(57)【要約】本発明は、少なくとも８．５％の分枝度及び少なくとも１０％のＤＰ５〜７を含む側鎖組成を有する、ゆっくりと消化可能な貯蔵炭水化物（デンプン、グリコーゲン）に関する。該ゆっくりと消化可能な炭水化物は、天然の源からの基質（グリコーゲン、デンプン）を、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ又はＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓに由来するグリコーゲン分枝酵素によって処理することにより製造されうる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも８．５〜９％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１１％の分枝度、及び少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％及びより好ましくは少なくとも２０％のＤＰ５〜７を含む側鎖組成を有する、ゆっくりと消化可能な貯蔵炭水化物。
【請求項２】
約６０〜約１５０ｋＤの分子量を有することを特徴とする、請求項１に記載のゆっくりと消化可能な貯蔵炭水化物。
【請求項３】
該貯蔵炭水化物が、ヒト又は動物の腸の酵素により、マルトースが同じ条件下で加水分解される速度の０．９倍以下、好ましくは０．１〜０．９倍、より好ましくは０．３〜０．７倍の速度で加水分解されうる、請求項１又は２に記載のゆっくりと消化可能な貯蔵炭水化物。
【請求項４】
天然の源からの貯蔵炭水化物を分枝酵素によって処理することにより、少なくとも９％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１１％の分枝度、及び少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％のＤＰ５〜７を含む側鎖組成を有する、ゆっくりと消化可能な炭水化物を製造する方法。
【請求項５】
該分枝酵素が、微生物、好ましくはＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ及び／又はＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ科又はＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕｓグループからの微生物、より好ましくはＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ及びＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓからなる群から選ばれる微生物、最も好ましくはＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ又はＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓに由来する酵素、好ましくはＥ．Ｃ．２．４．１．１８により記述される活性を有する酵素、又はそれらの任意の相同体又は変異体酵素である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該天然の源が、デンプン含有植物材料、好ましくは根又は塊茎、より好ましくはジャガイモ塊茎である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
天然の源からの該貯蔵炭水化物が少なくとも９０％のアミロペクチンを含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法により調製される、ゆっくりと消化可能な貯蔵炭水化物。
【請求項９】
好ましくは糖尿病の食料、ベビーフード、特別な食事療法の配合物並びに／又はスポーツフード及びスポーツドリンクの為に、食料又は飼料製品として、請求項１〜３および請求項８のいずれか１項に記載のゆっくりと消化可能な貯蔵炭水化物を使用する方法。
【請求項１０】
該ゆっくりと消化可能な貯蔵炭水化物が、該食料、飼料又はドリンクに、少なくとも１０重量％の量で添加される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも８．５〜９％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１１％の分枝度及び少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％のＤＰ５〜７を含む側鎖組成を有する、ゆっくりと消化可能な貯蔵炭水化物を製造する為に、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ及び／又はＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ科又はＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕｓグループからなる群から選ばれる微生物、より好ましくはＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ及びＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓからなる群から選ばれる微生物に由来するグリコーゲン分枝酵素、又はグリコーゲン分枝活性を有するそれらの任意の相同体又は変異体酵素を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゆっくりと消化可能な貯蔵炭水化物の調製に関し、より特にはグリコーゲン分枝酵素を用いるゆっくりと消化可能なデンプン又はグリコーゲンの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースのポリマーであるデンプンは、ヒトの体のためのエネルギーの主要な源の一つである。消化の間、デンプンのグルコースは、小腸内で血液に移行され、血液中の高められたグルコース水準をもたらす。反応として、体は、より高水準のインスリンを生産して、肝臓及び筋肉内にグリコーゲンとしてグルコースを貯蔵する。
【０００３】
小腸内のデンプンの消化挙動は、３つのカテゴリーに分類される：急速に消化可能なデンプン、ゆっくりと消化可能なデンプン及び消化されないデンプン（耐性デンプン）。急速に及びゆっくりと消化可能なデンプンは、いわゆる血糖応答（すなわちグルコースが血液中に放出される速度）により区別可能である。耐性デンプンは、小腸内で消化されないが、大腸で発酵される。デンプンの分類のよい概説が、Ｅｎｇｌｙｓｔら（Ｅｎｇｌｙｓｔ  Ｈ．，  Ｋｉｎｇｍａｎ  Ｓ．Ｍ．，  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｊ．Ｈ．  （１９９２）、“Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｓｔａｒｃｈ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．４６：３３−５０）により与えられる。
