(57)【要約】本発明は、下記の一般式１で表されるアミノ酸配列を含み、上皮細胞成長因子(EGF)活性を示すペプチド及びその用途に関する。  [一般式１]  Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−リンカー−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ  本発明のＥＧＦミミックペプチドは、天然のヒトＥＧＦと同一な機能または作用をすることができ、細胞内で天然の自己分泌(autocrine)ＥＧＦの生成を促進することができる。また、本発明のペプチドは、安定性が天然ＥＧＦと比較して非常に高く、皮膚透過度に非常に優れている。したがって、本発明のペプチドを含む組成物は、ＥＧＦ活性が要求される疾患または状態を治療、予防または改善するにおいて、非常に優れた効能を発揮して、医薬、医薬外品及び化粧品に非常に有利に適用できる。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式１で表されるアミノ酸配列を含み、上皮細胞成長因子(EGF)活性を示すペプチド。
[一般式１]
Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−リンカー−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
【請求項２】
前記リンカーは、複数のアミノ酸残基からなるリンカーであることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記リンカーは、２〜１０個のＧｌｙ残基からなっていることを特徴とする、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドのＮ−末端及びＣ−末端にあるアミノ酸残基の少なくとも一つは、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール(PEG)からなる群から選択される保護基が結合されていることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドのＣ−末端に位置したＡｓｐ残基には、保護基としてＡｌａまたはＧｌｙアミノ酸が追加的に結合されたことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドは、下記の一般式２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載のペプチド。
[一般式２]
Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ(ｎ)−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ
(式中、ｎは、２〜８の整数を示す。)
【請求項７】
上皮細胞成長因子(EGF)活性を示す請求項１乃至６のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む上皮細胞成長因子−有効性(epidermal growth factor-effective)の疾患または状態(conditions)の予防または治療用組成物。
【請求項８】
前記組成物は、(a)請求項１乃至６のいずれかに記載のペプチドの薬剤学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、(a)請求項１乃至６のいずれかに記載のペプチドの化粧品学的有効量(cosmetically effective amount)、及び(b)化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、天然のＥＧＦの生産を促進することにより、細胞増殖の促進、分裂促進、上皮細胞の生理活性促進、血管形成の促進、神経再生の促進、傷の治癒、血栓症の治療、動脈硬化症の治療、コラーゲン、エラスチン、ラミニン合成促進、歯周疾患の治療、または皮膚状態の改善の効能または活性を有することを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、皮膚状態の改善の効能または活性を有することを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記皮膚状態の改善は、シワの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、脱毛の防止または発毛促進、アトピー疾患の治療、皮膚保湿の改善、シミの除去またはニキビの治療であることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
上皮細胞成長因子(EGF)活性を示す請求項１乃至６のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む組成物を哺乳動物に投与する段階を含む上皮細胞成長因子−有効性(epidermal growth factor-effective)の疾患または状態(conditions)の予防または治療方法。
【請求項１４】
前記組成物は、(a)請求項１乃至６のいずれかに記載のペプチドの薬剤学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物は、(a)請求項１乃至６のいずれかに記載のペプチドの化粧品学的有効量(cosmetically effective amount)、及び(b)化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物は、天然のＥＧＦの生産を促進することにより、細胞増殖の促進、分裂促進、上皮細胞の生理活性促進、血管形成の促進、神経再生の促進、傷の治癒、血栓症の治療、動脈硬化症の治療、コラーゲン、エラスチン、ラミニン合成促進、歯周疾患の治療、または皮膚状態の改善の効能または活性を有することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物は、皮膚状態の改善の効能または活性を有することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記皮膚状態の改善は、シワの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、脱毛の防止または発毛促進、アトピー疾患の治療、皮膚保湿の改善、シミの除去またはニキビの治療であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上皮細胞成長因子−有効性(epidermal growth factor-effective)の疾患または状態(conditions)の予防または治療用薬物(medicament)を製造するための請求項１乃至６のいずれかに記載のペプチドの用途(use)。
