(57)【要約】本発明は、HIV感染の処置、HIV-1の薬物耐性株に対する阻害のための組成物および方法、ならびにHIV-1の薬物耐性株に対するペプチド阻害剤の抗HIV効力を増強する方法を提供する。具体的には、宿主細胞へのHIVの侵入を阻害するためのオリゴマーC-ペプチド阻害剤を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HIVウイルスの侵入を阻害する、アミノ酸配列
2010521478.tif 000036
を有する複数のペプチドまたはその断片および/もしくは変種を含む組成物であって、該複数のペプチドが分子リンカーにより物理的に連結されている、組成物。
【請求項２】
二つのペプチドの二量体である、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
三つのペプチドの三量体である、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
ペプチドが同一である、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
ペプチドが異なる、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
分子リンカーがペプチドリンカー分子である、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
ペプチドリンカーが少なくとも2個のアミノ酸残基を含む、請求項6記載の組成物。
【請求項８】
ペプチドリンカーが2〜10個のアミノ酸残基を含む、請求項7記載の組成物。
【請求項９】
分子リンカーが化学的リンカーである、請求項1記載の組成物。
【請求項１０】
ペプチドが、アミノ酸配列:
2010521478.tif 000037
からなるHIVウイルスの侵入を阻害するペプチド断片または変種の群より選択される、請求項1記載の組成物。
【請求項１１】
分子リンカーにより複数のC-ペプチド阻害剤分子を物理的に連結する段階を含む、所与のHIV C-ペプチド阻害剤の抗HIV効力を増強する方法。
【請求項１２】
二つのC-ペプチド阻害剤が連結されて、二量体C-ペプチド阻害剤を形成する、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
三つのC-ペプチド阻害剤が連結されて、三量体C-ペプチド阻害剤を形成する、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
分子リンカーがペプチドリンカー分子である、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
分子リンカーが少なくとも2個のアミノ酸残基を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
分子リンカーが化学的リンカーである、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
C-ペプチド阻害剤が、アミノ酸配列:
2010521478.tif 000038
からなるC-ペプチドの群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１８】
請求項1〜10記載の組成物と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
HIVウイルスの侵入を阻害する、アミノ酸配列
2010521478.tif 000039
を有する複数のペプチドまたはその断片および/もしくは変種を含むタンパク質をコードする単離核酸であって、該複数のペプチドがペプチドリンカーにより物理的に連結されている、単離核酸。
【請求項２０】
コードされるタンパク質が二つのペプチドの二量体である、請求項19記載の単離核酸。
【請求項２１】
コードされるタンパク質が三つのペプチドの三量体である、請求項19記載の単離核酸。
【請求項２２】
ペプチドリンカー分子が少なくとも2個のアミノ酸残基を含む、請求項19記載の単離核酸。
【請求項２３】
必要としている対象に、HIVウイルスの侵入を阻害する、アミノ酸配列
2010521478.tif 000040
を有する複数のペプチドまたはその断片および/もしくは変種を含む抗HIV活性を有する組成物の有効量を投与する段階であって、該ペプチドが分子リンカーにより物理的に連結されている、段階
を含む、対象において抗HIV療法に耐性であるHIV感染を処置する方法。
【請求項２４】
必要としている対象に、HIVウイルスの侵入を阻害する、アミノ酸配列
2010521478.tif 000041
を有する複数のペプチドまたはその断片および/もしくは変種を含む抗HIV活性を有する組成物の有効量を、抗HIV療法と組み併せて投与する段階であって、該ペプチドが分子リンカーにより物理的に連結され、耐性の発現が阻止される、段階
を含む、対象において抗HIV療法に対するHIV耐性の発現を阻止する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は2007年3月12日付で出願された米国仮特許出願第60/906,421号の35 U. S. C. 第119条（e）項の下での恩典を主張するものであり、その特許出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府支援
本発明は米国立衛生研究所によって与えられた助成金番号GM66682の下での政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、後天性免疫不全症候群（AIDS、免疫系が働かなくなり始め、致死的な日和見感染を引き起こす、ヒトでの状態）を引き起こすレトロウイルスである。HIV感染は主要な世界的健康問題であり続けている。現在、HIVまたはAIDSに対するワクチンまたは治療法は存在していない。逆転写酵素およびプロテアーゼ酵素を標的としている現在の抗HIV療法は、高い代償、つまり長期使用後に耐性および副作用を生み出す可能性の高さに苦しんでいる。このように、依然として、より強力な化合物および/または新規の抗ウイルス標的により新たな抗ウイルス戦略を開発する必要がある。
【０００４】
HIV細胞融合機構の特徴付けおよびこの過程に関与する関連タンパク質の相互作用の初期マッピングによって、ケモカイン共受容体を新たな抗ウイルス標的と同定かつ利用する機会が得られた。HIV膜融合粒子は、ウイルス由来のgp120、gp41、細胞由来のCD4およびケモカイン共受容体からなり、細胞へのウイルスの侵入を可能にするには、これらの全てが協調的な形で相互作用する必要がある。これらの成分の構造分析は、gp120:CD4結合とは異なるいくつかの新たな抗ウイルス融合標的の同定をもたらした。3種の膜融合粒子アンタゴニスト:（1）ケモカイン共受容体を標的としたリボザイムに基づく遺伝子治療;（2）gp41のドメインまたはケモカイン共受容体のどちらかを標的としたペプチドに基づくアンタゴニスト; および（3）ウイルスと共受容体間の相互作用を標的とした小分子阻害剤が登場している。
【０００５】
膜融合粒子アンタゴニストのなかで、ペプチドに基づくアンタゴニストは、新たな抗HIV治療物質の開発の前進に向けて非常に期待視されてきた。C-ペプチドは、HIV-1膜貫通糖タンパク質gp41の細胞外ドメイン（外部ドメイン）のC末端領域に由来するポリペプチド薬の集合名である。表面糖タンパク質gp120とともに、gp41はウイルス膜および細胞膜の融合を通じてHIV-1の侵入を媒介する。この過程は、gp120と標的細胞CD4との相互作用に始まり、ヘアピン三量体構造へのgp41外部ドメインの崩壊で最高潮に達する一連の協調的な構造変化を伴う。この最終の立体構造の熱安定中心は、3つのgp41外部ドメイン由来のHR1およびHR2ヘプタッド反復領域の会合により形成される6つのα-ヘリックスの束である。HR2領域に由来するC-ペプチドは、融合の前にHR1領域に結合し、それによってウイルスの侵入を阻害することによりgp41ヘアピン三量体の形成を遮断する。
【０００６】
現在、ヒトでのHIV感染の処置のために認可されたペプチドに基づくアンタゴニストは一つしかない。C-ペプチドT20（エンフュービルタイド-Hoffmann-La Roche & Trimeris; 米国特許第5,464,933号（特許文献1））は、AIDSに苦しむ患者の処置のためFDAにより認可された初のHIV-1侵入阻害剤である。それは、現在、他のもっと従来型の薬物（逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤）による処置が奏功しなかった患者のサルベージ療法において大いに利用されている。しかしながら、T20の臨床用途に関する主な問題は、耐性突然変異の急速出現である。ゆえに、HIV-1の一般株および耐性株に対してより強力な化合物および/または新規の抗ウイルス標的による新たな抗HIV戦略、ならびにHIV処置計画の間のHIV耐性株の発現の抑制に狙いを定めた新たな治療戦略の差し迫った必要性も存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第5,464,933号
【発明の概要】
【０００８】
本発明の態様は、HIV細胞融合のC37 C-ペプチド阻害剤のホモ二量体またはT20 C-ペプチド阻害剤のホモ二量体が、単量体C37またはT20に対して耐性になったHIVのHIV侵入を阻害するうえで、単量体C-ペプチドまたはT20よりも効果的であるという発見に基づく。C37のホモ二量体は、二つの同一の単量体C37ペプチド阻害剤を有し、T20のホモ二量体は、二つの同一の単量体T20ペプチド阻害剤を有する。
【０００９】
一つの態様において、HIVウイルスの侵入を阻害するアミノ酸配列
2010521478.tif 000002
