(57)【要約】核酸によってコードされたリボ核酸（ＲＮＡ）の発現を調節できる試薬を含む組成物を投与する工程を含む、神経変性疾患を治療または予防する方法が提供され、当該核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、またはそのいずれかの組み合わせのうち少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列を含む群から選択される。ポリペプチドの発現および／または活性を調節できる試薬を含む組成物を投与する工程を含む、神経変性疾患を治療または予防する方法がさらに提供され、当該ポリペプチドの配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、またはそのいずれかの組み合わせの少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列を含む群から選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における神経変性疾患を診断またはモニターする方法であって、前記患者の生物学的試料中の核酸の発現レベルを検出する工程を含み、前記核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、またはそのいずれかの組み合わせのうち少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項２】
前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、またはそのいずれかの組み合わせを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的試料は、細胞、組織、体液、またはそのいずれかの組み合わせを含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記発現レベルは、前記核酸によってコードされたリボ核酸（ＲＮＡ）の発現レベルの測定によって検出される請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記核酸によって発現したＲＮＡレベルを検出する工程の前に、前記生物学的試料からＲＮＡを単離する工程をさらに含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡの発現レベルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ、またはそのいずれかの組み合わせによって検出される請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡの発現レベルは、オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによって検出される請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＲＮＡ、相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、またはそのいずれかの組み合わせを含む請求項７記載の方法。
【請求項９】
配列番号１の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号１の座標１−１２１２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標６３９−８２２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標７６６−８２２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
配列番号３の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号３の座標１−１２１５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標６３９−８２５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標７６９−８２５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
配列番号５の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号５の座標１−１２１８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標６３９−８２８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標７７２−８２８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
配列番号７の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号７の座標１−１２９０と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標６３９−９００と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標８４４−９００と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
患者における神経変性疾患を診断またはモニターする方法であって、前記患者の生物学的試料中のポリペプチドの発現を検出する工程を含み、前記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、またはそのいずれかの組み合わせの少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列からなる群から選択される方法。
【請求項１４】
配列番号２の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸座標１−４０３と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２１４−２７４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２５６−２７４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
配列番号４の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸座標１−４０４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２７５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２５７−２７５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
配列番号６の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸座標１−４０５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２７６と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２５８−２７６と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
配列番号８の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸座標１−４２９と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２１４−３００と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２８２−３００と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的試料は、細胞、組織、体液、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
前記検出する工程は、前記ポリペプチドと前記ポリペプチドに特異的に結合するように適合された抗体との免疫複合体の検出を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
免疫複合体を検出する前記工程は、ウエスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
神経変性疾患を治療または予防する方法であって、前記方法は、核酸によってコードされたリボ核酸（ＲＮＡ）の発現を調節できる試薬を含んでいる組成物を投与する工程を含み、前記核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、またはそのいずれかの組み合わせのうち少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列からなる群から選択される方法。
【請求項２４】
配列番号１の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号１の座標１−１２１２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標６３９−８２２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標７６６−８２２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
配列番号３の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号３の座標１−１２１５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標６３９−８２５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標７６９−８２５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
配列番号５の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号５の座標１−１２１８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標６３９−８２８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標７７２−８２８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
配列番号７の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号７の座標１−１２９０と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標６３９−９００と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標８４４−９００と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
前記投与する工程は、患者、患者の細胞、患者の組織、またはそのいずれかの組み合わせへの投与を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
前記調節は、核酸によってコードされた前記リボ核酸（ＲＮＡ）の発現の減弱および／または発現の増加を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
前記試薬は、前記核酸とハイブリダイズできる１以上のポリヌクレオチドを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
前記１以上のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記ｓｉＲＮＡは、第１のポリヌクレオチド配列と相補的な第２のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされた第１のポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列の少なくとも１５のヌクレオチドの近接するスパンである請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記試薬は小分子実体（ＳＭＥ）である請求項２３記載の方法。
【請求項３４】
前記小分子実体は、ＥＲＫ−ＭＡＰ  キナーゼ経路の修飾因子、ＰＫＣ経路の修飾因子、または両方を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
神経変性疾患を治療または予防する方法であって、前記方法は、ポリペプチドの発現および／または活性を調節できる試薬を含んでいる組成物を投与する工程を含み、前記ポリペプチドの配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、またはそのいずれかの組み合わせの少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列からなる群から選択される方法。
【請求項３６】
配列番号２の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸座標１−４０３と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２１４−２７４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２５６−２７４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
配列番号４の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸座標１−４０４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２７５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２５７−２７５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
配列番号６の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸座標１−４０５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２７６と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２５８−２７６と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
配列番号８の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸座標１−４２９と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２１４−３００と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２８２−３００と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
前記投与する工程は、患者、患者の細胞、患者の組織、またはそのいずれかの組み合わせへの投与を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４１】
前記調節は、前記ポリペプチドの発現の減弱、前記ポリペプチドの発現の増加、または両方を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４２】
前記試薬は、前記ポリペプチドに特異的に結合するように適合された抗体を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
単離されたポリヌクレオチド分子であって、その配列は配列番号３を含む、ポリヌクレオチド分子。
【請求項４５】
請求項４４記載のポリヌクレオチド分子の補完物であって、前記補完物および前記ポリヌクレオチドは１００％相補的である補完物。
【請求項４６】
請求項４４記載の単離されたポリヌクレオチド分子由来の第１のポリヌクレオチドであって、前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド座標６３９−８２５と少なくとも９０％相同である近接する第１のヌクレオチド配列を含む、第１のポリヌクレオチド。
【請求項４７】
請求項４４記載の単離されたポリヌクレオチド分子由来の第２のポリヌクレオチドであって、前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接する第２のヌクレオチド配列を含む、第２のポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項４４記載の単離されたポリヌクレオチド分子由来の第３のポリヌクレオチドであって、前記第３のポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド座標７６９−８２５と少なくとも９０％相同である近接する第３のヌクレオチド配列を含む、第３のポリヌクレオチド。
【請求項４９】
前記ポリヌクレオチド分子は配列番号４を含んでいるポリペプチドをコードする請求項４４記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５０】
請求項４９記載のポリペプチド由来の第１のペプチドであって、前記第１のペプチドは、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２７５と少なくとも９０％相同である近接する第１のアミノ酸配列を含む、第１のペプチド。
【請求項５１】
請求項４９記載のポリペプチド由来の第２のペプチドであって、前記第２のペプチドは、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接する第２のアミノ酸配列を含む、第２のペプチド。
【請求項５２】
請求項４９記載のポリペプチド由来の第３のペプチドであって、前記第３のペプチドは、配列番号４のアミノ酸座標２５７−２７５と少なくとも９０％相同である近接する第３のアミノ酸配列を含む、第３のペプチド。
【請求項５３】
前記ポリペプチドの発現は、神経変性疾患と診断された患者から得た生物学的試料中で調節される請求項４９記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５４】
前記ポリペプチドは、ＣＤ４４変異体である請求項４９記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５５】
前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項４９記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５６】
単離されたポリヌクレオチド分子であって、その配列は配列番号５を含む、ポリヌクレオチド分子。
【請求項５７】
請求項５６記載のポリヌクレオチド分子の補完物であって、前記補完物および前記ポリヌクレオチドは１００％相補的である補完物。
【請求項５８】
請求項５６記載の単離されたポリヌクレオチド分子由来の第１のポリヌクレオチドであって、前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド座標６３９−８２８と少なくとも９０％相同である近接する第１のヌクレオチド配列を含む、第１のポリヌクレオチド。
【請求項５９】
請求項５６記載の単離されたポリヌクレオチド分子由来の第２のポリヌクレオチドであって、前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接する第２のヌクレオチド配列を含む、第２のポリヌクレオチド。
【請求項６０】
請求項５６記載の単離されたポリヌクレオチド分子由来の第３のポリヌクレオチドであって、前記第３のポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド座標７７２−８２８と少なくとも９０％相同である近接する第３のヌクレオチド配列を含む、第３のポリヌクレオチド。
【請求項６１】
前記ポリヌクレオチド分子は、配列番号６を含んでいるポリペプチドをコードしている請求項５６記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項６２】
請求項６１記載のポリペプチド由来の第１のペプチドであって、前記第１のペプチドは、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２７６と少なくとも９０％相同である近接する第１のアミノ酸配列を含む、第１のペプチド。
【請求項６３】
請求項６１記載のポリペプチド由来の第２のペプチドであって、前記第２のペプチドは、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接する第２のアミノ酸配列を含む、第２のペプチド。
【請求項６４】
請求項６１記載のポリペプチド由来の第３のペプチドであって、前記第３のペプチドは、配列番号６のアミノ酸座標２５８−２７６と少なくとも９０％相同である近接する第３のアミノ酸配列を含む、第３のペプチド。
【請求項６５】
前記ポリペプチドの発現は、神経変性疾患と診断された患者から得た生物学的試料中で調節される、請求項６１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項６６】
前記ポリペプチドは、ＣＤ４４スプライスバリアントである請求項６１記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項６７】
前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項６５記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項６８】
神経変性疾患を診断するためのキットであって、生物学的試料中の核酸の発現を検出できる少なくとも１の試薬を含み、前記核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、またはそのいずれかの組み合わせのうち少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列を含むキット。
【請求項６９】
配列番号１の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号１の座標１−１２１２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標６３９−８２２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標７６６−８２２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項６８記載のキット。
【請求項７０】
