(57)【要約】本発明は、組成物、および、例えば生物学的検出および診断におけるアッセイ技術およびその使用等の、方法を提供する。より具体的には、本発明は、受容体（およびそれらのファミリー）およびタンパク質（およびそれらのファミリー）の生物学的検出およびプロファイリングにおいて、核酸を鋳型とする化学に基づく組成物および方法、ならびに診断におけるそれらの使用を提供する。より具体的には、すべての既知のＥｒｂＢファミリー二量体のための免疫組織化学（ＩＨＣ）に基づくＥｒｂＢ二量体アッセイは、タンパク質複合体の高度に特異的な検出のためのＤＮＡプログラム化学を用いて開発することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体のファミリーの二量体化プロファイルを測定するための方法であって、
（ａ）一対のプローブを含むアッセイを提供するステップであって、
（ｉ）第１のプローブが、プロファイルされる受容体二量体の第１のメンバーに対する特異的結合親和性を有する第１の結合部を含み、前記第１の結合部は、任意選択的に第１のリンカーを介して、第１の反応基と関連する第１のオリゴヌクレオチドへ抱合され、
（ｉｉ）第２のプローブが、プロファイルされる受容体二量体の第２の受容体に対する特異的結合親和性を有する第２の結合部を含み、前記第２の結合部は、任意選択的に第２のリンカーを介して、第２の反応基と関連する第２のオリゴヌクレオチドへ抱合され、
前記第２のオリゴヌクレオチドは、前記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、前記第２の反応基は、互いに反応するように近接させると、前記第１の反応基に反応する、ステップと、
（ｂ）前記第１および第２の結合部が、それぞれ前記第１および第２の受容体メンバーと結合する条件下において、前記第１および第２の受容体メンバーの二量体化のために、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブを測定されるサンプルと組み合わせるステップと、
（ｄ）前記第１および前記第２の反応基を反応するように近接させるために、前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にするステップと、
（ｅ）前記第１と前記第２の反応基との間の反応を検出することにより、前記第１および第２の受容体メンバーの二量体化プロファイルを決定するステップと、を備える、方法。
【請求項２】
前記受容体のファミリーはＥｒｂＢ受容体ファミリーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥｒｂＢ受容体二量体は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４のホモ二量体から本質的に構成される群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＥｒｂＢ受容体二量体は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４のヘテロ二量体から本質的に構成される群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
受容体のファミリーの二量体化プロファイルを測定するための方法であって、
（ａ）一対のプローブを含むアッセイを提供するステップであって、
（ｉ）第１のプローブが、（１）プロファイルされる受容体二量体の第１のメンバーに対する特異的結合親和性を有する第１の結合部と、（２）第１のオリゴヌクレオチドジップコード配列と、を含み、
（ｉｉ）第２のプローブが、（１）プロファイルされる受容体二量体の第２のメンバーに対する特異的結合親和性を有する第２の結合部と、（２）第２のオリゴヌクレオチドジップコード配列と、を含み、
前記第１のプローブは、（１）前記第１のオリゴヌクレオチドジップコード配列に相補的であるオリゴヌクレオチドの抗ジップコード配列と、（２）第１のレポータオリゴヌクレオチドと、（３）第１の反応基と、を含む第１のレポータプローブにハイブリダイズされ、
前記第２のプローブは、（１）前記第２のオリゴヌクレオチドジップコード配列に相補的であるオリゴヌクレオチドの抗ジップコード配列と、（２）第２のレポータオリゴヌクレオチドと、（３）第２の反応基と、を含む第２のレポータプローブにハイブリダイズされ、
前記第２のレポータオリゴヌクレオチドは、前記第１のレポータオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができ、前記第２の反応基は、互いに反応するように近接させると、前記第１の反応基に反応する、ステップと、
（ｂ）前記第１および第２の結合部が、それぞれ前記第１および第２の受容体メンバーに結合する条件下において、前記第１および第２の受容体メンバーの二量体化のために、前記第１および第２のプローブを測定されるサンプルと組み合わせるステップと、
（ｃ）前記第１および前記第２の反応基を反応するように近接させるために、前記第２のレポータオリゴヌクレオチドが前記第１のレポータオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にするステップと、
（ｄ）前記第１と前記第２の反応基との間の反応を検出することにより、前記第１および第２の受容体メンバーの二量体化プロファイルを判定するステップと、を備える、方法。
【請求項６】
前記受容体のファミリーは前記ＥｒｂＢ受容体ファミリーである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥｒｂＢ受容体二量体は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４のホモ二量体から本質的に構成される群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥｒｂＢ受容体二量体は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４のヘテロ二量体から本質的に構成される群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
受容体のファミリーの二量体化プロファイルを測定するためのアッセイであって、
（ａ）プロファイルされる受容体二量体の第１のメンバーに対する特異的結合親和性を有する第１の結合部を含む第１のプローブであって、前記第１の結合部は、任意選択的に第１のリンカーを介して、第１の反応基と関連する第１のオリゴヌクレオチドへ抱合される第１のプローブと、
（ｂ）プロファイルされる受容体二量体の第２の受容体に対する特異的結合親和性を有する第２の結合部を含む第２のプローブであって、前記第２の結合部は、任意選択的に第２のリンカーを介して、第２の反応基と関連する第２のオリゴヌクレオチドへ抱合される第２のプローブと、を備え、
前記第２のオリゴヌクレオチドは、前記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、互いに反応するように近接させると、前記第２の反応基は前記第１の反応基に反応する、アッセイ。
【請求項１０】
前記受容体のファミリーは前記ＥｒｂＢ受容体ファミリーである、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記ＥｒｂＢ受容体二量体は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４のホモ二量体から本質的に構成される群から選択される、請求項１０に記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記ＥｒｂＢ受容体二量体は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４のヘテロ二量体から本質的に構成される群から選択される、請求項１０に記載のアッセイ。
【請求項１３】
受容体のファミリーの二量体化プロファイルを測定するためのアッセイであって、
（ａ）（１）プロファイルされる受容体二量体の第１のメンバーに対する特異的結合親和性を有する第１の結合部と、（２）第１のオリゴヌクレオチドジップコード配列と、を含む第１のプローブと、
（ｂ）（１）プロファイルされる受容体二量体の第２のメンバーに対する特異的結合親和性を有する第２の結合部と、（２）第２のオリゴヌクレオチドジップコード配列と、を含む第２のプローブと、を備え、
前記第１のプローブは、（１）前記第１のオリゴヌクレオチドジップコード配列に相補的であるオリゴヌクレオチドの抗ジップコード配列と、（２）第１のレポータオリゴヌクレオチドと、（３）第１の反応基と、を含む第１のレポータプローブにハイブリダイズされ、
前記第２のプローブは、（１）前記第２のオリゴヌクレオチドジップコード配列に相補的であるオリゴヌクレオチドの抗ジップコード配列と、（２）第２のレポータオリゴヌクレオチドと、（３）第２の反応基と、を含む第２のレポータプローブにハイブリダイズされ、
前記第２のレポータオリゴヌクレオチドは、前記第１のレポータオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができ、前記第２の反応基は、互いに反応するように近接させると、前記第１の反応基に反応する、アッセイ。
【請求項１４】
前記受容体のファミリーは前記ＥｒｂＢ受容体ファミリーである、請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項１５】
前記ＥｒｂＢ受容体二量体は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４のホモ二量体から本質的に構成される群から選択される、請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１６】
前記ＥｒｂＢ受容体二量体は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４のヘテロ二量体から本質的に構成される群から選択される、請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１７】
ＤＮＡプログラム化学を介して生成されるシグナルを検出するステップを備える、受容体ファミリーのプロファイルを分析するための方法。
【請求項１８】
前記受容体ファミリーは前記ＥｒｂＢ受容体ファミリーであり、前記シグナルはＥｒｂＢ二量体化を分析するために生成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記受容体ファミリーはＢＣＬ２ファミリー、ＩＡＰファミリーまたは三量体Ｇタンパク質のＧβγサブユニットである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的標的を検出するための方法であって、
（ａ）第１のプローブを提供するステップであって、前記第１のプローブは、（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第１の結合部と、（２）第１のオリゴヌクレオチド配列と、（３）前記第１のオリゴヌクレオチド配列と関連する第１の反応基と、を含む、ステップと、
（ｂ）第２のプローブを提供するステップであって、前記第２のプローブは、（１）前記生物学的標的に対する結合親和性を有する第２の結合部と、（２）第２のオリゴヌクレオチド配列と、（３）前記第２のオリゴヌクレオチド配列と関連する第２の反応基と、を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドは前記第１のオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができ、前記第２の反応基は、互いに反応するように近接させると、前記第１の反応基に反応する、ステップと、
（ｃ）前記第１および第２の結合部が前記生物学的標的と結合する条件下において、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブを、前記生物学的標的の存在について検査されるサンプルと組み合わせるステップと、
（ｄ）前記第１および前記第２の反応基を反応するように近接させるために、前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にするステップと、
（ｅ）前記第１と前記第２の反応基とのの間の反応を検出することにより、前記生物学的標的の存在を判定するステップと、を備え、
前記第１と第２の反応基との間の反応はローダミンまたはその類似体を生成する、方法。
【請求項２１】
前記第１の反応基は、ＤＡＺＲ部またはその類似体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の反応基は、ホスフィン部またはその類似体を含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００６年９月１８日に出願された米国特許出願第６０／８４５，３３０号、２００６年９月２８日に出願された同第６０／８４７，８５９号、２００７年３月７日に出願された同第６０／９０５，３６４号、および２００７年３月１４日に出願された同第６０／９１８，０２３号の利益および優先権を主張するものであり、参照することにより、各特許出願の開示の全体は、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、概して、生物学的検出および診断におけるアッセイ技術およびその使用に関する。より具体的には、本発明は、受容体（およびそれらのファミリー）およびタンパク質（およびそれらのファミリー）の生物学的検出において、核酸を鋳型とする化学における組成物および方法、ならびに診断におけるそれらの使用に関する
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡプログラム化学（ＤＮＡ‐Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＤＰＣ））技術は、反応性の化学基または基礎的要素に付着したオリゴヌクレオチドを用い、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを介して当該オリゴヌクレオチドが特異的に化学反応を導く方法である。反応物を１つにまとめる際のＤＮＡの使用は、反応の化学量論を制御し、活性化のエネルギーを低下させ、反応物を分離して、生理的条件下における高度に特異的な反応を確かなものにする。ＤＰＣの用途の１つにはタンパク質の検出がある。例えば、非特許文献１；非特許文献２；特許文献１；特許文献２；Ｃｏｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．による特許文献３を参照。ＤＰＣは、バイオマーカーの低ノイズ検出および／または特異的検出の可能性を提供するため、バイオマーカーのプロファイルの効率的かつ正確な検出および分析に有用な方法および組成物が望ましく、また、それによって診断および潜在的な治療オプションを改良することが可能である。
【０００４】
例えば、受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーは、ホモ二量体およびヘテロ二量体を含む多種の組み合わせの相互作用に関与する。ＥｒｂＢの過剰発現は、乳房、大腸、前立腺、肺、卵巣、および脳の癌と関連している。ＥｒｂＢを対象とした治療薬は、かかるＥｒｂＢの過剰発現による癌に対して効果的であるが、十分に解明されていない理由のためにその有効性は限られており、また変化しやすい。例えば、トラスツズマブ（ハーセプチンＴＭ）は、ＥｒｂＢ２に対する免疫組織化学的（ＩＨＣ）検査（ハーセプテストＴＭ）を用いて診断することができるＥｒｂＢ２過剰発現による転移性乳癌に有効ではあるものの、トラスツズマブは、かかる症例のごく少数にのみ有効である。有効性が限られている主な理由は、適切な患者を選択するために用いられる現在の診断検査では、活性化した受容体二量体を認識できないことである。これは、依然として、今日の技術における重要な技術的課題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，０７０，９２８号明細書
【特許文献２】米国特許第７，２２３，５４５号明細書
【特許文献３】国際公開第２００６／１２８１３８号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇａｒｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３０５，ｐｐ．１６０１‐１６０５
