(57)【要約】  本発明は、抗体断片を二量体化する方法、抗体断片二量体、抗体断片二量体を含有する薬学的組成物、並びに治療用途のための医薬におけるそれらの使用に関する。記載された方法は、二重特異性抗体及び／又はその二重特異性断片の生成に有利に使用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの抗体断片の二量体であり、該抗体断片が、重鎖(ＨＣ)ポリペプチドのＣ末端で結合している化合物。
【請求項２】
第１のＨＣポリペプチドのＣ末端が、次の構造：
2010520248.tif 000043
[上式中、第１のポリペプチドは「★」でマークされ、第２のＨＣポリペプチドは、基Ｒｌｉｎｋｅｒに結合している]
を有している、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
第１のＨＣポリペプチドのＣ末端が、次の構造：
2010520248.tif 000044
を有している、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ＨＣポリペプチドのＣ末端が、次の構造：
2010520248.tif 000045
[上式中、ＨＣポリペプチドは「★」でマークされ、Ｒｒｇは、アジド、アルキン、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン、ケトン、アルデヒド、１,２-ジオール、又は１,２アミノアルコールから選択される基を担持する基である]
を有している抗体断片。
【請求項５】
ＨＣポリペプチドのＣ末端が、次の構造：
2010520248.tif 000046
を有している、請求項４に記載の抗体断片。
【請求項６】
-Ｒｒｇが：
2010520248.tif 000047
から選択される、請求項４又は５に記載の抗体断片。
【請求項７】
(ａ)第１の抗体断片のＨＣポリペプチドのＣ末端に第１の化学基を導入し、
(ｂ)第２の抗体断片のＨＣポリペプチドのＣ末端に第２の化学基を導入し、
(ｃ)第１の化学基を第２の化学基と反応させ、２つの抗体断片の共有結合を形成させる、
工程を含む、２つの抗体断片を二量体化する方法。
【請求項８】
(ａ')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第１の抗体断片のＨＣポリペプチドのＣ末端に第１の化学基を導入し、
(ｂ')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第２の抗体断片のＨＣペプチドのＣ末端に第２の化学基を導入し、
(ｃ')第１の化学基を第２の化学基と反応させ、２つの抗体断片の共有結合を形成させる、
工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
(ａ'')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第１の抗体断片のＨＣポリペプチドのＣ末端に第１の化学基を導入し、
(ｂ'')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第２の抗体断片のＨＣポリペプチドのＣ末端に、第３の化学基を導入し、
(ｂ''')第４及び第２の化学基を担持する分子を第３の化学基と反応させ、第３の化学基と第４の化学基とを反応させることにより、第２の抗体断片のＨＣポリペプチドのＣ末端に、該分子を共有結合させ、
(ｃ)第１の化学基を第２の化学基と反応させ、２つの抗体断片の共有結合を形成させる、
工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の化学基と前記第２の化学基が互いに異なっている、請求項７ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
アジドとアルキンの間の反応が、２つの抗体断片の間に結合を形成するために使用され、アジドとアルキンの間の前記反応が、銅(Ｉ)イオンにより触媒される、請求項７ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミンとケトン又はアルデヒドとの間の反応が、２つの抗体断片の間に結合を形成させるために使用される、請求項７ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素がカルボキシペプチダーゼＹである、請求項７ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
２つのＨＣポリペプチドの少なくとも一方のＣ末端アミノ酸配が-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ａｌａである、請求項７ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記求核試薬が：
2010520248.tif 000048
からなる群から選択される、請求項８ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質化学、特に抗体断片の二量体化の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
２つの独立した抗原に対して親和性を有する二重特異性抗体は既に記載されている(Holliger及びWinter 1993 Curr. Opin. Biotech. 4, 446-449(Poljak, R. Jら(1994)Structure 2:1121-1123; Caoら(1998), Bioconjugate Chem. 9, 635-644も参照); Aramwitら Drugs of the Future 2005, 30, 1013-1016; Moosmayerら Clin. Cancer Res. 2006, 12, 5587-5595)。このような抗体は、(とりわけ)細胞傷害性薬剤又は免疫エフェクター細胞を腫瘍のような標的部位へ向け直すのに特に有用である。今日まで、殆どの二重特異性抗体は、あまりにも短すぎて同じ鎖上のドメイン間で対形成できないリンカーを使用して、２つの独立した抗体のＶＨとＶＬドメインを連結させ、よって異なる鎖上の相補的ドメイン間の対形成を促進させて２つの抗原結合部位を生じせしめることにより作製されている。このタイプの抗体分子はＦｃドメインを欠き、よって抗体のエフェクター機能(例えば補体活性化、Ｆｃ-レセプター結合等)を惹起させる能力を欠き、その比較的小さいサイズのため、半減期は典型的に低い。二重特異性抗体は、異なる特異性を有する２つの抗体の少なくとも抗原結合部位を含まなければならず、双方の部位は組換え的に発現されうる。例えば、Albrechtら(Bioconjugate Chem. 2004, 15, 16-26)は、ジチオ結合によって二量体化した二量体化ＳｃＦｖｓを記載している。
【０００３】
２つの生体分子の共有結合のためのスペーサーとして使用されている二官能性分子は、Liら(Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 5558-5561)により記載されている。しかしながら、二重特異性抗体コンストラクトの調製の場合、どの方法を使用するにしても、２つの異なる抗原結合部の連結が調製における重要な問題となる。ランダムな二量体化により、通常、分離が困難な、多くの異なるカップリング産物の混合物がもたらされる。互いに反応する断片の連結を制御するための現存する方法は、例えばノブ・イン・ホール変異(Carter, J. Immunol. Methods 2001, 248, 7-15)、ロイシン-ジッパー(Kostelnyら J. Immunol. 1992, 148, 1547-1553)、又はオリゴヌクレオチド対形成(Chaudriら FEBS Letters, 1999, 450, 23-26)である。異なる特異性の２つの抗体からの重鎖及び軽鎖抗体可変ドメインが単一のポリペプチド鎖として共に融合されているコンストラクトもまた記載されている(Kipriyanov及びLe Gall, Current Opinion in Drug Discovery & Development, 2004, 7, 233-242)。ヘテロ二量体コンストラクトの調製の場合、主要な問題は、どのモノマーが二量体を形成するかを制御することである。筆者の知識では、化学反応のみで二量体化が制御される方法は存在していない。
【０００４】
よって、商業的に関連のある収率で得ることができ、精製に適した二量体化抗体コンストラクト、例えば二重特異性抗体又はその断片を生産するための改善された代替法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
抗体断片を二量体化するための既知の方法の上述した限界を克服するために、本発明は、Ｃ末端の修飾を含み、Ｃ末端を反応させて２つの抗体断片間に共有結合を形成することを含む、２つの抗体断片をそれぞれの重鎖(ＨＣ)Ｃ末端で二量体化する新規方法を提供する。また、本発明により、２つの抗体断片の二量体を含む化合物が提供され、ここで、前記抗体断片は重鎖(ＨＣ)ポリペプチドのそれぞれのＣ末端で結合している。また本発明により、ＨＣポリペプチドのＣ末端が本発明に従って修飾されている抗体断片が提供される。
【０００６】
本発明により提供される方法に従い、一つの抗体断片は、第２の抗体断片に存在しない一つの化学官能基を担持しており、第２の抗体断片は、第１の抗体断片に存在しない他の化学基を担持している。二量体化は、これらの２つの化学基が互いに反応し、化学結合を生じた場合に得ることができる。
【０００７】
特定の実施態様では、図１に概略を示すたように、抗体二量体化断片は、軽鎖(ＬＣ)に付随したＨＣの可変ドメインを少なくともそれぞれ含むＦａｂ断片である。ついで、ＨＣポリペプチドのＣ末端が連結されてＦａｂ２断片が形成される。
本発明の方法は、高収率及び純度で、二量体化Ｆａｂ断片を生産し、構成Ｆａｂ断片の双方とも無傷のＮ末端を保持することを可能にするのに有用であることを実証した。同様の原理が、ＨＣポリペプチドのＣ末端での他の抗体断片の二量体にも適用できる。
化する
【０００８】
一態様では、本発明は、
(ａ)第１の抗体断片のＣ末端に第１の化学基を導入し、
(ｂ)第２の抗体断片のＣ末端に第２の化学基を導入し、
(ｃ)第１の化学基を第２の化学基と反応させ、２つの抗体断片の共有結合を形成させる、
工程を含む、２つの抗体断片を二量体化する方法を提供する。
【０００９】
他の態様では、本発明は、
(ａ')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第１の抗体断片のＣ末端に第１の化学基を導入し、
(ｂ')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第２の抗体断片のＣ末端に第２の化学基を導入し、
(ｃ)第１の化学基を第２の化学基と反応させ、２つの抗体断片の共有結合を形成させる、
工程を含む、抗体の２つの抗体断片を二量体化する方法を提供する。
【００１０】
他の態様では、本発明は、
(ａ')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第１の抗体断片のＣ末端に第１の化学基を導入し、
(ｂ'')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第２の抗体断片のＣ末端に、第３の化学基を導入し、
(ｂ''')第４及び第２の化学基を担持する分子と第３の化学基を反応させ、第３の化学基と第４の化学基とを反応させることにより、第２の抗体断片のＣ末端に、該分子を共有結合させ、
(ｃ)第１の化学基を第２の化学基と反応させ、２つの抗体断片の共有結合を形成させる、
工程を含む、抗体の２つの抗体断片を二量体化する方法を提供する。
【００１１】
上述した各方法の一実施態様では、各抗体断片はＦａｂ断片である。
上述した各方法及び実施態様の他の実施態様では、抗体断片は、異なる結合特異性、例えば異なる抗原又は同じ抗原の異なるエピトープへの結合性を有する。
上述した各方法及び実施態様の他の実施態様では、抗体断片の少なくとも一方、場合によっては双方のＨＣポリペプチドのＣ末端アミノ酸配列は、-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ａｌａである。
【００１２】
他の態様では、酵素により触媒される修飾は、セリンプロテアーゼにより実施される。一実施態様では、酵素により触媒される修飾は、セリンカルボキシペプチダーゼにより実施される。他の実施態様では、酵素により触媒される修飾は、酵素カルボキシペプチダーゼＹにより実施される。
他の態様では、本発明は、Ｃ末端アミノ酸配列が-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-ＡｌａであるＨＣポリペプチドを含んでなる抗体断片、並びに上述した方法におけるその使用に関する。一実施態様では、抗体断片はＦａｂ断片である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、Ｆａｂ断片の二量体化に適用される、本発明に係る抗体断片の二量体化方法の概要を示すものである。
【図２】図２は、実施例１の工程３に記載される二量体化Ｆａｂ断片調製物の、非還元(Ａ)及び還元(Ｂ)ＳＤＳ-ゲル分析を示す。非還元ＳＤＳ-ゲルは、ウェル３及び４に２つの濃度での出発Ｆａｂ断片を示す。ウェル５−１２は、それぞれ２つの濃度での、異なる反応時間での二量体化(工程３)中の反応混合物を示す。非還元ＳＤＳ-ゲルは、ウェル２に出発Ｆａｂを、ウェル３に工程３後の反応産物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、２つの抗体断片の二量体である化合物を提供するものであり、ここで該抗体断片は、重鎖(ＨＣ)ポリペプチドのＣ末端で結合している。
一実施態様では、本化合物は、非ペプチド結合により結合している抗体断片を含む。他の実施態様では、二量体化される抗体断片はＦａｂ断片である。他の実施態様では、第１のＨＣポリペプチドのＣ末端は、次の構造：
2010520248.tif 000002
[上式中、第１のポリペプチドは「★」でマークされ、第２のＨＣポリペプチドは、基Ｒｌｉｎｋｅｒに結合している]
を有する。特定の実施態様では、第１のＨＣポリペプチドのＣ末端は、次の構造：
2010520248.tif 000003
を有する。
【００１５】
さらなる他の実施態様では、本化合物は、一方の抗体断片のアジドと、他方の抗体断片のアルキンとの間で反応することにより結合している抗体断片を含む。さらなる他の実施態様では、本化合物は、一方の抗体断片のＯ-アルキル化ヒドロキシルアミンと、他方の抗体断片のケトン又はアルデヒドとの間の反応により結合している抗体断片を含む。さらなる他の実施態様では、抗体断片は、それぞれ、抗体の少なくとも２、又は３つ全ての相補性決定領域(ＣＤＲ)を有するＨＣポリペプチドを含む。
【００１６】
また本発明は、ここに記載の二量体化に有利に使用される抗体断片を提供する。一実施態様では、抗体断片に含有されるＨＣポリペプチドのＣ末端は、次の構造：
2010520248.tif 000004
