(57)【要約】  本発明は特に、生体分子標的がハイブリダイズするプローブのマトリクスであって、複数のプローブをそれぞれ含む多数の測定点２を含む、マトリクスを備えるタイプのバイオチップ１に付着させた生体分子標的の定量測定方法であって、ａ）少なくとも１つのレーザー光線１８を各測定点に集束照射して、そこから標的及び必要に応じてプローブにも存在する定量対象の化学元素を含む閉じ込められたホットプラズマを抽出する、集束照射する工程と、ｂ）プラズマからの輝線を、これらの線の各強度を測定することによって、各測定点に関して検出及び分析する工程と、その後のｃ）定量対象の元素に特異的な線の強度とこの元素の所定の濃度との相関を実証するこれらの線の事前の較正を通じて、標的中の元素又はそれを含む基の各測定点における濃度を求める工程とを含む、方法に関する。【選択図】図６
2010503842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子標的がハイブリダイズするプローブ（４４）のマトリクスであって、複数の該プローブをそれぞれ含む多数の測定点（２）を含む、マトリクスを備えるタイプのバイオチップ（１）に付着させた生体分子標的の定量測定方法であって、
ａ）少なくとも１つのレーザー光線（１０’、１１０、１８、１１８）を各測定点に集束照射して、そこから前記標的及び必要に応じて前記プローブにも存在する定量対象の化学元素を含む閉じ込められたホットプラズマ（Ｐ）を抽出する工程と、
ｂ）前記プラズマからの輝線を、これらの線の各強度を測定することによって、各測定点に関して検出及び分析する工程と、その後の
ｃ）定量対象の前記元素に特異的な線の強度とこの元素の所定の濃度との相関を実証するこれらの線の事前の較正を通じて、前記標的中の前記元素又はそれを含む基の各測定点における濃度を求める工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
工程ｃ）から各測定点（２）における前記元素の原子の数を演繹して、そこから前記標的がハイブリダイズしたプローブ（４４）の数を演繹することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レーザー誘起ブレークダウン分光（ＬＩＢＳ）技法を、工程ａ）〜工程ｃ）の実施に使用することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
レーザー誘起蛍光（ＬＩＦ）技法を、工程ａ）〜工程ｃ）の実施に併用することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
非標識核酸を含む標的を使用することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）及びリボ核酸エーテル（ＥＲＮ）から成る群から選ばれるプローブを使用することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸標的中に存在するリンのみを、工程ｂ）において、リンからの原子輝線及びイオン輝線を前記プラズマ（Ｐ）中で検出するために定量する元素として使用することを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸標的及び核酸も含む前記プローブの両方に存在するリンを、標的とプローブとを区別する事前の工程の後、工程ｂ）において、リンからの原子輝線及びイオン輝線を前記プラズマ（Ｐ）中で検出するために定量する元素として使用することを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
工程ｂ）において、リンからの前記輝線を、１３８ｎｍ±３ｎｍ、１４８ｎｍ±３ｎｍ、１５４ｎｍ±３ｎｍ、１６７ｎｍ±３ｎｍ、１７７ｎｍ±３ｎｍ、１９０ｎｍ±３ｎｍ、１９３ｎｍ±３ｎｍ、２０３ｎｍ±３ｎｍ、２１３ｎｍ±３ｎｍ及び２５３ｎｍ±３ｎｍから成る群から選ばれる値の波長で検出することを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）において、リンからの前記輝線を、２０３ｎｍ±３ｎｍの波長で検出することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ）の前に、各標的を、その大きさを各プローブ（４４）の大きさと実質的に等しくする較正工程で処理して、前記標的のハイブリダイズしていない部分を除去することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記較正工程を、前記バイオチップ（１）を、各測定点（２）上に存在する全ての一本鎖核酸を分解して、プローブ／標的二本鎖のみを保存することが可能なエキソヌクレアーゼ等のヌクレアーゼタイプの酵素で処理することによって実施することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程ａ）で使用する前記レーザー光線又は各レーザー光線（１０’、１１０、１８、１１８）を、周波数１０Ｈｚ〜１００ｋＨｚ、エネルギー１ｍＷ〜１ｋＷの１ｆｓ〜１００ｎｓのパルスにより、赤外−可視−紫外域で放出することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記レーザー光線又は各レーザー光線（１０’、１１０、１８、１１８）の各測定点（２）の表面での出力密度を１ＧＷ／ｃｍ２よりも大きくすることで、気化により、寿命が約２μｓの前記ホットプラズマ（Ｐ）を得ることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１μｍ幅〜５０μｍ幅の表面で各測定点（２）をアブレートする単一のレーザー光線（１１０）を使用し、且つ前記バイオチップ（１）を、１μｍ〜１００μｍのステップでの平面的なわずかな動きにより前記光線に対して相対的に移動させて、全ての前記測定点をスキャンすることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
幾つかのレーザー光線（１０’）を、前記バイオチップ（１）に対して相対的に同時に移動させて、これらの光線により全ての前記測定点（２）をアブレートすることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記光線又は各光線（１０’、１１０、１８、１１８）によって生成する前記プラズマ（Ｐ）を、このプラズマが分析対象の他の測定点（２）に干渉しないように閉じ込め、且つ前記光線又は各光線に対応する前記プラズマからの前記輝線を同時に検出することを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの活性化剤、例えば、アルゴン、ヘリウム、窒素又はこれらのガスの混合物を、前記閉じ込めたプラズマ又は各閉じ込めたプラズマ（Ｐ）に添加することを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の定量測定方法を実施するための装置であって、
生体分子標的がハイブリダイズするプローブ（４４）のマトリクスであって、複数の該プローブをそれぞれ含む多数の測定点（２）を含む、マトリクスを備えるタイプのバイオチップ（１）と、
前記測定点に少なくとも１つのレーザー光線（１０’、１１０、１８、１１８）を集束照射して、そこから前記標的及び必要に応じて前記プローブにも存在するリンのような定量対象の化学元素を含有するホットプラズマ（Ｐ）を抽出するための手段（３及び４）並びにこうして抽出された前記プラズマ又は各プラズマを閉じ込めるための手段を含む、プラズマ生成及び閉じ込めユニットと、
前記プラズマ生成及び閉じ込めユニットと接続し、且つ、前記元素の各測定点における濃度を、定量対象の前記元素に特異的な線の強度とこの元素の所定の濃度との間の相関に基づいて求めるように、各測定点の前記プラズマからの輝線を検出及び分析するのに好適な分光写真ユニット（５）と、
を備えた、装置。
【請求項２０】
前記プローブ（４４）とハイブリダイズする前記標的が非標識核酸を含み、且つ前記プローブが、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）及びリボ核酸エーテル（ＥＲＮ）から成る群から選ばれることを特徴とする、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
各標的の大きさが、各プローブ（４４）の大きさに実質的に等しく、各測定点（２）の全ての標的がハイブリダイズされることを特徴とする、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
抽出された前記プラズマ又は各プラズマ（Ｐ）を閉じ込めるための前記手段が、バイオチップに対して開いた状態で該バイオチップ（１）上に載る筺体（８、１０８）によって区切られたｎ（ｎ≧１）個のプラズマチャンバ（７、１０７）の少なくとも１つの配列（６、１０６）を含み、前記筺体には、それぞれ前記プラズマを形成することが可能な励起レーザー光線（１０’、１１０）を受光することを目的とした励起口（９、１０９）が設けられ、且つこれらのプラズマからの前記輝線を捕捉して前記分光写真ユニット（５）に伝達するための光ファイバー（１１３）が延在しており、プラズマチャンバ（複数可）の前記配列又は各配列が前記バイオチップに対して相対的に移動することを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２３】
前記プラズマ生成ユニットが、複数の励起レーザー光線（１０’）を放出し、且つそれぞれ及び同時に、前記励起口（９）を介して前記プラズマチャンバ（７）の内部にそれらを伝播するための手段（３）を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記励起レーザー光線（１０’）がそれぞれ、各種レーザー源に由来することを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
各プラズマチャンバ（７）の前記励起口（９）が、所定の波長に対応する前記レーザー光線（１０’）を導くことを目的とし、且つその自由端に、この光線を前記バイオチップ（１）へ集束させるのに好適な第１の光学レンズが設けられる、励起光ファイバー（１０）を収容する(receive)ことを特徴とする、請求項２３又は２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記励起レーザー光線（１０’）が、重なり合い且つ互いに０．４ｎｍ〜１ｎｍ離れる幾つかの波長を含む上流光線（２２）を放出する単一のレーザー源、及びこの上流光線を、それぞれ、前記励起レーザー光線の伝搬を目的とした励起光ファイバー（１０）と同数の波長を有する下流光線（２１）に分離するための波長分波器（２０、３０）に由来することを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項２７】
前記プラズマ生成ユニットが、単一の励起レーザー光線（１１０）を放出し、且つそれをガルバノメータヘッド（１１１）によって１つの励起口（１０９）から別の励起口へ移動させることによって、続けて前記プラズマチャンバ（１０７）の内部へ伝播するための手段（１０３）を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の装置。