【非特許文献２】Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ，２００４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｖｏｌ．４３，ｐｐ．４８４８‐４８７０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、バイオマーカープロファイリング（例えば、ＥｒｂＢ受容体ファミリーの二量体化プロファイル）はＤＰＣに基づく検出方法によって達成することができる、という発見に一部基づく。より具体的には、すべての既知のＥｒｂＢファミリー二量体のための免疫組織化学（ＩＨＣ）に基づくＥｒｂＢ二量体アッセイは、タンパク質複合体の高度に特異的な検出のためのＤＮＡプログラム化学を用いて開発することができる。これらのアッセイは、癌組織サンプルの完全なＥｒｂＢファミリーのプロファイリングに基づいて、個々の患者における薬物応答および癌の予後予測を可能にすることが見込まれる。ホルマリン固定パラフィン包埋組織サンプルを用いるこれらのアッセイは、ＥｒｂＢタンパク質が異常調節されるすべての癌の診断、治療、および予後を改良するであろう。
【０００８】
一態様において、本発明は、受容体のファミリーの二量体化プロファイルを測定するための方法に関連する。該方法は、（ａ）一対のプローブを含むアッセイを提供するステップであって、（ｉ）第１のプローブが、プロファイルされる受容体二量体の第１のメンバーに対する特異的結合親和性を有する第１の結合部を含み、上記第１の結合部は、任意選択的に第１のリンカーを介して、第１の反応基と関連する第１のオリゴヌクレオチドへ抱合され、（ｉｉ）第２のプローブが、プロファイルされる受容体二量体の第２の受容体に対する特異的結合親和性を有する第２の結合部を含み、上記第２の結合部は、任意選択的に第２のリンカーを介して、第２の反応基と関連する第２のオリゴヌクレオチドへ抱合され、上記第２のオリゴヌクレオチドは、上記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、上記第２の反応基は、互いに反応するように近接させると、上記第１の反応基に反応する、ステップと、（ｂ）上記第１および第２の結合部が、それぞれ上記第１および第２の受容体メンバーと結合する条件下において、上記第１および第２の受容体メンバーの二量体化のために、上記第１のプローブおよび上記第２のプローブを測定されるサンプルと組み合わせるステップと、（ｄ）上記第１および上記第２の反応基を反応するように近接させるために、上記第２のオリゴヌクレオチドが上記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にするステップと、（ｅ）上記第１と上記第２の反応基との間の反応を検出することにより、上記第１および第２の受容体メンバーの二量体化プロファイルを判定するステップと、を備える。
【０００９】
他の態様において、本発明は、受容体のファミリーの二量体化プロファイルを測定するための方法に関連する。該方法は（ａ）一対のプローブを含むアッセイを提供するステップであって、（ｉ）第１のプローブが、（１）プロファイルされる受容体二量体の第１のメンバーに対する特異的結合親和性を有する第１の結合部と、（２）第１のオリゴヌクレオチドジップコード配列と、を含み、（ｉｉ）第２のプローブが、（１）プロファイルされる受容体二量体の第２のメンバーに対する特異的結合親和性を有する第２の結合部と、（２）第２のオリゴヌクレオチドジップコード配列と、を含み、上記第１のプローブは、（１）上記第１のオリゴヌクレオチドジップコード配列に相補的であるオリゴヌクレオチドの抗ジップコード配列と、（２）第１のレポータオリゴヌクレオチドと、（３）第１の反応基と、を含む第１のレポータプローブにハイブリダイズされ、上記第２のプローブは、（１）上記第２のオリゴヌクレオチドジップコード配列に相補的であるオリゴヌクレオチドの抗ジップコード配列と、（２）第２のレポータオリゴヌクレオチドと、（３）第２の反応基と、を含む第２のレポータプローブにハイブリダイズされ、上記第２のレポータオリゴヌクレオチドは、上記第１のレポータオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができ、上記第２の反応基は、互いに反応するように近接させると、上記第１の反応基に反応する、ステップと、（ｂ）上記第１および第２の結合部が、それぞれ上記第１および第２の受容体メンバーに結合する条件下において、上記第１および第２の受容体メンバーの二量体化のために、上記第１および第２のプローブを測定されるサンプルと組み合わせるステップと、（ｃ）上記第１および上記第２の反応基を反応するように近接させるために、上記第２のレポータオリゴヌクレオチドが上記第１のレポータオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にするステップと、（ｄ）上記第１と上記第２の反応基との間の反応を検出することにより、上記第１および第２の受容体メンバーの二量体化プロファイルを判定するステップと、を備える。
【００１０】
さらに別の態様において、本発明は、受容体のファミリーの二量体化プロファイルを測定するためのアッセイに関連する。該アッセイは（ａ）プロファイルされる受容体二量体の第１のメンバーに対する特異的結合親和性を有する第１の結合部を含む第１のプローブであって、上記第１の結合部は、任意選択的に第１のリンカーを介して、第１の反応基と関連する第１のオリゴヌクレオチドへ抱合される第１のプローブと、（ｂ）プロファイルされる受容体二量体の第２の受容体に対する特異的結合親和性を有する第２の結合部を含む第２のプローブであって、上記第２の結合部は、任意選択的に第２のリンカーを介して、第２の反応基と関連する第２のオリゴヌクレオチドへ抱合される第２のプローブと、を備え、上記第２のオリゴヌクレオチドは、上記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、互いに反応するように近接させると、上記第２の反応基は上記第１の反応基に反応する。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、受容体のファミリーの二量体化プロファイルを測定するためのアッセイに関連する。該アッセイは、（ａ）（１）プロファイルされる受容体二量体の第１のメンバーに対する特異的結合親和性を有する第１の結合部と、（２）第１のオリゴヌクレオチドジップコード配列と、を含む第１のプローブと、（ｂ）（１）プロファイルされる受容体二量体の第２のメンバーに対する特異的結合親和性を有する第２の結合部と、（２）第２のオリゴヌクレオチドジップコード配列と、を含む第２のプローブと、を備え、上記第１のプローブは、（１）上記第１のオリゴヌクレオチドジップコード配列に相補的であるオリゴヌクレオチドの抗ジップコード配列と、（２）第１のレポータオリゴヌクレオチドと、（３）第１の反応基と、を含む第２のレポータプローブにハイブリダイズされ、上記第２のプローブは、（１）上記第２のオリゴヌクレオチドジップコード配列に相補的であるオリゴヌクレオチドの抗ジップコード配列と、（２）第２のレポータオリゴヌクレオチドと、（３）第２の反応基と、を含む第２のレポータプローブにハイブリダイズされ、上記第２のレポータオリゴヌクレオチドは、上記第１のレポータオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができ、上記第２の反応基は、互いに反応するように近接させると、上記第１の反応基に反応する。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、生物学的標的を検出するための方法に関連する。該方法は、（ａ）第１のプローブを提供するステップであって、上記第１のプローブは、（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第１の結合部と、（２）第１のオリゴヌクレオチド配列と、（３）上記第１のオリゴヌクレオチド配列と関連する第１の反応基と、を含む、ステップと、（ｂ）第２のプローブを提供するステップであって、上記第２のプローブは、（１）上記生物学的標的に対する結合親和性を有する第２の結合部と、（２）第２のオリゴヌクレオチド配列と、（３）上記第２のオリゴヌクレオチド配列と関連する第２の反応基と、を含み、上記第２のオリゴヌクレオチドは上記第１のオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができ、上記第２の反応基は、互いに反応するように近接させると、上記第１の反応基に反応する、ステップと、（ｃ）上記第１および第２の結合部が上記生物学的標的と結合する条件下において、上記第１のプローブおよび上記第２のプローブを、上記生物学的標的の存在について検査されるサンプルと組み合わせるステップと、（ｄ）上記第１および上記第２の反応基を反応するように近接させるために、上記第２のオリゴヌクレオチドが上記第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にするステップと、（ｅ）上記第１と上記第２の反応基とのの間の反応を検出することにより、上記生物学的標的の存在を判定するステップと、を備え、上記第１と第２の反応基との間の反応はローダミンまたはその類似体を生成する。
【００１３】
ある実施形態において、受容体のファミリーはＥｒｂＢ受容体ファミリーであり、任意選択的に、ＥｒｂＢ受容体二量体は、本質的に（例えば、８０％を上回る、９０％を上回る、９５％を上回る、９７％を上回る、９９．５％を上回る、および／または９９．９％を上回る）、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４のホモ二量体から構成される群から選択される。ある実施形態において、ＥｒｂＢ受容体二量体は、本質的に（例えば、８０％を上回る、９０％を上回る、９５％を上回る、９７％を上回る、９９．５％を上回る、および／または９９．９％を上回る）、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４のヘテロ二量体から構成される群から選択される。
【００１４】
別の態様において、本発明は、ＤＮＡプログラム化学を介して生成されるシグナルを検出するステップを備える、受容体ファミリーの利益を分析するための方法に関連する。本発明の本態様またはいずれの態様における受容体ファミリーは、ＥｒｂＢ受容体ファミリー（または、任意選択的に、シグナルはＥｒｂＢ二量体化を分析するために生成される）、ＢＣＬ２ファミリー、ＩＡＰファミリー、または三量体Ｇタンパク質のＧβγサブユニットであり得る。
【００１５】
（定義）
本明細書で用いられる「ＤＮＡプログラム化学」または「ＤＰＣ」という用語は、核酸を鋳型とする化学を意味し、例えば、（１）反応基と関連する１つ以上の鋳型を提供すること、（２）アンチコドン（例えば、１つ以上の鋳型を有する相補的配列）を有する１つ以上の転移基（試薬）と反応基を、鋳型とハイブリダイゼーションするための条件下で接触させること、および（３）産物を得るために反応基の反応によって達成される、特異的産物をもたらすための化学反応物の核酸配列特異的制御である。例えば、一段階の核酸鋳型反応においては、「鋳型」および「相補的」オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、反応基を集合させ、続いて所望の産物をもたらす化学反応を起こす。反応物および産物の構造は、鋳型および転移基のオリゴヌクレオチドを含む核酸の構造と関連する必要はない。例えば、Ｌｉｕらによる米国特許第７，０７０，９２８  Ｂ１号および第７，２２３，５４５号、ならびに欧州特許第１，４２３，４００  Ｂ１、Ｌｉｕらによる米国特許公開第２００４／０１８０４１２（ＵＳＳＮ  １０／６４３，７５２；ＡＵＧ  １９，２００３）、Ｇａｒｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３０５，ｐｐ．１６０１‐１６０５；Ｄｏｙｏｎ，ｅｔ  ａｌ，２００３，ＪＡＣＳ，ｖｏｌ．１２５，ｐｐ．１２３７２‐１２３７３を参照（参照することにより、そのすべては明示的に本明細書に組み込まれる）。２００６年５月３日出願のＣｏｕｌｌらによるＰＣＴ  ＷＯ０７／００８２７６Ａ２「Ｔｕｒｎ  Ｏｖｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」も参照のこと。
【００１６】
本明細書において用いられる「核酸」、「オリゴヌクレオチド」（単に「オリゴ」と称される場合もある）、または「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを意味する。ポリマーには、天然ヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２‐アミノアデノシン、２‐チオチミジン、イノシン、ピロロ‐ピリミジン、３‐メチルアデノシン、５‐メチルシチジン、Ｃ５‐ブロモウリジン、Ｃ５‐フルオロウリジン、Ｃ５‐ヨードウリジン、Ｃ５‐プロピニル‐ウリジン、Ｃ５‐プロピニル‐シチジン、Ｃ５‐メチルシチジン、７‐デアザアデノシン、７‐デアザグアノシン、８‐オキソアデノシン、８‐オキソグアノシン、Ｏ（６）‐メチルグアニン、および２‐チオシチジン）、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化された塩基）、挿入された塩基、修飾された糖（例えば、２’‐フルオロリボース、リボース、２’‐デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、または修飾されたホスフェート基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’‐Ｎ‐ホスホラミダイト結合）を含みうるが、これらに限定されない。核酸およびオリゴヌクレオチドは、他にも、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）等、修飾されたバックボーンを有する塩基の他のポリマーを含み得る。
本発明の記述全体にわたって、組成物が特定の構成要素を有する、含む、もしくは備えると記載される場合、または工程が特定の工程ステップを有する、含む、もしくは備えると記載される場合には、本発明の組成物は、列挙される構成要素から本質的に構成されるか、または構成されることも想定され、本発明の工程は列挙される工程ステップから本質的に構成されるか、または構成されることも想定される。また、本発明が機能可能である限りは、ステップの順序またはある動作を行うための順序は重要ではないことを理解されたい。さらに２つ以上のステップまたは動作が同時に行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明は、以下の図面からさらに理解することができる。
【図１】本発明の一実施形態における、生物学的標的の検出のための方法の略図を、ジップコード形式で示した図である。
【図２】本発明の一実施形態における、生物学的標的の検出のための方法の略図を、非ジップコード形式で示した図である。
【図３】本発明の一実施形態における、受容体の二量体化の検出のための方法の略図を、非ジップコード形式で示した図である。
【図４】本発明の一実施形態における、受容体の二量体化の検出のための方法の略図を、ジップコード形式で示した図である。
【図５】ポリメチン、シアニンおよびヘミシアニン色素の一般的な化学構造を示す図である。
【図６】ＤＰＣに基づくヘミシアニン形成の略図である。
【図７】多重化ならびにアルデヒドおよび第四級塩前駆体に有用なヘミシアニン色素の一般的な化学構造を示す図である。
【図８】４重ヘミシアニン＿ＤＮＡ染色システムの化学構造およびそれらの分光学的特性を示す図である。
【図９】本発明の一実施形態における、生物学的標的の検出のための方法の略図である。
【図１０】本発明の一実施形態における、生物学的標的の検出のための方法の略図である。
【図１１】濃度、温度、および単一の塩基対ミスマッチの有無の影響を受けたハイブリダイゼーションの例を示す図である。
【図１２】ある融解曲線の実験における例示的なオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図１３】本発明の一実施形態における、生物学的標的の検出のための方法の略図である。
【図１４】本発明の一実施形態における、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）の検出のための方法の略図である。
【図１５】アプタマーを標的結合部として用いる、スプリント付き、ジップコード形式の検出システムの例示的な実施形態を示す図である。
【図１６】抗体を標的結合部として用いる、スプリント付き、ジップコード形式の検出システムの例示的な実施形態を示す図である。
【図１７】抗体を標的結合部として用いる、スプリント付き、ジップコード形式の検出システムの例示的な実施形態を示す図である。
【図１８】ＤＰＣによる２つの蛍光ヘミシアニン色素の生成の一実施形態を示す図である。
【図１９】インドリニウム（ｉｎｄｏｌｉｎｉｕｍ）縮合を用いた、ＥＧＦＲホモ二量体のためのＤＰＣアッセイのある結果を示す図である。
【図２０】Ｎ８７細胞上における、ＥｒｂＢ２二量体のための、ＤＡＺＲに基づくＤＰＣアッセイのある結果を示す図である。
【図２１】Ａ４３１細胞上における、ＥｒｂＢ２二量体のための、ＤＰＣアッセイ（インドリニウム縮合）のある結果を示す図である。
【図２２】トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）およびアジドクマリン（ＡｚＣ）レポータ化学による蛍光シグナルの生成および生物学的標的の検出の一例を示す図である。
【図２３】ＴＰＰおよびＡｚＣレポータ化学による蛍光シグナルの生成および生物学的標的の検出の一例を示す図である。
