(57)【要約】本発明は、液体処方物中にソルビトールを含めることによって、凍結融解の間、液体処方物中のタンパク質の凝集を抑制するための方法を提供する。本発明はまた、タンパク質およびソルビトールを含む液体処方物を貯蔵および調製するための方法を提供し、ソルビトールの存在が、凍結および/または融解の間のタンパク質凝集を抑制する。一局面において、本発明は、液体処方物を貯蔵するための方法を提供し、この方法は、該液体処方物を、−１０℃より低い温度へと徐々に凍結する工程を包含し、ここで該液体処方物は、ソルビトールおよびタンパク質を含み、ソルビトールの存在が、凍結の間にタンパク質凝集を抑制する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体処方物を貯蔵するための方法であって、該方法は、該液体処方物を、−１０℃より低い温度へと徐々に凍結する工程を包含し、ここで該液体処方物は、ソルビトールおよびタンパク質を含み、ソルビトールの存在が、凍結の間にタンパク質凝集を抑制する、方法。
【請求項２】
前記温度は、−３０℃未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記温度は、−４０℃未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記温度は、−５０℃未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ソルビトールは、約４．５Ｍ以下の濃度で前記液体処方物中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ソルビトールは、約３００ｍＭ以下の濃度である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記液体処方物はマンニトールを含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記凍結する工程が、約０．５℃/分の速度である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記凍結する工程が、約０．３℃/分の速度である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記凍結する工程が、約０．１℃/分の速度である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質は抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質は、薬学的薬物物質である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は、処理手段（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
液体処方物を調製するための方法であって、該方法は、該液体処方物を、凍結状態から０℃より高い温度へ徐々に融解する工程を包含し、ここで該液体処方物は、タンパク質およびソルビトールを含み、ソルビトールの存在が、融解の間にタンパク質凝集を抑制する、方法。
【請求項１６】
前記温度は、２０℃より高い、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記温度は、３０℃より高い、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ソルビトールは、約４．５Ｍ以下の濃度である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ソルビトールは、約３００ｍＭ以下の濃度である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記液体処方物はマンニトールを含まない、請求項１５、１６、１７、１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記融解する工程が、約０．５℃/分の速度である、請求項１５、１６、１７、１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記融解する工程が、約０．３℃/分の速度である、請求項１５、１６、１７、１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記融解する工程が、約０．１℃/分の速度である、請求項１５、１６、１７、１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質は抗体である、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質は、薬学的薬物物質である、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法は、処理手段である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の方法によって調製された液体処方物において、生物学的に有効な量のタンパク質を含む、組成物。
【請求項２９】
液体処方物中にタンパク質を貯蔵するための方法であって、該方法は：
（ａ）該液体処方物にソルビトールを提供する工程；
（ｂ）該液体処方物を徐々に凍結する工程；および
（ｃ）該液体処方物を凍結状態から徐々に融解する工程；
を包含し、
ソルビトールの存在が、凍結融解の間のタンパク質凝集を抑制する、方法。
【請求項３０】
前記液体処方物がマンニトールを含まない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２９または３０に記載の方法によって、液体処方物に貯蔵された生物学的な有効量のタンパク質を含む組成物。
【請求項３２】
