(57)【要約】  本発明の様々な実施形態は、解析のために生物試料を最適に染色する方法およびシステムを提供する。一実施形態では、染色試薬および脱色試薬の接触の前後に試料の画像が記録される。次いで、染色および脱色試薬の接触の前後に記録された試料の画像の比較に少なくとも部分的に基づいて、差分画像が生成される。次いで、試料中の少なくとも１つの関心のあるターゲットを使用者がよりよく区別することを可能にすることができる試料の最終画像を生成するために、試薬を最適に再接触させることができるように、この差分画像に少なくとも部分的に基づいて、染色および脱色試薬の接触パラメータが補正される。一例では、本発明の実施形態が、グラム陽性菌だけまたはグラム陰性菌だけを示す画像の生成を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料の染色手順を実行する方法であって、
前記試料の第１の画像を記録すること、および
染色された複数の実体を含む染色された試料を調製するため、前記試料に染色剤を接触させること
を含み、
前記染色された複数の実体は、染色された複数の実体と外面が染色された複数の実体のうちの少なくとも一方を含み、
さらに、
前記染色された試料の第２の画像を記録すること、
少なくとも１つの前記染色された実体の表面上における位置を決定するため、前記第２の画像を前記第１の画像と比較することにより、第１の差分画像を生成すること、
前記外面が染色された実体から少なくとも一部の前記染色試薬が除去された部分脱色試料を調製するため、前記染色された試料に脱色剤を接触させること、
前記部分脱色試料の第３の画像を記録すること、
少なくとも１つの前記外面が染色された実体の表面上における位置を決定するため、前記第３の画像を前記第２の画像と比較することにより、第２の差分画像を生成すること、および
前記染色された実体を実質的に脱色することなく、前記外面が染色された実体を実質的に脱色するために、前記部分脱色試料に前記脱色剤を接触させることができる暴露時間を決定するため、前記第２の差分画像を解析すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記外面が染色された実体が実質的に脱色されており、前記染色された実体が実質的に脱色されていない実質的に脱色された試料を調製するため、決定された前記暴露時間の間、前記部分脱色試料に前記脱色剤を接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記実質的に脱色された試料の第４の画像を記録すること、
前記第４の画像を前記第２の画像と比較することにより、少なくとも１つの前記外面が染色された実体の表面上における位置を示す第３の差分画像を生成すること、および
前記第４の画像を前記第１の画像と比較することにより、少なくとも１つの前記染色された実体の表面上における位置を示す第４の差分画像を生成すること
をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料の前記第１の画像を記録する前に、前記試料を洗浄液で洗浄することをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記外面が染色された実体の形態を解析することをさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記染色された実体の形態を解析することをさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記染色剤はグラム染色剤を含み、前記外面が染色された実体は複数のグラム陰性菌を含み、前記染色された実体は複数のグラム陽性菌を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
生物試料の染色手順を実行するシステムであって、
染色剤の供給源および脱色剤の供給源と流体連通したチャネルを画定したフローチャンバであり、前記試料と使用可能に係合するように構成された表面を含むフローチャンバと、
前記フローチャンバ、前記染色剤の前記供給源および前記脱色剤の前記供給源と流体連通した流体システムと
を備え、
前記流体システムは、染色された複数の実体を含む染色された試料を調製するため、前記試料に前記染色剤を接触させるように構成されており、前記染色された複数の実体は、染色された複数の実体と外面が染色された複数の実体のうちの少なくとも一方を含み、
前記流体システムはさらに、前記外面が染色された実体から少なくとも一部の前記染色剤が除去された部分脱色試料を調製するため、前記染色された試料に前記脱色剤を接触させるように構成されており、
さらに、
前記フローチャンバに隣接して配置された画像化システムであり、前記染色剤と前記脱色剤のうちの少なくとも一方の前記接触の前、最中および／または後に、前記試料の少なくとも１つの画像を記録するように構成された画像化システムと、
前記画像化システムおよび前記流体システムと通信するコントローラ装置であり、前記染色剤と前記脱色剤のうちの少なくとも一方の前記接触を、前記少なくとも１つの画像に少なくとも部分的に基づいて制御するように構成されたコントローラ装置と
を備えることを特徴とするシステム。
【請求項９】
前記画像化システムは前記試料の第１の画像を記録するように構成されており、
前記画像化システムはさらに、前記流体システムを使用して前記試料に前記染色剤を接触させた後に、前記染色された試料の第２の画像を記録するように構成されており、
前記画像化システムはさらに、存在する場合に、少なくとも１つの前記染色された実体の前記表面上における位置を決定するため、前記第２の画像を前記第１の画像と比較することにより、第１の差分画像を生成するように構成されており、
前記画像化システムはさらに、前記流体システムを使用して前記脱色剤を接触させた後に、前記部分脱色試料の第３の画像を記録するように構成されており、
前記画像化システムはさらに、存在する場合に、少なくとも１つの前記外面が染色された実体の位置を決定するため、前記第３の画像を前記第２の画像と比較することにより、第２の差分画像を生成するように構成されており、
前記画像化システムはさらに、前記染色された実体を実質的に脱色することなく、前記外面が染色された実体を実質的に脱色するために、前記部分脱色試料に前記脱色剤を接触させることができる暴露時間を決定するため、前記第２の差分画像を解析するように構成されている
ことを特徴とする請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記フローチャンバは、前記試料と使用可能に係合する前記表面を画定したスライドを受け取るように適合されており、前記フローチャンバは、スライド開口を画定したフローチャネルハウジングを備え、前記スライド開口は、前記スライドが前記スライド開口の中に配置されたときに、前記試料が、前記スライドと前記フローチャネルハウジングの間に実質的に配置されるように前記スライドを受け取るように構成されており、前記フローチャネルハウジングは、前記スライドと前記フローチャネルハウジングの間に前記試料が配置されている間に、前記画像化システムが前記試料の少なくとも１つの画像を記録することができるように、実質的に透光性の材料を含むことを特徴とする請求項８に記載のシステム。
【請求項１１】
前記画像化システムは、
前記スライドと前記フローチャネルハウジングの間に前記試料が配置されている間に、前記試料の前記少なくとも１つの画像を記録するように構成されたカメラ装置と、
前記カメラ装置と動作可能に係合したアクチュエータ装置であり、前記フローチャンバに対する前記カメラ装置の位置を調整するように構成されたアクチュエータ装置と
を備えることを特徴とする請求項８に記載のシステム。
【請求項１２】
前記流体システムはさらに、存在する場合に、前記外面が染色された実体が実質的に脱色されており、存在する場合に、前記染色された実体が実質的に脱色されていない実質的に脱色された試料を調製するため、前記フローチャンバと協働して、決定された前記暴露時間の間、前記部分脱色試料に前記脱色剤を接触させるように適合されていることを特徴とする請求項８に記載のシステム。
【請求項１３】
前記画像化システムはさらに、
前記実質的に脱色された試料の第４の画像を記録し、
前記第４の画像を前記第２の画像と比較することにより、存在する場合に、少なくとも１つの前記外面が染色された実体の位置を示す第３の差分画像を生成し、
前記第４の画像を前記第１の画像と比較することにより、少なくとも１つの前記染色された実体の位置を示す第４の差分画像を生成する
ように構成されていることを特徴とする請求項９に記載のシステム。
【請求項１４】
前記画像化システムは、前記第２の差分画像を解析するように構成された画像処理コンピュータを備えることを特徴とする請求項９に記載のシステム。
【請求項１５】
前記画像化システムは、前記第１の差分画像、前記第２の差分画像、前記第３の差分画像および前記第４の差分画像のうちの少なくとも１つの画像を生成するように構成された画像処理コンピュータを備えることを特徴とする請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記画像処理コンピュータは、前記第１の差分画像、前記第２の差分画像、前記第３の差分画像および前記第４の差分画像のうちの少なくとも１つの画像を、
画像減算、
画像加算、
画像比計算、および
これらの組合せ
からなるグループから選択されたプロセスを使用して生成するように構成されていることを特徴とする請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記染色剤はグラム染色剤を含み、前記外面が染色された実体は複数のグラム陰性菌を含み、前記染色された実体は複数のグラム陽性菌を含むことを特徴とする請求項８に記載のシステム。
【請求項１８】
生物試料の染色手順を実行するシステムであって、
染色剤の供給源および脱色剤の供給源と流体連通したチャネルを画定したフローチャンバであり、前記試料と使用可能に係合するように構成された表面を含むフローチャンバと、
前記フローチャンバ、前記染色剤の前記供給源および前記脱色剤の前記供給源と流体連通した流体システムと
を備え、
前記流体システムは、染色された複数の実体を含む染色された試料を調製するため、前記試料に前記染色剤を接触させるように構成されており、前記染色された複数の実体は、染色された複数の実体と外面が染色された複数の実体のうちの少なくとも一方を含み、
前記流体システムはさらに、前記外面が染色された実体から少なくとも一部の前記染色剤が除去された部分脱色試料を調製するため、前記染色された試料に前記脱色剤を接触させるように構成されており、
さらに、
前記試料が画像化システムの視野内に配置されるように前記フローチャンバに隣接して配置された画像化システム画像化システム
を備え、
前記画像化システムは、前記染色剤と前記脱色剤のうちの少なくとも一方の接触を監視するように構成されており、
前記画像化システムはさらに、前記脱色剤の第１の接触の前に得られた前記試料の少なくとも１つの画像と、前記脱色剤の前記第１の接触の後に得られた前記試料の少なくとも１つの画像とを比較することにより、差分画像を生成するように構成されており、
前記画像化システムはさらに、前記外面が染色された実体から前記染色された実体をより容易に識別することができるように、前記染色された実体を実質的に脱色することなく、前記外面が染色された実体を実質的に脱色するための前記脱色剤の第２の接触の暴露時間を、前記差分画像に少なくとも部分的に基づいて決定するように構成されている
