(57)【要約】  本発明の反応性ポリフルオロベンゾオキサゾールポリメチン色素は生物物質その他の物質を標識し検出するのに有用である。色素は式（Ｉ）で表される。【化１】2010505991.tif 000066式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−及び次の基からなる群から選択され、【化２】2010505991.tif 000067基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘ又は−Ｌ−Ｒｐであり、Ｌは連結基であり、Ｒｘは本色素を成分に共有結合するのに適当な基であり、Ｒｐは成分であり、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つはフッ素を含有する。フッ素で置換され、さらにスルホン酸基で置換されたポリメチン色素を生物標的分子のラベリングに用いると、このような置換のないシアニン色素と比べて色素−色素凝集が少なく、光安定性が向上した標識生成物が得られる。【選択図】  【化１】
2010505991.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（Ｉ）の化合物。
【化１】
2010505991.tif 000050
式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−及び次の基からなる群から選択され、
【化２】
2010505991.tif 000051
（式中、Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈである。）、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘ又は−Ｌ−Ｒｐであり、Ｌは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される１〜２０個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、Ｒｘは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、Ｒｐは成分であり、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘ又は−Ｌ−Ｒｐでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択されるか、Ｒ３とＲ４又はＲ５とＲ６及び／又はＲ７とＲ８又はＲ９とＲ１０は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、１以上の−ＳＯ３Ｈ又は−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（ｍは前記の通り）で置換されていてもよく、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【請求項２】
Ｘが−Ｏ−又は−Ｓ−であるとき、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
次の式（ＩＩ）で表される、請求項１記載の化合物。
【化３】
2010505991.tif 000052
式中、基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘ又は−Ｌ−Ｒｐであり、Ｌ、Ｒｘ、及びＲｐは前記定義の通り、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘ又は−Ｌ−Ｒｐでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択され、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【請求項４】
次式（ＩＩＩ）で表される、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【化４】
2010505991.tif 000053
式中、基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘ又は−Ｌ−Ｒｐであり、Ｌ、Ｒｘ、及びＲｐは前記定義の通り、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘ又は−Ｌ−Ｒｐでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択され、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【請求項５】
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素である、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の化合物。
【請求項６】
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の２つ以上及び／又はＲ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の２つ以上がＦであり、残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９又はＲ１０がＨ又は−ＳＯ３Ｈからなる群から選択される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項７】
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６及び／又はＲ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０がＦである、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項８】
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の１つ以上及び／又はＲ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の１つ以上がペルフルオロＣ１−Ｃ４アルキルであり、残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０がＨ又はＦからなる群から選択される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５又はＲ６位置の２つ以下及び／又はＲ７、Ｒ８、Ｒ９又はＲ１０位置の２つ以下がペルフルオロＣ１−Ｃ４アルキルで置換されている、請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
ペルフルオロＣ１−Ｃ４アルキルがトリフルオロメチルである、請求項８又は請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈが−（ＣＨ２）３−ＳＯ３Ｈ又は−（ＣＨ２）４−ＳＯ３Ｈである、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１２】
基Ｒｘがターゲット物質上の官能基と反応する反応性基又はターゲット物質上の反応性基と反応する官能基を含む、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１３】
前記反応性基がスクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン及びホスホルアミダイトからなる群から選択される、請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
前記官能基がヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒド及びケトンを含むカルボニル、カルボン酸及びチオホスフェートからなる群から選択される、請求項１２記載の化合物。
【請求項１５】
基Ｒｘが親和性タグを含む、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１６】
連結基Ｌが直鎖状又は分岐状Ｃ１−Ｃ２０アルキル鎖からなる群から選択され、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ’−及びフェニレンからなる群から選択される結合を１以上含んでもよく、式中、Ｒ’は水素又はＣ１−Ｃ４アルキルである、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１７】
Ｌが５〜１２個の原子を含む、請求項１６記載の化合物。
【請求項１８】
Ｌが基−（ＣＨ２）ｐ−Ｑ−（ＣＨ２）ｒ−（式中、Ｑは−ＣＨ２−又は−ＣＯ−ＮＨ−を示し、ｐは１〜５、ｒは０〜５である。）である、請求項１６又は請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
ｉ）４−（２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物１）；
ｉｉ）４−（２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物２）；
ｉｉｉ）４−（２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−５−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物３）；
ｉｖ）４−［（２Ｅ）−２−（（２Ｅ）−３−｛３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−２−イル｝プロパ−２−エニリデン）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イル］ブタン−１−スルホネート（化合物４）；
ｖ）４−（２−｛（１Ｅ，３Ｚ）−３−［３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−２（３Ｈ）−イリデン］プロパ−１−エニル｝−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物５）；
ｖｉ）４−（２−｛（１Ｅ，３Ｚ）−３−［３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−２（３Ｈ）−イリデン］プロパ−１−エニル｝−５，６−ジフルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物６）；
ｖｉｉ）３−（５−カルボキシペンチル）−２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−６−スルホネート（化合物７）；及び
ｖｉｉｉ）３−｛６−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−６−オキソヘキシル｝−２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−６−スルホネート（化合物８）
からなる群から選択される化合物。
【請求項２０】
成分の標識方法であって、
ｉ）前記成分を下記式（Ｉ）の化合物と接触させ、
ｉｉ）前記化合物を前記成分とともに、化合物を成分に結合するのに適当な条件下でインキュベートし、これにより前記成分を標識する
工程を含む方法。
【化５】
2010505991.tif 000054
式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−及び次の基からなる群から選択され、
【化６】
2010505991.tif 000055
（式中、Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈである。）、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘであり、Ｌは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される１〜２０個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、Ｒｘは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択されるか、Ｒ３とＲ４又はＲ５とＲ６及び／又はＲ７とＲ８又はＲ９とＲ１０は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、１以上の−ＳＯ３Ｈ又は−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（ｍは前記の通り）で置換されていてもよく、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【請求項２１】
Ｘが−Ｏ−又は−Ｓ−であるとき、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
式（Ｉ）の化合物におけるＸが次式の基であり、
【化７】
2010505991.tif 000056
（式中、Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈである。）、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘであり、Ｌ及びＲｘは前記定義の通り、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択され、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つはフッ素を含有する、
請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
Ｘが−Ｏ−であり、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘであり、Ｌ及びＲｘは前記定義の通り、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択され、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つはフッ素を含有する、