【０００４】
急速に消化可能なデンプンは、血液中に迅速にグルコースを放出する。いくつかの悪い健康局面が、この迅速な放出及びその後のインスリン水準の増加に起因する。速い血糖応答を有する食事は、人口のいくつかの集団についての２型糖尿病の発達に関する（Ｓａｌｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  ＪＡＭＡ  ２７７：４７２−４７７）。さらに、急速に消化可能なデンプンは、肥満の発達に関連付けられる。グルコースの迅速な放出及び得られた、迅速なインスリンの増加は、人を空腹なままにし、そしてより多くの食物を取ろうとするように促す。結果として、ＦＡＯ／ＷＨＯによる最近の勧告は、インスリン応答は同様に重要な因子ではあるが、脂質異常症及び肥満の人々における並びに健康な人々におけるゆっくりとした応答を有するデンプンの選択を推奨した。
【０００５】
鳥について、ゆっくりと消化可能なデンプンがタンパク質及びアミノ酸の消化の効率を改善することが示唆された（Ｐｏｕｌｔｒｙ  ｗｏｒｌｄ、２００３年１０月）。これは、哺乳類、特にはヒトにとって同様に重要であり得る：アミノ酸摂取における増加は減食を軽減すると考えられている。
【０００６】
スポーツドリンクにおいて、グルコースの放出は、健康に直接に関連しないが、重要な問題である。ＰｅｐｔｏＰｒｏ（商標）と呼ばれるスポーツドリンクについての商業上の情報は、血糖応答を増加する為の、タンパク質加水分解物のグルコースポリマーへの適用を記載する。そのような増加は、スポーツ活動の間の回復を増強するだろう。しかしながら、長期間にわたる活動を要求するスポーツの為に準備する為に、体にグルコースが燃焼するより多くの時間を与える為の並びに筋肉及び肝臓における望ましくない貯蔵を防ぐ為の、グルコースのゆっくりとした放出が望まれるだろう。
【０００７】
いくつかのデンプンは、他のデンプンに対してゆっくりと消化可能なデンプンの増加した割合を有する。そのようなデンプンの一つは、Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｔｅｆｆ（エチオピアの穀物）からのデンプンであり、これは多くのエチオピア人の食物を成し、それ故に、エチオピア人スポーツ選手のマラソン成績に寄与すると考えられている（www.sporteff.nl）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
デンプンの分枝度を増加することにより消化速度を遅くすることは、前に産物が欧州特許出願公開第０  ４１８  ９４５号明細書において記載されているが、米国特許第２００３／０００５９２２号パンフレットに示唆されている。それ故に、米国特許出願公開第２００５／０１５９３２９号明細書において、追加の酵素的βアミラーゼ工程が、所望の特性を有する産物を作る為に導入された。他の特許文献も、デンプンを、比較的低い粘度を有する安定な、非ゲル化製品に変える為の分枝酵素の使用を記載した。米国特許出願公開第２００４／００１４９６１号明細書において、これは、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの分枝酵素又はすい臓のアミラーゼによりデンプンを処理しそして得られた産物を分画することにより達成される。米国特許出願公開第２００２／００６５４１０号明細書、特許出願公開第２００１／０３１５７４号公報及び独国特許出願公開第１０２３７４４２号明細書において、アミラーゼ（α−アミラーゼ、β−アミラーゼ又は両方）が、高度に分枝したデンプンを得る為に用いられる。国際公開第００／２２１４０号パンフレットにおいて、高度に分枝したデンプンを提供する、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａからの新たな酵素が記載された。しかしながら、これらの特許出願のどれもが、これらのデンプンの側鎖組成及びα−限界デキストリン含有量の効果、並びに消化率に対するそれらの影響を記載しない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、少なくとも８．５〜９％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１１％の分枝度を有するゆっくりと消化可能な新規貯蔵炭水化物に関する。該ゆっくりと消化可能な貯蔵炭水化物は好ましくは、約６０〜約１５０ｋＤの分子量を有する。さらに、該貯蔵炭水化物は好ましくは、ヒト又は動物の腸の酵素により、マルトースが同じ条件下で加水分解される速度の０．９倍以下、好ましくは０．１〜０．９倍、より好ましくは０．３〜０．７倍の速度で加水分解されうる。
【００１０】
少なくとも９％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１１％及び最も好ましくは少なくとも１２％の分枝度（すなわちα１，６グリコシド結合の量）を有するゆっくりと消化可能な貯蔵炭水化物を、天然の源からの貯蔵炭水化物を分枝酵素により処理することによって製造する方法も本発明の一部である。該酵素は好ましくは、微生物、好ましくはＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ及び／又はＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ科又はＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕｓグループからの微生物、より好ましくはＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ及びＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓからなる群から選ばれる微生物に由来する、Ｅ．Ｃ．２．４．１．１８により記載された活性を有する酵素である。
【００１１】
さらには、該方法において、該天然の源は、貯蔵炭水化物を含有する植物材料、すなわち、デンプン含有植物材料、好ましくは根又は塊茎、より好ましくはジャガイモ塊茎である。
【００１２】
有利には、天然の源からの該デンプンは少なくとも９０％のアミロペクチンを含む。
【００１３】
本発明の他の実施態様は、上記に記載されたような方法により調製されるゆっくりと消化可能な貯蔵炭水化物である。
【００１４】
