(57)【要約】  テンポールなどの安定なニトロキシドラジカルの有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において神経変性を治療又は予防する方法、ならびに関連する方法。【選択図】図１
2010520888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性を治療又は予防するのに十分な量の安定なニトロキシドラジカルを哺乳動物に投与することを含む、神経変性疾患に罹患した哺乳動物において神経変性を治療又は予防する方法。
【請求項２】
哺乳動物の中枢神経系において生物学的に利用可能な鉄の量を増加させるのに十分な量の安定なニトロキシドラジカルを哺乳動物に投与することを含む、中枢神経系（ＣＮＳ）の鉄が欠乏している哺乳動物のＣＮＳにおいて生物学的に利用可能な鉄の量を増加させる方法。
【請求項３】
哺乳動物において鉄調節タンパク質１（ＩＲＰ１）を活性化するのに十分な量の安定なニトロキシドラジカルを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてＩＲＰ１を活性化する方法。
【請求項４】
トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）発現を増加させるのに十分な量の安定なニトロキシドラジカルを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてＴｆＲ１発現を増加させる方法。
【請求項５】
該安定なニトロキシドラジカルがテンポール又はそのヒドロキシルアミン類似体である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該安定なニトロキシドラジカルがテンポール−Ｈである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該哺乳動物が鉄調節タンパク質２（ＩＲＰ２）機能を欠損している、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該哺乳動物がＴｆＲ１低発現である（ｕｎｄｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該哺乳動物がＣＮＳにおいて第二鉄の異常な蓄積により特徴付けられる神経変性疾患に罹患している、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該哺乳動物がパーキンソン病、アルツハイマー病、ハラーフォルデンシュパッツ症候群、無セルロプラスミン血症、難治性貧血、骨髄性プロトポルフィリア又は成人発症神経変性に罹患している、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該哺乳動物がヒトである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
さらに該哺乳動物に鉄サプリメント又は鉄高含有食を投与することを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、援用により組み込まれた２００７年３月９日に出願された米国仮特許出願６０／８９４，１３４号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
神経変性疾患は、世界中で何百万人もの人に影響を与えている。脳内の生物学的に利用可能な鉄量の欠乏が、神経変性をもたらすと考えられている。詳細には、鉄調節タンパク質、特にＩＲＰ１及びＩＲＰ２は神経変性疾患に罹患した患者に見られる損なわれた鉄ホメオスタシスに含まれると考えられている。ＩＲＰ１及びＩＲＰ２は、転写産物内の鉄応答性エレメントに結合することによってフェリチン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）受容体（ＴｆＲ１）、及び他の遺伝子の発現を制御する。ＩＲＰ２が不足する動物は、ＴｆＲ１発現が減少することによって貧血及び成人発症進行性神経変性が進行し、発生中の赤血球系細胞及び中枢神経系（ＣＮＳ）で機能的鉄の欠乏が生じる。ＩＲＰ１が不足する動物は、ＩＲＰ２がＩＲＰ１の減少を補償するので、鉄代謝のわずかな揺らぎがあるだけである。しかしながら、ＩＲＰ２が不足する動物では、ほとんどの組織でフェライトレベルが増加し、ＴｆＲレベルが減少することにより、使用可能な鉄量の欠乏が生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、神経変性の進行を遅らせ、治療し、又は予防するため、あるいは鉄代謝、ＩＲＰ機能、又はＴｆＲ１発現における異常を治療又は予防するために使用できる化合物が希求されている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（本発明の簡単な要旨）
本発明は、神経変性を治療又は予防するのに十分な量の安定なニトロキシドラジカルを哺乳動物に投与することを含む、神経変性疾患に罹患した哺乳動物における神経変性を治療又は予防する方法を提供する。
【０００５】
本発明はまた、哺乳動物の中枢神経系において生物学的に利用可能な鉄の量を増加させるのに十分な量の安定なニトロキシドラジカルを哺乳動物に投与することを含む、中枢神経系（ＣＮＳ）の鉄が欠乏している哺乳動物のＣＮＳにおいて生物学的に利用可能な鉄の量を増加させる方法を提供する。
【０００６】
本発明は更に、哺乳動物において鉄調節タンパク質１（ＩＲＰ１）を活性化するのに十分な量の安定なニトロキシドラジカルを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてＩＲＰ１を活性化する方法を提供する。
【０００７】
加えて本発明は、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）発現を増加させるのに十分な量の安定なニトロキシドラジカルを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるＴｆＲ１発現を増加させる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
（図面の簡単な説明）
以下の図面は、少なくともいくつかの本発明の実施態様を示す：
【０００９】
【図１】図１ａ、１ｂ、及び１ｃは、コントロール飼料又はテンポール添加飼料を与えた野生型（ＷＴ）及びＩＲＰ２−／−マウスのぶら下がり試験結果のグラフである。
【図２】図２ａ及び２ｂは、マウス胎児線維芽細胞におけるＩＲＰ１の鉄応答性エレメント（ＩＲＥ）結合活性ならびにＴｆＲ１、Ｌ−フェリチン（Ｌ−Ｆｔ）、ＩＲＰ１、及びチューブリンのタンパク質レベルを示すゲルである。
【図２ｃ】図２ｃは、ゲルのバンドの相対的な強度による結果のいくつかを表す。
【図３ａ】図３ａは、コントロール（Ｃｔｒｌ）又はテンポール（Ｔｅｍ）飼料を与えたＩＲＰ２−／−動物の小脳、前脳及び脳幹領域におけるＩＲＰ１のＩＲＥ結合活性及びＴｆＲ１、ＩＲＰ１およびアクチンタンパク質レベルを示すゲルである。
【図３ｂ】図３ｂは、ゲルのバンドの相対的な強度による結果のいくつかを表す。
【図４】図４ａは、コントロール又はテンポール飼料を与えた野生型及びＩＲＰ２−／−マウス由来の小脳溶解物のフェリチン及びアクチンタンパク質レベルを示すゲルである。図４ｂは、ゲルのバンドの相対的な強度による結果のいくつかを表す。
【図４ｃ】図４ｃ〜４ｆは、免疫組織化学及びペルルスの（Ｐｅｒｌ’ｓ）ＤＡＢ染色による野生型及びＩＲＰ２−／−マウスの脳の多様な領域における相対的なフェリチンと第二鉄レベルを示す写真である。
【図４ｄ】図４ｃ〜４ｆは、免疫組織化学及びペルルスの（Ｐｅｒｌ’ｓ）ＤＡＢ染色による野生型及びＩＲＰ２−／−マウスの脳の多様な領域における相対的なフェリチンと第二鉄レベルを示す写真である。
【図４ｅ】図４ｃ〜４ｆは、免疫組織化学及びペルルスの（Ｐｅｒｌ’ｓ）ＤＡＢ染色による野生型及びＩＲＰ２−／−マウスの脳の多様な領域における相対的なフェリチンと第二鉄レベルを示す写真である。
【図４ｆ】図４ｃ〜４ｆは、免疫組織化学及びペルルスの（Ｐｅｒｌ’ｓ）ＤＡＢ染色による野生型及びＩＲＰ２−／−マウスの脳の多様な領域における相対的なフェリチンと第二鉄レベルを示す写真である。
【図５ａ】図５ａは、野生型、ＩＲＰ２−／−及びＩＲＰ１−／−マウス由来のマウス胎児線維芽細胞溶解物における細胞質及びミトコンドリアのアコニターゼ活性を示すゲルを表す。
【図５ｂ】図５ｂは、テンポール又は鉄キレート剤（ｃｈｅｌｔｏｒ）デフェリプロン（ｄｅｆｅｒｉｐｒｏｎｅ）（ＤＦＯ）で処理後のマウス胎児線維芽細胞におけるＩＲＰ１レベル及びＩＲＰ２レベルを示すゲルを表す。
【図５ｃ】図５ｃは、テンポール又はＤＦＯ処理後のマウス胎児線維芽細胞の細胞質及びミトコンドリアアコニターゼ活性、ならびにＩＲＰ１及びＩＲＰ２タンパク質レベルを示すゲルを表す。
【図６】図６ａ及び６ｂは、βメルカプトエタノールとともにインキュベートした処理サンプルを用いたＩＲＥゲルシフトアッセイにより精製ホロＩＲＰ１のＩＲＥ結合活性を示すゲルを表す。図６ｃ及び６ｄは、結合溶液（coupled solution）アッセイにより時間の経過とともに測定したアコニターゼ活性のグラフである。
【図７】図７ａ及び７ｂは、赤芽球細胞及び前脳溶解物におけるＩＲＰ１、ＩＲＰ２及びアクチンタンパク質レベルを示すゲルを表す。
【図７ｃ】図７ｃは、コントロール又はテンポール添加飼料を与えた野生型、ＩＲＰ２−／−及びＩＲＰ１＋／−  ＩＲＰ２−／−マウスに対するぶら下がり試験の結果のグラフである。
【図７ｄ】図７ｄは、テンポールがＩＲＥ結合活性を回復させるＩＲＰ１の鉄−硫黄クラスターを直接不安定化できるという機序案を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（本発明の詳細な説明）
安定なニトロキシドラジカルは、一般式Ｒ２ＮＯを有する化合物を含有する。本発明を使用する哺乳動物にとって生理学的に許容可能なものであれば、いずれの安定なニトロキシドラジカルも本発明に使用可能である。全身的に投与される場合、選択されたニトロキシドラジカルは選ばれた哺乳動物の血液脳関門を通り抜けられることが望ましい。本発明の方法で使用される好ましい安定なニトロキシドラジカルは、テンポール又はそのヒドロキシルアミン類似体（テンポール−Ｈなど）を含む。テンポールはフリーラジカル捕捉剤であり、再利用できる抗酸化物質であり、動物飼料に添加することができ、血液脳関門を通り抜けて吸収される。安定なニトロキシドラジカルはフリーラジカルにとって良い捕捉剤であり、安定なニトロキシド電子は反応性ラジカル電子と安定な電子対を形成している。
