(57)【要約】  本発明は、3位でアミノカルボキシ置換基を有する1-ヒドロキシフェニル部位を含み、5位と3位のアミノカルボキシ置換基とが可変長さの脂肪族鎖により連結された、C21-デオキシアンサマイシンの誘導体又はその塩であって、該フェニル環の1-ヒドロキシ位置がアミノアルキレンアミノカルボニル基によって誘導体化され、アルキレン基(任意にアルキル基で置換され得る)が鎖長2若しくは3の炭素原子又はリン酸若しくはリン酸エステル(アルキルエステルなど)基又はその塩を有し、かつ誘導体化基が親分子の水溶性及び/又は生物学的利用能を増加させることを特徴とする、前記誘導体又はその塩を提供する。そのような化合物は、療法、例えば癌及びB-細胞性悪性腫瘍の治療に有用である。【選択図】  なし
2010520190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
3位でアミノカルボキシ置換基を有する1-ヒドロキシフェニル部位を含み、5位と3位のアミノカルボキシ置換基とが可変長さの脂肪族鎖により連結された、C21-デオキシアンサマイシンの誘導体又はその塩であって、
該フェニル環の1-ヒドロキシ位置がアミノアルキレンアミノカルボニル基によって誘導体化され、アルキレン基(任意にアルキル基で置換され得る)が鎖長2若しくは3の炭素原子又はリン酸若しくはリン酸エステル基を有し、かつ誘導体化基が親分子の水溶性及び/又は生物学的利用能を増加させることを特徴とする、前記C21-デオキシアンサマイシンの誘導体又はその塩。
【請求項２】
3位でアミノカルボキシ置換基を有する1-ヒドロキシフェニル部位を含み、5位と3位のアミノカルボキシ置換基とが可変長さの脂肪族鎖により連結された、請求項１記載のC21-デオキシアンサマイシンの誘導体又はその塩であって、
該フェニル環の1-ヒドロキシ位置がリン酸又はリン酸エステル基によって誘導体化され、かつ誘導体化基が親分子の水溶性及び/又は生物学的利用能を増加させることを特徴とする、請求項１記載のC21-デオキシアンサマイシンの誘導体又はその塩。
【請求項３】
3位でアミノカルボキシ置換基を有する1-ヒドロキシフェニル部位を含み、5位と3位のアミノカルボキシ置換基とが可変長さの脂肪族鎖により連結された、請求項１記載のC21-デオキシアンサマイシンの誘導体又はその塩であって、
該フェニル環の1-ヒドロキシ位置がアミノアルキレンアミノカルボニル基によって誘導体化され、アルキレン基(任意にアルキル基で置換され得る)が鎖長2若しくは3の炭素原子又はリン酸若しくはリン酸エステル基を有し、かつ誘導体化基が親分子の水溶性及び/又は生物学的利用能を増加させ、インビボで除去されることができることを特徴とする、請求項１記載のC21-デオキシアンサマイシンの誘導体又はその塩。
【請求項４】
下記式(IA-IC)のC21-デオキシアンサマイシン誘導体、又はその医薬として許容し得る塩：
【化１】
2010520190.tif 000082
(式中、
R1はH、OH、OMeを表し；
R2はOH、OMe又はケトを表し；
R3はOH又はOMeを表し；
R4はH、OH又はOCH3を表し；
R5はH又はCH3を表し
R6及びR7は双方ともHを表すか、又は一緒にこれらは結合を表し(すなわち、C4からC5は2重結合)；
R8はH又は-C(O)-NH2を表し；
R9は下記式を表す：
【化２】
2010520190.tif 000083
（式中、
nは0又は1を表し；
R10はH、Me、Et又はイソ-プロピルを表し；
R11、R12及びR13は各々独立に、H又はC1-C4分枝若しくは直鎖アルキル基を表し；
又はR11及びR12、又はR12及びR13は結合して、6員炭素環を形成することができ；
R14はH又はC1-C4分枝若しくは直鎖アルキル基を表し；かつ
R15はH、Me又はEtを表す。）。
【請求項５】
R1はH、OH、OMeを表し；
R2はOH、OMe又はケトを表し；
R3はOH又はOMeを表し；
R4はH、OH又はOCH3を表し；
R5はH又はCH3を表し
R6及びR7は双方ともHを表すか、又は一緒にこれらは結合を表し(すなわち、C4からC5は2重結合)；
R8はH又は-C(O)-NH2を表し；
R9は下記式を表す：
【化３】
2010520190.tif 000084
（式中、R15はH、Me又はEtを表す。）、
請求項４記載の化合物。
【請求項６】
R1はH、OH、OMeを表し；
R2はOH、OMe又はケトを表し；
R3はOH、又はOMeを表し；
R4はH、OH、又はOCH3を表し；
R5はH又はCH3を表し
R6及びR7は双方ともHを表すか、又は一緒にこれらは結合を表し(すなわち、C4からC5は2重結合)；
R8はH又は-C(O)-NH2を表し；
R9は下記式を表す：
【化４】
2010520190.tif 000085
（式中、
nは0又は1を表し；
R10はH、Me、Et又はイソ-プロピルを現し；
R11、R12及びR13は各々独立に、H又はC1-C4分枝若しくは直鎖アルキル基を表し；
又はR11及びR12、又はR12及びR13は結合して、6員炭素環を形成することができ；
R14はH又はC1-C4分枝若しくは直鎖アルキル基を表す。）、
請求項４記載の化合物。
【請求項７】
R1がHを表す、請求項４〜６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項８】
R1がOMeを表す、請求項４〜６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項９】
R2がOHを表す、請求項４〜８のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１０】
R2がOMeを表す、請求項４〜８のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１１】
R3がOMeを表す、請求項４〜１０のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１２】
R4がHを表す、請求項４〜１１のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１３】
R4がHを表す、請求項４〜１１のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１４】
R5がHを表す、請求項４〜１３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１５】
R6がHを表す、請求項４〜１４のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１６】
R7がHを表す、請求項４〜１５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１７】
R8が-C(O)-NH2を表す、請求項４〜１６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１８】
R15がHを表す、請求項４、５、又は７〜１７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１９】
R15がMe又はEtを表す、請求項４、５、又は７〜１７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２０】
R10がMeを表す、請求項４及び６〜１７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２１】
R10がEtを表す、請求項４及び６〜１７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２２】
R14がMeを表す、請求項４、６〜１７、２０、及び２１のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２３】
R14がEtを表す、請求項４、６〜１７、２０、及び２１のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２４】
R11がHを表す、請求項４、６〜１７、及び２０〜２３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２５】
R12がHを表す、請求項４、６〜１７、及び２０〜２４のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２６】
R13がHを表す、請求項４、６〜１７、及び２０〜２５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２７】
nが0を表す、請求項４、６〜１７、及び２０〜２６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２８】
nが0であり、R12及びR13が各々Hを表し、R10及びR14が各々Meを表す、請求項４及び６〜１７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２９】
nが0であり、R12及びR13が各々Hを表し、かつR10及びR14が各々Etを表す、請求項４及び６〜１７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項３０】
構造(IA)の化合物である、請求項１〜２９のいずれか１項記載の化合物。
【請求項３１】
構造(IB)の化合物である、請求項１〜２９のいずれか１項記載の化合物。
【請求項３２】
構造(IC)の化合物である、請求項１〜２９のいずれか１項記載の化合物。
【請求項３３】
4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-21-デオキソマクベシン-18-ホスフェート又はその医薬として許容し得る塩である、請求項４記載の化合物。
【請求項３４】
下記式又はその医薬として許容し得る塩である、請求項４記載の化合物：
【化５】
2010520190.tif 000086
。
【請求項３５】
一ナトリウム塩の形態である、請求項４、５、７〜１９、３０〜３４のいずれか１項記載の化合物。
【請求項３６】
18-O-(N,N'-ジメチルプロパンジアミンカルバモイル)-4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-18-ヒドロキシ-21-デオキソマクベシン又はその医薬として許容し得る塩である、請求項４記載の化合物。
【請求項３７】
18-O-(N,N'-ジエチルエチレンジアミンカルバモイル)-4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-18-ヒドロキシ-21-デオキソマクベシン又はその医薬として許容し得る塩である、請求項４記載の化合物。
【請求項３８】
18-O-(N,N'-ジメチルエチレンジアミンカルバモイル)-4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-18-ヒドロキシ-21-デオキソマクベシン又はその医薬として許容し得る塩である、請求項４記載の化合物。
【請求項３９】
下記式又はその医薬として許容し得る塩である、請求項４記載の化合物：
【化６】
2010520190.tif 000087
。
【請求項４０】
下記式又はその医薬として許容し得る塩である、請求項４記載の化合物：
【化７】
2010520190.tif 000088
。
【請求項４１】
下記式又はその医薬として許容し得る塩である、請求項４記載の化合物：
【化８】
2010520190.tif 000089
。
【請求項４２】
1種以上の医薬として許容し得る希釈剤又は担体とともに、請求項１〜４１のいずれか１項記載のC21-デオキシアンサマイシン誘導体又はその医薬として許容し得る塩を含む、医薬組成物。
【請求項４３】
医薬品として使用するための、請求項１〜４１のいずれか１項記載のC21-デオキシアンサマイシン誘導体又はその医薬として許容し得る塩。
【請求項４４】
癌、B-細胞性悪性腫瘍、マラリア、真菌感染、中枢神経系の疾患及び神経変性疾患、血管形成に依存する疾患、自己免疫疾患の治療のため、及び/又は癌の予防的前処置としての医薬品の製造における、請求項１〜４１のいずれか１項記載のC21-デオキシアンサマイシン誘導体又はその医薬として許容し得る塩の使用。
【請求項４５】
癌、B-細胞性悪性腫瘍、マラリア、真菌感染、中枢神経系の疾患及び神経変性疾患、血管形成に依存する疾患、自己免疫疾患の治療のため、及び/又は癌の予防的前処置としての医薬品として使用される、請求項１〜４１のいずれか１項記載のC21-デオキシアンサマイシン誘導体又はその医薬として許容し得る塩。
【請求項４６】
癌、B-細胞性悪性腫瘍、マラリア、真菌感染、中枢神経系の疾患及び神経変性疾患、血管形成に依存する疾患、自己免疫疾患の治療方法、又は癌の予防的前処置方法であって、その必要がある患者に、有効量の請求項１〜４１のいずれか１項記載のC21-デオキシアンサマイシン誘導体又はその医薬として許容し得る塩を投与することを含む、前記方法。
【請求項４７】
請求項１〜４１のいずれか１項記載のC21-デオキシアンサマイシン誘導体又はその医薬として許容し得る塩の製造方法であって、(a)式(IIA)、(IIB)、又は(IIC)の化合物又はその保護誘導体
【化９】
2010520190.tif 000090
(式中、Lは脱離基である)を、式(V)の化合物
【化１０】
2010520190.tif 000091
(式中、Pは保護基を表し、n及びR1〜R8及びR10〜R14は請求項１、３、４、６〜１７、２０〜３２、及び３６〜４１のいずれかに記載されているものである。)と反応させること;又は
(b)式(IIIA)、(IIIB)若しくは(IIIC)の化合物又はその保護誘導体
【化１１】
2010520190.tif 000092
(式中、R1〜R8は請求項１、２、５、７〜１９、３０〜３５のいずれかに記載されているものである。)をリン酸化試薬と反応させること;又は
(c)式(I)の化合物又はその塩を、式(I)の別の化合物又はその別の医薬として許容し得る塩に変換すること;又は
(d)式(I)の保護化合物を脱保護することを含む、前記方法。
【請求項４８】
式(IIA)、(IIB)、若しくは(IIC)の化合物又はその塩：
【化１２】
2010520190.tif 000093
(式中、R1〜R8は請求項１〜４１のいずれか１項に定義されるものであり、Lは脱離基である。)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（緒言）
本発明は、例えば、癌、B-細胞性悪性腫瘍、マラリア、真菌感染、中枢神経系の疾患及び神経変性疾患、血管形成に依存する疾患、自己免疫疾患の治療において、又は癌のための予防的前処置として有用である、C21-デオキシアンサマイシン化合物の誘導体に関する。特に、該誘導体は、C21-デオキシアンサマイシン化合物のプロドラッグであり、かつ/又はそれ自体で活性であってもよい。本発明は、これらの化合物の製造方法、並びにそれらの医薬品における使用、特に癌又はB-細胞性悪性腫瘍の治療及び/又は予防における使用を提供する。
【０００２】
（本発明の背景）
低毒性及び有利な薬物動態学的特徴を有する高度に特異的な抗癌剤の開発は、抗癌治療における大きな課題である。90kDa熱ショックタンパク質(Hsp90)は、タンパク質の折り畳み及び集合に関連した豊富な分子シャペロンであり、その多くはシグナル伝達経路に関与している(総説については、Neckersの論文、2002；Sreedharらの論文、2004a；Wegeleらの論文、2004、及びそれらの中の参考文献を参照されたい)。これまで、約50のこれらのいわゆるクライアントタンパク質が同定され、ステロイド受容体、非受容体チロシンキナーゼ、例えばsrcファミリー、サイクリン依存性キナーゼ、例えばcdk4及びcdk6、嚢胞性膜貫通調節因子(cystic transmembrane regulator)、一酸化窒素シンターゼ、及びその他を含む(Donze 及び Picard, 1999；McLaughlinらの論文, 2002；Chiosisらの論文, 2004；Wegeleらの論文, 2004；http://www.picard.ch/downloads/Hsp90interactors.pdf)。更にHsp90は、ストレス反応及び変異の影響に対する細胞の保護において重要な役割を果たす(Bagatell及びWhitesellの論文、2004；Chiosisらの論文、2004)。Hsp90の機能は複雑であり、かつこれは動的多酵素複合体(dynamic multi-enzyme complex)の形成に関与している(Bohenの論文、1998；Liuらの論文、1999；Youngらの論文、2001；Takahashiらの論文、2003；Sreedharらの論文、2004；Wegeleらの論文、2004)。Hsp90は、阻害剤の標的であり(Fangらの論文、1998；Liuらの論文、1999；Blagosklonnyの論文、2002；Neckersの論文、2003；Takahashiらの論文、2003；Beliakoff及びWhitesellの論文、2004；Wegeleらの論文、2004)、結果クライアントタンパク質の分解、細胞周期の異常調節及びアポトーシスを生じる。より最近になって、Hsp90は、腫瘍浸潤の重要な細胞外メディエーターとして同定された(Eustaceらの論文、2004)。Hsp90は癌療法の新たな主要な治療標的として同定され、このことは、Hsp90機能に関する活発で詳細な研究(Blagosklonnyらの論文、1996；Neckersの論文、2002；Workman及びKayeの論文、2002；Beliakoff及びWhitesellの論文、2004；Harrisらの論文、2004；Jezらの論文、2003；Leeらの論文、2004)、及びハイスループットスクリーニングアッセイの開発(Carrerasらの論文、2003；Rowlandsらの論文、2004)において反映されている。Hsp90阻害剤は、アンサマイシン、マクロライド、プリン、ピラゾール、クマリン抗生物質などのような、化合物クラスを含む(総説については、Bagatell及びWhitesellの論文、2004；Chiosisらの論文、2004、及びそれらの中の参考文献を参照されたい)。
ベンゼノイドアンサマイシンは、芳香族環構造のいずれかの側に連結された長さが変動する脂肪族環を特徴とする化学構造の広範なクラスである。天然のアンサマイシンは、マクベシン及び18,21-ジヒドロマクベシン(各々、マクベシンI及びマクベシンIIとしても公知)(1及び2；Tanidaらの論文、1980)、ゲルダナマイシン(3；DeBoerらの論文、1970；DeBoer及びDietzの論文、1976；WO 03/106653及びそれらの中の参考文献)、並びにハービマイシンファミリー(4；5、6、Omuraらの論文、1979；Iwaiらの論文、1980；及び、Shibataらの論文、1986a、WO 03/106653、及びそれらの中の参考文献)を含む。
【化１】
2010520190.tif 000003
アンサマイシンは、当初それらの抗菌活性及び抗ウイルス活性について同定されたが、最近抗癌剤としてのこれらの利用の可能性に関心が高まってきている(Beliakoff及びWhitesellの論文、2004)。現在多くのHsp90阻害剤が、臨床試験において評価中である(Csermely及びSotiの論文、2003；Workmanの論文、2003)。特にゲルダナマイシンは、ナノモルでの効能及び異常なプロテインキナーゼ依存型腫瘍細胞に対する明白な特異性を有する(Chiosisらの論文、2003；Workmanの論文、2003)。
【０００３】
Hsp90阻害剤による治療は、放射線による腫瘍細胞死滅の誘導を増強することが示されており、並びにHsp90阻害剤の細胞傷害性薬物との組合せによる増大した細胞殺傷能(例えば、乳癌、慢性骨髄性白血病及び非-小細胞肺癌)も明らかにされている(Neckersの論文、2002；Beliakoff及びWhitesellの論文、2004)。抗血管新生活性の潜在性も、対象である: Hsp90クライアントタンパク質HIF-1αは、固形腫瘍の進行において重要な役割を担う (Hurらの文献, 2002; Workman及びKayeの文献, 2002; Kaurらの文献, 2004)。
【０００４】
Hsp90阻害剤は、免疫抑制薬としても機能し、かつHsp90阻害後のいくつかの腫瘍細胞型の補体が誘導した溶解に関与している(Sreedharらの論文、2004)。Hsp90阻害剤による治療は、免疫細胞が媒介した溶解(Sreedharらの論文、2004)に関連したスーパーオキシド生成の誘導も生じることができる(Sreedharらの論文、2004a)。Hsp90阻害剤の抗-マラリア薬としての使用の可能性が議論されている(Kumarらの論文、2003)。更にゲルダナマイシンは、複合糖鎖形成された哺乳類のプリオンタンパク質PrPcの形成を妨げることが示されている(Winklhoferらの論文、2003)。
【０００５】
前述のように、アンサマイシンは、潜在的抗癌剤及び抗-B-細胞性悪性腫瘍化合物として、並びに他の潜在的利用を有するものとして関心があるが、しかし、現在入手可能なアンサマイシンの薬理学的特性又は医薬特性は不良であり、例えばこれらは、水溶解度が低く、代謝安定性が不良であり、生物学的利用能が悪く、又は製剤能が不良である(Goetzらの論文、2003；Workmanの論文、2003；Chiosisの論文、2004)。ハービマイシンA及びゲルダナマイシンは双方とも、それらの強い肝毒性(review Workman, 2003)のため臨床試験の候補として不良であることが確認された。ゲルダナマイシンは肝毒性のためフェーズI臨床試験から取り外された(Supkoらの文献、1995、WO 03/106653)。  
【０００６】
ゲルダナマイシンは、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)の培養ろ液から分離され、原生動物に対してインビトロで強い活性、及び細菌及び真菌に対して弱い活性を示す。1994年に、ゲルダナマイシンのHsp90との関連が示された(Whitesellらの論文、1994)。ゲルダナマイシン生合成遺伝子クラスターが、クローン化され、かつ配列決定された(Allen及びRitchieの論文、1994；Rascherらの論文、2003；WO 03/106653)。そのDNA配列は、NCBI寄託番号AY179507で入手可能である。遺伝子操作されたゲルダナマイシン産生菌株の単離は、S.ハイグロスコピカス亜種デュアマイセチカスJCM4427に由来し、並びに4,5-ジヒドロ-7-O-デスカルバモイル-7-ヒドロキシゲルダナマイシン及び4,5-ジヒドロ-7-O-デスカルバモイル-7-ヒドロキシ-17-O-デメチルゲルダナマイシンの単離は、最近説明された(Hongらの論文、2004)。ゲルダナマイシンを、ハービマイシン産生菌株ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスAM-3672へ供給することにより、化合物15-ヒドロキシゲルダナマイシン、三環系ゲルダナマイシン類似体KOSN-1633及びメチル-ゲルダナマイシネートが単離された(Huらの論文、2004)。２つの化合物17-ホルミル-17-デメトキシ-18-O-21-O-ジヒドロゲルダナマイシン及び17-ヒドロキシメチル-17-デメトキシゲルダナマイシンは、ハービマイシン産生菌株であるストレプトマイセス ハイグロスコピカスAM-3672 (Streptomyces hygroscopicus AM-3672)由来の様々な遺伝子を有するプラスミドpKOS279-78を含む、S. ハイグロスコピカス NRRL 3602(S. hygroscopicus NRRL 3602)から単離された(Huらの論文, 2004)。ゲルダナマイシン生合成経路の遺伝子工学は、非ベンゾキノン型ゲルダナマイシン類似体、フェノール型である指定されたKOSN1559及びKOS-1806などの更なるゲルダナマイシン類似体(Patelらの文献, 2004, Rascherらの文献, 2005)の生産につながった。ゲルダナマイシンの2-デスメチル-4,5-ジヒドロ-17-デメトキシ-21-デオキシ誘導体であるKOSN1559は、Hsp90と、ゲルダナマイシンより4倍大きな結合親和性、及び17-AAGより8倍大きな結合親和性で結合する。しかし、これは、SKBr3を用いてIC50測定の改良において反映されなかった。KOS-1806に関する活性データは、示されていない。