そのようなゆっくりと消化可能な貯蔵炭水化物の、好ましくは糖尿病の食物、ベビーフード、特別な食事療法の配合物並びに／又はスポーツフード及びスポーツドリンクの為の、食物又は飼料製品としての使用方法は、本発明のさらなる部分である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ジャガイモからのアミロペクチンデンプンと比較した、５つの異なるバクテリアの源からの酵素による処理により得られたデンプンについての側鎖分布（すなわち側鎖中のグルコース残基の数）を示すグラフである。「ＲＨ９．６」はＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓであり、「Ａｐｅｃ  ａａｒｄ」は高いアミロペクチン（アミロース無しの）ジャガイモデンプンである。
【図２】分枝したデンプンの生産の為のフローチャートを示す図である。詳細については、以下を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
グリコーゲン分枝酵素とも呼ばれる分枝酵素（ｇｌｇＢ遺伝子によりコードされる）は、微生物及び動物（ヒトを包含する）に存在する。それは、グリコーゲン内のα−１，６−グリコシド結合を作り、すなわち、グルコースの通常のα−１，４−グリコシド結合した鎖の部分（グリコーゲンの「骨格」を作る）からの分枝を形成する。同様の酵素が植物に存在し（デンプン分枝酵素）、これは、同じ機能（アミロペクチン（デンプンの２つのグルコースポリマーのうちの一つ）内のα−１，６−グリコシド結合の形成）を果たす。しかしながら、グリコーゲン分枝酵素が、それらの酵素活性にとっての基質としてデンプンを用いることができることがわかった。
【００１７】
本発明において基質として適当なデンプンは、任意の天然の源に由来する全てのデンプンを包含する。本明細書において用いられるときの天然のデンプンは、天然に発見されるデンプンとして定義される。他の適当なデンプンは、交雑育種、転流、転化、形質転換又は、天然のデンプンを変化させる為の遺伝子工学若しくは染色体工学の任意の他の方法を通じて植物から得られる。デンプンの次に、グリコーゲンも基質として用いられてよく、そしてグリコーゲンも、ゆっくりと消化可能なグリコーゲンへと本発明の酵素により転化されうるとみえる。本出願において、デンプン及びグリコーゲンの両方が、「貯蔵炭水化物」として示されるであろう。
【００１８】
デンプンの典型的な源は、植物の穀物、塊茎、根及び果実である。これらのデンプンは典型的には、アミロース及びアミロペクチンの混合物を含む。そのような源は、より一般的な源のいわゆる「もち性（waxy）」変異体とも呼ばれうる。ここで「もち性」は、植物が１０％未満のアミロースを含むデンプンを産生することを意味する。これらのデンプンは、「アミロペクチンデンプン」とも命名される。もち性デンプンは一般に非もち性デンプンより高い分枝度（約４％）をすでに含むので、もち性デンプンは好ましい。しかしながら、高アミロース含有量を有するデンプンも、本発明から利益を得ることができる。なぜなら、それらは分枝酵素により改変するとより安定になるであろうこと及びこれらの処理が促進されるであろうことが考えられるからである。
【００１９】
グリコーゲンの典型的な源は、さまざまな種類の動物（哺乳類を含む）の筋肉及び肝臓（より低い程度で腎臓及び脾臓も）である一方で、微生物、例えばバクテリア、菌類及び酵母などもグリコーゲンの源を形成しうる。
【００２０】
アミロペクチンデンプンは、その増加した分枝の故に、マルトースのｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化速度に匹敵するｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化速度（すなわち、マルトースの該消化速度の０．９〜１．０倍）を有する。そのような消化は、試験管分析におけるいわゆるＥｎｇｌｙｓｔ方法（Englyst,  H.N  et  al.,  1992,  Eur.  J.  Clin.  Nutr.  46:33-50）、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸モデル系（TIM-1,  Minekus,  M.  et  al.,  1995,  Alt.  Lab.  Animals  23:197-209）における、いわゆるＥｎｇｌｙｓｔ方法に従い測定される。アミロペクチンについて見られる速度は、バクテリアＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ（Van  der  Maarel  et  al.,  2003,  Biocat.  Biotransform.  21:199-207）及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Takata  H.  et  al.  1994,  Appl.  Environ.  Microbiol  60-3096-3104）に由来する分枝酵素により天然のデンプンを処理することによっても達成される。これらのバクテリアからの酵素による処理から得られるデンプンの分析から、それらが約５〜７％の分枝度を有することが分かった。さらに、これらの分子中の生成された側鎖のサイズは、比較的高かった（中央値ＤＰ−重合度−１側鎖当たり約９〜１５グルコース部分）。
【００２１】
他の源からの分枝酵素により、８．５％超の分枝度を得ることが可能であることが今わかる。以下の実験の部において示されるとおり、この増加した分枝は、貯蔵炭水化物の消化性に対する有益な効果を有する。さらに、重合度（すなわち側鎖の鎖長）が低い範囲において増加を示すこと、及びデンプンが少なくとも１０％の５〜７グルコース部分（ＤＰ５〜７）、好ましくは少なくとも１５％のＤＰ５〜７、より好ましくは少なくとも２０％のＤＰ５〜７を有する一方で、該鎖長の中央値は約６〜１２グルコース部分の中央値に減少し、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓの酵素により生成されたデンプンが約６〜７グルコース部分の中央値鎖長を有することがわかる。この後者のデンプンは、非常に高い分枝度（１１〜１２％）により特徴付けられるだけでなく、約６０ｋＤａの桁におけるデンプン分子の非常に低い分子量によっても特徴付けられる。
【００２２】
本発明において特に有用である酵素は、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ科及びＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ科のグループの属する微生物又はＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕｓグループに属する微生物からの酵素、より好ましくはＲｈｏｄｏｔｈｅｒｕｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ及びＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓからなる群から選ばれる微生物からの酵素である。
