(57)【要約】  本発明は、少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸の蛍光検出を目的とする二本鎖プローブであって、該二本鎖プローブが、式Ｔ’１−Ｔ１の配列を含む標的核酸の第一の鎖の検出を目的とする、式Ｘ１−（Ｌ１）ａ−Ｓ１−Ｓ’１−（Ｌ’１）ｂ−Ｙ１の第一の鎖；標的核酸の第二の鎖が存在する場合に、式Ｔ’２−Ｔ２の配列を含む標的核酸の第二の鎖の検出を目的とする、式Ｘ２−（Ｌ２）ｃ−Ｓ２−Ｓ’２−（Ｌ’２）ｄ−Ｙ２の第二の鎖を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２のうち二つは蛍光供与体であり、一方で、他の二つは蛍光受容体であり、また、Ｘ１およびＹ２が共に蛍光供与体であることはできない、二本鎖プローブに関する。
2010505440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  式Ｔ’１−Ｔ１の配列を含む標的核酸の第一の鎖の検出を目的とする、式Ｘ１−（Ｌ１）ａ−Ｓ１−Ｓ’１−（Ｌ’１）ｂ−Ｙ１の第一の鎖；
−  標的核酸の第二の鎖が存在するならば、式Ｔ’２−Ｔ２の配列を含む標的核酸の第二の鎖の検出を目的とする、式Ｘ２−（Ｌ２）ｃ−Ｓ２−Ｓ’２−（Ｌ’２）ｄ−Ｙ２の第二の鎖；
を含む、一本鎖または二本鎖標的核酸の蛍光検出を目的とする二本鎖プローブであって、ここで、
−  Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２のうち二つは蛍光供与体であり、一方で、他の二つは蛍光受容体であり、また、Ｘ１およびＹ２が共に蛍光供与体であることはできず；
−  ａ、ｂ、ｃおよびｄは０または１であり、ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１またはＹ２が蛍光供与体である場合、それぞれ、ａ、ｂ、ｃまたはｄは１であり；
−  Ｔ１およびＴ２は、互いに相補的な１０ないし３５ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり；
−  Ｔ’１およびＴ’２は互いに独立して、２ないし８ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり；
−  Ｓ１およびＳ２は、互いに相補的な１０ないし３５ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓ１はＴ１に対して少なくとも８５％相補的であり、Ｓ２はＴ２に対して少なくとも８５％相補的であり；
−  Ｓ’１およびＳ’２は互いに独立して、２ないし８ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓ’１はＴ’１に対して少なくとも６５％相補的であり、Ｓ’２はＴ’２に対して少なくとも６５％相補的であり；
−  Ｌ１およびＬ２は、Ｌ１に対するＳ１のの連結部位およびＬ２に対するＳ２の連結部位に対するＸ１およびＸ２の各回転半径が少なくとも３．４Åとなるようなスペーサー部分であり；
−  Ｌ’１およびＬ’２は、Ｌ’１に対するＳ’１の連結部位およびＬ’２に対するＳ’２の連結部位に対するＹ１およびＹ２の各回転半径が少なくとも３．４Åとなるようなスペーサー部分であり；
−  二本鎖プローブの融解温度は、二本鎖プローブの第一の鎖と標的核酸の第一の鎖との間で形成された複合体の融解温度より低く；標的核酸の第二の鎖が存在するならば、二本鎖プローブの第二の鎖と該標的核酸の第二の鎖との間で形成された複合体の融解温度より低いものである、
二本鎖プローブ。
【請求項２】
ｂ＝ｄ＝０であり、Ｘ１およびＸ２が蛍光供与体である請求項１記載の二本鎖プローブであって、故に、
−式Ｘ１−Ｌ１−Ｓ１−Ｓ’１−Ｙ１の第一の核酸鎖、および
−式Ｘ２−Ｌ２−Ｓ２−Ｓ’２−Ｙ２の第二の核酸鎖
から構成される二本鎖プローブ。
【請求項３】
蛍光供与体がキサンテン色素、ローダミン色素、カルボピロニン色素およびカルボキサミド色素からなる群より選択される、請求項１または２記載の二本鎖プローブ。
【請求項４】
蛍光受容体がＤａｂｃｙｌ、Ｄａｂｓｙｌ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＱＳＹ−７／９、ＱＳＹ−２１、ＤＡＢＭＩ、マラカイトグリーン、クマリンおよびダーククエンチャーからなる群より選択される、請求項１ないし３いずれかに記載の二本鎖プローブ。
【請求項５】
Ｘ１およびＸ２が蛍光部分である場合、Ｌ１およびＬ２それぞれＸ１およびＸ２の蛍光の２５％未満を消失させ、Ｙ１およびＹ２が蛍光部分である場合、Ｌ’１およびＬ’２がそれぞれＹ１およびＹ２の蛍光の２５％未満を消失させる、請求項１ないし４いずれかに記載の二本鎖プローブ。
【請求項６】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ’１および／またはＬ’２が少なくとも一つの正電荷を含む、請求項１ないし５いずれかに記載の二本鎖プローブ。
【請求項７】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ’１およびＬ’２が、同一または異なって、２ないし１０ヌクレオチドを有するポリヌクレオチド、３ないし１２個の炭素原子を有するアルキルまたはアミノアルキル基、および２ないし６の重合度を有するポリエチレングリコール基からなる群より選択される、請求項１ないし５いずれかに記載の二本鎖プローブ。
【請求項８】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ’１およびＬ’２が、同一または異なって、ポリＴポリヌクレオチドである、請求項７記載の二本鎖プローブ。
【請求項９】
Ｌ１および／またはＬ２がポリヌクレオチドである場合に、Ｌ１および／またはＬ２の長さがそれぞれＳ’２および／またはＳ’１の長さよりも短い、請求項７または８記載の二本鎖プローブ。
【請求項１０】
Ｌ１および／またはＬ２がポリヌクレオチドである場合に、Ｌ１および／またはＬ２がそれぞれＳ’２および／またはＳ’１に対して３５％未満の相補性を示す、請求項７ないし９いずれかに記載の二本鎖プローブ。
【請求項１１】
プローブの第二の鎖に対するプローブの第一の鎖の融解温度が、各標的核酸鎖に対するプローブのいずれかの鎖の融解温度よりも少なくとも１０％低い、請求項１ないし１０いずれかに記載の二本鎖プローブ。
【請求項１２】
−  式Ｘ１−Ｌ１−Ｓ１−Ｓ’１−Ｙ１の第一の核酸鎖、および
−  式Ｘ２−Ｌ２−Ｓ２−Ｓ’２−Ｙ２の第二の核酸鎖
から構成される請求項１ないし１１いずれかに記載の二本鎖プローブであって、ここで、
−  Ｘ１およびＸ２が、ＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２がＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２が３ないし６ヌクレオチドを有するポリＴポリヌクレオチドであり；
−  Ｓ１およびＳ２が１４ないし１８ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり；
−  Ｓ’１およびＳ’２が４ないし６ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列である、
二本鎖プローブ。
【請求項１３】
Ｓ１−Ｓ’１が以下のものからなる群より選択される配列のフラグメントである、請求項１２記載の二本鎖プローブ：
・５’−ＣＡＣＣＴＣＴＣＴＴＴＡＣＧＣＧＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＴＧＴ−３’（配列番号３１）；
この場合、Ｓ２−Ｓ’２は５’−ＧＧＡＧＴＣＣＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＣＣＣＣＧＴ−３’（配列番号３２）のフラグメントである；
・５’−ＣＧＡＧＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＧＧＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＧ−３’（配列番号３３）；
この場合、Ｓ２−Ｓ’２は５’−ＧＴＣＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧ−３’（配列番号３４）のフラグメントである；
・５’−ＣＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＣＴＧＣ−３’（配列番号３５）；
この場合、Ｓ２−Ｓ’２は５’−ＧＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＧＡＴＴＧＴＣ−３’（配列番号３６）のフラグメントである；
・５’−ＡＴＡＧＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧＴＣＡＧＣＴＡＡＡＡ−３’（配列番号３７）；
この場合、Ｓ２−Ｓ’２は５’−ＧＡＣＡＴＴＴＡＴＣＡＣＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴ−３’（配列番号３８）のフラグメントである；
・５’−ＡＧＴＣＴＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＣＴＴＴＴＡＴＡＴＧＧＣＡＴ−３’（配列番号３９）；
この場合、Ｓ２−Ｓ’２は５’−ＴＡＡＡＡＧＧＧＧＡＡＧＣＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＣＡＧＧＴＡＧＡＣＴＡＣＡＧＴＣＣＡ−３’（配列番号４０）のフラグメントである；
・５’−ＣＴＧＡＡＴＡＴＴＧＴＣＡＧＡＡＴＡＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＡ−３’（配列番号８４）；
この場合、Ｓ２−Ｓ’２は５’−ＴＡＴＣＧＴＣＧＧＴＡＡＧＧＣＡＣＧＣＴＣＡＣＴＡＴＴＣＴＧＡＣＡＡＴＡＴＴＣＡＧ−３’（配列番号８５）のフラグメントである。
【請求項１４】
−  ５’から３’への方向に式Ｘ１−Ｌ１−Ｓ１−Ｓ’１−Ｙ１の第一の核酸鎖、および
−  ５’から３’への方向に式Ｘ２−Ｌ２−Ｓ２−Ｓ’２−Ｙ２の第二の核酸鎖
から構成される、ＨＢＶ検出を目的とする請求項１２または１３記載の二本鎖プローブであって、ここで、
−  Ｘ１およびＸ２がＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２がＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２が５’−ＴＴＴＴ−３’（配列番号４１）であり；
−  Ｓ１が５’−ＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’（配列番号４２）であり；
−  Ｓ’１が５’−ＧＡＣＣ−３’（配列番号４３）であり；
−  Ｓ２が５’−ＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣ−３’（配列番号４４）であり；
−  Ｓ’２が５’−ＣＴＣＧ−３’（配列番号４５）であるか；
または
−  Ｘ１およびＸ２がＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２がＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２が５’−ＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号４６）であり；
−  Ｓ１が５’−ＧＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号４７）であり；
−  Ｓ’１が５’−ＴＡＧＧＧＧ−３’（配列番号４８）であり；
−  Ｓ２が５’−ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣ−３’（配列番号４９）であり；
−  Ｓ’２が５’−ＴＣＧＣＣＴ−３’（配列番号５０）であるか；
または
−  Ｘ１およびＸ２がＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２がＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２が５’−ＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号４６）であり；
−  Ｓ１が５’−ＣＴＣＴＴＴＡＣＧＣＧＧＡＣ−３’（配列番号５１）であり；
−  Ｓ’１が５’−ＴＣＣＣＣＧ−３’（配列番号５２）であり；
−  Ｓ２が５’−ＧＴＣＣＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧ−３’（配列番号５３）であり；
−  Ｓ’２が５’−ＡＧＧＴＧＣ−３’（配列番号５４）であるか；
または
−  Ｘ１およびＸ２がＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２がＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２が５’−ＴＴＴＴ−３’（配列番号４１）であり；
−  Ｓ１が５’−ＣＴＣＴＣＴＴＴＡＣＧＣＧＧＡＣＴＣ−３’（配列番号７６）であり；
−  Ｓ’１が５’−ＣＣＣＧ−３’（配列番号７７）であり；
−  Ｓ２が５’−ＧＡＧＴＣＣＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号７８）であり；
−  Ｓ’２が５’−ＧＴＧＣ−３’（配列番号７９）である、
二本鎖プローブ。
【請求項１５】
−  ５’から３’への方向に式Ｘ１−Ｌ１−Ｓ１−Ｓ’１−Ｙ１の第一の核酸鎖、および
−  ５’から３’への方向に式Ｘ２−Ｌ２−Ｓ２−Ｓ’２−Ｙ２の第二の核酸鎖
から構成される、ＨＩＶ−１検出を目的とする請求項１２または１３記載の二本鎖プローブであって、ここで、
−  Ｘ１およびＸ２がＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２がＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２が５’−ＴＴＴＴ−３’（配列番号４１）であり；
−  Ｓ１が５’−ＣＣＡＧＣＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧ−３’（配列番号５５）であり；
−  Ｓ’１が５’−ＴＣＡＧ−３’（配列番号５６）であり；
−  Ｓ２が５’−ＣＡＴＴＴＡＴＣＡＣＡＧＣＴＧＧ−３’（配列番号５７）であり；
−  Ｓ’２が５’−ＣＴＡＣ−３’（配列番号５８）であるか；
または
−  Ｘ１およびＸ２がＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２がＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２が５’−ＴＴＴＴ−３’（配列番号４１）であり；