【０００７】
1979年に、アンサマイシン抗生物質ハービマイシンAが、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス株AM-3672の発酵ブロスから単離され、その強力な除草活性に従い命名された。その抗腫瘍活性は、細胞の形質転換された形態に復帰する薬物のスクリーニングのためにラウス肉腫ウイルス(RSV)の温感性変異体に感染されたラット腎臓系細胞を使用することにより確立された(総説はUeharaの論文、2003を参照されたい)。
【０００８】
ハービマイシンAは、保存されたシステイン残基への直接結合ではなく、Hsp90シャペロンタンパク質への結合を介して主に作用するとして仮定され、及び後続のキナーゼ失活も考察された(Ueharaの論文、2003)。
【０００９】
化学誘導体が単離され、並びにベンゾキノン核のC19に変更された置換基を持つ化合物及びアンサ鎖がハロゲン化された化合物は、ハービマイシンAよりもより低い毒性及びより高い抗腫瘍活性を示した(Omuraらの論文、1984；Shibataらの論文、1986b)。ハービマイシン生合成遺伝子クラスターの配列は、WO 03/106653及び最近の論文において同定されている(Rascherらの論文, 2005)。
【００１０】
アンサマイシン抗生物質マクベシン(1)、及び18,21-ジヒドロマクベシン(2) (C-14919E-1及びC-14919E-1)は、これらの抗真菌活性及び抗原虫活性により特定され、ノカルジアsp 番号C-14919 (Nocardia sp No. C-14919)の培養上清から単離された（アンチノシンネマ プレチオスム亜種プレチオスム ATCC 31280 (Actinosynnema pretiosum subsp pretiosum ATCC 31280)）(Tanidaらの論文, 1980； Muroiらの論文, 1980； US 4,315,989号、及びUS 4,187,292号)。18,21-ジヒドロマクベシンは、その核のヒドロキノン形態を含むことにより特徴付けられる。マクベシン及び18,21-ジヒドロマクベシンの両方とも、同様の抗菌活性、及びマウス白血病P388細胞株のような癌細胞株に対する抗腫瘍活性を有することが示された(Onoらの論文、1982)。逆転写酵素及びターミナルデオキシヌクレオチジル転移酵素の活性は、マクベシンにより阻害されなかった(Onoらの論文、1982)。マクベシンのHsp90阻害機能が、文献において報告されている(Bohenの論文、1998；Liuらの論文、1999)。微生物培養ブロスへの添加後の、マクベシン及び18,21-ジヒドロマクベシンの、ある位置又は複数の位置でメトキシ基の代わりにヒドロキシ基を伴う化合物への変換は、特許US 4,421,687及びUS 4,512,975に開示されている。
【００１１】
様々な土壌微生物のスクリーニングの時に、ストレプトマイセス属に属する産生菌株から、抗生物質TAN-420A〜Eが発見された(7-11, EP 0 110 710)。
【化２】
2010520190.tif 000004
【００１２】
2000年、関連したゲルダナマイシンの単離、ストレプトマイセス属種の細胞培養液から非ベンゾキノンアンサマイシン代謝産物レブラスタチン(reblastatin)(12)、及び関節リウマチにおけるその潜在的治療薬価値が記載された(Steadらの文献, 2000)。更に、設計された合成KOS-1806(Rascherらの文献, 2005)と同様であるオートリチマイシン（autolytimycin)(13, Steadらの文献, 2000)など、天然に存在する非キノン含有アンサマイシン類も記載された。
【００１３】
更に化学的に無関係のベンゾキノンアンサマイシンとは異なるHsp90阻害剤は、ラディシコール(モノルデン)であり、これは真菌モノポリウム・ボノルデン(Monosporium bonorden)からその抗真菌活性について当初発見され(総説については、Ueharaの論文、2003を参照されたい)、並びにその構造は、ネクトリア・ラディシコール(Nectria radicicola)から単離された14-員マクロライドと同じであることがわかった。これは、その抗真菌活性、抗菌活性、抗原虫活性及び細胞傷害活性に加え、Hsp90シャペロンタンパク質の阻害剤として引き続き同定された(総説については、Ueharaの論文、2003；Schulteらの論文、1999を参照されたい)。ラディシコールの抗-血管新生活性(Hurらの論文、2002)及びそれらの半-合成誘導体(Kurebayashiらの論文、2001)も、説明されている。
【００１４】
最近の関心は、新規生成アンサマイシン抗癌化合物としてのゲルダナマイシンの17-アミノ誘導体(Bagatell及びWhitesellの論文、2004)、例えば、17-(アリルアミノ)-17-デスメトキシゲルダナマイシン(17-AAG, 14)(Hosteinらの論文、2001；Neckersの論文、2002；Nimmanapalliらの論文、2003；Vasilevskayaらの論文、2003；Smith-Jonesらの論文、2004)、及び17-デスメトキシ-17-N,N-ジメチルアミノエチルアミノ-ゲルダナマイシン(17-DMAG, 15)(Egorinらの論文、2002；Jezらの論文、2003)に集まっている。近年、ゲルダナマイシンを17位で誘導体化し、17-ゲルダナマイシンアミド、カルバメート、尿素、及び17-アリールゲルダナマイシンがもたらされた(Le Brazidecらの文献, 2003)。60種を超える17-アルキルアミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン類似体のライブラリーが報告されており、かつそれらのHsp90への親和性及び水溶解度について試験された(Tianらの論文、2004)。ゲルダナマイシンの毒性を低下する更なるアプローチは、腫瘍-標的化モノクローナル抗体との複合による、活性ゲルダナマイシン化合物の悪性細胞への選択的標的化及び送達である(Mandlerらの論文、2000)。
【化３】
2010520190.tif 000005
【００１５】
これらの誘導体は肝毒性の低下を示すが、これらは依然限定された水溶解度を有する。例えば17-AAG(14)は、それ自体が一部の患者において副作用を起こし得る可溶化担体(例えば、Cremophore(登録商標)、DMSO-卵レシチン)の使用を必要とする(Huらの論文、2004)。
【００１６】
Hsp90阻害剤のアンサマイシン種類のほとんどは、共通の構造部分;タンパク質、グルタチオンなどの求核試薬と共有結合を容易に形成するマイケル付加アクセプターであるベンゾキノンを有する。ベンゾキノン部位は、酸素ラジカルが形成される間に、ジヒドロキノンとのレドックス平衡も受け、このことは更なる非特異的毒性を生じる(Dikalovらの論文、2002)。例えばゲルダナマイシンによる治療は、スーパーオキシド生成の誘導を生じ得る(Sreedharらの論文、2004a)。したがって、癌及び/又はB-細胞性悪性腫瘍の治療において有用であり得る、ベンゾキノン部分を欠く新規のアンサマイシン誘導体を特定する必要性が残されている。このようなアンサマイシンは、投与のために、水溶性が向上され、薬理学的プロフィールが向上され、副作用プロフィールが低下されていることが好ましい。本発明は、固有活性を有するか、又は例えば、WO2007/074347(化合物14と記載されている)において強力なHsp90阻害剤であることが記載され、かつ示された化合物17などのC21-デオキシアンサマイシンのプロドラッグである、新規アンサマイシン誘導体を開示する。これらの化合物は、化学的に、又は酵素的に、C21-デオキシアンサマイシンに切断されることができる。それらは、現在利用できるアンサマイシン類を比較して医薬特性を改良しているであろう;特に、これらは、以下の特性のうちの１以上に対する改善を示す:低毒性、より高い水溶性、改良された代謝安定性、生物学的利用能及び製剤能力である。好ましくは、C21-デオキシアンサマイシン類似体の半合成誘導体は、改良された水溶性及び/又は生物学的利用能を示す。
【発明の開示】
【００１７】
（本発明の要旨）
本発明は、C21-デオキシアンサマイシンの誘導体、それらの化合物の製造方法、そのための中間体、及びそれらの化合物の医薬における使用方法を提供する。特に、C21-デオキシアンサマイシンの誘導体は、プロドラッグ及び/又はそれ自体で生物活性であってもよい。
【００１８】
その最も広い態様において、本発明は、親分子のフェノール位で誘導体化されるC21-デオキシアンサマイシンの誘導体を提供する。少なくともいくつかの実施態様において、これらの基は、自己切断されるか又は生物活性親分子の生成のために酵素活性によって切断されるように設計される。他の実施態様において、化合物は、それ自身において生物活性であってもよい。
【００１９】
従って、本発明は、3位でアミノカルボキシ置換基を有する1-ヒドロキシフェニル部位を含み、5位と3位のアミノカルボキシ置換基とが可変長さの脂肪族鎖により連結された、C21-デオキシアンサマイシンの誘導体又はその塩であって、該フェニル環の1-ヒドロキシ位置がアミノアルキレンアミノカルボニル基によって誘導体化され、アルキレン基(任意にアルキル基、例えばメチル基で置換され得る)が鎖長2若しくは3の炭素原子又はリン酸若しくはリン酸エステル(アルキルエステルなど)基を有し、かつ誘導体化基が親分子の水溶性及び/又は生物学的利用能を増加させることを特徴とする、前記誘導体又はその塩を提供する。適切に、誘導体化基は、インビボで取り除かれることができる。
【００２０】
この文脈において、「親分子」は、アンサマイシンの18位に相当する、フェニル環の1位で非誘導型ヒドロキシル基を有する対応する分子を意味する。
【００２１】
さらなる特定の態様において、本発明は、下記式(IA-IC)のC21-デオキシアンサマイシン誘導体、又はそれらの医薬として許容し得る塩を提供する:
【化４】
2010520190.tif 000006
(式中:
R1は、H、OH、OMeを表し;
R2は、OH、OMe又はケトを表し;
R3は、OH、又はOMeを表し;
R4は、H、OH又はOCH3を表し;
R5は、H、又はCH3を表し、
R6及びR7は、両方ともHを表すか又は一緒にそれらは結合を表し(すなわち、C4からC5は二重結合である);
R8は、H又はC(O)-NH2を表し;
R9は、次式を表す
【化５】
2010520190.tif 000007
(式中:
nは、0又は1を表し;
R10は、H、Me、Et又はイソプロピルを表し;
R11、R12及びR13は、各々独立に、H又はC1-C4分枝又は直鎖アルキル基を表し;又は、R11とR12又はR12とR13は、6員炭素環を形成するように結合されることができ;
R14は、H又はC1-C4分枝又は直鎖アルキル基を表し;
R15は、H、Me又はEtを表す。）
【００２２】
上記の構造は、代表的な互変異性体を示し、本発明は、式(IA)、(IB)及び(IC)の化合物のすべての互変異性体、例えばエノール化合物が示されるケト化合物及びその逆を包含する。
【００２３】
(IA)、(IB)及び(IC)の化合物のすべての立体異性体(リン酸エステル基のすべての可能な配向を含む)は、本発明の態様として包含される。
【００２４】
式(IA)、(IB)、及び(IC)の化合物は、上記において、まとめて式(I)の化合物と呼ぶ。
【００２５】
更なる態様において、本発明は、医薬として使用するための、式(I)の化合物などのC21-デオキシアンサマイシン誘導体又はその医薬として許容し得る塩を提供する。
【００２６】
(定義)
冠詞「ある(a, an)」は、冠詞の文法上の対象の1つ又は2つ以上(すなわち少なくとも1つ)を意味するように、本明細書において使用される。例として、「ある類似体」は、1つの類似体又は2つ以上類似体を意味する。
【００２７】
本明細書において使用される用語「類似体(類)」は、別のものに構造的に類似しているが、組成がわずかに異なる(1個の原子の別の原子との交換又は特定の官能基の存在もしくは非存在として)化合物を意味する。
【００２８】
本明細書中に使用される用語「癌」は、上皮組織から生じるか、皮膚、又はさらに一般的に体器官の内面、例えば乳房、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、又は腸で発見される、悪性新生物を意味する。癌は、隣接組織へ浸潤し、かつ例えば骨、肝臓、肺又は脳などの遠位臓器に広がる(転移する)傾向がある。
【００２９】
本明細書において使用される用語癌は、非限定的にメラノーマ、リンパ腫、白血病、線維肉腫、横紋筋肉腫及び肥満細胞腫のような転移性腫瘍細胞型、並びに非限定的に結腸直腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌及び非-小細胞肺癌、乳癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、胃癌、グリア芽細胞腫、原発性肝癌及び卵巣癌などの組織癌型の両方を含む。
【００３０】
本明細書において使用される用語「生物学的利用能」は、薬物又は他の物質が、投与後生物学的に活性のある部位で、吸収されるか、又は利用可能となり始める程度又は割合を意味する。この特性は、化合物の溶解度、消化管の吸収速度、タンパク質結合の程度及び代謝など多くの要因により左右される。当業者によく知られているであろう生体利用効率に関する様々な試験は、本明細書に記載されている(Egorinらの文献, 2002も参照のこと)。
【００３１】
本明細書において使用される用語「B-細胞性悪性腫瘍」は、慢性リンパ性白血病(CLL)、多発性骨髄腫、及び非ホジキンリンパ腫(NHL)を含む障害群を含む。これらは、血液及び造血臓器の新生物疾患である。これらは、骨髄及び免疫系の機能障害を引き起こし、このことは宿主を感染症に罹り易く、出血し易くする。
【００３２】
本出願に用いられる「プロドラッグ」という用語は、親薬剤と比較して改良された製剤プロフィールを有する、医薬活性物質の前駆体又は誘導体形態を指す。例えば、それは、親薬剤と比較してより低細胞障害性又はより可溶性であることができ、それは、活性化される(例えば、自己切断又は酵素的に)、又はより活性な親形態に変換されることができる(例えば、Wilman D.E.V.(1986)「癌化学療法のプロドラッグ(Pro-drugs in Cancer Chemotherapy)」, Biochemical Society Transactions 14, 375-382 (615th Meeting, Belfast)、及びStella V.J.らの文献(1985)「プロドラッグ: 標的化薬剤送達への化学的アプローチ(Pro-drugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery)」, Directed Drug Delivery R. Borchardtら(編集) ページ247-267 (Humana Press)を参照されたい。）。
【００３３】
本出願において使用される用語「水溶性」は、水媒体、例えば、pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、又は5%グルコース溶液おける溶解性を意味する。水溶性試験は、「水溶性アッセイ」として下記実施例に示す。
【００３４】
本明細書中で用いられる「C21-デオキシアンサマイシン誘導体」という用語は、その最も広い態様において、本発明を代表するものとして上記の、21位でヒドロキシ基を欠くベンゼノイドアンサマイシン誘導体、例えば、上記式(I)の化合物又はその医薬として許容し得る塩を指す。これらの化合物は、「本発明の化合物」又は「C21-デオキシアンサマイシンの誘導体」とも呼ばれ、これらの用語は、本出願において同義的に使われる。
【００３５】
式(I)の化合物のような、本発明の化合物の医薬として許容し得る塩は、医薬として許容し得る無機又は有機の酸又は塩基から形成される通常の塩、更には第4級アンモニウム塩、酸付加塩を含む。好適な酸性塩のより詳細な例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ギ酸、乳酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、パルモン酸(palmoic)、マロン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ヒドロキシナフトエ酸、ヨウ化水素酸、リンゴ酸、ステロイック酸(steroic)、タンニン酸などの塩を含む。塩酸塩が特別に関心のあるものである。
【００３６】
シュウ酸などの他の酸は、それら自身医薬として許容し得るものではないが、本発明の化合物及びそれらの医薬として許容し得る塩を得るための中間体として有用な塩の調製において有用なことがある。好適な塩基性塩のより詳細な例は、ナトリウム、リチウム、カリウム、マグネシウム、アルミニウム、カルシウム、亜鉛、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン及びプロカインの塩を含む。以後本発明の化合物の言及は、式(I)の化合物及びそれらの医薬として許容し得る塩の両方を含む。
【００３７】
アルキル、アルケニル、及びアルキニル基は、直鎖又は分枝鎖であってもよい。
アルキル基の例を挙げると、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル及びn-ブチルなどのC1-C4アルキル基がある。表現「アルキレン」は、用語「アルキル」に従って解釈されることができる。
アルケニル基の例を挙げると、エテニル、n-プロペニル、i-プロペニル及びn-ブテニルなどのC2-C4アルキル基がある。
【００３８】
本明細書中に使用される用語「18,21-ジヒドロマクベシン」、及び「マクベシンII」(マクベシンIのヒドロキノン)は、同義的に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】マクベシンへの最初の推定酵素フリー中間体、マクベシン前駆体及びポスト-PKSのプロセシングを示す、マクベシンの代表的生合成。図中のPKSプロセシング工程のリストは、事象の順番を表すことは意図されていない。クラスター内の特定の遺伝子について、下記略号を使用する：AL0−AHBA負荷ドメイン；ACP−アシルキャリヤタンパク質；KS-β-ケトアシルシンターゼ;AT−アシル転移酵素；DH−脱水酵素；ER−エノイルレダクターゼ；KR−β-ケトレダクターゼ。
【図２】マクベシンを生成するための、マクベシン前駆体のポスト-PKSプロセシング部位の説明。
【図３】プラスミドpLSS308が、mbcM遺伝子破壊を生じる相同組換えにより染色体に組込まれた、操作された菌株BIOT-3806作出の図表示。
【図４】実施例4に記載したmbcMのインフレーム欠失の構築の図示。
【図５】mbcP、mbcP450、mbcMT1、及びmbcMT2遺伝子が、mbcMの欠失に伴ってインフレーム欠失させられたアクティノシンネマ・プレチオスム(Actinosynnema pretiosum)株の産生の図示。
【図６】A:ヒト血液における20〜17のインビトロ変換。  B: マウス血液における20〜17のインビトロ変換。
【図７】A:10mg/kgで20を経口投与した後のマウス血漿中における17の薬動学。  B:3mg/kgで20を静脈内投与した後のマウス血漿中における20及びその代謝産物17の薬動学。
【図８】化合物20、21、22及び23の化学構造。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
(発明の説明)
本発明は、C21-デオキシアンサマイシン薬剤候補の物理特性を改善、例えば、プロドラッグ前駆体を使用することによる水溶性及び/又は生物学的利用能を改善するための戦略を提供する。これらのプロドラッグは、活性親薬剤を放出するために酵素加水分解を受けることができ、又はそれらは、自己開裂を受けることができる。
【００４１】
理論によって制限されることはないが、少なくとも幾つかの実施態様において、本発明は、C21-デオキシアンサマイシンの誘導体に活性薬剤放出方法を提供することを意図する。活性薬剤は、基質構造によって制御される速度で放出される。
このアプローチは、分子内環化-脱離反応を介して生理的pHで誘発する、組込まれたアミノ側鎖の自己開裂を利用すべきである。カルバマート官能基の末端アミノ基による前記分子内攻撃は、環状尿素断片を生成し、それによって親薬剤の放出を生じると予想される。
【００４２】
薬剤放出速度は、外部の影響よりもむしろ化学的環化速度定数(従ってpH)及び付随する置換基によって支配されるであろう。
【００４３】
カルバマート基を含む本発明の化合物は、化学的に媒介された自己開裂が可能であることが予想されるが、それらが酵素開裂のための基質であることも可能であり、これも本発明の範囲内に包含される。別の実施態様において、本発明は、リン酸誘導体であるC21-デオキシアンサマイシンの誘導体を提供する。これらの誘導体は、酵素加水分解に依存して活性親薬剤を放出すると考えられ、及び/又はそれ自身生物活性であってもよい。
【００４４】
従って、本発明は、上記に示したようにC21-デオキシアンサマイシンの誘導体、これらの化合物の製造方法、その中間体及び医薬品におけるこれらの化合物の使用方法を提供する。
【００４５】
式IA-ICの化合物の一例セットにおいて、R10は、Me又はEtを表す。式IA-ICの化合物の一例セットにおいて、R14は、C1-4分枝又は直鎖アルキル基を表す。式IA-ICの化合物の一例セットにおいて、R10はMe又はEtを表し、R14はC1-4分枝又は直鎖アルキル基を表す。
【００４６】
適切には、R1はHを表し、あるいは、適切には、R1はOMeを表す。
適切には、R2はOHを表し、あるいは、適切には、R2はOMeを表す。
適切には、R3は、OMeを表す。
適切には、R4はHを表す。あるいは、適切には、R4はOMeを表すことができる
適切には、R5は、Hを表す。
適切には、R6は、Hを表す。
適切には、R7は、Hを表す。
適切には、R8は、-C(O)-NH2を表す。
適切には、R9は、
【化６】
2010520190.tif 000008
を表す。
適切には、R15は、Hを表す。あるいは、R15は、Me又はEtを表す。
