強するために加えられた。結合は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（ベクトン  ディッキンソン、サンノゼ、カリフォルニア、ＵＳＡ）を用いて、１０4個の細胞を分析することによって測定された。
【００５６】
第２に、ＣＨＯ−ＶＡＰ−１およびＣＨＯ−モック細胞は、９６穴細胞培養プレート中で培養され、そして、コンフルエンスに到達させられた。ウェルをＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて、４℃で２０分間ブロックした後、５０マイクロリッターの、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０中に、２×１０5のＣＦＳＥ−ラベル化ＣＨＯ−Ｓｉｇｌｅｃ−１０細胞が添加された。５％ＣＯ2中、３７℃での３０分間のインキュベーションの後、ウェルは、非接着細胞を除去するために、１００マイクロリッターのＲＰＭＩ  １６４０を用いて、全部で９回洗浄された。それぞれの洗浄後に、接着性が、テーカン蛍光光度計を用いて蛍光を測定することにより定量された。
【００５７】
あるアッセイでは、細胞はノイラミニダーゼ（ロッシュ、バーゼル、スイス）を用いて処理された。細胞は、１ｍＬの、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０中に懸濁され、そして、０．１ｍＵのノイラミニダーゼを用いて、３７℃で１時間処理され、そしてその後、ＲＰＭＩ  １６４０で洗浄された。
【００５８】
エピトープ分析
ＣＨＯ−ＶＡＰ−１およびＣＨＯ−モック細胞の表面染色は、抗ＶＡＰ−１（ＪＧ２．１０）および陰性対照（９Ｂ５）ｍＡｂｓを用いて実施された。競合染色が、１０マイクログラム／ｍＬの、ヒトＩｇまたはＳｉｇｌｅｃ−１０−Ｉｇのいずれかの存在下、行われた。アレクサ５４６共役ヤギ抗ラットＩｇＧが、２次試薬として使用された。全ての細胞は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析された。
【００５９】
酵素同位体アッセイ
Ｓｉｇｌｅｃ−１０との相互作用後の、ＶＡＰ−１のセミカルバジド感受性アミン酸化酵素（ＳＳＡＯ）の酵素活性が、放射化学的に測定された。端的には、１４−Ｃラベル化ベンジルアミン（ＳＳＡＯのモデル基質）が、基質として使用された。アッセイは、１ｍＭのクロルジリン（ＭＡＯ阻害剤）の存在下、ＣＨＯ−ＶＡＰ−１細胞溶解物、および、トレーサーである14Ｃ  ベンジルアミン（４００００ｄｐｍ）を含む５マイクロＭのベンジルアミンを含む、最終的な容量が４００マイクロリッターの、０．１ｍＭのクレブス−リンガーリン酸塩グルコース緩衝液（ｐＨ７．３５）中、３７℃で１２０分間実施された。阻害効果の実験では、溶解物は、ベンジルアミンを添加する前に、１０マイクログラム／ｍＬもしくは７０マイクログラム／ｍＬのＳｉｇｌｅｃ−１０−Ｉｇ−キメラ、または、１ｍＭのセミカルバジドを用いて、３０分間プレインキュベートされた。触媒反応は、クエン酸で停止され、そして、反応生成物であるアルデヒドが、分析された混合物から、０．３５ｇ／Ｌのジフェニルオキサゾールを含むトルエン中に抽出された。１４Ｃ−ラベル化ベンズアルデヒドの量が、ベータカウンター  Ｗａｌｌａｃ−１４０９（ツルク、フィンランド）を用いたシンチレーション計数によって定量化され、そして、酵素の活性が、１ミリリッターの溶解物によって１時間あたりに生成されるベンズアルデヒドのピコモルとして表された。
【００６０】
結果
配列分析