【請求項２８】
各プラズマチャンバ（７、１０７）が、回転外側面によって区切られ、その上部には前記励起口（９、１０９）の１つが設けられ、この外側面に前記捕捉ファイバー（１３、１１３）を収容する捕捉口（１４、１１４）を有し、且つ該チャンバの下開口部を介して前記バイオチップ（１）のすぐ上方で開いており、対応する前記レーザー光線（１０’、１１０）によってそこから抽出された前記プラズマ（Ｐ）を閉じ込めることを特徴とする、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２９】
各プラズマチャンバ（７、１０７）の前記捕捉光ファイバー（１４、１１４）には、前記チャンバに現れるその自由端に第２の光学レンズ（１３ａ、１１３ａ）が設けられ、且つ前記外側面の内面が、前記捕捉ファイバー（１３、１１３）の方向に前記プラズマ（Ｐ）によって放出される前記光線の反射を最適化することが可能な凹面鏡（１５）が部分的に形成されるように設計されることを特徴とする、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
前記プラズマ生成ユニットがまた、第２の励起レーザー光線（１８、１１８）を放出し、且つ各チャンバの外側面の下部の前記プラズマ（Ｐ）が膨張する高さ又は前記バイオチップ（１）から抽出された前記物質を排斥する高さに作製された少なくとも１つの第２の励起口（１９、１１９）を介して、１つのチャンバ（７、１０７）から別のチャンバへこの光線を導入するための補助手段（４、１０４）を含み、各第２の励起口は、前記捕捉ファイバー（１３、１１３）又は前記凹面鏡（１５）による影響を受けないように計画した位置に作製されることを特徴とする、請求項２８又は２９に記載の装置。
【請求項３１】
請求項２８が請求項２３に記載のものと同様である場合、前記補助放出手段（４）が、前記第２の励起光線（１８）を１つの第２の励起口（１９）から別の第２の励起口へ移動させることが可能なガルバノメータヘッド（１７）を含むことを特徴とする、請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
各第２の励起口（１９）に、前記対応する第２の励起レーザー光線（１８）を前記膨張する高さ又は前記排斥する高さに集束させることが可能な第３の光学レンズが設けられることを特徴とする、請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
請求項２８が請求項２７に記載のものと同様である場合、各プラズマチャンバ（１０７）が、互いに向かい合う第２の励起口（１１９）の対を有し、これらの励起口の対が、チャンバの前記配列（１０６）内で位置合わせされ、この位置合わせを通じて、前記補助放出手段（１０４）によって放出される第２の励起レーザー光線（１１８）を集束照射することを特徴とする、請求項３０に記載の装置。
【請求項３４】
各測定点（２）が、例えば、コバルト、ニッケル又はそれらの酸化物の粒子を含有するポリスチレン製の磁性ビーズ又は常磁性ビーズ（４１ａ、４１ｂ、４１ｃ）を含み、各ビーズは、これらのビーズが前記分光写真ユニット（５）を備える撮像システムによって明瞭に同定することが可能な光学検査対象を形成するように、前記バイオチップ（１）の残部及び他の測定点とは色が異なることを特徴とする、請求項１９〜３３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３５】
前記バイオチップ（１）が、ビーズ（４１ａ、４１ｂ、４１ｃ）と同数の穴（４２）が作製され、且つこれらの穴において、強度０．５Ｔ〜５Ｔの磁場を生成することが可能な磁気ストリップ（４３）の上に載る、例えば、ポリイミド製の遮磁壁を形成するプラスチックシート（４０）を含むことを特徴とする、請求項３４に記載の装置。
【請求項３６】
各ビーズ（４１ａ、４１ｂ）が２つの半球（Ｓ１及びＳ２又はＳ１’及びＳ２’）から構成され、該２つの半球は、前記穴（４２）の１つで互いに結合し、且つ前記磁気ストリップ（４３）側を向いた下半球（Ｓ２又はＳ２’）のみが常磁性であり、前記プローブ（４４）が、着色された上半球（Ｓ１又はＳ１’）の凸面にグラフトされて、前記光学検査対象を形成することを特徴とする、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
各ビーズ（４１ｃ）が、前記光学検査対象の形成を目的とし、且つその凸面上に、前記プローブ（４４）がグラフトされる着色された上半球（Ｓ１’’）、並びに底面を介してこの半球の縁（Ｔ）の下で結合し、前記穴（４２）の内部の前記磁気ストリップ（４３）側にある常磁性の円錐体（Ｓ２’’）から構成されることを特徴とする、請求項３５に記載の装置。
【請求項３８】
各プラズマチャンバ（７、１０７）の前記外側面が、前記バイオチップ（１）に向かって徐々に広がり、高さが２ｍｍ〜１０ｍｍであり、且つ前記バイオチップから５μｍ〜２００μｍの距離が開いている円柱又は円錐であり、前記下開口部の直径が１ｍｍ〜５ｍｍであることを特徴とする、請求項２８〜３７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３９】
各プラズマチャンバ（７、１０７）に、前記励起口（９、１０９）のすぐ近傍の前記外側面上に作製され、且つ前記チャンバから酸素を除くと共に、前記プラズマ（Ｐ）をその形成時に活性化することが可能なアルゴン又はヘリウム等の不活性ガスの導入を目的とした管（１２）を収容する、ガス注入口（１１）がさらに設けられることを特徴とする、請求項２８〜３８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４０】
プラズマチャンバ（７）の前記配列（６）及び前記バイオチップ（１）がそれぞれ、２つの直交軸Ｘ及びＹに沿って移動することができるように載置され、Ｙ軸に沿って前記バイオチップがそれぞれ移動すると、前記配列がＸ軸に沿ってＫだけ移動するようにし、ここで、
Ｋは、２つの隣接するチャンバの各励起ファイバー（１０）間の距離Ｐと、各レーザーパルスでアブレートされた表面のＸ軸に沿った幅ｌとの比Ｐ／ｌによって規定され、この比は、気化後のアブレーションの形状因子によって調節され、且つ
これら２つの励起ファイバー間の距離Ｐは、等式Ｐ＝Ｌ／（Ｎ−１）（但し、Ｎ＞１、Ｌは、前記バイオチップの幅であり、且つＮは、前記配列中の励起ファイバーの数である）によって規定されることを特徴とする、請求項２２〜３９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４１】
２つの隣接する励起ファイバー（１０）間の前記距離Ｐが、前記バイオチップ（１）上の２つの測定点（２）間の複数の前記ステップであることを特徴とする、請求項４０に記載の装置。
【請求項４２】
前記筺体（８、１０８）に、その中での磁場の生成に好適な少なくとも１つのソレノイドを設けて、特に、前記プラズマ又は各プラズマ（Ｐ）の寿命を増加させ、および/または、それらの形状を制御することを特徴とする、請求項２２〜４１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４３】
例えば、前記バイオチップの支持体の導電性物質又は他ではこのバイオチップ支持体が担持する電極から構成される電場を生成するための手段が設けられ、前記電極は前記筺体が担持する別の電極と関連し、電位差を生成することを特徴とする、請求項２２〜４２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４４】
前記筺体（８、１０８）が、幾つかのプラズマチャンバ（７、１０７）の少なくとも１系統の包囲に好適であり、且つ光造形、積層、焼結又はフォトリソグラフィ等の、粉末又は液体ポリマーを使用するレーザー構造化技法又は機械的構造化技法によって形成される、実質的に平行六面体形状であることを特徴とする、請求項２２〜４３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４５】
前記分光写真ユニット（５）が、光電子増倍管タイプの少なくとも１つの分光写真器を含み、且つ所望の波長のみを通す光学フィルタが、各捕捉光ファイバー（１３、１１３）と前記分光写真器との間に配置されることを特徴とする、請求項１９〜４４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４６】
前記バイオチップ（１）を含有する閉鎖筺体から構成される単一のプラズマチャンバ（７’）を含み、少なくともその上面（７ａ’）は、石英製又は励起波長及び捕捉波長を通す任意の他の物質製であり、この閉鎖チャンバが、アルゴン又は窒素等のプラズマ形成性ガスを充填するためのバルブ（Ｖ１）及び空気を排除するためのバルブ（Ｖ２）を備えることを特徴とする、請求項２２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオチップに付着させた生体分子標的の定量測定方法、及びこの方法を実施するための装置に関する。本発明は特に、このバイオチップのプローブ上にハイブリダイズした非標識核酸の定量測定に適用する。
【背景技術】
【０００２】
バイオチップはここ１０年間の分子生物学技法における大革命である。バイオチップにより、数百又は数千もの遺伝子の発現レベルの同時研究が可能になるため、疾患又はストレス（例えば、放射線、汚染又は薬物摂取により生じる）の影響を個体の完全なゲノムのレベルで理解することができる。このため、近代生物学において、これらの技法がますます使用されるようになっている。
【０００３】
バイオチップは、２つの大きな群（マイクロ流体チップ及びプローブマトリクスチップを含む）に分けることができる。プローブマトリクスチップは、「スポット」又は測定点がマトリクス組織となっており、通常、受け手の（passive）支持体上の正確な座標に、生体高分子（例えば、ＤＮＡ、タンパク質又は抗体）から構築された分子プローブを付着させるか又は合成することによって得られる。これらの標的が、プローブの各「スポット」で特異的にハイブリダイズする場合、これらのプローブマトリクスバイオチップにより、生体サンプル中に存在する標的を同定することが可能となる。
【０００４】
一方では、高複雑性バイオチップ（５０００スポット超）が、全ゲノム（pan-genomic）研究用に存在し、他方では、所定のテーマ（例えば、治療試験、生物学的検出器）専用の低複雑性バイオチップ及び中複雑性バイオチップが存在する。
【０００５】
現行のプローブマトリクスバイオチップ技術には、特に、
蛍光標識の立体障害が大きいため、プローブと標的との間の認識の調節が散発的になる結果、多くの不自然な測定結果（measurement artifacts）がもたらされ、実験再現性が低下する、
定量測定でないため、２つの異なる標的間の発現のレベルを比較することができない、並びに
この現行の技術のコストが製造及び実施の両面で高い
といった或る特定数の大きな制限がある。
【０００６】
このことが、特に、
マイクロ流体カードにおける「ＲＴ  ＰＣＲ」技術（「逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応」、すなわち、相補的ＤＮＡへのリボ核酸の逆転写後のポリメラーゼ連鎖増幅）（最大で３８６個の異なる標的を並行して増幅することが可能であると共に、実施が簡単で且つ検出が改善されるが、標的間で真に比較するための定量測定ができない、分析対象の標的の数が制限される（低複雑性バイオチップをはるかに下回る）、及び実施コストが高いという欠点がある）、
