(57)【要約】  本発明は、ＳＴＩＭ２活性のレベルを決定するアッセイおよび方法を提供し、それにより、細胞内カルシウムレベルの調節を特徴付け、研究するためのツールを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のＳＴＩＭ２活性のアッセイであって、Ｉｃｒａｃ活性を測定するステップを含み、カルシウム貯蔵枯渇の非存在下での２−ＡＰＢの適用に反応したＩｃｒａｃ活性の増大が、前記細胞内のＳＴＩＭ２活性のレベルを示すアッセイ。
【請求項２】
細胞内のＳＴＩＭ２活性のアッセイであって、アミノグリコシド抗生物質の適用後のＩｃｒａｃ活性を測定するステップを含み、前記抗生物質によるＩｃｒａｃ活性の抑制が、前記細胞内のＳＴＩＭ２活性のレベルを示すアッセイ。
【請求項３】
Ｉｃｒａｃ活性の前記抑制が２−ＡＰＢの適用によって克服される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記細胞が哺乳動物対象に由来する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記細胞が前記哺乳動物対象の脳に由来する、請求項４に記載のアッセイ。
【請求項６】
ＳＴＩＭ２活性の存在が脳悪性腫瘍を示す、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項７】
Ｉｃｒａｃ活性の前記抑制により、前記アミノグリコシド抗生物質が免疫抑制因子としてさらに同定される、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項８】
ＳＴＩＭ２活性を調節する作用物質のアッセイであって、カルシウム貯蔵枯渇の非存在下での２−ＡＰＢの適用に反応したＩｃｒａｃ活性を測定するステップを含み、前記Ｉｃｒａｃ活性を調節する作用物質が、ＳＴＩＭ２活性を調節する作用物質として同定されるアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本出願は、参照によりすべての目的でその全体が本明細書に組み込まれている、２００７年３月２３日出願の米国特許仮出願第６０／８９６５８１号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
[0001]  本発明は概ね、ＣＲＡＣチャネル、ならびにＳＴＩＭ１およびＳＴＩＭ２とその会合に関する。詳細には、本発明は、細胞内のＳＴＩＭ２活性を決定するアッセイおよび方法を包含する。
【背景技術】
【０００３】
[0002]  細胞内遊離カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の変化は、極めて多くの細胞反応を調節する最も広範かつ重要なシグナル事象の典型である。多くの細胞型が、Ｃａ２＋流入のためのそれらの主要経路として貯蔵作動性Ｃａ２＋流入を利用している。この機序は、貯蔵からのＣａ２＋放出後に関与し、この貯蔵が枯渇すると、カルシウム放出活性化Ｃａ２＋（CRAC）チャネルの活性化が起こる。最近の研究によって、間質相互作用分子（STIM1）およびＣＲＡＣ調節因子１（CRACM1またはOrai1）が、機能的貯蔵作動性Ｃａ２＋流入の必須成分として同定された。ＳＴＩＭ１およびＣＲＡＣＭ１は、異種発現系でＣＲＡＣ電流を再構成および増幅するのに十分である。哺乳動物には、これらのタンパク質のいくつかの相同体が存在しており、すなわち、小胞体にＳＴＩＭ１およびＳＴＩＭ２、そして原形質膜にＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２およびＣＲＡＣＭ３が存在している。貯蔵作動性Ｃａ２＋流入におけるＳＴＩＭ２の役割は複雑であると思われ、いまだに完全には理解されていないままである。
【０００４】
[0003]  したがって、ＣＲＡＣチャネルの活性に対するＳＴＩＭ２のレベルおよび役割を評価できる方法の必要性が存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
[0004]  したがって、本発明は、細胞内のＳＴＩＭ２活性を決定するアッセイおよび方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
[0005]  一態様では、本発明は、細胞内のＳＴＩＭ２活性のアッセイであって、Ｉｃｒａｃ活性を測定するステップを含むアッセイを提供する。このアッセイの好ましい態様では、２−ＡＰＢが細胞に適用され、２−ＡＰＢのこの適用に反応したＩｃｒａｃ活性の増大が、前記細胞内のＳＴＩＭ２活性のレベルを示す。さらなる態様では、Ｉｃｒａｃ活性の増大は、カルシウム貯蔵枯渇の非存在下で起こる。
【０００７】
[0006]  別の態様では、本発明は、細胞内のＳＴＩＭ２活性のアッセイであって、アミノグリコシド抗生物質の適用後のＩｃｒａｃ活性を測定するステップを含むアッセイを提供する。このアッセイの一態様では、抗生物質によるＩｃｒａｃ活性の抑制は、細胞内のＳＴＩＭ２活性のレベルを示す。
