(57)【要約】  本発明は、遊走細胞の方向および／または移動を制御する組成物および方法を提供する。具体的には、本発明は、新規な化学忌避因子およびユニモーダル逸散因子、免疫、炎症性または癌性表現型に関与する細胞の移動を改変または影響するそのアゴニストおよびアンタゴニストの同定に関する。
2010521135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト遊走細胞を有効化学忌避因子と接触させる工程を含む、ヒト遊走細胞において負の化学走性を誘導する方法。
【請求項２】
ヒト遊走細胞が、好中球、CD4+およびCD8+ T細胞、B細胞、単球または樹状細胞からなる群より選択される免疫細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
有効化学忌避因子が、糖質結合タンパク質、セルピン、細菌細胞壁成分、熱ショックタンパク質、天然産物、Toll様受容体リガンド、ウイルス因子、セマフォリン、エラスターゼインヒビター、抗生物質、筋肉細胞タンパク質、植物細胞壁成分およびケモカインからなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
免疫細胞が好中球であり、有効化学忌避因子が糖質結合タンパク質であり、前記糖質結合タンパク質がガレクチン-1である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
免疫細胞が好中球であり、有効化学忌避因子がセルピンであり、前記セルピンがアンチトロンビンIIIである、請求項３記載の方法。
【請求項６】
免疫細胞が好中球であり、有効化学忌避因子が細菌細胞壁成分であり、前記細菌細胞壁成分がS.aureus由来のペプチドグリカンである、請求項３記載の方法。
【請求項７】
免疫細胞が好中球であり、有効化学忌避因子が熱ショックタンパク質であり、前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質25である、請求項３記載の方法。
【請求項８】
免疫細胞が好中球であり、有効化学忌避因子が天然産物であり、前記天然産物がレスベラトロールである、請求項３記載の方法。
【請求項９】
免疫細胞が好中球であり、有効化学忌避因子がToll様受容体リガンドであり、前記Toll様受容体リガンドが大腸菌K12 LPSである、請求項３記載の方法。
【請求項１０】
免疫細胞が好中球であり、有効化学忌避因子がウイルス因子であり、前記ウイルス因子がrvCMVUL146である、請求項３記載の方法。
【請求項１１】
免疫細胞が好中球であり、有効化学忌避因子がセマフォリンであり、前記セマフォリンがセマフォリン3Aである、請求項３記載の方法。
【請求項１２】
免疫細胞が好中球であり、有効化学忌避因子がエラスターゼインヒビターであり、前記エラスターゼインヒビターがエラフィンである、請求項３記載の方法。
【請求項１３】
免疫細胞が好中球であり、有効化学忌避因子が筋肉細胞タンパク質であり、前記筋肉細胞タンパク質がトロポミオシンである、請求項３記載の方法。
【請求項１４】
免疫細胞が好中球であり、有効化学忌避因子が植物細胞壁成分であり、前記植物細胞壁成分がシトラスペクチンである、請求項３記載の方法。
【請求項１５】
免疫細胞が好中球であり、有効化学忌避因子が抗生物質であり、前記抗生物質がエリスロマイシンである、請求項３記載の方法。
【請求項１６】
有効化学忌避因子が2より大きい忌避指数を有する、請求項２記載の方法。
【請求項１７】
有効化学忌避因子が5より大きい忌避指数を有する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
a. 遊走細胞の集団を得る工程、
b. 前記遊走細胞の集団を推定化学忌避因子と接触させる工程、ここで、前記推定化学忌避因子は、前記遊走細胞への化学忌避活性を有すると思われる薬剤である、
c. 推定化学忌避因子への遊走細胞の集団の遊走応答を評価する工程、
d. 工程(c)の遊走応答に基づいて推定化学忌避因子の忌避指数を計算する工程、ならびに
e. 1.2より大きい忌避指数を有する推定化学忌避因子を有効化学忌避因子と相関させる工程
を含む、有効化学忌避因子のスクリーニング方法。
【請求項１９】
遊走細胞が、好中球、T細胞、B細胞、単球または樹状細胞である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
好中球が抗凝固全血試料から得られる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
a. 化学忌避活性を有する少なくとも１種類の薬剤を分泌すると思われる細胞を含むならし培地を調製する工程、
b. 時限式アリコート選択を行なう工程、ここで、前記時限式アリコート選択は、1〜360日の間の１回以上の時点で(a)の細胞から上清を回収することを含む、
c. 選択された各時点で(b)で回収された上清への遊走細胞の遊走応答を評価する工程、ここで、回収された上清は未希釈のままである、
d. 選択された各時点での工程(c)の遊走応答から未希釈の上清の遊走指数を計算する工程、ならびに
e. 1.2より大きい遊走指数を有するアリコートを化学忌避活性を有する少なくとも１種類の薬剤を分泌する細胞と相関させる工程 
を含む、化学忌避活性を有する少なくとも１種類の薬剤を分泌する細胞の同定方法。
【請求項２２】
化学忌避活性を有する少なくとも１種類の薬剤を分泌すると思われる細胞が、疾患組織または器官に由来する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ヒト好酸球を、ガレクチン-1、ガレクチン-2、熱ショックタンパク質27、熱ショックタンパク質40、熱ショックタンパク質47、熱ショックタンパク質70、熱ショックタンパク質90、Pam3CSK4、HKLM(熱殺菌L. monocytogenes)、ポリ(I:C)、FLS-1、イミキモッド、パクリタキセル、リピドA Diphos、P. gingavalis LPS、リポマンナン M. smegmatis、LTA Staph、S. aureus由来標準LTA、N-アセチルムラミル(MDP)、カテスピンG、レスベラトロールおよび脱水ケルセチンからなる群より選択される化学忌避因子と接触させる工程を含む、ヒト好酸球において負の化学走性を誘導する方法。
【請求項２４】
a. 炎症性傷害または刺激を受けた被験体を特定する工程、ならびに
b. 前記被験体を、前記炎症性傷害または刺激への炎症性応答部位で、前記炎症性応答を含む免疫細胞集団の少なくとも一部の負の化学走性を誘導するのに有効な量の有効化学忌避因子と接触させる工程
を含む、被験体における炎症性応答の改善方法。
【請求項２５】
前記免疫細胞の集団が好中球である、請求項２４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は2006年10月6日に出願された米国特許仮出願第60/850,070号に関連する。上記の出願の全教示は参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
化学走性、即ち、化学薬剤に関して細胞の方向性のある移動は複雑で非常に統合されたプロセスである。化学勾配に関して、移動は正（進む）または負（離れる）であり得る。このプロセスが誘発されると、次にこのプロセスは、多くの中でも、組織の組織化、器官形成およびホメオスタシスを媒介し、最終的に胚の形態形成を支持し、組織修復および再生に寄与し、癌、精神遅滞、アテローム動脈硬化症、および関節炎における疾患進行を進める。遊走細胞は、空間的および時間的に構成要素のプロセスを統合する複雑な調節経路によって非常に極性を示す。
【０００３】
化学走性は原核生物および真核生物の両方で生じる。全ての場合において、薬剤または刺激に進む移動は、正の化学走性（即ち、該薬剤または刺激が細胞にとって化学誘引である）と称され、一方で薬剤または刺激から離れる移動は負の化学走性（即ち、該薬剤または刺激は細胞にとって化学忌避である）と称される。従って、化学誘引(CA)および化学忌避(chemorepulsion)(CR)は薬剤または刺激の特性であると同時に、化学走性は細胞の特性である。
【０００４】
原核生物および真核生物の両方で、化学走性を起こす細胞は薬剤濃度の変化を感知するので、濃度勾配に沿って移動すると考えられている。
【０００５】
数種類の真核生物細胞について化学走性が生じることが公知である。免疫系では、ケモカイン（または化学走性サイトカイン）として公知である種類の生物薬剤が、化学走性をしばしば作動させる。
【０００６】
化学走性、および関連する現象であるケモキネシス（薬剤濃度に関わらず、化学薬剤または生物薬剤に応答するランダムな細胞移動の促進）が、哺乳動物細胞の亜集団中で調べられている。しかし、化学忌避は、生理学的な現象としてほとんど記載されていない。一例において、ケモカインSDF-1(別名SDF-1α、CXCL12)が、2次元移動装置の状況で化学忌避因子(chemorepellent)として記載されており、同じ装置で化学誘引の誘導に必要な濃度よりも10倍の濃度で記載されている。観察上、「免散走性(fugetaxis)」と称される、SDF-1がアレルギー誘導する応答は、化学忌避に類似しているように思われ、「免散走性」は当該技術分野で公知である。しかし、「免散走性」が真に化学忌避と異なっているかどうかは明らかではない。
【０００７】
さらに、非ケモカイン生物薬剤または化学薬剤に応答する免疫細胞の化学忌避は、今まで記載されていなかった。
【０００８】
細胞遊走の基礎にある機構の全体的な理解によって、細胞遊走に関連する障害の治療のための療法の開発が促進される。
【発明の概要】
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、遊走細胞の方向および／または移動、あるいは細胞遊走を調節する方法を提供する。以前に化学忌避因子として当該技術分野で同定されていなかった非ケモカイン等の化学忌避因子を本明細書に開示する。
【００１０】
別の態様において、化学忌避因子としてのケモカイン薬剤および非ケモカイン薬剤の同定方法および確認方法が開示される。
【００１１】
本発明の別の局面によれば、化学忌避(chemorepulsive)剤を分泌する細胞の同定方法が提供される。
【００１２】
別の態様において、本発明は、免疫、炎症または癌の表現型に関わる一次細胞の移動を改変するまたは該移動に影響を及ぼすユニモーダル(unimodal)逸散因子(fugetaxin)の同定に関する。
【００１３】
本発明の別の局面によれば、免疫細胞の遊走移動を調節する方法が提供される。調節は、動物もしくは被験体における特定の位置もしくは部位に進むものであり得るか、または動物もしくは被験体における特定の位置もしくは部位から離れるものであり得る。
【００１４】
本発明の別の局面によれば、化学忌避剤をスクリーニングするハイスループット遊出アッセイが提供される。一般的に、この方法は、化学忌避因子であると思われる薬剤と遊走を誘導し得る細胞とを接触させる工程、細胞の移動を測定する工程を含み、薬剤から離れる細胞の移動は化学忌避を示す。
【００１５】
本発明の別の局面によれば、被験体における腫瘍部位への内皮細胞の遊走を阻害する方法が提供される。該方法は、治療の必要がある腫瘍部位の周囲領域に、被験体における腫瘍部位への内皮細胞の遊走を阻害するのに有効な量の有効(validated)化学忌避因子を局所投与する工程を含む。特定の態様において、腫瘍部位の周囲領域は、腫瘍部位に対して隣接していない。
【００１６】
