(57)【要約】  シクロオキシゲナーゼの複数の活性および複数のプロスタグランジンの合成において関与された複数の代謝（メタボリック）経路と関連された種々の疾病および疾患、例えば、２型糖尿およびこの後遺症、虚血血管疾病、炎症と関連された痛み、炎症皮膚病状、脊髄傷害、末梢ニューロパシー、多発硬化症、炎症腸疾病、およびリューマチ関節炎、並びに、種々のタイプの癌が、１５−デオキシプロスタグランジンＪ２産生を選択的に高めるある剤の使用により、処置されていたり、予防されたりしていることが、ある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高められたレベルのプロスタグランジンＥ２もしくはシクロオキシゲナーゼおよびプロスタグランジン合成酵素（シンターゼ）の作用の他の代謝物により、仲介された病状の処置もしくは予防用の、または、抑えられたレベルもしくは抑えられたアベイラビリティの１５−デオキシプロスタグランジンＪ２により、より悪くされた病状の処置もしくは予防用の、医薬品の製造のための、１５−デオキシプロスタグランジンＪ２産生を高める剤の、使用。
【請求項２】
高められたレベルのプロスタグランジンＥ２もしくはシクロオキシゲナーゼの作用の他の代謝物により、仲介された病状の処置もしくは予防用の、または、抑えられたレベルもしくは抑えられたアベイラビリティの１５−デオキシプロスタグランジンＪ２により、より悪くされた病状の処置もしくは予防用の、医薬品の製造のための、炎症発症剤存在下、１５−デオキシプロスタグランジンＪ２産生を容易化させ、プロスタグランジンＥ２産生を選択的に阻害する剤の、使用。
【請求項３】
神経突起の外殖を促進させるか、または、末梢ニューロパシーを処置するための医薬品の製造のための、１５−デオキシプロスタグランジンＪ２産生を高める剤の、使用。
【請求項４】
ＰＰＡＲγ活性化を必要としている病状を処置するための医薬品の製造のための、１５−デオキシプロスタグランジンＪ２産生を高め、順に、ＰＰＡＲγを活性化させる剤の、使用。
【請求項５】
前記剤が、式（Ｉ）：
【化１】
2010511028.tif 000037
の化合物であり、式中：
この破線の円が、これを含有しているこの環が、全部飽和されていてもよく、または、１、２、もしくは３の炭素炭素２重結合を持ってよいことを指し示し；
この破線の線が、この結合が、炭素炭素単もしくは２重結合であってよいことを指し示し；
Ｒ1が、水素原子もしくはメチル基を表し；
Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が、互いと同一であるか、もしくは、互いと異なっており、各々が、オキソ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、水素原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、もしくはアシル基を表し；
あるいは、医薬として許容可能なその塩もしくはそのエステルである、請求項１〜４のいずれか１項に従っている使用。
【請求項６】
前記化合物が、式（ＩＩ）：
【化２】
2010511028.tif 000038
を持つか（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が、請求項５において定義されたとおりである）、あるいは、そのエステルである、請求項５に従っている使用。
【請求項７】
前記化合物が、式（ＩＩＩ）：
【化３】
2010511028.tif 000039
を持つか（式中、Ｒ2aが、オキソ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、もしくはハロゲン原子を表し；Ｒ1、Ｒ3、およびＲ4が、請求項５において定義されたとおりである）、あるいは、そのエステルである、請求項５に従っている使用。
【請求項８】
前記化合物が、式（ＩＶ）：
【化４】
2010511028.tif 000040
を持つか（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が、請求項５において定義されたとおりである）、あるいは、そのエステルである、請求項５に従っている使用。
【請求項９】
前記化合物が、式（Ｖ）：
【化５】
2010511028.tif 000041
を持ち、式中、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が、請求項５において定義されたとおりである、請求項５に従っている使用。
【請求項１０】
前記化合物が、７−ヒドロキシテストステロンである、請求項５に従っている使用。
【請求項１１】
前記化合物が、７α−ヒドロキシデヒドロＥＰＩアンドロステロンもしくは７β−ヒドロキシデヒドロＥＰＩアンドロステロンである、請求項５に従っている使用。
【請求項１２】
前記化合物が、７β−ヒドロキシプレニェノロンもしくは７α−ヒドロキシプレニェノロンまたはこのエステルである、請求項５に従っている使用。
【請求項１３】
前記化合物が、７α−もしくは７β−ヒドロキシＥＰＩアンドロステロンもしくはこのエステルである、請求項５に従っている使用。
【請求項１４】
前記化合物が、７α−もしくは７β−ヒドロキシ−１７β−エストラジオールもしくはこのエステルである、請求項５に従っている使用。
【請求項１５】
前記化合物が、７α−もしくは７β−ヒドロキシエストロンもしくはこのエステルである、請求項５に従っている使用。
【請求項１６】
前記剤が、式（ＶＩ）：
【化６】
2010511028.tif 000042
の化合物であり、式中：
Ｘが、式＞ＣＲ5Ｒ6の基を表し、もしくは、Ｒ10が、水素原子を表さない場合、式＞ＳＯ2の基を表し；
Ｙが、式＞ＮＨもしくは式＞ＣＲ5Ｒ6の基を表し；
Ｚが、式＞Ｃ＝Ｏの基、式ＣＨ2の基、もしくは直接の結合を表し；
Ｒ5が、水素原子を表し、Ｒ6が、水素原子、カルボキシ基、もしくはヒドロキシ基を表し；
または
Ｒ5およびＲ6が、一緒に、オキソ基、メチレンジオキシ基、もしくはヒドロキシイミノ基を表し；
Ｒ7が、水素原子もしくは低級アルキル基を表し；
Ｒ8が、２水素原子またはオキソ基もしくはヒドロキシイミノ基を表し；
Ｒ9が、水素原子、低級アルキル基、もしくはハロゲン原子を表し；
Ｒ10が、水素原子、低級アルコキシ基、もしくはカルボキシ基を表し；
Ｒ11およびＲ12が、互いと同一であるか、もしくは、互いと異なっており、各々が、水素原子、低級アルキル基、もしくはハロゲン原子を表し；
あるいは、該化合物が、カルボキシ基を含有する場合、その塩もしくはそのエステルである、請求項１〜４のいずれか１項に従っている使用。
【請求項１７】
前記化合物が、以降の化合物１〜２３：
【化７−１】
2010511028.tif 000043
【化７−２】
2010511028.tif 000044
【化７−３】
2010511028.tif 000045
【化７−４】
2010511028.tif 000046
の１種である、請求項１６に従っている使用。
【請求項１８】
糖尿およびこの後遺症；複数の虚血血管疾病；炎症と関連された痛み；複数の炎症皮膚病状；脊髄傷害；末梢ニューロパシー；多発硬化症；炎症腸疾病；リューマチ関節炎；代謝症候群（メタボリックシンドローム）Ｘ；肥満；肢端巨大症；ならびに創傷治癒
の処置もしくは予防のための医薬品の製造のための請求項５〜１７のいずれか１項において定義されたとおりの化合物の使用。
【請求項１９】
癌の処置もしくは予防のための医薬品の製造のための１５−デオキシプロスタグランジンＪ２産生を高める剤の使用。
【請求項２０】
複数の癌細胞におけるアポトーシスを包含し、癌細胞増殖を阻害していくか、または、腫瘍の成長および進展を阻害していくための医薬品の製造のための１５−デオキシプロスタグランジンＪ２産生を高める剤の使用。
【請求項２１】
前記癌が、直腸結腸、消化管、胸、肝臓、前立腺、膀胱、甲状腺、乳頭、もしくは食道癌である、請求項１９および請求項２０のいずれか１項に従っている使用。
【請求項２２】
前記化合物が、請求項５〜１７のいずれか１項において定義されたとおりである、請求項１９、２０、および２１のいずれか１項に従っている使用。
【請求項２３】
前記病状が、複数の末梢臓器の炎症もしくは炎症疾病を包含する、請求項１もしくは請求項２に従っている使用。
【請求項２４】
前記末梢臓器が、肝臓もしくは腎臓を包含する、請求項２３に従っている使用。
【請求項２５】
前記病状が、複数の炎症気道疾病を包含する、請求項１もしくは請求項２に従っている使用。
【請求項２６】
前記炎症気道疾病が、喘息、鼻炎、気管支炎、もしくは慢性閉塞肺疾病を包含する、請求項２５に従っている使用。
【請求項２７】
炎症と関連された痛み；
重大な肢の虚血のような末梢動脈疾病およびこれらの後遺症；
冠状動脈疾病およびこの後遺症；
脳血管疾病およびこの後遺症；
肝臓および腎臓の虚血；
複数の代謝疾病；
肥満およびこの後遺症；
複数の炎症気道疾病；
複数の慢性神経変性疾病；
複数の急性神経学的変性病状； 
関節軟骨変性により特徴とされた複数の炎症疾病；ならびに
創傷治癒
の処置および予防のための、請求項１〜４のいずれか１項に従っている使用。
【請求項２８】
炎症と関連された痛み；
重大な肢の虚血；
虚血心臓疾病および心筋梗塞のような；
卒中発作および一過性虚血発作；
粥状（アテローム）硬化腎臓動脈狭窄；
２型糖尿およびこの後遺症、複数の末梢動脈疾病、冠状動脈疾病、複数の腎臓血管疾病、および糖尿ニューロパシー；
喘息および慢性閉塞肺疾病；
アルツハイマー病、パーキンソン病、多発硬化、および複数の末梢ニューロパシー；外傷脳傷害および脊髄傷害；
炎症腸疾病；ならびに
リューマチ関節炎および１次骨関節炎および２次骨関節炎およびこれらの後遺症
の処置および予防のための、請求項１〜４のいずれか１項に従っている使用。
【請求項２９】
前記末梢ニューロパシーが、化学療法剤により起こされている、請求項３もしくは請求項１８に従っている使用。
【請求項３０】
前記化学療法剤が、シスプラチンである、請求項２９に従っている使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明が、シクロオキシゲナーゼの活性および複数のプロスタグランジン合成酵素（シンターゼ）の活性において関与された複数の代謝経路ならびに複数のプロスタグランジンの合成を調節すると我々が、発見してきており、ある１結果として、それらのうちのある幾つかが、以前の複数の処置体制に対し非常に耐える（難治性である）と証明されてきている種々の疾病および疾患の処置および予防において使用されていることのある一連の化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
複数のプロスタグランジン（ＰＧｓ）が、プロスタノイドとも言われたが、生理学的なおよび病理学的な文脈両方において複数の細胞機能を調節する、広く分布された群（グループ）の酸素化脂質である。ＰＧｓの生合成が、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）により触媒されたある１反応たる、複数の細胞膜からの、主要な脂肪酸たる、アラキドン酸（ＡＡ）の放出を通じ、開始されている。放出されたＡＡが、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）による不安定な酸素化中間体（ＰＧＨ２）に変換されている。一旦形成されたら、該ＰＧＨ２中間体が、プロスタグランジン合成酵素（シンターゼ、例えば、ＰＧＥ合成酵素もしくはＰＧＥ−Ｓ、ＰＧＤ合成酵素もしくはＰＧＤ−Ｓ等）と呼ばれたある１範囲の特異的な複数の酵素により、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）、プロスタサイクリンＦ２α（ＰＧＦ２α）、もしくはプロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）のような種々のプロスタグランジンへと変換されていることが、ある。
【０００３】
ＣＯＸが、３種のアイソフォーム：ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、および、ＣＯＸ−１のスプライシング変異体たる、ＣＯＸ−３において存在している。ＣＯＸ−１が、大抵の組織において構成因子として発現されている一方で、ＣＯＸ−２が、複数の原炎症サイトカインおよびストレスに対する応答において一般的に誘発されている。これらの知見が、ＣＯＸ−２が、複数のプロスタノイドの複数の原炎症逆効果に関し、応答可能であるという真っ直ぐな見方に至った。これゆえ、ＣＯＸ−２の阻害が、複数の炎症疾病の処置用の複数の薬剤を開発していくことにおいて１次的な標的と見なされてきている。しかしながら、研究者らが、ＣＯＸ−２が、臓器および組織のベースの恒常性において重要な役割をも演じることを示してきている。
【０００４】
最近の臨床での複数の試行が、複数のＣＯＸ−２阻害剤を用いた長期の処置が、ＣＯＸ−２誘発ＰＧＩ２の複数の血管保護効果の遮断に属された合併症たる、卒中および心筋梗塞の罹患率を増加させることを明かしてきている。しかしながら、複数のＣＯＸ酵素の遮断が、ＰＧＤ２の産生をも抑える。複数の末梢組織において、ＰＧＤ２が、血管拡張を促進させ、血小板凝集を阻害する。脳において、最も潤沢なプロスタグランジンであり、最近の研究が、ＰＧＤ２が、複数本の海馬神経における複数の神経保護効果を仲介することを示す。ＣＯＸ−２誘発ＰＧＤ２の遮断が、これゆえ、複数のＣＯＸ−２阻害剤を用いた臨床での複数の試行において観察された卒中および心筋梗塞の罹患における増加に寄与することが、ある。
【０００５】
ＰＧＤ２が、非常に短命であり、プロスタグランジン１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）を包含している、Ｊ２系列の生物学的に活性なプロスタグランジンを与えるようにｉｎ  ｖｉｖｏにおいておよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて脱水する。このプロスタグランジンが、ＰＧＤ２の、天然の、化学的に安定な抗炎症誘導体である。１５ｄ−ＰＧＪ2が、複数の抗炎症作用を包含している、広範な細胞機能において暗に示されてきているリガンド依存核転写因子である、ペルオキシソーム増殖因子（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ）活性化受容体（レセプター、ＰＰＡＲ）亜型（サブタイプ）ＰＰＡＲγに関する高親和性（アフィニティ）リガンドである。１５ｄ−ＰＧＪ２が、ＰＰＡＲγ非依存機序（メカニズム）同様、ＰＰＡＲγ依存機序（メカニズム）を通じ、酸化窒素合成酵素（シンターゼ）遺伝子、プロスタグランジンＥ合成酵素（シンターゼ、ＰＧＥＳ）遺伝子、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）遺伝子のような幾つかの炎症遺伝子を抑制する。複数のラットコンドロサイトにおいて、１５ｄ−ＰＧＪ２が、サイトカインにより刺激されたＰＧＥ２合成およびＰＧＥＳ発現を殆ど完全に減少させ、１５ｄ−ＰＧＪ２が、これらの細胞における原炎症プロスタグランジンたるＰＧＥ２の産生のスウィッチを切る抗炎症メッセンジャーであることを指し示している。該機序（メカニズム）に関わらず、１５ｄ−ＰＧＪ２が、炎症の寛解相（フェーズ）の間中、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて存在しており、再び、炎症応答のフィードバック規制因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）として機能することのあることを示唆している。１５ｄ−ＰＧＪ２の投与が、炎症腸疾病のある１モデルたる、ラットにおける実験結腸炎の進展を抑えるようにも示されてきている。ＰＧＤ２および１５ｄ−ＰＧＪ２の味方におけるプロスタグランジン産生の平衡（バランス）を傾ける複数の剤および病状が、これゆえ、複数の抗炎症効果を持つように期待されると思われる。
【０００６】
中枢神経系において、１５ｄ−ＰＧＪ２の複数の抗炎症作用が、アルツハイマー氏病、パーキンソン氏病、および多発硬化のような複数の神経変性疾患において有益たり得ると思われるが、炎症が、脳損傷および細胞死に寄与する、卒中、脊髄傷害、および脳外傷（トラウマ）においてもである。これらの病状の全てにおいて、脳損傷が、ミクログリアの過剰な活性化と関連づけられている。中枢神経系において、その生来の常駐の複数の免疫細胞たる、ミクログリアが、炎症過程（プロセス）における主要な役割を演じる。ミクログリアのコントロールされなかった活性化が、複数の炎症サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）、ＮＯ、ＰＧＥ２、および超過酸化物（スーパーオキサイド）のような種々の物質を放出していくことにより、複数の脳細胞に対し直接、毒性であることが、ある。幾つかの研究が、１５ｄ−ＰＧＪ２が、活性化された複数のミクログリア細胞および複数のアストロサイトによる複数の炎症サイトカインおよびＮＯの産生を抑制し得ることを示し、これらプロスタグランジンが、グリア細胞の過剰な活性化と関連づけられた脳損傷を防いでいくことにおいて重要な役割を演じ得ると思われることを示唆している。多発硬化に関する動物モデルたる、実験自己免疫脳炎（ＥＡＥ）前、および、この発病時における１５ｄ−ＰＧＪ２の投与が、ＥＡＥの重篤さを有意に抑えたという知見が、更に、１５ｄ−ＰＧＪ２が、複数の炎症神経変性疾病における脳損傷を防いでいくことにおいて有効であることのあることを示唆する。
【０００７】
最近の複数の実験研究が、１５ｄ−ＰＧＪ２が、複数匹のラットにおける脳内出血後の脳組織炎症および行動機能不全および神経損失を抑え、卒中の実験モデルにおける虚血再灌流傷害から脳を保護することを示す。１５ｄ−ＰＧＪ２の（脳）室内点滴が、ＰＰＡＲγ依存的な様式で、脳梗塞の体積を抑え、脳および神経のアポトーシスを阻害し、ＮＦ−κＢの活性化を抑圧し、強力な内因性抗酸化剤たる、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）を上方修正（アップレギュレーション）させた。これらの結果が、虚血性卒中における１５ｄ−ＰＧＪ２の神経保護効果を示唆するが、急性虚血性卒中を有する複数の患者が、通常の複数の被験者よりも高い血漿でのレベルの１５ｄ−ＰＧＪ２を持つこと、および、血漿１５ｄ−ＰＧＪ２の増加が、より良好な早いおよび遅い神経学的な出来と関連づけられていることを示している最近の研究により更に確証されている。血漿１５ｄ−ＰＧＪ２の増加も梗塞の体積の抑制と関連づけられたが、この効果が、他の重要な可変的な複数の予後の効果から独立していた。１５ｄ−ＰＧＪ２の贔屓にあるプロスタグランジン産生の平衡（バランス）をずらす（シフトさせる）複数の剤および複数の病状が、これゆえ、アルツハイマー氏病（ＡＤ）、パーキンソン氏病（ＰＤ）、および多発硬化のような複数の慢性炎症性神経変性疾患における、ならびに、卒中、脊髄傷害、および外傷（トラウマ）脳傷害のような複数の急性病状における、両方における、有益な複数の効果を持つように期待されると思われる。
【０００８】
ＡＤが、脳における細胞外での複数のアミロイドβ（Ａβ）斑の付着および細胞内での複数の絡まりの形成により特徴化された進行性で致命的な神経変性疾患である。複数のＡβ斑が、アミロイドβペプチドおよびＡβペプチドから主に構成されている。Ａβの蓄積が、ＡＤの病原に寄与すると、および、神経の損傷を増加させると提案されてきている炎症応答を起こさせる。可溶性の複数のＡβペプチドの脳でのレベルの増加も、斑の付着するずっと（ｌｏｎｇ）前、神経機能不全および認知障害を起こさせると考えられている。脳における複数のＡβペプチドの形成が、これゆえ、ＡＤの病原の１次的な引き金である。
【０００９】
Ａβの発生が、当該ＡβペプチドのＮ末側において、βアミロイド前駆体蛋白（βＡＰＰ）たる、より大きい前駆体蛋白を開裂させるある１種のプロテアーゼにより開始されている。このプロテアーゼが、βセクレターゼもしくはβ部位ＡＰＰ開裂酵素（ＢＡＣＥ１）とも呼ばれたが、膜横断アスパラギン酸プロテアーゼである。ＢＡＣＥ１蛋白の複数のレベルおよびβセクレターゼの産物（βＣ末断片）が、散発的な複数のＡＤ患者の脳において増加されている。ＡＤ脳におけるＡβ産生を抑えていくことが、これゆえ、主要な治療課題である。
【００１０】
ＢＡＣＥ１のｍＲＮＡでのおよび蛋白でのレベルが、複数の原炎症メディエーターにより増加されており、ペルオキシソーム増殖因子（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ）活性化受容体（レセプター）γ（ＰＰＡＲγ）に関する複数のアゴニストである薬剤により下方修正（ダウンレギュレーション）されていることが、報告されてきている。より最近、ＰＰＡＲγの欠損が、ＢＡＣＥ１遺伝子プロモーター活性を増加させていくことにより、βセクレターゼのｍＲＮＡの複数のレベルを潜在化させる一方で、ＰＰＡＲγの過剰発現が、複数のＰＰＡＲγ活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ）同様、ＢＡＣＥ１遺伝子プロモーター活性を抑制していくことにより、ＢＡＣＥ１の転写を特異的に調節することも示されてきており、ＰＰＡＲγが、ＢＡＣＥ１のある１種のレプレッサーたり得ると思われることを示唆している。輪をかけて（Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ）、複数のＰＰＡＲγアゴニストを用いた複数匹の遺伝子導入（トランスジェニック）ｈＡＰＰマウスの処置が、複数の皮質神経におけるＢＡＣＥ１のｍＲＮＡのレベルと、細胞内β−アミロイドのレベルとの両方を抑えた。
【００１１】
ＰＰＡＲγの過剰発現が、ユビキチン化の活性化および前駆体蛋白たるβＡＰＰのプロテオソームにより仲介された劣化経由で、培養された複数の細胞におけるＡβ分泌を抑えるようにも示されてきており、ＰＰＡＲγの活性化が、培養における複数の細胞に外部付加されたＡβの安定性に直接影響を及ぼすように報告された。安定性におけるこの減少が、ＰＰＡＲγの活性化が、アミロイドペプチドに関する急速な細胞クリアランスの機序（メカニズム）を誘発させることのあることを示唆する。
【００１２】
全く（Ａｌｔｏｇｅｔｈｅｒ）、これらのデーターが、アミロイド−βの発生の調節におけるＰＰＡＲγに関する主要な役割を裏付け、ＰＰＡＲγの活性化が、脳における複数のアミロイド−βペプチドの産生を減少させる保護機序（メカニズム）を示唆する。
【００１３】
ペルオキシソーム増殖因子（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ）活性化受容体（レセプター、ＰＰＡＲ）亜型（サブタイプ）ＰＰＡＲγに関する高親和性（アフィニティ）リガンドたる、１５ｄ−ＰＧＪ2が、ＰＰＡＲγ非依存機序（メカニズム）同様、ＰＰＡＲγ依存機序（メカニズム）を通じ、幾つかの炎症遺伝子を抑制する。１５ｄ−ＰＧＪ２の内因性の産生を増加させる複数の病状が、これゆえ、複数の脳炎症過程（プロセス）を抑圧するようにと、ＡＤ脳におけるアミロイドペプチド形成を抑えるようにとの両方で、期待されると思われる。結末として、１５ｄ−ＰＧＪ２の内因性の産生を増加させる複数の剤および複数の病状が、アルツハイマー氏病の処置において有益な複数の効果を持つように期待されると思われる。
【００１４】
Ｊ２系列のプロスタグランジンが、神経成長因子（ＮＧＦ）および脳由来神経成長因子（ＢＤＮＦ）の産生の強力な誘発因子（ｉｎｄｕｃｅｒｓ）であり、細胞培養におけるＮＧＦによる神経突起の外殖を促進させる。１５ｄ−ＰＧＪ２の神経突起促進能力が、ＰＰＡＲγを通じて起きないのが、合成ＰＰＡＲγアゴニストおよびアンタゴニストが、１５−デオキシ−ＰＧＪ2の神経突起促進効果を変えなかったからである。動物での複数の研究において、ＮＧＦの脳室内投与が、複数本のコリン作動神経を救い、軸索の成長を刺激し、コリン作動機能を向上させるように示されてきている。同様に、ＮＧＦの脳室内注入が、脳虚血に付された複数匹のジャービル（荒れ地ネズミ）の海馬における神経の死を弱めた。ＢＤＮＦが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発達している複数本の神経の生存および成長を促進させ、複数の動物モデルにおける運動神経の複数の機能を向上させるように示されてきている。一過性前脳虚血に付された複数の動物において、ＢＤＮＦが、虚血神経傷害を弱めた。不運にも、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切るこれらの神経栄養の乏しい浸透により、臨床での複数の試行が、有意な複数の効果を示すのに失敗してきている。しかしながら、１５ｄ−ＰＧＪ２の内因性のレベルを増加させる複数種の病状もしくは複数回の処置が、これらの成長因子をの局所での（ｌｏｃａｌ）産生を容易化させるようにと、神経の成長を促進させ、このため脊髄におけるおよび脳における神経の修復を容易化させるようにとの両方で、期待されると思われる。
