(57)【要約】  本開示は、エストロゲン受容体β選択的アゴニストとして有用なリキリチゲニンまたは誘導体またはプロドラッグを含む組成物を提供する。本開示はまた、当該組成物を用いて、閉経期の症候およびエストロゲン関連障害を治療する方法を提供する。【選択図】なし
2010530880.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2010530880.tif 000010
［式中、
Ｘは、ＳまたはＲ立体配置を有する不斉炭素原子であり、
Ｒ１は、ＨおよびＯＲ４からなる群から選択され、かつ
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、ならびにそれぞれ水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、ベンジル、アルキルフェニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アシルオキシ、アミノ、カルボキシおよびアルコキシカルボニルから選択される１〜３個の基で置換されていてもよい、グリコシド、グルクロニド、アシル、リン酸、ホスホン酸、アルキルホスホネート、スルフェート、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、アリール、カーボネートおよびカーバメートからなる群から選択される］
の単離および精製された化合物、またはその医薬上許容され得る塩またはプロドラッグ、当該プロドラッグの医薬上許容され得る塩、および
医薬上許容され得る担体、ビヒクルまたは希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項２】
ＸがＳ立体配置であり、かつ、Ｒ１がＨである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ２およびＲ３が、Ｈならびに置換されていてもよいグリコシド、グルクロニド、ホスフェート、スルフェート、アセテート、ベンゾエートおよびカーバメートから選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ２およびＲ３が、Ｈおよびグリコシドから選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
Ｒ２およびＲ３が、Ｈであり、かつ、前記化合物が、式
【化２】
2010530880.tif 000011
の化合物およびその医薬上許容され得る塩である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記化合物が、式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）
【化３】
2010530880.tif 000012
のうちの１つである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
１つ以上の閉経期症状の治療を必要とする対象において、当該治療を行う方法であって、有効量の請求項１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項８】
前記１つ以上の閉経期症状が、のぼせ症、血管運動性不安定性に続発する発汗、のぼせ症、疲労、易刺激性、不眠、集中力低下、抑鬱、記憶喪失、頭痛、不安、神経過敏、間欠性眩暈、錯感覚、動悸、頻拍症、悪心、便秘、下痢、関節痛、筋肉痛、手足の冷え、体重増加、性器の変化、尿失禁、腟乾燥、性欲減退、尿失禁、骨盤筋緊張の抑制減少、増加した低密度リポタンパク質、循環器疾患のリスクの増加および骨粗鬆症からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記閉経期症状が、のぼせ症である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、式（ａ）、（ｂ）または（ｃ）
【化４】
2010530880.tif 000013
のうちの１つである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
対象においてエストロゲン受容体β媒介障害の治療方法であって、当該治療を必要とする対象に、有効量の請求項１の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１２】
前記エストロゲン受容体β媒介障害が、エストロゲン依存性癌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記エストロゲン依存性癌が、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮腺癌および腟癌の１つ以上から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記エストロゲン受容体β媒介障害が、乳房の障害、前立腺の障害、炎症性障害、自己免疫障害、動脈の障害、腸の障害、神経系の障害、尿路の障害、卵巣の障害および疼痛からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記乳房の障害が、良性乳房過形成、非定型乳房過形成および線維嚢胞性乳房障害の１つ以上から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記前立腺の障害が、前立腺癌および良性前立腺肥大から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記炎症性障害が、クローン病および大腸炎の１つ以上から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記自己免疫障害が、関節リウマチ、紅斑性狼瘡およびシェーグレン症候群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記動脈の障害が、粥状動脈硬化、末梢血管病、冠動脈狭窄および冠動脈再狭窄の１つ以上から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記腸の障害が、結腸癌、腸癌および腺癌から選択される腸の障害の１つ以上から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記神経系の障害が、老人性認知症、アルツハイマー病、閉経期の鬱、不眠、閉経期のほてり症および性欲減退の１つ以上から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記尿路系の障害が、排尿障害、尿失禁および頻尿の１つ以上から選択される、請求項１４の方法。
【請求項２３】
前記卵巣の障害が、多嚢胞性卵巣および無排卵の１つ以上から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記疼痛が、関節炎、骨関節炎および月経困難症の１つ以上に関連する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
式
【化５】
2010530880.tif 000014
［式中、
Ｘは、ＳまたはＲ立体配置を有する不斉炭素原子であり、
Ｒ１は、ＨおよびＯＲ４からなる群から選択され、かつ
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、ならびにそれぞれ水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、ベンジル、アルキルフェニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アシルオキシ、アミノ、カルボキシおよびアルコキシカルボニルから選択される１〜３個の基で置換されていてもよい、グリコシド、グルクロニド、アシル、リン酸、ホスホン酸、アルキルホスホネート、スルフェート、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、アリール、カーボネートおよびカーバメートからなる群から選択される］
の化合物、またはその医薬上許容され得る塩またはプロドラッグ、当該プロドラッグの医薬上許容され得る塩、および
医薬上許容され得る担体、ビヒクルまたは希釈剤から実質的になる、医薬組成物。
【請求項２６】
ＸがＳ立体配置であり、かつ、Ｒ１がＨである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、ならびに置換されていてもよいグリコシド、グルクロニド、ホスフェート、スルフェート、アセテート、ベンゾエートおよびカーバメートから選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｒ２およびＲ３が、Ｈおよびグリコシドから選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項２９】
Ｒ２およびＲ３が、Ｈであり、かつ、前記化合物が、式
【化６】
2010530880.tif 000015
の化合物およびその医薬上許容され得る塩である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記化合物が、式（ａ）、（ｂ）または（ｃ）
【化７】
2010530880.tif 000016
の化合物である、請求項２８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エストロゲン受容体β選択的アゴニストとして有用なリキリチゲニンまたは誘導体またはプロドラッグを含む組成物に関する。本発明はまた、当該組成物を用いる、閉経期症状およびエストロゲン依存性障害の治療方法に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００７年６月２２日に出願された出願番号第１１／７６７，３８０号の一部継続出願であり、当該出願に対して米国特許法第１２０条に基づく優先権を主張し、かつ、当該出願を参照することによりその全体を本明細書中に援用する。
【背景技術】
【０００３】
閉経期はしばしば、のぼせ症、寝汗、気分の変化、泌尿生殖器の萎縮症および骨密度の低下などの一連の症状を伴い、これらは伝統的にホルモン療法（ＨＴ）で治療されてきた。さらに、循環器疾患のリスクの増加および骨粗鬆症は、閉経期の開始と共に起こる。ＨＴは、閉経期の女性における骨粗鬆症、循環器疾患のリスクの増加などの種々の症状、ならびにのぼせ症、性欲減退および抑鬱などの更年期症状を治療するのに首尾良く用いられてきた。しかしながら、エストラジオール（Ｅ２）を用いるＨＴは、単独でまたはプロゲスチンとの組み合わせで、望ましくない影響をもたらし得る。最近のＷｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＷＨＩ）の研究は、ＨＲＴが３５％増加した乳癌のリスクに関連することが予備的結果により示されたとき、急に中止された。ＷＨＩの試みはまた、エストロゲンおよびプロゲスチンを用いるＨＴが、女性の乳癌のみならず、心疾患および認知症のリスクも増加することを見出した（（Ｗａｓｓｅｒｔｈｅｉｌ−Ｓｍｏｌｌｅｒら、ＪＡＭＡ  ２８９：２６７３−２６８４（２００３）、Ｃｈｌｅｂｏｗｓｋｉら、ＪＡＭＡ  ２８９：３２４３−３２５３（２００３）、Ｓｈｕｍａｋｅｒら、ＪＡＭＡ  ２８９：２６５１−２６６２（２００３）、Ｍａｎｓｏｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４９  ５２３−５３４（２００３）、Ｒｏｓｓｏｕｗら、ＪＡＭＡ  ２８８：３２１−３３３．（２００２））。さらに、ＷＨＩの第２の治療群は、エストロゲンの単独での使用が、脳卒中および認知症のリスクを増加させたことを見出した（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、ＪＡＭＡ  ２９１：１７０１−１７１２（２００４）、Ｓｈｕｍａｋｅｒら、Ｊａｍａ  ２９１：２９４７−２９５８（２００４））。ＨＴの乳癌および血餅への悪影響は、閉経期症状を治療するのに新たな戦略が必要とされていることを示す。
【０００４】
伝統的ＨＴの代替薬物は、タモキシフェンおよびラロキシフェンなどの選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）を潜在的に含み得る。現在のＳＥＲＭ治療は、骨塩量の改善（Ｄｅｌｍａｓら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ  Ｍｅｄ．３３７：１６４１−１６４７（１９９７）、Ｌｏｖｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６  ８５２−８５６（１９９２））および乳癌の予防などのいくつかの好ましい効果を有するが、ＳＥＲＭは、のぼせ症を増悪する（Ｃｒａｎｎｅｙ，Ｄｒｕｇ  Ｓａｆ．２８：７２１−７３０（２００５））。のぼせ症のための他の薬理学的選択肢には、セロトニンおよびノルエピネフリン再取り込み阻害剤、ならびにギャバペンチンなどの他の神経調節物質を用いる抗鬱薬治療（Ｌｏｐｒｉｎｚｉら、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ  ７７：１１５９−１１６３（２００２））が挙げられる。しかしながら、これらの治療は、その中程度の効力（Ｅｖａｎｓら、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１０５：１６１−１６６（２００５））、潜在的に有意な副作用（Ｓｉｃａｔら、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ２４：７９−９３（２００４）、Ｌｏｐｒｉｎｚｉら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５６．２０５９−２０６３（２０００））ならびに腟萎縮症および骨粗鬆症などの他の閉経期症状への利点がないことを考慮すると、全体的な利点が不明である。
【０００５】
