(57)【要約】  本発明は、ＡＭＤと相関する特定のポリヌクレオチド配列を提供する。これらのポリヌクレオチドは、診断薬として有用であり、好ましくは、患者の試料のスクリーニングに有用なアレイの製造に利用される。このアレイは、研究室の情報管理システムの一部として利用されて、患者のゲノムプロファイルに加えて、患者の更なる情報を保存して処理する。本発明のシステムは、患者の、ＡＭＤを発症するリスク、病気の進行のリスク、及び患者の制御可能な因子に基づく病気の予防可能性の評価を与える。
2010526555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率、ＡＭＤに対する防護的表現型、又はＡＭＤに対する中立的遺伝子型を診断する方法であって、該方法は、補体経路の遺伝子と関連する多型部位における特定の対立遺伝子の存否の検出を含み、この対立遺伝子は、ＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率を示す当該方法。
【請求項２】
多型部位が、補体因子３と関連する単一ヌクレオチド多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多型部位が、ｒｓ２２３０１９９(SEQ ID NO:１)であり、グアニン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
シトシン対立遺伝子が、１０２位のアミノ酸にグリシンを含むＣ３ポリペプチドを検出することにより検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
多型部位が、シチジン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率を示すｒｓ１０６１１７０(SEQ ID NO:２)；チミン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率を示すｒｓ１０４９０９２４(SEQ ID NO:３)；シチジン対立遺伝子がＡＭＤに対する防護的効果を与えるｒｓ９３３２７３９(SEQ ID NO:４)；チミン対立遺伝子がＡＭＤに対する防護的効果を与えるｒｓ６４１１５３(SEQ ID NO:５)；シチジン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率を示すｒｓ１４１０９９６(SEQ ID NO:６)；そしてシチジン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率を示すｒｓ２２３０２０３(SEQ ID NO:７)よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
特定の対立遺伝子の存否が、ハイブリダイゼーションアッセイにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
特定の対立遺伝子の存否が、マイクロアレイを利用して測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
特定の対立遺伝子の存否が、抗体を利用して測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＡＭＤ発症のリスクがあり又は該発症から防護されている患者を同定する方法であって、該方法は、
ａ）少なくとも一つのｒｓ２２３０１９９のリスク対立遺伝子の存否を検出し；
ｂ）補体因子Ｈと関連する少なくとも一つのリスク対立遺伝子又は防護的対立遺伝子の存否を検出し；
ｃ）ＨＴＲＡ１におけるＬＯＣ３８７７１５において関連する少なくとも一つのリスク対立遺伝子又は防護的対立遺伝子の存否を検出し；そして
ｄ）補体因子Ｂと関連する少なくとも一つのリスク対立遺伝子又は防護的対立遺伝子の存否を検出する
ことを含み、患者が、集団のうちの、ＡＭＤを発症する約１％未満のリスクを有する約２０％の１人であるならば、その患者はリスクがなく、ＡＭＤを発症する約５０％より大きいリスクを有する集団の約１％の一人であるならば、リスクがある、当該方法。
【請求項１０】
特定の対立遺伝子の存否が、ハイブリダイゼーションアッセイによって検出される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
特定の対立遺伝子の存否が、マイクロアレイを利用して測定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
多型部位及びSEQ ID NO:１〜７として表される一つ以上の配列の６以上の隣接ヌクレオチドを含む精製されたポリヌクレオチドであって、変異対立遺伝子が多型部位に存在する当該ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドに相補的である少なくとも一つのポリヌクレオチドプローブを含む診断用アレイ。
【請求項１４】
診断用システムであって：請求項１３に記載の診断用アレイ、アレイリーダー、イメージプロセッサー、データレコード及び情報レコードを有するデータベース、プロセッサー、及び情報出力装置を含み、患者のデータを編集して処理して、患者の進行するＡＭＤの統計的可能性に関する情報を出力する当該診断用システム。
【請求項１５】
患者の試料を診断用アレイに高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させ；患者の情報をシステムに入力し；そして該システムから患者の進行するＡＭＤの統計的可能性に関する情報を得ることを含む、請求項１４に記載の診断用システムの利用方法。
【請求項１６】
SEQ ID NO:１〜７を含む個々の精製されたポリヌクレオチド組成物の試料を、基材に、その基材上の複数の特定のアドレスに配置することを含む、請求項１３に記載の診断用アレイの作成方法。
【請求項１７】
患者におけるＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率を診断する方法であって、該方法は、遺伝的リスクを行動的リスクと合わせることを含み、補体経路の遺伝子と関連する多型部位における特定の対立遺伝子の存否を検出することにより遺伝的リスクを測定し、該対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病性を示すことを特徴とする当該方法。
【請求項１８】
多型部位がｒｓ２２３０１９９(SEQ ID NO:１)であり、グアニン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病性を示す請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
シトシン対立遺伝子が、アミノ酸の１０２位にグリシンを含むＣ３ポリペプチドを検出することにより検出される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
多型部位が、シチジン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病性を示すｒｓ１０６１１７０(SEQ ID NO:２)；チミン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病性を示すｒｓ１０４９０９２４(SEQ ID NO:３)；シチジン対立遺伝子がＡＭＤに対する防護効果を与えるｒｓ９３３２７３９(SEQ ID NO:４)；チミン対立遺伝子がＡＭＤに対する防護効果を与えるｒｓ６４１１５３(SEQ ID NO:５)；シチジン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病性を示すｒｓ１４１０９９６(SEQ ID NO:６)；及びシチジン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病性を示すｒｓ２２３０２０３(SEQ ID NO:７)よりなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
特定の対立遺伝子の存否が、ハイブリダイゼーションアッセイにより検出される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
特定の対立遺伝子の存否が、マイクロアレイを利用して測定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
特定の対立遺伝子の存否が、抗体を利用して測定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
患者が、肥満、喫煙、ビタミン及び食事サプリメントの摂取、アルコール又は薬物の使用、乏しい食事及び体を動かさない生活様式よりなる群から選択される行動又は習性を示すかどうかを測定することにより行動的リスクが評価される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
肥満の測定に上昇したＢＭＩを利用する、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、国立衛生研究所により与えられたＥＹ０１１３０９の下で、政府の支援によりなされた。更なる財政的援助を国立眼科研究所(Ｎ０１−ＥＹ−０−２１２７)及び国立研究財源センター(National Center for Research Resources)からの助成金Ｕ５４ ＲＲ０２０２７８により与えられた。
【背景技術】
【０００２】
加齢と関係する黄斑変性(ＡＭＤ)は、失明へと導く最も一般的な老人病的な眼の病気である。黄斑変性は、世界中で、控えめに約１６００万人と見積もられている、視覚的ハンディキャップの原因である。年配者のうちで、全体的罹患率は、初期ＡＭＤの定義、及び、殆ど理解されていない特性である正常な加齢からの区別によって変動するが、５．７〜３０％と見積もられている。
【０００３】
組織病理学的に、初期の新血管新生ＡＭＤの顕著な特徴は、細胞外のドルーゼン及び基底板沈着物(網膜色素上皮の原形質膜と基底板の間に局在化された異常な物質)及び基線沈着物(網膜色素上皮の基底板とブルック膜の内部コラーゲン様域との間に局在化した物質)の蓄積である。ＡＭＤの最終段階は、黄斑領域における知覚神経網膜及び下にある網膜色素上皮の完全な退行により特徴付けられる。ＡＭＤの進行した段階は、地図状萎縮と滲出性ＡＭＤに細分化することができる。地図状萎縮は、網膜色素上皮の進行性の萎縮によって特徴付けられる。滲出性ＡＭＤにおいては、鍵となる現象は、脈絡膜の新血管新生(ＣＮＶ)の出現である。ＣＮＶを有する眼は、新血管新生病変の位置、大きさ、種類及び年齢によって様々な程度の視力の低下を有する。脈絡膜の新血管新生膜の発生は、おそらく組織の破壊(ブルック膜)と、潜在的な長年のＡＭＤの過程の代償不全による病気の自然な過程における後期の合併症と考えることができる。
【０００４】
多くの病態生理学的な面並びに血管及び環境リスク因子は、病気の進行と関係するが、ＡＭＤ自体並びにＣＮＶの出現のような合併症の潜在的過程の病因論は、殆ど知られていない。家族、双生児、隔離及びケースコントロールスタディは、ＡＭＤの病因論における遺伝因子の関与を示唆している。しかしながら、遺伝率の程度、関与する遺伝子の数、及び潜在的な表現型の異質性は、未知である。ＡＭＤに関係する遺伝子及びマーカーの探索は、開始が生涯の終り近くであり、通常、研究に利用できるのは一世代のみであるという難題に直面する。患者の両親は、しばしば、死亡しており、子供は、この病気を明示するには若すぎる。一般に、この遺伝の遅い発病は、前の世代における診断の不確実さ及び冒された個人の子供のＡＭＤを診断できないことの原因を評価することを困難なものとしてきた。前の世代におけるＡＭＤの診断における曖昧さのないことさえ、この病気自体の遅い開始、自然死亡率、及び小さい家族規模は、遺伝形態のＡＭＤの過小評価及び散発性疾患の率の過大評価を生じる。その上、表現型の変動は、相当であり、現在用いられているＡＭＤの診断実体は、実際、潜在的条件の、関与する様々な遺伝的及び環境的因子との変動範囲を表している。