【００２３】
さらに、α−１，６−グリコシド結合を形成する機能をなお維持する、上記で言及されたそれらの相同な酵素が包含される。
【００２４】
この意味における相同は、上記言及された酵素との、７０％超、好ましくは８０％超、より好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超の、配列相同性を有するアミノ酸配列を相同な酵素が有することを意味する。
【００２５】
百分率同一性（又は相同性）の計算のために、デフォルトパラメータを用いて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムが用いられることができ（Altschul  et  al.,  1997  Nucl.  Acids  Res.  25:3389-3402）、又は代わりに、デフォルトパラメータを用いて、ＧＡＰアルゴリズムが用いられることができ（Needleman  and  Wunsch,  1970  J.  Mol.  Biol.  48:443-453）、この両方ともが、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ、マディソン、ウィスコンシン州、米国）中に含まれる。ＢＬＡＳＴサーチは、タンパク質がランダム配列としてモデル化されうると仮定する。しかしながら、多くの現実のタンパク質は、ホモポリマー的広がりであり、短い周期の繰り返しであり、又は１以上のアミノ酸に富む領域でありうる非ランダム配列の領域を含む。タンパク質の他の領域は全く似ていないけれど、そのような低い複雑度の領域は、関連しないタンパク質間に整列されうる。多くの低複雑度フィルタープログラムは、そのような低複雑度整列化を減少する為に採用されうる。例えば、ＳＥＧ（Wooten  and  Federhen,  1993  Comput.  Chem.  17:149-163）及びＸＮＵ（Claverie  and  States,  1993  Comput.  Chem.  17:191-201）低複雑度フィルターが、単独で又は組合せで採用されうる。
【００２６】
本明細書において用いられるときに、２つのタンパク質配列（又はヌクレオチド配列）の関係における「配列同一性」又は「同一性」又は「相同性」は、特定の比較枠上の最大の一致のために並べられたときに同じである２つの配列における残基への言及を包含する。配列同一性の百分率が、タンパク質に関して用いられるとき、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換（アミノ酸が類似の化学的特性（例えば電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸と置換され、それ故に分子の機能的特性を変えない）によりしばしば異なることが認められる。配列が保存的置換において異なる場合、百分率配列同一性は、該置換の保存的特性について補正する為に上昇するように調節されうる。そのような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有するといわれる。これらの調節を行う為の手段は、当技術分野の当業者によく知られている。典型的には、これは、全部よりもむしろ部分のミスマッチとしての保存的置換をスコアリングし、それにより百分率配列同一性を増すことを含む。すなわち、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ及び非保存的置換は０のスコアが与えられる場合、保存的置換は０及び１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（Computer  Applic.  Biol.  Sci.  4:11-17,  1988）に従い、計算される。
【００２７】
増加した熱安定性、すなわち高温に対する増大した抵抗性及び／又は増大した温度最適条件を有する、上記で定義されたような相同酵素が特に好ましい。
【００２８】
グリコシドヒドロラーゼファミリー１３（http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/fam/GH13.htmlを参照されたい）に属する分枝酵素は、４つの保存された領域を有し、そのうち触媒にとって重要な保存された残基の多くが局在化される（van  der  Maarel  et  al.  2002,  J.  Biotechnology  94:137-155を参照されたい）。グリコシドヒドロラーゼファミリー７０及び７７と一緒に、ファミリーＧＨ１３は、全ての酵素がこれらの保存されたドメインを共有するいわゆるα−アミラーゼファミリーを形成する。いくつかの最近の刊行物から、これらの保存されたドメイン及びそれらに直接の近辺における改変は、酵素活性、特異性及び、これらの酵素により作られる産物内に形成されるグリコシド結合に対して劇的な影響を有しうると知られている。Ｌｅｅｍｈｕｉｓら（Biochemistry,  2004,  43:13204-13213）は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．ＳＥ５０／１１０のacerviosylトランスフェラーゼ内のＧ１０４をＨに変えた場合（これは保存領域１に存在する）、該酵素はグルカのトランスフェラーゼ様の酵素になったことを示した。この変異は、シクロデキストリン形成活性も誘発した。他の例は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ１２１のreuteranスクラーゼへの、触媒的Ａｓｐのちょうど隣の領域４において導入された変異が、この酵素をデキストランスクラーゼへと変えたこと（該変異体により作られる産物内の１，６グリコシド結合の量は８５％であったが、野生型酵素は、約５０％の１，６グリコシド結合を有する産物を産生した）である（Kralj.  et  al.  Biochemistry  2005,  44,  9206-9216）。
【００２９】