【００１５】
複数の炎症マーカーのレベルの増加が、虚血血管疾病と関連づけられており、炎症が、複数の急性冠症候群（シンドローム）の病原において関与されるように益々見なされている。炎症が、粥状（アテローム）硬化の開始および進行における関連する役割を持つが、凝固過程（プロセス）を活性化させていくことによる血栓化の進展における１次的な役割をも演じ得る。血管炎症を抑える複数の病状および複数の剤が、これゆえ、冠心臓疾病のような、細胞死もしくは細胞損傷に炎症が寄与する複数の心臓血管疾患において有益たり得ると思われる。
【００１６】
プロスタグランジンＤ合成酵素（シンターゼ、ＰＧＤＳ）ｍＲＮＡが、心臓において発現されている。これゆえ、局所的に（ｌｏｃａｌｌｙ）産生されたＰＧＤ2が、複数の筋細胞もしくは複数の囲んでいる細胞における１５ｄ−ＰＧＪ2を結果与えることが、ある。ＰＰＡＲγも、複数の心筋細胞において存在しており、機能している。最近の研究が、ＰＧＤ2の天然の代謝産物たる、１５ｄ−ＰＧＪ２が、ＰＰＡＲに依存する様式で、ＩＬ−１β刺激ＣＯＸ−２、ＰＧＥ−Ｓ、およびｉＮＯＳを調節していくことにより、複数の心筋細胞において、複数の抗炎症効果を発揮することを示した。１５ｄ−ＰＧＪ2が、ＰＧＥ2産生のＩＬ−１β刺激をブロックしたが、ＰＧＩ2のＩＬ−１β刺激もＰＧＦ2αのＩＬ−１β刺激も修飾しなかった。複数のＰＰＡＲγリガンド効果が、ＰＧＥ−Ｓ特異的であることを指し示している。１５ｄ−ＰＧＪ2によるＩＬ−１β誘発ＰＧＥ−Ｓのブロックが、心臓組織における原炎症プロスタグランジンＰＧＥ２の産生を減少させるように期待されると思われる。１５ｄ−ＰＧＪ2が、複数の心筋細胞におけるヘメオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）の発現を上方修正（アップレギュレーション）し、局所虚血再灌流誘発心筋梗塞のラットモデルにおける心筋梗塞のサイズを抑えるようにも示されてきている。研究された異なる複数のＰＰＡＲγリガンドの間で、１５ｄ−ＰＧＪ２が、梗塞のサイズにおいて遙か遠く最も知らしめられた抑制を起こした。この効果が、ＰＰＡＲγを通じ、仲介されている一方で、抗酸化剤かつ細胞保護蛋白たるＨＯ−１の発現の増加が、ＰＰＡＲγ非依存的であった。全く（Ａｌｔｏｇｅｔｈｅｒ）、これらの結果が、１５ｄ−ＰＧＪ２の内因性の複数のレベルを増加させる複数の病状および複数の剤が、血管炎症を抑え、これゆえ、複数の心臓血管疾患において有益たり得ると思われることを示唆する。
【００１７】
益々の証拠が、特に肥満存在下、複数の循環炎症因子の主要な源として脂肪組織を同定する。脂肪が、複数の原炎症アジポサイトカインを産生し、これらが、ＴＮＦ−α、レプチン、ＰＡＩ−１、ＩＬ−６、およびアンジオテンシノーゲンを包含する。ＴＮＦ−αが、ＮＦκＢの主要な活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）である。ＴＮＦ−αが、インシュリンシグナルをも阻害し、これにより、インシュリン抵抗性を起こしている。ＰＡＩ−１の複数のレベルが、ＣＡＤおよび糖尿を予言し、これらが、肥満における原血栓状態に対する主要な寄与因子（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ）である。ＩＬ−６が、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）の肝での産生を刺激し、複数の肥満患者の血清中の高感受性（ｈｓ）ＣＲＰの複数のレベルの上昇に寄与する。ＨｓＣＲＰが、心筋梗塞、卒中、末梢動脈疾病、および突然死を予言する。アンジオテンシノーゲンが、ＡｎｇＩＩ前駆体であり、血管傷害の多重の機序（メカニズム）を活発化させるとよく知られている。一般的に、これらのアジポカインの全てが、原炎症環境を創出していく内臓脂肪度の増加を有する複数のインシュリン抵抗性被験者において上昇されている。２型糖尿（Ｔ２Ｄ）および肥満が、これゆえ、炎症病状である。
【００１８】
脂肪組織が、他の複数の組織と比べられたら、最高の複数のレベルのＰＰＡＲγを発現する。複数のＰＰＡＲγリガンドが、脂肪細胞分化、および、脂肪組織への無保護の複数の脂肪酸の取り込みを促進させる。これらが、ＴＮＦ−α、ＰＡＩ−１、およびＩＬ−６の発現を減少させていき、脂肪におけるアジポネクチン発現を増加させていくことによる原炎症環境を弱めるように重要な効果をも持つ。これゆえ、ＰＰＡＲγの活性化が、複数の血管細胞において直接、脂肪組織における遺伝子発現規制を通じて間接的に炎症を抑圧する。
【００１９】
Ｔ２Ｄおよび代謝症候群（メタボリックシンドローム）が、骨格筋、肝、および脂肪組織を包含している、複数の末梢組織におけるインシュリンの作用に対する抵抗性により特徴化されている。複数のチアゾリジンジオンのような、ある特定のこれら合成リガンドによるＰＰＡＲγの活性化が、Ｔ２Ｄの複数の齧歯類モデルにおけるインシュリン分泌を刺激してしまうことなく、インシュリン感受性を向上させ、葡萄糖（グルコース）、複数のトリグリセリド、および複数の無保護の脂肪酸の循環レベルを低める。複数のＰＰＡＲγアゴニストが、複数のヒトにおける末梢でのインシュリン抵抗性をも軽くさせ、複数のＴ２Ｄ患者の処置において有効に使用されてきている。
【００２０】
１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）が、ペルオキシソーム増殖者活性化受容体（レセプター）亜型（サブタイプ）たるＰＰＡＲγに関する推定内因性の、高親和性（アフィニティ）リガンドであるように見える天然の、化学的に安定な抗炎症プロスタグランジンである。１５ｄ−ＰＧＪ２の内因性の産生を増加させる複数の剤および病状が、これゆえ、血管炎症を抑圧し、２型糖尿におけるインシュリン感受性を向上させるように両方とも期待されると思われる。
【００２１】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−アルファのような、複数の原炎症サイトカインが、乾癬およびアトピー皮膚炎において過剰発現されている。ＴＮＦ−αが、炎症の開始と持続との両方における重要な役割を演じ、最近の実験データーが、乾癬の実験モデルにおける複数の病巣の発展が、ＴＮＦ−αにより仲介されていることを示す。これらの知見が、乾癬の病原におけるＴＮＦ−αに関するある１種の役割を示唆するが、最近の臨床での複数回の試行からの複数の結果により裏付けられており、ＴＮＦ−α（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）もしくは可溶性ＴＮＦ受容体（レセプター）融合蛋白（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の投与が、複数の乾癬患者における疾病の改善を結果与えたことを示している。
【００２２】
プロスタグランジンＰＧＤ２の化学的に安定な代謝産物たる、１５ｄ−ＰＧＪ2が、ペルオキシソーム増殖者活性化受容体（レセプター）γ（ＰＰＡＲγ）に関する高親和性（アフィニティ）リガンドである。
【００２３】
１５ｄ−ＰＧＪ2が、誘発可能なＮＯ合成酵素（シンターゼ、ｉＮＯＳ）の遺伝子および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の遺伝子を包含している、複数のミクログリア細胞におけるおよび複数のヒトアストロサイトにおける、複数の活性化マクロファージにおける幾つかの原炎症遺伝子を抑制し、この抑制が、ＰＰＡＲγ発現に少なくとも一部依存している。輪をかけて（Ｍｏｒｅｏｖｅｒ）、複数のインシュリン感受性化チアゾリジンジオンのような、複数の合成ＰＰＡＲγリガンドが、複数のヒト被験者における乾癬を改善させると示されてきている。全く（Ａｌｔｏｇｅｔｈｅｒ）、これらの知見が、１５ｄ−ＰＧＪ2の内因性の産生を増加させる複数の剤および病状が、乾癬の処置において有効たり得ると思われることを示唆する。
【００２４】
最近の証拠が、ある特定の複数の合成ＰＰＡＲγアゴニストが、多くの上皮由来ヒト癌細胞株に対し、中くらいの複数の抗増殖活性を呈することを指し示す。輪をかけて（Ｍｏｒｅｏｖｅｒ）、最近のデーターが、通常の複数の前立腺上皮細胞および複数のＴリンパ球が、これらのＰＰＡＲγリガンドによるアポトーシスの誘発に対し、より抵抗性であることを指し示す。この癌特異的な効果に光を当てると、複数の化学防疫剤としての複数のＰＰＡＲγアゴニストの潜在的な使用が、沢山の注目を受けてきている。
【００２５】
ＰＰＡＲγに関する天然リガンドたる、１５ｄ−ＰＧＪ2が、抗腫瘍活性を保有するとも示されてきている。例えば、１５ｄ−ＰＧＪ2が、有意に、細胞成長を阻害し、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、乳癌細胞、および肝癌細胞を包含している、幾つかの型の癌細胞におけるアポトーシスを誘発させる。機序（メカニズム）の複数の研究が、これらの成長阻害効果が、複数のＰＰＡＲγ非依存機序（メカニズム）を通じ、仲介されていることを示唆する。しかしながら、関与された機序（メカニズム）に関わらず、１５ｄ−ＰＧＪ2の複数の内因性レベルを増加させる複数の剤もしくは条件が、腫瘍成長および進行を阻害するように期待されると思われる。
【００２６】
プロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）のレベルの増加が、種々の悪性のものにおいて検出されてきている。幾つかの線の証拠が、複数の腫瘍におけるＰＧＥ2のレベルの上昇との知見を越え、ＰＧＥ2が、癌の進展および進行におけるある１種の役割を演ずることを示唆する。例えば、ＰＧＥ2が、細胞増殖および転移を刺激し得る一方、アポトーシスおよび免疫サーベイランスを阻害している。重要なことに、ＰＧＥ2が、血管内皮成長因子を包含している複数の原血管新生因子の産生を高めていくことにより、少なくとも一部、血管新生をも誘発させ得る。これらの知見と一貫し、複数の癌組織見本におけるより高いレベルのＰＧＥ2が、転移疾病の発病および腫瘍血管化の増加と有意に相関すると示されてきている。
【００２７】
複数の実験動物における最近の作業が、ＰＧＥ2が、発癌を促進させ得ることも示唆する。ＰＧＥ2受容体（レセプター）たるＥＰ2の遺伝子の分断が、実験の複数の腫瘍の数およびサイズを減少させるように見いだされたが、他の複数の研究が、抗ＰＧＥ2モノクローナル抗体を用いた処理が、移植可能な複数の腫瘍の成長を阻害したことを示した。この背景（バックグラウンド）を与えられたら、癌におけるＰＧＥ2の増加していった量に至るこれら酵素の経路を阻害する複数の剤および複数の病状が、腫瘍成長の進行をも阻害することを期待するかもしれない。
【００２８】
アラキドン酸からのＰＧＥ2の合成が、続けて作用する２酵素、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）およびプロスタグランジンＥ合成酵素（シンターゼ、ＰＧＥＳ）を必要とする。ＰＧＥＳ発現の増加が、幾つかのヒト悪性のものにおいて検出されてきており、異常な（ａｂｅｒｒａｎｔ）ＰＧＥＳ発現が、細胞増殖および腫瘍成長に寄与するＰＧＥ2の産生の増加を駆り立てるという可能性を惹起させている。１５ｄ−ＰＧＪ２が、サイトカイン誘発ＰＧＥ２合成および膜ＰＧＥ合成酵素（シンターゼ）発現を殆ど完全に阻害すると報告されてきている。続いて、１５ｄ−ＰＧＪ2のこれら内因性レベルを増加させる複数の剤および複数の病状が、ＰＧＥ2合成ならびにこのため細胞増殖および腫瘍成長を抑えるように期待されると思われ、これゆえ、癌の処置において有益な複数の効果を持つ。
【００２９】
我々が、以前、内因性７−ヒドロキシステロイドたる、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩアンドロステロン（７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ）が、神経保護効果と心臓保護効果との両方を持つことを示してきている（国際公開（ＷＯ）０２／００  ２２４、国際公開（ＷＯ）０２／００  ２２５、および国際公開（ＷＯ）０３／０１５  ７９１）。該ステロイドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて（臓器に典型的な複数の海馬スライス培養（ＯＴＨＳＣ）および複数のＰＣ１２細胞）神経細胞死に対し、および、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける数多くの実験モデルにおける脳損傷に対し、保護し、複数の灌流ラット心臓における虚血誘発局所心筋梗塞に対し、保護していくことにおいて有効である。全く、これらの知見が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、卒中、脊髄傷害、外傷（トラウマ）脳傷害、およびＡＤのような複数の神経変性病状の防止および処置において、ならびに、心筋梗塞（ＭＩ）のような複数の心臓血管病状において、有益な複数の効果を持ち得ると思われることを示唆する。
【００３０】
より最近、我々が、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤たる、インドメタシンを用いる複数のＰＣ１２細胞のインキュベートが、虚血に対する７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ誘発保護を完全に平坦化させたことを示してきている。これらの結果が、ＣＯＸ活性が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡのこれら神経保護効果に必要とされていることを示唆する。
【００３１】
我々が、今、ナノモル濃度の７β−ＯＨ−ＥＰＩＡを用いた複数のヒト単球血液細胞（ｈＭＢＣ）のインキュベートが、プロスタグランジン１５−デオキシ−Δ１２，１４−Ｊ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）産生における殆ど１０倍の増加を起こさせることを示す。この７−ヒドロキシステロイドのこの効果が、１５ｄ−ＰＧＪ２特異的であるように見えるのが、該ステロイドが、これらの細胞におけるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生を有意に代えなかった以来である。対照的に、原炎症サイトカインたる腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）を用いたｈＭＢＣのインキュベートが、およそ３倍、両プロスタグランジンの産生を増加させた。輪をかけて（Ｍｏｒｅｏｖｅｒ）、ＴＮＦ−αと７β−ＯＨ−ＥＰＩＡとを用いた同時インキュベートが、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ単独を用いて観察された増加に似た、１５ｄ−ＰＧＪ２におけるある１種の増加を起こさせた一方で、ナノモル濃度の７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの添加が、ＴＮＦαによるＰＧＥ２におけるこれら増加を完全に廃した。
【００３２】
１５ｄ−ＰＧＪ２が、複数のラットコンドロサイトにおけるサイトカイン誘発ＰＧＥ２合成および膜ＰＧＥ合成酵素（シンターゼ、ｍＰＧＥＳ）発現を殆ど完全に阻害すると報告されてきており、１５ｄ−ＰＧＪ２が、これらの細胞における原炎症プロスタグランジンＰＧＥ２の産生のスウィッチを切る抗炎症メッセンジャーであることを指し示している。我々の複数の知見が、これゆえ、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡによる原炎症プロスタグランジンＰＧＥ２のＴＮＦ−α誘発産生の阻害が、１５ｄ−ＰＧＪ２の放出の増加を通じ、仲介されていることを指し示すことが、ある。
【００３３】
１５ｄ−ＰＧＪ2が、抗炎症作用、神経保護作用、心臓保護作用、代謝作用、および抗腫瘍作用を包含している、広範な細胞機能において暗示されてきているリガンド依存核転写因子たる、ペルオキソーム増殖者活性化受容体（レセプター、ＰＰＡＲ）亜型（サブタイプ）ＰＰＡＲγに関する、高親和性（アフィニティ）リガンドである。我々が、今、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡのような複数の剤が、１５ｄ−ＰＧＪ2産生を選択的に容易化させ得、こうして、炎症腸疾病および乾癬のような炎症および複数の皮膚疾患において、ならびに、炎症が、機能不全および細胞死に寄与する、卒中、脊髄傷害、外傷（トラウマ）脳傷害、ＡＤ、ＰＤ、冠心臓疾病、および２型糖尿のような、神経学的疾患、心臓血管疾患、および代謝疾患において、ならびに、ＰＧＥ２産生の増加が、細胞増殖および腫瘍成長に寄与する、種々の型の癌において、有益たり得ると思われることを発見してきている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３４】
これゆえ、１態様において、本発明が、プロスタグランジンＥ２、もしくは、シクロオキシゲナーゼの他の複数の代謝産物のレベルの高まり、および、プロスタグランジン合成酵素（シンターゼ）活性により仲介された複数の病状の処置もしくは予防のための、または、１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２のレベルの抑制もしくはアベイラビリティの抑制によりより悪くされた複数の病状の処置もしくは予防のための、ある１医薬品の製造のための、１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２産生を高める、ある１剤の使用にある。
【００３５】
更なる態様において、本発明が、プロスタグランジンＥ２、もしくは、シクロオキシゲナーゼ−２の他の複数の代謝産物のレベルの高まりにより仲介された複数の病状の処置もしくは予防のための、または、１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２のレベルの抑制もしくはアベイラビリティの抑制によりより悪くされた複数の病状の処置もしくは予防のための、ある１医薬品の製造のための、炎症を起こしてしまう剤の存在下での、１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２産生を容易化させ、プロスタグランジンＥ２産生を選択的に阻害する、ある１剤の使用にある。
【００３６】
別のある１態様において、本発明が、神経突起の外殖を促進させるような、もしくは、末梢ニューロパシーを処置するような、ある１医薬品の製造のための１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２産生を高めるある１剤の使用にある。
【００３７】
末梢ニューロパシーが、シスプラチンのような、複数の化学療法剤を用いる処置によることが、あり、または、糖尿ニューロパシーのような、他の複数の原因からであることが、ある。
【００３８】
尚更なる態様において、本発明が、ＰＰＡＲγの活性化を必要としているある１病状を処置するようなある１医薬品の製造のための１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２産生を高め、順にＰＰＡＲγを活性化させるある１剤の使用にある。
【００３９】
まだ別のある１態様において、本発明が、癌の処置もしくは予防のためのある１医薬品の製造のための１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２産生を高めるある１化合物の使用を与える。
【００４０】
尚更に、本発明が、複数の癌細胞におけるアポトーシスを包含し、癌細胞増殖を阻害していくか、もしくは、腫瘍の成長および進行を阻害していくためのある１医薬品の製造のための１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２産生を高めるある１化合物の使用を与える。
【００４１】
本発明のこの態様が、特に有用である複数の癌細胞が、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、乳癌細胞、肝癌細胞、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、甲状腺乳頭癌細胞、および食道癌細胞を包含する。
【００４２】
加え、本発明のこれら化合物が：
炎症と関連づけられた痛み；
重症四肢虚血のような、複数の末梢動脈疾病（四肢に至る血流を妥協させ、末梢粥状（アテローム）硬化により起こされている複数の疾患を含んでいる）およびこれらの後遺症；
虚血心疾病（例えば、安定および不安定狭心症）および心筋梗塞（ＭＩ）のような、冠動脈疾病およびこの複数の後遺症；
卒中および複数の一過性虚血発作（ＴＩＡ）のような複数の脳血管疾病およびこの複数の後遺症；
肝および腎の虚血、例えば、粥状（アテローム）硬化腎動脈狭窄；
２型糖尿、および、複数の末梢動脈疾病、冠動脈疾病、腎の複数の脈管疾病、および糖尿ニューロパシーのような、その複数の後遺症のような複数の代謝疾病；
肥満、および、２型糖尿、複数の末梢動脈疾病、および冠動脈疾病のようなその後遺症；
喘息および慢性閉塞肺疾病（ＣＯＰＤ）、例えば、慢性気管支炎のような複数の炎症気道疾病；
アルツハイマー氏病、パーキンソン氏病、多発硬化、および複数の末梢ニューロパシーのような複数の慢性神経変性疾病；
外傷（トラウマ）脳傷害および脊髄傷害のような複数の急性神経学的変性病状；
炎症腸疾病；
リューマチ関節炎、および、１次および２次の骨関節炎、ならびにこれらの後遺症のような関節軟骨の変性により特徴化された複数の炎症疾病；
創傷治癒；ならびに
複数の化学療法剤により起こされた毒性もしくは複数の末梢ニューロパシー
の処置および予防において使用されていてよい。
【００４３】
好ましくはこれらの剤が、糖尿およびこの複数の後遺症；複数の虚血血管疾病；炎症と関連づけられた痛み；複数の炎症皮膚病状；脊髄損傷；末梢ニューロパシー；多発硬化；炎症腸疾病；リューマチ関節炎、代謝症候群（メタボリックシンドローム）Ｘ、肥満、肢端巨大症、および創傷治癒を処置するのに使用され得る。
【００４４】
これらのような剤が、例えば、肝および腎の虚血により起こされたとおりの、複数の末梢臓器、例えば、肝および腎の複数の炎症疾病のような複数の病状の処置もしくは予防においても有用であることが、ある。
【００４５】
これらの剤により処置され得る他の複数の炎症病状が、喘息、鼻炎、気管支炎、および慢性閉塞肺疾病（ＣＯＰＤ）のような、複数の炎症気道疾病を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
本発明が、添付されている図面により例証されており、ここで、そして今後、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩアンドロステロンが、本明細書において後、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡとして言及されている。これら図面において：
【図１】実施例１における別々の４実験からの平均百分率（％）細胞死の組み合わされたデーターを示す。
【図２】実施例１において報告された別々の複数の実験における平均百分率（％）細胞死を示す。
【図３】実施例１において報告された別々の複数の実験における平均百分率（％）細胞死を示す。
【図４】実施例１において報告された別々の複数の実験における平均百分率（％）細胞死を示す。
