(57)【要約】  個体がマイコバクテリア抗原：ＣＦＰ−１０、Ｒｖ１９８９ｃ、Ｒｖ３８７３、またはＲｖ３８７８のうちの１つ以上に対するＴ細胞応答を有しているかを決定する工程を含む、個体が活動性マイコバクテリア症を有するように進行するかを検出するための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体が、活動性マイコバクテリア症を有するように進行するかを検出するための方法であって、個体が以下のマイコバクテリア抗原のうちの１つ以上に対するＴ細胞応答を有しているかを決定する工程を含む、方法：
−  ＣＦＰ−１０、
−  Ｒｖ１９８９ｃ、
−  Ｒｖ３８７３、または
−  Ｒｖ３８７８。
【請求項２】
前記個体がマイコバクテリア抗原に対するＴ細胞応答を有しているかを決定する工程が：
−  個体のＴ細胞が前記マイコバクテリア抗原を認識するか、および／または
−  個体に由来する試料中の前記マイコバクテリア抗原に特異的なＴ細胞のレベル
を評価することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個体が、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、Ｒｖ１９８９ｃ、Ｒｖ３８７３、またはＲｖ３８７８のうちの２個、３個、４個、または全てに対するＴ細胞応答を有しているかを決定する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記個体が、ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０に対するＴ細胞応答を有しているかを決定する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記個体のＴ細胞が、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、Ｒｖ１９８９ｃ、Ｒｖ３８７３、またはＲｖ３８７８のＴ細胞エピトープを含むペプチドと接触し；前記ペプチドに対するＴ細胞の応答が評価される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６、またはそれに対して少なくとも７０％相同である前記配列のうちの１つのホモログを含むペプチドのＴ細胞認識を決定する工程を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、Ｒｖ１９８９ｃ、Ｒｖ３８７３、もしくはＲｖ３８７８の断片および／またはホモログのＴ細胞認識を決定する工程を含み、ここでは、前記断片および／またはホモログが、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、Ｒｖ１９８９ｃ、Ｒｖ３８７３、またはＲｖ３８７８のＴ細胞エピトープを認識するＴ細胞によって認識され得る、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔ細胞が個体に由来する試料中に存在し、
−  試験されるペプチドが全て、試料と同時に提供される、および／または
−  ２０種類未満、好ましくは、１０種類未満の様々なペプチドが試料に対して提供される、および／または
−  ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、Ｒｖｌ９８９ｃ、Ｒｖ３８７３、およびＲｖ３８７８のうちの２つ以上に由来する少なくとも１種類または２種類のペプチドが試料に対して提供される、
前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｔ細胞による認識が、Ｔ細胞中でのサイトカインの生産および／またはＴ細胞からのサイトカインの分泌の検出によって測定される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サイトカインの検出がサイトカインに対する抗体を使用することによって行われ、ここでは、前記抗体が状況に応じて固定され、および／またはサイトカインは、状況に応じてＩＦＮ−γまたはＩＬ−２である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試験される前記Ｔ細胞が新しく単離された（培養されていない）Ｔ細胞であるか、または凍結した後のＴ細胞である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
試験されるＴ細胞がインビトロで培養されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
個体が以下のマイコバクテリア抗原のうちの１つ以上に対するＴ細胞応答を有しているかを決定するための手段を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法において使用されるキット：
−  ＣＦＰ−１０、
−  Ｒｖ１９８９ｃ、
−  Ｒｖ３８７３、または
−  Ｒｖ３８７８。
【請求項１４】
ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、Ｒｖ１９８９ｃ、Ｒｖ３８７３、および／またはＲｖ３８７８に由来する１つ以上のペプチドと、状況に応じて、固体支持体上に固定されたＩＦＮ−γまたはＩＬ−２に対する抗体を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
