(57)【要約】【課題】  本発明は、細胞性免疫増強剤を提供し、その発癌、癌再発予防治療、癌免疫治療または病原微生物感染治療等への応用に寄与する。【解決手段】  本発明に係る細胞性免疫増強剤は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を有効成分として含んでなる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を有効成分として含んでなる、細胞性免疫増強剤。
【請求項２】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質がバルプロ酸である、請求項１に記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項３】
疾患部位におけるβ２マイクログロブリン発現が抑制されている疾病の治療または予防において用いられる、請求項１または請求項２に記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項４】
疾病が病原微生物による感染症である、請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項５】
病原微生物がウイルスである、請求項４に記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項６】
ウイルスが、ヘルペスウイルス、パポーバウイルス、レンチウイルスおよびパラミクソウイルスよりなる群に含まれるウイルスのうち１または複数である、請求項５に記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項７】
疾病が癌である、請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項８】
癌が乳癌である、請求項７に記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項９】
癌が前立腺癌または口腔癌である、請求項７に記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項１０】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を有効成分として含んでなる、ＨＬＡクラスＩ発現増強剤。
【請求項１１】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を有効成分として含んでなる、β２マイクログロブリン発現増強剤。
【請求項１２】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を有効成分として含有する組成物を対象において投与する工程を含む、細胞性免疫増強方法。
【請求項１３】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質がバルプロ酸である、請求項１２に記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項１４】
疾患部位におけるβ２マイクログロブリン発現が抑制されている疾病の治療または予防において用いられる、請求項１２または請求項１３に記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項１５】
対象が病原微生物に感染している、請求項１２から請求項１４のいずれかに記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項１６】
病原微生物がウイルスである、請求項１５に記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項１７】
ウイルスが、ヘルペスウイルス、パポーバウイルス、レンチウイルスおよびパラミクソウイルスよりなる群に含まれるウイルスのうち１または複数である、請求項１６に記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項１８】
疾病が癌である、請求項１２から請求項１４のいずれかに記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項１９】
癌が乳癌である、請求項１８に記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項２０】
癌が前立腺癌または口腔癌である、請求項１８に記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項２１】
１）対象から感染組織または癌組織を取得する工程；
２）前記組織からβ２マイクログロブリンまたはβ２マイクログロブリンをコードするｍＲＮＡを抽出する工程；
３）前記β２マイクログロブリンまたはβ２マイクログロブリンをコードするｍＲＮＡの量を、対照と比較する工程；
を含む、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を用いて細胞性免疫を増強する対象をスクリーニングする方法。
【請求項２２】
１）対象から感染組織または癌組織を取得する工程；
２）前記組織からクロマチン沈降を行い、沈降物からβ２マイクログロブリンＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を行う工程；
３）前記増幅されたＤＮＡ断片の存在の有無を評価する工程；
を含む、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を用いて細胞性免疫を増強する対象をスクリーニングする方法。
【請求項２３】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質がバルプロ酸である、請求項２１または請求項２２に記載のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を用いて細胞性免疫を増強する対象をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を用いることにより、細胞表面の主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩ発現レベルを増加させ、そのことを介して細胞性免疫力を増強する方法に関する。すなわち、本発明は、ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を用いた細胞性免疫増強方法に関する。さらに、本発明は、そのような細胞性免疫増強方法の、発癌予防もしくは癌再発予防、既に発生している癌の免疫治療、または病原微生物感染治療への応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の免疫力には大きく分けて、抗体の産生を中心とする液性免疫力と、リンパ球による標的細胞傷害を中心とする細胞性免疫力とに分類される。細胞内に感染した病原微生物や癌等の細胞性の疾患に対する抵抗性に最も重要な免疫は細胞性免疫であり、係る細胞性免疫力を増強することは、癌の予防や治療、ウイルスや細菌等の病原微生物の感染治療等、広い場面における効果が期待される。
【０００３】
細胞性免疫において、リンパ球が癌細胞やウイルス感染細胞等の標的細胞を認識し、傷害する機序にはＭＨＣクラスＩ抗原分子が重要な役割を果たしている。ヒトのＭＨＣはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。例えば、癌細胞では癌抗原蛋白質の分解産物抗原ペプチドが、ウイルス等の感染細胞では病原因子由来蛋白質の分解産物抗原ペプチドが、それぞれＨＬＡクラスＩ分子と結合し、細胞表面に表出している。免疫担当細胞のなかでＴ細胞は、細胞表面に持つＴ細胞抗原受容体によって標的細胞表面の抗原ペプチド・ＨＬＡ複合体を認識し、正常細胞と癌細胞／感染細胞とを識別する。そのためＨＬＡクラスＩ分子の発現が抑制された状態では、Ｔ細胞の標的細胞識別機構が正常に働かないことになる。
【０００４】