請求項２０又は請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素である、請求項２０乃至請求項２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の２つ以上がＦ及びＣＦ３からなる群から選択され、残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５又はＲ６がＨである、請求項２０乃至請求項２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６位置それぞれ及び／又はＲ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０位置それぞれがフッ素置換されている、請求項２０乃至請求項２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
前記成分が、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、（アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボン酸及びチオホスフェート基の１以上を含有するか含有するよう誘導体化された）ヌクレオチド、（アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボン酸及びチオホスフェート基の１以上を含有するか含有するよう誘導体化された）オキシ又はデオキシポリ核酸、微生物物質、薬物、ホルモン、細胞、細胞膜及び毒素よりなる群からなる群から選択される、請求項２０乃至請求項２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
式（Ｉ）で表される、成分の蛍光標識色素コンジュゲート。
【化８】
2010505991.tif 000057
式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−及び次の基からなる群から選択され、
【化９】
2010505991.tif 000058
（式中、Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈである。）、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｐであり、Ｌは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される１〜２０個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、Ｒｐは成分であり、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｐでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択されるか、Ｒ３とＲ４又はＲ５とＲ６及び／又はＲ７とＲ８又はＲ９とＲ１０は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、１以上の−ＳＯ３Ｈ又は−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（ｍは前記の通り）で置換されていてもよく、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【請求項２９】
Ｘが−Ｏ−又は−Ｓ−であるとき、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択される、請求項２８記載の色素コンジュゲート。
【請求項３０】
Ｘが次式の基であり、
【化１０】
2010505991.tif 000059
（式中、Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈである。）、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘであり、Ｌ及びＲｘは前記定義の通り、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択され、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つはフッ素を含有する、
請求項２８記載の色素コンジュゲート。
【請求項３１】
Ｘが−Ｏ−であり、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘであり、Ｌ及びＲｘは前記定義の通り、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択され、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つはフッ素を含有する、
請求項２８記載の色素コンジュゲート。
【請求項３２】
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素である、請求項２８乃至請求項３１のいずれか１項記載の色素コンジュゲート。
【請求項３３】
前記成分が、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、（アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボン酸及びチオホスフェート基の１以上を含有するか含有するよう誘導体化された）ヌクレオチド、（アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボン酸及びチオホスフェート基の１以上を含有するか含有するよう誘導体化された）オキシ又はデオキシポリ核酸、微生物物質、薬物、ホルモン、細胞、細胞膜及び毒素よりなる群からなる群から選択される、請求項２８乃至請求項３２のいずれか１項記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
請求項２８乃至請求項３３のいずれか１項記載の色素コンジュゲートを生体適合性キャリヤとともに哺乳動物への投与に適当な形態で含有する、製剤。
【請求項３５】
蛍光色素が前記定義の通りのＢＴＭを含有する成分にコンジュゲートしている、請求項３４記載の製剤。
【請求項３６】
請求項２８乃至請求項３３のいずれか１項記載の蛍光標識成分の分析又は検出用試薬としての使用。
【請求項３７】
請求項３４記載のＢＴＭの色素コンジュゲート又は請求項３５記載の製剤を使用して、in vivoでＢＴＭの局在化部位のイメージを得る工程を含む、哺乳動物体のin vivo光イメージング方法。
【請求項３８】
請求項３４記載の色素コンジュゲート又は請求項３５記載の製剤を予め哺乳動物体に投与しておく、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
サンプル中の二次成分の検出方法であって、
ｉ）検出すべき二次成分を含有するか含有すると推測されるサンプルを一次成分と、相補的な特異的結合対を形成するのに適当な条件下で接触させ、ここで前記一次成分が下記式（Ｉ）の化合物で標識されており、
ｉｉ）前記標識一次成分を前記二次成分に結合して標識二次成分を形成し、
ｉｉｉ）前記標識二次成分を光学的方法で検出する
工程を含む方法。
【化１１】
2010505991.tif 000060
式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−及び次の基からなる群から選択され、
【化１２】
2010505991.tif 000061
（式中、Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈである。）、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘであり、Ｌは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される１〜２０個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、Ｒｘは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択されるか、Ｒ３とＲ４又はＲ５とＲ６及び／又はＲ７とＲ８又はＲ９とＲ１０は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、１以上の−ＳＯ３Ｈ又は−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（ｍは前記の通り）で置換されていてもよく、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【請求項４０】
前記相補的な特異的結合対が、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質又は補因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ及びＤＮＡ／結合タンパク質よりなる群からなる群から選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
ａ）式（Ａ）の第１化合物をｂ）第１化合物と同じでも異なってもよい式（Ｂ）の第２化合物及びｃ）第１化合物と第２化合物との間にコンジュゲート結合を形成するのに適当な第３化合物と反応させる工程を含む方法。
【化１３】
2010505991.tif 000062
【化１４】
2010505991.tif 000063
式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−及び次の基からなる群から選択され、
【化１５】
2010505991.tif 000064
（式中、Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈである。）、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘであり、Ｌは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される１〜２０個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、Ｒｘは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択されるか、Ｒ３とＲ４又はＲ５とＲ６及び／又はＲ７とＲ８又はＲ９とＲ１０は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、１以上の−ＳＯ３Ｈ又は−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（ｍは前記の通り）で置換されていてもよく、
ｋは１〜１０の整数、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【請求項４２】
次の式（Ａ）の化合物。
【化１６】
2010505991.tif 000065
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈ、−Ｌ−Ｒｘ及び−Ｌ−Ｒｐからなる群から選択され、Ｌは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される１〜２０個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、Ｒｘは前記化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、Ｒｐは成分であり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択されるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光標識試薬、特に反応性フルオロベンゾオキサゾールポリメチン色素の分野に関し、またこのような色素での成分の標識及びこのような色素で標識された成分の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアニン色素は、生物学的に重要な分子、例えばタンパク質、核酸、ホルモン及び薬物を蛍光標識する試薬として広く利用されている。実際に、シアニン色素は他の蛍光色素に比べて多数の利点を有する。例えば、シアニン色素の励起及び発光スペクトルは４５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視から近赤外スペクトルに及ぶ。さらに、シアニン色素は非常に高い吸光係数及び好ましい量子収率を有することを特徴とする。例えば米国特許第６０４８９８２号、同第５２６８４８６号及び同第５５６９５８７号（Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ他）参照。しかし、シアニン色素構造によっては自己会合（即ち、凝集）する傾向があり、蛍光消光及び吸収波長の著しい浅色移動につながる。
【０００３】
近年、Ｗａｇｇｏｎｅｒ他（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，  （２００４），  ６（６），  ９０９−９１２）は、水性溶媒中で良好な光安定性を示すポリフルオロチアジカルボシアニン色素（化合物（ｉ））を開示している。この色素は、フッ素を含まない類似体と比べ、凝集性が低く、量子収率が高く、耐光退色性が優れていた。
【０００４】
【化１】
2010505991.tif 000003
国際公開第０２／２６８９１号（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）には、カルボシアニン色素のインドリウム環を少なくとも１つの３位で修飾することにより、反応性基又はコンジュゲート物質を導入することが記載されている。国際公開第０２／２６８９１号の修飾色素は、シアニン色素の自己会合する傾向を克服したと報告されており、この修飾色素で標識した色素コンジュゲートは類似構造のカルボシアニン色素で標識したコンジュゲートより蛍光性に優れていると報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６０４８９８２号明細書
【特許文献２】米国特許第５２６８４８６号明細書
【特許文献３】米国特許第５５６９５８７号明細書
【特許文献４】国際公開第０２／２６８９１号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Waggoner et al, Org. Letters, (2004), 6(6), 909-912
