(57)【要約】  本発明は、２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の新しい結晶形形態、それぞれ形態Ｄ及び形態Ｅ、それらの製造方法、該化合物を含有する医薬製剤、及び治療、特にＧＳＫ３関連の病態及び疾患に対する治療における該活性化合物の使用に関する。
2010535200.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に結晶形態の２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の化合物であって、粉末Ｘ線回折の１４．５６オングストロームのｄ値で特徴付けられる形態Ｄの化合物。
【請求項２】
実質的に結晶形態の２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の化合物であって、粉末Ｘ線回折の１４．５６、１１．３６、５．５７オングストロームのｄ値で特徴付けられる形態Ｄの化合物。
【請求項３】
実質的に結晶形態の２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の化合物であって、粉末Ｘ線回折の１４．５６、１１．３６、９．１１、５．５７、５．１１、４．２９、３．５２オングストロームのｄ値及び相対強度で特徴付けられる形態Ｄの化合物。
【請求項４】
無水物の形態である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の実質的に結晶形態の２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩を製造する方法であって、以下の工程：
ａ）２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩のいずれかの形態又はいずれかの形態の混合物を水に懸濁すること；
ｂ）スラリーを溶液が得られるまで約８５℃に加熱すること；
ｃ）得られた溶液を約３０分かけて約４５℃に冷却し、次いで約２０時間かけて約５℃に更に冷却することにより結晶化させること；
ｄ）得られた結晶化した化合物を、濾過し、その後エタノールで洗浄し、そして約５０℃で減圧乾燥することにより単離すること；
を含む方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法に従って製造された実質的に結晶形態の２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の化合物。
【請求項７】
実質的に結晶形態の２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の化合物であって、粉末Ｘ線回折の１５．５１オングストロームのｄ値で特徴付けられる形態Ｅの化合物。
【請求項８】
実質的に結晶形態の２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の化合物であって、粉末Ｘ線回折の１５．５１、１１．９０、５．１７オングストロームのｄ値で特徴付けられる形態Ｅの化合物。
【請求項９】
実質的に結晶形態の２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の化合物であって、粉末Ｘ線回折の１５．５１、１１．９０、５．９６、５．１７、３．６１オングストロームのｄ値及び相対強度で特徴付けられる形態Ｅの化合物。
【請求項１０】
一水和物の形態である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の実質的に結晶形態の２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の化合物を製造する方法であって、以下の工程：
ａ）２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩のいずれかの形態、又はいずれかの形態の混合物を水に懸濁すること；
ｂ）スラリーを溶液が得られるまで約９５℃に加熱すること；
ｃ）得られた溶液を約９０分かけて約７５℃に冷却し、次いでエタノールを水に対して約０％〜約４０％（容積比）の比率で加えること；
ｄ）工程ｃ）で得られた溶液を、８時間かけて約１５℃に更に冷却し、次いで終夜撹拌すること；
ｅ）得られた結晶化した化合物を、濾過し、その後アセトン／水で洗浄し、そして吸引乾燥することにより単離すること；
を含む方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法に従って製造された実質的に結晶形態の２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の化合物。
【請求項１３】
活性成分としての請求項１〜４、６〜１０及び１２のいずれか１項に記載の化合物の治療的有効量を、場合により希釈剤、受容体又は不活性の担体と一緒に含む医薬製剤。
【請求項１４】
治療に使用するための、請求項１〜４、６〜１０及び１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ−３に関連する病態、認知障害、認知症、統合失調症における認知欠陥（ＣＤＳ）、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、年齢関連の記憶傷害（ＡＡＭＩ）、年齢関連の認知機能低下（ＡＲＣＤ）又は認知機能障害非痴呆症（ＣＩＮＤ）、神経原線維変化と関連する認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン型を伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ）、 進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ピック病、ニーマン−ピック病、 大脳皮質基底核変性症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、ボクサー認知症、アルツハイマー病（ＡＤ）、ダウン症候群、血管性認知症、パーキンソン病（ＰＤ）、脳炎後パーキンソン症候群、レヴィー小体認知症、ＨＩＶ認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、クロイツフェルト−ヤコブ病、及びプリオン病、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、情動障害，急性躁病を含む双極障害、双極性うつ病、双極性維持、うつ病を含む大うつ病障害（ＭＤＤ）、大うつ病、気分安定化、統合失調症を含む統合失調性情動障害、気分変調症、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、糖尿病性神経障害、脱毛症、炎症性疾患、骨粗しょう症を含む骨関連疾患又は状態；海綿骨形成及び／又は新骨形成の増進を含む骨形成の増進；骨ミネラル密度の増進；骨折事故の減少及び骨折治癒の強化の予防及び／又は処置における、請求項１〜４、６〜１０及び１２のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の新しい形態、それぞれ形態Ｄ及び形態Ｅ、それらの製造方法、該化合物を含む医薬製剤、及び治療における該活性化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遊離塩基としての２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル及びその塩酸塩は、特許文献１に記載されている。この化合物は、ＧＳＫ３に対する阻害効果を示すことにより、薬理学的活性を有するので有用である（特許文献１）。この化合物は、アルツハイマー病、認知症、慢性及び急性の神経変性疾患、双極性障害、統合失調症、糖尿病、脱毛、骨関連障害、及び特許文献１に記載された全ての障害を処置するために使用することができ、この特許文献は、参照することにより本明細書に取り入れられている。
