(57)【要約】本発明は、ヒトＩＬ−２０に特異的に結合する抗体（例えば、ｍＡｂ  ７Ｅおよびその同等物）、ならびに、アテローム性動脈硬化症、ＲＡ、乾癬、乾癬性関節炎、細菌誘発性の胃潰瘍、および急性腎不全などのＩＬ−２０に関連する炎症性疾患の治療におけるその使用を特徴とする。本発明のｍＡｂ  ７Ｅおよびその機能的同等物の例には、ｍＡｂ  ７Ｅの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、ｍＡｂ  ７Ｅの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、およびｍＡｂ  ７Ｅから作製したキメラ抗体などの、ｍＡｂ  ７Ｅと同一の重鎖および軽鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を有する抗体が含まれる。他の例には、ｍＡｂ  ７Ｅのヒト化抗体が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体７Ｅ（ｍＡｂ  ７Ｅ）またはその機能的同等物である、ヒトＩＬ−２０に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
前記機能的同等物が、ｍＡｂ  ７ＥのＶＨ領域およびＶＬ領域を含む抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記機能的同等物が、ｍＡｂ  ７ＥのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、またはキメラ抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ｍＡｂ  ７Ｅである、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
前記機能的同等物がヒト化ｍＡｂ  ７Ｅである、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
アテローム性動脈硬化症を治療する方法であって、アテローム性動脈硬化症に罹患しているかまたはそのリスクを有する対象を同定するステップと、有効量の抗ＩＬ−２０抗体を該患者に投与するステップとを含む方法。
【請求項７】
前記抗体がｍＡｂ  ７Ｅまたはその機能的同等物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がｍＡｂ  ７Ｅである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記機能的同等物が、ｍＡｂ  ７ＥのＶＨ領域およびＶＬ領域を含む抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記機能的同等物が、ｍＡｂ  ７ＥのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、またはキメラ抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記機能的同等物が、ｍＡｂ  ７Ｅのヒト化抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が静脈内投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
ＩＬ−２０に関連する炎症性疾患を治療する方法であって、
ＩＬ−２０に関連する炎症性疾患に罹患しているかまたはそのリスクを有する患者を同定するステップと、
有効量のｍＡｂ  ７Ｅまたはその機能的同等物を該患者に投与するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
前記ＩＬ−２０に関連する炎症性疾患が、ＲＡ、乾癬、乾癬性関節炎、細菌誘発性の胃潰瘍、および急性腎不全からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＩＬ−２０に関連する炎症性疾患がＲＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、関節炎の関節に直接投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体がｍＡｂ  ７Ｅである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記機能的同等物が、ｍＡｂ  ７ＥのＶＨおよびＶＬを含む抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記機能的同等物が、ｍＡｂ  ７ＥのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、またはキメラ抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記機能的同等物が、ｍＡｂ  ７Ｅのヒト化抗体である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００７年６月１５日に出願された米国特許出願第１１／７６３，８１２号の優先権を主張する。この出願の内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
炎症とは、有害な刺激を取り除き、組織に対する治癒プロセスを開始するための、外傷または微生物の侵入に対する局所的な、保護的な応答を言う。炎症が欠如すると、患者が病原体に感染しやすくなる。一方、異物として宿主組織が異常に認識されることにより生じる過剰な炎症により、様々な炎症性疾患、例えばアテローム性動脈硬化症およびリウマチ性関節炎（ＲＡ）が生じ得る。
【０００３】
アテローム性動脈硬化症は、脂肪物質が動脈壁に沿って凝集してアテローム性動脈硬化性のプラークを形成する、慢性炎症性疾患である。泡沫細胞マクロファージがこの疾患の進行において重要な役割を有することが示唆されている。それらは、局所的な免疫応答を指示し増幅させる、様々なタイプのサイトカインおよびケモカインを分泌する。いくつかのケモカインおよびサイトカインが、アテローム性動脈硬化症の病変部において高いレベルで発現することが明らかにされており、このことは、これらが疾患の発症に関与することを示唆している。
【０００４】
ＲＡは、単核貪食細胞、リンパ球、および好中球の滑膜への浸潤を生じさせる、滑膜関節における激しい炎症によって特徴付けられる、炎症性関節炎の最も一般的な形態である。最近の研究により、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、およびＩＬ−８などのサイトカインおよびケモカインが疾患の進行に実質的に関与することが示されている。
【０００５】
ＩＬ−２０は、ＩＬ−１０ファミリーの、新たに発見されたメンバーである。このファミリーの他のメンバーは、多くの炎症性疾患、例えばＲＡの発症において極めて重要であることが明らかにされている。ＩＬ−２０は、多能性造血前駆細胞のレベルを選択的に増大させる。ＩＬ−２０はまた、ケラチン生成細胞の増幅を誘発し、それにより炎症促進性遺伝子が過剰発現する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つの態様において、本発明は、ヒトＩＬ−２０に特異的に結合する抗体、すなわちｍＡｂ  ７Ｅ、およびその機能的同等物を特徴とする。ｍＡｂ  ７Ｅの機能的同等物の例には、ｍＡｂ  ７Ｅの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、ｍＡｂ  ７Ｅの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、およびｍＡｂ  ７Ｅから作製したキメラ抗体などの、ｍＡｂ  ７Ｅと同一の重鎖および軽鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を有する抗体が含まれる。他の例には、ｍＡｂ  ７Ｅのヒト化抗体が含まれる。
【０００７】