本発明の一局面によれば、被験体における腫瘍細胞の転移を阻害する方法が提供される。該方法は、治療の必要がある被験体における腫瘍部位に、被験体における腫瘍部位からの腫瘍細胞の転移を阻害するのに有効な量の有効化学忌避因子のアゴニストまたはアンタゴニスト薬剤を局所もしくは全身的のいずれかで接触または投与する工程を含む。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の局面、ならびに様々な利点および有用性は、本発明の図面および詳細な説明の態様を参照してより明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、好中球およびリンパ球のガレクチン-3に対する化学走性応答の棒グラフである。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、ガレクチン-3抗体を用いた好中球およびリンパ球のガレクチン-3に対する化学走性応答の阻害を示す棒グラフである。
【図３】図３は、様々な濃度(μｇ／ｍｌ)のSDF-1、IL-8、ガレクチン-3およびバチルス  サブチリスのLTAに対する好中球の化学走性応答を比較する棒グラフである。各薬剤に対する最初の4つのバーは正の化学走性を示すが、次の4つのバーは負の化学走性を示す。
【図４】図４は、様々な濃度(μｇ／ｍｌ)のLPS、HSP-40、およびHSP-65に対する好中球の正および負の化学走性応答を比較する棒グラフである。各薬剤に対する最初の4つのバーは正の化学走性を示すが、次の4つのバーは負の化学走性を示す。
【図５】図５は、細胞遊走の解析のためのハイスループットスクリーニング装置である。
【図６】図６は、負の化学走性の解析のためのウェル配置である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明の態様の記載は以下の通りである。
【００２０】
本発明は、化学忌避因子として機能し得る薬剤の予期しない発見に関連し、ほとんどはGPCRによって作用が媒介されるケモカインまたは他のタンパク質とは関連していない。また、新しく発見された化学忌避因子は、ケモカイン起源であり、化学忌避因子として以前に認識されていない薬剤を含むものである。新規の化学忌避因子の他に、本発明者らはいくつかのユニモーダル逸散因子をさらに同定した。
【００２１】
また、本明細書には化学忌避因子の同定方法、および遊走細胞に対する影響をアゴナイズおよびアンタゴナイズする方法、化学忌避因子を含む医薬組成物ならびに化学忌避因子を分泌する細胞の同定のためのアッセイが開示される。
【００２２】
本発明の目的は、所望の方向に移動するように、ヒト遊走細胞を誘導する、誘発するまたは反応させる薬剤を同定および／または単離することである。「所望の方向」とは、部位もしくは場所から離れるまたは部位もしくは場所に進むものであろうと任意の方向を意味し、移動は疾患状態または状況の改善、減少、改善、予防、治療または緩和に寄与する治療に関連するものである。最も関心がある遊走細胞は、癌、免疫または炎症のプロセスに関与するものを含むが、任意の疾患状態または状況で役割を果たすと同定されたものを含み得る。
【００２３】
化学忌避因子
「化学忌避因子」は、遊走性真核生物細胞において負の化学走性（薬剤または刺激から離れる移動）を誘導する、誘発するまたは反応させる薬剤または刺激である。本明細書で使用されるように、用語「誘導する」、「誘発する」および「反応させる」は、化学忌避因子の化学忌避活性を示す場合、同じ意味を有する。化学忌避因子は「化学忌避」をもたらすまたは「化学忌避活性」を有すると言われている。「有効化学忌避因子」は、少なくとも10倍の濃度変化に対して1.2以上の忌避指数(repellent index)を示す薬剤である。「忌避指数」（RI）は、細胞が示し得る任意の自発的移動に関して薬剤が細胞の化学忌避を誘導する能力の測定である。薬剤の忌避指数は、自発的移動(SM)に対する化学忌避(CR)の比、即ち、[(CR)/(SM)]である。自発的移動は、薬剤を添加しないで生じる移動の量である。
【００２４】
本明細書で使用されるように、用語「薬剤」とは、一般的に任意の化合物のことをいう。本発明の状況におけるかかる化合物は、化学忌避活性を有すると思われる化合物または薬物もしくは他の治療物質のような既知の化合物であり得る。また、薬剤は、化学忌避因子、有効化学忌避因子または有効ならし化学忌避因子のアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【００２５】
本明細書で使用されるように、用語「刺激」とは、系で応答を生じるまたは引き起こす任意の物理的または化学的キューのことをいう。従って、薬剤はまた、刺激として機能し得る。
【００２６】
本発明の方法を用いて同定された化学忌避因子は、遊走細胞と接触すると、細胞の遊走を空間的または時間的に調節するように作用し得る。本明細書で使用されるように、用語「接触する」または「接触している」は、他のものに対して少なくとも１つの影響を可能にするように近接して、2つの部分または2つのものを接触させるまたは一緒にする行為を意味する。該定義は、物理接触を含むが、これに限定されない。
【００２７】
本明細書で使用されるように、句「空間的に細胞遊走を調節する」とは、被験体の特定の場所、特に移動後の被験体の同じ１つまたは複数の細胞の場所に関する被験体の１つまたは複数の細胞の場所に関して、同じ複数の細胞のある細胞または集団の移動を改変することをいう。
【００２８】
本明細書で使用されるように、句「時間的に細胞遊走を調節する」とは、特に１つまたは複数の細胞が移動するように誘導される速度に関して、時間の経過に対して同じ複数の細胞のある細胞または集団の移動を改変することをいう。
【００２９】
本発明によって化学忌避因子として同定および／または有効薬剤は、任意の経路または機構による化学忌避をもたらすように作用し得る。該薬剤は表面レセプターに結合し得る。表面レセプターとしては、限定されないが、Gタンパク質共役型レセプター；Toll様レセプター、サイトカインおよびケモカインレセプター、T細胞レセプター、ニューロピリンレセプター、腫瘍壊死因子レセプター、成長因子レセプター、イオンチャンネル、イオンポンプおよびポーリンが挙げられる。
【００３０】
薬剤は、結合すると、インターナリゼーションされ得るか、または細胞の表面に留まり得る。
【００３１】
薬剤は、細胞内環境で第二メッセンジャーまたは可溶性リガンドのような物質または生物因子と相互作用し得、次に化学忌避因子の効果を細胞に変換し続けて細胞の移動に影響を及ぼす。
【００３２】
化学忌避活性は、本明細書に記載されるハイスループット遊出アッセイ（実施例参照）などの、任意の遊出系を用いて検出され得る。また、当該技術分野で周知の様々な他の系を使用することができる（例えば、米国特許第5,514,555号、「Assays and therapeutic methods based on lymphocyte chemoattractants」）。
【００３３】
化学忌避因子の供給源
化学忌避因子は、均一および不均一な培養細胞集団などの様々な細胞から同定され得、様々な供給源に由来し得る。細胞は任意の型または起源であり得る。化学忌避因子は、健常または疾患組織の細胞から単離され得る。本明細書で使用されるように、「疾患組織または器官」としては、健康の障害または異常な機能の状態を有するまたは有すると思われる組織または器官が挙げられる。また、化学忌避因子は、免疫寛容組織から単離され得るか、または免疫寛容組織に関連する状態を治療するために使用され得る。「免疫寛容」組織は、免疫細胞が寛容である組織であり、限定されないが、脳組織、中枢神経系組織、精巣、眼または胎盤が挙げられる。
【００３４】
また、化学忌避因子は、１種以上の生体液から単離され得る。生体液としては、限定されないが、滑液、脳脊髄液、ファローピウス管液、精液、眼液、心膜液、胸膜液、炎症滲出物、溶出液、溶解物、および腹水が挙げられる。本明細書に開示される任意の遊走細胞が、化学忌避因子の供給源でもあり得ることが理解される。
【００３５】
遊走細胞
本明細書で使用されるように、「遊走細胞」は、刺激に応答してある場所から別の場所に移動し得る細胞である。本発明の同定されたおよび／または有効化学忌避因子によって遊走が媒介される細胞の好ましい型としては、限定されないが、免疫細胞、例えば、単球、ナチュラルキラー(NK)細胞、樹状細胞（未成熟または成熟であり得る）、一部の樹状細胞、例えば骨髄、形質細胞様（リンパ球様とも呼ばれる）またはランゲルハンス；マクロファージ、例えば組織球、クップファー細胞、肺胞マクロファージまたは腹腔マクロファージ；好中球、好酸球、肥満細胞、好塩基球；B細胞、例えば血漿B細胞、メモリーB細胞、B-1細胞、B-2細胞；CD45RO（ナイーブT）、CD45RA（記憶T）；CD4 ヘルパーT細胞、例えば、Th1、Th2およびTr1/Th3；CD8細胞傷害性T細胞、調節性T細胞およびガンマデルタT細胞が挙げられる。
【００３６】
細胞は、多くの適切な器官または組織から容易に得られ得、限定されないが、皮膚、肝臓、すい臓、脂肪、骨髄、リンパ節、胸腺、腎臓、結腸および脳が挙げられる。
【００３７】
細胞は、「造血起源」であり得、限定されないが、多能性幹細胞、多能性前駆細胞および／または特定の造血系譜に運命決定された前駆細胞が挙げられる。特定の造血系譜に運命決定された前駆細胞は、T細胞系譜、B細胞系譜、樹状細胞系譜、好中球系譜、ランゲルハンス細胞系譜および／またはリンパ様組織特異的マクロファージ細胞系譜であり得る。造血細胞は、組織に由来し得、例えば、骨髄、末梢血液(例えば、移動した末梢血液)、臍帯血、胎盤血液、胎児肝臓、胚細胞（例えば、胚性幹細胞）、大動脈−性腺−中腎由来細胞、およびリンパ様軟組織である。リンパ様軟組織としては、胸腺、脾臓、肝臓、リンパ節、皮膚、扁桃およびパイアー斑が挙げられる。他の態様において、「造血起源」細胞は、前記の細胞のいずれかのインビトロ培養、特に前駆細胞のインビトロ培養に由来し得る。
【００３８】
神経起源の細胞としては、ニューロンおよびグリア、および／または中枢および末梢神経組織の両方の細胞が挙げられる。
【００３９】
上皮起源の細胞としては、体のあらゆる表面を覆い、かつ該表面に沿って並ぶ組織の細胞が挙げられる。かかる上皮組織としては、皮膚および感覚器官の細胞、ならびに血管、胃腸管、気道、肺、腎臓および内分泌器官の管に並んだ特殊化し細胞が挙げられる。
【００４０】
間充織起源の細胞としては、コラーゲン、ビメンチンおよびフィブロネクチンのような典型的な線維芽細胞マーカーを発現する細胞が挙げられる。
【００４１】
脈管形成に関与する細胞は、血管形成に関わる細胞であり、内皮起源の細胞および間充織起源の細胞を含む。
【００４２】
生殖細胞は、半数体配偶子を生じるような特殊化した細胞である。生殖細胞は、幹細胞よりもさらに分化した細胞であり、より分化した生殖系列細胞をなお生じ得る。
【００４３】
本発明によれば、無血清ならし培地から単離される化学忌避因子を同定する方法が提供される。ならし培地としては、限定されないが、化学忌避因子を分泌する細胞が少なくとも24時間増殖または維持された任意の無血清増殖培地；癌を有する患者から回収された腹水；化学忌避因子が発現もしくは合成された細胞の溶解物または他の生体液が挙げられる。生体液としては、限定されないが、滑液、脳脊髄液、ファローピウス管液、眼液、心膜液、胸膜液、炎症滲出物が挙げられる。化学忌避因子は、細胞培養ならし培地としても公知の、細胞培養上清に由来する不均一な溶液から単離され得る。小さな規模で、ならし培地は培養フラスコ、プレートおよびディッシュに含まれ得る。大きな規模で、発酵器のような培養容器が使用され得る。また、3次元多孔性マトリックス中の培養も使用され得る。全ての態様において、ならし培地に存在する化学忌避因子は細胞培養物の遠心分離で除去されて細胞を除去し得、アスピレーションして細胞を満たす溶液を充填する。また、培養物は濾過されて細胞および細胞屑を除去し得る。ならし培地中の化学忌避因子は、標準のクロマトグラフィー法に従って分画されて化学忌避因子の単離を容易にし得る。当業者は、限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、FPLC、HPLC、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー等を含む方法に精通している。
【００４４】
好ましい態様において、ならし培地の一部は、次に免疫細胞を忌避させるために使用される。
