(57)【要約】  対象の肝臓における高い脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現を検出するための方法及び組成物が開示される。該検出は、肝細胞自体又は対象の体液における発現の検出でよい。高いＦＡＳに関連して肝疾患又は病状の存在又は不存在を同定するための方法も開示される。この開示された方法は、本明細書に記載のＦＡＳ発現を検出するための試薬を含む様々な組成物を用いて実施され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の肝臓において高い脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）を検出する方法であって、以下：
癌がないと推測された又は診断された対象からの体液試料中の脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）のレベルを検出又は測定すること、
を含み、ＦＡＳの高いレベルは、該対象の肝臓における高いＦＡＳを示す、前記方法。
【請求項２】
前記対象における肝疾患の存在又は不存在を同定することを更に含み、ここで、
ｉ）肝疾患のない対象におけるレベルに対して高いＦＡＳレベルが、該対象における肝疾患の存在を同定し、及び
ｉｉ）肝疾患のない対象におけるレベルに対して同一のＦＡＳレベルが、該対象における肝疾患の不存在を同定する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎又はアルコール性肝炎のような脂肪性肝炎のＦＡＳの高いレベルによって特徴付けられ；あるいは、肝臓毒性；肝臓のウイルス感染症、又はウイルス性肝炎；自己免疫肝炎；突発性肝硬変；低灌流後の肝臓壊死；及び他の疾患から起こる肝炎のようなＦＡＳの高いレベルによって特徴付けられない、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記肝臓毒性は、前記対象をテトラサイクリン又は四塩化炭素のような外因性薬物又は化学物質に曝露することに因り；
前記ウイルス感染又はウイルス性肝炎は、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤ型肝炎から選ばれ、又はサイトメガロウイルス又はヘルペスウイルスによる感染に因り；
前記自己免疫肝炎は、前記対象における全身性紅斑性狼瘡、強皮症又はＣＲＥＳＴ症候群に因り；
前記の低灌流後の肝炎壊死は、重度の低血圧、肝臓に対する機械的傷害、又は血管性易感染から選ばれ；あるいは
前記の他の疾患から起こる肝炎は、潰瘍性大腸炎、クローン病、又は硬化性胆管炎から選ばれる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記対象がヒトである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記体液が血液又は血清である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記検出又は測定が、前記試料にＦＡＳ結合抗体又は抗体フラグメントとＦＡＳとの複合体が存在する場合には、該複合体を形成し、及び検出又は測定することを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記検出又は測定が、ＥＬＩＳＡ又はラテラル・フロー・テスト・ストリップによって行われる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記対象へのＦＡＳレベルの伝達を更に含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、場合により、肝硬変の症状の発症前に、肝疾患に罹患していると推測される、請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
対象の肝臓において高い脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）を検出する方法であって、以下：
対象からの肝細胞を含む試料中の脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現のレベルを検出又は測定することを含み、ＦＡＳ発現の高いレベルが該対象の肝臓における高いＦＡＳを示す、前記方法。
【請求項１２】
前記対象における肝疾患の存在又は不存在を同定することを更に含み、ここで
ｉ）肝疾患のない対象におけるレベルに対して高いＦＡＳレベルが、該対象における肝疾患の存在を同定し、及び
ｉｉ）肝疾患のない対象におけるレベルに対して同一のＦＡＳレベルが、該対象における肝疾患の不存在を同定する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記肝疾患が、脂肪性肝炎（非アルコール性脂肪性肝炎又はアルコール性肝炎）；アルコール性肝炎；肝臓毒性；肝臓のウイルス感染症、又はウイルス性肝炎；自己免疫肝炎；突発性肝硬変；低灌流後の肝臓壊死；及び他の疾患から起こる肝炎から選ばれる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記肝臓毒性は、前記対象をテトラサイクリン又は四塩化炭素のような外因性薬物又は化学物質に曝露することに因り；
前記ウイルス感染又はウイルス性肝炎は、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤ型肝炎から選ばれ、又はサイトメガロウイルス又はヘルペスウイルスによる感染に因り；
前記自己免疫肝炎は、前記対象における全身性紅斑性狼瘡、強皮症又はＣＲＥＳＴ症候群に因り；
前記の低灌流後の肝炎壊死は、重度の低血圧、肝臓に対する機械的傷害、又は血管性易感染から選ばれ；あるいは
前記の他の疾患から起こる肝炎は、潰瘍性大腸炎、クローン病、又は硬化性胆管炎かｋら選ばれる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記対象がヒトである、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記体液が血液又は血清である、請求項１１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記検出又は測定が、前記試料にＦＡＳ結合抗体又は抗体フラグメントとＦＡＳとの複合体が存在する場合には、該複合体を形成し、及び検出又は測定することを含む、請求項１１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記検出又は測定が、ＥＬＩＳＡ又はラテラル・フロー・テスト・ストリップによって行われる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記対象へのＦＡＳレベルの伝達を更に含む、請求項１１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、場合により、肝硬変の症状の発症前に、肝疾患に罹患していると推測される、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
対象の肝臓における脂肪蓄積を検出する方法であって、以下：
対象からの肝細胞を含む試料中の脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現のレベルを検出又は測定すること
を含み、ここで、ＦＡＳの高いレベルは、該対象の肝臓においてデノボ合成された脂肪の蓄積を示す、前記方法。
【請求項２２】
肝臓炎症の検出を更に含み、炎症の不存在は脂肪症の存在を示し、炎症の存在は脂肪性肝炎の存在を示す、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記のＦＡＳ発現のレベルが、総肝臓重量の約５％超又は肝小葉中の肝細胞の約３０％超が、脂肪蓄積を有することを示す、請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示の分野