ＭＨＣクラスＩ抗原は、ヒトの場合、主としてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃの３種類の遺伝子によってコードされる重鎖（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）とβ２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）という１種類の遺伝子によってコードされる軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）との２分子のヘテロ２量体から成る。Ｂ２Ｍが正常に発現しないと、成熟したＨＬＡ複合体の形成や細胞膜表面への輸送が障害され、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ全ての遺伝子座産物について発現低下が生じる。
【０００５】
ＭＨＣクラスＩ抗原は、精巣の細胞を除くほとんどすべての体細胞の細胞表面に発現している。しかし、乳癌細胞や前立腺癌細胞等の一定の癌細胞においては、細胞表面ＭＨＣクラスＩ抗原の発現が高頻度に低下している。ＭＨＣクラスＩ抗原の発現が抑制されるメカニズムについては、これまで重鎖または軽鎖の遺伝子変異による発現低下機序が知られていたが（非特許文献１）、その詳細は明らかにされていない。一方、様々なウイルス感染においてもクラスＩ抗原の発現が阻害されていることが知られているが、そのメカニズムについては様々なものが報告されている。しかも、興味深いことに、それぞれのウイルスごとに、クラスＩの発現を阻害するための複数の入念な戦略を備えていることがわかっている。例えば、サイトメガロウイルスはＭＨＣクラスＩ経路を妨害する４つの遺伝子（ＵＳ３、ＵＳ２、ＵＳ１１、およびＵＳ６）を発現するが、このうちＵＳ３は小胞体からのＭＨＣクラスＩ複合体のエキスポートを、ＵＳ２およびＵＳ１１はＭＨＣクラスＩ複合体のプロテアソームにおける迅速な分解を、ＵＳ６は小胞体への抗原ペプチド供給を阻害することによって、ＭＨＣクラスＩ機能を妨害している（非特許文献２）。また、ＨＩＶウイルスは、ＴａｔによるＢ２ＭおよびｃｌａｓｓＩ遺伝子の転写阻害（非特許文献３）のほか、ＮｅｆによるｃｌａｓｓＩ産物の運搬経路変更によってＭＨＣクラスＩ機能を妨害している（非特許文献４）。
【０００６】
このように、癌組織やウイルス感染細胞では、ＨＬＡクラスＩ抗原分子の発現を巧みに阻害することによって、免疫系の監視機構から逃れている。従って、これらの組織・細胞においてクラスＩ分子の発現を増強できれば、宿主の細胞性免疫力を高めることになり、癌や感染症の予防・治療において大きな効果が期待される。
【０００７】
一方、遺伝子の塩基配列の変化を伴わないエピジェネティックな調節が、発癌等において広く関与することが近年明らかになってきた。クロマチンの活性を調節するヒストンアセチル化はエピジェネティックな調節において重要な役割を果たす要因の一つと考えられ、そのレベルを調節するヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、癌の分子標的等としても注目されている（非特許文献５）。ＨＤＡＣの作用を抑制するＨＤＡＣ阻害剤については、各種のものが知られている（非特許文献５〜６）。各クラスに属するＨＤＡＣに対するこれらＨＤＡＣ阻害剤の選択特異性は必ずしも厳格ではないが、例えばＴｒｉｃｏｓｔａｔｉｎ Ａ（ＴＳＡ）はクラスＩおよびＩＩのＨＤＡＣを阻害し、バルプロ酸（Ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ：ＶＰＡ）はクラスＩＩよりもクラスＩのＨＤＡＣの方をより好んで阻害すること等が報告されている（非特許文献５〜６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｅｌｉｇｅｒ，Ｂｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２００２，１２：３−１３
【非特許文献２】Ｍｉｒａｎｄｏｌａ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００６ Ａｐｒ．１；１９３（７）：９１７−９２６
【非特許文献３】Ｃａｒｒｏｌｌ ＩＲ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８ Ｄｅｃ．；３５（１８）：１１７１−１１７８
【非特許文献４】Ｌｕｂｂｅｎ ＮＢ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００７．
【非特許文献５】Ｋｉｍ ＤＨ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３ Ｊａｎ．３１；３６（１）：１１０−１１９
【非特許文献６】Ｇｏｔｔｌｉｃｈｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２００１ Ｄｅｃ．１７；２０（２４）：６９６９−６９７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
癌細胞や病原微生物感染細胞においては、高頻度にＭＨＣクラスＩ抗原分子の発現が低下しており、そのためにウイルス感染細胞や癌細胞は免疫監視機構から逃避し、生体内で免疫力によってウイルスや癌が排除できない原因になっていると考えられている。免疫力によって感染症や癌等の疾患を予防したり治療したりするためには、病原微生物感染細胞や癌細胞において低下している細胞表面のＭＨＣクラスＩ抗原発現レベルを増強することが重要であり、それを解決する方法が求められていた。
【００１０】
発明者らは、多くの癌細胞において、ＭＨＣクラスＩ重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子のいずれにも変異がないにもかかわらず、ＭＨＣクラスＩ抗原の細胞表面への発現レベルが低下していることを見出した。さらに発明者らは、一定の癌細胞におけるＭＨＣクラスＩ抗原発現抑制の原因が、Ｂ２Ｍ遺伝子と結合しているヒストンの脱アセチル化によっていることを見出した。そこで、ＨＤＡＣ阻害剤をＢ２Ｍの発現が低下している細胞に作用させたところ、Ｂ２Ｍ蛋白レベルの増加とともに、細胞表面のＭＨＣクラスＩ発現レベルも増加することが示された。すなわちＭＨＣクラスＩ抗原発現抑制が生じている細胞において、ＨＤＡＣ阻害剤の使用が、Ｂ２Ｍ遺伝子と結合しているヒストンのアセチル化を高め、Ｂ２Ｍ蛋白レベルを増加し、その結果として細胞表面のＭＨＣクラスＩ抗原発現レベルを増加させることを証明した。一方、ウイルス感染におけるＭＨＣクラスＩ発現レベル低下については、前述のように、多種多様で入念なシステムを介することが知られているところである。ところが発明者らが鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、ヒストンの脱アセチル化阻害剤の使用によって、様々なウイルス感染系におけるＭＨＣクラスＩ抗原発現レベルの上昇を一様に導き出せることを示し、本発明の完成に至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本発明に係る細胞性免疫増強剤は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を有効成分として含んでなる。
【００１２】
また、本発明に係る細胞性免疫増強剤において、前記ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質がバルプロ酸であることが好ましい。
【００１３】
また、本発明に係る細胞性免疫増強剤において、疾患部位におけるβ２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）発現が抑制されている疾患の治療または予防において用いられることが好ましい。
【００１４】
さらに、本発明に係る細胞性免疫増強剤は、細胞侵入性の病原微生物・因子による感染症に悩まされているかその危険のある対象、または、疾患に悩まされているかその危険のある対象において、その予防または治療のために用いることが好ましい。ここで前記病原微生物はウイルスであることが好ましい。また、前記因子はウイルス由来のものであることが好ましい。さらに、前記ウイルスはヘルペスウイルス、パポーバウイルス、レンチウイルス、パラミクソウイルスよりなる群に含まれるウイルスのうち１または複数であることがより好ましい。一方、前記疾病は癌であることがより好ましく、前記癌は乳癌、前立腺癌、あるいは口腔癌であることがより好ましく、乳癌であることがさらに好ましい。
【００１５】
次に、本発明に係るＨＬＡクラスＩ発現増強剤は、ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を有効成分として含んでなる。