伝統的中国医薬（ＴＣＭ）で用いられる植物学的栄養補助食品は、閉経期症状を緩和するために、多くの患者によって用いられている。約２５％の女性が、閉経期症状を治療するのに植物学的抽出物を用いていることが報告された（Ｕｐｃｈｕｒｃｈら、Ｊ．Ｗｏｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈ（Ｌａｒｃｈｍｔ）１６  １０２−１１３）。エストロゲンが乳癌を引き起こすという抗し難い証拠にもかかわらず、アジアの国々の女性は、大量の植物エストロゲン（フィトエストロゲン）を消費していても乳癌の発症率が最低であることが、観察的研究により示された。同様に、アジア人女性は、閉経期の間に訴える症状が最も少なく、卵巣機能が休止する時にのぼせ症を経験する傾向がずっと少ない。これらの知見は、アメリカ合衆国における多くの閉経期の女性に、乳癌を発症するリスクを増加することなくのぼせ症を軽減することを期待して、エストロゲンの代替として、ダイズ中に存在するフィトエストロゲンの摂取または漢方薬療法を奨励した。異なるエストロゲン様化合物は、乳房細胞に逆の効果を発揮し得る。例えば、エストラジオール（Ｅ２）などのエストロゲンは、乳癌を促進するが、フィトエストロゲンは、アジアで観察される乳癌の低い発症率に実際に寄与し得る。この傾向を支持する実質的な実験データおよび観察データは存在するものの（Ｋｕｒｔｚｅｒ  Ｍ．Ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｕｓｅ  ｂｙ  ｗｏｍｅｎ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．２００３、１３３：１９８３Ｓ−１９８６Ｓ）、今日まで、フィトエストロゲンが乳癌のリスクを低減することを実証したランダム化対照研究はなかった。
【０００６】
最近、ＴＣＭで用いられる２２の個別の植物から構成される植物抽出物の組成物であるＭＦ１０１を用いて、基礎的および臨床的研究がなされた。ＭＦ１０１は、Ｃｏｈｅｎの米国特許出願第１１／２７７，８１１号、２００６年１０月５日に公開された米国公開公報第２００６／０２２２７２１（これらは参照することによりその全体が本明細書中に援用される）に記載される。２２名の閉経後女性でのフェーズ１臨床試験により、ＭＦ１０１は短期での使用に安全であり、かつ、３０日間の治療後にのぼせ症を中程度に減少させることが見出された。ＭＦ１０１は、ＥＲβ経路経由で遺伝子転写を制御することにより、ＥＲβ選択的アゴニストとして作用することが実証された（非特許文献１７）。また、ＭＦ１０１は、マウス異種移植モデルにおいて、ＭＣＦ−７乳癌細胞の増殖または子宮の増殖を刺激しないことも示された（Ｃｖｏｒｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４８：５３８−５４７（２００７））。のぼせ症の治療のためのＭＦ１０１についてのフェーズ２臨床試験が、その安全性および有効性をさらに評価するために進行中である（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ００１１９６６５）。これらの知見は、ＴＣＭに用いられる植物が、閉経期症状を安全に治療するためのエストロゲン受容体β（ＥＲβ）サブタイプ選択性薬物を発見するための供給源であり得ることを示唆する。さらに、非治療用化合物のいくつかは有害な作用を誘発し得るので、個々の化合物は、粗製漢方薬製剤よりも安全である可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願第１１／２７７，８１１号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／０２２２７２１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗａｓｓｅｒｔｈｅｉｌ−Ｓｍｏｌｌｅｒら、ＪＡＭＡ  ２８９：２６７３−２６８４（２００３）
【非特許文献２】Ｃｈｌｅｂｏｗｓｋｉら、ＪＡＭＡ  ２８９：３２４３−３２５３（２００３）
【非特許文献３】Ｓｈｕｍａｋｅｒら、ＪＡＭＡ  ２８９：２６５１−２６６２（２００３）
【非特許文献４】Ｍａｎｓｏｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４９  ５２３−５３４（２００３）
【非特許文献５】Ｒｏｓｓｏｕｗら、ＪＡＭＡ  ２８８：３２１−３３３．（２００２）
【非特許文献６】Ａｎｄｅｒｓｏｎら、ＪＡＭＡ  ２９１：１７０１−１７１２（２００４）
【非特許文献７】Ｓｈｕｍａｋｅｒら、Ｊａｍａ  ２９１：２９４７−２９５８（２００４）
【非特許文献８】Ｄｅｌｍａｓら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ  Ｍｅｄ．３３７：１６４１−１６４７（１９９７）
【非特許文献９】Ｌｏｖｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６  ８５２−８５６（１９９２）
【非特許文献１０】Ｃｒａｎｎｅｙ，Ｄｒｕｇ  Ｓａｆ．２８：７２１−７３０（２００５）
【非特許文献１１】Ｌｏｐｒｉｎｚｉら、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ  ７７：１１５９−１１６３（２００２）
【非特許文献１２】Ｅｖａｎｓら、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１０５：１６１−１６６（２００５）
【非特許文献１３】Ｓｉｃａｔら、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ２４：７９−９３（２００４）
【非特許文献１４】Ｌｏｐｒｉｎｚｉら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５６．２０５９−２０６３（２０００）
【非特許文献１５】Ｕｐｃｈｕｒｃｈら、Ｊ．Ｗｏｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈ（Ｌａｒｃｈｍｔ）１６  １０２−１１３
【非特許文献１６】Ｋｕｒｔｚｅｒ  Ｍ．Ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｕｓｅ  ｂｙ  ｗｏｍｅｎ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．２００３、１３３：１９８３Ｓ−１９８６Ｓ
【非特許文献１７】Ｃｖｏｒｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４８：５３８−５４７（２００７）
【非特許文献１８】ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ００１１９６６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅが、ホルモン療法（ＨＴ）のリスクが利点を上回ることを見出した後、閉経期症状を治療するためのより安全な薬物の必要性が生じた。ＨＴのより安全な代替物を開発するための一つのアプローチは、閉経期症状の治療用の薬物および組成物として用いるためのＭＦ１０１などの既知のＴＣＭ漢方薬組成物から、個々の化学的実体を単離しかつ特徴付けることである。非治療用化合物のいくつかは、有害な作用を誘発し得るので、個々の化合物は、粗製漢方薬製剤よりも安全である可能性がある。活性化合物もまた合成および定量され得、既知の量およびより高い用量の活性薬物の投与を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一実施形態では、本開示は、式
【化１】
2010530880.tif 000003
［式中、Ｘは、ＳまたはＲ立体配置を有する不斉炭素原子であり、Ｒ１は、ＨおよびＯＲ４からなる群から選択され、かつ、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、ならびにそれぞれ水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、ベンジル、アルキルフェニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アシルオキシ、アミノ、カルボキシおよびアルコキシカルボニルから選択される１〜３個の基で置換されていてもよい、グリコシド、グルクロニド、アシル、ホスフェート、ホスホン酸、アルキルホスホネート、スルフェート、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、アリール、カーボネートおよびカーバメートからなる群から選択される］の単離および精製された化合物、またはその医薬上許容され得る塩またはプロドラッグ、当該プロドラッグの医薬上許容され得る塩、および医薬上許容され得る担体、ビヒクルまたは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。一態様では、ＸがＳ立体配置であり、かつ、Ｒ１がＨである。別の態様では、Ｒ２およびＲ３が、Ｈならびに置換されていてもよいグリコシド、グルクロニド、ホスフェート、スルフェート、アセテート、ベンゾエートおよびカーバメートから選択される。さらなる態様では、Ｒ２およびＲ３が、Ｈおよびグリコシドから選択される。特定の態様では、Ｒ２およびＲ３が、Ｈであり、かつ、上記化合物が、式
【化２】
2010530880.tif 000004
の化合物およびその医薬上許容され得る塩である。
【００１１】
別の実施形態では、本開示は、１つ以上の閉経期症状の治療を必要とする対象において、当該治療を行う方法であって、有効量の開示されたリキリチゲニンまたはその誘導体またはプロドラッグを含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。閉経期症状には、のぼせ症、血管運動性不安定性に続発する発汗、のぼせ症、疲労、易刺激性、不眠、集中力低下、抑鬱、記憶喪失、頭痛、不安、神経過敏、間欠性眩暈、錯感覚、動悸、頻拍症、悪心、便秘、下痢、関節痛、筋肉痛、手足の冷え、体重増加、性器の変化、尿失禁、腟乾燥、性欲減退、尿失禁、骨盤筋緊張の抑制減少、増加した低密度リポタンパク質、循環器疾患のリスクの増加および骨粗鬆症の１つ以上が挙げられる。一つの特定の態様では、閉経期症状がのぼせ症である。
【００１２】
別の実施形態では、本開示は、対象においてエストロゲン受容体β媒介障害を治療する方法であって、当該治療を必要とする対象に、有効量の開示されたリキリチゲニンまたはその誘導体またはプロドラッグを含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。一態様では、エストロゲン受容体β媒介障害が、エストロゲン依存性癌である。この態様では、エストロゲン依存性癌が、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮腺癌および腟癌の１つ以上から選択される。別の態様では、エストロゲン受容体β媒介障害が、乳房の障害、前立腺の障害、炎症性障害、自己免疫障害、動脈の障害、腸の障害、神経系の障害、尿路の障害、卵巣の障害および疼痛からなる群から選択される。別の態様では、乳房の障害が、良性乳房過形成、非定型乳房過形成および線維嚢胞性乳房障害の１つ以上から選択される。さらなる態様では、前立腺の障害が、前立腺癌および良性前立腺肥大から選択される。別の態様では、炎症性障害が、クローン病および大腸炎の１つ以上から選択される。さらなる態様では、自己免疫障害が、関節リウマチ、紅斑性狼瘡およびシェーグレン症候群から選択される。別の態様では、動脈の障害が、粥状動脈硬化、末梢血管病、冠動脈狭窄および冠動脈再狭窄の１つ以上から選択される。さらなる態様では、腸の障害が、結腸癌、腸癌および腺癌から選択される腸の障害の１つ以上の１つ以上から選択される。別の態様では、神経系の障害が、老人性認知症、アルツハイマー病、閉経期の鬱、不眠、閉経期のほてり症および性欲減退の１つ以上から選択される。さらなる態様では、尿路の障害が、排尿障害、尿失禁および頻尿の１つ以上から選択される。別の態様では、卵巣の障害が、多嚢胞性卵巣および無排卵の１つ以上から選択される。さらなる態様では、疼痛が、関節炎、骨関節炎および月経困難症の１つ以上に関連する。
【００１３】
別の実施形態では、本開示は、式
【化３】
2010530880.tif 000005
［式中、Ｘは、ＳまたはＲ立体配置を有する不斉炭素原子であり、Ｒ１は、ＨおよびＯＲ４からなる群から選択され、かつＲ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、ならびにそれぞれ水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、ベンジル、アルキルフェニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アシルオキシ、アミノ、カルボキシおよびアルコキシカルボニルから選択される１〜３個の基で置換されていてもよい、グリコシド、グルクロニド、アシル、ホスフェート、ホスホン酸、アルキルホスホネート、スルフェート、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、アリール、カーボネートおよびカーバメートからなる群から選択される］の単離および精製された化合物、またはその医薬上許容され得る塩またはプロドラッグ、当該プロドラッグの医薬上許容され得る塩、および医薬上許容され得る担体、ビヒクルまたは希釈剤から実質的になる、医薬組成物を提供する。一態様では、ＸがＳ立体配置であり、かつ、Ｒ１がＨである。別の態様では、Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、ならびに置換されていてもよいグリコシド、グルクロニド、ホスフェート、アセテート、ベンゾエートおよびカーバメートから選択される。さらなる態様では、Ｒ２およびＲ３が、Ｈおよびグリコシドから選択される。一つの特定の態様では、Ｒ２およびＲ３が、Ｈであり、かつ、上記化合物が、式
【化４】
2010530880.tif 000006
の化合物およびその医薬上許容され得る塩である。
【００１４】
参照による援用
本明細書中で言及した全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により援用されるべきであることが特別かつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書中で援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明の新規な特徴を、特に添付の特許請求の範囲に記載する。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的実施形態を記載した以下の詳細な説明、および以下の添付の図面を参照することにより得られるであろう：