【図２４】オリゴヌクレオチド濃度がＴｍに及ぼす影響を示す融解曲線のある例を示す図である。
【図２５】アビジン有／無のビオチン化オリゴヌクレオチドのＤＮＡハイブリダーゼーションの融解曲線のある例を示す図である。
【図２６】アビジンとの結合時における、相補的ビオチン化オリゴのＴｍ変化のある例を示す図である。
【図２７】オリゴヌクレオチド＋／−ビオチンの、Ｔｍに対する、塩およびマグネシウム濃度の影響のある例を示す図である。
【図２８】異なるオリゴヌクレオチド対アビジン比率における、ビオチン化オリゴヌクレオチドの融解温度挙動のある例を示す図である。
【図２９】アビジンの存在下および不在下におけるビオチン−５’（＋）鎖オリゴとの二重構造を持つ５’および３’（−）ビオチン鎖オリゴの融解曲線のある例を示す図である。
【図３０】アビジンの存在下および不在下におけるＡＴリッチなビオチン化オリゴ二量体の融解曲線のある例を示す図である。
【図３１】本発明の一実施形態における、生物学的標的の検出のための方法の略図である。
【図３２】本発明の一実施形態における、生物学的標的の検出の実験結果の例を示す図である。
【図３３】本発明の一実施形態における、生物学的標的の検出の実験結果（反応混合物中のホルムアミドの影響）の例を示す図である。
【図３４】本発明の一実施形態における、生物学的標的の検出の実験結果（反応混合物中のホルムアミドの影響）の例を示す図である。
【図３５】本発明の一実施形態における、生物学的標的の検出に関する実験結果（反応混合物中のホルムアミドの影響）の例を示す図である。
【図３６】本発明の一実施形態における、生物学的標的の検出に関する実験結果（反応混合物の経時変化）の例を示す図である。
【図３７】本発明の一実施形態における、生物学的標的の検出に関する実験結果（反応混合物の時間経過）の例を示す図である。
【図３８】本発明の一実施形態における、生物学的標的の検出に関する実験結果（プローブ比率）の例を示す図である。
【図３９】ジップコード形式の検出システムによるＰＤＧＦの検出の一例を示す図である。
【図４０】アプタマーとレポータの比率に関する実験を示す図である。
【図４１】ＰＤＧＦの検出のための「一体化」検出システムの一実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
最も簡略に述べると、本発明は、ＤＮＡプログラムのプローブ化学を用いた、バイオマーカーファミリーの測定およびプロファイリングのための方法および組成物を提供する。
【００１９】
ＥｒｂＢ二量体のプロファイリング
例えば、本発明は、受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーの二量体化プロファイルの測定および分析のための方法および組成物を提供する。
【００２０】
ＥｒｂＢ受容体のファミリーは、ＥｒｂＢ１（ヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体１（ＨＥＲ１）またはＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）としても知られる）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２またはＮｅｕとしても知られる）、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４を含む。それらは、細胞外の配位子結合領域、単一の膜貫通領域、中断されていないチロシンキナーゼ領域、および細胞質側末端から構成され、ホモ二量体およびヘテロ二量体に関与する組み合わせの相互作用のアレイに関係する。例えば、Ｃｉｔｒｉ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２００６．７（７），５０５‐１６；Ｍｕｔｈｕｓｗａｍｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９９．１９（１０），６８４５‐５７；Ｈｙｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，２００５，５（５）３４１‐５４を参照。
【００２１】
それらは、多くのヒト癌の発達に関係してきており、また治療標的として熱心に追及されてきた。Ｈｙｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，２００５，５（５）３４１‐５４；Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６  ３１２（５７７７），１１７５‐８を参照。ＥｒｂＢに特異的な治療薬は臨床的有効性を示してきたが、前臨床試験で予測されたほど抗腫瘍効果が強くないことが多い。例えば、ＥｒｂＢ２過剰発現による転移性乳癌を罹患する患者のうちのわずか３５％しか、トラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２、ハーセプチンＴＭ）療法に効果的に反応しない。Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２００２，２０（３）７１９‐２６．さらに、トラスツズマブは、ある程度、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２の両方が上昇レベルを示す乳癌の治療において有効であるが、いつもそうであるとは限らない。確かに、ＥｒｂＢのホモ二量体およびヘテロ二量体は、シグナリング、リガンドに対する応答、および腫瘍形成特性において異なっている。Ｃｉｔｒｉ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２００６．７（７），５０５‐１６；Ｍｕｔｈｕｓｗａｍｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９９．１９（１０），６８４５‐５７；Ｈｙｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，２００５，５（５）３４１‐５４．従って、腫瘍細胞のＥｒｂＢファミリーメンバーのレベルおよび二量体化状態における差異が、患者間での薬剤有効性における差異に起因することは、十分に考えられることである。例えば、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３の同時発現は、ハーセプチンＴＭ治療に対する反応性を予測するものであり得る。ハーセプチン療法の有効性は、他のＥｒｂＢ受容体の発現、それらのリガンド、および下流のシグナル伝達タンパク質の活性化によって影響を受ける。Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２００４，９１（６），１１９０‐４；Ｗｅｈｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２００６，１０３（５０），１９０６３‐８．
さらに、抗癌療法は、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ２二量体を妨害する抗体（例えば、オムニターグＴＭ）を含むが、組織サンプルから二量体の状態を検出するために利用できる安定したアッセイが存在しないため、治療反応性を予測することができない。また、ＥｒｂＢ２のｍＲＮＡ内における代替的な翻訳開始の結果として、ＥｒｂＢ２細胞外領域（ＥＣＤ）‐切断型の存在が、トラスツズマブに対する耐性を促進する可能性がある。Ａｎｉｄｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｅｍｂｏ  Ｊ，２００６，２５（１３），３２３４‐４４．従って、全長型受容体対切断型受容体の検出が、トラスツズマブに対する反応性を予測する助けとなる可能性がある。
【００２２】
ＥｒｂＢ受容体のホモ二量体化およびヘテロ二量体化は、プローブセットを用いて測定される。各セットは、特異的な二量体を特別に標的とする。「ジップコードされた」レポータの形式を含む図１に示すように、各プローブセットは、対応するレポータオリゴヌクレオチド（レポータＤＮＡ）に別個に結合する一対の反応基（反応性前駆体ＲｌおよびＲ２）を含む。オリゴヌクレオチドの対は配列において相補的である。反応性前駆体は、関連する結合部（例えば、ＥｒｂＢ抗体）が対応するＥｒｂＢ単量体に結合することに起因する、相補的オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションイベントを通して、反応するように近接させた場合にのみ反応する。例えば、反応性前駆体は、前駆体の対が近接している時、すなわち、関連する抗体がそれらの標的タンパク質のヘテロ二量体またはホモ二量体に原位置で結合する時に、蛍光産物（例えば、ローダミン）を生成する非蛍光前駆体の対（例えば、ジアジドローダミン（ＤＡＺＲ）およびビスジフェニルホスフィン）であり得る。この方法は、ホモ二量体、ヘテロ二量体、抗体、および核酸を検出するために用いることができる。
【００２３】
非ジップコードレポータの設計を用いる別の形式を図２に示す。結合部は、対応する相補的なレポータオリゴヌクレオチドを介して、それぞれの反応性前駆体に直接的に結合されている。
【００２４】
図３は、複数のＥｒｂＢファミリー受容体のための多重式のＩＨＣ試験を示す。複数対のプローブ（各対は異なるＤＰＣ産物（例えば、示すように各対からの異なる蛍光シグナル）を有する特定のＥｒｂＢホモまたはヘテロ二量体を標的とする）は、複数のＥｒｂＢ受容体二量体の検出およびプロファイリングを同時に提供することができる。ジップコードされたプローブ対（図４に示す）および非ジップコードプローブ対の両方を、多重試験に用いることができる。レポータ化学に関しては、多重検出システムにポリメチン色素が用いられてもよい。
【００２５】
ポリメチン色素は、それらのポリエン鎖の反対側の末端に電子供与体および電子受容体を有するメチン（‐ＣＨ＝）基の鎖によって特徴付けられる（図５）。（Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｃｏｌｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ，３ｎｄ  Ｅｄｎ．，Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｐｏｓｔｆａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，２００３）．ポリメチン色素の典型的なＡおよびＤ末端（図５に示す）は、チアゾール、ピロール、ピロリン、インドール、１，３，３‐トリメチルインドリン、テトラゾール、ピリミジン、ピリジン、キノリン、および高縮合Ｎ‐複素環または任意の置換ベンジル環をも含む。両方の末端がＮ原子を含有する複素環である場合には、化合物はシアニンと称される。１つのＮ原子のみが環系の一部である場合には、化合物はヘミシアニンと称される。ポリエン鎖内のビニル基の数を変更することにより、ポリメチン色素の蛍光発光波長を近紫外線から近赤外線に調整することが可能である。末端基も、より精巧な調整のための手段を提供する可能性がある。
【００２６】
図６は、らせん構造の末端を介したＤＰＣへミシアニン形成の一例を示す。アニーリング時には、２つのへミシアニン前駆体が、らせんの末端で反応するよう近接して配置され、縮合後に両方のＤＮＡに結合したへミシアニンが形成される。
【００２７】
図７は、多重化ならびにそれらのアルデヒドおよび第四級塩前駆体に有用なへミシアニン色素の一般的な化学構造を示す。一般的な構造に由来する４重へミシアニン＿ＤＮＡ色素の一例、ならびにそれらの最大ＵＶ吸収および蛍光の発光波長を図８に記載する。
【００２８】
ＤＰＣに基づく二量体プロファイリングの利点には、以下が含まれる。（１）高感度。ＤＮＡハイブリダイゼーションは、反応物の有効モル濃度を上昇させるので（ｎＭ台の濃度からｍＭ台の有効濃度まで、１０６倍）、アッセイは非常に低いプローブ濃度で行うことができる。（２）低い非特異的バックグラウンド。従来のアッセイの多くは、プローブが標識に結合した時の、または化学もしくは酵素イベントによって、フルオロフォア、クエンチャー、もしくは保護基が、標的に結合したプローブから遊離（切断）した時の、フルオロフォア標識プローブの蛍光における増加または減少に依存する。関連する蛍光バックグラウンドは通常高い。ＤＰＣに基づくアッセイにおいて、非蛍光前駆体が使用される場合には、非特異的バックグランドを非常に低く（「ゼロ」）維持することができる。例えば、へミシアニンに基づくＤＰＣシステムでは、プローブの標的タンパク質のへテロ二量体またはホモ二量体に結合後、および蛍光シグナル分子を作製するための反応時にのみ、プローブが蛍光になる。（３）特異性および親和性の向上。本発明のアッセイフォーマットは、２つのプローブおよび標識の二重認識を必要とする。分析物の認識は、２つの独立した結合イベントを伴う（タンパク質認識および核酸ハイブリダイゼーション）。したがって、二量体化によって誘導される核酸ハイブリダイゼーションおよびＤＰＣは、その検出特異性を著しく向上する。例えば、完全にマッチしたオリゴヌクレオチド配列を有するプローブ対のみが、蛍光へミシアニン産物を産生することができる。（４）機能的状況における検出。ＤＰＣに基づくアッセイフォーマットは、それらが機能する状況における受容体の検出および二量体化を可能にする。該アッセイは生物系に低侵襲である。また非常に単純で、ポイント・オブ・ケアまたはポイント・オブ・セールの形式に沿うものである。（５）本明細書に記載されるように、多重プラットフォームにカスタマイズ可能である。
【００２９】
ＤＰＣに基づくタンパク質の検出
核酸を鋳型とする化学に基づくプローブを用いた生物学的検出の方法および組成物は、ＣｏｕｌｌらによるＷＯ０６１２８１３８Ａ２に記載され、参照することにより、その全体は本明細書に組み込まれる。
【００３０】
図９および図１０は、タンパク質標的の検出のための本発明の一実施形態を示す。
【００３１】
図９は、ＤＰＣに基づくプローブによるタンパク質標的の検出の実施形態を示す。２つのプローブは、標的結合部、相補的オリゴヌクレオチド、および化学反応種ＸおよびＹを、それぞれ含有する。ハイブリダイゼーション時には、ＸとＹは反応して、共有結合的に両方のプローブを結合し得る、または結合し得ないシグナル生成（例えば、蛍光）化合物を作製する。ＸとＹの反応産物は、非結合性の可溶性化合物として、溶液中に放出され得る。タンパク質標的は、ビーズの表面、スライドガラス（マイクロアレイ）等の固相に付着し得るか、または溶液中に存在し得る。標的結合部は、例えば、アプタマー、抗体、抗体断片（すなわち、Ｆａｂ）、受容体タンパク質、または小分子であり得る。
【００３２】
図１０により具体的に示すのは、各々が「プレフルオロフォア」前駆体（Ｒ１およびＲ２）を持ち、互いにアニーリングするように設計された標的およびオリゴヌクレオチド配列のための結合部を含有する、２つのプローブを用いる２重プローブアプローチの例である。この実施形態では、標的の不在下ではプレフルオロフォアオリゴが互いにアニーリングしない条件下において、検出が行われる。これらの条件は、一般的に、標的の不在下において、周囲温度がオリゴヌクレオチド対のＴｍよりも高くなるように（意図する標的分析物の不在下においてオリゴ対がアニーリングしないように）選択される。しかしながら、意図する標的の存在下においては、局在化した高濃度のオリゴがそれらの２本鎖複合体のＴｍを上昇させてハイブリダイゼーションが起こり、続いてシグナル生成核酸鋳型の反応（Ｒ１とＲ２との間の反応）が起こる。シグナル生成核酸鋳型の反応は、両方とも局在化した高濃度のプレフルオロフォアによって促進されるが、プレフルオロフォア基の互いに対する近接性および配向によっても促進され得る。このシグナル生成の構成は、様々な生体分子、細胞、表面を検出するため、および原位置アッセイの設計のためのキットの作製を実現する可能性を有する。シグナル生成は酵素を必要とせず、均一なフォーマットはサンプル操作を必要としない。
【００３３】
図１０では、２つのオリゴヌクレオチドが示されており、その各々は任意選択的なスペーサアームを介して別個の結合剤（本例では抗体であるが、アプタマーまたは小分子等の他の結合剤であってもよい）と結合している。各抗体は、タンパク質等の共通した標的分析物上で別個のエピトープを認識する。オリゴと結合剤の間に、１つまたは両方のオリゴヌクレオチドにスペーサアームが加えられてもよい。ある場合においては、このスペーサアームは、所望の反応性を達成するための近接要件を満たすために要求され得る。原則的にスペーサアームは、例えば、直鎖または分岐鎖の脂肪族炭素鎖Ｃ３〜Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ１５、Ｃ２０、Ｃ２５、Ｃ３０、Ｃ３５、Ｃ４０、またはＣ１００基、１〜１０、１５、２０、３０、５０または１００塩基長のＤＮＡ配列、または適切な長さのポリエチレングリコールオリゴマー等のいずれの好適な基でもあり得る。
【００３４】