【図５】図５（ａ）および図５（ｂ）が、実施例２において報告されたとおり、ＴＮＦ−α存在下および非存在下、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡと共にインキュベートされた末梢血単核（球）の複数の細胞上清中、検出された複数のＰＧＤ2レベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させていくことの効果を示す。
【図６】図６（ａ）および図６（ｂ）が、実施例２において報告されたとおり、ＴＮＦ−α存在下および非存在下、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡと共にインキュベートされた末梢血単核（球）の複数の細胞上清中、検出された複数のＰＧＥ2レベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させていくことの効果を示す。
【図７】図７（ａ）および図７（ｂ）が、実施例２において報告されたとおり、ＴＮＦ−α存在下および非存在下、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡと共にインキュベートされた末梢血単核（球）の複数の細胞上清中、検出された複数の１５ｄ−ＰＧＪ2レベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させていくことの効果を示す。
【図８】図８が、実施例４においてより詳しく記載されたとおり、結腸組織における、（Ａ）ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに、複数の酸化ストレスマーカー、すなわち、（Ｂ）Ｐｒｏｔ  ＣＯ、（Ｃ）Ｔｂａｒｓ、および（Ｄ）抗酸化剤マーカーたるＧＳＨへの７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ処理の複数の効果を示す。
【図９】図９が、実施例４における７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ処理の間中の、種々の時刻における、結腸での１５ｄ−ＰＧＪ2レベル（Ａ）、ならびに、ＣＯＸ−２、ｍＰＧＥＳ−１、およびＨ−ＰＧＤＳの相対的なｍＲＮＡ発現の定量化（Ｂ）を示す。
【図１０】図１０が、実施例４におけるＤＳＳ投与の間中の、プロスタグランジンＥ2、Ｄ2、および１５ｄ−ＰＧＪ2の結腸での合成への７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの効果を示す。
【図１１】図１１が、実施例４における結腸炎誘発の間中の、ＣＯＸ−２、ｍＰＧＥＳ−１、およびＨ−ＰＧＤＳのｍＲＮＡの結腸での発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明において使用されていてよい複数の化合物が、式（Ｉ）：
【００４８】
【化１】
2010511028.tif 000002
のこんな複数の化合物ならびにこれらの医薬として許容可能な塩およびエステルを包含し、式中：
この破線の円が、これを含有している環が、全部飽和されていてよく、または、１本、２本、もしくは３本の炭素炭素２重結合を持ってよいことを指し示し；
この破線が、この結合が、炭素炭素単結合もしくは炭素炭素２重結合であってよいことを指し示し；
Ｒ1が、水素原子もしくはメチル基を表し；
Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が、互いと同一もしくは異なっており、各々が、オキソ基、水酸（ヒドロキシ）基、メルカプト（基）、水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、もしくはアシル基を表す。
【００４９】
上の式中の数字（３）および数字（７）が、用いられた付番システムを指し示すように、ガイダンスのみのためである。勿論、Ｒ2が、オキソ基を表す場合、この破線の円が、全部飽和された環（該環において２重結合が、全くないという感覚において）または１本もしくは２本の２重結合しか表さなくてよい。
【００５０】
これらの化合物の間で、好まれた複数の化合物が、式（ＩＩ）：
【００５１】
【化２】
2010511028.tif 000003
のこんな複数の化合物（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が、上で定義されたとおりである）およびこれらのエステルを包含する。
【００５２】
これらの化合物の好まれた別のある１分類（クラス）が、式（ＩＩＩ）：
【００５３】
【化３】
2010511028.tif 000004
のこんな複数の化合物（式中、Ｒ2aが、オキソ基、水酸（ヒドロキシ）基、メルカプト基、もしくはハロゲン原子を表し；Ｒ1、Ｒ3、およびＲ4が、上で定義されたとおりである）およびこれらのエステルである。
【００５４】
これらの化合物の尚更に好まれた分類（クラス）が、式（ＩＶ）：
【００５５】
【化４】
2010511028.tif 000005
のこんな複数の化合物（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が、上で定義されたとおりである）およびこれらのエステルである。
【００５６】
これらの化合物の更に好まれた分類（クラス）が、式（Ｖ）：
【００５７】
【化５】
2010511028.tif 000006
のこんな複数の化合物であり、式中、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が、上で定義されたとおりである。
【００５８】
式（ＩＩ）の複数の化合物の例が、式（ＩＩａ）：
【００５９】
【化６】
2010511028.tif 000007
を持つ、７−ヒドロキシテストステロン、および、この複数のエステルを包含する。この化合物における７−水酸（ヒドロキシ）基が、このαもしくはβの配置にあってよく、または、これら２種の異性体（アイソマー）のある１混合物が、使用されていてよい。
【００６０】
式（ＩＩＩ）の複数の化合物の例が、式（ＩＩＩａ）：
【００６１】
【化７】
2010511028.tif 000008
を持つ、７α−ヒドロキシデヒドロＥＰＩアンドロステロン（７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡ）およびこの複数のエステル、ならびに、式（ＩＩＩｂ）：
【００６２】
【化８】
2010511028.tif 000009
を持つ、７β−類似体およびこの複数のエステル、ならびに、式（ＩＩＩｃ）：
【００６３】
【化９】
2010511028.tif 000010
を持つ、７β−ヒドロキシ−プレグネノロンおよびこの複数のエステル、ならびに、７α−ヒドロキシ類似体およびこの複数のエステルを包含する。
【００６４】
式（ＩＶ）の複数の化合物の例が、７−ヒドロキシＥＰＩアンドロステロンを包含し、この７α異性体（アイソマー）もしくはこの７β異性体（アイソマー）およびこれらの複数のエステルの形態にあってよい。７β−ヒドロキシＥＰＩアンドロステロンが、本明細書において後、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡとして言及されたが、式（ＩＶａ）：
【００６５】
【化１０】
2010511028.tif 000011
を持つ一方、７α−ヒドロキシＥＰＩアンドロステロンが、本明細書において後、７α−ＯＨ  ＥＰＩＡとして言及されたが、式（ＩＶｂ）：
【００６６】
【化１１】
2010511028.tif 000012
【００６７】
を持つ。
【００６８】
式（Ｖ）の複数の化合物の例が、式（Ｖａ）：
【００６９】
【化１２】
2010511028.tif 000013
を持つ、７β−ヒドロキシ−１７β−エストラジオールおよびこの複数のエステル、およびその複数の７α−類似体およびこの複数のエステル、ならびに、式（Ｖｂ）：
【００７０】
【化１３】
2010511028.tif 000014
を持つ、７β−ヒドロキシ−エストロンおよびこの複数のエステル、およびその複数の７α−類似体およびこの複数のエステルである。
【００７１】
本発明のこれら化合物において、Ｒ2、Ｒ2a、Ｒ3、もしくはＲ4が、ハロゲン原子を表す場合、これが、弗素原子、塩素原子、臭素原子、もしくは沃素原子であってよく、好ましくは塩素原子である。
【００７２】
Ｒ2、Ｒ2a、Ｒ3、もしくはＲ4が、アルコキシ基を表す場合、これが、好ましくは１〜６炭素原子を持っている、直鎖基もしくは分岐鎖基であってよい。これらのような基の例が、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、２級ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、およびヘキシルオキシ基を包含する。
【００７３】
Ｒ2、Ｒ2a、Ｒ3、もしくはＲ4が、アシルオキシ基を表す場合、これが、好ましくはフェノキシ基もしくはナフチルオキシ基である。
【００７４】
Ｒ2、Ｒ2a、Ｒ3、もしくはＲ4が、アシル基を表す場合、これが、例えば、脂肪族アシル基もしくは芳香族アシル基であってよい。複数の脂肪族アシル基の例が、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、およびヘキサノイル基のような、１〜６炭素原子を持っている複数の基を包含する。複数の芳香族アシル基の例が、ベンゾイル基、ナフトイル基、およびトルオイル基を包含する。
【００７５】
該化合物が、式−ＯＲのある１基を含有し、式中、Ｒが、Ｒ2などに対する関係において上で定義された複数の基および複数の原子のいずれかである場合、該活性種が、無保護の該水酸（ヒドロキシ）基を含有している化合物であることの多いことが、認められる。従って、水酸（ヒドロキシ）基にｉｎ  ｖｉｖｏにおいて変換され得る如何なる基も該水酸（ヒドロキシ）基の代わりに使用されていてよい。
【００７６】
これらの化合物が、複数の親ステロイドから出発して、これら自体においてよく知られた、種々の過程（プロセス）により調製されていてよい。例えば、これらが、欧州特許（ＥＰ）１  ２９４  ３８２において記述された複数の方法により調製されていてよい。
【００７７】
式（Ｉ）のこれら化合物が、慢性神経変性疾病もしくは病状および急性神経変性疾病もしくは病状の処置もしくは予防における使用に関して、欧州特許（ＥＰ）１  ２９４  ３８２、国際公開（ＷＯ）２００２／０００  ２２４、および国際公開（ＷＯ）２００２／０００  ２２５において、および、慢性心臓変性疾病もしくは病状および急性心臓変性疾病もしくは病状の処置もしくは予防における使用に関して、国際公開（ＷＯ）２００２／０１５  ７９１において、開示されており、勿論、このような処置もしくは予防が、式（Ｉ）の複数の化合物に対する関係においてしか、これら本請求項から排他されていない。
【００７８】
本発明において使用されていてよい複数の化合物の別のある１分類（クラス）が、式（ＶＩ）：
【００７９】
【化１４】
2010511028.tif 000015
式中：
Ｘが、式＞ＣＲ5Ｒ6のある１基を表し、または、Ｒ10が、水素原子を表さない場合、式＞ＳＯ2のある１基を表し；
Ｙが、式＞ＮＨもしくは式＞ＣＲ5Ｒ6のある１基を表し；
Ｚが、式＞Ｃ＝Ｏの１基、式＞ＣＨ2の１基、もしくは直接の結合を表し；
Ｒ5が、水素原子を表し、Ｒ6が、水素原子、カルボキシ基、もしくはヒドロキシ基を表し；または
Ｒ5およびＲ6が、オキソ基、メチレンジオキシ基、もしくはヒドロキシイミノ基を一緒に表し； 
Ｒ7が、水素原子もしくは低級アルキル基を表し；
Ｒ8が、２水素原子またはオキソ基もしくはヒドロキシイミノ基を表し；
Ｒ9が、水素原子、低級アルキル基、もしくはハロゲン原子を表し；
Ｒ10が、水素原子、低級アルコキシ基、もしくはカルボキシ基を表し；
Ｒ11およびＲ12が、互いと同一もしくは異なっており、各々、水素原子、低級アルキル基、もしくはハロゲン原子を表す
こんな複数の化合物ならびに複数の塩および複数のエステルを含む。
【００８０】
式（ＶＩ）のこれら化合物において、Ｚが、直接の結合であってよく、このケースにおいて窒素含有複素環状５員環に融合された５員環の一部を形成し、または、式＞ＣＨ2もしくは式＞Ｃ＝Ｏのある１基であってよく、このケースにおいて６員環の一部を形成する。
【００８１】
Ｒ7、Ｒ9、Ｒ11、もしくはＲ12が、低級アルキル基を表す場合、これが、１〜１０、好ましくは１〜６炭素原子を持っている直鎖もしくは分岐鎖アルキル基であってよい。これらのような基の例が、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、２級ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、２−メチルブチル基、１−エチルプロピル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、およびデシル基を包含し、これらのうち、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、およびヘキシル基が、好まれており、メチル基およびエチル基が、より好まれており、メチル基が、最も好まれている。
【００８２】
Ｒ9、Ｒ11、もしくはＲ12が、ハロゲン原子を表す場合、これが、弗素、塩素、臭素、もしくは沃素原子であってよく、これらのうち、弗素原子および塩素原子が、好まれている。
【００８３】
Ｒ10が、低級アルコキシ基を表す場合、これが、１〜１０、好ましくは１〜６炭素原子を持っている直鎖もしくは分岐鎖アルコキシ基であってよい。これらのような基の例が、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、２級ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、２−メチルブトキシ基、１−エチルプロポキシ基、４−メチルペンチルオキシ基、３−メチルペンチルオキシ基、２−メチルペンチルオキシ基、１−メチルペンチルオキシ基、３，３−ジメチルブトキシ基、２，２−ジメチルブトキシ基、１，１−ジメチルブトキシ基、１，２−ジメチルブトキシ基、１，３−ジメチルブトキシ基、２，３−ジメチルブトキシ基、２−エチルブトキシ基、ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、ノニルオキシ基、およびデシルオキシ基を包含し、これらのうち、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、およびヘキシルオキシ基が、好まれており、メトキシ基およびエトキシ基が、より好まれており、メトキシ基が、最も好まれている。
【００８４】
本発明のこれら化合物のうち、我々が：
Ｘが、式＞ＣＲ5Ｒ6のある１基を表し、式中、Ｒ5が、ハロゲン原子を表し、Ｒ6が、水素原子、ヒドロキシ基、もしくはカルボキシ基を表し、またはＲ5およびＲ6が、オキソ基もしくはメチレンジオキシ基を一緒に表し；
Ｙが、式＞ＣＲ5Ｒ6のある１基を表し、式中、Ｒ5が、水素原子を表し、Ｒ6が、水素原子もしくはカルボキシ基を表し；
Ｒ7が、水素原子を表し；
Ｒ8が、２水素原子もしくはオキソ基を表し；
Ｒ9が、水素原子を表し；
Ｒ10が、水素原子、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ基、もしくはカルボキシ基を表し；
Ｒ11およびＲ12が、互いと同一もしくは異なっており、各々、水素原子もしくはＣ1〜Ｃ4アルキル基を表す
こんな複数のものならびにこれらの塩およびこれらのエステルを特に好む。
【００８５】
本発明の複数の化合物の特定の例が、以降の表１において与えられている：
【００８６】
【表１−１】
2010511028.tif 000016
【００８７】
【表１−２】
2010511028.tif 000017
【００８８】
【表１−３】
2010511028.tif 000018
【００８９】
【表１−４】
2010511028.tif 000019
【００９０】
式（ＶＩ）の最も好まれた複数の化合物が、上の表において、４、６、７、８、１０、１４、１５、１６、１７、２０、２１、２２、および２３と付番されたこんな化合物である。
【００９１】
本発明のこれら化合物が、カルボキシ基を含有する場合、例えば、Ｒ5もしくはＲ10が、カルボキシ基を表す場合、本発明のこれら化合物が、複数のエステルを形成し得、従来の複数のエステル化手法により調製されていてよい。該エステルの性質への特定の拘束が、全くないが、但し、この結果得られてくる化合物が、医療に使用される場合、該化合物が、医薬として許容可能であり、すなわち、親化合物よりも、より活性でないのでも許容不可能により活性でないのでもなく、より毒性であったり許容不可能により毒性であったりしない。しかしながら、該化合物が、例えば、他の複数の化合物の調製におけるある１中間体として、複数の非医療使用用に使用される場合、この拘束さえ、当てはまらず、この時、形成されていてよいこれらエステルの性質への拘束が、全くない。
【００９２】
複数のエステル基の例が：Ｒ7、Ｒ9、Ｒ11、もしくはＲ12、および、ドデシル基、トリデシル基、ペンタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、およびイコシル基のような、当業界においてよく知られているような複数の高級アルキル基に対する関係において例示されたもののような、１〜２０炭素原子、より好ましくは１〜１０炭素原子を持っている複数のアルキル基；
【００９３】
３〜７炭素原子を持っている複数のシクロアルキル基、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、およびシクロヘプチル基；
【００９４】
複数のアリールアルキル（アラルキル）基、ここで、このアルキル部が、１〜３炭素原子を持ち、このアリール部が、６〜１４炭素原子を持っているカルボ環状芳香族基であり、置換されていても置換されていなくてもよく；これらのようなアラルキル基の例が、ベンジル基、フェネチル基、１−フェニルエチル基、３−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基、２−（１−ナフチル）エチル基、２−（２−ナフチル）エチル基、ベンズヒドリル（つまり、ジフェニルメチル）基、トリフェニルメチル基、ビス（ｏ−ニトロフェニル）メチル基、９−アントリルメチル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、４−ブロモベンジル基、２−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、３−ニトロベンジル基、４−メトキシベンジル基、およびピペロニル基を包含し；
【００９５】
ビニル基、アリル基、２−メチルアリル基、１−プロペニル基、およびイソプロペニル基のような、２〜６炭素原子を持っている複数のアルケニル基；
【００９６】
２，２，２−トリクロロエチル基、２−ハロエチル基（例えば、２−クロロエチル、２−フルオロエチル、２−ブロモエチル、もしくは２−ヨードエチル）、２，２−ジブロモエチル基、および２，２，２−トリブロモエチル基のような、１〜６、好ましくは１〜４炭素原子を持っている複数のハロゲン化アルキル基；
【００９７】
複数の置換シリルアルキル基、例えば、２−トリ（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルシリルエチル基、特に、２−トリメチルシリルエチル基；
【００９８】
置換フェニル基および置換されなかったフェニル基、例えば、フェニル基、トリル基、およびベンズアミドフェニル基；
【００９９】
置換フェナシル基および置換されなかったフェナシル基、例えば、フェナシル基自体もしくはｐ−ブロモフェナシル基；
【０１００】
環状テルペニル基および非環状テルペニル基、例えば、ゲラニル基、ネリル基、リナリル基、フィチル基、メンチル基（特に、ｍ−およびｐ−メンチル）、ツジル基、カリル基、ピナニル基、ボルニル基、ノルカリル基、ノルピナニル基、ノルボルニル基、メンテニル基、カンフェニル基、およびノルボルネニル基；
【０１０１】
メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、およびメトキシエトキシメチル基のような、複数のアルコキシメチル基、ここで、このアルコキシ部が、１〜６、好ましくは１〜４炭素原子を持ち、これ自体が、置換されなかった単一アルコキシ基により置換されていてよく；
【０１０２】
アセトキシメチル基、プロピオニルオキシメチル基、ブチリルオキシメチル基、イソブチリルオキシメチル基、ピバロイルオキシメチル基、１−ピバロイルオキシエチル基、１−アセトキシエチル基、１−イソブチリルオキシエチル基、１−ピバロイルオキシプロピル基、２−メチル−１−ピバロイルオキシプロピル基、２−ピバロイルオキシプロピル基、１−イソブチリルオキシエチル基、１−イソブチリルオキシプロピル基、１−アセトキシプロピル基、１−アセトキシ−２−メチルプロピル基、１−プロピオニルオキシエチル基、１−プロピオニルオキシプロピル基、２−アセトキシプロピル基、および１−ブチリルオキシエチル基のような、複数の脂肪族アシルオキシアルキル基、ここで、このアシル基が、好ましくはアルカノイル基であり、より好ましくは２〜６炭素原子を持っているアルカノイル基であり、このアルキル部が、１〜６、好ましくは１〜４炭素原子を持ち；
【０１０３】
シクロヘキシルアセトキシメチル基、１−（シクロヘキシルアセトキシ）エチル基、１−（シクロヘキシルアセトキシ）プロピル基、２−メチル−１−（シクロヘキシルアセトキシ）プロピル基、シクロペンチルアセトキシメチル基、１−（シクロペンチルアセトキシ）エチル基、１−（シクロペンチルアセトキシ）プロピル基、および２−メチル−１−（シクロペンチルアセトキシ）プロピル基のような、複数のシクロアルキル置換脂肪族アシルオキシアルキル基、ここで、このアシル基が、好ましくはアルカノイル基であり、より好ましくは２〜６炭素原子を持っているアルカノイル基であり、このシクロアルキル置換基が、３〜７炭素原子を持ち、このアルキル部が、１〜６、好ましくは１〜４炭素原子を持ち；
【０１０４】
複数のアルコキシカルボニルオキシアルキル基、特に、１−メトキシカルボニルオキシエチル基、１−エトキシカルボニルオキシエチル基、１−プロポキシカルボニルオキシエチル基、１−イソプロポキシカルボニルオキシエチル基、１−ブトキシカルボニルオキシエチル基、１−イソブトキシカルボニルオキシエチル基、１−２級（ｓ−）ブトキシカルボニルオキシエチル基、１−ｔ−ブトキシカルボニルオキシエチル基、１−（１−エチルプロポキシカルボニルオキシ）エチル基、および１−（１，１−ジプロピルブトキシカルボニルオキシ）エチル基のような、複数の１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル基、および、他の複数のアルコキシカルボニルアルキル基、２−メチル−１−（イソプロポキシカルボニルオキシ）プロピル基、２−（イソプロポキシカルボニルオキシ）プロピル基、イソプロポキシカルボニルオキシメチル基、ｔ−ブトキシカルボニルオキシメチル基、メトキシカルボニルオキシメチル基、およびエトキシカルボニルオキシメチル基のような、ここで、該アルコキシ基および該アルキル基の両方が、１〜６、好ましくは１〜４炭素原子を持ち；
【０１０５】
