(57)【要約】  本発明は、ポリペプチドコンジュゲートを製造するための方法を提供する。特に本発明は、ポリ（アルキレンオキシド）部分などの少なくとも１つのポリマー修飾基を含むポリペプチドコンジュゲートを精製するための方法を提供する。例示的なポリ（アルキレンオキシド）部分としては、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）およびポリ（プロピレングリコール）が挙げられる。例示的な方法において、グリコＰＥＧ化ポリペプチドの種々のグリコフォームを分離するために、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）が用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のポリペプチドコンジュゲートを含む組成物を製造する方法であって、前記第１のポリペプチドコンジュゲートが、前記第１のポリペプチドに共有結合した第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含み、前記方法が、
（ａ）前記第１のポリペプチドコンジュゲートを含む混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および
（ｂ）前記第１のポリペプチドコンジュゲートを前記疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から溶出させること
を含み、それによって前記第１のポリペプチドコンジュゲートを含む前記組成物を製造する方法。
【請求項２】
前記混合物が第２のポリペプチドコンジュゲートを含み、前記第２のポリペプチドコンジュゲートが、前記第２のポリペプチドに共有結合した第２の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含み、前記第１の数と前記第２の数が異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドが同一のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のポリペプチドコンジュゲートが第１のグリコシル化パターンを含み、前記第１のグリコシル化パターンが、前記第１のポリペプチドに共有結合した少なくとも１つのグリカン残基を含み、各グリカン残基が前記ポリ（アルキレンオキシド）部分のうちの少なくとも１つに場合によって結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリ（アルキレンオキシド）部分の各々が、Ｏ−結合またはＮ−結合グリカン残基を介して前記第１のポリペプチドに共有結合している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記混合物が、第３のポリペプチドに共有結合した第３の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む第３のポリペプチドコンジュゲートを含み、前記第３のポリペプチドコンジュゲートが、第２のグリコシル化パターンを含み、前記第２のグリコシル化パターンが、前記少なくとも１つのグリカン残基の少なくとも１つのグリコシル部分により前記第１のポリペプチドコンジュゲートの前記第１のグリコシル化パターンとは異なる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のポリペプチドコンジュゲートの前記グリコシル化パターンが、実質的に一定の昆虫特異的グリコシル化パターンである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＩＣ媒体が、ブチル樹脂およびフェニル樹脂から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリ（アルキレンオキシド）部分の各々が、ポリ（エチレングリコール）部分およびポリ（プロピレングリコール）部分から独立して選択されるメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリ（アルキレンオキシド）部分の各々が、約１ｋＤａから約２００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のポリペプチドが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害因子）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮａｓｅ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ―２、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、アルファ−ガラクトシダーゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸マルターゼ）、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ−７）、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）、線維芽細胞成長因子２３（ＦＧＦ−２３）、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、Ｂ−ドメイン欠失因子ＶＩＩＩ、完全長因子ＶＩＩＩを有するｖＷＦ−因子ＶＩＩＩ融合タンパク質、Ｂ−ドメイン欠失因子ＶＩＩＩを有するｖＷＦ−因子ＶＩＩＩ融合タンパク質、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＸＩＩＩ、プロキネチシン、エクステンジン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、呼吸器合胞体ウイルスに対するモノクローナル抗体、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質Ｆに対するモノクローナル抗体、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体、ＶＥＧＦ−Ａに対するモノクローナル抗体、ＰＳＧＬ−１に対するモノクローナル抗体、ＣＤ４に対するモノクローナル抗体、ａ−ＣＤ３に対するモノクローナル抗体、ＥＧＦに対するモノクローナル抗体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するモノクローナル抗体およびＩＬ−２受容体に対するモノクローナル抗体から選択されるメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のポリペプチドがＥＰＯである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＰＯが、３つのポリ（エチレングリコール）部分に共有結合している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記３つのポリ（エチレングリコール）部分のうちの少なくとも２つが、Ｎ−結合グリカンを介して前記ＥＰＯに共有結合している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＥＰＯが配列番号１によるアミノ酸配列を含み、前記配列が、Ａｒｇ１３９からＡｌａ１３９、Ａｒｇ１４３からＡｌａ１４３、およびＬｙｓ１５４からＡｌａ１５４からなる群から選択される少なくとも１つの変異を場合によって有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリ（アルキレンオキシド）部分のうちの少なくとも１つが、グリコシル結合基を介して前記第１のポリペプチドに共有結合しており、前記グリコシル結合基が、前記第１のポリペプチドのアミノ酸残基に共有結合しているか、または前記第１のポリペプチドのグリコシル部分に共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記グリコシル結合基が完全形のグリコシル結合基である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記完全形のグリコシル結合基が、ＧｌｃＮＨ部分、ＧｌｃＮＡｃ部分、およびシアル酸部分から選択されるメンバーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ｃ）前記第１のポリペプチドコンジュゲートをアニオン交換クロマトグラフィー媒体から溶出させること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｃ）がステップ（ａ）の前に実施される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ｄ）前記第１のポリペプチドコンジュゲートをカチオン交換クロマトグラフィー媒体から溶出させること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｄ）がステップ（ｂ）の後に実施される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のポリペプチドと、ポリ（アルキレンオキシド）部分に共有結合したグリコシル部分を有する修飾糖ヌクレオチドとを、グリコシルトランスフェラーゼの存在下、前記グリコシルトランスフェラーゼが前記グリコシル部分と前記第１のポリペプチドとの間に共有結合を形成するのに十分な条件下で、接触させることをさらに含み、それによって前記第１のポリペプチドコンジュゲートを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記グリコシル部分がシアル酸部分であり、前記グリコシルトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
昆虫細胞中で前記第１のポリペプチドを組換え発現させることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
第１のポリペプチドに共有結合した第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む前記第１のポリペプチドコンジュゲートを、第２のポリペプチドに共有結合した第２の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む前記第２のポリペプチドコンジュゲートから単離する方法であって、前記第１の数が１〜２０から選択され、前記第２の数が０〜２０から選択され、前記第１の数と前記第２の数とが異なり、前記方法が、
（ａ）前記第１のポリペプチドコンジュゲートおよび前記第２のポリペプチドコンジュゲートを含む混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および
（ｂ）前記第１のポリペプチドコンジュゲートを前記疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から溶出させること
を含み、それによって前記第１のポリペプチドコンジュゲートを前記第２のポリペプチドコンジュゲートから単離する方法。
【請求項２８】
前記ポリ（アルキレンオキシド）部分の各々が、ポリ（エチレングリコール）部分およびポリ（プロピレングリコール）部分から独立して選択されるメンバーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリ（アルキレンオキシド）部分の各々が、約１ｋＤａから約２００ｋＤａの間の独立して選択される分子量を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドが同一のアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１のポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１のポリペプチドが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害因子）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮａｓｅ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ―２、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、アルファ−ガラクトシダーゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸マルターゼ）、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ−７）、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）、線維芽細胞成長因子２３（ＦＧＦ−２３）、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、Ｂ−ドメイン欠失因子ＶＩＩＩ、完全長因子ＶＩＩＩを有するｖＷＦ−因子ＶＩＩＩ融合タンパク質、Ｂ−ドメイン欠失因子ＶＩＩＩを有するｖＷＦ−因子ＶＩＩＩ融合タンパク質、因子ＩＸ、因子Ｘ、因子ＸＩＩＩ、プロキネチシン、エクステンジン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、呼吸器合胞体ウイルスに対するモノクローナル抗体、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質Ｆに対するモノクローナル抗体、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体、ＶＥＧＦ−Ａに対するモノクローナル抗体、ＰＳＧＬ−１に対するモノクローナル抗体、ＣＤ４に対するモノクローナル抗体、ａ−ＣＤ３に対するモノクローナル抗体、ＥＧＦに対するモノクローナル抗体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するモノクローナル抗体およびＩＬ−２受容体に対するモノクローナル抗体から選択されるメンバーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１のポリペプチドがＥＰＯである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＥＰＯが、３つのポリ（エチレングリコール）部分に共有結合している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記３つのポリ（エチレングリコール）部分のうちの少なくとも２つが、Ｎ−結合グリカンを介して前記ＥＰＯに共有結合している、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＥＰＯが配列番号１によるアミノ酸配列を含み、前記配列が、Ａｒｇ１３９からＡｌａ１３９、Ａｒｇ１４３からＡｌａ１４３、およびＬｙｓ１５４からＡｌａ１５４からなる群から選択される少なくとも１つの変異を場合によって有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＨＩＣ媒体が、ブチル樹脂およびフェニル樹脂から選択されるメンバーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリ（アルキレンオキシド）部分のうちの少なくとも１つが、グリコシル結合基を介して前記第１のポリペプチドに接続しており、前記グリコシル結合基が、前記第１のポリペプチドのアミノ酸残基に共有結合しているか、または前記第１のポリペプチドのグリコシル部分に共有結合している、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記グリコシル結合基が完全形のグリコシル結合基である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記完全形のグリコシル結合基が、ＧｌｃＮＨ部分、ＧｌｃＮＡｃ部分、およびシアル酸部分から選択されるメンバーである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
（ｃ）前記第１のポリペプチドコンジュゲートをアニオン交換クロマトグラフィー媒体から溶出させること
をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ｃ）がステップ（ａ）の前に実施される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
（ｄ）前記第１のポリペプチドコンジュゲートを前記カチオン交換クロマトグラフィー媒体から溶出させること
をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ｄ）がステップ（ｂ）の後に実施される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１のポリペプチドコンジュゲートが、実質的に一定の昆虫特異的グリコシル化パターンを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１のポリペプチドと、ポリ（アルキレンオキシド）部分に共有結合したグリコシル部分を有する修飾糖ヌクレオチドとを、グリコシルトランスフェラーゼの存在下、前記グリコシルトランスフェラーゼが前記グリコシル部分と前記第１のポリペプチドとの間に共有結合を形成するのに十分な条件下で、接触させることをさらに含み、それによって前記第１のポリペプチドコンジュゲートを形成する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４７】
前記グリコシル部分がシアル酸部分であり、前記グリコシルトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
昆虫細胞中で前記第１のポリペプチドを組換え発現させることをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１のポリペプチドとヌクレオチド糖とを、ヌクレオチド糖が基質である酵素の存在下、前記酵素が前記ヌクレオチド糖の前記糖と前記第１のポリペプチドとの間に共有結合を形成するのに十分な条件下で、接触させることをさらに含み、前記第１のポリペプチドが、グリコシル化および非グリコシル化から選択されるメンバーである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
第１のエリスロポエチン（ＥＰＯ）コンジュゲートを含む組成物を形成する方法であって、前記第１のＥＰＯコンジュゲートが、前記ＥＰＯに共有結合した第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含み、前記方法が、
（ａ）前記第１のＥＰＯコンジュゲートを含む混合物をアニオン交換媒体と接触させること；
（ｂ）前記第１のＥＰＯコンジュゲートを前記アニオン交換媒体から溶出させて、前記第１のＥＰＯコンジュゲートを含む第１の溶出液を形成すること；
（ｃ）前記第１の溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および
（ｄ）前記第１のＥＰＯコンジュゲートを前記疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から溶出させること
を含み、それによって前記第１のＥＰＯコンジュゲートを含む組成物を形成する方法。
【請求項５１】
前記ステップ（ａ）の混合物が、前記ＥＰＯに共有結合した第２の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を有する第２のＥＰＯコンジュゲートを含み、前記第１の数と前記第２の数とが異なる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１の数が３であり、前記第２の数が０、１、２および４から選択されるメンバーである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２のＥＰＯコンジュゲートが、前記組成物中に約１０％未満の濃度で存在する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＨＩＣ媒体が、ブチル樹脂およびフェニル樹脂から選択されるメンバーである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記ポリ（アルキレンオキシド）部分の各々が、ポリ（エチレングリコール）部分およびポリ（プロピレングリコール）部分から独立して選択されるメンバーである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記ポリ（アルキレンオキシド）部分の各々が、約１ｋＤａから約２００ｋＤａの間の独立して選択される分子量を有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記第１のＥＰＯコンジュゲートが、３つのポリ（エチレングリコール）部分を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記３つのポリ（エチレングリコール）部分のうちの少なくとも２つが、Ｎ−結合グリカンを介して前記ＥＰＯに共有結合している、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＥＰＯが配列番号１によるアミノ酸配列を含み、前記配列が、Ａｒｇ１３９からＡｌａ１３９、Ａｒｇ１４３からＡｌａ１４３、およびＬｙｓ１５４からＡｌａ１５４からなる群から選択される少なくとも１つの変異を場合によって有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＥＰＯコンジュゲートが、グリコシル結合基を介して前記ＥＰＯに共有結合している少なくとも１つのポリ（アルキレンオキシド）部分を含み、前記グリコシル結合基が、前記ＥＰＯのアミノ酸残基に共有結合しているか、または前記ＥＰＯのグリコシル部分に共有結合している、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
前記グリコシル結合基が完全形のグリコシル結合基である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記完全形のグリコシル結合基が、ＧｌｃＮＨ部分、ＧｌｃＮＡｃ部分、およびシアル酸部分から選択されるメンバーである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
（ｅ）前記第１のＥＰＯコンジュゲートをカチオン交換クロマトグラフィー媒体から溶出させること
をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６４】
ステップ（ｅ）がステップ（ｄ）の後に実施される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＥＰＯが、実質的に一定の昆虫特異的グリコシル化パターンを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＥＰＯと、ポリ（アルキレンオキシド）部分に共有結合したグリコシル部分を有する修飾糖ヌクレオチドとを、グリコシルトランスフェラーゼの存在下、前記グリコシルトランスフェラーゼが前記グリコシル部分と前記ＥＰＯとの間に共有結合を形成するのに十分な条件下で、接触させることをさらに含み、それによって前記第１のＥＰＯコンジュゲートを形成する、請求項５０に記載の方法。
【請求項６７】
前記グリコシル部分がシアル酸部分であり、前記グリコシルトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
昆虫細胞中で前記ＥＰＯを組換え発現させることをさらに含み、それによって前記ＥＰＯを含む昆虫細胞培養液を形成する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＥＰＯを前記昆虫細胞培養液から単離することをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
単一の反応容器中で、前記ＥＰＯとヌクレオチド−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）分子とヌクレオチドガラクトース（Ｇａｌ）分子とを、ＧｎＴ１およびＧｎＴ２から選択されるＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、およびガラクトシルトランスフェラーゼの存在下、前記Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよび前記ガラクトシルトランスフェラーゼが前記ＥＰＯに共有結合した末端−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ部分を形成するのに十分な条件下で、接触させることをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
第１のポリペプチドコンジュゲートを含む組成物であって、前記第１のポリペプチドコンジュゲートが、第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含み、前記ポリ（アルキレンオキシド）部分の各々が、完全形のグリコシル結合基を介して前記第１のポリペプチドに共有結合しており、前記組成物が、
（ａ）前記第１のポリペプチドコンジュゲートを含む混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および
（ｂ）前記第１のポリペプチドコンジュゲートを前記疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から溶出させ、それによって前記第１のポリペプチドコンジュゲートを含む前記組成物を製造すること
を含む方法により製造され、
前記第１のポリペプチドが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害因子）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮａｓｅ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ―２、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、アルファ−ガラクトシダーゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸マルターゼ）、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ−７）、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）、線維芽細胞成長因子２３（ＦＧＦ−２３）、因子Ｘ、因子ＸＩＩＩ、プロキネチシン、エクステンジン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、呼吸器合胞体ウイルスに対するモノクローナル抗体、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質Ｆに対するモノクローナル抗体、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体、ＶＥＧＦ−Ａに対するモノクローナル抗体、ＰＳＧＬ−１に対するモノクローナル抗体、ＣＤ４に対するモノクローナル抗体、ａ−ＣＤ３に対するモノクローナル抗体、ＥＧＦに対するモノクローナル抗体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するモノクローナル抗体およびＩＬ−２受容体に対するモノクローナル抗体から選択されるメンバーである組成物。
【請求項７２】
請求項７１に記載の組成物および薬学的に許容できる担体を含む医薬製剤。
【請求項７３】
第１のポリペプチドに共有結合した第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む前記第１のポリペプチドコンジュゲートを、前記第２のポリペプチドに共有結合した第２の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む第２のポリペプチドコンジュゲートから単離することを含む方法により製造された、単離された前記第１のポリペプチドコンジュゲートであって、前記第１の数が１〜２０から選択され、前記第２の数が０〜２０から選択され、前記第１の数と前記第２の数とが異なり、前記単離が、
（ａ）前記第１のポリペプチドコンジュゲートおよび前記第２のポリペプチドコンジュゲートを含む混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および
（ｂ）前記第１のポリペプチドコンジュゲートを前記疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から溶出させ、それによって前記第１のポリペプチドコンジュゲートを前記第２のポリペプチドコンジュゲートから分離すること
を含み、前記第１のポリペプチドが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害因子）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮａｓｅ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ―２、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、アルファ−ガラクトシダーゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸マルターゼ）、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ−７）、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）、線維芽細胞成長因子２３（ＦＧＦ−２３）、因子Ｘ、因子ＸＩＩＩ、プロキネチシン、エクステンジン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、呼吸器合胞体ウイルスに対するモノクローナル抗体、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質Ｆに対するモノクローナル抗体、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体、ＶＥＧＦ−Ａに対するモノクローナル抗体、ＰＳＧＬ−１に対するモノクローナル抗体、ＣＤ４に対するモノクローナル抗体、ａ−ＣＤ３に対するモノクローナル抗体、ＥＧＦに対するモノクローナル抗体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するモノクローナル抗体およびＩＬ−２受容体に対するモノクローナル抗体から選択されるメンバーである単離された第１のポリペプチドコンジュゲート。
【請求項７４】
請求項７３に記載された単離されたポリペプチドコンジュゲートおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬製剤。
【請求項７５】
第１のエリスロポエチン（ＥＰＯ）コンジュゲートを含む組成物であって、前記第１のＥＰＯコンジュゲートが、完全形のグリコシル結合基を介して前記ＥＰＯに共有結合した第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含み、前記組成物が、
（ａ）前記第１のＥＰＯコンジュゲートを含む混合物をアニオン交換媒体と接触させること；
（ｂ）前記第１のＥＰＯコンジュゲートを前記アニオン交換媒体から溶出させて、前記第１のＥＰＯコンジュゲートを含む第１の溶出液を形成すること；
（ｃ）前記第１の溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および
（ｄ）前記疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から前記第１のＥＰＯコンジュゲートを溶出させること
を含む方法によって製造される組成物。
【請求項７６】
請求項７５に記載の組成物および薬学的に許容できる担体を含む医薬製剤。
【請求項７７】
状態の治療を必要とする対象において状態を治療する方法であって、前記状態が、前記対象における赤血球産生不全を特徴とし、前記対象における前記状態を寛解させるのに有効な量の請求項７１に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項７８】
状態の治療を必要とする対象において状態を治療する方法であって、前記状態が、前記対象における赤血球産生不全を特徴とし、前記対象における前記状態を寛解させるのに有効な量の請求項７３に記載の単離されたポリペプチドコンジュゲートを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項７９】
状態の治療を必要とする対象において状態を治療する方法であって、前記状態が、前記対象における赤血球産生不全を特徴とし、前記対象における前記状態を寛解させるのに有効な量の請求項７５に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項８０】
組織傷害の治療を必要とする対象において組織傷害を治療する方法であって、前記傷害が、虚血、外傷、炎症および毒性物質との接触から選択されるメンバーにより引き起こされ、前記組織傷害に関連する損傷を寛解させるのに有効な量の請求項７１に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項８１】
組織傷害の治療を必要とする対象において組織傷害を治療する方法であって、前記傷害が、虚血、外傷、炎症および毒性物質との接触から選択されるメンバーにより引き起こされ、前記組織傷害に関連する損傷を寛解させるのに有効な量の請求項７３に記載の単離されたポリペプチドコンジュゲートを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項８２】
組織傷害の治療を必要とする対象において組織傷害を治療する方法であって、前記傷害が、虚血、外傷、炎症および毒性物質との接触から選択されるメンバーにより引き起こされ、前記組織傷害に関連する損傷を寛解させるのに有効な量の請求項７５に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項８３】
哺乳動物において赤血球産生を増強する方法であって、請求項７１に記載の組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項８４】
哺乳動物において赤血球産生を増強する方法であって、請求項７３に記載の単離されたポリペプチドコンジュゲートを前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項８５】
哺乳動物において赤血球産生を増強する方法であって、請求項７５に記載の組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年１０月３日出願の米国仮特許出願第６０／８４８,９６９号；２００６年１１月２日出願の米国仮特許出願第６０／８６４,１１７号；２００６年１１月３０日出願の米国仮特許出願第６０／８６８,０５７号；２００７年１月３１日出願の米国仮特許出願第６０／８８７,５１７号；２００７年７月２０日出願の米国仮特許出願第６０／９５１,１５９号；２００７年８月９日出願の米国仮特許出願第６０／９５５,００１号；および２００７年８月１７日出願の米国仮特許出願第６０／９５６,４６８号に対する優先権を主張し、これらの各々は、全ての目的に関して、参照としてそれらの全体が本明細書に援用されている。
【０００２】
本発明は、ポリペプチド製造の分野に関する。特に本発明は、ポリペプチドコンジュゲート、特にポリ（アルキレンオキシド）ベースの修飾基を含むコンジュゲートの精製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在の文献には、主にクロマトグラフィー法、ならびに膜濾過法を含むポリペプチド精製方法論に関する多数の情報が含まれている。しかし、修飾されたポリペプチド（例えばＰＥＧ化ポリペプチド）の有効な精製方法は十分知られていない。ポリマー部分によるポリペプチドの修飾によって、これらのポリペプチドの化学的および物理的性質に有意なシフトが生じる。非修飾ポリペプチドの精製にとって有用な方法は、それらの修飾型の捕捉には必ずしも有効ではない。
【０００４】
グリコシル化または非グリコシル化ポリペプチドが化学修飾反応に供されると、所望の修飾ポリペプチドに加えて副生成物が形成し得る。反応混合物から所望の生成物を単離するために、この方法は、化学試薬を除去するのに好適でなければならないだけでなく、不要な副生成物を除去できなければならない。これはポリペプチドが治療薬として使用される場合は特に重要である。酵素の特異性に依存するポリペプチド修飾技法は、他の化学的方法に比較した際に改善された均一性を特徴とする反応生成物をもたらすことができる。しかし、細胞（例えば、細菌、昆虫、酵母または哺乳動物の細胞）における組換えポリペプチドの発現により、典型的には、少なくともある程度、種々のグリカン構造を特徴とするポリペプチド集団が生じる。引き続き、例えばそれらのグリカンを介して、ポリペプチドを修飾すると、不均一な生成物が生じる。ポリペプチドの化学的または酵素的修飾の前にグリカン構造を再構築することで生成物の品質をかなり改善することはできるが、ある程度の不均一性は残る。したがって、化学試薬（例えば、非反応修飾基由来のもの）および／または触媒的酵素を含有し得るだけでなく、ポリペプチドコンジュゲート副生成物をも含み得る反応混合物から所望のポリペプチドコンジュゲートを単離するために設計された製造方法が求められている。本発明は、これらおよび他の必要性に取り組んでいる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ポリペプチドコンジュゲートを単離（例えば大規模精製）するための方法を提供する。本発明のポリペプチドコンジュゲートは、ポリマーなどの修飾基によって修飾されているポリペプチドを含む。例示的なポリマーとしては、水溶性ポリマーが挙げられる。本発明の方法は、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）などのポリ（アルキレンオキシド）ベースのポリマーを含むポリペプチドコンジュゲートの単離にとって特に有用である。逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーは、そのような極性の高い水溶性ポリマーによって誘導体化されているポリペプチドの精製に使用できるが、この方法は、アセトニトリルなどの水溶性有機溶媒の使用を必要とするため、望ましくない。特に大規模な方法における有機溶媒は、環境的な懸念に関連しているだけでなく、精製されたポリペプチドコンジュゲートの化学的安定性にも影響を及ぼす可能性がある。したがって、水溶液を利用する工程ステップが一般に好ましい。したがって、一実施形態において本発明は、基本的に有機溶媒を使用せずにポリペプチドコンジュゲートを単離することを可能にする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の例示的な方法は、少なくとも１つのポリ（アルキレンオキシド）部分を有するポリペプチドコンジュゲートを混合物の他の成分から分離するのに有効な少なくとも１つのクロマトグラフィー操作を含む。このようなポリペプチドコンジュゲートを任意の混合物から単離するために、本発明の方法を用いることができる。一例において、混合物は、反応混合物（例えば、化学的ＰＥＧ化反応または酵素触媒ＰＥＧ化反応、例えば、グリコＰＥＧ化反応の生成物）であり、他のポリペプチドコンジュゲートを場合によって含み得る。本発明の好ましい方法では、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体が利用される。一実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー、混合様式クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトまたはフルオロアパタイトクロマトグラフィーから選択される少なくとも１つの追加クロマトグラフィーステップと組み合わせてＨＩＣが用いられる。別の実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー、混合様式クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの少なくとも１つと組み合わせてＨＩＣが用いられる。本発明者らは、カチオンクロマトグラフィーと組み合わせたＨＩＣが、少なくとも１つのポリ（アルキレンオキシド部分）を含むポリペプチドコンジュゲートの分離のための効率的な方法であることを発見した。特に、ＨＩＣに引き続くカチオン交換により、ＥＰＯ−ＰＥＧ２種からＥＰＯ−ＰＥＧ３種を分離できることが発見された。一例において、カチオン交換と組み合わせたＨＩＣにより、極めて低い残留濃度のＥＰＯ−［ＰＥＧ（１０ｋＤａ）］２を有する精製されたＥＰＯ−［ＰＥＧ（１０ｋＤａ）］３の組成物が提供された。
【０００７】
