(57)【要約】  本発明は、眼の障害を処置する方法での補体成分C5阻害剤の使用および眼の障害の処置における医薬の製造での補体成分C5阻害剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号2、4および6からなる群から選択される核酸配列と少なくとも95%の核酸配列同一性を有する、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号2、4および6からなる群から選択される核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
制御配列と操作可能に結合した請求項2に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４】
請求項3に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５】
配列番号1、3および5からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する、単離ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号1、3および5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項７】
C5タンパク質を製造する方法であって、該ポリペプチドの発現のために適当な条件下で請求項4に記載の宿主細胞を培養し、細胞培養物から該ポリペプチドを回収することを含む、方法。
【請求項８】
C5タンパク質が、配列番号1、3および5からなる群から選択されるエピトープを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
配列番号1、3および5からなる群から選択されるアミノ酸の範囲内であるか、またはそれらと重複する、C5エピトープに特異的に結合する抗体の抗原結合部分を含む、単離C5結合分子。
【請求項１０】
抗原結合部分が、非ヒト霊長類のC5抗原と交差反応する、請求項9に記載のC5結合分子。
【請求項１１】
抗原結合部分が、齧歯動物のC5抗原と交差反応する、請求項9に記載のC5結合分子。
【請求項１２】
抗原結合部分が、直線状エピトープに結合する、請求項9に記載のC5結合分子。
【請求項１３】
抗原結合部分が、非直線状エピトープに結合する、請求項9に記載のC5結合分子。
【請求項１４】
抗原結合部分が、ヒトC5抗原と0.1 nM以下のKDで結合する、請求項9に記載のC5結合分子。
【請求項１５】
抗原結合部分が、非ヒト霊長類のC5抗原と0.3 nM以下のKDで結合する、請求項9に記載のC5結合分子。
【請求項１６】
抗原結合部分が、マウスC5抗原と0.5 nM以下のKDで結合する、請求項9に記載のC5結合分子。
【請求項１７】
抗原結合部分が、ヒト抗体の抗原結合部分である、請求項9から16のいずれか1項に記載のC5結合分子。
【請求項１８】
抗体が、ヒト化抗体である、請求項9に記載のC5結合分子。
【請求項１９】
抗原結合部分が、モノクローナル抗体の抗原結合部分である、請求項9から18のいずれか1項に記載のC5結合分子。
【請求項２０】
抗原結合部分が、ポリクローナル抗体の抗原結合部分である、請求項9に記載のC5結合分子。
【請求項２１】
キメラ抗体である、請求項9に記載のC5結合分子。
【請求項２２】
該抗体のFab断片、Fab'断片、F(ab')2もしくはFv断片を含む、請求項9に記載のC5結合分子。
【請求項２３】
一本鎖Fvを含む、請求項9に記載のC5結合分子。
【請求項２４】
ダイアボディを含む、請求項9に記載のC5結合分子。
【請求項２５】
抗原結合部分が、アイソタイプ: IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のうちのいずれか1種の抗体に由来する、請求項9から24のいずれか1項に記載のC5結合分子。
【請求項２６】
抗原結合部分が、アイソタイプ: IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のうちのいずれか1種の抗体に由来し、Fc配列が、エフェクター機能を調節するか、もしくはFc受容体への結合を変えるために、通常の配列と比較して改変された、請求項9から25のいずれか1項に記載のC5結合分子。
【請求項２７】
細胞でのMAC産生を阻害する、請求項9から26のいずれか1項に記載のC5結合分子。
【請求項２８】
転換酵素へのC5結合を阻害する、請求項9から27のいずれか1項に記載のC5結合分子。
【請求項２９】
細胞をC5結合分子と接触させることを含む、細胞でのMAC合成を阻害する方法。
【請求項３０】
対象でのMAC活性を調節する方法であって、該対象に補体系により仲介される細胞活性を調節するC5結合分子を投与することを含む、方法。
【請求項３１】
対象での眼の障害を処置または予防する方法であって、該対象に有効量の配列番号1、3および5からなる群から選択されるエピトープに特異的に結合する結合分子を投与することを含む、方法。
【請求項３２】
対象でのMACレベルを、結合分子を投与する前の対象でのMACレベルと比較して、少なくとも5%まで減少させる、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
結合分子を硝子体内投与する、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
眼の障害が、黄斑変性症、糖尿病性眼の疾患および障害、眼の浮腫、虚血性網膜症、前部虚血性視神経症、視神経炎、類嚢胞黄斑部浮腫、網膜疾患および障害、病的近視、未熟児網膜症、血管新生、拒絶反応、もしくは他の炎症した角膜、乾性角結膜炎、ドライアイ、ブドウ膜炎、強膜炎、上強膜炎、結膜炎、角膜炎、眼窩蜂巣炎、眼の筋炎、甲状腺眼窩疾患、涙腺もしくは眼瞼の炎症からなる群から選択される、請求項31に記載の方法。
【請求項３５】
結合分子が、モノクローナル抗体である、請求項31に記載の方法。
【請求項３６】
AMDを患うことが疑われる対象の存在もしくはその傾向を決定する方法であって、該対象から得られたサンプル中のC5タンパク質の量を測定し、その量をコントロールサンプルと比較することを含む、方法。
【請求項３７】
眼の疾患もしくは障害の処置またはそれらの進行の遅延のための医薬の製造における、副補体経路を阻害することができるタンパク質の使用であって、該タンパク質が、C5タンパク質活性を阻害することができるか、またはC5bのC6への結合を阻害することができる、使用。
【請求項３８】
副補体経路を阻害することができるタンパク質が、C5上のα鎖もしくはβ鎖に結合する抗体または抗体断片である、請求項37に記載の使用。
【請求項３９】
C5に結合する抗体または抗体断片が、C5活性を阻害することができる、請求項37に記載の使用。
【請求項４０】
C5に結合する抗体または抗体断片が、配列番号1、3および5からなる群から選択されるエピトープを含む、請求項37に記載の使用。
【請求項４１】
C5タンパク質の存在を検出するためのキットであって、請求項9に記載の抗体および該抗体に結合した該タンパク質を検出するための指示書の入った容器を含む、キット。
【請求項４２】
抗体がさらに、検出可能な標識を含む、請求項41に記載のキット。
【請求項４３】
眼の疾患もしくは障害を処置または阻害するか、またはそれらの進行を遅延させるための方法であって、副補体経路を阻害することができる有効量のタンパク質を該処置を必要とする対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
黄斑変性症は、主に、高齢者に見られる病状であり、該病状では、網膜の黄斑領域として既知の眼の内壁の中心が菲薄化(thinning)、萎縮し、ある場合には、出血を伴う。これは、中心視野の低下を生じ、細かいものが見えない、本が読めない、または顔を認識できないような状態を引き起こす。新規脈絡膜血管形成の原因は、あまり理解されていないが、炎症、虚血、および血管新生因子の局所産生のような要因が重要であると考えられる。
【背景技術】
【０００２】
補体系タンパク質についての遺伝子が、黄斑変性症を発症するヒトのリスクと強く関連することが決定されてきた。補体系は、微生物感染に対する先天性免疫の重要な構成要素であり、通常、不活性状態で血清中に存在する一帯のタンパク質を含む。これらのタンパク質は、下記の3つの活性化経路で構成される: 古典的経路、レクチン経路、および副経路。病原体の表面にある分子は、これらの経路を活性化し、C3-転換酵素として既知のプロテアーゼ複合体の形成を生じ得る。古典的経路は、カルシウム/マグネシウム依存的なカスケードであり、通常、抗原-抗体複合体の形成により活性化される。それはまた、リガンドと複合体を形成したC反応性タンパク質の結合によるか、またはグラム陰性菌を含む多くの病原体により、抗体非依存的な方法で活性化され得る。副経路は、マグネシウム依存的なカスケードであり、特定の感受性表面(例えば、酵母および細菌の細胞壁ポリサッカライド、ならびに特定のバイオポリマー物質)上で、C3の沈着およびその活性化により、活性化される。
【０００３】
副経路は、古典的経路およびレクチン経路の活性化の増幅に関与する。補体経路の活性化は、補体タンパク質の生物学的に活性な断片、例えば、C3a、C4aおよびC5aアナフィラトキシン、ならびにC5b-9膜侵襲複合体(MAC)を生じ、それは、白血球の遊走、マクロファージ、好中球、血小板、肥満細胞および内皮細胞の活性化、増大した血管透過性、細胞溶解、ならびに組織損傷を介して、炎症応答を仲介する。
【０００４】
補体成分C5は、補体カスケードにおけるレクチン、古典的および副経路に共通する最終経路の主要な成分である。副経路および古典的経路におけるC5転換酵素によるC5の切断は、C5bおよびC5a断片を産生する。C5aおよびC5bは、炎症性分子である。C5aは、強力なアナフィラトキシンである。C5aは、C5a受容体(C5aR)に結合し、TNF-α、IL-1β、IL-6およびIL-8のような炎症性サイトカインの合成およびヒト白血球からのその放出を刺激する。C5bは、また、細胞膜を貫通し、ポアを形成する最終補体複合体もしくは膜侵襲複合体(MAC)として既知であるC5b-9 (C5b、C6、C7、C8およびC9)の構築のための核形成部位として役立ち、非溶解(sublytic)濃度では、炎症性細胞活性化に関与し、溶解濃度では、細胞死を生じ得る。C5b-9 (MAC)の形成およびC5aの産生を減少させることは、AMDに関与する炎症応答の阻害のために必要であり得る。副経路および古典的経路のC5転換酵素により触媒されるC5の切断を阻害することは、AMDの治療的処置において重要であり得る。
【０００５】
古典的もしくは副経路と関連する疾患および障害、特に、AMDを処置するための現在の処置選択肢にもかかわらず、有効かつ十分に耐容な処置のために特定の標的を発見することが必要である。
【発明の概要】
【０００６】
発明の要約
本発明は、配列番号1〜6からなる群から選択される配列を含むC5タンパク質、その断片および該タンパク質の製造法もしくは使用法に関する。本発明はまた、C5ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む、ベクターおよび組み換え宿主細胞に関する。本発明の他の局面では、C5補体成分活性を調節する試験薬剤を同定する方法およびC5抗原の結合パートナーを同定する方法を提供する。本発明の単離C5タンパク質の利用は、補体活性の異常調節と関連する生物学的活性、特に、黄斑変性症に関与するC5の特定のエピトープの発見に基づく。
【０００７】
本発明は、補体経路活性の異常調節を含む疾患もしくは障害を予防、処置および/または遅延させる目的のために、配列番号1〜6からなる群から選択される少なくとも1個のC5のエピトープに結合する結合分子を作製するための、C5タンパク質またはその断片の免疫原としての使用を提供する。
【０００８】
他の局面では、本発明は、副補体経路の少なくとも1種の成分を阻害する結合分子を提供し、眼の疾患もしくは障害、例えば、AMDを予防、処置および/または遅延させるために、該結合分子を製造するか、もしくは使用する方法を含む。
【０００９】
特定の他の局面では、本発明は、眼の疾患もしくは障害を処置または予防するか、またはその進行を遅延させる方法であって、C5の1個またはそれ以上のエピトープに特異的に結合する有効量の抗体を投与し、それにより、そのような処置を必要とする対象の補体経路系におけるC5タンパク質の機能を阻害することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の他の局面では、処置の治療的もしくは予防的方法での使用のための医薬組成物を提供し、それ故、該組成物は、補体C5機能のタンパク質阻害剤、C5bのC6への結合のタンパク質阻害剤または薬学的に許容されるその塩を1種またはそれ以上の薬学的に許容される希釈剤もしくは担体と共に含む。
【００１１】
本発明はさらに、眼の疾患もしくは障害の処置またはそれらの進行の遅延のための医薬の製造における、副補体経路を阻害することができる結合分子の使用を提供し、ここで、該タンパク質は、C5タンパク質機能またはMAC複合体の産生を阻害することができる。
【００１２】
本発明はまた、サンプルをC5のエピトープまたは該ポリペプチドをコードする核酸に特異的に結合する結合分子、例えば、抗体と接触させ、所望により、複合体形成を検出することにより、サンプル中のC5のエピトープまたはそれをコードする核酸を同定する方法を提供する。C5エピトープを該化合物と接触させ、C5タンパク質活性が修飾されるか否かを決定することにより、C5タンパク質の活性を調節する化合物もしくは結合分子を同定する方法を提供する。
【００１３】
また他の局面では、本発明は、対象での補体経路の異常調節と関連する障害の存在もしくはその傾向を決定する方法であって、該対象からのサンプルを提供し、対象サンプル中のC5タンパク質の量を測定することを含む、方法を提供する。次いで、対象サンプル中の特定のタンパク質もしくは阻害量を、コントロールサンプル中のタンパク質もしくは阻害量と比較する。好ましくは、コントロールサンプルは、適合した個体、すなわち、同様の年齢、性別もしくは他の一般的な状態を有するが、補体経路関連疾患を有することが疑われない個体から得られる。あるいは、コントロールサンプルは、対象が補体経路異常調節と関連する疾患を有することが疑われない時点において、該対象から得ることができる。ある局面では、関心のある化合物または結合分子は、本明細書に記載したとおり、結合分子、特に、抗体を用いて検出される。
【００１４】
本発明のさらなる局面では、血清サンプル中のC5結合タンパク質のスクリーニング法であって、サンプル中の抗体と既知の量の本発明の抗体(抗C5)または機能的に同等な変異型もしくはその断片間で競合的に結合させ、既知の抗体の量を測定することを含む方法を提供する。
【００１５】
他の局面では、本発明は、補体経路異常調節と関連する障害を検出するための診断キットであって、適当なパッケージ内に本発明の化合物または結合分子および担体を含むキットに関する。好ましくは、キットは、C5エピトープの存在を検出するために、抗体を使用するための指示書を含む。好ましくは、担体は、薬学的に許容される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明および好ましい態様
本明細書で使用する“化合物”または“本発明の化合物”は、ペプチドを含むタンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド模倣剤、ホモログ、アナログおよびその修飾もしくは誘導型を意味する。本発明の化合物は、好ましくは、配列番号2、4および6からなる群から選択される核酸配列、その断片および誘導体を含む。本発明はまた、突然変異体もしくは変異型配列を含み、その塩基のすべてを相当する配列番号2、4および6から改変することができるが、なお、タンパク質、好ましくは、配列番号1、3および5からなる群から選択される抗原タンパク質をコードしたままである。
【００１７】
“結合分子”は、本発明の化合物、好ましくは、配列番号1〜6からなる群から選択される化合物に結合する、抗体、有機分子、ペプチドを含むタンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド模倣剤、ホモログ、アナログおよびその修飾もしくは誘導型を意味する。
【００１８】
本発明の化合物および結合分子の誘導体もしくは類似体は、同一のサイズの核酸もしくはアミノ酸配列と、または当分野で既知のコンピューター相同性プログラムで行われたアライメント配列と比較して、少なくとも約70%、80%、または95%の同一性(好ましくは80-95%の同一性)で、または、該コード核酸が、ストリンジェント、中ストリンジェント、または低ストリンジェント条件下(Ausubel et al., 1987)で、上記タンパク質をコードする配列の相補体とハイブリダイズすることができるさまざまな態様で、本明細書に記載した核酸もしくはタンパク質と実質的に相同な領域を含む分子を含むが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明は、C5タンパク質の抗原性エピトープ、直線状もしくは非直線状エピトープに特異的に結合する結合分子、該抗原性エピトープおよび結合分子の製造法および使用法を提供する。発明者らは、最初に、配列番号1〜6からなる群から選択される配列を有するC5のエピトープを記載したが、それらは、補体経路異常調節と関連する障害、好ましくは、眼の疾患および障害を予防、処置または改善するために調節し得る。
【００２０】
本発明により処置されるか、または予防される特定の眼の疾患および障害は、少なくとも眼の一部の炎症および/または血管新生を含む。例えば、黄斑変性症、糖尿病性眼の疾患および障害、眼の浮腫、虚血性網膜症、視神経炎、類嚢胞黄斑部浮腫、網膜疾患および障害、病的近視、未熟児網膜症、血管新生、拒絶反応、もしくは他の炎症した角膜(角膜手術もしくは移植の有無での)、乾性角結膜炎またはドライアイを含むが、これらに限定されない疾患および障害を、本明細書に示した方法による処置もしくは予防のために使用し得る。特定の局面では、本発明の化合物、結合分子および方法による処置もしくは予防に適当な好ましい眼の疾患および障害は、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、および未熟児網膜症から選択されるものを含む。そのような治療法の適用の可能性がある他の眼の疾患は、内部および外部の眼の炎症性障害、例えば、ブドウ膜炎、強膜炎、上強膜炎、結膜炎、角膜炎、眼窩蜂巣炎、眼の筋炎、甲状腺眼窩疾患、涙腺もしくは眼瞼の炎症を含む。
【００２１】
本明細書で使用する“眼の疾患もしくは障害”は、糖尿病性の眼の疾患もしくは障害、眼の浮腫、血管新生を有する虚血性網膜症、視神経炎、類嚢胞黄斑部浮腫(CME)、網膜疾患もしくは障害、例えば、血管新生病的近視、未熟児網膜症(ROP)、血管新生、拒絶反応、もしくは他の炎症した角膜(角膜手術もしくは移植の有無での)、乾性角結膜炎またはドライアイを含むが、これらに限定されない。そのような治療法の適用の可能性がある他の眼の疾患は、内部および外部の眼の炎症性障害、例えば、ブドウ膜炎、強膜炎、上強膜炎、結膜炎、角膜炎、眼窩蜂巣炎、眼の筋炎、甲状腺眼窩疾患、涙腺もしくは眼瞼の炎症を含む。
【００２２】
本明細書に示す“糖尿病性眼の疾患および障害”は、糖尿病性網膜症(DR)、糖尿病性黄斑浮腫(DME)、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明の特定の抗原性エピトープは、配列番号1〜6およびその相補体(complements)によりコードされる。
【００２４】
特定の抗原性エピトープは、配列番号1、3および6と少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２５】
表面に露出した3つの抗原性エピトープは、C5タンパク質上に同定される。該エピトープは、補体成分C5の3つの直線状アミノ酸配列、すなわち、α鎖上の2つの配列およびβ鎖上の1つの配列に基づき、結合のための抗原性部位として下記を含む:
【００２６】
1). ヌクレオチド配列TGCGTTAATAATGATGAAACCTGTGAGCAG (配列番号2)によりコードされたC5α鎖上のCVNNDETCEQ (配列番号1)を含む、アミノ酸配列;
【００２７】
2). ヌクレオチド配列CAGGATATTGAAGCATCCCACTACAGAGGCTACGGAAACTCTGAT (配列番号4)によりコードされたC5α鎖上のQDIEASHYRGYGNSD (配列番号3)を含む、アミノ酸配列;
【００２８】
3). ヌクレオチド配列ACTTAAAAGATGATCAAAAAGAAATG (配列番号6)によりコードされたC5β鎖上のDLKDDQKEM (配列番号5)を含む、アミノ酸配列。
【００２９】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明の単離ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、当分野で既知のすべての適当な方法により作製し得る。そのような方法は、直接タンパク質合成法から単離ポリペプチド配列をコードするDNA配列を構築し、適当な形質転換宿主内でそれらの配列を発現させる方法に及ぶ。
【００３０】
標準的な方法は、インビトロタンパク質合成の標準的な方法を用いて、興味のある単離ポリペプチド配列を合成するのに適用し得る。
【００３１】
組み換え法の1つの局面では、DNA配列を、興味のある野生型タンパク質をコードするDNA配列を単離するか、もしくは合成することにより構築する。所望により、配列は、その機能的アナログを得るために、部位特異的突然変異誘発法により突然変異を引き起こすか、またはすべての他の手段により、例えば、他の遺伝子と融合させて、融合タンパク質を作製するか、もしくは遺伝子配列の特定の部分を欠失させて、野生型と比較して特定の部位を欠失したタンパク質の発現を生じることにより修飾し得る。例えば、膜貫通ドメインを欠失させ、元の状態では膜に固定されたタンパク質の分泌型を作製し得る。
【００３２】
興味のあるポリペプチドをコードするDNA配列を構築する他の方法は、オリゴヌクレオチド合成機を用いた化学合成によるものである。そのようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、望むポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、好ましくは、興味のある組み換えポリペプチドが産生される宿主細胞に好まれるコドンを選択して設計し得る。例えば、配列番号1、3または5のエピトープをコードするヌクレオチド配列を含むDNAオリゴマーを合成し得る。1つの局面では、これらのエピトープの部分をコードするいくつかの小オリゴヌクレオチドを合成し、次いで、連結し得る。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補性構築(complementary assembly)のための5'もしくは3'オーバーハングを含む。完全なアミノ酸配列は、逆翻訳遺伝子を構築するために使用され得る。
【００３３】
いったん構築されると(合成、ポリメラーゼ連鎖反応、部位特異的突然変異誘発法、またはすべての他の方法により)、興味のある特定の単離ポリペプチドをコードする突然変異体DNA配列を発現ベクターに挿入し、望む宿主でのタンパク質発現のために適当な発現制御配列に操作可能に結合させ得る。適当な構築は、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、適当な宿主での生物学的に活性なポリペプチドの発現により確認し得る。当分野で既知のとおり、宿主でのトランスフェクト遺伝子の高発現を得るためには、該遺伝子を、該ベクターにより形質転換される選択発現宿主で機能する、転写および翻訳発現制御配列に操作可能に結合させなければならない。
【００３４】
発現制御配列および発現ベクターの選択は、対応する宿主の選択に依存する。さまざまな発現宿主/ベクターの組み合わせを使用し得る。真核細胞宿主のための有用な発現ベクターは、例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターを含む。細菌宿主のための有用な発現ベクターは、既知の細菌プラスミド、例えば、pCRI、pBR322、pMB9およびそれらの誘導体を含むEscherichia coli由来のプラスミド、広範な宿主範囲プラスミド、例えば、M13および線維状一本鎖DNAファージを含む。好ましいE. coliベクターは、λファージpLプロモーターを含むpLベクター(米国特許第4,874,702号)、T7ポリメラーゼプロモーターを含むpETベクターおよびpSP72ベクターを含む。酵母細胞のための有用な発現ベクターは、例えば、2 gおよびセントロメアプラスミドを含む。
【００３５】