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に記載した通りの、ベンゾオキサシアニン発色団に１つ、好ましくは複数のフルオロ置換基が結合した反応性シアニン色素は、上記文献のどれにも開示されていない。本発明の色素は、さらに、標的材料、例えばタンパク質、抗体、核酸等の直接共有結合標識に適当な基を１つ以上有している。本発明は、光安定性が高く、色素−色素相互作用が小さい特性をもつシアニン色素誘導体を提供する。したがって、本色素は、例えば速度論的研究で、連続励起が必要条件となる蛍光検出を含む検定や、マイクロアレイスライドを数日間にわたって再解析しなければならないことがあるマイクロアレイ解析において特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】化合物８及びフッ素を含有しないシアニン色素Ｃｙ２にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧの光安定性を示す比較グラフである。
【図２】化合物８で標識したヤギ抗マウスＩｇＧによる抗アクチンＩｇＧの検出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
したがって、第１の発明によれば、式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００１０】
【化２】
2010505991.tif 000004
式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−及び次の基からなる群から選択され、
【００１１】
【化３】
2010505991.tif 000005
（式中、Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈである。）、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘ又は−Ｌ−Ｒｐであり、
Ｌは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される１〜２０個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、
Ｒｘは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
Ｒｐは成分であり、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘ又は−Ｌ−Ｒｐでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択されるか、Ｒ３とＲ４又はＲ５とＲ６及び／又はＲ７とＲ８又はＲ９とＲ１０は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、１以上の−ＳＯ３Ｈ又は−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（ｍは前記の通り）で置換されていてもよく、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【００１２】
Ｘが−Ｏ−又は−Ｓ−であるとき、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択されるのが好ましい。
【００１３】
ｎが１又は２であるのが好ましく、即ち本発明の色素はトリメチン又はペンタメチン色素、特にトリメチン色素であるのが好ましい。
【００１４】
一実施形態では、Ｘは次式の基であり、
【００１５】
【化４】
2010505991.tif 000006
この場合、第１の発明の化合物は式（ＩＩ）で表される。
【００１６】
【化５】
2010505991.tif 000007
式中、基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘ又は−Ｌ−Ｒｐであり、Ｌ、Ｒｘ、及びＲｐは前記定義の通り、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘ又は−Ｌ−Ｒｐでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択され、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【００１７】
別の実施形態では、Ｘが−Ｏ−であり、この場合第１の発明の化合物は式（ＩＩＩ）で表される。
【００１８】
【化６】
2010505991.tif 000008
式中、基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘ又は−Ｌ−Ｒｐであり、Ｌ、Ｒｘ、及びＲｐは前記定義の通り、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘ又は−Ｌ−Ｒｐでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択され、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【００１９】
式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物において、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素であるのが好ましい。
【００２０】
第１の発明による化合物は対向イオンを含むのが適当であり、その対向イオンは色素発色団の形式電荷をバランスさせる正でも負でもよい。対向イオンの性質は本発明にとって重要ではなく、多数の既知のイオンのいずれか、例えばＮＨ４＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、トリフルオロ酢酸（Ｆ３Ｃ−ＣＯ２−）、過塩素酸塩（ＣｌＯ４−）、Ｂｒ−又はＩ−とすることができる。なお、本発明の文脈において、スルホン酸基（−ＳＯ３Ｈ）はスルホネート基（−ＳＯ３−）も含む。スルホネートは元の酸のイオン化形態であるからである。
【００２１】
第１の発明による化合物は、少なくとも１つ、好ましくは２個又はそれ以上のフッ素原子が色素発色団上に直接又は間接的に置換しているのが適当である。一実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物は、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６位置及び／又はＲ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０位置の１つ以上、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上でフッ素原子で置換されてよい。この実施形態で、１以上のフッ素原子での置換は、式（Ｉ）の対称又は非対称色素をもたらす。特に好ましい実施形態では、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６位置のそれぞれ及び／又はＲ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０位置のそれぞれがフッ素で置換される。色素発色団のペルフルオロ置換が色素−色素凝集を抑制し、これにより蛍光量子収率及び色素光安定性を高めることを確かめた（Ａ．Ｗａｇｇｏｎｅｒら前掲）。第２の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物は、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５又はＲ６位置及び／又はＲ７、Ｒ８、Ｒ９又はＲ１０位置の１つ、好ましくは２つ以下に、ペルフルオロＣ１−Ｃ４アルキル置換基を含むことができる。残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、Ｈ及びＦからなる群から選択される。ペルフルオロＣ１−Ｃ４アルキル置換基がトリフルオロメチル置換基であるのが好ましい。
【００２２】
所望に応じて、本発明の１、２、３、４個又はそれ以上のフッ素基が結合した色素は、さらに１つ以上のスルホン酸基で置換されてもよく、即ちスルホン酸基がフッ素で置換されていない残りのＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９又はＲ１０位置のどれにでも直接結合してよい。したがって、本発明の色素は１、２又は３個のスルホン酸基で直接又は間接的に置換されていてよい。フッ素置換され、さらに２個以上のスルホン酸基で置換されたシアニン色素を生物学的分子の標識（ラベリング）に用いると、このような置換のないシアニン色素と比べて、色素−色素凝集が少なく、光安定性が向上した標識生成物となる。このように本発明の好適な色素で標識された分子の蛍光発光強度は、共有結合した色素の数と共に増加する。さらに、複素環におけるＮ−スルホアルキル置換は、色素分子上の全体電荷を増加するのに加えて、立体的かさ高さを加え、これにより色素−色素凝集の低減に貢献する。
【００２３】
一実施形態では、連結基Ｌは色素発色団を、本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であるＲｘと連結する。第２の実施形態では、Ｌは色素をＲｐと直接連結する、即ち色素が成分に共有結合され、こうして成分にコンジュゲートされる。好適な実施形態では、本発明の色素は、Ｒ１又はＲ２位置のいずれかに結合した１つの基−Ｌ−Ｒｘ又は−Ｌ−Ｒｐを含有する。残りの基Ｒ１又はＲ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、好ましくはメチル、エチル又はプロピルからなる群から選択される。或いは、残りの基Ｒ１又はＲ２は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈ（式中、ｋは１〜１０の整数、好ましくは３又は４である。）でもよい。
【００２４】
Ｌは１〜２０個の結合原子を含有するのが適当であり、直鎖状又は分岐状Ｃ１−Ｃ２０アルキル鎖からなる群から選択され、所望に応じて−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ’−及びフェニレンからなる群から選択される１以上の結合を含んでもよい。ここでＲ’は水素又はＣ１−Ｃ４アルキルである。連結基Ｌが５〜１２個の原子を有するのが好ましい。Ｌが基−（ＣＨ２）ｐ−Ｑ−（ＣＨ２）ｒ−（式中、Ｑは−ＣＨ２−又は−ＣＯ−ＮＨ−を示し、ｐは１〜５、ｒは０〜５である。）であるのがより好ましい。
【００２５】
一実施形態では、Ｒｘは成分の相補的基と反応し得る基であり、その結果色素と成分の間に共有結合が形成される。この実施形態では、結合性基の選択は、標識すべき成分上に存在する基に依存し、このような基は当業者によく知られている。例えば、Ｒｘは、適当な条件下で成分の相補的官能基と反応し得る反応性基とすることができる。タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物などの成分中に存在する官能基の例には、ヒドロキシル、アミノ、スルホヒドリル、カルボニル（アルデヒド及びケトンを含む）、カルボン酸及びチオホスフェートがある。或いは、Ｒｘは官能基であり、成分が反応性要素を含有するか含有するよう誘導体化され、この場合色素の官能基が適当な条件下で成分の反応性基と反応できる関係にある。いずれの場合にも、成分が本発明の色素で標識される。Ｒｘが反応性基である場合、その反応性基をスクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ジクロロトリアジン及びホスホルアミダイトから選ぶのが適当である。反応性基がカルボン酸のスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド又はホスホルアミダイトであるのが好ましい。Ｒｘが官能基である場合、その官能基をヒドロキシル、アミノ、スルホヒドリル、カルボニル（アルデヒド及びケトンを含む）、カルボン酸及びチオホスフェートから選ぶのが適当である。これらの反応性基及び官能基により、本発明の化合物は成分と反応させることができ、成分と共有結合した状態になる。
【００２６】
本発明の化合物のＲ１及び／又はＲ２位置にある反応性基Ｒｘ並びに基Ｒ１及び／又はＲ２が反応して共有結合を形成し得る基の好適な例を表１に示す。或いは、Ｒ１及び／又はＲ２が、表１に示す、成分の反応性基と反応する官能基であってもよい。
【００２７】
【表１】
2010505991.tif 000009
アミノ及びヒドロキシル官能基を有する成分を標識するのに特に有用な反応性基としては下記の基が特に好適である。
【００２８】
【化７】
2010505991.tif 000010
チオール官能基を有する成分を標識するのに有用な反応性基としては下記の基が特に好適である。
【００２９】
【化８】
2010505991.tif 000011
基−Ｌ−Ｒｘの例としては、下記のようなカルボキシペンチル基を有する基が特に好適である。
【００３０】
【化９】
2010505991.tif 000012
別の実施形態では、Ｒｘは、その相補的な特異的結合パートナーと特異的にかつ非共有結合的に結合することのできる親和性タグとすることができる。特異的結合パートナー対の例には、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ポリヒスチジンタグ−金属イオンのニトリル三酢酸との錯体（例えばＮｉ２＋：ＮＴＡ）などがあるが、これらに限らない。相補的な特異的結合パートナーは、成分を検出するための標識用複合体の１成分とすることができる。したがって好適な標識用フォーマットでは、ビオチン標識に対して４つの結合部位を有するストレプトアビジンを、成分上のビオチン基を、基Ｒｘがビオチン、イミノビオチン又はデスチオビオチンである本発明による色素に連結するブリッジとして用いることができる。なお、本発明の文脈では、２つの原子又は分子が相互に特異的結合親和性をもつならば、いずれも用いることができる。親和性タグの例をビオチン、イミノビオチン及びデスチオビオチンから選ぶのが好ましい。
【００３１】