対象の肝臓における高い脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現を検出するための方法及び組成物が開示される。該検出は、肝細胞自体における又は対象の体液の物質における発現の検出でよい。高いＦＡＳに関連して肝疾患もしくは病状の存在又は不存在を同定するための方法も開示される。開示された方法は、本明細書に記載のＦＡＳ発現を検出するための試薬を含む様々な組成物によって実行され得る。
【背景技術】
【０００２】
関連出願
本願は、あたかもすべて記載されているように、その全体が本明細書によって援用される、２００７年２月に出願された米国仮出願６０／８９１，９２８からの優先権の利益を主張する。
【０００３】
開示の背景
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）としても知られ、単純な脂肪症（脂肪肝）から、確立された肝硬変に進行するＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤまでの病状スペクトルによって特徴付けられる慢性肝疾患である（１）。ＮＡＳＨの診断は、病状がアルコール性肝炎とは本質的に識別できない肝生検において確立されている。疾患の顕著な特徴には、脂肪症、肝細胞損傷による急性及び慢性炎症の病巣、マロリー硝子質、及び変化し得る線維形成量があり（２）、顕著なアルコール消費の不存在下で起こるに違いない。
【０００４】
ＮＡＳＨは、２つの群、続発性及び原発性に下位分類されてきた（１）。続発性ＮＡＳＨは、空腸回腸バイパス手術、薬物、肝細胞毒素のような疾患、又はリポジストロフィ、ウェーバー・クリスチャン病、又はＨＩＶのような疾患の結果としての脂肪肝疾患の環境で起こる。原発性ＮＡＳＨは肥満、ＩＩ型糖尿病、脂質異常症及びインシュリン抵抗性、代謝症候群の兆候及び症状の配列の一部に関連しており、あるいは固有であり得る。
【０００５】
その初期の段階で、ＮＡＳＨは、本質的に無症候性であり、そのため、肝硬変の兆候に通常関連する兆候症状の前に診断を確立することは重要である。肝硬変が症状の出現なしのＮＡＳＨにおいて発症することも可能である。肝臓生検は依然としてＮＡＳＨの診断のためのゴールド・スタンダードであるが、針生検は、サンプリングエラー及び可能性のある誤解を伴う（３、４）。更に、肝臓生検及び画像化技術例えば磁性共鳴分光法（ＭＲＳ）は、スクリーニング試験としてコストが妨げ、実用的でない。従って、ＮＡＳＨを検出するための血清について行われる一般的かつ安価な肝機能試験を利用する試みがあった。
【０００６】
単独又は肝臓疾患のマーカーとしての組合せで使用され得る血清中の肝臓酵素の存在を検出するために使用される多数のアッセイがある。血中のこれらの酵素の存在は、肝細胞損傷を示す。これらの酵素は、以下を含む：ＡＳＴ（アスパルテートアミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ＧＧＴ（γ−グルタミルトランスフェラーゼ）、及びラクテート・デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）。血中のこれらの酵素の上昇が肝細胞損傷を示すが、ＡＬＰ及びＧＧＴの細管状位置は、閉塞的プロセス、例えば石又は腫瘍由来の胆管閉塞を示すことがある（５）。
【０００７】
残念ながら、肝臓酵素のレベルは、一般に慢性肝疾患に非感受性かつ非特異的であり、ＮＡＳＨは特異的である（１、６−１０）。例えば、Kunde他による最近の研究では、クラスＩＩ／ＩＩ肥満を有する２３３人の女性におけるＮＡＳＨを検出するための血清ＡＴＬ上昇の感度及び特異性は、正常のカットオフとしてのＡＬＴ＞１９Ｕ／Ｌを用いて７４％及び４２％であった。カットオフ値をＡＬＴ＞３０Ｕ／Ｌに変えると、４２％及び８０％に感度及び特異性は増加した。しかしながら、筆者は、ＮＡＳＨを特定するためのＡＬＴの診断的利用は難しいと結論した（６）。ＮＡＳＨを有する１０６人の患者の長期的試験において、Fassio他は、ＡＬＴ又はＡＳＴ／ＡＬＴ比がＮＡＳＨの進行を予測するために有用であることを示した（８）。高いＡＬＴレベルを有する５０人の患者に比べて正常なＡＴＬレベルを有する５１人の患者におけるＮＡＳＨの試験では、疾患の全体的スペクトルは、脂肪症から確立された肝硬変までの範囲の正常ＡＴＬレベルを有する患者において見られた。従って、正常ＡＬＴ値は、進行線維症に対するＮＡＳＨの進行を除外するものではない（１０）。この問題を別に試験するために、献血の際に見出された高いＡＬＴレベルを有するＢ及びＣ型肝炎ウイルス陰性である１１９人の患者が、高いＡＬＴレベルの原因について試験された。肥満（３０．２％）及びアルコール中毒症（２８．６％）は、ＡＬＴ上昇と最もよく関連した。４０人の患者の肝臓組織学は、肝硬変、ヘモクロマトーシス及び門脈線維症の各々の場合について、脂肪症（３５％）、脂肪性肝炎（３０％）、非特異的肝炎（１２．５％）及び正常肝臓１５％を示した。やはり、ＡＬＴ上昇は、この集団中のＮＡＳＨの高い予測ではなかった（１１）。纏めると、ＮＡＳＨの存在を選別するために有用な実際の試験はない。
【０００８】
脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）は、ヒト癌治療のための薬物標的及び癌診断用のバイオマーカーとして興味がもたれてきた。ＦＡＳは、肺、前立腺、結腸及び卵巣のような、高い割合の最も一般的なヒト腫瘍で発現される（１２）。ＦＡＳの阻害は、ヒト癌細胞においてアポトーシスを引き起こし（１３）、小分子ＦＡＳインヒビターは、ヒト癌異種移植片の成長を阻害する（１４、１５）。加えて、乳癌患者の血液中のＦＡＳの高いレベルは報告されている（１６−１８）。対照に比べて、肺、胸、卵巣、膵臓、及び結腸癌を有する患者における顕著に高いＦＡＳレベルについての報告もある（１９）。近年、新たに構築されたＦＡＳ  ＥＬＩＳＡアッセイは、これらの従来の血清試験を確認してきた（図１）。
【０００９】
上記文献の引用は、それの文献のいずれかが関連する先行技術であることを認める意図ではない。日付についてのすべての記載又はこれらの文献の内容についての記載は、出願人に入手できる情報に基づき、これらの文献の日付又は内容の正確さについての承認を構成するものではない。
【発明の概要】
【００１０】
開示の概要
様々な病因を含む肝疾患及び病状を含む、肝臓の症状を検出又は同定するために方法及び組成物が本明細書に開示されている。本方法は、有利に、同定された肝臓の症状、疾患又は病状を治療する方法と組み合わされ、あるいはその後に同定された肝臓の症状、疾患又は病状を治療する方法を行い得る。本方法の局面及び本組成物の活性は、ヒト患者のような対象の肝臓における脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現を検出又は測定することを含む。本開示の実施態様は、疾患の診断における検出又は測定されたＦＡＳ発現レベルの適用、及び疾患の治療の選択を含む。
【００１１】
１つの局面では、本開示は、対象の肝臓における脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現を検出又は測定する方法を含む。該検出又は測定は、ＦＡＳ発現のレベル又は量についてのものでよい。ある実施態様では、該検出又は測定は、ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントについてである。本方法の非−限定的な実施態様は、対象由来の材料の試料を含むＦＡＳの使用を含む。ある実施態様では、試料を含むＦＡＳは、血液又は血清のような体液を含む。他の非−限定的な実施態様では、試料を含むＦＡＳは、対象由来の１以上の肝細胞、肝細胞のホモジネート、又はＦＡＳ含有肝細胞抽出物を含む。
【００１２】
ある実施態様では、試料は、肝臓症状を有すると考えられる、信じられる又は予測される対象由来でよい。あるいは、対象は、かかる症状を有すると予想され得る。他の実施態様では、対象は、癌がないと予測される、考えられる、信じられる又は診断される対象でよい。更なる別の実施態様として、対象は、高いＦＡＳ発現によって特徴付けられる肝障害とすでに診断されたものでもよく、本開示の方法は、診断のための更なる根拠を確認又は提供するために使用される。
【００１３】
更なる実施態様では、ＦＡＳ発現を検出又は測定する方法は、対象の肝臓においてＦＡＳの高いレベルを決定又は同定するために使用され得る。あるいは、本方法は、対象の肝臓における、高くない又は通常のＦＡＳレベルを決定又は同定するために使用され得る。ＦＡＳレベルは、肝臓疾患又は肝臓病状のない対象からの試料中のＦＡＳレベルと比べて、高い又は高くないと決定され得る。