シクロアルキルカルボニルオキシアルキル基およびシクロアルキルオキシカルボニルオキシアルキル基、例えば、１−メチルシクロヘキシルカルボニルオキシメチル基、１−メチルシクロヘキシルオキシカルボニルオキシメチル基、シクロペンチルオキシカルボニルオキシメチル基、シクロペンチルカルボニルオキシメチル基、１−（シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ）エチル基、１−（シクロヘキシルカルボニルオキシ）エチル基、１−（シクロペンチルオキシカルボニルオキシ）エチル基、１−（シクロペンチルカルボニルオキシ）エチル基、１−（シクロヘプチルオキシカルボニルオキシ）エチル基、１−（シクロヘプチルカルボニルオキシ）エチル基、１−メチルシクロペンチルカルボニルオキシメチル基、１−メチルシクロペンチルオキシカルボニルオキシメチル基、２−メチル−１−（１−メチルシクロヘキシルカルボニルオキシ）プロピル基、１−（１−メチルシクロヘキシルカルボニルオキシ）プロピル基、２−（１−メチルシクロヘキシルカルボニルオキシ）プロピル基、１−（シクロヘキシルカルボニルオキシ）プロピル基、２−（シクロヘキシルカルボニルオキシ）プロピル基、２−メチル−１−（１−メチルシクロペンチルカルボニルオキシ）プロピル基、１−（１−メチルシクロペンチルカルボニルオキシ）プロピル基、２−（シクロペンチルカルボニルオキシ）プロピル基、１−（１−メチルシクロペンチルカルボニルオキシ）エチル基、１−（１−メチルシクロペンチルカルボニルオキシ）プロピル基、アダマンチルオキシカルボニルオキシメチル基、アダマンチルカルボニルオキシメチル基、１−アダマンチルオキシカルボニルオキシエチル基、および１−アダマンチルカルボニルオキシエチル基；
【０１０６】
複数のシクロアルキルアルコキシカルボニルオキシアルキル基、例えば、シクロプロピルメトキシカルボニルオキシメチル基、シクロブチルメトキシカルボニルオキシメチル基、シクロペンチルメトキシカルボニルオキシメチル基、シクロヘキシルメトキシカルボニルオキシメチル基、１−（シクロプロピルメトキシカルボニルオキシ）エチル基、１−（シクロブチルメトキシカルボニルオキシ）エチル基、１−（シクロペンチルメトキシカルボニルオキシ）エチル基、および１−（シクロヘキシルメトキシカルボニルオキシ）エチル基；
【０１０７】
テルペニルカルボニルオキシアルキル基およびテルペニルオキシカルボニルオキシアルキル基、例えば、１−（メンチルオキシカルボニルオキシ）エチル基、１−（メンチルカルボニルオキシ）エチル基、メンチルオキシカルボニルオキシメチル基、メンチルカルボニルオキシメチル基、１−（３−ピナニルオキシカルボニルオキシ）エチル基、１−（３−ピナニルカルボニルオキシ）エチル基、３−ピナニルオキシカルボニルオキシメチル基、および３−ピナニルカルボニルオキシメチル基；
【０１０８】
複数の５−アルキル−もしくは５−フェニル−（２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル基、例えば、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基、（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基、（５−イソプロピル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基、（５−ｔ−ブチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基、および１−（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）エチル基；ならびに、他の複数の基、特に、フタリジル基、インダニル基、および２−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−１，３−ベンゾジオキソレン−４−イル基のようなｉｎ  ｖｉｖｏにおいて容易に除かれている複数の基を包含する。
【０１０９】
また、もし、本発明のこれら化合物が、カルボキシ基を含有すれば、これらが、従来の複数の方法により、ある１塩基との複数の塩へと変換され得る。これらのような塩の性質への特定の拘束が、全くなく、但し、これら化合物が、医療的に使用される場合、これら化合物が、医薬として許容可能である。しかしながら、本化合物が、例えば、他の複数の化合物の調製におけるある１中間体として、複数の非医療使用に使用される場合、この拘束さえ、当てはまらず、この時、形成されていてよいこれら塩の性質への拘束が、全くない。これらのような塩の例が：ナトリウム、カリウム、もしくはリチウムのような、アルカリ金属との複数の塩；バリウムもしくはカルシウムのような、アルカリ土類金属との複数の塩；マグネシウムもしくはアルミニウムのような、別のある１金属との複数の塩；複数のアンモニウム塩；メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、シクロヘキシルアミン、もしくはジシクロヘキシルアミンとのある１種の塩のような、複数の有機塩基塩；ならびに、リジンもしくはアルギニンのような、ある１種の塩基性アミノ酸との複数の塩を包含する。我々が、これら医薬として許容可能な塩を好む。
【０１１０】
本発明のこれら化合物が、従来の複数の方法により、複数の酸との複数の塩にも変換され得る。これらのような塩の性質への特定の拘束が、全くなく、但し、これら化合物が、医療的に使用される場合、これら化合物が、医薬として許容可能である。しかしながら、本化合物が、例えば、他の複数の化合物の調製におけるある１中間体として、複数の非医療使用に使用される場合、この拘束さえ、当てはまらず、この時、形成されていてよいこれら塩の性質への拘束が、全くない。これらのような塩の例が：複数の鉱酸、特に複数のハロゲン化水素酸（弗化水素酸、臭化水素酸、沃化水素酸、もしくは塩化水素酸のような）、硝酸、過塩素酸、炭酸、硫酸、もしくは燐酸との塩；メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、もしくはエタンスルホン酸のような、複数の低級アルキルスルホン酸との塩；ベンゼンスルホン酸もしくはパラ（ｐ−）トルエンスルホン酸のような、複数のアリールスルホン酸との塩；酢酸、フマル酸、酒石酸、蓚酸、マレイン酸、林檎酸、琥珀酸、安息香酸、マンデル酸、アスコルビン酸、乳酸、グルコン酸、もしくは枸櫞酸のような、複数の有機カルボン酸との塩；ならびに、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸のような、複数のアミノ酸との塩を包含する。我々が、これら医薬として許容可能な塩を好む。
【０１１１】
式（ＶＩ）のこれら化合物が、慢性および急性の神経変性疾病もしくは病状の処置もしくは予防における使用のための国際公開（ＷＯ）２００６／０８２  ４０９において開示されており、勿論、このような処置もしくは予防が、式（ＶＩ）の複数の化合物に対する関連においてしか、複数の本願請求項から排他されていない。
【０１１２】
本発明のこれら化合物が、これゆえ、種々の慢性および急性の疾病もしくは病状の処置もしくは予防において使用されていてよく、これらの目的に向け、当業界においてよく知られているとおり、従来の複数の医薬調製品として製剤されていてよい。これゆえ、これら化合物が、例えば、複数の錠剤（タブレット）、複数のカプセル、複数の顆粒、複数の粉末、複数のシロップ、複数のスプレーの形態において、もしくは他にこれらのようなよく知られた形態において、経口投与されていてよく、または、例えば、複数の注射、複数のスプレー、複数の点眼、複数の接着軟膏、もしくは複数の坐薬等により、非経口投与されていてよい。
【０１１３】
これらの医薬調製品が、従来手段により調製され得、この分野においてよく使用されたある１種の型の既知の複数のアジュヴァントを含有してよく、例えば、複数のビヒクル、複数のバインダー、複数の崩壊剤、複数の潤滑剤、複数の安定剤、複数の矯正薬等であり、該調製品の意図された使用および形態に依っている。その用量が、その患者の病状、年齢、および体重に並びに処置されるべき疾患の性質および重篤さに依ることとなるが、ヒト成人患者に対する経口投与のケースにおいて、我々が、通常、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の１日の全用量を示唆すると思うが（より好ましくは０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重）、例えば、１日当たり１〜３回、単回用量においてもしくは分けられた用量において投与されていてよい。
【０１１４】
一般的に、本発明のこれら化合物が、炎症に至る代謝経路（単数もしくは複数）から生じている種々の炎症病状もしくは種々の病状の処置用にもしくは予防用に使用されていてよい。これらの化合物の置かれていてよい複数の使用の例が：神経突起成長の促進；糖尿（特に２型糖尿）およびこの複数の後遺症の処置もしくは予防；複数の虚血血管疾病の処置および予防；炎症と関連づけられた痛みの処置；乾癬および創傷治癒を包含している、複数の炎症皮膚病状の処置および予防を包含する。処置されていたり予防されていたりしてよい、または、その複数の効果が、本発明のこれら化合物の使用により、和らげられていてよい他の複数の炎症病状が、脊髄損傷、末梢ニューロパシー、多発硬化、炎症腸疾病、リューマチ炎；および、シスプラチンのような複数種の化学療法剤により、もしくは、糖尿ニューロパシーのような他の複数種の原因により、起こされた末梢ニューロパシーもしくは毒性を包含する。仕上げに、処置されていたり予防されていたりしてよい、または、その複数の効果が、本発明のこれら化合物の使用により、和らげられていてよい複数の病状が、種々の型の癌をも包含する。
【０１１５】
本発明が、以降の複数の非限定実施例により更に例証されている。
【実施例】
【０１１６】
実施例１
複数のＰＣ−１２細胞における虚血に対する７β−ヒドロキシ−ＥＰＩアンドロステロンの複数の保護効果：シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤たるインドメタシンによる阻害
この実施例の目的が、プロスタグランジン合成のインドメタシンにより弱められている場合の低酸素のある１モデルにおけるその神経保護効率を７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、保持するかどうか調べることにあった。使用された主な実験系が、複数のＰＣ１２細胞における虚血誘発細胞毒性であった。実験の測定された終点が、細胞死であった。
【０１１７】
虚血誘発ＰＣ−１２細胞死が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡにより一貫して抑えられていた。インドメタシン（１０μＭ）が、プロスタグランジン合成をブロックするが、虚血により誘発された細胞死への直接の効果を全く持たなかったが、１μＭおよび１０μＭの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの神経保護効果に全部拮抗した。プロスタグランジン合成が、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの神経保護効果に必要とされているという仮説を裏付けている。
【０１１８】
方法論
ＰＣ−１２細胞培養
複数のＰＣ−１２細胞が、以降の組成：２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  焦性葡萄酸（ピルビン酸）ナトリウム、最終濃度４．５ｇ／Ｌを与えるように追加の葡萄糖（グルコース、ＲＰＭＩは通常２ｇ／Ｌを持つ）、１０％熱不活化馬血清、５％牛胎児血清、および５０単位のペニシリン／ストレプトマイシンを有する、Ｌ−グルタミン無しのＲＰＭＩ  １６４０を有する複数のＰＣ−１２培地において１型コラーゲンを用いてコーティングされた複数のフラスコ上、維持されていた。複数の培地が、２日毎、変えられていた。
【０１１９】
複数のＰＣ−１２細胞アッセイ
複数のＰＣ−１２細胞の合流培養が、無血清だが５０ｎｇ／ｍｌ  ＮＧＦを有するＰＣ−１２培地（複数の  ＰＣ−１２  ＮＧＦ  培地）において７日間、培養していくことにより分化された。これら細胞が、収穫され、洗浄され、計数されたが、１×１０5ＰＣ−１２細胞／穴（ウェル）が、葡萄糖（グルコース）のないＰＣ−１２  ＮＧＦ  培地においてミクロタイタープレートに終夜播かれた。該培地が、次いで、テストされるべき複数の化合物を含有している、葡萄糖（グルコース）のないＰＣ−１２  ＮＧＦ  培地に変更され、これら皿（プレート）が、３０分間、通常酸素条件下、放置された。
【０１２０】
この段階（ステージ）の間中、この無酸素被曝用のこれら培地およびこれらテスト物質が、ある１チャンバーに入れられ、９５％Ｎ2／５％ＣＯ2を用いて脱酸素化された。シールされて終夜（１８時間）３７℃においてインキュベートされていく前、これら皿（プレート）における培地が、これら脱酸素化培地を用いて変えられ、これら皿（プレート）が、次いで、１０分間、９５％Ｎ2  ５％ＣＯ2を用いて気体（ガス）を入れられた嫌気チャンバーに入れられた。通常酸素の複数のコントロールに関し、全てのインキュベートが、５％ＣＯ2／９５％空気（エア）中であったことを除き、これら細胞が、複数の虚血処理に同じく処理された。
【０１２１】
生存度が、トリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ）排他を使用しながら、求められた。
【０１２２】
複数の結果
複数のＰＣ−１２細胞が、低酸素に対し、相対的に抵抗性であった。このせいで、我々が、毒性を開始させるのにより重篤な酸素葡萄糖（グルコース）組み合わせ剥奪（虚血）プロトコールを使用した（図１）。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、１μＭ（細胞死における２６％の減少）および１０μＭ（細胞死における５３％の減少）において観察されている有意な神経保護と共にこのアッセイにおいて用量依存的に細胞保護的であった。図１が、この効果を示している４実験からのデーターの組み合わせを提示する。図１が、別々の４実験からのデーターの組み合わせからの平均百分率（％）細胞死を示す。このデーターが、平均±ｓｅｍとして表現されている。７６％±２．２％の細胞死が、虚血単独と共に観察された。細胞死における統計的に有意な減少が、１μＭ  ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（細胞死における２６％の減少、ｐ＜０．００１）、１０μＭ  ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（細胞死における５３％の減少、ｐ＜０．００１）と共に観察された。＊＊＊＝ｐ＜０．００１対（ｖｓ）虚血単独。
【０１２３】
ＮＭＤＡ受容体（レセプター）拮抗薬（アンタゴニスト）たるＭＫ−８０１が、複数のＰＣ−１２細胞の虚血により誘発された毒性をも抑えた（図２）。シクロオキシゲナーゼ阻害剤たるインドメタシンが、１００μＭにおいて中くらいの保護効果（細胞死における２９％の抑制）を持ったが、より低い複数の濃度において持たなかった（図２）。図２が、平均百分率（％）細胞死を示す。このデーターが、平均±ｓｅｍとして表現されている。７９％±５．３％の細胞死が、虚血単独と共に観察された。細胞死における統計的に有意な減少が、１００μＭ  インドメタシン（ＩＭ、細胞死における２９％の減少、ｐ＜０．０５）、１０μＭ  ＭＫ８０１（細胞死における６２％の減少、ｐ＜０．００１）と共に観察された。＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１対（ｖｓ）虚血単独。
【０１２４】
７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの神経保護効果が、虚血単独に曝された複数の培養から区別不可能であるこれらの培養における毒性と共に１０〜１００μＭのインドメタシン（ＩＭ、図３）により全部拮抗された。図３が、平均百分率（％）細胞死を示す。このデーターが、平均±ｓｅｍとして表現されている。７６％±４．２％の細胞死が、虚血単独と共に観察された。細胞死における統計的に有意な減少が、１０μＭ  ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（細胞死における５０％の減少、ｐ＜０．００１）、１０μＭ  ＭＫ８０１（細胞死における４２％の減少、ｐ＜０．００１）と共に観察された。＊＊＊＝ｐ＜０．００１対（ｖｓ）虚血単独。
【０１２５】
図４において見られたとおり、１０μＭ  インドメタシンが、１μＭおよび１０μＭ両方の７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの神経保護効果に全部拮抗した。図４が、平均百分率（％）細胞死を示す。このデーターが、平均±ｓｅｍとして表現されている。７６％±４．８％の細胞死が、虚血単独と共に観察された。細胞死における統計的に有意な減少が、１μＭ  ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（細胞死における２５％の減少、ｐ＜０．０５）、１０μＭ  ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（細胞死における５０％の減少、ｐ＜０．００１）と共に観察された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１対（ｖｓ）虚血単独。
【０１２６】
複数の結論
虚血により誘発されたＰＣ−１２細胞死が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡにより一貫して抑えられた。インドメタシンが、プロスタグランジン合成をブロックするが、１０μＭに至るまでの複数の濃度においてＰＣ−１２細胞死に直接影響しなかった。しかしながら、該濃度が、更に１００μＭに増加された場合、中くらいの神経保護効果が、観察された。
【０１２７】
インドメタシン（１０μＭ）が、虚血により誘発された細胞死への直接の効果を全く持たなかったが、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの神経保護効果を有意に弱めた。プロスタグランジン合成が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの神経保護効果に必要とされているという仮説を裏付けている。
【０１２８】
実施例２
複数のヒト単核細胞による、プロスタグランジンＤ2、プロスタグランジンＥ2、およびプロスタグランジン１５−デオキシ−Δ12,14−Ｊ2の産生への７β−ヒドロキシ−ＥＰＩアンドロステロンの効果
この実施例の目的が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、複数のヒト単球細胞におけるアラキドン酸特異的代謝産物、すなわち、プロスタグランジンＤ2（ＰＧＤ2）、プロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）、および１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2（１５ｄ−ＰＧＪ2）の生合成を誘発し得たかどうか確かめることにあった。
【０１２９】
複数の単球血液細胞が、原炎症刺激たる、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α非存在下もしくは存在下どちらかの下、ある１範囲の複数の濃度の７β−ＯＨ−ＥＰＩＡに曝され、産生されたＰＧＤ2、ＰＧＥ2、および１５ｄ−ＰＧＪ2の量が、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）により測定された。
【０１３０】
７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ）が、通常の複数のヒト末梢血単核細胞からのＰＧＤ2産生における濃度依存増加を誘発させた。ＴＮＦ−αが、コントロールに比べられたら、ＰＧＤ2産生を増加させたが、これが、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの最高濃度において高められた。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（１ｎＭ〜１０００ｎＭ）が、通常の複数のヒト末梢血単核細胞におけるＰＧＥ2生合成への有意な効果を全く持たないように見えたが、ＰＧＥ2産生におけるＴＮＦ−αにより誘発された複数の増加を完全に抑圧した。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ）が、それらのそれぞれのコントロールに比べられたら、ＴＮＦ−α非存在下、およそ９〜１２倍、および、ＴＮＦ−α存在下、２〜２．５倍、通常の複数のヒト末梢血単核細胞における１５ｄ−ＰＧＪ2産生を増加させると見いだされた。
【０１３１】
方法論
複数の末梢血単核細胞
複数の単核細胞（複数の単球および複数のリンパ球）が、フィコール／ハイパーク密度遠心にヒト全血４８ｍｌを付してみることにより調製された。血液が、該フィコール（密度＝１．０７７ｇ／ｍｌ）の頂（トップ）上、層状とされ、１時間、４００ｇにおいて遠心され（２２℃）、この後、相間における複数の細胞が、ピペットにより除かれ、真新しい複数の管（チューブ）に移された。複数の管（チューブ）が、徹底的に混合されたＲＰＭＩ  １６４０培養培地（２体積）を用いて満たされ、次いで、５分間、４００ｇにおいて遠心された（２２℃）。上清が、漉かれ、細胞ペレットが、ＲＰＭＩ  １６４０培養培地に再懸濁され、体積が、下の結果の部（セクション）において指し示されたとおりのインキュベート１回当たりの適切な数の細胞を与えるように調整された。複数の細胞が、３７℃、空気中５％ＣＯ2、および１００％湿度において１８時間、最終体積１ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地において１．５ｍｌの複数の無菌プラスチック管（チューブ）中、インキュベートされた。組み換えヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を加えていく前、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、次いで、加えられ、複数の細胞が、３７℃において更なる１時間、インキュベートされ、複数回のインキュベートが、更なる３時間、継続された。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中、調製され、全ての残っている剤が、ＲＰＭＩ  １６４０培地中、調製された。要件に関する複数のコントロールが、培地か、いつも＜０．１％（体積／体積、ｖ／ｖ）であった同一濃度のＤＭＳＯか、どちらかを含有した。複数回のインキュベートが、２２℃において３０秒間、１１，０００ｇにおいて複数の管（チューブ）を遠心いていき、１．５ｍｌの真新しい複数の管（チューブ）に複数の上清を移していくことにより終結された。複数のサンプルが、次いで、下記されたとおりＰＧＤ2の推定用に直ちに加工されたか、または、ＰＧＥ2もしくは１５ｄ−ＰＧＪ2の測定の前に−２０℃において保管されたか、どちらかであった。
【０１３２】
複数のプロスタグランジン酵素免疫アッセイ（ＥＩＡｓ）
ＴＮＦ−αを用いた刺激非存在下もしくは存在下どちらかの下、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡに対する応答における複数のヒト単球細胞によるプロスタグランジン産生が、商品として入手可能な複数のＥＩＡキットを使用しながら、エイコサノイド細胞外レベルを測定していくことにより求められた。
【０１３３】
ＰＧＤ2ＥＩＡ
ＰＧＤ2が、複数の細胞上清から直接アッセイされ得ないのが、これが、化学的に不安定であり、ＰＧＪ2、Δ12−ＰＧＪ2、および１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ2を包含している数多くのＪ系列のプロスタグランジンに急速に分解するからである。この問題を迂回するに当たり、不安定なＰＧＤ2が、安定な誘導体を与えるように化学的に処理されたが、このケースにおいてプロスタグランジンＤ2−メトキサミン（ＰＧＤ2−ＭＯＸ）であり、引き続いての分析用に保管されていた。複数のインキュベートの終結化の後直ちに、サンプル上清１００μｌが、１０：９０（体積／体積、ｖ／ｖ）エタノール／水溶液に溶解されたメチルオキシム化試薬（Ｍｅｔｈｙｌ  Ｏｘｉｍａｔｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ、塩酸メトキシルアミン（ＭＯＸ−ＨＣｌ））および酢酸ナトリウム１００μｌを含有している１．５ｍｌの複数の管（チューブ）に加えられた。複数の管（チューブ）が、次いで、水浴に入れられ、反応が、６０℃において３０分間、進むようにされた。この期間の終わりに複数のサンプルが、−８０℃において保管された。ＰＧＤ2の複数のレベルが、引き続き、Ｃａｙｍａｎ  ＣｈｅｍｉｃａｌのプロスタグランジンＤ2−ＭＯＸ  ＥＩＡキット（カタログ番号５１２０１１）を使用しながら、推定された。