【００１１】
本発明で使用されるのに適した他の安定なニトロキシドラジカルは、当該分野で既知である。一般的に、本発明で有用な安定なニトロキシドラジカルは、一般式Ｒ２ＮＯを有し、２つのＲ基が同一であっても異なっていても良い。概して、各Ｒ基は、Ｈ、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、スルホンアミド、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、アミノ、Ｃ１−Ｃ４ジアルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ６シクロアルキルアミノ、モルホリン、ヘテロアリール（チエニル、ピリジル及びピリミジニルに限定しないことを含む）、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、フェニル、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＮＲ’（ＣＯＲ’’）、ＮＲ’ＳＯ２Ｒ’’及びＮＲ’（ＣＯＮＲ’’Ｒ’’’）からなる群より独立に選択される。ここで、Ｒ’、Ｒ’’及びＲ’’’は独立してＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニル又は置換されたフェニルであり、また、Ｃ１−Ｃ８アルキルはＣ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ジアルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、及びモルホリンからなる群から選択された１つ以上で任意に置換されており、フェニルはハロゲン、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、及びＣ１−Ｃ４アルコキシからなる群から選択された１つ以上で任意に置換されており、またはＲ３及びＲ４は、それらが結合する炭素と一緒になって環を形成する。
【００１２】
本明細書では特に断りのない限り、用語「アルキル」は表示された数の炭素原子（例えば、Ｃ１−Ｃ２０、Ｃ１−Ｃ１０、Ｃ１−Ｃ４など）を有する飽和直鎖又は分岐非環状炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルは、−メチル、−エチル、−ｎ−プロピル、−ｎ−ブチル、−ｎ−ペンチル、−ｎ−ヘキシル、−ｎ−ヘプチル、−ｎ−オクチル、−ｎ−ノニル及び−ｎ−デシルを含有し、代表的な飽和分岐アルキルは−イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、−ｔｅｒｔ−ブチル、−イソペンチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、２−メチルヘキシル、３−メチルヘキシル、４−メチルヘキシル、５−メチルヘキシル、２，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルペンチル、２，４−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルヘキシル、２，４−ジメチルヘキシル、２，５−ジメチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，２−ジメチルヘキシル、３，３−ジメチルペンチル（ｄｉｍｔｈｅｙｌｐｅｎｔｙｌ）、３，３−ジメチルヘキシル、４，４−ジメチルヘキシル、２−エチルペンチル、３−エチルペンチル、２−エチルヘキシル、３−エチルヘキシル、４−エチルヘキシル、２−メチル−２−エチルペンチル、２−メチル−３−エチルペンチル、２−メチル−４−エチルペンチル、２−メチル−２−エチルヘキシル、２−メチル−３−エチルヘキシル、２−メチル−４−エチルヘキシル、２，２−ジエチルペンチル、３，３−ジエチルヘキシル、２，２−ジエチルヘキシル、３，３−ジエチルヘキシルなどを含有する。アルキル基は非置換であっても置換されていても良い。
【００１３】
本明細書では特に断りのない限り、用語「シクロアルキル」は炭素及び水素原子を含み、かつ、炭素−炭素多重結合を持たない単環又は多環飽和環を意味する。シクロアルキル基は、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチル、並びに飽和環状及び飽和二環式テルペンが挙げられるが、これらに限定されない。シクロアルキル基は非置換であっても置換されていても良い。好ましくは、シクロアルキル基は単環式環又は二環式環である。
【００１４】
本明細書では特に断りのない限り、用語「アルケニル基」は表示された数の炭素原子（例えば、Ｃ２−Ｃ２０、Ｃ２−Ｃ１０、Ｃ２−Ｃ４など）を有する直鎖又は分岐非環状炭化水素を意味する。代表的な直鎖及び分岐アルケニルは、−ビニル、−アリル、−１−ブテニル、−２−ブテニル、−イソブチレニル、−１−ペンテニル、−２−ペンテニル、−３−メチル−１−ブテニル、−２−メチル−２−ブテニル、−２，３−ジメチル−２−ブテニル、−１−ヘキセニル、−２−ヘキセニル、−３−ヘキセニル、−１−ヘプテニル、−２−ヘプテニル、−３−ヘプテニル、−１−オクテニル、−２−オクテニル、−３−オクテニル、−１−ノネニル、−２−ノネニル、−３−ノネニル、−１−デセニル、−２−デセニル、−３−デセニルなどが挙げられる。アルケニル基の二重結合は他の不飽和基と非共役であっても共役であっても良い。アルケニル基は非置換であっても置換されていても良い。
【００１５】
本明細書では特に断りのない限り、用語「アルキニル基」は表示された数の炭素原子（例えば、Ｃ２−Ｃ２０、Ｃ２−Ｃ１０、Ｃ２−Ｃ６など）を有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する直鎖または分岐非環状炭化水素を意味する。代表的な直鎖及び分岐アルキニルは−アセチレニル、−プロピニル、−１−ブチニル、−２−ブチニル、−１−ペンチニル、−２−ペンチニル、−３−メチル−１−ブチニル、−４−ペンチニル、−１−ヘキシニル、−２−ヘキシニル、−５−ヘキシニル、−１−へプチニル、−２−へプチニル、−６−へプチニル、−１−オクチニル、−２−オクチニル、−７−オクチニル、−１−ノニニル、−２−ノニニル、−８−ノニニル、−１−デシニル、−２−デシニル、−９−デシニルなどが挙げられる。アルキニル基の三重結合は他の不飽和基と非共役であっても共役であっても良い。アルキニル基は非置換であっても置換されていても良い。
【００１６】
本明細書では特に断りのない限り、用語「ハロゲン」又は「ハロ」はフッ素、塩素、臭素、又はヨウ素を意味する。更に、特に断りのない限り、用語「ハロアルキル」は１つ以上のハロゲンで置換されたアルキルを意味し、アルキル及びハロゲンは前記で定義した通りである。
【００１７】
本明細書では特に断りのない限り、用語「アルコキシ」は−Ｏ−（アルキル）を意味し、ここで、アルキルは前記で定義した通りである。更に、本明細書では用語「ハロアルコキシ」は１つ以上のハロゲンで置換されたアルコキシを意味し、アルコキシ及びハロゲンは前記で定義した通りである。
【００１８】
本明細書では特に断りのない限り、用語「ヘテロアリール」は窒素、酸素又は硫黄から独立に選択された少なくとも１つのヘテロ原子、好ましくは１〜３つのヘテロ原子を含む５〜１４の環原子を含む炭素環芳香族環を意味する。ヘテロアリール環構造は、単環、二環又は三環化合物などの１つ以上の環構造ならびに縮合ヘテロ環部分を有する化合物を含む。代表的なヘテロアリールは、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、ピリジル、フラニル、ベンゾフラニル、チオフェニル、チアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソチアゾリル、キノリニル、ピロリル、インドリル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、ベンゾキナゾリニル、アクリジニル、ピリミジル、オキサゾリル、ベンゾ［１，３］ジオキソール、及び２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシンが挙げられる。ヘテロアリール基は非置換であっても置換されていても良い。
【００１９】
本明細書では特に断りのない限り、用語「アルキルアミノ」は−ＮＨ（アルキル）又は−Ｎ（アルキル）（アルキル）を意味し、ここで、アルキルは前記で定義した通りである。本明細書では特に断りのない限り、用語「アミノアルキル」は−（アルキル）−ＮＨ２を意味し、ここで、アルキルは前記で定義した通りである。
【００２０】
本明細書では特に断りのない限り、用語「置換された」とは、１〜４以上の置換基（アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アロイル、ハロ、ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）、ハロアルコキシ（例えば、トリフルオロメトキシ）、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオエーテル、シクロアルキルオキシ、ヘテロシクロオキシ（ｈｅｔｅｒｏｃｙｌｏｏｘｙ）、オキソ、アルカノイル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロシクロ、アリールオキシ、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、ヘテロシクロアミノ、１又は２置換されたアミノ（アミノ基の２個の置換基はアルキル、アリール又はアリールアルキルから選択される）、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、置換されたアルカノイルアミノ、置換されたアリールアミノ、置換されたアラルカノイルアミノ、チオール、アルキルチオ、アリールチオ、アリールアルキルチオ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクロチオ、アルキルチオノ、アリールチオノ、アリールアルキルチオノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールアルキルスルホニル、スルホンアミド（例えば、ＳＯ２ＮＨ２）、置換されたスルホンアミド、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルバミル（例えば、ＣＯＮＨ２）、置換されたカルバミル（例えば、ＣＯＮＨ−アルキル、ＣＯＮＨ−アリール、ＣＯＮＨ−アリールアルキルあるいはアルキル又はアリールアルキルから選択された２個の置換基が窒素上に存在する場合）、アルコキシカルボニル、アリール、置換されたアリール、グアニジノ、置換又は非置換のヘテロシクロアルキル、置換又は非置換のヘテロアリール（インドリル、イミダゾリル、フリル、チエニル、チアゾリル、ピロリジル、ピリジル、ピリミジルなど）など）で置換された基を意味する。