好適な実施形態では、残りのＲ１又はＲ２位置の１つを−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈ（式中、ｋは前記定義の通り）で置換することができる。好ましくはｋは３又は４である。即ち、残りのＲ１又はＲ２位置を−（ＣＨ２）３−ＳＯ３Ｈ又は−（ＣＨ２）４−ＳＯ３Ｈで置換することができる。フッ素で直接又は間接的に置換され、さらに１以上のスルホン酸基で置換されているシアニン色素を生物分子を標識するのに用いる結果として、このような置換のないシアニンと比較して、色素−色素凝集が低減し、光安定性が向上した標識生成物が得られる。
【００３２】
アルキルは１〜４個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状アルキル基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル及びｔ−ブチルである。
【００３３】
ハライド及びハロ基はクロリド及びクロロ（塩素）、ブロミド及びブロモ（臭素）、及びヨージド及びヨード（ヨウ素）からなる群から選択される。
【００３４】
本発明の化合物の具体例には下記のものがある。
ｉ）４−（２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物１）；
ｉｉ）４−（２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物２）；
ｉｉｉ）４−（２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−５−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物３）；
ｉｖ）４−［（２Ｅ）−２−（（２Ｅ）−３−｛３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−２−イル｝プロパ−２−エニリデン）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イル］ブタン−１−スルホネート（化合物４）；
ｖ）４−（２−｛（１Ｅ，３Ｚ）−３−［３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−２（３Ｈ）−イリデン］プロパ−１−エニル｝−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物５）；
ｖｉ）４−（２−｛（１Ｅ，３Ｚ）−３−［３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−２（３Ｈ）−イリデン］プロパ−１−エニル｝−５，６−ジフルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物６）；
ｖｉｉ）３−（５−カルボキシペンチル）−２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−６−スルホネート（化合物７）；及び
ｖｉｉｉ）３−｛６−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−６−オキソヘキシル｝−２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−６−スルホネート（化合物８）
本発明はまた、蛍光標識成分（ラベルされた成分）及び標識方法（ラベルする方法）に関し、この場合前述した通りの少なくとも１つの基−Ｌ−ＲｘがＲ１及び／又はＲ２位置に結合した本発明の化合物を用いて、成分を標識し、こうして成分に蛍光特性を付与することができる。特に、本発明の化合物を、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、抗体などの生物分子の蛍光標識と検出に用いることができる。したがって、第２の観点によれば、成分を標識する方法が提供され、この方法は、
ｉ）前記成分を下記式（Ｉ）の化合物と接触させ、
ｉｉ）前記化合物を前記成分とともに、化合物を成分に結合するのに適当な条件下でインキュベート（培養）し、これにより前記成分を標識する工程を含む。
【００３５】
【化１０】
2010505991.tif 000013
式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−及び次の基からなる群から選択され、
【００３６】
【化１１】
2010505991.tif 000014
（式中、Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈである。）、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘであり、
Ｌは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される１〜２０個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、
Ｒｘは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択されるか、Ｒ３とＲ４又はＲ５とＲ６及び／又はＲ７とＲ８又はＲ９とＲ１０は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、１以上の−ＳＯ３Ｈ又は−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（ｍは前記の通り）で置換されていてもよく、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【００３７】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物におけるＸは次式の基であり、
【００３８】
【化１２】
2010505991.tif 000015
Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘであり、Ｌ及びＲｘは前記定義の通り、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択され、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【００３９】
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物におけるＸは−Ｏ−であり、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘであり、Ｌ及びＲｘは前記定義の通り、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択され、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【００４０】
好適な実施形態では、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物における基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素である。より好ましくは、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の２つ以上及び／又は基Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の２つ以上がフッ素である。残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はＨ又は−ＳＯ３Ｈからなる群から選択される。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６位置のそれぞれ及び／又はＲ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０位置のそれぞれがフッ素で置換されている化合物が特に好適である。
【００４１】
第２の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６位置の１つ、好ましくは２つ以下及び／又はＲ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０位置の１つ、好ましくは２つ以下にペルフルオロＣ１−Ｃ４アルキルを含むことができる。残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０はＨ又はＦからなる群から選択される。ペルフルオロＣ１−Ｃ４アルキル置換基がトリフルオロメチル置換基であるのが好ましい。
【００４２】
基Ｒｘは、前述したように、式（Ｉ）の化合物と反応性又は官能基を有する成分との間に共有結合を形成するのに適当な基である。本方法は、標識すべき成分を適当量の本発明の化合物とともに色素が成分に共有結合状態となるような条件下でインキュベートする工程を含む。成分との色素コンジュゲート又は複合体を形成する方法は、当業者に周知である。例えば、タンパク質の共有結合標識は、通例、水性緩衝媒体、好ましくは重炭酸塩緩衝媒体中でｐＨ９．０周囲温度で代表的には１時間の期間行う。反応は通常暗所で行う。標識タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィにより、例えば固定相としてＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）を、溶離液としてｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液を用いることにより、未反応色素から分離することができる。生物分子の多重標識のためには、生物分子に対する色素の量又は濃度の比を調節しなければならない。
【００４３】
第３の観点によれば、式（Ｉ）で表される、成分の蛍光標識色素コンジュゲートが提供される。
【００４４】
【化１３】
2010505991.tif 000016
式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−及び次の基からなる群から選択され、
【００４５】
【化１４】
2010505991.tif 000017
（式中、Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈである。）、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｐであり、
Ｌは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される１〜２０個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、
Ｒｐは成分であり、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｐでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択されるか、Ｒ３とＲ４又はＲ５とＲ６及び／又はＲ７とＲ８又はＲ９とＲ１０は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、１以上の−ＳＯ３Ｈ又は−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（ｍは前記の通り）で置換されていてもよく、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【００４６】
好ましくは、Ｘが−Ｏ−又は−Ｓ−であるとき、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択される。Ｘが−Ｏ−であるのが特に好ましい。
【００４７】
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素であるのが好ましい。
【００４８】
色素コンジュゲートの成分が、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、（アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボン酸及びチオホスフェート基の１以上を含有するか含有するよう誘導体化された）ヌクレオチド、（アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、カルボン酸及びチオホスフェート基の１以上を含有するか含有するよう誘導体化された）オキシ又はデオキシポリ核酸、微生物物質、薬物、ホルモン、細胞、細胞膜及び毒素よりなる群からなる群から選択されるのが適切である。
【００４９】
一実施形態では、式（Ｉ）の色素が生物学的標的分子を含む成分にコンジュゲートされる。用語「生物学的標的部分」（biological targeting moiety = BTM）は、哺乳動物体に投与後に、in vivoで哺乳動物体の特定の部位に選択的に捕集されるか局在化する化合物を意味する。このような部位（サイト）は、例えば、特定の疾患状態に関与したり、器官又は代謝プロセスがどのように機能しているかを表示する。ＢＴＭは合成起源のものでも天然起源のものでもよいが、合成であるのが好ましい。用語「合成」は普通の意味で、即ち天然ソース、例えば哺乳動物体から単離されたものではなく、人造である。このような化合物には、その製造及び不純物プロファイルを十全に制御できるという利点がある。ＢＴＭは、３〜１００ｍｅｒのペプチド又はペプチド類似体（線状ペプチド、環状ペプチド又はその組合せとすることができる）；又は酵素基質、酵素拮抗体又は酵素阻害剤；合成受容体結合化合物；オリゴヌクレオチド、又はオリゴＤＮＡもしくはオリゴＲＮＡ片からなるのが好ましい。ＢＴＭがペプチドである場合、４〜３０ｍｅｒのペプチドが好ましく、５〜２８ｍｅｒのペプチドが特に好ましい。
【００５０】
第４の観点によれば、第３の観点のコンジュゲートを生体適合性キャリヤとともに哺乳動物への投与に適当な形態で含有する、製剤（医薬組成物）が提供される。蛍光色素が前記定義の通りのＢＴＭを含有する成分にコンジュゲートしているのが好ましい。
【００５１】
「生体適合性キャリヤ」は、コンジュゲートを懸濁もしくは溶解することのできる、流体、特に液体であるのが好ましく、そうすれば組成物は生理学的に許容できる、即ち毒性や過度の不快感なしで哺乳動物体に投与することができる。生体適合性キャリヤとしては、注入可能なキャリヤ液体、例えば注射用の無菌の発熱性物質なし水；生理的食塩水のような水溶液（最終の注射液が等張液となるようなバランスとするのが有利である。）；張度調節剤（例えば血漿カチオンと生体適合性対向イオンとの塩）、糖（例えばブドウ糖又は蔗糖）、糖アルコール（例えばソルビット又はマンニット）、グリコール（例えばグリセリン）、その他の非イオン性ポリオール物質（例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の１種又は２種以上の水溶液が適当である。生体適合性キャリヤが、注射用の発熱性物質なし水又は等張生理的食塩水であるのが好ましい。