分枝酵素による酵素的処理は、当業者に既知の技術を用いて実施される。用いられる酵素の量は、酵素原料の活性、デンプン原料及び処理パラメーター、例えばｐＨ及び温度などに依存する。典型的には、５０〜４００Ｕ／乾燥重量ｇが採用される。１ユニット（Ｕ）は、１分当たり１％で、アミロース−ヨウ化物複合体の６６０ｎｍでの吸光を減少する酵素の量として定義される。ｐＨ及び温度に関して、先行文献及び本発明において用いられる酵素は、広く様々な最適の値を有する。デンプンの酵素的処理の産業上の利用のために、６０℃超又はより高い温度で活性である酵素又はそれらの変異体、又は比較的高い温度を少なくとも生き抜くことができる酵素又はそれらの変異体を使用することが好ましい。一般に、増大した温度安定性を結果する変異は、密接な近接内にあるアミノ酸残基間の相互作用（水素結合、ファンデルワールス相互作用、静電気的相互作用、疎水性相互作用）の量を増すものであるか、又は、硫黄架橋を形成する硫黄側鎖を含む１又は２のアミノ酸（システインなど）の特異的な導入（ao.  J.  Fitter,  2005.  Structural  and  dynamical  features  contributing  to  thermostability  in  alpha-amylases,  Cell  Mol  Life  Sci,  62:  1925-1937;  Kim  YW  et  al.,  2003,  Directed  evolution  of  Thermus  maltogenic  amylase  toward  enhanced  thermal  resistance.  Appl.  Environ.  Microbiol.  69:4866-4874）である。
【００３０】
以下の表１において、百分率分枝、得られたデンプンの分子量及び分枝酵素のいくつかについての最適温度が掲げられ、表６及び図１は、該分枝酵素により処理されたデンプンの側鎖の重合度の分布曲線を示す。
【００３１】
酵素的処理は、事前の糊化（gelatinisation）を伴う又は伴わないで、デンプンスラリーの加熱により又はジェットクッキング（jet  cooking）により実施されうる。糊化を用いる方法は、当技術分野の当業者に知られており、例えば、J.L.  Doublier.  Rheological  studies  on  starch.  Flow  behaviour  of  wheat  starch  pastes.  Starch  /Starke,  33(1981)  415-420;  P.DeMeuter,  J.  Amelrijckx,  H.  Rahier,  B.  Van  Mele.  Isothermal  crystallization  of  concentrated  amorphous  starch  systems  measured  by  modulated  differential  scanning  calorimetry.  J.  Polym.  Sci.:Part  B:  Polym.  Phys.,  37(1999)2881-2891に記載される。
【００３２】
表１．もち性ジャガイモデンプン及び通常のジャガイモデンプンと比較した、種々の分枝化産物の分枝度。分枝度は、１，６グリコシド結合を加水分解する為に、イソアミラーゼだけを用いることにより又は、イソアミラーゼ及び、プルラナーゼの組合せにより測定された。イソアミラーゼ／プルラナーゼの組合せが用いられときの、Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ分枝化産物の分枝度における増加に注目されたい。
【００３３】
2010514443.tif 000002
【００３４】
糊化はデンプンを可溶化し、すなわちそれを、酵素にとってより接近可能なものにする。代わりに、C.  Mercier,  P.  Feillet.  Modification  of  carbohydrate  components  by  extrusion-cooking  of  cereal  products.  Cereal  Chem.,  52(1975)  283-297に記載されたように押出プロセスにおいて酵素により、R.J.  Nicholls,  I.A.M.  Appelqvist,  A.P  Davies,  S.J.  Ingman,  P.J.  Lillford.  Glass  transition  and  the  fracture  behaviour  of  gluten  and  starches  within  the  glassy  state.  J.  Cereal  Sci.,  21(1995)  25-36に記載されたように加熱された低湿度パウダーにおいて酵素により、又はドラム乾燥（P.  Colonna,  J.L.  Doublier,  J.P.  Melcion,  F.  de  Monredon,  C.  Mercier.  Extrusion  cooking  and  drum  drying  of  wheat  starch.  I.  Physical  and  macromolecular  modifications.  Cereal  Chem.,  61(1984)538-543）により、デンプンは処理されうる。好ましくは、該酵素の転化は、最大の乾燥個体含有量が可能である条件で実施される。該転化の為の典型的な温度は、１０〜９０℃、より特には５０〜８０℃である。一般に、該反応が実施されるｐＨは、３．０〜６．０に調節される。該転化は漸近的時間曲線に従い、そして、反応は、デンプンの本質的に全てが転化されるまでの長い持続期間を有しうる。しかしながら、効率的な転化の為に、約１〜３６時間、より好ましくは２〜２４時間の反応時間が十分である。任意的に、該転化において用いられる酵素は、当技術分野で既知の技術、例えばｐＨ３．０未満へｐＨを低下させること又は例えばジェットクッキング（jet  cooking）により温度を増すことなどにより、該転化が完了された後に不活性化されうる。
【００３５】
転化及び任意的な酵素の不活性化後に、デンプンは、押出又は噴霧乾燥、フラッシュ乾燥、空気乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥、ベルト乾燥、ドラム乾燥又は、デンプンの乾燥の為に当技術分野で知られ且つ用いられる任意の他の方法により、分離される。好ましくは、デンプンは、噴霧乾燥により分離される。転化の程度は典型的には、デキストロース当量（ＤＥ）により定量化される。これは、破壊されたデンプンにおけるのグリコシド結合のおおよその割合（fraction）である。このようにして作られる食品製品は、
・マルトデキストリン、薄味のフィラー及び増粘剤として用いられる軽度に加水分解された（ＤＥ１０〜２０）デンプン製品
・種々のコーンシロップ（ＤＥ３０〜７０）、多くの種類の加工食品において甘味料及び増粘剤として用いられる粘性の溶液
・デキストロース（ＤＥ１００）、市販のグルコース、デンプンの完全な加水分解により調製される
・高フルクトースシロップ、グルコースの相当の部分がフルクトースに転化されるまで、酵素グルコースイソメラーゼへのデキストロース溶液の処理することにより作られる。米国では、高フルクトースコーンシロップは、フルクトースがグルコースよりも甘い味がし、及びより少ない甘味料が用いられうるので、甘くされた飲料において用いられる主要な甘味料である。
【００３６】