【００１４】
本方法のある実施態様は、そこにＦＡＳ発現レベルを反映する試料中の１以上の成分を検出又は測定することに基づく。ある場合には、該成分は、ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントでよい。かかる実施態様では、本方法は、ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントに結合する試薬の使用を含むことがある。他の実施態様では、該成分は、ＦＡＳ発現を反映する細胞因子又は中間体でよい。かかる実施態様では、本方法は、該因子又は中間体を検出又は測定するための１以上の試薬の使用を含むことがある。非−限定的な例として、該成分は、ｍＲＮＡをコードするＦＡＳタンパク質でよく、該試薬は、ｍＲＮＡを検出するための核酸プローブでよい。あるいは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のための試薬の組合せ、例えばプライマー及びプローブ分子が使用され得る。更なる別の例は、例えばｍＲＮＡの逆転写後のＦＡＳ  ｃＤＮＡを検出するための、定量的ＰＣＲの使用である。
【００１５】
別の局面では、本開示は、ＦＡＳの検出又は測定レベルに基づいて、肝臓症状の存在又は不存在を診断する方法を含む。ある実施態様では、該診断は、高いＦＡＳ発現に基づく肝臓疾患又は病状の存在についてのものでよい。他の実施態様では、該診断は、高いＦＡＳ発現に基づく肝臓疾患又は病状の不存在についてのものでよい。肝臓疾患又は症状の非−限定的な例は、脂肪性肝炎（又は非アルコール性脂肪性肝炎、ＮＡＳＨ）；アルコール性肝炎；肝臓毒性；肝臓のウイルス感染症又はウイルス性肝炎；自己免疫肝炎；突発性肝硬変；低灌流後の肝臓壊死；及び他の疾患から起こる肝炎又は続発性ＮＡＳＨを含む。
【００１６】
更なる局面では、本開示は、検出又は測定されたＦＡＳ発現レベルに基づいて対象の肝臓における脂肪蓄積を診断する方法を含む。ある実施態様では、対象の肝臓における脂肪蓄積の存在の診断は、高いＦＡＳ発現に基づく。あるいは、対象の肝臓における脂肪蓄積の不存在の診断は、ＦＡＳ発現の高くないレベルの検出又は測定に基づいてもよい。ある実施態様では、これらの方法は、肝臓炎症の検出又は測定と組み合わせて使用され得る。炎症の不存在は、脂肪症の存在の指標であり、一方、肝細胞損傷に関連した肝小葉中の急性炎症病巣のような炎症の存在は、脂肪性肝炎の存在の指標である。門脈三管の中程度の慢性炎症は脂肪症患者に存在し得ることが報告されている。
【００１７】
更なる局面では、本開示の方法は、差異的診断方法の一部としての他の医学的方法又は臨床的方法と組み合わせて使用され得る。かかる方法は、他の可能な疾患症状を含む又は除くことによって、医学的診断プロセスを進めるための他のアッセイと組み合わせた、本明細書に記載のＦＡＳ関連アッセイの実施を含むことがある。
【００１８】
なお更なる局面では、本開示は、本明細書に記載の肝臓症状の診断に基づいて処置又は治療を選択又は適用する方法を含む。ある実施態様では、該処置又は治療は、診断された症状の症候又は局面を緩和又は改善するための、当業者に知られた又は当業者によって考慮されているものである。非−限定的な例は、臨床医又は他の医療従事者によって認識されており、そして診断された疾患又は病状に対して有益であると考えられている又は知られている、処置又は治療を含む。
【００１９】
なお更なる局面では、本開示は、本明細書に記載の対象由来の生物材料の試料を調製する方法を含む。該調製は、当業者に公知の任意の手段又は方法でよい。ある実施態様では、生物流体の試料は、調製され、次いで本明細書に開示された方法において使用される。他の実施態様では、肝細胞を含む試料又はそれから得られる材料は、本明細書に記載の方法で調製され、使用され得る。
【００２０】
本開示は、本明細書に開示された方法の実施のための組成物を更に含む。非−限定的な実施態様は、ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントの検出のための、あるいは核酸をコードするＦＡＳの検出のための試薬を含む。当然のことながら、１以上のかかる試薬を含む組成物も開示されている。更なる材料は、ＦＡＳ発現を検出するための試薬、及び該試薬によって結合されたリガンドを含む複合体を含む。該試薬及びリガンドは、本開示の複合体がかかる「結合対」を含み得るように、本開示の「結合対」を形成する。リガンドの非−限定的な例は、該試薬によって結合されている生物流体又は肝細胞中の成分及び分子を含む。ある実施態様では、該複合体は、該リガンドを用いて通常見出される１以上の分子から単離又は精製される。
【００２１】
更なる実施態様の詳細は、添付図面及び以下の説明に記載されている。実施態様の他の特徴、目的及び利点は、図面及び詳細な説明から、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２２】
定義
本明細書で使用される用語「肝臓症状」及びその変形は、正常な又は疾患のない個体でない対象における肝臓の症状を言う。該症状は、異常な肝臓の症状又は望ましくない生理学的状態の症状でよい。１つの非−限定的な例は、脂肪肝である。該用語は、肝臓疾患及び肝臓病状のような症状を更に含む。
【００２３】
本明細書で使用される「肝臓疾患」及びその変形は、その正常なレベル又は特徴的機能を妨げる対象における肝臓の症状を言う。場合によっては、該妨害は、肝臓機能の中断、停止又は障害である。他の場合には、該妨害は、肝臓機能の誤ったもしくは異常なレベル又は性質である。疾患は、対象における遺伝的因子又は状態、あるいは１以上の病因的物質の結果であり得る。
【００２４】
本明細書で使用される用語「肝臓病」及びその変形は、肝細胞及び／又は組織の検査によって同定され得る構造成分を含む肝臓の疾患症状を言う。病状は、通常、組織、臓器及び／又は体液の試験によって同定され得る状態又は症状である。この試験は、場合により染色及び／又は免疫組織化学によって補強される、顕微鏡下のような外観検査に基づき得る。
【００２５】
本明細書における「脂肪性肝炎」は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及びアルコール性脂肪性肝炎の療法を含む。
【００２６】
用語「ヒト脂肪酸合成酵素」又は「ＦＡＳ」は、米国特許第５，７５９，７９１号明細書及びそれが依拠する特許出願において癌関連抗原として先に同定されたポリペプチドを言う。この抗原は、当該分野では、ＯＡ−５１９とも称され、脂肪酸合成酵素（Ｅ．Ｃ．２．３．１．８５）として、国際生化学分子生物学連合の命名法委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）によって定義されており、www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/に記載されている。該用語は、本開示の抗体によって認識されている、アミノ酸配列、むしろ任意のｈＦＡＳ又はフラグメントによる特定のヒト脂肪酸合成酵素に限定されない。該用語はまた、細胞内、並びに細胞外の環境及び体液において見られる細胞を含まない形態に留まる、完全長配列のフラグメントを含む、ｈＦＡＳタンパク質又はペプチドを言う。場合によっては、完全長ｈＦＡＳのフラグメントは、完全長ｈＦＡＳの（完全長ｈＦＡＳに固有の）指標であるものである。本明細書で使用される用語「ＦＡＳポリペプチド」、「ＦＡＳペプチド」及び「ＦＡＳタンパク質」は、全体としてＦＡＳのすべて又は部分であるアミノ酸残基のポリマーを言う。これらの用語は、該ポリマーが全体としてその機能、例えば本開示の抗−ＦＡＳ抗体によって認識される機能、を保持するように保存的アミノ酸置換を含むポリマーも包含する。
【００２７】
用語「含むこと」は、直接的な物理的関連性における置換、例えば、２つの成分（ｈＦＡＳポリペプチドと本開示の抗体）の複合体の形成が起こるように、ｈＦＡＳポリペプチドによる本開示の抗体の置換、を意味する。
【００２８】