[上式中、ＨＣポリペプチドは「★」でマークされ、Ｒｒｇは、アジド、アルキン、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン、ケトン、アルデヒド、１,２-ジオール、又は１,２アミノアルコールから選択される基を有する又は担持する基である]
を有する。一実施態様では、ＨＣポリペプチドのＣ末端は、次の構造：
2010520248.tif 000005
を有する。
【００１７】
他の実施態様では、-Ｒｒｇは：
2010520248.tif 000006
から選択される。
【００１８】
また本発明は、二重特異性コンストラクトの生成に使用可能で、異なる抗体断片間の誤対合を低減又はなくすことができる、抗体断片を二量体化する方法を提供する。
上述したように、本発明は、
(ａ)第１の抗体断片のＣ末端に第１の化学基を導入し、
(ｂ)第２の抗体断片のＣ末端に第２の化学基を導入し、
(ｃ)第１の化学基を第２の化学基と反応させ、２つの抗体断片の共有結合を形成させる、
工程を含む、抗体の２つの抗体断片を二量体化する方法を提供する。
【００１９】
他の態様では、本発明は、
(ａ')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第１の抗体断片のＣ末端に第１の化学基を導入し、
(ｂ')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第２の抗体断片のＣ末端に第２の化学基を導入し、
(ｃ)第１の化学基を第２の化学基と反応させ、２つの抗体断片の共有結合を形成させる、
工程を含む、抗体の２つの抗体断片を二量体化する方法を提供する。
【００２０】
他の態様では、本発明は、
(ａ')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第１の抗体断片のＣ末端に第１の化学基を導入し、
(ｂ'')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第２の抗体断片のＣ末端に、第３の化学基を導入し、
(ｂ''')第４及び第２の化学基を担持する分子を第３の化学基と反応させ、第３の化学基と第４の化学基とを反応させることにより、第２の抗体断片のＣ末端に、該分子を共有結合させ、
(ｃ)第１の化学基を第２の化学基と反応させ、２つの抗体断片の共有結合を形成させる、
工程を含む、抗体の２つの抗体断片を二量体化する方法を提供する。
【００２１】
一実施態様、上述した任意の態様又は実施態様では、工程(ａ)は、第１の化学基を含めるために、第１の抗体断片のＨＣポリペプチドのＣ末端を修飾することを含み、工程(ｂ)は、第２(又は第３)の化学基を含めるために、第２の抗体断片のＨＣポリペプチドにＣ末端を修飾することを含む。
さらなる他の実施態様では、ＨＣポリペプチドは、抗体の少なくとも２、又は３つ全ての相補性決定領域(ＣＤＲ)を有する。
本発明の一実施態様では、前記第１の化学基と前記第２の化学基は互いに異なっている。
【００２２】
本発明の他の実施態様では、前記第１の化学基と前記第２の化学基は、アルキン、アジド、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン、ケトン、アルデヒド、ヒドラゾン、及びＯ-アシル化ヒドロキシルアミンからなる群から独立して選択される。
本発明の他の実施態様では、第１の化学基がアジドであり、第２がアルキンであり、又はその逆である場合、アジドとアルキンの間の反応が、２つの抗体断片の間に結合を形成させるために使用される。本発明のさらなる他の実施態様では、アジドとアルキンの間の前記反応は、銅(Ｉ)-イオンにより触媒される。
本発明の他の実施態様では、第１の化学基がＯ-アルキル化ヒドロキシルアミンであり、第２の化学基がケトン又はアルデヒドであり、又はその逆である場合、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミンとケトン又はアルデヒドとの間の反応が、２つの抗体断片の間に結合を形成させるために使用される。
本発明の一態様では、このような対の各反応基は、酵素触媒反応により、ＨＣポリペプチドのＣ末端に導入される。一実施態様では、少なくとも一の反応基はヒドロキシルアミン又はアジドである。
【００２３】
抗体断片のＣ末端の酵素により触媒される修飾は、限定されるものではないが、セリンプロテアーゼ、例えばセリンカルボキシペプチダーゼを含む多様な酵素により実施されてよい。一実施態様では、酵素はカルボキシペプチダーゼＹ(ＣＰＹ)である。他の実施態様では、酵素はカルボキシペプチダーゼＹの変異体又は断片であり、該変異体又は断片は、反応を触媒する能力を保持しており、それにより、ポリペプチドのＣ末端は種々の化学部分に置き換えられる。カルボキシペプチダーゼＹのいくつかの変異体が当該分野で既知である；例えば、国際公開第９８／３８２８５号を参照。
【００２４】
本発明の他の実施態様では、前記求核試薬は：
2010520248.tif 000007
からなる群から選択される。
本発明の他の実施態様では、前記工程(ｃ)の反応により、１,２,３-トリアゾールが形成される。
本発明の他の実施態様では、前記工程(ｃ)の反応により、オキシム又はヒドラゾンが形成される。
【００２５】
本発明の一実施態様では、カップリングした抗体断片のＣ末端残基はＡｌａ残基、好ましくはＬｅｕ-Ｌｅｕ-Ａｌａペプチド配列である。他の実施態様では、Ａｌａ残基は、翻訳前又は翻訳後伸長により、それぞれの抗体断片のＣ末端に第１の化学基及び第２の化学基を導入する前に、各抗体断片のＣ末端に付加される。他の実施態様では、Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ａｌａポリペプチドは、翻訳前又は翻訳後伸長により、それぞれの抗体断片のＣ末端に第１の化学基及び第２の化学基を導入する前に、各抗体断片のＣ末端に付加される。
他の態様では、本発明は、抗体断片、例えばＦａｂ断片に関連し、ここでＣ末端アミノ酸配列は-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ａｌａである。
【００２６】
抗体断片
抗体(又は「免疫グロブリン」)は、抗原の外観に応じて、哺乳動物(例えばヒト)Ｂリンパ球誘導性形質細胞により分泌されるタンパク質である。多量体を形成可能であるが、各抗体の基本単位は、２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖からなる「Ｙ」字型分子である。
特に、このような各抗体は、同一の重鎖対(ＨＣｓ)と同一の軽鎖対(ＬＣｓ)を含む。各ＬＣは一つの可変ドメイン(ＶＬ)と一つの定常ドメイン(ＣＬ)を有するが、各ＨＣは一つの可変(ＶＨ)と３つの定常ドメイン(ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３)を有する。ついで、各可変ドメインは、フレームワーク領域(ＦＲｓ)により散在している３つの相補性決定領域(ＣＤＲｓ)を有する。ＣＨ１及びＣＨ２ドメインはヒンジ領域により連結している。各ポリペプチドは、鎖内ジスルフィド架橋の数により特徴付けられ、ポリペプチドは付加的なジスルフィド架橋により相互連結している。ポリペプチドのジスルフィド架橋に加えて、ポリペプチド鎖は、イオン相互作用(該相互作用は、ここで記載される本発明の多くの態様に直接関連している)によっても会合している。
【００２７】
重鎖には５つのタイプ：γ、δ、α、μ及びε(又はＧ、Ｄ、Ａ、Ｍ、及びＥ)がある。それらは免疫グロブリンのクラスを定める。全てのアイソタイプのＨ鎖は、２つのアイソタイプ−ｋ及びｌの軽(Ｌ)鎖と会合している。よって、抗体の基本的Ｈ２Ｌ２組成は、そのＨ及びＬアイソタイプにより、例えばｅ２ｋ２、(ｍ２ｌ２)５等と特定することができる。それらの重鎖における差異に基づき、免疫グロブリン分子は、５つの主要なクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤに分けられる。免疫グロブリンＧ(「ＩｇＧ」)は、内部成分、例えば血液、脳脊髄液及び腹水(腹腔に存在する液体)の、主だった免疫グロブリンである。ＩｇＧは、胎盤を渡り、胎児に母の免疫を付与する免疫グロブリンの唯一のクラスである。ＩｇＧは全免疫グロブリンの８０％をなす。それは分子量１５００００ダルトンを有する最も小さい免疫グロブリンである。よって、それは体循環から組織中に容易に拡散することができる。現在までに承認されている全ての抗体薬は、ＩｇＧ又はＩｇＧ誘導分子を含む。
【００２８】
いくつかの種において、免疫グロブリンクラスは、抗体構造に別の複雑度レイヤーを加えるサブクラスに従ってさらに分けられる。ヒトにおいては、例えばＩｇＧ抗体は、４つのＩｇＧサブクラス−ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。各サブクラスは、ｇ１(ＩｇＧ１)、ｇ２(ＩｇＧ２)、ｇ３(ＩｇＧ３)、ｇ４(ＩｇＧ４)、ａ１(ＩｇＡ１)又はａ２(ＩｇＡ２)と称される異なる重鎖アイソタイプに対応する。
【００２９】
哺乳動物(及びある種の他の脊索動物)において、抗体と抗原(通常は感染病原体に付随している)との間の反応により、抗原及びその供給源の除去に至る。この反応は高度に特異的であり、つまり、特定の抗体が１種類の抗原のみと反応する。抗体分子は直接には感染病原体を破壊せずにむしろ、免疫系の他の成分による破壊のために薬剤を「タグ付け」する。ヒト等の哺乳動物において、タグは、一般的にＦｃドメインと称される、抗体のＣＨ２-ＣＨ３部分により構成される。
【００３０】
免疫グロブリンは、抗原結合部位、抗原に対する特性を保持している、最も小さな断片に転換することができる。このような抗原結合断片は、Ｆａｂ(抗原結合断片)と称されている。Ｆａｂは２つのペプチドからなり、その一方は軽鎖可変及び定常ドメインＶＬ-ＣＬを有し、他方の切断型重鎖は可変ドメインと一つの定常ドメインＶＨ-ＣＨ１を有する。またヒンジ領域がジスルフィド架橋を含むならば、結合は２つのＦａｂ断片の間で生じ、Ｆａｂ２断片が生じる。よって、ＦｃドメインはＦａｂ及びＦａｂ２断片には存在しない。
無傷ＩｇＧにおける同様に、軽鎖及び重鎖はジスルフィド結合により互いに結合している。
【００３１】
ここで使用される「抗体断片」なる用語は、抗体の抗原結合断片、少なくとも全長ＨＣの一部を有するＨＣポリペプチドを含む抗原結合断片を意味する。典型的には、抗原結合断片はＨＣポリペプチドのみを含む。ＨＣポリペプチドは、例えば抗体のＶＨの１、２又は３つ全てのＣＤＲを有していてよい。抗体断片は、少なくとも全長ＬＣの一部を有するＬＣポリペプチドをさらに含有することができる。ＬＣポリペプチドは、例えば抗体のＶＬの１、２又は３つ全てのＣＤＲを有していてよい。抗体断片の例には、Ｆａｂ(ここでは「ＦＡＢ」とも称される)、Ｆａｂ'、Ｆｖ(典型的には、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメイン)、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｄドメイン(典型的には、ＶＨ及びＣＨ１ドメイン)、及びｄＡｂ(典型的にはＶＨドメイン)断片；ＶＨ、ＶｈＨ、及びＶ-ＮＡＲドメイン；並びに全長抗体の一価バージョン(全長ＨＣ及び全長ＬＣを含む)；ミニボディ(minibodies)、二量体、三量体、四量体、及びカッパ体の一価型(例えば、Illら, Protein Eng 1997；10：949-57を参照)；ラクダＩｇＧの一価型；ＩｇＮＡＲの一価型；及び一又は複数の単離されたＶＨ ＣＤＲ又は機能的パラトープが含まれ、ここで単離されたＣＤＲ又は抗原結合残基又はポリペプチドは、共に会合又は結合可能で、機能的抗体断片が形成される。二量体化に適した、種々の抗体断片が、例えばHolliger及びHudson, Nat Biotechnol 2005;23, 1126-1136; 国際公開第２００５０４０２１９号、及び米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号及び同２００２０１６１２０１号に記載され、又は概説されている。
【００３２】
抗体断片は、遺伝暗号によりコードされるアミノ酸、遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸、並びに合成アミノ酸を含んでよい。遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸は、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシ-グルタミン酸、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ-アラニン、Ｄ-グルタミン酸である。合成アミノ酸は、有機合成により製造されたアミノ酸、例えば遺伝暗号によりコードされたアミノ酸のＤ-異性体、及びＡｉｂ(α-アミノイソ酪酸)、Ａｂｕ(α-アミノ酪酸)、Ｔｌｅ(tert-ブチルグリシン)、及びβ-アラニンを含む。
【００３３】
本発明の態様では、２つの抗体断片の少なくとも一方、又はＦａｂ断片のＣ末端は無極性側鎖を有する。一実施態様では、２つの抗体断片の少なくとも一方、又はＦａｂ断片のＣ末端は-Ａｌａである。本発明の他の実施態様では、２つの抗体断片の少なくとも一方、又はＦａｂ断片のＣ末端は-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ａｌａである。この配列は、ＣＰＹ等の酵素を含む酵素反応に有利であることが示されている。一実施態様では、Ａｌａ残基又はＬｅｕ-Ｌｅｕ-Ａｌａペプチド配列は、カップリングの前に少なくとも一の抗体断片のＣ末端に導入される。
【００３４】
一実施態様では、抗体断片の各ＨＣポリペプチドは、抗体からの３つ全てのＣＤＲを有する。他の実施態様では、抗体断片の各ＨＣポリペプチドは、抗体ＨＣからの３つ全てのＣＤＲを有し、抗体ＬＣからの１、２又は３のＣＤＲを有するＬＣポリペプチドと会合している。他の実施態様では、、抗体断片の各ＨＣポリペプチドは、抗体ＨＣからの３つ全てのＣＤＲを有し、抗体ＬＣからの３つ全てのＣＤＲを有するＬＣポリペプチドと会合している。
【００３５】
本発明の方法は、抗体断片の二重特異性二量体(例えば、二重特異性Ｆａｂ断片)を提供する。よって、本発明の一実施態様では、２つの抗体断片は互いに異なっており、異なる抗原同じ抗原の異なるエピトープに結合する。
他の態様では、本発明は、Ｆａｂ断片等の抗体断片に関し、ここでＣ末端アミノ酸配列は-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ａｌａである。
【００３６】
次の、本発明の二量体化抗体断片を生成するための４つの例示的方法を記載する。以下、Ｆａｂ(「ＦＡＢ」とも称する)の二量体化を例示するが、同様の方法を他の抗体断片に適用することもできる。
【００３７】
(方法Ａ)
工程１：Ｃ末端で第１の化学基を担持する第１のＦＡＢ断片の調製
-ＬＬＡ等、適切なＣ末端アミノ酸配列を有する第１のＦＡＢ断片を、第２のＦＡＢ断片には存在しない第１の化学基を有するＲ１ｃｇ部分を担持する求核試薬の存在下、カルボキシペプチダーゼＹ(ＣＰＹ)と共にインキュベートする。このような化学基の例は、例えばアルキン類、アジド類、ケトン類、アルデヒド類、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン類、ヒドラジン類とすることができる。ペプチド転移反応生成物が形成され得る。Ｒ１ｃ及びＲ１ｃ−１は第１のＦＡＢ断片の位置のアミノ酸残基である。ＦＡＢ２は第２のＦＡＢ断片の基である。