別の態様において、本発明は、有効量の抗ＩＬ−２０抗体、例えばｍＡｂ  ７Ｅまたはその機能的同等物を投与することにより、ＩＬ−２０に関連する炎症性疾患を治療する方法を特徴とする。ＩＬ−２０に関連する炎症性疾患には、限定するものではないが、アテローム性動脈硬化症、リウマチ性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、急性腎不全、および胃潰瘍（例えば、細菌誘発性の胃潰瘍）が含まれる。抗体は、静脈内投与され得るか、または、炎症が生じている部位に向けられ得る。
【０００８】
また、有効量の抗ＩＬ−２０抗体、例えばｍＡｂ  ７Ｅまたはその機能的同等物を、その治療を必要としている患者に投与することにより、固形腫瘍などの腫瘍を治療する方法も、本発明の範囲内にある。
【０００９】
ＭＡｂ  ７Ｅおよびその機能的同等物はまた、ＩＬ−２０に関連する炎症を治療するための薬剤の製造において用いることができる。
【００１０】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細を、以下の記載において説明する。本発明の他の特徴、目的、および利点が、その記載および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
モノクローナル抗ＩＬ−２０抗体７Ｅ（ｍＡｂ  ７Ｅ）およびその機能的同等物は本発明の範囲内にある。「機能的同等物」という用語は、（１）ヒトＩＬ−２０に特異的に結合し、（２）ｍＡｂ  ７ＥのＶＨ領域（配列番号３）と少なくとも７０％（例えば、８０％、９０％、または９５％）同一なＶＨ領域およびｍＡｂ  ７ＥのＶＬ領域（配列番号６）と少なくとも７０％（例えば、８０％、９０％、または９５％）同一なＶＬ領域を含む抗体を言う。
【００１２】
ＭＡｂ  ７Ｅは、以下に記載する方法に従って作製することができる。その重鎖および軽鎖のアミノ酸配列／ｃＤＮＡ配列を以下に示す。
ｍＡｂ  ７Ｅの重鎖のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）
【００１３】
【化１】
2010530852.tif 000002
【００１４】
【化２】
2010530852.tif 000003
強調した領域は、ｍＡｂ  ７Ｅの重鎖の可変領域（配列番号３）である
ｍＡｂ  ７Ｅの軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号４）およびアミノ酸配列（配列番号５）
【００１５】
【化３】
2010530852.tif 000004
強調した領域は、ｍＡｂ  ７Ｅの軽鎖の可変領域（ＤＮＡ：配列番号６、タンパク質：配列番号２１）である。
【００１６】
本明細書において用いる場合、２つのアミノ酸配列の「パーセント相同性」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ，  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、５８７３〜５８７７頁、１９９３年において記載されているように改変された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ，  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻：２２６４〜２２６８頁、１９９０年において記載されているアルゴリズムを用いて決定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁、１９９０年のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施し、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得る。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施し、参照ポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得る。比較を目的として、ギャップを有するアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年に記載されているように用いる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を用いる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【００１７】
ｍＡｂ  ７Ｅの機能的同等物は、酵素消化により生じるその断片、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２であり得る。それはまた、例えばペプチドリンカーであるリンカーを介して共有結合により融合された、ｍＡｂ  ７ＥのＶＨおよびＶＬを含む一本鎖抗体であり得る。さらに、それは、ヒトＩｇＧの重鎖および軽鎖の定常領域とそれぞれ結合しているｍＡｂ  ７ＥのＶＨおよびＶＬを含む、マウス−ヒトキメラ抗体であり得る。あるいは、機能的同等物はヒト化抗体であり得る。「ヒト化抗体」という用語は、そのＶＨおよびＶＬのフレーム領域（ＦＲ）がヒト抗体のＦＲで置き換えられている非ヒト抗体を言う。さらに、ｍＡｂ  ７Ｅの機能的同等物は、ＶＨまたはＶＬのＦＲに突然変異を導入することにより生じさせることができる。抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）がその特異性を決定することが良く知られている。したがって、ＦＲにおける突然変異は、通常は抗体の特異性に影響しない。抗体のＣＤＲおよびＦＲは、そのＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列に基づいて決定され得る。ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓを参照されたい。本明細書において記載される機能的同等物の結合特異性は、当技術分野において知られている方法、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット分析を用いて試験することができる。
【００１８】
ＭＡｂ  ７Ｅおよびその機能的同等物は、上述のハイブリドーマ細胞から分泌される抗体を精製することにより、または遺伝子操作により、調製することができる。
【００１９】
本発明はまた、有効量の抗ＩＬ−２０抗体、例えばｍＡｂ  ７Ｅまたはその機能的同等物を用いて、ＩＬ−２０に関連する炎症性疾患を治療する方法を特徴とする。
【００２０】
「ＩＬ−２０に関連する炎症性疾患」という用語は、ＩＬ−２０がその疾患の開始または進行において役割を有する炎症性疾患を言う。ＩＬ−２０は、アテローム性動脈硬化症およびリウマチ性関節炎などの炎症性疾患の発症に関与することが明らかにされている。Ｃｈｅｎら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２６巻：２０９０〜２０９５頁、２００６年、およびＨｓｕら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、５４巻（９号）：２７２２〜２７３３頁、２００６年を参照されたい。さらに、ＩＬ−２０は、多くの炎症促進性疾患、例えば乾癬、敗血性ショック、および炎症性腸疾患において重要な役割を有する炎症性因子であるＩＬ−８を上方調節する。米国特許出願第２００６／０２６９５５１号を参照されたい。ＩＬ−２０はまた、急性腎不全および細菌誘発性の胃潰瘍に関与することが明らかにされている。したがって、ＩＬ−２０の機能を阻害する抗体は、ＩＬ−２０に関連する炎症性疾患の治療において有効である。
【００２１】