ＨＩＣに加えてアニオン交換およびカチオン交換クロマトグラフィーを含む本発明の例示的な方法は、図１に概要が示されている。一実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートの種々のグリコフォーム、特にポリペプチドに結合している(link)ポリ（アルキレンオキシド）部分の数によって識別されるグリコフォームの分離にとって本発明の方法は有用である。所望のポリペプチドコンジュゲートを形成するために用いられる反応条件下で不要なグリコフォームが副生成物として形成する可能性がある。
【０００８】
したがって、第１の態様において本発明は、第１のポリペプチドに共有結合した(covalently linked)第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を有する第１のポリペプチドコンジュゲートを含む組成物を製造する方法を提供する。この方法は、（ａ）第１のポリペプチドコンジュゲートを含有する混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および（ｂ）第１のポリペプチドコンジュゲートをＨＩＣ媒体から溶出させることを含む。この態様による一例において、混合物は、第２のポリペプチドに共有結合した第２の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を有する第２のポリペプチドコンジュゲートを含み、第１の数と第２の数は異なる。例えば、第１のポリペプチドコンジュゲートは、３つのポリ（アルキレンオキシド）部分を含み、一方、第２のポリペプチドコンジュゲートは、０、１、２または４つのポリ（アルキレンオキシド）部分を含む。一例において、ポリ（アルキレンオキシド）は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。
【０００９】
第２の態様において本発明は、第１のポリペプチドに共有結合した第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む第１のポリペプチドコンジュゲートを、第２のポリペプチドに共有結合した第２の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む第２のポリペプチドコンジュゲートから単離する方法を提供し、第１の数は、１〜２０から選択され、第２の数は、０〜２０から選択され、第１の数と第２の数は異なる。この方法は、（ａ）第１のポリペプチドコンジュゲートおよび第２のポリペプチドコンジュゲートを含有する混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および（ｂ）第１のポリペプチドコンジュゲートを前記疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から溶出させることを含む。この態様による一例において、第１のポリペプチドコンジュゲートは３つのポリ（アルキレンオキシド）部分を含み、第２のポリペプチドコンジュゲートは０、１、２、４、５、６または７つのポリ（アルキレンオキシド）部分を含む。
【００１０】
上記実施形態のいずれかによる一例において、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは同一のアミノ酸配列を有する。上記実施形態のいずれかによる別の例において、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは双方ともＥＰＯである。
【００１１】
第３の態様において本発明は、第１のエリスロポエチン（ＥＰＯ）コンジュゲートを含有する組成物を形成する方法を提供し、第１のＥＰＯコンジュゲートは、（ＥＰＯ）ポリペプチドに共有結合した第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む。この方法は、（ａ）第１のＥＰＯコンジュゲートを含有する混合物をアニオン交換媒体と接触させること；（ｂ）第１のＥＰＯコンジュゲートをアニオン交換媒体から溶出させて、第１のＥＰＯコンジュゲートを含む第１の溶出液を形成すること；（ｃ）第１の溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および（ｄ）第１のＥＰＯコンジュゲートを疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から溶出させることを含む。この方法は、（ｅ）第１のＥＰＯコンジュゲートをカチオン交換クロマトグラフィー媒体から溶出させることをさらに含み得る（例えば、ステップｄの後に）。
【００１２】
一実施形態においてこの方法は、化学的に、または酵素的に触媒した、グリコ修飾（例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび適切なグリコシルドナー分子（修飾糖ヌクレオチドなど）を用いるグリコＰＥＧ化）により、ポリペプチドコンジュゲートを形成することをさらに含む。グリコＰＥＧ化法は当技術分野に認識されており、例えば、ＤｅＦｒｅｅｓらに対する国際公開第０３／０３１４６４号または国際公開第０４／９９２３１号を参照されたい。これらの開示は参照としてそれらの全体が本明細書に援用されている。
【００１３】
本発明は、本発明の方法によって製造される組成物ならびに本発明の組成物を含む医薬製剤をさらに提供する。また本発明は、本発明の組成物を利用する治療方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の目的および利点は以下の詳細な説明から当業者に明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の方法による例示的なポリペプチドコンジュゲートの精製法の全体図である。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）後のダイアフィルトレーション／限外濾過ステップは任意選択である。
【図２Ａ】分離媒体としてＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓを用い、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、モノ、ジ、トリおよびテトラＰＥＧ化ＥＰＯグリコフォームからのトリＰＥＧ化ＥＰＯの分離を示す例示的なクロマトグラムである。
【図２Ｂ】図２ＡにおけるクロマトグラムのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３およびＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４溶出ピークの拡大図である。文字（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）は、プールされた画分を示し、（Ｆ）はＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の溶出を示す。
【図３Ａ】アミノ酸残基Ｎ２４、Ｎ３８およびＮ８３に共有結合した３つのＮ−結合モノアンテナグリカン残基を含む昆虫特異的グリコシル化パターンを有する本発明の例示的ＥＰＯポリペプチドコンジュゲートの模式図である。各グリカン残基は、末端ガラクトース（Ｇａｌ）部分を介して１０ｋＤａのＰＥＧ部分に共有結合している。図３Ａはまた、ＥＰＯコンジュゲートの合成に使用できる例示的な反応スキームを含む。酵素触媒変換に対する基質は、トリマンノシル部分を有する少なくとも１つのグリカン残基を含むＥＰＯポリペプチドである。第１のステップにおいて、末端マンノース部分の１つのみにＧｌｃＮＡｃ部分を付加するＮ−アシルグルコサミントランスフェラーゼ（ＧｎＴ−１）が用いられる。第２のステップにおいて、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ−１）を用いて、Ｇａｌ部分を新たに付加されたＧｌｃＮＡｃ部分に結合させ、末端−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ部分を形成する。第１と第２のステップは同じ反応容器内で実施することができる。第３のステップにおいて、シアリルトランスフェラーゼを用いて、ＰＥＧ部分で修飾されているシアル酸部分を末端Ｇａｌ部分に結合させる（ＳＴ３Ｇａｌ３）。
【図３Ｂ】例示的なポリペプチドコンジュゲート（例えばＥＰＯコンジュゲート）の種々のグリコフォームを含む本発明の例示的な組成物を表す図である。各グリコフォームは、ポリペプチドに共有結合しているＰＥＧ部分の数によって、またはＰＥＧ部分をポリペプチドに結合させているグリカンの構造によって、他のグリコフォームから識別される。示されたパーセンテージの値は例示的なものである。
【図４Ａ】２５ｍｇスケールで実施された、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４を含有する例示的なグリコＰＥＧ化反応混合物の逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣクロマトグラムである。分析には、Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ３（１５０×２．１ｍｍ、５ミクロン）カラムを用いた。以下の溶出液を用いた：水中０．１％のＴＦＡ（緩衝液Ａ）およびＣＡＮ中０．０９％のＴＦＡ（緩衝液Ｂ）。勾配は、４２〜５５％のＢで１４分間、引き続き、５５〜９５％のＢで２分間であった。流速は０．６ｍＬ／分であった。吸収は２１４ｎｍにおいて測定した。番号付けされたピークは以下を表す：（１）モノ−ＰＥＧ−ＥＰＯ＝ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１；（２）ジ−ＰＥＧ−ＥＰＯ＝ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２；（３）トリ−ＰＥＧ−ＥＰＯ＝ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３および（４）テトラ−ＰＥＧ−ＥＰＯ＝ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４。
【図４Ｂ】精製されたＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３を主要構成部分として含有し、本発明の方法を用いて得られた本発明の例示的な組成物の逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣクロマトグラムである。番号付けされたピークは以下を表す：（１）トリ−ＰＥＧ−ＥＰＯ＝ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３および（２）ジ−ＰＥＧ−ＥＰＯ＝ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２。
【図５】チャイニーズハムスターの卵巣細胞から単離された例示的なグリコペグ化ＥＰＯイソ型の概略を示す図である。Ａ．例示的な４０キロダルトンのＯ−結合ペグ化グリコフォーム。Ｂ．幾つかの３０キロダルトンのＮ−結合ペグ化グリコフォームの１つ。ＰＥＧ分子を含む修飾シアル酸部分は、Ｎ−結合グリコシル残基の任意の分枝のいずれか１つまたは複数に見ることができる。さらに、この図は、任意のグリコシル化ＥＰＯ分子は、モノ、バイ、トリ、またはテトラアンテナＮ−結合グリコシル残基のいずれかの混合物を含むことができ、いずれか１つまたは複数の分枝が修飾シアル酸部分をさらに含むことができることを例示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
略号
ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ、ポリ（プロピレングリコール）；Ａｒａ、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、マンノサミニルアセテート；Ｘｙｌ、キシロシル；およびＮｅｕＡｃ、シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）；Ｍ６Ｐ、マンノース−６−ホスフェート；ＢＥＶＳ、バキュロウイルス発現ベクター系；ＣＶ、カラム容量；ＮＴＵ、公称濁度単位；ｖｖｍ、容量／容量／分。
【００１７】
定義
別に定義されない限り、本明細書に用いられる専門用語および科学用語は一般に、本発明が帰属する通常の当業者に一般に認識されているのと同じ意味を有する。一般に、本明細書に用いられる命名法および細胞培養、分子遺伝学、有機化学ならびに核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験操作は、当技術分野によく知られており一般に用いられているものである。核酸およびペプチド合成には標準的技法が用いられる。この技法および操作は一般に、当技術分野の従来の方法および種々の一般的文献（一般に、本明細書に参照として援用されているＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州を参照）に従って実施され、本明細書全体に示されている。本明細書に用いられる命名法ならびに分析化学における実験手順および下記の有機合成は、当技術分野によく知られており一般に用いられているものである。化学合成および化学分析には標準的方法、またはそれらの改変されたものが用いられる。
【００１８】
本明細書に記載されているオリゴ糖は全て、非還元糖の名称または略号（すなわち、Ｇａｌ）、引き続いて、グリコシド結合（αまたはβ）のコンフィギュレーション、環結合（１または２）、結合に含まれる還元糖の環の位置（２、３、４、６または８）、および還元糖の名称または略号（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ）によって記載される。各糖はピラノースであることが好ましい。標準的な糖生物学の命名法のレビューに関しては、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖａｒｋｉら編、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。
【００１９】
オリゴ糖は、還元端における糖が実際に還元糖であってもなくても、還元端および非還元端を有すると考えられている。認められた命名法により、オリゴ糖は本明細書において、非還元端を左に、還元端を右に示される。
【００２０】
置換基が、左から右へ記されたそれらの従来の化学式によって明記されている場合、それらは、構造を右から左へ記すことから生じる化学的に同一の置換基を等しく包含する。例えば、−ＣＨ２Ｏ−はまた、−ＯＣＨ２−を指すことも意味する。
【００２１】
用語「アルキル」は、それ自体で、または他の置換基の一部として、別に記述されない限り、直鎖または分枝鎖、または環式（すなわち、シクロアルキル）炭化水素基、またはそれらの組合せを意味し、それらは完全に飽和、モノまたはポリ不飽和であり得、ジ−（例えばアルキレン）および多価基を含み得、指定された炭素原子数を有する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は、１個から１０個の炭素を意味する）。飽和炭化水素基の例としては、限定はしないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同体および異性体などの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、限定はしないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−プロピニルおよび３−プロピニル、３−ブチニル、およびより高級の相同体および異性体が挙げられる。用語「アルキル」はまた、別に記述しない限り、「ヘテロアルキル」など、下記により詳細に定義されたアルキルの誘導体を含むことを意味する。炭化水素基に限定されているアルキル基は、用語「ホモアルキル」と称される。
【００２２】
用語「アルキレン」は、それ自体で、または他の置換基の一部として、アルカンから誘導された二価の基を意味し、例として、限定はしないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられ、さらに、下記に「ヘテロアルキレン」として記載されている基を含む。一般に、アルキル（またはアルキレン）基は、１個から２４個の炭素原子を有するが、１０個以下の炭素原子を有する基が、本発明においては好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、より短い鎖のアルキルまたはアルキレン基であり、一般に、８個以下の炭素原子を有する。
【００２３】
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）は、それらの従来の意味で用いられ、分子の残部に、酸素原子、アミノ基、またはイオウ原子をそれぞれ介して接続したアルキル基のことである。
【００２４】
用語「ヘテロアルキル」は、それ自体で、または他の用語と組み合わせて、別に記述しない限り、表示された数の炭素原子、およびＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子からなる安定な直鎖または分枝鎖、または環式炭化水素基、またはそれらの組合せを意味し、窒素原子およびイオウ原子は場合によって酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は場合によって四級化されていてもよい。ヘテロ原子、Ｏ、ＮおよびＳならびにＳｉは、ヘテロアルキル基の内部の任意の位置、またはアルキル基が分子の残部に接続している位置に置くことができる。例としては、限定はしないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３など、２個までのヘテロ原子は連続していてもよい。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体で、または他の置換基の一部として、ヘテロアルキルから誘導された二価の基を意味し、例としては、限定はしないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が挙げられる。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子は鎖の末端の一方または双方を占有することもできる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン結合基では、結合基の方向は、結合基の式が記述されている方向を意味しない。例えば、式−ＣＯ２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’および−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’の双方を表す。
【００２５】
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それら自体で、または他の用語と組み合わせて、別に記述されない限り、それぞれ、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環式型を表す。また、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残部に接続している位置を占有することができる。シクロアルキルの例としては、限定はしないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、限定はしないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。
【００２６】
用語「ハロ」または「ハロゲン」は、それら自体で、または他の置換基の一部として、別に記述されない限り、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味する。また、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、用語「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」は、限定はしないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むことを意味する。
【００２７】
用語「アリール」は、別に記述されない限り、一緒に縮合しているか、または共有結合している、単環または多環（好ましくは、１つ〜３つの環）であり得る、多価不飽和、芳香族の置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳｉおよびＢから選択される１個から４個のヘテロ原子を含有するアリール基（または環）のことであり、窒素原子およびイオウ原子は場合によって酸化されており、窒素原子（複数可）は場合によって四級化されている。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残部と接続し得る。アリール基およびヘテロアリール基の非限定例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系の各々に関する置換基は、下記の許容できる置換基の群から選択される。
【００２８】
簡潔にするため、用語「アリール」は、他の用語と組み合わせて用いられる場合（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、上記に定義されたアリール環とヘテロアリール環の双方を含む。したがって、用語「アリールアルキル」は、炭素原子（例えばメチレン基）が、例えば、酸素原子によって置換されているアルキル基（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）などのアルキル基にアリール基が接続している基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含むことを意味する。
【００２９】
上記の用語の各々（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、指示された基の置換体と非置換体の双方を含むことを意味する。各タイプの基の好ましい置換基は、下記に提供されている。
【００３０】
アルキル基およびヘテロアルキル基に関する置換基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとしばしば称される基を含む）は一般に、「アルキル基置換基」と称され、それらは、限定はしないが、ゼロから（２ｍ’＋１）の範囲の数の、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ’、−（ＣＯ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から選択される種々の基の１つまたは複数であり得、式中、ｍ’は、このような基における炭素原子の総数である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は各々、好ましくは独立して、水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、例えば、１個から３個のハロゲンによって置換されたアリール、置換または非置換アルキル、アルコキシ基またはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基のことである。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、例えば、各々が独立して選択されるＲ基は、Ｒ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基の２つ以上が存在する場合、各々Ｒ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基である。Ｒ’およびＲ’’が同一の窒素原子に接続している場合、それらはその窒素原子と一緒になって、５員環、６員環、または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、限定はしないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意味する。上記の置換基の考察から、用語「アルキル」が、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）などの水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むことを意味することが当業者には理解されよう。
【００３１】
アルキル基に関して記載された置換基と同様に、アリール基およびヘテロアリール基に関する置換基は一般に、「アリール基置換基」と称される。置換基は例えば、芳香族環系上のゼロからオープン価の総数の範囲の数の、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択され、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されることが好ましい。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、例えば、各々が独立して選択されるＲ基は、Ｒ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基の２つ以上が存在する場合、各々Ｒ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基である。
【００３２】
アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−の置換基によって場合によって置換されていてもよく、式中、ＴおよびＵは独立して、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、ｑは０から３の整数である。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基によって場合によって置換されていてもよく、式中、ＡおよびＢは独立して、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは１から４の整数である。このように形成された新たな環の単結合の１つは、二重結合によって場合によって置換されていてもよい。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−の置換基によって場合によって置換されていてもよく、式中、ｓおよびｄは独立して０から３の整数であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は水素または置換もしくは非置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから独立して選択されることが好ましい。
【００３３】
本明細書に用いられる用語「アシル」は、カルボニル残基、Ｃ（Ｏ）Ｒを含有する置換基のことである。Ｒの例となる種としては、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換ヘテロシクロアルキルが挙げられる。
【００３４】
本明細書に用いられる用語「縮合環系」とは、各環が他の環と少なくとも２つの原子を共有している少なくとも２つの環を意味する。「縮合環系」は、芳香族環ならびに非芳香族環を含み得る。「縮合環系」の例は、ナフタレン類、インドール類、キノリン類、クロメン類などである。
【００３５】
本明細書に用いられる用語「ヘテロ原子」には、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、イオウ（Ｓ）、ケイ素（Ｓｉ）およびホウ素（Ｂ）が含まれる。
【００３６】
記号「Ｒ」は、置換基を表す一般的な略号である。置換基の例としては、置換または非置換アルキル基、置換または非置換ヘテロアルキル基、置換または非置換アリール基、置換または非置換ヘテロアリール基、および置換または非置換ヘテロシクロアルキル基が挙げられる。
【００３７】
用語「薬学的に許容できる塩」には、本明細書に記載されている化合物上にある具体的な置換基に依存して、比較的非毒性の酸または塩基によって調製される活性化合物の塩が含まれる。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含有する場合、このような化合物の中性形態を、ニートで、または好適な不活性の溶媒中で、十分な量の所望の塩基と接触させることによって、塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容できる塩基付加塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミノ塩、もしくはマグネシウム塩、または類似の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含有する場合、このような化合物の中性形態を、ニートで、または好適な不活性の溶媒中で、十分な量の所望の酸と接触させることによって、酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容できる酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無機酸から誘導された塩、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、酪酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの比較的非毒性の有機酸から誘導された塩が挙げられる。また、アルギン酸塩などのアミノ酸の塩、ならびにグルクロン酸またはガラクツノン酸などの有機酸の塩も挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６：１〜１９頁（１９７７）を参照）。本発明のある特定の化合物は、化合物を塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換することを可能にする塩基性官能基と酸性官能基の双方を含有する。
【００３８】
化合物の中性形態は、塩を、塩基または酸と接触させ、従来の様式で親化合物を単離することによって再生させることが好ましい。化合物の親形態は、極性溶媒中での溶解度などの特定の物理的性質において種々の塩形態と異なっているが、その他では、塩は本発明の目的に関して親化合物の形態と等価である。
【００３９】
塩形態に加えて、本発明はプロドラッグ形態の化合物を提供する。本明細書に記載されている化合物のプロドラッグは、生理学的条件下で容易に化学的変化を受けて、本発明の化合物を提供する化合物である。なおプロドラッグは、エクスビボの環境で化学的または生化学的方法により、本発明の化合物に変換することができる。例えばプロドラッグは、好適な酵素または化学試薬と共に経皮パッチリザバー中に入れた場合に、本発明の化合物へと徐々に変換することができる。
【００４０】
本発明の特定の化合物は、非溶媒和形態、ならびに水和形態などの溶媒和形態で存在することができる。一般に、溶媒和形態は非溶媒和形態と等価であり、本発明の範囲内に包含される。本発明の特定の化合物は、複数の結晶形態または非結晶形態で存在し得る。一般に、全ての物理的形態が本発明で考慮されている使用に関して等価であり、本発明の範囲内にあることが意図されている。
【００４１】
本発明の特定の化合物は、非対称性の炭素原子（光学的中心）または二重結合；ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体を有し、個々の異性体が本発明の範囲内に包含される。
【００４２】
本発明の化合物は、単独の異性体（例えば、鏡像異性体、シス−トランス、位置異性体、ジアステレオマー）として、または異性体の混合物として調製することができる。好ましい実施形態において、化合物は実質的に単独の異性体として調製される。異性体的に実質的に純粋な化合物を調製する方法は当技術分野に知られている。例えば、鏡像異性体が高濃度の混合物および純粋な鏡像異性体化合物は、キラル中心における立体化学を変化させずにおくかまたは完全な反転をもたらす反応と組み合わせて、鏡像異性体的に純粋な合成中間体を用いることによって調製することができる。あるいは、合成経路に沿った最終生成物または中間体を、単独の立体異性体へと分離することができる。特定の立体中心を反転させるか、または変化させずにおく技法、および立体異性体の混合物を分離するための技法は当技術分野によく知られており、具体的な状況で適切な方法を選択することは十分に当業者の能力の範囲内にある。一般的には、Ｆｕｒｎｉｓｓら（編）、ＶＯＧＥＬ’Ｓ  ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第５版、Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ社、Ｅｓｓｅｘ、１９９１年、８０９〜８１６頁；およびＨｅｌｌｅｒ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３：１２８頁（１９９０）を参照されたい。
【００４３】
本明細書に用いられているラセミ、アンビスケイレミック（ambiscalemic）およびスケイレミック（scalemic）、または鏡像異性体的に純粋な化合物の図式表示は、Ｍａｅｈｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．、６２：１１４〜１２０頁（１９８５）から入手し、キラル元素の絶対コンフィギュレーションを表すために実線および破線くさび形を用い；波線はそれが表す結合が生じさせ得る任意の立体化学的示唆を否認することを示し；実線および太い破線は、表示された相対的コンフィギュレーションを示すが任意の絶対立体化学を示唆しない幾何記述子であり；くさび形の輪郭線および点線または破線は、不確定の絶対的コンフィギュレーションの鏡像異性体的に純粋な化合物を表す。
【００４４】
用語「鏡像異性体的に過剰」および「ジアステレオマー的に過剰」は、本明細書において交換可能に用いられる。単一の立体中心を有する化合物は、「鏡像異性体的に過剰」に存在していると言われ、少なくとも２つの立体中心を有する化合物は、「ジアステレオマー的に過剰」に存在していると言われる。
【００４５】
本発明の化合物はまた、このような化合物を構成する１つまたは複数の原子において、非天然的な比率の原子同位体を含有し得る。例えば、化合物は、例えば、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）または炭素−１４（１４Ｃ）などの放射性同位体によって放射標識することができる。本発明の化合物の同位体変種の全ては、放射性であってもなくても、本発明の範囲内に包含されることが意図されている。
【００４６】
本明細書に用いられる「反応性官能基」とは、限定はしないが、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、オキシド、ハライド、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、酸無水物、サルフェート、スルフェン酸、イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、サルファイト、エナミン、イナミン、尿素、プソイド尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、およびニトロソ化合物などの基のことである。反応性官能基にはまた、バイオコンジュゲート、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミドなどを調製するために用いられるものも含まれる。これらの反応性官能基の各々を調製する方法は、当技術分野によく知られており、特定の目的のためのそれらの適用または改変は、当業者の能力の範囲内にある（例えば、ＳａｎｄｌｅｒおよびＫａｒｏ編、ＯＲＧＡＮＩＣ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＧＲＯＵＰ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９８９年参照）。
【００４７】
本明細書に用いられる用語「薬学的に許容できる担体」には、コンジュゲートと組み合わせた場合にコンジュゲートの活性を保持し、対象の免疫系と反応しない任意の物質が含まれる。「薬学的に許容できる担体」には、媒体、希釈剤および溶媒などの固体および液体が含まれる。例としては、限定はしないが、リン酸緩衝生理食塩液、水、油／水乳濁液などの乳濁液、および種々のタイプの湿潤剤などの標準的な製薬担体のいずれかが挙げられる。他の担体としては、滅菌溶液、コーティングした錠剤を含む錠剤およびカプセル剤も挙げられる。一般にこのような担体は、澱粉、乳汁、砂糖、特定のタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、タルク、植物脂肪または植物油、ゴム類、グリコール類、または他の公知の賦形剤などの賦形剤を含有する。このような担体はまた、芳香剤および着色添加物または他の成分も含み得る。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化される。
【００４８】
本明細書に用いられる用語「投与」とは、対象に対する、経口投与、座剤としての投与、局所的接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病変内、または皮下の投与、吸入による投与、または除放デバイス、例えばミニ浸透圧ポンプの移植を意味する。投与は、非経口および経粘膜（例えば、経口腔、経鼻、経膣、経直腸、または経皮）などの任意の経路により、特に吸引による。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋内、小動脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、および頭蓋内などが挙げられる。さらに、注入が腫瘍の処置、例えば、アポトーシスの誘導のためなどの場合、投与は、腫瘍に対して、および／または腫瘍周囲の組織に対して直接的であり得る。送達の他の様式としては、限定はしないが、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、経皮パッチなどが挙げられる。
【００４９】
用語「寛解(ameliorating)」または「寛解させる(ameliorate)」とは、症状の軽減、軽快または減少などの客観的または主観的パラメータ、または患者の身体的または精神的な健康状態の改善などの病態または状態の処置における成功の兆候のことを言う。症状の寛解は、身体検査および／または医師の評価の結果など、客観的または主観的なパラメータに基づくことができる。
【００５０】
用語「療法(therapy)」とは、疾患に罹患する素因があり得るが、疾患の症状をまだ経験していないか、または示していない対象（例えばヒト）が疾患または状態を生じさせることを防止すること（予防的処置）、疾患を抑制すること（その発現の緩徐化または阻止）、疾患の症状または副作用の軽減を提供すること（対症的処置を含む）、および疾患を軽減すること（疾患の後退を生じさせること）など、疾患または状態の「処置すること」または「処置」のことである。
【００５１】
用語「有効量」または「有効な量」または「治療的有効量」または文法的に等価な用語は、その量が、疾患を処置するために動物またはヒトに投与した際に、その疾患に対する治療に有効に作用する上で十分である量を意味する。
【００５２】
用語「昆虫細胞培養」とは、昆虫綱の生物に由来した細胞のインビトロの増殖および培養のことである。「昆虫細胞培養」とはまた、インビトロで増殖および培養した昆虫綱の細胞を含む細胞培養のことでもある。
【００５３】
「ペプチド」とは、代替的にポリペプチドとも称されるが、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合を介して一緒に結ばれているポリマーのことである。さらに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンもまた含まれる。遺伝子コードされていないアミノ酸もまた本発明に使用できる。さらに、反応性基、グリコシル化部位、ポリマー、治療的部分、生体分子などを含むように修飾されたアミノ酸もまた本発明に使用できる。本発明に使用されるアミノ酸は全てＤ−異性体またはＬ−異性体のいずれかであり得る。一般にＬ−異性体が好ましい。さらに、他のペプチド模倣物もまた、本発明に有用である。本明細書に用いられる「ペプチド」は、グリコシル化ペプチドと非グリコシル化ペプチドの双方を言う。また、ペプチドを発現する系によって不完全にグリコシル化されているペプチドも含まれる。一般的レビューに関しては、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク、２６７頁（１９８３）を参照されたい。用語、ペプチドには、一般にタンパク質またはポリペプチドと称されている分子が含まれる。
【００５４】
本明細書に用いられる用語「グリコペプチド」とは、それに共有結合した少なくとも１つの炭水化物部分を有するペプチドのことである。グリコペプチドは、「治療用グリコペプチド」であり得ることが理解される。用語「グリコペプチド」は、本明細書において、用語「グリコポリペプチド」および「糖タンパク質」と交換可能に用いられる。
【００５５】
用語「ペプチドコンジュゲート」とは、ペプチドが本明細書に記載された修飾糖とコンジュゲートしている本発明の化学種のことである。
【００５６】