【０１３４】
ＰＧＥ2ＥＩＡ
ＰＧＥ2の複数の細胞外レベルが、その高感受性プロトコール用の製造元の説明書に従いながら、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＰａｒａｍｅｔｅｒ  ＰＧＥ2ＥＩＡ  Ｋｉｔを使用しながら、推定された。
【０１３５】
１５ｄ−ＰＧ2ＥＩＡ
１５ｄ−ＰＧＪ2の複数の細胞外レベルが、その製造元の説明書に従いながら、Ａｓｓａｙ  ＤｅｓｉｇｎｓのＣｏｒｒｅｌａｔｅ−ＥＩＡ  プロスタグランジン１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2ＥＩＡキット（カタログ番号９００−０２３）を使用しながら、推定された。
【０１３６】
統計解析
複数の結果が、ｎ＝３のインキュベートに関し、その平均±ｓ．ｄ．として表現されている。対とされなかったＳｔｕｄｅｎｔｓ  ｔ−検定（ｔ−Ｔｅｓｔ）が、２組（セット）のデーターが、互いに異なっていたという確率（Ｐ）を求めるのに使用された。この違いが、Ｐ＜０．０５の場合、有意であると見なされた。複数の統計計算が、Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  Ｉｎｃ．からの、ソフトウェアパッケージたるＳｔａｔｖｉｅｗを使用しながら、アップル  マッキントッシュ（Ａｐｐｌｅ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）のコンピューター上、完遂された。
【０１３７】
複数の結果
複数のヒト単核細胞によるＰＧＤ2産生への７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの効果
図５（ａ）が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡを用いて４時間、インキュベートされた１×１０7末梢血単核細胞／ｍｌの細胞上清中、検出されたＰＧＤ2の複数のレベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させていく（０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ）ことの効果を示す。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、コントロールよりも有意に大きかった（４０±１３ｐｇ／ｍｌ  ＰＧＤ2；  Ｐ＝０．０１）１００ｎＭ  ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡにおけるある１極大（１０２±２４ｐｇ／ｍｌ  ＰＧＤ2）に届いているＰＧＤ2産生における濃度から独立している増加を誘発させるように見えた。
【０１３８】
図５（ｂ）が、ＴＮＦ−α（０．５μｇ／ｍｌ）存在下、インキュベートされた複数の単核細胞の細胞上清中、検出されたＰＧＤ2の複数のレベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させていく（０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ）ことの効果を示す。ＴＮＦ−αが、ＤＭＳＯビヒクルコントロールに比べられたら、ＰＧＤ2における２．３倍の増加を刺激した（Ｐ＜０．０５）。０．１ｎＭ〜１００ｎＭの濃度において７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、ＴＮＦ−α誘発ＰＧＤ2生合成への効果を全く持たないように見えた。この実験において使用された７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの最高濃度（１０００ｎＭ）においてＰＧＤ2の複数のレベルが、１６４±３１ｐｇ／ｍｌにまで増加した（ＴＮＦ−α単独に比べられたら、Ｐ＝０．０３）。
【０１３９】
複数のヒト単核細胞によるＰＧＥ2産生への７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの効果
図６（ａ）が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡを用いて４時間、インキュベートされた６×１０5末梢血単核細胞／ｍｌの細胞上清中、検出されたＰＧＥ2の複数のレベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させていく（１ｎＭ〜１０００ｎＭ）ことの効果を示す。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、複数のＤＭＳＯコントロールに比べられたら、ＰＧＥ2の複数のレベルを増加させるように見えたが、しかしながら、これらの増加が、統計的に有意に異なっていなかった。
【０１４０】
図６（ｂ）が、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下、インキュベートされた単核細胞の複数の細胞上清中、検出されたＰＧＥ2の複数のレベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させていく（１ｎＭ〜１０００ｎＭ）ことの効果を示す。ＴＮＦ−αが、ＤＭＳＯコントロールに比べられたら、ＰＧＥ2における有意な１．９７倍の増加を刺激した（Ｐ＝０．００１）。１ｎＭ〜１００ｎＭの濃度において、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、ＴＮＦ−α単独に対する応答における１６７±６ｐｇ／ｍｌから、ぞれぞれ、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭ  ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡに関しての７５±２５ｐｇ／ｍｌ、８２±２３ｐｇ／ｍｌ、および７４±１２ｐｇ／ｍｌにまでＴＮＦ−α誘発ＰＧＥ2生合成を有意に抑圧した（ＴＮＦ−αのみと比べられたら、全てのＰ＜０．０２）。この実験において使用された７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの最高濃度（１０００ｎＭ）においてＴＮＦ−α誘発ＰＧＥ2産生への効果が、全く観察されなかった。
【０１４１】
複数のヒト単核細胞による１５ｄ−ＰＧＪ2産生への７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの効果
図７（ａ）が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡを用いて４時間、インキュベートされた複数の単核細胞の細胞上清中、検出された１５ｄ−ＰＧＪ2の複数のレベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させていく（０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ）ことの効果を示す。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、使用された全ての濃度においておよそ９〜１２倍、１５ｄ−ＰＧＪ2の複数のレベルを有意に増加させた。複数のレベルが、複数のＤＭＳＯコントロールに関しての５１±６ｐｇ／ｍｌから、ぞれぞれ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭ  ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡに関しての５０６±１０１ｐｇ／ｍｌ、５３９±５１ｐｇ／ｍｌ、５２０±４５ｐｇ／ｍｌ、４５０±１３３ｐｇ／ｍｌ、および５９０±８４ｐｇ／ｍｌにまで増加された（複数のＤＭＳＯコントロールと比べられたら、全てのＰ＜０．０５）。
【０１４２】
図７（ｂ）が、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いてインキュベートされた複数の単核細胞の細胞上清中、検出された１５ｄ−ＰＧＪ2の複数のレベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させていく（０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ）ことの効果を示す。この実験において使用されたサイトカインの濃度において、ＴＮＦ−αが、１５ｄ−ＰＧＪ2における小さな増加を刺激するように見えたが、しかしながら、これが、複数のＤＭＳＯコントロールから、有意に異なっていなかった。使用された全ての濃度において７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、ＴＮＦ−α存在下、１５ｄ−ＰＧＪ2の複数のレベルを増加させた。１５ｄ−ＰＧＪ2の複数のレベルが、ＴＮＦ−α単独存在下での１５７±３９ｐｇ／ｍｌから、ぞれぞれ、ＴＮＦ−α＋０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭ  ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ存在下での３４８±４８ｐｇ／ｍｌ、３３４±２４ｐｇ／ｍｌ、３５６±８５ｐｇ／ｍｌ、４０６±３０ｐｇ／ｍｌ、および３１８±１００ｐｇ／ｍｌにまで増加された（ＴＮＦ−αのみと比べられたら、全てのＰ＜０．０５）。
【０１４３】
実施例３
７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡ、７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡ、および７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）およびエピアンドロステロン（ＥＰＩＡ）の複数の自然代謝産物である。数多くのステロイドが、炎症過程（プロセス）および免疫過程（プロセス）と干渉すると報告されているので、我々の課題が、ＰＧ産生および関連酵素遺伝子発現へのこれらのヒドロキシステロイドの効果をテストすることであった。複数のヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）が、原炎症サイトカインたるＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）の添加有りもしくは無しで、これらステロイドの各々（１〜１００ｎＭ）の存在下、４時間および２４時間、培養された。ＰＧＥ2のレベル、ＰＧＤ2のレベル、および１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ2（１５ｄ−ＰＧＪ2）のレベルが、そのインキュベート培地において測定されたが、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）およびＰＧＥ合成酵素（シンターゼ、ｍ−ＰＧＥＳ１）のｍＲＮＡの細胞含量が、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより査定された。ＴＮＦ−αの添加が、結果的に、ＰＧ産生の上昇ならびにＣＯＸ−２ｍＲＮＡレベルおよびｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡレベルの増加を与えた。テストされた３種のステロイドの間で、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡしか、ＣＯＸ−２およびｍ−ＰＧＥＳ１の発現を減少させなかった一方、顕著に、ＰＧＥ2の産生を減少させており、１５ｄ−ＰＧＪ2の産生を増加させている。これらの結果が、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、複数の抗炎症効果を持つことを指し示す。
【０１４４】
１．１．ヒトＰＢＭＣ調製および培養
全血が、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  ｄｕ  Ｓａｎｇ（ブレスト、フランス）における複数のＥＤＴＡ補完パウチ中の複数のドナーから、収集された。該ＰＢＭＣが、収集後、３６時間以内で、無菌条件下、全血から、次いで、単離された。密度勾配遠心が、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｅｕｒｏｂｉｏ）上、完遂された。ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｅｕｒｏｂｉｏ）中での洗浄後、複数の細胞が、１０％熱不活化牛胎児血清（Ｅｕｒｏｂｉｏ）、２ｍＭ  グルタミン（Ｄ．Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）、１００Ｕのペニシリン／ｍｌ（Ｄ．Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）、および１００μｇのストレプトマイシン／ｍｌ（Ｄ．Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）を用いて補完されたＲＰＭＩ  １６４０培地において懸濁された。複数の単球が、１時間、プラスチックに対する接着により選ばれ、およそ１０7の細胞が、。複数枚の６穴（ウェル）組織培養プレート（１ウェル当たり、３ｍＬの培地）においてプレートに播かれた。全てのインキュベートが、３７℃および５％ＣＯ2における湿らされたインキュベータ中、実施された。複数の細胞が、回収され、０．０１μｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α（シグマ−アルドリッチ）存在下もしくは非存在下、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ、７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡ、もしくは７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡ（エタノール２０μＬ中）のどれかを用いて補完された作りたてのインキュベート培地２ｍｌ中、分散された。コントロールの複数のインキュベートが、エタノール２０μｌを含有したが、全くステロイドを含有しなかった。複数の上清が、４時間後、収集されたが、これらのＰＧ含量および細胞の測定用の２４時間インキュベートが、引き続いてのＲＮＡの単離用に使用された。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、セルジ−ポントワーズ（Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ）、フランス（Ｆｒａｎｃｅ））を使用しながらの単一工程（ステップ）抽出法が、全ＲＮＡを与えた。
【０１４５】
１．２．リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ
複数のｃＤＮＡが、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  第１ストランド合成システムキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用しながら、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ  Ｉ処理ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）から、合成された。複数のＲＴ−ＰＣＲ増幅混合物（５０μＬ）が、２，５ｘＲｅａｌＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ／２０ｘ  ＳＹＢＲ溶液（１１，２５μＬ、エッペンドルフ、ル  ペック、フランス）ならびに２００ｎＭの順プライマーおよび逆プライマーを含有した。複数の反応が、ＲｅａｌＰｌｅｘ  ｅｐ  勾配  Ｓ  マスターサイクル機（エッペンドルフ）上、行われた。これらサイクルを回していく条件が、９５℃において１０分であったが、４５サイクルをそれぞれ、１５秒間、３０秒間、および３０秒間、９５℃、５５℃、および６８℃においてであった。各アッセイが、コントロールのｃＤＮＡの４点の連続の稀釈点（ポイント）の標準曲線を包含した。ＨＰＲＴ１ハウスキーピング遺伝子が、定量化用に使用された。全てのオリゴヌクレオチドプライマー（表２）が、Ｇｅｎｅｃｕｓｔ／Ｄｉｓｔｒｉｂｉｏ（エヴリ、フランス）により合成された。増幅された生成物の特異性が、その生成物融解曲線の審査によりモニターされたが、アガロースゲル電気泳動上での分析により確かめられた。
【０１４６】
１．３．複数のＰＧ測定
商品として入手可能な複数のＥＩＡキットが、複数の培養培地における複数のＰＧＥ2レベル（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＫ）および複数の１５ｄ−ＰＧＪ2レベル（Ａｓｓａｙ  ｄｅｓｉｎｇｎｓ、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）の決定用に使用された。複数のＰＧＤ2レベルの測定が、プロスタグランジンＤ2−ＭＯＸ  ＥＩＡ  キット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）を使用しながら、得られた。このケースにおいて、および、アッセイの前に、これら採れたてのサンプルが、ＰＧＤ2−ＭＯＸへとＰＧＤ2を変換した、ＭＯＸ−ＨＣｌ試薬と直ちに処理されたが、こうして如何なる更なる化学的劣化をも防いでいる。
【０１４７】
１．４．データーの統計解析
全てのアッセイが、３回ずつ完遂されたが、複数の結果が、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．としてプロットされた。分散の片道での解析が、複数の群の間での違いを比べるためにＤｕｎｃａｎの多数回ずつのレンジテストにより伴われて実施された。複数の違いが、ｐ＜０．０５の場合、統計的に有意と見なされた。
【０１４８】
２．１．７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡの複数の効果
ヒトＰＢＭＣが、４時間かもしくは２４時間かどちらか、ＴＮＦ−αの添加有りもしくは無しで、培養された。ＰＧＥ2レベル、ＰＧＤ2レベル、および１５ｄ−ＰＧＪ2レベルが、その培養培地において測定され、関連された複数の遺伝子（ＣＯＸ−２、ｍ−ＰＧＥＳ１）のｍＲＮＡ産生が、その細胞において測定された。得られたデーターが、表２において示されている。ＴＮＦ−αの非存在および３種の異なる濃度の７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡを用いた補完が、４時間、複数の培養における、ＰＧＥ2レベル、ＰＧＤ2レベル、および１５ｄ−ＰＧＪ2レベルにおける有意な変化を全く起こさなかった。１５ｄ−ＰＧＪ2しか、２４時間の培養後、中くらいの増加を示さなかった。７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡを用いたインキュベートが、２４時間後、複数の培養において複数のｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡレベルを有意に増加させた。
【０１４９】
ＴＮＦ−αの存在が、２４時間後、全てのＰＧのレベルにおいて期待された増加を起こさせた。４時間の７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡを用いたインキュベートが、テストされた複数の濃度のいずれにおいてもＰＧの複数のレベルを変化させなかった。対照的に、ＴＮＦ−α単独と比べられた場合、２４時間の７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡおよびＴＮＦ−αを用いた同時インキュベート後、ＰＧＥ2のレベルおよびＰＧＤ2−１５ｄ−ＰＧＪ2のカップリングのレベルが、それぞれ、有意に増加され、および、減少された。輪をかけて、ＴＮＦ−αとのインキュベート（つまり、炎症活性化）が、ＣＯＸ−２およびｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡ産生における顕著な増加に至った。７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡとの同時インキュベートが、ＴＮＦ−α単独と比べられた場合、複数のｍＲＮＡレベルにおける一貫している変化を全く起こさなかった。
【０１５０】
２．２．７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡの複数の効果
ヒトＰＢＭＣが、４時間かもしくは２４時間かどちらか、ＴＮＦ−αの添加有りもしくは無しで、培養された。ＰＧＥ2レベル、ＰＧＤ2レベル、および１５ｄ−ＰＧＪ2レベルが、その培養培地において測定され、関連された複数の遺伝子（ＣＯＸ−２、ｍ−ＰＧＥＳ１）のｍＲＮＡ産生が、その細胞において測定された。得られたデーターが、表３において示されている。ＴＮＦ−α非存在下での４時間の３種の濃度の７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡを用いたインキュベートが、その培養培地における、ＰＧＥ2レベル、ＰＧＤ2レベル、および１５ｄ−ＰＧＪ2レベルにおける有意な変化を全く起こさなかった。しかしながら、ＰＧＤ2レベルおよび１５ｄ−ＰＧＪ2レベル、並びにｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡレベルが、培養における７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡとのインキュベート２４時間後、増加された。
【０１５１】
ＴＮＦ−αの存在が、２４時間に全てのＰＧにおいて期待された増加を起こさせた。４時間の７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡとの同時インキュベートが、テストされた複数の濃度のいずれにおいてもＰＧの複数のレベルを更に変化させなかった。対照的に、ＴＮＦ−α単独と比べられた場合、２４時間の７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡおよびＴＮＦ−αを用いた同時インキュベート後、ＰＧＤ2レベルおよび１５ｄ−ＰＧＪ2レベル両方が、有意に減少された。輪をかけて、ＴＮＦ−αとのインキュベート（つまり、炎症活性化）が、ＣＯＸ−２およびｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡ産生における顕著な増加に至った。７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡとの同時インキュベートが、ＴＮＦ−α単独と比べられた場合、複数のｍＲＮＡレベルにおける一貫している変化を全く起こさなかった。
【０１５２】
２．３．７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの複数の効果