【０００８】
[0007]  さらなる態様では、本発明は、免疫抑制特性を有するアミノグリコシド抗生物質のアッセイを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】[0008]（Ａ）ＳＴＩＭ１＋ＣＲＡＣＭ１細胞、ＳＴＩＭ２＋ＣＲＡＣＭ１細胞、および２μＭ  ２−ＡＰＢによって刺激されたＳＴＩＭ２＋ＣＲＡＣＭ１細胞で、ＩＰ３（２０μＭ）によって誘導された平均ＣＲＡＣ電流密度を示す図である。（Ｂ）パネルＡに示した、ＳＴＩＭ１＋ＣＲＡＣＭ１発現細胞でＩＰ３（２０μＭ）によって、またはＳＴＩＭ２＋ＣＲＡＣＭ１発現細胞で２μＭ  ２−ＡＰＢによって誘導されたＣＲＡＣ電流の代表的な電流−電圧（I/V）関係を示す図である。（Ｃ）ＳＴＩＭ２単独（紫色、n=5）、ＣＲＡＣＭ１単独（黒色、n=3）、ＳＴＩＭ１＋ＣＲＡＣＭ１（青色、n=8）を発現するＨＥＫ２９３細胞、およびＧ４１８の存在下（赤色、n=9）または非存在下（緑色、n=6）で増殖させたＳＴＩＭ２＋ＣＲＡＣＭ１を発現するＨＥＫ２９３細胞の平均ＣＲＡＣ電流密度を示す図である。すべての細胞で、２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡおよび８ｍＭ  ＣａＣｌ２を用いて、［Ｃａ２＋］ｉを１５０ｎＭに緩衝化した。（Ｄ）Ｇ４１８の存在下（赤色、n=7）または非存在下（緑色、n=5）で増殖させたＳＴＩＭ２＋ＣＲＡＣＭ１細胞で、５０μＭ  ２−ＡＰＢによって誘導された、−８０ｍＶでの高分解能の平均ＣＲＡＣ電流を示す図である。
【図２】[0009]（Ａ）２０μＭ  ＩＰ３に応答したＳＴＩＭ２＋ＣＲＡＣＭ１細胞の平均ＣＲＡＣ電流密度の例を示す図である。データは、Ｇ４１８なしで増殖させたＨＥＫ２９３細胞から得た。データは、異なった形質移入から得られたものであり、観察された様々な電流表現型を実証するものである。支配的な表現型は、速い第１相と、遅い第２相とを有する小さな二相性のものであった（１）。他の形質移入は、２つの相の変動的な振幅および動態（速度論）を有した。（Ｂ）実験に入って１２０秒または３００秒における、パネルＡに示した代表的なＳＴＩＭ２＋ＣＲＡＣＭ１細胞から抽出されたＣＲＡＣ電流の平均電流−電圧（I/V）関係を示す図である。データは、Ｇ４１８なしで増殖させたＨＥＫ２９３細胞から得た。データは、−１００ｍＶから＋１００ｍＶまでの５０ｍｓ電位ランプ波で誘起された、漏出電流を差し引いて、細胞電気容量（ｐＡ／ｐＦ）に正規化された電流を表す。（Ｃ）ＣＲＡＣＭ１（１）、ＣＲＡＣＭ２（２）、およびＣＲＡＣＭ３（３）で形質移入され、２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡで［Ｃａ２＋］ｉがほぼゼロに固定されているＳＴＩＭ２発現ＨＥＫ２９３細胞で、２０μＭ  ＩＰ３によって誘導された平均ＣＲＡＣ電流密度を示す図である。データは、Ｇ４１８なしで増殖させたＨＥＫ２９３細胞から得た。（Ｄ）Ｇ４１８（黒塗りの円、n=34）非存在下、またはピペット中に３００ｎＭ（白抜きの円、n=9）、１μＭ（黒塗りの四角、n=11）、３μＭ（白抜きの四角、n=8）、または１０μＭ（黒塗りの三角、n=8）のＧ４１８存在下における、ＳＴＩＭ２＋ＣＲＡＣＭ１細胞の平均ＣＲＡＣ電流密度を示す図である。データは、Ｇ４１８なしで増殖させたＨＥＫ２９３細胞から得た。（Ｅ）Ｇ４１８濃度の関数として、パネルＤで示した記録から、３００秒において抽出された平均ＣＲＡＣ電流密度の用量反応関係を示す図である。データは、Ｇ４１８なしで増殖させたＨＥＫ２９３細胞から得た。データを用量反応曲線に適合させて、５２０ｎＭというＩＣ５０値および１というヒル係数を得た。（Ｆ）２０μＭ  ＩＰ３によって貯蔵枯渇を誘導し、かつ２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡによって［Ｃａ２＋］ｉをほぼゼロに緩衝化するか（黒色、n=5）、ＩＰ３を除外し、かつ［Ｃａ２＋］ｉを１５０ｎＭに緩衝化することによって貯蔵枯渇を阻止し（赤色、n=7）、５０μＭ  ２−ＡＰＢによって刺激したＳＴＩＭ２＋ＣＲＡＣＭ１細胞の平均ＣＲＡＣ電流密度を示す図である。データは、Ｇ４１８なしで増殖させたＨＥＫ２９３細胞から得た。２つのデータセットにおける、５０μＭ  ２−ＡＰＢの適用は、色分けされた横棒によって示されている。