適切には、R9が上述のリン酸基又は対応するエステル基を表すときに、式(I)の化合物は、例えばナトリウムなどのアルカリ金属を有するモノ又はジ塩基性塩として提供されることができる。
あるいは、適切には、R9は、
【化７】
2010520190.tif 000009
を表す。
【００４７】
適切には、R10は、Meを表す。あるいは、適切にはR10は、Etを表す。
適切には、R14は、Meを表す。あるいは、適切にはR14は、Etを表す。
適切には、R11は、Hを表す。適切には、R12は、Hを表す。あるいは、適切にはR13は、Hを表す。
R11及びR12又はR12及びR13は、6員炭素環を形成するために結合される。該環は、適切にはシクロヘキシル環とすることができる。
適切には、n = 0である。
【００４８】
例えば、nは0を表すことができ、R12及びR13はそれぞれHを表すことができ、R10及びR14はそれぞれMeを表すことができる。あるいは、nは0を表すことができ、R12及びR13はそれぞれHを表すことができ、R10及びR14はそれぞれEtを表すことができる。
【００４９】
あるいは、nは1を表すことができ、R11、R12及びR13はそれぞれHを表すことができ、R10及びR14はそれぞれMeを表すことができる。
【００５０】
本発明の一実施態様において、化合物は、式(IA)の化合物である。本発明の別の実施態様において、化合物は、式(IB)の化合物である。本発明の別の実施態様において、化合物は、式(IC)の化合物である。
【００５１】
本発明の一実施態様において、適切には、化合物は、式(IA)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R4はHを表し、R5はHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表す。
【００５２】
適切には、化合物は、式(IA)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R4はHを表し、R5はHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化８】
2010520190.tif 000010
を表し、R15はHを表す。例えば、下記構造によって表されるものである。
【化９】
2010520190.tif 000011
【００５３】
適切には、化合物は、式(IA)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R4はHを表し、R5はHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化１０】
2010520190.tif 000012
を表し、R15はHを表す。例えば、下記構造によって表されるものである。
【化１１】
2010520190.tif 000013
【００５４】
本発明の別の実施態様において、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R1はHを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表す。
【００５５】
適切には、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R1はHを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化１２】
2010520190.tif 000014
を表し、R15はHを表す。例えば、下記構造によって表されるものである。
【化１３】
2010520190.tif 000015
【００５６】
適切には、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンの一ナトリウム塩であり、R1はHを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化１４】
2010520190.tif 000016
を表し、R15はHを表す。例えば、このナトリウム塩は、下記構造によって表される。
【化１５】
2010520190.tif 000017
【００５７】
本発明の別の実施態様において、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R1はOMeを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表す。
【００５８】
適切には、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R1はOMeを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化１６】
2010520190.tif 000018
を表し、R15はHを表す。例えば、下記構造によって表される。
【化１７】
2010520190.tif 000019
【００５９】
適切には、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンの一ナトリウム塩であり、R1はOMeを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化１８】
2010520190.tif 000020
を表し、R15はHを表す。例えば、このナトリウム塩は、下記構造によって表される。
【化１９】
2010520190.tif 000021
【００６０】
あるいは適切には、化合物は、式(IA)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R4はHを表し、R5はHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化２０】
2010520190.tif 000022
を表し、R10はMeを表し、R12はHを表し、R13はHを表し、R14はMeを表し、n=0である。例えば、下記構造によって表されるものである。
【化２１】
2010520190.tif 000023
【００６１】
適切には、化合物は、式(IA)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R4はHを表し、R5はHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化２２】
2010520190.tif 000024
を表し、R10はEtを表し、R12はHを表し、R13はHを表し、R14はEtを表し、n=0である。例えば、下記構造によって表されるものである。
【化２３】
2010520190.tif 000025
【００６２】
適切には、化合物は、式(IA)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R4はHを表し、R5はHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化２４】
2010520190.tif 000026
を表し、R10はMeを表し、R11はHを表し、R12はHを表し、R13はHを表し、R14はMeを表し、n=1である。例えば、下記構造によって表されるものである。
【化２５】
2010520190.tif 000027
【００６３】
適切には、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R1はHを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表す。
【００６４】
適切には、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R1はHを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化２６】
2010520190.tif 000028
を表し、R10はMeを表し、R12はHを表し、R13はHを表し、R14はMeを表し、n=0である。例えば、下記構造によって表されるものである。
【化２７】
2010520190.tif 000029
【００６５】
適切には、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R1はHを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化２８】
2010520190.tif 000030
を表し、R10はMeを表し、R11はHを表し、R12はHを表し、R13はHを表し、R14はMeを表し、n=1である。例えば、下記構造で表されるものである。
【化２９】
2010520190.tif 000031
【００６６】
適切には、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R1はHを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化３０】
2010520190.tif 000032
を表し、R10はEtを表し、R12はHを表し、R13はHを表し、R14はEtを表し、n=0である。例えば、下記構造によって表されるものである。
【化３１】
2010520190.tif 000033
【００６７】
本発明の別の実施態様において、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R1はOMeを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表す。
【００６８】
適切には、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R1はOMeを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化３２】
2010520190.tif 000034
を表す。
【００６９】
適切には、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R1はOMeを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化３３】
2010520190.tif 000035
を表し、R10はMeを表し、R12はHを表し、R13はHを表し、R14はMeを表し、n=0である。例えば、下記構造によって表されるものである。
【化３４】
2010520190.tif 000036
【００７０】
適切には、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R1はOMeを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化３５】
2010520190.tif 000037
を表し、R10はMeを表し、R11はHを表し、R12はHを表し、R13はHを表し、R14はMeを表し、n=1である。例えば、下記構造によって表されるものである。
【化３６】
2010520190.tif 000038
【００７１】
適切には、化合物は、式(IB)のC21-デオキシアンサマイシンであり、R1はOMeを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8は-C(O)-NH2を表し、R9は
【化３７】
2010520190.tif 000039
を表し、R10はEtを表し、R12はHを表し、R13はHを表し、R14はEtを表し、n=0である。例えば、下記構造によって表されるものである。
【化３８】
2010520190.tif 000040
【００７２】
アンサマイシン環に対して側鎖の立体化学は、好ましくは天然アンサマイシンポリケチドのそれに従う(すなわち、マクベシン−図1及び2を参照;ゲルダナマイシン;ハービマイシンA;レブラスタチン−例えば、下記実施例2の構造17を参照)。
【００７３】
式(I)の化合物は、例えば、下記化合物のうちの1つの誘導体を表すことができる:
●C21-デオキシマクベシン又は類似体(式(IA), R9はHを表す);
○実施例2に記載され、かつWO2007/074347(そこでは化合物14記載される)において強力なHsp90阻害剤であることが示された化合物17など(式(IA), R4はHを表し、R5はHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8はC(O)NH2を表し、R9はHを表す。
●C21-デオキシゲルダナマイシン又は類似体(式(IB), R9はHを表す);
●C21-デオキシハービマイシンA、B若しくはC又は類似体(式(IC), R9はHを表す);
●レブラスタチン(Reblastatin)又は類似体(式(IB), R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R9はHを表す)。
○例えば、レブラスタチン(12)(式(IB), R1はOMeを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8はC(O)NH2を表し、R9はHを表す)。
●オートリチマイシン(13)(式(IB), R1はHを表し、R2はOHを表し、R6はHを表し、R7はHを表し、R8はC(O)NH2を表し、R9はHを表す)。
【００７４】
一般に、本発明の化合物は、化合物のアンサマイシンファミリーのC21-デオキシ類似体の半合成の誘導体化によって製造される。
【００７５】
式(I)の化合物又はその医薬として許容し得る塩の製造方法は、以下を含む:
(a) 式(IIA)、(IIB)又は(IIC)の化合物又はその保護誘導体を
【化３９】
2010520190.tif 000041
(式中、Lは脱離基である)
式(V)の化合物
【化４０】
2010520190.tif 000042
(式中、Pは保護基を表す)
と反応させることによって、式(I)の化合物を調製すること:又は
(b) 式(IIIA)、(IIIB)若しくは(IIIC)の化合物又はその保護誘導体を
【化４１】
2010520190.tif 000043
リン酸化試薬と反応させることによって、式(I)の化合物を調製すること;又は
(c) 式(I)の化合物又はその塩を、式(I)の別の化合物又はその別の医薬として許容し得る塩に変換すること;又は
(d) 式(I)の保護化合物を脱保護することである。
【００７６】
前述において、式(IIIA)、(IIIB)及び(IIIC)の化合物を集合的に式(III)の化合物と呼び、かつ式(IIA)、(IIB)及び(IIC)の化合物を集合的に式(II)の化合物と呼ぶ。
【００７７】
工程(a)において、脱離基Lの例を挙げると、ハロゲン(例えば塩素、臭素)、アルコキシ(例えばC1-4アルコキシ)、アリール(例えば4-ニトロフェノキシなどのフェノキシ又は置換フェノキシ)、又はアルキルアリール(例えばC1-4アルキルアリール、例えばベンジルオキシ)がある。好ましくは、Lは、4-ニトロフェノキシを表す。保護基Pの例を挙げると、置換カルバマート(例えば、BOC(すなわち、t-ブチルオキシカルボニル)保護基又はTROC(すなわち、2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル)保護基)などの、アミンに適していることが公知のものである。好ましくは、保護基Pは、トリチル基である。
【００７８】
式(II)の化合物と式(V)の化合物との反応は、それ自体はカルバマート形成として知られている従来の条件下、例えば、ジクロロメタンなどの不活性溶媒中、成分の還流下で実行されることができる。
【００７９】
式(II)の化合物、又はその保護誘導体は、式IIIA〜IIICの化合物、又はその保護誘導体を： 
【化４２】
2010520190.tif 000044
式(J)の化合物
L'-CO-L  （J）
（式中、L'は脱離基を表し、好ましくはその1つはLよりも不安定である。）
と反応させることにより、製造することができる。例証的なL'基は、上記のLに関して記載されているものである。
【００８０】
式(III)の化合物と式(J)の化合物との反応は、それ自体公知の従来の条件下、例えば、ジクロロメタンなどの不活性溶媒中、わずかに過剰量の式Jの化合物と適切な塩基とを用いて成分の還流下で実行されることができる。
【００８１】
式(V)の化合物は、当業者に公知の方法によって製造することができる。例えば、適切なジアミンを選択し、例えば、保護基としてBOC、TROC又はトリチル基、最も好ましくはトリチル基を用いて単一保護することができる。
【００８２】
本明細書中に提供される特定の方法、及び引用文献に加えて、当業者は、制限されないが「Vogelの実用有機化学の教科書(Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry)」(Furnissらの文献, 1989)、及び「マーチの高度有機化学(March's Advanced Organic Chemistry)」(Smith及びMarch, 2001)などの合成法用の標準教科書も参考にすることができる。
【００８３】
式(I)、(II)及び(III)の化合物は、C-11位で、第２のヒドロキシル基を含むことができる又は含む。これらの化合物をC-18ヒドロキシルだけで誘導体化するために、最初にC-11ヒドロキシルを修飾(すなわち、保護)する必要がある場合がある。ゲルダナマイシンについて、それを達成する方法を後述する。しかし、当業者は、それらを、親化合物がC-11でOH基を含む式(I)、(II)及び(III)の他の化合物に等しく適用することができることを認めるであろう。
【００８４】
当業者に理解されるように、必要であれば、本発明の化合物及び中間化合物の合成に、一般的に保護基を使用することができる。
【００８５】
式(III)の化合物を、様々な三価又は五価リン酸化誘導体と反応させることができる。
【００８６】
式(III)の化合物を三価リン酸化試薬(例えば三塩化リン(塩化リン(III)又はホスホアミデート)と反応させる場合、その後得られる亜リン酸は、過酸化水素又は有機過酸化物などの適切な酸化剤で五価リン酸に酸化することを必要とする。
【００８７】
式(III)の化合物を、一般に定義P(=O)(OR16)(OR17)L
【化４３】
2010520190.tif 000045
（式中、LはClなどの脱離基を表し、R16及びR17はアルキル、アルケニル、アルキルアリール、又はベンジル、アリル、パラメトキシベンジルなどアリール基から選択される）によって提供される五価リン酸化試薬と反応させることができ、酸又は水素化分解での処置を含む当業者に公知の方法によって、リン酸基を提供するためにその後に除去される。）。
【００８８】
式(III)の化合物を、一般に定義P(=O)L3
【化４４】
2010520190.tif 000046
（LがClなどの脱離基を表す。）によって提供される五価リン酸化試薬と反応させることができる。その後、この反応生成物を、過剰なL基を取り除くために、アルコール又は水によってクエンチすることができる。
【００８９】
典型的なリン酸化試薬は、塩化ホスホリルであり、適切な溶媒中、適切な温度で溶解した式(III)の化合物と反応させることができる。それは、適切な塩基でも処理される。好ましくは、塩基は、トリエチルアミン又は水素化ナトリウムである。
【００９０】
好ましくは、温度は、30℃以下、−78℃以上、好ましくは−10℃以上である。更なる求核試薬、例えば、アルキル若しくはアリールアルコール、より好ましくは水を、上記の反応混合物に加える。
【００９１】
リン酸エステルは、当業者に公知の方法によって、リン酸から調製されることができる。
【００９２】
式Iの化合物に関して、R9が
【化４５】
2010520190.tif 000047
である場合、様々な塩を形成することができる。当業者に公知である、それを行う多くの方法がある。XOH、XH若しくはXOMe(式中、X = 一価カチオンである)、又はYH2若しくはY(OH)2(式中、Y =二価カチオン)などの塩基の添加である。あるいは、塩は、イオン交換カラムで形成されることができる。好ましくは、ナトリウム塩は、前記化合物の水溶液を、Na+充填イオン交換カラムに通すことによって形成される。
【００９３】
本明細書中に提供される特定の方法、及び引用文献に加えて、当業者は、制限されないが、「Vogelの実用有機化学の教科書(Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry)」(Furnissらの文献, 1989)、及び「マーチの高度有機化学(March's Advanced Organic Chemistry)」(Smith及びMarch, 2001)などの合成法用の標準教科書も参考にすることができる。
【００９４】
式(I)、(II)及び(III)の化合物は、C-11位で、第２のヒドロキシル基を含むことができる又は含む。C-18ヒドロキシルでのみこれらの化合物を誘導体化するために、最初にC-11ヒドロキシルを修飾(すなわち、保護)することが必要であってもよい。ゲルダナマイシンについて、それを達成する方法を後述する。しかし、当業者は、それらが、親化合物がC-11でOH基を含む式(I) 、(II)及び(III)の他の化合物に等しく適用されることができることを認めるであろう。
【００９５】
当業者に理解されるように、必要であれば、本発明の化合物及び中間化合物の合成に、一般的に保護基を使用することができる。
本発明に包含される他の化合物は、本明細書中に記載の方法、及び/又は当業者に公知の方法により製造されることができる。
【００９６】
塩形成及び交換は、当業者に公知の従来の方法によって行うことができる。式(I)の化合物の相互変換は、公知の方法により行うことができる。例えば、ヒドロキシ及びケト基を、本明細書中の他に記載したように、酸化/還元により相互変換することができる。
【００９７】
保護基の例及びそれらの除去のための手段は、T W Greene「有機合成における保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)」(J Wiley and Sons, 1991)に見出せることができる。適切なヒドロキシル保護基は、加水分解により除去することができるアルキル(例えばメチル)、アセタール(例えばアセトニド)、及びアシル(例えばアセチル又はベンゾイル)、及び触媒的水素化分解により除去することができるアリールアルキル(例えばベンジル)、又は酸性加水分解又はフッ化物イオン支援開裂により除去することができるシリルエーテルを含む。適切なアミン保護基は、必要に応じて加水分解又は水素化分解により除去することができるスルホニル(例えばトシル)、アシル(例えばベンジルオキシカルボニル又はt-ブトキシカルボニル)、及びアリールアルキル(例えばベンジル)を含む。
【００９８】
本発明の他の化合物は、本質的に知られている方法により、又は上記の方法と類似した方法により製造することができる。式IIIA〜IIICの化合物(以下「式(III)の化合物」)及びその保護誘導体は、以下のように製造されることができる:
【００９９】
最初に、鋳型としての使用のために天然C21-デオキシアンサマイシンを、所望の化合物を生産する菌株の直接的発酵を経て得ることができる。当業者は、天然物鋳型の産生及び単離に適切な条件下で、産生菌株を培養することができるであろう。表１に示す菌株は、天然物鋳型のための産生菌株の例である。当業者は、適切な条件下で同一化合物を産生するであろう利用可能な別の菌株が存在することを認識するであろう。当業者は、本発明に役立つ他の天然物鋳型を産生する菌株があることを認めるであろう。