液体処方物を貯蔵するための方法であって、該方法は、−０℃未満の温度まで該液体処方物を徐々に冷却する工程を包含し、該液体処方物は、約５０ｋＤａより大きな分子量を有するタンパク質およびソルビトールを含み、ソルビトールの存在が、冷却の間のタンパク質凝集を抑制する、方法。
【請求項３３】
前記分子量が、１００ｋＤａより大きい、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記分子量が、１５０ｋＤａより大きい、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記温度が−１０℃未満である、請求項３２、３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ソルビトールが、約４．５Ｍ以下の濃度である、請求項３２、３３、３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ソルビトールが、約３００ｍＭ以下の濃度である、請求項３２、３３、３４または３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記液体処方物がマンニトールを含まない、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記冷却する工程が、約０．５℃／分の速度である、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記冷却する工程が、約０．３℃／分の速度である、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記冷却する工程が、約０．１℃／分の速度である、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記タンパク質は抗体である、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記タンパク質は薬学的薬物物質である、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法は処理手段である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４６】
凍結融解の間に液体処方物中の抗体の凝集を抑制するための方法であって、該方法は、該液体処方物中にマンニトールの代わりにソルビトールを使用する工程を包含する、方法。
【請求項４７】
前記ソルビトールは、約４．５Ｍ以下の濃度である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ソルビトールは、約３００ｍＭ以下の濃度である、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
この出願は、２００７年２月１６日に出願された、米国仮特許出願第６０／９０１，８１１号（その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ソルビトールを含むタンパク質処方物を貯蔵および調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
マンニトールは、一般に、タンパク質処方物の安定性および等張性を維持するために、タンパク質処方物において使用されてきた。過去、液体窒素を使用して、貯蔵のためにタンパク質処方物を急速凍結してきた。しかし、液体処方物の大規模な制御されていない凍結へのほぼすべてのアプローチは、制御されない凝固および融解のネガティブ効果を欠点として持っている。相変化の不適切な制御は、凝集、沈降、酸化および変性に起因して、生成物の喪失を生じることが示された。近年の技術は、タンパク質処方物の凍結および融解プロセスを制御するために導入された。しかしながら、これらの技術は、代表的には、非常にゆっくりとした速度で凍結および融解する。結果として、マンニトール含有タンパク質処方物においては、上記のゆっくりとした凍結融解プロセスは、マンニトールを結晶化させてしまい、このことは、続いて、タンパク質凝集を誘導する。
【０００４】
ゆっくりとした凍結融解プロセスの間のマンニトール誘導性のタンパク質凝集を避けるために、既存の方法は、マンニトールをタンパク質処方物から除去し、融解後の操作の間にマンニトールを添加し戻すことを要した。これらの方法は、高価かつさらなる加工時間を必要とする。したがって、マンニトールを含むタンパク質処方物を貯蔵および調製するための改善された方法に対する需要が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、タンパク質処方物を貯蔵および調製するための改善された方法を提供する。具体的には、本発明の方法は、凍結および融解の間にタンパク質凝集を抑制するためにソルビトールを使用する。結果として、本発明は、例えば、薬物生成物の貯蔵および増量（ｆｉｌｌｉｎｇ）操作の間にマンニトールを除去および添加する必要性を排除する。したがって、本発明は、タンパク質処方物の貯蔵および調製に伴うコストおよび加工時間を低減する。
【０００６】
一局面において、本発明は、液体処方物を貯蔵するための方法を提供し、この方法は、−１０℃未満の温度まで液体処方物を徐々に凍結する工程を包含する。この液体処方物は、タンパク質およびソルビトールを含み、ソルビトールの存在が、凍結の間のタンパク質凝集を抑制する。
【０００７】
特に、本発明の方法は、例えば、−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−７０℃または−８０℃未満の温度まで液体処方物を徐々に凍結する工程を包含する。一実施形態において、この温度は、−３０℃以下である。別の実施形態において、この温度は、−４０℃以下である。なお別の実施形態において、この温度は、−５０℃以下である。さらに別の実施形態において、この温度は、−８０℃以下である。
【０００８】
