(57)【要約】  本発明は、末端にＧａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつように修飾された、サイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質のグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質に関する。
2010526773.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつように修飾された、サイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質のグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質。
【請求項２】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの可溶性受容体、可溶性ＬＤＬ受容体またはその関連ホモログ、可溶性スカベンジャー受容体、可溶性ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１および可溶性ＦＬｋ−１から選択される請求項１記載のグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質。
【請求項３】
アシアロ可溶性ＴＮＦＲ（ａｓ−ｓＴＮＦＲ）、アシアロ、アガラクト可溶性ＴＮＦＲ（ａｓ−ａｇ−ｓＴＮＦＲ）、ラクトサミン可溶性ＴＮＦＲ（ｌａｃ−ｓＴＮＦＲ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン可溶性ＴＮＦＲ（ｓＴＮＦＲ−Ｇｎ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン可溶性ＬＤＬＲ（ｓＬＤＬＲ−Ｇｎ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン可溶性ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１（ｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１−Ｇｎ）およびラクトサミン可溶性ＦＬｋ−１（ｌａｃ−ｓＦＬＫ−１）から選択される請求項１または２記載のグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質。
【請求項４】
前記可溶性受容体または結合タンパク質に結合可能な、循環サイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質のクリアランスを促進するための医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１項に記載のグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質の使用。
【請求項５】
リポタンパク質または酸化リポタンパク質が、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化ＬＤＬおよびレムナントリポタンパク質から選択される請求項４記載の使用。
【請求項６】
サイトカインまたは成長因子が、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４／ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１Ｏ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−  １７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、ＩＬ−２９、アクチビン、アポ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＴＮＦＳＦ９、ＢＭＰ−２、ＣＤ２７Ｌ、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−７、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＮＴＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＡＳＬ、ＦＧＦ、ＣＳＦ、ＦＬＴ３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＮＦ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＨ、ＨＧＦ、ＩＧＦ  Ｉ  ＆  ＩＩ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシン、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＳＰ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＯＸ−４０Ｌ、ＰＤＧＦ、プロラクチン、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＰＯ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＳＬＰおよびＴＷＥＡＫから選択される請求項４記載の使用。
【請求項７】
病因または経過がサイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質の値および／または活性に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１項に記載のグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質の使用。
【請求項８】
疾患、障害または症状の病因または経過が、循環中の過剰なリポタンパク質または酸化リポタンパク質に関連する請求項７記載の使用。
【請求項９】
リポタンパク質または酸化リポタンパク質が、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化ＬＤＬまたはレムナントリポタンパク質から選択される請求項８記載の使用。
【請求項１０】
障害が、高コレステロール血症である請求項７〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
疾患、障害または症状の病因または経過が、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４／ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１Ｏ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、ＩＬ−２９、アクチビン、アポ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＴＮＦＳＦ９、ＢＭＰ−２、ＣＤ２７Ｌ、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−７、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＮＴＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＡＳＬ、ＦＧＦ、ＣＳＦ、ＦＬＴ３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＮＦ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＨ、ＨＧＦ、ＩＧＦ  Ｉ  ＆  ＩＩ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシン、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＳＰ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＯＸ−４０Ｌ、ＰＤＧＦ、プロラクチン、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＰＯ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＳＬＰおよびＴＷＥＡＫから選択されるサイトカインまたは成長因子の値または活性に関連する請求項７記載の使用。
【請求項１２】
疾患、障害または症状の病因または経過が過剰な成長因子により悪化されるか、または疾患、障害または症状の経過が成長因子の値を減少させることにより改善される請求項７記載の使用。
【請求項１３】
疾患が癌である請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
病因または経過がＴＮＦの値または活性に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための医薬の製造における、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦＲ）の使用。
【請求項１５】
疾患、障害または症状が、過剰なＴＮＦに関連する請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
疾患が、自己免疫疾患または炎症性疾患である請求項１４または１５記載の使用。
【請求項１７】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病および乾癬から選択される請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
疾患が関節リウマチである請求項１６記載の使用。
【請求項１９】
可溶性受容体が、ａｓ−ｓＴＮＦＲ、ａｓ−ａｇ−ｓＴＮＦＲ、ｌａｃ−ｓＴＮＦＲおよび／またはｓＴＮＦＲ−Ｇｎから選択される請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
ｓＴＮＦＲがｓＴＮＦＲｐ５５である請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
高コレステロール血症の治療のための医薬の製造における、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＬＤＬ受容体（ｓＬＤＬＲ）またはその関連ホモログの使用。
【請求項２２】
家族性高コレステロール血症の治療のための請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
可溶性受容体がｓＬＤＬＲ−Ｇｎである請求項２１または２２記載の使用。
【請求項２４】
個体におけるアテローム性動脈硬化症を治療または予防するための医薬の製造における、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１の使用。
【請求項２５】
前記個体が、収縮性アテローム性動脈硬化症のリスクが高い個体である請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
可溶性受容体が、ｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１−Ｇｎである請求項２４または２５記載の使用。
【請求項２７】
原発性癌または転移の治療のための医薬の製造における、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＦＬｋ−１の使用。
【請求項２８】
可溶性受容体が、ラクトサミン可溶性ＦＬｋ−１（ｌａｃ−ｓＦＬＫ−１）である請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
循環サイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質のクリアランスを促進するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のグリカン修飾可溶性受容体と薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
【請求項３０】
循環サイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質のクリアランスを促進するための、薬学的に許容され得る担体と、可溶性アシアロＴＮＦＲ（ａｓ−ｓＴＮＦＲ）、アシアロ−アガラクト可溶性ＴＮＦＲ（ａｓ−ａｇ−ｓＴＮＦＲ）、ラクトサミン可溶性ＴＮＦＲ（ｌａｃ−ｓＴＮＦＲ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン可溶性ＴＮＦＲ（ｓＴＮＦＲ−Ｇｎ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン可溶性ＬＤＬＲ（ｓＬＤＬＲ−Ｇｎ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン可溶性ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１（ｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１−Ｇｎ）およびラクトサミン可溶性ＦＬｋ−１（ｌａｃ−ｓＦＬＫ−１）から選択されるグリカン修飾可溶性受容体とを含む医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質の治療有効量を必要な対象に投与することを含む、循環サイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質のクリアランスを促進する方法。
【請求項３２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質の治療有効量を必要な対象に投与することを含む、病因または経過がサイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質の値および／または活性に関連する疾患、障害または症状を治療または予防する方法。
【請求項３３】
末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦＲ）の治療有効量を必要な対象に投与することを含む、病因または経過がＴＮＦの値または活性に関連する疾患、障害または症状を治療または予防する方法。
【請求項３４】
末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＬＤＬ受容体（ｓＬＤＬＲ）またはその関連ホモログの治療有効量を必要な対象に投与することを含む、高コレステロール血症を治療または予防する方法。
【請求項３５】
末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１の治療有効量を必要な対象に投与することを含む、アテローム性動脈硬化症を治療または予防する方法。
【請求項３６】
末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＦＬｋ−１の治療有効量を必要な対象に投与することを含む、原発性癌または転移を治療する方法。
【請求項３７】
病因または経過がサイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質の値および／または活性に関連する疾患または障害または症状を治療または予防するための、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃをもつように修飾された、サイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質のグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、循環から望ましくない成分をクリアランスできる薬剤および該薬剤の臨床用途に関する。このような望ましくない成分の例は、炎症性サイトカイン、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化ＬＤＬ、レムナントリポタンパク質および成長因子である。
【背景技術】
【０００２】
可溶性受容体および結合タンパク質は、種々のサイトカイン、成長因子、ポリペプチドホルモンおよび他の循環エフェクタータンパク質と高い親和性および特異性で結合する循環タンパク質である。ほとんどの場合、可溶性受容体は、対応する細胞表面受容体の細胞外のリガンド結合ドメインに相当する。このような可溶性受容体は、可溶性受容体をコードするｍＲＮＡスプライシング変異または細胞表面受容体のリガンド結合細胞外ドメインを切断することにより生じる。しかしながら、細胞表面受容体に対応しないＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）およびオステオプロテゲリンなどのサイトカイン結合タンパク質もある。
【０００３】
可溶性受容体の存在とその製造および機能についての複雑な制御とは、これらが通常の生理機能および疾患への応答において重要な役割を有することを示唆するが、場合によっては病理学的過程にも貢献すると考えられる。たとえば、アレルギー反応の重要な成分は、ＩＬ−５によりその製造および活性が著しく促進される好酸球によって媒介される。アレルギー喘息患者において、気管支生検試料中の膜結合性ＩＬ−５受容体をコードするｍＲＮＡの値は、気管支収縮の重症度とともに増加する。急性喘息症状から治療施行患者が回復すると、可溶性ＩＬ−５受容体ｍＲＮＡの発現が増加するため、可溶性ＩＬ−５受容体が肺内のＩＬ−５の影響に反作用し、その増加した発現が喘息からの回復に影響し得ることが示唆される（HeaneyおよびGolde, 1998）。
【０００４】