【請求項２０】
前記組成物は、天然のＥＧＦの生産を促進することにより、細胞増殖の促進、分裂促進、上皮細胞の生理活性促進、血管形成の促進、神経再生の促進、傷の治癒、血栓症の治療、動脈硬化症の治療、コラーゲン、エラスチン、ラミニン合成促進、歯周疾患の治療、または皮膚状態の改善の効能または活性を有することを特徴とする、請求項１９に記載の用途。
【請求項２１】
前記組成物は、皮膚状態の改善の効能または活性を有することを特徴とする、請求項２０に記載の用途。
【請求項２２】
前記皮膚状態の改善は、シワの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、脱毛の防止または発毛促進、アトピー疾患の治療、皮膚保湿の改善、シミの除去またはニキビの治療であることを特徴とする、請求項２１に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮細胞成長因子の活性を有するペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト上皮細胞成長因子(hEGF)は、５３個のアミノ酸から構成されており、米国のスタンリイ・コーエン博士によってマウスの顎下腺から最初に分離され、この物質を産まれたばかりのマウスなどに処理した時、瞼が正常的なマウスより早く開くことを実験的に証明して、‘上皮細胞の成長を促進する因子’という意味で‘Epidermal Growth Factor’と命名した(Cohen, S. (1962) J. Biol. Chem. 237, 1555-1562)。スタンリイ・コーエン博士は、ＥＧＦを最初に発見した功労が認められ、１９８６年ノーベル医学賞を受賞した。ＥＧＦは、構造的に三つの二硫化(disulfide)結合を有するポリペプチド(Savage, C.t., Jr. et al., (1973) J. Biol. Chem. 248, 7669-7672; Savage, C.R., Jr. et al., (1972) J. Biol. Chem. 247, 7612-7621)で、上皮細胞の成長を促進する因子であって、細胞膜にあるＥＧＦ受容体を通じて信号を伝達することにより、哺乳類の細胞、特に上皮及び皮膚細胞の成長及び分裂を誘導して、上皮細胞の成長を促進することが明かされている(Sporn, M. B. et al., (1985) Nature(London) 313, 745-747; Sporn M.B. et al., (1980) N. Engl. J. Med. 303, 878-880)。また、ＥＧＦは、傷の治療(Buckley, A. et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 7340-7344)などの過程において、分子水準における調節に非常に重要な役割をすると知られている。
【０００３】
ＥＧＦは、唾液、小便、母乳、涙液、血液などに高濃度で存在し、傷がついた時、血液から供給され、傷跡を残さずに傷を癒えさせる作用をする。その他にも様々な作用をするが、女性ホルモンの分泌を促進するＦＳＨ(Follicle stimulation hormone)と共に子宮中の受精卵を成熟させて、血管がなくて変質しやすい角膜の再生を助ける。また、上皮細胞及び内皮細胞の細胞増殖促進、真皮の構成成分であるコラーゲンを合成する線維芽細胞の細胞増殖促進、皮膚損傷部位の血管新生促進及びその他の再生促進因子の分泌誘導、皮膚組織が一定な方向に網を形成するようにする物質であるフィブロネクチンの合成促進など、皮膚再生に核心的な役割を担当する。
【０００４】
人体はＥＧＦを、損傷された組織に適切に供給して、正常的に回復されるように自律的に調節をするが、ＥＧＦがよく供給されない場合、外部から供給をして、正常的に回復されるようにしなければならない。このような側面で、ＥＧＦは多様に利用可能である。例えば、糖尿性足部潰瘍、火傷、創傷、角膜損傷、腹部切開手術、美容目的の剥皮手術、老化された皮膚の改善などに利用が可能であって、また、ｈＥＧＦは、上皮細胞の分化促進能力とは別途に、胃腸管内における胃酸の分泌抑制能力も有しており、胃潰瘍などの疾病の治療にも非常に有用に応用できると報告されている(Gregory, H., (1985) J. Cell Sci. Suppl. 3, 11-17)。
【０００５】
一方、１９７５年スターキー(Starkey)らが人間の尿からｈＥＧＦを分離精製して、その性質を究明した以来、ｈＥＧＦを高収率で持続的に得るための努力が続けられてきた(Starkey, R. H. et al., (1975) Science 189, 800; Cohen. S. et al., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 1317)。このような努力の一つとして、幾つかの研究グループは、遺伝工学技術を利用してｈＥＧＦ遺伝子をクローニングするに成功したと報告しているが(Smith, J. et al., (1982) Nucleic Acids Res. 10, 4467-4482; Urdea, M. S. et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7461-7465; Oka, T, et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7212-7216)、このような遺伝工学技術を利用して製造されたｈＥＧＦは、産業的に利用可能なくらいの十分な量または十分な活性を有していないという決定的な問題点があった。
【０００６】
このような血液及び組織に存在するポリペプチド成長因子の場合、その体内半減期が数分程度で、ごく短いと知られており、ＥＧＦの場合も同様に構造的な影響を受けるという問題点がある。また、ＥＧＦは、生物学的に不安定で、物理化学的にも不均質であって、治療効果が減少する場合があり、皮膚内透過率も非常に低調であるという問題点もある。
【０００７】
したがって、ＥＧＦの機能を代表するような、他の安定性及び透過率の高い物質の生産が切実に求められている実情である。