以下の工程を含む方法によってマイコバクテリア症に進行するリスクがある個体を治療するための医薬品の製造におけるマイコバクテリア感染またはマイコバクテリア症の治療薬である薬剤の使用：
−  請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって、個体がマイコバクテリア症へと進行するリスクがあるかを決定する工程、および
−  個体がマイコバクテリア症に進行するリスクがあることが明らかになった場合には、前記個体に対して前記薬剤を投与する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ツベルクリン反応検査（ＴＳＴ）は、これまで、最近結核菌に曝された人における活動性結核（ＴＢ）についての唯一のマーカーであった。ツベルクリンに対するより大きな皮膚試験反応は、活動性結核へのその後の進行の割合の大きさと関係している。しかし、無防備な集団（例えば、低年齢の子供）におけるＴＳＴの予測の信頼性は、低くなる場合がある。皮膚試験の適用にはまた論理的限界：例えば、結果を読み取るために３〜７日後に戻ってくる必要性と、皮膚の硬結の量の記録の主観性である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、特定のマイコバクテリア抗原に対するＴ細胞応答が、活動性マイコバクテリア症に進行するリスクがある個体を特定するために使用できる予測マーカーとなることを示した。この発見を、本発明の予測方法の原理として使用した。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって、本発明により、個体が以下のマイコバクテリア抗原のうちの１つ以上に対するＴ細胞応答を有しているかを決定する工程が含まれる、個体が活動性マイコバクテリア症を有するように進行するかを検出するための方法が提供される：
−  ＣＦＰ−１０、
−  Ｒｖ１９８９ｃ、
−  Ｒｖ３８７３、または
−  Ｒｖ３８７８。
【０００５】
本発明によって、以下の工程を含む方法により、マイコバクテリア症に進行するリスクがある個体を治療するための医薬品の製造における、マイコバクテリア感染またはマイコバクテリア症の治療薬である薬剤の使用も提供される。：
【０００６】
−  上記方法によって、個体がマイコバクテリア症に進行するリスクがあるかを決定する工程、および
−  個体がマイコバクテリア症に進行するリスクがあると見られる場合には、その個体に対して薬剤を投与する工程。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、実施例に記載される実験についてのフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明により、個体が活動性マイコバクテリア症を有するように進行するかを検出する方法が提供される。好ましい実施形態においては、そのようなマイコバクテリア症は、Mycobacterium tuberculosisによって引き起こされる。
【０００９】
個体は通常は哺乳動物であり、好ましくは、ヒトである。個体は、通常は、マイコバクテリア感染のいずれの兆候も有していない個体である。個体は、マントー反応で陽性反応を示す場合も、また陰性反応を示す場合もある。個体は、通常は、社会経済学的理由から、マイコバクテリア感染のリスクがある場合があり、また、遺伝的または後天的にマイコバクテリア感染の素因がある場合もある。
【００１０】
個体は、Mycobacterium tuberculosisに対してすでに曝されているか、または曝されている可能性がある、既知の、あるいは予想される「接触者」である。通常、暴露は、肺結核（例えば、Ａ．Ｆ．Ｂ．（好酸菌）喀痰塗抹陽性である「open」肺結核）に対する暴露である。接触者は、その暴露が家庭内、職場（例えば、医療従事者）、または刑務所（例えば、囚人）である人であり得る。暴露は、ＴＢの罹患率が高い国に滞在することによって生じる場合があり、１つの実施形態においては、予測方法は、ＴＢの罹患率が低い国への出国の後に行われる。したがって、個体は移民である場合がある。
【００１１】
個体（例えば、最近もしくは過去に暴露が明らかであるか、または疑われる人）は、健常者である場合があり、重感染もしくは慢性的な症状を有する場合があり、また、活動性ＴＢを発症するリスク高い人には治療薬が投与されている場合があり、および／または、これによってＴＢ感染を診断することが難しくなっている場合がある。例としては、ＨＩＶに感染した個体、免疫抑制剤（例えば、コルチコステロイド、アザチオプリン、および抗ＴＮＦα薬（例えば、インフリキシマブ）、およびガン治療薬）が投与されている個体、血液透析患者、臓器移植のレシピエント、極めて低年齢の糖尿病の小児（５歳未満、特に、２歳未満）が挙げられる。
【００１２】
本発明の方法は、個体が特定の抗原に対するＴ細胞応答を有しているかを決定することに関する。これは、任意の適切な方法（例えば、抗原に曝されたことのあるＴ細胞の存在を検出するために使用することができる任意の方法）によって決定され得る。１つの実施形態においては、これは、抗原（単数または複数）に特異的なＴ細胞のレベルを測定することによって決定される。これは、個体のＴ細胞が抗原（単数または複数）を認識するかを決定することによって決定することができる。
【００１３】