サイトカインは多くの疾患の病因に基本的に関与するため、これは生物学的治療アプローチの重要な標的を構成する。サイトカイン受容体の可溶型がサイトカイン活性の内生的調節に関与するという発見は、免疫療法薬としての潜在用途において重要な関心を促すものであった。このため、可溶性サイトカイン受容体は、特異性、低免疫原性および高親和性を含む多くの利点を有する。多くの可溶性サイトカイン受容体がこれらのリガンドの結合および生物活性を阻害できることにより、きわめて特異的なサイトカインアンタゴニストとなる。いくつかの製薬会社は、可溶性サイトカイン受容体に基づく多くの治療薬を生み出し、これらの多くが臨床試験中である。臨床開発が最も進んでいるものは、エタネルセプト（商品名エンブレル（商標）、アムジェン社）であり、ＩＩ型可溶性ＴＮＦ受容体とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域との融合タンパク質である。このＴＮＦ−αアンタゴニストは、ヒトでの使用の承認を受けた最初の可溶性サイトカイン受容体であった。通常、可溶性サイトカイン受容体に基づくほとんどの薬剤は安全で高い耐容性があり、ほとんどの患者において軽度の副作用しか示さない。可溶性サイトカイン受容体は、多種多様なヒトの疾患において著しい適用の可能性をもつ新世代の治療薬を構成する（IdrissおよびNaismith, 2000）。
【０００５】
ＴＮＦαは、５５ｋＤａおよび７５ｋＤａの分子量の２つの同族受容体に結合する。ヒトＴＮＦＲ−１は４３４のアミノ酸を含むのに対し、ＴＮＦＲ−２は４３９の残基を含む。これらの受容体は、細胞外領域においてきわめて限定的なホモロジーを共有する。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーは、システインクラスターの繰り返し単位の存在により規定される。ＴＮＦ受容体は、赤血球および非刺激Ｔ細胞など、いくつかの例外を除き、ほとんどの既知の細胞種に存在する。受容体の比重は、細胞毎に２００〜１０，０００の範囲である。細胞に存在する受容体数とＴＮＦ誘導反応の規模または方向性とのあいだには相関関係はないと考えられる。可溶型のＴＮＦＲ−１およびＴＮＦＲ−２はヒトの尿および癌患者の血清中に同定される。おそらく、これらはリガンドをおびき寄せることでＴＮＦの活性を調節し、発生シグナルをダウンレギュレーションする。
【０００６】
（ＴＮＦＲ−１および２を含む）多くの膜結合受容体がこれまでに同定されており、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーとして知られるものを形成している。これらの分子量は５０〜１２０ｋＤａの範囲内である。ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーは、Ｉ型膜貫通糖タンパク質に属する。また、「デコイ受容体」と称される多くの関連する受容体も同定されており、分泌されたリガンドを隔離するように機能する。デコイ受容体（ＤｃＲ１、ＤｃＲ２およびＤｃＲ３）は、Ｔｒａｉｌ（ＤｃＲ１およびＤｃＲ２）およびＦａｓ（ＤｃＲ３）リガンドを隔離するため、アポトーシスを回避する。さらに、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）と称された可溶性非膜結合デコイ受容体も同定されている。ＴＮＦＲ−１ファミリーには、それほど多くの翻訳後修飾は報告されていない。ＴＮＦＲ−１およびＴＮＦＲ−２は、両方ともＮ−グリコシル化されているが、ＴＮＦＲ−２のみがＯ−グリコシル化されている。また他のすべての膜受容体はグリコシル化されている（IdrissおよびNaismith, 2000）。
【０００７】
全身性疾患である関節リウマチ（ＲＡ）は、炎症性関節炎の最も多い病型である。この疾患は世界中で約１％の罹患率であり、年間に成人１０，０００人につき３人が発症する。ＲＡは、重大な疾病率および死亡率をともなう。初期の疾患の重症度により、身体障害の危険性は３３％の高さがあり、しばしば感染または循環器系統の疾患の結果として、死亡率は５２％にも増加し得る。予期されるように、ＲＡ患者は生活の質が多大に減退する。
【０００８】
治療の最終目的は、関節損傷の予防または制御、機能的損失の予防および痛みの軽減である。１９９９年の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニストの導入により、ＲＡの管理は顕著に変化した。インフリキシマブ（レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（登録商標））、エタネルセプト（エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標））およびアダリムマブ（ヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ）（商標））は、ＴＮＦを結合し、そのバイオアベイラビリティーを減少させることによりＲＡの炎症カスケードを調節するように設計されている。
【０００９】
ＴＮＦ、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−６を含む種々の炎症性サイトカインがＲＡ患者の髄液から検出されている。初期の研究は、滑膜細胞培養系において、ＩＬ−１および他のサイトカインの二次合成が、ＴＮＦを標的にすることで著しく減少可能であることを実証した。ＴＮＦの役割は、（１）インビトロにて軟骨および骨を分解する能力、（２）動物モデルにおける関節炎誘発特性、（３）ＲＡ滑膜およびパンヌス−軟骨関節での受容体の共存、および（４）培養されたＲＡ由来滑膜細胞におけるＩＬ−１の合成を調節する中心的役割に基づくものである。
【００１０】
エタネルセプトは、ヒトｐ７５ＴＮＦ受容体のリガンド結合部分にヒトＩｇＧ１のＦｃ断片を加えたものからなる融合タンパク質である。エタネルセプトは、１０２±３０時間の最終半減期を有する。推奨開始用量は、メトトレキサートを使用してまたは使用せずに、皮下に一週間に２度、２５ｍｇの用量である。エタネルセプトによる治療は、疾患活性を著しく用量依存的に減少し、重大な安全性の問題はなかった。ＴＮＦアンタゴニストは、活性ＲＡの治療において著しい進展を示す。これらは、多様な期間にわたる関節破壊の阻害と、症状の緩和、ＲＡ患者の身体機能の改善に有効性を示す（Schwartzman, Fleischmannら, 2004）。
【００１１】
エタネルセプトは、全身治療または光線治療の対象である中等度から重度の乾癬をもつ成人の皮下単剤療法として米国において使用が承認されている。該薬物は、乾癬性関節炎患者においても望ましく、メトトレキサートとの組み合わせにより使用可能である。中等度から重度の乾癬患者において、短期間のエタネルセプト治療は、プラセボと比較して、乾癬の面積と重症度の指数において７５％の減少を達成した患者の割合が著しく増加した。同様に、乾癬性関節炎患者において、短期間のエタネルセプト単独またはメトトレキサートとの組み合わせによる治療は疾患の臨床兆候を改善した一方で、Ｘ線上の関節損傷の進行は著しく遅くなったことが見られた（GoldsmithおよびWagstaff, 2005）。より最近には、エタネルセプトは強直性脊椎炎をもつ成人の治療における有効性を示した（McCormackおよびWellington, 2004）。
【００１２】
エタネルセプトはヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含むため、ＴＮＦとの複合体は、免疫細胞に見られるＦｃ受容体を介して循環からクリアランスされる。単独の可溶性ｐ５５ＴＮＦ受容体に基づく抗ＴＮＦ療法の開発は、該受容体がｐ７５ＴＮＦ受容体に比べてより高い親和性でＴＮＦと結合するにもかかわらず、現在までのところ成功していない。
【００１３】
アテローム性動脈硬化は、脂肪性物質、コレステロール、細胞分解物、カルシウムおよびフィブリンが動脈の内層にプラークを形成する過程である。プラークは、動脈を通る血流を部分的または完全に阻止し得る。プラーク崩壊は、きわめて細い動脈において塞栓症を生じ得るためさらに深刻な脅威である。アテローム性動脈硬化症は、大動脈および中動脈に影響する。動脈の種類およびプラークの発現箇所は個人により異なる。アテローム性動脈硬化症は、小児期に始まり得る遅効性の進行性疾患である。一部の人において、この疾病は３０歳代のときに急速に進行する。また他の人においては、５０歳代または６０歳代まで脅威とはならない。これは、脳、心臓、腎臓ならびに腕および脚の動脈に影響し得る。プラークが蓄積すると、これは重病化および合併症の原因となり得る。これらには、冠動脈疾患、狭心症、心臓発作、突然死、脳血管疾患、脳卒中、一過性脳虚血発作および末梢動脈疾患が含まれる。アテローム性動脈硬化症により生じた疾患は、西欧諸国において疾病および死亡の主要原因である。特定の習慣（高脂肪の食事、タバコの乱用および運動不足）の広がりにより、循環器疾患は、２０２０年までに世界中で生産年齢の落ち込みの主要原因となる（MurrayおよびLopez, 1997）。
【００１４】
近年、アテローム発生に関する分子メカニズムについての新たな見識が生み出された。ＢｒｏｗｎおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎは、血漿および動脈中のコレステロールの進行的蓄積が、ＬＤＬ受容体の欠陥によるものであり、これが家族性高コレステロール血症の主要原因であることを説明可能にした（BrownおよびGoldstein, 1986）。この合併症において、ＬＤＬ関連コレステロール（ＬＤＬｃ）は動脈硬化症におけるコレステロールの蓄積に関与することが示された。動脈硬化性プラークにおけるコレステロール蓄積のメカニズムのモデルは、血管壁へのＬＤＬの取り込みの増加、またはすでに血管壁に進入したＬＤＬの保持の増加を重視している。現在は、コレステロール合成の阻害による肝臓ＬＤＬ受容体発現のアップレギュレーションが、血漿コレステロール値を低下させる最も有効な手段である（Kong, Liuら, 2006）。
【００１５】
リポタンパク質は球状の分子であり、脂質とタンパク質とが結合した分子である。リポタンパク質は、体内において脂質の輸送および代謝に関与する。これらは、アテローム性リポタンパク質および血管保護性リポタンパク質に分けられる。アテローム性リポタンパク質は、通常、すべてがＶＬＤＬ、ＩＤＬまたはＬＤＬなどのアポＢ含有リポタンパク質であるが、血管保護性リポタンパク質はＨＤＬなどのアポＡ−Ｉ−含有リポタンパク質である。種々のリポタンパク質は、親水性遊離コレステロール、リン脂質およびアポリポタンパク質の層により囲まれたトリグリセリドとコレステロールエステルとの疎水性コアからなる。リポタンパク質は、異なる浮遊密度と大きさとにより分類される。リポタンパク質粒子の比重は、粒子中に含まれた脂質とタンパク質との相対量により決定される。
【００１６】
次の表は主要なリポタンパク質の特性を要約したものである。
【００１７】
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【００１８】
種々のリポタンパク質は、主として肝臓で生じる複合変換によって互いから由来するものである。リポタンパク質の展開に都合のよい開始点は最低比重クラスのキロミクロンである。これらの粒子は、食物脂肪、すなわちトリグリセリド、コレステロールおよびリン脂質、およびこれら細胞内で合成されるアポリポタンパク質（アポ）Ｂ４８から直接的に小腸粘膜細胞内で合成される。これらの比重は、粒径が大きく（≧１００ｎｍ）多量の脂質（特に浮遊トリグリセリド）を含むために低い。この大きいサイズは、毛細血管膜の浸透を不可能にする。その代わり、キロミクロンは、腸粘膜によってリンパ腺に分泌され、その後、胸管を通って循環に入る。キロミクロンは血中のアポＥおよびアポＣ−ＩＩを獲得する。その後、キロミクロントリグリセリドプールからの遊離脂肪酸の除去を触媒する血管内皮リポタンパク質リパーゼの作用によりサイズが漸減する。劣化キロミクロンレムナント粒子は、受容体媒介作用による肝細胞への取り込みによりこの経路を出て、キロミクロンアポＥは肝臓ＬＤＬ受容体のリガンドとして機能する。肝細胞内において、キロミクロンレムナントはその内容物（すなわち、残留トリグリセリド、コレステリルエステル、リン脂質およびアポリポタンパク質）を放出する。肝細胞は、これらのキロミクロンレムナント由来生成物を再構成して、内因性トリグリセリドおよびコレステリルエステルをきわめて低比重のリポタンパク質（ＶＬＤＬｓ）にし、これらを次段階の末梢部への脂質の輸送のために循環内に分泌する。キロミクロンと同様に、ＶＬＤＬｓもまたトリグリセリドに富むリポタンパク質であり、アポＣ−ＩＩおよびアポＥを含む。しかしながら、キロミクロンとは異なり、これらはより少ないトリグリセリドを含み、より小さく、アポＢ４８の代わりにアポＢ１００をもつ。
【００１９】
ここでのアポＢ１００の出現は、これがＬＤＬ受容体の生理的リガンドであるために重要である。このあと半時間にわたり、リポタンパク質リパーゼがＶＬＤＬトリグリセリド含有量をさらに減少し、既知のカスケードを中間比重リポタンパク（ＩＤＬ）へと下向するにつれて、粒子を漸次的により小さく濃密で、よりコレステロールが豊富にさせる。ＩＤＬトリグリセリドの遊離脂肪酸への加水分解は、さらに別のリパーゼおよび肝性リパーゼによって媒介され、程なくＬＤＬはこの経路において最終粒子として現れる。ＬＤＬは血漿中で最もコレステロールに富むリポタンパク質であり、血漿ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−ｃ）の上昇は、アテローム性動脈硬化症および冠状動脈性心臓病（ＣＨＤ）の主要な危険因子である。よって、肝臓由来のＬＤＬによる周辺部への過剰なコレステロールの運搬はアテローム硬化性プラークの蓄積につながる。したがって、ＬＤＬコレステロールを「悪玉コレステロール」およびＨＤＬコレステロールを「善玉コレステロール」と説明し、また単純化することがある。循環における半減期が約数日間であるＬＤＬはアポＢ１００のみを含有し、粒子毎に本質的にただ１つのコピーのみを含有する。また、上流の前駆体粒子（ＩＤＬおよびＶＬＤＬ）もアポＢ１００を含有することに留意を要する。このことは、ＬＤＬ値に比べてアポＢ１００値は心筋梗塞による死亡率により高程度に相関しており、食後のリポタンパク質もまたアテローム性であることを示唆するため重要である（TulenkoおよびSumner, 2002）。
【００２０】
第３の型のリポタンパク質であるＨＤＬは、第一に逆コレステロール輸送と称される過程において、主にコレステロールである脂質を肝臓に戻すことに関与する。
【００２１】
アテローム発生の最先の事象は、血管内皮細胞の活性化、付着および単球とＴリンパ球との内皮下空間への移動である。循環ＬＤＬは、これを高い生物反応性の酸化ＬＤＬ（ｏｘ−ＬＤＬ）に変換する血管細胞による酸化後に初めてアテロームを発生する。酸化ＬＤＬは泡沫細胞生成に関与し、接着分子、化学誘引物質、成長因子、炎症性およびアポトーシス促進性サイトカインの過剰発現などのアテローム形成促進的事象を誘引する。さらに、酸化ＬＤＬのこの毒性作用は、おそらくプラークの侵食／崩壊と、それに続くアテローム血栓症とに関与する。ｏｘ−ＬＤＬのいくつかの生物学的作用は、転写因子の活性とそれに続く遺伝子発現の変化とを通して媒介される。ｏｘ−ＬＤＬは酸化還元感受性転写因子ＮＦ−κＢを活性化し、これは接着分子の遺伝子、組織因子の遺伝子およびスカベンジャー受容体ＬＯＸ−１の遺伝子などのさらなる炎症促進性遺伝子の発現をアップレギュレーションする（Robbesyn, Salvayreら, 2004）。
【００２２】
アテローム形成促進性プラークに存在する脂質を持った「泡沫細胞」のほとんどは、固有のＬＤＬの取り込みの結果ではなく、むしろ酸化リポタンパク質の取り込みによるものである。ＬＤＬの酸化修飾は内皮下空間にて起こる。スカベンジャー受容体によるｏｘ−ＬＤＬの取り込みは、単球由来マクロファージを泡沫細胞に変化させる。これまで、少なくとも１０のスカベンジャー受容体が同定されており、このいずれがインビボでのこの特定の現象に寄与しているかはわかっていないが、ノックアウト実験に基づきＳＲＡおよびＣＤ３６が定量的に重要であることが明らかとなっている（Kita, Kumeら, 2001）。
【００２３】
血漿中のｏｘ−ＬＤＬの濃度は、ＣＨＤ患者の全ＬＤＬの０．５％未満であることがあり、これに対して内皮細胞が露出させられる。この血漿濃度は、ｏｘ−ＬＤＬのアテローム形成促進および炎症促進活性には充分でないこともある。いくつかの研究は、レムナントリポタンパク質（ＲＬＰ）が血漿中にてすでに酸化されていることを報告している。多量のアテローム形成促進性および炎症促進性の脂質ホスファチジルコリンは、ＲＬＰの成分であるキロミクロンレムナント中に同定された。換言すれば、血漿中に酸化された主要なリポタンパク質はｏｘ−ＲＬＰであり得る。血漿からのＲＬＰの単離は、レムナントリポタンパク質の酸化感受性を検証し、ＲＬＰのアテローム形成促進特性および炎症促進特性とｏｘ−ＬＤＬのこれらとの比較を可能にした。ｏｘ−ＬＤＬと同様に、循環ＲＬＰは血管構成細胞を活性化し、いくつかのアテローム形成促進遺伝子（ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−Ａ−Ｂ、ＣＯＸ−２およびｅＮＯＳ）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、ＣＤ−４０、ＣＤ−４０Ｌおよび組織因子（ＴＦ）を誘引する。多くの臨床研究は、血漿ｏｘ−ＬＤＬに比べて、血漿ＲＬＰ−Ｃ濃度が、早発性アテローム性動脈硬化症の危険性の増加とより関連することを示唆している。さらに、これらのリポタンパク質の血漿濃度から判断すると、内皮機能障害は、循環ｏｘ−ＬＤＬに比べて、循環ＲＬＰにより生じているようである。これらをもとに、とりわけＬＤＬ−Ｃ値ではなく、血漿ＲＬＰ−Ｃ値に高度に関連するメタボリックシンドローム患者において、血漿ＲＬＰを減少させることもまた高脂血症治療の目標とすべきである（Nakajima, Nakanoら, 2006）。
【００２４】
アポリポタンパク質Ｂは大きな両親媒性タンパク質であり、アポＢ１００およびアポＢ４８の２つの型で存在する。ヒトにおいて、アポＢ１００は肝臓中にて発現され、ＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＬＤＬ上に存在する。アポＢ４８は腸にて発現され、キロミクロンおよびこれらのレムナント上に存在する。アポＢ４８およびアポＢ１００は、同一の遺伝子によりコードされる。アポＢ４８のｍＲＮＡは、いわゆる編集工程によりアポＢ１００のｍＲＮＡから生じ、このあいだにシチジンからウリジンへの脱アミノ化によって、グルタミンコドンから終止コドンへと変化する。