【表１】
2010520190.tif 000048
【０１００】
あるいは、鋳型として用いることができる天然物化合物は、商業的に入手可能である。
【０１０１】
あるいは、C21-デオキシアンサマイシン鋳型は、適当な生合成経路の遺伝子工学によって生成することができる。この種の化合物を作る公表されている方法を、表2に示す。
【表２】
2010520190.tif 000049
【０１０２】
あるいは、C21-デオキシアンサマイシン鋳型は、例えば、表2に示す化合物の生成に用いられる方法、又は本明細書中に記載されている方法などの遺伝子工学方法を、表3に示すものなどのアンサマイシンポリケチドの生合成経路に利用することによって生成することができる。
【表３】
2010520190.tif 000050
【０１０３】
表3に示す菌株は、天然アンサマイシンの産生菌株の例であるが、当業者は、適当な状態の下で同じ化合物を産生する別の菌株が利用可能であることを認めるであろう。
【０１０４】
この種の技術がどのように達成されることができるかという総合的な説明が以下に続き、実施例1、2及び3において使用可能になる。この種のクラスターの生合成をカバーしている配列情報を有することは必須条件でないが、これを得ることはルーチンであり、これがどのようにマクベシンクラスターに対して実現されるかという例を実施例1に記載する。
【０１０５】
さらにまた、鋳型を送達するための遺伝子操作を行うために、クラスター配列を得ることは必須ではない。例えば、突然変異誘発、続くスクリーニングの従来の方法は、化合物を提供することができ、又は実施例2に説明するように、当業者は、操作されるクラスターの任意の配列を最初に得ずに、経路を設計するために相同遺伝子群の一般公開されている配列を使用することが可能である。しかし、クラスターの配列を得ることは有利であり、実施例3は、実施例1に記載されている方法によって生成する配列がどのように化合物17の生成に用いられるかについて記載する。誘導体化のためのC21-デオキシアンサマイシン鋳型を生成するために用いることができる、パブリックドメインにおいて利用可能なクラスター配列を表4に示す。
【表４】
2010520190.tif 000051
【０１０６】
本発明の発明者らは、マクベシンの生合成を担う遺伝子クラスターをクローン化し、かつ解明するために、意義深い研究を行った。この洞察について、例えば、mbcMへの組込み、mbcM遺伝子の全部又は一部を含むマクベシンクラスター領域の標的欠失、任意に続いて遺伝子挿入によるC21-デオキシマクベシン類似体を生成するために、特にベンゾキノン部位形成の原因となる遺伝子を標的とした。C21-デオキシ類似体を生成するために、MbcMを無機能化する他の方法は、例えば、化学的抑制、部位特異的突然変異誘発、又はUVによる細胞の突然変異誘発を含む。任意に、マクベシンのポストPKS改質に関与する更なる遺伝子の標的化欠失又は削除を、誘導体化のための鋳型を生成するために行うことができる。さらに、mbcMでないいくつかのこうした遺伝子を、細胞に再導入することもできる。ポスト-PKS遺伝子の任意の標的化は、例えば、ポスト-PKS遺伝子の全て又は一部を含むマクベシンクラスター領域の組込み、標的化された欠失、任意にそれに続く遺伝子(類)の挿入、又はポスト-PKS遺伝子もしくはそれらのコードされた酵素を非-機能性とするその他の方法、例えば細胞の化学阻害、部位特異的変異誘発又はUV照射などの使用による変異誘発などの様々な機序により引き起こすことができる。
【０１０７】
本発明の化合物を酵素的又は化学的に開裂することができる場合、開裂の速度を評価する開裂分析方法は従来技術において公知であり、後述する。
【０１０８】
中間体の上記構造は、互変異性化することがあり、代表的な互変異性体が示される場合、それ及び全ての互変異性体を理解することができるであろう。例えば、エノール化合物が示される場合、ケト化合物、及びその逆も同様、が言及されることを意図する。
【０１０９】
式(II)及び(III)の新規化合物及びその保護誘導体は、本発明の態様としても請求される。
【０１１０】
一態様において、本発明は、薬剤の製造におけるC21-デオキシアンサマイシン誘導体の使用を提供する。更なる実施態様において、本発明は、癌及び/又はB-細胞性悪性腫瘍の治療のための薬剤の製造におけるC21-デオキシアンサマイシン誘導体の使用を提供する。更なる実施態様において、本発明は、マラリア、真菌感染、中枢神経系の疾患、血管形成に依存する疾患、自己免疫疾患の治療のため、及び/又は癌の予防的前処置としての薬剤の製造における、C21-デオキシアンサマイシン誘導体の使用を提供する。
【０１１１】
別の態様において、本発明は、医薬品におけるC21-デオキシアンサマイシン誘導体の使用を提供する。更なる実施態様において、本発明は、癌及び/又はB-細胞性悪性腫瘍の治療におけるC21-デオキシアンサマイシン誘導体の使用を提供する。更なる実施態様において、本発明は、マラリア、真菌感染、中枢神経系の疾患及び神経変性疾患、血管形成に依存する疾患、自己免疫疾患の治療のため、及び/又は癌の予防的前処置としての薬剤の製造における、C21-デオキシアンサマイシン誘導体の使用を提供する。
【０１１２】
更なる実施態様において、本発明は、癌及び/又はB-細胞性悪性腫瘍の治療方法であって、その必要がある患者に、治療有効量のC21-デオキシアンサマイシン誘導体を投与することを含む、前記方法を提供する。更なる実施態様において、本発明は、マラリア、真菌感染、中枢神経系の疾患及び神経変性疾患、血管形成に依存する疾患、自己免疫疾患の治療方法、及び/又は癌の予防的前処置の方法であって、その必要がある患者に、治療有効量のC21-デオキシアンサマイシン類似体を投与することを含む、前記方法を提供する。
【０１１３】
前述のように、本発明の化合物は、癌及び/又はB-細胞性悪性腫瘍の治療に有用であると予想することができる。本発明の化合物、特に、Hsp90に対する優れた選択性及び/又は優れた毒物学プロフィール及び/又は優れた薬物動態を有する可能性があるものはまた、他の適応症(例えば、それだけには限らないが、マラリア、真菌感染、中枢神経系の疾患及び神経変性疾患、血管形成に依存する疾患、関節リウマチなどの自己免疫疾患)の治療において、あるいは癌のための予防的前処置として有効である可能性がある。
【０１１４】
また、他の状態の治療におけるアンサマイシン化合物の有用性は、制限されないが、心不全及び脳卒中の治療(US 6,174,875、WO 99/51223)、繊維形成障害の治療(WO 02/02123)、再狭窄の治療又は予防(WO 03/079936)、タンパク質凝集及びアミロイド機能に関連した疾患の治療又は予防(WO 02/094259)、末梢神経損傷の治療及び神経再生の促進(WO 01/03692、US 6,641,810、EP 1 024 806、US 2002/0086015、US 6,210,974、WO 99/21552、US 5,968,921)、及び血管新生の阻害(WO 04/000307)などである。また、本発明の化合物を含む使用及び方法は、これらの他の表示にまで及ぶ。
【０１１５】
中枢神経系疾患及び神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、プリオン病、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)及び筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含むが、これらに限定されるものではない。
血管新生依存性疾患は、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症及び様々な他の眼科疾患、アテローム硬化症及び関節リウマチを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１１６】
自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、1型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡及び乾癬を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１１７】
「患者」は、ヒト及び他の動物(特に哺乳動物)対象、好ましくはヒトの対象を包含する。したがって、本発明のC21-デオキシアンサマイシン類似体の方法及び使用は、ヒト及び家畜の医薬品(好ましくはヒトの医薬品)に有用である。
【０１１８】
好ましい実施態様において、本発明は、癌の治療に有用性がある化合物を提供する。当業者は、単調な実験により、腫瘍細胞増殖を阻害するこれらの化合物の能力を測定することができるであろう(Tianらの論文, 2004； Huらの論文 2004； Denglerらの論文, 1995を参照されたい。)。
【０１１９】
また、本発明は、医薬として許容し得る担体とともに、アンサマイシン誘導体又はその医薬として許容し得る塩を含む医薬組成物を提供する。
【０１２０】
臨床試験中である、又は臨床試験が行われた、ある種の既存のアンサマイシンHsp90阻害因子(ゲルダナマイシン及び17AAGなど)は、不十分な薬理学的プロフィール、不十分な水溶性、及び不十分な生体利用効率を有する。本発明は、溶解性及び/又は生物学的利用能などの特性を改良した新規C21-デオキシアンサマイシン誘導体を提供する。当業者は、標準的方法を用いて本発明の所定の化合物の溶解性を容易に測定することができるであろう。代表的な方法は、本明細書の実施例に示す。
【０１２１】
さらに、当業者は、制限されないが、下記及びEgorin MJらの論文, (2002)に記載される方法などの当業者に公知のインビボ及びインビトロ方法を用いて、本発明の化合物の薬物動態及び生物学的利用能を測定することができる。化合物の生物学的利用能は、様々な要因(例えば水溶性、腸内の吸収速度、タンパク質結合の範囲、及び代謝)により測定され、その各々は、下記のように、インビトロ試験により測定され得る。これらの要因の1以上の改善が、化合物の生物学的利用能の改善を導くであろうことは、当業者により理解されるであろう。また、化合物の生物学的利用能は、さらに詳細に下に記載されるようなインビボ方法を用いて測定することができる。
【０１２２】
(インビトロアッセイ)
a)Caco-2 浸透アッセイ
24ウェルCorning Costar Transwell構成中の集密的Caco-2細胞(Li, A.P., 1992； Grass, G.M.らの論文, 1992, Volpe, D.A.らの論文, 2001)を使用し、本明細書中に記載の方法を用いて、化合物の透過性及び流出速度を明らかにする。適切な構成は、In Vitro Technologies Inc. Baltimore, Maryland, USAにより提供されるものを含む。適切な構成において、頂端のチャンバーは、0.15 mL HBBS pH 7.4、1% DMSO、0.1 mM Lucifer Yellowを含み、かつ底部のチャンバーは、0.6 mL HBBS pH 7.4、1% DMSOを含む。コントロール及び試験アッセイを、加湿インキュベーター中、130 rpmで振盪させて、37℃でインキュベートする。Lucifer Yellowは、傍細胞経路のみ(すなわち、タイトジャンクション間)を介して透過することができ、Lucifer Yellowに関して、高い見かけ上の透過率(Apparent Permeability)(Papp)は、アッセイ間の細胞損傷を示し、かつ全てのそのようなウェルは、排斥される。親化合物に加えて、適切な参照コントロールは、公知の輸送効果のない良い受動透過を有するプロプラノロール、及びP-糖タンパク質による活性な流出により減衰される乏しい受動透過を有するアセブタロールを含む。
【０１２３】
化合物は、片側方向及び双方向構成内で、頂端又は底部チャンバー内に化合物を適用することにより試験される(0.01 mMで)。頂端又は底部チャンバー内の化合物を、LC-MSにより分析する。結果を、見かけ上の透過率Papp, (nm/s)として、及び流出比(A〜B 対 B〜A)として表す。
【数１】
2010520190.tif 000052
ボリュームアクセプター:0.6mL(A＞B)及び0.15mL(B＞A)
単層の面積: 0.33cm2
Δ時間:60分
【０１２４】
流出比の正の値は、細胞の頂端面から活性な流出を示す。従って、改善された生物学的利用能は、その親分子と比べて、本発明の化合物に関して増加したPapp、及び/又は低下した流出比により、上記アッセイにおいて示される。
【０１２５】
b)ヒト肝臓ミクロソーム(HLM)の安定性アッセイ
増加した代謝安定性も、改善される生物学的利用能に関連し、これは、例えば、下記に示すようなHLMアッセイを用いて測定することができる。肝臓ホモジネートは、CYP450s(例えばCYP2C8、CYP2D6、CYP1A、CYP3A4、CYP2E1)、エステラーゼ、アミダーゼ、及びフラビンモノオキシゲナーゼ(FMOs)などの第一相(酸化)酵素に対する化合物固有の脆弱性の測定を提供する。
【０１２６】
化合物の半減期(T1/2)は、ヒト肝臓ミクロソームに曝した状態で、LC-MSにより長時間に渡ってそれらの消失をモニタリングすることにより測定することができる。0.001 mMの化合物を、0.25 mg/mLタンパク質の肝臓ヒトミクロソームの細かい細胞分画(sub-cellular fraction)、及び補助因子として飽和濃度のNADPHとともに、40分間37℃、0.1 M トリス-HCl, pH 7.4でインキュベートする。指定時間間隔で、試験試料にアセトニトリルを加え、タンパク質を沈殿させ、かつ代謝を停止させる。試料を遠心し、かつ親化合物に関して分析する。
【０１２７】
改善された生物学的利用能は、上記アッセイにおいて、親化合物と比べて増加したT1/2により示される。
【０１２８】
(インビボアッセイ)
また、インビボアッセイを使用して、化合物の生物学的利用能を測定することができる。一般に、化合物を試験動物(例えばマウス又はラット)に、腹腔内(i.p.)又は静脈内(i.v.)、及び経口(p.o.)、双方で投与し、血液試料を定期的間隔で採取し、長時間に渡って、その薬剤の血漿濃度がどのくらい変動したかを調査する。長時間に渡る血漿濃度の経時変化を使用して、該化合物の絶対的生物学的利用能を、標準モデルを用いてパーセンテージとして計算することができる。典型的プロトコルの例を下に記載する。
【０１２９】
マウスに、本発明の化合物又は親化合物1、10、又は75 mg/kgをi.p.、i.v.、又はp.oで投与する。血液試料を5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、360、420、及び2880分で採取し、かつ該試料中の本発明の化合物の濃度をHPLCを介して測定する。次に、血漿濃度の経時変化を使用して、重要なパラメータ、血漿濃度時間曲線(AUC−体循環に至る不変薬剤の全量に正比例する)下の面積、最大(ピーク)血漿薬剤濃度、最大血漿薬剤濃が生じる時間(ピーク時間)、生物学的利用能の正確な測定に使用される付加的要因(化合物の終末半減期、全身クリアランス、分布の定常状態容量(steady-state volume of distribution)、及びF%を含む)などを導き出すことができる。次に、これらのパラメータを、ノンコンパートメント法、又はコンパートメント法により分析し、この種の方法の例に関して、計算されたパーセンテージの生物学的利用能を与える(この種の方法の例について、Egorinらの論文2002、及び本明細書中の引用文献を参照されたい。)。
【０１３０】
前述の本発明の化合物又はそれらの製剤は、いずれかの通常の方法により投与することができ、例えばこれらは、非経口的(静脈内投与を含む)、経口、局所的(口腔内、舌下又は経皮を含む)、医療用具を介して(例えばステント)、吸入によるか、又は注射により(皮下又は筋肉内)投与されるが、これらに限定されるものではない。本治療は、単回投与又はある期間に渡った反復投与によりなることができる。
【０１３１】
本発明の化合物は、単独で投与することが可能であるが、1種以上の許容し得る担体と共に、医薬製剤として与えることが好ましい。従って、本発明の化合物を、1種以上の医薬として許容し得る希釈剤又は担体と一緒に含有する医薬組成物が提供される。希釈剤(類)又は担体(類)は、本発明の化合物と相溶性がありかつそれらのレシピエントに有害でないという意味で、「許容でき」なければならない。好適な担体の例は、以下により詳細に説明される。
【０１３２】
本発明の化合物は、単独で又は他の治療薬と組合せて投与されてよい。2種(又はそれよりも多い)薬剤の同時投与は、使用される各々の投与量を著しく低くすることができ、これにより認められる副作用を軽減する。本発明の化合物はまた、疾患が抵抗性となった従来の療法の影響に、癌などの疾患の再感作を許容し得る。1種以上の医薬として許容し得る希釈剤又は担体と一緒に、本発明の化合物及び更なる治療薬を含有する医薬組成物も提供される。
【０１３３】
更なる態様において、本発明は、細胞傷害性薬物又は細胞増殖抑制薬のような、癌又はB-細胞性悪性腫瘍の治療のための第二の薬剤のような、第二の薬剤との併用における本発明の化合物の使用を提供する。
【０１３４】
一実施態様では、本発明の化合物は、別の治療薬(例えば、癌又はB細胞腫瘍の治療のための、細胞毒性又は細胞増殖抑制性薬剤などの治療薬)と共に同時投与される。更なる薬剤の例は、細胞傷害性薬物、例えばアルキル化剤及び有糸分裂阻害剤(トポイソメラーゼII阻害剤及びチューブリン阻害剤を含む)である。更なる薬剤のその他の例は、DNA結合剤、代謝拮抗薬及び細胞増殖抑制薬、例えばプロテインキナーゼ阻害剤及びチロシンキナーゼ受容体遮断薬がある。適切な薬剤としては、それだけには限らないが、メトトレキセート、ロイコボリン、プレニゾン、ブレオマイシン、シクロホスファミド、5-フルオロウラシル、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、タモキシフェン、トレミフェン、酢酸メゲストロール、アナストロゾール、ゴセレリン、抗HER2モノクローナル抗体(例えばトラスツズマブ、商品名Herceptin(商標))、カペシタビン、ラロキシフェン塩酸塩、EGFR阻害剤(例えばゲフィチニブ、商品名Iressa(登録商標)、エルロチニブ、商品名Tarceva(商標)、セツキシマブ、商品名Erbitux(商標))、VEGF阻害剤(例えばベバシズマブ、商品名Avastin(商標))、プロテアソーム阻害剤(例えばボルテゾミブ、商品名Velcade(商標))、又はイマチニブ、商品名Glivec(登録商標)が挙げられる。更に好適な薬剤は、通常の化学療法薬、例えば、シスプラチン、シタラビン、シクロヘキシルクロロエチルニトロ尿素、ゲムシタビン、イホスファミド、ロイコボリン、マイトマイシン、ミトキサントン、オキサリプラチン、タキソールを含むタキサン、及びビンデシンなど；ホルモン療法；モノクローナル抗体療法薬;プロテインキナーゼ阻害剤、例えばダサチニブ、ラパチニブなど；ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤、例えばボリノスタットなど；血管新生阻害剤、例えばスニチニブ、ソラフェニブ、レナリドマイドなど；並びにテムシロリムスなどのmTOR阻害剤が挙げられる。
【０１３５】
加えて本発明の化合物は、非限定的に放射線治療又は手術を含む、他の療法と組合せて投与されてよい。
【０１３６】
本製剤は好都合なことに、単位剤形で示され、及び調剤技術分野において周知の任意の方法により調製されてよい。このような方法は、活性成分(本発明の化合物)の、1種以上の補助成分を構成する担体との会合をもたらす工程を含む。一般に本製剤は、活性成分の液体担体又は微細化された固形担体又は両方との会合を均質かつ密接にし、その後必要ならば生成物を造形することで、調製される。
【０１３７】
本発明の化合物は、任意に医薬として許容し得る剤形中の無毒の有機もしくは無機の酸もしくは塩基、付加塩の形で、活性成分を含有する医薬製剤の形で通常経口又は任意に非経口経路により投与される。治療される障害及び患者に加え、投与経路に応じて、本組成物は変動する投与量で投与することができる。
【０１３８】
例えば、本発明の化合物は、即時-、遅延-又は制御された放出の適用のために、矯味矯臭剤又は着色剤を含有してよい、錠剤、カプセル剤、卵形剤(ovule)、エリキシル剤、液剤又は懸濁剤の形で、経口、口腔内、又は舌下へ投与することができる。
【０１３９】
こうした錠剤は、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム及びグリシンなどの賦形剤、デンプン(好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ、又はタピオカデンプン)、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、及び特定の複合ケイ酸塩などの崩壊剤、並びにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、スクロース、ゼラチン、及びアカシアなどの造粒結合剤を含有することが可能である。加えて、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル及びタルクのような滑沢剤を含んでよい。
【０１４０】
また、類似のタイプの固体組成物を、ゼラチンカプセル中の充填剤として用いることができる。これに関する好ましい賦形剤は、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖又は高分子量ポリエチレングリコールを含む。水性懸濁剤及び/又はエリキシル剤については、様々な甘味料又は香味剤、着色料又は色素と、また、乳化剤及び/又は懸濁剤と、また、水、エタノール、プロピレングリコール、及びグリセリンなどの希釈剤、並びにこれらの組み合わせと、本発明の化合物を組み合わせることができる。
【０１４１】
錠剤は、任意に1種以上の補助成分と共に、圧縮又は成形により作製することができる。圧縮錠剤は、適切な機械内で、粉末又は顆粒などの自由に流動できる形の活性成分を、結合剤(例えばポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤(例えばデンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム)、界面活性又は分散剤と任意に混合し、圧縮することによって調製することができる。成形錠は、不活性液体希釈剤で湿潤された粉末化された化合物の混合物を好適な装置において成形することにより作製することができる。これらの錠剤は、任意にコートされるか又は刻み目を入れることができ、かつ所望の放出プロフィールを提供するために例えば変動する割合でヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用し、活性成分の遅延放出又は制御放出を提供するために製剤することができる。
【０１４２】
