(57)【要約】  本発明は、雄哺乳類の性機能を改善するための、および精子形成効果を提供するための薬剤およびヘルスケア製品を調製するための、ジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔから選択される有効成分の使用に関する。本発明はさらに、雄哺乳類の性機能を改善するための、および／または精子形成効果を提供するための医薬組成物であって、ジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔから選択される少なくとも１つの有効成分、および薬学上許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
雄哺乳類の性機能を改善するための薬剤およびヘルスケア製品を調製するための、ジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔから選択される有効成分の使用。
【請求項２】
前記雄哺乳類の性機能改善が、雄動物の性行動の頻度を増加することおよび／または性行動の潜伏期を短縮することを示す、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
雄哺乳類の血清中のテストステロン含量を増加させ、そして海綿体中のｃＧＭＰ含量を増加させるための薬剤およびヘルスケア製品を調製するための、ジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔから選択される有効成分の使用。
【請求項４】
精子形成効果を提供するための薬剤およびヘルスケア製品を調製するための、ジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔから選択される有効成分の使用。
【請求項５】
前記精子形成効果が、精子形成を促進すること、精子の数を増加すること、および／または精子の質を改善することを含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
インポテンス、男性不妊症を治療するための、および男性の精子の数および質の低下を改善するための、薬剤およびヘルスケア製品を調製するための、ジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔから選択される有効成分の使用。
【請求項７】
雄哺乳類の性機能を改善するための、および／または精子形成効果を提供するための医薬組成物であって、ジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔから選択される少なくとも１つの有効成分の治療上有効な量、さらに所望により薬学上許容される賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
【請求項８】
雄哺乳類の性機能および／または精子形成を改善するための方法であって、被験体に、ジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔから選択される少なくとも１つの有効成分の治療上有効な量を投与することを含む、方法。
【請求項９】
前記雄哺乳類の性機能改善が、雄の性行動の頻度を増加することおよび／または性行動の潜伏期を短縮することを示す、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記精子形成が、精子形成を促進すること、精子の数を増加すること、および／または精子の質を改善することを含む、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、雄哺乳類の性機能を改善するための薬剤およびヘルスケア製品を調製するための、精子形成効果を有する薬剤を調製するための、特に精子形成を促進し、そして精子の数および／または質を増加させるための薬剤およびヘルスケア製品を調製するための、ジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔから選択される有効成分の使用に関する。本発明はさらに、雄哺乳類の性機能を改善するための、および／または精子形成効果を提供するための、特に精子形成を促進し、そして精子の数および／または質を増加させるための医薬組成物およびヘルスケア製品であって、ジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔから選択される少なくとも１つの有効成分、および薬学上許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物およびヘルスケア製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
統計によれば、世界中の適齢期のカップルのうち、不妊症の割合は約１５％であり、不妊症の原因の約４０％は夫の側によるものである。２０世紀以降、男性の生殖能力は、環境汚染、社会病およびＡＩＤＳの拡大、過度の喫煙および薬物中毒、ホルモン薬剤の乱用などが原因で世界中で明らかに減少する傾向がある。