【００２５】
アポＢ１００は、１つの球状Ｎ末端構造と、２つの両親媒性βシートドメインと、２つの両親媒性αへリックスドメインとからなる五深裂構造（pentapartite structure）を有する。Ｎ末端１０００アミノ酸領域は、ミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）と相互作用するため、ＶＬＤＬの生成にきわめて重要である。リポタンパク質の生成のあいだ、ＭＴＰは脂質のアポＢへの転移を触媒する。
【００２６】
両親媒性βシートドメインは、約３０Åの幅を有する逆平行βシートからなり、きわめて強い脂質結合構造を形成する。これらの領域は他のアポリポタンパク質に比べて独特で、別のリポタンパク質との平衡を阻害するが、血漿中に分泌された粒子に結合されたままである。両親媒性βシートの２つのドメインのあいだにおいて、別のアポリポタンパク質に見られる種類の両親媒性へリックスドメインがある。このようなドメインは、Ｃ末端の近傍にも存在する。ＬＤＬの全体構成は解明されたが、完全には解決されていない。タンパク質は細長い構造を有し、ＬＤＬ粒子全体を包囲する。Ｃ末端は前構造上に折りたたまれ、アミノ酸３５００にて交差する。ここで、アルギニン（残基３５００）はトリプトファン（残基４３９６）に結合し、Ｃ末端が、アミノ酸３３５９と３３６９とのあいだでのＬＤＬ受容体の結合部位を邪魔しないようにしている。実際に、これらのアミノ酸に関するいくつかの既知の突然変異（最もよく知られているのはＡｒｇ３５００のものである）はこの相互作用を壊し、ＬＤＬ受容体との結合を減少させる。タンパク質のＣ末端部はそのＮ末端と相互作用すると考えられる（Segrest, Jonesら, 2001; OlofssonおよびBoren, 2005）。
【００２７】
当初は血漿中のリポタンパク質の成分として同定されたアポＥは２９９のアミノ酸残基を含有し、３４，０００Ｄａの相対分子量を有する。他の可溶性アポリポタンパク質と同様に、アポＥは、リポタンパク質結合状態と無脂質状態とのあいだを可逆的に切替え可能にする両親媒性のα−へリックス脂質結合ドメインを含有する。無脂質状態においてアポＥは２つのドメインを含有し、それぞれは分子の各々の端部にある。２つのドメインは独立して折りたたまれ、各々は異なる主要機能に関与する。ＬＤＬ受容体結合領域は、残基１３６〜１５０にある。しかしながら、完全な受容体結合活性は、２つのドメインを接続する「ヒンジ領域」にある１７２位にアルギニンをも必要とする。無脂質アポＥは、ＬＤＬ受容体に高親和性で結合しない。アポＥの主要なリポタンパク質結合要素は、Ｃ末端ドメインの残基２４４〜２７２にある。
【００２８】
アポＥは多形であり、その種々のアイソフォームは別々の機能的および構造的特性を示す。３つの一般的な対立アイソフォームである、アポＥ２、アポＥ３およびアポＥ４は、１１２位および１５８位において異なる。最も一般的なアイソフォームであるアポＥ３は、それぞれにてシステインおよびアルギニンを含有するのに対し、アポＥ２はこれらの位置にて２つのシステインを有し、アポＥ４は２つのアルギニンを有する。アポＥ３およびアポＥ４は同様の高い親和性でＬＤＬ受容体に結合するのに対して、アポＥ２の結合は５０〜１００倍弱い。この結果、ホモ接合アポＥ２は、コレステロールおよびトリグリセリドの血漿レベルの増加に特徴付けられる脂質異常であるIII型高リポタンパク質血症と、早発性循環器疾患とに関連する。
【００２９】
ヒトにおけるアポＥの多形性に帰する最も顕著な病理学的作用は、アポＥ４とアルツハイマー病を含む神経変性疾患との関連である。ドメイン相互作用とアポＥ２およびアポＥ３に比して減少した安定性というアポＥ４の２つの主要特性は、アポＥ４と疾病との関連性の根拠をなす。「ドメイン相互作用」の概念は、なぜアポＥ３とアポＥ４とがリポタンパク質結合優先性において相異するのかを説明するために導入された。アポＥ４は、大きな低比重のリポタンパク質、すなわちＶＬＤＬｓおよびＬＤＬｓに優先的に結合するのに対し、アポＥ３およびアポＥ２は、ＨＤＬｓなどのより小さいコレステロールに富む高比重のリポタンパク質を優先する。アポＥ４の結合優先性は、１１２位での（正荷電の）アルギニンの存在により支配される。アポＥ３とアポＥ４とのＮ末端ドメインのＸ線構造の比較は、１１２位での残基がＡｒｇ６１の側鎖の構造に影響することを示す。アポＥ４において、Ａｒｇ１１２は、アポＥ４のＡｒｇ６１がそのＣ末端の酸性残基と相互作用することを可能にする。
【００３０】
無脂質アポＥのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの距離は、ドメイン間相互作用のために異なる。ドメイン相互作用は、アポＥ４を発現するためにニューロンに応力をかけて誘引する際の神経毒性フラグメントの生成に関与するとされている。ニューロンを殺すことに加えて、これらのフラグメントは、アミロイドプラークとともに、アルツハイマー病の病理的特徴とされる神経原線維変化に類似した細胞内堆積物を生じる。部分的に折りたたまれた構造またはモルテングロビュール状構造は、タンパク質に、リガンド結合に付随する実質的な構造変化に対する柔軟性および適合性を付与する。特に、３つのアポＥアイソフォームにおけるＮ末端ドメインの安定性の変動は、リポタンパク質結合優先度およびインビボの他の生物学的機能の相異に寄与し得る。アポＥ３に比べてのアポＥ４の低安定性は、脳内での重要な病理学的役割を有し得る。
【００３１】
リポタンパク質結合アポＥのＬＤＬ受容体結合領域近傍の構造における異質性は、特異的エピトープに対するモノクローナル抗体で検出されている。リン脂質との結合により、アポＥは相当な構造的変化をする。最近の研究により、リン脂質結合アポＥは、α−へリックスヘアピン様構造に折りたたまれることが示唆されている。α−へリックスヘアピン構造は、Ａｒｇ１７２を含むＬＤＬ受容体結合モチーフのすべての既知の要素を構造的頂点に置き、これによってなぜ脂質結合アポＥのみが高親和性でＬＤＬ受容体に結合するのかが説明され得る。しかしながら、アポＥ含有リポタンパク質粒子中のリン脂質二重層の存在は、実験的に証明されていない（Hatters, Peters-Libeuら, 2006）。
【００３２】
ＬＤＬＲは、１９７４年に最初に発見された。これ以後、その構造、機能、突然変異体および生理的ならびに薬理学的モジュレーションについて広く研究されている。細胞表面のＬＤＬＲは、循環からアポＢおよびアポＥ含有リポタンパク質を結合して内在化する。アポＥ３およびアポＥ４リポタンパク質に対するＬＤＬＲの親和性（ＫＤ＝０．１２ｎＭ）は、アポＢリポタンパク質のそれよりも２５〜５０倍高い。しかしながら、アポＥ含有キロミクロンレムナントは、肝細胞へのさらなるエントリーモードを有する。エンドサイトーシス後、ＬＤＬＲはそのリガンドから分離してリサイクリングのために細胞表面に戻るが、ＬＤＬはさらに代謝される（Kong, Liuら, 2006）。
【００３３】
ヒトＬＤＬＲは、ヒトおよび他の動物種における高度に保存された構造を有する膜貫通糖タンパク質である。この成熟形態は１６０ｋＤａの分子量を有する８３６のアミノ酸残基を含有し、次の５つの機能的ドメインを有する：リガンド結合ドメイン、上皮成長因子（ＥＧＦ）前駆体相同体ドメイン、Ｏ結合型多糖類ドメイン、膜貫通ドメインおよび短い細胞質ドメイン。ＬＤＬＲのオリゴ糖含有量の分析は、１つのＡｓｎ結合型オリゴ糖と６〜９個のＯ結合型ユニットとを明らかにした（Cummings, Kornfeldら, 1983）。単一のＡｓｎ結合オリゴ糖の位置は、ヒトＬＤＬＲ前駆体のアミノ酸残基６５７である（Zhang, Liら, 2003）。
【００３４】
ＬＤＬＲのリガンド結合ドメインは、いわゆるＬＤＬＲクラスＡリピート（ＬＤＬ−Ａ、相補型リピートとしても知られる）である、〜４０個のアミノ酸の７つのシステイン豊富な不完全リピート（Ｒ１〜Ｒ７）からなる。核磁気共鳴構造ならびに結晶構造は、３つのジスルフィド結合により安定化された２ループ構造を明らかにした。特徴的に、ジスルフィド結合の形成は、システイン残基ＩおよびIII、IIおよびＶ、IVおよびVI（ローマ数字はリピートにおけるシステイン残基の相対位置を示す）のあいだで生じる。さらに、酸性アミノ酸の保存配列（CDXXXDCXDXSDE；酸性残基は太字体で示され、Ｘは任意のアミノ酸を示す）は、各々のＬＤＬ−ＡリピートのＣ末端部に存在する。結晶分析は多くの酸性残基がカルシウムイオンの配位錯体化に関与していることを示し、ＬＤＬ−Ａリピートの正確な折りたたみとジスルフィド結合とのためのカルシウムの必要条件、およびリポタンパク質のＬＤＬＲへの結合のためのカルシウムの必要条件を明らかにした。ＬＤＬとＶＬＤＬとの結合のための構造的要件は異なる。ＬＤＬはアポＢ１００を介してその受容体と結合し、ＶＬＤＬはアポＥを介する。ＬＤＬの結合はＲ２〜Ｒ７の有無によるが、Ｒ５のみがＶＬＤＬとの相互作用に必須であると考えられる。Ｒ５の重要性は、このリピートに局在化された多数のＦＨの突然変異により強調される。ＦＨの突然変異の少数のみがＲ１に局在化され、これはいずれのリガンドをＬＤＬＲに結合するためにも重要でない（GentおよびBraakman, 2004）。
【００３５】
極低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体（ＶＬＤＬＲ）は、きわめてＬＤＬＲに類似している。主要な相違点は、Ｎ末端に存在するリガンド結合ドメインにおける１つの余分な相補型リピートの存在である。ＬＤＬＲと比較して、ＶＬＤＬＲのほとんどは、たとえば心臓、筋肉および脂肪組織などの肝外組織にて発現する。ＶＬＤＬＲは、トリグリセリド豊富なアポＥ含有リポタンパク質の取り込み機能を果たす（Hussain, Stricklandら, 1999）。
【００３６】
ヒトアポＥ受容体２、つまりＬＲ７／８Ｂは、リンカーにより隔てられた５Ｃ２にグループ化された７つのリガンド結合リピートを含有し、これはＶＬＤＬＲ（５Ｃ３）に見られるものと類似し、ＬＤＬＲ（４Ｃ３）に見られるものとは異なる。アポＥ受容体２は、ＬＤＬＲに比べてＶＬＤＬＲに近似しているため、ＬＤＬＲに見られる限定的特異性ではなく、ＶＬＤＬＲに見られるリガンド結合能力に類似した広範なリガンド結合能力を有することが期待される（Hussain, Stricklandら, 1999）。
【００３７】
メガリン（ｇｐ３３０またはＬＲＰ−２としても知られる）は、３６のシステイン豊富なリガンド結合ドメイン、１６のＥＧＦ前駆体ホモログドメインおよび細胞外ドメインに４０ＹＷＭＤリピートを含有する４６６０のアミノ酸の単一ポリペプチドである。分子中に、７、８、１０および１１の相補型リピートからなるリガンド結合ドメインの４つのクラスターがあり、いくつかのグループのリガンドを認識する（Hussain, Stricklandら, 1999）。ＬＤＬＲファミリーの他のメンバーは、ＬＤＬＲ関連タンパク質、ＬＲ１１（ＳＯＲＬＡ−１とも称される）、ＬＲＰ３およびＬＲＰ６を含む。これらの正確なリガンド結合特異性は、部分的に知られているのみである（Hussain, Stricklandら, 1999）。
【００３８】
ＬＤＬＲファミリーのメンバーは、いくつかの構造的に異なるリガンドを認識する。ＬＤＬＲおよびアポＥ受容体２は、リポタンパク質とリポタンパク質リパーゼを結合する。ＬＤＬＲは、アポＥ４＞アポＥ３＞＞＞アポＥ２の順序の結合親和性でアポＥの３つのアイソフォームを区別可能である。アポＥ４リポタンパク質とアポＥ３リポタンパク質との解離定数（ＫＤ）は０．１２ｎＭであるが、アポＥ４はＬＤＬＲに対してきわめて低い親和性を有する。しかしながら、ファミリーの他の受容体は区別せず、これらのすべてはアポＥのすべてのアイソフォームを均等に結合すると考えられる。それにもかかわらず、ホモ接合性アポＥ２である個人は（人口の約１％（Mahley, 1998））は、ＬＤＬ受容体を介するＶＬＤＬの非効率的な取り込みのために〜２倍の高さのＶＬＤＬトリグリセリドを示す（Cardona, Tinahonesら, 2003）。ＬＤＬＲファミリーの他のメンバーはより特異的でなく、リポタンパク質ならびに種々のプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤を結合する。重複するリガンドの特異性に加えて、各々の受容体は独自のリガンドを有すると考えられる。アポＢ１００は、ＬＤＬＲおよびメガリンと結合することが示されている。ＲＡＰ、アポＥ−ＶＬＤＬ、リポタンパク質リパーゼ、アプロチニンおよびラクトフェリンのメガリンへの結合を阻害したモノクローナル抗体は、ドメイン２内にて相補型リピート４および５を認識し（アミノ酸１１１１〜１２１０）、これがこれら４つのリガンドの共通する結合部位であることを示している。また、ＬＤＬＲに類似する７つの相補型リピートとＥＧＦ前駆体領域との構成はメガリンにも存在する。他の受容体は、これらのリガンド結合ドメインに８つの相補型リピートを含有する。８つのリピートの存在は、大きなＬＤＬがこれらの受容体に結合することを阻止し得る。小胞体のルーメンに存在するシャペロンである受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）は、ＬＤＬＲファミリーのすべてのメンバーに結合する。これは、適性な折りたたみと、リガンドの受容体への早期結合の阻止を補助する。ＲＡＰの顕著な特性は、すべてのリガンドの異なる受容体への結合の普遍的アンタゴニストとして作用することである（Hussain, Stricklandら, 1999）。
【００３９】
肝臓は、（ＶＬＤＬを介する）循環ＬＤＬの供給源であるのみならず、ＬＤＬ異化作用の主要部位でもある。肝臓によるＬＤＬの取り込みは、主として、低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）を伴う受容体依存性メカニズムによって媒介され、全身の受容体依存性ＬＤＬの取り込みの完全な８０〜９０％は肝臓にて生じる（Spady, 1992）。また、大きいＨＤＬ含有アポＥ粒子はコレステロールを直接肝臓に輸送可能であり、これは、粒子がＬＤＬＲに対して高い親和性を示すアポＥを含有するためである（Hatters, Peters-Libeuら, 2006）。西欧式の食事では、ヒトは１ｇ／日のコレステロールを合成し、さらに０．４ｇを摂取する（Grundy, 1983）。定常状態において、この量のコレステロールが除去されなければならない。コレステロールの輸送および代謝に関与する種々のリポタンパク質、受容体および酵素は、この「過剰な」コレステロールの値に対処するように調整される。これらのリポタンパク質、受容体または酵素の値または活性における干渉は、血清コレステロール値の変化につながる。
【００４０】
ＬＤＬＲの発現レベルは、細胞質コレステロールにより転写レベルにおいて間接的に調節される。ＬＤＬＲプロモーターは、翻訳開始コドンの上流の２００塩基対からなる。プロモーターは、２つのＳｐ１結合配列に隣接したステロール調節エレメント１（ＳＲＥ−１）を含有する。ＬＤＬＲの基礎発現は、２つのＳｐ１エレメントにより媒介される。ＬＤＬＲの発現は、核ステロール調節エレメント結合タンパク質（ｎＳＲＥＢＰｓ）のＬＤＬＲプロモーターのＳＲＥ−１への結合によって相乗的に増加可能である。ｎＳＲＥＢＰｓは、塩基性へリックス−ループ−へリックス−ロイシンジッパー（ｂＨＬＨ−Ｚｉｐ）転写因子の大きなファミリーに属する。ｎＳＲＥＢＰファミリーの３つのメンバーである、ｎＳＲＥＢＰ−１ａ、−１ｃおよび−２は同定されている。これらはＳＲＥＢＰと称される不活性前駆体としてＥＲにおいて合成される。これらのＮＨ２−末端ドメインはサイトゾル内に突出する。これは、ｂＨＬＨ−Ｚｉｐと、機能するために転写コアクチベータに結合されなければならない酸性ドメインとを含む。ＳＲＥＢＰの中心部は、ＳＲＥＢＰをＥＲおよび核エンベロープに固定する２つの膜全域ドメインからなる。また、ＣＯＯＨ末端部はサイトゾルまで延伸し、ＳＲＥＢＰの活性ｎＳＲＥＢＰへの変化のための調節ドメインとして機能する。
【００４１】
３つのＥＲ膜タンパク質は、ＳＲＥＢＰ処理の調節に関与する。細胞コレステロールが豊富な場合、これはＳＲＥＢＰ開裂活性タンパク質（ＳＣＡＰ）と称される膜貫通型エスコートタンパク質に結合し、そしてこれは、インスリン誘導遺伝子−１および−２（Ｉｎｓｉｇ−１およびＩｎｓｉｇ−２）と称される２つの他のタンパク質のうちの１つとともにＳＲＥＢＰ／ＳＣＡＰ／Ｉｎｓｉｇ三重複合体を形成する。この複合体はＥＲ膜に捕捉されるため、ＳＲＥＢＰの処理を阻止する。
【００４２】
細胞質コレステロールの減少は三重複合体を不安定にし、これは解離してＳＣＡＰ−ＳＲＥＢＰヘテロ二量体を生じる。これらのヘテロ二量体はゴルジ装置に輸送され、ここにてＳＲＥＢＰｓはタンパク質分解的に開裂されて活性ｎＳＲＥＢＰｓを生じる。これらのｎＳＲＥＢＰｓおよび特にｎＳＲＥＢＰ−２は核に転移し、ＬＤＬＲプロモーターならびに脂質代謝に関する他の約３０の遺伝子を結合および活性化する。ｎＳＲＥＢＰｓは安定していない。これらはポリユビキチン化され、３時間の推定半減期でプロテアソームによって急速に分解される。
【００４３】
したがって、コレステロールまたはその誘導体が細胞内に豊富にある場合、ＳＲＥＢＰ経路は抑制され、ＬＤＬＲ遺伝子の転写はきわめて低い水準に保持される。対照的に、コレステロールの欠乏はＬＤＬＲの発現を促進する（Kong, Liuら, 2006）。これらのメカニズムは、肝細胞を含むすべての細胞種において生じ、血清コレステロール（ＬＤＬ−ｃ）が豊富にある場合の肝臓のＬＤＬＲ発現の望ましくない減少につながる。
【００４４】
肝臓は、コレステロールの異化作用および腸に分泌される胆汁塩へのコレステロールの変換が可能である。しかしながら、ほとんどの胆汁塩は効率的に再吸収される。肝臓は、コレステロール−７α−ヒドロキシラーゼを発現し、これは、コレステロールのステロイド核にヒドロキシル基が２または３つの位置に導入され、コレステロールの側鎖が短縮およびカルボキシル化される複合酵素カスケードの最初の律速段階を触媒する。最終生成物は胆汁塩と称される分子である。ヒトの肝臓において生成される２つの胆汁塩のうちの１つはコール酸塩と称される。きわめて水に不溶性であるコレステロールとは異なり、胆汁塩は水溶性の洗剤様分子である。