−  Ｓ１が５’−ＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号５９）であり；
−  Ｓ’１が５’−ＣＣＣＴ−３’（配列番号６０）であり；
−  Ｓ２が５’−ＧＡＡＧＣＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＣＡＧ−３’（配列番号６１）であり；
−  Ｓ’２が５’−ＧＴＡＧ−３’（配列番号６２）である、
二本鎖プローブ。
【請求項１６】
−  ５’から３’への方向に式Ｘ１−Ｌ１−Ｓ１−Ｓ’１−Ｙ１の第一の核酸鎖、および
−  ５’から３’への方向に式Ｘ２−Ｌ２−Ｓ２−Ｓ’２−Ｙ２の第二の核酸鎖
から構成される、内部対照の検出を目的とする請求項１２または１３記載の二本鎖プローブであって、ここで、
−  Ｘ１およびＸ２がＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２がＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２が５’−ＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号４６）であり；
−  Ｓ１が５’−ＡＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧ−３’（配列番号６３）であり；
−  Ｓ’１が５’−ＧＡＧＧＡＣ−３’（配列番号６４）であり；
−  Ｓ２が５’−ＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＴＴ−３’（配列番号６５）であり；
−  Ｓ’２が５’−ＧＧＣＧＡＴ−３’（配列番号６６）であるか；
または
−  Ｘ１およびＸ２がＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２がＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２が５’−ＴＴＴＴ−３’（配列番号４１）であり；
−  Ｓ１が５’−ＡＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡ−３’（配列番号８０）であり；
−  Ｓ’１が５’−ＧＧＡＣ−３’（配列番号８１）であり；
−  Ｓ２が５’−ＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＴＴ−３’（配列番号８２）であり；
−  Ｓ’２が５’−ＧＧＣＧ−３’（配列番号８３）である、
二本鎖プローブ。
【請求項１７】
−  ５’から３’への方向に式Ｘ１−Ｌ１−Ｓ１−Ｓ’１−Ｙ１の第一の核酸鎖、および
−  ５’から３’への方向に式Ｘ２−Ｌ２−Ｓ２−Ｓ’２−Ｙ２の第二の核酸鎖
から構成される、サルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）の検出を目的とする請求項１２または１３記載の二本鎖プローブであって、ここで、
−  Ｘ１およびＸ２がＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２がＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２が５’−ＴＴＴ−３’（配列番号８６）であり；
−  Ｓ１が５’−ＧＡＡＴＡＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴ−３’（配列番号８７）であり；
−  Ｓ’１が５’−ＴＡＣＣＧ−３’（配列番号８８）であり；
−  Ｓ２が５’−ＡＧＧＣＡＣＧＣＴＣＡＣＴＡＴＴＣ−３’（配列番号８９）であり；
−  Ｓ’２が５’−ＴＧＡＣＡ−３’（配列番号９０）である、
二本鎖プローブ。
【請求項１８】
−  請求項１ないし１７いずれかに記載の式Ｘ１−（Ｌ１）ａ−Ｓ１−Ｓ’１−（Ｌ’１）ｂ−Ｙ１の第一の核酸鎖、および
−  請求項１ないし１７いずれかに記載の式Ｘ２−（Ｌ２）ｃ−Ｓ２−Ｓ’２−（Ｌ’２）ｄ−Ｙ２の第二の核酸鎖
を含む、一本鎖または二本鎖標的核酸の蛍光検出を目的とするキット。
【請求項１９】
少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸を蛍光検出するための、請求項１ないし１７いずれかに記載の二本鎖プローブまたは請求項１８記載のキットの使用。
【請求項２０】
標的核酸が生物試料中に存在する、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
少なくとも一つの一本鎖または二本鎖核酸の検出が、酵素ベース核酸増幅法にて実施される、請求項１９または２０記載の使用。
【請求項２２】
酵素ベース核酸増幅法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ、およびリアルタイムＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲからなる群より選択される、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
少なくとも一つの一本鎖または二本鎖核酸を蛍光定量するための、請求項１９ないし２２いずれかに記載の使用。
【請求項２４】
−  請求項１ないし１７いずれかに記載の少なくとも一つの二本鎖プローブ；
−  酵素ベース核酸増幅のための酵素；
−  酵素ベース核酸増幅に適した試薬混合物；
を含む、酵素ベース核酸増幅法にて少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸を蛍光検出するためのキット。
【請求項２５】
標的核酸の酵素ベース増幅に適したヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項２４記載のキット。
【請求項２６】
マルチプレックス酵素ベース核酸増幅法にていくつかの一本鎖または二本鎖標的核酸を検出するための請求項２４または２５記載のキットであって、該キットが請求項１ないし１７いずれかに記載のいくつかの二本鎖プローブを含んでおり該標的核酸の各々が該二本鎖プローブの少なくとも一つにより検出される傾向がある、キット。
【請求項２７】
以下の工程：
ａ）少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸と、
−  該標的核酸の検出を目的とする請求項１ないし１７いずれかに記載の少なくとも一つの二本鎖プローブ、または請求項１８記載の二つの核酸鎖の少なくとも一対、
−  酵素ベース核酸増幅のための酵素、
−  標的核酸の酵素ベース増幅に適したヌクレオチドプライマー、
−  酵素ベース核酸増幅に適した試薬混合物、
とを混合して反応混合物を得る工程；
ｂ）該反応混合物を加熱することにより、反応混合物中に存在する核酸を融解させる工程；
ｃ）該反応混合物を冷却することにより、二本鎖プローブおよびヌクレオチドプライマーを標的核酸にハイブリダイズさせる工程；
ｄ）酵素に核酸合成を触媒させる工程；
ｅ）工程ｂ）ないしｄ）を繰り返す工程；
を含む、酵素ベース核酸増幅法にて少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸を検出するための方法であって、ここで、反応混合物からの蛍光発光の強度が工程ｂ）ないしｄ）の少なくとも一つにて測定され、また、少なくとも蛍光発光の強度がバックグラウンドレベルを上回って測定されるまで工程ｂ）ないしｄ）が繰り返される、方法。
【請求項２８】
少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸がリアルタイムで検出される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸が定量される、請求項２７または２８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸の蛍光検出を目的とする二本鎖ヌクレオチドプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸定量は今や医学的に広く使用されており、特に、ウイルス学の分野で広く使用されている。実際、Ｂ型肝炎またはＡＩＤＳのごとき慢性ウイルス性疾患を患っている個人におけるウイルス負荷測定は、特に投薬計画の有効性をモニターするために、これらの病変の管理から今や切り離すことができない。
【０００３】
核酸定量について知られている様々な方法のうち、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、その感度およびその特異性の双方を考慮して、現在最も高く評価されている方法である。
【０００４】
リアルタイムＰＣＲは、核酸増幅と増幅した核酸の蛍光検出とを結び付ける。簡潔に言うと、標的核酸の増幅を目的とする標準的なＰＣＲを、標的核酸に結合した場合に蛍光シグナルを特異的に生じるプローブの存在下で実施し、ＰＣＲサイクルが進行する間、蛍光発光をモニターする。ＰＣＲから放出された蛍光が閾値を上回って（すなわち、バックグラウンド蛍光レベルを上回って）測定されるサイクルを閾値サイクル（Ｃｔ）と呼ぶ。Ｃｔは、ＰＣＲにおいて最初に存在する標的核酸の量の常用対数に比例することが示されている（非特許文献１を参照のこと）。故に、Ｃｔの測定は、試料中の標的核酸の初期濃度の測定を可能にする。
【０００５】
この方法の成功により、標的核酸に結合しない場合に最小量の蛍光を生じ、かつ標的核酸に結合する場合に最大量の蛍光を生じることを目的とする様々な蛍光プローブが開発された。この目的を成し遂げる一つの方法は、プローブが標的核酸に結合しない場合にはクエンチング部分が近接して蛍光発光を防ぎ、また、プローブが標的核酸に結合する場合にはクエンチング部分が互いから十分に離れて蛍光発光を可能とするような、蛍光およびクエンチング部分で標識されたプローブを提供することである。
【０００６】
故に、Ｍｏｒｉｓｓｏｎ（特許文献１）は、鎖が互いにかつ標的核酸の鎖に完全に相補的である二本鎖ヌクレオチドプローブを提供し、該プローブの各鎖は、例えば、５’末端に蛍光供与体を有し、例えば、３’末端に蛍光受容体を有する。プローブが標的核酸に結合しない場合、二本鎖プローブにて蛍光およびクエンチング部分が互いに向かい合うために、蛍光発光が消失される。一方、プローブが標的核酸に結合する場合、蛍光およびクエンチング部分は互いに離れており、それ故、蛍光発光が可能となる。
【０００７】
しかし、これらのプローブには重大な欠点がある。実際、二本鎖プローブそれ自体の融解温度と、プローブ鎖と標的核酸鎖の間の二本鎖の融解温度には有意な違いはない。故に、リアルタイムＰＣＲサイクルのアニーリング段階の間に、一方でそれ自体に結合するプローブ鎖と、他方で標的核酸に結合するプローブ鎖との間で競合が生じ、それにより、蛍光発光の減少が生じ、結果として、リアルタイムＰＣＲの感度が低下する。さらに、蛍光供与体の蛍光発光は、標的核酸に結合したプローブにより形成される二重ＤＮＡへリックスの末端にある核酸塩基により部分的に消失される。
【０００８】
これらの問題は、特許文献２に特に開示されている、いわゆるモレキュラー・ビーコン・プローブを考慮すると、部分的に解決される。
【０００９】
モレキュラー・ビーコン・プローブは通常、ステム−ループ構造に折り畳まれたヌクレオチドプローブの形態をとり、ここで、ステムの一方の末端は蛍光供与体に結合しており、一方で、他の末端は蛍光受容体に結合している。従って、ステム−ループ構造に折り畳まれる場合には、プローブから蛍光は全く放出されず、一方で、折り畳まれていない場合には、プローブから蛍光が放出される。さらに、これらのプローブは、標的核酸上のその相補的配列に対するステムの融解温度がループ配列の融解温度より低くなるように設計される。故に、ＰＣＲのアニーリング段階の間、それ自体に結合するプローブと、標的核酸に結合するプローブとの間には、非常に限られた競合しか存在しない。
【００１０】
モレキュラー・ビーコン・プローブは比較的長いオリゴヌクレオチドである（３５ないし４５ヌクレオチド長）。これらのプローブを設計する場合、特に、検出されるべき標的が核酸配列の可変部分から構成される場合、かかる大きなサイズが問題となる可能性がある。さらに、二重標識されたかかる長いオリゴヌクレオチドの化学合成は労力を要し、かつ費用がかかる。
【００１１】
加えて、ステムおよびループの融解温度の間に見出されるべきバランスを成し遂げるには細心の注意を要することが多いため、かかるプローブの設計は通常厄介な作業であることが分かる。実際、このバランスは用いる蛍光供与体−蛍光受容体の組み合わせ、ステムの長さおよび配列、ならびにループの長さおよび配列に特に依存する。狭い範囲のＰＣＲアニーリング温度において全てのプローブが機能的である必要があるマルチプレックスアッセイの場合に、この問題は強調される。
【００１２】
これらのプローブに関して注目に値する別の欠点は、プローブとその標的との特異的ハイブリダイゼーションを制限する、ハイブリダイゼーション工程の間の内部二次構造の形成にある。かかる制限は、マルチプレックスリアルタイム増幅アッセイにおいて重大となり得る。
【００１３】
いわゆる「ＴａｑＭａｎ」ハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いられる他のプローブ（Ｇｅｌｆａｎｄら  特許文献３、特許文献４；およびＬｉｖａｋら  特許文献５、特許文献６、特許文献７）もまた蛍光供与体−蛍光受容体系を利用する。これらのプローブは、プローブのいずれかの末端に位置し、それ故に、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）対を形成する蛍光供与体および蛍光受容体で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドから構成される。標的鎖にハイブリダイズするとヌクレオチドプローブの切断により単一または複数のヌクレオチドを放出する、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼをアッセイにて用いる。この切断は蛍光供与体および蛍光受容体を引き離し、かくして、ＦＲＥＴ対を破壊し、蛍光発光を可能とする。
【００１４】
これらのプローブには二つの重大な欠点がある。初めに、ＴａｑＭａｎ方法は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する特定のＴａｑポリメラーゼ酵素の使用を必要とする。第二に、核酸ポリメラーゼによる伸長を阻止するために、特定の位置に二つの異なる標識を有し、かつ３’末端ヌクレオチドにブロッキング基を有するオリゴヌクレオチドを合成することは、結果として、多数の副産物を生じる。これらの副産物の存在により、手間のかかる精製が必要となり、より高い費用がかかる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第５，９２８，８６２号
【特許文献２】国際特許出願ＷＯ９８／１００９６
【特許文献３】米国特許第５，２１０，０１５号
【特許文献４】米国特許第５，４８７，９７２号
【特許文献５】米国特許第５，５３８，８４８号
【特許文献６】米国特許第５，７２３，５９１号
