(57)【要約】  本発明の１つの態様は、遺伝子改変好熱性または中温性の微生物に関し、ここで第１の天然遺伝子が、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされ、この第１の天然遺伝子は、有機酸またはその塩の代謝産生に関与する第１の天然酵素をコードし、それによって、発酵生成物としてエタノールを産生する前記好熱性または中温性の微生物の天然の能力を増大させる。特定の実施の形態では、上記微生物は、第１の非天然遺伝子をさらに含み、ここで、この第１の非天然遺伝子は、エタノールの代謝産生に関与する第１の非天然酵素をコードする。本発明の別の態様は、リグノセルロース系バイオマスと、遺伝子改変した好熱性または中温性の微生物とを接触させることを含む、リグノセルロース系バイオマスをエタノールに変換する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５、３０〜３１、および４７〜６１のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号１〜５、３０〜３１、および４７〜６１のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその相補体と少なくとも８０％の同一性を共有するヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号１〜５、３０〜３１、および４７〜６１のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその相補体と少なくとも約９５％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
好熱性または中温性の細菌において発現可能なプロモーターに機能的に連結された配列番号１〜５、３０〜３１、および４７〜６１のいずれか１つを含む、遺伝子構築物。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子構築物を含む、組み換え好熱性または中温性の細菌。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が好熱性または中温性の細菌細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
第１の天然遺伝子が、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされた、遺伝子改変された好熱性または中温性の微生物であって、
前記第１の天然遺伝子が、有機酸またはその塩の代謝産生に関与する第１の天然酵素をコードし、それによって、発酵生成物としてエタノールを産生する前記好熱性または中温性の微生物の天然の能力を増大させる、
微生物。
【請求項１０】
前記微生物が、グラム陰性菌またはグラム陽性菌であることを特徴とする、請求項９に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１１】
前記微生物が、サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、サッカロコッカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｃｏｃｃｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カルディセルロシルプター（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ）、アネロセルム（Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ）またはアノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）属の種であることを特徴とする、請求項９に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１２】
前記微生物が、下記：サーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ）、サーモアナエロバクテリウム・アオテアロエンス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｏｔｅａｒｏｅｎｓｅ）、サーモアナエロバクテリウム・ポリサッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・ジアエ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｚｅａｅ）、サーモアナエロバクテリウム・キシラノリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ）、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクター・サーモヒドロスルフリカス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ）、サーモアナエロバクター・エタノリカス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）、サーモアナエロバクター・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ファイトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、クロストリジウム・ストラミノソルベンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｒａｍｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ）、ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サッカロコッカス・カルドキシロシリティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｌｄｏｘｙｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ）、サッカロッカス・サーモフィラス（Ｓａｃｃｈａｒｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、パエニバチルス・キャンピナセンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ）、バチルス・フラボテルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｏｔｈｅｒｍｕｓ）、アノキシバチルス・カムチャッカエンシス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｍｃｈａｔｋｅｎｓｉｓ）、アノキシバチルス・ゴネンシス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｏｎｅｎｓｉｓ）、カルディセルロシルプター・アセチゲネス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ａｃｅｔｉｇｅｎｕｓ）、カルディセルロシルプター・サッカロリティカス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、カルディセルロシルプター・クリストヤンソニー（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｋ��ｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）、カルディセルロシルプター・オーウェンセンシス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｏｗｅｎｓｅｎｓｉｓ）、カルディセルロシルプター・ラクトアセティカス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｌａｃｔｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、およびアネロセルム・テルモフィルム（Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）からなる群より選択される細菌であることを特徴とする、請求項９に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１３】
前記微生物が、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）であることを特徴とする、請求項９に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１４】
前記微生物が、下記：
（ａ）ヘキソース糖を代謝する天然の能力を有する好熱性または中温性の微生物；
（ｂ）ペントース糖を代謝する天然の能力を有する好熱性または中温性の微生物；ならびに
（ｃ）ヘキソース糖およびペントース糖を代謝する天然の能力を有する好熱性または中温性の微生物
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項９に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１５】
前記微生物が、ヘキソース糖を代謝する天然の能力を有することを特徴とする、請求項９に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１６】
前記微生物が、クロストリジウム・ストラミニソルベンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）またはクロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）であることを特徴とする、請求項１５に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１７】
前記微生物が、ヘキソース糖およびペントース糖を代謝する天然の能力を有することを特徴とする、請求項９に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１８】
前記微生物が、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・クリストヤンソニー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）またはクロストリジウム・ステルコラリウムｓｕｂｓｐ．レプトサプラルツム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｌｅｐｔｏｓａｐｒａｒｔｕｍ）であることを特徴とする、請求項１７に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１９】
第１の非天然遺伝子が挿入された、請求項１５に記載の遺伝子改変微生物であって、
前記第１の非天然遺伝子が、ペントース糖を代謝する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、ペントース糖から発酵生成物としてエタノールを産生させることを特徴とする、遺伝子改変微生物。
【請求項２０】
前記微生物が、ペントース糖を代謝する天然の能力を有することを特徴とする、請求項９に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項２１】
前記微生物が、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・キシラノリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・ポリサッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、およびサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２０に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項２２】
第１の非天然遺伝子が挿入された、請求項２０に記載の遺伝子改変微生物であって、
前記第１の非天然遺伝子が、ヘキソース糖を代謝する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、ヘキソース糖から発酵生成物としてエタノールを産生させることを特徴とする、遺伝子改変微生物。
【請求項２３】
前記有機酸が、乳酸および酢酸からなる群より選択されることを特徴とする、請求項９〜２２のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項２４】
前記有機酸が乳酸であることを特徴とする、請求項９〜２２のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項２５】
前記有機酸が酢酸であることを特徴とする、請求項９〜２２のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項２６】
前記第１の天然酵素が、乳酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、およびホスホトランスアセチラーゼからなる群より選択されることを特徴とする、請求項９〜２２のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項２７】
前記第１の天然酵素が乳酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする、請求項９〜２２のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項２８】
前記第１の天然酵素が酢酸キナーゼであることを特徴とする、請求項９〜２２のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項２９】
前記第１の天然酵素がホスホトランスアセチラーゼであることを特徴とする、請求項９〜２２のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項３０】
第２の天然遺伝子が、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされ、ここで、前記第２の天然遺伝子が、有機酸またはその塩の代謝産生に関与する第２の天然酵素をコードすることを特徴とする、請求項９〜２９のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項３１】
前記第２の天然酵素が、酢酸キナーゼまたはホスホトランスアセチラーゼであることを特徴とする、請求項３０に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項３２】
前記第２の天然酵素が、乳酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする、請求項３０に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項３３】
遺伝子改変された好熱性または中温性の微生物であって、
（ａ）第１の天然遺伝子が、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされ、ここで、前記第１の天然遺伝子が、有機酸またはその塩の代謝産生に関与する第１の天然酵素をコードし、
（ｂ）第１の非天然遺伝子が挿入され、ここで、前記第１の非天然遺伝子が、エタノールの代謝産生に関与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、発酵生成物としてエタノールを産生させる
ことを特徴とする、微生物。
【請求項３４】
前記第１の非天然遺伝子が、ヘキソース糖を代謝する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物にヘキソース糖を代謝させることを特徴とする、請求項３３に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項３５】
前記第１の非天然遺伝子が、ペントース糖を代謝する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物にペントース糖を代謝させることを特徴とする、請求項３３に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項３６】
前記第１の非天然遺伝子が、ヘキソース糖を代謝する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし；
第２の非天然遺伝子が挿入され、ここで、前記第２の非天然遺伝子が、ペントース糖を代謝する能力を付与する第２の非天然酵素をコードし、
それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、ヘキソース糖およびペントース糖を代謝させる
ことを特徴とする、請求項３３に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項３７】
前記有機酸が乳酸であることを特徴とする、請求項３３〜３６のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項３８】
前記有機酸が酢酸であることを特徴とする、請求項３３〜３６のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項３９】
前記第１の非天然酵素が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）であることを特徴とする、請求項３３、３４または３６のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４０】
前記第２の非天然酵素が、キシロースイソメラーゼであることを特徴とする、請求項３３または３５に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４１】
前記第１の非天然遺伝子が配列番号６、１０、または１４に対応することを特徴とする、請求項４０に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４２】
前記非天然酵素が、キシルロキナーゼであることを特徴とする、請求項３３、３５または３６のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４３】
前記非天然遺伝子が配列番号７、１１、または１５に対応することを特徴とする、請求項４２に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４４】
前記非天然酵素が、Ｌ−アラビノースイソメラーゼであることを特徴とする、請求項３３、３５、または３６のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４５】
前記非天然遺伝子が配列番号８または１２に対応することを特徴とする、請求項４４に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４６】
前記非天然酵素が、Ｌ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼであることを特徴とする、請求項３３、３５または３６のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４７】
前記非天然遺伝子が配列番号９または１３に対応することを特徴とする、請求項４６に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４８】
前記微生物が、代謝されたバイオマス由来の炭素の少なくとも６０％をエタノールに変換することが可能であることを特徴とする、請求項９〜４７のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４９】
前記微生物が、下記：
（ａ）セルロースを加水分解する天然の能力を有する好熱性または中温性の微生物；
（ｂ）キシランを加水分解する天然の能力を有する好熱性または中温性の微生物；ならびに
（ｃ）セルロースおよびキシランを加水分解する天然の能力を有する好熱性または中温性の微生物
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項９に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５０】
前記微生物が、セルロースを加水分解する天然の能力を有することを特徴とする、請求項９または３３に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５１】
前記微生物が、セルロースおよびキシランを加水分解する天然の能力を有することを特徴とする、請求項９または３３に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５２】
第１の非天然遺伝子が挿入された、請求項５０に記載の遺伝子改変微生物であって、
ここで、前記第１の非天然遺伝子が、キシランを加水分解する能力を付与する第１の非天然酵素をコードすることを特徴とする、遺伝子改変微生物。
【請求項５３】
前記微生物が、キシランを加水分解する天然の能力を有することを特徴とする、請求項９または３３に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５４】
第１の非天然遺伝子が挿入された請求項５３に記載の遺伝子改変微生物であって、
前記第１の非天然遺伝子が、セルロースを加水分解する能力を付与する第１の非天然酵素をコードすることを特徴とする、遺伝子改変微生物。
【請求項５５】
前記有機酸が、乳酸および酢酸からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４９〜５４のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５６】
前記有機酸が乳酸であることを特徴とする、請求項４９〜５４のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５７】
前記有機酸が酢酸であることを特徴とする、請求項４９〜５４のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５８】
前記第１の天然酵素が、乳酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、およびホスホトランスアセチラーゼからなる群より選択されることを特徴とする、請求項４９〜５４のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５９】
前記第１の天然酵素が乳酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする、請求項４９〜５４のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６０】
前記第１の天然酵素が酢酸キナーゼであることを特徴とする、請求項４９〜５４のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６１】
前記第１の天然酵素がホスホトランスアセチラーゼであることを特徴とする、請求項４９〜５４のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６２】
第２の天然遺伝子が、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされた、請求項５０〜６１のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物であって、
前記第２の天然遺伝子が、有機酸またはその塩の代謝産生に関与する第２の天然酵素をコードすることを特徴とする、遺伝子改変微生物。
【請求項６３】
前記第２の天然酵素が、酢酸キナーゼまたはホスホトランスアセチラーゼであることを特徴とする、請求項６２に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６４】
前記第２の天然酵素が、乳酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする、請求項６２に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６５】
遺伝子改変された好熱性または中温性の微生物であって、
（ａ）第１の天然遺伝子が、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされ、ここで、前記第１の天然遺伝子が、有機酸またはその塩の代謝産生に関与する第１の天然酵素をコードし、
（ｂ）第１の非天然遺伝子が挿入され、ここで、前記第１の非天然遺伝子が、多糖の加水分解に関与する第１の非天然酵素をコードし、
それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、発酵生成物としてエタノールを産生させることを特徴とする、微生物。
【請求項６６】
前記第１の非天然遺伝子が、セルロースを加水分解する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、セルロースを加水分解させることを特徴とする、請求項６５に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６７】
前記第１の非天然遺伝子が、キシランを加水分解する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、キシランを加水分解させることを特徴とする、請求項６５に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６８】
前記第１の非天然遺伝子が、セルロースを加水分解する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし；
第２の非天然遺伝子が挿入され、ここで、前記第２の非天然遺伝子が、キシランを加水分解する能力を付与する第２の非天然酵素をコードし、
それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、セルロースおよびキシランを加水分解させることを特徴とする、請求項６５に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６９】
前記有機酸が乳酸であることを特徴とする、請求項６５〜６８のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項７０】
前記有機酸が酢酸であることを特徴とする、請求項６５〜６８のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項７１】
前記第１の非天然酵素が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）であることを特徴とする、請求項６５、６６、または６８のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項７２】
前記微生物が、代謝されたバイオマス由来の炭素の少なくとも６０％をエタノールに変換することが可能であることを特徴とする、請求項４９〜７１のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項７３】
前記微生物が中温性であることを特徴とする、請求項９、１１、１２、１４、１６、１８、１９、２２、３３、３４、３５、３６、４９、６５、６６、６７、および６８のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項７４】
前記微生物が好熱性であることを特徴とする、請求項９、１１、１２、１３、１４、１９、２１、２２、３３、３４、３５、３６、４９、６５、６６、６７、および６８のいずれか１項記載の遺伝子改変微生物。
【請求項７５】
リグノセルロース系バイオマスと、請求項９〜４８のいずれか１項記載の遺伝子改変された好熱性または中温性の微生物とを接触させる工程を有してなる、リグノセルロース系バイオマスをエタノールに変換する方法。