【００１６】
また、本発明に係るＨＬＡクラスＩ発現増強剤において、前記ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質がバルプロ酸であることが好ましい。
【００１７】
次に、本発明に係るＢ２Ｍ発現増強剤は、ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を有効成分として含んでなる。
【００１８】
また、本発明に係るＢ２Ｍ発現増強剤において、前記ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質がバルプロ酸であることが好ましい。
【００１９】
次に、本発明に係る細胞性免疫増強方法は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を有効成分として含有する組成物を対象において投与するステップを含む。
【００２０】
また、本発明に係る細胞性免疫増強方法において、前記ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質がバルプロ酸であることが好ましい。
【００２１】
また、本発明に係る細胞性免疫増強方法において、疾患部位におけるβ２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）発現が抑制されている疾患の治療または予防において用いられることが好ましい。
【００２２】
さらに、本発明に係る細胞性免疫増強方法において、前記対象が病原微生物に感染していることが好ましく、前記病原微生物がウイルスであることがより好ましく、前記ウイルスがヘルペスウイルス、パポーバウイルス、レンチウイルス、パラミクソウイルスよりなる群に含まれるウイルスのうち１または複数であることがさらに好ましい。また、本発明において、前記疾病が癌であることが好ましく、前記癌が乳癌、前立腺癌、あるいは口腔癌であることがより好ましく、乳癌であることがさらに好ましい。
【００２３】
すなわち、本発明に係る細胞性免疫増強方法は、任意のウイルスを含む細胞侵入性の病原微生物・因子による感染症に悩まされているかその危険のある対象、または乳癌、前立腺癌、または口腔癌等の癌に悩まされているかその危険のある対象において、疾患の予防または治療を目的として用いることができる。
【００２４】
次に、本発明に係るＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を用いて細胞性免疫を増強する対象をスクリーニングする方法は、対象から感染組織または癌組織を取得する工程と、前記組織からＢ２ＭまたはＢ２ＭをコードするｍＲＮＡを抽出する工程と、前記Ｂ２Ｍまたは前記Ｂ２ＭをコードするｍＲＮＡの量を、対照と比較する工程とを含む。
【００２５】
さらに、本発明に係るＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を用いて細胞性免疫を増強する対象をスクリーニングする方法は、対象から感染組織または癌組織を取得する工程と、前記組織からクロマチン沈降を行い、沈降物からＢ２ＭのＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を行う工程と、前記増幅されたＤＮＡ断片の存在の有無を評価する工程を含む。
【００２６】
また本発明に係るスクリーニング方法において、ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質はバルプロ酸であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係る細胞性免疫増強剤、ＨＬＡクラスＩ発現増強剤、Ｂ２Ｍ発現増強剤、または細胞性免疫増強方法によれば、ＭＨＣクラスＩ軽鎖（Ｂ２Ｍ）蛋白レベルの低下を介して発現が低下している標的細胞のＭＨＣクラスＩ抗原の発現レベルを高めることができる。その結果、宿主において、細胞傷害性Ｔ細胞による該標的細胞の傷害効果を増強することができる。従って、例えば微生物感染症や癌等の疾患において、実際に治療を行ったり、併用する療法の治療効果を高めたりすることができる。
【００２８】
また、本発明に係るＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を用いて細胞性免疫を増強する対象をスクリーニングする方法によれば、ＨＣクラスＩ軽鎖（Ｂ２Ｍ）蛋白レベルの低下を介して発現が低下している標的細胞を選択することができることから、疾患部位においてＢ２Ｍ発現が抑制されている疾病を有するか、または発症／再発する危険のある対象をスクリーニングすることができ、同様に微生物感染症や癌等の疾患の治療を行ったり、併用する療法の治療効果を高めたりすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】クロマチン沈降法によって細胞内のＢ２Ｍ遺伝子結合ヒストン蛋白質が脱アセチル化していることを示す図である。左パネルはＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞をＴＳＡ存在下で培養した例で、右パネルはＨＭＣ−１ヒト乳癌細胞株をＶＰＡ存在下で培養した例である。いずれの場合も、無処理の状態では抗アセチル化ヒストン抗体免疫沈降物の中にＢ２Ｍ遺伝子がほとんど検出されていないことから、Ｂ２Ｍ遺伝子領域でヒストン蛋白質は脱アセチル化していることがわかる。ＴＳＡまたはＶＰＡを作用させることによって、同免疫沈降物中にＢ２Ｍ遺伝子が検出されるようになった。
【図２】ＨＤＡＣ阻害剤によって、細胞内Ｂ２Ｍ蛋白質のレベルが増加することを示す図である。左パネルはＨＭＣ−１ヒト乳癌細胞を、右パネルはＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株を、それぞれＴＳＡ存在下で２４時間培養した例である。いずれの細胞でも、無処理の状態では極めて低レベルのＢ２Ｍ蛋白質が、ＨＤＡＣ阻害剤ＴＳＡの作用によって顕著に増加することが示された。それに対して、無処理の状態でも高レベルに発現しているＨＬＡクラスＩ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎやａｃｔｉｎ蛋白質のレベルには大きな変化はない。
【図３】ＨＤＡＣ阻害剤ＴＳＡによって、細胞表面ＭＨＣクラスＩ抗原のレベルが増加することを示す図である。左パネルはＨＭＣ−１ヒト乳癌細胞を、右パネルはＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株を、それぞれＴＳＡ存在下で２４時間培養した。いずれの細胞でも、無処理の状態では低レベルの細胞表面ＭＨＣクラスＩ抗原が、ＨＤＡＣ阻害剤ＴＳＡの作用によって約１０倍程度増加することを示している。縦軸は細胞数を、横軸は細胞の蛍光強度を表す。
【図４】ヒトに対する安全性が確立しているＨＤＡＣ阻害剤ＶＰＡによって、細胞表面ＭＨＣクラスＩ抗原のレベルが増加することを示す図である。ＨＭＣ−１ヒト乳癌細胞を４ｍＭ ＶＰＡ存在下で４８時間培養した。無処理の状態では低レベルの細胞表面ＭＨＣクラスＩ抗原が、ＨＤＡＣ阻害剤ＶＰＡの作用によって約１０倍程度増加することを示している。縦軸は細胞数を、横軸は細胞の蛍光強度を表す。
【図５】ヒトの乳癌組織において、細胞表面のＨＬＡクラスＩ抗原（重鎖および軽鎖Ｂ２Ｍ蛋白）の発現が陽性の癌症例（上パネル２枚, Ｃａｓｅ Ａ）と陰性の癌症例（下パネル２枚, Ｃａｓｅ Ｂ）を示す図である。左パネル上下２枚は、乳癌組織標本を抗ＨＬＡクラスＩ重鎖抗体（ＥＭＲ８−５抗体）を用いて免疫染色した図で、右パネル上下２枚は、同じ乳癌組織標本を抗Ｂ２Ｍ抗体（ＥＭＲＢ６抗体）を用いて免疫染色した図である。ヒト乳癌組織のなかには、ＨＬＡクラスＩ陽性の癌（Ｃａｓｅ Ａ）と、陰性の癌（Ｃａｓｅ Ｂ）とがあることを示している。
【図６】図５と同様の抗ＨＬＡクラスＩ重鎖抗体（ＥＭＲ８−５抗体）を用いて免疫染色を行い、ヒトの様々な種類の癌組織についてＨＬＡクラスＩ抗原の細胞表面発現を検索した。表に示すように、癌の種類によって頻度は異なるが、全ての癌種に関して、ＨＬＡクラスＩ抗原が陽性の癌と陰性もしくは発現低下している癌とがあることを示している。乳癌と前立腺癌では特に、ＨＬＡクラスＩ抗原の発現が低下している頻度が高いことに注目される。
【図７】ＶＰＡ投与マウスの腫瘍（ＶＰＡ（＋））では、対照群（ＶＰＡ（−））と比較してＨＬＡクラスＩ抗原の発現レベルが増加していることを示す図である。