大量の標的のハイブリダイゼーション及び化学発光による標識に基づく、「ナイロン」フィルム上のバイオチップ（これも実施が簡単で、検出が改善されるが、それにもかかわらず、定量測定ができない、大きな反応容量を必要とする（低濃度のサンプルの分析を制限する）及び製造コスト及び実施コストが非常に高いという欠点がある）並びに
標識をしないバイオチップという新たなコンセプト（インピーダンスの測定又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による標的の検出に基づき、特に非特許文献１、非特許文献２又は非特許文献３に記載されているが、標的の数を定量することができないため、高密度チップの製造には問題があると共に、インピーダンス測定技法及びＳＰＲ技法のどちらについても、標的の大きさ及び立体配座が多様であるために、不自然な測定結果を伴う）
といったこの技術に対する幾つかの代替案が近年開発されている理由である。
【０００７】
ＩＣＰ（誘導結合プラズマ）分光法も開発されており（非特許文献４又は非特許文献５参照）、これらの方法により、核酸中に含有されるリンを定量的に測定して、例えば、「ＰＮＡ」（ペプチド核酸）バイオチップ上での当該核酸のハイブリダイゼーションの程度を推定することができる。
【０００８】
しかしながら、バイオチップの表面で生成するプラズマを使用してリンを定量的に測定するために質量分析を使用することは、緩徐な方法であり（典型的には、バイオチップ１ｃｍ２当たり数時間かかる）、またそれらの実施に必要な機器が高価であると考えられる。さらに、この「ＩＣＰ」分光技法は、ハイブリダイズするヌクレオチドのおおよその量を示すのみで、生体分子の大きさ及び数を区別することができないため、定量的ではないことに留意されたい。
【０００９】
特許文献１は、標識核酸から形成され、且つプローブマトリクスタイプのバイオチップの表面と結合する多数の標的のリアルタイム定量方法であって、特に、マトリクスの表面での励起用レーザー光線の放出及びこの励起光線に応答したハイブリダイズした標的からの光放出の測定を含む、リアルタイム定量方法を提供する。
【００１０】
この方法の大きな欠点は、それがまた、上記意味において定量的ではないこと、またさらに、標的分子と結合した標識分子の存在が必要となることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０１０５３５４号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】David F. et al., Bioscience Bioelectron. 2005
【非特許文献２】Li C.M. et al., Front Biosci. 2005
【非特許文献３】Macanovic A. et al., Nucleic Acid Research 2004
【非特許文献４】Inchul Yang et al., Analytical Biochemistry (2004), vol. 335, 150-161
【非特許文献５】Heinrich F., Arlinghaus et al., Analytical Chemistry (1997), vol. 69, No.18, 3747-3753
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、生体分子標的がハイブリダイズするプローブのマトリクスであって、複数の当該プローブをそれぞれ含む多数の測定点又は「スポット」を含む、マトリクスを備えるタイプのバイオチップに付着させた生体分子標的の定量測定方法であって、上記欠点の全てが改善される、定量測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この効果のために、本発明による測定方法は、
ａ）少なくとも１つのレーザー光線を各測定点に集束照射して（focused）、そこから上記標的及び必要に応じて上記プローブにも存在する定量対象の化学元素を含む閉じ込められたホットプラズマを抽出する工程と、
ｂ）上記プラズマからの輝線（light emission lines）を、これらの線の各強度を測定することによって、各測定点に関して検出及び分析する工程と、その後の
ｃ）定量対象の上記元素に特異的な線の強度とこの元素の所定の濃度との相関を実証するこれらの線の事前の較正を通じて、上記標的中の上記元素又はそれを含む基の各測定点における濃度を求める工程と、
を含む。
【００１５】
なお、線強度ｙと濃度ｘとの間のこの相関は、有利に線形（すなわち、親和定数内で、等式ｙ＝ａｘ＋ｂに従う比例関係）である。
【００１６】
なお、本発明によるこの方法により、バイオチップの全ての測定点を迅速且つ効率的に「スキャン」（すなわち、１回のスキャンで分析）し、且つ上述の工程ｃ）から、各測定点における上記元素の原子の数を演繹して、そこから、ほんの数分だけで上記標的がハイブリダイズしたプローブの数を演繹することもできる。
【００１７】
なお、バイオチップ上にハイブリダイズした標的を定量するためには、これらの標的の大きさが既知であるか又は較正される必要がある。
【００１８】
本発明の別の特徴によれば、工程ａ）の前に、各標的は、有利には、その大きさを各プローブの大きさと実質的に等しくする較正工程（当業者により標準化とも称される）で処理されて、標的のハイブリダイズしていない部分が除去される。この較正工程は、好ましくは、バイオチップを、各測定点に存在する全ての一本鎖核酸を分解して、プローブ／標的二本鎖のみを保存することが可能なエキソヌクレアーゼ等のヌクレアーゼタイプの酵素で処理することによって実行される。
【００１９】
好ましくは、工程ａ）で使用する上記レーザー光線又は各レーザー光線は、周波数１０Ｈｚ〜１００ｋＨｚ、エネルギー１ｍＷ〜１ｋＷの１ｆｓ〜１００ｎｓのパルスにより、赤外−可視−紫外域で放出される。
【００２０】
さらにより好ましくは、上記レーザー光線又は各レーザー光線は、１０ｎｓと実質的に等しい持続時間のパルスにより、例えば、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（ネオジム添加イットリウムアルミニウムガーネットレーザー）高調波を使用して、波長２６６ｎｍ又は１９３ｎｍの紫外域で放出される。
【００２１】
また好ましくは、小型レーザー及び集束レンズを使用して、上記レーザー光線又は各レーザー光線の各測定点の表面での出力密度を１ＧＷ／ｃｍ２よりも大きくすることで、気化により、寿命が約２μｓのホットプラズマが得られる。
【００２２】
なお、このようにエネルギーの密度が非常に高いと、各測定点の物質の一部が、気化現象によってバイオチップから排出され、この非常に明るいホットプラズマ（寿命は非常に短い）が生成する。プラズマの形態でアブレートされたこの物質は、各種原子成分及びイオン成分へと解離し、各レーザーパルスの最後で、このプラズマは急冷する。この際、励起された原子及びイオンが、より低いエネルギー準位に戻ることにより、それらに特徴的な光線を放出する。
【００２３】
本発明の別の特徴によれば、上記光線又は各光線によって生成するプラズマは、このプラズマが分析対象の他の測定点に干渉しないように閉じ込められ、上記光線又は各光線に対応するプラズマからの輝線が同時に検出される。
【００２４】
有利には、少なくとも１つのプラズマ活性化剤、例えば、アルゴン、ヘリウム、窒素又はこれらの各種ガスの混合物を、上記閉じ込められたプラズマ又は各閉じ込められたプラズマに添加することができる。
【００２５】
また有利には、１μｍ厚（sided）〜５０μｍ厚の表面で各測定点をアブレートする単一のレーザー光線を使用することができ、次いでバイオチップを、１μｍ〜１００μｍのステップでの平面的なわずかな動きにより光線に対して相対的に移動させて、全ての上記測定点をスキャンする。
【００２６】
変形としては、幾つかのレーザー光線を、バイオチップに対して相対的に同時に移動させて、これらの光線により全ての測定点をアブレートすることができる。
【００２７】
本発明の別の特徴によれば、レーザー誘起ブレークダウン分光（ＬＩＢＳ）技法は、有利には、工程ａ）〜工程ｃ）の実施に使用され、レーザー誘起蛍光（ＬＩＦ）技法は、好ましくは、並行してこれらの同一の工程に使用される。
【００２８】
有利には、非標識核酸を含む標的、並びに核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ、特徴的なモチーフの化学式については添付の図４参照）、ロックド核酸（ＬＮＡ）及びリボ核酸エーテル（ribonucleic ethers）（ＥＲＮ、特徴的なモチーフの化学式については添付の図５参照）（ＬＩＢＳ技法では、これらは２５４ｎｍ又は１９４ｎｍの波長を通す）から成る群から選ばれるプローブが使用される。
【００２９】
なお、エキソヌクレアーゼによる酵素消化に対して耐性であるこれらの分子により、消化中に、プローブとハイブリダイズする核酸標的の一部を保護することができる。したがって、消化後、ハイブリダイズされる核酸標的は全て操作者にとって既知であり、プローブのものと等価である。
【００３０】
なお、本発明による定量測定方法はまた、核酸（抗体認識用のアンカー及びビーコンとして機能する核酸配列）とカップリングした抗体を使用するタンパク質の研究に適用してもよい。
【００３１】
有利には、これらの核酸標的中に専ら存在するリンは、工程ｂ）において、リンからの原子輝線及びイオン輝線をプラズマ中で検出するために定量する元素として使用する。変形としては、標的とプローブとを区別する事前の工程の後、この検出のために、核酸標的とプローブの両方に存在するリン（この場合、核酸（したがってリン酸）も含む）を使用することができる。
【００３２】
また有利には、工程ｂ）において、リンからの輝線は、１３８ｎｍ±３ｎｍ、１４８ｎｍ±３ｎｍ、１５４ｎｍ±３ｎｍ、１６７ｎｍ±３ｎｍ、１７７ｎｍ±３ｎｍ、１９０ｎｍ±３ｎｍ、１９３ｎｍ±３ｎｍ、２０３ｎｍ±３ｎｍ、２１３ｎｍ±３ｎｍ及び２５３ｎｍ±３ｎｍから成る群から選ばれる値の波長で検出される。
【００３３】
さらにより有利には、工程ｂ）において、リンからの輝線は、２０３ｎｍ±３ｎｍの波長で検出される。
【００３４】
なお、プローブ及び標的（共に核酸から形成される）の使用により、測定されるリンの量が増加することで、検出の感度を増加させることができる。しかしながら、或る特定の構成において、特に標的の濃度が非常に低い場合には、ＰＮＡプローブを使用することが有利であり得る。これは、ＰＮＡの核酸に対する親和性が非常に高いために、分析する媒体中に存在する全てのオリゴヌクレオチド標的をトラップすることができるためである。
【００３５】
さらに、ＰＮＡは、そのＣＯＯＨ末端又はＮＨ末端を介して自発的に金の表面と結合することが可能であるため、これらのＰＮＡ分子は、数ミクロン厚の金の層でコーティングを施したプラスチックのバイオチップ支持体（例えば、「カプトン」ポリイミド製）上でのプローブの付着に特に有利である。
【００３６】
ＰＮＡがリンを含有しない、より包括的には２５３ｎｍ、１９４ｎｍ又は２０３ｎｍに独特な輝線を有する原子を有しないという事実から、不可欠な場合、一本鎖を分解するための上述の較正工程を用いずに、ハイブリダイゼーション後そのままオリゴヌクレオチド標的の定量を実行することが可能となる。しかしながら、本発明による測定が絶対的に定量的であるためには、この標的の較正を実行する必要がある。