さらに、各特定の発現ベクターの範囲内で、これらのDNA配列の挿入のために、さまざまな部位を選択し得る。これらの部位は、通常、それらを切断する制限エンドヌクレアーゼにより指定される。それらは、当業者に十分に認識されている。当然のことながら、本発明において有用な特定の発現ベクターは、選択DNA断片の挿入のための制限エンドヌクレアーゼ部位を有さなくてもよい。代わりに、該ベクターを、他の手段により断片に挿入し得る。
【００３６】
発現ベクター、ならびに選択DNA断片の挿入および発現制御配列の操作可能な結合のために選択される部位は、さまざまな要因により決定され、例えば、下記の要因を含む: 特定の制限酵素に感受性のある部位の数、ポリペプチドのサイズ、ポリペプチドがタンパク質分解される容易さなど。ベクターおよび特定のDNAのための挿入部位の選択は、これらの要因のバランスにより決定される。
【００３７】
本発明の組み換え構築体の十分な転写を提供するために、適当なプロモーター/エンハンサー配列を、好ましくは、組み換えベクターに組み込み得る(ただし、該プロモーター/エンハンサー制御配列は、興味のあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の転写を誘導することができる)。さまざまな発現制御配列のいずれかをこれらのベクターに使用し得る。そのような有用な発現制御配列は、外来発現ベクターの構造遺伝子と関連する発現制御配列を含む。有用な発現制御配列の例は、例えば、SV40もしくはアデノウイルスの早期および後期プロモーター、lac系、trp系、TACもしくはTR系、λファージの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、例えば、pL、fd被覆タンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリンサンキナーゼもしくは他の解糖系酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えば、Pho5、酵母α接合系のプロモーターおよび原核生物もしくは真核生物細胞およびそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが既知の他の配列、ならびにさまざまなそれらの組み合わせを含む。言及したベクターの多くが、市販で入手可能である。
【００３８】
本発明の単離化合物を大量に産生するために、細菌、真菌(酵母を含む)、植物、昆虫、ほ乳類、または他の適当な動物細胞もしくは細胞株、ならびにトランスジェニック動物もしくは植物を含むすべての適当な宿主を使用し得る。より特には、これらの宿主は、十分に既知な真核生物および原核生物宿主、例えば、E. coli、Pseudomonas、Bacillus、Streptomyces、真菌、酵母(例えば、Hansenula)、昆虫細胞、例えば、Spodoptera firugiperda (SF9)およびHIGH FIVE、動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、NS/Oのようなマウス細胞、アフリカミドリザル細胞、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40およびBMT 10、ならびにヒト細胞および植物細胞の株を含み得る。
【００３９】
真核生物細胞内でポリペプチドの発現を制御するために使用し得るプロモーターは、SV40早期プロモーター領域(すなわち、ラウス肉腫ウイルスの3'の長い末端反復配列に含まれるプロモーター)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(すなわち、メタロチオニン遺伝子の制御配列)を含むが、これらに限定されない。
【００４０】
ポリペプチドが植物で発現するとき、ノパリンシンターゼプロモーター領域またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーターおよび光合成酵素であるリブロース二リン酸カルボキシラーゼのためのプロモーターを含む植物発現ベクターを使用し得る。
【００４１】
ポリペプチドが酵母または他の真菌で発現するとき、Gal 4プロモーター、ADC (アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK (ホスホグリセロキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターのようなプロモーター要素が選択され得る。
【００４２】
ポリペプチドがトランスジェニック動物で発現するとき、組織特異性を示し、トランスジェニック動物で使用された下記の動物転写制御領域を使用し得る: 膵臓細胞で活性なエラスターゼI遺伝子制御領域; 膵臓細胞で活性なプロモーターのためのインスリン遺伝子エンハンサー; リンパ球細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子エンハンサーもしくはプロモーター; サイトメガロウイルス早期プロモーターおよびエンハンサー領域; 精巣、乳房、リンパ球および肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域; 肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域; 肝臓で活性なα-フェトプロテイン遺伝子制御領域; 肝臓で活性なα-アンチトリプシン遺伝子制御領域; 骨髄細胞で活性なβ-グロブリン遺伝子制御領域、脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域; 骨格筋で活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域;および視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域。
【００４３】
DNA配列の発現制御配列への操作可能な結合は、DNA配列の上流にある正確なリーディングフレーム中の翻訳開始シグナルの提供を含む。発現する特定のDNA配列がメチオニンで始まらないとき、開始シグナルは、産物のN末端に位置する追加のアミノ酸(メチオニン)を生じる。疎水性部分をN末端メチオニル含有タンパク質と結合させると、該タンパク質は、本発明の組成物で直接使用し得る。また、それらと共に発現させたポリペプチドからN末端メチオニンを除去する方法が、当分野において利用可能である。例えば、特定の宿主および発酵条件により、インビボで、実質的にすべてのN末端メチオニンを除去することが可能である。
【００４４】
すべてのベクターおよび発現制御配列が特定の単離ポリペプチドを発現するのに十分に等しく機能するわけではないことを理解すべきである。また、同様に、すべての宿主は、同じ発現系を用いて十分に等しく機能するわけではない。しかしながら、当業者は、過度の実験をすることなく、これらのベクターの中から発現制御系および宿主を選択することができる。
【００４５】
これらのポリヌクレオチド構築体の特定の発現ベクターへの成功した組み込みは、下記の3つの一般的な方法により同定し得る: (a) DNA-DNAハイブリダイゼーション、(b) “マーカー”遺伝子機能の存在または非存在、および(c) 挿入配列の発現。最初の方法では、発現ベクターに挿入された遺伝子の存在は、挿入遺伝子に相同な配列を含むプローブを用いたDNA-DNAハイブリダイゼーションにより検出し得る。第2の方法では、組み換えベクター/宿主系を同定し、ベクター内への外来遺伝子の挿入により誘導される特定の“マーカー”遺伝子機能(例えば、チミジンキナーゼ活性、G418のような抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスでの封入体の形成など)の存在または非存在に基づいて選択し得る。例えば、ポリヌクレオチドがベクターのマーカー遺伝子を遮断するように挿入されると、挿入を含む組み換え体は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。第3の方法では、組み換え発現ベクターは、組み換えベクターにより発現される外来遺伝子産物をアッセイすることにより同定し得る。そのようなアッセイは、例えば、バイオアッセイ系で、遺伝子産物の物理的もしくは機能的特性に基づいて行うことができる。
【００４６】
修飾タンパク質治療薬をコードする組み換え核酸分子は、当分野で既知のいずれかの方法で得ることができ(Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)、また公の利用可能なクローンから得られる。修飾は、欠失、挿入、点突然変異、他のポリペプチドへの融合を含むが、これらに限定されない。本発明のある態様では、組み換えベクター系は、正確なリーディングフレーム内の興味のある治療薬をコードする配列を合成ヒンジ領域と適合させるように作製し得る。さらに、組み換えベクター系の一部として、RNA切断/ポリアデニル化部位を含む、免疫グロブリン遺伝子の3'フランキング領域に相当する核酸および下流の配列を含むことが望ましくあり得る。さらに、組み換えベクターで形質転換した細胞からタンパク質治療薬の分泌を促進するために、修飾タンパク質治療薬の上流のシグナル配列を改変することが望ましくあり得る。これは、特に興味のあることであり、通常の膜結合タンパク質を、それが代わりに分泌されるように修飾する。
【００４７】
形質転換宿主により産生されたタンパク質は、任意の適当な方法により精製し得る。そのような標準的な方法は、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、およびサイジングカラム(sizing column)クロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差(differential solubility)、またはタンパク質精製のためのすべての他の標準的な技術を含む。免疫親和性クロマトグラフィーに関して、興味のあるタンパク質は、それを該タンパク質もしくは交差反応タンパク質に対して作製され、支持体に固定された抗体を含む親和性カラムに結合させることにより単離され、実質的に純粋なタンパク質を生じる。“実質的に純粋”なる用語は、タンパク質が、天然ではそれと結合している不純物から遊離していることを意図する。実質的な純度は、電気泳動での単一バンドにより証明され得る。単離したタンパク質は、また、タンパク質分解、核磁気共鳴、およびX線結晶解析のような技術を用いて、物理的に特徴づけることができる。
【００４８】
アンチセンス、リボザイム、三重螺旋RNA干渉およびアプタマー技術
本発明の他の局面は、治療薬としての化合物および/または修飾化合物の使用に関する。ある局面では、核酸は、遺伝子送達ベクターにより細胞内で産生される。他の局面では、これらの核酸は、インビボでほ乳類対象に直接投与され、例えば、下記の4つの異なる技術を含む: アンチセンス、リボザイム、RNA干渉およびアプタマー。
【００４９】
本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイム、および三重螺旋分子は、DNAおよびRNA分子の合成のために当分野で既知のいずれかの方法により製造し得る。これらは、当分野で既知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するための技術、例えば、固相ホスホラミダイト化学合成を含む。あるいは、RNA分子は、アンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のインビトロおよびインビボ転写により産生し得る。そのようなDNA配列は、適当なRNAポリメラーゼプロモーター、例えば、T7もしくはSP6ポリメラーゼプロモーターを組み込んださまざまなベクターに組み込み得る。あるいは、使用されるプロモーターに依存して、構成的に、または誘導的にアンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築体を、細胞株に安定的に導入し得る。
【００５０】
さらに、核酸分子へのさまざまな既知の修飾を、細胞内安定性および半減期を増大させる手段として導入し得る。考え得る修飾は、分子の5'および/または3'末端へのリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、またはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内で、ホスホジエステラーゼ結合よりも2' O-メチルのホスホロチオエートの使用を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
アンチセンス
本明明細書で使用する“アンチセンス”療法は、オリゴヌクレオチド分子またはそれらの誘導体の投与もしくはインサイチュ産生を意味し、それは、細胞条件下で、1個またはそれ以上のC5のエピトープをコードする細胞mRNAおよび/またはゲノムDNAと特異的にハイブリダイズし(例えば、結合し)、その結果、例えば、C5タンパク質の転写および/または翻訳を阻害することにより、C5の発現もしくは活性を阻害する。結合は、慣用的な塩基対相補性によるか、または例えば、DNA二本鎖の場合には、二重螺旋の主溝での特異的な相互作用を介することにより得る。一般に、“アンチセンス”療法は、当分野で一般に使用される一連の技術を意味し、オリゴヌクレオチド配列への特異的な結合に依存するすべての療法を含む。
【００５２】
本発明のアンチセンス構築体は、例えば、発現プラスミドとして送達し得て、それは、細胞内で転写されると、C5抗原性タンパク質をコードする細胞mRNA配列と相補的なRNAを産生する。あるいは、アンチセンス構築体は、エクスビボで作製されたオリゴヌクレオチドプローブであり、それは、細胞内に導入されると、C5ポリヌクレオチドのmRNAおよび/またはゲノム配列とハイブリダイズすることにより発現の阻害を生じる。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、内在性ヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼおよび/またはエンドヌクレアーゼに耐性のある修飾オリゴヌクレオチドであり、したがって、インビボで安定である。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての使用のための核酸分子は、例えば、DNAのホスホロアミデート、ホスホロチオエートおよびメチルホスホナートアナログである(また、米国特許第5,176,996号; 5,264,564号; および5,256,775号を参照のこと)。アンチセンスDNAに関して、配列番号2、4または6から選択される配列に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【００５３】
アンチセンス法は、C5タンパク質のエピトープをコードするmRNAに相補的なオリゴヌクレオチド(DNAまたはRNA)の設計を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、mRNA転写産物に結合し、翻訳を妨げる。完全な相補性が好ましいが、必ずしも必要とはされない。二本鎖アンチセンス核酸の場合には、したがって、二本鎖DNAの一本鎖を試験し得るか、または三本鎖形成をアッセイし得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さに依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が長い程、それが含み得るRNAとの塩基ミスマッチが増えるが、なお、安定な二本鎖(または場合によっては、三本鎖)を形成する。当業者は、標準的な手段を用いてミスマッチの耐用性の程度を確認し、ハイブリダイズした複合体の融点を決定することができる。
【００５４】
mRNAの5'末端、例えば、AUGまでの、およびそれらを含む5'非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳阻害において最も有効に作用する。mRNAの3'非翻訳配列に相補的な配列はまた、mRNAの翻訳阻害に有効であることが示された。したがって、遺伝子の5'もしくは3'非翻訳非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、該mRNAの翻訳を阻害するために、アンチセンス法で使用し得る。mRNAの5'非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、AUG開始コドンの相補体を含み得る。mRNAのコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、あまり有効な翻訳の阻害剤ではないが、また、本発明で使用し得る。mRNAの5'、3'もしくはコード領域のいずれにハイブリダイズするように設計されるかを問わず、アンチセンス核酸は、少なくとも6ヌクレオチド長であり得て、好ましくは約100未満、より好ましくは約50、25、17もしくは10ヌクレオチド長である。
【００５５】
標的配列の選択に関わらず、インビトロ試験は、最初に、遺伝子発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量化することが好ましい。これらの試験は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス遺伝子阻害と非特異的な生物学的効果を区別するコントロールを使用することが好ましい。また、これらの試験は、標的RNAもしくはタンパク質のレベルと内部コントロールRNAもしくはタンパク質のそれとを比較することが好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果を、コントロールオリゴヌクレオチドを用いて得られたものと比較することが想定される。コントロールオリゴヌクレオチドは、試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであり、標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを妨害する必要がある程度に、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列がアンチセンス配列と異なることが好ましい。
【００５６】
オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のDNAもしくはRNAもしくはキメラ混合物もしくはその誘導体もしくは修飾型であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾し得る。オリゴヌクレオチドは、他の付加集団、例えば、ペプチド(例えば、宿主細胞受容体を標的化するために)、または細胞膜(PCT公開W088/09810を参照)もしくは血液脳関門(例えば、PCT公開W089/10134を参照)の通過輸送を促進する薬剤、ハイブリダイゼーション誘導切断剤または挿入剤を含み得る。この目的を達成するために、オリゴヌクレオチドを、他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘導架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘導切断剤などと結合させ得る。
【００５７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの塩基修飾を含むことができ、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシトリエチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルクエオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル; β-D-マンノシルクエオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)wおよび2,6-ジアミノプリンからなる群から選択されるが、これらに限定されない。
【００５８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、少なくとも1つの修飾糖部分を含むことができ、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースからなる群から選択されるが、これらに限定されない。
【００５９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、中性ペプチド様骨格を含み得る。そのような分子は、ペプチド核酸(PNA)オリゴマーと呼ばれる。PNAオリゴマーの1つの利点は、DNAの中性骨格のために、基本的に、培地のイオン強度から独立して相補的なDNAに結合するそれらの能力である。また他の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール、またはその類似体からなる群から選択される少なくとも1つの修飾リン酸骨格を含む。
【００６０】
またさらなる局面では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アノマーオリゴヌクレオチドである。アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的RNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成するが、そこでは、通常のユニットとは逆に、該鎖は、互いに平行して走る。オリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルリボヌクレオチド、またはキメラRNA-DNAである。
【００６１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当分野で既知の標準的な方法により、例えば、自動DNA合成機(例えば、Biosearch, Applied Biosystemsなどから商業的に入手可能である)の使用により製造し得る。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、当分野で既知の方法により合成し得て、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御ポアガラスポリマー支持体の使用により製造し得る。
【００６２】
mRNAのコード領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドを使用し得るが、非翻訳領域および開始メチオニンを含む領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
【００６３】
アンチセンス分子を、インビボでC5タンパク質を発現する細胞に送達し得る。アンチセンスDNAもしくはRNAを細胞に送達するための多くの方法が開発されており; 例えば、アンチセンス分子を、組織に直接注入し得るか、または望まれる細胞を標的化するように設計された修飾アンチセンス分子(例えば、標的細胞表面上に発現する受容体もしくは抗原に特異的に結合するペプチドもしくは抗体に結合したアンチセンス)を、全身的に投与し得る。
【００６４】
しかしながら、特定の例では、内在性RNAの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成するのは、困難であり得る。したがって、好ましい方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、強力なpol mもしくはpol IIプロモーターの制御下に置いた組み換えDNA構築体を利用することである。患者の標的細胞にトランスフェクトするそのような構築体の使用は、十分な量の一本鎖RNAの転写を生じ、ヘッジホッグシグナル伝達転写産物と相補的な塩基対を形成し、それにより、翻訳を妨害する。例えば、ベクターをインビトロで導入することが可能であり、その結果、細胞に導入され、アンチセンスRNAの転写を生じる。そのようなベクターは、それが転写され、望まれるアンチセンスRNAを産生するかぎりにおいて、エピソームのままであるか、または染色体に組み込まれ得る。そのようなベクターは、当分野で標準的な組み換えDNA技術により構築され得る。ほ乳類細胞における複製および発現のために使用されるベクターは、プラスミド、ウイルス、または当分野で既知の他のものであり得る。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、ほ乳類、好ましくは、ヒト細胞で作動する、当分野で既知の任意のプロモーターにより為され得る。そのようなプロモーターは、誘導的または構成的であり得る。そのようなプロモーターは、SV40早期プロモーター領域(すなわち、ラウス肉腫ウイルスの3'の長い末端反復配列に含まれるプロモーター)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(すなわち、メタロチオニン遺伝子の制御配列) (Brinster et al, 1982, Nature 296:3942)などを含むが、これらに限定されない。プラスミド、コスミド、YACまたはウイルスベクターのすべての型が、組織部位へ直接導入され得る組み換えDNA構築体を作製するために使用され得る。あるいは、望まれる組織に選択的に感染するウイルスベクターが使用され得て、その場合、投与は、他の経路(例えば、全身的)により達成され得る。