経口投与に適した本発明の製剤は、各々予め決定された量の活性成分を含有する、カプセル剤、カシェ剤又は錠剤のような個別の単位として；散剤又は顆粒剤として；水性液体又は非水性液体中の液剤又は懸濁剤として；もしくは、水中油型液体乳剤又は油中水型液体乳剤として、提供されてよい。本活性成分は、ボーラス、舐剤又はペースト剤としても提供されてよい。
【０１４３】
口内の局所投与に好適な製剤は、通常ショ糖及びアカシアゴム又はトラガカントガムの香料基剤中に活性成分を含有する、トローチ剤；不活性ベース(ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアなど)中に活性成分を含む香錠;並びに、好適な液体担体中に活性成分を含有する、含嗽剤を含む。
【０１４４】
本発明の製剤は、前述の特定の構成成分に加え、問題の剤型に関する当該技術分野において通常の他の作用物質を含有することができることは理解されなければならず、例えば、経口投与に適したものは、矯味矯臭剤を含有してよい。
【０１４５】
局所投与に適合された医薬組成物は、軟膏剤、クリーム剤、懸濁剤、ローション剤、散剤、液剤、ペースト剤、ゲル剤、含浸包帯、スプレー剤、エアロゾル剤又は油剤、経皮デバイス、粉剤などとして製剤されてよい。これらの組成物は、活性物質を含む通常の方法により調製されてよい。従ってこれらは、相溶性のある通常の担体及び添加剤、例えばクリーム剤又は軟膏剤中の保存剤、薬物の透過を補助する溶媒、緩和剤など、並びにローション剤中のエタノール又はオレイルアルコールなどを含有することもできる。このような担体は、組成物の約1％から最大約98％で存在してよい。より一般的には、これらは組成物の最大約80％を形成する。単なる例証として、クリーム剤又は軟膏剤は、所望の稠度を有するクリーム剤又は軟膏剤を作製するのに十分な量で、化合物を約5〜10重量％含有する、親水性物質及び水の十分な量を混合することにより調製される。
【０１４６】
経皮投与に適合された医薬組成物は、長時間、レシピエントの表皮と密接に接触し続けることが意図された個別の貼付剤として提供されてよい。例えば、活性物質は、イオン導入法により貼付剤から送達されてよい。
【０１４７】
例えば口及び皮膚のような外部組織への適用に関して、本組成物は、局所用軟膏剤又はクリーム剤として適用されることが好ましい。軟膏剤として製剤される場合、活性物質は、パラフィン系又は水混和性のいずれかの軟膏基剤と共に使用することができる。
【０１４８】
あるいは、この活性物質は、水中油型クリーム基剤又は油中水型基剤と共に、クリーム剤に製剤されてもよい。
【０１４９】
非経口的投与に関して、活性成分、並びに無菌ビヒクル、例えば水、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油など(水が好ましい)であるが、これらに限定されないものを用いて、流体単位剤形が調製される。この活性成分は、使用されるビヒクル及び濃度に応じて、ビヒクル中に懸濁されるか又は溶解されるかのいずれかであることができる。溶液の調製において、活性成分は、注射用水に溶解され、濾過滅菌され、その後好適なバイアル又はアンプルに充填され、密封される。
【０１５０】
有利なことに、局所麻酔薬、保存剤及び緩衝剤などの作用物質を、このビヒクルに溶解することができる。安定性を増強するために、本組成物は、バイアルへの充填後に凍結し、かつ真空下で水を除去することができる。次に無水の凍結乾燥された粉末は、バイアル中で密封され、使用前に液体を再構成するように、注射用水のバイアルを伴って供給されてよい。
【０１５１】
非経口懸濁剤は、活性成分が、溶解される代わりにビヒクル中に懸濁されること及び滅菌を濾過により実現できないこと以外は、液剤と実質的に同じ様式で調製される。本活性成分は、無菌ビヒクル中へ懸濁される前に、エチレンオキシドへ曝露することにより滅菌することができる。有利なことに、活性成分の均質な分布を促進するために、本組成物中に界面活性剤又は湿潤剤が含まれる。
【０１５２】
本発明の化合物は、当該技術分野において公知の医療用具を用いて投与されてもよい。例えばひとつの実施態様において、本発明の医薬組成物は、US 5,399,163；US 5,383,851；US 5,312,335；US 5,064,413；US 4,941,880；US 4,790,824；又は、US 4,596,556に開示された装置のような、無針皮下注射装置により投与することができる。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例は、以下のものを含む：US 4,487,603は、投薬を制御された速度で分配するための、植え込み可能な微量注入ポンプを開示している；US 4,486,194は、皮膚を通る医薬品の投与のための治療装置を開示している；US 4,447,233は、正確な注入速度で投薬を送達するための投薬用注入ポンプを開示している；US 4,447,224は、連続薬物送達のための可変流量の植え込み可能な注入器具を開示している；US 4,439,196は、マルチ-チャンバーコンパートメントを備える浸透圧式薬物送達システムを開示している；並びに、US 4,475,196は、浸透圧式薬物送達システムを開示している。多くの他のインプラント、送達システム、及びモジュールが、当業者に公知である。
【０１５３】
本発明の化合物の投与される用量は、特定の化合物、関連する疾患、対象、並びに疾患の性質及び重症度、並びに対象の生理的状態、並びに選択された投与経路に従い変動する。適量は、当業者により容易に決定され得る。
【０１５４】
本組成物は、投与方法に応じて、本発明の化合物を0.1重量％以上、好ましくは5〜60％、より好ましくは10〜30重量％含有する。
【０１５５】
当業者により、本発明の化合物の最適量及び個々の投薬の間隔は、治療される状態の性質及び程度、剤型、投与経路及び部位、並びに治療される特定の対象の年齢及び状態により決定されること、並びに医師が使用されるべき適量を最終的に決定することは認められるであろう。この投薬は、適当なだけ繰り返すことができる。副作用が出現した場合には、通常の臨床の実践に従い、投薬の量及び/又は頻度を変更又は減少することができる。
【０１５６】
本発明者らの未公表の特許出願番号PCT/GB2006/050476にも記載されているように、本発明の発明者らは、本発明のプロドラッグ誘導体を生成する鋳型として用いることができるC21-デオキシアンサマイシン鋳型の製造方法を提供する。特に、C21-デオキシマクベシン類似体を製造方法を後述する。当業者によって、他のC21-デオキシアンサマイシン鋳型の生成に、類似の方法を使用することができる。
【０１５７】
マクベシンは、2段階で生合成されると考えることができる。第1段階では、コア-PKS遺伝子が、2-炭素単位の繰り返し集合体によるマクロライドコアが構築され、次いで、これが環化されて、酵素を含まない第1の中間体「マクベシン前駆体」が形成される(図1参照)。第二段階において、一連の「ポスト-PKS」を仕立てる酵素(例えば、P450モノオキシゲナーゼ、メチル基転移酵素、FAD-依存型オキシゲナーゼ及びカルバモイル基転移酵素)は、様々な追加の基をマクベシン前駆体鋳型に付加するように作用し、最終の親化合物構造を生じる(図2参照)。鋳型として用いられるC21-デオキシマクベシン類似体は、同様の方法で生合成されることができる。
【０１５８】
この生合成産生は、新規化合物の産生に適した産生菌株の遺伝子操作によって利用され得る。特に、本発明は、以下を含む、C21デオキシマクベシン類似体の製造方法を提供する:
a)適切な条件下で培養される場合にマクベシン又はその類似体を産生する第1の宿主菌株を提供することと、
b)1種以上のポスト-PKS遺伝子を欠失又は不活性化させることと(ただし、該ポスト-PKS遺伝子のうちの少なくとも1つは、mbcM又はその相同体である)、
c)C21-デオキシマクベシン類似体の生産に適した条件下で前記改質宿主菌株を培養すること;及び、
d)産生された化合物を任意に単離すること。
【０１５９】
ステップ(b)では、1種以上のポスト-PKS遺伝子(ただし、これらのポスト-PKS遺伝子のうちの少なくとも1つは、mbcM又はその相同体である)を欠失又は不活性化させることは、選択的に、適切に行われることとなる。
【０１６０】
機能性MbcMタンパク質が産生されないように、ステップb)はDNAのmbcM遺伝子(又はその同族体)への組込みによってmbcM(又はその同族体)を不活性化することを含むことができる。
【０１６１】
あるいは、ステップb)は、mbcM遺伝子又はその同族体の標的化欠失をすることを含む。あるいは、mbcM又はその同族体は、部位特異的突然変異誘発によって不活性化される。
【０１６２】
別法として、ステップa)の宿主菌株を、突然変異誘発させ、かつポストPKS酵素の１つ以上が非機能性であり、これらの少なくとも１つがMbcMである、改質された菌株を選択する。本発明はまた、mbcM又はその相同体の発現を制御する調節因子の突然変異体を包含し、当業者は、調節因子の欠失又は不活性化が、遺伝子の欠失又は不活性化と同じ結果を有する可能性があることを理解するであろう。
【０１６３】
例えば、ポストPKS遺伝子を選択的に欠失又は不活性化する方法は、以下を含む:
(i)縮重するオリゴを当該の遺伝子の相同体(1種又は複数)に基づいて(例えば、ゲルダナマイシンPKS生合成クラスターから、及び/又はリファマイシン生合成クラスターから)設計し、PCR反応においてこれらのプライマーを用いて、適切なマクベシン産生菌株から当該の遺伝子(例えばmbcM)の内部フラグメントを単離することと、
(ii)このフラグメントを含有するプラスミドを、同じ又は異なるマクベシン産生菌株に組み込み、それに続いて相同的組み換えを行うことと(これによって、標的化された遺伝子(例えばmbcM又はその相同体)の破壊がもたらされる)、
(iii)このように生成された菌株を、マクベシン類似体、すなわちC21-デオキシマクベシン類似体の生産に適している条件下で培養すること。
【０１６４】
ステップ(i)のマクベシン産生菌株は、アクチノシネマ ミルム(A. ミルム)であってもよく、ステップ(ii)のマクベシン産生菌株は、A. プレチオスムであってもよい。
【０１６５】
当業者は、等価な菌株が、上記の方法に代わる方法を用いて達成されることを認めるであろう。例えば：
・縮重するオリゴは、例えば、制限されないがA. プレチオスム又はA. ミルムなどの他のマクベシン産生菌株から、対象となる遺伝子を増幅するために用いることができる。
・マクベシン産生菌株のmcbM遺伝子又はその相同体の適切な領域を首尾よく増幅することとなる、様々な縮重するオリゴを設計することができる。
・A.プレチオスム(A. pretiosum)株のmbcM遺伝子の配列を、A.プレチオスム(A. pretiosum)のmbcM遺伝子に特異的であり得るオリゴを産生するために使用することができ、その後、内部フラグメントを、任意のマクベシン産生菌株、例えばA.プレチオスム(A.pretiosum)又はアクチノシネマ・ミルム(Actinosynnema mirum) (A.ミルム(A.mirum))から増幅することができる。
・A.プレチオスム(A. pretiosum)のmbcM遺伝子に対する縮重するオリゴを産生するために、A.プレチオスム(A. pretiosum)株のmbcM遺伝子の配列を、相同遺伝子の配列と共に使用することができ、その後、内部フラグメントを、任意のマクベシン産生菌株、例えばA.プレチオスム(A. pretiosum)又はA.ミルム(A.mirum)から増幅することができる。
【０１６６】
本発明のさらなる態様では、mbcMに加えて、さらなるポスト-PKS遺伝子も、欠失又は不活性化させることができる。図2は、マクベシン生合成クラスターにおけるポスト-PKS遺伝子の活性を示す。従って当業者は、関心対象の化合物(類)を生成する菌株に達するために、どの追加のポスト-PKS遺伝子が欠失又は失活されることが必要かを、確定することができるであろう。
【０１６７】
更なるC21-デオキシマクベシン類似体は、mbcMを含むポストPKS遺伝子の一つ以上を上記のように欠失又は不活性化し、そこに、mbcM又はその同族体を含んでいない同じポストPKS遺伝子(例えば、別のマクベシン産生菌株由来又は同じ菌株由来)の一つ以上を再導入した操作された菌株を用いて製造されることができる。
【０１６８】
例えば、C21-デオキシマクベシン類似体の製造方法は、以下を含むことができる: 
a)適切な条件下で培養される場合にマクベシンを産生する第1の宿主菌株を提供すること、
b)１以上のポスト-PKS遺伝子を欠失又は不活性化させること(ただし、該ポスト-PKS遺伝子のうちの少なくとも1つは、mbcM又はその相同体である)、
c)mbcMを含まないポスト-PKS遺伝子のいくつか又はすべてを再導入すること、
d)C21-デオキシマクベシン類似体の産生に適切な条件下で、前記改質宿主菌株を培養すること、及び
e)産生された化合物を任意に単離すること。
【０１６９】
さらに、mbcMを含む1以上のポスト-PKS遺伝子が欠失又は不活性化された操作された菌株は、それだけに制限されないがリファマイシン、アンサミトシン、ゲルダナマイシン、又はハービマイシンの生合成を誘導するクラスターを含む異種PKSクラスター由来の1以上のポストPKS遺伝子によって補完される。
【０１７０】
宿主菌株は、mbcMが欠失又は不活性化されたマクベシン産生菌株に基づく操作された菌株であってもよい。あるいは、宿主菌株は、mbcM、mbcMT1、mbcMT2、mbcP及びmbcP450が欠失又は失活されているマクベシン産生菌株を基にした操作された菌株であってよい。
【０１７１】
こうした系では、不活性化又は欠失を含めた記載した方法の1つの結果として、mbcM又はその相同体が機能しない株が産生される場合、2つ以上のマクベシン類似体が、産生され得ることを観察することができる。これに関して、当業者に理解される可能性のある理由が数多く存在する。例えば、ポスト-PKS工程の好ましい順番があり、並びにひとつの活性の除去は、全ての後続の工程が関連した酵素にとって天然でない基質上で実行されることにつながる。
【０１７２】
これは、ポスト-PKS酵素に提示された新規基質に対する効率が低下したために、中間体が培養ブロス中で構築されること、又は恐らく工程の順番が変更されたために、残りの酵素にとってもはや基質でない生成物へ短絡することにつながり得る。
【０１７３】
混合物中で観察される化合物の比は、振盪培養器における毎分回転数(rpm)及び振盪培養器の振幅の設定などの、増殖条件の変化を用いることによって操作することができる。実施例に記載されているように、BIOT-3806の産生培養液の培養は、化合物の混合物をもたらし、これらの化合物の比は、成長条件を変えることによって変えることができる。
【０１７４】
当業者は、生合成クラスターにおいて、一部の遺伝子は、オペロン内で組織化され、及びひとつの遺伝子の破壊は、同じオペロンの後続遺伝子の発現に対し作用を有することが多いことを理解するであろう。
【０１７５】
化合物の混合物が認められる場合に、これらは、その一部は下記実施例において説明されているような標準技術を用い、容易に分離することができる。
【０１７６】
単一化合物を参照する詳細において、菌株は、好ましくはこの化合物を作るために設計されることができる。これが不可能である通常でない状況においては中間体が生成され、これは次に所望の化合物を生成するように生体内変換される。
【０１７７】
本明細書中の説明は、プロドラッグであるC21-デオキシマクベシン誘導体を生成する半合成の鋳型として用いられることができる生成C21-デオキシマクベシン類似体に関する。
【０１７８】
特に興味がある鋳型は、マクベシン生合成遺伝子クラスターから、少なくともmbcM又はその同族体の選択された欠失又は不活性化によって生成される。例えば、mbcM又はその同族体は、単独で欠失又は不活性化される。あるいは、mbcMに加えて他のポストPKS遺伝子をさらに欠失又は不活性化する。具体的には、mbcN、mbcP、mbcMT1、mbcMT2及びmbcP450からなる群から選択されるさらなる遺伝子を、宿主菌株において欠失又は不活性化する。
【０１７９】
当業者は、遺伝子が非機能性になるためには、それが完全に欠失させられる必要はなく、結果として、本明細書では、用語「欠失又は不活性化させられる」は、それだけには限らないが以下を含めて、それによって遺伝子が非機能性になるいずれの方法も包含することを理解するであろう:遺伝子全体の欠失、標的遺伝子への挿入による不活性化、発現されない又は不活性化状態で発現される遺伝子をもたらす部位特異的突然変異誘発、発現されない又は不活性化状態で発現される遺伝子をもたらす宿主菌株の突然変異誘発(例えば放射線、又は突然変異誘発性化学薬品への暴露、プロトプラスト融合、又はトランスポゾン変異)。さらに、これには、遺伝子の内部のフラグメントの欠失が含まれる。あるいは、活性な遺伝子の機能を、阻害剤、例えばメタピロン(metapyrone)(別名2-メチル-1,2-ジ(3-ピリジル-1-プロパノン)、EP 0 627 009)を用いて化学的に弱めることができる。アンシミドールは、オキシゲナーゼの阻害剤であり、これらの化合物を、産生媒体に加えて、類似体を産生することができる。加えてシネフンギンは、同様にしかしメチル基転移酵素活性の阻害のためにはインビボで使用することができる、メチル基転移酵素阻害剤である(McCammon及びParksの論文 1981)。
【０１８０】
全てのポストPKS遺伝子を、欠失又は不活性化することができ、続いて、mbcM又はその同族体を含まない遺伝子の一つ以上を、相補性(例えば、att部位で、自己複製するプラスミドに、又は染色体の相同領域への挿入によって)によって再導入することができる。プロドラッグ誘導体を生成する半合成の鋳型として使用するため、C21-デオキシマクベシン類似体の製造方法は、以下を含むことができる:
a)適切な条件下で培養される場合にマクベシンを産生する第1の宿主菌株を提供すること、
b)すべてのポスト-PKS遺伝子を選択的に欠失又は不活性化させること、
c)C21-デオキシマクベシン類似体の産生に適切な条件下で、前記改質宿主菌株を培養すること、及び
d)産生された化合物を任意に単離すること。
【０１８１】
更に、欠失されたポストPKS遺伝子の一つ以上を再導入することができる。但し、mbcMは再導入される遺伝子の1つではない。例えば、mbcN、mbcP、mbcMT1、mbcMT2及びmbcP450の一つ以上を再導入する。
【０１８２】
加えて、mbcM又はその同族体を含むポストPKS遺伝子のサブセットを、欠失又は不活性化することができ、mbcMを含まない前記ポストPKS遺伝子のより小さいサブセットを、C21-デオキシマクベシン類似体産生菌株に到達するために再導入することができることは、当業者にとって明らかであろう。
【０１８３】
当業者は、マクベシンに対する生合成遺伝子クラスターを含有するが、少なくともmbcM又はその相同体を欠いている株を産生するいくつかの方法が存在することを理解するであろう。
【０１８４】
ポリケチド遺伝子クラスターは、異種宿主において発現され得ることは当業者に周知である(Pfeifer及びKhoslaの論文, 2001)。したがって、本発明は、mbcMを含まない又はmbcMの非機能性の突然変異体を含む、あるいは耐性及び調節遺伝子を含む又は含まない、あるいは完全又はさらなる欠失を含有するマクベシン生合成遺伝子クラスターの、異種宿主への移入を含む。あるいは、耐性及び調節遺伝子を含む又は含まない完全なマクベシン生合成クラスターを、異種宿主に移入することができ、次いで、これを、mbcMを欠失又は不活性化させるための本明細書で記述される方法によって操作することができる。そのようなDNAの大きい断片の先に定義されたような移入のための方法及びベクターは、当該技術分野において周知であるか(Rawlingsの論文, 2001；Staunton及びWeissmanの論文, 2001)、又は開示された方法で本明細書において提示される。この文脈において、好ましい宿主細胞株は、原核生物、より好ましくは、放線菌又は大腸菌(Escherichia coli)であり、さらに好ましくは、好ましい宿主細胞株としては、それだけには限らないが、アクチノシネマ・ミルム(Actinosynnema mirum) (A.ミルム(A.mirum))アクティノシンネマ・プレチオスム(Actinosynnema pretiosum)亜種プレチオスム(pretiosum)(A.プレチオスム(A. pretiosum))、S.ハイグロスコピカス(S.hygroscopicus)、S.ハイグロスコピカス(S.hygroscopicus)種、S.ハイグロスコピカス(S.hygroscopicus)変種アスコミケティクス(ascomyceticus)、ストレプトマイセス・ツクバエンシス(Streptomyces tsukubaensis)、ストレプトマイセス・コエリコル(Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、サッカロポリスポラ・エリスラエア(Saccharopolyspora erythraea)、ストレプトマイセス・フラディアエ(Streptomyces fradiae)、ストレプトマイセス・アヴェルミティリス(Streptomyces avermitilis)、ストレプトマイセス・キンナモネンシス(Streptomyces cinnamonensis)、ストレプトマイセス・リモスス(Streptomyces rimosus)、ストレプトマイセス・アルブス(Streptomyces albus)、ストレプトマイセス・グリセオフスクス(Streptomyces griseofuscus)、ストレプトマイセス・ロンギスポロフラウス(Streptomyces longisporoflavus)、ストレプトマイセス・ヴェネズアラエ(Streptomyces venezuelae)、ストレプトマイセス・アルブス(Streptomyces albus)、ミクロモノスポラ(Micromonospora)種、ミクロモノスポラ・グリセオルビダ(Micromonospora griseorubida)、アミコラトプシス・メディテラネイ(Amycolatopsis mediterranei)、又はアクチノプラネス(Actinoplanes)種N902-109が挙げられる。更なる例は、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス亜種ゲルダナス及びストレプトマイセス・ビオラセウスニガー(streptomyces violaceusniger)である。
【０１８５】
例えば、全生合成クラスターを移すことができる。あるいは、mbcMのない全てのPKSが移される。または、全てのPKSが、mbcMを含む関連ポストPKS遺伝子のいずれもを含まずに移される。
または、全マクベシン生合成クラスターが移されてから、本明細書中の記載に従って操作される。
【０１８６】
C21-デオキシマクベシン類似体は、適当な菌株を用いる生体内変換によって、更に処理されることができる。好適な菌株は、例えばアクチノシネマ・ミルム、アクチノシネマ・プレチオスム亜種プレチオスム、S.ハイグロスコピカス、S.ハイグロスコピカス種などであるが、これらに限定されるものではない利用可能な野生型菌株のいずれかである。あるいは、適切な株を、特定のポスト-PKS酵素(例えば、それだけには限らないが、mbcN、mbcP、mbcMT1、mbcMT2、mbcP450(本明細書で定義する通り)、gdmN、gdmM、gdmL、gdmP、(Rascherらの文献, 2003)、ゲルダナマイシン17-O-メチルトランスフェラーゼ、asm7、asm10、asm11、asm12、asm19、及びasm21(Cassadyらの文献, 2004, Spitellerらの文献, 2003)によってコードされるものを用いた生体内変換を可能にするように操作することができる。