配列番号３の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号３の座標１−１２１５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標６３９−８２５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標７６９−８２５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項６８記載のキット。
【請求項７１】
配列番号５の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号５の座標１−１２１８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標６３９−８２８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標７７２−８２８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項６８記載のキット。
【請求項７２】
配列番号７の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である前記近接するヌクレオチド配列は、配列番号７の座標１−１２９０と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標６３９−９００と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標８４４−９００と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項６８記載のキット。
【請求項７３】
前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項６８記載のキット。
【請求項７４】
前記少なくとも１の試薬は、前記核酸または前記核酸によってコードされるリボ核酸（ＲＮＡ）分子とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを含む、請求項６８記載のキット。
【請求項７５】
前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項７４記載のキット。
【請求項７６】
前記生物学的試料は、細胞、組織、体液、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項６８記載のキット。
【請求項７７】
神経変性疾患を診断するためのキットであって、生物学的試料中のポリペプチドの発現を検出できる少なくとも１の試薬を含み、前記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、またはそのいずれかの組み合わせの少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列を含むキット。
【請求項７８】
配列番号２の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸座標１−４０３と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２１４−２７４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２５６−２７４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項７７記載のキット。
【請求項７９】
配列番号４の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸座標１−４０４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２７５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２５７−２７５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項７７記載のキット。
【請求項８０】
配列番号６の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸座標１−４０５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２７６と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２５８−２７６と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項７７記載のキット。
【請求項８１】
配列番号８の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である前記近接するアミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸座標１−４２９と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２１４−３００と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２８２−３００と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項７７記載のキット。
【請求項８２】
前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項７７記載のキット。
【請求項８３】
前記少なくとも１の試薬は、前記ポリペプチドと特異的に相互作用し、かつ、検出可能な免疫複合体を形成するように適合された抗体を含む、請求項７７記載のキット。
【請求項８４】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項８３記載のキット。
【請求項８５】
前記生物学的試料は、細胞、組織、体液、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項７７記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮特許出願第６０／９２９，７０６号（出願日２００７年７月１０日）の利益を主張し、その開示は参照によって本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
いくつかの実施態様によれば、発現が、典型的な神経変性疾患（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）など）と診断された患者から入手した生物学的試料中で上昇しているＣＤ４４スプライスバリアントが与えられる。与えられるＣＤ４４スプライスバリアントのうち、単一のバリアントエクソンを含むいくつかの変異体は、前述のものではない、新規な変異体である。ＣＤ４４ポリペプチド、同様のものをコードしているポリヌクレオチド、ならびに、これらに対して作られた抗体およびオリゴヌクレオチドがさらに与えられ、これは神経変性疾患の治療および診断に使用されてもよい。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ４４は、脊椎動物の身体の細胞ごとに実質的に発現されたＩ型  膜貫通型糖タンパク質である。ＣＤ４４は細胞表面接着分子であり、これは、様々な工程（細胞輸送、細胞遊走、細胞のホーミング、細胞−細胞相互作用および細胞−基質相互作用など）に関与することが示されてきた。ＣＤ４４のＮ−末端は、分子の細胞外のリガンド結合領域を含む。様々なリガンドがＣＤ４４と相互作用することが知られる。ヒアルロン酸（ＨＡ）は、ＣＤ４４の主要なリガンドであり（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）、しかし、さらなる細胞外基質（ＥＣＭ）成分（ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンおよびコンドロイチン硫酸など（非特許文献４、非特許文献５）、ならびに非ＥＣＭ成分（粘膜血管のアドレシン、セルグリシン、オステオポンチンおよびクラスＩＩ  インバリアント鎖）、Ｅ−セレクチンおよび、Ｌ−セレクチン（非特許文献６および非特許文献７）ならびにアグリカン（非特許文献８）もまた、ＣＤ４４受容体と相互作用する可能性がある。ＣＤ４４（および時折ヒアルロン酸）の顕著な蓄積が、集中的な細胞遊走および細胞増殖の領域（癒傷、組織再構築、炎症（自己炎症を含む）、形態形成および発癌など）で検出される。ＣＤ４４の細胞質側末端の膜近傍の部分は、アクチンリンカー分子のエズリン−ラディキシン−モエシン（ＥＲＭ）ファミリーのメンバーに結合し、従って、細胞表面結合ＣＤ４４とアクチン細胞骨格との間の結合を与え（非特許文献９）、従って、ＣＤ４４依存性細胞運動性の基礎を確立する。
【０００４】
種によって、ＣＤ４４部位は、約２０のコーディングエクソン（ｃｏｄｉｎｇ  ｅｘｏｎ）を含む。例えば、ヒト  ＣＤ４４遺伝子は、計１９のエクソンを含み、一方、マウス  ＣＤ４４遺伝子は、２０のエクソンを含む。ＣＤ４４のエクソンは、２つのクラス（定常エクソン（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｅｘｏｎ）および可変エクソン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｅｘｏｎ））に分類することができる。ヒトおよびマウスの両方の定常エクソンは、エクソンＣ１−Ｃ５を５’末端に含み、かつ、Ｃ６−Ｃ９を３’末端に含み、ＣＤ４４のいわゆる定常部をコードする（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。可変エクソンは、分子の中央に位置し、ヒトにおいて９のエクソン（エクソンＶ２−Ｖ１０）を含み、マウスにおいて１０のエクソン（エクソンＶ１−Ｖ１０）を含む。当該可変エクソンは、ＣＤ４４の可変部をコードする。細胞で発現された主要な分子種は、ＣＤ４４の標準的な造血性の形態であり（ＣＤ４４ｓまたはＣＤ４４Ｈとも命名される）、これはＣＤ４４の最短の形態であり、もっぱら定常エクソンからなるｍＲＮＡ（メッセンジャーリボ核酸）によってコードされる。ｍＲＮＡにおける可変エクソンの異なる組み合わせの保持は、無数のＣＤ４４スプライスバリアントをもたらす（ＣＤ４４ｖ、非特許文献１３における概説）。しかし、理論上、１，０００超の個々のスプライスバリアントは、この方法で産生される可能性があるが、複数のスプライスバリアントが１つの組織または細胞型において同時発現する場合においてさえも、ＣＤ４４ｓは、依然として主要なアイソフォームである（例えば、非特許文献１４；非特許文献１５）。様々な状況および条件下で、ＣＤ４４のスプライシングの様式は、しばしば変化する（例えば、非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８など）。ＣＤ４４転写物は、さらなるエクソンを含むものが産生される可能性がある。例えば、スキップされていないエクソンＶ３、Ｖ５、Ｖ６およびＶ７は、活性化リンパ球および腫瘍細胞の転移性変異体によって発現されることが知られる（非特許文献１９）。ＣＤ４４スプライスバリアントの細胞選択は、結合親和性についての主要な決定要因である（非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２）。
【０００５】
いくつかの病状（自己免疫疾患など）における様々なＣＤ４４スプライスバリアントの発現が検討され、このような疾病の診断および治療の両方に対する標的として提案されてきた。ＣＤ４４の様々な変異領域に対して作られたモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、自己免疫疾患の治療のための強力な薬剤として示唆されている。Ｒｅｂｅｒらは、ラット膵臓腺癌のＣＤ４４Ｖ表面タンパク質の転移特異的な変異体に対して作られたｍＡｂｓについて記載している（非特許文献２３）。Ｔ細胞増殖を阻害する抗ＣＤ４４モノクローナル抗体はまた、様々な自己免疫疾患の治療のために提供される（非特許文献２４）。エクソンｖ６を含んでいるＣＤ４４の変異形態に対して特異的なモノクローナル抗体はまた、リンパ腫の診断に対して有用であるとして報告されている（非特許文献２５）。さらに、ＣＤ４４タンパク質、ペプチドまたは誘導体の投与は、様々な自己免疫疾患の治療に対して使用できることが報告されている（非特許文献２６）。ＣＤ４４の発現はまた、抗腫瘍性および抗炎症性の治療のための公知の標的である。動物実験は、抗体、アンチセンスオリゴおよびＣＤ４４可溶性タンパク質によるＣＤ４４のターゲティングは、様々な腫瘍の悪性の活性を顕著に減少させることを示した。ＣＤ４４発現に対して向けられたアンチセンス戦略および様々なオリゴヌクレオチドに基づいた治療が開発されてきており、例えば、特許文献１および特許文献２などに記載されている。
【０００６】
ＣＤ４４、およびそのスプライスバリアントのうちのいくつかが、自己免疫および病原体に誘発された神経障害（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）およびヒト  Ｔリンパ球向性ウイルス  Ｉ（ＨＴＬＶ−Ｉ）関連性脊髄症／熱帯痙性不全対麻痺症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）など）に関与するといういくつかのエビデンスがある。実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウス系統の研究は、多発性硬化症の動物モデルとして頻繁に使用されており、ＣＤ４４が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、グリア細胞周辺の炎症病変を引き起こすことを示した（非特許文献２７）。ＣＤ４４Ｖ１０  スプライスバリアントを発現する単核細胞は、ＥＡＥマウスの脊髄で検出された（非特許文献２８）。ＣＤ４４Ｖ３−Ｖ１０  ｃＤＮＡでワクチン接種された動物は、偽のワクチンを接種された動物または、ＣＤ４４ｓ  ｃＤＮＡでワクチン接種された動物と比較した場合、明らかに重症度が少ないＥＡＥを発症した（非特許文献２９）。ＣＤ４４ｓに対する抗体によるｉｎ  ｖｉｖｏでの治療は、疾病の負担に影響しなかったが、一方、可変部６、７および１０（ＣＤ４４Ｖ６、Ｖ７およびＶ１０）を含んでいるアイソフォームに対する抗体による併用治療は、疾病の負担をかなり減少させた（非特許文献２８）。
【０００７】
ヒト  Ｔリンパ球向性ウイルス  Ｉ（ＨＴＬＶ−Ｉ）関連性脊髄症／熱帯痙性不全対麻痺症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染によって引き起こされ、血管周囲でＨＴＬＶ−Ｉに感染し、かつ、ＣＤ４＋  Ｔ細胞浸潤が活性化された痙性対麻痺および排尿障害によって特徴付けられる。エクソンＶ６とＶ１０（ＣＤ４４Ｖ６／Ｖ１０）との間の直接的な結合を含むＣＤ４４スプライスバリアントは、ＨＡＭ／ＴＳＰの患者の末梢血液の単核細胞で頻繁に発現することが見出された（非特許文献３０）。これらの発見は、Ｖ６／Ｖ１０を含んでいるリンパ球は、疾病の初期段階においてさえも容易にＣＮＳの中に移動できるという推測を導く（非特許文献３０）。
【０００８】
「典型的な（ｃｌａｓｓｉｃ）」神経変性疾患（アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）など）は、成人で発生し、慢性、進行性および不可逆的な、苛酷に無力化する疾病である。さらに、非自己免疫の神経変性疾患としては、例えば、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）が挙げられる（例えば、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）および脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など、しかしこれらに限定されない）。アルツハイマー病（ＡＤ）は、結果としてアミロイドプラークの形成、神経原線維タングル、神経膠症およびニューロンの欠損を伴う、進行性の精神性かつ認知性の痴呆によって特徴付けられる。当該疾病は、臨床経過および病理学的特徴がかなり似ている、遺伝的形態および孤発性の形態の両方で生じる。３つの遺伝子が現在までに同定されてきており、これは、変異した場合、アルツハイマー病の常染色体優性形態の原因となる。これらの遺伝子は、アミロイドタンパク質前駆物質（ＡＰＰ）ならびに２つの構造的かつ機能的に関連したタンパク質、プレセニリン−１（ＰＳ１）およびプレセニリン−２（ＰＳ２）をコードする。３つのタンパク質のいずれかの変異は、ＡＰＰのタンパク質分解性の工程を、アミロイドβ  ペプチド（Ａβ）（アルツハイマー病のアミロイドプラークの主成分である４０−４２アミノ酸長のペプチド）を産生する細胞内経路を介して亢進する。
【０００９】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、各年でＡＬＳと診断された１００，０００人あたり１〜２人が発症する進行性の致死的な神経疾患である。ＡＬＳは、随意運動を制御する運動神経細胞が徐々に変性する場合に生じる。これらの運動神経の損失は、これらが弱めて萎縮させるように制御する筋肉に、麻痺および最終的に死をもたらす原因となる。大部分のＡＬＳの症例の原因は未知のままであるが、症例の２％は、Ｃｕ／Ｚｎ  スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子（ＳＯＤ１）の変異による。後者については、変異ＳＯＤ１は、未知の毒性獲得によって、非細胞自律性の運動神経の死滅を引き起こす。運動神経の選択的な脆弱性は、おそらく、いくつかの機構（タンパク質ミスフォールディング、ミトコンドリアの機能障害、酸化障害、欠陥のある軸索輸送、興奮毒性、不十分な増殖因子の情報伝達、および炎症を含む）の組み合わせから生じる。運動神経内の損傷は、非神経性の隣接する細胞によって、疾病進行を促進する炎症性反応を介して被った損傷によって亢進する（非特許文献３１、非特許文献３２）。
【００１０】
パーキンソン病（ＰＤ）は、脳の黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンの選択的な変性によって引き起こされる慢性かつ進行性の神経変性疾患である。ニューロンのうち８０％が、未知の原因によって、症状が現われる前に死滅する。症状は、肢の間欠的な振戦、平衡障害および運動開始困難を含む。
【００１１】
原発性側索硬化症（ＰＬＳ）は、随意筋の進行性の筋力低下によって特徴付けられる、まれな神経筋疾患である。運動神経疾患として、ＰＬＳは、随意筋の運動を制御する神経細胞が変性して死滅し、これらが制御する筋力の低下をもたらした場合に通常発症する。脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、遺伝的原因、ならびに脊髄および脳幹の運動神経の損失による脆弱性の徴候を共通して有する全ての様々な障害に適用するための用語である。
【００１２】
自然免疫系が血液脳関門をわたり、Ｔ細胞およびリンパ球の浸潤を通じて、通常の神経細胞成分を標的とする神経性自己免疫疾患（多発性硬化症など）とは異なり、典型的な神経変性疾患では、ニューロンは未知の理由によって死滅する。典型的な神経変性疾患におけるニューロン−グリア相互作用、および炎症工程の役割が示唆されてきた。マクログリア細胞およびミクログリア細胞は、ＡＬＳおよびそれぞれの疾病モデルで、多段階の変性工程における役割を有することが示唆されている。アストログリア細胞およびミクログリア細胞の活性化は、疾病の病理発生の早期に生じ、疾病の発生および促進に多大に影響すると思われる（非特許文献３３；非特許文献３４；非特許文献３５）。
【００１３】
アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症またはパーキンソン病におけるＣＤ４４の特定の変異体の役割についての明確なエビデンスは与えられていない。マウス  アストロサイトの初代培養において、ＣＤ４４の表面発現およびｍＲＮＡレベルは、ホルボールエステル（ＰＭＡ）、または、腫瘍壊死因子  αと、γ  インターフェロンのいずれかによる刺激を介して引き起こされ得る。産生されたＣＤ４４転写物は、さらなるエクソン（エクソンｖ６を含む）、およびより大きいサイズの変異体を含む。しかし、このような活性化が、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはヒトで、神経変性疾患の経過において生じるかどうかは知られていない（非特許文献２７）。ＣＤ４４ｓの局在は、対照被験者およびアルツハイマー病の患者の死後のヒト脳組織における免疫組織化学によって検討された。灰白質では、原形質の形態および線維性の形態の両方のいくつかのアストロサイトに関連することが見出された。アルツハイマー病の脳において、ＣＤ４４陽性のアストロサイトの数は劇的に増加した。ＣＤ４４は、これらのアストロサイトの工程において重要な接着分子である可能性がある（非特許文献３６）。しかし、ＣＤ４４を発現している細胞が疾病の進行に関与しているか、または、神経変性を防ぐのを補助しているか、については知られていない。これらの疾病において記載されているＣＤ４４スプライスバリアントはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６，１５０，１６２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９９０，２９９号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｍｉｙａｋｅら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９０、１７２：６９−７５
【非特許文献２】Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ  １９９０、６１：１３０３−１３
【非特許文献３】Ｐｅａｃｈら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９３、１２２：２５７−６４
【非特許文献４】Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９２、１１６：８１７−２５
【非特許文献５】Ｆａａｓｓｅｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９２、１１６：５２１−３１
【非特許文献６】Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆら、ＰＮＡＳ  ２０００、９７：１３８４１−６
【非特許文献７】Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００１、１５３：１２７７−８６
【非特許文献８】Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１、１３：３５９−６６
【非特許文献９】Ｔｓｕｋｉｔａら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９４、１２６：３９１−４０１
【非特許文献１０】Ｓｃｒｅａｔｏｎら、ＰＮＡＳ  １９９２、８９：１２１６０−４
【非特許文献１１】Ｔｏｅｌｇら、Ｎｅｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９９３  ２１：１２２５−９
【非特許文献１２】Ｓｃｒｅａｔｏｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９３、２６８：１２２３５−８
【非特許文献１３】Ｇｕｎｔｈｅｒｔ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９３、１８４：４７−６３
