(57)【要約】  薬剤の沈殿を生じ、その後材料により放出される材料の製造工程を伴う、材料の重合方法及び組成物。幾つかの態様において、生分解性ヒドロゲルからの生物活性物質の制御送達を開示する。特定の実施態様において、原位置に形成される生分解性ヒドロゲルは、通常水溶性である包括された沈殿タンパク質を含む。生物活性物質の溶解及び放出は、ヒドロゲル構造により妨げられ、遅い速度で起こる。このため、ヒドロゲルから前記生物活性物質の放出が制御される。従って、生理的環境において通常迅速に溶解される生物活性物質が、代わって制御方法で放出される。またヒドロゲル相は、生物活性剤を生理的環境に存在する細胞及び酵素から保護するのに役立つ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋ポリマーヒドロゲルの形成方法であって
水混和性溶媒に溶解した薬剤を含む溶液を水溶性前駆体と混合し、混合物を形成し、同時に該薬剤を沈殿させること;
生理的流体にさらされる位置で該混合物を蓄積させること;及び
前駆体を重合させ、架橋ヒドロゲルを形成し、沈殿された該薬剤を包括し、その後、生理的流体に該薬剤を徐々に放出させること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記溶液が水性であり、前記前駆体が薬剤の沈殿を引き起こす、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記沈殿を体積排除機構によって行う、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記前駆体がポリエチレンオキシドを含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記溶液が水性であり、前記沈殿が塩濃度、イオン量、pH及びそれらの組合せからなる群の要素の変化により生じる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記溶液が水性であり、塩を、塩析効果によって薬剤の沈殿を生じる濃度で前記混合物に混合する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記溶液が水性であり、緩衝液を、pHの変化によって薬剤の沈殿を生じる濃度及びpHで前記混合物に混合する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記水混和性溶媒がアルコール又は有機溶媒を含み、前記沈殿を、アルコール又は有機溶媒を水性である第2の溶媒で希釈することにより行う、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記水混和性溶媒がアルコール又は有機溶媒を含み、前記沈殿を、アルコール又は有機溶媒の除去によって行う、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記前駆体が求核性官能基を含む第1の前駆体あり、該求核性官能基と共有結合する求電子性基を含む第2の前駆体と混合され、前記重合を達成する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記前駆体が不飽和官能基を含む第1の前駆体であり、前記重合を開始する重合開始剤と混合される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒドロゲルが、互いに共有結合を形成するように反応する2つの前駆体から形成され、前記重合がその2つの前駆体の混合により開始される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記前駆体が、ポリアルキレンオキシド、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリジノン、又は分子量で少なくとも約40%のポリアルキレンオキシド、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、デキストラン、若しくはポリビニルピロリジノンを有するそれらのコポリマーを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が水溶性である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
患者の組織に利用可能な生理溶液に溶解する沈殿された薬剤を含む、該組織に接着及び適合する架橋材料を含む、医療機器。
【請求項１６】
前記前駆体がポリエチレンオキシドを含む、請求項１５記載の医療機器。
【請求項１７】
前記材料がヒドロゲルである、請求項１５の医療機器。
【請求項１８】
前記ヒドロゲルが、生物活性物質の沈殿に効果的な濃度で、塩、緩衝液、アルコール又は有機溶媒を含む、請求項１７の医療機器。
【請求項１９】
前記ヒドロゲルが、求核性官能基を含む第1の前駆体と、前記重合を達成するように該求核性官能基に共有結合する求電子性基を含む第2の前駆体との重合反応生成物を含む、請求項１７記載の医療機器。
【請求項２０】
前記第1の前駆体が、ポリアルキレンオキシド、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリジノン、又は分子量で少なくとも約40%のポリアルキレンオキシド、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、デキストラン、若しくはポリビニルピロリジノンを有するそれらのコポリマーを含む、請求項１７の医療機器。
【請求項２１】
前記薬剤が水溶性である、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本出願は、2007年2月6日に出願の米国出願番号第60/899,898号の優先権を主張する。これは、本明細書中に引用により取り込まれている。
【０００２】
(技術分野)
技術分野は、一般に高分子化学の分野に関し、特に水溶性高分子及び前駆体を用いて、ヒドロゲル内の薬剤を沈殿させる重合プロセスを伴うヒドロゲルの形成に関する。
【背景技術】
【０００３】
(背景)
ヒドロゲル及び架橋材料を形成する重合プロセスは公知である。ヒドロゲルを形成する前駆体の化学的及び物理的特徴並びに重合条件は、結果として得られる材料の特徴に影響を及ぼす。ヒドロゲルの環境と相互作用する薬剤を後に放出するヒドロゲルを製造することができる。
【０００４】
例えば、多くの疾患に関して、生物活性物質又は薬剤などの作用物質の局所的送達は、非常に有益である。薬剤の局所的送達は、全身毒性を低下させ、薬剤の高局所濃度をもたらす。このようなアプローチの例には、ガン腫瘍への薬剤局所送達、又は薬剤被覆ステントを用いる再狭窄の治療がある。多くの例において、生分解性機器又は担体を用いる低侵襲外科手術により、多くの局部疾患を治療することは大変価値があるものである。また予測可能な方法において薬剤の放出を制御することも有用である。場合によっては、長期間に渡って最小限の治療的濃度を維持するために、ボーラス放出に渡って生物活性薬剤又は薬剤の徐放が選択される。これにより、薬剤のより効果的な利用が提供されると同時に、反復投与も回避される。
【０００５】
局所及び制御薬剤送達に関する文献には、数種の非分解性及び分解性インプラントシステムが記載されている。ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、及びそれらのコポリマーなどの分解性ポリマーは、幾つかの他の分解性ポリマーとともに、局所及び制御薬剤送達に関して記載されている。しかしながら、これらのポリマーは、体内分解時に酸性種を創出し、成長因子などの感受性薬剤を変性させ、またインプラント部位で局所炎症を引き起こす可能性がある。また、それらは低侵襲手段による投与が容易ではない。それらが生体不活性でない有機溶媒にのみ可溶性であり、又は固体として存在するためである。様々な薬剤の投与に使用可能な生分解性ヒドロゲルも公知である。
【発明の開示】
【０００６】
(本発明の好ましい実施態様の詳述)
重合系を、材料の重合の間に、薬剤を沈殿させるために制御することができる。材料の環境が変化するにつれて、材料がその環境に応答するように材料の状態が変わり、薬剤を放出することができる。生物活性物質は、それらを包括するヒドロゲルが形成されると同時に患者の原位置(in situ)で沈殿されることができる。ヒドロゲルは、沈殿物を形成する化学環境を創出する。沈殿物質は、ヒドロゲルが生理的流体と新たな化学平衡に達することによってその生理的環境と相互作用するように、再溶解することができる。新たな化学平衡は、ヒドロゲルが溶解、分解、又は化学的相互作用によりその環境に応答するように、時間とともに変化することができる。これらの効果の全ては、物質を身体に制御送達するのに役立つ。
【０００７】