ソルビトールは、任意の濃度で存在し得る。代表的に、このソルビトールは、本発明の液体処方物中に約４．５Ｍ以下の濃度で存在する。一部の実施形態において、このソルビトールは、約３００ｍＭ以下の濃度である。一つの特定の実施形態において、ソルビトールの濃度は、約３００ｍＭである。一部の実施形態において、本発明の液体処方物はマンニトールを含まない。
【０００９】
一部の実施形態において、本発明の方法は、０．６〜０．１℃／分の範囲内の速度（例えば、約０．６、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１℃／分の速度）で液体処方物を徐々に凍結する工程を包含する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、上記液体処方物は、抗体であるタンパク質を含む。特に、上記抗体は、モノクローナル抗体である。他の実施形態において、上記液体処方物は、薬学的薬物物質であるタンパク質を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明の液体処方物を貯蔵するための方法は、処理手段（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）である。
【００１２】
別の局面において、本発明は、液体処方物を調製するための方法を提供し、上記方法は、上記液体処方物を、凍結状態から約０℃より高い温度へ徐々に融解させる工程を包含する。上記液体処方物は、タンパク質およびソルビトールを含み、その結果、ソルビトールの存在は、融解の間にタンパク質凝集を抑制する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、上記液体処方物を、凍結状態から約１０℃、２０℃、２５℃、３０℃またはそれ以上（例えば、３７℃）よりも高い温度へと徐々に融解する工程を包含する。
【００１４】
ソルビトールは、任意の濃度で存在し得る。代表的に、このソルビトールは、本発明の液体処方物中に約０Ｍ〜４．５Ｍの間の濃度で存在する。一部の実施形態において、このソルビトールは、約０Ｍ〜３００ｍＭの間の濃度である。一つの特定の実施形態において、ソルビトールの濃度は、約３００ｍＭである。一部の実施形態において、本発明の液体処方物はマンニトールを含まない。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、上記液体処方物を、０．６℃／分〜０．１℃／分の範囲内、例えば、約０．６℃／分、０．５℃／分、０．４℃／分、０．３℃／分、０．２℃／分、または０．１℃／分の速度で徐々に融解する工程を包含する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、上記液体処方物は、抗体であるタンパク質を含む。特に、上記抗体は、モノクローナル抗体である。他の実施形態において、上記液体処方物は、薬学的薬物物質であるタンパク質を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明の液体処方物を調製するための方法は、処理手段である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明にしたがう液体処方物は、通常は、水溶性処方物である。
【００１９】
本発明は、上記の種々の実施形態に記載されるように、本発明の方法によって調製される液体処方物において生物学的に有効な量のタンパク質を含む組成物をさらに提供する。
【００２０】
なお別の局面において、本発明は、液体処方物中にタンパク質を貯蔵するための方法を提供し、この方法は：（ａ）液体処方物にソルビトールを提供する工程；（ｂ）液体処方物を徐々に凍結する工程；（ｃ）液体処方物を徐々に融解する工程；を包含し、ここで、ソルビトールの存在が、凍結融解の間のタンパク質凝集を抑制する。
【００２１】
ソルビトールは、任意の濃度で存在し得る。代表的に、ソルビトールは、約４．５Ｍ以下の最終濃度に達するように液体処方物に提供される。一部の実施形態において、ソルビトールの最終濃度は、約３００ｍＭ以下である。一つの特定の実施形態において、ソルビトールの最終濃度は、約３００ｍＭである。一部の実施形態において、本発明の液体処方物はマンニトールを含まない。
【００２２】
一部の実施形態において、液体処方物を徐々に凍結または融解する工程は、０．６〜０．１℃／分の範囲内の速度（例えば、約０．６、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１℃／分の速度）である。
【００２３】
本発明はまた、上記の種々の実施形態で記載される本発明の方法によって、液体処方物中に貯蔵された生物学的な有効量のタンパク質を含む組成物を提供する。
【００２４】
なお別の局面において、本発明は、液体処方物を貯蔵するための方法を提供し、−０℃未満の温度まで液体処方物を徐々に冷却する工程を包含する。この液体処方物は、約５０ｋＤａより大きな分子量を有するタンパク質およびソルビトールを含み、ソルビトールの存在が、冷却の間のタンパク質凝集を抑制する。
【００２５】
一部の実施形態において、上記の液体処方物は、約７５ｋＤａ、１００ｋＤａ、１２５ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１７５ｋＤａ、２００ｋＤａ、２２５ｋＤａ、２５０ｋＤａ、２７５ｋＤａまたは３００ｋＤａを超える分子量を有するタンパク質を含む。
【００２６】
一部の実施形態において、本発明のこの局面の方法は、−１０℃〜−８０℃の範囲内または−８０℃未満（例えば、約−１０℃以下、約−２０℃以下、約−３０℃以下、約−４０℃以下、約−５０℃以下、約−６０℃以下、約−７０℃以下または約−８０℃以下）の温度まで、液体処方物を徐々に冷却する工程を包含する。
【００２７】
