(57)【要約】本発明は、種々のアミノ酸のうちの１つまたは複数の置換を保存領域に有するウイルスポリメラーゼに関する組成物および方法を包含し、複製の速度および忠実度の異なる酵素を産出する。弱毒化ウイルスおよび抗ウイルスワクチンの生成に関する普遍的に適用可能なポリメラーゼ機構に基づく手段を開示する。
2010514424.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼをコードするポリメラーゼ遺伝子を含む弱毒化ウイルスであって、前記ポリメラーゼ遺伝子は、ロイシン残基、ヒスチジン残基、またはアルギニン残基へのリシン残基の置換をもたらす改変を有し、前記リシン残基は、ヌクレオチド組み込み反応のリン酸転移段階において一般酸触媒として機能する能力を有し、かつ、ＡファミリーポリメラーゼのヘリックスＯ、ＢファミリーポリメラーゼのヘリックスＰ、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の構造モチーフＤのループ上に位置し、
前記置換により、前記ポリメラーゼの忠実度は、前記改変を有さない野生型ポリメラーゼ遺伝子によりコードされるポリメラーゼと比較して向上している、弱毒化ウイルス。
【請求項２】
前記ポリメラーゼはポリオウイルスポリメラーゼであり、前記リシン残基は受託番号Ｖ０１１４８を有する核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の位置３５９に位置する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
【請求項３】
前記ポリメラーゼはインフルエンザポリメラーゼであり、前記リシン残基は受託番号ＡＡＹ４４７７３を有する配列の位置４８１に位置する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
【請求項４】
前記ポリメラーゼはＨＩＶ−１逆転写酵素であり、前記リシン残基は受託番号４１３９７３９を有する配列の位置２２０に位置する、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
【請求項５】
前記ポリメラーゼはＡファミリーポリメラーゼである、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
【請求項６】
前記ポリメラーゼはＢファミリーポリメラーゼである、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
【請求項７】
前記ポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
【請求項８】
前記ウイルスは感染性である、請求項１に記載の弱毒化ウイルス。
【請求項９】
（ａ）ポリメラーゼをコードするポリメラーゼ遺伝子を含む弱毒化ウイルスであって、前記ポリメラーゼ遺伝子は、ロイシン残基、ヒスチジン残基、またはアルギニン残基へのリシン残基の置換をもたらす改変を有し、前記リシン残基は、ヌクレオチド組み込み反応のリン酸転移段階において一般酸触媒として機能する能力を有し、かつ、ＡファミリーポリメラーゼのヘリックスＯ、ＢファミリーポリメラーゼのヘリックスＰ、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の構造モチーフＤのループ上に位置し、
前記置換により、前記ポリメラーゼの忠実度は、前記改変を有さない野生型ポリメラーゼ遺伝子によりコードされるポリメラーゼと比較して向上している、弱毒化ウイルスと、
（ｂ）薬学的に許容される担体と
を含有するワクチン。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼはポリオウイルスポリメラーゼであり、前記リシン残基は受託番号Ｖ０１１４８を有する核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の位置３５９に位置する、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記ポリメラーゼはインフルエンザポリメラーゼであり、前記リシン残基は受託番号ＡＡＹ４４７７３を有する配列の位置４８１に位置する、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記ポリメラーゼはＨＩＶ−１逆転写酵素であり、前記リシン残基は受託番号４１３９７３９を有する位置２２０に位置する、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記ポリメラーゼはＡファミリーポリメラーゼである、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記ポリメラーゼはＢファミリーポリメラーゼである、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記ポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記ワクチンはアジュバントをさらに含有する、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１７】
ポリメラーゼをコードするポリメラーゼ遺伝子を含む精製核酸であって、前記ポリメラーゼ遺伝子は、ロイシン残基、ヒスチジン残基、またはアルギニン残基へのリシン残基の置換をもたらす改変を有し、前記リシン残基は、ヌクレオチド組み込み反応のリン酸転移段階において一般酸触媒として機能する能力を有し、かつ、ＡファミリーポリメラーゼのヘリックスＯ、ＢファミリーポリメラーゼのヘリックスＰ、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の構造モチーフＤのループ上に位置し、
前記置換により、前記ポリメラーゼの忠実度は、前記改変を有さない野生型ポリメラーゼ遺伝子によりコードされるポリメラーゼと比較して向上している、精製核酸。
【請求項１８】
前記核酸はベクター内に含まれている、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
ポリメラーゼをコードするウイルスポリメラーゼ遺伝子を改変する工程を含むウイルスを弱毒化する方法であって、その改変は、ロイシン残基、ヒスチジン残基、またはアルギニン残基へのリシン残基の置換をもたらし、前記リシン残基は、ヌクレオチド組み込み反応のリン酸転移段階において一般酸触媒として機能する能力を有し、かつ、ＡファミリーポリメラーゼのヘリックスＯ、ＢファミリーポリメラーゼのヘリックスＰ、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の構造モチーフＤのループ上に位置し、
前記置換により、前記ポリメラーゼの忠実度は、前記改変を有さない野生型ポリメラーゼ遺伝子によりコードされるポリメラーゼと比較して向上している、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して分子生物学、微生物学、および免疫学の分野に関する。より具体的に、本発明は、ウイルスの弱毒化および抗ウイルスワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの奏効するウイルスワクチンは、弱毒化生ウイルス株を用いる。生ウイルスワクチン開発の律速段階は、適切な弱毒化ウイルスの同定である。弱毒化ウイルスを開発する従来の方法は、ウイルスが新たな条件下で進化するにつれて、その元の宿主に対する病原性を低下させるように、“外来”細胞系または非増殖許容性細胞系中におけるウイルスの継代培養などの新規の条件下におけるウイルスの増殖を伴う。この方法は、目覚ましい成功を示したが、弱毒化変異が生じて進化する過程についてはほとんど知られておらず、弱毒化ウイルスの単離はランダムで緩慢な過程である。加えて、試みられる弱毒化の多くは予測不能であり、弱毒化の性質に依存し、弱毒化ウイルスが毒性に転じることもある。
【０００３】
現在用いられる弱毒化法の一部は、毒性が強すぎて生成できないウイルスワクチン株を引き起こす。強毒性株は宿主にとって有害であり、ワクチンの開発はウイルスの不活化を要する。ここにはある欠点が存在する。例えば、経口または経鼻適用されるワクチンとしての不活化ウイルスは、抗体の著しい増加を引き起こすためには高濃度で投与しなければならない。別の例では、副作用のない経鼻または経口投与による簡便な市販の調剤で不活化インフルエンザウイルスまたは抗原を投与しても、アジュバントの使用なしでは十分な免疫反応をもたらさない（非特許文献１および非特許文献２参照）。したがって、例えば、乳剤不活化ワクチンの経口投与により免疫反応を最適に誘導するには、抗原６６μｇ／投与から抗原３８４μｇ／投与の抗原含量が必要とされる（非特許文献３参照）。この用量は、抗原約１５μｇ／投与である非経口投与用の不活化ワクチンの用量をはるかに上回る。
【０００４】
経鼻投与に関する臨床試験で見出される低温適応の弱毒化インフルエンザ生ウイルスワクチンはウイルス抗原に基づき、それに由来するリアソートメントを、対応するＡ型インフルエンザ株またはＢ型インフルエンザ株の血球凝集素抗原およびノイラミダーゼ抗原に対する遺伝子を弱毒化された低温適応マスターウイルス株に転移させる遺伝学的方法により、毎年生成しなければならない。この方法はきわめて長時間を要し、手間もかかる。加えて、復帰変異を介して弱毒化ウイルスが毒性ウイルスに復帰突然変異し、ウイルス血症を引き起こしうる危険が存在する。生ウイルスにより免疫処置を行う場合、免疫化された個体の体内でさらなる拡散も起こる。低温適応ウイルスを用いる場合、できる限り−２０℃に近い氷点下においてウイルスワクチンを保管する恒常的な必要性もまた存在し、これがワクチンの十分な保管寿命を確保するための冷凍の連鎖を絶対的に維持する必要を生じる。
【０００５】
弱毒化インフルエンザ生ウイルスワクチンの生成、ウイルスリアソートメント、およびワクチンウイルスの増殖には卵細胞が用いられるが、存在しうる夾雑感染性因子が卵細胞内に転移されうる危険性がこれには伴う。生ウイルスは感染性物質の典型であり、したがって安全性のより高い基準が維持されなければならないので、その精製もまた問題なしではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Chen et al., 1989, Current Topics in Microbiology and Immunology 146:101-106
【非特許文献２】Couch et al., 1997, J. Infect. Dis. 176:38-44
【非特許文献３】Avtushenko et al., 1996, J. Biotechnol. 44:21-28
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
迅速かつ非ランダムな方法でウイルスを弱毒化する技法が用いられれば、現行の方法に付随する欠点は除かれるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、野生型（ＷＴ）ポリメラーゼと比較して複製速度の変化および忠実度の変化をもたらす活性部位リシン残基の置換を有する改変ウイルスポリメラーゼの開発に関する。典型的な実施形態において、ここに記載する改変ポリメラーゼは、ウイルス中に組み込まれたとき、対応するＷＴポリメラーゼよりも低い複製速度および高い忠実度を示す。ここに記載する実験において、ポリオウイルス（ＰＶ）３Ｄｐｏｌ活性部位残基であるＬｙｓ−３５９は、ヌクレオチド組み込み反応のリン酸転移段階における一般酸触媒として同定された。驚くべきことに、ポリメラーゼの反応速度および反応精度におけるわずかな変化がウイルスに対する劇的な弱毒化効果を有することが判明した。変異ＰＶウイルスは、Ｋ３５９ＲまたはＫ３５９Ｈ置換をもたらす改変ポリメラーゼ遺伝子を有するように作製した。これらのウイルスは、ＷＴウイルスと比べ、細胞内で感染性でありかつ弱毒化されることが示された。ここに記載するポリメラーゼ活性部位に良好に保存される残基は、ポリメラーゼの反応速度および／または反応精度を調節し、したがってウイルス弱毒化の標的となる。他のクラスの活性部位リシン残基もまた同定および解析した。かくして、ここに記載する組成物および方法は、一定間隔の抗原変化を伴うウイルス（例えば、インフルエンザ）、新興および再興ウイルス（例えば、ＳＡＲＳ、西ナイル、デング）、およびテロまたは生物兵器の作用物質として用いられるウイルス（例えば、エボラ、天然痘）を含むあらゆるウイルスに適用することができる。したがって、ここに記載する組成物および方法は、抗ウイルスワクチン用にウイルスを弱毒化する普遍的な手段を提供する。本発明はまた、強毒性ウイルスのワクチン生成の問題、および体液性免疫反応もしくは細胞性免疫反応またはその両方の免疫反応を誘導する量でのワクチン生成の問題をどちらも解決する。
【０００９】
したがって、本発明は、ロイシン残基、ヒスチジン残基、またはアルギニン残基へのリシン残基の置換をもたらす改変を有するポリメラーゼをコードするポリメラーゼ遺伝子を含む弱毒化ウイルスを含み、リシン残基は、ヌクレオチド組み込み反応のリン酸転移段階において一般酸触媒として機能する能力を有し、ＡファミリーポリメラーゼのヘリックスＯ、ＢファミリーポリメラーゼのヘリックスＰ、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の構造モチーフＤのループ上に位置する。この置換により、ポリメラーゼの忠実度は、改変を有さないＷＴポリメラーゼ遺伝子によりコードされるポリメラーゼと比較して向上する。ポリメラーゼは、例えば、ＰＶポリメラーゼおよび受託番号Ｖ０１１４８を有する核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の位置３５９に位置するリシン残基、インフルエンザポリメラーゼおよび受託番号ＡＡＹ４４７７３を有する配列の位置４８１に位置するリシン残基、またはＨＩＶ−１逆転写酵素および受託番号４１３９７３９を有する配列の位置２２０に位置するリシン残基でありうる。ポリメラーゼは、例えば、Ａファミリーポリメラーゼ、Ｂファミリーポリメラーゼ、またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼでありうる。典型的な実施形態において、ウイルスは感染性である。
【００１０】
（ａ）ポリメラーゼをコードするポリメラーゼ遺伝子を含む弱毒化ウイルスであって、ポリメラーゼ遺伝子は、ロイシン残基、ヒスチジン残基、またはアルギニン残基へのリシン残基の置換をもたらす改変を有し、リシン残基は、ヌクレオチド組み込み反応のリン酸転移段階において一般酸触媒として機能する能力を有し、ＡファミリーポリメラーゼのヘリックスＯ、ＢファミリーポリメラーゼのヘリックスＰ、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の構造モチーフＤのループ上に位置する、弱毒化ウイルスと、薬学的に許容される担体とを含有するワクチンもまた本発明の範囲内にある。この置換により、ポリメラーゼの忠実度は、改変を有さないＷＴポリメラーゼ遺伝子によりコードされるポリメラーゼと比較して向上する。ポリメラーゼは、例えば、ＰＶポリメラーゼおよび受託番号Ｖ０１１４８を有する核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の位置３５９に位置するリシン残基、インフルエンザポリメラーゼおよび受託番号ＡＡＹ４４７７３を有する配列の位置４８１に位置するリシン残基、またはＨＩＶ−１逆転写酵素および受託番号４１３９７３９を有する配列の位置２２０に位置するリシン残基でありうる。ポリメラーゼは、Ａファミリーポリメラーゼ、Ｂファミリーポリメラーゼ、またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼでありうる。ワクチンはアジュバントをさらに含有しうる。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、ポリメラーゼをコードするポリメラーゼ遺伝子を含む精製核酸であって、ポリメラーゼ遺伝子は、ロイシン残基、ヒスチジン残基、またはアルギニン残基へのリシン残基の置換をもたらす改変を有し、リシン残基は、ヌクレオチド組み込み反応のリン酸転移段階において一般酸触媒として機能する能力を有し、かつ、ＡファミリーポリメラーゼのヘリックスＯ、ＢファミリーポリメラーゼのヘリックスＰ、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の構造モチーフＤのループ上に位置する、精製核酸を含む。この置換により、ポリメラーゼの忠実度は、改変を有さないＷＴポリメラーゼ遺伝子によりコードされるポリメラーゼと比較して向上する。核酸はベクター内に存在しうる。
【００１２】
さらに別の実施形態において、本発明は、ポリメラーゼをコードするウイルスポリメラーゼ遺伝子を改変する工程を含むウイルスを弱毒化する方法であって、その改変は、ロイシン残基、ヒスチジン残基、またはアルギニン残基へのリシン残基の置換をもたらし、リシン残基は、ヌクレオチド組み込み反応のリン酸転移段階において一般酸触媒として機能する能力を有し、ＡファミリーポリメラーゼのヘリックスＯ、ＢファミリーポリメラーゼのヘリックスＰ、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の構造モチーフＤのループ上に位置する、方法を含む。この置換により、ポリメラーゼの忠実度は、改変を有さないＷＴポリメラーゼ遺伝子によりコードされるポリメラーゼと比較して向上する。
【００１３】
別段の定義がない限り、ここで用いられるすべての技術的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
ここで用いられる「弱毒化された」という用語は、ＷＴウイルスよりも毒性（病原性）の弱い形に改変されたウイルスを意味する。
【００１４】
ここで用いられる「ワクチン」という用語は、すべての予防的ワクチンおよび治療的ワクチンを含む。一実施形態によれば、ワクチンは、無毒性の感染性ウイルスまたは弱毒化された感染性ウイルスを含有し、ウイルスポリメラーゼはポリメラーゼの保存領域にアミノ酸の変化を有する。これらの変化は、例えば、アミノ酸の置換、類似体、欠失などを含む。
【００１５】
本発明のワクチン組成物は、インビボで生体適合性を有する形態で対象へ投与するのに適する。ここで用いられる「インビボ投与に適する生体適合性のある形態」とは、投与すべき物質の治療効果が毒性作用を上回る形態を意味する。その物質は、任意の動物、好ましくはヒトに投与してよい。
【００１６】
「ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ」および「ＲＤＰ」という用語は、ＲＮＡ鋳型からＲＮＡまたはＤＮＡを転写するウイルスポリメラーゼを意味する。ここに記載するＲＮＡウイルスは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）を産生し、ここに記載するレトロウイルスは、「逆転写酵素」とも称するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを産生する。
【００１７】
「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、ＤＮＡ鋳型からＤＮＡを転写するウイルスポリメラーゼを意味する。
ここで用いられる「核酸」、「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ（リボ核酸）およびＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの２つ以上のヌクレオチドからなる鎖を意味する。「精製」核酸分子とは、核酸が自然発生する細胞または生物体内の他の核酸配列から実質的に分離または孤立している（例えば、夾雑物を３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％含まない）核酸分子である。この用語は、例えば、ベクター、プラスミド、ウイルス中に組み込まれた組み換え核酸分子、あるいは原核生物もしくは真核生物のゲノムを含む。
【００１８】
ここで用いられる「タンパク質」または「ポリペプチド」は、長さまたは翻訳後の修飾、例えば、グリコシル化もしくはリン酸化の有無にかかわらず、任意のペプチド結合したアミノ酸鎖を意味するように同義に用いられる。
【００１９】
核酸分子、ポリペプチド、またはウイルスを指す場合、「天然の」という用語は、自然発生の（例えば、ＷＴの）核酸、ポリペプチド、またはウイルスを指す。