【請求項７６】
前記リグノセルロース系バイオマスが、草、スイッチグラス、コードグラス、ライグラス、リードカナリーグラス、プレーリーグラス混合種、ススキ、製糖残留物、サトウキビバガス、サトウキビワラ、農業廃棄物、イナワラ、籾殻、オオムギワラ、トウモロコシ穂軸、穀物ワラ、コムギワラ、カノーラワラ、エンバクワラ、エンバク種皮、トウモロコシ繊維、茎葉、ダイズ茎葉、トウモロコシ茎葉、森林廃棄物、再生木材パルプ繊維、ペーパースラッジ、大鋸屑、硬木、軟木、およびそれらの組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記リグノセルロース系バイオマスが、トウモロコシ茎葉、サトウキビバガス、スイッチグラス、およびポプラ材からなる群より選択されることを特徴とする、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記リグノセルロース系バイオマスがトウモロコシ茎葉であることを特徴とする、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記リグノセルロース系バイオマスがサトウキビバガスであることを特徴とする、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記リグノセルロース系バイオマスがスイッチグラスであることを特徴とする、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記リグノセルロース系バイオマスがポプラ材であることを特徴とする、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
前記リグノセルロース系バイオマスはヤナギであることを特徴とする、請求項７５に記載の方法。
【請求項８３】
前記リグノセルロース系バイオマスがペーパースラッジであることを特徴とする、請求項７５に記載の方法。
【請求項８４】
リグノセルロース系バイオマスと、請求項４９〜７４のいずれか１項記載の遺伝子改変された好熱性または中温性の微生物とを接触させる工程を有してなる、リグノセルロース系バイオマスをエタノールに変換する方法。
【請求項８５】
前記リグノセルロース系バイオマスが、草、スイッチグラス、コードグラス、ライグラス、リードカナリーグラス、プレーリーグラス混合種、ススキ、製糖残留物、サトウキビバガス、サトウキビワラ、農業廃棄物、イナワラ、籾殻、オオムギワラ、トウモロコシ穂軸、穀物ワラ、コムギワラ、カノーラワラ、エンバクワラ、エンバク種皮、トウモロコシ繊維、茎葉、ダイズ茎葉、トウモロコシ茎葉、森林廃棄物、再生木材パルプ繊維、ペーパースラッジ、大鋸屑、硬木、軟木、およびそれらの組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記リグノセルロース系バイオマスが、トウモロコシ茎葉、サトウキビバガス、スイッチグラス、およびポプラ材からなる群より選択されることを特徴とする、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
前記リグノセルロース系バイオマスがトウモロコシ茎葉であることを特徴とする、請求項８４に記載の方法。
【請求項８８】
前記リグノセルロース系バイオマスがサトウキビバガスであることを特徴とする、請求項８４に記載の方法。
【請求項８９】
前記リグノセルロース系バイオマスがスイッチグラスであることを特徴とする、請求項８４に記載の方法。
【請求項９０】
前記リグノセルロース系バイオマスがポプラ材であることを特徴とする、請求項８４に記載の方法。
【請求項９１】
前記リグノセルロース系バイオマスがヤナギであることを特徴とする、請求項８４に記載の方法。
【請求項９２】
前記リグノセルロース系バイオマスがペーパースラッジであることを特徴とする、請求項８４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、参照することにより本明細書に援用される、２００７年５月９日に出願された米国仮特許出願第６０／９１６，９７８号の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、第１の天然遺伝子が、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされた、遺伝子改変された好熱性または中温性の微生物に関する。本発明はまた、遺伝子改変された好熱性または中温性の微生物を利用した、バイオマスをエタノールに変換する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
エネルギーの変換、利用およびアクセスは、持続可能性、環境品質、安全、および貧困に関連するものを含む現在の多くの大きな課題の底流をなす。これらの課題に答えるための新技術の新たな応用が、求められている。バイオテクノロジー（新技術の最も強力なものの１つ）は、重要なエネルギー変換プロセスを生じ得る。植物バイオマスおよびそれらの誘導体は、エネルギーの人類に有用な形態への生物学的変換のための資源である。
【０００４】
その大規模利用可能性、低コスト、および環境的に良性の産生のため、植物バイオマスの形態のうち、リグノセルロース系バイオマス(「バイオマス」)は、エネルギー応用に特に良く適している。特に、セルロース系バイオマスに基づく多くのエネルギー産生および利用サイクルは、ライフサイクルに基づく温室効果ガスをほとんど排出しない。バイオマス原料由来のエネルギーのより広範な産生を妨げる主な障害は、これらの材料を有用な燃料に変換し難いという問題を克服するための低コストの技術が一般にないことである。リグノセルロース系バイオマスは、エタノールに変換することができる炭水化物画分（例えば、セルロースおよびヘミセルロース）を含有する。これらの画分を変換するためには、セルロースおよびヘミセルロースは、究極的に単糖類に変換または加水分解されなければならないが；歴史的に問題が多いことが証明されているのは、加水分解である。
【０００５】
生物が媒介するプロセスは、エネルギー変換、特に、リグノセルロース系バイオマスの燃料への変換に有望である。酵素または微生物的加水分解に関与するバイオマス処理スキームは、一般に、次の４つの生物が媒介する変換が関与する：（１）糖類分解酵素（セルラーゼおよびヘミセルラーゼ）の産生；（２）前処理されたバイオマスに存在する炭水化物成分の糖への加水分解；（３）ヘキソース糖（例えば、グルコース、マンノース、およびガラクトース）の発酵；ならびに（４）ペントース糖（例えば、キシロースおよびアラビノース）の発酵。これらの４つの変換は、セルラーゼおよび／またはヘミセルラーゼ産生のための専用のプロセス工程が関与しない、それほど高度に統合されていない構成とは異なる、連結バイオプロセス（ＣＢＰ）と呼ばれるプロセス構成における単一工程において生じる。
【０００６】
ＣＢＰは、専用のセルラーゼ産生を特徴とするプロセスより低コストであり、高い効率の可能性を提供する。この利益は、資本コスト、基質および他の原材料の回避、ならびにセルラーゼ産生に関連する有用性から部分的には生じる。加えて、いくらかの要因は、より高い速度の加水分解の実現、従って、酵素−微生物相乗作用ならびに好熱性生物および／または複雑なセルラーゼ系の使用を含むＣＢＰを使用するリアクタ容積および設備投資の削減を支援する。さらに、セルロース粘着性セルロース分解微生物は、セルロース加水分解の産物について、粘着しない微生物、例えば、混入体と首尾よく競合するようであり、これは、微生物セルロース利用に基づく産業的プロセスの安定性を増大し得る。ＣＢＰを可能にする微生物の開発における進展は、次の２つのストラテジーを介して行われている：天然に存在するセルロース分解微生物を操作して、収量および力価のような産物関連特性を改善すること；ならびに高い産物収量および力価を示すセルロース非分解生物を操作して、セルロースおよびヘミセルロース利用を可能にする異種のセルラーゼおよびヘミセルラーゼ系を発現させること。
【０００７】
多くの細菌は、解糖のプロセスを経て、単純なヘキソース糖を酸性およびｐＨ中性の産物の混合物に発酵する能力を有する。解糖経路は、豊富であり、一連の酵素工程を含み、それによって、６炭素グルコース分子は、多数の中間体を経て、２分子の３炭素化合物ピルビン酸塩に分解される。このプロセスは、ＡＴＰ（生物学的エネルギー供給）の正味の産生および補因子ＮＡＤＨの減少を生じる。
【０００８】
ピルビン酸塩は、代謝の重要な中間化合物である。例えば、好気条件下では、ピルビン酸塩は、アセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）に酸化され得、次いで、トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）に入り、次に、合成前駆体、ＣＯ２および還元型補因子を生じる。次いで、補因子は、一連の酵素工程を経て水素等価物を酸素に供与することによって酸化され、水およびＡＴＰの形成を生じる。エネルギー形成のこのプロセスは、酸化的リン酸化として公知である。
【０００９】
嫌気条件（酸素が利用可能でない）下では、発酵が生じ、ここで、有機化合物の分解産物は、水素供与体および受容体としての役割を果たす。解糖由来の過剰のＮＡＤＨは、有機基質の乳酸塩およびエタノールのような産物への還元が関与する反応において、酸化される。加えて、ＡＴＰは、基質準位リン酸化として公知であるプロセスにおいて酢酸塩のような有機酸の産生から再生される。従って、解糖およびピルビン酸代謝の発酵生成物は、多様な有機酸、アルコールおよびＣＯ２を含む。
【００１０】
通性嫌気性菌の大部分は、好気または嫌気条件のいずれにおいても高収率のエタノールを産生しない。ほとんどの通性嫌気性菌は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）およびトリカルボン酸サイクル（ＴＣＡ）を経て、ピルビン酸塩を好気的に代謝する。嫌気的条件下では、ピルビン酸塩の代謝のための主なエネルギー経路は、ピルビン酸−ギ酸−リアーゼ（ＰＦＬ）経路を経て、ギ酸塩およびアセチル−ＣｏＡを生じる。次いで、アセチル−ＣｏＡは、ＡＴＰの同時産生を伴い、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）および酢酸キナーゼ（ＡＣＫ）を経て、酢酸塩に変換されるか、またはアセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｃＤＨ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）を経て、エタノールに還元される。還元性等価物の均衡を維持するために、解糖から産生される過剰のＮＡＤＨは、ピルビン酸塩から乳酸塩への還元中に、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）によってＮＡＤ＋に再酸化される。ＮＡＤＨはまた、アセチル−ＣｏＡからエタノールへの還元中に、ＡｃＤＨおよびＡＤＨによって再酸化され得るが、これは、機能性ＬＤＨを伴う細胞では重要でない反応である。従って、ほとんどのアセチルＣｏＡが酢酸塩に変換されてＡＴＰを再生し、解糖中に産生される過剰のＮＡＤＨはＬＤＨにより酸化されるため、エタノールの理論的収率は達成されない。
【００１１】
微生物の代謝工学はまた、乳酸デヒドロゲナーゼのような酵素の産生をコードする、標的とするノックアウト遺伝子の作出ももたらし得る。この場合、遺伝子の「ノックアウト」は、部分的、実質的、もしくは完全な欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレーションを意味する。ＬＤＨの作用によるピルビン酸塩の乳酸塩（乳酸の塩形態）への変換が解糖経路の早期段階において利用可能でない場合、ピルビン酸塩は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼまたはピルビン酸−フェレドキシンオキシドレダクターゼの作用によって、より効率的にアセチルＣｏＡに変換され得る。ホスホトランスアセチラーゼおよび酢酸キナーゼによるアセチルＣｏＡの酢酸塩（酢酸の塩形態）へのさらなる変換もまた利用可能でない場合、即ち、ＰＴＡおよびＡＣＫの産生をコードする遺伝子がノックアウトされる場合、アセチルＣｏＡは、ＡｃＤＨおよびＡＤＨによって、より効率的にエタノールに変換され得る。従って、有機酸の産生を排除するそのような標的化された遺伝子ノックアウトを伴う微生物の遺伝子改変株は、発酵生成物としてエタノールを産生する能力が増大する。
【００１２】
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、ザイモバクター・パルマエ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ）、アセトバクター・パスツリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、またはサルシナ・ベントリクリ（Ｓａｒｃｉｎａ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｉ）およびいくつかの酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））のようなエタノール生産性の生物は、一般にアルコール発酵と称される、ピルビン酸がピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）によってアセトアルデヒドおよびＣＯ２に代謝される第２のタイプの嫌気発酵の能力を有する。次いで、アセトアルデヒドは、ＡＤＨによってエタノールに還元され、ＮＡＤ＋が再生される。アルコール発酵は、１分子のグルコースから２分子のエタノールおよび２分子のＣＯ２への代謝を生じる。上記で詳述したようなピルビン酸の所望されない有機酸への変換が回避され得る場合、そのような遺伝子改変された微生物は、発酵生成物としてエタノールを産生する能力が増大する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の１つの態様は、配列番号１〜５、３０〜３１、および４７〜６１のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、単離された核酸分子に関する。本発明の別の態様は、配列番号１〜５、３０〜３１、および４７〜６１のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその相補体と少なくとも８０％の同一性を共有するヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子に関する。特定の実施の形態では、本発明は、配列番号１〜５、３０〜３１、および４７〜６１のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその相補体と少なくとも約９５％の配列同一性を共有する上記の核酸分子に関する。
【００１４】
本発明の別の態様は、好熱性または中温性の細菌において発現可能なプロモーターに機能的に連結された配列番号１〜５、３０〜３１、および４７〜６１のいずれか１つを含む、遺伝子構築物に関する。本発明はまた、上記の遺伝子構築物を含む組み換え好熱性または中温性の細菌に関する。
【００１５】
本発明はまた、上記の核酸分子のいずれか１つを含むベクターを包含する。本発明はまた、上記の核酸分子のいずれか１つを含む宿主細胞を包含する。特定の実施の形態では、本発明は、上記の宿主細胞に関し、ここで、前記宿主細胞は、好熱性または中温性の細菌細胞である。
【００１６】
本発明の別の態様は、第１の天然遺伝子が、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされ、前記第１の天然遺伝子は、有機酸またはその塩の代謝産生に関与する第１の天然酵素をコードし、それによって、発酵生成物としてエタノールを産生する前記好熱性または中温性の微生物の天然の能力を増大させる、遺伝子改変された好熱性または中温性の微生物に関する。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変された微生物に関し、ここで、前記微生物はグラム陰性菌またはグラム陽性菌である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変された微生物に関し、ここで、前記微生物は、サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、サッカロコッカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｃｏｃｃｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カルディセルロシルプター（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ）、アネロセルム（Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ）またはアノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）属の種である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変された微生物に関し、ここで、前記微生物は、次のものからなる群より選択される細菌である：サーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ）、サーモアナエロバクテリウム・アオテアロエンス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｏｔｅａｒｏｅｎｓｅ）、サーモアナエロバクテリウム・ポリサッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・ジアエ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｚｅａｅ）、サーモアナエロバクテリウム・キシラノリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ）、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクター・サーモヒドロスルフリカス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ）、サーモアナエロバクター・エタノリカス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）、サーモアナエロバクター・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ファイトフ���ーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、クロストリジウム・ストラミノソルベンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｒａｍｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ）、ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サッカロコッカス・カルドキシロシリティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｌｄｏｘｙｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ）、サッカロッカス・サーモフィラス（Ｓａｃｃｈａｒｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、パエニバチルス・キャンピナセンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ）、バチルス・フラボテルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｏｔｈｅｒｍｕｓ）、アノキシバチルス・カムチャッカエンシス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｍｃｈａｔｋｅｎｓｉｓ）、アノキシバチルス・ゴネンシス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｏｎｅｎｓｉｓ）、カルディセルロシルプター・アセチゲネス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ａｃｅｔｉｇｅｎｕｓ）、カルディセルロシルプター・サッカロリティカス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、カルディセルロシルプター・クリストヤンソニー（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）、カルディセルロシルプター・オーウェンセンシス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｏｗｅｎｓｅｎｓｉｓ）、カルディセルロシルプター・ラクトアセティカス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｌａｃｔｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、およびアネロセルム・テルモフィルム（Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記微生物はサーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記微生物は：（ａ）ヘキソース糖を代謝する天然の能力を有する好熱性または中温性の微生物；（ｂ）ペントース糖を代謝する天然の能力を有する好熱性または中温性の微生物；ならびに（ｃ）ヘキソース糖およびペントース糖を代謝する天然の能力を有する好熱性または中温性の微生物からなる群より選択される。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記微生物は、ヘキソース糖を代謝する天然の能力を有する。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記微生物は、クロストリジウム・ストラミニソルベンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）またはクロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記微生物は、ヘキソース糖およびペントース糖を代謝する天然の能力を有する。特定の実施の形態では、本発明は、上記の��伝子改変微生物に関し、ここで、前記微生物は、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・クリストヤンソニー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）、またはクロストリジウム・ステルコラリウムｓｕｂｓｐ．レプトサプラルツム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｌｅｐｔｏｓａｐｒａｒｔｕｍ）である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、第１の非天然遺伝子が挿入され、ここで、第１の非天然遺伝子は、ペントース糖を代謝する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、ペントース糖から発酵生成物としてエタノールを産生させる。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記微生物は、ペントース糖を代謝する天然の能力を有する。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記微生物は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・キシラノリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・ポリサッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、およびサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）からなる群より選択される。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、第１の非天然遺伝子が挿入され、ここで、第１の非天然遺伝子は、ヘキソース糖を代謝する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、ヘキソース糖から発酵生成物としてエタノールを産生させる。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記有機酸は、乳酸および酢酸からなる群より選択される。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記有機酸は乳酸である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記有機酸は酢酸である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の天然酵素は、乳酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、およびホスホトランスアセチラーゼからなる群より選択される。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の天然酵素は乳酸デヒドロゲナーゼである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の天然酵素は酢酸キナーゼである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の天然酵素はホスホトランスアセチラーゼである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、第２の天然遺伝子は、部分的、実質的、もしくは完���に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされ、前記第２の天然遺伝子は、有機酸またはその塩の代謝産生に関与する第２の天然酵素をコードする。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第２の天然酵素は酢酸キナーゼまたはホスホトランスアセチラーゼである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第２の天然酵素は乳酸デヒドロゲナーゼである。
【００１７】