【００２１】
構造中の原子数の範囲が示されているときはいつでも（例えば、Ｃ１−Ｃ８、Ｃ１−Ｃ６、Ｃ１−Ｃ４、又はＣ１−Ｃ３アルキル、ハロアルキル、アルキルアミノ、アルケニルなど）、示された範囲内のいずれの小領域又は各数の炭素原子も使用できることが明確に意図される。したがって、例えば、本明細書で引用されるいずれの化学基（例えば、アルキル、ハロアルキル、アルキルアミノ、アルケニルなど）に関しても使用されるように、１〜８個の炭素原子（例えば、Ｃ１−Ｃ８）、１〜６個の炭素原子（例えば、Ｃ１−Ｃ６）、１〜４個の炭素原子（例えば、Ｃ１−Ｃ４）、１〜３個の炭素原子（例えば、Ｃ１−Ｃ３）、又は２〜８個の炭素原子（例えば、Ｃ２−Ｃ８）の範囲の記載は、１、２、３、４、５、６、７又は８個の炭素原子、ならびに必要に応じてその小領域を包含し、具体的に記載する（例えば、必要に応じて、１〜２個の炭素原子、１〜３個の炭素原子、１〜４個の炭素原子、１〜５個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、１〜７個の炭素原子、１〜８個の炭素原子、２〜３個の炭素原子、２〜４個の炭素原子、２〜５個の炭素原子、２〜６個の炭素原子、２〜７個の炭素原子、２〜８個の炭素原子、３〜４個の炭素原子、３〜５個の炭素原子、３〜６個の炭素原子、３〜７個の炭素原子、３〜８個の炭素原子、４〜５個の炭素原子、４〜６個の炭素原子、４〜７個の炭素原子、４〜８個の炭素原子、５〜６個の炭素原子、５〜７個の炭素原子、５〜８個の炭素原子、６〜７個の炭素原子、又は６〜８個の炭素原子）。
【００２２】
特定の理論に拘束されることなく、安定なニトロキシドラジカルを哺乳動物に投与すると、もし投与されなければｍＲＮＡに結合してＴｆＲ１及びフェリチンの発現を制御できる部位から抑制性鉄−硫黄クラスターを取り除くことによりＩＲＰ１の活性が高まると考えられる。かかる制御により、鉄吸収を増加させ、利用できないタンパク質中への鉄の封鎖を減少させることができる。したがって、安定なニトロキシドは、ＩＲＰ１がＩＲＰ２欠乏を補うことを可能にすると考えられる。それゆえ、本発明の方法は鉄調節タンパク質２（ＩＲＰ２）機能を欠損した哺乳動物に対して投与するのに特に有用であり、そのためＩＲＰ２欠乏に関連するいずれの疾患の治療にも特に有用であると考えられる。同様に、ＴｆＲ１発現をアップレギュレートする能力のおかげで、直接的又は間接的に、本発明の方法はＴｆＲ１低発現の哺乳動物への投与に有用であり、それゆえＴｆＲ１低発現に関連するいかなる疾患の治療にも有用であると考えられる。本発明の範囲において低発現とは、特に限定しないが、減少したタンパク質レベル、その他の正常なタンパク質機能の阻害要因の存在、又はその機能に影響するタンパク質の変異を含むいずれの理由であってもタンパク質の活性が減少することを包含することを意図する。
【００２３】
したがって、本発明は、哺乳動物の中枢神経系で生物学的に利用可能な鉄の量を増加させるのに十分な量の安定なニトロキシドラジカルを哺乳動物に投与することを含む、ＣＮＳの鉄が欠乏している哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）において生物学的に利用可能な鉄の量を増加させる方法を提供する。「生物学的に利用可能な鉄の量を増加させる」とは、安定なニトロキシドラジカルの投与前（または投与なし）の哺乳動物における生物学的に利用可能な鉄の量と比較した場合に、安定なニトロキシドラジカルの投与後の哺乳動物における生物学的に利用可能な鉄を増加させることを意味する。好ましくは、生物学的に利用可能な鉄の量は、約１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、５０％以上、又は１００％以上増加する。「生物学的に利用可能な」とは、哺乳動物の細胞で有用であること又は利用できることを意味する。生物学的に利用可能な鉄の量を測定し、比較する方法は、当該分野で既知である。
【００２４】
本発明はさらに、哺乳動物においてＩＲＰ１を活性化するのに十分な量の安定なニトロキシドラジカルを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において鉄調節タンパク質１（ＩＲＰ１）を活性化する方法を提供する。安定なニトロキシドラジカルの投与前（又は投与なし）の哺乳動物、又は哺乳動物から得られた生物学的サンプルにおけるＩＲＰ１の活性よりも、安定なニトロキシドラジカルの投与後に哺乳動物、又は哺乳動物から単離された生物学的サンプルの活性が増加する場合、ＩＲＰ１は活性化される。好ましくは、ＩＲＰ１活性は少なくとも約１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、５０％以上、１００％以上、又は５００％以上までも増加する。ＩＲＰ１の活性を測定し、比較する方法は当該分野で既知である。
【００２５】
本発明はさらに、ＴｆＲ１発現を増加させるのに十分な量の安定なニトロキシドラジカルを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）発現を増加させる方法を提供する。ＴｆＲ１発現の増加は、安定なニトロキシドラジカルの投与前（又はニトロキシドラジカルなし）の哺乳動物又は哺乳動物由来の生物学的サンプルでのＴｆＲ１発現と比較した場合の、安定なニトロキシドラジカル投与後の哺乳動物又は哺乳動物由来の生物学的サンプルにおけるＴｆＲ１発現のいかなる増加でもあり得る。ＴｆＲ１発現の増加は、例えばＴｆＲ１量の増加なしに、存在するＴｆＲ１の相対量が増加すること、またはＴｆＲ１の生物学的活性が増加することを含むことができる。好ましくは、ＴｆＲ１発現が約１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、５０％以上、１００％以上、又は５００％以上までも増加する。ＴｆＲ１の発現を測定し、比較する方法は、当該分野で既知である。
【００２６】
本発明の方法は、生物学的に利用可能な鉄の異常なレベル（例えば、正常より低い）、異常なＩＲＰ１又はＩＲＰ２の活性レベル（例えば、正常より低い）、又はＴｆＲ１発現の異常なレベル（例えば、正常より低い）に関連する疾患の研究、診断、予防、治療のためにいかなる目的でも使用することができる。かかる状態は神経変性に関連し得る。したがって、前記のいずれの方法も神経変性疾患の研究、診断、予防又は治療と組み合わせて使用することができる。
【００２７】
それゆえ本発明は、別の側面では、神経変性を治療又は予防するのに十分な量の安定なニトロキシドラジカルを哺乳動物に投与することを含む、神経変性疾患に罹患した哺乳動物における神経変性を治療又は予防する方法を提供する。哺乳動物における神経変性の治療又は予防は、神経変性の１つ以上の症状を治療又は予防することを含む。かかる症状は当該分野で既知であり、そのうちのいくつかを実施例で示す。
【００２８】
本発明のいずれの方法も、特に神経変性疾患又は異常な鉄代謝（例えば、ＣＮＳでの第二鉄の異常蓄積）、ＩＲＰ機能の欠損（例えば、ＩＲＰ２変異又は欠失）、又はＴｆＲ１低発現に特徴づけられた神経変性疾患又は神経変性状態に罹患した哺乳動物に組み合わせて使用することができる。ＩＲＰ２が欠乏したヒトは、部分的又は完全に、軽度の小球性貧血、血清フェリチンの上昇、又は赤血球中のプロトポルフィリンＩＸ量の上昇に関連し得る成人発症神経変性疾患を有することが予想される。例としては、かかる疾患又は状態は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハラーフォルデンシュパッツ症候群、無セルロプラスミン血症、難治性貧血、フリードライヒ失調症、骨髄性プロトポルフィリア、又は成人発症神経変性を含み得る。もちろん、本発明の方法は、神経変性の兆候を示していないがＩＲＰ機能の欠損又はＴｆＲ１低発現を有する哺乳動物と組み合わせて使用することもできる。本発明の方法のかかる適用は、例えば、ＩＲＰ機能、ＴｆＲ１発現、及び／又は鉄代謝を回復させること、ならびにおそらく神経変性の開始を予防又は遅延させるのに有用であるだろう。
【００２９】
さらに、本発明の方法はいずれも、哺乳動物に鉄サプリメント又は効果的に鉄高含有食を投与する工程と組み合わせて行うことができる。テンポールなどの安定なニトロキシドラジカルの投与により得られる利益をさらに議論するために、ＩＲＰ２が欠乏した哺乳動物において、機能的鉄の欠乏は、当業者には既知の適切な鉄化合物で補給することができる。かかる鉄高含有食又は他の鉄サプリメントは、安定なニトロキシドラジカル投与に関して以下で議論等されたいずれの適切な方法でも投与することができる。
【００３０】
安定なニトロキシドラジカルは、いずれの適切な方法によっても投与できる。例えば、安定なニトロキシドラジカルは、経口投与、エアロゾル投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または動脈内投与により投与することができる。本発明の方法と組み合わせて使用するテンポールの適切な剤形は、当該分野で既知である。
【００３１】
ニトロキシドラジカルは、化合物と担体（特に薬学的に許容可能な担体）を含む医薬組成物などの組成物として製剤することができる。医薬組成物は、２つ以上の異なるニトロキシドラジカルを含むことができる。その代わりに、又はそれに追加して、医薬組成物は、他の薬学的に活性な剤や薬と併用させて１つ以上のニトロキシラジカルを含むことができる。その薬は、それと関連した前記疾患又は症状のいずれかを治療又は予防するのに有用であることが知られているものを含む（例えば、レボドパ、カルビドパ、ドーパミン作動薬（パーロデル、ペルマックス、リキップ、ミラペックス、シンメトレル）、抗コリン薬（アーテン、コゲンチン）、エルデプリル、ＣＯＭＴ阻害剤（タスマール、コムタン）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＧＳＫ−３阻害剤など）。かかる他の薬もニトロキシドラジカルと同時投与又は逐次投与して使用することができる。