【図１】ラセミ体リキリチゲニンの化学合成のスキームを示す。
【図２】ＥＲＥｔｋＬｕｃおよびＥＲαまたはＥＲβ発現ベクターのいずれかで同時形質移入し、次いで種々の量のリキリチゲニンで１８時間処理した（Ａ）Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞、（Ｂ）ＨｅＬａ子宮頚癌細胞および（Ｃ）ＷＡＲ５前立腺癌細胞におけるルシフェラーゼ活性を示す。
【図３】（Ａ）ＴＡＴ３−ルシフェラーゼおよびアンドロゲン受容体（ＡＲ）；（Ｂ）ＭＭＴＶ−ルシフェラーゼおよびグルココルチコイド受容体（ＧＲ）；（Ｃ）ＴＡＴ３−ルシフェラーゼおよびプロゲステロン受容体Ｂ（ＰＲ）；ならびに（Ｄ）Ｆ２−ｔｋＬｕｃおよび甲状腺ホルモン受容体β１（ＴＲ）を用いて形質移入し、次いで（Ａ）１ｎＭのジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、（Ｂ）１ｎＭのデキサメサゾン（Ｄｅｘ）、（Ｃ）１ｎＭのプロゲステロン（Ｐｒｏｇ）および（Ｄ）１０ｎＭのトリヨードサイロニン（Ｔ３）のいずれかでそれぞれ、または２．５μＭのリキリチゲニンで１８時間処理したＵ２ＯＳ骨肉腫細胞におけるルシフェラーゼ活性を示す。示される各点は、３回の測定の平均±標準誤差である。
【図４】（Ａ）ＣＥＣＲ６−ｔｋ−Ｌｕｃ、（Ｂ）ＮＫＧ２Ｅ−ｔｋ−Ｌｕｃおよび（Ｃ）ＮＫＤ−ｔｋ−Ｌｕｃの１つならびにＥＲαまたはＥＲβのいずれかで同時形質移入し、次いで種々の量のリキリチゲニンで１８時間処理したＵ２ＯＳ骨肉腫細胞のルシフェラーゼ活性を示す。
【図５】テトラサイクリン誘導性ＥＲαまたはＥＲβで安定に形質移入し、ドキシサイクリンで１８時間処理してＥＲ発現を誘発し、次いでリキリチゲニンで種々の時間間隔で処理したＵ２ＯＳ細胞における相対的なｍＲＮＡ発現を示す。（Ａ）ＣＥＣＲ６、（Ｂ）ＮＫＧ２Ｅおよび（Ｃ）ＮＫＤｍＲＮＡのレベルをリアルタイムＰＣＲで測定した。各データ点は、３回の測定の平均±標準誤差である。
【図６】（Ａ）増加する量のリキリチゲニンの非存在下または存在下における、精製ＥＲαまたはＥＲβへの蛍光標識Ｅ２の結合を示す。（Ｂ）は、種々の時間にわたってリキリチゲニンで処理し、次いでＳＲＣ−２に対する抗体を用いてＣｈＩＰアッセイに供したＵ２ＯＳ−ＥＲβまたはＵ２ＯＳ−ＥＲα細胞を示す。（Ａ）ＣＥＣＲ６、（Ｂ）ＮＫＧ２Ｅおよび（Ｃ）ＮＫＤ遺伝子におけるＥＲ調節因子のレベルを増幅するため、リアルタイムＰＣＲを行った。各データ点は、３回の測定の平均±標準誤差である。
【図７】（Ａ）コントロール、（Ｂ）Ｅ２および（Ｃ）リキリチゲニンで処置したマウスにおいて、矢印で腎臓莢膜下に移植したＭＣＦ−７乳癌細胞を利用するマウス異種移植モデルにおける巨視的形態学を示す。各群（ｎ＝５）からの（Ｄ）腫瘍移植片および（Ｅ）子宮角の平均±標準誤差を示す。＊は対照と薬物処置群との間の有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
用語「閉経期」は、正常な排卵サイクルの休止後、正常な月経が止まっている期間であると定義される。閉経期は、卵巣によるエストラジオール（Ｅ２）産生の減少を伴う。このＥ２産生の減少は、体内のホルモンバランスの転換をもたらし、これはしばしば、閉経期に関連する種々の症状を引き起こす。
【００１７】
用語「閉経周辺期」は、閉経前または更年期としても知られるが、正常な排卵サイクルが次第に月経の休止へと向かう閉経期の前の期間であると定義される。排卵サイクルが長くなりより不規則になるにつれて、Ｅ２のレベルが最初に増加し得るが、閉経期の開始と共に最終的に低下するであろう。閉経期症状は、しばしば、Ｅ２レベルの低下を伴う。
【００１８】
用語「閉経期症状」は、閉経周辺期、閉経期および閉経後の１つ以上の症状であると定義され、のぼせ症、および血管運動不安定性に続発する発汗などの身体的症状が挙げられる。疲労、易刺激性、不眠、集中力低下、抑鬱、記憶喪失、頭痛、不安および神経過敏などの心理学的および情動的症状はまた、更年期の開始にも伴う。さらなる症状には、間欠性眩暈、錯感覚、動悸および頻拍症、ならびに悪心、便秘、下痢、関節痛、筋肉痛、手足の冷えおよび体重増加が挙げられ得る。さらに、性器の変化、尿失禁、腟乾燥、骨盤筋緊張の抑制減少、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の増加、循環器疾患のリスクの増加および骨粗鬆症が、閉経期の開始と共に増加する。
【００１９】
用語「閉経期の治療」は、閉経周辺期、閉経期または閉経後に関連する１つ以上の症状の軽減、寛解または予防を意味し、少なくとも１つの閉経期症状の重症度または頻度の減少を含む。本明細書中で用いる「または」の使用は、別段特定しない限り、接続語であることを意図する。従って、治療はまた、少なくとも１つの閉経期症状の重症度および頻度の両方を減少させることも含む。症状の頻度および重症度の減少が完全であり得るという意味から、治療はまた、症状の予防も含み得る。これに関し、閉経期の治療は、閉経期に関連する少なくとも１つの症状の頻度および重症度を検出不能なレベルまで減少させることを確かに含むが、ヒト成人女性における月経の自然な休止の予防は含まないことが留意される。
【００２０】
用語「閉経期の対象」は、かつて初経に達し、かつ、現在、閉経周辺期、閉経期または閉経後を経験している成人女性を意味する。婦人科学の当業者は、当技術分野で認識されている臨床的方法により、閉経の開始の診断上の特徴を同定すること、および対象が「閉経期の対象」であることを同定することが可能であろう。
【００２１】
用語「エストロゲン」は、思春期から閉経期の開始までに女性の卵巣により主に産生されるステロイドホルモンの分類であると定義される。エストラジオール（１７β−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３，１７−ジオール、Ｅ２）は、卵巣の濾胞細胞により産生される主なエストロゲンホルモンである。エストラジオールは、エストロゲン受容体α（ＥＲα）およびエストロゲン受容体β（ＥＲβ）サブタイプの両方において強力な非選択的アゴニストとして作用する。他のエストロゲンには、エストロン（Ｅ１）およびエストリオール（Ｅ３）が挙げられる。エストロゲンは、女性の乳房、子宮および卵巣の正常な成長および発達に重要である。エストロゲンは、体温の制御、腟の内膜の維持および骨密度の保存などの女性における種々の生理的機能に影響する。正常な女性では、閉経期の開始時、通常は約５０歳で、エストロゲンの産生が急激に低下する。エストロゲン産生の減少の影響には、アテローム硬化型沈着物の増加（心疾患の発症率の大幅な増加をもたらす）、骨密度減少（骨粗鬆症）、および体温の変動などが挙げられる。
【００２２】
用語「アゴニスト」は、受容体に結合して細胞中での応答を活性化する化学物質を意味する。ＥＲβ選択的アゴニストは、ＥＲαよりもＥＲβの活性化により効果的である。用語「アンタゴニスト」は、同様に受容体に結合するが、応答を活性化しない化学物質を意味する。
【００２３】
用語「エストロゲン応答因子」（ＥＲＥ）は、ＥＲ−αおよびＥＲ−βの両方が高親和性で結合する特定のＤＮＡ配列であると定義される。応答因子は、転写制御因子の認識部位であり、この場合、転写制御因子はエストロゲン受容体である。
【００２４】
用語「クロマチン免疫沈降」（ＣｈＩＰ）は、所与のタンパク質が特定のＤＮＡ配列に結合するかまたはそれに局在化するかどうかを決定するのに用いられる手順を意味する。ＣｈＩＰ技術は、ホルムアルデヒドを用いる細胞内でのインビボ架橋を利用してクロマチン関連タンパク質をＤＮＡに結合し、次いで、これらの複合体を、特異抗体での免疫沈降により単離する。
【００２５】
用語「ＳＲＣ−２」は、ステロイド受容体活性化補助因子−２であると定義され、これはまた、グルココルチコイド受容体相互作用タンパク質１（ＧＲＩＰ１）および核内受容体共役因子２（ＮＣＯＡ２）としても知られる。ＳＲＣ−２は、ＥＲ媒介転写を制御するよう作用し得る核内受容体共調節性タンパク質である。
【００２６】
用語「エストロゲン受容体」（ＥＲ）は、リガンド活性化核タンパク質である核内受容体の一分類であると定義する。結合後、受容体リガンド複合体は、遺伝子転写を活性化する。２つの型のエストロゲン受容体：ＥＲαおよびＥＲβが存在する。リガンド（アゴニストまたはアンタゴニスト）のＥＲへの結合は、受容体にアロステリックな変化をもたらす。これらの変化は、シャペロンタンパク質の解離およびＥＲの二量体化をもたらし得る。エストロゲン受容体αおよびβは、いずれもホモ二量体化し得、ヘテロ二量体化の頻度はより低い。リガンド−受容体複合体は、標的遺伝子の調節領域内で、染色質−組織化ＤＮＡ配列に結合する。ＥＲ結合は、ＤＮＡ中で主溝に向かう屈曲を引き起こし、かつ、重要な転写性成分の相互作用を促進する。
【００２７】
２つの公知のエストロゲン受容体であるＥＲαおよびＥＲβは、ステロイド核内受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＥＲαは、１９８６年に初めてクローン化され、そして約１０年後、第２のＥＲが発見され、ＥＲβと命名された。ＥＲαは５９５のアミノ酸を含み、一方、ＥＲβは５３０のアミノ酸を含む。いずれの受容体も、３つの別の領域から構成されるモジュラータンパク質である。アミノ末端領域（Ａ／Ｂ領域）は、ＥＲαとＥＲβとの間で１５％のみの相同性を示す最小保存領域である。この領域は、エストラジオールの非存在下で遺伝子転写の活性化を活性化し得る活性化機能（ＡＦ−１）を有する。ＥＲの中心部は、標的遺伝子のプロモータ中に位置する３つのヌクレオチドにより分離される反転パリンドローム反復配列に結合する２つの亜鉛フィンガーモチーフを含む。ＥＲαおよびＥＲβ中のＤＮＡ結合領域（ＤＢＤ）は実質的に同一であり、９５％の相同性を示す。
【００２８】
カルボキシ末端領域は、いくつかの必須の機能を行うリガンド結合領域（ＬＢＤ）を含む。ＬＢＤは、エストロゲン様物質が結合する大きな疎水性ポケットを構成する領域、およびＥＲ二量体形成に関与する領域を含む。ＬＢＤはまた、共調節性タンパク質と相互作用する第２の活性化機能（ＡＦ−２）を含む。ＡＦ−２は、エストロゲンの活性化および遺伝子転写の抑制の両方に必要とされる。ＥＲαおよびＥＲβのＬＢＤは、約５５％相同性であるにすぎない。ＥＲαおよびＥＲβのＬＢＤのアミノ酸組成物における差が進化して、異なる転写上の役割を有するＥＲを創製したのかもしれない。このことは、ＥＲαおよびＥＲβが異なる遺伝子の活性を制御することおよび異なる生理的効果を誘発することを可能にするであろう。この知見は、ＥＲαおよびＥＲβノックアウトマウスの研究により支持される。例えば、ＥＲαノックアウトマウスは、原始的な乳房のおよび子宮の発生を有するが、ＥＲβノックアウトマウスは、正常な乳腺および子宮を発生する。これらの知見は、ＥＲαのみがこれらの組織の発生に必要とされることを実証する。さらに、ＥＲαは活性化遺伝子においてＥＲβよりも効率的であるが、一方、ＥＲβは、抑圧された遺伝子転写においてＥＲαよりも効率的である。
【００２９】
エストロゲンは、遺伝子転写を活性化または抑制し得る。遺伝子転写の活性化のための２つの特徴的な経路である古典的ＥＲＥ（エストロゲン応答因子）経路およびＡＰ−１（アクチベータータンパク質１）経路が存在する。遺伝子の転写を制御するためにエストロゲンに必要とされる少なくとも３つの必須成分：ＥＲ（ＥＲαおよび／またはＥＲβ）、標的遺伝子におけるプロモーター領域、および共調節性タンパク質が存在する。エストラジオール（Ｅ２）のＥＲへの結合は、立体構造の変化をもたらし、結果として、転写性経路を開始するいくつかの重要な段階がもたらされる。まず、Ｅ２のＥＲとの相互作用は、シャペロンタンパク質の解離をもたらし、これは、ＥＲの二量体形成表面およびＤＮＡ結合領域を曝露する。シャペロンタンパク質の損失により、ＥＲが二量体化することおよび標的遺伝子のプロモーター領域のＥＲＥに結合することが可能になる。次に、Ｅ２の結合は、ＬＢＤのらせん体１２を移動して、ＥＲのＡＦ−２機能を構築する表面を作製する。ＡＦ−２は、ＥＲのらせん体３、５および１２から構成される保存疎水性ポケットからなり、これらは一緒になって、ステロイド受容体活性化補助因子−１（ＳＲＣ−１）またはグルココルチコイド受容体相互作用タンパク質１（ＧＲＩＰ  １）などの活性化補助因子タンパク質（活性化補助因子）のｐ１６０クラスの結合表面を構成する。活性化補助因子（「共調節因子」としても知られる）は、ＡＦ−２のらせん体に囲まれた疎水性間隙内に突き出た、ＬＸＸＬＬから構成されるいくつかの反復アミノ酸モチーフを含む。活性化補助因子は、ヒストンアセチラーゼ活性を有する。遺伝子活性化は、ＥＲおよび活性化補助因子タンパク質が、ＤＮＡに結合したヒストンタンパク質のアセチル化を引き起こすＥＲＥ上で複合体を形成した後に起こると考えられている。ヒストンのアセチル化は、クロマチン構造を変化させ、その結果、ＥＲ／共調節性因子複合体は、遺伝子転写を開始するために標的遺伝子のＴＡＴＡボックス領域に構築されたＥＲＥと塩基性転写性タンパク質との間に架橋を形成し得る。
【００３０】
閉経周辺期、閉経期および閉経期の症状を治療するために現在のＨＴ治療計画に用いられるエストロゲンは、公知のエストロゲン受容体サブタイプであるＥＲαおよびＥＲβの両方を活性化する。２つのエストロゲン受容体（ＥＲ）であるＥＲαおよびＥＲβは、構造上の領域およびエストラジオール（Ｅ２）への同様の親和性を共有するが、多くの他のリガンドはＥＲに結合し、種々の組織中でアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。両方のＥＲの正確な役割は不明であるが、各サブタイプの特定の活性化は、異なる生物学的結果をもたらす。ＥＲαおよびＥＲβノックアウトマウスは、異なる表現型を有する（Ｈｅｗｉｔｔら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６７：２８５−３０８（２００５））。さらに、ＥＲα対ＥＲβのＥ２活性化は、異なる遺伝子制御パターンをもたらす（Ｋｉａｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １５：１２６２−１２７２（２００４））。エストロゲンは、全ての組織型でＥＲαおよびＥＲβへのアゴニストとして作用し、このことはおそらくＨＴの有利な態様を説明するであろうが、この非選択的作用はまた、おそらく、ＷＨＩによって明らかにされた有害な副作用を引き起こす。ＥＲαまたはＥＲβを選択的に活性化する薬物は、副作用を回避しつつ、有利な効果のいくつかを模倣するであろう。ＥＲαは乳癌細胞の細胞増殖を引き起こすことが示され、ＥＲβは腫瘍抑制因子となることが実証されている（Ｐａｒｕｔｈｉｙｉｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：４２３−４２８（２００４）,２１．Ｓｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１５６６−１５７１（２００４））。一実施形態では、本開示は、伝統的ＨＴに対してより安全な長期の代替治療の役割を果たすＥＲβ−選択的アゴニストを含む組成物を提供する。