【００３７】
しかしながら、本発明による方法は、リン以外のプラズマ中に検出される化学元素、例えばヨウ素に適用することができることに留意されたい（この例は限定を意味するものではない）。
【００３８】
検出限界を改善するために、有利には：
（ｉ）ダブルパルスＬＩＢＳタイプのダブルレーザーパルスを行うことによって、ＬＩＢＳ技法を実施すること、及び／又は
（ｉｉ）このＬＩＢＳ技法をＬＩＦ技法と併用すること（すなわち、ＬＩＢＳとＬＩＦとの組合せ）
が可能である。
【００３９】
これら２つの好ましい方法（ｉ）及び（ｉｉ）の一方及び／又は他方により、特に、リンからの輝線をより長く維持し、増幅することが可能となり、より良好なＳＮ比を得ることを通じて、リン、したがってそれが由来する核酸の検出閾値を少なくとも１０分の１に低減させることが結果的に可能となる。
【００４０】
具体的にこのダブルレーザーパルス法（ｉ）に関しては、第２のパルス用の別の角度及び別の光線（出力、周波数、波長）を用いて実行することができるが、第１のパルスと同一の角度及び／又は同一の性質のレーザー光線を用いて実行することもできる。実際、プラズマの寿命が約２μｓであれば、プラズマは、その形成後（黒体放射の終了並びに原子線及びイオン線の発生が考えられる）約１００ｎｓから光学的に分析可能である。
【００４１】
この第２のレーザーパルスは、その消滅直前に、プラズマの寿命を引き伸ばし、放出された放出を増幅することができる。標的原子（複数可）が強い吸収又は放出を有する波長、すなわち、その原子に特徴的な波長が有利には選択される。
【００４２】
例えば、本発明の方法で定量する化学元素がリンの場合、第２の励起は、２５４ｎｍ、１９３ｎｍ、１５３ｎｍ又は２０３ｎｍで実行することができ、検出は、これら同一の波長で観察して実行することができる（１９３ｎｍの放射及び１５３ｎｍの放射の空気による相当量の吸収は、これらの波長でのプラズマの蛍光を大幅に低減させる可能性がある）。
【００４３】
したがって、標的とするイオン及び／又は原子（適例はリン）からの光の放射を、それらの特異的な蛍光をこの第２のレーザーパルスで励起させることによって、増加させることが可能である。
【００４４】
本発明による方法の別の特徴によれば、バイオチップの物質のアブレーション及びプラズマの形成は脱共役することができる。この場合、第１のレーザーパルスは、バイオチップの表面の一部をアブレートし、それをバイオチップの上方に排出した後、第２のパルスが有利には、周波数１００Ｈｚ〜１００ｋＨｚのフェムト秒タイプのレーザーを使用して、プラズマを形成し、その構成成分の特徴的な放出をもたらす。必要に応じて、第３のパルスを引き続いて使用して、標的とする化合物の蛍光を励起してもよい。
【００４５】
したがって、本発明による方法によって、特に、プラズマを放出した後の核酸分子を構成するリン原子の蛍光に基づいて、核酸を標識することなく、効率的且つ迅速に核酸を検出することが可能となる。これらの核酸分子を真に定量的に測定するためには、それぞれの大きさを標準化して、上述した標的の較正を必ず実行する。
【００４６】
上記で規定した定量測定方法を実施するための本発明による装置は、
生体分子標的がハイブリダイズするプローブのマトリクスであって、複数の当該プローブをそれぞれ含む多数の測定点又は「スポット」を含む、マトリクスを備えるタイプのバイオチップと、
測定点に少なくとも１つのレーザー光線を集束照射して、そこから上記標的及び必要に応じて上記プローブにも存在するリン等の定量対象の化学元素を含有するホットプラズマを抽出するための手段、並びにこうして抽出された上記プラズマ又は各プラズマを閉じ込める手段を含む、プラズマ生成及び閉じ込めユニットと、
上記プラズマ生成ユニットと接続し、且つ、上記元素の各測定点における濃度を、定量対象の上記元素に特異的な線の強度とこの元素の所定の濃度との間の相関に基づいて求めるように、各測定点のプラズマからの輝線を検出及び分析するのに好適な分光写真ユニットと、
を含む。
【００４７】
有利には、これらのプローブとハイブリダイズする標的は、非標識核酸を含み、上記プローブは、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）及びリボ核酸エーテル（ＥＲＮ）から成る群から選ばれる。
【００４８】
本発明の別の特徴によれば、各標的の大きさは、有利には上述の較正工程後の各プローブの大きさと実質的に等しく、この場合、各測定点の全ての標的がハイブリダイズされる。
【００４９】
上記のように、バイオチップの表面で逐次生成するプラズマの光学分析により、リン原子の量、したがってハイブリダイズした標的を形成する核酸内のヌクレオチドの量の各測定点での画像を再構成することができる。したがって、そこからバイオチップの各点又は「スポット」のハイブリダイゼーションの程度を演繹することが可能である。
【００５０】
なお、各「スポット」上にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの数の絶対的な定量を実行するためには、バイオチップを構成する物質がリンを含有しないことが不可欠である。本出願人は、ポリイミド（例えば、「カプトン」）又は金の層でコーティングを施したこのポリイミドから構成されるバイオチップ支持体が中性で、１３５ｎｍ〜２６６ｎｍの放出波長でのＬＩＢＳ技法による測定の実行に特に好適であることを実証した。より包括的には、リンを含有せず（例えば、プラスチック、ガラス、シリカ等）且つ生体物質と親和性のある全てのタイプの物質が本発明によるバイオチップの製造に好適であり得る。
【００５１】
各測定点で生成するプラズマからの輝線は、例えば、１つ又は複数の光捕捉ファイバー（その自由端は、プラズマから０．５ｍｍ〜１０ｍｍの距離にある）によって捕獲され得る。その開口数の大きさから、上記捕捉ファイバー又は各捕捉ファイバーは、プラズマにより放出される放射線を正確に入射する（injecting）ための適切なレンズ（ファイバーコリメータ）の組でキャップされる。
【００５２】
したがって、本発明によるこの装置により、有利には、微小移動テーブル（２つの直交方向Ｘ及びＹに沿っての微小移動）上に位置したバイオチップの表面を分析することができる。テーブルを移動させると、例えば、レーザーの各パルスでアブレートしたエリアに対応する１０μｍのステップで、上記レーザー光線又は各レーザー光線によって分析対象の表面全体をスキャンすることができる。
【００５３】
バイオチップの表面で逐次生成するプラズマの光学分析により、ヌクレオチドの量に比例する各測定点でのリン原子の量の画像を再構成することができる。したがって、そこからバイオチップ上の各測定点（「スポット」）でのハイブリダイゼーションの程度を演繹することができる。
【００５４】
なお、各スポット上にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの数の絶対的な定量を実行するためには、バイオチップを構成する物質が全くリンを含有しないことが不可欠である。
【００５５】
本発明の別の特徴によれば、抽出された上記プラズマ又は各プラズマを閉じ込めるための上記手段は、バイオチップに対して開いた状態でバイオチップ上に載る筺体によって区切られたｎ（ｎ≧１）個のプラズマチャンバの少なくとも１つの配列（arrangement）を含み、上記筺体には、それぞれ上記プラズマを形成することが可能な励起レーザー光線を受光することを目的とした励起口が設けられ、且つこれらのプラズマからの各輝線を捕捉して分光写真ユニットに伝達するための光ファイバーが延在しており、プラズマチャンバ（複数可）の上記配列又は各配列がバイオチップに対して相対的に移動する。
【００５６】
このチャンバ又はこれらのチャンバにより、生成するプラズマを閉じ込めることができ、幾つかのチャンバがある場合、これらの各種プラズマによって放出される光の間の干渉がない。上記筺体に関しては、例えば、実質的に平行六面体（parallelepipedal）形状である可能性があり、これは、プラズマチャンバ又は幾つかのプラズマチャンバの少なくとも１つの系統を包囲するのに好適であると共に、粉末又は液体ポリマーを使用する機械的構造化技法又はレーザー構造化技法、例えば、光造形、積層、焼結若しくはフォトリソグラフィ、又は他では成型によって形成される。
【００５７】
変形としては、プラズマチャンバ（複数可）を、少なくとも上面が石英製又は励起波長及び捕捉波長を通す任意の他の物質製の、バイオチップを含有する単一の閉鎖チャンバ（この閉鎖チャンバは、アルゴン／窒素等のプラズマ形成性（plasmagenic）ガスを充填するためのバルブ及び空気を排除するためのバルブを備える）で置き換えてもよい。
【００５８】
本発明の第１の実施の形態によれば、上記プラズマ生成ユニットは、複数の励起レーザー光線を放出し、且つそれぞれ及び同時に、上記励起口を介してプラズマチャンバの内部にそれらを伝播するための手段を含む。
【００５９】
この第１の実施の形態に関する第１の例によれば、これらの励起レーザー光線はそれぞれ、各種レーザー源に由来し得る。この場合、本発明による各プラズマチャンバの上記励起口は、所定の波長に対応するレーザー光線を導くことを目的とし、且つその自由端に、この光線をバイオチップへ集束させるのに好適な第１の光学レンズが設けられる、励起光ファイバーを収容する。
【００６０】
この第１の実施の形態に関する第２の例によれば、これらの励起レーザー光線は、
重なり合い、且つ互いに好ましくは０．４ｎｍ〜１ｎｍ離れる幾つかの波長で上流光線を放出する単一のレーザー源と、
上流光線を、それぞれ、励起レーザー光線の伝搬を目的とした励起光ファイバーと同数の波長を有する下流光線に分離するための波長分波器と、
に由来し得る。
【００６１】
本発明の第２の実施の形態によれば、上記プラズマ生成ユニットは、単一の励起レーザー光線を放出し、且つそれをガルバノメータヘッドによって１つの励起口から別の励起口へ移動させることによって、続けて上記プラズマチャンバの内部へ伝播するための手段を含む。
【００６２】
本発明の上記第１の実施の形態及び第２の実施の形態によれば、各プラズマチャンバは、回転外側面によって区切られ、その上部には上記励起口の１つが設けられ、この外側面に上記捕捉ファイバーを収容する捕捉口を有し、且つ当該チャンバの下開口部を介してバイオチップのすぐ上方で開いており、前記対応するレーザー光線によってそこから抽出されたプラズマを閉じ込める。
【００６３】
好ましくは、各プラズマチャンバの上記外側面が、バイオチップに向かって徐々に広がり、高さが２ｍｍ〜１０ｍｍであり、且つ上記バイオチップから５μｍ〜２００μｍの距離が開いている円柱又は円錐であり、上記下開口部の直径が１ｍｍ〜５ｍｍである。
【００６４】
本発明の別の有利な特徴によれば、プラズマチャンバの上記配列及び上記バイオチップをそれぞれ、２つの直交軸Ｘ及びＹに沿って移動可能に載置することができ、Ｙ軸に沿ってバイオチップがそれぞれ移動すると、上記配列がＸ軸に沿ってＫだけ移動するようにし、ここで、
Ｋは、２つの隣接するチャンバの各励起ファイバー間の距離Ｐと、各レーザーパルスでアブレートされた表面のＸ軸に沿った幅ｌとの比Ｐ／ｌによって規定され、この比は、気化後のアブレーションの形状因子によって調節され、且つ