本明細書に用いられる用語「修飾糖」とは、本発明の過程において、ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基上に酵素的に付加される天然または非天然炭水化物のことである。修飾糖は、限定はしないが、糖ヌクレオチド（モノ、ジ、およびトリホスフェート）、活性化糖（例えば、グリコシルハライド、グリコシルメシレート）および活性化されてもおらず、ヌクレオチドでもない糖などの多数の酵素基質から選択される。「修飾糖」は、「修飾基」によって共有的に官能化されている。有用な修飾基としては、限定はしないが、ＰＥＧ部分、治療的部分、診断的部分、生体分子などが挙げられる。修飾基は、天然でないこと、または非修飾の炭水化物でないことが好ましい。修飾基による官能化の位置は、ペプチドへの「修飾糖」の酵素的付加を妨げないように選択される。
【００５７】
本明細書に用いられる用語「グリココンジュゲーション」とは、ポリペプチド、例えば、本発明の方法によって調製されたエリスロポエチンペプチドのアミノ酸残基、またはグリコシル残基に対する修飾糖種の酵素に媒介されたコンジュゲーションのことである。「グリココンジュゲーション」の亜属は、修飾糖の修飾基が、ポリ（エチレングリコール）、そのアルキル誘導体（例えば、ｍ−ＰＥＧ）または反応性誘導体（例えば、Ｈ２Ｎ−ＰＥＧ、ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）である「グリコ−ＰＥＧ化」である。
【００５８】
用語「大規模」および「工業的規模」は交換可能に用いられ、１つのサイクルの完了時に、少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは、少なくとも約５００ｍｇ、より好ましくは、少なくとも約１グラムのペプチドを製造する反応サイクルまたは反応過程のことである。
【００５９】
本明細書に用いられる用語「グリコシル結合基」とは、修飾基（例えば、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子）が共有接続しているグリコシル残基のことであり、グリコシル結合基は、修飾基をコンジュゲートの残部に結びつける。本発明の方法において、「グリコシル結合基」は、グリコシル化ポリペプチドまたは非グリコシル化ポリペプチドに共有接続し、そのことによって修飾基を、ポリペプチドのアミノ酸残基および／またはグリコシル残基に結合させる。「グリコシル結合基」は一般に、ポリペプチドのアミノ酸残基および／またはグリコシル残基に対する「修飾糖」の酵素的接続により、「修飾糖」から誘導される。グリコシル結合基は、修飾基−修飾糖カセットの形成中（例えば、酸化→シッフ塩基形成→還元）に分解される糖由来の構造であり得るか、またはグリコシル結合基は、完全形であり得る。「完全形のグリコシル結合基」とは、修飾基およびコンジュゲートの残部に結合している糖モノマーが分解されていない（例えば、メタ過ヨウ素酸ナトリウムにより、例えば、酸化されていない）グリコシル部分に由来する結合基のことである。本発明の「完全形のグリコシル結合基」は、グリコシル単位の付加または親糖構造からの１つまたは複数のグリコシル単位の除去によって、天然オリゴ糖から誘導できる。「グリコシル結合基」は、グリコシル模倣部分を含み得る。例えば、グリコシル化ポリペプチドへの修飾糖の付加に用いられるグリコシルトランスフェラーゼ（例えばシアリルトランスフェラーゼ）は、グリコシル模倣基質（例えば、糖部分がグリコシル模倣部分−例えば、シアリル模倣部分である修飾糖）に対して寛容性を示す。修飾グリコシル模倣糖の転移により、グリコシル模倣部分であるグリコシル結合基を有するコンジュゲートが生じる。
【００６０】
本明細書に用いられる用語「グリコシル模倣部分」とは、グリコシル部分に構造的に類似している部分（例えば、ヘキソースまたはペントース）のことである。「グリコシル模倣部分」の例としては、グリコシル部分のグリコシド酸素または環の酸素、または双方が、結合または他の原子（例えばイオウ）、または炭素含有基（例えば、ＣＨ２）、または窒素含有基（例えば、ＮＨ）などの他の部分によって置換された部分が挙げられる。例としては、置換または非置換シクロヘキシル誘導体、環式チオエーテル、環式第２級アミン、チオグリコシド結合を含む部分などが挙げられる。一例において、「グリコシル模倣部分」は、酵素触媒反応において、ポリペプチドのアミノ酸残基またはグリコペプチドのグリコシル部分に転移される。これは、例えば、ハロゲンなどの脱離基により、「グリコシル模倣部分」を活性化することによって達成することができる。
【００６１】
本明細書に用いられる用語「ポリペプチドグリコフォーム」または「グリコフォーム」とは、同一のアミノ酸配列を有しているが、修飾基（例えば、ポリ（アルキレンオキシド）部分）が共有結合しているグリカン残基に関して、異なるグリコシル化パターンを有する２つのポリペプチドコンジュゲートのことである。異なる数の修飾基（例えば、ポリ（アルキレンオキシド）部分）を有する２つのポリペプチドコンジュゲートもまたグリコフォームと称される。図３Ｂは、ＥＰＯポリペプチドコンジュゲートの例示的なグリコフォームを示している。ＥＰＯが昆虫特異的なグリコシル化パターンを含む、ＥＰＯ−ＰＥＧコンジュゲートのトリ−ＰＥＧ化グリコフォーム、ジ−ＰＥＧ化グリコフォームおよびテトラ−ＰＥＧ化グリコフォームが示されている。他の例示的なＥＰＯ−ＰＥＧグリコフォームは、図５に示されているように、ＣＨＯ細胞において発現したＥＰＯから誘導することができる。本発明の方法によって単離できるさらなるＥＰＯ−ＰＥＧグリコフォームは、２００４年１１月２４日出願の米国特許出願第１０／９９７，４０５号および２００５年６月２日出願の米国特許出願第１１／１４４，２２３号に開示されており、それらの開示は、本明細書にそれらの全体が開示されている。下記の実施例で考察されているＥＰＯ−ＰＥＧコンジュゲートは、代替的にＥＰＯ−ＰＥＧ「種」、ＥＰＯ−ＰＥＧ「体（フォーム）」またはＥＰＯ−ＰＥＧ「状態」と称される。
【００６２】
用語「単離された」とは、物質を製造するために用いられる成分が本質的に無い物質のことである。本発明のペプチドコンジュゲートでは、用語「単離された」とは、ペプチドコンジュゲートの調製に用いられる混合物中の物質に通常伴っている成分が本質的に無い物質のことである。用語「単離された」と「純粋な」とは、交換可能に用いられる。一般に、本発明の単離されたペプチドコンジュゲートは、ある範囲として表されたレベルの純度を有する。一般に、例えば、範囲の下端は、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％または約８０％であり、範囲の上端は、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９５％超である。
【００６３】
ペプチドコンジュゲートが約９０％超純粋である場合、それらの純度はある範囲として表されることが好ましい。例えば、範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％であり、範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％である。
【００６４】
純度を判定するための方法は当業者に知られている。ポリペプチドコンジュゲートの純度は、任意の好適な、当技術分野で認められた分析方法（例えば、銀染色ゲル上でのバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣなど）によって判定できる。例示的な方法は、本明細書下記のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣである。純度は、ＨＰＬＣクロマトグラムなどのクロマトグラムにおけるピークに関して一般に得ることができる相対的「曲線下面積」（ＡＵＣ）値を用いて判定できる。場合によって、既知の純度を有する参照物質を用いて作出された標準曲線を使って、クロマトグラフィーの手段または他の手段によって、純度を判定する。純度はまた、重量対重量を基準に判定できる。
【００６５】
「純度」の判定に有用な方法（例えば、上記の方法）はまた、混合物（例えば、本発明の組成物）中のある特定の成分の「濃度」、または１つまたは複数の他の成分に対する１つの成分の相対的濃度の判定にも有用である。例えば、異なるグリコフォーム間の比率を判定するために、または本発明の組成物中の特定のグリコフォームの濃度を判定するために、ＳＥＣ  ＨＰＬＣを用いることができる。
【００６６】
本明細書に用いられる「本質的に集団の各メンバー」とは、ペプチド上の部位の「均一性」、および共通の構造（例えば、共通のグリコシル化パターン／グリコシル構造）を有するペプチドの集団を言う。
【００６７】
「均一性」とは、ポリペプチドの集団にわたる構造の一貫性のことである。したがって、各グリカン残基が同一の構造を有する本発明のグリコペプチドにおいて、グリコペプチドは、約１００％均一性であると言われる。同様に、グリコペプチドの集団において、集団の各ペプチドが本質的に同一分子種のものであるように各グリコペプチドが同一構造のグリカン残基を有する場合、集団は、約１００％均一性であると言われる。均一性は一般に、ある範囲として表される。ペプチドコンジュゲートに関する均一性の範囲の下端は、約６０％、約７０％または約８０％であり、純度の範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。
【００６８】
ペプチドコンジュゲートが約９０％以上均一性である場合、それらの均一性もまたある範囲として表されることが好ましい。均一性の範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％である。ペプチドコンジュゲートの均一性は一般に、当業者に知られた１つまたは複数の方法、例えば、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、フライト分光法のマトリックス支援レーザー脱離質量時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動などによって判定される。
【００６９】
本発明のグリコペプチド種を述べる場合、「実質的に一定のグリコシル化パターン」とは、同一構造のグリカン残基を有するポリペプチド上のグリコシル化部位のパーセンテージのことである。例えば、複数のＮ−結合グリコシル化部位またはＯ−結合グリコシル化部位を含むポリペプチドは、同等のグリコシル化部位の全てに、全ての同等の部位の約９０％に、全ての同等のグリコシル化部位の約８０％または約７５％に、同一構造のグリコシル残基を有し得る。これらの例において、ポリペプチドは、「実質的に一定のグリコシル化パターン」を有すると言われるであろう。あるいは、グリコペプチドの集団が共通のグリコシル化パターンを有する場合、集団におけるペプチドの大部分が本質的に単一の分子種であるならば、集団は、「実質的に一定のグリコシル化パターン」を有すると言うことができる。
【００７０】
例えば、グリコシル化ポリペプチドの集団が、さらなる修飾なしに細胞から単離される場合、集団のメンバーは、それらのグリカン残基の正確な構造においてある範囲の変化を含み得る。しかし、例示的な実施形態において、昆虫細胞から単離されたペプチドは、実質的に一定の昆虫特異的なグリコシル化パターンを有する。このことは、ポリペプチドの大部分、またはポリペプチドの実質的に全てが、調製物において１つの明確な分子種であることを意味している。
【００７１】
「実質的に一定」の上記の定義における用語「実質的に」とは一般に、受容体部分の少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらに１００％が、予測される昆虫細胞特異的なグリコシル化パターンによってグリコシル化されることを意味する。
【００７２】
用語「昆虫特異的なグリコシル化パターン」とは、昆虫細胞によって産生された成熟グリコペプチド上に見られるグリコシル化パターンのことである。一般に昆虫細胞は、末端がマンノースである単純なＮ−結合オリゴ糖を生成する（レビューに関しては、例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ａ．Ｖａｒｋｉら編、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）、３２〜３３頁を参照）。一般に、昆虫細胞系によって産生されるＮ−結合グリカンは（成熟時に）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を含む糖タンパク質を生成する。フコース単位もまた、ペプチドに直接結合しているＧｌｃＮＡｃ残基上に見ることができる。したがって、「昆虫特異的なグリコシル化パターン」によって細胞から生成する成熟ペプチドは、トリマンノシル（Ｍａｎ３）構造またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有する１つまたは複数のグリカンを含む。「昆虫特異的なグリコシル化パターン」はまた、本質的に全てのポリペプチドが共通のモチーフ（例えば、Ｍａｎ３またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のモチーフ）を末端に有するグリカン構造を有し、分解されない（例えば、ポリペプチドに直接結合した２つのＧｌｃＮＡｃ残基の１つを曝露しない）ポリペプチド集団のことでもある。
【００７３】
用語「負荷緩衝液」とは、精製中のポリペプチドコンジュゲートを、精製デバイス、例えば、クロマトグラフィーカラムまたはフィルターカートリッジに適用する緩衝液のことである。一般に負荷緩衝液は、不要の不純物から対象となっているペプチドコンジュゲートの分離を達成することができるように選択される。例えば、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）またはフルオロアパタイトのカラムでポリペプチドコンジュゲートを精製する場合、負荷緩衝液のｐＨおよび負荷緩衝液の塩濃度は、ポリペプチドコンジュゲートが最初、カラム上に保持される一方、特定の不純物が流出物中に見られるように選択することができる。他の例において、不純物を保持する一方、所望のポリペプチドコンジュゲートが流出物中に見られるように、負荷緩衝液が選択される。
【００７４】
用語「溶出緩衝液」とは、ポリペプチドコンジュゲートを先に適用した精製デバイス（例えば、クロマトグラフィーカラムまたはフィルターカートリッジ）からポリペプチドコンジュゲートを除去する（溶出させる）ために一般に用いられる緩衝液のことである。一般に溶出緩衝液は、不要の不純物からの対象となっているポリペプチドコンジュゲートの分離を達成できるように選択される。溶出緩衝液中の特定の塩（例えば、ＮａＣｌ）などの特定成分の濃度は、しばしば溶出操作中に変化させる（勾配）。勾配は連続的の場合もあるし、段階的の場合もある（保留期間が間に入る）。
【００７５】
用語「制御された室温」とは、少なくとも約１０℃、少なくとも約１５℃、少なくとも約２０℃、または少なくとも約２５℃の温度のことである。一般に制御された室温は約２０℃から約２５℃の間である。
【００７６】
Ｉ．方法
本発明は、混合物からのポリペプチドコンジュゲートの単離（例えば、大規模単離）のための方法を提供する。本発明の方法によって単離されたポリペプチドコンジュゲートは、少なくとも１つの修飾基を含む。例示的な修飾基としては、ポリ（アルキレンオキシド）部分（例えば、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール））などのポリマーを含む。例示的な修飾基は本明細書の下記にある。
【００７７】
一実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートは反応混合物から単離される。一例において、反応混合物は、化学的ＰＥＧ化反応などの化学反応の生成物である。この実施形態による一例において、反応混合物は、未反応ポリマー試薬および／またはその加水分解生成物などの化学物質を含有し得る。別の例において、反応混合物は、酵素触媒グリコＰＥＧ化反応などの酵素触媒反応の生成物である。この例において、反応混合物は、酵素を含み得、未反応酵素基質（例えば、ヌクレオチド糖など）などの試薬をさらに含み得る。一例において本発明の方法は、上記に掲げた反応混合物の成分からのポリペプチドコンジュゲートの単離に好適である。
【００７８】
他の実施形態において、本発明の方法は、所望のポリペプチドコンジュゲートから分離することが求められている他のポリペプチドコンジュゲートを含む混合物から、所望のポリペプチドコンジュゲートを単離する上で有用である。このような「不要な」ポリペプチドコンジュゲートまたは副生成物は、所望のポリペプチドコンジュゲートの形成に至らせる同じ反応の間に生成し得る。例えば、組換えポリペプチドが化学的ＰＥＧ化反応に供される。反応生成物は、各タイプのポリペプチドコンジュゲートが種々の数のＰＥＧ部分を含む、種々のポリペプチドコンジュゲートを含む（例えば、反応混合物中のポリペプチドコンジュゲートの大部分が３つのＰＥＧ部分を含むが、ポリペプチドコンジュゲートの小パーセンテージが、１つまたは２つだけのＰＥＧ部分と共有結合している）。別の例において、組換え作製されたポリペプチドが、酵素触媒グリコＰＥＧ化反応に供される。反応に用いられるポリペプチド集団の不均一なグリコシル化パターンのために、反応混合物は、各タイプのポリペプチドコンジュゲートがポリペプチドに共有結合しているＰＥＧ部分の数、および／または各ＰＥＧ部分がポリペプチドに接続しているグリカン残基の構造に関して異なる構造を有する、種々のポリペプチドコンジュゲートを含む。混合物はまた、未反応ポリペプチドも含有し得る。
【００７９】
本発明者は、ブチル樹脂およびフェニル樹脂（例えば、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ）などの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂が、少なくとも１つのポリ（アルキレンオキシド）部分によって修飾されたポリペプチドの単離にとって特に有用であることを発見した。ＨＩＣは、ポリペプチドコンジュゲートの種々のグリコフォーム、特に、ポリペプチドに結合しているポリ（アルキレンオキシド）部分の数によって識別されるグリコフォームの分離に優れていることが明らかになった。
【００８０】
例えば、３つのポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分を含むエリスロポエチン（ＥＰＯ）コンジュゲートを、０、１、２、３、４、５、６つまたは７つのＰＥＧ部分を含む他のＥＰＯコンジュゲートから分離することにおいて、ＨＩＣは効率的である。またＨＩＣは、同数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含むが、ポリペプチドコンジュゲートが異なるグリコシル化パターンを有するポリペプチドコンジュゲートの分離に用いることができる。
【００８１】
疎水性相互作用クロマトグラフィーに加えて、本発明の方法は、追加のクロマトグラフィーステップをさらに使用することができる。一実施形態において、この方法は、ＨＩＣに加えて、アニオン交換クロマトグラフィーまたは混合様式クロマトグラフィーを含む。別の実施形態において、この方法は、ＨＩＣに加えて、カチオン交換クロマトグラフィーを含む。さらに他の実施形態において、この方法は、ＨＩＣに加えて、アニオン交換クロマトグラフィーまたは混合様式クロマトグラフィーとカチオン交換クロマトグラフィーの双方を含む。さらなる実施形態において、この方法は、ＨＩＣに加えて、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはフルオロアパタイトクロマトグラフィーを含む。本発明の方法に用いられるクロマトグラフィーステップは、任意の所望の順序で実施することができる。一実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィーまたは混合様式クロマトグラフィーが、疎水性相互作用クロマトグラフィーの前に実施される。別の実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィーまたは混合様式クロマトグラフィーが、疎水性相互作用クロマトグラフィーの後に実施される。さらに他の実施形態において、カチオン交換クロマトグラフィーが、疎水性相互作用クロマトグラフィーの前に実施される。さらなる実施形態において、カチオン交換クロマトグラフィーが、疎水性相互作用クロマトグラフィーの後に実施される。一実施形態において、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはフルオロアパタイトクロマトグラフィーが、ＨＩＣの前に実施される。別の実施形態において、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはフルオロアパタイトクロマトグラフィーが、ＨＩＣの後に実施される。
【００８２】
したがって、第１の態様において、本発明は、第１のポリペプチドコンジュゲートを含む組成物を製造する方法を提供し、第１のポリペプチドコンジュゲートは、第１のポリペプチドに共有結合した第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む。この方法は、（ａ）第１のポリペプチドコンジュゲートを含有する混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および（ｂ）第１のポリペプチドコンジュゲートをＨＩＣ媒体から溶出させることを含む。この方法は、（ｃ）第１のポリペプチドコンジュゲートをアニオン交換クロマトグラフィー媒体または混合様式クロマトグラフィー媒体から溶出させることをさらに含む。一実施形態において、ステップ（ｃ）はステップ（ａ）の前に実施される。別の実施形態において、ステップ（ｃ）はステップ（ｂ）の後に実施される。この方法は、（ｄ）第１のポリペプチドコンジュゲートをカチオン交換クロマトグラフィー媒体から溶出させることをさらに含み得る。一実施形態において、ステップ（ｄ）はステップ（ａ）の前に実施される。別の実施形態において、ステップ（ｄ）はステップ（ｂ）の後に実施される。
【００８３】
この態様による一実施形態において、混合物は、追加のポリペプチドコンジュゲートを含み、そこから第１のポリペプチドコンジュゲートが単離される。例示的な実施形態において、混合物は、第２のポリペプチドに共有結合した第２の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を有する第２のポリペプチドコンジュゲートを含む。一例において、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは、同一のアミノ酸配列を有する。別の例において、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する。一例において、第１の数と第２の数は異なっており、このことは、第１のポリペプチドコンジュゲートと第２のポリペプチドコンジュゲートが、各ポリペプチドに結合しているポリ（アルキレンオキシド）部分の数によって識別されることを意味する。例えば、第１のポリペプチドコンジュゲートは３つのポリ（アルキレンオキシド）部分を含み、一方、第２のポリペプチドコンジュゲートは０、１、２、または４つのポリ（アルキレンオキシド）部分を含む。特定の例において、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは同一のアミノ酸配列を有し、第１のポリペプチドコンジュゲートと第２のポリペプチドコンジュゲートは異なる数のポリ（アルキレンオキシド）部分（第１の数と第２の数が異なる）によって識別される。
【００８４】
上記のいずれかの実施形態による一例において、本発明の方法は、第１のポリペプチドコンジュゲートを含む組成物を提供するのに有用であり、この組成物中の第２のポリペプチドコンジュゲートの濃度は、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満であり、好ましくは、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満である。他の実施形態において、混合物は、第１のポリペプチドコンジュゲートの２つ以上のグリコフォームを含み、この方法は、第１のポリペプチドコンジュゲートと異なる構造を有する全てのグリコフォームの合わせた濃度が約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満であり、好ましくは、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満である組成物を提供する。
【００８５】
任意の上記実施形態による一例において、第１のポリペプチドはグリコペプチドであり、第１のポリペプチドに共有結合した少なくとも１つのグリカン残基を含む第１のグリコシル化パターンを含む。各グリカン残基は、ポリ（アルキレンオキシド）部分などの少なくとも１つのポリマー修飾基に結合することができる。上記実施形態による他の例において、第１のポリペプチドは第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含み、それらの各々は、Ｎ−結合グリカンまたはＯ−結合グリカンを介して第１のポリペプチドに共有結合している。
【００８６】
さらに他の実施形態において、本発明の方法は、同数の修飾基を含み得るが異なるグリコシル化パターンを有する２つのポリペプチドグリコフォームを分離するのに有用である。したがって、一例において、第１のポリペプチドが単離される混合物は、第３の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む第３のポリペプチドコンジュゲートを含む。一例において、第３のポリペプチドコンジュゲートと第１のポリペプチドコンジュゲートは同数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含むが、第３のポリペプチドは、少なくとも１つのグリコシル部分が第１のポリペプチドコンジュゲートのグリコシル化パターンと異なるグリコシル化パターンを有する。例えば、第３のポリペプチドコンジュゲートは、第１のポリペプチドコンジュゲートに存在しないグリカン残基を含む。例示的な実施形態において、第３のポリペプチドはＯ−結合グリカンを含むが、第１のポリペプチドはＮ−結合グリカンのみを含む（例えば、図３Ｂ、トリ−ＰＥＧ化ＥＰＯ構造を参照）。別の例示的実施形態において、第３のポリペプチドは切断型グリカン残基を含むが、第１のポリペプチドコンジュゲートの対応するグリカン残基は完全形である（すなわち、より多数のグリコシル部分を含む）。
【００８７】
第２の態様において本発明は、第１のポリペプチドに共有結合した第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む第１のポリペプチドコンジュゲートを、第２のポリペプチドに共有結合した第２の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む第２のポリペプチドコンジュゲートから単離する方法を提供する。この方法は、（ａ）第１のポリペプチドコンジュゲートおよび第２のポリペプチドコンジュゲートを含有する混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および（ｂ）第１のポリペプチドコンジュゲートを前記疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から溶出させることを含む。この方法は、（ｃ）第１のポリペプチドコンジュゲートを、アニオン交換クロマトグラフィー媒体から溶出させることをさらに含み得る。一実施形態において、ステップ（ｃ）はステップ（ａ）の前に実施される。別の実施形態において、ステップ（ｃ）はステップ（ｂ）の後に実施される。この方法は、（ｄ）第１のポリペプチドコンジュゲートをカチオン交換クロマトグラフィー媒体から溶出させることをさらに含み得る。一実施形態において、ステップ（ｄ）はステップ（ａ）の前に実施される。別の実施形態において、ステップ（ｄ）はステップ（ｂ）の後に実施される。
【００８８】
上記のいずれかの実施形態による一例において、第１のポリペプチドに結合した第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分は、１から約４０より選択される。別の例において、第１の数は１から約３０より選択される。さらに別の例において、第１の数は１から約２０より選択される。さらなる例において、第１の数は１、２、３、４、５、６、７、８、９、および約１０から選択される。別の例において、第１のポリペプチドコンジュゲートは、正確に３つのポリ（アルキレンオキシド）部分を含む。
【００８９】
上記のいずれかの実施形態による一例において、第２のポリペプチドに結合した第２の数のポリ（アルキレンオキシド）部分は、０から約４０より選択される。別の例において、第２の数は０から約３０より選択される。さらに別の例において、第２の数は０から約２０より選択される。さらなる例において、第２の数は０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および約１０から選択される。別の例において、第１の数と第２の数は異なる。例えば、第１のポリペプチドコンジュゲートは、３つのポリ（アルキレンオキシド）部分を含み、一方、第２のポリペプチドコンジュゲートは、０、１、２または４つのポリ（アルキレンオキシド）部分を含む。ポリ（アルキレンオキシド）部分に結合していないポリペプチド（第２の数＝０）は、未反応のポリペプチドであり、それが他の修飾基を含有しない限り、技術的にはコンジュゲートではないことが当業者には理解されよう。
【００９０】
上記のいずれかの実施形態による一例において、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは同一のアミノ酸配列を有する。上記任意の実施形態による別の例において、第１のポリペプチドは治療用ポリペプチドである。例示的な治療用ポリペプチドは本明細書下記にある。上記任意の実施形態によるさらに別の例において、第１のポリペプチドはＥＰＯである。上記任意の実施形態による別の例において、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは双方ともＥＰＯである。さらに別の例において、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドは双方ともＥＰＯである。
【００９１】
本発明の一実施形態において、第１のポリペプチドコンジュゲートは、酵素触媒のグリコ修飾反応によって形成され、反応中に、修飾グリコシル部分［例えば、少なくとも１つのポリ（アルキレンオキシド）部分によって修飾されたグリコシル部分］は、第１のポリペプチドに共有結合する。したがって、上記任意の実施形態による一例において、本発明の方法は、修飾グリコシルドナー種が基質である酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ）の存在下、この酵素が、ポリマー（例えば、ポリ（アルキレンオキシド）部分）に結合しているグリコシル部分と第１のポリペプチドの間の共有結合の形成を触媒するのに十分な条件下で、第１のポリペプチドを、ポリマーに共有結合したグリコシル部分を有する修飾グリコシルドナー種（例えば、修飾糖ヌクレオチド）と接触させることをさらに含み得る。一例において、修飾グリコシル部分はシアル酸（ＳＡ）部分である。一例において、この酵素はシアリルトランスフェラーゼである。別の例において、ポリマーはＰＥＧ（例えば、ｍ−ＰＥＧ）である。グリコＰＥＧ化法は、当技術分野で認識されており、例えば、ＤｅＦｒｅｅｓらに対する国際公開第０３／０３１４６４号、または国際公開第０４／９９２３１号を参照されたい。これらの開示は参照として、本明細書にそれらの全体が援用されている。
【００９２】
上記のいずれかの実施形態による一例において、本発明の方法は、昆虫細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）または真菌細胞（例えば、酵母細胞）などの宿主細胞中で第１のポリペプチドを組換え発現させることをさらに含み得る。一例において、第１のポリペプチドは昆虫細胞系（例えば、ヨトウガ細胞、例えば、Ｓｆ９）中で発現させる。
【００９３】
第１のポリペプチドをさらに修飾して（例えば、グリカン再構築により）、実質的に一定の（例えば、昆虫特異的な）グリコシル化パターンを含ませることができる。ペプチドのグリコシル化パターンは、酵素を利用する方法によって、合成、削除または修飾することができる。糖のドナーを受容体に転移する酵素を利用してペプチドを再構築する方法は、Ｄｅ  Ｆｒｅｅｓらに対する国際公開第０３／０３１４６４号（２００３年４月１７日公開）；米国特許出願第２００４０１３７５５７号（２００２年１１月５日出願）；米国特許出願第２００５０１４３２９２号（２００４年１１月２４日出願）および国際公開第０５／０５１３２７号（２００４年１１月２４日出願）に詳細に考察されており、これらの各々は参照として、本明細書にその全体が援用されている。
【００９４】
したがって、一実施形態において本発明の方法は、グリコシルドナー分子（例えば、ヌクレオチド糖）が基質である酵素の存在下、この酵素が、グリコシルドナー分子のグリコシル部分と第１のポリペプチドの間の共有結合を形成するのに十分な条件下で、第１のポリペプチドをグリコシルドナー分子と接触させることさらに含み得る。この反応において基質として用いられるポリペプチドは、グリコシル化されていてもよく、グリコシル化されていなくてもよい。この酵素は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、Ｇａｌトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼであり得る。
【００９５】
したがって、一例において、本発明の方法は、第１のグリコシル化または非グリコシル化ポリペプチドを、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴ１またはＧｎＴ２）またはＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの存在下、それぞれ、ヌクレオチド−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）分子またはヌクレオチド−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）分子と接触させることを含む。反応混合物は、ヌクレオチドガラクトース（Ｇａｌ）分子、およびガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧａｌＴ１）をさらに含み得る。Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼが、末端−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ部分または−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ部分を有する少なくとも１つのグリカン残基を有する第１のグリコシル化ポリペプチドを形成するのに十分な条件下で、反応混合物の成分を接触させる（例えば、単一の反応容器で、または連続的に）。そのグリカン残基は、新たに付加された−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌまたは−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ部分に関して、モノアンテナ(mono-antennary)であることが好ましい。一実施形態において、−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ部分が、トリマンノシルモチーフの一部であるマンノース残基に付加される。別の実施形態において、−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ部分が、第１のポリペプチドのセリン残基またはスレオニン残基に付加される。
【００９６】
第３の態様において本発明は、第１のＥＰＯコンジュゲートを含有する組成物を製造する方法を提供し、第１のエリスロポエチン（ＥＰＯ）コンジュゲートは、ＥＰＯポリペプチドに共有結合した第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む。この方法は、（ａ）第１のＥＰＯコンジュゲートを含有する混合物をアニオン交換媒体と接触させること；（ｂ）第１のＥＰＯコンジュゲートをアニオン交換媒体から溶出させて、第１のＥＰＯコンジュゲートを含む第１の溶出液を形成すること；（ｃ）第１の溶出液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および（ｄ）第１のＥＰＯコンジュゲートを疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から溶出させることを含む。この方法は、（ｅ）カチオン交換クロマトグラフィー媒体から第１のＥＰＯコンジュゲートを溶出させることをさらに含み得る。一例において、ステップ（ｅ）はステップ（ｄ）の後に実施される。別の例において、ステップ（ｅ）はステップ（ｃ）の前に実施される。この方法は、１つまたは複数の希釈ステップまたはダイアフィルトレーション(diafiltration)ステップをさらに含み得る。一例において、ダイアフィルトレーションは、次の方法ステップのためのサンプルを調整する目的で、緩衝液を濃縮および／または交換するために用いられる。例えば、カチオン交換クロマトグラフィーのためのサンプルを調製する目的で、ＨＩＣステップからの溶出液を濃縮し、新たな緩衝液系にダイアフィルトレートする。
【００９７】
この態様による一実施形態において、混合物は追加のＥＰＯコンジュゲートを含み、混合物から第１のＥＰＯコンジュゲートが単離される。例示的な実施形態において混合物は、ＥＰＯポリペプチドに共有結合した第２の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を有する第２のＥＰＯコンジュゲートを含む。一実施形態において、第１の数と第２の数は異なっており、このことは、第１のＥＰＯコンジュゲートと第２のＥＰＯコンジュゲートは、各ＥＰＯポリペプチドに結合しているポリ（アルキレンオキシド）部分の数によって識別されるグリコフォームであることを意味する。例えば、第１のＥＰＯコンジュゲートは３つのポリ（アルキレンオキシド）部分を含み、第２のＥＰＯコンジュゲートは、０、１、２または４つのポリ（アルキレンオキシド）部分を含み得る。一例において、この方法は、第１のＥＰＯコンジュゲートを含む組成物を提供するのに有用であり、この組成物中の第２のＥＰＯコンジュゲートの濃度は、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満であり、好ましくは、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満である。別の実施形態において、混合物は第１のＥＰＯコンジュゲートの２つ以上のグリコフォームを含み、方法は、第１のＥＰＯコンジュゲートの構造とは異なる構造を有する全てのグリコフォームの合わせた濃度が約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満であり、好ましくは、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満である組成物を提供する。
【００９８】
上記実施形態のいずれかと関連させた有用で例示的なＥＰＯ配列は、配列番号１で表され、これは少なくとも１つの変異（例えば、Ａｒｇ１３９からＡｌａ１３９へ、Ａｒｇ１４３からＡｌａ１４３へ、およびＬｙｓ１５４からＡｌａ１５４へ）を含み得る。別の例示的な実施形態において、本発明のＥＰＯコンジュゲートは、少なくとも１つのＮ−結合グリカン残基を含み得る。一例において、Ｎ−結合グリカン残基は、配列番号１のＡｓｎ２４、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３から選択されるアミノ酸残基に共有結合している。ＥＰＯコンジュゲートはさらに、Ｏ−結合グリカン残基を含み得る。一例において、Ｏ−結合グリカン残基は、配列番号１のセリン（例えば、Ｓｅｒ１２６）残基に共有結合している。上記グリカン残基のいずれも、ポリ（アルキレンオキシド）部分に場合によって結合することができる。上記実施形態のいずれかによる一例において、ＥＰＯは、３つのポリ（アルキレンオキシド）部分（例えば、３つのＰＥＧ部分）に共有結合している。上記実施形態のいずれかによる別の例において、ＥＰＯは、３つのポリ（アルキレンオキシド）部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合しており、それら３つのポリ（アルキレンオキシド）部分の少なくとも２つは、Ｎ−結合グリカンを介してＥＰＯポリペプチドに共有結合している。一例において、少なくとも１つのＮ−結合グリカンはモノアンテナである。別の例において、３つ全てのＮ−結合グリカンがモノアンテナである（例えば、図３Ａに示されるように）。例示的なトリ−ＰＥＧ化ＥＰＯコンジュゲートは、図３Ｂに示されている。
【００９９】