ことを特徴とするシステム。
【請求項１９】
前記フローチャンバは、前記試料と使用可能に係合する前記表面を画定したスライドを受け取るように適合されており、前記フローチャンバは、スライド開口を画定したフローチャネルハウジングを備え、前記スライド開口は、前記スライドが前記スライド開口の中に配置されたときに、前記試料が、前記スライドと前記フローチャネルハウジングの間に実質的に配置されるように前記スライドを受け取るように構成されており、前記フローチャネルハウジングは、前記スライドと前記フローチャネルハウジングの間に前記試料が配置されている間に、前記画像化システムが前記試料の画像を記録することができるように、実質的に透光性の材料を含むことを特徴とする請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記画像化システムは、
前記スライドと前記フローチャネルハウジングの間に前記試料が配置されている間に、前記試料の画像を記録することができるように構成されたカメラ装置と、
前記カメラ装置と動作可能に係合したアクチュエータ装置であり、前記フローチャンバに対する前記カメラ装置の位置を調整するように構成されたアクチュエータ装置と
を備えることを特徴とする請求項１８に記載のシステム。
【請求項２１】
前記画像化システムは、前記差分画像を生成するように構成された画像処理コンピュータを備えることを特徴とする請求項１８に記載のシステム。
【請求項２２】
前記画像処理コンピュータは、
画像減算、
画像加算、
画像比計算、および
これらの組合せ
からなるグループから選択されたプロセスを使用して前記差分画像を生成するように構成されていることを特徴とする請求項１８に記載のシステム。
【請求項２３】
前記染色剤はグラム染色剤を含み、前記外面が染色された実体は複数のグラム陰性菌を含み、前記染色された実体は複数のグラム陽性菌を含むことを特徴とする請求項１８に記載のシステム。
【請求項２４】
生物試料を最適に染色する方法であって、
試料を、画像化システムの試料ステージと使用可能に係合させること、
前記試料への染色剤および脱色剤の接触の前後に、前記画像化システムを使用して前記試料の画像を記録すること、
前記試料への前記染色剤および前記脱色剤の前記接触の前後に記録された前記試料の前記画像の比較に少なくとも部分的に基づいて、差分画像を生成すること、
前記差分画像に少なくとも部分的に基づいて、前記染色剤と前記脱色剤のうちの少なくとも一方の前記接触を補正すること、
前記補正ステップに従って、前記染色剤と前記脱色剤のうちの少なくとも一方を再び接触させること、ならびに
前記再接触ステップによって識別可能となった前記試料中の少なくとも１つの関心のあるターゲットを区別するため、前記試料の最終画像を生成すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記染色剤はグラム染色剤を含み、前記試料への前記染色試薬の前記接触は、複数のグラム陰性菌を含む外面が染色された複数の実体の存在、および複数のグラム陽性菌を含む染色された複数の実体の存在を示すように構成されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原微生物を検出し、同定する目的で生物材料を染色する方法および装置に関する。より詳細には、本発明は、顕微鏡スライド上で自動グラム染色（Ｇｒａｍ  ｓｔａｉｎ）を実行する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム染色は、現代の微生物実験室において最も頻繁に実行されている手順の１つである。該手順は、細菌を「グラム陽性」または「グラム陰性」に大まかに分類するために使用される。細菌を含む試料を顕微鏡スライドに付着させた後、その試料を、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）とグラムヨウ素（Ｇｒａｍ’ｓ  ｉｏｄｉｎｅ）の組合せなどの染色試薬を使用して処理する。この最初のステップはすべての細菌を濃い青色または青紫色に染色する。「グラム陽性」菌と「グラム陰性」菌の主な違いは、「グラム陽性」試料では染色試薬が細胞構造全体に吸収されるのに対して、「グラム陰性」試料では染色が外面でのみ起こることである。その結果、続いて試料を（酸アルコールなどの）脱色剤で処理すると、グラム陰性菌はその色を失う傾向があり、グラム陽性菌は青色または青紫色に染められたまま残る。
【０００３】
グラム染色は従来から手作業で調製され、分析されている。手作業でのグラム染色は労働集約的であり、熟練した作業者を必要とするものであり、その試料セットの最適な染色特性を達成することができないことがある。最適でない染色は、偽グラム陽性菌および偽グラム陰性菌を生み出す可能性がある。
【０００４】
グラム染色手順を自動化することはこれまでにも様々に試みられている。例えばＷｉｌｋｉｎｓ他の特許文献１を参照されたい。同様に、Ｗｅｓｃｏｒ，Ｉｎｃ．社（米ユタ州Ｌｏｇａｎ）から市販されているＡｅｒｏｓｐｒａｙ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｔａｉｎｅｒは初歩的な自動染色装置である。染色装置にはこのほか、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ社（ドイツ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）から市販されているＭｉｄａｓ  ＩＩＩ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｔａｉｎｅｒ、ＩＵＬ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ社（ドイツ、Ｋｏｅｎｉｇｓｗｉｎｔｅｒ）から市販されているＰｏｌｙ  Ｓｔａｉｎｅｒ、およびＧＧ＆Ｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ社（米テキサス州Ｗｉｃｈｉｔａ  Ｆａｌｌｓ）から市販されており、Ｇｉｂｂｓ他の特許文献２に概要が記載されているＡｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｇｒａｍ  Ｓｔａｉｎｅｒなどがある。しかしながら、これらの機器または技法はいずれも、試料スライドの検査および／または画像処理の前、最中ならびに／あるいは後に、染色剤および／または脱色剤を接触させる（ａｐｐｌｙ）機能を持たない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４０２９４７０号明細書
【特許文献２】米国特許第６４６８７６４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、改良された自動染色法およびシステムが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、様々な実施形態において、生物試料の（例えばグラム染色などの）染色手順の最適化に関する多くの技術的課題を解決する方法およびシステムを提供する。具体的には、一実施形態では、本発明は、試料を染色する方法であって、試料を、画像化システムの試料ステージと使用可能に係合させるステップと、試料への染色試薬および脱色試薬の接触の前後に、画像化システムを使用して試料の画像を記録するステップとを含む方法を提供する。この方法はさらに、試料への染色試薬および脱色試薬の接触の前後に記録された試料の画像の比較に少なくとも部分的に基づいて、差分画像を生成すること、ならびに差分画像に少なくとも部分的に基づいて、染色試薬および脱色試薬の接触を補正することを含む。この方法はさらに、前記補正ステップに従って、染色試薬と脱色試薬のうちの少なくとも一方を再び接触させること、ならびに前記再接触ステップによって識別可能となった試料中の少なくとも１つの関心のあるターゲットを区別するため、試料の最終画像を生成することを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態はさらに、試料の染色手順を実行する方法であって、試料の第１の画像を記録するステップと、染色された複数の実体を含む染色された試料を調製するため、試料に染色剤を接触させるステップとを含む方法を提供する。いくつかの方法実施形態はさらに、第１の画像を記録する前に、（染色剤と脱色剤のうちの少なくとも一方の接触の後に記録された試料の画像と比較するためのベースを提供する）「ゼロ」染色レベルを確立するために、それぞれの試料が洗浄されることを保証するため、試料の第１の画像を記録する前に、試料を洗浄液で洗浄するステップを含む。
【０００９】
染色された複数の実体は、染色された複数の実体と外面が染色された複数の実体のうちの少なくとも一方を含むことができる。このようないくつかの実施形態では、存在する場合に、外面が染色された実体が複数のグラム陰性実体を含み、存在する場合に、染色された実体が複数のグラム陽性実体を含むように、染色剤がグラム染色剤を含むことができる。この方法はさらに、染色された試料の第２の画像を記録すること、および少なくとも１つの染色された実体の表面上における位置を決定するため、第２の画像を第１の画像と比較することにより、第１の差分画像を生成することを含むことができる。
【００１０】
この方法はさらに、外面が染色された実体から少なくとも一部の染色試薬が除去された部分脱色試料を調製するため、染色された試料に脱色剤を接触させること、および部分脱色試料の第３の画像を記録することを含むことができる。この方法はさらに、少なくとも１つの外面が染色された実体の表面上における位置を決定するため、第３の画像を第２の画像と比較することにより、第２の差分画像を生成することを含むことができる。最後に、この方法はさらに、染色された実体を実質的に脱色することなく、外面が染色された実体を実質的に脱色するために、部分脱色試料に脱色剤を接触させることができる暴露時間を決定するため、第２の差分画像を解析することを含むことができる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、この方法がさらに、外面が染色された実体が実質的に脱色されており、染色された実体が実質的に脱色されていない実質的に脱色された試料を調製するため、決定された暴露時間の間、部分脱色試料に脱色剤を接触させることを含むことができる。このようないくつかの実施形態では、この方法がさらに、（１）実質的に脱色された試料の第４の画像を記録すること、（２）第４の画像を第２の画像と比較することにより、少なくとも１つの外面が染色された実体の表面上における位置を示す第３の差分画像を生成すること、および（３）第４の画像を第１の画像と比較することにより、少なくとも１つの染色された実体の表面上における位置を示す第４の差分画像を生成することを含むことができる。染色された実体および外面が染色された実体の位置が、第３の差分画像と第４の差分画像のうちの少なくとも一方において少なくとも部分的に識別可能である方法実施形態では、この方法がさらに、染色された実体および／または外面が染色された実体の形態を解析することを含むことができる。
【００１２】
本発明の様々な実施形態はさらに、試料の最適化された染色手順を実行するシステムを提供することができる。一実施形態では、このシステムは、染色剤の供給源および脱色剤の供給源と流体連通したチャネルを画定するフローチャンバ（ｆｌｏｗ  ｃｈａｍｂｅｒ）を備える。さらに、このようないくつかの実施形態では、フローチャンバが、試料と使用可能に係合するように構成された表面を含むことができる。このシステムはさらに、フローチャンバ、染色剤の供給源および／または脱色剤の供給源と流体連通した流体システム（ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｙｓｔｅｍ）を備えることができる。