【０００３】
２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩、及びその結晶形態の形態Ａは、特許文献２に記載されている。
【０００４】
グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ３（ＧＳＫ３）は、２つのイソ型（α及びβ）から成るセリン／トレオニン・タンパク質キナーゼであり、それは異なる遺伝子によりエンコードされるが、しかし、触媒ドメイン内では高度に相同的である。ＧＳＫ３は、中枢及び末梢神経系において高度に発現する。ＧＳＫ３は、タウ（Tau）、β−カテニン、グリコーゲン・シンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ及び伸長開始因子２ｂ（ｅＩＦ２ｂ）を含むいくつかの基質をリン酸化する。インスリン及び成長因子は、タンパク質キナーゼＢを活性化し、それは、セリン９残基上のＧＳＫ３をリン酸化し、そしてそれを不活性化する。
【０００５】
アルツハイマー病（ＡＤ）、認知症、及びタウパチー（taupathies）
ＡＤは、認知性低下、コリン作動性機能障害及び神経細胞死、神経原線維の絡み、及びアミロイド−β沈積物より成る老人斑により特徴付けられる。ＡＤにおけるこれらの一連の事象は明確ではないが、しかし関連していると信じられている。グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）、又はタウリン酸化キナーゼは、ＡＤ脳における過リン酸化された部位において、ニューロン中の微小管に結合したタンパク質タウを選択的にリン酸化する。過リン酸化されたタウは、微小管に対する親和性がより低くなり、対をなしたらせん状のフィラメントとして蓄積し、それはＡＤ脳における神経原線維の絡み及び神経網糸を構成する主成分である。これは、微小管の解重合をもたらし、そして軸索の臨終及び神経ジストロフィーに到る。神経原線維の絡みは、ＡＤ、筋萎縮性側索硬化症、グアム（Guam）のパーキンソン認知症、大脳皮質基底核変性症、ボクサー認知症及び頭部外傷、ダウン症候群、脳炎後パーキンソン症候群、進行性核上麻痺、ニーマン−ピック（Neimann-Pick）病及びピック病の様な疾患において常に認められる。アミロイド−βを一次海馬培養へ加えることは、ＧＳＫ３β活性の導入を経由してタウの過リン酸化及び対ラセン状フィラメント状態をもたらし、次いで軸索輸送の崩壊及び神経細胞死が起こる（非特許文献１）。ＧＳＫ３βは、神経原線維の絡みを優先的に標識化し、そしてＡＤ脳中の絡みあう前の神経細胞中で活性であることを示している。ＧＳＫ３タンパク質のレベルは、また、ＡＤ患者からの脳組織においては、５０％増加している。更に、ＧＳＫ３βは、糖分解経路における重要な酵素である、ピルビン酸デヒドロゲナーゼをリン酸化し、そしてピルビン酸塩のアセチル−Ｃｏ−Ａへの転換を防ぐ（非特許文献２）。アセチル−Ｃｏ−Ａは、認識機能を有する神経伝達物質であるアセチルコリンの合成に重要である。アミロイド−βの蓄積は、ＡＤにおける初期の事象である。ＧＳＫ−Ｔｇマウスは、脳内のアミロイド−βレベルの増加を示す。また、リチウムで飼育されたＰＤＡＰＰマウスは、海馬におけるアミロイド−βのレベルの低下、アミロイド斑面積の減少を示す（非特許文献３）。それ故、ＧＳＫ３βの阻害は、アルツハイマー病及びその他の上記で参照した疾患に関連する進行並びに認知障害において、有益な効果を有する可能性がある。
【０００６】
慢性及び急性の神経変性疾患
成長因子が介在するＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化は、神経細胞の生き残りに重要な役割を果たすことが示されている。この経路の活性化は、ＧＳＫ３βの阻害をもたらす。最近の研究（非特許文献４）は、ＧＳＫ３βの活性が、脳虚血などの神経変性、又は成長因子喪失後の細胞及び動物モデルにおいて増加することを示している。例えば、活性部位のリン酸化は、認知障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン（Huntington）病、及びＨＩＶ認知症及び外傷性脳損傷；並びに虚血性脳梗塞などにおけるような慢性及び急性神経変性疾患において生じると一般に想定されている細胞死の１種である、アポトーシスを起こしやすい神経細胞において増加した。リチウムは、ＧＳＫ３βの阻害をもたらす用量で、細胞及び脳におけるアポトーシスの阻害に神経防護作用を示した。それ故、ＧＳＫ３β阻害剤は、神経変性疾患の経路を減衰させるのに役立つ可能性がある。
【０００７】
双極性障害（ＢＤ）
双極性障害は、躁病症状及びうつ病症状で特徴付けられる。リチウムは、その気分安定化効果に基づいてＢＤを処置するために用いられている。リチウムの欠点は治療濃度域が狭いこと、及びリチウム中毒に到る過剰投与の危険である。リチウムが治療的濃度でＧＳＫ３を阻害するという発見は、この酵素が脳におけるリチウムの作用の重要な対象を代表するという可能性を提起している（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。ＧＳＫ３阻害剤は、うつ病行動を評価するモデルである、強制水泳試験における静止時間を減少させることが示されている（非特許文献８）。ＧＳＫ３は、双極性ＩＩ障害において認められる多形と関連している（非特許文献９）。従って、ＧＳＫ３βの阻害は、ＢＤの処置並びに情動障害を有するＡＤ患者において、治療的な妥当性を有する可能性がある。
【０００８】
統合失調症
蓄積された証拠は、気分障害及び統合失調症におけるＧＳＫ３の異常な活性を関係あるものとしている。ＧＳＫ３は、多重細胞過程、特に神経発生の間のシグナル伝達カスケードに関係している。Kozlovskyらは、ＧＳＫ３βレベルが、統合失調症の患者においては、比較の被験者より４１％低いことを見出した（非特許文献１０）。この研究は、統合失調症が神経発生の病理に関与し、そして異常なＧＳＫ３の制御が、統合失調症において役割を果たし得ることを示唆している。更に、β−カテニンレベルの減少が、統合失調症を示す患者において報告されている（非特許文献１１）。オランザピン、クロザピン、クエチアピン及びジプラシドンなどの非定型抗精神病薬は、Ｓｅｒ９のリン酸化を増加させることによりＧＳＫ３を阻害し、抗精神病薬がＧＳＫ３阻害を通して有益な効果を発揮することを暗示している（非特許文献１２）。