【００４５】
肝細胞は偏向した肝臓の細胞であり、一方にて血液と他方にて胆汁とのあいだの境界を生成する。類洞膜は血液に面し、管状膜は胆汁に面する。管状膜には３つの主要な輸送体がある。ＡＢＣＢ１１は、胆汁塩を胆汁に輸送するＡＴＰ依存性輸送に関与する。胆汁に含まれると、胆汁塩は反転して、管状膜および輸送体ＡＢＣＢ４およびＡＢＣＧ５／Ｇ８と相互作用する。この複合的相互作用は、胆汁ミセルの生成につながる。胆汁脂質の１日の分泌量は、コレステロールが最大２ｇ／日であり、リン脂質が１１ｇ／日であり、胆汁塩が２４ｇ／日の範囲である。しかしながら、胆汁塩は一度胆道系および腸内でその機能を果たすとほとんどすべてが遠位回腸にて再吸収され、門脈循環を通って肝臓に戻るため、平均的個人においては０．４ｇ／日のみの割合で合成される。毎日５％未満の胆汁塩が排出物中に失われ、これは約０．４ｇ／日となる。コレステロールが肝臓での胆汁塩合成の基質であることを考慮すると、胆汁塩の０．４ｇ／日の喪失は同一量のコレステロールの喪失となる（Carey MC, Duane WC. Enterohepatic circulation. In: Arias IM, Boyer JL, Faustoet Nら, eds. The Liver: Biology and Pathobiology. New York: Raven Press, 1994: 719-767）。コレステロールは、最大２ｇ／日の割合で胆汁に分泌される。平均的なアメリカ人の食事は、約０．４ｇ／日のコレステロールを含む。したがって、腸内での胆汁由来のコレステロールの量は、食事によって摂取された量の最大５倍である。平均的個人は、毎日腸を通過するコレステロールの５０％を吸収する。このことは、５０％は排出物に喪失され、１．２ｇ／日の量となる。合計して、通常は１．６ｇのコレステロールが排出物中に除去され、そのうちの１．２ｇが肝臓から発生する。
【００４６】
コレスチポール（商標）などの胆汁酸分離剤は、多くの臨床試験により有効なＬＤＬｃ降下薬である。これらは、用量依存的にＬＤＬｃを１０〜３０％減少するが、頻繁な副作用により多くの場合においてその使用が制限される。コレセベラムは、新しく、より有効な胆汁酸分離剤であり、６２５ｍｇの錠剤で入手可能である。成人の推奨投与量は１日３．８ｇ（１日２回３錠を食事とともに）であり、より有効でない胆汁酸分離剤、コレスチラミンおよびコレスチポール（商標）よりも優れた耐容性がある。これらの優れた安全的特徴により、新たなレジンは、特に子供または若い女性への単剤療法におけるスタチンの代替物として残存する。
【００４７】
エゼチミブは、食事および胆汁源からのコレステロールの腸吸収を、腸壁にわたってコレステロールの輸送を妨げることにより阻害する新しい脂質降下薬である。単剤治療として使用して、エゼチミブはＬＤＬｃを平均して１７．３％減少する。現行のスタチン治療への１日１０ｍｇのエゼチミブの追加は、プラセボに比べてさらにＬＤＬｃ値を減少する（−１４〜−２５％）。この投薬法は、異なるスタチンの広範な用量範囲にわたって一般的に耐容性が良好であり、またスタチンの大量投与を回避し、または高リスク患者においてＬＤＬｃの目標を達成する有効なスタチンとともに使用する際に、ＬＤＬｃにおいて６０％を超える減少を可能にすることによりＬＤＬｃの減少への新たな手法を提供する（Civeira, 2004）。
【００４８】
家族性高コレステロール血症（ＦＨ）は、低比重リポタンパク質（ＬＤＬｃ）のきわめて高い血漿濃度、腱黄色腫および早発性冠状動脈性心臓病（ＣＨＤ）の危険性の増大により特徴付けられるリポタンパク質代謝の常染色体の相互優性遺伝性疾患である。通常、臨床的に同定されるＦＨは、ＬＤＬ受容体遺伝子（ＬＤＬＲ）の突然変異により生じる。ＦＨのヘテロ接合体はヒトにおける最も一般的な常染色体性優性遺伝病の一つであり、ホモ接合体は稀ではあるがより重症である。ほとんどの国において、ヘテロ接合体の頻度は、５００人に約１人である。しかしながら、フランス系カナダ人、南アフリカ系白人、レバノン人およびフィンランド人などの人は創始者効果のためより高い有病率である。世界中で１０，０００，０００人がＦＨを有すると推測されている。ＦＨは、主としてＣＨＤである、早発性（５５歳未満の男性および６５歳未満の女性）循環器疾患の高発生率と、ＦＨをもつ多くの家族に見られる平均寿命の減少とのために、世界的な公衆衛生問題である。治療がされない場合、約８５％の男性と５０％の女性とが６５歳以前に冠状動脈血栓症を生じる。フィンランド東部およびドイツにおいて最大９％の全早発性ＣＨＤがＦＨに関連している（Civeira, 2004）。
【００４９】
現在までにＦＨを生じる８００を超える突然変異が報告されており、これらはタンパク質への表現型効果に基づきいくつかの種類に分類される（Kong, Liuら, 2006）。ＦＨの浸透率はほぼ１００％であり、罹患した親の子の半数が出生時からきわめて上昇した血漿コレステロール値を有し、男性および女性は同等に罹患する。上昇した血漿ＬＤＬ値は、遅いＬＤＬの異化作用と奇異性のリポタンパク質過剰生成とに起因する。未治療のヘテロ接合性ＦＨ（ｈｅＦＨ）対象中のＬＤＬｃは、通常１９０〜４００ｍｇ／ｄｌ（４．９〜１０．３ｍｍｏｌ／ｌ）の範囲内にある。同様に、マウスＬＤＬＲ（−／−）肝細胞は、野生型肝細胞と比較して、３．５倍の高い割合でアポＢ１００を分泌する。さらに、ＬＤＬＲ（−／−）細胞においては、野生型肝細胞の５５％に比べて、新たに合成されたアポＢの２０％未満が分解される。したがって、機能性肝ＬＤＬＲは循環ＬＤＬの減少において重要である（Twisk, Gillian-Danielら, 2000）。National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel（ＮＣＥＰ−ＡＴＰＩＩＩ）ガイドラインの３回目の報告書により、＜１００ｍｇ／ｄｌ（２．６ｍｍｏｌ／ｌ）が最適なＬＤＬｃ濃度と規定されていることを考慮すると、目標達成のためにはｈｅＦＨ患において５０〜７５％のあいだの平均的減少が達成される必要がある。生活様式の改善は常に行わなければならないが、許容されるＬＤＬｃ値になる可能性は低い。＜１００ｍｇ／ｄｌ（２．６ｍｍｏｌ／ｌ）のＬＤＬｃは、依然として、症候性ＣＶＤを有する対象の最適値であり、目標である（Civeira, 2004）。したがって、特にＦＨ患者に対して、血清ＬＤＬｃを減少するためのいくつかの手段の組み合わせが必要である。
【００５０】
現行のｈｅＦＨの治療は次を含む（http://www.emedicine.com/med/TOPIC1072.HTM）：
・飽和脂肪、トランス脂肪およびコレステロールを大幅に制限した食事。望ましい体重に達するべきである。著しい体重の減少はすべての脂質のパラメータ（ＬＤＬｃ、ＨＤＬｃ、トリグリセリド）の改善となるはずである。
【００５１】
・エアロビクスおよびトーン運動は、３０分以上で一週間に４回以上行われる場合に血中脂質値を改善する。
【００５２】
・いずれのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の２倍投与はＬＤＬｃを６〜７％減少するのみであるため、異なるコレステロール降下薬の組み合わせがより有効である。このような組み合わせは、高用量の３つの最も強力なスタチンのうちの１つと、胆汁酸分離剤、エゼチミブまたはナイアシンなどの１つ以上の他のＬＤＬ降下薬を含むべきである。ミオパシーの危険性を減少させるために、最大量の一段階下のスタチンを考慮すべきである。第３の薬剤、あるいは第４の薬剤を追加することも有益である。５０％の機能性ＬＤＬ受容体を有するヘテロ接合性ＦＨ患者は、通常のコレステロール降下薬に対して優れた反応を有するが、治療は依然として困難である。閉経後の女性におけるエストロゲン補充療法もまたＬＤＬｃ値の低下を補助するが、この療法は、利益が時としてリスクを上回ることがあるにもかかわらず、より高齢の女性における副作用のために推奨されない。
【００５３】
・従来の治療によりＬＤＬｃ値を２００ｍｇ／ｄＬ未満に減少できないと確認されたＣＨＤを有する患者はＬＤＬ血漿交換の候補となる。また、ＣＨＤではないが、３００ｍｇ／ｄＬを超えるＬＤＬｃ値を有する患者も本治療法に適する。しかしながら、健康保険の補償は自動的でなく、その判断は、患者の生涯にわたり２週間に１度、各治療において＄３０００に達する費用のため個別的に行われる。
【００５４】
Ｃ型レクチンは、その炭水化物認識ドメインにおいて一次性の構造的ホモロジーを共有するｃａ２＋依存性レクチンの大きなファミリーを示す。多くの細胞内受容体と、多くのプロテオグリカンと、すべての既知のコレクチンおよびセレクチンとを含む、このきわめて大きいファミリーは動物界にわたって見出される。しかしながら、このファミリーのほとんどのメンバーは、高親和性で認識する炭水化物構造の種類において相違する。
【００５５】
動物において同定された最初のレクチンは、肝アシアロ糖タンパク質受容体または肝Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ受容体であった。脱シアル化糖タンパク質は、親糖タンパク質よりも迅速に循環から除去される。さらに、脱シアル化の際に露出された最後から２番目のガラクトース残基はクリアランスのために重要である。循環から除去されたアシアロ糖タンパク質は、肝臓および主としてリソソームにて隔離される。アシアロ糖タンパク質に対する特異的Ｃａ２＋依存性受容体は、肝細胞血漿膜分画にて同定された。肝レクチンは、非還元末端ＧａｌＮＡｃまたはガラクトースのいずれかを含有する糖タンパク質と結合する。
【００５６】
すべてのＣａ２＋依存性レクチンは共通の構造的モチーフを共有する。配列ホモロジーはＣＲＤにおいて記され、このモチーフを有するタンパク質はＣ型レクチンファミリーのメンバーとして分類される。Ｃ型レクチンに対するＣＲＤの発見は、炭水化物リガンドとのＣａ２＋依存性結合をも示す他の関連するタンパク質を特徴付けする道を開いた。現在まで、ヒトにおいてＣ型レクチンＣＲＤを含有する２０を超える異なるタンパク質が同定されており、対応するホモログもまた多くの他の高等動物にて見出されている。高等動物におけるこれらの多くのＣ型レクチンは、その機能または独自の局在性に基づき、サブファミリーに分類される。
【００５７】
肝レクチンは、結合リガンドのエンドサイトーシスを媒介可能にするＣ型レクチンの種類である。エンドサイトーシス経路は、細胞表面でのリガンドのレクチン認識と、被覆小窩を介する内在化と、低いｐＨがリガンドとレクチンとの解離を誘発するエンドソーム区画への複合体の輸送とに関与する。レクチンは細胞表面にリサイクルされ、工程を繰り返す（Essentials of Glycobiology, Varki A.ら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。
【００５８】
哺乳動物において、既知であり充分に研究されたＣ型レクチンの１つに、肝細胞に独自に見出されるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）がある。この高容量の受容体は、末端ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を有するリガンドと結合し、細胞表面へのリサイクルの前に、これらをリソソームに送る。ＡＳＧＰ−Ｒに対する天然のリガンドは、循環中にその末端シアル酸を喪失し、これらのＮ−グリカン上の末端近傍のＧａｌ残基のクラスターを露出させる血清糖タンパク質であると考えられる。その結果、ＡＳＧＰ−Ｒは、主として構造的に異なる糖タンパク質の血清濃度の維持に関与すると考えられる。
【００５９】
より最近、ＡＳＧＰ−Ｒは、そのＮ−グリカンがシアル化ＧａｌＮＡｃにて終結する糖タンパク質のより豊富でないファミリーを迅速にクリアランスするが、Ｎ−グリカンがシアル化Ｇａｌで終結する大部分の糖タンパク質は、肝クッパー細胞に存在するガラクトース粒子受容体による末端シアル酸の除去の後に主として除去されることが見出された。実際に、ＡＳＧＰ−ＲのＧａｌＮＡｃで終結するＮグリカンに対する親和性は、Ｇａｌで終結するものに比べて約５０倍高い。
【００６０】
先行技術は、その末端糖残基がＧａｌではなくＧａｌＮＡｃである組換え糖タンパク質を生成する方法を教示している。したがって、機能性ＵＤＰ−Ｇａｌ輸送体が欠損したＣＨＯ  ｌｅｃ８細胞のβＧａｌＮＡｃ転移酵素（βＧａｌＮＡｃＴ）での安定したトランスフェクションは糖タンパク質の発現となり、糖タンパク質のＮ−グリカンは三本鎖、四本鎖、およびβＧａｌの代わりに最後から２番目のβＧａｌＮＡｃを有するさらに高度の構造である（Kawar, Haslamら, 2005）。このようなＣＨＯ細胞は、最後から２番目のβＧａｌＮＡｃをもつ組換え糖タンパク質の発現のために、通常のＣＨＯ細胞の代わりに使用され得る。
【００６１】
ＡＳＧＰ−Ｒは、１５０，０００〜５００，０００の結合部位／細胞をもち、肝細胞にきわめて豊富にある。肝臓に存在する肝細胞の数は、１匹のマウスにつき約２×１０8であり、ＡＳＧＰ−Ｒ内在化の速度は、１０6細胞毎に０．１ｐｍｏｌ／分である。このような推定のもとに、マウスの肝臓は、ＡＳＧＰ−Ｒによって約１．２ｎｍｏｌ／時間でリガンドを除去可能であり、これは２０，０００Ｄａの分子量である糖タンパク質での２．４μｇ／時間に等しい（Park, Miら, 2005）。ヒト肝臓への推測においては、５ｍｇ／時または１２０ｍｇ／日を超える、ほぼ無限の可能なクリアランス速度が示唆される。分子量が２×１０6であるタンパク質の場合には、これらの値は５ｇ／時または１２０ｇ／日に増加する。
【００６２】
肝臓ＡＳＧＰ−Ｒに基づき血清ＬＤＬを減少するいくつかのアプローチが開発された。１つのアプローチは、末端ＧａｌＮＡｃ残基を含有する糖脂質の合成に基づくものであった。この考えは、長鎖脂肪酸である糖脂質の疎水成分がＬＤＬ粒子に迅速および不可逆的に浸透することにより、粒子の肝臓ＡＳＧＰ−Ｒへの結合と、その後の内在化を可能にするものであった。この糖脂質は急性毒性の兆候を示さないが、ＬＤＬに対する特異性を示さず、実際にＨＤＬおよび任意の細胞膜に結合可能であった。さらに、この全体的な洗剤様の構造は、長期毒性の危険性を上昇させる。それにもかかわらず、この研究は、〜３０％の血清コレステロールの減少が見られ、ＡＳＧＰ−Ｒ手段が実現可能であることを示唆する原理の証明であった（Rensen, van Leeuwenら, 2004; Rensen, Sliedregtら, 2006）。
【００６３】
初期の研究においては、ヒトＬＤＬに対する抗体のＦａｂ断片の使用による、より多くのＬＤＬ特異的アプローチが採用された。乳糖は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムとの還元アミノ化によってこれらのＦａｂ断片に結合され、放射性標識ヒトＬＤＬのクリアランスはラットにおいて実証された（Bernini, Tanenbaumら, 1986）。このアプローチは、これ自体が免疫原性であり得る抗体またはＦａｂ断面の使用により、特に血清ＬＤＬとの結合に必要な多くの量を定期的に投与すると抗イディオタイプの抗体の生成を導くために制限される。
【００６４】
血液またはリンパ液などの細胞外液中に存在する、選択された物質を細胞内に輸送する代替的アプローチが、２００５年２月２２日に発行された米国特許第６，８５８，５７８号明細書に提供されている。米国特許第６，８５８，５７８号明細書の一実施例によると、可溶性ＬＤＬＲおよびトランスフェリンを含むキメラが生成され、ＬＤＬの細胞への取り込みに使用される。このアプローチは実現可能ではあるが、これはＬＤＬを特異的に肝臓に誘導しない。トランスフェリン受容体はほとんどの細胞種と臓器とにおいて発現する。ほとんどの細胞に進入する過剰なコレステロールは元の循環に分泌される。したがって、コレステロールが胆汁酸に代謝されて消化管に分泌され得る肝臓に対して、特異的に過剰のコレステロールを向かわせる必要性が依然として存在する。
【００６５】
米国特許第５，９５８，４０８号明細書（Griffithsら, 1999年9月28日）および第５，９６５，１３１号明細書（Griffithsら, 1999年10月12日）は、診断用薬および治療薬の標的部位への輸送を記載する。これらの発明によると、「直接標的種（direct targeting species）」は、タンパク質に結合された診断用薬または治療薬である。例えば腫瘍特異性抗体などの前記タンパク質は、前記薬剤を標的組織に誘導する。「クリアランス剤」が提供され、これは直接標的種に対する特異的結合相補体である。該クリアランス剤の例は抗イディオタイプの抗体である。本発明の一実施態様において、クリアランス剤は、肝アシアロ糖タンパク質受容体に結合するガラクトースに共役され、これによってクリアランス剤およびクリアランス剤一次標的種複合体が肝細胞によって迅速に認識される。これは、患者に投与された過剰な治療薬または過剰な診断用薬を除去し、これらの薬剤の標的組織への改善された結合特異性を得るということである。
【００６６】
酸化ＬＤＬは、主要なアテローム形成リポタンパク質である。その親ＬＤＬとは異なり、これはＬＤＬＲには結合しないため、肝取り込みによってクリアランスされない。ｏｘＬＤＬを代表的なリガンドとして使用する広範な研究により、集合的に「スカベンジャー受容体ファミリー」と分類される少なくとも１１の異なる受容体が開示されている。終末糖化産物（ＡＧＥ）とその受容体システムとは、ＡＧＥタンパク質もまた同一のスカベンジャー受容体による活性リガンドとして認識された最近の研究成果までは独立して研究されてきた。これらの受容体は、Ａ型スカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）、ＣＤ３６およびＳＲ−ＢＩなどのＢ型スカベンジャー受容体、Ｄ型スカベンジャー受容体（ＯＬＲ１／ＬＯＸ１）およびＦＥＥＬ−１／ＦＥＥＬ−２を含むいくつかのサブファミリーに属する。マクロファージまたはマクロファージ由来細胞によるｏｘＬＤＬおよびＡＧＥタンパク質のエンドサイトーシス取り込みは、ＳＲ−ＡおよびＣＤ３６によって主として媒介される（Horiuchi, Sakamotoら, 2003）。ＳＲ−Ａは、マクロファージに発現される膜貫通糖タンパク質である。この前駆体は、そのうちのＮ末端５０が細胞質であり、２６の膜貫通残基と３７５の残基が細胞外ドメインに続く４５１のアミノ酸残基からなる。細胞外ドメインは７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含む。