ソルビトールは、任意の濃度で存在し得る。代表的に、本発明の液体処方物は、約４．５Ｍ以下の濃度でソルビトールを含む。一部の実施形態において、ソルビトールの濃度は、約３００ｍＭ以下である。一つの特定の実施形態において、ソルビトールの濃度は、約３００ｍＭである。一部の実施形態において、本発明の液体処方物はマンニトールを含まない。
【００２８】
一部の実施形態において、本発明のこの局面の方法は、０．６〜０．１℃／分の範囲内の速度（例えば、約０．６、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１℃／分の速度）で液体処方物を徐々に冷却する工程を包含する。
【００２９】
一部の実施形態において、上記の液体処方物は、抗体であるタンパク質を含む。特に、この抗体は、モノクローナル抗体である。他の実施形態において、この液体処方物は、薬学的薬物物質であるタンパク質を含む。
【００３０】
一部の実施形態において、本発明のこの局面の液体処方物を貯蔵するための方法は、処理手段である。
【００３１】
さらなる局面において、本発明は、凍結融解の間に液体処方物中の抗体の凝集を抑制するための方法を提供し、この方法は、液体処方物中にマンニトールの代わりにソルビトールを使用する工程を包含する。
【００３２】
ソルビトールは、任意の濃度で存在し得る。代表的に、本発明の液体処方物は約４．５Ｍ以下の濃度でソルビトールを含む。一部の実施形態において、ソルビトールの濃度は、約３００ｍＭ以下である。一つの特定の実施形態において、ソルビトールの濃度は、約３００ｍＭである。
【００３３】
種々の実施形態で先に記載される本発明は、任意の所定の濃度で可溶化したタンパク質を含む液体処方物を貯蔵および／または調製するために使用され得る。例えば、この液体処方物は、約３５ｍｇ／ｍｌ以下、約４９ｍｇ／ｍｌ以下、約７５ｍｇ／ｍｌ以下、約１００ｍｇ／ｍｌ以下、約１２５ｍｇ／ｍｌ以下、約１５０ｍｇ／ｍｌ以下、約１７５ｍｇ／ｍｌ以下、約２００ｍｇ／ｍｌ以下の濃度でタンパク質を含み得る。他の実施形態において、この液体処方物は、約３５ｍｇ／ｍｌ超、約４９ｍｇ／ｍｌ超、約７５ｍｇ／ｍｌ超、約１００ｍｇ／ｍｌ超、約１２５ｍｇ／ｍｌ超、約１５０ｍｇ／ｍｌ超、約１７５ｍｇ／ｍｌ超または約２００ｍｇ／ｍｌ超の濃度でタンパク質を含み得る。
【００３４】
代表的に、上記の種々の実施形態で記載される本発明において使用される凍結工程または冷却工程は、同時の乾燥プロセス（例えば、凍結乾燥プロセスで使用されるようなもの）によって伴われない。
【００３５】
本願において、「または」の使用は、別段示されなければ、「および／または」を意味する。本開示において使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの用語のバリエーション（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）は、他の付加物、構成成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、成分（ｉｎｔｅｇｅｒ）もしくは工程を排除することを意味しない。本願において使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、等価物として使用される。両方の用語は、関連分野の当業者によって認識される任意の正常の変動を網羅することを意味する。
【００３６】
本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明において明らかになる。しかし、詳細な説明は、本発明の実施形態を示すと同時に、単なる例示によって提供されるに過ぎず、限定によって提供されるのではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の種々の変更および改変は、詳細な説明から当業者に明らかになる。
【００３７】
図面は、例示目的に過ぎず、限定のためではない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、ＣｒｙｏＰｉｌｏｔ（ＣＰ）システムによる各例示的プロセススケールでのサンプル生成物温度追跡を示す。
【図２】図２は、マンニトールが凍結融解サイクルの間に抗体の凝集を誘導することを示す。
【図３】図３は、種々の多価アルコールを含む液体処方物における抗体の凝集を示す。
【図４】図４は、凍結融解の間、ソルビトールが、液体処方物において複数の例示的なタンパク質の凝集を抑制することを示す。
【図５】図５は、ソルビトールを含む処方物中において冷却および加温の間、結晶化が生じなかったことを示した周囲温度以下（ｓｕｂ  ａｍｂｉｅｎｔ）のＤＳＣ走査を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、タンパク質を含む液体処方物を貯蔵および調製するための改善された方法を提供する。特に、本発明は、液体処方物にソルビトールを含めることによって、ゆっくりとした凍結および/または融解プロセスの間、液体処方物中のタンパク質の凝集を抑制または排除するための方法を提供する。
【００４０】
本発明の種々の局面は、以下の小節においてさらに詳細に記載される。小節の使用は、本発明の限定を意味しない。各小節は、本発明のいずれに局面にも当てはまり得る。
【００４１】
（タンパク質処方物）