本発明のなお別の態様は、遺伝子改変好熱性または中温性の微生物に関し、ここで、（ａ）第１の天然遺伝子は、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされ、ここで、前記第１の天然遺伝子は、有機酸またはその塩の代謝産生に関与する第１の天然酵素をコードし、および（ｂ）第１の非天然遺伝子が挿入され、ここで、第１の非天然遺伝子は、エタノールの代謝産生に関与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、発酵生成物としてエタノールを産生させる。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の非天然遺伝子は、ヘキソース糖を代謝する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、ヘキソース糖を代謝させる。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の非天然遺伝子は、ペントース糖を代謝する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、ペントース糖を代謝させる。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の非天然遺伝子は、ヘキソース糖を代謝する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし；第２の非天然遺伝子が挿入され、ここで、前記第２の非天然遺伝子は、ペントース糖を代謝する能力を付与する第２の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、ヘキソース糖およびペントース糖を代謝させることを特徴とする。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記有機酸は乳酸である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記有機酸は酢酸である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の非天然酵素は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第２の非天然酵素はキシロースイソメラーゼである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の非天然遺伝子は、配列番号６、１０、または１４に対応する。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記非天然酵素はキシルロキナーゼである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記非天然遺伝子は、配列番号７、１１、または１５に対応する。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記非天然酵素はＬ−アラビノースイソメラーゼである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記非天然遺伝子は、配列番号８または１２に対応する。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記非天然酵素はＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記非天然遺伝子は、配列番号９または１３に対応する。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記微生物は、代謝されたバイオマス由来の少なくとも６０％の炭素をエタノールに変換することが可能である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記微生物は：（ａ）セルロースを加水分解する天然の能力を有する好熱性または中温性の微生物；（ｂ）キシランを加水分解する天然の能力を有する好熱性または中温性の微生物；ならびに（ｃ）セルロースおよびキシランを加水分解する天然の能力を有する好熱性または中温性の微生物からなる群より選択される。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記微生物は、セルロースを加水分解する天然の能力を有する。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記微生物は、セルロースおよびキシランを加水分解する天然の能力を有する。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、第１の非天然遺伝子が挿入され、ここで、前記第１の非天然遺伝子は、キシランを加水分解する能力を付与する第１の非天然酵素をコードする。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記微生物は、キシランを加水分解する天然の能力を有する。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、第１の非天然遺伝子が挿入され、ここで、前記第１の非天然遺伝子は、セルロースを加水分解する能力を付与する第１の非天然酵素をコードする。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記有機酸は、乳酸および酢酸からなる群より選択される。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記有機酸は乳酸である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記有機酸は酢酸である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の天然酵素は、乳酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、およびホスホトランスアセチラーゼからなる群より選択される。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の天然酵素は乳酸デヒドロゲナーゼである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の天然酵素は酢酸キナーゼである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の天然酵素はホスホトランスアセチラーゼである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、第２の天然遺伝子は、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされ、前記第２の天然遺伝子は、有機酸またはその塩の代謝産生に関与する第２の天然酵素をコードする。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第２の天然酵素は酢酸キナーゼまたはホスホトランスアセチラーゼである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第２の天然酵素は乳酸デヒドロゲナーゼである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、（ａ）第１の天然遺伝子は、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされ、ここで、前記第１の天然遺伝子は、有機酸またはその塩の代謝産生に関与する第１の天然酵素をコードし、および（ｂ）第１の非天然遺伝子が挿入され、ここで、第１の非天然遺伝子は、多糖の加水分解に関与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、発酵生成物としてエタノールを産生させる。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の非天然遺伝子は、セルロースを加水分解する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、セルロースを加水分解させる。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の非天然遺伝子は、キシランを加水分解する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、キシランを加水分解させる。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の非天然遺伝子は、セルロースを加水分解する能力を付与する第１の非天然酵素をコードし；第２の非天然遺伝子が挿入され、ここで、前記第２の非天然遺伝子は、キシランを加水分解する能力を付与する第２の非天然酵素をコードし、それによって、前記好熱性または中温性の微生物に、セルロースおよびキシランを加水分解させる。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記有機酸は乳酸である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記有機酸は酢酸である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記第１の非天然酵素は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物に関し、ここで、前記微生物は、代謝されたバイオマス由来の少なくとも６０％の炭素をエタノールに変換することが可能である。
【００１８】
特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物のいずれかに関し、ここで、前記微生物は中温性である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の遺伝子改変微生物のいずれかに関し、ここで、前記微生物は好熱性である。
【００１９】
本発明の別の態様は、リグノセルロース系バイオマスと、上記の遺伝子改変好熱性または中温性の微生物のいずれか１つとを接触させることを含む、リグノセルロース系バイオマスをエタノールに変換するための方法に関する。特定の実施の形態では、本発明は、上記の方法に関し、ここで、前記リグノセルロース系バイオマスは、草、スイッチグラス、コードグラス、ライグラス、リードカナリーグラス、プレーリーグラス混合種、ススキ、製糖残留物、サトウキビバガス、サトウキビワラ、農業廃棄物、イナワラ、籾殻、オオムギワラ、トウモロコシ穂軸、穀物ワラ、コムギワラ、カノーラワラ、エンバクワラ、エンバク種皮、トウモロコシ繊維、茎葉、ダイズ茎葉、トウモロコシ茎葉、森林廃棄物、再生木材パルプ繊維、ペーパースラッジ、大鋸屑、硬木、軟木、およびそれらの組合せからなる群より選択される。特定の実施の形態では、本発明は、上記のプロセスに関し、ここで、前記リグノセルロース系バイオマスは、トウモロコシ茎葉、サトウキビバガス、スイッチグラス、およびポプラ材からなる群より選択される。特定の実施の形態では、本発明は、上記の方法に関し、ここで、前記リグノセルロース系バイオマスはトウモロコシ茎葉である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の方法に関し、ここで、前記リグノセルロース系バイオマスはサトウキビバガスである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の方法に関し、ここで、前記リグノセルロース系バイオマスはスイッチグラスである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の方法に関し、ここで、前記リグノセルロース系バイオマスはポプラ材である。特定の実施の形態では、本発明は、上記の方法に関し、ここで、前記リグノセルロース系バイオマスはヤナギである。特定の実施の形態では、本発明は、上記の方法に関し、ここで、前記リグノセルロース系バイオマスはペーパースラッジである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】解糖経路を図示する。
【図２】ペントースとグルクロン酸塩との相互変換を図示し、Ｄ−キシロースからエタノールへの経路における酵素、キシロースイソメラーゼ（ＸＩまたは５．３．１．５）およびキシルロキナーゼ（ＸＫまたは２．７．１．１７）を強調している。
【図３】ペントースとグルクロン酸塩との相互変換を図示し、Ｌ−アラビノース資化経路における酵素、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（５．３．１．４）およびＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼ（５．１．３．４）を強調している。
【図４】ペントースとグルクロン酸塩との相互変換を図示し、Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）においてキシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、およびＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼの遺伝子が存在することを示す。
【図５】ペントースとグルクロン酸塩との相互変換を図示し、Ｃ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）においてキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼが存在する一方、Ｌ−アラビノースイソメラーゼおよびＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼが存在しないことを示す。
【図６】１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のレベルにおいて約７３〜８９％の相同性を示すクロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）（配列番号７７）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）（配列番号７８）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）（配列番号７９）、Ｃ．ステルコラリウム（Ｃ．ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）（配列番号８０）、Ｃ．ステルコラリウム（Ｃ．ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）ＩＩ（配列番号８１）、カルディスセルロシルプター・クリストヤンソニー（Ｃａｌｄｉｓｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）（配列番号８２）、Ｃ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）（配列番号８３）のアラインメントを示す。
【図７】プラスミドｐＩＫＭ１に基づくクロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）におけるａｃｋ遺伝子の不活化のための二重交差ノックアウトベクターの構築を示す。
【図８】複製プラスミドｐＮＷ３３Ｎに基づくクロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）におけるａｃｋ遺伝子の不活化のための二重交差ノックアウトベクターの構築を示す。
【図９】プラスミドｐＩＫＭ１に基づくクロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）におけるｌｄｈ遺伝子の不活化のための二重交差ノックアウトベクターの構築を示す。
【図１０】複製プラスミドベクターｐＮＷ３３Ｎに基づくクロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）におけるｌｄｈ遺伝子の不活化のための二重交差ノックアウトベクターの構築を示す。
【図１１】プラスミドｐＵＣ１９に基づくクロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）におけるｌｄｈ遺伝子の不活化のための二重交差自殺ベクターの構築を示す。
【図１２Ａ】セロビオース上で増殖させたＣ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）の産物形成およびＯＤ６００を示す。
【図１２Ｂ】Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）上で増殖させたＣ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）の産物形成およびＯＤ６００を示す。
【図１３Ａ】セロビオース上で増殖させたＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）の産物形成およびＯＤ６００を示す。
【図１３Ｂ】Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）上で増殖させたＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）の産物形成およびＯＤ６００を示す。
【図１４Ａ】セロビオース上で増殖させたＣ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）の産物形成およびＯＤ６００を示す。
【図１４Ｂ】Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）上で増殖させたＣ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）の産物形成およびＯＤ６００を示す。
【図１５Ａ】セロビオース上で増殖させたＣ．ステルコラリウム・ｓｕｂｓ．レプトスパルツム（Ｃ．ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ  ｓｕｂｓ．ｌｅｐｔｏｓｐａｒｔｕｍ）の産物形成およびＯＤ６００を示す。
【図１５Ｂ】Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）上で増殖させたＣ．ステルコラリウム  ｓｕｂｓ．レプトスパルツム（Ｃ．ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ  ｓｕｂｓ．ｌｅｐｔｏｓｐａｒｔｕｍ）の産物形成およびＯＤ６００を示す。
【図１６Ａ】セロビオース上で増殖させたカルディセルロシルプター・クリストヤンソニー（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）の産物形成およびＯＤ６００を示す。
【図１６Ｂ】Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）上で増殖させたカルディセルロシルプター・クリストヤンソニー（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）の産物形成およびＯＤ６００を示す。
【図１７Ａ】セロビオース上で増殖させたクロストリジウム・ファイトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の産物形成およびＯＤ６００を示す。
【図１７Ｂ】Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）上で増殖させたクロストリジウム・ファイトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の産物形成およびＯＤ６００を示す。
【図１８】２．５ｇ／Ｌキシランおよび２．５ｇ／Ｌセロビオースの４８時間の発酵後の全代謝副産物を示す。
【図１９】ａｃｋ遺伝子の地図および遺伝子破壊のためにＰＣＲによって増幅された領域を示す。
【図２０】ｌｄｈ２２６２遺伝子の地図および遺伝子破壊のためにＰＣＲによって増幅された領域を示す。
【図２１】Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）（Ｃ．ｃｅｌｌ．）ｌｄｈ（２２６２）二重交差ノックアウトフラグメントの一例を示す。
【図２２】クロストリジウム・ファイトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のａｃｋ遺伝子の地図および遺伝子破壊のためにＰＣＲによって増幅された領域を示す。
【図２３】クロストリジウム・ファイトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）における選択マーカーとしてｍＬｓ遺伝子を伴う推定二重交差ノックアウト構築物の一例を示す。
【図２４】ｌｄｈ１３８９遺伝子の地図および遺伝子破壊のためにＰＣＲによって増幅された領域を示す。
【図２５】選択マーカーとしてｍＬｓ遺伝子を伴う推定二重交差ノックアウト構築物の一例を示す。
【図２６】ｐＭＯＤ（商標）−２＜ＭＣＳ＞のｂｐ２５０〜５５０（配列番号８４）を表す図である。
【図２７】Ｃ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）を使用した１％Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）の産物濃度プロファイルを示す。エタノール対酢酸比をＥ／Ａとして示し、エタノール対全生成物の比をＥ／Ｔとして示す。
【図２８】Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンを、Ｃ．ｃｅｌｌ．ＡＣＫ遺伝子における挿入物（配列番号２１）に再標的化するためのベクターの一例を示す。
【図２９】Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンを、Ｃ．ｃｅｌｌ．ＬＤＨ２７４４遺伝子における挿入物（配列番号２３）に再標的化するためのベクターの一例を示す。
【図３０】１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のレベルにおけるＴ．シュードエタノリカス（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）３９Ｅ（配列番号８５）、Ｔ．ｓｐ株５９（配列番号８６）、Ｔ．サッカロリティカム（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）Ｂ６Ａ−ＲＩ（配列番号８７）、Ｔ．サッカロリティカム（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＹＳ４８５（配列番号８８）およびコンセンサス（配列番号８９）のアラインメントを示す。
【図３１】ｐｔａ遺伝子のレベルにおけるＴ．ｓｐ．株５９（配列番号３６）、Ｔ．シュードエタノリカス（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）（配列番号３５）、Ｔ．サッカロリティカム（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）Ｂ６Ａ−ＲＩ（配列番号３８）、Ｔ．サッカロリティカム（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＹＳ４８５（配列番号３２）およびコンセンサス（配列番号９０）のアラインメントを示す。
【図３２】ａｃｋ遺伝子のレベルにおけるＴ．ｓｐ．株５９（配列番号３７）、Ｔ．シュードエタノリカス（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）（配列番号３４）、Ｔ．サッカロリティカム（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）Ｂ６Ａ−ＲＩ（配列番号３９）、Ｔ．サッカロリティカム（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＹＳ４８５（配列番号３３）およびコンセンサス（配列番号９１）のアラインメントを示す。
【図３３】ｌｄｈ遺伝子のレベルにおけるＴ．ｓｐ．株５９（配列番号４１）、Ｔ．シュードエタノリカス（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）３９Ｅ（配列番号４２）、Ｔ．サッカロリティカム（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）Ｂ６Ａ−ＲＩ（配列番号４３）、Ｔ．サッカロリティカム（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＹＳ４８５（配列番号４０）およびコンセンサス（配列番号９２）のアラインメントを示す。
【図３４】解糖／発酵経路の略図を示す。
【図３５】ｐＭＵ３４０プラスミドの一例を示す。
【図３６】ｐＭＵ１０２  Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＰＤＣ−ＡＤＨプラスミドの一例を示す。
【図３７】ｐＭＵ１０２  Ｚ．パルマエ（Ｚ．ｐａｌｍａｅ）ＰＤＣ、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＤＨプラスミドの一例を示す。
【図３８】ｐＭＵ３６０のプラスミド地図を示す。ｐＭＵ３６０のＤＮＡ配列は、配列番号６１に記載されている。
【図３９】チアンフェニコール耐性形質転換体の９つのコロニーの乳酸レベルを示す。
【図４０】Ｔ．ｓａｃｃｈ．ｐｆｌ  ＫＯ単一交差プラスミドの一例（配列番号４７）を示す。
【図４１】Ｔ．ｓａｃｃｈ．ｐｆｌ  ＫＯ二重交差プラスミドの一例（配列番号４８）を示す。
【図４２】Ｃ．ｔｈｅｒｍ．ｐｆｌ  ＫＯ単一交差プラスミドの一例（配列番号４９）を示す。
【図４３】Ｃ．ｔｈｅｒｍ．ｐｆｌ  ＫＯ二重交差プラスミドの一例（配列番号５０）を示す。
【図４４】Ｃ．ｐｈｙｔｏ．ｐｆｌ  ＫＯ単一交差プラスミドの一例（配列番号５１）を示す。
【図４５】Ｃ．ｐｈｙｔｏ．ｐｆｌ  ＫＯ二重交差プラスミドの一例（配列番号５２）を示す。
【図４６】Ｔ．ｓａｃｃｈ．＃５９  Ｌ−ｌｄｈ  ＫＯ単一交差プラスミドの一例（配列番号５３）を示す。
【図４７】Ｔ．ｓａｃｃｈ．＃５９  Ｌ−ｌｄｈ  ＫＯ二重交差プラスミドの一例（配列番号５４）を示す。
【図４８】Ｔ．ｓａｃｃｈ．＃５９  ｐｔａ／ａｃｋ  ＫＯ単一交差プラスミドの一例（配列番号５５）を示す。
【図４９】Ｔ．ｓａｃｃｈ．＃５９  ｐｔａ／ａｃｋ  ＫＯ二重交差プラスミドの一例（配列番号５６）を示す。
【図５０】Ｔ．ｐｓｅｕｄｏ．Ｌ−ｌｄｈ  ＫＯ単一交差プラスミドの一例（配列番号５７）を示す。
【図５１】Ｔ．ｐｓｅｕｄｏ．Ｌ−ｌｄｈ  ＫＯ二重交差プラスミドの一例（配列番号５８）を示す。
【図５２】Ｔ．ｐｓｅｕｄｏ．ａｃｋ  ＫＯ単一交差プラスミドの一例（配列番号５９）を示す。
【図５３】Ｔ．ｐｓｅｕｄｏ．ｐｔａ／ａｃｋ  ＫＯ二重交差プラスミドの一例（配列番号６０）を示す。
【表の簡単な説明】
【００２１】
表１は、代表的な高度セルロース分解生物についてまとめている。
【００２２】
表２は、代表的な天然のセルロース分解生物およびキシラン分解生物についてまとめている。
【００２３】
表３は、基質資化に基づく細菌株の分類を示す。
【００２４】
表４は、イントロンをＣ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）酢酸キナーゼに再標的化させるための挿入位置およびプライマーを示す。
【００２５】
表５は、イントロンをＣ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）乳酸デヒドロゲナーゼに再標的化させるための挿入位置およびプライマーを示す。
【００２６】
表６は、操作されたサーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）株およびサーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株の発酵性能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の態様は、リグノセルロース系バイオマスからのエタノールの産生に使用するための好熱性または中温性の微生物の操作に関する。エタノール産生のための好熱性細菌の使用は、中温性エタノール産生体に基づく従来の方法を超える多くの利点を提供する。例えば、好熱性生物の使用は、より低いエタノール分離コスト、外部からの酵素添加の必要性の低減、および処理時間の低減のため、従来の処理方法を超える大幅な経済的節約を提供する。
【００２８】
本発明の態様は、新規の処理構成を使用することによって、セルロース系バイオマス含有材料のエタノール産生のコストを削減することができる方法に関する。特に、本発明は、遺伝子改変微生物においてエタノール産生を増大させるための多数の方法を提供する。
【００２９】
他の特定の実施の形態では、本発明は、遺伝子改変された好熱性または中温性の微生物に関し、ここで、遺伝子または特定のポリヌクレオチド配列は、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされ、ここで、前記遺伝子またはポリヌクレオチド配列は、発酵生成物として有機酸を産生する能力を微生物に付与する酵素をコードし、それによって、主要な発酵生成物としてエタノールを産生する微生物の能力を増大させる。さらに、連結バイオプロセスとして一般に公知である処理工程の新規の組み込みによって、本発明の態様は、セルロース系バイオマス含有原材料からのエタノールのより効率的な産生を提供する。前記材料の処理への遺伝子改変好熱性または中温性の微生物の組み入れは、発酵工程をより高い温度で行うことを可能にし、処理経済性を改善する。例えば、反応動態は、典型的に、温度に比例し、そのため、温度が高いほど、一般的に、全体的な産生速度の増大に関連する。さらに、温度が高いほど、ブロスからの揮発産生物の取り出しが容易であり、前処置後の冷却の必要性が減少する。