【００１３】
このようなシステム実施形態によれば、（例えばフローチャンバと協働する）この流体システムを、染色された複数の実体を含む染色された試料を調製するため、試料に染色剤を接触させるように構成することができ、染色された複数の実体は、染色された複数の実体と外面が染色された複数の実体のうちの少なくとも一方を含む。本発明の様々な方法実施形態に関して上で述べたとおり、存在する場合に、外面が染色された実体が複数のグラム陰性実体を含み、存在する場合に、染色された実体が複数のグラム陽性実体を含むように、染色剤はグラム染色剤を含むことができる。様々なシステム実施形態によれば、（例えばフローチャンバと協働する）この流体システムを、外面が染色された実体から少なくとも一部の染色剤が除去された部分脱色試料を調製するため、染色された試料に脱色剤を接触させるように構成することができる。
【００１４】
様々なシステム実施形態では、フローチャンバを、試料と使用可能に係合する表面を画定したスライドを受け取るように適合させることができる。このような実施形態によれば、フローチャンバはさらに、スライド開口を画定したフローチャネルハウジングを備えることができ、スライド開口は、スライドがスライド開口の中に配置されたときに、試料が、スライドとフローチャネルハウジングの間に実質的に配置されるようにスライドを受け取るように構成される。さらに、フローチャネルハウジングは、スライドとフローチャネルハウジングの間に試料が配置されている間に、画像化システムが試料の画像を記録することができるように、実質的に透光性の材料を含むことができる。
【００１５】
このシステムはさらに、フローチャンバに隣接して配置された画像化システムを備え、試料を画像化システムの視野内に配置されるようにすることができる。このようなシステム実施形態では、画像化システムを、フローチャンバを通した染色剤と脱色剤のうちの少なくとも一方の接触を監視するように構成することができる。さらに、この画像化システムを、脱色剤の第１の接触の前に得られた試料の少なくとも１つの画像と、脱色剤の第１の接触の後に得られた試料の少なくとも１つの画像とを比較することにより、差分画像を生成するように構成することができる。この画像化システムをさらに、外面が染色された実体から染色された実体をより容易に識別することができるように、染色された実体を実質的に脱色することなく、外面が染色された実体を実質的に脱色するための脱色剤の第２の接触の暴露時間を、差分画像に少なくとも部分的に基づいて決定することができるように構成することができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、このシステムがさらに、画像化システムおよび流体システムと通信するコントローラ装置を備えることができる。このコントローラ装置をさらに、染色剤と脱色剤のうちの少なくとも一方の接触を、画像化システムによって生成された画像および／または差分画像に少なくとも部分的に基づいて制御するように構成することができる。
【００１７】
いくつかのシステム実施形態では、画像化システムが、（例えばスライドとフローチャネルハウジングの間などの）フローチャンバ内に試料が配置されている間に、試料の画像を記録することができるように構成されたカメラ装置を備えることができる。このようないくつかの実施形態によれば、画像化システムがさらに、カメラ装置と動作可能に係合したアクチュエータ装置であり、フローチャンバに対するカメラ装置の位置を調整するように構成されたアクチュエータ装置を備えることができる。さらに、いくつかのシステム実施形態では、画像化システムがさらに、差分画像を生成するように構成された画像処理コンピュータを備えることができる。このようないくつかの実施形態では、この画像処理コンピュータを、限定はされないが画像減算、画像加算、画像比計算およびこのようなプロセスの組合せを含むことができるプロセスを使用して差分画像を生成するように構成することができる。
【００１８】
様々な方法実施形態に関して本明細書において概略的に説明されているとおり、画像化システムを、試料の第１の画像を記録し、続いて、フローチャンバと協働する流体システムを使用して試料に染色剤を接触させた後に、染色された試料の第２の画像を記録するように構成することができる。画像化システムをさらに、少なくとも１つの染色された実体（すなわちいくつかの実施形態では「グラム陽性」実体）の表面上における位置を決定するため、第２の画像を第１の画像と比較することにより、第１の差分画像を生成するように構成することができる。さらに、画像化システムを、フローチャンバを使用して脱色剤を接触させた後に、部分脱色試料の第３の画像を記録し、続いて、少なくとも１つの外面が染色された実体（すなわちいくつかの実施形態では「グラム陰性」実体）の位置を決定するため、第３の画像を第２の画像と比較することにより、第２の差分画像を生成するように構成することができる。画像化システムをさらに、染色された実体を実質的に脱色することなく、外面が染色された実体を実質的に脱色するために、部分脱色試料に脱色剤を接触させるべき暴露時間を決定するため、第２の差分画像を解析するように構成することができる。本明細書において記載されているとおり、このようないくつかのシステム実施形態では、フローチャンバをさらに、存在する場合に、外面が染色された実体が実質的に脱色されており、存在する場合に、染色された実体が実質的に脱色されていない、実質的に脱色された試料を調製するため、決定された暴露時間の間、部分脱色試料に脱色剤を接触させるように構成することができる。
【００１９】
このようないくつかのシステム実施形態では、画像化システムをさらに、実質的に脱色された試料の第４の画像を記録し、続いて、第４の画像を第２の画像と比較することにより、第３の差分画像を生成するように構成することができる。第３の差分画像は、少なくとも１つの外面が染色された実体の位置を示すことができる。画像化システムをさらに、第４の画像を第１の画像と比較することにより、第４の差分画像を生成するように構成することができ、第４の差分画像は、少なくとも１つの染色された実体の位置を示す。
【００２０】
したがって、本発明の実施形態において説明された生物材料の染色手順を実行する方法およびシステムは、試料の染色および脱色をよりうまく制御し、かつ／または最適化するため、染色プロセスの間、試料の識別可能な光学的変化を監視することができる方法およびシステムを提供すること、染色および／または脱色ステップ間において識別可能であることがある光学的変化を監視し、試料中のグラム陽性および／またはグラム陰性実体に固有の光学的変化を際立たせることにより、試料中のグラム染色された実体を分類し、試料中のグラム染色された実体の位置を決定することができる特別な方法およびシステムを提供すること、試料中の（例えば病原菌などの）関心のある実体を探索するために染色された試料を解析するときに「偽陽性」および／または「偽陰性」を最小限に抑えることができる独自の方法およびシステムを提供すること、ならびに光学画像化装置によってリアルタイムで監視し、かつ／または制御することができる最適化された染色法およびシステムを提供すること、を含む多くの利点を提供する。ただし利点はこれらに限定されるわけではない。したがって、本発明の様々な実施形態はさらに、完成した（最適化された）染色済み試料スライドを、下流での形態学的調査に対しても同じ画像化装置上に置くことができる「オールインワン（ａｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅ）」染色装置／試料解析ツールを提供することができる。試料調製（すなわち染色）ステップおよび解析ステップのこの完全な統合は、より効率的な実験室処理能力を可能にすることができる。
【００２１】
以上に本発明の概要を説明した。次に添付図面を参照する。添付図面は必ずしも一律の尺度では描かれていない。
【００２２】
図１乃至１０は、本発明の一実施形態による、染色された（すなわち例えばグラム陽性）実体と外面が染色された（すなわち例えばグラム陰性）実体の両方を含む試料の、記録された一連の「シングルライン（ｓｉｎｇｌｅ−ｌｉｎｅ）」画像を示す図である。  
図１１乃至１９は、本発明の一実施形態による、染色された（すなわち例えばグラム陽性）実体だけを含む試料の、記録された一連の「シングルライン」画像を示す図である。  図２０乃至２９は、外面が染色された（すなわち例えばグラム陰性）実体だけを含む試料の、記録された一連の「シングルライン」画像を示す図である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施形態に従って生成された、第１の画像に対応する、未染色試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図２】試料中の染色された実体（すなわちグラム陽性実体）の位置を示す、本発明の一実施形態に基づく試料の「シングルライン」を示す非限定的な概略図である。
【図３】試料中の外面が染色された実体（すなわちグラム陰性実体）の位置を示す、本発明の一実施形態に基づく試料の「シングルライン」を示す非限定的な概略図である。
【図４】本発明の一実施形態に従って生成された、第２の画像に対応する、染色された試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図５】本発明の一実施形態に従って生成された、試料中の染色された実体および外面が染色された実体の位置を際立たせる、第１の差分画像に対応する、試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図６】本発明の一実施形態に従って生成された、第３の画像に対応する、３５％脱色後の試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図７】本発明の一実施形態に従って生成された、試料中の外面が染色された実体に対する３５％脱色の効果を際立たせる、第２の差分画像に対応する、試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図８】本発明の一実施形態に従って生成された、第４の画像に対応する、１００％脱色後の試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図９】本発明の一実施形態に従って生成された、試料中の外面が染色された（すなわち例えばグラム陰性）実体の位置を際立たせる、第３の差分画像に対応する、試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図１０】本発明の一実施形態に従って生成された、試料中の染色された（すなわち例えばグラム陽性）実体の位置を際立たせる、第４の差分画像に対応する、試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図１１】本発明の一実施形態に従って生成された、第１の画像に対応する、未染色試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図１２】試料中の染色された実体（すなわちグラム陽性実体）の位置を示す、本発明の一実施形態に基づく試料の「シングルライン」を示す非限定的な概略図である。