【００６５】
リボザイム
C5 mRNA転写産物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子は、また、mRNAの翻訳を妨害するために使用し得る(例えば、1990年10月4日に公開されたPCT国際公開W090/11364; 米国特許第5,093,246号を参照)。部位特異的認識配列でmRNAを切断するリボザイムは、特定のmRNAを破壊するために使用し得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的mRNAと相補的な塩基対を形成するフランキング領域により決定された位置でmRNAを切断する。唯一必要なのは、標的mRNAが下記の2つの塩基: 5'-UG-3'を有することである。
【００６６】
本発明のリボザイムはまた、RNAエンドリボヌクレアーゼ(以後、“Cech型リボザイム”と記す)、例えば、テトラヒメナ・サーモフィラで天然に生じるもの(IVS、またはL-19 IVS RNAとして既知である)を含み、それは、国際特許出願WO88/04300で公開されていた。Cech型リボザイムは、標的RNA配列にハイブリダイズし、その後、標的RNAの切断が生じる8つの塩基対活性部位を有する。発明は、8つの塩基対活性部位配列を標的とするCech型リボザイムを含む。
【００６７】
アンチセンス法と同様に、リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチドからなり(例えば、改善された安定性、標的化などのために)、インビボでC5タンパク質を発現する細胞に送達し得る。送達の好ましい方法は、強力な構成的pol IIIもしくはpol IIプロモーターの制御下でリボザイムを“コードする”DNA構築体を用いることを含み、その結果、トランスフェクト細胞は、十分な量のリボザイムを産生し、その結果、標的化メッセンジャーを破壊し、翻訳を阻害し得る。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは触媒的であるので、より低い細胞内濃度が効果を達成するために必要とされる。
【００６８】
三重螺旋形成
あるいは、内在性C5遺伝子発現は、遺伝子の制御領域(すなわち、プロモーターおよび/またはエンハンサー)に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化し、体内の標的細胞における遺伝子の転写を妨げる三重螺旋構造を形成することにより減少させ得る。
【００６９】
転写の阻害のために三重螺旋形成において使用される核酸分子は、好ましくは、一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成物は、Hoogsteen塩基対ルールにより、三重螺旋形成を促進し得て、それは、一般に、二本鎖のうちの一本鎖に存在するプリンまたはピリミジンのかなり大きい領域(stretch)を必要とする。ヌクレオチド配列は、ピリミジンに基づいていてもよく、それは、生じた三重螺旋の3つの関連する鎖に沿って、TATおよびCGCトリプレットを生じる。ピリミジン-リッチ分子は、その鎖に平行な方向で、二本鎖のうちの一本鎖のプリン-リッチ領域に相補的な塩基を提供する。さらに、例えば、G残基の領域を含むプリンリッチである核酸分子を選択し得る。これらの分子は、GC対が豊富なDNA二本鎖と三重螺旋を形成し、そこでは、多くのプリン残基が、標的二本鎖のうちの一方に位置し、三重螺旋の3本の鎖に沿って、CGCトリプレットを生じる。
【００７０】
あるいは、三重螺旋形成のために標的化しうる潜在的な配列は、いわゆる“スイッチバック”核酸分子を作製することにより増加させ得る。スイッチバックは、交互に起きる5'-3'、3'-5'法で合成され、その結果、それらは、二本鎖のうちの最初の一方の鎖と、次いで、他方の鎖と塩基対を形成し、プリンまたはピリミジンのかなり大きい領域が、二本鎖の一方の鎖に存在するべき必要性を除去する。
【００７１】
RNA干渉
RNA干渉(RNAi)が遺伝子をサイレンシングするための普遍的なメカニズムである可能性があることの発見は、遺伝子発現を減少させる別の新規方法を示し、それは、上記した他の方法の制限を克服することができる。低分子干渉RNA(siRNA)は、RNAiの核心である。siRNAのアンチセンス鎖がRNAiサイレンシング複合体に用いられ、相補的なmRNA分子の切断を誘導し、その結果、対応する遺伝子の発現をサイレンシングする。
【００７２】
したがって、本発明−レバレッジング(leveraging) RNAi-は、方法および効果の点で、他の核酸に基づく戦略(アンチセンスおよびリボザイム法)とは異なる: (a) アンチセンス戦略と比較して、RNAiは、触媒過程を利用し、すなわち、少量のsiRNAにより、標的細胞内の標的遺伝子mRNAの濃度を減少させることが可能である。アンチセンスは、化学量論的過程に基づくので、より高い濃度のエフェクター分子が細胞内で必要とされ、すなわち、内在性mRNAの濃度と等しいか、またはより高い濃度が必要とされる。したがって、RNAiは、触媒過程であるので、より低い濃度のエフェクター分子(すなわち、siRNA)が治療効果を仲介するのに十分である。(b) リボザイム(それは、同様の触媒機能を有する)と比較して、RNAiは、より柔軟な戦略のように思われ、それは、より多くの標的配列を標的化することが可能であり、その結果、構築体設計においてより多くの柔軟性を提供する。さらに、RNAi構築体の設計は、当業者がRNAi標的遺伝子の配列情報に基づいてそれらの構築体を設計することができるので、迅速かつ容易に行うことができる。リボザイムの場合には、それがより複雑な性質を有しているために、より多くの試行錯誤実験および高度な設計アルゴリズムが必要とされる。最後に、(c) RNAiは、それが普遍的な内在性細胞機構を利用するので、リボザイムと比較してインビボでより効果的である。
【００７３】
本発明はまた、タンパク質に基づく戦略とは異なり、RNAが非内在性タンパク質(例えば、人工転写因子)の発現を必要としないので、その結果として、意図しない免疫応答のリスクを低減させる。
【００７４】
要約すると、遺伝子発現のRNAi仲介ダウンレギュレーションは、存在する遺伝子発現ダウンレギュレーション法を超えた明確な利点を有する新規メカニズムである。
【００７５】
RNAi構築体は、標的遺伝子の発現を特異的に阻害できる二本鎖RNAを含む。したがって、RNAi構築体は、特定の遺伝子の発現を特異的に阻害することにより、アンタゴニストとして作用し得る。“RNA干渉”または“RNAi”は、最初、植物および昆虫で観察された現象に適用された用語であり、そこでは、二本鎖RNA(dsRNA)が特異的および転写後に遺伝子発現を阻害する。理論に拘泥されることなく、RNAiは、mRNA分解を含み得て、その生化学的なメカニズムの探求が現在の研究の活発な領域である。作用メカニズムに関するいくつかの謎にもかかわらず、RNAiは、インビトロまたはインビボで遺伝子発現を阻害する有用な方法を提供する。
【００７６】
本明細書で使用する“dsRNA”なる用語は、siRNA分子、または二本鎖特徴を有し、細胞内でsiRNAに加工され得る他のRNA分子、例えば、ヘアピン型RNA部分を意味する。
【００７７】
“機能の欠失”なる用語は、それが対象RNAi法により阻害される遺伝子を意味するとき、RNAi構築体の非存在におけるレベルと比較して、遺伝子発現レベルの減少を意味する。
【００７８】
本明細書で使用する“RNAiを仲介する”なる句は、RNAが、RNAi過程により分解されるべきであることを区別する能力、例えば、分解が、配列独立dsRNA応答、例えば、PKR応答ではなく配列特異的な方法で生じることを意味する(示す)。
【００７９】
本明細書で使用する“RNAi構築体”なる用語は、本明細書を通して使用される総称であり、低分子干渉RNA(siRNA)、ヘアピン型RNA、およびインビボで切断され、siRNAを形成できる他のRNA種を含む。本明細書のRNAi構築体はまた、細胞内でdsRNAまたはヘアピン型RNAを形成する転写産物、および/またはインビボでsiRNAを産生することができる転写産物を生じることが可能な発現ベクター(また、RNAi発現ベクターと呼ばれる)を含む。
【００８０】
“RNAi発現ベクター”(また、本明細書では“dsRNAコードプラスミド”と呼ぶ)は、構築体を発現させる細胞においてsiRNA部分を産生する、RNAを発現する(転写する)のに使用される複製可能核酸構築体を意味する。そのようなベクターは、(1) (2)と操作可能に結合した、遺伝子発現の制御的な役割を有する遺伝学的要素、例えば、プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、(2) 転写され、二本鎖RNAを産生する“コード”配列(細胞内でアニールしてsiRNAを形成する、2つのRNA部分、またはsiRNAに加工され得る、一本鎖ヘアピン型RNA)、および(3) 適当な転写開始および終結配列の構築を含む転写単位を含む。プロモーターおよび他の制御エレメントの選択は、一般に、意図する宿主細胞に応じて変わる。一般に、組み換えDNA技術で利用される発現ベクターは、しばしば、環状二本鎖DNAループを意味する“プラスミド”の形態であり、それらのベクター形態で、染色体に結合しない。本明細書において、“プラスミド”および“ベクター”は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるとき、交換可能に使用される。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たし、後に当分野で既知になる、発現ベクターの当該他の形態を含むことを意図する。
【００８１】
RNAi構築体は、細胞の生理学的な条件下で、阻害される遺伝子(すなわち、“標的”遺伝子)のmRNA転写産物の少なくとも一部のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。二本鎖RNAは、RNAiを仲介する能力を有する天然のRNAに十分に類似していることのみを必要とする。したがって、本発明は、遺伝学的突然変異、株多型または進化的分岐のために予測され得る配列変化を許容できる利点を有する。標的配列とRNAi構築体配列間の許容されるヌクレオチドミスマッチの数は、5塩基に1個以下、または10塩基に1個以下、または20塩基に1個以下、または50塩基に1個以下である。
【００８２】
siRNA二本鎖の中心部でのミスマッチは、最も重要であり、基本的に、標的RNAの切断を無効にし得る。対照的に、標的RNAに相補的なsiRNA鎖の3'末端のヌクレオチドは、標的認識の特異性にあまり関与しない。
【００８３】
配列同一性は、当分野で既知の配列比較およびアライメントアルゴリズム(Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991を参照)により最適化し、例えば、既定値パラメーターを用いて、BESTFITソフトウェアプログラムで実施されるような、Smith-Watermanアルゴリズム(例えば、University of Wisconsin Genetic Computing Group)により、ヌクレオチド配列間の差異割合を計算し得る。阻害性RNAと標的遺伝子部分間の90%以上の配列同一性、またはさらに、100%配列同一性が好ましい。あるいは、RNAの二本鎖領域は、標的遺伝子転写産物の一部とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列として機能的に定義し得る(例えば、400 mM NaCl、40 mM PIPES pH 6.4、1 mM EDTA、50℃または70℃、12-16時間のハイブリダイゼーション; その後の洗浄)。
【００８４】
RNAi構築体の作製は、化学合成法によるか、または組み換え核酸技術により行い得る。処理細胞の内在性RNAポリメラーゼは、インビボでの転写を仲介することができ、またはクローン化RNAポリメラーゼを、インビトロでの転写のために使用し得る。RNAi構築体は、例えば、細胞ヌクレアーゼへの感受性を減少させ、バイオアビリティを改善し、製剤特性を改善し、および/または他の薬物動態特性を変化させるために、リン酸-糖骨格またはヌクレオシドに修飾を含み得る。例えば、天然RNAのホスホジエステル結合が、少なくとも1つの窒素または硫黄ヘテロ原子を含むように修飾され得る。
【００８５】
RNA構造の修飾は、特異的な遺伝学的阻害を可能にするが、一般的なdsRNAに対する応答を回避するように調整し得る。同様に、塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性を妨害するように修飾し得る。RNAi構築体は、酵素学的または部分/全体有機合成により作製し得て、任意の修飾リボヌクレオチドを、インビトロ酵素学的または有機合成により導入し得る。
【００８６】
化学的にRNA分子を修飾する方法は、RNAi構築体を修飾するために適用し得る。単なる例示に過ぎないが、RNAi構築体の骨格は、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、キメラメチルホスホネート-ホスホジエステル、ペプチド核酸、オリゴマーを含む5-プロピニル-ピリミジンまたは糖修飾物(例えば、2'-置換リボヌクレオシド、a-配置(configuration))を用いて修飾し得る。
【００８７】
二本鎖構造は、単一自己相補的RNA鎖または2つの相補的RNA鎖により形成し得る。RNA二本鎖形成は、細胞の内外で開始され得る。RNAは、少なくとも細胞あたり1コピーの送達を可能にする量で導入され得る。二本鎖物質のより多くの用量(例えば、少なくとも細胞あたり5、10、100、500または1000コピー)は、より有効な阻害を産生し得て、一方で、より少ない用量はまた、特定の適用のために有用であり得る。阻害は、RNAの二本鎖領域に相当するヌクレオチド配列が遺伝学的阻害の標的であるという点で、配列特異的である。
【００８８】
ある態様では、対象RNAi構築体は、“低分子干渉RNA”または“siRNA”である。これらの核酸は、約19-30ヌクレオチド長、より好ましくは、21-23ヌクレオチド長であり、例えば、より長い二本鎖RNAのヌクレアーゼ“ダイシング(dicing)”により産生した断片の長さに相当する。siRNAは、ヌクレアーゼ複合体を集合させ、特異的な配列と塩基対を形成することにより、該複合体を標的mRNAに標的化するものと理解される。結果として、標的mRNAは、タンパク質複合体中のヌクレアーゼにより分解される。特定の態様では、21-23ヌクレオチドsiRNA分子は、3'ヒドロキシル基を含む。
【００８９】
本発明のsiRNA分子は、当業者に既知の多くの技術を用いて取得し得る。例えば、siRNAは、当分野で既知の方法を用いて、化学的に合成されるか、または組み換え的に産生され得る。例えば、短いセンスおよびアンチセンスRNAオリゴマーを合成し、各末端で2-ヌクレオチドオーバーハングとアニールさせ、二本鎖RNA構造を形成し得る。次いで、これらの二本鎖siRNA構築体を、受動的取り込みによるか、または最適な送達系により、細胞に直接導入し得る。
【００９０】
特定の局面では、siRNA構築体は、例えば、酵素dicerの存在下で、より長い二本鎖RNAを加工することにより作製し得る。ある態様では、インビトロ系で、ショウジョウバエが使用される。この態様では、dsRNAを、ショウジョウバエ胚に由来する可溶性抽出物と合わせ、その結果、混合物(combination)が生じる。該混合物を、dsRNAが約21から約23ヌクレオチドのRNA分子に加工される条件下で維持する。
【００９１】
siRNA分子は、当業者に既知の多くの技術を用いて精製し得る。例えば、siRNAを精製するために、ゲル電気泳動を使用し得る。あるいは、非変性法、例えば、非変性カラムクロマトグラフィーを、siRNAの精製に使用し得る。さらに、クロマトグラフィー(例えば、サイズ排除クロマトグラフィー)、グリセロール勾配遠心分離、抗体を用いた親和性精製を、siRNAの精製に使用し得る。
【００９２】
特定の好ましい態様では、siRNA分子の少なくとも一本鎖が、約1から約6ヌクレオチド長の3'オーバーハングを有するが、2から4ヌクレオチド長であってもよい。より好ましくは、3'オーバーハングは、1-3ヌクレオチド長である。特定の態様では、一方の鎖が3'オーバーハングを有し、他の鎖が平滑末端を有するか、またはオーバーハングを有する。オーバーハングの長さは、各鎖に関して、同じであるか、または異なり得る。siRNAの安定性をさらに高めるために、3'オーバーハングを分解に対して安定化し得る。1つの局面では、RNAは、プリンヌクレオチド、例えば、アデノシンもしくはグアノシンヌクレオチドを含むことにより安定化する。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、2'-デオキシチミジンによるウリジンヌクレオチド3'オーバーハングの置換は、耐容であり、RNAiの効果に影響を与えない。2'ヒドロキシルの非存在は、組織培養培地におけるオーバーハングのヌクレアーゼ耐性をかなり促進し、インビボで有益であり得る。
【００９３】
他の態様では、RNAi構築体は、長い二本鎖RNAの形態である。特定の態様では、RNAi構築体は、少なくとも25、50、100、200、300または400塩基である。特定の態様では、RNAi構築体は、400-800塩基長である。二本鎖RNAは、細胞内で消化され、例えば、細胞内でsiRNA配列を産生する。しかしながら、長い二本鎖RNAのインビボでの使用は、おそらく、配列独立dsRNA応答により生じ得る有害効果のために、必ずしも実用的ではない。そのような態様では、局所送達系および/またはインターフェロンもしくはPKRの効果を減少させる薬剤の使用が好ましい。
【００９４】
特定の局面では、RNAi構築体は、ヘアピン型構造の形態(ヘアピン型RNAと呼ばれる)である。ヘアピン型RNAは、外生的に合成し得るか、またはインビボでRNAポリメラーゼIIIプロモーターからの転写により形成し得る。好ましくは、該ヘアピン型RNAは、望む遺伝子の継続した安定的な抑制を保証するために、細胞もしくは動物内で改変される。細胞内でヘアピン型RNAを加工することにより、siRNAが産生されることは、当分野で既知である。
【００９５】
また他の局面では、二本鎖RNAを、例えば、転写産物として送達するために、プラスミドが使用される。該局面では、プラスミドは、RNAi構築体のセンスおよびアンチセンス鎖の各々のための“コード配列”を含むように設計される。コード配列は、同じ配列、例えば、逆位プロモーターにより隣接した配列であり得るか、または別々のプロモーターの転写制御下での各々2つの別々の配列であり得る。コード配列が転写された後、相補的RNA転写産物が塩基対を形成し、二本鎖RNAを生じる。
【００９６】
トランスジーンの両方向転写のための典型的なベクターがPCT出願WO01/77350に記載されており、それは、真核細胞内で同じトランスジーンのセンスおよびアンチセンスRNAを産生する。したがって、特定の局面において、本発明は、下記の特有の特徴を有する組み換えベクターを提供する: それは、反対方向に配置された2つの重複転写単位を有し、興味のあるRNAi構築体のためのトランスジーンに隣接するウイルスレプリコンを含み、ここで、2つの重複転写単位は、宿主細胞内で、同じトランスジーン断片から、センスおよびアンチセンスRNA転写産物を生じる。
【００９７】
RNAi構築体は、標的核酸配列と同一であるか、もしくは実質的に同一である二本鎖RNAの長鎖(long stretches)または標的核酸配列の一部の領域にのみ同一であるか、もしくは実質的に同一である二本鎖RNAの短鎖(short stretches)を含み得る。長鎖または短鎖RNAi構築体を製造および送達する方法は、例えば、WO01/68836およびWO01/75164に見い出され得る。
【００９８】
特定の遺伝子または特定の遺伝子ファミリーを特異的に認識する典型的なRNAi構築体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの選択に関して、上記で詳述した方法を用いて、選択し得る。同様に、RNAi構築体を送達する方法は、上記で詳述したアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達するための方法を含む。一般に、上記の方法のいずれかが、C5タンパク質の存在もしくは翻訳もしくは活性を減少させることが予測される。
【００９９】
RNAi発現カセットの設計は、本発明の範囲を限定しない。RNAi発現カセットを設計するために、異なる戦略を適用することができ、異なる設計に基づくRNAi発現カセットは、インビボでのRNA干渉を誘導することができる(RNAi発現カセットの設計は、本発明の範囲を限定するものではないが、いくつかのRNAi発現カセット設計が、本発明の詳細な説明に含まれ、下記する)。
【０１００】
すべてのRNAi発現カセットに共通する特徴は、それらが、RNA分子をコードするRNAコード領域を含むことであり、それは、分子内で、または分子間で、単独で、もしくは他のRNA分子と組み合わせて、二本鎖RNA複合体を形成することによりRNA干渉を誘導することができる。
【０１０１】
異なる設計原理を、同じ目的を達成するために使用し得て、当業者に既知である。例えば、RNAi発現カセットは、1種またはそれ以上のRNA分子をコードし得る。RNAi発現カセットからのRNAの発現後、もしくは発現中に、二本鎖RNA複合体が単一自己相補的RNA分子または2つの相補的RNA分子により形成され得る。dsRNA複合体の形成は、核の内外で開始され得る。
【０１０２】
RNAi標的遺伝子は、本発明の範囲を限定するものではなく、C5活性もしくは発現に関与するすべての遺伝子であり得る。したがって、RNAi標的遺伝子の選択は、本発明を限定するものではなく: 当業者は、興味のある任意のRNAi標的遺伝子の遺伝子発現をダウンレギュレートするRNAi発現カセットを設計する方法について既知である。特定のRNAi標的遺伝子および送達法に依存して、該手順は、RNAi標的遺伝子の部分的もしくは完全な機能の欠失を提供し得る。
【０１０３】
アプタマー
アプタマーは、標的に対して望まれる作用を有する、非天然に生じる核酸である。望まれる作用は、標的の結合、標的を触媒的に改変すること、標的または標的の機能的活性を修飾/改変する方法で、標的と反応させること、自殺阻害剤として標的に共有結合させること、標的と他の分子間の反応を促進させることを含むが、これらに限定されない。本発明の場合の標的は、ヘッジホッグシグナル伝達経路の構成要素である。
【０１０４】
アプタマーは、SELEX法(Gold, et al., PNAS 94:59-64, 1997)に基づいて同定される。その最も基本的な形態では、SELEX法は、一連の下記の工程により定義され得る:
【０１０５】
異なる配列の核酸の候補混合物を調製する。候補混合物は、一般に、固定配列の領域(すなわち、候補混合物のメンバーの各々が、同じ位置に同じ配列を含む)および無作為配列の領域を含む。固定配列領域は、(a) 下記の増幅工程を助けるか、(b) 標的に結合することが知られている配列を模倣するか、または(c) 候補混合物中で特定の構造配置の濃度を高めるために選択される。無作為配列は、全体的に無作為であるか(すなわち、任意の位置で塩基を見出し得る可能性は、4つのうちの1つである)、または部分的に無作為であり得る(例えば、任意の位置で塩基を見出し得る可能性は、0〜100%の任意のレベルで選択し得る)。
【０１０６】
標的と候補混合物のメンバー間の結合のために好ましい条件下で、候補混合物を選択した標的と接触させる。これらの状況下で、標的と候補混合物の核酸間の相互作用は、標的と標的について最も強い親和性を有する核酸の間で核酸-標的対を形成するものと考えられ得る。
【０１０７】
標的についての最も高い親和性を有する核酸を、標的へのより低い親和性を有する核酸から分画する。最大親和性核酸に相当する極端に少ない数の配列のみ(および1個のみの核酸分子の場合もあり得る)が、候補化合物中に存在するので、一般には、混合物中のかなりの量(約5-50%)の核酸が分画の間に保持される分画基準を設定することが望ましい。
【０１０８】
次いで、標的に対して相対的に高い親和性を有するものとして分画の間に選択された核酸を、標的に対して相対的に高い親和性を有する核酸に富んだ新しい候補混合物を作製するために増幅する。