【００３０】
特定の実施の形態では、本発明は、発酵生成物としてエタノールを産生する能力を付与する酵素を産生する能力の増大を伴う遺伝子改変または組み換え好熱性または中温性の微生物に関し、ここで、前記酵素の存在は、リグノセルロース系バイオマス材料を代謝して、主要な発酵生成物としてエタノールを産生するプロセスを改変する。本発明の１つの態様では、１つもしくはそれ以上の非天然遺伝子が遺伝子改変された好熱性または中温性の微生物に挿入され、ここで、前記非天然遺伝子は、エタノールの代謝産生に関与する酵素をコードし、例えば、そのような酵素は、ペントース糖および／またはヘキソース糖を代謝する能力を付与し得る。例えば、１つの実施の形態では、酵素は、Ｄ−キシロースまたはＬ−アラビノース経路に関与し得、それによって、微生物に、ペントース糖、即ち、Ｄ−キシロースまたはＬ−アラビノースを代謝させる。Ｄ−キシロースまたはＬ−アラビノースの代謝または資化に関与する酵素をコードする非天然遺伝子を挿入（例えば、導入もしくは付加）することによって、微生物は、天然の生物と比較して、増大したエタノール産生能力を有する。
【００３１】
本発明はまた、本発明の微生物に組み込まれ得る新規の組成物を提供する。１つの実施の形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１〜７６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列の相補体である核酸分子を含む。別の実施の形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１〜７６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部の相補体である核酸分子を含む。配列番号１〜７６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、またはそのコーディング領域に相補的である核酸分子は、それが、配列番号１〜７６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、またはそのコーディング領域にハイブリダイズすることができ、それによって安定な二重鎖を形成するように、配列番号１〜７６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、またはそのコーディング領域に十分に相補的である核酸分子である。
【００３２】
なお別の好適な実施の形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１〜７６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列（例えば、ヌクレオチド配列の全長）、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部分に、少なくとも約５０％、５４％、５５％、６０％、６２％、６５％、７０％、７５％、７８％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上相同であるヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１〜７６のいずれか１つの核酸配列、またはそのコーディング領域の一部のみを含んでもよく；例えば、核酸分子は、プローブもしくはプライマーとして使用することができるフラグメントであってもよく、またはタンパク質の生物活性のある部分をコードするフラグメントであってもよい。別の実施の形態では、核酸分子は、配列番号１〜７６のいずれか１つの少なくとも約１２もしくは１５、好ましくは、約２０もしくは２５、より好ましくは、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、もしくは７５連続ヌクレオチドを含み得る。
【００３４】
定義
用語「異種ポリヌクレオチドセグメント」は、１つもしくはそれ以上ポリペプチド、またはポリペプチドの部分もしくはフラグメントをコードするポリヌクレオチドセグメントを含むことが意図される。異種ポリヌクレオチドセグメントは、任意の供給源、例えば、真核生物、原核細胞、ウイルスから誘導してもよく、または合成ポリヌクレオチドフラグメントであってもよい。
【００３５】
用語「プロモーター」または「サロゲートプロモーター」は、それが自然では転写制御しない目的の遺伝子を転写制御することができるポリヌクレオチドセグメントを含むことが意図される。特定の実施の形態では、サロゲートプロモーターの転写制御は、目的の遺伝子の発現の増大を生じる。特定の実施の形態では、サロゲートプロモーターは、目的の遺伝子の５’側に配置される。サロゲートプロモーターは、天然のプロモーターと入れ換えて使用してもよく、または天然のプロモーターに追加して使用してもよい。サロゲートプロモーターは、それが使用される宿主細胞に関して内因性であってもよく、またはそれは、宿主細胞に導入される異種ポリヌクレオチド配列、例えば、それが使用される宿主細胞に関して外因性であってもよい。
【００３６】
用語「遺伝子」または「ポリヌクレオチドセグメント」または「ポリヌクレオチド配列」は、核酸分子、例えば、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを含むことが意図され、非コーディング調節配列、およびイントロンをさらに含むことができる。加えて、この用語は、機能的遺伝子座に位置する１つもしくはそれ以上の遺伝子を含むことが意図される。加えて、この用語は、選択された目的に特異的な遺伝子を含むことが意図される。遺伝子は、宿主細胞に対して内因性であってもよく、または例えば、エピソーム的に維持されるプラスミドもしくはゲノムに安定に組み込まれるプラスミド(またはそのフラグメント)として宿主細胞に組み換え導入してもよい。プラスミド形態に加えて、遺伝子は、例えば、線状ＤＮＡの形態であってもよい。特定の実施の形態では、ポリヌクレオチドセグメントの遺伝子は、炭水化物からエタノールへの生体変換における少なくとも１つの工程に関与する。従って、この用語は、酵素の酢酸キナーゼ（ＡＣＫ）、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）、および／または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼのようなＤ−キシロース経路における酵素、Ｌ−アラビノースイソメラーゼおよびＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼのようなＬ−アラビノース経路における酵素のようなポリペプチドをコードする任意の遺伝子を含むことが意図される。遺伝子という用語はまた、特定の遺伝子のすべてのコピー、例えば、特定の遺伝子産物をコードする細胞中のすべてのＤＮＡ配列に及ぶことが意図される。
【００３７】
用語「転写制御」は、転写のレベルにおいて遺伝子発現を調節する能力を含むことが意図される。特定の実施の形態では、転写、およびそれ故、遺伝子発現は、目的の遺伝子のコーディング領域の５’末端付近のサロゲートプロモーターを置き換えるか、または付加し、それによって、変更された遺伝子発現を生じさせることによって、調節される。特定の実施の形態では、１つもしくはそれ以上の遺伝子の転写制御が操作されて、例えば、所望される割合のそのような遺伝子の最適な発現を生じる。この用語はまた、当該分野において認識される誘導性転写制御を含む。
【００３８】
用語「発現」は、少なくともｍＲＮＡ産生のレベルにおける遺伝子の発現を含むことが意図される。
【００３９】
用語「発現産物」は、発現される遺伝子の得られた産物、例えば、ポリペプチドを含むことが意図される。
【００４０】
用語「増大した発現」は、少なくとも増大したｍＲＮＡ産生のレベル、および好ましくは、ポリペプチド発現のレベルにおける遺伝子発現の変更を含むことが意図される。用語「増大した産生」は、ポリペプチド、またはそれらの組合せの酵素活性のレベルにおける発現されたポリペプチドの量における増大を含むことが意図される。
【００４１】
用語「活性」、「活性（複数）」、「酵素活性」、および「酵素活性（複数）」は同義的に使用され、好適な条件下で産生される場合、通常、選択されたポリペプチドに起因する任意の機能的活性を含むことが意図される。典型的に、選択されたポリペプチドの活性は、産生されるポリペプチドに関連する全酵素活性を包含する。宿主細胞によって産生され、酵素活性を有するポリペプチドは、細胞の細胞内空間に局在するか、細胞結合性であるか、細胞外環境に分泌されるか、またはそれらの組合せであり得る。選択された活性と比較して全活性を決定するための技術は、本明細書に記載されており、当該分野において公知である。
【００４２】
用語「キシラン分解活性」は、オリゴペントースおよびポリペントースにおけるグリコシド結合を加水分解する能力を含むことが意図される。
【００４３】
用語「セルロース分解活性」は、オリゴヘキソースおよびポリヘキソースにおけるグリコシド結合を加水分解する能力を含むことが意図される。セルロース分解活性はまた、セルロースおよびヘミセルロースを脱重合または脱分枝する能力を含み得る。
【００４４】
本明細書において使用する用語「乳酸デヒドロゲナーゼ」すなわち「ＬＤＨ」は、ピルビン酸塩を乳酸塩に変換することが可能な酵素を含むことが意図される。ＬＤＨはまた、ヒドロキシ酪酸塩の酸化も触媒することができることが理解される。
【００４５】
本明細書において使用する用語「アルコールデヒドロゲナーゼ」すなわち「ＡＤＨ」は、アセトアルデヒドをアルコール、有利なことに、エタノールに変換することが可能な酵素を含むことが意図される。
【００４６】
用語「ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性」は、ピルビン酸塩をアセトアルデヒドに酵素的に変換するポリペプチド（例えば、「ピルビン酸デカルボキシラーゼ」すなわち「ＰＤＣ」)の能力を含むことが意図される。典型的に、選択されたポリペプチドの活性は、例えば、酵素のより優れた基質親和性、耐熱性、異なるｐＨにおける安定性、またはこれらの特性の組合せを含む産生されるポリペプチドに関連する全酵素活性を包含する。
【００４７】
用語「エタノール生産性」は、発酵生成物として炭水化物からエタノールを産生する微生物の能力を含むことが意図される。この用語は、限定されえないが、天然に存在するエタノール生産生物、天然に存在するまたは誘導された変異を伴うエタノール生産生物、および遺伝子改変されているエタノール生産生物を含むことが意図される。
【００４８】
用語「発酵する」および「発酵」は、特に、発酵の産物として、炭水化物からエタノールが産生される酵素プロセス（例えば、細胞性または無細胞性、例えば、溶解物もしくは精製されたポリペプチド混合物）を含むことが意図される。
【００４９】
用語「分泌される」は、ポリペプチドのペリプラズム空間または細胞外環境への移動を含むことが意図される。用語「増大した分泌」は、所与のポリペプチドが増大したレベル（即ち、天然に存在する量の分泌より多く）分泌される状態を含むことが意図される。特定の実施の形態では、用語「増大して分泌される」は、天然に存在するレベルの分泌と比較して、少なくとも約１０％または少なくとも約１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、もしくはそれ以上である所与のポリペプチドの分泌の増大を指す。
【００５０】
用語「分泌ポリペプチド」は、細胞の細胞内空間から細胞外環境への別のポリペプチドの輸送を容易にする単独または他のポリペプチドと組み合わせられた任意のポリペプチドを含むことが意図される。特定の実施の形態では、分泌ポリペプチドは、グラム陰性またはグラム陽性宿主細胞に分泌活性を与えるのに十分なすべての必要な分泌ポリペプチドを包含する。典型的に、分泌タンパク質は、遺伝子操作を使用して、１つの宿主細胞から単離し、別の宿主細胞に移し得る単一の領域または遺伝子座においてコードされる。特定の実施の形態では、分泌ポリペプチドは、分泌活性を有する任意の細菌細胞から誘導される。特定の実施の形態では、分泌ポリペプチドは、ＩＩ型分泌活性を有する宿主細胞から誘導される。特定の実施の形態では、宿主細胞は、好熱性細菌細胞である。
【００５１】
用語「から誘導される」は、示された供給源からのポリヌクレオチドセグメントの(全体的もしくは部分的)単離、または示された供給源からのポリペプチドの精製を含むことが意図される。この用語は、例えば、直接クローニング、ＰＣＲ増幅、または示されたポリヌクレオチド供給源に関連した配列からもしくはそれに基づく人工合成を含むことが意図される。
【００５２】
「好熱性」とは、約４５℃もしくはそれ以上の温度で生育する生物を意味する。
【００５３】
「中温性」とは、約２０〜４５℃もしくはそれ以上の温度で生育する生物を意味する。
【００５４】
用語「有機酸」は、当該分野において認識されている。用語「乳酸」は、遊離酸または塩形態のいずれかにおける有機酸２−ヒドロキシプロピオン酸を指す。乳酸の塩形態は、中和剤、即ち、炭酸カルシウムまたは水酸化アンモニウムにかかわらず、「乳酸塩」を指す。用語「酢酸」は、遊離酸または塩形態のいずれかにおけるエタン酸としても公知の有機酸メタンカルボン酸を指す。酢酸の塩形態は「酢酸塩」と称される。
【００５５】
本発明の特定の実施の形態は、好熱性または中温性の微生物内の所定の遺伝子または特定のポリヌクレオチド配列の「挿入」（例えば、付加、組み込み、組み入れ、もしくは導入）を提供し、ここで、遺伝子または特定のポリヌクレオチド配列の前記挿入は、前記好熱性または中温性の微生物の得られる株が「遺伝子改変」もしくは「形質転換」されていると理解され得るような「遺伝子改変」または「形質転換」を包含することが理解され得る。特定の実施の形態では、株は、細菌、真菌、または酵母由来であってもよい。
【００５６】
本発明の特定の実施の形態は、好熱性または中温性の微生物内の所定の遺伝子もしくは特定のポリヌクレオチド配列の「不活化」または「欠失」を提供し、ここで、遺伝子もしくは特定のポリヌクレオチド配列の「不活化」または「欠失」は、前記好熱性または中温性の微生物の得られる株が「遺伝子改変」もしくは「形質転換」されていると理解され得るような「遺伝子改変」または「形質転換」を包含することが理解され得る。特定の実施の形態では、株は、細菌、真菌、または酵母由来であってもよい。
【００５７】
用語「ＣＢＰ生物」は、本発明の微生物、例えば、ＣＢＰに適切な特性を有する微生物を含むことが意図される。
【００５８】
本発明の１つの態様では、酵素の発現のようなそれらがコードする活性を活性化させるために、遺伝子または特定のポリヌクレオチド配列が挿入される。特定の実施の形態では、エタノールの代謝産生における酵素、例えば、ペントース糖および／またはヘキソース糖を代謝する酵素をコードする遺伝子を、中温性または好熱性生物に付加してもよい。本発明の特定の実施の形態では、酵素は、ペントース糖を代謝する能力を付与し、例えば、Ｄ−キシロース経路および／またはＬ−アラビノース経路に関与し得る。
【００５９】
本発明の１つの態様では、酵素の発現のようなそれらがコードする活性を活性化させるために、遺伝子または特定のポリヌクレオチド配列は、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされる。欠失は、機能を回復するための復帰変異の機会がないため、最大の安定性を提供する。あるいは、遺伝子の機能および／または発現を破壊する核酸配列の挿入（例えば、Ｐ１形質導入もしくは当該分野において公知の他の方法）により、遺伝子を部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートすることができる。用語「排除する」「排除」、および「ノックアウト」は、用語「欠失」と同義的に使用される。特定の実施の形態では、目的の好熱性または中温性の微生物の株は、有機酸の産生をノックアウトするための部位特異的相同組み換えによって操作してもよい。なお別の実施の形態では、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＤＮＡ（ａｓＤＮＡ）を使用して、特定の目的の遺伝子を部分的、実質的、もしくは完全にサイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートしてもよい。
【００６０】
特定の実施の形態では、本明細書に記載の欠失または不活化のために標的化された遺伝子は、微生物の天然の株に対して内因性であり得、それ故、「天然遺伝子」または「内因性遺伝子」と称されることが理解され得る。生物が遺伝子操作されておらず、またはそうでなければ生物の遺伝子および／または表現型構成を意図的に変更する様式で人為的に操作されてもいない場合、生物は「天然の状態」である。例えば、野生型の生物は、天然の状態であるとみなすことができる。他の実施の形態では、欠失または不活化のために標的化された遺伝子は、生物に対して非天然であり得る。
【００６１】
バイオマス
用語「リグノセルロース材料」、「リグノセルロース基質」、および「セルロース系バイオマス」は、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、またはそれらの組合せを含む任意のタイプのバイオマス、例えば、限定されないが、木質バイオマス、イネ科牧草、草木系のエネルギー作物、非木質植物バイオマス、農業廃棄物および／または農業残渣、森林残渣および／または森林廃棄物、製紙スラッジおよび／または古紙スラッジ、廃水処理スラッジ、一般廃棄物、ウェットおよびドライミル方式のトウモロコシエタノール工場由来のトウモロコシ繊維、ならびに製糖残留物を意味する。
【００６２】
非制限的例では、リグノセルロース材料として、再生木材パルプ繊維、大鋸屑、硬木、軟木、およびそれらの組合せのような木質バイオマス；スイッチグラス、コードグラス、ライグラス、リードカナリーグラス、ススキ、またはそれらの組合せのような草類；限定されないが、サトウキビバガスのような製糖残留物；限定されないが、イナワラ、籾殻、オオムギワラ、トウモロコシ穂軸、穀物ワラ、コムギワラ、カノーラワラ、エンバクワラ、エンバク種皮、およびトウモロコシ繊維のような農業廃棄物；限定されないが、ダイズ茎葉、トウモロコシ茎葉のような茎葉；ならびに限定されないが再生木材パルプ繊維、大鋸屑、硬木（例えば、ポプラ、オーク、カエデ、カバ、ヤナギ）、軟木、またはそれらの任意の組合せのような森林廃棄物を挙げることができるが、これらに限定されない。リグノセルロース材料は繊維の一種を含み得るか；あるいは、リグノセルロース材料は、異なるリグノセルロース材料を起源とする繊維の混合物を含み得る。特に有利なリグノセルロース材料は、コムギワラ、オオムギワラ、カノーラワラおよびエンバクワラを含む穀物ワラ；トウモロコシ繊維；トウモロコシ茎葉およびダイズ茎葉のような茎葉；スイッチグラス、リードカナリーグラス、コードグラス、およびススキのような草類；またはそれらの組合せのような農業廃棄物である。
【００６３】
ペーパースラッジもまた、エタノール産生のための実行可能な原料である。ペーパースラッジは、パルプ化および製紙から生じる固体残渣であり、最初のクラリファイヤにおける処理廃水から典型的に取り出される。３０ドル／湿重量トンの処分費において、スラッジ処理のコストは、販売のために産生される紙の５ドル／トンに等しい。湿性スラッジの廃棄コストは、エタノールへの変換のような他の用途のために材料を変換するための重要な動機付けになる。本発明によって提供される方法は、広範に適用可能である。さらに、糖化および／または発酵生成物を使用して、エタノールまたは有機酸、芳香族化合物、エステル、アセトンおよびポリマー中間体のようなさらに付加価値の高い化学物質を産生させてもよい。
【００６４】
ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬ）
ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ＰＦＬ）は、嫌気的グルコース代謝を調節するのに役立つ重要な酵素（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および他の生物において見出される)である。ラジカル化学を使用して、それは、ピルビン酸塩および補酵素Ａのギ酸塩およびアセチル−ＣｏＡ、エタノールの前駆体への可逆的変換を触媒する。ピルビン酸ギ酸リアーゼは、８５ｋＤａ、７５９残基のサブユニットから構成されるホモダイマーである。それは、主な触媒残基を含有するβフィンガーに挿入される１０の標準的なβ／αバレルモチーフを有する。Ｘ線結晶学によって解明された酵素の活性部位は、触媒を実施する３個の必須アミノ酸（Ｇｌｙ７３４、Ｃｙｓ４１８、およびＣｙｓ４１９）、基質ピルビン酸塩を近くに保持する３個の主要な残基（Ａｒｇ４３５、Ａｒｇ１７６、およびＡｌａ２７２）、ならびに２個のフランキング疎水性残基（Ｔｒｐ３３３およびＰｈｅ４３２）を保持する。
【００６５】
研究により、ピルビン酸ギ酸リアーゼの活性部位とクラスＩおよびクラスＩＩＩリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）酵素の活性部位との間に構造的類似性が見出された。３つの触媒残基の役割は次のとおりである：Ｇｌｙ７３４（グリシルラジカル）−Ｃｙｓ４１９を経てラジカルを断続的にＣｙｓ４１８に移動する；Ｃｙｓ４１８（チイルラジカル）−ピルビン酸カルボニルの炭素原子に対してアシル化化学を実施する；Ｃｙｓ４１９（チイルラジカル）−水素原子移動を実施する。
【００６６】
ピルビン酸ギ酸リアーゼについて提唱された機構は、Ｃｙｓ４１９を介するＧｌｙ７３４からＣｙｓ４１８へのラジカル移動から開始する。Ｃｙｓ４１８チイルラジカルは、ピルビン酸塩のＣ２（２番目の炭素原子）に共有結合で付加し、アセチル−酵素中間体（ここでラジカルを含有する）を生じる。アセチル−酵素中間体は、Ｃｙｓ４１９によって水素原子移動を受けるホルミルラジカルを放出する。これにより、ギ酸塩およびＣｙｓ４１９ラジカルが生じる。補酵素Ａは、Ｃｙｓ４１９ラジカルによって水素原子移動を受け、補酵素Ａラジカルを生じる。次いで、補酵素Ａラジカルは、Ｃｙｓ４１８からアセチル基を取り込み、アセチル−ＣｏＡを生じ、Ｃｙｓ４１８ラジカルを後に残す。次いで、ピルビン酸ギ酸リアーゼは、ラジカル移動を受け、ラジカルをＧｌｙ７３４に戻すことができる。上記の工程のそれぞれはまた、可逆的である。
【００６７】
さらなる２つの酵素が、ピルビン酸ギ酸リアーゼの「オン」および「オフ」の状態を調節して、嫌気的グルコース代謝を調節する：ＰＦＬアクティベース（ＡＥ）およびＰＦＬディアクティベース（ＤＡ）。活性型ピルビン酸ギ酸リアーゼは、アセチル−ＣｏＡ（ピルビン酸塩が利用可能である場合、エネルギーの生成に重要な小分子）の形成を可能にする。非活性型ピルビン酸ギ酸リアーゼは、基質が存在しても、反応を触媒しない。ＰＦＬアクティベースは、ラジカルＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）スーパーファミリーの一部である。
【００６８】
酵素は、５’−デオキシアデノシルラジカル（ラジカルＳＡＭ）を経てＧｌｙ７３４（Ｇ−Ｈ）をＧｌｙ７３４ラジカル（Ｇ＊）に変換することによって、ピルビン酸ギ酸リアーゼを「オン」に切り換える。ＰＦＬディアクティベース（ＤＡ）は、Ｇｌｙ７３４ラジカルをクエンチすることによって、ピルビン酸ギ酸リアーゼを「オフ」に切り換える。さらに加えて、ピルビン酸ギ酸リアーゼは、分子状の酸素（Ｏ２）に感受性であり、その存在は、酵素を締め出す。
【００６９】
キシロース代謝
キシロースは、多様な生物によって有用な産物に代謝され得る５炭素単糖である。キシロース代謝には主に２つの経路が存在し、それぞれ、それらが利用する特徴的な酵素が独特である。１つの経路は、「キシロースレダクターゼ−キシリトールデヒドロゲナーゼ」すなわちＸＲ−ＸＤＨ経路と呼ばれる。キシロースレダクターゼ（ＸＲ）およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）は、キシロース分解のこの方法において使用される２つの主要酵素である。ＸＹＬ１遺伝子によってコードされるＸＲは、キシロースからキシリトールへの還元を担い、補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨによって援助される。次いで、キシリトールは、ＸＹＬ２遺伝子を介して発現され、補因子ＮＡＤ＋によってのみ達成されるＸＤＨによって、キシルロースに酸化される。この経路に必要な多様な補因子およびそれらが使用に利用可能である程度のため、不均衡は、キシリトール副産物の過剰産生および所望のエタノールの非効率的産生を生じ得る。ＸＲおよびＸＤＨ酵素レベルの多様な発現が、キシロース代謝経路の効率を最適化するための試みとして研究室で試験されている。
【００７０】
キシロース代謝の他の経路は、「キシロースイソメラーゼ」（ＸＩ）経路と呼ばれる。酵素ＸＩは、キシロースのキシルロースへの直接変換を担い、キシリトール中間体を介して進行しない。両方の経路ともキシルロースを作製するが、利用される酵素は異なる。キシルロースの産生後、ＸＲ−ＸＤＨおよびＸＩ経路の両方とも、遺伝子ＸＫＳ１上でコードされる酵素キシルロキナーゼ（ＸＫ）を経て進行して、キシルロースをさらにキシルロース−５−Ｐに改変し、ここで、次いで、それは、さらなる異化のためにペントースリン酸経路に進入する。
【００７１】
キシロース代謝中のペントースリン酸経路を介するフラックスに関する研究により、この工程の速度を制限することは、エタノールへの発酵の効率に有益であり得ることが示された。エタノール産生を改善し得るこのフラックスに対する改変として、ａ）ホスホグルコースイソメラーゼ活性を低下させること、ｂ）ＧＮＤ１遺伝子を欠失すること、およびｃ）ＺＷＦ１遺伝子を欠失することが挙げられる（Ｊｅｐｐｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ペントースリン酸経路は、代謝中にさらなるＮＡＤＰＨを生成するため、この工程を制限することは、ＮＡＤ（Ｐ）ＨとＮＡＤ＋補因子との間の既に明白な不均衡を補正し、キシリトール副産物を減少するのに役立つ。２つのキシロース代謝経路を比較する別の実験は、ＸＩ経路が最もキシロースを代謝して、最大のエタノール収量を生じることが可能であった一方、ＸＲ−ＸＤＨ経路は、より速い速度のエタノール産生に到達したことを示した（Ｋａｒｈｕｍａａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００７２】
微生物
本発明は、ＣＢＰに必要な基質資化および産物形成特性の組合せを伴う微生物の開発のための多数のストラテジーを含む。「天然のセルロース分解ストラテジー」は、天然に存在するセルロース分解微生物を操作して、収量および力価のような産物関連特性を改善することをに関与する。「組み換えセルロース分解ストラテジー」は、高い産物収量および力価を示す天然の非セルロース分解生物を操作して、セルロース資化もしくはヘミセルロース資化または両方を可能にする異種セルラーゼ系を発現させることに関与する。
【００７３】
セルロース分解微生物
セルロース分解性であるか、またはセルロース分解活性を有することが文献において報告されたいくらかの微生物が、結晶セルロースならびに他の多様な糖において増殖するそれらの能力を含む多様な手段によって、特徴付けされている。さらに、生物は、セルロースおよびヘミセルロースを脱重合および脱分枝するそれらの能力を含むがそれらに限定されない他の手段によって特徴付けしてもよい。クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）（株ＤＳＭＺ  １２３７）を使用して、目的の生物の性能を比較評価した。本明細書において使用するＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）は、ＤＳＭＺ１２３７、ＤＳＭＺ１３１３、ＤＳＭＺ２３６０、ＤＳＭＺ４１５０、ＤＳＭＺ７０７２、およびＡＴＣＣ３１９２４を含むがこれらに限定されない様々な株を含み得る。本発明の特定の実施の形態では、Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）の株は、ＤＳＭＺ１３１３またはＤＳＭＺ１２３７を含み得るが、これらに限定されない。別の実施の形態では、本発明に使用するために特に適切な目的の生物は、Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）に対して７０％を超える１６Ｓ  ｒＤＮＡ相同性を伴うセルロース分解微生物を含む。クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｃ．ステルコラリウム（Ｃ．ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）、Ｃ．ステルコラリウム（Ｃ．ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）ＩＩ、カルディスセルロシルプター・クリストヤンソニー（Ｃａｌｄｉｓｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）、Ｃ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のアラインメントは、１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のレベルにおいて７３〜８５％の相同性を示す（図６）。