【００４５】
本発明の別の局面によれば、化学忌避剤を分泌する細胞を同定する方法が提供される。該方法は、腫瘍もしくは他の疾患状態に由来する哺乳動物細胞の培養物または細菌、ウイルスもしくは真菌細胞の培養物を調製する工程、培養物から化学忌避剤を含むと思われる上清を単離する工程、化学忌避活性を有する多数の画分に上清を分画する工程、ならびに画分から離れる細胞の移動を測定する工程を含む。前記態様のいずれかにおいて、多数の画分は希釈され得ないかまたは濃縮され得る。細胞分泌物は、１種以上の推定の化学忌避因子を含み得るかまたは混合物、アリコートまたはそこからプールされた画分であり得る。
【００４６】
陽性画分から単離された薬剤は、標準方法または化学もしくは電気化学断片化と合わせた質量分析器によって画分をタンパク質配列決定に供することをさらに特徴とし得る。このように得られた任意の化学情報は、既存のタンパク質、ポリペプチド、糖質、脂質、またはこれらの組み合わせに対するホモロジーのためのデータベースを用いてスクリーニングされ得る。あるいは、陽性画分を使用して化学忌避因子を認識する抗体を作製し得る。かかる抗体は次に、発現クローニングプロトコール、ウエスタンブロット、およびならし培地からの化学忌避因子の単離に有用な他の技術に使用され得る。
【００４７】
他の態様において、化学忌避因子は、腫瘍細胞培養上清、腫瘍細胞溶出液および／または腫瘍細胞溶解物中に存在する。腫瘍細胞は、免疫認識を回避すると考えられる癌または腫瘍型であり得る。
【００４８】
かかる癌は、以下の起源；胆汁管癌；脳の癌、例えば神経膠芽細胞腫および髄芽細胞腫；乳癌；頸部癌；絨毛上皮腫；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌、胃癌；血液学新形成、例えば急性リンパ球および骨髄性白血病；多発性骨髄腫；AIDS関連白血病および成人T細胞白血病リンパ腫；上皮内新形成、例えばボーエン病およびパジェット病；肝臓癌（肝癌）；肺癌；リンパ腫、例えばホジキン病およびリンパ球性リンパ腫；神経芽細胞腫；口腔癌、例えば扁平上皮細胞癌；卵巣癌、例えば上皮細胞、ストローマ細胞、生殖細胞および間充織細胞から生じるもの；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫、例えば平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫；皮膚癌、例えばメラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮細胞癌；精巣癌、例えば生殖器腫瘍（精上皮腫、非精上皮腫[奇形腫、絨毛上皮腫]）、間質腫瘍および生殖細胞腫瘍；甲状腺癌、例えば甲状腺腺癌および髄質癌；ならびに腎臓癌、例えば腺癌およびウイルムス腫瘍であり得る。重要な態様において、免疫認識を回避する癌または腫瘍としては、グリオーマ、結腸癌、結腸直腸癌、リンパ球様細胞由来白血病、絨毛上皮腫およびメラノーマが挙げられる。
【００４９】
他の態様において、化学忌避因子は微生物によって分泌または提示される。微生物とは、DNAまたはRNAベースであろうと、グラム陽性細菌もしくはグラム陰性細菌、真菌、例えば酵母またはカビ、ウイルスを意味する。
【００５０】
化学忌避因子の同定および確認
可能性のある化学忌避因子の供給源が、選ばれた遊走細胞集団における呼びかけまたは調査について同定されると、次に化学走性の可能性を有する細胞の移動が高密度またはハイスループット遊走装置で測定される。「高密度」とは、上部チャンバー、ポリカーボネートまたはポリエステル平面膜および下部チャンバーを含む96または384ウェル装置を意味する（実施例９を参照）。簡単に、細胞懸濁液を平面膜上の上部チャンバーに入れて、種々の濃度の化学忌避因子を遊走装置の上部ウェルに添加して細胞が遊走するように誘導される（図5〜6参照）。遊走時間の後に、遊走装置が分解されて、細胞溶解物および化学発光剤を下部（即ち、遊走）チャンバーに添加して、下部プレート中の液体を、アスピレーションして発光測定に適切な白色96または384ウェルプレートへの送達または遠心分離のいずれかによって回収する。遠心分離のために、下部チャンバーのプレートは、発光の測定に適切な白色読み取りプレートに全ての液体溶液を遠心移送するための漏斗デバイスと適合される。どの方法を使用するかに関わらず、白色読み取りプレートを暗所で10分間軌道状に振って、自動化プレートローダーに負荷し、発光の測定に適切なデバイス中でウェル毎に読み取る。あるいは、遊走プレート中の細胞は、蛍光マーカーで染色され得、アスピレーションまたは遠心分離によって黒色読み取りプレートに移送され、蛍光測定に適切なデバイス中でウェル毎に蛍光を読み取り得る。任意のウェルへの細胞の遊走を、試験されるまたは推定の化学忌避因子に曝露されていない細胞の遊走と比較して、忌避指数を算出する。
【００５１】
「忌避指数」(RI)は、細胞自体の任意の自発的遊走に関して薬剤が細胞の化学忌避を誘導する能力の測定である。自発的遊走は、任意の薬剤を添加せずに測定されるが、ケモキネシスとは、薬剤の存在下での遊走のことをいい、該薬剤は細胞を置く膜の上および下で等しい濃度である。細胞は膜孔から出る場合、デバイスは垂直であり細胞が膜から脱着するので、本発明の装置はケモキネシスを測定することができないことに注意する。従って、細胞は平衡に達することができず、ケモキネシスは測定することができない。
【００５２】
薬剤の忌避指数は、薬剤によって誘導される自発的遊走(SM)に対する化学忌避(CR)の比、即ち、[(CR)/(SM)]である。「有効化学忌避因子」は、少なくとも10倍の濃度変化に対して1.2以上の忌避指数を示す薬剤である。例えば、薬剤のRIを算出する際に、化学忌避(CR)および自発的遊走(SM)を含む遊走応答が、数十倍または対数スケールの濃度に対して測定され得る。少なくとも10倍異なる濃度での任意の2つの連続的測定に対して、2つの連続的測定のそれぞれでのSMに対するCRの比が1.2以上である場合、薬剤は有効化学忌避因子とみなされる。
【００５３】
１種以上の化学忌避因子を分泌する細胞の同定および１種以上の化学忌避因子を含み得る溶液中の化学忌避因子の同定を含む研究のために、指数は信頼性のある統計交差実験分析を可能にするように開発されている。
【００５４】
「遊走指数」(MI)は、哺乳動物の培養細胞からの分泌物またはそこからの回収画分のいずれかである推定の化学忌避剤の混合物が、細胞中で誘導し得る任意の自発的移動に関して細胞の化学忌避を誘導する能力の測定である。混合物の遊走指数は、無血清培地自体が化学忌避を誘導する能力に関して推定の化学忌避剤の混合物に観察される化学忌避(CR)の比として計算され（即ち、CRは細胞が存在するインキュベーション培地によって誘導される自発的遊走(SM）に対して正規化される)、[(CR)/(SM)]として表される。本明細書で使用される場合、用語「混合物」は、ならし培地アッセイおよび系からの化学忌避因子の同定を含む研究を示す場合、溶液、細胞上清、単離物、組織滲出物、不均一溶液、および画分、アリコートまたはそれらの一部を含む。
【００５５】
化学忌避因子のアゴニストおよびアンタゴニスト
化学忌避因子が同定されると、化学忌避因子は上記の技術を用いて確認され得る。いくつかの状況において、治療組成物としての化学忌避因子自体の使用は最適ではない場合があることがさらに企図される。例えば、非常に大きなタンパク質が化学忌避因子として同定される場合、治療剤としてその部分を開発することは適していない。しかし、遊走応答を誘発するタンパク質の領域、エピトープまたは断片の同定、および化学忌避剤のアゴニストまたはアンタゴニストの設計が有利である。次に、これらのアゴニストおよびアンタゴニストは医薬用途においてまたは医薬組成物として使用され得、これらは、病因の構成要素として細胞遊走の異常な制御もしくは調節と関連するまたは該制御もしくは調節によって生じるまたは該制御もしくは調節を有する疾患指示もしくは状態を軽減し、予防し、治療しまたは治すために被験体に投与され得る。本明細書で使用されるように、用語「軽減する」は状態を良好にすることまたはより寛容にすることを意味する。
【００５６】
また、化学忌避因子として機能し、特定の疾患状態で化学忌避因子として機能することがこれまでに公知ではない薬剤の存在の同定は、マーカーとしてまたは診断用途において役立ち得る。結果的に、本発明は、化学忌避因子として機能する薬剤の分泌、発現または提示のための組織、細胞および生物試料のスクリーニングを包含する。
【００５７】
同定された化学忌避剤は、ポリペプチド、核酸ベースであり得、限定されないが、糖質、脂質等を含む任意の翻訳後部分で修飾され得る。アゴニストおよびアンタゴニストは、同定または有効化学忌避因子と同じ種類の分子である必要はない。例えば、ポリペプチドのアンタゴニストは、低分子、抗体、アプタマー、アドネクチンまたは同定された薬剤の化学忌避活性をアンタゴナイズする任意の薬剤であり得る。
【００５８】
化学忌避剤は、糖タンパク質、ペプチドグリカン、またはタンパク質-核酸コンジュゲートのようなハイブリッド分子であり得る。これらは、送達部分、安定化部分、または組成物の医薬特性もしくは診断特性を改善するもしくは促進する任意の他の部分のコンジュゲーションによって修飾され得る。
【００５９】
また、本発明によって、細胞表面レセプターなどの化学忌避因子と結合するタンパク質、脂質または糖質を単離することが可能とされる。化学忌避因子と結合するタンパク質、糖質および脂質は、例えば、細胞または培地由来混合物中の忌避物質の存在または非存在を検出するスクリーニングアッセイで使用され得る。また、結合するタンパク質、糖質または脂質は、単離された化学忌避因子の影響を阻害するために使用され得る。
【００６０】
従って、本発明は、例えば、化学忌避因子と選択的に結合する能力を有する抗体、またはその断片であり得る任意の結合薬剤を包含する。
【００６１】
治療の機会
炎症
遊走細胞の移動を調節することによって、細菌感染、組織損傷誘導炎症(虚血還流損傷)、結晶誘導炎症、補体誘導炎症および酸化ストレス（血液透析）、免疫複合体誘導炎症（抗体媒介糸球体腎炎）、サイトカイン誘導炎症（関節リウマチ）、抗好中球細胞質抗体および脈管炎（好中球成分に対する自己免疫）、好中球調節の遺伝的障害（遺伝性周期的熱症候群）、移植関連炎症、および嚢胞線維症等の、状態における炎症応答を妨げるまたは減少することができると考えられる。
【００６２】
別の態様において、本発明は、炎症の部位への免疫細胞の遊走を阻害する方法を提供する。「炎症」とは、外来(非自己)抗原および／または１つ（または複数）の組織の損傷または破壊によって誘発される局所的な保護応答のことをいい、外来抗原、損傷剤および／または損傷した組織を破壊するように作用する。「炎症応答」は、炎症損傷に対するヒト体による応答である。本明細書で使用されるように、「炎症損傷」は、炎症を誘発する任意の事象である。炎症は、組織がウイルス、細菌、外傷、化学物質、熱、寒さまたは任意の他の害がある刺激によって損傷する場合に生じる。かかる例では、T細胞、B細胞またはマクロファージのような免疫細胞は、炎症応答を媒介する細胞および可溶化産物（例えば、好中球、好塩基球、好酸球、キニンおよび凝固系および補体カスケード）と接触する。
【００６３】
また、炎症は自己抗原によって生じ得、治療の必要がある被験体は自己免疫疾患を有する。「自己免疫疾患」は、被験体の免疫系が自己の器官または組織を攻撃する場合にもたらされ、関節リウマチ、ブドウ膜炎、インスリン依存性真性糖尿病、溶血性貧血、リウマチ性熱、クローン病、ギヤン−バレー症候群、乾癬、甲状腺炎、グレーブス病、重症筋無力症、糸球体腎炎、自己免疫肝炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス等のような疾患によって例示される、該組織の破壊と関連する臨床状態を生じる。本明細書で使用されるように、「免疫応答」は、外来物質の導入に対して体を防御するヒトおよび高等動物における生理学的応答を意味する。前記状態のいずれかにおける炎症の選択部位または領域への免疫細胞の遊走の阻害は、これが炎症応答の上昇を阻害し、「自己損傷」に関わる特定の部位を保護するために、有益である。