【０００５】
患者におけるＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病性を診断し又は予後を予想する改良された方法並びに新しい治療方法を評価して開発することに対する強い要求が残っている。ＡＭＤを発症する増大したリスクを示唆し又は一層侵略的な形態の病気の開始を予想する遺伝性リスク因子を同定することは、この発明の一つの目的である。
【０００６】
要約
本発明は、ＡＭＤ及びＡＭＤに対する罹病率の改良された診断を可能にする方法及び組成物に向けられている。これらの組成物及び方法は、遺伝マーカーの予想外の発見に向けられており、補体経路と関連する遺伝子の多型を引き起こす。これらのマーカー及び多型は、ＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率の診断、薬物標的としての利用、治療剤の同定、及び効力及び患者の治療に対する応答の測定に有用である。
【０００７】
一具体例において、本発明は、ＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率、ＡＭＤに対する防護的表現型、又はＡＭＤに対する中立的遺伝子型を診断する方法に向けられており、該方法は、補体経路の遺伝子と関連する多型部位における特定の対立遺伝子の存否の検出を含み、この対立遺伝子は、ＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率を示す。特定の具体例において、多型部位は、補体因子３例えばｒｓ２２３０１９９(SEQ ID NO:１)と関連した単一ヌクレオチド多型であり、グアニン対立遺伝子はＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率を示し、シトシン対立遺伝子は１０２位のアミノ酸にグリシンを含むＣ３ポリペプチドを検出することにより検出することができる。特定の具体例において、多型部位は、シチジン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率を示すｒｓ１０６１１７０(SEQ ID NO:２)；チミン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率を示すｒｓ１０４９０９２４(SEQ ID NO:３)；シチジン対立遺伝子がＡＭＤに対する防護的効果を与えるｒｓ９３３２７３９(SEQ ID NO:４)；チミン対立遺伝子がＡＭＤに対する防護的効果を与えるｒｓ６４１１５３(SEQ ID NO:５)；シチジン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率を示すｒｓ１４１０９９６(SEQ ID NO:６)；そしてシチジン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率を示すｒｓ２２３０２０３(SEQ ID NO:７)よりなる群から選択される。特定の具体例において、特定の対立遺伝子の存否は、ハイブリダイゼーションアッセイにより検出される。特定の具体例において、特定の対立遺伝子の存否は、マイクロアレイを利用して測定される。特定の具体例において、特定の対立遺伝子の存否は、抗体を利用して測定される。
【０００８】
一具体例において、本発明は、ＡＭＤ発症のリスクがあり又は該発症から防護されている患者を同定する方法に向けられており、該方法は、
ａ）少なくとも一つのｒｓ２２３０１９９のリスク対立遺伝子の存否を検出し；ｂ）補体因子Ｈと関連する少なくとも一つのリスク対立遺伝子又は防護的対立遺伝子の存否を検出し；ｃ）ＨＴＲＡ１におけるＬＯＣ３８７７１５において関連する少なくとも一つのリスク対立遺伝子又は防護的対立遺伝子の存否を検出し；そしてｄ）補体因子Ｂと関連する少なくとも一つのリスク対立遺伝子又は防護的対立遺伝子の存否を検出することを含み、患者が、集団のうちの、ＡＭＤを発症する約１％未満のリスクを有する約２０％の１人であるならば、その患者はリスクがなく、ＡＭＤを発症する約５０％より大きいリスクを有する集団の約１％の一人であるならば、リスクがある。特定の具体例において、特定の対立遺伝子の存否は、ハイブリダイゼーションアッセイによって検出される。特定の具体例において、特定の対立遺伝子の存否は、マイクロアレイを利用して測定される。
【０００９】
一具体例において、本発明は、多型部位及びSEQ ID NO:１〜７として表される一つ以上の配列の約６以上の隣接ヌクレオチドを含む精製されたポリヌクレオチドであって、変異対立遺伝子が多型部位に存在する当該ポリヌクレオチドに向けられる。
【００１０】
一具体例において、本発明は、少なくとも一つのこの発明のプローブ例えばこの発明のポリヌクレオチドに相補的であるプローブを含む診断用アレイに向けられる。一具体例において、この発明は、この発明の診断用アレイ、アレイリーダー、イメージプロセッサー、データレコード及び情報レコードを有するデータベース、プロセッサー、及び情報出力装置を含む診断用システムであって、患者のデータを編集して処理して、患者の進行するＡＭＤの統計的可能性に関する情報を出力する当該診断用システムに向けられている。
【００１１】
一具体例において、本発明は、この発明の診断システムを利用する方法であって、患者の試料を診断用アレイに高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させ；患者の情報をシステムに入力し；そして該システムから患者の進行するＡＭＤの統計的可能性に関する情報を得ることを含む当該方法に向けられている。
【００１２】
一具体例において、本発明は、この発明の診断用アレイを作成する方法であって、SEQ ID NO:１〜７を含む個々の精製されたポリヌクレオチド組成物の試料を、基材に、その基材上の複数の特定のアドレスに配置することを含む当該方法に向けられている。
【００１３】
一具体例において、本発明は、患者におけるＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率を診断する方法であって、該方法は、遺伝的リスクを行動的リスクと合わせることを含み、補体経路の遺伝子と関連する多型部位における特定の対立遺伝子の存否を検出することにより遺伝的リスクを測定し、該対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病性を示すことを特徴とする当該方法に向けられている。
特定の具体例において、多型部位は、グアニン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病性をを示すｒｓ２２３０１９９(SEQ ID NO:１)である。
特定の具体例において、シトシン対立遺伝子は、アミノ酸の１０２位にグリシンを含むＣ３ポリペプチドを検出することにより検出される。
特定の具体例において、多型部位は、シチジン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病性を示すｒｓ１０６１１７０(SEQ ID NO:２)；チミン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病性を示すｒｓ１０４９０９２４(SEQ ID NO:３)；シチジン対立遺伝子がＡＭＤに対する防護効果を与えるｒｓ９３３２７３９(SEQ ID NO:４)；チミン対立遺伝子がＡＭＤに対する防護効果を与えるｒｓ６４１１５３(SEQ ID NO:５)；シチジン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病性を示すｒｓ１４１０９９６(SEQ ID NO:６)；及びシチジン対立遺伝子がＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病性を示すｒｓ２２３０２０３(SEQ ID NO:７)よりなる群から選択される。特定の具体例において、特定の対立遺伝子の存否は、ハイブリダイゼーションアッセイにより検出される。特定の具体例において、特定の対立遺伝子の存否は、マイクロアレイを利用して決定される。特定の具体例において、特定の対立遺伝子の存否は、抗体を利用して決定される。特定の具体例において、行動的リスクは、患者が、肥満、喫煙、ビタミン及び食事サプリメントの摂取、アルコール又は薬物の使用、乏しい食事及び体を動かさない生活様式よりなる群から選択される行動又は習性を示すかどうかを測定することにより評価される。特定の具体例において、上昇したＢＭＩは、肥満の決定に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】様々なリスクスコアカットポイントについての敏感度及び特異度を示すプロット及び進行した加齢関連黄斑変性予想のためのＲＯＣ曲線を、より若い群と年上の群との間で示した図である。
【図２】進行した加齢関連黄斑変性リスクスコアについて、患者と対照について、元の試料(上)と複製試料(下)の間で、すべての遺伝的変異体並びに人口統計的及び環境的変数に基いてプロットされたヒストグラムを示した図である。
【図３】多型部位：ｒｓ２２３０１９９(SEQ ID NO:１)、ｒｓ１０６１１７０(SEQ ID NO:２)、ｒｓ１０４９０９２４(SEQ ID NO:３)、ｒｓ９３３２７３９(SEQ ID NO:４)、ｒｓ６４１１５３(SEQ ID NO:５)、ｒｓ１４１０９９６(SEQ ID NO:６)及びｒｓ２２３０２０３(SEQ ID NO:７)で対立遺伝子を示す配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、補体経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子と関連する多型部位の特定の対立遺伝子がＡＭＤ及びＡＭＤに対する罹病性のマーカーとして有用であるという予想外の発見に関する。ここに記載の組成物及び方法は、特に、補体因子３(Ｃ３)又は補体因子５(Ｃ５)に言及する。
【００１６】
ここで用いる場合、「遺伝子」は、発現産物(例えば、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びポリペプチド)を生じさせる遺伝的要素を記載するために用いられる用語である。遺伝子は、調節用エレメント及び構造的事項のみを有すると考えられる配列(例えば、イントロン及び非翻訳領域)を含む。
【００１７】
遺伝的マーカーは、特定の補体因子例えばＣ３及びＣ５と関連した「多型部位」の特定の「対立遺伝子」である。集団(天然の集団又は合成の集団例えば合成分子のライブラリー)中において、２以上のヌクレオチドが存在しうるヌクレオチド位置は、ここでは、「多型部位」と呼ばれる。多型部位が単一ヌクレオチド長である場合には、その部位は、単一ヌクレオチド多型(「ＳＮＰ」)として言及される。もし特定の染色体配置において、例えば、ある集団の一のメンバーがアデニンを有し、その集団の他のメンバーが同じゲノム位置でチミンを有するならば、この位置は、多型部位であり、一層詳細には、この多型部位は、ＳＮＰである。多型部位は、置換、挿入又は欠失に基いて、配列における差異を与えることができる。多型部位に関する配列の各バージョンを、ここでは、多型部位の「対立遺伝子」と呼ぶ。従って、前の例において、ＳＮＰは、アデニン対立遺伝子及びチミン対立遺伝子の両方を与える。
【００１８】
遺伝的マーカーは、例えば、もしマーカーが遺伝子エレメント又は表現型の特徴と、対立遺伝子のランダムな組合せにより予想されるよりも一層高い頻度(特定の集団の対立遺伝子頻度に基く)で共存すれば、遺伝子エレメント又は表現型の特徴と「関連して」いる。関連は又、物理的関連、例えばゲノム中の近位又はマーカー及び遺伝子エレメントのハプロタイプブロック中の存在をも示す。
【００１９】
基準配列は、典型的には、特定の遺伝的エレメント例えば遺伝子について言及される。その基準と異なる対立遺伝子は、「変異体」対立遺伝子と呼ばれる。基準配列は、しばしば、最も頻繁に現れる対立遺伝子として又は典型的な表現型を与える対立遺伝子として選ばれ、「野生型」対立遺伝子と呼ばれる。
【００２０】