【００５２】
本発明による蛍光色素標識成分は、その後、例えばミクロウェルプレート、ゲルに、また細胞検定に、分析又は検出用試薬として使用することができる。用語「光イメージング」は、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージャ（例えば走査型イメージャ又は面積型イメージャ）によって、検出用のイメージを形成する方法を意味する。ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ（登録商標）システムは、ＣＣＤカメラを搭載し、高密度ミクロウェルプレートで行われる検定の蛍光イメージ形成を単一パスにて可能にしている。イメージ形成は定量的かつ迅速であり、イメージ形成用途に適当な計器は現在マルチウェルプレートの全部を同時にイメージ形成することができる。
【００５３】
或いはまた、ＢＴＭのような成分の蛍光色素標識コンジュゲートを適当な動物モデルにin vivo投与することができる。したがって、一実施形態では、ＢＴＭの色素コンジュゲート又はその製剤を使用して、緑から近赤外領域（波長５００〜１２００ｎｍ）の光との相互作用に基づいて、in vivoなＢＴＭの局在化部位のイメージを得る工程を含む、哺乳動物体のin vivo光イメージング方法が提供される。光イメージングは、なんの装置も使用しない直接可視化から、種々のスコープ、カテーテル及び光イメージング機器（例えばトモグラフィ表示用のコンピュータ支援機器）などの装置の使用までに及ぶあらゆる方法を包含する。使用法及び測定法としては、ルミネセンスイメージング；内視鏡；蛍光内視鏡；光学的コヒーレンストモグラフィ；透過イメージング；時間分解透過イメージング；共焦点イメージング；非線形顕微鏡；光音響イメージング；音響光学イメージング；分光法；反射分光法；干渉法（インターフェロメトリ）；コヒーレンス干渉法；拡散光学トモグラフィ及び蛍光媒介拡散光学トモグラフィ（連続波、時間ドメイン及び周波数ドメインシステム）、及び光散乱、吸収、偏光、ルミネセンス、フルオレセンス寿命、量子収率及び消光の測定などがあるが、これらに限らない。これらの技術についての詳細は、下記を参照されたい。Tuan Vo-Dinh (Editor): "Biomedical Photonics Handbook" (2003), CRC Press LCC; Mycek & Pogue (Editors): "Handbook of Biomedical Fluorescence" (2003), Marcel Dekker, Inc.; Splinter & Hopper: "An Introduction to Biomedical Optics" (2007), CRC Press LCC
上述した１工程標識プロセスのほかに、本発明は２工程標識及び検出プロセスにも関する。プロセスの第１工程で、上述したように少なくとも１つの基−Ｌ−ＲｘがＲ１及び／又はＲ２位置に結合した本発明の化合物を使用して一次成分（例えば抗体、タンパク質、ＤＮＡプローブなど）に標識し、これにより一次成分に蛍光特性を付与する。プロセスの第２工程では、蛍光標識一次成分を二次成分（例えば上記抗体が特異的である抗原）を検出するプローブとして使用する。したがって、第５の観点によれば、サンプル中の二次成分を検出する方法が提供され、本方法は、
ｉ）検出すべき二次成分を含有するか含有すると推測されるサンプルを一次成分と、相補的な特異的結合対を形成するのに適当な条件下で接触させ、ここで前記一次成分が下記式（Ｉ）の化合物で標識されており、
ｉｉ）前記標識一次成分を前記二次成分に結合して標識二次成分を形成し、
ｉｉｉ）前記標識二次成分を光学的方法で検出する
工程を含む。
【００５４】
【化１５】
2010505991.tif 000018
式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−及び次の基からなる群から選択され、
【００５５】
【化１６】
2010505991.tif 000019
（式中、Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈである。）、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘであり、
Ｌは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される１〜２０個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、
Ｒｘは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択されるか、Ｒ３とＲ４又はＲ５とＲ６及び／又はＲ７とＲ８又はＲ９とＲ１０は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、１以上の−ＳＯ３Ｈ又は−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（ｍは前記の通り）で置換されていてもよく、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【００５６】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物におけるＸは次式の基であり、
【００５７】
【化１７】
2010505991.tif 000020
Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘであり、Ｌ及びＲｘは前記定義の通り、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択され、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【００５８】
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物におけるＸは−Ｏ−であり、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘであり、Ｌ及びＲｘは前記定義の通り、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択され、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【００５９】
本発明の２工程標識及び検出方法は、互いに特異的結合親和性を有する分子であればどのような分子にも適用することができる。したがって、本発明の色素を用いて相補的な特異的結合対の一方の成分を標識することができ、そしてこの標識成分を相補的な特異的結合対の他方の成分への結合の検出に使用することができる。相補的な特異的結合対の例には、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質又は補因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ及びＤＮＡ／結合タンパク質があるが、これらに限らない。
【００６０】
ある適用例では、本発明の色素をウェスタンブロット法に使用でき、この場合色素を蛍光色素ラベル（Ｃｙ３（登録商標）λｍａｘ５７０ｎｍ及びＣｙ５  λｍａｘ６７０ｎｍ）と組み合わせて使用し、これにより三色多重波長蛍光検出を可能にする。この技法の１例では、ＥＣＬ  Ｐｌｅｘ蛍光ウェスタンブロット・システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて多重タンパク質検出が可能である。本方法によれば、電気泳動分離後に、例えばポリアクリルアミドゲルによって、タンパク質を検出することができ、そのためにゲルを低蛍光性ニトロセルロース・メンブラン上にブロットする。次にブロットをタンパク質に特異な抗体とともにインキュベート（培養）し、その後蛍光色素標識種に特異な二次抗体を用いて、検出する。例えば、Ausubel et al (Eds), (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., 10.8.1-10.8.16参照。別の例では、本発明の適度に反応性の蛍光化合物をＤＮＡ又はＲＮＡ片にコンジュゲートし、次いで得られた蛍光標識コンジュゲートをＤＮＡ又はＲＮＡの相補的鎖に結合させる。色素標識成分を、光学手段によって、好ましくはＣＣＤカメラ、蛍光スキャナ又は共焦点イメージャなどのイメージャを用いる蛍光顕微鏡法により検出及び／又は定量することができる。
【００６１】
本発明はさらに、式（Ｉ）の色素を製造するのに適当な中間体及び方法に関する。したがって、第６の観点によれば、式（Ａ）の化合物が提供される。
【００６２】
【化１８】
2010505991.tif 000021
式中、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈ、−Ｌ−Ｒｘ及び−Ｌ−Ｒｐからなる群から選択され、
Ｌは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される１〜２０個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、
Ｒｘは前記化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
Ｒｐは成分であり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択されるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【００６３】
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の少なくとも１つがフッ素であるのが好ましい。基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の２つ以上がフッ素であるのがより好ましい。残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はＨ又は−ＳＯ３Ｈからなる群から選択される。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６位置のそれぞれがフッ素で置換されている式（Ａ）の化合物が特に好適である。
【００６４】
或いは、式（Ａ）の化合物は、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６位置の１つ、好ましくは２つ以下にペルフルオロＣ１−Ｃ４アルキル置換基を含んでよい。その残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はＨ又はＦからなる群から選択される。ペルフルオロＣ１−Ｃ４アルキル置換基がトリフルオロメチル置換基であるのが特に好ましい。
【００６５】
第７の観点によれば、本発明の化合物の製造方法が提供され、本方法は、ａ）式（Ａ）の第１化合物をｂ）第１化合物と同じでも異なってもよい式（Ｂ）の第２化合物及びｃ）第１化合物と第２化合物との間にコンジュゲート結合を形成するのに適当な第３化合物（Ｃ）と反応させる工程を含む。
【００６６】
【化１９】
2010505991.tif 000022
【００６７】
【化２０】
2010505991.tif 000023
式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−及び次の基からなる群から選択され、
【００６８】
【化２１】
2010505991.tif 000024
（式中、Ｒ１１はＣＨ３又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈである。）、
基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは基−Ｌ−Ｒｘであり、
Ｌは炭素、窒素及び酸素原子からなる群から選択される１〜２０個の連結原子からなる連鎖を有する連結基であり、
Ｒｘは本化合物を成分に共有結合するのに適当な基であり、
基Ｒ１及びＲ２のいずれかが前記基−Ｌ−Ｒｘでないとき、その残りの基Ｒ１又はＲ２はＣ１−Ｃ４アルキル又は−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈであり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択されるか、Ｒ３とＲ４又はＲ５とＲ６及び／又はＲ７とＲ８又はＲ９とＲ１０は互いに結合して炭素原子を含む縮合芳香族六員環を形成し、１以上の−ＳＯ３Ｈ又は−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（ｍは前記の通り）で置換されていてもよく、
ｋは１〜１０の整数であり、ｎは１〜３の整数であるが、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の少なくとも１つがフッ素を含有することを条件とする。
【００６９】
好ましくは、Ｘが−Ｏ−又は−Ｓ−であるとき、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は各々独立に水素、−ＳＯ３Ｈ及び基−（ＣＦ２）ｍ−Ｆ（式中、ｍは０又は１〜４の整数である。）からなる群から選択される。
【００７０】
−（ＣＨ２）ｋ−ＳＯ３Ｈが−（ＣＨ２）３−ＳＯ３Ｈ又は−（ＣＨ２）４−ＳＯ３Ｈであるのが好ましい。
【００７１】
上記方法によれば、中間化合物（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｂ）を、１工程で又は複数工程プロセスにて反応させて、式（Ｉ）の化合物を形成することができる。構造（Ａ）と（Ｂ）が同一である式（Ｉ）の対称な化合物は、式（Ａ）（又は（Ｂ））の化合物を２モルの割合で１、３又は５個の炭素原子を有する適当な二官能性メチン片と反応させることにより、製造できる。例えば、置換Ｎ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン又はオルトエステルを第３化合物（Ｃ）として用いて、トリメチンシアニン色素類似物を製造することができる。同様に、ペンタメチンシアニン色素類似物を製造するのに、適当に置換されたマロンジアルデヒドジアニルを用いることができ、ヘプタメチンシアニン色素類似物を製造するのに、グルタコン酸アルデヒドを用いることができる。反応は通常有機溶剤、例えばピリジン中で行い、加熱還流する。その後混合物を冷却し、エーテルなどの有機溶剤中に注ぐ。得られる固体又は半固体を、一連のメタノール／クロロホルム溶媒を用いてシリカゲルカラムでのクロマトグラフィにより精製することができる。