【０００８】
本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、天然ヒト上皮細胞成長因子と同一な機能または作用をすることができて、且つ天然ＥＧＦより安定性に優れて皮膚透過率に優れているペプチドを製造するために、多様な種類のヒトＥＧＦ−由来ペプチドを製造及びスクリーニングした。その結果、数多いペプチド候補物質の中から、生理活性だけではなく安定性にも優れているペプチドを選択することにより、本発明を完成した。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、上皮細胞成長因子(EGF)活性を示すペプチドを提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、上皮細胞成長因子−有効性(epidermal growth factor-effective)の疾患または状態(conditions)の予防または治療用組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一様態によると、本発明は、下記の一般式１で表されるアミノ酸配列を含み、上皮細胞成長因子(EGF)活性を示すペプチドを提供する。
[一般式１]
Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−リンカー−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
【００１４】
本発明の他の様態によると、本発明は、上皮細胞成長因子(EGF)活性を示す上記のペプチドを有効成分として含む上皮細胞成長因子−有効性(epidermal growth factor-effective)の疾患または状態(conditions)の予防または治療用組成物を提供する。
【００１５】
本発明者らは、天然ヒト上皮細胞成長因子と同一な機能または作用をすることができて、且つ天然ＥＧＦより安定性に優れて皮膚透過率に優れているペプチドを製造するために、多様な種類のヒトＥＧＦ−由来ペプチドを製造及びスクリーニングした。その結果、数多いペプチド候補物質の中から、生理活性だけではなく安定性にも優れているペプチドを選択した。
【００１６】
本発明において、本発明者らが採択した戦略は以下のようである。まず、本発明のペプチドをＥＧＦ−由来配列(即ち、EGF活性部位)及び細胞付着部位の二つの部分で形成させる。前記ＥＧＦ活性部位は、天然ＥＧＦアミノ酸配列から選択する。そして、本発明のペプチドのＥＧＦ活性を向上させるための前記細胞付着部位を、細胞間質タンパク質であるフィブロネクチン(fibronectin)から選択する。
【００１７】
このようにして選択されたＥＧＦ活性部位は、‘Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ’ペプチド配列であり、細胞付着部位は、‘Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ’配列である。また、本発明者らは、前記二つの機能部位を直接連結するより、リンカーを介して間接的に連結することが好ましいということを見出した。
【００１８】
上述の戦略によって、前記一般式１のＥＧＦ−ミミック(mimicking)ペプチドが導出される。
【００１９】
前記ＥＧＦ活性部位及び細胞付着部位を連結するリンカーとしては、当業界に公知の多様なリンカーが利用できる。好ましくは、前記リンカーは、複数のアミノ酸残基からなるリンカーである。アミノ酸配列からなるリンカーは、Huston, et al., Methods in Enzymology, 203:46-88(1991)、及びWhitlow, et al., Protein Eng., 6:989(1993))に開示されており、前記文献は、本明細書に参照として取り込まれる。本発明に適したリンカーは、主にグリシンまたはグリシンとセリンアミノ酸から構成されて、その長さは、２〜１８アミノ酸である。本発明のより好ましい具現例によると、前記リンカーは、２〜１０個のＧｌｙ残基からなっている。本発明のペプチドにおいて、アミノ酸からなるリンカー、特にＧｌｙ残基からなるリンカーは、本発明のペプチドの安定性にも寄与する。
【００２０】
本発明のペプチドは、それ自体が天然ＥＧＦより非常に優れた安定性を示すが、アミノ酸の変形によって安定性が向上され得る。本発明の好ましい具現例によると、 前記一般式１のペプチドのＮ−末端及びＣ−末端に存在するアミノ酸残基の少なくとも一つは、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール(PEG)から構成された群から選択される保護基が結合されている。このような保護基は、本発明のペプチドの安定性を増加させる役割をする。
【００２１】
本発明の他の変形例によると、前記一般式１のペプチドのＣ−末端は、アミノ基に変形されており、これは、ペプチドの安定性を増加させる作用をする。
【００２２】
本明細書において用語‘安定性’は、インビボ安定性だけではなく、貯蔵安定性(例えば、常温貯蔵安定性)も意味する。上述の保護基は、生体内の蛋白質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。
【００２３】
本発明の好ましい具現例によると、前記一般式１のペプチドのＣ−末端に位置したＡｓｐ残基には、保護基としてＧｌｙまたはＡｌａが追加的に結合されており、より好ましくは、Ｇｌｙ残基が保護基として結合されている。
【００２４】
本発明の最も好ましい具現例によると、本発明のペプチドは、下記の一般式２のアミノ酸配列を含む。
[一般式２]
Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ(ｎ)−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ
(式中、ｎは、２〜８の整数を示す。)
【００２５】
本発明のペプチドの具体的な例は、配列番号１に記載されている。
【００２６】
本発明のペプチドは、前記一般式１のアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明におけるペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列で必須的に構成されている。最も好ましくは、本発明におけるペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列で構成されている。