ここで用いられる「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を運ぶ能力を有する核酸分子を指す。それらが作動的に連結された遺伝子の発現を誘導する能力を有するベクターを、ここでは「発現ベクター」と称する。
【００２０】
第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、第１の配列は第２の核酸配列と「作動的に」連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動的に連結される。一般に、作動的に連結された核酸配列は隣接し、２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合にはリーディングフレーム内で隣接する。
【００２１】
本発明の実施または試験では、ここに記載する組成物および方法と類似または同等の組成物および方法を用いることができるが、適切な組成物および方法が以下に説明される。ここで言及されるすべての刊行物、特許出願、および特許は、その全体が参照によりここに組み込まれる。矛盾が生じる場合は、定義を含む本願明細書が優先される。以下に考察される特定の実施形態は、例示的であるにとどまり、限定的であることを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ポリメラーゼによって触媒されるリン酸転移の概略図のペアである。図１Ａは、２金属イオン機構を表す。ヌクレオシド三リン酸は、２価カチオン（Ｍｇ２＋、金属Ｂ）を有する活性部位に入り込む。この金属は、ヌクレオチドのβ−リン酸およびγ−リン酸によって、３Ｄｐｏｌ残基を示すが、すべてのポリメラーゼの構造モチーフＡに位置するＡｓｐ残基によって、ならびにおそらく水分子（特定の指示がなければ、金属に対する酸素配位子として示される）によって配位結合される。この金属は、活性部位中の三リン酸を配向し、触媒作用の間に電荷中和に寄与しうる。ヌクレオチドが所定の位置にあれば、第２の２価カチオンが結合する（Ｍｇ２＋、金属Ａ）。金属Ａは、３’−ＯＨ、α−リン酸、ならびに構造モチーフＡおよびＣのＡｓｐ残基によって配位結合される。この金属は、３’−ＯＨ（Ｈａとして示す）のｐＫａを低下させて生理的ｐＨでの触媒作用を促進する。図１Ｂは、プロトン転移反応を示す図である。リン酸転移反応の間に、２プロトン転移反応が起こりうる。３’−ＯＨ求核基（Ｈａ）のプロトンは取り除かれなければならず、プロトンはピロリン酸離脱基（Ｈｂ）に与えられてもよい。
【図２】図２は、２つのイオン性基がリン酸転移に必要とされることを示すグラフのペアである。ｋｐｏｌの値は、ストップフローアッセイを使用して、Ｍｇ＋２（図２Ａ）またはＭｎ＋２（図２Ｂ）でのＳ／Ｓ−＋１へのＡＭＰの組み込みについて得た。Ｍｇ＋２およびＭｎ＋２での１０を超えるｐＨの値は、ヌクレオチドの沈殿を引き起こした。実線は、７．０±０．１および１０．５±０．１のｐＫａ値が得られるＭｇ＋２について式３にデータをフィットさせたもの、および８．２±０．１のｐＫａ値が得られるＭｎ＋２について式４にデータをフィットさせたものを示す。図２Ｂの点線は、予測される曲線から、Ｍｎ＋２に存在する１０．５のｐＫａを有するイオン性基が得られるはずであることを示す。
【図３】図３は、定常状態前のヌクレオチド組み込みの反応速度に対する溶媒重水素同位体効果を示す一連のグラフである。Ｍｇ２＋（図３Ａ）またはＭｎ２＋（図３Ｂ）でのＨ２Ｏ（●）またはＤ２Ｏ（■）中におけるＳ／Ｓ−＋１へのＡＭＰの定常状態前の組み込み。実線は、式１にデータをフィットさせたものであり、Ｍｇ２＋でＨ２ＯおよびＤ２Ｏについてそれぞれ３０±４秒−１および１０±１秒−１の速度定数ｋｏｂｓが得られ、Ｍｎ２＋で１０±１秒−１および１．４±０．３秒−１の速度定数ｋｏｂｓが得られた。Ｍｇ２＋（図３Ｃ）またはＭｎ２＋（図３Ｄ）でのＨ２Ｏ（●）またはＤ２Ｏ（■）中におけるＳ／Ｓ−＋１へのＡＭＰの定常状態の組み込み。線は、線にデータをフィットさせたものであり、Ｈ２ＯおよびＤ２Ｏ中でそれぞれ３．４×１０−４±１×１０−５μＭｓ−１および２．９×１０−４±３×１０−５μＭｓ−１のＭｇ２＋の速度、ならびにＭｎ２＋で０．５±０．１μＭｓ−１および０．３±０．１μＭｓ−１の速度を得た。
【図４】図４は、２つのプロトンがリン酸転移の間に転移されることを示すグラフのペアである。プロトンインベントリーをＭｇ２＋（図４Ａ）またはＭｎ２＋（図４Ｂ）で行った。ｋｎは、Ｄ２Ｏの特定のモル分率のヌクレオチド組み込みについて観察された速度定数である。ｋＨ２ＯはＨ２Ｏ中でのヌクレオチド組み込みについて観察された速度定数である。ｎは、Ｄ２Ｏのモル分率である。実線は、２プロトン転移モデル（式５）にデータをフィットさせたものを表す。点線は、１プロトン転移モデル（式６）から予測される線を示す。
【図５】図５は、すべてのポリメラーゼによって触媒されるリン酸ジエステル結合形成の間に２つのプロトンが転移することを示す一連のグラフである。図５Ａは、他のポリメラーゼについての溶媒重水素同位体効果を示す。［ｉ］ＲＢ６９  ＤｄＤｐ、［ｉｉ］Ｔ７  ＤｄＲｐ、および［ｉｉｉ］ＨＩＶ  ＲＴ。ヌクレオチド組み込みについての定常状態前速度定数は、Ｈ２Ｏ（●）またはＤ２Ｏ（■）ですべてのポリメラーゼについて決定した。実線はデータを式１にフィットさせたものである。速度定数は、ＲＢ６９  ＤｄＤｐについてＨ２ＯおよびＤ２Ｏでそれぞれ１６０±１５秒−１および６０±６秒−１、Ｔ７  ＤｄＲｐについてＨ２ＯおよびＤ２Ｏでそれぞれ４６±５秒−１および８±１秒−１、ＨＩＶ  ＲＴについてＨ２ＯおよびＤ２Ｏでそれぞれ１４０±１４秒−１および６０±５秒−１。図５Ｂは、他のポリメラーゼについてのプロトンインベントリーを示す。［ｉ］ＲＢ６９  ＤｄＤｐ、［ｉｉ］Ｔ７  ＤｄＲｐ、および［ｉｉｉ］ＨＩＶ  ＲＴ。実線は、２プロトン転移モデル（式５）にデータをフィットさせたものである。点線は、１プロトン転移モデル（式６）で予測される線を示す。すべての場合で、２プロトン転移モデルがデータに最もフィットする。
【図６】図６は、ポリメラーゼによって触媒されるヌクレオチジル転移反応での一般的な塩基および一般的な酸の概略図である。データは、求核基の活性化が７．０のｐＫａで起こり、離脱基のプロトン化が１０．５のｐＫａで起こるモデルと一致している。このｐＫａは、用いる２価カチオンによっておよびヌクレオチド基質のα−位置に存在する原子によって調整されるので、７．０のｐＫａはおそらく３’−ＯＨである。
【図７】図７は、３Ｄｐｏｌによって触媒されるヌクレオチド組み込み反応のための蛍光プローブとしての２−アミノプリンを示す図である。図７Ａは、２−アミノプリン（２Ａ）塩基を示す概略図であり、これは蛍光性であってウラシルと２つの塩基対を形成する能力を有する一方、２Ａとは反対のＵＭＰの組み込みは、Ａとは反対の組み込みほど効率的ではない。図７Ｂは、ここで使用されるプライマー鋳型基質を示す。それはｓｙｍ／ｓｕｂと呼ばれる１０ｎｔの自己相補的ＲＮＡである。鋳型位置は、図のとおりに指定した。Ｓ／Ｓ−０、Ｓ／Ｓ−＋１、およびＳ／Ｓ−＋２。図７Ｃは、蛍光性の過渡応答の大きさおよび方向が鋳型中の２Ａの位置に依存することを示す一連のグラフである。Ｓ／Ｓ−０、Ｓ／Ｓ−＋１、およびＳ／Ｓ−＋２の位置で２Ａについて使用した基質の実際の配列を示す。最初の「正しい」ヌクレオチドのみを評価した。位置０についてのＵＴＰ（２００μＭ）ならびに位置＋１および＋２についてのＡＴＰ（２００μＭ）。Ｓ／Ｓ−０へのＵＭＰ組み込みは、蛍光の５０％の変化および１±０．１秒−１の観察された速度定数ｋｏｂｓを示した。Ｓ／Ｓ−＋１へのＡＭＰの組み込みは、蛍光の２５％の変化および６０±８秒−１のｋｏｂｓを示した。Ｓ／Ｓ−＋２へのＡＭＰの組み込みは、蛍光の１５％の変化および５０±６秒−１のｋｏｂｓを示した。
【図８】図８は、ストップフロー蛍光アッセイが化学的クエンチフローアッセイと同じ反応速度定数を得ることを示すグラフのペアである。図８Ａは、２ＡＰの蛍光によってモニターされたＡＴＰ濃度の関数としてのＡＭＰ組み込みの反応速度を示す。３ＤｐｏｌをＳ／Ｓ−＋１とインキュベートし、ストップフロー装置中で４０〜１２００μＭのＡＴＰと混合した。実線は、単一の指数方程式（式１）にデータをフィットさせたものを表す。図８Ｂは、図８Ａで得られた値をＡＴＰ濃度の関数としてプロットしたことを示す。実線は、双曲型方程式（式２）にデータをフィットさせたものを表し、７０±１０μＭのＫＤ，ａｐｐおよび７０±１０秒−１のｋｐｏｌの値を得た。
【図９】図９は、３Ｄｐｏｌによって触媒されるヌクレオチド組み込みについての反応速度機構を示す略図である。ポリオウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）（３Ｄｐｏｌ）についての反応速度機構を一実施形態として示す。この系の利点のうちの１つは、３Ｄｐｏｌがプライマー鋳型基質上に集合すると、この複合体は２時間を超える半減期を有し、反応速度分析を非常に単純化することである。段階１では、酵素核酸複合体（ＥＲｎ）がヌクレオシド三リン酸に結合し、３元複合体（ＥＲｎＮ）を形成する。段階２は、触媒作用のために三リン酸を配向させる構造変化（＊ＥＲｎＮ）を含む。段階３で、リン酸転移が起こり（＊ＥＲｎ＋１ＰＰｉ）、第２の構造変化の段階（ＥＲｎ＋１ＰＰｉ）およびピロリン酸の放出（ＥＲｎ＋１）がそれに続く。
【図１０】図１０は、ＰＶポリメラーゼの構造モチーフＤがＦｌｕポリメラーゼで予測されることを示す略図である。図１０Ａは、赤で強調したモチーフＤと共に、灰色で色づけしたカートゥーン（cartoon）モデル（ｐｄｂ：１ＲＡＪ）として表したＰＶポリメラーゼのパーム（触媒）ドメインを示す。図１０Ｂは、示されている重要な残基Ｌｙｓ３５９およびＴｈｒ３６２を有するＰＶポリメラーゼのモチーフＤを示す。図１０Ｃは、シアンで色づけしたインフルエンザポリメラーゼのモチーフＤのモデル化構造を示す。ＢのＬｙｓ３５９およびＴｈｒ３６２に対して等価な位置の残基Ｌｙｓ４８１およびＩｌｅ４８４を示す。図１０Ｄは、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型のインフルエンザウイルス由来のＰＢ１タンパク質のモチーフＤの残基の揃いを、ポリオウイルス３Ｄｐｏｌとともに示す。保存されている残基を赤で示す。
【図１１】図１１は、ＰＶ  ３Ｄｐｏｌ  ＲｄＲｐ  Ｌｙｓ−３５９が一般酸触媒として機能するための位置に存在することを明らかにする配列アラインメントおよび分子モデリングを示す図である。図１１Ａ：様々なＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列アラインメントが、モチーフＤ活性部位のリシンの絶対的な保存を示している。ポリオウイルス（ＰＶ）、コクサッキーウイルス（Ｃｏｘ）、ヒトライノウイルス１４（ＨＲＶ１４）、ウサギ出血性疾患ウイルス（ＲＨＤＶ）、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１型逆転写酵素（ＨＩＶＲＴ）、バクテリオファージＱ−β（ＱＢｅｔａ）。図１１Ｂ：ポリオウイルス３Ｄｐｏｌ−三重複合体に関するモデルにおけるＬｙｓ−３５９、Ａｓｐ−３２８、および結合ヌクレオチド（ＡＴＰ）の配置。Ｌｙｓ−３５９は、ヌクレオチド三リン酸部分のβ−リン酸と最も密接に相互作用する。図１１Ｃ：Ｌｙｓ−３５９は、リン酸転移において一般酸触媒として機能するように配置される。図１１Ｃｉ：Ｌｙｓ−３５９は、リン酸転移の以前、β−リン酸と空間的に近接している。図１１Ｃｉｉ：リン酸転移の遷移状態に近づくと、プライマー３’−ＯＨプロトン、Ｈａは未同定の塩基によって引き離され、Ｌｙｓ−３５９のε−アミノ基は、その解離性プロトン、Ｈｂを、α−リン原子とβ−リン原子の間の非架橋の酸素に与える。
【図１２】図１２は、ＰＶ  ３Ｄｐｏｌ  ＷＴに関するｐＨ速度プロファイル、および位置３５９突然変異体がＬｙｓ−３５９の一般酸触媒としての役割を支えることを示す一連のグラフである。図１２Ａ：ＷＴ  Ｋ３５９  ３Ｄｐｏｌに関するｐＨ−速度プロファイルは、２つのイオン性基がリン酸転移の速度に影響を与えることを示す。２つの基の推定ｐＫａは、３’−ＯＨプロトンに相当すると考えられる７．０、およびＬｙｓ−３５９プロトンに相当すると仮定される１０．５である。図１２Ｂ：ｐＨ−速度プロファイルの塩基性のアームは３Ｄｐｏｌ  Ｋ３５９Ｌ酵素において消失し、これは、１つの化学的に影響を与えるイオン性基の消失を示す。図１２Ｃ：Ｋ３５９Ｈ  ３ＤｐｏｌおよびＫ３５９Ｒ  ３ＤｐｏｌのｐＨ−速度プロファイルは、Ｋ３５９Ｌ酵素に関するそれと重なり合う。Ｋ３５９Ｈポリメラーゼは、およそＨｉｓイミダゾール基解離性プロトンのｐＫａであるｐＨ７．５においてＫ３５９Ｌより反応速度論的に５倍優れているが、それよりも高いｐＨではＫ３５９Ｌの反応速度特性に収束する。Ｋ３５９Ｒポリメラーゼは、ｐＨ７．５においてＫ３５９Ｌよりも反応速度論的に５倍優れているが、それよりも高いｐＨでは、Ａｒｇ側鎖のｐＫａに近づくにつれて、Ｋ３５９Ｒの触媒能力はＷＴ  Ｋ３５９  ３Ｄｐｏｌのそれに近づく。
【図１３】図１３は、図１２Ｃ中に示したグラフを拡大したものである。
【図１４】図１４は、Ｌｙｓ−３５９が触媒作用時の１プロトン転移の源であることを明らかにする、ＷＴ  Ｋ３５９  ３ＤｐｏｌならびにＫ３５９ＬおよびＫ３５９Ｒ変異体に関するｐＤ７．５におけるプロトンインベントリーを示す一連のグラフである。図１４Ａ：ＷＴ  Ｋ３５９のプロトンインベントリーのプロットはボウル形であり、リン酸転移の遷移状態のときに２つ以上の速度増大プロトンが転移することを示す。実線は２プロトンモデル（式５）に適合しており、破線の直線は視覚的な参考として加えている。図１４Ｂ：Ｋ３５９Ｌ  ３Ｄｐｏｌに関するプロトンインベントリーのデータは１プロトンの直線モデル（式６）に最も適合しており、化学的に不活性なＬｅｕへのＬｙｓ−３５９の変化がリン酸転移反応の間の１つの速度増大プロトンの転移を消失させたことを示す。図１４Ｃ：Ｋ３５９Ｒ  ３Ｄｐｏｌに関するプロトンインベントリーはボウル形であり、Ａｒｇが３Ｄｐｏｌ  ３５９位置を占めるとき、２つ以上のプロトンが遷移状態において転移することを示す。
【図１５】図１５は、ＨＩＶ−１、Ｔ７、およびＲＢ６９ポリメラーゼに関する一連の結晶構造である。保存活性部位のＬｙｓは、他のクラス由来のポリメラーゼのリン酸転移において一般酸触媒として機能するための位置に存在する。高解像度Ｘ線結晶構造から、保存活性部位のリシンは、ＨＩＶ−１  ＲＴ  ＲｄＤｐのＬｙｓ−２２０（図１５Ａ）、ＲＢ６９  ＤｄＤｐのＬｙｓ−５６０（図１５Ｂ）、およびＴ７  ＤｄＲｐのＬｙｓ−６３１（図１５Ｃ）であることが分かる。それぞれの場合において、保存されているＬｙｓは、ヌクレオチド三リン酸部分のα−リン原子とβ−リン原子の間の架橋酸素と密接に相互作用すると考えられる。
【図１６】図１６は、保存活性部位のＬｙｓ位置におけるＷＴポリメラーゼおよびＬｅｕ変異体に関するプロトンインベントリーを示す一連のグラフであり、全てのクラスの核酸ポリメラーゼにおけるこのＬｙｓに関する一般酸触媒としての役割を示す。図１６Ａｉ：ＨＩＶ−１  ＲＴ  ＷＴ  Ｌｙｓ−２２０  ＲｄＤｐに関するプロトンインベントリーのプロットはボウル形であり、遷移状態のときに２つ以上のプロトンが転移することを示す。実線は２プロトンモデル（式５）に適合しており、破線の直線は視覚的な参考として加えている。図１６Ａｉｉ：ＨＩＶ−１  ＲＴ  Ｋ２２０Ｌ  ＲｄＤｐに関するプロトンインベントリーは直線モデル（式６）に最も適合しており、位置２２０の化学的に不活性なＬｅｕによるＬｙｓの置換がリン酸転移反応の間の１つの速度増大プロトンの転移を消失させたことを示す。図１６Ｂｉ：同様に、ＷＴ  ＲＢ６９  Ｌｙｓ−５６０  ＤｄＤｐのプロトンインベントリーはボウル形であり、２つ以上のプロトンの転移が触媒作用を高めることを示す。図１６Ｂｉｉ：ＲＢ６９  Ｋ５６０Ｌに関するプロトンインベントリーのデータは直線に最も適合しており、この変異体ではただ１つのプロトンの転移が触媒作用を高めることを示す。図１６Ｃ：Ｔ７  ＤｄＲｐ  ＷＴ  Ｌｙｓ−６３１のプロトンインベントリーのプロットはボウル形であり、２つ以上のプロトンの転移がヌクレオチド組み込みのリン酸転移段階の速度に影響することを示す。
【図１７】図１７は、ＰＶ  Ｋ３５９Ｒ、ＨのサブゲノムレプリコンがＷＴレプリコンよりも複製が遅いことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ＷＴポリメラーゼと比較して複製速度の変化および忠実度の変化をもたらす活性部位リシン残基の置換を有する改変ウイルスポリメラーゼの開発に関係する組成物および方法を包含する。ここに記載する組成物および方法は、ウイルスワクチン用にウイルスを弱毒化する普遍的な手段を提供する。
【００２４】
ポリメラーゼが触媒するヌクレオチジル基転移反応には、２金属イオン機構が提起されている［リュー  ジェイ（Ｌｉｕ，Ｊ．）およびツァイ  エム  ディー（Ｔｓａｉ，Ｍ．−Ｄ．）（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０，９０１４−９０２２；シュタイツ  ティー  エー（Ｓｔｅｉｔｚ，Ｔ．Ａ．）（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３，３１−３８］。この機構（図１Ａ）では、金属ＡがそのｐＫａ値を低下させることによりプライマー３’−ＯＨの求核性を上昇させ、金属Ｂが遷移状態において形成されるオキシアニオンを安定化させ、ピロリン酸の放出を促進しうる。ヌクレオチジル基転移時においては、プライマーの３’−ＯＨからプロトン（図１ＢのＨａ）を除去しなければならない。ピロリン酸離脱基がプロトン化（図１ＢのＨｂ）されなければならないかどうかは知られていないが、ピロリン酸のプロトン化により、ｐＫａ値が９．３領域にあるとした場合の生理的条件下における触媒速度は上昇するであろう。活性部位における残基が、これらの重要なプロトン転移反応のアクセプターまたはドナーとして機能するかどうかはこれまで知られていなかった。
【００２５】
ここに記載する試験では、ヌクレオチジル基転移機構により、ピロリン酸離脱基をプロトン化することによってヌクレオチド付加を促進するすべてのポリメラーゼの活性部位中における残基が同定され、この残基はＰＶポリメラーゼ中のＬｙｓ−３５９である（図６）。表１に示すとおり、ポリメラーゼのこの位置における種々のアミノ酸の置換により、複製の速度および忠実度の異なる酵素が産出される。変異ＰＶウイルスは、各々がＫ３５９Ｒ置換またはＫ３５９Ｈ置換をもたらす改変ポリメラーゼ遺伝子を有するように作製した。これらのウイルスは、ＷＴウイルスと比べて、細胞内で感染性であり弱毒化されていることが示された。すべてのウイルスポリメラーゼ中にこの残基の機能的な同等物が存在するので、１つまたは複数のＰＶ変異体がＷＴのＰＶによる攻撃に対して保護能を有するならば、ウイルスワクチン株の生成に関する普遍的に適用可能なポリメラーゼ機構に基づく手段を確立する段階が定められるであろう。
【００２６】
【表１】
2010514424.tif 000003
以下に説明される好ましい実施形態では、これらの組成物および方法の適応を例示する。しかしながら、以下に示される説明に基づき、これらの実施形態の説明から本発明の他の態様を作製および／または実施することができる。
【００２７】
生物学的方法