2010520248.tif 000008
【００３８】
工程２：Ｃ末端で第２の化学基を担持する第２のＦＡＢ断片の調製
-ＬＬＡ等、適切なＣ末端アミノ酸配列を有する第２のＦＡＢ断片を、第２のＦＡＢ断片には存在しない第２の化学基を有するＲ２ｃｇ部分を担持する求核試薬の存在下、適切な酵素、例えばカルボキシペプチダーゼＹ(ＣＰＹ)と共にインキュベートする。このような化学基の例は、例えばアルキン類、アジド類、ケトン類、アルデヒド類、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン類、ヒドラジン類とすることができる。ペプチド転移反応生成物が形成され得る。Ｒ２ｃ及びＲ２ｃ−１は第２のＦＡＢ断片の位置のアミノ酸残基である。ＦＡＢ２は第２のＦＡＢ断片の基である。
2010520248.tif 000009
【００３９】
工程３：第１及び第２の化学基の反応による、第１及び第２の抗体断片の結合
第１のペプチド転移ＦＡＢ断片に結合し、第２のＦＡＢ断片に近接しない又は存在する、第１の化学基を有する部分を、第２のペプチド転移ＦＡＢ断片に結合し、第１のペプチド転移ＦＡＢ断片に近接する又は存在しない、第２の化学基を有する部分と反応させて、結合部分Ｒ１Ｌｉｎｋ２を形成させる。互いに反応する化学基の対の例は、例えば銅(Ｉ)触媒等、適切な条件下でトリアゾール化合物に反応し得る、アルキン類及びアジド類、又は適切なｐＨでオキシム類に反応し得る、ケトン類又はアルデヒド類及びＯ-アルキル化ヒドロキシルアミン類とすることができる。
2010520248.tif 000010
【００４０】
(方法Ｂ)
工程１：Ｃ末端で第１の化学基を担持する第１のＦＡＢ断片の調製
-ＬＬＡ等、適切なＣ末端アミノ酸配列を有する第１のＦＡＢ断片を、第２のＦＡＢ断片には存在しない第１の化学基を有する部分を担持する求核試薬の存在下、カルボキシペプチダーゼＹ(ＣＰＹ)と共にインキュベートする。このような化学基の例は、例えばアルキン類、アジド類、ケトン類、アルデヒド類、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン類、ヒドラジン類とすることができる。ペプチド転移反応生成物が形成され得る。Ｒ１ｃ及びＲ１ｃ−１は第１のＦＡＢ断片の位置のアミノ酸残基である。
2010520248.tif 000011
【００４１】
工程２：Ｃ末端で第３の化学基を担持する第２のＦＡＢ断片の調製
-ＬＬＡ等、適切なＣ末端アミノ酸配列を有する第２のＦＡＢ断片を、第２のＦＡＢ断片には存在しない第３の化学基を有するＲ３ｃｇ部分を有する部分を担持する求核試薬の存在下、カルボキシペプチダーゼＹ(ＣＰＹ)と共にインキュベートする。このような化学基の例は、例えばアルキン類、アジド類、ケトン類、アルデヒド類、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン類、ヒドラジン類とすることができる。ペプチド転移反応生成物が形成され得る。Ｒ２ｃ及びＲ２ｃ−１は第２のＦＡＢ断片の位置のアミノ酸残基である。ＦＡＢ２は第２のＦＡＢ断片の基である。ＦＡＢ２は第２のＦＡＢ断片の基である。
2010520248.tif 000012
【００４２】
工程３：第２及び第４の化学基を担持する分子との反応
先の工程で得られた第３の化学基を有する第２のＦＡＢ断片を、ジラジカルが第４の化学基を有するＲ４ｃｇ部分と第２の化学基を有するＲ２ｃｇ部分とを有するＭｏｌである分子と反応させる。このような化学基の例は、例えばアルキン類、アジド類、ケトン類、アルデヒド類、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン類、ヒドラジン類とすることができる。ペプチド転移反応生成物が形成され得る。第３の化学基と第４の化学基とが反応し、共有結合が形成して、結合部分Ｒ３ｌｉｎｋａｇｅ４が形成される。
2010520248.tif 000013
【００４３】
工程４：２つのＦＡＢ断片の結合
それぞれ工程１及び工程３で得られたＦＡＢ断片を、第１のペプチド転移ＦＡＢ断片に結合し、工程３で得られた第２のＦＡＢ断片に近接しない又は存在する、第１の化学基を有する部分と反応させることにより二量体化化合物を形成させ、第２のペプチド転移ＦＡＢ断片に結合し、第１のペプチド転移ＦＡＢ断片に近接する又は存在しない、第２の化学基を有する部分と反応させることにより結合部分Ｒ１Ｌｉｎｋ２を形成させる。互いに反応する化学基の対の例は、例えば銅(Ｉ)触媒等、適切な条件下でトリアゾール化合物に反応し得る、アルキン類及びアジド類、又は適切なｐＨでオキシム類に反応し得る、ケトン類又はアルデヒド類及びＯ-アルキル化ヒドロキシルアミン類とすることができる。
【００４４】
2010520248.tif 000014
(方法Ｃ)
工程１：Ｃ末端で第１の化学基を担持する第１のＦＡＢ断片の調製
-ＬＬＡ等、適切なＣ末端アミノ酸配列を有する第１のＦＡＢ断片を、第２のＦＡＢ断片には存在しない第１の化学基を有するＲ１ｃｇ部分を担持する求核試薬の存在下、カルボキシペプチダーゼＹ(ＣＰＹ)と共にインキュベートする。このような化学基の例は、例えばアルキン類、アジド類、ケトン類、アルデヒド類、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン類、ヒドラジン類とすることができる。ペプチド転移反応生成物が形成され得る。Ｒ１ｃ及びＲ１ｃ−１は第１のＦＡＢ断片の位置のアミノ酸残基である。ＦＡＢ２は第２のＦＡＢ断片の基である。
2010520248.tif 000015
【００４５】
工程２：Ｃ末端で第２の化学基を担持する第２のＦＡＢ断片の調製
-ＬＬＡ等、適切なＣ末端アミノ酸配列を有する第２のＦＡＢ断片を、第２のＦＡＢ断片には存在しない第２の化学基を有するＲ２ｃｇ部分を担持する求核試薬の存在下、適切な酵素、例えばカルボキシペプチダーゼＹ(ＣＰＹ)と共にインキュベートする。このような化学基の例は、例えばアルキン類、アジド類、ケトン類、アルデヒド類、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン類、ヒドラジン類とすることができる。ペプチド転移反応生成物が形成され得る。Ｒ２ｃ及びＲ２ｃ−１は第２のＦＡＢ断片の位置のアミノ酸残基である。ＦＡＢ２は第２のＦＡＢ断片の基である。
2010520248.tif 000016
【００４６】
工程３：第１及び第２の化学基の反応による、第１及び第２の抗体断片の結合
第１のペプチド転移ＦＡＢ断片に結合し、第２のＦＡＢ断片に近接しない又は存在する、第１の化学基を有する部分を、第２のペプチド転移ＦＡＢ断片に結合し、第１のペプチド転移ＦＡＢ断片に近接する又は存在しない、第２の化学基を有する部分と反応させて、結合部分Ｒ１Ｌｉｎｋ２を形成させる。互いに反応する化学基の対の例は、例えば銅(Ｉ)触媒等、適切な条件下でトリアゾール化合物に反応し得る、アルキン類及びアジド類、又は適切なｐＨでオキシム類に反応し得る、ケトン類又はアルデヒド類及びＯ-アルキル化ヒドロキシルアミン類とすることができる。
2010520248.tif 000017
【００４７】
(方法Ｄ)
工程１：Ｃ末端で第１の化学基を担持する第１のＦＡＢ断片の調製
-ＬＬＡ等、適切なＣ末端アミノ酸配列を有する第１のＦＡＢ断片を、第２のＦＡＢ断片には存在しない第１の化学基を有する部分を担持する求核試薬の存在下、カルボキシペプチダーゼＹ(ＣＰＹ)と共にインキュベートする。このような化学基の例は、例えばアルキン類、アジド類、ケトン類、アルデヒド類、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン類、ヒドラジン類とすることができる。ペプチド転移反応生成物が形成され得る。Ｒ１ｃ及びＲ１ｃ−１は第１のＦＡＢ断片の位置のアミノ酸残基である。
2010520248.tif 000018
【００４８】
工程２：Ｃ末端で第３の化学基を担持する第２のＦＡＢ断片の調製
-ＬＬＡ等、適切なＣ末端アミノ酸配列を有する第２のＦＡＢ断片を、第２のＦＡＢ断片には存在しない第３の化学基を有するＲ３ｃｇ部分を有する部分を担持する求核試薬の存在下、カルボキシペプチダーゼＹ(ＣＰＹ)と共にインキュベートする。このような化学基の例は、例えばアルキン類、アジド類、ケトン類、アルデヒド類、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン類、ヒドラジン類とすることができる。ペプチド転移反応生成物が形成され得る。Ｒ２ｃ及びＲ２ｃ−１は第２のＦＡＢ断片の位置のアミノ酸残基である。ＦＡＢ２は第２のＦＡＢ断片の基である。ＦＡＢ２は第２のＦＡＢ断片の基である。
2010520248.tif 000019
【００４９】
工程３：第２及び第４の化学基を担持する分子との反応
先の工程で得られた第３の化学基を有する第２のＦＡＢ断片を、ジラジカルが第４の化学基を有するＲ４ｃｇ部分と第２の化学基を有するＲ２ｃｇ部分とを有するＭｏｌである分子と反応させる。このような化学基の例は、例えばアルキン類、アジド類、ケトン類、アルデヒド類、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン類、ヒドラジン類とすることができる。ペプチド転移反応生成物が形成され得る。第３の化学基と第４の化学基とが反応し、共有結合が形成して、結合部分Ｒ３ｌｉｎｋａｇｅ４が形成される。
2010520248.tif 000020
【００５０】
工程４：２つのＦＡＢ断片の結合
それぞれ工程１及び工程３で得られたＦＡＢ断片を、第１のペプチド転移ＦＡＢ断片に結合し、工程３で得られた第２のＦＡＢ断片に近接しない又は存在する、第１の化学基を有する部分と反応させることにより二量体化化合物を形成させ、第２のペプチド転移ＦＡＢ断片に結合し、第１のペプチド転移ＦＡＢ断片に近接する又は存在しない、第２の化学基を有する部分と反応させることにより結合部分Ｒ１Ｌｉｎｋ２を形成させる。互いに反応する化学基の対の例は、例えば銅(Ｉ)触媒等、適切な条件下でトリアゾール化合物に反応し得る、アルキン類及びアジド類、又は適切なｐＨでオキシム類に反応し得る、ケトン類又はアルデヒド類及びＯ-アルキル化ヒドロキシルアミン類とすることができる。
2010520248.tif 000021
【００５１】
コンジュゲーション
また、本発明の二量体化抗体断片は、さらに又は代替的に、非-ポリペプチド部分等の、化学基にコンジュゲート、すなわち結合(コンジュゲーション)していてもよい。
よって、一実施態様では、本方法は、化学基に、少なくとも一の構成抗体ポリペプチドをコンジュゲートさせる、同時及び／又は後続工程をさらに含む。このようなコンジュゲートは、還元されたシステイン残基を介して実施されてよく、又はグルタミン酸残基を介して実施されてもよい。
コンジュゲートは、二量体化抗体断片の合成前に、構成抗体断片の一方で実施されてよく、又は二量体化抗体断片が合成された後に実施されてよいと理解される。
【００５２】
一実施態様では、化学基は延長(protractor)基、すなわち、未修飾のポリペプチドと比較した場合に、ポリペプチドへコンジュゲートして、該ポリペプチドの循環半減期を増加させる基である。延長効果の背後にある特定の原理は、サイズを増加させ、ペプチダーゼ又は抗体により認識可能なペプチド配列を保護し、又はマクロファージ、又は肝臓等に存在するグルカン特異性レセプターにより認識されないような方法でグルカンをマスキングし、クリアランスを防止又は低減させることに起因しうる。また延長基の延長効果は、例えばアルブミン等の血液成分への結合、又は脈管組織への非特異的付着に起因する可能性もある。コンジュゲートされたポリペプチドは、その生物活性を実質的に保持している。
【００５３】
一実施態様では、一つの抗体断片のみが、化学基、例えば非ポリペプチド部分にコンジュゲートしている。
本発明の一実施態様では、延長基は、
(ａ)一又は複数のカルボン酸、アミン類、スルホン酸、ホスホン酸、又はその組合せを含んでいてよい、低分子の有機帯電ラジカル(１５−１０００Ｄａ)、
(ｂ)場合によっては分枝状であってもよいポリエチレン鎖、又はシクロデキストリン等、低分子(１５−１０００Ｄａ)の中性の親水性分子、
(ｃ)脂肪酸又はコール酸又はその誘導体等、低分子(１５−１０００Ｄａ)の疎水性分子、
(ｄ)２０００−６００００Ｄａの平均分子量を有するポリエチレングリコール、
(ｅ)７００〜２００００Ｄａ、好ましくは７００−１００００Ｄａの範囲の正確な分子量を有するデンドリマー等、十分に定義された精密ポリマー、
(ｆ)アルブミン、抗体又はその一部等、実質的に非免疫原生のポリペプチド、例えばアルブミン断片又は抗体断片で、場合によってはＦｃ-ドメインを有していてよいもの、及び
(ｇ)デキストラン等、高分子量の有機ポリマー、
からなる群から選択される。
【００５４】
本発明の一実施態様では、延長基は、デンドリマー、ポリアルキレングリコール(ＰＡＧ)、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)及びポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)を含むポリアルキレンオキシド(ＰＡＯ)、分枝状ＰＥＧ、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリカルボキシラート、ポリ-ビニルピロリドン、ポリエチレン-コ-マレイン酸無水物、ポリスチレン-コ-マレイン酸無水物、及びカルボキシメチルデキストランを含むデキストランからなる群から選択される。本発明の関心ある特定の一実施態様では、延長基はＰＥＧ基である。
「分枝状ポリマー」、又は交換可能に「樹枝状ポリマー」、「デンドリマー」又は「樹枝状構造」なる用語は、そのいくつかが分枝状部を含む、モノマー構成ブロックから選択されて組立られる有機ポリマーを意味する。
【００５５】
本発明の一実施態様では、延長基は、血清タンパク質結合-リガンド、例えばアルブミンに結合した化合物、特に脂肪酸、Ｃ５−Ｃ２４脂肪酸、脂肪族二酸(例えばＣ５−Ｃ２４)等からなる群から選択される。延長基の他の例には、生理学的状態下で電荷特性が変化する部分を有する小有機分子、例えばカルボン酸又はアミン類、又はグリカン特異的認識を防止する中性置換基、例えばより小さいアルキル置換基(例えば、Ｃ１−Ｃ５アルキル)が含まれる。本発明の一実施態様では、延長基はアルブミンである。
【００５６】
一実施態様では、化学基は非ポリペプチドである。
関心ある一実施態様では、化学基はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、特に５００−１０００００、例えば１０００−７５０００、又は２０００−６００００の範囲の平均分子量を有するものである。
コンジュゲートは、国際公開第０２／０７７２１８Ａ１号及び国際公開第０１／５８９３５Ａ２号に開示されているようにして実施することができる。
【００５７】
特に関心があるのは、タンパク質とのコンジュゲートのための化学基として、ＰＥＧが使用されることである。「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」なる用語は、カップリング剤、カップリング又は活性化部分を伴うか又は伴わない(例えば、チオール、トリフラート、トレシラート(tresylate)、アジルジン(azirdine)、オキシラン、ピリジルジチオ、ビニルスルホンを伴うか又は好ましくはマレイミド部分を伴う)ポリエチレングリコール化合物又はその誘導体を意味する。マレイミドモノメトキシＰＥＧ等の化合物は、例示的な本発明の活性化ＰＥＧ化合物である。