プレフルオロフォアは、一方がオリゴの５’末端に付着し、他方が３’末端に付着して、「らせんの末端」構成（図１０上）で存在し得る。（例えば、２つのプレフルオロフォアを配列内に配置させる、または１つのオリゴを部分的なヘアピン構造（例えば、１００オングストロームの長さ）にハイブリダイズさせる等、他の構成が適用されてもよい）。最初の例では、１つのオリゴヌクレオチドはスペーサアームおよび標的結合剤に５’で付着しており、もう一方はスペーサアームおよび別個の標的結合剤に３’で付着している。スペーサアームは、非相補的ＤＮＡ配列、またはエチレングリコールのオリゴマー等の合成スペーサアームから構成され得、近接要件を満たすように加えられ得る。かかるスペーサアームは、非常に柔軟であり得、硬いスペーサで起こり得る、結合に関するいかなる立体障害をも克服するという利点を有する。オリゴヌクレオチドが逆平行構成でアニーリングすることが可能であり、反応基が互いに反応することができる限りは、適切な長さのスペーサアームの設計は、両方のオリゴヌクレオチドをそれらの結合剤に５’で結合するか（図１０下）、または両方を３’で結合することを可能にする。各標的について最適なスペーサアームの長さが設計され得る。過剰に長いスペーサアームは、システムにおける特異性を低下するか、またはＴｍを上げる効果を減少させる可能性があるので、避けるべきである。
【００３５】
一対のオリゴヌクレオチド連結することによって得られる近接効果は、溶液中に遊離するオリゴヌクレオチドと比較して、２つの相補的オリゴヌクレオチド配列をアニーリングする動態に影響を及ぼす可能性がある。さらに重要なことに、局在化した高濃度は、遊離複合体と比較して融解曲線を上向きに変化させる、すなわち、複合体のＴｍを上昇させる。バルク溶液では、下の方程式に示されるように、Ｔｍが総オリゴヌクレオチド濃度に依存することが知られている。Ｗｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔｉ．Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，２６，２２７‐２５９。
Ｔｍ＝（１０００＊ΔＨ）／（Ａ＋ΔＳ＋Ｒ  ｌｎ（Ｃ１／４）‐２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ  Ｎａ＋）
式中、ΔＨおよびΔＳはらせん形成のエンタルピーおよびエントロピーであり、Ｒはモル気体定数であり、Ｃ１はオリゴマーの総濃度であり、Ｎａ＋は、溶液中のナトリウムイオンのモル濃度である。
【００３６】
図１１は、０．１Ｍ塩中の短いオリゴヌクレオチドの範囲内のＴｍ対濃度の勾配であり、上記の方程式に基づいて、オリゴヌクレオチド（図１２の配列）の濃度が１０倍増加すると約＋７℃温度が上昇するという依存性を示す。つまり、例えば、局所濃度が１０００倍上昇すると、Ｔｍは約＋２１℃上昇することが予測される。
【００３７】
ＲｌとＲ２との反応産物は、化学変換の結果として、ハイブリダイゼーション複合体から放出され得る。したがって、フルオロフォアまたは発色団は、ハイブリダイゼーション複合体から分離されて独立して分析され得るか、または、フルオロフォアもしくは発色団およびアニーリングされたオリゴヌクレオチドは、さらに何度かのサンプル調査を行うことができるように、一旦検出されてから除去され得る。一旦産物が形成されると、Ｒ１とＲ２との間の反応は、２つのプローブを共有結合的に結合してもしなくてもよい。
【００３８】
図１３は、核酸鋳型に基づく生物学的検出のために「ジップコードされた」スプリント構造を用いる、本発明の別の実施形態を示す。この実施形態においては、標的結合部が、ハイブリダイズして核酸鋳型反応を起こす相補的オリゴヌクレオチドに直接結合（任意選択的にスペーサ基を介して）する代わりに、標的結合部は「ジップコードされた」オリゴヌクレオチド配列に結合している。対応するレポータオリゴヌクレオチドの各々が、（核酸鋳型反応を起こす「レポータ」配列の他に）相補的な「抗ジップコード」配列を有する。核酸鋳型化学反応は、反応し、検出可能なシグナルを生成する反応基に結合するレポータオリゴのハイブリダイゼーションによって引き起こされる。プローブの各オリゴヌクレオチド配列は、意図されるハイブリダイゼーションパートナーにのみ相補的であって、検出システム内の他のオリゴヌクレオチドには非相補的であることが重要である。
【００３９】
このジップコードされた構造は、抗ジップコード配列を介して、異なる下流のレポータオリゴヌクレオチドとともに構築する単一のレポータ‐オリゴヌクレオチド抱合体を作製する補助となる。特有の抗ジップコードに結合された異なるレポータのライブラリは、各々を、その相補的ジップコードを持つ化学量論的な量の結合剤‐ジップコードオリゴヌクレオチド抱合体と混合することによって、容易にテストすることができる。
【００４０】
図１４は、標的結合部が２つのアプタマーである、ジップコードされたスプリント構造のアプローチを示したものである。例示的なオリゴ配列およびレポータ化学（例えば、トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）および７‐アジドクマリン（ＡｚＣ））を用いた血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）検出のための本例では、ジップコード配列（ＮＮＮ）がＴＰＰレポータオリゴヌクレオチド上の相補的な非ジップコード配列（Ｎ’Ｎ’Ｎ’）にハイブリダイゼーションすることにより、ＴＰＰレポータオリゴヌクレオチドはＰＤＧＦアプタマーオリゴヌクレオチドに自律的に集合する。レポータオリゴヌクレオチドは、例示的な１０塩基のレポータ配列および５’‐ＴＰＰ基で終結している。異なるジップコードおよび抗ジップコード（互いに対で相補的である）を持つオリゴヌクレオチドの別個の対も、自律的に集合してＡｚＣレポータ配列および３’‐ＡｚＣ基を提供する。ＡｚＣオリゴヌクレオチドは、ＴＰＰオリゴヌクレオチドに対して相補的かつ逆平行であるため、ＴＰＰとＡｚＣオリゴヌクレオチドとが互いにアニーリングした場合、ＴＰＰおよびＡｚＣ基は末端と末端を合わせて終結する。
【００４１】
図１５は、例示的なオリゴ配列およびレポータ化学（ＴＰＰおよびＡｚＣ）を用いた、ＰＤＧＦ検出のためのジップコードされたスプリント構造のアプローチを、より具体的に示したものである。ＴＰＰ対は、最初に、５’末端上にＰＤＧＦ‐アプタマー、Ｃ１８ポリエチレン‐グリコール系のスペーサ、１８塩基長のジップコード配列を含む。ＴＰＰレポータ配列は、３’終端上の相補的な抗ジップコード配列、Ｃ１８  ＰＥＧスペーサ、および５’ＴＰＰ基で終結する１０の塩基対レポータ配列を含む。オリゴヌクレオチドのＡｚＣ対は、Ｃ１８  ＰＥＧスペーサを介して別個のジップコードに結合された３’‐アプタマー、５’抗ジップコードに結合された検出オリゴヌクレオチド、Ｃ１８  ＰＥＧスペーサ、および３’ＡｚＣ基で終結するレポータオリゴヌクレオチド（ＴＰＰオリゴヌクレオチドに相補的である）を含む。
【００４２】
図１６は、アプタマーの代わりに抗体が標的結合部として用いられた、対応する構造の例を示す。
【００４３】
「ジップコードされた」アプローチの利点の１つは、レポータオリゴヌクレオチドを別個に作製し、結合剤および核酸鋳型によって活性化される化学の両方の活性を保持する条件下において、それらを結合剤によって集合させる能力である。
【００４４】
ジップコードされたシステムは２対のオリゴヌクレオチドに基づいており、特有のジップコードと抗ジップコードとの対の塩基対形成により、各対がともに保たれる。「ジップコード」は、それらの相補的配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチド配列であり、好ましくは、既知のゲノム配列に相補的ではなく（サンプルがゲノムＤＮＡを含有する可能性がある場合に関係する）、同様のＴｍ値を有し、重要な２次的構造を持たず、検出システムにおいて他のジップコードまたは抗ジップコード配列にアニーリングしないように設計される。
【００４５】
本発明の方法は、第１および／または第２のオリゴヌクレオチド配列の酵素または化学ライゲーションを必要としないということは指摘するに値する。
【００４６】
ジップコードされた構造の設計を最適化する際に考察され得る要因には、例えば、（１）アプタマー／抗体とジップコード（スペーサ１）との間のスペーサ基（例えば、オリゴヌクレオチドおよび／または塩基性ではない基）（例えば、ハイブリダイゼーションパートナーが互いに到達することを可能にするため、あらゆる立体障害を回避するため）（２）複合体を形成するために、抗ジップコード配列との十分に安定したアニーリングを形成するためのジップコード配列の長さ、および（３）抗ジップコードとレポータ配列との間のスペーサ基（スペーサ２）（例えば、あらゆる立体障害を回避するため）を含む。
【００４７】
オリゴヌクレオチドに付着した結合剤（標的結合部）は、標的分子に特異的に結合して本発明の設計が機能することを可能にするいかなる化学成分であってもよい。例には、（１）抗体：例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、Ｆａｂ’ｓ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｄａｂ、ＦｖまたはＳｃＦｖ断片、（２）阻害剤、薬剤、補助因子等の小分子結合剤、（３）タンパク質検出のための受容体、および受容体検出のためのタンパク質、（４）ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡアプタマー、（５）ＤＮＡ結合および調節タンパク質のＤＮＡ配列、（６）タンパク質結合モチーフを代表するペプチド、（７）ファージディスプレイ、ランダム合成、突然変異誘発を介して発見されるペプチド、（８）自然に結合するタンパク質対および複合体、（９）抗原（抗体検出のため）、および（１０）異なる特異性を持つ２つの別個の結合剤としての役割を果たし得る、２つのオリゴヌクレオチドに別個に付着した単一のポリクローナル抗体等、広範囲にわたる官能基を含む。
【００４８】
オリゴヌクレオチドに付着した標的結合部は、同じ標的内の異なる部位を標的とする異種であってもよい。例えば、２つの結合剤は、２つの異なる抗体、抗体と受容体、抗体と小分子結合剤、受容体とペプチド、アプタマーと補助因子、または他のいかなる組み合わせであってもよい。
【００４９】
標的分析物は、その標的が２つ（またはそれ以上）の結合部位を持つ限り、いかなる種類であってもよい。単量体型およびホモ二量体またはそれより高いポリマー相と平衡状態にあって存在する分子は、同じ結合剤および異なる相補的ＤＮＡ配列を含有するプローブ対によって検出することができる。好適な標的には、タンパク質、細胞表面、抗体、抗原、ウイルス、細菌、有機表面、膜、小器官、固定細胞の原位置分析、タンパク質複合体が挙げられる。本発明は、融合タンパク質（例えば、ＢＣＲおよびＡＢＬの存在下におけるＢＣＲ‐ＡＢＬ）の検出に特に適している可能性がある。
【００５０】
プローブを設計する上で考慮すべきことの１つは、反応基を持つ２つのレポータ配列のＴｍである。２本鎖のＴｍは、標的の不在下において室温を下回るべきであるため、この配列は通常短く（例えば６〜１５塩基および／またはＡ‐Ｔリッチ）なければならない。１０塩基対の長さである典型的なレポータのＴｍは、低塩濃度では約３０℃であり得る。従って、たとえ短い配列であっても、アッセイ温度を下回るように温度をさらに低下させるため、またはアッセイ温度を上昇させるために、１０％〜４０％の体積比のホルムアミドを加えることがしばしば必要である。非常に短いレポータオリゴヌクレオチドは、特異性が欠如し、ジップコード配列への結合（用いられる場合は）を示す可能性があるが、それは望ましくない。
【００５１】
プローブの設計におけるもう１つの要因は、いかなるジップコード配列をも含む、結合部とレポータ配列との間のオリゴヌクレオチドの長さである。これらは、レポータオリゴヌクレオチドが互いに到達してアニーリングするために十分長くなくてはならない。配列には、柔軟なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーが散在し得、あらゆる立体障害に対してさらに保護を与え得る。例えば、オリゴヌクレオチドの全長は、約３５塩基長であり得る。０、１つ、もしくは２つのＣ１８  ＰＥＧスペーサ、またはホモポリマー経路を含有するオリゴヌクレオチドも用いることができる（すなわちＣ１０）。
【００５２】
３番目に考慮すべきことは、ジップおよび抗ジップ配列が用いられる場合の、それらの長さである（すなわち図１４および図１７）。各ジップコードは他のいかなるジップコード、抗ジップコード、またはレポータ配列ともアニーリングせず、その抗ジップコードとのみアニーリングする必要があるということを除けば、重要なパラメータは、ジップコードと抗ジップコードとの間にある２本鎖のＴｍである。該Ｔｍは、レポータオリゴヌクレオチドが結合部にしっかりと付着した状態でいるためにアッセイで用いられる最高温度よりも、実質上高くなければならない。実践において、レポータ配列の約２倍の長さのジップコード（すなわち、全長１５〜３０塩基）が望ましく、通常はこれらの基準を満たす。
【００５３】
シグナル生成に関しては、核酸鋳型化学が、光シグナルを生じさせる標識を作製または破壊（例えば、蛍光、化学発光、もしくは比色の分子を作製または破壊）するために用いられてもよい。また、検出反応は、検出可能な標識を直接的または間接的に作製する産物を作成または破壊するために設計され得る（例えば、光標識を作製する反応を触媒する産物、光標識を作製する反応を阻害する産物、蛍光クエンチャーである産物、蛍光エネルギー移動分子である産物、Ｒａｍｅｎ標識を作製する産物、電気化学ルミネセンス標識を作製する産物（すなわち、ルテニウムビピリジル）、電子スピン標識分子を生成する産物）。
【００５４】
以下の実施例は、様々な実施形態およびその均等物において本発明の実践に適応することができる重要な追加情報、例証、および指針を含む。本発明の実践は、下に示すこれらの実施例によってより完全に理解されるであろうが、これらの実施例は、例示の目的のみに本明細書に記載されるものであって、本発明を何ら限定するものであると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５５】
オリゴヌクレオチド配列
標準的なホスホラミダイト化学（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ，ＵＳＡ）を用いてオリゴヌクレオチドを調製し、逆相Ｃ１８クロマトグラフィーによって精製した。５’‐アミノ基を担持するオリゴヌクレオチドは、５’‐アミノ‐修飾因子５（抗ジップレポータオリゴヌクレオチド）または５’‐アミノ‐修飾因子Ｃ６（ジップオリゴヌクレオチド）のいずれかを用いて調製した。３’‐アミノ基を担持するオリゴヌクレオチドは、３’‐アミノ‐修飾因子Ｃ７  ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ，ＵＳＡ）を用いて調製した。
【００５６】
【表２】
2010503860.tif 000002
（実施例１）ＤＰＣレポータ化学：ＤＡＺＲのホスフィン還元によるローダミン形成
図式１は、ＤＮＡプログラム化学を介したＤＡＺＲ（ジアジドローダミン、非蛍光性）のローダミン（蛍光性）への還元を示す。
【００５７】
図式１：ローダミン形成のＤＰＣ（アジドを還元することのできるいずれのホスフィンも使用可能）
【００５８】
【化１】
2010503860.tif 000003
アミド結合形成により、ＤＡＺＲおよびホスフィンの両方をオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）に結合させる。最初に、酸前駆体を合成した。次いで、該酸前駆体を、溶液（ＤＮＡ＿ＤＡＺＲ、図式２）中にアミン官能基を担持するＤＮＡと反応させた活性Ｎ‐ヒドロキシこはく酸イミドエステル（ＮＨＳエステル）に変換するか、またはアミン官能基を担持するＤＮＡとＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）上で直接結合させた（ＤＮＡ＿ビスジフェニルホスフィン、図式３）。
【００５９】
図式２は、ＤＡＺＲおよびＤＮＡ＿ＤＡＺＲの抱合体の様々な合成経路を示す。非常に過酷な条件下（例えば、高温、強い酸、および長い反応時間）で３‐アミノフェノールを１，３‐ジオキソ‐１，３‐ジヒドロイソベンゾフラン‐５‐カルボン酸と縮合させることにより、文献の手順に従って、最初にローダミンの酸誘導体（異性体）を合成した（図式２ａ）。これらの条件下において、著しい量のフルオレセインおよびロドール（ｒｈｏｄｏｌ）の化合物が生成され、ローダミン酸から分離することが困難であった。この反応の収率も極めて低かった。化合物の異性体（１）は双性イオンであり、シリカゲルカラムを用いて精製することができない。１とニトリルナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｎｉｔｒｉｌｅ）およびアジ化ナトリウムとの後続反応では、わずか１１％のＤＡＺＲを得たのみであった（Ｎｏｖｉｋｏｖａ，ｅｔ  ａｌ，Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，３４，１７６２‐１７６７）。
【００６０】