幾つかの態様において、生物活性物質はこのように、第1の濃度で溶解することができる、すなわち可溶性であり、体内に取り込まれる準備条件下にあるが、ヒドロゲル成分のその化学的環境内への導入によりその溶解度が制限される。その後、該物質は制限された溶解度のみを有し、第1の濃度より低い第2の濃度でのみ溶液中に存在することができ、その放出が制御される。このような薬剤の制御放出は挑戦的課題であるが、これらの技術は、薬剤のその溶解度のため、放出制御が保証され、従来の技術を超える重要な改善を達成することができる。したがって、生物活性物質は、第1の濃度で溶解され、ヒドロゲル系の成分にさらされ、該物質が沈殿し、続いて再溶解によりその環境に制御可能に放出されることができる。
【０００８】
このアプローチの1つの利点は、重合が薬剤の環境を変化させ、生物活性物質などの幅広い選択薬剤が沈殿するように、ヒドロゲル前駆体及び重合プロセスを選択することができることである。更に、多剤が同時に容易に送達され得るように、単一ヒドロゲル系を用いて、多くの薬剤を送達することができる。更に、この標準化は、多くの物質の土台として使用される標準的な、臨床的に許容されるヒドロゲルを提供する。幅広い一連の薬剤の基準となる材料は、各薬剤についてヒドロゲルのカスタムメイドが必要な他の方法を超える重要な改良である。別の利点は、その系は物質の溶解度を熟考して構成され得るので、沈殿機構が全く単純であるということである。対照的に、多くの他のスキームは、制御放出を達成することを試みるために、複雑な材料構造、又は物質との化学的組合せを使用する。
【０００９】
(沈殿)
沈殿は、化学反応の間の溶液中の固体の形成である。反応時に形成される固体は、沈殿物と呼ばれる。沈殿物の形成は、化学変化の徴候である。慣習的に化学プロセスにおいて使われるように、固体が形成し、溶質相から落ち、様々な方法、例えば、濾過、デカント又は遠心分離によって溶液から回収され得る。
【００１０】
様々な要因が溶解度及び沈殿に影響を及ぼし得る。例えば、体積排除効果、塩濃度、溶媒特性、イオン量及びpHが、それぞれ影響を及ぼし得る。これらの影響の全ては、用いられるヒドロゲル又は他の送達系を考慮して送達される物質の適切な技術の実現に必要とされるように、混合及び適合されることができる。
【００１１】
1つの沈殿技術は、物質を濃縮するために溶質を使用することに基づく排除体積プロセス(excluded volume process)である。溶媒に溶解される物質は、その物質以外の溶媒体積を占有する他の溶質を加えることによって濃縮され、結果、その物質は溶媒中において濃縮される。物質の濃度がその溶解度を超えるときに、通常、沈殿が生じる。タンパク質分離の科学文献において、タンパク質を、ポリエチレングリコール(PEG)、デキストラン、ポリビニルピロリジノン、ポリビニルピロリジノン、様々な親水性ポリマーなどの水溶性ポリマーを用いて分離できることは公知である。
【００１２】
排除体積プロセスの例は、PEGを用いることによる水溶液からのタンパク質の沈殿である。Atha及びIngham, J. Biol. Chem., 256(23): 12108-12117 (1981)を参照されたい。本文献は引用により本明細書中に取り込まれている。PEG又はPEOは、エチレンオキシド繰返し単位を含むポリマーについて使用される用語である。一般に、PEG存在下のタンパク質の溶解度は式logS=bC+xに従う。Sは溶解度、CはPEG濃度である。PEGとタンパク質との引力及び反発力の化学相互作用は、一般に、沈殿機構においてはあまり重要でない。温度は、典型的には重要な影響を有しない。それらの分子量(MW)が増加するにつれて、PEGは沈殿を生じることに多少効果的である。そして、それらのMWが増加するにつれて、タンパク質はPEGに多少影響される。従って、PEGは、様々な種類のタンパク質及び他の物質を沈殿させるために用いることができる。
【００１３】
PEG及び他のポリマーを用いる分離は、ポリマー濃度、その分子量及びポリマー使用の種類に依存する。沈殿のためのポリマーは、本明細書中の手引を考慮して、必要に応じて選択されることができる。ポリエーテル及びポリアルキレンオキシドは、沈殿に有用である。ポリエーテルは、PEG及びポリプロピレングリコール(PPG)を含む。使用されるポリエーテル、ポリアルキレンオキシド又はPEG誘導体にもよるが、好ましい分子量範囲は、約200〜約100,000、より好ましくは約400〜約5,000、例えば約2,000である；当業者は、明確に定まった範囲内のすべての範囲及び値が意図されることを直ちに理解するであろう。一般に、ポリマーを沈殿させるより高い濃度は、より有効な分離を生じる。典型的には、好ましいポリエーテル、ポリアルキレンオキシド又はPEG誘導体に関して、濃度は、約10〜約70%w/w、より好ましくは約20〜約60%w/w範囲である。更に、ポリエーテル、ポリアルキレンオキシド又はPEG誘導体は、沈殿のためのコポリマー、例えば、PLURONICSポリマーを製造するために用いることができる。幾つかの実施態様において、コポリマーは、分子量で少なくとも約40%、例えば、100%、少なくとも約50%又は60%のポリエーテル、ポリアルキレンオキシド又はPEGである;当業者は、明確に定まった範囲内のすべての範囲及び値が意図されると直ちに理解するであろう。
【００１４】
別の沈殿技術は、塩析と呼ばれる。タンパク質溶解度は、タンパク質、pH、温度及び使用される塩の濃度の生理化学的な性質の関数である。また、塩がコスモトロピック(水の構造を安定化させる)であるか、カオトロピック(水の構造を破壊する)かどうかに依存する。低濃度の塩で、タンパク質の溶解度は、通常わずかに増加する(塩溶)。低濃度の最初の塩溶は、デバイ-ヒュッケル理論によって説明される。タンパク質は塩対イオン(逆の実効電荷のイオン)によって囲まれ、このスクリーニングはタンパク質の静電自由エネルギーの減少及び溶媒の活性の増加を生じる。すなわち、溶解度を増加させる。この理論は、イオン強度の二乗根に比例する溶解度の対数を予測する。
【００１５】
しかし、高濃度の塩では、タンパク質の溶解度は激減する(塩析)。多量の塩イオンは塩イオンの溶媒和力を減少させ、結果、タンパク質の溶解度が減少し、沈殿が生じる。高塩濃度で、溶解度は、経験的な表式によって与えられる:log S = B - KI、式中、Sはタンパク質の溶解度であり、Bは定数(タンパク質、pH及び温度の関数)であり、Kは塩析定数(pH、混合物及び塩の関数)であり、Iは塩のイオン強度である。異なるタンパク質がアミノ酸の異なる組成物を有するので、異なるタンパク質分子は異なる濃度の塩溶液で沈殿する。
【００１６】
特定のイオンは、イオンの濃度が増加するときに、タンパク質の溶解度を減少させる代わりにタンパク質の溶解度を増加させることができる。幾つかのイオンは特定のタンパク質を変性させることができるので、タンパク質の機能上の分析が意図される場合、別のイオン又は代わりの精製方法を使用しなければならない。硫安塩析は、タンパク質の溶解度を変えることによるタンパク質精製法である。硫酸アンモニウムは一般に、その溶解度が高く、高イオン強度を有する塩溶液となるように使用される。
【００１７】
また、スクロース、フルクトース、グルコース、塩化ナトリウム、グリセロール、塩化カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウム、トリエタノールアミン、トリエタノールアミン塩酸塩、塩化マグネシウム、及びそれらの組合せなどの生物学的適合性塩又は低分子量化合物を、タンパク質又は他の生物活性物質を沈殿させるために用いることができる。生物学的適合性とは、生物体又はポリマーのインプラント部位と適合可能な組織相互作用を記載するように使用される用語である。典型的には、塩化ナトリウムなどの塩は、5%〜30%、より好ましくは、15%〜30%の範囲の濃度域において用いられ得る。塩化ナトリウム(30%)及びスクロース(10〜45%)などの2つの以上塩の組合せを、タンパク質の固体状態の保持又はその溶解の抑制のために用いることができる。ゲル化プロセスに干渉しない塩又は化合物が最も好ましい。例えば、ポリアミンベースの前駆体又はマクロモノマーと反応することができる官能基を有しないスクロース又は塩化ナトリウムが最も好ましい。高濃度(＞30%)のスクロースなどの幾つかの添加剤は、高粘度溶液を生じる。カテーテル技術又は特定のスプレー適用で送達される場合、高粘度溶液は望ましくないであろう。このような条件下では、塩化ナトリウムなどの塩のような化合物を用いることができる。塩化ナトリウムの使用は、重要な方法において媒体の粘性に影響を及ぼさない。一実施態様において、20%塩化ナトリウム及び25%スクロースの溶液を、低濃度で、ジリシン又はマクロモノマーを溶解するために用いる。
【００１８】