【００３２】
組成物はさらに担体を含む。該担体は、いずれの適切な担体でもあり得る。好ましくは、該担体は薬学的に許容可能な担体である。医薬組成物に関しては、該担体は慣用されているものであればいずれでも使用できるし、生理化学的検討（溶解性や活性な化合物（単数又は複数）との反応性を欠くなど）によって及び投与経路によってのみ限定される。後述の医薬組成物に加えて、本発明の方法の化合物と阻害剤とを包接錯体（シクロデキストリン包接錯体など）又はリポソームとして製剤することができることは当業者なら認識できるだろう。
【００３３】
本明細書に記載の薬学的に許容可能な担体は、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、および希釈剤であり、当業者に周知で公衆に容易に利用可能なものである。薬学的に許容可能な担体は、活性薬剤（単数又は複数）に対して化学的に不活性のものであり、有害な副作用又は使用状態下で毒性がないものであることが好ましい。
【００３４】
担体の選択は、特定のニトロキシドラジカル及び使用された他の活性薬剤又は薬によって、ならびに化合物及び／又は阻害剤を投与するのに使用した特定の方法によってある程度決定されるだろう。したがって、本発明の方法の医薬組成物の適切な製剤は様々である。経口、エアロゾル、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、直腸内及び膣内投与用の下記製剤は、例示であって限定ではない。ニトロキシドラジカルのこれらの投与経路が知られていることは当業者であれば理解しているし、また、特定の化合物を投与するために１以上の経路が使用され得るが、特定の経路が、他の経路よりもより早くより効果的な応答を提供し得る。
【００３５】
本発明に係る有用な製剤の中に注射製剤がある。注射組成物用の効果的な薬学的担体が必要であることは、当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，２３８  ２５０頁（１９８２）、及びＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，６２２  ６３０頁（１９８６）参照）。
【００３６】
局所的な製剤は、当業者に周知である。かかる剤形は本発明の範囲において皮膚への適用に特に適している。
【００３７】
経口投与に適した製剤は、（ａ）水、生理食塩水、オレンジジュースなどの希釈剤で溶解された有効量の阻害剤などの液体溶液；（ｂ）カプセル、小袋、錠剤、ロゼンジ及びトローチ（それぞれ固体又は顆粒として事前に決定された量の活性成分を含む）；（ｃ）粉体；（ｄ）適当な液体中の懸濁液；及び（ｅ）適切な乳剤からなり得る。液体製剤は、薬学的に許容可能な界面活性剤の添加又は無添加の、水やアルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、及びポリエチレンアルコール）などの希釈剤を含んでいてもよい。カプセル製剤は通常の硬い又は軟らかいシェルをもつゼラチンタイプであることができ、例えば、界面活性剤、滑沢剤及び不活性充填剤（乳糖、蔗糖、リン酸カルシウム及びコーンスターチなど）を含む。錠剤製剤は、乳糖、蔗糖、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、結晶セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、及びその他の賦形剤、着色料、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、保存料、着香料、ならびに薬学的に適合する賦形剤から１つ以上を含有させることができる。ロゼンジ製剤は、香味料、通常蔗糖及びアラビアゴム又はトラガカント中に活性成分を含有させることができ、またトローチは活性成分に加えて、当該分野で既知の賦形剤を含む不活性基剤（ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアラビアゴムなど）、乳剤、ゲル等中に活性成分を含有させることができる。
【００３８】
医薬組成物は、吸入により投与するためにエアロゾル製剤にすることができる。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な高圧ガス中に置くことができる。エアロゾル製剤は、非加圧調合のための医薬としても、ネブライザー又はアトマイザー中などで製剤され得る。かかるスプレー製剤はまた、粘膜に噴霧するために使用され得る。
【００３９】
非経口投与に適切な製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び対象のレシピエントの血液と等張の製剤にする溶質を含有することができる水性及び非水性の等張滅菌注射液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び保存料を含むことができる水性及び非水性滅菌懸濁剤を含む。ニトロキシドラジカルは滅菌液又は混合液（水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、アルコール（エタノール、イソプロパノール又はヘキサデシルアルコールなど）、グリコール（プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）、ジメチルスルホキシド、グリセロールケタール（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールなど）、エーテル（ポリ（エチレングリコール）  ４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステル又はグリセリドなど）、又はアセチル化脂肪酸グリセリドを含む）などの薬学的担体における生理学的に許容可能な希釈剤中に入れて投与することができ、薬学的に許容可能な界面活性剤（石鹸又は合成界面活性剤など）、懸濁化剤（ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースなど）、又は乳化剤及びその他の薬学的アジュバントは添加しても、しなくても良い。
【００４０】
非経口製剤に使用できる油は、石油、動物油、植物油、又は合成油を含む。油の具体例としては、落花生油、大豆油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、流動パラフィン、及び鉱油が挙げられる。非経口製剤に使用するのに適切な脂肪酸は、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸を含む。適切な脂肪酸エステルの例としては、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルが挙げられる。
【００４１】
非経口製剤で使用される適切な石鹸は、脂肪族アルカリ金属、アンモニウム、及びトリエタノールアミン塩を含む。そして、適切な合成界面活性剤は、（ａ）カチオン合成界面活性剤、例えば、ハロゲン化ジメチルジアルキルアンモニウム及びハロゲン化アルキルピリジニウムなど、（ｂ）アニオン性合成界面活性剤、例えば、アルキル、アリール及びオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル及び硫酸モノグリセリド及びスルホサクシネートなど、（ｃ）非イオン合成界面活性剤、例えば、脂肪族アミンオキシド、脂肪族アルカノイルアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレン共重合体、（ｄ）両性合成界面活性剤、例えば、ｂ−アミノプロピオン酸アルキル、及び２−アルキル−イミダゾリン第４級アンモニウム塩、ならびに（ｅ）それらの混合物を含む。
【００４２】
概して、非経口製剤は、約０．５％から約２５％の重量の活性成分を溶液中に含むであろう。保存料及び緩衝液が使用され得る。注射部位の刺激を最小にする又は取り除くために、かかる組成物は約１２から約１７の親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つ以上の非イオン界面活性剤を含み得る。かかる製剤における界面活性剤の量は、概して約５重量％から約１５重量％の範囲であろう。適切な界面活性剤は、モノオレイン酸ソルビタンなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びエチレンオキシドと疎水性塩基との高分子量付加物を含み、プロピレングリコールで酸化プロピレンとを縮合することにより形成される。非経口製剤は、単位用量又は複数回用量で密封された容器（アンプルやバイアルなど）中に存在させることができ、使用直前に注射のために滅菌液体賦形剤（例えば、水）を添加することのみが要求されるフリーズドライ（凍結乾燥された）状態で保存することができる。即席の注射溶液及び懸濁液は、前記の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。
【００４３】
加えて、医薬組成物は、乳化基剤又は水溶性基剤などの様々な基剤と混合して座薬にすることができる。膣投与に適切な製剤は、活性成分に加えて適当であることが当該分野で既知の担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡、又はスプレーの処方として提示することができる。
【００４４】
当業者は、化合物の治療効果を増加させる多数の方法でニトロキシドラジカルが改良できることを容易に理解するだろう。例えば、ニトロキシドラジカルは標的部分に対するリンカーにより直接的又は間接的のどちらかで結合できるだろう。標的部分に対して化合物を結合させるプラクティスは当該分野で既知である。本明細書で使用される用語「標的部分」とは、標的部分が受容体が表面に発現している個々の細胞に化合物又は阻害剤を直接運搬できる、細胞表面の受容体を特異的に認識して結合するいずれの分子又は剤をもいう。標的部分は、抗体又はその断片、ペプチド、ホルモン、成長因子、サイトカイン、及び他のいかなる天然又は非天然に存在するリガンド（該リガンドは細胞表面に結合する）も含むが、これに限定されない。本明細書で使用される用語「リンカー」とは、標的部分に化合物を架橋させるいずれの剤も分子もいう。当業者は、いったん化合物に付着したらリンカー及び／又は標的部分はその機能を妨げないという条件で、化合物又は阻害剤の機能に必要でない化合物上の部位が、リンカー及び／又は標的部分に付着するのに理想的な部位であることを認識している。