【０００９】
糖尿病
インスリンは、脱リン酸化を経由して骨格筋におけるグリコーゲンの合成、及びそれによるグリコーゲン・シンターゼの活性化を刺激する。安静時には、ＧＳＫ３はリン酸化し、そして脱リン酸化を経由して、グリコーゲン・シンターゼを不活性化させる。ＧＳＫ３は、また、ＩＩ型糖尿病患者からの筋肉において過剰発現する（非特許文献１３）。ＧＳＫ３の阻害はグリコーゲン・シンターゼの活性を増加し、それによりそのグリコーゲンへの転換によりグルコースのレベルを低下させる。糖尿病の動物モデルにおいて、ＧＳＫ３阻害剤は、プラズマ・グルコース・レベルを５０％まで低下させた（非特許文献１４）。それ故、ＧＳＫ３の阻害は、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病及び糖尿病神経障害の処置において、治療的な妥当性を有する可能性がある。
【００１０】
脱毛症
ＧＳＫ３はβ−カテニンをリン酸化し、分解する。β−カテニンは、ケラトニン合成経路のエフェクターである。β−カテニンの安定化は、発毛の増加を導く可能性がある。ＧＳＫ３でリン酸化された部位の変異により安定化したβ−カテニンを発現するマウスは、デノボ（de novo）毛髪形態形成と類似した過程を受ける（非特許文献１５）。皮脂腺及び皮膚乳頭を形成する新しい毛包は、通常は胚発生においてのみ確立する。それ故、ＧＳＫ３の阻害は、脱毛症の処置を提供する可能性がある。
【００１１】
骨関連障害及び病態
ＧＳＫ３阻害剤は、新しい増加した骨形成の必要性を含む、骨関連の障害又はその他の病態の処置のために用い得る。骨格の再形成は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、局所因子（例えば、プロスタグランジンＥ2）、サイトカイン、及びその他の生物学的に活性な物質などの、全身ホルモンで制御される連続過程である。２つの細胞型：骨芽細胞（骨の形成に関与する）及び破骨細胞（骨吸収に関与する）、は極めて重要である。ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド及び破骨細胞分化抑制因子調整システムを経て、これら２つの細胞型は、正常な骨代謝を維持するため相互作用する（非特許文献１６）。
【００１２】
骨粗しょう症は、骨質量の低下及び骨微細構造の劣化が骨の脆弱性及び骨折のリスクの増加に到る、骨格の障害である。骨粗しょう症を処置するための２つの主要な方策は、骨吸収を阻害すること、又は骨形成を刺激することのいずれかである。骨粗しょう症を処置するための、現在上市されている大多数の医薬品は、破骨細胞の骨吸収を阻害することにより骨質量を増加させるように作用する。骨形成を増進させる能力を有する医薬品は、骨粗しょう症の処置、並びに患者の骨折治癒を強化する潜在能力を有することに大きな価値があると認識されている。ＧＳＫ３阻害剤は、原発性及び続発性骨粗しょう症に使用することができ、ここで、原発性骨粗しょう症は、閉経後骨粗しょう症及び男性及び女性両方の老人性骨粗しょう症を含み、そして続発性骨粗しょう症は、コルチゾンで誘発される骨粗しょう症、並びに任意のその他の型の誘発される続発性骨粗しょう症を含む。これに加えて、ＧＳＫ３阻害剤は、また、骨髄腫の処置に用いられる。ＧＳＫ３阻害剤は、これらの病態を処置するため、異なった製剤様式で、局部的に又は全身に投与してもよい。
【００１３】
炎症性疾患
ＧＳＫ３阻害剤が抗炎症性効果を与えることの発見は、炎症性疾患への治療介入に対するＧＳＫ３阻害剤の使用の可能性を提起している（非特許文献１７）。炎症は、アルツハイマー病及び気分障害を含む広範囲の病態に共通した特徴である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開公報第０３／０８２８５３号
【特許文献２】国際公開公報第０７／０８９１９１号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Imahori and Uchida, J. Biochem 121:179-188, 1997
【非特許文献２】Hoshi et al., PNAS 93:2719-2723, 1996
【非特許文献３】Su et al., Biochemistry 2004, 43:6899-6908
【非特許文献４】Bhat et al.,PNAS 97:11074-11079(2000)
【非特許文献５】Stambolic et al., Curr. Biol. 6:1664-1668, 1996
【非特許文献６】Klein and Melton; PNAS 93:8455-8459, 1996
【非特許文献７】Gould et al., Neuropsychopharmacology, 1:32-8, 2004
【非特許文献８】O'Brien et al., J Neurosci 2004, 24:66791-6798
【非特許文献９】Szczepankiewicz et al., Neuropsychobiology. 2006;5 3(1):51-6
【非特許文献１０】Kozlovsky et al., Am J Psychiatry 2000 May; 157(5):831-3
【非特許文献１１】Cotter et al., Neuroreport 9:1379-1383 (1998)
【非特許文献１２】Li X et al., Int J Neuropsychopharmacol, 10(1):7-19 (2007)
【非特許文献１３】Nikoulina et al., Diabetes 2000 Feb; 49(2):263-71
【非特許文献１４】Cline et al., Diabetes, 2002, 51:2903-2910; Ring et al., Diabetes 2003, 52:588-595
【非特許文献１５】Gat et al., Cell 1998 Nov 25;95 (5):605-14)
【非特許文献１６】Bell NH, Current Drug Targets −Immune, Endocrine & Metabolic Disorders, 2001, 1:93-102
【非特許文献１７】Martin et al., Nat Immunol 2005, 6:777-784; rev. in Jope et al., Neurochem Res 2006, Aug 30
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、結晶形態、それぞれ形態Ｄ及び形態Ｅの、２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の化合物を提供することである。該化合物は、ＧＳＫ３に対する選択的阻害効果、及びそれを医薬製剤へ処方するのに好適にしている低吸湿性を有する。
【００１７】
本発明の２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリルの化合物の実質的に結晶性のクエン酸塩は、国際公開公報第０３／０８２８５３号に記載されたようにして製造される、２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・塩酸塩より改善された化学的安定性を示すことが見出されており、それがそれらを医薬製剤へ処方するのに特に好適にしている。