ＰＥＧは、デキストラン等の多糖類と比較して、架橋可能な反応基がわずかであるため、適切なポリマー分子である。特に、一置換ＰＥＧ、例えばメトキシポリエチレングリコール(ｍＰＥＧ)は、カップリング化学が比較的単純である(唯一の反応基が、ポリペプチド上の付着基とコンジュゲートするのに利用される)ため、関心がある。その結果、架橋の危険性が排除され、得られた抗体断片コンジュゲートはより均質であり、ポリマー分子と抗体断片との反応が、より容易に制御される。
【００５８】
抗体断片へポリマー分子(群)を共有結合させるために、ポリマー分子のヒドロキシル末端基を活性形態、すなわち反応性官能基を有する形態で提供する。適切な活性ポリマー分子は、例えばShearwater Corp., Huntsville, Ala., USA、又はPolyMASC Pharmaceuticals plc, UKから商業的に入手可能である。また、ポリマー分子は、国際公開第９０／１３５４０号に開示されているような、当該分野で既知の従来からの方法により活性化可能である。本発明で使用するための、活性化された直鎖状又は分枝状のポリマー分子の特定の例は、Shearwater Corp. 1997及び2000カタログ(参照としてここに導入される、Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives)に記載されている。活性化されたＰＥＧポリマーの特定の例には、次の直鎖状のＰＥＧ：ＮＨＳ-ＰＥＧ(例えば、ＳＰＡ-ＰＥＧ、ＳＳＰＡ-ＰＥＧ、ＳＢＡ-ＰＥＧ、ＳＳ-ＰＥＧ、ＳＳＡ-ＰＥＧ、ＳＣ-ＰＥＧ、ＳＧ-ＰＥＧ、及びＳＣＭ-ＰＥＧ)、及びＮＯＲ-ＰＥＧ)、ＢＴＣ-ＰＥＧ、ＥＰＯＸ-ＰＥＧ、ＮＣＯ-ＰＥＧ、ＮＰＣ-ＰＥＧ、ＣＤＩ-ＰＥＧ、ＡＬＤ-ＰＥＧ、ＴＲＥＳ-ＰＥＧ、ＶＳ-ＰＥＧ、ＩＯＤＯ-ＰＥＧ、及びＭＡＬ-ＰＥＧ、及び分枝状のＰＥＧ、例えばＰＥＧ２-ＮＨＳ、及び双方とも出典明示によりここに援用される米国特許第５９３２４６２号及び米国特許第５６４３５７５号に開示されているものが含まれる。さらに、出典明示によりここに援用される次の文献：米国特許第５８２４７７８号、米国特許第５４７６６５３号、国際公開第９７／３２６０７号、欧州特許第２２９１０８号、欧州特許第４０２３７８号、米国特許第４９０２５０２号、米国特許第５２８１６９８号、米国特許第５１２２６１４号、米国特許第５２１９５６４号、国際公開第９２／１６５５５号、国際公開第９４／０４１９３号、国際公開第９４／１４７５８号、国際公開第９４／１７０３９号、国際公開第９４／１８２４７号、国際公開第９４／２８０２４号、国際公開第９５／００１６２号、国際公開第９５／１１９２４号、国際公開第９５／１３０９０号、国際公開第９５／３３４９０号、国際公開第９６／０００８０号、国際公開第９７／１８８３２号、国際公開第９８／４１５６２号、国際公開第９８／４８８３７号、国際公開第９９／３２１３４号、国際公開第９９／３２１３９号、国際公開第９９／３２１４０号、国際公開第９６／４０７９１号、国際公開第９８／３２４６６号、国際公開第９５／０６０５８号、欧州特許第４３９５０８号、国際公開第９７／０３１０６号、国際公開第９６／２１４６９号、国際公開第９５／１３３１２号、欧州特許第９２１１３１号、米国特許第５７３６６２５号、国際公開第９８／０５３６３号、欧州特許第８０９９９６号、米国特許第５６２９３８４号、国際公開第９６／４１８１３号、国際公開第９６／０７６７０号、米国特許第５４７３０３４号、米国特許第５５１６６７３号、欧州特許第６０５９６３号、米国特許第５３８２６５７号、欧州特許第５１０３５６号、欧州特許第４００４７２号、欧州特許第１８３５０３号及び欧州特許第１５４３１６号に、有用なポリマー分子及び／又はＰＥＧ化化学が開示されている。
【００５９】
ポリペプチドと活性化されたポリマー分子とのコンジュゲートは、任意の従来からの方法を使用して、例えば次の参照(ポリマー分子の活性化についての適切な方法が開示されているもの)：R. F. Taylor, (1991), 「Protein immobilisation. Fundamental and applications」, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), 「Chemistry of Protein Conjugation and  Crosslinking」, CRC Press, Boca Raton：G. T. Hermansonら, (1993), 「Immobilized Affinity Ligand Techniques」, Academic Press, N.Y.)に記載されているようにして実施される。当業者であれば、使用される活性化法及び／又はコンジュゲート化学が、抗体断片の結合基(類)(さらに上で得られた例)、並びにポリマーの官能基(例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、スルフィドリル(sulfydryl)、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、又はハロアセタート)に依存することが分かるであろう。ＰＥＧ化は、抗体断片上の全ての有用な結合基へのコンジュゲーションに関するものであってもよいし、一又は複数の特異的な結合基、例えばＮ末端アミノ基に関するものであってもよい。さらに、コンジュゲートは単一工程又は段階的方式にて達成されうる(例えば国際公開第９９／５５３７７号に記載)。
【００６０】
ＰＥＧ化は、結合されるＰＥＧ分子の数、かかる分子のサイズ及び形態(例えば、それらが直鎖状であるか分枝状であるか）について最適な分子が生成され、抗体断片においてかかる分子が結合するように設計されると理解される。使用されるポリマーの分子量は、達成される所望の効果を考慮して選択されるであろう。例えば、コンジュゲートの主要な目的が、高分子量の大きなサイズを有するコンジュゲートを達成するため(例えば、腎クリアランスを低減させるため)のものであるならば、所望の効果を得るために、一方は、一又は少数の高分子量ポリマー分子、又はより小さな分子量を有する多数のポリマー分子のいずれかを、コンジュゲートのために選択してもよい。しかしながら、好ましくは、低分子量を有するいくつかのポリマー分子が使用されるであろう。また、このことは、高度なエピトープ保護が所望されている場合でもしかりである。またこのような場合においては、例えば約５０００Ｄａの分子量を有する２−８ポリマー、例えば３−６のこのようなポリマーが使用されてもよい。以下に具体例を例証するように、コンジュゲートのインビボ半減期における機能を改善することに関しては、高分子量を有する少数(例えば、１２０００−２００００のＭＷを有する１−３)のポリマー分子と比較して、低分子量を有する多数(例えば、５０００のＭｗを有する４−６)のポリマー分子を有することが有利であり得、このことは、２つの場合で、結合したポリマー分子の全分子量が同一又は類似している場合であってもしかりである。多数の小さなポリマー分子が存在していると、少なくともポリマー分子が抗体断片表面に比較的均一に分布している場合、例えば単一のさらに大きなポリマー分子よりも、より大きな直径又は見かけサイズを有する抗体断片が提供される。
【００６１】
さらに有利な結果が、本発明のコンジュゲートの少なくとも一の主要部分の見かけサイズ(「見かけ分子量」又は「見かけ質量」とも称される)が、少なくとも約５０ｋＤａ、例えば少なくとも約５５ｋＤａ、例えば少なくとも約６０ｋＤａ、例えば少なくとも約６６ｋＤａである場合に得られることが見出された。これは、十分に大きな見かけサイズを有するコンジュゲートに対しては腎クリアランスが実質的に無視されるという事実のためであると考えられる。本文脈において、抗体断片の「見かけサイズ」は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ法により測定することができる。
【００６２】
さらに、過剰のポリマーコンジュゲーションにより、化学基(例えば、非ポリペプチド部分)がコンジュゲートしている抗体断片の活性(結合親和性)の喪失に至る可能性がある(さらに以下を参照)。この問題は、例えばＣＤＲ又は可変領域に位置する結合基を除去することにより、又は抗体断片の結合部位がコンジュゲート中ブロックされるように、コンジュゲートの前に官能部位を可逆的にブロックすることにより取り除かれる。特に、抗体断片と化学基(例えば、非ポリペプチド部分)との間のコンジュゲーションは、抗体断片の結合部位がヘルパー分子によりブロックされる条件下で実施されうる。好ましくは、ヘルパー分子は、抗体断片に特異的に結合するものである。
【００６３】
抗体断片は、コンジュゲートを行う前に、好ましくはヘルパー分子と相互作用される。多くの場合、ヘルパー分子として、抗原又は抗原模倣物を使用することが有利である。このことにより、確実に抗原断片の結合部位が遮断又は保護され、従って、化学基(例えば、非ポリペプチド部分)、例えばポリマーによる誘導体化に利用できなくなる。
ヘルパー分子からの溶出に続き、化学基と抗体断片とのコンジュゲートは、少なくとも部分的に保存された結合部位で回収可能である。
【００６４】
薬学的組成物
本発明の抗体断片二量体は、患者の疾患又は病気を処置するための薬学的組成物として利用できる。
他の態様では、本発明は、その範疇に、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と共に、活性成分として抗体断片二量体、又はその薬学的に許容可能な塩を含有する薬学的組成物を含む。
【００６５】
本発明の化合物は、化合物及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含有する薬学的組成物に製剤化され得る。このような担体には、水、生理的食塩水、エタノール、ポリオール類、例えばグリセロール又はプロピレングリコール、又は植物性油が含まれる。ここで使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」には、任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗真菌剤、保存料、等張剤等も含まれる。任意の一般的な媒体が活性成分及びその意図する使用と不適合でない限りは、本発明の組成物におけるその使用が考慮される。
【００６６】
組成物は、従来からの技術により調製されてよく、従来からの形態、例えばカプセル、錠剤、溶液又は懸濁液であってよい。使用される製薬用担体は、従来からの固形又は液状担体であってよい。固形担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、及びステアリン酸である。液状担体の例は、シロップ、ピーナッツ油、オリブ油及び水である。同様に、担体又は希釈液には、当該分野で既知の任意の遅延化物質、例えばモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルを単独で又はロウと混合したものが含まれる。また製剤は、さらに湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、保存料、甘味料、又は香味剤をさらに含有していてもよい。本発明の製剤は、当該技術でよく知られている手順を使用することにより、患者への投与後、活性成分の放出が迅速、持続又は遅延化されるように製剤化されうる。
【００６７】
薬学的組成物は、滅菌し、所望するならば、補助剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、バッファー、及び／又は着色物質等で、活性化合物と有害な反応を生じないものと混合することができる。
【００６８】
投与経路は、作用の適切な所望する部位に活性化合物を効果的に輸送する任意の経路、例えば経口又は非経口、特に直腸、経皮、皮下、経鼻、筋肉内、局所、静脈内、尿道内、眼用の溶液又は軟膏であってよく、経口経路が好ましい。
経口投与用の固形担体が使用される場合、調製物は、パウダー又はペレット形態の硬質ゼラチンカプセルに配されて錠剤化することもでき、又はトローチ又は薬用キャンデーの形態にすることもできる。固形担体の量は広範囲で変えてもよいが、通常は約２５ｍｇ〜約１ｇである。液状担体を使用する場合、調製物は、シロップ、エマルション、軟質ゼラチンカプセル又は滅菌注入用液、例えば水性又は非水性の液状懸濁液又は溶液の形態であってよい。
【００６９】
経鼻投与用として、調製物は、エアゾール用途のために、液状担体、特に水性担体に溶解又は懸濁させて、抗体断片二量体を含有してよい。担体は添加剤、例えば可溶化剤、例えばプロピレングリコール、界面活性剤、吸収促進剤、例えばレシチン(ホスファチジルコリン)又はシクロデキストリン、又は保存料、例えばパラベンを含有していてよい。
非経口投与用として特に適切なのは、注入用溶液又は懸濁液、好ましくは適切なバッファーとの水溶液である。
タルク及び／又は炭水化物担体又はバインダー等を有する錠剤、糖衣錠又はカプセルが、経口投与には特に適している。錠剤、糖衣錠又はカプセル用の好ましい担体には、ラクトース、コーンスターチ、及び／又はジャガイモデンプンが含まれる。甘味ビヒクルが使用可能なケースでは、シロップ又はエリキシル剤を使用することができる。
【００７０】
本発明の抗体断片二量体は、種々の病気又は疾患のこのような処置、予防、除去、緩和又は改善が必要とされている哺乳動物、特にヒトに投与され得る。このような哺乳動物には、家畜、例えば家庭用ペット、及び家畜ではない動物、例えば野生動物の双方の動物が含まれる。
【００７１】
通常、静脈内又は皮下投与に適した投与形態は、薬学的に許容可能な担体又は希釈液と混合して、約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇの抗体断片二量体を含む。
抗体断片二量体は、経口、直腸、又は非経口(皮下を含む)経路によろうがよるまいが、薬学的に許容可能な担体又は希釈液と同時的に、同時に、又は一緒に投与されうる。本化合物は、しばしば、また好ましくは、そのアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩の形態である。
適切な投与範囲は、投与の正確な方式、投与形態、投与が指向する兆候、関連した被験者、関連した被験者の体重、及び担当の医師又は獣医の嗜好又は経験に応じて、上述したように変化する。
【００７２】
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、特定の文献の任意の別個になされる援用が、本明細書の他の箇所でなされているかどうかにかかわらず、その全体が出典明示によりここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
【００７３】
本発明で記載されて使用されている「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似指示対象なる用語は、ここで示され、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーすると解釈される。