この方法において抗原を認識するＴ細胞は、一般的には、マイコバクテリウム由来の抗原に対してインビボで予め感作されているＴ細胞である。これらの抗原に曝されたことがあるＴ細胞は、一般的には、マイコバクテリウムに曝されている個体の末梢血の中に、１０６中の１〜１０３中の１の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の頻度で存在する。Ｔ細胞は、ＣＤ４および／またはＣＤ８  Ｔ細胞であり得る。
【００１４】
この方法においては、Ｔ細胞は、抗原とインビトロまたはインビボで、好ましくは、個体に由来する試料中でインビトロで、接触させることができる。
【００１５】
一般的には、この方法において接触するＴ細胞は血液試料の中に個体から採取されるが、Ｔ細胞を含む他のタイプの試料を使用することもできる。試料はアッセイに直接添加される場合も、また最初に処理される場合もある。通常、処理には、試料の（例えば、水、緩衝液、または媒体での）稀釈が含まれ得る。通常、試料は１．５〜１００倍に、例えば、２倍〜５０倍、または５倍〜１０倍に稀釈される。
【００１６】
処理には、試料の複数の成分の分離が含まれる場合がある。通常、単核細胞（ＭＣ）が試料から分離される。ＭＣには、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）が含まれるであろう。したがって、この方法においては、分離されたＭＣの中に存在するＡＰＣはＴ細胞に対してペプチドを提示することができる。別の実施形態においては、Ｔ細胞のみ（例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞だけ）を試料から精製することができる。ＰＢＭＣ、ＭＣ、およびＴ細胞は、当該分野で公知の技術（例えば、Lalvani et al (1997) J. Exp. Med.186, p859-865に記載されている技術）を使用して試料から分離することができる。
【００１７】
好ましくは、アッセイで使用されるＴ細胞は、未処理の試料または稀釈された試料の形態であるか、エキソビボで直接使用される（すなわち、この方法で使用される前に培養されていない）新しく単離されたＴ細胞（例えば、新しく単離されたＭＣまたはＰＢＭＣの形態）であるか、あるいは、融解した細胞（以前に凍結した）である。しかし、Ｔ細胞は、使用の前に、例えば、抗原と、一般的には、さらに外因性の増殖を促進するサイトカインの存在下で培養することができる。培養の間は、抗原は通常、ＡＰＣ（例えば、この方法で使用されるＡＰＣ）の表面上に存在する。Ｔ細胞の前培養により、この方法の感度の増大が誘導される場合がある。したがって、Ｔ細胞は、細胞株（例えば、短期細胞株）に変換することができる（例えば、Ota et al (1990) Nature 346, p183-187に記載されている）。
【００１８】
この方法において通常存在するＡＰＣは、Ｔ細胞と同じ個体に由来する場合、または、異なる個体に由来する場合がある。ＡＰＣは、自然界に存在しているＡＰＣである場合、または、人工のＡＰＣである場合がある。ＡＰＣは、Ｔ細胞に対して抗原を提示することができる細胞である。これは通常は、Ｂ細胞、樹状細胞、またはマクロファージである。これは通常は、Ｔ細胞と同じ試料から分離され、通常は、Ｔ細胞と一緒に精製される。したがって、ＡＰＣは、ＭＣまたはＰＢＭＣの中に存在し得る。ＡＰＣは、通常は、新しく単離されたエキソビボ細胞であるか、または培養細胞である。これは、細胞株（例えば、短期細胞株または不死化細胞株）の形態であり得る。ＡＰＣはその表面上に空のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現し得る。
【００１９】
１つの実施形態においては、抗原は、Ｔ細胞とＡＰＣを含むアッセイに対して直接添加される。上記で議論されたように、そのようなアッセイのＴ細胞とＡＰＣはＭＣの形態であり得る。抗原がＡＰＣによる提示の必要なくＴ細胞によって認識され得る場合には、ＡＰＣは必要ない。ＭＨＣ分に結合したもとの抗原を模倣する類似体が、そのような抗原の一例である。
【００２０】
１つの実施形態においては、抗原は、Ｔ細胞が存在しない条件下でＡＰＣに対して提供される。その後、ＡＰＣがＴ細胞に対して、通常は、その表面上に抗原が存在することが可能にされた後に、提供される。抗原はＡＰＣの内部に取り込まれ、提示される場合があり、また、ＡＰＣの内側に入ることなく単に表面上に取り込まれる場合もある。
【００２１】
通常は、１０５〜１０７、好ましくは、２．５×１０５〜１０６個のＰＢＭＣが個々のアッセイに添加される。ペプチドがアッセイに直接添加される場合には、その濃度は１０−１〜１０３μｇ／ｍｌ、好ましくは、０．５〜５０μｇ／ｍｌまたは１〜１０μｇ／ｍｌである。
【００２２】
通常は、Ｔ細胞が抗原とともにインキュベートされる時間の長さは、エフェクターＴ細胞については４時間〜２４時間（好ましくは、５時間〜１８時間）、またはセントラルメモリー細胞（central memory cell）については２４時間を越えてインキュベートされる。エキソビボでＰＭＢＣを使用する場合には、５．０×１０６個のＰＢＭＣを１０μｇ／ｍｌのペプチドの中で３７℃で５時間インキュベートできることが明らかにされている。
【００２３】