【００１８】
２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の結晶形態Ｄは、無水物として存在する。
【００１９】
２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の結晶形態Ｅは、一水和物として存在し、そのような形態で非常に低い吸湿性を示している。
【００２０】
無水の結晶形態Ｄは、水和した結晶形態Ｅへ転換することができ、そしてその逆もまた同様であり、それ故、形態Ｄと形態Ｅの２つの形態の混合物が存在し得る。
【００２１】
医薬製剤の処方において、薬学的に許容される化合物（活性薬物化合物）が、都合良く取り扱うことができそして製造することができる形態であることは重要である。これは、商業的に存続し得る製造方法を得る観点のみならず、その後の活性薬物化合物を含む医薬製剤の製造の観点からも重要である。
【００２２】
化学的安定性、固体状態の安定性、及び活性成分の「有効期限」も、また、非常に重要な因子である。薬物化合物及びそれを含む製剤は、かなりの期間にわたって、活性化合物の物理化学的特性、例えば、その化学的組成、密度、吸湿性及び溶解性における顕著な変化を示すことなく、効果的に保存可能でなければならない。
【００２３】
用語「化学的安定性」とは、化合物が、正常な保存条件下で、単離された形態で、又は薬学的に許容される担体、希釈剤若しくは助剤との混合物で提供される製剤の形態（例えば、錠剤、カプセルなどの経口投与形態）で、化学的劣化又は分解を殆ど若しくは全く起こさないで保存可能であることを意味する。
【００２４】
それ故、商業的に存続可能で、薬学的に許容される医薬製剤の製造において、可能な限り、医薬品化合物を実質的に結晶性で安定な形態で提供することが重要である。
【００２５】
本明細書で用いられるように、用語「実質的に結晶性の」とは、少なくとも約５０％の結晶性であり、１００％までの範囲の結晶性であることを意味する。本発明は、２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩を、少なくとも約５０％の結晶性、少なくとも約６０％の結晶性、少なくとも約７０％の結晶性、少なくとも約８０％の結晶性、少なくとも約９０％の結晶性、少なくとも約９５％の結晶性、少なくとも約９８％の結晶性、又は約１００％の結晶性の形態で提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
医薬製剤
本発明の１つの態様に従えば、グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ−３に関連した病態の予防及び／又は処置において使用するための、２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の化合物が、それぞれ形態Ｄ及び形態Ｅの結晶形態で提供される。
【００２７】
製剤は、経口投与用、例えば、錠剤として、非経口の注射剤用、滅菌溶液又は懸濁液として、体腔内又は骨空洞内における局所投与用、例えば、滅菌溶液又は懸濁液として、好適な形態であってよい。
【００２８】
一般的に、上記製剤は、薬学的に許容される担体又は希釈剤を用いて通常の手法で製造することができる。ヒトを含む哺乳類の処置において、本発明の化合物の塩の好適な一日量は、経口投与では約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、そして非経口投与では約０．００１〜２５０ｍｇ／ｋｇ体重である。活性成分の典型的な一日量は広範囲に亘って変化し、そして関連する適応、投与経路、患者の年齢、体重及び性別など種々の要因に依存し、医師により決定することができる。
【００２９】
獣医学的使用に対しては、種々の成分の量、医薬の剤形及び用量は変えることができ、そして処置される動物の、例えば、個々の要求のような種々の要因に依存する。
【００３０】
本発明の化合物は、そのままで使用可能であるが、しかし、該化合物の塩（活性成分）が薬学的に許容される希釈剤又は担体と共存している、医薬製剤の形態で投与されるであろう。
【００３１】
投与の方式に依存して、医薬製剤は、０．０５〜９９質量％、例えば、０．１０〜５０質量％の活性成分を含んでよく、ここで、全てのパーセンテージは、全組成物に対する質量％である。
【００３２】
希釈剤又は不活性担体としては、水、水性ポリエチレングリコール、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖（ラクトースなど）、ペクチン、デキストリン
、澱粉、トラガカント、微結晶性セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム又はココア脂が挙げられる。
【００３３】
本発明の製剤は、錠剤又は注射可能な形態であってよい。錠剤は、更に崩壊剤を含んでもよく、及び／又は、（例えば、腸溶性コーティング剤で又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのコーティング剤で）コーティングされてもよい。
【００３４】
本発明は、更に、上記に定義した化合物を薬学的に許容される希釈剤又は不活性な担体と混合することを含む、本発明の医薬製剤を製造する方法を提供する。
【００３５】
本発明の医薬製剤の例は、上記に定義した本発明の化合物、滅菌水、必要に応じて、最終製剤のｐＨを約５にするための水酸化ナトリウム又は塩酸、そして場合により、溶解を助けるための界面活性剤を含有する注射剤である。
【００３６】
好適な製剤の例は、純水に溶解した５．０％〜１００％の、上記に定義した２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩を含む溶液である。
【００３７】
医学用途
本発明に記載の２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の新しい結晶形態の形態、それぞれ形態Ｄ及び形態Ｅは、グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ−３（ＧＳＫ３）を阻害するのに十分好適であることが見出されている。
【００３８】
従って、本発明の該化合物は、グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ−３と関連する病態の予防及び／又は処置に有用であることが期待されている。即ち、該化合物は、その様な予防及び／又は処置を必要とするヒトを含む哺乳類において、ＧＳＫ３の阻害効果を生み出すために使用することができる。
【００３９】