【０１８７】
遺伝子が依然同定されていないか又は配列がパブリックドメインにない場合は、そのような配列を常法により獲得することは当業者にとって慣習である。例えば、ゲルダナマイシン17-O-メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の配列は、公共のドメインにはないが、当業者は、生体内変換システムをもたらすために、プローブ(類似のO-メチル基転移酵素を使用する非相同プローブ、又は利用可能な相同遺伝子から縮重するプライマーを設計することによる相同プローブ)を産生し、ゲルダナマイシン産生菌株に対してサザンブロットを行うことによって、この遺伝子を獲得することができる。
【０１８８】
宿主として又は生体内変換のために使用される菌株は、天然ポリケチドクラスターによって産生されるポリケチドの産生を防ぐために、完全に又は部分的に欠失又は不活性化された１以上のその天然ポリケチドクラスターを有することができる。前記操作された株は、例えば、制限されないが、アクチノシネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)、アクティノシンネマ・プレチオスム(Actinosynnema pretiosum)亜種プレチオスム(pretiosum)、S.ハイグロスコピカス(S. hygroscopicus)、S.ハイグロスコピカス(S. hygroscopicus)種、S.ハイグロスコピカス(S. hygroscopicus)変種アスコミケティクス(ascomyceticus)、ストレプトマイセス・ツクバエンシス(Streptomyces tsukubaensis)、ストレプトマイセス・コエリコル(Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、サッカロポリスポラ・エリスラエア(Saccharopolyspora erythraea)、ストレプトマイセス・フラディアエ(Streptomyces fradiae)、ストレプトマイセス・アヴェルミティリス(Streptomyces avermitilis)、ストレプトマイセス・キンナモネンシス(Streptomyces cinnamonensis)、ストレプトマイセス・リモスス(Streptomyces rimosus)、ストレプトマイセス・アルブス(Streptomyces albus)、ストレプトマイセス・グリセオフスクス(Streptomyces griseofuscus)、ストレプトマイセス・ロンギスポロフラウス(Streptomyces longisporoflavus)、ストレプトマイセス・ヴェネズアラエ(Streptomyces venezuelae)、ミクロモノスポラ(Micromonospora)種、ミクロモノスポラ・グリセオルビダ(Micromonospora griseorubida)、アミコラトプシス・メディテラネイ(Amycolatopsis mediterranei)、アクチノプラネス(Actinoplanes)種N902-109、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス亜種ゲルダヌス（Streptomyces hygroscopicus subsp. geldanus）又はストレプトマイセス・ビオラセウスニガー(streptomyces violaceusniger)を含む群から選択することができる。
【０１８９】
上記のC21-デオキシマクベシン鋳型の製造方法は、実質的に又は完全に生合成的であるが、標準合成化学法を含む方法による本発明のC21-デオキシマクベシン類似体の生成又は相互変換を除外するものではない。
【０１９０】
マクベシン生合成遺伝子クラスターの遺伝子操作を可能にするために、最初に、アクティノシンネマ・プレチオスム(Actinosynnema pretiosum)亜種プレチオスム(pretiosum)から、遺伝子クラスターが配列決定されたが、当業者は、マクベシンを産生する別の株(例えば、限定されないがアクチノシネマ・ミルム(Actinosynnema mirum))が存在することを理解するであろう。これらの菌株由来のマクベシン生合成遺伝子クラスターは、アクチノシネマ・プレチオスム亜種プレチオスムについて本明細書において説明されたように配列決定されてよく、その情報を使用し、同等の菌株を作出する。
【０１９１】
半合成の鋳型としてC21-デオキシマクベシン類似体を生成するためにマクベシン経路の操作の上記の説明に記載されている方法は、C21-デオキシアンサマイシン類似体を生成するために、当業者によって任意のアンサマイシンポリケチドクラスターに適用されることができる。
【０１９２】
本発明の化合物は、下記の特性の1種以上を有することを期待することができる点が利点である：Hsp90への強い結合、Hsp90と結合する速い速度、良好な水溶性、良好な安定性、良好な製剤化能、良好な経口的生物学的利用能、低いグルクロン酸抱合を含むがこれに限らず良好な薬物動態学的特性、良好な細胞取込み、良好な脳薬動学、赤血球に対する低い結合、良好な毒物学プロフィール、良好な肝毒性プロフィール、良好な腎毒性、低い副作用及び低い心臓副作用。
【実施例】
【０１９３】
(全般的方法)
(培養物の発酵)
細菌株アクチノシネマ・プレチオスム亜種プレチオスムATCC 31280 (US 4,315,989)及びアクチノシネマ・ミルムDSM 43827(KCC A-0225, Watanabeらの論文、1982)の増殖に使用される条件は、特許US 4,315,989及びUS 4,187,292に開示されている。本明細書で使用する方法は、これらの特許から適合させたものであり、振盪培養器中のチューブ又はフラスコ中でブロスを培養することについては、以下の通りである。公開されたプロトコルに対する変化形は、実施例中に示す。両株を、ISP2寒天(培地3, Shirling, E.B.及びGottlieb，D.らの文献, 1966)上で28℃で2〜3日間増殖させ、シード培地(培地1, 出典米国特許第4,315,989号及び米国特許第4,187,292号, 下記参照)に接種するために使用する。その後接種された種培地を、5又は2.5cmの振り(throw)で200〜300rpmの間で振盪しながら、28℃で48時間インキュベーションした。C21-デオキシマクベシン類似体の製造のために、発酵培地(培地2、下記及びUS 4,315,989及びUS 4,187,292を参照)を、2.5% - 10%の種培養液で播種し、5又は2.5 cmの振りで200〜300 rpmの間で振盪しながら、最初に28℃で24時間、続いて26℃で4〜6日間インキュベーションした。その後培養物を、抽出のために収集した。
【０１９４】
(培地)
(培地1−種培地)
【表５】
2010520190.tif 000053
20分間121℃でのオートクレーブ処理による殺菌。
オートクレーブ処理後適宜、アプラマイシンを添加し、最終濃度50mg/Lとした。
【０１９５】
(培地2−発酵培地)
蒸留水1L中：
【表６】
2010520190.tif 000054
20分間121℃でのオートクレーブ処理による殺菌。
【０１９６】
(培地3−ISP2培地)
蒸留水1L中：
【表７】
2010520190.tif 000055
20分間121℃でのオートクレーブ処理による殺菌。
【０１９７】
(培地4−MAM)
蒸留水1L中：
【表８】
2010520190.tif 000056
20分間121℃でのオートクレーブ処理による殺菌。
【０１９８】
(LCMS分析のための培養ブロスの抽出)
培養ブロス(1mL)及び酢酸エチル(1mL)を加え、15〜30分間混合し、10分間遠心した。有機層0.5mLを回収し、蒸発乾固させ、0.25mLのメタノールに再溶解させた。
【０１９９】
(発酵ブロス分析及びインビボ変換研究のためのLCMS手順)
HPLCは、Phenomenex Hyperclone 3ミクロンBDS C18カラム, 150mm x 4.60mm上、移動相を流して行った: 
移動相A：  水中0.1%ギ酸
移動相B：  アセトニトリル中0.1%ギ酸
流速：  1 mL/分。
HPLC条件は：10 % Bを1分間、続いて7分間で100 % Bになる線形勾配、及び100 % Bでの定組成時間2分間である。分析物は、255 nmでのUV吸収、及びそのHPLC に連結したBruker Daltonics Esquire 3000+質量分析計を用いて質量分析計により検出した。
【０２００】
(合成)
特に明記しない限り、すべての反応は、乾燥溶媒を使用して真空下で冷やされるオーブン乾燥ガラス製品で、無水条件下で実行した。反応は、交互の走査のための正イオンと陰イオンモードの間を切り替えるBruker Daltonics Esquire3000エレクトロスプレー質量分析計に連結されたAgilent 1100 HPLCでLC-UV-MSによってモニターした。クロマトグラフィーは、1mL/分で11分に渡って、移動相A/移動相B(40:60〜100)の線形勾配を用いる、Phenomenex Hypercloneカラム, BDS C18 3u(150×4.6mm)で実現した。
移動相A：  水中0.1%ギ酸
移動相B：  アセトニトリル中0.1%ギ酸
流速：  1 mL/分。
【０２０１】
(水溶性分析)
(動的測定)
該化合物のDMSOストック溶液(10 mM)を調製した。それぞれの一定分量(0.01 mL)をPBS溶液又はDMSOを用いて合計0.5 mLにした。得られた0.2 mM溶液をIKA(登録商標) vibrax VXRシェーカー上で室温で振盪した。
【０２０２】
振盪後に、得られた溶液又は懸濁液を2 mLエッペンドルフチューブに移し、30分間13200 rpmで遠心した。次に、上清の一定分量を、Bruker Daltonics Esquire3000エレクトロスプレー質量分析計と連結したAgilent 1100 HPLCにより分析した(詳細は本明細書中の特定の実施例を参照されたい。)。クロマトグラフィーは、Phenomenex Hypercloneカラム, BDS C18 3u (150 x 4.6 mm)で、11分に渡って1 mL/分でアセトニトリル/水(40/60〜100)の線形勾配を用いて達成した。UV吸収を、λ= 258及び280 nmでモニターした。
【０２０３】
全ての分析は、3回繰り返し行い、個々の化合物の溶解性は、DMSO 0.2 mM中100 %の仮定される溶解性を用いて、PBS中のこれらの溶解性を比較することにより計算した。
【０２０４】
(熱力学的測定)
2、5、10、及び/又は20 mM溶液の化合物の適切量を、5%グルコースの適切量、及び褐色ガラスバイアル中のDMSOと混合し、IKA(登録商標) vibrax VXRシェーカー上で室温で振盪した。6時間後に、得られた懸濁液/溶液を20分間13200 rpmで遠心した。
【０２０５】
次に、上清の一定分量を、Bruker Daltonics Esquire3000エレクトロスプレー質量分析計と連結したAgilent 1100 HPLCにより分析した(詳細は本明細書中の特定の実施例を参照されたい。)。クロマトグラフィーは、Phenomenex Hypercloneカラム, BDS C18 3u (150 x 4.6 mm)で、11分に渡って1 mL/分でアセトニトリル/水(40/60〜100)の線形勾配を用いて達成した。UV吸収を、λ= 258及び280 nmでモニターした。
【０２０６】
全ての分析は、3回繰り返し行い、個々の化合物の溶解性は、DMSO中100 %の仮定される溶解性を用いて、5%グルコース中のこれらの溶解性を比較することにより計算した。
【０２０７】
(全血開裂分析)
ヒト全血(単一ドナー、バッチHBE4534)をFirst Link UK Ltdから得た。マウス全血(10のプール、バッチ07-2470)をHarlan UKから得た。血液は、抗凝血物質としてEDTAを含むチューブに回収し、氷上で発送した。血液は、到着日に使用した。ヒトの場合、全血インキュベーションは、新しい血液で、及び血液を凍結後に解凍して行った。コントロール化合物を、リドカイン、ビサコジル及びシムバスタチンとした。
【０２０８】
すべての試験化合物を、37℃で全血の10uMでインキュベーションした。選択時間点で、0.1mlの血液を、0.3mlのアセトニトリルと混合し、直ちにボルテックスした。すべての試料を遠心分離し、上清を同量の脱イオン水で希釈した。試料分析は、LC/MS/MSで行った。20の試料分析のために、質量分析は17及び20をモニターした。ブランク全血抽出物及びリファレンス試料(1.25uMの20及び17を含む)を調製し、インキュベーション試料を注入した。
【０２０９】
20の消滅についての半減期は、下記関係に従って決定された:
半減期(分) = 0.693/λ(λは、ln 濃度対時間曲線の傾斜である)
【０２１０】
(化合物検出及び実験的な方法論)
Micromass Quattro Micro質量分析計(Waters Ltd)を使用した。方法開発及び次のデータ収集のために使用する負モードのエレクトロスプレーイオン源(ESI)の設定を下に詳述する。Waters 2795 HPLCシステムを、質量分析の前工程として用いた。
【０２１１】
(細胞透過性のためのインビトロCaco-2アッセイ)
Caco-2細胞(ATCC Cat# HTB-37)を、24ウェルBioCaot(商標)インサートプレート中、原繊維コラーゲン被覆された微小孔構造ポリカーボネート膜で成長させた。10%FBSで補充されたイーグル最少必須培地中での5日間成長の後、細胞を、BioCoat腸細胞分化培地(BD、Cat。# 05496)に2日間曝露し、腸細胞分化を誘導した。投与前に、各々ウェル内のCaco-2細胞の経上皮電気抵抗(TEER)を測定し、単層の質を確保した。TEER 1400Ω超過を有する条件つきのウェルだけを使用した。
【０２１２】
試験化合物のストック溶液を、DMSO中、3mMで調製した。投与溶液を、透過性アッセイ緩衝液で10Mに調製した。透過性アッセイ緩衝液は、pH 7.4±0.2で10mMのHEPESを含むハンク平衡塩溶液(Hank's balanced salt solution)とした。
【０２１３】
Caco-2細胞を、先端(apical side)(AからB浸透)又は側底部(basolateral side)(BからA浸透)に試験化合物で投与し、37℃、5% CO2、90%相対湿度でインキュベートした。各化合物についての試験は、2回繰り返して行った。2時間のインキュベーション後、20μLの試料を、投与溶液及びドナー及びレシーバ区画(receiver compartments)の各々から取った。Caco-2アッセイの有効性を確実にするために、プロプラノロール及びビンブラスチンを、それぞれ、高-、及び低-から中間-透過性ポジティブコントロールとして使用した。
ビンブラスチンも、P-gp基質(P-gp阻害剤(ベラパミル)とともに試験した)として供給した。
【０２１４】
LC/MS/MSによって試験化合物を定量化するために、関連したゲルダナマイシン様化合物(17-メトキシエチルアミノゲラナマイシン(Schnurらの文献、1995))を、内部標準として用いた。各化合物の透過性の計算は、同じ試験化合物の濃度比率のみに関係し、濃度比率は、試験化合物対内部標準のピーク面積比で表した。各化合物のピーク面積比は、LC-MS/MSによって得た。
【０２１５】
(透過性の計算)
(Pappの計算)
推定透過係数Pappは、下記のように計算した:
【数２】
2010520190.tif 000057
式中、
dCr:レシーバ区画の累積的濃度M:
dt:アッセイの持続時間(すなわち、7200秒)。
Vr:レシーバ区画の体積cm3。
A:細胞単層の面積(24ウェルBioCoatTMプレートに関して0.31cm2)。
C0:投与溶液の濃度M。
【０２１６】
(Peの計算)
透過係数Peは、以下の通りに算出した:
【数３】
2010520190.tif 000058
式中、
Vd:ドナー区画の体積cm3(すなわち、0.15cm3):
Vr:レシーバ区画の体積cm3(すなわち、0.3cm3):
Cr:インキュベーション終わりのレシーバ区画の試験化合物の濃度(M):
Ce:インキュベーション終わりのドナー及びレシーバ区画両方の試験化合物の平均濃度
A:膜の面積(すなわち、0.30cm2)
T:培養の持続時間(秒)(すなわち、64800秒) 
【０２１７】
(抗癌活性に関するインビトロバイオアッセイ)
ヒト腫瘍細胞株のパネルの単層増殖において、化合物の抗癌活性についてのインビトロ評価を、Oncotest Testing Facility, Institute for Experimental Oncology, Oncotest GmbH, Freiburgで行った。選択された細胞株の特徴を、表5に要約する。
【表９】
2010520190.tif 000059
【０２１８】
Rothらの文献, (1999)に記載される通り、ヒト腫瘍異種移植片から、Oncotest細胞株を樹立する。ドナー異種移植片の起源は、Fiebigらの論文, (1999)に記載されている。他の細胞株は、NCI(DU145、MCF-7)から入手したか、又はDSMZ(Braunschweig, 独国)から購入したかのいずれかであった。
【０２１９】
全ての細胞株は、特に明記しない限り、RPMI 1640培地、10%ウシ胎仔血清及び0.1mg/mLゲンタマイシン(PAA、Colbe、ドイツ)を含む、「レディミックス(ready-mix)」培地中、湿雰囲気(95%空気、5%CO2)下、37℃で成長させた。
【０２２０】
改質ヨウ化プロピジウム分析を、6つのヒト腫瘍細胞株の成長における試験化合物の影響を評価するために用いた(Denglerらの文献、(1995))。
【０２２１】
簡単に述べると、細胞を、トリプシン処理により対数期培養物から収穫し、カウントし、96ウェル平底マイクロタイタープレートに細胞株に応じた細胞密度(5〜10,000個生存細胞/ウェル)で播種した。24時間後、細胞を対数増殖を再開するために回収し、培養培地(6対照ウェル/プレート)又はマクベシンを含有する培養培地の0.010mLを、これらのウェルに添加した。各濃度は、3つ組で播種した。化合物を2つの濃度(0.001 mM及び0.01 mM)で加えた。4日間連続曝露後、被験化合物を伴う又は伴わない、細胞培養培地を、ヨウ化プロピジウム(PI)水溶液(7mg/L)0.2mLにより交換した。生細胞の割合を測定するために、細胞を、プレートを凍結することによって透過処理した。これらのプレートを解凍後、Cytofluor 4000マイクロプレートリーダー(励起530nm、発光620nm)を用い蛍光を測定し、生存細胞の総数に対する直接相関を得た。
【０２２２】
増殖阻害は、処置/対照×100(％T/C)として表した。
【０２２３】
(薬物動態学的研究)
試験化合物は、エンドトキシンフリーの水中で直接調製した。10mg/kg p.o.又は3mg/kg i.v.の単一投与量を、雌のCD1マウス(１時点当たり、各化合物に対して3匹のマウス)のグループに投与した。投与量は、経口的及び静脈投与、双方について10mL/kgとした。4分及び0.25、0.5、1、2、4、8、24時間で、グループを犠牲にし、血漿を、さらなる分析のために各マウスから回収した。経口投与に関して、試験物質の単一投与量を、経口胃管を介してマウスに投与した。静脈投与に関して、試験物質の単一投与量を、尾静脈を介してマウスに静脈内投与した。
【０２２４】
(薬物動態学的研究試料の分析)
血漿試料中の当該化合物の濃度を、MS検出を備えたHPLCで測定した。
【０２２５】
(生物分析方法及び試料分析)
質量分析計:                API 3200Qトラップトリプル四重極質量分析計
液体クロマトグラフィー:    Agilent 1200/PAL HTCオートサンプラー
イオン化モード:            エレクトロスプレー(TAに応じて変えることができる)
モニタリング:              多反応モニタリング(Multiple Reaction Monitoring)
LCクロマトグラフィー分離:  BetaBastic-8、50×2.1mm、5μm(TAに応じて変えることができる)
試験物質対内部標準(17-メトキシエチルアミノゲラナマイシン(Schnurらの文献、1995))のピーク面積比に基づいて、未知試料の濃度を、較正曲線によって得た。
【０２２６】
(抽出方法)
試験血漿試料(0.05ml)、検体フリーのマウス全体血清(0.05ml)、内部標準液(メタノールに溶解した10mg/mLの17-メトキシエチルアミノゲラナマイシン0.1ml(Schnurらの文献、1995))、及びアセトニトリル(0.5ml)を、2mLのポリプロピレンチューブへピペットで移し、管の内容物を、最低5分間混合した(Vibraxミキサー)。その後、チューブを12,000 rpmで最低2分間、遠心管で遠心分離した。0.1mlの溶媒層を、1mLの酸性希釈剤(0.1%ギ酸)を含む2mLのポリプロピレンチューブに移した。その後、チューブを最低5分間混合し(Vibraxミキサー)、続いて、5分間、約3500 rpmで遠心分離した。抽出物を、オートサンプラーバイアルに移し、外界温度に設定されたオートサンプラートレイに配置した。オートサンプラーを、分析カラム上に0.005mlの各抽出物のアリコートを注入するようにプログラムした。
【０２２７】
(実施例１−マクベシン生合成遺伝子クラスターの配列決定)
ゲノムDNAを、Kieserの文献に記載されている標準プロトコルを使用して、アクチノシンネマ・プレチオスム(ATCC 31280)、及びアクチノシンネマ・ミルム(DSM 43827、ATCC 29888)から単離し、DNA配列決定を、標準手順を用いて、Biochemistry Department, University of Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge CB2 1QWの配列決定設備により行った。
プライマー
【化４６】
2010520190.tif 000060
を利用し、標準技術を用い、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスNRRL 3602 (配列の寄託番号：AY179507)のゲルダナマイシン生合成遺伝子クラスターからのカルバモイル基転移酵素をコードしている遺伝子gdmNを増幅した。サザンブロット実験を、DIG試薬及び「非放射性核酸標識及び検出キット」を製造業者(Roche)の指示に従って用いて行った。DIG標識されたgdmN DNAフラグメントを、非相同プローブとして使用した。gdmN作出されたプローブ及びA.プレチオスム2112から単離されたゲノムDNAを用い、サザンブロット分析において、およそ8kb EcoRI断片を同定した。この断片を、標準手順を適用し、Litmus 28へクローニングし、並びに形質転換体を、コロニーハイブリダイゼーションにより同定した。クローンp3を単離し、およそ7.7kb挿入断片を、配列決定した。クローンp3から単離されたDNAは、EcoRI及びEcoRI/SacIで消化し、各々およそ7.7kb及び約1.2kbのバンドを単離した。標識反応を、製造業者のプロトコールに従い行った。
【０２２８】