を有する複数のペプチドまたはその断片および/もしくは変種を含んだ組成物が提供され、該複数のペプチドは分子リンカーにより物理的に連結されている。この態様の組成物において用いられるペプチド断片は、アミノ酸配列:
2010521478.tif 000003
からなるペプチド断片の群より選択される。
【００１０】
KYT、KYI、およびNYIのようなSED. ID. No. 1のNYTにおいて突然変異を有するペプチドが本発明に含まれる。
【００１１】
分子リンカーによる複数のペプチドの物理的連結は、ペプチドのオリゴマーを生ずる。この組成物は、二つのペプチドの二量体、三つのペプチドの三量体、四つのペプチドの四量体、または五つのペプチドの五量体であるオリゴマーペプチドを含むことができる。好ましい態様において、オリゴマーペプチドは二つのペプチドの二量体および/または三つのペプチドの三量体である。一つの態様において、オリゴマーペプチドは、本明細書において開示される本発明による同一のペプチドを含んだホモオリゴマーペプチドである。異なるペプチド、その断片および/または変種を含むヘテロオリゴマーペプチドも企図される。
【００１２】
一つの態様において、ペプチドを連結してオリゴマーペプチドを形成させる分子リンカーは、ペプチドリンカー分子または化学的リンカーでありうる。ペプチドリンカー分子は少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸残基を含むことができる。
【００１３】
一つの態様において、所与のHIV C-ペプチド阻害剤の抗HIV効力を増強するための方法が提供され、本方法は、分子リンカーにより多数のC-ペプチド阻害剤分子を物理的に連結する段階を含む。この態様のC-ペプチド阻害剤は、アミノ酸配列:
2010521478.tif 000004
からなるC-ペプチドの群より選択される。
【００１４】
分子リンカーによる複数のペプチドの物理的連結は、C-ペプチド阻害剤のオリゴマーを生ずる。オリゴマーC-ペプチド阻害剤は、二つのC-ペプチドの二量体、三つのC-ペプチドの三量体、四つのC-ペプチドの四量体、または五つのC-ペプチドの五量体であってよい。好ましい態様において、オリゴマーC-ペプチド阻害剤は、二つのC-ペプチドの二量体および/または三つのC-ペプチドの三量体である。一つの態様において、オリゴマーC-ペプチド阻害剤は、本明細書に記載の同一のC-ペプチドを含んだホモオリゴマーC-ペプチド阻害剤である。異なるC-ペプチド、その断片および/または変種を含むヘテロオリゴマーC-ペプチド阻害剤も企図される。
【００１５】
一つの態様において、C-ペプチド阻害剤を連結してオリゴマーC-ペプチド阻害剤を形成させる分子リンカーは、ペプチドリンカー分子または化学的リンカーでありうる。ペプチドリンカー分子は少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸残基を含むことができる。
【００１６】
一つの態様において、HIVウイルスの侵入を阻害する、アミノ酸配列
2010521478.tif 000005
を有する複数のペプチドまたはその断片および/もしくは変種を含んだ抗HIV活性を有する組成物と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物が提供され、該複数のペプチドは分子リンカーにより物理的に連結されている。この態様において、組成物において用いられるペプチド断片は、アミノ酸配列:
2010521478.tif 000006
からなるペプチド断片の群より選択される。
【００１７】
一つの態様において、HIVウイルスの侵入を阻害する、アミノ酸配列
2010521478.tif 000007
を有する複数のペプチドまたはその断片および/もしくは変種を含んだタンパク質をコードする単離核酸が提供され、該複数のペプチドはペプチドリンカー分子により物理的に連結されている。単離核酸によってコードされるタンパク質は、二つのペプチドの二量体、三つのペプチドの三量体、四つのペプチドの四量体、または五つのペプチドの五量体であってよい。好ましい態様において、タンパク質は、二つのペプチドの二量体および/または三つのペプチドの三量体である。一つの態様において、コードされるタンパク質は、本明細書に記載の同一のペプチドを含んだホモオリゴマーペプチドである。異なるペプチド、その断片および/または変種を含むヘテロオリゴマーペプチドも企図される。コードされるタンパク質中の同一のまたは異なるペプチドは、グリシン、チロシン、システイン、リジン、プロリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸などのスペーサーアミノ酸により分離されうる。一つの態様において、タンパク質中のペプチド間のスペーサーアミノ酸の長さは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸残基である。
【００１８】
一つの態様において、対象において抗HIV療法に耐性であるHIV感染を処置するための方法が提供され、本方法は、それを必要としている対象に、HIVウイルスの侵入を阻害するアミノ酸配列
2010521478.tif 000008
を有する複数のペプチドまたはその断片および/もしくは変種を含んだ抗HIV活性を有する組成物の有効量を投与する段階を含み、これらのペプチドは分子リンカーにより物理的に連結されている。
【００１９】
一つの態様において、対象において抗HIV療法に対するHIV耐性の発現を阻止するための方法が提供され、本方法は、それを必要としている対象に、HIVウイルスの侵入を阻害するアミノ酸配列
2010521478.tif 000009
を有する複数のペプチドまたはその断片および/もしくは変種を含んだ抗HIV活性を有する組成物の有効量を、抗ウイルスHIV療法と併せて投与する段階を含み、これらのペプチドは分子リンカーにより物理的に連結されている。
【００２０】
本明細書において開示される本発明の態様は、HIVプロテアーゼ阻害剤、HAART、およびHIVインテグラーゼ阻害剤を含む他の抗ウイルスHIV療法で実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】結合親和性の増強したC-ペプチドのデザインを示した模式図を示す。
【図１Ｂ】gp41ヘアピン三量体の中心を形成する6ヘリックス束の軸方向像を示す。このモデルはN36およびC34ペプチド（図1A中のWTおよびC37配列における下線の残基）の結晶構造に基づく。
【図１Ｃ】gp41ヘアピン三量体の中心を形成する6ヘリックス束の側面像を示す。このモデルはN36およびC34ペプチド（図1A中のWTおよびC37配列における下線の残基）の結晶構造に基づく。
【図２Ａ】野生型C37ペプチドによるT20-およびC37-耐性HIV-1の阻害を示す。
【図２Ｂ】野生型C37_KYIペプチドによるT20-およびC37-耐性HIV-1の阻害を示す。菌株HXB2由来の野生型Env（黒四角）またはV549E変異Env（Res1、黒丸）のどちらかで偽型にしたウイルスを利用して、HOS-CD4-Les標的細胞に感染させた。
【図２Ｃ】野生型（C37_GC)2ペプチドによるT20-およびC37-耐性HIV-1の阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本明細書において他に定義されていない限り、本出願に関連して用いられる科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００２３】
本発明は、本明細書に記載する特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、したがって変わることがあるものと理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、単に特定の態様を記載する目的のためであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定するよう意図されるものではない。
【００２４】
他に指定されている場合、または操作例の場合を除き、本明細書において用いられる成分の量または反応条件を表す全ての数は、いかなる場合でも、「約」という用語によって修飾されるものと理解されるべきである。「約」という用語は、百分率と関連して用いられる場合、平均値±1%を意味することができる。
【００２５】
特定されている全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用できるそのような刊行物に記載の方法論を、記載および開示する目的で参照により本明細書に明示的に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日の前にこれらが単に開示されたことを示しているだけである。この点で、本発明者らが先行発明によってまたはその他任意の理由で、そのような開示に先行する資格がないと認めるものと解釈されるべきではない。日付に関する全ての記載またはこれらの書類の内容に関する表現は、本出願者らが入手できる情報に基づいており、これらの書類の日付または内容の正確さに関して何らの承認をなすものではない。
【００２６】