【０１０９】
上記の分画および増幅工程を繰り返すことにより、新たに形成された候補混合物は、弱い結合配列を含まないようになり、標的に対する核酸の平均的な親和性の程度は、一般的に増加する。最終的には、SELEX法は、1個または少数の核酸を含む候補混合物を産生し、それは、標的分子に対する最も高い親和性を有する元の候補混合物由来の核酸を示す。
【０１１０】
医薬としての使用のために望ましい核酸を産生するために、核酸リガンドは、(1) 標的に対する望む効果を達成することができる方法で標的に結合し; (2) 望む効果を得るようにできるだけ小さく; (3)できるだけ安定しており; そして(4) 選択した標的に対して特異的なリガンドであることが好ましい。最も好ましいのは、核酸リガンドが、標的に対しておそらく最大であろう親和性を有することである。
【０１１１】
SELEX特許出願は、この工程に関して詳述している。下記の工程で使用される標的が含まれる; 候補化合物内の核酸を分画する方法; および分画した核酸を増幅し、豊富な候補混合物を産生する方法。SELEX特許出願はまた、タンパク質が、核酸結合タンパク質である場合とない場合の両タンパク質を含む、多くの標的種に対して得られたリガンドを開示している。SELEX法はさらに、1995年5月4日に出願され、表題が“Nucleic Acid Ligand Complexes”である米国特許出願第08/434,465号に記載されたとおり、診断もしくは治療複合体中で、選択した核酸リガンドを脂溶性もしくは非免疫原性高分子量化合物と結合させることを含む。
【０１１２】
本発明の特定の態様では、非免疫原性高分子量化合物もしくは脂溶性化合物と共有結合した、C5タンパク質の成分に対する1個またはそれ以上の核酸リガンドを含む複合体を提供することが望ましい。非免疫原性高分子量化合物は、約100 Daから1,000,000 Da、より好ましくは、約1000 Daから500,000 Da、最も好ましくは、約1000 Daから200,000 Daの化合物であり、典型的には、免疫応答を産生しない。本発明の目的のために、免疫応答は、生物が抗体タンパク質を製造する1つである。本発明の1つの好ましい態様では、非免疫原性高分子量化合物は、ポリアルキレングリコールである。最も好ましい態様では、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール(PEG)である。より好ましくは、PEGは、約10-80Kの分子量を有する。最も好ましくは、PEGは、約20-45Kの分子量を有する。本発明の特定の態様では、非免疫原性高分子量化合物もまた、核酸リガンドであり得る。
【０１１３】
抗体
特定の態様では、本発明の化合物は、補体経路機能を阻害する結合分子を同定するために有用である。
【０１１４】
本発明の化合物(すなわち、C5のエピトープ)(その部分もしくは断片を含む)は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体作製のための標準的な技術を用いて、C5ポリペプチドに結合する結合分子、好ましくは、抗体を作製するための免疫原として使用し得る。本発明の化合物は、配列番号1、3および5に示されたアミノ酸配列の少なくとも4個の残基を含み、直線状および非直線状エピトープを包含し、結合分子は、特異的な免疫複合体を形成するような方法で、C5ペプチドの抗原性部分に結合する。好ましくは、化合物は、少なくとも6、8、10、15、20または30個のアミノ酸残基を含む。より長いペプチドは、ときどき、使用に依存して、および当業者に既知の方法にしたがって、より短いペプチドよりも好ましい。
【０１１５】
典型的には、ペプチドは、適当な対象(例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他のほ乳類)を免疫原で免疫することにより抗体を作製するのに使用し得る。適当な免疫原調製物は、例えば、組み換え的に作製された副経路成分、例えば、C5タンパク質、またはその部分もしくは断片、または化学的に合成された副経路成分、例えば、C5ペプチドまたはアンタゴニストを含む。例えば、米国特許第5,460,959号、第5,601,826号、第5,994,127号、第6,048,729号、第6,083,725号を参照のこと(その各々は、引用によりそれらの全体を本明細書の一部とする)。調製物は、さらに、フロイント完全もしくは不完全アジュバントのようなアジュバント、または同様の免疫刺激剤を含む。免疫原性の副経路成分、例えば、C5タンパク質、またはその部分もしくは断片の免疫化は、ポリクローナル抗体応答を誘導する。
【０１１６】
独立して提案されたエピトープ配列(配列番号1、3、5)の各々について、抗体または抗体認識部位として、同定されたアミノ酸残基のすべてに、または同定されたアミノ酸残基の一部に結合する抗体は、別のもしくは古典的経路のC5転換酵素によりタンパク質分解される、C5のαおよび/またはβ鎖上の切断部位の近接であることが予期される。したがって、該抗体は、C5αもしくはβ切断部位の近接内のエピトープに結合し、立体障害を介して、機能的に切断部位のタンパク質分解を阻害することにより、C5の切断を阻害する能力を有することが提案される。
【０１１７】
ヒト補体成分に結合するか、またはその産生および/または活性を妨害する結合分子が想定される。したがって、結合分子は、本明細書において、C5aの産生および/またはC5bと関連する膜侵襲複合体(MAC)の構築を予防するか、もしくは阻害するのに有用である。本発明のある結合分子は、補体成分C5と結合するものを含み、したがって、MAC複合体の構築を生じるC5aおよびCb5への変換を阻害する。
【０１１８】
興味のある抗原、例えば、C5ポリペプチド抗原に“結合する”結合分子は、十分な結合親和性をもって抗原に結合する分子であり、その結果、結合分子は、抗原を発現する細胞もしくは組織において、診断および/または治療剤として有用であり、他のタンパク質とほとんど交差反応を示さない。1つの局面では、“非標的”タンパク質への、例えば、抗体の結合量は、蛍光標識細胞分取(FACS)解析または放射性免疫沈降法(RIA)により決定されたとき、その特定の標的タンパク質への抗体の結合の約10%未満であり得る。標的分子への抗体の結合に関して、“特異的結合”もしくは“に特異的に結合する”または特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープに“特異的な”なる用語は、測定可能なほどに、非特異的な相互作用とは異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有さない類似構造の分子であるコントロール分子の結合と比較した、分子の結合を決定することにより測定し得る。例えば、特異的結合は、標的に類似するコントロール分子、例えば、過剰量の非標識標的との競合により決定し得る。この場合に、プローブへの標識化標的の結合が、過剰量に非標識標的により競合的に阻害されるとき、特異的結合を示す。本明細書で使用する、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープに“特異的な結合”またはそれらに“に特異的に結合する”またはそれらに“に特異的である”なる用語は、例えば、少なくとも、約10-4 M、あるいは少なくとも、約10-5 M、あるいは少なくとも、約10-6 M、あるいは少なくとも、約10-7 M、あるいは少なくとも、約10-8 M、あるいは少なくとも、約10-9 M、あるいは少なくとも、約10-10 M、あるいは少なくとも、約10-11 M、あるいは少なくとも、約10-12 M、またはそれ以上の標的についてのKdを有する分子量により示され得る。1つの局面では、“特異的結合”なる用語は、化合物が、あらゆる他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合のことを意味する。
【０１１９】
本明細書で使用するための特に有用な結合分子は、補体成分C5の補体成分C5aおよびC5bへの変換を直接または間接的に減少させる抗体である。有用な抗体の1つのクラスは、少なくとも1つの抗体-抗原結合部位を有し、ヒト補体成分C5への特異的な結合を示すものであり、ここで、特異的結合は、ヒト補体成分C5のα鎖に標的化される。より特には、モノクローナル抗体(mAb)を使用し得る。そのような抗体は、1) ヒト体液中の補体活性を阻害し;2) 精製したヒト補体成分C5のヒト補体成分C3またはヒト補体成分C4への結合を阻害し: および/または3) C5aのためにヒト補体活性化産物に特異的に結合しない。特に有用な補体阻害剤は、C5a ELISAまたは溶血アッセイで測定したとき、C5aおよび/またはC5b-9の産生を、約30%、40%または50%以上減少させる化合物である。
【０１２０】
機能的には、適当な抗体は、C5の切断を阻害し、その結果、有力な炎症性分子であるC5aおよびC5b-9(最終補体複合体)の産生を阻害する。補体経路異常調節と関連する障害、好ましくは、本明細書に開示した眼の疾患を処置するのに使用し得る好ましい抗C5抗体は、C5またはその断片、例えば、C5aもしくはC5bに結合する。好ましくは、抗C5抗体は、精製ヒト補体成分C5のαおよび/またはβ鎖上のエピトープに対して免疫反応性であり、C5転換酵素によるC5のC5aおよびC5bへの変換を妨害することができる。この能力は、Wurzner, et al., Complement Inflamm 8:328-340, 1991に記載された技術を用いて測定し得る。
【０１２１】
特に有用な局面では、抗C5抗体は、精製ヒト補体成分C5のβ鎖上のエピトープおよび/またはα鎖内のエピトープ、好ましくは、配列番号1、3および5からなる群から選択されるエピトープに対して免疫反応性がある。この局面において、抗体はまた、C5転換酵素によるC5のC5aおよびC5bへの変換を妨害することができる。α鎖内で、最も好ましい抗体は、アミノ末端領域に結合するが、それらは、遊離C5aに結合しない。
【０１２２】
本発明の他の局面は、C5に結合し、副経路のC5転換酵素(C3bBbC3b)のみによるその切断を阻害する治療抗体の作製および使用である。そのような抗体は、古典的経路の補体のC5転換酵素(C3bC4bC2a)の通常の機能を妨害することなしに、副経路の異常調節を生じる多型から生じる補体活性を阻害することが予期され得る。
【０１２３】
本明細書に記載した抗C5抗体は、ヒトモノクローナル抗体を含む。ある局面では、C3bに結合する抗体の抗原結合部分(例えば、VHおよびVL鎖)を、他の抗C5結合分子を作製するために“混合および適合させる”。そのような“混合および適合化”抗体の結合は、上記結合アッセイ(例えば、ELISA)を用いて試験し得る。特定のVL配列と混合し、適合させるVHを選択するとき、典型的には、VLとの対で、それが置換されるVHと構造的に類似したVHを選択する。同様に、特定の完全長重鎖/完全長軽鎖対からの完全長重鎖配列は、構造的に類似した完全長重鎖配列で置換され得る。同様に、特定のVH/VL対からのVL配列は、構造的に類似したVL配列で置換され得る。同様に、特定の完全長重鎖/完全長軽鎖対からの完全長軽鎖配列は、構造的に類似した完全長軽鎖配列で置換され得る。この文脈で構造類似性を同定することは、当分野で既知の方法である。
【０１２４】
他の局面では、本発明は、1種またはそれ以上のC5結合抗体の重鎖および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3をさまざまな形態で含む抗体を提供する。これらの抗体の各々がC5に結合し、抗原結合特異性が、主に、CDR1、2および3領域により提供されるとき、VH CDR1、2および3配列ならびにVL CDR1、2および3配列を、“混合し、適合させ”得る(すなわち、異なる抗体由来のCDRを、混合し、適合させ得る)。そのような“混合し、適合させ”た抗体のC5結合は、本明細書に記載した結合アッセイ(例えば、ELISA)を用いて試験し得る。VH CDR配列を混合し、適合させるとき、特定のVH配列由来のCDR1、CDR2および/またはCDR3配列を、構造的に類似したCDR配列で置換し得る。同様に、VL CDR配列を混合し、適合させるとき、特定のVL配列由来のCDR1、CDR2および/またはCDR3配列を、構造的に類似したCDR配列で置換し得る。この文脈で構造類似性を同定することは、当分野で既知の方法である。
【０１２５】
本明細書で使用するとき、ヒト抗体は、抗体の可変領域もしくは完全長鎖が、該配列の起源としてヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られるとき、特定の生殖細胞系列配列“の産物”もしくはそれ“に由来する”重鎖もしくは軽鎖可変領域または完全長重鎖もしくは軽鎖を含む。1つのそのような系では、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスで作製する。トランスジェニックマウスを興味のある抗原(例えば、C5のエピトープおよびさらに下記したもの)で免疫する。あるいは、ヒト抗体は、ファージ上に提示したヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを提供し、興味のある抗原(例えば、C5タンパク質またはエピトープ)でライブラリーをスクリーニングすることにより同定される。
【０１２６】
ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列“の産物”もしくはそれ“に由来する”ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列と比較し、ヒト抗体の配列と配列が最も近いヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列(すなわち、最大%同一性)を選択することにより、それ自体同定し得る。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列“の産物”もしくはそれ“に由来する”ヒト抗体は、生殖細胞系列コード配列と比較して、アミノ酸差異を含み得て、それは、例えば、天然に生じる体細胞突然変異または人工的な部位特異的突然変異によるものである。しかしながら、選択されたヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされたアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸を有し、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖細胞系列配列)と比較して、ヒト抗体がヒトであることを同定するためのアミノ酸残基を含む。ある場合には、ヒト抗体のアミノ酸配列は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、少なくとも、60%、70%、80%、90%、または少なくとも、95%、またはさらに少なくとも、96%、97%、98%、または99%同一であり得る。
【０１２７】
2つの配列間の%同一性は、ギャップの数、および各ギャップの長さ(それらは、2つの配列の最適アライメントを導入するのに必要とされる)を考慮した、該配列により共有される同一部分の数の関数(すなわち、%同一性 = 同一部分の数/部分の全数 x 100)である。2つの配列間の配列の比較および%同一性の決定は、E. Meyers and W. Millerのアルゴリズム(1988 Comput. Appl. Biosci., 4:11-17)を用いて決定され、それは、PAM120重量残基表(weight residue table)、12のギャップ長ペナルティおよび4のギャップペナルティを用いたALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれている。
【０１２８】
典型的には、特定のヒト生殖細胞系列配列に由来するヒト抗体のVHもしくはVLは、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、10個以下のアミノ酸差異を示す。特定の場合には、ヒト抗体のVHもしくはVLは、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、5個以下の、または4、3、2もしくは1個以下のアミノ酸差異を示し得る。
【０１２９】
ラクダ抗体
New Worldメンバー、例えば、ラマ種(Lama paccos、Lama glamaおよびLama vicugna)を含む、ラクダおよびヒトコブラクダ(Camelus bactrianusおよびCalelus dromaderius)ファミリーのメンバーから得られた抗体タンパク質は、サイズ、構造複雑性およびヒトに対する免疫原性に関して特徴づけられている。ほ乳類のこのファミリーにおいて実際上見出された特定のIgG抗体は、軽鎖を欠いており、したがって、他の動物由来の抗体に典型的な2つの重鎖および2つの軽鎖を有する4つの鎖の四次構造とは構造的に異なる。WO 94/04678を参照のこと。
【０１３０】
VHHとして同定された小さな単一可変ドメインであるラクダ抗体の領域は、遺伝学的な改変により得ることができ、標的についての高い親和性を有する小さなタンパク質を産生し、その結果、“ラクダ抗体”として既知の低分子量抗体由来タンパク質を生じる。米国特許第5,759,808号を参照; また、Stijlemans et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger et al., 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62; およびLauwereys. et al., 1998 EMBO J. 17: 3512-3520を参照のこと。ラクダ抗体および抗体断片の改変ライブラリーは、例えば、Ablynx, Ghent, Belgiumから市販で入手可能である。非ヒト起源の他の抗体に関して、ラクダ抗体のアミノ酸配列を組み換え的に改変し、よりヒト配列に類似した配列を得ることができる(すなわち、ナノボディを“ヒト化”し得る)。したがって、ラクダ抗体のヒトに対する天然の低抗原性をさらに減少させ得る。
【０１３１】
ラクダナノボディは、ヒトIgG分子の約10分の1の分子量を有し、該タンパク質は、わずか数ナノメーターの物理的直径を有する。小サイズの1つの結果は、より大きな抗体タンパク質には機能的に認識されない抗原性部位に結合することが可能なラクダナノボディの能力であり、それはすなわち、ラクダナノボディが、古典的な免疫学的技術を用いて、別に隠れている抗原を検出する試薬として、および有望な治療剤として有用であることを示す。したがって、また、小サイズにより生み出される他の結果は、ラクダナノボディが、標的タンパク質の溝もしくは狭い裂け目内の特定の部位に結合する結果としてそれを阻害し、それにより、古典的抗体の機能よりも古典的低分子量薬剤の機能により近似した能力をもって作用することである。
【０１３２】
さらに、低分子量およびコンパクトサイズのために、ラクダナノボディは、極端に熱安定性であり、極端なpHおよびタンパク質分解消化に対して安定であり、抗原性がほとんどない。他の結果は、ラクダナノボディが、循環系から組織へ、さらに血液脳関門を越えて、容易に移動し、神経組織に影響を与える傷害を処置し得ることである。ナノボディは、さらに、血液脳関門を越える薬剤輸送を促進する。2004年8月19日に公開された米国特許第20040161738号を参照のこと。ヒトでの弱い抗原性と合わせたこれらの特徴は、多大な治療可能性を示す。さらに、これらの分子は、E. coliのような原核細胞で十分に発現し得る。
【０１３３】
したがって、本発明の特徴は、C5についての高親和性を有するラクダ抗体もしくはラクダナノボディである。本明細書の特定の局面において、ラクダ抗体もしくはナノボディは、ラクダ内で天然に産生され、それは、すなわち、他の抗体のために本明細書に記載した技術を用いて、C5またはそのペプチド断片で免疫した後に、ラクダにより産生される。あるいは、抗C5ラクダナノボディは改変され、すなわち、例えば、標的として、本明細書に記載したC5またはC5エピトープでのパニング手順を用いて、適当な突然変異ラクダナノボディタンパク質を示すファージライブラリーからの選択により産生される。改変ナノボディはさらに、レシピエント対象において、45分から2週間まで半減期を増加させるような遺伝学的改変により作製し得る。
【０１３４】
ダイアボディ
ダイアボディは、VHおよびVLドメインを、リンカーにより結合された単一ポリペプチド鎖上で発現する、二価、二重特異性分子であり、それは、非常に短いので、同じ鎖上の2つのドメイン間で対を形成しない。VHおよびVLドメインは、他の鎖の相補的ドメインと対を形成し、それにより、2つの抗原結合部位を産生する(例えば、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123を参照)。ダイアボディは、同じ細胞内で、構造VHA-VLBおよびVHB-VLA (VH-VL構造)、またはVLA-VHBおよびVLB-VHA (VL-VH構造)を有する2つのポリペプチド鎖を発現させることにより、作製し得る。それらの多くは、細菌中に可溶形で発現させ得る。
【０１３５】
一本鎖ダイアボディ(scDb)は、2つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖を約15個のアミノ酸残基のリンカーで連結させることにより産生する(Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36を参照)。scDbは、細菌中に可溶性単量体形で発現させることができる(Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21を参照)。ダイアボディをFcと融合させ、“ジダイアボディ(di-diabody)”を作製することも可能である(Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65を参照)。
【０１３６】
改変および修飾抗体
本発明の抗体は、1個またはそれ以上のVHおよび/またはVL配列を有する抗体を出発物質として用いて修飾抗体を作製することで作製し得る。該修飾抗体は、出発抗体からの特性を変え得る。抗体は、一方もしくは両方の可変領域(すなわち、VHおよび/またはVL)内、例えば、1個もしくはそれ以上のCDR領域内の、および/または、1個もしくはそれ以上のフレームワーク領域内の1個またはそれ以上の残基を修飾することにより改変し得る。さらにあるいは、抗体は、定常領域内の残基を修飾することにより、例えば、抗体のエフェクター機能を変えることにより改変し得る。
【０１３７】
行い得る可変領域改変の1つの型は、CDR移植である。抗体は、主に、6つの重鎖および軽鎖CDRに位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。このために、CDR内のアミノ酸配列は、CDRの外側の配列よりも個々の抗体間でより多様である。CDR配列は、たいていの抗体-抗原相互作用に関与しているので、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植された特定の天然で生じる抗体由来のCDR配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然で生じる抗体の特性を模倣した組み換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen et al., 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; 米国特許第5,225,539号、ならびに米国特許第5,530,101号; 第5,585,089号; 第5,693,762号および第6,180,370号を参照)。
【０１３８】
フレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公のDNAデータベースもしくは公開文献から得ことが可能である。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子についての生殖細胞系列DNA配列は、“VBase”ヒト生殖細胞系列配列データベース(www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbaseのインターネット上で利用可能である)、ならびにKabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992  J. Mol. Biol. 227:776-798; およびCox et al., 1994 Eur. J. Immunol. 24:827-836に見出すことができ、その各々の内容は、引用により本明細書の一部とする。
【０１３９】