ＩＬ−２０に関連する炎症性疾患に罹患している対象とは、炎症が生じている部位にその疾患の少なくとも１つの症状、例えば発赤、腫れ、または痛みを有する対象（例えばヒトの患者）を言う。例えば、アテローム性動脈硬化症に罹患している患者とは、通常の医療手順によって検出することが可能な少なくとも１つのアテローム性プラーク（アテローム性動脈硬化症の症状）を有する患者を言う。このような患者は、プラーク破綻または動脈狭窄により、臓器への血液供給が不十分であり得る。この患者は、心臓への動脈が関与している場合の胸痛、または足の動脈が関与している場合の足の痛みなどの症状を有し得る。別の例において、ＲＡに罹患している患者は滑膜関節に炎症を有しており、それにより、発赤、腫れ、痛み、または関節の硬直、および滑膜への免疫細胞の浸潤が生じる。一部のＲＡ患者において、慢性炎症により、軟骨、骨、および靭帯の破壊が生じ、それにより、関節が変形する。重症なＲＡを有する患者では、関節の機能が喪失し得る。
【００２２】
ＩＬ−２０に関連する炎症性疾患のリスクを有する対象とは、遺伝的背景、家族歴、および生活習慣（例えば食事または喫煙）などの、この炎症性疾患の１つまたは複数の危険因子を有する対象を言う。「アテローム性動脈硬化症のリスクを有する」患者は、アテローム性動脈硬化症の１つまたは複数の危険因子、例えば心疾患の個人歴または家族歴、高脂肪の食事、喫煙、肥満、高血圧、および高い血中コレステロールレベルを有する。ＲＡのリスクを有する患者は、喫煙の習慣または自己免疫疾患の家族歴を有し得る。
【００２３】
本明細書において用いられる「炎症性疾患の治療」という用語は、別段の指示がない限り、疾患の症状の緩和、疾患に関連する炎症の進行の逆転、改善、または阻害を意味する。
【００２４】
本明細書において用いる場合、「有効量」という用語は、意図した効果または生理学的結果を得るためのその投与の状況において有効な、一定期間にわたって用いられる（急性投与または慢性投与、および断続的な投与または連続投与を含む）作用物質の量または濃度を言う。本発明において用いるための抗ＩＬ−２０抗体の有効量には、例えば、対象におけるＩＬ−２０に関連する炎症を予防もしくは阻害するために有効な量、または、このような炎症の症状、例えば発赤、腫れ、痛み、および炎症が生じている臓器の機能の喪失を緩和もしくは改善するために有効な量が含まれる。
【００２５】
本明細書において記載される抗ＩＬ−２０抗体は、薬学的組成物を形成するために、薬学的に許容可能な担体と混合することができる。「許容可能」とは、担体が、組成物の活性成分と適合可能（かつ好ましくは、活性成分を安定化させることが可能）でなくてはならず、治療される対象に有害であってはならないことを意味する。適切な担体には、微結晶セルロース、マンニトール、グルコース、脱脂粉乳、ポリビニルピロリドン、およびデンプン、またはその組み合わせが含まれる。
【００２６】
薬剤の分野の当業者に知られている従来の方法を、治療する炎症性疾患のタイプまたは疾患に関連している炎症の部位に応じて、抗ＩＬ−２０抗体含有薬学的組成物を対象に投与するために用いることができる。アテローム性動脈硬化症の治療では、組成物は静脈内注射を介して投与することができる。リウマチ性関節炎の治療では、抗体含有組成物は、注射を介して滑膜関節に直接送達され得る。この組成物はまた、他の従来の経路、例えば皮下経路を介して投与することができる。さらに、これは、１カ月、３カ月、または６カ月の蓄積注射可能なまたは生分解可能な材料および方法などを用いる、注射可能な蓄積投与経路を介して対象に投与することができる。
【００２７】
注射可能な組成物は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、カルボン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）などの様々な担体を含み得る。静脈内注射では、水溶性の抗体をドリップ法によって投与することができ、それにより、抗体および生理学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的製剤が注入される。生理学的に許容可能な賦形剤には、例えば、５％デキストロース、０．９％生理食塩水、リンゲル液、または他の適切な賦形剤が含まれ得る。筋肉内調製物、例えば適切な可溶性塩の形態の抗体の無菌製剤を、注射用水、０．９％生理食塩水、または５％グルコース溶液などの薬学的賦形剤内に溶解し、その賦形剤内において投与することができる。
【００２８】
さらに詳述することなく、上記の記載により本発明は十分に可能となっていると考えられる。したがって、以下の実施例は、例示的なものとしてのみ解釈されるものであり、開示の残りの部分を限定するものでは決してない。本明細書において引用される全ての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２９】
ａｐｏＥ−／−マウスのアテローム性動脈硬化症の病変部におけるＩＬ−２０およびその受容体の両方の上方調節
Ｃ５７ＢＬ／６  ａｐｏＥ−／−（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥから入手）マウスに、通常の飼料または０．１５％のコレステロールを含むアテローム生成飼料を給餌した。２４週目に、マウスの心臓および上行大動脈を切除し、ホルムアルデヒド内で固定し、一連の１０μｍ厚の凍結切片を大動脈弓から心室に向かって切断した。
【００３０】
凍結切片を次に、スライド上で、４％パラホルムアルデヒドで固定し、バックグラウンドを低減させる成分（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）と共に６０分間、抗体希釈剤に浸して、非特異的な免疫グロブリンの染色を抑制した。スライドを９０ｍｌのメタノールおよび１０ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２内に１０分間室温で浸して内因性ペルオキシダーゼをブロッキングし、ＰＢＳで洗浄し、次に、ブロッキング試薬内において４℃で一晩、抗ｈＩＬ−２０Ｒ２ウサギポリクローナル抗体と共にインキュベートした。スライドを次に、ＨＲＰ結合型ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で連続的に処理し、室温で２時間インキュベートした。スライドをジアミノベンジジンＤＡＢ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と共にインキュベートし、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン（Ｔｈｅｒｍｏｓｈａｎｄｏｎ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）で対比染色した。一次抗体とのインキュベートを行わなかった陰性対照を、同時に実施した。
【００３１】
ＩＬ−２０受容体の１つであるＩＬ−２０Ｒ１を染色するために、一次抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍ．Ｏ．Ｍ．ペルオキシダーゼキットＰＫ−２２００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬（Ｍ．Ｏ．Ｍ．キット内に含まれる）を用いて、製造者のプロトコルに従って１：１５０に希釈した。マウスＩｇＧ１アイソタイプ（クローン１１７１  １、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を陰性対照として用いた。ＨＲＰ結合型ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を二次抗体として用いて、組織に結合した一次抗体のシグナルを検出した。
【００３２】
マウスＩＬ−２０を染色するために、一次抗体（クローン１７６００５、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１：２００に希釈し、ビオチン標識したラット抗マウスＩｇＧ二次抗体およびＡＢＣ試薬で検出した。
【００３３】