特に指定のない限り、本明細書において記載される組成物および方法は、例えばManiatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA（1982）; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual（2 ed.）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA（1989）; Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA（1986）; Current Protocols in Protein Science（CPPS）（John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.）およびCurrent Protocols in Immunology（CPI）（John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.）, Current Protocols in Cell Biology（CPCB）（Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.）, Virology Methods Manual, First Edition（Hillar O. Kangro, ed., Academic Press, 1996）, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition（2005）, Animal Cell Culture Methods（Methods in Cell Biology, Vol 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998）に記載されているように、標準的な手順を用いて作出または使用され、それらの参考資料は全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２７】
定義
本明細書において種々の通常アミノ酸に用いられる一文字および三文字略記はPure Appl. Chem. 31, 639-645（1972）and 40, 277-290（1974）において推奨される通りであり、37 CFR § 1.822（55 FR 18245, May 1, 1990）に従う。これらの略記は、特にD-またはD,L-と指定されない限り、L-アミノ酸を表す。ある種のアミノ酸は、天然のものも非天然のものもともに、光学不活性、例えばグリシンである。全てのペプチド配列は、N末端アミノ酸を左側におよびC末端アミノ酸を右側にして示される。
【００２８】
「アミノ酸」とは一般式: NH2-CRH-COOHを有する化合物をいうよう本明細書において用いられ、ここで側鎖RはHまたは有機基である。Rが有機的である場合、Rは多様であってよく、極性または非極性（すなわち、疎水性）のいずれかである。本発明のアミノ酸は、天然に存在してもまたは合成（非タンパク質新生といわれることが多い）されてもよい。本明細書で用いる場合、有機基は、脂肪族基、環式基、または脂肪族基および環式基の組み合わせと分類される炭化水素基である。「脂肪族基」という用語は、飽和または不飽和直鎖または分枝鎖炭化水素基を意味する。この用語は、例えば、アルキル、アルケニル、およびアルキニル基を包含するように用いられる。「環式基」という用語は、脂環式基、芳香族基、または複素環式基と分類される閉環式炭化水素基を意味する。「脂環式基」という用語は、脂肪族基のものに類似した特性を有する環式炭化水素基を意味する。「芳香族基」という用語は、単環式または多環式芳香族炭化水素基をいう。本明細書で用いる場合、有機基は置換されてもまたは置換されなくてもよい。当技術分野において公知の20種の通常アミノ酸は、本明細書に記載されるペプチドの合成に使われる好ましいアミノ酸である。
【００２９】
本明細書で用いる場合、「抗HIV活性」という用語は、宿主細胞へのHIVウイルスの侵入を阻害し、遮断し、妨害し、阻止し、または停止し、かくして宿主細胞中でのHIVウイルスの複製および増殖、ならびにHIVウイルスに感染した対象におけるHIVウイルスの蔓延を阻害する活性をいう。抗HIV活性は同様に、ウイルス膜と宿主細胞膜の融合の阻害をいう。
【００３０】
「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、アミノ酸の重合体をいうように本明細書において互換的に用いられる。これらの用語は、アミノ酸の重合体の特定の長さを意味しない。したがって、例えば、この用語は、組換え技術、化学的もしくは酵素的合成を用いて産生されるか、または天然に存在するかにかかわらず、二つまたはそれ以上の物理的に連結されたペプチドで構成されているオリゴマーペプチドを含む。この用語は、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などにより修飾されまたは誘導されたポリペプチドも含む。
【００３１】
本明細書で用いる場合、C-ペプチドは、アミノ酸番号114-162（SEQ. ID. No. 8）を含んだ、HIV-1膜貫通糖タンパク質gp41タンパク質（SEQ. ID. No. 7, Genbankアクセッション番号NP_579895）のC末端細胞外ドメイン（外部ドメイン）ヘプタッド反復領域2（HR2）領域に由来するアミノ酸配列を含むペプチドである。gp41のこのC末端ヘプタッド反復領域2（HR2）は、いくつかの広く知られたC-ペプチドの供給源であり、アミノ酸番号114-150（SEQ. ID. No. 9）に対応するC37（Root, M., et. al., 2001, Science, 291: 884）、アミノ酸番号117-150（SEQ. ID. No. 10）に対応するC34（Chan, C., et. al., 1997, Cell 89: 263; Nameki, D., et. al., 2005, J. Virol., 79:764）、およびアミノ酸番号127-162（SEQ. ID. No. 11）に対応するT20（米国特許第5,464,933号）は、このC末端ドメインに由来する。C-ペプチドは、全49アミノ酸、またはもっと小さなその断片、例えば37、34または36アミノ酸を有するC-ペプチドを含むことができる。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「断片」という用語は、gp41のHR2領域のアミノ酸配列（アミノ酸番号114-162）に対応する49アミノ酸を下回るおよび10アミノ酸を上回るアミノ酸配列をいう。これらのC-ペプチドおよび「断片」は、宿主細胞へのHIVウイルスの侵入に対する阻害活性を有する。当技術分野において公知のおよび本明細書に記載の方法を、C-ペプチドによる宿主細胞へのウイルス侵入の阻害活性を評価するために使用することができる。
【００３３】
本明細書で用いる場合、「阻害する」または「阻害」という用語は、新たな宿主細胞に感染するHIVウイルス（多数の菌株）およびヒト対象内での感染の蔓延の低減および/または阻止を意味する。阻害は、培養宿主細胞へのHIVウイルスの侵入のインビトロ実験またはHIV陽性ヒト対象内を循環しているCD4+ T細胞の数の測定のような、当技術分野において公知のさまざまな方法により決定することができる。HIVの菌株は、薬物耐性株および非薬物耐性株を含み、菌株HIV-1およびHIV-2と、HIV-1およびHIV-2の変種菌株とを含む。「阻害」は、ウイルス感染の速度の緩徐化を含む。HIV感染が「阻害」される場合、感染の速度は、本明細書に記載の抗HIV組成物がない場合と比べて、少なくとも約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%までに、または100%までにも低減される。細胞融合阻害アッセイ法は米国特許第5,464,933号および同第6,656,906号に十分に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「C-ペプチド阻害剤」という用語は、HIVウイルスの侵入を阻害する上記のC-ペプチドである。本明細書において用いられる「C-ペプチド」および「C-ペプチド阻害剤」は、互換的に用いられる。
【００３５】
「処置する」および「処置」という用語は、対象がHIVウイルスに感染していると診断されている場合の治療的処置をいう。「処置する」および「処置」という用語は、そのような対象における正常CD4+ T細胞の感染および破壊の阻止または緩徐化をいう。それは同様に、極端に低いCD4+ T細胞数およびマイコバクテリア属の種（Mycobacteria sp.）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumopcystis carinii）、ニューモシスチス・クリプトコッカス（Pneumopcystis cryptococcus）などのような日和見病原体による反復性感染症のような、後天性免疫不全症の症状の発症の阻止および緩徐化をいう。有益なまたは望ましい臨床結果は、絶対的なナイーブCD4+ T細胞数の増大（範囲10〜3520）、全循環免疫細胞に対するCD4+ T細胞の割合の増大（範囲1〜50%）、および/または非感染対象における正常CD4+ T細胞数の割合としてのCD4+ T細胞数の増大（範囲1〜161%）を含むが、これらに限定されることはない。「処置」は同様に、対象が何のHIV標的処置も受けていなかった場合に予想される生存期間と比較して、感染対象の生存期間を延長することを意味することもできる。
【００３６】
処置の有効性は、感染対象の血中のウイルス量およびCD4+ T細胞数をモニタリングすることによって評価することができる。処置の開始後2〜4週以内に、ウイルス量が、1 log以上、好ましくは10,000コピー/ml HIV-RNA未満に低下するはずである。ウイルス量の低下が<0.5 logなら、またはHIV-RNAが100,000を超えたままなら、処置は、薬物を追加するかまたは切り替えるかのいずれかにより調整されるべきである。ウイルス量の測定は、患者が臨床的に安定であれば、4〜6ヶ月ごとに繰り返されるべきである。ウイルス量が前処置レベルの0.3〜0.5 logに戻ったなら、治療はもはや効いておらず、変更されるべきである。処置の開始から2〜4週以内に、CD4+ T細胞数は少なくとも細胞30個/mm3までに増大されるべきである。これが達成されなければ、治療は変更されるべきである。CD4+ T細胞数のモニタリングは、臨床的安定期の3〜6ヶ月ごとになされるべきであり、さらに頻繁には、症候性疾患が起こるたびになされるべきである。CD4+ T細胞数がベースラインまでに（または前処置からの増大50%未満に）落ちれば、治療は変更されるべきである。