幾つかの変異型対立遺伝子は、ポリペプチド例えば補体経路の遺伝子によりコードされるポリペプチドに影響を与える変化を含みうる。これらの配列の差異は、基準ヌクレオチド配列と比較した場合、単一ヌクレオチドの又は２以上のヌクレオチドの挿入又は欠失を含みえて、これは、フレームシフト；即ち、コードされるアミノ酸の変化を生じる少なくとも一ヌクレオチドの変化；未成熟停止コドンの生成を生じる少なくとも一ヌクレオチドの変化；これらのヌクレオチドによりコードされる一以上のアミノ酸の欠失を生じる数個のヌクレオチドの欠失；リーディングフレームのコード配列の中断を生じる同等でない組換え又は遺伝子変換などによる一以上のヌクレオチドの挿入；配列の全部又は一部の複製；転移；又はヌクレオチド配列の再配置を生じる。或は、ＡＭＤ又はＡＭＤに対する罹病率と関係する多型は、一以上のヌクレオチドにおける類義語的変化でありうる(即ち、補体経路の遺伝子のコドンの変化を生じない変化)。かかる多型は、例えば、スプライス部位を変え、ｍＲＮＡの能力又は輸送に影響を与え、或は、ポリペプチドの転写又は翻訳に影響を及ぼす。基準ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドは、特定の基準アミノ酸配列を有する「基準」ポリペプチドであり、変異型対立遺伝子によりコードされるポリペプチドは、変異型アミノ酸配列を有する「変異型」ポリペプチドと呼ばれる。
【００２１】
ハプロタイプは、遺伝マーカー例えば多型部位における特定の対立遺伝子の組合せである。本明細書のハプロタイプは、ＡＭＤ及び／又はＡＭＤに対する罹病性と関係している。本明細書におけるハプロタイプの存否の検出は、それ故、ＡＭＤ、ＡＭＤに対する罹病性を示し又はその欠如を示す。ここに記載のハプロタイプは、ＳＮＰ及びマイクロサテライト等の遺伝マーカーの組合せである。それ故、ハプロタイプの検出は、多型部位の配列を検出するための当分野で公知の方法により達成される。
【００２２】
ここに開示したハプロタイプ及びマーカーは、好適な補体経路遺伝子例えばＣ３又はＣ５、同様に、ＡＭＤ及び補体関連表現型とは、「連鎖不平衡」(ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ、ＬＤ)にある。「連鎖」は、遺伝子型及び／又は表現型の互いの予想される統計的関係より高いことをいう。ＬＤは、２つの遺伝的エレメントのランダムでない組合せをいう。もし、例えば、特定の遺伝的エレメント(例えば、多型部位における対立遺伝子)が、集団中に０．２５の頻度で生じ且つ他方も０．２５の頻度で生じれば、両エレメントを有する個人の予想される出現は、これらのエレメントのランダムな分布を仮定して、０．１２５である。しかしながら、もし、これらの２つのエレメントが一緒に０．１２５より高頻度で出現することが発見されたならば、それらのエレメントは、それらは、独立した対立遺伝子頻度が予想するものより高頻度で一緒に遺伝される傾向があるので、ＬＤにあるといわれる。概して、ＬＤは、一般に、これらの２つのエレメント間の組換え事象の頻度と相関している。対立遺伝子頻度は、集団中で、例えば、集団中の個人のゲノタイピングにより及び集団における各対立遺伝子の出現を測定することによって決定することができる。例えば、二倍体個体の集団例えばヒトの集団について、個人は、典型的には、各遺伝的エレメント(例えば、マーカー又は遺伝子)に対して２つの対立遺伝子を有する。
【００２３】
この発明は又、「ハプロタイプブロック」又は「ＬＤブロック」において同定されるマーカーにも向けられている。これらのブロックは、例えば補体経路遺伝子等のそれらの遺伝的エレメントへの物理的近さにより、又は該エレメントからの「遺伝的距離」によって規定される。当業者には、他のブロックは、好適な補体経路遺伝子例えばＣ３又はＣ５を有するＬＤにおける遺伝学領域として明らかであろう。これらのブロックにおいてそれらのＡＭＤ及び補体経路との関係の故に同定されたマーカー及びハプロタイプは、この発明に包含される。当業者は、まれに組換えを起こす染色体の領域及び「ホットスポット」であって例えば頻繁な組換え事象を示す染色体の領域がＬＤブロックを示すことを認めるであろう。ホットスポットに関係するまれ組換え事象の領域は、細胞分裂中に維持されるブロックを形成するであろう。従って、表現型と関係したマーカー(該マーカーは、ＬＤブロックに含まれる)の同定は、表現型と関連したブロックを同定する。それ故、このブロック内で同定された何れのマーカーも、表現型を同定するために利用することができる。
【００２４】
この発明のマーカー又はハプロタイプと共にＬＤ中にある更なるマーカーは、ここでは、「サロゲート」マーカーと呼ばれる。かかるサロゲートは、他のマーカー又は他のサロゲートマーカーに対するマーカーである。サロゲートマーカーは、それら自体マーカーであって、他のマーカーの存在を示すものであり、それは、更に、他のマーカー又は関連表現型の何れかを示す。
【００２５】
幾つかの候補遺伝子が、ＡＭＤとの関連につき消極的にスクリーニングされてきた。これらの結果のすべては、Haddad等に総説されており、それは、関連参考文献を列記している。これは、ＴＩＭＰ３(メタロプロテイナーゼ−３の組織インヒビター)、網膜内光レセプターマトリクス(ＩＰＭ)プロテオグリカンのＩＭＰ２００をコードする遺伝子のＩＭＰＧ２、ＶＭＤ２(ベストフィン遺伝子)、ＥＬＯＶＬ４(非常に長鎖の脂肪酸の伸張)、ＲＤＳ(ペリフェリン)、ＥＦＥＭＰ１(ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリクス)、ＢＭＤ(ベストロフィン)を含む。ある遺伝子、ＧＰＲ７５(Ｇタンパク質共役レセプター遺伝子)は、ＡＭＤの患者において、コード領域における多様性を有することが示されてきた。他の遺伝子は、少なくとも一つの病気との可能な関連を示されてきた−ＰＯＮ１(パラオキソナーゼ遺伝子)；ＳＯＤ２(マンガンスーパーオキシドジスムターゼ；ＡＰＯＥ(アポリポタンパク質Ｅ)、(ε４対立遺伝子が、幾つかの研究で、この病気と関連し、他の病気とは関係しないことが示されている))；及びＣＳＴ３(シスタチンＣ)(これは、ある研究が、ＣＳＴ３ Ｂ／Ｂホモ接合体におけるＡＲＭＤに対する増大した罹病性を示唆している)。ＡＢＣＲ遺伝子(ＡＢＣＡ４)の、ＡＭＤに関する役割については、矛盾した報告がある。
【００２６】
補体経路マーカーの同定
他の補体経路のメンバーのうちで、Ｃ３及びＣ５は、評価のための候補遺伝子として選択された。タグＳＮＰを、Ｃ３及びＣ５を横切って選択したが、Ｃ３には、ＳＮＰｒｓ２２３０１９９が含まれ、これは、４００症例のＡＭＤ及び２００の対照のゲノムワイドな関係に関してＮＩＨｄｂＧＡＰデータベースにおいて利用可能な単一マーカー試験でｐ＝２．８×１０-5を有することが報告されたものである。ゲノタイピングを、以前に記載されたように、Illumina GoldenGateアッセイ及びSequnom iPLEXシステムを利用する実験の一部として行なった。６０代以上の無関係の白人２，１７２人よりなる研究用集団を、眼の実験及び基底部写真に基づいて診断した(乾燥及び新血管新生(湿潤) の進行したＡＭＤの両方で１，２３８症例及び９３４の対照例)。これは、以前にMaller等によって、同じフェノタイピング基準を利用して、詳細に記載され、集団の下部構造による症例対称関係の統計の膨張を示さないように、以前に確立された同じ試料セットである。
【００２７】
Ｃ３中の単一ＳＮＰ(ｒｓ２２３０１９９；SEQ ID NO:１)は、ｐ＜１０-12での有意のＡＭＤとの関係を示し、少ない対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）として対照で０．２１及び症例で０．３１を示した(表２)。このＳＮＰは、非類義語のコーディング変化(Ａｒｇ１０２Ｇｌｙ)をＣ３の第二エキソン中に造る。Ｃ３に分類された他のＳＮＰは、個々に統計的に有意の関係を示さなかった(表３)。すべての個々のゲノタイピングしたＳＮＰを試験することに加えて、マルチマーカーハプロタイプ試験を利用して、ＨａｐＭａｐ上に存在する未タイピングＳＮＰにおける関係を評価したが、更なる関係は、見出されなかった。これらのＳＮＰ及びハプロタイプにおける関係を、更に、ｒｓ２２３０１９９にて遺伝子型を調節して試験して、有意の関係は認められなかった(表３)。試験は又、新血管新生ＡＭＤと地図状萎縮型ＡＭＤとの間の何らかの差異を検出するためにも行なわれた。統計的に有意の差異は、認められなかった。Ｃ５中のＳＮＰは、ＡＭＤへの有意の関係を示さなかった(表４)。
【００２８】
ｒｓ２２３０１９９と５つの変異体との間のエピスタシスの役割も評価した。ＣＦＨにおける２つの変異体(１０６１１７０ − SEQ ID NO:２及び１０４９０９２４ − SEQ ID NO:３)、ＣＦＢ／Ｃ２遺伝子座における２つの変異体(９３３２７３９ − SEQ ID NO:４及び６４１１５３ − SEQ ID NO:５)、及びＬＯＣ３８７７１５／ＨＴＲＡ１遺伝子座のもの(１４１０９９６ − SEQ ID NO:６)が、この一団におけるＡＭＤのリスクと明確に関係されるとして確立された。ロジスティック回帰分析を利用しては、統計的に有意な相互作用期間は、これらのＳＮＰ、一つのカテゴリーとして稀な陽性ＳＮＰの２つの因子Ｂ、又は２つの異なるＣＦＨＳＮＰにより形成された３つのハプロタイプの何れの対の間でも認められなかった。弱い相互作用は排除できなかったが、この結果は、同じ経路を標的としているにもかかわらず、これらの変異体が、独立した、ロジスティック相加的（log-additive）様式で非常にリスクを与えることを示唆している。
【００２９】
この新規な変異体ｒｓ２２３０１９９の独立的な作用を仮定すると、それは、Maller等のマルチ遺伝子座リスクモデルに加えられた。ＡＭＤに関連した変異体の個別の及び組み合わされた効果は相加的であるので、この遺伝子座によって説明されるリスクにある集団変異体(この年齢群における後期ＡＭＤの罹患率を５％と仮定)の全体的割合は、凡そ２％である(この集団を横切るリスクの下にある正規分布Ｎ(０，１)と仮定)。比較のために、ＣＦＨ、ＬＯＣ３８７７１５／ＨＴＲＡ１及びＣＦＢの変異の効果の比較評価は、それぞれ、１６％、１０％及び２．５％であり、これは、これらの４つの同定された遺伝的因子の個々の効果が単独で、公知の環境的共変量(covariate)による遅発性の異常のリスクにおける顕著な３０％の集団変異を説明することを示している。これらの対立遺伝子の頻度及び浸透度を仮定すれば、これらの独立的効果は、組み合わせた場合、これらの症例及び対照を引き出した集団中の後期ＡＭＤについての真の予想値を与える。この年齢群においては後期ＡＭＤの浸透度は凡そ５％であるが、これらの４つの遺伝子の変異は、１％未満の病気のリスクを有する集団の２０％を同定することができ、逆に、５０％を超えるリスクを有する集団の１％を同定することができる。実際、この後者の範疇では、１５４人の患者(１２３８人中)が、たった９人の対照(９３４人中)に比べて、同定された。
【００３０】
ＨａｐＭａｐフェーズＩＩは、たった２個のＳＮＰがｒ2＞０．４で相関するだけで、ｒｓ２２３０１９９の代理(proxies)をほとんど示さなかった。第一に、ｒｓ２２３０２０３(SEQ ID NO:７)は、７．６ｋｂ下流の類義語的エキソン多型であって、ｒ2＝０．７５で相関する。他のものは、ｒｓ２２３０１９９の５．９ｋｂ上流のこの遺伝子の外にあるものであり、やはり、ｒ2＝０．７５で相関する。これらの少数の代理は、この領域における低レベルの連鎖不平衡と共に、原因対立遺伝子が１４ｋｂ未満の領域にあることことを示唆している。
【００３１】
この関連するＡｒｇ１０２Ｇｌｙ変異体(SEQ ID NO:１)は、これらの２つの共通アロタイプＣ３：Ｃ３Ｆ(fast)及びＣ３Ｓ(slow)(このように命名されたのは、電気泳動時の移動度の差異による)の分子的基礎として確立されている。このＣ３Ｆ変異体は、以前に、他の免疫に媒介される病気例えばＩｇＡ腎障害及び腎糸球体腎炎に関連して報告されている。この変異体は又、腎臓移植物の長期的成功に影響を与えることも報告されており、即ち、Ｃ３Ｓホモ接合体のレシピエントは、Ｃ３Ｆアロタイプのドナーの腎臓を受けた場合に、一致したホモ接合体のＣ３Ｓドナーよりずっと良好な移植片生存及び機能を有した。更に一般的には、Ｃ３及びＣＦＨ両方の欠如は、膜増殖性糸球体腎炎(ＭＰＧＮ)における、免疫媒介による腎臓傷害と関連付けられてきており、ＡＭＤ関連Ｙ４０２Ｈ変異体も又、これらの２つの病気の病因論において深い関係を強調するＭＰＧＮと有意に関連していることが示されている。補体系とＡＭＤにおける変異の間の更なる関係の発見は、機能的実験及び治療剤の開発を、補体カスケードの別の経路の特異的活性に一層正確に集中させるのに役立つであろう。