【０００３】
一方で、疫学研究では、ＵＳＡにおける２０歳を超える男性のうち、勃起機能障害の罹患率が１８．４％であることが立証されている。２０００年に行われた国勢調査統計によって算出した場合には、ＵＳＡにおいてこの疾患に罹患している男性の数はおよそ１８００万人程度となる。この疾患の罹患率は年齢と密接に関係しており、５．１％（２０〜３９歳の男性）から〜７０．２％（７０歳を超える男性）まで様々である。全体としては、男性の６５．０％は、いつも、正常な勃起をし、性交を果たすことができ；男性の１６．５％は、一般的な場合において、正常な勃起をすることができ；男性の１２．３％は、時々、勃起をし、性交を果たすことができ；男性の６．２％は正常な勃起を全くしない。経口投与用のＰＤＥ５阻害剤として、シルデナフィルは、最大何百万人という、性機能障害に罹患している患者の疼痛を緩和しているが、それによってその後に起こる副作用はまた非常に重篤でもある。
【０００４】
もう一方で、報告されているように、１９４０年〜１９９０年に、成人の精液１ｍｌ中に含まれる精子の数は１．１３ｘ１０８から６．６ｘ１０７まで減少し、精液の量は３．４０ｍｌから２．７５ｍｌまで減少している。１９４０年の状況と比較すると、世界中で男性の精子密度は５０％低下し、すなわち、平均で１年に１％低下している。精子の数の減少に加え、活発な精子の割合および正常な形状の精子の割合も毎年減少している（それぞれ１年に０．６％および０．５％減少している）。精液の質の連続的な低下は、生殖能力や生殖機能の低下に直接つながり、そしてこれが徐々に明らかな社会問題となってきている。雄の不妊症の重大な原因の１つは、精子の質（精子の数および運動性）の低下であるため、精子の質を改善することができる薬剤を探し出すことが非常に重要である。しかしながら、現在まで、世界中で、正確な治療効果を有し、精子の数を増加させることができ、精子の活動度を改善することができる薬剤は依然としてない。
【０００５】
そのため、生殖医療分野では、雄哺乳類、特に男性の性機能を改善すること、精子の数を増加すること、そして精子の質を改善することが可能な薬剤を開発することは、長い間、まだ解決されていない難しい問題であった。  上述の問題を解決するために、本発明者らは、多くの調査に基づいて、植物由来のジンセノサイドＲｇ１、特にその代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１および／またはＰｐｔは、男性の性機能を有効に改善することができ、精子形成を促進することができ、精子の数を増加させることができ、そして精子の質を改善することができることを発見した。
【発明の概要】
【０００６】
周知のように、ジンセノサイドは、朝鮮人参の主成分の１つである。現在のところ、朝鮮人参植物から少なくとも４０種類のジンセノサイドモノマーが単離され、抽出されており、それらは化学構造の観点から次の３つのカテゴリーに一般的に分けられ得る：２０ｓ−プロトパンキサジオール(20s-Protopanxadiol)、２０ｓ−プロトパンキサトリオール(20s-Protopanxatriol)およびオレアノール酸。ジンセノサイドＲｇ１は、２０ｓ−プロトパンキサトリオールのカテゴリーに属し、代謝後に、次の構造で表されるＲｈ１および／またはＰｐｔに変わる：
【化１】
2010520894.tif 000002
【０００７】
１つの態様では、本発明は、雄哺乳類の性機能を改善するための、ジンセノサイドＲｇ１、特にその代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１および／またはＰｐｔから選択される有効成分の使用に関する。
【０００８】
本発明において、用語「雄哺乳類の性機能を改善すること」とは、雄の性行動の頻度を増加することおよび性行動の潜伏期を短縮することを示す。具体的には、雄哺乳類の性機能の改善の作用機構は、雄哺乳類の血清中のテストステロン含量を増加すること、および海綿体中のｃＧＭＰ含量を増加することにある。
【０００９】
別の態様では、本発明は、精子形成効果を有する薬剤を調製するための、ジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔから選択される有効成分の使用に関する。本発明において、用語「精子形成」とは、精子形成を促進すること、精子の数を増加すること、および／または精子の質を改善することを含む。
【００１０】
本発明において、哺乳類は、好ましくはヒトである。
【００１１】
周知のように、綿実油中に含まれるゴシポールは毒物である。ゴシポールは、精巣組織の精子形成にダメージを与え、それによって、精子の数の減少、精子生存率の低下、および精子の活動度の低下をもたらす。本発明者らは、酢酸ゴシポールのｉｐ投与に成体マウスを用いることによって精子形成モデルを確立した。本発明者らは、マウスへのゴシポールの投与と同時に、ジンセノサイドＲｇ１を異なる用量で胃管栄養法により投与することで、ゴシポールによる精子の質へのダメージを著しく軽減することができ、精子の数を大幅に増加させることができ、精子の生存率を高めることができ、精子の運動性を改善することができることを発見した。