ＩＬ−２０は、正常なＣ５７ＢＬ／６マウスと比較して、ａｐｏＥ−／−マウスのアテローム性動脈硬化症プラークにおいて上方調節されることが明らかにされた。ＩＬ−２０はまた、Ｍａｃ−３に富んだ（泡沫細胞／マクロファージ）区域においても検出された。免疫反応性の増大もまた、ＩＬ−２０Ｒ１およびＩＬ−２０Ｒ２の両方で、野生型マウスと比較して、ａｐｏＥ−／−マウスのアテローム性動脈硬化性のプラーク、内皮、および大動脈弓の外膜において検出された。
【００３４】
これらの結果は、ＩＬ−２０およびＩＬ−２０受容体の両方のレベルがアテローム性動脈硬化性のプラークにおいて増大し、アテローム性動脈硬化性の大動脈の内皮において顕著に上方調節されたことを示している。泡沫細胞／マクロファージはプラークにおけるＩＬ−２０の主要な産生体であると考えられる。
【００３５】
ヒトのアテローム性動脈硬化性の動脈におけるＩＬ−２０およびその受容体の両方の上方調節
ＩＬ−２０およびその受容体のレベルをまた、上述した方法に従って、ヒトのアテローム動脈硬化性の動脈において試験した。簡潔に述べると、アテローム性動脈硬化症患者から得た大腿動脈の外科的な試料をパラフィン内で固定し、１０μｍ厚の切片にスライスした。これらの切片において、内膜および中膜において顕著な肥厚が生じ、これらの両方は広範囲の血管形成を示した。
【００３６】
ＩＬ−２０は、ＣＤ６８の陽性染色を示した、微小血管の内側を覆う内皮細胞およびマクロファージ由来泡沫細胞において検出された。ＩＬ−２０Ｒ１およびＩＬ−２０Ｒ２の両方が、栄養血管の内皮細胞において主に検出された。逆に、ＩＬ−２０は正常な大動脈切片においては検出されず、低レベルのその受容体のみが正常な大動脈切片の内皮において検出された。
【００３７】
ＩＬ−２０がアテローム性動脈硬化症の病変部における既存の炎症性刺激によって誘発されたかを決定するために、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施して、酸化ＬＤＬ（ＯｘＬＤＬ）で処理したヒト末梢単球におけるＩＬ−２０のｍＲＮＡレベルを試験した。
【００３８】
ヒトの天然ＬＤＬを、不連続な遠心分離を用いてヒト血液の血漿から単離した。ＬＤＬを、３７℃で８時間、ＰＢＳ中でＣｕＳＯ４（５μＭの遊離Ｃｕ２＋）にさらすことによって酸化した。ＯｘＬＤＬを５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ、およびｐＨ７．４の２ｍＭのＥＤＴＡ内で維持し、調製後１０日以内に使用した。ヒト単球を、健康なドナーの末梢血試料から単離し、無血清ＲＰＭＩ内で培養した。マウスマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７を、１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ培地内で培養した。ヒト単球（１×１０６個細胞）またはＲＡＷ２６４．７（１×１０６個細胞）細胞を、ＯｘＬＤＬ（１、１０、または１００μｇ／ｍｌ）と共に６時間インキュベートした。全ＲＮＡをこれらの細胞から精製し、ＲＴ−ＰＣＲ分析に供して、ＩＬ−２０のｍＲＮＡレベルを決定した。
【００３９】
この実験から得られた結果は、ＯｘＬＤＬがヒト末梢単球およびマウスＲＡＷ２６４．７マクロファージにおけるＩＬ−２０の発現を誘発したことを示す。
【００４０】
ＯｘＬＤＬは、ケモカインの分泌を誘発し、白血球接着分子の発現を増大させることにより、泡沫細胞の発生、および他の構成内皮機能を促進することが示されている。Ｓｅｉｎｂｅｒｇら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、８巻：１２１１〜１２１７頁、２００２年を参照されたい。したがって、上述した結果は、免疫組織化学的な染色により決定される、泡沫細胞およびＩＬ−２０の共局在化を説明するものである。
【００４１】
Ｉｌ−２０はまた、低酸素条件下において誘発されることも明らかにされた。低酸素は様々な血管形成因子を誘発し、その結果、虚血組織において血管新生が生じることが知られている。
【００４２】
ヒト末梢単球を、インビトロで低酸素誘導因子−１αを活性化することにより低酸素様応答を引き起こす因子であるＣｏＣｌ２で処理した。Ｙｕａｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７８巻：１５９１１〜１５９１６頁、２００３年、およびＳｅｍｅｎｚａら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、１５巻：５５１〜５７８頁、１９９９年を参照されたい。簡潔に述べると、ヒト末梢単球（１×１０６個）を単離し、１００μＭまたは５００μＭのＣｏＣｌ２と共に６時間インキュベートした。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を無血清のＭ１９９と共にインキュベートし、同一の濃度でＣｏＣｌ２で６時間処理するか、または１％Ｏ２および５％ＣＯ２と共に１２時間インキュベートした。
【００４３】
ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＩＬ−２０がＣｏＣｌ２で処理したヒト末梢単球において誘発されたことを示している。ＣｏＣｌ２は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）においてＩＬ−２０、ＩＬ−２０Ｒ１、およびＩＬ−２０Ｒ２の発現を上方調節するが、ＩＬ−２２Ｒ１の発現は上方調節しない。同様の結果が、低酸素条件を模倣するために１％Ｏ２を供給した容器内で１２時間インキュベートしたＨＵＶＥＣにおいて得られた。
【００４４】
まとめると、低酸素は、ＩＬ−２０およびその受容体の両方の発現を誘発することが明らかにされた。
【００４５】
ＩＬ−２０はケモカインを誘発し血管形成を促進する
アテローム性動脈硬化症の進行は、アテローム性動脈硬化症の病変部へのＴリンパ球の動員を伴う。３つのＣＸＣＲ３リガンド、すなわちＭｉｇ／ＣＸＣＬ９、ＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０、およびＩ−ＴＡＣ／ＣＸＣＬ１１は、このＴリンパ球動員のプロセスを仲介し、アテロームに関連することが明らかにされている。Ｍａｃｈら、Ｊ．  ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１０４巻：１０４１〜１０５０頁、１９９９年を参照されたい。
【００４６】
これらのケモカインのレベルに対するＩＬ−２０の効果を調べた。ＨＵＶＥＣ細胞を、ＩＬ−２０を含む培地において培養し、これらのＣＸＣＲ３リガンドのレベルをＲＴ−ＰＣＲによって試験した。結果は、ＨＵＶＥＣおよびヒト微小血管内皮細胞において、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣ１１はＩＬ−２０によって上方調節されるがＣＸＣＬ１０はされないことを示す。
【００４７】
血管形成に対するＩＬ−２０の効果も調べた。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、マウス肝細胞癌細胞であるＭＬ−１（１×１０６個）を、ｍＩＬ−２０を含むマトリゲル、ｍＩＬ−２０および抗ｍＩＬ−２０Ｒ１抗体、またはＶＥＧＦと共に皮下注射した。７日後、腫瘍を切除し、ＣＤ３１で染色して微小血管密度の分析を行った。ＶＥＦＧと同様、ｍＩＬ−２０は、生理食塩水で処理した対照と比較して、固形腫瘍の周りの血管化を増強した。ＣＤ３１での染色はまた、生理食塩水で処理したマウスよりも、ｍＩＬ−２０で処理したマウスから切除した腫瘍において微小血管密度が高いことを示した。さらに、マウスＩＬ−２０Ｒ１に対する抗体はｍＩＬ−２０誘発性の血管形成を阻害し、このことは、ＩＬ−２０Ｒ１がＩＬ−２０誘発性の血管形成に関与していたことを示している。
【００４８】
血管形成は腫瘍、とりわけ固形腫瘍の発生に極めて重要であるため、ＩＬ−２０誘発性の血管形成を阻害する作用物質、例えば抗ＩＬ−２０抗体を、腫瘍の治療に用いることができる。
【００４９】
ＩＬ−２０はアポリポタンパク質Ｅ欠損マウスにおいてアテローム性動脈硬化症を促進する