ヒトＰＢＭＣが、４時間かもしくは２４時間かどちらか、ＴＮＦ−αの添加有りもしくは無しで、培養された。ＰＧＥ2レベル、ＰＧＤ2レベル、および１５ｄ−ＰＧＪ2レベルが、その培養培地において測定され、関連された複数の遺伝子（ＣＯＸ−２、ｍ−ＰＧＥＳ１）のｍＲＮＡ産生が、その細胞において測定された。得られたデーターが、表４において示されている。ＴＮＦ−α非存在下での４時間の３種の濃度の７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、その培養培地における、ＰＧＥ2レベル、ＰＧＤ2レベル、および１５ｄ−ＰＧＪ2レベルにおける有意な変化を全く起こさなかった。しかしながら、複数の細胞培養が、２４時間、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡと共にインキュベートされた場合、ＰＧＤ2および１５ｄ−ＰＧＪ2両方が、顕著に増加された。ＣＯＸ−２発現が、４時間かもしくは２４時間かどちらかに前記ステロイドにより知らされ得るほど（ｎｏｔｉｃｅａｂｌｙ）変化されていなかったが、複数のｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡレベルが、それぞれ、４時間および２４時間に有意な減少および増加を示した。
【０１５３】
ＴＮＦ−αの存在が、２４時間に全てのＰＧにおいて期待された増加を起こさせた。４時間の７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡとの同時インキュベートが、テストされた複数の濃度のいずれにおいてもＰＧの複数のレベルを更に変化させなかった。対照的に、２４時間に、ＴＮＦ−α単独と比べられた場合、これら２種のより低い方の用量の７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、ＰＧＤ2レベルを減少させ、１５ｄ−ＰＧＪ2レベルを増加させた。ＴＮＦ−αとのインキュベート（つまり、炎症活性化）が、ＣＯＸ−２およびｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡにおける顕著な増加にも至った。複数の細胞培養が、２４時間、１０および１００ｎＭ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡと共にインキュベートされた場合、ＴＮＦ−αによるＣＯＸ−２における増加およびｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡ産生における増加が、平滑化された。
【０１５４】
全く（Ａｌｔｏｇｅｔｈｅｒ）、これらの結果が、明らかに、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、驚くべきことに、有意な複数の抗炎症効果を持つことを指し示す。
【０１５５】
【表２】
2010511028.tif 000020
【０１５６】
【表３】
2010511028.tif 000021
【０１５７】
【表４】
2010511028.tif 000022
【０１５８】
実施例４
結腸炎の実験モデルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの効果
連続６日間の飲料水中のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の複数のラットに対する投与が、結腸の長さの抑制、ＭＰＯ活性の増加、複数の杯細胞における粘液の枯渇、ならびに、ＣＯＸ−２およびｍＰＧＥＳ−１合成酵素（シンターゼ）の発現の増加、および、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の産生の増加により特徴化された結腸の炎症（結腸炎）を起こさせる。ＤＳＳの投与が、腸における蛋白のカルボニル（Ｐｒｏｔ  ＣＯ）および複数のＴバーのような複数の酸化ストレスマーカーをも増加させる。我々が、今、ＤＳＳ投与前、７日間、１日１回、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いた処置が、ＤＳＳ誘発結腸炎の発展を防ぎ得るとの証拠を与える。０．０１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの投与が、結腸炎による損傷および組織の炎症を完全に防いだが、この７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの効果が、複数の酸化ストレスマーカーおよびＰＧＥ2産生における顕著な抑制と関連づけられ、ＣＯＸ−２発現における早いが一過性の増加および抗炎症プロスタグランジン１５ｄ−ＰＧＪ2産生における持続された増加と関連づけられた。これらの結果が、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、炎症腸疾病（ＩＢＤ）のこの許容された実験モデルにおける非常に低い複数の用量レベルにおいて顕著な複数の抗炎症効果を持つことを示す。
【０１５９】
複数の実験手順
複数の動物
全ての実験プロトコールおよび手順が、複数の実験動物の使用に関する、ヨーロッパ共同体（ＥＣ）の方針８６／６０９／ＣＥＥとの合意にあった。複数の雄ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット（１８０〜２００ｇ）が、チャールズリヴァー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）、ラルブレスル（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ）、フランス（Ｆｒａｎｃｅ）から購入されたが、齧歯類の実験室での食事を用いて給餌され、自由に水を与えられた。
【０１６０】
薬剤処理および結腸炎誘発
７日の適応期間後、複数の動物が、コントロールの２群（擬似（ｓｈａｍ）コントロールおよび７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ処置コントロール群）ならびに結腸炎の２群（結腸炎および７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ処置結腸炎）へと分けられた。７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＤＭＳＯに溶解された、０．０１、０．１、および１ｍｇ／ｋｇ体重）あるいはＤＭＳＯ単独（ビヒクル）が、０日目〜７日目、７日間、１日１回、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与された。結腸炎が、飲料水に対するＤＳＳ（分子量３６〜５０ｋＤａ；  ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、フランス）の添加により、７〜１４日目、誘発された。これらコントロールの２群が、水道水しか受けなかった。
【０１６１】
結腸の損傷の巨視的査定
９、１１、１３、１４日目に、体重、結腸長さ、軟便度が、記録され、採れたての直腸での出液が、肉眼での検査により評価された。結腸の損傷の重篤さが、Ｍａｂｌｅｙら、２００１、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．；  ５０：  ５６１−５６９  により記述されたとおり盲検的にスコア化された（０：  よく形成された複数のペレットおよび全く結腸の損傷なし；  １：  複数の糞便と混合されて存在する少量の血液を有する結腸；  ２：  複数の糞便と共に存在する大量の血液を有する結腸；  ３：  血液で満たされた結腸および全く糞便なし）。
【０１６２】
組織学的審査
近位結腸のある１部分（１ｃｍ）が、４％ホルムアルデヒド（Ｌａｂｏｎｏｒｄ、Ｔｅｍｐｌｅｍａｒｓ、Ｆｒａｎｃｅ）中、固定され、パラフィン中、埋められた。複数の組織切片（５μｍ）が、調製され、この後、きれいにされ、水和され、それぞれ、結腸の損傷および粘液杯細胞含量の組織学的評価用の複数の標準プロトコールに従いながら、ヘマトキシリン／エオシンを用いるかアルシアンブルーを用いるかどちらかで染色された。
【０１６３】
複数の組織ホモジェネートの調製
結腸が、腸間膜縁に沿って開けられ、その複数の上皮細胞が、ガラススライドの平滑な端を用いてスクラップされて離され、次いで、重量を量られ、洗浄され、そして遠心された。そのペレットが、９体積のＴＫＥ緩衝液（バッファー、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１５０ｍＭ  ＫＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）中、均一化され、次いで、更なる使用までずっと、−８０℃において凍結された。複数のホモジェネートの蛋白含量が、Ｌｏｗｒｙら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９５１；  １９３：  ２６５−７４）に従いながら、測定された。
【０１６４】
ＭＰＯ活性
ＭＰＯ活性が、Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒらの複数の変法（Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ２００６；７１（３）：２４０−８）と共にＫｒａｗｉｓｚらのオルト（ｏ−）ジアニシジン法（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９８４；８７（６）：１３４４−５０）を使用しながら、複数のホモジェネート中、査定された。ＭＰＯ活性が、酸化されたオルト（ｏ−）ジアニシジンに関する消光係数（１．１３×１０4モル-1ｃｍ-1）を使用しながら、４６０ｎｍでの吸光度における１分当たりの変化を生成させるのに必要な酵素の量として表現された。
【０１６５】
酸化ストレスの生化学的決定
脂質過酸化（Ｔｂａｒｓ）が、Ｏｈｋａｗａらにより記述された方法（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９７９；  ９５：  ３１５−５８）の、Ａｌｂｒｅｃｈｔらによるある１種の変法（１９９２、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ；  ６３：  ９１−９６）により測定された。赤い１：２付加物たるマロンジアルデヒド−チオバルビツール酸（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、サンカンタン−ファラヴィエ（Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ−Ｆａｌｌａｖｉｅｒ）、フランス（Ｆｒａｎｃｅ））の吸光度が、５３２ｎｍにおいて測定された（使用された消光係数：０．１５６μモル-1ｃｍ-1）。酸化された複数の蛋白におけるカルボニル含量（Ｐｒｏｔ  ＣＯ）が、Ｌｅｖｉｎｅらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９９０；１８６：４６４−７８）により査定された。その非蛋白スルフヒドリル基含量（大抵、ＧＳＨ）が、複数のホモジェネート中の抗酸化剤防禦マーカーとして採られ、ＳｅｄｌａｋおよびＬｉｎｄｓａｙの方法（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９６８；２５（１）：１９２−２０５）により求められた。
【０１６６】
複数のプロスタグランジン免疫アッセイ
商品として入手可能な複数のＥＩＡキットが、採れたての複数のホモジェネートから得られた結腸の複数の上清中、ＰＧＥ2の複数のレベル（オックスフォード  バイオメディカル  リサーチ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、英国（ＵＫ））および１５ｄ−ＰＧＪ2の複数のレベル（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）の決定用に使用された。ＰＧＤ2の複数のレベルの測定が、プロスタグランジンＤ2−ＭＯＸ  ＥＩＡ  キット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）を使用しながら、得られた。このケースにおいて、および、あっせいの前に、これら採れたてのサンプルが、ＰＧＤ2−ＭＯＸへとＰＧＤ2を変換したＭＯＸ−ＨＣｌ試薬を用いて直ちに処理されたが、こうして如何なる更なる化学的劣化をも防いでいる。
【０１６７】
リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ
採れたての複数の結腸サンプル（３００ｍｇ）からの全ＲＮＡが、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、セルジ−ポントワーズ（Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ）、フランス（Ｆｒａｎｃｅ））を使用しながら、抽出された。ポリ（Ａ）ＲＮＡが、ＭｉｃｒｏＰｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｉｓｔ  キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ、英国（ＵＫ））を用い、全ＲＮＡから精製された。ｃＤＮＡが、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  第１ストランド合成システムキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用しながら、合成された。リアルタイムＰＣＲが、２．５ｘＲｅａｌＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ／２０ｘ  ＳＹＢＲ溶液（１１．２５μＬ、エッペンドルフ、ル  ペック、フランス）および３００ｎＭの順プライマーおよび逆プライマーを含有している複数の混合物（２５μＬ）を使用しながら、実施された。複数の反応が、ＲｅａｌＰｌｅｘ  ｅｐ  勾配  Ｓ  マスターサイクル機（エッペンドルフ）上、行われた。これらサイクル化条件が、１０分間、９５℃においてであったが、４０サイクルをそれぞれ、１５秒間、３０秒間、および３０秒間、９５℃、５５℃、および６８℃においてであった。各アッセイが、コントロールのｃＤＮＡの４点の連続の稀釈点（ポイント）の標準曲線を包含した。複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、Ｇｅｎｅｃｕｓｔ／Ｄｉｓｔｒｉｂｉｏ（エヴリ、フランス）により合成された。増幅された生成物の特異性が、その生成物融解曲線の審査によりモニターされたが、アガロースゲル電気泳動上での分析により確かめられた。ｍＲＮＡのこれらレベルが、ＨＰＲＴ１に対する規格化後、ＤＭＳＯコントロールのものに相対し、表現された。
【０１６８】
統計解析
全てのアッセイが、各動物に関し、３回ずつ完遂されたが、複数の結果が、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．としてプロットされている。分散の片道での解析が、複数の群の間での違いを比べるためにＤｕｎｃａｎの多数回ずつのレンジテストにより伴われて実施された。複数の違いが、ｐ＜０．０５の場合、統計的に有意と見なされた。
【０１６９】
複数の結果
結腸炎誘発の時間経過（タイムコース）研究
７日間（７日目〜１４日目、Ｄ７〜Ｄ１４）、飲料水中、５％のＤＳＳを用いた複数のラットの処置が、死亡率を伴わず、結腸炎の臨床兆候および組織学的兆候を結果的に与えた。典型的に、全てのこれらラットが、結腸炎誘発（１２日目）後の５日、重篤な下痢を呈し、次の日、直腸での出液が、起きた。体重、副睾丸の脂肪組織の質量、および肝重量におけるある１種の減少が、複数の擬似コントロールと比べられた場合、全てのＤＳＳ処置ラットにおいて１１日目に記録された（それぞれ、−５％、−１７％、−８％；ｐ＜０．０５）。これらの減少が、１４日目にも観察された（表５）。脾重量における変化が、全く観察されなかった。該擬似コントロール群と比べた場合、複数のＤＳＳ処置ラットが、結腸の厚くなった組織および大便の損失（ロス）と関連づけられて、１１日目（−１４％、ｐ＜０．０５）〜１４日目（−２６％；ｐ＜０．０５）、結腸の有意な短縮も実証した。表５を見よ。結腸粘膜におけるＭＰＯ活性が、好中球浸潤のある１指標（インデックス）として測定された。１３および１４日目に、粘膜のＭＰＯ活性の９倍および７倍の増加が、複数の擬似コントロールと比べられた場合、該結腸炎群において観察された（ｐ＜０．０５、図８Ａ）。ＭＰＯ活性の修飾が、１３日目の前に全く観察されなかった。これらの結果が、組織学的分析と一致している。本当に、結腸の炎症の主要な複数の刻印（ホールマーク）、すなわち、隠蔽された歪み、粘膜組織中への好中球の浸潤、および、より少なきムチンを含有した複数の杯細胞の損失（ロス）が、１３日目に該結腸炎群において明らかとなり、擬似コントロール群と比べられた場合、１４日目により多く知れ渡った（データーは示されなかった）。
【０１７０】
図８において示されたとおり、酸化ストレスに関するこれら２種のマーカー、すなわち、Ｐｒｏｔ  ＣＯ、複数のＴバー、および、抗酸化剤防禦パラメーターＧＳＨの複数のレベルが、結腸炎を有する複数の動物の結腸の粘膜において１３および１４日目にコントロールの複数のレベルを上回って有意に増加された。
【０１７１】
結腸炎への７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの保護効果
７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡのこれら２種の低い用量（０．０１、０．１ｍｇ／ｋｇ）が、１４日目に下痢の抑圧および直腸での出液により指し示されたとおりのこれらＤＳＳ誘発結腸損傷を防いだ。ＤＳＳ投与前、７日間、日に１回、０．０１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの腹腔内注射が、副睾丸の重量を代えてしまうことなく、コントロールの複数のレベルに体重を復元させた（表５）。９日目〜１４日目、結腸の長さの抑制が、結腸炎群におけるよりも、ステロイドのこれら２種の低い方の用量（０．０１、０．１ｍｇ／ｋｇ）により処置されたこれら群においてより少なく見受けられた（ｐｒｏｎｏｕｎｃｅｄ）（９日目に関してはデータは示されなかった、表５）。７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、１４日目に複数の杯細胞における粘液の枯渇、および、クリプト（ｃｒｙｐｔｓ）および好中球の浸潤の異常のような複数の組織学的変化を防ぎ（データーは示されなかった）、全ての用量のレベル、０．０１、０．１、および１ｍｇ／ｋｇにおいてＭＰＯ活性を有意に減少させた（図８Ａ）。これら酸化ストレスパラメーター（Ｐｒｏｔ  ＣＯ、複数のＴバー）および複数のＧＳＨのレベルが、全ての群、すなわち、擬似コントロール、結腸炎、および７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ処置（０．０１、０．１、および１ｍｇ／ｋｇ）結腸炎群において９日目（示されなかった）および１１日目に似ていた（図８Ｂ、Ｃ、およびＤ）。酸化ストレスの全てのマーカーおよび抗酸化剤防禦マーカーが、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いて処置されてきていた複数の動物において変化されていなかったままであった一方（Ｄ０〜７日目）、これらのパラメーターが、該結腸炎群において有意に増加された（ｐ＜０．０５）。これらの結果が、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、炎症腸疾病（ＩＢＤ）のこの実験モデルにおいて非常に低い複数の用量レベルにおいて顕著な複数の抗炎症効果を持つことを示す。
【０１７２】
【表５】
2010511028.tif 000023
【０１７３】
結腸組織におけるプロスタグランジン（ＰＧ）産生：β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの複数の効果
複数の７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ処置が、結腸炎のないコントロールの複数のラットにおけるＰＧＥ2結腸組織レベルおよびＰＧＤ2結腸組織レベルを代えさせなかった（データは示されなかった）。対照的に、０日目〜７日目、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの投与が、２日目〜１４日目、複数の１５ｄ−ＰＧＪ2レベルのベースのレベルを上回る有意な増加に至った。０．１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの投与が、２日目に５１倍の増加を結果的に与えたが、４日目〜１４日目、漸進的に減少した（４４倍〜５倍の範囲である増加分。図９Ａ、図１０Ｃ）。
【０１７４】
７日目〜１４日目、炎症剤ＤＳＳの投与が、１４日目に原炎症プロスタグランジンＰＧＥ2産生における顕著な複数の増加を結果的に与えた一方で、抗炎症プロスタグランジン１５ｄ−ＰＧＪ2の複数のレベルが、鋭く抑えられた（図１０）。
【０１７５】
０日目（Ｄ０）〜７日目（Ｄ７）、０．０１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いた処置が、〜日目に結腸ＰＧＥ2のＤＳＳ誘発産生を完全に防いだ一方、１５ｄ−ＰＧＪ２のレベルを劇的に増加させている（図１０）。
【０１７６】
擬似群および結腸炎群におけるＣＯＸ−２およびＰＧ合成酵素（シンターゼ）発現：７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ前処理効果
複数のプロスタグランジンレベルにおける有意な複数の修飾が、ＤＳＳ投与および７複数のβ−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ処置と共に観察されたので、我々が、ＣＯＸ−２、ｍＰＧＥＳ−１、およびＨ−ＰＧＤＳの発現が、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる特異的ｍＲＮＡの定量によるステロイド前処理により代えられた（変化した）かどうかテストした。これらの遺伝子の転写が、審査され、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１のものに関連づけられた。結腸炎のないコントロールの複数のラットにおいて、０．１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの投与が、１５時間に複数のＣＯＸ−２ｍＲＮＡレベルにおける有意な１．５倍の増加を誘発させたが、次いで、２日目および４日目に有意な減少、この後、ベースの複数の値に戻っていった（図９Ｂ）。ｍＰＧＥＳ−１ｍＲＮＡ発現が、６時間〜１５時間の間、一過性に増加したが、２日目にベースの複数のレベルに向かって戻っていった。Ｈ−ＰＧＤＳのｍＲＮＡの合成が、本実験のコースの間中、変えられなかったままであった。
【０１７７】
ＤＳＳによる結腸炎誘発後、ＣＯＸ−２ｍＲＮＡ発現における２．５倍の増加が、１３および１４日目に観察された一方（図１１Ａ）、ｍＰＧＥＳ−１ｍＲＮＡが、１３日目にしか有意に増強されなかった（図１１Ｂ）。Ｈ−ＰＧＤＳが、ＤＳＳ投与により代えられなかった（変化しなかった）。
【０１７８】
７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いた前処理（０日目〜７日目）が、ＤＳＳによるＣＯＸ−２およびｍＰＧＥＳ−１ｍＲＮＡ合成両方におけるこれらの増加を抑圧した（図１１）。
【０１７９】
全く（Ａｌｔｏｇｅｔｈｅｒ）、これらの知見が、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡのこれら抗炎症効果が、ＰＧＥ2における並行減少および１５ｄ−ＰＧＪ2産生におけるある１種の増加を通じ、仲介されていることを指し示す。この研究において見られた１５ｄ−ＰＧＪ2産生への７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの長く続いている効果が、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、炎症およびこの寛解において関与された複数の遺伝子の発現における複数の変化の持続を起こすことを示唆する。