【００２７】
本明細書において、用語‘ペプチド’は、ペプチド結合によりアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。
【００２８】
本発明のペプチドは、当業界に公知の化学的合成方法、特に、固相合成技術(solid-phase synthesis techniques)によって製造できる(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984))。
【００２９】
一方、本発明のペプチドの基本的な構造は、ＥＧＦ−由来配列及びフィブロネクチン−由来細胞付着配列が結合されている構造である。したがって、前記一般式１は、本発明のペプチドの構造を便宜的に表現するためのもので、これの変形も本発明に属するということは当業者に明らかである。例えば、前記一般式１において、ＥＧＦ−由来配列及びフィブロネクチン−由来細胞付着配列が反対に位置したペプチド‘Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−リンカー−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ’も本発明の範囲に属するということは、当業者に自明である。また、本発明で採択したＥＧＦ−由来配列及び/またはフィブロネクチン−由来細胞付着配列に、幾つか(例えば、１〜２個)のアミノ酸が追加的に結合されたものも本発明の範囲に属する。例えば、細胞付着配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＡｓｐのＣ−末端にＳｅｒが追加的に結合されたものも本発明の範囲に属する。
【００３０】
本発明のペプチドは、天然ＥＧＦとほぼ同一な活性で生理活性を発揮するだけではなく、熱安定性及び酸とアルカリなどの物理化学的因子に対する安定性に優れている。したがって、優れた長期保存性を有する本発明のペプチドは、医薬品、医薬外品、化粧品及び口腔用品のような長期間貯蔵が要求される製品に有利に適用できる。
【００３１】
本発明の他の様態によると、本発明は、上皮細胞成長因子(EGF)活性を示す上述の本発明のペプチドを有効成分として含む上皮細胞成長因子−有効性(epidermal growth factor-effective)の疾患または状態(conditions)の予防または治療用組成物を提供する。
【００３２】
本発明の組成物は、上述の本発明のペプチドを有効成分として含むため、その重複する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
【００３３】
本発明で有効成分として利用するペプチドは、ＥＧＦ活性を保有し、生体に適用時、天然ＥＧＦが発揮する作用または機能を発揮する。本明細書において、用語‘ＥＧＦ活性’は、天然ＥＧＦに対して従来究明された全ての活性、例えば、細胞増殖及び分裂促進などの活性を意味する。本発明のペプチドは、天然ＥＧＦの作用を真似る(mimicking)ように製作されたものであるため、天然ＥＧＦの多様な生体内活性を全て発揮することができる。
【００３４】
本発明で利用されるペプチドは、天然ＥＧＦと同一な機能または作用をすることができるだけではなく、生理活性度も類似しているため、ＥＧＦ−有効性の疾患または状態の予防または治療に有利に利用できる。本明細書で使用される用語‘ＥＧＦ−有効性の疾患または状態’は、天然のＥＧＦにより治療または予防できる疾患または状態を意味する。
【００３５】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物により発揮される活性は、細胞増殖の促進、分裂促進、上皮細胞の生理活性促進、血管形成の促進、神経再生の促進、傷の治癒、血栓症の治療、動脈硬化症の治療、コラーゲン、エラスチン、ラミニンまたはヒアルロン酸合成促進、歯周疾患の治療、または皮膚状態の改善で表現できる。
【００３６】
本発明の組成物が歯周疾患に適用される場合、本発明の組成物は、歯磨き(toothpaste)、口腔清浄用組成物または口腔保護用組成物に製造できる。本明細書において用語‘歯周疾患治療用組成物’は、‘口腔保護用組成物(composition for tooth and mouth care)’または‘口腔清浄用組成物(composition for tooth and mouth cleaning)’に代替できる。本発明のペプチドは、歯茎組織の上皮細胞の生理活性を促進して、迅速な歯茎傷の治癒を通じて、損傷された歯茎組織を再生させることにより、歯周疾患を治療または予防することができる。
【００３７】
より好ましい具現例によると、本発明の組成物は、皮膚状態の改善の効能または活性を有する。特に、本発明の組成物において有効成分として利用されるペプチドは、天然ＥＧＦより分子量が遥かに少ないため、皮膚浸透率に非常に優れている。したがって、本発明の組成物を局所的に皮膚に塗布する場合、皮膚状態の改善を大きく達成することができる。より好ましくは、本発明の組成物による皮膚状態の改善は、シワの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、皮膚保湿の改善、シミの除去、ニキビの治療、傷の除去及び皮膚再生効果であり、最も好ましくは、シワの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、傷の除去及び皮膚再生効果である。
【００３８】
例えば、本発明で有効成分として利用されるペプチドは、角質細胞の増殖を促進し、これらの細胞からプロコラーゲン及びフィブロネクチンの合成増加を誘導し、皮膚成長物質である天然のＥＧＦを自発的に生成させることにより、皮膚の角質細胞層、上皮層及び真皮層を再生または成長させ、シワの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、皮膚保湿の改善、傷の除去及び皮膚再生効果などの効能を奏する。
【００３９】
本発明の組成物は、薬剤学的組成物と化粧品組成物に製造できる。
【００４０】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物は、(a)上述の本発明のペプチドの薬剤学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物である。
【００４１】
本明細書において用語‘薬剤学的有効量’は、上述のペプチドの効能または活性を達成するに十分な量を意味する。