【００４５】
その代わりに、ニトロキシドラジカルが投与された体内で放出される方法が時間と体内の場所に応じてコントロールされるように、デポの剤形に変更することができる（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号参照）。デポの剤形は、例えば、カプセル化又は多孔質材中に拡散しているニトロキシドラジカルとポリマーなどの多孔質材とを含む埋め込み可能な組成物にすることができる。その後、デポは体内の所望の部位に埋め込まれ、活性成分が多孔質材を通過して拡散することにより事前に決定された速度でインプラントから放出される。
【００４６】
ニトロキシドラジカルは、くも膜下への送達を可能にするよう埋め込まれたポンプを介して有利に投与することができる場合もある。かかる送達方法は、投与された薬物が他の方法では血液脳関門を十分に通り抜けないとき、特にＣＮＳへの薬物送達に有用である。
【００４７】
本明細書で記載されたニトロキシドラジカルは、哺乳動物へのニトロキシドラジカル投与に関して前記したいずれの効果も達成するようにインビトロで細胞中に投与できる。本明細書において、用語「インビトロ」とは、細胞が生体器官内にないことを意味する。ニトロキシドラジカルはまた、インビボでも細胞に投与できる。本明細書で使用する場合、用語「インビボ」は細胞が生体器官の一部又は生体器官内にあることを意味する。さらに、ニトロキシドラジカルは、宿主にインビボ又はエキソビボで投与することができる。本明細書で使用される場合、用語「エキソビボ」は１つの細胞または細胞集団にインビトロで化合物を投与し、その後、細胞または細胞集団を宿主に投与することをいう。
【００４８】
さらに、ニトロキシドラジカルは、それ単独で投与することもできるが、ニトロキシドラジカルの有効性を高める剤と一緒に投与することもできる。かかる剤には、例えば、医薬組成物に関して本明細書で記載したいかなる他の活性成分も含まれ、該剤はニトロキシドラジカルを含む組成物とは分離した組成物で投与することができる。
【００４９】
ニトロキシドラジカルの量又は用量は、適切な期間中宿主に治療又は予防応答をもたらすのに十分な量であるべきである。適当な用量は、治療又は予防するべき疾患又は苦痛の性質及び深刻さ、ならびにその他の要因によるだろう。例えば、用量はまた、特定の化合物の投与に伴い得るいずれの副作用の存在、性質及び程度によっても決定することができる。最終的には、年齢、体重、全体的な健康、食べ物、性別、投与するべき阻害剤、投与経路、及び治療される状態の深刻さなどの多様な要因を考慮して、主治医が各患者を治療する用量を決定するだろう。典型的な用量は、例えば毎日０．１ｍｇ〜１ｇであり、例えば毎日５ｍｇ〜５００ｍｇであり得る。
【００５０】
本発明の方法は、哺乳動物のいずれのタイプとも組み合わせて使用することができる。本明細書で議論された哺乳動物は、特に限定されないが、マウスなどのげっ歯目、ウサギなどのウサギ目（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）が挙げられる。哺乳動物は、ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）を含む食肉目由来であることが好ましい。哺乳動物は、ウシ及び豚を含む偶蹄目、またはウマを含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）由来であることがより好ましい。哺乳動物は、霊長目、Ｃｅｂｏｉｄ又はＳｉｍｏｉｄ（サル）あるいは類人猿（Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄ）（ヒト又は類人猿（ａｐｅ））であることが最も好ましい。特に好ましい哺乳動物はヒトである。さらに、子宮内で化合物を投与する場合には、哺乳動物はいずれの前の（ｆｏｒｇｏｉｎｇ）宿主（特に哺乳動物又はヒト）のいずれの胎児であることもできる。
【００５１】
該方法は、いずれの目的（本明細書で議論された疾患又は状態のいずれか、他の疾患又は状態の研究、治療、又は予防を含むが、これに限定されない）にも使用することができる。
【００５２】
以下の実施例は、さらに本発明を例証するが、当然本発明の範囲を限定する手段として考えられるべきでない。
【実施例】
【００５３】
実験モデルの背景：以下の実施例において、ＩＲＰ２−／−マウスが神経変性疾患モデルに使用される。ＩＲＰ２−／−動物の神経変性は、例えば、成獣における、ぶら下がり試験（ｈａｎｇ−ｔｅｓｔ）、ロータロッド回転ドラム式トレッドミルテスト（ｒｏｔａｒｏｄ  ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｄｒｕｍ  ｔｒｅａｄｍｉｌｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ）、平均台（ｂａｌａｎｃｅ  ｂｅａｍｓ）、登棒テスト（ｃｌｉｍｂｉｎｇ  ｐｏｌｅ  ｔｅｓｔｓ）、アレルロッド（ａｌｌｅｌｅｒｏｄｓ）、足跡、減少した身づくろい行動及び歩行異常に関する動作によりマウスで測定されたように、進行性の運動能力喪失によって特徴付けられる。ＩＲＰ２−／−動物の神経変性は動物の加齢とともにゆっくりと進行する。
【００５４】
鉄調節タンパク質（ＩＲＰ）が鉄代謝タンパク質をコードする転写産物中に見られる鉄応答性エレメント（ＩＲＥ）として知られるＲＮＡステムループと結合することによって、細胞性鉄ホメオスタシスを制御すると考えられる。例えば、フェリチンＨ又はＬの転写産物の５’末端でＩＲＥと結合するＩＲＰは、フェリチンの翻訳を抑制する。一方、ＴｆＲ１の３’ＵＴＲにおいてＩＲＥと結合するＩＲＰ、及び金属トランスポーターＤＭＴ１の１つのアイソフォームは、ｍＲＮＡを安定化する。フェリチンレベルはＩＲＰ２−／−動物のほとんどの組織で異常に高いが、ＴｆＲ１レベルは異常に低い。
【００５５】
ＩＲＰ２を欠損するマウスは、低ＴｆＲ１及び高フェリチン発現により生じる機能的細胞性鉄の減少に関連して小球性貧血及び神経変性が進行する。ＩＲＰ１−／−動物は、鉄代謝を有意には誤って制御しない。１つには、ＩＲＰ１が、哺乳動物組織において主に細胞質アコニターゼとして機能する鉄−硫黄タンパク質であり、ＩＲＰ２活性がＩＲＰ１の構造と結合するＩＲＥの欠失を補償するために増加するためである。これまでのところ、細胞質アコニターゼの欠失に起因する表現型は同定されていない。
【００５６】
特に、１つのＩＲＰ１アレル（ＩＲＰ１−／＋）も欠失したＩＲＰ２−／−動物は、貧血や神経変性の深刻さの増大につれてＩＲＰ標的転写産物のより大きな誤制御を示す。このことは、ＩＲＥ結合活性を有するＩＲＰ１の小さな断片が細胞内の鉄代謝の制御に寄与することを示す。ＩＲＰ１のＩＲＥ結合活性は鉄ホメオスタシスに重要であるという認識と一致して、ＩＲＰ２に加えてＩＲＰ１の両アレルが欠損している動物（ＩＲＰ１−／−  ＩＲＰ２−／−）が発生の胞胚期を越えて生存しない。
【００５７】
ＩＲＰ２−／−マウスでは、マウス脳白質の鉄の染色により観察することができる進行性神経変性疾患が進行する。高められたペルルスの（Ｐｅｒｌｓ’）ＤＡＢ染色及びアミノ銅銀染色において、軸索の鉄は軸索の変性とともに局所的に集積しているのが観察できる。軸索炎症もまた、脊髄前根や頸髄などの部分でＩＲＰ２−／−マウスで広く見られる。神経細胞体の変性の初期兆候は、核質の暗色化、核膜の完全性の喪失、及び血漿膜のブレブ形成を含み、これはコントロールＷＴマウスに対して上丘試料の比較分析により観察することができる。ニューロンのサイズや形と一致する空胞が、脳の患部の至る所に見られる。多数の空胞がＩＲＰ２−／−マウスの黒質にあるのが見られる。軸索の変性は、少なくとも部分的には、機能的鉄の欠乏とミトコンドリア機能不全に導かれるＴｆＲ低発現と結びついて、フェリチンターンオーバー由来の鉄毒性に起因し、フェリチンによる鉄の封鎖に起因するように思われる。見かけの「鉄過負荷」における鉄の不均等分布は、機能的鉄の欠乏と関連付けできる。それによって、フェリチンは、他の鉄タンパク質を犠牲にして鉄を封鎖し、発生中の赤血球におけるＴｆＲ発現が欠損するのでＩＲＰ２−／−マウスは鉄欠乏性貧血になる。ＩＲＰ２−／−マウスの鉄機能不全性貧血は、ＷＴと比較してヘモクリットレベルが減少し、遊離プロトポルフィリンや亜鉛プロトポルフィリンレベルが上昇することが観察される。さらに、ペルルスの（Ｐｅｒｌｓ’）鉄染色で試験した場合、ＩＲＰ２−／−動物の骨髄は、完全に鉄が欠損していると思われる。
【００５８】
加えて、約９７ｋＤのウェスタンブロット像は、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）受容体レベルがＩＲＰ２−／−及び（ａｍｄ）ＩＲＰ１＋／−  ＩＲＰ２−／−マウス由来の赤血球造血細胞において低下することを示すが、約３６ｋＤ及び２２ｋＤの像で示されるフェリチンＬ及びＨレベル（ｌｅｖｅｓ）は上昇する。約６４ｋＤ及び５１ｋＤの像で示されるｅＡＬＡＳの翻訳はＷＴコントロールと比較して増加する。ｅＡＬＡＳの過剰発現は、プロトポルフィリンＩＸ合成の増加を導き、鉄欠乏はヘム形成を妨げると思われる。ＩＲＰ２欠乏は赤芽球増殖性プロトポルフィリン症（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｒｙｉａ）（ＥＰＰ）を生じ得る。非ヘム脳内鉄含有量はＩＲＰ２−／−動物で減少しているのが観察された。例えば、ＷＴマウスの約７８．９＋／−９μｇ／グラム  乾燥重量は、ＩＲＰ２−／−マウスではＰ＜０．０１で約６２．２＋／−１２になった。しかし、全量の非ヘム脳内鉄は同じか僅かに減るが、全第二鉄イオンはＩＲＰ２−／−脳で比較的増加し（４つの要因のうち約１つより多くで）、生物学的に利用可能な第一鉄がＷＴに対して比較的減少する（４つの要因のうち約１つより多くで）と思われる。
【００５９】
ＴｆＲは脳内鉄摂取に重要であり、鉄−硫黄クラスターはミトコンドリア呼吸複合体に重要であると思われる。ミトコンドリアは軸索の維持を必要とする。軸索の完全性の喪失はＩＲＰ２−／−マウスで広く見られる。遺伝子型分析に基づくと、ＮＦ−κＢはニューロンの活性に依存する転写の制御及び軸索の挙動における重要な遺伝子であると思われる。逆行性輸送により、ＮＦ−κＢがニューロンの安定に関する標的遺伝子を転写的に活性化することができる。したがって、特定の理論に拘束されることなく、ＩＲＰ２−／−マウスにおける神経変性の病因は、ミトコンドリア機能に欠陥を生じさせる鉄欠乏によるものであり、減少したＡＴＰ産生は軸索の腫脹と軸索の輸送の減少を導き、ならびに、ＮＦ−κＢが核に移動できないことはニューロンの維持と安定に重要な多数のタンパク質の発現を減少させると考えられる。テンポールなどの安定なニトロキシドラジカルを投与することにより、ＩＲＰ２欠損患者にとって、神経変性を妨げる有用な治療が得られる。
