(57)【要約】 本発明は、インビボにおけるオリゴヌクレオチドの送達を目的とした、ヒンダードエステル系生体分解性リンカーを提供すると共に、それらの調製方法および使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式（Ｉ）： 
【化１】
2010503707.tif 000054
に従った構造を有してなる化合物であって、
ここで、
Ａは、キャッピング基または：
【化２】
2010503707.tif 000055
であり、
Ｒ1は、実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり；
Ｌ1およびＬ'1は、独立して、Ｃ（＝Ｙ1）またはＣ（＝Ｙ'1）から４〜１０原子に位置する自由電子対を有するスペーサーから選択され、；
Ｌ2およびＬ'2は、独立して、二官能性リンカーから選択され；
Ｙ1およびＹ'1は、独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲ5であり；
ＸおよびＸ'は、独立して、ＯまたはＳであり；
Ｒ2、Ｒ'2、Ｒ3、Ｒ'3およびＲ5は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、および置換アリールカルボニルオキシからなる群より選択されるか、あるいは、Ｒ2はＲ3と共同し、Ｒ'2はＲ'3と共同し、独立して、少なくとも３つの炭素原子を含む、置換もしくは非置換の非芳香族環状炭化水素を形成し；
Ｒ4およびＲ'4は、独立して、ポリヌクレオチドおよびそれらの誘導体から選択され；                  
（ｐ）および（ｐ'）は、独立して、０または正の整数であり； 
（ｑ）および（ｑ'）は、独立して、０または１であり；
Ｒ2がＨのとき、Ｒ3は、少なくとも３つの炭素原子を有する置換もしくは非置換の炭化水素であり、さらに、Ｌ1は、Ｃ（Ｒ2）（Ｒ3）と同一ではないことを条件とする、
化合物。  
【請求項２】
構造式（Ｉａ）：
【化３】
2010503707.tif 000056
を有する化合物であって、
ここで、（ｑ）は１であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項３】
構造式（Ｉｂ）：
【化４】
2010503707.tif 000057
の化合物をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｌ1およびＬ'1が、独立して、
【化５】
2010503707.tif 000058
からなる群より選択され、
ここで、
Ｒ11〜Ｒ16は、独立して、水素、アミノ、置換アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、シリルエーテル、スルホニル、メルカプト、Ｃ1-6アルキルメルカプト、アリールメルカプト、置換アリールメルカプト、置換Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、および置換アリールカルボニルオキシから選択され；
（ｓ）および（ｓ'）は、独立して、０または正の整数であり； 
（ｒ）は、０または１である
ことを特徴とする請求項１記載の化合物。              
【請求項５】
Ｌ2およびＬ'2が、独立して、
【化６−１】
2010503707.tif 000059
【化６−２】
2010503707.tif 000060
からなる群より選択され、
ここで、（ｒ）および（ｒ'）は、独立して、０または１である
ことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項６】
Ｌ2およびＬ'2が、独立して、
【化７−１】
2010503707.tif 000061
【化７−２】
2010503707.tif 000062
からなる群より選択され、
ここで、
Ｙ11-19は、独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲ48であり；
Ｒ31-48、Ｒ50-51およびＡ51は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-12分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、フェノキシおよびＣ1-6ヘテロアルコキシからなる群より選択され；
Ａｒは、アリールまたはヘテロアリール部分であり；
Ｌ11-15は、独立して、二官能性スペーサーから選択され；
Ｊ3およびＪ'3は、独立して、標的細胞内に能動的に輸送される部分、疎水性部分、二官能性連結部分およびそれらの組合せから選択され；
（ｃ１１）、（ｈ１１）、（ｋ１１）、（ｌ１１）、（ｍ１１）および（ｎ１１）は、独立して、正の整数から選択され；
（ａ１１）、（ｅ１１）、（ｇ１１）、（ｊ１１）、（ｏ１１）および（ｑ１１）は、独立して、０または正の整数であり；さらに、
（ｂ１１）、（ｘ１１）、（ｘ'１１）、（ｆ１１）、（ｉ１１）および（ｐ１１）は、独立して、０または１である
ことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項７】
Ｌ2およびＬ'2が、独立して、アミノ酸、アミノ酸誘導体およびペプチドからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の化合物。  
【請求項８】
−Ｌ1−Ｃ（Ｒ2）（Ｒ3）−Ｃ（＝Ｙ1）−および−Ｌ'1−Ｃ（Ｒ'2）（Ｒ'3）−Ｃ（＝Ｙ'1）−が、独立して、
【化８】
2010503707.tif 000063
からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項９】
Ｌ1およびＬ'1が、独立して、−（ＣＨ2）x21−または−（ＣＨ2）x21−Ｗ−（ＣＨ2）x22−であり、
ここで、
（ｘ２１）および（ｘ２２）は、独立して、１〜７までの整数から選択され、
Ｗは、ＯまたはＮＨＣ（Ｏ）である
ことを特徴とする請求項１記載の化合物。  
【請求項１０】
構造式（ＩＩ）：
【化９】
2010503707.tif 000064
を有することを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
Ａは、Ｈ、ＮＨ2、ＯＨ、ＣＯ2Ｈ、Ｃ1-6アルコキシおよびＣ1-6アルキルからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ4およびＲ'4が、独立して、オリゴヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ4およびＲ'4が、独立して、センスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）、トリシクロ(tricyclo)−ＤＮＡ、二本鎖オリゴヌクレオチド（デコイＯＤＮ）、触媒ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、スピーゲルマー、ＣｐＧオリゴマーおよびそれらの組合せからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ4およびＲ'4が、独立して、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはそれらの組合せを含むことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ4およびＲ'4が、独立して、一本鎖オリゴヌクレオチドまたは二本鎖ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ4およびＲ'4が、独立して、ホスホロジエステル骨格またはホスホロチオエート骨格を有することを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ1が、直鎖型、末端分岐鎖型またはマルチアーム型のポリアルキレンオキシドを含むことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項１８】
前記ポリアルキレンオキシドが、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールからなる群より選択されることを特徴とする請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
前記ポリアルキレンオキシドが、
【化１０】
2010503707.tif 000065
からなる群より選択され、
ここで、
Ｙ71およびＹ73は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＲ73または結合であり；
Ｙ72は、Ｏ、ＳまたはＮＲ74であり；
Ｒ71-74は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニルおよび置換アリールカルボニルオキシから選択され；
（ａ２）および（ｂ２）は、独立して、０または正の整数であり；
（ｎ）は、約１０〜約２３００の整数である
ことを特徴とする請求項１７記載の化合物。
【請求項２０】
前記ポリアルキレンオキシドが、構造式−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−を有するポリエチレングリコールであり；
ここで、（ｎ）は、約１０〜約２３００までの整数である
ことを特徴とする請求項１７記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ1の平均分子量が、約２，０００〜約１００，０００であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ1の平均分子量が、約５，０００〜約６０，０００であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ1の平均分子量が、約５，０００〜約２５，０００、あるいは、約２０，０００〜約４５，０００であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ2、Ｒ'2、Ｒ3およびＲ'3が、独立して、メチル、エチルおよびイソプロピルからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項２５】
次の構造式：
【化１１−１】
2010503707.tif 000066
【化１１−２】
2010503707.tif 000067
【化１１−３】
2010503707.tif 000068
【化１１−４】
2010503707.tif 000069
【化１１−５】
2010503707.tif 000070
からなる群より選択され、
ここで、
Ｒ4は、ＯＨ、脱離基、標的基、診断薬および生物活性部分からなる群より選択され；
（ｚ）は、約１〜約１０の正の整数であり；
（ｚ'）は、０または約１〜約４の正の整数であり；
ｍＰＥＧは、構造式：ＣＨ3−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−を有し；
ＰＥＧは、構造式−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−を有し； 
（ｎ）は、約１０〜約２３００の正の整数である
ことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ4およびＲ'4が、独立して、配列番号１、配列番号２および３，配列番号４ならびに配列番号５からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項２７】
構造式：
【化１２】
2010503707.tif 000071
を有し、
ここで、Ｒ4は、配列番号１、配列番号２および３，配列番号４ならびに配列番号５からなる群より選択される
ことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項２８】
ヒンダード・アシルまたはエステル部分含有ポリマー複合体を調製する方法であって、  
十分な条件下、構造式（ＶＩ）で表される化合物：
【化１３】
2010503707.tif 000072
を、構造式（ＶＩＩ）で表される化合物：
【化１４】
2010503707.tif 000073
と反応させて、構造式（ＶＩＩＩ）で表される化合物：
【化１５】
2010503707.tif 000074
を形成する工程を有してなり、
ここで、 
Ａ4は、キャッピング基またはＭ4であり；
Ａ5は、キャッピング基または：
【化１６】
2010503707.tif 000075
であり、
Ｍ3は、−ＯＨ、ＳＨまたは−ＮＨＲ105であり；
Ｍ4は、ハロゲン、活性化カルボナート類、イソシアナート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、トシラート、メシラート、トレシラート、ノシラート、オルト−ニトロフェノキシ、イミダゾール、および、当業者に既知のその他の脱離基などの脱離基であり；
Ｒ104は、生物活性部分、標的基および診断薬から選択され；
Ｒ105は、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、および置換アリールカルボニルオキシから選択され； 
その他全ての変数は、従前に定義した通りである