【００３７】
「治療上有効量」とは、さらなる抗HIV治療法の非存在下での宿主細胞へのHIVウイルスの侵入を低減するのに必要な量を意味する。この量は、HIV感染対象においてウイルス量の低減およびCD4+ T細胞数の増大をもたらすべきである。ウイルス量の低減は、本明細書において記載されるいずれかの抗HIV組成物がない場合と比べて、少なくとも約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、またはそれ以上およびそれらの間の全ての割合である。CD4+ T細胞数は、正常な非HIV感染CD4+ T細胞数の少なくとも約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、またはそれ以上およびそれらの間の全ての割合であるべきである。一般的に最大用量、すなわち健全な医学的判断による最高の安全用量が使用されることが好ましい。しかしながら、医学的な理由、心理的な理由から、別の抗HIV薬が同時に投与される場合、または別の理由から、処置を行う医師の裁量の範囲内で、もっと低用量または耐用量が投与されてもよいことを当業者は理解するであろう。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「C-ペプチドの変種型」という用語は、それぞれ、一つもしくは複数のアミノ酸、ヌクレオチド塩基対、コドン、イントロン、またはエクソンで修飾されたC-ペプチドを指し（またはそれらをコードする核酸配列を指し）、宿主細胞へのHIV侵入に対するその阻害活性により決定されるように、野生型C-ペプチドの生物活性および細胞機能の少なくとも80%を保持している。すなわち、変種C-ペプチド配列は、gp41遺伝子のC末端HR2ドメイン（SEQ. ID. No. 12）（Genbankアクセッション番号BD407105、NC_001802、AJ293865）によって規定されるものとはわずかに異なる。変種C-ペプチドの中には保存または非保存アミノ酸残基とともに一つまたは複数のアミノ酸突然変異が存在する。例えば、アミノ酸のセリンはトレオニンに代わって置き換えられることができ、アミノ酸のアスパラギン酸はグルタミン酸に代わって置き換えられることができる。変種C-ペプチドは、一つまたは複数の置換によってアミノ酸配列が異なりうる。好ましい変種の中には、保存的アミノ酸置換により参照ポリペプチドと異なるものも含まれる。そのような置換は、所与のアミノ酸を、似た特徴の別のアミノ酸により置き換えるものである。保存的置換は、脂肪族アミノ酸Ala、Val、Leu、およびIle間での、一方から他方への置換; ヒドロキシル残基SerおよびThrの相互交換; 酸性残基AspおよびGluの交換; アミド残基AsnおよびGln間の置換; 塩基性残基LysおよびArgの交換; ならびに芳香族残基PheおよびTyr間の置換である。以下の非限定的なアミノ酸の列挙は保存的置換（類似）とみなされる: （a）アラニン、セリン、およびトレオニン; （b）グルタミン酸およびアスパラギン酸; （c）アスパラギンおよびグルタミン; （d）アルギニンおよびリジン; （e）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン、ならびに（f）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。最も好ましいのは、その元となる親C-ペプチドと同じ生物学的機能および活性を保持する変種C-ペプチドであり、その機能および活性は宿主細胞へのHIVウイルスの侵入の阻害である。
【００３９】
gp41タンパク質（SEQ. ID. No. 7）のAsp126（gp160前駆体糖タンパク質中のAsp637, SEQ. ID. No. 20）にN→K突然変異を有するC-ペプチド、および／またはgp41タンパク質のThr128（gp160のThr639に対応する）にT→I突然変異を有するC-ペプチドは、変種C-ペプチドと考えられる。例えば、
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は
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の変種であり、および
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は
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の変種である。gp41のHR2領域のその他の変種C-ペプチドは、米国特許出願第2006/0247416号に記載されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【００４０】
用語「変種」としての変種C-ペプチドは、本明細書において用いられ、親C-ペプチドに匹敵するまたは親C-ペプチドを超えるHIV侵入阻害活性を有する。変種C-ペプチドは、親C-ペプチドのHIV侵入阻害活性の少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも110%、少なくとも120%、少なくとも130%、少なくとも140%、または少なくとも150%を有するであろう。変種は、例えば、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、指数的アンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、GSSM、およびそれらの任意の組み合わせのような方法を含め、いくつかの手段によって作出することができる。当技術分野において公知の方法および本明細書に記載の方法を、C-ペプチドによる宿主細胞へのウイルスの侵入の阻害を評価するために使用することができる。
【００４１】
本明細書において用いられる「オリゴマー」という用語は、C-ペプチドに関して用いられる場合、単量体C-ペプチドの有限数の構築ブロックで構成されている複合体をいう。オリゴマー形成は、C-ペプチドの単量体をC-ペプチドの複合体に変換する過程である。
【００４２】
本明細書で用いる場合、ペプチドリンカーは、連結されている二つのペプチドのどちらの配列の一部でもないアミノ酸の短い配列である。ペプチドリンカーはそのアミノ末端で一方のポリペプチドまたはポリペプチドドメインに付着され、そのカルボキシル末端でもう一方のポリペプチドまたはポリペプチドドメインに付着される。有用なリンカーペプチドの例には、グリシン-セリンおよびグリシン-アラニン重合体を含むグリシン重合体（（G)n）（例えば（Gly4Ser)nリピート、ここでn=1〜8、好ましくは、n=3、4、5または6）が含まれるが、これらに限定されることはない。ペプチドリンカーは、その配列がタンパク質において公知のいかなる二次構造、例えばαヘリックスも取らないという点で、可動性リンカーでありうる。そのような可動性リンカーは、非荷電非極性アミノ酸残基で主に構成され、疎水性である。二次タンパク質構造は、当技術分野において公知の方法、例えば、円偏光二色性により決定することができる。可動性ペプチドリンカーの例は
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である。あるいは、ペプチドリンカーは、単量体の親水性α-ヘリックス、例えば
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の形態をとることもできる。
【００４３】
例えば、C-ペプチドをコードする構築体に関連して本明細書において用いられる「ベクター」という用語は、HIV-1膜貫通糖タンパク質gp41タンパク質のHR2領域、アミノ酸番号114-162（SEQ. ID. No. 12）（Genbankアクセッション番号BD407105、NC_001802、AJ293865）の全部または一部のコード配列を含む核酸構築体であって、宿主細胞への送達、異なる宿主細胞間での移動のために、または細胞中でのC-ペプチド、オリゴマーC-ペプチド、もしくはそのC-ペプチド変種の発現のためにデザインされた核酸構築体をいう。核酸構築体は、反復HR2領域を有するポリペプチドを発現するために縦列に配列されたHR2領域のコード配列のいくつかのコピーを有することができる。本明細書で用いる場合、ベクターはウイルス性または非ウイルス性であってよい。
【００４４】
本明細書において他に定義されていない限り、本出願に関連して用いられる科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００４５】
本発明の態様は、公知のHIV C-ペプチド阻害剤のオリゴマーがHIVの侵入を阻害するうえで、単量体のHIV C-ペプチド阻害剤と等しく有効であり、このオリゴマーに対して決定された細胞侵入の阻害IC50がナノモル範囲にあるという発見に基づく。さらに驚きなのは、これらのオリゴマーC-ペプチド阻害剤がHIVのC-ペプチド耐性株に対してより有効なことである。HIVのこれらの耐性株は単量体の親C-ペプチド阻害剤に耐性となっており、したがって単量体の親C-ペプチドはHIV細胞融合およびその後の細胞侵入を阻害するうえでもはや有効ではない。耐性株HIVの細胞侵入に関するこれらのオリゴマーC-ペプチド阻害剤のIC50阻害値も、ナノモル範囲内にある。
【００４６】