【００３２】
診断用遺伝子アレイ
一面において、この発明は、遺伝子断片、特に、SEQ ID NO:１〜７として与えたＳＮＰを含む遺伝子断片のアレイ及び、SEQ ID NO:１〜７のＳＮＰにおいて対立遺伝子を検出するためのプローブを含む。ポリヌクレオチドのアレイは、単一試料中の多数のポリヌクレオチド配列をアッセイすることのできる高スループット技術を提供する。この技術は、例えば、ＡＭＤを発症するリスクポテンシャルを、この発明のＳＮＰとプローブを用いて、評価するための診断用ツールとして利用することができる。ポリヌクレオチドアレイ(例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡアレイ)は、基材上に、規定されたｘ及びｙ座標に、予め決めた配置で配置した通常異なる配列のポリヌクレオチドの領域を含む。これらの領域(ときに、「フィーチャー」と呼ばれる)は、基材上の各位置(「アドレス」)に置かれる。これらのアレイは、試料にさらされた場合に、観察される結合パターンを示す。この結合パターンは、該アレイに応答指令信号を送ることにより検出することができる。例えば、試料中のすべてのポリヌクレオチド標的(例えば、ＤＮＡ)を、適当な標識(例えば、蛍光化合物)で標識して、アレイ上の蛍光パターンを、試料への曝露後に、正確に観察することができる。異なる配列のポリヌクレオチドは、正確に、予め決めた配置に従って付着すると仮定すれば、観察された結合パターンは、試料中の一種以上のポリヌクレオチド成分の存在及び／又は濃度を示すであろう。
【００３３】
アレイは、以前に得られた生体高分子を基材上に付着させるか又はイン・サイチュー合成法によって作成することができる。この基材は、ポリヌクレオチドプローブが結合することのできる任意の支持材料であってよく、これは、ガラス、ニトロセルロース、ケイ素及びナイロンを包含するが、これらに限られない。ポリヌクレオチドは、この基材に、共有結合により又は非特異的相互作用(例えば、疎水性相互作用)によって結合させることができる。イン・サイチュー作成法は、ペプチドアレイの合成についての米国特許第５，４４９，７５４号、及びポリヌクレオチドアレイの合成についての米国特許第６，１８０，３５１号及びＷＯ９８／４１５３１(並びにこれらにおいて引用された参考文献)に記載されたものを含む。生体高分子アレイの作成の更なる詳細は、米国特許第６，２４２，２６６号；米国特許第６，２３２，０７２号；米国特許第６，１８０，３５１号；米国特許第６，１７１，７９７号；欧州特許第０７９９８９７号；ＰＣＴ No.ＷＯ９７／２９２１２;ＰＣＴ No.ＷＯ９７／２７３１７；欧州特許第０７８５２８０号；ＰＣＴ No.ＷＯ９７／０２３５７；米国特許第５，５９３，８３９号；５，５７８，８３２号；欧州特許第０７２８５２０号；米国特許第５，５９９，６９５号；欧州特許第０７２１０１６号；米国特許第５，５５６，７５２号；ＰＣＴ No.ＷＯ９５／２２０５８；及び米国特許第５，６３１，７３４号に記載されている。生体高分子アレイを作成する他の技術は、合成技術に向けられた公知の考え方を包含する。市販のポリヌクレオチドアレイ、例えばAffymetrix GeneChip(商標)を利用することもできる。GeneChip(商標)の遺伝子発現を示すための利用は、例えば、Lockhart等、Nat.Biotechnol., 14:1675, 1996；Chee等、Science, 274:610, 1996；Hacia等、Nat.Gen., 14:441, 1996；及びKozal等、Nat.Med., 2:753, 1996に記載されている。他のタイプのアレイは、当分野で公知であり、本発明のＡＭＤ診断用アレイを開発するのに十分である。
【００３４】
これらのアレイを造るために、一本鎖ポリヌクレオチドプローブを、基材上に、２次元的マトリクス又はアレイに配置することができる。各一本鎖ポリヌクレオチドプローブは、SEQ ID NO:１〜７に示したヌクレオチド配列又はそれらの相補配列から選択される少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５又は３０の或は一層多くの隣接するヌクレオチドを含むことができる。好適なアレイは、SEQ ID NO:１〜７に示したヌクレオチド配列又はそれらの相補配列から選択される少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５又は３０の或は一層多くの隣接するヌクレオチドを含む少なくとも一つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブを含む。
【００３５】
患者からの組織試料を、例えば、当分野で公知のように、熱することにより又は化学的変性により処理して、一本鎖ポリヌクレオチドを形成することができる。組織試料中の一本鎖ポリヌクレオチドを、次いで、標識して、アレイ上のポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせることができる。用いることのできる検出可能な標識は、放射性標識、ビオチン化標識、蛍光物質、及び化学発光標識を包含するが、これらに限られない。ポリヌクレオチドプローブに結合した標識された試料のポリヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドは、一度試料の未結合部分を洗い去ると検出することができる。検出は、可視化することができ又はコンピューターの助けにより行なうことができる。好ましくは、アレイを試料にさらした後で、そのアレイを、アレイフィーチャーからのシグナル(例えば、蛍光パターン)を検出するリーディング装置(例えば、アレイ「スキャナー」)を用いて読む。かかるリーダーは、好ましくは、接近したフィーチャーを有するアレイについての非常に細かい解像度(例えば、５〜２０ミクロンの範囲)を有する。
【００３６】
アレイの読みから生じたシグナルイメージを、次いで、デジタル処理して、読まれたデータの何れの領域(ピクセル)が所定のフィーチャーに属するかを評価することができ並びに各フィーチャーに結合した全シグナル強度を計算することができる。前述の工程は、個別的又は集合的に、「フィーチャー（特徴）抽出」と呼ばれる(米国特許第７，２０６，４３８号)。これらのフィーチャー抽出技術を利用して、患者由来のポリヌクレオチド試料の、SEQ ID NO:１〜７として与えたアレイ上でのＡＭＤマーカーの一つとのハイブリダイゼーションの検出は、上記のように、ＡＭＤの遺伝的リスク因子を有する患者又は有しない患者を同定する。
【００３７】
患者のデータを分析するためのシステム
他の面において、この発明は、患者のデータを編集して処理し、ＡＭＤ発症についてのリスクプロファイルを与えるシステムを提供する。コンピューター補助された医療データ交換システムが好ましい。このシステムは、医療提供者が利用できるデータの管理を容易にすることによって、高品質の医療を患者に与えるようにデザインされている。医療提供者には、典型的には、内科医、外科医、看護士、臨床医、様々な専門家、その他が含まれる。しかしながら、本件明細書では、一般的には臨床医が参照されるが、医療提供者には、事務職員、保険会社、教師と生徒なども含まれうるということに注意すべきである。このシステムは、臨床医がデータをデータ処理システムと交換することを可能にするインターフェースを提供する。このデータ処理システムは、統合された知識ベース及びデータベースにリンクされている。
【００３８】
このデータベースは、ソフトウェアベースであってよく、下記のように様々なリソースから情報を引き出すための、又はかかる情報のアクセスを調整し若しくは解釈するためのデータアクセスツールを含んでいる。一般に、このデータベースは、生のデータを利用可能な形式に統一する。任意の適当な形式を採用することができ、多数の形式を採用することができ、それには、ハイパーテキストマークアップランケージ(ＨＴＭＬ)エキステンデドマークアップランゲージ(ＸＭＬ)、デジタルイメージング・アンド・コミュニケーションズ・イン・メジスン(ＤＩＣＯＭ)、Ｈｅａｌｔｈ Ｌｅｖｅｌ Ｓｅｖｅｎ(商標)(ＨＬ７)などが含まれる。本明細書において、統合された知識ベースは、任意の及びすべての種類の利用可能な医学データを含むと考えられ、該データは、データ処理システムによって処理され得て、所望の医療を提供するために臨床医に利用可能なものとされる。一般に、これらのリソース及び知識ベース中のデータは、データベース及びデータ処理システムによる抽出及び分析に利用可能なデータとするためにデジタル化されて保存される。一層伝統的なデータ収集用リソースを用いた場合でも、そのデータは、データ処理システムにより実行される様々な種類の分析において同定し操作することのできる形式で配置される。
【００３９】
この統合された知識ベースは、広義の医学関連データの一つ以上の収納場所、並びにそれらの収納場所間のインターフェース及びトランスレーター、及びデータに対する所望の処理(分析、診断、報告、表示及び他の機能を含む)を実行するための処理能力を含むことを意図している。データ自体は、患者に特異的な特徴並びに患者に特異的でない情報に関連しうる(人、機械、システムなどの種類に関して)。その上、これらの収納場所は、専らデータを保存するためのシステム、又は種々の要素からなるシステム例えばイメージングシステムの部分であるメモリー装置を含むことができる。上記のように、統合された知識ベースを作り上げている収納場所及び処理用リソースは、拡張可能であり、物理的に、任意の数の位置にあってよい(典型的には、専用の又は開放されたネットワークリンクにより繋がれている)。その上、統合された知識ベース内に含まれたデータは、臨床データ(例えば、患者の状態に特異的に関係するデータ)及び非臨床データの両方を含むことができる。好適な臨床データの例は、患者の病歴、患者の血清及び細胞の抗酸化物質レベル、及び患者にＡＭＤを発症しやすくする過去又は現在の環境、生活様式及び他の因子を含む。これらは、肥満、喫煙、ビタミン及び食事サプリメント摂取、アルコール又は薬物の使用、乏しい食事及びすわりがちの生活様式などの様々なリスク因子を含むが、これらに限られない。非臨床的データは、患者に関する一層一般的な情報例えば住所、保険業者に関するデータ、及び患者を診てきた重要な又は現在の開業医(主たる内科医、専門医などを含む)の名前及び住所若しくは電話番号を含むことができる。
【００４０】
情報の流れは、広範な種類及び情報交換のためのビヒクルを含むことができる。一般に、患者は、臨床医と伝統的な往診を通して交流することができ並びに遠方では、電話、電子メール、フォームなどによって交流することができる。患者は又、これらのリソースの要素と、伝統的な患者の病歴フォームを含みうる一定範囲の患者情報獲得用インターフェース、イメージング用インターフェース、組織試料、体液などを集めて分析するためのシステムを介して相互作用することもできる。臨床医とインターフェースとの間の相互作用は、インターフェースの性質によって、任意の適当な形態をとることができる。従って、臨床医は、このデータ処理システムと、伝統的な入力装置例えばキーボード、コンピューター用マウス、タッチスクリーン、ポータブル式又は遠隔式入出力装置によって相互作用することができる。インターフェース、データ処理システム、知識ベース、データベース及びこれらのリソースの間のリンクは、典型的には、コンピューターのデータ交換用相互接続、ネットワーク接続、ローカルエリアネットワーク、広域ネットワーク、専用ネットワーク、バーチャルプライベートネットワークなどを含む。
【００４１】