幾つかの実施態様では、溶媒特性を、沈殿制御のために用いる。幾つかの材料は、水溶液に不溶性又はやや溶けにくいだけであるが、有機溶媒又は水性及び有機溶媒の混合物によって溶解されることができる。幾つかの有機溶媒は、他の溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド又は幾つかの低分子量アルコールより比較的に生物学的適合性である。生物活性物質を有機溶媒又は有機水性溶媒混合物に溶解し、続いて、有機溶媒の濃度を溶解度未満に下げて物質を沈殿させるように、他の溶液に曝すことができる。アルコールの例には、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、及びC3又はより長いアルキルと-OHとを含む分子(-OHは任意にアルキル上又は任意にアルキル末端に存在する；したがって、C4又はC6などのアルキルを用いることができる。）がある
【００１９】
幾つかの実施態様において、イオン量又はpHを沈殿の制御に用いる。
【００２０】
(原位置でのヒドロゲル重合)
ヒドロゲルは、原位置で1以上の前駆体分子から形成されることができる。ヒドロゲルとは、相当量の水を保持する固体架橋不溶性親水性材料を意味する。架橋は、共有結合形成方法を指し、又はポリマー/巨大分子の間のいずれをも架橋する。架橋剤は、架橋形成ができる化合物である。原位置とは、ヒドロゲルが配置され、その機能寿命の間残存され、典型的には組織と接触されることを目的とする、患者体内の局所部位を指す。幾つかの実施態様において、2以上前駆体を混合し、架橋を開始し、ヒドロゲルを形成する;従って、ヒドロゲルは、ヒドロゲルの成分である前駆体より成る。重合は、前駆体の多量の繰返しを有する架橋材料を形成するように、求電子-求核反応によって前駆体を反応させることを含む幅広い用語である。他の実施態様において、1以上の前駆体は、架橋、例えばフリーラジカル重合の開始による架橋を含むプロセスを開始するために活性化される。原位置に形成される生分解性ヒドロゲルを液体又は流動性状態で投与し、続いて、適用部位で固体に変換することができる。この変換は、光重合などの外部のエネルギーを用いて、又は自発的に化学的に開始される重合を用いて行うことができる。上記プロセスは、外部エネルギー印加(例えば、非光活性化)の非存在下、又はフリーラジカル開始剤の非存在下でも行うことができる。すなわち、その系(例えば、求電子-求核反応)の成分を単に混合することによって誘発することもできる。
【００２１】
原位置での形成は、多くの現代の手術に役立つ低侵襲外科手術とともに、任意の適切な手段によって行うことができる。幾つかの実施態様は、混合又は重合などの別事象と同時に薬剤の沈殿を要求する;この文脈において、同時という用語は、時間的に近くかつ因果的に関連することを意味する。例えば、混合プロセスは、溶媒の特性を変え、結果、沈殿を生じるのに時間がかかるかもしれないが、それにもかかわらず事実上同時である。従って、同時混合及び重合に関する幾つかの実施態様について、重合は混合から始まり、後に終了し得る。幾つかの実施態様は、局所での混合及び蓄積の組合せに対応する;混合は、蓄積時の前、蓄積時と同時、蓄積時前後に終了してもよい。したがって、局所で材料を形成する前駆体を混合及び蓄積させる噴霧器は、幾つかの用途では混合時に重合を開始する成分が必要とされることを考慮して、重合を蓄積時の前、蓄積時と同時、蓄積時前後に開始させることができる。
【００２２】
本明細書中に使用される低侵襲外科手術又はMISという用語は、腹腔鏡検査、胸腔鏡検査、関節鏡検査、腔内内視鏡検査、血管内技術などの外科技術;カテーテルに基づく心臓技術(バルーン血管形成など)及びインターベンショナルラジオロジーを含む。また、低侵襲外科手術は、細針による又は針のない注射系(needleless injector systems)による注入を意図する。
【００２３】
ヒドロゲルは、例えば、水中での自然発生的な加水分解、すなわち、酵素の介入なく、例えば水への暴露によるエステル基の開裂により、小片に生分解可能であってもよい。一般に、生分解は、その後体内で開裂される小成分、例えば腎臓で排出される小分子に分解する材料を生じる。他の材料は、酵素又は細胞系分解、例えば、大部分のタンパク質によって分解されることができる。ヒドロゲル分解の副産物は非炎症性の傾向があり得るので、生分解性ヒドロゲルは、他の生分解性ポリマーを超えて高い生体適合性を示すことができる材料である。
【００２４】
原位置で重合可能な特定の生分解性ヒドロゲルは、米国特許第5,410,016号に記載されている。それはフリーラジカル重合による生分解性ヒドロゲル形成のための組成物又は方法を記載する。重合は、モノマー連結を生じる共有結合形成能を有する分子、例えば、アクリレート型分子の炭素-炭素二重結合を含む分子、又は適切な環境下で互いに曝露された場合に共有結合形成可能な相補的な官能基を有する他の分子と相互作用することができる官能基を有する分子が反応することを意味する。生分解性は、ヒト又は動物体内で分解又は加水分解するそれらの架橋剤、ゲル、ポリマー、及び巨大分子に使用される用語である。
【００２５】
別の参考文献は、米国特許第6,566,406号であり、とりわけ、生分解性ヒドロゲル形成に用いられる求電子性又は求核性前駆体間の縮重合又は反応による生分解性ヒドロゲルの形成が記載されている。両特許は、それらの形成の方法及びそれらの分解時間を制御することを教示している。生分解性ヒドロゲルの他の方法は、温度変化の結果形成されるゲル、例えば、プルロニックゲル又は水混和性有機溶媒を用いて送達されるときに形成されるヒドロゲルなどのゲルを含む。原位置のヒドロゲル形成を記載する他の参考文献は、米国特許第5,874,500号、第6,152,943号、第6,514,534号、第6,605,294号、第6,632,457号、第6,818,018号及び第6,887,974号である。
【００２６】
重合は、共有結合を形成するために求電子性官能基を求核性官能基と反応させることによって行うことができる。官能基は、例えば、求核試薬と反応可能な求電子試薬、一級アミンなどの特定の求核試薬と反応可能な基、タンパク質とアミド結合を形成する基、カルボキシルとアミド結合を形成する基、活性酸官能基又はこれらの組合せであってもよい。求電子試薬は、マイケル型反応に関与しない種類のもの、又はマイケル型反応に関与する種類のものであってもよい。マイケル型反応は、共役不飽和系の求核試薬の1,4付加反応を指す。共役という用語は、炭素-炭素、炭素-ヘテロ原子、ヘテロ原子-ヘテロ原子多重結合の交互変化、或いは合成ポリマー又はタンパク質などの巨大分子への官能基の結合、双方を指す。マイケル型反応は、米国特許第6,958,212号に詳述されている。この文献は、本明細書中に明確に開示されていることと矛盾しない程度に、全ての目的に関して本明細書中に引用されている。マイケル型反応に関与しない求電子試薬の例は、スクシンイミド、スクシンイミジルエステル、NHS-エステル又はマレイミドである。マイケル型求電子試薬の例は、アクリレート、メタクリレート、メタアクリル酸メチル及び他の不飽和重合可能基である。
【００２７】
前駆体の反応性官能基の例は、n-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、n-ヒドロキシスルホスクシンイミド及びマレイミドである。特にNHS-アミン反応の利点は、通常10分以内、1分以内、又は10秒以内に迅速なゲル化を生じる混合物を生成する反応速度論を用いることができることである。ゲル化は、重合終了前にもたらされ得る粘稠状態を指す。NHS-アミン架橋反応は、副生成物としてN-ヒドロキシスクシンイミドの形成を生じる。N-ヒドロキシスクシンイミドのスルホン化又はエトキシル化形態は、水への溶解度を増加させ、それ故、体から迅速に除去される。スクシンイミド環上のスルホン酸塩は、NHS基の一級アミンの反応性を変更しない。幾つかの実施態様において、NHS-アミン架橋反応は、水溶液中及び緩衝液の存在下で行われる。例を挙げると、リン酸緩衝液(pH5.0-7.5)、トリエタノールアミン緩衝液(pH7.5-9.0)、及びホウ酸緩衝液(pH 9.0-12)及び炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH 9.0-10.0)がある。
【００２８】
ヒドロゲル生成の一実施態様は、少なくとも一種の多官能性架橋剤の使用を伴う。多官能性という用語は、共有結合を形成するための少なくとも2つの反応性官能基を有する前駆体を指す。架橋剤は、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12官能基、又はそれ以上を含むことができる。
【００２９】
原位置材料は、前記前駆体、又は組織表面の間隙及び微小凹凸部に浸透可能であるが同時に重合して凝固し、その凹凸部を囲う頑強な構造を作り出す粘性及び流動性を有する前駆体を提供することにより、組織に接着させることができる。流動性材料は、組織に有利に適合し、それを親密にコーティングする;対照的に、作成済み機器を組織に配置し、それを接触させることができるが、原位置形成により生成される親密な適合性を欠く。したがって、組織に配置される原位置形成材料は、非原位置(not-in situ)形成材料と比較して異なる構造を有する。この異なる構造は、適合表面(conformal surface)、すなわち、原位置形成材料が製作される表面である。組織という用語は広範であり、体外及び体外部位を含む。幾つかの実施態様は湿性組織、例えば、体内組織(表皮に触れない)、眼組織(例えば、眼内又は角膜)、又は体外(皮膚の表皮を越えて浸透していない)を意図する。