【００３１】
以前の結果は、ＴＣＭに基づく植物抽出物であり、２２の個別の植物から構成されるＭＦ１０１が、ＥＲＢ選択的活性を含むことを示した（Ｃｖｏｒｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４８：５３８−５４７（２００７））。ＭＦ１０１が２２の異なる植物学的薬剤および多数の化合物から構成されているという事実にもかかわらず、ＭＦ１０１はＥＲβ選択性を示し、かつ、ヒト乳癌細胞またはマウス子宮に増殖効果を示さない（Ｃｖｏｒｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４８：５３８−５４７（２００７））。形質移入アッセイにおけるエストロゲンの活性において、ＭＦ１０１を構成する２２の漢方薬が個々にスクリーニングされた。当該２２の漢方薬のなかでも、ウラルカンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｕｒａｌｅｎｓｉｓ）は、高いエストロゲン活性を含んだ。さらなる試験のため、ウラルカンゾウを含むＭＦ１０１の個々の植物成分から活性化合物を単離した。
【００３２】
ウラルカンゾウからの化合物の活性に基づく単離は、ＥＲＥ  ｔｋＬｕｃおよびＥＲβの発現ベクターを用いて行われた。これらの研究の結果、フラバノンリキリチゲニンが同定された。
【００３３】
本開示は、ＥＲβに対して有用なアゴニスト活性を有する化合物を含む組成物を提供する。本開示は、さらに、哺乳動物の対象においてエストロゲン受容体が媒介する障害を治療するのに有用な方法を提供する。従って、本明細書中に記載の化合物、組成物および方法は、のぼせ症および骨粗鬆症などの閉経期症状、ならびに乳癌、卵巣癌および子宮癌（しかし、これらに限定されない）などの広範な種々のエストロゲン受容体が媒介する障害を予防および／または治療するのに有用性を有する。一実施形態では、本開示は、ＥＲβ選択的アゴニストであるリキリチゲニンをウラルカンゾウから単離する方法を提供する。
【００３４】
別の実施形態では、リキリチゲニンの合成調製および特徴付けの方法が開示される。
【００３５】
さらなる実施形態では、細胞および動物モデルにおけるエストロゲン受容体へのリキリチゲニンの生物学的活性が開示される。一態様では、ＥＲによるリキリチゲニンの結合および転写活性化が開示される。
【００３６】
別の実施形態では、本開示は、リキリチゲニンまたはその誘導体、類似体またはプロドラッグを含む組成物を用いて閉経期症状を治療する方法を提供する。
【００３７】
用語「リキリチゲニン」は、（２Ｓ）−７−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ジヒドロ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンとして、または４’，７−ジヒドロキシフラバノンとして定義され、化学式Ｃ１５Ｈ１２Ｏ４、分子量２５６．２５、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ登録番号（ＣＡＳ  ＲＮ）５７８−８６−９である。リキリチゲニン（Ｉ）の構造を、以下に示す。
【化５】
2010530880.tif 000007
リキリチゲニン（Ｉ）
【００３８】
本発明は、閉経期の治療、特にのぼせ症などの閉経期症状を治療するための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、リキリチゲニンまたはその誘導体またはプロドラッグを含む。リキリチゲニン、誘導体、類似体またはプロドラッグは、式
【化６】
2010530880.tif 000008
から選択される。
【００３９】
［式中、Ｘは、ＳまたはＲ立体配置を有する不斉炭素原子であり、Ｒ１は、ＨおよびＯＲ４からなる群から選択され、かつＲ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ、ならびにそれぞれ水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、ベンジル、アルキルフェニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アシルオキシ、アミノ、カルボキシおよびアルコキシカルボニルから選択される１〜３個の基で置換されていてもよい、グリコシル、グルクロニル、アシル、リン酸、ホスホン酸、アルキルホスホネート、スルフェート、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、アリール、カーボネートおよびカーバメートからなる群から選択される］の化合物、またはその医薬上許容され得る塩またはプロドラッグ、当該プロドラッグの医薬上許容され得る塩、ならびに医薬上許容され得る担体、ビヒクルまたは希釈剤から選択される。
【００４０】
本開示はまた、式ＩおよびＩＩの化合物の医薬上許容され得るプロドラッグを提供する。プロドラッグは、化学的に修飾され、かつ、その作用点で生物学的に不活性であり得るが、１つ以上の酵素により、または他のインビボでのプロセスにより、親生理活性体に分解され得るかまたは修飾され得る薬物である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、式ＩまたはＩＩの化合物は、以下から選択される：
【化７】
2010530880.tif 000009
【００４２】
本明細書中で用いる、用語「アルキル」は、単独または組み合わせで、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチルおよびペンチルなどの１〜７の、好ましくは１〜４の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキル基を意味する。用語「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」は、１〜６の炭素原子に限定されたアルキルである。
【００４３】
用語「シクロアルキル」は、単独または組み合わせで、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロへプチルなどの３〜７の炭素のシクロアルキルを意味する。
【００４４】
用語「アルコキシ」は、単独または組み合わせで、−Ｏ−結合により共有結合で結合したアルキルである。アルコキシの例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシおよびｔ−ブトキシである。アルコキシアルキルは、例えば、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍは１〜７、または好ましくは１〜４であり、かつ、ｎは０〜６である）である。用語アルコキシカルボニルは、例えば、ｔ−ブトキシカルボニルまたはＢＯＣである。
【００４５】
用語「アシル」は、単独または組み合わせで、最大７の、好ましくは最大６の炭素原子を含むアルカン酸由来の部分（例えば  アセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、ピバロイル）または芳香族カルボン酸由来の部分（例えばベンゾイル）である。アシルには、ピバロイル（−（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３）もまた含まれる。
【００４６】
用語「アリール」は、単独または組み合わせで、非置換型フェニル基、またはハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、ベンジルオキシ、アルコキシ、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフミル（ａｌｋｙｌｓｕｌｆｍｙｌ）、アルキルスルホニルおよびシアノから独立して選択される１つ以上の、好ましくは１〜３の置換基を有するフェニル基を意味する。用語アリールアルキルは、好ましくはベンジルである。
【００４７】
用語「グルクロニド」は、そのヒドロキシル基がフリーであるか、またはＯ−アセチル化された、Ｏ−メチル化された、アミノ、モノおよびジ−アルキルアミノ置換されたまたはアシルアミノ置換されたグルクロン酸部分を意味する。
【００４８】
用語「グリコシル」は、そのヒドロキシル基がフリーであるか、またはＯ−アセチル化された、Ｏ−メチル化された、アミノ、モノおよびジ−アルキルアミノ置換されたまたはアシルアミノ置換された単糖、二糖、多糖、オリゴ糖、アミノ糖またはデオキシ糖を意味する。本開示の一実施形態は、グリコシル基が酵素加水分解により切断され得る化合物を提供する。
【００４９】
用語「糖」は、実験的一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎを有する１つ以上の単位から構成される炭水化物または糖であると定義される。糖はさらに、単位の数、または１つ以上の酸素原子が窒素原子により置換される場合はアミノ糖の数によって、単糖、二糖または多糖類に分類される。糖はまた、１つ以上のヒドロキシ基が水素原子により置換される場合、デオキシ糖として分類され得る。適切な糖類には、アドニトール、アラビノース、アラビトール、アスコルビン酸、キチン、Ｄ−セルビオース、２−デオキシ−Ｄ−リボース、アピオフラノース、ズルシトール、（Ｓ）−（＋）−エリスルロース、フルクトース、フコース、ガラクトース、グルコース、イノシトール、ラクトース、ラクツロース、リキソース、マルチトール、マルトース、マルトトリオース、マンニトール、マンノース、メレジトース、メリビオース、微結晶性セルロース、パラチノース、ペンタエリスリトール、ラフィノース、ラムノース、リボース、ソルビトール、ソルボース、デンプン、スクロース、トレハロース、キシリトール、キシロースおよびそれらの水和物が挙げられる。適切な糖類にはまた、ＤおよびＬ鏡像異性体、ならびに上記に列挙した化合物のαおよびβアノマーが挙げられる。好ましい炭水化物は、単純糖（例えば、単糖および二糖）である。糖置換基は、例えば、アルキル、アルコキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、エーテル、エステル、アセタール、カーボネートまたはカーバメートにより、任意の第１または第２のヒドロキシ基上でさらに置換され得る。
【００５０】
用語「単糖」は、単一の炭水化物または糖単位であると定義される。単糖の２つのファミリーは、アルドースまたはケトースである。アルドースは、単糖を直線的な開鎖式で記載した場合、カルボニル基をアルデヒドとして炭素鎖の末端に有する。カルボニルが炭素鎖の任意の他の位置にある場合、単糖はケトンであり、ケトースと呼ばれる。３つの炭素単糖は、グリセルアルデヒド、アルドース、およびケトースであるジヒドロキシアセトンのトリオースである。ジヒドロキシアセトン以外の単糖は、１つ以上の不斉中心を有する。接頭辞Ｄ−またはＬ−は、カルボニル炭素から最も遠いキラルな炭素の炭素原子の立体配置を意味する。それらの骨格に４、５、６および７個の炭素原子を有する単糖を、それぞれ、テトロース、ペントース、ヘキソースおよびヘプトースと呼ぶ。これらのそれぞれは、２つの系列で存在する：アルドテトロースおよびケトテトロース、アルドペントースおよびケトペントース、アルドヘキソースおよびケトヘキソース、アルドヘプトースおよびケトヘプトース。テトロースには、エリトロースおよびトレオースが挙げられる。ペントースには、リボース、アラビノース、キシロースおよびリキソースが挙げられる。ヘキソースには、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトースおよびタロースが挙げられる。骨格に５以上の炭素を有する単糖は、通常、環状、またはカルボニル炭素が鎖の周囲のヒドロキシ基の１つと共有結合を形成した環構造として生成する。６員の単糖環化合物はピラノースと呼ばれ、５員の単糖環化合物はフラノースと呼ばれる。六員環の形成は、不斉炭素原子を含むヘミアセタールを形成するためのアルデヒドおよびアルコールの反応から生じる。Ｃ−１炭素の周囲の一方の立体配置は、αと記載され、他方はβ型と記載される。
【００５１】
用語「二糖」は、互いに共有結合で結合した２つの単糖を含む分子の部分を意味する。二糖類には、マルトース［グルコース−グルコース］、ラクトース［ガラクトース−グルコース］およびスクロース［フルクトース−グルコース］が挙げられる。
【００５２】
用語「多糖類」は、互いに共有結合した複数の単糖単位を含む。多糖類には、デンプン、ヒアルロン酸、アミロース、アミロペクチン、デキストラン、シクロデキストリンおよびグリコーゲンが挙げられる。
【００５３】
用語「アミノ単糖」は、１つ以上のヒドロキシ基がアミノ基で置換された炭水化物分子を意味する。これは、単糖グルコサミンおよびムラミン酸および多糖類キチンを含む。アミノ基は、アセチル化されてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−ムラミン酸を含んでもよい。
【００５４】
用語「デオキシ糖」は、１つ以上のヒドロキシ基が水素で置換された炭水化物分子を意味する。これらには、例えば、Ｌ−ラムノース（６−デオキシ−Ｌ−マンノース）、Ｌ−フコース（６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース）およびＤ−フコース（ロデオース）が挙げられる。