【０１８０】
これら図面において、図８が、（Ａ）ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、および、複数の酸化ストレスマーカー、すなわち、（Ｂ）Ｐｒｏｔ  ＣＯ、（Ｃ）複数のＴバー、および（Ｄ）結腸組織における抗酸化剤マーカーたるＧＳＨへの７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ処置の複数の効果を示す。複数の生体マーカーレベルが、複数のＤＳＳ処置ラットが、１３および１４日目に複数のコントロールから有意に（ｐ＜０．０５）異なったことを示す。７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、有意に（ｐ＜０．０５）、結腸炎群に比べたら、１３および１４日目にＭＰＯ活性を抑え、全ての用量レベルにおいて１３および１４日目に複数のコントロールレベルに複数の酸化ストレスパラメーター（Ｂ、Ｃ、およびＤ）を復元させた。複数の値が、１群当たり、３〜２３匹のラットを用い、平均±ＳＥＭであり（Ａ）、擬似群に対する百分率（％）である（Ｂ、Ｃ、およびＤ）。図８Ａ〜図８Ｄにおいて、これら黒いバー＝擬似コントロール；これら白いバー＝ＤＳＳ結腸炎群；これら暗い灰色のバー＝ＤＳＳ＋０．０１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；これら中くらいの灰色のバー＝ＤＳＳ＋０．１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；そして、これら明るい灰色のバー＝ＤＳＳ＋１．０ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ。
【０１８１】
ＤＳＳ結腸炎対（ｖ）擬似コントロール群（ｐ＜０．０５）；§  複数の７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ処置群対（ｖ）ＤＳＳ結腸炎群（ｐ＜０．０５）。
【０１８２】
図９が、結腸での１５ｄ−ＰＧＪ２のレベル（Ａ）、および、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ処置の間中の、種々の時刻での、ＣＯＸ−２、ｍＰＧＥＳ−１、およびＨ−ＰＧＤＳの相対的なｍＲＮＡ発現の定量化（Ｂ）を示す。複数の値が、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３〜１５）であり（Ａ）、複数のｍＲＮＡが、ＨＰＲＴ１に対する規格化後、擬似コントロールのものに相対し、表現されている。図９Ａにおいて、黒いバー＝擬似コントロール群；暗い灰色のバー＝０．０１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；中くらいの灰色のバー＝０．１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；そして、明るい灰色のバー＝１．０ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ。図９Ｂにおいて、白い複数のドットを有する暗い灰色のバー＝ＣＯＸ−２；黒い複数のドットを有する明るい灰色のバー＝ｍＰＧＥＳ−１；そして、黒い複数のドットを有する白いバー＝Ｈ−ＰＧＤＳ。
【０１８３】
図１０が、ＤＳＳ投与の間中の、プロスタグランジンＥ２、Ｄ２、および１５ｄ−ＰＧＪ２の結腸での合成への７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの効果を示す。ＤＳＳ投与が、１３（ｐ＜０．０５）および１４（ｐ＜０．０５）日目に有意に、ＰＧＥ２（Ａ）、Ｄ２（Ｂ）、および１５ｄ−ＰＧＪ２の合成を増加させた。ＤＳＳ投与前、７日間、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いた処置が、１３および１４日目にＰＧＥ２の合成を抑えた一方（Ａ）、全ての用量のレベルにおいて有意に、１５ｄ−ＰＧＪ２の産生を増加させている（Ｃ）。データが、ｎ＝３〜２３を用いた平均±ＳＥＭとして表現されている。図１０Ａ〜図１０Ｃにおいて、黒いバー＝擬似コントロール；白いバー＝ＤＳＳ結腸炎群；白い複数のドットを有する暗い灰色のバー＝ＤＳＳ＋０．０１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；黒い複数のドットを有する明るい灰色のバー＝ＤＳＳ＋０．１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；そして、黒い複数のドットを有する白いバー＝ＤＳＳ＋１．０ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ。
【０１８４】
図５が、結腸炎誘発の間中の、ＣＯＸ−２、ｍＰＧＥＳ−１、およびＨ−ＰＧＤＳのｍＲＮＡの結腸での発現を示す。結腸炎が、１３および１４日目にＣＯＸ−２のｍＲＮＡの合成の有意な増加に至った一方（Ａ）、ｍＰＧＥＳ−１が、１３日目にしか増強されなかった（Ｂ）。遺伝子発現の複数のベースのレベルに向かってのある１種の戻りが、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの全ての用量を用いて観察された。図１０Ａ〜図１０Ｃにおいて、白いバー＝ＤＳＳ結腸炎群；暗い灰色のバー＝ＤＳＳ＋０．０１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；中くらいの灰色のバー＝ＤＳＳ＋０．１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；そして、明るい灰色のバー＝ＤＳＳ＋１．０ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ。
【０１８５】
実施例５
１．コラーゲン誘発関節炎における７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの効果
この研究が、コラーゲン誘発関節炎のある１モデルと関連された炎症変化および病理変化をコントロールしていくことに狙いを定めた７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの有効さをテストした。そのネズミモデルが、ヒト関節炎の臨床での疾病のレミニッセントを実証する。
【０１８６】
複数の雄のＤＢＡ／１鼠（１０〜１２週齢）が、尾の付け根での注射により０日目、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント（ＣＩＩ／ＣＦＡ）中に乳化された１００μｇの鶏ＩＩ型コラーゲンを与えられた。複数回の処置が、皮下注射により２０日目〜５０日目（群２、３、および４）、皮下注射により０日目〜３０日目（群５）、毎日与えられたが、下記のとおり：
複数の実験群（ｎ＝１０／群）
群１：  ０日目、ＣＩＩ／ＣＦＡ、処置されなかった〜見かけ処置された、２０日目〜５０日目
群２：  ０日目、ＣＩＩ／ＣＦＡ、処置７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ      １μｇ／ｋｇ、２０日目〜５０日目
群３：  ０日目、ＣＩＩ／ＣＦＡ、処置７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ    １０μｇ／ｋｇ、２０日目〜５０日目
群４：  ０日目、ＣＩＩ／ＣＦＡ、処置７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ  １００μｇ／ｋｇ、２０日目〜５０日目
群５：  ０日目、ＣＩＩ／ＣＦＡ、処置７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ    １０μｇ／ｋｇ、  ０日目〜３０日目
群６：  ０日目、ＣＩＩ／ＣＦＡ、処置されなかった〜見かけ処置された、  ０日目〜３０日目。
【０１８７】
終末化において、（２本の）後ろ脚が、除かれ、複数の膝ホモジェネートが、プロスタグランジン測定用に集められ（群１および群４だけ）、（２本の）足が、複数の標準方法による病理審査用に固定された。各足が、縦に半側切断され、切開され、切断していくのを可能とさせるように脱灰された。これら脱灰されたサンプルが、ルーティーンで加工され、切断され、染色された１区画が、審査用に調製された。これが、各見本の両半分を包含した。各足が、標準スコア化システムに従いながら、スコア化された。複数のサンプルが、実験プロトコールの知識も複数の群の同定もなく、盲検的にスコア化された。
【０１８８】
臨床での関節膨潤が、２１日目〜５０日目、週に２回、スコア化された。各機会に、四肢の各々が、以降のスコア化システム（臨床での疾病スコアの組み合わせ）に従いながら、ある１スコアを与えられた：
０  通常
１  関節全部の僅かな膨潤または個々の桁での炎症
２  赤味を帯びた関節全部の中間的な膨潤および／または１桁よりも多い桁における炎症
３  重篤な関節炎症および多数の桁にまで広がっている赤味
４  重篤な関節炎症および多数の桁にまで広がっている赤味、骨の再モデル化の顕わな複数の兆候（サイン）。
【０１８９】
これら結果が、表６中、示されている。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡを用いて処置しいていくと、複数のコントロール群（これら見かけのコントロール群１および６が、組み合わされてきている）に比べられた場合、上の臨床疾病スコア化方法により測定されたとおり、関節の膨潤の顕著な抑制に至ったことが、判る。この知見が、両足における膨潤の抑制の病理学的証拠により確かめられた（表７）。表７から、１０匹の動物のうちの９匹が、両足関節における組織病理学的変化の完全に明らかであった場合の最低病理学的スコアが、判り、そこで、そのコラーゲンが、その関節炎を誘発させるように与えられ、処置が、３０日目までずっと継続された場合と同一時刻において（０日目）７β−ヒドロキシＥＰＩＡ処置が、始まった。これゆえ、リューマチ関節炎のような複数の疾病の７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いた早い処置が、有益な複数の効果を持ち得る。
【０１９０】
２．これら膝ホモジェネート中の複数のプロスタグランジンの測定
上で調製されたとおりの複数の膝ホモジェネート中の１５ｄ−ＰＧＪ２レベルおよびＰＧＥ２レベルが、複数の標準アッセイ手法を使用しながら、測定された。表８から判るのが、ＰＧＥ２のこれらレベルが、処置されなかったコントロール群に比べられた場合、０．１ｍｇ／ｋｇの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡを用いて処置された群においてより低かったことである。０．１ｍｇ／ｋｇの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡを用いて処置された群が、処置されなかったコントロールに比べられた場合、より高い複数のレベルの１５ｄ−ＰＧＪ２を持った。
【０１９１】
結論：
７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの明らかな抗炎症効果が、あった。誘発時での処置が、最大効果を持つように見えた。これが、このモデルにおいて複数のステロイドを包含している他の複数のテスト化合物と共に保っていくことにあり、既存の複数の変更を逆転させていくのに反対されたとおり、関節の損傷を防いでいくことの相対的な容易さを反映する。こう言ってきているが、より高い方の複数の用量の７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いて処置されたそんな複数の動物における疾病のこれらレベルが、処置が、２０日目までずっと遅らされた場合、似ていた。疾病からの保護のこのレベルが、治療体制用に良好である。最低用量の７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、疾病の複数のレベルへより少ない効果を持つように見えたが、統計解析が、これが、明らかな用量効果であったかどうか調べるのに必要とされると思われる。
【０１９２】
プロスタグランジンＥ２レベルおよび１５ｄ−Ｊ２レベルの解析が、処置の明らかな効果を示した。ＰＧＥ２の複数のレベルが、処置されなかった複数のコントロールに比べられたよりも処置された複数の鼠において低かった。対照的に、１５ｄ−ＰＧＪ２の複数のレベルが、処置に追随しながら、増加された。
【０１９３】
臨床での疾病のこれら観察およびその組織病理を一緒に採ったら、関節炎のこのモデルにおける７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの抗炎症効果に関する強力な証拠が、与えられる。疾病発症前の処置が、最も有効であったのが、殆ど変動せずにこのモデルにおけるケースであるからである。しかしながら、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、発症時前後、与えられた場合、疾病の進行を抑圧し得るという知見が、多くの競合者からこの化合物をマークして取り出し、とても勇気づけている。
【０１９４】
【表６】
2010511028.tif 000024
【０１９５】
これらの結果から、１．０μｇ／ｋｇぐらい低い複数の用量での７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、関節の損傷を抑えるに可能であると、結論されていてよい。
【０１９６】
【表７】
2010511028.tif 000025
【０１９７】
これらの結果から、１０．０μｇ／ｋｇでの７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、殆ど完全に（ａｌｍｏｓｔ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）疾病、つまり、関節の損傷の展開を防ぐことが、結論されていてよい。
【０１９８】
【表８】
2010511028.tif 000026
【０１９９】
これらの結果から、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、コラーゲン誘発関節炎のこれら臨床症状の重篤さを抑え、炎症の解消、細胞の保護、および組織の修復に味方して組織プラスタグランジン産生を代えることが、結論されていてよい。
【０２００】
実施例６
シスプラチン誘発末梢ニューロパシーモデルについての７β−ＯＨ  ＥＰＩＡの効果
シスプラチンが、複数の癌の処置に使用された抗有糸分裂化合物である。しかしながら、この使用が、幾つかの逆効果により、限られており、これらの間でもこれら末梢ニューロパシーが、特に窮迫している。複数のシスプラチン誘発ニューロパシーが、優先して敏感な複数のニューロパシーである。複数の患者が、感覚失調により伴われた遠位の四肢における感覚の複数の損失を患う。複数の組織学研究が、軸索の変性を示した。複数の細胞培養中、シスプラチンによる複数の感覚神経の処理が、細胞体の変性により伴われた神経突起ネットワーク密度のある１減少を誘発させた。複数の感覚神経に特異的な成長因子たる、神経成長因子（ＮＧＦ）が、この中毒に対する複数の神経への複数の保護効果を持つ。培養におけるシスプラチンによる複数の感覚神経の中毒が、これゆえ、複数の末梢ニューロパシーにける複数の化合物の複数の神経保護効果の研究用のふさわしいモデルである。
【０２０１】
７β−ＯＨ  ＥＰＩＡの複数の神経保護効果が、末梢ニューロパシーのある１モデルにおける複数のラット感覚神経について評価された。
【０２０２】
解離された複数の背根神経節感覚神経の複数の１次培養が、４８時間および７２時間、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡありおよびなしで、３μｇ／ｍｌのシスプラチンを用いてインキュベートされ、以降の複数のパラメーターが、評価された：
−抗ＭＡＰ  ２（微小管関連蛋白２）抗体を用いて染色された複数の神経細胞体
−抗β−チューブリン抗体を用いて染色された神経突起ネットワークの密度
【０２０３】
複数の神経の培養
複数のラット感覚神経が、Ｈａｌｌら、１９９７年［Ｈａｌｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７年４月１５日；１７（８）；２７７５〜８４］により記述された方法に従いながら、調製された。端的に、雌ラット（妊娠１５日）が、頸脱臼により屠殺され（Ｒａｔｓ  Ｗｉｓｔａｒ；Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ、フランス）、その複数の胎児が、その子宮から除かれた。複数の背根神経節（ＤＲＧ）を有するそれらの脊髄が、除かれ、ペニシリン５０ＵＩ／ｍｌ−ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ（ＰＳ、１％）および牛血清アルブミン（ＢＳＡ１％、Ｓｉｇｍａ  Ａ６００３）を含有しているＬｅｉｂｏｖｉｔｚ（Ｌ１５、Ｆｉｓｈｅｒ  １１４１５−０４９）の氷冷培地に入れられた。これらＤＲＧが、回収され、カルシウムおよびマグネシウムなく、ＰＢＳ中、稀釈された（Ｆｉｓｈｅｒ  ２００７−０３）トリプシンＥＤＴＡ１０Ｘ、１０％、Ｆｉｓｈｅｒ  １５４０００５４、３７℃において２０分間、トリプシン処理により、解離された。この反応が、ＤＮａｓｅ  Ｉ  グレード  ＩＩ（ＩＩ等級、０．１ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ診断薬１０４１５９）および牛胎児血清（ＦＢＳ１０％、Ｆｉｓｈｅｒ１０２７０−０９８）を含有しているＤｕｌｂｅｃｃｏ修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｆｉｓｈｅｒ２１９６９−０３５）の添加により、止められた。この細胞懸濁が、１０ｍｌのピペットを用いて擦られ、室温において１０分間、３５０×ｇにおいて遠心された。解離された複数の細胞のペレットが、次いで、決められた培養培地において再懸濁された。
【０２０４】
複数の生存可能な細胞が、前記トリパンブルー排除テスト（Ｓｉｇｍａ）を使用しながら、Ｎｅｕｂａｕｅｒ細胞計数機において計数され、複数枚の９６穴（ウェル）プレート（Ｎｕｎｃ）において密度３０，０００細胞／ウェルにおいて播かれた。複数のウェルが、超純粋無菌水（Ｍｅｒｃｋ  Ｅｕｒｏｌａｂ  ６０７５９．０１）中、ポリ−Ｌ−リジン（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ２６３６）を用いて予めコーティングされた。
【０２０５】
複数の細胞が、２時間、接着するようにされ、５％ＣＯ2／９５％空気の雰囲気中、３７℃において湿らされたインキュベーター中、維持された。
【０２０６】
７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いた複数の神経培養のインキュベート
培養５日後、その培養培地が、下記：
・ビヒクル（ＤＭＳＯ  ０．１％）
・ビヒクル（ＤＭＳＯ  ０．１％）＋シスプラチン（３μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ参照番号：ｐ４３９４）
・テスト化合物７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ（１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭ）＋シスプラチン（３μｇ／ｍｌ）
・対照化合物ＮＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋シスプラチン（３μｇ／ｍｌ）
の異なる条件に従いながら、決められた培養培地へと変更された。
【０２０７】
１条件当たり６ウェルが、神経の生存率を査定するように完遂された。インキュベート４８時間および７２時間後、これら神経細胞が、−２０℃でのエタノール／酢酸溶液（９５％／５％）中、５分間、固定され、ＰＢＳ中、３回、濯がれた。
【０２０８】
複数の化合物の神経栄養効果のコントロールに関し、ＮＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）および７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ（１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭ）が、４８時間および７２時間の間中、インキュベートされた。このインキュベートの終わりにおいて、これら細胞が、−２０℃でのエタノール／酢酸溶液（９５％／５％）中、５分間、固定され、ＰＢＳ中、３回、濯がれた。
【０２０９】
１フィールド当たりの細胞体数および神経突起ネットワークの解析
複数の感覚神経の細胞体が、モノクローナル抗ＭＡＰ−２抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｍ４４０３）により標識され（ラベルされ）、複数の感覚神経の神経突起が、モノクローナルβ−チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｔ８６６０）により標識された（ラベルされた）。これらの抗体が、インキュベート溶液（ＦＣＳ５％およびサポニン０．１％を有するＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ  Ｓ−７９００）中、１：４００において稀釈された。これらの抗体が、それぞれ、複数の神経細胞体および複数の神経突起を特異的に標識する（ラベルする）。
【０２１０】
インキュベート２時間後、これら細胞が、ＰＢＳ中、洗浄され、そのＭＡＰ−２抗体およびそのβ−チューブリン抗体を明かすようにインキュベート溶液中、１：３００において稀釈された  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａ１１００１）を用いてインキュベートされた。複数の細胞核が、蛍光マーカーを用いて染色された（Ｈｏｅｃｈｓｔ  染色溶液、ＳＩＧＭＡ  Ｈ６０２４、１時間の間中、インキュベート溶液中１μｇ／ｍｌ）。
【０２１１】
各条件に関し、１ウェル当たり２枚の写真（１条件当たり１２枚の写真）が、コンピューターソフトウェア  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００  ３．２．によりコントロールされた  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用しながら、撮られた。そのＭＡＰ−２標識化に関し、その拡大率が、×１０であり、そのβ−チューブリン標識化に関し、その拡大率が、×２０であった。各標識化に関し、全ての画像（イメージ）が、同一条件において撮られた。
【０２１２】
複数の抗ＭＡＰ−２抗体を用いて標識された（ラベルされた）複数の細胞体の数、および、複数の抗β−チューブリン抗体を用いて標識された（ラベルされた）複数の神経突起の全長の解析が、Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００  ３．２．Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ソフトウェアを使用しながら、完遂された。これら結果が、前記ビヒクルに比べられた百分率（％）において表現された。各群（各グループ）の比較が、対とされなかったＴ検定を使用しながら、完遂された。
【０２１３】
結果
神経突起密度のシスプラチン誘発損失に対しての７β−ＯＨ  ＥＰＩＡによる保護
３μｇ／ｍｌのシスプラチンを用いた４８時間のインキュベート