【非特許文献１４】Ｎｉら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ  ２００２、１３９：５９−６５
【非特許文献１５】Ｂｅｌｌら  ＭＣＢ  １９９８、１８：５９３０−４１
【非特許文献１６】Ｇｕｎｔｈｅｒｔら、Ｃｅｌｌ  １９９１、６５：１３−２４
【非特許文献１７】Ｈｅｉｄｅｒら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９３、１２０：２２７−３３
【非特許文献１８】Ｗｉｅｌｅｎｇａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９３、５３：４７５４−６
【非特許文献１９】Ｎａｏｒら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｓｃｉ、２００２、３９：５２７−７９
【非特許文献２０】Ｌｅｓｌｅｙら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９５  １８２：４３１−７
【非特許文献２１】Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら  Ｅｍｂｏ  Ｊ  １９９１  １０：３４３−８
【非特許文献２２】Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｏｏｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９５  ２１４：１３５−１４４
【非特許文献２３】Ｒｅｂｅｒら  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１９９０、４６：９１９−２７
【非特許文献２４】Ｒｏｔｈｍａｎら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１  １４７：２４９３−９
【非特許文献２５】Ｒｉｓｔａｍａｋｉら  Ｂｌｏｏｄ、１９９４、８４：２３８−４３
【非特許文献２６】Ｈａｙｎｅｓら  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ、１９９１、３４：１４３４−４３
【非特許文献２７】Ｈａｅｇｅｌら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９３、１２２：１０６７−７７
【非特許文献２８】Ｌａｍａｎら、Ｍｕｌｔ  Ｓｃｌｅｒ．１９９８、４：１４７−５３
【非特許文献２９】Ｇａｒｉｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ．２００７、２５８：１７−２６
【非特許文献３０】Ｍａｔｓｕｏｋａら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２０００、１０２：１−７
【非特許文献３１】Ｂｏｉｌｌｅｅら  Ｎｅｕｒｏｎ．２００６、５２：３９−５９
【非特許文献３２】Ｐｅｈａｒら、Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ．Ｄｉｓ．２００５、２：１３９−４６
【非特許文献３３】Ｄｉ  Ｇｉｏｒｇｉｏら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００７；１０：６０８−６１４
【非特許文献３４】Ｅｓｐｏｓｉｔｏら  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００７
【非特許文献３５】Ｋｉｍら、Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００６；３８：３３３−４７
【非特許文献３６】Ａｋｉｙａｍａら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９３、６３２：２４９−５９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
下記の実施態様およびその特徴は、系、手段および方法（模範かつ図解を意図したものであり、範囲を制限するものではない）とともに記載され、図示される。様々な実施態様では、１以上の上記の問題が減少し、または除去され、一方他の実施態様は、他の利点または改善に向けられる。
【００１７】
いくつかの実施態様によれば、典型的な神経変性疾患（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）など）と診断された患者から入手した生物学的試料中で発現が上昇しているＣＤ４４スプライスバリアントが与えられる。与えられるＣＤ４４スプライスバリアントのうち、単一のバリアントエクソンを含むいくつかの変異体は新規な変異体であり、前述のものではない。ＣＤ４４ポリペプチド、同様のものをコードしているポリヌクレオチド、ならびに、これらに対して作られた抗体およびオリゴヌクレオチドがさらに与えられ、これらは神経変性疾患の治療および診断に使用されてもよい。
【００１８】
いくつかの実施態様によれば、患者における神経変性疾患を診断またはモニターする方法が提供され、当該方法は、当該患者の生物学的試料中の核酸の発現レベルを検出する工程を含み、当該核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、またはそのいずれかの組み合わせのうち少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
さらなる実施態様によれば、配列番号１の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列は、配列番号１の座標１−１２１２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標６３９−８２２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標７６６−８２２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号３の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列は、配列番号３の座標１−１２１５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標６３９−８２５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標７６９−８２５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号５の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列は、配列番号５の座標１−１２１８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標６３９−８２８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標７７２−８２８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号７の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列は、配列番号７の座標１−１２９０と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標６３９−９００と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標８４４−９００と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００２０】
さらなる実施態様によれば、当該神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００２１】
さらなる実施態様によれば、当該生物学的試料は、細胞、組織、体液、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００２２】
さらなる実施態様によれば、当該核酸の発現レベルは、当該核酸によってコードされるリボ核酸（ＲＮＡ）の発現レベルの測定によって検出されてもよい。当該方法は、当該核酸によって発現した当該ＲＮＡレベルを検出する工程の前に、当該生物学的試料からＲＮＡを単離する工程を含んでいてもよい。
【００２３】
さらなる実施態様によれば、当該ＲＮＡの発現レベルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ、またはそのいずれかの組み合わせによって検出されてもよい。当該ＲＮＡの発現レベルは、オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによって検出されてもよい。当該オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＲＮＡ、相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００２４】
いくつかの実施態様によれば、患者における神経変性疾患を診断またはモニターする方法が提供され、当該方法は、当該患者の生物学的試料中のポリペプチドの発現を検出する工程を含み、当該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、またはそのいずれかの組み合わせの少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列を含む群から選択される。
【００２５】
さらなる実施態様によれば、配列番号２の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸座標１−４０３と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２１４−２７４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２５６−２７４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号４の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸座標１−４０４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２７５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２５７−２７５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号６の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸座標１−４０５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２７６と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２５８−２７６と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号８の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸座標１−４２９と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２１４−３００と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２８２−３００と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００２６】
さらなる実施態様によれば、当該神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００２７】
さらなる実施態様によれば、当該生物学的試料は、細胞、組織、体液、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００２８】
さらなる実施態様によれば、検出する工程は、ポリペプチドと当該ポリペプチドに特異的に結合するように適合された抗体との免疫複合体の検出を含んでいてもよい。免疫複合体の検出は、ウエスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。当該抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００２９】
いくつかの実施態様によれば、神経変性疾患を治療または予防する方法が提供され、当該方法は、核酸によってコードされたリボ核酸（ＲＮＡ）の発現を調節できる試薬を含んでいる組成物を投与する工程を含んでいてもよく、当該核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、またはそのいずれかの組み合わせのうち少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００３０】
さらなる実施態様によれば、配列番号１の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列は、配列番号１の座標１−１２１２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標６３９−８２２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標７６６−８２２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号３の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列は、配列番号３の座標１−１２１５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標６３９−８２５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標７６９−８２５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号５の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列は、配列番号５の座標１−１２１８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標６３９−８２８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標７７２−８２８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号７の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列は、配列番号７の座標１−１２９０と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標６３９−９００と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標８４４−９００と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００３１】
さらなる実施態様によれば、当該投与する工程は、患者、患者の細胞、患者の組織、またはそのいずれかの組み合わせへの投与を含んでいてもよい。調節は、当該核酸によってコードされたＲＮＡの発現の減弱、当該核酸によってコードされたＲＮＡの発現の増加、または両方を含んでいてもよい。
【００３２】
さらなる実施態様によれば、当該試薬は、当該核酸とハイブリダイズできる１以上のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。１以上のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。当該ｓｉＲＮＡは、第１のポリヌクレオチド配列と相補的な第２のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされた第１のポリヌクレオチド配列を含んでいてもよく、当該第１のポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列の少なくとも１５のヌクレオチドの少なくとも１５のヌクレオチドの近接するスパンである。
【００３３】
さらなる実施態様によれば、当該リボ核酸の発現を調節できる試薬は、小分子実体（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｎｔｉｔｙ、ＳＭＥ）を含んでいてもよい。当該小分子実体は、ＥＲＫ−ＭＡＰ  キナーゼ経路の修飾因子、ＰＫＣ  キナーゼの修飾因子、などを含んでいてもよい。
【００３４】
いくつかの実施態様によれば、神経変性疾患を治療または予防する方法がさらに提供され、当該方法は、ポリペプチドの発現および／または活性を調節できる試薬を含んでいる組成物を投与する工程を含み、当該ポリペプチドの配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、またはそのいずれかの組み合わせの少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００３５】
さらなる実施態様によれば、配列番号２の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸座標１−４０３と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２１４−２７４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２５６−２７４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号４の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸座標１−４０４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２７５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２５７−２７５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号６の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸座標１−４０５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２７６と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２５８−２７６と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号８の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸座標１−４２９と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２１４−３００と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２８２−３００と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００３６】
さらなる実施態様によれば、投与する工程は、患者、患者の細胞、患者の組織、またはそのいずれかの組み合わせへの投与を含んでいてもよい。調節は、当該ポリペプチドの発現および／もしくは活性の減弱、当該ポリペプチドの発現および／もしくは活性の増加、または両方を含んでいてもよい。
【００３７】
さらなる実施態様によれば、当該試薬は、当該ポリペプチドに特異的に結合するように適合された抗体を含んでいてもよい。当該抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００３８】
いくつかの実施態様によれば、単離されたポリヌクレオチド分子が提供され、その配列は、配列番号３を含む。当該単離されたポリヌクレオチド分子の補完物がさらに提供され、当該補完物および当該ポリヌクレオチドは１００％相補的である。他の実施態様によれば、単離されたポリヌクレオチド分子由来の第１のポリヌクレオチドがさらに提供され、当該第１のポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド座標６３９−８２５と少なくとも９０％相同である近接する第１のヌクレオチド配列を含む。単離されたポリヌクレオチド分子由来の第２のポリヌクレオチドがさらに提供され、当該第２のポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接する第２のヌクレオチド配列を含む。単離されたポリヌクレオチド分子由来の第３のポリヌクレオチドがさらに提供され、当該第３のポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド座標７６９−８２５と少なくとも９０％相同である近接する第３のヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
さらなる実施態様によれば、配列番号３の単離されたポリヌクレオチド分子は、ポリペプチドをコードしていてもよく、その配列は配列番号４を含む。配列番号４のポリペプチド由来の第１のペプチドがさらに提供され、当該第１のペプチドは、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２７５と少なくとも９０％相同である近接する第１のアミノ酸配列を含む。配列番号４のポリペプチド由来の第２のペプチドがさらに提供され、当該第２のペプチドは、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接する第１のアミノ酸配列を含む。配列番号４のポリペプチド由来の第３のペプチドがさらに提供され、当該第３のペプチドは、配列番号４のアミノ酸座標２５７−２７５と少なくとも９０％相同である近接する第１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、当該ポリペプチドの発現は、神経変性疾患と診断された患者から得た生物学的試料中で上昇する。当該ポリペプチドは、ＣＤ４４変異体である。当該神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００４０】
いくつかの実施態様によれば、単離されたポリヌクレオチド分子が提供され、その配列は配列番号５を含む。当該単離されたポリヌクレオチド分子の補完物がさらに提供され、当該補完物および当該ポリヌクレオチドは１００％相補的である。他の実施態様によれば、単離されたポリヌクレオチド分子由来の第１のポリヌクレオチドがさらに提供され、当該第１のポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド座標６３９−８２８と少なくとも９０％相同である近接する第１のヌクレオチド配列を含む。単離されたポリヌクレオチド分子由来の第２のポリヌクレオチドがさらに提供され、当該第２のポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接する第１のヌクレオチド配列を含む。単離されたポリヌクレオチド分子由来の第３のポリヌクレオチドがさらに提供され、当該第３のポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド座標７７２−８２８と少なくとも９０％相同である近接する第３のヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