【００４２】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適合した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)に詳細に記載されている。
【００４３】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口、好ましくは、非経口で投与でき、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などにより投与できる。
【００４４】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって様々である。一方、本発明の薬剤学的組成物の好ましい投与量は、１日当たり、０．０００１〜１００μｇである。
【００４５】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び/または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００４６】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物は、(a)上述の本発明のペプチドの化粧品学的有効量(cosmetically effective amount)、及び(b)化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物である。
【００４７】
本明細書において用語‘化粧品学的有効量’は、上述の本発明の組成物の皮膚改善効能を達成するに十分な量を意味する。
【００４８】
本発明の化粧品組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形にも製造でき、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。より詳しくは、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤形に製造することができる。
【００４９】
本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合は、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、または酸化亜鉛などが利用できる。
【００５０】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーである場合は、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、またはポリアミドパウダーが利用でき、特にスプレーの場合は、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン/ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体をさらに含むことができる。
【００５１】
本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合は、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が利用されて、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、またはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００５２】
本発明の剤形が懸濁液である場合は、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラガカントなどが利用できる。
【００５３】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合は、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イソチオネート、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用できる。
【００５４】
本発明の化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチドと担体成分の他に、化粧品組成物に通常的に利用される成分を含むが、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常的な補助剤を含むことができる。
【発明の効果】
【００５５】
本発明の特徴及び利点(advantages)を要約すると、以下のようである。
(i)本発明のＥＧＦ−ミミックペプチドは、天然のヒトＥＧＦと同一な機能または作用をすることができる。
(ii)本発明のペプチドは、細胞内で天然の自己分泌(autocrine)ＥＧＦの生成を促進することができる。
(iii)本発明のペプチドは、安定性が天然ＥＧＦと比較して非常に優れており、皮膚透過度に非常に優れている。
(iv)したがって、本発明のペプチドを含む組成物は、ＥＧＦ活性が要求される疾患または状態を治療、予防または改善するに非常に優れた効能を発揮する。
(v)上述の本発明のペプチドの優れた活性及び安定性は、医薬、医薬外品及び化粧品に非常に有利に適用できるようにする。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の実施例により製造されたトリデカペプチドに対するＨＰＬＣ(high performance liquid chromatography)分析結果を示すグラフである。
【図２】本発明のペプチドの安定性を測定した結果を示すグラフである。‘ペプチド’及び‘ｒｈＥＧＦ’は、それぞれ本発明のトリデカペプチド及び組み換えＥＧＦを示す。
【図３】本発明のペプチドのヒト角質細胞の成長促進能を示す顕微鏡像である。パネルＡは、非処理対照群、パネルＢは、本発明のペプチドを処理したヒト角質細胞に対する写真である。
【図４】本発明のペプチドのヒト角質細胞に対する濃度−依存性成長促進能を示すグラフである。
【図５】本発明のペプチドによるヒト角質細胞の付着能向上を示す顕微鏡像である。
【図６】本発明のペプチドをＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に処理した後、この細胞が増殖して移動される効果を顕微鏡で確認した写真である。