一実施形態において、修飾グリコシル部分（例えば、少なくとも１つのポリ（アルキレンオキシド）部分によって修飾されたグリコシル部分）がＥＰＯポリペプチドに接続される酵素触媒グリコ修飾反応によって、ＥＰＯコンジュゲートが形成される。したがって、上記実施形態のいずれかによる一例において、本発明の方法は、修飾グリコシルドナー種（例えば、修飾糖ヌクレオチド）が基質である酵素（例えばグリコシルトランスフェラーゼ）の存在下、この酵素がポリマー（例えば、ポリ（アルキレンオキシド）部分）に結合しているグリコシル部分とＥＰＯポリペプチドの間の共有結合の形成を触媒するのに十分な条件下で、ＥＰＯポリペプチドを、ポリマーに共有結合したグリコシル部分を有する修飾グリコシルドナー種と接触させることをさらに含み得る。一例において、修飾グリコシル部分はシアル酸（ＳＡ）部分である。別の例において、この酵素はシアリルトランスフェラーゼである。この方法は、細菌（例えば、大腸菌）、昆虫細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ）細胞または真菌細胞などの宿主細胞中でＥＰＯポリペプチドを組換え発現させることをさらに含み得る。一例において、ＥＰＯポリペプチドは、昆虫細胞系（例えば、Ｓｆ９）中で発現させ、例えば、Ｋａｎｇらに対する国際公開第０６／１０５４２６号に概説されている方法に従って、昆虫細胞培養物から場合によって精製される。
【０１００】
ＥＰＯペプチドは、実質的に一定の（例えば、昆虫特異的な）グリコシル化パターンを含むように、グリカンリモデルリングによってさらに修飾できる。したがって、一実施形態において、本発明の方法は、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴ１またはＧｎＴ２）およびガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧａｌＴ１）の存在下、前記Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよび前記ガラクトシルトランスフェラーゼが、末端−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ部分を有する少なくとも１つのグリカン残基を有するグリコシル化ＥＰＯポリペプチドを形成するのに十分な条件下、グリコシル化ＥＰＯポリペプチドをヌクレオチド−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）分子およびヌクレオチドガラクトース（Ｇａｌ）分子と接触させること（例えば、単一の反応容器内で）をさらに含み得る。前記グリカン残基は、新たに付加された−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ部分に関して、モノアンテナであることが好ましい。一実施形態において、−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ部分は、トリマンノシルモチーフの一部であるマンノース残基に付加される。
【０１０１】
上記実施形態のいずれかによる一例において、各ポリ（アルキレンオキシド）部分は、ポリ（エチレングリコール）（例えば、ｍ−ＰＥＧ）およびポリ（プロピレングリコール）（例えば、ｍ−ＰＰＧ）から独立して選択されるメンバーである。例示的なポリ（エチレングリコール）部分は、本明細書下記にある。上記実施形態のいずれかによる別の例において、各ポリ（アルキレンオキシド）部分は、約１ｋＤａから約２００ｋＤａの間の独立して選択される分子量を有する。ポリ（アルキレンオキシド）部分に関するさらなる分子量範囲は、本明細書下記に示されている。
【０１０２】
上記実施形態のいずれかによる一例において、第１のポリペプチドコンジュゲートは、グリコシル結合基を介して第１のポリペプチドに共有結合している少なくとも１つのポリ（アルキレンオキシド）部分を含む。一例において、グリコシル結合基は、前記第１のポリペプチドのアミノ酸残基に共有結合している。別の例において、グリコシル結合基は、第１のポリペプチドのグリコシル部分に共有結合している。さらに別の例において、グリコシル結合基は、完全形のグリコシル結合基である。例示的なグリコシル結合基は、本明細書、および、例えば、ＤｅＦｒｅｅｓらに対する国際公開第０３／０３１４６４号、国際公開第０４／９９２３１号、および２００７年７月２３日出願のＰＣＴ／ＵＳ０７／７４１３９に記載されており、これらの開示は、参照として本明細書にそれらの全体が援用されている。例示的な完全形のグリコシル結合基としては、シアル酸部分、ＧｌｃＮＨ部分およびＧｌｃＮＡｃ部分、ならびにＧａｌ部分、ＧａｌＮＨ部分およびＧａｌＮＡｃ部分が挙げられる。
【０１０３】
上記実施形態のいずれかにおいて有用な例示的なＨＩＣ媒体としては、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ（例えば、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ）などのブチル樹脂およびフェニル樹脂が挙げられる。疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび好適なＨＩＣ媒体は、本明細書下記に、および、例えば、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、Ｅｄ．Ｓｈｕｋｌａ  ＡＡ、Ｅｔｚｅｌ  ＭＲ、Ｇａｄａｍ  Ｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ（２００７）、１９７〜２０６頁に記載されており、この開示は参照として、本明細書に援用されている。
【０１０４】
本発明の方法が種々多様なポリペプチドに基づいたポリペプチドコンジュゲートに関して実施できることを、当業者は認識すれるであろう。この方法は特定のポリペプチドに限定されない。したがって、本発明の上記実施形態のいずれかを、下記のポリペプチドコンジュゲートのいずれかによって実施することができる。
【０１０５】
Ｉ．ａ）ポリペプチドコンジュゲート
本発明の方法によって単離されたポリペプチドコンジュゲートは、ポリペプチドおよびポリペプチドに（例えば、グリコシル結合基を介して）共有結合した少なくとも１つの修飾基を含む。例示的なポリペプチドコンジュゲートは、本明細書下記に、および、例えば、ＤｅＦｒｅｅｓらに対する国際公開第０３／０３１４６４号、ＤｅＦｒｅｅｓらに対する国際公開第０４／９９２３１号、およびＤｅＦｒｅｅｓらに対する国際公開第０４／３３６５１号に考察されており、これらの開示は参照として、それらの全体が本明細書に援用されている。
【０１０６】
ポリペプチド
本発明のポリペプチドコンジュゲートの一部であるポリペプチドは、任意のグリコシル化または非グリコシル化ポリペプチドであり得る。一実施形態において、ポリペプチドは組換えポリペプチドである。この実施形態による一例において、ポリペプチドは、細菌細胞（例えば、大腸菌）、昆虫細胞（例えば、ヨトウガ細胞）、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）および細菌細胞（大腸菌細胞）から選択される宿主細胞中で発現させる。昆虫細胞系におけるポリペプチドの発現方法は、本明細書下記に考察されている。別の実施形態において、ポリペプチドは、化学的に合成され、非天然アミノ酸を場合によって含む。
【０１０７】
ポリペプチドは任意の数のアミノ酸を有し得る。一実施形態において、ペプチドまたはグリコペプチドは、約５ｋＤａから約５００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態において、ペプチドまたはグリコペプチドは、約１０ｋＤａから約１００ｋＤａの分子量を有する。さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、約１０ｋＤａから約３０ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態において、ポリペプチドは、約２０ｋＤａから約２５ｋＤａの分子量を有する。
【０１０８】
例示的なポリペプチドとしては、野生型ポリペプチドおよびそれらの断片ならびに天然対応物から（例えば、変異または切断により）修飾されているポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドはまた、融合タンパク質であり得る。例示的な融合タンパク質としては、ポリペプチドが蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、治療用ポリペプチド、抗体、受容体リガンド、タンパク様毒素、ＭＢＰ、Ｈｉｓタグなどに融合しているものが挙げられる。
【０１０９】
一実施形態において、ポリペプチドは、現在、医薬品として用いられているものなどの治療用ポリペプチド（すなわち、承認済み薬剤）である。ポリペプチドの非限定的選択は、本明細書に参照として援用されている、２００６年６月８日出願の米国特許出願第１０／５５２，８９６号の図２８に示されている。
【０１１０】
例示的なポリペプチドとしては、線維芽成長因子などの成長因子（例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２およびＦＧＦ−２３）、血液凝集因子（例えば、因子Ｖ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、Ｂ−ドメイン欠失因子ＶＩＩＩ、部分的Ｂ−ドメイン欠失因子ＶＩＩＩ、ｖＷＦ因子ＶＩＩＩ融合（例えば、完全長またはＢ−ドメイン欠失因子ＶＩＩＩと）、因子ＩＸ、因子Ｘおよび因子ＸＩＩＩ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）などのホルモン、ならびにインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２）およびインターフェロン（例えば、ＩＮＦ−アルファ、ＩＮＦ−ベータ、ＩＮＦ−ガンマ）などのサイトカインが挙げられる。
【０１１１】
他の例示的なポリペプチドとしては、グルコセレブロシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ（例えば、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（商標））、酸性アルファ−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（例えば、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（商標））、チロイドペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ベータ−グルコシダーゼ（例えば、米国特許出願第１０／４１１，０４４号に記載の酵素を参照）、およびアルファ−ガラクトシダーゼＡ（例えば、米国特許第７，１２５，８４３号に記載の酵素を参照）などの酵素が挙げられる。
【０１１２】
他の例示的な親ポリペプチドとしては、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン類（例えば、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５）、エリスロポエチン類（ＥＰＯ）、成長分化因子（例えば、ＧＤＦ−５）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、ｖＷＦプロテアーゼ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、α１−アンチトリプシン（ＡＴＴ、またはα−１プロテアーゼ阻害因子）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ヒルジン、レプチン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮａｓｅ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ−２、グルカゴン様ペプチド（例えば、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２）、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）、プロキネチシン、ＣＤ４、α−ＣＤ２０、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、Ｐ−セレクチン糖タンパクリガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質およびエクステンジン−４が挙げられる。上記に掲げたポリペプチドの幾つかに関する例示的なアミノ酸配列は、米国特許第７，２１４，６６０号に記載されており、それらは全て参照として、本明細書に援用されている。
【０１１３】
例示的な実施形態において、ポリペプチドは、下記に示されているアミノ酸配列（配列番号１）を含むＥＰＯである。
【０１１４】
【化１】
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【０１１５】
抗体であるポリペプチドも本発明の範囲内にある。抗体という用語には、抗体断片（例えば、Ｆｃドメイン）、一本鎖抗体、Ｌａｍａ抗体、ナノ体などが含まれることが意図されている。またこの用語には、Ｉｇキメラなどの抗体融合タンパク質も含まれる。好ましい抗体としては、ヒト化、モノクローナル抗体またはそれらの断片が挙げられる。このような抗体の全ての既知アイソタイプが本発明の範囲内にある。例示的な抗体としては、内皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（例えば、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標））などのＶＥＧＦ−Ａに対するモノクローナル抗体）およびＦＧＦ−７、ＦＧＦ−２１およびＦＧＦ−２３などの線維芽成長因子などの成長因子に対する抗体およびそれらそれぞれの受容体に対する抗体が挙げられる。他の例示的な抗体としては、抗ＴＮＦ−アルファモノクローナル抗体（例えば、米国特許出願第１０／４１１，０４３号を参照）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質（例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（商標））、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質Ｆに対するモノクローナル抗体（例えば、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標））、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））、ＩＩｂ／ＩＩＩａなどの糖タンパク質に対するモノクローナル抗体（例えば、Ｒｅｏｐｒｏ（商標））、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標））、ＣＤ４およびアルファ−ＣＤ３に対するモノクローナル抗体、ＰＳＧＬ−１およびＣＥＡに対するモノクローナル抗体が挙げられる。上記に掲げたポリペプチドのいずれかの任意の修飾（例えば、変異）型もまた本発明の範囲内にある。
【０１１６】
昆虫細胞中で発現させたポリペプチド
一実施形態において、ポリペプチドは昆虫細胞中で発現させる。本発明における使用に好適な昆虫細胞は、組換えウイルス（例えば、バキュロウイルス）または野生型ウイルスに対して宿主になることができ、本発明の媒体組成物中、増殖しウイルスに感染した際に組換えペプチド生成物を産生できる、昆虫綱の任意の目からのものである。例示的な実施形態において、細胞は、双翅目または鱗翅目からのものである。実質的に一定の、昆虫特異的なグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生するために使用できる昆虫細胞系が好ましい。一実施形態において、ポリペプチドは安定にトランスフェクトされた細胞によって発現させる。
【０１１７】
約３００の昆虫種が核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）疾患に罹っていることが報告されており、その大部分（２４３）は、鱗翅目から単離されている（例えば、Ｇｒａｎａｄｏｓら（編）、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓにおけるＷｅｉｓｓら、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ：第ＩＩ巻、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、６３〜８７頁、６４頁（１９８６）を参照）。以下の昆虫由来の昆虫細胞系が例示的である：カルポカプサ・ポモネラ（Carpocapsa pomonella）（細胞系は好ましくはＣＰ−１２８）；イラクサギンウワバ（細胞系は好ましくはＴＮ−３６８）；オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）；ヨトウガ（細胞系は好ましくはＳｆ９）；マイマイガ；ヨトウガ；ヒトスジシマカ；オルギイア・シュードツガタ（Orgyia pseudotsugata）；マツノキハバチ；ネッタイシマカ；ヤママユガ；グノリモスキーマ・オペルクレラ（Gnorimoschema opercullela）；ハチノスツヅリガ；ヤガガ；キイロショウジョウバエ；タバコガ；シロイチモジヨトウ；ラキプルシア・オウ（Rachiplusia ou）；ノシメマダラメイガ；アムサクタ・ムーレイ（Amsacta moorei）；アグロチス・ｃ−ニトラム（Agrotis c-nitrum）；リンゴコカクモンハマキ；カブラヤガ；カイコ；ヒポノメウタマリネラス；オオアメリカモンキチョウ；アンチカルシア・ゲンメタリス（Anticarsia gemmetalis）；アパンテレスメラノスケレス；ヒトリガ；およびマイマイガ。
【０１１８】
例示的な実施形態において、昆虫細胞は、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)からのものであり、別の例示的な実施形態において、細胞系はＳｆ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）である。Ｓｆ９、Ｓｆ２１、およびＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ昆虫細胞が、バキュロウイルス発現に一般に用いられる。Ｓｆ９およびＳｆ２１は、ヨトウガからの卵巣細胞系である。Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞は、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)からの卵細胞である。Ｓｆ９、Ｓｆ２１、およびＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞系は、室温（例えば、２５℃から２７℃）で増殖でき、ＣＯ２インキュベーターを必要としない。それらの倍加時間は約１８時間から２４時間の間である。本発明のペプチドおよびグリコペプチドを産生させるために培養される昆虫細胞系は、ピコルナウイルス、パルボウイルス、昆虫ポックスウイルス、バキュロウイルスおよびラブドウイルスなどの多数の昆虫病原性ウイルスの増殖に好適なものであることが好ましい。例示的実施形態において、バキュロウイルス群からの核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）および顆粒病ウイルス（ＧＶ）が好ましい。
【０１１９】
バキュロウイルスは、一般に包埋体（多角体とも称される）に包埋されている桿状ウイルス粒子を特徴とする。バキュロウイルス科は、２つの亜科：包埋ウイルスの２つの属；核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）および顆粒病ウイルス（ＧＶ）を含む真正バキュロウイルス、ならびに非包埋ウイルスを含むヌードバキュロウイルス亜科に分けることができる。
【０１２０】
ウイルス発現系を調製し使用する方法は、当技術分野に一般に知られている。例えば、バキュロウイルス系に関して代表的な文献として、米国特許第５，１９４，３７６号、米国特許第５，１４７，７８８号、米国特許第４，８７９，２３６号、ならびにＢｅｄａｒｄ  Ｃ．ら（１９９４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：１２９〜１３８頁；Ｈｉｎｋ  ＷＴら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ７：９〜１４頁；Ｌｉｃａｒｉ  Ｐ．ら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３９：６１４〜６１８頁が挙げられ、これらの各々は参照として、その全体が本明細書に援用されている。バキュロウイルス発現ベクター内への所望の核酸の組込みは、当技術分野に周知の技法を用いて達成することができる。例えば、このような技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（第３版、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）に記載されている。
【０１２１】
一実施形態において、任意の好適な発現系で発現させたポリペプチドは、ポリペプチドが修飾基によって修飾される前に、細胞培養物から単離される。一例において、ポリペプチドを先ず、細胞培養培地、細胞残屑および他の粒子から取り出してからさらに、種々の濾過およびクロマトグラフィーの精製デバイスを用いて、ウイルス粒子および不要のタンパク質などの不純物を除去するために精製する。ポリペプチドの精製法は、知られている。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、編集者Ｈａｒｒｉｓ  ＥＬＶ、Ａｎｇａｌ  Ｓ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、英国（１９８９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、編集者Ｊａｎｓｏｎ  ＪＣ、Ｒｙｄｅｎ  Ｌ、ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、独国（１９８９）、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃｌｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、編集者Ｓｈｕｋｌａ  ＡＡ、Ｅｔｚｅｌ  ＭＲ、Ｇａｄａｍ  Ｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ（２００７）、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｓｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（第２版１９９８年）、編集者Ｊａｎｓｏｎ  Ｊ−ＣおよびＲｙｄｅｎ  Ｌを参照されたい。昆虫細胞中で発現させたポリペプチドを単離するための例示的な方法は、Ｋａｎｇらに対する国際公開第０６／１０５４２６号にも開示されている。
【０１２２】
修飾基
本発明の修飾基は、任意の化学的部分であり得る。例示的な修飾基は、下記に考察されている。
【０１２３】
ポリマー修飾基
一実施形態において、修飾基は、線状または分枝状のポリマー修飾基（ポリマー）である。ポリマー修飾基は、少なくとも１つのポリマー部分を含み、各ポリマー部分は独立して選択される。別の実施形態において、ポリマー修飾基は水溶性である。水溶性ポリマー修飾基は、少なくとも１つの極性基を含む。例示的な極性基としては、ポリエーテル基、ヒドロキシル基およびカルボン酸基が挙げられる。
【０１２４】
多くの水溶性ポリマーが当業者に知られており、本発明の実施において有用である。用語、水溶性ポリマーには、糖（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン類、ヘパリン類など）；ポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アルキレンオキシド）、ペプチド、タンパク質などの化学種が包含される。好ましい実施形態において、ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）またはポリプロピレングリコールなどのポリ（アルキレンオキシド）である。
【０１２５】
一例において、水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ縁体、例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）（ｍ−ＰＥＧ）である。別の例において、水溶性ポリマーはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、例えば、メトキシ−ポリプロピレングリコール（ｍ−ＰＰＧ）である。ＰＥＧは、治療用タンパク質などのポリペプチドの性質を修飾するためにしばしば用いられる。例えば、治療用グリコペプチドのインビボ半減期をＰＥＧ部分によって延長させることができる。ＰＥＧによるポリペプチドの化学修飾（ＰＥＧ化）により、それらの分子サイズが増大し、一般に、表面と官能基の接近容易性が減少するが、これらの各々は、ポリペプチドに接続したＰＥＧ部分の数およびサイズに依存する。この修飾によって、血漿中半減期およびタンパク質分解への安定性の改善、ならびに免疫原性および肝臓による取込みの減少がもたらされる（Ｃｈａｆｆｅｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１６４３〜１６５１頁（１９９２）；Ｐｙａｔａｋら、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：１１３〜１２７頁（１９８０））。例えば、インターロイキン−２のＰＥＧ化は、そのインビボでの抗腫瘍効力を増大させることが報告されており（Ｋａｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ.８４：１４８７〜１４９１頁（１９８７））モノクローナル抗体Ａ７由来のＦ（ａｂ’）２のＰＥＧ化は、その腫瘍局在化を改善した（Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ.２８：１３８７〜１３９４頁（１９９０））。このように、別の実施形態において、本発明の方法によってＰＥＧ部分により誘導体化したポリペプチドのインビボ半減期は、非誘導体化親ポリペプチドのインビボ半減期に比較して増加する。
【０１２６】
ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）は、いずれか特定の形態または分子量範囲に限定されない。これらの修飾基のサイズは、例えば、それらが接続しているポリペプチドの性質およびサイズならびに修飾ポリペプチドに関する所望の性質に依存し得る。非分枝状ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）分子に関する分子量は、約０．５ｋＤａから約５００ｋＤａの間であることが好ましい。分枝状ポリマーは、５００ｋＤａ超の大きさであり得る。一実施形態において、分枝状ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）は、約０．５ｋＤａから約１０００ｋＤａの分子量を有する。
【０１２７】
例示的な実施形態において、本発明に用いられるＰＥＧまたはＰＰＧ分子（分枝状または非分枝状）は、約０．５ｋＤａ、１ｋＤａ、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約ｋ１５Ｄａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約５５ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約６５ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約７５ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約８５ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約９５ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１０５ｋＤａ、約１１０ｋＤａ、約１１５ｋＤａ、約１２０ｋＤａ、約１２５ｋＤａ、約１３０ｋＤａ、約１３５ｋＤａ、約１４０ｋＤａ、約１４５ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約１５５ｋＤａ、約１６０ｋＤａ、約１６５ｋＤａ、約１７０ｋＤａ、約１７５ｋＤａ、約１８０ｋＤａ、約１８５ｋＤａ、約１９０ｋＤａ、約１９５ｋＤａおよび約４００ｋＤａから選択される分子量を有する。
【０１２８】
一実施形態において、ポリペプチドはＥＰＯである。別の実施形態において、ＥＰＯペプチドは、それに共有結合した少なくとも２つ、好ましくは３つのポリ（エチレングリコール）部分を有する。この実施形態による一例において、ＥＰＯペプチドに共有結合した各ＰＥＧ分子は、約２ｋＤａから約８０ｋＤａ、好ましくは、約５ｋＤａから約６０ｋＤａ、より好ましくは、約１０ｋＤａから約４０ｋＤａの分子量を有する。
【０１２９】
例示的な水溶性ポリマーは、ポリマーのサンプル中のかなりの割合のポリマー分子が、ほぼ同一の分子量を有するものであり、このようなポリマーは「ホモ分散」である。
【０１３０】
ＰＥＧ部分を含むポリマーの以下の考察は、説明を明確にするためのものである。以下の節、および例示的なポリマーとしてＰＥＧを用いる記載された種々のモチーフにおいて中心となるものは、ＰＥＧ以外のポリマー（例えば、別のポリ（アルキレンオキシド））が利用される化学種にも等しく適用できることを、当業者は認識するであろう。
【０１３１】
本発明に用いられる例示的なポリ（エチレングリコール）分子としては、限定はしないが、式：
【０１３２】
【化２】
2010505874.tif 000003
を有するものであり、式中、Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、例えば、アセタール、ＯＨＣ−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｑ−、ＨＳ−（ＣＨ２）ｑ、または−（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ）Ｚ１である。添字「ｅ」は、１から２５００の整数を表す。添字ｂ、ｄ、およびｑは独立して、０から２０の整数を表す。記号ＺおよびＺ１は独立して、ＯＨ、ＮＨ２、脱離基、例えば、イミダゾール、ｐ−ニトロフェニル、ＨＯＢＴ、テトラゾール、ハライド、Ｓ−Ｒ９、活性化エステルのアルコール部分；−（ＣＨ２）ｐＣ（Ｙ１）Ｖ、または−（ＣＨ２）ｐＵ（ＣＨ２）ＳＣ（Ｙ１）Ｖを表す。記号Ｙは、Ｈ（２）、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ１０を表す。記号Ｘ、Ｙ、Ｙ１、Ａ１、およびＵは独立して、部分Ｏ、Ｓ、Ｎ−Ｒ１１を表す。記号Ｖは、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ１２、活性化エステルのアルコール部分、活性化アミドのアミン部分、糖ヌクレオチド、およびタンパク質を表す。添字ｐ、ｑ、ｓおよびｖは、０から２０の整数より独立して選択されるメンバーである。記号Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキルおよび置換または非置換ヘテロアリールを表す。
【０１３３】
本発明のコンジュゲートの形成に有用なポリ（エチレングリコール）は、線状または分枝状のいずれかである。本発明における使用に好適な分枝状ポリ（エチレングリコール）分子としては、限定はしないが、以下の式：
【０１３４】
【化３】
2010505874.tif 000004
によって記述されるものであり、式中、Ｒ８およびＲ８’は、上記Ｒ８に関して定義された基から独立して選択されるメンバーである。Ａ１およびＡ２は、上記Ａ１に関して定義された基から独立して選択されるメンバーである。添字ｅ、ｆ、ｏ、およびｑは上記のとおりである。ＺおよびＹは上記のとおりである。Ｘ１およびＸ１’は、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨならびにＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨから独立して選択されるメンバーである。
【０１３５】
他の例示的な実施形態において、分枝状ＰＥＧは、システイン核、セリン核またはジ−リシン核に基づいている。別の例示的実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、以下の構造：
【０１３６】
【化４】
2010505874.tif 000005
から選択される。
【０１３７】
さらなる実施形態において、ポリ（エチレングリコール）は、２つ以上のＰＥＧ部分が接続した分枝状ＰＥＧである。分枝状ＰＥＧの例は、米国特許第５，９３２，４６２号；米国特許第５，３４２，９４０号；米国特許第５，６４３，５７５号；米国特許第５，９１９，４５５号；米国特許第６，１１３，９０６号；米国特許第５，１８３，６６０号；国際公開第０２／０９７６６号；Ｋｏｄｅｒａ  Ｙ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５：２８３〜２８８頁（１９９４）；およびＹａｍａｓａｋｉら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５２：２１２５〜２１２７頁、１９９８年に記載されている。好ましい実施形態において、分枝状ＰＥＧの各ポリ（エチレングリコール）の分子量は、４０，０００ダルトン以下である。
【０１３８】
代表的なポリマー修飾部分は、側鎖を含有するアミノ酸、例えば、セリン、システイン、リシン、および小型ペプチド、例えば、ｌｙｓ−ｌｙｓに基づく構造を含む。例示的な構造としては、
【０１３９】
【化５】
2010505874.tif 000006
が挙げられる。
【０１４０】
ジ−リシン構造における遊離アミンもまた、ＰＥＧ部分を有するアミド結合またはウレタン結合によってペグ化できることを、当業者は認識するであろう。
【０１４１】
さらに別の実施形態において、ポリマー修飾基は、トリ−リシンペプチドに基づく分枝状ＰＥＧ部分である。トリ−リシンは、モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化、トリＰＥＧ化、またはテトラＰＥＧ化することができる。この実施形態による例示的な分子種は、式：
【０１４２】
【化６】
2010505874.tif 000007
を有し、式中、添字ｅ、ｆおよびｆ’は、１から２５００の整数から独立して選択され；添字ｑ、ｑ’およびｑ’’は、１から２０の整数から独立して選択される。
【０１４３】
当業者には明らかであろうが、本発明に使用される分枝状ポリマーには、上記の主題に関しての変型が含まれる。例えば、上記に示されたジ−リシン−ＰＥＧコンジュゲートは、３つのポリマーサブユニットを含むことができ、第３のものは、上記の構造において非修飾として示されたα−アミンに結合している。同様に、所望の様式でポリマー修飾部分によって標識された３つまたは４つのポリマーサブユニットをによって官能化されたトリ−リシンの使用は、本発明の範囲内にある。
【０１４４】
１つまたは複数のポリマー部分（例えば、ＰＥＧ部分）を含む例示的な分枝状修飾基としては、式：
【０１４５】
【化７】
2010505874.tif 000008
が挙げられる。
【０１４６】
一実施形態において、この式による分枝状ポリマー種は、本質的に純粋な水溶性ポリマーである。Ｃは炭素である。Ｘ５は、非反応性基である。一実施形態において、Ｘ５は、Ｈ、ＯＨ、およびＯＨにより場合によって置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル（例えば、ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３）から選択される。Ｒ１６およびＲ１７は、非反応性基（例えば、Ｈ、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル）およびポリマーアーム（例えば、ＰＥＧ）から独立して選択される。Ｘ２およびＸ４は、生理学的条件下で本質的に非反応性であることが好ましい結合断片(linkage fragment)である。Ｘ２およびＸ４は独立して選択される。例示的なリンカーは、芳香族部分もエステル部分も含まない。あるいは、これらの結合は、生理学的関連条件下で分解するように設計されている１つまたは複数の部分、例えば、エステル、ジスルフィドなどを含み得る。Ｘ２およびＸ４は、ポリマーアームのＲ１６およびＲ１７をＣに結合させる。Ｘ２およびＸ４などの例示的な結合断片は独立して選択され、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨならびにＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、およびＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＣＨ２Ｓ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｓ、（ＣＨ２）０Ｏ、（ＣＨ２）０Ｓまたは（ＣＨ２）０Ｙ’−ＰＥＧが挙げられ、式中Ｙ’は、Ｓ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、またはＯであり、ｏは１から５０の整数である。例示的な実施形態において、結合断片Ｘ２およびＸ４は、異なる結合断片である。
【０１４７】
例示的な実施形態において、修飾基は、天然または非天然のアミノ酸、アミノ酸類縁体またはアミノ酸模倣物、または、このような１つまたは複数の化学種から形成された小型ペプチドから誘導される。例えば、本発明のポリペプチドコンジュゲートに見られる特定の分枝状ポリマーは、以下の式を有し、Ｌａは、修飾基をポリペプチドコンジュゲートの残部に結合させるリンカー部分である。
【０１４８】
【化８】
2010505874.tif 000009
【０１４９】
例示的な実施形態において、Ｌａは、構造：
【０１５０】
【化９】
2010505874.tif 000010
を有する結合性部分であり、式中、ＸａおよびＸｂは、独立して選択される結合断片であり、Ｌ１は、結合、置換または非置換アルキルまたは置換または非置換ヘテロアルキルから選択される。
【０１５１】
ＸａおよびＸｂに関する例示的な化学種としては、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、およびＯＣ（Ｏ）ＮＨが挙げられる。
【０１５２】
別の例示的な実施形態において、Ｘ４は、Ｒ１７に対するペプチド結合であり、アルファ−アミン部分および／または側鎖ヘテロ原子がポリマー修飾部分によって修飾されている、アミノ酸、ジペプチド（例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）またはトリペプチド（例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）である。
【０１５３】
他の例示的な実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートは、群：
【０１５４】
【化１０】
2010505874.tif 000011
から選択される部分を含む。
【０１５５】
上記式の各々において、添字ｅおよびｆは、１から２５００の整数から独立して選択される。さらなる例示的な実施形態において、ｅおよびｆは、約１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａおよび８０ｋＤａであるＰＥＧ部分を提供するように選択される。記号Ｑは、置換または非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、例えばメチル）、置換または非置換ヘテロアルキルまたはＨを表す。
【０１５６】
他の分枝状ポリマーは、ジ−リシン（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）ペプチドに基づく構造、例えば、
【０１５７】
【化１１】
2010505874.tif 000012
およびトリ−リシンペプチド（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）に基づく構造、例えば、
【０１５８】
【化１２】
2010505874.tif 000013
を有する。
【０１５９】
上記の図の各々において、添字ｅ、ｆ、ｆ’およびｆ’’は、１から２５００より独立して選択される整数を表す。添字ｑ、ｑ’およびｑ’’は、１から２０より独立して選択される整数を表す。
【０１６０】
別の例示的な実施形態において、本発明のコンジュゲートは、
【０１６１】
【化１３】
2010505874.tif 000014
から選択されるメンバーである式を含み、式中、Ｑは、Ｈおよび置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルから選択されるメンバーである。添字ｅおよびｆは、１から２５００より独立して選択される整数であり、添字ｑは、０から２０より選択される整数である。
【０１６２】
別の例示的な実施形態において、本発明のコンジュゲートは、
【０１６３】
【化１４】
2010505874.tif 000015