ここでは、従来の分子生物学の技法にかかわる方法を説明する。このような技法は当該技術分野で一般的に知られており、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，サムブルックら編（ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．），コールドスプリングハーバーラボラトリープレス社（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在］，２００１、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，アウスベルら編（ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．），グリーンパブリシングアンドワイリーインターサイエンス社（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）［ニューヨーク州所在］，１９９２（定期的な改定を伴う）などの方法論文において詳細に説明されている。ワクチン生成用のウイルスを増殖させ、ウイルスワクチンを投与する方法もまた、当該技術分野で一般的に知られており、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），アンドリュー  ロビンソン（Ａｎｄｒｅｗ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ），マーチン  ピー  クレニッジ（Ｍａｒｔｉｎ  Ｐ．Ｃｒａｎａｇｅ），およびマイケル  ジェイ  ハドソン（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．Ｈｕｄｓｏｎ）著，２ｎｄ  ｅｄ．，フマーナプレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）社［ニュージャージー州トトワ所在］，２００３；Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，マンモハン  シン（Ｍａｎｍｏｈａｎ  Ｓｉｎｇｈ）著，１ｓｔ  ｅｄ．，ワイリーインターサイエンス社（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）［ニュージャージー州ホボケン］，２００７；アーヴィン  エー  エム（Ａｒｖｉｎ  Ａ．Ｍ．）およびグリーンバーグ  エイチ  ビー（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｈ．Ｂ．），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４４：２４０−２４９，２００６；およびアール  モレンヴァイザー（Ｒ．Ｍｏｒｅｎｗｅｉｓｅｒ），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ１０３−Ｓ１１０，２００５において詳細に説明されている。ウイルスポリメラーゼのアミノ酸配列、およびウイルスポリメラーゼをコードする核酸配列は当該技術分野で知られている。例えば、受託番号４１３９７３９を有するＨＩＶ−１  ＲＴアミノ酸配列は、フアンら（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１６６９−１６７５，１９９８）において説明されている。このＨＩＶ−１  ＲＴは、ＷＴバックグラウンドに基づくが、固有の発現、結晶学的特性を許容し、かつ、酵素をそのＲＮＡ／ＤＮＡ基質と共有結合させる改変を有する。別の例では、受託番号Ｖ０１１４８を有するヒトＰＶ核酸配列が説明されている［北村およびヴィンマー（Ｋｉｔａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｗｉｍｍｅｒ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３１９６−３２００，１９８０］。さらに別の例では、受託番号ＡＡＹ４４７７３を有するヒトＡ型インフルエンザのアミノ酸配列が説明されている［ゲディンら（Ｇｈｅｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ  ４３７：１１６２−１１６６，２００５］。これらの参考文献は参照によりここに組み込まれる。
【００２８】
弱毒化ウイルス
本発明は、ウイルスポリメラーゼの活性部位中の保存アミノ酸残基に少なくとも１つの変異（例えば、置換、欠失、挿入）を有する弱毒化ウイルスを含む。典型的に、こうした改変ポリメラーゼは、ヌクレオチド組み込みのリン酸転移段階において一般酸触媒として機能する能力を有するポリメラーゼ活性部位のリシン残基を、ロイシン残基、ヒスチジン残基、またはアルギニン残基に置換することを含む。このリシン残基は、隣接する保存アミノ酸残基とともに、ＡファミリーポリメラーゼのヘリックスＯ、ＢファミリーポリメラーゼのヘリックスＰ、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）および逆転写酵素（ＲＴ）のモチーフＤのループ上に位置している。
【００２９】
ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは保存構造を有する。ＰＶのＬｙｓ−３５９は、ここでインフルエンザ用にモデル化されたモチーフ（図１０Ｃ）である保存構造モチーフＤ（図１０Ｂ）上にある酵素の「パーム」サブドメイン（図１０Ａ）中に存在する。インフルエンザにおけるＬｙｓ−３５９との構造的相同体は、ＰＢ１サブユニットのＬｙｓ−４８１である（図１０Ｃ）。この残基は、インフルエンザＡ、ＢおよびＣ遺伝子型に見出される（図１０Ｄ）。まとめると、これらの観察により、インフルエンザは、ここに記載するポリメラーゼ機構に基づく手段を用いることにより弱毒化しうるという考えが強化される。
【００３０】
同等の残基は、ＡファミリーポリメラーゼのヘリックスＯ、ＢファミリーポリメラーゼのヘリックスＰ、ならびにＲｄＲｐおよびＲＴのモチーフＤのループ上に位置している（表６）。多くのＤＮＡウイルスポリメラーゼはＢファミリーポリメラーゼ、例えばヘルペスウイルスおよびポックスウイルスであり、この保存されているＬｙｓ残基を有する。これらのウイルスもまた、ここに記載するポリメラーゼ機構に基づく手段を用いることにより弱毒化することができる。以下に記載する実験において、ＰＶ変異ウイルスＫ３５９ＲおよびＫ３５９Ｈは複製されることが分かった。
【００３１】
ここに記載する一部の実施形態において、弱毒化ウイルスは、複製欠損型または非複製型であり、宿主細胞内で発現される外来の核酸を含む。こうした核酸の例は、例えばサイトカインや酵素などの治療分子を含む。
【００３２】
したがって、本発明はまた、本発明のワクチンを、それを必要とする動物に投与する工程を含んだウイルス感染の予防法または治療法も含む。例えば、本発明によるヒト疾患を引き起こすウイルス体は、フィロウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、レトロウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、トガウイルス、ピコナウイルス、パポバウイルス、および胃腸炎ウイルスを含む（ただし、これらに限定されない）。
【００３３】
一部の実施形態において、弱毒化ウイルスは、複製欠損型であるか複製能がなく、ワクチンの製造に用いられる。例えば、ワクチン調製に用いられる急速複製型毒性ウイルス、例えばインフルエンザウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１）やＨＩＶウイルスは、宿主細胞にとって有害である。弱毒化ワクチン株は、複製速度が緩慢であり、所望の場合にはウイルスが非複製型とされる点において有利であり、急速な複製速度のせいでウイルス株が宿主に対して致死性となることを阻止する。したがって、好ましい実施形態において、複製速度は、一般酸をリシンから別の残基（例えば、ロイシン、アルギニン、ヒスチジン）に変化させる変異を組み込む工程により制御される。一般に、ここに記載する改変ポリメラーゼおよび方法を用いると、ウイルス複製は、ＷＴウイルスと比較して少なくとも２４分の１にまで低減される。別の実施形態において、弱毒化ウイルス株は、正常ウイルスにより正常に溶解される宿主細胞内で増殖する。例としては、ヒトリンパ球内で増殖してこれらの細胞を即時に溶解または死滅させない弱毒化ＨＩＶ株がある。
【００３４】
核酸
ここに記載する改変ウイルスポリメラーゼは、ヌクレオチド組み込み反応のリン酸転移段階において一般酸触媒として機能する能力を有するポリメラーゼ活性部位のアミノ酸残基に変異（例えば、置換、欠失、挿入）をもたらす改変を有するウイルスポリメラーゼ遺伝子によりコードされる。ウイルスポリメラーゼの保存領域における１つまたは複数の変異は、ポリメラーゼの活性（例えば、複製速度、忠実度など）を調節する。
【００３５】
以下に記載する実験において、ＰＶポリメラーゼは、受託番号Ｖ０１１４８を有する核酸配列によりコードされるＷＴのＰＶポリメラーゼアミノ酸配列の位置３５９に対応するリシンがロイシン、アルギニン、ヒスチジンに置換されることを含むよう改変された。ＨＩＶ−１ウイルスおよびインフルエンザウイルス中の対応する残基もまた同定した。例えば、ＨＩＶ−１  ＲＴ中の対応するリシンは、受託番号４１３９７３９を有するＨＩＶ−１  ＲＴアミノ酸配列の位置２２０に対応する。同様に、インフルエンザウイルス中の対応するリシンは、受託番号ＡＡ４４４７７３を有するＷＴのインフルエンザウイルス遺伝子セグメントのＰＢ１アミノ酸配列の位置４８１に対応する。
【００３６】
一部の実施形態において、ポリメラーゼ遺伝子中の複数の隣接する核酸は、保存アミノ酸残基をコードしないオリゴヌクレオチドで置換することができる。本発明に関して想定される一部の好ましいオリゴヌクレオチドの例としては、改変骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホン酸、短鎖アルキル結合もしくはシクロアルキル糖間結合、または短鎖ヘテロ原子結合もしくはヘテロサイクリック糖間結合を含むオリゴヌクレオチドがある。最も好ましいのは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチド、特に、天然のホスホジエステル骨格がＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨと表される、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２骨格、ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２骨格［メチレン（メチルイミノ）骨格またはＭＭＩ骨格］、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２骨格、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２骨格、およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格である。デ  メスメカーら（Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５，２８：３６６−３７４により開示されたアミド骨格もまた好ましい。モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチド［サマートンおよびウェラー（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ），米国特許第５，０３４，５０６号］もまた好ましい。ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格など他の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格で置換され、核酸塩基がポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接または間接に結合する［ニールセンら（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５４，１４９７］。オリゴヌクレオチドはまた、１つまたは複数の置換糖部分も含みうる。好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の１つを含む。ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３［式中、ｎは１〜約１０］、Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリール、またはアラルキル、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入基、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基、および同様の特性を有する置換基。好ましい改変は、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られる２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３］［マーチンら（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６］を含む。他の好ましい改変は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の改変はまた、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上における糖の３’位置および５’末端ヌクレオチ��の５’位置においても行いうる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣体も有しうる。
【００３７】
オリゴヌクレオチドはまた、それに加えてあるいは代わって、核酸塩基（当該技術分野では、単に「塩基」と称することが多い）の改変または置換も含みうる。ここで用いられる「非改変の」核酸塩基または「天然の」核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。改変核酸塩基は、天然の核酸中ではまれにまたは一過性で見出されるにすぎない核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に、５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも称し、当該技術分野では５−Ｍｅ−Ｃと称することが多い）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、およびゲントビオシルＨＭＣの他、合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン、または他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロシキメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、および２，６−ジアミノプリンを含む［コーンバーグ  エー（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．），ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ダブリューエイチフリーマンアンドカンパニー社（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．）［サンフランシスコ］，１９８０，ｐｐ７５−７７；ゲベイェフ  ジーら（Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８７，１５：４５１３］。当該技術分野で知られる「普遍的な」塩基、例えばイノシンを含めてよい。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸の２本鎖での安定性を０．６〜１．２℃だけ上昇させることが示されており［サンヴィー  ワイ  エス（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．），クルーク  エス  ティー（Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．）およびルブルー  ビー（Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．）編，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣプレス社（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）［米国ボカラトン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）所在］，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８］、現在のところ好ましい塩基置換である。
【００３８】
本発明によるオリゴヌクレオチドの別の改変は、オリゴヌクレオチドの活性または細胞内への取り込みを増強する１つまたは複数の部分または共役体のオリゴヌクレオチドへの化学的連結を含む。こうした部分は、コレステロール部分、コレステリル部分などの脂質部分［レスティンガーら（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８９，８６，６５５３］、コリン酸［マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．１９９４，４，１０５３］、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール［マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９２，６６０，３０６；マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．１９９３，３，２７６５］、チオコレステロール［オーバーハウザーら（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２，２０，５３３］、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基［セゾン−ベモアラら（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９１，１０，１１１；カバノフら（Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９０，２５９，３２７；スヴィナルチュクら（Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  １９９３，７５，４９］、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート［マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９５，３６，３６５１；シェイら（Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，１８，３７７７］、ポリアミン鎖またはポリエチレングリコール鎖［マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９５，１４，９６９］、またはアダマンタン酢酸［マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９５，３６，３６５１］を含むがこれらに限定されない。親油性部分を含むオリゴヌクレオチド、およびこうしたオリゴヌクレオチドの調製法は、当該技術分野、例えば米国特許第５，１３８，０４５号、同第５，２１８，１０５号、および同第５，４５９，２５５号で知られている。
【００３９】
所与のオリゴヌクレオチド中のすべての位置が一様に改変される必要はなく、実際、前述の複数の改変は、単一のオリゴヌクレオチド中、あるいはオリゴヌクレオチド内のまさに単一のヌクレオシド内に組み込んでよい。本発明はまた、先に定義したようなキメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含む。
【００４０】
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、またはポリ炭化水素化合物を含むがこれに限定されない別の部分と共役する。当業者は、これらの分子を、糖、塩基、またはリン酸基上の複数の位置において、核酸分子を含む１つまたは複数の任意のヌクレオチドに連結しうることを認めるであろう。