【図３】[0010]（Ａ）貯蔵枯渇が、２０μＭ  ＩＰ３＋２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡによって誘導されているか（３）、２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡ単独で受動的であるか（２）、ＩＰ３の除外および［Ｃａ２＋］ｉを１５０ｎＭに緩衝化することによって阻止されている（１）、ＳＴＩＭ２＋ＣＲＡＣＭ１細胞の平均ＣＲＡＣ電流密度を示す図である。データは、Ｇ４１８なしで増殖させたＨＥＫ２９３細胞から得た。（Ｂ）Ｃｓ−グルタミン酸が等モルのＫＣｌで置換されているか、または２０ｍＭ  ＥＧＴＡおよび８．９ｍＭ  ＣａＣｌ２を用いて［Ｃａ２＋］ｉを１５０ｎＭに緩衝化することによって貯蔵枯渇が阻止されている溶液中の２０μＭ  ＩＰ３＋２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡによって誘導された、ＳＴＩＭ２＋ＣＲＡＣＭ１細胞の平均ＣＲＡＣ電流を示す図である。データは、Ｇ４１８なしで増殖させたＨＥＫ２９３細胞から得た。他の２つのデータセット用のピペット溶液は、［Ｃａ２＋］ｉを１５０ｎＭに緩衝化するのにＢＡＰＴＡおよび８ｍＭ  ＣａＣｌ２を用い、さらに３ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰおよび３００μＭ  Ｎａ−ＧＴＰ、または１００μＭカルモジュリンを含有していた。（Ｃ）貯蔵枯渇が２０μＭ  ＩＰ３＋２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡによって誘導されているＳＴＩＭ２＋ＣＲＡＣＭ１細胞の平均ＣＲＡＣ電流密度を示す図である。データは、Ｇ４１８なしで増殖させたＨＥＫ２９３細胞から得た。軌跡は、ピペットの直列抵抗が、２〜４ＭΩ、５〜７ＭΩまたは７〜９ＭΩの範囲内にあった実験の集積データを表す。（Ｄ）１ｍＭの細胞外Ｃａ２＋の非存在下（黒色）または存在下（赤色）において、空のベクターで形質移入されたＳＴＩＭ２細胞で、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍで励起されたｆｕｒａ−２蛍光の比率として測定された［Ｃａ２＋］ｉの変化を示す図である。データは、Ｇ４１８なしで増殖させたＨＥＫ２９３細胞から得た。カルバコール（１００μＭ）は矢印で示されている時点で適用した。（Ｅ）パネルＤと同じ実験条件であるが、ＳＴＩＭ２＋ＣＲＡＣＭ１細胞に関する、［Ｃａ２＋］ｉの変化を示す図である。データは、Ｇ４１８なしで増殖させたＨＥＫ２９３細胞から得た。（Ｆ）Ｃａ２＋存在下で得られた［Ｃａ２＋］ｉシグナルから、Ｃａ２＋を含まない溶液中の［Ｃａ２＋］ｉシグナルを差し引き、正味のＣａ２＋流入が得られている、パネルＤおよびＥから差し引いた結果の軌跡を表す図である。データは、Ｇ４１８なしで増殖させたＨＥＫ２９３細胞から得た。
【図４】[0011]（Ｓ１）ＳＴＩＭ１またはＳＴＩＭ２を安定的に過剰発現している細胞における、２０μＭ  ＩＰ３に反応した、−８０ｍＶでの平均ＣＲＡＣ電流密度を示す図である。[Ｃａ２＋]ｉは、２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡでほぼゼロに固定した。データは、約０．５ｐＡ／ｐＦの電流密度を発生するｗｔ  ＨＥＫ２９３細胞と比較して、ＳＴＩＭ１過剰発現はＣＲＡＣ電流をわずかに増強し、ＳＴＩＭ２過剰発現はＣＲＡＣ電流をわずかに減弱することを実証している。（Ｓ２）Ｇ４１８の存在下で増殖させたＳＴＩＭ１＋ＣＲＡＣＭ１細胞（n=7）の平均ＣＲＡＣ電流を示す図である。ピペット溶液は、ＩＰ３（２０μＭ）および１０μＭ  Ｇ４１８を含有していた。これは、これらの細胞が細胞内Ｇ４１８にほとんど非感受性であることを実証している。１０μＭ  Ｇ４１８の細胞外適用は、ＣＲＡＣ電流の微小かつ可逆的な低減を引き起こした。（Ｓ３）Ｇ４１８の非存在下で増殖させたＳＴＩＭ２＋ＣＲＡＣＭ１細胞（n=7）の平均ＣＲＡＣ電流を示す図である。ピペット溶液は、二相性ＣＲＡＣ電流を活性化するために、ＩＰ３（２０μＭ）を含有していた。横棒は、様々な濃度のＧ４１８の細胞外適用を示す。これらはＣＲＡＣ電流の微小かつ可逆的な低減を引き起こした。３００ｎＭ（黒塗りの円、n=3）、１μＭ（白抜きの円、n=4）および１０μＭ（黒塗りの四角、n=5）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
略語
[0012]  「２−ＡＰＢ」は、ホウ酸２−アミノエトキシジフェニルを指す。
【００１１】
[0013]  「ＩＰ３」は、イノシトール１，４，５−三リン酸を指す。
【００１２】
[0014]  「ＳＴＩＭ１」は、間質相互作用分子１を指す。同様に、「ＳＴＩＭ２」は、間質相互作用分子２を指す。
【００１３】
[0015]  「ＣＲＡＣチャネル」は、カルシウム放出活性化Ｃａ２＋チャネルを指す。
【００１４】
定義
[0016]  文脈により別段明確に指示されていない限り、「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」には複数への言及が含まれる。したがって、例えば、「薬物」を送達するための組成物への言及は、１、２またはそれより多い数の薬物への言及が含まれる。
【００１５】