抗原は任意の適切な形態であり得る。抗原には、一般的には、ＣＦＰ−１０、Ｒｖ１９８９ｃ、Ｒｖ３８７３、またはＲｖ３８７８に由来する１つ以上のＴ細胞エピトープが含まれる。したがって、１つの実施形態においては、ＣＦＰ−１０、Ｒｖｌ９８９ｃ、Ｒｖ３８７３、またはＲｖ３８７８の断片であるペプチドが使用されるが、これらのタンパク質のうちのいずれかの完全な形態（配列番号２〜５に示される）が使用されることが好ましい。加えて、ＣＦＰ−１０、Ｒｖｌ９８９ｃ、Ｒｖ３８７３、またはＲｖ３８７８の中のエピトープを認識するＴ細胞によって認識される配列を含むペプチドを使用することができる。そのような配列は、もともとのエピトープ配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％の相同性を有し得る。
【００２４】
本発明で使用されるペプチドは、通常、８〜１０００アミノ酸の長さ、例えば、１０〜５００、１５〜２００、または２０〜１００アミノ酸の長さを有する。
【００２５】
１つの実施形態においては、ＣＦＰ−１０、Ｒｖｌ９８９ｃ、Ｒｖ３８７３、またはＲｖ３８７８のうちの２つ以上に対するＴ細胞応答が、例えば、ペプチドの組み合わせを使用して研究される。この実施形態においては、ＥＳＡＴ−６に対するＴ細胞応答もまた、本発明の予測方法の能力を増大させるために研究され得る。重ねて、使用されるペプチドには、ＥＳＡＴ−６の断片もしくは好ましくは、完全な形態（配列番号１に示される）、および／またはＥＳＡＴ−６の中のエピトープを認識するＴ細胞によって認識される相同配列が含まれ得る。特に好ましい実施形態においては、ＥＳＡＴ−６とＣＦＰ−１０の組み合わせに対するＴ細胞応答が研究される。
【００２６】
抗原は、自然界に存在しているＴ細胞エピトープ配列を認識するＴ細胞によって認識される自然界に存在しているタンパク質の断片（例えば、ペプチド）および／またはホモログであり得る。抗原は、ＭＨＣ分子に結合した自然界に存在しているタンパク質のエピトープを模倣する類似体である場合もある。
【００２７】
サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＴＮＦ−γ）は、通常は、支持体（例えば、プレート、ビーズ）の上に、またはサイトカインを分泌する細胞自体の上に固定することができる特異的な捕捉剤にそれらが結合できるようにすること、その後、通常は第２の結合検出剤との特異的な結合剤／サイトカイン複合体の存在を測定することによって検出することができる。洗浄工程を、捕捉剤に非特異的に結合した材料を除去するために組み込むことができる。
【００２８】
通常は、第２の薬剤は、第１の薬剤が結合する部位とは異なる部位でサイトカインに結合する。第２の薬剤は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）もしくは蛍光標識に直接結合する場合があり、また、第２の薬剤に、酵素もしくは蛍光標識に直接結合したストレプトアビジンを含む第３の薬剤によって検出されるビオチン部分が含まれる場合もある。結合した酵素は、その後、試薬の色を変化させる。薬剤は好ましくは抗体であり、モノクローナルまたはポリクローナルである。サイトカインに対する抗体は市販されており、また、標準的な技術を使用して作成することもできる。
【００２９】
サイトカインを検出するために使用される好ましい方法は、サイトカインを分泌する細胞の頻度を検出するサンドイッチ免疫アッセイ（例えば、比色もしくは蛍光ELISpot）、限界稀釈アッセイ、細胞内サイトカイン染色およびサイトカイン分泌アッセイ（Miltenyi Biotecによって最初に開発されたサイトカインを分泌する細胞の富化を伴うかもしくは伴わない）に基づくであろう。あるいは、分泌されるサイトカインの量は、ＥＬＩＳＡをベースとするシステム、例えば、プレートおよびその改良されたもの（例えば、Cellestisから市販されている）の上に固定された捕捉抗体を用いる全血Quantiferon（登録商標）システム、またはビーズ上に固定された捕捉抗体とともにBeadlyte（登録商標）キットを使用するLuminex（登録商標）懸濁アレイ技術）によって測定することができる。サイトカインｍＲＮＡの発現はまた、ＲＴ−ＰＣＲのようなアッセイを用いて測定することもできる。
【００３０】
１つの実施形態においては、使用される検出システムは、ＷＯ９８／２３９６０に記載されているエキソビボELISpotアッセイである。このアッセイでは、Ｔ細胞から分泌されたＩＦＮ−γが、固体支持体上に固定された第１のＩＦＮ−γ特異的抗体に結合される。次いで、結合したＩＦＮ−γが、検出標識で標識された第２のＩＦＮ−γ特異的抗体を使用して検出される。そのような標識された抗体はＭＡＢＴＥＣＨ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手することができる。使用できる他の検出可能な標識は以下で議論される。
【００３１】
キット
本発明によって、個体がＣＦＰ−１０、Ｒｖ１９８９ｃ、Ｒｖ３８７３、またはＲｖ３８７８のうちのいずれかに対してＴ細胞応答を有しているかを決定するための手段を含む、本発明の方法を実行するためのキットも提供される。通常、認識を検出するための手段は、上記で議論された技術に基づく検出を可能にするか、または支援する。したがって、これらの手段は、認識後にＴ細胞によって分泌されるサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２）の検出を可能にし得る。したがって、キットにはさらに、サイトカインについての特異的な結合剤（例えば、抗体）が含まれる場合がある。この薬剤は通常は固体支持体上に固定される。これは、試薬の結合後に、サイトカインが、それが分泌されたＴ細胞の近くに留まるであろうことを意味する。したがって、サイトカイン／試薬複合体の「スポット」は支持体上に形成され、個々のスポットは、サイトカインを分泌しているＴ細胞を示す。スポットの定量、通常は、対照に対する比較により、サイトカインを分泌する細胞の相対的な数の決定が可能となる。