一般に、これらのリソースは、患者特異的であるか又は患者に関連しており、即ち、物理的に直接接近して又は遠方から(例えば、コンピューターリンクにより)集めることができる。このリソースデータは又、特定の患者のリスク及び状態の分析を、既知の集団の特徴との比較に基づいて可能にするように集団特異的であってもよい。これらのリソースは、一般に、データを一般化するプロセスと考えられうるということに注意すべきである。これらのシステム及びリソースの多くは、それら自身データを含むであろうが、これらのリソースは、制御可能であって、患者の適切な治療に必要なデータを生成するためにそれらを利用することのできる範囲を示すことができる。典型的な制御可能で指示可能なリソースは、例えば、患者の生理的パラメーターを感知したシグナルに基づいて検出するようにデザインされた様々なデータ収集システムを含む。かかる電子的リソースは、例えば、脳波検査(ＥＥＧ)用リソース、心電図検査(ＥＣＧ)用リソース、筋電図検査(ＥＭＧ)用リソース、電子的障害断層撮影(ＥＩＴ)用リソース、神経伝導試験用リソース、電気眼振検査(ＥＮＧ)用リソース、及びかかるリソースの組合せを含むことができる。様々なイメージング用リソースを、数的に指示されたように制御して規定することができる。かかるリソースの幾つかのモダリティー例えばＸ線イメージングシステム、磁気共鳴(ＭＲ)イメージングシステム、コンピューター断層撮影(ＣＴ)イメージングシステム、陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)システム、蛍光間接撮影システム、超音波検査システム、近赤外線イメージングシステム、核イメージングシステム、熱音響学的システムなどが、現在、利用可能である。イメージングシステムは、他のイメージングシステムから情報を引き出すことができ、電気的リソースは、情報の直接的交換のために、イメージングシステムと連結する(例えば、イメージデータ生成のタイミング又は調整などのために)ことができる。
【００４２】
かかる電気的で高度に自動化されたシステムに加えて、臨床的及び研究的性質の様々なリソースがアクセス可能である。かかるリソースは、血液、尿、唾液及び他の液体分析用リソース(胃腸、生殖器、及び脳脊髄液の分析システムを含む)を含むことができる。かかるリソースは、更に、ポリメラーゼ(ＰＣＲ)連鎖反応分析システム、遺伝子マーカー分析システム、放射免疫アッセイシステム、クロマトグラフィー及び類似の化学分析システム、レセプターアッセイシステム及びかかるシステムの組合せを含むことができる。例えば組織分析システム、細胞学及び組織分類システムなどの組織学的リソースも、ある程度は同様に含まれてもよい。他の組織学的リソースは、免疫細胞化学及び組織病理学的分析システムを含むことができる。同様に、電子及び他の顕微鏡システム、イン・サイチューハイブリダイゼーションシステムなどは、典型的な組織学的リソースを構成することができる。薬物速度論的リソースは、治療用薬物モニターシステム、レセプター特性決定及び測定システムなどのシステムを含むことができる。再び、かかるデータ交換は、データ処理システムを通過すると考えうるが、様々なリソース間での直接的交換も又、実行することができる。
【００４３】
本システムの利用は、患者試料を得る臨床医、及びＡＭＤの疾病素質を示す(又は、示さない)その患者における遺伝子マーカー例えばSEQ ID NO:１〜７の存在の、単独での又は他の公知のリスク因子と組み合わせての評価を含む。臨床医又はその助手は又、適当な臨床上の又は臨床上でない患者の情報をも獲得して、このシステムに入力する。このシステムは、次いで、そのデータを編集・処理して、その患者についてのＡＭＤを発症するリスクプロファイルを含む出力情報を与える。
【００４４】
本発明は、こうして、ＡＭＤと相関されてきたある種のポリヌクレオチド配列を提供する。これらのポリヌクレオチドは、診断として有用であり、好ましくは、患者の試料をスクリーニングするのに有用なアレイを作成するために利用される。このアレイは、現在最も好適な具体例において、実験室情報管理システムの一部として利用されて、患者の遺伝的プロファイルに加えて、更なる患者情報を保存して処理する。ここに記載のように、このシステムは、患者の制御可能な因子に基いて、患者のＡＭＤ発症のリスク、病気の進行のリスク、及び病城の予防の見込みの評価を与える。
【実施例】
【００４５】
実施例１．
ＡＭＤと関連する遺伝的変異体の発見：幾つかの実験室は、今や、ＡＭＤと関連する遺伝的変異体を同定している。これらの幾つかは、補体経路にある(ＣＦＨ、ＢＦ／Ｃ２)。それらの遺伝子及び変異体の機能は完全には理解されていないが、染色体１０上の幾つかの密接にリンクした遺伝子を含む領域(ＬＯＣ３８７７１５、ＨＴＲＡ１)への結合もある。我々のデータベースを利用して、ＣＦＨにおいて以前に認められていない一般的な非コード変異体が同定され、それは、この遺伝子座のＡＭＤに対する影響を実質的に増大させ、３つの遺伝子において４つの他の公知の一般的対立遺伝子の関係を強力に複製し、ＢＦ／Ｃ２遺伝子座の第一の確認も複製した(ｐ値は、約１０−１２〜１０−７０)。
【００４６】
補体経路は、ＡＭＤに関与する：遺伝的変異体及び環境は、ＡＭＤの発症及び病因論において一つの役割を演じる。それ故に、個人のリスクを決定する際に両者を考慮に入れることは望ましい。現在まで、ＡＭＤと関連する幾つかの変異体のうちで補体因子Ｈ(ＣＦＨ)のＹ４０２Ｈ変異体は、もっとも複製されて研究されたものであり、ホモ接合体条件を有する患者において７倍増大したと見積もられているリスクを与える。Ｙ４０２Ｈ ＳＮＰは、ヘパリン及びＣ反応タンパク質のためのＣＦＨ結合部位内にある。これらの部位への結合は、機能喪失；例えば減少した標的に結合する能力及び／又はＣＲＰと相互作用する能力へと導くように変わりえて、それにより、おそらく、過剰の補体活性化を生じさせる。補体断片についてのアッセイは、益々、免疫反応における初期事象についての有用なマーカーとなりつつある。補体の活性化の開始は、細胞表面並びに液相で起こりうるので、補体の活性化は、文献化されうる最初の事象の一つでありうる。局所的過程は、血液中に常には反映されえない。
【００４７】
Ｃ１の抗体への結合及び活性化による典型的経路の活性化がおきる場合には、Ｃ４が開裂して、Ｃ４ａ及びＣ４ｂを生じる。Ｃ４ａは、局所的に放出されて、循環に到達することができる。それは、市販のＥＬＩＳＡキット(例えば、Pharmingen, OPT-EIA)によってｎｇ／ｍｌの量で検出することができる。レクチン経路が、マンノース結合性レクチン(ＭＢＬ)の炭水化物に覆われた細菌表面への結合により活性化されたとき及びマンノース結合性レクチン関連セリンプロテアーゼ(ＭＡＳＰ)酵素がＣ４を開裂したときには、類似の事象が起きる。微生物又は多くの種類の免疫グロブリンの凝集物を含む他の粒子の帯電した多くの表面は、他の補体経路を活性化することが示されている。この経路において最初に放出された第一の開裂生成物は、因子Ｂの開裂から生じたＢｂである。Ｂｂは、血漿中で、市販のＥＬＩＳＡキット(例えば、Quidel)によって、μｇ／ｍｌの量で測定することができる。補体経路は、互いに相互作用することができ、それ故、各々の成分を測定することは重要でありうる。
【００４８】
何れかの経路による活性化が持続するならば、Ｃ３は、測定可能な断片を生成するための次の主要タンパク質である。Ｃ３は、初期に、２つの断片に分裂し、Ｃ３ａは、アナフィラトキシン活性を有する小さい断片であって、多くの細胞種で見いだされる特異的Ｃ３ａレセプターを介して相互作用し、Ｃ３ｂは、一層大きい断片であって、表面近く又は分子に活性なチオエステル結合を介して共有結合する特性を有する。後者は、Ｃ３コンバーターゼがそれを開裂したときに、分子中のコンホメーション変化により生成される。この共有結合は、表面の補体活性化の近くへＣ３ｂ(又は、その後の開裂断片)を永久的に配置させる。これらの配置及びその後の開裂断片は、多くの細胞種において見出されるＣ３レセプター(ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、ＣＲ４)と相互作用する。これは、免疫付着へと導き、免疫複合体、細菌、ウイルス又は何であれＣ３ｂが結合したもののクリアランスのための輸送機構を与える。Ｃ５ａ及びＣ５ｂ−９(膜攻撃複合体(ＭＡＣ))は、末端活性化経路のマーカーでもある。
【００４９】
ＣＦＨは、別経路を、次の３つの作用によって抑制する：１）因子ＢのＣ３ｂへの結合を阻止し、２）Ｃ３ｂＢｂ(別経路Ｃ３コンバーターゼ)に結合して、Ｂｂ酵素サブユニットをはずし、そして３）因子Ｉに対して補因子活性を与え、これはＣ３ｂを開裂させることができて、不活性形態ｉＣ３ｂを生成する。幾つかのｉＣ３ｂは、液相中にあり、通常、血漿中で３０μｇ／ｍＬより少なく、低い変動性を有する。上昇すると、ＣＦＨがＣ３ｂを不活性化させるように機能することの間接的指示を与えることができる。抗体によるＣＦＨの阻害は、ウエスタンブロットにより測定でき、Ｃ３ｂのｉＣ３ｂへの開裂を減少させる。Ｃ３ｂの不活性化におけるＣＦＨの機能を測定するために、Ｃ３ｂとｉＣ３ｂを測定することは望ましいであろう。しかしながら、Ｃ３ｂアッセイは、実質的変動性を示す。それ故、我々は、ある種の病状を反映するＣ３を測定するが、ｉＣ３ｂ／Ｃ３の比も又、ＡＭＤのリスクの別の可能な指標として分析する。
【００５０】
因子Ｂは、Ｃ３コンバーターゼの酵素サブユニットＢｂを与え、別経路の増幅ループ、及びＣ５コンバーターゼの形成に寄与する。ＣＦＨは別経路を抑制するが、プロパージンは、別経路のＣ３及びＣ５コンバーターゼを安定化させ、そうして、Ｃ３ｂの不活性化ではなく、膜攻撃複合体(ＭＡＣ)の形成を促進するのに役立つ。ＣＦＨの変異体はＡＭＤのリスクを増大させるが、因子Ｂをコードする遺伝子の変異は、ＡＭＤのリスクを減少させることが見出された。因子Ｂ及びＣ３の両者は、マウスモデルにおいて、レーザー誘発性脈絡膜新血管新生の発症において重要であることが見出された。
【００５１】
遺伝学的考察に加えて、環境因子が、ＡＭＤリスクにおいて役割を演じており、補体レベルに影響を与えうる。喫煙は、独立したＡＭＤのリスク因子であり、補体を活性化すること及び因子Ｂのレベルを高めることが報告されている。喫煙者は、低下したＣＦＨレベルを有することが報告されている。ＣＦＨの血漿レベルは、全集団中で広範囲(１１０〜６１５μｇ／ｍＬ)に変化することが報告されており、ＣＦＨの測定は、変異型ＣＦＨから正常型を識別することができないが、ＡＭＤについては、更なるデータが必要とされている。それ故、リスクがある患者を決定するためには、我々は又、ＡＭＤと関連する最近の遺伝子変異体と関連する他の可能なバイオマーカーであって、ＡＭＤの増大したリスクと強く関連する環境因子によっても影響されうるバイオマーカーをも測定するであろう。我々は、ｉＣ３ｂ(又は、ｉＣ３ｂ／Ｃ３)がＣＦＨ Ｙ４０２Ｈ ＴＴ遺伝子型を有して、低いＢＭＩ(ステージ１を有すると予想される)を有する非喫煙者において最も上昇すること、及び高いＢＭＩ及び進行したＡＭＤを有するＣＣ喫煙者では検出しえないことを予想する。ステージ１のＣＣ喫煙者については、我々は、因子Ｂレベルが、進行したＡＭＤを有する者より一層低いことを予想する(因子Ｂの防護的変異体を有する患者の可能な警告を伴う)。別経路の活性化により生成される因子Ｂの断片であるＢｂは、別経路の活性化の信頼できるマーカーである。ＢｂのＢに対する比は、別経路の活性化の比率及び程度に関する情報を再度与え、これらの因子の分析及びＣ３測定は、炎症病巣において進行中の過程への洞察を与える。
【００５２】
アルツハイマー病のプラークにおけるベータアミロイドによる典型的経路の活性化が、Tenner及び共同研究者により示されている。ベータアミロイドがドルーゼン中で同定されたならば、この機構は、この病気における補体活性化の開始因子を与えうる。Ｃ１は、Ｃ４をこの経路で開裂させて、Ｃ４ａ及びＣ４ｂを生成する。Ｃ４ａ及びＣ４ｄ(Ｃ４ｂの更なる分解産物)の測定は、この病理に関与する過程に関する更なる情報を与えることが予想される。Ｃ３が、典型的経路Ｃ３コンバーターゼ(Ｃ４ｂＣ２ａ)により一旦開裂されてＣ３ｂを生成したならば、この別経路は、Ｃ３断片、Ｃ５ａ及びＣ５ｂの一層効率的な産生にとって代わりうる。Ｃ５ａは、補体カスケードの主要な炎症成分であるが、極めて短い半減期を有するので、ＡＭＤで見られるようなゆっくりした活性化過程に対する信頼しうるマーカーたりえない。膜結合性でないＭＡＣとＳタンパク質との組合せにより形成される末端補体複合体であるＳＣ５ｂ−９は、補体活性化の液相マーカーであり、Ｃ５開裂及びＭＡＣの細胞又はアクチベーター表面への配置の間接的指標である。それは、Ｃ５ａより長い半減期を有し、ＡＭＤ患者で起きる補体活性化の程度に関して更なる情報を与えるであろう。