【図１３】試料中の外面が染色された実体（すなわちグラム陰性実体）が存在しないことを示す、本発明の一実施形態に基づく試料の「シングルライン」を示す非限定的な概略図である。
【図１４】本発明の一実施形態に従って生成された、第２の画像に対応する、染色された試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図１５】本発明の一実施形態に従って生成された、試料中の染色された実体の位置を際立たせる、第１の差分画像に対応する、試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図１６】本発明の一実施形態に従って生成された、第３の画像に対応する、３５％脱色後の試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図１７】本発明の一実施形態に従って生成された、試料中に外面が染色された実体が存在しないことをさらに示す、第２の差分画像に対応する、試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図１８】本発明の一実施形態に従って生成された、試料中に外面が染色された（すなわち例えばグラム陰性）実体が存在しないことを際立たせる、第３の差分画像に対応する、試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図１９】本発明の一実施形態に従って生成された、試料中の染色された（すなわち例えばグラム陽性）実体の位置を際立たせる、第４の差分画像に対応する、試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図２０】本発明の一実施形態に従って生成された、第１の画像に対応する、未染色試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図２１】試料中に染色された実体（すなわちグラム陽性実体）が存在しないことを示す、本発明の一実施形態に基づく試料の「シングルライン」を示す非限定的な概略図である。
【図２２】試料中の外面が染色された実体（すなわちグラム陰性実体）の位置を示す、本発明の一実施形態に基づく試料の「シングルライン」を示す非限定的な概略図である。
【図２３】本発明の一実施形態に従って生成された、第２の画像に対応する、染色された試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図２４】本発明の一実施形態に従って生成された、試料中の外面が染色された実体の位置を際立たせる、第１の差分画像に対応する、試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図２５】本発明の一実施形態に従って生成された、第３の画像に対応する、３５％脱色後の試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図２６】本発明の一実施形態に従って生成された、試料中の外面が染色された実体に対する３５％脱色の効果を際立たせる、第２の差分画像に対応する、試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図２７】本発明の一実施形態に従って生成された、第４の画像に対応する、１００％脱色後の試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図２８】本発明の一実施形態に従って生成された、試料中の外面が染色された（すなわち例えばグラム陰性）実体の位置を際立たせる、第３の差分画像に対応する、試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図２９】本発明の一実施形態に従って生成された、試料中に染色された（すなわち例えばグラム陽性）実体が存在しないことを際立たせる、第４の差分画像に対応する、試料の「シングルライン」画像を示す非限定的な図である。
【図３０】試料の染色手順を実行する本発明の一実施形態に基づく方法ステップを要約した非限定的な流れ図である。
【図３１】染色剤および／または脱色剤を試料に接触させるように構成されたフローチャンバに隣接して配置された画像化システムを示す、本発明の一実施形態に基づくシステムの非限定的な概略図である。
【図３２】カメラ装置、アクチュエータ装置、画像処理コンピュータおよびシステムコントローラを含む画像化システムと、フローチャネルとを含む、本発明の一実施形態に基づくシステムの非限定的な概略図である。
【図３３】本発明の一実施形態に基づくフローチャンバを示す非限定的ないくつかの図であり、このフローチャンバは、試料と使用可能に係合する表面を画定したスライドと、スライドを受け取るように構成されたスライド開口を画定したフローチャネルハウジングとを含む。
【図３４】スライドをフローチャンバのフローチャネルハウジングと使用可能に係合させるステップを示す、本発明の一実施形態に基づくフローチャンバの非限定的ないくつかの図である。
【図３５】本発明の一実施形態に基づくフローチャンバおよびフローチャンバに隣接して配置された画像化システムの非限定的な概略図である。
【図３６】試料を最適に染色する本発明の一実施形態に基づく方法の方法ステップを要約した非限定的な流れ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
次に、本発明のすべてではないいくつかの実施形態が示された添付図面を参照して、本発明をより詳細に説明する。実際、本発明は多くの異なる形態で具体化することができ、本発明が、本明細書に記載された実施形態に限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が、適用可能な法律上の要件を満たすように提供される。全体を通じて同様の符号は同様の要素を指す。
【００２５】
本明細書に開示された様々な方法およびシステム実施形態は、グラム染色手順の文脈で説明されるが、本明細書に記載された様々な方法およびシステム実施形態は、試料の光学的変化および／または比色上の変化（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｃｈａｎｇｅ）を生じさせることができる他の多くの染色手順にも適用することができることを理解すべきである。さらに、図１〜２９に示された例示的な画像は２次元画像の１本のラインだけを表すことが強調されるべきである。本発明の様々な方法およびシステム実施形態を実施する際には、例えばスライドと使用可能に係合した試料の２次元画像に結合される、このような多くのラインを処理することができる。さらに、本明細書においてさらに説明するように、いくつかの実施形態では、試料中の複数の細菌、または他の染色された実体（ｅｎｔｉｔｙ）および外面が染色された実体の位置を決定し、それらを分類するため、使用者が、画像化システム（および／またはそれに含まれるカメラ装置８）を利用して、試料スライド上の２つ以上のフィールドにおいて画像を記録することができる。
【００２６】
本明細書で使用される用語「画像を記録する」は、例えばカメラによって捕捉されたアナログ画像に限定されないことも理解すべきである。より詳細には、いくつかの実施形態では、「画像を記憶する」ことが、画像を表し、かつ／または画像に対応するデータを捕捉することを指すことがある。例えば、いくつかの実施形態では、「画像を記録する」ことが、表面上の１つまたは複数の点の色および／または光強度に対応するデジタルデータを集めることを含むことがある。
【００２７】
本発明の様々な方法およびシステム実施形態は、（例えばグラム染色などの）染色プロセスが、試料の識別可能かつ／または検出可能な光学的変化を生み出すことができることを利用することを理解すべきである。染色プロセスの間のこのような変化を、試料が使用可能に係合した（顕微鏡スライドなどの）表面において直接に監視することによって、染色ステップおよびそれに続く脱色ステップを制御し、最適化することができる。本発明のこの態様は特に脱色ステップに適用することができる。例えば、グラム染色プロセスでは、過少な脱色が偽グラム陽性菌を生み出す可能性があり、過度な脱色が偽グラム陰性菌を生み出す可能性があることが知られている。本明細書において説明されているとおり、本発明の様々な実施形態は、（例えばグラム染色プロセスを含む）様々な染色プロセスにおける脱色の程度を向上させるのを助けることができる。
【００２８】
さらに、本発明の様々な実施形態は、試料中のグラム陽性実体およびグラム陰性実体に対して異なって生じる可能性がある識別可能かつ／または検出可能な光学的変化を際立たせて、（限定はされないがグラム染色された細菌実体を含むことができる）これらの実体の分類を可能にするため、差分画像（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｍａｇｅ）（例えば図５、７、９、１０参照）を利用することもできることを理解すべきである。本明細書においてさらに説明されるとおり、本発明の様々なシステムおよび方法実施形態は、例えば、部分脱色ステップの前後（例えば図３０のステップ１０７参照）および／または完全脱色ステップ（例えば図３０のステップ１１２参照）の前後に捕捉されたスライドの画像を比較することによって生成される様々な差分画像を解析することによって、存在する場合に、試料が使用可能に係合した（一般的な顕微鏡スライドなどの）表面上のグラム陽性菌および／またはグラム陰性菌の特定の位置の正確な決定を可能にすることができる。
【００２９】
図３０に概略的に示されているように、本発明の様々な実施形態は、試料（例えば図３４および３５の要素３２参照）に対して（例えばグラム染色手順などの）染色手順を実行する方法を提供することができる。一実施形態では、この方法が、試料３２の第１の画像を記録するステップ１０３を含む。図１は、グラム染色プロセスを最適化するために使用されるある方法実施形態において生成された試料３２の例示的な第１の画像を示し、（例えば図３４に示された顕微鏡スライドによって画定された）表面３０上に固定された未染色試料３２中には、グラム陰性菌およびグラム陽性菌が存在する。本発明の様々な実施形態によれば、ステップ１０３が、未染色試料３２上の異なるフィールドにおいて一連の第１の画像を記録することを含むことができる。図１は、第１の画像を横切る例示的な１本のライン（ｌｉｎｅ）を示していることを理解すべきである。染色試薬を接触させる他の方法ステップ（例えば図３０のステップ１０４参照）は、試料中の実体を概ね青色に着色することを含むことができるため、ステップ１０３では、試料３２と（ＣＣＤカメラ（例えば図３２の要素５および８参照））などのカメラ装置との間に配置された青色フィルタを使用して、図１に概略的に示された第１の画像を記録することができる。
【００３０】
図１の第１の画像は、それをもとに（染色された試料の第２の画像（図４）を第１の画像（図１）と比較することにより）第１の差分画像（例えば図５参照）を生成することができる「ベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）」画像の役目を果たすことができる。この例の目的上、図２および３は、試料中の（例えばそれぞれ試料中に存在するグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対応する）染色された実体および外面が染色された実体の位置を示すことを理解すべきである。例えば、図２は、図１に関して上で説明した同じ１つのライン画像フィールドに沿った、試料中に存在するグラム陽性菌の位置を示す象徴的な図である。図２の文脈において、Ｙ軸上の語「存在」は、空間分解能によってグラム陽性菌を検出する（例えば画像化システムおよび／またはカメラ装置８などの）機能検出器が、図２のＸ軸上に示されたＸ位置において信号を生成するであろうことを意味する。また、図３は、図１に関して上で説明した同じ１つのライン画像フィールドに沿った、試料中に存在するグラム陰性菌の位置を示す象徴的な図である。図３の文脈において、Ｙ軸上の語「存在」は、空間分解能によってグラム陰性菌を検出する（例えば画像化システムなどの）機能検出器が、図３のＸ軸上に示されたＸ位置において信号を生成するであろうことを意味する。