【００５５】
句「置換されていてもよい」は、句「置換または非置換型の」と互換的に用いられる。別段示さない限り、置換されていてもよい基は、基のそれぞれの置換可能な位置に置換基を有していてもよく、各置換は、いかなる他の置換からも独立している。また、置換基または変数の組み合わせは、そのような組み合わせが安定な化合物を生じる場合のみ許容され得る。さらに、別段示さない限り、官能基ラジカルは独立に選択される。「置換されていてもよい」が、カンマで区切られた一連の群を修飾する場合（例、「置換されていてもよいＡ、ＢまたはＣ」、または「で置換されていてもよいＡ、ＢまたはＣ」）、群のそれぞれ（例えば、Ａ、ＢおよびＣ）が置換されていてもよいことを意図する。
【００５６】
用語「医薬上許容され得る塩」には、当業者に周知の塩、例えば、本発明の化合物の単塩（例えば、アルカリ金属およびアンモニウム塩）ならびにポリ塩（例えば、二塩または三塩）が挙げられるが、これらに限定されない。式ＩまたはＩＩの化合物の医薬上許容され得る塩は、例えば、−ＯＨまたは−ＮＨ−中の水素などの交換可能な基が、医薬上許容され得るカチオン（例えば、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオン）で置換される場合、例えば、適切な塩基との反応により、式Ｉの対応する化合物から簡便に調製され得る。化合物が安定な無毒の塩基性または酸性の塩を形成するのに十分に塩基性または酸性である場合、化合物の塩としての投与が適切であり得る。医薬上許容され得る塩の例は、生理学的に許容され得るアニオンを形成する酸と共に形成された有機酸付加塩、例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩およびａ−グリセロリン酸塩である。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸水素塩および炭酸塩などの適切な無機塩もまた形成され得る。医薬上許容され得る塩は、当技術分野で周知の標準的な手順を用いて、例えば、アミンなどの十分に塩基性の化合物を、生理学的に許容され得るアニオンを提供する適切な酸と反応させることにより、得られ得る。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムまたはリチウム）またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩もまた作製され得る。
【００５７】
用語「単離および精製する」は、式ＩまたはＩＩの化合物を意味し、これらの化合物は、植物種などの天然の供給源からの抽出による単離、または化学合成のいずれか、またはそれらの組み合わせ、および次いでクロマトグラフィ、結晶化、蒸留または化学分野の当業者が慣用する他の手段による精製により得られ、その結果、単離および精製された化合物が、逆相ＨＰＬＣなどの適切な分析クロマトグラフィ技術により測定される少なくとも約９０％の純度、および好ましくは少なくとも約９５％の純度を有する。
【００５８】
一実施形態では、本開示は、不斉炭素がＳ立体配置であり、Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２、Ｒ３がＨである式（ＩＩ）の化合物を含む組成物を提供し、当該組成物は、ナリゲニン（４’，５，７−トリヒドロキシフラバノン、（Ｓ）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）を含む。別の実施形態では、不斉炭素がＳ立体配置であり、Ｒ１、Ｒ３がＨであり、かつＲ２がグリコシドである。特定の態様では、組成物はリキリチンを含む。さらなる特定の実施形態では、組成物は、リキリチゲニン−グリコシド−アピオフラノシドを含み、ここで、不斉炭素がＳ立体配置であり、Ｒ１、Ｒ３がＨであり、かつＲ２がグリコシド−アピオフラノシドである。好ましい実施形態では、不斉炭素原子がＳ立体配置を有し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４がＨであり、かつ、組成物がリキリチゲニン（Ｉ）を含む。
【００５９】
一実施形態では、リキリチゲニンの誘導体およびプロドラッグは、当業者に慣用される技術により調製される。リキリチゲニン（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の以上のフェノール性ヒドロキシ基を誘導体化するための合成手順は、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，２ｎｄ  Ｅｄ．１９９１，Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１４３−１７０に記載されている。ベンゾエートフェノール性誘導体は、例えば、Ｌｕら、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１５：２６０７−２６０９（２００５）の技術により調製され得る。ホスフェートおよびホスフェートエステルプロドラッグは、例えば、Ｓｉｍｏｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９：３１４３−３１５２（２００６）またはＰｅｔｔｉｔおよびＬｉｐｐｅｒｔ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１５：２０３−２１６（２０００）に記載の技術により調製され得る。モノ−およびジ−ホスホリル化フェノール性誘導体およびホスフェートエステルは、例えば、Ｃａｓａｇｒａｎｄｅら、米国特許第５，０７３，５４７号に記載の技術により調製され得る。フェノール性グリコシドの合成は、例えば、Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５（８）：２１２３−２１２８（１９９１）またはＳａｔｏら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、３４１（８）：９６４−９７０（２００６）の技術により行われ得る。フェノール性グルクロニドは、例えば、Ｒｏｆｆｌｅｒらの米国特許第６，０４３，３６７号の技術により調製され得る。カーバメートフェノール性誘導体は、例えば、Ｉｇａｒａｈｉら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，５５（２）：３２８−３３３（２００７）の技術により調製され得る。
【００６０】
一実施形態では、本開示は、リキリチゲニン、誘導体またはプロドラッグを含む組成物を提供する。本開示の組成物は、Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞アッセイにおいて、エストロゲン応答因子（ＥＲＥ）をエストロゲン受容体β（ＥＲβ）で活性化するが、エストロゲン受容体α（ＥＲα）では活性化しない。組成物がＥＲＥをＥＲβとの相互作用により活性化するがＥＲαではしないので、その後者のみがエストロゲンＨＴの有害な作用に関連し、かつ、本明細書中に開示された本発明の組成物および方法は、閉経期症状の治療用のエストロゲンホルモン療法の代替物を提供し、乳癌のリスクの増加などのエストロゲン補充に関連するとしてＷＨＩに同定された症状を引き起こす可能性がより低い。
【００６１】
一実施形態では、リキリチゲニンは、形質移入アッセイにおいてＥＲβ特異的経路のみを誘発する。特定の態様では、リキリチゲニンは、ＥＲＥ−ｔｋ−ルシフェラーゼ、およびＥＲβで細胞形質移入したがＥＲαではしていない３つの未変性のＥＲ調節因子（ＮＫＧ２Ｅ、ＣＥＣＲ６およびＮＫＤ）を活性化する。この態様において、ＥＲβ選択性は、未変性のＮＫＧ２Ｅ、ＣＥＣＲ６およびＮＫＤ遺伝子の活性化がＵ２ＯＳ−ＥＲα細胞において起こらなかったという知見により実証されるように、これらの遺伝子でも観察される。別の態様では、ＥＲβ選択性のメカニズムは、ＥＲαおよびＥＲβへの結合の差異に関連する可能性が低いが、これは、ＥＲβはＥＲαと比較して２０倍高いリキリチゲニンへの親和性を有するにすぎないからである。別の態様では、ＣｈＩＰの研究は、リキリチゲニンが、Ｕ２ＯＳ−ＥＲβ細胞のみにおいてＳＲＣ−２をＮＫＧ２Ｅ、ＣＥＣＲ６およびＮＫＤ遺伝子に補充し、Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞では補充しないことを示した。理論に束縛されないが、これらの知見は、リキリチゲニンの選択性が、ＥＲβに対する活性化補助因子の特異的な補充によることを示唆する。
【００６２】
ＨＴについての主要な問題は、有効性に欠けることではなく、むしろ、その乳癌細胞に対する増殖効果である。したがって、ＨＴのいかなる代替薬物についても増殖性作用を除外することが必須である。本開示の一実施形態では、リキリチゲニンは乳癌腫瘍形成を刺激しない。一態様では、マウス異種移植モデルにおいて、リキリチゲニンは、大きな腫瘍の形成を引き起こすＥ２の治療的投与と比較して、治療３０日後の乳癌腫瘍形成を刺激しない。関連する態様では、Ｅ２とは異なり、リキリチゲニンは子宮のサイズを増大しない。別の態様では、リキリチゲニンは動物においてＥＲβ選択性であるが、これは、ＥＲノックアウトマウスで実証されたように、乳房および子宮細胞への増殖効果がＥＲαにより媒介されるからである（Ｈｅｗｉｔｔら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６７：２８５−３０８（２００５））。リキリチゲニンによる乳房および子宮細胞の刺激がないことは、合成ＥＲβ−選択薬であるＥＲβ−０４１もまたラットにおいて乳房組織および子宮組織へのいかなる増殖効果も誘発しない（Ｈａｒｒｉｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４４：４２４１−４２４９（２００３））という知見と一致する。リキリチゲニン、ＭＦ１０１およびＥＲβ−０４１についてのデータ、ならびにＥＲβが乳癌細胞において腫瘍抑制因子として作用するという知見（Ｐａｒｕｔｈｉｙｉｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：４２３−４２８（２００４）、２１．Ｓｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１５６６−１５７１（２００４））は、ＥＲβ選択的アゴニストが、おそらく、ＥＲαおよびＥＲβの両方を活性化する、現在ＨＴにおいて用いられているエストロゲンよりも安全な特性を有するであろうことを示す。
【００６３】
植物は多くのエストロゲン様物質を含むことが知られているが（Ｏｅｒｔｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８８：４０７７−４０７９（２００３））、それらのＥＲサブタイプへの選択性は大部分が依然として研究されていない。イソフラボンゲニステインは、ＥＲαよりもＥＲβにより良く結合し（Ｋｕｉｐｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９：４２５２−４２６３（１９９８））、かつ、遺伝子導入実験においてＥＲβ選択性を示す（Ａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７８０８−１７８１４（２００１））。
【００６４】
本開示の一態様では、リキリチゲニンはゲニステインよりもＥＲβ選択性である。１μＭのゲニステインは、ＥＲＥ−ｔｋＬｕｃの大きな活性化を生じ（Ａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７８０８−１７８１４（２００１））、かつ、Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞において多数の遺伝子を活性化した。対照的に、本開示の別の態様では、リキリチゲニンは、同じ１μＭの濃度で、複数のＥＲ調節因子または内在性遺伝子を活性化しない。関連化合物である、トリヒドロキシカルコンであるイソリキリチゲニンは、ＭＣＦ−７細胞においてＥＲαを活性化することが示された（Ｍａｇｇｉｏｌｉｎｉら、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ８２：３１５−３２２（２００２））。イソリキリチゲニンは、ＥＲαおよびＥＲβ転写性経路の両方を活性化する非選択的アゴニストである。リキリチゲニン、ゲニステイン、およびリキリチゲニンにより高いＥＲβ選択性をもたらすイソリキリチゲニンの構造的差異は、現在研究されている。
【００６５】
粗製植物学的混合物ＭＦ１０１は、活性化補助因子の補充を引き起こすＥＲβ受容体において機能的な立体構造の変化を誘発することによる選択的ＥＲβ−アゴニストである（Ｃｖｏｒｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４８：５３８−５４７（２００７））。本開示の一実施形態では、リキリチゲニンを、ＥＲβに高度に選択的なＭＦ１０１における植物の１つに由来する主要な活性化合物として同定する。ＭＦ１０１でのヒト薬物動態研究はまた、リキリチゲニンが血漿中で見出される最も活性なＥＲβ選択的化合物の１つであることを示す。従って、本開示の特定の実施形態では、リキリチゲニンはＥＲβを選択的に活性化する実施可能な薬物候補である。
【００６６】
一態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体をＥＲβ選択的アゴニストとして含む組成物を投与することを含む、閉経期症状の治療方法を提供する。特定の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体をＥＲβ選択的アゴニストとして含む組成物を投与することを含む、のぼせ症の治療方法を提供する。別の特定の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体を含む組成物を投与することを含む、骨粗鬆症を治療する方法を提供する。
【００６７】
別の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体をＥＲβ選択的アゴニストとして含む組成物を投与することを含む、エストロゲン依存性癌を治療する方法を提供する。一態様では、エストロゲン依存性癌は、乳癌であり、別の態様では、エストロゲン依存性癌は、子宮内膜癌である。さらに別の態様では、エストロゲン依存性癌は、卵細胞癌である。さらに別の態様では、エストロゲン依存性癌は、例えば子宮腺癌などの子宮癌である。