ことを特徴とする方法。
【請求項２９】
構造式（Ｉａ）で表される化合物を有効量で、それらを必要とする患者に投与する工程を有してなる、ほ乳類の治療方法。
【請求項３０】
構造式（Ｉａ）で表される化合物が有効量で、それらの治療を必要とする細胞に送達されることを含む、ポリヌクレオチドをほ乳類の細胞に投与する方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、２００６年９月１５日に出願した米国仮特許出願第６０／８４５，０２８号の優先権の利益を主張し、その内容を参照として本明細書に援用する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、インビボにおいてオリゴヌクレオチドを送達するためのエステル系の生体分解性リンカーを提供する。
【背景技術】
【０００３】
医学における古典的な治療的介入は、一般的に、身体タンパク質、例えば、レセプター、酵素、ホルモンなどとの相互作用に重点が置かれ、それらの疾病発症または疾病の可能化因子を緩和することに努力を払ってきた。新規な治療法においては、これらのタンパク質の実際の産生を調節することが望ましい。タンパク質産生を干渉することにより、副作用を最小限に抑えながら最大の治療効果が得られると考えられる。故に、そのような治療法の一般的な目的は、所望しないタンパク質の生成につながる遺伝子の発現を干渉する、あるいは調節することである。
【０００４】
特定の遺伝子の発現を阻害するひとつの方法は、オリゴヌクレオチド、特に、特定の標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列に相補的なオリゴヌクレオチドを使用することである。一般的に、遺伝子転写産物（例えば、ｍＲＮＡなど）に対して相補的な核酸配列は、「アンチセンス」と称され、また、転写産物もしくは転写産物として産生されたものと同一の配列を有する核酸配列は「センス」と称される。例えば、非特許文献１などを参照。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子の発現を調節するような様式で、該遺伝子全体または一部とハイブリダイゼーションするように選択できる。転写因子は、転写制御中に二本鎖ＤＮＡと相互作用する。オリゴヌクレオチドは、転写因子に対する競合阻害因子として作用し、転写因子の作用を調節する。そのような相互作用については、最近いくつかの報告がなされている（非特許文献２；非特許文献３を参照）。
【０００５】
分子レベルでの戦略は、不要な遺伝子発現を抑制制御する方向で開発が進められている。近年では、修飾オリゴヌクレオチド化合物の使用は、ウイルス感染症、炎症性および遺伝子の疾患、特に癌などの疾病に対する有望な治療法として開発されている。アンチセンスＤＮＡｓは、最初は、天然に存在する核酸に対する、アルキル化された相補的オリゴデオキシヌクレオチドだと考えられていた（非特許文献４）。合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを治療目的で使用することを最初に提案したのはZamecnikおよびStephensonであった（非特許文献５；非特許文献６）。彼らは、ルイス肉腫ウイルスのＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド１３−ｍｅｒを使用することにより、細胞培養中のウイルスの増殖が阻害されたと報告した。それ以来、ウイルス増殖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害についてのインビトロでの効果を明らかにした論文が多数発表されており、そのようなウイルスとしては、例えば、水疱性口内炎ウイルス（非特許文献７）、単純ヘルペスウイルス（非特許文献８）およびインフルエンザウイルス（非特許文献９）などが挙げられる。  
オリゴヌクレオチドは、診断試験、研究試薬（例えば、ＰＣＲ技術およびその他の実験室手段などにおけるプライマー）などにおいても用途が見出されている。オリゴヌクレオチドは、注文に応じて合成し、所望する用途に適合するようにつくられた特性を含むようにできる。故に、オリゴマー化合物に多数の化学的修飾を導入し、診断において、研究試薬および治療剤としての有用性を高めてきた。
【０００６】
オリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドは、治療剤としての可能性があるが、ヌクレアーゼに対して非常に感受性が高く、また、標的細胞に侵入する前後に急速に分解されることから、非修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドはインビボ系での使用には不適である。大部分の組織においては、分解を司る酵素が見出されていることから、オリゴヌクレオチドに対する修飾は、化合物を安定化させ、この問題を軽減するために行われている。最も広範に試みられている修飾は、オリゴヌクレオチド化合物の骨格部分に対するものである。一般的には、非特許文献１０およびその中に引用されている参考文献を参照。調製された多数の別異の骨格の中で顕著なアンチセンス活性を示したのは、ホスホロチオエートのみであった。例えば、非特許文献１１などを参照。骨格に硫黄原子を導入することにより、酵素分解速度が減速されたが、同時に、毒性も上昇した。骨格に硫黄原子を付加することによるもうひとつの欠点は、骨格がアキラルからキラルに変化し、その結果、２ｎ個のジアステレオ異性体が生じたことである。このことにより、さらに副作用が引き起こされる可能性がある。このアンチセンスオリゴヌクレオチドの更なる欠点は、リン酸基上に負の電荷を有することであり、これにより、大部分が親油性である細胞膜を透過する能力が妨げられる。化合物が長ければ長いほど細胞の外側に留まり、さらに分解され、標的に到達した時点では活性の弱い化合物になると考えられる。このアンチセンス化合物の更なる欠点は、オリゴヌクレオチドが二次およびさらに高次の溶液構造をとる傾向を有することである。一度これらの構造が形成されると、多様な酵素、タンパク質、ＲＮＡおよびＤＮＡの結合標的になる。その結果、非特異的副作用が起こり、ｍＲＮＡに結合する活性化合物の量が減少する。オリゴヌクレオチド療法を向上させるためのその他の試みとしては、連結部分およびポリエチレングリコールの付加が挙げられる。例えば、非特許文献１２および特許文献１などを参照。これらの例においては、天然の状態で不変であるような連結部分を使用することにより、オリゴヌクレオチドを分解に対して安定化させ、かつ、細胞透過性を高める努力をしている。しかしながら、これらの試みでは全く効果が上がっていない。
【０００７】
より最近では、共同所有されている特許文献２（全体を参照として本明細書中に援用する）では、アミノ放出性ポリマーを連結したオリゴヌクレオチドが提供されている。しかしながら、アミノ末端リンカーを使用せずに血漿中にオリゴヌクレオチドを制御放出することがより望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４，９０４，５８２号明細書
【特許文献２】米国特許出願第１０／８２２，２０５号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Crooke,1992,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,32:329-376
【非特許文献２】Bielinska,A.ら、1990,Science,250:997-1000
【非特許文献３】Wu,H.ら、1990,Gene,89:203-209
【非特許文献４】Belikovaら、Tetrahedron Lett.,37:3557-3562,1967
【非特許文献５】Zamecnik & Stephenson, 1978, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 75: 285-289
【非特許文献６】Zamecnik & Stephenson, 1978, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 75: 280-284
【非特許文献７】Leonettiら、1988,Gene,72:323
【非特許文献８】Smithら、1987,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,83:2787
【非特許文献９】Seroaら、1987,Nucleic Acids Res.,15:9909
【非特許文献１０】UhlmannおよびPeymann,1990,Chemical Reviews,90:545-561
【非特許文献１１】PadmapriyaおよびAgrawal, 1993, Bioorg. & Med. Chem. Lett., 3: 761
【非特許文献１２】Kawaguchiら、「５'−末端をポリ（エチレングリコール）で修飾したオリゴデオキシヌクレオチドのマウスにおける安定性、特異的結合活性、および血漿濃度（Stability,Specific Binding Activity,and Plasma Concentration in Mice of an Oligondeoxynucleotide Modified at 5'-Terminal with Poly(ethylene glycol)）」，Biol.Pharm.Bull., 18(3): 474-476(1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これらの方法が不適切であることから、安定性およびヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を改善すること、ならびに、オリゴヌクレオチド化合物の毒性を低減し、ｍＲＮＡへの結合性を高める必要性がある。現在行われているオリゴヌクレオチド治療は高価である。これは主に分解という問題があるからである。従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドを分解に対して保護し、高次構造の形成を阻止し、同時に、標的に対して十分量の活性アンチセンスオリゴヌクレオチドを送達することが、真に必要とされている。本発明はそのような改善策を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の１つの態様では、本発明は、次の構造式（Ｉ）： 
【化１】
2010503707.tif 000002
【００１２】
に従った構造を含む、オリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチドをインビボ送達するための化合物を提供し、
ここで、
Ａは、キャッピング基または：
【化２】
2010503707.tif 000003
【００１３】
であり、
Ｒ1は、実質的に非抗原性水溶性ポリマーであり；
Ｌ1およびＬ'1は、独立して、Ｃ（＝Ｙ1）またはＣ（＝Ｙ'1）から４〜１０原子に位置する、自由電子対を有するスペーサーから選択され、Ｃ（＝Ｙ1）またはＣ（＝Ｙ'1）からの原子数は、好ましくは、約４〜約８、最も好ましくは、約４〜約５であり；
Ｌ2およびＬ'2は、独立して、二官能性リンカーから選択され；
Ｙ1およびＹ'1は、独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲ5であり；
ＸおよびＸ'は、独立して、ＯまたはＳであり；
Ｒ2、Ｒ'2、Ｒ3、Ｒ'3およびＲ5は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニルおよび置換アリールカルボニルオキシからなる群より選択されるか、あるいは、Ｒ2はＲ3と共同し、Ｒ'2はＲ'3と共同し、独立して、少なくとも３つの炭素原子からなる置換もしくは非置換の非芳香族環状炭化水素を形成し；
Ｒ4およびＲ'4は、独立して、ポリヌクレオチドおよびそれらの誘導体から選択され；                  
（ｐ）および（ｐ'）は、独立して、０または正の整数であり、好ましくは、０または約１〜約３の整数であり、より好ましくは、０または１であり；さらに、
（ｑ）および（ｑ'）は、独立して、０または１であり；
Ｒ2がＨのとき、Ｒ3は、少なくとも３つの炭素原子を有する置換もしくは非置換の炭化水素であり、さらに、Ｌ1は、Ｃ（Ｒ2）（Ｒ3）と同一ではないことを条件とする。
【００１４】
本発明のこの態様に従う好ましい実施の形態では、実質的に非抗原性のポリマーはポリアルキレンオキシドであり、より好ましくは、ポリエチレングリコール（以後、ＰＥＧと記す）である。別の態様では、該ＰＥＧは、ひとつの末端をＣＨ3基でキャップされている（すなわち、ｍＰＥＧ）か、また別の実施の形態では、ビス活性化ＰＥＧは、上記の構造式に対応するようなものとして提供される。
【００１５】
本発明のさらなる態様には、ヒンダードエステルを含む複合体の調製法、ならびに生物活性部分を含む複合体を有効量で、それらを必要とする患者（ほ乳類）に投与することに基づいた治療法が含まれる。そのような治療を必要とする細胞に該複合体を送達する方法も含まれる。
【００１６】