【００３２】
キットにはまた、サイトカイン／薬剤複合体を検出するための手段も含まれる場合がある。検出可能な変化は、サイトカインの結合の後にその試薬自体において起こる場合があり、例えば、色の変化であり得る。あるいは、検出のために直接または間接的に標識された第２の薬剤は、スポットの決定を可能にするためにサイトカイン／薬剤複合体に結合できるようにされる場合もある。上記で議論されたように、第２の薬剤はサイトカインに特異的であり得るが、第１の薬剤とは異なるサイトカイン上の部位に結合する。
【００３３】
固定された支持体は、細胞を有しているプレート、例えば、マイクロタイタープレートであり得る。したがって、個々のアッセイは、プレートの中の別のウェルにおいて行うことができる。
【００３４】
キットにはさらに、検出工程において使用される、Ｔ細胞のための媒体、検出試薬、または洗浄用緩衝液が含まれる。加えて、キットには、試料からの分離（例えば、試料からのＰＢＭＣまたはＴ細胞の分離）に適している試薬が含まれる場合がある。キットは、試料の構成成分の分離を全く必要とすることなく、試料中のＴ細胞の直接的な検出が可能であるように設計される場合がある。
【００３５】
キットにはまた、対照（例えば、陽性対照または陰性対照）が含まれ得る。陽性対照は、検出システムが試験されることを可能にし得る。したがって、陽性対照は、通常、上記の方法のいずれかにおけるペプチドの認識を模倣する。インビトロで認識を決定するために設計されたキットにおいては、通常は、陽性対照はサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２）である。
【００３６】
キットにはまた、ヒト由来のＴ細胞を含む試料（例えば、血液試料）を採取するための手段も含まれる場合がある。キットには、個体に由来する試料から単核細胞またはＴ細胞を分離するための手段が含まれる場合がある。
【００３７】
治療
上記のように、本発明によって、以下の工程を含む方法によって、マイコバクテリア症に進行するリスクがある個体を治療するための医薬品の製造における、マイコバクテリア感染またはマイコバクテリア症の治療薬である薬剤の使用も提供される：
−  個体が上記方法によりマイコバクテリア症に進行するリスクがあるかを決定する工程、および
−  個体がマイコバクテリア症に進行するリスクがあることが明らかになった場合には、個体に対して上記薬剤を投与する工程。
【００３８】
個体には、マイコバクテリア感染および／またはマイコバクテリア症を治療する薬剤が投与され得る。この薬剤は、自然界に存在している薬剤（例えば、ビタミン（例えば、ビタミンＤ）、ミネラル、または植物由来の生成物）であり得る。薬剤は、予防用または治療用のワクチンである場合もある。薬剤は、通常、イソニアジド、リファンピシン、エタンブトール、ピラジンアミド、ストレプトマイシン、パラ−アミノサリチル酸、カナマイシン、カプレオマイシン、エチオナミド、シクロセリン、チアセタゾン、またはフルオロキノロン（例えば、シプロフロキサシン）である。
【００３９】
個体（治療が必要な個体）には、通常、有効な無毒量の薬剤が投与される。薬剤は薬学的組成物の形態であり得、これには、薬剤と、薬学的に許容される担体または希釈剤が含まれる。適切な担体および希釈剤には、等張性の生理食塩溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）が含まれる。通常、生成物は、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、皮内、経口、鼻内、（肺への）吸入、膣内、または直腸内投与によって投与される。
【００４０】
生成物の用量は、様々なパラメーターにしたがって（特に、特定の薬剤；治療される患者の年齢、体重、および症状；投与経路；ならびに必要なレジュメにしたがって）決定することができる。医師は、任意の特定の患者について必要な投与経路と投与量を決定することができるであろう。しかし、適切な用量は、１０μｇ〜１０ｇまで、例えば、１００μｇ〜１ｇまでの生成物であり得る。
【００４１】
相同性
上記のように、マイコバクテリア配列の相同性を本発明の方法において使用することができる。別のペプチドに対して相同であるペプチドは、通常、例えば、少なくとも８アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば、少なくとも４０、６０、もしくは１００アミノ酸、またはそれ以上の連続するアミノ酸の領域にわたって、あるいはその全長にわたって、そのペプチドに対して少なくとも７０％相同であり、好ましくは、それに対して少なくとも８０または９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％相同である。ホモログは、通常は、例えば、相同性について言及される領域の上記の長さのいずれかにわたって、１個、２個、６個未満、例えば、１２個未満の変異（そのそれぞれは置換（例えば、保存的置換）、欠失、または挿入である）によって、タンパク質あるいはペプチドとは異なる。