得られたデンプンは、３より低いＤＥにより特徴付けされる。デンプンの酵素的処理についての典型的なプロセススキームについてのフローチャートが図２に見られる。開始は、約２０％乾燥重量デンプンのスラリーに（好ましくは脱硬水（de-hardened  water）中のジャガイモデンプン）より成され、これがジェットクッカー（jet-cooker）を通過される（５秒間の１４０℃）。次に、酵素が添加され、そして反応が、適切な条件（ｐＨ、温度）下で十分な時間実施される。上昇した温度（例えば５０〜７０℃）が好ましい。なぜなら、これは汚染微生物が増殖し始めるのを抑制するからである。反応後、加工デンプン溶液がジェットクッカーを通過されて（５秒間の１３０℃）該酵素を不活性化し、そして、物質は緩衝容器中に集められる。最終的には、該加工デンプンは噴霧乾燥される。
【００３７】
製造された加工デンプンは、食品及び飼料の適用におけるゆっくりと消化可能なデンプンとして、理想的には適用されうる。現今では、デンプンは食品及び飼料における多くの適用において、例えば基礎的食品化合物として、ベーカリー製品（パン、ケーキ、クッキー、スナック、キャンディーバー（candy-bar）など）の製造の為、乳製品（クリーム、プリンなど）、スープ及びソースの製造の為の、結合剤、フィラー、増粘剤又はゲル化剤として、用いられる。
【００３８】
さらなる利点は、比較的短い側鎖を有する高度に分枝した貯蔵炭水化物の減少した粘度及びゲル形成特性である。上記言及された食品及び飼料製品を調製する方法においてだけでなく、デンプンが用いられる非食品プロセス（本プロセスにおいてしばしば、適用されたデンプンを含む中間生産物の加熱及び冷却が用いられる）、例えば繊維工業（紡績の間の糸の強化の為）、製紙工業などにおいて、並びにペーパーコーティングの為に、先行技術のアミラーゼ分子とデンプンのアミロペクチン分子の長い側鎖とが相互作用すると知られており、それにより不可逆的ゲルを形成する。先行技術のデンプンのこの特性は、そのようなプロセスにおいて減少した適用可能性を結果する。本発明の高度に分枝した貯蔵炭水化物は、これらの相互作用を示さないか又は最小にだけ示し、すなわちこれは不可逆的ゲルのより少ない形成を結果するであろうし及びすなわち上記言及されたプロセスにおけるこれらのデンプンの増加した適用可能性を結果するであろう。
【００３９】
実施例
本特許出願において記載された酵素の遺伝子配列及びそれらの対応するアミノ酸配列が、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）タンパク質データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=protein）において見られる。アミノ酸配列は以下のアクセス番号を有する
Ｒ．ｏｂａｍｅｎｓｉｓ：ＮＣＢＩアクセス番号Ｑ９３ＨＵ３
Ｄ．ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ：ＮＣＢＩアクセス番号ＡＢＦ４５２８１（Ｑ１ＩＺＱ３）
Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ：ＮＣＢＩアクセス番号ＡＥ０００５１３（Ｑ９ＲＴＢ７）
Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：ＮＣＢＩアクセス番号ＡＡＡ２２４８２（Ｐ３０５３８）。
【００４０】
当技術分野の当業者は、上記与えられた配列情報に基づき、該酵素をコードするＤＮＡを得ることができ及び異種発現系においてこのＤＮＡを使用することができる。上記言及された微生物の培養物から該酵素を単離することも可能である。
【００４１】
Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓ遺伝子のクローニングが、van  der  Maarel  et  al.  Biocatalysis  and  Biotransformation  2003,  21:199-207において記載された。
【実施例１】
【００４２】
加工デンプンの製造
通常の商品グレードジャガイモデンプン及びモチ性ジャガイモでんぷんから、最大に分枝した製品が、１グラムのデンプン当たり４００Ｕの分枝酵素活性を、６８℃で２０時間インキュベートすることにより作成された。デンプンスラリーは、１ｌ当たり０．２８８３ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含む脱塩水中にデンプンを懸濁することそしてそれを攪拌しながら１００℃の水浴中で２０分間加熱すること（次に該デンプン溶液を１２１℃で２０分間オートクレーブされた）により調製された。分枝酵素は、該基質が所望のインキュベーション温度に冷却された後に添加された。２０時間後に、反応は、１００℃に該インキュベーション混合物を加熱することにより停止された。その後、該分枝したグルカンがエタノール沈殿及びその後の乾燥により回収された。エタノールが、９０％の最終濃度へと添加され、そして次に、エタノール／デンプン懸濁物が５０分間穏やかに混合された。該加工デンプンは次に、ペーパーフィルター上で濾過された。該フィルター上に維持された物質は１００％エタノールにより洗浄され、そしてその後、１００％エタノール中に懸濁された。次に、該デンプンが再度濾過され、そして３７℃で乾燥された。
【００４３】
Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓ酵素により得られた分枝したグルカンは、平均して５．３％の分枝度を有した一方で、Ｒ．ｏｂａｍｅｎｓｉｓ酵素により得られた産物は９．５％の分枝度を有した。
【００４４】
酵素活性の分析
分枝酵素活性の量は、分枝酵素の作用に起因する、ヨウ素／ヨウ化物／アミロース複合物の６４０ｎｍでの吸光度における変化を測定することにより決定された。手順は以下のとおりである：１５０μｌの０．１２５％アミロース溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａ０５１２、タイプＩＩＩ、ジャガイモ）の、５０μｌの酵素との、適切な希釈（１０〜１５Ｕ／ｍｌ）における、１５分間の適切な温度（Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓ  ８０℃、Ｒ．ｏｂａｍｅｎｓｉｓ  ６０℃）でのインキュベート。参照として、添加された酵素無しのアミロース溶液が用いられた。試料を氷上で手短に（１〜３秒）冷却、及び、ボルテックス後にそれらを室温に置く。１５μｌの試料を取り、そして、これを１５０μｌのヨウ素溶液（１リットル当たり１ｇのＫＩ、０．１ｇのＩ２及び９４０ｇのＣａＣｌ２）とｐｖｃマイクロタイタープレート（ＩＣＮ）中で混合する。５〜１０分後、６４０ｎｍでの消衰（extinction）を測定する。吸収（absorption）の減少から、酵素活性が以下の式に従い計算される：
2010514443.tif 000003
【００４５】
分枝度の分析