C-ペプチドは、HIV-1膜貫通糖タンパク質gp41（SEQ. ID. No. 7, Genbankアクセッション番号NP_579895）の細胞外ドメイン（外部ドメイン）のC末端領域に由来する、主にヘプタッド反復（HR2）領域に由来するペプチド薬の集合名である。表面糖タンパク質gp120とともに、gp41はウイルス細胞膜および宿主細胞膜の融合を通じてHIV-1の侵入を媒介する。この過程は、gp120と標的細胞表面受容体CD4との相互作用に始まり、ヘアピン三量体構造へのgp41外部ドメインの崩壊で最高潮に達する一連の協調的な構造変化を伴う。この最終の立体構造の熱安定中心は、3つのgp41外部ドメイン由来のHR1およびHR2ヘプタッド反復領域の会合により形成される6つのα-ヘリックスの束である。HR2はHR1と相互作用し、ヘアピン三量体構造の形成に関わる。HR2領域に由来するC-ペプチドは、膜融合の前にHR1領域に結合し、それによってウイルスの侵入を阻害することによりgp41ヘアピン三量体の形成を遮断する。
【００４７】
C-ペプチドT20（エンフュービルタイド-Hoffmann-La Roche & Trimeris; 米国特許第5,464,933号）は、AIDSに苦しむ患者の処置のためFDAにより認可された初のHIV-1侵入阻害剤である。それは
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のペプチド配列を有する。HIV-1侵入の遮断に有効であることが示されている他の公知のC-ペプチドは、
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の配列を有するC37（Root, M., et. al., 2001, Science 291:884）および
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の配列を有するC34（Chan, D., et. al., 1997, Cell 89:263-73; Malashkevich, V. N., et. al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9134-9）を含む。T20は、現在、他のもっと従来型の薬物（逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤）による処置が奏功しなかった患者のサルベージ療法において大いに利用されている。T20はHIV侵入に対して非常に強力である（IC50および1 nm）。しかしながら、T20の臨床用途に関する主な問題は、耐性突然変異の急速出現であり、この場合IC50がひいては>900 nmになる。Trimeris Inc.によるT1249のような、T20に類似したC-ペプチド阻害剤の特性を生み出そうという試みは、臨床試験において成功していない。
【００４８】
C-ペプチドは、CD4-gp120相互作用からヘアピン三量体形成までの動態（kinetic window）のなかでgp41を阻害する。結果として、その効力は、結合親和性に左右されるだけでなく、C-ペプチドとgp41の会合速度および感受性の中間状態の存続期間のような動的パラメータによっても影響を受ける。これらの動的パラメータ（ウイルス株および感染可能な標的細胞に依るバラツキ）は、T20およびC37の効力を低ナノモル域に抑制する傾向がある。T20およびC37の密着結合性の変種は、同じナノモルの効力で野生型ウイルスを阻害する傾向がある。
【００４９】
C-ペプチドに対する耐性は、少なくとも二つの異なる機構を通じて現れる。一つ目は直接的であり、はるかに多く見られる: 耐性ウイルスは、HXB2配列中のgp41 HR1領域の中に、特にアミノ酸番号543と552との間の配列QLLSGIVQQQ（SEQ. ID. NO. 13）の中に、T20およびC37の結合親和性を実質的に低減する突然変異を蓄積する傾向がある。多く見られる二つの耐性プロファイルは、QLLSDTVQQQ（SEQ. ID. No. 14）およびQLLSGIEQQQ（SEQ. ID. No. 15）であり、この場合、導入されたAspまたはGluの負電荷が、T20およびC37の結合を実質的に破壊するように思われる。それほど多くは見られない二つ目の耐性プロファイルは、gp41のHR2領域中の突然変異を含む。このプロファイルの背後にある機構は十分に確認されていないが、Asn637およびThr639によって形成される保存されたグリコシル化部位を含むHR2領域中の突然変異が、gp41中間状態の存続期間を短くし、それによってC-ペプチドがgp41に結合するほかない時間量を少なくしてしまう。
【００５０】
本発明は、HIV療法耐性ウイルス株と非耐性ウイルス株の両方の、HIVウイルス活性を阻害するための組成物および方法に関連し、同様にHIV療法耐性ウイルス株の発現の阻止に関連する。特に、耐性ウイルス株は、T20、C37、C34およびそれらの組み合わせのような、公知のC-ペプチドに基づくHIV療法に耐性である。
【００５１】
本発明に包含されるのは、HIV-1の一般的な耐性株に対して効力を維持しているC-ペプチド阻害剤の戦略および配列である。記載される阻害剤は、HIV耐性の一般的な機構を克服するHIV-1侵入阻害剤を産生するための新規の戦略に基づいた対象となる組成物である。具体的には、それらは単量体として確立されたHIV-1侵入のペプチド阻害剤であるC37およびT20のようなC-ペプチドのオリゴマーを包含する。オリゴマーC-ペプチドは、本明細書において記載されるC-ペプチドの変種型のオリゴマーも包含する。単量体C-ペプチドはともに物理的に連結されて、オリゴマーC-ペプチドを形成する。単量体として、C-ペプチドは、HIV侵入阻害活性を有することが示されている。例えば、臨床用途において唯一FDAに認可されたHIV-1侵入阻害剤T20（エンフュービルタイド）は、およそ1 nmのIC50を有する。本明細書において記載されるオリゴマーC-ペプチドは、野生型HIV-1に対してオリジナルの単量体C37およびT20ペプチドと全く同じように強力（IC50 およそ1 nM）である。さらに重要なことには、これらのオリゴマーC-ペプチドは、オリジナルの単量体Cペプチド阻害剤に対する耐性を与える共通のウイルス回避突然変異という状況でも、このナノモルの効力を保持している。
【００５２】
本明細書で用いる場合、C-ペプチドおよびC-ペプチド阻害剤は互換的に用いられ、どちらの用語も宿主細胞へのHIVウイルスの侵入を阻害できるC-ペプチドをいう。HIVの侵入をアッセイする方法は、本明細書において記載される。そのようなHIV侵入阻害のインビボ効果は、HIVに感染した対象の循環末梢血中でのウイルス量の低減およびCD4+ T細胞数の増大によって決定することができる。ウイルス量およびCD4+ T細胞数をモニタリングする方法は、当技術分野で周知である。
【００５３】
一つの態様において、本発明は、いくつかの改変を有する既存のおよび確立されたC-ペプチド阻害剤の使用を包含する。本明細書で概説する改変は、オリゴマー形成および単一点突然変異であり、これらはオリジナルのC-ペプチドの化学的特性を実質的に変えず、薬物速度論的特性にわずかな影響しか与えない可能性が高い。
【００５４】
一つの態様において、本発明は、HIVウイルスの侵入を阻害する、アミノ酸配列
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を有する複数のペプチドまたはその断片および/もしくは変種を含んだ組成物を提供し、該複数のペプチドは分子リンカーによって物理的に連結されている。複数のペプチドの物理的連結は、オリゴマーペプチドである複合体を生ずる。
【００５５】
一つの態様において、配列
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のHIVウイルスの侵入を阻害するペプチド断片または変種が、オリゴマーペプチド組成物の調製に使用される。ペプチド断片または変種配列は、本明細書において開示の配列と少なくとも75%の同一性を有する。
【００５６】
一つの態様において、ペプチドは、本明細書において例証されるアミノ酸配列と、少なくとも85%の同一性、より好ましくは少なくとも90%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも95%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも97%の同一性、および最も好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。
【００５７】
好ましい態様において、ペプチド断片または変種は、アミノ酸配列:
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からなるペプチド断片の群より選択される。
【００５８】
本発明の一つの態様において、二つまたはそれ以上のペプチドが、リンカー分子によって連結される。好ましくは、リンカー分子はペプチドリンカーである。一つの態様において、抗HIV活性を有する組成物は、連結されている複数のペプチドを含む。この組成物は、例えば、オリゴマーペプチドとしてともに連結された2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のペプチドを有することができる。好ましい態様において、抗HIV活性を有する組成物は、二つのペプチドの二量体、三つのペプチドの三量体、四つのペプチドの四量体、または五つのペプチドの五量体を含む。一つの態様において、抗HIV活性を有する組成物は、二つのペプチドの二量体および/または三つのペプチドの三量体を含む。
【００５９】
包含されるのは、本明細書においてホモオリゴマーペプチドといわれる、本発明による同一のペプチドを含むオリゴマーポリペプチド、およびヘテロオリゴマーペプチドといわれる、異なるペプチドを含むポリペプチドの組成物である。一つの態様において、抗HIV活性を有する組成物は、二量体ペプチド、三量体ペプチド、四量体ペプチド、および五量体ペプチドの混合物を含む。一つの態様において、この混合物は、オリゴマーペプチドとともに単量体ペプチドを含むこともできる。単量体ペプチド、二量体ペプチド、三量体ペプチド、四量体ペプチド、五量体ペプチド、およびホモオリゴマーペプチド、ならびにヘテロオリゴマーペプチドの全ての可能な組み合わせを、本明細書において記載される組成物に含められるものと考えられる。