【図８】ＶＰＡ投与マウスの腫瘍（ＶＰＡ（＋））では、対照群（ＶＰＡ（−））と比較してＢ２Ｍの発現レベルが増加していることを示す図である。
【図９】ＶＰＡ存在下（ＶＰＡ（＋））では、対照群（ＶＰＡ（−））と比較してＨｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ（ＨＩＶ）持続感染Ｔ細胞におけるＨＬＡクラスＩ抗原の発現レベルが増加していることを示す図である。
【図１０】ＶＰＡ存在下（ＶＰＡ（＋））では、対照群（ＶＰＡ（−））と比較してＰａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ持続感染上皮細胞株（ＨｅＬａ  ｃｅｌｌ）におけるＨＬＡクラスＩ抗原の発現レベルが増加していることを示す図である。
【図１１】ＶＰＡ存在下（ＶＰＡ（＋））では、対照群（ＶＰＡ（−））と比較してＥＢ ｖｉｒｕｓ持続感染Ｂ細胞（ＬＧ２ＥＢＶ細胞）におけるＨＬＡクラスＩ抗原の発現レベルが増加していることを示す図である。
【図１２】ＶＰＡ存在下（ＶＰＡ（＋））では、対照群（ＶＰＡ（−））と比較してＭｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ持続感染Ｂ細胞（Ａｋａｔａ−ＭＰ１細胞）におけるＨＬＡクラスＩ抗原の発現レベルが増加していることを示す図である。
【図１３】ＶＰＡ存在下（ＶＰＡ（＋））では、対照群（ＶＰＡ（−））と比較してＭｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ持続感染Ｂ細胞（Ｒａｊｉ−ＺＨ細胞）におけるＨＬＡクラスＩ抗原の発現レベルが増加していることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明の好適な態様について説明する。本発明の１の態様は、ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を有効成分として含む組成物に関する。
【００３１】
本発明における「ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質」とは、人体または動物に投与可能なＨＤＡＣ阻害剤であればどのようなものでもよい。例えば、現時点でヒトに対する安全性が最も確立されているＨＤＡＣ阻害作用を有する薬剤のひとつにバルプロ酸（ＶＰＡ）がある。ＶＰＡの場合、ヒトにおいては１日量約１０００ｍｇから２４００ｍｇを安全に経口投与することができるが、投与量は体重や年齢、薬物代謝動態、安全性、効果、目的、投与方法等に応じて、適宜加減することができる。
【００３２】
ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質としては、ＶＰＡのほか任意のＨＤＡＣ阻害剤を同等に用いることができる。例えば、本出願の時点においては、ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ、ＦＫ２２８（Ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ）、ＳＡＨＡ （ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＸＤ１０１、ＣＩ−９９４（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ｄｉｎａｌｉｎｅ)、ＭＧＣＤ０１０３、Ｐｉｖａｎｅｘ、ＣＲＡ−０２４７８１、ＭＳ−２７５、ＬＢＨ５８９、ＭＧ９８９、ＬＡＱ−８２４、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４等の薬剤が、本発明とは別の用途において既に臨床試験中である。そのほかにも、ＴＳＡ、Ｔｒａｐｏｘｉｎ、ＣＨＡＰ、Ａｐｉｃｉｄｉｎ、Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ等、数多くのＨＤＡＣ阻害剤が知られている。従って、「ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質」として、本発明の効果においてＶＰＡと同等の作用および／または特異性を有するＨＤＡＣ阻害剤を用いることができる。このようなＨＤＡＣ阻害剤は、クラスＩおよび／またはクラスＩＩのＨＤＡＣに対する阻害剤であるといえる。
【００３３】
また、本発明におけるＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を有効成分として含む組成物は、疾患部位におけるＢ２Ｍ発現が抑制されている疾患の治療または予防において用いられる。なお、前記疾患部位とは、例えば癌であれば癌細胞を、感染症であれば病原微生物が感染している細胞を意味する。
【００３４】
さらに本発明におけるＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を有効成分として含む組成物を投与する対象は特に限定されないが、癌患者、癌の発症、または再発の危険がある対象、もしくはウイルスその他の病原微生物に感染しているか、またはその危険がある対象が含まれる。
【００３５】
本発明における病原微生物の感染症は、特に限定されないが、例えば、ＥＢウイルス、サイトメガロウイルス、ＨＳＶ、ＨＨＶ−７等を含むヘルペスウイルス科ウイルス、パピローマウイルス等を含むパポーバウイルス科ウイルス、パルボウイルス科ウイルス、アデノウイルス科ウイルス、ＨＢＶ等を含むヘパドナウイルス科ウイルス、ポックスウイルス科ウイルス、エンテロウイルス属のコクサッキーウイルス、ＨＡＶ等を含むピコルナウイルス科ウイルス、ＳＡＲＳウイルスを含むコロナウイルス科ウイルス、トガウイルス科ウイルス、ＨＣＶ、ウエストナイル熱ウイルス等を含むフラビウイルス科ウイルス、ラブドウイルス科ウイルス、フィロウイルス科ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎（ムンプス）ウイルス、パラインフルエンザウイルス等を含むパラミクソウイルス科ウイルス、アレナウイルス科ウイルス、ハンタウイルス等を含むブニヤウイルス科ウイルス、インフルエンザウイルスを含むオルソミクソウイルス科ウイルス、レンチウイルス亜科のＨＩＶ−１／２、ＦＩＶや、オンコウイルス亜科のＨＴＬＶ−１／２等を含むレトロウイルス科ウイルス、ロタウイルスを含むレオウイルス科ウイルス、その他様々なウイルスを含むウイルス、ならびに、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、真菌、および、原虫等の寄生虫等による感染症のほか、病原因子を必ずしも特定できない任意の感染症をも含む。換言すれば、前記感染症は特に限定されないが、例えばレオウイルス感染症、ＳＡＲＳ、レトロウイルス感染症、黄熱病、日本脳炎、デング熱、西ナイル熱、牛ウイルス性下痢・粘膜病、豚コレラ、ボーダー病、Ｃ型肝炎、口蹄疫、ポリオ（急性灰白髄炎）、Ａ型肝炎、風邪、風疹、シンドビスウイルス感染症、馬ウイルス性動脈炎、サル出血熱、ノロウイルス感染症、サポウイルス感染症、ウサギ出血熱、猫カリシウイルス病、豚水疱疹、Ｅ型肝炎、マールブルグ病、エボラ出血熱、狂犬病、水胞性口炎、麻疹、小反芻獣疫、犬ジステンパー、牛疫、流行性耳下腺炎、メナングルウイルス感染症、ニューカッスル病、ＲＳウイルス感染症、ヒト・メタニューモウイルス感染症、ニパウイルス感染症、インフルエンザ、アカバネ病、ハンタウイルス肺症候群、腎症候群性出血熱、リンパ球性脈絡髄膜炎、ラッサ熱、アルゼンチン出血熱、ボリビア出血熱、ＡＩＤＳ、成人Ｔ細胞白血病、あるいは、水痘、天然痘、帯状疱疹、サイトメガロウイルス感染症、アデノウイルス感染症、Ｂ型肝炎、その他の疾患を有するかまたはその危険のある対象に適用することができる。
【００３６】
また、本発明におけるＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を有効成分として含む組成物は、病原微生物の感染症の治療または予防において、単独に、または他の任意の当業者に知られた感染症の治療・予防処置を補完するための免疫賦活剤として用いることもできる。
【００３７】
また、本発明におけるＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を有効成分として含む組成物は、癌の治療または予防において、抗癌剤として、および／または他の抗癌治療を補完するための免疫賦活剤として用いることができる。前記癌の予防における最も好ましい態様は、癌の再発予防である。