[0017]  「ＳＴＩＭ２活性」は、ＣＲＡＣチャネル機能に対するＳＴＩＭ２の作用を指し、これには、電流振幅、活性化および不活性化の動態（速度論）、ならびに薬理が含まれるが、これらに限定されない。
【００１６】
[0018]  「Ｉｃｒａｃ活性」は、カルシウム放出活性化カルシウムチャネルの活性を指す。かかる活性は、カルシウムレベルの蛍光イメージング、およびカルシウム電流を含めたイオン電流の電気生理学的測定を含めた、当技術分野で知られている方法で観察および定量化できる。
【００１７】
[0019]  ＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２およびＣＲＡＣＭ３は、ＣＲＡＣチャネル相同体である。
【００１８】
緒言
[0020]  ＣＲＡＣチャネルは、細胞内貯蔵、とりわけ小胞体からのカルシウム放出によって活性化される。これらのチャネルは、筋肉の収縮、タンパク質および液体の分泌ならびに細胞の成長および増殖の制御を含めた広範な細胞機能の調節における主要因子である。
【００１９】
[0021]  異種発現されたＣＲＡＣチャネル相同体の研究によって、これらのチャネルの活性化は、ＳＴＩＭ１およびＳＴＩＭ２を含めた多くの細胞因子によって調節されていることが示された。ＳＴＩＭ１は、貯蔵枯渇の後に、原形質膜に向けて移動して、ＣＲＡＣＭ１チャネルに結合し、それを活性化する小胞体内カルシウムセンサーとして作用する。ＳＴＩＭ２の活性は、ＳＴＩＭ１の活性ほど完全には特徴付けられていないが、ＳＴＩＭ２は、ＣＲＡＣチャネル活性に対して、ＳＴＩＭ１とは大きく異なった作用を有することが初期の研究によって示唆されている。本発明は、ＳＴＩＭ２に関連するＣＲＡＣチャネルの機能特性を利用した、細胞内のＳＴＩＭ２活性のレベルを決定するアッセイおよび方法を提供する。
【００２０】
薬理
[0022]  ホウ酸２−アミノエトキシジフェニル（2-APB）は、低用量（≦５μＭ）ではＣＲＡＣ電流への亢進作用を有するが、高用量（≧１０μＭ）ではそれらを抑制する化合物である。細胞がさらに高い濃度、例えば５０μＭの２−ＡＰＢで刺激された場合、ＣＲＡＣ電流は、迅速に活性化され、その後直ちに２−ＡＰＢの阻害作用によって縮小し、その結果、内向き電流の一過性サージをもたらす（図１Ｃ）。貯蔵枯渇を避けるために、ＩＰ３を取り除き、［Ｃａ２＋］ｉを緩衝化した場合、２−ＡＰＢの適用の際に電流を誘導することが可能である。しかし、この作用は、ＳＴＩＭ２およびＣＲＡＣＭ１を過剰発現する細胞に特異的であり、ＳＴＩＭ２またはＣＲＡＣＭ１のいずれかを単独で過剰発現する細胞でも、ＳＴＩＭ１およびＣＲＡＣＭ１の組合せを過剰発現する細胞でも観察されない（図１Ｃ）。したがって、ＳＴＩＭ１に会合したＣＲＡＣチャネルとＳＴＩＭ２に会合したＣＲＡＣチャネルとの間の薬理の相違を用いて、細胞内のＳＴＩＭ２活性のレベルをアッセイすることが可能である（図１Ｃおよび１Ｄ）。
【００２１】
[0023]  一態様では、本発明は、これらの薬理特性を利用して、細胞内のＳＴＩＭ２活性のアッセイを提供する。このアッセイは、２−ＡＰＢに反応したＩｃｒａｃ活性を測定するステップを含む。２−ＡＰＢに反応したＩｃｒａｃ活性の増大は、前記細胞内のＳＴＩＭ２活性のレベルを示す。さらに別の態様では、２−ＡＰＢに対するこの反応が、カルシウム貯蔵枯渇の非存在下で起こる。
【００２２】
[0024]  ＳＴＩＭ２活性は、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、シプロフロキサシン、アズトレオナム、セフタジジム、セホタキシム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、ピペラシリン−タゾバクタム、チカルシリン−クラブラン酸およびＧ４１８（ジェネテシンとしても知られている）などのアミノグリコシド抗生物質の薬理作用によっても調節されうる。
【００２３】
[0025]  Ｇ４１８の存在は、ＣＲＡＣＭ１電流のＳＴＩＭ１依存的活性化を損なわないようである。Ｇ４１８中で増殖させたＳＴＩＭ１細胞は、抗生物質に曝露されていない細胞によって生成されたものに類似した特性を有するＣＲＡＣＭ１電流を生成する。しかし、ＳＴＩＭ２媒介のシグナル伝達は、Ｇ４１８によって損なわれる。Ｇ４１８の非存在下で増殖させたＨＥＫ２９３細胞は、２−ＡＰＢに対する増強された反応を示す。さらに、ＳＴＩＭ２細胞は、抗生物質に曝露された場合、ＩＰ３誘導の貯蔵枯渇に反応しないが、Ｇ４１８の非存在下で増殖させた細胞は、貯蔵枯渇の際にＣＲＡＣＭ１電流の活性化を示す。この影響は、ＳＴＩＭ１およびＣＲＡＣＭ１を同時発現する細胞では見られない。
【００２４】
[0026]  したがって、別の態様では、本発明は、細胞内のＳＴＩＭ２活性のアッセイであって、アミノグリコシド抗生物質の適用後のＩｃｒａｃ活性を測定するステップを含むアッセイを提供する。このアッセイの一実施形態では、抗生物質によるＩｃｒａｃ活性の抑制が、細胞内のＳＴＩＭ２活性のレベルを示す。好ましい実施形態では、抗生物質によるＩｃｒａｃ活性の抑制が、ＳＴＩＭ２を介したＩｃｒａｃの貯蔵枯渇誘導性活性化の阻害によって起こる。本発明の好ましい実施形態では、抗生物質活性の作用が２−ＡＰＢの適用によって克服され、２−ＡＰＢによるこの作用が細胞内のＳＴＩＭ２活性に関するさらなる指標として働く。