【００４１】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）：ＲＮＡｉは、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ここでは低分子干渉ＲＮＡの場合にｓｉＲＮＡ、または二重鎖低分子干渉ＲＮＡの場合にｄｓ  ｓｉＲＮＡとも称する）が動物または植物細胞中の相同的なｍＲＮＡの配列特異的な分解を誘導する目覚ましく有効な方法である［フトヴァーグナーおよびゼイマー（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，１２：２２５−２３２（２００２）；シャープ（Ｓｈａｒｐ），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：４８５−４９０（２００１）］。哺乳動物細胞において、ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の２本鎖［チウら（Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１０：５４９−５６１（２００２）；エルバシールら（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８（２００１）］によっても、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、機能的低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと共にＤＮＡ鋳型を用いてインビボで発現される他のｄｓＲＮＡ［ゼンら（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，９：１３２７−１３３３（２００２）；パディソンら（Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１６：９４８−９５８（２００２）；リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：５００−５０５（２００２）；ポールら（Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：５０５−５０８（２００２）；トゥシュル  ティー（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：４４０−４４８（２００２）；ユーら（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（９）：６０４７−６０５２（２００２）；マクマナスら（ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．），ＲＮＡ，８：８４２−８５０（２００２）；スイら（Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（６）：５５１５−５５２０（２００２）］によっても始動される。
【００４２】
ここに記載する作用物質は、ポリメラーゼ間で保存される残基領域および／または異なるポリメラーゼ間における構造的相同領域を標的とする（すなわち、これに結合する）ｄｓＲＮＡ分子を含みうる。例えば、ポリオウイルスポリメラーゼの位置３５９に位置するリシン（例えば、表１および表６も参照されたい）。構造的な相同領域は、ＢＬＡＳＴなど各種プログラムを用いて容易に同定される。
【００４３】
ｄｓＲＮＡ分子は、各鎖中に１６〜３０、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のヌクレオチドを含むのが典型的であり、一方の鎖は、ｍＲＮＡ中の標的領域と、例えば、少なくとも８０％（あるいはそれ以上、例えば、８５％、９０％、９５％、または１００％）同一であるか、３つ、２つ、１つ、または０のミスマッチするヌクレオチドを有するなど、実質的に同一であり、もう一方の鎖は、第１の鎖と同一であるかあるいは実質的に同一である。各鎖はまた、１つまたは複数のオーバーハンギングの（すなわち、非相補的な）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはこれを超えるオーバーハンギングのヌクレオチド、例えばｄＴｄＴｄＴもまた有しうる。
【００４４】
ｄｓＲＮＡ分子は化学的に合成することもでき、インビトロにおいてＤＮＡ鋳型から転写することもでき、インビボにおいて、例えばｓｈＲＮＡから転写することもできる。ｄｓＲＮＡ分子は、当該技術分野で知られる任意の方法を用いて設計することができ、多数のアルゴリズムが当該技術分野で知られており［例えば、トゥシュルら（Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３（２４）：３１９１−７（１９９９）を参照されたい］、多くがインターネット上、例えば、ダルマコン社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）［コロラド州ラファイエット所在］またはアンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ）［テキサス州オースチン所在］のウェブサイト上で入手できる。
【００４５】
陰性対照のｓｉＲＮＡは、選択されたｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するとしても、適切なゲノムに対する著しい配列相補性を有さない。こうした陰性対照は、選択されたｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列に無作為のスクランブルをかける工程により設計することができ、相同性検索を実施して、陰性対照が、適切なゲノム中の他の任意の遺伝子に対して相同性を欠くことを確認することができる。加えて、陰性対照ｓｉＲＮＡは、配列内に１つまたは複数の塩基ミスマッチを導入する工程によっても設計することができる。
【００４６】
約２２ヌクレオチドのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を用いて、転写後または翻訳後の段階における遺伝子発現を調節することができる。ｍｉＲＮＡは、細胞内において、ダイサー、ＲＮアーゼＩＩＩ型酵素、またはこれらの相同体により、約７０ヌクレオチドの前駆体ＲＮＡステムループから切り出すことができる。ｍｉＲＮＡ前駆体のステム配列を、標的のｍＲＮＡに対して相補的なｍｉＲＮＡ配列で置換することにより、新規のｍｉＲＮＡを発現するベクター構築物を用いて、哺乳動物細胞内の特異的なｍＲＮＡ標的に対してＲＮＡｉを開始するｓｉＲＮＡを生成することができる［前出のゼン（Ｚｅｎｇ）（２００２）］。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含有するＤＮＡベクターにより発現される場合、マイクロＲＮＡにより設計されたヘアピンは、遺伝子発現をサイレンシングすることができる［前出のマクマナス（ＭｃＭａｎｕｓ）（２００２）］。
【００４７】
ｄｓＲＮＡは、当該技術分野で知られる方法、例えば、陽イオンリポソームトランスフェクション法、ナノ粒子法、および電気穿孔法を用いて、インビボまたはインビトロで細胞内に直接に送達することもでき、機能的な二重鎖ｓｉＲＮＡを発現する能力を有する哺乳動物Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター系（例えば、Ｈ１プロモーター系またはＵ６／ｓｎＲＮＡプロモーター系［前出のトゥシュル（Ｔｕｓｃｈｌ）（２００２）］）を含み、細胞内におけるより長期にわたる標的遺伝子の抑制を可能とする、組み換えＤＮＡ構築物からインビボまたはインビトロで発現させることもできる［バジェラら（Ｂａｇｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７７：２０６−２１３（１９９８）；前出のリーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）、前出の宮岸ら（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）、前出のポールら（Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）、前出のユーら（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）、前出のスイら（Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）］。
【００４８】
ｓｉＲＮＡの発現を介する標的遺伝子の特異的なサイレンシングを誘導するには、例えば、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターによる転写制御下においてｓｉＲＮＡを有する組み換えアデノウイルスを生成する工程［前出のシアら（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）］によってウイルスを介する送達機構を使用することもできる。ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩによる転写の終結は、ＤＮＡ鋳型中においてＴ残基が４回連続で現れる際に生じ、特異的な配列においてｓｉＲＮＡ転写物を終端させる機構を提供する。こうして生成されたｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の５’→３’方向および３’→５’方向における配列に対して相補的であり、同じ構築物中でも別個の構築物中でもｓｉＲＮＡの２本鎖を発現させることができる。Ｈ１プロモーターまたはＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーターにより駆動され、細胞内で発現されるヘアピンｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害することができる［前出のバジェラら（Ｂａｇｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９８）、前出のリーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）、前出の宮岸ら（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）、前出のポールら（Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）、前出のユーら（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）、前出のスイら（Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）］。Ｔ７プロモーターの制御下にあるｓｉＲＮＡ配列を含有する構築物もまた、ベクター発現Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと共に細胞内に共トランスフェクトすると、機能的なｓｉＲＮＡを創出する［前出のジャック（Ｊａｃｑｕｅ）（２００２）］。
【００４９】
動物の場合、全胚電気穿孔法により、合成ｓｉＲＮＡを植え込み後のマウス胚中に効率的に送達することができる［カレガーリら（Ｃａｌｅｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（２２）：１４２３６−４０（２００２）］。成体マウスの場合、ｓｉＲＮＡの効率的な送達は「高圧」送達法であり、ｓｉＲＮＡを含有する大量の溶液を、尾静脈を介して動物に急速に（５秒以内）注射することにより達成することができる［前出のリュー（Ｌｉｕ）（１９９９）、前出のマカフレイ（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ）（２００２）、ルイス（Ｌｅｗｉｓ），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３２：１０７−１０８（２００２）］。例えば、細胞内への送達を容易にするリピオドール（油中のヨウ素）などの担体による局所的送達を使用することもできる。
【００５０】
細胞または全生物体内に導入されるここに記載する組み換えＲＮＡ前駆体は、所望のｓｉＲＮＡ分子の生成に用いることができる。次いで、こうしたｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ経路の内因性タンパク質成分と会合して、特異的なｍＲＮＡ配列に結合し、これを切断および破壊の標的とする。このようにして、組み換えＲＮＡ前駆体から生成されたｓｉＲＮＡにより標的化されるｍＲＮＡは細胞または生物体から枯渇し、そのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の細胞または生物体中の濃度は低下する。ＲＮＡｉの使用に関する追加の情報は、ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ，ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），ゴット編（Ｇｏｔｔ，Ｅｄ．），［フマーナプレス社（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ），２００４］中に見出すことができる。
【００５１】
アンチセンスポリヌクレオチド：「アンチセンス」核酸は、ポリメラーゼ間で保存される残基領域および／または異なるポリメラーゼ間における構造的相同領域をコードする「センス」核酸に対して相補的であるヌクレオチド配列を含みうる。例えば、ポリオウイルスポリメラーゼの位置３５９に位置するリシン（例えば、表１および表６も参照されたい）。
【００５２】
ここに開示する配列に基づけば、当業者は、本発明に従って用いられる多数の適切なアンチセンス分子のいずれかを容易に選択し合成することができる。例えば、ポリメラーゼ間で保存される残基領域および／または異なるポリメラーゼ間における構造的相同領域の全長にわたる１５〜３０ヌクレオチドからなる一連のオリゴヌクレオチドを含む「遺伝子ウォーク」。例えば、ポリオウイルスポリメラーゼの位置３５９に位置するリシン（例えば、表１および表６も参照されたい）。核酸を調製した後で、ウイルス複製の阻害について調べることができる。場合によっては、５〜１０ヌクレオチドのギャップをオリゴヌクレオチド間に残すことで、合成して調べるオリゴヌクレオチド数を低減することができる。コンピュータによる解析法、ＲＮＡアーゼによるＨマッピング法、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドによる走査マイクロアレイ法を含む他の方法を用いることもできる［ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，シェーナ編（Ｓｃｈｅｎａ，Ｅｄ．）オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）１９９９；シェルおよびロッシ（Ｓｃｈｅｒｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６（２２）：５０７９−５０８５（１９９８）］。
【００５３】
アンチセンス核酸は、標的ポリメラーゼの全コード領域に対して相補的であるように設計することができるが、標的ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域のごく一部に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドでもありうる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域、例えば、対象の標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０〜＋１０の領域に対して相補的でありうる。アンチセンス核酸は、ポリメラーゼ間で保存される残基領域および／または異なるポリメラーゼ間における構造的相同領域を標的とすることが好ましい。例えば、ポリオウイルスポリメラーゼの位置３５９に位置するリシン（例えば、表１および表６も参照されたい）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０またはこれを超えるヌクレオチド長でありうる。
【００５４】
アンチセンス核酸は、当該技術分野で知られる手順を用いた化学合成反応および酵素連結反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、分子の生物学的安定性を向上させること、あるいはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される２本鎖の物理的安定性を向上させることを目的とする自然発生のヌクレオチド、または様々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジンで置換したヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸はまた、その中に核酸がアンチセンス方向（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡが、対象の標的核酸に対してアンチセンスの方向となる）にサブクローンされた発現ベクターを用いて、生物学的にも生成することができる。
【００５５】
アンチセンス核酸は、典型的には、対象に対して投与される（例えば、組織部位への直接の注射により）か、あるいはポリメラーゼ間で保存される残基領域および／もしくは異なるポリメラーゼ間における構造的相同領域をコードするｍＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡとハイブリダイズするか、もしくはこれに結合するようにその場で（in situ）生成される。例えば、ポリオウイルスポリメラーゼの位置３５９に位置するリシン。
【００５６】
あるいは、アンチセンス核酸分子を改変して、選択された細胞を標的化し、その後に全身投与することができる。全身投与の場合、アンチセンス分子は、選択された細胞表面上で発現される受容体または抗原にそれらが特異的に結合するよう、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することにより改変することができる。アンチセンス核酸分子はまた、ここに記載するベクターを用いても細胞に送達することができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構築物を用いることができる。
【００５７】
さらに別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的なＲＮＡと特異的な２本鎖によるハイブリッド体を形成するが、ここでは、通常のβユニットとは異なり、２本鎖が互いに平行に並ぶ［ゴルティエら（Ｇａｕｌｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７）］。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド［井上ら（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７）］またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体［井上ら（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２１５：３２７−３３０（１９８７）］も含みうる。
【００５８】
いわゆる「スイッチバック型」の核酸分子を創出することにより、３重らせんの形成を標的としうる潜在的な配列を増加させることができる。スイッチバック型分子は、２本鎖のうちまず第１の一本鎖、次いで他の鎖と塩基対を形成することで、２本鎖の１つの鎖上に存在すべきプリンまたはピリミジンが相当程度に伸展する必要がなくなるよう、配列５’→３’方向と３’→５’方向とが交代する形で合成される。
【００５９】
リボザイム：リボザイムは、特異的かつ配列依存的な形で、他のＲＮＡ標的を酵素的に切断し不活化するよう組み換えうる種類のＲＮＡである。標的ＲＮＡを切断することにより、リボザイムは翻訳を阻害し、これにより標的遺伝子の発現を阻止する。リボザイムは、実験室内で化学的に合成し、当該技術分野で知られる方法を用いて、その安定性および触媒活性を上昇させるよう構造的に改変することができる。あるいは、当該技術分野で知られる遺伝子送達機構を介して、細胞内にリボザイム遺伝子を導入することもできる。ポリメラーゼ間で保存される残基領域および／または異なるポリメラーゼ間における構造的相同領域に対する特異性を有するリボザイムは、これらのヌクレオチド配列に対して相補的な１つまたは複数の配列、およびｍＲＮＡ切断の原因となる既知の触媒配列を有する配列を含みうる［米国特許第５，０９３，２４６号、または、ハッセウホッフおよびゲルラッハ（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ），Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５−５９１（１９８８）］。
【００６０】
以下の実施例は、例示のために提示されるものであり、限定のために提示されるものではない。具体的な実施例が提供されているが、上記の説明は例示的なものであり、限定的なものではない。前述で説明された実施形態の１つまたは複数の任意の特徴を、本発明における他の任意の実施形態の１つまたは複数の特徴と、任意の形で組み合わせることができる。さらに、本明細書を検討した当業者には、本発明の多くの変更が明らかとなるであろう。
【００６１】
本出願に引用されるすべての刊行物および特許文献は、各個別の刊行物または特許文献がそのように個別に表示されたと仮定した場合と同じ程度に、すべての目的に関する関連部分において組み込まれる。本件出願人は、本文書中で各参考文献を引用することにより特定の参考文献が自らの発明に対する「先行技術」であることを承認するわけではない。