【００６４】
癌
本発明の別の局面によれば、被験体における腫瘍部位への内皮細胞の遊走を阻害する方法が提供される。該方法は、治療の必要がある腫瘍部位の周囲領域に、被験体における腫瘍部位への内皮細胞の遊走を阻害するのに有効な量の有効化学忌避因子を局所投与するまたは接触させる工程を含む。また、有効化学忌避因子のアンタゴニストは、腫瘍部位もしくは位置に投与され得るかまたは腫瘍部位もしくは位置と接触させ得る。特定の態様において、腫瘍部位の周囲領域は、腫瘍部位に対して隣接していない。
【００６５】
本発明の一局面によれば、被験体における腫瘍細胞の転移を阻害する方法が提供される。該方法は、治療の必要がある被験体における腫瘍部位に、被験体における腫瘍部位からの腫瘍細胞の転移を阻害するのに有効な量の有効化学忌避因子、模倣物、アゴニストまたはアンタゴニスト薬剤を接触させるまたは局所もしくは全身的のいずれかで投与する工程を含む。
【００６６】
免疫不全
本発明のさらに別の局面によれば、選択部位を含む状態を有する被験体における免疫応答を高める方法が提供される。該方法は、治療の必要がある被験体における選択部位に、被験体における免疫細胞特異的な化学忌避を阻害するのに有効な量の化学忌避因子のアンタゴニストを局所もしくは全身的のいずれかで投与するまたは接触させる工程を含む。
【００６７】
避妊／不妊／早産
本発明の別の局面によれば、避妊の方法が記載される。該方法は、被験体における生殖細胞の遊走を阻害するのに有効な量の有効化学忌避因子のアンタゴニストを投与する工程を含む。
【００６８】
本発明の別の局面によれば、不妊および早産を治療する方法が提供される。該方法は、被験体において免疫細胞が生殖細胞の近くに遊走することを阻害するのに有効な量の有効化学忌避因子を投与する工程を含む。さらなる態様において、投与は、被験体の生殖細胞を含む部位に対して局所的である。
【００６９】
物質表面
一態様において、本発明の薬剤、化合物もしくは医薬組成物のいずれかが、被験体もしくは患者における特定の部位、場所、組織、器官、移植片もしくはグラフトへの細胞遊走の方向またはこれらからの細胞遊走の方向を調節する必要を特徴とする状態の治療に使用され得る。
【００７０】
一態様において、本発明の組成物はまた、移植片、包埋物のような非生物物質、細菌浸潤の領域もしくは部位、または生物起源でないデバイス(物質表面)、例えば、ピン、スクリュー等のような整形用途に使用されるもの、または例えばペースメーカー、バルブ、ステント等のような心臓血管用途もしくは歯科用途に使用されるものから離れる細胞の移動を指示する、誘発する、誘導するまたは引き起こすことができる。この局面において、有効化学忌避因子または模倣物またはアゴニストによって、免疫細胞を忌避する有効量で物質表面が被覆される。化学忌避因子に加えて、該物質は、細胞増殖増強剤、抗感染剤および／または抗炎症剤で被覆され得る。
【００７１】
本発明の組成物および方法は、正常な身体機能または治癒に干渉し得る細胞の凝集、細胞分泌または細胞浸潤を妨げる、減少するまたは排除することが望ましい任意の状態に有用であり得ることを当業者は理解しよう。本発明から得られた知識を使用することで、かかる化学忌避因子のアンタゴニストの使用によって細胞の化学忌避を調節することができ、それによって、他の場合では忌避されるであろう細胞の移動を進行させることができる。
【００７２】
本発明の好ましい態様は、本明細書に開示される方法によって同定および／有効化学忌避因子を用いて免疫細胞または免疫起源の細胞の化学忌避性の移動を誘発する、誘導するまたは引き起こすことである。
【００７３】
特定の態様において、本発明は、１種以上の有効化学忌避因子を被覆、含浸または注入した心臓血管ステントを提供する。かかる被覆ステントは、薬物の高い細胞取り込みをもたらし得るので、血管平滑筋細胞(VSMC)の生存が低く、先行技術の心臓血管ステントと比べて再狭窄を妨げる点で良好の効果を保持する。
【００７４】
医薬組成物
本発明の別の局面によれば、被験体における選択部位への免疫細胞の遊走を阻害する方法が提供される。該方法は、治療の必要がある被験体における選択部位に、部位からの免疫細胞の化学忌避を引き起こす、誘発する、高める、誘導するのに有効な量の化学忌避剤を局所または全身的のいずれかで投与する工程を含む。本明細書で使用されるように、「化学忌避剤」としては、化学忌避因子、有効化学忌避因子、化学忌避因子または有効化学忌避因子の模倣物、および化学忌避因子のアゴニスト等が挙げられる。
【００７５】
あるいは、化学忌避因子のアゴニストは、効果の増大のために投与され得る。かかるアゴニストは特定の薬物動態学特性または薬理学特性のために化学忌避因子に対して好ましくあり得る。
【００７６】
一態様において、化学忌避因子の有効用量は、結合定数に基づいて計算され得る。本発明の薬剤は、標的に対して1〜10nM、好ましくは3〜7nM、より好ましくは4〜5nMの結合定数を示すことが予測される。さらに結合定数は標的に対しておよそ5nMであり得る。
【００７７】
特定の態様において、化学忌避因子および化学忌避因子を含む医薬組成物が、第二薬剤（例えば、別の化学忌避因子またはそれ自体化学忌避因子ではない任意の薬物または薬剤と共に）と同時投与され得る。同時に投与される薬剤は、協調的、付加的、または相乗的に作用し得る。同時に投与される薬剤、化合物、化学忌避因子または治療剤は、正確に同時に投与される必要はない。特定の態様によれば、化学忌避剤は、実質的に同時に投与される。「実質的に同時に」とは、化学忌避因子が、第二薬剤の投与の前、第二薬剤の投与と同時および／または第二薬剤の投与の後に、投与されることを意味する。
【００７８】
化学忌避剤、そのアンタゴニストまたはアゴニスト、およびその医薬組成物は、抗炎症剤、抗癌剤、抗感染剤、免疫療法剤（免疫抑制剤）または任意の治療化合物を含む任意の第二薬剤と同時投与され得る。
【００７９】
抗感染剤は、微生物の活動を減少させる薬剤または微生物を殺傷する薬剤であり、アズトレオナム；グルコン酸クロルヘキシジン；イミド尿素；リセタミン；ニブロキサン；ピラズモナムナトリウム；プロピオン酸；ピリチオンナトリウム；塩化サンギナリウム；チゲモナムジコリン；アセダプソン；アセトスルホンナトリウム；アラメシン；アレキシジン；アムジノシリン；アムジノシリンピボキシル；アミサイクリン；アミフロキサシン；アミフロキサシンメシレート；アミカシン；アミカシンスルフェート；アミノサリチル酸；アミノサリチル酸ナトリウム；アモキシシリン；アンホマイシン；アンピシリン；アンピシリンナトリウム；アパルシリンナトリウム；アプラマイシン；アスパルトシン；アストロミシンスルフェート；アビラマイシン；アボパルシン；アジスロマイシン；アズロシリン；アズロシリンナトリウム；塩酸バカンピシリン；バシトラシン；バシトラシンメチレンジサリチル酸；バシトラシン亜鉛；バンバーマイシン（bambermycin）；ベンゾイルパスカルシウム；ベリスロマイシン；ベタミシンスルフェート；ビアペネム；ビニラマイシン；塩酸ビフェナミン；ビスピリチオンマグスルフェクス；ブチカシン；ブチロシンスルフェート；カプレオマイシンスルフェート；カルバドックス；カルベニシリン二ナトリウム；カルベニシリンインダニルナトリウム；カルベニシリンフェニルナトリウム；カルベニシリンカリウム；カルモナムナトリウム；セファクロール（cefaclor）；セファドロキシル；セファマンドール；セファマンドールナフェート；セファマンドールナトリウム；セファパロール；セファトリジン；セファザフルール(cefazaflur)ナトリウム；セファゾリン；セファゾリンナトリウム；セフブペラゾン；セフジニル（cefdinir）；セフェピム（cefepime）；塩酸セフェピム；セフェテコール；セフィキシム（cefixime）；塩酸セフィネノキシム(cefinenoxime)；セフメタゾール；セフメタゾールナトリウム；セフォニシドモノナトリウム；セフォニシドナトリウム；セフォペラゾンナトリウム；セフォラニド；セフォタキシムナトリウム；セフォテタン；セフォテタン二ナトリウム；塩酸セフォチアム；セフォキシチン；セフォキシチンナトリウム；セフピミゾール；セフピミゾールナトリウム；セフピラミド；セフピラミドナトリウム；セフピロムスルフェート；セフポドキシムプロキセチル；セフプロジル；セフロキサジン；セフスロジンナトリウム；セフタジジム；セフチブテン；セフチゾキシムナトリウム；セフトリアキソン(ceftriaxone)ナトリウム；セフロキシム；セフロキシムアクセチル(axetil)；セフロキシムピボキセチル；セフロキシムナトリウム；セファセトリルナトリウム；セファレキシン；塩酸セファレキシン；セファログリシン；セファロリジン；セファロチンナトリウム；セファピリンナトリウム；セフラジン；塩酸セトサイクリン；セトフェニコール；クロラムフェニコール；クロラムフェニコールパルミテート：クロラムフェニコールパントテネート錯体；コハク酸クロラムフェニコールナトリウム；クロルヘキシジンホスファニレート；クロロキシレノール；クロルテトラサイクリンビスルフェート；塩酸クロルテトラサイクリン；シノキサシン；シプロフロキサシン；塩酸シプロフロキサシン；シロレマイシン；クラリスロマイシン；塩酸クリナフロキサシン；クリンダマイシン；塩酸クリンダマイシン；パルミチン酸クリンダマイシン塩酸塩；リン酸クリンダマイシン；クロファジミン；クロキサシリンベンザチン；クロキサシリンナトリウム；クロキシキン；コリスチメテートナトリウム；コリスチンスルフェート；クメルマイシン(coumermycin)；クメルマイシンナトリウム；シクラシリン；シクロセリン；ダルフォプリスチン；ダプソン；ダプトマイシン；デメクロサイクリン；塩酸デメクロサイクリン；デメサイクリン；デノフンギン(denofungin)；ジアベリジン；ジクロキサシリン；ジクロキサシリンナトリウム；ジヒドロストレプトマイシンスルフェート；ジピリチオン；ジリスロマイシン；ドキシサイクリン；ドキシサイクリンカルシウム；ドキシサイクリンホスファテックス(fosfatex)；ドキシサイクリンヒクラート；ドロキサシンナトリウム；エノキサシン；エピシリン；塩酸エピテトラサイクリン；エリスロマイシン；エリスロマイシンアシストレート；エリスロマイシンエストレート；エリスロマイシンエチルスクシネート；エリスロマイシングルセプテート；エリスロマイシンラクトビオネート；エリスロマイシンプロピオネ−ト；エリスロマイシンステアレート；塩酸エタンブトール；エチオナミド；フレロキサシン；フロキサシリン；フルダラニン；フルメキン；ホスホマイシン；ホスホマイシントロメタミン；フモキシシリン；塩化フラゾリウム；酒石酸フラゾリウム；フシデートナトリウム；フシジン酸；ゲンタマイシンスルフェート；グロキシモナム；グラミシジン；ハロプロジン；ヘタシリン；ヘタシリンカリウム；ヘキセジン；イバフロキサシン；イミペネム；イソコナゾール；イセパミシン；イソニアジド；ジョサマイシン(josamycin)；カナマイシンスルフェート；キタサマイシン；レボフラルタドン；レボプロピルシリンカリウム；レキシスロマイシン；リンコマイシン；塩酸リンコマイシン；ロメフロキサシン；塩酸ロメフロキサシン；ロメフロキサシンメシレート；ロラカルベフ；マフェニド；メクロサイクリン；スルホサリチル酸メクロサイクリン；リン酸メガロミシンカリウム；メキドクス(mequidox)；メロペネム；メタサイクリン；塩酸メタサイクリン；メテナミン；馬尿酸メテナミン；メテナミンマンデレート；メチシリンナトリウム；メチオプリム；塩酸メトロニダゾール；リン酸メトロニダゾール；メズロシリン；メズロシリンナトリウム；ミノサイクリン；塩酸ミノサイクリン；ミリンカマイシンリドロクロライド；モネンシン；モネンシンナトリウム；ナフシリンナトリウム；ナリジクス酸ナトリウム；ナリジクス酸；ナタマイシン；ネブラマイシン；ネオマイシンパルミテート；ネオマイシンスルフェート；ネオマイシンウンデシレネート；ネチルミシンスルフェート；ニュートラマイシン；ニフラデン；ニフラルデゾン；ニフラテル；ニフラトロン；ニフルダジル；