神経突起密度が、培地（＜＜ビヒクル＞＞）を用いた複数の感覚神経のインキュベート後、つまり、４８時間、シスプラチンなしで、１フィールド当たり平均５４５９μｍの全神経突起長を表現した。シスプラチンを用いた４８時間のインキュベートが、およそ４５８５μｍにまで、１フィールド当たりの該全神経突起長を抑えた。シスプラチンによる神経突起ネットワーク密度におけるこの抑制が、ビヒクルに比べられた場合、統計的に有意であった（−１６％、ｐ＜０．００１）。
【０２１４】
１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いた４８時間のインキュベートが、培地だけを用いてインキュベートされた複数の培養と比べられた場合、複数の神経突起のシスプラチン誘発損失を防ぎ、神経突起長における有意な増加を起こさせた。
【０２１５】
１ｎＭおよび１０ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、４８時間でのシスプラチン誘発神経突起損失に対して複数の感覚神経を保護した。この効果が、統計的に有意であった。全神経突起長が、それぞれ、１ｎＭおよび１０ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベート４８時間後、５３７８μｍおよび５５４９μｍであったが、それぞれ、９０．７％および１０１％のシスプラチン誘発毒性の抑制を表す。
【０２１６】
３μｇ／ｍｌのシスプラチンを用いた７２時間のインキュベート
シスプラチンなしの＜＜ビヒクル＞＞培地における複数の感覚神経が、１フィールド当たり平均５３２０μｍの全神経突起長を発現させた。シスプラチンを用いた７２時間のインキュベートが、およそ４０４６μｍにまで、１フィールド当たりの該全神経突起長を抑えた。シスプラチンによる神経突起ネットワーク密度におけるこの抑制が、ビヒクルに比べられた場合、統計的に有意であった（−２４％、ｐ＜０．００１）。
【０２１７】
１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いた７２時間のインキュベートが、培地だけを用いてインキュベートされた複数の培養と比べられた場合、複数の神経突起のシスプラチン誘発損失を防ぎ、神経突起長における有意な増加を起こさせた。
【０２１８】
１ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、７２時間でのシスプラチン誘発神経突起損失に対して複数の感覚神経を保護した。その効果が、統計的に有意であった。全神経突起長が、１ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベート７２時間後、４９４８μｍであったが、７０．８％のシスプラチン誘発毒性の抑制を表す。
【０２１９】
【表９】
2010511028.tif 000027
【０２２０】
【表１０】
2010511028.tif 000028
【０２２１】
シスプラチン誘発神経細胞死（複数の神経細胞体の損失）に対する７β−ＯＨ  ＥＰＩＡによる保護
４８時間、３μｇ／ｍｌのシスプラチンを用いたインキュベート
フィールド当たり平均６１本の感覚神経が、４８時間においてシスプラチンなく、＜＜ビヒクル＞＞と一緒の培地中でのインキュベート後、観察された。３μｇ／ｍｌのシスプラチンを用いたインキュベートが、フィールド当たりある１平均４１本の感覚神経にまで、神経数を抑えた。シスプラチンによる複数の神経細胞体のこの損失（ロス）が、シスプラチンなく、つまり、ビヒクルだけを含有している培地が、４８時間後、査定された細胞体の数に比べられた場合、統計的に有意であった（−３３％、ｐ＜０．００１）。
【０２２２】
４８時間、１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いたインキュベートが、複数の細胞体のシスプラチン誘発損失（ロス）を殆ど完全に防いだ。
【０２２３】
１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、４８時間でのシスプラチン誘発細胞死に対し、複数の感覚神経を保護した。この効果が、統計的に有意であった。フィールド当たりの感覚神経全数が、それぞれ、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベート４８時間後、５１、４５、および５０であったが、それぞれ、５３，１％、１８，７％、および４３，８％のシスプラチン誘発細胞死の抑制を表す。
【０２２４】
７２時間、３μｇ／ｍｌのシスプラチンを用いたインキュベート
フィールド当たり平均５４本の感覚神経が、７２時間においてシスプラチンなく、＜＜ビヒクル＞＞と一緒の培地中でのインキュベート後、観察された。３μｇ／ｍｌのシスプラチンを用いたインキュベートが、フィールド当たりある１平均３３本の感覚神経にまで、神経数を抑えた。シスプラチンによる複数の神経細胞体の損失（ロス）が、シスプラチンなく、つまり、ビヒクルだけを含有している培地が、７２時間後、査定された細胞体の数に比べられた場合、統計的に有意であった（−３９％、ｐ＜０．００１）。
【０２２５】
４８時間、１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いたインキュベートが、複数の細胞体のシスプラチン誘発損失（ロス）を完全に防いだ。
【０２２６】
１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、７２時間でのシスプラチン誘発細胞死に対し、複数の感覚神経を殆ど完全に保護した。この効果が、統計的に有意であった。フィールド当たりの感覚神経全数が、それぞれ、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベート７２時間後、５２、５５、および５２であったが、それぞれ、９３％、１０４％、および９３％のシスプラチン誘発細胞死の抑制を表す。
【０２２７】
【表１１】
2010511028.tif 000029
【０２２８】
【表１２】
2010511028.tif 000030
【０２２９】
実施例７
本研究が、複数の１次培養における解離脊髄の複数の運動神経および複数の感覚神経への７β−ＯＨ  ＥＰＩＡの神経突起成長促進効果を評価する。複数の神経が、抗β−チューブリン抗体を用いて染色され、全神経長の解析が、＜＜Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ＞＞を使用しながら、完遂された。複数の神経細胞培養が、１０-9Ｍ〜１０-4Ｍの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いてインキュベートされ、その神経ネットワークの密度が、インキュベート６時間後、１２時間後、および２４時間後、査定された。複数の運動神経に特異的な成長因子たる、脳由来神経成長因子（ＢＤＮＦ）、および、複数の感覚神経に特異的な成長因子たる、神経成長因子（ＮＧＦ）が、複数の対照化合物として使用された。我々のデーターが、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡが、複数の運動神経および複数の感覚神経両方への、顕著な複数の神経栄養効果を持つことを示す。これらの効果が、ＢＤＮＦの効果およびＮＧＦの効果に比肩可能であったが、このヒドロキシステロイドのナノモル濃度において特に見受けられた。全く持って、我々の知見が、神経突起の外殖を促進させていくためのおよび末梢ニューロパシーを処置するに至る複数の７−ヒドロキシステロイドの使用を裏付ける。
【０２３０】
１．材料および方法
１．１．複数のラット脊髄運動神経細胞培養の調製
複数のラット脊椎運動神経が、Ｍａｒｔｉｎｏｕら、１９９２年（Ｍａｒｔｉｎｏｕ  ＪＣ、Ｍａｒｔｉｎｏｕ  Ｉ、Ｋａｔｏ  ＡＣ、コリン作動分化因子（ＣＤＦ／ＬＩＦ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける複数の単離ラット胚運動神経の延命を促進させる。Ｎｅｕｒｏｎ．１９９２年４月；８（４）：７３７〜４４）により記述された方法に従いながら、調製された。端的に、妊娠１５日の複数の妊娠雌Ｗｉｓｔａｒラットが、頸脱臼により屠殺され、その複数の胎児が、子宮から除かれた。それらの脊髄が、除かれ、牛血清アルブミン（脂肪酸なしＢＳＡ、Ｅｕｒｏｂｉｏ、Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ、フランス、ＧＸＸＢＳＡ０１−６５）１％を含有しているＬｅｉｂｏｖｉｔｚ（Ｌ１５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１４１５−０４９）氷冷培地に入れられた。複数の髄膜が、注意して除かれた。
【０２３１】
これら脊椎運動神経が、３７℃での２０分間のトリプシン処理により解離され（トリプシンＥＤＴＡ  １０Ｘ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５４０００５４）、カルシウムおよびマグネシウムなく、ＰＢＳ中、稀釈された（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２００７−０３）。この反応が、ＤＮａｓｅ  Ｉ  グレード  ＩＩ（ＩＩ等級、０．１ｍｇ／ｍｌ  Ｒｏｃｈｅ  診断薬  １０４１５９）および１０％子牛胎児血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０２７００９８）を含有しているＤｕｌｂｅｃｃｏ修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２１９６９−０３５）の添加により止められた。この懸濁が、次いで、１０ｍｌのピペットを３回通して機械的に解離された。複数の細胞が、次いで、室温において１０分間、５８０ｇにおいて遠心された。解離された複数の細胞のペレットが、Ｌ１５培地中、再懸濁され、この結果得られてきた懸濁が、Ｌ１５培地中、ある１層のＢＳＡ溶液（３．５％）上、室温において１０分間、１８０×ｇでの遠心により、運動神経に富まされた。その上清が、漉され、該ペレットが、ＤＮａｓｅ  Ｉ（１％）を用いて補われたＬ１５培地中、再懸濁された。次いで、該懸濁が、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（ｄ：１．０６ｇ／ｍｌ；Ａｂｃｙｓ、パリ、フランス；１０３００６１）クッションを覆って層とされ、室温において１５分間、３３５×ｇにおいて遠心された。上の方の相が、これら精製された運動神経を含有しており、回収され、Ｌ１５培地を用いて再懸濁され、室温において１０分間、８００×ｇにおいて遠心された。該細胞ペレットが、２％のＢ２７、２ｍＭのＬ−グルタミン、およびペニシリン５０ＵＩ／ｍｌ−ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを用いて補われた神経基礎培地からなっている定められた培養培地中、仕上げに再懸濁された。生存可能な複数の細胞が、トリパンブルー除外テスト（Ｓｉｇｍａ  Ｔ８１５４）を使用しながら、Ｎｅｕｂａｕｅｒ細胞計数機において計数（カウント）され、次いで、複数枚の９６穴プレート（ポリ−ｌ−リジンを用いて予めコーティングされた；Ｎｕｎｃｌｏｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐ５８９９）において３０，０００細胞／穴において入れられ、湿らされた空気（９５％）ＣＯ2（５％）雰囲気中、３７℃において培養された。
【０２３２】
１．２．複数のラット感覚神経細胞培養の調製
複数のラット感覚神経が、Ｈａｌｌら、１９９７年（Ｈａｌｌ  ＡＫ、Ａｉ  Ｘ、Ｈｉｃｋｍａｎ  ＧＥ、ＭａｃＰｈｅｄｒａｎ  ＳＥ、Ｎｄｕａｇｕｂａ  ＣＯ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＣＰ。ラット感覚神経節（ガングリオン）における神経の不均一さの発生。Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７年４月１５日；１７（８）：２７７５〜８４）により記述された方法に従いながら、調製された。端的に、複数の雌ラット（妊娠１５日）が、頸脱臼により屠殺され（Ｒａｔｓ  Ｗｉｓｔａｒ；Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ、フランス）、それらの胎児が、子宮から除かれた。その複数の背根神経節（ＤＲＧ）と共にそれらの脊髄が、除かれ、ペニシリン５０ＵＩ／ｍｌ−ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ（ＰＳ、１％）および牛血清アルブミン（ＢＳＡ１％、Ｓｉｇｍａ  Ａ６００３）を含有しているＬｅｉｂｏｖｉｔｚ氷冷培地（Ｌ１５、Ｆｉｓｈｅｒ  １１４１５−０４９）に入れられた。これらＤＲＧが、回収され、３７℃での２０分間のトリプシン処理により解離され（トリプシンＥＤＴＡ  １０Ｘ、１０％、Ｆｉｓｈｅｒ  １５４０００５４）、カルシウムおよびマグネシウムなく、ＰＢＳ中、稀釈された（Ｆｉｓｈｅｒ  ２００７−０３）。この反応が、ＤＮａｓｅ  Ｉ  グレード  ＩＩ（ＩＩ等級、０．１ｍｇ／ｍｌ  Ｒｏｃｈｅ  診断薬  １０４１５９）および牛胎児血清（ＦＢＳ１０％、Ｆｉｓｈｅｒ  １０２７０−０９８）を含有しているＤｕｌｂｅｃｃｏ修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｆｉｓｈｅｒ  ２１９６９−０３５）の添加により止められた。この細胞懸濁が、１０ｍｌのピペットを用いてすりつぶされ、室温において１０分間、３５０×ｇにおいて遠心された。解離された複数の細胞のペレットが、次いで、定められた培養培地中、再懸濁された。
【０２３３】
生存可能な複数の細胞が、トリパンブルー除外テスト（Ｓｉｇｍａ）を使用しながら、Ｎｅｕｂａｕｅｒ細胞計数機において計数（カウント）され、複数枚の９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）において密度２５，０００細胞／穴において播かれた。複数の穴が、超純粋無菌水（Ｍｅｒｃｋ  Ｅｕｒｏｌａｂ  ６０７５９．０１）中、ポリ−Ｌ−リジン（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ２６３６）を用いて予めコーティングされた。
【０２３４】
複数の細胞が、２時間、接着するようにされ、５％ＣＯ2／９５％空気の雰囲気中、３７℃での湿らされたインキュベーター中、維持された。
【０２３５】
１．３．複数の活性化合物を用いた複数の脊髄運動神経細胞培養のインキュベート
本培養培地が、下記：
コントロール（ビヒクル、０．１％ＤＭＳＯ）
７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ−１０-4Ｍ、１０-5Ｍ、１０-6Ｍ、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、および１０-9Ｍ（０．１％ＤＭＳＯ中）
ＢＤＮＦ  ５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌ（０．１％ＤＭＳＯ中）
の条件を伴いながら、１２時間のインキュベート期間後、定められた培養培地へと変更された。
【０２３６】
インキュベート６時間後、１２時間後、および２４時間後、複数の細胞が、−２０℃においてエタノール／酢酸の溶液（９５％／５％）中、５分間、固定され、ＰＢＳ中、３回、濯がれた。
【０２３７】
１．４．複数の活性化合物を用いた複数の感覚神経細胞培養のインキュベート
本培養培地が、下記：
コントロール（ビヒクル、０．１％ＤＭＳＯ）
７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ−１０-4Ｍ、１０-5Ｍ、１０-6Ｍ、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、および１０-9Ｍ（０．１％ＤＭＳＯ中）
ＮＧＦ  ５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌ（０．１％ＤＭＳＯ中）
の条件を伴いながら、１２時間のインキュベート期間後、定められた培養培地へと変更された。
【０２３８】
７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベート６時間後、１２時間後、および２４時間後、複数の細胞が、−２０℃においてエタノール／酢酸の溶液（９５％／５％）中、５分間、固定され、ＰＢＳ中、３回、濯がれた。
【０２３９】
１．５．神経突起成長解析
複数の運動神経および複数の感覚神経が、インキュベート溶液（ＦＣＳ５％およびサポニン０．１％を有するＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ  Ｓ−７９００）中、１：４００において稀釈されたモノクローナル抗β−チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｔ８６６０）により標識された（ラベルされた）。この抗体が、複数の神経細胞体および複数の神経突起を特異的に標識する（ラベルする）。
【０２４０】
インキュベート２時間後、これら細胞が、ＰＢＳ中、洗浄され、これらβ−チューブリンＩＩＩ抗体を解き明かすようにインキュベート溶液中、１：３００において稀釈されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａ１１００１）を用いてインキュベートされた。
【０２４１】
複数の抗β−チューブリン抗体を用いて標識された（ラベルされた）複数の神経の全長の解析が、Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００  ３．２．Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ソフトウェアを使用しながら、完遂された。
【０２４２】
これら結果が、前記ビヒクルに比べられた、百分率（パーセンテージ、％）で表現された。複数の群の比較が、対とされなかったＴ検定を使用しながら、完遂された。
【０２４３】
２−結果
２．１．複数の運動神経の神経突起長への薬剤処理の効果
複数の細胞伸長の全長の解析が、これらテスト化合物の神経栄養特性のある１指示を与える。
【０２４４】
ａ）インキュベート６時間後
これら結果が、表１３中、示されている。５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌでのＢＤＮＦを用いた処理が、それぞれ、１８０％および１９３％、前記ビヒクルに比べられたら、複数の運動神経により形成された神経突起ネットワークの密度を、有意に増加させた（ｐ＜０．００１）。
【０２４５】
６時間、１０-8Ｍおよび１０-9Ｍの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、それぞれ、前記ビヒクルに比べられた場合、１５０％および１８８％、複数の運動神経の神経突起ネットワーク密度を有意に増加させた（ｐ＜０．００１）。
【０２４６】
ｂ）インキュベート１２時間後
これら結果が、表１４中、示されている。５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦを用いた処理が、それぞれ、１５２％および１７３％、前記ビヒクルに比べられた場合、複数の運動神経により形成された神経突起ネットワークの密度を、有意に増加させた（ｐ＜０．００１）。
【０２４７】
１２時間、１０-4Ｍ〜１０-9Ｍの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、前記ビヒクルに比べられた場合、２２６％〜１３７％、本神経突起ネットワーク密度を有意に増加させた。
【０２４８】
ｃ）インキュベート２４時間後
これら結果が、表１５中、示されている。１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦを用いたインキュベート２４時間が、ビヒクルに比べられた場合、本神経突起ネットワーク密度を有意に増加させた（１７０％、ｐ＜０．０１）。しかしながら、５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦを用いたインキュベートが、本神経突起ネットワーク密度を有意に修飾しなかった。
【０２４９】
２４時間、１０-8Ｍの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、ビヒクルに比べられた場合、１７４％、神経突起ネットワーク密度を増加させた（ｐ＜０．００５）。
【０２５０】
２．２．複数の感覚神経の神経突起長への薬剤処理の効果
ａ）インキュベート６時間後
これら結果が、表１６中、示されている。６時間、５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いた処理が、それぞれ、２７３％（ｐ＜０．００１）および１９１％（ｐ＜０．０１）、前記ビヒクルに比べられたら、複数の感覚神経により形成された神経突起ネットワークの密度を、有意に増加させた。
【０２５１】
６時間、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、および１０-9Ｍの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、それぞれ、１７１％（ｐ＜０．００１）、１７６％（ｐ＜０．００５）、および１４９％（ｐ＜０．０５）、コントロールに比べられた場合、複数の感覚神経の神経突起ネットワーク密度が、増加した。
【０２５２】
ｂ）インキュベート１２時間後
これら結果が、表１７中、示されている。５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いたインキュベートが、それぞれ、２１６％（ｐ＜０．００１）および１２８％（ｐ＜０．０５）、前記ビヒクルに比べられたら、複数の感覚神経により形成された神経突起ネットワークの密度を、有意に増加させた。
【０２５３】
１０-9Ｍおよび１０-7Ｍの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、それぞれ、１４５％（ｐ＜０．００１）および１３４％（ｐ＜０．０５）、前記ビヒクルに比べられた場合、本神経突起ネットワーク密度が、有意に増加した。
【０２５４】
ｃ）インキュベート２４時間後
これら結果が、表１８中、示されている。インキュベート２４時間後、５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いたら、前記ビヒクルに比べられた場合、それぞれ、３０９％および３７１％、複数の感覚神経により形成された神経突起ネットワークの密度が、有意に増加した（ｐ＜０．００１）。
【０２５５】
２４時間、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、および１０-9Ｍの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベート２４時間後、それぞれ、１７３％（ｐ＜０．００５）、１７４％（ｐ＜０．０１）、および１４７％（ｐ＜０．０５）、前記ビヒクルに比べられた場合、本神経突起ネットワーク密度が、増加した。
【０２５６】
【表１３】
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【０２５７】
【表１４】
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【０２５８】
【表１５】
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【０２５９】
【表１６】
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【０２６０】
【表１７】
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【０２６１】
【表１８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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