【図７】本発明のペプチドを利用した細胞培養時、増加された上皮細胞成長因子(EGF)生成量の増加を示したグラフである。
【図８】本発明のペプチドによるヒアルロン酸合成促進様相を示すグラフである。
【図９】本発明のペプチドを含む化粧品組成物を適用したＢａｌｂＣマウスの皮膚厚の変化を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【００５８】
実施例１：NH2-Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-Gly(n)-Arg-Gly-Asp-Gly-OHの合成
クロロトリチルクロライドレジン(chloro trityl chloride resin；CTL resin, Nova Biochem Cat No. 01-64-0021)７００ｍｇを反応容器に入れて、メチレンクロライド(MC)１０ｍｌを加えて３分間攪拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド(DMF)を１０ｍｌ入れて３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのメチレンクロライド溶液を入れて、Fmoc-Gly-OH(Nava Biochem, USA)２００ｍｍｏｌｅ及びＤＩＥＡ(N,N’-Diisopropyl ethylamine)４００ｍｍｏｌｅを入れた後、攪拌してよく溶かして、１時間攪拌しながら反応させた。反応後、洗浄して、メタノールとＤＩＥＡ(2:1)をＭＣに溶解してレジンと１０分間反応した後、過量のＭＣ/ＤＭＦ(1:1)で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド(DMF)を１０ｍｌ入れて３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液(20%のピペリジン/DMF)１０ｍｌを反応容器に入れて、１０分間常温で攪拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、再び１０分間反応を維持した後、溶液を除去し、ＤＭＦで２回、ＭＣで１回、再びＤＭＦで３分間１回洗浄して、Gly-CTLレジンを製造した。新しい反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れて、Fmoc-Asp(tBu)-OH(Nova Biochem、米国)２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ  ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ  ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、攪拌してよく溶解させた。反応器に４００ｍｍｏｌｅのＤＩＥＡを分画で２回にかけて入れて、全ての固体が溶解されるまで少なくとも５分間攪拌した。溶解されたアミノ酸混合溶液を、脱保護されたレジンが入っている反応容器に入れて、１時間常温で攪拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で５分間ずつ３回攪拌した後、未反応溶媒を除去した。反応レジンを少量取って、カイザーテスト(Ninhydrine test)を利用して反応程度を点検した。脱保護溶液で上記と同様に２回脱保護反応し、Asp(tBu)-Gly-CTL resinを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄し、再びカイザーテストを行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。即ち、上記一般式１に記載のアミノ酸配列に基づき、Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Gly(n回), Fmoc-Glu(tBu), Fmoc-Ile, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Met及びFmoc-Cys(trt)の順に連鎖反応を行った。但し、中間のGlyは、ペプチド別にそれぞれ２回反復から８回反復まで多様な残基数で合成を行い、合計７種のペプチジルレジンを製造した。
【００５９】
製造されたペプチジルレジンは、同一な方法により脱保護し、Fmocを除去した後、ＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、Ｐ2Ｏ5下で真空に減圧して完全に乾燥し、ペプチジルレジンを準備した。製造されたレジンに脱漏溶液[トリフルオロ化酢酸(TFA)81.5%、蒸留水5%、チオアニソール5%、フェノール5%、EDT 2.5%及びTIS 1%]３０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のNH2-Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-Gly(n)-Arg-Gly-Asp-Gly-OHを７種のペプチドとして獲得した。この中、NH2-Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Gly-OHの場合は、約０．８２ｇを収得し、分子量測定器(Perseptive Pioneer DE-STR ABI, 米国)を利用して、分子量１２７２．０(理論値1671.41)が得られた。
【００６０】
図１は、合成して精製したペプチドに対するＨＰＬＣ分析結果である。ポンプは、韓国分析機器のＧｉｌｓｏｎポンプを利用した。使用したカラムは、Ｃ18  ４．６×２５０ｍｍカラムを使用して、Ａ溶媒(0.1%  TFA)とＢ溶媒(0.1%  MeCN)を５０分間一次濃度勾配を与えて分析を行った。紫外線領域２１６ｎｍで物質を検出してみたところ、トリデカペプチドは、約２０分間の滞留時間(retention time)を有することが分かって、適切な純度で合成されたことが分かった。
【００６１】
実施例２：トリデカペプチドの安定性評価