【００３１】
図３０に概略的に示されているように、図１に示された１つまたは複数の第１の画像を記録するステップ１０３の前に、様々な試料調製ステップを実行することができる。例えば、いくつかの方法実施形態は、（顕微鏡スライドなどの）表面に試料または標本を付着させ、この表面に試料を固定するステップ１０１を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、表面を画定する顕微鏡スライド３０上の一般的な試料付着領域３１内に試料３２（例えば図３４参照）を配置し、（例えば熱を巧妙に加えることによって）熱固定することができる。図３４Ｂは、試料３２が付着したスライド３０の例示的な側面図である。
【００３２】
本発明の様々なシステム実施形態に関して本明細書において説明されているとおり、次いで、この調製されたスライド３０を、スライド３０を受け取るように構成されたスライド開口を画定したフローチャネルハウジング（ｆｌｏｗ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｈｏｕｓｉｎｇ）（概要は図３４Ｂおよび３４Ｃを参照されたい）の中へ、スライドがスライド開口の中に配置されたときに、試料３２が、スライド３０とフローチャネルハウジングとの間に実質的に配置されるように、「スナップ式にはめ込む」ことができる。本明細書においてさらに説明されるように、フローチャネルハウジングは、スライド３０とフローチャネルハウジングとの間に試料が配置されている間に、画像化システム５（例えば図３５参照）が試料の画像を記録することができるように、実質的に透光性（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ）の材料を含むことができる。フローチャネルハウジングは、スナップ式にはめ込まれた顕微鏡スライド３０とカバーガラスとが、洗浄液（例えばステップ１０２参照）、脱色試薬（例えばステップ１０７および１１２参照）および／または染色試薬（例えばステップ１０４参照）を接触させるためのフロースルーセル（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｅｌｌ）を形成することができるように構築された使い捨てのボディ（ｂｏｄｙ）を備えることができる。このカバーガラスは、このボディに組み込むことができる。その結果形成されるフロースルーセル（または本明細書においてさらに説明されるフローチャネル（ｆｌｏｗ  ｃｈａｎｎｅｌ））は、洗浄、脱色および染色試薬の入口ポート（ｐｏｒｔ）および出口ポートを備えることができる。完成した使い捨てフローチャネルの一例が図３４Ｄに概略的に示されており、図３４Ｅではこの例が、（例えば顕微鏡ステージなどの）画像化システムのステージ上に配置する向きに示されている。
【００３３】
洗浄し（ステップ１０２）、染色剤を接触させ（ステップ１０４）、脱色剤を接触させる（例えばステップ１０７および１１２）様々な方法ステップは、例えば図３４Ｄおよび３４Ｅに示されたフローチャンバ（ｆｌｏｗ  ｃｈａｍｂｅｒ）システム実施形態に関して本明細書に記載されたもの以外の様々な洗浄および／または流体接触技術によって達成することができることを理解すべきである。例えば、洗浄液、染色剤および／または脱色剤の接触は、限定はされないが、ピペット法、吸引法、混合法、遠心法およびこのような方法の組合せを含む知られている様々な実験室法によって達成することができる。
【００３４】
さらに、図３０に概略的に示されているように、いくつかの方法実施形態はさらに、試料の第１の画像を記録する前に試料を洗浄液で洗浄するステップ１０２を含むことができる。例えば、ステップ１０２は、フローチャネル、または試料３２が使用可能に係合した表面とカバーガラスとの間に画定された他の空間（および／またはこの表面を画定した顕微鏡スライドを受け取るように構成されたフローチャネルハウジング）の中へ、実質的に無色の洗浄液を導入することを含むことができる。この洗浄液は、試料（および試料を構成する生物実体）を液体と接触させることにより試料の「状態を整え」、試料を「準備する」ために、フローチャネルの中に流すことができる。洗浄ステップ１０２は、試料中の様々な実体が、例えば（本明細書においてさらに説明される）ステップ１０４において接触させることができる染色剤を適正かつ特徴的に吸収し、および／または外面において吸収することを保証することができるため、ステップ１０２は、様々な画像を互いに比較する後続のステップにとって（すなわち差分画像を生成するときに）重要であることがある。また、洗浄ステップ１０２はさらに、試料とカバーガラス（またはフローチャネルハウジング）との間の空間を実質的に無色の洗浄流体で有利に満たすことができ、これによりさらに、試料の画像を記録するとき（例えばステップ１０３参照）に画像化条件を向上させることができる。
【００３５】
グラム染色分野の技術者には知られているとおり、それぞれの染色ステップおよびそれぞれの脱色ステップは、過剰の染料または脱色試薬を除去するために水などの洗浄液で試料を洗浄する部分ステップを含む。単純にするため、本明細書では、これらの部分ステップについては言及せず、それらのステップは、染色ステップステップおよび／または脱色ステップの一部であるとみなす。任意の染色または脱色ステップの前に実施される洗浄ステップ１０２は単に例外であり、したがって本明細書において言及される。
【００３６】
再び図３０を参照すると、未染色試料の第１のベースライン画像（例えば図１参照）を（例えばステップ１０３で）記録した後、本発明の様々な方法実施形態はさらに、複数の染色された実体を含む染色された試料を調製するため、試料に染色剤を接触させるステップ１０４を含むことができる。これらの染色された複数の実体は、（染色剤が実体によって吸収された）染色された複数の実体（すなわち例えばグラム陽性菌）と、（染色剤が単に実体の外面に存在する）外面が染色された複数の実体（すなわち例えばグラム陰性菌）とのうちの少なくとも一方を含むことができる。本発明の様々なシステム実施形態に関して本明細書において説明されているとおり、染色剤を接触させるステップ１０４は、試料を染色するために（試料が使用可能に係合する表面によってその一部分が画定された）フローチャネルの中に染色剤を流すことによって達成することができる。さらに、本明細書において説明されているとおり、ステップ１０４で接触させる染色剤はグラム染色剤を含むことができる。このような実施形態によれば、外面が染色された実体は複数のグラム陰性実体を含むことができ、染色された実体は複数のグラム陽性の実体を含むことができる。さらに、ステップ１０４で接触させる染色剤は、下流側での画像化および形態学的調査に備えて試料を調製するのに適当な様々な染色剤を含むことができることを理解すべきである。例えば、染色剤は、限定はされないが、クリスタルバイオレットとグラムヨウ素とを含む試薬を含むことができる。
【００３７】
染色剤を試料に接触させた（例えばステップ１０４）後、いくつかの方法実施形態はさらに、染色された試料の第２の画像を記録するステップ１０５を含むことができる。図１に関して上で説明した同じ１本のライン画像フィールドに沿った例示的な第２の画像が、例えば図４に示されている。図４は、この１本のラインに沿って存在するすべての細菌実体（例えばグラム陽性菌およびグラム陰性菌）の位置を示す。図１に示された第１の画像の詳細な特徴に応じて、図４の実体の「見え具合（ｖｉｓｉｂｉｌｉｔｙ）」は、存在する可能性がある構造化された背景信号によって、より最適になることも、それほど最適にならないこともある。
【００３８】
再び図３０を参照すると、この方法はさらに、（存在する場合に）少なくとも１つの染色された実体のスライドの表面における位置を決定するため、第２の画像（例えば図４参照）を第１の画像（例えば図１参照）と比較することにより、第１の差分画像（図５参照）を生成するステップ１０６を含むことができる。ステップ１０６で生成された（例えば図５に示された）第１の差分画像は、第１の差分画像を生成することにより、本発明の様々な実施形態によって、試料中に存在する細菌または他の実体の見え具合を相当に高めることができることを示す。第１の差分画像は、ステップ１０６で、カメラ８を備える画像化システムと通信する画像処理コンピュータ１８（例えば図３２参照）によって生成することができる。例えば、ステップ１０６は、第２の画像（例えば図４参照）と第１の画像（例えば図１参照）との間の（例えば画像減算（ｉｍａｇｅ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）などの）画像処理ステップを実行する画像処理コンピュータ１８によって実行することができる。このような（画像減算などの）画像処理ステップを実行することにより、グラム染色ステップによって影響されない画像特徴の多くを、（例えば図５に示されている）第１の差分画像から除去することができる。本発明の様々なシステム実施形態に関して本明細書において説明されているとおり、Ｓ＝（Ｊ１−Ｊ２）／（Ｊｌ＋Ｊ２）の形の画像処理アルゴリズムを使用して、差分画像信号（１つまたは複数）を生成することができる。Ｊ１およびＪ２はそれぞれ第１および第２の画像の信号強度を指す。
【００３９】
したがって、図５の第１の差分画像中には、存在する（細菌などの）実体に関係し、この染色手順に反応する特徴だけが示され、（図１の第１の画像に概略的に示された）構造化された背景信号は除去される。第１の差分画像（例えば図５）は、（例えばグラム陽性菌、グラム陰性菌などの）染色された実体および／または外面が染色された実体のスライド上における位置を際立たせ、それらの位置の可視化を増強するため、第１の差分画像は本発明の方法の一実施形態の技術的な効果を示す。この増強効果は特に、（形態解析（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（例えばステップ１１６参照）などの）画像の可能な後続の目視検査に役立つ。
【００４０】
様々な方法実施形態はさらに、外面が染色された実体から少なくとも一部の染色試薬が除去された部分脱色試料を調製するため、染色された試料に脱色剤を接触させるステップ１０７を含むことができる。例示的な一実施形態によれば、図６は、試料の部分脱色、このケースでは完全な脱色の約３５％の脱色（例えばステップ１０７参照）を実行した後に記録された第３の画像を示す。様々な実施形態によれば、ステップ１０７はさらに、脱色の程度を制御することを含むことができ、これは例えば、スライド２とカバーガラス３との間の空間（例えば図３１参照）に酸アルコールなどの脱色剤を流す持続時間を調整することによって実行することができる。図６のプロットから分かるように、ステップ１０７で脱色剤を追加することによって、Ｘ位置５０および８０の外面が染色された（例えばグラム陰性菌を含む）実体に対応する信号をやや低減させることができる。やはり試料中に存在する可能性がある（例えばグラム陽性菌に対応する）染色された実体に対するある割合の脱色も明らかなことがあるが、染色された実体の脱色は、（例えばグラム陰性菌に対応する）外面が染色された実体の脱色に比べて全体にはるかに目立たない。図３０はさらに、部分脱色試料の第３の画像を記録するステップ１０８を示す。ステップ１０８は一般に、例えば図６に示された第３の画像を与える。