【００６０】
一つの態様において、オリゴマーポリペプチドを形成するのに使用される分子リンカーは、ペプチドリンカー分子である。一つの態様において、ペプチド連結分子は、本発明による少なくとも二つのペプチドを連結する少なくとも一つのアミノ酸残基を含む。ペプチドリンカーは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸残基を含む。ペプチド連結分子は、ポリペプチドまたはタンパク質を共有結合的にまたは非共有結合的にカップリングすることができる。連結に使用される典型的なアミノ酸残基は、グリシン、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸などである。ペプチドリンカーはそのアミノ末端で一方のペプチド、ポリペプチド、またはポリペプチドドメイン（例えば、C-ペプチド）に付着され、そのカルボキシル末端でもう一方のペプチド、ポリペプチド、またはポリペプチドドメイン（この場合も先と同様に、例えば、C-ペプチド）に付着される。有用なリンカーペプチドの例には、グリシン-セリンおよびグリシン-アラニン重合体を含むグリシン重合体（（G)n）（例えば（Gly4Ser)nリピート、ここでn=1〜8、好ましくは、n=3、4、5、または6）が含まれるが、これらに限定されることはない。ペプチドリンカー分子の他の例は、米国特許第5,856,456号に記載されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【００６１】
別の態様において、分子リンカーは、システインアミノ酸残基間のジスルフィド結合による、またはアミン架橋剤、例えば、グルタルアルデヒド、ビス（イミドエステル）、ビス（スクシンイミジルエステル）、ジイソシアン酸エステル、および二酸塩化物によって形成される化学的架橋による連結のような化学的リンカーである。化学架橋剤に関する広範なデータは、InvitrogenのMolecular Probeセクション5.2の下で見出すことができる。
【００６２】
一つの態様において、オリゴマーペプチドは、個々の単離ペプチドを連結することによって作出することができる。個々のペプチドは、当技術分野において公知の化学的方法によって、または同様に当技術分野において公知の組換え方法によって作出することができる。組換え方法の場合、ペプチドのDNAコード配列は、PCR反応の鋳型としてのHIV-1膜貫通糖タンパク質gp41タンパク質の全HR2領域、アミノ酸番号114-162（SEQ. ID. No. 12）（Genbankアクセッション番号BD407105、NC_001802、AJ293865）での、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いた増幅によって作出することができる。制限酵素消化部位および/または追加のスペーサーもしくはタグアミノ酸残基を組み入れた特製PCRプライマーを用いて、DNAの連結、組換えタンパク質の発現、およびタンパク質の精製を容易にすることができる。ペプチドの連結をともに容易にするために、DNAコード配列によって、ペプチドにさらなるアミノ酸残基を付加することができる。例えば、アミノ酸のシステインを含有するチオール基およびアミノ酸のリジンを含有するアミン基を付加することができる。チオール基およびアミン基は、架橋反応に有用な反応基を供与する。一つの態様において、さらなるアミノ酸がペプチドの末端に付加される。当技術分野において公知である標準的な組換え分子生物学法を用いて、コード配列の中に追加のアミノ酸を遺伝子工学で作出することができる。さらに、タグを構成する追加のアミノ酸を付加して、ペプチドの発現および精製を容易にすることもできる。そのようなタグの例としては、チオレドキシンの最初の105アミノ酸、縦列の6ヒスチジン-タグ、HA-タグ、およびflag-タグが挙げられる。末端に付加されたシステイン基およびヒスチジン（6×）精製タグを有するそのようなペプチドの例は
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である。
【００６３】
異なる個々のペプチドのDNAコード配列を発現ベクターの中に連結し、次いでこれを適切な発現宿主細胞にトランスフェクトし、誘導して組換えペプチドを発現させることができる。その後、発現された組換えペプチドを当技術分野において公知の方法により精製し、次に架橋に用いて、本明細書において記載される二量体、三量体、四量体、または五量体オリゴマーペプチド組成物を形成させることができる。
【００６４】
ペプチドが化学的架橋に利用可能な反応性チオール基を含有していない場合には、内因性ジスルフィドの還元、ならびにアミンまたはカルボン酸基のチオール基への変換を含むがこれらに限定されないいくつかの方法が、タンパク質およびペプチドにチオール基を導入するのに利用可能である。そのような方法は、当業者に公知であり、例えばInvitrogen Inc.のMolecular Probes部門およびPierce Biotechnologyからなど、その目的のための多くの市販キットがある。
【００６５】
別の態様において、オリゴマーペプチドは、個々の単離ペプチドを化学的架橋によって連結する必要なく組換え方法により作出することができる。組換え方法を用いて、ペプチドのいくつかのコード配列を含む単一のコードDNA配列を合成することができる。例えば、2つおよび最大で5つまでのペプチドコード配列が、縦列で連結される。2〜10個のアミノ酸をコードするさらなるアミノ酸コード配列を、隣接ペプチドの各対の間にスペーサー配列として付加することができる。単一のコードDNAが転写され翻訳される場合、発現されるポリペプチドは、2〜10個の追加のアミノ酸によってそれぞれが分離された縦列反復のペプチドを含有することができる。配列に間隔をあけるのに使用される典型的なアミノ酸残基は、グリシン、チロシン、システイン、リジン、プロリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸などである。好ましい態様において、オリゴマーペプチドは、アミノ-カルボキシル-アミノ-カルボキシルの縦列配置で発現される。同様に、合成されるオリゴマーペプチドは、オリゴマーペプチドの発現、同定、および精製を容易にするためのタグアミノ酸配列を含むこともできる。そのような組換え方法は当業者に周知である。
【００６６】
一つの態様において、オリゴマーペプチドの複合体は、NH2末端アシル化、例えば、アセチル化、またはチオグリコール酸アミド化により、例えば、アンモニア、メチルアミンでの末端カルボキシルアミド化により、および当技術分野において公知である同様の末端修飾により、修飾することができる。末端修飾は、プロテイナーゼ消化による感受性を低減するのに有用であり、それゆえ、溶液、特にプロテアーゼが存在しうる生体液中でのポリペプチドの半減期を延ばす働きをする。
【００６７】
一つの態様において、本発明は同様に、所与のHIV C-ペプチド阻害剤の抗HIV効力を増強する方法を提供し、本方法は、複数のC-ペプチド阻害剤を分子リンカーによって物理的に連結する段階を含む。別の態様において、HIVウイルスの侵入を阻害する所与のHIV C-ペプチドの断片および/または変種型を、抗HIV効力を増強するために本明細書において記載される方法において使用することもできる。本発明に向けて想定されるC-ペプチドのアミノ酸残基の変化は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第2006/0247416号に記載されている。複数のC-ペプチドの物理的連結は、オリゴマーC-ペプチドを生ずる。一つの態様において、C-ペプチド阻害剤は、以下のアミノ酸配列からなるC-ペプチドの群より選択される:
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【００６８】
一つの態様において、本明細書で提供されるオリゴマーHIV C-ペプチド阻害剤は、本明細書で同様に記載される方法により、その阻害効力についてアッセイされる。例えば、HIVの野生型株および耐性株のウイルス侵入に対するオリゴマーHIV C-ペプチド阻害剤のIC50を決定することができる。
【００６９】
一つの態様において、HIVウイルスの侵入を阻害するオリゴマーペプチド、そのペプチド断片および/または変種の組成物と、許容される薬学的担体とを含んだ薬学的組成物が提供される。本明細書で用いる場合、「薬学的組成物」という用語は、製薬産業においてよく使われる化学薬品および化合物の薬学的に許容される担体と組み合わせた活性薬剤をいう。本明細書において用いられる活性薬剤とは、宿主細胞へのHIVの侵入に対して阻害活性を有するオリゴマーC-ペプチド、そのペプチド断片および/または変種をいう。「薬学的に許容される担体」という用語は、組織培地を除外する。そのような薬学的組成物は溶液、懸濁液、ローション、ゲル、クリーム、軟膏、乳濁液、皮膚パッチなどを含む。これらの剤形の全てが、その調製の方法とともに、製薬分野および美容分野において公知である。Harry's Cosmeticology（Chemical Publishing, 7th ed. 1982）; Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Co., 18th ed. 1990）。典型的には、局所処方物は、適当な小胞と混合して、0.1〜100 mg/mlの濃度範囲の活性成分を含有する。適当な薬学的に許容される担体は、本明細書において記載されるオリゴマーペプチド構築体に対する免疫反応を促進しないであろう。そのような調製物で用いるのに望ましい他の成分は、保存料、共溶媒、粘度増強剤、担体などを含む。担体それ自体または担体に溶解される成分は、保湿特性、洗浄特性、または抗炎症/抗掻痒特性を含めて、それ自体の緩和特性または治療特性を有することができる。浸透促進剤は、例えば、界面活性剤; ジメチルスルホキシドおよび他のスルホキシド、ジメチルアセトアミドおよびピロリドンのような、ある種の有機溶媒; 複素環アミンのある種のアミド、グリコール（例えばプロピレングリコール）; プロピレンカーボネート; オレイン酸; アルキルアミンおよび誘導体; さまざまなカチオン性、アニオン性、非イオン性、および両性の界面活性剤などでありうる。