【特許文献７】米国特許第６，２５８，５６９号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】“Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ”  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓ．，Ｄｏｒａｋ  ＭＴ編，ＴａｙｌｏｒおよびＦｒａｎｃｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、本発明の目的は、当該分野において既に知られているプローブに関連する欠点を有さない、蛍光供与体および受容体の使用を組み合わせた蛍光プローブを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、図１および２に例示されている以下の二本鎖プローブを提供することにより、上記問題を解決した。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によるプローブは、互いに部分的に相補的な二つの鎖から構成される。これらの鎖の各標的核酸鎖への結合は、それらの相互結合より優先され、これは、二本鎖プローブの各鎖上に、標的核酸に結合するが、プローブの他方の鎖には結合しないよう設計されたヌクレオチド配列を提供することにより成し遂げられる。かかる二本鎖プローブの融解温度は、二本鎖プローブの第一および第二の鎖と各々の標的核酸の第一および第二の鎖から形成される複合体の融解温度より低い。
【００２０】
かかる二本鎖プローブは、任意の特定の標的核酸にマッチするよう容易に適合され得る。
【００２１】
さらに、本発明によるプローブは一般的に、蛍光供与体とプローブの残りの間にスペーサー部分を提供し、それにより、プローブと標的核酸の鎖の間に形成される二重らせん体の末端にある核酸塩基の接近によりもたらされる可能性があるクエンチングを防ぐことにより、最適なＰＣＲ条件下で試験された場合に、当該分野にて知られている他の蛍光プローブよりも高い蛍光を提供する。
【００２２】
本発明者らは、予想外にも、本発明による二本鎖プローブが特定のアニーリング温度に厳密に依存せず、故に、マルチプレックスアッセイにおいて真の利点を提供することも証明した。
【００２３】
故に、本発明は、
−  式Ｔ’１−Ｔ１の配列を含む標的核酸の第一の鎖の検出を目的とする、式Ｘ１−（Ｌ１）ａ−Ｓ１−Ｓ’１−（Ｌ’１）ｂ−Ｙ１の第一の鎖；
−  標的核酸の第二の鎖が存在するならば、式Ｔ’２−Ｔ２の配列を含む標的核酸の第二の鎖の検出を目的とする、式Ｘ２−（Ｌ２）ｃ−Ｓ２−Ｓ’２−（Ｌ’２）ｄ−Ｙ２の第二の鎖；
を含む、一本鎖または二本鎖標的核酸の蛍光検出を目的とする二本鎖プローブに関し、ここで、
−  Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２のうち二つは蛍光供与体であり、一方で、他の二つは蛍光受容体であり、また、Ｘ１およびＹ２が共に蛍光供与体であることはできず；
−  ａ、ｂ、ｃおよびｄは０または１であり、ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１またはＹ２が蛍光供与体である場合、それぞれ、ａ、ｂ、ｃまたはｄは１であり；
−  Ｔ１およびＴ２は、１０ないし３５ヌクレオチド、より好ましくは、１２ないし２０ヌクレオチドを有する、互いに相補的なオリゴヌクレオチド配列であり；
−  互いに独立して、Ｔ’１およびＴ’２は、２ないし８ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり；
−  Ｓ１およびＳ２は、１０ないし３５ヌクレオチド、より好ましくは、１２ないし２０ヌクレオチドを有する、互いに相補的なオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓ１はＴ１に対して少なくとも８５％相補的であり、Ｓ２はＴ２に対して少なくとも８５％相補的であり；
−  互いに独立して、Ｓ’１およびＳ’２は、２ないし８ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓ’１はＴ’１に対して少なくとも６５％相補的であり、Ｓ’２はＴ’２に対して少なくとも６５％相補的であり；
−  Ｌ１およびＬ２は、Ｌ１に対するＳ１の連結部位およびＬ２に対するＳ２の連結部位に対するＸ１およびＸ２の各回転半径が少なくとも３．４Åとなるようなスペーサー部分であり；
−  Ｌ’１およびＬ’２は、Ｌ’１に対するＳ’１の連結部位およびＬ’２に対するＳ’２の連結部位に対するＹ１およびＹ２の各回転半径が少なくとも３．４Åとなるようなスペーサー部分であり；
−  二本鎖プローブの融解温度は、二本鎖プローブの第一の鎖と標的核酸の第一の鎖の間で形成される複合体の融解温度よりも低く；標的核酸の第二の鎖が存在する場合には、二本鎖プローブの第二の鎖と該標的核酸の第二の鎖の間で成される複合体の融解温度よりも低い。
【００２４】
本明細書にて意図される場合、別記されない限り、鎖、配列または部分に含まれる以下の式：Ｘ１−（Ｌ１）ａ−Ｓ１−Ｓ’１−（Ｌ’１）ｂ−Ｙ１、Ｘ２−（Ｌ２）ｃ−Ｓ２−Ｓ’２−（Ｌ’２）ｄ−Ｙ２、Ｔ’１−Ｔ１、Ｔ’２−Ｔ２、Ｓ１−Ｓ’１、Ｓ２−Ｓ’２、Ｓ１、Ｓ’１、Ｓ２、Ｓ’２、Ｌ１、Ｌ’１、Ｌ２、Ｌ’２により示されるポリヌクレオチドは、５’から３’または３’から５’への方向であり得る。しかし、当業者には明らかであるように、同一の式においては、全てのポリヌクレオチドは同じ方向を有する。さらに、特定の二本鎖プローブについては、全ての式は同じ方向で読み取られるべきことが意図され、例えば、鎖に含まれるＸ１−（Ｌ１）ａ−Ｓ１−Ｓ’１−（Ｌ’１）ｂ−Ｙ１およびＸ２−（Ｌ２）ｃ−Ｓ２−Ｓ’２−（Ｌ’２）ｄ−Ｙ２により示されるポリヌクレオチドは、全て５’から３’への方向であるか、または全て３’から５’への方向である。
【００２５】
本明細書にて意図される場合、「ヌクレオチド」は、全ての知られている天然および非天然ヌクレオチド、特に、天然および非天然リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む。
【００２６】
本発明の範囲内で用いられるべき好ましい非天然ヌクレオチドは、（結合特性を高め、縮重度を減少させ、特異性を増大させることなどを目的として設計された）特異的ハイブリダイゼーションを可能とする修飾塩基部分および／または修飾糖部分を有する合成ヌクレオチド、例えば、Ｃ−５メチルピリミジンヌクレオシド、２，６−ジアミノプリン  ２’−デオキシリボシド、Ｇ−クランプ（フェノキサジンアナログ）、Ｎ−４−エチル  ２’−デオキシシチジン、２’−デオキシイノシン、２’−デオキシネブラリンおよび３−ニトロピロール  ２’デオキシヌクレオシドから構成される群より選択され得る。
【００２７】
本明細書にて意図される場合、「オリゴヌクレオチド」なる表現は、ヌクレオチド間に修飾された骨格および／または修飾された結合を有するかまたは有さずに２ないし１００ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドに関する。ヌクレオチド間に修飾された骨格および／または修飾された結合を有するポリヌクレオチドは特にＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等を含む。ホスホジエステル結合のアナログは特にホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート等を含む。
【００２８】
本明細書にて意図される場合、「核酸標的」は、上記定義のヌクレオチドの任意の天然由来または合成ポリマー、例えば、一本鎖または二本鎖のデオキシリボ核酸（以後、「ＤＮＡ」）、リボ核酸（以後、「ＲＮＡ」）に関する。特に、標的核酸は、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、バクテリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡおよび染色体ＤＮＡに由来する。
【００２９】
本明細書にて意図される場合、「蛍光供与体」は、フルオロフォア、すなわち、特定の波長（励起波長）のエネルギーを吸収すると、より長い特定の波長（発光波長）にて蛍光のシグナルを通じてエネルギーを再放出する分子に関する。フルオロフォアは当業者によく知られており、特に、欧州特許出願ＥＰ１  １７３  ５１９；ＰＣＴ公開  ＷＯ  ２００４／０５５１１７；Ｄｒｅｘｈａｇｅ  Ｋ．Ｈ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｌａｓｅｒ  ｄｙｅｓ”  ｉｎ  Ｄｙｅ  Ｌａｓｅｒｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｆ．Ｐ．Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，（１９９０）ｐｐ．１５５−２００；Ｖａｌｅｕｒ  Ｂ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｅｄ．ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，２００１；Ｂｅｒｌｍａｎ，Ｉ．Ｂ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｊ．“Ｃｏｌｏｕｒ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）に記載されている。
【００３０】
本明細書にて意図される場合、「蛍光受容体」は、続いて別の波長での蛍光光子の発光が起こるか否かにかかわらず、関連するフルオロフォアから放出されたエネルギーを吸収する分子に関する。その後のエネルギー放出が生じるならば、蛍光受容体はそれ自体もフルオロフォアである。その後のエネルギー放出が生じないならば、蛍光受容体はクエンチャーである。蛍光受容体は当業者によく知られており、特に、Ｃｈｅｎら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：８５１−３；Ｈａｕｇｌａｎｄ  ＲＰ．“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ”，１９９２−１９９４；ＰＣＴ公開  ＷＯ  ０１／８６００１；Ｌｕｋｈｔａｎｏｖら（２００１）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９：６８−６９；およびＣｌｅｇｇら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１：３５３−３８９に記載されている。
【００３１】
本明細書にて意図される場合、二本鎖プローブの二本の鎖が互いにハイブリダイズした場合、蛍光供与体は蛍光受容体に接近して位置している。これは、二本鎖プローブから放出されるであろう蛍光供与体の発光波長にて最小の蛍光発光をもたらす。蛍光受容体がクエンチャーである場合は、いずれの波長でも、最小の蛍光が発光される。二本鎖プローブのいずれかの鎖がその各々の関連する標的と結合した場合、蛍光供与体と蛍光受容体との距離に起因して、この効果は除去される。
【００３２】
文献、例えば、Ｗｕら（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１−１３；Ｗｈｉｔｅら“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７０には、適切な供与体／受容体対を選択するための実際的な指針が多数存在する。
【００３３】
蛍光供与体および受容体の多数の適切な形態は、オリゴヌクレオチドへ連結するための結合官能基としての置換基と共に市販されている。
【００３４】
好ましくは、ホスホラミダイト部分で誘導体化された蛍光供与体および受容体が用いられる。というのも、それらは固相合成の終わりにオリゴヌクレオチドの５’ＯＨへ直接連結するからである。故に、例えば、Ｍｕｌｌａｈら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：１３１１−１３１２により記載されているように、合成は完全に自動化され得る。従って、例えば、米国特許第５，５８３，２３６号、米国特許第５，７２１，３５５号およびＥＰ  ０  ６５２  １６７に記載されているように、このホスホラミダイトケミストリーを用いることにより、フルオレセイン色素および誘導体が都合よくオリゴヌクレオチドの５’末端に導入され得る。Ｙａｎｇら（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２８：４１７−４４１により記載されているように、蛍光供与体または受容体で標識されたヌクレオチドを用いることもでき、それはその合成の間にオリゴヌクレオチド配列の任意の部分に取り込まれ得る。
【００３５】
合成後または手動カップリングと呼ばれる、蛍光供与体または受容体を連結するための代替的方法も、例えば、以下の参考文献：Ｓｐｒｏａｔら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：４８３７−４８４８；Ｓｐｒｏａｔら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：６１８１−６１９６；Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：７１４９−７１５８；Ａｇｒａｗａｌ  “Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４にて十分に記載されている。
【００３６】
５’末端修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、５’−チオール修飾因子Ｃ６および５’−アミノ修飾因子Ｃ６（例えば、Glen Researchから）を用いることによる、５’アミノ基または５’スルフヒドリル基の直接取り込みにより合成され得る。蛍光受容体または供与体のハロゲノアセトアミドまたはマレイミド誘導体がスルフヒドリル基にカップリングされるか、あるいは蛍光受容体または供与体のスクシニミジル誘導体がアミノ基にカップリングされる。このケミストリーは、自動合成の間に安定ではなく、および／または固体担体からの脱保護および開裂のために必要とされる処理（一般的に、濃縮アンモニア）により損傷を受ける敏感な蛍光供与体または受容体、例えば、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、シアニン色素または他のものについて非常に有用である。
【００３７】
オリゴヌクレオチドの３’末端に標識を導入するために、修飾カラム（すなわち、孔径調整ガラスまたはポリスチレン）が、好ましくは、自動合成機にて直接用いられ得る。担体のアミノ基は標識に共有結合する。クエンチャーは特にこの方法により導入され得る。
【００３８】
オリゴヌクレオチドの３’末端に標識を導入するための別のよく知られた方法は、例えば、Ｎｅｌｓｏｎら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：７１８７−７１９４により記載されているように、オリゴヌクレオチドの３’末端をアミノ基で官能基化すること、および蛍光供与体または受容体のスクシニミジル誘導体を使用することである。