【００７４】
クロストリジウム・ストラミニソルベンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）は、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）上でＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）とほぼ同様に良好に増殖することが決定された。表１は、所定の高度セルロース分解生物についてまとめている。
【表１】
2010526536.tif 000002
【００７５】
生物を、２０ｇ／Ｌセロビオースまたは２０ｇ／ＬのＡｖｉｃｅｌ（登録商標）上で増殖させた。Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）を６０℃で増殖させ、Ｃ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）を５５℃で増殖させた。両方とも、５０ｍＭのＭＯＰＳを伴うＭ１２２上で、−８０℃冷凍ストック（起源ＤＳＭＺ）からプレ培養した。中期〜後期対数増殖期の間、プレ培養物を使用して、１００ｍＬ血清瓶中のバッチ培養物を５０ｍＬの作業容積に播種した。代謝副産物および糖消費のＨＰＬＣ分析のために、定期的に液体サンプルを取り出した。これらの各時点で、ＯＤ６００を測定した。図１２Ａおよび１２Ｂは、それぞれセロビオースおよびＡｖｉｃｅｌ（登録商標）に対するＣ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）の産物形成およびＯＤ６００を示す。ＯＤが低下し、産物形成が水平レベルになる４８時間前に、実質的セロビオース（３７％）が消費された。図１３Ａおよび１３Ｂは、それぞれセロビオースおよびＡｖｉｃｅｌ（登録商標）に対するＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）の産物形成およびＯＤ６００を示す。Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）は、産物形成が水平レベルになった時点の４８時間内に、セロビオースの約６０％を消費した。有機酸の形成による阻害は、基質の不完全な資化を生じた。
【００７６】
例えば、Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）およびＣ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）を含む所定の微生物は、Ｄ−キシロースまたはＬ−アラビノースのようなペントース糖を代謝することができないが、ヘキソース糖を代謝することは可能である。Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースは両方とも、バイオマスにおいて豊富な糖であり、Ｄ−キシロースは、軟木および硬木において約１６〜２０％を占め、Ｌ−アラビノースは、トウモロコシ繊維において約２５％を占める。従って、本発明の１つの目的は、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースのようなペントース糖を代謝し、それによって、バイオマス〜エタノール産業における発酵のための生体触媒としてのそれらの使用を増強する能力を有する遺伝子改変セルロース分解微生物を提供する。
【００７７】
セルロース分解およびキシラン分解微生物
セルロース分解性およびキシラン分解性の両方であることが文献から決定されたいくらかの微生物が、結晶セルロースおよびカバキシランならびに他の多様な糖に対して増殖するそれらの能力によって、特徴付けされている。クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）を使用して、目的の生物の性能を比較評価した。特徴付けのために選択した株のうち、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ステルコラリウムｓｕｂｓ．レプトスパルツム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ  ｓｕｂｓ．ｌｅｐｔｏｓｐａｒｔｕｍ）、カルディセルロシルプター・クリストヤンソニー（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）およびクロストリジウム・ファイトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）が、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）上では低度に、カバキシラン上では良好に増殖した。表２は、天然のセルロース分解およびキシラン分解生物のいくつかについてまとめている。
【表２−１】
2010526536.tif 000003
【表２−２】
2010526536.tif 000004
【００７８】
生物を、２０ｇ／Ｌセロビオース、２０ｇ／ＬのＡｖｉｃｅｌ（登録商標）または５ｇ／Ｌカバキシラン上で増殖させた。Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）を３７℃で増殖させ、Ｃ．ステルコラリウム・ｓｕｂｓ．レプトスパルツム（Ｃ．ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ  ｓｕｂｓ．ｌｅｐｔｏｓｐａｒｔｕｍ）を６０℃で増殖させ、カルディセルロシルプター・クリストヤンソニー（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）を７５℃で増殖させ、クロストリジウム・ファイトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）を３７℃で増殖させた。すべてを、５０ｍＭのＭＯＰＳを補充したＭ１２２ｃにおいて、−８０℃冷凍ストックからプレ培養した。中期〜後期対数増殖期の間、プレ培養物を使用して、１００ｍＬ血清瓶中のバッチ培養物を５０ｍＬの作業容積に播種した。代謝副産物および糖消費のＨＰＬＣ分析のために、定期的に液体サンプルを取り出した。これらの各時点で、ＯＤ６００を測定した。図１４Ａ〜１７Ｂは、セロビオースおよびＡｖｉｃｅｌ（登録商標）上での増殖の産物形成およびＯＤ６００を示す。
【００７９】
個別の実験で、セロビオース、グルコース、キシロース、ガラクトース、アラビノース、マンノースおよびラクトースを含む２．５ｇ／Ｌの単糖ならびに５ｇ／ＬのＡｖｉｃｅｌ（登録商標）およびカバキシラン上で、生物を増殖させた。図１８では、産物形成を、２日後のセロビオースおよびカバキシランにおいて比較している。表３は、細菌株が、それらの基質資化に基づいてどのように分類され得るかについてまとめている。
【表３】
2010526536.tif 000005
【００８０】
微生物のトランスジェニック変換
本発明は、所定の微生物のトランスジェニック変換のための組成物および方法を提供する。例えば、Ｄ−キシロースおよび／またはＬ−アラビノースを含むエタノールの代謝経路に関与する酵素をコードする遺伝子が、これらの遺伝子の１つもしくはそれ以上を欠如する細菌株、例えば、Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）またはＣ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）に導入される場合、Ｄ−キシロース上での増殖またはＬ−アラビノース上での増殖について、形質転換株を選択し得る。他のクロストリジウム種由来の遺伝子もＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）およびＣ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）において発現されるはずであることが予想される。標的遺伝子供与体として、ヘキソース糖およびペントース糖を代謝する能力を付与する微生物、例えば、Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、カルディセルロシルプター・クリストヤンソニー（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）、Ｃ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｃ．ステルコラリウム（Ｃ．ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）、およびサーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）を挙げることができる。
【００８１】
Ｔ．サッカロリティカム（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、およびＣ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のゲノムが利用可能である。従って、本発明は、上記の３種の宿主のそれぞれにおけるキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼに対応する配列を提供する。特に、Ｔ．サッカロリティカム（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のキシロースイソメラーゼ（配列番号６）、キシルロキナーゼ（配列番号７）、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（配列番号８）、およびＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼ（配列番号９）に対応する配列を本明細書に記載する。同様に、Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のキシロースイソメラーゼ（配列番号１０）、キシルロキナーゼ（配列番号１１）、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（配列番号１２）、およびＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼ（配列番号１３）に対応する配列を本明細書に記載する。Ｃ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）は、Ｄ−キシロース経路を利用し、Ｌ−アラビノースを資化しない。従って、Ｃ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来のキシロースイソメラーゼ（配列番号１４）およびキシルロキナーゼ（配列番号１５）に対応する配列を本明細書に記載する。
【００８２】
Ｃ．クリストヤンソニー（Ｃ．ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）は、キシロースを代謝する。この目的のために、Ｃ．クリストヤンソニー（Ｃ．ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）のキシロースイソメラーゼ（配列番号７１）およびキシルロキナーゼ（配列番号７０）遺伝子を配列決定し、本明細書に提供する。Ｃ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）は、キシロース上では増殖しないことが示されているが、しかし、それは、炭素源としてキシロース上での適応後に機能的であり得るキシロースイソメラーゼ（配列番号７３）およびキシルロキナーゼ（配列番号７２）遺伝子を含有する。
【００８３】
Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）およびＣ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）は、Ｄ−キシロースからエタノールへの経路および／またはＬ−アラビノース資化経路において１つもしくはそれ以上の既知の遺伝子または酵素を欠如し得る。図２および３は、Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）におけるこれらの経路のそれぞれにおいて欠落している２つの重要な酵素を示す。Ｃ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）は、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼを有するが、これらの酵素の機能性については知られていない。ゲノムの配列決定では、Ｃ．ストラミノソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ）のＬ−アラビノースイソメラーゼまたはＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼのいずれのコピーも示されていない。
【００８４】
Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）およびＣ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）は、キシルロースを代謝することができないが、これは、Ｄ−キシロースをＤ−キシルロースに変換するキシロースイソメラーゼ（図２では、「ＸＩ」または５．３．１．５と称する）、およびＤ−キシルロースをＤ−キシルロース−５−リン酸に変換するキシルロキナーゼ（図２では、「ＸＫ」または２．７．１．１とも称する）の遺伝子の不在（Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ））、あるいは活性および／または発現の欠如（Ｃ．ストラミンソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｓｏｌｖｅｎｓ））を反映し得る。さらに加えて、キシロースの輸送は、Ｃ．ストラミンソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｓｏｌｖｅｎｓ）では制限的であり得る。この潜在的制限は、Ｔ．サッカロリティカム（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）およびＣ．クリストヤンソニー（Ｃ．ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）のようなキシロース資化生物由来の糖輸送遺伝子の発現によって克服され得る。
【００８５】
Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）およびＣ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）はまた、Ｌ−アラビノースを代謝することができないが、これは、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（図３では、５．３．１．４とも称する）およびＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼ（図３では、５．１．３．４とも称する)の遺伝子の不在を反映し得る。
【００８６】
上記の４つの遺伝子、例えば、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、Ｌ−アラビノースイソメラーゼおよびＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼは、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）（図４を参照のこと）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｃ．ステルコラリウム（Ｃ．ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）、カルディスセルロシルプター・クリストヤンソニー（Ｃａｌｄｉｓｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）、およびＣ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）を含むが、これらに限定されないいくらかのクロストリジウム種およびサーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）種に存在し；これらの株は、これらの糖の良好な資化体である。上記の細菌株は、本明細書に記載の遺伝子の供与体として使用され得ることが理解されよう。
【００８７】
Ｃ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）は、上記の２つのキシロース経路遺伝子（キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ）を発現するが、上記のアラビノース経路遺伝子（Ｌ−アラビノースイソメラーゼおよびＬ−リブロース−５−リン酸４−エピメラーゼ）を欠如するかまたは発現しない（図５を参照のこと）。
【００８８】
従って、本発明の目的は、例えば、バイオマス由来のペントース、例えば、Ｄ−キシロースまたはＬ−アラビノース代謝からのエタノールの産生に必要な１つもしくはそれ以上の酵素の遺伝子を誘導することによって、糖資化能を最適化するように、上記の細菌株のいくつかを改変することである。トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、ＧＡＰＤＨ、およびＬＤＨのようなＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）またはＣ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）の天然プロモーターを含むプロモーターを使用して、これらの遺伝子を発現させてもよい。Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）の天然プロモーターに対応する配列として、（ＴＰＩ）（配列番号１６）、ＧＡＰＤＨ（配列番号１７）、およびＬＤＨ（配列番号１８）が挙げられる。一旦、遺伝子がクローニングされたら、発現の前に、コドン最適化を実施してもよい。次いで、例えば、天然プロモーター、キシラン分解性遺伝子またはアラビノース分解性（ａｒａｂｉｎｏｌｙｔｉｃ）遺伝子、および選択マーカーを含有するカセットを使用して、Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）またはＣ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）を形質転換し、炭水化物供給源としてＤ−キシロースまたはＬ−アラビノースを含有する培地上でのＤ−キシロースおよびＬ−アラビノース増殖について選択してもよい。
【００８９】
トランスポゾン
宿主に進入した外来ＤＮＡを選択するために、ＤＮＡが目的の生物において安定に維持されることが好適である。プラスミドに関して、これが生じ得る２つのプロセスが存在する。１つは、複製プラスミドの使用を介する。これらのプラスミドは、宿主に認識され、娘細胞への細胞分裂中に分配される安定的、自律的な染色体外エレメントとしてプラスミドを複製させる複製開始点を有する。第２のプロセスは、プラスミドの染色体への組み込みを介して生じる。これは、主に相同組み換えによって生じ、プラスミド全体またはプラスミドの部分の宿主染色体への挿入を生じる。それ故、プラスミドおよび選択マーカーは、染色体の組み込み片として複製され、娘細胞に分離される。従って、選択マーカーの使用を介して、プラスミドＤＮＡが形質転換事象中に細胞に進入しているかどうかを確かめるには、複製プラスミドの使用またはプラスミドを染色体に組み換える能力が必要である。特に、一式の遺伝子ツールを有さない生物を取り扱う場合、これらのような要件を満たしたものに常に遭遇し得る訳ではない。
【００９０】
プラスミド関連マーカーに関する問題を回避するための１つの方法は、トランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、トランスポゼースと称する酵素機構によって認識されるモザイクＤＮＡ配列によって規定される可動性ＤＮＡエレメントである。トランスポゼースの機能は、トランスポゾンＤＮＡを宿主または標的ＤＮＡに無作為に挿入することである。標準的な遺伝子操作によって、選択マーカーをトランスポゾンにクローニングすることができる。得られるＤＮＡフラグメントは、インビトロ反応でトランスポゼース機構に結合させることができ、複合体をエレクトロポレーションによって標的細胞に導入することができる。染色体へのマーカーの安定な挿入は、トランスポゼース機構の機能のみを必要とし、相同組み換えまたは複製プラスミドの必要性を軽減する。
【００９１】
トランスポゾンの組み込みに関連する無作為性には、変異誘発の形態として作用するという利点が加えられる。トランスポゾン変異の混交を含むラブラリーを作製することができる。これらのライブラリーは、所望される表現型を伴う変異を生成するためのスクリーニングまたは選択に使用することができる。例えば、ＣＢＰ生物のトランスポゾンライブラリーを、より多くのエタノール、あるいはより少ない乳酸および／またはより少ない酢酸塩を産生する能力についてスクリーニングし得る。
【００９２】
天然のセルロース分解ストラテジー
天然に存在するセルロース分解微生物は、天然のストラテジーを介するＣＢＰ生物開発のための開始点である。嫌気性菌および通性嫌気性菌は特に興味深い。主な目的は、産業プロセスの要件を満たす産物収量およびエタノール力価を操作することである。これらの目的に関係する混合酸発酵の代謝工学は、中温性の、非セルロース分解腸内細菌の場合では成功している。適切な遺伝子導入技術における最近の開発は、このタイプの研究をセルロース分解細菌によって行うことを可能にしている。
【００９３】
組み換えセルロース分解ストラテジー
所望される産物形成特性（例えば、高いエタノール収量および力価）を伴う非セルロース分解微生物は、組み換えセルロース分解ストラテジーによるＣＢＰ生物開発のための開始点である。そのような開発の主な目的は、前処置されたリグノセルロースに対する増殖および発酵を可能にする異種セルラーゼ系を操作することである。セルラーゼの異種産生は、主に高収量でエタノールを産生する細菌宿主（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、およびザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の操作された株）ならびに酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によって実行されている。Ｋ．オキシトカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）の株におけるセルラーゼ発現は、結晶セルロースでの増大した加水分解収量（但し、セルラーゼの添加を伴わなければ増殖は認められない）、および非結晶セルロースにおける嫌気的増殖を生じた。多数の糖分解酵素がＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において機能的に発現されているが、そのような発現の結果としてのセルロース上での嫌気的増殖は、最終的に実証されていない。
【００９４】