本発明者らは、９６穴プレートに固定された、精製された組換えＶＡＰ−１に対するリガンドを探索するために、ＣＸ8Ｃファージライブラリを使用した。４回のパンニング法の後、本発明者らは、ＢＳＡを陰性対照として使用した対照に比べて、ＶＡＰ−１に結合した４００倍に濃縮されたファージを獲得した。ランダムに選択されたクローンの配列分析によって、２つの異なる配列、ＣＶＫＷＲＧＶＶＶＣ（配列番号１）（ペプチドＰ１）およびＣＷＳＦＲＮＲＶＬＣ（配列番号２）（ペプチドＰ２）が得られた（それらのＶＡＰ−１への結合が、図１Ａに示されている）。
【００６１】
ペプチドＰ１およびＰ２のアミノ酸配列は、タンパク質−タンパク質−ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアライメントサーチツール（basic local alignment search tool））データベース探索に付された。
【００６２】
下記に示される配列比較において、上段の配列は試験されたペプチドのものであり、下段の配列はデータベース中に存在する配列であり、そして、真ん中の行は共通のアミノ酸を示している。＋の印は、アミノ酸が同種のものであることを意味している。数字は、アミノ酸の通し番号を参照している。
【００６３】
配列ＣＶＫＷＲＧＶＶＶＣ（配列番号１）（ペプチドＰ１）のＢＬＡＳＴ探索により、１０３ヒットが得られた。最も良いヒットは：
免疫グロブリンの可変κ鎖
2010514741.tif 000002
【００６４】
もう１つの興味深いヒット：
ＳＩＧＬＥＣ−９（シアリン酸結合性Ｉｇ様レクチン）
2010514741.tif 000003
【００６５】
ペプチドの挿入部分のみ（ＶＫＷＲＧＶＶＶ）（配列番号１２）のＢＬＡＳＴ探索により、１０５ヒットが得られた。最も良いヒットは
ＳＯＳ１（son of sevenless）
2010514741.tif 000004
【００６６】
もう１つの興味深いヒットは：
ＡＤＡＭ２８（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）（a disintegrin and metalloprotease）
2010514741.tif 000005
【００６７】
配列ＣＷＳＦＲＮＲＶＬＣ（配列番号２）（ペプチドＰ２）のＢＬＡＳＴ探索により、１１６ヒットが得られた。最も良いヒットは：
非構成（a non-designed）タンパク質
2010514741.tif 000006
【００６８】
ペプチドＰ２の挿入部分のみ（ＷＳＦＲＮＲＶＬ）（配列番号１８）のＢＬＡＳＴ探索により、１０６ヒットが得られた。最も良いヒットは：
Ｌｉｇｈｔ  ｅａｒタンパク質、アイソフォームＤ
2010514741.tif 000007
【００６９】
その他の興味深いヒットは
ＳＩＧＬＥＣ−１０
2010514741.tif 000008
【００７０】
ＣＤ５８またはＬＦＡ−３
2010514741.tif 000009
【００７１】
より長鎖のペプチド
ＣＶＫＷＲＧＶＶＶＣ（配列番号１）（ペプチドＰ１）およびＣＷＳＦＲＮＲＶＬＣ（配列番号２）（ペプチドＰ２）のファージディスプレイによって得られたペプチドは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＶＡＰ−１に結合することが示された（結果は図１Ａに示されている）。したがって、タンパク質のアミノ酸配列に相当する、より長鎖のペプチドもまた、試験された。ペプチドは、標的タンパク質Ｓｉｇｌｅｃ−９、Ｓｉｇｌｅｃ−１０およびＡＤＡＭ２８に関連する：
2010514741.tif 000010
【００７２】
全ての長鎖ペプチドＰ３およびＰ５のＶＡＰ−１への結合が試験され、そして、結果が図２に示されている。
【００７３】
ＶＡＰ−１に結合するペプチドのためのファージライブラリのスクリーニング
配列ＣＶＫＷＲＧＶＶＶＣ（配列番号１）（ペプチドＰ１）およびＣＷＳＦＲＮＲＶＬＣ（配列番号２）（ペプチドＰ２）のＶＡＰ−１への結合を確認するために、本発明者らは、これらの配列に相当する合成ペプチドの結合を、ＥＬＩＳＡを用いて試験した。これらの実験は、ペプチドが、精製された組換えＶＡＰ−１に、効果的に結合することを示していた（図１Ｂ）。