そこで、より効率的にＤＡＺＲ酸を得る手法を提供するために、代替のアプローチを開発した（図式２ｂ）。このアプローチでは、ジヨードおよびジブロモ置換ローダミン（３および４）を合成して、ＤＡＺＲ酸に変換した。化合物３および４は双性イオンではないため、容易に精製することが可能であり、これらの化合物の生成収率は良好である（収率４０〜６０％）。ＤＡＺＲ酸の異性体のうち約８０％は、ジブロモ置換ローダミンから生成された（４）
図式２：ＤＡＺＲおよびＤＮＡ＿ＤＡＺＲ抱合体の合成経路
【００６１】
【化２】
2010503860.tif 000004
図式３：ビスジフェニルホスフィン酸およびＤＮＡ＿ビスジフェニルホスフィン抱合体の合成経路
【００６２】
【化３】
2010503860.tif 000005
【００６３】
【化４】
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化合物２の合成（３’，６’‐ジアジド‐３‐オキソ‐３Ｈ‐スピロ［イソベンゾフラン‐１，９’‐キサンテン］‐５‐［および‐６］‐カルボン酸混合異性体、図式２ａ）：２Ｎ  ＨＣｌ（４ｍＬ）中の１（３’，６’‐ジアミノ‐３‐オキソ‐３Ｈ‐スピロ［イソベンゾフラン‐１，９’‐キサンテン］‐５‐［および‐６］‐カルボン酸混合異性体、６００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の溶液に、亜硝酸ナトリウム（２７６ｍｇ、４．０１ｍｍｏｌ）を加えた。室温（ＲＴ）で３０分撹拌した後で氷を加え、続いて最小量の水に溶解させたアジ化ナトリウム（６２５ｍｇ、９．６２ｍｍｏｌ）を加えた。沈殿した固体を濾過によって分離した。ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎクロマトグラフィーシステム上のＲｅｄｉＳｅｐシリカゲルカラム（４ｇ）で粗生成物を精製し（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ中の１％トリエチルアミン）、４０ｍｇの混合異性体２（１１％）を得た。
【００６４】
化合物３の合成（３’，６’‐ジヨード‐３‐オキソ‐３Ｈ‐スピロ［イソベンゾフラン‐１，９’‐キサンテン］‐５‐［および‐６］‐カルボン酸混合異性体）：１００ｍｌフラスコに、２，４‐ベンゼントリカルボン酸無水物（４．５０ｇ、２３．４ｍｍｏｌ）、３‐ヨードフェノール（１０．３ｇ、２６．８ｍｍｏｌ）、およびメタンスルホン酸（４０ｍＬ）を加えた。アルゴン雰囲気中において混合物を１２５°Ｃで１６時間撹拌した。冷却した混合物を氷１００ｇに注いだ。沈殿物をアセトン／ＤＣＭに溶解させて、水で洗浄した。ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎクロマトグラフィーシステム上のＲｅｄｉＳｅｐシリカゲルカラム（８０ｇ）で粗生成物を精製し（ＤＣＭ／アセトン）、６．０ｇの生成物（白色粉末、４３．０％）を得た。Ｃ２１Ｈ１０Ｉ２Ｏ５の精密質量の計算値：５９５．８６
観測値：５９４．８３４８（Ｍ‐Ｈ）。
【００６５】
化合物４の合成（３’，６’‐ジブロモ‐３‐オキソ‐３Ｈ‐スピロ［イソベンゾフラン‐１，９’‐キサンテン］‐５‐［および‐６］‐カルボン酸混合異性体）：１００ｍｌフラスコに、１，２，４‐ベンゼントリカルボン酸無水物（２ｇ、１０．４１ｍｍｏｌ）、３‐ブロモフェノール（２．３４１ｇ、１３．５３ｍｍｏｌ）、およびメタンスルホン酸（４５ｇ、４６８ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン雰囲気中において、混合物を１３５℃で１４時間撹拌した。冷却した混合物を氷水（１００ｇ）に注いだ。生成物を７５ｍＬのＤＣＭで抽出し、水１００ｍＬで洗浄した。回転蒸発により溶媒を除去した。固体残渣をＤＣＭで洗浄し、未反応のブロモフェノールおよび他の非極性不純物を除去した。シリカゲルクロマトグラフィー（０〜５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）を用いて粗生成物をさらに精製して、３．０の生成物（白色粉末、５７．４％）を得た。Ｃ２１Ｈ１０Ｂｒ２Ｏ５の精密質量の計算値：４９９．８９、観測値：５００．９６７９（Ｍ＋Ｈ）。
【００６６】
化合物２の合成（３’，６’‐ジアジド‐３‐オキソ‐３Ｈ‐スピロ［イソベンゾフラン‐１，９’‐キサンテン］‐５‐［および‐６］‐カルボン酸混合異性体、図式２ｂ）：１００ｍｌフラスコに、ヨードフルオラン（ｉｏｄｏｆｌｕｏｒａｎ）（３）（０．３０ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（０．０１ｇ）、アスコルビン酸ナトリウム（０．０２ｇ）、１，２‐ジメチルアミノエタン（０．０２ｇ）、アジ化ナトリウム（０．１０ｇ、１．５０ｍｏｌ）、エタノール（１５ｍＬ）、および水５ｍｌを加えた。得られた混合物をアルゴン下で３０分間１００℃で加熱した。冷却した混合物を水で希釈し、ＨＣｌで中和してからＤＣＭで抽出した。シリカゲルクロマトグラフィー（０‐５％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で粗生成物を精製して、０．１３ｇの生成物（白色粉末、６０．６％）を得た。
【００６７】
化合物５の合成（ＤＡＺＲ５‐［および６‐］異性体のＮＨＳエステル）：１００ｍｌフラスコに、化合物２（０．１８ｇ、０．４２２ｍｍｏｌ）およびＤＣＭ（５ｍｌ）、続いて１‐ヒドロキシピロリジン‐２，５‐ジオン（０．１５ｇ、１．３０３ｍｍｏｌ）、およびＮ１
‐（（エチルイミノ）メチレン）‐Ｎ３，Ｎ３‐ジメチルプロパン‐１，３‐ジアミン（０．１５ｇ、０．９６６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で５分間撹拌した。ＴＬＣで反応の終了（ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ、９：１）が示された。混合物をＲｅｄｉＳｅｐシリカゲルカラム（１２ｇ）上に直接搭載して、勾配０〜１５％のＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ溶媒システムで溶出した。０．１９ｇの生成物（白色粉末、８６％）を得た。Ｃ２５Ｈ１３Ｎ７Ｏ７の精密質量の計算値：５２３．０９、観測値：５２４．１２１２（Ｍ＋Ｈ）。
【００６８】
ＤＡＺＲ＿ＤＮＡ抱合体の合成：水５０μＬ中にＤＮＡ（５５ｎｍｏｌ）を含有する遠心分離用の１．５ｍＬバイアルに、Ｎ‐メチル‐２‐ピロリジン（ＮＭＰ）７０μＬに溶解させたＮ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）３０μＬおよび５（０．００５ｍｍｏｌ）３ｍｇを加えた。ＲＴで１６時間反応させた後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ‐２５を用いたゲル濾過により反応混合物を脱塩し、逆相Ｃ１８カラムを用いて精製した。抗ジップ２レポータ１＿ＤＡＺＲ（ＤＮＡ：配列番号６９）：ＬＣ‐ＭＳ：［Ｍ７］‐７のモノアイソトピック質量計算値：１３５９．９５８０、観測値１３５９．９８５２。抗ジップ２レポータ２＿ＤＡＺＲ（ＤＮＡ：配列番号７３）：ＬＣ‐ＭＳ：［Ｍ‐７］‐７のモノアイソトピック質量の計算値：１４８３．８３５０、観測値：１４８３．８７７７。
【００６９】
ジフェニルホスフィン＿ＤＮＡ抱合体の合成：標準的なホスホラミダイト化学（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ，ＵＳＡ）を用いて、５’‐アミノ‐修飾因子５（１ｕｍｏｌｅスケール）を含有するオリゴヌクレオチドを調製した。５’‐アミノのトリチル基を除去した後、オリゴ‐ＣＰＧを１．５ｍＬの遠心分離管に移した。９の溶液（８１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、Ｎ‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐Ｎ’‐エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）（２８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、およびＮＭＰ（３００μＬ）中のＤＩＰＥＡ（３３μＬ）を加えた。３７℃で２時間反応させた後、遠心分離により溶媒を除去し、アンモニアメチルアミン（ＡＭＡ）を用いて５５℃で４５分間オリゴ‐ＣＰＧを処理した。ＡＭＡ切断から放出された粗オリゴを、逆相Ｃ１８ＨＰＬＣで精製した。抗ジップ５＿ビスジフェニルホスフィン（ＤＮＡ：配列番号７２）：ＭＳ：［Ｍ‐４］‐４のモノアイソトピック質量の計算値１９３１．３５７、観測値１９３１．４６５。抗ジップ５ｍ＿ジスフェニルホスフィン（ＤＮＡ：配列番号７１）：ＭＳ：［Ｍ‐４］‐４のモノアイソトピック質量の計算値１９２５．１５８３、観測値１９２５．０８７３。
【００７０】
（実施例２）ＤＰＣレポータ化学：インドリニウムとアルデヒドとのアルドール型縮合によるへミシアニン形成
図式４は、ジアミン触媒化ＤＮＡプログラム化学を用いて実現される、へミシアニンを形成するためのインドリニウムとアルデヒドとの縮合を示す。アルデヒドおよびインドリニウムの両方の前駆体は、アミド結合形成を介してＤＮＡに抱合させた。
【００７１】
図式５は、ＤＮＡ抱合インドリニウム化合物の合成の一例を示す。酸官能基をＮ‐四級化によってインドリン環に導入した。図式６はＤＮＡ抱合アルデヒドの合成の一例を提供する。過酸化水素を用いたシアノ基の加水分解によって、アルデヒド前駆体中の酸官能基を導入した（Ｂｒａｄｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６，１８８１２‐１８８１８．）。図式７は、ＤＮＡ標識化α，β‐不飽和アルデヒド１のもう１つの例を提供する。ウィティッヒ試薬を用いて、対応するα，β‐エナールにアルデヒドを２炭素ホモログ化した（Ｅｉｔｅｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９８９）３６４‐３６７）。濃縮ＨＣｌを用いたシアノ基の加水分解によって、アルデヒド前駆体中の酸官能基を導入した（Ｂｒａｔｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（２００４）４０，１２７９‐１２８２）。
【００７２】
図式４：へミシアニン形成のＤＰＣ
【００７３】
【化５】
2010503860.tif 000007
触媒の追加例を図６に示す。
図式５：ＤＮＡおよびインドリニウム抱合体の合成例
【００７４】
【化６】
2010503860.tif 000008
図式６：ＤＮＡおよびアルデヒド抱合体（ＤＮＡ＿Ａ０）の合成例
【００７５】
【化７】
2010503860.tif 000009
図式７：ＤＮＡ抱合アルデヒドの合成例（ＤＮＡ＿Ａ１）
【００７６】
【化８】
2010503860.tif 000010
化合物１０の合成：５‐ブロモ吉草酸（２．４３５ｇ、１３．４５ｍｍｏｌ）に、２，３，３‐トリメチルインドリン（２．１４１ｇ、１３．４５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、激しく撹拌しながら１１０℃で一晩加熱した。得られた暗赤色の粘性油をＧｒｅｇａｒ抽出器に移し、ＥｔＯＡｃで一晩抽出した。明赤色の固体を得た。固体を３０ｍＬのＭｅＯＨに再度溶解させた。減圧下でＭｅＯＨを除去し、残りの残渣を１０ｍＬのＥｔＯＡｃで処理した。褐色の固体を沈殿させて濾過した。固体を２×５０ｍＬのアセトンおよび２×１００ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。合計１．５９０ｇの明褐色の固体を得た（収率３５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δｐｐｍ：７．９８（ｍ，１Ｈ），７．８４（ｍ，１Ｈ），７．６１（ｍ，２Ｈ），４．４９（ｔ，２Ｈ），２．８４（ｓ，３Ｈ），２．３０（ｔ，２Ｈ），１．８４（ｍ，２Ｈ），１．６３（ｍ，２Ｈ），１．５３（ｓ，６Ｈ）。ＭＡＬＤＩ‐ＭＳ（陽性モード）：２６０．２４１９。
【００７７】
化合物１１の合成：化合物１１（０．１ｇ、０．２９４ｍｍｏｌ）、Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミド（０．０６８ｇ、０．５８８ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ’‐ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．０８５ｇ、０．４１１ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１．５ｍＬに溶解させた。反応混合物を３７℃で１時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）を濾過により除去し、濾液をエーテル１５ｍＬで処理した。明橙色の固体をエーテル１０ｍＬで３回洗浄し、真空下で数時間乾燥させた。得られた固体を直接次の反応に用いた。ＭＡＬＤＩ‐ＭＳ（陽性モード）：３５７．１５９０。
【００７８】
インドリニウム化合物を用いたＤＮＡ標識化：２０ｎｍｏｌのＤＮＡを含有する１．５ｍＬの遠心分離用のバイアルに、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰｉ）４１．６μＬ（ｐＨ７．８）、ＮＭＰ（９６ｍＭ）中の化合物１０（４１．６μＬ）、およびＮＭＰ４１．６μＬを加えた。バイアルを振とう機内に設置して、３７℃で４時間振とうした。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ‐２５を用いたゲル濾過により反応混合物を脱塩し、逆相Ｃ８カラムを用いて精製した。抗ジップ５＿インドリニウム（ＤＮＡ：配列番号７２）：収率１０％。ＬＣ‐ＭＳ（陰性モード）：Ｃ３０７Ｈ４０１Ｎ１０８Ｏ１８０Ｐ２９の計算値（平均）：１３４０．２６１４［Ｍ‐８Ｈ］７‐；観測値：１３４０．２７０５［Ｍ‐８Ｈ］７‐。抗ジップ５ｍ＿インドリニウム（ＤＮＡ：配列番号７１）：収率１０％。ＬＣ‐ＭＳ（陰性モード）：Ｃ３０８Ｈ４０４Ｎ１０９Ｏ１７７Ｐ２９計算値（モノアイソトピック質量）：１３３６．４９６９［Ｍ‐８Ｈ］７‐、観測値：１３３６．６７３［Ｍ‐８Ｈ］７‐抗ジップ３＿インドリニウム（ＤＮＡ：配列番号７０）：収率５％。ＬＣ‐ＭＳ（陰性モード）：Ｃ３０７Ｈ４０４Ｎ１０７Ｏ１７８Ｐ２９計算値（モノアイソトピック質量）：１３３２．４０３４［Ｍ‐８Ｈ］７‐、観測値：１３３２．６２９３［Ｍ‐８Ｈ］７‐。
【００７９】
化合物１２の合成：Ｎ‐メチル‐Ｎ‐シアノエチル‐４‐アミノベンズアルデヒド（１．０２４ｇ、５．４４ｍｍｏｌ）を含有する５０ｍＬ丸底フラスコに、５Ｎ  ＮａＯＨ溶液２７．２ｍＬおよび３０％のＨ２Ｏ２６．８ｍＬを加えた。反応混合物を２時間還流した。冷却後、濃縮ＨＣｌ（３７重量％）を加えることにより反応混合物を中和し、２×１００ｍＬのＥｔＯＡｃおよび１×１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を合わせてブライン５０ｍＬで１回洗浄し、濃縮乾固した。ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎクロマトグラフィーシステム（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）上のＲｅｄｉＳｅｐシリカゲルカラム（４０ｇ）で粗生成物を精製した。合計０．７０２ｇの明るいピンクがかった固体を得た（６２％）。エレクトロスプレーＭＳ：Ｍ＋Ｈ２０８．０７３５．（Ｂｒａｄｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６，１８８１２‐１８８１８）。
【００８０】
アルデヒドを用いたＤＮＡ標識化：化合物１１と同じ手順に従って、１２のＮＨＳエステルを合成した。濾過によりＤＣＵを除去した後、濾液を直接ＤＮＡ抱合に用いた（ＤＭＦ中０．２Ｍの生成物として計算）。５０ｎｍｏｌのＤＮＡを含有する１．５ｍＬの遠心分離用バイアルに、０．１ＭのＮａＰｉ  １０４μＬ（ｐＨ８．６）、上記の濾液１２５μＬ、ＮＭＰ  ８３μＬを加えた。バイアルを振とう機内に設置して、３７℃で一晩振とうした。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ‐２５を用いたゲル濾過により反応混合物を脱塩し、逆相Ｃ８カラムを用いて精製した。抗ジップ２レポータｌ＿Ａ０（ＤＮＡ：配列番号６９）（収率３０％）。ＬＣ‐ＭＳ：Ｃ３０３Ｈ３９６Ｎ１１０Ｏ１７７Ｐ２９の計算値（モノアイソトピック質量）：１３２８．２４５８［Ｍ‐７Ｈ］７‐、観測値：１３２８．３０５１［Ｍ‐７Ｈ］７−。
【００８１】
化合物１３の合成：Ｎ‐メチル‐Ｎ‐シアノエチル‐４‐アミノベンズアルデヒド（１．１１６ｇ、５．９ｍｍｏｌ）およびイリド（２．７１ｇ、８．９ｍｍｏｌ）を含有する１００ｍＬ丸底フラスコに、５７ｍＬの乾燥トルエンを加えた。還流下で反応混合物を一晩加熱し、冷却して、濾過紙で濾過した。濾液から溶媒を除去した後、残渣を最初にＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎクロマトグラフィーシステム（トルエン／エーテル）上のＲｅｄｉＳｅｐシリカゲルカラム（４０ｇ）で、続いて調製用のＨＰＬＣ  Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ‐Ｃ１８、３０×１００ｍｍ、１０ｕｍ）で精製し、０．２７ｇの純粋な生成物を得た（２１％）。ＭＡＬＤＩ‐ＭＳ（陽性モード）：２１５．２２６。