【００６８】
別の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体をＥＲβ選択的アゴニストとして含む組成物を投与することを含む、例えば、良性乳房過形成、非定型乳房過形成および線維嚢胞性乳房障害などの乳房の障害の治療方法を提供する。
【００６９】
さらなる態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体をＥＲβ選択的アゴニストとして含む組成物を投与することを含む、前立腺癌および良性前立腺肥大などの前立腺の障害の治療方法を提供する。
【００７０】
別の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体を含む組成物を投与することを含む、クローン病および大腸炎などの炎症性障害の治療方法を提供する。
【００７１】
別の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体を含む組成物を投与することを含む、関節リウマチ、紅斑性狼瘡およびシェーグレン症候群などの自己免疫障害の治療方法を提供する。
【００７２】
別の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体を含む組成物を投与することを含む、結腸癌、腸癌および腺癌などの腸の障害の治療方法を提供する。
【００７３】
別の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体を含む組成物を投与することを含む、粥状動脈硬化、末梢血管病、冠動脈狭窄および冠動脈再狭窄などの動脈の障害の治療方法を提供する。
【００７４】
別の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体を含む組成物を投与することを含む、結腸癌、腸癌および腺癌などの腸の障害の治療方法を提供する。
【００７５】
別の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体を含む組成物を投与することを含む、例えば、子宮腺癌、子宮筋腫、子宮内膜症および月経困難症などの子宮の障害の治療方法を提供する。
【００７６】
別の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体を含む組成物を投与することを含む、例えば、関節炎、骨関節炎および月経困難症に由来する疼痛の治療方法を提供する。
【００７７】
別の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体を含む組成物を投与することを含む、排尿障害、尿失禁および頻尿などの尿路の障害の治療方法を提供する。
【００７８】
別の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体を含む組成物を投与することを含む、例えば、老人性認知症、アルツハイマー病、閉経期の鬱、不眠、閉経期のほてり症および性欲減退などの神経系の障害の治療方法を提供する。
【００７９】
別の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体を含む組成物を投与することを含む、例えば、腟乾燥、性交疼痛症ならびに外陰部および腟の萎縮症などの外陰部または腟の障害の治療方法を提供する。
【００８０】
別の態様では、本開示は、リキリチゲニンまたはリキリチゲニン誘導体を含む組成物を投与することを含む、例えば、多嚢胞性卵巣および無排卵などの卵巣の障害の治療方法を提供する。
【００８１】
本開示はさらに、開示された組成物を用いるインビボエストロゲン方法を提供する。通常、インビボ方法は、対象においてエストロゲン様作用をもたらすのに十分な量のリキリチゲニン、誘導体またはアナログを対象に投与することを含む。インビボ方法は、エストロゲンのＥＲＥ制御遺伝子の活性化を生じるであろう。従って、インビボ方法は、インビボで種々の陽性表現型を生じるであろう。
【００８２】
対象は、マウス、ラット、ウサギ、サル、チンパンジー、イヌ、ネコまたはヒツジなどの哺乳類であり得、通常は雌性である。対象はまた、ヒト、特にヒト女性であり得る。いくつかの実施形態では、対象は閉経期または卵巣切除後の雌性であり、エストロゲン治療を必要とする。このような場合には、対象は、のぼせ症、不眠、腟乾燥、性欲減退、尿失禁および抑鬱などの更年期症状に罹患し得る。他のこのような場合には、対象は骨粗鬆症に罹患し易いかまたは罹患し得る。適切なインビボ方法には、エストロゲン補充療法に応答性の医学的徴候の治療および／または予防が挙げられる。
【００８３】
疾患、障害、症候群、症状または症候の治療（およびその文法上の変化形、例えば、治療する、治療するための、治療、治療したなど）には、臨床医が当該治療を受けるべき対象を同定する工程、および本発明の組成物を対象に投与する工程が含まれる。従って、治療は、本発明のエストロゲン植物抽出物を対象に投与することにより寛解、緩和、改善、除去、治癒されそうな疾患、症候群、症状または症候を診断することを含む。治療はまた、疾患、障害、症候群、症状または症候を同時に寛解、緩和、改善、除去または治癒することを含む。いくつかの実施形態では、治療は、疾患、障害、症候群、症状または症候の開始を予防または遅延すること（すなわち、予防法）、疾患、障害、症候群、症状または症候の進行を予防または遅延すること、および／または疾患、障害、症候群、症状または症候の重症度を減少させることを含む。特に、新生物の増殖の場合には、治療は、新生物の増殖の寛解、および逆転、停止または遅延を含む。これに関し、治療はまた、完全なおよび部分的な寛解などの寛解を含む。更年期症状の場合には、治療は、種々の症候の予防および寛解を含む。
【００８４】
疾患、障害、症候群、症状または症候の予防（およびその文法上の変化形）は、当該疾患、障害、症候群、症状または症候を発症するリスクのある対象を同定すること、および当該対象に、当該疾患、障害、症候群、症状または症候の発症を除去または遅延するのに十分であると思われる量の本発明の植物抽出物を投与することを含む。いくつかの場合には、予防は、臨床医が医療の的確な標準を適用してホルモン補充療法を必要とすると判断する閉経後の女性を同定すること、および当該女性に、リキリチゲニンまたは誘導体または類似体を含む組成物を投与することを含み、これにより、１つ以上の更年期症状が阻害または遅延される。いくつかの実施形態では、骨粗鬆症の予防は、臨床医が医療の的確な標準を適用して骨粗鬆症の発症のリスクがあると判断する閉経後の女性を同定すること、および当該女性に本発明の組成物を投与することを含み、これにより、骨量減少の開始が阻害または遅延される。
【００８５】
寛解は、疾患、障害、症候群、症状または症候の重症度、数および／または発症の頻度を減少させることを含む。更年期症状の寛解は、のぼせ症、不眠、失調症、抑鬱などの頻度および／または重症度を減少させることを含む。
【００８６】
骨粗鬆症の治療は、閉経後女性などの骨量減少のリスクがある人を同定すること、および当該女性に本発明の組成物を投与することを含み、これにより、骨量減少は、重症度が減少されるか、開始が遅延されるか、または予防される。いくつかの実施形態では、骨粗鬆症の治療はまた、骨量の追加も含み得る。
【００８７】
本開示はさらに、リキリチゲニンを植物からの抽出単離により、または合成手段により得る方法を提供する。本開示は、特に、リキリチゲニンをウラルカンゾウから抽出する方法を提供する。当該方法は、ウラルカンゾウ種の植物から一定量の植物物質を得ることを含み、必要に応じて、植物物質を粉砕すること、植物物質を抽出ビヒクルに接触させること、および植物物質を抽出ビヒクルから分離することを含む。
【００８８】
閉経期症状または癌（例えば、乳癌）の急性または慢性の管理における、リキリチゲニン誘導体またはその類似体、誘導体またはプロドラッグまたはその組み合わせの予防または治療用量の規模は、閉経期症状の重症度または癌のステージ（例えば、治療すべき固形腫瘍）、用いる化学療法剤または他の抗癌治療および投与の経路によって異なる。用量、およびおそらく用量頻度もまた、個々の患者の年齢、体重および応答によって異なる。通常、本明細書に記載の症状についてのリキリチゲニン誘導体およびその類似体の全１日用量の範囲は、単回または分割用量で、約０．５ｍｇ〜約２５００ｍｇである。好ましくは、１日用量の範囲は、単回または分割用量で、１日あたり約０．５ｍｇ〜約２００ｍｇ、最も好ましくは１日あたり約５〜約５０ｍｇであるべきである。患者の管理において、治療は、より低い用量で開始し、患者の全身応答に応じて増加させるべきである。６５歳を超える患者、および腎臓または肝臓の機能不全を有する患者では、最初はより低い用量を投与し、かつ、用量を全身応答および血中濃度に基づいて漸増させることがさらに推奨される。いくつかの場合には、これらの範囲外の薬物用量を用いることが必要であり得る。さらに、臨床医または治療にあたる内科医は、個々の患者の応答に合わせて、治療をどのようにおよびいつ中断、調整または終結するかを理解するであろうことが留意される。用語「有効量」または「有効感作量」は、上記薬物用量および用量頻度スケジュールに包含される。
【００８９】
任意の適切な投与経路が、有効用量のリキリチゲニンまたは誘導体またはプロドラッグを患者に提供するのに用いられ得る（例えば、経口、舌下、経直腸、静脈内、硬膜外、くも膜下腔内、皮下、経皮、筋肉内、腹腔内、皮内、吸入、経皮、経鼻スプレー、経鼻ゲルまたは点鼻薬など）。治療に用いるに際して、リキリチゲニン誘導体またはその類似体は、純粋な化学物質として、例えば、吸入器により微細な粉末を吸入することによって投与され得るが、活性成分は、医薬製剤として存在することが好ましい。従って、本発明は、さらに、リキリチゲニン、その誘導体または類似体を、１つ以上のその医薬上許容され得る担体と共に、必要に応じて他の治療上および／または予防上の成分を含む医薬製剤を提供する。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、かつヒト患者または家畜などのそのレシピエントに有害でないという意味で、「許容され得る」べきである。
【００９０】
医薬製剤には、経口または非経口（筋肉内、皮下および静脈内など）投与に適したものが挙げられる。非経口投与に適した形状はまた、吸入または吹送法による投与に、または経鼻または局所的（経頬、経直腸、経腟および舌下など）投与に適した形状も含む。製剤は、必要に応じて、別々の単位投与形態で簡便に存在し得、かつ、薬学の分野で周知の方法のいずれかで調製され得る。このような方法は、活性化合物を、液体担体、固体マトリックス、半流動性担体、微細に分割した固体担体またはその組み合わせと会合させる工程、および、次いで、必要に応じて、生成物を所望の送達系に成形する工程を含む。
【００９１】
経口投与に適した医薬製剤は、それぞれ所定量の活性成分を、粉末または顆粒として、溶液、懸濁液または乳濁液として、またはチューインガムから薬物を摂取するための合成樹脂またはチクルなどのチュアブル基剤中に含む、硬質または軟質ゼラチンカプセル、カシェ剤または錠剤などの、別々の単位投与形態として存在し得る。活性成分はまた、ボーラス、舐剤またはペーストなどとしても存在し得る。経口投与用の錠剤およびカプセルは、結合剤、賦形剤、潤滑剤、崩壊剤または湿潤剤などの通常の賦形剤を含み得る。錠剤は、当技術分野で周知の方法に従って、すなわち、腸溶コーティングを用いてコーティングされ得る。
【００９２】
経口液体製剤は、例えば、水性または油性の懸濁液、溶液、乳濁液、シロップまたはエリキシル剤の形態であり得るか、または使用前に水または他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として存在し得る。このような液体製剤は、懸濁剤、乳化剤、非水系ビヒクル（これは食用油を含み得る）または保存料などの通常の添加剤を含み得る。
【００９３】
本発明の化合物はまた、非経口投与（例えば、ボーラス注射または持続点滴などの注射による）用に処方され得、かつ、保存料を加えたアンプル、予備充填シリンジ、少量注入容器または複数回投与容器などの単位投与形態で存在し得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液などの形態をとり得、かつ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤用剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前は、例えば、無菌の、発熱物質を含まない水などの適切なビヒクルで構成するための、無菌の固体の無菌的単離によってまたは溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形態であり得る。
【００９４】
表皮への局所投与のため、化合物は、軟膏、クリームまたはローションとして、または経皮性パッチの活性成分として製剤化され得る。適切な経皮送達系は、例えば、Ａ．Ｆｉｓｃｈｅｒら（米国特許第４，７８８，６０３号）またはＲ．Ｂａｗａら（米国特許第４，９３１，２７９号、米国特許第４，６６８，５０６号および米国特許第４，７１３，２２４号）に開示されている。軟膏およびクリームは、例えば、適した濃厚化および／またはゲル化剤を添加することにより、水性または油性の基剤を用いて製剤化され得る。ローションは、水性または油性の基剤を用いて製剤化され得、通常はまた、乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、濃厚化剤または着色料の１つ以上を含むであろう。
【００９５】
口腔への局所投与に適した製剤には、風味付けした基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性成分を含むロゼンジなどの単位投与形態、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中に活性成分を含むトローチ、粘膜接着性ゲル、ならびに適切な液体担体中に活性成分を含む口腔洗浄剤が挙げられる。
【００９６】
所望であれば、上記処方物は、例えば、天然のゲル、合成ポリマーゲルまたはそれらの混合物を含む特定の親水性ポリマーマトリックスとの組み合わせにより、用いられる活性成分の徐放を生じるよう適合され得る。ポリマーマトリックスは、ステント、バルブ、シャント、グラフトなどの医学的プロステーシスの上に被覆され得るか、またはそれらを形成するのに用いられ得る。