【００６７】
ＯＬＲ−１／ＬＯＸ−１は、血漿ｏｘＬＤＬおよびＡＧＥタンパク質の肝クリアランスに関与するＣ型レクチン受容体である。これは、４０ｋＤａの単分子量の一回膜貫通型糖タンパク質であるが、Ｃｙｓ１４０でのジスルフィド結合によって８０ｋＤａの二量体として存在する（Xie, Matsunagaら, 2004）。ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１前駆体は２７３のアミノ酸残基からなり、そのうち２１６のＣ末端残基は細胞外領域にあってリガンド結合ドメインを含有する。これは血管内皮と、肺、脊椎および骨髄などの血液豊富な器官とに発現する（Sawamura, Kumeら, 1997）。細胞外残基７３および１３９は、潜在的Ｎ−グリコシル化部位である（Shi, Niimiら, 2001）。これは、血管内皮細胞およびマクロファージによるｏｘＬＤＬの認識、内在化および分解を媒介する。
【００６８】
可溶型のＯＬＲ１／ＬＯＸ−１は大動脈内皮細胞の培地にて同定された。これは、Ａｒｇ８６またはＬｙｓ８９のいずれかを通る開裂によって膜結合性受容体のタンパク質分解により生じた（Murase, Kumeら, 2000）。予備的研究は、可溶性ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１とｏｘＬＤＬとの結合を示していない（Murase, Kumeら, 2000）。しかしながら、これは、グリコシル化が膜結合ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１へのリガンド結合に必須であることが実証されたため、残基７３での必須Ｎ−グリカンの損失によるものであった可能性がある（Kataoka, Kumeら, 2000）。しかしながら、より最近には、ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１のリガンド結合ドメインに対応する可溶性受容体はｏｘＬＤＬの内皮細胞への取り込みを阻害した（Smirnova, Sawamuraら, 2004）。
【００６９】
可溶性受容体または結合タンパク質は、種々のサイトカインの活性を中和および阻害する手段として提案された。しかしながら、その大きい粒径のために、得られたサイトカイン可溶性受容体複合体は、個々の成分に比べて循環においてより長い半減期を有する。さらに、複合体の生成は可逆性であるため、サイトカインの持続的供給源となり得る。したがって、可溶性受容体とそのリガンドとのあいだに生じた複合体の迅速なクリアランスのための手段を提供する必要性がある。
【発明の概要】
【００７０】
一側面において、本発明は、末端Ｇａｌ、ＧＬｃＮＡｃまたはＧＡｌＮＡｃをもつように修飾された、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの可溶性受容体、可溶性ＬＤＬ受容体または関連ホモログ、可溶性スカベンジャー受容体、可溶性ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１および可溶性ＦＬｋ−１などの、サイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質のグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質に関する。
【００７１】
グリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質の例としては、アシアロ可溶性ＴＮＦＲ（ａｓ−ｓＴＮＦＲ）、アシアロ、アガラクト可溶性ＴＮＦＲ（ａｓ−ａｇ−ｓＴＮＦＲ）、ラクトサミン可溶性ＴＮＦＲ（ｌａｃ−ｓＴＮＦＲ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン可溶性ＴＮＦＲ（ｓＴＮＦＲ−Ｇｎ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン可溶性ＬＤＬＲ（ｓＬＤＬＲ−Ｇｎ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン可溶性ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１（ｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１−Ｇｎ）およびラクトサミン可溶性ＦＬｋ−１（ｌａｃ−ｓＦＬＫ−１）を含むが、これらに限定されない。
【００７２】
別の側面において、本発明は、可溶性受容体または結合タンパク質に結合可能な循環サイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質のクリアランスを促進するための医薬の製造における本発明のグリカン修飾可能性受容体または結合タンパク質の使用に関する。
【００７３】
本発明の一実施態様において、リポタンパク質または酸化リポタンパク質は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化ＬＤＬまたはレムナントリポタンパク質であり得る。
【００７４】
本発明のさらなる実施態様において、サイトカインまたは成長因子は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４／ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、ＩＬ−２９、アクチビン、アポ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＴＮＦＳＦ９、ＢＭＰ−２、ＣＤ２７Ｌ、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−７、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＮＴＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＡＳＬ、ＦＧＦ、ＣＳＦ、ＦＬＴ３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＮＦ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＨ、ＨＧＦ、ＩＧＦ  Ｉ＆ＩＩ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシン、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＳＰ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＯＸ−４０Ｌ、ＰＤＧＦ、プロラクチン、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＰＯ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＳＬＰおよびＴＷＥＡＫであり得る。
【００７５】
別の側面において、本発明は、その病因または経過がサイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質の値および／または活性に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための医薬の製造における、本発明のグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質の使用に関する。
【００７６】
本発明の一実施態様において、疾患、障害または症状状態の病因または経過が、循環中のＬＤＬ、ＶＬＤＬ、酸化ＬＤＬおよびレムナントリポタンパク質などの過剰なリポタンパク質または酸化リポタンパク質に関連する。
【００７７】
本発明のさらなる実施態様において、障害は高コレステロール血症である。
【００７８】
本発明のさらに別の実施態様において、疾患、障害または症状の病因または経過が、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４／ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、ＩＬ−２９、アクチビン、アポ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＴＮＦＳＦ９、ＢＭＰ−２、ＣＤ２７Ｌ、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−７、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＮＴＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＡＳＬ、ＦＧＦ、ＣＳＦ、ＦＬＴ３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＮＦ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＨ、ＨＧＦ、ＩＧＦ  Ｉ＆ＩＩ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシン、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＳＰ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＯＸ−４０Ｌ、ＰＤＧＦ、プロアクチン、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＰＯ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＳＬＰおよびＴＷＥＡＫから選択されたサイトカインまたは成長因子の値または活性に関連する。
【００７９】
本発明の別のさらなる実施態様において、疾患、障害または症状の病因または経過が過剰な成長因子により悪化されるか、または疾患、障害または症状の経過が成長因子の値を減少させることにより改善される。
【００８０】
本発明の別のさらなる実施態様において、疾病が癌である。
【００８１】
本発明のさらなる側面は、病因または経過がＴＮＦの値または活性に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための医薬の製造における、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦ）の使用に関する。
【００８２】
病因または経過がＴＮＦの値または活性に関連する疾患または障害あるいは症状の例として、関節リウマチ、クローン病および乾癬などの炎症性疾患や自己免疫疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
本発明のさらなる実施態様において、ｓＴＮＦＲが、ａｓ−ｓＴＮＦＲ、ａｓ−ａｇ−ｓＴＮＦＲ、ｌａｃ−ｓＴＮＦＲおよび／またはｓＴＮＦＲ−Ｇｎである。
【００８４】
本発明のさらなる実施態様において、ｓＴＮＦＲがｓＴＮＦＲｐ５５である。
【００８５】
また、本発明の別の側面は、高コレステロール血症の治療のための医薬の製造における、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＬＤＬ（ｓＬＤＬＲ）受容体またはその関連ホモログの使用に関する。
【００８６】
本発明の一実施態様において、医薬は家族性高コレステロール血症の治療のためのものである。
【００８７】
本発明のさらなる実施態様において、可溶性受容体がｓＬＤＬＲ−Ｇｎである。
【００８８】
本発明のさらなる側面は、個体におけるアテローム性動脈硬化症を治療または予防するための医薬の製造における、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１の使用に関する。
【００８９】
本発明の一実施態様において、個体が、収縮性アテローム性動脈硬化症のリスクが高い個体である。
【００９０】
本発明の別の実施態様において、可溶性受容体が、ｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１−Ｇｎである。
【００９１】
本発明のさらなる特徴は、原発性癌または転移の治療のための医薬の製造における、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＦＬｋ−１の使用に関する。
【００９２】
本発明の一実施態様において、可溶性受容体が、ラクトサミン可溶性ＦＬｋ−１（ｌａｃ−ｓＦＬＫ−１）である。
【００９３】
本発明の１つの目的は、循環サイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質のクリアランスを促進するための本発明のグリカン修飾可溶性受容体と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を提供することである。
【００９４】
本発明は、循環サイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質のクリアランスを促進するための、薬学的に許容され得る担体と、可溶性アシアロＴＮＦＲ（ａｓ−ｓＴＮＦＲ）、アシアロ、アガラクト可溶性ＴＮＦＲ（ａｓ−ａｇ−ｓＴＮＦＲ）、ラクトサミン可溶性ＴＮＦＲ（ｌａｃ−ｓＴＮＦＲ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン可溶性ＴＮＦＲ（ｓＴＮＦＲ−Ｇｎ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン可溶性ＬＤＬＲ（ｓＬＤＬＲ−Ｇｎ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン可溶性ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１（ｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１−Ｇｎ）およびラクトサミン可溶性ＦＬｋ−１（ｌａｃ−ｓＦＬＫ−１）から選択されるグリカン修飾可溶性受容体とを含む医薬組成物を提供する。
【００９５】
本発明の別の目的は、本発明のグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質の治療有効量を必要な対象に投与することを含む、循環サイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質のクリアランスを促進する方法を提供することである。
【００９６】
本発明のさらなる目的は、本発明のグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質の治療有効量を必要な対象に投与することを含む、病因または経過がサイトカイン、成長因子、リポタンパク質または酸化リポタンパク質の値および／または活性に関連する疾患、障害または症状を治療または予防する方法を提供することである。
【００９７】
また、本発明は、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦＲ）の治療有効量を必要な対象に投与することを含む、病因または経過がＴＮＦの値または活性に関連する疾患、障害または症状を治療または予防する方法を提供する。
【００９８】
さらに、本発明は、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＬＤＬ受容体（ｓＬＤＬＲ）またはその関連ホモログの治療有効量を必要な対象に投与することを含む、高コレステロール血症を治療または予防する方法を提供する。
【００９９】
さらに、本発明は、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＯＬＲ／ＬＯＸ−１の治療有効量を必要な対象に投与することを含む、アテローム性動脈硬化症を治療または予防する方法を提供する。
【０１００】
さらに、本発明は、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性ＦＬｋ−１の治療有効量を必要な対象に投与することを含む、原発性癌または転移を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】ＰＮＧａｓｅ（Ｎ−グリコシダーゼＦとしても知られる。これは、Ｎ型糖タンパク質由来の高マンノースでハイブリッドの複合オリゴ糖の最内側のＧｌｃＮＡｃとアスパラギン残基とのあいだで開裂するアミダーゼである）での処理前後のＣＨＯ細胞にて発現されたｓＬＤＬＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。試料は勾配ゲルにて実施され、クマシーブルーで染色された。
【図２】ＬＤＬがある場合（実線）または無い場合（破線）におけるＳｕｐｅｒｏｓｅ６カラムにてｓＬＤＬＲのサイズ排除クロマトグラフィーにより得られた画分のｓＬＤＬＲのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０２】
一側面において、本発明は、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質と、該可溶性受容体または結合タンパク質と結合可能な循環不要成分の迅速なクリアランスを促進するためのその使用に関する。
【０１０３】