【００３９】
本明細書にて意図される場合、「スペーサー部分」なる表現は、核酸に結合する傾向がある任意の化学基に関する。このスペーサー部分は、プローブおよび標的核酸の鎖間で形成される二重らせん体の末端にある核酸塩基の近接により生じてもよい、蛍光供与体から発光される蛍光のクエンチングを防ぐのに有用である。
【００４０】
本明細書にて意図される場合、「回転半径」なる表現は、最も伸びた立体配座のスペーサー部分において、スペーサー部分Ｌ１およびＬ２上のＳ１またはＳ２の連結部位と、それぞれ同スペーサー部分上のＸ１またはＸ２の連結部位との間の距離に関するか、あるいは最も伸びた立体配座のスペーサー部分において、スペーサー部分Ｌ’１およびＬ’２上のＳ’１またはＳ’２の連結部位と、それぞれ同スペーサー部分上のＹ１またはＹ２の連結部位との間の距離に関する。本明細書にて意図される場合、回転半径についての条件に従う限りは、例えば、並んで、または末端に、Ｘ１およびＸ２がそれぞれＬ１およびＬ２の任意の部分に連結され得、ならびにＹ１およびＹ２がそれぞれＬ’１およびＬ’２の任意の部分に連結され得ることも留意されるべきである。
【００４１】
Ｓ１またはＳ２を構成する核酸塩基の近接により蛍光供与体のクエンチングが最小となることを確実にするために、少なくとも３．４Åの距離が必須であることが見出されている。実際、ヌクレオチド、特に、Ｇヌクレオチドは、クエンチング特性を有することがよく知られている。
【００４２】
一例として、特定のフルオロフォアに対する天然ヌクレオチドのクエンチング効率（％）を以下の表に示す：
【表１】
2010505440.tif 000003
【００４３】
スペーサー部分（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ１’またはＬ２’）は、蛍光供与体または受容体とカップリングするための特定のリンカー部分を含んでいてもよい。これは、例えば、好ましくは自動合成機ケミストリーに適合した、ジメトキシトリチル基または任意の他の酸に不安定な保護基により保護されたヒドロキシル官能基であり得る。
【００４４】
本明細書にて意図される場合、「相補的な」なる表現は、塩基が完全にマッチしている同じ長さの二つのヌクレオチド配列を意味する。
【００４５】
本明細書にて意図される場合、「Ｘ％の相補性」なる表現は、全長にわたって対で整列された同じ長さの二つの配列が、マッチした塩基をＸ％含むことを意味する。
【００４６】
本明細書にて意図される場合、「融解温度」（Ｔｍ）なる表現は、ハイブリダイゼーション反応において、ヌクレオチドの半分が変性しており（一本鎖）、および半分がアニーリングまたはハイブリダイズしている（二本鎖）温度点に関する。融解温度は、ストリンジェンシーに言及する一連の条件、例えば、用いられるハイブリダイゼーションバッファーに依存する。それは、当業者によく知られている方法、例えば、Ｗａｌｌａｃｅら（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．６：３５４３−３５５８；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３７６−３７５０；およびＸｉａら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１４７１９−１４７３５に記載されているものに従って決定され得る。
【００４７】
例えば、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３７６−３７５０およびＯｗｃｚａｒｚｙら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：３５３７−３５５４により記載されているように、Ｔｍ値は最隣接熱力学パラメーターおよび特定の塩補正を用いて予測され得る。かかる予測は、１０ｍＭないし１．２Ｍの一価陽イオン濃度を有する中性緩衝液（ｐＨ７〜８）中、８ないし６０塩基長のオリゴヌクレオチドについて正確であると考えられる。オリゴヌクレオチドの濃度は相補的な標的の濃度よりも有意に高いと考えられる。化学修飾の効果は無視される。二価陽イオンの効果は考慮されない。このように決定されるＴｍにおける平均誤差は通常＋／−２℃である。
【００４８】
有利には、スペーサー部分のおかげで、本発明による二本鎖プローブは一般的に、最適ＰＣＲ条件にて試験される場合に、当該分野において知られている他の蛍光プローブよりも高い蛍光を提供する。加えて、先行技術の蛍光プローブと比較してより少量の本発明による二本鎖プローブが用いられ得、故に、それらを利用するアッセイの費用を軽減し、アッセイ、特に、マルチプレックスアッセイにおける立体障害に関連した問題を減少させる。さらに、本発明による二本鎖プローブは、非常に少量の核酸（例えば、１ＰＣＲアッセイあたり５〜１０コピー）の検出を特に可能とする、頑強で、再現性があり、かつ高感度な系を提供する。
【００４９】
同様に有利に、かつ予想外なことに、本発明による二本鎖プローブは特定のアニーリング温度に厳密には依存しない。これは、プローブのより容易な設計を可能にし、かつ標的核酸への結合のために用いられる傾向のある配列においてより重要な選択を可能にすることにより、用いられる様々なプローブが同じアニーリング温度で機能的である必要があるマルチプレックスアッセイを実施する場合に、特に有利である。
【００５０】
本発明による二本鎖プローブは試料中の標的核酸を検出するために有用である。かかる標的核酸は、ウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））またはバクテリア（例えば、リステリア、サルモネラ、マイコバクテリア）のごとき微生物に由来し得る。本発明の二本鎖プローブは、例えば、遺伝病または癌の診断または予後の枠内で、単一ヌクレオチド多型、または核酸中の挿入、欠失および多重変異を検出するためにも有用である。
【００５１】
上記定義の二本鎖プローブの一の好ましい実施態様では、ｂ＝ｄ＝０であり（この場合、ａおよびｃは１である）、ならびにＸ１およびＸ２は蛍光供与体であり、この場合、該二本鎖プローブは：
−式Ｘ１−Ｌ１−Ｓ１−Ｓ’１−Ｙ１の第一の核酸鎖、および
−式Ｘ２−Ｌ２−Ｓ２−Ｓ’２−Ｙ２の第二の核酸鎖
から構成される。
【００５２】
上記定義の二本鎖プローブの別の好ましい実施態様では、蛍光供与体はキサンテン色素、ローダミン色素、カルボピロニン色素およびカルボキサミド色素からなる群より選択される。
【００５３】
上記定義の二本鎖プローブの別の好ましい実施態様では、蛍光受容体はＤａｂｃｙｌ、Ｄａｂｓｙｌ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＱＳＹ−７／９、ＱＳＹ−２１、ＤＡＢＭＩ、マラカイトグリーン、クマリンおよびダーククエンチャーからなる群より選択される。
【００５４】
本発明の枠内で用いられる傾向のある蛍光供与体および受容体の特徴を以下の表に示す：
【表２】
2010505440.tif 000004
【００５５】
幾つかの蛍光受容体の吸光度（Ａｂｓ）の特徴を以下の表に示す：
【表３】
2010505440.tif 000005
【００５６】
本発明に関して用いることができる適当な蛍光供与体／受容体対の例を、最大励起（Ｅｘｃ）および最大発光（Ｅｍ）を含めて、以下の表に示す：
【表４】
2010505440.tif 000006
【００５７】
上記定義の二本鎖プローブの別の好ましい実施態様では、Ｘ１およびＸ２が蛍光部分である場合、Ｌ１およびＬ２は各々Ｘ１およびＸ２の蛍光の２５％未満を消失し、そして、Ｙ１およびＹ２が蛍光部分である場合、Ｌ’１およびＬ’２は各々Ｙ１およびＹ２の蛍光の２５％未満を消失する。
【００５８】
上記定義の二本鎖プローブの別の好ましい実施態様では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ’１および／またはＬ’２は少なくとも一つの正電荷を含む。スペーサー部分における少なくとも一つの正電荷の存在は、二本鎖プローブの両鎖が共に結び付く場合に、正電荷および負に荷電したＤＮＡ鎖のリン酸骨格の間に生じる静電相互作用のおかげで、蛍光およびクエンチング部分が互いに近接することを確実にする。
【００５９】
上記定義の二本鎖プローブの別の好ましい実施態様では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ’１およびＬ’２は、同一または異なって、２ないし１０ヌクレオチドを有するポリヌクレオチド、３ないし１２個の炭素原子を有するアルキルまたはアミノアルキル基、および２ないし６の重合度を有するポリエチレングリコール基からなる群より選択される。
【００６０】
上記定義の二本鎖プローブのさらなる一の実施態様では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ’１およびＬ’２は、同一または異なって、ポリＴポリヌクレオチドである。有利には、ポリＴポリヌクレオチドは他のポリヌクレオチドに関して最小のクエンチングを提供する。
【００６１】
上記定義の二本鎖プローブの別の好ましい実施態様では、Ｌ１および／またはＬ２がポリヌクレオチドである場合、Ｌ１および／またはＬ２の長さは各々Ｓ’２および／またはＳ’１の長さより短い。有利には、かかる配置において、本発明による二本鎖プローブの鎖が共に結合する場合、スペーサー部分に結合された蛍光供与体はＳ’２および／またはＳ’１のヌクレオチドに近接し得、その結果、特に、Ｓ’２および／またはＳ’１がＧヌクレオチドを含むならば、クエンチされ得る。
【００６２】
上記定義の二本鎖プローブの別の好ましい実施態様では、Ｌ１および／またはＬ２がポリヌクレオチドである場合、Ｌ１および／またはＬ２は各々Ｓ’２および／またはＳ’１に関して３５％未満の相補性を示す。かかる低いパーセントの相補性は、本発明による二本鎖プローブの鎖がそれらの相互結合よりも各々の標的核酸鎖に特に優先的に結合可能となるため、有利である。
【００６３】
上記定義の二本鎖プローブのさらなる別の好ましい実施態様では、プローブの第二の鎖に対するプローブの第一の鎖の融解温度は、各標的核酸鎖に対するプローブのいずれかの融解温度よりも少なくとも１０％低い。かかる融解温度は、本発明による二本鎖プローブの鎖がそれらの相互結合よりも各々の標的核酸鎖に特に優先的に結合可能となるため、好ましい。
【００６４】
上記定義の二本鎖プローブの一の好ましい実施態様において：
−  Ｘ１およびＸ２はＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２はＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２は３ないし６ヌクレオチドを有するポリＴポリヌクレオチドであり；
−  Ｓ１およびＳ２は１４ないし１８ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり；
−  Ｓ’１およびＳ’２は４ないし６ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列である。
【００６５】
上記定義の二本鎖プローブの別の好ましい実施態様では、Ｓ１−Ｓ’１は：
・５’−ＣＡＣＣＴＣＴＣＴＴＴＡＣＧＣＧＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＴＧＴ−３’（配列番号：３１）；
この場合、Ｓ２−Ｓ’２は５’−ＧＧＡＧＴＣＣＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＣＣＣＣＧＴ−３’（配列番号：３２）のフラグメントである（かかる二本鎖プローブはＨＢＶ  Ａゾーンの検出を特に目的とする）；
・５’−ＣＧＡＧＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＧＧＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＧ−３’（配列番号：３３）；
この場合、Ｓ２−Ｓ’２は５’−ＧＴＣＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧ−３’（配列番号：３４）のフラグメントである（かかる二本鎖プローブはＨＢＶ  Ｂゾーンの検出を特に目的とする）；
・５’−ＣＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＣＴＧＣ−３’（配列番号：３５）；
この場合、Ｓ２−Ｓ’２は５’−ＧＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＧＡＴＴＧＴＣ−３’（配列番号：３６）のフラグメントである（かかる二本鎖プローブは内部対照の検出を特に目的とする）；
・５’−ＡＴＡＧＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧＴＣＡＧＣＴＡＡＡＡ−３’（配列番号：３７）；
この場合、Ｓ２−Ｓ’２は５’−ＧＡＣＡＴＴＴＡＴＣＡＣＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：３８）のフラグメントである（かかる二本鎖プローブはＨＩＶ−１Ｍの検出を特に目的とする）；
・５’−ＡＧＴＣＴＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＣＴＴＴＴＡＴＡＴＧＧＣＡＴ−３’（配列番号：３９）；
この場合、Ｓ２−Ｓ’２は５’−ＴＡＡＡＡＧＧＧＧＡＡＧＣＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＣＡＧＧＴＡＧＡＣＴＡＣＡＧＴＣＣＡ−３’（配列番号：４０）のフラグメントである（かかる二本鎖プローブはＨＩＶ−１Ｏの検出を特に目的とする）；
・５’−ＣＴＧＡＡＴＡＴＴＧＴＣＡＧＡＡＴＡＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＡ−３’（配列番号：８４）；
この場合、Ｓ２−Ｓ’２は５’−ＴＡＴＣＧＴＣＧＧＴＡＡＧＧＣＡＣＧＣＴＣＡＣＴＡＴＴＣＴＧＡＣＡＡＴＡＴＴＣＡＧ−３’（配列番号：８５）のフラグメントである（かかる二本鎖プローブはサルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）の検出を特に目的とする）；
からなる群より選択される配列のフラグメントである。
【００６６】
本発明は、ＨＢＶの検出のために用いることができる以下の上記定義の二本鎖プローブにも関し、該二本鎖プローブは、
−  ５’から３’への方向に式Ｘ１−Ｌ１−Ｓ１−Ｓ’１−Ｙ１の第一の核酸鎖
および
−  ５’から３’への方向に式Ｘ２−Ｌ２−Ｓ２−Ｓ’２−Ｙ２の第二の核酸鎖
から構成され、ここで、
−  Ｘ１およびＸ２はＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２はＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２は５’−ＴＴＴＴ−３’（配列番号：４１）であり；