【００７４】
ファージライブラリスクリーニング由来の配列は、白血球の表面に発現しているいくつかのタンパク質、例えば、シアリン酸結合性Ｉｇ様レクチン、Ｓｉｇｌｅｃ−１０の短い配列（２８８〜２９５残基）などに短い類似性を示した。Ｓｉｇｌｅｃ−１０の大きな細胞外部分は、１つのＩｇ様Ｖ型ドメインおよび３つのＩｇ様Ｃ２型ドメインからなる。ファージライブラリから得られた配列は、細胞外Ｃ２型ドメイン２の一部である。Ｖ型ドメインは、Ｓｉｇｌｅｃおよびシアリン酸の間の相互作用において役割を有することが知られているが、Ｃ２型ドメインの役割は不明である。
【００７５】
次に、２つのより長鎖であるペプチド、Ｓｉｇｌｅｃ−１０のアミノ酸配列（２８４〜２９７残基）に完全に一致するアミノ酸配列を有するＰ３およびＳｉｇｌｅｃ−９に一致するＰ５の、ＶＡＰ−１への結合が試験された。Ｐ３の配列は、ＣＡＴＬＳＷＶＬＱＮＲＶＬＳＳＣ（配列番号４）であった（ペプチドの両末端に、システインが付け加えられた。なぜなら、ファージディスプレイスクリーニング由来の元のペプチドが、システインを有しており、環化していたためである）。Ｐ５の配列は、ＣＡＲＬＳＬＳＷＲＧＬＴＬＣＰＳ（配列番号３）であった。Ｐ３およびＰ５は、ＢＳＡと比べて、精製されたＶＡＰ−１で被覆されたウェルに特異的に結合した（図２）。
【００７６】
インビトロ結合アッセイは、ＶＡＰ−１およびＳｉｇｌｅｃ−１０の間の相互作用を示している
ファージディスプレイの最初の所見を確認するために、本発明者らは、次に、組換えＶＡＰ−１が、Ｓｉｇｌｅｃ−１０タンパク質と相互作用するかどうかを測定した。精製されたＶＡＰ−１およびＳｉｇｌｅｃ−１０−Ｉｇ−キメラを用いた、ＥＬＩＳＡ実験は、Ｓｉｇｌｅｃ−１０−Ｉｇ−キメラがＶＡＰ−１と相互作用することを示した（図３Ａ）。本発明者らは、また、別のタイプの結合アッセイを実施し、そこで、組換えＶＡＰ−１の、Ｓｉｇｌｅｃ−１０を発現している細胞への結合を試験した。結果は、組換えＶＡＰ−１が、Ｓｉｇｌｅｃ−１０を発現している細胞に結合することを示している（図３Ｂ）。次に、本発明者らは、ＶＡＰ−１を発現している細胞およびＳｉｇｌｅｃ−１０を発現している細胞の間の相互作用が、ＶＡＰ−１−Ｓｉｇｌｅｃ−１０依存性の様式で起こるのかどうかを試験した。結果は、先の知見と一貫しており、そして、Ｓｉｇｌｅｃ−１０を発現している細胞は、ＶＡＰ−１を発現している細胞には結合するが、モックトランスフェクト細胞には結合しないことを示した（図３Ｃ）。
【００７７】
Ｓｉｇｌｅｃ−１０−ＩｇまたはヒトＩｇのいずれかの存在下での、ＶＡＰ−１を発現している細胞および対照細胞の、抗ＶＡＰ−１抗体を用いた競合的染色もまた、ＶＡＰ−１およびＳｉｇｌｅｃ−１０の間の相互作用を示唆している。ＶＡＰ−１を発現している細胞が、対照のヒトＩｇとともに、および、抗ＶＡＰ−１抗体とともに、インキュベートされる場合、９０．６％の細胞が陽性であるが、細胞が、初めにＳｉｇｌｅｃ−１０−Ｉｇとともにインキュベートされる場合、４３．７％の細胞のみが陽性である（図４）。陰性対照抗体を用いた場合、および、全ての染色がモックトランスフェクト細胞を用いて行われた場合もまた、細胞は陰性である。これらのデータは、したがって、ＶＡＰ−１を発現している細胞がＳｉｇｌｅｃ−１０−Ｉｇとインキュベートされる場合、それらは相互作用し、そして、ＶＡＰ−１およびＳｉｇｌｅｃ−１０の間の相互作用は、抗ＶＡＰ−１抗体の、細胞表面上に発現されているＶＡＰ−１への結合を部分的に妨げることを示唆している。さらに、これらの結果は、ＶＡＰ−１上のＳｉｇｌｅｃ−１０結合部位が、抗体結合部位と部分的に重なり合っていることを示唆している。