VH CDR1、2および3配列ならびにVL CDR1、2および3配列を、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子に見出されたものと同一の配列を有するフレームワーク領域に移植し得るか、またはCDR配列を、生殖細胞系列配列と比較して、1個またはそれ以上の突然変異を含むフレームワーク領域に移植し得る。例えば、特定の例では、抗体の抗原結合能力を維持するか、または促進するために、フレームワーク領域内の残基に突然変異を導入することが有益であることが見出された(例えば、米国特許第5,530,101号; 第5,585,089号; 第5,693,762号および第6,180,370号を参照)。
【０１４０】
CDRはまた、免疫グロブリンドメイン以外のポリペプチドのフレームワーク領域に移植し得る。適当なスカホールドは、移植残基を示す構造的に安定なフレームワークを形成し、それにより、それらは、局在化した表面を形成し、興味のある標的(例えば、C5抗原)に結合する。例えば、CDRをスカホールドに移植し得て、そこでは、フレームワーク領域は、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノスタチン、シトクロームb、CP1ジンクフィンガー、PST1、コイルドコイル、LACI-D1、Zドメインまたはテンダミスタット(tendramisat) (例えば、Nygren and Uhlen, 1997 Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469を参照)に基づく。
【０１４１】
他の型の可変領域修飾は、VHおよび/またはVL CDR1、CDR2および/またはCDR3領域内のアミノ酸残基の突然変異であり、それにより、興味のある抗体の1個またはそれ以上の結合特性(例えば、親和性)を改善する(“親和性成熟”として既知である)。部位特異的突然変異誘発またはPCR仲介突然変異誘発を、突然変異を導入するために行い得て、抗体結合または興味のある他の機能的特性についての効果を、本明細書に記載したインビトロもしくはインビボアッセイで評価し得る。保存的修飾を導入することも可能である。突然変異は、アミノ酸置換、付加または欠失であり得る。さらに、典型的には、CDR領域内の1、2、3、4もしくは5個の残基のみが改変される。
【０１４２】
本発明の改変抗体は、修飾が、例えば、抗体の特性を改善するために、VHおよび/またはVL内のフレームワーク残基で行われたものを含む。典型的には、そのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、1つの方法は、1個またはそれ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列に“復帰突然変異させる”ことである。より特には、体細胞突然変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定し得る。フレームワーク配列をそれらの生殖細胞系列構造に戻すために、体細胞突然変異を、例えば、部位特異的突然変異誘発またはPCR仲介突然変異誘発により、生殖細胞系列配列に“復帰突然変異させ”得る。そのような“復帰突然変異”抗体は、また、本発明に包含されることを意図する。
【０１４３】
フレームワーク修飾の他の型は、フレームワーク領域内の、またはさらに、1個またはそれ以上のCDR領域内の1個またはそれ以上の残基を突然変異させることを含み、T細胞-エピトープを除去し、それにより、抗体の潜在的な免疫原性を減少させる。この方法はまた、“脱免疫化”と呼ばれ、さらに、Carr et al.による米国特許第20030153043号に詳述されている。
【０１４４】
フレームワークまたはCDR領域内において為される修飾に加えて、本発明の抗体は、Fc領域内の修飾を含むように改変し得て、典型的には、1個またはそれ以上の抗体の機能的特性、例えば、血清半減期、補体固定、Fc受容体結合、および/または抗原依存性細胞毒性を変えることができる。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾し得る(例えば、1個またはそれ以上の化学的部分を抗体に結合させ得る)か、またはその糖修飾を変えるように、さらに、1個またはそれ以上の抗体の機能的特性を変えるように修飾し得る。
【０１４５】
1つの局面では、CH1のヒンジ領域が修飾され、ヒンジ領域における多くのシステイン残基が改変される(例えば、増加または減少)。この方法は、さらに、Bodmer et al.による米国特許出願第5,677,425号に記載されている。CH1のヒンジ領域における多くのシステイン残基が、例えば、軽鎖および重鎖の構築を促進するように、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるために、改変される。
【０１４６】
他の局面では、抗体のFcヒンジ領域を、抗体の生物学的半減期を減少させるように突然変異させる。より特には、1個またはそれ以上のアミノ酸突然変異を、Fc-ヒンジ断片のCH2-CH3ドメインインターフェース領域に導入し、その結果、該抗体は、天然のFc-ヒンジドメインブドウ球菌タンパク質A (SpA)結合と比較して、SpA結合を減少させた。この方法はさらに、Ward et al.による米国特許第6,165,745号に詳述されている。
【０１４７】
他の局面では、抗体を、その生物学的半減期を増加させるように修飾する。さまざまな方法が可能である。例えば、米国特許第6,277,375号は、インビボでのその半減基を増加させる、IgGにおける下記の突然変異を開示している: T252L、T254S、T256F。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、Presta et al.による米国特許第5,869,046号および第6,121,022号に記載されたとおり、抗体を、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから得られるサルベージ(salvage)受容体結合エピトープを含むように、CH1もしくはCL領域内で改変し得る。
【０１４８】
また他の局面では、Fc領域を、少なくとも1個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換し、抗体のエフェクター機能を変えることにより改変する。例えば、1個またはそれ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換することができ、その結果、該抗体は、エフェクターリガンドについての改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持する。親和性を改変するエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1成分であり得る。この方法は、さらに、Winter et al.による米国特許第5,624,821号および第5,648,260号に詳述されている。
【０１４９】
他の局面では、アミノ酸残基から選択される1個またはそれ以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置換することができ、その結果、該抗体は、C1q結合を改変し、および/または補体依存性細胞障害(CDC)を減少させるか、もしくは消失させた。この方法は、さらに、Idusogie et al.による米国特許第6,194,551号に詳述されている。
【０１５０】
他の局面では、1個またはそれ以上のアミノ酸残基を改変し、それにより、補体を固定する抗体の能力を変える。この方法は、さらに、WO 94/29351に記載されている。
【０１５１】
また他の局面では、Fc領域を、抗体依存性細胞毒性(ADCC)を仲介する抗体の能力を増加させるために、および/または1個またはそれ以上のアミノ酸を修飾することにより、Fcγ受容体についての抗体の親和性を増加させるために修飾する。この方法は、さらに、PrestaによるWO 00/42072に記載されている。さらに、FcγRl、FcγRII、FcγRIIIおよびFcRnのためのヒトIgG1上の結合部位をマッピングし、改善された結合を有する変異型が記載されている(Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604を参照)。
【０１５２】
また他の局面では、抗体の糖修飾を修飾する。例えば、無糖抗体を作製し得る(すなわち、抗体は、糖修飾を欠損している)。糖修飾は、例えば、抗原についての抗体の親和性を増加させるように改変し得る。そのような糖修飾は、例えば、抗体配列内の1個またはそれ以上の糖修飾部位を改変することにより達成し得る。例えば、1個またはそれ以上のアミノ酸置換を行うことができ、その結果、1個またはそれ以上の可変領域フレームワーク糖修飾部位の除去、それによる該部位での糖修飾の除去を生じる。そのような糖修飾は、抗原についての抗体の親和性を増加させ得る。そのような方法は、さらに、米国特許第5,714,350号および第6,350,861号に記載されている。
【０１５３】
さらにまたは、糖修飾の改変型を有する抗体、例えば、減少した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体または増加したバイセクティングGlcNac構造を有する抗体を作製し得る。そのような改変糖修飾パターンは、抗体のADCC能を増大させることが証明されている。そのような糖修飾は、例えば、改変糖修飾機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成し得る。改変糖修飾機構を有する細胞は、当分野で既知であり、本発明の組み換え抗体を発現し、その結果、改変糖修飾を有する抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、Hang et al.によるEP 1,176,195は、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたFUT8遺伝子を有する細胞株を記載しており、その結果、そのような細胞株で発現する抗体は、低フコシル化を示す。PrestaによるPCT国際公開WO 03/035835は、フコースをAsn(297)結合糖鎖に結合させることに関して減少した能力を有する変異型CHO細胞株、Lecl3細胞を開示しており、それはまた、該宿主細胞内で発現する抗体の低フコシル化を生じる(また、Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740を参照)。Umana et al.によるWO 99/54342は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、β(1,4)-N アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII (GnTIII))を発現するように改変された細胞株を開示しており、そこでは、改変細胞株で発現した抗体は、増加したバイセクティングGlcNac構造を示し、それは、抗体の増加したADCC活性を生じる(また、Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180を参照)。
【０１５４】
本発明により考え得る本明細書中の抗体の他の修飾は、ペグ化である。例えば、抗体の生物学的(例えば、血清)半減期を増大させるためにペグ化し得る。抗体をペグ化するために、抗体またはその断片を、典型的には、ポリエチレングリコール(PEG)、例えば、PEGの反応性エステルもしくはアルデヒド誘導体と、1個またはそれ以上のPEG部分が抗体または抗体断片と結合する条件下で反応させる。ペグ化は、反応性PEG分子(または類似の反応性水可溶性ポリマー)を用いて、アシル化反応またはアルキル化反応により行うことができる。本明細書で使用する“ポリエチレングリコール”なる用語は、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されるPEGの任意の形態、例えば、モノ(C1-C10)アルコキシ-もしくはアリールオキシ-ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール-マレイミドを包含することを意図する。特定の局面では、ペグ化される抗体は、無糖抗体である。タンパク質をペグ化する方法は、当分野で既知であり、本発明の抗体に適用し得る。例えば、Nishimura et al.によるEP 0 154 316およびIshikawa et al.によるEP 0 401 384を参照のこと。
【０１５５】
さらに、ペグ化は、非天然アミノ酸の導入により、本発明のC5結合ポリペプチドの任意の部分で達成し得る。特定の非天然アミノ酸は、Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004または米国特許出願第7,083,970号に記載された技術により導入し得る。簡潔には、これらの発現系のいくつかは、ナンセンスコドン、例えば、アンバー(amber)TAGを、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに導入するための部位特異的突然変異誘発を含む。次いで、そのような発現ベクターを、導入したナンセンスコドンに特異的なtRNAを利用することができる宿主に導入し、最適な非天然アミノ酸でチャージする(charged)。部分を本発明のポリペプチドに結合させる目的のために有益な特定の非天然アミノ酸は、アセチレンおよびアジド側鎖を有するものを含む。次いで、これらの新規アミノ酸を含むポリペプチドを、タンパク質中の選択された部位でペグ化し得る。
【０１５６】
抗体を改変する方法
上記したとおり、抗C5抗体は、完全長重鎖および/または軽鎖配列、VHおよび/またはVL配列、またはそれに結合した定常領域により、新規抗C5抗体を作製するために使用し得る。例えば、抗体の1個またはそれ以上のCDR領域を、既知のフレームワーク領域および/または他のCDRと組み換え的に結合させ、新規組み換え改変抗C5抗体を作製し得る。修飾の他の型は、上記したものを含む。改変法のための出発物質は、1個またはそれ以上のVHおよび/またはVL配列、または1個またはそれ以上のそのCDR領域である。改変抗体を作製するために、実際に、1個またはそれ以上のVHおよび/またはVL配列、または1個またはそれ以上のそのCDR領域を有する抗体を作製する(すなわち、タンパク質として発現させる)必要はない。むしろ、配列中に含まれる情報を出発物質として使用して、元の配列に由来する“第2世代”配列を産生し、次いで、該“第2世代”配列をタンパク質として作製および発現させる。
【０１５７】
標準的な分子生物学的技術は、改変抗体配列を作製し、発現させるために使用し得る。改変抗体配列によりコードされる抗体は、それが由来する抗C5抗体の機能的特性のうちの1つ、いくつか、もしくはすべてを保持するものであり、ここで、機能的特性は、本明細書に記載したC5活性を含むが、これに限定されない。改変抗体の機能特性は、当分野で利用可能な、および/または本明細書に記載した標準的なアッセイ(例えば、ELISA)を用いて評価し得る。
【０１５８】
本発明の抗体を改変する方法の特定の局面において、突然変異を、抗C5抗体コード配列の全体もしくは部分にそって、無作為にまたは選択的に導入し得て、生じた修飾抗C5抗体を、本明細書に記載した結合活性および/または他の機能的特性(例えば、MAC形成を阻害し、補体経路異常調節を変調すること)についてスクリーニングし得る。突然変異法は、当分野で既知である。例えば、ShortによるPCT国際公開WO 02/092780は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーション構築、またはその組み合わせを用いて、抗体突然変異を作製およびスクリーニングする方法を開示している。あるいは、Lazar et al.によるWO 03/074679は、抗体の物理化学的特性を最適化するために、コンピュータースクリーニングを用いた方法を開示している。
【０１５９】
ヌクレオチド配列は、それが、産生細胞または生物、一般には、真核細胞、例えば、Pichiaのような酵母の細胞、昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)のようなほ乳類細胞またはヒト細胞において好ましいコドンを用いてアミノ酸配列をコードするように改変されたとき、“最適化された”と言われる。最適化ヌクレオチド配列は、元の出発ヌクレオチド配列(それは、また、“親”配列として知られている)によりコードされるアミノ酸配列と同一またはほぼ同一のアミノ酸配列をコードするように改変される。
【０１６０】
非抗体C5結合分子
本発明はさらに、抗体の機能的特性を示すが、他のポリペプチド(例えば、抗体遺伝子によりコードされたもの、もしくはインビボで抗体遺伝子の組み換えにより作製されたもの以外のポリペプチド)からそれらのフレームワークおよび抗原結合部分を得る、C5結合分子を提供する。これらの結合分子の抗原結合ドメイン(例えば、本発明のC5結合ドメインもしくはエピトープ)は、定方向進化過程を通して生じる。米国特許第7,115,396号を参照のこと。抗体の可変ドメインのそれ(“免疫グロブリン様”フォールド)に類似する全体のフォールド(overall fold)を有する分子は、適当なスカホールドタンパク質である。抗原結合分子を得るための適当なスカホールドタンパク質は、フィブロネクチンもしくはフィブロネクチン二量体、テネイシン、N-カドヘリン、E-カドヘリン、ICAM、チチン、GCSF-受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質色素タンパク質、ミエリン膜接着分子P0、CD8、CD4、CD2、MHCクラスI、T-細胞抗原受容体、CD1、C2およびVCAM-1のI-セットドメイン、ミオシン結合タンパク質CのI-セット免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質HのI-セット免疫グロブリンドメイン、テロキンのI-セット免疫グロブリンドメイン、NCAM、トゥイッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロンγ受容体、β-ガラクトシダーゼ/グルクロニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、T細胞抗原受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロームF、緑色蛍光タンパク質、GroELならびにタウマチンを含む。
【０１６１】
非抗体結合分子の抗原結合ドメイン(例えば、免疫グロブリン様フォールド)は、7.5 kDより大きく、10 kDより小さい分子量(例えば、7.5-10 kDの分子量)を有する。抗原結合ドメインを得るために使用されるタンパク質は、天然に生じるほ乳類タンパク質(例えば、ヒトタンパク質)であり、抗原結合ドメインは、それが由来するタンパク質の免疫グロブリン様フォールドと比較して、50%まで(例えば、34%、25%、20%、または15%まで)の突然変異アミノ酸を含む。免疫グロブリン様フォールドを有するドメインは、一般に、50-150個のアミノ酸(例えば、40-60個のアミノ酸)からなる。
【０１６２】
非抗体結合分子を作製するために、抗原結合表面を形成するスカホールドタンパク質の領域(例えば、抗体可変領域ドメイン免疫グロブリンフォールドのCDRと位置および構造が類似した領域)の配列が無作為化された、クローンライブラリーを作製する。ライブラリークローンを、興味のあるエピトープ(例えば、C5)への特異的結合に関して、および他の機能(例えば、C5活性の阻害)について試験する。選択したクローンを、さらなる無作為化および選択のための基礎として使用し、抗原についてのより高い親和性を有する誘導体を産生し得る。
【０１６３】
高親和性結合分子は、例えば、スカホールドとして、フィブロネクチンIIIの10番目のモジュール(10Fn3)を用いて作製される。ライブラリーを、10FN3の23-29、52-55、および78-87残基にある3つのCDR様ループの各々について構築する。各ライブラリーを構築するために、各CDR様領域に重複するDNA断片コード配列を、オリゴヌクレオチド合成により無作為化する。選択可能な10Fn3ライブラリーを産生するための技術は、米国特許第6,818,418号および第7,115,396号; Roberts and Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:12297; 米国特許第6,261,804号; 米国特許第6,258,558号; およびSzostak et al.によるWO98/31700に記載されている。
【０１６４】
非抗体結合分子は、標的抗原についての結合活性を増大させるために、二量体または多量体として作製し得る。例えば、抗原結合ドメインは、抗体の定常領域(Fc)との融合として発現させ、Fc-Fc二量体を形成する。例えば、米国特許第7,115,396号を参照のこと。
【０１６５】
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の他の局面は、本発明のC5結合分子をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞、細胞ライセートに存在し得るか、または部分的に精製されているか、もしくは実質的に純粋な形態での核酸であり得る。核酸は、アルカリ/SDS処理、CsCl分染法、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野で既知の他のものを含む標準的な技術により、他の細胞成分または他の不純物、例えば、他の細胞核酸もしくはタンパク質から精製されたとき、“単離される”か、または“実質的に純粋になる”。F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと。本発明の核酸は、例えば、DNAまたはRNAであり得て、イントロン配列を含み得るか、または含み得ない。1つの局面では、核酸は、cDNA分子である。核酸は、ベクター、例えば、ファージディスプレイベクター中に、または組み換えプラスミドベクター中に存在し得る。
【０１６６】
結合分子の核酸配列は、標準的な分子生物学的技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、下記に詳述したヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから作製したハイブリドーマ)により発現させた抗体に関して、ハイブリドーマにより作製された抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAは、標準的なPCR増幅法またはcDNAクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた(例えば、ファージディスプレイ技術を用いて)抗体に関して、該抗体をコードする核酸は、ライブラリーのメンバーであるさまざまなファージクローンから回収され得る。
【０１６７】
VHおよびVL断片をコードするDNA断片を得ると、これらの断片をさらに、例えば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子、Fab断片遺伝子またはscFv遺伝子に変換するための標準的な組み換えDNA技術により操作し得る。これらの操作において、VL-またはVH-をコードするDNA断片を、他のDNA分子と、または他のタンパク質、例えば、抗体定常領域もしくはフレキシブルリンカーをコードする断片と操作可能に結合させる。この文脈で使用する“操作可能に結合”なる用語は、例えば、2つのDNA断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームにあるか、またはタンパク質が望むプロモーターの制御下で発現するように、2つのDNA断片が機能的な方法で結合することを意味することを意図する。
【０１６８】
VH領域をコードする単離DNAを、VH-コードDNAを重鎖定常領域(CH1、CH2およびCH3)をコードする他のDNA分子と操作可能に結合させることにより、完全長重鎖遺伝子に変換させ得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当分野で既知であり(例えば、Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照)、これらの領域を包含するDNA断片は、標準的なPCR増幅法により得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgMもしくはIgD定常領域であり得る。Fab断片重鎖遺伝子に関して、VH-コードDNAを、重鎖CH1定常領域のみをコードする他のDNA分子に操作可能に結合させ得る。