【００９７】
担体が固体である直腸投与に適した医薬製剤は、最も好ましくは、単位用量坐薬として存在する。適切な担体には、カカオバターおよび当技術分野で一般に用いられる他の物質が挙げられ、また、坐薬は、活性化合物を軟化したまたは融解した担体と混合し、次いで型中で冷却および成形することにより簡便に形成され得る。
【００９８】
経腟投与に適した製剤は、活性成分に加えて、適切であることが当技術分野で既知である担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡状物またはスプレーとして存在し得る。
【００９９】
吸入による投与のため、本発明の化合物は、吹送器、噴霧器または加圧パック、またはエアロゾル噴霧を送達するための他の適切な手段により、簡便に送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスなどの適切な推進剤を含み得る。加圧エアロゾルの場合は、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することにより測定され得る。
【０１００】
あるいは、吸入器または吹送器による投与のために、本発明の化合物は、例えば、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物などの乾燥粉末組成物の形態をとり得る。粉末組成物は、例えば、そこから吸入器または吹送器の補助により粉末が投与され得るカプセルまたはカートリッジ、または、例えば、ゼラチンまたはブリスターパック中の単位投与形態で提供され得る。
【０１０１】
鼻内投与のために、本発明の化合物は、プラスチックボトル噴霧器によるなどの液体噴霧により投与され得る。これらの代表的なものは、Ｍｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）（Ｗｉｎｔｒｏｐ）およびＭｅｄｉｈａｌｅｒ（登録商標）（Ｒｉｋｅｒ）である。
【０１０２】
眼への局所投与のために、化合物は、点眼薬、ゲル（米国特許第４，２５５，４１５号）、ガム（米国特許第４，１３６，１７７号）として、または持続放出性眼内インサートにより、投与され得る。
【０１０３】
本発明を、以下の非限定的な実施例を参照しながら、より詳細に説明する。
【実施例】
【０１０４】
［実施例１］ウラルカンゾウからのリキリチゲニンの単離および構造の同定
乾燥粉末ウラルカンゾウ根、根を、溶媒対質量比１０：１で、９：１の水−メタノールで抽出した（１８時間、常時混合）。吸引濾過（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１フィルタ）の後に濾液を回収し、回転式蒸発により濃縮してメタノールを除去し、等容積の酢酸エチルで分液した（１回繰り返した）。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で回転式蒸発により濃縮して乾燥させ、少容量の酢酸エチルに再懸濁した。試料をシリカゲル（２００〜４０メッシュ、６Å）を充填したフリットガラスカラム上に装填し、１００％ヘキサンから開始し、ヘキサン／酢酸エチル勾配を用いて溶出した。リキリチゲニンを、ヘキサン中６０〜８０％酢酸エチルを用いてシリカカラムから溶出した。シリカカラムから回収したリキリチゲニン画分を、ＵＶ検出（λ＝２５４ｎｍ）で、Ｃ８カラム（ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ，１９×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上での分取逆相ＨＰＬＣ（Ｄｅｌｔａ  ６００  ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）によりさらに精製した。１２ｍＬ／分の流速で１５分にわたる水中の３５〜４０％アセトニトリルからの勾配溶出を利用して、リキリチゲニンを高純度（９５％超）で単離した。質量分析解析を、ＨＰ  １１００  ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）上で行い、ｍ／ｚ２５５［Ｍ−Ｈ］−の予測された分子イオンを得た。１Ｈおよび１３Ｃスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  ５００ＭＨｚ核磁気共鳴分光装置（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｆａｌｌａｎｄｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で記録した。ＮＭＲスペクトルをメタノール−ｄ４中で得たが、これらはカンゾウ種から単離されたリキリチゲニンについて公開されたデータ（Ｆｕら、Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ５３：７４０８−７４１４（２００５））と一致した。
【０１０５】
［実施例２］ラセミ体リキリチゲニンの合成および特徴付け
ラセミ体リキリチゲニンの合成のための一つの合成スキームを、図１に示す。合成段階および中間体の特徴付けは、以下の実施例２ａ〜２ｃに説明する。
【０１０６】
［実施例２ａ］２’−ヒドロキシ−４，４ｔ−ジメトキシカロン（３）：
２−ヒドロキシ−４−メトキシアセトフェノン（１）（５．２４ｇ、３１．５ｍｍｏｌ）および４−メトキシベンズアルデヒド（２）（３．８５ｍＬ、３１．７ｍｍｏｌ）の無水エタノール（１００ｍＬ）中の攪拌溶液に、８０ｍＬの５０％水性ＫＯＨを添加した。得られた混合物を、室温で４８時間攪拌した。反応混合物を、０℃で、１０％水性ＨＣｌで酸性化し、次いで、Ｅｔ２Ｏ（３×１５０ｍＬ）で抽出した。合わせたエーテル性抽出物をブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。得られた橙黄色固体残渣を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィ（ヘキサン−ＥｔＯＡｃ、８：２で溶出）で精製して、３の橙黄色固体５．９１ｇ（２０．８ｍｍｏｌ）（６６％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．８６（６Ｈ，ｓ）、６．５０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ）、６．９５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ）、７．６２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、７．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、７．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ）、１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ５５．６７、５５．８１、１０１．２７、１０７．８５、１１４．３７、１１４．６９、１１８．０４、１２７．７５、１３０．５９、１３１．３４、１４４．５０、１６６．２６、１６６．８６、１９２．１０。
【０１０７】
［実施例２ｂ］２，４，４’−トリヒドロキシカルコン（イソリキリチゲニン）（４）：
（３）（８４ｇ、２９．５ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）中の良く攪拌した溶液に、−７８℃で、ＢＢｒ３（６．７ｍＬ、２．５当量）を滴下した。混合物を−７８℃で１時間攪拌し、次いで、緩徐に室温に戻し、さらに２４時間攪拌した。反応を、Ｈ２Ｏ（１５ｍＬ）を添加することにより停止した。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃおよび５％メタノールで抽出した。合わせた有機層をＨ２Ｏおよびブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。得られた残渣を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（８：２）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィにより精製して、４（６．５８ｇ、２５．７ｍｍｏｌ、８７％）を橙黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）：δ６．３８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、６．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ）、７．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ）、７．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）：δ１０３．１１、１０８．３０、１１３．５９、１１５．９７、１１７．１２、１２６．５０、１３０．６１、１３１．８７、１４４．６１、１５９．８３、１６４．６８、１６５．８４。
【０１０８】
［実施例２ｃ］リキリチゲニン（５）：
４（３．５ｇ、１３．６ｍｏｌ）のエタノール（６０ｍＬ）中攪拌溶液に、ＮａＯＡｃ（５．５ｇ、６７ｍｍｏｌ）および水（２００μＬ）を添加した。混合物を還流下で３６時間加熱した。混合物を外界温度まで冷却した後、Ｈ２Ｏを添加し、混合物をＥｔ２Ｏ（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、Ｈ２Ｏおよびブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で蒸発させた。残渣を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（９：１．１：１）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィにより精製して、ラセミ体５（２．４６ｇ、９．６ｍｍｏｌ、６９％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣ１３＋ＣＤ３ＯＤ）：δ２．７６〜２．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．８，２８Ｈｚ）、３．０９，３．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．２，２．８Ｈｚ）、５．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ）、６．４１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ）、６．５４〜６．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ）、６．８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．３３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）：δ４４．０１、７９．８０、１０３．１３、１１１．０３、１１３．９９、１１５．６３、１２７．９９、１２９．１３、１２９．８４、１５７．４８、１６４．１５、１６５．１９、１９２．３６。
【０１０９】
［実施例３］細胞培養、形質移入およびルシフェラーゼアッセイ
Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞およびＨｅＬａヒト子宮頚癌細胞を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏの細胞培養施設から得た。ＭＣＦ−７株化細胞は、Ｅ２が誘発するヒト乳癌細胞の増殖の研究用に良く確立されたモデルであるので、本研究のために選択した（３５）。ＷＡＲ５前立腺癌細胞は、以前に記載されたとおりに準備した（Ｒｉｃｋｅら、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１８：２１２３−２１３１（２００６））。全ての株化細胞を、以前に記載されたとおりに維持および継代した（Ａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６  １５１６１−１５１６６（１９９９））。形質移入を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ遺伝子パルサーを用いて行った。細胞を電気穿孔し、３μｇのＥＲＥまたはＣＥＣＲ６またはＮＩＣＤ、またはＮＫＧ２チミジンキナーゼ（ｔｋ）−ルシフェラーゼレポーターベクターの１つを、１μｇのＥＲαまたはＥＲβ発現ベクターの１つと共に用いて同時形質移入した。電気穿孔後、細胞を播き、Ｅ２またはリキリチゲニンで約２４時間処理した。次いで、細胞を可溶化し、ルシフェラーゼ活性を測定した（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。
【０１１０】
［実施例３ａ］
ＥＲαまたはＥＲβによりリキリチゲニンの相対的活性を評価するため、増加する濃度のリキリチゲニンでの形質移入アッセイを用いた。ＥＲＥｔｋＬｕｃを、ＥＲαまたはＥＲβの発現ベクターを用いて細胞に同時形質移入した。形質移入後、細胞を、増加する量のリキリチゲニンで１８時間処理し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図２に示す。リキリチゲニンは、ＥＲβで細胞形質移入したＵ２ＯＳではルシフェラーゼの用量応答活性化を生じたが、ＥＲαでは生じなかった（図２Ａ）。活性化はまず１ｎＭで起こり、最大の活性化が５００ｎＭで観察された。リキリチゲニンのＥＲβ選択性はまた、ＨｅＬａ細胞（図２Ｂ）および前立腺癌ＷＡＲ５株化細胞（図２Ｃ）でも観察された。従って、リキリチゲニンは、Ｕ２ＯＳ骨肉腫、ＨｅＬａ子宮頚部癌細胞株およびＷＡＲ５前立腺癌細胞株においてＥＲＥをＥＲβで選択的に活性化し、かつ、リキリチゲニンは、複数の株化細胞においてＥＲβ転写性経路を選択的に活性化する。
【０１１１】
［実施例３ｂ］
Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞を、ＴＡＴ３−ルシフェラーゼおよびアンドロゲン受容体（ＡＲ）（図３Ａ）、ＭＭＴＶ−ルシフェラーゼおよびグルココルチコイド受容体（グルココルチコイド受容体）（ＧＲ）（図３Ｂ）、ＴＡＴ３−ルシフェラーゼおよびプロゲステロン受容体Ｂ（ＰＲ）（図３Ｃ）、またはＦ２−ｔｋＬｕｃおよび甲状腺ホルモン受容体β１（ＴＲ）（図３Ｄ）を用いて形質移入した。細胞を、１ｎＭのジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、または１ｎＭのデキサメサゾン（Ｄｅｘ）、または１ｎＭのプロゲステロン（Ｐｒｏｇ）、または１０ｎＭのトリヨードサイロニン（Ｔ３）（それぞれ図３Ｄ、図Ｅ、図Ｆおよび図Ｇ）、または２．５μＭのリキリチゲニン（Ｌｉｑ）で１８時間処理した。各データ点は、３回の測定値の平均±標準誤差である。結果を図３Ａ〜図３Ｄに示す。リキリチゲニンは、形質移入アッセイにおいて、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、プロゲステロン受容体Ｂ（ＰＲ）および甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）を含む他の核内受容体を活性化しなかった。
【０１１２】
［実施例４］リアルタイムＰＣＲ
テトラサイクリン誘導性ＥＲαまたはＥＲβｃＤＮＡを発現するＵ２ＯＳ細胞を、先に記載したように調製した（Ｋｉａｎら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １５：１２６２−１２７２（２００４）。細胞を、ドキシサイクリン（１００ｎｇ／ｍｌ）で１６〜２０時間処理し、次いで、Ｅ２またはリキリチゲニンで３時間処理した。全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて単離し、逆転写（ＲＴ）反応を、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて行った。リアルタイム定量ＰＣＲを、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＳｕｐｅｒｍｉｘをｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と共に用いて行った。以下のプライマーを用いた。
ＮＫＤ      順方向５’−ＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＧＴＣ−３’
逆方向５’−ＣＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＴＡＡＧＴＡＧＴＧＧＴ−３’
ＮＫＧ２Ｅ  順方向５’−ＧＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＡＣＣＴＴＣＣＴＣＡＴ−３’
逆方向５’−ＡＡＣＡＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＡＡ−３’
ＣＥＣＲ６  順方向５’−ＡＣＡＧＴＣＧＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＣ−３’
逆方向５’−ＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＣＡ−３’
【０１１３】
［実施例４Ａ］天然のＥＲ調節因子および遺伝子のＥＲβによる転写のリキリチゲニン活性化
従来のＥＲＥに加えて、リキリチゲニンが天然のＥＲ標的遺伝子由来の因子中のＥＲβを選択的に活性化するか否かを決定することは重要である。Ｅ２により活性化されるキャットアイ症候群染色体領域候補６（ＣＥＣＲ６）、キラー細胞レクチン様受容体（ＮＫＧ２Ｅ）およびネイキッドクチクラ相同体（ｎａｋｅｄ  ｃｕｔｉｃｌｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ）（ＮＫＤ）遺伝子由来のＥＲ調節因子（Ｌｅｖｙら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ｄｏｉ：１０．１２１０／ｅｎ．２００６−１６３２（２００７））を用いた。ＣＥＣＲ６−ｔｋ−Ｌｕｃ（Ａ）、ＮＫＧ２Ｅ−ｔｋ−Ｌｕｃ（Ｂ）およびＮＫＤ−ｔｋ−Ｌｕｃ（Ｃ）を、ヒトＥＲαまたはＥＲβ用発現ベクターを用いて、Ｕ２ＯＳ細胞に形質移入した。形質移入後、細胞を増加する量のリキリチゲニンで１８時間処理し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図４に示す。リキリチゲニンは、ＥＲβではＣＥＣＲ６、ＮＫＧ２ＥおよびＮＫＤの用量依存的活性化を生じたが、ＥＲαでは生じなかった（それぞれ、図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ）。次いで、細胞を、増加する時間にわたってリキリチゲニンで処理した。ＣＥＣＲ６、ＮＫＧ２ＥおよびＮＫＤ  ｍＲＮＡのレベルを、リアルタイムＰＣＲで測定した。結果をそれぞれ図５Ａ〜図Ｃに示す。各データ点は、３回の測定の平均値±標準誤差である。リキリチゲニンは、Ｕ２ＯＳ−ＥＲβ細胞において、リアルタイムＰＣＲによりＣＥＣＲ６（図５Ａ）、ＮＫＧ２Ｅ（図５Ｂ）およびＮＫＤ（図５Ｃ）ｍＲＮＡの時間依存的増加を生じたが、Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞では生じなかった。これらの結果は、リキリチゲニンが、複数のＥＲ調節因子および天然の標的遺伝子についてのＥＲβ選択的アゴニストであることを実証する。
【０１１４】
［実施例５］ＥＲ結合アッセイ
リキリチゲニンの純粋な全長ＥＲαおよびＥＲβに対する相対的結合親和性を、ＥＲαおよびＥＲβ競合アッセイキットを製造者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に従って用いることにより測定した。増加する量の競合リガンドまたは抽出物の存在下でのＥＲαおよびＥＲβに結合したフルオロフォアタグ化エストロゲンの蛍光偏光を、フルオレセン励起（４８５ｎＭ）および放出（５３０ｎＭ）フィルタを有するＧＥＮｉｏｓ  Ｐｒｏマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて測定した（１ウェル当たり１０回の読み取り、積分時間０．０２ミリ秒、Ｇ係数＝１．１０８７）。各リキリチゲニンの投与は３回行い、相対誤差は、平均値からの３つの値の標準誤差を計算することにより決定した。
【０１１５】
エストロゲン受容体リガンドは、ＥＲαまたはＥＲβに対して異なる親和性を有することが示されている。例えば、Ｅ２は、等しい親和性でＥＲαおよびＥＲβのいずれにも結合するが、イソフラボンゲニステインなどのいくつかのフィトエストロゲンは、ＥＲαと比べて、ＥＲβに対してより高い親和性で結合する（Ｂａｒｋｈｅｍら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５４：１０５−１１２（１９９８）、Ｋｕｉｐｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９：４２５２−４２６３（１９９８））。リキリチゲニンのＥＲβ選択性の考えられる機構の１つは、それがＥＲαに対するよりもＥＲβに対してより高い親和性で結合することである。しかしながら、競合結合曲線は、ＥＲβがＥＲαに比較してわずかに約２０倍大きい親和性を有するにすぎないことを示し（図６Ａ）、これは転写制御の差を説明するのには十分でないようである。ＥＲβ−選択性についてのより説得力のある説明は、リキリチゲニンが活性化補助因子をＥＲβにのみ補充することである。この仮説を試験するため、Ｕ２ＯＳ−ＥＲαおよびＵ２ＯＳ−ＥＲβ細胞を増加する時間にわたってリキリチゲニンでインキュベートし、次いで、活性化補助因子ＳＲＣ−２に対する抗体を用いて、ＣｈＩＰを行った。ＳＲＣ−２に焦点を当てたが、これは、ＳＲＣ−２がＳＲＣ−２のみをＮＫＧ２Ｅ、ＣＥＣＲ６およびＮＫＤ遺伝子などの複数のＥＲ調節因子に補充することが以前に示されたからである（Ｌｅｖｙら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ｄｏｉ：１０。１２１０／ｅｎ．２００６−１６３２（２００７））。
【０１１６】
［実施例６］染色質免疫沈降（ＣｈＩＰ）
リキリチゲニンまたはＥ２での処理に続いて、安定に形質移入したＵ２ＯＳ−ＥＲαおよびＵ２ＯＳ−ＥＲβ細胞を１％ホルムアルデヒドで架橋し、ＣｈＩＰを上記のように行った（Ｃｖｏｒｏら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２１：５５５−５６４（２００６））。
【０１１７】
細胞を処理および架橋した後、それらを洗浄し、回収し、溶解した。免疫沈降を抗−ＳＲＣ−２（ａｂ９２６１，Ａｂｅａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）抗体を用いて４℃で一晩行った。ＤＮＡ断片を精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、ＰＣＲ増幅した。ＣｈＩＰに用いたプライマーは：
ＣＥＣＲ６  順方向５’−ＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＡＧＴＧＡＧＧＴＧＣＣ−３’
逆方向５’−ＡＧＡＡＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＡＣＡＡＴ−３’
ＮＫＤ      順方向５’−ＧＧＧＴＣＡＧＧＡＣＧＡＧＴＧＴＴＴＴＣＴＴ−３’
逆方向５’−ＡＣＣＣＣＧＧＡＣＣＡＡＡＴＴＴＣＡＧＴＴＡ−３’
ＮＫＧ２Ｅ  順方向５’−ＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＡＧＴＣＴＣＣＴＡＴ−３’
逆方向５’−ＴＴＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＴＣＡＧＧＴＴ−３’
である。
【０１１８】
非免疫アッセイに対するＰＣＲ反応は、負の対照の役割を果たす。ＣｈＩＰの結果を、図６に示す。リキリチゲニンは、Ｕ２ＯＳ−ＥＲβ細胞中のＣＥＣＲ６（図６Ｂ）、ＮＫＧ２Ｅ（図６Ｃ）およびＮＫＤ（図６Ｄ）遺伝子へのＳＲＣ−２の補充を引き起こすが、Ｕ２ＯＳ−ＥＲα細胞には引き起こさない。これらの結果は、リキリチゲニンがＥＲβ選択的アゴニストとして作用することを実証するが、なぜなら、それはＥＲβに活性化補助因子を補充するにすぎないからである。
【０１１９】
［実施例７］ヌードマウスにおける異種移植の研究
ＭＣＦ−７（２５０，０００）細胞を懸濁液中で凝集させ、次いで、上記したように、２００μＬの中和コラーゲン中に再懸濁した（Ｐａｒｍａｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３：４８８６−４８９６（２００２）。次いで、細胞を、
ｈｔｔｐ：／／ｍａｍｍａｒｙ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｍｏｕｓｅｗｏｒｋ／Ｃｕｎｈａ００１／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．に詳細に記載および図解されるように、ヌードマウスの腎臓莢膜下に移植した。１群当たり５匹のマウスを、２．５μｌ／時間で１ヶ月注入されるビヒクル、Ｅ２（０．４ｍｇ）またはリキリチゲニン（２ｍｇ）を含む浸透圧性ポンプ（Ａｌｚｅｔ,Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ,ＣＡ）を用いる持続点滴により処置した。１ヶ月の処置後、腫瘍および子宮を取り出し、分析した。これらの動物試験を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｃｏｍｍｉｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈからの承認を得て行った。結果を図７に示す。
【０１２０】
閉経期症状についてのエストロゲンに関する主な懸念は、乳癌および子宮癌のリスクの増加の原因となる乳房および子宮内膜細胞の増殖である。リキリチゲニンが乳癌細胞および子宮内膜細胞に増殖効果を有するかどうかを決定するため、ＭＣＦ−７乳癌細胞をヌードマウスの腎臓莢膜下に移植した。一定用量の薬物を送達するように設計された皮下浸透圧ポンプを用いて、マウスを、ビヒクル、Ｅ２またはリキリチゲニンで３０日間処置した。Ｅ２（図７Ｂ）で処置したマウスでは大きな腫瘍が発生したが、ビヒクル（図７Ａ）またはリキリチゲニン（図７Ｃ）で処置したマウスでは実質的に腫瘍の増殖はなかった。リキリチゲニンで処置したマウスにおける腫瘍の重量には、対照マウスと比較して差はなかった（図７Ｄ）。さらに、処置の３０日後、リキリチゲニンは子宮角の質量を増加しなかったが、Ｅ２は増加した（図７Ｅ）。マウス異種移植モデルにおいて、リキリチゲニンは乳癌細胞または子宮に増殖効果を有しない。
【０１２１】
本明細書中で言及した全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照することにより援用されることが特別にかつ個々に示されるのと同程度に、本明細書中で参照することにより援用される。
【０１２２】
本発明の好ましい実施形態を本明細書中で示しかつ説明してきたが、このような実施形態が例示のみの目的で提供されていることが当業者に明らかである。当業者は、多数の変動、変更および置換を、本発明から逸脱することなくすぐに思いつくであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の多様な代替物が、本発明の実施において用いられ得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、かつ、これらの請求の範囲およびその均等物の範囲内の方法および構造がそれらによって包含されることが意図される。
【図１】
2010530880.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2010530880000001.app
【国際調査報告】
2010530880.tif 000024