用語「高いＦＡＳレベル」又はその変形は、試料又は他の材料中のＦＡＳポリペプチドもしくはＦＡＳポリペプチドを含む複合体の存在又は不存在の定性的又は定量的評価に関する。該用語は、例えば、参照細胞又は試料（正常対象由来の細胞又は試料を含む）中のバックグラウンドノイズ又はレベルを超えるレベルに限定されない、特定のレベルを超えるＦＡＳオリゴヌクレオチドの存在の検出も考慮し得る。本明細書で使用されるＦＡＳポリペプチドのレベルを「決定すること」又は「検出すること」の使用は、定量的又は半−定量的レベルでのポリペプチド量の評価を言う。該評価は、絶対的に正確である必要はないが、その代わり、近似し得る。
【００２９】
用語「複合体」、「結合」、「連結」及びそれらの変形は、少なくとも１つの共有結合の形成による２つの構成要素の物理的結合を言う。ある状況では、それらは、２つのポリペプチドの、１つの接触したポリペプチド分子への作製を言う。本開示の文脈では、該用語は、固相物質の表面を含む固相支持体又は他の固相物質及び別の分子への抗体部分の結合についての言及を含む。共有結合の形成は、結合を形成するための化学反応の使用によるものでよい。用語「支持体」は、慣用的支持体、例えば、ビーズ、粒子、ディップスティック、繊維、フィルタ、膜、及びシラン又は硝子スライドのようなシリケート支持体を言う。本開示の複合化抗体は、標識に結合されている抗体を含むが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、正常対象と比べた乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌及び結腸癌を有する患者における血清ＦＡＳレベルを説明する。正常男性は、ｎ＝１０の時、０．２１＋０．２７ｎｇ／ｍｌの結果を意味する（平均±標準偏差）。正常女性は、ｎ＝２０の時、０．４５＋０．６７ｎｇ／ｍｌの結果を意味する（平均±標準偏差）。「卵巣］は、ｎ＝１３の時の卵巣癌を言う。「胸］は、ｎ＝１２の時の乳癌を言う。「結腸］は、ｎ＝１０の時の結腸癌を言う。「前立腺］は、ｎ＝１３の時の前立腺癌を言う。「肺］は、ｎ＝１１の時の肺癌を言う。男性及び女性の正常上限は、１．０２及び２．４６ｎｇ／ｍｌ（平均＋３標準偏差）である。
【図２】図２は、３８人（ｎ＝３８）の肥満対象由来の肝生検における脂肪症及び脂肪性肝炎に関連したＦＡＳ発現を説明する。パートＡは、ｐ＜０．０００１  片側ＡＮＯＶＡ、及び＊＊＊が両側ｔ−検定によるｐ＜０．００１を示す場合の、脂肪肝スコア−対−脂肪性肝炎スコアのプロットを示す。パートＢは、ｐ＜０．０１１  片側ＡＮＯＶＡ、＊がｐ＜０．０５、＊＊＊が両側ｔ−検定によるｐ＜０．０１を示す場合の、ＦＡＳ発現スコア−対−脂肪肝スコアのプロットを示す。パートＣは、ｐ＜０．０００３  片側ＡＮＯＶＡ、＊＊が０．０１両側ｔ−検定によるｐ＜０．０１を示す場合の、ＦＡＳ発現スコア−対−脂肪性肝炎スコアのプロットを示す。
【図３】図３は、正常肝臓、脂肪症、脂肪性肝炎及び肝硬変の試料中のＦＡＳ発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
開示の実施の形態の詳細な説明
本開示は、対象における肝臓症状の検出のための方法及び組成物を含む。該症状の検出は、対象における疾患の診断及び／治療を改善するために使用され得る。本方法は、例えばあるレベル以上のＦＡＳ発現の検出によって定量的方法で行われ得る。あるいは、本方法は、例えばＦＡＳ発現のレベル又は量の測定によって定量的方法で行われ得る。
【００３２】
本開示は、対象の肝臓における高いＦＡＳを検出する方法を含む。ある実施態様では、本方法は、１以上の肝細胞におけるＦＡＳ発現の分析を含むことがある。他の実施態様では、本方法は、肝臓から放出されたＦＡＳの分析、例えば対象の体液中のＦＡＳの分析を含みことがある。体液が血清である実施態様では、ＦＡＳレベルは、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、総ビリルビン、総タンパク質又はアルブミンのレベルと相関しないものとして本明細書に開示されている。更なる実施態様では、血清は、４℃で約１、約１〜２、約２、約２〜３、約３、約３〜４又は約４日間保存されている。
【００３３】
分析の非限定的な例は、対象の肝臓におけるＦＡＳ発現又はＦＡＳレベルを検出又は測定することを含む。該検出又は測定は、例えばＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントの検出によって直接的になされる。あるいは、該検出又は測定は、例えばＦＡＳ発現の中間的指標によって間接的になされる。
【００３４】
上記検出又は測定は、試料、例えば対象由来の１以上の肝細胞の試料又は対象由来の試料もしくは体液についてのものでよい。ある実施態様では、対象はヒトである。他の実施態様では、対象は、非−ヒト動物であり、例えば代謝性肝臓症候群に罹患した非−ヒト動物である（Hansen, RJ. et al. "Avian fatty liver hemorrhagic syndrome: a comparative review." Adv Vet Sci Comp Med 37: 451-468, 1993参照）。非限定的な例は、トリ（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ及び他の農業的に重要な家禽種）、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ及び他の農業的に重要な四足動物）、及びヒトとの交友のための動物（例えば、ネコ、イヌ等）を含む。
【００３５】
ある実施態様では、対象はヒト患者であり、例えば一般的に肥満人の血清ＦＡＳレベルよりも低い血清ＦＡＳレベルを有する非−肥満患者である。従って、非−肥満人の高い血清ＦＡＳレベルは、脂肪症又は脂肪性肝炎の存在を示す。更に、肝臓疾患又は肝臓病状を有する肥満人は、一般的に、同一の疾患又は病状を有する非−肥満人よりも高い血清ＦＡＳレベルを有する。従って、炎症肝臓疾患、例えばウイルス肝炎を有する患者における高い血清ＦＡＳレベルは、炎症疾患に加えて脂肪症又は脂肪性肝炎の存在を示し得る。
【００３６】
更なる実施態様では、対象の高いＦＡＳ発現は、肝臓、より具体的には肝細胞による増加した発現が原因となる。従って、ある実施態様では、対象は、検出可能な又は測定可能な高いレベルの発現の原因となる、ＦＡＳ発現の他の起源を有さない。増加したＦＡＳ発現の別の起源の非限定的な例は、癌又は他の悪性腫瘍の場合に見られる。従って、ある実施態様では、対象は、癌又は悪性腫瘍に罹患していない又はこれらを有さないと考えられるものである。別の言い方をすれば、対象は、癌であると診断された、又は癌であると決定されたもしくは予想されたものである。従って、本開示の実施態様は、対象の肝臓における高い脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）を検出する方法である。該方法は、癌がないと予測された又は診断された対象由来の体液試料中の脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）のレベルを検出又は測定すること含む。
【００３７】
本明細書に開示されている試料中の高いＦＡＳレベルは、該対象の肝臓における高いＦＡＳを示す。理論に拘束されるものではなく、及び本開示の理解を助けるために提供されるものではないが、本明細書に記載の局面及び実施態様は、非限定的な例として脂肪症及び脂肪性肝炎のような肝臓症状を有する対象において高いＦＡＳ発現が起こるという認識に一部基づいている。従って、及び肝臓症状を有する対象において、高いＦＡＳ発現の検出及び測定は、該症状の存在を示すために使用され得る。従って、この高いレベルは、対象における該症状の存在のマーカー又は指標であり得る。
【００３８】
脂肪症及び脂肪性肝炎に見られるＦＡＳ発現の増加は、脂肪蓄積の起源が肝臓におけるデノボ合成から少なくとも部分的に生じることを示す。従って、本開示は、１以上の肝細胞、肝細胞のホモジネート又はＦＡＳ含有肝細胞抽出物の試料中のＦＡＳ発現を検出又は測定することによって、脂肪肝又は脂肪症として知られている肝臓症状を検出する方法も含む。
試料は、肥大肝臓を有する及び／又は脂肪症を有することが見いだされた又はそのように診断された対象からの試料でよい。かかる試料は、ＦＡＳ発現に基づいて脂肪症を有する又は罹患しているとして対象を診断又は同定する方法において使用され得る。他の実施態様では、脂肪症を有する対象における高いＦＡＳレベルは、肝生検によって同定されない脂肪性肝炎の存在を示すことがある。本開示の方法は、肝生検と組み合わせて使用される同一の基準によって、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）とアルコール性脂肪性肝炎とを当業者に識別させることができる。