本明細書に記載するポリマー送達システムは新規なリンカーを含み、それらは、ポリマーと生物活性部分（例えば、オリゴヌクレオチドなど）との間に、エステル結合などの放出可能な結合を形成できる。オリゴヌクレオチドのヒンダードエステルは、貯蔵中は安定であるが、ホスホジエステル結合またはホスホチオエステル結合が加水分解されることにより、末端のない天然型のオリゴヌクレオチドを放出可能である。さらに、本発明に従うポリマー化合物は、リンカーからの隣接基関与により、安定なヒンダードエステル結合の加水分解が起こりやすい。
【００１７】
本明細書に記載するヒンダードエステル系のポリマー輸送システムのひとつの長所は、ポリマー送達システムの安定性が高められていることである。理論的な裏付けがあるわけではないが、ポリマーとオリゴヌクレオチドなどの部分との間において立体的に束縛された環境下にあるエステル結合は、塩基性水性媒体または酵素への暴露に起因するエステル連結を阻害でき、従って、共有結合を安定化する。ポリマー系が安定することにより、ポリマー複合体の貯蔵期間が長くなる。安定性の向上は、対費用効果を向上に繋がる。
【００１８】
本明細書に記載するポリマー送達システムは、特に、オリゴヌクレオチドおよび関連するアンチセンス、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはロックされた核酸（locked nucleic acid:LNA）化合物を利用した使用に適している。オリゴヌクレオチドが結合している近隣にヒンダードエステル基が存在することにより、安定性が高められ、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性が増す。また、オリゴヌクレオチド化合物の毒性の低下およびｍＲＮＡへの結合親和性の上昇に役立っている。本発明に従って調製された複合体により、分解に対し、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を保護するため、高次構造の形成を阻止するための手段が提供される。さらに、該ポリマー複合体を利用することにより、標的に十分量の活性アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を送達できる。
【００１９】
本発明に従うリンカーは、動物またはヒトへの液状の形態での静脈内投与に適した全ての緩衝液条件下において安定である。本発明に従うリンカーは、血漿酵素存在下において加水分解され、血漿中に原形の形態のオリゴヌクレオチドを放出する。リンカーにおける立体障害の変化により、特定の送達系に対する要求に応じて加水分解速度が加減される。
【００２０】
ヒンダードエステルを有する活性化ポリマーの別の長所は、選択したオリゴヌクレオチドに対してより容易に連結できることである。ＰＥＧ化の際に、オリゴヌクレオチドまたは標的部分をヒンダードエステルで修飾する必要がない。オリゴヌクレオチドはそのまま用いられ、所望のヒンダードエステル保護基を有する活性化ＰＥＧリンカーを用いてＰＥＧ化を行う。
【００２１】
本発明に従うリンカーのさらなる長所は、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）と連結でき、その後、ホスホアミデートなどに転換できることである。次に、該ホスホアミデートを通常の固相オリゴヌクレオチド合成条件下で使用し、オリゴヌクレオチド分子を合成できる。リンカーとオリゴヌクレオチドとの間の結合は、合成および生成に必要な条件下では安定である。
【００２２】
その他および更なる長所については、以下の記述から明らかである。
【００２３】
本発明の目的では、「残基」という用語は、例えば、利用可能な水酸基またはアミノ基を修飾して、それぞれエステルまたはアミドを生成させることによるプロドラッグの担体部分を付加する反応が進行した後も残っている、オリゴヌクレオチドなどの生物学的に活性な化合物の部分を意味すると解されるべきである。同様に、実質的に非抗原性のポリマー（例えば、ポリアルキレンオキシドポリマーなど）の残基は、リンカー、スペーサーおよび／または、生物活性化合物もしくはそれらの残基に該ポリマーが結合する反応が進行した後も残っているような部分である。
【００２４】
本発明の目的では、単独の、または複数の、という語の使用は、言及する材料または目的物の数値を限定することを意味しているわけではない。故に、細胞、ポリマーまたは薬物に対して、単独の、と使用する場合には、単に１つの細胞を処理する、単に１つの分子を調製するもしくは使用する、ならびに／または、単に１つの薬物を使用することを指しているわけではなく、また、複数の、と使用する場合に、特に明記していない限り、単独の言及した材料の使用を排除するものではない。
【００２５】
特に定義されていない限りは、本発明の目的では：
「アルキル」という用語は、直鎖、分岐鎖、置換されたアルキル、例えば、ハロ−、アルコキシ−、およびニトロ−Ｃ1-12アルキル類、Ｃ3-8シクロアルキル類、または置換シクロアルキル類などを含むと理解すべきであり；  
「置換された」という用語は、ある官能基もしくは化合物内のひとつ以上の原子をひとつ以上の別異の原子に付加する、または置き換えることを含むと理解すべきであり；
「置換アルキル」という用語は、カルボキシアルキル類、アミノアルキル類、ジアルキルアミノ類、ヒドロキシアルキル類およびメルカプトアルキル類を含み；
「置換シクロアルキル」という用語は、４−クロロシクロヘキシルなどの部分を含み；アリールは、ナフチルなどの部分を含み；置換アリールは、３−ブロモフェニルなどの部分を含み；アラルキルは、トルイルなどの部分を含み；ヘテロアルキル類は、エチルチオフェンなどの部分を含み；
「置換ヘテロアルキル」という用語は、３−メトキシチオフェンなどの部分を含み；アルコキシは、メトキシなどの部分を含み；さらに、フェノキシは、３−ニトロフェノキシなどの部分を含む。
【００２６】
「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ヨードおよびブロモを含むと理解すべきであり；さらに、
「十分量」および「有効量」という用語は、本発明の目的では、通常の技量を有する当業者が有効であると理解している程度の治療効果に達する量を意味する。  
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１〜９に記載される合成法を示す流れ図。
【図２】実施例１０に記載される合成法を示す流れ図。
【図３】実施例１１〜１３に記載される合成法を示す流れ図。
【図４】実施例１４に記載される合成法を示す流れ図。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
Ａ．概要
本発明は、インビボにおけるオリゴヌクレオチド送達のためのヒンダードエステル系生体分解性リンカーを提供する。従って、本発明は、診断および分析試薬、インビトロおよびインビボでの研究開発の道具、ならびに治療剤としての用途を含む、多くの実用的用途を有する有用なポリマー連結オリゴヌクレオチドプロドラッグを提供する。上記に従い、構造式（Ｉ）：
【化３】
2010503707.tif 000004
【００２９】
で表される化合物を提供し、
ここで、
Ａは、キャッピング基または：
【化４】
2010503707.tif 000005
【００３０】
であり、
Ｒ1は、実質的に非抗原性水溶性ポリマーであり；
Ｌ1およびＬ'1は、独立して、Ｃ（＝Ｙ1）またはＣ（＝Ｙ'1）から４〜１０原子の位置にに存在する、自由電子対を有するスペーサーから選択され、Ｃ（＝Ｙ1）またはＣ（＝Ｙ'1）からの原子数は、好ましくは、約４〜約８、最も好ましくは、約４〜約５であり；
Ｌ2およびＬ'2は、独立して、二官能性リンカーから選択され；
Ｙ1およびＹ'1は、独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲ5であり；
ＸおよびＸ'は、独立して、ＯまたはＳであり；
Ｒ2、Ｒ'2、Ｒ3、Ｒ'3およびＲ5は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニルおよび置換アリールカルボニルオキシからなる群より選択されるか、あるいは、Ｒ2はＲ3と共同し、Ｒ'2はＲ'3と共同し、独立して、少なくとも３つの炭素原子からなる置換もしくは非置換の非芳香族環状炭化水素を形成し；
Ｒ4およびＲ'4は、独立して、ポリヌクレオシドおよびそれらの誘導体から選択され；                  
（ｐ）および（ｐ'）は、独立して、０または正の整数であり、好ましくは、０または約１〜約３の整数であり、より好ましくは、０または１であり；さらに、
（ｑ）および（ｑ'）は、独立して、０または１であり；
Ｒ2がＨのとき、Ｒ3は、少なくとも３つの炭素原子を有する置換もしくは非置換の炭化水素であり、さらに、Ｌ1は、Ｃ（Ｒ2）（Ｒ3）と同一ではないことを条件とする。
【００３１】
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載する化合物は、次の構造式（Ｉａ）で表されるポリマーを含み：
【化５】
2010503707.tif 000006
【００３２】
ここで、（ｑ）は１である。
【００３３】
本発明のこの態様のある好ましい実施の形態では、実質的に非抗原性のポリマーは、ポリアルキレンオキシドであり、より好ましくはポリエチレングリコール（以後、ＰＥＧと記す）である。別の態様では、ＰＥＧは、ひとつの末端がＣＨ3でキャップされている、すなわち、ｍＰＥＧである。
【００３４】
別の実施の形態では、ビス活性化ＰＥＧｓは、次の構造式（ＩＩ）に対応するものが提供される：
【化６】
2010503707.tif 000007
【００３５】
本発明のこれらの態様では、置換を行うための置換基、すなわち、Ｒ2、Ｒ'2、Ｒ3、Ｒ'3およびＲ5で表される部分は、置換の可能性のある基を示しており、例えば、アシル、アミノ、アミド、アミジン、アラ−アルキル、アリール、アジド、アルキルメルカプト、アリールメルカプト、カルボニル、カルボキシレート、シアノ、エステル、エーテル、ホルミル、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシ、イミノ、ニトロ、チオカルボニル、チオエステル、チオアセテート、チオホルメート、アルコキシ、ホスホリル、ホスホナート、ホスフィナート、シリル、スルフヒドリル、スルフェート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミドおよびスルホニルなどが挙げられる。
【００３６】
好ましくは、Ｌ1およびＬ'1は、独立して、Ｃ（＝Ｙ1）またはＣ（＝Ｙ'1）から４〜１０原子に位置する、自由電子対を有するスペーサーから選択され；より好ましくは、原子数は４〜６であり；さらに、Ｙ1およびＹ'1はＯである。
【００３７】
本発明の別の態様では、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドを含み、オリゴマー数は、好ましくは、約２〜約１００であり、より好ましくは、約３〜約５０であり、最も好ましくは、約５〜約３０である。
【００３８】
また別の態様では、Ａは、Ｈ、ＮＨ2、ＯＨ、ＣＯ2Ｈ、Ｃ1-6アルコキシおよびＣ1-6アルキルから選択できる。いくつかの好ましい実施の形態では、Ａは、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ、ＨおよびＯＨである。より好ましくは、Ａは、メチルまたはメトキシである。
【００３９】
さらなる態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを伸長するための中間体を提供する。この態様に従って、構造式（Ｉ）の化合物は、Ｎ，Ｎ−テトライソプロピル−シアノエチルホスホルアミディートをさらに含み、構造式（Ｉｂ）：
【化７】
2010503707.tif 000008
【００４０】
で表される化合物を形成する。
【００４１】
この態様では、好ましくは、（ｑ）は０である。
【００４２】
Ｂ．実質的に非抗原性の水溶性ポリマー
本明細書に記載されるポリマー送達システムに使用するポリマーは、好ましくは、水溶性ポリマーであり、実質的に非抗原性であるポリアルキレンオキシド類（ＰＡＯ'ｓ）などである。
【００４３】
本発明の１つの態様では、本明細書に記載する化合物は、直鎖型、末端分岐型、またはマルチアーム型のポリアルキレンオキシドを含む。いくつかの好ましい実施の形態では、ポリアルキレンオキシドは、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを含む。
【００４４】
ポリアルキレンオキシドの平均分子量は、約２，０００〜約１００，０００であり、好ましくは、約５，０００〜約６０，０００である。いくつかの態様では、ポリアルキレンオキシドの分子量は、タンパク質またはオリゴヌクレオチドが結合している場合には、約５，０００〜約２５，０００、好ましくは、約１２，０００〜約２０，０００であり、あるいは、本明細書に記載する化合物中に薬剤として活性な化合物（低分子化合物）を用いる場合には、約２０，０００〜約４５，０００、好ましくは、約３０，０００〜約４０，０００である。
【００４５】
ポリアルキレンオキシドとしては、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールが挙げられる。より好ましくは、ポリアルキレンオキシドはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。一般的に、ＰＥＧは、次のような構造式で表され：
−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−