特に明記しない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の要因又は測定値に関して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる)。
【００７４】
特に明記せず、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、成分又は成分類に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含める」等の用語を使用する、本発明の任意の側面又は実施態様のここでの記載は、特定の成分又は成分類「からなる」、「本質的になる」、又は「実施的に含有する」といった本発明の類似した側面又は実施態様を支持することを意図したものである(例えば、特定の成分を含有するここに記載の組成物は、特に明記しない又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、その成分からなる組成物を記載するものと理解すべきである)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、決して本発明を限定するものとは解釈されない。
【００７５】
ここで提供される任意の及び全ての実施例、又は例示的言語(例えば、「等」)の使用は、単に、本発明をより解明することを意図したものであり、特に示さない限りは、本発明の範囲を制限するものではない。明細書中の如何なる言語も、請求項に記載していない要素素を本発明の実施に必須であることを示していると解してはならない。
ここでの特許公報の引用及び導入は便宜上のものであって、このような特許公報の正当性、特許性及び／又は執行可能性についての見解を示すものではない。
この発明は、適応される法律により許容されるよう、ここに提案された態様及び／又は請求項に列挙された主題事項の全ての修正及び等価事項を含む。
【００７６】
本発明は、以下の実施例によりさらに例証されるが、それにより、本発明の範囲を限定するものとは解釈はされない。上述した記載及び以下の実施例に開示された特徴は、別々に、又は任意のそれらの組合せであってもよいが、その多様な形態において、本発明を実現するための構成要素である。
【実施例】
【００７７】
実施例１−ＩＬ-２０ ＦＡＢ断片の二量体化
工程１：(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミドとのペプチド転移反応
３０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーと１５０ｍＭの塩化ナトリウムからなるｐＨ７．２のバッファーにおいて、そのＣ末端をロイシルロイシルアラニンで伸長させたＩＬ-２０ＦＡＢ断片の０．５１ｍｇ／ｍｌ溶液(１．３７ｍｌ、１４ｎｍｏｌ)を、１００００Ｄａのカットオフを有するBiomix遠心分離バイアルで遠心分離することにより、０．２５ｍＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるｐＨ８．０のバッファー(０．０４０ｍｌ)に、バッファー交換した。０．２５ｍＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるｐＨ８．０のバッファー(０．０２０ｍｌ)中の(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(７．２ｍｇ、１６８００ｎｍｏｌ)の溶液を調製した。水酸化ナトリウムの４Ｍ水溶液(０．００３ｍｌ)を添加することにより、この溶液のｐＨを８に調節した。この溶液の一部(０．００５ｍｌ、４２００ｎｍｏｌ)を、ＦＡＢ断片の溶液に添加した。ｐＨは７．９７であることが見出された。ＣＰＹの水溶液(２００Ｕ／ｍｌ、０．００８ｍｌ)。反応混合物を３０℃で２４時間、穏やかに振揺した。無水イソプロパノール(０．０００２ｍｌ)中に、フェニルメチルスルホニルフルオリドの新たに調製された１０ｍＭ溶液を添加した。反応混合物を室温で３０分、穏やかに振揺した。１０ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド溶液の他の部分(０．００５３ｍｌ)を添加した。１００００Ｄａのカットオフを有するBiomix遠心分離バイアルで遠心分離することにより、反応混合物を濃縮した。水中(０．５ｍｌ)に２,６-ルチジンの２％溶液で、それを希釈した。無水イソプロパノール(０．００４５ｍｌ)に、フェニルメチルスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を添加した。１００００Ｄａのカットオフを有するBiomix遠心分離バイアルで遠心分離することにより、反応混合物を０．１００ｍｌの容量まで濃縮した。ＮＡＰ-５カラムを、水中に２,６-ルチジンの２％溶液で平衡にした。反応混合物の溶液をカラムに添加した。水中に２,６-ルチジンの２％溶液で、タンパク質を洗い流した。タンパク質を含有する溶液を、１００００Ｄａのカットオフを有するBiomix遠心分離バイアルで遠心分離することにより、０．０４０ｍｌの容量まで濃縮した。
【００７８】
工程２：(２Ｓ)-２-アミノ-３-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)プロピオン-アミドとのペプチド転移反応
３０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーと１５０ｍＭの塩化ナトリウムからなるｐＨ７．２のバッファーにおいて、そのＣ末端をロイシルロイシルアラニンで伸長させたＩＬ-２０ＦＡＢ断片の０．５１ｍｇ／ｍｌ溶液(１．３７ｍｌ、１４ｎｍｏｌ)を、１００００Ｄａのカットオフを有するBiomix遠心分離バイアルで遠心分離することにより、０．２５ｍＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるｐＨ８．０のバッファー(０．０４０ｍｌ)に、バッファー交換した。０．２５ｍＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなる、ｐＨ８．０のバッファー中の、(２Ｓ)-２-アミノ-３-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミド(５．７ｍｇ、１６７４１ｎｍｏｌ、実施例２に記載したようにして調製)の溶液を調製した。水酸化ナトリウムの４Ｍ水溶液(０．００１３ｍｌ)を添加することにより、この溶液のｐＨを８．０３に調節した。ＣＰＹの水溶液(２００Ｕ／ｍｌ、０．００８ｍｌ)を混合物に添加した。それを３０℃で３時間、穏やかに振揺した。無水イソプロパノール(０．０００２ｍｌ)中に、フェニルメチルスルホニルフルオリドの新たに調製された１０ｍＭ溶液を添加した。反応混合物を室温で３０分、穏やかに振揺した。１０ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド溶液の他の部分(０．００５３ｍｌ)を添加した。１００００Ｄａのカットオフを有するBiomix遠心分離バイアルで遠心分離することにより、反応混合物を濃縮した。水中(０．５ｍｌ)に２,６-ルチジンの２％溶液で、それを希釈した。無水イソプロパノール(０．００４５ｍｌ)に、フェニルメチルスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を添加した。１００００Ｄａのカットオフを有するBiomix遠心分離バイアルで遠心分離することにより、反応混合物を０．１００ｍｌの容量まで濃縮した。ＮＡＰ-５カラムを、水中に２,６-ルチジンの２％溶液で平衡にした。反応混合物の溶液をカラムに添加した。水中に２,６-ルチジンの２％溶液で、タンパク質を洗い流した。タンパク質を含有する溶液を、１００００Ｄａのカットオフを有するBiomix遠心分離バイアルで遠心分離することにより、０．０５０ｍｌの容量まで濃縮した。
【００７９】
工程３：２つのＦＡＢ断片の二量体化
水中(０．０５ｍｌ)に硫酸銅(ＩＩ)(０．３６ｍｇ、１４４５ｎｍ)の溶液を、水(０．０４８ｍｌ)と２,６-ルチジン(０．００２ｍｌ)の混合物にアスコルビン酸(１．３０ｍｇ、７９８０ｎｍｏｌ)が入った溶液に添加した。この混合物を室温で５分放置し、銅(Ｉ)溶液を形成させた。
工程１及び工程２で得られた溶液を組合せた。銅(Ｉ)溶液の一部(０．０１０ｍｌ)を添加した。反応混合物を室温で３時間放置した。非還元条件下でのＳＤＳ-ゲル電気泳動及びＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ分析は、二量体化生成物についての予想と一致した。工程１−３を含む第２の反応シーケンスを、再度行う。還元条件下でのＳＤＳ-ゲル電気泳動は予想と一致した(図２)。
【００８０】
実施例２−２-(２Ｓ)-２-アミノ-３-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミド
ＨＰＬＣ法０２-ｂ４-４：
ＲＰ-分析を、ウォーターズ２４８７二重バンド検出器が取り付けられたアリアンス・ウォーターズ２６９５システムを使用して実施した。２１４ｎｍ及び２５４ｎｍでのＵＶ検出を、シンメトリー３００ Ｃ１８、５ｕｍ、３．９ｍｍ×１５０ｍｍカラム、４２℃を使用して収集した。流量１．０分／分で１５分以上かけて、０．０５％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に５−９５％のアセトニトリルが入った線形勾配で化合物を溶離させた。
【００８１】
工程１：
[１-カルバモイル-２-(４-ヒドロキシフェニル)エチル]-カルバミン酸-tert-ブチルエステル
2010520248.tif 000022
０℃で、１-(３-ジメチルアミノプロピル)-３-エチルカルボジイミドヒドロクロリド(１７．０ｇ、８８．９ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(２５０ｍｌ)及びジクロロメタン(２５０ｍｌ)に、(Ｓ)-２-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-３-(４-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸(２５ｇ、８８．９ｍｍｏｌ)及び１-ヒドロキシベンゾトリアゾール(１２．０ｇ、８８．９ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を０℃で２０分攪拌した。水(９０ｍｌ)にアンモニアが入った２５％水溶液を添加した。反応混合物を室温で３日間攪拌した。酢酸エチル(５００ｍｌ)で希釈し、硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液で酸性化させた。相分離させた。水相を酢酸エチル(３００ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相を、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(２５０ｍｌ)と水(２５０ｍｌ)の混合物で洗浄した。それらを硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を酢酸エチル／ヘプタンから結晶化させた。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３０３(Ｍ＋Ｎａ)＋。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)：δ１．３１(ｓ  ９Ｈ)；２．８０(ｄｄ、１Ｈ)；２．８３(ｄｄ、１Ｈ)；４．００(ｍ、１Ｈ)；６．６２(ｄ、２Ｈ)；６．７０(ｄ、１Ｈ)；６．９７(ｂｒ、１Ｈ)；７．０３(ｄ、２Ｈ)；７．３１(ｂｒ、１Ｈ)；９．１４(ｓ、１Ｈ)。
【００８２】
工程２：
[(Ｓ)-１-カルバモイル-２-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)エチル]カルバミン酸-tert-ブチルエステル
2010520248.tif 000023
[(Ｓ)-１-カルバモイル-２-(４-ヒドロキシフェニル)エチル]-カルバミン酸-tert-ブチルエステル(１．０ｇ、３．５７ｍｍｏｌ)、テトラブチルアンモニウムヨージド(６５  ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ)、炭酸カリウム(３．９４ｇ、２９ｍｍｏｌ)、臭化プロパルギル(０．３８ｍｌ、４．２８ｍｍｏｌ)及びＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(１５ｍｌ)の混合物を、６０℃で１６時間加熱した。それを室温まで冷却し、水(３０ｍｌ)で希釈し、硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液で酸性化させた。混合物を酢酸エチル(２×１００ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相を、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(２００ｍｌ)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。溶離液として、ジクロロメタン／メタノール(１０：１)の混合物を使用し、シリカ(１００ｇ)におけるフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製したところ、９９８ｍｇの[(Ｓ)-１-カルバモイル-２-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)エチル]カルバミン酸-tert-ブチルエステルが得られた。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３４１(Ｍ＋Ｎａ)＋。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ１．３１(ｓ、９Ｈ)；２．５０(ｓ、１Ｈ)；２．６７(ｄｄ、１Ｈ)；２．９１(ｄｄ、１Ｈ)；４．０３(ｍ、１Ｈ)；４．７４(ｓ、２Ｈ)；６．７７(ｄ、１Ｈ)；６．８６(ｄ、２Ｈ)；６．９９(ｓ、１Ｈ)、７．１７(ｄ、２Ｈ)；７．３５(ｓ、１Ｈ)。
【００８３】
工程３：
(２Ｓ)-２-アミノ−３-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミド
2010520248.tif 000024
トリフルオロ酢酸(１０ｍｌ)を、ジクロロメタン(１０ｍｌ)に[(Ｓ)-１-カルバモイル-２-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)エチル]カルバミン酸-tert-ブチルエステル(９９８ｍｇ、３．１３ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で１．５時間攪拌した。溶媒を除去した。残留物をジクロロメタン(３０ｍｌ)に溶解させた。溶媒を除去した。後者の手順を２回繰り返したところ、１．５３ｇの(２Ｓ)-２-アミノ-３-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミドのトリフルオロ酢酸塩が得られた。