ＧＳＫ３は、中枢及び末梢神経系、及びその他の組織で高度に発現する。従って、本発明の化合物は、中枢及び末梢神経系におけるグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ−３と関連する病態の予防及び／又は処置に十分好適である。特に、本発明の化合物は、認知障害及び前認知症状態、特に、認知症、アルツハイマー病（ＡＤ）、統合失調症における認知欠陥（ＣＤＳ）、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、加齢による記憶障害（ＡＡＭＩ）、加齢による認知低下（ＡＲＣＤ）、及び認知機能障害非痴呆症（ＣＩＮＤ）、神経原線維変化と関連する疾患、前頭側頭型認知症(ＦＴＤ)、パーキンソン型前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ピック病、ニーマン−ピック病、 大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、及びボクサー認知症に関連する病態の予防及び／又は処置に好適であることが期待される。
【００４０】
本発明の１つの実施態様は、アルツハイマー病の予防及び／又は処置、特に、アルツハイマー病の症状の進行を遅延させるための使用に関する。
【００４１】
他の病態は、ダウン症候群、血管性認知症、パーキンソン病（ＰＤ）、脳炎後パーキンソン症候群、レヴィー（Lewy）小体認知症、ＨＩＶ認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、クロイツフェルト−ヤコブ（Creutzfeld-Jacob）病、及びプリオン病から成るグループから選択される。
【００４２】
他の病態は、注意力欠如障害（ＡＤＤ）、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、及び情動障害から成るグループから選択され、ここで、情動障害は、急性躁病を含む双極性障害、双極性うつ病、双極性維持、うつ病を含む大うつ病障害（ＭＤＤ）、大うつ病、気分安定化、統合失調症を含む統合失調性情動障害、気分変調から選択される。
【００４３】
他の病態は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、糖尿病性神経障害、脱毛症、及び炎症性疾患から成るグループから選択される。
【００４４】
本発明の１つの実施態様は、上記に定義した化合物の、哺乳類における骨関連疾患の予防及び／又は処置のための使用を対象とする。
【００４５】
本発明の別の態様は、上記に定義した化合物の、哺乳類における骨粗しょう症の予防及び／又は処置のための使用を対象とする。
【００４６】
本発明の１つの態様は、上記に定義した化合物の、哺乳類における骨生成を促進及び／又は増加させるための使用を対象とする。
【００４７】
本発明の１つの態様は、上記に定義した化合物の、哺乳類における骨ミネラル密度を増加させるための使用を対象とする。
【００４８】
本発明の別の態様は、上記に定義した化合物の、哺乳類における骨折の割合を低下させ、及び／又は、骨折治癒の割合を増加させるための使用を対象とする。
【００４９】
本発明の別の態様は、上記に定義した化合物の、哺乳類における海綿骨形成及び／又は新骨形成を増加させるための使用を対象とする。
【００５０】
特別な疾患又は特別な病態の治療的又は予防的処置に対して必要とされる用量は、処置を受ける宿主、投与経路、及び処置される病気又は傷害の重症度に依存して、必ず変えられる。
【００５１】
本明細書の文脈の中で、用語「治療」は、また、特に別の指示のない限り、「予防」を含む。用語「治療的」及び「治療的に」は、相応に解釈すべきである。
【００５２】
本発明は、また、グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ−３と関連する病態の処置及び／又は予防の方法であって、２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の化合物の結晶形態、それぞれ形態Ｄ及び形態Ｅの治療的有効量を、そのような処置及び／又は予防を必要とするヒト又は動物を含む哺乳類へ投与することを含む方法を提供する。
【００５３】
本発明の別の態様は、上記方法であって、ここで、本明細書に記載の化合物又はそのような化合物を含む医薬組成物又は製剤は、別の薬学的に活性な化合物、又は以下の薬剤から選択される化合物と、並行して、同時に、順次、別々に、又は併用して投与される：
【００５４】
（ｉ）アゴメラチン、アミトリプチリン、アモキサピン、ブプロピオン、シタロプラム、クロミプラミン、デシプラミン、ドキセピン、デュロキセチン、エルザソナン、エスシタロプラム、フルボキサミン、フルオキセチン、ゲピロン、イミプラミン、イプサピロン、マプロチリン、ノルトリプチリン、ネファゾドン、パロキセチン、フェネルジン、プロトリプチリン、ラメルテオン、レボキセチン、ロバルゾタン、セルトラリン、シブトラミン、チオニソキセチン、トラニルシプロマイン、トラゾドン、トリミプラミン、ベンラファキシンなどの抗うつ剤、並びにそれらの等価物及び薬学的に活性な異性体及び代謝物；
【００５５】
（ｉｉ）例えば、クエチアピン並びに薬学的に活性なその異性体及び代謝物を含む、非定型の統合失調症治療薬；
【００５６】
（ｉｉｉ）例えば、アミスルプリド、アリピプラゾール、アセナピン、ベンジソキシジル、ビフェプルノクス、カルバマゼピン、クロザピン、クロルプロマジン、デベンザピン、ジバルプレックス、デュロキセチン、エスゾピクロン、ハロペリドール、イロペリドン、ラモトリギン、ロキサピン、メソリダジン、オランダピン、パリペリドン、ペルラピン、ペルフェナジン、フェノチアジン、フェニルブチルピペリジン、ピモジン、プロクロルペラジン、リスペリドン、セルチンドール、スルピリド、スプロクローン、スリクローン、チオリダジン、トリフルロオペラジン、トリメトジン、バルプロエート、バルプロ酸、ゾピクロン、ゾテピン、ジプラシドン、並びにそれらの等価物、薬学的に活性な異性体及び代謝物を含む、統合失調症治療薬；
【００５７】
（ｉｖ）例えば、アルネスピロン、アザピロン類、ベンゾジアゼピン類、アジナゾラム、アルプラゾラム、バレゼパム、ベンタゼパム、ブロマゼパム、ブロチゾラム、ブスピロン、クロナゼパム、クロラゼペート、クロルジアゼポキシド、シプラゼパム、ジアゼパム、ジフェンヒドラミン、エスタゾラム、フェノバム、フルニトラゼパム、フルラゼパム、ホサゼパム、ロラゼパム、ロルメタゼパム、メプロバメート、ミダゾラム、ニトラゼパム、オキサゼパム、プラゼパム、クアゼパム、レクラゼパム、トラカゼラート、トレピパム、テマゼパム、トリアゾラム、ウルダゼパム、ゾラゼパムなどのバルビツール酸塩類、並びにそれらの等価物及び薬学的に活性な異性体及びその代謝物を含む、抗不安薬；
【００５８】
（ｖ）例えば、カルバマゼピン、バルプロエート、ラモトロギン、ガバペンチン、並びにそれらの等価物及び薬学的に活性な異性体及び代謝物を含む、抗けいれん薬；
【００５９】
（ｖｉ）例えば、ドネピジル、メマンチン、タクリン、並びにそれらの等価物及び薬学的に活性な異性体及び代謝物を含む、アルツハイマー治療薬；
【００６０】
（ｖｉｉ）例えば、デプレニル、Ｌ−ドーパ、レキップ、ミラペックス、セレギン及びラサギリンなどのＭＡＯＢ阻害剤、タスマーなどのｃｏｍＰ阻害剤、Ａ−２阻害剤、ドーパミン再取り込み阻害剤、ＮＭＤＡ拮抗薬、ニコチン作動薬、ドーパミン作動薬、及び神経性一酸化窒素シンターゼの阻害剤、並びにそれらの等価物及び薬学的に活性な異性体及び代謝物を含む、パーキンソン病治療薬；