さらなる実施態様によれば、配列番号５の単離されたポリヌクレオチド分子はポリペプチドをコードしていてもよく、その配列は配列番号６を含む。さらなる実施態様によれば、配列番号６のポリペプチド由来の第１のペプチドがさらに提供され、当該第１のペプチドは、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２７６と少なくとも９０％相同である近接する第１のアミノ酸配列を含む。配列番号６のポリペプチド由来の第２のペプチドがさらに提供され、当該第２のペプチドは、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接する第２のアミノ酸配列を含む。配列番号６のポリペプチドに由来する第３のペプチドがさらに提供され、当該第３のペプチドは、配列番号６のアミノ酸座標２５８−２７６と少なくとも９０％相同である近接する第３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様によれば、当該ポリペプチドの発現は、神経変性疾患と診断された患者から得た生物学的試料中で上昇する。当該ポリペプチドは、ＣＤ４４変異体を含んでいてもよい。当該神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００４２】
いくつかの実施態様によれば、神経変性疾患を診断するためのキットが提供され、当該キットは、生物学的試料中の核酸の発現を検出できる少なくとも１の試薬を含み、当該核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、またはそのいずれかの組み合わせのうち少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。さらなる実施態様によれば、配列番号１の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列は、配列番号１の座標１−１２１２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標６３９−８２２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号１の座標７６６−８２２と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号３の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列は、配列番号３の座標１−１２１５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標６３９−８２５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号３の座標７６９−８２５と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号５の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列は、配列番号５の座標１−１２１８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標６３９−８２８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号５の座標７７２−８２８と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号７の少なくとも２０のヌクレオチドと少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列は、配列番号７の座標１−１２９０と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標６３９−９００と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標６３９−６９６と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、配列番号７の座標８４４−９００と少なくとも９０％相同である近接するヌクレオチド配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。さらなる実施態様によれば、当該神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。当該生物学的試料は、細胞、組織、体液、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００４３】
さらなる実施態様によれば、当該少なくとも１の試薬は、当該核酸または当該核酸によってコードされるリボ核酸（ＲＮＡ）分子とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。当該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００４４】
いくつかの実施態様によれば、生物学的試料中のポリペプチドの発現を検出できる少なくとも１の試薬を含んでいる神経変性疾患を診断するためのキットが提供され、当該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、またはそのいずれかの組み合わせの少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様によれば、配列番号２の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸座標１−４０３と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２１４−２７４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸座標２５６−２７４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号４の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸座標１−４０４と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２７５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸座標２５７−２７５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号６の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸座標１−４０５と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２７６と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸座標２５８−２７６と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。配列番号８の少なくとも１０のアミノ酸と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸座標１−４２９と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２１４−３００と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２１４−２３２と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸座標２８２−３００と少なくとも９０％相同である近接するアミノ酸配列、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。さらなる実施態様によれば、当該神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。当該生物学的試料は、細胞、組織、体液、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００４５】
さらなる実施態様によれば、当該少なくとも１の試薬は、当該ポリペプチドと特異的に相互作用し、かつ、検出可能な免疫複合体を形成するように適合された抗体を含んでいてもよい。当該抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００４６】
上記の代表的な態様および実施態様に加え、さらなる態様および実施態様は、図への参照および下記の詳細な説明の検討によって明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
実施態様で示した例は、本願明細書に添付された図への参照とともに、下記で記載される。図において、２以上の図に現われた、同一の構造、要素または部分は、一般的に、同じ数字によって、それらが現われた全ての図において標識される。図に示された構成要素および特徴の寸法は、一般的に、説明の便宜および明確さのために選択され、必ずしも規模を示したものではない。図は以下に記載される。
【図１】ＣＤ４４のゲノムの構造を模式的に示す。
【図２】Ｖ３バリアントエクソンのヌクレオチド配列およびタンパク質配列、ならびにＶ３バリアントエクソンのスプライスジャンクションを、定常エクソンＣ５およびＣ６とともに模式的に示す。
【図３】Ｖ６バリアントエクソンのヌクレオチド配列およびタンパク質配列、ならびにＶ６バリアントエクソンのスプライスジャンクションを、定常エクソンＣ５およびＣ６とともに模式的に示す。
【図４】Ｖ７バリアントエクソンのヌクレオチド配列およびタンパク質配列、ならびにＶ７バリアントエクソンのスプライスジャンクションを、定常エクソンＣ５およびＣ６とともに、模式的に示す。
【図５】Ｖ１０バリアントエクソンのヌクレオチド配列およびタンパク質配列、ならびにＶ１０バリアントエクソンのスプライスジャンクションを定常エクソンＣ５およびＣ６とともに模式的に示す。
【図６】ＣＤ４４Ｖ６抗体による、ＡＤ患者の海馬の切片の免疫組織化学染色を示す。
【図７】いくつかの実施態様による、様々なＣＤ４４変異体のｍＲＮＡ発現へのｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図８】いくつかの実施態様による、様々なＣＤ４４変異体のｍＲＮＡ発現へのＳＭＥの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
下記の記載において、本発明の様々な態様が記載される。説明のため、特定の配置および詳細は、本発明の十分な理解を与えるために示される。しかし、当業者には、本発明は、本願明細書に示された詳細な情報なく行うことができることも明らかだろう。さらに、周知の特色は、本発明を不明瞭にしないために、省略され、または単純化され得る。
【００４９】
いくつかの実施態様によれば、発現が、典型的な神経変性疾患（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）など）と診断された患者から入手した生物学的試料中で上方制御されたＣＤ４４スプライスバリアントが与えられる。同様のものをコードしているＣＤ４４  ポリペプチド、ポリヌクレオチドがさらに与えられ、これらに対して作られた抗体およびオリゴヌクレオチドは、神経変性疾患の治療および診断で使用してもよい。
【００５０】
下記は、本願明細書全体で使用され、かつ、下記を意味するように、様々な実施態様に従って理解されるべき用語である。
【００５１】
本願明細書で言及される用語「ＣＤ４４  遺伝子」は、ＣＤ４４の遺伝子配列および／または遺伝子構造に関し、これは図１Ａに模式的に示される。
【００５２】
本願明細書で言及される用語「ＣＤ４４スプライスバリアント核酸配列」（「ＣＤ４４変異コード配列」または「ＣＤ４４変異体」または「ＣＤ４４スプライスバリアント転写物」とも交換可能に呼ばれる）は、１以上のＣＤ４４スプライスバリアントに関連していてもよく、これは本願明細書において下記で記載される。
【００５３】
本願明細書で言及される用語「ＣＤ４４スプライスバリアントＶ３核酸コード配列」（「ＣＤ４４スプライスバリアントＶ３コード配列」または「ＣＤ４４Ｖ３」または「ＣＤ４４Ｖ３転写物」または「ＣＤ４４Ｖ３コード配列」または「ＣＤ４４スプライスバリアントＶ３」とも交換可能に呼ばれる）は、配列番号１に示された配列を有する核酸分子、当該配列と少なくとも９０％の同一性（下記参照）を有する核酸分子、および少なくとも２０のヌクレオチド長の上記分子の断片（下記参照）に関連していてもよい。この分子は、天然かつ公知のＣＤ４４転写物の、自然に存在する別のスプライスバリアントをコードしている配列を含む。ＣＤ４４Ｖ３（図１Ｂで模式的に示される）は、少なくとも定常エクソンＣ５、バリアントエクソンＶ３および定常エクソンＣ６を含み、さらに好ましくは、ＣＤ４４遺伝子の定常エクソンＣ１−Ｃ５、Ｃ６−Ｃ９および可変エクソンＶ３を含む。図２Ａは、バリアントエクソンＶ３のヌクレオチド配列を記載する。図２Ｂは、定常エクソンＣ５とバリアントエクソンＶ３との間の接合ブリッジ（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｒｉｄｇｅ）のヌクレオチド配列を記載する。図２Ｃは、バリアントエクソンＶ３と定常エクソンＣ６との間の接合ブリッジのヌクレオチド配列を記載する。
【００５４】
本願明細書で言及される用語「ＣＤ４４スプライスバリアントＶ６核酸コード配列」（「ＣＤ４４スプライスバリアントＶ６コード配列」または「ＣＤ４４Ｖ６」または「ＣＤ４４Ｖ６転写物」または「ＣＤ４４Ｖ６コード配列」または「ＣＤ４４スプライスバリアントＶ６」とも交換可能に呼ばれる）は、配列番号３に示された配列を有する核酸分子、当該配列と少なくとも９０％の同一性（下記参照）を有する核酸分子、および少なくとも２０のヌクレオチド長の上記分子の断片（下記参照）に関連していてもよい。この分子は、天然かつ公知の、ＣＤ４４転写物の新規な別のスプライスバリアントをコードしている配列を含む。ＣＤ４４Ｖ６（図１Ｃに模式的に示される）は、少なくとも定常エクソンＣ５、バリアントエクソンＶ６および定常エクソンＣ６を含み、さらに好ましくは、ＣＤ４４遺伝子の定常エクソンＣ１−Ｃ５、Ｃ６−Ｃ９および可変エクソンＶ６を含む。図３Ａは、バリアントエクソンＶ６のヌクレオチド配列を記載する。図３Ｂは、定常エクソンＣ５とバリアントエクソンＶ６との間の接合ブリッジのヌクレオチド配列を記載する。図３Ｃは、バリアントエクソンＶ６と定常エクソンＣ６との間の接合ブリッジのヌクレオチド配列を記載する。
【００５５】
本願明細書で言及される用語「ＣＤ４４スプライスバリアントＶ７核酸コード配列」（「ＣＤ４４スプライスバリアントＶ７コード配列」または「ＣＤ４４Ｖ７」または「ＣＤ４４Ｖ７転写物」または「ＣＤ４４Ｖ７コード配列」または「ＣＤ４４スプライスバリアントＶ７」とも交換可能に呼ばれる）は、配列番号５に示された配列を有する核酸分子、当該配列と少なくとも９０％の同一性（下記参照）を有する核酸分子、および少なくとも２０のヌクレオチド長の上記分子の断片（下記参照）に関連していてもよい。この分子は、新規な、自然に存在する、天然かつ公知のＣＤ４４転写物の別のスプライスバリアントをコードしている配列を含む。ＣＤ４４Ｖ７（図１Ｄに模式的に示される）は、少なくとも定常エクソンＣ５、バリアントエクソンＶ７および定常エクソンＣ６を含み、さらに好ましくは、ＣＤ４４遺伝子の定常エクソンＣ１−Ｃ５、Ｃ６−Ｃ９および可変エクソンＶ７を含む。図４Ａは、バリアントエクソンＶ７のヌクレオチド配列を記載する。図４Ｂは、定常エクソンＣ５とバリアントエクソンＶ７との間の接合ブリッジのヌクレオチド配列を記載する。図４Ｃは、バリアントエクソンＶ７と定常エクソンＣ６との間の接合ブリッジのヌクレオチド配列を記載する。
【００５６】
本願明細書で言及される用語「ＣＤ４４スプライスバリアントＶ１０核酸コード配列」（「ＣＤ４４スプライスバリアントＶ１０コード配列」、または「ＣＤ４４Ｖ１０」、または「ＣＤ４４Ｖ１０転写物」または「ＣＤ４４Ｖ１０コード配列」または「ＣＤ４４スプライスバリアントＶ１０」とも交換可能に呼ばれる）は、配列番号７に示された配列を有する核酸分子、当該配列と少なくとも９０％の同一性（下記参照）を有する核酸分子、および少なくとも２０のヌクレオチド長の上記分子の断片（下記参照）に関連していてもよい。この分子は、天然かつ公知のＣＤ４４転写物の、自然に存在する別のスプライスバリアントをコードしている配列を含む。ＣＤ４４Ｖ１０（図１Ｅに模式的に示される）は、少なくとも定常エクソンＣ５、バリアントエクソンＶ１０および定常エクソンＣ６を含み、さらに好ましくは、ＣＤ４４遺伝子の定常エクソンＣ１−Ｃ５、Ｃ６−Ｃ９および可変エクソンＶ１０を含む。図５Ａは、バリアントエクソンＶ１０のヌクレオチド配列を記載する。図５Ｂは、定常エクソンＣ５とバリアントエクソンＶ１０との間の接合ブリッジのヌクレオチド配列を記載する。図５Ｃは、バリアントエクソンＶ１０と定常エクソンＣ６との間の接合ブリッジのヌクレオチド配列を記載する。
【００５７】
本願明細書で言及される用語「ＣＤ４４スプライスバリアント生成物」（「ＣＤ４４変異生成物」または「ＣＤ４４変異体タンパク質」または「ＣＤ４４変異体ペプチド」とも交換可能に呼ばれる）は、本願明細書に下記で記載された１以上のＣＤ４４スプライスバリアント生成物に関連していてもよい。
【００５８】
本願明細書で言及される用語「ＣＤ４４Ｖ３生成物」（「ＣＤ４４Ｖ３タンパク質」または「ＣＤ４４Ｖ３ペプチド」とも交換可能に呼ばれる）は、ＣＤ４４Ｖ３コード配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。「ポリペプチド」により、ペプチドまたはタンパク質、および、化学的に修飾されたアミノ酸を有するペプチドまたはタンパク質（下記参照）（糖ペプチドまたは糖タンパク質など）が意図される。ＣＤ４４Ｖ３生成物のアミノ酸配列は配列番号２に示される。ＣＤ４４Ｖ３のＣ５−Ｖ３−Ｃ６領域のアミノ酸配列は、配列番号２の座標２１４−２７４に対応する。図２Ａは、バリアントエクソンＶ３のアミノ酸配列を記載する。図２Ｂは、定常エクソンＣ５とバリアントエクソンＶ３との間の接合ブリッジのアミノ酸配列を記載する。図２Ｃは、バリアントエクソンＶ３と定常エクソンＣ６との間の接合ブリッジのアミノ酸配列を記載する。「ＣＤ４４Ｖ３生成物」はまた、１以上のアミノ酸が付加され、欠損され、置換され（下記参照）または化学的に修飾された（下記参照）当該アミノ酸配列の相同体（下記参照）、および少なくとも６のアミノ酸を有するこの配列の断片（下記参照）を含む。
【００５９】
本願明細書で言及される用語「ＣＤ４４Ｖ６生成物」（「ＣＤ４４Ｖ６タンパク質」または「ＣＤ４４Ｖ６ペプチド」とも交換可能に呼ばれる）は、ＣＤ４４Ｖ６コード配列によってコードされたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。「ポリペプチド」により、ペプチドまたはタンパク質、および、化学的に修飾されたアミノ酸を有するペプチドまたはタンパク質（下記参照）（糖ペプチドまたは糖タンパク質など）が意図される。ＣＤ４４Ｖ６生成物のアミノ酸配列は、配列番号４に示される。ＣＤ４４Ｖ６のＣ５−Ｖ６−Ｃ６領域のアミノ酸配列は、配列番号４の座標２１４−２７５に対応する。図３Ａは、バリアントエクソンＶ６のアミノ酸配列を記載する。図３Ｂは、定常エクソンＣ５とバリアントエクソンＶ６との間の接合ブリッジのアミノ酸配列を記載する。図３Ｃは、バリアントエクソンＶ６と定常エクソンＣ６との間の接合ブリッジのアミノ酸配列を記載する。「ＣＤ４４Ｖ６生成物」はまた、１以上のアミノ酸が付加され、欠損され、置換され（下記参照）または化学的に修飾された（下記参照）当該アミノ酸配列の相同体（下記参照）、および少なくとも６のアミノ酸を有するこの配列の断片（下記参照）を含む。
【００６０】
本願明細書で言及される用語「ＣＤ４４Ｖ７生成物」（「ＣＤ４４Ｖ７タンパク質」または「ＣＤ４４Ｖ７ペプチド」とも交換可能に呼ばれる）は、ＣＤ４４Ｖ７コード配列によってコードされたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。「ポリペプチド」により、ペプチドまたはタンパク質、および、化学的に修飾されたアミノ酸を有するペプチドまたはタンパク質（下記参照）（糖ペプチドまたは糖タンパク質など）が意図される。ＣＤ４４Ｖ７生成物のアミノ酸配列は、配列番号６に示される。ＣＤ４４Ｖ７のＣ５−Ｖ７−Ｃ６領域のアミノ酸配列は、配列番号６の座標２１４−２７６に対応する。図４Ａは、バリアントエクソンＶ７のアミノ酸配列を記載する。図４Ｂは、定常エクソンＣ５とバリアントエクソンＶ７との接合ブリッジのアミノ酸配列を記載する。図４Ｃは、バリアントエクソンＶ７と定常エクソンＣ６との間の接合ブリッジのアミノ酸配列を記載する。「ＣＤ４４Ｖ１０生成物」はまた、１以上のアミノ酸が付加され、欠損され、置換され（下記参照）または化学的に修飾された（下記参照）当該アミノ酸配列の相同体（下記参照）、および少なくとも６のアミノ酸を有するこの配列の断片（下記参照）を含む。
【００６１】
本願明細書で言及される用語「ＣＤ４４Ｖ１０生成物」（「ＣＤ４４Ｖ１０タンパク質」または「ＣＤ４４Ｖ１０ペプチド」とも交換可能に呼ばれる）は、ＣＤ４４Ｖ１０コード配列によってコードされたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。「ポリペプチド」により、ペプチドまたはタンパク質、および、化学的に修飾されたアミノ酸を有するペプチドまたはタンパク質（下記参照）（糖ペプチドまたは糖タンパク質など）が意図される。ＣＤ４４Ｖ１０生成物のアミノ酸配列は、配列番号８に示される。ＣＤ４４Ｖ１０のＣ５−Ｖ１０−Ｃ６領域のアミノ酸配列は、配列番号８の座標２１４−３００に対応する。図５Ａは、バリアントエクソンＶ１０のアミノ酸配列を記載する。図５Ｂは、定常エクソンＣ５とバリアントエクソンＶ１０との間の接合ブリッジのアミノ酸配列を記載する。図５Ｃは、バリアントエクソンＶ１０と定常エクソンＣ６との間の接合ブリッジのアミノ酸配列を記載する。「ＣＤ４４Ｖ１０生成物」はまた、１以上のアミノ酸が付加され、欠損され、置換され（下記参照）または化学的に修飾された（下記参照）当該アミノ酸配列の相同体（下記参照）、および少なくとも６のアミノ酸を有するこの配列の断片（下記参照）を含む。
【００６２】
相同体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８のうちいずれか１の配列と少なくとも９０％同一である、または、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８の配列のうちいずれか１つの少なくとも６のアミノ酸の断片と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドと関連する。相同体と、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８のうちいずれか１の配列またはその断片との間のアミノ酸配列の変異は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８のうちいずれか１の配列の１以上のアミノ酸の付加、欠損、置換または化学修飾から生じる。当該相同体が置換を含む場合、その置換は、好ましくは保存的なものである。
【００６３】