タンパク質は、水性状態においては比較的不安定であり、化学的および物理的分解を受け、処理および貯蔵の間に生物学的活性の喪失を生じる。凍結融解および凍結乾燥は、貯蔵のためのタンパク質を保存する十分に確立された方法である、タンパク質のコンホメーション、活性および安定性を保存するために、タンパク質処方物は、通常、このことを促進するための薬剤、いわゆる溶解保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）および凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む。凍結保護剤は、凍結誘導性のストレスからタンパク質に対して安定性を提供する薬剤である；しかし、上記用語はまた、例えば、非凍結誘導性プロセスから貯蔵の間にバルク薬物処方物に、安定性を提供する薬剤を含む。溶解保護剤は、おそらく、水素結合を介するタンパク質の適切なコンホメーションを維持することによって、乾燥プロセスの間に上記系から水を除去する間にタンパク質に対する安定性を提供する薬剤である。凍結保護剤はまた、溶解保護効果も有し得る。頻繁に使用される充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の例としては、マンニトール、グリシン、スクロース、ラクトースなどが挙げられる。上記薬剤はまた、上記処方物の等張性に寄与する。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「タンパク質」は、任意の組換えポリペプチドまたは精製ポリペプチドを含み、これらとしては、抗体（例えば、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、および他の抗体改変体）；種々の成長ホルモン；および任意の薬学的薬物物質が挙げられるが、これらに限定されない。本願において言及されるタンパク質は、任意の天然に存在するポリペプチド、改変されたポリペプチド、または合成ポリペプチドを包含する。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「タンパク質処方物」、「液体処方物」、または文法的等価物は、任意の液体ポリペプチド含有組成物を包含する。上記液体ポリペプチド含有組成物は、受容可能な範囲において上記溶液ｐＨを維持する因子を含む「緩衝化剤」をさらに含み得、そして上記の充填剤を含み得、そしてまた、ヒスチジン、ホスフェート、シトレート、トリス、ジエタノールアミンなどを含み得る。上記液体ポリペプチド含有組成物が薬学的組成物である場合、上記液体処方物は、「賦形剤」をさらに含み得る。用語「賦形剤」とは、薬学的に受容可能なキャリア、ならびに生物学的活性の実質的な保持およびタンパク質安定性が維持されるように、貯蔵の間にタンパク質の適切なコンホメーションを提供する溶解保護剤および凍結保護剤を包含する。
【００４４】
（マンニトールは、ゆっくりとした凍結および融解の間にタンパク質凝集を誘導する）
上記で議論されるように、凍結および融解は、長期貯蔵のために、または中間工程として十分に確立された方法である。しかし、液体処方物の大規模凍結に対するほぼすべてのアプローチは、制御されていない凝固および融解というネガティブな効果を欠点として持っている。バッグおよびボトル中での凍結のようなアプローチは、容器内における低温濃縮および不均一な温度プロフィールを生じることが繰り返し示されてきた。相変化の不適切な制御は、凝集、沈澱、酸化および変性に起因して、生成物の喪失を生じることが示されてきた。対照してみると、制御された凍結および融解（ゆっくりとした凍結および融解ともいわれる）は、制御されていない方法に代表的な生成物変性を回避し、費用および時間のかかる洗浄を排除する。さらに、全体的なプロセスは、十分に制御されかつ推定可能な作動から利益を得る。
【００４５】
制御された凍結（またはゆっくりとした凍結）は、代表的には、液体処方物を、所定の速度で貯蔵に適した温度にまで徐々に凍結または冷却する工程を包含する。代表的に、貯蔵に適した温度としては、０℃〜−８０℃または−８０℃未満、好ましくは、−１０℃〜−８０℃の範囲内または−８０℃未満，例えば、約０℃以下、約−１０℃以下、約−２０℃以下、約−３０℃以下、約−４０℃以下、約−５０℃以下、約−６０℃以下、約−７０℃以下または約−８０℃以下の温度が挙げられるが、これらに限定されない。徐々に冷却する工程は、０．６〜０．１℃／分の範囲内の速度（例えば、約０．６、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１℃／分の速度）であり得る。
【００４６】
同様に、制御された融解（ゆっくりとした融解）は、代表的には、液体処方物を、所定の速度で所望の温度まで徐々に融解または加温する工程を包含する。特に、この液体処方物は、凍結状態から融解または加温される。代表的には、融解目的の所望の温度としては、約０℃以上、約１０℃以上、約２０℃以上、または約３０℃以上が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、一つの好ましい温度は、３７℃である。徐々に加温する工程は、０．６〜０．１℃／分の範囲内の速度（例えば、約０．６、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１℃／分の速度）であり得る。
【００４７】
制御された凍結および/または融解は、容器（例えば、チューブ、バッグ、ボトルまたは任意の他の適した容器）中で行われ得る。上記容器は、使い捨てであり得る。制御された凍結および/または融解はまた、大規模で行われてもよいし、小規模で行われてもよい。代表的な大規模生成については、液体処方物は、約１Ｌから３００Ｌ、例えば、１Ｌ、３Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、５０Ｌ１００Ｌ、１２５Ｌ、２５０Ｌまたは３００Ｌのバッチで凍結され得る。代表的な小規模系については、液体処方物は、約１ｍｌから５００ｍｌ、例えば、１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２００ｍｌ、３００ｍｌ、４００ｍｌまたは５００  ｍｌのバッチで凍結され得る。
【００４８】
しかし、マンニトール含有液体処方物において、上記のゆっくりとした凍結および／または融解は、マンニトールを結晶化させてしまい、続いて、このことは、タンパク質凝集を誘導する。本明細書において使用される場合、「タンパク質凝集」は、高分子量（ＨＭＷ）種の形成を意味する。上記高分子量種は、濁度測定によって検出可能な不溶性種およびサイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）、Ｘ線回折（ＸＲＤ）、変調型示差走査熱量測定法（ｍＤＳＣ）および当業者に公知の他の手段によって検出可能な可溶性種の両方を包含する。