ｍＩＬ−２０の全長ｃＤＮＡを、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した：
センスプライマー：５’−ＡＴＧＡＡＡＧＧＣＴＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡ−３’（配列番号７）
アンチセンスプライマー：５’−ＴＡＧＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＴＣＴ−３’（配列番号８）
ヘキサヒスチジンタグを有する増幅したｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１に挿入して、ｍＩＬ−２０発現ベクターを構築した。
【００５０】
５０μｇのｍＩＬ−２０発現ベクターを、１４週齢のメスのＡｐｏＥ−／−マウスに、両側の大腿四頭筋での筋肉内注射により送達した。注射の直後に、経皮的電気パルスを、Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．、６巻：４９３〜４９９頁、２００５年に記載されているように加えた。エレクトロポレーションを、１週間に１回、１０週間にわたり、それぞれのマウスの交互の脛骨の筋肉に実施した。これらのマウスには、この期間、アテローム生成飼料を給餌した。これらのマウスを次に屠殺し、それらのアテローム性動脈硬化症の病変部の領域を分析した。
【００５１】
エレクトロポレーション後の血清ＩＬ−２０のレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果は、ＩＬ−２０タンパク質のレベルがエレクトロポレーション後の最初の１週間でピークに達し、その後の週では徐々に低下したことを示す。ＩＬ−２０を投与すると、大動脈、すなわち大動脈洞の正面の病変が増強した。Ｍａｃ−３陽性マクロファージの数もまた、大動脈洞で増大した。ＭｉｇおよびＩ−ＴＡＣの発現もまた、対照マウスと比較して、ｍＩＬ−２０で処理したマウスの大動脈において増大した。さらに、炎症促進性サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子−αおよびＩＬ−６もまた、ｍＩＬ−２０で処理したマウスの大動脈において上方調節された。これらの結果は、ＩＬ−２０がアテローム形成性因子であり、アテローム性動脈硬化症の発症に起与し得ることを示唆している。
【００５２】
ＲＡ患者の滑液におけるＩＬ−２０およびその受容体の両方の上方調節
１６人のリウマチ性関節炎（ＲＡ）患者、３２人の変形性関節炎（ＯＡ）患者、８人の痛風患者、および１０人の健康なボランティアがこの研究に参加した。
【００５３】
全てのＲＡ患者（１０人の女性および６人の男性、３４〜８７歳）が、関節腔が一様に狭くなるというＸ線画像上の特徴を示し、リウマチ因子が陽性であった。さらに、この患者の全員が、米国リウマチ学会により確立されたＲＡについての７つの基準のうち４つに適合した。Ａｒｎｅｔｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．、３１巻：３１５〜３２４頁、１９８８年を参照されたい。
【００５４】
ＯＡ患者（２１人の女性および１１人の男性、４８〜８２歳）は、関節腔の不均一な狭まり、軟骨下硬化、軟骨下嚢胞、および骨棘の形成を含む、Ｘ線画像上の特徴を示した。痛風患者（１人の女性および７人の男性、４７〜８３歳）は、関節液における尿酸結晶の蓄積の存在に基づいて診断した。
【００５５】
滑液試料は、針吸引を用いて、全ての参加者の鋭敏な関節から回収した。血液試料もこれらの参加者から回収した。新鮮な滑液、滑膜組織、および血液試料を標準的な手順に従って調製した。簡潔に述べると、滑液をヒアルロニダーゼで消化し、ナイロンメッシュカラム（１００ｍｍの孔サイズ）に入れた。流入物を回収し、等容積のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅに入れ、遠心分離し（室温で、１８００ｒｐｍで３０分間）、上清を回収した。滑膜組織をリン酸緩衝生理食塩水で２回すすぎ、３．７％ホルムアルデヒド内で一晩保存し、次に、脱水し（ホルマリン、アルコール、およびキシレンの系内で）、パラフィン（生理食塩水で被覆したスライド上の５ｍｍのパラフィン塊）内に埋包した。血液を遠心分離し（２０００ｒｐｍで１０分間）、血清を回収した。全ての試料を、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５６】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施して、ヒトＩＬ−２０モノクローナル抗体を用いて、滑液および血清におけるＩＬ−２０のレベルを決定した。Ｗｅｉら、Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７巻：６５〜７２頁、２００５年を参照されたい。
【００５７】
ＲＡ患者の滑液におけるＩＬ−２０の濃度は、ＯＡ患者（ｐ＜０．０００１）および痛風患者（ｐ＜０．０５）よりも有意に高かった。ＲＡ患者、ＯＡ患者、および痛風患者から得た滑液におけるＩＬ−２０のメジアンレベルはそれぞれ、４３２．１ｎｇ／ｍｌ（２５から７５パーセンタイルは２５．４〜１６５３ｎｇ／ｍｌ）、０ｎｇ／ｍｌ（２５から７５パーセンタイルは０〜８．５ｎｇ／ｍｌ）、および０ｎｇ／ｍｌ（２５から７５パーセンタイルは０〜２６．７ｎｇ／ｍｌ）であった。
【００５８】
１２人のＲＡ患者および１０人の健康なボランティアの血清におけるＩＬ−２０のレベルを、上述した方法に従って決定した。ＲＡ患者におけるＩＬ−２０の血清ＩＬ−２０レベルは、健康な対照のレベルと非常に類似していた（Ｐ＝０．３５４４）。ＲＡ患者および健康な対照から得た血清におけるＩＬ−２０のメジアンレベルはそれぞれ、９９．５ｎｇ／ｍｌ（２５から７５パーセンタイルは９６．５〜１０２．５ｎｇ／ｍｌ）および９８．５ｎｇ／ｍｌ（２５から７５パーセンタイルは９０．５〜１０２．５ｎｇ／ｍｌ）であった。
【００５９】
これらのデータは、ＲＡ患者の滑液において高いレベルのＩＬ−２０が局所的に産生されていることを示唆している。
【００６０】
ＲＡの滑膜およびＲＡの滑膜線維芽細胞におけるＩＬ−２０およびその受容体の発現
免疫組織化学的染色を実施して、ＲＡの滑膜におけるＩＬ−２０およびその受容体の発現を試験した。簡潔に述べると、滑膜組織を上述したように調製した。キシレンを用いて滑膜上のパラフィンを除去し、エタノールを用いて膜を再水和した。スライドを、バックグラウンドの染色を低減させることができるブロッキング剤で処理し（ＤａｋｏＣｔｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）、次に、ブロッキング剤中で、ＩＬ−２０、ＩＬ−２０ＲＩ（共にＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮから入手）、およびＩＬ−２０ＲＩＩに特異的なモノクローナル抗体と共にインキュベートした。次に、スライドを、二次抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合型ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、およびジアミノベンジジン基質（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）で連続的に処理した。インキュベーションの後、スライドを洗浄し、Ｎａｙｅｒのヘマトキシリン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ、Ｐｉｔｔｂｕｒｇｈ、ＰＡ）で対比染色した。マウスＩｇＧ１アイソタイプ（クローン１１７１１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を陰性対照として用いた。
【００６１】
内側を覆う最初の層における滑膜細胞のほとんどは強い陽性の免疫反応性を示したが、内側を覆う下位の層における細胞は、中程度の陽性の免疫反応性を示した。マウスＩｇＧ１アイソタイプ抗体を用いた陰性対照は、検出可能な免疫反応性を示さなかった。これらの結果は、ＩＬ−２０ならびにその受容体であるＩＬ−２０ＲＩおよびＩＬ−２０ＲＩＩが全てＲＡの滑膜において発現していることを示す。