ここで、（ｎ）は、約１０〜約２，３００までの整数であり、マルチアーム型ポリマーを用いる場合には、ポリマーアームの数によって決まる。あるいは、本発明に従うポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基部分は次のものから選択でき：
【化８】
2010503707.tif 000009
【００４６】
ここで、
Ｙ71およびＹ72は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＲ73または結合であり；
Ｙ72は、Ｏ、ＳまたはＮＲ74であり；
Ｒ71-74は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニルおよび置換アリールカルボニルオキシから選択され；
（ａ２）および（ｂ２）は、独立して、０または正の整数であり、好ましくは、０または約１〜約６までの整数であり、より好ましくは１であり；さらに、
（ｎ）は、約１０〜約２３００までの整数である。
【００４７】
分岐鎖またはＵ−ＰＥＧ誘導体については、米国特許第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号、同第６，１１３，９０６号および同第６，５６６，５０６号の各明細書に記載されており、各特許の開示を参照として本明細書に援用する。これらのポリマーの例として、限定はしないが、以下の構造を有するポリマー系（ｉ）〜（ｖｉｉ）が挙げられる：
【化９−１】
2010503707.tif 000010
【化９−２】
2010503707.tif 000011
【００４８】
ここで、
Ｙ61-62は、独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲ61であり；
Ｙ63は、Ｏ、ＮＲ62、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ2であり；
（ｗ６２）、（ｗ６３）および（ｗ６４）は、独立して、０または正の整数であり、好ましくは、０または約１〜約３までの整数であり；
（ｗ６１）は、０または１であり；
ｍＰＥＧはメトキシＰＥＧであり、
ここで、ＰＥＧは、既に定義したとおりであり、ポリマー部分の総分子量は、約２，０００〜約１００，０００であり；さらに、
Ｒ61およびＲ62は、独立して、Ｒ73として使用できる同一の部分である。
【００４９】
さらに別の態様では、ポリマーは、マルチアーム型ＰＥＧ−ＯＨ、または、日油株式会社（NOF Corp.）の薬物送達システムカタログ（Drug Delivery System catalog）第８版（２００６年４月）（内容を参照として援用する）に記載される「スター型ＰＥＧ」生成物などが挙げられる。マルチアーム型ポリマー複合体は、４またはそれ以上のポリマーアームを有し、好ましくは、４本または８本のポリマーアームを有する。
【００５０】
例示の目的であって、限定するわけではないが、マルチアーム型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基は：
【化１０】
2010503707.tif 000012
【００５１】
であって差し支えなく、
ここで、
Ｘは、０および正の整数、すなわち、約０〜約２８であり；さらに、
ｎは、重合度である。
【００５２】
本発明のひとつの特定の実施の形態では、マルチアーム型ＰＥＧは次のような構造を有し；
【化１１】
2010503707.tif 000013
【００５３】
ここで、ｎは正の整数である。本発明のひとつの好ましい実施の形態では、ポリマーの総分子量は約５，０００〜約６０，０００であり、好ましくは、約１２，０００〜４０，０００である。
【００５４】
さらに別の特定の実施の形態では、マルチアーム型ＰＥＧは次のような構造を有し：
【化１２】
2010503707.tif 000014
【００５５】
ここで、ｎは正の整数である。本発明に従った、ひとつの好ましい実施の形態では、マルチアーム型ポリマーの重合度（ｎ）は、約２８〜約３５０であって、ポリマーの総分子量は約５，０００〜約６０，０００であり、好ましくは、重合度は約６５〜２７０であって、ポリマーの総分子量は約１２，０００〜約４５，０００である。これは、ポリマー鎖内の反復ユニット数を表しており、ポリマーの分子量によって決まる。  ポリマーは、米国特許第５，１２２，６１４号または同第５，８０８，０９６号の各明細書に記載されている活性化技術を用いることにより、適切な活性化ポリマーに転換できる。特に、そのようなＰＥＧは次のような構造を有し：
【化１３】
2010503707.tif 000015
【００５６】
ここで、
（ｕ'）は、約４〜約４５５までの整数であり；残基の末端部分のうち、３カ所までがメチルもしくはその他の低級アルキルでキャップされている。
【００５７】
別の好ましい実施の形態では、ＰＥＧの４本のアーム全てを転換し、適切な活性化基にすることにより、芳香環基に結合させることができる。転換前のそのような化合物としては次のようなものが挙げられる：
【化１４−１】
2010503707.tif 000016
【化１４−２】
2010503707.tif 000017
【００５８】
好ましくは、本明細書に挙げられているポリマー性物質は、室温で水溶性である。そのようなポリマーの例としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール類などのポリアルキレンオキシドホモポリマー類、ポリオキシエチレン化ポリマー類、それらのコポリマー類およびそれらのブロックコポリマー類などであって、該ブロックコポリマー類の水溶性が維持されることを条件とする。
【００５９】
さらなる実施の形態およびＰＡＯに基づくポリマーに代わるものとしては、ひとつもしくはそれ以上の有効な非抗原性材料、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール類、炭水化物に基づくポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリアルキレンオキシド類、および／または、それらを用いたコポリマー類などが用いられる。一般的に取り上げられる米国特許第６，１５３，６５５号明細書も参照のこと（参照として本明細書中に援用する）。通常の技術を有する当業者であれば、ＰＥＧなどのＰＡＯ類について本明細書に記載する活性化法と同様の方法は理解できるはずである。さらに、当業者であれば、前述のリストは単なる例示であり、本明細書に記載されている性質を有する全てのポリマー性材料が包含されることがわかるはずである。本発明の目的では「実質的に、または事実上非抗原性である」とは、非毒性であり、ほ乳類の体内で明らかな免疫原性応答を誘起しないことが当該分野において確認されている全ての材料を意味する。
【００６０】
いくつかの態様では、末端アミン基を有するポリマーを用い、本明細書に記載する化合物を調製できる。末端アミン基を有するポリマーを高純度で調製する方法については、米国特許出願第１１／５０８，５０７号および同第１１／５３７，１７２号の各明細書に記載されており、それらの内容を参照として援用する。例えば、アジドを有するポリマーに、ホスフィンに基づく還元剤（例えば、トリフェニルホスフィンなど）またはアルカリ金属ボロヒドリド還元剤（例えば、ＮａＢＨ4など）を反応させる。別の方法としては、脱離基を有するポリマーに保護基のついたアミン塩類（例えば、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカルボナートのカリウム塩（ＫＮＭｅＢｏｃ）またはジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカルボナートのカリウム塩（ＫＮＢｏｃ2）など）を反応させ、次に、保護基のついたアミン基を脱保護する。これらの行程を経て生成された末端アミン基を有するポリマーの純度は、約９５％以上、好ましくは９９％以上である。
【００６１】
別の態様では、末端カルボン酸基を有するポリマーを本明細書に記載するポリマー送達システムに使用できる。末端カルボン酸基を有するポリマーを高純度で調製する方法については、米国特許出願第１１／３２８，６６２号明細書に記載されており、参照することにより、その内容を本明細書中に援用する。該方法は、まず始めに、ポリアルキレンオキシドの第三級アルキルエステルを調製し、続いて、それらをカルボン酸誘導体に転換することを含む。該工程に従い、ＰＡＯカルボン酸の調製を行う第一段階では、ポリアルキレンオキシドカルボン酸のｔ−ブチルエステルなどのような中間体の形成を含む。この中間体は、カリウムｔ−ブトキシドなどの塩基の存在下、ＰＡＯにｔ−ブチルハロアセテートを反応させることによって生成する。一旦ｔ−ブチルエステル中間体が生成すると、ポリアルキレンオキシドのカルボン酸誘導体は、純度９２％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは９９．５％以上で容易に得られる。
【００６２】
Ｃ．ヒンダードエステル
本発明の目的では、「ヒンダード（束縛された）」とは、Ｃ（＝Ｙ1）の周囲の環境が立体的に混み合っているという意味、あるいはそのような状態を含むと解されるべきである。一般的に、そのような環境は、環状または分岐鎖部分などの嵩高い置換基を取り込むことによって作り出される。構造式（Ｉ）に従い、Ｃ（＝Ｙ1）およびＣ（＝Ｙ'1）に隣接するＣＲ2Ｒ3およびＣＲ'2Ｒ'3の各部分がヒンダードエステルを形成する。Ｒ2、Ｒ'2、Ｒ3、Ｒ'3およびＲ5は、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニルおよび置換アリールカルボニルオキシなどから選択される。Ｒ2およびＲ3（Ｒ'2およびＲ'3）に対しては、本明細書に記載する任意の可能な基は、Ｒ2およびＲ3（Ｒ'2およびＲ'3）が同時にＨでない限りは使用できる。Ｒ2およびＲ3（Ｒ'2およびＲ'3）のうちのひとつがＨである場合には、他方は少なくとも３つの炭化水素である。ひとつの好ましい実施の形態では、Ｒ2、Ｒ'2、Ｒ3およびＲ'3は、メチル、エチルおよびイソプロピルを含む。
【００６３】
別の実施の形態では、Ｒ2はＲ3と共同して、また、Ｒ'2はＲ'3と共同して、少なくとも３つの炭素を有する置換もしくは非置換の非芳香環式環状炭化水素を形成できる。
【００６４】
Ｄ．スペーサー：Ｌ1およびＬ'1
本発明の別の態様では、ＣＲ2Ｒ3およびＣＲ'2Ｒ'3部分に連結しているＬ1およびＬ'1スペーサーの自由電子対がキメラ効果を発揮する。理論的な裏付けがあるわけではないが、Ｃ（＝Ｙ1）およびＣ（＝Ｙ'1）から４〜１０原子に位置する自由電子対により、本明細書に記載するポリマー送達システムからの生物活性部分、標的基および診断薬の放出速度が加速（加減）される。
【００６５】
ひとつの好ましい実施の形態では、Ｌ1およびＬ'1スペーサーは、次のものから選択することができ：
【化１５】
2010503707.tif 000018
【００６６】
ここで、
Ｒ11〜Ｒ16は、独立して、水素、アミノ、置換アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、シリルエーテル、スルホニル、メルカプト、Ｃ1-6アルキルメルカプト、アリールメルカプト、置換アリールメルカプト、置換Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、および置換アリールカルボニルオキシから選択され；
（ｓ）および（ｓ'）は、独立して、０または正の整数であり、好ましくは、約１〜約４であり；さらに、
（ｒ）は、０または１である。
【００６７】
あるいは、Ｌ1およびＬ'1は、次のものから選択することができ：
【化１６】
2010503707.tif 000019
【００６８】
ここで、
（ｐ）は、約１〜約１２の整数であり、好ましくは、約１〜約８であり、より好ましくは、約２〜約５であり；さらに、
（ｑ）は、独立して、正の整数であり、好ましくは約１〜約８であり、より好ましくは約１〜約4である。
【００６９】
好ましくは、Ｌ1およびＬ'1は、−（ＣＨ2）x21−または−（ＣＨ2）x21−Ｗ−（ＣＨ2）x22−を含み、ここで、（ｘ２１）および（ｘ２２）は、１〜７の整数であり、さらに、Ｗは、ＯまたはＮＨである。
【００７０】
さらに別の好ましい実施の形態では、Ｌ1-2およびＬ'1-2スペーサーの自由電子対は、Ｃ（＝Ｙ1）およびＣ（＝Ｙ'1）から４〜１０原子の位置に存在する。より好ましくは、そのような電子対は、Ｃ（＝Ｙ1）およびＣ（＝Ｙ'1）から４〜５原子に位置する。
【００７１】
好ましい態様に従う好ましい実施の形態は、−Ｌ1−Ｃ（Ｒ2）（Ｒ3）−Ｃ（＝Ｙ1）−および−Ｌ'1−Ｃ（Ｒ'2）（Ｒ'3）−Ｃ（＝Ｙ'1）であり、次のようなものが挙げられる：
【化１７】
2010503707.tif 000020
【００７２】
別の態様では、本明細書に記載するポリマー送達システムは、Ｒ2がＨの場合には、Ｒ3は、少なくとも３つの炭素原子を有する置換もしくは非置換の炭化水素であり、さらに、Ｌ1は、Ｃ（Ｒ2）（Ｒ3）と同一ではないことを条件とする。
【００７３】
Ｅ．二官能性リンカー