【００６２】
組成物の投与
ここに記載するワクチン組成物、弱毒化ウイルス、および弱毒化ウイルスを含む組成物は、任意の適切な製剤中において、任意の適切な方法により細胞内に導入することも対象（例えば、ヒト）に投与することもできる。例えば、ここに記載する組成物および抗ウイルスワクチンは、マイクロインジェクションなどにより細胞内に直接注入してもよい。別の例では、ここに記載する組成物および抗ウイルスワクチンは、静脈内（ＩＶ）注射、腹腔内（ＩＰ）注射、皮下注射、筋肉内注射、あるいは標的組織内へのｉｎ  ｓｉｔｕでの注射を含む方法により、対象（例えば、ヒト）に直接導入してよい。例えば、従来のシリンジおよび注射針を用いて、ここに記載する抗ウイルスワクチンを含有する懸濁液を対象に注射することができる。所望の投与経路に応じて、注射は、ｉｎ  ｓｉｔｕ（すなわち、特定の組織または組織上の特定の位置に）、ＩＭ、ＩＶ、ＩＰ、または別の非経口経路によることが可能である。ここに記載する組成物および抗ウイルスワクチンはまた、経口投与、吸入、経皮投与、または坐薬塗布によっても投与することができる。
【００６３】
本発明のワクチンは、適切な希釈剤、アジュバント、および／または担体を追加的に含有することがある。ワクチンは、インビボにおけるワクチンの免疫原性を増強しうるアジュバントを含有することが好ましい。アジュバントは、グラム陰性菌内毒素のリピッドＡ部分、マイコバクテリアのトレハロースジミコレート、リン脂質であるリゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、一部の直鎖状ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン（ＰＯＰ−ＰＯＥ）ブロックポリマー、水酸化アルミニウム、およびリポソームを含む当該技術分野で知られる多くのアジュバントから選択しうる。ワクチンはまた、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ、およびＩＦＮγを含む免疫反応を増強することが知られるサイトカインも含有しうる。
【００６４】
ワクチンの用量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体内において抗体が所望の反応を引き起こす能力に応じて変化しうる。投与計画を調整することにより、最適の治療応答を提供しうる。例えば、複数回に分割した用量を毎日投与してもよく、治療状況の必要が示す度合いに応じて用量を低減してもよい。最適の予防的な投与応答を提供するためには、状況に応じてワクチンの用量を変化させうる。
【００６５】
実施例
本発明は、以下の特定の実施例によってさらに示される。実施例は、例示のみのために提供され、発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００６６】
ＲＮＡ依存性およびＤＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるヌクレオチジル転移についての律速的な遷移状態での２プロトン転移反応
材料および方法
材料：［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（＞７０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＩＣＮ社から購入した。
［α−３２Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はニューイングランドニュークリアー社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）から入手した。ヌクレオシド５’−三リン酸（超高純度の溶液）はアマシャムファルマシアバイオテクインコーポレイティッド社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）から入手した。アデノシン５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）（ＡＴＰαＳ）はアクソラバイオケミカルズ社（Ａｘｘｏｒａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）［カリフォルニア州サンディエゴ所在］から入手した。Ｄ２Ｏは、アイソテック社（Ｉｓｏｔｅｃ）［オハイオ州マイアミズバーグ所在］から購入した。重水素化グリセロールは、ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）［マサチューセッツ州アンドーバー所在］から入手した。ＲＮＡオリゴヌクレオチドはすべてダーマコンリサーチインコーポレイティッド社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）［コロラド州ボールダー所在］から入手した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドはすべてインテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）［アイオワ州コーラルビル所在］から入手した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼはニューイングランドバイオラボインコーポレイティッド社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ）から入手した。他のすべての試薬は、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、フィシャー社（Ｆｉｓｈｅｒ）、またはＶＷＲ社から入手可能な最上級のものとした。
【００６７】
略語：ＤｄＲｐはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤｄＤｐはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｐはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＴは逆転写酵素、ＰＶはポリオウイルス、Ｓ／Ｓは対称プライマー／鋳型基質、ＣＱＦは化学的クエンチフロー機器、ＳＦはストップフロー機器、２ＡＰは２−アミノプリン、ＳＤＩＥは溶媒重水素同位体効果、ＤＴＴはジチオトレイトール、ＢＭＥはベータ−メルカプトエタノール、ＥＤＴＡはエチレンジアミノテトラ酢酸、ＮＰ−４０はｎｏｎｉｄｅｎｔ  Ｐ−４０、ＰＭＳＦはフッ化フェニルメチルスルホニル、ＰＥＩはポリエチレンイミンである。
【００６８】
ＰＶ  ３Ｄｐｏｌによって触媒されるヌクレオチド組み込み実験
ストップフロー実験：ストップフロー実験は、水浴を装備したＭｏｄｅｌ  ＳＦ−２００１ストップフロー装置（キンテックコーポレーション社（Ｋｉｎｔｅｋ  Ｃｏｒｐ．）［テキサス州オースチン所在］）を使用して行った。反応はすべて３０℃で行った。反応は、バッファーの２つの異なるセットで行った。ＨＥＰＥＳ中での反応は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６０μＭ  ＺｎＣｌ２中で３分間、室温で１μＭ酵素を１μＭ  ｓｙｍ／ｓｕｂ（０．５μＭ２本鎖）とインキュベートすることによって行い、次いで、サンプル区画内で３０℃で平衡を保たせて、次いで、同じバッファーを使用することによって調製したヌクレオチドと素早く混合した反応を指す。ＭＴＣＮまたはＭＨＣＮ中での反応は、３分間、室温で１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５中で１μＭ酵素を１μＭ  ｓｙｍ／ｓｕｂ（０．５μＭ２本鎖）とインキュベートすることによって行い、次いで、サンプル区画内で３０℃に平衡を保たせて、次いで、示されるｐＨで２×ＭＴＣＮバッファーを含有する溶液中でヌクレオシド三リン酸基質と素早く混合した反応を指す。１×ＭＴＣＮバッファーは、５０ｍＭ  ＭＥＳ、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、２５ｍＭ  ＣＡＰＳ、および５０ｍＭ  ＮａＣｌとする。酵素−ｓｙｍ／ｓｕｂおよびヌクレオチド溶液の両方についての他のバッファー成分は同じものとした。１×ＭＨＣＮバッファーは、５０ｍＭ  ＭＥＳ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ  ＣＡＰＳ、および５０ｍＭ  ＮａＣｌとする。３Ｄｐｏｌは、使用の直前に、酵素バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、６０μＭ  ＺｎＣｌ２、および２０％グリセロール）に希釈した。あらゆる反応に添加した酵素の容量は、全反応容量の２０分の１と常に等しくした。１ｍＭよりも高い最終ＡＴＰ濃度を有する反応については、遊離Ｍｇ２＋の量は、反応中のＭｇＣｌ２の量を１ｍＭを上回るＡＴＰ濃度に加えた５ｍＭに増加させることによって一定に保った。例えば、５ｍＭ  ＡＴＰを含有する反応では、最終Ｍｇ２＋濃度は９ｍＭに調整した。使用した励起波長は３１３ｎｍとした。蛍光発光は、３７０ｎｍカットオンフィルター（モデルＥ３７０ＬＰ、クロマテクノロジーコーポレーション社（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．）［バーモント州ロッキンガム所在］）を使用することによってモニターした。加水分解抵抗性のＡＴＰ類似体α，β−メチレンアデノシン５’−三リン酸（ＡＭＰＣＰＰ）を利用する反応は、蛍光で観察される変化が、ヌクレオチド結合の結果として２ＡＰ環境での変性に起因した可能性を調べるために行った。これは、蛍光の変化が調査下の時間枠にわたって最小限であったので、そうではないことを証明した。ヌクレオチド基質の濃度および使用するバッファーの含有量は適切な図および表の説明文に示す。ヌクレオチド組み込みについての速度定数は、機器のデータ分析ソフトウェアを使用することによって得た。
【００６９】
急速化学的クエンチフロー実験
急速混合／クエンチング実験は、ＭｏｄｅｌＲＱＦ−３化学的クエンチフロー装置（キンテックコーポレーション社（Ｋｉｎｔｅｋ  Ｃｏｒｐ．）［テキサス州オースチン所在］）を使用することによって行った。３Ｄｐｏｌ−ｓｙｍ／ｓｕｂ複合体およびすべてのバッファー溶液は、上記に記載されるストップフロー実験と同じ方法で調製した。反応は、１Ｍの最終濃度までの、ＨＣｌの添加によってクエンチした。ＨＣｌの添加直後に、溶液は、１Ｍ  ＫＯＨおよび３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基（最終濃度）の添加によって中和した。ヌクレオチド基質の濃度および使用するバッファーの含有量は適切な図および表の説明文に示す。
【００７０】
急速クエンチ産物分析：変性ＰＡＧＥ
等容量のローディング／クエンチング色素（８５％ホルムアミド、０．０２５％ブロモフェノールブルー、および０．０２５％キシレンシアノール、９０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を、１０μｌのクエンチした反応混合物に添加し、１×ＴＢＥ（２ｍＭ  ＥＤＴＡ、８９ｍＭホウ酸、８７ｍＭ  Ｔｒｉｓ）および７Ｍ尿素を含有する変性２３％ポリアクリルアミドゲル上に５μｌを加える前に２〜５分間７０℃に加熱した。電気泳動は９０Ｗで１×ＴＢＥ中で行った。ゲルは、リン撮像装置を使用することによって視覚化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（モレキュラーダイナミクス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ））を使用することによって定量化した。
【００７１】
ｓｙｍ／ｓｕｂの中へのＡＭＰの定常状態の組み込み
定常状態の実験は、３０℃で、９０秒間、ｐＨ７．５の１Ｍｍ  ＨＥＰＥＳバッファー中で、１μＭ  ３Ｄｐｏｌを、３０μＭ  ｓｙｍ／ｓｕｂ（１５μＭ２本鎖）とインキュベートすることによって行い、次いで、ｐＨ７．５の２×ＭＴＣＮバッファー中でＡＴＰと混合した。反応は、等容量のローディング／クエンチング色素と混合することによって様々な時間でクエンチした。産物分析は、上記に記載されるように、変性ＰＡＧＥを使用することによって行った。バッファーおよび溶液はすべて、各実験についてＨ２ＯまたはＤ２Ｏ中のいずれかで調製した。ｐＤは、Ｄ２Ｏ中の溶液のためにｐＨの代わりに使用し、ｐＤ＝ｐＨ＋０．４に従って調整した。
【００７２】
プロトンインベントリー
プロトンインベントリー実験のための酵素、基質、およびバッファーは、１００％水または１００％Ｄ２Ｏ中で調製し、その後、適切な比で混合して、０、２５、５０、７５、または１００％のＤ２Ｏを得た。重水素化グリセロールは、Ｄ２Ｏ中のすべての溶液中で使用した。データ収集はすべて、上記に示されるストップフロー機器で行った。ｐＤは、上記に記載されるように、Ｄ２Ｏ中の溶液のためにｐＨの代わりに使用した。
【００７３】
データ分析
固定ヌクレオチド濃度での時間的経過を単一指数関数にフィットさせた：
［産物］＝Ａ＊ｅｘｐ（−ｋｏｂｓ＊ｔ）＋Ｃ    （１）
Ａはバーストの振幅であり、ｋｏｂｓはバーストを説明する観察された１次速度定数であり、ｔは時間であり、Ｃは定数である。ストップフロー機器からの時間的経過は、機器ソフトウェアを使用して同じ式にフィットさせた。データは、プログラムＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（シナジーソフトウェア社（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）［ペンシルベニア州レディング所在］）を使用して非線形回帰によってフィットさせた。ヌクレオチド組み込み（ｋｐｏｌ）についての見かけの結合定数（ＫＤ，ａｐｐ）および最大速度定数は式：
ｋｏｂｓ＝ｋｐｏｌ［ＮＴＰ］／ＫＤ，ａｐｐ＋［ＮＴＰ］    （２）
を使用して決定した。
【００７４】
ｋｐｏｌのｐＨ依存性についてのｐＫａ値は、２−イオン性基（ベビラックア  ピー  シー（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｐ．Ｃ．）（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２，２２５９−６５）：
ｋｐｏｌ＝ｋｉｎｄ／（１＋１０＾（ｐＫａ１−ｐＨ）＋（ｐＨ−ｐＫａ２））    （３）
または１−イオン性基（ベビラックア  ピー  シー（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｐ．Ｃ．）前掲）
ｋｐｏｌ＝ｋｉｎｄ／（１＋１０＾（ｐＫａ−ｐＨ））    （４）
ｋｉｎｄはｐＨ非依存性の速度定数である、を説明するモデルにフィットさせることによって得た。
【００７５】
プロトンインベントリーのデータは、改変Ｇｒｏｓｓ−Ｂｕｔｌｅｒ式にフィットさせ、２プロトン転移モデルについては（ショーウェン  アール  エル（Ｓｃｈｏｗｅｎ，Ｒ．Ｌ．）およびベンカタスッバン  ケー  エス（Ｖｅｎｋａｔａｓｕｂｂａｎ，Ｋ．Ｓ．）（１９８５）ＣＲＣ  Ｃｒｙｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７，１−４４）：
ｋｎ／ｋＨ２Ｏ＝（１−ｎ＋ｎ＊φ１）（１−ｎ＋ｎ＊φ２）    （５）
または１プロトン転移モデル（ショーウェンら（Ｓｃｈｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．））については：
ｋｎ／ｋＨ２Ｏ＝（１−ｎ＋ｎ＊φ）    （６）
とし、ｋｎは、異なるパーセンテージのＤ２Ｏで観察された速度定数であり、ｋＨ２Ｏは、水中で観察された速度定数であり、ｎは、Ｄ２Ｏのモル分率であり、φは、各イオン性基の同位体効果の逆数である。
【００７６】
報告された平衡定数および速度定数は、それぞれ少なくとも２回決定した。誤差は、式６を使用することによって積および指数によって増大させた。
Δｚ＝（（Δｘ／ｘ）２＋（Δｙ／ｙ）２）＾１／２＊ｚ    （７）
ｘおよびｙは１次データであり、ｚはｘおよびｙの積または指数であり、Δｘ、Δｙ、およびΔｚは対応する誤差の値である（エイケンス  ディー  エー（Ａｉｋｅｎｓ，Ｄ．Ａ．），ベイリー  アール  エー（Ｂａｉｌｅｙ，Ｒ．Ａ．），ムーア  ジェイ  エー（Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．），ジョアキーノ  ジー  ジー（Ｇｉａｃｈｉｎｏ，Ｇ．Ｇ．）およびトムキンス  アール  ピー  ティー（Ｔｏｍｋｉｎｓ，Ｒ．Ｐ．Ｔ．）（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ウェーブランドプレス社（Ｗａｖｅｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ），イリノイ州プロスペクトハイツ所在）。
【００７７】
ＲＢ６９  ＤｄＤｐの発現および精製
ＲＢ６９  ＤｄＤｐをＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で発現させた。凍結させた細胞を、解凍し、溶解バッファー（１００ｍＭ  ＫＰＯ４  ｐＨ８．０、２０％グリセロール、２０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、２．８μｇ／ｍＬペプスタチンＡ、２．０μｇ／ｍＬロイペプチン）中に懸濁させ、１０００ｐｓｉでフレンチプレスを通過させることによって溶解させた。溶解の直後に、ＮＰ−４０を０．１％（容量／容量）まで添加し、ＰＭＳＦを２ｍＭまで添加した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、０．２５％（容量／容量）の最終濃度まで４℃で滴下し、３０分間攪拌した。次いで、この懸濁液を、４℃で３０分間、７５，０００ｘｇで遠心分離した。上清をデカントし、収集し、粉砕した硫酸アンモニウム粉末を４℃で６０％飽和度までゆっくり添加し、３０分間攪拌した。硫酸アンモニウム沈殿物をバッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２０％グリセロール、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％ＮＰ−４０）中に懸濁させ、１２〜１４，０００ＤａのＭＷＣＯ膜を使用して、７５ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１ＬのバッファーＡに対して一晩透析した。透析の後にサンプルを、５０ｍＭの最終ＮａＣｌ濃度までバッファーＡ中に希釈した。サンプルは、１ｍＬ／分間の流速で、ホスホセルロースカラム（約１ｍＬベッド容量／２５ｍｇ総タンパク質量）上にロードした。カラムは、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーＡの１０カラム容量を用いて洗浄し、タンパク質を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーＡを用いて溶出した。画分は、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のそれらの純度に基づいてプールした。プールした画分を、５０ｍＭの最終塩濃度までバッファーＡ中に希釈した。サンプルを、１ｍＬ／分間で、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１ｍＬベッド容量／４０ｍｇのタンパク質）上にロードした。カラムは、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーＡの１０カラム容量を用いて洗浄し、タンパク質を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーＡを用いて溶出した。タンパク質を含有する画分を前のようにプールした。タンパク質を、小さな（０．５ｍｌ）Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用して濃縮した。カラムのロードおよび洗浄は上記に記載される通りのものとした。溶出は、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーＡ中で行った。
【００７８】
Ｔ７  ＤｄＲｐの発現および精製