【００２５】
[0027]  ドキソルビシンなどのある種のアミノグリコシド抗生物質は、特にインターロイキン−２などのサイトカインと併用した場合、免疫抑制効果を有することが示されている（Ewens et al.、Cancer Res.、（2006）、66（10）:5419-26）。したがって、本発明のアッセイは、Ｉｃｒａｃ活性を抑制するアミノグリコシド抗生物質を同定することによって、免疫抑制効果を有するアミノグリコシド抗生物質を得るためのスクリーニングに使用できる。
【００２６】
ＳＴＩＭ２の過剰発現は脳悪性腫瘍に関連している
[0028]  多形膠芽腫などの脳悪性腫瘍は、複雑な構造的変化および遺伝的変化を特徴とする。多形膠芽腫における遺伝子コピー数変化の研究は、ＳＴＩＭ２を含めた特定の遺伝子がこれらの悪性腫瘍で過剰発現されていることを示し、これらの腫瘍の発病機序におけるこれらの分子の潜在的役割を示した（Ruana et al.、Molecular Cancer、（2006）、5:39）。他の研究は、ＳＴＩＭ２が小脳ニューロンの発生、特に脳橋神経突起の精密化における役割を演じていることを示した（Hansen et al.、Brain Res. Mol. Brain. Res.（2004）、124（2）:165-77）。したがって、ＳＴＩＭ２活性の同定を用いて、脳悪性腫瘍および神経発生のある種の側面を特徴付け、診断することができる。
【００２７】
[0029]  本発明の一実施形態では、ＳＴＩＭ２活性のアッセイで使用される細胞は哺乳動物対象に由来する。好ましい実施形態では、細胞は、哺乳動物対象の脳に由来し、ＳＴＩＭ２活性の存在が脳悪性腫瘍を示す。
【００２８】
ＳＴＩＭ２と免疫系
[0030]  ＣＲＡＣチャネルは、Ｔリンパ球およびＢ細胞を含めた、免疫系の細胞全体で見出されている。ＣＲＡＣチャネル機能の調節因子として、ＳＴＩＭ１およびＳＴＩＭ２も、これらの細胞の機能特性で重要な役割を演じている。したがって、本発明のアッセイを利用して、免疫系に影響を与える作用物質をスクリーニングすることができる。
【００２９】
[0031]  本発明を例示するものとして提供する以下の非限定的な実施例を参照することによって、本発明をよりよく理解することができる。本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために、以下の例を提示するが、それらは、いかなる意味においても、本発明の広範な範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００３０】
実施例Ｉ  ＳＴＩＭ１またはＳＴＩＭ２とＣＲＡＣＭ１との異種同時発現
[0032]  ＳＴ１Ｍ１またはＳＴ１Ｍ２を安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を用いた実験から、両方のタンパク質が内在性ＩＣＲＡＣをわずかに改変することが確認された。イノシトール１，４，５−三リン酸（IP3）によるＣａ２＋貯蔵枯渇に反応して、ＳＴＩＭ２発現細胞は、低減したＩＣＲＡＣ（約０．２ｐＡ／ｐＦ）を示し、ＳＴＩＭ１発現細胞は、野生型細胞（約０．５ｐＡ／ｐＦ）と比較してわずかに増大したＩＣＲＡＣ（約０．８ｐＡ／ｐＦ）を示した。（図４）。ＳＴＩＭ１細胞は、大きなＣＲＡＣ電流を発生させたが、ＳＴＩＭ２細胞は発生させなかった（図１Ａ）。以前の報告とは対照的に、ブレークイン時（at break-in）における＜１ｐＡ／ｐＦの小さな基底ＣＲＡＣ電流は見落とした可能性があるが、これらの条件下では、ＣＲＡＣチャネルの容易に識別可能ないかなる構成的活性も存在しなかった。しかし、平均して、−８０ｍＶで約−１ｐＡ／ｐＦに達する極めて緩徐に発生する小さなＣＲＡＣ電流が存在した。
【００３１】
[0033]  パッチクランプ実験を２１〜２５℃、密封全細胞構成で行った。高分解能の電流記録は、ＥＰＣ−９（HEKA社）を用いて取得した。−１００Ｖから＋１００ｍＶまでの範囲にまたがる時間５０ｍｓの電位ランプ波を、０．５Ｈｚの速度で１００〜７００秒の時間にわたって、０ｍＶの保持電位から送達した。すべての電位は、１０ｍＶ（主要内部陰イオンとしてＣｌ−を用いた場合は３ｍＶ）の液間電位に関して補正した。電流を２．９ｋＨｚでフィルタリングし、１００μｓ間隔でデジタル化した。容量性電流を決定し、各電位ランプの前に補正した。個々のランプ電流記録から−８０ｍＶの電流振幅を抽出することによって、低分解能の時間的な電流の発生を評価した。適用可能な場合には、平均データの統計誤差をｎ回の決定での平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で示す。