【００４９】
複数回の凍結融解サイクルの際のマンニトール含有液体処方物中のＨＭＷ種のパーセンテージは実質的に増加する（実施例の節を参照のこと）ことが認められた。上記処方物中においてマンニトール量の増加はまた、より高いパーセンテージのＨＭＷ種形成を生じる。低下させた処理容積は、大規模（例えば、１２５Ｌ）と比較して、形成されるＨＭＷ種のパーセンテージを維持するようである。
【００５０】
マンニトール含有液体処方物における冷却の間に、発熱事象が認められる。認められたエンタルピー（これは、マンニトールの結晶化および凍結していない水に起因する）は、処理スケールが増大する（凍結および融解の速度が低下するにつれて）か、または上記処方物におけるマンニトールレベルが増大するにつれて増大する。上記マンニトール含有液体処方物において融解する際の結晶化事象もまた、認められる。理論に拘束されることは望まないが、凍結溶液中での上記結晶化事象は、結晶化に起因する相転移が、凍結および融解の際に、タンパク質の凝集を誘導し得ることを示唆する。マンニトールの結晶化は、マンニトールレベルとともに増大し、これは、より高い％ＨＭＷ形成に対応する。より多くのマンニトール結晶化が、小規模のものよりも、大規模プロセスシミュレーションにおいて認められた。このことは、繰り返すと、ＨＭＷ形成のより大きな割合に対応した。上記処方物中のマンニトールを減少させると、一般に、凍結および融解の間の上記液体処方物中のＨＭＷ種形成の減少に好都合である。
【００５１】
（ソルビトールは、タンパク質凝集を抑制する）
マンニトール誘導性のタンパク質の凝集に取り組むため、そして凍結融解の間、タンパク質を安定化させる液体処方物を提供するために、本発明は、マンニトールと他の多価アルコール（すなわち、ガラクチトール、ソルビトール、および式ＣｎＨ２ｎ＋２Ｏｎを有する他の多価アルコールとを比較した。最大溶解度は、立体異性体に依存して、１８０ｍＭ〜４．５ｍＭの範囲に及ぶ。例えば、ガラクチトールの最大溶解度は１８０ｍＭである。マンニトールの最大溶解度は１Ｍである。ソルビトールの最大溶解度は４．５Ｍである。実施例２に記載されるように、本発明は、凝集速度が、より低い溶解度を有する多価アルコールでかなり速いことを発見した。したがって、マンニトールおよび他の可溶性の低い多価アルコールと比較して、液体処方物にソルビトールを使用することは、ゆっくりとした凍結および／または融解プロセスの間にタンパク質の凝集を抑制または阻害する。特に、ソルビトールは、凍結融解の間、タンパク質凝集を抑制するためにマンニトールの代わりに液体処方物に使用され得る。
【００５２】
本明細書において使用される場合、用語「タンパク質凝集を抑制する」、「タンパク質凝集を阻害する」または文法的等価物は、類似だが、ソルビトールの代わりにマンニトールを含む液体処方物中で形成されるＨＭＷ種のパーセンテージと比較して、ソルビトールを含む液体処方物中のＨＭＷ種のパーセンテージの低下を示す。用語「タンパク質凝集を抑制する」または「タンパク質凝集を阻害する」はまた、ＨＭＷ種の形成を排除することを包含する。
【００５３】
ソルビトールは、所定の液体処方物におけるその最大溶解度によって制限される、任意の濃度で存在し得る。代表的に、ソルビトールは、液体処方物中に約４．５Ｍ以下の濃度で存在する。例えば、ソルビトールは、約３００ｍＭ以下の濃度であり得る。好ましくは、ソルビトールの濃度は、約３００ｍＭである。
【００５４】
本発明は、凍結および／または融解プロセスの間、タンパク質の凝集を阻害するために、ソルビトールが種々の液体処方物に使用され得ることを発見した。この液体処方物は、任意の所定の濃度で可溶化したタンパク質を含み得る。例えば、この液体処方物は、約３５ｍｇ／ｍｌ以下、約４９ｍｇ／ｍｌ以下、約７５ｍｇ／ｍｌ以下、約１００ｍｇ／ｍｌ以下、約１２５ｍｇ／ｍｌ以下、約１５０ｍｇ／ｍｌ以下、約１７５ｍｇ／ｍｌ以下、約２００ｍｇ／ｍｌ以下の濃度でタンパク質を含み得る。あるいは、この液体処方物は、約３５ｍｇ／ｍｌ超、約４９ｍｇ／ｍｌ超、約７５ｍｇ／ｍｌ超、約１００ｍｇ／ｍｌ超、約１２５ｍｇ／ｍｌ超、約１５０ｍｇ／ｍｌ超、約１７５ｍｇ／ｍｌ超または約２００ｍｇ／ｍｌ超の濃度でタンパク質を含み得る。
【００５５】
ソルビトールは、先に記載されるかまたは当該分野で公知の任意のタンパク質またはポリペプチドを含む液体処方物に使用され得る。例えば、このタンパク質は、抗体であり得る。特に、この抗体は、モノクローナル抗体または一本鎖抗体または他の抗体改変体であり得る。このタンパク質またはポリペプチドはまた、成長ホルモンまたは薬学的薬物物質であり得る。このタンパク質またはポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、改変されたポリペプチドまたは合成されたポリペプチドであり得る。このタンパク質またはポリペプチドは、小型分子または大型分子であり得る。例えば、このタンパク質またはポリペプチドは、２５ｋＤａ〜３００ｋＤａ以上の範囲内の分子量、例えば、約２５ｋＤａ超、約５０ｋＤａ超、約７５ｋＤａ超、約１００ｋＤａ超、約１２５ｋＤａ超、約１５０ｋＤａ超、約１７５ｋＤａ超、約２００ｋＤａ超、約２２５ｋＤａ超、約２５０ｋＤａ超、約２７５ｋＤａ超または約３００ｋＤａ超の分子量を有し得る。このタンパク質は、モノマー、ダイマーまたはマルチマーであり得る。
【００５６】