から選択されるメンバーである式を含み、式中、Ｑは、Ｈおよび置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルから選択されるメンバーであり、好ましくは、Ｍｅである。添字ｅ、ｆおよびｆ’は、１から２５００より独立して選択される整数であり、ｑおよびｑ’は、１から２０より独立して選択される整数である。
【０１６４】
別の例示的な実施形態において、本発明のコンジュゲートは、以下の式：
【０１６５】
【化１５】
2010505874.tif 000016
による構造を含み、式中、添字ｍおよびｎは、０から５０００より独立して選択される整数である。添字ｊおよびｋは、０から２０より独立して選択される整数である。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＡ１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２および−ＳｉＡ１２Ａ１３から独立して選択されるメンバーである。Ａ１２およびＡ１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである。
【０１６６】
上記の式による一実施形態において、分枝状ポリマーは、以下の式：
【０１６７】
【化１６】
2010505874.tif 000017
による構造を有する。例示的な実施形態において、Ａ１およびＡ２は、−ＯＣＨ３およびＯＨから独立して選択されるメンバーである。
【０１６８】
別の例示的な実施形態において、リンカーＬａは、アミノグリシン誘導体から選択されるメンバーである。この実施形態による例示的なポリマー修飾基は、以下の式：
【０１６９】
【化１７】
2010505874.tif 000018
による構造を有する。
【０１７０】
一例において、Ａ１およびＡ２は、ＯＣＨ３およびＯＨから独立して選択されるメンバーである。この実施例による例示的なポリマー修飾基は、
【０１７１】
【化１８】
2010505874.tif 000019
を含む。
【０１７２】
修飾基が立体中心（例えば、アミノ酸リンカーまたはグリセロ−ルベースのリンカーを含む立体中心）を含む上記実施形態の各々において、立体中心は、ラセミ体であるか確定されたものであるかのいずれかであり得る。このような立体中心が確定されている一実施形態において、それは（Ｓ）のコンフィギュレーションを有する。別の実施形態において、立体中心は（Ｒ）のコンフィギュレーションを有する。
【０１７３】
分枝状ポリマーのｍ−ＰＥＧアームの１つまたは複数が、異なる末端、例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、Ｃ２〜Ｃ１０アルキルなどを有するＰＥＧ部分によって置換できることを、当業者は認識するであろう。さらに、上記の構造は、α−炭素原子と側鎖の官能基の間にアルキルリンカーを挿入する（または炭素原子を除去する）ことによって、容易に修飾される。したがって、「ホモ」誘導体およびより高度の相同体、ならびにより低度の相同体は、本発明に用いられる分枝状ＰＥＧに関するコアの範囲内にある。
【０１７４】
本明細書に記載された線状および分枝状のＰＥＧコンジュゲートは、当技術分野に認識されている方法を用いて調製できる。官能化およびＰＥＧのコンジュゲーションについての幾つかのレビューおよびモノグラフが入手できる。例えば、Ｈａｒｒｉｓ、Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５〜３７３頁（１９８５）；Ｓｃｏｕｔｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：３０〜６５頁（１９８７）；Ｗｏｎｇら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６〜８７４頁（１９９２）；Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：２４９〜３０４頁（１９９２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：１５０〜１６５頁（１９９５）；およびＢｈａｄｒａら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５７：５〜２９頁（２００２）を参照されたい。反応性ＰＥＧ分子の調製および反応性分子を用いたコンジュゲートの形成に関する経路は、当技術分野に知られている。例えば、米国特許第５，６７２，６６２号、米国特許第６，３７６，６０４号、国際公開第９９／４５９６４号、国際公開第９６／２１４６９号、米国特許第５，９３２，４６２号、米国特許第５，４４６，０９０号、国際公開第９９／３４８３３号、国際公開第９９／１４２５９号、米国特許第６，３４８，５５８号。
【０１７５】
本明細書に記載された分枝状ポリマーの形成において、上記に掲げられたポリマー活性化の当技術分野で認識されている方法が本発明の文脈において用いられる。
【０１７６】
グリコシル結合基
一実施形態において、グリコシル結合基を介して、修飾基がポリペプチドに共有結合している。修飾糖の糖部分が、ポリペプチドと修飾基の間に置かれた場合、「グリコシル結合基」になる。例示的な実施形態において、グリコシル結合基は、修飾基による修飾後、グリコシルトランスフェラーゼなどの適切な酵素に対する基質である単糖またはオリゴ糖から形成される。別の例示的な実施形態において、グリコシル結合基は、グリコシル模倣部分から形成される。本発明のポリペプチドコンジュゲートは、一価または多価（例えば、アンテナ構造）であるグリコシル結合基を含むことができる。したがって、本発明のコンジュゲートは、修飾基が一価のグリコシル結合基を介してポリペプチドに接続している双方の化学種を含む。また、２つ以上の修飾基が多価結合基を介してポリペプチドに接続しているコンジュゲートも本発明に含まれる。例示的な結合基は、２００７年７月２３日出願のＰＣＴ／ＵＳ０７／７４１３９に開示されており、その開示は参照として、本明細書にその全体が援用されている。
【０１７７】
例示的な実施形態において、本発明は、
【０１７８】
【化１９】
2010505874.tif 000020
から選択される式を有する完全形のグリコシル結合基を介してポリマー修飾部分にコンジュゲートしているグリコペプチドを単離する方法を提供し、式Ｉ中、Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ２ＯＲ７、ＣＯＯＲ７またはＯＲ７、であり、式中、Ｒ７は、Ｈ、置換または非置換アルキルもしくは置換または非置換ヘテロアルキルを表す。ＣＯＯＲ７がカルボン酸またはカルボキシレートである場合、単一構造ＣＯＯ−またはＣＯＯＨの表示によって双方の形態が表される。式ＩおよびＩＩにおいて、記号Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ６’は独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル、ＯＲ８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ９を表す。添字ｄは、０または１である。Ｒ８およびＲ９は独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、シアル酸またはポリシアル酸から選択される。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ６’の少なくとも１つは、結合または結合基を介して結合したポリマー修飾部分、例えばＰＥＧを含む。例示的な実施形態において、Ｒ６およびＲ６’は、それらが接続している炭素と一緒になってシアル酸のピルビル側鎖の構成部分である。さらなる例示的な実施形態において、この側鎖は、ポリマー修飾部分によって官能化されている。別の例示的な実施形態において、Ｒ６およびＲ６’は、それらが接続している炭素と一緒になってシアル酸の側鎖の構成部分であり、ポリマー修飾部分は、Ｒ５の構成部分である。
【０１７９】
さらなる例示的実施形態において、ポリマー修飾部分は、下記に示されるように、リンカーＬを介して、コア上の一般にヘテロ原子（例えば窒素）を介して、糖のコアに結合している。
【０１８０】
【化２０】
2010505874.tif 000021
Ｒ１はポリマー部分であり、Ｌは、結合および結合基から選択される。添字ｗは、１〜６、好ましくは１〜３、より好ましくは１〜２より選択される整数を表す。例示的な結合基としては、置換または非置換アルキル部分、置換または非置換ヘテロアルキル部分およびシアル酸が挙げられる。リンカーの例示的な構成部分はアシル部分である。
【０１８１】
本発明による例示的な化合物は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ６’のうちの少なくとも１つが、式：
【０１８２】
【化２１】
2010505874.tif 000022
を有する式ＩまたはＩＩに従った構造を有する。
【０１８３】
この実施形態による別の例において、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ６’のうちの少なくとも１つが、式：
【０１８４】
【化２２】
2010505874.tif 000023
を有し、式中ｓは、０から２０の整数であり、Ｒ１は、線状ポリマー修飾部分である。
【０１８５】
例示的な一実施形態において、ポリマー修飾部分−リンカー構造は、中心部分に接続した２つ以上のポリマー鎖を含む分枝状構造である。この実施形態において、この構造は、式：
【０１８６】
【化２３】
2010505874.tif 000024
を有し、式中Ｒ１およびＬは、上記に検討されたとおりであり、ｗ’は、２から６、好ましくは２から４、より好ましくは２から３の整数である。
【０１８７】
Ｌが結合である場合、Ｒ１の前駆体上の反応性官能基と糖コア上の相補的反応性の反応性官能基の間で該結合が形成される。Ｌが非ゼロオーダーのリンカーである場合、Ｌの前駆体は、Ｒ１の前駆体との反応に先立ってグリコシル部分の所定位置にあることができる。あるいは、Ｒ１およびＬの前駆体は、予め形成されたカセットに組み込むことができ、引き続きグリコシル部分に接続される。本明細書に説明されているように、適切な反応性官能基を有する前駆体の選択と調製は、当業者の能力の範囲内にある。さらに、前駆体のカップリングは、当技術分野に十分に解される化学によって進行する。
【０１８８】
例示的な一実施形態において、Ｌは、アミノ酸、または小型のペプチド（例えば、１〜４つのアミノ酸残基）から形成される結合基であり、ポリマー修飾部分が、置換アルキルリンカーを介して接続している修飾糖を提供する。例示的なリンカーとしては、グリシン、リシン、セリンおよびシステインが挙げられる。ＰＥＧ部分は、アミドまたはウレタン結合を介してリンカーのアミン部分に接続することができる。ＰＥＧは、それぞれチオエーテル結合およびエーテル結合を介してシステインおよびセリンのイオウ原子または酸素原子に結合している。
【０１８９】
例示的な一実施形態において、Ｒ５は、ポリマー修飾部分を含む。別の代表的な実施形態において、Ｒ５は、ポリマー修飾部分および修飾部分を分子の残部に結びつけるリンカーＬの双方を含む。上記に検討されたように、Ｌは線状構造または分枝状構造であり得る。同様にポリマー修飾は、分枝状または線状であり得る。
【０１９０】
一実施形態において、本発明は、部分：
【０１９１】
【化２４】
2010505874.tif 000025
を含むエリスロポエチンペプチドコンジュゲートの単離のための方法を提供し、式中Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり；Ｇは、ＨおよびＲ１−Ｌ−ならびに−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり；Ｒ１は、直鎖または分枝状ポリ（エチレングリコール）残基を含む部分であり；Ｌは、リンカー、例えば、結合（「ゼロオーダー」）、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルである。代表的な実施形態において、ＤがＯＨである場合、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである場合、ＤはＲ１−Ｌ−ＨＮ−である。
【０１９２】
別の例示的な実施形態において、本発明は、本発明の修飾糖と基質ＥＰＯペプチドの間で形成されたコンジュゲートを提供する。この実施形態において、修飾糖の糖部分は、ペプチド基質と修飾基の間に挿入されたグリコシル結合基となる。例示的なグリコシル結合基は、完全形のグリコシル結合基であり、グリコシル部分または結合基を形成する部分は、化学的（例えば、メタ過ヨウ素酸ナトリウム）処理または酵素（例えば、オキシダーゼ）処理によって分解されない。本発明の選択されたコンジュゲートとしては、アミノ糖、例えば、マンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸などのアミン部分に接続する修飾基が挙げられる。このモチーフによる例示的な修飾基−完全形グリコシル結合基のカセットは、式：
【０１９３】
【化２５】
2010505874.tif 000026
を有するものなど、シアル酸構造に基づいている。
【０１９４】
上式において、Ｒ１およびＬは上記のとおりである。代表的なＲ１基の構造についてのさらなる詳細は、下記に提供されている。
【０１９５】
なおさらなる例示的な一実施形態において、コンジュゲートは、基質ＥＰＯと糖部分の間に形成され、修飾基は、リンカーを介して糖部分の６−炭素位に接続する。したがって、この実施形態による例示的コンジュゲートは、式：
【０１９６】
【化２６】
2010505874.tif 000027
を有し、式中の基は上記に検討されたとおりである。このような糖部分としては、限定はしないが、グルコース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、マンノース、マンノサミン、Ｎ−アセチル−マンノサミンなどが挙げられる。
【０１９７】
ＥＰＯなどの治療用ペプチド上のグリコシル残基を修飾するために利用できる方法の汎用性のため、本発明のペプチドコンジュゲート上のグリコシル構造は、実質的に任意の構造を有することができる。さらに、グリカン類は、Ｏ−結合またはＮ−結合であり得る。下記の考察で例示されているように、上記に考察されたピラノースおよびフラノース誘導体の各々は、ペプチドのグリコシル部分の構成成分であり得る。
【０１９８】
本発明は、式：
【０１９９】
【化２７】
2010505874.tif 000028
を有するグリコシル基を含む修飾ＥＰＯペプチドを提供する。
【０２００】
他の実施形態において、基は、式：
【０２０１】
【化２８】
2010505874.tif 000029
を有し、式中の添字ｔは０または１である。
【０２０２】
さらなる例示的な一実施形態において、基は、式：
【０２０３】
【化２９】
2010505874.tif 000030
を有し、式中の添字ｔは０または１である。
【０２０４】
さらに別の実施形態において、基は、式：
【０２０５】
【化３０】
2010505874.tif 000031
を有し、式中の添字ｐは１から１０の整数を表し；ａは０または１である。
【０２０６】
例示的な一実施形態において、本発明のグリコＰＥＧ化ＥＰＯペプチドは、下記に説明されたグリコシル残基：
【０２０７】
【化３１】
2010505874.tif 000032
から選択される少なくとも１つのＮ−結合グリコシル残基を含む。
【０２０８】
上式において、添字ｔは０または１であり、添字ｐは１から１０の整数である。記号Ｒ１５’は、Ｈ、ＯＨ（例えば、Ｇａｌ−ＯＨ）、シアリル部分、ポリマー修飾シアリル部分（すなわち、グリコシル結合基−ポリマー修飾部分（Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１））またはポリマー修飾シアリル部分が結合している（すなわち、Ｓｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１）（「Ｓｉａ−Ｓｉａｐ」）シアリル部分を表す。本発明の例示的なＥＰＯペプチドは、Ｒ１５’を有する少なくとも１つのグリカンを含む。式ＩおよびＩＩの開放原子価を有する酸素は、ＧａｌまたはＧａｌＮＡｃ部分の炭素に対するグリコシド結合を介して接続することが好ましい。さらなる例示的な一実施形態において、酸素は、ガラクトース残基の３位の炭素に接続する。例示的な一実施形態において、修飾シアル酸は、ガラクトース残基のα２，３−に結合する。別の例示的な一実施形態において、修飾シアル酸は、ガラクトース残基のα２，６−に結合する。
【０２０９】
修飾グリカンは、Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８、Ａｓｎ８３および／またはＳｅｒ１２６から選択される１つまたは複数の位置に結合する。例示的な一実施形態において、ＥＰＯは哺乳動物細胞から誘導され、修飾基は、Ａｓｎ２４におけるグリカン上にのみ存在する。このモチーフによる一実施形態において、グリコシル結合部分は、別のＳｉａ残基、例えば、
【０２１０】
【化３２】
2010505874.tif 000033
を介してＳｉａ残基に結合する。このモチーフによる例示的な化学種は、Ｓｉａ−Ｓｉａ結合を形成する酵素、例えば、ＣＳＴ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩおよびＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶを用いて、Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ１を、Ａｓｎにおけるグリカンの末端シアル酸にコンジュゲートさせることにより調製する。
【０２１１】
別の例示的な実施形態において、グリカン類は、基：
【０２１２】
【化３３】
2010505874.tif 000034
から選択される式およびそれらの組合せを有する。
【０２１３】
この基のグリカン類は一般に、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）により産生されるＥＰＯペプチド上に見られるものに相当し、次いで本明細書に説明された方法に従ってグリカンの再構築およびグリコＰＥＧ化を行う。例えば、トリ−マンノシルコアにより発現する昆虫誘導のＥＰＯは、引き続きＧｌｃＮＡｃドナーおよびＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ならびにＧａｌドナーおよびＧａｌトランスフェラーゼと接触させる。ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌのトリ−マンノシルコアへの付加は、２ステップまたは単一ステップで達成される。修飾シアル酸は、本明細書に検討されたグリコシル部分の少なくとも１つの分枝に付加する。修飾シアル酸により官能化されないこれらのＧａｌ部分は、シアリルトランスフェラーゼの存在下、シアル酸ドナーとの反応により場合によって「キャップ」される。
【０２１４】
例示的な一実施形態において、ペプチド集団における末端Ｇａｌ部分の少なくとも６０％が、シアル酸によりキャップされ、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、なお好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％がシアル酸によりキャップされる。
【０２１５】
上式の各々において、Ｒ１５’は上記で考察されたとおりである。さらに、本発明の例示的な修飾ＥＰＯペプチドは、式ＩまたはＩＩに従った構造を有し、Ｒ１５’部分を有する少なくとも１つのグリカンを含む。
【０２１６】
別の代表的な一実施形態において、ＥＰＯは、昆虫細胞から誘導され、ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌをマンノースコアに付加させることにより再構築される。再構築されたペプチドは、線状ＰＥＧ部分を担持するシアル酸を用いてグリコペグ化され、式：
【０２１７】
【化３４】
2010505874.tif 000035
を有する少なくとも１つの部分を含むＥＰＯペプチドが得られ、式中ｓは１から１０の整数を表し、ｆは１から２５００の整数を表す。
【０２１８】
ある特定の実施形態において、ＥＰＯペプチドは、３つのこのような部分を含み、Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３の各々に接続する。別の実施形態において、ペプチドは、これらのＡｓｎ部分のうちの２つの組合せで接続した２つのこのような部分を含む。また、これら２つの化学種（すなわち、ＰＥＧ３およびＰＥＧ２）の混合物である組成物が提供される。この混合物は、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは９０％、なお一層好ましくは９５％、９６％、９７％または９８％の３つの修飾グリコシル残基を含む化学種を含む。上記に考察されたとおり、非修飾末端Ｇａｌ残基はＳｉａにより場合によってキャップされる。例示的な実施形態において、ペプチドは、昆虫細胞内で発現され、再構築され、グリコペグ化される。
【０２１９】
添字ｅおよびｑは、上記に検討されたとおりである。例示的な実施形態において、修飾グリコシル部分の各々に関するｅは、約１０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ部分として提供する整数である。
【０２２０】
Ｉ．ｂ）ポリペプチドコンジュゲートの単離
下記の膜濾過法およびクロマトグラフィー法は、本発明の方法内の有用なステップであり、ポリペプチドが、ポリ（アルキレンオキシド）部分などの少なくとも１つの修飾基に結合されるポリペプチドコンジュゲートの単離に適用される。当然のことながら、ステップの順序が明白に述べられない限り、例示的なステップは、任意の所望の順序で実施することができる。
【０２２１】
膜濾過法
一実施形態において、本発明の方法は１つまたは複数の膜濾過ステップを含む。膜濾過法は、ポリペプチドを透明化し、濃縮し、精製するために広く用いられる分離法である。
【０２２２】
限外濾過／ダイアフィルトレーション
小型ＭＷＣＯを有する膜を用いる限外濾過法
例示的な一実施形態において、本発明のポリペプチド精製処理は、例えば、保存に好適な組成物を生成するための最終処理ステップとして、少なくとも１つのダイアフィルトレーション／限外濾過ステップを含む。一例において、ダイアフィルトレーション／限外濾過法は、クロマトグラフィー処理ステップのために混合物を調整するために実施する。例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップからの溶出液は濃縮され、緩衝液は、次の精製ステップ（例えば、カチオン交換クロマトグラフィー）用サンプルを調製するために交換される。
【０２２３】
例示的な一実施形態において、サンプルを濃縮するためにダイアフィルトレーションステップを使用する。別の例示的実施形態において、緩衝液を変更するためにダイアフィルトレーションステップを使用する。さらに別の例示的な実施形態において、新たな緩衝液は、精製ポリペプチドコンジュゲートの保存に好適である。ダイアフィルトレーション／限外濾過膜は、任意の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）規格値を有することができる。
【０２２４】
例示的な一実施形態において、供給物は、精製ポリペプチドコンジュゲートを濃縮するために好適なＭＷＣＯを有する限外濾過膜を通過させる。選択されたＭＷＣＯは、ポリペプチドに共有結合したポリ（アルキレンオキシド）部分のサイズなど、ポリペプチドと修飾基とのサイズの組合せに依る。サンプルを濃縮するために、精製ペプチドコンジュゲートの分子量よりも実質的に低いＭＷＣＯを有するように膜が選択される。一例において、膜により保持されるために、ペプチドコンジュゲートの分子量よりも３倍から６倍低いＭＷＣＯを有するように限外濾過膜が選択される。流速または処理時間が主として考慮される場合、この範囲の下端に近いＭＷＣＯを有する膜（例えば３×）の選択により、より高い流速が生じるであろう。ペプチドコンジュゲートの回収が主要な関心事である場合、より緊密な膜（例えば６×）が選択される（一般に、より低い流速で）。
【０２２５】
例示的な一実施形態において、ダイアフィルトレーション膜は、約２ｋＤａから約５００ｋＤａのＭＷＣＯを有する。別の例示的な実施形態において、ダイアフィルトレーション膜は、約５ｋＤａから約４００ｋＤａ、約５ｋＤａから約３００ｋＤａまたは約５ｋＤａから約２００ｋＤａのＭＷＣＯを有する。なお別の例示的な実施形態において、ダイアフィルトレーション膜は、約５ｋＤａから約１８０ｋＤａ、５ｋＤａから約１６０ｋＤａ、５ｋＤａから約１４０ｋＤａ、５ｋＤａから約１３０ｋＤａ、５ｋＤａから約１２０ｋＤａ、５ｋＤａから約１１０ｋＤａ、または５ｋＤａから１００ｋＤａのＭＷＣＯを有する。ポリペプチドコンジュゲートがＥＰＯ−ＰＥＧである場合、ダイアフィルトレーション膜は、約５ｋＤａから約８０ｋＤａ、５ｋＤａから約６０ｋＤａ、５ｋＤａから約４０ｋＤａまたは５ｋＤａから約２０ｋＤａのＭＷＣＯを有する。一実施形態において、ポリペプチドコンジュゲートがＥＰＯ−［ＰＥＧ−１０ｋＤａ］３である場合、ダイアフィルトレーション膜は、約８ｋＤａから約１２ｋＤａ、好ましくは約１０ｋＤａのＭＷＣＯを有する。
【０２２６】
別の例示的な実施形態において、濾過は、約１ｐｓｉから約３０ｐｓｉの間の膜間圧および約５ｋＤａから約１５ｋＤａの間、好ましくは１０ｋＤａのＭＷＣＯを有するフィルター膜を用いて実施される。濾過ステップにより、濃縮流および透過流が生じる。濃縮水は、緩衝液を濃縮水に添加することによって、供給物中の本質的に一定のペプチド濃度の条件下、ペプチド液供給物用リザーバにリサイクルすることができる。
【０２２７】
使用される濾過膜の表面積は、一般に精製されるペプチドコンジュゲートの量に依存する。膜は、吸着損失を最少にするために低結合材料から製造することができ、好ましくは、耐久性で清浄化可能であり、かつ使用される緩衝剤と化学的に適合性である。多くの好適な膜は市販されている。例示的な一実施形態において、限外濾過膜／ダイアフィルトレーション膜は、セルロースアセテート、再生セルロースおよびポリエーテルスルホンから選択されるメンバーである。好適な膜としては、膜ポリマーが化学的に修飾されるものが挙げられる。好ましい一実施形態において、膜は再生セルロースである。
【０２２８】
一実施形態において、流速は、一定の膜間圧を維持するために調整される。一般に、濾過は、より高い圧力およびより高い流速によって迅速に進行するが、より高い流速はまた、膜通過によるペプチドに対する損傷またはペプチドの損失をもたらし得る。さらに、種々のデバイスが、それらの操作の際に一定の圧力限界を有すると考えられ、製造元の仕様書に従って圧力が調整される。代表的な一実施形態において、圧力は、約１ｐｓｉから約３０ｐｓｉの間であり、別の代表的な一実施形態において、圧力は、約８ｐｓｉから約１５ｐｓｉの間である。一般に、循環ポンプは、供給路内のぜん動性ポンプまたは膜型ポンプであり、圧力は、濃縮水バルブを調整することによって制御される。
【０２２９】
濾過ステップ後に濃縮水が集められる。膜フィルターを洗浄し、膜により保持されたペプチドを回収するために水または水性緩衝液（例えば、ダイアフィルトレーション用緩衝液）を使用することができる。この洗浄液は、濃縮ペプチドを含有する元の濃縮水と合わせることができる。この濃縮水をＴＲＩＳまたはＨＥＰＥＳなどの別の緩衝液に対して場合によって透析する。
【０２３０】
精製生成物は低温で保存する。例示的な一実施形態において、生成物は、１ｍＬの保存緩衝液当り約１ｍｇから約１０ｍｇのペプチドコンジュゲートのポリペプチド濃度において約−２０℃で保存される。保存前に、例えば、約２μＭのポアサイズを有する膜フィルター（例えば、セルロースアセテートフィルター）を用いて、生成物溶液を滅菌濾過することができる。
【０２３１】
ポリペプチドコンジュゲートのクロマトグラフィー単離
サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、混合様式クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトおよびフルオロアパタイトクロマトグラフィーなど、種々の公認されたクロマトグラフィー技法が、ポリペプチドおよびタンパク質の単離に使用される。これらの技法はまた、ポリペプチドコンジュゲートを単離するために使用することができる。例示的な一実施形態において、本発明の方法には、幾つかのクロマトグラフィー技法の組合せを使用する。これらのステップが実施される順序は、精製されるポリペプチドコンジュゲートの性質および除去される不純物の性質に依る。
【０２３２】
本発明の実施に好適な技法により、電荷、疎水性度、および／またはサイズに基づいて種々の不純物から対象のポリペプチドコンジュゲートを分離する。種々のクロマトグラフィー樹脂および膜を、これら技法の各々に利用することができ、精製スキームの正確な要求に適応できる。
【０２３３】
クロマトグラフィーの一技法において、混合物中の成分は、カラム材料と異なる相互作用をしてカラム長に沿って異なる速度で移動し、成分がカラムを通過するにつれて増加する物理的分離が達成される。別のクロマトグラフィー技法において、対象のペプチドコンジュゲートを含む混合物の成分は、分離用媒体に選択的に接着する一方、他の成分は流液中に見られる。次に当初に保持された成分は、溶媒または緩衝系の成分を変えることによって差異的に溶出される。別のアプローチにおいて、所望の成分が流液中に見られる一方、不純物はカラム上に保持され、したがって混合物から除去される。
【０２３４】
イオン交換クロマトグラフィー
一実施形態において、本発明の方法は、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィーステップを使用する。アニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィーは当技術分野に知られている。イオン交換クロマトグラフィーは、正味の電荷に基づいて化合物を分離する。イオン性分子は、アニオン類（負電荷を有する）またはカチオン類（正電荷を有する）として分類される。幾つかの分子（例えば、タンパク質）は、アニオン基およびカチオン基の双方を有することができる。正電荷の支持体（アニオン交換体）は、全体的に負電荷を有する化合物に結合する。逆に、負電荷の支持体（カチオン交換体）は、全体的に正電荷を有する化合物に結合する。イオン交換マトリックスは、強イオン交換体または弱イオン交換体としてさらに分類される。強イオン交換マトリックスは、広範囲のｐＨレベルに亘って荷電（イオン化）される。弱イオン交換マトリックスは、狭いｐＨ範囲内でイオン化される。交換カラムのイオン基は、ゲルマトリックスに共有結合し、緩衝液に存在する小濃度の対イオンにより相殺される。最も一般的なイオン交換化学物質としては：強アニオン交換に関しては四級アンモニウム残基（Ｑ）、弱アニオン交換に関してはジエチルアミノエチル残基（ＤＥＡＥ）、強カチオン交換に関してはスルホプロピル（ＳＰ）樹脂およびスルホン酸（Ｓ）樹脂、ならびに弱カチオン交換に関してはカルボキシメチル残基（ＣＭ）が挙げられる。
【０２３５】
サンプルをカラムに添加すると、弱結合対イオンとの交換が生じる。最初の溶媒が低溶出強度である限り、サンプル成分をカラムを通して進行させないためには、イオン交換クロマトグラフィーにおけるサンプル容量の大きさは二次的に重要なことである。このような条件下、サンプル成分をカラムの上部に集めることが好ましい。より強い溶出移動相の添加により勾配を開始すると、サンプル成分の分離が開始される。分離不良が見られたら、勾配傾斜を変えることによって改善し得る。選択された条件下で、ポリペプチドコンジュゲートがカラムに結合しない場合、開始緩衝液の組成物および／またはｐＨを変える必要がある。各緩衝液組成物が、イオン交換体およびサンプル組成物を独自に溶媒和することから、緩衝液系を、異なる緩衝液塩類を選択することによりさらに最適化することができる。
【０２３６】
一例において、約５ｍＭから約５０ｍＭまでの塩濃度を有する従来の任意の緩衝液系を、イオン交換クロマトグラフィーに使用することができる。しかしながら、正電荷の緩衝イオンは、アニオン交換体に使用され、負電荷の緩衝イオンは、カチオン交換体に使用される。リン酸緩衝液は、一般に双方の交換体タイプに使用される。一般に、対象のペプチド結合を可能にする最高塩濃度を、出発条件として使用する。一例において、全ての緩衝液をＭｉｌｌｉＱ−水から調製し、濾過する（０．４５μｍまたは０．２２μｍのフィルター）。
【０２３７】
アニオン交換クロマトグラフィー
例示的な一実施形態において、対象のペプチドコンジュゲートを含有するサンプルを、ペプチドがカラムから溶出すると思われる濃度以下の塩濃度を含む負荷緩衝液中のアニオン交換体上に添加する。精製ペプチドがアニオン交換媒体に保持されるように、緩衝液のｐＨを選択する。緩衝液のｐＨを変えることにより、ペプチド電荷を変化させ、ｐＨ値を低下させることにより、アニオン交換体による保持時間を短縮させる。タンパク質の等電点（ｐＩ）は、タンパク質の電荷がゼロであるｐＨである。一般に、アニオン交換体による緩衝液のｐＨ値は、対象のペプチドのｐＩ値よりも１．５倍から２倍の高さを維持する。あるいは、不純物を優先的に結合させる一方、精製ペプチドは流液中に見られるように、アニオン交換条件が選択される。
【０２３８】
幾つかのカラム容量（ＣＶ）の緩衝液でカラムを洗浄して未結合物質および／または樹脂に弱く結合する物質を除去することができる。次に、例えば、従来の方法による生理食塩水の勾配を用いて、画分をカラムから溶出させる。溶液中の塩は、カラムとの結合において、タンパク質と競合し、タンパク質が放出される。弱イオン相互作用を有する成分は、強イオン相互作用を有する成分よりもより低い塩濃度で溶出する。サンプル画分をカラムから集める。高濃度の所望のペプチドおよび低濃度の不純物を含有する画分をプールするか、または個々に処理する。
【０２３９】
一例において、本発明の方法で用いられるアニオン交換を使用して、微粒子、化学物質およびタンパク質／ペプチド（グリコＰＥＧ化反応に用いられる酵素）などの不純物からポリペプチドコンジュゲートを単離する。
【０２４０】
アニオン交換媒体は、当業者に知られている。例示的なアニオン交換媒体は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、編集者Ｈａｒｒｉｓ  ＥＬＶ、Ａｎｇａｌ  Ｓ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ、英国（１９８９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、編集者Ｊａｎｓｏｎ  ＪＣ、Ｒｙｄｅｎ  Ｌ、ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、独国（１９８９）；Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、編集者Ｓｈｕｋｌａ  ＡＡ、Ｅｔｚｅｌ  ＭＲ、Ｇａｄａｍ  Ｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ（２００７）、１８８〜１９６頁；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ２００７年（１８−１１３２−２９）およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（第２版１９９８年）、編集者Ｊａｎｓｏｎ  Ｊ−ＣおよびＲｙｄｅｎ  Ｌ．に記載されており、それらの開示は、参照としてそれらの全体が本明細書に援用されている。本発明の例示的なアニオン交換体は、四級アンモニウムフィルターおよびＤＥＡＥ樹脂から選択される。一実施形態において、アニオン交換体は、四級アンモニウム樹脂（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑイオン交換膜、Ｐａｌｌ社）である。一例において、アニオン交換体はＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑである。他の有用な樹脂としては、ＱＸＬ樹脂、Ｃａｐｔｏ樹脂およびＢｉｇＢｅａｄｓ樹脂が挙げられる。
【０２４１】
例示的なアニオン交換媒体を下記に要約する：
ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：
Ｑ−セファロースＦＦ（Q-Sepharose FF）
Ｑ−セファロースＢＢ（Q-Sepharose BB）
Ｑ−セファロースＸＬ（Q-Sepharose XL）
Ｑ−セファロースＨＰ（Q-Sepharose HP）
ミニＱ（Mini Q）
モノＱ（Mono Q）
モノＰ（Mono P）
ＤＥＡＥセファロースＦＦ（DEAE Sepharose FF）
ソース１５Ｑ（Source 15Q）
ソース３０Ｑ（Source 30Q）
Ｃａｐｔｏ  Ｑ
ＡＮＸセファロース４ＦＦ（ハイサブ）（ANX Sepharose 4 FF (high sub)）
ストリームラインＤＥＡＥ（Streamline DEAE）
ストリームラインＱＸＬ（Streamline QXL）
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：
Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ  １０μｍおよび２０μｍセルフパック
Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ  ２０μｍおよび５０μｍバルク媒体
Ｐｏｒｏｓ  ＰＩ  ２０μｍおよび５０μｍ
Ｐｏｒｏｓ  Ｄ  ５０μｍ
Ｔｏｓｏｈａａｓ：
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＤＥＡＥ  ６５０Ｓ、ＭおよびＣ
スーパーＱ  ６５０（Super Q 650）
ＱＡＥ  ５５０Ｃ
Ｐａｌｌ社：
ＤＥＡＥハイパーＤ（DEAE Hyper D）
ＱセラミックハイパーＤ（Q Ceramic Hyper D）
Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜アブソーバ（Mustang Q membrane absorber）
Ｍｅｒｃｋ  ＫＧｇＡ：
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＤＭＡＥ
ＦｒａｃｔｏＰｒｅｐ  ＤＥＡＥ
ＦｒａｃｔｏＰｒｅｐ  ＴＭＡＥ
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＥＡＥ
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ
Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ：
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜アブソーバ（Sartobind Q membrane absorber）
【０２４２】
カチオン交換クロマトグラフィー
一実施形態において、本発明の方法は、少なくとも１つのカチオン交換ステップを含む。例示的な一実施形態において、対象のペプチドコンジュゲートを含有するサンプルを、ペプチドがカラムから溶出すると思われる濃度以下の塩濃度を含む負荷緩衝液中のカチオン交換樹脂上に添加する。
【０２４３】
一例において、対象のペプチドコンジュゲートがカチオン交換樹脂に保持されるように負荷緩衝液のｐＨを選択する。緩衝液のｐＨを変えることにより、ペプチドの電荷を変化させ、緩衝液のｐＨ値を増加させることにより、カチオン交換体による保持時間を短縮させる。一般にカチオン交換は、ペプチドのｐＩの１．５から２のｐＨ単位下で実施する。あるいは、不純物を優先的に結合させる一方、精製ペプチドは流液中に見られるように、カチオン交換条件が選択される。
【０２４４】
[  一実施形態において、カラムを幾つかのカラム容量の緩衝液で洗浄して、未結合物質および／または樹脂に弱く結合する物質を除去する。次に、従来の方法による塩勾配を用いて、画分をカラムから溶出させる。サンプル画分をカラムから集める。高濃度の所望のペプチドおよび低濃度の不純物を含有する１つまたは複数の画分を集め、場合によってプールする。
【０２４５】
例示的な一実施形態において、本発明の方法に用いられるカチオン交換体は、精製処理の主要な精製ステップの１つを提供する。一実施形態において、カチオン交換体は、対象のペプチドコンジュゲートを含有する混合物から望ましくないタンパク質を除去する。別の実施形態において、カチオン交換ステップは、精製ポリペプチドコンジュゲートの不要なグリコフォームを除去するために有用である。
【０２４６】
カチオン交換媒体は、当業者に知られている。例示的なカチオン交換媒体は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、編集者Ｈａｒｒｉｓ  ＥＬＶ、Ａｎｇａｌ  Ｓ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ、英国（１９８９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、編集者Ｊａｎｓｏｎ  ＪＣ、Ｒｙｄｅｎ  Ｌ、ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、独国（１９８９）；Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、編集者Ｓｈｕｋｌａ  ＡＡ、Ｅｔｚｅｌ  ＭＲ、Ｇａｄａｍ  Ｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ（２００７）、１８８〜１９６頁；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ２００７年（１８−１１３２−２９）およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（第２版１９９８年）、編集者Ｊａｎｓｏｎ  Ｊ−ＣおよびＲｙｄｅｎ  Ｌ．に記載されており、それらの開示は、参照としてそれらの全体が本明細書に援用されている。例示的な実施形態において、本発明に使用されるカチオン交換樹脂は、スルホン酸（Ｓ）およびカルボキシメチル（ＣＭ）支持体から選択される。一実施形態において、カチオン交換体は、スルホン酸支持体（例えば、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳ、Ｂｉｏ−Ｒｅｄラボラトリーズ）またはスルホプロピル（ＳＰ）樹脂である。別の実施形態において、カチオン交換樹脂は、ＳＰＦＦ、ＳＰＨＰセファロース、ＢｉｇＢｅａｄｓ  ＳＰ、Ｃａｐｔｏ  Ｓなどから選択される。一例において、カチオン交換体はソース１５Ｓである。