可溶性受容体および結合タンパク質という用語は、種々のサイトカイン、成長因子、ポリペプチドホルモンおよび他の循環エフェクタータンパク質に高い親和性と特異性で結合する循環および人工タンパク質に関する。本発明による結合タンパク質という用語は、抗体およびその断片を除外する。可溶性受容体は、対応する細胞表面受容体の細胞外のリガンド結合ドメインを含む。このような可溶性受容体は、たとえば、可溶性受容体をコードするｍＲＮＡを通じて、あるいは細胞表面受容体のリガンド結合細胞外ドメインの酵素切断により生じ得る。また、本発明は、分泌されたリガンドを隔離する機能の「デコイ受容体」と称される多数の関連受容体に関する。このようなデコイ受容体の例は、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＤｃＲ３およびオステオプロテゲリンである（ＯＰＧ）である。結合タンパク質の例としては、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）などの細胞表面受容体に対応しないサイトカイン結合タンパク質を含むが、これに限定されない。
【０１０４】
循環システム（科学的に特に循環器系として知られる）は、細胞へまたは細胞から物質を移動する器官系であり、またこれは、体温およびｐＨ（ホメオスタシスの一部）を安定化することを補助し得る（ウィキペディア）。循環系の主要な要素は、心臓、血液および血管である。
【０１０５】
可溶型のサイトカイン受容体および結合タンパク質がサイトカイン活性の内生調節に関与するという発見は、免疫療法薬としての潜在的適用において相当な関心を促した。このため、可溶性サイトカイン受容体は、特異性、低免疫原性および高親和性を含む多くの利点を有する。多くの可溶性サイトカイン受容体がそのリガンドの結合および生物活性を阻害するという能力は、これをきわめて特異的なサイトカインアンタゴニストにする。通常、可溶性サイトカイン受容体に基づくほとんどの物質は安全で、良好な耐容性があり、ほとんどの患者においてわずかな副作用を示すのみである。可溶性サイトカイン受容体は、広範なヒトの疾患においての適用に対して多大な可能性を有する新世代の治療薬を構成する（IdrissおよびNaismith, 2000）。
【０１０６】
炎症性サイトカインの可溶性受容体または結合タンパク質は、このような炎症性サイトカインの作用を中和および阻害するように提案されたものである。一般的に、このような可溶性受容体および結合タンパク質は、それらのそれぞれの炎症性サイトカインの作用を中和するために過剰に投与される。しかしながら、その大きなサイズのために、得られた受容体／結合タンパク質−サイトカイン複合体は、個々の成分に比べて循環においてより長い半減期を有し得る。さらに、複合体の生成は可逆性であるため、複合体は炎症性サイトカインの持続的供給源となり得る。本発明による可溶性受容体または結合タンパク質の修飾は、可溶性受容体または結合タンパク質の炎症性サイトカインへの結合能を変化させずに循環から複合体の迅速なクリアランスを促進する。したがって、本発明は、炎症性サイトカインに、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾した可溶性受容体または結合タンパク質を提供することによって、ＡＳＧＰ−Ｒまたは他の任意のレクチン型細胞表面受容体など、循環からのタンパク質のクリアランスに関与する特異的な受容体に複合体を結合することを支援する。したがって、前述のグリカン修飾可能性受容体または結合タンパク質の投与は、循環する炎症性サイトカインの迅速なクリアランスを促進するために、本発明により提供される。同様に、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつように修飾された、成長因子の可溶性受容体または結合タンパク質が本発明により提供される。前述の成長因子の可溶性受容体または結合タンパク質の投与は、たとえば癌細胞の増殖または血管内皮増殖を支援する成長因子などの望ましくない循環成長因子の有効的で迅速なクリアランスのために、本発明により提供される。
【０１０７】
末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつ対応するグリカン修飾受容体または結合タンパク質を使用して循環からのクリアランスが促進可能な他の不要成分は、リポタンパク質または酸化リポタンパク質である。
【０１０８】
したがって、一側面において、本発明は、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつグリカン修飾受容体または結合タンパク質と、その病因または経過が前述の受容体または結合タンパク質と結合可能な成分の値および／または活性に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための医薬の製造における本発明のグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質の使用を提供する。前述の成分の例は、サイトカイン、成長因子、リポタンパク質および酸化リポタンパク質を含むが、これに限定されない。
【０１０９】
一実施態様において、本発明は、そのＮ−グリカン構造が本発明により修飾され、哺乳類細胞に発現されるサイトカインＴＮＦ−α（ｐ５５）の可溶性受容体を提供する。このような修飾可溶性ＴＮＦ受容体（ｍ−ｓＴＮＦＲ）は、たとえば関節リウマチ、クローン病、乾癬および種々の他の自己免疫疾患など、過剰なＴＮＦにより特徴付けられる疾患の治療に有効である。前記疾患を有する患者へのｍ−ｓＴＮＦＲの投与により、循環ＴＮＦとｍ−ｓＴＮＦＲとのあいだでの複合体が形成される。得られた複合体は、ＡＳＧＰ−Ｒまたは他の任意のレクチン型細胞表面受容体への結合によって循環から迅速にクリアランスされる。レクチン型受容体への結合に続いて、レクチン型受容体、ｍ−ｓＴＮＦＲおよびＴＮＦ−αからなる三重複合体はレクチン受容体を通じて内在化して複合体が解離し、ｍ−ｓＴＮＦＲおよびＴＮＦ−αはリソソーム中で分解されるのに対し、レクチン型受容体は細胞表面に復元再生される。このようなレクチン型受容体は肝臓、マクロファージ、血管内皮細胞および他の多くの細胞種中に豊富に存在する。
【０１１０】
末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃを有する修飾糖タンパク質を生成するためのいくつかの方法が先行技術において既知である。これらの方法は、３つの主要な群に分類され得る。（１）修飾グリカン構造による糖タンパク質の生合成に向けられた発現システム、（２）糖タンパク質の酵素変換反応、および（３）タンパク質の化学修飾。これらの方法は、末端Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃを有する本発明の可溶性サイトカイン受容体または結合タンパク質を生成するために採用され得る。本発明の一実施態様において、ＣＨＯ細胞に発現されるｓＴＮＦＲｐ５５が、末端Ｎアセチルノイラミン酸を除去するノイラミニダーゼで処理されることにより、最後から２番目のガラクトース残基を露出する。本発明の別の実施態様において、前記ｓＴＮＦＲは、ノイラミニダーゼ、次にβガラクトシダーゼにより処理されてＧｌｃＮＡｃ残基を露出する。得られた切断糖タンパク質は、そのままで使用されるか、あるいはＧａｌＮＡｃ転移酵素（βＧａｌＮＡｃＴ）の存在下でＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとさらに反応させられる（Rice, Thomasら, 2003）。代替的に、ｓＴＮＦＲは、ＧａｌＮＡｃをＮ−グリカン部分に組み込むシステム中に発現され得る。たとえば、ＣＨＯ−ｌｅｃ８細胞は、βＧａｌＮＡｃＴおよびｓＴＮＦＲｐ５５を発現するベクターで安定して共トランスフェクト可能である。これらの細胞はｓＴＮＦＲを発現および分泌し、ここにてＧａｌ残基がＧａｌＮＡｃにより置き替えられる。得られた糖タンパク質のノイラミニダーゼによる処理は、最後から２番目のＧａｌＮＡｃを露出させる（Kawar, Haslamら, 2005）。別のアプローチにおいて、ｓＴＮＦＲｐ５５は、ノイラミニダーゼ、次にβガラクトシダーゼにより処理されて、末端Ｎ−アセチルノイラミン酸および最後から２番目のβガラクトースを除去する。得られた切断糖タンパク質は、その後、ＧａｌＮＡｃＴの存在下でＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと反応させられる（Rice, Thomasら, 2003）。末端ＧａｌＮＡｃを有する得られたｓＴＮＦＲは、ＧａｌＮＡｃにより終結する糖タンパク質に対して高い特異性を示すフジ凝集体（Wisteria Floribunda）レクチン−アガロースカラムにて単離可能である（Do, Doら, 1997）。
【０１１１】
代替的には、ＧａｌＮＡｃは、ＣＨＯ細胞または大腸菌などの原核発現系において発現されるｓＴＮＦＲに化学的に追加され得る。たとえば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムでの還元アミノ化により、ＧａｌＮＡｃまたは乳糖をｓＴＮＦＲにおいてＬｙｓ残基のεアミノ基に直接結合することも可能である。同様に、ＧａｌＮＡｃの２つの残基は、Ｌリジンのεおよびαアミノ基に結合可能であり、得られた誘導体は水溶性カルボジイミドにより活性化され、その後ｓＴＮＦＲにおいてＬｙｓ残基のεアミノ基に結合されることにより、ＧａｌＮＡｃ残基とｓＴＮＦＲ骨格とのあいだにスペーサを生み出す。ｓＴＮＦＲへの結合に適した他のＧａｌＮＡｃシントンが文献に記載された。たとえば、Ｗｅｓｔｅｒｌｉｎｄらの化合物５および８ｆ（Westerlind, Westmanら, 2004）は、弱アルカリにより脱Ｏ−アセチル化され、水溶性カルボジイミドにより活性化されて、その後ｓＴＮＦＲに結合され得る。
【０１１２】
すべてのサイトカインおよび成長因子は特異的細胞表面受容体によって作用するため、前記受容体または結合タンパク質の細胞外ドメインを発現し、ｓＴＮＦＲｐ５５のＮ−グリカンで説明したように、Ｎ−またはＯ−グリカンのいずれかを修飾することが可能である。代替的に、所望の糖残基がこのような可溶性受容体または結合タンパク質に化学的に追加可能である。次のサイトカインおよび成長因子のリストは、ｓＴＮＦＲ  ｐ５５について前述した１または複数の方法を使用して、本発明によりそのグリカン部分が修飾された、対応する可溶性受容体または結合タンパク質を使用して循環から迅速および効率的にクリアランスされ得るエフェクター分子の例である。ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４／ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、ＩＬ−２９、アクチビン、アポ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＴＮＦＳＦ９、ＢＭＰ−２、ＣＤ２７Ｌ、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−７、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＮＴＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＡＳＬ、ＦＧＦ、ＣＳＦ、ＦＬＴ３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＮＦ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＨ、ＨＧＦ、ＩＧＦ  Ｉ＆ＩＩ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシン、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＳＰ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＯＸ−４０Ｌ、ＰＤＧＦ、プロラクチン、ＳＣＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＰＯ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＳＬＰ、ＴＷＥＡＫ。
【０１１３】
分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術についての先行技術において既知のツールは、次の文献中に見出すことができる。Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Co., New York (1980); Oligonucleotide Synthesis Gait, M. J., ed. (1984); Transcription and Translation Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); Animal Cell Culture Freshney, R. I., ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes IRL Press, (1986); Nucleic Acid Hybridization Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988); Molecular Cloning: A laboratory Manual Sambrook et al., (1989); Academic Press; PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990); Perbal, Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) Genome Analysis: A Laboratory Handbook, Cellis, J. E., ed. (1994); Current Protocols in Immunology Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), Basic and Clinical Immunology, Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds),; Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual CSHL Press (1996); および A Laboratory Manual Series, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); Methods in Enzymology Vol. 1-317。
【０１１４】
ＡＳＧＰ−Ｒは、１５０，０００〜５００，０００の結合部位／細胞をもつ肝細胞にきわめて豊富にあり、さらなるレクチン受容体もまた多くの細胞種に存在するため、サイトカインまたは成長因子と、露出したＧａｌ、ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃをもつ、それぞれの可溶性受容体とからなる複合体のクリアランスはきわめて迅速である。ちょうど１つのレクチン型受容体、ＡＳＧＰ−Ｒに対して入手できる情報は、クリアランスの有効性を実証する。したがって、肝臓中にある肝細胞数は、マウスにつき約２×１０8であり、ＡＳＧＰ−Ｒ内在化の速度は１０6細胞毎に０．１ｐｍｏｌ／分である。このような推測に基づいて、マウスの肝臓は、ＡＳＧＰ−Ｒにより約１．２ｎｍｏｌ／時にてリガンドを除去可能であり、または同等に２．４μｇ／時にて分子量が２０，０００の糖タンパク質を除去可能である（Park, Miら, 2005）。ヒトの肝臓に対する推定では、たとえば、ｍ−ｓＴＮＦＲとＴＮＦ−αとの複合体の５ｍｇ／時または１２０ｍｇ／日を超えるほぼ無限の潜在的クリアランス速度が示唆される。
【０１１５】
本発明者らは、水疱性口内炎ウイルスに対する抗ウイルス活性に基づき、ヒトＬＤＬＲ（ｓＬＤＬＲ）のリガンド結合ドメインに対応する可溶性タンパク質を単離した（Fischer, Talら, 1993）。その後、本発明者らは、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞中に発現された組換えｓＬＤＬＲを特徴付けした（ＬＤＬＲ前駆体のアミノ酸残基２５〜３５２；受入番号第Ｐ０１１３０、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＥｘＰＡＳｙデータベース）。予想外に、本発明によって、この可溶性ＬＤＬＲ（ｓＬＤＬＲ）は、ＰＮＧａｓｅによる開裂前後のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されたようにＮ−グリコシル化されることが見出された（図１）。Ｎ−グリコシル化部位は、ＰＮＧａｓｅでの処理前後において、トリプシンペプチド消化の質量分析的特徴を比較することにより、ＬＤＬＲ前駆体のＡｓｎ２７２にあることが見出された（表１）。本発明により、Ｎ−グリコシル化ｓＬＤＬＲはＬＤＬに結合し、該結合は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水中でのサイズ排除クロマトグラフィーによって測定されるように、生理学的条件での解離に抵抗することが見出された（図２）。したがって、末端ＧａｌＮＡｃ（ｓＬＤＬＲ−Ｇｎ）をもつｓＬＤＬＲが本発明により提供される。本発明によるｓＬＤＬＲ−Ｇｎには、たとえば、全ＬＤＬ結合部位を含む７つの不完全なリピートならびにＥＧＦ前駆体ホモログドメイン（リガンド結合に寄与すると報告されている）のリピートＡを含有するアミノ酸残基２５〜３５２にわたるＬＤＬＲ前駆体のポリペプチドと、全ＬＤＬ結合部位を含む７つの不完全なリピートを含有するアミノ酸残基２５〜３１３にわたるＬＤＬＲ前駆体のポリペプチドなどがあり得る。ｓＬＤＬＲ−Ｇｎの投与は、循環中のコレステロールの有効的で迅速な減少を促進するために、本発明により提供される。このような投与は、突然変異ＬＤＬＲまたはＬＤＬＲ減少による家族性高コレステロール血症を有する個体、ならびにＬＤＬＲ値またはＬＤＬＲ機能が減少した他の個人にとって有用である。ｓＬＤＬＲ−Ｇｎの投与は、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害物質などの血清コレステロールを減少する他の手段に耐容がない個人に対しても有用である。ｓＬＤＬＲ−Ｇｎの投与は、従来のいずれの方法によっても血清コレステロールが管理できないため、ＬＤＬ血漿交換に依存する一部の家族性高コレステロール血症の患者にとって特に有用である。