標準外部溶液は以下の通り、すなわち、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．２にした、３００ｍＯｓｍの、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣｓＣｌ、２．８ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＴＥＡ−Ｃｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコースであった。一部の実験では、２μＭもしくは５０μＭのホウ酸２−アミノエチルジフェニル（2-APB）または１０μＭ  Ｇ４１８を標準外部溶液に添加し、先端の広いパフピペットを通して適用した。標準内部溶液は以下の通り、すなわち、ＣｓＯＨを用いてｐＨ７．２にした、３００ｍＯｓｍの、１２０ｍＭ  Ｃｓ−グルタミン酸、８ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｃｓ・ＢＡＰＴＡ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０２ｍＭ  ＩＰ３であった。図の説明で示した通り、一部の実験には、２０ｍＭ  Ｃｓ・ＢＡＰＴＡおよび８ｍＭ  ＣａＣｌ２、または２０ｍＭ  Ｃｓ・ＥＧＴＡおよび８、９ｍＭ  ＣａＣｌ２によって、［Ｃａ２＋］ｉを１５０ｎＭに緩衝化した。受動枯渇実験用には、ＩＰ３およびＣａ２＋の非存在下で、内部溶液にＣｓ・ＢＡＰＴＡを補足した。一部の実験では、Ｃｓ−グルタミン酸およびＣｓ・ＢＡＰＴＡを等モルのＫＣｌおよびＫ・ＢＡＰＴＡで置換した。他では、Ｇ４１８、Ｎａ・ＡＴＰおよびＮａ・ＧＴＰまたはカルモジュリンを、図の説明で指定されている通りに細胞内溶液に添加した。すべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．から購入した。
【００３２】
[0034]  蛍光測定には、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．２にした、１０７ｍＭ  ＮａＣｌ、７．２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１１．５ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有する外部溶液中に、カバーガラス上で増殖させた細胞を入れ、２０℃で３０分間、ｆｕｒａ−２アセトキシメチルエステル（２μＭ）を添加した。細胞を洗浄し、２０℃で最低３０分間おいて、色素を脱エステル化させた。サポニン透過化処理後に残留しているシグナルによる決定では、色素の約９５％が細胞質に限局していた。１ｍＭ  ＣａＣｌ２の非存在下または存在下で、カバーガラス上の細胞を外部溶液中に入れた。Ｃａ２＋測定は、ＩｎＣｙｔ二波長蛍光イメージングシステム（Intracellular Imaging Inc.）を用いて行った。５０５ｎｍにおける蛍光発光を３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの励起によってモニターし、単一細胞の群（３５〜４５細胞）から得られた３４０ｎｍ／３８０ｎｍの比率で細胞内Ｃａ２＋の測定値を示した。これらのＣａ２＋測定の詳細については、以前に記述されている。示したすべての測定値は、最低３回の独立した実験を代表するものである。
【００３３】
実施例ＩＩ  ＳＴＩＭ１およびＳＴＩＭ２存在下におけるＣＲＡＣＭ１電流の薬理
[0035]  ２μＭのホウ酸２−アミノエトキシジフェニル（2-APB）の外部適用によって、ＩＰ３誘導のＣＲＡＣＭ１電流がないのにもかかわらず、通常は内向き整流性の電流−電圧関係を有する大きなＣＲＡＣＭ１電流（図１、ＡおよびＢ）を誘導できる（図１Ａ）。２−ＡＰＢは、低用量（≦５μＭ）ではＣＲＡＣ電流への亢進作用を有するが、高用量（≧１０μＭ）ではそれらを抑制する化合物である、実際、５０μＭ  ２−ＡＰＢというさらに高い濃度で細胞を刺激した場合、ＣＲＡＣ電流は、迅速に活性化され、そして直ちに２−ＡＰＢの阻害作用によって縮小し、その結果、内向き電流の一過性サージをもたらした（図１Ｃ）。ＩＰ３をパッチピペットから取り除き、［Ｃａ２＋］ｉを１５０ｎＭに緩衝化して、いかなる種類の貯蔵枯渇も回避した。したがって、ここで観察された２−ＡＰＢの作用は貯蔵枯渇を必要としていなかった。
【００３４】
[0036]  さらに高い分解能でこの反応の動態（速度論）を分析するために、−８０ｍＶの固定膜電位で、２−ＡＰＢ作用の高分解能の記録を得た。図１Ｄで見ることができるように、２−ＡＰＢ誘導電流が数秒以内に活性化され、さらに迅速に遮断され、それによって、一過性の電流が生じた。この２−ＡＰＢ誘導作用は、ＳＴＩＭ２およびＣＲＡＣＭ１を過剰発現する細胞に特異的であり、ＳＴＩＭ２もしくはＣＲＡＣＭ１単独、またはＳＴＩＭ１およびＣＲＡＣＭ１の組合せを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞では観察されなかった。（図１Ｃ）。