ＨＰＬＣ(方法０２-Ｂ４-４)：Ｒｆ＝５．６２分。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝２１９(Ｍ＋１)＋。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ２．５１(ｓ、１Ｈ)；３．０２(ｍ、２Ｈ)；３．９０(ｍ、１Ｈ)；４．７８(ｓ、２Ｈ)；６．９５(ｄ、２Ｈ)；７．２０(ｄ、２Ｈ)；７．５６(ｓ、１Ｈ)；７．８７(ｓ、１Ｈ)；８．１０(ｂｒ、３Ｈ)。
【００８４】
実施例３−２つのＦａｂ断片の二量体化と後続する精製
工程１：
((Ｓ)-５-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-５-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸ベンジルエステル
2010520248.tif 000025
２,５-ジオキソピロリジン-１-イル(Ｓ)-６-((ベンジルオキシカルボニル)アミノ)-２-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキサノアート(例えばFluka又はBachem等、商業的に入手可能、１５ｇ、３１ｍｍｏｌ)を、ジクロロメタン(５０ｍｌ)に溶解させた。水にアンモニアが入った２５％溶液を添加した。反応混合物を室温で１６時間激しく攪拌した。溶媒を減圧下で除去したところ、精製をすることなく次の工程に使用される、２１．２７ｇの粗((Ｓ)-５-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-５-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸ベンジルエステルが生じた。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)：δ１．２-１．６(ｍ、６Ｈ)；１．３７(ｓ、９Ｈ)；２．９５(ｑ、２Ｈ)；３．８０(ｔｄ、１Ｈ)；５．００(ｓ、２Ｈ)；６．７０(ｄ、１Ｈ)；６．９０(ｓ、１Ｈ)；７．２０-７．４０(ｍ、７Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝２８０。
【００８５】
工程２：
((Ｓ)-５-アミノ-１-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸-tert-ブチルエステル
2010520248.tif 000026
粗((Ｓ)-５-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-５-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸ベンジルエステル(１１．９２ｇ、３１．４１ｍｍｏｌ)を、メタノール(２５０ｍｌ)に懸濁させた。パラジウム炭(５０％湿気)１．６７ｇを添加した。圧力下で１６時間、混合物を水素化にかけた。セライトプラグを通して濾過した。溶媒を減圧下で除去したところ、さらなる精製をすることなく次の工程で使用される、１３．１３ｇの粗((Ｓ)-５-アミノ-１-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸-tert-ブチルエステルが得られた。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)：δ１．３０-１．６０(ｍ、６Ｈ)；１．３７(ｓ、９Ｈ)；２．６５(ｔ、２Ｈ)；３．８０(ｄｔ、１Ｈ)；５．７０(ｂｒ、２Ｈ)；６．８０(ｄ、１Ｈ)；６．９５(ｓ、１Ｈ)；７．３０(ｓ、１Ｈ)。
【００８６】
工程３：
３-(アジドメチル)安息香酸メチル
2010520248.tif 000027
アジ化ナトリウム(５．６８ｇ、８７ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(５０ｍｌ)に３-(ブロモメチル)安息香酸メチル(５．００ｇ、２２ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。テトラブチルアンモニウムヨージド(８１ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ)を添加した。反応混合物を６０℃で１６時間加熱した。それを室温まで冷却し、水(２００ｍｌ)に付与した。この混合物を酢酸エチル(４００ｍｌ)で抽出した。有機相を水(３×２００ｍｌ)で洗浄し、続いて硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去したところ、さらなる精製をすることなく使用される、４．１１ｇの粗３-(アジドメチル)安息香酸メチルが得られた。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１９２。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)：δ３．９２(ｓ、３Ｈ)；４．４０(ｓ、２Ｈ)；７．５０(ｍ、２Ｈ)；８．００(ｍ、２Ｈ)。
【００８７】
工程４：
３-(アジドメチル)安息香酸
2010520248.tif 000028
水(２５ｍｌ)に水酸化リチウム(３．８１ｇ、２１．５ｍｍｏｌ)が入った溶液を、１,４-ジオキサン(２５ｍｌ)に粗３-(アジドメチル)安息香酸メチル(４．１１ｇ、２１．５ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。透明な溶液が得られるまで、水と１,４-ジオキサンを添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。水酸化ナトリウムの１Ｎ水溶液(１００ｍｌ)を添加した。tert-ブチルメチルエーテル(２×２００ｍｌ)で反応混合物を洗浄した。硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液を用いて、水相を酸性化させた。酢酸エチル(２×２００ｍｌ)で抽出した。組合せた酢酸エチル相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去したところ、さらなる精製をすることなく使用される、３．６８ｇの粗３-(アジドメチル)安息香酸が得られた。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５０
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)：δ４．５７(ｓ、３Ｈ)；７．５５(ｍ、２Ｈ)；８．００(ｍ、２Ｈ)；１３．１０(ｂｒ、１Ｈ)。
【００８８】
工程５：
ピロリジン-２,５-ジオン-１-イル-３-(アジドメチル)安息香酸エステル
2010520248.tif 000029
２-スクシンイミド-１,１,３,３-テトラメチルウロニウム-テトラフルオロボラート(ＴＳＴＵ、３２．５２ｇ、１０７ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(５０ｍｌ)に３-(アジドメチル)安息香酸(１９．０１ｇ、１０７ｍｍｏｌ)及びトリエチルアミン(１４．９６ｍｌ、１０７ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。酢酸エチル(２５０ｍｌ)で希釈し、水(３×１２０ｍｌ)で洗浄した。有機相を、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(１５０ｍｌ)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去したところ、２５．２２ｇのピロリジン-２,５-ジオン-１-イル-３-(アジドメチル)安息香酸エステルが得られた。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ２．９２(ｍ、４Ｈ)；４,４５(ｓ、２Ｈ)；７．５５(ｔ、１Ｈ)、７．６５(ｄ、２Ｈ)；８．１０(ｍ、２Ｈ)。
【００８９】
工程６：
(Ｓ)-６-(３-(アミノメチル)ベンゾイルアミノ)２-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサンアミド
2010520248.tif 000030
粗(Ｓ)-５-アミノ-１-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸-tert-ブチルエステル(１０．２６ｇ、４１．８２ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(１５０ｍｌ)に溶解させた。ピロリジン-２,５-ジオン-１-イル-３-(アジドメチル)安息香酸エステル(１１．４７ｇ、４１．８２２ｍｍｏｌ)及びエチルジイソプロピルアミン(２１．４８ｍｌ、１２５．５ｍｍｏｌ)を、逐次添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。酢酸エチル(５００ｍｌ)で希釈し、まず硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液(２００ｍｌ)、水(３×２５０ｍｌ)及び炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(２００ｍｌ)で洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去したところ、６．０５ｇの(Ｓ)-６-(３-(アミノメチル)ベンゾイルアミノ)２-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサンアミドが得られた。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ１．４０(ｓ、９Ｈ)；１．６３(ｍ、４Ｈ)；１．８３(ｍ、２Ｈ)；３．４３(ｑ、２Ｈ)；４．１５(ｍ、１Ｈ)；４．３７(ｓ、２Ｈ)；５．５６(ｄ、１Ｈ)；６．０８(ｓ、１Ｈ)；６．７５(ｓ、１Ｈ)；７．００(ｓ、１Ｈ)；７．４３(ｍ、２Ｈ)；７．７７(ｍ、２Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝４２７(Ｍ＋Ｎａ)＋、３０５(Ｍ−Ｂｏｃ)＋。
【００９０】
工程７：
(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド
2010520248.tif 000031
ガス状の塩化水素を、酢酸エチル(７５ｍｌ)に(Ｓ)-６-(３-(アミノメチル)ベンゾイルアミノ)２-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサンアミド(６．０５ｇ、１４．９６ｍｍｏｌ)の懸濁液を通して、２回、それぞれ１５分バブリングした。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝された、水に８-２８％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ１８-逆相カラムにおいて、ＨＰＬＣ-クロマトグラフィーを９回実施することにより精製したところ、５．０３ｇの(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミドのトリフルオロ酢酸塩が、共に得られた。ＨＰＬＣ：６．５３分(方法０２-ｂ１-２)。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ１．３６(ｍ、２Ｈ)；１．５５(ｍ、２Ｈ)；１．７５(ｍ、２Ｈ)；３．２６(ｑ、２Ｈ)；３．７０(ｍ、１Ｈ)；４．５３(ｓ、２Ｈ)；７．５２(ｍ、３Ｈ)；７．８４(ｍ、３Ｈ)；８．０６(ｂｒ、３Ｈ)；８．５４(ｔ、１Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３０５(Ｍ＋１)＋
【００９１】
工程８：
２-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸メチルエステル
2010520248.tif 000032
Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(５０ｍｌ)に、２-ヒドロキシ安息香酸メチル(４．２２３ｍｌ、３２．９ｍｍｏｌ)、炭酸カリウム(９．０８４ｇ、６５．７ｍｍｏｌ)、及びテトラブチルアンモニウムヨージド(６０７ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ)が入った混合物に、臭化プロパルギル(３．１１６ｍｌ、３６．１ｍｍｏｌ)を添加した。反応混合物を６０℃で１６時間攪拌した。室温まで冷却した。全ての塩が溶解するまで、水を添加した。混合物を酢酸エチル(４００ｍｌ)で抽出した。有機相を、水(３×２００ｍｌ)、及び炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(２００ｍｌ)で洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。溶離液として、酢酸エチル／ヘプタン(１：２)の混合物を使用し、シリカ(９０ｇ)におけるフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製したところ、４．０９ｇの２-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸メチルエステルが得られた。
ＭＳ：Ｍ７ｚ＝１９１、Ｍ＋１に必要：１９１
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ２．５３(ｔ、１  Ｈ)；３．８９(ｓ、３Ｈ)；４．８０(ｄ、２Ｈ)；７．０４(ｔ、１Ｈ)；７．１４(ｄ、１Ｈ)；７．４８(ｔ、１Ｈ)；７．８２(ｄ、１Ｈ)。
【００９２】
工程９：
２-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸
2010520248.tif 000033
水(５０ｍｌ)に水酸化リチウム(０．６０４ｇ、２５．２ｍｍｏｌ)が入った溶液を、１,４-ジオキサン(５０ｍｌ)に２-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸メチルエステル(４ｇ、２１．０３ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。水酸化ナトリウムの１Ｎ水溶液を用いて塩基性にし、tert-ブチルメチルエーテル(３×１００ｍｌ)で洗浄した。硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液を添加することにより、水相をｐＨ２-３に酸性化させた。酢酸エチル(３×２００ｍｌ)で抽出した。組合せた酢酸エチル相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去したところ、３．０７ｇの２-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸が得られた。
ＭＳ：Ｍｚ＝１７７、Ｍ＋１に必要：１７７