【００３９】
本開示は、肝臓から放出されたＦＡＳを検出又は測定することによって脂肪性肝炎として知られている肝臓症状を検出する方法を更に含む。ある実施態様では、該放出は、血清のような体液にＦＡＳを遊離する肝細胞損傷に因る。本方法は、体液中の高いＦＡＳレベルに基づいて、脂肪性肝炎を有する又はそれに罹患している対象を診断又は同定するための体液試料の分析を含み得る。従って、１つの非限定的な実施態様は、脂肪性肝炎の存在を示す高いＦＡＳレベルを検出又は測定するために対象由来の血清試料の使用を含む。場合により、本方法は、本明細書に記載の肝臓癌又は脂肪症の検出のような１以上の追加のアッセイを組み合わせて行われる。
【００４０】
関連する局面では、本開示は、肝臓中のＦＡＳ発現を検出又は測定する方法を含む。ある実施態様では、該方法は、肝細胞、肝細胞のホモジネート又はＦＡＳ含有肝細胞抽出物を含む試料中のＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントの量を検出又は測定することを含み得る。場合により、試料は、針生検のような肝生検のすべて又は一部である。ある実施態様では、試料は、例えば免疫組織化学的方法によるＦＡＳレベルの検出前に、癌の存在について選別される。試料はまた、例えば、通常のヘマトキシリン及びエオシン染色、次いで分析によって、脂肪症の存在について選別され得る。
【００４１】
他の実施態様では、該方法は、対象の体液試料中のＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントの量を検出又は測定することを含み得る。本明細書で使用されるＦＡＳタンパク質フラグメントは、ＦＡＳタンパク質の存在又はレベルの指標であるＦＡＳタンパク質の一部である。ある実施態様では、該フラグメントは、ＦＡＳタンパク質も検出する試薬によって検出される。
【００４２】
ある実施態様では、ＦＡＳ発現の検出された又は測定されたレベルは、肝臓症状のない及び肝臓疾患又は病状のない正常な対象におけるＦＡＳ発現に比較して高いことが検出されうる。他の実施態様では、該比較は、正常なＦＡＳの生理学的発現を有する対象においてなされてよい。
【００４３】
開示された方法がＦＡＳ発現のレベルを決定することを含む場合には、該レベルは、肝臓症状のない対象におけるレベルに対して上昇していると決定され得る。このことは、試験される対象を、肝臓疾患又は病状のような肝臓症状を有するとして同定させる。あるいは、該レベルは、肝臓疾患又は病状を有さない対象におけるレベルと比べて同一又は高くないと決定され得る。このことは、試験される対象を、肝臓症状を有さないと同定する。
【００４４】
そのため、本開示の実施態様は、ＦＡＳ発現の分析によって、対象における肝臓疾患又は病状のような肝臓症状の存在又は不存在を同定する方法を含む。該方法は、以下：
対象由来の体液中の脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）のレベルを検出又は測定すること、ここで、
ｉ）肝臓疾患又は病状を有さない対象におけるレベルに比べて高いＦＡＳのレベルは、該対象の肝臓症状の存在を同定し、及び
ｉｉ）肝臓疾患又は病状を有さない対象におけるレベルに比べて同一であるＦＡＳレベルは、該対象の肝臓症状の不存在を同定する、
を含み得る。
【００４５】
ある実施態様では、対象は、高いＦＡＳレベルによって特徴付けられる肝臓疾患又は病状、例えば非アルコール性脂肪性肝炎又はアルコール脂肪症を含む脂肪性肝炎に罹患していると予想される。他の実施態様では、該疾患又は病状は、例えば肝臓毒性；肝臓のウイルス感染症又はウイルス肝炎；自己免疫肝炎；突発性肝硬変；低灌流後の肝臓壊死；及び他の疾患から起こる肝炎のようなＦＡＳの高いレベルによって特徴付けられない。
【００４６】
開示された方法では、対象は、血清又は１以上の他の体液中のＦＡＳを上昇させる１以上の追加の症状と整合する脂肪肝を有する可能性がある。ＦＡＳの上昇が脂肪由来である場合に、追加の症状（複数）は、本明細書に記載の肝臓症状である。ＦＡＳ上昇が非−肝臓源由来である場合には、当業者は、脂肪肝症状を、当該分野で公知の方法、非限定的例として肝臓の例えば組織学的（又は組織病理学的）検査によって、非−肝臓症状と識別し得る。
【００４７】
該疾患又は病状が肝臓毒性である態様では、外因性の薬物又は化学物質への対象の曝露に原因があるかもしれない。場合によっては、該薬物又は化学物質は、テトラサイクリン又は四塩化炭素である。あるいは、該疾患又は病状がウイルス感染症又はウイルス肝炎である態様では、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤ型肝炎から選ばれるウイルスの結果でよい。他の実施態様では、該ウイルスは、サイトメガロウイルス又はヘルペスウイルス、あるいは全身性又は局所的なウイルス感染である。
【００４８】
該疾患又は症状が自己免疫関連又は自己免疫系である態様では、全身性紅斑性狼瘡、強皮症又はＣＲＥＳＴ症候群、又は他の自己免疫疾患に因るかもしれない。該疾患又は症状が低灌流後の肝臓壊死である場合には、重度の低血圧、肝臓に対する機械的傷害、又は血管性易感染（compromise）でよい。あるいは、該疾患又は症状は、潰瘍性大腸炎、クローン病、又は硬化性胆管炎に因るかもしれない。
【００４９】
更なる実施態様では、該疾患又は病状は、悪性疾患由来の肝臓の限局性又はびまん性浸潤でよい。かかる悪性疾患の非限定的例は、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、又は他の原発性もしくは転移性悪性腫瘍を含む。
【００５０】
本明細書に記載されているように、開示された方法は、ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントに結合する試薬の使用によって実施され得る。ある実施態様では、該試薬は、ヒト脂肪酸合成酵素（ｈＦＡＳ）に対する抗体のようなＦＡＳに対する抗体である。本明細書で使用される「抗体」は、特定の抗原と免疫学的に反応する、免疫グロブリン分子及びそのフラグメントを言う。場合によっては、抗体は、ヒト癌細胞由来のＦＡＳと反応し、同時に非−形質転換細胞由来の肝臓ＦＡＳとも反応する。場合によっては、モノクローナル抗体、又はそのＦＡＳ結合フラグメントは、開示された方法において使用され得る。
【００５１】
用語「抗体」は、多数のかかる分子を言い、抗体の単一種の相同な集団に限定されない。用語「抗体」はまた、遺伝子工学的に作製された形態、例えばキメラ抗体（例えば、ヒト化ネズミ抗体）、ヘテロ複合性抗体（例えば、二重特異的抗体）、及び組換え単一鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、及び二流化安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖフラグメントを含む（例えば米国特許第５，７４７，６５４号明細書参照）。用語「抗体」はまた、抗体の抗原結合形態を含む（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｒｌｇＧ）。また、Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, III)参照。用語「抗−ｈＦＡＳ」は、ｈＦＡＳに対して作製される抗体を言う。
【００５２】
本明細書に記載のＦＡＳ又はｈＦＡＳと免疫学的に反応する抗体は、ＦＡＳ又はｈＦＡＳポリペプチドで抗体産生動物を免疫するような公知の方法によって作製され得る。モノクローナル抗体は、当業者に知られている様々な技術によって得られる。かかるモノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えばStites他 (著) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4TH ED.)、Lange Medical Publications, Los Altos, Calif.、及び本明細書に引用された文献; Harlow & Lane, 前掲; Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2D ED.), Academic Press, New York, N.Y. (1986); Kohler & Milstein, Nature 256:495497 (1975); 並びに特に1つの非限定的なモノクローナル抗体の作製方法を考察するChowdhury, P. S., et al. Mol Immunol. 34:9 (1997) に見られる。