【００８２】
化合物１４の合成：化合物１３（０．１ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を含有する５０ｍＬの丸底フラスコに、３０ｍＬの濃縮ＨＣｌを加えた。反応混合物を沸騰するまで加熱し、室温で１時間放置した。ＨＰＬＣ分析は、１つの生成物のみが形成され、混合物中には開始物質が残っていないことを示した。大部分のＨＣｌを除去した後、化合物を水に溶解させ、凍結乾燥させて生成物を得た。
【００８３】
α，β‐不飽和アルデヒドを用いたＤＮＡ標識化：化合物１４のＮＨＳエステルを、化合物１１と同じ手順に従って合成したが、代わりにシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘａｎｅｓ）を用いて精製した。真空下で数時間乾燥させた後、化合物１４のＮＨＳエステルをＮＭＰ（９６ｍＭ）に溶解させＤＮＡ＿Ａ０抗ジップ２レポータ１＿Ａ１を標識化するのと同じ手順に従ってＤＮＡの標識化に用いた（ＤＮＡ：配列番号６９）：収率４０％。Ｃ３０５Ｈ３９８Ｎ１１０Ｏ１７７Ｐ２９の計算値（モノアイソトピック質量）：１３３１．９６２３９［Ｍ‐７Ｈ］−７、観測値：１３３２．０７７８［Ｍ‐７Ｈ］−７。
【００８４】
（実施例３）ＤＰＣを介した２つの蛍光へミシアニン色素の生成
抗ジップ３＿インドリニウムを抗ジップ２レポータ１＿Ａ０および抗ジップ２レポータ１＿Ａ１とそれぞれ混合することにより、２つのへミシアニン生成物を形成した（ＤＮＡ：配列番号６９）。抗ジップ３＿インドリニウム（ＤＮＡ：配列番号７０）と抗ジップ２レポータ１＿Ａ０（ＤＮＡ：配列番号６９）との間に形成された生成物（Ｐ１）は、最大励起５４０ｎｍおよび最大発光６００ｎｍであったのに対し、抗ジップ３＿インドリニウム（ＤＮＡ：配列番号７０）と抗ジップ２レポータ１＿Ａ１（ＤＮＡ：配列番号６９）との間に形成された生成物（Ｐ３）は、最大励起６００ｎｍおよび最大発光６７０ｎｍであった（図１８）。
【００８５】
ＤＰＣ反応：１５ｍＭのＮ，Ｎ‐ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤＡ）、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭ  ＭｇＣ１２中で、各々２００ｎＭの試薬を用いて３０℃で反応を行った。合計反応容積は５０μＬであった。反応緩衝液中で両方の試薬を混合した後、触媒ＤＭＥＤＡを加えた。触媒ＤＭＥＤＡを加えた直後に蛍光を記録した。
【００８６】
（実施例４）抗体オリゴヌクレオチド抱合体の合成
ＤＮＡは架橋剤を介して抗体またはＡｆｆｉｂｏｄｙに共有結合的に付着している。ＤＮＡ‐抗体抱合体を合成するために様々なヘテロ二官能性の架橋剤を用いることができる。最も一般的に使用されるのは、１）ＳＭＣＣ（サクシニミジル‐４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）シクロヘキサン‐１‐カルボン酸）等のアミン反応性およびスルフヒドリル反応性の架橋剤、２）ヒドラジン／ヒドロキシルアミンおよびマレイミド／ヨード酢酸官能基を含有する化合物等のアルデヒド反応性およびスルフヒドリル反応性の架橋剤、３）ヒドラジン／ヒドロキシルアミンおよびサクシニミジル官能基を含有する化合物等のアルデヒド反応性およびアミン反応性の架橋剤である。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６を参照。ＤＮＡに付着することが可能な前駆体は、通常、カルボン酸基で官能化されてから、アミン含有ＤＮＡと反応する。アルデヒドおよびスルフヒドリル等の他の官能基もＤＮＡに組み入れられ得る。それに応じて前駆体はヒドラゾン／ヒドロキシルアミンおよびマレイミド基で官能化される。図式８は、ＢＭＰＳによるＡｆｆｉｂｏｄｙ＿オリゴヌクレオチド抱合体合成の一例を提供する。ジップ２＿ＥｒｂＢ２（ＤＮＡ：配列番号６６）Ａｆｆｉｂｏｄｙは、以下の図式に従って合成された。
【００８７】
図式８：ＮＨＳエステル‐マレイミドのヘテロ二官能性架橋剤によるＡｆｆｉｂｏｄｙ‐オリゴヌクレオチドの抱合
【００８８】
【化９】
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（実施例５）へミシアニンＤＰＣアッセイによるＥＧＦＲホモ二量体の検出
様々なレベルのＥＧＦＲを発現する細胞の懸濁液（Ａ４３１、ＢＴ４７４、またはＮ８７）を、ＥＧＦＲホモ二量体の存在について、ＤＰＣに基づくへミシアニン合成を用いたアッセイにより分析した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中のＥＧＦ（上皮成長因子、２００ｎｇ／ｍＬ）で、細胞を４℃で１時間培養した。対照細胞（未処理）は、ＥＧＦ無しの同じ条件下で培養した。処理後、ＰＢＳ中の３％ホルムアルデヒドで４℃で３０分間培養することにより、細胞を固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１００μｇ／ｍｌヤギＩｇＧ、および１０μＭ酵母ｔＲＮＡを含有するＰＢＳを用いて、４℃で４５分間培養することによりブロックした。その後、ブロックした細胞を、抗ＥＧＦＲ抗体‐ジップオリゴヌクレオチド抱合体（ｅｇｆｒ１‐ジップ２（ＤＮＡ：配列番号６６）およびｅｇｆｒ１‐ジップ５（ＤＮＡ：配列番号６８）、各々３０ｎＭ）および抗ジップオリゴヌクレオチド（抗ジップ５＿Ａ０、（ＤＮＡ：配列番号７２）、および抗ジップ２レポータ１＿インドリニウム、ＤＮＡ：（配列番号６９）、各々６０ｎＭ）で、室温で１時間培養した。反応物を除去し、１μＭ酵母ｔＲＮＡを含有するＰＢＳで細胞を洗浄した。５ｍＭのＮ，Ｎ‐ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤＡ）を含有するＰＢＳ中に細胞を懸濁して、室温で４時間培養した。２％のＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に懸濁して、フローサイトメトリーを用いてＤＰＣ反応による蛍光生成について分析した。陽性細胞のパーセントおよび平均蛍光強度（ＭＦＩ）の積として表した、ＥＧＦＲホモ二量体についてのＤＰＣアッセイの結果を図１９に示す。
【００８９】
ＥＧＦで処理していない細胞については、陽性ＤＰＣシグナル（すなわち、ＤＰＣ反応から生じた蛍光シグナル）が検出され、ＥＧＦＲホモ二量体の存在を示唆した。ＤＰＣシグナルの強度はＥＧＦＲの発現レベルと比例していた（Ａ４３１細胞はＢＴ４７４またはＮ８７細胞と比較して有意に高いレベルを発現する）。ＥＧＦで処理した細胞は、ＤＰＣシグナルの強度が約２倍増加する結果となった。これらの結果は、ＥＧＦの不在下において不活性化ＥＧＦＲホモ二量体が可逆的に形成され、これらの二量体の平衡レベルはＥＧＦのライゲーション時に増加し、受容体の細胞質領域内の特異的チロシンの自己リン酸化からも分るように、これらのホモ二量体の活性化も引き起こす、というＥＧＦＲの作用機構モデルと一致するものである（Ｃｉｔｒｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００６，７，５０５‐５１６）。
【００９０】
（実施例６）ＤＡＺＲ還元ＤＰＣアッセイによるｅｒｂＢ２二量体の検出
ＤＡＺＲ還元反応を用いたＤＰＣアッセイによって、Ｎ８７細胞上にＥｒｂＢ２のホモ二量体およびＥＧＦＲ‐ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体の両方を検出した。Ｎ８７細胞の懸濁液は、ＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒドとともに、４℃で３０分間培養することにより固定した。固定した細胞をＰＢＳで洗浄してから、２％ＢＳＡ、１０μＭ酵母ｔＲＮＡ、１００μｇ／ｍＬヤギＩｇＧ、および５％硫酸デキストランを含有するＰＢＳを用いて、４℃で４５分間培養することでブロックした。ブロックした細胞を、抗体‐ジップコード（ＥｒｂＢ２ホモ二量体アッセイには抗ｅｒｂＢ２  ９Ｇ６‐ジップ２（ＤＮＡ：配列番号６６）および９Ｇ６‐ジップ５（ＤＮＡ：配列番号６８）、またはヘテロ二量体アッセイには抗ＥＧＦＲ  ｅｇｆｒ１‐ジップ５（ＤＮＡ：配列番号６８）、抗体抱合体には３０ｎＭ濃度）および６０ｎＭ抗ジップ２レポータ２＿ＤＡＺＲ（ＤＮＡ：配列番号７３）を用いて、３０℃で１時間培養した。細胞を遠心分離して反応物を除去し、２回洗浄してから８０ｎＭ抗ジップ５＿ビスジフェニルホスフィン（ＤＮＡ：配列番号７２）を用いて３７℃で１時間培養した。その後、細胞を２回洗浄してＰＢＳに懸濁した後、フローサイメトリーを用いたアッセイにより蛍光細胞について分析した。陽性に染色された細胞の割合×平均蛍光強度として表した、ＥｒｂＢ２二量体のＤＰＣアッセイの結果を図２０に示す。
【００９１】
アッセイにおけるバックグラウンドシグナルは、上記の９Ｇ６‐ジップ５抱合体を排除することにより評価した。ＥｅｒｂＢ２の状態とは関係なくＤＰＣ反応が得られる条件下でＤＰＣを行うことにより、ＥｒｂＢ２の総量（単量体、ホモ二量体、およびヘテロ二量体）を評価した。ＥｒｂＢ２‐ＥｒｂＢ２ホモ二量体について得られたＤＰＣシグナルは、ＥＧＦＲ‐ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体について得られたシグナルと比較して有意に大きく、また、両方の二量体ＤＰＣシグナルはＥｒｂＢ２全体のシグナルよりも有意に低かった。Ｎ８７細胞は、高レベルのＥｒｂＢ２および有意に低いレベルのＥＧＦＲを発現し、従って、ＤＰＣシグナルの相対的な強度はこれらの発現レベルと一致する。Ａ４３１細胞上のＥＧＦＲホモ二量体の場合、これらの結果は、未処理細胞上のホモおよびヘテロ二量体の存在を示唆する。
【００９２】
（実施例７）インドリニウム縮合ＤＰＣアッセイによるＡ４３１細胞上のＥｒｂＢ２二量体の検出
ＥＧＦＲホモ二量体の代わりに、ＥｒｂＢ２ホモ二量体およびＥＧＦＲ‐ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体が検出された以外は、実施例５に記載するように、Ａ４３１細胞の懸濁液にＤＰＣアッセイを行った。本アッセイにおいて、細胞は、未処理であるか、２００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで４℃で１５分間処理したか、またはＥＧＦＲに特異的なチロシンキナーゼ阻害剤ＡＧ１４７８で、ＥＧＦ処理の前に予め処理（１μＭ、３７℃で１５分）しておいたかのいずれかであった。それらの、様々な処理の後、ＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒドを用いて、４℃で３０分間細胞を固定した。その後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、２％ＢＳＡ、５％硫酸デキストラン、１００μｇ／ｍｌヤギＩｇＧ、および１０μＭ酵母ｔＲＮＡを含有するＰＢＳで、４℃で４５分間ブロックした。ブロックした細胞を、抗体‐ジップ抱合体、抗ジップ２レポータ１＿Ａ０、および抗ジップ５＿インドリニウムで３０℃で１時間培養した。ＥｒｂＢ２ホモ二量体検出には、抗ＥｒｂＢ２  ９Ｇ６‐ジップ５および抗ＥｒｂＢ２  Ａｆｆｉｂｏｄｙ‐ジップ２抱合体を用いて、ＥＧＦＲ‐ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体検出には、抗ＥＧＦＲ  ｅｇｆｒ１‐ジップ５および抗ｅｒＢＢ２  Ａｆｆｉｂｏｄｙ‐ジップ２抱合体を用いた。反応物を除去し、１μＭ酵母ｔＲＮＡを含有するＰＢＳで細胞を洗浄した。５ｍＭのＤ  ＭＥＤＡを含有するＰＢＳに細胞を懸濁させ、室温で３時間培養した。その後、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞を洗浄し、ＰＢＳに懸濁させて、フローサイメトリーによりＤＰＣ反応によって生成された蛍光について分析した。陽性に染色された細胞の割合および平均蛍光強度の積として表したＥｒｂＢ２二量体についてのＤＰＣアッセイの結果を、図２１に示す。
【００９３】
アッセイにおけるバックグラウンドシグナルは、ジップ抱合体のうちの１つを排除することにより評価した。ＥｒｂＢ２ホモ二量体のＤＰＣシグナルは極めて低かったが、それでもバックグラウンドシグナル（３〜４のシグナル／バックグラウンド）を上回った。かかる低ＤＰＣシグナルは、Ａ４３１細胞における低レベルのＥｒｂＢ２発現と一致するものであった。ＥＧＦＲ‐ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体のアッセイにおいて得られたＤＰＣシグナルの強度はより高く、処理に対応して有意に変化した。ＥＧＦＲホモ二量体の場合と同じように、未処理細胞のアッセイにおいてシグナルが存在し、ヘテロ二量体の基礎レベルを示唆した。ＤＰＣシグナルは、ＥＧＦで処理した細胞においてほぼ２倍増加し、ＥＧＦ処理の前に予めＡＧ１４７８で処理した細胞では約３倍増加した。
【００９４】
これらのＤＰＣアッセイの結果は、未処理細胞におけるＥＧＦＲ‐ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体の存在、およびＥＧＦに応じてさらなるヘテロ二量体の誘導を示した、多くの試験（例えば、免疫沈降の後にウェスタンブロッティング）と一致するものである。ＡＧ１４７８単独での処理は、ＥＧＦＲ‐ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体の形成を誘導することが明らかになっている（Ａｒｔｅａｇａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２，２３２４７‐２３２５４）。さらに、チロシンキナーゼ阻害剤を用いた事前処理は、ＥＧＦＲの細胞質領域の自己リン酸化を防ぎ、エンドサイトーシスによる受容体の下方制御を防ぎ、その蓄積を可能にする（Ｇａｎｎｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２，１２０５２‐１２０５６．）。
【００９５】
ＤＰＣ塩基のタンパク質検出に関する一般例
（実施例８）  ハイブリタイゼーション誘導のアジドクマリン還元による蛍光の作成
５つのオリゴヌクレオチドは、標準ホスホラミダイト化学（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ，ＵＳＡ）を使用して調製した。５´−アミノ基（オリゴ２およびオリゴ６）を担持するオリゴヌクレオチドは、５´−アミノ−修飾因子５を使用して調製し、３´−アミノ基（オリゴ４およびオリゴ５）を担持するオリゴヌクレオチドは、３´−アミノ−修飾因子Ｃ７  ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ，ＵＳＡ）を使用して調製した。
【００９６】
【数１】
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オリゴ１、オリゴ４、およびオリゴ５は、合成担体から除去し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。オリゴ２およびオリゴ６のアミノ基は、それらのトリフェニルホスフィン誘導体と樹脂結合する間に変換し、これらを精製、単離し（Ｓａｋｕｒａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．，２００５，１２７，ｐｐ１６６０−１６６７）、それぞれオリゴ２−ＴＰＰおよびオリゴ−６ＴＰＰを得た。
【００９７】
オリゴ４およびオリゴ５を担持するアミノ基は、７−アジド−４−メチルクマリン−３−酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの各オリゴの反応によって、それらのアジドクマリン誘導体（それぞれ、オリゴ４−ＡｚＣおよびオリゴ５−ＡｚＣ）に変換した（Ｔｈｅｖｅｎｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）Ｖｏｌ．２０６，ｐｐ−４７１−４７７）。反応は、１μＬのトリフルオロ酢酸を５μＬのＮ−メチルモルホリンに加えることによって行い、６．６ｎｍｏｌのオリゴ４もしくはオリゴ５を含有する１０μＬの水を加え、その後、ジメチルホルムアミド中のクマリンＮＨＳ−エステルの３０μＬの０．１６Ｍの水溶液を追加した緩衝液を調製した。各反応は、室温で２時間、継続し、その後、５０μＬの０．１Ｍの含水酢酸トリエチルアンモニウムを加えた。混合物をＮＡＰ−５脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ  ＵＳＡ）に加え、取扱説明書に従い溶出し、溶出液をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、それぞれ７７％および７０％の収率でオリゴ４−ＡｚＣおよびオリゴ５−ＡｚＣを得た。生成物の同一性は、Ｍａｌｄｉ−ＴｏＦ質量分析によって確認した。
【００９８】