【００３８】
本発明において治療または予防の対象となる前記癌は特に限定されないが、肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、大腸癌、膀胱癌等の様々な癌を挙げることができ、好ましくは前立腺癌または口腔癌であり、さらに好ましくは乳癌である。一方、Ｂ２Ｍ発現が多数の症例で抑制されている疾患（たとえば乳癌や前立腺癌）ではなくとも、個々の症例においてＢ２Ｍ発現が抑制されていれば、本発明の細胞性免疫増強剤を好んで適用することができる。
【００３９】
また、前記抗癌治療の方法は特に限定されないが、放射線治療、温熱療法、化学療法（例えば、アナストロゾール、シクロホスファミド、イリノテカン、シタラビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ブスルファン、カルボコン、ミトブロニトール、ダカルバジン、メルファラン、ブロカルバジン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、カモフール、メルカプトプリン、メトトレキサート、シタラビンオクホスファート、テガフール、カルボプラチン、シスプラチン、チオテパ、ドキソルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、L-アスパラギナーゼ、マイトマイシンＣ、メドロキシプロゲステロン、クレスチン、タモキシフェン、トレミフェン、ビノレルビン、エトポシド等の抗癌剤、またはこれらの医薬上許容される塩を用いるもの等）、遺伝子治療（ｐ５３等の癌抑制遺伝子を導入するもの、免疫刺激性サイトカイン遺伝子を導入した腫瘍細胞を用いるもの等）、外科療法、食餌療法等の様々な治療を含み、好ましくは免疫療法である。免疫療法には、腫瘍抗原ペプチドを用いた癌ワクチン療法、ペプチド抗原や腫瘍細胞の遺伝子をウイルス等のベクター・担体を介して生体に導入するＤＮＡワクチン、腫瘍細胞のＲＮＡを利用したＲＮＡワクチン、サイトカインや抗原提示細胞としての樹状細胞を併用した治療、モノクローナル抗体療法等が含まれる。
【００４０】
なお、本発明におけるＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を有効成分として含む組成物は、細胞性免疫を増強するために用いる医薬を製造するためにも用いることができる。そのような細胞性免疫増強剤は、本発明に係る様々な疾患に関連して、治療や疾患状態の改善のほか、予防、再発防止等に使用される。
【００４１】
また、本発明におけるＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を有効成分として含む組成物を対象に投与する方法は特に限定されないが、通常の手法を用いて、対象に例えば経口または非経口投与（例えば、点滴投与を含む静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、もしくは局所投与等）することが可能である。投与する対象は任意の動物であってよく、例えばトカゲ、ニワトリ、アヒル、カモ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、ヒトその他が考えられ、好ましくはヒトを含む哺乳類動物である。
【００４２】
次に、本発明におけるＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を有効成分として含む組成物は、投与方法に従い、通常用いられる医薬用担体と共に製剤化して調製することができる。例えば、有効成分であるＨＤＡＣ阻害剤をシロップ剤等の経口液状製剤として、又はエキス、粉末等に加工し、医薬上許容される担体と配合して錠剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、顆粒剤、散剤等の経口製剤とすることができる。
【００４３】
ここで医薬上許容できる担体としては、通常用いられている各種の物質が用いられ、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、賦形剤、溶解補助剤、可溶化剤、乳化剤、懸濁化剤、結合剤等を配合することが可能である。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、着色料、甘味剤等の製剤添加物を加えることもできる。
【００４４】
本発明における、ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を有効成分として含む組成物は、これを単独で用いることもできるが、細胞性免疫増強を目的として用いられるため、好ましくは、癌抗原特異的ワクチン、ウイルスワクチン等の抗原特異的ワクチンや、その他の抗原非特異的免疫賦活剤、例えばインターフェロン等のサイトカインや各種アジュバント等を併用することができる。併用する薬剤は、本発明におけるＨＤＡＣ阻害剤を含む薬剤と混合して、または別々に用いることもできる。
【００４５】
次に、本発明の２の態様は、ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を有効成分として含む組成物を対象において投与するステップを含む細胞免疫増強方法に関する。つまり、免疫低下に由来する疾患に悩むかまたはその危険のある対象において細胞性免疫を増強する方法であって、薬学的に許容される担体およびＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を含む組成物を、細胞性免疫を増強する用量において対象に投与するステップを含む方法である。
【００４６】
本発明における細胞性免疫増強方法に適した、疾患部位においてＢ２Ｍ発現が抑制されている疾病を有するかまたは従って、本発明に従う細胞免疫増強方法に適した、疾患部位においてＢ２Ｍ発現が抑制されている疾病を有するかまたは発症／再発する危険のある対象をスクリーニングする方法も本発明の範囲内であり、本発明の３の態様である。このようなスクリーニングには、
１）対象から癌組織等の疾患部位を取得する工程；
２）前記組織からＢ２ＭまたはＢ２ＭをコードするｍＲＮＡを抽出する工程；
３）前記Ｂ２ＭまたはＢ２ＭをコードするｍＲＮＡの量を、対照と比較する工程；
以上１）〜３）の工程が含まれる。
【００４７】
また、組織の取得は、各臓器に対して通常用いられる生検によるほか、洗浄液、擦過採取、あるいは血液、髄液、リンパ液、尿、唾液、腹水、胸水、浸出液等の体液の取得等を介することができる。
【００４８】
次に、Ｂ２ＭまたはＢ２ＭをコードするｍＲＮＡの量の比較は、当業者に知られた方法、たとえば、質量分析計を用いたり、あるいはＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ法、蛍光抗体法、ウエスタンブロット法、もしくは免疫組織染色法等の免疫学的手法、またはノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法もしくはマイクロアレイ法等の遺伝子学的手法等を用いて達成することができる。
【００４９】
前記スクリーニングは、特に、本発明の方法を適用する対象を選別する一次スクリーニングに適するものであるが、さらに厳密には、次のような工程を含むスクリーニングをさらに行うか、または当初から行うことによって、選別される対象をより絞り込むことが好ましい。
１）対象から癌組織等の疾患部位を取得する工程；
２）前記組織からクロマチン沈降を行い、沈降物からＢ２ＭのＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を行う工程；
３）前記増幅されたＤＮＡ断片の存在の有無を評価する工程。
【００５０】
この手順によってＢ２ＭのＤＮＡ断片が増幅されてこない対象は、ＨＤＡＣ活性の存在によってＢ２Ｍ遺伝子の発現が抑制されている可能性があり、本発明の治療法等の適用による効果が期待される。ここで、「クロマチン沈降」とは、クロマチンに結合しているＤＮＡをクロマチンとともにアフィニティー沈降させる方法であり、任意の適当な方法を用いることができるが、例えば組織細胞を予め１％ホルムアルデヒド等の架橋剤で処理（例えば室温１０分間）することによりクロマチンとＤＮＡの結合状態を維持させておいてから、通常用いられるＲＩＰＡ緩衝液等を用いて細胞を溶解し、超音波破砕機等を用いてＤＮＡを剪断した後、例えば抗アセチル化ヒストン抗体によって、クロマチンとそこに結合したＤＮＡ断片を沈降させることが可能である（Ａｓｓａｍ Ｅｌ−Ｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，（２００２）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ２２（６）ｐ１８４４−１８５７を参照のこと）。