【０１６９】
VL領域をコードする単離DNAを、VL-コードDNAを軽鎖定常領域であるCLをコードする他のDNA分子と操作可能に結合させることにより、完全長軽鎖遺伝子(およびFab軽鎖遺伝子)に変換させ得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当分野で既知であり(例えば、Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照)、これらの領域を包含するDNA断片は、標準的なPCR増幅法により得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であり得る。
【０１７０】
scFv遺伝子を作製するために、VH-およびVL-コードDNA断片を、フレキシブルリンカー、例えば、アミノ酸配列(Gly4 -Ser)3をコードする他の断片と操作可能に結合させ、その結果、VHおよびVL配列を、フレキシブルリンカーにより結合したVHおよびVL領域を有する、隣接一本鎖タンパク質として発現させ得る(例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554を参照)。
【０１７１】
モノクローナル抗体作製
モノクローナル抗体(mAb)は、慣用的なモノクローナル抗体方法論、例えば、Kohler and Milstein(1975 Nature, 256:495)の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術、またはライブラリーディスプレイ方法、例えば、ファージディスプレイを用いることを含むさまざまな技術により作製し得る。
【０１７２】
ハイブリドーマを作製するための動物系にはマウス系がある。マウスでのハイブリドーマ作製は、十分に確立された手順である。免疫化プロトコールおよび融合のための免疫化脾細胞の単離技術は、当分野で既知である。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合手順は、また、既知である。
【０１７３】
本発明のキメラもしくはヒト化抗体は、上記のとおり作製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて作製し得る。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAは、興味のあるマウスハイブリドーマから入手することができ、標準的な分子生物学的技術を用いて、非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含むように改変し得る。例えば、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域を、当分野で既知の方法を用いて、ヒト定常領域と結合させ得る(例えば、Cabilly et al.による米国特許第4,816,567号参照)。ヒト化抗体を作製するために、マウスCDR領域を、当分野で既知の方法を用いて、ヒトフレームワークに挿入し得る。例えば、米国特許第5,225,539号、ならびに米国特許第5,530,101号; 第5,585,089号; 第5,693,762号および第6,180,370号を参照のこと。
【０１７４】
特定の局面では、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。C5エピトープに対するそのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス免疫系よりもヒト免疫系の一部を有するトランスジェニックもしくはトランス染色体マウスを用いて作製し得る。これらのトランスジェニックもしくはトランス染色体マウスは、本明細書において、それぞれHuMAbマウスおよびKMマウスと呼ぶマウスを含み、本明細書では、集合的に、“ヒトIgマウス”と呼ぶ。
【０１７５】
HuMAbマウス(登録商標) (Medarex, Inc.)は、内在性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化突然変異と共に、非再編成ヒト重鎖(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリンミニ遺伝子座を含む(例えば、Lonberg et al., 1994 Nature 368(6474): 856 859を参照)。したがって、該マウスは、マウスIgMもしくはκの減少した発現を示し、免疫化に応答して、導入された重鎖および軽鎖トランスジーンが、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受け、高親和性のヒトIgGκモノクローナル抗体を産生する(上記Lonberg, N. et al., 1994; Lonberg, N.による1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93、およびHarding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546)。HuMAbの作製および使用、ならびに該マウスが有するゲノム修飾は、さらに、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; およびFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851に記載されており、その内容は、それらの全体を引用により本明細書の一部とする。さらに、Lonberg and Kayによる米国特許第5,545,806号; 第5,569,825号; 第5,625,126号; 第5,633,425号; 第5,789,650号; 第5,877,397号; 第5,661,016号; 第5,814,318号; 第5,874,299号; および第5,770,429号;; Surani et al.による米国特許第5,545,807号; Lonberg and Kay によるPCT国際公開WO 92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO 98/24884およびWO 99/45962; ならびにKorman et al.によるPCT国際公開WO 01/14424を参照のこと。
【０１７６】
他の局面では、本発明の抗体は、トランスジーンおよびトランス染色体に関してヒト免疫グロブリン配列を有するマウス、例えば、ヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランス染色体を有するマウスを用いて作製し得る。そのようなマウスは、本明細書では“KMマウス”と呼び、WO 02/43478に詳述されている。
【０１７７】
またさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスジェニック動物系が当分野で利用可能であり、本発明の抗C5抗体を作製するのに使用し得る。例えば、Xenomouse(登録商標) (Abgenix, Inc.)と呼ばれる別のトランスジェニック系を使用し得る。そのようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許第5,939,598号; 第6,075,181号; 第6,114,598号; 第6,150,584号および第6,162,963号に記載されている。
【０１７８】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランス染色体動物系が当分野で利用可能であり、本発明の抗C5抗体を作製するのに使用し得る。例えば、“TCマウス”と呼ばれるヒト重鎖トランス染色体およびヒト軽鎖トランス染色体を有するマウスを使用し得て; そのようなマウスは、Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランス染色体を有するウシが当分野で記載されており(Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894)、本発明の抗C5抗体を作製するのに使用し得る。
【０１７９】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、また、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いて作製し得る。そのようなヒト抗体を単離するためのファージディスプレイ法は、当分野で確立されている。例えば、Ladner et al.による米国特許第5,223,409号; 第5,403,484号; および第5,571,698号; Dower et al.による米国特許第5,427,908号および第5,580,717号; McCafferty et al.による米国特許第5,969,108号および第6,172,197号; ならびにGriffiths et al.による米国特許第5,885,793号; 第6,521,404号; 第6,544,731号; 第6,555,313号; 第6,582,915号および第6,593,081号を参照のこと。ライブラリーは、完全長C5抗原または配列番号1、3、5の特定のC5エピトープへの結合に関してスクリーニングし得る。
【０１８０】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、また、ヒト免疫細胞が再構築されており、その結果、ヒト抗体応答が免疫で産生され得るSCIDマウスを用いて作製し得る。そのようなマウスは、例えば、Wilson et al.による米国特許第5,476,996号および第5,698,767号に記載されている。
【０１８１】
ヒトIgマウスでのヒトモノクローナル抗体の作製
原核細胞(例えば、E. coli)または真核細胞(例えば、ほ乳類細胞、例えば、HEK293細胞)で発現させた精製組み換えヒトC5は、抗原として使用し得る。該タンパク質を、担体、例えば、キーホールリムペットヘモシアニン(KLH)と結合させ得る。
【０１８２】
C5 ネオ-エピトープに対する完全ヒトモノクローナル抗体は、HuMabトランスジェニックマウスのHCo7、HCo12およびHCo17株ならびにトランスジェニックトランス染色体マウスのKM株を用いて作製し、その各々は、ヒト抗体遺伝子を発現する。これらのマウス株の各々において、内在性マウスκ軽鎖遺伝子は、Chen et al., 1993 EMBO J.12:811-820に記載されたとおり、同型接合的に破壊され、内在性マウス重鎖遺伝子は、WO 01109187の実施例1に記載されたとおり、同型接合的に破壊され得る。これらのマウス株の各々は、Fishwild et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851に記載されたとおり、ヒトκ軽鎖トランスジーンであるKCo5を有する。HCo7株は、米国特許第5,545,806号; 第5,625,825号; および第5,545,807号に記載されたとおり、HCo7ヒト重鎖トランスジーンを有する。HCo12株は、WO 01/09187の実施例2に記載されたとおり、HCo12ヒト重鎖トランスジーンを有する。HCo17株は、HCo17ヒト重鎖トランスジーンを有する。KNM株は、WO 02/43478に記載されたとおり、SC20トランス染色体を含む。
【０１８３】
C5 エピトープに対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するために、HuMabマウスおよびKMマウスを、抗原として、精製組み換えC5、C5断片、またはその結合体(例えば、C5-KLH)を用いて、免疫した。HuMabマウスについての一般的な免疫化スキームは、Lonberg, N. et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851およびWO 98/24884に記載されている。6-16週齢のマウスに、抗原の最初の接種を行う。抗原の精製した組み換え調製物(5-50 μg)が、腹腔、皮下(Sc)もしくは足蹠注射で、HuMabマウスおよびKMマウスを免疫するために使用される。
【０１８４】
トランスジェニックマウスを、腹腔(IP)、皮下(Sc)もしくは足蹠注射(FP)で、完全フロイントアジュバントまたはRibiアジュバント内の抗原を用いて2回免疫し、その後、不完全フロイントアジュバントまたはRibiアジュバント内の抗原を用いて、3-21日間のIP、ScもしくはFP免疫化を行う(合計11回の免疫化まで)。免疫応答は、後眼窩採血によりモニターする。血漿をELISAによりスクリーニングし、抗C5ヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを、融合のために使用する。マウスを、安楽死させる3および2日前に、抗原で静脈内追加免疫を行い、脾臓を除去する。典型的には、各抗原について、10-35回の融合(fusions)を行う。数十匹のマウスを、各抗原について免疫する。全部で82匹のマウス(HCo7、HCo12、HCo17およびKMマウス株)を、C5抗原で免疫する。
【０１８５】
C5 エピトープに結合する抗体を産生するHuMabもしくはKMマウスを選択するために、免疫化マウスからの血漿を、Fishwild, D. et al., 1996に記載されたとおり、ELISAにより試験し得る。簡潔には、マイクロタイタープレートを、PBS中の1-2 μg /mlの精製した組み換えC5で被覆し(50 μl/ウェル)、4℃で一夜インキュベートし、次いで、200 μl/ウェルのPBS/Tween中の5% ニワトリ血清(0.05%)でブロックする。C5免疫化マウスからの血清の希釈物を各ウェルに加え、室温で1-2時間インキュベートする。プレートを、PBS/Tweenで洗浄し、次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合したヤギ抗ヒトIgG Fcポリクローナル抗体を用いて、室温で1時間、インキュベートする。洗浄後、プレートを、ABTS基質(Sigma, A-1888, 0.22 mg/ml)で展開し、分光光度計により、OD 415-495で解析する。抗C5抗体の最大の力価を示したマウスの脾細胞を融合のために使用する。融合を行い、ハイブリドーマ上清を、ELISAにより、抗C5活性に関して試験する。
【０１８６】
HuMabマウスおよびKMマウスから単離したマウス脾細胞を、標準的なプロトコールに基づいて、PEGを用いてマウス骨髄腫細胞株と融合させる。次いで、生じたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングする。免疫化マウス由来の脾臓内リンパ球の単一細胞懸濁物を、SP2/0非分泌マウス骨髄腫細胞(ATCC, CRL 1581)の4分の1の数に、50% PEG(Sigma)を用いて融合させ得る。細胞を、平底マイクロタイタープレートに、約1x10 5/ウェルで播種し、その後、DMEM (Mediatech, CRL 10013(高グルコース、Lグルタミンおよびピルビン酸ナトリウム)中の10% ウシ胎児血清、10% P388D 1(ATCC, CRL TIB-63)条件培地、3-5% Origen(登録商標) (IGEN)＋5 mM HEPES、0.055 mM 2-メルカプトエタノール、50 μmg/ml ゲンタマイシンおよびlx HAT (Sigma, CRL P-7185)を含む選択培地で、約2週間インキュベートする。1-2週間後、HATをHTで置換した培地で細胞を培養する。次いで、個々のウェルを、ヒト抗C5モノクローナルIgG抗体について、ELISAによりスクリーニングする。伸展したハイブリドーマ増殖が生じると、培地は、通常、10-14日後に観察し得る。抗体分泌ハイブリドーマを再び播種し、再度スクリーニングし、まだヒトIgGに関してポジティブであるときは、抗C5モノクローナル抗体を、少なくとも2回、限界希釈によりサブクローン化し得る。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養し、さらなる特徴づけのために、組織培養培地中に少量の抗体を産生させ得る。
【０１８７】
ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫したマウスから脾細胞および/またはリンパ節細胞を単離し、適当な不死化細胞株、例えば、マウス骨髄腫細胞株と融合させ得る。生じたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングし得る。例えば、免疫化マウス由来の脾臓内リンパ球の単一細胞懸濁物を、P3X63-Ag8.653非分泌マウス骨髄腫細胞(ATCC, CRL 1580)の6分の1の数と、50% PEGを用いて融合させ得る。細胞を、平底マイクロタイタープレートに、約2 x 145で播種し、その後、20% 胎児クローン血清、18% “653”条件培地、5% Origen(登録商標) (IGEN)、4 mM L-グルタミン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0:055 mM 2-メルカプトエタノール、50 ユニット/ml ペニシリン、50 μg/ml ストレプトマイシン、50 μg/ml ゲンタマイシンおよび1X HAT (Sigma; HATは、融合後、24時間加える)を含む選択培地で、2週間インキュベートする。約2週間後、細胞を、HATをHTで置換した培地で培養し得る。次いで、個々の細胞を、ヒトモノクローナルIgMおよびIgG抗体について、ELISAによりスクリーニングし得る。伸展したハイブリドーマ増殖が生じると、培地は、通常、10-14日後に観察し得る。抗体分泌ハイブリドーマを再び播種し、再度スクリーニングし、まだヒトIgGに関してポジティブであるときは、モノクローナル抗体を、少なくとも2回、限界希釈によりサブクローン化し得る。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養し、特徴づけのために、組織培養培地中に少量の抗体を産生させ得る。
【０１８８】
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択したハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のための2リットルスピナーフラスコで増殖させ得る。上清をろ過し、濃縮し、その後、protein A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.)を用いた親和性クロマトグラフィーを行い得る。溶出したIgGを、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで確認し、純度を保証し得る。緩衝液をPBSに交換し得て、濃度を、1.43の消光率を用いて、OD280により決定し得る。モノクローナル抗体を、一定分量に分けて(aliquoted)、-80℃で貯蔵し得る。
【０１８９】
モノクローナル抗体を産生するトランスフェクト細胞(transfectomas)の産生
本発明の抗体はまた、例えば、当分野で既知の組み換えDNA技術および遺伝子トランスフェクション法(例えば、Morrison, 1985 Science 229:1202)の組み合わせを用いて、トランスフェクト宿主細胞で産生させ得る。
【０１９０】
例えば、抗体、またはその抗体断片を発現させるために、部分もしくは完全長軽鎖および重鎖をコードするDNAを、標準的な分子生物学的技術(例えば、興味のある抗体を発現するハイブリドーマを用いたPCR増幅またはcDNAクローニング)により取得し得て、該遺伝子が転写および翻訳制御配列に操作可能に結合するように、該DNAを発現ベクターに挿入し得る。この文脈で、“操作可能に結合する”なる用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を制御するというそれらの意図する機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターに連結されることを意味することを意図する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入するか、またはより典型的には、両遺伝子を同じベクターに挿入し得る。抗体遺伝子は、標準的な方法(例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的な制限酵素部位のライゲーション、または制限酵素部位が存在しないとき、平滑末端ライゲーション)により、発現ベクターに挿入される。本明細書に記載した抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、それらを望まれるアイソタイプの重鎖および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクターに挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製するために使用され得て、その結果、VH断片は、ベクター内のCH断片(複数も可)と操作可能に結合し、VL断片は、ベクター内のCL断片と操作可能に結合する。さらに、あるいは、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで結合するように、ベクター中にクローン化し得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド)であり得る。
【０１９１】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する、制御配列を有する。“制御配列”なる用語は、抗体鎖遺伝子の転写もしくは翻訳を制御する、プロモーター、エンハンサーおよび発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図する。そのような制御配列は、例えば、Goeddel (Gene Expression Technology. 1990 Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA)に記載されている。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、望まれるタンパク質の発現レベルなどに依存し得ることは、当業者により当然に認識される。ほ乳類宿主細胞発現のための制御配列は、ほ乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、シミアンウイルス40 (SV40)、アデノウイルス、(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))、およびポリオーマに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサーを含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはP-グロビンプロモーターのような非ウイルス制御配列を使用し得る。またさらに、制御エレメントは、異なる起源由来の配列、例えば、SRaプロモーター系からなり、それは、SV40初期プロモーターおよび1型ヒトT細胞白血球ウイルスの長い末端反復由来の配列を含む(Takebe et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
【０１９２】
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本発明の組み換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞内でベクターの複製を制御する配列(例えば、複製開始点)および選択可能マーカー遺伝子を有する。選択可能マーカーは、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する(例えば、Axel et al.による米国特許第4,399,216号; 第4,634,665号; および第5,179,017号参照)。例えば、典型的な選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、薬剤、例えば、G418、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートに対する耐性を与える。選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子(メトトレキサート選択/増幅を用いたdhfr-宿主細胞での使用のために)およびネオ遺伝子(G418選択のために)を含む。