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ２．６５(ｔ、１Ｈ)；４．９４(ｄ、２Ｈ)；７．１８(ｍ、２Ｈ)；７．５８(ｔ、１Ｈ)；８．１７(ｄ、１Ｈ)；１０．５(ｂｒ、１Ｈ)。
【００９３】
工程１０：
２-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル
2010520248.tif 000034
２-スクシンイミド-１,１,３,３-テトラメチルウロニウム-テトラフルオロボラート(ＴＳＴＵ、５．７０ｇ、１８．８ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(５０ｍｌ)に２-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸(３．０１ｇ、１７．１ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。エチルジイソプロピルアミン(７．１４ｍｌ、６１．２６ｍｍｏｌ)を添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。酢酸エチル(１００ｍｌ)で希釈し、硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液(２００ｍｌ)で洗浄した。水相を酢酸エチル(２×２００ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相を、水(１００ｍｌ)とブライン(１００ｍｌ)の混合物で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を酢酸エチルから再結晶させたところ、２．８６ｇの２-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステルが得られた。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝２９６、Ｍ＋Ｎａ＋に必要：２９６
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ２．８８(ｍ、４Ｈ)；３．６５(ｔ、１Ｈ)；４．９８(ｄ、２Ｈ)；７．１９(ｔ、１Ｈ)；７．３５(ｄ、１Ｈ)；７．７７(ｔ、１Ｈ)；７．９３(ｄ、１Ｈ)。
【００９４】
工程１１：
[(Ｓ)-１-カルバモイル-５-(２-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゾイルアミノ)ペンチル]カルバミン酸-tert-ブチルエステル
2010520248.tif 000035
２-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル(２．８０ｇ、１０．２５ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(５０ｍｌ)に((Ｓ)-５-アミノ-１-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸-tert-ブチルエステル(２．７７ｇ、１１．２７ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。エチルジイソプロピルアミン(４．２９ｍｌ、３０．１１ｍｍｏｌ)を添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。酢酸エチル(３００ｍｌ)で希釈し、硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液で洗浄した。水相を酢酸エチル(２×１００ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相を、水(１００ｍｌ)とブライン(１００ｍｌ)の混合物、続いて、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で洗浄した。それらを硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去したところ、さらなる精製をすることなく次の工程で使用される、３．９９ｇの粗[(Ｓ)-１-カルバモイル-５-(２-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゾイルアミノ)ペンチル]カルバミン酸-tert-ブチルエステルが得られた。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０４、Ｍ＋１に必要：４０４
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ１．３０-１．８０(ｍ、６Ｈ)；１．３７(ｓ、９Ｈ)；３．２４(ｑ、２Ｈ)；３．６３(ｔ、１Ｈ)；３．８５(ｍ、１Ｈ)；４．９２(ｄ、２Ｈ)；６．７３(ｄ、１Ｈ)；６．９３(ｂｒ、１Ｈ)；７．０５(ｔ、１Ｈ)；７．１８(ｄ、１Ｈ)；  ７．２３(ｂｒ、１Ｈ)；７．４５(ｔ、１Ｈ)；７．６８(ｄ、１Ｈ)；８．１０(ｔ、１Ｈ)。
【００９５】
工程１２：
Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-２-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンズアミド
2010520248.tif 000036
トリフルオロ酢酸(５０ｍｌ)を、ジクロロメタン(５０ｍｌ)に[(Ｓ)-１-カルバモイル-５-(２-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゾイルアミノ)ペンチル]カルバミン酸-tert-ブチルエステル(１．７２ｇ、４．２６ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。溶媒を減圧下で除去した。０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝され、水に１０-３０％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、逆相Ｃ１８-カラムにおいて、ＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。溶媒を減圧下で除去した。残留物を水(２０ｍｌ)に溶解させ、凍結乾燥させたところ、９８０ｍｇのＮ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-２-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンズアミドが得られた。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３０４、Ｍ＋１に必要：３０４
ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝４．１１分(方法０２-ｂ４-４)
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ１．３７(ｍ、２Ｈ)；１．５３(ｍ、２Ｈ)、１．７５(ｍ、２Ｈ)；３．２６(ｑ、２Ｈ)；３．６４(ｓ、１Ｈ)；３．７１(ｑ、１Ｈ)；４．９３(ｓ、２Ｈ)；７．０６(ｔ、１Ｈ)；７．２１(ｄ、１Ｈ)；７．４６(ｔ、１Ｈ)；７．５７(ｂｒ、１Ｈ)；７．６７(ｄ、１Ｈ)；７．６９(ｂｒ、１Ｈ)；８．１０(ｂｒ、３Ｈ)。
【００９６】
工程１３：
ＣＰＹの触媒下での、(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミドを用いたＦＡＢ断片のペプチド転移反応
３．２ｍｇ／ｍｌ(０．６３ｍｌ、２ｍｇ、４１ｎｍｏｌ)の濃度を有する、ロイシルロイシルアラニン-配列でＣ末端が延長したＦＡＢ断片の溶液を、５ｋＤａのカットオフを有するBiomixフィルター装置(Millipore)に移した。ｐＨ７．９６に調節され、０．２５ＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファーに、(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(０．２２０ｍｌ)が入った１５０ｍＭの溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇの超遠心分離で６分濃縮した。ｐＨ８．１１に調節され、０．２５ＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファーに、(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(０．２２０ｍｌ)が入った１５０ｍＭの溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇの超遠心分離で６分濃縮した。ｐＨ８．１１(１．００ｍｌ)に調節され、０．２５ＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファーに、(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(０．２２０ｍｌ)が入った１５０ｍＭの溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇの超遠心分離で６分濃縮した。ｐＨ８．１１(１．００ｍｌ)に調節され、０．２５ＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファーに、(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(０．２２０ｍｌ)が入った１５０ｍＭの溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇの超遠心分離で６分濃縮した。ｐＨ８．１１(１．００ｍｌ)に調節され、０．２５ＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファーに、(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(０．２２０ｍｌ)が入った１５０ｍＭの溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇの超遠心分離で６分濃縮した。ｐＨ８．１１(１．００ｍｌ)に調節され、０．２５ＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファーに、(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(０．２２０ｍｌ)が入った１５０ｍＭの溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇの超遠心分離で６分濃縮した。ｐＨ８．１１(１．００ｍｌ)に調節され、０．２５ＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファーに、(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(０．２２０ｍｌ)が入った１５０ｍＭの溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇの超遠心分離で６分濃縮した。この後、混合物の容量を０．４４ｍｌにした。カルボキシペプチダーゼＹの溶液(２００Ｕ／ｍｌ、０．０１４ｍｌ、２．６Ｕ)を添加した。溶液を室温で２．７５時間、穏やかに振揺した。イソプロパノール(０．００４ｍｌ)に、フェニルメタンスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を添加した。反応混合物を３０分、穏やかに振揺した。５ｋＤａのカットオフを有するBiomixフィルターに移した。水(０．１００ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を添加した。イソプロパノール(０．００１ｍｌ)に、フェニルメタンスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を添加した。混合物を１２０００Ｇで６分濃縮した。水(０．２００ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を添加した。イソプロパノール(０．００２ｍｌ)に、フェニルメタンスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を���加した。混合物を１２０００Ｇで６分濃縮した。水(０．２００ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を添加した。イソプロパノール(０．００２ｍｌ)に、フェニルメタンスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を添加した。混合物を１２０００Ｇで６分濃縮した。水(０．２００ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を添加した。イソプロパノール(０．００２ｍｌ)に、フェニルメタンスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を添加した。混合物を１２０００Ｇで６分濃縮した。水(０．２００ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を添加した。イソプロパノール(０．００２ｍｌ)に、フェニルメタンスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を添加した。混合物を１２０００Ｇで６分濃縮した。残留物をＮＡＰＴＭ５カラム(GE Healthcare Uppsala)に適用し、水(１ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を用いてタンパク質を溶出させたところ、Ｃ末端にアジドを担持する、ＦＡＢ断片の溶液が得られた。
【００９７】
工程１４：
ＣＰＹの触媒下での、Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-２-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンズアミドを用いたＦＡＢ断片のペプチド転移反応