【００６２】
ＩＬ−２０およびその受容体の発現をまた、ＲＡの滑膜線維芽細胞（ＲＡＳＦ）において試験した。ＲＡの患者から得た、新鮮な単離した滑膜組織を、２〜３ｍｍの小片に細かく刻み、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＥＭＥ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）内において３７℃で１時間、ディスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）消化に供した。ＲＡＳＦを１０％ウシ胎児血清を含むＤＥＭＥ内で培養した。全てのインビトロでの実験は、５代継代から１２代継代のＲＡＳＦの初代培養を用いて行った。ＲＡＳＦを無菌のスライドグラス上で培養し、次に３．７％パラホルムアルデヒド内で固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳを用いて透過処理した。非特異的な結合部位を、０．１％ウシ血清アルブミン（重量／容積）を含むＰＢＳ内においてＲＡＳＦをインキュベートすることによってブロッキングした。ＩＬ−２０タンパク質、ＩＬ−２０ＲＩタンパク質、およびＩＬ−２０ＲＩＩタンパク質の存在を次に、上述したような免疫染色によって検出した。
【００６３】
ＲＡの滑膜から単離した細胞（ＲＡＳＦ）は、ＩＬ−２０およびその受容体を発現することが明らかにされた。それらの発現パターンは、ＲＡの滑膜の免疫染色において見られたものと類似している。また、ＩＬ−２０が時間に依存した形でリン酸化ＥＲＫ−１／２の発現を誘発することも明らかにされた。ＩＬ−２０で処理したＲＡＳＦにおいて、リン酸化されたｐ３８、ＭＡＰＫ、またはＪＮＫのレベルの顕著な変化は見られなかった。
【００６４】
ＩＬ−２０はインビトロで好中球の走化性およびＲＡＳＦの移動を誘発する
好中球の走化性を、８μＭの孔を有するポリカーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ、Ｃａｂｉｎ  Ｊｏｈｎ、ＭＤ）を有する４８ウェルの容器（改変されたＢｏｙｄｅｎ容器）を用いて分析した。上部のウェルには５×１０４個の好中球を入れた。下部の容器は、０．２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地における、ヒトＩＬ−２０（２００ｎｇ／ｍｌ）またはホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）（２０ｎｇ／ｍｌ）で満たした。０．２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０を陰性対照として用い、ＰＭＡを陽性対照として用いた。容器を３７℃で１時間インキュベートした。フィルターの下側に接着している細胞をメタノール内で固定し、細胞計数のためにギムザ溶液内で染色した。２００倍の倍率の顕微鏡によって、ランダムに選択した１２個の視野を計数することによりフィルターの下側表面上にある好中球の数を決定した。
【００６５】
細胞の移動を、５μＭの孔を有するポリカーボネートフィルターを用いたことを除いて、上述した方法に従って分析した。
【００６６】
ＲＡＳＦの移動を調べるために、上部のウェルに６５００個のＲＡＳＦを入れ、８ｍＭの孔を有するポリカーボネートフィルターを用いた。下部の容器は、０．２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにおける、ヒトＩＬ−２０（２００ｎｇ／ｍｌ）または陽性対照である形質転換成長因子β１（ＴＧＦβ１）（５０ｎｇ／ｍｌ）で満たした。容器を３７℃で４．５時間インキュベートした。ＲＡＳＦの数を、１００倍の倍率の顕微鏡によって決定した。
【００６７】
ＩＬ−２０は、陰性対照よりも顕著に大きな好中球の走化性およびＲＡＳＦの移動を誘発した（Ｐ＜０．０１）。しかし、ＩＬ−２０は、Ｔ細胞の移動は誘発しなかった。好中球の走化性およびＲＡＳＦの移動は、ＲＡの発症において重要であることが知られている。したがって、これらのデータは、ＩＬ−２０がＲＡの発症に関与していることを示唆している。
【００６８】
これらの移動データに関する、それぞれの処理群の、対照群との統計的比較は、多重比較のためのＤｕｎｎｅｔｔの手順を用いて、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で行った。
【００６９】
ＩＬ−２０受容体Ｉはコラーゲン誘発性の関節炎を予防する
８週齢のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、等量のフロイント完全アジュバント、４ｍｇ／ｍｌの熱殺菌したｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、および０．０５Ｍの酢酸内に２ｍｇ／ｍｌで可溶化したウシのＩＩ型コラーゲンを含む乳濁液で免疫化した。それぞれのラットの背部に２００μｌの乳濁液を皮内注射した。ラットにはまた、７日目に、尾部の付け根に１００ｍｌの同じ乳濁液を皮下的に追加免疫投与した。
【００７０】
それぞれの後肢における関節炎の重症度をモニターし、
０：発赤または腫れなし、
１：ラットの足首にわずかな腫れ、または足に発赤、
２：足首から中足部にかけて進行性の腫れ、炎症、および発赤、
３：つま先を除く足全体の腫れおよび炎症、
４：つま先を含む足全体の腫れおよび炎症、
５：動かすことが不可能な足全体の腫れおよび炎症
という０〜５のスケールでスコア付けした。
３以上のスコアは重症の腫れを示す。それぞれのラットにおける関節炎の重症度は、４人の個別の観察者が、個別にかつ盲検的に決定し、それらのスコアの平均を計算した。
【００７１】
ラットのＩＬ−２０受容体であるＩＬ−２０ＲＩおよびＩＬ−２０ＲＩＩの可溶性形態（細胞外ドメイン）（ｓＩＬ−２０ＲＩおよびｓＩＬ−２０ＲＩＩ）を３’末端でヒスチジンタグと融合し、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター内にクローニングした。プラスミドＤＮＡを以下のようにして試験ラット内に送達した。ｓＩＬ−２０ＲＩまたはｓＩＬ−２０ＲＩＩを有する２５０μｇのプラスミドＤＮＡを、ラットの両側の大腿四頭筋に注射し、経皮的電気パルスをその直後に上述したように加えた。２００ボルトの５回のパルスを、１回パルス／秒の速度で、それぞれのパルスにつき７５ｍ秒の間、それぞれの注射部位に加えた。皮膚の火傷を防ぐために電極ペーストを用いた。
【００７２】
ＣＩＩでの最初の免疫化の２日後に、ラットを分けた。ウシＣＩＩの最初の注射の５日後および１０日後に、試験ラットを５つの群に分け、それぞれを、５日目および１０日目に、ｓＩＬ−２０ＲＩ、ｓＩＬ−２０ＲＩＩ、ｐｃＤＮＡ３．１、ＰＢＳ、およびＣＩＩでのエレクトロポレーションに供した。ＣＬＬ誘発性の関節炎の重症度に対する可溶性ＩＬ−２０受容体のインビボでの筋肉内投与の効果を、１２日目から２０日目に評価した。それぞれの後肢における関節炎の重症度を視覚的に評価し、上述したようにスコア付けした。２０日目の関節炎の重症度のスコアは、プラスミド対照を注射したラットと比較して、ｓＩＬ−２０ＲＩを注射したラットにおいて有意に低かった（ｐ＜０．０１）。メジアン重症度スコアは、コラーゲン対照では４．３（２５から７５パーセンタイルは４〜４．４）、ＰＢＳ対照では４．１（２５から７５パーセンタイルは３．８〜４．３）、およびプラスミド対照では３．５（２５から７５パーセンタイルは３．３〜４．４）であった。可溶性ＩＬ−２０受容体で処理したラットのメジアンスコアは非常に低く、すなわち、ｓＩＬ−２０ＲＩで処理したラットでは０．６（２５から７５パーセンタイルは０〜２．１）、およびｓＩＬ−２０ＲＩＩで処理したラットでは３．４（２５から７５パーセンタイルは１．１〜４．３）であった。これらの結果は、ｓＩＬ−２０ＲＩがコラーゲン誘発性の関節炎の重症度を顕著に低減させることを示す。可溶性ＩＬ−２０受容体は、ＩＬ−２０／ＩＬ−２０受容体のシグナル伝達経路を遮断することが知られているため、これらのデータは、ＩＬ−２０のシグナル伝達がコラーゲン誘発性の関節炎において重要な役割を有することを示唆している。したがって、この経路を阻害することができる作用物質、例えば抗ＩＬ−２０抗体は、この疾患の治療において有効であり得る。