したがって、液体処方物にソルビトールを使用することによって、本発明は、顕著なタンパク質の凝集を誘導せずに、この液体処方物をゆっくりと凍結および/または融解することを可能にする。本発明は、薬物物質を含む薬物製品を貯蔵することに特に有用である。例えば、本発明は、薬物物質を安定かつ生物学的に活性にしたまま、薬物製品中の全ての賦形剤が、ゆっくりとした凍結および/または融解プロセスの間に存在することを可能にする。したがって、本発明は、貯蔵の前に薬物処方物からマンニトールを除去し、薬物製品の増量操作の間にマンニトールを添加し戻す必要性を排除する。本発明はまた、薬物製品の増量操作の間にマンニトールを添加することを可能にするために、高濃度まで薬物物質を濃縮すべき必要性も防止する。
【００５７】
したがって、タンパク質およびソルビトールを含む液体処方物は、後の使用のための形態で直接貯蔵され得るか、中間工程（intermediate step）として凍結状態で貯蔵され、使用前に融解され得るか、または、使用前に液体形態または他の形態へ後に再構成するために凍結乾燥形態、空気乾燥形態もしくは噴霧乾燥形態のような乾燥形態に続いて調製され得る。加えて、便利さ、再構成なしでの投与の容易さ、および予め充填された、直ぐに使用できる注射器を供給するか、または処方物が静菌剤と適合性である場合、複数用量調製物として供給する能力を十分に利用する本出願にしたがって、生物学的に活性な量のタンパク質を含む組成物は、その液体形態で直接調製および貯蔵され得る。本出願はまた、先に記載されるように貯蔵および調製された液体処方物中に生物学的に活性な量のタンパク質を含む他の形態の組成物を提供する。
【００５８】
上記の実施形態および以下の実施例は、例示によって提供されるのであって、限定ではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の種々の変化および改変は、本発明の説明から当業者に明らかになる。
【実施例】
【００５９】
（実施例１：マンニトールは、凍結および融解の間に、タンパク質の凝集を誘発させる）
種々の濃度のモノクローナル抗体（この実験において、ＭＡＢ−００１と呼ぶ）、ならびに１０ｍＭ  ヒスチジン、１０ｍＭ  メチオニン、４％  マンニトールおよび０．０００５％  ポリソルベート−８０、ｐＨ６．０を含む処方物を、ＣｒｙｏＰｉｌｏｔ（ＣＰ）システム（Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、複数回凍結および融解した。各凍結および融解プロフィールには、−５５℃への段階的冷却（ｓｔｅｐ−ｄｏｗｎ  ｃｏｏｌｉｎｇ）、および上記溶液を混合する間に３２℃への加温を含めた。
【００６０】
上記ＣＰは、ＣｒｙｏＶｅｓｓｅｌ（Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フルスケール生成ユニットの操作を模倣する。種々のプロセス容積のための上記ＣＰ設定点プロフィールは、ＣｒｙｏＶｅｓｓｅｌの挙動を模倣するために、この研究より前に開発した。図１は、ＣＰシステムを用いた各プロセススケールにおける生成物温度追跡のサンプルを例示する。凍結（または融解）速度は、熱電対が０℃から−４２℃に達する（または０℃から−４２℃）のを時間で割ったものとして定義される。
【００６１】
融解サンプルを、最初にＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＣＥＸ−ＨＰＬＣによって分析して、高分子量種のレベル（％ＨＭＷ）を評価し、酸性種および塩基性種のレベルを追跡した。変調型示差走査熱力測定法（ｍＤＳＣ）およびＸ線回折（ＸＲＤ）も使用して、凍結溶液中のマンニトールの結晶度および同質異像を評価した。
【００６２】
ＭＡＢ−００１は、上記のゆっくりとした凍結融解プロセスの間に、マンニトールの存在下で凝集することが分かった。図２は、凍結融解サイクルの間のＭＡＢ−００１のＨＭＷ種の形成を示す。
【００６３】
実施例２．種々の多価アルコールを含む液体処方物中のモノクローナル抗体の凝集
この実験は、異なる最大溶解度を有する他の多価アルコールとマンニトールを、凍結融解の間の凝集を誘導するそれらの能力に関して比較した。ＭＡＢ−００２と呼ばれるモノクローナル抗体を、種々の濃度でそれぞれマンニトール、ガラクチトールまたはソルビトールを含む、異なる液体処方物に透析した。各処方物はまた、１０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ６．０を含んだ。各液体処方物中のＭＡＢ−００２の最終濃度は、５ｍｇ／ｍｌであった。次に、各処方物を、５つのサイクルの凍結融解に供し、ＨＭＷ種の形成に関してモニタリングした。ＨＭＷ種のパーセンテージの変化を、図３において多価アルコール濃度に対してプロットした。図３に示されるように、１８０ｍＭの最大溶解度を有するガラクチトールは、マンニトールと比較して低濃度かつより速い速度で凝集を誘導したが、４．５Ｍの最大溶解度を有するソルビトールは、マンニトールと比較して顕著には凝集を誘導しなかった。したがって、この実験は、凝集速度が、より低い溶解度を有する多価アルコールではかなり速いことを示す。ソルビトールを含む液体処方物は、凍結融解の間、顕著なタンパク質の凝集を生じなかった。
【００６４】
実施例３．ソルビトールは、複数のタンパク質の凝集を抑制する
４つの異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４およびｍＡｂ５と呼ばれる）、サイトカインおよび融合タンパク質を含む６つの異なるタンパク質を、１０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ６．０および２５０  ｍＭマンニトールまたはソルビトールに透析した。各タンパク質の最終濃度は１ｍｇ／ｍｌであった。次に、処方物を、上記のように５つのサイクルの凍結融解に供し、そしてＨＭＷ種の形成に関してモニタリングした。図４に示されるように、マンニトールを含む処方物は、ソルビトールを含む処方物よりもかなり多くのタンパク質の凝集を生じた。図５に示されるように、周囲温度以下のＤＳＣ走査は、冷却および加温の間、ソルビトールを含む処方物中に結晶化は生じなかったことを示した。言い換えると、ソルビトールは、凍結融解の間、液体処方物中の複数のタンパク質の凝集を抑制した。この実験はまた、ソルビトールの凝集抑制効果が、抗体に限定されないことを示す。