蛍光のハイブリタイゼーションに特異的な作成を証明するために、アジド−クマリンおよびトリフェニルホスフィン部分を担持する相補的および非相補的オリゴヌクレオチドの様々な組み合わせを、３０％含水ホルムアミド、５０ｍＭのＮａＣｌ、およびｐＨ７．２の１０ｍＭのナトリウムから成る緩衝液において、室温で反応させた。反応進行は、サンプルを３６０ｎｍで励起し、４５５ｎｍで光の放射をモニタするように設定したＶｉｃｔｏｒ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ蛍光光度計（ＥＧ＆Ｇ  Ｗａｌｌａｃｈ，Ｔｕｒｋｕ  Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して経時的にモニタした。
【００９９】
図２２は、オリゴ４−ＡｚＣおよびオリゴ２−ＴＰＰを、それぞれ２００ｎＭおよび４００ｎＭの最終濃度に混合する場合、蛍光の急速な増加が見られることを示す。この図において、００４は、オリゴ４−ＡｚＣを意味し、００２は、オリゴ２−ＴＰＰを意味し、００６は、オリゴ６−ＴＰＰを意味する。オリゴ６−ＴＰＰがオリゴ２−ＴＰＰに置換した場合、蛍光は生じない。オリゴ２−ＴＰＰは、オリゴ４−ＡｚＣに対するその塩基対合能力において完全に相補的であるが、オリゴ６−ＴＰＰは、３つのミスマッチのヌクレオチドを含有するため、相補的ではない。結果は、蛍光の作成が、オリゴ２−ＴＰＰのオリゴ４−ＡｚＣとハイブリダイズする能力によること、従って、得られたハイブリッドにおいてＴＰＰとアジドクマリン部分との間の反応を促進するという結論が裏付ける。オリゴ６−ＴＰＰとオリゴ４−ＡｚＣの反応の場合におけるシグナルの欠如は、これらの２つのオリゴヌクレオチドの二本鎖を形成する能力がないことに一致し、したがって、反応は促進されない。各単一オリゴヌクレオチドを含む対照反応は、いかなる非特異的効果をも排除するために行った。
【０１００】
三重複合体に関与する追加実験の結果を図２３に示す。これらの実験において、オリゴ１は、ハイブリタイゼーションによって、２つの完全に相補的なオリゴヌクレオチド（オリゴ５−ＡｚＣおよびオリゴ−２ＴＰＰ）を結合させるその能力と、１つの完全に相補的なオリゴヌクレオチド（オリゴ５−ＡｚＣ）および１つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチド（オリゴ６−ＴＰＰ）を結合させるその能力を比較するために試験した。オリゴ１およびオリゴ５−ＡｚＣは、２００ｎＭの最終濃度で、オリゴ２−ＴＰＰおよびオリゴ６−ＴＰＰは、４００ｎＭの最終濃度で使用した。図２３において、００１は、オリゴ１を意味し、００２は、オリゴ２−ＴＰＰを意味し、００５は、オリゴ５−ＡｚＣを意味し、００６は、オリゴ６−ＴＰＰを意味する。結果として、蛍光は、完全に相補的なオリゴヌクレオチド（オリゴ１、オリゴ５−ＡｚＣおよびオリゴ２−ＴＰＰ）の組み合わせが存在する場合にのみ生成された。
【０１０１】
（実施例９）オリゴヌクレオチドのハイブリタイゼーション、濃縮、および融解温度
１０塩基の相補的領域および１０塩基の一本鎖のスペーサアームを有し、さらに６炭素スペーサアームと連結した２つの２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを含むモデルシステムを調製した。これらのオリゴは、５´−ビオチン（６炭素スペーサアームを有する）の存在および不在の両方で合成した。以下に示されるように、相補的領域には、下線が引かれている。第３のオリゴは、（−）鎖オリゴと同一であるが、（＋）鎖に対して４つの塩基ミスマッチ（イタリック体）がある。
【０１０２】
【数２】
2010503860.tif 000013
１０塩基対オリゴヌクレオチド対（オリゴ２６＋オリゴ２７）の融解曲線は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒにおいて、二本鎖ＤＮＡと結合するＳＹＢＲ色素の蛍光を測定することによって調べた（Ｌｉｐｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００１，４７［４］，６３５−４４）。最大値が、曲線の屈曲点を表すように、結合曲線は、融解曲線の傾斜の第１の誘導体として表した（Ｔｍ、または二本鎖の部位の混合群の場合、「局部」Ｔｍ）。結合曲線は、アビジンが、７０℃以上までビオチン結合活性を保持するため、少なくともこの温度まで得た。
【０１０３】
この特定の対のオリゴヌクレオチドの濃度に対する依存性を調べるために、融解曲線を、５００から２０ｎＭの範囲で変化したオリゴヌクレオチド対に対して生成した（図２４）（例えば、Ｌｉｐｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００１，４７［４］，６３５−４４を参照）。得られたＴｍは、図２４のグラフにおける予測と同様に、オリゴヌクレオチド対の濃度が１０分の１になるごとに、約１０℃の割合で低下した（ＲＦＵは、相対蛍光単位を示す）。融解曲線は、ビオチン化および非ビオチン化オリゴヌクレオチド対に対して本質的に同一であった。４塩基のミスマッチ対は、本質的に、二本鎖構造を示さなかった。
【０１０４】
（＋）および（−）鎖をタンパク質標的に結合することが、Ｔｍを増加させるかどうかを試験するために、ビオチン化したこれらのオリゴヌクレオチドを、アビジンの存在下でインキュベートした。アビジンは、比較的互いに近く配置され、非常に堅く（Ｋａ約＜１０−１５Ｍ）、非協力的にビオチンと結合する、４つの同等物結合部位を含有する。
【０１０５】
ビオチン化した形でのオリゴヌクレオチド＃２６および＃２７の等モル濃度を見ると、ビオチン結合部位の約半分がオリゴヌクレオチドの相補的な対によって占められ、約半分が、同オリゴヌクレオチド（非相補的な対）で示されることが予想される。アビジンの存在下で２つの融解曲線ピークが見られることが予測される。１つのピークは、いずれかがアビジン（水溶液中で遊離）と非結合である、もしくはＴｍに対して近接効果を提示しないはずであるアビジンとの２つの結合のうちの１つのパートナーのみを有する、任意の対のオリゴヌクレオチドの結果である。有意に高いＴｍの第２のピークは、近接効果を提示するはずである両方がアビジンと結合した一対のビオチン化オリゴを提示する。
【０１０６】
そのような実験は、図２５で示されるように行われた。オリゴヌクレオチドは、６０℃に維持された、いわゆるホットスタートで、アビジンの存在下または不在下の水溶液に加えた。「ホットスタート」において、オリゴヌクレオチドは、水溶液におけるそれらのＴｍをはるかに上回る温度で、ビオチン結合部位と結合し、それらが一本鎖であることを確実にする。その後、水溶液を１０℃に下げ、７０℃まで上昇させて、融解曲線分析を行なった、。図２５に示されるように、アビジンの存在下または不在下における非ビオチン化オリゴ対の融解曲線は、３０〜３２℃のＴｍを示した（ＲＦＵは、相対蛍光単位を示す）。しかしながら、アビジンの存在下では、２つの十分に離れたＴｍピークが、３３℃および５２℃のＴｍ値で生成された。上昇温度ピーク（ほぼ２０℃に上昇したＴｍ）は、アビジンの存在下における２つの相補的ビオチン化オリゴヌクレオチドの存在下でのみ見られた。ビオチン存在下と不在下のＴｍの差は、低塩濃度で最も高い傾向を示し（図２６）、１０ｍＭの塩化マグネシウムの存在下においてわずかに高い（図２７）（ＲＦＵは、相対蛍光単位を示す）。ビオチン化オリゴヌクレオチド対アビジンの最適モル比は、約３．５：１であることがわかり（オリゴ＋アビジンの総濃度＝０．７μＭ）、４つの同等物結合部位を有するアビジンに一致した（図２８）（ＲＦＵは、相対蛍光単位を示す）。これは、オリゴヌクレオチドは、アビジンの同分子と結合するという、Ｔｍ効果を得るための要件を実証するため重要なことである。５´ビオチン化鎖オリゴヌクレオチドに対する３´ビオチン化（−）鎖オリゴへの置換は、両方のオリゴヌクレオチドが、５´ビオチン化であった過去の結果に対し、Ｔｍ値の差はほとんど示さなかった（図２９）（ＲＦＵは、相対蛍光単位を示す）。
【０１０７】
室温で両方のオリゴヌクレオチドの等モル量を加え、６０℃に上昇し、その後、融解曲線を得ることによって実験を行ったが、結果は本質的に同一であった。この方法（およびホットスタート法）では、適切な融解曲線は、必要に応じて、各オリゴのアビジンに対する過剰モルを加えることによって生成することができる（しかしながら、予測されるように、オリゴ対の大過剰によって、低Ｔｍピークの大きさが増加する）。オリゴ対は、等モル量で一緒に加える限り、ビオチン結合部位を得るために同等に競合したため、これは、高ＴｍハイブリッドＤＮＡを形成する際に有害ではなかった。オリゴを、一度に１つずつ加えた場合、第１のオリゴ対アビジンの約２：１のモル比、その後、第２のオリゴ対アビジンを２：１で加えることが重要であった。逐次追加では、いずれかのオリゴのアビジンに対する過剰モル量を加えることによって、第１のオリゴによりアビジンの全ての結合部位が占領され、第２の相補的オリゴは、隣接する部位の占領できなくなり、Ｔｍ効果上昇が提示されない。これらの観察は、Ｔｍピークの上昇を提示するハイブリッドを得るための、相補的オリゴの隣接する対の２つの隣接するビオチン結合部位との結合であるメカニズムに一致する。
【０１０８】
実験は、全体がＡおよびＴから成る１０塩基の自己相補的オリゴヌクレオチドでも行った（オリゴ３１：５´−ビオチン−スペーサアーム−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＡ）（配列番号２７）。このオリゴヌクレオチドは、塩基組成において均一であり、全体がＡＴから成るため、上に記載のモデルシステムより低いＴｍで融解し、相当急な融解曲線を形成した。アビジンの存在下では、そのＴｍは、３０．５℃から６１．５℃に増加した（図３０）（ＲＦＵは、相対蛍光単位を示す）。このオリゴヌクレオチドは自己相補的であるため、全ての結合は、結合の２分の１のみではなく、相補的鎖に至る。そのため、Ｔｍの増加の単一ピークのみが見られた。
【０１０９】
これらの実験は、アビジンではなく、抗ビオチン抗体を標的として使用して繰り返された。抗ビオチン抗体は、抗体のＦａｂ部分の端部の近くに位置する２つのビオチン結合部位を含有するが、結合部位は、アビジン上のビオチン結合部位よりさらに離れている。
【０１１０】
（実施例１０）アプタマーを標的結合剤とする、タンパク質標的の検出
ここで、２つの相補的ＤＮＡプローブのアプタマー結合およびアニール時におけるタンパク質標的を検出するために、核酸を鋳型とするアジドクマリン（ＡｚＣ）−トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）化学を使用する例示的なシステムを設計した。
【０１１１】
材料
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＡは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（それぞれ、２２０−ＢＢおよび２２０−ＡＡ）から得た。抗ヒトＰＤＧＦ−Ｂサブユニットモノクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＡＢ２２０１）から得た。緩衝液は、ｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２で、トリス／Ｍｇ緩衝液を含んだ。以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１１２】
【表３−１】
2010503860.tif 000014
【０１１３】
【表３−２】
2010503860.tif 000015
方法
ＤＰＣ反応条件  指定のない限り、１００μｌの総体積において、各１００マイクロリットルの反応物は、１×トリス／Ｍｇ緩衝液、４０ピコモルのＴＰＰおよびＡｚＣ反応プローブ、４０ピコモルの標的オリゴヌクレオチドもしくは標的タンパク質、および典型的に２５〜３０％ｖ／ｖのホルムアミドを含有した。サンプルは、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ１４２０分光光度計において２５℃でインキュベートし、蛍光の増加を、３５５ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光でモニタした。
【０１１４】
結果：アプタマー−ＤＰＣプローブによるＰＤＧＦ−ＢＢの検出
図３１に示されるように、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）Ｂ−サブユニットに対して標的されたアプタマー配列を選択した（Ｆａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．ＢｉｏＣｈｅｍ．２００３，４，８２９−３４）。これは、ＰＤＧＦ−Ｂサブユニット（約１０−９Ｍ）に対する高い親和性、およびＰＤＧＦ−Ａサブユニットに対して約１０分の１の低い親和性を有する一群のアプタマーに属する（Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，１４４１３−２４，１９９６）。プローブ配列を合成し、それぞれ、相補的１０−ｍｅｒＤＮＡ配列、Ｃ１０スペーサ配列、および同３５−ｍｅｒアプタマー配列を含有した（オリゴ＃２０１、＃２０２）。各配列は、それぞれ３´もしくは５´と連結したアプタマーを有する５´−ＴＰＰもしくは３´−ＡＺＣ基を含有した。第２のＡｚＣプローブであるオリゴ＃２０３は、そのアニール配列が、完全に、ＴＰＰオリゴ（＃２０１）とミスマッチしたこと以外は、オリゴ＃２０２と同じであった。
【０１１５】
図３２に示されるように、３０％（体積）ホルムアミドの存在下では、ＴＰＰおよびＡｚＣプローブの互いの反応は、完全に、プローブ上のＰＤＧＦ−ＢＢおよび相補的ＤＮＡ配列の存在に依存した。反応は、いずれかのプローブの不在下においては不成功に終わった。
【０１１６】
反応のＤＮＡ依存性は、アッセイ温度に対するＤＮＡの融解温度に非常に依存した。０％ホルムアミドの存在下では（計算され、観測されたＴｍ＞Ｔアッセイで）、反応は、標的タンパク質ＰＤＧＦ−ＢＢの存在または不在下において行った（図３３Ａ）。実際には、これらの条件の下、ＰＤＧＦ−ＢＢの追加によって、反応率が、約５０％増加ではなく減少した。１０％ホルムアミドでは、ＰＤＧＦ−ＢＢは、それほど抑制的ではなかった（図３３Ｂ）。２０％ホルムアミド（図３４Ａ）では、状況は完全に逆であり、反応率は、ＰＤＧＦ−ＢＢの存在下を除いて、弱くなかった。３０％ホルムアミド（図３４Ｂ）では、反応は、完全に、ＰＤＧＦ−ＢＢの存在に依存した。４０％ホルムアミドでは、反応は、いかなるセットの反応物でも非常に遅かった（図３５）。全ての場合において、ミスマッチのプローブは、反応をほとんど、または全く生じなかった。
【０１１７】
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎでモニタされた、相補的配でのＤＮＡ融解実験は、ホルムアミドの不在下におけるトリス／Ｍｇ緩衝液において配列のＴｍは約３０℃、およびホルムアミドの１０％の増加ごとに配列のＴｍが約７℃低下することを示した。検出アッセイに対する最適ホルムアミド濃度３０％に対するＴｍは、１０℃であった。
【０１１８】
０％ホルムアミドでは、オリゴヌクレオチドは、ＰＤＧＦ−ＢＢの不在下においても、少なくとも部分的二本鎖を形成することができる（Ｔｍは、Ｔアッセイよりわずかに高い）。２０％および３０％ホルムアミドにおける反応のＤＮＡ標的依存性は、タンパク質標的の不在下においてＴｍより高い温度で行ったアッセイによって説明される。反応は、複合体のＴｍが、２つのプローブのＰＤＧＦ−ＢＢ標的との結合によって増加しない限り、起こらない。４０％ホルムアミドでは、反応は、いかなる反応物のセットでも起こらない。可能性として、Ｔｍが減少しすぎたため、ＰＤＧＦ−ＢＢとの結合によって、それをＴアッセイ上に上昇させることができなかった、または、ホルムアミドが、ＰＤＧＦ−ＢＢのアプタマーへの結合を抑制したと説明できる。より複雑な状況は、ホルムアミドの不在下でのＰＤＧＦ−ＢＢの追加時における反応率の観測された抑制である。ＰＤＧＦ−ＢＢによって形成された二本鎖の半分は、非生産的であるため（５０％は、ホモ二本鎖）、率の低下は、恐らく、ＰＤＧＦ−ＢＢ結合によって、これらのホモ二本鎖が、ヘテロ二本鎖を形成する相補的対と、水溶液において解離そして再連結しないようになることによる可能性が高い。この状況は、特にヘテロ二量体標的における異なる結合部位を標的にするプローブ対の使用によって生じないはずである。
【０１１９】
当該アッセイの感度（図３６）は、ＰＤＧＦ−ＢＢ濃度の希釈系列から生成された反応率を測定することによって計算した。Ｗａｌｌａｃ機器での最小検出レベルは、アッセイの背景雑音の標準偏差の３倍の計算値に基づいて、１００マイクロリットルアッセイ体積において０．８ピコモルと予想した。
【０１２０】
アッセイ感度も、ＰＤＧＦ−ＡＡを標的として使用して判定された。アプタマーモノマーは、ＰＤＧＦ−ＢＢに対する親和性の約１０倍弱いＰＤＧＦ−ＡＡに対する親和性を有すると考えた。しかしながら、アッセイは、２つのアプタマー二量体といずれかの型のＰＤＧＦとの複合性の形成に関与するため、二量体の結合の親和力は、モノマーの親和性より堅いと考えられ、その親和性は、標的ＰＤＧＦの試験された濃度より（約１ナノモノマー低下）実質的に堅い（低Ｋｉ）べきである。図３７に示されるように、低もしくは高濃度（０、１．２５、２．５、５、１０、２０、および４０ピコモルのＰＤＧＦ−ＡＡ）でのＰＤＧＦ−ＡＡとのアプタマーＤＰＣプローブの反応率は、ＰＤＧＦ−ＢＢとの反応率と実質的に異ならない。これは、二量体として結合し、親和力の増加を提示するアプタマー対のモデルに一致する。