ニフリミド；ニフルピリノール；ニフルキナゾール；ニフルチアゾール；ニトロサイクリン；ニトロフラントイン；ニトロミド；ノルフロキサシン；ノボビオシンナトリウム；オフロキサシン；オルメトプリム；オキサシリンナトリウム；オキシモナム；オキシモナムナトリウム；オキソリン酸���オキシテトラサイクリン；オキシテトラサイクリンカルシウム；塩酸オキシテトラサイクリン；パルジマイシン；パラクロロフェノール；パウロマイシン；ペフロキサシン；ペフロキサシンメシレート；ペナメシリン；ペニシリンGベンザチン；ペニシリンGカリウム；ペニシリンGプロカイン；ペニシリンGナトリウム；ペニシリンV；ペニシリンVベンザチン；ペニシリンVヒドラバミン；ペニシリンVカリウム；ペンチジドンナトリウム；アミノサリチル酸フェニル；ピペラシリンナトリウム；ピルベニシリンナトリウム；ピリジシリンナトリウム；塩酸ピルリマイシン；塩酸ピバンピシリン；ピバンピシリンパモエート；ピバンピシリンプロベネート；ポリミキシンBスルフェート；ポルフィロマイシン；プロピカシン；ピラジンアミド；ピリチオン亜鉛；キンデカミンアセテート；キヌプリスチン；ラセフェニコール；ラモプラニン；ラニマイシン；レロマイシン；レプロマイシン；リファブチン；リファメタン；リファメキシル；リファミド；リファンピン；リファペンチン；リファキシミン；ロリテトラサイクリン；ロリテトラサイクリンニトレート；ロサラマイシン；ロサラマイシンブチレート；ロサラマイシンプロピオネート；リン酸ロサラマイシンナトリウム；ロサラマイシンステアレート；ロソキサシル；ロキサルソン；ロキシスロマイシン；サンサイクリン；サンフェトリネンナトリウム；サルモキシシリン；サルピシリン；スコパフンギン(scopafungin)；シソマイシン；シソマイシンスルフェート；スパルフロキサシン；塩酸スペクチノマイシン；スピラマイシン；塩酸スタリマイシン；ステフィマイシン；ストレプトマイシンスルフェート；ストレプトニコジド；スルファベンズ；スルファベンズアミド；スルファセタミド；スルファセタミドナトリウム；スルファシチン；スルファジアジン；スルファジアジンナトリウム；スルファドキシン；スルファレン；スルファメラジン；スルファメータ(sulfameter)；スルファメタジン；スルファメチゾール；スルファメトキサゾール；スルファモノメトキシン；スルファモキソール；スルファニレート亜鉛；スルファニトラン；スルファサラジン；スルファソミゾール；スルファチアゾール；スルファザメト；スルフィソキサゾール；スルフィソキサゾールアセチル；スルフィソキサゾールジオラミン；スルホミキシン；スロペネム；スルタミシリン；サンシリンナトリウム；塩酸タランピシリン；テイコプラニン；塩酸テマフロキサシン；テモシリン；テトラサイクリン；塩酸テトラサイクリン；リン酸テトラサイクリン錯体；テトロキソプリム；チアンフェニコール；チフェンシリンカリウム；チカルシリンクレシルナトリウム；チカルシリン二ナトリウム；チカルシリンモノナトリウム；チクラトン；塩化チオドニウム；トブラマイシン；トブラマイシンスルフェート；トスフロキサシン；トリメトプリム；トリメトプリムスルフェート；トリスルファピリミジン；トロレアンドマイシン；トロスペクトマイシンスルフェート；チロスリシン；バンコマイシン；塩酸バンコマイシン；バージニアマイシン；ゾルバマイシン；塩酸ジフロキサシン；ラウリルイソキノリニウムブロミド；モキサラクタム二ナトリウム；オルニダゾール；ペンチソマイシン；および塩酸サラフロキサシンが挙げられる。
【００８０】
抗癌剤としては、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロンアセテート；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタト(batimastat)；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビスアントレン；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシンスルフェート；ブレキナル(brequinar)ナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー(carbetimer)；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシレート；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；ドロモスタノロンプロピオネート；デュアゾマイシン；エダトレキセート；塩酸エフロリチン(
eflorithine hydrochloride)；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；インターフェロンα-2a；インターフェロンα-2b；インターフェロンα-n1；インターフェロンα-n3；インターフェロンβ-Ia；インターフェロンγ-Ib；イプロプラチニ；塩酸イリノテカン；ランレオチドアセテート；レトロゾール；ロイプロリドアセテート；塩酸リアロゾール；ロメトレキソル(lometrexol)ナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコル；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；メゲストロールアセテート；メレンゲストロールアセテート；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトジリン；マイトマルシン；ミトマイシン；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトザントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシンスルフェート；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポドフィロックス；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴル；塩酸サフィンゴル；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル(sulofenur)；タリソマイシン；タキソテレ(taxotere)；テコガランナトリウム；テガフル；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；塩酸トポテカン；クエン酸トレミフェン；トレストロンアセテート；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルリン(verteporlin)；ビンブラスチンスルフェート；ビンクリスチンスルフェート；ビンデシン；ビンデシンスルフェート；ビネピジンスルフェート；ビングリシネートスルフェート；ビンレウロシンスルフェート；酒石酸ビノレルビン；ビルロシジン(virlrosidine)スルフェート；ビンゾリジンスルフェート；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシンが挙げられる。
【００８１】
免疫抑制剤としては、アザチオプリン；アザチオプリンナトリウム；シクロスポリン；ダルトロバン；三塩酸グスペリムス；シロリムス；タクロリムスが挙げられる。
【００８２】
抗炎症剤としては、アルクロフェナク；アルクロメタゾンジプロピオネート；アルゲストンアセトニド；アルファアミラーゼ；アンシナファル；アンシナフィド；アンフェナクナトリウム；塩酸アミプリロース；アナキンラ；アニロラク；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；塩酸ベンジダミン；ブロメライン；ブロペラモル；ブデソニド；カルプロフェン；シクロプロフェン；シンタゾン；クリプロフェン；クロベタゾールプロピオネート；クロベタゾンブチレート；クロピラク；クロチカゾンプロピオネート；コルメタゾンアセテート；コルトドキソン；デフラザコート；デソニド；デスオキシメタゾン；デキサメタゾンジプロピオネート；ジクロフェナクカリウム；ジクロフェナクナトリウム；ジフロラゾンジアセテート；ジフルミドンナトリウム；ジフルニサル；ジフルプレドネート；ジフタロン；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド；エンドリゾン；エンリモマブ；エノリカムナトリウム；エピリゾール；エトドラク；エトフェナメート；フェルビナク；フェナモル；フェンブフェン；フェンクロフェナク；フェンクロラク；フェンドサル(fendosal)；フェンピパロン；フェンチアザク；フラザロン；フルアザコート；フルフェナム酸；フルミゾール；フルニソリドアセテート；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルオコルチンブチル；フルオロメトロンアセテート；フルカゾン；フルルビプロフェン；フルレトフェン；フルチカゾンプロピオネート；フラプロフェン；フロブフェン；ハルシノニド；ハロベタゾールプロピオネート；ハロプレドンアセテート；イブフェナク；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム;イブプロフェンピコノール；イロニダプ；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソール；イントラゾール；イソフルプレドンアセテート；イソキセパク；イソキシカム；ケトプロフェン；塩酸ロフェミゾール；ロルノキシカム；ロテプレドノールエタボネート；メクロフェナメートナトリウム；メクロフェナム酸；メクロリゾンジブチレート；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；メチルプレドニゾロンスレプタネート；モルニフルメート；ナブメトン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；塩酸パラニリン；ペントサンポリスルフェートナトリウム；フェンブタゾングリセレートナトリウム；ピルフェニドン；ピロキシカム；ピロキシカムシンナメート；ピロキシカムオラミン；ピルプロフェン；プレドナザート；プリフェロン；プロドリン酸(prodolic acid)；プロカゾン；プロキサゾール；プロキサゾールシトレート；リメキソロン；ロマザリト；サルコレクス(salcolex)；サルナセジン；サルサレート；塩化サンギナリウム；セクラゾン；セルメタシン；スドキシカム；スリンダク；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルメート；タロサレート；テブフェロン；テニダプ；テニダプナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テトリダミン；チオピナク；チキソコルトルピバレート(tixocortol pivalate)；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド；トリフルミデート；ジドメタシン；ゾメピラクナトリウムが挙げられる。
【００８３】
本明細書で使用されるように、被験体は動物である。動物としては、限定されないが、全ての霊長類(ヒトおよび非ヒト)、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、および任意の方法で本発明の化合物、薬剤または組成物を治療または療法として受けて有益であり得る任意の他の動物が挙げられる。また、被験体は、治療または予防が必要な患者であり得る。
【００８４】
ユニモーダル逸散因子の同定