【００４２】
タンパク質の相同性を測定する方法は当該分野で周知であり、本発明の状況においては、相同性がアミノ酸の同一性（「硬相同性」と呼ばれる場合がある）に基づいて計算されることは当業者に理解されるであろう。例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅにより、相同性を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムが提供されている（例えば、そのデフォルト設定で使用される）(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395)。
【００４３】
ホモログにおいては、ＭＨＣ分子の結合に寄与しているか、またはＴ細胞受容体による認識に関与しているもともとのタンパク質またはペプチドの中のアミノ酸と等しいアミノ酸は、同じである場合も、また、保存的に置換されている場合もある。保存的置換は以下の表において定義される。第２列の同じブロックの中、好ましくは、第３列の同じ並びにあるアミノ酸は、互いに置換することができる：
［表Ａ］
2010503846.tif 000002
【００４４】
以下の実施例は本発明を説明する。
【実施例１】
【００４５】
実験の参加者
２００２年１０月〜２００４年５月の間にイスタンブールのアジア側にある７つの政府系の結核症の病院のいずれかで喀痰塗抹陽性肺結核と診断された全ての成人に、家庭内に子供がいるかを尋ね、実験に参加するように要請した。４４３人の患者が、１人以上の子供と家庭内での接触があり、全てが参加に同意し、彼らの子供の代わりに書面でのインフォームドコンセントを得た。発症症例が親ではなかった場合は、子供の親または法的な保護者から同意を得た。接触者には、彼らが１６歳以下である場合を含め、活動性結核の既往の症例は除外した。
【００４６】
ＢＣＧワクチン接種についてのTurkish Ministry of Healthの指針は以下である：全ての子供に、２ヶ月〜３ヶ月の間の月齢でBCG Pasteur 1173-P2 (Serum Institute of India Ltd, Pune, India）を皮内にワクチン接種し、追加のワクチンを、６歳〜７歳の年齢で、小学校１年生の間に投与する。トルコでのＢＣＧワクチン接種率についての監視データは、２００４には子供の７９％のワクチン接種率を示している。
【００４７】
臨床評価と治療
喀痰塗抹陽性肺結核の４４３人の発症患者の子供である１，０２４人の接触者全てを、２００２年１０月〜２００４年５月の間にPaediatic Infectious Diseases Clinic, Marmara University School of Medicineで、毎週同じ２週日に、参加させた。全ての病歴、健康診断、およびＢＣＧワクチン接種の瘢痕の文書化は、実験を行う小児科医が行った。人口統計学および社会経済学的情報は、実験を行う看護士が記録した。全ての子供にＴＳＴと胸部Ｘ線撮影を受けさせ、１，０２０人から、ELISpotアッセイのために１０ｍｌの静脈血試料を採取した。
【００４８】
活動性結核を示唆する臨床的特徴またはＸ線写真による所見がある子供を、臨床所見によって示されるようにさらに調べた。活動性結核の最終的な診断がなされた場合には、子供を、６ヶ月間の標準的な短期の化学療法で治療し、１年間追跡調査した。
【００４９】
６ヶ月間のイソナイアジドでの予防的治療を、Turkish Ministry of Healthの指針にしたがって行った。全ての接触者を病院で６ヶ月間追跡調査したが、彼らが結核症と一致する併発症状を発症した場合には、さらなる臨床的評価のためにすぐに戻ってくるように求めた。
【００５０】
抗原
ＣＦＰ１０、Ｒｖ３８７３、およびＲｖ３８７８は全て、Region of Difference 1 (RD1)のゲノムセグメントによってコードされている。Ｒｖ１９８９ｃはＲＤ２の中にコードされている。ＲＤ１とＲＤ２は、M.bovisのＢＣＧワクチンのほとんどの株とほとんどの環境に存在しているマイコバクテリア(environmental mycobacteria)には存在しないが、M.tuberculosisの全ての株の中に存在する。
【００５１】
ツベルクリン反応検査
ＴＳＴを、０．１ｍｌ（２ツベルクリン単位）の精製したタンパク質誘導体（ＰＰＤ）ＲＴ２３(Statens Serum Institut, Copenhagen, Denmark)を使用してMantoux法によって全ての子供に投与した。試験は、ELISpotの結果について盲検とされた実験を行う医師によって行われ、読み取られた。橙皮状皮膚の出現を全ての参加者について記録し、これによりＰＰＤの皮内接種を確認した。硬結（induration）を、４８〜７２時間後に定規で測定した。ＴＳＴ反応は、硬結の直径が、ＢＣＧをワクチン接種していない接触者において≧１０ミリメートルであり、ＢＣＧワクチン接種をした接触者の場合には硬結が≧１５ミリメートルであった場合に、陽性と記録した。ＴＳＴの結果が陰性であった接触者には、６ヵ月後までＴＳＴを繰り返し行った。ＴＳＴの変換は、≧６ｍｍの増大と、ＢＣＧをワクチン接種しなかった場合の≧１０ｍｍである第２回目のＴＳＴによる硬結、およびＢＣＧをワクチン接種した場合の≧１５ｍｍと定義した。
【００５２】
エキソビボでのインターフェロン−γ  ELISpot