【０２４７】
代表的な市販のカチオン交換媒体を下記に要約する：
ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：
ＳＰ−セファロースＦＦ（SP-Sepharose FF）
ＳＰ−セファロースＢＢ（SP-Sepharose BB）
ＳＰ−セファロースＸＬ（SP-Sepharose XL）
ＳＰ−セファロースＨＰ（SP-Sepharose HP）
ミニＳ（Mini S）
モノＳ（Mono S）
ＣＭセファロースＦＦ（CM Sepharose FF）
ソース１５Ｓ（Source 15S）
ソース３０Ｓ（Source 30S）
Ｃａｐｔｏ  Ｓ
ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ
ストリームラインＳＰ−ＸＬ（Streamline SP-XL）
ストリームラインＣＳＴ−１（Streamline CST-1）
Ｔｏｓｏｈａａｓ樹脂：
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｍｅｇａ  Ｃａｐ  ＩＩ  ＳＰ−５５０ＥＣ
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｇｉｇａ  Ｃａｐ  Ｓ−６５０Ｍ
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ、ＭおよびＣ
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ６５０Ｓ、ＭおよびＣ
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ５５０Ｃ
ＪＴ  Ｂａｋｅｒ樹脂：
カルボキシ−スルホン（Carboxy-Sulphon）−５μｍ、１５μｍおよび４０μｍ
スルホニック（Sulfonic）−５μｍ、１５μｍおよび４０μｍ
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：
Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ  ２０μｍおよび５０μｍ
Ｐｏｒｏｓ  Ｓ  １０μｍおよび２０μｍ
Ｐａｌｌ社：
ＳセラミックハイパーＤ（S Ceramic Hyper D）
ＣＭセラミックハイパーＤ（CM Ceramic Hyper D）
Ｍｅｒｃｋ  ＫＧｇＡ樹脂：
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＣＯＯ−
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ
Ｆｒａｃｔｏ  Ｐｒｅｐ  Ｓｏ３
Ｂｉｏｒａｄ樹脂：
Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓ
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ膜：
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜アブソーバ（Sartobind S membrane absorber）
【０２４８】
本発明の方法に用いられるイオン交換体は場合によって、クロマトグラフィー用の樹脂または支持体というよりむしろ膜アブソーバである。例示的な一実施形態において、膜アブソーバは、カチオン交換体である。別の例示的な実施形態において、膜アブソーバは、スルホン酸（Ｓ）カチオン交換体（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ）である。膜アブソーバは場合によって、使い捨てである。
【０２４９】
混合様式またはシュード−アフィニティークロマトグラフィー
一実施形態において、本発明のペプチドコンジュゲートの精製処理は、混合様式またはシュード−アフィニティークロマトグラフィーを含む。
【０２５０】
一例において、処理は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーおよびフルオロアパタイト（ＦＡ）クロマトグラフィーなど、セラミックまたは結晶性アパタイト媒体上で実施されるクロマトグラフィーを含む。ＨＡおよびＦＡクロマトグラフィーは、有効な精製機構であり、イオン交換技法および／または疎水性相互作用技法を補足して生体分子の選択性を提供する。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびフルオロアパタイトクロマトグラフィーは当技術分野に知られている。一例において、アパタイト媒体はＡｄｈｅｒｅ  ＭＭＣである。
【０２５１】
ヒドロキシアパタイト
Ｉ型およびＩＩ型の例示的なヒドロキシアパタイト吸着剤は、セラミックまたは結晶性材料から選択される。ヒドロキシアパタイト吸着剤は、種々の粒径で入手できる（例えば、１型、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。例示的な一実施形態において、ヒドロキシアパタイト吸着剤の粒径は、約２０μｍから約１８０μｍの間、約２０μｍから約１００μｍの間または約６０μｍから約１００μｍの間である。特定の例において、ヒドロキシアパタイト吸着剤の粒径は、約８０μｍである。
【０２５２】
一実施形態において、ヒドロキシアパタイト吸着剤は、アガロースメッシュに閉じ込められたヒドロキシアパタイトの微結晶を有する架橋結合したアガロースビーズから構成される。場合によって、アガロースは、化学的に安定化される（例えば、強アルカリ条件下でエピクロロヒドリンにより）。例示的な一実施形態において、ヒドロキシアパタイト吸着剤は、ＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（Ｐａｌｌ社）である。
【０２５３】
フルオロアパタイト
例示的なＩ型およびＩＩ型のフルオロアパタイト吸着剤は、セラミック（例えば、ビーズ様粒子）および結晶性材料から選択される。セラミックフルオロアパタイト吸着剤は、種々の粒径で入手できる（例えば、１型および２型、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。例示的な一実施形態において、セラミックフルオロアパタイト吸着剤の粒径は、約２０μｍから約１８０μｍ、好ましくは、約２０μｍから約１００μｍ、より好ましくは、約２０μｍから約８０μｍである。一例において、セラミックフルオロアパタイト媒体の粒径は、約４０μｍである（例えば、１型セラミックフルオロアパタイト）。別の例において、フルオロアパタイト媒体は、フルオロアパタイトに加えてヒドロキシアパタイトを含む。特定の例において、フルオロアパタイト媒体は、Ｂｉｏ−ＲａｄのＣＦＴ（商標）セラミックフルオロアパタイトである。
【０２５４】
サンプルをヒドロキシアパタイトカラムまたはフルオロアパタイトカラム上に添加するために用いられる流速、ならびに溶出流速の選択は、ヒドロキシアパタイト吸着剤またはフルオロアパタイト吸着剤のタイプおよびカラム形状寸法に依存する。例示的な一実施形態において、処理スケールにおいて、添加流速は、約３０ｃｍ／時間から約９００ｃｍ／時間、約１５０ｃｍ／時間から約９００ｃｍ／時間、好ましくは約５００ｃｍ／時間から約９００ｃｍ／時間、より好ましくは約６００ｃｍ／時間から約９００ｃｍ／時間より選択される。
【０２５５】
例示的な一実施形態において、溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ７から約ｐＨ９、好ましくは約ｐＨ７．５から約８．０から選択される。
【０２５６】
一態様において、本発明は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはフルオロアパタイトクロマトグラフィーにより組換えペプチドを精製する方法を提供する。この方法は、（ａ）ペプチドを含有する混合物を脱塩し、ヒドロキシアパタイト樹脂またはフルオロアパタイト樹脂のペプチド結合能力を増加させる上で十分に低い塩導電率を有する脱塩混合物を形成するステップ（例えば、ゲル濾過により）；（ｂ）この脱塩混合物をヒドロキシアパタイト樹脂またはフルオロアパタイト樹脂に適用するステップ；（ｃ）ヒドロキシアパタイト樹脂またはフルオロアパタイト樹脂を洗浄し、それによって樹脂から不要な成分を溶出させるステップ；（ｄ）アミノ酸を場合によって含有する溶出緩衝液により樹脂からペプチドを溶出させるステップ；および（ｅ）ペプチドを含有する１つまたは複数の溶出液画分を集めるステップを含む。
【０２５７】
脱塩
一実施形態において、対象のペプチドを含有する混合物を脱塩してから、混合物をＨＡクロマトグラフィーまたはフルオロアパタイトクロマトグラフィーに供する。脱塩ステップは、アパタイトカラムが対象のペプチドと結合する能力を増加させる。一実施形態において、アパタイトカラムの能力（樹脂１リットル当りのペプチド量）は、ペプチドを含有する添加物の塩導電率を減少させるとともに増加する。
【０２５８】
添加物を脱塩する例示的な一実施形態において、ＨＡ樹脂１リットル当りのペプチドの添加質量は、約１ｇ／Ｌから約２５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌ、好ましくは、約１ｇ／Ｌから約１５ｇ／Ｌ、より好ましくは、約１ｇ／Ｌから約１０ｇ／Ｌである。
【０２５９】
例示的な一実施形態において、添加物の導電率は、脱塩および希釈から選択される方法を用いて減少させることができる。
【０２６０】
例示的な一実施形態において、負荷緩衝液の導電率を、脱塩により低下させ、好ましい導電率は、約０．１ｍＳ／ｃｍから約４．０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは、約０．１ｍＳ／ｃｍから約１．０ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは、約０．１ｍＳ／ｃｍから約０．６ｍＳ／ｃｍ、さらにより好ましくは、約０．１ｍＳ／ｃｍから約０．４ｍＳ／ｃｍである。
【０２６１】
一例において、ペプチドコンジュゲート溶液の脱塩は、膜フィルターを用いて達成され、膜フィルターは、対象のペプチド／タンパク質よりも小さなＭＷＣＯを有する。ペプチド／タンパク質は濃縮水に見られ、選択緩衝液中で再構成される。しかしながら、比較的低分子量のペプチド（例えば、ＥＰＯ）を精製する場合、脱塩に用いられる膜のＭＷＣＯは、膜ポアを通してのペプチドの漏れを避けるために比較的小さくなければならない。しかしながら、狭いＭＷＣＯ膜（例えば、約５ｋＤａのポアサイズを有する）を通す大容量の液体の濾過に、一般に大きな膜面積が必要であり、この濾過処理には時間がかかる。
【０２６２】
したがって、一実施形態において、ＨＡクロマトグラフィーまたはフルオロアパタイトクロマトグラフィーの添加物の脱塩は、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）を用いて達成される。この技法は、サイズに基づいて分子を分離する。一般に、高分子量成分のサイズがビーズポアに入ることができないことから、高分子量成分は、より小型の分子よりも容易にカラムを通って移動することができる。したがって、低分子量成分は、カラムを通過するのにより長い時間がかかる。このように不要な塩類などの低分子量物質を、対象のペプチドから分離することができる。
【０２６３】
例示的な一実施形態において、カラム材料は、デキストラン、アガロース、およびポリアクリルアミドゲルから選択され、ゲルは、種々の粒径を特徴とする。別の例示的な実施形態において、材料は、硬質の水相溶性サイズ排除材料から選択される。本発明の例示的なゲル濾過樹脂は、セファロースＧ−２５樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。
【０２６４】
例示的な一実施形態において、カチオン交換クロマトグラフィーに続いて（例えば、ソース１５Ｓクロマトグラフィー後に）脱塩が実施される。
【０２６５】
溶出緩衝液へのアミノ酸の添加
一実施形態において、ＨＡ樹脂またはフルオロアパタイト樹脂から対象のペプチドを溶出させるために用いられる溶出緩衝液にアミノ酸が添加される。例示的な一実施形態において、アミノ酸は、約５ｍＭから約５０ｍＭ、約１０ｍＭから約４０ｍＭ、好ましくは、約１５ｍＭから約３０ｍＭ、より好ましくは、約２０ｍＭの最終濃度で溶出緩衝液に添加される。
【０２６６】
一実施形態において、アミノ酸の添加なしで得られた回収と比較すると、溶出緩衝液へのアミノ酸（例えば、グリシン）の添加により、ＨＡクロマトグラフィーからペプチドのステップ回収率が増加する。例示的な一実施形態において、ペプチドの回収率は、少なくとも約１％から約２０％、少なくとも約１％から約１５％、少なくとも約１％から約１０％、好ましくは、少なくとも約１％から約７％、より好ましくは、約５％のアミノ酸の添加により増加する。
【０２６７】
別の例示的な実施形態において、アミノ酸（例えば、グリシン）の添加により、精製されたペプチドの溶出ピークがよりシャープになる。したがって、ピークの末端画分におけるペプチドの回収が少なくなり、主要ピークにおけるペプチドの回収が多くなる。別の例示的な実施形態において、アミノ酸（例えば、グリシン）の添加により、ＨＡクロマトグラフィーからの生成物の純度は減少しない。
【０２６８】
例示的な一実施形態において、アミノ酸はグリシンである。好ましい一実施形態において、グリシンは、最終濃度が２０ｍＭで溶出緩衝液に添加される。
【０２６９】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、表面疎水性の相違に基づいて生体分子を分離する液体クロマトグラフィー技法である。例えば、ポリペプチド表面に露出した疎水性アミノ酸側鎖は、ＨＩＣマトリックス上の疎水性部分と相互作用することができる。露出した疎水性アミノ酸の量は、ポリペプチド間で異なることから、ＨＩＣゲルと相互作用するポリペプチドの能力も異なる。生体分子とＨＩＣマトリックスの間の疎水性相互作用は、一般にイオン強度の高い緩衝液により増強するので、生体分子のＨＩＣは、高塩濃度で実施されることが非常に多い。次にカラムから対象のペプチド溶出は、塩勾配を減少させることによって開始される。
【０２７０】
一実施形態において、種々のポリペプチドグリコフォームの最適な分離のために、ＨＩＣ樹脂が選択される。本発明の方法に有用な例示的なＨＩＣ樹脂は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、編集者Ｈａｒｒｉｓ  ＥＬＶ、Ａｎｇａｌ  Ｓ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ、英国（１９８９）２２４頁；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、編集者Ｊａｎｓｏｎ  ＪＣ、Ｒｙｄｅｎ  Ｌ、ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、独国（１９８９）２０７〜２２６頁；Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、編集者Ｓｈｕｋｌａ  ＡＡ、Ｅｔｚｅｌ  ＭＲ、Ｇａｄａｍ  Ｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ（２００７）、１９７〜２０６頁、Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ２００７年（１１−００１２−６９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ２００７年（１８−１１３２−２９）およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（第２版１９９８年）、編集者Ｊａｎｓｏｎ  Ｊ−ＣおよびＲｙｄｅｎ  Ｌ．、「Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」２８３頁に記載されており、それらの開示は、参照としてそれらの全体が本明細書に援用されている。
【０２７１】
ＨＩＣ媒体は、粒径（例えば、ビーズサイズ）、ポアサイズおよびＨＩＣマトリックス上の疎水性部分の密度（例えば、低置換または高置換）により、媒体が担持する疎水性部分によって区別される。例示的な一実施形態において、カラムマトリックスの疎水性部分は、アルキル基、芳香族基およびエーテルから選択されるメンバーである。例示的な疎水性アルキル基としては、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、およびｎ−オクチルなどの低級アルキル基が挙げられる。例示的な芳香族基としては、置換および非置換フェニルが挙げられる。
【０２７２】
別の例示的な実施形態において、ＨＩＣ媒体のマトリックスは、アガロース、セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ポリスチレン、ジビニルベンゼン、およびそれらの組合せから選択されるメンバーである。例示的なＨＩＣ樹脂としては、低置換型または高置換型のＢｕｔｙｌ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗおよびＰｈｅｎｙｌ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が挙げられる。好ましい一実施形態において、ＨＩＣ樹脂はフェニル樹脂である。特定の例において、ＨＩＣ樹脂はＰｈｅｎｙｌ  ６５０ＳまたはＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍ（例えば、Ｔｏｓｏｈａａｓ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）である。
【０２７３】
一例において、ＨＩＣ媒体は、以下の市販樹脂から選択される：
ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＨＩＣ樹脂：
ブチルセファロース４ＦＦ（Butyl Sepharose 4 FF）
ブチル−ＳセファロースＦＦ（Butyl-S Sepharose FF）
オクチルセファロース４ＦＦ（Octyl Sepharose 4 FF）
フェニルセファロースＢＢ（Phenyl Sepharose BB）
フェニルセファロースＨＰ（Phenyl Sepharose HP）
フェニルセファロース６ＦＦハイサブ（Phenyl Sepharose 6 FF High Sub）
フェニルセファロース６ＦＦローサブ（Phenyl Sepharose 6 FF Low Sub）
ソース１５ＥＴＨ（Source 15ETH）
ソース１５ＩＳＯ（Source 15ISO）
ソース１５ＰＨＥ（Source 15PHE）
Ｃａｐｔｏフェニル（Capto Phenyl）（プロトタイプ樹脂）
Ｃａｐｔｏブチル（Capto Butyl）（プロトタイプ樹脂）
ストリームラインフェニル（Streamline Phenyl）
Ｔｏｓｏｈａａｓ  ＨＩＣ樹脂：
ＴＳＫエーテル５ＰＷ（TSK Ether 5PW）（２０μｍおよび３０μｍ）
ＴＳＫフェニル５ＰＷ（TSK Phenyl 5PW）（２０μｍおよび３０μｍ）
Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ、ＭおよびＣ（Phenyl 650S, M, and C）
Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｓ、ＭおよびＣ（Butyl 650S, M and C）
ヘキシル−６５０ＭおよびＣ（Hexyl-650M and C）
エーテル−６５０ＳおよびＭ（Ether-650S and M）
ブチル−６００Ｍ（Butyl-600M）
スーパーブチル−５５０Ｃ（Super Butyl-550C）
ＰＰＧ−６００Ｍ（PPG-600M）
Ｗａｔｅｒｓ  ＨＩＣ樹脂：
ＹＭＣ−パックオクチルカラム（YMC-Pack Octyl Columns）−ポアサイズ１２０、２００、３００Ａを有する３、５、１０Ｐ、１５および２５μｍ
ＹＭＣ−パックフェニルカラム（YMC-Pack Phenyl Columns）−ポアサイズ１２０、２００、および３００Ａを有する３、５、１０Ｐ、１５および２５μｍ
ＹＭＣ−パックブチルカラム（YMC-Pack Butyl Columns）−ポアサイズ１２０、２００、および３００Ａを有する３、５、１０Ｐ、１５および２５μｍ
ＣＨＩＳＳＯ社  ＨＩＣ樹脂：
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅブチル（Cellufine Butyl）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅオクチル（Cellufine Octyl）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅフェニル（Cellufine Phenyl）
ＪＴ  Ｂａｋｅｒ  ＨＩＣ樹脂：
ＷＰ  ＨＩ−プロピル（Ｃ３）（WP HI-Propyl (C3)）
Ｂｉｏｒａｄ  ＨＩＣ樹脂：
Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ｔ−ブチル（Macroprep t-Butyl）
Ｍａｃｒｏｐｒｅｐメチル（Macroprep methyl）
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＨＩＣ樹脂：
高密度フェニル−ＨＰ２  ２０μｍ（High Density Phenyl - HP2 20um）
【０２７４】
さらなる例示的な一実施形態において、ＨＩＣ媒体に添加されるポリペプチドコンジュゲートの量は、約０．０５ｍｇコンジュゲート／ｍＬ樹脂から約１．０ｍｇコンジュゲート／ｍＬ樹脂の間である。一例において、ポリペプチドコンジュゲートの添加量は、約０．０５ｍｇコンジュゲート／ｍＬ樹脂から０．３ｍｇコンジュゲート／ｍＬ樹脂の間で選択される。別の例において、ＨＩＣ媒体は、約０．１ｍｇコンジュゲート／ｍＬ樹脂から約０．２ｍｇコンジュゲート／ｍＬ樹脂の間（例えば、０．１５〜０．１８ｍｇ／ｍＬ）で添加される。別の実施形態において、ＨＩＣカラムに添加されるポリペプチドコンジュゲートの量は、ペプチドコンジュゲートの回収およびグリコフォームの分解能に関して最適化される。ポリペプチドコンジュゲートがＥＰＯ−ＰＥＧ３である一実施形態において、ＨＩＣ添加条件は、約８％未満、好ましくは、約７％未満、さらに好ましくは、約６％未満、さらにより好ましくは、約５％未満、最も好ましくは、約４％未満のＥＰＯ−ＰＥＧ２を含むＨＩＣ溶出液を作製するために選択される。
【０２７５】
一実施形態において、負荷緩衝液（精製されたポリペプチドコンジュゲートがＨＩＣカラムに適用される緩衝液）は、精製されたポリペプチドコンジュゲートをＨＩＣ媒体に結合させるために選択される。次に未結合の不純物は、ＨＩＣ洗浄用緩衝液を用いてカラムから洗浄する。その結果、ポリペプチドコンジュゲートは、ＨＩＣ溶出緩衝液を用いて溶出される。
【０２７６】
例示的な一実施形態において、ＨＩＣ負荷緩衝液、ＨＩＣ洗浄用緩衝液およびＨＩＣ溶出緩衝液の各々は、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）およびリン酸ナトリウムなどの１種または複数種の塩類を含有する。これらおよび他の塩類に関する濃度範囲は一般に、精製されるポリペプチドコンジュゲートの最適な結合に作用するように各タイプのＨＩＣ樹脂に関して最適化される。
【０２７７】
一実施形態において、ＨＩＣ負荷緩衝液は、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）または硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。例示的な実施形態において、負荷緩衝液中の硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムの濃度は、約１００ｍＭから約１２００ｍＭである。別の例示的な実施形態において、ＨＩＣ負荷緩衝液中の硫酸ナトリウムの濃度は、約３００ｍＭから約１１００ｍＭ、約３００ｍＭから約１０００ｍＭ、約３００ｍＭから約９００ｍＭ、約３００ｍＭから約８００ｍＭ、約３００ｍＭから約７００ｍＭ、約３００ｍＭから約６００ｍＭまたは約３００ｍＭから約５００ｍＭである。さらに別の実施形態において、ＨＩＣ負荷緩衝液中の硫酸ナトリウムの濃度は、約４００ｍＭから約８００ｍＭである。さらなる例示的な実施形態において、ＨＩＣ負荷緩衝液中の硫酸ナトリウムの濃度は、約５００ｍＭから約７００ｍＭ、好ましくは、約６００ｍＭである。
【０２７８】
一実施形態において、ＨＩＣ負荷緩衝液、ＨＩＣ洗浄用緩衝液およびＨＩＣ溶出緩衝液は、リン酸ナトリウムを含む。一例において、これら緩衝液のいずれかにおけるリン酸ナトリウムの濃度は、約５ｍＭから約７０ｍＭの間で選択される。別の例において、ＨＩＣ洗浄用緩衝液中のリン酸ナトリウムの濃度は、約１０ｍＭから約５０ｍＭの間、約１０ｍＭから約３０ｍＭの間または約２０ｍＭから約３０ｍＭの間で選択される。特定の例において、ＨＩＣ洗浄用緩衝液および溶出緩衝液中のリン酸ナトリウムの濃度は、約２５ｍＭである。
【０２７９】
別の例示的な実施形態において、ＨＩＣ洗浄用緩衝液は、約４．０から約８．０のｐＨを有する。一例において、ＨＩＣ洗浄用緩衝液のｐＨは、約５．０から約８．０までから選択される。別の例において、ｐＨは、約６から約８までから選択される。さらに別の例において、ｐＨは、約６．５から約８．０までから選択される。さらなる一実施形態において、ＨＩＣ洗浄用緩衝液のｐＨは、約７．０から約８．０、約７．０から約７．９、約７．０から約７．８、約７．０から約７．７、約７．０から約７．６、または約７．０から約７．５までから選択される。特定の例において、ＨＩＣ洗浄用緩衝液のｐＨは、約７．５である。
【０２８０】
一実施形態において、精製されたポリペプチドコンジュゲートを、硫酸ナトリウム濃度を減少させる勾配を用いてＨＩＣ樹脂から溶出させる。場合によって、この溶出緩衝液は、硫酸ナトリウムを含有しない。
【０２８１】
別の実施形態において、ＨＩＣは、各々が少なくとも１つのポリ（アルキレンオキシド）部分に共有結合したポリペプチドグリコフォームを分離するための方法として使用される。一例において、溶出勾配プロフィールは、精製混合物中に含まれた種々のポリペプチドグリコフォームの最適な分離に作用するように選択される。一実施形態において、ＨＩＣ溶出緩衝液は、２５ｍＭのリン酸ナトリウムを含み、リン酸緩衝液中、約６００ｍＭの硫酸ナトリウムから硫酸ナトリウムの無い範囲に亘る勾配および保持時間の組合せを用いてＨＩＣ媒体からポリペプチドコンジュゲートを溶出させる。
【０２８２】
例示的な一実施形態において、ＨＩＣは、アニオン交換クロマトグラフィー後に実施される。一例において、部分的に精製されたポリペプチドコンジュゲートを含有するアニオン交換体からの流液は、疎水性相互作用クロマトグラフィーのために調節される。一例において、アニオン交換体からの流液は、ＨＩＣ用負荷緩衝液として好適な緩衝液により希釈することができる。例えば、アニオン交換体からの流液は、ＨＩＣ添加物中の硫酸ナトリウム濃度（例えば、ポリペプチドコンジュゲートをＨＩＣ媒体に結合させるのに好適な硫酸ナトリウム濃度、例えば、約６００ｍＭ）を調整するために、硫酸ナトリウムを含有する緩衝液により希釈することができる。場合によって、アニオン交換体からの流液は、希釈前に濃縮される。別の例において、アニオン交換体からの流液は、濃縮および／または緩衝液交換のためにダイアフィルトレーション／限外濾過に供される。
【０２８３】
ＩＩＩ．ｈ）例示的な精製処理の説明
本発明の一実施形態において、対象のポリペプチドコンジュゲートは、図１に概説された例示的な精製処理を用いて混合物（例えば、グリコＰＥＧ化反応などの反応混合物）から精製される。第１のステップにおいて、グリコＰＥＧ化反応の生成物は、アニオン交換クロマトグラフィー／濾過（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ樹脂を用いて）に供される。一例において、不純物が、アニオン交換媒体によって結合する一方、精製されたポリペプチドコンジュゲートは流液中に見られる。一実施形態において、このアニオン交換ステップは、アニオン交換手法に先立って実施されたグリカン再構築および／または糖修飾（例えば、グリコＰＥＧ化）反応に用いられた触媒酵素を除去するために有用である。一例において、アニオン交換ステップは、グリコＰＥＧ化反応混合物に含まれた少なくとも１種のグリコシルトランスフェラーゼからポリペプチドコンジュゲートを単離するために有用である。
【０２８４】
第２のステップにおいて、部分的に精製されたポリペプチドコンジュゲートを含有するアニオン交換ステップの流液が調節され、次いで疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂上に添加される。一例において、ＨＩＣ媒体はＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓである。
【０２８５】
一実施形態において、ＨＩＣ媒体へのポリペプチドコンジュゲートの結合に作用する十分な塩濃度を含むＨＩＣ添加サンプルを生成するためにアニオン交換流液が調節される。一実施形態において、アニオン交換流液は、硫酸ナトリウムを含有する緩衝液により希釈される。一実施形態において、希釈用緩衝液は、約５００ｍＭから約７００ｍＭの間の硫酸ナトリウム濃度を有するＨＩＣ添加サンプルを生成するのに十分な硫酸ナトリウムを含有する。一例において、ＨＩＣ添加サンプルが、約６００ｍＭの硫酸ナトリウムを含むように、アニオン交換流液が希釈される。サンプルをカラムに適用した後、ＨＩＣ樹脂は、未結合不純物を溶出させるために洗浄用緩衝液により洗浄される。一例において、ＨＩＣ洗浄用緩衝液はリン酸緩衝液である。別の例において、ＨＩＣ洗浄用緩衝液は、約７．５のｐＨで約２５ｍＭのリン酸緩衝液を含有する。
【０２８６】
洗浄後、溶出緩衝液を用いて、ポリペプチドコンジュゲートをＨＩＣ媒体から溶出させる。一例において、ポリペプチドコンジュゲートは、リン酸緩衝液（例えば、７．５のｐＨで２５ｍＭのリン酸ナトリウム）およびリン酸緩衝液中、硫酸ナトリウムを減少させる勾配を用いてＨＩＣ媒体から溶出される。一例において、コンジュゲートは、約６００ｍＭから約０ｍＭの硫酸ナトリウムまでの勾配を用いて溶出される。溶出液画分を集め、場合によって、生成物含量を分析する。生成物含有画分をプールし、得られたＨＩＣプールを、カチオン交換媒体上に添加するために場合によって調節する。
【０２８７】
一実施形態において、ＨＩＣプールを濃縮し、ダイアフィルトレーションを用いて緩衝液を交換する。一例において、ダイアフィルトレーション膜は、１０ｋＤａのＭＷＣＯを有する。別の例において、ＨＩＣプールの容量は、元の容量の約１／３０から約１／１０の間に減少させる。特定の例において、ＨＩＣプールの容量は、元の容量の約１／２０に減少させる。次いで例えば、新たな緩衝液によりサンプルを希釈し、引き続きサンプルを再濃縮することによって緩衝液を交換することができる。新たな緩衝液が所望の組成（例えば、所望の塩導電率）を有するまで、希釈および再濃縮ステップを反復（例えば、２〜６回）することができる。
【０２８８】
部分的に精製されたポリペプチドコンジュゲートを、２ステップの緩衝液交換を用いて所望の緩衝液に移すことができる。第１の緩衝液交換ステップにおいて、緩衝液を、硫酸ナトリウムを含まないリン酸緩衝液に変換させることができる。生じたコンジュゲート溶液のｐＨは、場合によって調整することができる（例えば、酢酸ナトリウムを用いて）。第２の緩衝液交換ステップにおいて、緩衝液は、カチオン交換体上への添加に好適な緩衝液系に変換することができる。例えば、第２の緩衝液は、約５．４のｐＨで約１０ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことができる。別の例において、カチオン交換ステップのための負荷緩衝液は、約１．０ｍＳ／ｃｍから約３．０ｍＳ／ｃｍの間（例えば、約１．５ｍＳ／ｃｍ）の塩導電率を有する。
【０２８９】
第３のステップにおいて、ダイアフィルトレートされたＨＩＣプールを、カチオン交換に供する。一実施形態において、カチオン交換体はソース１５Ｓである。一例において、カチオン交換媒体は、精製されたポリペプチドコンジュゲートの中の不要なグリコフォームの含量をさらに減少させるために有用である。
【０２９０】
一例において、部分的に精製されたポリペプチドコンジュゲートをカチオン交換媒体に適用し、不要な不純物が、カチオン交換洗浄用緩衝液（例えば、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４）を用いて溶出される。次に結合したポリペプチドコンジュゲートが、カチオン交換溶出緩衝液を用いて溶出される。一実施形態において、コンジュゲートは、上記洗浄用緩衝液中のＮａＣｌ濃度を増加して溶出させる。例えば、コンジュゲートを、０〜０．５ＭのＮａＣｌの勾配を用いて溶出させる。一実施形態において、グリコフォーム最適化分解能のために、勾配と保持時間の組合せを含み得る勾配溶出プロフィールが選択される。溶出液画分が集められ、場合によって分析される（例えば、生成物含量および純度に関して）。選択された生成物含有画分をプールしてカチオン交換プールを形成する。
【０２９１】
一実施形態において、カチオン交換プールを濃縮し、保存用緩衝液中にダイアフィルトレートする。一例において、このダイアフィルトレーションステップには、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜も使用される。一実施形態において、カチオン交換プールの容量を、その元の容量の約１／１００から約１／２５（例えば、その元の容量の約１／５０）に減少させる。次いで濃縮されたカチオン交換プールは、例えば、サンプルを新たな緩衝液で希釈し、引き続きサンプルを再濃縮することにより、緩衝液交換に供される。新たな緩衝液が所望の組成を有するまで、希釈および再濃縮ステップを反復（例えば、２〜６回）することができる。最終濃縮水が、保存用緩衝液中に再構成される。例示的な保存用緩衝液は、生理的な範囲内の塩化ナトリウム濃度を有するものである。例えば、保存用緩衝液は、約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む酢酸ナトリウム緩衝液であり得る。濃縮された生成物プールは、保存用緩衝液中に再構成されて所望のペプチド濃度に達する。一実施形態において、最終コンジュゲート濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬから約２ｍｇ／ｍＬの間で選択される。最終溶液は、例えば、セルロースアセテート膜を通して場合によって滅菌濾過される。
【０２９２】
図１に概説された精製処理は、追加のクロマトグラフィーステップを場合によって含むことができる。一実施形態において、処理は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーステップまたはフルオロアパタイトクロマトグラフィーステップを含む。一例において、アパタイトクロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィー後に実施される。別の例において、アパタイトクロマトグラフィーは、ＨＩＣ後に実施される。なお別の例において、アパタイトクロマトグラフィーは、カチオン交換クロマトグラフィー後に実施される。部分的に精製されたポリペプチドコンジュゲート溶液は、例えば、サイズ排除カラム（例えば、Ｇ２５）を用いて脱塩し、アパタイトクロマトグラフィーのための調製においてコンジュゲート溶液の塩導電率を低下させることができる。
【０２９３】
例示的な一実施形態において、上記処理により精製されたポリペプチドコンジュゲートは、ＥＰＯコンジュゲートである。
【０２９４】
ＩＩ．組成物
別の態様において、本発明は、本発明の方法により製造された組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、第１のポリペプチドコンジュゲートを含む組成物を提供し、前記第１のポリペプチドコンジュゲートは、第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を有し、ポリ（アルキレンオキシド）部分の各々は、完全形のグリコシル結合基を介して第１のポリペプチドに共有結合している。組成物は、（ａ）第１のポリペプチドコンジュゲートを含む混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および（ｂ）第１のポリペプチドコンジュゲートを疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から溶出させることを含む方法によって製造される。
【０２９５】
別の態様において、本発明は、第１のポリペプチドに共有結合した第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む第１のポリペプチドコンジュゲートを、第２のポリペプチドに共有結合した第２の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を含む第２のポリペプチドコンジュゲートから分離することを含む方法により製造された、単離された第１のポリペプチドコンジュゲートを提供する。一実施形態において、第１の数は１〜２０から選択され、第２の数は０〜２０から選択される。別の実施形態において、第１の数と第２の数は異なる。２種のポリペプチドコンジュゲートは、（ａ）第１のポリペプチドコンジュゲートおよび第２のポリペプチドコンジュゲートを含む混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および（ｂ）第１のポリペプチドコンジュゲートを疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から溶出させることによって分離される。
【０２９６】
一例において、上記実施形態のいずれかに従って、第１のポリペプチドは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質１５（ＢＭＰ−１５）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）プロテアーゼ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、α１−アンチトリプシン（α−１プロテアーゼ阻害因子）、グルコセレブロシダーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトＤＮａｓｅ、インスリン、Ｂ型肝炎表面タンパク質（ＨｂｓＡｇ）、キメラジフテリア毒素−ＩＬ―２、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、アルファ−ガラクトシダーゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、酸α−グルコシダーゼ（酸マルターゼ）、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ−７）、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）、線維芽細胞成長因子２３（ＦＧＦ−２３）、因子Ｘ、因子ＸＩＩＩ、プロキネチシン、エクステンジン−４、ＣＤ４、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）、α−ＣＤ２０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存細胞接着分子（ＧｌｙＣＡＭ）、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ領域融合タンパク質、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、呼吸器合胞体ウイルスに対するモノクローナル抗体、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質Ｆに対するモノクローナル抗体、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体、ＶＥＧＦ−Ａに対するモノクローナル抗体、ＰＳＧＬ−１に対するモノクローナル抗体、ＣＤ４に対するモノクローナル抗体、ａ−ＣＤ３に対するモノクローナル抗体、ＥＧＦに対するモノクローナル抗体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するモノクローナル抗体およびＩＬ−２受容体に対するモノクローナル抗体から選択されるメンバーである。上記ポリペプチドのいずれの変異体もまた、本発明の範囲内にある。
【０２９７】