【００３０】
原位置形成材料を、様々な目的のために用いることができる。一実施態様は、例えば、体内インプラントなどの薬剤送達蓄積の形成である。他の用途は、例えば、外科用接着剤、接着剤、包帯剤、止血剤、創傷治療薬又は封止剤である。例えば、前駆体は、架橋材料を形成するために、反応性官能基(生分解性基を有する又は有しない)を持つ天然又は合成ポリマーと反応することができる。またモノマーを重合反応に使用して、架橋材料を形成することができる。溶媒が、架橋剤、モノマー又はマクロマーと結合されてもよい。また、無溶媒又は無水組成物を、原位置に材料を生成するために配合することができる。都合良くは、架橋ゲル材は、視覚化剤を含むことができる(例えば、封止剤が腹腔鏡法で用いられる場合)。様々な臨床応用が、例えば、Schlag & Redl, Fibrin Sealant in Operative Surgery (1986) Vol. 1-7にあるように、例えば心臓血管手術、整形外科手術、神経外科、眼科手術、一般手術、並びに外傷、プラスチック復元及び顎顔面手術、耳鼻咽喉科などに用いられることができる。
【００３１】
幾つかの実施態様は、材料の原位置形成に関し、使用のその意図された部位で材料を形成することに関する。従って、ヒドロゲルは、ヒドロゲルが使われることを意図する部位で、例えば、封止剤、創傷被覆材又は徐放用薬剤蓄積として、患者において原位置で形成されることができる。材料が外科的封止剤として使用されるゲルである場合、架橋ゲルは、ヒト又は他の動物において利用されることができる。封止剤のための医療用途は、例えば、組織又は器官の結合すること、放出を止めること、創傷を癒やすこと、外科創傷を封止することを含む。または、架橋材料は、マトリックスを代用血管の細胞増殖又はコーティングに提供するなどの、組織工学用途のために用いられることができる。組成物の投与量は、その意図された使用に依存する。大部分の外科的用途において、生物学的流体(又は他の前駆体流体)及び原位置に導入される架橋剤の総体積1〜500mlは十分であるが、必要に応じて、他の量を使用してもよい;当業者は、明確に定まった範囲内のすべての範囲及び値が意図されると直ちに認めるであろう。
【００３２】
(沈殿のための生物活性物質)
生物活性物質は、本明細書中に引用される特許に記載され、水溶性(1リットル当たり少なくとも1グラムの濃度で水性溶液に可溶)、わずかに水溶性(1リットル当たり少なくとも0.01グラム及び1リットル当たり1グラム未満の濃度で水性溶液に可溶)、本質的に水性溶液に不溶、疎水性、又はそれらの水溶解度を向上させる官能基で修飾され、これらのカテゴリーの1つから別のものに変わるこれらの薬剤である生物活性物質(生物活性薬剤、治療薬、薬剤)を含む。
【００３３】
幾つかの実施態様において、生物活性物質は、水溶性であり、固相に存在するように、原位置重合化ヒドロゲル内に包括される。その溶解は、ヒドロゲル構造よって妨げられ、生理的状態下で数日〜数ヶ月の長期間に渡ってゆっくり溶解し、放出する。包括とは、包括材料を実質的に囲むことを指す;ヒドロゲル中の沈殿物の場合、その沈殿物は、ヒドロゲルストランド間の平均空間より大くても小さくてもよい。薬剤の調製を制御し、所望サイズの粒子を製造し、同じことを達成することができる。材料を包括する方法は一般に大部分の材料を包括するが、特に明記しない限り、材料の一部がヒドロゲル上又はその外側に残されていてもよい。様々な材料及び方法を、生物活性物質の制御された薬剤送達のために本明細書中に記載する。この種の組成物は、ヒドロゲルの液体前駆体を有する生物活性薬剤又は薬剤の再構築時に原位置で生成するか、又はこれらの前駆体中の懸濁若しくは分散固体として存在してもよく、かつ侵襲的外科治療を用いて任意に送達されてもよい。
【００３４】
薬剤という用語は、診断、医学視覚化又は生物活性効果などの医学目的のために使用されるそれらの薬剤を指し、本明細書において、生物活性薬剤又は生物活性物質と称される薬剤を含む。生物活性薬剤又は生物活性物質という用語は、生物活性効果を有するように医学目的に使用されるそれらの薬剤を指すために用いられる。ヒト又は動物体内で放出され得る生物活性物質の幾つかの例を挙げると、抗ウイルス薬;抗生物質などの抗感染薬;止痒剤;抗精神病薬;コレステロール又は脂質低下剤、細胞周期阻害剤、抗癌剤、抗パーキンソン薬、HMG-CoA阻害剤、抗再狭窄剤、抗炎症剤;気管支喘息治療薬剤;抗血友病薬;免疫抑制薬;筋弛緩薬;抗利尿薬;一酸化窒素又は一酸化窒素付加物などの血管拡張薬;ベータ受容体遮断薬;ホルモン;抗鬱薬：充血除去薬;カルシウムチャネルブロッカー;骨成長因子、骨髄タンパク質、血管内皮成長因子、血小板誘導成長因子、酸性成長因子、塩基性成長因子などの成長因子、損傷治癒剤、鎮痛薬及び鎮痛薬の組合せ;局所麻酔薬剤、抗ヒスタミン剤;鎮静剤;血管形成促進剤;血管形成阻害剤;精神安定剤などがある。多くの例において、薬剤放出の継続は、薬剤の疎水性に影響を受ける。組織複合材料に取り込まれる生物活性物質の量は、約0.1パーセント〜約90パーセントの範囲で、より好ましくは、約5〜約70パーセントの範囲、より好ましくは、約10〜約50パーセントの範囲である。場合によっては、2種の以上の生物活性物質を、望ましい治療効果を達成するために用いることができる。
【００３５】
(原位置ヒドロゲル形成及び生物活性物質沈殿)
ヒドロゲルは、生物活性物質がヒドロゲル形成時点で沈殿されるように、存在する生物活性物質とともに原位置に形成されることができる。一般に、生物活性物質は溶液中に置かれ、該物質が前駆体自身の存在により又は物質の化学環境の他の変化、例えば体積排除効果又は塩濃度、溶媒特性、イオン量若しくはpHの変化により沈殿するように、溶液をヒドロゲルの少なくとも一種の前駆体と混合する。
【００３６】
幾つかの実施態様において、前駆体溶液は、生物活性物質の沈殿を生じることができるPEG及び/又は他の要因を含むことができる。前駆体溶液は生物活性物質と混合され、それによって沈殿する。前駆体溶液はまた、ヒドロゲルを形成するために反応し、沈殿された生物活性物質を包括する。
【００３７】
制御薬剤送達に有用であり、かつ外科的手術の間に原位置に形成される得る生分解性ヒドロゲルは、制御薬剤送達のための光重合性ヒドロゲルの使用を記載する米国特許第5,410,016号など、これまでに記載されている。この特許は、生物活性物質の放出を制御するために、架橋密度の使用を記載している。そして、米国特許第6,566,406号は、縮重合反応を用いる生分解性ヒドロゲルの形成を記載している。しかしながら、これらの特許は生物活性物質の沈殿を教示していない。制御方法の生理的環境において通常水溶性であり、低侵襲外科手術に適合する技術を介して、薬剤を送達することができる組成物及び方法、特に、生分解性組成物及び方法の必要性がある。また、送達の長い期間に渡って、前記薬剤を生理的環境による分解から保護する必要性もある。
【００３８】
(生物活性物質送達)
幾つかの実施態様において、生分解性ヒドロゲルは原位置に形成され、ヒドロゲルは一以上の生物活性物質を有する。生物活性物質は、固体状態などの別の相に存在してもよい。定義上、ヒドロゲルは大量の水を含み、水に溶解しない。生物活性物質は、例えば、アモルファス又は結晶性又は半結晶固体として存在してもよく、或いは油又は半流動ワックスなどの不溶性液体として存在してもよい。生分解性ヒドロゲルから相分離は、原位置のヒドロゲル形成後に生じてもよく、又はゲルの原位置形成の前に存在してもよい。
【００３９】
幾つかの実施態様において、生物活性物質は、前駆体を用いてヒドロゲルに沈殿する(実施例1を参照)。生物活性物質は固体として存在し、ヒドロゲルがその周囲に形成し、該物質が時間とともに放出される。あるいは、該物質は、原位置ヒドロゲル製造プロセスにおいて、他の溶液と混合される溶液中、別の要因によって沈殿される。
【００４０】
実施例1は、どのようなPEGが生物活性物質を沈殿させるために使用されることができるかということ、及びヒドロゲルが形成されるときにその物質は固体であってもよいことを示す。原位置の重合可能なヒドロゲルは、求電子性及び求核性基を含む2つの前駆体を混合することによって得られる。求電子性及び求核性基は、生分解性なヒドロゲルを形成するために、原位置で反応する。前記の原位置重合系の商業用の例は、Confluent Surgical社(Waltham, MA)によって市販されるDURASEAL又はSPRAYGEL外科的封止剤である。
【００４１】
一般に、物質は、生理的流体にさらされる位置で製造されることができる。生理的流体は、患者、例えばヒト又は動物の流体にを指す。前記流体は、涙、唾液及び間質液を含む。前記位置は、これら種類のうちの１つの流体又は他の流体、すなわち特定のpH範囲、例えば、pH約7〜約8の流体への配達を標的とするように選択されることができる。pH 6未満の他の位置、例えば、胃を標的とすることができる。従って、幾つかの実施態様は、胃の外側の位置、又は胃のpH状態以外の位置を対象にする。他の位置は、pH約8より大きいアルカリ性であり、従って標的とされることができる。生理的流体にさらされる位置は、体液と接する患者の部位を指す。場合によって、前記位置は、血液流体との接触を避けるように選択される。従って、血管外蓄積は、本発明の実施態様である。