一態様において、本発明は、これらの細胞を、ユニモーダル逸散走性リガンドまたはユニモーダル逸散因子、そのアゴニストまたはアンタゴニストと接触させることにより、かかる細胞の移動の制御のための方法を提供する。一態様において、ユニモーダル逸散因子はガレクチン-3である。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「逸散因子」は、細胞または細胞群において逸散走性を誘発する薬剤である。「逸散走性」は、ケモキネシス剤から離れようとする細胞の積極的移動と規定される。「ケモキネシス剤」は、任意の方向の細胞の移動を誘発する、きっかけとなる、または引き起こす任意の薬剤または刺激である。この意味において、逸散因子は、化学忌避因子と類似(すなわち、同じ)である。「ユニモーダル逸散因子」は、(1)任意の所定の用量の化合物によって誘発される化学走性(化学誘引性)応答と同等または大きい逸散走性応答を誘発する化合物;ならびに(2)該化合物によって誘発される逸散走性応答が逸散走性有効用量の該化合物によって誘発される化学走性応答より大きい場合の化合物である。「逸散走性有効用量」は、逸散因子から離れようとする細胞の移動を引き起こす、誘導するまたはきっかけとなる逸散因子の用量である。
【００８６】
本発明のこれらのユニモーダル逸散因子および方法は、自己免疫応答および種々の癌と関連する炎症および疾患または状態などを治療するために開発され得る。
【００８７】
本発明の化合物および方法はまた、白血球を制御し、種々の細胞型において新規な型の化学忌避因子分子(すなわち、ユニモーダル逸散因子)として作用することにより種々の癌を治療するために使用され得る。
【００８８】
本発明の一態様において、ユニモーダル逸散因子によって誘発される逸散走性応答は、急速開始で起こる。本明細書で使用される場合、「急速開始」は、治療後およそ1時間以内に測定可能な逸散走性または化学走性応答の生成と規定される。ある種の細胞型では、急速開始は、治療後の2、3または4時間だが通常5時間までに起こり得る。
【００８９】
一態様において、逸散走性有効用量は少なくとも10uMである。さらなる態様において、遊走細胞は好中球である。逸散走性有効用量は、少なくとも0.01uM〜0.1uM、0.1uM〜15uM、1uM〜15uM、2uM〜10uM、5uM〜8uMの範囲または好ましくは、0.1uM未満で生じ得ることが企図される。
【００９０】
本発明の別の局面によれば、免疫細胞、炎症細胞または癌細胞の遊走の改変方法が提供される。該方法は、かかる治療を必要とする被験体に、被験体において免疫細胞、炎症細胞または癌細胞の遊走を改変するための逸散走性有効用量のユニモーダル逸散因子を投与する工程または接触させる工程を伴う。投与は、本発明によれば、任意の経路、局所、全身性または経口によるものであり得る。
【００９１】
あるいは、免疫細胞、炎症細胞または癌細胞の遊走は、被験体にユニモーダル逸散因子のアンタゴニストを提供すること、またはかかる治療を必要とする被験体を該アンタゴニストと接触させることにより改変され得る。この態様において、ユニモーダル逸散因子の活性が減衰され、それにより免疫細胞、炎症細胞または癌細胞の逸散走性が阻害され得る。一態様において、ユニモーダル逸散因子アンタゴニストはガレクチン-3アンタゴニストである。
【００９２】
本発明によれば、ユニモーダル逸散因子アンタゴニストは、小分子、RNAまたはDNAのいずれかのアンチセンス化合物、siRNA、miRNA、アプタマー、抗体、ペプチドまたはペプチド断片、免疫細胞、炎症細胞または癌細胞に対するユニモーダル逸散因子の活性を干渉、排除、減衰、改変あるいは阻害する作用をする任意のものを含み得る。
【００９３】
別の態様において、該方法は、さらに、被験体に、ユニモーダル逸散因子、逸散走性剤、非逸散走性剤または他の治療用化合物とともに共投与する工程を含む。一態様において、逸散走性剤は、間質由来因子-1(sdf-1)であり得、非逸散走性剤としては、抗炎症剤および／または免疫抑制剤が挙げられ得、他の治療用化合物としては、以前に治療上の利益を有することが同定された任意の薬物または部分が挙げられ得る。
【００９４】
一態様において、被験体は自己免疫疾患を有する。一態様において、被験体は、炎症性疾患または状態を有する。一態様において、被験体は過剰増殖性状態を有する。一態様において、過剰増殖性状態は癌を含む。
【００９５】
本明細書で使用される標題のものは、いずれも本発明の任意の態様をいずれかの様式に限定すると解釈されることは意図されないことが理解されよう。
【実施例】
【００９６】
実施例1：トランスウェル(trans-well)遊走アッセイプロトコル
アッセイを開始する前に、0.5%ウシ胎児血清(FCS)を含むイスコブ改変ダルベッコ培地(IMDM)を調製し、氷上で保存する(アッセイ培地)。2×107細胞/mlの濃度の遊走細胞をアッセイ培地中に懸濁させる。ドナー血またはバッフィーコートから単離されたT細胞を、5%CO2中37℃でアッセイ培地中に一晩放置する。好中球、単球およびB細胞は、ドナー血またはヒト起源の他の供給源から精製されたらすぐに使用する。次いで、アッセイ培地中でリガンドの４つの連続(10×)希釈物を調製する(通常、10μg/ml〜0.01μg/ml)。
【００９７】
アッセイプレートNeuroprobe ChemoTx(部品番号106-5；5μm孔径)を白血球または顆粒球に使用する。培養細胞株(ジャーカット、Molt4、HL-60およびSupT-1など)には、部品番号106-8(8μm孔径)を使用する。好中球には、部品番号106-3(3μm孔径)を使用する。
【００９８】
プレートをパッケージから出し、膜を後ろ側にそのままにしておく。膜を取り分けておく。各ウェル内に31μlの溶液をピペッティングする。培地対照および逸散走性(化学忌避)試料には、アッセイ培地を使用する。化学誘引試料には、アッセイ培地中での薬剤の適切な希釈物を使用する。
【００９９】
滅菌針を用いて、各ウェル内に存在するすべての小泡を突き、膜を、プレート上に片側からゆっくりと他方の端を下ろして注意深くプレート上に配置する。
【０１００】
次いで、29μlを、ポリカーボネートまたはポリエステル膜上に刻印された各円形内にピペッティングする。培地対照および化学誘引試料には、アッセイ培地を使用する。逸散走性(化学忌避)試料には、アッセイ培地中のリガンドの適切な希釈物を使用する。
【０１０１】
上記の各29uLのアリコートに、2μlの細胞(40,000細胞)を添加する。開始する前に細胞が充分懸濁されていること、およびこれが混合されていることを確実にすることが重要である。この混合は、各添加間にチューブを攪拌することによって達成され得る。
【０１０２】
次いで、プレートを付属の蓋で覆い、5%CO2中37℃で、加湿インキュベーター内で1〜3時間インキュベートする。インキュベーション期間後、プレート上部の液体をティッシュまたは同様の吸取り材料(例えば、キムワイプ)で除去する。膜をプレート上部から注意深く除去し、廃棄する。30μlに設定したマルチチャネルピペッターを使用し、ウェルの内容物を白色マイクロプレート(Perkin-Elmer CulturPlate 96 #6005689)に移す。マルチチャネルピペッターを使用し、マイクロプレートの各ウェルを25μlのリン酸緩衝生理食塩水(Mediatech # 21-040-CV)ですすぎ、白色マイクロプレートの同じウェルに移す。マルチチャネルピペッターを使用し、50μlのCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega # G7572)を各ウェルに添加し、混合する。
【０１０３】
プレートの上部8mmの高さに設定したLarge Aperture Luminescenceを使用するPerkin Elmer Victor3Vプレートリーダーを用いて滞留時間1秒でプレートを読み、遊走した細胞数を定量した。
【０１０４】
実施例2：表現型スクリーニングプロトコル
懸濁細胞について、各フラスコ内の細胞の濃度を測定するために初期細胞カウントを行なう。必要とされる細胞の総数は少なくとも120×106である。細胞をペレット化し(500×g、10分間)、再懸濁し、１つの50mlファルコンチューブ内のハイブリドーマ無血清(HSF)培地(Gibco 12045)に合わせる。次いで、細胞を遠心分離および再懸濁によってHSF培地でさらに2回洗浄する。最後の洗浄後、細胞を再度ペレット化し、ペニシリン-ストレプトマイシン(ATCC 30-2300、1%-最終濃度100単位/ml-100μg/ml、HSF+PS)を添加したハイブリドーマ無血清(HSF)培地中に元の細胞カウントに対して3×106/mlの濃度まで再懸濁する。5ml(15×106細胞)を既に10mlのHSF+PSを含む各8つの25cm2フラスコに移す。
【０１０５】
付着細胞を8〜75cm2のフラスコ内でおよそ70〜90%コンフルエンスまで培養する。細胞をおよそ10mlのHSF+PSで2回すすぎ、30mlのHSF+PSで覆う。
【０１０６】
フラスコを37℃、5%CO2でインキュベートし、 フラスコの培養上清を種々の時点(インキュベーターに戻してから1時間後(第0日目)、24時間、48時間、72時間など7日間まで)で回収する。回収するためには、培養液を500×gで10分間遠心分離し、次いで、0.2μm Costarシリンジフィルター(カタログ番号8110)を用いて新しいチューブに濾過すべきである。各々250μlの多数のアリコートの保存はマイクロ遠心チューブ内に行なわれ得る。残留上清は、ファルコンチューブ内に保存され得る。すべての試料は-80℃で保存される。
【０１０７】
すべての上清を回収した後、遊出アッセイにおいて100%、10%および1%強度でリガンド試料として使用する。陽性対照(これは、間質由来因子-1(SDF-1)(0.1、1および10μg/ml)であり得る、およびHSF+PS陰性対照もまたアッセイにおいて実施されるべきである。
【０１０８】
実施例3：
ガレクチン-3へのヒト一次好中球、CD4+リンパ球およびCD8+リンパ球の遊走応答の定量
ガレクチン-3は、細胞の行動を制御するように滴定され得るユニモーダル逸散因子であることが見出された。各ガレクチン-1、2、3、5、7および8を、好中球、CD4+およびCD8+ Tリンパ球に対するその効果について、96トランスウェル遊走アッセイにおいて試験した。完全長ガレクチンタンパク質分子を異なる販売業者(Sigma、R&DおよびBio Vision)から購入した。
【０１０９】
アッセイは、ノイズを排除するため、および信号雑音比を増加させるために以下の変更を行なった以外は本明細書に記載の方法に従って行なった。
【０１１０】
まず、新鮮ヒト末梢血を精製開始前5分間以内に抜き出した。15ml円錐型チューブ内で、上面に重層された新鮮血5mlあたり5mlのPolymorph調製物(Axis Shield、Netherlands)を用いて好中球を単離した。次いで、血液を600×gで60分間遠心分離した。次いで、好中球を含有する下側のバンドを、パスツールピペットを用いて抽出した。細胞を0.45%NaClと1：1で混合し、500×gで10分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を50mlの1%ペニシリン-ストレプトマイシンIMDM(ATCC、Manassas、VA)で洗浄し、500×gで10分間スピンした。上清を除去し、ペレットを10mlの0.5%FCS、1%ペニシリン-ストレプトマイシンIMDMで洗浄した。細胞をカウントし、次いで、適切な容量で再懸濁した。5%CO2により37℃でアッセイを1時間から1時間半行なった。
【０１１１】
図1は、ガレクチン-3の試験の結果を示す。RUは、5μmの孔径を有するポリカーボネート膜を通ってトランスウェル(Neuro Probe、Gaithersburg、MD)の下側部分に遊走した細胞のCellTiter-Glo (Promega、Madison、WI)アッセイのルミネセンス単位である。ヒト一次好中球(A)、CD4+リンパ球(B)、またはCD8+リンパ球(C)を上側チャンバに添加した。逸散走性(化学忌避性)(FT、各グラフの右側)の場合、上側チャンバはまた、表示した濃度のガレクチン-3も含んだが、下側チャンバは培地を含んだ。化学走(化学誘引)(CT、各グラフの左側)では、上側チャンバは培地を含み、下側は表示した濃度のガレクチン-3を含んだ。培地対照は、両方のチャンバに培地のみを含んだ。