【００７３】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０ソフトウェアを用いた統計分析を、得られたデータの全てに対して実施した。Ｋｒｕｓｋａ−Ｗａｌｌｉｓ試験を用いて、異なる群の間で滑液のＩＬ−２０レベルおよび関節炎の重症度のスコアを比較した。Ｄｕｎｎの多重比較試験を用いてポストホック比較を実施した。これらの動物の後肢における重症な腫れ（３以上の重症度スコアとして規定される）に関する、処理群および対照群の間の差異は、統計上有意であった。
【００７４】
抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体７Ｅの生成
ＢＡＬＢ／ｃＪマウスを、１週間に１回、４週間にわたり、等容量のフロイント完全／不完全アジュバントで乳化した組換えｈＩＬ−２０タンパク質（１００μｇ／マウス）で皮下的に免疫化した。細胞融合の３日前に、３匹のマウスに、アジュバントを含まない抗原を用いて静脈内注射によって追加免疫した。免疫化したマウスから得た脾臓細胞（１．２×１０８個）を、ＰＥＧ４０００（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ）を用いて、Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３骨髄腫細胞（１．５×１０７個）と融合した。融合細胞を２４ウェルプレート内に分配し、ＨＡＴ培地において１４日間培養した。培養上清を、ＥＬＩＳＡによって、ｈＩＬ−２０と反応する抗体について試験した。ｈＩＬ−２０に対して反応する抗体を産生する融合細胞に、限界希釈を行った。ハイブリドーマ細胞を、１５％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２％Ｌ−グルタミン、および１％調節ＮａＨＣＯ３溶液を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＧＩＢＣＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において培養した。選択された抗体であるＩｇＧのアイソタイプを、アイソタイプ決定ＥＬＩＳＡを用いて決定した。プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、腹水から抗体を精製した。ハイブリドーマを産生する抗ｈＩＬ−２０モノクローナル抗体７Ｅ（ｍＡｂ  ７Ｅ）は米国培養細胞系統保存機関（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９、ＵＳＡ）に寄託されており、寄託番号ＰＴＡ−８６８７を割り当てられている。この抗体は、ウェスタンブロット分析によって、ヒトＩＬ−２０を特異的に認識することが明らかにされた。
【００７５】
ｍＡｂ  ７Ｅの重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を以下のようにクローニングした。全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞から単離し、次に、仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して５’リン酸を除去した。脱リン酸化したＲＮＡをタバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）で処理して、インタクトな全長ｍＲＮＡから５’キャップ構造を除去し、その後、そのｍＲＮＡの５’末端で、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いて、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）ＲＮＡオリゴ（５’−ＣＧＡＣＵＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＵＧＡＣＡＵＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＵＡＧＡＡＡ−３’）（配列番号９）（ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションした。ライゲーションしたｍＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ逆転写酵素およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）オリゴｄＴプライマー（５’−ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）（配列番号１０）を用いて逆転写し、５’末端および３’末端に既知のプライミング部位を有する、ＲＡＣＥ−ｒｅａｄｙ一本鎖ｃＤＮＡを生成した。
【００７６】
ｃＤＮＡの５’末端を得るために、遺伝子特異的なリバースプライマー（重鎖について：５’−ＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴ−３’（配列番号１１）、軽鎖について：５’−ＧＴＧＡＧＴＧＧＣＣＴＣＡＣＡＧＧＴＡＴＡＧＣＴ−３’）（配列番号１２）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）５’プライマー（５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’）（配列番号１３）として抗体の定常領域の配列を用いて、一本鎖ｃＤＮＡ鋳型にＰＣＲを実施した。５’末端にライゲーションしたＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）ＲＮＡオリゴを有するｍＲＮＡのみが、完全に逆転写され、ＰＣＲを用いて増幅された。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）５’入れる型プライマー（５’−ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧ  ＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ−３’）（配列番号１４）および遺伝子特異的な入れる型プライマー（重鎖について：５’−ＡＣＣＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号１５）、軽鎖について：５’−ＧＡＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＡＴＧＣＴＧＴＡＧＧＴ−３’）を用いてさらなるＰＣＲを行い、特異的なＰＣＲ産物を同定した。
【００７７】
３’末端を得るために、遺伝子特異的なフォワードプライマー（重鎖について：５’−ＣＡＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＴ−３’（配列番号１６）、軽鎖について：５’−ＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＣＡ−３’）（配列番号１７）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）３’プライマー（５’−ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧ−３’）（配列番号１８）を用いて、一本鎖ｃＤＮＡを増幅した。ポリＡ尾部を有するｍＲＮＡのみが逆転写され、ＰＣＲによって増幅された。全てのＰＣＲ産物をゲル精製し、配列決定のためにｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター内にサブクローニングした。５’および３’ＲＡＣＥから得られたヌクレオチド配列に従って、重鎖および軽鎖についての特異的なプライマーを設計し、ＲＡＣＥ−ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ鋳型から全長ｃＤＮＡを増幅して、哺乳動物細胞において抗体を発現させた。