【００５３】
ここに記載の敏感度試験は、活性化が起きたときにのみ生成される低レベルの補体分割産物を検出することができ、該産物は、典型的／レクチン、別経路又は末端経路の活性化と関連している。ＣＨ５０アッセイは、９つのすべての典型的経路タンパク質の順次的活性化に依存する機能的アッセイである。有意な程度でＣＨ５０を減少させるには、何れか一つのタンパク質の本当に大きな減少を要する。加えて、ＣＨ５０は、典型的経路を反映している。一層研究された変異体例えばＣＦＨ及び因子Ｂの殆どは補体機能の別経路に含まれるので、ＣＨ５０は、これらの変異体によって影響されるとは予想されない。
【００５４】
ＡＭＤへの遺伝学的アプローチ：ＡＭＤは、ＩＩ型糖尿病、アルツハイマー病、心臓血管病、高血圧症などに類似した複雑な後発性疾患の範疇に入り、これらにおける遺伝的寄与は、必ずしも簡単なメンデル式遺伝によって明らかとされるものではない。むしろ、これらの及び他の複雑な疾患は、環境因子と多数の遺伝子の罹病性対立遺伝子との間の複雑な相互作用の結果であると考えられ、これらの因子は、組み合わされて、罹病性の閾値に達したときにのみ病気を引き起こすと考えられる。これらの遺伝的リスク因子を探すために、２つの主要な仮説「一般的疾患／一般的変異仮説」(例えば、ＡＰＯＥ４対立遺伝子のアルツハイマー病との関連により示唆されるものなど)及び多数の遺伝子における、一層稀な、複数の遺伝子でのより遺伝的に浸透性な変異が、多因性疾患の遺伝的要素を説明するという仮説が一般に、探査されている。個々の病気において何れの仮説が一層効果を生じるかを示唆する一般的合意はなく、限られた経験的データしかないが、多くの遺伝子が関与する複雑な病気は、普通の変異と稀な変異の両方からの寄与を極めて自然に有しうるということが最もありそうである。
【００５５】
一般的な、低浸透性遺伝的変異を検出するためには、関連研究は、選択の設計(design of choice)である。前記のように、一般的変異は、ＡＭＤの遺伝率においてかなりの役割を演じることが決定的に測定されてきた。しかしながら、以前の研究は、遺伝子のコード領域及び調節領域に変化を生じることが既に知られた多型に専ら集中されていた。このゲノムに対する限られた知識、配列コンテキストのみから潜在的に機能的な変異の多くの形態を認識する限られた能力、及び原因経路の真の理解の欠如は、これらの技術を適用する能力を制限し、それら技術は同時に、極めて高価で且つ未確認であった。これらのハードルの多くは、克服された。ＡＭＤにおいて記載した成功に加えて、ゲノムワイドの関連アプローチは、肥満症、心臓再分極及びＩ型糖尿病における有効な遺伝子発見を生じており、遺伝的に複雑な病気における同様の可能性がある。
【００５６】
補体系における血漿バイオマーカーは、ＡＭＤ及びＡＭＤの進行と関係しており、これらの関係は、遺伝子型、環境因子の制御により異なっている。
【００５７】
補体因子の基準線の血漿レベルは、ＡＭＤについてゲノタイピングされて表現型も決定された患者において、これらのマーカーが所定の環境リスク因子下でＡＭＤのリスクを予測できるかどうかを決定するために測定された。この研究用集団は、（１）不一致の複数の同胞対(家族又は二卵性双生児由来)で、グレード３ｂ、４及び５の同胞及びグレード１の同胞(Ｎ＝１００対、２００名)、及び（２）経時的にグレード１−４からグレード３ｂ、４及び５への移行又はグレード４から５への移行を有する同胞中の病状進行者 (全サンプル６２０人中２１４人が進行した)を含んでいる。すべての被験者は、血漿試料を保存し、これらは一度も解凍されておらず、これらの研究室での分析に用いることのできる方法で集められた。喫煙、体重インデックス(ＢＭＩ)を含むリスク因子データ及び提供された血漿の補体アッセイ(不一致対についての)と同日に採取した別の血液のアリコートからの血清高感度Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)は、該試料につき上記のようにして、入手可能であった。血清ＣＲＰ及び血漿補体因子(基準である同日に採取されたアリコート由来)を、予測分析のための研究の進行局面にある被験者について測定する。この同胞デザインは、喫煙がＡＭＤのリスクを増大させること、及びオメガ−３脂肪酸食事の摂取が該リスクを低下させることを示すために利用された。補体のアッセイ：ＣＦＨ、因子Ｂ、因子Ｉ、Ｃ３及びＣ５レベルは、主として放射状免疫拡散法により、これらの成分に対するポリクローナル抗血清を用いて、ＮＪＣの補体研究所による手順に従って測定する。分離生成物Ｃ３ａ、ｉＣ３ｂ、Ｃ５ａ及びＣ４ａ及び最終補体複合体(ＳＣ５ｂ−９)を、ＥＬＩＳＡにより、Pharmingen BD 又は Quidel により作成されたキットを用いて測定する。比ｉＣ３ｂ：Ｃ３及びＣ３ａ：Ｃ３をも計算する。これらの成分について我々の研究室で確立された正常範囲を、表１に与える。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
臨床検査においては、３個の標準偏差の外側はいずれも異常と考えられる。これらの患者の何人かが低い自然補体(Ｃ３、ＦＢ及びＣ４)を有するならば、それらの分離生成物に対するレベルの比は、絶対量より一層有用であると予想される。対照を有する病気の集団からの結果の比較は、ＡＭＤの患者に対する適当なバイオマーカーを同定することによって更なる研究のために極めて有用である。すべての補体分離生成物は、ＥＤＴＡ管中に採取され、処理されてＥＤＴＡ−血漿を採血後迅速に得て、液体窒素フリーザー中に凍結保存された試料で評価される。各試料は、凍結−解凍サイクルの繰り返しは偽陽性の結果を生じうるので、最初の解凍時に、すべてのタンパク質について試験される。
【００６０】
方法 - ＣＦＨ、因子Ｉ、因子Ｂ、Ｃ５：放射状免疫拡散法を、測定すべき化合物に対する適当量の特異的抗体を含む１％アガロースゲルを調製することにより行なう。ウェルをゲル内に切り、測定した量の各試験用の血清又は血漿、対照用の血清又は血漿、及び既知濃度の測定される化合物を含む少なくとも３つの標準のシリーズで満たす。それらの満たされたゲルを４℃で７２時間インキュベーションした後に、抗体の抗原(その成分を試験する)との結合により形成された沈降素リングの直径を測定し、沈降素リングの面積を計算する。これらの標準により形成されたリングの面積を利用して、試験試料中に存在する成分の濃度を線形回帰により計算する。
【００６１】
Ｃ３、Ｃ４：Ｃ３及びＣ４のレベルは、Beckman-Coulter イメージ装置を用いて、比濁分析により測定される。Ｃ３ａ、Ｃ４ａ：Pharmingen-BD 社(San Diego)製ＯｐｔＥＩＡキット（商品名）を利用するＥＬＩＳＡ。
【００６２】
ｉＣ３ｂ、Ｂｂ、ＳＣ５ｂ−９：これらのマーカーは、Quidel社(San Diego, CA)製キットを利用して測定される。３つのインハウス対照を、試験試料と共に試験にかけて、これらの試料をすべて二重に試験する。
【００６３】
Ｃ反応性タンパク質(ＣＲＰ)は、Ｙ４０２Ｈ ＣＦＨ多型が存在する場合、ＣＦＨに、ＣＣＰ７で結合する。血清ＣＲＰが、ＡＭＤの患者において、対照と比較して上昇することが観察された。ＣＲＰは又、ＣＦＨ変異体の少なくとも一つの対立遺伝子を有する患者におけるＡＭＤのリスクをも増大させる。ＣＲＰは、その基質との結合に際して典型的経路を活性化するが、ＣＲＰは、Ｃ５ｂ−Ｃ９活性化の強さを下げるということも示された。
【００６４】
ＳＮＰピッキング：８ＳＮＰのすべてを、Ｃ３を横切ってゲノタイピングし、７ＳＮＰを、Ｃ５を横切ってゲノタイピングした。ＳＮＰをＴａｇｇｅｒ(www.broad.mit.edu/mpg/tagger/で見出される)及びＣＥＰＨ集団からのＨａｐＭａｐデータ(フェーズＩＩ、www.hapmap.org)を利用して選択した。ＳＮＰを、０．８の最小ｒ2の少ない対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）(＞５％)で選択した。選択されたＳＮＰは、関心ある各領域内の他のＳＮＰの直接的代理であるので、それらの領域内に非常に代表的な遺伝的変異を有するであるか、又は、それらのＳＮＰは、自身が強いＬＤにある他の選択したＳＮＰから作られたマルチマーカーハプロタイプの一部であった。
【００６５】
分析：患者と対照との比較のために、条件付きロジスティック回帰を利用して、遺伝子型のカテゴリー内で、様々な補体因子及びＣＲＰ値の所定のレベルの進行したＡＭＤを有する見込みを測定し、同時に、喫煙年数、体重インデックス及び心臓血管病歴を評価して調整した。補体因子対ＣＲＰと補体因子対遺伝子型との間の効果修正も決定される。リスク因子データは、現存するデータベース中で入手可能であり、分析される。更なる分析も又、遺伝子型と補体因子との間の関連を評価するために、一般的線形モデルを利用して行われる。進行については、類似のＣｏｘ回帰分析を適用して、補体レベルがＡＭＤの進行と関連しているかどうかを、遺伝子型、喫煙、ＢＭＩ、ＣＲＰなどを制御しながら評価する。相互作用及び効果修正を評価して、補体因子がある種の遺伝子型内で多少ともＡＭＤと関係しているかどうか、又はこれらの関係が喫煙状態、ＢＭＩのレベルなどによって変化するかどうかを測定する。一致しない対の分析の力は、効果サイズ(即ち、標準偏差当たりのグループ間の平均的差異)＝０．４０を、１００人の患者と１００人の対照との比較に基づいて、８０％の力で検出するのに十分である。力は、６２０人の患者のうち２１４人の進行者がいる場合、進行の研究のためより一層大きい。多数の試験に関して、種々の補体因子は、高度に相関する傾向があり、ボンフェローニ型相関は不適当であろう。
【００６６】
このプロジェクトの初めの数年間に、３７０家族からの１７９０人の個人が、この研究において登録された。すべての個人から遺伝的研究のためにＤＮＡが精製され、家族の病歴及びリスク因子の情報も又、すべての被験者について集められた。連鎖分析は、ＡＭＤにおいて成功した。個々の研究は、遺伝子局在化の明確な証拠を与えなかったが、連鎖研究のメタアナリシスは、第１及び第１０染色体上に、連鎖の説得力のある証拠を示す領域を、示唆的証拠を示す少数の他の領域と共に同定した。これらの２つの最も説得力のある領域は、後に、ＣＦＨ及びＬＯＣ３８７７１５／ＨＴＲＡ１領域で強く関連した変異体を有することが見出された。進歩がなされたとはいえ、今日までに確認された遺伝子変異体によっては全体的遺伝の一部分しか説明されていないことは明らかである。本発明の関連アプローチは病気に対する一般的な低浸透度の誘因を同定する極めて効率的な方法を提供するが、それらは、病気事象に寄与し、合理的に高い浸透度を有する一層稀な対立遺伝子を見逃す可能性があることも確かである。それ故、進行中の遺伝子発見の努力を補足するために、一層稀な、一層高い浸透度の遺伝子変異のＡＭＤに対する寄与を評価するのに一層最適化された特別のストラテジーを記載する。
【００６７】
【表２】
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【００６８】
【表３】
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【００６９】
【表４】
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【００７０】
実施例２．進行した萎縮性及び新血管新生加齢関連黄斑変性についての、遺伝学的、人口統計的及び環境的変量に基づく予測モデル