これら２つの励起ファイバー間の距離Ｐは、等式Ｐ＝Ｌ／（Ｎ−１）（但し、Ｎ＞１、Ｌは、バイオチップの幅であり、且つＮは、上記配列中の励起ファイバーの数である）によって規定される。
【００６５】
同じく有利には、２つの隣接する励起ファイバー間の距離Ｐは、バイオチップ上の２つの測定点間の複数のステップである。
【００６６】
本発明の別の特徴によれば、上記筺体に、その中での磁場の生成に好適な少なくとも１つのソレノイドを設けて、上記プラズマ又は各プラズマの寿命を増加させ、且つ／又はそれらの形状、及び種々の荷電粒子の選択も制御することができる。
【００６７】
この磁場の他、例えば、バイオチップの支持体として、導電性物質又は他では電極（上記筺体が担持する別の電極と関連し、電位差を生成する）を担持する支持体を使用することができる手段によって電場を生成することも可能である。
【００６８】
好ましくは、各プラズマチャンバの捕捉光ファイバーには、チャンバ内に現れるその自由端に第２の光学レンズが設けられ、上記外側面の内面は、上記捕捉ファイバーの方向にプラズマが放出する光線の反射を最適化することが可能な凹面鏡を部分的に形成するように設計される。
【００６９】
本発明の別の優先的な特徴によれば、上記分光写真ユニットは、光電子増倍管タイプの少なくとも１つの分光写真器を含む。しかしながら、分光光度計、ＣＣＤ（電荷結合素子）若しくはインテンシファイドＣＣＤタイプのカメラ又は他ではマイクロチャネルの「ウエハ」もプラズマからの輝線の検出に使用することができることに留意されたい。
【００７０】
また優先的に、所望の波長のみを通す光学フィルタを、各捕捉光ファイバーと分光写真器との間に配置することができる。
【００７１】
また有利には、上記プラズマ生成ユニットはまた、第２の励起レーザー光線を放出し、且つ各チャンバの外側面の下部の、プラズマが膨張する高さ又はバイオチップから抽出された物質を排斥する高さに作製された少なくとも１つの第２の励起口を介して、１つのチャンバから別のチャンバへこの光線を導入するための補助手段も含んでもよく、各第２の励起口は、捕捉ファイバー又は上記凹面鏡による影響を受けないように計画した位置に作製される。
【００７２】
本発明の上記第１の実施の形態に関連して、上記補助放出手段は、有利には、上記第２の励起光線を１つの第２の励起口から別の第２の励起口へ移動させることが可能なガルバノメータヘッドを含むことができ、この場合、各第２の励起口には、対応する第２の励起レーザー光線を上記膨張する高さ又は排斥する高さに集束させることが可能な第３の光学レンズを設けてもよい。
【００７３】
変形として、また本発明の上記第２の実施の形態に関連して、各プラズマチャンバは、有利には互いに向かい合う第２の励起口の対を有することができ、これらの励起口の対は、チャンバの上記配列内で位置合わせされ、この位置合わせを通じて、上記補助放出手段によって放出される第２の励起レーザー光線を集束照射する。
【００７４】
本発明の上述した上記第１の実施の形態及び第２の実施の形態に共通する本発明の別の特徴によれば、各プラズマチャンバには、上記励起口のすぐ近傍の上記外側面上に作製され、且つ上記チャンバから酸素を除くと共に、プラズマをその形成時に活性化することが可能なアルゴン又はヘリウム等の不活性ガスの導入を目的とした管を収容する、ガス注入口も設けられ得る。この手順は、例えば、減圧下で実行することができる。
【００７５】
本発明の好ましい例示的な実施の形態によれば、各測定点は、例えば、コバルト、ニッケル又はそれらの酸化物の粒子を含有するポリスチレン製の磁性ビーズ又は常磁性ビーズを含んでもよく、各ビーズは、これらのビーズが上記分光写真ユニットを備える撮像システムによって明瞭に同定することが可能な光学検査対象を形成するように、バイオチップの残部及び他の測定点とは色が異なる。
【００７６】
本発明によるこの優先的な例の別の特徴によれば、バイオチップは、ビーズと同数の穴が作製され、且つこれらの穴において、強度０．５Ｔ〜５Ｔの磁場を生成することが可能な磁気ストリップの上に載る、例えば、ポリイミド（例えば、「カプトン」）製の遮磁壁を形成するプラスチックシートを含んでもよい。
【００７７】
本発明の例示的な一実施の形態によれば、各ビーズは、２つの半球から構成され、当該２つの半球は、上記穴の１つで互いに結合し、且つ上記磁気ストリップ側を向いた下半球のみが常磁性であり、上記プローブは、着色された上半球の凸面にグラフトされて、上述の光学検査対象のうちの１つを形成する。
【００７８】
変形としては、各ビーズは、上記光学検査対象の形成を目的とし、且つその凸面上に、上記プローブがグラフトされる着色された上半球、並びに底面を介してこの半球の縁の下で結合し、上記穴の内部の上記磁気ストリップ側にある常磁性の円錐体から構成してもよい。
【００７９】
なお、（バイオチップの表面と平行な）ビーズの中央水平面に対して非対称な上記（the latter）ビーズの形状により、有利には本発明による方法の収率を向上させることができる。
【００８０】
上述した本発明の特徴その他も、非限定的な例示を用いた本発明の幾つかの例示的な実施の形態に関する下記の記述を読むことでより理解されよう。当該記述は、添付の図面に関連して示される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】様々なオリゴヌクレオチド濃度を特徴とする標的サンプル（「ＯＬＩＧＯｓサンプル」と略称する）に関する、本発明の方法によって得られたプラズマ中のリン由来の輝線を示す画像である。
【図２】これらの輝線の強度と試験した濃度又は希釈率との間で測定した比例関係（定数内）を示すグラフである。
【図３】これらの輝線の強度と試験した濃度又は希釈率との間で測定した比例関係（定数内）を示すグラフである。
【図４】本発明によるプローブマトリクスバイオチップ上のプローブとして使用することができるＰＮＡの化学式の特徴的な配列を示す図である。
【図５】本発明によるプローブマトリクスバイオチップ上のプローブとして使用することができるＥＲＮの化学式の特徴的な配列を示す図である。
【図６】本発明の第１の実施形態による定量測定装置の部分概略斜視図である。
【図７】図６の装置に含まれるプラズマチャンバの配列とバイオチップとの間隔を示す概略側面図である。
【図８】図６の装置の配列に含まれるプラズマチャンバの概略斜視図である。
【図９】図８のプラズマチャンバの上部からの図である。
【図１０】図８のチャンバにおける時刻ｔでのプラズマの形成を示す概略斜視図である。
【図１１】図８のチャンバを使用する時刻ｔ＋△ｔでのその輝線の捕捉を示す概略斜視図である。
【図１２】バイオチップの励起光ファイバー内に導くために入射レーザー光線を複数の出射レーザー光線へ分解するための、本発明により使用することができるカスケードフィルタリング分波器の原理のスキームである。
【図１３】図１２に示す分波器の構成要素を示す円形図（medallion）である。
【図１４】図１２及び図１３の装置の本発明による変形として使用することもできる、回折格子合波器−分波器の原理の他の模式図である。
【図１５】図１２及び図１３の装置の本発明による変形として使用することもできる、回折格子合波器−分波器の原理の他の模式図である。
【図１６】図６の変形に対応する本発明の第２の実施形態による定量測定装置の部分概略斜視図である。
【図１７】図１６の装置に含まれるバイオチップのプラズマチャンバの配列間の間隔を示す概略側面図である。
【図１８】図１６の装置の配列に含まれるプラズマチャンバの概略斜視図である。
【図１９】図１８のプラズマチャンバの上部からの図である。
【図２０】図１８のチャンバにおける時刻ｔでのプラズマの形成を示す概略斜視図である。
【図２１】図１８のチャンバを使用する時刻ｔ＋△ｔでのその輝線の捕捉を示す概略斜視図である。
【図２２】本発明の第１の例による、本発明によるプローブマトリクスバイオチップの各測定点を形成するビーズの概略経線図（meridian section view）である。
【図２３】本発明の第２の例による、本発明によるプローブマトリクスバイオチップの各測定点を形成するビーズの概略経線図である。
【図２４】本発明の第３の例による、本発明によるプローブマトリクスバイオチップの各測定点を形成するビーズの概略経線図である。
【図２５】図２２のビーズを包含する本発明によるバイオチップの部分的な概略斜視図及び部分断面図である。
【図２６】図２４のビーズを包含する本発明によるバイオチップの部分的な概略斜視図及び部分断面図である。
【図２７】図２５に記載のバイオチップのビーズを製造する主な工程を示す方法概略図である。
【図２８】波長に応じて、リンが放出する原子線の、その最も強い線に対する位置及び相対強度を示すグラフである。
【図２９】スペクトル域１６０ｎｍ〜２６０ｎｍにおける元素Ｐ、Ｆｅ、Ｆｅ＋、Ｓｉ及びＣ由来の輝線の位置及び強度を比較して示すグラフである。
【図３０】リン由来の輝線の波長に選択された試験帯域（study zone）の場所（localization）及び環境を、元素Ｆｅ及びＳｉと比較してより正確に示すグラフである。
【図３１】特に、集束系及びプラズマ形成性ガスをこのチャンバ内に供給するための管の配列の組立体を示す、本発明による定量測定装置（例えば、図６の定量測定装置）に含まれるプラズマチャンバの部分概略縦断面図である。
【図３２】さらに、各プラズマチャンバに対する、光ファイバーの配列を示す、図３１の変形である。
【図３３】バイオチップを含有する気密セルから構成され、且つプラズマ形成性ガスを充填するためのバルブ及び空気を排除するためのバルブを備えるプラズマチャンバを示す、図３２の変形である。
【図３４】図３３に記載のバイオチップを含有する気密セルの配列の部分斜視図である。
【図３５】集束系の対物レンズと線の放出部位であるバイオチップの分析点との間に、本発明による装置の各チャンバ内でプラズマが放出される様子を、立体角の観点で示す図である。
【図３６】本発明により使用することができる光捕捉システムの例（光ファイバー−干渉フィルタ／光電子増倍管「ＣＰＭ」タイプ）の特徴を示す図である。
【図３７】本発明により使用することができる光捕捉システムの例（光ファイバー−干渉フィルタ／光電子増倍管「ＣＰＭ」タイプ）の特徴を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
本発明の方法を用いて、プローブマトリクスバイオチップのプローブ上にハイブリダイズした標的核酸を定量するためには、これらの標的の大きさが既知であるか又は較正される必要があることが想起される。
【００８３】
この較正を達成するために、ハイブリダイゼーション後、バイオチップを、バイオチップ上に存在する全ての一本鎖核酸を分解することが可能なエキソヌクレアーゼタイプの酵素（例えば、毒（venom）ホスホジエステラーゼ１、エキソヌクレアーゼＩ）等で処理する。このエキソヌクレアーゼ処理及び洗浄後、プローブ／標的二本鎖のみがバイオチップ上に存在し、標的は正確にプローブの大きさである（エキソヌクレアーゼの立体障害の範囲内）。
【００８４】
測定されるリンの濃度は、プローブの大きさ及び密度が完全に較正される限り、ハイブリダイゼーションの程度に比例する。実際、図２及び図３のグラフに示すように、測定される放出シグナルの強度は、バイオチップの支持体を形成する「カプトン」として知られるポリイミドのシート上に存在するオリゴヌクレオチド（１９塩基長で試験される）の濃度と線形の相関がある（図１参照）。