「核酸分子」または「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）ヌクレオチド、ＲＮＡ（リボ核酸）ヌクレオチドもしくは両方のタイプの組み合わせからなる一本鎖または二本鎖のポリマーに関連し、天然のヌクレオチド、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび合成ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００６４】
「アミノ酸配列」は、２０の自然に存在するアミノ酸、化学的に修飾されたアミノ酸（下記参照）、または合成アミノ酸のうちいずれか１からなる配列に関連する。
【００６５】
「保存的な置換」は、１つのクラスのアミノ酸を同一のクラスのアミノ酸によって置換することを意味し、クラスは、一般的な物理化学的なアミノ酸の側鎖の特性、および自然で見出される相同のタンパク質の高い置換頻度によって定義され、例えば、標準的なデイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）周波数頻度マトリックスまたはＢＬＯＳＵＭ  マトリックスによって測定される。アミノ酸側鎖の６の一般的なクラスが分類され、以下を含む：クラス  Ｉ（Ｃｙｓ）；クラス  ＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラス  ＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｉｎ、Ｇｌｕ）；クラス  ＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラス  Ｖ（Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；およびクラス  ＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。例えば、Ａｓｐの、別のクラス  ＩＩＩの残基（Ａｓｎ、Ｇｉｎ、またはＧｌｕなど）への置換は保存的な置換である。
【００６６】
「非保存的な置換」は、１つのクラスのアミノ酸を別のクラスからのアミノ酸と置換すること（例えば、Ａｌａ（クラス  ＩＩの残基）を、クラスＩＩＩの残基（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＧｉｎなど）と置換する）を意味する。
【００６７】
「化学的に修飾された」とは、少なくとも１のそのアミノ酸残基が、自然の工程（プロセシングまたは他の翻訳後の修飾など）または、当該技術分野で周知の化学修飾技術のいずれかによって修飾された生成物（タンパク質）を意味する。多数の公知の修飾のうち、典型的な例（しかし、排他的ではない）としては、アセチル化、アシル化、アミド化、ＡＤＰ−リボシル化、グリコシル化、グリコサミノグリカン化（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎａｔｉｏｎ）、ＧＰＩ  アンカー形成、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、メチル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｌｙａｔｉｏｎ）、ペグ化、プレニル化、リン酸化、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｔｉｎａｔｉｏｎ）、またはいずれかの類似する工程が挙げられる。
【００６８】
「最適な配列比較」は、最も高い同一性スコアの割合を与える配列比較として定義される。このような配列比較は、初期状態のパラメータの設定を使用して、局所配列比較プログラム  ＬＡＬＩＧＮなどの様々な市販の配列分析プログラムを用いて、行うことができる。
【００６９】
アミノ酸または核酸配列の２つのセットに関して「少なくとも９０％の同一性を有している」とは、配列が最適に整列された場合に、２つの配列において同一である残基の割合を意味する。従って、少なくとも９０％のアミノ酸配列の同一性とは、２以上の最適に整列されたポリペプチド配列において少なくとも９０％のアミノ酸が同一であることを意味する。しかし、この定義は、最初の核酸配列または最初のタンパク質配列（変異体はこれらから変化した）と１００％同一である配列を明確に除外する。
【００７０】
「変異核酸配列を有する単離された核酸分子」および「単離されたポリヌクレオチド分子」は、変異コード配列を含む核酸分子を意味する。当該単離された核酸分子は、独立した挿入物としての変異コード配列を含んでいてもよいがこれに限定されず、変異コード配列が優性のコード配列である融合タンパク質を一緒にコードしている、さらなるコード配列と融合された変異コード配列を含んでいてもよく（例えば、当該さらなるコード配列は、シグナルペプチドをコードしていてもよい）、当該変異コード配列は、適した宿主におけるコード配列の発現に効果的な非コード配列（例えば、イントロンまたは調節領域（プロモーターならびにターミネーター領域または５’および／もしくは３’の非翻訳領域など））と組み合わせてもよく、あるいは、変異体タンパク質コード配列が異種であるベクターであってもよい。
【００７１】
「発現ベクター」は、異種のＤＮＡ断片を外来細胞に取り込むことができ、発現させることができるベクターを意味する。多くの原核生物および真核生物の発現ベクターは公知であり、かつ／または市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００７２】
「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはその模倣物の、一本鎖もしくは二本鎖のオリゴマーまたはポリマーを意味する。この用語は、自然に存在する塩基、糖、および共有結合性のヌクレオシド内（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）連鎖（例えば、主鎖）からなるオリゴヌクレオチド、ならびに自然に存在しない部分（これは、それぞれ自然に存在する部分と同様に機能する）を有しているオリゴヌクレオチドを含む。
【００７３】
「欠損」は、自然に存在する配列と比較した場合、１以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基がそれぞれ存在しない、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のいずれかの変化を意味する。
【００７４】
「挿入」または「付加」は、自然に存在する配列と比較した場合、１以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基の付加をそれぞれもたらす、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の変化を意味する。
【００７５】
「置換」は、自然に存在する配列と比較した場合、それぞれ異なるヌクレオチドもしくはアミノ酸による、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の置換を意味する。アミノ酸配列に関しては、当該置換は保存的または非保存的であってもよい。
【００７６】
「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ抗体のいずれかのクラスの抗体を意味する。当該定義は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む。この用語は、全抗体、または抗変異生成物の抗体（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ部分のない他の抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、二特異性抗体、基本的に抗体の可変の抗原−結合領域のみからなる他の断片など）の抗原−結合領域を含み、その由来である当該全抗体の抗原結合特性を実質的に保持する当該抗体の断片を意味する。
【００７７】
「作動薬」は、ＣＤ４４変異生成物の効果を模倣し、またはＣＤ４４変異生成物と比較して増強された活性を有し、または、時折、変異生成物の生物学的活性の持続時間を、変異生成物自身によって引き起こされるものと比較して増加もしくは延長さえもする分子を意味する。当該機構は、生物学的分子の活性（受容体への結合など）の延長；分子の寿命の延長；その標的への分子の活性の増加；その受容体に対する分子の結合性の増加；分子の分解またはタンパク質分解の阻害などについて知られるいずれかの機構であってもよい。作動薬は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、もしくはその誘導体、または、変異生成物の活性を正に調節できるいずれかの他の分子であってもよい。
【００７８】
「拮抗薬」は、ＣＤ４４変異生成物の生物学的活性の持続時間を抑制または短縮する分子を意味する。このことは、生物学的分子を非活性化または阻害することが知られたいずれかの機構（受容体の遮断、活性部位の遮断、結合部位上の競合、分解の亢進、など）によって達成してもよい。拮抗薬は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、もしくはその誘導体、またはＣＤ４４変異生成物の活性を負に調節できるいずれかのほかの分子であってもよい。
【００７９】
「生物学的試料」は、様々な実施態様および実施例で使用される生物学的試料は、いずれかの適切な身体由来の試料であってもよい。当該試料は、液体試料（全血、末梢血液の単球、白血球など）を含んでいてもよい。当該試料は、様々な細胞および組織を含んでいてもよい。当該試料は、固定および／または包埋された組織切片を含んでいてもよい。当該試料は、抽出したばかりのもの、または冷凍されたもののいずれであってもよい。当該試料は、生きている被験者または死亡した被験者から入手してもよく、いずれかの生物（例えば、ヒト、マウスおよびラットなど）から入手してもよい。
【００８０】
「疾病を治療する」とは、疾病に関連する症状を寛解させ、重症度を和らげ、もしくは疾病を治療し、または疾病の発症を予防するのに効果的な、少なくとも１の試薬／物質を含む組成物の投与を意味する。
【００８１】
本願明細書で言及される用語「調節する」とは、核酸および／もしくはポリペプチドの発現ならびに／または活性に影響する（変化させる）ことに向けられる。用語、調節は、核酸および／もしくはポリペプチドの発現および／もしくは活性の増加ならびに／または減弱（下方制御）を意味していてもよい。
【００８２】
「検出」、「診断」は、疾病、症状、障害、病理学的また通常の症状の検出；疾病、症状、障害、病理学的症状の分類；疾病、症状、障害、病理学的症状の重症度の判定；疾病、症状、障害、病理学的症状の進行のモニター；これらの回復の結果および／または見通しの予測、をする方法を意味する。
【００８３】
「プローブ」は、試料中の他の類似する配列の存在を検出するために使用される場合、変異コード配列を含んでいる核酸分子、またはその相補的な配列である。当該検出は、プローブとアッセイされた配列との間のハイブリダイゼーション複合体の同定によって行われる。当該プローブは、いくつかの実施態様では、固体の担体または検出可能な標識に付着していてもよい。当該プローブは、一般的に一本鎖であり、一般的に１０〜１００ヌクレオチドの間である。プローブの特定の特性は、特定の使用に依存し、当業者の能力の範囲内で容易に決定される。
【００８４】
「プライマー対」は一連の２つの核酸分子（「プライマー」）であり、これらのそれぞれは、ポリメラーゼまたは転写酵素による鋳型に向けられた重合を刺激する役目を果たすことができ、このプライマーは、プライマーハイブリダイゼーションの領域の間に位置する二本鎖配列のヌクレオチド配列の重合（および増幅）に方向付けるような様式で、二本鎖核酸配列（「鋳型」）の逆ストランドにハイブリダイズする。このようなプライマー対は、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用できる。プライマー対の設計は、当該技術分野で周知であり、増幅される特定の配列に依存する。一般的に、当該プライマーは一本鎖であり、長さが１０〜４０塩基の間であり、５０〜２０００塩基離れて位置する鋳型配列の領域にハイブリダイズする。
【００８５】
「スプライスジャンクション」（「ブリッジングジャンクション（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）」とも交換可能に呼ばれる）は、スプライシングが生じるヌクレオチド領域に関連する。これは、エクソンが、その隣接しているエクソンに、処理された転写物の配列において結合する領域である。
【００８６】
「ハイブリダイゼーション」、または「核酸ハイブリダイゼーション」は、一本鎖の核酸分子と相補的な核酸分子との間を１分子に結合（相互作用）する工程に関連する。
【００８７】
ここで、ヒトＣＤ４４遺伝子構造を模式的に図示する図１が参照される。図１Ａは、９つの可変エクソン（塗りつぶされた正方形、Ｖ２〜１０と示されている）および定常エクソン（塗りつぶされていない正方形、Ｃｌ〜５およびＣ６〜１０と示されている）から構成されるヒトＣＤ４４遺伝子の構造を図示する。図１Ｂは、定常エクソンに加えて、可変エクソン３を含むＣＤ４４変異体転写物ＣＤ４４Ｖ３の構造を模式的に図示する。図１Ｃは、定常エクソンに加えて、可変エクソン６を含むＣＤ４４変異体転写物ＣＤ４４Ｖ６の構造を模式的に図示する。図１Ｄは、定常エクソンに加えて、可変エクソン７を含むＣＤ４４変異体転写物ＣＤ４４Ｖ７の構造を模式的に図示する。図１Ｅは、定常エクソンに加えて、可変エクソン１０を含むＣＤ４４変異体転写物ＣＤ４４Ｖ１０の構造を模式的に図示する。
【００８８】
いくつかの実施態様によれば、ＲＮＡ試料は、神経変性疾患と診断された被験者（患者）の生物学的試料から、またはモデル動物（例えば、神経変性疾患のモデルとして使用される遺伝子導入マウスなど）から抽出されてもよい。当該抽出されたＲＮＡは、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含んでいてよい。当該抽出されたＲＮＡは、逆転写されてＰＣＲ増幅反応で使用されてもよい。このＰＣＲ増幅反応は、ＣＤ４４遺伝子の様々なバリアントエクソン内の領域、ＣＤ４４遺伝子の様々な定常エクソン内の領域、定常エクソンおよび可変エクソンをブリッジするジャンクション領域のヌクレオチド配列を包含する領域、またはこれらのいずれかの組み合わせからヌクレオチド配列が誘導され得るプライマーをさらに含んでいてもよい。次いで、結果として得られるＰＣＲ生成物は分析されて、その配列が決定されてもよい。このようにして、とりわけ、当該技術分野で前例がなかった新規なＣＤ４４スプライスバリアント転写物を含んでいてもよい様々なＣＤ４４転写物が同定され得る。
【００８９】
さらに、ＲＮＡ試料は、神経変性疾患と診断された被験者（患者）の生物学的試料から、および神経変性疾患と診断されなかった年齢および性別が合致する被験者（正常対照）から抽出されてもよい。当該抽出されたＲＮＡは、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含んでいてよい。当該抽出されたＲＮＡは、逆転写されてＰＣＲ増幅反応で使用されてもよい。このＰＣＲ増幅反応は、ＣＤ４４遺伝子の様々なバリアントエクソン内の領域、ＣＤ４４遺伝子の様々な定常エクソン内の領域、定常エクソンおよび可変エクソンをブリッジするジャンクション領域のヌクレオチド配列を包含する領域、およびこれらのいずれかの組み合わせからヌクレオチド配列が誘導され得るプライマーをさらに含んでいてもよい。次いで、当該患者の生物学的試料および当該正常対照被験者から得られる結果として得られるＰＣＲ生成物は分析されて、その配列が決定されてもよい。このＰＣＲ生成物は、とりわけ、当該技術分野で前例がなかった新規なＣＤ４４スプライスバリアント転写物を含んでいてもよいＣＤ４４転写物を含んでいてもよい。さらに、様々なＣＤ４４変異体転写物を表すこの様々なＰＣＲ生成物の発現レベルは、患者から得た試料と正常対照から得た試料との間で比較されてもよい。様々なＣＤ４４変異体転写物の発現レベルおよび異なる試料間の発現レベルの比較は、当該技術分野で公知の様々な方法により（例えば、半定量的逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲの方法によるなど）判定され得る。例えば、このような比較は、正常対照から得た試料と比べて、患者から得た試料における特異的スプライスバリアント（単数または複数）の排他的な発現を示し得る。例えば、このような比較は、正常対照から得た試料と比べて、患者から得た試料における特異的スプライスバリアント（単数または複数）の高められた発現レベル（上方調節）を示し得る。例えば、このような比較は、正常対照から得た試料と比べて、患者から得た試料における特異的スプライスバリアント（単数または複数）の発現レベルの減少（下方調節）を示し得る。例えば、このような比較は、正常対照から得た試料と比べて、患者から得た試料において特異的スプライスバリアント（単数または複数）の発現レベルの変化がまったく認められないことを示し得る。例えば、このような比較は、患者から得た試料と比べて、正常対照から得た試料における特異的スプライスバリアント（単数または複数）の排他的な発現を示し得る。
【００９０】
いくつかの代表的な実施態様によれば、全ＲＮＡは、アルツハイマー病と診断された被験者（ＡＤ患者）由来、および当該疾病と診断されなかった年齢および性別が合致する被験者（正常対照）由来の死亡後の海馬試料から抽出される。当該ＲＮＡは、本願明細書で後述される実施例１でさらに詳述されるように、逆転写されてＰＣＲ増幅反応で使用される。このＰＣＲは、ＣＤ４４遺伝子の様々なバリアントエクソン内の領域、ＣＤ４４遺伝子の様々な定常エクソン内の領域、定常エクソンおよび可変エクソンをブリッジするジャンクション領域のヌクレオチド配列を包含する領域、およびこれらのいずれかの組み合わせからヌクレオチド配列が誘導されてもよいプライマーをさらに含む。代表的なプライマー配列は、本願明細書で後述される実施例１に列挙される。このようにして得られる結果として得られるＰＣＲ生成物の分析によって、正常対照から得た試料と比べて患者から得た試料において発現が上方調節されるＣＤ４４のいくつかのスプライスバリアントが示される。特に、ＣＤ４４の定常エクソンに隣接している単一のスキップされていないバリアントエクソンを含み正常対照と比べてＡＤ患者において発現の有意な増加を呈したいくつかのＣＤ４４スプライスバリアントがこのように同定された。このように同定されたＣＤ４４スプライスバリアントとしては、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４４Ｖ７およびＣＤ４４Ｖ１０が挙げられる。本願明細書で後述される実施例２で詳述されるリアルタイムＰＣＲ実験は、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６、およびＣＤ４４Ｖ１０スプライスバリアントが、正常対照と比べてＡＤ患者においてそれぞれ約７．１７、７．０２および１８．１５倍の発現の上方調節を呈したことを示す。さらに、ＣＤ４４のＣＤ４４Ｓアイソフォームは、正常対照と比べてＡＤ患者において約４．９５倍の発現の上方調節を呈した。
【００９１】
さらなる実施態様によれば、全ＲＮＡは、本願明細書で後述される実施例３でさらに詳述されるように、ＡＤ様の病理についてのモデルとして使用されてもよいＡＰＰ７５１遺伝子導入マウスから抽出される。海馬組織由来のＲＮＡは、７〜７．５月齢の雌のＡＰＰ７５１遺伝子導入マウスおよび非遺伝子導入同腹仔（ｌｉｔｔｅｒ  ｍａｔｅ）から単離される。当該ＲＮＡは、本願明細書で後述される実施例３でさらに詳述されるように、逆転写されてＰＣＲ増幅反応で使用される。その結果は、対照の非遺伝子導入マウスと比べてＡＰＰ７５１遺伝子導入マウスにおいて、Ｖ７−Ｃ１０接合部を有する転写物をコードするｍＲＮＡの発現の７．２倍の増加を示した。同一条件下では、ＣＤ４４Ｓの発現レベルは１６％の増加を示した。ＡＰＰ７５１遺伝子導入マウスにおけるＣＤ４４Ｖ７発現の上方調節（実施例３に示されるとおり）は、ＡＤ患者の脳においてＣＤ４４Ｖ７が見出されること（実施例１に示されるとおり）とともに、例えばＡβ（特定の脳領域におけるＡβの蓄積はＡＤの顕著な特徴の１つである）の蓄積の下流でのＡＤ病理へのＣＤ４４Ｖ７の関与を示す。
【００９２】
いくつかの実施態様によれば、そして図１Ｂに模式的に図示されるように、スプライスバリアントＣＤ４４Ｖ３転写物は、少なくとも定常エクソンＣ５、バリアントエクソンＶ３および定常エクソンＣ６を含む。より好ましくは、スプライスバリアントＣＤ４４Ｖ３転写物は、定常エクソンＣ１〜Ｃ５、バリアントエクソン３および定常エクソンＣ６〜Ｃ９を含む。初期状態のパラメータを使用しかつＣＤ４４Ｖ３のヌクレオチド配列を使用する、ヒトの発現された配列の公のデータベースのＢｌａｓｔサーチは、いずれの公知のｍＲＮＡに対しても同一性を有しない１つのＥＳＴ（受入番号ＤＡ２８３５３１）を与えた。ＣＤ４４Ｖ３のＣ５−Ｖ３−Ｃ６領域のヌクレオチド配列（配列番号：１の座標６３９〜８２２、および図２Ａ〜Ｃに図示されるとおり）を使用する同様のＢｌａｓｔサーチは同様の結果を与えた。
【００９３】
いくつかの実施態様によれば、そして図１Ｃに模式的に図示されるように、スプライスバリアントＣＤ４４Ｖ６転写物は、少なくとも定常エクソンＣ５、バリアントエクソンＶ６および定常エクソンＣ６を含む。より好ましくは、スプライスバリアントＣＤ４４Ｖ６転写物は、定常エクソンＣ１〜Ｃ５、バリアントエクソン６および定常エクソンＣ６〜Ｃ９を含む。初期状態のパラメータを使用しかつＣＤ４４Ｖ６のヌクレオチド配列を使用する、ヒトの発現された配列の公のデータベースのＢｌａｓｔサーチは、類似のＥＳＴまたはｍＲＮＡ配列を１つも与えなかった。ＣＤ４４Ｖ６のＣ５−Ｖ６−Ｃ６領域のヌクレオチド配列（配列番号：３の座標６３９〜８２５、および図３Ａ〜Ｃに図示されるとおり）を使用する同様のＢｌａｓｔサーチは、同じ分子の中にＣ５Ｖ６およびＶ６Ｃ６の両方のヌクレオチド配列の組み合わせを含むと見出されたｍＲＮＡまたはＥＳＴは１つも存在しないことを示した。従って、ＣＤ４４Ｖ６は、前例がなかったＣＤ４４遺伝子の新規なスプライスバリアントである。Ｇｕｒｉｅｃら（Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．１９９７  ４４：２６１−８）は、Ｖ６のみには触れているが、Ｖ６−Ｃ６領域のみを確認し、Ｖ６に連結された他の領域は確認していない。
【００９４】
いくつかの実施態様によれば、そして図１Ｄに模式的に図示されるように、スプライスバリアントＣＤ４４Ｖ７転写物は、少なくとも定常エクソンＣ５、バリアントエクソンＶ７および定常エクソンＣ６を含む。より好ましくは、スプライスバリアントＣＤ４４Ｖ７転写物は、定常エクソンＣ１〜Ｃ５、バリアントエクソン７および定常エクソンＣ６〜Ｃ９を含む。ＣＤ４４Ｖ７のＣ５−Ｖ７−Ｃ６領域のヌクレオチド配列は、配列番号：５の座標６３９−８２８に対応する。初期状態のパラメータを使用しかつＣＤ４４Ｖ７のヌクレオチド配列を使用する、ヒトの発現された配列の公のデータベースのＢｌａｓｔサーチは、同一のＥＳＴまたはｍＲＮＡ配列を１つも与えなかった。すなわち、同じ分子の中にＣ５Ｖ７およびＶ７Ｃ６ブリッジの両方を含むｍＲＮＡは見出されなかった。
【００９５】
いくつかの実施態様によれば、そして図１Ｅに模式的に図示されるように、スプライスバリアントＣＤ４４Ｖ１０転写物は、少なくとも定常エクソンＣ５、バリアントエクソンＶ１０および定常エクソンＣ６を含む。より好ましくは、スプライスバリアントＣＤ４４Ｖ１０転写物は、定常エクソンＣ１〜Ｃ５、バリアントエクソン１０および定常エクソンＣ６〜Ｃ９を含む。初期状態のパラメータを使用しかつＣＤ４４Ｖ１０のヌクレオチド配列を使用する、ヒトの発現された配列の公のデータベースのＢｌａｓｔサーチは、１つのｍＲＮＡ（ＥＦ５８１８３７）および２つのＥＳＴ（ＣＤ６４１１７７およびＡＷ９９５５２１）を与えた。ＣＤ４４Ｖ１０のＣ５−Ｖ１０−Ｃ６領域のヌクレオチド配列（配列番号：７の座標６３９〜９００、および図５Ａ〜Ｃ図示されるとおり）を使用する同様のＢｌａｓｔサーチは、同様の結果を与えた。