先に名前を挙げた2種の菌株のコスミドライブラリーを、ベクターSuperCos 1及びGigapack III XLパッケージングキット(Stratagene)を製造業者の指示に従い用いて作製した。これら2種のライブラリーは、標準プロトコールを用いてスクリーニングし、及びプローブとして、クローンp3由来の7.7kb EcoRI断片のDIG-標識断片を使用した。
【０２２９】
コスミド52は、A.プレチオスムのコスミドライブラリーから同定し、配列決定のためにケンブリッジ大学の生化学部門のシークエンシング施設へ送付した。
同様に、コスミド43及びコスミド46を、A.ミルムのコスミドライブラリーから同定した。サザンブロット分析により示されるように、3種のコスミド全てが、7.7kb EcoRI断片を含んだ。
【０２３０】
標準プロトコールを適用し、コスミド43のPKS領域のおよそ0.7kbp断片を、プライマー
【化４７】
2010520190.tif 000061
を用いて増幅し、クローニングし、重複クローンに関するA.プレチオスムコスミドライブラリーのスクリーニングのためのプローブとして使用した。コスミド52の配列情報も、プライマー
【化４８】
2010520190.tif 000062
により増幅されたDNA断片由来のプローブの作製のために使用し、これをA.プレチオスムのコスミドライブラリーのスクリーニングのために使用した。コスミド311及び352は単離し、並びにコスミド352は、配列決定のために送付した。コスミド352は、コスミド52とのほぼ2.7kbの重複を含む。更なるコスミドのスクリーニングのために、ほぼ0.6kb PCR断片を、標準プロトコールを適用し、プライマー
【化４９】
2010520190.tif 000063
及び鋳型としてコスミド311を用いて増幅した。A.プレチオスムのコスミドライブラリーをスクリーニングし、かつコスミド410を単離した。これは、コスミド352とほぼ17kb重複し、配列決定のために送付した。これら3種の重複コスミド(コスミド52、コスミド352及びコスミド410)の配列をまとめた。配列決定された領域は、約100kbpに広がり、マクベシン生合成遺伝子クラスター(配列番号:11).配列番号:11における各オープンリーディングフレームの位置は、表7に示している。
【表１０】
2010520190.tif 000064
【表１１】
2010520190.tif 000065
[注記1：cは、遺伝子がDNA相補鎖によりコードされていることを示す；注記2：時々、2種以上の可能性のある開始コドンの候補が同定される場合がある。当業者は、これを認め、かつ別の可能性のある開始コドンを同定することができるであろう。本発明者らは、2種以上の可能性のある開始コドンを有する遺伝子を同定し、印「*」を付けた。本発明者らが開始コドンであると考えるものを全て示したが、当業者は、別の開始コドンを用い、活性タンパク質を作出することが可能であることを理解するであろう。]
【０２３１】
(実施例2−菌株BIOT-3806：gdmM相同体mcbMがプラスミドの挿入及びC21-デオキシマクベシン類似体17及び18の単離によって中断されたアクチノシンネマ・プレチオスム菌株)
pLSS308の構築の要約を図3に示す。
(2.1.  プラスミドpLSS308の構築)
ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)株NRRL 3602(AY179507)のゲルダナマイシン生合成遺伝子クラスター由来のgdmM遺伝子のDNA配列と、アミコラトプシス・メディテラネイ(Amycolatopsis mediterranei)(AF040570 AF040571)のリファマイシン生合成遺伝子クラスター由来のorf19を、VectorNTI配列アラインメントプログラムを使用して整列配置した(図4)。このアラインメントは、アクチノシネマ・ミルム(BIOT-3134；DSM43827；ATCC29888)由来の相同遺伝子の断片を増幅するために使用した縮重オリゴのデザインに適している相同領域を同定した。縮重オリゴは以下である：
【化５０】
2010520190.tif 000066
【０２３２】
PCR増幅のための鋳型は、アクチノシネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)コスミド43とした。コスミド43の作出は、先に実施例1に説明されている。オリゴFPLS1及びFPLS3を使用し、鋳型としてコスミド43を及びTaq DNAポリメラーゼを使用し、標準PCR反応において、アクチノシネマ・ミルム由来のgdmM相同体の内部断片を増幅した。得られた793bp PCR産物を、SmaIで線状としたpUC19へクローニングし、プラスミドpLSS301を得た。クローン化された領域を、配列決定すると、gdmMに対して有意な相同性を有することが示された。コスミド43(A.ミルム)から増幅された遺伝子フラグメントを、アクティノシンネマ・プレチオスム亜種プレチオスムのマクベシン生合成遺伝子クラスターのmbcM遺伝子の配列とアラインメントさせると、これらの配列の間の1bpのみの違いが示された(縮重するオリゴの配列によって決定される領域を除外する)。増幅された配列は、A.ミルムのマクベシンクラスターのmcbM遺伝子に由来すると仮定した。プラスミドpLSS301を、EcoRI/HindIIIで消化し、この断片を、EcoRI/HindIIIで消化されたプラスミドpKC1132(Biermanらの論文、1992)へクローニングした。得られたプラスミドを、pLSS308と命名し、これはアプラマイシン耐性であり、かつA.ミルムmbcM遺伝子の内部断片を含む。
【０２３３】
(2.2  アクチノシネマ・プレチオスム亜種プレチオスムの形質転換)
プラスミドpUZ8002を抱えている大腸菌ET12567を、電気穿孔法により、pLSS308で形質転換し、接合のための大腸菌ドナー株を作出した。この菌株を使用し、栄養接合により、アクチノシネマ・プレチオスム亜種プレチオスムを形質転換した(Matsushimaらの論文、1994)。接合完了体を、培地4にプレートし、28℃でインキュベートした。プレートを、50mg/Lアプラマイシン及び25mg/Lナリジキシン酸を用いて24時間後にかぶせた。pLSS308は、アクチノシネマ・プレチオスム亜種プレチオスムにおいて複製することができないので、アプラマイシン抵抗性コロニーは、プラスミド媒介性mcbM内部断片を介した相同組換えにより、染色体のmbcM遺伝子に組込まれたプラスミドを含んだ形質転換体であると予想された(図3)。これは、染色体上のmbcM遺伝子の2種の切断型コピーを生じた。
【０２３４】
形質転換体は、PCR分析により確認し、増幅された断片を配列決定した。コロニーを、培地4(50mg/Lアプラマイシン及び25mg/Lナリジクス酸を含む)の上にパッチした(patched)。各パッチからの6mmの円形プラグを用い、10mL種培地(培地1の変種−2％グルコース、3％可溶性デンプン、0.5％コーンスチープ固体、1％大豆粉、0.5％ペプトン、0.3％塩化ナトリウム、0.5％炭酸カルシウム)に加え50mg/Lアプラマイシンを含む、個別の50mLファルコンチューブに接種した。これらの種培養物を、振り5cmの200rpmで、28℃で2日間インキュベーションした。その後これらを用い、(5％v/v)発酵培地(培地2)を接種し、28℃で24時間増殖し、その後26℃で更に5日間増殖した。これらから、前述の標準プロトコールに従い、代謝産物を抽出した。
【０２３５】
試料を、前述の標準プロトコールを使用し、HPLCにより、マクベシン類似体の生成について評価した。選択された生産的単離体は、BIOT-3806と命名した。
【０２３６】
(2.3  BIOT-3806からの化合物の同定)
LCMSは、陽及び/又は陰イオンモードで作動するBruker Daltonics Esquire 3000+エレクトロスプレー質量分析計と組み合わせた、Agilent HP1100 HPLCシステムを使用して実施した。クロマトグラフィーは、以下のグラジエント溶離プロセスを使用して1mL/分の流速で溶出する、Phenomenex Hypercloneカラム(C18 BDS、3u、150×4.6mm)を通して達成した:T＝0、10％B；T＝2、10％B；T＝20、100％B；T＝22、100％B；T＝22.05、10％B；T=25, 10%B。移動相A=水+0.1%ギ酸;移動相B＝アセトニトリル＋0.1％ギ酸。
【０２３７】
UVスペクトルは、190と400nmの間で記録し、抽出されたクロマトグラムは、210、254及び276nmで採取した。質量スペクトルは、100及び1500amuの間で記録した。
【表１２】
2010520190.tif 000067
【０２３８】
(2.4  7-O-カルバモイルマクベシン前駆体(17)(別名4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-21-デオキソマクベシン))の発酵及び単離)
BIOT-3806の増殖ストックを、50mg/Lアプラマイシンを有する培地1で成長後に調製し、蒸留水中20%w/vグリセロール: 10%w/vラクトースに保存し、−80℃で貯蔵した。増殖ストックを、50mg/Lアプラマイシンで補充したISP2培地(培地3)のプレート上へ戻し、28℃で48時間保温した。増殖培養株を、ISP2プレートから2つの寒天プラグ(直径5mm)を取り出すことによって調製し、これらを、50mg/Lのアプラマイシンを含有する250mLの振とうフラスコ内の30mL培地1に接種した。フラスコは、28℃、200rpm(振幅5cm)で48時間保温した。増殖培養株を、2Lの振とうフラスコ中の200mL産生培地(培地2)に、5% v/vで接種した。培養は、28℃で1日、それに続いて26℃、300rpm(振幅2.5cm)で5日行った。
【０２３９】
BIOT-3806(1 L、ピンク色)の発酵ブロスを、等体積の酢酸エチル(EtOAc)を用いて3回抽出した。合わせたEtOAc抽出物から、溶媒を真空中で取り除き、2.34gの褐色のオイルを得た。次いで、抽出物を、シリカゲル60を通したクロマトグラフィーにかけ、CHCl3とMeOHとの混合物(95:5)で最初に溶出し、それに続いてMeOH濃度を10%まで増大させ、いくつかの分画(分画あたり約250mL)を収集した。これらの分画を、HPLCを使用して、代謝物質の存在について分析した。新規化合物を含有する特定の分画(分画5; 溶媒の除去後の334mgの粗質量)を、水:アセトニトリル(80:20)から(50:50)の勾配を用いて21mL/分の流速で25分間にわたって溶出する、Phenomenex Luna C18-BDSカラム(21.2×250mm;粒径5um)を通したクロマトグラフィーによってさらに精製した。分画を、分析用HPLCによって分析し、新規化合物を含有するものを合わせ、溶媒を取り除き、オフホワイトの固体(86mg)を得た。LCMS/MS、及びアセトン-d6中で行われた1D及び2D NMR実験による分析によって、この化合物は、7-O-カルバモイルマクベシン前駆体(17)と同定された。
【化５１】
2010520190.tif 000068
【０２４０】
(2.5  7-O-カルバモイル-15-ヒドロキシマクベシン前駆体(18)(別名4,5-ジヒドロ-11,15-O-ジデメチル-18,21-ジデヒドロ-21-デオキソマクベシン)の発酵及び単離)
50mg/Lアプラマイシンを含有する培地1中での増殖の後、BIOT-3806の増殖ストックを調製し、20% w/vグリセロール:10% w/vラクトース(蒸留水中)中に保存し、-80℃で保管した。増殖ストックを、50mg/Lアプラマイシンで補充したISP2培地(培地3)のプレート上へ戻し、28℃で48時間保温した。ISP2プレートから2つの寒天プラグ(直径5mm)を取り出し、50mg/Lアプラマイシンを含有する250mL振とうフラスコ中の30ml 培地1にそれらを接種することによって、増殖培養株を調製した。フラスコは28℃、200rpm(振幅5cm)で48時間保温した。増殖培養株を、2Lの振とうフラスコ中の200mL産生培地(培地2)に、5% v/vで接種した。培養は、28℃で1日、それに続いて26℃、200rpm(振幅5cm)で5日行った。
【０２４１】
BIOT-3806(1.3L、クリーム色)の発酵ブロスを、等体積の酢酸エチル(EtOAc)を用いて3回抽出した。合わせた抽出物から、溶媒を真空中で取り除き、2.87gの褐色のオイルを得た。次いで、抽出物を、シリカゲル60を通したクロマトグラフィーにかけ、CHCl3及びMeOH混合物(95:5)で最初に溶出し、それに続いてMeOH濃度を10%まで増大させ、いくつかの分画(分画あたり約250mL)を収集した。これらの分画を、HPLCを使用して、代謝物質の存在について分析した。新規化合物を含有する特定の分画(分画7; 溶媒の除去後の752mgの粗質量)を、水:アセトニトリル(85:15)から(55:45)の勾配を用いて、21mL/分の流速で25分間にわたって溶出する、Phenomenex Luna C18-BDSカラム(21.2×250mm;粒径5um)を通したクロマトグラフィーによってさらに精製した。分画を、分析用HPLCによって分析し、新規化合物を含有するものを合わせ、溶媒を取り除き、オフホワイトの固体(245.5mg)を得た。同定及び特徴付けのためにMS、及び1及び2D NMR実験を、アセトン-d6中で行った。LCMS/MSによる、及びアセトン-d6中で行われた1D及び2D NMRによる分析によって、この化合物は、7-O-カルバモイル-15-ヒドロキシ-マクベシン前駆体(18)と同定された。
【化５２】
2010520190.tif 000069
【０２４２】
(2.6 同定及び特徴付け)
様々なMS及びNMR実験、すなわちLCMS, MSMS, 1H, 13C, APT, COSY-45, HMQC, HMBCを実施した。これらのデータの完全かつ網羅的な参照によって、マクベシン前駆体の2つの類似体の大部分のプロトン及び炭素を帰属することができた。NMR帰属は、表9に記載されている。
【化５３】
2010520190.tif 000070
【表１３】
2010520190.tif 000071
【０２４３】
(実施例3−gdmM相同体mbcMがインフレーム欠失及びC21-デスオキシマクベシン類似体17及び18の産生を有するアクチノシネマ・プレチオスム菌株の生成)
(3.1  mbcMの下流フランキング領域に相同なDNAのクローニング)
オリゴBV145 (配列番号: 14) 及びBV146(配列番号:15)を用い、標準PCR反応において、鋳型としてコスミド52(実施例1由来)及びPfu DNAポリメラーゼを使用し、アクチノシネマ・プレチオスム(ATCC 31280)由来のDNAの1421bp領域を増幅した。5'伸長を、各オリゴにおいてデザインし、増幅断片のクローニングを補助するために制限部位を導入した(図4)。増幅されたPCR産物は、mbcMの3'末端の33bp及び更に下流相同領域(downstream homology)の1368bpをコードしていた。この1421bp断片を、SmaIで直線化したpUC19へクローニングし、プラスミドpWV308を生じた。
【０２４４】
(3.2  mbcMの上流フランキング領域に相同なDNAのクローニング)
オリゴBV147(配列番号:16)及びBV148(配列番号:17)を用い、標準PCR反応において、鋳型としてコスミド52(実施例1由来)及びPfu DNAポリメラーゼを使用し、アクチノシネマ・プレチオスム(ATCC 31280)由来のDNAの1423bp領域を増幅した。5'伸長を、各オリゴにおいてデザインし、増幅断片のクローニングを補助するために制限部位を導入した(図4)。増幅されたPCR産物は、mbcMの5'末端の30bp及び更に上流相同領域の1373bpをコードしていた。この1423bp断片を、SmaIで直線化したpUC19へクローニングし、プラスミドpWV309を生じた。
【化５４】
2010520190.tif 000072
【０２４５】
生成物PCRwv308及びPCRwv309を、次のクローニング工程でpUC19ポリリンカーにおけるPstI部位を利用するために、pUC19へ同じ配向でクローニングした。
【０２４６】
pWV309由来の1443bp AvrII/PstI断片を、pWV308の4073 bp AvrII/PstI断片にクローン化し、pWV310を作成した。従って、pWV310は、AvrII部位で融合したmbcMのフランキング領域にDNA相同体をコードするSpeI/XbaI断片を含む。この2816bp SpeI/XbaI断片を、SpeIで直線化されたpKC1132(Biermanらの論文、1992)へクローニングし、pWV320を作出した。
【０２４７】
(3.3  アクチノシネマ・プレチオスム亜種プレチオスムの形質転換)
プラスミドpUZ8002を抱えている大腸菌ET12567を、電気穿孔法により、pWV320で形質転換し、接合のための大腸菌ドナー株を作出した。この菌株を使用し、栄養接合により、アクチノシネマ・プレチオスム亜種プレチオスムを形質転換した(Matsushimaらの論文、1994)。接合完了体を、培地4にプレートし、28℃でインキュベートした。プレートを、50mg/Lアプラマイシン及び25mg/Lナリジキシン酸を用いて24時間後にかぶせた。pWV320は、アクチノシネマ・プレチオスム亜種プレチオスムにおいて複製することができないので、アプラマイシン抵抗性コロニーは、プラスミド媒介性mbcMフランキング相同領域のひとつを介した相同組換えにより、染色体に組込まれたプラスミドpWV320を含んだ形質転換体であると予想された。
【０２４８】
ゲノムDNAを、6種の接合完了体から単離し、消化し、かつサザンブロットで分析した。このブロットは、6種の単離体組込みのうちの4種は、相同領域の上流領域で生じ、6種の単離体相同組込みのうちの2種は、下流領域で生じたことを示した。上流領域の相同組込みから生じる1種の菌株(BIOT-3831と称す)を、二次組換え体のスクリーニングのために選択した。下流領域の相同組込みから生じる1種の菌株(BIOT-3832)を、二次組換え体のスクリーニングのために選択した。
【０２４９】
(3.4  二次組換え体のスクリーニング)
菌株を、培地4(50mg/Lアプラマイシンを補充)の上にパッチし、28℃で4日間増殖した。各パッチの1cm2切片を使用し、50mLファルコンチューブ内で、抗生物質を含まない、改変ISP2(蒸留水1L中0.4％酵母エキス、1％麦芽エキス、0.4％デキストロース)7mLへ接種した。培養物を2〜3日間増殖し、その後50mLファルコンチューブ中で、別の改変ISP2(前記参照)7mLへ(5％接種菌液)継代培養した。4〜5世代継代培養した後、培養物を音波処理し、連続希釈し、培地4上に播種し、28℃で4日間培養した。その後1個のコロニーを、アプラマイシンを含有する培地4上及び抗生物質を含有しない培地4上に2つ組でパッチし、これらのプレートを、28℃で4日間インキュベーションした。抗生物質非含有プレート上で増殖したがアプラマイシン含有プレート上では増殖しなかったパッチを、＋/−アプラマイシンプレート上に再度パッチし、これらが抗生物質マーカーを喪失していたことを確認した。すべてのアプラマイシン感受性株からゲノムDNAを単離し、サザンブロットによって分析した。このステージでは、二次交差株の半分は、野生型に戻ったが、半分は、所望のmbcM欠失変異株を産生した。この突然変異株は、502アミノ酸のインフレーム欠失を伴うmbcMタンパク質をコードする(図9)。
【０２５０】
mbcM欠失変異体を、培地4上にパッチし、28℃で4日間増殖した。各パッチからの6mmの円形プラグを用い、10mL種培地(1〜2％グルコース、3％可溶性デンプン、0.5％コーンスチープ固体、1％大豆粉、0.5％ペプトン、0.3％塩化ナトリウム、0.5％炭酸カルシウムの培地から適合)を含む個別の50mLファルコンチューブへ接種した。これらの種培養物を、振り2インチ(5.08 cm)の200rpmで、28℃で2日間インキュベーションした。その後これらを使用し、生産培地(培地2の応用−5％グリセロール、1％コーンスチープ固体、2％酵母エキス、2％リン酸二水素カリウム、0.5％塩化マグネシウム、0.1％炭酸カルシウム)へ接種し(10mLへ0.5mL)、28℃で24時間増殖し、その後、26℃で更に5日間増殖した。28℃で24時間、その後、さらに26℃で5日間増殖させた。等しい体積の酢酸エチルを加えることによって、これらの培養物から二次代謝産物を抽出した。遠心分離によって壊死組織片を取り除いた。
【０２５１】
上清を、清潔な管に移し、真空中で溶媒を取り除いた。試料を0.23mlのメタノール中で、それに続いて0.02mLの1%(w/v)FeCl3溶液を加えることによって再構成した。試料を、マクベシン類似体の産生について評価した。上記実施例2.3に記載した方法を用いるLCMSによる化学分析によって、同一の保持時間及び質量スペクトルを有することに基づき、化合物18及び19の存在を明らかに確認した。
【０２５２】
(3.5  BIOT-3872プロトプラストの作出による個別のコロニーの選択)
プロトプラストは、培地を下記のように変更した、Weber及びLosickの論文(1988)から適合された方法を用い、BIOT-3872から作出した；アクチノシネマ・プレチオスム培養物は、ISP2プレート(培地3)上で28℃で3日間増殖し、5mm2の掻取を使用し、滅菌した10％(w/v)グリシン水溶液2mlを補充したISP2ブロス40mlに接種した。プロトプラストは、Weber及びLosickの文献 1988に記載される通りに産生し、次いで、R2プレート上で再生させた(R2製法−スクロース103g、K2SO4 0.25g、MgCl2.6H2O 10.12g、グルコース10g、Difco カザミノ酸(Casaminoacids) 0.1g、Difco Bacto寒天22g、800mLまでの蒸留水)。この混合物を、121℃で20分間、オートクレーブ処理によって滅菌した。オートクレーブ後、下記のオートクレーブ処理した溶液を添加した；0.5％KH2PO4 10ml、3.68％CaCl2・2H2O 80mL、20％L-プロリン15mL、5.73％TES緩衝液(pH7.2)100mL、微量元素溶液(ZnCl2 40mg、FeCl3・6H2O 200mg、CuCl2・2H2O 10mg、MnCl2・4H2O 10mg、Na2B4O7・10H2O 10mg、(NH4)6Mo7O24・4H2O 10mg、蒸留水で1Lとする)2mL、NaOH(1N)(非滅菌処置)5mL)。
【０２５３】
80の個々のコロニーを、MAMプレート(培地4)上へパッチとして植え、上の実施例2.3で述べた通りにマクベシン類似体の産生について分析した。大多数のプロトプラストは、親株と類似のレベルで産生されるパッチを産生した。試験した80種の試料中15種が、親株よりも有意に多い化合物18及び19を生成した。最も優れた産生菌株、WV4a-33(BIOT-3870)は、親株よりも有意に高いレベルで18及び19を産生することが観察された。
【０２５４】
(実施例4−mbcMがインフレーム欠失を有し、mbcMT1、mbcMT2、mbcP及びmbcP450が、さらに欠失され、C-21デスオキシマクベシン類似体17を産生するアクチノシネマ・プレチオスム菌株の生成)
(4.1  mbcMT2の下流フランキング領域へのDNA相同体のクローニング)