【００５１】
なお、本発明の２の態様である細胞性免疫増強方法は、ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を有効成分として含む組成物を対象に投与するステップを含む、対象においてＨＬＡクラスＩ発現を増強するための方法である。このような組成物は、限定されないが、ウイルス等の病原微生物の感染症の治療または予防剤として用いられ、または、Ｂ２Ｍが抑制されている疾病、例えば癌の治療における抗癌剤として、もしくは当該疾病の他の治療法を補助するために用いられる。
【００５２】
また、本発明に係る細胞性免疫増強方法は、ＨＤＡＣ阻害活性を有する物質を有効成分として含む組成物を対象に投与するステップを含む、対象においてＢ２Ｍ発現を増強するための方法である。このような組成物は、限定されないが、例えば癌を治療もしくは予防するために、単独で、または他の治療法と併用して用いられる。
【００５３】
特段の記載のない限り、本明細書において用いられている用語は、当業者に通常理解され、用いられている意味を有するものとする。また、特に記載のない限り、本明細書で使用されている方法および技術は、当該技術分野においてよく知られた慣用の手順に従って遂行することができる。これらの手順等が記載された参考文献としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９および２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２および補遺）；およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）等のものや、本明細書に記載されているようなプロバイダーが頒布する使用説明書等が挙げられる。本明細書において引用された科学文献、特許、特許出願等の引用文献は、その全体が本明細に参照として取り込まれる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００５５】
本実施例では、細胞内Ｂ２Ｍ遺伝子領域に結合しているヒストン蛋白質が脱アセチル化しており、ＨＤＡＣ阻害剤によってこの脱アセチル化が解除されることを示す。以下にその手順を示す。
【００５６】
ヒトの乳癌細胞株、ＭＣＦ−７細胞およびＨＭＣ−１細胞を用いて、１００ｎＭ ＴＳＡ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）存在下２４時間または４ｍＭ ＶＰＡ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）存在下４８時間、それぞれ培養した後、メーカー（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）の使用説明書に従って、細胞からクロマチンを抽出し抗アセチル化ヒストンＨ３抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてクロマチンの免疫沈降を行った（Ａｓｓａｍ Ｅｌ−Ｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，（２００２）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ２２（６）ｐ１８４４−１８５７を参照のこと）。アセチル化ヒストンと結合している遺伝子を、Ｂ２Ｍ遺伝子特異的プライマー（ＧＡＡＡＡＣＧＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＴＣＴ、およびＡＧＡＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＡＣＴＡＧＣ）を用いてＰＣＲにて増幅し、１％アガロースゲルで電気泳動後、臭化エチジウムの存在下、トランスイルミネータで検出した。この結果、いずれの癌細胞においてもＢ２Ｍ遺伝子領域のヒストンは脱アセチル化していることが示された。ＴＳＡやＶＰＡのようなＨＤＡＣ阻害剤の作用によってヒストンアセチル化が促進されると、アセチル化ヒストンとともにＢ２Ｍ遺伝子が検出された（図１）。
【実施例２】
【００５７】
本実施例では、ＨＤＡＣ阻害剤によって細胞内Ｂ２Ｍ蛋白質の発現が増加することを示す。以下にその手順を示す。
（１）上記実施例１と同じ細胞を用いて、ＨＤＡＣ阻害剤ＴＳＡ（１００ｎＭ）存在下で２４時間、それぞれ培養した後、細胞を回収した。
（２）１×１０６の細胞を１００μＬの細胞溶解液（ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ）に溶解し、可溶性分画をライゼートとして回収する。ライゼートにＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えた。
（３）蛋白試料を７．５％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動した。
（４）ゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。
（５）転写膜を５％スキムミルク・ＰＢＳに浸し、約１時間ブロッキングした。
（６）転写膜を一次抗体（抗ｐａｎ−ＨＬＡクラスＩ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ抗体ＥＭＲ８−５（ホクドー、札幌）、または抗Ｂ２Ｍ抗体ＥＭＲＢ６（ホクドー、札幌）、または抗ａｃｔｉｎ抗体（ＤＡＫＯ）に浸し、室温で１時間インキュベーションした。
（７）転写膜を洗浄液ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
（８）転写膜を二次抗体ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ、ＵＳＡ）に浸し、室温で１時間インキュベーションした。
（９）転写膜を洗浄液ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
（１０）転写膜をＥＣＬキット（アマシャム、ＵＳＡ）発光液に浸し、約１分間発色反応させた。
（１１）発光シグナルをＸ線フィルムで検出した。
【００５８】
その結果、ＴＳＡの有無によって細胞内ＨＬＡ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎとａｃｔｉｎ蛋白質の発現レベルに大きな差はなかったが、Ｂ２Ｍ蛋白質のレベルはＴＳＡ処理によって顕著に増加することが示された（図２）。
【実施例３】
【００５９】
上記実施例１、２と同じ細胞を用いて、ＨＤＡＣ阻害剤ＴＳＡ(１００ｎＭ）存在下で２４時間、またはＶＰＡ（４ｍＭ）存在下で４８時間、それぞれ培養した後、細胞表面に発現しているＭＨＣクラスＩ抗原のレベルをフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって解析した。その手順を以下に示す。
（１）１×１０６の細胞を１００μＬのＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒに浮遊させ、一次抗体（抗ｐａｎ−ＨＬＡクラスＩ抗体であるＷ６／３２（Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅ Ｃ．Ｊ．，Ｂｏｄｍｅｒ Ｗ．Ｊ．，Ｂｒｏｗｎ Ｇ．，Ｇａｌｆｒｅ Ｇ．，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ａ．Ｆ．，ａｎｄ Ｚｅｉｇｌｅｒ Ａ．（１９７８）Ｃｅｌｌ １４，９−２０））を添加し、４℃で４０分間インキュベーションした。
（２）細胞をＰＢＳで２回洗浄した。
（３）細胞浮遊液に二次抗体（ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ，ＵＳＡ））を添加し、４℃で４０分間インキュベーションした。
（４）細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１％ホルマリン添加ＰＢＳに浮遊させた後、フローサイトメーターによって細胞表面のＦＩＴＣレベルを解析した。
【００６０】