分枝度は、酵素イソメラーゼにより脱分枝することそしてその後形成された還元末端の量を測定することにより分析された。該分析は以下のとおりに行われた：１００ｍｇの試料が、１０ｍｌの脱塩水と混合され、そしてこれが次に、回転により混合しながら、ストーブ（stove）中で１００℃で１時間加熱された。それを３５℃に冷却しそして１５分間待った後に、１Ｍ酢酸を用いてｐＨが４．５に調節された。次に、０．８７５Ｕイソアミラーゼ溶液（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、ウィックロー、アイルランド）が添加され、２０時間の３５℃でのインキュベートが続いた。反応は、該反応混合物を２分間煮沸することにより停止され、そして試料は３０分間、３６００ｒｐｍで遠心された（ＭＳＥ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）。上清中の還元糖の量が、Ｎｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉアッセイ（G.  Spiro:Analysis  of  sugars  found  in  glycoproteins,  in  Methods  Enzymol.  8  (Ed.  E.  F.  Neufeld,  V.  Ginsburg)  Academic  Press,  1966）を用いて決定された。
【００４６】
側鎖組成
分枝したグルカンの側鎖組成はイソアミラーゼを用いて脱分枝することそしてその後のＨＰＬＣによるオリゴ糖の分析により決定された。
分枝したグルカンは、微生物の脱分枝酵素イソアミラーゼを添加することにより脱分枝された。分析されるべき試料のｐＨは、１Ｍ酢酸を用いて４．５に調節され、０．８７５Ｕイソアミラーゼ溶液（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）が添加され、１時間の４０℃でのインキュベーションが続いた。反応は、２分間反応混合物を煮沸することにより停止された。ＨＰＬＣ分析の前に、試料が８０％ＤＭＳＯ中に５倍に希釈され、回転により混合しながら、９０℃で１２０分間加熱されて透明な溶液を得て、そしてその後０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州、米国）を通してろ過された。次に、線状オリゴ糖が、２０μｌ注入ループ、ＣａｒｂｏＰａｃ  Ｐａ−１ガードカラム及びＰａ−１カラム、４成分グラジエントポンプ（quaternary  gradient  pump）、ヘリウムガスを用いた溶離物脱ガスモジュール、及び金電極を有するパルスアンペロメトリック検出器を備えられた、パルスアンペロメトリック検出を伴う高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ；Ｄｉｏｎｅｘ、サニーベール、カリフォルニア州、米国）により分析された。該電極の電位は以下のとおりにプログラムされた：０〜０．４秒の０．１Ｖ、次に、０．４１〜０．６１秒の０．７Ｖ及び最後に、０．６１〜１．００秒の−０．１Ｖ；シグナルは０．２〜０．４秒で積分された。
【００４７】
Ｅｎｇｌｙｓｔアッセイ。
Ｅｎｇｌｙｓｔ分析方法（Englyst,  H.  N.,  Kingman,  S.  M.,  and  J.  H.  Cummings.  1992.  Classification  and  measurement  of  nutritionally  important  starch  fractions.  Eur.  J.  Clin.  Nutr.  46:  33-50）により、迅速に及びゆっくりと分解可能なデンプンの量が評価されうる。ヒトの胃及び小腸が、パンクレアチン、インベルターゼ及びアミログルコシダーゼと一緒に試料をインキュベートすること及び２０分後（迅速に分解可能なデンプン；ＲＤＳ）及び１２０分後（ゆっくりと分解可能なデンプン；ＳＤＳ）の添加された産物の量を測定することにより、試験管内で模倣された。合計量デンプン（ＴＧ）も、α−アミラーゼ及びＡＭＧにより得られたグルコースの量として測定された。抵抗性デンプンの量は、デンプンの合計量と分解されたデンプンの量の間の差から計算される。高度に分枝したグルカンの場合、アミログルコシダーゼ（分枝点を加水分解する）の使用は、分析に対する望ましくない効果を有しえた。それ故に、Ｅｎｇｌｙｓｔ方法が若干修正された：アミログルコシダーゼ及びインベルターゼが、インキュベーション混合物から除去され、そして転化されたデンプンの量の分析が変更された。転化されたデンプンの量は、産生されたマルトオリゴ糖からマルトペンタオースまでの合計量として定義された。用いられたＥｎｇｌｙｓｔ方法についての第２の変法は、パンクレアチンのより少ない用量及びより多い試料採取（sampling）が用いられるものであった。全ての試料は、陽イオン交換ＨＰＬＣ（分枝化した産物は検出されなかった）による、及びＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（線状の及び分枝化した産物が検出された）による、ＧＯＰＯＤ方法によってグルコースについて分析された。
【００４８】
分析
試料は「食べられたように」調製された。これは、５ｍｌの水を０．６グラムのデンプンに添加すること、これを１００℃で１０分間加熱すること、及びそれを３７℃に冷却することにより行われた。これに、１０ｍｌのアラビノース／ペプシン／グアー溶液（５ｇ／Ｌのペプシン[Ｓｉｇｍａ番号Ｐ−７０００]及びグアーガム[Ｓｉｇｍａ番号Ｇ−４１２９]が添加された、０．０５Ｍ塩化ナトリウムで飽和した２５％安息香酸中の２０ｇ／Ｌアラビノースの溶液）が添加され、そして、この溶液は３０分間、３７℃でインキュベートされた。５ｍｌの酢酸ナトリウム（０．５Ｍ）及び５のガラスマーブル（glass  marble）が添加された後に、全部の懸濁物が穏やかに混合されそして、３７℃で置かれて平衡化した。次に、５ｍｌの酵素溶液（１２０ｍｌの超純水中の３グラムのパンクレアチン[Ｓｉｇｍａ番号Ｐ−７５４５]を、よく混合し及び１５００×ｇで遠心し、次に９０ｍｌの上清に、４ｍｌのアミログルコシダーゼ[ＮｏｖｏｚｙｍｅｓのＡＭＧ  ４００Ｌ  タイプＬＰ]及び６ｍｌのインベルターゼ[Ｍｅｒｃｋ番号３９０２０３Ｄ]が添加された）が、該管中の該懸濁物に添加され、これは次に１００ｒｐｍで混合しながら、３７℃の振とう水浴中に水平に置かれた。２０分毎に、０．２ｍｌの試料がそれぞれの管から取られ、そしてこれが、４ｍｌの無水エタノールに添加された。該インキュベーションの終わりで、該管は徹底的に混合されて全ての粒子を崩壊して、そして次に、それらが沸騰水を有する水浴中に３０分間置かれた。短い混合後、該管が氷水上に１５分間置かれた。該管に、１０ｍｌの水酸化カリウム（７Ｍ）が添加され、そして、この溶液は次に３０分間氷水中に、１００ｒｐｍで混合しながらインキュベートされた。
【００４９】