１０ｍＬの静脈血試料をELISpotアッセイのために採血した。簡単に説明すると、予めコーティングしたインターフェロン−γ  ELISpotプレート（Mabtech AB, Stockholm, Sweden）に、１ウェルあたり２．５×１０５個の末梢血単核細胞を播種した：２連のウェルには、抗原を含まないもの（陰性対照）、５μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（陽性対照；ICN Biomedical, OH, USA）、２０．８ＩＵ／ｍＬのストレプトキナーゼ−ストレプトドルナーゼ（非ＭＴＢ関連抗原）、さらに、それぞれ以下を含む１９対の２連のウェルを含めた：８．３４μｇ／ｍＬの組み換え体ＥＳＡＴ−６抗原（配列番号１）、８．３４μｇ／ｍＬの組み換え体ＣＦＰ１０抗原（配列番号２）、１６．７μｇ／ｍＬの精製したタンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ならびに、個々のペプチドの最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、ＥＳＡＴ−６もしくはＣＦＰ１０の長さ全体にまたがる９６のそのようなペプチドに由来する５、６、または７の１５マーのペプチド、またはＲｖ３８７３、Ｒｖ３８７８、Ｒｖ３８７９ｃ、およびＲｖ１９８９ｃから選択された領域が取り込まれている１６のペプチドプールのうちの１つ。Ｒｖ３８７３由来の先に記載された非特異的ペプチドは除外した。５％のＣＯ２の中での３７℃で一晩のインキュベーションの後、プレートを予め結合させた検出抗体(Mabtech AB)、続いて発色基質(Moss Inc,Pasadena,MD,USA)で発色させた。ELISpotプレートを、自動ELISpotカウンター(AID-GmbH, Strassberg, Germany)によってOxfordにおいて記録した。強度とスポットの大きさの設定は予め定義し、同じ設定を一貫して使用した。２連のウェルからの読み取り値の平均を、カスタマイズしたソフトウェアプログラムＥＬＩＳＴＡＴ(AID-GmbH, Strassberg, Germany)によって集計紙に電送した。反応は、試験ウェルが陰性対照ウェルの平均よりも少なくとも５個多い平均のスポット形成細胞を含み、加えて、この数が陰性対照ウェルの平均の少なくとも２倍であった場合に陽性と記録した。アッセイを行い、読み取った人には、全ての個々の識別子とＴＳＴ結果を伏せておいた。
【００５３】
上記のような陰性対照と陽性対照を含むエキソビボでのＩＦＮ−γ  ELISpotアッセイを、募集後６ヶ月間繰り返した。しかし、アッセイの繰り返しには、それぞれが、ＥＳＡＴ−６またはＣＦＰ１０の長さ全体にまたがる３５のそのようなペプチドに由来する５または６の１５マーのペプチドが取り込まれている６つのプールのうちの１つを含む、２連のウェルのさらなる６つの対だけを含めた。
【００５４】
発症例の定義
子供の接触者は、病院で２年間の間、６ヶ月ごとに臨床的に追跡調査したが、彼らが併発症状を発症した場合には、さらなる臨床的評価のためにすぐに戻ってくるように求めた。活動性結核の診断は、実験を行う小児科医によって、症状、身体的兆候、放射線による所見と微生物学的所見を考慮して行われた。活動性肺結核と診断された子供は、６ヶ月間の標準的な短期の化学療法で治療した。粟粒結核症と診断された子供は、イソナイアジド、リファマイシン、ストレプトマイシン、およびピラジンアミドで２ヶ月間、続いて、イソナイアジドとリファマイシンでさらに１０ヶ月間治療した。多剤耐性結核症と診断された子供は、抗生物質についての感受性のプロフィールに基づいて第二選択薬で治療した。
【００５５】
統計分析
個々の特定の抗原に反応している接触者の集団の間での相違を、ペアーバイナリー変数(paired binary variable)についてのMcNemar’s試験を使用して比較した。反応している接触者の間での特定の抗原に対するＴ細胞応答の強さは、連続型変数についてのMann-Whitney試験を使用して比較した。相対的リスクと９５％の信頼区間（９５％  ＣＩ）、カイ二乗試験によって計算したＰ値によって評価されるそれらの有意性を使用して、ＴＳＴの変換、ＥＳＡＴ−６／ＣＦＰ１０  ELISpotの変換、および活動性ＴＢ症への進行についてのアッセイ結果の予測値を評価した。全ての分析は、Graphpad Prism 4 for Windows (Version 4.03, GraphPad Software, lnc, CA, USA)とSPSS for Windows (Rel 13.0, SPSS Inc, Chicago, USA)で行った。
【００５６】
結論