本発明の態様は、天然のセルロース分解ストラテジーを介する改変のための宿主としての好熱性または中温性の微生物の使用に関する。バイオテクノロジーのプロセス用途におけるそれらの可能性は、付随する高い代謝速度、物理的および化学的に安定な酵素の産生、ならびに最終産物の収量の上昇を伴って比較的高い温度で増殖するそれらの能力に起因する。好熱性細菌の主なグループとして、真正細菌および古細菌が挙げられる。好熱性真正細菌として、次のものが挙げられる：光合成細菌、例えば、シアノバクテリア、紅色細菌、および緑色細菌；グラム陽性細菌、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、乳酸菌、およびアクチノマイセス；ならびに他の真正細菌、例えば、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スピロヘータ、デスルホトマクルム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）、グラム陰性好気菌、グラム陰性嫌気菌、およびサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）。古細菌のうち、メタン生成菌、高度高熱菌（当該分野において認識されている用語）、およびサーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）が考慮される。特定の実施の形態では、本発明は、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属のグラム陰性有機栄養好熱菌、グラム陽性真正細菌、例えば、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属に関し、それらはまた、桿菌および球菌の両方、真正細菌の群における属、例えば、サーモシフォ（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ）およびサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、古細菌の属、例えば、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）（桿状）、サーモフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）（桿状）、パイロディクティウム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）、アシディアヌス（Ａｃｉｄｉａｎｕｓ）、スルホロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、パイロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモディスカス（Ｔｈｅｒｍｏｄｉｓｃｕｓ）、スタフィロサーマス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ）、デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アーキオグロバス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ならびにメタノピルス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）を含む。本発明に適切であり得る好熱性または中温性（細菌、原核微生物、および真菌を含む）のいくつかの例として、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：クロストリジウム・サーモスルフロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・サーモアセチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・サーモサッカロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・タルタリボルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔａｒｔａｒｉｖｏｒｕｍ）、クロストリジウム・サーモセルラセウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｌａｓｅｕｍ）、クロストリジウム・ファイトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、クロストリジウム・ストラミノソルベンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｒａｍｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ）、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモバクテロイデス・アセトエチリカス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ａｃｅｔｏｅｔｈｙｌｉｃｕｓ）、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、アネロセルム・サーモフィリウム（Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ）、パイロディクティウム・オカルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ）、サーモプロテウス・ニュートロフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモフィラム・リブルム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ  ｌｉｂｒｕｍ）、サーモスリクス・チオパルス（Ｔｈｅｒｍｏｔｈｒｉｘ  ｔｈｉｏｐａｒｕｓ）、デスルホビブリオ・サーモフィラス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、ヒドロゲノモナス・サーモフィラス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモミクロビウム・ロゼウム（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖａｓ）、サーマス・ルベル（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クロロフレクサス・アウランチアクス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、パイロディクティウム・アビシ（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ａｂｙｓｓｉ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シアニジウム・カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ）、マスティゴクラダス・ラミノサス（Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ  ｌａｍｉｎｏｓｕｓ）、クラミドスリクス・カリジスシマ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｔｈｒｉｘ  ｃａｌｉｄｉｓｓｉｍａ）、クラミドスリクス・ペニシラタ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｔｈｒｉｘ  ｐｅｎｉｃｉｌｌａｔａ）、チオトリクス・カーネア（Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ  ｃａｒｎｅａ）、フォルミディウム・テヌイスシムム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｔｅｎｕｉｓｓｉｍｕｍ）、フォルミディウム・ジェイセリコーラ（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｇｅｙｓｅｒｉｃｏｌａ）、フォルミディウム・サブテルラネウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ）、フォルミディウム・ビジャヘンシ（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｂｉｊａｈｅｎｓｉ）、オシラトリア・フィリフォルミス（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、シネココッカス・リビダス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄｕｓ）、クロロフレクサス・アウランチアクス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、パイロディクティウム・ブロッキイ（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ）、硫黄酸化細菌（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、チオバチルス・タソフィリカ（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃａ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、セルコスルサイファー・ハマテンシス（Ｃｅｒｃｏｓｕｌｃｉｆｅｒ  ｈａｍａｔｈｅｎｓｉｓ）、バルカンフィア・レイチ（Ｖａｈｌｋａｍｐｆｉａ  ｒｅｉｃｈｉ）、サイクリディウム・キトルルス（Ｃｙｃｌｉｄｉｕｍ  ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、ダクチィラリア・ガルロパバ（Ｄａｃｔｙｌａｒｉａ  ｇａｌｌｏｐａｖａ）、シネココッカス・リビダス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄｕｓ）、シネココッカス・エロンガータス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、シネココッカス・ミネルヴァ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｎｅｒｖａｅ）、シネコシスティス・アクアチルス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ａｑｕａｔｉｌｕｓ）、アファノカプサ・サーマリス（Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ  ｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、オシラトリア・テレブリホルミス（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｔｅｒｅｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）、オシラトリア・アンフィビア（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ａｍｐｈｉｂｉａ）、オシラトリア・ゲルミナタ（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｇｅｒｍｉｎａｔａ）、オシラトリア・オケニイ（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｏｋｅｎｉｉ）、フォルミディウム・ラミノスム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｌａｍｉｎｏｓｕｍ）、フォルミディウム・パルパラシエンス（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｐａｒｐａｒａｓｉｅｎｓ）、シンプロカ・サーマリス（Ｓｙｍｐｌｏｃａ  ｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、バチルス・アシドカルダリアス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉａｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモカテナラタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎａｌａｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・パミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｍｉｌａｓ）、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕ���ｔｉｌｉｓ）、バチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、デスルホトマクルム・ニグリフィカンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サーモフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム・サーモフィルム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ストレプトマイセス・フラグメントスポラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔｏｓｐｏｒｕｓ）、ストレプトマイセス・サーモニトリフィカンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ストレプトマイセス・サーモブルガリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｖｕｌｇａｒｉｓ）、シュードノカルジア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、好熱性放線菌（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サーモアクチノマイセス・サッカリ（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓａｃｃｈａｒｉ）、サーモアクチノマイセス・カンジダス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｃａｎｄｉｄａｓ）、サーモモノスポラ・カーバタ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｒｖａｔａ）、サーモモノスポラ・ビリディス（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｖｉｒｉｄｉｓ）、サーモモノスポラ・シトリナ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｉｔｒｉｎａ）、ミクロビスポラ・サーモディアスタティカ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｄｉａｓｔａｔｉｃａ）、ミクロビスポラ・アエラータ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ａｅｒａｔａ）、ミクロビスポラ・ビスポラ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｂｉｓｐｏｒａ）、アクチノビフィダ・ジコトミカ（Ａｃｔｉｎｏｂｉｆｉｄａ  ｄｉｃｈｏｔｏｍｉｃａ）、アクチノビフィダ・クロモゲナ（Ａｃｔｉｎｏｂｉｆｉｄａ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎａ）、ミクロポリスポーラ・ケシア（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｃａｅｓｉａ）、ミクロポリスポーラ・フェニィ（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｆａｅｎｉ）、ミクロポリスポーラ・セ
チブギダ（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｃｅｃｔｉｖｕｇｉｄａ）、ミクロポリスポーラ・カブロブルネア（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｃａｂｒｏｂｒｕｎｅａ）、ミクロポリスポーラ・サーモビリダ（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｖｉｒｉｄａ）、ミクロポリスポーラ・ビリジニグラ（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｖｉｒｉｄｉｎｉｇｒａ）、メタノバクテリウム・サーモオートスロピクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｈｒｏｐｉｃｕｍ）、カルディセルロシルプター・アセチゲネス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ａｃｅｔｉｇｅｎｕｓ）、カルディセルロシルプター・サッカロリティカス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、カルディセルロシルプター・クリストヤンソニー（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）、カルディセルロシルプター・オーウェンセンシス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｏｗｅｎｓｅｎｓｉｓ）、カルディセルロシルプター・ラクトアセティカス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｌａｃｔｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、それらの変異体、および／またはそれらの子孫。
【００９５】
特定の実施の形態では、本発明は、フェルビドバクテリウム・ゴンデワネンス（Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｎｄｗａｎｅｎｓｅ）、クロストリジウム・スラルコラリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｌａｃｔｉｃｕｍ）、ムーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）ｓｐ．、およびロドサーマス・マリナス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）からなる群より選択される好熱性細菌に関する。
【００９６】
特定の実施の形態では、本発明は、サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはサーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属の好熱性細菌に関し、次からなる群より選択される種を含むが、これらに限定されない：サーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ）、サーモアナエロバクテリウム・アオテアロエンス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｏｔｅａｒｏｅｎｓｅ）、サーモアナエロバクテリウム・ポリサッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・ジアエ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｚｅａｅ）、サーモアナエロバクテリウム・キシラノリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ）、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、サーモアナエロバクター・サーモヒドロスルフリカス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ）、サーモアナエロバクター・エタノリカス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）、サーモアナエロバクター・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ）、それらの変異体、およびそれらの子孫。
【００９７】
特定の実施の形態では、本発明は、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サッカロコッカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、およびアノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物に関し、次からなる群より選択される種を含むが、これらに限定されない：ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サッカロコッカス・カルドキシロシリティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｌｄｏｘｙｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ）、サッカロッカス・サーモフィラス（Ｓａｃｃｈａｒｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、パエニバチルス・キャンピナセンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ）、バチルス・フラボテルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｏｔｈｅｒｍｕｓ）、アノキシバチルス・カムチャッカエンシス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｍｃｈａｔｋｅｎｓｉｓ）、アノキシバチルス・ゴネンシス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｏｎｅｎｓｉｓ）、それらの変異体、およびそれらの子孫。
【００９８】
特定の実施の形態では、本発明は、サッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ）；フラボバクテリウム・ジョンソンニエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）；フィブロバクター・サクシノゲネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）；クロストリジウム・ヒュンゲイテイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｕｎｇａｔｅｉ）；クロストリジウム・ファイトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）；クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）；クロストリジウム・アルドリチイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｌｄｒｉｃｈｉｉ）；クロストリジウム・テルミチディディス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｒｍｉｔｉｄｉｄｉｓ）；アセチビブリオ・セルロライチカス（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）；アセチビブリオ・エタノルギグネンス（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ  ｅｔｈａｎｏｌｇｉｇｎｅｎｓ）；アセチビブリオ・マルティボランス（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）；バクテロイデス・セルロソルベンス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ）；およびアルカリバクター・サッカロホメタンス（Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｃｃｈａｒｏｆｏｍｅｎｔａｎｓ）、それらの変異体およびそれらの子孫からなる群より選択される中温性の細菌に関する。
【００９９】
本発明の方法
解糖中、細胞は、ＡＴＰおよびＮＡＤＨの純産生を伴って、グルコースのような単糖をピルビン酸に変換する。酸化的リン酸化のために機能している電子伝達系がなければ、ピルビン酸の少なくとも９５％が、ＮＡＤ＋（継続した解糖およびＡＴＰ生成に必須の要件）を再生する短い経路で消費される。これらのＮＡＤ＋再生系の廃棄生成物を、一般に、発酵生成物と称する。
【０１００】
微生物は、乳酸塩（乳酸の塩形態）、酢酸塩（酢酸の塩形態）、コハク酸塩、酪酸塩のような有機酸、ならびにエタノール、ブタノール、アセトン、およびブタンジオールのような中性産物を含む多様な発酵生成物を産生する。発酵の最終産物は、多様な程度で、次を含むいくらかの基本的特徴を共有する：それらは、それらが最初に生成されるときの条件下では比較的非毒性であるが、蓄積により毒性になること；およびそれらの中間前駆体が、解糖中に末端電子受容体としての役割を果たしたため、それらは、ピルビン酸よりも還元されること。本発明の態様は、リグノセルロース系バイオマス基質からのエタノールの産生において有用な新規の微生物を提供するための遺伝子ノックアウト技術の使用に関する。本明細書に記載の有機酸への非制限的経路のような競合経路をコードする１つもしくはそれ以上の遺伝子を欠失または不活化すること、場合により、それに続く、発酵生成物としてエタノールを産生する改善された性能を伴う変異体の増殖に基づく選択によって、形質転換生物が調製される。
【０１０１】
特定の実施の形態では、微生物に、発酵生成物として乳酸を産生する能力を付与する少なくとも１つの遺伝子を天然状態で含有する好熱性または中温性の微生物を、形質転換して、前記少なくとも１つの遺伝子の発現を減少または排除する。前記微生物に、発酵生成物として乳酸を産生する能力を付与する遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼの発現をコードし得る。ＬＤＨの発現をコードする遺伝子または特定のポリヌクレオチド配列の欠失もしくは抑制は、全体的解糖経路における反応スキームを低減または排除し、それによって、ピルビン酸塩は乳酸に変換され；解糖のこれらの第１段階からのピルビン酸塩の得られる相対量は、エタノールの増産を可能にするものであろう。
【０１０２】
特定の実施の形態では、微生物に発酵生成物として酢酸を産生する能力を付与する少なくとも１つの遺伝子を天然状態で含有する好熱性または中温性の微生物を、形質転換して、前記少なくとも１つの遺伝子の発現を減少または排除する。微生物に、発酵生成物として酢酸を産生する能力を付与する遺伝子は、酢酸キナーゼおよび／またはホスホトランスアセチラーゼの発現をコードし得る。ＡＣＫおよび／またはＰＴＡの発現をコードする遺伝子または特定のポリヌクレオチド配列の欠失もしくは抑制は、全体的解糖経路における反応スキームを低減または排除し、それによって、アセチルＣｏＡは酢酸に変換され（図１）；解糖のこれらの後者の段階からのアセチルＣｏＡの得られる相対量は、エタノールの増産を可能にするものであろう。
【０１０３】
特定の実施の形態では、上記で詳述した遺伝子ノックアウトスキームは、個々にまたは協力して、適用することができる。乳酸塩の産生の機構を排除すること（即ち、ＬＤＨの発現をコードする遺伝子または特定のポリヌクレオチド配列をノックアウトすること）により、さらに多くのアセチルＣｏＡが生じ；酢酸塩の産生の機構もまた排除される（即ち、ＡＣＫおよび／またはＰＴＡの発現をコードする遺伝子または特にポリヌクレオチド配列をノックアウトすること）場合、アセチルＣｏＡの存在量はさらに増強され、エタノールの増産を生じるはずであるということになる。
【０１０４】
特定の実施の形態では、好熱性または中温性の微生物が、天然もしくは内因性のＰＤＣまたはＡＤＨを有することは必要ではない。特定の実施の形態では、ＰＤＣおよび／またはＡＤＨをコードする遺伝子は、本発明の遺伝子改変微生物において、組み換え的に発現させることができる。特定の実施の形態では、本発明の遺伝子ノックアウト技術は、ＰＤＣおよび／またはＡＤＨをコードする異種遺伝子を含み得る組み換え微生物に適用することができ、ここで、前記異種遺伝子は、発酵生成物としてエタノールを産生する前記組み換え微生物（好熱性であり得る）の能力を増大させるか、または前記組み換え微生物（好熱性であり得る）に、発酵生成物としてエタノールを産生する能力を付与するのに十分なレベルで、発現される。
【０１０５】
特定の実施の形態では、本発明の態様は、セルロース含有量もしくはヘミセルロース含有量または両方に基づく理論的収量の少なくとも７０％である濃度でエタノールを産生するためのリグノセルロース基質の発酵に関する。
【０１０６】
特定の実施の形態では、本発明の態様は、セルロース含有量もしくはヘミセルロース含有量または両方に基づく理論的収量の少なくとも８０％である濃度でエタノールを産生するためのリグノセルロース基質の発酵に関する。
【０１０７】
特定の実施の形態では、本発明の態様は、セルロース含有量もしくはヘミセルロース含有量または両方に基づく理論的収量の少なくとも９０％である濃度でエタノールを産生するためのリグノセルロース基質の発酵に関する。
【０１０８】
特定の実施の形態では、自然状態の微生物からの有機酸産生の実質的または完全な排除は、１つもしくはそれ以上の部位特異的ＤＮＡ相同組み換え事象を使用して、達成され得る。
【０１０９】
好熱性の温度において、同時糖化および同時発酵（ＳＳＣＦ）またはＣＢＰプロセスのいずれかを操作することは、３０〜３７℃の従来の中温性の発酵温度を超えるいくらかの重要な有益性を提供する。特に、セルラーゼ産生に専用のプロセス工程のコストは、好熱性のＳＳＣＦでは実質的に減少し（例えば、２倍もしくはそれ以上）、ＣＢＰでは排除される。発酵槽の冷却、ならびにまた発酵の前および後の熱交換に関与するコストもまた、好熱性のＳＳＣＦおよびＣＢＰの両方で減少することが予想される。最終的に、好熱性の生体触媒を特徴とするプロセスは、従来の中温性の生体触媒を特徴とするプロセスと比較して、微生物の混入を受け難くあり得る。
【０１１０】
炭素フローへの改変によって電子フローを再指向する能力は、広範な影響を有する。例えば、このアプローチは、Ｔ．サッカロリティカム（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）以外の株において高いエタノール収量を生じるため、および／またはエタノール以外の溶媒、例えば、高級アルコール（即ち、ブタノール）を産生するために、使用し得る。
【０１１１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｓＲＮＡ）ストラテジーを介する代謝工学
酵母および嫌気性菌のような発酵微生物は、糖を発酵してエタノールおよび他の還元された有機最終産物を生じる。理論的に、乳酸塩および酢酸塩のような競合する最終産物の発酵を抑制することができる場合、炭素フローを、エタノール産生に指向することができる。本発明は、本発明のＣＢＰ生物におけるそのような競合経路を取り除くように設計されたいくらかの遺伝子操作アプローチを提供する。これらのアプローチの大部分は、（単一交差組み換えのための）ノックアウト構築物または（二重交差組み換えのための）対立遺伝子交換構築物を利用し、ａｃｋおよびｌｄｈの遺伝子座を標的にする。これらのツールは、「立証済みの」株開発技術を用いるが、なお展開し得る次のいくらかの潜在的問題が存在する：（ｉ）それらは、すべての場合において、ＣＢＰ生物について未知である宿主組み換え効率に依存すること；（ｉｉ）それらを使用して、一度にただ１つの経路しかノックアウトすることができず、そのため、いくらかの選択マーカーまたはリサイクル可能マーカーを有するときに、連続的な遺伝子の変更が義務となること；（ｉｉｉ）標的遺伝子の欠失は、毒性であるか、または下流の遺伝子発現に対して極性効果を及ぼし得ること。