【００８５】
図６〜図１１に示す、本発明の第１の実施形態による測定装置は、ＬＩＢＳ技法及びＬＩＦ技法を併用し、本質的に、
標的がハイブリダイズするプローブのマトリクスを備えるタイプであり、多数のプローブスポット２を含むバイオチップ１と、
バイオチップ１の様々な点に幾つかのレーザー光線を同時に集束照射して、そのそれぞれから、これらの標的にのみ存在するリン等の定量対象の化学元素を含有するホットプラズマを抽出する、集束照射するための手段３及び４、並びにこうして抽出された上記プラズマ又は各プラズマを閉じ込めるための手段を含む、プラズマ生成及び閉じ込めユニットと、
プラズマ生成及び閉じ込めユニットと接続し、且つ、上記元素の各スポット２における濃度を、上記元素に特異的な線の強度とこの元素の所定の濃度との間の相関に基づいて求めるように、各スポット２のプラズマからの輝線を検出及び分析するのに好適な分光写真ユニット５と、
を含む。
【００８６】
図６に示すように、閉じ込め手段は、ｎ個のプラズマチャンバ７（ｎ≧１）の配列６から形成され、その壁は、例えば、バイオチップ１に向かって徐々に広くなる直立円錐体の形状（円柱状も想定され得る）である。この配列６は、例えば、平行六面体形状の筺体８によって区切られ、これは、バイオチップ上に開いた状態でバイオチップ１上に載り、このバイオチップ１に対して相対的に移動する。
【００８７】
筺体８には、それぞれチャンバ７の上部に作製され、且つＮ個の第１の励起レーザー光線１０’（図１０参照）を伝搬するＮ個の第１の励起光ファイバー１０を収容することを目的とし、使用する波長に好適なＮ個の第１の励起口９が設けられる。光学レンズ、例えば、液体レンズ（図示せず）を、各ファイバー１０の自由端に接合して、対応する光線１０’をバイオチップ１の表面に集束させる。
【００８８】
したがって、作業時、ＬＩＢＳ技法によって分析される上述のプラズマを形成する目的で、又は他では第１の工程のみでバイオチップ１の物質をアブレートする目的で、これらの光線１０’は、上記集束照射手段３によって、各スポット上に集束照射される。
【００８９】
図７に示すように、筺体８の下縁８ａは、好ましくは距離ｄ（５μｍ〜２００μｍ）だけバイオチップ１と離される。プラズマチャンバ７に関しては、それぞれ、例えば、２ｍｍ〜１０ｍｍの範囲の高さ（Ｚ軸に沿う）及び１ｍｍ〜５ｍｍの範囲であり得る直径の下開口部（円錐体の底面又は円柱の端部）を有する。
【００９０】
また、各プラズマチャンバ７には、その円錐状の側壁上に（図８参照）、好ましくは対応する第１の励起口９に隣接し、且つ管１２（例えば、チューブ又はホース）を収容するガス注入口又は孔１１が設けられ、ガス注入口又は孔１１はその軸が、チャンバ７によって形成される円錐体の母線と実質的に直交しており、中性ガス（例えば、アルゴン）の注入を可能にする。実際、核酸から形成された標的の場合、プラズマにより放出される紫外光の吸収を制限するために、各プラズマチャンバ７に存在する空気中の酸素が結果的に排除される。
【００９１】
さらに、これらのプラズマからの輝線を捕捉するためのＮ個の光ファイバー１３は、各チャンバ７に特異的な線スペクトルの分光写真ユニット５への伝達のために、筺体８を貫通し、それぞれチャンバ７の内部と連通する（図８、図９及び図１１の矢印Ａ参照）。捕捉ファイバー１３はそれぞれ、チャンバ７の側壁に作製された捕捉口１４内に収容され、各ファイバー１３の自由端は、プラズマによって放出される光をこのファイバー１３に入射するのに好適な光学レンズ１３ａでキャップされる。
【００９２】
さらに、捕捉口１４の反対に位置する各チャンバ７の壁の円錐状（又は円柱状）の内面は、捕捉ファイバー１３に対して最大量の光を反射することが可能な凹面鏡１５（積分球と同様、図９参照）が形成されるように、研磨及び金属化される。
【００９３】
プラズマ生成及び閉じ込めユニットに含まれる他の集束照射手段４は、例えば、ＬＩＢＳ技法と並行して上述のＬＩＦ技法を実施することを目的とする。補助的な第２の励起手段を構成するこれらの手段４は、集束照射手段３によって実行されるアブレーションの後、各チャンバ７でプラズマを生成するように機能することもできる。
【００９４】
この目的のために、これらの集束照射手段４は、筺体８内及び各チャンバ７の側壁内の両方に作製された第２の励起穴又はスリット１９を通る単一の第２の励起レーザー光線１８を様々な角度で集束照射するための、下流にガルバノメータヘッド１７を伴うレーザーヘッド１６を含む（図８及び図９参照）。各穴又はスリット１９は、プラズマが膨張する予測上の高さ又は他ではバイオチップ１のアブレートした物質を排斥する高さ、及び対応する捕捉ファイバー１３又は鏡１５に対しての「死（blind）」角に作製される。
【００９５】
各穴又はスリット１９の反対側に、レーザー光線１８をプラズマ又は排出物質の形成レベルに集束させる光学レンズ（図示せず）を配置することができる（図１０中、このプラズマは参照符号Ｐで表す）。このレンズは必要に応じて、レンズの焦点を合わせることができる電磁石から構成される小型の磁性ジャック上に置いてもよい。
【００９６】
レーザー光線１８は、上述のガルバノメータヘッド１７を形成するガルバノメータモータ上に載置された一組の鏡により、１つの第２の励起穴又はスリット１９から他の第２の励起穴又はスリット１９へ移動する。この組立体により、所望量の時間、各光ファイバー１０が伝搬する第１の励起光線１０’のパルスに対する第２の励起パルス１８を進行させるか又は遅延させることができる。
【００９７】
分光写真ユニット５に関しては、好ましくは、例えば、光電子増倍管（ＰＭと略記する）、分光光度計、ＣＣＤカメラ若しくはインテンシファイドＣＣＤカメラ又はマイクロチャネルの「ウエハ」である検出器を含む。検出器に光を入射するために、所望の波長のみを選択する光学フィルタを、各捕捉光ファイバー１３と検出器との間に挿入することができる。さらに、好適なレンズを、各光ファイバー１３の出口に取り付けてもよい。
【００９８】
図６〜図１１に記載のこの装置により、従来技術の装置よりも迅速にバイオチップ１の表面全体をスキャンすることができる。このスキャン中の分析時間は、使用する励起光線１０’の数に反比例する。
【００９９】
Ｎ個のファイバー１０が伝搬する各種第１の励起光線１０’は、各種レーザー源から得ることができる。しかしながら、代替的には、互いに近接した（典型的には互いに０．４ｎｍ〜１ｎｍ離れた）幾つかの波長の重ね合わせから構成される光線を生成する単一の光源を使用した後、各波長を単一のファイバー１０に入射するために、波長分波器（波長分割多重システム又はＷＤＭと略記する）を使用して、この光線を分解する。図１２〜図１５は、上述したＮ個の第１の励起光線を得るための、本発明によるこの変形を示す。
【０１００】
より具体的には、この効果のために、Ｎ＝６の下流光線２１（上流光線２２から得られる各波長λ１〜λ６を有する）を示す、図１２に概略的に示すような、カスケードフィルタリング分波器２０を使用することができる。これらの下流光線２１はそれぞれ、例えば、屈折率分布型レンズから構成されるコリメータ２３に由来する。図１３の円形図に示すように、分波器２０を構成する６個の空洞２４はそれぞれ、側面を多層誘電体反射器２５に包囲される。
【０１０１】
なお、この上流光線２２は、使用する全ての波長が、バイオチップ１の表面の部分的な気化及びプラズマの形成をもたらすのに十分なエネルギーを有する光線を生成するように、十分なエネルギーを有する必要がある（組立体に随伴する損失の見込みを考慮するため）。適切な場合、プラズマは、排出原子、より詳細には、先に説明したようにリンの原子からの放出の誘導に好適な波長を有する別の光線を用い、排出物質において、第２のレーザーパルスによって生成する。
【０１０２】
変形としては、図１４及び図１５に示すような、回折格子合波器−分波器を使用することができる。
【０１０３】
図１４の合波器−分波器３０は、回折格子３１を含み、反対側のその端部に、入力光ファイバー３２及び出力光ファイバー３３が設けられ、また、入射する光線を反射することが可能な球形鏡３４を含み、出力ファイバー３３によってそれぞれ伝搬される光線を生成する。図１５は、その部分に関して、この回折格子３１を組み込む光学系の上流に設けられた合波器（multiplex）３５を示す。
【０１０４】
プラズマチャンバ７の配列６とバイオチップ１との間で実行される相対移動に関して、この配列６は、例えば、Ｘ軸に沿って移動する構造体上に配置することができる（図６参照）。このＸ軸に沿っての移動は、ステッピングモータ、磁石又は電磁石のシステム、ガルバノメータシステム又はＸ軸に沿った正確な移動を提供するための任意の他のシステムによって行われる（或る特定の状況において、Ｘ軸は、一定の半径を有する円であってもよい）。
【０１０５】
分析対象のバイオチップ１は、その部分に関して、Ｘ軸方向と直交したＹ軸に沿って移動し、このＹ軸上での移動は、上記Ｘ軸に関して上述したものと等価なシステムによって行われる。Ｘ及びＹに沿った移動は、各レーザーパルスで精査した表面のＹに沿った高さＺ及びＸに沿った幅Ｉによって規定される。各パルスで精査したこの表面の断面が長方形でない場合、Ｘ及びＹに沿った移動は、動いたエリアの表面全体のアブレートを可能にするために、Ｚ／２及びＩ／２に低減する必要がある。
【０１０６】
Ｙ軸に沿ってバイオチップ１が移動するとそれぞれ、プラズマチャンバ７の配列６が、Ｘ軸に沿ってＫだけ移動する（Ｋという数は、２つの連続するプラズマチャンバ７の励起ファイバー１０間の距離Ｐ及び各レーザーパルスでアブレートした表面のＸに沿った幅Ｉによって規定され、Ｋ＝Ｐ／Ｉとなる（気化後、アブレーションの形状因子よって調節される）。
【０１０７】
上述した２つの連続する励起ファイバー１０間の距離Ｐは、分析対象のバイオチップ１の幅Ｌ及び配列６の励起ファイバー１０の数Ｎによって規定され、Ｐ＝Ｌ／（Ｎ−１）（但し、Ｎ＞１）となる。
【０１０８】
配列６が、共働するプラズマチャンバ７の幾つかの系統から構成される場合、Ｙ軸に沿った移動にも、同一の推論を働かせることができる。Ｘ方向及びＹ方向の全ての移動は、電動式のプラットフォームで行うことができる。
【０１０９】
アブレートする表面を減少させて、バイオチップ１の分析を実行するためには、２つの連続する励起ファイバー１０間で選ばれるギャップが、バイオチップ１上のプローブスポット２の多数のステップであることが有利である。実際、本発明によるバイオチップ１を形成するプローブスポット２のマトリクスは、これらのマトリクスがバイオチップ１の大きな領域（典型的には数ｃｍ２）にわたって或る一定のステップの間隔を有するようなものである。このステップを考慮してプラズマチャンバ７の配列６を生成することによって、プローブがグラフトした領域のみをアブレートすることが可能になる。
【０１１０】
同様に、アブレーションの設定能（resolution）及び２つのアブレーション間のＸ及びＹに沿った移動の値は、試験されるバイオチップ１の領域に好適であることが有利である。Ｘ軸及びＹ軸に沿った移動は全て、例えば、バイオチップ１が配置された単一の微小移動プラットフォームによって行うことができる（プラズマチャンバ７はそのまま固定される）。
【０１１１】
図１６〜図２１に示す、本発明の第２の実施形態による測定装置も、ＬＩＢＳ技法及びＬＩＦ技法を併用するが、図６〜図１１を参照して先程説明した本発明の第１の実施形態による装置とは以下の点で本質的に異なる。
【０１１２】