【００５３】
モノクローナル抗体を調製する方法は、所望のイムノゲン、この場合、ＦＡＳポリペプチド、をコードする核酸配列で動物を免疫することを含む。この方法は、タンパク質系免疫を超える少なくとも２つの利点を有する；タンパク質精製の必要性を回避すること、及びイムノゲンの適当な転写後修飾の高い可能性。
【００５４】
ある実施態様では、抗体は、ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントに「特異的」であるか、又はＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントと「特異的に免疫反応する」ものを言う。これらの用語は、ヒトＦＡＳ又はそのフラグメントのようなＦＡＳへの結合反応において反応する抗体の能力を言う。該反応は、他のタンパク質、細胞又は物質の存在下でＦＡＳの存在又は量の決定因子であり得る。本明細書に開示された非限定的条件を含む当業者によって望まれるアッセイ条件下で、抗体は選択的にＦＡＳと結合し、試料中の他の因子には有意に又は検出可能な方法においては結合しない。本開示の非限定的な実施態様は、抗体又はそれ由来の別の形態が、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は少なくとも１０倍から１００倍であるシグナルを生じるように選択的に結合する条件を利用する。
【００５５】
本開示のＦＡＳ特異的抗体の別の形態は、当業者に公知の方法によって容易に製造され得る、抗体の抗原結合フラグメントを製造する能力は、よく知られており、本明細書に開示の使用のための二価Ｆ（ａｂ’）２及び一価Ｆａｂフラグメントを製造するために利用される。本明細書で使用される「Ｆａｂ」は、少なくとも機能的に完全な軽及び重鎖可変ドメインを含む抗体の二重鎖結合フラグメントを言う。更に、抗体の、ハイブリッド、キメラ、改変、組換え（単一鎖を含む）、又はヒト化の形態の製造方法も、当業者に知られている。これらの抗体形態は、本明細書に開示の抗体の誘導体及びモノクローナル抗体と考えられる。
【００５６】
ある実施態様では、別の形態は、「単一鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」であり、典型的な２つの鎖抗体の重鎖及び軽鎖が単一結合部位を有する１つの鎖を形成するように結合されている、抗体を言う。典型的には、リンカーペプチドは、活性結合部位を形成するために、可変領域の適当な折り畳み及び位置付けを可能にする２つの鎖間に置かれる。用語「リンカーペプチド」は、可変軽鎖に可変重鎖を間接的に結合するために役立つ抗体結合フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント）内のポリペプチド鎖を言う。
【００５７】
より一般的には、「リンカー」は、該抗体を他の分子に結合するために使用される分子である。リンカーは、抗体及び他の分子に対して共有結合を形成することができる。
好適なリンカーは、当業者によく知られており、直鎖又は分岐鎖リンカー、ヘテロ環状炭素リンカー、又はペプチドリンカーを含むが、これらに限定されない。抗体及び他の分子がポリペプチドである場合には、リンカーは、その側鎖基を介して（例えば、システインへのジスルフィド結合を介して）構成アミノ酸に結合され得る。あるいは、リンカーは、末端アミノ酸のα炭素アミノ及びカルボキシル基に結合される。
【００５８】
追加の誘導体は、他の化学部分に複合化されている、本開示の抗体及びその別の形態を含む。非限定的な例は、標識された抗体又はその別の形態を含む。用語「標識」、「検出可能に標識された」又は「検出可能なマーカーで標識された」は、「標識された」分子の存在を示すために、（直接的又は間接的に）検出され得る抗体組成物を言う。検出は、定量的又は定性的になされる。従って、標識は、標識分子の存在を示す検出可能なシグナルであり、本開示の標識された抗体は該標識によって検出され得る。好適な標識は、結合ペア（例えば、ビオチン−アビジン、又はビオチン−ストレプトアビジン結合ペア）、放射性同位体、クロモフォア、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びＥＬＩＳＡで通常使用される他のもの）、基質、色素、蛍光分子（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、化学発光部分、磁性粒子又はビーズ、生物発光部分、熱量標識、例えば金コロイド等、の１つのメンバーを含む。そのようなわけで、標識は、分光的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、電気的、光学的、又は化学的手段によって直接的又は間接的に検出可能な任意の組成物である。ある実施態様では、標識は、外観検査、例えば肉眼によって検出され得る目に見えるシグナルをつくる。
【００５９】
かかる標識を検出するための手段は、当業者によく知られている。例えば、放射性標識は、写真フィルム又はシンチレーションカウンタを用いて検出され、蛍光マーカーは発光されたイルミネーションを検出するために光検出器を用いて検出され得る。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を与えることによって、基質上の酵素作用によって製造される反応生成物を検出することによって検出され、そして熱量標識は、単に着色標識を視覚化することによって検出される。
【００６０】
本開示の抗体及びその別の形態は、例えばガラス、プラスチック、合成膜に限定されない固相支持体に、公知の方法及び手段によって複合化されてもよい。１つの非限定的な例は、ビーズ、粒子、ディップスティック、繊維、フィルタ、ペトリ皿、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着剤アッセイ）プレート、マイクロタイタープレート、シリコン又はシリケート支持体、例えばガラススライド、及びディッシュ、ウェル又は容器、並びにそのスライドを含む。抗体のかかる固体化形態は、本明細書に開示された検出方法において使用され得る。
【００６１】
本開示の抗体及びその別の形態も組成物に調合され得る。該組成物は、ＦＡＳ又はそのフラグメントの検出のための１以上の他の試薬を更に含み得る。非限定的な例は、その同系ＦＡＳに結合された抗体及び抗体の組合せと、抗体系検出法における使用のための他の試薬との複合体を含む。他の例は、他のＦＡＳ結合抗体又は検出試薬との混合物を含む。抗体及びその別の形態と、他の検出物質との組合せは、ＦＡＳを検出するために使用される試験装置のような製造物品の一部でもよい。
【００６２】
ＦＡＳ又はそのフラグメントを検出又は測定するために使用される方法は、設計によって限定されない。非限定的な例は、本開示の抗体、及び本明細書に記載のその別の形態を利用し、そしてウェスタンブロッティング又は他のイムノブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ラテラルフロー装置、サンドウィッチアッセイ、顕微鏡による外観観察、競合的及び非−競合的イムノアッセイ、免疫酵素アッセイ、免疫蛍光、免疫磁性選択、及びフローサイトメトリー（ポリクロマチンフローサイトメトリーによる検出を含む）に基づく方法を含む。更なるイムノアッセイ形式は、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkによって記載されている。本開示の方法は、試料又は本明細書に記載の「試験試料」中のＦＡＳの存在又は不存在を定性的又は定量的に検出又は測定するために利用される。
【００６３】