実施例１で製造及び精製されたトリデカペプチドの安定性を確認するために、１０μｇ/ｍｌとなるように、トリデカペプチドを50 mM Tris-HCl (pH 8.0)緩衝溶液に溶解した。対照群として、１μｇ/ｍｌの濃度で大腸菌から生産された組換えＥＧＦ(Sigma)を同一緩衝溶液に用意した。用意した溶液をガラスバイアルに入れて、３７℃で静置した。３７℃で静置された溶液を、０、１、１０、２５、５０、７５、そして１００日目にサンプリングして、NIH-3T3 cell (Korean Cell Line Bank)に対するＭＴＴ分析(Scudiero, D. A., et al. Cancer Res. 48:4827-4833(1988))を行って、残っているペプチドとＥＧＦの活性を測定した(図２)。この時、０日のサンプル活性を１００％と基準した。
【００６２】
図２から分かるように、組換えＥＧＦの場合、時間が経過するにつれて、活性度が急激に減少するが、本発明によるトリデカペプチドの場合は、活性度が長く持続されることを確認することができた。したがって、本発明のＥＧＦペプチドが、全体アミノ酸配列を有するＥＧＦと比較し、著しく優れた安定性を有することが分かる。
【００６３】
実施例３：ナノ化ペプチドの製造
前記実施例１から得られたトリデカペプチド５０ｍｇを正確に秤量した後、蒸留水５００ｍｌで十分に攪拌して溶解した。ペプチド溶液を、レシチン５ｇ、オレイン酸ナトリウム(sodium oleate)０．３ｍｌ、エタノール５０ｍｌ及び少量のオイルと共に混合した後、総量が１Ｌとなるように蒸留水で調節した後、マイクロ流動化装置(microfluidizer)を利用して高圧で乳化し、大きさ１００ｎｍ程度のナノソームを製造した。製造されたナノソームは、最終濃度が約５０ｐｐｍであって、化粧品製造用に使用した。
【００６４】
剤形例１：柔軟化粧水
前記実施例３で製造されたトリデカペプチドナノソームを含み、下記組成からなる柔軟化粧水を、一般的な化粧水製造方法により製造した。
【００６５】
【表１】
2010505941.tif 000003
【００６６】
剤形例２：栄養クリーム
前記実施例３で製造されたトリデカペプチドナノソームを含み、下記組成からなる栄養クリームを、一般的な栄養クリームの製造方法により製造した。
【００６７】
【表２】
2010505941.tif 000004
【００６８】
剤形例３：栄養化粧水
前記実施例３で製造されたトリデカペプチドナノソームを含み、下記組成からなる栄養化粧水を、一般的な化粧水製造方法により製造した。
【００６９】
【表３】
2010505941.tif 000005
【００７０】
剤形例４：エッセンス
前記実施例３で製造されたトリデカペプチドナノソームを含み、下記組成からなるエッセンスを、一般的なエッセンス製造方法により製造した。
【００７１】
【表４】
2010505941.tif 000006
【００７２】
実施例４：本発明のペプチドのＨａＣａＴ角質細胞成長効果能力の分析
本発明のペプチドに対する角質細胞の成長効果を分析するために、Rizzinoらの方法(Rizzino, et al. Cancer Res., 48:4266(1988))などを参照し、ＨａＣａＴ角質細胞株を利用したＳＲＢ(Sulforhodamine B)の比色法を利用して測定した。ＨａＣａＴ角質細胞株(The Korean Cell Line Bank)を、１００％ＦＢＳ(fetal bovine serum)の含有されたＥＭＥＭ(Eagle's minimal essential media, Gibco, U.S.A.)が入っている２５０ｍｌ容量の組織培養用フラスコを利用して培養した。培養されたＨａＣａＴ角質細胞株を、０．２５％トリプシン溶液で培養容器の底から取り外した後、遠心分離して細胞沈殿物のみを集めた。これを、ＦＢＳが含有されていないＥＭＥＭ培養液に再び懸濁した後、９６ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり４×１０3細胞となるように入れて、２４時間３７℃、７％ＣＯ2条件下で培養した。２４時間後、血清を完全に排除した同一な培養液で培地を入れ替えた後、標準を取るための空試料、ヒトのＥＧＦ、トリ−デカペプチドを、水と１０％ＤＭＳＯに滅菌状態で溶解した後、１０ｎｇと１，０００ｎｇの濃度で７２時間、上記の同一条件で培養した。培養が完了した後、培養上澄み液を除去して、ＰＢＳで１回洗浄した。洗浄溶液を除去した後、比色ＳＲＢ溶液(Sigma)で処理し、ＰＢＳで十分洗浄した後、顕微鏡で細胞を観察して、生存細胞の状態を観察し(図３)、紫外線５９０ｎｍで吸光度を測定して、細胞の生存状態を測定した(図４)。また、細胞の培養皿への付着能力を確認するために、何も処理しなかった６０ｍｍ培養皿と予めペプチドを処理して準備した培養皿にヒトの角質細胞を２４時間培養した後、付着される細胞を顕微鏡で検鏡した。ペプチドを処理した培養皿に約３倍近い細胞が付着されることが分かった(図５)。
【００７３】
さらに、細胞の成長効果を調べるための他の効能検索法として細胞移動相実験を行ったが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を６０ｍｍ培養皿に接種して十分培養した後、細胞が皿底に多く培養された状態で、ピペットを利用して培養皿の底面を掻いた後、ペプチドを１μｇ/ｍｌ処理して、細胞が移動していく過程を観察した。図６のＡとＢは、ペプチドを処理しなかったもので、ＣとＤは、１μｇ/ｍｌの濃度でペプチドを処理したものである。ＡとＣは、処理１日後の図で、ＢとＤは、処理３日後の図である。
【００７４】
一方、６日間、本発明のトリデカペプチド(1μg/ml)をＨａＣａＴ細胞株に処理して、培養液中のＥＧＦの量をＥＬＩＳＡキット(Ｒ＆Ｄ.、米国)を利用して測定し、非常に高いＥＧＦの自己分泌(autocrine)効果を検証した(図７)。また、７２時間本発明のトリデカペプチド５μｍｏｌｅをＨａＣａＴ細胞株に処理して、皮膚シワ改善の標識因子であるヒアルロン酸の量の変化を、ＨＡ ＥＬＩＳＡキット(echelon, 米国)を利用して観察した(図８)。
【００７５】
図３、４及び５から分かるように、本発明のペプチドは、対照群に比べ、高い細胞の成長と生存率及び高い付着率を示すことが分かる。また、図６から分かるように、細胞の移動性においても、ペプチドを処理した場合がより優れた結果を示した。また、本発明のペプチドをＨａＣａＴ角質細胞株に処理した場合、細胞内ＥＧＦの含量が著しく増加することが分かる(図７)。また、本発明のペプチドは、ヒアルロン酸の量も大きく増加させる作用をするということが分かる(図８)。
【００７６】
したがって、本発明のペプチドは、非常に優れた皮膚改善効能を奏することが分かる。
【００７７】
実施例５：本発明のペプチドによる皮膚厚さの変化の測定
本発明のペプチドの化粧品としての有用性と生体内効能を調べるために、上記の剤形例２で製造した栄養クリームをマウス皮膚に適用させた。