第１に、第２の実施形態によるプラズマチャンバ１０７の配列１０６は、それが、集束照射手段１０３により送達される単一の励起レーザー光線１１０の入力点として機能する各プラズマチャンバ１０７上部の第１の励起口１０９であることから、励起ファイバーを設けない。レーザー光線１１０を分析対象のバイオチップ１の表面に集束させる光学レンズ（図示せず）が、有利には各励起口１０９に配置され、このレンズは、必要に応じてレンズの焦点を合わせることができる電磁石から構成される小型の磁性ジャック上に置くことが可能である。
【０１１３】
図１７に示すように、筺体１０８は、好ましくは、５０μｍ〜１００μｍの距離だけバイオチップ１と離される。
【０１１４】
レーザー光線１１０の、チャンバ１０７の配列１０６に沿った、１つの励起口１０９から他の励起口への移動は、ガルバノメータモータ（したがって、レーザーヘッド１１２の下流に設けられるガルバノメータヘッド１１１を形成する）上に載置された一組の鏡によって行われる。このガルバノメータ鏡のシステムは、レーザー光線１１０が分析対象エリアで常にバイオチップ１の表面と直交するように規定される。これは、長さが、配列１０６の移動長及び移動幅の合計の領域内である鏡、並びに大きさが小さめの２つの他の鏡の使用を伴う。
【０１１５】
このガルバノメータヘッド１１１の別の実施形態では、図１６に示すように、回転移動するのみの２つの鏡の他に、回転移動するだけでなく並進移動もする鏡を使用し得る。励起光線１１０が分析対象の表面と直交したままの作動領域（working field）を提供するテレセントリック系対物レンズを備えるガルバノメータヘッド１１１を使用することが好ましい。
【０１１６】
なお、バイオチップ１に対する励起光線１１０の直角度を保証するための多くの可能性が存在し、この制約（constraint）により、画像を再構成するために、チャンバ１０７の配列１０６の移動と光線１１０の移動とが正確に同期することが可能となる。
【０１１７】
第２に、補助的な第２の励起手段１０４は、ＬＩＦ技法による単一の集束照射レーザー光線１１８の第２の放出用に、集束レンズ１１７付のレーザーヘッド１１６を含む。この効果のために、２つの第２の励起穴又はスリット１１９が、プラズマが膨張する予測上の高さ又はアブレートした物質を排斥する高さ、及び常にＮ個の捕捉ファイバー１１３（それぞれ、チャンバ１０７の対応する捕捉口１１４に近傍のレンズ１３ａに類似のレンズ１１３ａが設けられる）又は上記凹面鏡（図１８、図２０及び図２１参照）それぞれに対する「死」角で互いに向かい合う各プラズマチャンバ１０７の側壁（円錐状又は円柱状）上に互いに対向して設けられる。
【０１１８】
図１６に示すように、配列１０６のチャンバは全て、ｎ個のチャンバ１０７のＮ対の第２の励起穴又はスリット１１９を通過する想像上の直線で接続される。
【０１１９】
したがって、これらの補助的な第２の励起手段１０４によって、単一のレーザー光線１１０によって生成する全てのプラズマを励起することができる。
本発明による方法の実施及びこの方法で使用するバイオチップの加工の例
なお、事前に、本発明の第１の実施形態による装置の各プラズマチャンバ７の上部に設けられた励起ファイバー１０を、１つ又は２つのさらなるファイバーを用いて２倍又は３倍にして、一方では、ビデオカメラ又はデジタル撮影装置により、バイオチップ１の表面を撮像することができ（「ＲＧＢ」モード、すなわち、赤緑青で）、他方では、白色光でこの表面を照らすことができる。したがって、本発明によるこの装置により、バイオチップ１の表面のカラー画像又は白黒画像を生成することができる。
【０１２０】
結果として、プローブの位置を正確に特定することが可能となる（但し、バイオチップ１の背景と異なる色の光学検査対象にプローブをグラフトした場合）。プラズマチャンバ７、１０７が、これらの光学検査対象のうち１つの上に載っている場合にのみ、アブレーションが引き起こされる。この構成において、色コードは、３×２５６個の可能なレベル（ビデオカメラ又はデジタル撮影装置により通常処理されるレベル）でＲＧＢコードの３つの基本色を混合することによって確立することができる。したがって、これにより、これらの光学検査対象に対し可能な１６７７７２１６色が提供され、各標的スポット２に対して異なる色の光学検査対象を割り当てることが可能となる。
【０１２１】
異なる色のこれらの光学検査対象を製造するために、リンを含有しないカラープリンタ色素（すなわち、シアン、マゼンタ、黄、ＣＭＹと略記する）を使用することができる。同様に、バイオチップ１上の異なる色の光学検査対象のアレイを印刷するために１６００万色を有するプリンターを使用することができる（このプリンターは、ＲＧＢを色素の混合物に変換する）。
【０１２２】
次いで、各標的スポット２は、単一色の光学検査対象上にグラフトされ、バイオチップ１の読み取り時に、その明確な同定が可能となる。光学検査対象のこの方法を用いることによって、上記バイオチップを形成するマトリクス中のプローブスポット分布がランダムであるバイオチップ１の分析が可能となる。
【０１２３】
これを行うためには、本発明によれば、以下のことを組み合わせて実施することが有利である：
本出願人による、２００６年２月２４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００４２８号に記載の、核酸懸濁液の分析方法、及び
本出願人名義の国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ−０２／４３８５５号に記載の、固定化ベクターを用いた磁性カップリングにより支持体と結合したプローブのアレイ組織の加工方法。
【０１２４】
より具体的には、各生体分子プローブの多数のコピーは、所定色且つ単一色の磁性ビーズ又は常磁性ビーズ上にグラフトされる。例えば、コバルト、ニッケル又はそれらの酸化物の粒子を含有する、較正したポリスチレンビーズであってもよい。
【０１２５】
粒子は、光学検査対象に関して記載したように、例えば、色素の混合物で全体的に塗装又は染色される。次いで、異なるプローブの化学量論混合物（それぞれが分析対象の標的の混合物中に存在する核酸配列とハイブリダイズすることが可能である）が得られるように、これらの粒子を化学量論的に混合する。
【０１２６】
プローブ及び標的は混合され、各タイプのプローブは、相補的な標的とハイブリダイズし、それらを飽和する。粒子及びプローブ／標的複合体は単離、洗浄後、再溶解する。
【０１２７】
図２２〜図２６を参照して、シート４０（例えば、カプトン等のポリイミド系、１μｍ〜１０μｍ厚（好ましくは各ビーズ４１ａ、４１ｂ又は４１ｃの直径に等しい））に、直径がビーズ４１ａ、４１ｂ、４１ｃに等しい多数の穴４２を開けて、穴４２のマトリクスを形成する（理想的には、ビーズ４１ａ、４１ｂ、４１ｃと同数の穴４２が存在する）。この「カプトン」シート４０は、磁気ストリップ４３上に配置されるか又は代替的にはこれと結合し、その大きさは、数センチメートル（理想的には、２．５ｃｍ×７．６ｃｍ）である。ストリップ４３は、磁化粒子を含有するポリマー又は樹脂から構成されることが有利であり、ストリップ４３により発生する磁場は、ほぼ０．５Ｔ〜５Ｔである。シート４０は、そのストリップ４３をカバーするエリア全体にわたって遮磁壁を形成する一方、穴４２では磁場が自由なままである。
【０１２８】
図２５に関する図２２の例示的な実施形態によれば、各ビーズ４１ａは、それらの各縁Ｔ（すなわち、平面）を介して互いに結合する２つの同一の半球Ｓ１及びＳ２から構成される。これらの穴４２の１つにおいて、磁化ストリップ４３側を向いた下半球Ｓ２のみが、例えば、常磁性粒子を含有するポリマー又は樹脂製であるため、常磁性である。
【０１２９】
図２２〜図２６からも分かるように、生物学的プローブ４４は、上記光学検査対象を形成するために着色された上半球Ｓ１の凸面にグラフトされる。
【０１３０】
図２３の変形において、下半球Ｓ２’は、プローブ４４がグラフトされる着色された上半球Ｓ１’よりも小さい直径を有し、また、半球Ｓ１’及びＳ２’の各縁Ｔを介して中心を合わせて上記上半球と結合することによって組み合わせられ、こうして各ビーズ４１ｂを形成する。
【０１３１】
図２４及び図２６に示す他の変形において、各ビーズ４１ｃは、その凸面上にプローブ４４がグラフトされる着色された上半球Ｓ１’’、並びに底面を介してこの半球Ｓ１’’の縁Ｔの下で結合し、穴４２の内部の磁気ストリップ４３に面する常磁性の円錐体Ｓ２’’から構成される。
【０１３２】
なお、ビーズ４１ｃのこの非対称形状により、方法の収率を改善することができ、さらに、かかるビーズ４１ｃを、より容易にシート４０の穴４２（これも円錐状に設けられる）に挿入することができる。
【０１３３】
上記のように、これらのビーズ４１ａ、４１ｂ、４１ｃの上半球Ｓ１、Ｓ１’、Ｓ１’’はそれぞれ有利には、塗装されるか又は着色されたプラスチック、例えば、ポリスチレン（又はリンを含有しない任意の他の生体適合性物質）から構成される。
【０１３４】
磁気ストリップ４３上に「カプトン」シート４０を組み合わせた後、ビーズ／プローブ／標的複合体を、このストリップ４３をカバーするこのシート４０の表面に付着させる。次に、針、すなわち、ストリップ４３の磁場よりも小さい磁場（典型的には、静磁石（static magnet）又は電磁石を介して０．５Ｔ〜１．５Ｔ）を供給する尖先端を、ビーズ４１ａ、４１ｂ、４１ｃの平均直径の実質的に４分の３の距離を置いて、シート４０全体を移動させる。ビーズは、この針によって引き付けられ、シート４０を通る磁場が針の磁場よりも弱いことから、シート４０の表面で移動する。しかしながら、針がシート４０の穴４２の近傍を通過するや否や、磁場がこの穴４２の中ではより強いために、ビーズ４１ａ、４１ｂ、４１ｃが磁場によって捕獲される。穴４２の大きさ及び磁場間での競合のために、穴４２に対して単一のビーズ４１ａ、４１ｂ、４１ｃが捕獲される。一旦全てのビーズ４１ａ、４１ｂ、４１ｃが捕獲されると、ストリップ４３を除去することができ、ビーズ４１ａ、４１ｂ、４１ｃがシート４０上に残る。
【０１３５】
磁気ストリップ４３及び／又は「カプトン」シート４０は、引き続いて上記本発明による測定装置で分析される。各ビーズ４１ａ、４１ｂ、４１ｃの色は、撮像システムにより求められ、それによりプローブ４４の性質を求めることが可能となる。各ビーズ４１ａ、４１ｂ、４１ｃに結合したプローブ４４の量は、物質のアブレーション及びこのアブレーションによって生成したホットプラズマからの輝線の分析の後、リンを定量することによって求める。
【０１３６】
図２７に示すように、磁気極性ビーズ４１ａの加工は、それぞれポリスチレン及び常磁性樹脂から構成され、且つ接着層５３を介して相互に結合する、異なる物質製の２つのシート又はフィルム５１及び５２から構成されるプレート５０のレーザー加工によって実行することができる（矢印Ｂ及び矢印Ｃを参照）。例えば、「Ｖａｃｒｅｌ」として知られるポリマー系の２つのシート５１及び５２（下シート５２のみがニッケル又はコバルトのナノ粒子を含有する）の使用が可能となる。
【０１３７】
したがって、第１の工程（ｉ）において、相互に結合した半球Ｓ１及び半球Ｓ２の対は、このレーザー加工を通じて得られ、これらの対は、接着層５３を介して互いに接続する。
【０１３８】
第２の工程（ｉｉ）において、上半球Ｓ１は、それらを形成する物質がまだ着色されていない場合、着色される。
【０１３９】
第３の工程（ｉｉｉ）において、半球Ｓ１及びＳ２のこれらの対は、対応するビーズ４１ａを他と区別し、プローブ４４をグラフトするために、さらなるレーザー加工（矢印Ｄ）を用いて分離される。