【００９６】
さらに代表的な実施態様によれば、そして本願明細書で後述される実施例４でさらに詳述されるように、全ＲＮＡは、ＡＬＳと診断された被験者（ＡＬＳ患者）由来および当該疾病と診断されなかった被験者（正常対照）由来の死後の腰髄および運動皮質試料から抽出される。当該ＲＮＡは、逆転写されてＰＣＲ増幅反応で使用される。このＰＣＲは、ＣＤ４４遺伝子の様々なバリアントエクソン内の領域、ＣＤ４４遺伝子の様々な定常エクソン内の領域、定常エクソンおよび可変エクソンをブリッジするジャンクション領域のヌクレオチド配列を包含する領域、およびこれらのいずれかの組み合わせからヌクレオチド配列が誘導されてもよいプライマーをさらに含む。このようにして得られる結果として得られるＰＣＲ生成物の分析によって、正常対照から得た試料と比べて患者から得た試料において発現が上方調節されるＣＤ４４のいくつかのスプライスバリアントが示された。特に、ＣＤ４４の定常エクソンに隣接している単一のスキップされていないバリアントエクソンを含み正常対照と比べてＡＤ患者において発現の有意な増加を呈したいくつかのＣＤ４４スプライスバリアントが同定された。このように同定されたＣＤ４４スプライスバリアントとしては、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６、およびＣＤ４４Ｖ１０が挙げられる。
【００９７】
このように同定されたＣＤ４４変異体転写物（例えば、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４４Ｖ７およびＣＤ４４Ｖ１０など）、およびそれらのそれぞれのタンパク質生成物は、常在性のグリア細胞（ミクログリアまたはアストロサイト）により、または浸潤性の炎症性細胞（保護的または有害のいずれかである可能性があるＴリンパ球など）により媒介される可能性があり、かつ当該疾病の過程においていくつかのエクソンの非スキッピング（ｎｏｎ−ｓｋｉｐｐｉｎｇ）へと刺激される炎症工程に関与する可能性がある。スプライスバリアントの選択は、種および疾病に特異的であるように思われる。
【００９８】
いくつかの実施態様によれば、様々なＣＤ４４変異体タンパク質の配列から誘導されるペプチドは、様々な手段によって（例えば、化学合成および／または組み換え方法によってなど）調製されてもよく、それらのペプチドに対して方向付けられる特異的抗体の生産のための抗原として使用されてもよい。このように調製された抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含めることができ、このように調製された抗体は様々なＣＤ４４変異体タンパク質を特異的に認識し得る。この抗体の調製および精製は、当該技術分野で公知のいずれの方法によって行われてもよい。様々なＣＤ４４変異体タンパク質を特異的に認識して結合する抗体は、本願明細書に記載された実施態様のいずれにも記載されていない当該技術分野で公知の他のＣＤ４４変異体タンパク質に結合することと比較して、少なくとも２倍高い親和性を示す。結合の特異性は、当業者に周知の様々な方法（結合アッセイ、生物学的アッセイおよびこれらのいずれかの組み合わせなど）によって評価されてよい。
【００９９】
いくつかの実施態様によれば、本発明で同定された様々なＣＤ４４変異体生成物（ＣＤ４４Ｖ３生成物、ＣＤ４４Ｖ６生成物、ＣＤ４４Ｖ７生成物、ＣＤ４４Ｓ生成物およびＣＤ４４Ｖ１０生成物など）の配列から誘導されるペプチドは、固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．  １９６４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３：１３８５−９０）によって化学的に合成されてもよく、ＣＤ４４変異体タンパク質を特異的に認識し得る抗体の生産のために使用されてもよい。この抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体を挙げることができる。好ましくは、様々なＣＤ４４変異体生成物の配列から誘導されるペプチドは、可変エクソンと定常エクソンとの間のジャンクションに対応する領域から得てもよい。ＣＤ４４Ｖ３タンパク質から誘導されるペプチドは、例えば、エクソンＣ５およびＶ３をブリッジするアミノ酸配列（配列番号：２のアミノ酸２１４〜２３３および図２Ｂ）に対応するジャンクション領域を含んでいてもよい。例えば、ＣＤ４４Ｖ３タンパク質から誘導されるペプチドは、エクソンＶ３およびＣ６をブリッジするアミノ酸配列（配列番号：２のアミノ酸２５６〜２７５、および図２Ｃに図示されるとおり）に対応するジャンクション領域を含んでいてもよい。ＣＤ４４Ｖ６タンパク質から誘導されるペプチドは、例えば、エクソンＣ５およびＶ６をブリッジするアミノ酸配列（配列番号：４のアミノ酸２１４〜２３３、および図３Ｂ）に対応するジャンクション領域を含んでいてもよい。例えば、ＣＤ４４Ｖ６タンパク質から誘導されるペプチドは、エクソンＶ６およびＣ６をブリッジするアミノ酸配列（配列番号：４のアミノ酸２５７〜２７６、および図３Ｃに図示されるとおり）に対応するジャンクション領域を含んでいてもよい。ＣＤ４４Ｖ１０タンパク質から誘導されるペプチドは、エクソンＣ５およびＶ１０をブリッジするアミノ酸配列（配列番号：８のアミノ酸２１４〜２３３および図５Ｂ）に対応するジャンクション領域を含んでいてもよい。例えば、ＣＤ４４Ｖ１０タンパク質から誘導されるペプチドは、エクソンＶ１０およびＣ６をブリッジするアミノ酸配列（配列番号：８のアミノ酸２８２〜３０１、および図５Ｃに図示されるとおり）に対応するジャンクション領域を含んでいてもよい。これらのペプチドを用いて免疫されたマウスの脾細胞は骨髄腫細胞に融合されてもよく、そして特定のモノクローナルＡｂを産生するハイブリドーマは、それらの細胞の上清の、形質移入されていない対照細胞またはＣＤ４４ｓで形質移入された対照細胞に対してではくてＣＤ４４変異体をコードする組み換え構築物を用いて安定に形質移入されたＮａｍａｌｗａ  Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫株化細胞に対して結合する能力を試験することによって選択されてもよい。
【０１００】
いくつかの実施態様によれば、様々なＣＤ４４スプライスバリアントタンパク質に対して特異的に反応してもよくかつそれらを認識してもよい試薬（特異的抗体など）は、神経変性疾患の診断において使用されてもよい。様々なＣＤ４４スプライスバリアントタンパク質の発現の分析は、試験されるべき個体から得られた様々な生物学的試料に対して行われてもよい。このような試料としては、例えば、血漿試料、組織試料などを挙げることができる。当該試料の分析は、様々なＣＤ４４変異体タンパク質の存在（ｐｒｅｓｅｎｃｅ）、存在（ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）、および発現レベルを測定するために使用されてもよい。当該分析は、試料中のタンパク質発現を測定するために使用される様々な周知の方法（ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）など）を含んでいてもよい。当該ＣＤ４４変異体タンパク質の存在および／または発現レベルは既知の、予め較正された対照と比較されてもよく、そして試験された個体とその対照との間の発現の相違は、疾病の存在および当該疾病の進行のレベルに関する指標を与え得る。
【０１０１】
いくつかの代表的な実施態様によれば、本願明細書で後述される実施例５でさらに詳述されるように、ＡＤ患者の脳の海馬組織の免疫組織化学的分析が行われる。ＡＤ患者の脳組織の免疫組織化学的染色のためのＣＤ４４Ｓ、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６またはＣＤ４４Ｖ１０に対する特異的抗体。免疫組織化学的染色の結果は、様々なＣＤ４４アイソフォームの差異的な細胞内局在および細胞レベル下（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）内局在を示す。実施例５に詳述されるように、ＣＤ４４Ｓは主にアストロサイト中および老人斑内で見出されるが、ＣＤ４４Ｖ６およびＣＤ４４Ｖ１０染色は、リポフスチンの自己蛍光の領域と重なる核傍領域のニューロンにおいて見出される。ＣＤ４４Ｖ３染色は、アストロサイトおよび神経核傍領域の両方において見出された。リポフスチンは、時間を経た（ａｇｅｄ）ニューロンに蓄積される酸化されたタンパク質および脂質分解残基のリソソーム複合体である。当該結果は、ＣＤ４４Ｓとは対照的に、ニューロンで発現されるＣＤ４４変異体タンパク質は、神経細胞の死滅につながり得る病態生理的工程において直接的な役割を有し得ることを示す。例えば、ＣＤ４４変異体は、ニューロンのＡＰＰ前駆体タンパク質からのＡβの細胞内プロセッシング（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）において新規な機能を有し得る。例えば、ＣＤ４４変異体（ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４４Ｖ７およびＣＤ４４Ｖ１０など）は、長命の（ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ）タンパク質および小器官（ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ）の分解、細胞再構築、ならびに栄養飢餓の際の生存に関与する主要経路である自己貪食に関与する場合がある。自己貪食は、凝集する傾向があるα−シヌクレイン（Ｒａｖｉｋｕｍａｒ  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．  ２００４、３６：５８５−９５）およびハンチンチン（Ｓｈｉｂａｔａ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２００６、２８１：１４４７４−８５）の細胞内分解に関与する。自己貪食空胞は、これまでにＡＤ脳の異栄養性の神経突起において同定されており、それはＡβ生産のための部位である場合がある（Ｙｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００５、１７１：８７−９８）。自己貪食は、ＡＤマウスモデルにおいてＡβ蓄積、細胞外のＡβ沈着およびニューロン変性において重要な予防的役割を有することが最近示された（Ｐｉｃｋｆｏｒｄら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００８、１１８：２１９０−９９）。ここで、図６Ａおよび図６Ｂが参照される。図６Ａおよび図６Ｂは、それぞれＣＤ４４Ｖ６およびＣＤ４４Ｖ１０抗体を用いた、ＡＤ患者の海馬の切片の典型的な染色を図示する。図６Ａに示されるように、様々な神経細胞（例えば、神経細胞２Ａ〜Ｆなど）が、海馬の切片（４）内に同定される場合がある。当該細胞は、典型的に陽性に染色されたニューロンである細胞２Ｆによって例証されるように、染色され得る。図６Ａの下方右手側（パネル６）は代表的な陽性に染色された細胞（８）の拡大図を示すのに対し、細胞核（１０）は染色されておらず、他方、核傍および細胞質区画（１２）はＣＤ４４Ｖ６抗体で陽性に染色され、すなわち、ＣＤ４４Ｖ６生成物はこれらの細胞区画で発現される。図６Ｂに示されるように、様々な神経細胞（例えば、神経細胞１２Ａ��Ｆなど）は、海馬の切片（１４）内に同定される場合がある。当該細胞は、典型的に陽性に染色されたニューロンである細胞１２Ｆによって例証されるように、染色され得る。図６Ｂの下方右手側（パネル１６）は代表的な陽性に染色された細胞（１８）の拡大図を示すのに対し、細胞核（２０）は染色されておらず、他方、核傍および細胞質区画（２２）はＣＤ４４Ｖ１０抗体で陽性に染色され、すなわち、ＣＤ４４Ｖ１０生成物はこれらの細胞区画で発現される。要するに、当該染色結果は、ニューロンの細胞質における強い染色を示し、従ってこれがＣＤ４４変異体生成物が発現されるニューロン区画である。
【０１０２】
いくつかの実施態様によれば、従って、神経変性疾患（例えば、ＡＤおよびＡＬＳなど）の存在および／または進行レベルを診断する定性的方法が提供される。当該方法は、様々なＣＤ４４スプライスバリアントタンパク質（ＣＤ４４Ｖ３タンパク質、ＣＤ４４Ｖ６タンパク質、ＣＤ４４Ｖ１０タンパク質、またはこれらのいずれかの組み合わせなど）に対して特異的に反応してもよくかつそれらを認識してもよい試薬の使用を含んでいてもよい。当該試薬としては、例えば、個別に当該様々なＣＤ４４変異体タンパク質を認識する特異的モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を挙げることができる。当該ＣＤ４４変異体タンパク質（ＣＤ４４Ｖ３タンパク質、ＣＤ４４Ｖ６タンパク質および／またはＣＤ４４Ｖ１０タンパク質など）の存在は、試験される被験者から得られる生物学的試料（例えば、組織、液体試料、細胞など）において試験されてもよい。当該ＣＤ４４スプライスバリアントタンパク質（ＣＤ４４Ｖ３タンパク質、ＣＤ４４Ｖ６タンパク質および／またはＣＤ４４Ｖ１０タンパク質など）の存在は、当該生物学的試料から得られる組織切片および／またはタンパク質抽出物に対して行われる免疫組織化学および／またはウエスタンブロット分析によって試験されてもよい。上で示されたように、当該様々なＣＤ４４スプライスバリアントタンパク質（ＣＤ４４Ｖ３タンパク質、ＣＤ４４Ｖ６タンパク質、ＣＤ４４Ｖ１０タンパク質、またはこれらのいずれかの組み合わせなど）の検出された発現（存在）は、当該試験された被験者における神経変性疾患の存在を示し得る。さらに、定性的方法として本願明細書に記載される方法はまた、定量的方法としても使用されてもよい。定量的方法において、当該試験された被験者における当該ＣＤ４４Ｖ３タンパク質、ＣＤ４４Ｖ６タンパク質、ＣＤ４４Ｖ１０タンパク質またはこれらのいずれかの組み合わせの発現レベルは、これらのタンパク質の既知の較正された発現レベルと比較される。当該ＣＤ４４スプライスバリアントタンパク質（ＣＤ４４Ｖ３タンパク質、ＣＤ４４Ｖ６タンパク質、ＣＤ４４Ｖ１０タンパク質など）の発現レベルの数量化によって、当該神経変性疾患の進行状態が推定することができる。
【０１０３】
いくつかの実施態様によれば、様々なＣＤ４４スプライスバリアントタンパク質に対して特異的に反応してもよくかつそれらを認識してもよい試薬（特異的抗体など）は、発生または進行について神経変性疾患の治療のために使用されてもよい。従って、必要とする患者において神経変性疾患を治療する方法であって、必要とする患者に、有効量の試薬（ＣＤ４４スプライスバリアントタンパク質（ＣＤ４４Ｖ３タンパク質、ＣＤ４４Ｖ６タンパク質、ＣＤ４４Ｖ１０タンパク質、またはこれらのいずれかの組み合わせなど）に対して方向付けられる特異的抗体など）を投与する工程を含む方法が提供される。当該試薬（特異的抗体など）は、当該ＣＤ４４スプライスバリアントの活性または発現を下方調節し、これにより当該神経変性疾患を治療することができる。
【０１０４】
いくつかの実施態様によれば、様々な生物学的試料におけるＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４４Ｖ７およびＣＤ４４Ｖ１０スプライスバリアントの発現の同定、特性解析、検出および定量化のために使用してもよいオリゴヌクレオチド分子が提供される。当該オリゴヌクレオチド分子としては、当該ＣＤ４４Ｖ３（配列番号：１）および／またはＣＤ４４Ｖ６（配列番号：３）および／またはＣＤ４４Ｖ７（配列番号：５）および／またはＣＤ４４Ｖ１０（配列番号：７）転写物のヌクレオチド配列の少なくともある１つの領域にヌクレオチド配列がハイブリダイズし得るＤＮＡまたはＲＮＡ核酸（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、オリゴヌクレオチドプライマーまたはこれらのいずれかの組み合わせなど）を挙げることができる。例えば、当該オリゴヌクレオチド分子は核酸プローブを含んでいてもよい。適した核酸プローブは１００〜２００ヌクレオチドを含むことができ、このようなプローブは、様々な生物系におけるＣＤ４４スプライスバリアントの発現を同定および定量化するために使用されてもよい。ＣＤ４４スプライスバリアントの発現の同定および定量化のための当該プローブの使用は、当該プローブと当該ＣＤ４４スプライスバリアントとの特異的ハイブリダイゼーションに頼る様々な方法によって成し遂げられてもよい。このような方法としては、例えば、ノーザンブロット法分析およびＲＮＡインサイツハイブリダイゼーションを挙げることができる。例えば、当該核酸分子はプライマー対をも含んでいてもよい。プライマー対は、２つの短いオリゴヌクレオチド分子（例えば、１０〜３０ヌクレオチド長のものなど）であり、当該技術分野で周知の逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などの方法で様々なＣＤ４４スプライスバリアントのｍＲＮＡ（ＣＤ４４スプライスバリアント転写物）の発現を検出し定量するために使用されてもよい。この方法では、生物学的試料から抽出されたＲＮＡ分子は、逆転写酵素によってＤＮＡへと逆転写される。結果として得られるＤＮＡ分子は、次いで、配列が個々のＣＤ４４スプライスバリアントの領域の少なくとも一部と同一またはそれに相補的である特異的プライマー対とともに、ＰＣＲ反応における鋳型として使用される。特異的ＣＤ４４スプライスバリアントが発現される場合（そのｍＲＮＡがある生物学的試料の中に見出されることを意味する）、増幅反応の際に、ＰＣＲ生成物を認めることができ、そのレベルを定量化することができる。本願明細書に上で記載された様々なＣＤ４４スプライスバリアントの各々について、少なくとも１つの特異的プライマー対が設計および調製されてもよい。当該プライマー対の配列は、好ましくは、当該スプライスバリアントの各々の独特の配列領域から誘導されてもよい。当該スプライスバリアントの各々の独特の配列領域は、定常エクソンとバリアントエクソンとをブリッジするジャンクション領域（スプライスジャンクション）に最近接していることが最も好ましい。その目的のために使用されてもよい代表的な特異的プライマー対配列は、本願明細書に後述される実施例１および実施例３に列挙される。
【０１０５】
いくつかの実施態様によれば、従って、様々なＣＤ４４スプライスバリアントを特異的に認識するオリゴヌクレオチド（特異的プローブおよびプライマー対（本願明細書に後述される実施例１および実施例３に列挙されるものなど）など）は、神経変性疾患の診断のために使用されてもよい。当該様々なＣＤ４４スプライスバリアントの発現の分析は、試験されるべき個体から得られる様々な生物学的試料に対して行われてもよい。このような試料としては、例えば、血漿試料、組織試料などを挙げることができる。当該試料の分析は、様々なＣＤ４４変異体の存在（ｐｒｅｓｅｎｃｅ）、存在（ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）、および発現レベルを測定するために使用されてもよい。この分析としては、試料中の転写物発現を測定するために使用される様々な周知の方法（ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーションなど）を挙げることができる。当該ＣＤ４４変異体転写物の存在および／または発現レベルは既知の、予め較正された対照と比較されてもよく、そして試験された個体とその対照との間の発現の相違は、疾病の存在および当該疾病の進行のレベルに関する指標を与え得る。例えば、上でおよび実施例１〜２で詳述されるように、様々なＣＤ４４転写物（例えば、ＣＤ４４Ｓ、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６および／またはＣＤ４４Ｖ１０など）の発現レベルは、対照の脳と比べてＡＤ患者の脳では有意に上昇している。例えば、ＣＤ４４Ｖ３およびＣＤ４４Ｖ６転写物発現は、対照と比べてＡＤ患者では約７倍増加される。例えば、ＣＤ４４Ｖ１０発現は、対照と比べてＡＤ患者では約１８倍増加される。
【０１０６】
いくつかの実施態様によれば、従って、患者において神経変性疾患（ＡＬＳ、ＡＤ、ＰＤなど）を診断またはモニターする方法であって、当該患者の生物学的試料における核酸の発現レベルを検出する工程を含み、前記核酸は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む方法が提供される。当該生物学的試料としては、細胞、組織、体液、またはこれらのいずれかの組み合わせを挙げることができる。この発現レベルは、当該生物学的試料から単離される核酸によってコードされるＲＮＡの発現レベルを測定することによって検出され得る。ＲＮＡ発現レベルの検出は、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲなど、またはオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドなど、またはこれらのいずれかの組み合わせなど）への当該ＲＮＡのハイブリダイゼーションを検出するために使用されてもよいこれらのいずれかの組み合わせなど、様々な方法を含んでいてもよい。例えば、当該診断方法は、当該患者の生物学的試料においてポリペプチドの発現レベルを検出する工程であって、当該ポリペプチドが配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む群から選択され得る工程を含んでいてもよい。当該ポリペプチドの発現レベルを検出する工程は、当該ポリペプチドと、当該ポリペプチドに特異的に結合するように適合された抗体との免疫複合体を、ウエスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）など、またはこれらのいずれかの組み合わせのような方法（これらに限定されない）によって、検出する工程を含んでいてもよい。例えば、神経変性疾患（例えば、ＡＤ、ＡＬＳおよびパーキンソン病など）の存在および／または進行レベルを診断する定性的方法は、様々なＣＤ４４スプライスバリアント転写物（例えば、ＣＤ４４Ｓ転写物、ＣＤ４４Ｖ３転写物、ＣＤ４４Ｖ６転写物、ＣＤ４４Ｖ７転写物ＣＤ４４Ｖ１０転写物、またはこれらのいずれかの組み合わせなど）を認識するオリゴヌクレオチドの使用を含んでいてもよい。当該オリゴヌクレオチドとしては、例えば、合成オリゴヌクレオチド（例えば、実施例１および実施例３に列挙されるもののようなプライマー対など）を挙げることができる。当該ＣＤ４４変異体転写物（ＣＤ４４Ｖ３転写物、ＣＤ４４Ｖ６転写物、ＣＤ４４Ｖ７転写物、ＣＤ４４Ｓ転写物、および／またはＣＤ４４Ｖ１０転写物など）の存在は、試験された被験者から得られた生物学的試料において試験されてもよい。当該ＣＤ４４スプライスバリアント転写物（ＣＤ４４Ｖ３転写物、ＣＤ４４Ｖ６転写物、ＣＤ４４Ｖ７転写物、ＣＤ４４Ｖ１０転写物またはこれらのいずれかの組み合わせなど）の存在は、当該生物学的試料から得られたＲＮＡ抽出物に対して行われる例えばＲＴ−ＰＣＲ分析、ＲＴ−リアルタイムＰＣＲ分析などによって試験されてもよい。当該様々なＣＤ４４スプライスバリアント転写物（例えば、ＣＤ４４Ｖ３転写物、ＣＤ４４Ｖ６転写物、ＣＤ４４Ｖ１０転写物、ＣＤ４４Ｓ、ＣＤ４４Ｖ７、またはこれらのいずれかの組み合わせ）の検出された発現（存在）は、当該試験された被験者における神経変性疾患の存在を示し得る。さらに、定性的方法として本願明細書に記載される方法はまた、定量的方法としても使用されてもよい。定量的方法では、当該試験された被験者における当該ＣＤ４４Ｖ３転写物、ＣＤ４４Ｖ６転写物、ＣＤ４４Ｖ６転写物、ＣＤ４４Ｖ１０転写物、ＣＤ４４Ｓ、またはこれらのいずれかの組み合わせの発現レベルは、例えばＲＴ−ＰＣＲ法またはリアルタイムＰＣＲ法によって測定されてよく、これらの転写物の既知の較正された発現レベルと比較される。当該ＣＤ４４スプライスバリアント転写物（ＣＤ４４Ｖ３転写物および／またはＣＤ４４Ｖ６転写物、ＣＤ４４Ｖ６転写物、および／またはＣＤ４４Ｖ１０転写物、および／またはＣＤ４４Ｓ転写物など）の発現レベルの定量化によって、当該神経変性疾患の進行状態が推定され得る。