【００４１】
図３０に概略的に示されたいくつかの方法実施形態はさらに、少なくとも１つの外面が染色された実体のスライド２（例えば図３１参照）の表面上における位置を決定するため、第３の画像（例えば図６参照）を第２の画像（例えば図４参照）と比較することにより、第２の差分画像（例えば図７参照）を生成するステップ１０９を含むことができる。図７は、（例えばグラム陰性菌に対応する）外面が染色された実体に関係した信号だけを示すこのような例示的な第２の差分画像を示す。本発明の様々なシステム実施形態に関して本明細書においてさらに説明されるように、図７に示された第２の差分画像は、（例えばＣＣＤカメラ８と通信する）画像処理コンピュータ１８によって生成することができる。画像処理コンピュータ１８は例えば、（ステップ１０７での脱色剤の追加によって最も影響を受けた（すなわち脱色された）試料中の実体を際立たせるために第３の画像（図６）を第２の画像（例えば図４）から差し引く）画像減算ステップを実行することにより、第２の差分画像（例えば図７）を生成するように構成することができる。グラム染色実施形態において、ステップ１０９は、この脱色手順に最も反応するグラム陰性菌の位置を明らかにし、かつ／または際立たせることができる。第２の差分画像を生成するステップ１０９はさらに、使用者（および／または画像処理コンピュータ１８）が、図４のプロットと図６のプロットの外面が染色された実体（すなわちグラム陰性菌）の信号を定量的および／または定性的に比較し、部分脱色ステップ（例えばステップ１０７）中に達成されたその時点における脱色の程度を決定するステップ１１０を実行することを可能にする技術的効果を提供する。
【００４２】
したがって、図３０に示されているように、第２の差分画像を生成するステップ１０９はさらに、試料の最適化された脱色を得るために必要な追加の脱色時間を推定するステップ１１１の実行を可能にする比較のベースを提供する。より具体的には、いくつかの方法実施形態では、ステップ１１１が、染色された実体（すなわち例えばグラム陽性菌）を実質的に脱色することなく、外面が染色された実体（すなわち例えばグラム陰性菌）を実質的に脱色するために、部分脱色試料に脱色剤を接触させるべきである暴露時間を決定するため、第２の差分画像（例えば図７参照）を解析することを含むことができる。ステップ１１１は、例えば図７に示された第２の差分画像の「青色強度」を調べることによって明らかな外面が染色された実体の脱色レベルを与えた暴露時間に少なくとも部分的に基づく比計算（ｒａｔｉｏ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）を実行することにより、後続のステップ１１２において外面が染色された実体を実質的に脱色する暴露時間を定量的に推定することを含むことができる。
【００４３】
いくつかの方法実施形態はさらに、外面が染色された実体（すなわち例えばグラム陰性菌）が実質的に脱色されており、染色された実体（例えばグラム陽性菌）が実質的に脱色されていない実質的に脱色された試料を調製するため、（ステップ１１１で決定された暴露時間の間）部分脱色試料に（例えば酸アルコールなどの）脱色剤を接触させるステップ１１２を含むことができる。図３０に示されているように、この方法はさらに、実質的に脱色された試料の第４の画像（例えば図８参照）を記録するステップ１１３を含むことができる。図８は、例えば最終脱色ステップ（ステップ１１２）を実行した後に得られた第４の画像を示す。図８に示されているように、スライド表面のＸ位置３０および９０に、染色された実体（すなわちグラム陽性菌）に対応する信号だけが検出可能のまま残る。
【００４４】
再び図３０を参照すると、様々な方法実施形態はさらに、第３の差分画像（例えば画像処理コンピュータ１８（図３２参照）によって生成された例示的な第３の差分画像を示す図９を参照されたい）を生成するステップ１１４を含むことができる。第３の差分画像は、第４の画像（図８参照）を第２の画像（例えば図４参照）と比較することにより生成することができる。いくつかの実施形態では、第２の画像（図４）で検出された信号から第４の画像（図８）で検出された信号を「差し引く」画像減算手順を実行することにより、図９の第３の差分画像を生成することができる。図９に示されているように、第３の差分画像は、少なくとも１つの外面が染色された実体（すなわち例えばグラム陰性菌）の表面上における位置を明らかに示すことができる。図９に示された第３の差分画像の例示的なプロットでは、グラム陰性菌の位置がスライド表面上の位置４０および８０に示されている。
【００４５】
染色された実体（すなわちグラム陽性菌）のスライド表面上における位置（すなわち例えばＸ位置）を確認するため、いくつかの方法実施形態はさらに、第４の画像（図８）を第１の画像（図１）と比較することにより第４の差分画像（図１０参照）を生成するステップ１１５を含むことができる。図１０に示されているように、第４の差分画像は、少なくとも１つの染色された実体のスライドの表面上における位置を示すことができる。いくつかの実施形態では、図８の信号プロットから図１の信号プロットを差し引くためにＣＣＤカメラ８（または他の画像化システム構成要素）と通信する画像処理コンピュータ１８によって、ステップ１１５を実行することができる。この差分画像（例えば図１０）は、グラム陽性菌の信号（および対応する位置）を示す。
【００４６】
いくつかの方法実施形態では、第３および第４の差分画像（それぞれ図９および１０）を使用して、試料３２中に見られるすべての実体（すなわち例えばグラム陽性菌およびグラム陰性菌）をさらに分類するためのより詳細な形態解析（ステップ１１６参照）を実行することができる。ステップ１１６は例えば、例えば図３０のステップ１０１〜１１５に示された様々な方法ステップによって位置が決定され、かつ／または確認された様々な実体（すなわち例えばグラム陰性菌およびグラム陽性菌）を使用者が分類するのを助けるために既知の実体のライブラリ（ｌｉｂｒａｒｙ）を記憶するように構成された一体化された記憶装置（図示せず）を有する画像処理コンピュータ１８を使用して実行することができる。例えば、ステップ１１６は、外面が染色された実体（すなわちグラム陰性菌）の形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を解析することを含むことができる。また、いくつかの実施形態ではステップ１１６がさらに、染色された実体（すなわちグラム陽性菌）の形態を解析することを含むことができる。
【００４７】
図１１〜１９は、試料３２中にグラム陽性菌だけが存在する例示的なケースにおいて、本発明の様々な方法ステップ（概要は図３０および３６を参照されたい）に従って生成された様々な画像を示す。具体的には、図１１〜１３はそれぞれ図１〜３に完全に対応し、第１の画像、（例えばスライド表面上のＸ位置３０および９０における）グラム陽性菌の位置、およびグラム陰性菌（存在せず）の位置を示す。また、図１４は、染色試薬の接触（例えばステップ１０４参照）後に捕捉された第２の画像を示し、グラム陽性菌に対応する信号だけを示す。
【００４８】
図１５は、（例えばグラム陽性菌の位置を際立たせるために図１４の染色後の画像から図１１の「背景」信号を差し引くことによって得られた）背景信号のない信号を有する第１の差分画像を示す。また、図１６は、試料の部分脱色を得るための脱色剤の接触後に得られた第３の画像を示す。図１７は、場合によってはグラム陰性菌からの信号を示すであろう第２の差分画像である。このケースでは（図１３に示された既知のデータから）予想されるとおり、信号は存在しない。この結果は、本発明の方法ステップ（例えば図３０および３６参照）の型どおりの実行によって、操作者があまり多くの入力をしなくても、グラム陰性菌の有無についての正しい情報を得ることができることを示している。図１８は、存在する場合にはグラム陰性菌の存在をやはり指示するであろう第３の差分画像である。最後に、図１９は、グラム陽性菌のより完全な形態解析（例えば図３０のステップ１１６参照）を可能にするために、グラム陽性菌の信号および位置を優れたコントラストで示す第４の差分画像を示す。
【００４９】
図２０〜２９は、試料３２中に外面が染色された実体（すなわちグラム陰性菌）だけが存在する例示的なケースにおいて、本発明の様々な方法ステップ（概要は図３０および３６を参照されたい）に従って生成された様々な画像を示す。具体的には、図２０〜２２はそれぞれ図１〜３に完全に対応し、第１の画像、グラム陽性菌の位置（存在せず）、および（例えばスライド表面上のＸ位置５０および８０における）グラム陰性菌の位置を示す。
【００５０】
図２３は、染色試薬の接触後のグラム陰性菌からの信号だけを示す第２の画像を示す。図２４は、背景信号のない信号を有する第１の差分画像を示し、Ｘ位置５０および８０におけるグラム陰性菌の位置を明らかに示している。様々な方法およびシステム実施形態に関して本明細書において説明されているとおり、差分画像（例えば図２４、２６、２８および２９）はそれぞれ、ＣＣＤカメラ８または他の画像化システム構成要素によって提供される様々な像を使用して画像減算手順を実行するように構成された画像処理コンピュータ１８（図３２参照）によって生成することができる。図２５は、脱色剤の接触によって達成することができる試料の部分脱色（例えば図３０のステップ１０７参照）後に得られた第３の画像を示す。
【００５１】
図２６は、グラム陰性菌からの信号を示すであろう第２の差分画像を示す。このケースでは、予想されるとおり、信号が存在する。この結果も、本発明の様々な実施形態に基づく方法ステップの型どおりの実行によって、操作者があまり多くの入力をする必要なしに、試料３２中のグラム陰性菌の有無についての正しい情報を与える技術的効果が達成されることを示している。図２７は、最終脱色後に得られた第４の画像である。予想どおり、この画像では、外面が染色されたグラム陰性菌からの信号を検出することはできなかった。図２８は、スライド表面上におけるグラム陰性菌の明瞭な存在および位置を示す第３の差分画像である。最後に、図２９は、試料中に存在する場合にはグラム陽性菌の存在を指示するであろう第４の差分画像である。このケース（図２１参照）では、予想されるとおり、グラム陽性菌からの信号は検出されない。
【００５２】
図３６は、試料を染色する本発明の代替実施形態に基づく方法の概略流れ図を示す。この方法は最初に、試料を、画像化システム（概要は図３５参照）の試料ステージ１と使用可能に係合させるステップ２０１を含む。いくつかの実施形態では、ステップ２０１を、図３４に概略的に示されているように実施することができる。例えば、図３４は、本発明の一実施形態で使用することができる試料取付け手順を示す図である。図３４Ａでは、通常の顕微鏡スライド３０上の一般的な試料付着領域３１内に試料３２が配置され、熱固定される。図３４Ｂは、試料３２が付着したスライド３０の側面図である。次いで、使用可能に係合した試料３２を一方の表面が有する調製されたスライド３０が、使い捨てボディの中に「スナップ式にはめ込まれる」（概要は図３４Ｃ参照）。この使い捨てボディは、スナップ式にはめ込まれた顕微鏡スライドと使い捨てボディの中に組み込まれたカバーガラスとが、染色試薬と脱色試薬のうちの少なくとも一方を試料３２に接触させるためのフローチャンバ２０を形成するように構築される。図３５に示されているように、フローチャンバ２０は、フローチャンバ２０の中の試料３２を通過するように脱色および染色試薬を「流す」ため、試薬入口２２および試薬出口２３を画定することができる。完成した使い捨てフローチャンバの一実施形態が図３４Ｄに示されている。顕微鏡ステージ１上に配置するため、フローチャンバ２０をひっくり返すことができる（図３４Ｅおよび３５参照）。