【００１２】
本発明者らは、精子形成を促進するためのジンセノサイドＲｇ１機構をさらに研究した。ゴシポールの精子にダメージを与える機能は、中後期における精子細胞の干渉変態および精母細胞の発達を主として含み、それによって、精子へのダメージおよび曲精細管の萎縮をもたらす。研究によって、ゴシポールによる精子へのダメージ効果は、ゴシポールにより精巣組織中に過剰の亜酸化窒素（ＮＯ）が発生することが主な原因であることが分かった。ＮＯは、フリーラジカルとして、精子形成組織および精子細胞だけでなく間質細胞にもダメージを与え、それによってテストステロン（Ｔ）の生成および放出が減少する。本発明者らは、放射性免疫分析により精巣組織中の亜酸化窒素（ＮＯ）の含量、ならびに血清中のテストステロン（Ｔ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の含量を分析した。分析の結果により、Ｒｇ１は精巣組織中の過剰のＮＯを著しく減少し、それによってＮＯによるダメージから精子を保護することができ、血液中のＴ含量を増加させることができることが立証された。その一方で、Ｒｇ１は血液中のＬＨおよびＦＳＨの含量に影響を及ぼすに至らなかった（Ｐ＞０．０５）。
【００１３】
ジンセノサイドＲｇ１の代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔについてのさらなる研究後に、本発明者らは、驚くべきことに、これらの代謝産物自体も、独立に、雄哺乳類の性機能および精子形成を改善する効果を有することを見つけた。
【００１４】
別の態様では、本発明は、雄哺乳類の性機能および／または精子形成を改善するための方法であって、被験体に、ジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔから選択される少なくとも１つの有効成分の治療上有効な量を投与することを含む方法に関する。
【００１５】
本明細書において用いる用語「治療上有効な量」とは、被験体の疾患または障害の性質および重篤度に応じてある特定の被験体に投与したときに、所望の治療効果、例えば、標的疾患または障害の治癒、予防、抑制あるいは少なくとも部分的な抑制または部分的な予防、をもたらすことができる量を指す。
【００１６】
本発明における化合物の治療上有効な用量は、例えば、細胞培養試験および動物実験、から得られたデータによって決定され、ヒトおよび他の哺乳類に有用な用量範囲の準備に用いることができる。前記化合物の用量は、好ましくは、毒性が最小限であるかまたは全く毒性がなく、全身血漿濃度または他の体液濃度におけるＥＤ５０を含む範囲内である。前記用量はこの範囲内で変動し得、用いる投与形および投与経路によって決まる。本発明におけるあらゆる化合物に関し、その治療上有効な用量は、最初に動物実験によって予測してよい。前記用量は、動物モデルにおいて、全身血漿濃度におけるＩＣ５０（すなわち最大阻害濃度の５０％に達する試験化合物の濃度）を含む試験範囲が得られるように設計してよい。この情報を利用して、ヒトおよび他の哺乳類に用いられる用量をより正確に決定することができる。化合物の血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって決定することができる。
【００１７】
薬学上許容されるビヒクルと組み合わせて単回投与形を作ることができる前記化合物の量は、治療中の被験体および具体的な投与様式によって異なる。当業者には明らかであるように、複数の個別用量を投与することによって治療上有効な量とし得るため、各投与形の個別用量に含まれる化合物の単位量が治療上有効な量である必要はない。当業者によって決定されるように、前記用量の選択は、用いる投与形、治療する疾患および達成すべき具体的な目的による。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明は、雄哺乳類の性機能を改善するための、および／または精子形成効果を提供するための医薬組成物であって、ジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔから選択される少なくとも１つの有効成分の治療上有効な量、さらに所望により、薬学上許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物に関する。
【００１９】
本発明において、記載「雄哺乳類の性機能を改善すること」とは、雄の性行動の頻度を増加することおよび性行動の潜伏期を短縮することを指す。具体的には、雄哺乳類の性機能の改善の作用機構は、雄哺乳類の血清中のテストステロン含量を増加すること、および海綿体中のｃＧＭＰ含量を増加することにある。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、雄哺乳類の性機能および／または精子形成を改善するための方法であって、被験体に、ジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔから選択される少なくとも１つの有効成分の治療上有効な量を投与することを含む方法に関する。本発明において、用語「精子形成効果」とは、精子形成を促進すること、精子の数を増加すること、および／または精子の質を改善することを含む。