【００４２】
(具体例によって例証される一般原則)
様々な例を、本明細書中に記載されている一般原則を例証するために記載する。一般に、各実施態様の特徴を、操作可能である他の実施態様を構成するために、互いに混合及び調和されてもよい。
【００４３】
実施例1に記載されている例示的実施態様において、アバスチンを、モデル生物活性物質として使用する。前駆体Aは、PBS中にPEG-NHSエステルを溶解することによって調製され、前駆体Bは、PBS中にPEG-アミン溶液を溶解することによって調製される。アバスチン又はベバシツマブ(Genentech Inc)、ヒト血管内皮成長因子(VEGF)に結合し、かつその生物活性を阻害する組換えヒト化モノクローナルIgG1抗体。ベバシツマブは、ヒトフレームワーク領域及びVEGFに結合するマウス抗体の相補性決定領域を含む。ベバシツマブは、約149キロダルトンの分子量を有し、抗血管形成薬として共通に言及される新規薬剤種として考えられている。この種の薬剤は、癌治療、更には、新生血管年齢関連黄斑変性症のような眼の疾患、並びに黄斑浮腫の治療に役立つと考えられている。アバスチンを溶液Bに加え、PEG溶液の懸濁液を形成する。PEG及びタンパク質は、水素結合に関して水分子と競合し、溶解度を増加させるので、タンパク質薬剤の溶解度はPEG含有溶液において制限される。PEGの存在は、タンパク質薬剤アバスチンが水性媒体に可溶化するのを防止する。アバスチンは、固体粒子(相分離)として、前駆体中にとどまる。求電子性基と求核性基間の化学量論が維持されるような状態で、前駆体を混合する。アミン及びNHS基のモル等価は、迅速かつ完全な重合及び架橋の促進に有用である。A及びBを混合すると、即座に、PEGアミン及びPEG-NHSエステルは、アバスチン粒子の存在下で反応し、架橋ヒドロゲルネットワークを形成する。A及びBを混合し、アバスチンを含むことによって調製される架橋ヒドロゲルを使用し、該架橋ヒドロゲルからアバスチンの放出をモニターする。ヒドロゲルを、数週間に渡って37℃でPBS溶液中でインキュベートし、溶出サンプル中のアバスチン濃度をタンパク質分析によってモニターする。ヒドロゲルからアバスチンを放出するために、アバスチンは水に可溶化し、その後、ヒドロゲルマトリックスから治療的作用周囲組織に外へ拡散されなければならない。全体の速度論又は放出は、アバスチンの水への溶解、及び架橋ヒドロゲルからの拡散によって制御される。アバスチンの溶解は、ヒドロゲルからの放出を制御する際の鍵要素であり、新しい要素でもある。
【００４４】
アバスチンのこの相分離は、計画的に作成される。相分離は、2つの重要な効果を有する。相分離は、放出の制御に役立つ原位置重合の後に薬剤の遅い溶解を可能にする。また相分離は、重合/架橋反応の薬剤又は生物活性物質による干渉を減少する。実施例1において、相分離を、ポリエチレングリコール又はその誘導体を用いて作成する。溶液中の塩/糖の存在は、重合系においてアバスチン又はフィブリノーゲンの溶解を抑制することができる。PEG又は塩の存在は、架橋及び重合反応の間、アバスチンを固体状態に保つ。重合の化学(pH、緩衝液、濃度及び温度)、様々な求電子性及び求核性基、架橋ヒドロゲルの分解制御は、本明細書中に引用される特許において説明されている。上記のA及びB溶液は、ヒト又は動物の体内に薬剤送達機器を形成するために、MIS技術を用いて配置されることができる。A及びBの成分は、凍結乾燥粉末として提供されることができ、使用直前に再構成されることができる。スプレー又は他のMIS技術を、手術部位に組成物を輸送するために用いることができる。生物活性物質の用量は、使用される薬剤の種類又は性質、及び対処されている疾患状態によって制御されることができる。生物活性物質は、溶液A又はBと混合されることができる。選択は、使用される前駆体に関して、生物活性物質の反応性により測定される。好ましくは、生物活性物質は、通常の貯蔵及び使用において生物活性物質と反応しない前駆体と混合される。例えば、アバスチンは、通常の貯蔵及び使用条件下で、PEGアミン前駆体のアミン基と反応する可能性は低く、従って、PEGアミンと混合されることが好ましい。高分子化学、薬化学の当業者は、前駆体及び生物活性物質の化学作用に応じて、適当な混合条件を選択することが可能であろう。アバスチンと同様に、他のタンパク質薬剤を使用することもできる。重合条件及び緩衝液条件を、タンパク質薬剤を沈殿又は相分離するために用いることができる。例えば、特定の塩基性及び酸性成長因子はそれぞれ、酸性又は塩基性溶液に溶解する。緩衝液などの前駆体反応条件を選択することができ、それらの濃度を、タンパク質薬剤を沈殿させるように調整することができる。一実施態様において、強酸性溶液に溶解するが、中性又は塩基性条件下では不溶性である骨成長因子を使用し、薬剤を懸濁化する。骨成長因子は、成長因子が懸濁を形成する高PHで、ポリアミン溶液中に懸濁化される。懸濁液はPEG-NHSエステルと反応し、重合を完了して、骨成長因子の粒子を包括する。薬剤の分離又は沈殿において、生物活性物質がタンパク質の変性のためその望ましい生物活性を失わないよう注意する。タンパク質化学の当業者は、その積極的な溶媒、過剰pH、高温が生物活性の損失を促進し得ることを理解しているであろう。好ましい重合条件は、生物活性物質の生物活性が維持される所で、実験的に選択される。
【００４５】
市販のパクリタキセル製剤は、多くの場合、水溶性又は水分散性形態で存在する。この種の形態で投与される場合、それは水性環境において迅速に分散する。しかし、パクリタキセルの低い水溶性を、インプラントの原位置形成時の、分離相作成に利用することができる。静脈内投与用の市販のパクリタキセル製剤を、トリリシン誘導前駆体(実施例7)と混合することができる。アミン溶液の混合は、パクリタキセル結晶を溶液中に懸濁する。PEG NHSエステル基との混合時に、重合及び架橋が起こり、パクリタキセル結晶がヒドロゲルに包括される。パクリタキセル結晶はゆっくり溶解し、その後、可溶化パクリタキセルは、ヒドロゲルネットワークから拡散する。この場合において、パクリタキセルは小分子治療薬であり、溶出速度は、パクリタキセル結晶の溶解によって支配され、ヒドロゲルマトリックスからの薬剤の拡散によっては支配されない。パクリタキセルの代わりに使用することができる他の水不溶性薬剤は、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない:アトルバスタチン、シムバスタチン、セリバスタチンのようなスタチン薬剤、クロルヘキシジン誘導体などのような抗生物質など。
【００４６】
別の実施態様において、ビタミンEなどの水不溶性生物活性物質が、モデル生物活性物質として用いられる。ビタミンE(アルファ-トコフェロール)又はその誘導体は、周囲条件又は生理的条件で、油性液体として存在する。ビタミンEとアミン前駆体溶液との混合により水-油懸濁液/エマルジョンを形成し、その後、PEG-NHSエステルと反応させ、架橋ヒドロゲルを形成する。油性水不溶性相は、ヒドロゲル中に包括され、その後、それが水に溶解するにつれて放出される。
【００４７】
別の例示的実施態様において、感熱性ヒドロゲルを、アバスチン放出のために使用する。最初に、プルロニックF-127の溶液を、6グラムのPBS中、4グラムのプルロニックF127溶液を溶解することによって作る。混合物を10℃未満に冷却し、ポリマーを溶解する。100mgのアバスチン凍結乾燥粉末を、その冷却溶液に加える。薬剤は、プルロニックポリマー(PEGベース誘導体)の存在により、懸濁粒子として残存する。冷却溶液を、体温によりプルロニック溶液が柔ヒドロゲルに変化される組織に適用する。薬剤結晶の溶解により、薬剤がヒドロゲルから放出される。また、PEG-ポリヒドロキシコポリマー、テトロニックポリマー、n-イソプロピルアクリルアミド系システムをベースとした他の感熱性感度システムを用いることができる。あるいは、薬剤(例えば、アバスチン)を、少量の食塩溶液に溶解することができ、濃縮ポリマー溶液、例えば、プルロニックF-127の50%w/w溶液と混合することができる。食塩水とポリマー溶液とを混合する場合、薬剤が沈殿されるように混合比を、例えば、約37%の溶液が作られるように薬剤対溶液比1:3に調節することができる。混合物は、生理的温度に暖められるときに、薬剤が原位置で包括されるように体内でゲルを形成するであろう。幾つかの実施態様において、混合物は、体内又は体表上の標的部位で作られる。すなわち、ゲルが原位置で形成される。
【００４８】