【０１９３】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準的な技術により宿主細胞にトランスフェクトする。“トランスフェクション”のさまざまな形態は、外因性DNAの原核もしくは真核宿主細胞への導入のために通常使用されるさまざまな技術、例えば、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図する。理論的には、原核もしくは真核宿主細胞で本発明の抗体を発現させることは可能である。真核細胞、特に、ほ乳類宿主細胞での抗体の発現は、そのような真核細胞、特に、ほ乳類細胞が、原核細胞よりも適切に折り畳まれた、免疫学的に活性な抗体を構築する可能性が高いので検討される。抗体遺伝子の原核細胞発現は、高収量の活性な抗体の産生のためには効率的でないことが報告されている(Boss and Wood, 1985 Immunology Today 6:12-13)。
【０１９４】
本発明の組み換え抗体を発現させるためのほ乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞) (例えば、Kaufman and Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621に記載されたDH FR選択可能マーカーと共に使用される、Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されたdhfr-CHO細胞を含む)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞を含む。特に、NSO骨髄腫細胞での使用に関して、他の発現系は、WO 87/04462、WO 89/01036およびEP 338,841に示されたGS遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターがほ乳類宿主細胞に導入されると、抗体は、宿主細胞での抗体の発現または宿主細胞が増殖する培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、該宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて、培養培地から回収し得る。
【０１９５】
二重特異性分子
他の局面では、本発明は、本発明のC5結合分子(例えば、抗C5抗体、またはその断片)を含む二重特異性分子を特徴とする。本発明のC5結合分子は、誘導体化するか、または他の機能性分子、例えば、他のペプチドもしくはタンパク質(例えば、他の抗体または受容体についてのリガンド)と結合させて、少なくとも2個の異なる結合部位もしくは標的分子に結合する二重特異性分子を作製し得る。本発明のC5結合分子は、実際に、誘導体化するか、または2個以上の他の機能性分子と結合させて、3個以上の異なる結合部位および/もしくは標的分子に結合する多重特異性分子を作製し得て; そのような多重特異性分子はまた、本明細書で使用する“二重特異性分子”なる用語に包含されることを意図する。本発明の二重特異性分子を作製するために、本発明の抗体を、二重特異性分子を生じる1個またはそれ以上の他の結合分子、例えば、他の抗体、抗体断片、ペプチドもしくは結合模倣剤と機能的に結合させ得る(例えば、化学的カップリング、遺伝学的融合、非共有結合または別の方法で)。
【０１９６】
したがって、本発明は、C5エピトープについての少なくとも1個の第1結合特異性および第2の標的エピトープについての第2結合特異性を含む、二重特異性分子を含む。
【０１９７】
1つの局面において、本発明の二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも1個の抗体、またはその抗体断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、または一本鎖Fvを含む)を含む。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖二量体、またはそのいずれかの最小断片、例えば、Ladner et al. 米国特許第4,946,778号に記載されたFvもしくは一本鎖構築体であり得て、該文献の内容は、引用により本明細書の一部とする。
【０１９８】
本発明の二重特異性分子は、当分野で既知の方法を用いて、構成要素である結合特異性を結合させることにより作製し得る。例えば、二重特異性分子の各々の結合特異性を別々に作製し、次いで、互いに結合させ得る。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるとき、さまざまなカップリングまたは架橋剤を共有結合のために使用し得る。架橋剤の例は、protein A、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸) (DTNB)、o-フェニレンジマレイミド(oPDM)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、およびスルホスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル) シクロヘキサン-l-カルボキシレート(sulfo-SMCC)を含む(例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照)。他の方法は、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83)、およびGlennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375)に記載されたものを含む。結合剤は、SATAおよびsulfo-SMCCであり、両者共に、Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)から入手可能である。
【０１９９】
結合特異性が抗体であるとき、それらを、2つの重鎖のC末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合により結合させ得る。特定の局面では、ヒンジ領域は、結合前に、奇数の（例えば、1個の）スルフヒドリル残基を含むように修飾される。
【０２００】
あるいは、結合特異性の両方を同じベクター中にコードし、同じ宿主細胞内で発現および構築させ得る。この方法は、特に、二重特異性分子が、mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')2またはリガンド x Fab融合タンパク質である場合に有用である。本発明の二重特異性分子は、一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子、または2個の結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも2個の一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を作製する方法は、例えば、米国特許第5,260,203号; 第5,455,030号; 第4,881,175号; 第5,132,405号; 第5,091,513号; 第5,476,786号; 第5,013,653号; 第5,258,498号; および第5,482,858号に記載されている。
【０２０１】
二重特異性分子のそれらの特異的標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、放射性免疫測定法(REA)、FACS解析、生物検定法(例えば、増殖阻害)、またはウエスタンブロット解析により確認し得る。これらのアッセイの各々は、一般に、興味のある複合体に特異的な標識試薬(例えば、抗体)を使用することにより、特定の興味のあるタンパク質-抗体複合体の存在を検出する。
【０２０２】
補体活性を測定すること
補体経路分子の存在および補体系の活性を測定するさまざまな方法を使用し得る(例えば、米国特許第6,087,120号; およびNewell et al., J Lab Clin Med, 100:437-44, 1982を参照)。例えば、補体活性は、(i) 赤血球細胞の補体仲介溶解(溶血)の阻害の測定; (ii) C3またはC5の切断を阻害する能力の測定; および(iii) 溶血を仲介する副経路の阻害によりモニターし得る。
【０２０３】
2つの最も一般的に使用される技術は、溶血アッセイ(例えば、Baatrup et al., Ann Rheum Dis, 51:892-7, 1992を参照)および免疫学的アッセイ(例えば、Auda et al., Rheumatol Int, 10:185-9, 1990を参照)である。溶血技術は、全体かつ一連の古典的もしくは副経路の機能的能力を測定する。免疫学的技術は、特定の補体成分もしくは分解産物のタンパク質濃度を測定する。本発明の方法において、補体活性を検出するか、もしくは補体成分の活性を測定し得る他のアッセイは、例えば、T細胞増殖アッセイ(Chain et al., J Immunol Methods, 99:221-8, 1987)、および遅延型過敏(DTH)アッセイ(Forstrom et al., 1983, Nature 303:627-629; Hallidayet al., 1982, in Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic, New York pp. 1-26; Koppi et al., 1982, Cell. Immunol. 66:394-406; および米国特許第5,843,449号)を含む。
【０２０４】
溶血技術では、補体成分のすべてが存在し、かつ、機能的でなければならない。したがって、溶血技術は、補体系の機能的な統合性および欠損をスクリーニングし得る（例えば、Dijk et al., J Immunol Methods 36: 29-39, 1980; Minh et al., Clin Lab Haematol. 5:23-34 1983;およびTanaka et al., J Immunol 86: 161-170, 1986を参照）。古典的経路の機能的能力を測定するために、ヘモリシン(ヒツジ赤血球細胞に対するウサギIgG)で被覆したヒツジ赤血球細胞を標的細胞として使用する。これらのAg-Ab複合体は、古典的経路を活性化し、成分が機能的であり、かつ、十分な濃度で存在するとき、標的細胞の溶解を生じる。副経路の機能的能力を決定するために、ウサギ赤血球細胞を標的細胞として使用する(例えば、米国特許第6,087,120号を参照)。
【０２０５】
溶血補体測定は、それが、完全な機能的補体タンパク質を必要とする細胞溶解を誘導する補体の機能に基づいているので、例えば、対象の赤血球において、補体タンパク質の欠損および機能的障害を検出するために適用可能である。古典的経路の活性を決定するいわゆるCH50法および副経路のためのAP50法は、全血清の代わりに特定の単離補体タンパク質を用いることにより拡張されてきているが、高希釈試験サンプルは、未知の濃度の制限補体成分を含む。この方法により、より詳細な補体系の測定を行うことが可能となり、それは、どの補体が欠損しているのかを示す。
【０２０６】
免疫学的技術は、さまざまな補体成分(例えば、C3、C4およびC5)の異なるエピトープに対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を使用し、例えば、補体成分の分解産物を検出する(例えば、Hugli et al., Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460, 1980; Gorski et al., J Immunol Meth 47: 61-73, 1981; Linder et al., J Immunol Meth 47: 49-59, 1981; およびBurger et al., J Immunol 141: 553-558, 1988を参照)。次いで、既知の濃度の標識化分解産物と競合する分解産物の抗体との結合を測定する。放射性免疫測定法、ELISA、および放射拡散(radial diffusion)アッセイのようなさまざまなアッセイを、補体分解産物を検出するのに利用可能である。
【０２０７】
免疫学的技術は、それらが、黄斑変性症関連障害を有するか、もしくは有さない、試験対象およびコントロール対象からの血液中の分解産物形成の測定を可能にするので、補体活性を検出するための高い感度を提供する。したがって、本発明のある方法では、眼の障害に関連する障害の診断は、試験対象からの血漿において、補体成分の可溶性分解産物(例えば、C3a、C4a、C5a、およびC5b-9最終複合体)の定量を介して、異常な補体活性の測定により得られる。測定は、例えば、Chenoweth et al., N Engl J Med 304: 497-502, 1981; およびBhakdi et al., Biochim Biophys Acta 737: 343-372, 1983に記載されたものとして行われ得る。好ましくは、インビボで形成された補体活性のみを測定する。これは、補体系の阻害剤を含む培地で、対象からの生物学的サンプル(例えば、血清)を収集し、次いで、サンプル中の補体活性を測定すること(例えば、分解産物の定量)により達成し得る。
【０２０８】
臨床診断または眼の疾患もしくは障害と関連する障害を患う患者のモニタリングにおいて、正常な対象からの対応する生物学的サンプルのレベルと比較したときの補体タンパク質の検出は、黄斑変性症と関連する障害を患う患者であることを示す。
【０２０９】
インビボ診断もしくはイメージングは、US2006/0067935に記載されている。簡潔には、これらの方法は、一般に、非侵襲的な方法により検出可能なマーカーもしくは標識と操作可能に結合した診断的に有効量のC5結合分子を、患者に投与するか、または導入することを含む。抗体-マーカー複合体は、眼内に局在し、補体タンパク質に結合するのに十分な時間を許容される。次いで、患者を検出可能マーカーを同定するための検出装置に曝し、その結果、患者の眼内におけるC5結合分子の局在像を形成する。C5結合分子またはその複合体の存在は、抗体-マーカーが眼の成分に結合するか否かを決定することにより検出する。AMD疾患を有さない正常な個体と比較したときの選択した補体タンパク質またはタンパク質の組み合わせにおける増加したレベルの検出は、黄斑変性症と関連する障害を患いやすい傾向にあるか、および/またはそれを発症していることを示す。本発明のこれらの局面はまた、眼のイメージング法ならびに合わせた血管新生診断および処置法での使用のために好ましい。
【０２１０】
また他の局面では、無細胞アッセイにおいて、C5タンパク質またはエピトープを、C5タンパク質と結合する既知の結合分子と接触させて、アッセイ混合物を形成し、次いで、該アッセイ混合物を試験化合物または結合分子と接触させて、既知の化合物を超えてC5タンパク質と相互作用する試験化合物または結合分子の能力を決定し得る。
【０２１１】
トランスジェニック動物
トランスジェニック動物は、本発明の化合物または結合分子を用いて作製し得る。特に、トランスジェニック非ヒト動物は、野生型もしくは突然変異型核酸分子の宿主動物細胞への挿入により作製し得る。核酸分子の宿主動物細胞への挿入は、トランスフェクション、粒子衝撃、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションを含むが、これらに限定されないさまざまな方法により行い得る。挿入は、生殖細胞系、胚性もしくは成熟成体宿主動物細胞で行い得る。
【０２１２】
例えば、1つの局面では、本発明の宿主細胞は、C5タンパク質コード配列が導入された受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、これらの宿主細胞は、外因性C5核酸配列がそれらのゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物または外因性C5配列が改変された相同な組み換え動物を作製するために使用され得る。そのような動物は、C5タンパク質の機能および/または活性を研究するために、ならびにタンパク質活性のモジュレーターを同定および/または評価するために有用である。本明細書で使用する“トランスジェニック動物”は、1個またはそれ以上の動物の細胞がトランスジーンを含む、非ヒト動物、好ましくは、ほ乳類、より好ましくは、齧歯類、例えば、ラットまたはマウスである。トランスジェニック動物の他の例は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを含む。
【０２１３】
トランスジーンは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれ、成熟した動物のゲノム中になお存在する外因性DNAであり、それにより、トランスジェニック動物の1個またはそれ以上の細胞型(例えば、肝臓)またはその組織で、コード遺伝子産物の発現を生じる。本明細書で使用する“相同組み換え動物”は、内因性C5タンパク質遺伝子が、動物の発生前に、内因性遺伝子と動物の細胞、例えば、動物の胚性細胞に導入された外因性DNA分子の間で相同組み換えにより改変された、非ヒト動物、好ましくは、ほ乳類、より好ましくは、マウスである。
【０２１４】
本発明のトランスジェニック動物は、C5タンパク質コード核酸を受精卵母細胞の雄性前核に導入し(例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により)、卵母細胞を偽妊娠雌仮親(foster)動物で発生させることにより作製し得る。C5タンパク質DNA配列、例えば、配列番号2、4または5のうちの1つを、トランスジーンとして非ヒト動物のゲノム中に導入し得る。あるいは、C5タンパク質遺伝子の非ヒトホモログ、例えば、マウスC5タンパク質遺伝子を、ヒト遺伝子DNAとのハイブリダイゼーションに基づいて単離し、トランスジーンとして使用し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルは、また、トランスジーンの発現効率を増大させるために、トランスジーンに含まれ得る。組織特異的制御配列を、特定の細胞、例えば、肝臓細胞でのタンパク質の発現を誘導するために、C5タンパク質トランスジーンと操作可能に結合させ得る。胚操作およびマイクロインジェクションにより、トランスジェニック動物、とりわけ、マウスなどの動物を作製する方法は、当分野で慣用的であり、例えば、米国特許第4,736,866号; 第4,870,009号; および第4,873,191号; ならびにHogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。
【０２１５】
非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、また、Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813に記載された方法にしたがって作製され得る。簡潔には、トランスジェニック動物由来の細胞(例えば、体細胞)を単離し、増殖サイクルから脱出させ、G0期に入れることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスを介して、静止細胞を単離したのと同じ種の動物由来の除核卵母細胞と融合させ得る。その後、再構築卵母細胞を、それが桑実胚または未分化胚芽細胞まで成長するように培養し、偽妊娠雌仮親動物に移す。この雌仮親動物から生まれた子孫は、細胞(例えば、体細胞)を単離した動物のクローンである。
【０２１６】
診断アッセイ
本明細書で同定したエピトープ配列(および、対応する完全遺伝子配列)は、ポリヌクレオチド試薬として、多くの方法で使用し得る。例えば、これらの配列は、(i) 染色体上においてそれらの各遺伝子をマッピングし、それにより、遺伝学的疾患と関連する遺伝子領域を位置づける; (ii) わずかな生物学的サンプルから個体を同定する(組織タイピング); および(iii) 生物学的サンプルの法医学的同定に役立てるために使用され得るが、これらに限定されない。
【０２１７】
1つの局面では、本発明は、生物学的サンプル(例えば、血液、血清、細胞、組織)において、または疾患もしくは障害を患うか、もしくはAMDと関連する障害を発症するリスクのある個体からの、C5タンパク質および/または核酸発現ならびにC5タンパク質機能を決定するための診断アッセイを含む。
【０２１８】
診断アッセイ、例えば、競合アッセイは、通常の結合パートナー上の限られた数の結合部位について試験サンプル検体と競合する標識類似体(“トレーサー”)の能力に依存する。結合パートナーは、一般に、競合の前後で不可溶であり、次いで、結合パートナーに結合したトレーサーおよび検体を、非標識トレーサーおよび検体から分離する。この分離は、デカンテーション(ここでは、結合パートナーは、前もって不可溶である)または遠心分離(ここでは、結合パートナーは、競合反応後に沈殿した)により達成される。試験サンプル検体の量は、マーカー物質の量により測定したとおり、結合トレーサーの量に反比例する。既知量の検体の用量応答曲線を作製し、試験結果と比較し、定量的に、試験サンプル中に存在する検体の量を決定する。これらのアッセイは、酵素を検出可能マーカーとして使用するとき、ELISA系と呼ばれる。この形態のアッセイにおいて、抗体および抗C5抗体間の競合的結合は、結合したC5タンパク質、好ましくは、本発明のC5エピトープを生じ、それは、血清サンプル中の抗体、最も特には、血清サンプル中の中和抗体の測定である。
【０２１９】
中和抗体(すなわち、C5タンパク質、特に、エピトープの結合を妨害するもの)を直接測定することは、アッセイのかなりの利点である。そのようなアッセイ、特に、ELISAの形態でのアッセイは、臨床環境において、および通常の血液スクリーニングにおいてかなりの適用を有する。
【０２２０】
本発明はまた、予測医学の分野に関するものであり、そこでは、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノム学、およびモニタリング臨床試験を予後(予測)目的のために使用し、それにより、個体を予防的に処置する。
【０２２１】
本発明はまた、個体が補体経路活性の異常調節と関連する障害を発症するリスクがあるか否かを決定するための予後(または予測)アッセイのために提供される。例えば、C5遺伝子の突然変異は、生物学的サンプルでアッセイし得る。そのようなアッセイは、予後もしくは予防目的のために使用され、それにより、C5タンパク質、核酸発現もしくは活性により特徴づけられるか、またはそれと関連する障害の発症前に、予防的に個体を処置し得る。
【０２２２】
本発明の他の局面では、個体中のC5核酸発現またはC5タンパク質活性を決定し、それにより、該個体のために適当な治療もしくは予防剤を選択する方法(本明細書では、“薬理ゲノム学”と呼ぶ)を提供する。薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型に基づいて(例えば、個体の遺伝子型は、特定の薬剤に対する個体の応答能力を決定するために調べた)、個体の治療もしくは予防処置のための薬剤(例えば、薬物)の選択を可能にする。
【０２２３】
また本発明の他の局面は、臨床試験でのC5タンパク質の発現もしくは活性における薬剤(例えば、薬物)の影響をモニターすることに関する。
【０２２４】
これらの方法におけるC5核酸およびタンパク質の使用に加えて、抗C5結合分子は、上記したとおり、本発明により、上記した血管新生、炎症を含むことが発見された障害および疾患を処置するために使用し得る。
【０２２５】
医薬組成物
本発明の化合物または結合分子は、遊離形または薬学的に許容される塩形で、担体、賦形剤および安定化剤と共に投与し得る。そのような組成物は、慣用的な方法で製造し得て、遊離化合物と同オーダーの活性を示す(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980])。
【０２２６】
例えば、上記した炎症性もしくは血管新生イベントを含む眼の疾患および障害の処置における、抗C5抗体または抗C5抗体断片の利用は、下記の方法にしたがって、動物実験法および臨床で証明し得る。
【０２２７】
本発明による、本発明の化合物および結合分子は、任意の慣用的な経路で、特に、経腸的に、例えば、経口で、例えば、錠剤もしくはカプセルの形態で、または非経腸的に(好ましくは、皮下に、静脈内に、もしくは眼房内に、硝子体内に、もしくは結膜下に、またはテノン嚢下に)、例えば、注射用溶液もしくは懸濁液の形態で、局所に(好ましくは、眼に投与される点眼剤で)、例えば、溶液、ゲル、軟膏もしくはクリームの形態で、または経鼻、経皮パッチもしくは坐薬の形態で投与し得る。
【０２２８】
遊離形もしくは薬学的に許容される塩形での本発明の化合物および結合分子を少なくとも1個の薬学的に許容される担体または希釈剤と共に含む医薬組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤と共に混合することにより、慣用的な方法で製造し得る。経口投与のための単位用量形は、例えば、約0.1 mgから約500 mgの活性物質を含む。