オリゴls4del1(配列番号: 18)及びls4del2a(配列番号: 19)を用いて、アクチノシネマ・プレチオスム(ATCC 31280)由来DNAの1595bp領域を、鋳型及びPfu DNAポリメラーゼとしてコスミド52(実施例1から)を用いる標準PCR反応において増幅した。増幅されたフラグメントのクローニングを助けるために、AvrII部位を導入するように、5'伸長を、オリゴls4del2a中に設計した(図10)。増幅されたPCR産物は、mbcMT2の3'末端の196bp及びさらに下流の相同性の1393bpをコードしていた。この1595bp断片を、SmaIで直線化したpUC19へクローニングし、プラスミドpLSS1+2aを生じた。
【化５５】
2010520190.tif 000073
【０２５５】
(4.2  mbcMの上流フランキング領域に相同なDNAのクローニング)
オリゴls4del3b(配列番号:20)及びls4del4(配列番号:21)を用い、標準PCR反応において、鋳型としてコスミド52(実施例1由来)及びPfu DNAポリメラーゼを使用し、アクチノシネマ・プレチオスム(ATCC 31280)由来のDNAの1541bp領域を増幅した。増幅されたフラグメントのクローニングを助けるために、AvrII部位を導入するように、5'伸長を、オリゴls4del3b中に設計した(図10)。増幅されたPCR産物は、mbcPの5'末端の〜100bp及び更に上流相同領域の〜1450bpをコードしていた。この〜1550bp断片を、SmaIで直線化したpUC19へクローニングし、プラスミドpLSS3b+4を生じた。
【化５６】
2010520190.tif 000074
【０２５６】
生成物1+2a及び3b+4を、次のクローニング工程でpUC19ポリリンカーにおけるHindIII及びBamHI部位を利用するために、pUC19へクローニングした。
pLSS1+2a由来の1621bp AvrII/HindIII断片、及びpLSS3b+4由来の1543bp AvrII/BamHI断片を、pKC1132の3556 bp HindIII/BamHI断片にクローン化し、pLSS315を作成した。従って、pLSS315は、AvrII部位で融合した所望のORF決失領域のフランキング領域と相同的なDNAをコードするHindIII/BamHI断片を含む(図5)。
【０２５７】
(4.3  pLSS315を有するBIOT-3870の形質転換)
プラスミドpUZ8002を抱えている大腸菌ET12567を、電気穿孔法により、pLSS315で形質転換し、接合のための大腸菌ドナー株を作出した。この菌株を使用し、栄養接合により、BIOT-3870を形質転換した(Matsushimaらの論文、1994)。接合完了体を、MAM培地(1%小麦デンプン、0.25%コーンスチープ固体、0.3%酵母エキス、0.3%炭酸カルシウム、0.03%硫酸鉄、2%寒天)にプレートし、28℃でインキュベートした。プレートを、50mg/Lアプラマイシン及び25mg/Lナリジキシン酸を用いて24時間後にかぶせた。pLSS315は、BIOT-3870において複製することができないので、アプラマイシン抵抗性コロニーは、プラスミド媒介性相同領域を介した相同組換えにより、染色体に組込まれたプラスミドを含んだ形質転換体であると予想された。
【０２５８】
(4.4  二次組換え体のスクリーニング)
BIOT-3870の3つの一次形質転換体:pLSS315を二次培養するために選択し、二次組換え体のスクリーニングをした。
菌株を、MAM培地(50mg/Lアプラマイシンを補充)の上にパッチし、28℃で4日間増殖した。2個の6mm円形プラグを使用し、250 mlコニカルフラスコ中のISP2(0.4％酵母エキス、1％麦芽エキス、0.4％デキストロース、抗生物質は補充せず)30mLへ接種した。培養物は、2〜3日増殖し、250mLコニカルフラスコ内のISP2の30mLへ継代した(5％接種)。4〜5代の継代培養の後、培養株を、実施例3.6に記載される通りにプロトプラスト化し、プロトプラストを連続的に希釈し、再生培地(実施例3.6参照)に蒔き、28℃で4日間保温した。その後単独のコロニーを、アプラマイシンを含有するMAM培地上及び抗生物質を含有しないMAM培地上に2つ組でパッチし、これらのプレートを、28℃で4日間インキュベーションした。7個のパッチは、クローン番号1(番号32-37)に由来し、4個のパッチは、クローン番号3(番号38-41)に由来し、これは抗生物質非含有プレート上で増殖したが、アプラマイシンプレート上では増殖せず、これを、＋/−アプラマイシンプレート上に再度パッチし、これらが抗生物質マーカーを喪失していたことを確認した。
【０２５９】
マクベシン類似体の生成は、「全般的方法」に説明されたように実行した。
分析は、全般的方法及び実施例2で記載した通りに実施した。化合物17は、親株BIOT-3870と同等の収率で生成され、並びに化合物18の生成は、パッチ33、34、35、37、39及び41について認められなかった。この結果は、所望の変異株は、当初のmbcMの欠失に加え、遺伝子mbcP、mbcP450、mbcMT1及びmbcMT2を含むマクベシンクラスターの3892bpの欠失を有することを示している。
【０２６０】
(実施例5: 4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-21-デオキソマクベシン-18-ホスフェート(化合物20)の合成)
不活性条件下で、4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-21-デオキソマクベシン(110mg、2.19x10-4モル、1当量)を、テトラヒドロフランに溶解し(5ml、44mM溶液)、氷浴で冷却した。トリエチルアミン(0.185ml、1.31x10-3モル、6当量)を加え、続いて、塩化ホスホリル(0.03ml、3.28x10-4モル、1.5当量)をマイクロシリンジから滴下添加した。反応物を、水氷上、不活性条件下で更に1時間撹拌させた。その時に、水(0.5ml、28mmol、125当量)を加え、反応物を水氷上で更に1時間撹拌した。その後、溶媒を真空下で除去し、白色固体を得た。
【０２６１】
セファデックスG25を、HPLC等級の水中で一晩膨張させ、カラムを準備した(直径2.5cm x 40cm)。白色固体を水(5ml)及びアセトニトリル(1ml)に溶解し、カラムに加え、水で溶出した。10mlの画分を回収し、UV活性化合物を含むものをプールし、乾燥し、白色固体(240mg)を得た。
【０２６２】
その物質を、バイオラドP2カラムで更に脱塩し、水で溶出し、UV活性画分をプールし、乾燥した。
【０２６３】
この物質の一部(11.6mg)を、水(3ml)に溶解し、20gのDOWEX 50Wx8 200(Na+サイクル)に重力下で加え、その後HPLC等級の水で溶出した。UV活性画分をプールし、乾燥した(6.5mg)。
【０２６４】
LC-MS(2.3節で説明した方法):RT 8.8分、正イオン(m/z) = 605.5([M+Na]+付加体)、陰イオン(m/z) = 581.5([MH]-)
【化５７】
2010520190.tif 000075
【０２６５】
(実施例６)
(18-O-(N,N'-ジメチルプロパンジアミンカルバモイル)-4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-18-ヒドロキシ-21-デオキソマクベシン(化合物21)の合成)
(6.1  18-O-(4-ニトロフェニルカルボネート)-4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-21-デオキソマクベシンの合成)
不活性条件下で、4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-21-デオキソマクベシン(260mg、0.517mmol、1当量)を、ジクロロメタン(20ml)に溶解した。4-ニトロフェニルクロロホルマート(130mg、0.646mmol、1.25当量)を、ジクロロメタン(1ml)に溶解し、21-デスオキソアンサマイシン溶液に加えた。その後、反応物を還流下で加熱し、2,6-ルチジン(0.078ml、0.672mmol、1.30当量)を加えた。
【０２６６】
還流下3時間の加熱の後、反応物を、更なるジクロロメタンで50mlに希釈し、1M HCl水溶液(2×50ml)及び水(2×50ml)で洗浄し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空で減少させ、オフホワイトの固体(420mg)を得た。
【０２６７】
この物質を、セファデックスLH20カラムで精製した。セファデックスLH20をメタノール/ジクロロメタン(1:1)で一晩膨張させ、カラムを準備した(直径3cm x 90cm)。
【０２６８】
この物質をメタノール/ジクロロメタン(1:1)のカラムから溶出し、3mlの画分を回収した。画分60〜69は所望の生成物を含み、これらをプールし、乾燥した(188mg、オフホワイト固体)。これを、3つの別々の注入において、分取HPLCで精製した(Phenomenex、LUNA C18、25cm x 22.5mm直径、30分に渡って50%溶媒Bから80%溶媒B、21ml/分で流した。溶媒Aは水であり、溶媒Bはアセトニトリルである)。合わせた画分をプールし、真空下で乾燥し、所望の化合物(93.3mg、オフホワイトの固体、1.39×10-4モル、27%)を得た。
【０２６９】
LCMS(上記の一般合成の節に記載されている方法):RT:7.7分、正イオン(m/z) = 690.3([M+Na]+)、陰イオン(m/z) = 666.5([MH]-)、712.4(M+HCOO-)
【０２７０】
(6.2  18-O-(N,N'-ジメチルプロパンジアミンカルバモイル)-4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-18-ヒドロキシ-21-デオキソマクベシンの調製)
不活性条件下で、18-O-(4-ニトロフェニルカルボネート)-4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-21-デオキソマクベシン(74mg、0.111mmol)を、ジクロロメタン(2ml)に溶解した。N-トリチル-N,N'-ジメチルプロパンジアミン(110mg、0.333mmol、3当量)をジクロロメタン(2ml)に溶解し、21-デスオキソアンサマイシン誘導体に加えた。得られた溶液を還流下で5時間加熱し、その後、一晩室温で撹拌し、続いて、溶媒を真空下で除去し、所望の化合物を、セファデックスLH20カラムでメタノール/ジクロロメタン(1:1)によって溶出させて精製した。
【０２７１】
LCMS(上記の一般合成の節に記載されている方法):RT:6〜8分、正イオン(m/z) = 631.7([M-トリチル+H]+)、陰イオン(m/z) = 629.6([M-トリチル-H]-)、675.5(M-トリチル+HCOO-)。
【０２７２】
クロマトグラム上のブロードピークは、LC溶媒条件下でのトリチル基の除去による。さらにまた、親化合物17は、環化-解放のためLCMSによって観察した。
トリチル基はその後、エーテル中、2M HClを用いて取り除かれる。
【０２７３】
(実施例7: 18-O-(N,N'-ジエチルエチレンジアミンカルバモイル)-4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-18-ヒドロキシ-21-デオキソマクベシン, 化合物22の合成)
不活性条件下で、18-O-(4-ニトロフェニルカルボネート)-4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-21-デオキソマクベシン(20mg、0.03mmol)(実施例6.1のように合成)を、ジクロロメタン(1ml)に溶解した。N-トリチル-N,N'-ジエチルエチレンジアミン(32mg、0.09mmol、3当量)を、ジクロロメタン(1ml)に溶解し、21-デスオキソアンサマイシン誘導体に加えた。得られた溶液を、還流下で5時間加熱し、その後、室温で一晩撹拌し、続いて、溶媒を真空下で除去し、所望の化合物を、セファデックスLH20カラムでメタノール/ジクロロメタン(1:1)によって溶出させて精製した。
【０２７４】
LCMS(上記の一般合成の節に記載されている方法):RT:6〜8分、正イオン(m/z) = 645.7([M-trityl+H]+)、陰イオン(m/z) = 643.6([M-トリチル-H]-)、689.6(M-トリチル+HCOO-)。
【０２７５】
クロマトグラム上のブロードピークは、LC溶媒条件下でのトリチル基の除去による。さらにまた、親化合物17は、環化-解放のためLCMSによって観察した。
トリチル基はその後、エーテル中、2M HClを用いて取り除かれる。
【０２７６】
(実施例8‐18-O-(N,N'-ジメチルエチレンジアミンカルバモイル)-4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-18-ヒドロキシ-21-デオキソマクベシン、化合物23の合成)
不活性条件下、18-O-(4-ニトロフェニルカルボネート)-4,5-ジヒドロ-11-O-デメチル-15-デメトキシ-18,21-ジデヒドロ-21-デオキソマクベシン(152mg、0.228mmol)(実施例6.1のように合成)を、ジクロロメタン(10ml)に溶解した。N-トリチル-N,N'-ジメチルエチルジアミン(276mg、0.835mmol、3.7当量)を、ジクロロメタン(1ml)に溶解し、21-デスオキソアンサマイシン誘導体に加えた。得られた溶液を、還流下で5時間加熱し、その後、室温で一晩撹拌し、続いて、溶媒を真空下で除去し、所望の化合物を、セファデックスLH20カラムで4:6、続いて1:1アセトン/ヘキサンによって溶出させて精製した。活性画分を合わせ、減圧下で乾燥し、白色固体(187mg、0.218mmol、95%単離収率)を得た。
【化５８】
2010520190.tif 000076
【０２７７】
トリチル保護された表題化合物(187mg、0.218mmol)を、ジクロロメタン(80ml)に溶解し、塩/氷浴(約−5℃)で冷却した。ジエチルエーテル中の2M HCl(0.2ml、0.4mmol、1.83当量)を、DCM(1ml)に溶解し、30秒かけて、該冷却溶液に加えた。5分後に、容器を室温に暖め、更に75分間撹拌した。ヘキサン(150ml)を加え、撹拌を停止した。30分に渡って定着された白色沈殿物が形成した。溶媒をデカントし、得られた固体を氷冷ヘキサン/ジエチルエーテル(1:1ml、2×1ml)によって滴定し、白い非晶体(80.6mg、57%単離収率)を得た。
【０２７８】
LCMS(上記の一般合成に記載されている方法):RT:4.0分、正イオン(m/z) = 617.9([M+H]+)、陰イオン(m/z) = 615.8([MH]-)、661.8(M+HCOO-)
【０２７９】
(実施例9−溶解度分析)
17-AAG、ゲルダナマイシン、18,21-ジヒドロマクベシン、及びマクベシンの溶解度を分析するために、試験化合物の溶液(25mM)を、適当な量のDMSOに3〜5mgのアリコートを溶解することによって調製した。
【０２８０】
一定分量(0.01mL)を、ガラスバイアル中の0.490mLのpH 7.3 PBSに加えた。各時点に対して、3つのPBSバイアルを、アンバーガラスバイアル中に調製した。6時間の時点については、DMSO中の三つ組の一定分量も、調製した。
【０２８１】
1、3、及び6時間で、分析のためにバイアルを取り出し、得られた0.5mMの溶液を、最高6時間振盪した。試料を、HPLC(0.025mL注入)によって分析した。化合物を、274nmでのピーク面積測定によって定量化した。
【０２８２】
各時点での2% DMSO(PBS中)中の溶解度を、各クロマトグラムの総ピーク面積を、相当する6時間のDMSO溶液から作成されるクロマトグラムの平均総ピーク面積と比較することによって決定した。(DMSO溶液における平均の総ピーク面積は、0.5mM溶液と同等であるとみなされた)。これらの結果を、表8に示す。化合物17の溶解度は、全般的方法にて説明したように、熱力学的分析で測定した。
【０２８３】
それらの固有の高い水溶解度のため、20及び23の溶解度をこの方法で測定することはできない。これらの化合物の水溶解度の絶対的限界は試験しなかった。しかし、化合物20は、10mg/ml(17mM)で脱イオン水に完全に溶解し、化合物23は、pH 4.5で3mg/ml(4.6mM)で、水性5mMクエン酸塩に完全に溶解する。
【表１４】
2010520190.tif 000077
【０２８４】
20及び23の溶解度をそれらの制限にとらわれることなく、それらが17-AAG、マクベシン、ゲルダナマイシン及び親化合物17などの標準化合物より実質的に可溶性であり、従って、製剤化が非常に容易である(例えば、それらは、投与に有用な濃度で水に直接溶解することができる)ことが理解され得る。
【０２８５】
(実施例１０:インビトロ開裂分析)
0.1mg/mlの化合物23を、第1の注入の3分未満前に、指定pHで水性0.1Mリン酸カリウム緩衝液に溶解した。試料を、Agilent 1100 HPLCでLC-UVによってモニターした。クロマトグラフィーを、Phenomenex Hypercloneカラム(BDS C18 3u(150×4.6mm))で成し遂げた:
移動相A：  水中0.1%ギ酸
移動相B：  アセトニトリル中0.1%ギ酸
流速：  1 mL/分。
勾配、t = 0分、B =10%;t = 2分、B = 10%;t = 20分、B = 100%。
化合物23は12.1分で溶出し、化合物17はこれらの条件で11.2分で溶出する。
【０２８６】
50時間、3.18時間毎に同じ試料から繰り返し0.05mlの注入を行った。外界温度を23℃とした。化合物23及び17について、UV反応を各時点で測定した。化合物23の消失の半減期を、このように計算した:
【０２８７】
反応の自然対数を、時間(時間単位)に対してプロットした。得られた線の傾斜及び一致を計算し、半減期、t1/2 =(ln 2)/ラムダとした。式中、ラムダはグラフの傾斜である。
【表１５】
2010520190.tif 000078
【０２８８】
化合物23の開裂の生成物は、LC-UV-MSにより化合物17であることが示された。
従って、23がインビトロにおいて、pHに依存して異なる速度で開裂し、活性代謝産物17を生成することがデータから示され、結果、インビボにおいてプロドラッグとして作用することが予測されるであろう。
【０２８９】
(実施例１１:化合物20を用いるインビトロ血液開裂分析)
全般的方法にて説明したように、ヒト及びマウス血液を用いてインキュベートしたときに、20がプロドラッグとして作用し、開裂し、化合物17を生成することを確認するため、血液開裂分析を行った。化合物を、2時間に渡って取り除かれた試料を有するヒト又はマウス血液中でインキュベートし、20及び17の存在のためにLC MS/MSによって分析した(図6を参照)。いずれの場合においても、20はプロドラッグとして作用し、17を放出することが見られた。質量分析上の17及び20の異なる反応により、20から17への変換の程度を定量化することはできなかった。
【０２９０】
(実施例１２:インビトロ透過性アッセイ)
20及び親17のインビトロ透過性は、全般的方法にて説明したように、caco-2細胞を用いて分析した。すべての化合物は、10uMの濃度で分析した。データを表9に示した。
【表１６】
2010520190.tif 000079
【０２９１】
示されるように、17とそのリン酸塩プロドラッグ20とを比較して、吸収ポテンシャルは類似性を維持する(AからB)が、逆の輸送は大きく低下し、化合物がもはや制限された流出ではなく、おそらくP-gpなどの流出輸送体からの効果が減少するためであることを示唆している。これは、改善された生物学的利用能をもたらすことが予想される。
【０２９２】
(実施例１２:マクベシン類似体の抗癌活性のインビトロ評価)
単層増殖アッセイのヒト腫瘍細胞のパネルにおける抗癌活性について、試験化合物20のインビトロ評価を、改質ヨウ化プロピジウムを用いて全般的方法にて説明したように行った。
【０２９３】
結果を下記表6に示す。示されるすべての処理/コントロール(%T/C)値は、2つの別々の実験の平均である。表12は、試験した細胞株パネルにわたる化合物の平均IC70を示す。参照としてマクベシンを示した(平均は、全反復試験の幾何平均として計算する)。
【表１７】
2010520190.tif 000080
【表１８】
2010520190.tif 000081
【０２９４】
従って、20の作用強度は、マクベシンと類似範囲であるが、これは化合物の固有の活性のため、又は親の開裂及び放出のためであるかどうかは未知である。細胞クラスターの上清のLC-MS分析は、20でなく、低量の17の存在を明らかにした。17の存在は、細胞中で20から17への開裂後の上清への放出に起因され得る。
【０２９５】
(実施例１３:生物学的データ−インビボ薬物動態学的アッセイ)
20の親分子17への開裂のインビボでの確認を、全般的方法にて記載したように行った。
雌のCD-1マウスに20の単一投与を、静脈内に3mg/kg、又は経口的に10mg/kgで与えた。続いて、血漿試料を24時間に渡って8つの時間点(投与後0.067、0.25、0.5、1、2、4、8及び24時間)で回収した。その後、該試料中の20及び17の量を分析した。図7は、研究に渡って、血漿中の20及び17のレベルを示す。
示されるように、20は経口投与後に血漿中には見られず、17が投与8時間後まで検出された。静脈内投与後、20は、投与0.25時間後まで検出されるのみであったが、17は、投与4時間後まで検出された。このデータは、経口又は静脈内投与後、いずれであっても、20がインビボで迅速に17に変換することを示唆している。
【０２９６】
本出願において言及された特許及び特許出願に含まれる参考文献は全て、可能な限り完全な範囲で引用により本明細書に組み込まれている。
【０２９７】
本明細書及び前記「特許請求の範囲」を通じて、状況がそうでないことを必要としない限りは、語句「を含む(comprise)」並びに「を含む(comprises)」及び「を含んでいる(comprising)」のような変形は、陳述された整数もしくはステップ又は整数の群の包含を暗示するが、任意の他の整数もしくはステップ又は整数もしくはステップの群を排除するものではないことが理解されるであろう。
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【図１】
2010520190.tif 000094
【図２】
2010520190.tif 000095
【図３】
2010520190.tif 000096
【図４】
2010520190.tif 000097
【図５】
2010520190.tif 000098
【図６】
2010520190.tif 000099
【図７】
2010520190.tif 000100
【図８】
2010520190.tif 000101
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月4日(2010.1.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010520190000001.app
【国際調査報告】
2010520190.tif 000102
2010520190.tif 000103
2010520190.tif 000104