【０１１６】
末端ＧａｌＮＡｃを有するｓＬＤＬＲまたは関連ホモログを生成するために、先行技術において既知であるいくつかの一般的方法を使用することができる。本発明の一実施態様において、ＣＨＯ−ｌｅｃ８細胞は、βＧａｌＮＡｃ転移酵素（βＧａｌＮＡｃＴ）およびｓＬＤＬＲを発現するベクターとともに安定して共トランスフェクト可能である。これらの細胞は、最後から２番目のＧａｌＮＡｃを露出させるためにノイラミニダーゼで処理され得るｓＬＤＬＲ−Ｇｎを発現および分泌する（Kawar, Haslamら, 2005）。別のアプローチにおいて、ｓＬＤＬＲは、ＣＨＯ細胞などの宿主細胞中に発現され、培養上清から回収可能である。産生されたｓＬＤＬＲはノイラミニダーゼ、次にβガラクトシダーゼにより処理されて、末端Ｎ−アセチルノイラミン酸および最後から２番目のβガラクトースを除去する。得られた切断糖タンパク質は、その後、ＧａｌＮＡｃＴの存在下にてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと反応させることができる（Rice, Thomasら, 2003）。得られたｓＬＤＬＲ−Ｇｎは、ＧａｌＮＡｃにて終端する糖タンパク質に対して高い特異性を示すフジ凝集体レクチン−アガロースカラムにて単離可能である（Do, Doら, 1997）。
【０１１７】
代替的に、ＧａｌＮＡｃをｓＬＤＬＲまたはその関連ホモログに化学的に追加可能である。たとえば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムでの還元アミノ化により、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）をｓＬＤＬＲのＬｙｓ残基のεアミノ基に直接結合可能である。同様に、ＧａｌＮＡｃの２つの残基は、Ｌ−リジンのεおよびαアミノ基により結合可能であり、得られた誘導体は水溶性カルボジイミドにより活性化可能であり、その後ｓＬＤＬＲのＬｙｓ残基のεアミノ基に結合されることにより、ＧａｌＮＡｃ残基とｓＬＤＬＲ骨格とのあいだにスペーサを生じる。ｓＬＤＬＲを結合するのに適した他のＧａｌＮＡｃシントンが文献に記載されていた。たとえば、Westerlindらの化合物５および８ｆ（Westerlind, Westmanら, 2004）は、弱アルカリにより脱Ｏ−アセチル化され、水溶性カルボジイミドにより活性化されたのち、ｓＬＤＬＲに結合される。
【０１１８】
アポＢの合成および異化率は、正常な個体において８．０±０．７ｍｇ／ｋｇ／日であり、ＦＨヘテロ接合体の個人においては１３．８±３．６ｍｇ／ｋｇ／日であり、ＦＨホモ接合体の個人においては２６．４±１０ｍｇ／ｋｇ／日である（Bilheimer, Stoneら, 1979）。したがって、異化率は、５．８±３．６ｍｇ／ｋｇ／日の血漿アポＢを除去することによりＦＨヘテロ接合体において標準化される。グリコシル化ｓＬＤＬＲの分子量は３４，０００で、アポＢの分子量は５５０，０００であるため（Johs, Hammelら, 2006）、１００％の有効率を仮定すると、少なくとも０．３６±０．２２ｍｇ／ｋｇ／日のｓＬＤＬＲ−Ｇｎ誘導体の投与が、ＦＨヘテロ接合体におけるＬＤＬＲの異化率を標準化する。しかしながら、肝細胞により得られたコレステロールの向上した取り込みは、さらに細胞表面ＬＤＬＲの発現をダウンレギュレーションするため、投与量の増大を要する。極端な場合には、０．８５±０．５ｍｇ／ｋｇ／日のｓＬＤＬＲ−Ｇｎ誘導体の投与がｈｅＦＨ患者の全コレステロール産出量を内在化する。また、ｓＬＤＬＲのアポＥ含有リポタンパク質への結合が生じる。アポＥはきわめて大きいＶＬＤＲおよびさらに小さいＨＤＬ−アポＥの両方に存在するため、リポタンパク質中に存在するアポＥの正確な効果は評価できず、またｓＬＤＬＲ−Ｇｎの最適投与量は実験的に決定されなければならない。
【０１１９】
２つ以上の構造体が、共通する祖先のために類似している場合にこれらはホモログであると称される。タンパク質およびＤＮＡのあいだのホモロジーは、特に生物情報学において配列の類似性に基づきしばしば決定される。たとえば、通常、もし２つの遺伝子がほぼ同一のＤＮＡ配列を有する場合は、これらはホモログである可能性が高い。多くのアルゴリズムがタンパク質の配列を配列の系統群にまとめるために存在し、これらは一連の共通ホモログ配列である。配列のホモロジーは、オーソロガスまたはパラロガスの２種類であり得る。共通の祖先に由来する２つの異なる種における２つの類似した遺伝がオーソロガスである。ホモログ配列が種形成事象によって分かれた場合はオーソロガスである。もし遺伝子がある種において存在し、その種が２つの種に分岐した場合、得られた種におけるこの分岐コピーした遺伝子はオーソロガスである。オーソロガスの２つ目の定義は、２つの種において、きわめて類似した機能を有する任意の２つの遺伝子である。ホモログ配列が、遺伝子複製事象により分かれた場合はパラロガスである。生物中の遺伝子が同一のゲノムにおいて２つの異なる位置を占めるように複製された場合、その２つのコピーはパラロガスである。ミオグロビンおよびヘモグロビンをコードする遺伝子は古来のパラログと考えられる。
【０１２０】
そのそれぞれの細胞関連受容体の細胞外リガンド結合ドメインに対応し、Ｇａｌの代わりにＧａｌＮＡｃをもつ可溶性スカベンジャー受容体を発現するために、本発明によって同様の方法が提供される。このような修飾可溶性受容体は、ｏｘＬＤＬおよびｏｘＲＬＰなどの酸化リポタンパク質を結合してこれらを肝臓に渡し、ここにおいて複合体が迅速にＡＳＧＰ−Ｒに結合して内在化および分解される。ｓＬＤＬＲの場合、組換え可溶性スカベンジャー受容体はＣＨＯ−ｌｅｃ８細胞などの宿主細胞中に発現可能であり、βＧａｌＮＡｃＴを発現するベクターと安定して共トランスフェクト可能である。可溶性スカベンジャー受容体構築物は、シグナルペプチドの配列コードに続き、前記スカベンジャー受容体の細胞外ドメインのいずれかのＤＮＡコードを含む一般的配置を有する。分泌生成物はノイラミニダーゼで処理し、最後から２番目のＧａｌＮＡｃを露出させることが可能である（Kawar, Haslamら, 2005）。別のアプローチにおいて、可溶性スカベンジャー受容体のいずれかは、ＣＨＯ細胞などの宿主細胞にて発現されて、培地から単離可能である。単離後、可溶性受容体は、ノイラミニダーゼ、次にβガラクトシダーゼで処理し、末端Ｎ−アセチルノイラミン酸および最後から２番目のβ−ガラクトシダーゼを除去することが可能である。得られた切断糖タンパク質は、ＧａｌＮＡｃＴの存在下でＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと反応可能である（Rice, Thomasら, 2003）。得られた修飾可溶性スカベンジャー受容体は、ＧａｌＮＡｃにて終端する糖タンパク質に対して高い特異性を示すフジ凝集体レクチン−アガロースカラムにて単離可能である（Do, Doら, 1997）。
【０１２１】
代替的に、ＧａｌＮＡｃを可溶性スカベンジャー受容体に化学的に追加することが可能である。たとえば、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムでの還元アミノ化により、前記可溶性スカベンジャー受容体のＬｙｓ残基のεアミノ基に直接結合可能である。同様に、ＧａｌＮＡｃの２つの残基は、Ｌ−リジンのεおよびαアミノ基に結合可能であり、得られた誘導体は水溶性カルボジイミドにより活性化され、その後いずれかの可溶性スカベンジャー受容体のＬｙｓ残基のεアミノ基に結合されることにより、ＧａｌＮＡｃ残基と前記受容体骨格とのあいだにスペーサを生ずる。種々のタンパク質との結合に適した他のＧａｌＮＡｃシントンが文献に記載された。たとえば、Westerlindらの化合物５および８ｆ（Westerlind, Westmanら, 2004）は、弱アルカリにより脱Ｏ−アセチル化され、水溶性カルボジイミドにより活性化されて、その後可溶性スカベンジャー受容体のいずれかに結合される。
【０１２２】
本発明は、本発明によるグリカン修飾可溶性受容体または結合タンパク質を含有する活性物質を含む医薬組成物を包含する。
【０１２３】
活性タンパク質の治療有効量は、たとえば投与経路、患者の臨床状態などの種々の変数の関数である。
【０１２４】
「治療有効量」とは、投与された場合、グリカン修飾受容体または結合タンパク質が生物活性を示すような量である。個人に対して単回または複数回の投与により投与される用量は、薬物動態特性、投与経路、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康状態およびサイズ）、症状の程度、併用療法、治療回数および所望の効果を含む種々の要因により変化する。設定された用量範囲の調整および操作、ならびに個人における効果を決定するインビトロおよびインビボ方法は当業者の能力の範囲内である。
【０１２５】
参考文献中に含まれたすべての情報は、参照としてここに組み入れられる。
【０１２６】
本発明を、次の非限定的実施例により説明する。
【実施例】
【０１２７】
実施例１：アシアロｓＴＮＦＲ  ｐ５５の生成
製造者の指示にしたがって、ＰＢＳ１ｍｌ中の５０，０００単位のノイラミニダーゼ（ニューイングランド  バイオラボ（New England Biolabs）、カタログ番号Ｐ０７２０Ｌ）が、Ａｆｆｉｇｅｌ  １０（１ｍｌの充填ビーズ、バイオラッド  ラボラトリーズ（BioRad Labs））に固定化され、カラム内に充填される。クエン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６、１０ｍｌ）中のＣＨＯ細胞（１ｇ、メルクセローノ  ラボラトリーズ（Merck Serono laboratories））に発現した、プロ−ＴＮＦ−Ｒ１（http://www.expasy.org/uniprot/P19438）のアミノ酸２２〜２１１に対応する組換えｓＴＮＦＲ  ｐ５５が、２５℃にて２時間、固定化されたノイラミニダーゼカラムを通って循環される。得られたアシアロｓＴＮＦＲ（ａｓ−ｓＴＮＦＲ）は回収され、ＰＢＳ（５００ｍｌ、３回交換）に対して透析され、遊離Ｎ−アセチルノイラミン酸が除去される。
【０１２８】
実施例２：アシアロｓＴＮＦＲ  ｐ５５からのβ１−３ガラクトースの除去
製造者の指示にしたがって、ＰＢＳ１ｍｌ中の１０，０００単位のβ１−３ガラクトシダーゼ（ニューイングランド  バイオラボ、カタログ番号Ｐ０７２６Ｌ）が、Ａｆｆｉｇｅｌ  １０（１ｍｌの充填ビーズ、バイオラッド  ラボラトリーズ）に固定化され、カラム内に充填される。アセテート緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．５、１０ｍｌ）中の、実施例１で説明したように生成されたアシアロ−ｓＴＮＦＲ  ｐ５５（１ｇ）が、２５℃にて２時間、固定化されたβガラクトシダーゼカラムを通って循環される。得られたアシアロ−アガラクトｓＴＮＦＲ（ａｓ−ａｇ−ｓＴＮＦＲ）は回収され、ＰＢＳ（５００ｍｌ、３回交換）に対して透析され、遊離ガラクトースが除去される。
【０１２９】
実施例３：ｓＴＮＦＲ  ｐ５５のラクトサミン化
乳糖（２７０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ、シグマ（Sigma））が、ＮａＨＣＯ3（５０ｍＭ、１０ｍｌ、ｐＨ８．４）中の大腸菌（１ｇ、ぺプロテック社（PeproTech Inc.））に発現したプロ−ＴＮＦ−Ｒ１（http://www.expasy.org/uniprot/P19438）のアミノ酸２２〜２１１に対応する組換えｓＴＮＦＲ  ｐ５５に添加され、ついでシアノ水素化ホウ素ナトリウム（４８ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）が添加される。溶液は室温にて１７０時間保持される。ラクトサミンｓＴＮＦＲ（ｌａｃ−ｓＴＮＦＲ）はＰＢＳ（５００ｍｌ、３回交換）に対して透析され、低分子量成分が除去される。
【０１３０】
実施例４：末端ＧａｌＮＡｃを有する組換えｓＴＮＦＲ  ｐ５５の発現
ＣＨＯ  Ｌｅｃ８細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７３７）は、ＣＭＶプロモーターの制御下にてＣｅβ４ＧａｌＮＡｃＴの完全なオープンリーディングフレームをコードするプラスミド（このプラスミドはジェネティシン耐性遺伝子もコードする。）で、記載されたように（Kawar,Haslamら,2005）トランスフェクトされた。細胞は、１０％のウシ胎仔血清および６００μｇ／ｍｌのジェネティシン（インビトロジェン）を含有するダルベッコ改変イーグル培地中で培養されて、安定した転換細胞が選択された。４週間の培養後、Ｃｅβ４ＧａｌＮＡｃＴ活性を発現する細胞系（Ｌ８−ＧａｌＮＡｃＴ）が、記載されたように（Kawar,Haslamら,2005）限界希釈培養によって単細胞からクローン化された。
【０１３１】
その後、Ｌ８−ＧａｌＮＡｃＴ細胞は、ＣＭＶプロモーターの制御下にて、分泌のための同族シグナルペプチドを含むヒトＴＮＦＲ（ｐ５５）のコドン１〜２１１のオープンリーディングフレーム（http://www.expasy.org/uniprot/P19438）を、続いて終止コドンをコードする哺乳類発現プラスミドｐＣＤＮＡ４／Ｈｉｓ（インビトロジェン）（このプラスミドはゼオシン耐性遺伝子もコードする。）で前述のようにトランスフェクトされる。その後、細胞は１０％のウシ胎仔血清および６００μｇ／ｍｌのジェネティシンおよび４００μｇ／ｍｌのゼオシン（インビトロジェン）を含有するダルベッコ改変イーグル培地中で培養されて、安定した転換細胞が選択される。４週間の培養後、ＧａｌＮＡｃＴおよびｓＴＮＦＲを発現する細胞系は、記載されたように（Selmaj, 2000; Kawar, Haslamら, 2005）単細胞からクローン化された。
【０１３２】
実施例５：ＣＨＯ細胞に発現される組換えｓＬＤＬＲは糖タンパク質である。
Cummingsらは、ヒトＬＤＬＲが単Ａｓｎ結合オリゴ糖を含有することを見出した（Cummings, Kornfeldら, 1983）（１５２６９頁、右欄、第３段落参照）。Ｎ−グリコシル化部位は、プロ−ＬＤＬＲのＡｓｎ６５７に位置していた（http://www.expasy.org/uniprot/P01130）。すべてのＯグリコシル化部位は、血漿膜に隣接した細胞外ドメインに集まっている（GentおよびBraakman, 2004）。したがって、ｓＬＤＬＲ２５−３５２のグリコシル化は見込まれない。３２８個のアミノ酸残基のｓＬＤＬＲ（プロｓＬＤＬＲのＡｓｐ２５〜Ｃｙｓ３５２に対応する）がＣＨＯ細胞（インターファーム  ラボラトリーズ（InterPharm laboratories）、ネスジオナ（Ness Ziona）、イスラエル）中で生成された。簡潔には、ｈｓＬＤＬＲおよびＤＨＦＲ発現の両方が、プロモーターおよびＳＶ４０由来の転写終結要素により制御されている場合、ＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞のトランスフェクションのために構築される発現プラスミドは、同一プラスミド上に、プロｈｓＬＤＬＲのアミノ残基１〜３５２にわたるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列［（同族２４アミノ酸シグナルペプチドおよび後続に成熟ポリペプチドの３２８アミノ酸残基（ＬＤＬＲ前駆体タンパク質のアミノ酸２５〜３５２にわたる）を含む）］と、マウスＤＨＦＲとを含有した。
【０１３３】
プロｈｓＬＤＬＲの１〜３５２のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ断片は、全プロＬＤＬＲ遺伝子をテンプレートとして使用してＰＣＲ増幅により単離された（ＬＤＬＲのｃＤＮＡ、Yamamotoら, Cell 39: 27-38, 1984）。増幅は、全量１００マイクロリットル中に、１ｎｇのテンプレート、４００ｎｇの各プライマー（フォアワードおよびリバース）、０．２ｎＭのｄＮＴＰ混合物、２ｍＭのＭｇＣｌ2、５Ｕ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（この酵素が供給される緩衝液で）を含むＰＣＲ反応混合物を使用して実施された。３１回の熱サイクルが適用され（９４℃にて１分間、６５℃にて１分間、７２℃にて２分間）、９４℃での２分間の加熱が先行し、７２℃での１０分間の加熱が後続した。使用されたプライマーは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位、コザック配列およびプロｈｓＬＤＬＲの最初の５のアミノ酸をコードする配列を含むフォワードプライマー（配列番号１）5'CCC AAGCTT CCACC ATG GGG CCC TGG GGC TG、ならびにＢａｍＨＩ部位、２つの停止コドンおよび最後がＣｙｓ３５２である最後の６アミノ酸の配列を含むリバースプライマー（配列番号２）5'CCG GGATCC TTA CTA GCA TCT TCG CTG GGC CAC Cである。ｈｓＬＤＬＲの発現カセットを含む中間プラスミドは、ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍ  ＨＩで消化し、これをＨＩＮＤＩＩＩおよびＢｃ１Ｉで事前に消化したｐＳＶＥ３プラスミドに導入することにより得られた（これらの酵素による消化はｐＳＶＥ３のほとんどのＳＶ４０初期領域を除去する）。ｈｓＬＤＬＲおよびＤＨＦＲの発現カセットを含む最終プラスミドは、ＢａｍＨＩで中間プラスミドを消化してｈｓＬＤＬＲ発現カセットを単離し、ＢａｍＨＩで事前に消化されたｐＤＨＦＲの大きな断片に連結することにより得られた。当技術分野において既知の方法で、制限地図および配列分析による最終構築物の確認後、細胞は最終プラスミドによりトランスフェクトされ、ＤＨＦＲ陽性細胞を選択するために選択培地にさらされた。トランスフェクションは、製造者により説明されたプロトコルにしたがって、リポフェクトアミン（ギブコ（Gibco）  ＢＲＬ）を使用してカチオン性リポソームにより実施された。トランスフェクションの７２時間後、細胞は、デオキシおよびリボヌクレオシドを欠き、１０％透析ＦＣＳが補充された選択培地に移された。ＤＨＦＲ活性を発現した細胞は選択培地にてコロニーを形成することができ、これはトリプシン浸漬ペーパーディスクで細胞をリフティングさせることにより単離された。米国特許第６８４９７２０号明細書の実施例９に記載されているように、単離細胞は培養されてｒ−ｈｓＬＤＬＲ抗ウイルス活性について選別される。その後、ｒ−ｈｓＬＤＬＲを産生するトランスフェクト細胞は、徐々にＭＴＸ濃度を上昇させることにより遺伝子増幅され、安定した産生クローンのサブクローニングおよび選択がされた。ｒ−ｈｓＬＤＬＲは、Ｃｙｓ３１３を欠いたｈｓＬＤＬＲの短縮形（該特許において２９１型とされている、プロｓＬＤＬＲからのアミノ酸２５〜３１２全域）の産生を記載した米国特許第６８４９７２０号明細書の実施例１に示されたこのような安定したＣＨＯ産生クローンの培養から産生されたため、奇数のＣｙｓ残基を含む。