【００７０】
一つの態様において、HIVウイルスの侵入を阻害するアミノ酸配列
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またはその断片および/もしくは変種を有する複数のペプチドを含んだタンパク質をコードする単離された核酸構築体が提供され、該複数のペプチドは、ペプチドリンカーによって物理的に連結されている。個々の単離ペプチドを連結することによってオリゴマーペプチドを合成することが可能であるが、当技術分野において公知の組換え方法を用いて、オリゴマーペプチドを合成することができる。ペプチドのDNAコード配列は、PCR反応の鋳型としてHIV-1膜貫通糖タンパク質gp41タンパク質の全部のHR2領域、アミノ酸番号114-162（SEQ. ID. No. 12）（Genbankアクセッション番号BD407105、NC_001802、AJ293865）を用いたPCRによって増幅することができる。制限酵素消化部位および/または追加のスペーサーもしくはタグアミノ酸残基を組み入れた特製PCRプライマーを用いて、DNAの連結、組換えタンパク質の発現、タンパク質の精製、およびタンパク質の同定を容易にすることができる。次に、ペプチドの増幅されたDNAコード配列を連結して、縦列に連結されたペプチドのいくつかのコード配列を含む単一のコードDNA配列を形成させることができる。2つおよび最大で5つまでのペプチドコード配列が、縦列で連結される。2〜10個のアミノ酸をコードするさらなるアミノ酸コード配列を、隣接ペプチドの各対の間にスペーサー配列として付加することができる。単一のコードDNA配列が転写され翻訳される場合、発現されるポリペプチドは、2〜10個の追加のアミノ酸によってそれぞれが分離された縦列反復のペプチドを含有するであろう。配列に間隔をあけるのに使用される典型的なアミノ酸残基は、グリシン、チロシン、システイン、リジン、プロリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸などである。好ましい態様において、オリゴマーペプチドは、個々のペプチドのコピーがアミノ-カルボキシル-アミノ-カルボキシルの縦列配置で配置されて発現される。スペーサーとしての2つのグリシン残基と6ヒスチジンタグとを有する、同一ペプチドの2つのコピーを含んだ発現オリゴマーペプチドの例:
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【００７１】
一つの態様において、単離された核酸構築体は
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からなる群より選択されるペプチドのDNAコード配列を含む。
【００７２】
一つの態様において、単離された核酸構築体は、ペプチドのDNAコード配列の2つまたはそれ以上のコピーを含む。したがって、コードされるタンパク質は、反復する同一のペプチド配列を含む。例えば、単離された核酸は、
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だけをコードする3つの縦列に連結されたDNA配列を含むことができる。結果として、発現される組換えタンパク質は、例えば、単一のポリペプチド中の
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でありうる。「xxx」はスペーサーのアミノ酸残基を表し、「HHHHHH」は、発現タンパク質の精製および同定に有用な6ヒスチジンタグである。別の態様において、単離された核酸構築体は、異なるペプチドのDNAコード配列を含む。したがって、コードされるタンパク質は、異なるペプチドで構成される。例えば、核酸は縦列に連結された
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のDNAコード配列を含むことができる。発現される組換えオリゴマータンパク質は、例えば、単一のポリペプチド中の
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でありうる。
【００７３】
好ましい態様において、オリゴマーペプチドのDNAコード配列は、ペプチドをコードするDNA配列の2つのコピー、ペプチドをコードするDNA配列の3つのコピー、ペプチドをコードするDNA配列の4つのコピー、またはペプチドをコードするDNA配列の5つのコピーを含む。さらに好ましい態様において、オリゴマーペプチドのDNAコード配列は、ペプチドをコードするDNA配列の2つのコピーおよび/またはペプチドをコードするDNA配列の3つのコピーを含む。同様に想定されるのは、ペプチドの同一のコピーを含み、したがってホモオリゴマーC-ペプチド阻害剤を発現する、オリゴマーペプチドをコードするDNA配列である。同様に、オリゴマーペプチドのDNAコード配列は、異なったおよび/または改変されたペプチドのDNAコード配列のコピーを含み、したがってヘテロオリゴマーC-ペプチド阻害剤をもたらすこともできる。異なるペプチドに対するDNAコード配列の全ての可能な組み合わせをともに連結して、本明細書に記載のオリゴマーC-ペプチド構築体、例えば、HIVウイルスの侵入を阻害するHIV阻害ペプチド
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またはその断片および/もしくは変種を含むオリゴマーC-ペプチド構築体をコードする核酸配列を形成できるものと想定され、該複数のペプチドは物理的に連結されたアミノ酸残基である。
【００７４】
一つの態様において、本明細書で開示する本発明は、対象において抗HIV療法に耐性である菌株によって引き起こされるHIV感染を処置するための方法を提供し、本方法は、そのような対象に、HIV侵入を阻害するアミノ酸配列
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を有する複数のペプチドまたはその断片および/もしくは変種を含んだ抗HIV活性を有する組成物の有効量を投与する段階を含み、これらのペプチドは分子リンカーにより物理的に連結されている。
【００７５】
一つの態様において、本明細書において開示される方法および組成物は、他の抗HIV療法と併せて投与される。現行のHIV処置に共通の主な戦略は、異なるクラスのHIV阻害剤を組み合わせることである。他のクラスの阻害剤は、HIV特異的なプロテアーゼ阻害剤（PI）、例えば、リトナビル、インジナビル（Indivavir）、チプラナビル、およびTMC114であり、他のクラスの阻害剤は、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（例えば、AZT、DDC、DDI、およびラムビジン）、ならびに非ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（例えばネビラピン）を含め逆転写酵素阻害剤を含む高活性抗レトロウイルス療法（HAART）である。より最近のクラスの阻害剤は、Japan Tobacco, Inc（JT）によって発見されたGS 9137、MK-0518および参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,250,421号に記載されている化合物のようなHIVインテグラーゼ阻害剤である。抗HIV処置の効力は、血流中のウイルス量および正常CD4+ T細胞数の日常的なモニタリングによって評価される。
【００７６】
標準的治療で処置されている対象においてウイルス量の増大および/または正常CD4+ T細胞数の減少が認められる場合、これは使用中の抗HIV療法に対する耐性の発現の兆候でありうる。抗レトロウイルス薬耐性試験を行って、耐性の原因をさらに検証することができる:（a）遺伝子型アッセイ法により関連ウイルス遺伝子（すなわちRTおよびプロテアーゼ）に存在する薬物耐性突然変異が検出される。遺伝子型アッセイ法のなかには、RTおよびプロテアーゼ遺伝子全体の配列決定を伴うものもあるが、オリゴヌクレオチドプローブを利用して、薬物耐性を与えることが公知である選択された突然変異を検出するものもある; および（b）表現型アッセイ法により、さまざまな濃度の抗レトロウイルス薬の存在下におけるウイルスの増殖能が測定される。組換え表現型アッセイ法は、実験室のHIVクローンへの、患者血漿HIV RNAに由来するRTおよびプロテアーゼ遺伝子配列の挿入を伴う。さまざまな薬物濃度での組換えウイルスの複製を、レポーター遺伝子の発現によってモニターし、HIVの参照株の複製と比較する。ウイルス複製の50%および90%を阻害する薬物の濃度（すなわちIC50およびIC90）を計算し、試験ウイルスおよび参照ウイルスのIC50の比率をIC50の倍の増大、または倍の耐性として報告する。
【００７７】