【００３５】
[0037]  上述の結果は、ＳＴＩＭ２はＩＰ３誘導の貯蔵枯渇に反応してＣＲＡＣＭ１チャネルを活性化することができないが、２−ＡＰＢは有意なＣＲＡＣＭ１活性化を引き起こし、この作用機序にはＳＴＩＭ２の存在が必要であることを示唆している。
【００３６】
実施例ＩＩＩ  ＳＴＩＭ１活性およびＳＴＩＭ２活性へのアミノグリコシド抗生物質の作用
[0038]  ＳＴＩＭ２の挙動は、アミノグリコシド抗生物質であるＧ４１８によって引き起こされる薬理作用によって複雑化されていた。Ｇ４１８は、ＳＴＩＭ１またはＳＴＩＭ２で安定的に形質移入されている細胞の選択圧を維持するために、増殖培地中で慣行的に使用されていた。Ｇ４１８中で増殖させたＳＴＩＭ１細胞は、Ｇ４１８に曝露されないままであったｗｔ  ＨＥＫ２９３細胞内でのＳＴＩＭ１およびＣＲＡＣＭ１の同時発現によって生成されたものと類似した特性を有するＣＲＡＣＭ１電流を生成させるので（図１Ａを参照）、Ｇ４１８の存在は、ＳＴＩＭ１依存的なＣＲＡＣＭ１電流の活性化を損なっていなかった。しかし、事実上、ＳＴＩＭ２媒介のシグナル伝達はＧ４１８によって損なわれていた。Ｇ４１８の非存在下で数日または数週間増殖させた、ＳＴＩＭ２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞は、２−ＡＰＢに対する増強された反応を示し、かつ貯蔵枯渇に対して著しく異なった反応を示した。図１ＣおよびＤは、これらの細胞が、有意に、より速い動態（速度論）およびより大きな電流振幅で５０μＭの２−ＡＰＢに対して反応することを実証している。しかし、最も重要な相違は、これらの細胞がこの場合には、様々な形および振幅の増幅されたＣＲＡＣ電流を発生させることによってＩＰ３誘導の貯蔵枯渇に反応したことであった（図２Ａ）。大部分の細胞で観察される支配的なＣＲＡＣ電流表現型は、小さくて速い活性化相と、それに続く、約１００秒後に始まり６００秒後にさえ定常状態にめったに達しない、より遅い相とからなる二相性活性化パターンを特徴とする（図２Ｃおよび図３も参照）。この二相性表現型のため、実験に入って３００秒で得られた−８０ｍＶの電流振幅は約−１５ｐＡ／ｐＦであった。しかし、一部の形質移入および細胞集団では、二次相が比較的小さいか、または存在しないかのごとく、最大−１２０ｐＡ／ｐＦまでの、より大きな電流と、顕著に速い活性化動態（活性化速度論）が観察された（例えば図２Ａを参照）。これらのすべての場合で、ＩＰ３によって活性化された電流は、ＣＲＡＣ電流に典型的なＩ／Ｖ曲線を有していた。（図２Ｂ）。
【００３７】
[0039]  Ｇ４１８の非存在下で増殖させた細胞はＩＰ３誘導の貯蔵枯渇に反応したので、細胞を特定の濃度のＧ４１８で灌流することによって、ＣＲＡＣＭ１のＳＴＩＭ２媒介活性化におけるこの抗生物質の阻害作用を評価することができた。図２Ｄは、漸増濃度のＧ４１８によって、両相のＩＰ３誘導ＣＲＡＣＭ１電流の用量依存性阻害を示し、この結果、０．５μＭという最大半量阻害濃度が得られた（図２Ｅ）。細胞内に１０μＭのＧ４１８を灌流させた同じ実験条件下では、それによって、ＳＴＩＭ１およびＣＲＡＣＭ１の同時発現細胞におけるＩＰ３誘導ＣＲＡＣ電流が改変されなかった（図５を参照）。Ｇ４１８の最も強力な作用は細胞内空間から媒介され、ＳＴＩＭ２発現細胞に特異的に作用しているようであるが、細胞外側から１０μＭで適用された場合にも、アミノグルコシドによる何らかの阻害があった。しかし、この作用はＳＴＩＭ１発現細胞およびＳＴＩＭ２発現細胞の両方で同様であったので、それはＳＴＩＭ２に特異的ではないようであった（図５および６）。これは、それがＣＲＡＣＭ１への薬理効果である可能性があることを示唆している。細胞内Ｇ４１８（および潜在的に他のアミノグリコシド抗生物質）によって引き起こされるＳＴＩＭ２媒介ＣＲＡＣ電流の特異的かつ強力な阻害は、それゆえ、天然の細胞系でＳＴＩＭ２機能を評価する強力な薬理学的なツールである。
【００３８】
実施例ＩＶ  ＣＲＡＣチャネル、ＳＴＩＭ１およびＳＴＩＭ２の活性に作用するサイトゾル因子の研究
[0040]  ２−ＡＰＢは、ＳＴＩＭ２発現細胞およびＣＲＡＣＭ１発現細胞のＣＲＡＣ電流を活性化し、貯蔵の充填状態に関係なく、Ｇ４１８媒介の抑制を克服することができる。貯蔵枯渇を、ＩＰ３によって能動的に誘導するか、またはＩＰ３を含まない溶液で細胞を灌流し、かつ［Ｃａ２＋］ｉを１５０ｎｍに緩衝化することによって阻止する実験プロトコールを用いて、Ｇ４１８の非存在下で増殖させたＳＴＩＭ２発現細胞およびＣＲＡＣＭ１発現細胞における、２−ＡＰＢの作用を評価した（図２Ｆ）。両方の場合とも、５０μＭ  ２−ＡＰＢは大きな一過性のＣＲＡＣ電流を活性化することができた。これはおそらく、貯蔵に依存しない予め連結されたＳＴＩＭ２およびＣＲＡＣＭ１複合体の動員によるものである（図１Ｃも参照）。興味深いことに、２−ＡＰＢを洗い出した後に、ＣＲＡＣ電流が再活性化され、貯蔵が空であったか、または充填されたままであったかに関係なく、実験時間中、活性のまま残った。もしこの電流の第２相が貯蔵枯渇によるものだったならば、それは、ＩＰ３灌流細胞の場合には再活性化されたが、充填された貯蔵を有する細胞では再活性化されなかったはずである。