本明細書で使用される「試料」又は「試験試料」は、高いＦＡＳ又は検出可能な兆候として高いＦＡＳを含む症状を有すると予想される個体から単離された試料を言う。あるいは、該用語は、ＦＡＳの存在を確認し又はその量を定量するために、開示された検出方法において対照として使用するための又は開示された検出方法において使用するための、ヒトＦＡＳのようなＦＡＳを含むことが知られている試料を言う。試料は、細胞含有試料の場合に生検及び針生検、及び血清含有試料の場合に血液回収、を含む好適な手段によって回収され得る。本開示の試料は、非限定的な例として肝細胞のホモジネート又は抽出物でもよい。試料は、アッセイされる前の試料希釈を伴う希釈のような血清の希釈でもよい。希釈は、当業者によって望まれる任意の好適な溶媒でよい。
【００６４】
１つの実施態様では、本開示の方法は、ＦＡＳ又はそのフラグメントに結合してそれとの複合体を形成する捕獲試薬の使用に基いている。捕獲試薬は、本明細書に記載のモノクローナル抗体又はその別の形態でよい。あるいは、捕獲試薬は、多数のＦＡＳ及び他の細胞成分に結合するポリクローナル抗体又は組換え抗体を含むがこれらに限定されない、ＦＡＳに結合する別の抗体でよい。捕獲試薬は、場合により本開示の試料と接触する前に固相支持体に固定され得る。それは、本開示の抗体について本明細書に記載されている。当然のことながら、抗体のみよりもむしろ、ＦＡＳタンパク質とＦＡＳ特異的抗体との複合体に結合する捕獲試薬も、本開示の実施において使用され得る。
【００６５】
捕獲試薬と共に使用される場合も又は使用されない場合も、本開示はまた、その存在又は量が直接的又は間接的に指摘される、ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントに結合する検出試薬を含む。検出試薬は、ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントに結合する、本開示の抗体又はその別の形態でよい。結合に際して、結合試薬は、その結合パートナーとの結合複合体を形成する。結合試薬は、同系の結合パートナーの存在又は量、従ってＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントが検出試薬の結合後に標識によって顕在化されるように、検出可能に標識され得る。あるいは、検出試薬は、検出可能に標識された二次的物質によってそれ自体結合される。
【００６６】
捕獲試薬と組み合わせて使用される場合に、捕獲試薬、ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメント及び検出試薬を含むサンドウィッチ複合体が形成される。このサンドウィッチ複合体は、複合体が検出試薬に曝露されてサンドウィッチ複合体を形成する、捕獲試薬及びＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントを含む複合体の形成によって先行される。あるいは、サンドウィッチ複合体は、複合体が次いで捕獲試薬に曝露されてサンドウィッチ複合体を形成する、検出試薬及びＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントを含む複合体の形成によって先行されてもよい。サンドウィッチ複合体及び他の形式の特異性は、捕獲試薬、検出試薬又はその両方のいずれかによって導入され得る。
【００６７】
本開示の実施態様は、捕獲試薬と検出試薬との以下の組合せの使用を含む：
ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントに結合するポリクローナル抗体、及びＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントに結合するモノクローナル抗体；
ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントを含む複合体に結合するポリクローナル抗体、及びＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントを含む複合体に結合するモノクローナル抗体；
ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントに結合するモノクローナル抗体、及びＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントに結合するポリクローナル抗体；
ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントに結合するモノクローナル抗体、及びＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントを含む複合体に結合するポリクローナル抗体；並びに
ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントに結合するモノクローナル抗体、及びＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントに結合するモノクローナル抗体。
【００６８】
本開示の方法はまた、実施態様としての競合的結合アッセイを含む。これらは、本明細書に記載の検出試薬及び／又は捕獲試薬及びアナローグへの結合を競走する、ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントの標識形態の、当該分野で公知の競合的アッセイ法への使用を含む。本開示によって提供される方法は、全体的に又は部分的に自動化してよい。
【００６９】
本開示の方法において使用するための材料は、理想的には、周知の手段に従って製造されたキットの調製に適する。本開示は、本明細書に記載の試料中のＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントの検出及び／又は定量のための試薬を含むキットを含む。かかるキットは、場合により、該キットの使用に関連する識別記載もしくはラベル又は教示と共に、物質及び／又は試薬、あるいは、本開示の方法におけるキットの好適性を含む。かかるキットは、容器を含んでもよく、その各々は、例えば検出試薬及び／又は捕獲試薬の予備−固定化形態を含む、本方法において利用される１以上の様々な物質及び／又は試薬（場合により濃縮形態で）を含む。教示又は試薬識別のセットも、典型的に含められることになる。他の具体的なキットは、開示された方法（複数）の実施のための装置又は固相支持体を含み、それは、ラテラルフロー装置、テストストリップ、ビーズ、膜、又はコートされた容器表面、ディッシュ又はウェルに限定されない。
【００７０】
本キットは、場合により、対照試料、例えば免疫反応性ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントの公知の試料、を含んでもよい。対照は、試料を希釈するために使用され、外的対照として使用されるか又は実際の試料に加えられ、及び内部対照として使用される、試料希釈を有する希釈のための公知の量で、場合により試験される試料種との関連でアッセイの感度を決定するために使用するための公知の量で存在し得る。
【００７１】
従って、本開示の実施態様は、ＦＡＳ結合抗体又はそのＦＡＳ結合フラグメントとＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントとの複合体の形成、次いでその検出又は測定を含む、方法を含む。ある実施態様では、該複合体は、ＦＡＳ結合抗体又はそのＦＡＳ結合フラグメントを、ＦＡＳタンパク質又はそのフラグメントを含むことがある試料と接触させることによって形成され得る。ＦＡＳが試料中に存在する場合には、この接触は該複合体の形成を可能にする条件下で起こる。本明細書に開示されているように、試料は、試料もしくは体液の試料を含むか又はそれから得られる肝細胞でよい。更なる実施態様では、試料はＦＡＳを含む陽性対照でよい。
【００７２】
ある場合には、検出又は測定は、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は放射免疫アッセイの使用によって行われる。あるいは、検出又は測定は、ラテラルフロー装置の固相成分上で上記の複合体が単離され得る、ラテラルフロー装置の使用によって行われる。
【００７３】
別の局面では、本開示は、対象の肝臓において脂肪蓄積を検出する方法を含む。ある実施態様では、本方法は、１以上の肝細胞、肝細胞のホモジネート又は対象由来のＦＡＳ含有肝細胞抽出物を含む試料中のＦＡＳ発現を検出又は測定することを含み得る。ＦＡＳ発現のレベルは、本明細書に記載のように高いことが決定され得る。高レベルは、対象の肝臓におけるデノボ合成脂肪の蓄積を示すために使用され得る。