０．２ｍｌの試料が夫々の管から取り出され、そして、１ｍｌの酢酸（１Ｍ）及び４０μｌのアミログルコシダーゼ溶液（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓの１：７希釈されたＡＭＧ４００ＬタイプＬＰ）が添加された。これが、３０分間７０℃でインキュベートされ、そして次に、沸騰水中に１０分間置かれた。次に、これらの管が氷水中で室温に冷却され、そして１２ｍｌの無水エタノールがそれぞれの管に添加された。この後者の試料中のグルコースの量が、上記のとおりの酵素的インキュベーション後に残ったグルコースの合計量を表す。
【００５０】
それぞれの試料中のグルコースの量は以下のとおりに測定された：試料が最初に５分間１５００×ｇで遠心され、そして、グルコースの量が、上清中において、製造者の指示に従い、標準としてのグルコースによるＧＯＰＯＤアッセイ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｋ−Ｇｌｕｃ）を用いて測定された。
【００５１】
結果
【００５２】
分枝した産物
Ｒ．ｏｂａｍｅｎｓｉｓ及びＡ．ａｅｏｌｉｃｕｓ酵素により作られた分枝したグルカン産物は夫々９〜９．５％及び５．３〜５．５％の分枝度を有した。これらの分枝したグルカンの側鎖分布は、最大でＤＰ３０までの範囲において違いを示した。特に、Ｒ．ｏｂａｍｅｎｓｉｓ産物は、より短い側鎖を、Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓ産物より多く有したことに注目されたい（表６及び図１を参照されたい）。
【００５３】
消化性
詳細なＥｎｇｌｙｓｔ分析がＡ．ａｅｏｌｉｃｕｓ産物（５．３％分枝した）及びＲ．ｏｂａｍｅｎｓｉｓ産物（９．５％分枝した）について行われた。１２０分の時間にわたって、２０分毎に試料が取られ、そして、遊離グルコースの量が測定された。結果が表２に示される。これらの結果は、１０％乾燥固形分懸濁物として用いられたＲ．ｏｂａｍｅｎｓｉｓ産物の約９０％が、最初の２０分以内でグルコースに転化されたことを示す。Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓ産物は、いくぶんより速く分解された（最初の２０分以内で９５％）。４０分後、両方の産物はほとんど完全に分解された。マルトースは、最初の２０分以内で完全にグルコースに転化された。モチ性ジャガイモデンプン試料が、最初の２０分以内で９６％について転化され、そして４０分後に完全に分解された。Ｒ．ｏｂａｍｅｎｓｉｓ産物が５０％乾燥固形分溶液として用いられたとき、６７％だけが最初の２０分以内で分解された。１２０分後、この産物も完全に分解された。
【００５４】
表３から分かるように、分解されたＲ．ｏｂａｍｅｎｓｉｓ産物の８０％が、短いオリゴ糖として回収された。Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓ産物及びモチ性ジャガイモデンプンについて、分解された物質の約９０％が、短いオリゴ糖として回収された。転化されたＲ．ｏｂａｍｅｎｓｉｓ物質の８０％だけが、多くともＤＰ５のオリゴ糖として回収されることができた一方で、Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓ産物及びモチ性ジャガイモデンプンについて９４〜９７％が回収されることができた。これらの結果は、比較的高い分枝度が、よりゆっくりとした分解を得る為に要求されることを示す。これらの観察に基づき、よりゆっくりとした消化性を与える為に９％超の分枝度が必要とされることが予備的結論である。
【００５５】
さらに、α−アミラーゼによるデンプン消化後、マルトース及びマルトトリオースの次に、いわゆるα限界デキストリンが形成される（Beers  et  al.,  1995,  Crit.  Rev.  Biochem.  Mol.  Biol.  30:197-262を参照されたい）。分枝した産物のα限界デキストリン含有量は表３から得られうる。この表において、ＤＰ１〜３の形成は、全部の炭水化物の百分率として与えられる。ＨＰＬＣ分析は、ＤＰ４又はより高いもののオリゴ糖が、すべて非線状であることを明らかにし、それら全てが少なくとも１つのα−（１，６）−グルコシドの分枝点を含み、それ故にα限界デキストリンであることを示す。それ故に、該α限界デキストリン含有量は、１００％−ＤＰ１〜３含有量に等しく、これはＰａｓｅｌｌｉ  ＳＡ２（これは未加工デンプンを密接に模倣する）について２０％のα限界デキストリン含有量、及びＡ．ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒ．ｏｂａｍｅｎｓｉｓ及びＤ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓについて夫々３６％、４３％及び５８％のα限界デキストリン含有量を結果する。それ故に、本発明のデンプンは、少なくとも８．５〜９％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１１％の分枝度、及び少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％及び最も好ましくは少なくとも５０％のα限界デキストリン含有量を有する、ゆっくりと消化可能な貯蔵炭水化物としても定義されうる。
【００５６】
表２．時間内に産生された遊離グルコースの量による、いろいろな種類の分枝したグルカン及び多くの参照産物の標準Ｅｎｇｌｙｓｔ分析の結果。
2010514443.tif 000004
【００５７】
表３．参照産物（Ｐａｓｅｌｌｉ  ＳＡ２）と比較した、種々の微生物の分枝酵素により作られた分枝化産物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化の結果。該ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、Ｅｎｇｌｙｓｔらにより記載された方法（上記参照）基づく一方で、添加された酵素カクテルの量はさまざまであった。時間内に形成された小さいオリゴ糖（ＤＰ１〜３）の量が、側鎖組成について記載されたようにＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ方法を用いて測定された。
2010514443.tif 000005
【００５８】
表４．異なるアッセイにより種々のデンプンにおいて検出された％分枝。
2010514443.tif 000006
【００５９】
表６．側鎖分布
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【図１】
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【図２】
2010514443.tif 000009
【国際調査報告】
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