【０２２９】
好ましくは、本発明の化合物および結合分子、例えば、抗C5抗体またはその断片を、局所的に、例えば、眼の表面に、または非経腸で、例えば、静脈内に、硝子体内に、眼房内に、結膜下に、もしくはテノン嚢下に、または皮下に投与する。
【０２３０】
本発明の方法を実施するために必要とされる1日投与量は、例えば、使用される化合物もしくは結合分子、宿主、投与形態、処置される疾患の重篤度に依存して変わる。
【０２３１】
本明細書に開示したスクリーニングアッセイにより同定した化合物もしくは結合分子は、当分野で既知の標準的な技術を用いて、同様の方法で製剤し得る。
【０２３２】
製品
本発明の他の態様において、上記障害の診断もしくは処置のために有用な物質(例えば、本発明の化合物または結合分子を含む)を含む製品を提供する。製品は、容器および指示書を含む。適当な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックのようなさまざまな物質から製造し得る。容器は、状態を診断もしくは処置するために有効な組成物を含み、滅菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器が、皮下注射針により刺通可能なストッパーを有する輸液バッグもしくはバイアルであり得る)。組成物中の活性剤は、通常、本発明のポリペプチドもしくは抗体である。容器上の、もしくは容器に結合した指示書または標識は、組成物が、最適な状態を診断もしくは処置するために使用されることを示す。製品はさらに、薬学的に許容される緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む、第2容器を含む。それはさらに、商業的および需用者の観点から望まれる他の材料を含み、それは、例えば、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジおよび使用説明を含む添付文書を含む。
【０２３３】
本発明は、十分に開示されているが、下記の実施例および特許請求の範囲においてさらに例示し、それは、あくまでも例示であり、さらなる限定を意図するものではない。当業者は、本明細書に記載した特定の手順に対する多くの等価物を認識するか、または通常の実験のみを用いてそれを確認することができる。そのような等価物は、本発明および特許請求の範囲の範囲内に含まれる本出願を通して引用された公開特許および公開特許出願を含むすべての参照の内容は、引用により本明細書の一部とする。
【実施例】
【０２３４】
実施例1
多くの場合に、マウスおよびヒト間のC5タンパク質配列の低い保存性のために、ヒトC5に対して作製された抗体は、マウスC5に対する結合を示さない。したがって、キメラC5タンパク質(ヒトおよびマウスタンパク質配列を含む)を、抗ヒト抗C5抗体のエピトープを決定するために使用し得る。
【０２３５】
ヒトα鎖/マウスβ鎖; またはマウスα鎖/ヒトβ鎖を発現するDNA構築体を、ヒトα鎖またはβ鎖上のエピトープに対して抗体をマッピングするために使用し得る。プラスミド形でのキメラヒト/マウスC5構築体のためのDNAは、GeneArtから入手される。鎖内のエピトープは、各々のヒト配列を置換するようにヒトC5タンパク質配列に移植された100個のアミノ酸マウスタンパク質配列の領域(stretch)を発現するキメラ構築体を用いて、詳細にマッピングされる。各々のキメラタンパク質は、親和性精製のために、そのC末端にヒスチジンの領域を含む。
【０２３６】
プラスミドからキメラタンパク質をコードするインサートを単離し、標準的な技術(Sambrook, Maniatis, etc.を参照)を用いて、ほ乳類発現ベクター(例えば、pCDNA3.1)にクローン化し、コードタンパク質を産生する。簡潔には、293T細胞を、ペニシリン-ストレプトマイシン不含のMEM (Gibco 11995-073)、10% FBS (Hyclone SH30070.03)中の6x106細胞/100 mmプレートで播種する。次いで、トランスフェクションを、最終的に750 μlのOPTI-MEM (Gibco 51985-034)で混合したキメラヒト/マウスタンパク質コード配列を含む、10 μgのプラスミド構築体を用いて達成する。トランスフェクション混合物を、10個の100 mmプレートに入れる。30 μlのLipofectamine 2000 (Invitrogen 11668-019)を、720 μlのOPTI-MEM (100 mmプレートあたり)と混合する。トランスフェクションの24時間後、プレートをIS GRO培地(Irvine Scientific 91103)で洗浄し、6 mlの新たなIS GRO培地を各プレートに加え、24-48時間インキュベートする。生じた上清を収集する。新たなIS GRO培地を各プレートに加え、細胞を、さらなる収集のために24-48時間インキュベートする。しばしば、3回の上清の収集のために、同じ工程を行う。
【０２３７】
上清を、0.2ミクロンフィルターを介してろ過し、さらに精製する(あるいは、上清を精製まで-80℃で貯蔵する)。慣用的な精製工程を使用し得る。簡潔には、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Roche)を上清に加え、pHを、NaOHで8に調整する。Ni-NTA樹脂を、PBS、10 mMイミダゾール、pH 7.4およびプロテアーゼ阻害剤で平衡化する。上清を、1時間樹脂に結合させ(1.5 mL BV)、重力流カラムに適用する。カラムを洗浄し、そしてタンパク質を、PBS、300 mMイミダゾール、pH 7.4およびプロテアーゼ阻害剤の溶液で溶出する。フラクションを電気泳動ゲルで試験する。フラクションをプールし、PBS pH 7.4で透析し、イミダゾールを除去する。タンパク質を、純度および活性について試験する。
【０２３８】
C5抗原性エピトープの同定
抗C5抗体断片(Fab)および完全長IgGのエピトープマッピングを、競合ELISAアッセイを用いて調べる。5G1.1 (α鎖結合抗体、Thomas TC et al, Molecular Immunology, 33, 1389-1401, (1996))抗体およびN19/8 (β鎖結合抗体、Evans MJ et al, Molecular Immunology, 332 1183-1195, (1995))抗体に対する競合もまた調べる。いくつかのELISAアッセイを、さらに下記したとおり、使用し得る。1つのアッセイは、プレート上に被覆した5G1.1またはN19/8を使用し、天然のC5を使用し、抗体の結合を検出する。C5のβ鎖がマウス起源であり、α鎖がヒト起源であるキメラC5タンパク質または上記した他のキメラC5タンパク質を使用する。他のアッセイは、溶液相競合を含み、そこでは、FabまたはIgGを、少なくともビオチン-C5よりも10倍モル超で、プレインキュベートし、次いで、抗C5 Fabもしくは抗体で被覆したプレートに加え、ストレプトアビジン-HRPで検出する。これらの実験からの結果は、抗体候補が5G1.1、N19/8または選択された他の抗体候補と同じ結合部位で競合するか否かを示す。結果はまた、試験抗体がヒトC5タンパク質のα鎖またはβ鎖に結合するか否かを示す。
【０２３９】
キメラヒト/マウスC5を用いた競合
Maxisorp Plate Nunc. 442404を、100μl/ウェル量で、炭酸緩衝液(Pierce 28382) pH 9.6中の4μg/mlの抗ヒトC5精製FabおよびMabで被覆する。プレートを密封し、4℃で一夜、置く。次いで、プレートを吸引し、300μl/ウェル量のPBS/0.5% Tween20 (PBST)で3回洗浄する。プレートを、300μl/ウェルのSynBlock (AbD Serotec BUF034C)でブロックし、室温で2時間、インキュベートし、次いで、300μl/ウェル量のPBSTで1回洗浄する。マウス/ヒトキメラC5タンパク質でトランスフェクトした293T細胞からの上清を、希釈剤(2% BSA Fraction V (Fisher ICN16006980)、0.1% Tween20 (Sigma P1379)、0.1% Triton-x-100 (Sigma P234729)、PBS)で1:8に希釈し、100μl/ウェルを加えるか、または精製ヒトC5 (Quidel A403)を、1μg/mlまで希釈剤で希釈し、100μl/ウェルをプレートに加える。プレートを、室温で1時間、インキュベートし、300μl/ウェル量のPBSTで3回洗浄する。5G1.1 IgGを、1μg/mlの希釈剤で希釈し、100μl/ウェルでプレートに加える。プレートを、室温で1時間、インキュベートし、PBSTで3回洗浄する。検出抗体抗ヒトIgG Fc-HRP (Pierce 31125)を、1:5000で希釈し、100μl/ウェルを、プレートに加える。プレートを、室温で1時間、インキュベートし、PBSTで4回洗浄する。次いで、TMB基質(Pierce 34028)を、100μl/ウェルで加える。プレートを、室温で10 +/- 2分間、インキュベートし、停止溶液(2N H2SO4)を、50μl/ウェルで加える。吸光度を、Spectramax 450nm-570nmで読み取る。
【０２４０】
ビオチン化ヒトC5を用いた競合
Maxisorp Plate Nunc. 442404を、50μl/ウェル量で、炭酸緩衝液(Pierce 28382) pH 9.6中の5μg/mlの精製抗ヒトC5精製FabおよびIgGで被覆する。プレートを密封し、室温で4時間、振とう機上に置く。次いで、プレートを吸引し、PBSTで3回洗浄する。プレートを、300μl/ウェルのSuperBlock PBS (Pierce 37515)でブロックし、室温で2時間、インキュベートする。次いで、PBSTで1回洗浄する。抗ヒトC5 Fab/Mabを、0.25μg/mlの濃度のビオチン化C5(Morphosys)と共に、5μg/mlの濃度までSuperblockで希釈し、1時間インキュベートし、50μl/ウェルをプレートに加える。プレートを、室温で1時間、インキュベートし、300μl/ウェル量のPBSTで3回洗浄する。ポリストレプトアビジンHRP (Endogen N200)を、Superblockで1:5000に希釈し、100μl/ウェルを、プレートに加える。プレートを、室温で30分間、インキュベートし、PBSTで3回洗浄する。次いで、TMB基質(Pierce 34028)を、100μl/ウェルで加える。プレートを、室温で10 +/- 2分間、インキュベートし、停止溶液(2N H2SO4)を、50μl/ウェルで加える。吸光度を、Spectramax 450nm-570nmで読み取る。
【０２４１】
5G1.1およびN19/9を用いた競合アッセイ
Maxisorp Plate Nunc. 442404を、100μl/ウェル量で、炭酸緩衝液(Pierce 28382) pH 9.6中の5μg/mlの抗ヒトC5 IgG 5G1.1またはN19/8で被覆する。プレートを密封し、室温で一夜、置く。次いで、プレートを吸引し、PBSTで3回洗浄する。プレートを、300μl/ウェルの希釈/ブロック(4% BSA Fraction V (Sigma A403),0.1% Tween20 (Sigma P1379), 0.1% Triton-x-100 (Sigma P234729), PBS)でブロックし、室温で2時間、インキュベートする。次いで、PBSTで1回洗浄する。抗ヒトC5 Fab/Mabを、0.5μg/mlの濃度の精製C5 (Quidel A403)と共に、2.5μg/mlの濃度まで希釈剤で希釈し、30分間インキュベートし、100μl/ウェルをプレートに加える。プレートを、室温で1時間、インキュベートする。プレートを、PBSTで3回洗浄する。抗ヒス(Roche 11965085001)を、200mU/mlの希釈剤で希釈するか、またはヤギ抗マウスIg-HRP (BD Pharmingen 554002)を、1:5000に希釈し、100μl/ウェルを、プレートに加える。プレートを、室温で1時間、インキュベートし、PBSTで3回洗浄する。次いで、TMB基質(Pierce 34028)を、100μl/ウェルで加える。プレートを、室温で5-10分間、インキュベートし、停止溶液(2N H2SO4)を、50μl/ウェルで加える。吸光度を、Spectramax 450nm-570nmで読み取る。
【０２４２】
実施例2 ファージディスプレイによるヒト抗体の作製
C5に対する抗体の作製のために、MorphoSys HuCAL GOLD(登録商標)ファージディスプレイライブラリーを用いた選択を行う。HuCAL GOLD は、HuCALコンセプトに基づくFabライブラリーであり、そこでは、6個のCDRが多様であり、Fab断片とファージ表面を結合させるのにCYSDISPLAY技術を使用している(Knappik et al., 2000 J.Mol. Biol. 296:57-86; Krebs et al., 2001 J Immunol. Methods 254:67-84; Rauchenberger et al., 2003 J Biol Chem. 278(40):38194-38205; WO 01/05950, Loehning, 2001)。
【０２４３】
ファージミドレスキュー、ファージ増幅、および精製
HuCAL GOLDライブラリーを、34 μg/mlクロラムフェニコールおよび1%グルコース(2xYT-CG)を含む2xYT培地で増幅させる。0.5のOD600nmでVCSM13ヘルパーファージを感染させた後(振とうなしで、37℃で30分間; 250 rpmで、37℃で30分間振とう)、細胞をスピンダウンし(4120 g; 5分; 4℃)、2xYT/ 34 μg/ml クロラムフェニコール/ 50 μg/ml カナマイシン/ 0.25 mM IPTGに再懸濁し、22℃で一夜、増殖させる。ファージを、上清から2回、PEG沈殿し、PBS/ 20%グリセロールで再懸濁し、-80℃で貯蔵する。
【０２４４】
2回のパニングラウンド間のファージ増幅は、下記のとおり行う: 対数期の中間部のE. coli TG1細胞を、溶出ファージで感染させ、1%のグルコースおよび34 μg/mlのクロラムフェニコールを補充したLB寒天(LB-CGプレート)にプレートする。30℃で一夜、インキュベーションした後、TG1コロニーを寒天プレートから掻き取り、0.5のOD600nmに到達するまで、2xYT-CGを植菌するために使用し、VCSM13ヘルパーファージを、上記のとおり、感染のために加える。
【０２４５】
HuCAL GOLDでのパニング
C5を認識する抗体の選択のために、2つの異なるパニング戦略を適用する。要約すると、HuCAL GOLDファージ抗体を、VHマスター遺伝子の異なる組み合わせを含む4つのプールに分類する(プール1： VH1/5λκ、プール2: VH3；κ、プール3： VH2/4/6λκ、プール4： VH1-6λκ)。これらのプールを、Maxisorpプレートに直接被覆したヒトC5上で、個々に、3回の固相パニングにかけ、さらに、ビオチン化C5抗原上で、3回の溶液パニングにかける。
【０２４６】
最初のパニング変形は、C5に対する固相パニングであり: Maxisorpプレート(F96 Nunc-Immunoplate)上の2つのウェルを、300 μlの5μg/ml C5で被覆する(各々、4℃で一夜)。被覆ウェルを、350μlのPBSで2回洗浄し、マイクロタイタープレート振とう機で、室温で2時間、350μlの5% MPBSを用いてブロックする。約1013 HuCAL GOLDファージ抗体を各々パニングするために、等しい量のPBST/5% MPで、室温で2時間、ブロックする。被覆ウェルを、ブロッキング後、350μlのPBSで2回洗浄する。300μlの前もってブロックしたHuCAL GOLD(登録商標)ファージ抗体を、各被覆ウェルに加え、振とう機で、室温で2時間、インキュベートする。350μlのPBS/0.05% Tweenの添加により、5回洗浄し、その後、PBSでさらに4回洗浄する。プレートからのファージの溶出は、ウェルあたり、10mM Tris/HCl pH8中、300 μlの20mM DTTで、10分間行う。DTTファージ溶出物を14 mlのE.coli TG1に加え、2YT培地中、37℃で、0.6-0.8のOD600まで増殖させ、50mlのプラスチック管で、ファージ感染のための振とうなしに、37℃で45分間、インキュベートする。5000rpmで10分間の遠心分離後、細菌ペレットを、500μlの2xYT培地に各々再懸濁し、2xYT-CG寒天プレートにプレーティングし、30℃で一夜、インキュベートする。次いで、コロニーをプレートから掻き取り、上記したとおり、ファージをレスキューおよび増幅させた。直接、被覆C5抗原上での2回目、3回目の固相パニングは、最初のプロトコールに従って行われるが、洗浄手順のストリンジェンシーは、増加させる。
【０２４７】
2回目のパニング変形は、ビオチン化ヒトC5抗原に対する溶液パニングであり: 溶液パニングのために、Dynabeads M-280 (Dynal)に結合したビオチン化C抗原を用いて、下記のプロトコールを適用する: 1.5 ml Eppendorfチューブを、PBSで1:1に希釈した1.5 ml 2xChemiblockerで、4℃で一夜、ブロックする。200μlのストレプトアビジン被覆磁気Dynabeads M-280 (Dynal)を、200μlのPBSで1回洗浄し、200 μlの1xChemiblocker(1x PBSで希釈されている)に再懸濁する。ビーズのブロッキングは、プレブロック化チューブで、4℃で一夜、行う。各パニング条件について、500μlのPBSで希釈したファージを、500μlの2xChemiblocker / 0.1% Tweenと共に、室温で1時間、混合する(ローター)。ファージのプレ吸着は、2回行う: 50 μlのブロック化ストレプトアビジン磁気ビーズを、ブロック化ファージに加え、ローターで、室温で30分間、インキュベートする。磁気装置(Dynal MPC-E)によるビーズの分離後、ファージ上清(〜1ml)を、新たなブロック化チューブに移し、50 μlのブロックビーズで30分間、プレ吸着を繰り返した。その後、200 nMのビオチン化C5を、新たなブロック化1.5 mlチューブ中のブロック化ファージに加え、ローターで、室温で1時間、インキュベートする。100 μlのブロック化ストレプトアビジン磁気ビーズを、各パニングファージプールに加え、ローターで、室温で10分間、インキュベートする。ビオチン化C5に結合したファージは、磁気ビーズに固定され、磁性粒子分離装置(Dynal MPC-E)で集められる。次いで、ビーズを、ローターを用いて、PBS/0.05% Tweenで7回洗浄し、その後、PBSでさらに3回洗浄する。Dynabeadからのファージの溶出は、各チューブに、10 mM Tris/HCl pH 8中、300 μlの20 mM DTTを10分間加えることにより行う。Dynabeadを、磁性粒子分離装置から除去し、上清を、14mlのE.coli TG-1培養に加えて、0.6-0.8のOD600nmまで増殖させる。次いで、ビーズを、200μlのPBSで1回洗浄し、さらに除去されたファージと共に、PBSを、14 mlのE.coli TG-1培養に加えた。ファージ感染のために、培養物を、50 mlのプラスチックチューブで、振とうなしに、37℃で45分間、インキュベートする。5000rpmで10分間の遠心分離後、細菌ペレットを、500μlの2xYT培地に各々再懸濁し、2xYT-CG寒天プレートにプレーティングし、30℃で一夜、インキュベートする。次いで、コロニーをプレートから掻き取り、上記したとおり、ファージをレスキューおよび増幅させた。
【０２４８】
ビオチン化C5抗原上での2回目、3回目の溶液パニングは、最初のプロトコールに従って行われるが、洗浄手順のストリンジェンシーは、増加させる。
【０２４９】
可溶性Fab断片のサブクローン化および発現
選択したHuCAL GOLD(登録商標)ファージミドのFabコード挿入物を、発現ベクターpMORPH(登録商標)X9_Fab_FHにサブクローン化し、迅速なおよび効率のよい可溶性Fabの発現を促進する。この目的のために、選択したクローンのプラスミドDNAを、XbaIおよびEcoRIで消化し、それにより、Fabコード挿入物(ompA-VLCLおよびphoA-Fd)を切り出し、XbaI/EcoRI消化発現ベクターpMORPH(登録商標)X9_Fab_FHにクローン化する。このベクターから発現するFabは、検出および精製のために、2つのC末端タグ(各々、FLAG(商標)および6xHis)を有する。
【０２５０】
E. coliでのHuCAL GOLD(登録商標) Fab抗体のマイクロ発現
選択したFabのpMORPH(登録商標)X9_Fab_FH発現ベクターへのサブクローン化後に得られたクロラムフェニコール耐性単一コロニーを、ウェルあたり100 μlの2xYT-CG培地を含む、滅菌96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに播種するために使用し、37℃で一夜、増殖させる。5 μlの各E. coli TG-1培養を、ウェルあたり、34 μg/mlのクロラムフェニコールおよび0.1%のグルコースを補充した100 μlの2xYT培地であらかじめ満たした、新鮮な滅菌96ウェルマイクロタイタープレートに移す。培養物が、〜0.5のOD600nmを有し、わずかに混濁するまで(〜2-4 hrs)、マイクロタイタープレートを、30℃で、マイクロプレート振とう機を用いて400 rpmで振とうしながら、インキュベートする。
【０２５１】
これらのプレートに、ウェルあたり、34 μg/mlクロラムフェニコールおよび3 mM IPTG (イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)を補充した20 μlの2xYT培地を加え(最終濃度0.5 mM IPTG)、マイクロタイタープレートを、ガス透過性テープで密封し、プレートを、400 rpm.で振とうしながら、30℃で一夜、インキュベートする。
【０２５２】
全細胞ライセートの産生(BEL抽出物): 発現プレートの各ウェルに、40 μlのBEL緩衝液(2xBBS/ EDTA: 24.7 g/l ホウ酸、18.7 g NaCl/l、1.49 g EDTA/l、pH 8.0)を、2.5 mg/mlのリゾチームを含むように加え、マイクロタイタープレート振とう機(400 rpm)で、22℃で1時間、インキュベートする。BEL抽出物を、ELISAによる結合アッセイまたはBioVeris M-シリーズ(登録商標)384分析器のために使用する。
【０２５３】
酵素結合免疫吸着法(ELISA)技術
PBS中の5 μg/mlのヒト組み換えC5抗原で、384ウェルMaxisorpプレート(Nunc-Immunoplate)を、4℃で一夜、被覆する。被覆後、ウェルを、PBS / 0.05 % Tween (PBS-T)で1回、PBSで2回洗浄する。次いで、細胞を、2% BSAを含むPBS-Tを用いて、室温で2時間、ブロックする。同時に、15 μlのBEL抽出物および2% BSAを含む15 μlのPBS-Tを、室温で2時間、インキュベートする。ブロック化Maxisorpプレートを、PBS-Tで3回洗浄し、その後、10 μlのブロック化BEL抽出物をウェルに加え、室温で1時間、インキュベートする。一次Fab抗体を検出するために、下記の二次抗体を適用する: アルカリホスファターゼ(AP)結合AffiniPure F(ab')2断片、ヤギ抗ヒト、抗マウス、抗ヒツジIgG (Jackson Immuno Research)。検出のために、AttoPhos (Roche)のようなAP結合蛍光性基質を、製造者の指示に従い使用する。すべてのインキュベーション工程間に、マイクロタイタープレートのウェルを、PBS-Tで3回、二次抗体での最終インキュベーション後に3回、洗浄する。蛍光は、TECAN Spectrafluorプレートリーダーで測定することができる。
【０２５４】
E. coliでのHuCAL GOLD(登録商標) Fab抗体の発現および精製
TG-1細胞中のpMORPH(登録商標)X9_Fab_FHによりコードされたFab断片の発現を、34 μg/mlのクロラムフェニコールを補充した750 mlの2xYT培地を用いて、振とうフラスコ培養で行う。OD600nmが0.5に達するまで、培養物を30℃で振とうする。発現を、0.75 mM IPTGの添加により、30℃で20時間、誘導する。細胞を、リゾチームを用いて破壊し、Fab断片を、Ni-NTAクロマトグラフィー(Qiagen, Hilden, Germany)により単離する。タンパク質濃度は、UV-分光光度法(Krebs et al. J Immunol Methods 254, 67-84 (2001)により決定し得る。
【国際調査報告】
2010521194.tif 000002
2010521194.tif 000003
2010521194.tif 000004
2010521194.tif 000005
2010521194.tif 000006