【０１３４】
生成されたｒ−ｈｓＬＤＬＲは、ＰＮＧａｓｅ（１５，０００単位、ニューイングランド  バイオラボ、カタログ番号Ｐ０７０４Ｓ）により製造者の指示にしたがい消化された。未消化と消化ｓＬＤＬＲのアリコート（各１μｇ）は、勾配ポリアクリルアミドゲル（８〜１５％アクリルアミド）で分解されて、クマシーブルーで染色された。消化後にｒ−ｈｓＬＤＬＲの移動度の著しい増加が見られ、ＣＨＯ細胞に発現したｒ−ｈｓＬＤＬＲ２５〜３５２が糖タンパク質であることを示した（図１）。
【０１３５】
実施例６：ｓＬＤＬＲのグリコシル化位置の測定
実施例５の非処理ｒ−ｈｓＬＤＬＲおよびＰＮＧａｓｅ消化ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対応するバンドがゲルから切り出されて還元およびアルキル化され、ついでトリプシンで消化された。得られたペプチド混合物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を受けた。２つの調製物中で同定されたペプチドの比較により、ＰＮＧａｓｅ後に出現した１つの新たなペプチド（ペプチド１７）を明らかにした（表１）。このペプチドは、プロＬＤＬＲのＡｓｎ２７２にて潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含むペプチド
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に対応する。
【０１３６】
【表１】
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【０１３７】
実施例７：組換えｓＬＤＬＲとＬＤＬの結合
表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によるＣＨＯ細胞中で産生された組換えｓＬＤＬＲのＬＤＬへの結合を実証する試みはうまくいかなかった。したがって、本発明者らは、ｓＬＤＬＲのＬＤＬとの結合を試験する別の方法を採用した。この目的のため、本発明者らは、ＰＢＳプラス１０μＭの塩化カルシウム（ＰＢＳ＋）中にて、各７μＭの最終濃度のＬＤＬ溶液（バイオメディカル  テクノロジー社（Biomedical technologies, Inc.）、マサチューセッツ、米国）および実施例５のｒ−ｈｓＬＤＬＲを３７℃で１時間インキュベートした。０．１ｍｌのアリコートが、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＨＲ  １０／３０カラム（ＧＥヘルスケア  ライフ  サイエンス（GE Healthcare Life Sciences）、カタログ番号１７−５１７２−０１）にてサイズ排除クロマトグラフィーに付された。カラムは０．４ｍｌ／分の流速にてＰＢＳ＋で溶出され、０．５ｍｌの画分が集められた。ｒ−ｈｓＬＤＬＲの濃度は、つぎのとおり特異的ＥＬＩＳＡにより測定された。
【０１３８】
Ｍａｂ  ＃２８抗ヒトｓＬＤＬＲ（ＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌ；米国特許第６８４９７２０号明細書でＮｏ．１−２３９１としてＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマクローン２８由来のＭａｂに対応）が、室温にて一晩、０．１ｍｌ／ウェルで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの被覆に使用された。その後、プレートは、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３回洗浄され、０．３ｍｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中に１％のウシ血清アルブミン、５％のショ糖、０．０５％のアジ化ナトリウム）によってブロックされた。その後、プレートはＰＢＳで３回洗浄された。０．１ｍｌのＰＢＳ中のＣＨＯ細胞（１２５  ｎｇ／ｍｌ、インターファーム  ラボラトリーズ、ネスジオナ、イスラエル）に発現した標準組換えｓＬＤＬＲ２５〜３５２は、第１のウェルに添加され、連続的に２倍希釈された。同様に、未知量のｓＬＤＬＲを含有する試料は他の列の第１のウェルに添加され、連続的に２倍希釈された。その後、プレートは室温にて２時間インキュベートされた後、ブロッキング緩衝液で３回洗浄された。試薬希釈剤（ＰＢＳ中に１％のウシ血清アルブミン、０．１ｍｌ）中に４μｇ／ｍｌに希釈された、ビオチン化ｍａｂ  ＃２９．８抗ヒトｓＬＤＬＲ（米国特許第６８４９７２０号明細書でＮｏ．１−２３９２としてＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマクローン２９．８由来のＭａｂに対応）が各ウェルに添加され、室温で２時間インキュベートされた。その後、プレートは試薬希釈剤で３回洗浄された。製造者（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D systems））の指示にしたがって、作業希釈で試薬希釈剤中のストレプトアビジンＨＲＰ（Ｒ＆Ｄシステムズ）（０．１ｍｌ）は、各ウェルに添加されて、プレートは室温にて２０分間インキュベートされた。その後、プレートは試薬希釈剤で３回洗浄され、基質溶液（０．１ｍｌＴＭＢ／Ｅ、ケミコン（Chemicon））が各ウェルに添加されて、プレートは６３０ｎｍで５分以内で読み取られるか、またはＨ2ＳＯ4（２Ｎ、０．０５ｍｌ）で停止されて４５０ｎｍで読み取られた。プレートの光学的不完全性は、５４０ｎｍまたは５７０ｎｍでの表示を差し引くことにより補正された。
【０１３９】
ｓＬＤＬＲのみのクロマトグラフィー（図２の破線）は、画分２７〜３５にて溶出した遊離ｓＬＤＬＲのピークが画分３１でピークに達したことを示した。ＬＤＬ−ｓＬＤＬＲ複合体のクロマトグラフィーは、ＬＤＬ（平均質量２．５×１０6Ｄａ）移動のピークと同じ画分２０〜２６のより高い分子量にて溶出したｓＬＤＬＲのピークならびに遊離ｓＬＤＬＲの大きなピークを示した。ｓＬＤＬＲのＥＬＩＳＡにより測定された２つのピークの割合に基づき、初期濃度に対して５倍の希釈と仮定して、本発明者らは、ＬＤＬ−ｓＬＤＬＲ複合体のＫＤは１０ｎＭの範囲にあると想定する。
【０１４０】
実施例８：大腸菌に発現したｓＬＤＬＲのＮ−アセチルガラクトサミン化
組換えｓＬＤＬＲ（プロＬＤＬＲのアミノ酸２５〜３５２、http://www.expasy.org/uniprot/P01130）は大腸菌中に発現し、基本的に記載されたように（Simmons, Newhouseら,1997）再度折りたたまれ、精製される。Ｎ−アセチルガラクトサミン（１００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、カルビオケム（Calbiochem））は、ＮａＨＣＯ3緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．４、１０ｍｌ）中の１ｇのｓＬＤＬＲ  ２５−３５２に添加され、その後シアノ水素化ホウ素ナトリウムが添加される（シグマ、２８ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）。溶液は室温にて１７０時間保持される。Ｎ−アセチルガラクトサミンｓＬＤＬＲ  ２５−３５２（ｓＬＤＬＲ−Ｇｎ）は、ＰＢＳ（５００ｍｌ、３回交換）に対して透析されて低分子量成分が除去された。
【０１４１】
実施例９：大腸菌中のｓＬＤＬＲ断片のＮ−アセチルガラクトサミン化
アポＥ含有リポタンパク質（プロＬＤＬＲのアミノ酸１４６−２３３、http://www.expasy.org/uniprot/P01130）と選択結合可能な組換えｓＬＤＬＲ断片は、大腸菌中に発現し、基本的に記載されたように（Fisher, Abdul-Azizら,2004）再度折りたたまれ、精製される。Ｎ−アセチルガラクトサミン（３４０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）は、ＮａＨＣＯ3（５０ｍＭ、ｐＨ８．４、１０ｍｌ）中の１ｇのｓＬＤＬＲ  １４６−２３３に添加され、その後シアノ水素化ホウ素ナトリウム（９１ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）が添加される。溶液は室温にて１７０時間保持される。Ｎ−アセチルガラクトサミンｓＬＤＬＲ  １４６−２３３は、ＰＢＳ（５００ｍｌ、３回交換）に対して透析されて低分子量成分が除去された。
【０１４２】
実施例１０：末端ＧａｌＮＡｃを有するｓＬＤＬＲの発現
実施例４のＬ８−ＧａｌＮＡｃＴ細胞は、ＣＭＶプロモーターの制御下に、分泌のための同族シグナルペプチドを含むコドン１から３１５までヒトＬＤＬＲのオープンリーディングフレーム（http://www.expasy.org/uniprot/P01130）、続いて停止コドンをコードするプラスミドｐＣＤＮＡ４／Ｈｉｓ（インビトロジェン）（このプラスミドはゼオシン耐性遺伝子もコードする。）で前述のようにトランスフェクトされた。その後、細胞は１０％のウシ胎仔血清、６００μｇ／ｍｌのジェネティシンおよび４００μｇ／ｍｌのゼオシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地中で培養されて、安定した転換細胞が選択される。４週間の培養後、ＲＴ−ＰＣＴにより測定されたＧａｌＮＡｃＴと実施例７で記載されたＥＬＩＳＡにより測定されたｓＬＤＬＲとを発現する細胞系が、前述のように単細胞からクローン化される。Ｎグリカン（ｓＬＤＬＲ−Ｇｎ）にてＧａｌの代わりに最後から２番目のＧａｌＮＡｃを有するｓＬＤＬＲは、これらのＣＨＯ細胞の培養上清から単離され、当技術分野において既知であるクロマトグラフィー法を使用して精製される。ｓＬＤＬＲ−Ｇｎは、末端Ｎ−アセチルノイラミン酸残基を除去するために固定化ノイラミニダーゼで処理される。ｓＬＤＬＲ−Ｇｎは、ＰＢＳ（５００ｍｌ、３回交換）に対して透析されて低分子量成分が除去される。
【０１４３】
実施例１１：大腸菌に発現した可溶性ｏｘＬＤＬ受容体断片のＮ−アセチルガラクトサミン化
ｏｘＬＤＬに選択結合可能なＯＬＲ１／ＬＯＸ−１の組換え断片（ＯＬＲ１／ＬＯＸ−１のアミノ酸１４３−２７３）は大腸菌中に発現し、基本的に記載されたように（Smirnova, Sawamuraら,2004）（Ishigaki, Ohkiら,2005）再度折りたたまれ、精製される。Ｎ−アセチルガラクトサミン（３４０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）は、ＮａＨＣＯ3（５０ｍＭ、ｐＨ８．４、１０ｍｌ）中の１ｇのｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１  １４３−２７３に添加され、その後シアノ水素化ホウ素ナトリウムが添加される（９１ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）。溶液は室温にて１７０時間保持される。Ｎ−アセチルガラクトサミンｓＯＬＲ１／ＬＯＸ１  １４３  ２７３（ｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１−Ｇｎ）は、ＰＢＳ（５００ｍｌ、３回交換）に対して透析されて低分子量成分が除去される。
【０１４４】
実施例１２：末端ＧａｌＮＡｃを有するｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１の発現
実施例４のＬ８−ＧａｌＮＡｃＴ細胞は、ＣＭＶプロモーターの制御下に、ヒトＯＬＲ１／ＬＯＸ−１のオープンリーディングフレームのコドン５８−２７３に続くシグナルペプチド（http://www.expasy.org/uniprot/P78380）、続いて停止コドンをコードするプラスミドｐＣＤＮＡ４／Ｈｉｓ（インビトロジェン）で前述のようにトランスフェクトされる。また、このプラスミドはゼオシン耐性遺伝子をコードする。その後、細胞は１０％のウシ胎仔血清、６００μｇ／ｍｌのジェネティシンおよび４００μｇ／ｍｌのゼオシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地中で培養されて、安定した転換細胞が選択される。４週間の培養後、ＧａｌＮＡｃＴおよびｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１を発現する細胞系が前述のように単細胞からクローン化される。Ｎ−グリカンにてＧａｌの代わりに最後から２番目のＧａｌＮＡｃを有するｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１（ｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１−Ｇｎ）は、これらのＣＨＯ細胞の培養上清から単離され、当該技術分野において既知であるクロマトグラフィー法を使用して精製される。ｓＬＤＬＲ−Ｇｎは、末端Ｎ−アセチルノイラミン酸残基を除去するために固定化ノイラミニダーゼで処理される。Ｎ−アセチルグルコサミンｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１（ｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１−Ｇｎ）は、ＰＢＳ（５００ｍｌ、３回交換）に対して透析されて低分子量成分が除去される。
【０１４５】
実施例１３：末端ガラクトースを有するｓＶＥＧＦ受容体２の発現
アミノ酸２０から７６４の可溶性ＶＥＧＦ受容体２（ｓＦｌＫ−１）（http://www.expasy.org/uniprot/P35968）は、基本的に記載されたように（Huang, Gottsteinら,1998）バキュロウイルス系にて発現する。得られたｓＦＬｋ−１は、当該技術分野において既知であるクロマトグラフィー法を使用して精製され、製造者の指示にしたがってＡｆｆｉｇｅｌ  １０（１ｍｌの充填ビーズ、バイオラッド  ラボラトリーズ）に固定化されたＰＮＧａｓｅ（１５，０００単位、ニューイングランド  バイオラボ、カタログ番号Ｐ０７０４Ｓ）により処理され、実施例３の記載のように化学的にラクトサミン化されて、ラクトサミンｓＦｌｋ−１（ｌａｃ−ｓＦＬＫ−１）が得られる。ｌａｃ−ｓＦＬＫ−１は、ＰＢＳ（５００ｍｌ、３回交換）に対して透析されて低分子量成分が除去される。
【０１４６】
実施例１４：ラットの循環からの過剰ＴＮＦ−アルファの除去
ＰＢＳ中のヒトＴＮＦ−アルファ（１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｌのＰＢＳで）が、ＰＢＳ（０．１ｍｌ）、ｓＴＮＦＲ  ｐ５５（５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｌのＰＢＳで）または実施例１のアシアロｓＴＮＦＲ  ｐ５５（５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｌのＰＢＳで）とともに、麻酔された成体ラット（３００ｇ）の尾部静脈に注射される。時間０から開始して、血液試料（０．１ｍｌ）が２０分間隔で１２０分にわたり抽出される。血清が集められ、血清ＴＮＦ値がＥＬＩＳＡにより測定される。血清ＴＮＦの半減期は３０分間である。これは、ｓＴＮＦＲ  ｐ５５の同時投与により増加し、アシアロｓＴＮＦＲ  ｐ５５の同時投与により減少する。
【０１４７】
実施例１５：アシアロＴＮＦＲによる関節リウマチの治療
実施例１のＡｓ−ｓＴＮＦＲが、１日用量５０ｍｇ／ｓｑ．ｍ．にて関節リウマチ患者の皮下に投与される。
【０１４８】
実施例１６：ｓＬＤＬＲ−Ｇｎによる家族性高コレステロール血症の治療
実施例８または１０のｓＬＤＬＲ−Ｇｎが、１日用量５０ｍｇ／ｓｑ．ｍ．にて、血清コレステロールが２００ｍｇ％を超える患者の皮下または点滴（infusion）により投与される。
【０１４９】
実施例１７：ｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１−Ｇｎによるアテローム性動脈硬化症を発現する危険性が高い患者の治療
実施例１１または１２のｓＯＬＲ１／ＬＯＸ−１−Ｇｎが、１日用量５０ｍｇ／ｓｑ．ｍ．にて、血清コレステロールが２００  ｍｇ％を超える患者の皮下に投与される。
【０１５０】
実施例１８：ｌａｃ−ｓＦｌｋ−１による癌患者の治療
実施例１３のｌａｃ−ｓＦｌｋ−１が、１日用量５０ｍｇ／ｓｑ．ｍ．にて、癌患者の皮下に投与される。
【０１５１】
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【図２】
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【図１】
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【国際調査報告】
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