【実施例】
【００２１】
実施例１
マウスの性機能改善に対するジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１および／またはＰｐｔの効果
１．１．１  材料と方法
１．１．１．１  試験動物
Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Medical Sciencesから購入したＫｕｎｍｉｎｇ雄マウス（１０週齢、体重３２〜３６ｇ）、Ｋｕｎｍｉｎｇ雌マウス（１０週齢、体重(weight body)３０〜３４ｇ）（証明書番号ＳＣＸＫ  （Ｊｉｎｇ）２００５−０００４）を、明所および暗所の清浄グレードの動物小屋に交互に入れ（１２時間：１２時間）、水および食物は自由に摂取させた。試験は、マウスを動物小屋で環境に５日間適応させた後に開始した。環境への適応期間中、雄マウスと雌マウスは互いに分離した。
【００２２】
１．１．１．２  発情期の雌マウスの準備
性機能における雄マウスの変化を正確に反映するように、我々は発情期の雌マウスを、卵巣を摘出し外部ホルモンを適用することによりそれらを誘発することによって準備した。抱水クロラールで麻酔した後、雌マウスを、背側アプローチにより両側卵巣を摘出するステップ、残留卵管末端を連結するステップ、および皮膚を縫合するステップ、続いて１週間回復するステップに供した。
【００２３】
ホルモンの適用による誘発は、文献を参照することによって行い(Masayoshi Nomura, et al, Physiology & Behavior 91 (2007) 223-228)、使用の４８時間前に安息香酸エストラジオール（１マウス当たり３０μｇ）を皮下注射するステップ、および使用の４時間前にプロゲステロン（１マウス当たり５００μｇ）を皮下注射するステップを含み、それによって発情期の雌マウスを得た。
【００２４】
１．１．１．３  雄マウスの選択
発情期の雌マウスを、雄マウスを入れた交配ボックスの内部に、雄マウスに対して２：１の割合で入れた。それらのマウスを連続５日間、１日１２分訓練した。雄マウスの交尾反応が安定してきたら、各群のマウスの馬乗りになっている時間が実質的に同じであることを考慮してマウスを群に分け、比較的弱い反応を示すマウスおよび無反応であるマウスは処分した。
【００２５】
１．１．１．４  性行動学試験
暗所において、雄マウスの飼育ケージ内で行動学試験を行った。発情期の雌マウスと雄マウスを２：１の割合で同じボックス内部に１２分間閉じ込め、その間に、雄マウスの馬乗りになっている時間と交尾頻度を観察した。
【００２６】
１．１．２  統計分析
総ての値を、平均値と標準誤差（Ｍ±ＳＥＭ）を用いることによって表し、用いた解析法は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）であり、統計結果は二重星法、すなわち、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１によって表した。
【００２７】
１．１．３  結果
１．１．３．１  マウスの馬乗りになっている時間に対するジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１および／またはＰｐｔの影響
表１から分かるように、投与後１６日目または１８日目に、ジンセノサイドＲｇ１ならびにその代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１および／またはＰｐｔは、対照群と比較して、総てがマウスの馬乗りになっている時間を著しく延長することができ、３つのＲｇ１、Ｒｈ１およびＰｐｔでは統計的な差はなかった。対照群に対して＊Ｐ＜０．０５。
【００２８】
表１  マウスの馬乗りになっている時間に対するジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１および／またはＰｐｔの影響（分）（ｎ＝７〜８）
【表１】
2010520894.tif 000003
【００２９】
１．１．３．２  マウスの交尾頻度に対するジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１および／またはＰｐｔの影響
表２から分かるように、投与後１８日目に、ジンセノサイドＲｇ１ならびにその代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１および／またはＰｐｔは総てマウスの交尾頻度を著しく増加させることができ、３つのＲｇ１、Ｒｈ１およびＰｐｔでは統計的な差はなかった。対照群に対して＊Ｐ＜０．０５。
【００３０】