【０１１２】
本発明は、宿主の組み換え効率によらない遺伝子操作に対するさらなるアプローチを提供する。これらの代替的ツールの１つは、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）と呼ばれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビトロおよびインビボの両方において遺伝子発現レベルを抑制するために２５年を超えて使用されているが、ｍＲＮＡ構造予測における最近の進歩は、ａｓＲＮＡ分子の高性能の設計を容易にしている。これらの進歩は、多くのグループが、細菌の代謝工学におけるａｓＲＮＡの有用性を実証することを促進した。
【０１１３】
ノックアウトおよび対立遺伝子交換技術に代わりａｓＲＮＡを使用する有益性は多数ある：（ｉ）単一のａｓＲＮＡ構築物によって多数の経路を標的にすることができるため、多数の選択マーカーの必要性が軽減されること；（ｉｉ）ａｓＲＮＡ間の会合比を増加または減少することによって、標的ｍＲＮＡの減衰レベルを調整することができること；（ｉｉｉ）条件プロモーターによってａｓＲＮＡ転写物を駆動する場合、経路不活化は条件付であり得ること。最近、この技術は、グラム陽性中温細菌、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）におけるソルベント生成能を増大するために使用されている（Ｔｕｍｍａｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３））。ａｓＲＮＡがどのようにして遺伝子発現を減衰するかという正確な分子機構は不明であるが、ａｓＲＮＡの標的ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション時に、同様の機構が誘発される。機構は、次の１つもしくはそれ以上を含むことができる：（ｉ）リボゾーム結合部位がリボソームと適切に相互作用することを阻止することによる、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳の阻害、（ｉｉ）二本鎖ＲＮＡを迅速に分解するＲＮａｓｅＨのようなｄｓＲＮＡ依存性ＲＮａｓｅを介してｍＲＮＡの半減期を減少すること、および（ｉｉｉ）ｍＲＮＡの早期転写終結による転写の阻害。
【０１１４】
アンチセンス配列の設計
ａｓＲＮＡは、典型的に、１８〜２５ヌクレオチド長である。ａｓＲＮＡ配列を選択するために使用し得るＲＮＡ標的化核酸の合理的な設計に利用可能ないくらかの計算ツール（Ｓｆｏｌｄ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳＴＺ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｓｉｇｎ）が存在する。例えば、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ａｃｋ（酢酸キナーゼ）の遺伝子配列を、合理的な設計サーバーに供することができ、いくらかのａｓＲＮＡ配列を選別することができる。簡単に説明すると、設計パラメータは、推測される二次構造を含有しないｍＲＮＡ標的配列を選択する。
【０１１５】
送達ベクターの設計
複製プラスミドは、ａｓＲＮＡコーディング配列を標的生物に送達するために使用される。限定されないが、ｐＮＷ３３Ｎ、ｐＪＩＲ４１８、ｐＪＩＲ７５１、およびｐＣＴＣ１のようなベクターは、宿主細胞の内部へのａｓＲＮＡコーディング配列の送達のためのａｓＲＮＡ構築物の骨格を形成する。染色体外（プラスミドに基づく）発現に加えて、異種遺伝子座において、ａｓＲＮＡを微生物のゲノムに安定的に挿入して、ａｓＲＮＡの安定な発現を得てもよい。特定の実施の形態では、目的の好熱性または中温性の微生物の株を、部位特異的相同組み換えによって操作して、有機酸の産生をノックアウトし、ａｓＲＮＡによって、目的の他の遺伝子を、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートしてもよい。
【０１１６】
プロモーターの選択
ａｓＲＮＡ転写物の発現を確実にするため、所与の宿主について比較可能なプロモーターは、ａｓＲＮＡコーディング配列に融合される。プロモーター−ａｓＲＮＡカセットは、単一のＰＣＲ工程で構築される。プロモーター領域を増幅するために設計されたセンスおよびアンチセンスプライマーは、ａｓＲＮＡ配列（合理的な設計アプローチから選別された）がアンチセンスプライマーの５’末端に付着されるように、改変される。さらに、ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩのような制限部位は、最終ＰＣＲ増幅が制限酵素によって直接消化され、従来のクローニング技術によってベクター骨格に挿入され得るように、各プライマーの末端部に付加される。
【０１１７】
本明細書に記載のように、ペントース糖を代謝する能力を有さないが、ヘキソース糖を代謝することが可能な微生物に関して、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）およびクロストリジウム・ストラミニソルベンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）のａｃｋおよびｌｄｈ遺伝子は、例えば、本明細書に記載の方法に従い、アンチセンスＲＮＡを使用して、不活化のために標的化され得ることが理解されよう。
【０１１８】
本明細書に記載のように、ペントース糖およびヘキソース糖を代謝する能力を付与する微生物に関して、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ファイトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）およびカルディセルロシルプター・クリストヤンソニー（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）のａｃｋおよびｌｄｈ遺伝子は、例えば、本明細書に記載の方法に従い、アンチセンスを使用して、不活化のために標的化され得ることが理解されよう。
【０１１９】
ａｓＲＮＡ送達ベクターを発現する株の抗生物質選択に加えて、そのような株を、フルオロ酢酸ナトリウム（ＳＦＡ）、ブロモ酢酸（ＢＡＡ）、クロロ酢酸（ＣＡＡ）、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）およびクロロ乳酸のようないくらかの毒性の代謝物類似体のいずれかを含有する条件培地上で選択してもよい。エタンスルホン酸メチル（ＥＭＳ）を含むが、これに限らない化学変異剤の使用は、１つもしくはそれ以上の遺伝子が部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートされた株を作製するために、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｓＲＮＡ）の発現との組合せで使用され得る。
【実施例】
【０１２０】
本発明についての概要を述べてきたが、単に、本発明の特定の態様および実施の形態の単なる例証の目的で含まれ、本発明を制限することを意図されていない、以下の実施例を参照することによって、さらに容易に理解されるであろう。
【０１２１】
実施例１
中温性および好熱性セルロース分解、キシラン分解生物のカスタムトランスポゾンの作製
本発明は、セルロース分解および／またはキシラン分解および／または好熱性の生物のカスタムトランスポゾン（ｃｕｓｔｏｍ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）を作製するための方法を提供する。これを行うために、宿主生物由来の天然プロモーターは、この生物において機能することが判明している選択マーカーに融合される。このフラグメントは、ベクターｐＭＯＤ（商標）−２＜ＭＣＳ＞（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）上に担持されるＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポゾンにクローニングされる。例えば、Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ｇａｐＤＨプロモーターが、ｍＬｓ薬物マーカー、ならびにｃａｔ遺伝子に融合され、次いで、ベクターｐＭＯＤ（商標）−２＜ＭＣＳ＞にサブクローニングされる。
【０１２２】
市販のトランスポゾンは、耐熱性薬物マーカー、ならびにセルロース分解および／またはキシラン分解および／または好熱性生物の天然プロモーターを欠いている。ｍＬｓおよびｃａｔマーカーは、好熱性細菌において機能化されており、ｇａｐＤＨプロモーターは重要な解糖系酵素を調節し、一定に発現されるはずである。上記の薬物マーカーおよびｇａｐＤＨプロモーターの組合せは、機能的トランスポゾンを作製する確率をかなり増大させる。このアプローチは、他のセルロース分解および／またはキシラン分解および／または好熱性生物に適用することができる。
【０１２３】
実験デザイン
図２６は、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のユーザマニュアル（参照により本明細書に援用される）から転用した図であり、ｐＭＯＤ（商標）−２＜ＭＣＳ＞のｂｐ２５０〜５５０を表す。上部において、ＭＥと表示された黒色矢じりは、トランスポゾンを規定している１９ｂｐのモザイク端部を示す。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位は、ＭＣＳと表示された黒色ボックスによって表されるマルチクローニング部位を規定している。下部には、ＭＣＳに関連するＤＮＡ配列および制限酵素を示す。
【０１２４】
次のプライマーは、ｐＭＱ８７−ｇａｐＤＨ−ｃａｔおよびｐＭＱ８７−ｇａｐＤＨ−ｍｌｓからプロモーター融合フラグメントを増幅するために使用される：ＧＧＣＧｇａａｔｔｃ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＧＣ（配列番号１９）；ＧＧＣＧｇａａｔｔｃ  ＴＡＴＣＡＧＴＴＡＴＴＡＣＣＣＡＣＴＴＴＴＣＧ（配列番号２０）。小文字は、操作されたＥｃｏＲＩ制限部位を示す。作製されたアンプリコンのサイズは、約１．９ｋｂである。標準的な分子手順により、アンプリコンがＥｃｏＲＩによって消化され、ｐＭＯＤ（商標）−２＜ＭＣＳ＞の独特なＥｃｏＲＩ部位にクローニングされる。製造者によって記載のように、トランスポゾンおよび以後のトランスポソソームが作製され、宿主生物に導入される。
【０１２５】
実施例２
セルロース分解株およびキシラン分解株を操作するための構築物
本発明は、炭素フローをエタノールから他へ転換する代謝経路の重要な酵素をコードする遺伝子を変異させることによって、目的の生物を遺伝子操作してＣＢＰにするための組成物および方法を提供する。単一交差ノックアウト構築物は、外来ＤＮＡの大きなフラグメントを目的の遺伝子に挿入して、それを、部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートするように、設計される。二重交差ノックアウト構築物は、染色体由来の目的の遺伝子を部分的、実質的、もしくは完全に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートするか、あるいは染色体上の目的の遺伝子を、抗生物質耐性カセットによって妨害された遺伝子の形態のような遺伝子の変異されたコピーと置き換えるように、設計される。
【０１２６】
単一交差ノックアウトベクターの設計は、目的の遺伝子の内部フラグメントのプラスミドに基づく系へのクローニングを必要とする。理想的には、このベクターは、宿主株において発現されるが、宿主株において複製しない選択マーカーを担持する。それ故、宿主株への導入時に、プラスミドは複製されない。プラスミド上に担持されたマーカーについて選択する条件培地に細胞が置かれる場合、プラスミドを維持する方法を見出したそれらの細胞のみが増殖する。プラスミドは、自律的ＤＮＡエレメントとして複製することができないため、プラスミドが維持される最も可能性のある方法は、宿主染色体への組み換えを介する。最も組み換えが生じる可能性のある場所は、プラスミドと宿主染色体との間の相同性の領域である。
【０１２７】
あるいは、複製型プラスミドを使用して、単一交差妨害（single crossover interruptions）を作製することができる。ノックアウトベクターを取り込んだ細胞を条件培地上で選択し、次いで、選択の非存在下で継代培養することができる。条件培地によって提供されるポジティブ選択がない場合、多くの生物がプラスミドを消失する。プラスミドが宿主染色体に挿入される場合、それは、選択の非存在下では消失しない。次いで、細胞を条件培地に戻すことができ、染色体組込みを介してマーカーを保持した細胞のみが増殖する。ＰＣＲに基づく方法は、染色体に局在するマーカーを含有する生物についてスクリーニングするように工夫される。
【０１２８】
二重交差ノックアウトベクターの設計は、少なくとも、目的の遺伝子にフランキングするＤＮＡ（約１ｋｂ）をプラスミドにクローニングすることを必要とし、場合によって、目的の遺伝子をクローニングすることを含んでもよい。選択マーカーはフランキングＤＮＡの間に置いてもよく、または目的の遺伝子がクローニングされる場合、マーカーは、遺伝子に関して、内部に置かれる。理想的には、使用したプラスミドは、宿主株において複製することができない。プラスミドの宿主への導入およびマーカーに対して条件付けられた培地上での選択時、相同ＤＮＡを染色体上に組み換えた細胞のみが増殖する。２つの組み換え事象は、目的の遺伝子を選択マーカーと置き換えるのに必要である。
【０１２９】
あるいは、複製性プラスミドを使用して、二重交差遺伝子置換を作製することができる。ノックアウトベクターを取り込んだ細胞を条件培地上で選択し、次いで、選択の非存在下で継代培養することができる。条件培地によって提供されるポジティブ選択がない場合、多くの生物がプラスミドを消失する。薬物マーカーが宿主染色体に挿入される場合、それは、選択の非存在下では消失しない。次いで、細胞を条件培地に戻すことができ、染色体組み込みを介してマーカーを保持した細胞のみが増殖する。ＰＣＲに基づく方法は、染色体に局在するマーカーを含有する生物についてスクリーニングするように工夫され得る。
【０１３０】
抗生物質選択スキームに加えて、フルオロ酢酸ナトリウム（ＳＦＡ）、ブロモ酢酸（ＢＡＡ）、クロロ酢酸（ＣＡＡ）、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）およびクロロ乳酸のようないくらかの毒性の代謝物類似体を使用して、相同組み換え、またはトランスポゾンに基づくストラテジーのいずれかから生じる変異体を選択してもよい。エタンスルホン酸メチル（ＥＭＳ）を含むが、これに限らない化学変異剤の使用は、相同組み換えを用いる特異的変異誘発スキーム、またはトランスポゾンに基づくストラテジーと組み合わせて、使用してもよい。
【０１３１】
Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）ノックアウト構築物
酢酸キナーゼ（ゲノムが公開されたＣ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の遺伝子１３１）：
単一交差
Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）の酢酸キナーゼ遺伝子は、１，１１０ｂｐ長である。ヌクレオチド９１〜７５２にわたる６６２ｂｐ内部フラグメント（配列番号２１）を、ＰＣＲによって増幅し、自殺ベクター、および異なる選択マーカーを有する複製型ベクターにクローニングした。選択マーカーは、エリスロマイシンおよびクロラムフェニコール耐性を提供するものを含んでもよい。これらのプラスミドは、ａｃｋ遺伝子を破壊するために使用される。ａｃｋ遺伝子の地図および遺伝子破壊のためにＰＣＲによって増幅された領域を、図１９に示す。下記の配列番号２１の下線を付した部分は、ノックアウトフラグメントにフランキングするＥｃｏＲＩ部位である部位に対応する。
【０１３２】
2010526536.tif 000006
これらの部位は、「ａｃｋ  ＫＯプライマー」の設計中に操作したが、これは、フラグメントの多数のベクターへの以後のクローニングを可能にする。
【０１３３】
二重交差
Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）のａｃｋ遺伝子の二重交差ベクターを構築するために、ａｃｋ遺伝子の各側にフランキングする約１ｋｂのＤＮＡがクローニングされる。選択マーカーは、フランキングＤＮＡ間に挿入される。選択マーカーは、エリスロマイシンおよびクロラムフェニコール耐性を提供するものを含んでもよい。ａｃｋ遺伝子の３’フランキング領域は、利用可能なドラフトゲノムにおいて利用可能ではない。このＤＮＡを獲得するために、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製のＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒのようなキットが使用される。
【０１３４】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ゲノムが公開されたＣ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）の遺伝子２２６２および２７４４）：
単一交差
Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）のｌｄｈ遺伝子は、（遺伝子２２６２では）９５１ｂｐ（配列番号２２）および（遺伝子２７４４では）９３２ｂｐ（配列番号２３）長である。各遺伝子の５’末端付近の約５００ｂｐ内部フラグメントは、ＰＣＲによって増幅され、自殺ベクター、および異なる選択マーカーを有する複製型ベクターにクローニングされる。選択マーカーは、エリスロマイシンおよびクロラムフェニコールのような薬剤耐性を提供するものを含んでもよい。これらのプラスミドは、ｌｄｈ２２６２およびｌｄｈ２７４４遺伝子を破壊するために使用される。例として、ｌｄｈ２２６２遺伝子の地図および遺伝子破壊のためにＰＣＲによって増幅された領域を、図２０に示す。
【０１３５】
二重交差
Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）のｌｄｈ遺伝子の二重交差ノックアウトベクターを構築するために、ｌｄｈ遺伝子の各側にフランキングする約１ｋｂのＤＮＡがクローニングされる。選択マーカーは、フランキングＤＮＡ間に挿入される。選択マーカーは、エリスロマイシンおよびクロラムフェニコールのような薬剤耐性を提供するものを含んでもよい。図２１は、Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）ｌｄｈ（２２６２）二重交差ノックアウトフラグメントの一例を提供する。
【０１３６】
下記の配列（配列番号２４）では、ｍＬｓ遺伝子（選択マーカー）に下線を付しており、フランキングＤＮＡは、残りの配列である。プライマーの設計中、制限部位が操作され、上記のフラグメントの５’および３’末端は、それが多くの複製および非複製ベクターにクローニングすることができるようにされる。同じストラテジーが、ベクターを作製して、ｌｄｈ２７４４を欠失するために使用される。
【０１３７】
2010526536.tif 000007
【０１３８】
Ｃ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ノックアウト構築物
酢酸キナーゼ（ゲノムが公開されたＣ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来の遺伝子３２７）について：
単一交差
Ｃ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の酢酸キナーゼ遺伝子は、１，２４４ｂｐ長である。ヌクレオチド５５〜６２６にわたる５７２ｂｐ内部フラグメントを、ＰＣＲによって増幅し、自殺ベクター、および異なる選択マーカーを有する複製型ベクターにクローニングする。使用するための選択マーカーは、薬剤耐性をＣ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）に提供するものを含む。これらのプラスミドは、ａｃｋ遺伝子を破壊するために使用される。ａｃｋ遺伝子の地図および遺伝子破壊のためにＰＣＲによって増幅された領域を、図２２に示す。制限部位は、「ａｃｋ  ＫＯプライマー」の設計中に操作され、フラグメントの多数のベクターへの以後のクローニングを可能にする。上記のノックアウトフラグメントの配列は、配列番号２５に記載されている。
【０１３９】
二重交差
Ｃ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のａｃｋ遺伝子の二重交差ノックアウトベクターを構築するために、ａｃｋ遺伝子の各側にフランキングする約１ｋｂのＤＮＡがクローニングされる。選択マーカーは、フランキングＤＮＡ間に挿入される。使用するための選択マーカーは、薬剤耐性をこの株に提供するものを含む。推定選択マーカーとしてｍＬｓ遺伝子を伴う推定二重交差ノックアウト構築物の一例を、図２３に示す。
【０１４０】
図２３に示すフラグメントに対応する配列（配列番号２６）を、下記に示す。ｍＬｓ遺伝子（推定選択マーカー）に下線を付し、配列の残りの部分はフランキングＤＮＡに対応する。プライマーの設計中、制限部位が操作され、上記のフラグメントの５’および３’末端は、それが多くの複製および非複製ベクターにクローニングすることができるようにされる。
【０１４１】
2010526536.tif 000008
【０１４２】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ゲノムが公開されたＣ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の遺伝子１３８９および２９７１）について：
単一交差
Ｃ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のｌｄｈ遺伝子は、（遺伝子１３８９では）９７８ｂｐ（配列番号２７）および（遺伝子２９７１では）９６０ｂｐ（配列番号２８）長である。各遺伝子の５’末端付近の約５００ｂｐ内部フラグメントは、ＰＣＲによって増幅され、自殺ベクター、および異なる選択マーカーを有する複製型ベクターにクローニングされる。使用する選択マーカーは、薬剤耐性を提供するものを含む。これらのプラスミドは、ｌｄｈ１３８９およびｌｄｈ２９７１遺伝子を破壊するために使用される。例として、ｌｄｈ１３８９遺伝子の地図および遺伝子破壊のためにＰＣＲによって増幅された領域を、図２４に示す。
【０１４３】
二重交差
Ｃ．ファイトファーメンタンス（Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のｌｄｈ遺伝子の二重交差ノックアウトベクターを構築するために、ｌｄｈ遺伝子の各側にフランキングする約１ｋｂのＤＮＡがクローニングされる。選択マーカーは、フランキングＤＮＡ間に挿入される。使用する選択マーカーは、薬剤耐性をこの株に提供するものを含む。推定選択マーカーとしてｍＬｓ遺伝子を伴う推定二重交差ノックアウト構築物の一例を、図２５に示す。
【０１４４】
図２５に示すフラグメントに対応する配列を、配列番号２９として下記に示す。ｍＬｓ遺伝子（推定選択マーカー）に下線を付し、配列の残りの部分はフランキングＤＮＡに対応する。プライマーの設計中、制限部位が操作され、上記のフラグメントの５’および３’末端は、それが多くの複製および非複製ベクターにクローニングすることができるようにされる。同じストラテジーが、ベクターを作製して、ｌｄｈ２９７１を欠失するために使用される。
【０１４５】
2010526536.tif 000009
【０１４６】
Ｃａｌｄ．クリストヤンソニー（Ｃａｌｄ．ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）およびＣ．ステルコラリウムｓｕｂｓレプトスパルツム（Ｃ．ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ  ｓｕｂｓ．ｌｅｐｔｏｓｐａｒｔｕｍ）
本発明者らの知る限り、上記の生物のゲノム配列決定は行われておらず、それが行われている場合、それは、公的に利用可能にされていない。本発明者らの実験結果に基づいて、生物は、セルロース分解性およびキシラン分解性である。これらの生物由来の重要な代謝酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列は、それらを遺伝子操作し、炭素フローをエタノールへ転換するために、必要である。これらは、酢酸キナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼのような酵素を含む。これらの遺伝子の配列を得るために、これらの生物のゲノムが配列決定される。
【０１４７】
ゲノム配列へのアクセスにより、上記の酵素の保存された性質を使用して、コードする遺伝子およびフランキングＤＮＡを見出すことができる。これらの配列は、単一および二重交差ストラテジーを用いて、標的化された変異誘発のための構築物を設計するために、使用される。これらのストラテジーは、上記のストラテジーと同一である。本発明者らはまた、これらの生物において選択マーカーとしてどの抗生物質を使用することができるか、および形質転換のためのプロトコルはどれが最も良好に作動するかについて決定する。
【０１４８】
実施例３
Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）の形質転換
細胞を、４ｇ／ｌセロビオースを伴う５０ｍＬのＧＳ培地において、０．８のＯＤまで、嫌気的条件で、増殖させ、３４℃でインキュベートした。回収後、それらを、５００ｍＭスクロースおよび５ｍＭのＭＯＰＳを含有する、７に調整されたｐＨを伴う等容積の洗浄緩衝液で３回、洗浄した。最後の洗浄後、細胞ペレットを、等容積の洗浄緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁液の１０μｌのアリコートを、１ｍｍの電極間距離を伴う標準的なエレクトロポレーションキュベットに置いた。１μｌのプラスミドＤＮＡを添加した。プラスミドＤＮＡの濃度を調整して、プラスミド対細胞の１：１〜１０：１モル比の間を確実にした。５ｍｓパルスを、サンプルを横切る７ｋＶ／ｃｍの電界強度（測定値）を伴って、適用した。カスタムパルスジェネレータを使用した。サンプルを、最初の培養において使用した同じ培地で、直ちに１０００：１に希釈し、増殖が回復するまで回収を許容し、ＯＤの増加を介して決定した（２４〜４８時間）。回収したサンプルを、５０：１に希釈し、１５μｇ／ｍＬエリスロマイシンまたは１５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールのいずれかを伴う選択培地に置き、５〜６日間、増殖させた。選択培地において増殖を示すサンプルを試験して、それらが事実上Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）であったこと、およびそれらがプラスミドを有したことを確認した。
【０１４９】
実施例４
セルロース分解株を操作するための構築物
セルロースは、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）を伴う発酵による燃料エタノールの作製のための基質として潜在的に使用することができるバイオマスの主な成分の１つである。しかし、このプロセスでは、かなりのエネルギーおよび炭素源が、副産物の酢酸塩および乳酸塩を形成するために使用される。セルロース資化クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）の代謝経路の操作は、乳酸塩および酢酸塩産生を最小限にし、エネルギーおよび炭素フローを、エタノール形成に好適にするのに必要である。
【０１５０】
酢酸キナーゼは、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）において酢酸塩を形成するためにセルロース資化の代謝経路において重要な酵素であり、これは、ａｃｋ遺伝子によってコードされる。ａｃｋ遺伝子の不活化は、酢酸キナーゼを妨害し得、酢酸塩の減少または排除をもたらす。
【０１５１】