【００５３】
図３６に示されているように、様々な方法実施形態はさらに、試料への染色試薬および脱色試薬の接触の前後に、画像化システムを使用して試料の画像を記録するステップ２０２を含むことができる。ステップ２０２は例えば、本明細書に記載された染色および／または脱色プロセスの様々な段階において、試料の画像を記録することを含むことができる。ステップ２０２で記録される像は、限定はされないが、未染色試料の画像（例えば図１）、染色された試料の画像（例えば図４）、および部分脱色試料の画像（例えば図６参照）を含むことができる。
【００５４】
この方法はさらに、試料への染色試薬および脱色試薬の接触の前後に記録された試料の画像の比較に少なくとも部分的に基づいて、差分画像を生成するステップ２０３を含むことができる。いくつかの実施形態では、ステップ２０３が例えば、染色された試料の画像（例えば図４参照）中に存在する画像信号から部分脱色試料の画像（例えば図６参照）の画像信号を差し引くことにより、第２の差分画像（例えば図７参照）を生成することを含むことができる。
【００５５】
図３６を再び参照すると、本発明の様々な方法実施形態はさらに、ステップ２０３で生成された差分画像に少なくとも部分的に基づいて、染色試薬および／または脱色試薬の接触を補正するステップ２０４を含むことができる。ステップ２０４は例えば、ステップ２０３の差分画像を解析することにより、試料中（および／またはその中に含まれる外面が染色された実体中）の見掛けの脱色の程度を定量的に決定することを含むことができる。例えば、図７の測定可能な「青色強度」は一般に、脱色剤の接触中に達成された脱色の量を定量的に示す。露出および／または「フラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）」時間が既知である場合、ステップ２０４は、試料中に存在する外面が染色された実体から残りの染色試薬を除去することが予想される補正されたおよび／または追加の暴露時間を決定することを含むことができる。この方法はさらに、補正ステップ２０４で計算された（露出および／またはフラッシング時間などの）様々なパラメータに基づいて、染色試薬と脱色試薬のうちの少なくとも一方を再接触させるステップ２０５を含むことができる。最後に、図３６に示されているように、このような方法実施形態はさらに、再接触ステップ２０５によって識別可能とすることができる試料中の少なくとも１つの関心のあるターゲット（ｔａｒｇｅｔ）（すなわちグラム陽性菌実体）を区別するため、試料の最終画像（例えば図８参照）を生成することを含むことができる。
【００５６】
本発明の様々な実施形態はさらに、（グラム染色手順などの）最適化された染色手順を試料３２に対して実行するシステムおよび／または装置実施形態を提供することができる。例えば、図３２および３５に概略的に示された１つのシステム実施形態は、染色剤の供給源１１および脱色剤の供給源１２と流体連通したチャネルを画定したフローチャンバ２０を備え、このフローチャンバは、試料３２と使用可能に係合するように構成された表面３１を含む（例えば図３４Ａ〜３４Ｅ参照）。いくつかのシステム実施形態では、（図３１に概略的に示されており、本明細書においてさらに説明されるように）、フローチャンバを画定するためそれらの間に使用可能に係合したスペーサ４を有するスライド２とカバーガラス３の間に、フローチャンバを画定することができる。
【００５７】
図３４および３５に概略的に示されているように、フローチャンバ２０は、試料３２と使用可能に係合する表面３１を画定したスライド３０を備えることができる。フローチャンバ２０はさらに、スライド開口を画定したフローチャネルハウジングを備えることができ、スライド開口は、スライドがスライド開口の中に配置されたときに、試料３２が、スライド３０とフローチャネルハウジングの間に実質的に配置されるように標準スライドを受け取るように適合されている（フローチャネルハウジングと使用可能に係合したスライドを示す図３４Ｂ〜３４Ｃを参照されたい）。フローチャネルハウジングはさらに、スライド３０とフローチャネルハウジングの間に試料３２が配置されている間に、画像化システム（および／またはそのレンズ５）が、試料３２の画像を記録することができるように、（組み込まれたガラスおよび／またはポリカーボネートカバーガラス２１などの）実質的に透光性の材料を含むことができる。
【００５８】
フローチャンバ２０（および／またはそれと通信するシステムのシステムコントローラ１９部分）は、染色された複数の実体を含む染色された試料を調製するため、（例えば試薬入口２２を通して）試料３２に染色剤を接触させるように構成された（例えば、図３２に示された適当な様々なポンプ１４、弁１５、および１つまたは複数の結合弁１６を備える）流体システム（ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｙｓｔｅｍ）と協働することができる。様々な方法実施形態に関して本明細書において説明されているとおり、染色された複数の実体は、染色された複数の実体（例えばグラム陽性菌実体）と外面が染色された複数の実体（例えばグラム陰性菌実体）のうちの少なくとも一方を含むことができる。（フローチャンバ２０と協働する）流体システム１４、１５、１６をさらに、外面が染色された実体から少なくとも一部の染色剤が除去された部分脱色試料を調製するため、染色された試料に脱色剤を（例えば試薬入口２２を通して）接触させるように構成することができる。いくつかのシステムおよび／または装置実施形態では、（フローチャンバ２０および／またはシステムコントローラ１９と協働する）流体システム１４、１５、１６をさらに、外面が染色された実体が実質的に脱色されており、染色された実体が脱色剤の接触によって実質的に脱色されていない実質的に脱色された試料を調製するため、（例えば図３０の例えばステップ１１１で計算された）決定された暴露時間の間、部分脱色試料に脱色剤１２を接触させるように構成することができる。さらに、図３２に概略的に示されているように、様々なシステム実施形態は、それぞれ洗浄、染色、脱色および対比染色（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒａｉｎｉｎｇ）試薬を含むリザーバ（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）１０、１１、１２および１３を備えることができる。これらの試薬を、適当なポンプ１４、弁１５および１つまたは複数の結合弁１６によって、フロースルー使い捨て品（すなわちフローチャンバ２０）の試薬入口６に向かって導くように、システムコントローラ１９を構成することができる。フローチャンバ２０に流した試薬は、いくつかのシステム実施形態において提供される廃液リザーバ１７の中に集めることができる。
【００５９】
本発明のシステムおよび装置実施形態はさらに、試料３２が画像化システムの視野内に配置されるようにフローチャンバ２０に隣接して配置された画像化システム（および／またはその対物レンズ５）を備えることができる。図３２に示されているように、画像化システムは、対物レンズ５と、スライド３０とフローチャネルハウジング２０の間に試料３２が配置されている間に試料の画像を記録することができるように構成された、ＣＣＤカメラなどの画像化受信器またはカメラ装置８と、カメラ装置８と動作可能に係合したアクチュエータ装置であり、フローチャンバ２０に対するカメラ装置８の位置を調整するように構成された（例えばＸＹＺ並進機構９などの）アクチュエータ装置とを含むことができる。代替システム実施形態では、このシステムが、ステージ１（図３２参照）と動作可能に係合したアクチュエータ装置であり、カメラ装置８に対するフローチャンバ２０の位置を調整するように構成された（ＸＹＺ並進機構などの）アクチュエータ機構を備えることができることを理解すべきである。いくつかの実施形態では、カメラ装置８が、（本明細書においてさらに説明される）画像処理コンピュータ１８と通信することができ、画像処理コンピュータ１８はシステムコントローラ１９と通信することができる。また、システムコントローラ１９は、試料３２上の異なる関心のあるフィールドへ対物レンズ５を移動させ、試料３２に対する自動焦点操作を実行するために、ＸＹＺ並進機構９の制御入力とも通信することもできる。
【００６０】
スライド３０および／またはフローチャンバ２０は、画像化システムのステージ１と動作可能に係合しているため、染色剤と脱色剤のうちの少なくとも一方の接触の前、最中および／または後に試料３２を（リアルタイムで）監視するように、画像化システムの（画像化受信器８などの）構成要素を構成することができる。画像化システム（および／またはその画像処理コンピュータ１８）をさらに、脱色剤の第１の接触の前に得られた試料３２の少なくとも１つの画像（例えば図４参照）と、脱色剤の第１の接触の後に得られた試料の少なくとも１つの画像（例えば図６参照）とを比較することにより、差分画像（例えば図７参照）を生成するように構成することができる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、画像化システム（および／またはその中に含まれる画像処理コンピュータ１８）をさらに、外面が染色された実体から染色された実体をより容易に識別することができるように、染色された実体を実質的に脱色することなく、外面が染色された実体を実質的に脱色するための脱色剤の第２の適用の暴露時間を、差分画像（図７）に少なくとも部分的に基づいて決定する（例えば図３０のステップ１１１参照）ように構成することができる。様々なシステム実施形態はさらに、画像化システム８、９、１８および流体システム１４、１５、１６と通信する（例えば図３２に示されたシステムコントローラ１９などの）コントローラ装置を備えることができる。このコントローラ装置を、染色剤と脱色剤のうちの少なくとも一方の接触を、（例えばカメラ装置８を備える）画像化システムによって生成された画像に少なくとも部分的に基づいて制御するように構成することができる。
【００６２】
いくつかのシステム実施形態では、画像化システム（および／または（画像処理コンピュータ１８などの）その構成要素）を、図３０および３６に概要が記載された方法ステップのうちの１つまたは複数のステップを実行するように構成することができる。例えば、一実施形態では、画像化システム（および／またはそのカメラ装置８）を、試料３２の第１の画像（図１参照）を記録するステップ１０３を実行するように構成することができる。画像化システムをさらに、フローチャンバ２０を使用して試料に染色剤を接触させた後に、染色された試料の第２の画像（図４参照）を記録するように構成することができる。
【００６３】
さらに、画像化システム（および／またはその中に含まれる画像処理コンピュータ１８）を、少なくとも１つの染色された実体のスライド３０の表面３１上における位置を決定するため、第２の画像（図４）を第１の画像（図１）と比較することにより、第１の差分画像（例えば図５参照）を生成するように構成することができる。画像化システム（および／またはそのカメラ装置８）をさらに、フローチャンバ２０を使用して脱色剤を接触させた後に（図３０のステップ１０７参照）、部分脱色試料の第３の画像（例えば図６）を記録するように構成することができる。画像化システム（および／または画像処理コンピュータ１８）をさらに、少なくとも１つの外面が染色された実体の位置を決定するため、第３の画像（図６）を第２の画像（図４）と比較することにより、第２の差分画像（図７参照）を生成するように構成することができる。最後に、いくつかのシステム実施形態では、画像化システム（および／またはシステムコントローラ１９と協働する画像処理コンピュータ１８）をさらに、染色された実体を実質的に脱色することなく、外面が染色された実体を実質的に脱色するために、部分脱色試料に脱色剤を接触させる暴露時間を決定するため、第２の差分画像（図７）を解析するステップ１１１を実行するように構成することができる。