【００６０】
方法：
【００６１】
マウス：ＩＲＰ２−／−マウスはＬａＶａｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２７，２０９−２１４（２００１）に記載の通り飼育し、遺伝子型を決定することにより生産し繁殖させた。本研究に使用したマウスは１２９Ｓ４／ＳｖＪａｅ×Ｃ５７Ｂｌ／６の雑種であるという背景を有する（各系統の詳細な比は不明である）。同一の遺伝子型で異なる飼料を与えたマウスにおける実験で、遺伝的背景の違いによる表現型の多様性を最小化するために同胞を使用した。異なる遺伝子型で異なる飼料を与えたマウスは、齢と性別が一致していた。すべてのプロトコルは米国国立小児保健発達研究所動物実験委員会に承認されており、米国立衛生研究所動物の人道的管理に関する指針を満たした。
【００６２】
飼料：マウスは生後３〜４週で離乳した。離乳直後から、マウスはテンポール添加飼料またはコントロールの飼料で維持した。テンポール添加飼料では、粉末にしたテンポールを飼料に対して１０ｍｇ／ｇの濃度で「コールドプレス」技術（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ、フレンチタウン、ＮＪ、ＵＳＡ）によりベーコン風味のマウス食に均一に混合した。テンポールなしのベーコン風味食をコントロール飼料として使用した。
【００６３】
ぶら下がり試験：ぶら下がり試験では、マウスは金網を握らせ、その後、逆さにした。マウスが落下前（最大６０秒まで）に逆さにした金網にぶら下がっていられた時間の長さを計測して記録した。
【００６４】
組織及び溶解物の調製：動物は安楽死させ、組織は採取後すぐに液体窒素中で凍結し、アルゴン下−８０℃で保存した。実験は、嫌気性チャンバー中、液体窒素で冷却した乳鉢で粉砕した組織で行い、周期的な凍結融解及びアルゴンを用いた空気除去により脱気した溶解バッファーで溶解した。核及び残渣を遠心分離により除去した。ＩＲＰ１活性アッセイ、ウェスタンブロッティング、カルボニルアッセイ及びタンパク質分析のための溶解物の調製は、嫌気的に行われた。
【００６５】
細胞：１３日齢胚の胎児線維芽細胞はＬａＶａｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．ｓｕｐｒａに記載の通り、野生型、ＩＲＰ１−／−マウス及びＩＲＰ２−／−マウスから単離した。ＩＲＰ２発現が誘導され得るＭｙｃタグされたＨＥＫ２９３Ｔｅｔ−ｏｎ細胞株は、Ｂｏｕｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ，３１，２４７−２５５（２００３）に記載の通り、調製され培養された。赤芽球はＣｏｏｐｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０６，１０８４−１０９１（２００５）に記載の通り、骨髄から採取し、精製した。
【００６６】
ＲＮＡ移動度シフトアッセイ：ゲル遅延度アッセイをＭｅｙｒｏｎ−Ｈｏｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，２３，３８６−３９５（２００４）に記載の通り行った。組織溶解物は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ  ＫＣｌ、５％グリセロール、０．２％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン及びｃｏｍｐｌｅｔｅＴＭ  ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ  アプライド  サイエンス社、インディアナ）を含有する酸素除去溶解バッファーで前記の嫌気性チャンバー中で調製した。全タンパク質１０μｇを含有する溶解物（ｘμｌ）を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び４０ｍＭ  ＫＣｌを含有するバンドシフトバッファー（１２．５−ｘ）μｌに添加した。サンプルは、２０％グリセロール、０．２Ｕ／μｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＲＮＡｓｉｎｅ（アンビオン社、テキサス）、０．６μｇ／μｌ酵母ｔ−ＲＮＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ及び２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び４０ｍＭ  ＫＣｌ中２０ｎＭ  ヒトフェリチンＨ鎖遺伝子由来の３２ＰでラベルしたＩＲＥを含有する反応カクテル１２．５μｌとともに室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。本反応混合物２０μｌの測定は、１０％アクリルアミド／ＴＢＥゲルにロードし（２００Ｖ、２．１５時間で電気泳動し）、その後、ゲルを固定、乾燥し、オートラジオグラフィーに供した。
【００６７】
ウェスタンブロッティング及び抗体：タンパク質分析はＬａＶａｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａに記載の通り行った。等量のタンパク質（２０〜４０μｇ／レーン）を１３％  ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを５％無脂肪ミルク、ＰＢＳ中０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で固定し、同一のブロッキングバッファー中、室温（ＲＴ）でプローブ標識した。ＩＲＰ１抗体は精製したｈＩＲＰ１に対して調製し、１：５０００に希釈して使用した。Ｌ−フェリチン抗体はマウス肝臓から精製したＬ−フェリチンタンパク質からウサギで産生した。ザイメッド社のマウスモノクローナルＴｆＲ抗体は、１：２０００に希釈して使用した。シグマ社のモノクローナル抗αチューブリン抗体及び抗βアクチン抗体は、１：５０００に希釈して使用した。ウェスタンブロットは、ＧＥヘルスケア社の二次ペルオキシダーゼｃｏｎｊｕｇａｔｅヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体またはヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体をそれぞれ１：５０００及び１：２０００に希釈して処理した。ウェスタンブロットは、高感度化学発光法（ＥＣＬキット、ピアス社、イリノイ）を使用して現像した。
【００６８】
アコニターゼアッセイ：ヒト溶解物に対するアコニターゼ活性ゲルはＴｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎｆｒａに記載の通り行い、マウス溶解物に対するアコニターゼ活性ゲルは以下の変更をして行った。ゲルは、６％アクリルアミド、１３２ｍＭトリス塩基、６６ｍＭホウ酸塩、３．６ｍＭクエン酸塩を含む分離ゲル及び４％アクリルアミド、６６ｍＭトリス塩基、３３ｍＭホウ酸塩、３．６ｍＭクエン酸塩を含むスタッキングゲルから作成された。ランニングバッファーは、２５ｍＭトリスｐＨ８．３、９６ｍＭグリシン、及び３．６ｍＭクエン酸塩を含む。電気泳動は、１７０Ｖ、４℃で行った。スペクトルアコニターゼ活性は、基質としてシス−アコニターゼを使用してＦｉｌｌｅｂｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎｆｒａの方法に従って測定した。
【００６９】
免疫組織化学：パラフィン包埋組織切片を、脱ろう、補水後に１０ｍＭクエン酸バッファーｐＨ６．４中で抗原回復のために１５分間電子レンジ（ｍｉｃｒｏ  ｏｖｅｎ）で煮沸した。切片は３０分間ブロッキングバッファー（トリス緩衝食塩水ｐＨ７．４、５％正常ヤギ血清、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロックし、その後、室温で２時間ポリクローナルウサギ抗フェリチン抗体とともにインキュベートした。タンパク質−抗体複合体はＣＹ３−ロバ抗ウサギ抗体（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、ウェストグローブ、ＰＡ）で標識した。核は対比染色としてＤＡＰIで標識した。スライドを観察し、写真をニコンＥｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００蛍光顕微鏡で記録した。
【００７０】
ペルルスの（Ｐｅｒｌ’ｓ）ＤＡＢ鉄染色：脱ろう及び補水後、パラフィン包埋組織切片は、予熱した染色液（５％フェロシアン化カリウム１５．０ｍｌ、５％塩酸１５．０ｍｌ、電子レンジ（ｍｉｃｒｏ  ｏｖｅｎ）で１５秒間）で５分間染色した。切片は滅菌水、及びトリス緩衝食塩水ｐＨ７．４で洗浄し、その後、ＤＡＢ染色液（２０ｍｇ  ＤＡＢ、５０μｌ  ３０％  Ｈ２Ｏ２、２０ｍｌトリス緩衝食塩水ｐＨ７．４）で室温で３０分間染色した。滅菌水で洗浄後、切片はＣｒｙｓｔａｌ  Ｍｏｕｎｔマウンティング液（シグマ社）でマウントし、観察し、ニコンＥｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００蛍光顕微鏡で写真撮影した。
【００７１】
統計：対応のあるスチューデントｔ検定（ｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）でぶら下がり時間の平均値間の違いを調べた。ｐ＜０．０５の結果は、統計的に有意であると考えられた。
【００７２】
（実施例１）
以下の実施例は、ＩＲＰ２欠損マウスにおける神経変性を治療又は予防するためにテンポールを使用することを示す。
【００７３】
安定なニトロキシドラジカル、テンポールを栄養補助食品としてノックアウトマウス（ＩＲＰ２−／−）に投与し、「ぶら下がり試験」を用いて神経変性を調べた。該「ぶら下がり試験」では、マウスに逆さまにした位置で金網スクリーンを握らせ、スクリーンを握っていられる時間の長さを測定した（最大６０秒まで）。ぶら下がり試験はマウスにおける神経変性の進行を定量的に評価する。Ｃｒａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８３５，１８−２６（１９９９）。