Ｔ７  ＤｄＲｐの精製は、以下の修正を有する、ＲＢ６９  ＤｄＤｐと同じプロトコールを使用して行った。１．硫酸アンモニウムを４０％飽和度まで添加した。２．ホスホセルロースカラムは、バッファーＡ中で５０ｍＭ〜７００ｍＭ  ＮａＣｌの直線勾配（６カラム容量）を使用して溶出した。３．Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムをロードし、洗浄し、タンパク質は、バッファーＡ中で５０ｍＭ〜４００ｍＭ  ＮａＣｌの直線勾配（６カラム容量）を使用して溶出した。タンパク質を含有する画分を前のようにプールした。タンパク質を濃縮するための付加的なステップは必要ではなかった。
【００７９】
ＨＩＶ  ＲＴの発現および精製
ＨＩＶ  ＲＴを、以前に記載されるように発現させて生成した（レグライス  エス  エフ（Ｌｅ  Ｇｒｉｃｅ，Ｓ．Ｆ．）およびグルニンガー−ライチ  エフ（Ｇｒｕｎｉｎｇｅｒ−Ｌｅｉｔｃｈ，Ｆ．）（１９９０）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １８７，３０７−１４）。
【００８０】
ＲＢ６９  ＤｄＤｐについての溶媒重水素同位体効果およびプロトンインベントリー
実験は、小さな修正を伴うが本質的には記載されるように（ヤン  ジーら（Ｙａｎｇ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．）（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１，２５２６−３４）、２５℃でストップフロー機器を用いて行った。アッセイは、１μＭ  ＲＢ６９  ＷＴ酵素および１５０ｎＭプライマー鋳型基質を用いて、１×ＭＴＣＮ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ｄＡＴＰ中で行った。使用したＤＮＡプライマーは、５’−ＣＣＧＡＣＣＡＧＣＣＴＴＧ−３’（配列番号１）であり、使用したＤＮＡ鋳型は、５’−ＡＡＡＧＣ（２ＡＰ）ＴＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴＣＧＧ−３’（配列番号２）とした。溶媒重水素同位体効果およびプロトンインベントリーは３Ｄｐｏｌについて上記に記載されるように行った。
【００８１】
Ｔ７  ＤｄＲｐについての溶媒重水素同位体効果およびプロトンインベントリー
実験は、小さな修正を伴うが３Ｄｐｏｌについて本質的には記載されるように、３０℃でストップフロー機器を用いて行った。１μＭ  ＲＮＡプライマー、５’−ＵＵＵＵＧＣＣＧＣＧＣＣ−３’（配列番号３）を１μＭ  ＤＮＡ鋳型、５’−ＧＧＡＡＴＧＣ（２ＡＰ）ＴＧＧＣＧＣＧＧＣ−３’（配列番号４）にアニールし、次いで、１×ＭＴＣＮ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＢＭＥ、および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で、室温で１０分間、１．６μＭ  Ｔ７  ＷＴとインキュベートした。反応は、ＭＴＣＮ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＢＭＥ、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（付加的）中で、３ｍＭ  ＡＴＰとＴ７プライマー鋳型複合体を混合することによって開始した。溶媒重水素同位体効果およびプロトンインベントリーは３Ｄｐｏｌについて上記に記載されるように行った。
【００８２】
ＨＩＶ−ＲＴについての溶媒重水素同位体効果およびプロトンインベントリー
定常状態前の実験は、いくつかの修正を伴うが本質的には記載されるように（ゴッテ  エムら（Ｇｏｔｔｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ）（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３５７９−３５８５）、３７℃で化学的クエンチフロー機器を用いて行った。２μＭ  ３２ＰラベルＤＮＡプライマー、５’−ＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＣＴＧＧＡ−３’（配列番号５）を２．２μＭ  ＤＮＡ鋳型、５’−ＣＧＴＴＧＧＧＡＧＴＧＡＡＴＴＡＧＣＣＣＴＴＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＴＡＡＧＡ−３’（配列番号６）とアニールし、金属を含有しない溶液中で４μＭ  ＲＴとインキュベートした。反応は、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する反応バッファー中で２００μＭ  ｄＡＴＰの添加によって開始した。混合の後に、反応物の濃度を５０％低減させた。反応は、化学的クエンチフロー機器を使用することによって行った。産物分析は、以下の修正を伴うが本質的にはＰＶ  ３Ｄｐｏｌについて記載されるように行った。１．非標識ＤＮＡプライマーは、以前に記載されるように（アーノルド  ジェイ  ジェイ（Ａｒｎｏｌｄ，Ｊ．Ｊ．），ゴーシュ  エス  ケイ（Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．Ｋ．），ベビラックア  ピー  シー（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｐ．Ｃ．）およびキャメロン  シー  イー（Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｃ．Ｅ．）（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２７，４５０−２，４５４，４５６）、標識プライマーの１００倍の濃度でローディング／クエンチング色素に添加した。２．４０％ホルムアミドを含有する１５％ポリアクリルアミドゲルを使用した。
【００８３】
【表２】
2010514424.tif 000004
結果
３Ｄｐｏｌによって触媒されるヌクレオチド組み込みの評価のための急速蛍光アッセイを開発した。このアッセイは、この反応のｐＨ依存性を評価するために用いられ、ヌクレオチド組み込みのための律速段階での２つのイオン性基についての証拠を提供してきた。生理学的条件下で、溶媒重水素同位体効果が観察された。プロトンインベントリー実験は、ポリメラーゼによって触媒されるヌクレオチド組み込みの間の２プロトン転移反応についての最初の観察を提供した。２プロトン転移反応はまた、ＲＢ６９  ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、およびＨＩＶ逆転写酵素によって触媒されるヌクレオチジル転移反応についても観察された。共に、これらのデータは、ポリメラーゼによって触媒されるヌクレオチジル転移反応での一般的な塩基および一般的な酸の使用のための非常に説得力のある証拠を提供する。
【００８４】
２つのイオン性基は、ＲｄＲｐによって触媒されるヌクレオチジル転移に必要とされる。化学作用が、３Ｄｐｏｌによって触媒されるヌクレオチド組み込みについて少なくとも部分的に律速であるので、本発明者らは、反応のｐＨ依存性を評価することによって、律速的な遷移状態の間に起こるプロトン転移を洞察することが可能であるはずだと推論した。得られる反応速度データの量を最大限にするために、本発明者らは、２−アミノプリンを含有するＲＮＡ鋳型を用いた、３Ｄｐｏｌについてのストップフロー蛍光アッセイを開発し、検証した（図７および図８）。イオン強度を変動させずに、反応のｐＨを変動させるために、本発明者らはＭＴＣＮおよびＭＨＣＮのバッファー系を選んだ（エリス  ケイ  ジェイ（Ｅｌｌｉｓ，Ｋ．Ｊ．）およびモリソン  ジェイ  エフ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．）（１９８２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ８７，４０５−４２６）。バッファーは比較可能であり、ｐＨ７．５でそれぞれ２００±２０μＭおよび５０±１０ｓ−１のＫＤ，ａｐｐ値およびｋｐｏｌ値を得た（表３）。前に用いたバッファー系と比べたＡＴＰについてのより高いＫＤ，ａｐｐ値は、ＭＴＣＮおよびＭＨＣＮのバッファーのイオン強度の増加によって引き起こされた。
【００８５】
【表３】
2010514424.tif 000005
ヌクレオチド組み込みについてのＫＤ，ａｐｐ値およびｋｐｏｌ値をＭｇ２＋またはＭｎ２＋で異なるｐＨ値で測定した（表４）。実験は、より高いｐＨ値ではヌクレオチドが沈殿するので、Ｍｇ２＋でｐＨ１０に、Ｍｎ２＋でｐＨ９に制限した。ｋｐｏｌについての値をｐＨの関数としてプロットした（図２）。Ｍｇ２＋では、２つのイオン性基を示すベル型曲線が観察された。データを式３にフィットさせて、７．１±０．１および１０．５±０．１のｐＫａ値が得られた。Ｍｎ２＋では、同様のｐＨ依存性がプロフィールの酸性の範囲について観察されたが、８．２±０．１への約１ｐＨ単位のｐＫａのシフトが伴った。これらのデータは、単一イオン化モデルに十分にフィットする。しかしながら、本発明者らは、Ｍｎ２＋での２イオン化モデルを除外することができなかった。８．２および１０．５のｐＫａ値で観察されるであろうｐＨ速度プロフィールを図２Ｂに示す（点線）。ｐＨ９を上回るデータは、１イオン化モデルおよび２イオン化モデルを区別するために必要とされるであろう。
【００８６】
【表４】
2010514424.tif 000006
ｐＨの関数としての律速段階。律速段階がｐＨの関数として変化していたかどうかを決定するために、本発明者らは、上で評価されるｐＨ領域にわたるホスホロチオエート（チオ）の効果を評価した（表５）。３Ｄｐｏｌについては、化学作用は、ｐＨ７．５でＭｇ２＋で部分的に律速である。これらの条件下で、観察されたチオの効果は３±０．３であった（表５）。７．５未満のｐＨ値では、チオの効果についての値が変化しなかった（ｐＨ７．０）または増加しなかった（ｐＨ６．０）ので、化学作用は、明らかに、部分的に律速であった（表５）。チオの効果はまた８．０および９．０のｐＨ値でも観察された。しかしながら、ｐＨ１０では観察されなかった（表５）。興味深いことには、ｐＨ７．５を上回るチオの効果の値の減少は、ＡＭＰαＳ組み込みについて観察された速度定数の特定の増加によるものであり、ＡＭＰの組み込み（表５）に対するいかなる有意な効果も伴わなかった。ｐＨ７．５のＭｎ２＋では、化学作用は唯一の律速段階となる。ｐＨ６．０〜９．０で、チオの効果は７〜５まで変動し（表５）、このｐＨ領域にわたって速度論的に有意なままである化学作用と一致した。
【００８７】
【表５】
2010514424.tif 000007
ヌクレオチド組み込みの間の律速段階についての試験としての溶媒重水素同位体効果。ｐＨ１０．０でのＭｇ２＋のチオの効果の損失を解釈するのが困難であったので、溶媒重水素同位体効果を調べた。プロトン転移が、ヌクレオチド組み込みアッセイによって測定される律速段階の間に起こっている場合、同位体効果は見かけ上のものであるはずである。ｐＨ７．５でのＭｇ２＋では、３±０．５の同位体効果は、定常状態前のＡＭＰの組み込みで観察された（図３Ａ）。ｐＨ７．５でのＭｎ２＋では、７±２の同位体効果が観察された（図３Ｂ）。用いた２価カチオンに対する同位体効果の大きさの依存性は、化学作用がＭｇ２＋で部分的に律速となり、Ｍｎ２＋ではもっぱら律速となる前の観察と一致していた。しかしながら、観察された同位体効果の原因としての、構造上の原因を除外するために、定常状態でのＡＭＰの組み込みを評価した。
【００８８】
定常状態での律速段階ではプライマー鋳型基質からの酵素の解離である。この段階の同位体効果は予想されないと思われた。図３Ｃおよび３Ｄに示されるように、同位体効果は観察されなかった。溶媒重水素同位体効果は、ヌクレオチド組み込みの間の律速段階としての化学作用についての有用な試験であることが結論付けられた。Ｍｇ２＋での溶媒重水素同位体効果のｐＨ依存性の評価は、ｐＨ７．５〜１０．０で２±０．２の一定値を示した（表５）。したがって、化学作用は、評価した全ｐＨ領域にわたって部分的に律速となる。
【００８９】
ＲｄＲｐについて律速的な遷移状態での２プロトン転移反応はヌクレオチジル転移を触媒した。ヌクレオチド組み込みについての速度定数に対する溶媒重水素同位体効果の存在により、律速的な遷移状態で転移されたプロトンの数の定量化を可能にする（プロトンインベントリー）。この実験では、ヌクレオチド組み込み（ｋｎ）について観察された速度定数は、異なるモル分率のＤ２Ｏ（ｎ）を含有する反応で測定する。ｎの関数としての指数ｋｎ／ｋＨ２Ｏ（ｋＨ２ＯはＨ２Ｏで観察された速度定数である）のプロットは、単一のプロトンが転移する場合、ｋＨ２Ｏ／ｋＨ２Ｏおよびｋ１００％Ｄ２Ｏ／ｋＨ２Ｏによって定義される線上に当たるであろう。データは、２つのプロトンが転移する場合、２次多項式にフィットし、３つのプロトンが転移する場合、３次多項式にフィットするなどである。プロトンインベントリー実験を、Ｍｇ２＋（図４Ａ）およびＭｎ２＋（図４Ｂ）で３ＤｐｏｌによってＡＭＰの組み込みについて行った。いずれの場合も、データは、単一のプロトン転移を定義するであろう線上に当たらなかった（図４Ａ、４Ｂの点線）。
【００９０】
しかしながら、データは、２次多項式、２プロトン転移についてのＧｒｏｓｓ−Ｂｕｔｌｅｒ式（式５）に十分にフィットする（図４Ａ、４Ｂで実線）。これらのデータに基づいて、本発明者らは、ポリオウイルスＲｄＲｐによって触媒されるリン酸ジエステル結合形成のための律速的な遷移状態で２プロトン転移反応が起こるといった結論を下した。
【００９１】
他のクラスの核酸ポリメラーゼのヌクレオチジル転移のための律速的な遷移状態での２プロトン転移反応。ＲｄＲｐについてここで到達した結論が他のクラスの核酸ポリメラーゼに適応するかどうかを決定するために、同様の実験を、ＲＢ６９  ＤｄＤｐ、Ｔ７  ＤｄＲｐ、およびＨＩＶ  ＲＴを用いて行った。すべての場合で、溶媒重水素同位体効果は、３〜６の範囲（表１）で観察された（図５Ａ、パネルｉ〜ｉｉｉ）。重要なことには、プロトンインベントリー実験は、これらのポリメラーゼについて２プロトンモデルに十分にフィットした（図５Ｂ、パネルｉ〜ｉｉｉおよび表２）。すべてのクラスの核酸ポリメラーゼによって触媒されるヌクレオチジル転移のための律速な遷移状態で２プロトン転移反応が起こることが結論付けられた。
【００９２】
３Ｄｐｏｌによって触媒されるヌクレオチド組み込みは、２−アミノプリンを含有するプライマー／鋳型基質を使用することによってモニターすることができる。３Ｄｐｏｌ機構に関する前の研究は、３Ｄｐｏｌによって触媒されるヌクレオチド組み込みの速度は、Ｍｇ２＋の存在下で、構造変化および化学作用の両方によって部分的に制限される。しかしながら、Ｍｎ２＋の存在下では、反応は、もっぱら、化学作用によって制限されることを明らかにした。これらの結論に結びつく実験に、放射能標識基質および化学的クエンチフロー機器（ＣＱＦ）を用いた。このアプローチは遅く、反応の間に起こるかもしれない構造変化についての直接の情報を提供しない。２−アミノプリン（２ＡＰ）を、ＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼによって触媒される反応を研究するために用いた。２ＡＰは構造がアデニンに類似しており、６位にそのアミノ基を有する（図７Ａ）。２ＡＰは、らせん構造の著しい変化を伴うことなく核酸２本鎖でアデニンに取って代わることができる。我々は、ｓｙｍ／ｓｕｂ（Ｓ／Ｓ）と呼ばれる本発明者らのクラスのプライマー鋳型基質の鋳型鎖の様々な位置に存在する場合の、単一のヌクレオチドの添加についての蛍光プローブとしての２ＡＰの使用について調べた（図７Ｂ）。位置０は、２ＡＰが鋳型ヌクレオチドであることを示す（Ｓ／Ｓ−０）。位置＋１は、２ＡＰが鋳型ヌクレオチドの１ｎｔ下流にあることを示し（Ｓ／Ｓ−＋１）、位置＋２は、２ＡＰが鋳型ヌクレオチドの２ｎｔ下流にあることを示す（Ｓ／Ｓ−＋２）。２ＡＰ蛍光（ΔＦ）で観察された変化の大きさおよび方向は、鋳型ヌクレオチド（図７Ｃ）と比べた２ＡＰの位置に依存した。Ｓ／Ｓ−０へのＵＭＰの組み込みは、最大のΔＦおよび信号対雑音比を生成した（図７Ｃ）。しかしながら、この基質は、入ってくるヌクレオチドが「正しい」塩基によって鋳型にされない望ましくない特徴を有する。２ＡＰの場合には、ＵＭＰの組み込みは予想されたものよりも遅いが（１±０．１ｓ−１）、化学的クエンチフローで観察されものと同程度である。２ＡＰが鋳型塩基の下流に移動すると共に、ΔＦおよび信号対雑音比は減少したが、組み込みについて観察された速度定数（Ｓ／Ｓ−＋１およびＳ／Ｓ−＋２それぞれについて６０±８ｓ−１および５０±６ｓ−１）は、ＵＭＰと反対のＡＭＰの組み込みについて予想された通りであった。振幅および信号対雑音は＋２位置よりも＋１位置の２ＡＰがより好都合であった。後のＳＦ実験はすべてＳ／Ｓ−＋１を利用した。
【００９３】
ＳＦアッセイの検証。本発明者らは、ＣＱＦで、放射標識Ｓ／Ｓを使用して、３Ｄｐｏｌによって触媒されるヌクレオチド組み込みの完全な反応速度機構を以前に決定した。ＫＤ，ａｐｐおよびｋｐｏｌについてそれらの実験で得られた値は、それぞれ、１３０±２０μＭおよび９０±１０ｓ−１であった。ＣＱＦ実験でのＳ／Ｓ−＋１の使用により、それぞれ、７０±１０μＭおよび８０±１０ｓ−１のＫＤ，ａｐｐおよびｋｐｏｌについての値がもたらされた（表３）。本発明者らは、２ＡＰによって引き起こされる隣接効果としてＫＤ，ａｐｐの減少を解釈する。ｋｐｏｌ値が同じである−すなわち測定の誤差の範囲内であることに注目されたい。
【００９４】
ＳＦでのＳ／Ｓ−＋１の実験は、３１３ｍｎの励起波長を用いて行い、２ＡＰのみの励起であることを確実にし、蛍光で観察された変化は、３Ｄｐｏｌの活性部位で２ＡＰプローブを取り囲む環境の変化にのみ起因したことを保証した。蛍光で観察された変化はＡＴＰ濃度の関数として測定した（図８Ａ）。各ＡＴＰ濃度で観察された速度定数、ｋｏｂｓはＡＴＰ濃度の関数としてプロットし、データを双曲線（式２）にフィットさせて、それぞれ、７０±１０μＭおよび７０±１０ｓ−１のＫＤ，ａｐｐおよびｋｐｏｌの値を得た（図８Ｂ）。２ＡＰアッセイは、産物形成またはその後のいくらか速い段階を報告することが結論付けられた。
【００９５】
ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるヌクレオチジル転移についての化学機構の疑問は、構造変化はヌクレオチド組み込みに対して律速となるといった一般的な考えによって阻止されてきた。この考えは、非常に論争の的になっているパラメータである、チオの効果の大きさの解釈に依存した考えである（ジョイス  シー  エムら（Ｊｏｙｃｅ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４３，１４３１７−２４；ショワルター  エー  ケイら（Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．）（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１，１０５７１−６）。しかしながら、ポリオウイルス由来のＲｄＲｐについてここに記載される研究は、化学作用は、Ｍｇ２＋でヌクレオチド組み込みに対して少なくとも部分的に律速となり、Ｍｎ２＋で完全に律速となることを示した。この系は、ヌクレオチド組み込みアッセイを用いることによる化学機構の疑問を許容するものである。
【００９６】
Ｍｇ２＋での、ＰＶポリメラーゼによって触媒されるヌクレオチド組み込みのｐＨ依存性の評価は、７．０および１０．５（図２Ａ）のｐＫａ値を有する２つのイオン性基への反応の依存性を明らかにした。このグループのプロトン化はヌクレオチド組み込みの効率を低減させ、化学作用は、ｐＨ７．５未満で明らかに律速となるので、７．０のｐＫａ値を３’−ＯＨに特定した（表５）。このグループの脱プロトン化はヌクレオチド組み込みの効率を低減させ、化学作用が７．５〜１０．５のｐＨ領域で律速となる程度は同じであるので、１０．５のｐＫａ値を、ＰＰｉ離脱基をプロトン化するための役目をする酵素上の残基に特定した（表５）。
【００９７】
２価カチオンのサイズを増加させるまたはＡＴＰの代わりにＡＴＰαＳを用いることによって引き起こされる歪みが、観察されたｐＫａ値の増加を引き起こすので、３’−ＯＨについて観察されたｐＫａ値は、活性部位中の残基の性質に感受性である（図２Ｂおよび表５）。ＡＴＰαＳを用いる場合の３’−ＯＨの求核性の観察された低減は、７．５を上回るｐＨ値でのチオの効果の、観察された低減を説明する。この観察は、ポリメラーゼ系でのチオ効果の正当性に疑問を呼ぶ。チオ効果の大きさについて、ヌクレオチド添加サイクルの間の律速段階についての情報を得るため、ＡＭＰの組み込みと比べたＡＭＰαＳ組み込みについて速度定数の観察された低減は、もっぱら、硫黄置換によって引き起こされるα−亜リン酸の求電子性の低減に起因するはずである。ＲｄＲｐデータから他のポリメラーゼ系を推測するために、ＡＭＰの組み込みについて観察される速度定数は、同じｐＨ値でＡＭＰαＳ組み込みについて観察された速度定数と直接比較するべきではない。