【００３９】
[0041]  第２相が、実際に貯蔵枯渇によるものであったのか、または何らかの他の過程によって引き起こされたものであるか調査した。図３Ａは、ＩＰ３による能動的貯蔵枯渇中（［Ｃａ２＋］ｉを緩衝化するための２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡの存在下からほぼゼロまで）に発生したＣＲＡＣ電流がＣＲＡＣＭ１電流の典型的な二相性活性化を有していたことを示す。２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡのみを含有するピペット溶液で細胞を灌流して、受動的貯蔵枯渇を誘導した場合には、ＣＲＡＣ電流の速い相が消失し、第２相のみが観察された。これは貯蔵依存的な活性化と一致している。しかし、ＩＰ３を含まない溶液で細胞を灌流し、［Ｃａ２＋］ｉを１５０ｎＭに緩衝化して貯蔵枯渇を回避させても、依然として遅い第２相が生じた。これらの結果は、第１相は貯蔵枯渇によって引き起こされるが、第２相は細胞内貯蔵の充填状態に関係なく発生することを示唆している。したがって、第２相は、本発明者らのピペット充填溶液の何らかの成分によって活性化されるか、またはＣＲＡＣチャネルを構成的に抑制する何らかのサイトゾル因子の減失によって引き起こされるものである。
【００４０】
[0042]  標準ピペット充填溶液の主要成分を交換することによって、これらの可能性を調査した。図３Ｂに示す通り、細胞内の主要な塩であるＣｓ−グルタミン酸をＫＣｌで完全に置換しても、ＩＰ３によって誘導された二次電流成分を抑制するのに効果がなかった。また、主要キレート剤であるＢＡＰＴＡを等モル濃度のＥＧＴＡで置換しても、［Ｃａ２＋］ｉを１５０ｎＭに緩衝化することによって貯蔵枯渇が阻止されている細胞における第２相を抑制しなかった。したがって、ＣＲＡＣ電流の第２相は、未だ同定されていない細胞因子を洗い出した結果である可能性が高い。
【００４１】
[0043]  サイトゾル因子が二次電流成分を活性化していたことを確認するために、ピペットの先端の直径を変え、その結果得られる二相性電流を分析した。ピペットの先端が小さい（直列抵抗が高い）ほど、サイトゾル阻害因子の拡散逸脱率が低下する。図３Ｃは、これが実際に第２相の発生を遅延させたことを実証している。生理濃度のＡＴＰ（３ｍＭ）およびＧＴＰ（０．３ｍＭ）を添加しても第２相が抑制されなかったので、このサイトゾル因子は、２種の主要サイトゾルヌクレオチドのいずれでもないようである。同様に、１００μＭカルモジュリンで灌流された細胞でも第２相が観察された（図３Ｂ）。
【００４２】
[0044]  無傷細胞では、内在性阻害因子が逸脱しえず、それゆえ、ＳＴＩＭ２によるＣＲＡＣチャネルの初期貯蔵作動性活性化の後に阻害が続き、その結果、一過性の貯蔵作動性Ｃａ２＋流入相がもたらされると予測される。Ｃａ２＋指示体であるｆｕｒａ−２を添加し、ムスカリン受容体を介して、カルバコールを用いて貯蔵作動性Ｃａ２＋流入を刺激した無傷細胞でこれを試験した。この実験は、細胞外Ｃａ２＋の存在下および非存在下の両方で、空のベクターまたはＣＲＡＣＭ１で一時的に形質移入された安定なＳＴＩＭ２発現ＨＥＫ２９３細胞内で行った。図３ＤおよびＥに示す通り、空のベクターで形質移入されている細胞およびＣＲＡＣＭ１過剰発現細胞では、［Ｃａ２＋］ｉの一過性の上昇が生じた。これは、細胞外Ｃａ２＋に依存せず、ＩＰ３に媒介された、細胞内貯蔵からのＣａ２＋の放出によるものであった。予測通り、細胞外Ｃａ２＋の存在は、［Ｃａ２＋］ｉが上昇しているプラトー相を生成した。これは、両方の細胞集団における貯蔵作動性Ｃａ２＋流入によるものである。しかし、ＣＲＡＣＭ１発現細胞は、ＳＴＩＭ２による貯蔵作動性活性化による一過性の放出の後に、より顕著な肩を示した。
【００４３】
[0045]  ２つの集団間にあるＣａ２＋流入の相違をさらに解明するために、Ｃａ２＋存在下で得られたシグナルから、Ｃａ２＋非存在下で得られたシグナルを差し引いて、２種の細胞集団における正味の流入成分に至った。図３Ｆで見ることができるように、ＣＲＡＣＭ１発現細胞は、貯蔵作動性カルシウム流入の一過性の上昇を生成し、この上昇は、空ベクター形質移入細胞内のレベルと同様なレベルまで減衰した。貯蔵作動性カルシウム流入のこの一過性の上昇は、貯蔵枯渇の後で、ＣＲＡＣＭ１チャネルに連結したＳＴＩＭ２によって誘導される貯蔵作動性Ｃａ２＋流入を反映している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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