【００６１】
（ｖｉｉｉ）例えば、アルモトリプタン、アマンタジン、ブロモクリプチン、ブタルビタール、カベルゴリン、ジクロラールフェナゾン、エレトリプタン、フロバトリプタン、リスリド、ナラトリプタン、ペルゴリド、プラミペキソール、リザトリプタン、ロピニロール、スマトリプタン、ゾルミトリプタン、ゾミトリプタン、並びにそれらの等価物及び薬学的に活性な異性体及び代謝物を含む、片頭痛治療薬；
【００６２】
（ｉｘ）例えば、アブシキシマブ、アクチベース、ＮＸＹ−０５９、シチコリン、クロベネチン、デスモテプラーゼ、リピノタン、トラキソプロジル、並びにそれらの等価物及び薬学的に活性な異性体及び代謝物を含む、脳卒中治療薬；
【００６３】
（ｘ）例えば、ダリフェナシン、フラボキサート、オキシブチニン、プロピベリン、ロバルゾタン、ソリフェナシン、トルテロジン、並びにそれらの等価物及び薬学的に活性な異性体及び代謝物を含む、尿失禁治療薬；
【００６４】
（ｘｉ）例えば、ガバペンチン、リドデルム、プレガブリン、並びにそれらの等価物及び薬学的に活性な異性体及び代謝物を含む、神経因性疼痛の治療薬；
【００６５】
（ｘｉｉ）セレコキシブ、エトリコキシブ、ルミラコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ジクロフェナック、ロキソプロフェン、ナプロキセン、パラセプタモール、並びにそれらの等価物及び薬学的に活性な異性体及び代謝物などの、障害受容性疼痛治療薬；
【００６６】
（ｘｉｉｉ）例えば、アゴメラチン、アロバルビタール、アロニミド、アモバルビタール、ベンゾクタミン、ブタバルビタール、カプリド、クロラール、クロペリドン、クロレタート、デクスクラモール、エトクロルビノール、エトミダート、グルテチミド、ハラゼパム、ヒドロキシジン、メクロクアロン、メラトニン、メホバルビタール、メタクアロン、ミダフルル、ニソバマート、ペントバルビタール、フェノバルビタール、プロポホール、ラメルテオン、ロレタミド、トリクロホス、セコバルビタール、ザレプロン、ゾルピデム、並びにそれらの等価物及び薬学的に活性な異性体及び代謝物を含む、不眠症治療薬；
【００６７】
（ｘｉｖ）例えば、カルバマゼピン、ジバルプレックス、ガバペンチン、ラモトリギン、リチウム、オランザピン、クエチアピン、バルプロエート、バルプロ酸、ベラパミル、並びにそれらの等価物及び薬学的に活性な異性体及び代謝物を含む、気分安定化剤。
【００６８】
そのような組み合わせ製品は、本明細書に記載された用量範囲内の本発明の化合物、及び刊行された参考文献に記載された、認可された用量範囲内の及び／又は用量の、他の薬学的に活性な化合物又は複数の化合物を使用する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】５８０と１４８０ｃｍ-1の間の形態Ａ（点線）、形態Ｄ（破線）、形態（Ｅ）（実線）のラマンスペクトルを示す。
【図２】２１７０と２２５５ｃｍ-1の間の形態Ａ（点線）、形態Ｄ（破線）、及び形態（Ｅ）（実線）のラマンスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
塩形成の方法
２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリルのクエン酸塩化合物の形成は、  ２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリルを、溶媒の存在下でクエン酸と混合することにより製造することができる。クエン酸の当量は、１〜３モル当量の範囲内で変化させてもよい。反応は、水、又は水とメタノール、エタノール又はプロパノールなどのアルコールとの混合物中で実施することができる。水、又は水とエタノールの混合物である溶媒が好ましい。水のアルコールに対する比率は、約６０〜１００％（Ｖ／Ｖ）の範囲内でよい。使用する溶媒の全容積は、出発物質の単位質量当たりの容積部で１（ｖ／ｗ）〜１００（ｖ／ｗ）、好ましくは出発物質の単位質量当たりの容積部で１０（ｖ／ｗ）〜４５（ｖ／ｗ）の間で変化させてもよい。反応温度は、−３０℃〜＋１５０℃の間、好ましくは−５℃〜＋１００℃の間でよい。
【００７１】
純粋な２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩は、好適な溶媒中、添加剤の有り又は無しで結晶化させ、純度約９５％、好ましくは約９８％を有する結晶性固体として得ることができる。
【００７２】
本発明の目的は、２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の結晶性形態、それぞれ形態Ｄ及び形態Ｅを製造する方法である。
【００７３】
従って、該目的の１つは、２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の結晶形態、形態Ｄを製造する方法であって、以下の工程：
ａ）２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩のいずれかの形態、又はいずれかの形態の混合物を水に懸濁させること；
ｂ）溶液が得られるまでスラリーを約８５℃に加熱すること；
ｃ）得られた溶液を約３０分かけて約４５℃に冷却し、次いで約２０時間かけて約５℃に更に冷却して結晶化させること；
ｄ）得られた結晶した化合物を濾過し、次いでエタノールで洗浄し、そして約５０℃で減圧乾燥して単離すること；
を含む方法である。
【００７４】
該目的の他のものは、２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の結晶形態、形態Ｅを製造する方法であって、以下の工程：
ａ）２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩のいずれかの形態、又はいずれかの形態の混合物を水に懸濁させること；
ｂ）溶液が得られるまでスラリーを約９５℃に加熱すること；
ｃ）得られた溶液を約９０分かけて約７５℃に冷却し、次いでエタノールを水に対して０％〜４０％（ｖ／ｖ）の比率で加えること；
ｄ）工程ｃ）で得られた溶液を約８時間かけて約１５℃に更に冷却し、次いで終夜撹拌することにより結晶化させること；
ｅ）得られた結晶した化合物を濾過し、次いでアセトン／水で洗浄し、吸引乾燥して（pulled dry）単離すること；
を含む方法である。
【００７５】
例示のための実施例
以下の実施例は本発明を説明するが、しかし本発明を限定するものではない。
【００７６】
〔実施例１〕
２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の形態Ｄ
２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩（４ｇ、７．６ｍｍｏｌ）に水（４０ｍｌ）を加え、全てが完全に溶解するまで、スラリーを８５℃に加熱した。その後、３０分かけて溶液を４５℃に冷却し、その後２０分かけて５℃に更に冷却した。結晶を濾過し、エタノールで洗浄した。５０℃で減圧乾燥し、２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩（３．２２ｇ、収率：８１％）を９８．９面積％の純度で得た。
1ＨＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：１４．８（ｂｒｓ，１Ｈ），１０．９８（ｓ，１Ｈ），８．１（ｓ１Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ）；７．７６（ｂｒｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），３．６０（ｔ；Ｊ＝８Ｈｚ，４Ｈ），３．４５（ｍ，２Ｈ），２．７５（ａｐｄ，２Ｈ），２．６５（ａｐｄ，２Ｈ），２．４７（ｓ，４Ｈ）ｐｐｍ；13ＣＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ１７４．９，１７１．３，１６８．７，１４８．４，１４２．１，１３７．１，１３６．４，１２５．２，１２４．１，１２１．１，１１８．８，１１８．４，１０８．８，１０１．４，８４．６，７２．３，６５．７，５８．０，５２．５，４２．９ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ：［Ｍ+＋１］３３５。
【００７７】
結晶を粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）で分析した。形態Ｄの回折図形は、以下のオングストロームで示すｄ値、及び相対強度を示す。
１４．５６（ｖｓ），１１．３６（ｍ），９．１１（ｍ），７．９５（ｍ），７．７４（ｖｗ），７．２７（ｖｗ），６．７５（ｖｗ），６．３４（ｗ），６．１０（ｖｗ），５．８４（ｖｗ），５．５７（ｍ），５．１１（ｗ），４．９９（ｖｗ），４．８５（ｍ），４．６９（ｓ），４．５６（ｖｗ），４．４６（ｗ），４．２９（ｗ），４．１０（ｖｗ），４．０３（ｍ），４．００（ｗ），３．９４（ｍ），３．８２（ｖｗ），３．６７（ｗ），３．５２（ｓ），３．３７（ｗ），３．３４（ｗｗ），３．０８（ｗｗ），３．０２（ｖｗ），２．９８（ｗ），２．８８（ｖｗ），２．８２（ｖｗ），２．７８（ｖｗ），２．７５（ｖｗ），２．７２（ｖｗ），２．７１（ｖｗ），２．６２（ｗ）。
【００７８】
最も重要なオングストロームで示すｄ値は、１４．５６である。
【００７９】
３つの重要なオングストロームで示すｄ値は、１４．５６、１１．３６、５．５７である。
【００８０】
重要なオングストロームで示すｄ値は、１４．５６、１１．３６、９．１１、５．５７、５．１１、４．２９、３．５２である。
【００８１】
相対強度は信頼性が低く、数値の代わりに以下の定義を用いた。
用いた定義：         ％相対強度    
ｖｓ（非常に強い）：    １００〜６０.０ 
ｓ（強い）：            ６０.０〜２５.０
ｍ（中）：              ２５.０〜１０.０
ｗ（弱い）：            １０.０〜６.０
ｖｗ（非常に弱い）：    ＜６.０ 
相対強度は、可変スリットで測定した回折図形から誘導した。
【００８２】
〔実施例２〕
２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の形態Ｅ
２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩（１１．７ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）に水（２００ｍｌ）を加え、そして全てが完全に溶解するまで９５℃で加熱した。次いで溶液を９０分かけて７５℃に冷却し、その後エタノール（３９ｍｌ）を加えた。溶液を８時間かけて１５℃に更に冷却し、次いで１５℃で終夜撹拌した。結晶を濾過し、アセトン／水（５０／５０、１７０ｍｌ）で洗浄し、吸引乾燥して、２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩（９．５９ｇ、収率：８２％）を、９９．５面積％の純度で得た。1ＨＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）及び13ＣＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）は、実施例１に示した値と全く同一のδ値を示した。
ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ：［Ｍ+＋１］３３５。
【００８３】
結晶を粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）で分析した。形態Ｅの回折図形は、以下のオングストロームで示すｄ値、及び相対強度を示した：
１５．５１（ｖｓ），１１．９０（ｗ），９．３０（ｖｗ），７．９８（ｖｗ），７．７４（ｍ），７．１６（ｖｗ），６．２６（ｖｗ），５．９６（ｖｗ），５．７１（ｖｗ），５．１７（ｍ），４．９９（ｓ），４．８５（ｗ），４．６６（ｖｗ），４．５２（ｖｗ），４．４６（ｖｗ），４．４３（ｗ），４．２３（ｖｗ），４．１０（ｖｗ），４．０１（ｍ），３．９２（ｖｗ），３．６８（ｖｗ），３．６１（ｍ），３．５５（ｗ），３．３５（ｖｗ），３．１７（ｖｗ），３．１３（ｖｗ），３．０４（ｖｗ），２．９１（ｖｗ），２．８８（ｖｗ），２．８４（ｗ），２．７３（ｖｗ），２．７１（ｖｗ），２．６６（ｖｗ），２．６２（ｖｗ）。
【００８４】
最も重要なオングストロームで示すｄ値は、１５．５１である。
【００８５】
３つの重要なオングストロームで示すｄ値は、１５．５１、１１．９０、５．１７である。
【００８６】
重要なオングストロームで示すｄ値は、１５．５１、１１．９０、５．９６、５．７１、５．１７、３．６１である。
【００８７】
相対強度は信頼性が低く、数値の代わりに以下の定義を用いた。
用いた定義：         ％相対強度    
ｖｓ（非常に強い）：    １００〜６５.０
ｓ（強い）：            ６５.０〜３０.０
ｍ（中）：              ３０.０〜１４.５
ｗ（弱い）：            １４.５〜７.０
ｖｗ（非常に弱い）：    ＜７.０
相対強度は、可変スリットで測定した回折図形から誘導した。
【００８８】
２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩の結晶度を、以下に示すように粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）を用いて分析した。
Braggの式から計算されるｄ値で同定されたピーク及び強度は、結晶性クエン酸塩の多形態Ｄ及びＥの回折図からそれぞれ抽出されている。最も特異的な、重要な、明確な、及び／又は、再現可能な主なピークのみを表に示したが、更なるピークを、回折図から従来の方法を用いて抽出することは可能である。再現可能で、誤差限界内のこれら主ピークの存在は、大半の環境下においては、結晶性クエン酸塩の前記の異なる多形の存在を立証するのに十分である。単に１つのピークがなくても、化合物の別の結晶形態が得られていることを意味しない。
【００８９】