さらに別の態様において、本発明は、第１のエリスロポエチン（ＥＰＯ）コンジュゲートを含む組成物を提供し、第１のＥＰＯコンジュゲートは、グリコシル結合基（例えば、完全形のグリコシル結合基）を介してＥＰＯポリペプチドに共有結合した第１の数のポリ（アルキレンオキシド）部分を有する。組成物は、（ａ）第１のＥＰＯコンジュゲートを含む混合物をアニオン交換媒体と接触させること；（ｂ）アニオン交換媒体から第１のＥＰＯコンジュゲートを溶出させて、第１のＥＰＯコンジュゲートを含む第１の溶出液を形成すること；（ｃ）第１の溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体と接触させること；および（ｄ）第１のＥＰＯコンジュゲートを疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から溶出させることを含む方法によって製造される。
【０２９８】
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって製造された組成物を含む医薬製剤および薬学的に許容できる担体を提供する。一実施形態において、医薬製剤は、本発明の方法によって製造された単離されたポリペプチドコンジュゲートおよび薬学的に許容できる担体を含む。本実施形態による一例において、単離されたポリペプチドコンジュゲートはＥＰＯコンジュゲートである。
【０２９９】
ＩＩＩ．治療方法
別の態様において、本発明は、本発明の方法によって製造された組成物（例えば、単離されたポリペプチドコンジュゲート）を利用する治療方法を提供する。一実施形態において、本発明は、状態の治療を必要とする対象において状態を治療する方法であって、状態は、対象の赤血球産生不全を特徴とし、この方法は、対象における状態を寛解させるのに有効な量の本発明の組成物を対象に投与することを含む。一例において、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。別の例において、組成物は、本発明の方法によって製造されたＥＰＯコンジュゲートを含む。
【０３００】
別の実施形態において、本発明は、組織傷害の治療を必要とする対象において組織傷害を治療する方法を提供する。一例において、傷害は、虚血、外傷、炎症および毒性物質との接触から選択されるメンバーにより引き起こされる。この方法は、組織傷害に関連する損傷を寛解させるのに有効な量の本発明の方法により製造された組成物（例えば、単離されたポリペプチドコンジュゲート）を対象に投与することを含む。一例において、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。別の例において、組成物は、本発明の方法により製造されたＥＰＯコンジュゲートを含む。
【０３０１】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物において赤血球産生を増強する方法を提供し、前記方法は、本発明の方法により製造された組成物を前記哺乳動物に投与することを含む。一例において、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。別の例において、組成物は、本発明の方法により製造されたＥＰＯコンジュゲートを含む。
【０３０２】
以下の実施例は、本発明の方法を例示するために提供されるが、請求された発明を限定するものではない。
【実施例】
【０３０３】
分析方法
タンパク質の濃度測定
タンパク質の濃度は、ＵＶ法（２８０ｎｍ）を用いて測定したか、または製造元の取扱説明書（Ｐｉｅｒｃｅ）に従ってＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキットを用いて測定した。
【０３０４】
導電率測定
処理サンプルおよび緩衝液の導電率は、製造元の取扱説明書に従って導電率プローブ（ＶＷＲ  ２０５２）を用いて測定した。
【０３０５】
ＥＰＯ−ＰＥＧ純度およびＰＥＧ状態のアッセイ（Ｃ３  ＲＰ−ＨＰＬＣ）
ＥＰＯ−ＰＥＧ体［ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４］の各々の比率は、Ｃ３  ＲＰ  ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ３、１５０×２．１ｍｍ、５ミクロン、４５℃）を用いて測定した。ＨＰＬＣは、以下の溶液：Ａ、水中０．１％ＴＦＡ、およびＢ、ＡＣＮ中０．０９％ＴＦＡを用いて実施した。移動相は、１４分に亘り４２〜５５％のＢ、２分に亘り５５〜９５％のＢ、９５％のＢで２分の洗浄、次いで２分に亘り９５〜４２％のＢの勾配として実施した。クロマトグラフィーの全実施時間は、０．６ｍＬ／分の流速を用いて３０分であった。試験システムの適性に対する参照標品として混合物１を用いた。タンパク質に基づいて５μｇから１０μｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の標準的な注入濃度を提供するために、注入容量を変えた。２１４ｎｍでのタンパク質の吸光度を検出し、ＥＰＯ種のピーク面積を用いてタンパク質純度を測定した。３２カラットソフトウェアを用いて全てのピークを積算した。一般にＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４のピークは、面積が小さいため正確には積算できなかった。
【０３０６】
ＳＥＣ  ＨＰＬＣによるタンパク質純度および凝集
ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３のイソ型純度および凝集を、ＳＥＣ  ＨＰＬＣクロマトグラフィー（ＴＳＫゲルＧ５０００ＰＷ×Ｌ、７．８×３００ｎｍ、１０ミクロン、４℃）により測定した。定組成移動相（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）を用い、０．５ｍＬ／分の流速で方法を実施した。
【０３０７】
［実施例１］
疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いるグリコＰＥＧ化ＥＰＯ精製用精製処理の開発
本実施例では、グリコＰＥＧ化反応混合物からＥＰＯコンジュゲートを単離するための単離処理の開発を記載する。もたらされた処理は、全ＥＰＯコンジュゲートの高回収率を特徴とし、高純度で所望のＥＰＯコンジュゲート［ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３］を産生する。処理により製造された組成物には、モノ−、ジ−およびテトラ−ＰＥＧ化ＥＰＯコンジュゲートなど、他のＥＰＯ−ＰＥＧグリコフォームは本質的に存在しない。
【０３０８】
所望のＥＰＯ−ＰＥＧコンジュゲートは、３つのモノアンテナＮ−結合グリカンの各々に接続した３つの１０ｋＤａ  ｍＰＥＧ基を含有するグリコＰＥＧ化エリスロポエチンタンパク質である。ＥＰＯポリペプチドは、バキュロウイルス感染プロトコルを用いてＳｆ９細胞からタンパク質の発現により産生させる。昆虫細胞発現系は、Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８およびＡｓｎ８３において３つのＮ−結合グリカンを有するＥＰＯを産生し、各々が主たる化学種としてトリマンノシルコアを含有する。他の種々のグリカン構造は少量で存在し、発酵条件によって変わる。他の構造は、追加のＧｌｃＮＡｃ、高級マンノース体（Ｍａｎ４、Ｍａｎ５）、欠失グリカン類およびエンドグリコシダーゼ型（エンド−Ｈ）活性の結果として生じるＧｌｃＮＡｃ−（Ｆｕｃ）スタブを有するトリマンノシルコアを含む。小パーセンテージのＥＰＯ分子は、Ｓｅｒ１２６においてＯ−結合グリカン類を含有する。ごく低濃度（＜１％）のホスホリルコリン結合グリカン（ＰＣ−グリカン）もまた、昆虫細胞由来のＥＰＯにおいて同定されている。ＭＢＰ−ＧｎＴ１、ＭＢＰ−ＧａｌＴ１、およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａを有するＭＢＰ−ＳＴ３Ｇａｌ３またはＳＴ３Ｇａｌ３によるグリコＰＥＧ化の際の主たる生成物は、３つのＰＥＧ化モノアンテナＮ−結合グリカンを含有するＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３である。１つまたは複数のグリカンを欠くか、または１つまたは複数のＧｌｃＮＡｃスタブグリカンを含有するＥＰＯ体から生じるＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜２もまた、より少ない量で存在する。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４（およびより高級なもの）は、ごく低容量で産生される。これらの高級ＰＥＧ化種は、Ｍａｎα１，６分枝上に追加のＧｌｃＮＡｃを有するトリ−マンノシルコアを含有するＥＰＯグリコフォームのグリコＰＥＧ化から生じると考えられている。反応条件下でこれらグリカン双方の分枝が増加構築されてＰＥＧ化され、テトラ−ＰＥＧ（またはより高級）ＥＰＯ種上にビアンテナのＰＥＧ化グリカンを得ることができる。例示的なＥＰＯグリコフォームは、図３に示されている。
【０３０９】
逆相クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＳＰ−セファロースＨＰ上で）を用いて単離されたグリコＰＥＧ化ＥＰＯは、約８５％以上のＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３、約３〜１４％のＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２、約１〜８％のＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４〜６および約１％以下のＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１を含有する組成物を提供した。上記組成物は、下記において混合物１と称される。
【０３１０】
有機溶媒を使用しないがＥＰＯグリコフォームを溶解させることができる別のクロマトグラフィーステップを、逆相クロマトグラフィーステップの代わりに使用する取り組みが行われた。大量の有機溶媒は、環境問題に関連し、生物学的薬剤製品を処理する特定の施設において使用することができない。さらに、高濃度の有機溶媒（例えば、アセトニトリル）を用いる溶液中ではＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３などのＥＰＯ−ＰＥＧコンジュゲートの安定性に問題がある。逆相クロマトグラフィーステップの可能性のある代替ステップとして、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を調べた。
【０３１１】
ＨＩＣは、グリコＰＥＧ化処理（例えば、イソ型ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４の分画）から生じる混合物中に含まれた種々のＰＥＧ状態（グリコフォーム）を分離することができることが発見された。ＨＩＣ精製法は、種々のＨＩＣ樹脂および処理パラメータを評価することによって最適化された。Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ樹脂（例えば、Ｔｏｓｏｈａａｓ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）に基づく処理は、新規な単離処理へ組み込むために選択された。
【０３１２】
また、グリコＰＥＧ化反応の酵素成分を除去するために有用であるアニオン交換ステップが、新規な処理に組み込まれた。酵素は、アニオン交換媒体と結合する一方、ＥＰＯ−ＰＥＧコンジュゲートのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜６は、流液中に見られる。
【０３１３】
１．１．方法
疎水性相互作用クロマトグラフィー条件（最初の樹脂スクリーン）
最初のＨＩＣ樹脂スクリーニング実験は、ビーズの高さ５ｃｍに充填されたＴｒｉｃｏｒｎ５カラムを用いて実施した。選択された疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂は、下表１に要約している。
【０３１４】
【表１】
2010505874.tif 000036
【０３１５】
適切な樹脂（表１）の１ｍＬ（０．５ｃｍ×５ｃｍ）を充填したＴｒｉｃｏｒｎ５カラムまたは予め充填したＨｉＴｒａｐカラム（１ｍＬ、０．７ｃｍ×２．５ｃｍ）を、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に取り付けた。生成物の溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度によりモニターした。各カラムを、５カラム容量（ＣＶ）の緩衝液Ｂ（表１に示されるように）により平衡にした。混合物１（１００ｍｃｇ、２５０ｍｃＬ）を、１ｍＬの緩衝液Ｂで１．２５ｍＬに希釈し、２ｍＬのサンプルループを用いて注入した。未結合物質を５ＣＶの緩衝液で洗浄した。緩衝液Ａ（表１に示されるような）を用いて、以下の勾配溶出：２０ＣＶに亘って１００〜０％の緩衝液Ｂ、次いで５ＣＶで０％の緩衝液Ｂにより、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３を溶出させた。全てのステップを０．６４ｍＬ／分（１９６ｃｍ／時間）で実施した。生じたクロマトグラムを比較し、選択された画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＥＰＯ−ＰＥＧコンジュゲートを保持する能力、種々のグリコフォームおよびピーク形状を分解する能力に関して樹脂を選択した。
【０３１６】
１．２．結果
以下の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂；Ｂｕｔｙｌ−ＦＦ、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ−ＦＦ、Ｏｃｔｙｌ−ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ−ＦＦ  Ｈｉｇｈ  ｓｕｂおよびＰｈｅｎｙｌ−ＦＦ  Ｌｏｗ  ｓｕｂを、緩衝液Ｂ：２５ｍＭのリン酸Ｎａ、１Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０中の混合物１を注入することにより最初に試験した。試験条件下、混合物１の結合および溶出に関してはＰｈｅｎｙｌ−ＦＦ低置換が、最良の樹脂であると思われた。混合物１は、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ−ＦＦ、Ｂｕｔｙｌ−ＦＦ、Ｏｃｔｙｌ−ＦＦにより結合せず、Ｐｈｅｎｙｌ−ＦＦ  Ｈｉｇｈ  ｓｕｂは、混合物１にかなり密に結合し、溶出ピークは、極めてブロードであった（約１５ＣＶ）。
【０３１７】
ＨＩＣ調査の第２ラウンドにおいて、結合用緩衝液（負荷緩衝液）として、２５ｍＭのリン酸Ｎａ、１Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０または２５ｍＭのリン酸Ｎａ、４Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０のいずれかを用いて、Ｐｈｅｎｙｌ−ＦＦ  Ｌｏｗ  ｓｕｂを、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０ＭおよびＢｕｔｙｌ  ６５０Ｍと比較した。Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍは、硫酸アンモニウムによってのみ試験し、極めて幅広くテイリングなピークを生じた。Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０ＭおよびＰｈｅｎｙｌ−ＦＦ  ｌｏｗ  ｓｕｂは、硫酸ナトリウムを用いると、より対称的なピーク形状を有した。塩化ナトリウムを使用すると、極めてブロードな溶出ピークが生じた。
【０３１８】
ＨＩＣ試験の第３ラウンドでは、混合物１のＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍの精製を種々の緩衝液で比較する。緩衝液Ｂ：１Ｍの硫酸Ｎａ＋０．５ＭのＮａＣｌ＋２０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０を試験した。というのは、この条件が、ＰＥＧ化に先立って、ＥＰＯ中間体の精製に有効であったからである。この条件により、０．５ＭのＮａＣｌなしの同じ緩衝液（１Ｍの硫酸Ｎａ＋２０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０）でのように、多数のバンプを伴うブロードな溶出ピークが得られた。４ＭのＮａＣｌ＋緩衝液Ａ、ｐＨ７．０を用い、カラムに結合した混合物１を用いてＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍを試験し、２５ｍＭのリン酸Ｎａ、２０％のエチレングリコール、ｐＨ７．０により溶出を行った。エチレングリコールの添加によって、緩衝液Ｂ中のＮａＣｌから生じるブロード溶出プロフィールは有意に改善しなかった。それ故、条件ＮおよびＱは、他の試験条件よりも優れていることが判明した。製造時に好ましい硫酸ナトリウムによって、硫酸アンモニウムと同じ位に良好か、またはより良好な溶出プロフィールが得られた。
【０３１９】
クロマトグラフィー条件（ＨＩＣ）の最適化
ＴｏｓｏｈａａｓのＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍ樹脂からグリコシルトランスフェラーゼの溶出
Ａ２８０での吸光度を連続的にモニターするＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムに、１ｍＬ（０．５ｃｍ×５ｃｍ）のＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍ樹脂で充填したＴｒｉｃｏｒｎ５カラムを取り付けた。このカラムを、緩衝液Ｂ（１Ｍの硫酸ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）の５カラム容量（ＣＶ）で平衡にした。生成物溶出を、２８０ｎｍでの吸光度によりモニターした。
【０３２０】
以下の物質の４つの個別サンプル注入を、２ｍＬのサンプルループを用いてカラムに適用した：１）１ｍＬの緩衝液Ｂにより１．２５ｍＬに希釈した混合物１（１００ｍｃｇ、２５０ｍｃＬ）。２）１．１２７ｍＬの緩衝液Ｂにより１．２２５ｍＬに希釈したＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ３（９８ｍｃＬ、９８ｍｇ）。３）１．０２９ｍＬの緩衝液Ｂにより１．２２５ｍＬに希釈したＭＢＰ−ＧｎＴ１（１９６ｍｃＬ、５７．４ｍｃｇ）。４）１．０２９ｍＬの緩衝液Ｂにより１．２２５ｍＬに希釈したＭＢＰ−ＧａｌＴ１（１９６ｍｃＬ、１８６ｍｃｇ）。
【０３２１】
各サンプルを注入した後、未結合物質はいずれも、５ＣＶの緩衝液Ｂを用いてカラムから洗浄した。結合物質はいずれも、緩衝液Ａ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いる勾配：２０ＣＶに亘って１００〜０％の緩衝液Ｂ、次いで５ＣＶで０％の緩衝液Ｂ（表１、設定ＩＩＩ、Ｎ）を用いてカラムから溶出させた。クロマトグラフィーの操作は、０．６４ｍＬ／分の流速で実施した。溶出プロフィールを比較し、選択された画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０３２２】
グリコＰＥＧ化酵素を個々にＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍに注入して、以下の条件を用いて混合物１に対する溶出プロフィールを比較した：緩衝液Ａ：２５ｍＭのリン酸Ｎａ、ｐＨ７．０。緩衝液Ｂ：１Ｍの硫酸Ｎａ＋緩衝液Ａ、ｐＨ７．０。溶出勾配：２０ｃｖに亘って１００〜０％Ｂ。ＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ３、ＭＢＰ−ＧｎＴ１およびＭＢＰ−ＧａｌＴ１は全て、勾配の同じ部分において溶出した。混合物１は酵素の直前に溶出させる。混合物１およびグリコＰＥＧ化酵素は、完全には共溶出しないが、混合物１と酵素溶出ピークの先行部分が、重なっているようであった。
【０３２３】
Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍクロマトグラフィーを用いる硫酸ナトリウム濃度の最適化
混合物１をＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍに結合させるのに必要な硫酸ナトリウムの濃度を調べた。Ｔｒｉｃｏｒｎ５カラムに、上記のとおりＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍ樹脂（１ｍＬ、０．５ｃｍ×５ｃｍ）を充填し、Ｖａｒｉａｎ  ＨＰＬＣシステムに取り付けた。各カラムを、下記に掲げた緩衝液の１つの５カラム容量（ＣＶ）で平衡にした。生成物溶出を、２８０ｎｍでの吸光度によりモニターした。
【０３２４】
混合物１（１００ｍｃｇ、１ｍＬの緩衝液Ｂで１．２５ｍＬに希釈した２５０ｍｃＬ）の５つの個別注入を、２ｍＬのサンプルループを用いてカラムに適用した。各クロマトグラフィーは、緩衝液Ｂ中、以下の硫酸ナトリウム濃度のうちの１つを用いた：１）１．０Ｍの硫酸ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；２）０．８Ｍの硫酸ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；３）０．６Ｍの硫酸ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；４）０．４Ｍの硫酸ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；５）０．３Ｍの硫酸ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５。
【０３２５】
未結合物質はいずれも、５ＣＶの緩衝液Ｂを用いてカラムから洗浄した。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３は、緩衝液Ａ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）の勾配：２０ＣＶに亘って１００〜０％の緩衝液Ｂ（勾配変化が５％緩衝液Ｂ／ＣＶ）、次いで５ＣＶで０％の緩衝液Ｂを用いて溶出させた。クロマトグラフィーの操作は、０．６４ｍＬ／分（１９６ｃｍ／時間）の流速で実施した。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３のピーク画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析まで４℃で保存した。
【０３２６】
混合物１をカラムに結合させるために、最少０．４Ｍの硫酸ナトリウムを要した。予想されたように、硫酸ナトリウム濃度が高くなるにつれて、カラム上の保持時間が長くなる。５つ全ての精製操作に関して、同じ勾配傾斜（％Ｂの１分当りの変化）を維持した。緩衝液Ｂの初発濃度が減少するにつれて、実際の勾配（塩濃度／分の変化）はより浅くなった。このことにより、緩衝液Ｂの開始濃度が減少するにつれ、溶出ピーク幅の増加が見られる。
【０３２７】
Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓクロマトグラフィーを用いる硫酸ナトリウムの溶出勾配の最適化
Ｔｒｉｃｏｒｎ５カラムに、上記のとおりＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ樹脂（１ｍＬ、０．５ｃｍ×５ｃｍ）を充填し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムに取り付けた。生成物溶出を、２８０ｎｍでの吸光度によりモニターした。３つの個別の精製を、各々異なる溶出勾配を用いて実施した。各実験からのカラムを、緩衝液Ｂ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５）の５カラム容量（ＣＶ）で平衡にした。
【０３２８】
混合物１（１００ｍｃｇ、２５０ｍｃＬ）を、１ｍＬの緩衝液Ｂで１．２５ｍＬに希釈し、２ｍＬのサンプルループを用いてカラムに注入した。未結合物質はいずれも、５ＣＶの緩衝液Ｂを用いてカラムから洗浄した。緩衝液Ａ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）を用いる以下の勾配の１つを用いて、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の生成物をカラムから溶出した。勾配１：２０ＣＶに亘って１００〜０％の緩衝液Ｂ（勾配変化は５％緩衝液Ｂ／ＣＶ）、次いで５ＣＶに関して０％の緩衝液Ｂ。勾配２：１２ＣＶに亘って１００〜０％の緩衝液Ｂ（勾配変化は８．３３％緩衝液Ｂ／ＣＶ）、次いで５ＣＶに関して０％の緩衝液Ｂ。勾配３：２ＣＶに亘って１００〜６０％の緩衝液Ｂ、１ＣＶに関して保持し、２０ＣＶに亘って６０〜２０％の緩衝液Ｂ（勾配変化は２％緩衝液Ｂ／ＣＶ）、２ＣＶに亘って２０〜０％の緩衝液Ｂ、次いで５ＣＶに関して０％の緩衝液Ｂ。クロマトグラフィーの操作は、０．６４ｍＬ／分の流速で実施した。クロマトグラフィー溶出プロフィールを比較し、選択された画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。試験された３つの勾配プロフィールのうち、勾配３によってＥＰＯ−ＰＥＧ種について最良の分離が提供された。
【０３２９】
処理パラメータの動作範囲（ＴｏｓｏｈａａｓのＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ）
ＥＰＯ−ＰＥＧの分離に対するｐＨの効果
ＥＰＯ−ＰＥＧのＰＥＧ状態を分離するＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓクロマトグラフィーの処理能力に及ぼすｐＨの効果を調べた。Ｔｒｉｃｏｒｎ１０カラムに、１５．７ｍＬ（内径１．０ｃｍ×２０ｃｍ）のＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓを充填した。このカラムを、緩衝液Ｂ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、選択されたｐＨ）の５カラム容量（ＣＶ）で平衡にした。緩衝液ＡおよびＢ双方において、緩衝液のｐＨが６．５、７．０、７．５または８．０であること以外、個々の実験でこの処理を繰り返した。ＥＰＯ−ＰＥＧｘ混合物（０．８ｍｇのＥＰＯタンパク質コンジュゲート；１ｍＬ）溶液を、０．４ｍＬの緩衝液Ａ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、選択されたｐＨ）および０．６ｍＬの緩衝液（２Ｍの硫酸ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、選択されたｐＨ）の添加により０．６Ｍの硫酸ナトリウム濃度に調整した。次にこの溶液を、等容量の緩衝液Ｂで希釈し、サンプル全体（４ｍＬ）をカラム上に注入した。カラムを５ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄し、緩衝液Ａを用いる勾配を用いて生成物を溶出させた。２ＣＶに亘って１００〜６０％の緩衝液Ｂの勾配、１ＣＶで保持、１３ＣＶに亘って６０〜３５％の緩衝液Ｂ、１ＣＶで保持、次いで５ＣＶに関して０％の緩衝液Ｂで溶出させた。クロマトグラフィーの流速は、２．０ｍＬ／分（１５０ｃｍ／時間）であり、カラム溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度によりモニターした。画分（１．６ｍＬ）を、Ｎｕｎｃ９６ウェルのマイクロタイタープレート内に集めた。クロマトグラフィー溶出プロフィールを比較し、選択された画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。生成物プールの分析は、下表２に要約している：
【０３３０】
【表２】
2010505874.tif 000037
【０３３１】
標準的な精製条件（緩衝液Ａ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５。緩衝液Ｂ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５（０．０５ｍｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４／ｍＬ添加樹脂による））を、ｐＨ６．５、７．０および８．０に調製した緩衝液ＡおよびＢによる精製操作と比較した。溶出ピーク（Ａ２８０）は、標準的な溶出条件の左右へ僅かにシフトする。これらＡ２８０トレースのＸ軸は、ピークをオーバーレイさせるようシフトした。Ｘ軸のシフトピークの比較により、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３、およびＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４の溶出に関して同様のピークトレースが示されている。これは特にｐＨ７．０、７．５および８．０に関して当てはまる。ｐＨ６．５の操作では、ピーク最大が僅かに低く、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３ピークとＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４ピークの間の分解能は僅かに低かった。
【０３３２】
上表２では、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の回収、ＭＢＰ−ＥＬＩＳＡ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、およびＳＥＣの分析データを比較している。ｐＨ６．５から８．０の範囲内で精製されたＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３間に有意差は見られなかった。回収率は、６０．３％から６６．７％の間である（ＢＣＡ分析）。ＭＢＰ−ＥＬＩＳＡでは、＜０．０７７〜０．０８５ｍｃｇのＭＢＰ／ｍｇ残存ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３が示される。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析では、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３ピークに残存するＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２の量は、２．５％から４．９％の間であることが示されている。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４の積算は、低濃度では困難であるが、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出される。ＳＥＣ分析により、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の凝集は検出されない。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３プールの各々の純度は同様であることが示されている。しかしながら、ｐＨ６．５での精製物質は、約５０ｋＤａのタンパク質分解バンドをより多量に含有した。ｐＨ７．０での精製物質に関しても、このタンパク質分解生成物は少量検出された。
【０３３３】
ＥＰＯ−ＰＥＧの分離に及ぼすリン酸ナトリウム濃度の効果
ＥＰＯ−ＰＥＧのＰＥＧ状態を分離するＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓクロマトグラフィーの処理能力に及ぼすリン酸ナトリウム濃度の効果を調べた。Ｔｒｉｃｏｒｎ１０カラムに、１５．７ｍＬ（内径１．０ｃｍ×２０ｃｍ）のＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓを充填した。このカラムを、緩衝液Ｂ（種々の濃度のリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５）の５カラム容量（ＣＶ）で平衡にした。リン酸ナトリウム濃度が、緩衝液ＡおよびＢ双方において１５ｍＭ、２５ｍＭまたは５０ｍＭであること以外、個々の実験でこの処理を繰り返した。ＥＰＯ−ＰＥＧｘ混合物（０．８ｍｇのＥＰＯタンパク質；１ｍＬ）溶液を、０．４ｍＬの緩衝液Ａ（種々の濃度のリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）および０．６ｍＬの緩衝液（２Ｍの硫酸ナトリウム、種々の濃度のリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）の添加により０．６Ｍの硫酸ナトリウム濃度に調整した。次にこの溶液を、等容量の緩衝液Ｂで希釈し、サンプル全体（４ｍＬ）をカラム上に注入した。カラムを５ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄し、緩衝液Ａを用いる勾配を用いて生成物を溶出させた。２ＣＶに亘って１００〜６０％の緩衝液Ｂの勾配、１ＣＶで保持、１３ＣＶに亘って６０〜３５％の緩衝液Ｂ、１ＣＶで保持、次いで５ＣＶで０％の緩衝液Ｂによって溶出した。クロマトグラフィーの流速は、２．０ｍＬ／分（１５０ｃｍ／時間）であり、カラム溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度によりモニターした。クロマトグラフィー溶出プロフィールを比較し、選択された画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。主生成物ピークのプールした画分を分析した。結果は、下表３に要約している：
【０３３４】
【表３】
2010505874.tif 000038
【０３３５】
標準的な精製条件（緩衝液Ａ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５。緩衝液Ｂ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５（０．０５ｍｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４／ｍＬ添加樹脂による））を、１５ｍＭおよび５０ｍＭのリン酸ナトリウムで調製した緩衝液ＡおよびＢによる精製操作と比較した。得られたＡ２８０溶出プロフィールを比較した。１５ｍＭのリン酸Ｎａの溶出物質が一番速く溶出し、次いで２５ｍＭのリン酸Ｎａ、最後に５０ｍＭのリン酸Ｎａである。溶出プロフィールのシフトは、緩衝液の導電率の相対的変化によるものである（表３を参照）。これらＡ２８０トレースのＸ軸は、ピークをオーバーレイさせるようシフトした。Ｘ軸のシフトピークの比較により、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３、およびＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４の溶出に関して同様のピークトレースが示される。
【０３３６】
表３では、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の回収、ＭＢＰ−ＥＬＩＳＡ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、およびＳＥＣの分析データを比較している。この１５ｍＭから５０ｍＭのリン酸ナトリウム濃度範囲内で精製されたＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３間に有意差は見られなかった。回収率は、６０．２％から６１．９％の間である。ＭＢＰ−ＥＬＩＳＡでは、＜０．０８３〜０．０８５ｍｃｇのＭＢＰ／ｍｇ残存ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３が示されている。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３ピークに残存するＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２の量は、３．７％から４．５％の間であることが示された。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４ピークの積算は、低濃度では困難であるが、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３プールの各々の純度は、コロイドブルーゲルおよび銀染色ゲルにより測定された際に同等であることが示された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより顕著な純度差は検出されなかった。
【０３３７】
ＥＰＯ−ＰＥＧの分離に及ぼす硫酸ナトリウム濃度の効果
ＥＰＯ−ＰＥＧのＰＥＧ状態を分離するＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓクロマトグラフィーステップのロバストネスおよび能力を、緩衝液Ｂ中の硫酸Ｎａ濃度変化に関して調べた。Ｔｒｉｃｏｒｎ１０カラムに、１５．７ｍＬ（内径１．０ｃｍ×２０ｃｍ）のＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓを充填した。このカラムを、緩衝液Ｂ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、種々の濃度の硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５）の５カラム容量（ＣＶ）で平衡にした。緩衝液Ｂの硫酸ナトリウムの緩衝液濃度を０．５Ｍ、０．６Ｍおよび０．７Ｍに変えたこと以外、個々の実験でこの処理を繰り返した。０．３〜０．５ｍＬの緩衝液Ａ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）および０．５〜０．７ｍＬの緩衝液（２Ｍの硫酸ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）の添加によりＥＰＯ−ＰＥＧｘ混合物（０．８ｍｇのＥＰＯタンパク質；１ｍＬ）溶液を、実験に使用される硫酸ナトリウム濃度に依る硫酸ナトリウム濃度に調整した。次にこの溶液を、等容量の緩衝液Ｂで希釈し、サンプル全体（４ｍＬ）をカラム上に注入した。カラムを５ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄し、緩衝液Ａを用いる勾配を用いて生成物を溶出した。２ＣＶに亘って１００〜６０％の緩衝液Ｂの勾配、１ＣＶで保持、１３ＣＶに亘って６０〜３５％の緩衝液Ｂ、１ＣＶで保持、次いで５ＣＶで０％の緩衝液Ｂによって溶出した。クロマトグラフィーの流速は、２．０ｍＬ／分（１５０ｃｍ／時間）であり、カラム溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度によりモニターした。クロマトグラフィー溶出プロフィールを比較し、選択された画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。主生成物ピークに相当するプールされた画分の分析を、下表４に要約している：
【０３３８】
【表４】
2010505874.tif 000039
【０３３９】
標準的な精製条件（緩衝液Ａ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５。緩衝液Ｂ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５。０．０５ｍｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４／ｍＬ添加樹脂による）を、０．５Ｍおよび０．７Ｍの硫酸ナトリウムで調製した緩衝液Ｂによる精製操作と比較した。溶出プロフィール（Ａ２８０）を比較した。０．５Ｍの硫酸Ｎａを含有する緩衝液Ｂによる操作により一番早く溶出し、次いで０．６Ｍの硫酸Ｎａ操作、最後に０．７Ｍの硫酸Ｎａ操作である。これらＡ２８０トレースのＸ軸は、ピークをオーバーレイさせるようシフトした。Ｘ軸のシフトピークの比較により、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３、およびＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４の溶出に関して同様のピークトレースが示されている。溶出ピークプロフィールを比較すると、ピーク幅に僅かな差が認められた。０．７Ｍの硫酸Ｎａを含有する緩衝液Ｂは、最も鋭いピーク形状を示し、次いで０．６Ｍの硫酸Ｎａ操作、次に０．５Ｍの硫酸Ｎａ操作である。クロマトグラフィーシステム上でプログラム化された勾配は、各操作に関して一定に保持された。しかしながら、緩衝液Ｂ中の硫酸ナトリウムの増減により、実際の溶出勾配の傾斜はそれぞれ増減する。
【０３４０】