−  Ｓ１は５’−ＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：４２）であり；
−  Ｓ’１は５’−ＧＡＣＣ−３’（配列番号：４３）であり；
−  Ｓ２は５’−ＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣ−３’（配列番号：４４）であり；
−  Ｓ’２は５’−ＣＴＣＧ−３’（配列番号：４５）であり；
かかる二本鎖プローブはＨＢＶ  Ｂゾーンの検出を特に目的としており；
または：
−  Ｘ１およびＸ２はＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２はＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２は５’−ＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：４６）であり；
−  Ｓ１は５’−ＧＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号：４７）であり；
−  Ｓ’１は５’−ＴＡＧＧＧＧ−３’（配列番号：４８）であり；
−  Ｓ２は５’−ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣ−３’（配列番号：４９）であり；
−  Ｓ’２は５’−ＴＣＧＣＣＴ−３’（配列番号：５０）であり；
かかる二本鎖プローブはＨＢＶ  Ｂゾーンの検出を特に目的としており；
または：
−  Ｘ１およびＸ２はＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２はＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２は５’−ＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：４６）であり；
−  Ｓ１は５’−ＣＴＣＴＴＴＡＣＧＣＧＧＡＣ−３’（配列番号：５１）であり；
−  Ｓ’１は５’−ＴＣＣＣＣＧ−３’（配列番号：５２）であり；
−  Ｓ２は５’−ＧＴＣＣＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：５３）であり；
−  Ｓ’２は５’−ＡＧＧＴＧＣ−３’（配列番号：５４）であり；
かかる二本鎖プローブはＨＢＶ  Ａゾーンの検出を特に目的としており；
または：
−  Ｘ１およびＸ２はＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２はＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２は５’−ＴＴＴＴ−３’（配列番号：４１）であり；
−  Ｓ１は５’−ＣＴＣＴＣＴＴＴＡＣＧＣＧＧＡＣＴＣ−３’（配列番号：７６）であり；
−  Ｓ’１は５’−ＣＣＣＧ−３’（配列番号：７７）であり；
−  Ｓ２は５’−ＧＡＧＴＣＣＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号：７８）であり；
−  Ｓ’２は５’−ＧＴＧＣ−３’（配列番号：７９）であり；
かかる二本鎖プローブはＨＢＶ  Ａゾーンの検出を特に目的としている。
【００６７】
本発明は、ＨＩＶの検出のために用いることができる以下の上記定義の二本鎖プローブにも関し、該二本鎖プローブは、
−  ５’から３’への方向に式Ｘ１−Ｌ１−Ｓ１−Ｓ’１−Ｙ１の第一の核酸鎖
および
−  ５’から３’への方向に式Ｘ２−Ｌ２−Ｓ２−Ｓ’２−Ｙ２の第二の核酸鎖
から構成され、ここで、
−  Ｘ１およびＸ２はＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２はＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２は５’−ＴＴＴＴ−３’（配列番号：４１）であり；
−  Ｓ１は５’−ＣＣＡＧＣＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧ−３’（配列番号：５５）であり；
−  Ｓ’１は５’−ＴＣＡＧ−３’（配列番号：５６）であり；
−  Ｓ２は５’−ＣＡＴＴＴＡＴＣＡＣＡＧＣＴＧＧ−３’（配列番号：５７）であり；
−  Ｓ’２は５’−ＣＴＡＣ−３’（配列番号：５８）であり；
かかる二本鎖プローブはＨＩＶ−１Ｍの検出を特に目的としており；
または：
−  Ｘ１およびＸ２はＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２はＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２は５’−ＴＴＴＴ−３’（配列番号：４１）であり；
−  Ｓ１は５’−ＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号：５９）であり；
−  Ｓ’１は５’−ＣＣＣＴ−３’（配列番号：６０）であり；
−  Ｓ２は５’−ＧＡＡＧＣＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＣＡＧ−３’（配列番号：６１）であり；
−  Ｓ’２は５’−ＧＴＡＧ−３’（配列番号：６２）であり；
かかる二本鎖プローブはＨＩＶ−１Ｏの検出を特に目的としている。
【００６８】
本発明は、内部対照の検出のために用いることができる以下の上記定義の二本鎖プローブにも関し、該二本鎖プローブは、
−  ５’から３’への方向に式Ｘ１−Ｌ１−Ｓ１−Ｓ’１−Ｙ１の第一の核酸鎖
および
−  ５’から３’への方向に式Ｘ２−Ｌ２−Ｓ２−Ｓ’２−Ｙ２の第二の核酸鎖
から構成され、ここで、
−  Ｘ１およびＸ２はＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２はＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２は５’−ＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：４６）であり；
−  Ｓ１は５’−ＡＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧ−３’（配列番号：６３）であり；
−  Ｓ’１は５’−ＧＡＧＧＡＣ−３’（配列番号：６４）であり；
−  Ｓ２は５’−ＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＴＴ−３’（配列番号：６５）’であり；
−  Ｓ’２は５’−ＧＧＣＧＡＴ−３’（配列番号：６６）であるか；
または：
−  Ｘ１およびＸ２はＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２はＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２は５’−ＴＴＴＴ−３’（配列番号：４１）であり；
−  Ｓ１は５’−ＡＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡ−３’（配列番号：８０）であり；
−  Ｓ’１は５’−ＧＧＡＣ−３’（配列番号：８１）であり；
−  Ｓ２は５’−ＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＴＴ−３’（配列番号：８２）であり；
−  Ｓ’２は５’−ＧＧＣＧ−３’（配列番号：８３）である。
【００６９】
本発明は、サルモネラ・ティフィの検出のために用いることができる以下の上記定義の二本鎖プローブにも関し、該二本鎖プローブは、
−  ５’から３’への方向に式Ｘ１−Ｌ１−Ｓ１−Ｓ’１−Ｙ１の第一の核酸鎖
および
−  ５’から３’への方向に式Ｘ２−Ｌ２−Ｓ２−Ｓ’２−Ｙ２の第二の核酸鎖
から構成され、ここで、
−  Ｘ１およびＸ２はＦＡＭ、Ａｔｔｏ５３２、ＮＫ１４１、ＮＫ２３０およびＡｔｔｏ６４７Ｎからなる群より選択され；
−  Ｙ１およびＹ２はＤａｂｃｙｌであり；
−  Ｌ１およびＬ２は５’−ＴＴＴ−３’（配列番号：８６）であり；
−  Ｓ１は５’−ＧＡＡＴＡＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＣＴ−３’（配列番号：８７）であり；
−  Ｓ’１は５’−ＴＡＣＣＧ−３’（配列番号：８８）であり；
−  Ｓ２は５’−ＡＧＧＣＡＣＧＣＴＣＡＣＴＡＴＴＣ−３’（配列番号：８９）であり；
−  Ｓ’２は５’−ＴＧＡＣＡ−３’（配列番号：９０）である。
【００７０】
本発明はさらに、上記定義の式Ｘ１−（Ｌ１）ａ−Ｓ１−Ｓ’１−（Ｌ’１）ｂ−Ｙ１の第一の核酸鎖および上記定義の式Ｘ２−（Ｌ２）ｃ−Ｓ２−Ｓ’２−（Ｌ’２）ｄ−Ｙ２の第二の核酸鎖を含む、少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸の蛍光検出のためのキットに関する。
【００７１】
本発明はまた、特に、核酸ハイブリダイゼーションの少なくとも一つの工程を含む方法における、一本鎖または二本鎖標的核酸を蛍光検出するための、本発明による二本鎖プローブの使用にも関する。
【００７２】
上記定義の使用の一の好ましい実施態様では、標的核酸は生物試料中に存在する。
【００７３】
上記定義の使用の別の好ましい実施態様では、少なくとも一つの一本鎖または二本鎖核酸の検出は酵素ベース核酸増幅法において実施される。
【００７４】
「酵素ベース核酸増幅法」なる表現は、酵素に触媒される核酸合成が生じる任意の方法に関する。
【００７５】
かかる酵素ベース核酸増幅法は、ＬＣＲ、Ｑ−ベータ複製、ＮＡＳＢＡ、ＬＬＡ（連鎖的線形増幅法（Ｌｉｎｋｅｄ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））、ＴＭＡ、３ＳＲ、当該分野において知られているＰＣＲに基づく全ての方法を特に含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、シンプレックスおよびマルチプレックスＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、エンドポイントＰＣＲ、定量的または定性的ＰＣＲおよびそれらの組み合わせからなる群より優先的に選択され得る。これらの酵素ベース核酸増幅法は当業者によく知られており、Ｓａｉｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７，ＥＰ  ２００  ３６２およびＥＰ  ２０１  １８４（ＰＣＲ）；Ｆａｈｙら（１９９１）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．１：２５−３３（３ＳＲ，自家持続配列複製法）；ＥＰ  ３２９  ８２２（ＮＡＳＢＡ，核酸配列ベース増幅法）；米国特許第５，３９９，４９１号（ＴＭＡ，転写媒介増幅法），Ｗａｌｋｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９２−３９６（ＳＤＡ，鎖置換増幅法）；ＥＰ  ０  ３２０  ３０８（ＬＣＲ，リガーゼ連鎖反応）；Ｂｕｓｔｉｎ  ＆  Ｍｕｅｌｌｅｒ（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．（Ｌｏｎｄｏｎ）１０９：３６５−３７９（リアルタイム逆転写ＰＣＲ）に特に記載されている。
【００７６】
好ましくは、酵素ベース核酸増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ、およびリアルタイムＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲからなる群より選択される。最も好ましくは、酵素ベース核酸増幅法は、リアルタイムの、所望により、マルチプレックスのＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ方法である。
【００７７】
本明細書にて意図される場合、「マルチプレックス」は、少なくとも二つの本発明による二本鎖プローブを用いることによる、少なくとも二つの異なる核酸標的の検出に関し、ここで、該標的核酸の各々は、該二本鎖プローブの少なくとも一つにより検出される傾向がある。好ましくは、異なる蛍光供与体で各プローブを標識することにより、それらの標的核酸に結合した異なるプローブにより放出されたシグナルを別々に検出することが可能となる。
【００７８】
別の実施態様では、上記定義の使用は、少なくとも一つの一本鎖または二本鎖核酸標的の蛍光定量に適用される。これは、内部定量対照を実施するか、または標準曲線を用いることにより、当業者により容易に成し遂げられてもよい。
【００７９】
本発明は、酵素ベース核酸増幅法における少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸の蛍光検出のためのキットであって、
−  少なくとも一つの上記定義の二本鎖プローブ；
−  酵素ベース核酸増幅のための酵素；
−  酵素ベース核酸増幅に適した試薬混合物；
を含むキットにも関する。
【００８０】
一の好ましい実施態様では、酵素ベース核酸増幅法における少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸の蛍光検出のための上記定義のキットは、標的核酸の酵素ベース増幅に適したヌクレオチドプライマーをさらに含む。
【００８１】
別の好ましい実施態様では、酵素ベース核酸増幅法における少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸の蛍光検出のための上記定義のキットは、マルチプレックス酵素ベース核酸増幅法における幾つかの一本鎖または二本鎖標的核酸の検出にさらに特に適しており、該キットは、幾つかの上記定義の二本鎖プローブを含み、該標的核酸の各々は、該二本鎖プローブの少なくとも一つにより検出される傾向がある。
【００８２】
本発明は、酵素ベース核酸増幅法における少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸を検出するための方法であって、以下の工程：
ａ）少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸を、
該標的核酸の検出を目的とする少なくとも一つの上記定義の二本鎖プローブ、または上記キットにて定義した二つの核酸鎖の少なくとも一対、
酵素ベース核酸増幅のための酵素、
標的核酸の酵素ベース増幅に適したヌクレオチドプライマー、
酵素ベース核酸増幅に適した試薬混合物
と混合して、反応混合物を得る工程；
ｂ）該反応混合物を加熱することにより、反応混合物中に存在する核酸を融解する工程；
ｃ）反応混合物を冷却することにより、二本鎖プローブおよびヌクレオチドプライマーを標的核酸にハイブリダイズさせる工程；
ｄ）酵素に核酸合成を触媒させる工程；
ｅ）工程ｂ）ないしｄ）を繰り返す工程；
を含む方法にも関し、ここで、
反応混合物からの蛍光発光の強度は、工程ｂ）ないしｄ）の少なくとも一つにて測定され、また、少なくとも蛍光発光の強度がバックグラウンドレベルを上回って測定されるまで、工程ｂ）ないしｄ）は繰り返される。
【００８３】
本明細書にて意図される場合、上記工程ｃ）およびｄ）は同時に進行し得る。