【００７４】
金網を逆さまにした後に握り続けるＩＲＰ２−／−マウスの能力は、動物の加齢につれて次第に減少し、ＷＴマウス（図１ａ参照）に比べてＩＲＰ２−／−マウスで有意に悪化する（ｐ値＝０．０１５）。テンポール添加飼料を与えたノックアウトマウスは、治療されていないノックアウトマウスに比べてぶら下がり時間の実質的な増加を示した。これは、テンポール添加飼料で維持されたＩＲＰ２−／−マウスが神経筋の能力を次第に失うことから有意に（ｐ値＝０．００９）守られていることを示す（図１ｃ）。テンポールを添加されたＩＲＰ２−／−マウスは、行動障害、震えまたは歩行や毛づくろい異常などの神経変性の他の兆候が進行しなかった。
【００７５】
（実施例２）
以下の実施例は、安定なニトロキシドラジカルが、鉄代謝遺伝子の活性及び／又は発現のポジティブな効果を介して治療的有用性を提供することを示す。
【００７６】
テンポールなどのニトロキシドラジカルは、酸化ストレスを軽減する治療的有用性を提供するフリーラジカル捕捉剤として機能すると一般的に考えられている。しかしながら、ＩＲＰ２−／−動物における脂質酸化、ＤＮＡ酸化（８−ヒドロキシグアニンアッセイ）及びタンパク質酸化アッセイを含む酸化ストレスに対する複数のアッセイは、酸化ストレスが疾患の進行に重大な役割を有することは示さなかった（本明細書ではデータを示さない）。
【００７７】
ＩＲＰ１のＩＲＥ結合活性に対するテンポールの効果を調査するため、ＩＲＰ２−／−胎児線維芽細胞に、０、０．３及び１．０ｍＭテンポールを添加し、クエン酸第二鉄アンモニウム（ＦＡＣ）を添加した培地又は無添加の培地で１６時間維持した。図２ａ及び２ｂのウェスタンブロットは、ＩＲＰ１のＩＲＥ結合活性ならびにＴｆＲ１、Ｌ−Ｆｔ、ＩＲＰ１及びチューブリンのタンパク質レベルを示す。全てのＩＲＥ結合活性は、ＩＲＰ１活性化に起因した。その結果は、テンポール処理細胞においてＴｆＲ１レベルが増加し、フェリチンレベルが減少する一方で、ＩＲＰ１レベル及びチューブリンレベル（ロードしたコントロール）は変化しないことを示す。図２ｃは、異なった濃度のテンポール（ＦＡＣ添加なし）でのＩＲＰ１、ＴｆＲ１及びＬ−フェリチン（Ｌ−Ｆｔ）タンパク質レベルのＩＲＥ結合活性を、ここで１００％と表わされるコントロールレーンと比較した強度として示す。定量化はＩＱＭａｃ（ＩＲＰ１活性）又はＮＩＨイメージ（タンパク質レベル）プログラムで行った。エラーバーは、２つの異なるセットの実験から計算された標準偏差を示す。
【００７８】
総合すれば、これらの結果は、ニトロキシラジカル処理がＩＲＰ１の潜在的なＩＲＥ結合活性を活性化し、かくしてＴｆＲ１及びフェリチンの誤制御を覆すことにより、細胞にＩＲＰ２の喪失を補償することを可能にする。したがって、テンポール及び同様の安定なニトロキシドラジカルは有意なフリーラジカルストレス又は鉄減少を生じないメカニズムによってＩＲＰ１を活性化するので、魅力的な神経保護療法である。
【００７９】
（実施例３）
以下の実施例は、インビボでのＩＲＥ結合活性に対するニトロキシドラジカルの効果を示す。
【００８０】
コントロール飼料またはテンポール添加飼料で維持したＩＲＰ２−／−マウスの様々な脳領域から作製された溶解物は、ゲルシフトアッセイ及びウェスタンブロットによりＩＲＰ１のＩＲＥ結合活性、ならびにＴｆＲ１、ＩＲＰ１及びアクチンタンパク質レベルについて分析された。結果は図３ａに示す。図３ｂは、ここで１００％と表されたコントロールと比較したバンドの強度としての結果を定量化したものである。定量化はＩＱＭａｃ（ＩＲＰ１活性）又はＮＩＨイメージ（タンパク質レベル）プログラムで行った。エラーバーは、２つの異なるセットの動物から計算された標準偏差を示す。
【００８１】
小脳、脳幹及び前脳由来の溶解物において、ＩＲＥ結合活性及びＴｆＲ１タンパク質レベルがコントロールマウスと比較してテンポール補給マウスで顕著に増加した。ＩＲＰ１及びアクチンタンパク質レベルは、テンポール処理結果としてはこれらの脳領域で有意な変化を生じなかった。これらの結果は、テンポールがインビボでＩＲＰ１のＩＲＥ結合活性に対するポジティブな効果を与えることを裏付ける。
【００８２】
（実施例４）
以下の実施例は、脳白質におけるニトロキシドラジカル処理がフェリチン発現及び第二鉄蓄積を減少させることを示す。
【００８３】
コントロール飼料又はテンポール添加飼料で維持した野生型マウス及びＩＲＰ２−／−マウス由来の小脳溶解物を、フェリチン発現又はアクチン発現について分析した。図４ａは、ウェスタンブロット分析結果を示す。図４ｂでは、１００％として表されるコントロールと比較した相対的な強度の測定値としてフェリチンレベルを示す。定量化はＮＩＨイメージプログラムで行った。エラーバーは、３つの異なるセットの動物の結果から計算された標準偏差を示す。結果が示すように、フェリチンレベルは野生型マウスと比較してコントロール飼料のＩＲＰ２−／−マウスで上昇した。テンポールを用いた処理はＩＲＰ２−／−マウスでのフェリチンレベルを減少させた。これはテンポールにより誘導されたＩＲＥ結合活性の観察された増加と一致する。
【００８４】
免疫組織化学研究は、マウス脳の海馬及び大脳皮質領域におけるフェリチン発現を分析することで行った。結果は図４ｃ及び４ｄに示す。結果が示すように、フェリチン発現は野生型動物と比較してＩＲＰ２−／−動物（左下パネル）の海馬及び大脳皮質で顕著に増加した。フェリチン過剰発現はテンポール処理とともに減少した。
【００８５】
コントロール飼料又はテンポール添加飼料で維持した野生型マウス及びＩＲＰ２−／−マウスの小脳葉及び線条体は、ペルルスの（Ｐｅｒｌｓ’）ＤＡＢ染色を用いた第二鉄蓄積で分析した。結果を図４ｅ及び４ｆに示す。図で示すように、第二鉄染色は野生型コントロールと比較してコントロール飼料のＩＲＰ２−／−動物の試験領域において増加した。これは、ＩＲＰ２−／−動物のオリゴデンドロサイト及び小脳白質路における第二鉄の封鎖を示す。染色は、テンポール飼料のＩＲＰ２−／−動物で減少し、これは鉄の封鎖が減少したことを示す。
【００８６】
これらの結果は、安定なニトロキシドラジカルが脳におけるフェリチン発現及び第二鉄蓄積を減少させられることを示す。
【００８７】
（実施例５）
以下の実施例は、ニトロキシドラジカルがＩＲＰ１のＩＲＥ結合構造を生じさせるために細胞質（ｃｙｔｏｌｉｃ）アコニターゼの鉄−硫黄クラスターの分解を介してＩＲＥ結合活性を回復させることを示す。
【００８８】
ＩＲＰ１は、２つの形態の間で変化する二官能性タンパク質である：鉄が豊富な細胞において、ＩＲＰ１はキュバン鉄−硫黄クラスター及び機能をクエン酸塩とイソクエン酸塩で相互転換する細胞質アコニターゼとして含む。一方、酸化還元−感受性鉄−硫黄クラスターを喪失する際に、ＩＲＰ１はＩＲＥと結合できるように重要な形態変化をする。動物組織中で、ほとんどのＩＲＰ１は、主に活性化したアコニターゼとして無傷の鉄−硫黄クラスター及び機能を含む。
【００８９】
ニトロキシドラジカルが鉄−硫黄クラスターの分解によりＩＲＰ１結合を活性化することを裏付けるために、我々はｉｎ−ｇｅｌアコニターゼアッセイを行ってテンポールが細胞質アコニターゼの活性を減少させたかどうかを決定した。図５ａはマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）溶解物における細胞質アコニターゼ活性を示す。バンドは、細胞質アコニターゼがＩＲＰ１−／−細胞由来の溶解物中にないことが直ちに確認されたことを示す。特に、テンポール処理は、ＷＴ及びＩＲＰ２−／−胎児線維芽細胞由来の溶解物中の細胞質アコニターゼの活性を減少させる。一酸化窒素、Ｏ２・−及びアスコルビン酸塩などの小さな酸化還元分子が細胞質アコニターゼの鉄−硫黄クラスターと反応できること、それにより鉄−硫黄クラスターの喪失とＩＲＰ１のＩＲＥ結合構造への転化を導くことは、当該分野での他の所見と一致している。Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ３，１９９−２１０（２００６）；Ｂｏｕｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００３，ｐｅ  １７（２００３）。
【００９０】
ＩＲＰ１活性に対するテンポールの効果が鉄−硫黄クラスターの酸化分解と動力学的に一致するかどうかを決定するために、アコニターゼ活性に関するテンポールの効果をＩＲＰ１での鉄−硫黄クラスターの新規合成と修復を限定することによってＩＲＰ１のＩＲＥ結合活性を活性化する鉄キレート剤、デフェリプロン（ＤＦＯ）の効果と比較した。野生型及びＩＲＰ２−／−マウス由来のマウス胎児線維芽細胞は、テンポール又は鉄−キレート剤デフェリプロン（ＤＦＯ）で１６時間処理し、その後、新鮮な無添加培地に取り換え、続いてゲルシフトアッセイ及びアコニターゼゲルアッセイにより様々な時間ポイントでアッセイした。アコニターゼ活性の回復は、野生型及びＩＲＰ２−／−細胞で評価した。結果は図５ｂ及び５ｃに示す。
【００９１】
テンポール及びＤＦＯの両方の処理により、ＩＲＰ１のＩＲＥ結合活性が活性化された。しかしながら、テンポールにより誘導されたＩＲＥ結合活性の活性化及び細胞質アコニターゼ活性の喪失は、テンポール除去２時間後まで容易に逆転したが、細胞質アコニターゼ活性の回復はＤＦＯ除去８時間後に活性を評価したときでさえもほとんど認識されなかった。ＤＦＯと比較してテンポール処理後の鉄−硫黄クラスター回復の速度における差異は、テンポールとＤＦＯが異なる機序によりＩＲＰ１を活性化することを示した。結果は、ＩＲＰ１の鉄−硫黄クラスターはテンポールによって分解されるが、クラスター不安定化試薬が除去されると直ちに再構築されることを示す。一方、ＤＦＯ処理後の細胞質アコニターゼ活性の回復は、細胞内鉄の減少、及び減少した鉄−硫黄会合タンパク質の発現により制限された。加えて、処理は実質的にミトコンドリアアコニターゼ活性に影響を及ぼさず、それゆえに相対的に良性であった。
【００９２】
（実施例６）
以下の実施例は、ニトロキシドラジカルがＩＲＰ１の鉄−硫黄クラスターに対して直接効果を与えることを示す。
【００９３】