表２  マウスの交尾頻度に対するジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１および／またはＰｐｔの影響（ｎ＝７〜８）
【表２】
2010520894.tif 000004
【００３１】
１．１．３．３  マウスの血清中のテストステロン含量に対するジンセノサイドＲｇ１の影響
ジンセノサイドＲｇ１の２０日間の経口投与後に、雄マウスの血清中のテストステロン含量を放射性免疫分析により分析した。これらの結果より、ジンセノサイドＲｇ１（１０ｍｇ／ｋｇ）は血清中のテストステロン含量を著しく増加させることができることが立証された。Ｎ＝６〜８。対照群に対して＊Ｐ＜０．０５（これらの結果は表３に示した）。
【００３２】
表３  マウスの血清中のテストステロン含量に対するジンセノサイドＲｇ１の影響
【表３】
2010520894.tif 000005
【００３３】
上述の結果に反映される動物行動学的指数から分かるように、ジンセノサイドＲｇ１ならびにその代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１および／またはＰｐｔは総てマウスの性行動学を著しく改善し、マウスの性行為を増加させることができた。研究により、短期投与でも長期投与でも動物の血清中のテストステロン含量を増加させることができるということも分かった。
【００３４】
テストステロンは、陰茎の勃起および性行動に関して重要な役割を果たす。陰茎の勃起は、中性神経系により放出される興奮性シグナルの刺激と末梢の神経伝達物質のプール放出との相互作用による。この相互作用の実現にテストステロンが触媒している。ジンセノサイドＲｇ１ならびにその代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１および／またはＰｐｔがマウスの血清中のテストステロン含量を著しく増加させることができるということがそれらのマウス性機能改善機構の１つである。
【００３５】
１．２．１  Newland whiteウサギの海綿体中のＮＯ放出およびｃＧＭＰ含量に対するジンセノサイドＲｇ１の影響（表４に示すとおりである）
【００３６】
表４  Newland whiteウサギの海綿体中のＮＯ放出およびｃＧＭＰ含量に対する異なる濃度のジンセノサイドＲｇ１の影響
【表４】
2010520894.tif 000006
【００３７】
表４に示されるように、ジンセノサイドＲｇ１は、ウサギの海綿体中のＮＯ放出を用量依存的に増加させることができた。ジンセノサイドＲｇ１（５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）群は、対照群と比較して、ＮＯ放出を大幅に増加させることができ、２群間には有意差があった。ジンセノサイドＲｇ１（１０ｍｇ／ｋｇ）は、対照群と比較して、海綿体中のｃＧＭＰ含量を著しく増加させることができた。対照群に対して＊Ｐ＜０．０５。
【００３８】
ジンセノサイドＲｇ１は、ＮＯ放出を増加させることができただけでなく、海綿体中のｃＧＭＰ含量も増加させることができ、それによって陰茎の勃起が起こった。ｃＧＭＰ含量を増加させるジンセノサイドＲｇ１の機構をさらに解明するために、我々はニトロプルシドナトリウム（ＮＯ供与体）とジンセノサイドＲｇ１との相互作用下でｃＧＭＰ含量を分析し、ニトロプルシドナトリウムを同一用量で投与した場合でも、ジンセノサイドＲｇ１群はなお、対照群より高いｃＧＭＰ含量をもたらすことが観察された。ジンセノサイドＲｇ１はＰＤＥ５によるｃＧＭＰの分解を阻止することができることが示唆された。この点を立証するために、本発明者らはＰＤＥ５に対するジンセノサイドＲｇ１の阻害効果を研究した。
【００３９】
１．２．２  ＰＤＥ５に対するジンセノサイドＲｇ１の阻害効果
表５  ＰＤＥ５に対するジンセノサイドＲｇ１の阻害効果
【表５】
2010520894.tif 000007
【００４０】
ｃＧＭＰ含量を、放射性免疫自動記録技術を用いることにより分析した。これらの分析結果により、ジンセノサイドＲｇ１はｃＧＭＰの分解を遮断することができることが立証された。海綿体中のｃＧＭＰ含量の増加は、ＰＤＥ５に対するジンセノサイドＲｇ１の阻害効果によってまさに起こった。ジンセノサイドＲｇ１とシルデナフィルでは、ＰＤＥ５に対する阻害効果に関して、有意差はなかった。
【００４１】
男性性機能改善に対するジンセノサイドＲｇ１の効果は、数人のボランティア（３０〜５０歳の健康な男性）で研究した。これらの結果により、ジンセノサイドＲｇ１（１００〜２００ｍｇ／ｄ）の投与後５日目にボランティアが性行為の大幅な改善と、より頻度か高い陰茎の勃起を示すことが立証された。さらに、ドライマウスを除き、大きな副作用は起こらなかった。
【００４２】
実施例２
精子形成に対するジンセノサイドＲｇ１、その代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１および／またはＰｐｔの効果
２．１．１  材料と方法
２．１．１．１  薬剤の調製