別の例示的実施態様において、米国特許第6,566,406号に記載されているものと類似の生分解性組成物を使用する。生分解性架橋マトリックスは、PEG-NHSエステルとトリリシンとの縮重合反応によって形成される。典型的なタンパク質ベースの生物活性物質、フィブリノーゲンを、トリリシン溶液と混合する。トリリシン及びPEG-NHSエステルは、架橋ヒドロゲルマトリックスを形成する重合及び架橋を受ける。ジリシンと混合されたフィブリノーゲンは、ポリエチレングリコールポリマーを含む溶液と混合されるときに、沈殿する。多くのタンパク質、特に高分子量タンパク質は、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどのような水溶性ポリマーと混合されるとき、相分離を起こす。フィブリノーゲンの沈殿は、ジリシンとPEG-NHSエステルとの架橋反応に影響を及ぼさない。沈殿フィブリノーゲンは、架橋マトリックス内に包括される。沈殿フィブリノーゲンは、水に溶解し、周囲組織で放出される。全体の放出は、架橋マトリックスの架橋密度、生理的pHでの水へのフィブリノーゲンの溶解速度、及び架橋ヒドロゲルの分解速度に依存する。米国特許第6,566,406号は、ヒドロゲルの分解速度及び架橋密度を制御するために、方法及び組成物を教示している。沈殿生物活性物質(フィブリノーゲン)の溶解は、生物活性物質の放出を制御する新しい方法を提供する。米国特許第6,566,406号に記載される組成物を用いる場合、生物活性物質が生物活性物質と化学反応を受けない前駆体成分と混合されることが理解される。上記の例において、化合物は、フィブリノーゲンと反応しないジリシン誘導体と混合される。生物活性物質がPEG-NHSエステル基と反応し得るアミン基などの化学基を有する場合、それらの寄与は、求電子性基と求核性基の間の化学量論を計算する際に考慮しなければならない。架橋ヒドロゲルの生物活性物質の濃度は、0.1%〜90%、より好ましくは5〜70%、さらにより好ましくは10〜40%の範囲であることができる。上記の例は、溶解度刺激によって生物活性物質の相を生じる。別の例において、相変化又は沈殿は、前駆体組成物のpH変化によって生じる。例示的実施態様において、骨形成タンパク質-2などの酸性成長因子を使用する。骨形成タンパク質(BMP)及びトランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)は、骨修復及び再生の重要な制御因子である。BMPは通常、酸性溶液に溶解し、生理的pH(pH 7.2)にさらされるときに、特に高濃度で使用されるときに沈殿する。好ましい実施例において、求電子性前駆体と求核性前駆体との反応(PEG-NHSエステル及びポリアミン)は、前駆体混合時の最終的pHが約7.2を示すように設計され、制御される。このpHで、高濃度の前駆体と混合されるBMP-2は、架橋マトリックスのpH 7.2で沈殿される。沈殿されたBMP-2は、血管形成又は骨形成などの局所的治療効果を生じるように遅い溶解によって、ヒドロゲルにより放出される。
【００４９】
別の実施態様において、例えば、米国特許第5,410,016号のように、PEGベースのマクロマーなどの光重合性前駆体を使用する。1つの例示的実施態様において、PEGベースのマクロモノマーを、長UV光重合開始剤イルガキュア2959と混合する。続いて、このマクロマー溶液を、典型的な薬剤フィブリノーゲン溶液と混合し、PEGマクロマーの重合が部分的又は実質的に終了するまで、長UV光で照射し、ヒドロゲルの形成を生じる。PEG溶液のフィブリノーゲン溶液との接触は、フィブリノーゲンを強制的に沈殿させる。ヒドロゲルマトリックスのフィブリノーゲンの溶解は、その放出を制御するために利用される。また、BMPなどの他の生物活性物質、酸性及び塩基性成長因子を類似の様式で用いることができ、マクロモノマーとの接触によって、又は重合前に得られる最終溶液のpHを変えることによって、強制的に沈殿させることもできる。米国特許第5,410,016号に記載されている方法及び組成物は、マクロモノマー及び架橋マトリックスの特性を制御するために用いることができる。
【００５０】
別の実施態様において、相変化又は沈殿が有機溶媒の使用により生じる組成物を用いる。例証的実施態様において、パクリタキセルなどの水不溶性薬剤は、マクロモノマー及び遊離基開始剤などを含むエタノール溶液などの半水溶液中に溶解される。マクロモノマーの重合及びエタノールの除去時に、パクリタキセルは、固体としてヒドロゲルマトリックスに包括される。パクリタキセル結晶の溶解は、架橋マトリックスからの徐放につながる。使用され得るその他のわずかに水溶性の生物活性は、セリバスタチン、シムバスタチンのようなスタチン薬剤、グルコン酸クロルヘキシジンなどを含み、使用することもできる。
【００５１】
他の有用な非生物活性物質を加えることができる。これらは、凍結乾燥支援化合物、抗酸化剤、原位置のゲル化を促進する触媒、着色若しくは視覚化剤、イメージング剤、塩化ナトリウムのような沈殿剤などを含む。加えられる添加物の量及び種類は、使用される生物活性物質及び選択されるゲル化システムに応じて決まる。製薬化学の当業者は、所定の製剤化のための適切な成分を選択することが可能である。
【００５２】
本明細書中に記載されるすべての特許、特許出願、論文、刊行物及び引用例は、それらが明確に開示されることと矛盾しないという程度で本明細書中に取り込まれている。
【００５３】
以下の非限定的な実施例は、様々なヒドロゲル組成物、その組成物の沈殿方法、及び生物活性物質の取込方法の一部を例示することを目的とする。これらの実施例は、本発明を製作し使用するための一般原則を示している。
【実施例】
【００５４】
(材料及び機器)
ポリエチレングリコールは、Shearwater Polymers、Union Carbide、Fluka、及びPolysciencesなどの様々な提供先から購入することができる。多官能性ヒドロキシル及びアミン末端ポリエチレングリコールは、Shearwater Polymers、Dow Chemicals、及びTexacoから購入する。プルロニック及びテトロニック系ポリオールは、BASF社から購入することができる。他の全ての試薬、溶媒は、試薬等級のものであり、Polysciences、Fluka、Aldrich、及びSigmaなどの商業的提供先から購入することができる。大部分の試薬/溶媒は、Perrinらの文献に記載されている標準的研究室手順により精製/乾燥される。小さい研究室用機器及び医薬品は、Fisher又はCole-Parmerから購入することができる。アバスチン(bevacizuma)は、Genentech社から購入する。
【００５５】
(一般的分析法)
合成されるポリマーの化学分析法は、核磁気共鳴法(プロトン及び炭素-13)、赤外分光法、高圧液体クロマトグラフィ(HPLC)、及びゲルパーミエーションクロマトグラフィー(分子量測定用)を用いる構造決定を含む。融解点及びガラス遷移温度などの熱的特性は、示差走査熱量分析によって行うことができる。ミセル形成、ゲル形成などの水溶液特性は、蛍光分光法、UV-可視分光法、及びレーザ光散乱装置で測定することができる。
【００５６】
リン酸緩衝食塩水(pH 7.2)などの水性緩衝媒体中、ポリマーのインビトロ分解は、37℃で重量測定的に追跡する。インビボ生体適合性及び分解寿命は、ゲル化製剤をラット又はウサギの腹腔に直接注射又は形成し、2日〜12ヵ月期間にわたって、その分解を観察することによって評価する。あるいは、その分解は、架橋剤-生物流体組成物を型に入れることによる方法のような方法によって作成された作成済み無菌インプラントによって評価する。流体という用語は一般に、溶液、エマルジョン、懸濁液及びゲルを指す。続いて、インプラントを、動物体内に外科的に挿入する。インプラントの分解を、重量測定的又は化学分析によって時間とともにモニターする。インプラントの生体適合性を、標準組織学的技術によって評価することができる。
【００５７】
(実施例1)
(沈殿モデルタンパク質薬剤(アバスチン)を有する架橋生分解性ヒドロゲルの調製;縮重合により調製されるヒドロゲル)
薬剤は原位置ゲル化の間、固体粒子として存在する。
ポリエチレングリコールカルボキシメチレン-酪酸の4アーム-n-ヒドロキシスクシンイミドエステル1g (平均分子量10000ダルトン(Shearwater 4 arm CM-HBA-NS-10K))をPBS 4mlに溶解する。溶液Bは、2mlのPBSに1グラムのアミン末端ポリエチレングリコール(8アーム、分子量20000g/モル)を溶解することによって調製する。100mgのアバスチンを、PEGアミン溶液(溶液B)に加える。アバスチンは、高濃度PEGアミンのため、溶液Bに不溶性であり、懸濁/エマルジョンを形成する。0.1mlの溶液A及び溶液Bを共に混合し、架橋生分解性ヒドロゲルを形成する。アバスチンは懸濁を維持し、ヒドロゲルマトリックスに包括される。ヒドロゲルを5mlのPBS中に懸濁化し、PBS中のアバスチンの溶出を6週間にわたって37℃でモニターする。新たなPBSを、10分、30分、60分、2時間、4時間、8時間、16時間、24時間、2日、4日、7日、14日及び21日に交換する。アバスチン溶出溶液を、分析まで−20℃に保つ。PBS中のアバスチンの濃度を、標準タンパク質分析測定により、又は紫外分光測光法により測定する。