【０１１２】
データは、1時間目に測定した値を示す。この図は、ガレクチン-3が、10μg/mlの用量のアッセイにおいて逸散走性(化学忌避性)であることを示す。この図において、マイクロモル濃度のこの分子が、主に一方向の様式でいくつかの細胞型(好中球(neutophil)、CD4+およびCD8+ Tリンパ球)の移動を誘導し得ることが測定され、そのことがわかる。すべての3つの細胞型において、同じ期間で10μg/mlガレクチン-3により、誘引されるよりも2〜3倍多くの細胞が忌避される。出願人の知る限り、この効果は立証されたことがない。
【０１１３】
本明細書に記載し、図3および4に示したアッセイ方法によって行なった比較試験では、好中球を1時間目の他のリガンドに対する応答について調べた。
【０１１４】
図3には、10uMで、好中球が間質由来因子-1(sdf-1)およびリポテイコ酸(LTA)に対するその化学走性(化学誘引性)および逸散走性(化学忌避性)応答において同一に作用したことが示されている。また、好中球は、インターロイキン-8(IL8)への応答において逸散走性(化学忌避性)であるよりも2倍より多く化学走性(化学誘引性)であった。
【０１１５】
図4には、好中球が、ガレクチン-3への応答において化学走性(化学誘引性)であるよりもほぼ3倍逸散走性(化学忌避性)であり、熱ショックタンパク質65(HSP65)への応答において化学走性(化学誘引性)であるよりもほぼ2倍逸散走性(化学忌避性)であったことが示されている。また、図4には、10uMにおいて、好中球が、リポ多糖(LPS)へのその化学走性(化学誘引性)および逸散走性(化学忌避性) 応答において同一に作用したことが示されている。
【０１１６】
実施例4：ガレクチン-3へのヒト一次好中球、CD4+リンパ球およびCD8+リンパ球の遊走応答の確認：抗体試験
抗体阻害アッセイの結果を図2に示す。この図において、RUは、5μmの孔径を有するポリカーボネート膜を通ってトランスウェル(Neuro Probe、Gaithersburg、MD)の下側部分に遊走した細胞のCellTiter-Glo (Promega、Madison、WI)アッセイのルミネセンス単位である。ヒト一次好中球(A)、CD4+リンパ球(B)、またはCD8+リンパ球(C)を上側チャンバに添加した。培地対照は両方のチャンバにおいて培地のみを含んだ。a1からa100までの試料では、ウェルの上部チャンバおよび底部チャンバの両方が1、10または100μg/mlのガレクチン-3に対するモノクローナル抗体(BD Biosciences、San Jose、CA)を含んだ。CT1試料では、上側チャンバは、培地のみを含んだが、下側チャンバは1μg/mlのガレクチン-3を含んだ。FT10試料では、上側チャンバは10μg/mlのガレクチン-3を含んだが、下側は培地のみを含んだ。al、a10またはa100で標識したすべての試料において、抗体は、上側および下側チャンバの両方に表示した濃度で存在した。
【０１１７】
プロトコルは、上記のものと同じであり、系をガレクチン-3に対する抗体で刺激した。この図は、遊走する細胞の数が抗ガレクチン-3抗体の濃度の増加に伴って減少したことを示す。データは、ガレクチン-3の逸散走性(化学忌避性)効果が直接競合的様式で排除され得、実施例3において提案された機構を支持することを明白に示す。したがって、ガレクチン-3抗体は、ユニモーダル逸散因子アンタゴニストとしての機能を果たし得る。
【０１１８】
実施例5：他のユニモーダル逸散因子へのヒト一次好中球、CD4+リンパ球およびCD8+リンパ球の応答
上記の実施例3に記載の方法を用いて、他の化合物および／またはリガンドをユニモーダル逸散因子としての機能を果たす能力について試験した。表1に該化合物、ならびにヒト好中球、CD4+リンパ球およびCD8+リンパ球に対するその効果を示す。表中の「+」は、該特定の細胞型に関する、用語を本明細書において定義したユニモーダル逸散因子としての陽性ヒットを示す。薬剤がユニモーダル逸散因子の定義を満たしていなかったことを示すデータはない。
【０１１９】
2010521135.tif 000003
2010521135.tif 000004
2010521135.tif 000005
【０１２０】
実施例6：さらなる遊走試験
HL-60クローン15として知られるヒト骨髄性白血病細胞株に対応する細胞型EO-HL60を用いてさらなる遊走応答試験を行った。比較的少ないため好酸球の代理として、骨髄系細胞型から好酸球様細胞型への分化を引き起こすことが知られた化合物で処理しておいたこれらの細胞を利用した。
【０１２１】
以下の細胞型およびリガンドでの実験を、実施例1に記載のようにして行なった。報告された結果は、リガンドへの細胞の正味の観察された遊走応答を反映し、ユニモーダル逸散因子の定義に基づくものではない。
【０１２２】
HL60細胞(クローン15)を、American Type Culture Collection(ATCC、Manasas VA)から得た。未分化表現型の細胞を維持し、拡大するため、5%CO2で37℃の加湿インキュベーター内で、10%ウシ胎児血清、100I.U./ml ペニシリンおよび100ug/mLストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地中で細胞を培養した。好酸球様表現型(EO-HL60)への分化を誘導するため、0.5mMのn-酪酸と5ng/mlのGM-CSFを添加した以外は上記の培養条件を用いて、細胞を新しいフラスコに移し、アッセイ前に7日間インキュベートした。データを表2にまとめる。
【０１２３】
2010521135.tif 000006
2010521135.tif 000007
【０１２４】
実施例7：多形核細胞(PMN、一次ヒト好中球)の精製
一次ヒト好中球を得るため、80mlまでの血液をヒトドナーから、ヘパリンナトリウムVacutainerチューブ(Becton-Dickinson)内に抜き出す。次いで、5ミリリットル(5ml)の血液を、15ml円錐型遠心チューブ内の5mlのPolymorphprep(Axis-Shield)上に重層する。スイングバケットローター内で600×gで60分間遠心分離後、血漿および末梢血の単核細胞(PBMC)を除去し、廃棄する。次いで、ガラスパスツールピペットを用いて、PMNを含有する細胞の第２バンドを50ml円錐型チューブ内に移す。次いで、等容量の0.45%NaClをPMNに添加して洗浄する。500×gで10分間の遠心分離後、上清を除去し、PMNペレットを50mlのイスコブ改変ダルベッコ培地(IMDM)(Cellgro、Herndon、VA)に再懸濁させる。PMNを500×gで10分間再度遠心分離し、上清を除去する。30mlのIMDM中に再懸濁後、血球計(Reichert)を用いて細胞数を定量する。元の血液の容量が30mL未満である場合、次いで、細胞を10mLに再懸濁して正確な血球計カウントを得たことに留意されたい。次いで、グリコホリンAマイクロビーズ(Miltenyi Biotec、Auburn、CA)を製造業者の使用説明書どおりに用いた陽性選択によってPMN調製物を汚染する残留赤血球を除く。次いで、得られたPMNをIMDMで50mlに希釈する。500×gで10分間の遠心分離後、上清を除去し、0.5%熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)(ATCC、Manasas、VA)を添加した15mlのIMDMにPMNを再懸濁させる。500×gで10分間さらに遠心分離後、上清を再度除去し、PMNをIMDM(アッセイ培地)中0.5%FCS 7ml に再懸濁させ、15ml円錐型遠心チューブに移す。次いで、血球計を用いてPMNを定量する。次いで、実施例9の遊出アッセイ前に、さらなる遠心分離および適量のアッセイ培地の除去によってPMNの濃度を2×107/mlに調整する。
【０１２５】
実施例8：末梢血単球(PBMC)の精製
一次ヒトT細胞のため、80mlまでの血液をヒトドナーからヘパリンナトリウムVacutainerチューブ(Becton-Dickinson)内に抜き出す。次いで、血液(チューブあたり10〜15ml)を50ml円錐型遠心チューブ内の30mlのLymphocyte Separation Medium(LSM)(Cellgro、Herndon、VA)に重層し、スイングバケットローター内で2440×gで20分間遠心分離する。各チューブの上部から大部分の血漿を除去した後、末梢血単球(PBMC)層を除去し、新しい50ml円錐型遠心チューブに移す。次いで、チューブを50mlまでIMDMで満たし、500×gで10分間遠心分離する。次いで、およそ5ml以外すべての上清を除去し、ペレットを25mlのIMDMで再懸濁し、遠心分離を繰返す。上清の除去後、細胞を再懸濁し、1つの50mlチューブ(被験体あたり)に合わせ、総容量を50mlにする。次いで、血球計(Reichert)を用いて細胞をカウントする。同じ条件下で遠心分離後、上清を除去し、製造業者の使用説明書に従って適切なMiltenyi Biotec (Auburn、CA)陰性選択キットを用いて細胞を処理し、所望の細胞型を富化する。次いで、得られた精製細胞をIMDMで50mlに希釈する。500×gで10分間遠心分離後、上清を除去し、0.5%熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)(ATCC、Manasas、VA)を添加した15mlのIMDMに細胞を再懸濁する。500×gで10分間さらに遠心分離後、上清を再度除去し、IMDM (アッセイ培地)中0.5%FCS 7mlに細胞を再懸濁させ、15ml円錐型遠心チューブに移す。次いで、血球計を用いて細胞を定量する。単球を富化する場合、遠心分離および適切な容量のアッセイ培地の除去によって細胞の濃度を2×107/mlに調整する。すべての他の細胞型について、チューブキャップを25cm2組織培養フラスコ(Corning)のものと交換し、加湿した37℃のインキュベーター内で5%CO2で細胞を一晩保存する。実施例9の遊出アッセイの直前に、細胞の濃度を単球の場合のようにして調整する。
【０１２６】
この手順は、単球を単離および／または精製するために使用され得る。単球精製方法では、同じくMiltenyi Biotec (Auburn、CA)から購入したCD61マイクロビーズの使用による血小板除去のためのさらなる工程を含める。
【０１２７】
実施例9：ハイスループット遊出アッセイ
細胞遊走試験のためのアッセイ開発の過程において、試験される薬剤の効果を定量できることが必要であった。この目的のための方法を開発するための努力により、実施例1に報告した元のアッセイよりも、統計学的に再現可能な遊走の測定がもたらされ、したがって実験間のより良好な比較が可能になる点で改善されたハイスループット遊出アッセイが得られた。
【０１２８】
化学的または生物学的薬剤から離れようとする遊走(化学忌避性(CR))を、ChemoTxプレート(Neuroprobe)を用いて測定した。これらのプレートはエッチングおよび穿孔された平面的なポリカーボネートまたはポリエステル膜を含み、そのため、細胞がエッチングされた溝に沿って移動し、穿孔された穴から落下することができ、細胞が回収され、遊走細胞数が定量されることが可能になっている(図5〜6)。目的の薬剤のいくつかの希釈物(通常、10倍ずつ増やして4種類)を調製する。好中球には、3μmの孔の膜を有するプレートを使用するが、すべての他の一次細胞型には、5μmの孔の膜を使用する。膜は、湿潤剤としてポリビニルピロリドン(PVP)でコーティングされていてもされていなくてもよい。
【０１２９】
自発遊走対照および化学忌避性(CR)アッセイのため、31μlのアッセイ培地を遊出装置の下側ウェルにピペッティングする(図5〜6)。自発遊走対照および化学誘引(CA)アッセイでは、29μlのアッセイ培地を遊出装置の上側チャンバにピペッティングする(図5)。CRでは、上側ウェルのアッセイ培地は、薬剤または候補化学忌避因子を含有する。自発遊走対照では、上側ウェルのアッセイ培地は、FCSを最終濃度0.5%(v/v)まで添加しておいたIMDMのみを含有する。