予測マーカーは、特異的な結果についてのリスクの様々な程度で患者を特定すること、治療の選択を容易にすることを助けることができる。本発明者らは、喀痰塗抹陽性肺結核の成人の７８９人の子供である家庭での接触者において活動性結核症への進行を予測することにおいて、抗原ｒＥＳＡＴ−６（配列番号１）、ｒＣＦＰ−１０（配列番号２）に対する、およびこれらの抗原の長さ全体にまたがるペプチド（ＥＳＡＴ−６についてはペプチドＥＳ１〜ＥＳ１７、ＣＦＰ−１０についてはペプチドｃｆ１０／１〜ｃｆｐ１０／１８）に対する、ならびに、Ｒｖ３８７３（ＮＥＷ  ＰＯＯＬ  １およびＮＥＷ  ＰＯＯＬ  ３）、ＲＶ３８７８（ＮＥＷ  ＰＯＯＬ  ４およびＮＥＷ  ＰＯＯＬ  ５）、およびＲｖ１９８９ｃ（ＮＥＷ  ＰＯＯＬ  ９、１０、および１１）に由来するペプチドに対する陽性なエキソビボでのＩＦＮ−γ  ELISpot反応の予測値を評価した。ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、Ｒｖ３８７３、またはＲＶ３８７８に対する陽性なELISpot反応は、２年間にわたる活動性結核症への進行の予測であった（表１）。相対的な発症率は、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、Ｒｖ３８７３、およびＲｖ３８７８ペプチドに対してELISpot陽性であった子供の接触者においては類似していた（表１）。ｒＥＳＡＴ−６またはｒＣＦＰ−１０に対してELISpot陽性であった子供は、高い発症率を有していた（表１）。
【００５７】
ＰＰＤ（およそ２００のＭ．ｔｂ抗原の混合物）またはＳＫＳＤ（Ｍ．ｔｂにおいては見られない抗原）に対するELISpot反応は、その後の活動性結核の予測ではなかった（表１）。ELISpotアッセイの特異的な組み合わせにおいて１つ以上の抗原または様々な抗原に由来する複数のペプチドを使用することにより、活動性結核症に進行するリスクがあるより多くの子供を特定した（表２）。注目すべきは、Ｍ．ｔｂ抗原に対する反応者は全て、先に記載されたように、Ｒｖ３８７９ｃ（ＮＥＷ  ＰＯＯＬＳ  ６、７、および８、表３）ならびにＰＰＤ（表１）に対するＴ細胞応答の予測値がないことによって明らかにされるように、活動性結核症に進行する高いリスクを生じるわけではない。マイコバクテリア抗原またはペプチドに対するＴ細胞応答の検出は、活動性結核に進行する可能性が最も高い接触者の特定を改善し、医師が予防的治療の開始の決定のための指針において疾患の進行するリスクを正確に予測することを助ける。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
【表２】
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【００６０】
［表Ｂ］
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上記の表は、ペプチドの組み合わせの使用を示す。重ねて、列は発症例、数、活動性ＴＢを有していない、合計、相対的な罹患率（９５％  ＣＩ）、およびＰ値を示す。
【００６１】
【表３】
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［表Ｃ］
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［表Ｄ］
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［表Ｅ］
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［表Ｆ］
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【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号１は、Mycobacterium tuberculosis抗原ＥＳＡＴ−６のアミノ酸配列である。
配列番号２は、Mycobacterium tuberculosis抗原ＣＰＦ１０のアミノ酸配列である。
配列番号３は、Mycobacterium tuberculosis抗原Ｒｖ１９８９ｃのアミノ酸配列である。
配列番号４は、Mycobacterium tuberculosis抗原Ｒｖ３８７３のアミノ酸配列である。
配列番号５は、Mycobacterium tuberculosis抗原Ｒｖ３８７８のアミノ酸配列である。
配列番号６は、Mycobacterium tuberculosis抗原Ｒｖ３８７９ｃのアミノ酸配列である。
ＥＳ１〜ＥＳ１７は、ＥＳＡＴ−６由来の１７個のペプチドのプールのアミノ酸配列である。
ｃｆｐ１０／１〜ｃｆｐ１０／１８は、ＣＦＰ−１０由来の１８個のペプチドのプールのアミノ酸配列である。
ＮＥＷ  ＰＯＯＬ  １には、Ｒｖ３８７３由来の６個のペプチドのプールのアミノ酸配列を列挙する。
ＮＥＷ  ＰＯＯＬ  ３には、Ｒｖ３８７３由来の６個のペプチドのプールのアミノ酸配列を列挙する。
ＮＥＷ  ＰＯＯＬ  ４には、Ｒｖ３８７８由来の７個のペプチドのプールのアミノ酸配列を列挙する。
ＮＥＷ  ＰＯＯＬ  ５には、Ｒｖ３８７８由来の７個のペプチドのプールのアミノ酸配列を列挙する。
ＮＥＷ  ＰＯＯＬ  ６には、Ｒｖ３８７９ｃ由来の６個のペプチドのプールのアミノ酸配列を列挙する。
ＮＥＷ  ＰＯＯＬ  ７には、Ｒｖ３８７９ｃ由来の６個のペプチドのプールのアミノ酸配列を列挙する。
ＮＥＷ  ＰＯＯＬ  ８には、Ｒｖ３８７９ｃ由来の５個のペプチドのプールのアミノ酸配列を列挙する。
ＮＥＷ  ＰＯＯＬ  ９には、Ｒｖ１９８９ｃ由来の６個のペプチドのプールのアミノ酸配列を列挙する。
ＮＥＷ  ＰＯＯＬ  １０には、Ｒｖ１９８９ｃ由来の６個のペプチドのプールのアミノ酸配列を列挙する。
ＮＥＷ  ＰＯＯＬ  １１には、Ｒｖ１９８９ｃ由来の６個のペプチドのプールのアミノ酸配列を列挙する。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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