本明細書に記載する化合物は二官能性リンカーを含む。そのような二官能性リンカーには、アミノ酸またはアミノ酸誘導体などがある。アミノ酸としては、天然に存在するものまたは非天然アミノ酸が含まれる。天然に存在するアミノ酸の誘導体および類似体、ならびに、当該分野において既知の多様な非天然アミノ酸（ＤまたはＬ）、疎水性もしくは非疎水性のものも本発明の範疇に含まれる。非天然アミノ酸としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノブチル酸、４−アミノブチル酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソブチル酸、３−アミノイソブチル酸、２−アミノピメリン酸、２，４−アミノブチル酸、デスモシン、２，２−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチル−イソロイシン、６−Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチン。いくつかの好ましいアミノ酸残基としては、グリシン、アラニン、メチオニンおよびサルコシンが挙げられ、より好ましくは、グリシンである。
【００７４】
あるいは、Ｌ2およびＬ'2は、次のものから選択され：
【化１８−１】
2010503707.tif 000021
【化１８−２】
2010503707.tif 000022
【００７５】
ここで、
Ｒ21-29は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-12分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、フェノキシおよびＣ1-6ヘテロアルコキシからなる群より選択され；
（ｔ）および（ｔ'）は、独立して、０または正の整数であり、好ましくは、０または約１〜約１２の整数であり、より好ましくは、約１〜約８の整数であり、もっとも好ましくは、１または２であり；さらに、
（ｖ）および（ｖ'）は、独立して、０または１である。
【００７６】
好ましい実施の形態では、Ｌ2およびＬ'2は、次のものから選択され：
【化１９−１】
2010503707.tif 000023
【化１９−２】
2010503707.tif 000024
【００７７】
ここで、（ｒ）および（ｒ'）は、独立して、０または１である。
【００７８】
さらに別の実施の形態では、二官能性リンカーとして次のようなものが挙げられ：
【化２０−１】
2010503707.tif 000025
【化２０−２】
2010503707.tif 000026
【００７９】
ここで、
Ｙ11-19は、独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲ48であり；
Ｒ31-48、Ｒ50-51およびＡ51は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-12分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、フェノキシおよびＣ1-6ヘテロアルコキシからなる群より選択され；
Ａｒは、アリールまたはヘテロアリール部分であり；
Ｌ11-15は、独立して、二官能性リンカーから選択され；
Ｊ3およびＪ'3は、独立して、標的細胞内に能動的に輸送される部分、疎水性部分、二官能性リンカー部分およびそれらの組合せから選択され；
（ｃ１１）、（ｈ１１）、（ｋ１１）、（ｌ１１）、（ｍ１１）および（ｎ１１）は、独立して、正の整数から選択され；
（ａ１１）、（ｅ１１）、（ｇ１１）、（ｊ１１）、（ｏ１１）および（ｑ１１）は、独立して、０または正の整数であり；さらに、
（ｂ１１）、（ｘ１１）、（ｘ'１１）、（ｆ１１）、（ｉ１１）および（ｐ１１）は、独立して、０または１である。
【００８０】
Ｆ．Ｒ4およびＲ'4基
１．脱離基
本発明の目的では、脱離基は、所望する標的、すなわち、オリゴヌクレオチド、二官能性リンカー、中間体などの上に見出される求核基と反応できる基と考えるべきである。そのような標的は、置換のための基（例えば、オリゴヌクレオチド上のＯＨまたはＳＨ基など）を有する。
【００８１】
ヒンダードエステルに連結している脱離基により、選択した物質、すなわち、薬学的に活性な化合物（低分子量化合物）、オリゴヌクレオチドなどの生物活性部分に対して共有結合反応が起こる。適切な脱離基としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：ハロゲン（Ｂｒ、Ｃｌ）、活性化エステル、環状イミドチオン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミジル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、イミダゾール、トシラート、メシラート、トレシラート、ノシラート、Ｃ1−Ｃ6アルキルオキシ、Ｃ1−Ｃ6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、オルト−ニトロフェノキシ、パラ−ニトロフェノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、１，３，５−トリクロロフェノキシおよび１，３，５−トリフルオロフェノキシ、あるいは、当業者において自明であるその他の適切な脱離基。
【００８２】
本発明に従う特に好ましい実施の形態では、脱離基は、ＯＨ、メトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、パラ−ニトロフェノキシおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミジルから選択される。
【００８３】
２．ポリヌクレオチド部分
本発明をより十分に理解することを目的として、次の用語を定義する。当業者であれば、「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、特に指定がない限りは、１本鎖または２本鎖のデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ」）ならびに、それらの化学修飾体に対して使用することは周知である。一般的に、「オリゴヌクレオチド」とは、比較的短いポリヌクレオチドであり、例えば、ヌクレオチド数が約２〜約２００の範囲、より好ましくは、約１０〜約３０の範囲のものをさす。一般的に、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、特に指定していない限りは、合成核酸であり、かつ、一本鎖である。本明細書においては、「ポリヌクレオチド」および「ポリ核酸」という用語も同様に使用している。
【００８４】
本明細書において使用している「アンチセンス」という用語は、遺伝子産物または制御配列をコードしている特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対して相補的なヌクレオチド配列をさす。「アンチセンス鎖」という用語は、「センス」鎖に相補的である核酸鎖に関して使用する。細胞代謝の正常な活動においては、ＤＮＡ分子のセンス鎖は、ポリペプチドおよび／またはその他の遺伝子産物をコードしている鎖である。センス鎖は、メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）転写体（アンチセンス鎖）の合成用の鋳型であり、続いて、コードされている任意の遺伝子産物の合成を指図する。アンチセンス核酸分子は、当該分野において既知の任意の方法によって産生でき、例えば、相補鎖の合成を行わせるウイルスプロモーターに対して目的の遺伝子を逆方向に接続することによる合成法などが挙げられる。一旦細胞内に導入されると、この転写鎖は、細胞によって産生された天然の配列と組み合わさり、二本鎖を形成する。次に、これらの二本鎖が更なる転写または翻訳を阻止する。このようにして突然変異表現型が作出される。「負」または（−）という記号は、アンチセンス鎖を指すことは当該分野において既知であり、また、「正」または（＋）という記号がセンス鎖を指すことは当該分野において既知である。
【００８５】
例えば、細胞内でのｍＲＮＡ転写体の発現を抑制制御したいのであれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入する。一旦細胞内に導入されると、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ワトソン−クリック結合を介し、対応するｍＲＮＡ配列にハイブリダイズし、ヘテロ二本鎖を形成する。一旦二本鎖が形成すると、結合しているｍＲＮＡの配列によってコードされているタンパク質の翻訳が阻止される。従って、当該分野においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般的にはタグもしくはラベルに連結したプローブ（例えば、ハイブリダイゼーションプローブなど）として、さらに、特定の細胞生成物の発現を正確に抑制制御するために、あるいは、開発および治療目的の遺伝子制御要素としても使用される。
【００８６】
多様なポリヌクレオチド部分を本明細書に記載する活性化ポリマーに結合させることができる。
【００８７】
本発明に従う１つの態様では、ポリヌクレオチドは、治療を必要とする状態にある動物（例えば、ヒトを含むほ乳類など）の治療において、医薬品または診断用としての使用に適している。
【００８８】
別の態様では、ヒドロキシル−またはチオール−含有ポリヌクレオチドが本発明の範疇に含まれる。本発明の範疇に包含される適切な生物活性部分の型について課せられる制限は、担体部分と反応でき、かつ結合できるヒドロキシル−もしくはチオール−基を少なくとも１つ有していること、および、本明細書に記載するポリマー送達システムに連結した状態において、生体活性が実質的に消失しないことである。
【００８９】
あるいは、本発明に従うポリマー輸送複合体化合物への組込みに適した親化合物は、連結している化合物から加水分解放出された後に活性であるか、あるいは、加水分解放出後は活性ではないが、さらに化学処理／反応を受けることによって活性化する。例えば、ポリマー輸送システムによって血流に送達される抗癌剤は、癌もしくは腫瘍細胞に侵入するまでは不活性に保たれて差し支えないが、例えば細胞に特異的な酵素反応によってなど、癌もしくは腫瘍の細胞化学によって活性化される。
【００９０】
ひとつの好ましい実施の形態では、コンジュゲーション用の選択肢はオリゴヌクレオチドであり、連結後は、標的はオリゴヌクレオチドの残基である。オリゴヌクレオチドは、既知の任意のオリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチドのうちから選択でき、例えば、ホスホロジエステル骨格もしくはホスホロチオエート骨格を有するもの、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、ペプチド骨格を有する核酸（ＰＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ、二本鎖オリゴヌクレオチド（デコイＯＤＮ）、触媒ＲＮＡ配列（ＲＮＡｉ）、リボザイム、スピーゲルマー（spiegelmer）およびＣｐＧオリゴマーなどが挙げられる。当業者であれば、以上のリストは単なる例示であり、全ての核酸材料が包含されることは容易に理解できるであろう。
【００９１】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、２〜１００のオリゴマーからなるオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは、３〜５０のオリゴマーからなり、最も好ましくは、１０〜３０のオリゴマーからなるものである。その他全ての適切な大きさのオリゴヌクレオチドも本発明に包含される。
【００９２】
本明細書に記載されている化合物のポリヌクレオチドは、ホスホロジエステル骨格またはホスホロチオエート骨格を有する一本鎖または二本鎖のものである。「ポリヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」）には、オリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチドが含まれ、例えば、ジェナセンス（ａ／ｋ／ａ  オブリマーセンナトリウム、ジェンタ（Ｇｅｎｔａ）社製、米国ニュージャージー州バークレーハイツ所在）のように同一もしくは実質的に類似のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。ジェナセンスは、１８量体ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ：配列番号４）であり、これは、ヒトｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの開始配列の最初の６つのコドンと相補性がある（ヒトｂｃｌ−２  ｍＲＮＡは当該分野において既知であり、例えば、米国特許第６，４１４，１３４号明細書中の配列番号１９などのように記載されている。これを参照として本明細書中に援用する）。合衆国食品および医薬品局（ＦＤＡ）は、２０００年８月にジェナセンスを稀用薬として認証した。
【００９３】
さらに、本発明に従って有用なオリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチドとしては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：