粉末Ｘ線回折分析（ＸＲＰＤ）は、標準的方法、例えば、Giacovazzo, C. et al (1995), Fundamentals of Crystallography（結晶学の基礎）, Oxford University Press；Jenkins, R. and Snyder, R. L. (1996), Introduction to X-Ray Powder Diffractometry（粉末Ｘ線回折法序論）, John Wiley & Sons, New York；Bunn, C. W. (1948), Chemical Crystallography（化学結晶学）, Clarendon Press, London；又はKlug, H. P. & Alexander, L. E. (1974), X-ray Diffraction Procedures（Ｘ線回折手順）, John Wiley and Sons, New Yorkに記載された方法に従って調製された試料について実施した。Ｘ線回折分析は、PANalytical X'Pert Pro MPD を用いて、９６分間、１〜６０°の２θの範囲内で実施した。ｄ値（距離値）への計算がなされたが、それらは最後の小数位において±２の範囲内で変動してよい。
【００９０】
ラマン分光法が結晶形態改良のプロセス制御において用いられたが、最終同定は、湿潤した又は軽度に乾燥した物質について、ＸＲＰＤにより実施した。
【００９１】
ラマン Raman Rxn3 分析器（Kaiser Optical Systems, Inc.製）を、ラマン分光測定のため用いた。ラマンスペクトルは、７８５ｎｍでの近赤外（ＮＩＲ）励起輻射、及び５ｃｍ-1のスペクトル解像度を有する多チャンネル電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器を用いて測定した。しかしながら、計器の設定により、ピークシフトは１．７ｃｍ-1まで細かく検出可能であった。スペクトルは固体物質に関しては、オフラインで測定した。全てのスペクトルは、１２５０〜１３５０ｃｍ-1間の最高ピーク、１３５０〜１４００ｃｍ-1間の最低ベースラインを用いて、評価前に目盛を調整し、ベースラインを中心に合わせた。
【００９２】
図１は、５８０と１４８０ｃｍ-1の間の形態Ａ（点線）、形態Ｄ（破線）、形態（Ｅ）（実線）のラマンスペクトルを示す。差異が見られる２つの領域は、矢印でマークしている。
図２は、２１７０と２２５５ｃｍ-1の間の形態Ａ（点線）、形態Ｄ（破線）、及び形態（Ｅ）（実線）のラマンスペクトルを示す。形態Ｅのピーク（約２２１５ｃｍ-1）は形態Ａのピーク（約２２１７ｃｍ-1）に非常に近接しているが、形態Ｄのピーク（約２２０９ｃｍ-1）とは大きく異なる。
【００９３】
形態Ｅのスペクトルは、視覚化の目的のために０．８倍に縮小した。測定されたラマンスペクトルは、形態Ａと形態Ｄを比較した場合、いくつかの差異を有する。差異は、約７５３〜７９３ｃｍ-1及び１１８６〜１２５８ｃｍ-1（図１に矢印で明マークしている）のピークなどの中程度の強度を有する双方のピーク、そしてまた、それぞれの形態に対して異なったラマンシフトを有する全てのスペクトルにおける２番目に大きいピーク（図２を参照）：形態Ａ：約２２１７ｃｍ-1、形態Ｅ：約２２１５ｃｍ-1及び形態Ｄ：約２２０９ｃｍ-1で見られる。
【００９４】
薬理学
シンチレーション近接ＧＳＫ３βアッセイにおけるＡＴＰ競合の測定
ＧＳＫ３βシンチレーション近接アッセイ
競合実験は、透明な底のマイクロタイタープレート（Wallac社製、Finland）内において、１０種の異なった濃度の阻害剤で２回ずつ実施した。ビオチニル化ペプチド基質：ビオチン−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＰＯ3Ｈ2）−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ（AstraZeneca社製、Lund）を、１ｍＵの遺伝子組み替えヒトＧＳＫ３β（Dundee大学、UK）；１２ｍＭのモルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）；ｐＨ＝７．０、０．３ｍＭのＥＤＴＡ；０．０１％のβ−メルカプトエタノール；０．００４％のBrij 35（天然洗浄剤）；０．５％のグリセロール、及び０．５μｇのＢＳＡ／２５μｌを含むアッセイ緩衝液に、１μＭの最終濃度で加えた。０．０４μＣｉの［γ−33Ｐ］ＡＴＰ（Amersham社製：UK）及び非標識化ＡＴＰを、１μＭの最終濃度、２５μｌのアッセイ容積で加えて反応を開始した。室温で２０分間インキュベーションした後、各々の反応を、５ｍＭのＥＤＴＡ；５０μＭのＡＴＰ；０．１％のTriton X-100、及びストレプトアビジンをコーティングしたシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）用ビーズ（０．２５ｍｇ、Amersham社製：UK）を含む停止溶液（２５μｌ）を加えて停止した。６時間後、放射能を液体シンチレーションカウンター（1450 MicroBeta Trilux, Wallac社製）で測定した。阻害曲線は、GraphPad Prism、USA製を用いて、非線形回帰分析で求めた。化合物の阻害定数（Ｋj）を計算するために用いた、ＧＳＫ３βのＡＴＰのＫmの値は２０μＭであった。
【００９５】
以下の略号を用いている：
ＭＯＰＳ：モルホリンプロパンスルホン酸；
ＥＤＴＡ：  エチレンジアミン四酢酸；
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン；
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸；
ＳＰＡ：シンチレーション近接アッセイ；
ＧＳＫ３：グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ３。
【００９６】
結果
２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリル・クエン酸塩のＧＳＫ３βのＫj値は、３１ｎＭである。
【００９７】
吸湿性
動的蒸気収着分析（ＤＶＳ）
動的蒸気収着装置（ＤＶＳ、Surface Measurement Systems社製、London、UK）を用いて研究を行った。装置は、温度制御されたキャビネットの中に収納されたCahn微量天秤から構成されていた。全ての実験は２５℃で実施した。ＤＶＳは、異なった相対湿度（ＲＨ）で水分の取り込み（質量％）を評価するために使用した。試料（５〜１０ｍｇ）を直接ＤＳＶ試料カップに秤量して入れ、異なった相対湿度に暴露した。
【００９８】
結果
【表１】
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【００９９】
上記の結果から、２−ヒドロキシ−３−［５−（モルホリン−４−イルメチル）ピリジン−２−イル］−１Ｈ−インドール−５−カルボニトリルのクエン酸塩は、その塩酸塩より低い吸湿性を示し、従って、医薬製剤を製造するためにより好適であることは明白である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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