【００５８】
アミン溶液中のアバスチンの溶解度を制御するために、約5〜約45パーセントの範囲のスクロースの添加を用いることができる。
【００５９】
(実施例2)
(沈殿モデルタンパク質薬剤(フィブリノーゲン)を有する架橋生分解性ヒドロゲルの調製:縮重合により調製されるヒドロゲル)
(PEG溶液によるフィブリノーゲンの沈殿)
ポリエチレングリコール及びカルボキシメチレエン-酪酸の4アーム-n-ヒドロキシスクシンイミドエステル0.68グラム(平均分子量10000ダルトン(Shearwater 4 arm CM-HBA-NS-10K))を、pH 4.0で0.01Mリン酸緩衝液2.82gに溶解し、無菌濾過する。溶液Bは、0.025グラムのトリリシン及び10mgのウシフィブリノーゲン(Sigma Chemicalsから購入)を、視覚化のための0.1mg/mLのメチレンブルーを含むpH 9.5の0.1Mホウ酸緩衝液3.47gに溶解することにより調製する。1mlの溶液A及びBを、縮重合の促進のために混合する。トリリシン及びPEG-NHSエステルを反応させ、架橋ヒドロゲルを形成する。PEG-NHSエステル溶液及びリシン溶液を混合するときに、トリリシン溶液中のフィブリノーゲンの沈殿が見られる。フィブリノーゲンタンパク質は、ポリエチレングリコールなどの合成ポリマーと適合しない。沈殿フィブリノーゲンは、長期に渡ってヒドロゲルから放出される。放出の速度は、加水分解架橋ヒドロゲル、並びに生理的条件下での水中の沈殿フィブリノーゲンの溶解速度によって制御される。所望であれば、A及びBを使用直前に混合することができ、続いて、Confluent Surgical社によって商品化されたDuraSeal又はSprayGelシステムによって使用されるように、市販のスプレーシステムを用いて噴霧することができる。
【００６０】
この実施態様の別の変化において、スクロースをリシン溶液(溶液B)に加え(最終濃度20％)、フィブリノーゲンの溶解を抑制する。別の変化において、スクロースを、20%濃度で塩化ナトリウムと置き換える。
【００６１】
(実施例3)
(沈殿タンパク質薬剤(フィブリノーゲン)を有する架橋生分解性ヒドロゲルの調製: フリーラジカル重合により調製されるヒドロゲル)
パート1: ポリエチレングリコール乳酸塩コポリマー(10KL5)の合成
30.0gのPEG 10000、4.3gのdl-ラクチド及び30mgのオクタン酸第一スズを、100mlのパイレックス圧封管に充填する。その後、該管をアルゴンガスラインに結合し、アルゴン下で密封する。その後、該管を、140℃に維持した油浴に浸水する。反応を、140℃で16時間行う。該管からのポリマーを、パイレックス管を破壊することによって回収する。その後、ポリマーを、70mlのトルエンに溶解し、2000mlの冷ヘキサン中で沈殿させる。沈殿したポリマーを、濾過によって回収し、60℃で1日間、真空下で乾燥する。その後、直ぐに次の反応に使用した。
【００６２】
パート2: 10KL5の重合可能又は架橋可能な基のエンドキャップ(10KL5A2)。
30gの10KL5を、450mlの乾燥トルエンに溶解する。約50mlのトルエンを、反応混合物から微量の水を除去するために蒸留する。暖かい溶液を、65℃に冷却する。この暖かい溶液に、1.6gのトリエチルアミン及び1.5gの塩化アクリロイルを加える。その後、反応混合物を50〜60℃で30分間撹拌し、濾過する。ろ液を2000mlの冷ヘキサンに加えることによって反応性前駆体を沈殿させる。沈殿したポリマーを、濾過によって回収する。その後、50℃で12時間、真空下で乾燥する。
【００６３】
パート3:モデル薬剤としての沈殿フィブリノーゲンを有するヒドロゲルマトリックスの調製
溶液Aを、20gの10KL5A2、20gの塩化ナトリウム、1000mMのトリエタノールアミン緩衝液(pH 7.4)で緩衝した80gの食塩溶液、及び100mgのイルガキュア2959(Ciba Specialty Chemicals)光開始剤の混合により調製する。溶液Bを、15gのウシフィブリノーゲン又はヒトフィブリノーゲンを1000mMのトリエタノールアミン緩衝液(pH 7.4)で緩衝した80gの食塩溶液に溶解することによって調製する。1mlの溶液A及びBを混合し、360nmの長波UVランプ発光(強度10mW/cm2)で照射する。10KL5A2は、イルガキュア及びUV光によって開始される重合及び架橋を受ける。A及びBの混合はまた、PEG溶液との接触により、フィブリノーゲンの沈殿を生じる。沈殿フィブリノーゲンは、重合化10KL5A2マトリックスに包括されたままであり、周囲の水性媒体への溶解時にゆっくり放出される。放出速度は、フィブリノーゲンの溶解速度、及び10KL5A2架橋ヒドロゲルの分解速度により制御される。
【００６４】
(実施例4)
(沈殿タンパク質薬剤(骨成長因子)を有する架橋生分解性ヒドロゲルの調製)
(pH変化によるタンパク質薬剤の沈殿)
ポリエチレングリコールカルボキシメチレン-酪酸の4アーム-n-ヒドロキシスクシンイミドエステル1.41グラム(平均分子量10000ダルトン(Shearwater 4 arm CM-HBA-NS-10K))、及び100mgの骨形成タンパク質2(BMP-2タンパク質、組換え、SigmaカタログB3555)を、凍結乾燥粉末として固体状態で混合し、使用直前に、2.96mlの0.1M HClに溶解/懸濁化する。溶液Bを、視覚化のための0.1mg/mLのメチレンブルーとともに、pH 9.5の0.1Mホウ酸緩衝液7.2g中、0.06グラムのジリシン(Sigma Chemicalsから購入)を溶解することにより調整する。1mlの溶液A及びBを、ジリシンとPEG-NHSエステルとの縮重合の促進のために混合する。ジリシン及びPEG-NHSエステルが反応し、架橋ヒドロゲルを形成する。HClを、ホウ酸緩衝液で中和し、中性/塩基性溶液媒体を形成する。このpH及び濃度(pH＞7)で、BMPは不溶性であり、架橋前に溶液中に沈殿する。沈殿タンパク質は、ヒドロゲルに包括される。沈殿BMP-2は、長期間に渡ってヒドロゲルから放出される。放出の速度は、加水分解架橋ヒドロゲル並びに沈殿BMP-2の溶解速度によって制御される。あるいは、BMPを、0.1M HClの第1ジリシン溶液と混合し、混合時の最終pHを約7.2に維持して、CM-HBA-NS-10Kと反応させる。
【００６５】
(実施例5)
(沈殿疎水性薬剤を有する架橋生分解性ヒドロゲルの調製)
(水混合性有機溶媒を水溶液と混合することによるパクリタキセルの沈殿)
ポリエチレングリコールカルボキシメチレン-酪酸の4アーム-n-ヒドロキシスクシンイミドエステル0.70グラム(平均分子量10000ダルトン(Shearwater 4 arm CM-HBA-NS-10K))を、pH 4.0で0.01Mのリン酸緩衝液2.96gに溶解し、無菌濾過する。溶液Bを、0.30グラムのテトラリシン及び50mgのパクリタキセルを水中25%エタノール溶液3.64gに溶解することによって調製する。1mlの溶液A及びBを、縮重合を促進するために混合する。ジリシン及びPEG-NHSエステルが反応し、架橋ヒドロゲルを形成する。エタノール含量の減少は、ヒドロゲルに包括されている架橋ヒドロゲル中のパクリタキセル結晶を沈殿させる。沈殿パクリタキセルは、長期間に渡ってヒドロゲルから放出される。水性環境における放出の速度は、水中のパクリタキセルの溶解によって制御される。
【００６６】
(実施例6)
(沈殿パクリタキセルを含む架橋ヒドロゲルの調製)
重合可能なPEG系マクロモノマーを、20gの10KL5A2(実施例2)、20gエタノール、1000mMトリエタノールアミン緩衝液(pH 7.4)によって緩衝した60gの食塩溶液、100mgのイルガキュア2959、及び100mgのパクリタキセルの混合により調製する。1mlの溶液/懸濁液を、ラット腹腔組織表面に適用し、UV光(360nm)を用いて、原位置で重合する。重合時に、架橋ゲルを、開始剤断片及びアルコールの除去ために食塩溶液で洗浄する。アルコールの除去は、水性の環境のパクリタキセルの沈殿を生じる。パクリタキセルは、パクリタキセル結晶の溶解によりヒドロゲルから放出される。
【００６７】
(実施例7)
(沈殿されたモデル小化合物薬剤(パクリタキセル)を有する架橋生分解性ヒドロゲルの調製: 縮合重合により調製されるヒドロゲル)
(ヒドロゲルに包括された疎水性薬剤の使用)
ポリエチレングリコールカルボキシメチレン-酪酸の4アーム-n-ヒドロキシスクシンイミドエステル1.37グラム(平均分子量10000ダルトン(Shearwater 4 arm CM-HBA-NS-10K))を、pH 4.0で0.01Mリン酸緩衝液5.64gに溶解し、無菌濾過する。溶液Bは、視覚化のための0.5mg/mLのメチレンブルーとともに、pH 9.5で0.1Mホウ酸緩衝液6.94g中の0.050グラムのトリリシン及び100mgのパクリタキセルを溶解することにより調製する。パクリタキセルは、ホウ酸緩衝液に不溶性であり、溶液Bに懸濁化される。1mlの溶液A及びBを、縮重合を促進するために混合する。トリリシン及びPEG-NHSエステルが反応し、架橋ヒドロゲルを形成する。トリリシン溶液中のパクリタキセルは、微粒子として架橋ヒドロゲルに包括されている。パクリタキセル結晶は、架橋ヒドロゲルマトリックスにゆっくり溶解し、周囲組織に放出される。パクリタキセル放出の速度は、パクリタキセル結晶の溶解により支配される。パクリタキセルの溶出を、PBS中、実施例1に記載されている類似の方法を用いてモニターする。溶出されたサンプル中のパクリタキセルの分析を、HPLCを用いて実行する。