【０１２１】
ＡｚＣプローブに対するＴＰＰの比率  反応メカニズムのモデルを確認するために（図９、ＴＰＰ対ＡｚＣプローブの最適比率は、１：１と予測される）、図３８は、２つのプローブの比率は変化するが、２つのプローブの総量は、８００ｎｍｏｌｅのプローブ／反応で一定にした実験である。最高反応率を生じる比率は、約１：１であり、予測されたメカニズムに一致した。
【０１２２】
そのため、このモデルシステムでは、アプタマ−が結合し、２つのプローブにおける相補的配列が互いにアニールしない限り、蛍光は生成されなかった。
【０１２３】
（実施例１１）アプタマー結合剤での核酸を鋳型とする化学ベースの生物学的検出に対するジップコード形式の構造
図１５、例示的なジップコード構造をより詳細に示す。ＴＰＰ対は、まず、５´−末端上のＰＤＧＦ−アプタマー、Ｃ１８ポリエチレン−グリコールベースのスペーサ、および１８−ｍｅｒジップコード配列を含有した。ＴＰＰレポータ配列は、その３´末端上の相補的抗ジップコード配列、Ｃ１８ＰＥＧスペーサ、および５´ＴＰＰ基で終了する１０塩基対レポータ配列を含有した。ＡｚＣ検出プローブを含むオリゴヌクレオチド対は、Ｃ１８ＰＥＧスペーサによって別のジップコードと連結した３´−アプタマー、および５´抗ジップコード、Ｃ１８ＰＥＧスペーサ、および３´ＡｚＣ基で終了するレポータオリゴヌクレオチド（ＴＰＰオリゴヌクレオチドに相補的）と連結する検出オリゴヌクレオチドを含有した。
【０１２４】
２２℃の３５％ホルムアミドでは、反応は、両方のレポータオリゴヌクレオチド、両方のアプタマーオリゴヌクレオチド、および標的ＰＤＧＦ−ＢＢの存在に依存した（図３９）。２２℃でのホルムアミドの不在下では、反応は、ＰＤＧＦの存在とは関係なく進行した。これは、上に記載の「一体化」構造の性質に一致し、３５％ホルムアミドにおける蛍光生成のメカニズムが、ＰＤＧＦの追加時における、ホルムアミドにおけるレポータ配列二本鎖熱安定性の増加に依存することを反映する。２２℃でのホルムアミドの不在下において、レポータオリゴヌクレオチド二本鎖は、ＰＤＧＦの存在または不在下の両方において安定した。
【０１２５】
モデルの正確さは、ＴＰＰ対ＡｚＣアプタマーオリゴの比率を変えた実験によって確認した（図４０）。これらの実験は、アプタマーオリゴの最適比は、予測された１：１の比率（すなわち、０．４μＭのＰＤＧＦおよびアプタマーオリゴの総濃度で、５０％ＴＰＰオリゴ）であったことを示した。総レポータオリゴヌクレオチド対総アプタマーオリゴの最適比も、１：１であった。ＰＤＧＦ依存性反応は、受容体もしくはアプタマーオリゴヌクレオチドのいずれか１つの完全不在下では生じなかった。レポータオリゴヌクレオチドの化学量論的濃度以上では、ＰＤＧＦ非依存性シグナルは増加したが（背景）、ＰＤＧＦ依存性シグナルは、ほぼ一定であった。これらの観察の両方は、複合体が、各アプタマーオリゴ、各レポータオリゴ、およびＰＤＧＦに対して、１：１：１の比率で集合するモデルに一致した。
【０１２６】
これらの実験は、各ジップコードおよびその抗ジップコードが、レポータ配列またはアプタマー配列との最小の干渉の中で互いにアニールするように、複合体は、水溶液において自己集合することを示した。
【０１２７】
追加の順序、したがって、アプタマーおよびレポータプローブの集合の様態が、重要であったかどうかを判定するためにも、実験を行った。全てのプローブを混合物に一度に加えることと比較して、レポータオリゴヌクレオチドを加える前に、アプタマーオリゴヌクレオチドを、まずＰＤＧＦでインキュベートした場合、わずかに遅い反応率が得られた。アプタマーオリゴヌクレオチドおよびレポータオリゴヌクレオチドの各対を、混合し、ＰＤＧＦでインキュベートする前に、２つのセットを、まずインキュベートし、互いに集合できるようにした場合、幾分高い反応率が得られた。この理由は、アプタマープローブが、既に標的と結合している場合、アプタマープローブにアニールするジップコードと抗ジップコードに対して多少の立体障害があるからである可能性がある。
【０１２８】
対照として、ジップコード−抗ジップコード配列ではなく、ジップコード配列のみを含有する、１セットの一体化ＴＰＰおよびＡｚＣプローブを比較した（図４１）。この一体化システムの反応率は、ＰＤＧＦの追加による率の改善が、典型的に、二体化システムよりもわずかに良好であることを除いて、二体化システムのそれと同様であった。
【０１２９】
アプタマー含有ＴＰＰおよびＡｚＣプローブの配列も、設計に対する任意の制約を判定するために、体系的に変化させた。アプタマー含有ＴＰＰおよびＡｚＣオリゴを合成し、両方とも、図１５に記載されるように同じ配列を有したが、次の変更があった。（１）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサの省略（オリゴ１１９および１２２）、（２）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサの配列Ｃ１０−での置換（オリゴ１２０および１２３）、（３）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサの配列Ｃ２０−での置換（オリゴ１２１および１２４）、（４）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサの省略、およびジップコード領域における３つの３´塩基の省略（１５塩基への長さの減少）（オリゴ１２７および１２９）、および（５）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサの省略、およびジップコード領域における６つの３´塩基の省略（１２塩基への長さの減少）（オリゴ１２８および１３０）。
【０１３０】
この実施例で使用したオリゴヌクレオチドは、以下を含む。
【０１３１】
【表４−１】
2010503860.tif 000016
【０１３２】
【表４−２】
2010503860.tif 000017
これらの、いずれの変更によっても、システムの性能に有意差は生じなかった。実験４）および５）も、レポータオリゴヌクレオチドにおけるＣ１８スペーサのすぐ上流で３および６塩基の一本鎖（ジップコードにアニールしない）構造をもたらした。
【０１３３】
これらの実験の結果は、アプタマーベースのＰＤＧＦ検出システムは、結合およびＤＰＣ機能を２つの個別のオリゴヌクレオチドに分離することによって構成できることを示す。適切なジップコード配列の選択によって、図１４に記載される検出形式は、一体形成で合成されたオリゴヌクレオチドと同様に機能する、アニールされたオリゴヌクレオチドの対に自己集合した。レポータおよびアプタマーオリゴヌクレオチドは、標的の導入前に、個別に集合され得るか、もしくは、全ての種は、ほぼ任意の順序で、一緒に追加され得る。この工程は、例えば、複数の標的を検出するために、アニールされた検出オリゴの１つ以上の対の溶液相集合に拡張し得る。複数の標的の検出は、個別で認識できるシグナル（例えば、放射光の異なる波長）を生成する異なるレポータオリゴヌクレオチドの使用を必要とする場合がある。
【０１３４】
これらの結果は、例えば、アプタマー含有オリゴヌクレオチドを使用して、ジップコード形式の報告法を、効果的に設計することができることを示す。
【０１３５】
アプタマーシステムでの結果が、結合とレポータ配列との間の安定複合体は、単に、ジップコードおよび抗ジップコード領域をアニールすることによって形成することができることを示したが、レポータ反応基の活性を高い可能性で保持する、共有結合的および不可逆的に２つのオリゴヌクレオチドを互いに連結する技術があることに注意するべきである。例えば、オリゴヌクレオチドは、ジップコードおよび抗ジップコードがほとんど二本鎖であり、残りの配列は一本鎖である温度において、対（核酸を鋳型とする化学に対する結合剤オリゴヌクレオチドおよび反応性オリゴヌクレオチド）でインキュベートすることができる。Ｔｒｉｏｘａｌｅｎ等の光活性化可能な挿入架橋剤を加え、その後、紫外線を照射することによって、２つの鎖を不可逆的にクロスリンクすることができる。同様に、紫外線照射によって、アニールされた配列の個別の鎖の間にチミジン二量体を導入し得る。別様に、配列は、後にＤＮＡリガーゼと結紮し得る、短標的（接合）ＤＮＡ、隣接した３´および５´に相補的に導入し得る。接合オリゴヌクレオチドは、別様に、ＲＮＡから成ってもよく、ＤＮＡにアニールされたＲＮＡを加水分解するＲＮａｓｅＨとの結紮の後に除去してもよい。これによって、２つのオリゴヌクレオチドを、単一の一本鎖ＤＮＡに変換することができる。これらの方法により、特定の標的に対する検出キットにおけるオリゴヌクレオチド試薬を、費用効率良く製造することができる。
【０１３６】
この実施例に関連する参照文献は、Ｃａｐａｌｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２０００，２８［７］，ｅ２１．；Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．，２００４，７１６１−７２；Ｆａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００３，４，８２９−３４．；Ｇｅｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９９，２９２，２５１−６２を含む。
【０１３７】
（実施例１２）ＤＰＣ塩基の生物学的検出に対するジップコード形式の構造−抗体結合剤
他の実施形態において、アプタマー配列は、抗体等の非ＤＮＡ結合剤と置き換えられる。ＰＤＧＦおよび他のタンパク質標的に対して、アプタマー配列は、アルデヒド等の化学的活性基と置き換え、タンパク質標的に対する抗体または受容体等の非ＤＮＡ結合剤配と反応させる（図１７）。結合剤およびレポータオリゴヌクレオチドに対する最適設計は、結合剤の大きさおよび形状、および標的の結合部位の大きさおよび形状に配慮して得ることができる。例えば、より長い、もしくはより短いスペーサアームを、標的上の結合部位の間の距離を最適に補い、結合剤自体による立体障害を回避するために使用され得る。
【０１３８】
図１７を参照すると、ＴＰＰレポータ分子とハイブリタイズするように設計されたジップコード形式のオリゴヌクレオチドを５´−アミノ基を含有するように合成した。ＡｚＣレポータ分子とハイブリタイズするように設計されたジップコード形式のオリゴヌクレオチドは、３´−アミノ基を含有した。オリゴヌクレオチドと抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体との抱合体の合成は、ＳｏｌｕＬｉｎｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって行われた。
【０１３９】
抗体およびオリゴヌクレオチドの抱合のためのＳｏｌｕＬｉｎｋ技術は、まず、アセトンヒドラゾンを抗体上に取り込むために、スクシンイミジル２−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾンによる抗体の第一級アミノ基の修飾が必要である。オリゴヌクレオチドの第一級アミンは、スクシンイミジル４−安息香酸ホルミルで個別に活性化した。２つの活性分子は、所望の比率（典型的に、６：１）で混合し、安定したヒドラゾン連結を形成するために、弱酸性のｐＨで反応させた。この化学の詳細は、ｗｗｗ．ＳｏｌｕＬｉｎｋ．ｃｏｍで閲覧可能である。２つの抱合体を調製し、一方は、ＡｚＣ含有レポータオリゴヌクレオチドにアニールするためのジップコードを含有し、他方は、ＴＰＰ含有レポータオリゴヌクレオチドにアニールするためのジップコードを含有した。
【０１４０】
ＳｏｌｕＬｉｎｋから入手した抗体−オリゴヌクレオチド抱合体は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４の０．０１Ｍのカリウムリン酸塩−０．１３８Ｍの塩化ナトリウム）においてＳｕｐｅｒｄｅｘＳ−２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１．６×６０ｃｍカラムのゲルクロマトグラフィによってさらに精製した。カラム体積の約０．６倍で溶出する主要抗体ピークを採取し、汚染している非抱合オリゴヌクレオチドの後の溶出ピークは、処分した。抗体抱合体は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用して、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）３０Ｋ分画分子量Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒによる逆透析で濃縮した。タンパク質含有量は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを使用して測定し、オリゴヌクレオチド含有量は、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ結合色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して測定した。抱合体は、両方とも、タンパク質分子当たり平均約３オリゴヌクレオチドを含有することが判定された。
【０１４１】
組み換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（２２０−ＢＢ）およびマウスモノクローナル抗ＰＤＧＦ−ＢＢ（ＭＡＢ２２０）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）から入手した。
【０１４２】
本研究において使用した配列は、以下のものを含む（ＡｚＣは、アジドクマリンを示し、ＴＰＰは、トリフェニルホスフィンを示す）。
【０１４３】
【表５】
2010503860.tif 000018
なお、５´アミノ修飾因子Ｃ６は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ホスホラミダイト１１０−１９０６）から入手した。３´−アミノ修飾因子Ｃ７は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＣＰＧ２０−２９５７）から入手した。Ｃ１８ＰＥＧは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ホスホラミダイト１０−１９１８）から入手した。
【０１４４】
抗体−オリゴ抱合体とレポータオリゴヌクレオチドとの集合
それらのレポータを有する２つの抗体−オリゴ抱合体は、まず、１０μｌの体積において個別に集合させた。各集合体は、ｐＨ８の０．０５Ｍのトリス／ＨＣｌ−０．０１Ｍの塩化マグネシウムにおいて、０．５μＭ（５ピコモル）の抗体−オリゴヌクレオチド抱合体、および０．１５μＭ（１５ピコモル）の相補的レポータオリゴヌクレオチドを含有した。それぞれ、検出反応混合物における使用の前に、少なくとも１５分、４℃でインキュベートした。
【０１４５】
ＰＤＧＦ−ＢＢでの抗ＰＤＧＦ−ＢＢ  ＤＰＣ抱合体／レポータの検出反応
検出反応を行うために、各反応物は、５０μｌの体積中に、上のように調製された各１０μｌの抱合集合体、および、可変量のＰＤＧＦ−ＢＢを、ｐＨ８の０．０５Ｍのトリス／ＨＣｌ、０．０１Ｍの塩化マグネシウム、４０％ｖ／ｖホルムアミドの緩衝液において、含み得る。抱合体は、０．２μＭでこの反応混合物に存在する。サンプルは、２５℃のＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ照度計内の黒い９６ウェルのマイクロプレートのウェルでインキュベートする。蛍光は、３５５ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光で、時間に対して追求することができる。
【０１４６】
反応は、典型的に、２５℃で行い、反応生成物である７−アミノクマリンの波長の最適条件で蛍光生成をモニタし得る。
【０１４７】
参照による援用
本明細書で言及される各出版物および特許文献の開示の全体は、各個別の出版物もしくは特許文献が、そのように個別で示されるのと同じ程度で、あらゆる目的のために、全体として参照することにより援用される。
【０１４８】
同等物
本発明は、その精神もしくは本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形で具体化されてもよい。したがって、前述の実施形態は、あらゆる点で、本明細書に記載される本発明への制限ではなく、実例となるものとみなされる。そのため、本発明の範囲は、前述の説明ではなく、添付の請求項の範囲によって示され、特許請求の同等の意味および範囲内に入る全ての変更は、本明細書に包含されることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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