【００７４】
更なる実施態様では、本方法は、肝臓炎症及び／又は肝細胞損傷を検出することを更に含むことがある。炎症又は損傷の不存在は脂肪症の存在を示し、一方、炎症又は損傷の存在は脂肪症肝炎の存在を示す。
【００７５】
更なる実施態様では、脂肪蓄積の存在を示すＦＡＳ発現の高いレベルはまた、総肝臓重量の約５％超又は総肝小葉中の肝細胞の約３０％超が脂肪蓄積される、ことを示すために使用され得る。
【００７６】
開示された方法は、更なる役割を含み得る。ある実施態様では、追加の役割は、対象へのＦＡＳ発現レベルの伝達である。他の実施態様では、追加の役割は、ＦＡＳ発現を検出又は測定するための報酬を要求又は受けることである。
【００７７】
本開示を一般的に記載してきたが、例証的方法によって提供され、そして他に特定しない限り、本開示の限定を意図するものではない、以下の実施例を参考に同一のものが容易に理解されるだろう。
【実施例】
【００７８】
実施例 1：
脂肪症、脂肪性肝炎及びＦＡＳ発現との関係を試験するために、モノクローナル抗−ヒトＦＡＳ抗体を用いて免疫組織化学的によって３８の肥満対象から針生検において、ＦＡＳ発現を試験した。脂肪症、脂肪性肝炎及びＦＡＳ発現は、０．５の区切りで０−４＋から半定量的にランク付けした。データの分析は、脂肪症及びＦＡＳ発現が３つのカテゴリーにうまく分類されることを示した：負の又は充分でない発現を示す０−０．５＋、軽程度〜中程度を示す１．０−２．５＋、及び強い発現を示す３．０−４．０。図２は、この試験の結果を示す。
【００７９】
図２、パネルＡは、脂肪性肝炎と脂肪肝との関係を比較する。予想されるように、脂肪肝を有さない患者（０−０．５＋）はほとんど脂肪性肝炎を有し、一方、顕著な脂肪症（３．０−４．０＋）を有する患者はｐ＜０．０００１の最も高レベルの脂肪性肝炎を有する（1-方向ANOVA分析，Prism 4.00 for Windows（登録商標）, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com）。これらの発見は、脂肪肝と脂肪性肝炎との公知の関係と一致する（２）。
【００８０】
図２、パネルＢは、脂肪肝（脂肪症）とＦＡＳ発現との関係を比較する。高い脂肪症とＦＡＳ発現との関係がある（ｐ＝０．０１１）。理論に拘束されるものではなく、本開示の理解を助けるために提案されるものではないが、これらの結果は、肝臓に蓄積された脂肪のいくらか又はほとんどが、脂肪組織から肝臓への脂肪酸の代表的な流動及び輸送よりもむしろ、肝臓内でのデノボ脂肪酸合成の生成物である、ことを示唆する。
【００８１】
図２、パネルＣは、ＦＡＳ発現と活性な脂肪性肝炎とを比較する。高いＦＡＳ発現と脂肪性肝炎の存在との強い関係がある（ｐ＝０．０００３）。従って、脂肪肝に類似して、ＦＡＳ発現はまた、脂肪性肝炎の存在と高い関係がある。理論に拘束されるものではなく、そして本開示の理解を助けるために提案されるものではないが、これらの結果は、脂肪性肝炎と高いＦＡＳの血中及び血清レベルとの関係がある、ことを示唆する。
【００８２】
実施例  ２：
図３は、ＦＡＳ発現と脂肪症、脂肪性肝炎及び肝硬変との関係を説明する顕微鏡写真群である。図３Ａは、脂肪症及び脂肪性肝炎の証拠のない組織学的に目立たない肝臓のホルマリン固定パラフィン埋没肝臓のヘマトキシリン及びエオシン染色切片である。３Ｄでは、正常な肝臓生検の好適な連続切片が、抗−ヒトＦＡＳマウスモノクローナル抗体で染色された。ＦＡＳ発現に対応するレンガ色染色によって注目される、この肝臓中のＦＡＳに対するわずかな反応性がある（矢印）。対照的に、図３Ｃは、重度の脂肪症を有する肝臓のヘマトキシリン及びエオシン染色切片である。肝細胞を詰め込むトリグリセリド溶滴を示す大きな丸い空間（矢印）は注目するべきである。このことは、大滴性胞脂肪症の例である。加えて、微小胞の脂肪症の１成分の指標である細胞質に「シャボン玉」外観を与える小液胞を有する数個の細胞がる。
【００８３】
図３Ｄは、同一の生検におけるＦＡＳの免疫組織化学を説明する。豊富なトリグリセリド（矢印）を有する細胞中のＦＡＳのための強力な細胞質染色は、３Ｄにおける正常肝臓と比べてＦＡＳ発現のアップレギュレーションを示し、注目するべきである。脂肪性肝炎は、図３Ｅに示されている。主に大滴性脂肪症の部位（矢印）における肝細胞中の炎症の病巣は注目するべきである。
【００８４】
３ＦにおけるＦＡＳのための免疫組織化学染色は、すべての肝細胞、炎症において捉えられる細胞においてさえＦＡＳのための強い細胞質染色を示す（矢印）。脂肪性肝炎を有する患者は、進行して、肝硬変を発症することがある。図３Ｃは、脂肪性肝炎の状況において発症した進行性肝硬変を有する患者由来のヘモキシリン及びエオシン染色生検である。肝硬変の結節性外観を生じるこれらの濃い繊維性瘢痕（矢印）は、注目するべきである。ＦＡＳ発現の高レベルは、図３Ｈに示されるこの肝硬変肝臓において残存する（矢印）。
【００８５】
纏めると、ＦＡＳ発現の高いレベルは、ＮＡＳＨを有する患者における確立された肝硬変の発症まで脂肪症及び脂肪性肝炎と関連するようである。
【００８６】
実施例  ３：
脂肪症又は脂肪性肝炎の関係が検出可能な循環性ＦＡＳを有することを決定するために、病的肥満のための肥満外科手術を経験している１６患者由来の廃棄された術前血清においてＦＡＳを測定した。加えて、手術肝臓生検も、脂肪症又は脂肪性肝炎の存在を評価するためにこれらの患者の１２患者において実行した。血清ＦＡＳレベルは、モノクローナル抗−ヒトＦＡＳサンドィッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。２０人の正常対象と比べて、１６人の肥満患者は、図４Ａに示される血清ＦＡＳのより高いレベルを有した（３．５±１．１７ｎｇ／ｍｌ、肥満；０．１７±０．０７ｎｇ／ｍｌ、正常；ｐ＝０．００３、両側不対t-検定、GraphPad Prism version 4.00 for Windows（登録商標）, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com）。
【００８７】
肝臓組織を手術、脂肪性肝炎及び脂肪症から得た１２患者について、脂肪変化、炎症及び線維症の程度に基いて０−４＋半定量的スケールを用いて等級付けをした。高い血清ＦＡＳレベルは、脂肪性肝炎と関連し、脂肪症とは関連しなかった（ｐ＝０．０３、片側不対ｔ−検定、Prism 4.0, Graph Pad Software）。図４Ｂは、脂肪性肝炎を有さない患者と比べた脂肪性肝炎を有する患者における高い血清ＦＡＳレベルのグラフ表示である。
【００８８】
血清ＦＡＳ測定を有する１７患者について、１組の肝機能試験を行った。その試験は、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、総ビリルビン、総タンパク質、及びアルブミンを含んだ。ピヤソン相関検定を用いて、これらの検体は、血清ＦＡＳ値と有意な相関を示さなかった。このことは、血清ＦＡＳレベルが、この組の規定の肝機能試験と関係ないらしいことを示唆している。
【００８９】
特許、特許出願及び刊行物を含む本明細書で引用されているすべての文献は、先に明確に援用されていても又はいなくても、その全体が参考として本明細書に援用される。本開示を充分に提供してきたが、当業者に承知されるように、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく及び過度な実験を行うことなく、等価なパラメータ、濃度及び条件の幅広い範囲内で、同一のものが実行され得る。
【００９０】
本開示は、その具体的な態様に関連して記載されてきたが、更なる変更が可能であることが理解されるだろう。本願は、一般的に開示された趣旨に従う、及び本開示が追求する技術内での公知のもしくは慣用的な実施の範囲内で行われ、及び本明細書に器さに記載された本質的特徴に適用され得るような開示からの逸脱を含む、開示の任意の変更、使用又は適合を含むものである。
【００９１】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【国際調査報告】
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