天然に存在するホスホロジエステル骨格もしくはホスホロチオエート骨格、または、その他の任意の修飾骨格類似体類を有するオリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチド；
ＬＮＡ（ロックされた核酸）；
ＰＮＡ（ペプチド骨格を有する核酸）；
トリシクロ−ＤＮＡ；
デコイＯＤＮ（二本鎖オリゴヌクレオチド）；
触媒ＲＮＡ配列；
リボザイム；
スピーゲルマー（Ｌ−配座オリゴヌクレオチド）；
ＣｐＧオリゴマーなど、例えば、Tides 2002、オリゴヌクレオチドおよびペプチド技術会議（Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences）（２００２年５月６〜８日、米国ネバダ州ラスベガス）、オリゴヌクレオチドおよびペプチド技術（Oligonucleotide & Peptide Technologies）（２００３年１１月１８および１９日、独国ハンブルグ）に開示されているもの（これらの内容を参照として本明細書中に援用する）。
【００９４】
本発明に従うオリゴヌクレオチドは、以下の表１に挙げているような、当該分野において既知の任意の適切なヌクレオチド類似体および誘導体を含む場合もある：
【表１】
2010503707.tif 000027
【００９５】
本発明に包含されるオリゴヌクレオチドの修飾としては、例えば、選択したヌクレオチドに対し、所望するポリマーへのオリゴヌクレオチドの共有結合が許容されるような官能基もしくは部分の付加または置換、ならびに／または、オリゴヌクレオチドに更なる電荷、極性、水素結合、静電相互作用および機能性を持たせるような官能基の付加または置換などが挙げられる。そのような修飾の例としては次のようなものが挙げられるが、これらの限定されるわけではない：２'−位の糖修飾、５−位のピリミジン修飾、８−位のプリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモもしくは５−ヨードウラシルの置換、骨格修飾、メチル化、塩基対結合（例えば、イソシチジンおよびイソグアニジンなどのイソ塩基類、および同様の組合せなど）。オリゴヌクレオチド修飾には、キャッピングなどの３'および５'修飾も含まれる。代表的なヌクレオシド類似体の構造を以下に示す。
【化２１】
2010503707.tif 000028
【００９６】
ヌクレオチド類似体のさらなる例については、Freier&Altmann; Nucl.Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann;Curr.Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213などを参照。これらの内容を参照として本明細書中に援用する。
【００９７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび関連化合物は、ヒンダードエステルを有するポリマーが結合するための好ましい標的だと見なされてはいるが、Ｒ4およびＲ'4は、ＰＥＧまたはポリマーが結合することによって利益を得ることがわかっている全ての適切なポリヌクレオチドを含むものである。
【００９８】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、標的腫瘍細胞内に含まれているか、または、抗癌剤治療に対する腫瘍細胞の抵抗性に関係しているタンパク質を抑制制御する。例えば、癌治療に対し、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた抑制制御を行うために、ＢＣＬ−２などの既知の任意の細胞性タンパク質を本発明に使用できる。２００４年４月９日に受理された米国特許出願第１０／８２２，２０５号明細書などを参照。その内容を本明細書中に参照として援用する。好ましい治療用オリゴヌクレオチドとしては、アンチセンスＨＩＦ−１αオリゴヌクレオチドおよびアンチセンススルビビンオリゴヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００９９】
好ましい実施の形態としては次のようなものが挙げられる：
(i)    アンチセンススルビビンＬＮＡ（配列番号：１）
2010503707.tif 000029
【０１００】
ここで、大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」は、ホスホロチオエート骨格を表す；
(ii)         アンチセンスＢｃｌ２  ｓｉＲＮＡ
センス  ５'-ＧＣＡＵＧＣＧＧＣＣＵＣＵＧＵＵＵＧＡｄＴｄＴ-３'
（配列番号：２）
アンチセンス  ３'-ｄＴｄＴＣＧＵＡＣＧＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡＡＣＵ-５'
（配列番号：３）
ここで、ｄＴは、ＤＮＡを表す；
(iii)  ジェナセンス（ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド）
（配列番号：４）
2010503707.tif 000030
【０１０１】
ここで、小文字はＤＮＡを表し、「ｓ」は、ホスホロチオエート骨格を表す；
(iv)   アンチセンスＨＩＦ１αＬＮＡ
５'- sＴsＧsＧsｃsａsａsｇsｃsａsｔsｃsｃsＴsＧsＴsａ-３' 
（配列番号：５）
ここで、大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」は、ホスホロチオエート骨格を表す。
【０１０２】
ＬＮＡは、下に示すような２'−Ｏ，４'−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドを有する：
【化２２】
2010503707.tif 000031
【０１０３】
スルビビンＬＮＡについての詳細な記述は、米国特許出願第１１／２７２，１２４号「ＬＮＡオリゴヌクレオチドおよび癌治療（LNA Oligonucleotides and the Treatment of Cancer）」、および同第１０／７７６，９３４号「調節スルビビン発現用のオリゴマー化合物（Oligomeric Compounds for the Modulation Survivin Expression）」の各明細書に開示されており、それらの内容を参照として本明細書中に援用する。また、米国特許出願第１０／４０７，８０７号「調節ＨＩＦ−１α発現用のオリゴマー化合物（Oligomeric Compounds for the Modulation HIF-1 Alpha Expression）」、および同第１１／２７１，６８６号「ＨＩＦ−１α発現を阻害するための強力なＬＮＡオリゴヌクレオチド（Potent LNA Oligonucleotides for Inhibition of HIF-1 alpha Expression）」の各明細書も参照。これらの内容も参照として本明細書中に援用する。
【０１０４】
ひとつの好ましい実施の形態では、本明細書に記載した化合物は、オリゴヌクレオチドの５'または３'末端がヒンダードエステルを有する（ＣＨ2）wアミノリンカーで修飾されたオリゴヌクレオチドを含み、ここで、本態様におけるｗは、好ましくは約１〜約１０の正の整数であり、好ましくは約６である。ポリマー化合物は、アミノ末端を持たないオリゴヌクレオチドを放出する。例えば、そのようなオリゴヌクレオチドは次のような構造を有し：
【化２３】
2010503707.tif 000032
【０１０５】
ここで、ｗは、約１〜約１０までの正の整数であり、好ましくは約６である。
【０１０６】
別の好ましい実施の形態では、オリゴヌクレオチドは、（ＣＨ2）wスルフヒドリルリンカー（チオオリゴヌクレオチド）を有する。チオオリゴヌクレオチドは、正の電荷を帯びたペプチドのシステインへの直接連結、あるいは、マレイミジル基を介した連結に使用できる。チオオリゴヌクレオチドは次のような構造を有している：
【化２４】
2010503707.tif 000033
【０１０７】
本発明の更なる態様では、本明細書中に記載されているポリマー送達システムに連結している診断用タグを用いて調製された複合体化合物が提供され、ここで、該タグは、診断目的または画像採取目的に合わせて選択される。故に、適切なタグは、アミノ酸残基などの適切な任意の部分を、当該分野において標準的な任意の放出アイソトープ、放射線不透過ラベル、核磁気共鳴ラベルあるいは核磁気共鳴画像に適したその他の非放射活性同位体ラベル、蛍光型ラベル、可視色および／または、紫外線、赤外線もしくは電気化学的刺激によって蛍光を発するラベルに連結することによって調製し、外科的手術中などの場合に腫瘍組織を画像化できる。さらに、治療部分に診断用タグを組み込む、および／または、連結することにより、動物またはヒト患者の体内での治療用生物活性材料の分布をモニターできる。
【０１０８】
本発明の更なる態様では、本発明に従うタグ付けした連結は、放射性同位体ラベルなどの任意の適切なラベルを用い、当該分野において既知の方法によって容易に調製される。そのようなものとしては、例えば、131ヨウ素、125ヨウ素、99mテクネチウム、および／または111インジウムなどが挙げられ、インビボで腫瘍細胞内に選択的に取り込まれるような放射免疫シンチグラフ剤を調製できる。例えば、Ｔｃ−９９ｍにペプチドを連結する方法は既に多数知られており、そのような例としては、米国特許第５，３２８，６７９号、同第５，８８８，４７４号、同第５，９９７，８４４号、および同第５，９９７，８４５号の各明細書に開示されているものなどがあり、それらの内容を参照として本明細書中に援用する。
【０１０９】
Ｆ．構造式（Ｉ）に対応する好ましい実施の形態
構造式（Ｉ）に従う化合物は、ポリアルキレンオキシドなどの実質的に非抗原性のポリマーに共有結合している。特に好ましい実施の形態では、構造式（Ｉ）に従う化合物としては次のようなものが挙げられる：
【化２５−１】
2010503707.tif 000034
【化２５−２】
2010503707.tif 000035
【化２５−３】
2010503707.tif 000036
【化２５−４】
2010503707.tif 000037
【化２５−５】
2010503707.tif 000038
【０１１０】
ここで、
Ｒ4は、センスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）、トリシクロ−ＤＮＡ、二本鎖オリゴヌクレオチド（デコイＯＤＮ）、触媒ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、スピーゲルマー、ＣｐＧオリゴマーおよびそれらの組合せであり；
（ｚ）は、約１〜約１０の正の整数であり；
（ｚ'）は、０または約１〜約４の正の整数であり；
ｍＰＥＧは、構造式ＣＨ3−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−を有し；
ＰＥＧは、構造式−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−を有し；
（ｎ）は、約１０〜約２３００の正の整数である。
【０１１１】
本発明に従う好ましいポリマー化合物には次のようなものが挙げられる：
【化２６】
2010503707.tif 000039
【０１１２】
Ｒ4についてのひとつの好ましい実施の形態としては、次のようなものが挙げられる：
(i)   アンチセンススルビビンＬＮＡ（配列番号：１）
2010503707.tif 000040
【０１１３】
ここで、大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」は、ホスホロチオエート骨格を表す；
(ii)  アンチセンスＢｃｌ２  ｓｉＲＮＡ
センス      ５'-ＧＣＡＵＧＣＧＧＣＣＵＣＵＧＵＵＵＧＡｄＴｄＴ-３'
（配列番号：２）
アンチセンス  ３'-ｄＴｄＴＣＧＵＡＣＧＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡＡＣＵ-５'
（配列番号：３）
ここで、ｄＴは、ＤＮＡを表す；
(iii)  ジェナセンス（ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド）
（配列番号：４）
2010503707.tif 000041
【０１１４】
ここで、小文字はＤＮＡを表し、「ｓ」は、ホスホロチオエート骨格を表す；
(iv)         アンチセンスＨＩＦ１αＬＮＡ（配列番号：５）
５'−sＴsＧsＧsｃsａsａsｇsｃsａsｔsｃsｃsＴsＧsＴsａ−３'
ここで、大文字はＬＮＡを表し、「ｓ」は、ホスホロチオエート骨格を表す。
【０１１５】
本発明の目的では、ジェナセンス（配列番号：４）は、次のように表される：
ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ
または
５'−ｔsｃsｔsｃsｃsｃsａsｇsｃsｇsｔsｇsｃsｇsｃsｃsａsｔ−３'
【０１１６】
Ｇ．複合体の調製法
本発明の１つの態様では、ヒンダードエステルを有するポリマー化合物は、末端にＯＨまたは脱離基を有するポリマー化合物に対し、遠位末端に保護されたヒンダードエステルまたはヒンダード酸を有する求核剤を連結させることによって調製できる。さらに、脱保護および活性化を行うことによって得られるポリマー化合物が本発明に従う化合物である。本発明に従う末端基は、ＯＨまたはＳＨ含有部分とすぐに結合できるカルボン酸型、あるいは、ＯＨまたはＳＨ含有部分と連結することによって置換され得るような活性化型である。