ジンセノサイドＲｇ１ならびにその代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１および／またはＰｐｔを、それぞれ、再蒸留水に溶かし、４℃の環境で保存した。ゴシポールを、Laboratory of Synthesis, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciencesより準備し、精製食用油に溶かし、４℃の環境で暗所で保存した。
【００４３】
２．１．１．２  動物
Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Medical Sciences から購入した成体Ｗｉｓｔａｒ雄マウス、体重１８０〜２００ｇ（証明書番号ＳＣＸＫ（京）２００５−００１３）。
【００４４】
２．１．１．３  主な器械
Beijing Spaceflight Ruiqi Science and Technology Co., Ltd.によって開発された、Peking Union Medical College Hospitalによって提供されるコンピュータを用いた精子評価（ＣＡＳＡ）。
【００４５】
２．１．１．４  精子形成モデルの確立
マウスに５０ｍｇ／ｋｇゴシポールを、隔日に１回、２週間経口投与し、それによって、精子形成モデルを確立した。
【００４６】
２．１．１．５  動物の群分けおよび投与計画
５日間の環境適応後に、動物を無作為に次の８群に分けた：
対照群：食用油の隔日経口投与。
モデル群：５０ｍｇ／ｋｇゴシポールの隔日経口投与。
ジンセノサイドＲｇ１群
低用量群：５０ｍｇ／ｋｇゴシポールの隔日投与、および５ｍｇ／ｋｇジンセノサイドＲｇ１の毎日投与。
高用量群：５０ｍｇ／ｋｇゴシポールの隔日投与、および１０ｍｇ／ｋｇジンセノサイドＲｇ１の毎日投与。
代謝産物Ｒｈ１群
低用量群：５０ｍｇ／ｋｇゴシポールの隔日投与、および５ｍｇ／ｋｇ代謝産物Ｒｈ１の毎日投与。
高用量群；５０ｍｇ／ｋｇゴシポールの隔日投与、および１０ｍｇ／ｋｇ代謝産物Ｒｈ１の毎日投与。
代謝産物Ｐｐｔ群
低用量群：５０ｍｇ／ｋｇゴシポールの隔日投与、および５ｍｇ／ｋｇ代謝産物Ｐｐｔの毎日投与。
高用量群：５０ｍｇ／ｋｇゴシポールの隔日投与、および１０ｍｇ／ｋｇ代謝産物Ｐｐｔの毎日投与。
【００４７】
１４日目に、これらのマウスに麻酔をかけ、固定した。精巣上体尾から精子を採取し、３ｍｌ生理食塩水に溶かし、３７℃で５分間インキュベートした。その後、コンピュータを用いた精子評価（ＣＡＳＡ）により精子の量を分析した。
【００４８】
２．１．２  統計分析
これらの分析結果をＸ（エックスバー）±ｓとして表し；統計分析をｔ−検定により行い、それによって、様々な群間を比較し、Ｐ＜０．０５を有意差の指標とした。
【００４９】
２．１．３  試験結果
２．１．３．１  マウス精巣上体尾中の精子数に対するジンセノサイドＲｇ１ならびにその代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔの影響（表６に示すとおりである）
【００５０】
表６  マウス精巣上体尾中の精子数に対するジンセノサイドＲｇ１ならびにその代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔの影響
【表６】
2010520894.tif 000008
【００５１】
表６の結果により、ジンセノサイドＲｇ１ならびにその代謝産物であるジンセノサイドＲｈ１およびＰｐｔは総てゴシポールによって起こる精子の質の低下を改善することができ、投与群とモデル群間に有意差があることが立証された。モデル群に対して＊Ｐ＜０．０５、モデル群に対して＊＊Ｐ＜０．０１、対照群に対して＃Ｐ＜０．０５、対照群に対して＃＃Ｐ＜０．０１。
（添付：精子の運動性を分類するためのＷＨＯ基準：Ａグレード−速く前進する精子；Ｂグレード−ゆっくりまたは鈍く前進する精子；Ｃグレード−前進しない精子；Ｄグレード−静止した精子）。
【００５２】
２．１．３．４  マウスの精巣組織中のＮＯ含量に対するジンセノサイドＲｇ１の影響
分析を、Nanjingにおいて確立されたＮＯキットを用いることによって行い、これらの結果を表７に示した。
【００５３】
表７  マウスの精巣組織中のＮＯ含量に対するジンセノサイドＲｇ１の影響
【表７】
2010520894.tif 000009
【００５４】
表７に示されるように、モデル群のマウス精巣中のＮＯ含量は、対照群におけるマウス精巣中のＮＯ含量と比較して、大幅に増加した（Ｐ＜０．０５）。低用量群と高用量群との間には差はなかった。高用量群のマウス精巣中のＮＯ含量が大幅に減少したことが示され、従って、ジンセノサイドＲｇ１は精巣中のＮＯ含量を下げることができ、それに応じて精子を保護することができた。値は平均値±ＳＤとして表した。モデル群に対して＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝１０。
【００５５】
２．１．３．５  マウス血清中のホルモン（Ｔ、ＦＳＨ、およびＬＨ）含量に対するジンセノサイドＲｇ１の影響