３．２ｍｇ／ｍｌ(０．６３ｍｌ、２ｍｇ、４１ｎｍｏｌ)の濃度を有する、ロイシルロイシルアラニン-配列でＣ末端が延長したＦＡＢ断片の溶液を、５ｋＤａのカットオフを有するBiomixフィルター装置に移した。ｐＨ８．０４に調節され、０．２５ＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファーに、Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-２-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンズアミド(０．４０ｍｌ)が入った１５０ｍＭの溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇで６分濃縮した。ｐＨ８．０４に調節され、０．２５ＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファーに、Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-２-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンズアミド(０．４０ｍｌ)が入った１５０ｍＭの溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇで６分濃縮した。ｐＨ８．０４に調節され、０．２５ＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファーに、Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-２-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンズアミド(０．２０ｍｌ)が入った１５０ｍＭの溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇで６分濃縮した。ｐＨ８．０４に調節され、０．２５ＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファーに、Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-２-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンズアミド(０．２０ｍｌ)が入った１５０ｍＭの溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇで６分濃縮した。ｐＨ８．０４に調節され、０．２５ＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファーに、Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-２-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンズアミド(０．２０ｍｌ)が入った１５０ｍＭの溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇで６分濃縮した。ｐＨ８．０４に調節され、０．２５ＭのＨＥＰＥＳと５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファーに、Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-２-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンズアミド(０．２０ｍｌ)が入った１５０ｍＭの溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇで６分濃縮し、０．４２０ｍｌを得た。ＣＰＹの溶液(２００Ｕ／ｍｌ、０．０１３ｍｌ、２．５Ｕ)を混合物に添加した。それを室温で２．５時間、穏やかに振揺した。イソプロパノール(０．００４ｍｌ)に、フェニルメタンスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を添加した。反応混合物を３０分、穏やかに振揺した。５ｋＤａのカットオフを有するBiomixフィルターに移した。水(０．１００ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を添加した。イソプロパノール(０．００１ｍｌ)に、フェニルメタンスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を添加した。混合物を１２０００Ｇで６分濃縮した。水(０．１００ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を添加した。イソプロパノール(０．００１ｍｌ)に、フェニルメタンスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を添加した。混合物を１２０００Ｇで６分濃縮した。水(０．２００ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を添加した。イソプロパノール(０．００２ｍｌ)に、フェニルメタンスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を添加した。混合物を１２０００Ｇで６分濃縮した。水(０．２００ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を添加した。イソプロパノール(０．００２ｍｌ)に、フェニ��メタンスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を添加した。混合物を１２０００Ｇで６分濃縮した。水(０．２００ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を添加した。イソプロパノール(０．００２ｍｌ)に、フェニルメタンスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を添加した。混合物を１２０００Ｇで６分濃縮した。水(０．２００ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を添加した。イソプロパノール(０．００２ｍｌ)に、フェニルメタンスルホニルフルオリドの新たに調製された１００ｍＭ溶液を添加した。混合物を１２０００Ｇで６分濃縮した。残留物をＮＡＰＴＭ５カラム(GE Healthcare Uppsala)に適用し、水(１ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を用いてタンパク質を溶出させたところ、Ｃ末端にアルキンを担持する、ＦＡＢ断片の溶液が得られた。
【００９８】
工程１５：
工程１３で得られた溶液と工程１４で得られた溶液を、５ｋＤａのカットオフを有するBiomix遠心分離フィルター装置(Millipore)において組合せた。溶液を１２０００Ｇで６分、約０．３０ｍｌの容量まで濃縮した。水(０．３００ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇで６分濃縮した。水(０．３００ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇで６分濃縮した。水(０．３００ｍｌ)中に２,６-ルチジンの２％溶液を添加した。溶液を１２０００Ｇで６分濃縮した。混合物をEppendorfバイアルに移した。水に、硫酸銅五水和物(１０．２ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ)が入った溶液を、水(０．１９６ｍｌ)と２,６-ルチジン(０．００４ｍｌ)の混合物にアスコルビン酸(３６ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加し、Ｃｕ(Ｉ)溶液を形成させた。この溶液を室温で２分放置した。その一部(０．００４ｍｌ)をタンパク質溶液に添加した。この溶液を室温で３．５時間、穏やかに振揺した。混合物を、５ｋＤａのカットオフを有するBiomix遠心分離装置に移した。ｐＨ５．５(０．２００ｍｌ)に調節され、１０ｍＭのＭＥＳと２００ｍＭの塩化ナトリウムからなるバッファーを添加した。溶液を１２０００Ｇで６分濃縮した。ｐＨ５．５(０．４００ｍｌ)に調節され、１０ｍＭのＭＥＳと２００ｍＭの塩化ナトリウムからなるバッファーを添加した。溶液を１２０００Ｇで６分濃縮した。ｐＨ５．５(０．４００ｍｌ)に調節され、１０ｍＭのＭＥＳと２００ｍＭの塩化ナトリウムからなるバッファーを添加した。溶液を１２０００Ｇで６分濃縮した。ｐＨ５．５(０．９００ｍｌ)に調節され、１０ｍＭのＭＥＳと２００ｍＭの塩化ナトリウムからなるバッファーを添加し、１ｍｌの全容量を得た。混合物を、５ｋＤａのカットオフを有するBiomix遠心分離装置に移し、１２０００ｒｃｆで６分濃縮した。１６／６０カラムにおけるSuperdex200にて、ゲルクロマトグラフィーにかけた。溶離液として、ｐＨ５．５に調節され、１０ｍＭのＭＥＳと２００ｍＭの塩化ナトリウムのバッファーを使用し、１ｍｌ／分の流速で、カラムから溶出させた。所望する化合物を含有するフラクションを組合せ、５ｋＤａのカットオフを有するAmicon Ultra遠心分離フィルター装置(Millipore)で、４０００ｒｐｍで２８分濃縮した。残存する溶液(０．６００ｍｌ)を分析した。タンパク質濃度を、１４．１１の吸収係数を用いたNanoDrop NP1000分光光度計で見出したところ、単離された二量体化ＦＡＢ断片は０．０２０ｍｇであり、ＳＤＳ-ゲルをベースにした約６０％純度では３５０ｎＭであり、不純物は約４０％の量の単量体ＦＡＢ断片であった。ｐＨ５．５に調節され、０．７ｍｌ／分の流速で、１０ｍＭのＭＥＳと２００ｍＭの塩化ナトリウムからなるバッファーを使用する、Superdex200 １６／６０カラムにおける、ゲルクロマトグラフィーによる二量体化ＦＡＢ断片のさらなる精製は、出発溶液のＦＡＢ断片が高度に希釈されていたため、成功しなかった。
【００９９】
(例示的実施態様)
以下、本発明の例示的実施態様である。
１．２つの抗体断片の二量体であり、該抗体断片が、重鎖(ＨＣ)ポリペプチドのＣ末端で結合している化合物。
２．前記ＨＣポリペプチドが非ペプチド結合により結合している、実施態様１の化合物。
３．第１のＨＣポリペプチドのＣ末端が、次の構造：
2010520248.tif 000037
[上式中、第１のポリペプチドは「★」でマークされ、第２のＨＣポリペプチドは、基Ｒリンカーに結合している]
を有している、実施態様１−２のいずれかの化合物。
４．第１のＨＣポリペプチドのＣ末端が、次の構造：
2010520248.tif 000038
を有している、実施態様３の化合物。
【０１００】
５．前記ＨＣポリペプチドが、一方のＨＣポリペプチドのアジドと、他方のＨＣポリペプチドのアルキンとの間の反応により結合している、実施態様１ないし４のいずれかの化合物。
６．前記ＨＣポリペプチドが、一方のＨＣポリペプチドのＯ-アルキル化ヒドロキシルアミンと、他方のＨＣポリペプチドのケトン又はアルデヒドとの間の反応により結合している、実施態様１−４のいずれかの化合物。
７．ＨＣポリペプチドのＣ末端が、次の構造：
2010520248.tif 000039
[上式中、ＨＣポリペプチドは「★」でマークされ、Ｒｒｇは、アジド、アルキン、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン、ケトン、アルデヒド、１,２-ジオール、又は１,２アミノアルコールから選択される基を担持する基である]
を有している抗体断片。
８．ＨＣポリペプチドのＣ末端が、次の構造：
2010520248.tif 000040
を有している、実施態様７の抗体断片。
９．-Ｒｒｇが：
2010520248.tif 000041
から選択される、実施態様７−８のいずれかの抗体断片。
【０１０１】
１０．(ａ)第１の抗体断片のＨＣポリペプチドのＣ末端に第１の化学基を導入し、
(ｂ)第２の抗体断片のＨＣポリペプチドのＣ末端に第２の化学基を導入し、
(ｃ)第１の化学基を第２の化学基と反応させ、２つの抗体断片の共有結合を形成させる、
工程を含む、２つの抗体断片を二量体化する方法。
１１．(ａ')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第１の抗体断片のＨＣポリペプチドのＣ末端に第１の化学基を導入し、
(ｂ')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第２の抗体断片のＨＣペプチドのＣ末端に第２の化学基を導入し、
(ｃ')第１の化学基を第２の化学基と反応させ、２つの抗体断片の共有結合を形成させる、
工程を含む、実施態様１０の方法。
１２．(ａ'')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第１の抗体断片のＨＣポリペプチドのＣ末端に第１の化学基を導入し、
(ｂ'')求核試薬の存在下で酵素と反応させることにより、第２の抗体断片のＨＣポリペプチドのＣ末端に、第３の化学基を導入し、
(ｂ''')第４及び第２の化学基を担持する分子と第３の化学基とを反応させ、第３の化学基と第４の化学基とを反応させることにより、第２の抗体断片のＨＣポリペプチドのＣ末端に、該分子を共有結合させ、
(ｃ)第１の化学基を第２の化学基と反応させ、２つの抗体断片の共有結合を形成させる、
工程を含む、実施態様１０の方法。
【０１０２】
１３．前記第１の化学基と前記第２の化学基は互いに異なっている、実施態様１０-１２のいずれかの方法。
１４．前記化学基が、アルキン、アジド、Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミン、ケトン、アルデヒド、ヒドラゾン、及びＯ-アシル化ヒドロキシルアミンからなる群から独立して選択される、実施態様１０−１３のいずれかの方法。
１５．アジドとアルキンの間の反応が、２つの抗体断片の間に結合を形成させるために使用される、実施態様１０−１４のいずれかの方法。
１６．アジドとアルキンの間の前記反応が、銅(Ｉ)-イオンにより触媒される、実施態様１５の方法。
１７．Ｏ-アルキル化ヒドロキシルアミンとケトン又はアルデヒドとの間の反応が、２つの抗体断片の間に結合を形成させるために使用される、実施態様１０−１４のいずれかの方法。
【０１０３】
１８．前記酵素がセリンカルボキシペプチダーゼである、実施態様１０−１７のいずれかの方法。
１９．前記酵素がカルボキシペプチダーゼＹである、実施態様１０−１８のいずれかの方法。
２０．２つのＨＣポリペプチドの少なくとも一方のＣ末端アミノ酸配が-Ａｌａである、実施態様１０−１９のいずれかの方法。
２１．２つのＨＣポリペプチドの少なくとも一方のＣ末端アミノ酸配が-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ａｌａである、実施態様１０−２０のいずれかの方法。
２２．前記２つの抗体断片が互いに異なっている、実施態様１０−２１のいずれかの方法。
【０１０４】
２３．求核試薬が：
2010520248.tif 000042
からなる群から選択される、実施態様１１−２２のいずれかの方法。
２４．前記工程(ｃ)の反応により、１,２,３-トリアゾールが形成される、実施態様１０−２３のいずれかの方法。
２５．前記工程(ｃ)の反応により、オキシム又はヒドラゾンが形成される、実施態様１０-２４の方法。
【０１０５】
２６．２つの抗体断片の二量体であり、実施態様１０−２５のいずれかの方法により得られる化合物。
２７．Ｃ末端アミノ酸配列が-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ａｌａである抗体断片。
【図１】
2010520248.tif 000049
【図２】
2010520248.tif 000050
【国際調査報告】
2010520248.tif 000051
2010520248.tif 000052