【０１４０】
したがって、ビーズ４１ａは、レーザー光線の集束照射によってフィルム５１及び５２の大部分で重合する。ビーズ４１ａの最終構造体は、フィルム５１及び５２の表面に配置されたマスク又はグリッドを用いて得ることができ、相互に結合した半球Ｓ１及びＳ２の各対を得ることができる。これらのビーズ４１ａは、水酸化ナトリウムでフィルムの重合していない部分を消化することによって放出される。
【０１４１】
これらの磁気極性ビーズを製造する別の代替案は、立体写真術を実施するために、２つの異なる感光性樹脂及び１つ又は２つのレーザー光線を使用してそれらを製造することである。第１の磁気的に中性の樹脂は、ビーズ４１ａの第１の部分（例えば、半球Ｓ１）の合成に使用され、常磁性コバルト又はニッケル粒子を含有する第２の樹脂は、第２の部分（例えば、半球Ｓ２）の合成に使用される。
【０１４２】
リンの原子線に関する図２８を参照すると、この元素の発光スペクトルは、紫外域及び極紫外域に強い線を示現する。１３０００Ｋの温度で、最も強いリン線は１６７．９６ｎｍにある。相対強度の順番で分類して（Ｉ／Ｉ１６７．９６）、２４個の最も強いリン線を、下記第１表及び対応する図２８に列記する。
【０１４３】
【表１】
2010503842.tif 000003
【０１４４】
なお、線の強度の算出は、以下の等式に基づく：
【０１４５】
【数１】
2010503842.tif 000004
【０１４６】
ｈ  プランク定数、
ｃ  光の速度
λｉｊ  考察中のより高い状態ｉからより低い状態ｊへの遷移の波長
ｇｉ  輝線の初期エネルギー準位ｉの統計的重み
Ａｉｊ  考察中の線の遷移確率
Ｚ（Ｔｅｘｃ）  分配関数
Ｅｉ  遷移が起こる励起した準位のエネルギー
Ｔｅｘｃ  プラズマの温度
図２９及び図３０は、ＬＩＢＳ技法によるバイオチップの分析中の特有な（parasitic）元素の存在を示す（これらのバイオチップは特に、ケイ素系（ガラス基板を備えるバイオチップの最も広く知られた例）である）。
【０１４７】
ガラス基板の各種組成：Ａｌ、Ｃ、Ｎａ、Ｏ、Ｃａ、Ｂ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｆｅ、Ｔｉ、Ｎｉ、Ｚｎ及び／又は
核酸の骨格：Ｃ、Ｎ、Ｏ及び／又は
プローブを結合するための分子自己集合体：Ａｕ、Ｓ、Ｏ、Ｃ、Ｎ、Ｂｒ
中に存在し得る他の特有な元素を一覧にすると、３つの元素Ｓｉ、Ｆｅ（Ｆｅ＋）及びＣのみが、１６０ｎｍ〜２６０ｎｍのスペクトル域で、リンの線と比較して多少強い線を有することが分かる（図２９参照）。
【０１４８】
図２９及び図３０のグラフは、このスペクトル域及び１３０００Ｋの温度で、これらの各種元素の最も強い線を（リンの最も強い線も）全て記録している。そこから分かるのは、優先的に２００ｎｍを上回る波長を示すものを選択することによって、２０３ｎｍ±３ｎｍに位置するリン線の組が、
特有な線に対するこの線の組の相対「距離」（１９８．８９ｎｍの弱めのケイ素線及び２１２．４１ｎｍの別の強めのケイ素線の存在）（２０３ｎｍを中心とし、スペクトルバンド幅が３ｎｍ〜６ｎｍの干渉フィルタを使用することがこの場合には非常に好適であることが特定される）と、
単一の線ではなく、「累積」強度が２５３．５６ｎｍのリン線よりも（４倍〜５倍）大きい、一組の線を取り扱う可能性と、
の間で達成される折衷に基づいて、特に有利だと考えられることである。
【０１４９】
変形としては、明らかに２５３．５６ｎｍよりも４倍強いが、上述した２１２．４１ｎｍのケイ素線からはほんの１２Åである、２１３．６１ｎｍのリン線の本発明による使用を挙げることができる。
【０１５０】
図３０のグラフは、特に、２０３ｎｍのいずれかの側でリンからの輝線に対して優先的に選択される試験帯域Ｚを示す。
【０１５１】
図３１及び図３２は、チャンバの雰囲気を制御するための手段及び対応する集束系と接続した、本発明による定量測定のための装置で使用することができるプラズマチャンバ７の例を示す。
【０１５２】
ＬＩＢＳ技法に関して、最適組成のプラズマを得る（すなわち、詳細なスペクトル分析を可能にする）には、上述のように、ガス（例えば、アルゴン、ネオン又は窒素）から構成される制御された雰囲気の使用が必要となる。図３１〜図３３に示すように、例えば、アルミニウム（容易に加工可能で且つ高価でない物質）で加工することができる各プラズマ閉じ込めチャンバ７を、これらの例では、顕微鏡対物レンズＯに固定することによって、集束系（レンズＬ、Ｌ’を含む）とバイオチップ１との間に位置付ける。こうして各チャンバ７を集束系のバレルに固定する。チューブ１２と接続する各チャンバ７の側方の開口部により、このチャンバ７を通じてプラズマ形成性ガス（上記でコメントした図８参照）を入れることが可能である。
【０１５３】
この対物レンズＯの直径が２５ｍｍに等しく、また作動距離Ｄが１０ｍｍの場合、各チャンバ７の幾可学的形状は、結果的に、例えば、体積５０ｍｍ３未満の雰囲気を閉じ込めることができる。チャンバ７とバイオチップ１の分析表面との間に残る間隔ｄ（好ましくは、ｄ＜１ｍｍ）により、ガスの排出が可能となる。以下で説明するように、想定される捕捉光学系は、各チャンバ７の構造に一体化することができる。
【０１５４】
図３２の本発明によるチャンバ７には、プラズマ形成性ガスを供給するチューブ１２の他に、チャンバを横方向に通過する光ファイバー１２’が設けられる。
【０１５５】
図３３及び図３４の本発明による実施形態において、閉じ込めチャンバ７は、例えば、平行六面体状の、閉鎖セル又はチャンバ７’で置き換えられており、少なくとも上面７ａ’は、石英製又は励起波長及び捕捉波長を通す任意の他の物質製である。チャンバ７’の下面には、それぞれプラズマ形成性ガス、例えば、アルゴン／窒素の充填及び空気の排除用に、２つのバルブＶ１及びＶ２が備えられる。したがって、チャンバ７’に含有される空気がフラッシュバルブＶ２により引き抜かれた後、このチャンバ７’には、フィリングバルブＶ１によりプラズマ形成性ガスが充填される。これらの図３３及び図３４からも分かるように、電動式プラットフォームの底面Ｓ上には、図６のＸ方向及びＹ方向に移動することができるようにバイオチップ１が載置されている。このセルの上面７ａ’により、レーザーパルスが通過して、バイオチップ１の表面でプラズマを生成し、この表面の近傍に配置された光ファイバー１２’により、プラズマから輝線を捕捉することができる。なお、セル７’の側面はまた、必要に応じて石英製であってもよく、こうして側方に配置された別のレーザー光線を用いてプラズマを励起することができる。
【０１５６】
図３５は、１０ｍｍ未満になるように選ばれた、顕微鏡の対物レンズＯとバイオチップ１の分析表面との間の作動距離Ｄで、放射線が放出される中心点から始まる立体角２πステラジアンでのプラズマＰの均一な放出を示す。
【０１５７】
なお、上記光ファイバー又は各光ファイバーの最小長は、検出器を適切な位置に配置することができるように、少なくとも対物レンズＯの直径の半分と等しくする必要がある。その一方で、光ファイバー長は１０ｃｍよりも長くする必要はない。捕捉光ファイバー１３’の出力には、ＬＩＢＳマイクロプローブの場合、多少強く真空引きされている分光計の代わりに、有利には、２００ｎｍに近い波長λに特に好適な、干渉フィルタ及び「ＣＰＭ」（チャネル型光電子増倍管）を有するタイプの別の捕捉システムを使用することができる。
【０１５８】
図３６及び図３７は、光ファイバー１３’及び干渉フィルタ（図の参照符号６０）／ＣＰＭ（図の参照符号７０）を備えるタイプのこの捕捉ユニット５’の主な光学特性を示す。光ファイバー１３’は、例えば、ＮＡ（開口数）０．２２、すなわち、２４．８°の「Ocean Optics」のファイバーモデルであってもよく、干渉フィルタとジョイントしたＣＰＭ７０は、例えば、Perkin Elmerのモデルであってもよい。
【０１５９】
リンの特徴的な波長の１つに関して、干渉フィルタ６０（屈折率ｎ１、厚さｅ１）は、有利には、プラズマＰに含有されるリンの分析用の波長に関する。
【０１６０】
ＣＰＭ７０は、石英窓７１（屈折率ｎ２及び厚さｅ２）及びマルチアルカリ光電面（厚さｅ３）を特徴とする。変形としては、このＣＰＭの代わりに、「ＰＭ」タイプの光電子増倍管、マイクロチャネルウエハ又は任意の他の光子検出器も使用することができる。
【０１６１】
図３７では、干渉フィルタ６０及びＣＰＭ７０の他、この捕捉ユニット５’用に選ばれた捕捉波長を透過するように設計した、空気、水又は光学オイルの層８０（空気が優先的に使用される）も確認することができる。
【０１６２】
なお、別の実施形態では、光ファイバー１３’とＣＰＭ７０との間に、このＣＰＭ７０上のファイバー出力を画像化するため、集束レンズを導入することができる。
【図１】
2010503842.tif 000005
【図２】
2010503842.tif 000006
【図３】
2010503842.tif 000007
【図４】
2010503842.tif 000008
【図５】
2010503842.tif 000009
【図６】
2010503842.tif 000010
【図７】
2010503842.tif 000011
【図８】
2010503842.tif 000012
【図９】
2010503842.tif 000013
【図１０】
2010503842.tif 000014
【図１１】
2010503842.tif 000015
【図１２】
2010503842.tif 000016
【図１３】
2010503842.tif 000017
【図１４】
2010503842.tif 000018
【図１５】
2010503842.tif 000019
【図１６】
2010503842.tif 000020
【図１７】
2010503842.tif 000021
【図１８】
2010503842.tif 000022
【図１９】
2010503842.tif 000023
【図２０】
2010503842.tif 000024
【図２１】
2010503842.tif 000025
【図２２】
2010503842.tif 000026
【図２３】
2010503842.tif 000027
【図２４】
2010503842.tif 000028
【図２５】
2010503842.tif 000029
【図２６】
2010503842.tif 000030
【図２７】
2010503842.tif 000031
【図２８】
2010503842.tif 000032
【図２９】
2010503842.tif 000033
【図３０】
2010503842.tif 000034
【図３１】
2010503842.tif 000035
【図３２】
2010503842.tif 000036
【図３３】
2010503842.tif 000037
【図３４】
2010503842.tif 000038
【図３５】
2010503842.tif 000039
【図３６】
2010503842.tif 000040
【図３７】
2010503842.tif 000041
【国際調査報告】
2010503842.tif 000042
2010503842.tif 000043
2010503842.tif 000044
2010503842.tif 000045
2010503842.tif 000046
2010503842.tif 000047