【００７８】
モノクローナル抗体７Ｅは仔ウシ肺動脈内皮細胞（ＣＰＡＥ）およびヒトＨＵＶＥＣのＩＬ−２０誘発性の増殖を阻害する
ｍＡｂ  ７Ｅは、ＩＬ−２０により誘発されるＣＰＡＥ細胞およびＨＵＶＥＣ細胞の増殖を中和することが明らかにされた。
【００７９】
ＣＰＡＥを１ウェル当たり１×１０４個細胞の密度で２４ウェルプレート内に播種した。標準的な成長培地におけるインキュベーションの２４時間後に、細胞を様々な濃度のｈＩＬ−２０に７２時間さらした。次に、細胞を１ｍｇ／ｍｌの３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）溶液と共に４時間インキュベートした。２００ｐｌのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）（Ｓｉｇｍａ）を培養物に加えた。５５０ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーを用いて決定した。サイトカイン処理した細胞の吸光度を、未処理の対照細胞に対するパーセンテージとして表した。塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｓｉｇｍａ）を、細胞増殖アッセイにおいて陽性対照として用いた。
【００８０】
ヒトＩＬ−２０のスプライシング変異体であるヒトＩＬ−２０Ｗは、２５〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度でＣＰＡＥの増殖を誘発した。ヒトＩＬ−２０の別のスプライシング変異体であるヒトＩＬ−２０ＳもまたＣＰＡＥの増殖を誘発したが、それはさらに低い濃度、すなわち１２〜１００ｎｇ／ｍｌであった。興味深いことに、高濃度のＩＬ−２０（１０００ｎｇ／ｍｌ超のＩＬ−２０Ｗおよび２００ｎｇ／ｍｌ超のＩＬ−２０Ｓ）は、ＣＰＡＥの増殖を阻害した。
【００８１】
ＩＬ−２０誘発性の細胞増殖に対するモノクローナル抗体７Ｅの効果を以下のようにして試験した。ＣＰＡＥを、３７℃で２４時間、１ウェル当たり１×１０４個細胞の密度で２４ウェルプレート内に播種した。処理の前に、１０倍過剰な抗ｈＩＬ−２０モノクローナル抗体７ＥまたはｓＩＬ−２０Ｒ１タンパク質もしくはｓＩＬ−２０Ｒ２タンパク質を、最適な濃度のｈＩＬ−２０Ｓ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはｈＩＬ−２０Ｗ（２５０ｎｇ／ｍｌ）と共に、４℃で３０分間インキュベートした。ＩＬ−２０と７Ｅとの混合物、またはＩＬ−２０とｓＩＬ−２０Ｒ１との混合物、またはＩＬ−２０とｓＩＬ−２０Ｒ２との混合物をＣＰＡＥに加え、７２時間インキュベートした。次に、細胞を１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液と共に４時間インキュベートした。２００μｌのＤＭＳＯを培養物に加えた。５５０ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーを用いて決定した。
【００８２】
ＩＬ−２０の可溶性受容体と同様に、抗体７ＥはＩＬ−２０Ｗ誘発性のＣＰＡＥの増殖を顕著に遮断した。抗体７Ｅはまた、ＩＬ−２０Ｓ誘発性の細胞増殖も遮断したが、それはさほど顕著ではなかった。
【００８３】
ＩＬ−２０誘発性のＨＵＶＥＣの増殖に対する抗体７Ｅの効果をまた、上述した方法に従って調べ、同様の結果が明らかにされた。
【００８４】
これらの結果は、モノクローナル抗体７ＥがヒトＩＬ−２０の活性を阻害することを示す。
【００８５】
モノクローナル抗体７Ｅを用いたコラーゲン誘発性の関節炎の治療
コラーゲン誘発性の関節炎（ＣＩＡ）を有するラットは、ヒトのリウマチ性関節炎を研究するための、十分に開発された動物モデルである。したがって、このモデルは、ＲＡの治療についてのモノクローナル抗体７Ｅの有効性を試験するために用いられる。
【００８６】
オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、１：ラットをＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）およびＰＢＳで処理した媒質対照群、２：ラットをＣＩＩおよびエンブレル［３ｍｇ／ｋｇを皮下投与］で処理したエンブレル群、３：ラットをＣＩＩおよび７Ｅ［３ｍｇ／ｋｇを皮下投与］で処理した抗体７Ｅ群、４：健康な対照群の、４つの群（それぞれの群につき５匹のラット）に分けた。全てのラットを、ＩＩ型コラーゲンでまず免疫化して、ＣＩＡを誘発した。全てのラットの後肢の厚みは、免疫化の１１日後から顕著におよび一貫して増大した。次に、第１〜３群のラットに、エンブレル、７Ｅ、またはＰＢＳを、２日に１回、４回にわたり（１１日目、１３日目、１５日目、および１７日目）注射した。第４群のラットは健康な対照として用いた。
【００８７】
薬剤での治療後の関節炎の重症度を測定し、健康な対照と比較した。治療の過程において、治療の前と後とで体重における顕著な差は見られず（Ｐ＞０．０５）、このことは、７ＥがＣＩＡを有するラットの全身的な身体状態に対する顕著な影響を有していないことを示唆している。ＣＩＡのラットにおける７Ｅの効果を１１日目から２５日目まで評価した。それぞれの後肢の腫れを、ノギスによってミリメートル単位で測定した。後肢の腫れは、媒質対照と比較すると、７Ｅまたはエンブレルで処理した後に顕著に抑制された（Ｐ＜０．０５）。１８日目の後肢の厚みもまた、ＰＢＳ対照ラットよりも７Ｅで処理したラットにおいて顕著に低かった（Ｐ＜０．０５）。媒質対照および健康な対照の後肢の厚みのメジアン値は、それぞれ、１．０５（２５から７５パーセンタイルは１．０〜１．１１）および０．５２（２５から７５パーセンタイルは０．５２〜０．５３）であった。７Ｅおよびエンブレルで処理したラットの後肢の厚みのメジアン値は、それぞれ、０．８５（２５から７５パーセンタイルは０．７１〜０．９５）および０．８６（２５から７５パーセンタイルは０．７６〜０．９１）であった。これらの結果は、モノクローナル抗体７Ｅが、ＲＡおよび他の炎症性疾患を治療するための市販薬であるエンブレルと同程度に効率的にＣＩＡの重症度を低減させたことを明らかに示すものである。したがって、ＩＬ−２０モノクローナル抗体である７Ｅは、リウマチ性関節炎または他の炎症性疾患、例えば乾癬、乾癬性関節炎をエンブレルのように治療するための薬剤として用いることができる。
【００８８】
他の実施形態
本明細書において開示される特徴の全ては、あらゆる組み合わせで組み合わせることができる。本明細書において開示されるそれぞれの特徴は、同一の、同等の、または類似の目的にかなう別の特徴で置き換えることができる。したがって、明らかな別段の記載がない限り、開示されるそれぞれの特徴は、一般的な一連の同等なまたは類似の特徴の一例にすぎない。
【００８９】
上記の記載から、当業者は、本発明の必須の特徴を容易に理解することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく本発明の様々な変更および改変を施して、本発明を様々な利用および状況に適合させることができる。したがって、他の実施形態もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【配列表】
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【国際調査報告】
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