【０１０７】
いくつかの実施態様によれば、当該技術分野で公知の様々な方法、試薬および技術が、当該様々なＣＤ４４変異体転写物、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６および／またはＣＤ４４Ｖ１０の発現レベルに影響を及ぼすために使用されてもよい。例えば、これらの技術としては、とりわけ、当該ＣＤ４４変異体転写物、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６および／またはＣＤ４４Ｖ１０の配列に対して少なくとも部分的に相補的な配列を有していてもよい核酸分子（通常は、オリゴヌクレオチドの形態にある）の使用を含んでいてもよい。このような核酸分子としては、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどを挙げることができる。例えば、当該技術分野で周知のｓｉＲＮＡは、２つのヌクレオチド３’−オーバーハングによって特徴付けられる塩基対構造を有する短いヌクレオチド配列（約２１〜２３ヌクレオチド）を含んでいてもよい（ＴｕｓｃｈｌおよびＢｏｒｋｈａｒｄｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ．  ２００２、２（３）：１５８−６７）。動物細胞へのｓｉＲＮＡの導入は、当該ｓｉＲＮＡが方向付けられる遺伝子の強力な、長期間持続する、特定の転写後サイレンシングを結果として生じ得る（Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ２００１、９８：９７４２−７；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ．  ２００１、４１１：４９４−８；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２００１、１５：１８８−２００；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２００１、２０：６８７７−８８）。ｓｉＲＮＡを使用するための方法および組成物は、例えば、米国特許第６，５０６，５５９号明細書に記載されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系から２１〜２３ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡを生産する方法、および細胞または生物の中で遺伝子のｍＲＮＡと干渉させるための当該ｓｉＲＮＡの使用は、例えば国際公開第０１７５１６４号パンフレットに記載されている。当該ｓｉＲＮＡはまた、安定な発現系を用いて哺乳類細胞の中でｉｎ  ｖｉｖｏで製造されてもよい。例えば、哺乳類細胞の中での低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成を方向付けるｐＳＵＰＥＲと名づけられたベクター系が報告された（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−３）。実施例６（およびその中の表５）に詳述されるように、当該様々なＣＤ４４変異体転写物（ＣＤ４４Ｖ３、および／またはＣＤ４４Ｖ６および／またはＣＤ４４Ｖ１０および／またはＣＤ４４Ｓなど）に対して方向付けられる特定のｓｉＲＮＡ配列は、本願明細書で上述された方法のいずれかによって調製されてもよい。当該ｓｉＲＮＡは当該技術分野で公知のいずれかの方法（例えばＭｅａｄｅら、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ、２００７に記載されるものなど）によって投与されてもよい。当該ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４４Ｖ１０、ＣＤ４４Ｓおよびこれらのいずれかの組み合わせの発現のサイレンシングの成功を確実にするために、当該ｓｉＲＮＡは、当該様々なＣＤ４４変異体転写物のｍＲＮＡの様々な配列領域に対して方向付けられ得る。実施例６に詳述されるように、そして図７に示されるように、様々なＣＤ４４変異体の��ＲＮＡの発現レベルは特定のｓｉＲＮＡ分子の使用によって減弱され得る。実施例６に詳述されるように、３つのｓｉＲＮＡ分子がＣＤ４４Ｓ、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ３およびＣＤ４４Ｖ１０変異体の各々に対して設計された。当該ｓｉＲＮＡ分子は細胞の中へと導入されて、ｍＲＮＡの発現レベル、および当該ＣＤ４４のタンパク質はＲＴ−ＰＣＲによって検出された。ここで、様々なＣＤ４４転写物のｍＲＮＡ発現に対する様々なｓｉＲＮＡ分子の効果を示す図７を参照する。図７のパネルＩは、異なる実験条件下（「−ＲＴ」  −  反応液中に逆転写酵素なし；「ＮＴ」  −  形質移入されていない細胞；「ＮＲ」  −  関連性のないｓｉＲＮＡ；ＣＤ４４Ｖ３  ｓｉＲＮＡ  ＃１−＃３  −  表６に列挙されたそれぞれの配列を有するｓｉＲＮＡ分子）でのＣＤ４４Ｖ３転写物の発現レベルを示すアガロースゲルピクトグラムを図示する。図７、パネルＩに示すように、当該ｓｉＲＮＡのうちの少なくとも２つの存在下でのＣＤ４４Ｖ３の発現レベルは有意に減少されるが、これに対して、対照遺伝子アクチンのｍＲＮＡの発現レベル、およびＣＤ４４Ｓの発現レベルは影響を受けなかった。図７のパネルＩＩは、異なる実験条件下（「−ＲＴ」  −  反応液中に逆転写酵素なし；「ＮＴ」  −  形質移入されていない細胞；「ＮＲ」  −  関連性のないｓｉＲＮＡ；ＣＤ４４Ｖ６  ｓｉＲＮＡ  ＃１−＃３  −  表６に列挙されたそれぞれの配列を有するｓｉＲＮＡ分子）でのＣＤ４４Ｖ６転写物の発現レベルを示すアガロースゲルピクトグラムを図示する。図７、パネルＩＩに示すように、当該ｓｉＲＮＡのうちの少なくとも２つの存在下でのＣＤ４４Ｖ６の発現レベルは有意に減少されるが、これに対して、対照遺伝子アクチンのｍＲＮＡの発現レベル、およびＣＤ４４Ｓの発現レベルは影響を受けなかった。図７のパネルＩＩＩは、異なる実験条件下（「−ＲＴ」  −  反応液中に逆転写酵素なし；「ＮＴ」  −  形質移入されていない細胞；「ＮＲ」  −  関連性のないｓｉＲＮＡ；ＣＤ４４Ｖ１０  ｓｉＲＮＡ  ＃１−＃３  −  表６に列挙されたそれぞれの配列を有するｓｉＲＮＡ分子）でのＣＤ４４Ｖ１０転写物の発現レベルを示すアガロースゲルピクトグラムを図示する。図７、パネルＩＩＩに示すように、当該ｓｉＲＮＡのうちの少なくとも２つの存在下でのＣＤ４４Ｖ１０の発現レベルは有意に減少されるが、これに対して、対照遺伝子アクチンのｍＲＮＡの発現レベル、およびＣＤ４４Ｓの発現レベルは影響を受けなかった。実施例６の表７に提示される定量分析は、ｓｉＲＮＡ分子は当該様々なＣＤ４４変異体のｍＲＮＡの発現を有意に減少させることができるということを示す。
【０１０８】
アンチセンス技術は、一般的に、（ＤＮＡまたはＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子など）を含んでいてもよい）標的の発現を減弱および／または抑制するために使用され、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用、三重らせん相互作用、リボザイムおよびリボヌクレアーゼＨ媒介性の効果が伴う場合がある。アンチセンス核酸分子（アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）は、通常はＲＮＡまたはＤＮＡ分子（上記標的）の中の相補的な塩基とのハイブリダイゼーションの際に、例えば特定の遺伝子、ｍＲＮＡ分子などを含んでいてもよい標的の発現を減弱および／または抑制し得る一本鎖の核酸分子である。当該アンチセンス核酸分子は、合成的に調製されてもよいし、または細胞中での発現のための組み換え遺伝子によってコードされてもよい。合成オリゴヌクレオチドのいくつかの非限定的な例は、ホスホロチオエート、リン酸トリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキル、またはシクロアルキル糖間（ｉｎｔｅｒｓｕｇａｒ）連鎖または短鎖へテロ原子もしくは複素環式糖間連鎖を含むオリゴヌクレオチドを挙げることができる。窒素リンカーまたは窒素含有基もまた、オリゴヌクレオチド模倣物を調製するために使用されてもよい。ホスホロアミド酸およびホスホロチオアミド酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｍｉｄａｔｅ）オリゴマー化合物、ならびにモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドもまた含まれる。オリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル骨格がポリアミド骨格で置き換えられて、塩基が当該ポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接にまたは間接的に結合されてもよいペプチド−核酸（ＰＮＡ）骨格もまた、使用されてもよい。他の合成オリゴヌクレオチドは、２’位置に以下のもののうちの１つを含む置換された糖部分を含んでいてもよい：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＨ２またはＯ（ＣＨ２）ｎＨ３（式中、ｎは１〜約１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−−；Ｓ−−、またはＮ−アルキル；Ｏ−−、Ｓ−−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ２；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；蛍光部分；ＲＮＡ切断基；レポーター基；介入物（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）；オリゴヌクレオチドの薬物動態および／または薬力学的特性を改善するための基；および同様の特性を有する他の置換基。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりに糖模倣物（シクロブチルまたは他の炭素環式部分）をも有していてもよい。例えば、様々なＣＤ４４変異体転写物（ＣＤ４４Ｖ３、および／またはＣＤ４４Ｖ６および／またはＣＤ４４Ｖ１０など）に対して方向付けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのアンチセンス分子が調製されてもよい。当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４４Ｖ１０、およびこれらのいずれかの組み合わせの発現の減弱／サイレンシングの成功を確実にするために、当該様々なＣＤ４４変異体転写物のｍＲＮＡの様々な配列領域に対して方向付けられてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、好ましい細胞条件（例えば、Ｄｕ  Ｌ．ら、ＰＮＡＳ、２００７，１０４：６００７−１２；Ｈｕａら、ＰｌｏＳ  Ｂｉｏｌ．  ２００７、５：ｅ７３に記載されるような、最適な温度およびバッファー条件を含む）下で行われる。
【０１０９】
いくつかの実施態様によれば、当該ＣＤ４４変異体転写物配列（ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４４Ｖ７、ＣＤ４４Ｓおよび／またはＣＤ４４Ｖ１０など）の発現を減弱（下方調節）するように設計される、これらの転写物の様々な領域に対して方向付けられるオリゴヌクレオチドは、神経変性疾患を治療するために使用されてもよい。当該オリゴヌクレオチドとしては、例えば、本願明細書で上記および実施例６に記載されたもののようなｓｉＲＮＡ分子を挙げることができる。従って、このように、患者の神経変性疾患の治療方法であって、核酸によってコードされるＲＮＡの発現を減弱し得る試薬を含んでいる組成物の投与を含んでいてもよく、当該核酸は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：７、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される方法が提供される。当該試薬は、例えば、前記核酸とハイブリダイズし得る１以上のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。当該１以上のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはこれらのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。例えば、当該試薬は、１以上のＳＭＥ（例えば、ＥＲＫ  ＭＡＰ−キナーゼ経路修飾因子、ＰＫＣ修飾因子など）を含んでいてもよい。例えば、当該方法は、様々なＣＤ４４変異体（ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４４Ｖ７、ＣＤ４４Ｓおよび／またはＣＤ４４Ｖ１０など）のＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的とするアンチセンス核酸および／またはｓｉＲＮＡ分子を、神経変性疾患を有する患者、患者の細胞、または生物の中へと導入する工程と；導入された細胞または生物を、オリゴヌクレオチドとともに、当該オリゴヌクレオチドと当該様々なＣＤ４４スプライスバリアントの標的ｍＲＮＡとの相互作用を優先する条件下で維持する工程と；当該様々なＣＤ４４スプライスバリアント、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４４Ｖ７、ＣＤ４４Ｖ１０、ＣＤ４４Ｓ、またはこれらのいずれかの組み合わせの発現の下方制御を検証することによって、当該神経変性疾患を治療する工程とを含んでいてもよい。
【０１１０】
いくつかの実施態様によれば、様々なＣＤ４４スプライスバリアントの活性および／または発現に影響を及ぼし得る（調節し得る）小分子実体（ＳＭＥ）が同定されてもよい。小分子実体としては、当該ＣＤ４４スプライスバリアントと相互作用して、当該ＣＤ４４変異体とその生理学的に関連するリガンドとの相互作用を崩壊し得るいずれの分子または物質を挙げることができる。例えば、ＳＭＥは、物質を同定することが当該技術分野で公知の適切なハードウェアおよびソフトウェアを用いてコンピュータ内（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で開発されてもよい。ＳＭＥは、例えば当該ＣＤ４４スプライスバリアントと相互作用し得る分子実体についての化学ライブラリのｉｎ−ｖｉｔｒｏおよびｉｎ−ｖｉｖｏスクリーニングによって、開発されてもよい。例えば、ＣＤ４４スプライスバリアント（ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６および／またはＣＤ４４Ｖ１０など）と生理的リガンドであるヒアルロン酸およびその誘導体との結合は、当該ＳＭＥの存在下または不存在下で評価されてもよい。同様に、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６および／またはＣＤ４４Ｖ１０の相互作用は、ＳＭＥ候補の存在下または不存在下で試験されてもよい。このようにして同定されたＳＭＥは、当該様々なＣＤ４４スプライスバリアントの活性および／または発現に影響を及ぼす（調節する）ために使用されてもよい。例えば、当該ＳＭＥは、当該ＣＤ４４スプライスバリアントの拮抗薬として使用されてもよい。例えば、当該ＳＭＥは、当該ＣＤ４４スプライスバリアントの作動薬として使用されてもよい。例えば、当該ＳＭＥは、当該様々なＣＤ４４変異体の発現に直接にまたは間接的に影響を及ぼし得る（調節し得る）いずれの分子または物質を含んでいてもよい。例えば、当該ＳＭＥは、様々なＣＤ４４変異体の発現レベルを直接または間接的に減少させる（減弱する）および／または増加させるために使用されてもよい阻害剤および／または活性化剤を含んでいてもよい。
【０１１１】
例えば、ＥＲＫ  ＭＡＰ−キナーゼ経路がＣＤ４４選択的スプライシングの調節に関与する場合があることが示されている（Ｗｅｇ−Ｒｅｍｅｒｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２００１、２０：４１９４−２０３）。いくつかの実施態様によれば、ニューロン由来の細胞でのＣＤ４４選択的スプライシングに対する当該ＥＲＫ経路の関与は、実施例７に詳述され、図８に示される。胚の脊髄運動ニューロンおよび神経芽細胞腫細胞の融合物に由来するマウスのＮＳＣ−３４細胞の細胞培養液が播かれ、未処置のまま残されるか、またはＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６で処置されるかされた。ＣＤ４４変異体のｍＲＮＡの発現レベルはＲＴ−ＰＣＲによって検出された。図８に示されるように、Ｕ０１２６によるＥＲＫ−ＭＡＰＫ経路の調節（阻害による）はＣＤ４４バリアントエクソンスプライシングの有意な減少を引き起こす。図８、パネルＡに示されるように、ＣＤ４４ＳのｍＲＮＡレベルは阻害剤（ＵＯ１２６）の存在下でも変化しない。図８、パネルＢに示されるように、ＣＤ４４Ｖ３のｍＲＮＡレベルは、当該阻害剤の不存在下でのＣＤ４４Ｖ３の発現レベル（「−」、中央レーン）と比べて、当該阻害剤の存在下で減少される（「＋」、右レーン）。図８、パネルＣに示されるように、ＣＤ４４Ｖ７のｍＲＮＡレベルは、当該阻害剤の不存在下でのＣＤ４４Ｖ７の発現レベル（「−」、中央レーン）と比べて、当該阻害剤の存在下で減少される（「＋」、右レーン）。図８、パネルＤに示されるように、ＣＤ４４Ｖ５のｍＲＮＡレベルは、当該阻害剤の不存在下でのＣＤ４４Ｖ５の発現レベル（「−」、中央レーン）と比べて、当該阻害剤の存在下で減少される（「＋」、右レーン）。図８、パネルＥに示されるように、ＣＤ４４Ｖ１０のｍＲＮＡレベルは、当該阻害剤の不存在下でのＣＤ４４Ｖ１０の発現レベル（「−」、中央レーン）と比べて、当該阻害剤の存在下で減少される（「＋」、右レーン）。図８にさらに示されるように、パネルＦは対照であり、対照遺伝子、アクチンの発現に対する当該阻害剤ＵＯ１２６の効果の欠如を示す。また、パネルＡ〜Ｆの左手レーンは、ＲＴ酵素の不存在下（「−ＲＴ」）で行われた陰性対照である。従って、ＥＲＫ経路を調節することが知られている小分子は、神経細胞におけるＣＤ４４選択的スプライシングの調節のためにさらに使用されてもよい。
【０１１２】
患者の神経変性疾患の治療を目的とする当該様々なＣＤ４４スプライスバリアントの発現および／または活性を（下方調節（減弱）および／または増加することによって）調節するように設計される本願明細書に上記された試薬（例えばｓｉＲＮＡ分子など）は、それが薬剤的に許容できる担体および賦形剤と混合される医薬組成物の一部であるまたは一部であり得るとして当該患者に提供されてもよい。当該ｓｉＲＮＡ分子は、例えば当該患者の細胞、組織などへさらに導入されてもよい。試薬および／またはそれを含有する医薬組成物は、いずれかの公知の投与経路によって提供されてもよい。当該試薬はまた、パックまたは分注器装置（キットなど）の中で提供されてもよい。さらに、当該試薬はまた、様々な他の有効成分と組み合わせても投与されてもよい。
【０１１３】
当該様々なＣＤ４４スプライスバリアントおよび当該ＣＤ４４スプライスバリアント生成物の発現を検出および定量化するように設計される本願明細書に上記された試薬は、キットの形態で提供されてもよい。例えば、当該キットとしては、神経変性疾患を診断するためのキットを挙げることができる。当該キットは、生物学的試料における核酸の発現を検出し得る少なくとも１つの試薬を含んでいてよく、当該核酸は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、またはこれらのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。当該試薬は、例えば、当該核酸または当該核酸によってコードされるＲＮＡ分子とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、当該キットは、生物学的試料におけるポリペプチドの発現を検出し得る少なくとも１つの試薬を含んでいてよく、当該ポリペプチドは配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、またはこれらのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。当該試薬は、例えば、当該ポリペプチドと特異的に相互作用しかつ当該ポリペプチドと検出可能な免疫複合体を形成するように適合された抗体を含んでいてもよい。
【０１１４】
他の実施態様によれば、当該様々なＣＤ４４スプライスバリアントのコード配列（ＣＤ４４Ｖ３コード配列またはＣＤ４４Ｖ６コード配列またはＣＤ４４Ｖ７コード配列またはＣＤ４４Ｖ１０コード配列など）を含んでいてもよい組み換え構築物（例えば発現ベクターなど）が調製されてもよい。当該構築物は、当該ＣＤ４４スプライスバリアントのヌクレオチド配列がフォーワード配向またはリバース配向で挿入されるベクター（プラスミドまたはウイルスベクターなど）を含んでいてもよい。さらに、当該構築物はさらに、制御配列（プロモーターなど）を含んでいてもよい。当該構築物はさらに、当該ＣＤ４４スプライスバリアントヌクレオチド配列の前後にインフレームに挿入されてもよい様々な他の非関連タンパク質および／またはペプチドのさらなるコード配列を含んでいてもよい。当該ベクターの中に導入されるＣＤ４４スプライスバリアントのヌクレオチド配列は、当該ＣＤ４４スプライスバリアント転写物の全体の、全長のコード配列、または一部の配列のみを含んでいてもよい。ベクターの選択および当該組み換え構築物の構築は、当該技術分野で公知の方法のいずれかによって行われてもよい。当該組み換え構築物は、例えば実験目的、診断目的および／または治療目的のために、様々な生物系において当該様々なＣＤ４４スプライスバリアント（ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６、またはＣＤ４４Ｖ７および／またはＣＤ４４Ｖ１０など）の発現を誘導するために、使用されてもよい。
【０１１５】
いくつかの代表的な態様および実施態様が上で議論されたが、当業者は、特定の修飾、順列、付加およびこれらのサブコンビネーションを認識するだろう。従って、添付の特許請求の範囲および今後導入される請求項が、全てのこのような修飾、順列、付加およびこれらのサブコンビネーションを、それらの真の趣旨および範囲内にあるものとして含むと解釈されるものとすることが意図されている。
【実施例】
【０１１６】
（実施例１  −  ＡＤ患者および正常対照の海馬におけるＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６およびＣＤ４４Ｖ１０の発現）