【０１３０】
細胞を200uL画分のアリコートに分け、各々をプレートに準備するまで37℃に維持する。適切な温度での細胞のこの再分および保存により、アッセイの時間的経過間のより良好な一致が可能になる。
【０１３１】
自発遊走対照およびCRのため、2μlの細胞懸濁(およそ40,000細胞)を上側チャンバに添加して遊走を開始させる。遊走は、37℃および5%CO2で指定された期間進行させる。好中球遊走は1時間起こり、B細胞または単球は2時間遊走し、T細胞は3時間遊走する。
【０１３２】
インキュベーション期間後、キムワイプ(Kimberly-Clark)で静かに拭き取ることにより膜上の液体を除去した後、遊走(下側)プレートから膜を除去する。マルチチャネルピペッターを使用し、5μlのCellTiter-Glo(Promega、city state)を遊走プレートの各ウェルに添加し、ウェル内に存在する細胞の数を定量する。次いで、各ウェルの内容物を25μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Cellgro)を添加しておいたルミネセンスの測定に適した96ウェル白色リーディングプレート(例えば、OptiPlate (Perkin Elmer))に移す。これは、マルチチャネルピペットまたはスイングバケット遠心分離機において漏斗プレート装置(Neuroprobe)を使用することのいずれかによって達成され得る。
【０１３３】
次いで、白色リーディングプレートをマイクロプレートリーダー(例えば、Victor3 (Perkin Elmer))においてルミネセンスを読む前に暗所で10分間軌道を描くように振とうしながらインキュベートする。発光シグナルは、30分間まで変動することなく持続すると測定されたので、50個のプレートが適当なマイクロプレートリーダーを使用し、自動プレート負荷およびプレートリーディングモードにおいて読むことができる。
【０１３４】
ルミネセンス出力は、遊走細胞の数と直接相関する。細胞遊走の程度は、任意の所定の実験において、特定の細胞型およびドナーに関して自発遊走に対してコンピュータ処理される。
【０１３５】
実施例10：ならし培地の調製
他の試験において、ならし培地を用いて化学忌避因子を同定した。これらの試験では、ならし培地は、細胞培養物が臨界密度に達するまで血清含有増殖培地中での哺乳動物起源の細胞のインキュベーションによって調製した。懸濁培養した細胞の細胞数が120×106を超えた場合、臨界密度に達する。付着細胞では、細胞が70〜90%コンフルエンシーに達した場合に臨界密度に達する。臨界密度まで培養後、細胞を回収し、ペニシリン-ストレプトマイシン(ATCC 30-2300、1%-最終濃度100単位/ml-100μg/ml)(HSF-PS)を添加したHybridoma Serum Free Medium(Gibco)中で2回洗浄し、少なくとも24時間、新鮮HSF-PSに移し、360日間という長期間インキュベートした。懸濁細胞では、この洗浄は、遠心分離およびHSF-PS中での再懸濁によって達成された。これらの懸濁細胞を、8個の25cm2フラスコ(各々15ml)に1×106細胞/mlの最終密度で播種した。付着細胞では、8個のフラスコを臨界密度まで培養し、HSF-PSですすいだが、なおフラスコの底に付着した。75cm2フラスコを使用した場合、細胞を最終容量30mlのHSF-PSで覆ったが、175cm2フラスコを使用した場合は、70mlを使用した。フラスコを加湿した37℃のインキュベーター内で5%CO2でインキュベートし、フラスコの培養上清を1時間〜360日の間の種々の時点で回収した。選択した時点での培養上清の回収プロセスを、本明細書では「時限式(timed)アリコート選択」という。
【０１３６】
上清を回収するため、培養液を500×gで10分間で遠心分離し、次いで、0.2μmシリンジフィルターを用いて新たなチューブに濾過した。あるいは、上清は、滅菌0.2μmフィルターユニットを用いて濾過され得、上清は含まれたビン内に保存され得る。各々250μlの多数のアリコートの保存は、マイクロ遠心チューブ内であり得る。残留した上清は、円錐型チューブ内に保存され得るか、または滅菌フィルターユニットレシーバーフラスコ内に放置され得る。すべての試料は-80℃で保存した。
【０１３７】
実施例11：ならし培地からの化学忌避因子の同定および単離
実施例10で上記のならし培地での培養または維持後、細胞培養物を回収し、上清を化学忌避剤の存在について評価した。
【０１３８】
すべての上清を回収した後(例えば、時限式アリコート選択によって)、さらに希釈せずに実施例9に記載のハイスループット遊出アッセイにおいて評価した。続いて、上清は、標準的なクロマトグラフィー手順に従って分画され、化学忌避因子の単離が容易となり得る。
【０１３９】
分画は、サイズ排除クロマトグラフィー、FPLC、HPLC、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィーなどによって行なわれ得る。
【０１４０】
各分画工程において、化学忌避性は、各画分またはそのサブセットについて、実施例9に記載の方法を用いて測定した。個々の測定を行なったら、遊走指数を計算した。
【０１４１】
遊走指数の計算の結果によって、プールして次の工程で使用される画分が決定され、それにより、その後プールした任意の画分において任意の推定化学忌避剤の量の富化を行なった。
【０１４２】
1回以上の分画工程後、最大遊走指数(したがって最大遊走活性)を有するプールされた画分は、一次元または二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D-PAGE)によって解析され、分離された成分は銀または蛍光染色によって可視化され、可視化された成分は、当該技術分野で公知の技術によって溶出される。溶出されたゲルスポットを化学的または酵素的断片化および質量分析を用いた同定、アミノ酸配列決定または当業者に公知の他の技術に供する。あるいは、最大遊走指数を有するプールされた画分は、液体クロマトグラフィー(LC)質量分析(MS)によって直接解析され得る。
【０１４３】
実施例12：有効化学忌避因子の同定
実施例9〜11に記載の方法を使用し、いくつかのクラスおよび個々の薬剤が化学忌避因子と同定された。結果を表3〜15に示す。これらの薬剤は、実施例9の遊出アッセイを用いて細胞遊走効果について解析した場合、および1.2より大きい忌避指数が計算された場合、有効化学忌避因子と同定された。
【０１４４】
忌避指数に基づき(確認の閾値は1.2)、新規なクラスの化学忌避剤がここに同定され、いずれも、本発明者らの知る限り、これらの細胞において化学忌避活性を有することは報告されていなかった。
【０１４５】
結果は、糖質結合タンパク質(表3)、セルピン(表4)、細菌細胞壁成分(表5)、熱ショックタンパク質(表6)、天然産物(表7)、Toll様受容体リガンド(表8)ウイルス因子(表9)、セマフォリン(表10)、エラスターゼインヒビター(表11)、抗生物質(表12)、筋肉細胞タンパク質(表13)、植物細胞壁成分(表14)およびケモカイン(表15)などの薬剤を含む。
【０１４６】
各薬剤の忌避指数を、3人の異なる個体由来のドナー血の3つのバッチの独立した評価から計算し、ドナー血の各測定は、異なる4つのリガンド濃度で3つ一組で行なった。その範囲を表に示し、濃度の1000倍変化を包含する。表3〜15に報告した忌避指数は、最大活性が観察されたリガンド濃度での3種類のドナー血試料の平均値を示す。したがって、列挙した各化合物について、観察された化学忌避性は、ドナー群間および同様にヒト集団間の生理学的な違いとは独立しているようであり、有効化学忌避因子による化学忌避性の誘導が真の生理現象であることを強く示す。濃度は、特に記載のない限りμMで示されたものである。熱殺菌Listeriaでは、濃度は、単に、1ミリリットルあたりの細胞数で示され得ることに注意されたい。
【０１４７】
表16において、表3〜15の化合物のクラスの選択された構成員の4つの濃度で測定される忌避指数および標準偏差を示す。表16に示す標準偏差は、3つ一組で行なわれた1つの実験(1人のドナー)に基づいて計算されたことを示す。
【０１４８】
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【０１４９】
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【０１５０】
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【０１５１】
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【０１５２】
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【０１５３】
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【０１５４】
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【０１５５】
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【０１５６】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１５９】
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【０１６０】
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【０１６１】
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【０１６２】
実施例13：化学忌避剤を分泌するヒト癌由来細胞の同定
ヒト癌由来の化学忌避剤の存在を同定するため、実施例9〜11の方法を用いてリンパ腫、卵巣癌、前立腺癌および乳癌系統を評価した。表17に、一連の市販のヒト腫瘍由来細胞株の遊走指数(MI)を示す。これらの細胞株の各々を、従来の細胞増殖培地中で培養物がコンフルエンシーに達するまで培養した。次いで、細胞を回収し、洗浄し、フラスコ内の無血清培地中に細胞を等分することにより再懸濁した。無血清培地中に入れたら、各細胞型について、別々のフラスコから培地中の細胞分泌物を各日連続7日間回収した。推定化学忌避因子を含有する分泌細胞の混合物を、希釈または濃縮せずに実施例9の遊出アッセイ方法において試験し、遊走指数を計算した。
【０１６３】
測定は時間的経過全体にわたって(すなわち、各日)行なったため、ピーク活性を有する毎日のアリコートを、新規な化学忌避剤の存在について評価する上清とみなした。表17に結果を示す。
【０１６４】
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【０１６５】
遊走指数が1.2以上である混合物を、少なくとも1種類の「有効ならし(conditioned)化学忌避因子」を含むとみなす。
【０１６６】
表から、記載したピーク活性時点において、一部のヒト癌細胞株は、少なくとも好中球、CD4+およびCD8+細胞の移動のきっかけとなる、または該移動を誘発する化学忌避因子をならし培地中に分泌することが明白である。
【０１６７】
これらの化学忌避因子の実体を調べる研究が現在進行中である。
【０１６８】
本発明を、その好ましい態様を参照して具体的に示し、記載したが、形態および詳細における種々の変形が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱せずになされ得ることは、当業者によって理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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