ＩＲＰ１の鉄−硫黄クラスター状態に対するテンポールの効果が直接的化学的分解過程を表すかどうかを評価するため、テンポールで精製ホロＩＲＰ１（無傷の［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターを含む）を一酸化窒素によるＩＲＰ１の鉄−硫黄クラスターの分解を示すために当該分野で使用されてきた条件と同様の時間及び温度条件で処理した。Ｓｏｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｏｒｇ  Ｃｈｅｍ，８，２２６−２３２（２００３）。精製ホロＩＲＰ１（１１ｎｇ）のＩＲＥ結合活性は、ＩＲＥゲルシフトアッセイによって評価した。精製タンパク質（１１ｎｇ）を１ｍＭテンポールなし（レーン１）又はあり（レーン２）で室温で２時間０．１％  β−メルカプトエタノールとともにインキュベートした。レーン３のサンプルはテンポールなしで２時間インキュベートした後、２％  β−メルカプトエタノールで２分間処理した。結果は図６ａ及び６ｂに示す。アコニターゼ活性は、室温及び３７℃で３時間コントロール及びテンポール処理されたサンプルにおいて、時間とともにアコニターゼ活性を同程度に喪失することを示す基質としてシスアコニターゼを使用し、Ｆｉｌｌｅｂｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３８８，１４３−１５０（２００５）の方法に従った結合溶液（coupled solution）アッセイにより測定した。結果は図６ｄ及び６ｅに示す。
【００９４】
テンポール処理は、［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターの完全な崩壊と一致してＩＲＰ１のＩＲＥ結合活性を増加させる。ＩＲＥ結合活性は２時間室温でテンポール処理したＩＲＰ１及び３時間３７℃でテンポール処理したＩＲＰ１では、室内空気のみに暴露したＩＲＰ１と比較してはるかに高かった。図６ｂは、ＩＲＥ結合活性は、３時間３７℃で１．０ｍＭテンポールによるホロＩＲＰ１の処理でほとんど完全に回復したことを示す。しかしながら、テンポールを精製タンパク質に添加することは、２時間まで又は３時間３７℃で室内空気に暴露されて生じるアコニターゼ活性の喪失を促進しなかった。これらの結果は、精製タンパク質を使用したアッセイにおいてテンポールがクラスターの分解を促進することを示した。一方、酸素だけに暴露するとアコニターゼ活性を欠く識別可能な中間体の形成を促進するが、ＩＲＥ結合を妨げるクラスターの残存物を保持する。
【００９５】
精製タンパク質に関するこれらのアッセイは、テンポールが直接的及び十分にＩＲＰ１の鉄−硫黄クラスターを分解することを示し、直接ＩＲＰ１の鉄−硫黄クラスターを不安定化することによってテンポールが細胞及び動物におけるＩＲＰ１のＩＲＥ結合活性を活性化するという結論を支持する。鉄−硫黄クラスターの部分的に分解された構造は細胞及び動物内では修復されるかもしれないが、精製タンパク質サンプルでは修復されないかもしれない。このことは、テンポール処理後のインビボ及びインビトロでのアコニターゼ活性測定結果を説明している。
【００９６】
（実施例７）
以下の実施例は、ニトロキシドラジカルがＩＲＰ１結合活性の回復を通して治療効果に影響することを示す。
【００９７】
赤芽球は、ＩＲＰ１とＩＲＰ２との相対的な活性を評価するため及び赤芽球におけるＩＲＰ１の潜在的プールからＩＲＰ１がＩＲＥ結合構造に回復できたかどうかを決定するために野生型マウスから単離された。ゲルシフト研究により、ＩＲＰ１及びＩＲＰ２が赤芽球でのＩＲＥ結合活性に同等に寄与することを示した（図７ａ）。しかしながら、ＩＲＰ１レベルは脳と比べて赤芽球で顕著に減少した（図７ｂ）。同様に、ＩＲＰ１を細胞質アコニターゼ構造からＩＲＥ結合構造に変換する高濃度のβメルカプトエタノールで赤芽球を処理することは、赤芽球でのＩＲＰ１のさらなるＩＲＥ結合活性を活性化しない。対照的に、ＩＲＥ結合活性の有意な増加を、βメルカプトエタノール処理を使用した脳溶解物から得た（図７ａ）。このことは、発生中の赤血球が、テンポール又は他の鉄−硫黄クラスター不安定化試薬で処理することによりＩＲＥ結合構造へと変換され得る細胞質アコニターゼ構造においてＩＲＰ１の有意な量を欠失していることを示す。
【００９８】
これらの結果は、ＩＲＰ２−／−動物の軽度の鉄欠乏貧血が主に赤芽球における減少したＴｆＲ１の発現及び減少した骨髄鉄蓄積に寄与するが、ＩＲＰ２−／−マウスのテンポール処理がなぜ神経変性を予防するのに、ＩＲＰ２−／−マウスの軽度の貧血を改善に導かないのかを説明する。ＩＲＰ２−／−マウスの軽度の貧血（ヘマトクリット値はＷＴの５２±２に対して４６±５であった。ｐ＝０．０２２）は、テンポール処理動物では改善されず、テンポール飼料を与えた８ヵ月後４６±４のままであった。赤芽球では非常に少しのＩＲＥ結合活性しか改善できないので、テンポールはＩＲＰ２−／−マウスの貧血を治さなかった。
【００９９】
さらに、テンポールは神経変性からＩＲＰ２−／−動物を保護するが、ＩＲＰ１＋／−  ＩＲＰ２−／−マウスにおける疾患の進行を有意には（ｐ＝０．５５９）妨げなかった（図７ｃ）。ＷＴ、ＩＲＰ２−／−及びＩＲＰ１＋／−  ＩＲＰ２−／−マウスのぶら下がり試験結果は、ＩＲＰ１＋／−  ＩＲＰ２−／−動物がＩＲＰ２−／−動物よりも症状を示した。しかしながら、テンポール処理は、神経変性症状の進行から有意に（ｐ＝０．５５９）十分にＩＲＰ１＋／−  ＩＲＰ２−／−動物を保護しないことは明らかであった。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。曲線は、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈプログラムの多項式曲線適合を用いて描いた。図１に示したＷＴ及びＩＲＰ２−／−マウスのぶら下がり試験曲線は、ＩＲＰ１＋／−  ＩＲＰ２−／−動物と比較してここで再度表示する。これらの結果は、１つのＩＲＰ１アレルの喪失はＩＲＰ１＋／−  ＩＲＰ２−／−マウスにおけるＩＲＰ１量を顕著に減少させ、これによりＩＲＥへの結合を回復できるということを示唆している。
【０１００】
総合すると、これらの結果は、テンポール処理による正常な鉄ホメオスタシスの回復がＩＲＥ結合構造へのＩＲＰ１の十分な量の変換によるものであるという結論をさらに支持する。
【０１０１】
本明細書中で引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、本明細書中で参考として援用されることが個別におよび具体的に示され、かつその全体が記載されているのと同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。本発明を記載する文脈において（特に、添付の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示語の使用は、本明細書中で他に特に明記がない限り、又は文脈に明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を包含するように解釈されるべきである。「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、他に特に明記がない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むが、限定されない」ことを意味する）として解釈されるべきである。本明細書中での値の範囲の記載は、本明細書中で他に特に明記がない限り、その範囲内にある各々の別々の値を個々に言及する略記方法として働くことが単に意図され、そして各々の別々の値は、それが本明細書中で個々に列挙されているかのように本明細書中に含まれるものである。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に特に明記がない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書中で提供される任意及び全ての例、又は例示的な言葉（例えば、「などの」）の使用は、本発明をより良く明瞭にすることが単に意図され、そして他に特に主張されない限り、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書中の如何なる言葉も、本発明の実施に必須なものとして主張されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【０１０２】
本発明の実施に関して、本発明者らが知っている最良の形態を含む、本発明の好適な実施態様を本明細書中に記載する。もちろん、それらの好適な実施態様のバリエーションは、上記の説明を読むと、当業者に明白となるであろう。本発明者らは、当業者が適宜このようなバリエーションを用いることを予想し、そして本発明者らは、本発明が本明細書中に具体的に記載されたものとは別の状態で実施されることを意図する。従って、本発明は、適用法によって許されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての改変物及び均等物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上記要素の任意の組合わせは、本明細書中で他に特に明記がない限り、又は文脈に明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【図１】
2010520888.tif 000003
【図２ｃ】
2010520888.tif 000004
【図２】
2010520888.tif 000005
【図３ａ】
2010520888.tif 000006
【図３ｂ】
2010520888.tif 000007
【図４】
2010520888.tif 000008
【図４ｃ】
2010520888.tif 000009
【図４ｄ】
2010520888.tif 000010
【図４ｅ】
2010520888.tif 000011
【図４ｆ】
2010520888.tif 000012
【図５ａ】
2010520888.tif 000013
【図５ｂ】
2010520888.tif 000014
【図５ｃ】
2010520888.tif 000015
【図６】
2010520888.tif 000016
【図７】
2010520888.tif 000017
【図７ｃ】
2010520888.tif 000018
【図７ｄ】
2010520888.tif 000019
【国際調査報告】
2010520888.tif 000020
2010520888.tif 000021
2010520888.tif 000022
2010520888.tif 000023
2010520888.tif 000024