【００９８】
溶媒重水素同位体効果は、ＲｄＲｐによるヌクレオチド組み込みについての律速段階での化学作用についての有用な試験となる（図３および表５）。溶媒重水素同位体効果について実測値は、化学作用が単に部分的に律速となるｐＨ７．５でのＭｇ２＋での２（図３Ａ）から（１）化学作用は完全に律速となるｐＨ７．５でのＭｎ２＋での７（図３Ｂ）までの範囲であった。有意な同位体効果は、いずれの２価カチオンの存在下でも定常状態で測定されず（図３Ｃおよび３Ｄ）、これらの条件下で測定されたポリメラーゼ解離について速度定数と一致した。他のポリメラーゼ系への溶媒重水素同位体効果の適用（図５Ａ）は、化学作用が、ＲＢ６９  ＤｄＤｐ、Ｔ７  ＤｄＲｐ、およびＨＩＶ  ＲＴによって触媒されるヌクレオチド組み込みについて、部分的に律速なものであることを明らかにし、すべてのポリメラーゼについての律速段階の有用な機構的な試験として溶媒重水素同位体効果を検証した（表２）。
【００９９】
溶媒重水素同位体効果についての観察は、ＲｄＲｐ（図４）および同様に他のポリメラーゼによって（図５Ｂ）触媒されるヌクレオチド組み込みについて律速的な遷移状態の間の起こるプロトン転移反応の数の定量化を可能にした。すべての場合で、２プロトン転移反応は観察された（表２）。この観察は、３’−Ｏ−への３’−ＯＨの変換が、結合したヌクレオチドのα−亜リン酸の攻撃の前に、別々の段階として起こらないことおよびＰＰｉ離脱基が実際にプロトン化されたままではないといった最初の証拠を提供するを示唆すると思われた。
【０１００】
７つの溶媒重水素同位体効果を、化学作用がヌクレオチド組み込みについて唯一の律速段階となる条件下でＲｄＲｐについて観察し（図３）、両方のプロトンが律速的な遷移状態で同時に転移するのと一致した。効率的なプロトン転移は適したプロトンアクセプターおよびプロトンドナーを必要とすると思われた。上記に論じられるように、構造の研究は、この機能に役立つ水分子を同定していない。さらに、ＰＶポリメラーゼによって触媒されるヌクレオチジル転移についてここで観察された７．０および１０．５のｐＫａ値は（図２）もまた、水がプロトンアクセプターまたはプロトンドナーとして役立つことと一致しない。ここに記載されるデータは、一般的な塩基および一般的な酸は、すべてのポリメラーゼによって触媒されるヌクレオチジル転移反応で用いられることを示唆する（図６）。他の系のｐｏｌβ  Ａｓｐ−２５６の構造相同体は、モチーフＣの進化的に保存されたＡｓｐ残基であるといった一般的な合意がある（表６）。多くのポリメラーゼ構造では、このモチーフＣの残基は、一方または両方の金属の配位子として役立つと分かることが多い。この環境は、一般的な塩基として役立つ残基に対して使用される距離の議論を許容する。しかしながら、触媒作用を受けるバチルスステアロサーモフィルスＤＮＡポリメラーゼＩ断片（ＢＦ）の構造では、このモチーフＣの残基は、ヌクレオチド結合の後にであるが、第２の金属イオン（金属Ａ）の結合の前にプライマー３’−ＯＨと相互作用する。加えて、Ｔ７  ＤｄＤｐによって触媒されるヌクレオチジル転移反応のコンピュータモデリングは、保存されたモチーフＣの残基、Ａｓｐ−６５４が一般的な塩基として役立つことを示唆した。
【０１０１】
Ｍｇ２＋結合ＰＰｉについてのｐＫａ値は、触媒作用の間のプロトン化を妨げるのに十分に低いと一般に仮定されている。しかしながら、溶液中では、ＰＰｉについての最も高いｐＫａ値は約９．３である。したがって、一般的な酸によるＰＰｉのプロトン化は、触媒作用の速度を増加させるはずであるが、絶対的に不可欠ではないかもしれない。構造の研究は、塩基性アミノ酸、ほとんどの場合、リシンが、ある位置で、一般的な酸として役立つことを明らかにした（表６）。この残基は、ＡファミリーポリメラーゼのヘリックスＯ、ＢファミリーポリメラーゼのヘリックスＰ、ならびにＲｄＲｐおよびＲＴの構造モチーフＤのループ上に位置する。モチーフＤは、最初のＲＴ構造の解決以来、構造的な足場以外の機能が捜されてきた。この推定上の一般的な酸を変更したすべての場合で、ヌクレオチド組み込みについて観察された速度定数は実質的に小さくなった。特に注目すべきは、化学作用は、ＲＢ６９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｌｙｓ−５６０の推定上の一般的な酸をアラニンに変更することによって、律速段階になるように思われるといった観察である。
【０１０２】
ＰＶ由来のＲｄＲｐは、ここに記載される研究のモデルとして使用し、核酸ポリメラーゼについての化学機構の最初の包括的な分析をもたらした。この系は、酵素からのプライマー鋳型基質の解離についての速度定数の非常に遅い（０．０００１ｓ−１）、ｐＨ非依存性の性質のために、特に魅力的であることを証明した。これらの研究は、協調的に起こる、３’−ＯＨからのおよびＰＰｉへのプロトン転移を伴う非常に対称的な遷移状態についての非常に説得力のある証拠を提供した。ピロリン酸プロトン化は予想されなかった。すべてのクラスのポリメラーゼは同様の遷移状態の構造を有するように思われる。協調的なプロトン転移反応は都合よく位置したアクセプターおよびドナーを必要とする。ヌクレオチジル転移のために必要とされる観察されたｐＫａ値およびすべての場合での適切な位置の規則的な水分子の不在はすべてのポリメラーゼによる、一般の酸塩基によって促進される触媒作用を再提案することを余儀なくさせる。
【０１０３】
【表６】
2010514424.tif 000008
【実施例２】
【０１０４】
核酸ポリメラーゼのリン酸転移反応において、一般酸触媒作用は重要である。
ここに記載する実験は、ポリオウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（３Ｄｐｏｌ）の活性部位Ｌｙｓ−３５９が、触媒性の一般酸として作用することによって、リン酸転移速度を高めることを示す。この発見は、ＨＩＶ−１  ＲＴ  ＲｄＤｐおよびＲＢ６９  ＤｄＤｐの保存活性部位のリシンに関する、触媒性の一般酸としての役割の実証によって、他の種類に由来するポリメラーゼにおける保存活性部位のリシン残基まで拡大された。プロトンを供与できる保存活性部位の残基による一般酸触媒作用は、したがって、すでに２金属陽イオンにより供給されている速度上昇をさらに２〜３桁増し、ヌクレオチドの組み込み速度を生物学的に十分なレベルにさせる、核酸ポリメラーゼのリン酸転移反応の普遍的特徴であると思われる。
【０１０５】
核酸ポリメラーゼは、すべての生物およびウイルスにおけるゲノムの複製、維持および発現の主要因子である。この役割を果たすために、これらの酵素は、生物学的に十分な速度で核酸鎖を組み立てるだけでなく、適合に最適であるヌクレオチド選択の精度（忠実度）のレベルを達成しなければならない。
【０１０６】
核酸ポリメラーゼは、それらの核酸の役割において大きく変化する。それらは鋳型としてＤＮＡまたはＲＮＡを必要とする。ほとんどの状況において、それらは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドのプライマー末端の３’−ＯＨにヌクレオチドを付加する。しかし、いくつかの場合において、プライマーの末端の必要条件が欠けていて、ヌクレオチドの付加が新たに起こる。ポリメラーゼの忠実度も同様に大きく変化する。組み込み違いの頻度は、いくつかのゲノム複製ＤＮＡポリメラーゼにおける組み込み当たり、１０−８の誤り程の低さから、特定のウイルスＲＮＡポリメラーゼに関しては１０−５まで、いくつかの修復酵素に関しては１０−２またはそれより高い頻度に及ぶ。すべての場合において、組み込み違いの割合は、生物学的欲求を反映すると思われる。酵素の大きさおよび構造の複雑さもまた、ポリメラーゼ活性のみを有する小型の単一のサブユニット酵素から、さらなる活性を保有する、大型の、複数のサブユニットの巨大分子の集団まで大きく変化する。
【０１０７】
生物学的役割、組み込みの精度および全体構造における範囲の広さは、それ故に、ポリメラーゼのヌクレオチド組み込みの機構について複数の機能的制約を与える。さらに、この複雑性にもかかわらず、最も基本的で根本的なポリメラーゼ活性部位の構造的特徴は、高度に保存されている。さらに、すべての核酸ポリメラーゼは、同じ基本的なリン酸転移化学反応を達成し、単一のヌクレオチドの組み込みサイクルにおいて同じ５つのステップの機構を原則的に使用する。ステップ１において、入ってきたヌクレオチドは、酵素−プライマー／鋳型の２元複合体に結合する。ステップ２において、この３元複合体が構造変化を生じ、ステップ３においてリン酸転移のための反応官能基が１列に並ぶ。ステップ４において、化学反応後の構造変化が起こる。ステップ５においてリン酸の放出が起こり、サイクルがリセットされ、次の組み込みが開始される。
【０１０８】
ポリメラーゼのアミノ酸配列アラインメントと、ポリメラーゼ−プライマー／鋳型−ヌクレオチド３元複合体の高解像度Ｘ線結晶構造の成長表との併用により、共有結合切断の正確な位置における、活性部位であるプラスに帯電したアミノ酸残基、普通はＬｙｓであるが時としてＡｒｇまたはＨｉｓ、の普遍的な存在およびヌクレオチドの組み込みサイクルのリン酸転移であるステップ３の間の離脱基の形成が明らかになる。この特異的な位置におけるプロトンを供与できる残基の保存は、この活性部位のアミノ酸に関するリン酸転移の間の、一般酸触媒としての直接の役割を示唆する。しかし、いくつかの十分に研究された核酸ポリメラーゼモデル系の長年の実験的限界は、化学反応に先立つ、急速な律速的構造変化のため、直接かつ便利にリン酸転移ステップを調べることができないことである。この限界は、ここに記載された、ＰＶポリメラーゼ（３Ｄｐｏｌ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）に関して、リン酸転移は、それぞれＭｇ２＋またはＭｎ２＋において、部分的または完全に律速であり、したがって機構的検査に到達できるという発見により取り除かれた。
【０１０９】
ヌクレオチドの組み込みの化学的ステップの間の１つのプロトンの転移は、攻撃性求核試薬の作製の間のプライマー末端の３’−ＯＨからのプロトンの除去（および不確定の受容体による受取）である。上記のように、結合切断の正確な部位においてプロトンを供与できる、プラスに帯電したアミノ酸残基の普遍的な保存、およびリン酸転移の間のピロリン酸離脱基の形成は、第２の触媒的に重要なプロトン転移が、一般酸触媒としての役割で、この活性部位のアミノ酸残基に関与し得ることを示唆している。
【０１１０】
材料および方法
材料：  材料は、実施例１に記載したように購入および調製した。
ポリメラーゼの発現および精製：３Ｄｐｏｌ  ＲｄＲｐ、ＨＩＶ−１  ＲＴ、ＲＢ６９  ＤｄＤｐおよびＴ７  ＤｄＲｐを、以下を除いて、前述のように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させ、精製した（カストロら（Ｃａｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０４：４２６７−４２７２，２００７）。ＲＢ６９  ＤｄＤｐ  Ｋ５６０Ｌ突然変異体の構築−Ｋ５６０Ｌ変異体を、ｐＳＰ７２−ＲＢ６９−ｐｏｌの鋳型を使用して、突然変異をコードするＫ５６０Ｌを、フォワードオリゴヌクレオチドであるＲＢ６９−ＤｄＤｐ−Ｋ５６０Ｌ−ｆｗｄ５’−ＧＣＡＣＡＡＡＴＴＡＡ  ＴＣＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＴＡＴＣＡＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号７）およびリバースオリゴヌクレオチドであるＲＢ６９−ＤｄＤｐ−Ｋ５６０Ｌ−ｒｅｖ５’−ＧＴＧＡＧＴＴＧＡＴＡＡＧＣＡＡＣＡＧＡＣＧＡＴＴＡＡＴＴＴＧＴＧＣ−３’（配列番号８）を使用するＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＰＣＲによって、ポリメラーゼ遺伝子（ｇｐ４３）に導入して構築した。ＲＢ６９  Ｋ５６０Ａのための発現ベクターは、エール大学のウイリアム  ケーニヒスマルク（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ）博士のご厚意により提供いただいた。
【０１１１】
ＰＶ  ３Ｄｐｏｌ−触媒ヌクレオチドの組み込み実験。ＰＶ  ３Ｄｐｏｌのストップフロー実験および化学的クエンチフロー実験を前述のように達成した（カストロら（Ｃａｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０４：４２６７−４２７２，２００７）。プロトンインベントリー実験のための酵素、基質およびバッファーは、１００％の水または１００％のＤ２Ｏにおいて調製し、次いで適切な割合で混合し、０、２５、５０、７５または１００％のＤ２Ｏを得た。重水素化グリセロールを、すべてのＤ２Ｏ中溶液に使用した。すべてのデータ収集は、ストップフロー装置において実施した。上記のようなＤ２Ｏ中溶液に関して、ｐＤをｐＨの代わりに使用した。
【０１１２】
ＷＴおよびＫ２２０Ａ  ＨＩＶ−ＲＴに関する溶媒重水素同位体効果およびプロトンインベントリーを、原則的に実施例１に記載のように実施した。
ＲＢ６９  ＷＴ  ＤｄＤｐのストップフロー実験および化学的クエンチフロー実験。ＲＢ６９  ＤｄＤｐ  ＷＴの溶媒重水素同位体効果およびプロトンインベントリーの化学的クエンチフロー実験を、原則的に実施例１に記載のように行い、反応を１ＭのＨＣｌで停止させ、実施例１に記載のように中和し、分析した。
【０１１３】
ＲＢ６９  Ｋ５６０Ａに関する、ストップフローＫｄ，ａｐｐおよびｋｐｏｌ、溶媒重水素同位体効果ならびにプロトンインベントリー。原則的にＷＴに関して記載した通りの反応条件ならびにＤＮＡのプライマーおよび鋳型を使用して実験を行った（カストロら（Ｃａｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０４：４２６７−４２７２，２００７）。Ｋｄ，ａｐｐおよびｋｐｏｌの決定のために、ｋｏｂｓを、０．５、１、２．５、５および１０ｍＭの［ｄＡＴＰ］を使用して得た。２．５および１０ｍＭのｄＡＴＰ反応のために、ＭｇＳＯ４を添加し、遊離のＭｇ２＋を１０ｍＭに維持した。ｋｏｂｓ対［ｄＡＴＰ］のプロットは、双曲線（式２）に適合した。溶媒重水素同位体効果実験およびプロトンインベントリー実験を、［ｄＡＴＰ］が１０ｍＭであり、ＭｇＳＯ４を、ｄＡＴＰに結合する遊離のＭｇ２＋より１０ｍＭ多く遊離のＭｇ２＋を提供するように増加したことを除いて、ＷＴに関する通りに実施した。ＲＢ６９  Ｋ５６０Ａに関する、化学的クエンチフローの溶媒重水素同位体効果−実験を、［ｄＡＴＰ］が５ｍＭであったことを除いて、ストップフローにおいて上に記載したように行った。反応を、実施例１に記載したように、０．２５Ｍ  ＥＤＴＡを用いて停止させた。
【０１１４】
ＲＢ６９  Ｋ５６０Ｌに関する化学的クエンチフローのＫｄ，ａｐｐおよびｋｐａｃ、溶媒重水素同位体効果およびプロトンインベントリー。原則的にＷＴに関して記載した通りの反応条件ならびにＤＮＡのプライマーおよび鋳型を使用して実験を行った（カストロら（Ｃａｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０４：４２６７−４２７２，２００７）。Ｋｄ，ａｐｐおよびｋｐｏｌの決定のために、ｋｏｂｓを、０．３、１、３、６および１２ｍＭの［ｄＡＴＰ］を使用して得た。３、６および１２ｍＭのｄＡＴＰの反応のために、ＭｇＳＯ４を添加し、遊離のＭｇ２＋を１０ｍＭに維持した。ｋｏｂｓ対［ｄＡＴＰ］のプロットは、双曲線（式２）に適合した。溶媒重水素同位体効果実験およびプロトンインベントリー実験を、［ｄＡＴＰ］が５ｍＭであり、ＭｇＳＯ４を、ｄＡＴＰに結合する遊離のＭｇ２＋より１０ｍＭ多く遊離のＭｇ２＋を提供するように増加したことを除いて、ＷＴに関する通りに実施した。化学的クエンチフローのＲＢ６９  Ｋ５６０Ｌ反応を、実施例１に記載したように、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて停止させた。
【０１１５】
データ分析。データ分析を、実施例１に記載したように実施した。
結果
ＰＶ  ３Ｄｐｏｌにおける保存活性部位のプラスに帯電したアミノ酸残基はＬｙｓ−３５９である。核酸ポリメラーゼの構造は、パーム、親指および他の指状のサブドメインからなるカップ状の右手と似ている。保存構造モチーフは、パーム状のサブドメイン、ポリメラーゼ活性部位の位置を含む。ＲＮＡポリメラーゼのパーム状構造モチーフＤのアミノ酸残基のアラインメントは、リシン残基の絶対的保存を示す（図１１Ａ）。ＰＶ  ３Ｄｐｏｌにおいて、この保存活性部位の残基はＬｙｓ−３５９である（図１１Ａ）。ＰＶ  ３Ｄｐｏｌの結晶構造に基づいた分子モデリングは、３ＤｐｏｌのＬｙｓ−３５９は、α−とβ−リン原子の間の部位における結合ヌクレオチドの三リン酸部分と密接に相互作用することを示唆する（図１１Ｂおよび１１Ｃｉ）。以下に要約する実験データは、ＰＶ  ３ＤｐｏｌのＬｙｓ−３５９は、結合切断部位におけるその解離性プロトンをピロリン酸離脱基に与えることによって、ヌクレオチド組み込みのリン酸転移段階中に一般酸触媒として働くことを示す（図１１Ｃｉｉ）。
【０１１６】
３Ｄｐｏｌ位置３５９突然変異体に関する動的パラメータはＬｙｓ−３５９に関する触媒的役割を示唆する。リン酸転移段階に対するＰＶ  ３ＤｐｏｌのＬｙｓ−３５９の影響を評価するために、この残基をＬｅｕ、ＨｉｓまたはＡｒｇに変えた（表７）。Ｋ３５９Ｌ  ３Ｄｐｏｌは金属イオン補因子としてのＭｇ２＋と共に、ＷＴ  Ｋ３５９に対して単一ヌクレオチドの組み込みの触媒速度（ｋｐｏｌ）の５０倍の低下、およびＫｄ，ａｐｐによって報告されるヌクレオチド結合の３倍の弱化を示した。これらのデータは、触媒作用におけるＬｙｓ−３５９の顕著な役割、およびヌクレオチド結合における低度の役割を示唆する。Ｋ３５９Ｌ  ３Ｄｐｏｌの低下した触媒性能は、化学的に不活性なＬｅｕ側鎖によるプロトンを供給する能力の欠如と一致する。わずかではあるがヌクレオチド結合の低下は、マイナスに帯電したヌクレオチド三リン酸部分との結合相互作用におそらく重要な、Ｌｅｕ側鎖上のプラス電荷の不在と一致する。
【０１１７】
【表７】
2010514424.tif 000009
ＷＴ  Ｋ３５９  ３Ｄｐｏｌに関する溶媒中重水素の動的同位体効果（ＳＤＫＩＥ）は、Ｍｇ２＋においてよりＭｎ２＋の存在下で２倍大きく、Ｍｎ２＋において完全に律速であり、かつＭｇ２＋において部分的に律速であるという化学的性質と一致した。対照的に、同一および低いｋｐｏｌ値およびＭｇ２＋における区別不能なＳＤＫＩＥ値およびＫ３５９Ｌ  ３Ｄｐｏｌに関するＭｎ２＋は、触媒作用におけるＬｙｓ−３５９の重要性を指摘し、かつ化学的性質はこの突然変異体酵素のいずれかの金属イオン補因子によって完全に律速であることを示す（表７）。
【０１１８】
Ｋ３５９ＨおよびＫ３５９Ｌ  ３Ｄｐｏｌ変異体に関する触媒速度は、Ｋ３５９Ｌ  ３Ｄｐｏｌに関する触媒速度より５倍速かったが、ＷＴ  Ｋ３５９ポリメラーゼより１０倍遅かった（表７）。Ｋ３５９ＨおよびＫ３５９Ｌ酵素に関するヌクレオチド結合相互作用は野生型のそれと同様であり、マイナスに帯電した流入ヌクレオチドと結合するプラスに帯電したＨｉｓおよびＡｒｇ側鎖の保持能力と一致した。しかしながら、ＨｉｓとＡｒｇの両方が触媒作用を支援するのに理論上利用可能である交換可能なプロトンを有しているが、ＷＴ  Ｋ３５９酵素に対して１０倍低下したそれらの触媒速度は、リン酸転移中の活性部位環境は、位置３５９に存在するときこれらの非生物学的残基の有効な触媒的使用を行うのに、化学的に（すなわち、ｐＫａの適合など）および／または空間的に最適ではないことを示唆する。
【０１１９】
図１２Ｂ中に示すように、Ｋ３５９Ｌ酵素に関するｐＨ−速度プロファイルの塩基性のアームが消失し、リン酸転移に影響を与えるただ１つのイオン性基が離脱した。この発見は、一般酸触媒としての役割におけるＬｙｓ−３５９によるプロトン供給と一致する。Ｋ３５９Ｌ酵素に関するプロファイルと重複する、Ｋ３５９ＨおよびＫ３５９Ｒ  ３Ｄｐｏｌに関するｐＨ−速度プロファイルは、プロトン供給触媒としてのＬｙｓ−３５９の役割をさらに支持する（図１３）。Ｋ３５９Ｈ酵素は低いｐＨにおいてＫ３５９Ｌより動力学的に優れており、約７．５のそのｐＫａ付近で最高に優れており（表７および図１３）、より高いｐＨではＫ３５９Ｌのそれに対する動的性能に収束した。Ｋ３５９ＨのｐＨ−速度の挙動は、そのｐＫａまでおよびそのｐＫａをある程度超えて触媒作用を高める、その解離性イミダゾール基のプロトンのいくらかの能力を示唆する。しかしながら、位置３５９でＬｅｕのそれを超えて触媒作用を高める能力は、Ｋ３５９Ｈではより高いｐＨ値で失われる。なぜならＨｉｓイミダゾールは完全に脱プロトン化状態になるからである。（図２Ａ中でＷＴ  Ｋ３５９  ３Ｄｐｏｌに関して見られるように）Ｋ３５９ＨのｐＨ−速度プロファイル（図１３）は下行の塩基性のアームを欠く。なぜなら、プライマー鋳型３’−ＯＨプロトンの転移と関係があるｐＫａとＨｉｓイミダゾールと関係があるｐＫａはおそらく十分類似しているので、それらはｐＨ−速度プロファイルの同じ領域でほぼ重複し、したがって解明できないからである。