表４では、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の回収、ＭＢＰ−ＥＬＩＳＡ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、およびＳＥＣ分析データが比較されている。０．５Ｍから０．７Ｍの硫酸ナトリウム濃度の範囲内で精製されたＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３間に有意差は認められなかった。回収率は、６１．５％から６４．２％の間である。ＥＬＩＳＡでは、＜０．０４〜０．０８３ｍｃｇのＭＢＰ／ｍｇ残存ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３が示される。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３ピークに残存するＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２の量は、３．４％から４．６％の間であることが示された。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４ピークの積算は、低濃度では困難であるが、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりグリコフォームが検出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３プールの各々の純度は、コロイドブルーゲルならびに銀染色ゲルにより測定された際に同様であることが示された。
【０３４１】
ＥＰＯ−ＰＥＧに対するカラム能力（Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ）
ＥＰＯ−ＰＥＧに対する樹脂能力およびＥＰＯ−ＰＥＧのＰＥＧ状態を分離するＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓクロマトグラフィーの処理能力を調べた。Ｔｒｉｃｏｒｎ１０カラムに、１５．７ｍＬ（内径１．０ｃｍ×２０ｃｍ）のＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓを充填した。このカラムを、緩衝液Ｂ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５）の５カラム容量（ＣＶ）で平衡にした。個々の実験において、処理に用いるＥＰＯ−ＰＥＧの量を変えた（０．０５、０．１、０．２、０．５ｍｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４タンパク質／ｍＬ樹脂）。ＥＰＯ−ＰＥＧｘ混合物を０．６Ｍの硫酸ナトリウム濃度および４ｍＬの最終容量に調整した。この溶液をカラム上に注入した。カラムを５ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄し、緩衝液Ａを用いる勾配を用いて生成物を溶出した。２ＣＶに亘って１００〜６０％の緩衝液Ｂの勾配、１ＣＶで保持、１３ＣＶに亘って６０〜３５％の緩衝液Ｂ、１ＣＶで保持、次いで５ＣＶで０％の緩衝液Ｂにより溶出した。クロマトグラフィーの流速は、２．０ｍＬ／分（１５０ｃｍ／時間）であり、カラム溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度によりモニターした。クロマトグラフィー溶出プロフィールを比較した。画分をプールし、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。主生成物ピークの分析を、下表５に要約している：
【０３４２】
【表５】
2010505874.tif 000040
【０３４３】
Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓクロマトグラフィーステップのロバストネスを、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ樹脂１ｍＬ当り添加されたＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４の変化量に関して試験した。標準的な精製条件（緩衝液Ａ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５。緩衝液Ｂ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５（０．０５ｍｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４／ｍＬ添加樹脂））を、カラムに、０．１ｍｇ、０．２ｍｇおよび０．５ｍｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４／ｍＬ樹脂を添加した精製操作と比較した。得られた溶出プロフィール（Ａ２８０）を比較すると、カラムに添加されたタンパク質量が増すにつれてＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２ピークとＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３ピークの間の分解能の低下が示される。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を用いて、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３のプールされたピーク中に残存するＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２の量を比較した。表５では、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の回収、ＭＢＰ−ＥＬＩＳＡ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、およびＳＥＣの分析データが比較されている。調査されたカラム添加範囲内で精製されたＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３間で有意差は認められなかった。回収率は、６１．９％から７０．２％の間であった（ＢＣＡ分析）。カラム上に添加された物質量が増すにつれて回収率が増加する。しかしながら、この増加はまた、残存するＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２の量の増加と相関する。ＭＢＰ−ＥＬＩＳＡでは、＜０．０１９〜０．０８５ｍｃｇのＭＢＰ／ｍｇ残存ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３が示される。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３％対ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２％が、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇおよび０．５ｍｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４／ｍＬ添加樹脂に関して、それぞれ９６．３：３．７、９５．８：４．２、９４．９：５．１、９２．５：７．５の比率が示された。
【０３４４】
ピークが同じ様式でプールされたため、カラム上に添加されたタンパク質の量が増すと、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３ピーク中のＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２の量が増加する。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４の積算は、低濃度では困難であるが、グリコフォームは、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出された。ＳＥＣ分析によりＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の凝集は検出されなかった。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の少量の凝集（０．２２％）が、０．０５ｍｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４／ｍＬ添加樹脂（これは、リン酸ナトリウム緩衝液の濃度実験で記載されたものと同じサンプルである）のＳＥＣ分析により検出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３プールの各々の純度は、コロイドブルーゲルならびに銀染色ゲルにより測定された場合と同様であることが示された。
【０３４５】
Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ樹脂とＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍ樹脂との比較
ＥＰＯ−ＰＥＧのＰＥＧ状態を分離するＰｈｅｎｙｌ  ６５０ＭおよびＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓのクロマトグラフィー樹脂の能力を調べた。Ｔｒｉｃｏｒｎ１０カラムに、１５．７ｍＬ（内径１．０ｃｍ×２０ｃｍ）のＰｈｅｎｙｌ  ６５０ＳまたはＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍを充填した。各カラムを、緩衝液Ｂ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５）の５カラム容量（ＣＶ）で平衡にした。ＥＰＯ−ＰＥＧｘ（０．８ｍｇのＥＰＯタンパク質；１ｍＬ）溶液を、０．４ｍＬの緩衝液Ａ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）および０．６ｍＬの緩衝液（２Ｍの硫酸ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）の添加により０．６Ｍの硫酸ナトリウム濃度に調整した。次にこの溶液を、等容量の緩衝液Ｂで希釈し、サンプル全体（４ｍＬ）をカラム上に注入した。カラムを５ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄し、緩衝液Ａを用いる勾配を用いて生成物を溶出した。２ＣＶに亘って１００〜６０％の緩衝液Ｂの勾配、１ＣＶで保持、１３ＣＶに亘って６０〜３５％の緩衝液Ｂ、１ＣＶで保持、次いで５ＣＶで０％の緩衝液Ｂにより溶出した。クロマトグラフィーの流速は、２．０ｍＬ／分（１５０ｃｍ／時間）であり、カラム溶出を、２８０ｎｍにおける吸光度によりモニターした。クロマトグラフィー溶出プロフィールを比較し、選択された画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。主生成物ピークの分析を、下表６に要約している：
【０３４６】
【表６】
2010505874.tif 000041
【０３４７】
Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ（３５ミクロンのビーズサイズ）クロマトグラフィーステップを、標準的な精製条件（緩衝液Ａ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５。緩衝液Ｂ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５（０．０５ｍｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４／ｍＬ添加樹脂））を用いて、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍ（６５ミクロンのビーズサイズ）と比較した。生じた溶出プロフィールの比較により、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓは、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２とＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の間でより良好な分解能を有することが示された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるそれぞれのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３ピークプールの比較では、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ精製物質がより少ないＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４を有すると思われることを除いては同様の純度を示した。ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析により、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３対ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２は、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ精製に関しては９６．３：３．７の比率、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍ精製に関しては９３．６：６．４の比率を示した。
【０３４８】
システム全体およびカラムの圧力測定により、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍ精製中の平均圧は、約０．１２ｍＰａであり、一方、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ圧は、約０．２９ｍＰａであった。
【０３４９】
Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ対Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰのクロマトグラフィー
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（３４ミクロンビーズサイズ）を用いるＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３精製は、標準的な精製条件（緩衝液Ａ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５。緩衝液Ｂ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５、０．０５ｍｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４／ｍＬ添加樹脂による）を用いて実施した。溶出プロフィールは、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１と、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２と、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３と、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４の間で実際の分解を示さなかった（クロマトグラムは示していない）。種々のＰＥＧ状態間で分解されなかったため、溶出物質に対する分析は実施しなかった。
【０３５０】
［実施例２］
疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いるグリコＰＥＧ化ＥＰＯの大規模精製
グリコＰＥＧ化反応混合物からグリコＰＥＧ化ＥＰＯをさらに精製し、三官能化ＥＰＯ種［ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３］を他のＰＥＧ化種（例えば、モノ−、ジ−およびテトラ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種）から分離するために、混合物（例えば、アニオンクロマトグラフィー媒体からの流液）を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供する。例示的なＨＩＣ法を下記に概説する：ＸＫ２６カラムに、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ樹脂（１０６ｍＬ、２．６ｃｍ×２０ｃｍ）を充填し、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００システムに取り付けた。生成物溶出を、２１４ｎｍ、２５４ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度によりモニターした。このカラムを、緩衝液Ｂ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５）の５カラム容量（ＣＶ）で平衡にした。
【０３５１】
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ精製ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４の溶液（６２ｍＬ、ｐＨ６．９４、２．５９ｍＳ／ｃｍ）を、６２ｍＬの１．２Ｍの緩衝液（１．２Ｍの硫酸ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）を用いる希釈により０．６Ｍの硫酸ナトリウムに調整した。この溶液（１２４ｍＬ）をカラム上に注入した。カラム上に注入の際、樹脂に対するＥＰＯ−ＰＥＧの比率は、カラム中の樹脂１ｍＬ当り０．１８ｍｇのＥＰＯタンパク質であった。未結合物質はいずれも、緩衝液Ｂ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５）の５ＣＶを用いてカラムから洗浄した。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３は、緩衝液Ａ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）を用いる以下の勾配溶出法を用いてカラムから溶出させた。勾配：２ＣＶに亘って１００〜６０％の緩衝液Ｂ、１ＣＶで保持、１３ＣＶに亘って６０〜３５％の緩衝液Ｂ（勾配変更１．９２％の緩衝液Ｂ／ＣＶ）、１ＣＶで保持、次いで５ＣＶで０％の緩衝液Ｂにより溶出させた。平衡化ステップ、添加ステップおよび洗浄ステップを、８ｍＬ／分（９０ｃｍ／時間）の流速で実施した。
【０３５２】
流液および洗浄画分を１ＬのＮａｌｇｅｎｅ容器内に集め、個々の溶出画分（１２ｍＬ）を１４ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ内に集めた。溶出プロフィールおよび画分の指標は、図２Ａおよび２Ｂに示している。画分を合わせ、緩衝液を交換し、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ−２ＸＬ５０ｃｍ２を用いてこのプールを濃縮した。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３（プールＦ）を含有するプール画分を、タンパク質含量（ＢＣＡ、ＵＶ）、同定（ＳＤＳ−ＰＧＥ）、グリコシルトランスフェラーゼ（ＭＢＰ−ＥＬＩＳＡ）、純度およびＥＰＯ−ＰＥＧ体（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、凝集ならびに純度（ＳＥＣ）およびエンドトキシンに関して分析した。結果は下表７に要約している：
【０３５３】
【表７】
2010505874.tif 000042
Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓクロマトグラフィーを、０．８ｍｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４添加（１５．７ｍＬのカラム）から２２．４ｍｇ（１０６ｍＬカラム）にスケールアップした。カラム上に添加した物質量を、０．０５ｍｇから０．２ｍｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）１〜４／ｍＬ樹脂に増加させたこと以外、標準的条件を用いた。図２Ｂに示されるようにＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３のピークをプールし、４０８ｍＬのピークプール（３．８５ＣＶ）を得た。濃縮に先立って、１６．１ｍｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３が回収され（７２％）、添加物質中、元の１４．９％のＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２から５．７％のＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２が残存した。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ−２ＸＬ５０ｃｍ２を用いる濃縮および１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．４へのダイアフィルトレーションにより９５％の回収を得た。
【０３５４】
［実施例３］
グリコＰＥＧ化反応混合物からのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の調製および単離
本実施例では、２０ｍｇスケールにおけるバキュロウイルス由来のグリコＰＥＧ化ヒトエリスロポエチンＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３（上記実施例１のＥＰＯ−ＰＥＧコンジュゲートの記載を参照）の単離のための、３つのクロマトグラフィーステップ（および２つの限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）ステップ）精製処理により得られた結果が要約される。全体的な処理効率および生成物の品質が評価された。
【０３５５】
ＰＥＧ−ＥＰＯコンジュゲートは流動させるが、ＭＢＰ−ＧｎＴ１、ＭＢＰ−ＧａｌＴ１、ＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ３および他の酵素混入物などのグリコＰＥＧ化酵素を捕捉する負の結合様式で使用されるＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜により精製処理（例えば、図１を参照）を開始した。次にグリコＰＥＧ化反応で生じた種々のＰＥＧ種を、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ樹脂上のＨＩＣを用いて分画し（実施例１も比較する）、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３を、＞９６％（ステップ収率は約７５％）の濃度に濃縮した。再生セルロース（１０ｋＤａのＭＷＣＯ）膜を使用する接線方向流濾過（ＴＦＦ、限外濾過／ダイアフィルトレーション）を用いて、濃縮し、ＨＩＣ溶出プールの導電率を減少させた。次にソース１５Ｓを用いるカチオン交換クロマトグラフィーを使用して、残存する宿主細胞タンパク質を除去し、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３を、さらに９７％超の濃度に濃縮した（８０％のステップ収率）。最終的には、再生セルロースの１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜によるＴＦＦを用いて濃縮し、バルク生成物の保存のために緩衝液を変えた。６．７ｍｇの精製ＥＰＯ−ＰＥＧコンジュゲートが得られたが、これは、精製処理に関して５６％の全収率に相当する（サンプリングおよび小スケールの副実験に関して補正後）。処理パラメータは、下表８に要約している：
【０３５６】
【表８】
2010505874.tif 000043
【０３５７】
各クロマトグラフィーステップにおいて、ＰＥＧ−ＥＰＯ生成物プールは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＰＥＧ状態に関して、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＢＰ  ＥＬＩＳＡにより分析して、酵素関連混入物の除去を追跡した。得られたＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３生成物を、利用できる薬物放出試験に供した。純度は、ＨＰＬＣにより９９％超（グリコフォームを合わせて）であることが判明した。最終組成物中のＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の濃度は、９６．９％であった。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２の濃度は２．５％であり、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）４の濃度は０．６％であった。他のＥＰＯ−ＰＥＧグリコフォームは、最終組成物において検出されなかった。ＳＥＣにより凝集体は１％未満であった。
【０３５８】
グリコＰＥＧ化反応
ヒトＥＰＯ中間体タンパク質（バキュロウイルス発酵により産生され、精製された）を、ＢＣＡアッセイにより判定された１．２９ｍｇ／ｍＬの濃度で−２０℃、ｐＨ７．５、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ中に凍結保存した。ＭＢＰ−ＧｎＴ１を、−２０℃で５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０、１３８ｍＭのＮａＣｌ中に凍結保存した。報告された０．５Ｕ／ｍＬの活性アッセイ値を用いた。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、タンパク質濃度が０．３ｍｇ／ｍＬであると判定した。ＭＢＰ−ＧａｌＴ１を、−２０℃で、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ中に凍結保存した。この活性は、１５Ｕ／ｍＬであると報告され、タンパク質濃度はＲＰ−ＨＰＬＣにより測定して１．０ｍｇ／ｍＬであった。ＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ３を、−２０℃で、ｐＨ７．０の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ中に凍結保存した。報告された活性は、２．０５Ｕ／ｍＬであり、タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイにより１．０６ｍｇ／ｍＬであると測定された。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−Ｇａｌは、使用直前に１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３中、６０ｍｇ／ｍＬの原液として調製した。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａは、使用直前に１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３中、２００ｍｇ／ｍＬの原液として調製した。
【０３５９】
２５ｍｇのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３反応の調製および分析
ＥＰＯ中間体タンパク質（２５ｍｇ、１９．４ｍＬ、ＢＣＡアッセイにより１．２５マイクロモル）を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−２０遠心濾過機（５ｋＤａ  ＭＷＣＯ）中１．０ｍＬの容量に濃縮し、次いで１５ｍＬの１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３により希釈した。ＥＰＯ溶液を０．９４ｍＬ（２６．７ｍｇ／ｍＬ）に濃縮した。ＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ３（３．０５ｍＬ、６．２５Ｕ）を、別のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−２０遠心濾過機（５ｋＤａ  ＭＷＣＯ）中、１３ｍＬの１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３により希釈し、０．５１ｍＬ（１２．３Ｕ／ｍＬ）に濃縮した。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（２５マイクロモル、０．２７ｍＬ）およびＵＤＰ−Ｇａｌ（２５マイクロモル、０．２５ｍＬ）の原液（双方とも１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３中６０ｍｇ／ｍＬで）、ＭＢＰ−ＧｎＴ１（０．５ｍＬ、０．２５Ｕ）、ＭＢＰ−ＧａｌＴ１（０．３３ｍＬ、５Ｕ）、濃縮ＭＢＰ−ＳＢＤ−ＳＴ３Ｇａｌ３（上記から０．５１ｍＬの１２．３Ｕ／ｍＬ、６．２５Ｕ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ（２５マイクロモル、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３中２００ｍｇ／ｍＬ溶液の１．２５ｍＬ）およびＭｎＣｌ２（５ｍＭ、水中２００ｍＭ溶液の０．１０４ｍＬ）を合わせた。４．１７ｍＬの全容量にするために、さらに１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３緩衝液（１．０ｍＬ）を加えた。反応は、振とうすることなく３２℃で２時間インキュベートした。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の変換収率を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣ３ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した（図４Ａを比較）。反応混合物は、下記のとおりＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑカートリッジ上で直ちに精製した。
【０３６０】
ＰＥＧ−ＥＰＯグリコＰＥＧ化反応混合物のＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ精製
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ  ＳｉｎｇｌｅＳｅｐ  Ｎａｎｏ（１ｍＬ）カートリッジを、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００システムに取り付けて、２１４ｎｍ、２５４ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を連続的にモニターした。このカートリッジを、双方とも１５ｍＬ／分の流速で２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０（約１００ｍＬ）、次いで２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０（約１００ｍＬ）でフラッシュした。ＰＥＧ−ＥＰＯ反応混合物（約２５ｍｇ、６ｍｇ／ｍＬ、４．２ｍＬ）を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０（２２．８ｍＬ）により２７ｍＬの最終容量に希釈した。１ｍＬのアリコートを分析用に保持し、この濃度は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより０．８０４ｍｇ／ｍＬであると判定した。残りの希釈サンプル（２６ｍＬ、ＲＰ−ＨＰＬＣにより２０．９ｍｇ）をカプセルに添加し、１５ｍＬ／分の流速で２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０（７０ｍＬ）により洗浄した。
【０３６１】
画分を、ＰＥＧ−ＥＰＯ生成物プールに合わせた（８０ｍＬ）。流液／洗浄生成物ピークに亘って、プールサンプルおよび選択された個々の画分を、ヨウ素および銀染色でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。このステップに関するコンジュゲートの回収率（９４％）を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより判定した（表８）。
【０３６２】
ＰＥＧ−ＥＰＯプールを、残存酵素混入物に関してＭＢＰ−ＥＬＩＳＡにより分析し（表８）、次いで２つの部分に分けた：主要な画分（６２ｍＬ、１５．２５ｍｇ）を、下記のとおりＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ樹脂上のＨＩＣクロマトグラフィーにより精製した。少量サンプル（１８ｍＬ、４．４ｍｇ）は、フルオロアパタイトクロマトグラフィーなどの代わりの処理により精製した。
【０３６３】
結合不純物は、１５ｍＬ／分の流速で２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０（１３ｍＬ）によりカラムから溶出させた。
【０３６４】
ＨＩＣ（Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ）を用いるＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ流液／洗浄プールからのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３の単離
上記のとおり、ＸＫ２６カラムに、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ樹脂（１０６ｍＬ、２．６ｃｍ×２０ｃｍ）を充填し、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００システムに取り付けて、２１４ｎｍ、２５４ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を連続的にモニターした。このカラムを５カラム容量（ＣＶ）の２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５（２１２ｍＬ）で平衡にした。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ  ＰＥＧ−ＥＰＯ生成物プール（６２ｍＬ、１８ｍｇ、０．１７ｍｇのＰＥＧ−ＥＰＯ／ｍＬ樹脂、ｐＨ６．９４、２．５９ｍＳ／ｃｍ）を、１．２Ｍの硫酸ナトリウム、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５（６２ｍＬ）により１：１に希釈して硫酸ナトリウム濃度を０．６Ｍに調整した。この調節されたサンプル（１２４ｍＬ）をカラムに適用した。未結合物質は、８ｍＬ／分（９０ｃｍ／時間）の流速で２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５（２１２ｍＬ）の５ＣＶを用いてカラムから洗浄した。ＰＥＧ−ＥＰＯ種を分画し、緩衝液Ａ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）および緩衝液Ｂ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．６Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５）を用いる以下の勾配を用いて８ｍＬ／分（９０ｃｍ／時間）の流速で溶出した：２ＣＶに亘って１００〜６０％のＢ、１ＣＶで６０％のＢの定組成で保持し、１３ＣＶに亘って６０〜３５％のＢ（勾配変更１．９２％のＢ／ＣＶ）、１ＣＶで３５％のＢの定組成で保持し、１ＣＶに亘り３５〜０％、５ＣＶで０％のＢにより溶出させた。流液および洗浄画分を、１ＬのＮａｌｇｅｎｅのフィルターユニットからボトルに集め、１２ｍＬの溶出画分を、１４ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに集めた。個々の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３が高濃度である画分を合わせた（４℃で約３６時間保存後）。他のＰＥＧ−ＥＰＯ種および溶出ピークからの画分もまたプールした。画分プールをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。希釈ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３プール（４４４ｍＬ）をＡ２８０により分析し（０．０２５ｍｇ／ｍＬ、１１．１ｍｇ）、ステップの回収率は７３％であると判定された（表１）。この生成物プールの緩衝液を交換し、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ−２ＸＬ再生セルロース膜を用いて濃縮した。残りの１０ｍｇの物質（１９．４４ｍＬ）を氷上に保持してから、後で同じ日に、下記のとおりソース１５Ｓ樹脂上でのカチオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。
【０３６５】
濃縮およびダイアフィルトレートされたＰｈｅｎｙｌ  ６５０ＳのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３プールのソース１５Ｓクロマトグラフィー上での精製
Ｔｒｉｃｏｒｎ  １０カラムに、ソース１５Ｓ（１５．７ｍＬ、１ｃｍ×２０ｃｍ）を充填し、２１４ｎｍ、２５４ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度を連続的にモニターするＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００システムに取り付けた。このカラムを、５カラム容量（ＣＶ）の１０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ５．４（緩衝液Ａ）で平衡にした。濃縮およびダイアフィルトレートされたＰｈｅｎｙｌ  ６５０ＳのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３プール（１０ｍｇのＰＥＧ−ＥＰＯ、１９．４４ｍＬ、ｐＨ５．４、導電率：１．５４ｍＳ／ｃｍ）を２つの等容量に分け、これらを、調製されたカラム上で２つの別個であるが同一の注入物で精製した。ダイアフィルトレートされたＰｈｅｎｙｌ  ６５０ＳのＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３生成物プールの半分（５ｍｇのＰＥＧ−ＥＰＯ、各々９．７２ｍＬ、０．３２ｍｇのＰＥＧ−ＥＰＯ／ｍＬ樹脂）を、３００ｃｍ／時間（１．９６ｍＬ／分）の流速でカラムに適用した。未結合物質を、５ＣＶの１０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ５．４（緩衝液Ａ）を用いてカラムから洗浄した。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３を、緩衝液Ｂ（０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ５．４）による以下の勾配：２４ＣＶに亘って０〜３０％のＢ、１ＣＶで３０％の定組成Ｂで保持、５ＣＶで１００％Ｂへのステップにより溶出させた。全てのステップを、３００ｃｍ／時間（１．９６ｍＬ／分）で実施した。画分（１．６ｍＬ）を、９６ディープウェルマイクロタイタープレートに集め、４℃に保存した。双方の注入物からの画分をプールした。ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）３プールのタンパク質含量分析（Ａ２８０）により、ソース１５Ｓクロマトグラフィーステップを通してのステップ回収率が、７９％であることが示された（表８）。生成物プールのＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、ＥＰＯ−（ＳＡ−ＰＥＧ−１０ｋＤａ）２の不純物が、２．９％に減少したことを示した（表８）。生成物プールは、約７０ｍＭの推定塩化ナトリウム濃度を有し、これを濃縮して緩衝液を交換した。ソース１５Ｓの流液／洗浄液プールを、ＰＶＤＦ膜上に電気ブロットし、本明細書に記載されたＥｄｍａｎのアミノ末端配列決定に供して、プール内の主要バンドの正体を測定した。得られたアミノ末端配列は、ＥＰＯであると判定された。
【０３６６】
当然のことながら、本明細書に記載された実施例および実施形態は、例示のみを目的としており、それに考慮した種々の修正または変更は、当業者に示唆されるであろうし、添付の特許請求の範囲の適用および範囲の趣旨および権限内に含まれるものとする。本明細書に引用された刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために参照としてそれらの全体が本明細書に援用されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【国際調査報告】
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