この分析を放射性免疫分析によって行い、China North Institute of Biological Technology（中国北方生物技術研究所）から購入したキットを用いた。これらの結果を表８に示した。
【００５６】
表８  マウス血清中のホルモン含量に対するジンセノサイドＲｇ１の影響
【表８】
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【００５７】
上述の結果により、モデル群のマウス血清中のテストステロン含量は、対照群のマウス血清中のテストステロン含量と比較して、大幅に減少している：ことが立証された。ジンセノサイドＲｇ１（５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）の投与により、マウス血清中のテストステロン含量を大幅に増加させることができた。ＦＳＨおよびＬＨの含量は様々な群間で有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）、これにより、ジンセノサイドＲｇ１は、神経内分泌経路によって作用するのではなくむしろモデルの精巣組織に直接作用することが示唆された。モデル群に対して＊Ｐ＜０．０５、モデル群に対して＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝１０。
【００５８】
実施例３
ジンセノサイドＲｇ１についての老齢マウスにおける精子の質低下の改善効果
次の試験により、ジンセノサイドＲｇ１が、老齢マウスにおいて精子の質低下を改善する効果を有することを立証した。この分析では、１２ヶ月齢のＫｕｎｍｉｎｇマウスを用いた。ジンセノサイドＲｇ１を、５ｍｇ／ｋｇの用量で、毎日１回、２週間経口投与した。精子の質もやはりＣＡＳＡにより決定し、これらの結果を表９に示した。
【００５９】
表９  ジンセノサイドＲｇ１についての老齢マウスにおける精子の質低下の改善効果
【表９】
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【００６０】
上述の結果により、老齢マウス群の精子数は、老齢マウス＋ジンセノサイドＲｇ１の精子数と比較して、大幅に減少している：ことが立証された。しかしながら、これらの２群では、運動性精子の割合およびＡ＋Ｂグレードの割合に関して差はなかった。ジンセノサイドＲｇ１は老齢マウスにおける精子形成を改善することができることが示唆された。値は平均値±ＳＤとして表した。老齢マウス群に対して＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝４。
【００６１】
実施例４
ジンセノサイドＲｇ１についてのマウスにおける低温ストレス条件での精子の質低下の改善効果
次の試験により、ジンセノサイドＲｇ１が、マウスにおいて、低温ストレスによって生じる精子の質低下を改善することができることを立証した。この分析では、Ｋｕｎｍｉｎｇ（昆明）マウスを用いて、ストレスモデルを確立した。これらのマウスを４℃の環境に毎日８時間入れ、各マウスを単一ケージに、絶食させ水も与えず、１４日間入れ、それによって、低温ストレスモデルを確立した。ジンセノサイドＲｇ１を、２種類の異なる用量、すなわち５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ投与した。毎日、低温環境に曝す１時間前にマウスに前記薬物を経口摂取させた。１４日後、精子の質をＣＡＳＡにより決定し、これらの結果を表１０に示した。
【００６２】
表１０  ジンセノサイドＲｇ１についてのマウスにおける低温ストレスによる精子の質低下の改善効果
【表１０】
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【００６３】
上述の結果により、繰り返し低温ストレスが加わることで精子の運動性が低下し得、５ｍｇ／ｋｇのジンセノサイドＲｇ１により、精子の質を改善することができ、運動性精子の数を増加させることができ、そして死滅精子を減少させることができることが立証された。
【００６４】
上述の実施例により、精子形成の過程は、視床下部−下垂体−精巣によって分泌されるホルモンによって主として調節されることが立証された。ホルモン以外の因子では、酸化窒素（ＮＯ）が精子形成および受精能獲得に影響を及ぼす重要な物質の１つとなり、精子形成に関して二重調節機能を担う、すなわち、低濃度のＮＯは精子形成および受精能獲得を刺激し、そして精子の運動性を増加させることができ；一方、高濃度のＮＯは精子形成および精子の運動性を抑制することができた。この検討により、ジンセノサイドＲｇ１は、ゴシポールによるＮＯの過剰発生を減少させることができ、それによって、ゴシポールにより誘発される精子の質低下を改善することが確認された。加えて、ジンセノサイドＲｇ１は、老齢およびストレスが原因の精子の質低下を大幅に改善することができた。
【国際調査報告】
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