【００７８】
ＶＡＰ−１およびＳｉｇｌｅｃ−１０の間の相互作用は、シアリン酸依存性ではない
ＶＡＰ−１は、高度にシアリン酸化されており、そして、Ｓｉｇｌｅｃは、シアリン酸に結合することが知られているので、本発明者らは、ＶＡＰ−１およびＳｉｇｌｅｃ−１０の間の相互作用がシアリン酸依存性であるかどうかを試験することを望んだ。本発明者らは、ＶＡＰ−１を発現している細胞およびＳｉｇｌｅｃ−１０を発現している細胞の間の接着アッセイを行い、そして、ＶＡＰ−１を発現している細胞をシアリダーゼで、または、Ｓｉｇｌｅｃ−１０を発現している細胞をシアリダーゼで処理した。Ｓｉｇｌｅｃ−１０を発現している細胞のシアリダーゼ処理は、Ｓｉｇｌｅｃ−１０およびＶＡＰ−１の間の相互作用を変化させず、そして、シアリダーゼ処理がＶＡＰ−１を発現している細胞に対して行われた場合も、明白に同じ結果であった（図５）。一方、細胞のシアリダーゼ処理は、バックグラウンドの結合を増加させるようである。以上のことから、結果は、ＶＡＰ−１およびＳｉｇｌｅｃ−１０の間の相互作用は、シアリン酸依存性ではなく、ＶＡＰ−１またはＳｉｇｌｅｃ−１０のいずれかに依存しているが、同時に、シアリン酸が除去された場合、非特異的結合が増加することを示している。
【００７９】
ＶＡＰ−１およびＳｉｇｌｅｃ−１０の間の相互作用は、ＶＡＰ−１の酵素活性を変化させる
ＶＡＰ−１の酵素活性は、炎症部位への白血球の補充に役割を担っていることが知られている。したがって、本発明者らは、ＶＡＰ−１およびＳｉｇｌｅｃ−１０の間の相互作用が、ＶＡＰ−１の酵素活性に影響を及ぼすかどうかを解明することを望んだ。酵素同位体アッセイは、ＶＡＰ−１のＳＳＡＯ活性が、Ｓｉｇｌｅｃ−１０と相互作用させられた場合に、有意に阻害されることを示した（図６）。ＳＳＡＯ活性の２０％の阻害が、１０μｇ／ｍＬ（〜７ｎＭ）のＳｉｇｌｅｃ−１０−Ｉｇ−キメラを用いた場合に、すでに達成された。さらに、７０μｇ／ｍＬ（〜５０ｎＭ）のＳｉｇｌｅｃ−１０−Ｉｇ−キメラの使用により、３０％の阻害が得られたので、ＳＳＡＯ活性の阻害は、容量依存性であった。一方、ＣＤ４４−Ｉｇ−キメラおよびヒトＩｇの対照では、ＶＡＰ−１の酵素活性に対する影響は見られなかった。本発明者らのデータは、したがって、Ｓｉｇｌｅｃ−１０のＶＡＰ−１への結合は、ＶＡＰ−１の酵素活性を抑制することを示唆している。
【００８０】
本発明の方法は、様々な実施態様の形で組み込まれ得ること、それらのごく僅かなもののみが本明細書中に開示されていることは、容易に理解されるであろう。当業者にとっては、その他の実施態様が存在しており、そして、それらが本発明の精神から逸脱することがないことは明らかであろう。したがって、記載された実施態様は、例証であり、そして、限定的に解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
2010514741.tif 000011
【図１Ｂ】
2010514741.tif 000012
【図２】
2010514741.tif 000013
【図３Ａ】
2010514741.tif 000014
【図３Ｂ】
2010514741.tif 000015
【図３Ｃ】
2010514741.tif 000016
【図４】
2010514741.tif 000017
【図５】
2010514741.tif 000018
【図６】
2010514741.tif 000019
【配列表】
2010514741000001.app
【国際調査報告】
2010514741.tif 000020
2010514741.tif 000021
2010514741.tif 000022
2010514741.tif 000023
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