【００６５】
等価物
上記は、本発明の特定の非限定的な実施形態の説明である。当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または慣例的であることを超えない実験を使用して確認することができる。当業者は、この説明に対する種々の変更および改変が、以下の特許請求の範囲において規定される本発明の精神または範囲から逸脱せずになされ得ることを認識する。
【００６６】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」のような冠詞は、反対であることが示されているか、または他に文脈から明らかではない限り、１つまたは１つより多いことを意味し得る。グループの１つ以上のメンバーの間に「または（ｏｒ）」を含む特許請求の範囲または説明は、１つ、１つより多いまたはグループのメンバーの全てが、反対であることが示されているか、または他に文脈から明らかではない限り、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それらに使用されるか、またはその他の方法でそれらに関与する場合に満足されるとみなされる。本発明は、グループの厳密に１つのメンバーが、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それらに使用されるか、またはその他の方法でそれらに関与する実施形態を含む。本発明はまた、１つより多い、または全てのグループのメンバーが、所定の生成物またはプロセスに存在するか、それらに使用されるか、またはその他の方法でそれらに関与する実施形態を含む。さらに、本発明が、１つ以上の請求項または説明の関連する部分に由来する１つ以上の限定、構成要素、条項、記述用語などが、別の請求項に導入される全ての改変、組み合わせおよび並び替えを包含することが理解される。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項が、同一の基礎とする請求項に従属する任意の他の請求項に見出される１つ以上の限定を含むように改変され得る。さらに、特許請求の範囲が組成物を言及する場合、その他のものが示されず、矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかではない限り、本明細書に開示される任意の目的のためにこの組成物を使用する方法が包含され、本明細書に開示される任意の作製方法または当該分野において公知の他の方法にしたがってこの組成物を作製する方法が包含されることが理解される。さらに、本発明は、本明細書に開示される組成物を調製するための任意の方法にしたがって作製された組成物を包含する。
【００６７】
構成要素が、リスト（例えば、マーカッシュグループ様式で）として提示される場合、構成要素の各部分グループ（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）もまた開示され、任意の構成要素がグループから除去され得ることが理解される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が、開放（ｏｐｅｎ）であることが意図され、かつ追加の構成要素または工程の包含を許容することも注意される。一般的に、本発明または本発明の局面が特定の構成要素、特徴、工程などを含むといわれる場合、本発明の特定の実施形態または本発明の局面が、このような構成要素、特徴、工程などから構成されるか、または本質的にそれらから構成されることが理解されるべきである。単純さの目的のために、これらの実施形態は、本明細書においてこの語で（ｉｎ  ｈａｅｃ  ｖｅｒｂａ）具体的に示されていない。したがって、１つ以上の構成要素、特徴、工程などを含む本発明の各実施形態に関して、本発明は、これらの構成要素、特徴、工程などから構成されるか、または本質的にそれらから構成される実施形態も提供する。
【００６８】
範囲が示される場合、終点が包含される。さらに、その他のものが示されないか、または文脈および／または当業者の理解からその他のものが明らかではない限り、範囲として表現される値は、文脈が明らかにその他のものを指さない限り、本発明の種々の実施形態において言及された範囲内の、範囲の下限の単位の１０分の１（ｔｈｅ  ｔｅｎｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｏｗｅｒ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｎｇｅ）までの、任意の具体的な値であるとみなされ得ることが理解される。その他のものが示されないか、または文脈および／または当業者の理解からその他のものが明らかではない限り、範囲として表現される値は、所定の範囲内の任意の部分範囲（ｓｕｂｒａｎｇｅ）とみなされ得ることも理解される（ここで、部分範囲の終点は、範囲の下限の単位の１０分の１と同程度の精度まで表現される）。
【００６９】
加えて、本発明の任意の特定の実施形態が、任意の１つ以上の請求項から明確に排除され得ることが理解される。本発明の組成物および／または方法の任意の実施形態、構成要素、特徴、適用または局面は、任意の１つ以上の請求項から排除され得る。簡潔さの目的のために、１つ以上の構成要素、特徴、目的または局面が排除された全ての実施形態は、本明細書に明確には示されない。
【００７０】
（援用の表示）
本願で引用されるすべての刊行物および特許文献は、各個々の刊行物または特許文献の内容が本明細書に参考として援用されるかのように同程度まで、すべての目的で、それら全体が本明細書に参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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