コンテキスト：５つの遺伝子中の６つの単一ヌクレオチド多型は、加齢関連黄斑変性(ＡＭＤ)と関係するが、それらのＡＭＤに対する独立した効果は、環境因子を制御しながら評価されたことはない。ここに示したのは、遺伝的及び環境的変量の結合効果の評価及び潜在的なスクリーニングのための予測モデルを設計して評価することである。
【００７１】
設計、セッティング及び参加者：複数の医療研究機関で、進行したＡＭＤ及び視覚喪失を伴う(ｎ＝５０９人の患者)か又は伴わない(ｎ＝２２２人の対照)加齢関連眼病の研究において、白色人種の参加者を評価した。進行したＡＭＤを、地図状萎縮、新血管新生疾患として規定した。喫煙とＢＭＩを含むリスク因子を評価して、ＤＮＡ試料を５つの遺伝子ＣＦＨ、ＬＯＣ３８７７１５／ＨＴＲＡ１、ＣＦＢ、Ｃ２及びＣ３中の６つの変異体についてゲノタイピングした。無条件のロジスティック回帰分析を行なった。受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線を計算した。
【００７２】
結果測定：進行した乾燥及び新血管新生ＡＭＤの罹病率及びリスクスコアの、患者と対照とを識別するための、敏感度及び特異度に基づく予測能力
【００７３】
結果：ＣＦＨ Ｙ４０２Ｈ、ＣＦＨｒｓ１４１０９９６、ＬＯＣ３８７１１５ Ａ６９Ｓ、Ｃ２ Ｅ３１８Ｄ、ＣＦＢＲ３２Ｑ、及びＣ３Ｒ１０２Ｈ多型を、各々、独立に、人口統計的因子、喫煙、ＢＭＩ、及びビタミン／ミネラル処理割当てを制御しながら進行したＡＭＤと関連付けた。多変量のオッズ比(ＯＲ)は、ＣＦＨ Ｙ４０２Ｈについて３．５(９５％信頼区間(ＣＩ)１．７−７．１)；ＣＦＨｒｓ１４１０９９６についての３．７(９５％ＣＩ１．６−８．４)；ＬＯＣ３８７７１５ Ａ６９Ｓについて２５．４(９５％ＣＩ８．６−７５．１)；Ｃ２ Ｅ３１８Ｄについて０．３(９５％ＣＩ０．１−０．７)；ＣＦＢについて０．３(９５％ＣＩ０．１−０．５)；及びＣ３ Ｒ１０２Ｈについて３．６(９５％ＣＩ１．４−９．４)であった(ホモ接合リスク／防護的遺伝子型を参照用遺伝子型と比較)。遺伝的及び環境的リスクスコアは、０．８０３〜０．８５９にわたるＣ統計値を与えた(これは、４５２人の患者と３１７人の対照の独立した試料において複製された)。
【００７４】
結論：６つの遺伝子変異体、並びに喫煙及びＢＭＩは、独立に、視覚の喪失を引き起こす進行したＡＭＤと関連しており、この関係は高い予測性を示す。
【００７５】
これらの遺伝的及び環境的因子のすべてが独立に又は共同して作用するのか及びそれらが群として如何なる程度までＡＭＤの出現を予言できるのかは未知のままであるので、かかる情報を得ることは、陽性の家族の病歴又は初期若しくは中程度の病気の兆候を有する者(その中の何人かは進行した段階のＡＭＤへと進行する)のために、高リスクの者のスクリーニングに有用である。初期の検出は、潜在的に、人生のより早い時期に修正可能な習慣を標的として強調して、この病気にかかり易い者に対する一層高頻度の監視を勧めることによって、ＡＭＤのために増大する社会の負担を減じることができよう。治療の試みは、患者を登録するならば、かかる情報からも利益を得られよう。
【００７６】
方法：
表現型データ
加齢関連眼病の研究(ＡＲＥＤＳ)は、抗酸化剤及びミネラルサプリメントの、ＡＭＤ及び白内障のリスクに対する効果を評価するための無作為の臨床試験、及びＡＭＤの長期的研究を含んだ。眼の検査及び中心基底写真の写真等級付けを読むＡＲＥＤＳに基づいて、この研究における白色人種の参加者を、最も一致しない表現型を表す次の２つの主なグループに分けた：ドルーゼンを有さず又は非拡張性の小さいドルーゼンを有するＡＭＤなし(ｎ＝２２２人)又は視覚の喪失を伴う進行したＡＭＤ(ｎ＝５０９)。非白色人種は、その集団における進行したＡＭＤの分布が白色人種と比べて相当に異なっているので、除かれた。非中心及び中心萎縮、新血管新生疾患並びに視覚の喪失を含む最初のＡＲＥＤＳ分類中の、進行した形態のＡＭＤの、グループ３及び４を、次いで、非中心若しくは中心地図状萎縮(ｎ＝１３６)又は新血管新生疾患(ｎ＝３７３)の２つのサブタイプに再分類した(これらの２つの(進行した乾燥及び湿潤性)表現型の間で結果が異なるかどうかを決定するために、視覚的明瞭度とは無関係に、臨床的加齢関連黄斑症等級付けシステムを用いて再分類した)。他の比較を、片側の進行したＡＭＤと両側の進行したＡＭＤの間で、ＡＲＥＤＳシステムに従って行なった。教育、喫煙歴、及び体重インデックスを含む人口統計及びリスク因子データを質問事項並びに身長及び体重測定値からのベースライン参照で得た。抗酸化剤状態を、臨床試験で抗酸化剤(抗酸化剤単独又は抗酸化剤と亜鉛)を摂るか又は摂らない(プラシーボ又は亜鉛単独)かで規定した。この調査プロトコールは、施設内倫理委員会により認可され、すべての参加者は、インフォームドコンセント声明書に署名した。
【００７７】
ゲノタイピング
１９９８年から集め始めたＤＮＡ試料が、ＡＲＥＤＳ Genetic Repositoryから得られた。次ぎの６つの、ＡＭＤと関連する共通のＳＮＰは、１）第１染色体ｌｑ３１上のＣＦＨ遺伝子のエキソン９中の補体因子Ｈ(ＣＦＨ)Ｙ４０２Ｈ(ｒｓ１０６１１７０)、変化１２７７Ｔ＞Ｃは、ＣＦＨタンパク質のコドン４０２のチロシンのヒスチジンでの置換を生じ、２）ＣＦＨｒｓ１４１０９９６は、独立に、ＣＦＨのイントロン１４中のＳＮＰ変異体と関係し、３）ＬＯＣ３８７７１５ Ａ６９Ｓ(第１０染色体のＬＯＣ３８７７１５／ＨＴＲＡ１領域中のｒｓ１０４９０９２４)、ＬＯＣ３８７７１５のエキソン１中の非類義語コーディングＳＮＰ変異体は、コドン６９のアラニンのアミノ酸セリンによる置換を生じ、４）補体因子２又はＣ２ Ｅ３１８Ｄ(ｒｓ９３３２７３９)、Ｃ２のエキソン７中の非類義語コーディングＳＮＰ変異体は、コドン３１８のグルタミン酸のアスパラギン酸への変化を生じ、５）補体因子Ｂ又はＣＦＢ Ｒ３２Ｑ(ｒｓ６４１１５３)、ＣＦＢのエキソン２中の非類義語コーディングＳＮＰ変異体は、コドン３２のアミノ酸グルタミンのアルギニンへの変化を生じ、そして６）補体因子３又はＣ３ Ｒ１０２Ｈ(ｒｓ２２３０１９９)、Ｃ３のエキソン３中の非類義語コーディングＳＮＰ変異体は、コドン１０２のアミノ酸グリシンのアルギニンへの変化を生じることが評価された。第１０染色体上の遺伝子変異体ＬＯＣ３８７７１５Ａ６９Ｓについて、それは、それに隣接する遺伝子ＨＴＲＡ１が実際に１０ｑ２６におけるＡＭＤ罹病性遺伝子でありうるのかどうか論争の的であったが、これらの２つの遺伝子中の関連ＳＮＰは、密接に完全に相関していると報告された。従って、他のＳＮＰは将来有望な候補の変異体であるが、この研究で用いられたｒｓ１０４９０９２４は、この領域に存在する原因変異体のサロゲートであると考えることができる。ゲノタイピングは、プライマーマス伸長及びSequenom社 (San Diego, CA) のＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（商品名）法によって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を利用して行われた。
【００７８】
統計的分析
進行したＡＭＤ並びに乾燥、湿潤性の別個のサブタイプ及び両側の進行したＡＭＤを有する個人を、ＡＭＤを有しない白色人種の対照群と、遺伝子型及びリスク因子データに関して比較した。多変量の無条件ロジスティック回帰分析を行なって、ＡＭＤとすべての遺伝子型及び様々なリスクファクターとの間の関係を、年齢(７０歳以上、７０歳未満)、性別及び教育(高校以下、高校より高学歴)、紙巻き煙草の喫煙(非喫煙、過去に喫煙、現在喫煙中)、及び体重(ｋｇ)を身長(ｍ)の二乗で割ることにより計算されるＢＭＩ(＜２５、２５−２９．９、及び≧３０)を制御しながら評価した。このＡＲＥＤＳの無作為臨床試験における割当ても又、多変量モデルに加えられた(抗酸化剤を含むサプリメントを摂るか又は抗酸化剤を含まない研究用サプリメントを摂る)。遺伝子型の各々と喫煙及びＢＭＩのそれぞれとの間の乗法的相互作用についての試験を、遺伝子型及び個々のリスク因子による乗積項(cross product terms)を利用して計算した。類似の分析を行なって、遺伝子−遺伝子相互作用を、各遺伝子の組合せについて評価した。オッズ比及び９５％信頼区間を、各リスク因子について、３つの遺伝子型グループ内で計算した。各遺伝子変異体(０、１、２)についてのリスク対立遺伝子の数についてのトレンドの試験を計算した。様々なリスクスコアカットポイントについての敏感度及び特異度を評価して、個々のリスク例えば敏感度及び特異度の少なくとも８０％の予測のためのこのモデルの最適利用を評価した。ＡＭＤのリスクスコアの、すべての遺伝学的、人口統計的及び行動的因子に基づく計算方法を表５に説明した。受信者動作特性(ＲＯＣ)曲線の下方の面積が、年齢グループ５０−６９歳と７０歳以上のグループについて別々に得られた。ＲＯＣ曲線に基づく年齢調節された一致した又は「Ｃ」統計を、遺伝子と環境因子の種々の組合せについて計算して、無作為抽出した患者のそのモデルにおけるリスク因子の群に基づくリスクスコアが、同じ１０年齢グループ内の無作為抽出した対照からの対応するリスクスコアよりも一層高い可能性を評価した。このリスク予測モデルの再現性を試験するために、４５２人の患者と３１７人の対照よりなる別個の複製試料を、ＡＭＤ研究データベースから、視覚的写真に基づく同じ等級付けシステムを利用して得て、Ｃ統計値を、元の試料から得られたリスクスコアを利用して計算した。ＲＯＣ曲線を、この複製試料について得た。
【００７９】
結果
患者及び対照の平均年齢(±ＳＤ)は、それぞれ、６９．１(±５．２)及び６６．８(±４．２)であった。女性は、５８％の患者と５４％の対照を含んだ。表６は、対照間の遺伝子型と共変量との間の関係を示している。何れの遺伝的変量と人口統計的、行動的又は処置的変量との間にも統計的に有意の関係はなかった。年齢とＣ３変異体との間の関係に対しては、１つ、２つのリスク対立遺伝子又はＧＣ若しくはＧＧ遺伝子型を有する一層若い個人は、幾らか高目の割合であったが、有意の傾向はなかった。
【００８０】
遺伝子の対の間の関係も又、評価された。ＣＦＨ Ｙ４０２Ｈ(ｒｓ１０６１１７０)及びＣＦＨ(ｒｓ１４１０９９６)は、これらの部位の間の連鎖不平衡の結果として、有意に関係し(ｐ＜０．００１)、ＣＦＢ Ｒ３２Ｑ(ｒｓ６４１１５３)は、Ｃ３ Ｒ１０２Ｈ(ｒｓ２２３０１９９)と弱く関係した(ｐ＝０．０３)(表７)。他の遺伝子の対の間での関係は、統計的に有意ではなかった。遺伝子型による粗ＡＭＤ罹患率(未調節のオッズ比(ＯＲ))は、ＣＦＨ変異体の各々とＡＭＤとの間の強い正の関係を示し、Ｙ４０２Ｈについての罹患率ＯＲは６．９であり、ｒｓ１４１０９９６については１１．１であり、並びにＬＯＣ３８７７１５遺伝子は、ＯＲ１８．０(ｐトレンド＜０．００１)であった(表８)。Ｃ３変異体とＡＭＤ罹患率との間にも、比較的小さいが非常に有意な正の関係がある(ＯＲ＝３．１、ｐトレンド＜０．００１)。Ｃ２及びＣＦＢ変異体とＡＭＤ罹患率との間には、逆の関係(防護的効果)があった(ＯＲは、それぞれ、０．４及び０．３であり、ｐ＜０．００１)。
【００８１】
表９は、進行したＡＭＤと人口統計的及び行動的因子との間の、多変量の調節した関係を、すべての遺伝子変異体を制御しながら示しており、並びに、ＡＭＤと環境因子を調節する遺伝的因子との間の関係を示している。２つの独立のＣＦＨ変異体及び組み合わせられた進行したＡＭＤグループの間には、正の関係があった(Ｙ４０２Ｈ、ＯＲ＝３．５、９５％ＣＩ １．７−７．１、ｐトレンド＝０．０００３)；ＣＦＨｒｓ１４１０９９６(ＯＲ＝３．７、ｐトレンド＝０．０００３)。ＡＭＤとＬＯＣ３８８７１５ Ａ６９Ｓ変異体(ＯＲ＝２５．４、ｐトレンド＜０．０００１)及びＣ３(ＯＲ＝３．６、ｐトレンド＝０．００１)との間には、正の関係があった。Ｃ２(ＯＲ＝０．３、ｐ＝０．００３)とＣＦＢ変異体(ＯＲ＝０．３、ｐ＜０．０００１)との間には、防護的関係があった。年齢(ＯＲ＝２．８、ｐ＜０．０００１)、現在の喫煙(ＯＲ＝３．９、ｐ＝．００１)、及び過去の喫煙(ＯＲ＝１．９、ｐ＝０．００４)には、正の独立した関係があった。高い教育には、防護的効果があった(ＯＲ＝０．６、ｐ＝．０１)。境界線上のＢＭＩとの正の関係が存在するが(ＯＲ＝１．５、ｐ＝０．１１)、性別又は抗酸化剤処置では、有意の関係が見られなかった。一般に、遺伝子とＡＭＤとの間で類似の関係が、片側及び両側の進行したＡＭＤ及び乾燥及び湿潤型の進行したＡＭＤを含むすべてのＡＭＤサブタイプについて見られたが、これらの関係は、進行したＡＭＤの特定の種類では僅かに変化した。