【００８４】
酵素ベース核酸増幅法における少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸の検出のための上記定義の方法の一の実施態様では、少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸はリアルタイムで検出される。
【００８５】
酵素ベース核酸増幅法における少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸を検出するための上記定義の方法の別の実施態様では、少なくとも一つの一本鎖または二本鎖標的核酸は定量される。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、本発明による二本鎖プローブおよびその標的核酸への結合の一般的図式である。Ｘ１およびＸ２はフルオロフォアであり、Ｙ１およびＹ２はクエンチャーである。
【図２】図２は、本発明による二本鎖プローブおよびその標的核酸への結合の一例である。Ｆはフルオロフォアであり、Ｑはクエンチャーである。
【図３】図３は、本発明による二本鎖プローブ（上部パネル）およびモレキュラー・ビーコン・プローブ（下部パネル）を用いて実施されたＰＣＲの電気泳動ゲル移動（上から下）である。左から右へ、レーンは：ＥＺ分子量マーカー  −  無負荷レーン  −  水対照×３レーン  −  ５コピーのＨＢＶ／ＰＣＲ  ×３レーン  −  １０コピーのＨＢＶ／ＰＣＲ  ×３レーン  −  ５０コピーのＨＢＶ／ＰＣＲ  ×３レーン  −  ５００コピーのＨＢＶ／ＰＣＲ  ×２レーン  −  ５０００コピーのＨＢＶ／ＰＣＲ  ×２レーン  −  無負荷レーン  −  ＥＺ分子量マーカーに対応する。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは各々、本発明による二本鎖プローブ（図４Ｂ）または参照モレキュラー・ビーコン・プローブ（図４Ａ）の存在下での、ＨＩＶ−１Ｍの検出のためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ（実施例７に記載の通り）における、サイクル数に対する正規化蛍光の曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
以下の実施例により本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００８８】
実施例１
オリゴヌクレオチド合成
用いたオリゴヌクレオチドはEurogentecから購入したものか、または製造元推奨の条件ならびにApplied BiosystemsおよびGlen Researchから購入した試薬を用いて、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Perkin Elmer）にて合成した。
【００８９】
オリゴヌクレオチドプローブは、３’末端にＤａｂｃｙｌ蛍光受容体を、そして、５’末端にフルオレセイン（ＦＡＭ）またはＡｔｔｏ５３２フルオロフォア部分を含んだ。
【００９０】
Ｄａｂｃｙｌ部分は、孔径調整ガラスカラム（Glen Researchからの３’Ｄａｂｃｙｌ−ＣＰＧ）を用いて、自動オリゴヌクレオチド合成の間に導入した。
【００９１】
次いで、Glen Researchからの特定の５’−チオール修飾リンカーを用いて、オリゴヌクレオチドの５’末端を官能基化した。
【００９２】
次いで、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、オリゴヌクレオチドを精製した。精製後、５’末端にあるスルフィドリル基から保護基を除去し、次いで、オリゴヌクレオチドの５’ＳＨ末端をフルオレセイン（ＦＡＭ）ヨードアセトアミド誘導体（Molecular Probesからの６−ＩＡＦ，品番Ｉ−３０４５２）またはＡｔｔｏ５３２マレイミド誘導体（Atto-TEC，品番ＡＤ５３２−４）にカップリングさせた。
【００９３】
ＮＡＰ−５カラム（Pharmacia，スウェーデン）を用いる排除クロマトグラフィーにより、未反応色素を除去した。
【００９４】
最後に、当業者によく知られた手順により、二重標識されたオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣにより精製し、脱塩し、凍結乾燥した。
【００９５】
二本鎖プローブの融解温度（Ｔｍ）の実験的測定
温度の関数として蛍光をモニターすることにより、融解温度を測定した。
【００９６】
簡潔に言うと、ＦＡＭフルオロフォア（４９０ｎｍで励起、５３０ｎｍで発光）で標識したハイブリッドについての熱変性特性は、Ｖａｒｉａｎ分光蛍光光度計（品番８５−１０２０２３−００、Cary Eclipse Bio）を用いて得た。全ての測定は以下のハイブリダイゼーションバッファーにて実施した：２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（品番１１５５８１４７，Qiagen）、ＰＣＲバッファー  １×（ＰＣＲバッファー  １０×，品番１２１８２２０１，Qiagen）。最終容量５０μｌ中、ＦＡＭ−標識オリゴヌクレオチドの濃度は０．１μＭであり、標的オリゴヌクレオチドの濃度は０．２μＭであった。温度は２５から９５℃まで０．５℃ずつ段階的に上昇させ、各段階を６０秒間持続させた。最後の３０秒間に蛍光を測定した。励起および発光スリットは１０ｎｍであり、ＰＭＴ（光電子増倍管）の電圧を６００Ｖに設定した。
【００９７】
変性実験の前に以下の手順を用いてハイブリダイゼーションを促進するように全二本鎖溶液を処理した：３０分間９５℃で加熱、１８０分間室温で冷却、次いで、一晩４℃で貯蔵。
【００９８】
Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Varian）にて一次導関数手法を用いてＴｍを算出した。
【００９９】
室温にて、二本鎖プローブの二本の鎖をアニールさせる。低い蛍光が観察される（ＤａｂｃｙｌおよびＦＡＭが近接している）。温度が増大するにつれ、ハイブリッドが融解して離れ、ＤａｂｃｙｌがＦＡＭから離れ、クエンチングが減少し、ＦＡＭからの蛍光発光の強度の増大が生じる。逆に、二本鎖プローブの一本の鎖が室温にてその標的とアニールした場合、ＦＡＭはＤａｂｃｙｌから分離されており、これが高い蛍光シグナルを生じる。温度が上昇するにつれ、ハイブリッドが融解して離れ、蛍光シグナルが減少する。
【０１００】
測定されたＴｍ値（実験的Ｔｍ）を以下の表に示す。
【表５】
2010505440.tif 000007
【０１０１】
ＳｃｉＴｏｏｌ中のＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ３．０のＴｍ計算機（Integrated DNA Technologies）を用いて、理論的な融解温度（理論的Ｔｍ）を算出した。
【０１０２】
実験的Ｔｍ値は理論的Ｔｍ値より若干高い。二本鎖プローブについてのＴｍと、二本鎖プローブの各鎖とその関連する標的とのハイブリッドについてのＴｍとの差異は、実際（実験的ΔＴｍ）および理論上（理論的ΔＴｍ）で同様である。Ｔｍ値を用いて、以下のＰＣＲ実験での最適アニーリング温度（最適Ｔａ）を決定した。通常、アニーリング温度は、二本鎖プローブについてのＴｍより高く、および二本鎖プローブの各鎖とそれらの各標的とのハイブリッドについてのＴｍより低くなるように選択した。
【０１０３】
ＮＢ：以下のプローブについては理論的Ｔｍ値のみを決定した：
【表６】
2010505440.tif 000008
【０１０４】
実施例２
ＨＢＶ  Ｃ遺伝子（Ｂゾーン）の３’末端部分およびＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼコード化領域の開始部分を標的化することによるＨＢＶゲノムの検出
初めに、ＨＢＶゲノムのＢゾーン（参照株  ａｄｗ  ｎ°  Ｍ９８０７７のヌクレオチド（ｎｔ）２３００−２４３５）の検出のために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにて本発明による二本鎖プローブを試験し、参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した。
【０１０５】
材料および手法
ＱＩＡａｍｐ  ＤＳＰウイルスキット（Qiagen，品番６０７０４）を製造元の指示に従って用いて、BBI Diagnosticから入手したＨＢＶ  ＤＮＡ陽性対照Ａｃｃｕｒｕｎ３２５（品番Ａ３２５−５７２３）から、ＨＢＶゲノムＤＮＡを抽出した。使用前にＨＢＶゲノムＤＮＡを水で希釈した。
【０１０６】
ヌクレオチドプローブおよびプライマーはEurogentecに注文した。以下のプローブおよびプライマーを用いた：
【表７】
2010505440.tif 000009
【０１０７】
ＰＣＲ混合物は以下の通りであった：ＨＢＶ  ＤＮＡ  １ＰＣＲあたり０〜５０，０００コピー、モレキュラー・ビーコン・プローブ  ０．６μＭまたは二本鎖プローブの各鎖  ０．３μＭ、ＨＢＶプライマー  ０．６μＭ、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Qiagen，品番２０３２０５）  ２．５Ｕ、ＭｇＣｌ２  ６ｍＭ、ｄ（ＡＣＧＵ）ＴＰ  ２００μＭ、ｄＴＴＰ  １００μＭ、０．２５Ｕ  ＵＤＧ、ＰＶＰ  ０．３％、グリセロール  ５％。
【０１０８】
ＢｉｏＲａｄ  Ｃｈｒｏｍｏ４蛍光サーモサイクラーにて以下の熱特性を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した：
2010505440.tif 000010
【０１０９】
結果
本発明による二本鎖プローブおよび参照モレキュラー・ビーコン・プローブを比較するために、幾つかのパラメーターを研究した：
−  混合物中の様々な開始量のＤＮＡについて閾値サイクル（Ｃｔ）を評価した；Ｃｔは、バックグラウンドの蛍光より高い蛍光シグナルを生じるのに必要なサイクル数である；Ｃｔ値はＤＮＡの開始量のｌｏｇ１０に比例する；
−  検出限界は検出されるＤＮＡの最低量に対応する；
−  ＰＣＲ混合物中の初期ＤＮＡ量に対するＣｔの曲線の直線性（少なくとも０．９５の相関係数を対象とする）；
−  蛍光強度レベル、およびバックグラウンドの蛍光とプローブによる蛍光発光との差異（差異が重きいほど、少数のＤＮＡコピーの区別がより簡単かつ有意となる）。
【０１１０】
平均Ｃｔは、所定の初期数の標的ＤＮＡコピーについて測定された異なるＣｔ値から算出し、ＳＤは標準偏差であり、ＣＶは変動係数である。
【０１１１】
参照モレキュラー・ビーコン・プローブおよび本発明による二本鎖プローブについて得られた結果を以下の表に示す。
【０１１２】
【表８】
2010505440.tif 000011
【０１１３】
【表９】
2010505440.tif 000012
【０１１４】
本発明の二本鎖プローブを用いることにより得られた蛍光増加を以下の表にまとめる：
【表１０】
2010505440.tif 000013
【０１１５】
本発明による二本鎖プローブを用いて測定されたＣｔ値は、参照モレキュラー・ビーコン・プローブを用いて測定されたものと同様である。
【０１１６】
両プローブを用いての感度は同様であるが、本発明による二本鎖プローブを用いた場合、平均して３５．６％の最大蛍光の増大が得られる。
【０１１７】
参照モレキュラー・ビーコン・プローブについてのように、本発明による二本鎖プローブについて、標的ＤＮＡコピーの初期数に関するＣｔの線形回帰は、高い相関係数（Ｒ２＝０，９７８８）を示す。
【０１１８】
本発明による二本鎖プローブを用いるリアルタイムＰＣＲは、広範囲に及ぶアニーリング温度の範囲内（５１℃ないし６０℃）で引き続き機能する。
【０１１９】
実際、５１℃および６０℃のアニーリング温度を用いて二本鎖プローブを試験した場合、同様の結果が得られた（以下の表を参照のこと）。
【０１２０】
【表１１】
2010505440.tif 000014
【０１２１】
【表１２】
2010505440.tif 000015
【０１２２】
さらに、同じ二本鎖プローブを各鎖０．２μＭのより低い濃度にて用いて実施したリアルタイムＰＣＲは同様の結果をもたらした（０．６μＭの濃度の参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した場合）。
【０１２３】
実施例３
ＨＢＶゲノムのＢゾーンの検出
本発明による別の二本鎖プローブを設計して、アニーリング温度を５０℃に設定したこと以外は実施例２に示したものと同じ条件で用い、モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した。
【表１３】
2010505440.tif 000016
【０１２４】
【表１４】
2010505440.tif 000017
【０１２５】
実施例１に示した二本鎖プローブについてのように、本発明による二本鎖プローブを用いて測定されたＣｔは、参照モレキュラー・ビーコン・プローブを用いて測定されたものと同様である。
【０１２６】
さらに、両プローブを用いての感度は同様である。
【０１２７】
参照モレキュラー・ビーコン・プローブについてのように、本発明による二本鎖プローブについての標的ＤＮＡコピーの初期数に関するＣｔの線形回帰もまた高い相関係数（Ｒ２＝０，９７４６）を示す。
【０１２８】
この二本鎖プローブを用いるリアルタイムＰＣＲは、広範囲に及ぶアニーリング温度の範囲内（４６℃ないし５５℃）で引き続き機能する。５５℃のアニーリング温度を用いて二本鎖プローブを試験した場合、同様の結果が得られた（以下の表を参照のこと）。
【０１２９】
【表１５】
2010505440.tif 000018
【０１３０】
さらに、同じ二本鎖プローブを各鎖０．２μＭのより低い濃度にて用いて実施したリアルタイムＰＣＲは同様の結果をもたらした（０．６μＭの濃度の参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した場合）。
【０１３１】
実施例４
ＨＢＶゲノムのオーバーラップ領域（Ａゾーン）を標的化することによるＨＢＶゲノムの検出
次に、二本鎖プローブ濃度を０．２μＭに設定したこと以外は実施例２に示したものと同じ条件を用いて、ＨＢＶゲノムのＡゾーン（ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼコード化の末端およびＨＢＶ  Ｘ蛋白質コード化配列の開始部分  −  参照株  ａｄｗ  ｎ°  Ｍ９８０７７のヌクレオチド（ｎｔ）１４４０−１６０２）の検出のために、本発明による二本鎖プローブをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにて試験し、参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した。
【０１３２】
以下のプローブおよびプライマーを用いた：
【表１６】
2010505440.tif 000019
【０１３３】
モレキュラー・ビーコン・プローブおよび本発明による二本鎖プローブについて得られた結果を以下の表に示す。
【０１３４】