【０１１７】
あるいは、ＯＨまたはＳＨ含有化合物を連結することによってヒンダードエステル中間体を形成し、次に、活性化ポリマーと反応させることにより、生物活性部分を備えたヒンダードエステルを有するポリマー複合体が得られる。
【０１１８】
例を挙げると、ヒンダードのアシルまたはエステル部分を有するポリマー複合体の調製法は、
十分な反応条件の下、構造式（ＩＩＩ）：
【化２７】
2010503707.tif 000042
【０１１９】
で表される化合物に、構造式（ＩＶ）：
【化２８】
2010503707.tif 000043
【０１２０】
で表される化合物を反応させ、構造式（Ｖ）：
【化２９】
2010503707.tif 000044
【０１２１】
で表される化合物を得る、
工程を有してなり、
ここで、
Ａ1は、キャッピング基またはＭ1であり；
Ａ2は、キャッピング基または次の構造式で表されるものであり：
【化３０】
2010503707.tif 000045
【０１２２】
Ｍ1は、ハロゲン、活性化カルボナート類、イソシアナート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、トシラート、メシラート、トレシラート、ノシラート、オルト−ニトロフェノキシ、イミダゾールおよび当業者において既知のその他の脱離基であり；
Ｍ2は、−ＯＨ、−ＳＨまたは−ＮＨＲ101であり；
Ｒ100は、ＯＨまたはＯＲ101であり；ここで、Ｒ101は、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、および置換アリールカルボニルオキシから選択され；さらに、
その他全ての変数は、先に定義した通りである。
【０１２３】
ＰＥＧもしくはその他のポリマーへの構造式（ＩＶ）に従うヒンダードエステル部分の結合は、当業者において既知の標準的な化学合成技術を用いて行える。ＳＣ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−アミン、ＰＥＧ−酸などのような活性化ポリマー部分は、市販品から、または、当業者であれば、不要な実験をすることなく合成することによって入手できる。
【０１２４】
本発明の目的では、そのようなヒンダードエステルとしては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：
【化３１】
2010503707.tif 000046
【０１２５】
ここで、（ｚ）は、先に定義した通りである。
【０１２６】
構造式（Ｖ）で表される化合物は、十分な条件下、塩基およびカップリング剤の存在下で−ＯＨもしくは−ＳＨ含有部分とさらに反応させることにより、構造式（Ｉａ）で表される化合物が生成し：
【化３２】
2010503707.tif 000047
【０１２７】
ここで、
Ａ3は、キャッピング基または：
【化３３】
2010503707.tif 000048
【０１２８】
であり、
Ｒ103は、標的基、診断薬および生物活性部分から選択され；さらに、
その他全ての変数は、先に定義した通りである。
【０１２９】
本発明の目的では、Ｒ103は、ＯＨまたはＳＨ含有部分の一部と解されるべきであり、それらは、構造式（Ｖ）で表される化合物と反応した後も残存している。
【０１３０】
別の方法としては、本明細書に記載する化合物は、次のような方法で調製できる：
十分な条件下、構造式（ＶＩ）：
【化３４】
2010503707.tif 000049
【０１３１】
で表される化合物に、構造式（ＶＩＩ）：
【化３５】
2010503707.tif 000050
【０１３２】
で表される化合物を反応させることにより、構造式（ＶＩＩＩ）：
【化３６】
2010503707.tif 000051
【０１３３】
で表される化合物が生成し、
ここで、
Ａ4は、キャッピング基またはＭ4であり；
Ａ5は、キャッピング基または：
【化３７】
2010503707.tif 000052
【０１３４】
であり、
Ｍ3は、−ＯＨ、ＳＨまたは−ＮＨＲ105であり；
Ｍ4は、脱離基であって、例えば、ハロゲン、活性化カルボナート類、イソシアナート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、トシラート、メシラート、トレシラート、ノシラート、オルト−ニトロフェノキシ、イミダゾール、ならびに、当業者において既知のその他の脱離基であり；
Ｒ104は、生物活性部分、標的基および診断薬から選択され；
Ｒ105は、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、および置換アリールカルボニルオキシから選択され；さらに、                             
その他全ての変数は、先に定義した通りである。
【０１３５】
好ましくは、ヒンダードエステル含有基をポリマー部分へ結合する場合は、カップリング剤の存在下で行う。適切なカップリング剤としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、任意の適切なジアルキルカルボジイミド類、２−ハロ−１−アルキル−ピリジニウムハライド類（向山試薬）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、プロパンホスホニックアシッドサイクリックアンヒドリド（ＰＰＡＣＡ）およびフェニルジクロロホスフェートなど。これらは、例えば、シグマ−アルドリッヒ・ケミカル（Sigma-Aldrich Chemical）社などからの市販品が購入でき、あるいは、既知の技術を用いて合成できる。
【０１３６】
好ましくは、反応は、塩化メチレン、クロロホルム、ＤＭＦまたはそれらの混合物などの不活性溶媒中で行う。好ましくは、反応は、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、トリエチルアミンなどの塩基の存在下で行い、生成した酸を中和させる。反応は、約０℃〜約２２℃（室温）の範囲で行える。
【０１３７】
Ｈ．治療法
本発明の別の態様では、ほ乳類の多様な医学的状態に対する治療法を提供する。そのような方法とは、治療を要するほ乳類に、本明細書に記載する化合物の治療有効量を投与することを含む。とりわけ、ポリマー複合体化合物は、酵素置換療法、腫瘍性疾患など、親化合物を用いて治療が行われている疾病と類似した疾病の治療、腫瘍総量の減少、ほ乳類における腫瘍の転移阻止および腫瘍増殖の再発阻止などに有用である。
【０１３８】
投与するポリマー複合体の量は、複合体に含まれている親分子の量によって決まる。一般的に、治療に使用されるポリマー複合体の量は、ほ乳類において所望する治療結果が効率的に得られるような量である。通常、多様なポリマー複合体化合物の投与量は、親化合物、ポリマーの分子量、インビボ加水分解速度などによって異なる。当業者であれば、臨床経験および治療指針に基づき、選択したポリマー輸送複合体の至適投与量を決定できる。当業者においては、実際の投与量は、不要な実験をするまでもなく明かである。
【０１３９】
本発明に従う化合物は、ほ乳類への投与用に、ひとつもしくはそれ以上の適切な医薬品組成物に組み込まれている。そのような医学品組成物は、当該分野において既知の方法に従って調製された液体、懸濁液、錠剤、カプセルなどの剤型である。そのような組成物の投与は、当業者の要請に応じ、経口および／または非経口経路で行える。例えば、該組成物の液体および／または懸濁液は、当該分野において既知の方法、例えば、静脈内、筋肉内、腹膜内、皮下への注射などにより、組成物を注入または浸潤させることを目的として、担体ビヒクルを用いることができる。そのような投与は、体隙または体腔への浸潤により、ならびに、吸入および／もしくは経鼻経路によっても行える。しかしながら、本発明の好ましい態様では、ポリマー複合体は、それらを必要とするほ乳類に非経口投与する。
【０１４０】
本発明の更なる態様では、ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドのほ乳類細胞への投与法を提供する。そのような方法には、本明細書に従って調製された複合体を有効量で、治療すべき症状に対して送達することを含み、有効量は、そのような症状に対するポリヌクレオチドの効果によって決まる。例えば、非複合体化オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＢＣＬ２オリゴヌクレオチド、アンチセンススルビビンオリゴヌクレオチドなど）がある種の癌または腫瘍性細胞に対して効力を有する場合には、該方法は、修飾していないオリゴヌクレオチドに感受性の細胞に対し、オリゴヌクレオチドを含有するポリマー複合体を送達することを含む。送達は、適切な医薬品組成物の一部としてインビボで、あるいは、生体外環境下で細胞に直接行える。ひとつの特別な治療法においては、オリゴヌクレオチド（配列番号１、配列番号２および３、ならびに配列番号４）を含むポリマー複合体を用いることができる。
【実施例】
【０１４１】
以下の実施例は、本発明をさらに理解するためのものであり、如何なる意味においても、本発明の範疇を制限するものではない。実施例中に記している太字の数字は図１〜４に示す数字に対応している。実施例を通して、略号を使用しており、それらは次のようなものである：ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ'−ジメチルホルムアミド）、ＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−３−エチルカルボジイミド）、ＩＰＡ（イソプロパノール）、Ｍｍｔ（４−メトキシトリフェニルメチル）、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＳＣＡ−ＳＨ（一本鎖抗体）、ＳＣ−ＰＥＧ（スクシンイミジルカルボナートポリエチレングリコール）、ＴＥＡＡ（テトラエチルアンモニウムアセテート）、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）およびＴＨＦ（テトラヒドロフラン）など。
【０１４２】
一般的方法：
全ての反応は、乾燥窒素またはアルゴンの雰囲気下で行った。市販の反応試薬は、さらに精製することなく使用した。ＰＥＧ化合物は、全て、減圧下乾燥するかまたは、トルエンからの共沸蒸留を行ってから使用した。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ（登録商標）３００ＮＭＲスペクトロメーターを使用し、特に別記しない限り、溶媒として重クロロホルムおよび重ピリジンを用い、７５．４６ＭＨｚで測定を行った。化学シフト（δ）は、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）の顆粒領域でのｐｐｍで記載する。
【０１４３】
ＨＰＬＣ法：
反応混合物ならびに中間体および最終生成物の純度は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＨＰＬＣ装置でモニターした。カラムは、ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）３００ＳＢ  Ｃ８逆相カラム（１５０×４．６ｍｍ）またはＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）３００Ａ  Ｃ１８逆相カラム（１５０×４．６ｍｍ）を使用し、１６８ダイオードアレイＵＶ検出器を接続し、０．０５Ｍのテトラエチルアンモニウムアセテート（ＴＦＡＡ）中、アセトニトリル濃度を５〜８０％に変化させ、流速を１ｍｌ／分とした。
【０１４４】
実施例１：Ｂｒ−ＨＥ−ＯＥｔ（化合物（３））の調製
−７８℃において、エチルイソブチラート（化合物１、３５ｇ）のＴＨＦ（５００ｍｌ）溶液にブチルリチウム（ｔ−ＢｕＯＨ中１．６Ｍの溶液、２００ｍｌ）を加え、温度を維持しながらこの溶液を１時間撹拌した。１，５−ジブロモペタン（化合物７、１００ｇ）を加え、混合物を放置して室温に戻した。この混合物を室温で１時間撹拌し、重炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍｌ）中に注いだ。有機層を留去させた。残渣をシリカゲルカラムにかけ、ヘキサンに酢酸エチルを１０％含む溶液で溶出させ、所望する生成物を液体として得た（２９．２ｇ、収率３６．７％）。
【０１４５】
実施例２：Ｎ3−ＨＥ−ＯＥｔ（化合物（４））の調製
ＤＭＦ（５００ｍｌ）中、エチル７−ブロモ−２，２−ジメチルヘプタノエート（化合物３、２６．５ｇ）をアジ化ナトリウム（１３ｇ）と共に１００℃で２時間加熱した。混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムにかけ、ヘキサンに酢酸エチルを１０％含む溶液で溶出させ、所望する生成物を液体として得た（２０．５ｇ、収率９０．３％）。
【０１４６】
実施例３：Ｎ3−ＨＥ−ＯＨ（化合物（５））の調製
エタノール（５００ｍｌ）中、エチル７−アジド−２，２−ジメチルヘプタノエート（化合物４、２０．５ｇ）を水酸化ナトリウム（１０ｇ、８５％）と共に環流下２時間加熱した。混合物を濃縮し、水（４００ｍｌ）を加えた。濃塩酸を加えて混合物をｐＨ２まで酸性にし、酢酸エチル（５００ｍｌ）で抽出した。有機層を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムにかけ、ヘキサンに酢酸エチルを５０％含む溶液で溶出させ、所望する生成物を液体として得た（１７．１ｇ、収率９５％）。