【００７８】
実験に使用したＢａｌｂ  Ｃマウス(Central Lab. Animal, Inc., Korea)は、６週齢の雄で、購入後、一週間の安定期を経た後、背中部位を、チオグリコール酸含有クリームを利用して部分除毛した。除毛後、マウスを二つのグループに分け、一つのグループは、剤形例２のトリデカペプチドを含有したナノソームを含むクリームで、他のグループは、ペプチドの入っていない空クリームで、朝８時３０分と夜６時に、１００ｍｇずつを除毛した部位に塗布した。５日間クリームを処理後、動物を頚椎脱骨で致死させた後、皮膚の組織を切断してパラフィンで固定し、microtombにより８μｍ厚の薄片試料を作った後、スライドに固定し、ヘマトキシリン・エオシン染色をして、光学顕微鏡で検鏡した(図９)。
【００７９】
図９から分かるように、本発明のトリデカペプチドを含有するナノソーム化粧品は、マウスの角質細胞層及び上皮細胞層を明確に成長させることができることが分かる。したがって、本発明のペプチドを化粧品として皮膚に適用すると、優れた皮膚シワ改善及び弾力改善効能を奏することができることが分かる。
【００８０】
本発明のＥＧＦ−ミミックペプチドは、天然のヒトＥＧＦと同一な機能または作用をすることができ、細胞内で天然の自己分泌(autocrine)ＥＧＦの生成を促進することができる。また、本発明のペプチドは、安定性が天然ＥＧＦに比べ非常に高く、皮膚透過度に非常に優れている。したがって、本発明のペプチドを含む組成物は、ＥＧＦ活性が要求される疾患または状態を治療、予防または改善するに非常に優れた効能を発揮して、医薬、医薬外品及び化粧品に非常に有利に適用できる。
【００８１】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１】
2010505941.tif 000007
【図２】
2010505941.tif 000008
【図４】
2010505941.tif 000009
【図７】
2010505941.tif 000010
【図８】
2010505941.tif 000011
【図３】
2010505941.tif 000012
【図５】
2010505941.tif 000013
【図６】
2010505941.tif 000014
【図９】
2010505941.tif 000015
【配列表】
2010505941000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月20日(2009.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式１で表されるアミノ酸配列を含み、上皮細胞成長因子(EGF)活性を示すペプチド。
[一般式１]
Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−リンカー−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
【請求項２】
前記リンカーは、複数のアミノ酸残基からなるリンカーであることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記リンカーは、２〜１０個のＧｌｙ残基からなっていることを特徴とする、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドのＮ−末端及びＣ−末端にあるアミノ酸残基の少なくとも一つは、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール(PEG)からなる群から選択される保護基が結合されていることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドのＣ−末端に位置したＡｓｐ残基には、保護基としてＡｌａまたはＧｌｙアミノ酸が追加的に結合されたことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドは、下記の一般式２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載のペプチド。
[一般式２]
Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ(ｎ)−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ
(式中、ｎは、２〜８の整数を示す。)
【請求項７】
上皮細胞成長因子(EGF)活性を示す請求項１乃至６のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む上皮細胞成長因子−有効性(epidermal growth factor-effective)の疾患または状態(conditions)の予防または治療用組成物。
【請求項８】
前記組成物は、(a)請求項１乃至６のいずれかに記載のペプチドの薬剤学的有効量、及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、(a)請求項１乃至６のいずれかに記載のペプチドの化粧品学的有効量(cosmetically effective amount)、及び(b)化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、天然のＥＧＦの生産を促進することにより、細胞増殖の促進、分裂促進、上皮細胞の生理活性促進、血管形成の促進、神経再生の促進、傷の治癒、血栓症の治療、動脈硬化症の治療、コラーゲン、エラスチン、ラミニン合成促進、歯周疾患の治療、または皮膚状態の改善の効能または活性を有することを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、皮膚状態の改善の効能または活性を有することを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記皮膚状態の改善は、シワの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、脱毛の防止または発毛促進、アトピー疾患の治療、皮膚保湿の改善、シミの除去またはニキビの治療であることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【国際調査報告】
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