死後のＡＤ患者および正常対照から単離した凍結した海馬試料から全ＲＮＡを抽出した（ＥＺ  ＲＮＡキット、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ）。次いでＲＮＡを半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析で使用した。まず、ＲＮＡを逆転写反応（ＲＴ）に供した。逆転写を、５ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン）を用いて行った。反応混合物を、４２℃で１時間インキュベーションした。２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、１．２５Ｕ  Ｔｈｅｒｍｏｐｒｉｍｅ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（エービージーン（ＡＢｇｅｎｅ））および０．５ｍＭ  プライマー：
Ｖ３＿Ｆ：５’−ＴＧＡＣＣＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＡＡＣＣＡ−３’
Ｃ６＿Ｒ：５’−ＣＣＣＡＴＧＴＧＡＧＴＧＴＣＣＡＴＣＴＧ−３’
Ｃ５＿Ｆ：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＡＣ−３’
Ｖ６＿Ｒ：５’−ＧＧＧＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＣＧＴＴＧ−３’
Ｃ５Ｖ１０＿Ｆ：５’−ＧＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴＡＧＧ−３’
Ｖ１０Ｃ６＿Ｒ：５’−ＧＧＡＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＴ−３’
を含む２０μｌの反応体積で、１μｌのＲＴ反応液を用いて、マイクロプロセッサ制御の恒温器の中でＰＣＲ工程を行った。
【０１１７】
増幅のために４２サイクルを行い、各サイクルは９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間からなっていた。さらに、結果の正規化のためにアクチン用プライマーを当該ＰＣＲ反応液の中に含めた。増幅生成物を、アガロースゲル（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））から精製し、当該ＰＣＲ反応で使用したプライマーのうちの１つを用いて配列決定した。配列データを、ヒトＲｅｆＳｅｑおよびゲノムのデータベース（ＮＣＢＩ）に対して実行されるＢｌａｓｔＮアルゴリズムを用いて解析した。
【０１１８】
当該半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を表１にまとめた。表１の左カラムは、配列決定により確認したバリアントエクソンの同一性および定常エクソンへの連結ブリッジ（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ  ｂｒｉｄｇｅ）を示す。当該様々なＰＣＲ生成物の発現レベルは、アガロースゲル上で認められた相対的なバンド強度によって判定した。相対的な発現のレベルは、＋記号の数（１、２および３。それぞれ、弱い発現、中程度の発現、強い発現を表す）で示した。０は認められるバンドがなかったことを意味し（発現がなかったことを意味する）、ＮＤは反応を行わなかったことを意味する。
【０１１９】
【表１】
2010532989.tif 000002
【０１２０】
（実施例２  −  リアルタイムＰＣＲにより正常対照と比較した、ＡＤの脳におけるＣＤ４４Ｓ、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６およびＣＤ４４Ｖ１０の発現）
ＥＺ  ＲＮＡキット（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ）を用いて、死後のＡＤ患者（ｎ＝１０）および正常対照（ｎ＝１０）から単離した凍結した海馬の試料から、全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ濃度は、ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００装置（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて測定した。製造業者の指示に従ってＢｉｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（バイオライン（Ｂｉｏｌｉｎｅ））を用いて、各試料からの１．５μｇのＲＮＡを逆転写した。当該反応混合物を４２℃で１時間インキュベーションした。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（インビトロジェン）試薬を、５００ｎＭ  プライマーとともに、ｑＰＣＲのために用いた。ｑＰＣＲ反応の線形性を確実にするためおよび当該Ｃｔ実験値を相対的な発現値に変換するために、標準曲線を、プライマーの各対に対して、（ｃＤＮＡプールの６つの濃度（二重）に対して）行った。リアルタイムＰＣＲサイクルプログラムは以下のとおりである：５０℃、２分間、９５℃、２分間、次いで９５℃  １５秒間および６０℃  ３４秒間を４０サイクル。全てのｑＰＣＲ反応を、アプライドバイオシステムズ  ７５００  リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）で行った。
【０１２１】
データは、年齢および性別を合致させた正常対照と比較した、ＡＤ患者におけるＣＤ４４Ｓ、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４４Ｖ１０の発現の有意な増加を示す。
【０１２２】
【表２】
2010532989.tif 000003
【０１２３】
（実施例３  −  ＡＰＰ７５１遺伝子導入マウスおよび正常対照におけるＣＤ４４Ｖ７の発現）
ＡＤ様病理におけるＣＤ４４Ｖ７変異体の発現を特徴付けるために、マウスのＴｈｙ−１プロモーターの調節下でロンドン（Ｖ７１７Ｉ）およびスウェーデン（Ｋ６７０Ｍ／Ｎ６７１Ｌ）変異（両変異は家族性のＡＤと関連することが見出された）を含むヒトＡＰＰ７５１を発現するｈＡＰＰマウスを使用した。当該ＡＰＰ７５１マウスは、４〜６月齢で新皮質および海馬にアミロイド斑を発生し、６ヶ月で始まる記憶欠損を示す。７〜７．５月齢の雌のＡＰＰ７５１遺伝子導入マウスおよび遺伝子導入していない同腹仔から海馬組織を単離した。ＥＺ−ＲＮＡ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ）を使用して、ＲＮＡを抽出した。５ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン）を用いて、等量の全ＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。当該反応混合物を４２℃で１時間インキュベーションした。２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、１．２５Ｕ  Ｔｈｅｒｍｏｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラローバ（Ｌａｒｏｖａ））および０．５μＭの、下記の一覧からのオリゴヌクレオチド、
Ｃ３Ｆ：５’−ＴＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡ
Ｃ６Ｒ：５’−ＣＣＣＡＴＧＴＧＡＧＴＧＴＣＣＡＴＣＴＧ
Ｖ７Ｆ：５’−ＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＴＴＣＧ
アクチンＦ：５’−ＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＡＣＧＡＧ
アクチンＲ：５’−ＣＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴ
を含む２０μｌの反応体積で、１μｌのＲＴを用いて、マイクロプロセッサ制御の恒温器の中で半定量的ＰＣＲ工程を行った。当該ＰＣＲのための工程サイクルプログラムは、４２サイクル（ＣＤ４４Ｖ７について）、３２サイクル（ＣＤ４４Ｓ増幅について）または２５サイクル（基準遺伝子として使用したβ−アクチンについて）に対して、９４℃で３０秒間の変性、５８℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で３０秒間の伸張を含んでいた。アガロースゲル上で流したＰＣＲ生成物のバンド強度を、ＴｏｔａｌＬａｂソフトウェアを用いて数量化した。非遺伝子導入マウスと比べて、ＡＰＰ７５１マウスでは、Ｖ７−Ｃ１０接合部を有する転写物を含むｍＲＮＡの発現の７．２倍の増加が認められた。ＣＤ４４Ｓの１６％の増加を、類似の条件下で認めた。
【０１２４】
（実施例４  −  ＡＬＳ患者および正常対照の腰髄および運動皮質におけるＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６およびＣＤ４４Ｖ１０の発現）
組織を、Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ（米国、カリフォルニア州）から得た。ＡＬＳ患者および年齢および性別を合致させた正常対照の腰髄および運動皮質からＲＮＡを抽出した。当該ＲＮＡを、実施例１で詳述したとおりの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応で用いた。ＡＬＳ患者および正常対照の運動皮質および腰髄から得たＲＮＡ試料に対して行った半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を表３に提示する。表３の左カラムは、配列決定により確認したバリアントエクソンの同一性および定常エクソンへの連結ブリッジを示す。当該様々なＰＣＲ生成物の発現レベルは、アガロースゲル中で認められた相対的なバンド強度によって判定した。相対的な発現のレベルは、＋記号の数（１、２および３。それぞれ、弱い発現、中程度の発現、強い発現を表す）で示した。０は認められるバンドがなかったことを意味し（発現がなかったことを意味する）、ＮＤは反応を行わなかったことを意味する。
【０１２５】
【表３】
2010532989.tif 000004
2010532989.tif 000005
【０１２６】
（実施例５  −  ＡＤ患者の脳の中のＣＤ４４スプライスバリアントの免疫細胞化学的分析）
８μｍの切片を、ホルマリンで固定した、パラフィンに包埋した海馬組織（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ’ｓ  ｂｒａｉｎ  ｂａｎｋ）から調製した。用いた一次抗体は、ＣＤ４４（ＨＣＡＭ、ラットクローン  ＩＭ７、サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））、ＣＤ４４Ｖ３（マウスモノクローナル  ｖｆｆ−３２７、エービーカム（ＡＢｃａｍ））、ＣＤ４４Ｖ６（ウサギポリクローナル、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））およびＣＤ４４Ｖ１０（ウサギポリクローナル、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））に対してものであった。用いた二次抗体は、ＨＲＰに接合した関連種、ポリマー増強（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）、ダコ（Ｄａｋｏ））、基質：ＤＡＢに対してものであった。陰性対照は、当該ウサギポリクローナル抗体については、当該一次抗体と同じタンパク質濃度のｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｅウサギ血清中のアイソタイプを合致させた血清対照であり、当該マウス抗体については複数のアイソタイプ対照（ダコ（Ｄａｋｏ））であった。当該ラット抗体については、それは当該一次抗体と同じタンパク質濃度の合致したアイソタイプの対照であった。表４は、免疫組織化学的染色の結果をまとめる。
【０１２７】
この免疫組織化学的染色は、差異的な細胞内および細胞レベル下（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）内局在を明らかにする。ＣＤ４４ｓは主にアストロサイト中および老人斑内に見出されるが、ＣＤ４４変異体染色は、細胞質内核傍領域のニューロンに見出される。
【０１２８】
【表４】
2010532989.tif 000006
【０１２９】
（実施例６  −  ｓｉＲＮＡ実験  −  ヒト細胞におけるＣＤ４４発現のノックダウン）
確立したパラメータを用いて様々なＣＤ４４変異体に対して方向付けられる様々なｓｉＲＮＡ分子を設計し、その配列を下記の表５に列挙した。ＨｅＬａ細胞（前日に、６穴プレートに１５×１０４細胞を播いた）に、製造業者の指示に従ってリポフェクタミン  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ（インビトロジェン）を用いて、１０ｎＭの最終濃度で様々なｓｉＲＮＡ（ＩＤＴ）を用いて形質移入した。陰性対照として、細胞を形質移入しないまま残す（ＮＴ）か、または細胞を、５’末端でＴＹＥ５６３で標識した関連性のないｓｉＲＮＡ（その配列はいずれの公知のヒトｍＲＮＡに対してもまったく意味ある相同性を有しない）を用いて形質移入した（ＮＲ）。ＣＤ４４Ｖ６  ｓｉＲＮＡで形質移入した細胞は形質移入後２４時間血清不足にし、さらに８時間血清更新した（ｓｅｒｕｍ  ｒｅｎｅｗａｌ）（例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．（２００６）２０：１７１５−２０に記載されるとおり）。陽性対照として、この変異体については、Ｃｈｅｎｇらが使用したｓｉＲＮＡ配列を基準として用いた（ｓｉＲＮＡ  ＃２）。
【０１３０】
ＥＺ−ＲＮＡ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ）を用いて形質移入後４８時間のＨｅｌａ細胞から全ＲＮＡを単離し、５ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン）を用いて等量の全ＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。当該反応混合物を４２℃で１時間インキュベーションした。２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、１．２５Ｕ  Ｔｈｅｒｍｏｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラローバ（Ｌａｒｏｖａ））、および０．５μＭの、下記の一覧：
Ｃ３Ｆ：５’−ＴＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡ
Ｃ６Ｒ：５’−ＣＣＣＡＴＧＴＧＡＧＴＧＴＣＣＡＴＣＴＧ
Ｖ３Ｒ：５’−ＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧＡＴＧＧＴＡＴＴＴＧＡ
Ｖ６Ｒ：５’−ＧＧＧＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＣＧＴＴＧ
Ｖ１０Ｒ：５’−ＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＧＴＧＡＣＡＴＣＡＴＴＣ
アクチンＦ：５’−ＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＡＣＧＡＧ
アクチンＲ：５’−ＣＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴ
からのオリゴヌクレオチドを含む２０μｌの反応体積で、１μｌのＲＴ反応液を用いて、マイクロプロセッサ制御の恒温器の中で半定量的ＰＣＲ工程を行った。
【０１３１】
当該ＰＣＲのための工程サイクルプログラムは、４２サイクル（Ｖ３、Ｖ６およびＶ１０増幅）、３２サイクル（ＣＤ４４Ｓ増幅）または２５サイクル（基準遺伝子として使用したβ−アクチンについて）に対して、９４℃で３０秒間の変性、５８℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で３０秒間の伸張に設定した。データのさらなる定量化のために、ＴｏｔａｌＬａｂソフトウェアを用いてバンド強度を数量化した。数量化の結果を表６に提示する。表６は、形質移入していない細胞（ＮＴ）に対して正規化したＣＤ４４変異体とβ−アクチン（対照遺伝子）との間の比を示す。
【０１３２】
ＣＤ４４Ｓ、ＣＤ４４Ｖ３、ＣＤ４４Ｖ６およびＣＤ４４Ｖ１０のｍＲＮＡ発現レベルの有意な減少（＞８０％）が、当該ＣＤ４４アイソフォームの各々に対して方向付けられる少なくとも１つの新規なｓｉＲＮＡの同時発現の結果として、認められた。
【０１３３】
【表５】
2010532989.tif 000007
【０１３４】
【表６】
2010532989.tif 000008
【０１３５】
（実施例７  −  ニューロン由来の細胞におけるＥＲＫ−ＭＡＰキナーゼの阻害剤によるＣＤ４４選択的スプライシングの調節）
ニューロン由来の細胞でのＣＤ４４選択的スプライシングに関するＥＲＫ経路の関与を試験するために、胚の脊髄運動ニューロンおよび神経芽細胞腫細胞の融合物に由来するマウスのＮＳＣ−３４細胞を使用した。ＮＳＣ−３４細胞培養（前日に、６穴プレートに１５×１０４細胞を播いた）を、未処置のまま残すか、または１０μＭのＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で６時間処置するかした。ＥＺ−ＲＮＡキット（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ）を用いて全ＲＮＡを当該細胞から単離し、等量のＲＮＡを、５ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン）を用いてｃＤＮＡへと逆転写した。当該反応混合物を４２℃で１時間インキュベーションした。２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、１．２５Ｕ  Ｔｈｅｒｍｏｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（エービージーン（ＡＢｇｅｎ））および０．５μＭの、以下：
Ｃ５Ｆ：５’−ＧＡＧＣＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＡＣＡＴＴ−３
Ｃ７Ｒ：５’−ＣＣＡＧＡＡＧＴＴＧＴＧＧＴＣＡＣＴＣＣＡＣ−３
Ｖ３Ｒ：５’−ＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＡ−３
Ｖ５Ｆ：５’−ＣＣＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＴＣＡＡＴＡＡＣＣ−３
Ｖ７Ｆ：５’−ＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＴＴＣＧ−３
Ｖ１０Ｆ：５’−ＴＣＴＧＧＧＴＡＴＴＧＡＡＡＧＧＴＧＴＡＧＣＣ−３
アクチンＦ：５’−ＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＡＣＧＡＧ−３
アクチンＲ：５’−ＣＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴ−３
のプライマーを含む２０μｌの反応体積で、１μｌのＲＴを用いて、マイクロプロセッサ制御の恒温器の中で半定量的ＰＣＲ工程を行った。当該ＰＣＲのための工程サイクルプログラムを、４２サイクル（Ｖ３、Ｖ７、Ｖ５およびＶ１０増幅）または３２サイクル（ＣＤ４４Ｓ増幅）に対して、９４℃で３０秒間の変性、５８℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で３０秒間の伸張に設定した。アクチン対照ＰＣＲを、結果の正規化のために行った。図８、パネルＢ〜Ｅに見られ得るように、Ｕ０１２６（右レーン、「＝」）によるＥＲＫ経路の阻害により、ＣＤ４４バリアントエクソンスプライシングの有意な減少が認められた。
【０１３６】
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Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、（２００２）  Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ。  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６：５５０−３。
ＭｅａｄｅおよびＤｏｗｄｙ、（２００７）  Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ／ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ。  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、５９：１３４−４０。
Ｄｕ，Ｌら、（２００７）  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃ  ＡＴＭ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ＡＴＭ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ。  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ、１０４：６００７−１２。
Ｈｕａら、（２００７）  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＳＭＮ２  ｅｘｏｎ  ７  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｏｎ。  ＰｌｏＳ  Ｂｉｏｌ．、２００７、５：ｅ７３。
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Ｃｈｅｎｇら、（２００６）  Ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｌｏｏｐ  ｃｏｕｐｌｅｓ  Ｒａｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＣＤ４４  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ。  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２０：１７１５−２０。
【図１】
2010532989.tif 000009
【図２】
2010532989.tif 000010
【図３】
2010532989.tif 000011
【図４】
2010532989.tif 000012
【図５】
2010532989.tif 000013
【図６Ａ】
2010532989.tif 000014
【図６Ｂ】
2010532989.tif 000015
【図７】
2010532989.tif 000016
【図８】
2010532989.tif 000017
【配列表】
2010532989000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年3月5日(2010.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010532989000001.app
【国際調査報告】
2010532989.tif 000029
2010532989.tif 000030
2010532989.tif 000031