【００７２】
構造（Ａ）と（Ｂ）が異なる式（Ｉ）の非対称な化合物は、２工程プロセスで製造するのが好都合である。本プロセスでは、まず中間化合物を形成するため、式（Ａ）のインドリウム化合物を結合の形成に適当な化合物、例えば適当に置換されたＮ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン又又はマロンアルデヒドジアニルと無水酢酸の存在下で反応させて、２−アニリノビニル又は４−アニリノ−１，３−ブタジエニル四級塩を形成する。中間の四級塩を第２の２−メチルインドリウム四級塩と反応させて、式（Ｉ）の化合物を得ることができる。複素環式環系を接合するポリメチン連結基を形成する別の中間体が既知であり、例えばHamer, F.M., "The Cyanine Dyes and Related Compounds", Interscience (1964)に記載されている。
【００７３】
ＣｙはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ社の登録商標である。
【００７４】
以下に実施例に言及して本発明を詳細に説明する。
【実施例】
【００７５】
フッ素化２−メチルベンゾオキサゾールを製造する一般手順
置換２−アミノフェノールとトリアルキルオルトエステルからベンゾオキサゾール誘導体を製造する一般的な方法はIraj Mohammadpoor-Baltork, Ahmad R. Khosropour, and Seyedeh F. Hojati, Monatshefte fur Chemie (2007), 138, 663-667に記載されている。以下の実施例は、フッ素化２−メチルベンゾオキサゾールの製造に上記方法を適用したものである。
【００７６】
１．  ６−フルオロ−２−メチルベンゾオキサゾール
【００７７】
【化２２】
2010505991.tif 000025
２−アミノ−５−フルオロフェノール（９５０ｍｇ、７．５ｍｍｏｌ、１．０当量）、オルト酢酸トリエチル（１．５１ｍｌ、８．２５ｍｍｏｌ、１．１当量）及びトリフルオロメタンスルホン酸ビスマス（ＩＩＩ）（５０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、０．０１当量）を混合し、周囲温度で３０分間撹拌した。次に、得られた溶液をジクロロメタンで希釈し、シリカフラッシュクロマトグラフィー（０〜２％メタノール／ジクロロメタン）により精製し、表題化合物を透明な液体として得た。７２５ｍｇ。この液体は５℃未満の温度で結晶性固体になった。この生成物を分析したところ、市販の標品（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）と同一であった。
【００７８】
２．  ５−フルオロ−２−メチルベンゾオキサゾール
【００７９】
【化２３】
2010505991.tif 000026
２−アミノ−４−フルオロフェノール（１．０１ｇ、７．９５ｍｍｏｌ、１．０当量）、オルト酢酸トリエチル（１．６０ｍｌ、８．７ｍｍｏｌ、１．１当量）及びトリフルオロメタンスルホン酸ビスマス（ＩＩＩ）（５０ｍｇ）を混合し、周囲温度で３０分間撹拌した。次に、得られた溶液をジクロロメタンで希釈し、シリカフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン）により精製し、表題化合物を透明な液体として得た。１．０４５ｇ（８７％）。この液体は５℃未満の温度で結晶性固体になった。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝１５２
ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：吸収λｍａｘ＝２８２、２７６、２３０ｎｍ
δＨ／ｐｐｍ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：２．６０（ｓ，３Ｈ）、７．０２（１Ｈ，ｔｄ）、７．３３（１Ｈ，ｄｄ）、７．３９（１Ｈ，ｄｄ）
３．  ５，６−ジフルオロ−２−メチルベンゾオキサゾール
【００８０】
【化２４】
2010505991.tif 000027
２−アミノ−４，５−ジフルオロフェノール（１．００ｇ、７６．９ｍｍｏｌ、１．０当量）、オルト酢酸トリエチル（１．４０ｍｌ、７．６ｍｍｏｌ、１．１当量）及びトリフルオロメタンスルホン酸ビスマス（ＩＩＩ）（５０ｍｇ）を混合し、周囲温度で３０分間撹拌した。次に、得られた溶液をジクロロメタンで希釈し、シリカフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン）により精製し、表題化合物を白色の結晶性固体として得た。１．０３５ｇ（８９％）。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝１７０
ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：吸収λｍａｘ＝２８２、２７８、２７３、２２７ｎｍ
δＨ／ｐｐｍ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：２．６５（ｓ，３Ｈ）、７．３３（１Ｈ，ｄｄ）、７．４４（１Ｈ，ｄｄ）
４．  ５，７−ジフルオロ−２−メチルベンゾオキサゾール
【００８１】
【化２５】
2010505991.tif 000028
２−アミノ−４，６−ジフルオロフェノール（１．００ｇ、７６．９ｍｍｏｌ、１．０当量）、オルト酢酸トリエチル（１．４０ｍｌ、７．６ｍｍｏｌ、１．１当量）及びトリフルオロメタンスルホン酸ビスマス（ＩＩＩ）（５０ｍｇ）を混合し、周囲温度で３０分間撹拌した。次に、得られた溶液をジクロロメタンで希釈し、シリカフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン）により精製し、表題化合物を結晶性固体として得た。１．０８８ｇ（９３％）。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝１７０
ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：吸収λｍａｘ＝２７８、２６８、２３１ｎｍ
δＨ／ｐｐｍ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：２．６６（ｓ，３Ｈ）、６．８５（１Ｈ，ｔｄ）、７．１６（１Ｈ，ｄｄｄ）
５−フルオロ及び６−フルオロ−２−メチルベンゾオキサゾールのＮ−アルキル化によるＮ−カルボキシアルキル及びＮ−スルホアルキル誘導体を生成する一般的な方法
５（６）−フルオロ−２−メチルベンゾオキサゾールのＮ−アルキル化によるＮ−カルボキシアルキル及びＮ−スルホアルキル誘導体の生成は、インドレニン類似体について文献に記載された方法（例えば、Mujumdar, R.B. et al, Bioconjugate Chemistry, (1993), 4, 105-111参照）に類似の方法により行うことができる。
【００８２】
５．  ３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウムブロミド
【００８３】
【化２６】
2010505991.tif 000029
６−フルオロ−２−メチルベンゾオキサゾール（実施例１、７００ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ）及び４−（ブロモメチル）フェニル酢酸（７００ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）を混合し、加熱して反応させた（油浴、１４０℃で３０分間、１２０℃で１６時間）。固体は、最初溶解して僅かに濁った液体になり、これが終夜反応時に固化した。固形物を室温まで放冷し、その後ジエチルエーテルとともにすりつぶして微細スラリーにし、遠心分離法及びデカンテーションによりスラリーから固体を分離した。固体ペレットを酢酸エチル中に再懸濁し、その後遠心分離し、液体をデカンテーションした。この操作をエーテルを用いて繰り返し、得られたものを真空乾燥した。粗生成物（塩）をこれ以上精製せずに色素の合成に使用した。
【００８４】
６．  ４−（６−フルオロ−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート
【００８５】
【化２７】
2010505991.tif 000030
６−フルオロ−２−メチルベンゾオキサゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ社カタログ、コードＮｏ．５３８４３４、５００ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）及び１，４−ブタンスルトン（２．５０ｍｌ）を混合し、窒素下１１０℃で１６時間加熱した。その後反応混合物を室温まで放冷し、ジエチルエーテルとともにすりつぶして不混和ガムを得た。液体をデカンテーションし、ガムをさらにエーテルで洗浄し、その後真空下で乾燥した。粗生成物（塩）をこれ以上精製せずに色素の合成に使用した。
【００８６】
７．  ４−（５−フルオロ−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート
【００８７】
【化２８】
2010505991.tif 000031
５−フルオロ−２−メチルベンゾオキサゾール（実施例２、５００ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）及び１，４−ブタンスルトン（２．５０ｍｌ）を混合し、窒素下１１０℃で１６時間加熱した。その後反応混合物を室温まで放冷し、ジエチルエーテルとともにすりつぶして不混和ガムを得た。液体をデカンテーションし、ガムをさらにエーテルで洗浄し、その後真空下で乾燥した。粗生成物（塩）をこれ以上精製せずに色素の合成に使用した。
【００８８】
８．  ４−（５，６−ジフルオロ−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート
【００８９】
【化２９】
2010505991.tif 000032
５，６−ジフルオロ−２−メチルベンゾオキサゾール（実施例３、５００ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）及び１，４−ブタンスルトン（２．５０ｍｌ）を混合し、窒素下１１０℃で１６時間加熱した。その後反応混合物を室温まで放冷し、ジエチルエーテルとともにすりつぶして不混和ガムを得た。液体をデカンテーションし、ガムをさらにエーテルで洗浄し、その後真空下で乾燥した。粗生成物（塩）をこれ以上精製せずに色素の合成に使用した。
【００９０】
９．  ４−（５，７−ジフルオロ−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート
【００９１】
【化３０】
2010505991.tif 000033
５，７−ジフルオロ−２−メチルベンゾオキサゾール（実施例４、１００ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）及び１，４−ブタンスルトン（０．５０ｍｌ）を混合し、窒素下１１０℃で１６時間加熱した。その後反応混合物を室温まで放冷し、ジエチルエーテルとともにすりつぶして少量の不混和ガムを得た。液体をデカンテーションし、ガムをさらにエーテルで洗浄し、その後真空下で乾燥した。粗生成物（塩）をこれ以上精製せずに色素の合成に使用した。
【００９２】
１０．  ４−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【００９３】
【化３１】
2010505991.tif 000034
１０．１  ５−（エトキシカルボニル）−５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸ナトリウム塩
水素化ナトリウム（６０ｗｔ％、ＮａＨ、１２ｇ＝０．３ｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１００ｍｌ）でスラリーにした。得られた懸濁液を撹拌しながら０℃に冷却した。ここに２−メチルアセト酢酸エチル（５０ｇ、０．３４６ｍｏｌ）のＤＭＦ（２５ｍｌ）溶液を、温度を１０℃未満に保ち、かつ沸騰を抑制しながら滴下した。添加が完了し、水素の発生が終わったら、混合物を湯浴中で温めて透明淡黄色の溶液を得た。これを再び０℃に冷却した。温度を１０℃未満に保ちながら、１，４−ブタンスルトン（４５ｇ、０．３３ｍｏｌ）のＤＭＦ（２５ｍｌ）溶液を１５分間かけて添加した。添加完了後、混合物を５０℃で１６時間加熱した。次いで溶媒を真空下で蒸発乾固させ、残留物を水とジエチルエーテル間で分配した。水層は取っておき、有機層は新しい水で抽出した後に処分した。水抽出物を合わせて新しいエーテルで洗浄し、その後真空下で蒸発を行い生成物をワックス状の固体として得た。
δＨ／ｐｐｍ（２７０ＭＨｚ；Ｄ２Ｏ）４．２３（２Ｈ，ｑ）、２．９（２Ｈ，ｔ様）、２．２６（３Ｈ，ｓ）、２．０〜１．６（６Ｈ，ｍ）、１．３６（３Ｈ，ｓ）、１．２６（３Ｈ，ｔ）
１０．２  ５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸
５−（エトキシカルボニル）−５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸ナトリウム塩（実施例１０．１）を濃塩酸（２００ｍｌ）中で、ＴＬＣにより反応の終了が示されるまで（約３時間）９０℃に加熱した。次いで、溶媒を真空下で蒸発させ、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、エタノール／ジクロロメタン混合溶離液）により精製し、５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸を４９．６ｇ得た。
δＨ／ｐｐｍ（２７０ＭＨｚ；Ｄ２Ｏ）２．９（２Ｈ，ｔ様）、２．６８（１Ｈ，ｍ）、２．２（３Ｈ，ｓ）、１．８〜１．３（６Ｈ，ｍ）、１．１８（３Ｈ，ｄ）