乳酸デヒドロゲナーゼは、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）において乳酸塩を形成するためにセルロース資化の代謝経路において重要な酵素であり、これは、ｌｄｈ遺伝子によってコードされる。ｌｄｈ遺伝子の不活化は、乳酸デヒドロゲナーゼを妨害し得、乳酸塩作製の減少または排除をもたらす。
【０１５２】
プラスミドｐＩＫＭ１に基づくＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）におけるａｃｋ遺伝子の不活化
ａｃｋ遺伝子をノックアウトするために、プラスミドｐＩＫＭ１のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）に対してベクターを構築し、ここで、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするｃａｔ遺伝子が、ａｃｋ遺伝子およびｐｔａ遺伝子（ホスホトランスアセチラーゼをコードする）に関与する３０５５ｂｐのＤＮＡフラグメントに挿入され、４７６ｂｐのａｃｋ遺伝子および３９９ｂｐのｐｔａ遺伝子のノックアウトをもたらし、ｍＬｓ遺伝子の両側において、それぞれ１０２５ｂｐおよび１０４８ｂｐのフランキング領域を形成する（図７）。ｐＮＷ３３Ｎは、ｐＢＣ１レプリコンを含有し、これは、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）から単離され、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）を含む細菌のグラム陽性株において安定に複製されることが予想される。プラスミドｐＩＫＭ１上において構築されたａｃｋノックアウトベクターの配列を、配列番号１に記載する。
【０１５３】
反復プラスミドｐＮＷ３３Ｎに基づくＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）におけるａｃｋ遺伝子の不活化
ａｃｋ遺伝子をノックアウトするために、複製プラスミドｐＮＷ３３Ｎのマルチクローニング部位（ＭＣＳ）に対してベクターを構築し、ここで、マクロライド、リンコサミド、およびストレプトグラミンＢ（ＭＬＳＢ）耐性遺伝子ｍＬｓが、ａｃｋ遺伝子、ｐｔａ遺伝子（ホスホトランスアセチラーゼをコードする）および不明な上流遺伝子を含む３３４５ｂｐのＤＮＡフラグメントに挿入され、８５５ｂｐのａｃｋ遺伝子のノックアウト、ならびにｍＬｓ遺伝子の両方の側における１１９５ｂｐおよび１３０１ｂｐのフランキング領域の形成をもたらす（図８）。ｐＮＷ３３Ｎは、ｐＢＣ１レプリコンを含有し、これは、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）から単離され、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）を含む細菌のグラム陽性株において安定に複製されることが予想される。プラスミドｐＮＷ３３Ｎ上において構築されたａｃｋノックアウトベクターの配列を、配列番号２に記載する。
【０１５４】
プラスミドｐＩＫＭ１に基づくＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）におけるｌｄｈ遺伝子の不活化
ｌｄｈ遺伝子をノックアウトするために、プラスミドｐＩＫＭ１のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）に対してベクターを構築し、ここで、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするｃａｔ遺伝子が、ｌｄｈおよびｍｄｈ遺伝子（リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする）に関与する３１８８ｂｐのＤＮＡフラグメントに挿入され、１１７１ｂｐのＤＮＡフラグメントのノックアウトをもたらし、ｍＬｓ遺伝子の両側において、それぞれ８９４ｂｐおよび１１２３ｂｐのフランキング領域を形成する（図９）。プラスミドｐＩＫＭ１上において構築されたｌｄｈノックアウトベクターの配列を、配列番号３に記載する。
【０１５５】
プラスミドｐＮＷ３３Ｎに基づくＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）におけるｌｄｈ遺伝子の不活化
ｌｄｈ遺伝子をノックアウトするために、複製プラスミドｐＮＷ３３Ｎのマルチクローニング部位（ＭＣＳ）に対してベクターを構築し、ここで、マクロライド、リンコサミド、およびストレプトグラミンＢ（ＭＬＳＢ）耐性遺伝子ｍＬｓが、ｌｄｈ遺伝子およびｍｄｈ遺伝子（リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする）を含む２５２３ｂｐのＤＮＡフラグメントに挿入され、ｌｄｈ遺伝子の４８９ｂｐのフラグメントのノックアウト、ならびにｍＬｓ遺伝子の両方の側における１０３４ｂｐおよび１０００ｂｐのフランキング領域の形成をもたらす（図１０）。ｐＮＷ３３Ｎは、ｐＢＣ１レプリコンを含有し、これは、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）から単離され、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）を含む細菌の他のグラム陽性株において安定に複製されることが予想される。プラスミドｐＮＷ３３Ｎ上において構築されたｌｄｈノックアウトベクターの配列を、配列番号４に記載する。
【０１５６】
プラスミドｐＵＣ１９に基づくクロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）におけるｌｄｈ遺伝子の不活化
ｌｄｈ遺伝子をノックアウトするために、ｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニング部位（ＭＣＳ）に対してベクターを構築し、ここで、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ遺伝子）をクローニングする遺伝子が、７１７ｂｐのｌｄｈ遺伝子フラグメントに挿入され、ｃａｔ遺伝子の両方の側に２４５ｂｐおよび２５５ｂｐのフランキング領域をもたらす（図１１）。ｐＵＣ１９は、ｐＭＢ１起点を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドベクターであり、これは、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）を含む細菌のグラム陽性株において、増幅させることができない。ｍＬｓ遺伝子が、ｌｄｈ遺伝子フラグメントによってフランキングされている類似のベクターを構築してもよい。プラスミドｐＵＣ１９上において構築されたｌｄｈノックアウトベクターの配列を、配列番号５に記載する。
【０１５７】
Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ならびにＣ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）におけるキシロースイソメラーゼおよびキシルロースキナーゼの発現（予測的実施例）
Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）におけるキシロースイソメラーゼおよびキシルロースキナーゼの発現のために、キシロースイソメラーゼおよびキシルロースキナーゼ遺伝子を、Ｔ．サッカロリティカム（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）からクローニングし、Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ｇａｐＤＨプロモーターの制御下に置いた。このカセットは、ｐＮＷ３３Ｎ骨格に基づくＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）複製プラスミドに含まれ、ｐＭＵ３４０（図３５）配列番号７４を生じる。Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）への導入時、得られる形質転換を、キシロース上で増殖する能力についてアッセイすることができる。Ｃ．クリスタヤンソニー（Ｃ．ｋｒｉｓｔａｊａｎｓｓｏｎｉｉ）キシロースイソメラーゼおよびキシルロースキナーゼ遺伝子を使用して、類似構築物を作製することができる。これらの構築物は、Ｃ．ストラミンソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｓｏｌｖｅｎｓ）の機能性についても試験することができる。
【０１５８】
Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ならびにＣ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）におけるピルビン酸デカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼの発現（予測的実施例）
Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）におけるピルビン酸デカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼの発現のために、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を、供給源Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）およびＺ．パルマエ（Ｚ．ｐａｌｍａｅ）からクローニングし、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を、供給源Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）からクローニングする。これらの遺伝子（ｐｄｃおよびａｄｈ）は、Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ｐｔａ−ａｃｋプロモーター由来のオペロンとして発現される。このカセットは、ｐＮＷ３３Ｎ骨格に基づくＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）複製プラスミドに含まれる（図３６および３７）、配列番号７５および７６。Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）への導入時、得られる形質転換を、増強されたエタノール産生および／またはアルデヒド産生についてスクリーニングして、発現された酵素の機能性を測定することができる。これらの構築物は、Ｃ．ストラミンソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｓｏｌｖｅｎｓ）の機能性についても試験される。
【０１５９】
実施例５
Ｃ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）を使用するＡｖｉｃｅｌ（登録商標）の発酵
Ｃ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）を使用して、ＣＴＦＵＤ培地を含有する血清瓶中の１％Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）を発酵させた。産物濃度プロファイルおよび比を、図２７に示す。約２ｇ／Ｌの全生成物が３日目に作製され、エタノールは全生成物の約５０％を構成した。図２７は、Ｃ．ストラミニソルベンス（Ｃ．ｓｔｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）を使用した１％Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）の産物濃度プロファイルを示す。エタノール対酢酸比をＥ／Ａとして示し、エタノール対全生成物の比をＥ／Ｔとして示す。
【０１６０】
実施例６
中温性および好熱性セルロース分解、キシラン分解生物について操作されたグループIIイントロン
多くの細菌ゲノムにおいて見出される可動性グループＩＩイントロンは、触媒ＲＮＡおよびレトロ転移因子の両方である。それらは、切り出されたイントロンＲＮＡが、ＤＮＡ標的部位に直接逆スプライシングし、次いで、イントロンによりコードされたタンパク質によって、逆転写されるレトロ転移として公知である移動機構を使用する。可動性ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）Ｌｌ．ＬｔｒＢグループＩＩイントロンは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｔｃｈから市販されているＴａｒｇｅｔｒｏｎ（商標）ベクター（カタログ番号ＴＡ０１００）として公知の遺伝子ツールに開発されている。この産物およびその使用は、米国特許第５，６９８，４２１号明細書、同第５，８０４，４１８号明細書、同第５，８６９，６３４号明細書、同第６，０２７，８９５号明細書、同第６，００１，６０８号明細書、および同第６，３０６，５９６号明細書および／またはＩｎＧｅｘ，ＬＬＣによって管理された他の係属中の米国および他国における特許出願の１つもしくはそれ以上の主題である。
【０１６１】
レトロ転移に必要なすべての配列を含有するＴａｒｇｅｔｒｏｎカセット（図２８および２９）を、中温性または好熱性セルロース分解生物における複製が可能なベクターにサブクローニングしてもよい。Ｔａｒｇｅｔｒｏｎカセットは、ｌａｃプロモーターを任意の宿主または種特異的構成性もしくは誘導性プロモーターで置き換えることによって、改変してもよい。カセットは、グループＩＩイントロンが再標的化されて、目的の遺伝子に挿入され、遺伝子ノックアウトを作製するように、天然の認識配列の部位特異的変異誘発を介して、さらに改変してもよい。例えば、グループＩＩイントロンは、任意の中温性または好熱性セルロース分解生物において乳酸デヒドロゲナーゼまたは酢酸キナーゼをノックアウトするために、再設計され得る。表４は、イントロンをＣ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）酢酸キナーゼを再標的化するための挿入位置およびプライマーの一例を示す（配列番号２１）。表５は、イントロンをＣ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）乳酸デヒドロゲナーゼを再標的化するための挿入位置およびプライマーの一例を示す（配列番号２１）。
【０１６２】
Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンを、Ｃ．ｃｅｌｌ．ＡＣＫ遺伝子における挿入物（配列番号２１）に再標的化するためのベクターの一例を図２８に示す。ｐＭＵ３６７のベクター配列（Ｃ．ｃｅｌｌ．酢酸キナーゼＫＯベクター）は配列番号３０である。
【０１６３】
Ｌｌ．ＬｔｒＢイントロンを、Ｃ．ｃｅｌｌ．ＬＤＨ２７４４遺伝子における挿入物（配列番号２３）に再標的化するためのベクターの一例を図２９に示す。ｐＭＵ３６７のベクター配列（Ｃ．ｃｅｌｌ．乳酸デヒドロゲナーゼＫＯベクター）を、配列番号３１として記載する。
【表４】
2010526536.tif 000010
【表５】
2010526536.tif 000011
【０１６４】
実施例７
サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）株およびサーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株の形質転換（予測的実施例）
サーモアナエロバクター・シュードエタノリカス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｓｅｕｄｏｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）３９Ｅ、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）Ｂ６Ａ−ＲＩ、およびサーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．株５９は、次のプロトコルによって形質転換される。細胞を、５５℃、４０ｍＬのＤＳＭＺ  Ｍ１２２培地（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／ｍｅｄｉａ＿ｌｉｓｔ．ｐｈｐ）において、次の改変を伴って増殖させる：セルロースの代わりに、５ｇ／Ｌセロビオース、１．８ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、グルタチオンなし、および０．５ｇ／ＬのＬ−システイン−ＨＣｌ、０．６〜０．８の光学密度まで。次いで、細胞を回収し、４０ｍＬの０．２Ｍセロビオースによって、室温で２回、洗浄する。細胞を、０．２Ｍセロビオースにおいて、１００μＬのアリコートで再懸濁し、０．１〜１μｇプラスミドＤＮＡを、１ｍｍ間隙幅のエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｔａｔｉｏｎ）キュベット中のサンプルに添加する。１．８ｋＶ、２５μＦ、２００Ω、約３〜６ｍｓの指数形パルス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）をキュベットに適用し、細胞を、新鮮Ｍ１２２において１００〜２００倍希釈し、１２〜１６時間、５５℃でインキュベートする。次いで、回収された細胞を、ペトリプレートにおいて、２００μｇ／ｍＬカナマイシンのような選択薬剤を含有する新鮮寒天含有培地で２５〜１００倍希釈する。一旦、培地を固化したら、プレートを、コロニー形成のために５５℃で、２４〜７２時間、インキュベートする。コロニーは、部位特異的組み換えの証明のために、ＰＣＲにより試験することができる。
【０１６５】
実施例８
操作されたサーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）株およびサーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株の発酵性能
表６は、操作されたサーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）株およびサーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株の発酵性能を示す。培養物を、２４時間、Ｍ１２２において５５℃で振盪を伴わずに増殖させた。次の略称を表６において使用する：セロビオース（ＣＢ）、グルコース（Ｇ）、乳酸（ＬＡ）、酢酸（ＡＡ）、およびエタノール（Ｅｔｏｈ）。容積は、１リットルあたりのグラム数である。ＹＳ４８５−サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＪＷ／ＳＬ−ＹＳ４８５、Ｂ６Ａ−ＲＩ−サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）Ｂ６Ａ−ＲＩ、３９Ｅ−サーモアナエロバクター・シュードエタノリカス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｓｅｕｄｏｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）３９Ｅ。
【表６】
2010526536.tif 000012
【０１６６】
実施例９
セルロース分解株およびキシラン分解株を操作するための構築物−アンチセンスＲＮＡ技術の例
乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｃｔｈｅ＿１０５３）をコードするＣ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）遺伝子を標的にするアンチセンスＲＮＡカセットを担持する複製プラスミド（図３８）を、エレクトロポレーションおよびチアンフェニコール選択によって、Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）１３１３に導入した。このプラスミドについて観察された形質転換効率は、親ベクター、ｐＭＵ１０２のものに等しかった。プラスミドの配列を配列番号６１に示す。ａｓＲＮＡカセットを図３８に示し、次のように組織化される：（ｉ）１８２７ｂｐのカセット全体を図３８に示す配向でｐＭＵ１０２のマルチクローニング部位にクローニングする、（ｉｉ）天然プロモーター領域は、カセットの最初の６００ｂｐ内に含有される、（ｉｉｉ）ｌｄｈオープンリーディングフレームの最初の８７７ｂｐを、アンチセンス配向で天然プロモーターに融合する、（ｉｖ）約３００のさらなるｂｐが、ａｓＲＮＡ  ｌｄｈ領域の下流に含まれる。
【０１６７】
図３９に示されるように、６μｇ／ｍＬチアンフェニコール（プラスミドを維持するため）の存在下で、Ｍ１２２Ｃ培地上で培養物を静置増殖させることによって、変更された最終産物について、得られるチアンフェニコール耐性コロニーをスクリーニングした。９個の無作為に選択したチアンフェニコール耐性形質転換体の予備スクリーニングは、４つの培養物が、野生型と比べて、低いレベルの乳酸塩産生を示すことを示した。さらに、両方のｌｄｈ遺伝子に対して指向されたアンチセンスＲＮＡ担持する構築物は、部分的、実質的、もしくは完全に、両方の遺伝子を同時に欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートするために、構築するべきである。
【０１６８】
実施例１０
配列番号４４、４５、および４６は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＹＳ４８５、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ  ２７４０５、およびクロストリジウム・ファイトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来のピルビン酸−ギ酸−リアーゼ（ａｋａギ酸アセチルトランスフェラーゼ、ＥＣ．２．３．１．５４、ｐｆｌ）遺伝子である。ｐｆｌは、ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡおよびギ酸塩への変換を触媒する（図３４）。ｐｆｌの欠失は、ギ酸塩産生の排除を生じ、いくつかの好熱性株において酢酸収量の減少を生じ得、結果的にエタノール収量の増大を伴う。
【０１６９】
図４０〜４５に示される配列番号４７〜５２は、ｐｆｌノックアウトプラスミドを、上記で列挙した３つの生物について、それぞれ２つずつ示す。各生物は、部分的、実質的、もしくは完全に、ｐｆｌ酵素を欠失、サイレンシング、不活化、またはダウンレギュレートするように設計された単一交差および二重交差プラスミドを有する。単一交差プラスミドは、ｐｆｌ遺伝子の内部セクションに相同な単一のＤＮＡ配列（４００ｂｐ〜１０００ｂｐ）で設計され、二重交差プラスミドは、ｐｆｌ遺伝子の上流（５’）および下流（３’）の領域に相同な２つのＤＮＡ配列（４００〜１０００ｂｐ）で設計される。すべてのプラスミドは、所与の生物における選択のために最も良好に利用可能な抗生物質マーカーを使用するために設計される。プラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において維持し、Ｃｏｄｏｎ  ＤｅｖｉｃｅｓまたはＤＮＡ２．０のようなＤＮＡ合成請負会社を介して、構築することができる。
【０１７０】
援用
本明細書において引用したすべての米国特許第および米国公開特許出願は、参照により本明細書に援用される。
【０１７１】
均等物
当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施の形態に対する多くの均等物を認識し、日常的域を超えない程度の実験を使用して、これを確かめることが可能である。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
2010526536.tif 000013
【図２】
2010526536.tif 000014
【図３】
2010526536.tif 000015
【図４】
2010526536.tif 000016
【図５】
2010526536.tif 000017
【図６】
2010526536.tif 000018
【図６−１】
2010526536.tif 000019
【図６−２】
2010526536.tif 000020
【図６−３】
2010526536.tif 000021
【図６−４】
2010526536.tif 000022
【図６−５】
2010526536.tif 000023
【図７】
2010526536.tif 000024
【図８】
2010526536.tif 000025
【図９】
2010526536.tif 000026
【図１０】
2010526536.tif 000027
【図１１】
2010526536.tif 000028
【図１２Ａ】
2010526536.tif 000029
【図１２Ｂ】
2010526536.tif 000030
【図１３Ａ】
2010526536.tif 000031
【図１３Ｂ】
2010526536.tif 000032
【図１４Ａ】
2010526536.tif 000033
【図１４Ｂ】
2010526536.tif 000034
【図１５Ａ】
2010526536.tif 000035
【図１５Ｂ】
2010526536.tif 000036
【図１６Ａ】
2010526536.tif 000037
【図１６Ｂ】
2010526536.tif 000038
【図１７Ａ】
2010526536.tif 000039
【図１７Ｂ】
2010526536.tif 000040
【図１８】
2010526536.tif 000041
【図１９】
2010526536.tif 000042
【図２０】
2010526536.tif 000043
【図２１】
2010526536.tif 000044
【図２２】
2010526536.tif 000045
【図２３】
2010526536.tif 000046
【図２４】
2010526536.tif 000047
【図２５】
2010526536.tif 000048
【図２６】
2010526536.tif 000049
【図２７】
2010526536.tif 000050
【図２８】
2010526536.tif 000051
【図２９】
2010526536.tif 000052
【図３０】
2010526536.tif 000053
【図３０−１】
2010526536.tif 000054
【図３０−２】
2010526536.tif 000055
【図３１】
2010526536.tif 000056
【図３１−１】
2010526536.tif 000057
【図３１−２】
2010526536.tif 000058
【図３２】
2010526536.tif 000059
【図３２−１】
2010526536.tif 000060
【図３２−２】
2010526536.tif 000061
【図３３】
2010526536.tif 000062
【図３３−１】
2010526536.tif 000063
【図３４】
2010526536.tif 000064
【図３５】
2010526536.tif 000065
【図３６】
2010526536.tif 000066
【図３７】
2010526536.tif 000067
【図３８】
2010526536.tif 000068
【図３９】
2010526536.tif 000069
【図４０】
2010526536.tif 000070
【図４１】
2010526536.tif 000071
【図４２】
2010526536.tif 000072
【図４３】
2010526536.tif 000073
【図４４】
2010526536.tif 000074
【図４５】
2010526536.tif 000075
【図４６】
2010526536.tif 000076
【図４７】
2010526536.tif 000077
【図４８】
2010526536.tif 000078
【図４９】
2010526536.tif 000079
【図５０】
2010526536.tif 000080
【図５１】
2010526536.tif 000081
【図５２】
2010526536.tif 000082
【図５３】
2010526536.tif 000083
【配列表】
2010526536000001.app
【国際調査報告】
2010526536.tif 000084
2010526536.tif 000085
2010526536.tif 000086