その結果、ＴＳＡまたはＶＰＡの存在下で細胞表面ＭＨＣクラスＩレベルが約１０倍増加することが示された（図３、図４）。
【実施例４】
【００６１】
本実施例では、ホルマリン固定ヒト癌組織の免疫組織染色を行ない、実際のヒト癌組織におけるＭＨＣクラスＩ抗原の発現レベルを解析した。その手順を以下に示す。
（１）２０％ホルマリン固定液で固定されたヒト乳癌組織のパラフィン包埋切片をエチルアルコールによって脱パラフィン処理した。
（２）抗原賦活化処理として、切片を０．０１ｍｏｌ／Ｌクエン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）に浸して、オートクレーブ処理（１１０℃、５分）した。
（３）一次抗体として抗ＨＬＡクラスＩ重鎖抗体（ＥＭＲ８−５）５μｇ／ｍＬまたは抗β２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）抗体（ＥＭＲＢ６）５μｇ／ｍＬを０．５ｍＬ切片上に滴下し、室温で１時間インキュベーションした。
（４）洗浄液ＰＢＳ−Ｔ （０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
（５）二次抗体ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（シンプルステインＭＡＸ−ＰＯ、ＮＩＣＨＩＲＥＩ）を切片上に滴下し、室温で３０分間インキュベーションした。
（６）洗浄液ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
（７）切片を過酸化水素水とＤＡＢ基質の混合液（シンプルステインＭＡＸ−ＰＯ、ＮＩＣＨＩＲＥＩ）に浸し、１〜２分間発色反応させた。
（８）切片を流水で１分間洗浄した。
（９）Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ核染色（１〜２分）を行った。Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ核染色は、次の手順に倣った。
１．Ｔａｋｅ ｓｅｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｗａｔｅｒ．
２．Ｐｌａｃｅ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｙｅｒｓ Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（ｆｉｌｔｒａｔｅｄ）ｆｏｒ ５ ｍｉｎｕｔｅｓ．
３．Ｗａｓｈ ｉｎ ｔａｐ ｗａｔｅｒ．
４．‘Ｂｌｕｅ’ｓｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔａｐ ｗａｔｅｒ．
５．Ｐｌａｃｅ ｓｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ １％ Ａｃｉｄ Ａｌｃｏｈｏｌ（７０％ Ａｌｃｏｈｏｌ ９９ｍｌ ｐｌｕｓ ｃｏｎｃ．Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ Ａｃｉｄ １ｍｌ）ｆｏｒ ａ ｆｅｗ ｓｅｃｏｎｄｓ．
６．Ｗａｓｈ ｉｎ ｔａｐ ｗａｔｅｒ．
７．Ｐｌａｃｅ ｓｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｅｏｓｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｏｓｉｎ Ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ １．０ｇ ｉｎ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ １００ｍｌ）ｆｏｒ ５ ｍｉｎｕｔｅｓ．
８．Ｗａｓｈ ｉｎ ｔａｐ ｗａｔｅｒ．
９．Ｄｅｈｙｄｒａｔｅ，ｃｌｅａｒ．
１０．Ｍｏｕｎｔ ｓｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｍｏｕｎｔ ｏｒ ＤＰＸ．
【００６２】
その結果、図５上パネル２枚（Ｃａｓｅ Ａ）のようにＨＬＡクラスＩ重鎖およびＢ２Ｍ蛋白が陽性の癌と、下パネル２枚（Ｃａｓｅ Ｂ）のようにＨＬＡクラスＩ重鎖およびＢ２Ｍ蛋白が陰性の癌とが存在することが示された。
【実施例５】
【００６３】
実施例５と同様の免疫染色法によって、ヒトの種々の癌組織におけるＭＨＣクラスＩ抗原の発現レベルを解析した。図６に示すように、乳癌では４１例中３５例（８５％）でＨＬＡクラスＩ抗原の発現が低下もしくは消失、肺癌では３５例中７例（２０％）、肝臓癌では５７例中２４例（４２％）、大腸癌では１５例中４例(２７％)、腎細胞癌では４５例中１６例(３５％)、膀胱癌では５３例中１８例（３４％）、口腔癌では７８例中４５例（５８％）、前立腺癌では４９例中４０例（８２％）で、それぞれＨＬＡクラスＩ抗原の発現が低下もしくは陰性であった。乳癌と前立腺癌では発現低下の頻度が著しく高いことが注目された。
【実施例６】
【００６４】
ＳＣＩＤマウスにヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７細胞を移植し、２週間後、約５ｍｍ径の皮下腫瘍 を形成させた。１匹のマウスには、０．４％ Ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ（ＶＰＡ，Ｓｉｇｍａ）を含んだ水を１０日間与え、他の１匹には対照群として無添加の水を与えた。１０日後、腫瘍を外科的に切除し、１０％ホルマリン（腫瘤が小さいため過固定を防ぐために実施例４より低い濃度とした）を用いて、室温で一晩固定を行った後、パラフィン包埋切片を得た。実施例４記載の方法に従って、組織切片の処理、ならびに抗ＨＬＡクラスＩ抗体（ＥＭＲ８−５）および抗Ｂ２Ｍ抗体（ＥＭＲ−Ｂ６）による免疫染色を行った。その結果、図６、図７に示すように、ＶＰＡ投与マウスの腫瘍では、対照群と比較してＨＬＡクラスＩ抗原、およびＢ２Ｍの発現レベルが増加していた。この実験から、ＨＤＡＣ阻害剤ＶＰＡの経口投与によってヒト乳癌組織のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ抗原発現を増加させることが可能であることが示された。
【実施例７】
【００６５】
《ＨＩＶ感染系の実施例》
ＨＩＶ感染Ｔ細胞（ｃｌｏｎｅ ８Ｅ５，ＡＴＣＣより購入）を４ｍＭ Ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ添加培養液（ＲＰＭＩ１６４０）または無添加培養液で４８時間培養した後、抗ｐａｎ−ＨＬＡクラスＩ抗体であるＷ６／３２抗体とＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌ抗マウスＩｇＧ抗体とを各４０分間反応させ、０．１％ホルマリン／ＰＢＳにて細胞を固定した。Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて蛍光強度を測定した。ＨＤＡＣ阻害剤存在下では、細胞表面のＨＬＡクラスＩレベルが低下している感染細胞群において発現の回復が観察された。
【実施例８】
【００６６】
Ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ持続感染細胞（ＨｅＬａ ｃｅｌｌ）を４ｍＭ Ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ添加培養液（ＲＰＭＩ１６４０）または無添加培養液で４８時間培養した後、抗ｐａｎ−ＨＬＡクラスＩ抗体であるＷ６／３２抗体とＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌ抗マウスＩｇＧ抗体とを各４０分間反応させ、０．１％ホルマリン／ＰＢＳにて細胞を固定した。Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて蛍光強度を測定した。ＨＤＡＣ阻害剤存在下では、細胞表面のＨＬＡクラスＩレベルが低下している感染細胞群において発現の回復が観察された。
【実施例９】
【００６７】