【０１４７】
実施例４：Ｎ3−ＨＥ−Ｔ（化合物（７））の調製
７−アジド−２，２−ジメチルヘプタン酸（化合物５、８ｇ）をジクロロメタン（２００ｍｌ）に溶解した。塩化オキサリル（６．４ｇ）を加え、混合物を２時間環流させた後、溶媒留去した。残渣をジクロロメタン（１００ｍｌ）に溶解し、３'−アセチルチミジン（化合物６、５．８５ｇ）のピリジン（１００ｍｌ）溶液を加えた。この溶液を室温で２４時間撹拌し、重炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍｌ）に注いだ。混合物をジクロロメタン（５００ｍｌ）で抽出し、有機層を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムにかけ、ＤＣＭにメタノールを５％含む溶液で溶出させ、所望する生成物を無色固体として得た（５．６ｇ、収率６１％）。
【０１４８】
実施例５：ＮＨ2−ＨＥ−Ｔ（化合物（８））の調製
５'−（７−アジド−２，２−ジメチルヘプタノイル）３'−アセチルチミジン（化合物７、４．６５ｇ）は、Ｐｄ／Ｃ（１０％、０．５ｇ）の存在下、３０気圧をかけ、メタノール（２００ｍｌ）中、１時間かけて水素化した。混合物をろ過し、ろ液を溶媒留去して固体を得た（４．４ｇ、収率１００％）。
【０１４９】
実施例６：ＭｍｔＮＨ−ＨＥ−Ｔ（化合物（９））の調製
５'−（７−アミノ−２，２−ジメチルヘプタノイル）３'−アセチルチミジン（化合物８、４．４ｇ）、トリエチルアミン（４ｍｌ）および４−メトキシトリチルクロリド（７．５ｇ）は、ピリジン（１００ｍｌ）中で１０時間撹拌した。メチルアミン（４０％、１０ｍｌ）を加え、溶液を２時間撹拌した。混合物は、重炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍｌ）に注ぎ、ジクロロメタン（５００ｍｌ）で抽出した。有機層を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムにかけ、ＤＣＭにメタノールを５％含む溶液で溶出させ、所望する生成物を無色固体として得た（４．９ｇ、収率７１％）。
【０１５０】
実施例７：ＭｍｔＮＨ−ＨＥ−Ｔ−ホスホルアミディート（化合物（１０））の調製
アセトニトリル（５０ｍｌ）中、５'−（７−［（ＭＭＴ−アミノ）−２，２−ジメチルヘプタノイル］チミジン（化合物９、４．９ｇ）、Ｎ，Ｎ−テトライソプロピル−シアノエチルホスホルアミディート（３ｇ）およびテトラゾール（０．５ｇ）を一晩撹拌した。混合物は、重炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍｌ）に注ぎ、ジクロロメタン（５００ｍｌ）で抽出した。有機層を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムにかけ、ヘキサンに酢酸エチルを５０％含む溶液で溶出させ、所望する生成物を無色固体として得た（４．５ｇ、収率７１％）。
【０１５１】
実施例８：ＮＨ2−ＨＥ−オリゴ（化合物（１１））の調製
化合物１０をトリリンク・バイオテクノロジーズ社（Trilink Biotechnologies（米国カリフォルニア州所在））に運び、オリゴ合成の最終モノマーとして使用した。合成後にＭｍｔ基を脱保護し、オリゴをＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、化合物１１は、ＰＥＧコンジュゲーション用の遊離アミンとして得た。オリゴヌクレオチドの配列は、ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（配列番号４）であった。
【０１５２】
実施例９：ＰＥＧ−ＨＥ−オリゴ（化合物（１３））の調製
化合物１１（１０ｍｇ、１．７μｍｏｌ）のＰＢＳ緩衝液（５ｍｌ、ｐＨ７．８）溶液にＳＣ−ＰＥＧ（化合物１２、分子量３０ｋＤａ、５２０ｍｇ、１７μｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。反応混合物を５０ｍｌの水で希釈し、強力な陰イオン交換カラムであるＰｏｒｏｓＨＱ（１０ｍｍ×１．５ｍｍ、層容量約１６ｍｌ）を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（緩衝液Ａ）で予め平衡化したものにかけた。カラムは、３〜４容量の緩衝液Ａで洗浄し、過剰のＰＥＧリンカーを除去した。次に生成物を加え、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｂ）中、１０分間で１ＭのＮａＣｌの濃度を０〜１００％まで変化させた液で溶出させ、続いて、１００％の緩衝液Ｂで溶出させた（流速は１０ｍｌ／分）。溶出物は、ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム（５０ｍｌ）を用いて脱塩し、凍結乾燥することによって所望する化合物６ｍｇを得た。ＵＶによって測定した複合体中のオリゴヌクレオチドの当量は、６０％（ｗ／ｗ）であった。
【０１５３】
実施例１０：ＰＥＧ−リンカー−ＨＥ−オリゴ（化合物（１５））の調製
化合物１１（１０ｍｇ、１．７μｍｏｌ）のＰＢＳ緩衝液（５ｍｌ、ｐＨ７．８）溶液にＰＥＧ−リンカー−ＮＨＳ（化合物１４、分子量３０ｋＤａ、５２０ｍｇ、１７μｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。反応混合物を５０ｍｌの水で希釈し、強力な陰イオン交換カラムであるＰｏｒｏｓＨＱ（１０ｍｍ×１．５ｍｍ、層容量約１６ｍｌ）を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（緩衝液Ａ）で予め平衡化したものにかけた。カラムは、３〜４容量の緩衝液Ａで洗浄し、過剰のＰＥＧリンカーを除去した。次に生成物を加え、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｂ）中、１０分間で１ＭのＮａＣｌの濃度を０〜１００％まで変化させた液で溶出させ、続いて、１００％の緩衝液Ｂで溶出させた（流速は１０ｍｌ／分）。溶出物は、ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム（５０ｍｌ）を用いて脱塩し、凍結乾燥することによって所望する化合物５ｍｇを得た。ＵＶによって測定した複合体中のオリゴヌクレオチドの当量は、５０％（ｗ／ｗ）であった。
【０１５４】
実施例１１：ＢｏｃＮＨ−ＨＥ−Ｔ（化合物（１８））の調製
クロロホルム（１０ｍｌ）とＤＭＦ（５ｍｌ）の混合液に４−Ｂｏｃ−アミノ−２，２−ジメチル酪酸（化合物１６、０．５０ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）を溶解し、チミジン（化合物１７、０．７９ｇ、３．２５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を氷槽中で冷却し、ＥＤＣ（０．６２ｇ、３．２５ｍｍｏｌ）を加え、次に、ＤＭＡＰ（０．４０ｇ、３．２５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を放置して室温に戻し、２０時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣を酢酸エチルに懸濁し、０．１ＮのＨＣｌおよび塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧除去して粗油状物質を得た。これをシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけ、ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ（４０：６０、ｖ／ｖ）で溶出させることにより、所望する生成物０．２８ｇを得た。 13C NMR δ 177.21, 164.08, 156.41, 150.80, 135.46, 111.49, 85.43, 84.30, 80.21, 71.28, 63.77, 41.67, 41.08, 40.00, 37.69, 36.99, 28.87, 26.14, 25.55, 13.06。
【０１５５】
実施例１２：ＮＨ2−ＨＥ−Ｔ（化合物（１９））の調製
化合物１８（０．２５ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍｌ）に溶解し、この溶液に、室温でＴＦＡ（０．２５ｍｌ）をピペットで加えた。反応混合物は室温で２０分間撹拌した。溶媒およびＴＦＡは、ＤＣＭを加え、減圧下、共沸留去することによってＴＦＡを完全に除去し、ガラス状固体の生成物０．３２ｇを得た。 13C NMR (CD3CN)：δ 176.61, 164.22, 150.81, 136.41, 136.18, 110.82, 85.14, 85.07, 84.14, 83.97, 70.99, 64.56, 41.32, 39.35, 37.13, 36.92, 25.10, 24.92, 24.75, 12.08, 11.98。
【０１５６】
実施例１３：ＰＥＧ−ＨＥ−Ｔ（化合物（２１））の調製
ｍＰＥＧ−リンカー−ＮＨＳ（化合物２０、分子量２０ｋ、０．５０ｇ、０．０２４６ｍｍｏｌ）および化合物１９（２６ｍｇ、０．０７３８ｍｍｏｌ）は、ＤＣＭ（５ｍｌ）およびＤＭＦ（１ｍｌ）の混合物に溶解し、この溶液にＤＭＡＰ（１５ｍｇ、０．０１２３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は室温で２．５時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、粗生成物は、ジエチルエーテルを加えて沈澱させた。ろ過によって固体を回収し、アセトニトリル／ＩＰＡから再結晶させることにより、白色固体の生成物０．４３ｇを得た。13C NMR：δ 177.9, 168.0, 164.0, 150.9, 134.9, 133.1, 129.8, 128.1, 110.2, 84.4, 83.9, 70.4, 67.8, 64.5, 63.2, 60.0, 58.7, 40.1, 39.4, 37.2, 25.2, 24.7, 16.1, 12.2。
【０１５７】
実施例１４：ＰＥＧ−ＨＥ−Ｔ（化合物（２３））の調製
ｍＰＥＧ−ＮＨＳ（化合物２２，分子量２０ｋ、１ｇ、０．０４９２ｍｍｏｌ）および化合物１９（２６ｍｇ、０．１４７６ｍｍｏｌ）は、ＤＣＭ（１０ｍｌ）およびＤＭＦ（２ｍｌ）の混合物に溶解し、この溶液にＤＭＡＰ（３０ｍｇ、０．２４６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は室温で２．５時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、粗生成物は、ジエチルエーテルを加えて沈澱させた。ろ過によって固体を回収し、アセトニトリル／ＩＰＡから再結晶させることにより、白色固体の生成物０．９０ｇを得た。13C NMR：δ 178.2, 162.9, 156.0, 149.5, 134.6, 110.3, 84.4, 83.4, 70.1, 69.1, 64.4, 63.5, 62.6, 61.2, 58.6, 40.6, 40.0, 39.4, 37.1, 12.2。
【０１５８】
実施例１５：緩衝液およびラット血漿中でのＰＥＧ複合体の安定性測定
加水分解速度は、Ｃ８逆相カラム（Ｚｏｒｂａｘ（登録商標）ＳＢ−Ｃ８）を使用し、濃度勾配流動層としては、（ａ）０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液および（ｂ）アセトニトリルからなるものを用いて求めた。流速は１ｍｌ／分とし、クロマトグラムのモニターは、パクリタクセル用に２２７ｎｍ、およびオリゴヌクレオチド用に２６０ｎｍにおいてＵＶ検出器を使用して行った。緩衝液中での加水分解については、０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）または水に５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＥＧ誘導体を溶解し、一方、血漿中での加水分解については、蒸留水に２０ｍｇ／１００μｌとなるようにＰＥＧ誘導体を溶解し、この溶液にラット血漿９００μｌを加えた。混合物は、２分間激しく撹拌し、２ｍｌのガラスバイアルに各１００μｌずつ分けて入れた。溶液は、３７℃で時間を変えてインキュベートした。正確な間隔を空けてメタノール−アセトニトリル混合液（１：１、ｖ／ｖ、４００μｌ）をバイアルに加え、この混合物を１分間激しく撹拌し、その後、０．４５ｍｍのフィルター膜を通してろ過した（場合によっては、０．２ｍｍのフィルター膜を用いて２回目のろ過を行った）。ろ液のアリコート２０μｌをＨＰＬＣに入れた。ピーク面積に基づき、元の化合物およびＰＥＧ誘導体の量を推定し、また、ＰＥＧ誘導体の消失に基づく直線回帰分析を用い、異なる溶媒中での各化合物の半減期を計算した。本実施例で行った化合物に対する安定性試験の結果を表２に示す。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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