【０１２０】
Ｋ３５９Ｒ  ３Ｄｐｏｌの動的挙動は、低いｐＨ値においてＫ３５９Ｈのそれと同様であった（図１３）。しかしながら、高いおよびより高いｐＨ値では、Ｋ３５９Ｒ酵素はＫ３５９ＨおよびＫ３５９Ｌ  ３Ｄｐｏｌの動的性能を次第に超え、ｐＨ１０でＷＴ  Ｋ３５９ポリメラーゼのそれに近づいた。Ｋ３５９Ｒ  ３ＤｐｏｌのｐＨ−速度の挙動は、Ａｒｇ側鎖の高いｐＫａと一致する。低いｐＨでは、Ａｒｇの解離性プロトンは、プロトン供給によって触媒作用を支援するのにほぼ利用不能である。しかしながら、そのｐＫａに近づくと、Ａｒｇの解離性プロトンは次第に利用可能な状態になり、一般酸触媒として次第に有効に機能する。予想通り、Ｋ３５９ＲのｐＨ−速度プロファイルに関する塩基性のアームはｐＨ１０まで観察されなかった。Ａｒｇ側鎖のｐＫａがｐＨ１２範囲にあると考えて、少なくともｐＨ１２を介した反応、沈殿による実験不能は、塩基性のアームを観察するのにおそらく必要とされる可能性がある。
【０１２１】
プロトンインベントリーは、ＰＶ  ３Ｄｐｏｌ  Ｌｙｓ−３５９による一般酸触媒作用を明らかにする。ＰＶ  ＷＴ  Ｌｙｓ−３５９  ３Ｄｐｏｌに関するプロトンインベントリーはボウル形であり、ヌクレオチド組み込みのリン酸転移段階の遷移状態における２つ以上のプロトンの転移が示された（図１４Ａ）。対照的に、Ｋ３５９Ｌ突然変異体ポリメラーゼに関するプロトンインベントリーは、遷移状態におけるただ１つのプロトンの転移を示す直線プロットをもたらした。この観察結果は、Ｌｙｓ−３５９が触媒作用を高めるプロトンのドナーであり、したがって一般酸触媒として働く強力な証拠である。これと一致して、動的データ（表７）およびｐＨ−速度の挙動（図１３）によって前に示唆されたように、Ｋ３５９Ｒ  ３Ｄｐｏｌ変異体に関するプロトンインベントリーはボウル形であり、プロトン供給により触媒作用を容易にする位置−３５９位置におけるＡｒｇに関するいくらかの能力が示された。
【０１２２】
保存活性部位のＬｙｓは、他のポリメラーゼクラスにおいて一般酸触媒である。配列アラインメントおよび高解像度結晶構造は、他のクラス由来の核酸ポリメラーゼにおいてＰＶ  ３Ｄｐｏｌ  Ｌｙｓ−３５９と同じ活性部位の機能的位置を占める保存Ｌｙｓ残基の同定を可能にする。ＨＩＶ−１  ＲＴ  ＲｄＤｐのＬｙｓ−２２０（図１５Ａ）、ＲＢ６９  ＤｄＤｐのＬｙｓ−５６０（図１５Ｂ）およびＴ７  ＤｄＲｐ（ＲＮＡポリメラーゼに関してＲＮＡＰと呼ばれることが多い）のＬｙｓ−６３１（図１５Ｃ）を調べた。ＰＶ  ３Ｄｐｏｌ  Ｌｙｓ−３５９に関して前に記載した発見（表７）と一致して、動的データはこれらの他のポリメラーゼにおける保存活性部位のＬｙｓ残基に関する触媒的役割を示唆する（表８）。保存活性部位のＬｙｓのＬｅｕへの突然変異は、ＨＩＶ−１  ＲＴ  ＲｄＤｐのＫ２２０ＬおよびＴ７  ＤｄＲｐのＫ６３１Ｌに関して約２桁から、ＲＢ６９  ＤｄＤｐのＫ５６０Ｌに関して３桁を超えるまでの範囲の低下した触媒速度をもたらした。これらの酵素における触媒速度に対するＬｙｓからＬｅｕへの変化の影響は一貫しており重大であったが、Ｋｄ，ａｐｐによって報告したヌクレオチド結合に対する影響は非常に変動した。ＨＩＶ−１  ＲＴ  Ｋ２２０Ｌにおいて変化はほとんどまたはまったく見られず、結合親和性の２５倍の低下がＲＢ６９  Ｋ５６０Ｌにおいて見られ、ヌクレオチド基質と結合する能力の衝撃的な消失がＴ７  ＤｄＲｐ  Ｋ６３１Ｌにおいて見られた（表８）。後者の酵素に関しては、ヌクレオチドでの飽和を実験的に実施することはできなかった。７５ｍＭのＡＴＰでさえ、ｋｏｂｓ対［ＡＴＰ］プロットのプラトー領域において触媒速度をもたらすことはなかった。ＲＢ６９  ＤｄＤｐの場合興味深いのは、Ｋ５６０Ａ酵素はＫ５６０Ｌより動力学的に１０倍優れていた（ただし依然としてＷＴ  ＲＢ６９  Ｋ５６０ポリメラーゼより２５０倍劣っていた）という発見であった。対照的に、Ｋ５６０ＡおよびＫ５６０Ｌに対するヌクレオチドの結合親和性は区別不能であった。
【０１２３】
【表８】
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ＰＶ  ３Ｄｐｏｌ  ＲｄＲｐに関して前に記載したように（図１４）、ＨＩＶ−１  ＲＴ  ＲｄＤｐおよびＲＢ６９  ＤｄＤｐに関するプロトンインベントリーのプロットは、これら後者２つのポリメラーゼにおける保存活性部位のＬｙｓの一般酸触媒としての役割を明らかにする。ＷＴ  ＨＩＶ−ＲＴ  Ｋ２２０  ＲｄＤｐ、Ｔ７  Ｋ６３１  ＤｄＲｐおよびＲＢ６９  Ｋ５６０  ＤｄＤｐに関するプロトンインベントリーのプロットはボウル形であり、ヌクレオチド組み込み中のリン酸転移反応の遷移状態における２つ以上の速度に影響を与えるプロトンの転移を示した（図１６Ａｉ、１６Ｂｉおよび１６Ｃ）。対照的に、ＨＩＶ−１  ＲＴ  Ｋ２２０Ｌ（図１６Ａｉｉ）およびＲＢ６９  Ｋ５６０Ｌ（図１６Ｂｉｉ）に関するプロトンインベントリーのプロットは直線状であり、遷移状態におけるただ１つの速度に影響を与えるプロトンの転移を示した。これらのデータは、一般酸触媒としてのＨＩＶ−ＲＴ  ＲｄＤｐおよびＲＢ６９  ＤｄＤｐの保存活性部位のＬｙｓ残基を強く示す。
【０１２４】
Ｔ７  ＤｄＲｐ  Ｋ６３１Ｌポリメラーゼに関するプロトンインベントリーは実施することができなかった。なぜなら、前に記載したように、この酵素におけるＬｅｕへのＬｙｓの突然変異は、実験的にヌクレオチドで酵素−プライマー／鋳型二重複合体を飽和する能力を無効にしたからである。
【０１２５】
ＤＮＡおよびＲＮＡの複製および維持の作用物質としての核酸ポリメラーゼによって果たされる生物学的役割における広範囲の多様性にもかかわらず、１ヌクレオチドの組み込みを実施するために使用される根本的な活性部位構造および機構段階は高度に保存される。特に、リン酸転移中の触媒的役割は、２つの活性部位のＭｇ２＋イオンにほぼすべて割り当てられている。官能基と反応するこれらの金属イオンの配置はプライマー−３’末端−ＯＨの脱プロトン化を容易にして、攻撃性求核剤を生成し、遷移状態中のマイナス電荷の蓄積を軽減する。
【０１２６】
しかしながら、２つの遷移状態のプロトンの転移が速度化学に影響を与えるという発見は、核酸ポリメラーゼのリン酸転移反応中のプロトン触媒作用の重要性を明らかにする。プライマー−３’末端−ＯＨプロトンの分離は、１つの重要なプロトンの相互作用をおそらく含む。本書に記載する多数の一連の実験証拠は、他の重要なプロトンの交換は、一般酸触媒として作用する保存活性部位のプラスに帯電したアミノ酸残基、通常リシンによるプロトン供給であるという結論に収束する。近年の高解像度Ｘ線結晶構造は、このプラスに帯電した活性部位の残基の存在は絶対的に保存され、さらにより有意なことに、結合ヌクレオチド三リン酸部分のα−とβ−リン原子の間の架橋酸素付近のその空間位置、結合切断およびピロリン酸離脱基の離脱を容易にするのに理想的な位置も保存されることを明らかにする。このような特異的保存は、非常に重要な機能の考慮を必要とする。触媒作用中の保存活性部位の塩基性残基の直接的関与は、１）金属イオンの触媒作用は明らかに非常に重要である、２）ヌクレオチド結合における役割は保存塩基性残基の存在を説明すると考えられた、および３）リン酸転移段階を明確に調べる能力は多くのモデルポリメラーゼ系において欠けているので、大部分は見落とされている。
【０１２７】
ＰＶ  ３Ｄｐｏｌ  ＲｄＲｐでは、配列アラインメントおよび分子モデリングによって、推定活性部位の一般酸としてＬｙｓ−３５９を同定した（図１１）。ＷＴ  Ｋ３５９  ３ＤｐｏｌのｐＨ−速度プロファイルは、２つのイオン性官能基がリン酸転移の速度に影響を与えることを示した（図１２Ａ）。プロトンインベントリーのアッセイは、ＷＴ  ３Ｄｐｏｌに関する遷移状態中の２プロトンの転移をさらに支持した（図１４Ａ）。化学的に不活性なＬｅｕへのＬｙｓ−３５９の突然変異は塩基性のアームを欠くｐＨ−速度プロファイルをもたらし（図１２Ｂ）、Ｋ３５９Ｌ酵素において化学的性質に影響を与えるただ１つのイオン性基を示した。これと一致して、Ｋ３５９Ｌ  ３Ｄｐｏｌのプロトンインベントリーは、遷移状態中のただ１つのプロトンの転移を示した（図１２Ｂ）。ＰＶ  ３Ｄｐｏｌの位置３５９におけるＬｅｕへのＬｙｓの突然変異は、ヌクレオチド結合親和性のわずか３倍の低下をもたらしたが（その構造位置が明らかになるまで、その歴史的役割はこの保存残基に帰するものであった）、触媒速度のより一層著しい５０倍の低下が見られた（表７）。
【０１２８】
Ｋ３５９ＨおよびＫ３５９Ｒ  ３Ｄｐｏｌを用いた試験も、ＰＶ  ３Ｄｐｏｌ  Ｌｙｓ−３５９に関する一般酸触媒としての役割を支援する。Ｋ３５９Ｈ  ３ＤｐｏｌのｐＨ−速度プロファイルは、この酵素はＨｉｓイミダゾール部分のｐＫａを超えてほぼ１ｐＨ単位までＫ３５９Ｌ酵素より動力学的に優れているが、次いで高いｐＨではＫ３５９Ｌ  ３Ｄｐｏｌの触媒的非効率に収束することを明らかにした（図１３）。Ｋ３５９Ｒ  ３ＤｐｏｌのｐＨ−速度プロファイルは、この酵素は低いｐＨではＫ３５９Ｈ  ３Ｄｐｏｌと動力学的に同等であるが、さらに高いｐＨでは、Ｋ３５９ＲポリメラーゼはｐＨ１０までは触媒的によりよく働き、Ｋ３５９Ｒの触媒速度はＷＴ  Ｋ３５９酵素のそれに近づいたことを示した（図１３）。さらに、３ＤｐｏｌのＬｙｓ−３５９の一般酸触媒としての役割と一致したのは、Ｋ３５９Ｒ  ３Ｄｐｏｌに関するプロトンインベントリーは、このポリメラーゼ変異体に関する遷移状態における２プロトンの転移を明らかにしたという発見であった（図１４ｃ）。ＨｉｓまたはＡｒｇへのＬｙｓ−３５９の突然変異によって、ＷＴ  ３Ｄｐｏｌ酵素に対してヌクレオチド結合はほとんど影響を受けない状態となったが、ＷＴ  Ｋ３５９より１０倍遅くＫ３５９Ｌ  ３Ｄｐｏｌより５倍速い触媒速度をもたらした（表７）。要約すると、ＰＶ  ３Ｄｐｏｌ  Ｋ３５９ＨおよびＫ３５９Ｒポリメラーゼ変異体に関する実験データは、ＨｉｓまたはＡｒｇが位置３５９を占めるとき、いくつかの残基の一般酸触媒作用の機能が存在すること、ただしプロトン触媒作用はＷＴ  Ｌｙｓ−３５９と比較して実質的に低下した有効性で生じることを示唆する。これはおそらく、プロトンドナーとアクセプター群の間のｐＫａのミスマッチ、および／または非生物学的ＨｉｓまたはＡｒｇがＰＶ  ３Ｄｐｏｌにおいてこの活性部位の位置を占めるときの相互作用原子間の空間的ミスアラインメントによる、プロトン供給の制限の結果である。
【０１２９】
保存ポリメラーゼ活性部位のプラスに帯電したアミノ酸残基に関する一般酸触媒としての役割をさらに支持する際に、ＰＶ  ３Ｄｐｏｌ  ＲｄＲｐに関して前に記載したこの結論を、他のクラスのポリメラーゼに拡大する。配列アラインメントと高解像度Ｘ線結晶構造の組合せは、ＨＩＶ−１  ＲＴ  ＲｄＤｐ（Ｋ２２０）（図１５Ａ）、ＲＢ６９  ＤｄＤｐ（Ｋ５６０）（図１５Ｂ）およびＴ７  ＤｄＲｐ（Ｋ６３１）（図１５Ｃ）において保存活性部位リシン推定の一般酸触媒の同定を可能にした。これらのポリメラーゼのそれぞれにおいて、保存活性部位ＬｙｓからＬｅｕへの突然変異は、約２〜３桁の触媒速度の大幅な低下をもたらした（表８）。ＲＢ６９  ＤｄＤｐの場合興味深いのは、触媒速度の点で、Ｋ５６０ＡポリメラーゼはＫ５６０Ｌ変異体より動力学的に１桁優れていたが（ただし依然としてＷＴ  Ｌｙｓ−５６０酵素より２桁劣っていた）、一方Ｋ５６０Ａ酵素とＫ５６０Ｌ酵素はヌクレオチド結合において同等であったという発見である（表８）。Ｋ５６０Ｌに優るＫ５６０Ａの動的優位性に関して考えられる説明は、小さなＡｌａ側鎖は、非効率的ではあるがその部位で触媒的に貢献し得る水構造分子の、安定した挿入のための空間を与えることができるということである。
【０１３０】
ＷＴ  ＨＩＶ−１  ＲＴ  ＲｄＤｐ、ＲＢ６９  ＤｄＤｐおよびＴ７  ＤｄＲｐに関するプロトンインベントリーのプロットは明らかにボウル形であり、リン酸転移の遷移状態における２つ以上の速度に影響を与えるプロトンの転移が明らかになった（図１６Ａｉ、１６Ｂｉおよび１６Ｃ）。対照的に、ＨＩＶ−１  ＲＴ  Ｋ２２０ＬおよびＲＢ６９  Ｋ５６０Ｌポリメラーゼに関するプロトンインベントリーのプロットは直線状であり、ただ１つのプロトンが遷移状態において転移していたことが示された（図１６Ａｉｉおよび１６Ｂｉｉ）。これらのプロトンインベントリーに関する発見は、ＰＶ  ３Ｄｐｏｌ  ＲｄＲｐに関して前に記載した発見と同様であった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。したがって、ＰＶ  ３Ｄｐｏｌ  ＲｄＲｐ、ＨＩＶ−１  ＲＴ  ＲｄＤｐおよびＲＢ６９  ＤｄＤｐでは、プロトンとして不活性なＬｅｕへの保存活性部位Ｌｙｓの突然変異によって、リン酸転移段階の遷移状態において１つの速度に影響を与えるプロトンの転移がなくなり、触媒速度が２〜３桁低下した。
【０１３１】
どのようにして核酸ポリメラーゼが忠実度を高めるかは、現在非常に議論の的となっている。ヌクレオチド基質でＴ７  ＤｄＲｐ  Ｋ６３１Ｌ反応を飽和する能力の欠如は、酵母菌では、ＲＮＡＰＩＩのヌクレオチド結合と触媒作用を、活性部位の塩基性残基、Ｈｉｓ−１０８５によってカップリングさせることが可能であるという観察と実験上一致するようである。基質選択と触媒作用のカップリングは、ＲＮＡポリメラーゼにおいて忠実度を高める可能性があることがさらに示唆されている。Ｌｙｓ−６３１を有するＴ７  ＲＮＡＰ  Ｏ−ヘリックスは、Ｈｉｓ−１０８５を有する酵母菌ＲＮＡＰＩＩ誘導ループと機能的に類似している可能性がある：両者は、ポリメラーゼ活性部位へのヌクレオチドの進入に関与する可動構造要素である。基質としてｄＡＴＰを用いたＬｅｕへのＲＢ６９  Ｌｙｓ−５６０の突然変異は、（ｋｐｏｌの２５００倍の低下と共に）Ｋｄ，ａｐｐの２５倍の低下をもたらしたという、ここで報告する発見（表８）は、ヌクレオチド結合および触媒作用との考えられるカップリングにおける、この残基の有意な役割を示唆する。しかしながら、ＰＶ  ３Ｄｐｏｌ  ＲｄＲｐおよびＨＩＶ−１  ＲｄＤｐにおける触媒ＬｙｓのＬｅｕへの突然変異によるヌクレオチド結合の実質的な変化の欠如は、約２桁の触媒速度の低下にもかかわらず（表７および８）、基質結合と触媒作用のカップリングはこれらのポリメラーゼの特徴ではあり得ないことを示唆する。
【０１３２】
ここで好ましい機構モデルは、結合切断および離脱基の離脱を容易にするための、活性部位の一般的な酸からピロリン酸離脱基へのプロトンの供給に関与する。しかしながら、プロトンの完全な物理的供給は首尾よい触媒作用の要件ではあり得ないこと、およびプロトン共有は十分であり得ることに留意しなければならない。要約すると、ここに記載する多数の一連の証拠は、保存活性部位のプラスに帯電したアミノ酸残基は、核酸ポリメラーゼにおいて一般酸触媒として重要な機能を果たすことを全体で論じる。プロトン供給／共有は、酵素活性部位の反応においてエネルギー的に好ましくないマイナス電荷の発生をなくす、最も簡単な、最も基本的な手段である。ここで報告する発見は重要である。なぜならそれらは、どのようにしてリン酸転移の触媒作用が、この普遍的に重要な酵素群によって実施されるかという、より完全な概念を明らかにするからである。２金属イオンの触媒作用は明らかに非常に重要であり、ヌクレオチドの組み込みを加速するための主要基盤をもたらすが、金属イオンの触媒作用のみによって与えられる速度は不適切である可能性がある。活性部位の一般的な酸によって与えられる追加的な２〜３桁の触媒作用速度の増大は、生物学的に十分なレベルまでのヌクレオチド組み込み速度をもたらすのに必要である可能性がある。実際、３Ｄｐｏｌ  Ｋ３５９ＨおよびＫ３５９Ｒ突然変異体ポリオウイルスの細胞培養試験は、これらの変異体による有意に遅くなったプラーク形成を示し、ウイルスゲノム複製の不適切な速度が原因で感染性および病原性が弱化した状態になる可能性があることを示唆する。
【実施例３】
【０１３３】
突然変異体ＰＶ
ＰＶ突然変異体ウイルスＫ３５９ＲおよびＫ３５９Ｈを、作製し、複製（図１７）、およびＷＴウイルスと比較して細胞内において感染性であり、弱毒化されていることを示した。ＨｅＬａ細胞に野生型ＰＶのＲＮＡ、３Ｄｐｏｌに表示の変異株を含むＲＮＡをトランスフェクトし、またはＲＮＡをトランスフェクトせず（モックのトランスフェクション）、ＰＢＳで１００倍に希釈し、その後トランスフェクトされていないＨｅＬａ細胞の単分子層に播種した。プレートを、寒天培地で覆い、３７℃において２日間インキュベートした。図１７は、ＰＶ  Ｋ３５９Ｒ、Ｈのサブゲノムレプリコンが、ＷＴより複製が遅いことを例示する。用いたサブゲノムレプリコンは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子によって置換された、カプシドコード領域を有した。ＨｅＬａ細胞に、２ｍＭのＧｄｎＨＣＬ（＋Ｇ）の存在下でＷＴ配列を含む、またはＧｄｎＨＣＬの不在下でＷＴ配列を含む、サブゲノムレプリコンＲＮＡをトランスフェクトした。ＧｄｎＨＣＬは、ＰＶ  ＲＮＡ複製の可逆的阻害剤である。したがって、ＧｄｎＨＣＬの存在下で測定したルシフェラーゼ活性は、流入したＲＮＡの翻訳結果である。ＧｄｎＨＣＬの不在下において、Ｋ３５９Ｒ、Ｈ変異株を含むレプリコンを使用して、さらにトランスフェクションを実施した。トランスフェクション反応液を、３７℃においてインキュベートした。トランスフェクション後、様々な時間に、細胞を処理し、ルシフェラーゼ活性を評価した。
【０１３４】
他の実施形態
組成物および方法のステップの一部またはすべてにおいて任意の改良が可能である。ここに引用した出版物、特許出願および特許を含むすべての参考文献は参照によりここに引用される。任意のおよびすべての実施例の使用、またはここで提供される例示の言葉（例えば「など」）は、発明の理解を容易にする意図のものであり、特に主張しない限り、発明の範囲の限定をもたらすものではない。本発明の性質または利益についての、または好ましい実施形態についてのここでのいかなる言及も限定する意図のものではなく、添付の特許請求の範囲は、このような言及によって限定されると判断すべきではない。さらに全般に、本明細書中のどのような言葉も、本発明の実践に必須である任意の要素が、特許請求されていないことを示すとして解釈されるべきではない。本発明は、適用法によって容認されるように、ここに添付の特許請求の範囲に記載される主題ののすべての変形および等価物を含む。ポリメラーゼの活性部位にリシン残基の置換を有する改変ポリメラーゼがここに記載されているが、ここに記載される改変ポリメラーゼは、プロトンを受容するおよびプロトンを供与するアミノ酸残基の突然変異、欠失、および置換を含む。ポリメラーゼの活性（例えば、複製速度、忠実度など）を変化させる任意の分子を利用できる。さらに、それらのすべての可能な変形において、上記の要素の任意の組合せは、ここに示されていない限り、または文脈により明らかに禁忌でない限り、本発明に包含される。
【受託番号】
【０１３５】
Ｖ０１１４８
ＡＡＹ４４７７３
４１３９７３９
【図１】
2010514424.tif 000011
【図２ＡＡＮＤ２Ｂ】
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【図３】
2010514424.tif 000013
【図４Ａ−４Ｂ】
2010514424.tif 000014
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2010514424.tif 000018
【図９】
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【図１０Ａ−１０Ｄ】
2010514424.tif 000020
【図１１】
2010514424.tif 000021
【図１２Ａ−１２Ｃ】
2010514424.tif 000022
【図１３】
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【図１４Ａ−１４Ｃ】
2010514424.tif 000024
【図１５】
2010514424.tif 000025
【図１６Ａ−１６Ｃ】
2010514424.tif 000026
【図１７】
2010514424.tif 000027
【配列表】
2010514424000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月28日(2009.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
2010514424.tif 000028
【国際調査報告】
2010514424.tif 000029
2010514424.tif 000030