【００８２】
各遺伝子型と喫煙(常時／非喫煙)及びＢＭＩ(２５＋／＜２５)との間の相互作用を評価した(表１０)。如何なる遺伝子型と喫煙又はＢＭＩとの間でも、有意の相互作用は見出されなかったが、ＢＭＩの、遺伝子型ＣＦＨ Ｙ４０２Ｈ ＴＴを有する者に対する一層少ない効果及び、リスク対立遺伝子(ＣＣ及びＣＴ遺伝子型)を有する者に対するＢＭＩの逆の効果に関して、弱く有意でない傾向があった。所定の遺伝子型内で、喫煙及び一層高いＢＭＩは、進行したＡＭＤのリスクを増大させた。ホモ接合型のＧＧのリスク遺伝子型例えばＣ３に関して、進行したＡＭＤについてのＯＲは、非喫煙者について３．３(１．０−１０．９)であり、喫煙体験者については９．８(２．０−４７．５)に増大し、これは、喫煙とＣ３遺伝子型の両者に主たる効果があるが、相互作用効果はないことを示している。
【００８３】
遺伝子の対の間の相互作用を評価した(表１１)。ＣＦＨＹ４０２Ｈ遺伝子型とＣＦＨｒｓ１４１０９９６遺伝子型との間で見出された境界線上の有意の相互作用が一つだけあり、それは、ＣＦＨＹ４０２Ｈ遺伝子型がＴＴよりむしろＣＴであるときにＣＦＨｒｓ１４１０９９６ＣＣ遺伝子型の僅かに強い効果である(ｐ＝０．０５)。
【００８４】
表１２には、遺伝的、人口統計的、及び環境的変量の種々の組合せを用いたモデルについてのＣ統計値が与えられている。２つの以前に報告された遺伝子、ＣＦＨ Ｙ４０２Ｈ及びＬＯＣ３８７７１５ Ａ６９Ｓ、(ｒｅｆ)及び年齢、性別、教育、並びに抗酸化剤処理に基づくモデル１についてのＣ統計値は、０．８０３±０．０１８であった。このＣ統計値には、モデル２において更なるリスク因子としての喫煙とＢＭＩを追加すると、有意の改善があり、０．８２２±０．０１７のＣ統計値であった(モデル１対２で、ｐ＝０．０２７)。モデル３は、すべての６つの変量を、年齢、性別、教育及び抗酸化剤処理と共に含み、０．８４６±０．０１６のＣ統計値を示し、これは、対応する２つの遺伝子モデルを超える有意な改善であった(モデル１対３、ｐ＜０．００１)。喫煙とＢＭＩを基本的な６つの遺伝的変異体モデル３に加えた場合、Ｃ統計値は、０．８５９±０．０１５に増大し、これは、対応する２つの遺伝子のモデルと比べて有意の改善であった(モデル２対４、ｐ＝０．００１)。これらの６つの変異体を用いるモデルに対する環境的変量の追加により、少ないが改善があった(モデル３対４、ｐ＝０．０３７)。Ｃ統計値は、冠動脈心疾患に(ＣＨＤ)ついてのFramingham リスクスコア予測モデルの結果より高いということは、注意すべきである。
【００８５】
ＡＭＤリスクスコアを、アルゴリズムの構築に用いられなかった４５２人の患者及び３１７人の対照の別個の複製試料において試験した。平均年齢(±ＳＤ)は、患者が７６±６．６歳で、対照者が７２±４．４歳であり、これらのうち、男性は、それぞれ、４９％及び５３％であった。この研究用集団は、ここに記載の他の進行中の遺伝学的及び疫学的因子の研究から得られた。このＣ統計値は、表４に示したように、複製試料に基づくもので、０．８１０±０．０１６であり、患者と対照との間の優れた識別力を示す。このＣ統計値は、年齢、性別、教育、喫煙及びＢＭＩに関する調整を用いて計算された。この分析に関して、参加者は、研究への登録時にＡＲＥＤＳサプリメントを摂っておらず且つ以前の分析においても被験者は、食事でこれらの抗酸化剤を多量に消費していなかったので、抗酸化剤状態は、「ｎｏ」とされた。これらの元の試料と複製試料の両方についてのＣ統計値は、ＣＨＤの予測のためのFraminghamリスクスコアについてのＣ統計値に匹敵するか超えている。
【００８６】
表８に示したモデル４は、個人のリスクの予測目的で考えられた。モデル４の敏感度及び特異度は、潜在的なスクリーン陽性基準を各年齢群について別々に示すために、表５(図１)に記載したような種々のカットポイントを利用して計算された。その目的は、敏感度と特異度の両方が少なくとも８０％となるカットポイントを特定することである。これは、一層高齢者の群について達成され(リスクスコア３以上はスクリーン陽性、３未満はスクリーン陰性)、８３％の敏感度及び８２％の特異度を生じた。一層若い年齢の群についてのリスク予測は、幾分低いがやはり良好であり、スクリーン陽性度２．５のカットポイントについて、敏感度は７６％で特異度は７８％であった。一般に、リスク予測は、より高齢の群について、幾分良好であった。
【００８７】
患者及び対照についてのスコアのヒストグラムを、２つの年齢群についてプロットした(図２)。所定の年齢群内のリスクスコア分布は、実質的に異なっていることが明らかで、患者のスコアは、幾らかの重なりはあったものの、対照より高い傾向があった。年齢及び患者−対照状態に関する複製試料についてのこれらのリスクスコアは、図２の下部に見られ、患者と対照の良好な分離を特に高齢の個人について示している。
【００８８】
検討
ここに記載されたのは、独立した６つの遺伝的変異体のＡＭＤとの関係であり、これらのすべての変異体について、人口統計的及び行動的因子に加えて調整している。患者と対照との識別は、元の試料と複製試料の両方で、全リスクスコアについて顕著である。本発明の進行したＡＭＤについてのリスク因子の複合体の予測力は、０．８６のＣ統計値スコア及び０．８１の複製Ｃ統計値を示し、Ｃ統計値は、白人男性では０．７９、白人女性では０．８３であって、幾つかの複製試料では更に幾分か低いＣＨＤに関するFraminghamリスク機能に匹敵するか又は一層優れている。明らかに、遺伝的因子は、遺伝子変異体の、片側及び両側の病気を含む進行したＡＭＤの様々な群、並びに地図状萎縮(乾燥型)及び新血管新生(湿潤型)進行性ＡＭＤに対する大きくて首尾一貫した効果の評価により示したように、この病気において主要な役割を演じている。他方で、修正可能な因子も又、影響力を有している。紙巻きタバコの喫煙は、すべての遺伝子型についてリスクを増大させた。例えば、進行したＡＭＤのリスクは、同じホモ接合型のＣ３リスク遺伝子型を有する個人において非リスク遺伝子型の非喫煙者と比べて、非喫煙者では３倍以上であったが喫煙者では殆ど１０倍であった。一層高いＢＭＩも又、すべての遺伝子型について、リスクプロファイルに寄与した。
【００８９】
これらの分析は、測定値(実施例１)を、重要で意義のある方法で、新たな遺伝子変異体を加え、人口統計的及び行動的因子を組み込み、進行したＡＭＤについてのＣ統計値を、遺伝的及び環境的変量の種々の組合せを用いるモデルに基づいて計算し、そしてその結果得られたリスクスコアの、進行したＡＭＤを有する個人と有しない個人を識別する能力を評価することにより、拡張して精密化する。
【００９０】
この研究のユニークな特徴は、米国周辺の様々な地理的領域からの、進行したＡＭＤを有する又は有しない白人患者の大きい、十分に特性決定された集団に基づく予測力の評価を含む。更なる長所は、リスク因子情報の標準化された収集、身長及び体重の直接的測定値、及び黄斑症の、標準化された眼科学的試験及び基底部写真の等級付けによる分類を含む。等級はリスク因子又は遺伝子型の知識なしで割り当てられたので、誤った分類は起こりえない。対照は、年齢、教育、ＢＭＩ、喫煙及び治療割当てを含む既知のＡＭＤリスク因子について、遺伝子変異体と進行したＡＭＤの関係を評価しながら行われた。環境的及び遺伝的リスク因子の両者は、同時に考える場合、独立に、ＡＭＤと関係した。これは、選択された集団であっても、被験者が、進行したＡＭＤを有する典型的な患者を代表することはありそうなことであり、集団全体は、この年齢範囲においては、喫煙及び糖尿病の罹患率並びに遺伝子型の分布に関して他者に類似している。この大きくて十分に特性決定された集団は、遺伝子と環境の関係及び相互作用を評価するユニークな機会を提供した。その上、遺伝子変異体の生物学的効果は、ＡＭＤを有する様々な白人集団において主要な点で異なっているようには見えない。
【００９１】
これらの関係を起こりやすいＡＭＤについて評価するのが望ましいが、この年配者のグループ内のＡＭＤを有しない多くの個人が残り人生の間に進行した病気に進行することはありそうにない。従って、最終的に患者になりうる対照者の誤った分類の可能性は小さいだろう。
【００９２】
初期及び中程度の病気を有する者に特徴的なドルーゼンの知識も又、進行したＡＭＤへの進行に関係しているが、この研究は、進行したＡＭＤを有する患者又はＡＭＤの兆候を有しない対照としての状態の予測における遺伝的因子と非遺伝的因子の識別力という、異なる問題に関する。その上、高いリスクのドルーゼン又は色素異常を有する個人のうちで、６つの遺伝子変異体のうちの２つが、進行した病気への進行を、それらの基底部の外観とは無関係に予言する。
【００９３】
これらの分析及び結果は、ＡＭＤについての、個人のリスクの予測の可能性を示している。リスクスコアの計算において、例えば、喫煙(１．３)、一層高いＢＭＩ(０．４)及び様々な遺伝子変異体(−１．３から＋３．２まで及ぶ)についての回帰係数(表５)から「ポイント」を評価して、個人について、進行したＡＭＤを発症する全体的リスクを得ることができよう。これは、新たな遺伝的及び他のリスクの予測法が確立されるので、精密化することができよう。かかるリスクスコアを知ることの利点は、一層狙いを定めた教育及び既知の修正可能な因子についての助言の可能性を含む。スクリーニングは、高リスクの人々を同定し、喫煙をせず、野菜及び魚を食べ、正常な体重及び運動することを持続し、そしてＡＭＤの可能性を有する者に対するＡＲＥＤＳ型抗酸化剤及びミネラルサプリメントを摂ることによって健康な生活様式を進むことを奨励されるであろう。これらの因子のすべては、ＡＭＤの病因論に含まれる炎症及び免疫経路に影響を与えることが知られている。高リスクの個人の発見を目的とすることは、自己認識の向上及び一層高頻度のサーベイランス及び臨床的検査を可能とすると共に、新治療の臨床試験に組み込むための高リスクの個人の同定も可能とする。
【００９４】
表５．ＡＭＤリスクスコアの計算
リスクスコアは、下記式から計算された：
【数１】
2010526555.tif 000007
ここに、βi及びＸiは、下記により与えられる：
【００９５】
【表５】
2010526555.tif 000008
【００９６】
【表６Ａ】
2010526555.tif 000009
【００９７】
【表６Ｂ】
2010526555.tif 000010
【００９８】
【表７Ａ】
2010526555.tif 000011
【００９９】
【表７Ｂ】
2010526555.tif 000012
【０１００】
【表８】
2010526555.tif 000013
【０１０１】
【表９】
2010526555.tif 000014
【０１０２】
【表１０−１】
2010526555.tif 000015
【０１０３】
【表１０−２】
2010526555.tif 000016
【０１０４】
【表１１Ａ】
2010526555.tif 000017
【０１０５】
【表１１Ｂ】
2010526555.tif 000018
【０１０６】
【表１１Ｃ】
2010526555.tif 000019
【０１０７】
【表１１Ｄ】
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【０１０８】
【表１１Ｅ】
2010526555.tif 000021
【０１０９】
【表１２】
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【０１１０】
【表１３】
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【０１１１】
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2010526555.tif 000025
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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