ＥＢ ｖｉｒｕｓ持続感染Ｂ細胞（ＬＧ２ＥＢＶ細胞）を４ｍＭ Ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ添加培養液（ＲＰＭＩ１６４０）または無添加培養液で４８時間培養した後、抗ｐａｎ−ＨＬＡクラスＩ抗体であるＷ６／３２抗体とＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌ抗マウスＩｇＧ抗体とを各４０分間反応させ、０．１％ホルマリン／ＰＢＳにて細胞を固定。Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて蛍光強度を測定した。ＨＤＡＣ阻害剤存在下では、細胞表面のＨＬＡクラスＩレベルが低下している感染細胞群において発現の回復が観察された。
【実施例１０】
【００６８】
Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ持続感染Ｂ細胞（Ａｋａｔａ−ＭＰ１細胞）を４ｍＭ Ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ添加培養液（ＲＰＭ１６４０）または無添加培養液で４８時間培養した後、抗ｐａｎ−ＨＬＡクラスＩ抗体であるＷ６／３２抗体とＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌ抗マウスＩｇＧ抗体とを各４０分間反応させ、０．１％ホルマリン／ＰＢＳにて細胞を固定。Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて蛍光強度を測定した。ＨＤＡＣ阻害剤存在下では、細胞表面のＨＬＡクラスＩレベルが低下している感染細胞群において発現の回復が観察された。
【実施例１１】
【００６９】
Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ持続感染Ｂ細胞（Ｒａｊｉ−ＺＨ細胞）を４ｍＭ Ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ添加培養液（ＲＰＭＩ１６４０）または無添加培養液で４８時間培養した後、抗ｐａｎ−ＨＬＡクラスＩ抗体であるＷ６／３２抗体とＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌ抗マウスＩｇＧ抗体とを各４０分間反応させ、０．１％ホルマリン／ＰＢＳにて細胞を固定。Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて蛍光強度を測定した。ＨＤＡＣ阻害剤存在下では、細胞表面のＨＬＡクラスＩレベルが低下している感染細胞群において発現の回復が観察された。
【００７０】
以上の全てのウイルス感染系においては、ＨＤＡＣ阻害剤の適用によって、Ｂ２Ｍ発現の上昇が全く観察されないにもかかわらず、一様にＭＨＣクラスＩ発現上昇が観察された。これは癌組織における観察と比しても、全く予想に反する結果であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年9月3日(2009.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を有効成分として含んでなる、細胞性免疫増強剤。
【請求項２】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質がバルプロ酸である、請求項１に記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項３】
疾患部位におけるβ２マイクログロブリン発現が抑制されている疾病の治療または予防において用いられる、請求項１または請求項２に記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項４】
疾病が病原微生物による感染症である、請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項５】
病原微生物がウイルスである、請求項４に記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項６】
ウイルスが、ヘルペスウイルス、パポーバウイルス、レンチウイルスおよびパラミクソウイルスよりなる群に含まれるウイルスのうち１または複数である、請求項５に記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項７】
疾病が癌である、請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項８】
癌が乳癌である、請求項７に記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項９】
癌が前立腺癌または口腔癌である、請求項７に記載の細胞性免疫増強剤。
【請求項１０】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を有効成分として含んでなる、ＨＬＡクラスＩ発現増強剤。
【請求項１１】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を有効成分として含んでなる、β２マイクログロブリン発現増強剤。
【請求項１２】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を有効成分として含有する組成物を対象において投与する工程を含む、細胞性免疫増強方法。
【請求項１３】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質がバルプロ酸である、請求項１２に記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項１４】
疾患部位におけるβ２マイクログロブリン発現が抑制されている疾病の治療または予防において用いられる、請求項１２または請求項１３に記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項１５】
対象が病原微生物に感染している、請求項１２から請求項１４のいずれかに記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項１６】
病原微生物がウイルスである、請求項１５に記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項１７】
ウイルスが、ヘルペスウイルス、パポーバウイルス、レンチウイルスおよびパラミクソウイルスよりなる群に含まれるウイルスのうち１または複数である、請求項１６に記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項１８】
疾病が癌である、請求項１２から請求項１４のいずれかに記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項１９】
癌が乳癌である、請求項１８に記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項２０】
癌が前立腺癌または口腔癌である、請求項１８に記載の細胞性免疫増強方法。
【請求項２１】
１）対象から感染組織または癌組織を取得する工程；
２）前記組織からβ２マイクログロブリンまたはβ２マイクログロブリンをコードするｍＲＮＡを抽出する工程；
３）前記β２マイクログロブリンまたはβ２マイクログロブリンをコードするｍＲＮＡの量を、対照と比較する工程；
を含む、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を用いて細胞性免疫を増強する対象をスクリーニングする方法。
【請求項２２】
１）対象から感染組織または癌組織を取得する工程；
２）前記組織からクロマチン沈降を行い、沈降物からβ２マイクログロブリンＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を行う工程；
３）前記増幅されたＤＮＡ断片の存在の有無を評価する工程；
を含む、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を用いて細胞性免疫を増強する対象をスクリーニングする方法。
【請求項２３】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質がバルプロ酸である、請求項２１または請求項２２に記載のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害活性を有する物質を用いて細胞性免疫を増強する対象をスクリーニングする方法。
【国際調査報告】
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