・参照モレキュラー・ビーコン（ＭＢ）・プローブ（Ｔａ＝５５℃）：
【表１７】
2010505440.tif 000020
【０１３５】
・二本鎖（ＤＳ）プローブ（Ｔａ＝５５℃）：
【表１８】
2010505440.tif 000021
【０１３６】
結果を以下の表にまとめる：
【表１９】
2010505440.tif 000022
【０１３７】
本発明による二本鎖プローブを用いて測定されたＣｔは、参照モレキュラー・ビーコン・プローブを用いて測定されたものと一致する。
【０１３８】
両プローブを用いての感度は同様であるが、本発明による二本鎖プローブを用いる場合、平均して４９．１％の最大蛍光の増大が得られる。
【０１３９】
参照モレキュラー・ビーコン・プローブについてのように、本発明による二本鎖プローブについて、標的ＤＮＡコピーの初期数に関するＣｔの線形回帰は、高い相関係数（Ｒ２＝０，９８２６）を示す。
【０１４０】
本発明による二本鎖プローブを用いるリアルタイムＰＣＲは、広範囲に及ぶアニーリング温度の範囲内（５１℃ないし６０℃）で引き続き機能する。
【０１４１】
実際、５１℃および６０℃のアニーリング温度を用いて二本鎖プローブを試験した場合、同様の結果が得られた（以下の表を参照のこと）。
【０１４２】
【表２０】
2010505440.tif 000023
【０１４３】
【表２１】
2010505440.tif 000024
【０１４４】
さらに、同じ二本鎖プローブを各鎖０．１μＭのより低い濃度および０．３μＭのより高い濃度にて用いて実施したリアルタイムＰＣＲは共に同様の結果をもたらした（０．６μＭの濃度の参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した場合）。
【０１４５】
実施例５
内部対照（ＩＣ）の検出
また、本発明による二本鎖プローブを内部対照（ＩＣ）の検出のためにリアルタイムＰＣＲアッセイにて試験し、参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した。
【０１４６】
ＩＣをマルチプレックスアッセイにて用いて、ＰＣＲ結果をその標的Ｃｔおよびその信頼区間により検証する。さらに、それにより、試料中の阻害剤の検出が可能となり、故に、それらの定量の検証に役立つ。ＩＣは通常、標的核酸と同じＰＣＲ効率および同じ長さの単位複製配列を有するように設計される。
【０１４７】
現在使用されているＩＣは、以下の特定のプライマー：
ＡＤＨ５Ｆｃ：５’−ＴＧＣ  ＣＡＴ  ＣＧＣ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＡＣ−３’（配列番号１８）
ＡＤＨ５Ｒｃ：５’−ＡＡＣ  ＧＡＣ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＧＣ−３’（配列番号１９）
を用いてＡＤＨトウモロコシ遺伝子（トウモロコシＧＭＯスタンダード  ＥＲＭ−ＢＦ４１１ａ，品番９１５２８  Fluka）からＰＣＲにより生成された４０８ヌクレオチドのフラグメントである。
【０１４８】
次いで、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Qiagen，品番２８１０４）を製造元の指示に従って用いて、ＩＣフラグメントＤＮＡを抽出した。ＵＶ照射後であって使用前にＩＣフラグメントＤＮＡを水で希釈した。
【０１４９】
使用したＰＣＲ混合物は、増幅すべきＤＮＡ：ＩＣ  ＤＮＡ  １ＰＣＲあたり０〜１０，０００コピー；プローブの濃度：モレキュラー・ビーコン・プローブ  ０．２μＭ、本発明による二本鎖プローブ  各鎖０．１μＭ；およびプライマーの濃度  ０．３μＭであること以外は実施例２にて記載した通りであった。
【０１５０】
プローブおよびプライマーの配列を以下に示す：
【表２２】
2010505440.tif 000025
【０１５１】
モレキュラー・ビーコン・プローブおよび本発明による二本鎖プローブについて得られた結果を以下の表に示す。
【０１５２】
【表２３】
2010505440.tif 000026
【０１５３】
【表２４】
2010505440.tif 000027
【０１５４】
結果を以下の表にまとめる：
【表２５】
2010505440.tif 000028
【０１５５】
本発明による二本鎖プローブを用いて測定されたＣｔは、参照モレキュラー・ビーコン・プローブを用いて測定されたものと同様である。
【０１５６】
両プローブを用いての感度および最大蛍光は同様である。
【０１５７】
モレキュラー・ビーコン・プローブについてのように、本発明による二本鎖プローブについて、標的ＤＮＡコピーの初期数に関するＣｔの線形回帰は、高い相関係数（Ｒ２＝０，９７６７）を示す。
【０１５８】
本発明による二本鎖プローブを用いるリアルタイムＰＣＲは、広範囲に及ぶアニーリング温度の範囲内（５１℃ないし６０℃）で引き続き機能する。
【０１５９】
実際、５１℃および６０℃のアニーリング温度を用いて二本鎖プローブを試験した場合、同様の結果が得られた（以下の表を参照のこと）。
【０１６０】
【表２６】
2010505440.tif 000029
【０１６１】
【表２７】
2010505440.tif 000030
【０１６２】
さらに、同じ二本鎖プローブを各鎖０．１μＭのより低い濃度にて用いて実施したリアルタイムＰＣＲは同様の結果をもたらした（０．２μＭの濃度の参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した場合）。
【０１６３】
マルチプレックスアッセイ
ＨＢＶゲノムのＡゾーンおよび内部対照の検出を組み合わせたマルチプレックスアッセイ（ＰＣＲの間の抽出量および阻害量の測定が可能となる）は実施例４および実施例５のプローブおよびプライマーを用いて設定された。
【０１６４】
簡潔に言うと、以下の鋳型ＤＮＡ、プローブおよびプライマー濃度を、ほかの点については実施例２と同様の混合物にて用いた：
−ＩＣ  ＤＮＡ  １ＰＣＲあたり３００コピー；ＩＣプライマー  ０．３μＭ；
−ＨＢＶ  ＤＮＡ  １ＰＣＲあたり０〜５０，０００コピー；ＨＢＶプライマー  ０．６μＭ；
−モレキュラー・ビーコン  ＩＣプローブ  ０．２μＭ  または二本鎖ＩＣプローブ  各鎖０．１μＭ；
−モレキュラー・ビーコン  ＨＢＶプローブ  ０．６μＭ  または二本鎖ＨＢＶプローブ  各鎖０．２μＭ。
【０１６５】
リアルタイムＰＣＲ条件は、上で設定したものと比較して不変であった。
【０１６６】
ＦＡＭ蛍光の検出（ＨＢＶ  ＤＮＡ検出）：
【表２８】
2010505440.tif 000031
【０１６７】
【表２９】
2010505440.tif 000032
【０１６８】
結果を以下の表にまとめる：
【表３０】
2010505440.tif 000033
【０１６９】
Ａｔｔｏ５３２蛍光の検出（ＩＣ  ＤＮＡ検出）：
予想通り、この検出は両プローブ系について本質的に一定の結果をもたらした。ＦＡＭとＡｔｔｏ５３２色素との間の干渉に起因して、Ｃｔの若干の低下のみが、高濃度のＨＢＶ  ＤＮＡ（５０，０００コピー／ＰＣＲ）にて観察された。
【０１７０】
全体として、マルチプレックスアッセイについて得られた結果は、本発明による二本鎖プローブがかかる検出系において十分に機能することを示す。
【０１７１】
さらに、本発明の二本鎖プローブを用いてもたらされた結果は、参照モレキュラー・ビーコン・プローブを用いて得られたものと同様である。さらに、これらの結果は、モレキュラー・ビーコン・プローブと比べてより低い濃度の二本鎖プローブを用いて成し遂げられ得る。
【０１７２】
本発明による二本鎖プローブが広範囲に及ぶアニーリング温度において機能することも注目に値する。これは、用いられる様々なプローブが同じアニーリング温度で機能する必要があるマルチプレックスアッセイを実施する場合に特に有利である。
【０１７３】
最後に、本発明による二本鎖プローブはまた広範囲に及ぶＭｇＣｌ２濃度（４〜７ｍＭ）において機能することが示された（以下の表を参照のこと）。
【０１７４】
【表３１】
2010505440.tif 000034
【０１７５】
実施例６
単位複製配列の検証
上記ＰＣＲ反応を用いて得られたＰＣＲ産物の性質をアガロースゲル電気泳動により検証した。結果を図３に示す。
【０１７６】
モレキュラー・ビーコン・プローブの存在下または二本鎖プローブの存在下、予想サイズを１６３塩基対とするＰＣＲにより、１つの核酸フラグメントのみが増幅する。非特異的増幅は観察されない。さらに、本発明による二本鎖プローブの使用は、モレキュラー・ビーコン・プローブが用いられる場合のように、さらなるプライマーダイマー（ＭＷ≦５０ｂｐ）を生じない。
【０１７７】
実施例７
ＨＩＶ１−Ｍゲノムの検出
本発明による二本鎖プローブを、ＨＩＶ−１Ｍの様々な遺伝子型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ）のリアルタイムＰＣＲ検出に適用し、参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した。
【０１７８】
材料および手法：
アッセイされる試料は、１ｍｌあたり７．７５  １０８個のＨＩＶ−１ＭサブタイプＢのウイルス粒子のウイルス力価を有するリンパ芽球様ＣＥＭ細胞の培養液の上清であるか、または１ｍｌあたり５０，０００個のウイルス粒子にて８遺伝子型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ）のＨＩＶ１−Ｍを含むＰＲＤ２０１パネル（ＢＢＩダイアグノスティック）のいずれかであった。
【０１７９】
ＱＩＡａｍｐ  ＤＳＰ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔ（Qiagen，品番６０７０４）を製造元の指示に従って用いて、ＨＩＶ  ＲＮＡを抽出する。次いで、抽出されたＲＮＡを水およびキャリアＲＮＡ（１ｎｇ／ｍｌ，Qiagen，品番１００９６１５）で希釈する。
【０１８０】
用いたプローブおよびプライマーの配列を以下に示す：
【表３２】
2010505440.tif 000035
【０１８１】
ＳＨ１ＢＭ１４プローブは、ＨＩＶ１−ＭのＢ遺伝子型の検出を目的としており、ＳＨ１ＢＭ１７はＣおよびＤ遺伝子型、およびＳＨ１ＢＭ１８はＥ遺伝子型の検出を目的としている。
【０１８２】
本発明による二本鎖プローブはＳＨ１ＢＭ１４と同じ標的核酸に結合する。それはまた、Ｃ遺伝子型の対応する標的核酸について３つのミスマッチを含み、Ｄ遺伝子型の対応する標的核酸について２つのミスマッチを含む。
【０１８３】
二本鎖プローブの特徴を以下の表に示す：
【表３３】
2010505440.tif 000036
【０１８４】
モレキュラー・ビーコン・プローブと共に用いられる場合、ＰＣＲ混合物は以下の通りであった：
ＨＩＶ  ＲＮＡ  表に示される通り、ＳＨ１ＢＭ１４  ０．４μＭ、ＳＨ１ＢＭ１７  ０．２μＭ、ＳＨ１ＢＭ１８  ０．２μＭ、ＨＩＶ１−Ｍプライマー  ０．６μＭ、４Ｕ  ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Qiagen，品番２０３２０７）、１００μＭ  ＭｇＣｌ２、ｄ（ＡＣＧＵ）ＴＰ  ４００μＭ、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＲＴ  Ｍｉｘ  ０．５×（Qiagen）、２．５％  ＤＭＳＯ。
【０１８５】
本発明の二本鎖プローブと共に用いられる場合、ＰＣＲ混合物は以下の通りであった：
ＨＩＶ  ＲＮＡ  表に示される通り、二本鎖プローブ  ０．１μＭ、ＨＩＶ１−Ｍプライマー  ０．１５μＭ、４Ｕ  ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Qiagen，品番２０３２０７）、１００μＭ  ＭｇＣｌ２、ｄ（ＡＣＧＵ）ＴＰ  ４００μＭ、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＲＴ  Ｍｉｘ  ０．５×（Qiagen）、２．５％  ＤＭＳＯ。
【０１８６】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＢｉｏＲａｄ  Ｃｈｒｏｍｏ４蛍光サーモサイクラーにて以下の熱特性を用いて実施した：
2010505440.tif 000037
【０１８７】
結果
Ａ．リンパ芽球様ＣＥＭ細胞の培養液の上清由来の試料（ＨＩＶ１−Ｍ  Ｂサブタイプ）
【０１８８】
・参照モレキュラー・ビーコン（ＭＢ）・プローブＳＨ１ＢＭ１４（Ｔａ＝５５℃）：
【表３４】
2010505440.tif 000038
【０１８９】
・参照モレキュラー・ビーコン（ＭＢ）・プローブＳＨ１ＢＭ１４／１７／１８（Ｔａ＝５５℃）：
【表３５】
2010505440.tif 000039
【０１９０】
モレキュラー・ビーコン・プローブと比較される二本鎖プローブについては、アニーリング温度を５０℃に設定したこと以外は同じ熱特性を用いる。
【０１９１】
・本発明による二本鎖プローブ（Ｔａ＝５０℃）：
【表３６】
2010505440.tif 000040
【０１９２】
結果を以下の表にまとめる：
・二本鎖プローブに対する参照モレキュラー・ビーコン（ＭＢ）・プローブＳＨ１ＢＭ１４
【表３７】
2010505440.tif 000041
【０１９３】
・二本鎖プローブに対する参照モレキュラー・ビーコン（ＭＢ）・プローブＳＨ１ＢＭ１４／１７／１８
【表３８】
2010505440.tif 000042
【０１９４】
上記の表から分かるように、本発明による二本鎖プローブは、検出閾値（１ＰＣＲあたり２コピー）、Ｃｔ値、直線性（相関係数）および再現性（ＳＤ）に関して、参照モレキュラー・ビーコン・プローブと同様の結果をもたらす。
【０１９５】
さらに、参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較して、平均１９４．６％の蛍光増加が得られることが注目されるべきである。
【０１９６】
さらに、二本鎖プローブ（図４Ａ）およびＳＨ１ＢＭ１４／１７／１８モレキュラー・ビーコン・プローブ（図４Ｂ）についての、サイクル数に対する蛍光の曲線の比較は、二本鎖プローブを用いて得られた曲線がより顕著なＳ字状を示し、また、曲線がさらに再グループ化されることを明確に示しており、それにより、陰性対照（水）と少量の標的核酸を用いたアッセイとの間のより良好な識別が可能となる。
【０１９７】
加えて、本発明の二本鎖プローブを用いる場合、ＳＨ１ＢＭ１４／１７／１８モレキュラー・ビーコン・プローブを用いる場合よりも４分の１量のプローブおよびプライマーが必要とされる。
【０１９８】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのアニーリング温度を４８ないし５５℃で変化させたところ、本発明者らは、本発明の二本鎖プローブが引き続き十分に機能することを示した。
【０１９９】
Ｂ．ＰＲＤ２０１パネル（ＨＩＶ１−ＭサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ）
・参照モレキュラー・ビーコン（ＭＢ）・プローブＳＨ１ＢＭ１４（Ｔａ＝５５℃）：
【表３９】
2010505440.tif 000043
【０２００】
・参照モレキュラー・ビーコン（ＭＢ）・プローブＳＨ１ＢＭ１４／１７／１８（Ｔａ＝５５℃）：