１０．３  ２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３Ｈ−インドール二ナトリウム塩
２，３，４，５−テトラフルオロアニリン（１．７５ｇ、０．０１Ｍ）を濃ＨＣｌ（２８０ｍｌ）に溶解した。フラスコを−１０℃に保ち、そこにＮａＮＯ２（１当量）の水溶液（１０ｍｌ）を滴下し、その後塩化スズ（ＩＩ）（３．４ｇ）の濃ＨＣｌ溶液（４０ｍｌ）を滴下した。反応を周囲温度に戻し、１時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、粗生成物を黄色塩として得た（７ｇ）。
【００９４】
ヒドラジン塩及び粗生成物をスルホン化ケトン、即ち５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸（６ｇ）とともに酢酸（５０ｍｌ）に溶解した。この溶液を１４０℃で２時間加熱してオレンジ色の微細析出物の生じたオレンジ色の溶液を得た。溶媒を蒸発させ、茶色のガムを得た。逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ、水／アセトニトリル  グラジエント）により生成物を単離した。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝３５４
１０．４  ４−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
テトラフルオロインドール（実施例１０．３）（１５０ｍｇ、４．２ｘ１０−４ｍｏｌ、１当量）をブロモヘキサン酸（１５ｇ、０．０７３ｍｏｌ、２６０当量）とともに窒素下１４０℃で２４時間加熱した。生成物をジエチルエーテルとともにすりつぶし、真空下で乾燥して茶色の塊を得た。ＬＣ−ＭＳより主成分を４−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネートであると確認し、これ以上精製せずに使用した。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝４７０
１１．  ４−［４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−１−イル］ブタン−１−スルホネート
【００９５】
【化３２】
2010505991.tif 000035
テトラフルオロインドール（実施例１０．３、１００ｍｇ、２．８ｘ１０−４ｍｏｌ、１当量）をブタンスルトン（１０ｇ、０．０７３ｍｏｌ）とともに窒素下１４０℃で２４時間加熱した。生成物をジエチルエーテルとともにすりつぶし、真空下で乾燥して茶色の塊を得た。ＬＣ−ＭＳより主成分を４−［４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−１−イル］ブタン−１−スルホネートであると確認し、これ以上精製せずに使用した。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝４９０
１２．  ４−［１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
１２．１  ５，７−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール
【００９６】
【化３３】
2010505991.tif 000036
２，４−ジフルオロフェニルヒドラジン塩酸塩（２ｇ）の酢酸（６０ｍｌ）溶液に５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸（４．５ｇ）を添加し、次いで溶液を２時間加熱環流した。ロータリーエバポレーターで揮発物を除去して粗生成物を得、これをフラッシュクロマトグラフィー（ＲＰ−１８シリカ、水／アセトニトリル混合溶離液）により精製した。目的の留分（ＬＣ−ＭＳで同定）を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥して、所望の生成物（６ｇ）を得た。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝３１７
１２．２  ４−［１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート
【００９７】
【化３４】
2010505991.tif 000037
５，７−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール（１．０ｇ）に６−ブロモヘキサン酸（５ｇ）を添加し、溶液を１４０℃で２日間加熱した。冷却後、生成物をジエチルエーテルとともにすりつぶしてスラリーにした。固体を濾過により回収し、エーテルで洗浄し、真空下で乾燥して、粗生成物を得た。分取ＨＰＬＣにより、粗生成物をさらに精製し、表題生成物（３００ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ＭＨ＋＝４３２
１３．  ３−（５−カルボキシペンチル）−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−６−スルホネート
【００９８】
【化３５】
2010505991.tif 000038
１３．１  ２−メチル−６−スルホベンゾオキサゾール
濃硫酸（３７．５ｇ）を氷浴中で４℃に冷却した。２−メチルベンゾオキサゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ社製、コードＮｏ．２７，０９７−０）（２２．５ｍｌ、２５ｇ）をゆっくり滴下し、それに伴い白色結晶が形成した。冷却した混合物に２０％発煙硫酸（Ａｌｄｒｉｃｈ社製、コードＮｏ．３２，３５５−１）（３７．５ｍｌ）をゆっくり滴下し、次いで塩化第二鉄（１２５ｍｇ）を添加した。反応混合物を油浴中１２５℃で１．７５時間加熱した。続いて、反応混合物を４℃に冷却したアセトンに滴下し、混合物を４℃で１５分間撹拌した。茶色〜紫色固体を濾過により回収し、アセトン（１００ｍｌ  ２回）で洗浄し、乾燥した。ＫＯＨの２−プロパノール溶液での中和により生成物である２−メチル−６−スルホベンゾオキサゾールを薄茶色固体のカリウム塩に転化した。
【００９９】
１３．２  ３−（５−カルボキシペンチル）−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−６−スルホネート
３０℃に加温したテトラメチレンスルホン（２５ｇ）中の２−メチル−６−スルホベンゾオキサゾール（５ｇ）に６−ブロモヘキサン酸（１５ｇ）を同量ずつ、３回に分けて添加した。反応混合物を１４０℃で終夜加熱し、その後約４０℃に冷却し、続いて酢酸エチル（２００ｍｌ）に添加した。濾過により生成物である２−メチル−３−カルボキシペンチル−６−スルホベンゾオキサゾールを集め、酢酸エチル（５０ｍｌ  ２回）で洗浄し、真空下で乾燥した。
【０１００】
色素合成
１４．  ４−（２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物１）
【０１０１】
【化３６】
2010505991.tif 000039
１４．１  ４−｛２−［（Ｅ）−２−アニリノビニル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル｝ブタン−１−スルホネート
【０１０２】
【化３７】
2010505991.tif 000040
４−（６−フルオロ−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（実施例６、粗生成物約３ｍｍｏｌ）にＮ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン（５００ｍｇ）、オルトぎ酸トリエチル（１．６５ｍｌ）及びエタノール（５ｍｌ）を添加した。混合物を１００℃で２．５時間加熱し、その後冷却し、次いで溶媒を真空下で蒸発させた。残留物をジエチルエーテル、続いて酢酸エチルとともにすりつぶした後、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、メタノール／ジクロロメタン）により精製した。表題化合物を淡黄色固体として単離した。４１３ｍｇ。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝３９１
ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：吸収λｍａｘ＝３８５ｎｍ
１４．２  ４−（２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート
４−｛２−［（Ｅ）−２−アニリノビニル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル｝ブタン−１−スルホネート（実施例１４．１、６０ｍｇ）及び４−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート（実施例１０、５０ｍｇ）をピリジン（９００μｌ）及び酢酸（９００μｌ）に溶解し、その後無水酢酸（２００μｌ）を添加した。混合物を１００℃で３時間加熱し、その後冷却し、次いで溶媒を真空下で蒸発させた。残留物をジエチルエーテルとともにすりつぶし、その後ＨＰＬＣ（Ｃ１８、水＋０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）により精製した。該当する留分を集め、真空下で蒸発させて減容し、凍結乾燥して、生成物（色素）を得た。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝７６５
ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：吸収λｍａｘ＝５０４ｎｍ
蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝５０３ｎｍ；発光λｍａｘ＝５２９ｎｍ
精密質量：ＭＨ＋＝Ｃ３３Ｈ３８Ｎ２Ｆ５Ｏ９Ｓ２＋理論値７６５．１９３９、実測値ＭＨ＋＝７６５．１９８１（５．５ｐｐｍ）
１５．  ４−（２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物２）
【０１０３】
【化３８】
2010505991.tif 000041
４−｛２−［（Ｅ）−２−アニリノビニル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル｝ブタン−１−スルホネート（実施例１４．１、６０ｍｇ）及び４−［１−（５−カルボキシペンチル）−５，７−ジフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホネート（実施例１２、４５ｍｇ）をピリジン（９００μｌ）及び酢酸（９００μｌ）に溶解し、その後無水酢酸（２００μｌ）を添加した。混合物を１００℃で３時間加熱し、その後冷却し、次いで溶媒を真空下で蒸発させた。残留物をジエチルエーテルとともにすりつぶし、その後ＨＰＬＣ（Ｃ１８、水＋０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）により精製した。該当する留分を集め、真空下で蒸発させて減容し、凍結乾燥して、生成物（色素）を得た。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝７２９
ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：吸収λｍａｘ＝５１１ｎｍ
蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝５１１ｎｍ；発光λｍａｘ＝５３５ｎｍ
１６．  ４−（２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−５−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物３）
【０１０４】
【化３９】
2010505991.tif 000042
１６．１  ４−｛２−［（Ｅ）−２−アニリノビニル］−５−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル｝ブタン−１−スルホネート
【０１０５】
【化４０】
2010505991.tif 000043
４−（５−フルオロ−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（実施例７、粗生成物約３ｍｍｏｌ）を入れたフラスコにＮ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン（６５０ｍｇ）、オルトぎ酸トリエチル（０．５５ｍｌ）及びエタノール（５ｍｌ）を添加した。混合物を１００℃で３時間加熱したところ、最初から淡黄色の析出物が溶液に生成した。その後混合物を冷却し、固体を真空濾過により集め、酢酸エチルで洗浄し、真空下４０℃で乾燥した。表題化合物を淡黄色固体として単離した。３０５ｍｇ。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝３９１
ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：吸収λｍａｘ＝３８６ｎｍ
１６．２  ４−（２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−５−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート
４−｛２−［（Ｅ）−２−アニリノビニル］−５−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル｝ブタン−１−スルホネート（実施例１６．１、５０ｍｇ）及び４−［１−（５−カルボキシペンチル）−４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−３−イル］ブタン−１−スルホン酸（実施例１０、５０ｍｇ）をピリジン（９００μｌ）及び酢酸（９００μｌ）に溶解し、その後無水酢酸（２００μｌ）を添加した。混合物を１００℃で３時間加熱し、その後冷却し、次いで溶媒を真空下で蒸発させた。残留物をジエチルエーテルとともにすりつぶし、その後ＨＰＬＣ（Ｃ１８、水＋０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）により精製した。該当する留分を集め、真空下で蒸発させて減容し、凍結乾燥して、生成物（色素）を得た。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝７６５
ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：吸収λｍａｘ＝５０６ｎｍ
蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝５０８ｎｍ；発光λｍａｘ＝５３１ｎｍ
１７．  ４−［（２Ｅ）−２−（（２Ｅ）−３−｛３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−２−イル｝プロパ−２−エニリデン）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イル］ブタン−１−スルホネート（化合物４）
【０１０６】
【化４１】
2010505991.tif 000044
１７．１  ２−［（Ｅ）−２−アニリノビニル］−３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム＝アセテート
【０１０７】
【化４２】
2010505991.tif 000045
３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウムブロミド（実施例５、粗製固体３００ｍｇ）を入れたフラスコにＮ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン（２００ｍｇ）及び酢酸（１．５ｍｌ）を添加した。混合物を１００℃に５時間加熱して黄色がかった溶液を得た。その後混合物を冷却し、次いで真空下で溶媒を蒸発させた。残留物をジエチルエーテルとともにすりつぶし、固体を集め、酢酸エチルで洗浄し、空気乾燥した。その後この固体をＨＰＬＣ（Ｃ１８、水＋０．１％ＡｃＯＨを含むアセトニトリル）により精製した。該当する留分を集め、真空下で蒸発させて減容し、凍結乾燥して、生成物（色素）を薄黄色固体として得た。７１ｍｇ。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝４０３
ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：吸収λｍａｘ＝３８５ｎｍ
１７．２  ４−［（２Ｅ）−２−（（２Ｅ）−３−｛３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−２−イル｝プロパ−２−エニリデン）−４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−３−（４−スルホブチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イル］ブタン−１−スルホネート
２−［（Ｅ）−２−アニリノビニル］−３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム＝アセテート（実施例１７．１、３０ｍｇ）及び４−［４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−１−イル］ブタン−１−スルホネート（実施例１１、６０ｍｇ）をピリジン（９００μｌ）及び酢酸（９００μｌ）に溶解し、その後無水酢酸（２００μｌ）を添加した。混合物を１００℃で３時間加熱し、その後冷却し、次いで溶媒を真空下で蒸発させた。残留物をジエチルエーテルとともにすりつぶし、その後ＨＰＬＣ（Ｃ１８、水＋０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）により精製した。該当する留分を集め、真空下で蒸発させて減容し、凍結乾燥して、生成物（色素）を得た。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝７９９
ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：吸収λｍａｘ＝５０８ｎｍ
蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝５０９ｎｍ；発光λｍａｘ＝５３２ｎｍ
１８．  ４−（２−｛（１Ｅ，３Ｚ）−３−［３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−２（３Ｈ）−イリデン］プロパ−１−エニル｝−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物５）
【０１０８】
【化４３】
2010505991.tif 000046
４−（６−フルオロ−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（実施例６、約５０ｍｇ）及び３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウムブロミド（実施例５、約５０ｍｇ）を温めながら超音波処理を施しピリジン（１．５ｍｌ）に溶解した。その後オルトぎ酸トリエチル（０．５ｍｌ）を添加し、混合物を１２０℃で３時間加熱して濃黄色溶液を得た。この溶液を冷却し、溶媒を真空下で蒸発させた。残留物をジエチルエーテルとともにすりつぶし、その後ＨＰＬＣ（Ｃ１８、水＋０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）により精製した。所望の非対称色素を含む留分をＴＬＣ／ＭＳにより同定し、集め、真空下で蒸発させて減容し、凍結乾燥して、生成物（色素）を得た。６．９ｍｇ。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝５９７
ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：吸収λｍａｘ＝４８８ｎｍ
蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝４８７ｎｍ；発光λｍａｘ＝５０４ｎｍ
精密質量：ＭＨ＋＝Ｃ３０Ｈ２７Ｎ２Ｆ２Ｏ７Ｓ＋理論値５９７．１５０７、実測値ＭＨ＋＝５９７．１５１０（０．５ｐｐｍ）
１９．  ４−（２−｛（１Ｅ，３Ｚ）−３−［３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−２（３Ｈ）−イリデン］プロパ−１−エニル｝−５，６−ジフルオロ−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（化合物６）
【０１０９】
【化４４】
2010505991.tif 000047
４−（５，６−ジフルオロ−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−３−イル）ブタン−１−スルホネート（実施例８、約５０ｍｇ）及び３−［４−（カルボキシメチル）ベンジル］−６−フルオロ−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウムブロミド（実施例５、約５０ｍｇ）を温めながら超音波処理を施しピリジン（１．５ｍｌ）に溶解した。その後オルトぎ酸トリエチル（０．５ｍｌ）を添加し、混合物を１２０℃で３時間加熱して濃黄色溶液を得た。この溶液を冷却し、溶媒を真空下で蒸発させた。残留物をジエチルエーテルとともにすりつぶし、その後ＨＰＬＣ（Ｃ１８、水＋０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）により精製した。所望の非対称色素を含む留分をＴＬＣ／ＭＳにより同定し、集め、真空下で蒸発させて減容し、凍結乾燥して、生成物（色素）を得た。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝６１５
ＵＶ／ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）：吸収λｍａｘ＝４９０ｎｍ
蛍光（ＭｅＯＨ）：励起λｍａｘ＝４９０ｎｍ；発光λｍａｘ＝５０５ｎｍ
精密質量：ＭＨ＋＝Ｃ３０Ｈ２６Ｎ２Ｆ３Ｏ７Ｓ＋理論値６１５．１４１３、実測値ＭＨ＋＝６１５．１４２１（１．３ｐｐｍ）
２０．  ３−（５−カルボキシペンチル）−２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−６−スルホネート（化合物７）
【０１１０】
【化４５】
2010505991.tif 000048
３−（５−カルボキシペンチル）−２−メチル−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−６−スルホネート（実施例１３．２、１３ｍｇ；０．０４ｍｍｏｌ）を酢酸／無水酢酸（１０／１；５ｍｌ）に溶解し、次いでジフェニルホルムアミジン（７ｍｇ；０．０３７ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を１２０℃で１時間加熱後、４−［４，５，６，７−テトラフルオロ−２，３−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−１−イル］ブタン−１−スルホネート（実施例１１、２０ｍｇ；０．０４ｍｍｏｌ）及び酢酸カリウム（４０ｍｇ；０．４ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を８０℃で３０分間加熱後、真空下で濃縮し、得られた油状物からＨＰＬＣにより生成物である３−（５−カルボキシペンチル）−６−スルホ−２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウムを単離した。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：ＭＨ＋＝８２７
２１．  カルボキシ色素の活性化：３−｛６−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−６−オキソヘキシル｝−２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−６−スルホネート（化合物８）の製造
【０１１１】
【化４６】
2010505991.tif 000049
３−（５−カルボキシペンチル）−２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−６−スルホネート（実施例２０、２ｍｇ）をジイソプロピルエチルアミン（１．６μｌ；４ｖ／ｖ％）を含むＤＭＦ（４００μｌ）に溶解した。ヘキサフルオロりん酸ジピロリジノ−（Ｎ−スクシンイミジルオキシ）−カルベニウム（１０ｍｇ）を添加し、この溶液を１時間撹拌した後ＴＬＣにより分析した。新しいスポットに完全に転化したことが確認された。生成物である３−｛６−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−６−オキソヘキシル｝−２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［４，５，６，７−テトラフルオロ−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈインドール−２−イリデン］プロパ−１−エニル｝−１，３−ベンゾオキサゾール−３−イウム−６−スルホネート（化合物８）をすぐに抗体コンジュゲート形成に使用した。
【０１１２】
２２．  抗体コンジュゲート形成
サイズ排除クロマトグラフィー（Ｂｉｏｒａｄ社製、脱塩カラムＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ１０ＤＧ）を使用して、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製；ＰＢＳ／アジド中０．５ｍｇ）をＮａＨＣＯ３バッファ（０．１Ｍ；ｐＨ９．２）でバッファ交換した。溶液の濃度はＵＶ分光法で測定した。化合物８（８モル当量）をＤＭＦに溶解し、次いでＩｇＧ溶液に添加し、室温で１時間撹拌した。サイズ排除クロマトグラフィーによりＰＢＳ（０．１Ｍ；ｐＨ７．２）を用いて、反応混合物を精製した。色素／タンパク質の比をＵＶ分光法により求めた。生成物を凍結乾燥により単離した。
【０１１３】
２３．  光安定性試験
光安定性試験を以下のように行った。すべての蛍光色素を水に溶解し、強い光源に露光した。
【０１１４】
強い光源としてＷａｌｌａｃ  ｌｉｇｈｔ  ｂｏｘ（１２９５−０１３）を用いた。サンプルを光源より２２ｃｍ上に保持し、連続露光した。各サンプルのＵＶ／可視スペクトルを２４時間毎に測定した。各測定ポイントで同じキュベット及び分光光度計を使用した。以下の実験を行った。
【０１１５】
抗マウスＩｇＧ：化合物８コンジュゲートの光安定性を非フッ素化類似物Ｃｙ２：ＩｇＧコンジュゲートと比較して試験した。各実験データを正規化し、図１にプロットした。結果から、フッ素化色素が非フッ素化色素類似物と比べてより優れた耐光退色性を有することがわかる。
【０１１６】
２４．  ウェスタンブロッティング
アクチン（Ｓｉｇｍａ社製；Ａ３６５３）をサンプルローディングバッファＳＬＢ（０．５Ｍトリス−ＨＣｌ、ＳＤＳ、グリセリン、ブロモフェノールブルー）で希釈して、１μｇ／μｌの原液を作製した。このタンパク質をさらにＳＬＢで１／３０に希釈し、１２％トリスグリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｎｏｖｅｘ（登録商標）；ＥＣ６００５５ＢＯＸ）上にのせ、１００Ｖで約２時間泳動させた。終夜でタンパク質をＨｙｂｏｎｄ  ＬＦＰメンブレン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に移動し、固定化した後、メンブレンを一次抗体（Ｓｉｇｍａ社製；モノクローナル抗アクチン；Ａ４７００）で処理した。一連の洗浄工程後、メンブレンを、洗浄／固定化溶液（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１／２５００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ：化合物８コンジュゲート（実施例２２）と１時間インキュベートした。さらに一連の洗浄工程後、メンブレンを３７℃で１時間乾燥し、Ｔｙｐｈｏｏｎ８６００（フィルター・セット＝フルオレセイン；ＰＭＴ＝５５０Ｖ；画素サイズ＝１００μｍ）により分析した。結果を図２に示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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