【００６８】
(実施例8)
(懸濁化されたモデル小化合物薬剤(ビタミンEl)を有する架橋生分解性ヒドロゲルの調製: 縮重合により調製されるヒドロゲル)
(ヒドロゲルに包括される疎水液体薬剤の使用)
ポリエチレングリコールカルボキシメチレン-酪酸の4アーム-n-ヒドロキシスクシンイミドエステル1.4グラム(平均分子量10000ダルトン(Shearwater 4 arm CM-HBA-NS-10K))を、pH 4.0で0.01Mリン酸緩衝液5.92gに溶解し、無菌濾過する。溶液Bは、0.06グラムのジリシンを溶解すること、及び視覚化のための0.5mg/mLのメチレンブルーとともに、pH 9.5での0.1Mホウ酸緩衝液7.28g中のモデル液体疎水性薬剤として100mgビタミンEを懸濁化することにより調製する。ビタミンEは、ホウ酸緩衝液に不溶性であり、溶液Bに懸濁化される。1mlの溶液A及びBを、縮重合を促進するために混合する。ジリシン及びPEG-NHSエステルが反応し、架橋ヒドロゲルを形成する。ビタミンEは、油滴として架橋ヒドロゲルに包括されている。ビタミンEは、ヒドロゲルから周囲組織にゆっくり溶出された。
【００６９】
(実施例9)
(懸濁化タンパク質薬剤を送達する感熱性ゲル化システムの使用)
プルロニックF-127の溶液を、6グラムのPBS中、4グラムのプルロニックF127を溶解することにより作る。混合物を、24〜48時間、ポリマーを溶かすために10℃未満に冷却する。完全溶解後、100mgのアバスチン凍結乾燥粉末を、その冷却溶液に加える。溶液中の高濃度PEGベースポリマーのため、薬剤は懸濁粒子として残存する。冷却溶液を、ヒト又は動物組織に適用する。体温がプルロニック溶液を柔ヒドロゲルに変える。沈殿された薬剤は、薬剤結晶の溶解によりヒドロゲルから放出される。また、PEG-ポリヒドロキシコポリマー、テトロニックポリマー、n-イソプロピルアクリルアミド系ポリマーシステムに基づく他の感熱性感度システムを用いることもできる。
【００７０】
(実施例10)
(送達薬剤の溶解度変化のためのpH変化の使用)
求電子性基(例えば、4アーム-n-ヒドロキシスクシンイミドエステル)で修飾されたPEGなどの第1の前駆体を提供する。これは、求核性基(例えば、一級アミン又はトリリシンを有する多アームPEG(multiarmed PEG))を有する第2の前駆体と反応可能である。視覚化のために任意に色素を含せることができる。但し、それは、ゲル化及び要求される物性の生成を干渉しないように選択され得る。前駆体を、その前駆体官能基間での反応を効果的に防ぐ低pHの第1の媒体、例えば、pH 4弱緩衝液に可溶化する。第2の媒体は、第1の媒体との混合時に、高pHとなる強さを有する高pH緩衝液を含むことができる。前駆体及び緩衝液は、所望の時間、前駆体のゲル化を完成するように調整されることができる。反応は、ゲル化完成前に、2つの成分の混合及び標的組織への適用時に原位置で生じるであろう。
【００７１】
例えば、PEG-スクシンイミジルグルタル酸及びFD&C Blue #1破砕粉末を、トリリシン酢酸塩及び一塩基性リン酸ナトリウムを含むpH 4の弱酸性緩衝液系に溶解した。約30秒のゲル化時間で、pH 4の緩衝液を、混合したときに最終pH約7.6を達成するように、pH 8.8の塩基性ホウ酸ナトリウム/リン酸ナトリウム緩衝液と混合した。約5秒未満のゲル化時間に関して、pH約9.4の塩基性緩衝液を用いて、同じ系を使用した。従って、例えばこの系において、塩基性緩衝液は、高pH(例えば、約8.8を超える)でのみ溶解する薬剤を含むことができる。2つの緩衝液を混合すると、系のpHは低下し、薬剤は、生理的pHで溶解度低下により粒子として沈殿する。この種の薬剤の例は、薬剤リファンピシンである。リファンピシンは、抗生物質である。pH 4での溶解度は1.6g/Lであり、pH 7では0.16g/L、pH 10では1000g/Lである。
【００７２】
あるいは、低pH(例えば、pH約4)で可溶性である薬剤は、酸性緩衝液に溶解することができる。緩衝液を混合すると、系のpHは増加し、薬剤は、生理的pHで溶解度低下により粒子として沈殿する。この種の薬剤の例は、薬剤チモロール及びモキシフロキサシンであるチモロールは、緑内障を治療するために用いられる薬剤である。pH 4での溶解度は1000g/Lであり、pH 7では160g/Lであり、pH 10では2.4g/Lである。モキシフロキサシンは、別の抗生物質である。pH 4での溶解度は11 g/Lであり、pH 7では0.13g/Lであり、pH 10では0.14g/Lである。
【００７３】
別の変形例は、薬剤の懸濁液の調製及び環境(例えば、選択された生理的環境)に薬剤を置くことであり、pHは、薬剤の溶解性を上げ、それによってその溶解及び放出を導く状態に変化させる。薬剤は、粒子としてそれを調製することによって、例えば、噴霧、製粉又は制御沈殿によって懸濁されることができる。粒子は、第1のpHで溶液中に分散する。pHが変化するにつれて、その溶解速度は変わる。幾つかの実施態様において、薬剤を、弱又は事実上不溶性のpHの弱緩衝液(例えば、薬剤特性に応じて酸性緩衝液又は塩基性緩衝液)中に懸濁化又は貯蔵し、粒子は、その緩衝液中に存在している間、溶解又は事実上溶解しない。生理的媒体への曝露時に比較的より可溶性である薬剤に関して、粒子は、生理的環境への配置後にpHが変化するにつれて溶解を始める。例えば、チモロールは、pH 10の緩衝液中の懸濁液として分散することができ、その環境が生理的pHに変えられる時点で、それは徐々に溶解する。このケースは、不溶性の第1のpHで薬剤を提供すること、及びその環境をより可溶なpHに変化することができることを実証している。
【００７４】
(様々な実施態様)
従って、本発明の幾つかの実施態様は、ヒドロゲルが沈殿生物活性物質に包括するようにヒドロゲルが原位置に形成されるにつれて、生物活性物質が沈殿されることを含む、生物活性物質の患者への送達方法に関する。同様に、実施態様は、ヒドロゲル:沈殿生物活性又は物質を含むヒドロゲルを有する、自由表面及び患者の組織に適合する表面を含む原位置形成ヒドロゲルである。従って、患者に生物活性物質を送達する方法は、ヒドロゲル前駆体とともに生物活性物質を沈殿させること、及びヒドロゲルが沈殿生物活性物質を包括するように、原位置にヒドロゲルを形成する前駆体を活性化すること含む方法であり得る。生物活性物質は、第1の水溶液を、ヒドロゲル形成のために架橋される第1の前駆体を含む第2の水溶液と混合することにより、第1の水溶液から沈殿することができる。この沈殿は、前駆体への曝露によって生じてもよい。例えば、前駆体は、体積排除機構により生物活性物質を沈殿させることができる。または、沈殿は、塩濃度、溶媒特性、イオン量、pH、又はそれを沈殿させる物質の特性及び状態を考慮して選択されるこれらの要因の組合せの変化によって生じることができる。説明したように、幾つかの実施態様において、第1の前駆体が第2の前駆体と反応し、ヒドロゲルを形成する。従って、第1の前駆体は、ヒドロゲルを形成するために光重合されることができる。または、ヒドロゲルは、互いに前駆体の架橋を開始するために混合される2つの前駆体から形成されてもよい。そして、例えば、前駆体又は前駆体の少なくとも1つは、ポリアルキレンオキシド、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、デキストラン、又はポリビニルピロリジノン、或いはそれらのコポリマー、例えば、分子量で少なくとも約40%のポリアルキレンオキシド、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、デキストラン又はポリビニルピロリジノンを有するコポリマーを含むことができる。
【００７５】
幾つかの実施態様において、薬剤を第1のpHで第1の溶液又は緩衝液に溶解し、薬剤がほとんど溶解しないような、pHを変える第2の緩衝液と混合し、結果、薬剤を沈殿させる。患者体内又は表面上の所定位置で生理溶液を曝露したとき、薬剤の環境は、薬剤が溶解するpHに変化され、薬剤が放出される。従って、第1の溶液中の薬剤の一部もしくは全部、例えば、薬剤の少なくとも約25% w/w、少なくとも約90% w/w、少なくとも約99% w/wが沈殿する;当業者は、明確に定まった範囲内の全ての範囲及び値が、例えば、約25%〜約98%又は約80%より大きいことが意図されると直ちに理解するであろう。
【国際調査報告】
2010519183.tif 000002
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