【００６４】
本発明の様々なシステム実施形態によれば、（様々な画像処理コンピュータ１８および／またはカメラ装置８構成要素を含む）画像化システムをさらに、限定はされないが、実質的に脱色された試料の第４の画像（例えば図８参照）を記録するステップ１１３、第４の画像を第２の画像と比較することにより、第３の差分画像（図９）を生成するステップ１１４、および第４の画像を第１の画像と比較することにより第４の差分画像（図１０）を生成するステップ１１５を含む、様々な方法ステップを実行するように構成することができる。本発明の様々な方法実施形態に関して本明細書において説明されているとおり、第３の差分画像（例えば図９参照）は、少なくとも１つの外面が染色された実体（すなわち例えばグラム陰性菌実体）の位置を示すことができる。さらに、第４の差分画像（例えば図１０参照）は、少なくとも１つの染色された実体（すなわち例えばグラム陽性菌実体）の位置を示すことができる。
【００６５】
図３２に示されているように、本発明の様々なシステム実施形態において提供される画像化システムは、限定はされないが第１の差分画像（例えば図５）、第２の差分画像（例えば図７）、第３の差分画像（例えば図９）および第４の差分画像（例えば図１０）を含むことができる差分画像を生成するように構成された画像処理コンピュータ１８を備えることができる。このようなシステム実施形態では、画像処理コンピュータ１８を、限定はされないが画像減算、画像加算、画像比計算およびこのような画像処理ルーチンの組合せを含むことができるプロセスを使用して様々な差分画像のうちの１つまたは複数の差分画像を生成するように構成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、画像処理コンピュータ１８（および／またはいくつかの実施形態ではシステムコントローラ１９）を、Ｓ＝（Ｊ１−Ｊ２）／（Ｊｌ＋Ｊ２）の形の画像処理アルゴリズムを使用して差分画像信号（Ｓ）を生成するように構成することができる。Ｊ１およびＪ２はそれぞれ第１および第２の画像の信号強度を指す。
【００６６】
図３１は、本発明の一実施形態に基づくシステムの概略図である。顕微鏡のＸＹステージ１上に配置することができる顕微鏡スライド２上に生物試料が配置され、固定され、顕微鏡対物レンズ５を通し、ＣＣＤカメラなどの画像化受信器（または他のカメラ装置８（図３２参照））に向かって画像化される。顕微鏡スライド２から選択されたある距離のところに、適当な厚さを有するスペーサ４によってカバーガラス３が保持される。スペーサ４は、片側に試薬入口６、別の側に試薬出口７を有するフローチャネルを、スライド２とカバーガラス３の間に形成することができる。スペーサ４は、スペーサ４とスライド２の間、およびスペーサ４とカバーガラス３の間に実質的な流体密（ｆｌｕｉｄ−ｔｉｇｈｔ）係合を提供し、それによって平行フローチャンバが形成されるように構成されたエラストマー物質を含むことができる。効果的なスペーサ４の厚さは、たとえ対物レンズ５の倍率が１００×であったとしても、カメラ装置８（または他の画像化システム構成要素）によって、顕微鏡スライド２上の生物試料の鮮明な画像を得ることができるように選択することができる。
【００６７】
図３３は、本発明の様々な方法および／またはシステム実施形態を実施するのに適したスナップ式のフロースルー使い捨て品の一例を示す。図３３Ａは、上から、すなわち図３１および３２に示された対物レンズ５が配置されるであろう側から見た使い捨て品を示す。他の実施形態では、使い捨て品の下に対物レンズ５を配置することができる。このような実施形態において図３３Ａは、「下」から見た図を表すことになる。図３３Ａは、予め形成された使い捨てボディ２０を示し、この例では、ボディ２０が、その中に組み込まれたカバーガラス２１を有する。例えば図３２に示されたリザーバ１０、１１、１２、１３と流体連通することができる試薬入口２２および試薬出口２３も示されている。図３３Ｂは、予め形成された使い捨てのボディ２０、組み込まれたカバーガラス２１、試薬入口２２および試薬出口２３を示す使い捨て品の側面図を示す。調製された顕微鏡スライド３０をボディ２０と使用可能に係合させると、それぞれ入口２２および出口２３へのコネクタチャネル（ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ  ｃｈａｎｎｅｌ）２６および２７を有するフロースルーチャンバ２８が形成される。いくつかの実施形態では、使い捨てボディ２０が、スライド３０とボディ２０の間にフロースルーチャンバ２８を形成するため、使い捨てボディにスライド２４を取外し可能に「スナップ式にはめ込む」ことを可能にするコーナ（ｃｏｒｎｅｒ）「リップ（ｌｉｐ）」フィーチャ（ｆｅａｔｕｒｅ）２５を備えることができる。図３３Ｃは、フロースルーチャンバ２８と、試薬入口２２と試薬出口２３のうちの少なくとも一方との間に画定することができるコネクタチャネル２６および２７の例示的な一実施形態を特に示す使い捨て品の背面図を示す。
【００６８】
図３４は、（従来の顕微鏡スライド３０の試料付着領域３１などの）表面と試料３２を使用可能に係合させる例示的な手順を示す。図３４Ａでは、評価対象の試料３２を、通常の顕微鏡スライド３０上の一般的な試料付着領域３１内に配置し、それに固定することができる。図３４Ｂは、試料３２が付着したスライド３０の側面図である。次いで、一方の面が試料３２を担持した調製されたスライドが、使い捨てボディの中に「スナップ式にはめ込まれる」（図３４Ｃ参照）。この使い捨てボディは、スナップ式にはめ込まれた顕微鏡スライドと（ボディの中に組み込まれた）カバーガラスとが、本発明の様々な実施形態において使用することができる様々な洗浄、染色、脱色および／または対比染色試薬用のフローチャネルを形成することができるように構築される。本明細書において説明されているとおり、フローチャンバは、フローチャンバ内へおよびフローチャンバから外へ試薬を流すため、試薬入口ポートおよび試薬出口ポートを備えることができる。完成した使い捨て品が図３４Ｄに示されており、これは最終的に、顕微鏡ステージ上に配置するためひっくり返される（図３４Ｅ参照）。
【００６９】
図３５は、本発明の様々な実施形態に基づく様々な洗浄（ステップ１０２参照）、染色（ステップ１０４参照）および／または脱色（ステップ１０７および１１２参照）手順を実行するために、顕微鏡上に配置され、液体処理システムに接続された完成した使い捨て品を示す。いくつかの実施形態では、フローチャンバと液体処理システム（例えば図３２の要素１４、１５および１６参照）との間の流体連通を、コネクタパイプ３３および３４によって確立することができ、コネクタパイプ３３および３４は、画像化システム（および／またはその対物レンズ５）に対して使い捨てフローチャンバ２０を所定の位置に保持するように構成し、さらに、圧力フィッティング３５および３６を介してそれぞれ試薬入口２２および試薬出口２３への実質的に流体密の接続を提供するように構成することができる。いくつかの実施形態では、コネクタパイプ３３、３４が、画像化システムのステージ１と係合するように使い捨てフローチャンバ２０を全体的に下方へ押し付けるように構成された相当に堅いポリマー物質を含むことができる。
【００７０】
図３１〜３５に関して本明細書で説明した様々なシステム実施形態を、図１〜２９に示された様々な画像に関して説明し、図３０および３６に要約した様々な方法ステップを実行するように構成することができることを理解すべきである。例えば、図３２に示されたシステム実施形態を参照すると、システムコントローラ１９を、自動化された染色プロセス（例えばステップ１０４参照）および脱色プロセス（ステップ１０７および１１２参照）を制御するように構成することができる。自動焦点操作を実行するとき、画像を記録するとき、関心のある新しいフィールドへ移動するとき、および様々な差分画像を生成するために（例えば画像減算などの）画像処理ステップを実行すべきときを決定するため、システムコントローラ１９をさらに、画像処理コンピュータ１８および（例えばＸＹＺ並進機構を備える）アクチュエータ装置９と通信するように構成することができる。いくつかの実施形態では、画像処理コンピュータ１８が、グラム陽性菌またはグラム陰性菌を示す最適化された画像を自動的に生成することができる。使用者が、形態解析を手作業で実行し、かつ／または所与の試料中に存在する可能性がある様々な実体を同定することを可能にするため、このような画像を、画像処理コンピュータ１８によって（例えばその中に組み込まれた記憶装置内に）記憶することができ、実験技師、微生物学者または他の使用者がそれらの画像を利用できるようにすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、顕微鏡ステージ１または画像化システムに対する他の解析フィールドから試料を除去する必要なしに、試料実体の形態を解析するステップ１１６を使用者が実行することができるよう、試料中のグラム陽性菌またはグラム陰性菌の最適化された画像の視覚表現を生成するように構成された（高解像度ディスプレイ（図示せず）などの）ユーザインターフェースを、画像処理コンピュータ１８が備えることができる。他の実施形態では、画像処理コンピュータ１８が、様々な既知の微生物（およびそれに対応する染色された特性画像）を含む画像データベースを含んだ記憶装置を備えることができる。画像処理コンピュータ１８は次いで、自動細菌同定手順を実行することができ、続いて、ユーザインターフェースを介して使用者に結果を提供することができる。使用者は次いで、自動同定の出力を受け入れることができ、または、その自動同定の結果を、フォローアップ手動確認の出発点として使用することができる。これらの様々なシステム実施形態では、使用者が、画像処理コンピュータ１８によって生成された様々な差分画像を、最適に染色された試料の実際の未処理画像と比較することができるように、試料３２を、画像化システムの試料ステージ１上に残すことができる。
【００７１】
以上の説明および関連図面中に提示された教示の恩恵を受ける本発明が属する分野の技術者には、本明細書に記載された発明の多くの変更および他の実施形態が思い浮かぶであろう。したがって、本発明は開示された特定の実施形態に限定されないこと、ならびに変更および他の実施形態は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されていることを理解すべきである。本明細書では特定の用語が使用されるが、それらは、単に総称的かつ記述的な意味で使用されているのであって、限定目的で使用されているのではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年2月26日(2010.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】削除
【補正の内容】
【国際調査報告】
2010520487.tif 000038
2010520487.tif 000039
2010520487.tif 000040