【表４０】
2010505440.tif 000044
【０２０１】
・本発明による二本鎖プローブ（Ｔａ＝５０℃）：
【表４１】
2010505440.tif 000045
【０２０２】
本発明による二本鎖プローブにより、ＡないしＨのすべての遺伝子型、特に、ＳＨ１ＢＭ１４モレキュラー・ビーコン・プローブにより検出されないか（サブタイプＣ）、または高いＣｔ値で検出されるか（サブタイプＥ）、またはさらにバックグラウンドを僅かに上回るだけの非常に低い蛍光強度で検出されるか（サブタイプＤ）のいずれかである、サブタイプＣ、ＤおよびＥの検出が可能となることに注目されるべきである。
【０２０３】
３つのモレキュラー・ビーコン・プローブに対して二本鎖プローブを用いることにより、遺伝子型の大部分について、平均して７４．４％の蛍光増加が観察される。
【０２０４】
さらに、３つのモレキュラー・ビーコン・プローブと比較して４分の１量のプローブおよびプライマーが本発明による二本鎖プローブと共に使用される必要がある。
【０２０５】
実施例８
ＨＩＶ１−ＭおよびＨＩＶ１−Ｏゲノムのマルチプレックス検出
以下のさらなるプローブを用いた：
【表４２】
2010505440.tif 000046
【０２０６】
二本鎖プローブの特徴を以下の表に示す：
【表４３】
2010505440.tif 000047
【０２０７】
本発明の二本鎖プローブと共に用いられる場合、ＰＣＲ混合物は以下の通りであった：
二本鎖プローブＨＩＶ１−Ｍ  ０．１μＭ、二本鎖プローブＨＩＶ１−Ｏ  ０．１μＭ、ＨＩＶ１−Ｍ／Ｏプライマー  配列番号２５  ０．１５μＭ、ＨＩＶ１−Ｍプライマー  配列番号２６  ０．０７５μＭ、ＨＩＶ１−Ｏプライマー  配列番号３０  ０．１５μＭ、４Ｕ  ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Qiagen，品番２０３２０７）、１００μＭ  ＭｇＣｌ２、ｄ（ＡＣＧＵ）ＴＰ  ４００μＭ、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＲＴ  Ｍｉｘ  １×（Qiagen）、２．５％  ＤＭＳＯ。
【０２０８】
リンパ芽球様ＣＥＭ細胞の培養液の上清由来の試料を用いて、上記ＨＩＶ１−Ｏプローブと混合されたＨＩＶ１−Ｍの検出のためのプローブについて得られた結果を以下の表に示す（Ｔａ＝５０℃）：
【表４４】
2010505440.tif 000048
【０２０９】
良好な検出閾値、Ｃｔ、直線性および再現性がこのように証明され得た。
【０２１０】
蛍光は十分に常用標準内である。
【０２１１】
サイクル数に対する正規化蛍光の曲線はＳ字状であり、また、初期ＤＮＡ濃度の全範囲にわたって再グループ化され、それにより、ＨＩＶ１−Ｍシンプレックス検出について証明されたように、水陰性対照と少量のＤＮＡコピーを用いた試料との間の良好な識別が可能となる。
【０２１２】
従って、本発明者らは、少量（０．１μＭ）の本発明による二本鎖プローブがデュプレックスアッセイにおいても効果的であることを示した。
【０２１３】
さらに、ＰＲＤ２０１パネル（ＨＩＶ−１Ｍ）およびＢＢＩ３０１パネル（ＨＩＶ１−Ｏ）にて、実施例７で記載したものと混合されたＨＩＶ１−Ｏの検出のためのプローブについて得られた結果を以下の２つの表に示す：（Ｔａ＝５０℃）：
【表４５】
2010505440.tif 000049
【０２１４】
【表４６】
2010505440.tif 000050
【０２１５】
本発明による二本鎖プローブは、デュプレックスアッセイにて、ＨＩＶ１−Ｍの遺伝子型（ＡないしＨ、特に、ＳＨ１ＢＭ１４モレキュラー・ビーコン・プローブ単独では検出されないＣ、ＤおよびＥサブタイプ）およびＨＩＶ１−Ｏパネルの全ての遺伝子型を検出し得る。
【０２１６】
実施例９
マルチプレックスアッセイＨＢＶ  Ａゾーン（ＦＡＭ／Ａｔｔｏ６４７Ｎ）−定量
ＩＣ検出のためにＡｔｔｏ５３２色素の代わりにＡｔｔｏ６４７Ｎ色素を用い、実施例４および５のプローブおよびプライマー（以後、「系１」と称する）、ならびに本発明による別の二本鎖プローブ（以後、「系２」と称する）を用いて、（ｉ）ＨＢＶゲノムのＡゾーンおよび内部対照（ＩＣ）の検出ならびに（ｉｉ）ＨＢＶの定量を組み合わせたマルチプレックスアッセイを設計した。
【０２１７】
簡潔に言うと、以下の鋳型ＤＮＡ、プローブおよびプライマー濃度を、ほかの点については実施例２と同様の混合物にて用いた：
−  ＩＣ  ＤＮＡ  １ＰＣＲあたり３００コピー、
−  ＨＢＶ  ＤＮＡ  １ＰＣＲあたり１００〜１０６コピー、
−  ＨＢＶプライマー  ０．６μＭ、
−  ＩＣプライマー  ０．３μＭ；
−  モレキュラー・ビーコン  ＩＣプローブ（０．２μＭ）、系１  二本鎖ＩＣプローブ（各鎖０．１μＭ）、または系２  二本鎖ＩＣプローブ（各鎖０．０５μＭ）；
−  モレキュラー・ビーコン  ＨＢＶプローブ（０．６μＭ）、系１  二本鎖ＨＢＶプローブ（各鎖０．２μＭ）、または系２  二本鎖ＨＢＶプローブ（各鎖０．０５μＭ）；
−  ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Qiagen，品番２０３２０５）  ２．５Ｕ、ＭｇＣｌ２  ６ｍＭ、ｄ（ＡＣＧＵ）ＴＰ  ２００μＭ、ｄＴＴＰ  １００μＭ、０．２５Ｕ  ＵＤＧ、ＰＶＰ  ０．３％、グリセロール  ５％。
【０２１８】
用いた熱特性は実施例７についてと同じである。
系２について以下の二本鎖プローブを用いた：
【表４７】
2010505440.tif 000051
【０２１９】
【表４８】
2010505440.tif 000052
【０２２０】
ＦＡＭ蛍光の検出（ＨＢＶ  ＤＮＡ検出）：
・参照モレキュラー・ビーコン（ＭＢ）・プローブ（Ｔａ＝５５℃）：
【表４９】
2010505440.tif 000053
【０２２１】
・二本鎖（ＤＳ）プローブ（系１）（Ｔａ＝５５℃）：
【表５０】
2010505440.tif 000054
【０２２２】
・二本鎖（ＤＳ）プローブ（系２）（Ｔａ＝５５℃）：
【表５１】
2010505440.tif 000055
【０２２３】
系１についての結果を以下の表にまとめる：
【表５２】
2010505440.tif 000056
【０２２４】
系２についての結果を以下の表にまとめる：
【表５３】
2010505440.tif 000057
【０２２５】
Ａｔｔｏ６４７Ｎ蛍光の検出（ＩＣ  ＤＮＡ検出）：
予想通り、この検出は本質的に一定の結果をもたらし、両プローブ系について同等である。
【表５４】
2010505440.tif 000058
【０２２６】
ＨＢＶ  ＤＮＡの定量
【表５５】
2010505440.tif 000059
【０２２７】
本発明による二本鎖プローブの２つの異なる系を用いて測定されたＣｔ値は、参照モレキュラー・ビーコン・プローブを用いて測定されたものと同様であり、両プローブを用いての感度は同様であり、また、二本鎖プローブの２つの系について、標的ＤＮＡコピーの初期数に対するＣｔの線形回帰は高い相関係数（Ｒ２＝０，９９２）を示し、参照モレキュラー・ビーコン・プローブについて観察され得るものと一致する。
【０２２８】
既に観察されたように、該結果は、モレキュラー・ビーコン・プローブと比べてより低い濃度の二本鎖プローブを用いて成し遂げられ得る。
【０２２９】
さらに、このマルチプレックスアッセイについて得られた結果は、Ａｔｔｏ６４７Ｎのごとき高い発光波長を有する蛍光色素に関して、本発明による二本鎖プローブが十分に機能することを示す。
【０２３０】
最後に、このマルチプレックスアッセイについて得られた結果は、本発明による二本鎖プローブがＨＢＶ  ＤＮＡの定量のために十分に機能することを示す。
【０２３１】
実施例１０
シンプレックスアッセイＨＩＶ（ＦＡＭ）−代替的配置５’ＦＡＭ／３’ＦＡＭおよび５’Ｄａｂｃｙｌ／３’Ｄａｂｃｙｌ
ＨＩＶ−１Ｍの様々な遺伝子型の検出のために、２つの代替的配置の本発明による二本鎖プローブを用い（同じ鎖上に２つのフルオロフォア、および他の同じ鎖上に２つのクエンチャー、および逆もまた同様：系Ａおよび系Ｂ）、実施例７のプローブおよびプライマーを用いて、シンプレックスアッセイを設計した。
【０２３２】
簡潔に言うと、以下の鋳型ＲＮＡ、プローブおよびプライマー濃度を、ほかの点については実施例７と同様の混合物にて用いた：
−  ＨＩＶ  ＲＮＡ  表に示される通り；
−  プライマー  ０．１５μＭ；
−  二本鎖ＨＩＶプローブ各鎖０．１μＭ；
−  ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Qiagen，品番２０３２０７）  ４Ｕ、ＭｇＣｌ２  ０．１ｍＭ、ｄ（ＡＣＧＵ）ＴＰ  １００ｍＭ、２．５％  ＤＭＳＯ；
−  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＲＴ  Ｍｉｘ  １×（Qiagen）。
【０２３３】
用いられる熱特性は、アニーリング温度を４８℃に設定したこと以外は実施例７のものと同じである。
【０２３４】
系ＡおよびＢのために以下の二本鎖プローブを用いた：
【表５６】
2010505440.tif 000060
【表５７】
2010505440.tif 000061
【０２３５】
【表５８】
2010505440.tif 000062
【０２３６】
結果
Ａ．リンパ芽球様ＣＥＭ細胞の培養液の上清由来の試料（ＨＩＶ−１Ｍ  Ｂサブタイプ）
・参照二本鎖（ＤＳ）プローブ：
【表５９】
2010505440.tif 000063
【０２３７】
・系Ａ  二本鎖（ＤＳ）プローブ：
【表６０】
2010505440.tif 000064
【０２３８】
・系Ｂ  二本鎖（ＤＳ）プローブ：
【表６１】
2010505440.tif 000065
【０２３９】
上記の表から分かるように、代替的配置（同じ鎖上に２つの色素、および別の同じ鎖上に２つのクエンチャー）を有する二本鎖プローブは、検出閾値（１ＰＣＲあたり１０コピー）、Ｃｔ値および再現性（ＳＤ）に関して、参照二本鎖プローブと同様の結果をもたらす。
【０２４０】
Ｂ．ＰＲＤ２０１パネル（ＨＩＶ１−ＭサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ）
・参照二本鎖（ＤＳ）プローブ：
【表６２】
2010505440.tif 000066
【０２４１】
・系Ａ  二本鎖（ＤＳ）プローブ：
【表６３】
2010505440.tif 000067
【０２４２】
・系Ｂ  二本鎖（ＤＳ）プローブ：
【表６４】
2010505440.tif 000068
【０２４３】
フルオロフォア／クエンチャーの配置に関係なく、ＡないしＨの全ての遺伝子型は本発明による二本鎖プローブにより検出され得る。
【０２４４】
実施例１１
サルモネラ・ティフィの検出
本発明による二本鎖プローブを、サルモネラ・ティフィ（ｉａｇＡ遺伝子のヌクレオチド１５０１ないし１６５５に及ぶ１５５ヌクレオチドのフラグメント、ＮＣＢＩ  ＣｏｒｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  参照Ｘ８０８９２）の検出のために設計されたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）シンプレックスアッセイにてさらに試験し、参照モレキュラー・ビーコン・プローブと比較した。
【０２４５】
材料および手法
古典的なプラスミド調製キットを製造元の指示に従って用いて、サルモネラ・ティフィ標的化配列を含むＤＮＡプラスミド（ｉａｇＡ遺伝子由来の６１９塩基対（Ｘ８０８９２由来の１１１４ないし１７３２の位置）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを含むｐＵＣ１８プラスミド）を抽出した。使用前にＤＮＡプラスミドを水で希釈した。
【０２４６】
以下のプローブおよびプライマーを用いた：
【表６５】
2010505440.tif 000069
【０２４７】
ＰＣＲ混合物は以下の通りであった：
−  プラスミドＤＮＡ：０〜２０，０００コピー／ＰＣＲ；
−  サルモネラプライマー  ０．５μＭ；
−  モレキュラー・ビーコンサルモネラプローブ  ０．２μＭ  または二本鎖サルモネラプローブ  各鎖０．１μＭ；
−  ポリメラーゼ（Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Roche）  ３Ｕ／反応、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｐｌｕｓ（Qiagen）  ２．５Ｕ／反応、ＮｏｖａＴａｑTM  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ（Novagen）  ２Ｕ／反応、ＤｙｎａｚｙｍｅTM  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes）  ３Ｕ／反応、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Roche）  ３Ｕ／反応）；
−  ＭｇＣｌ２  ４ｍＭ；ｄ（ＡＣＧＴ）ＴＰ  １００μＭ。
【０２４８】
リアルタイムＰＣＲは、ＢｉｏＲａｄ  Ｃｈｒｏｍｏ４蛍光サーモサイクラーにて以下の熱特性を用いて実施した：
2010505440.tif 000070
【０２４９】
結果
ＦＡＭ蛍光の検出（サルモネラＤＮＡ検出）：
・ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
【表６６】
2010505440.tif 000071
【０２５０】
・他のポリメラーゼ
【表６７】
2010505440.tif 000072
【０２５１】
全体として、シンプレックスアッセイについて得られた結果は、本発明による二本鎖プローブがサルモネラ・ティフィＤＮＡの検出のために十分に機能することを示す。
【０２５２】
本発明による二本鎖プローブを用いて測定されたＣｔ値は、参照モレキュラー・ビーコン・プローブを用いて測定されたものと同様であるか、または有利にはそれよりも低い。
【０２５３】
両プローブを用いての感度は同様であるが、本発明による二本鎖プローブを用いた場合には、最大蛍光の有利な２００％増大が平均して得られる。
【０２５４】
最後に、化学修飾されているか否かに関わらず、５つの異なる市販ポリメラーゼを用いて同じ結果が観察されたので、本実験は、二本鎖プローブを用いることにより得られた蛍光増加が用いるポリメラーゼに無関係であることも示す。
【図１】
2010505440.tif 000073
【図２】
2010505440.tif 000074
【図３】
2010505440.tif 000075
【図４】
2010505440.tif 000076
【配列表】
2010505440000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月11日(2009.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010505440000001.app
【国際調査報告】
2010505440.tif 000095
2010505440.tif 000096
2010505440.tif 000097