薬物耐性が対象において確認された場合、その対象を、本明細書に記載のオリゴマーペプチドまたはオリゴマーC-ペプチド阻害剤を含む組成物で処置することができる。好ましい態様において、この組成物は、対象に以前に投与されていないPIクラスのさらに新たなかつ有効な抗HIV薬またはHAART逆転写酵素阻害剤と併せて投与される。別の好ましい態様において、この組成物は、異なるオリゴマーC-ペプチド阻害剤の混合物を含む。さらに好ましい態様において、この混合物は、異なるヘテロオリゴマーC-ペプチド阻害剤のものである。ヘテロオリゴマーC-ペプチド阻害剤のそのような混合物を、別のPIおよび/またはHAART療法とともに用いることで、ウイルスがこの組み合わせの薬物療法に対する薬物耐性を発現する機会を大幅に制限するのに役立つ。
【００７８】
一つの態様において、本発明は、対象において抗HIV療法に対するHIV耐性の発現を阻止する方法を提供し、本方法は、そのような対象に、HIVウイルスの侵入を阻害するアミノ酸配列
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を有する複数のペプチドまたはその断片および/もしくは変種を含んだ抗HIV活性を有する組成物の有効量を、別のクラスの抗HIV治療薬と併せて投与する段階を含み、これらのペプチドは分子リンカーにより物理的に連結されている。薬物耐性は、抗HIV薬によって課せられる選択圧の結果として発現する。各薬物クラスは、ウイルスを、その感染生活環の中の異なる過程で標的にする。異なる抗HIVクラスの薬物、例えばPI、HAART、抗融合阻害、および抗ウイルス複製の組み合わせを用いることにより、PIまたはHAART薬の選択圧から出てくる耐性株は、抗融合阻害剤および/または抗ウイルス複製が同時に存在することによって除去されうる。一つの態様において、本明細書において記載される組成物は、PI、HAARTクラス、または抗ウイルス複製クラスの抗レトロウイルス薬からの少なくとも1つの抗HIV薬とともに投与される。好ましい態様において、本明細書において記載される組成物は、好ましくは異なるクラスからの、2つの他の抗HIV薬とともに投与される。例えば、薬物未投与の患者についてのモデルとして、本明細書に記載のオリゴマーC-ペプチド阻害剤に加えて新たなPIの組成物、または本明細書に記載のオリゴマーC-ペプチドと2つの逆転写酵素阻害剤ヌクレオシドとの組成物を用いて、処置を達成することができる。別の好ましい態様において、この組成物は、異なるオリゴマーC-ペプチド阻害剤の混合物を含む。さらに好ましい態様において、この混合物は、異なるヘテロオリゴマーC-ペプチド阻害剤のものである。別の態様において、抗HIV薬は、GS 9137のようなHIVインテグラーゼ阻害剤の群由来でありうる。
【００７９】
ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（NRTI）の例は、アバカビル、アバカビル硫酸塩、アジドチミジン、ジデオキシシチジン、ジデオキシイノシン（didexoyionsine）、ジソプロキシル、ジダノシン、エムトリシタビン、フマル酸塩、ラミブジン、テノホビル、スタブジン、ザルシタビン、およびジドブジンである。非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（NNRTI）の例は、デラビルジン、エファビレンツ、およびネビラピンである。プロテアーゼ阻害剤（PI）の例は、アンプレナビル、アタザナビル、ダルナビル、ホスアンプレナビルカルシウム、インジナビル、ロピナビル、メシル酸ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、メシル酸サキナビル、およびチプラナビルである。融合阻害剤の例は、エンフュービルタイドである。
【００８０】
本明細書で用いる場合、耐性の発現は、治療的介入の間に本明細書に記載のオリゴマーC-ペプチド阻害剤または構築体による処置を受けた対象において、HIVウイルス感染が耐性にならなければ（すなわち抗HIV療法の効力が実質的に一定のままであれば）「阻止」される。
【００８１】
本明細書で用いる場合、「実質的に」という用語は、抗HIV療法を受けている対象において行われた以前のウイルス量またはT細胞モニタリングに比べてHIVウイルス量の5%未満の増大および/またはCD4+ T細胞数の5%未満の減少をいう。対象が少なくとも3ヶ月の間抗HIV療法を続けると、抗HIV療法は、対象におけるウイルス量の低減およびCD4+ T細胞数の増大に有効であった。好ましい態様において、HIVウイルス量の増大は1%未満であり、CD4+ T細胞数の減少は1%未満である。
【００８２】
ペプチドの合成
本明細書において記載されるペプチドは、排他的固相技術、部分的固相技術、断片縮合、または古典的な溶液カップリングなどの、適当な公知のペプチド重合技術によって合成的に構築することができる。例えば、本発明のペプチドは、t-ブチルオキシカルボニル（BOC）または9-フルオレニルメトキシ-カルボニル（FMOC）保護基のいずれかに基づく標準的な方法を用いて、固相法により合成することができる。この方法論は、G. B. FieldsらによりSynthetic Peptides: A User's Guide, W. M. Freeman & Company, New York, N.Y., pp. 77-183（1992）におよびテキストブック「Solid-Phase Synthesis」, Stewart & Young, Freemen & Company, San Francisco, 1969に記載されており、1979年8月8日付で公表された米国特許第4,105,603号の開示によって例証されている。古典的な溶液合成は、「Methoden der Organischen Chemic（Houben-Weyl）: Synthese von Peptiden」, E. Wunsch（editor）（1974）Georg Thieme Verlag, Stuttgart West Germanyに詳細に記載されている。合成の断片縮合法は、米国特許第3,972,859号に例証されている。他の利用可能な合成は、1975年1月28日付で公表された米国特許第3,842,067号、米国特許第3,872,925号、Merrifield B, Protein Science（1996）, 5: 1947-1951; The chemical synthesis of proteins; Mutter M, Int J Pept Protein Res 1979 Mar; 13（3）: 274-7 Studies on the coupling rates in liquid-phase peptide synthesis using competition experiments; およびSolid Phase Peptide Synthesis in the series Methods in Enzymology（Fields, G. B.（1997）Solid-Phase Peptide Synthesis. Academic Press, San Diego. #9830）に例証されている。上記の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００８３】
一つの態様において、本発明のHIV阻害C-ペプチドは、当技術分野において公知である組換え分子技術によって合成することができる。発現される組換えC-ペプチドおよびオリゴマーC-ペプチドは、天然のアミノ酸残基を含有することができる。
【００８４】
さらに、C-ペプチド、その断片および/または変種のDNAコード配列を、発現ベクターまたはプラスミドのような公知の技術によって構築し、DNA配列を発現しうる適当な微生物にトランスフェクトし、かくして微生物が増殖される培地から後で抽出するペプチドを調製することができる。例えば、米国特許第5,595,887号は、結合タンパク質および所望の標的ペプチドの1つまたは複数のコピーを含んだ融合タンパク質をコードする組換え遺伝子構築体の発現を通じて、種々の比較的小さなペプチドを形成する方法について記載している。発現後、融合タンパク質を単離し、化学的および/または酵素的方法を用いて切断し、所望の標的ペプチドを産生する。
【００８５】
組換え技術は当業者に周知である。代表的な方法は、参照により本明細書に組み入れられるManiatis, et al., Molecular cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Springs Harbor Laboratory（1989）に開示されている。上記のように、組換えDNA合成を用いて、個々のペプチドだけでなく、いくつかのC-ペプチドを含んだオリゴマーC-ペプチドも産生することができる。
【００８６】
ペプチドのDNAコード配列は、PCR反応の鋳型としてHIV-1膜貫通糖タンパク質gp41タンパク質の全部のHR2領域、アミノ酸番号114-162（SEQ. ID. No.）（Genbankアクセッション番号BD407105、NC_001802、AJ293865）を用いたPCRによって増幅することができる。制限酵素消化部位および/または追加のスペーサーもしくはタグアミノ酸残基を組み入れた特製PCRプライマーを用いて、DNAの連結、組換えタンパク質の発現、タンパク質の精製、およびタンパク質の同定を容易にすることができる。次に、ペプチドの増幅されたDNAコード配列を連結して、縦列に連結されたペプチドの複数のコード配列を含む単一のコードDNA配列を形成させることができる。2つおよび最大で5つまでのペプチドコード配列が、縦列で連結される。2〜10個のアミノ酸をコードするさらなるアミノ酸コード配列を、隣接ペプチドの各対の間にスペーサー配列として付加することができる。単一のコードDNA配列が転写され翻訳される場合、発現されるポリペプチドは、2〜10個の追加のアミノ酸によってそれぞれが分離された縦列反復のペプチドを含有するであろう。配列に間隔をあけるのに使用される典型的なアミノ酸残基は、グリシン、チロシン、システイン、リジン、プロリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸などである。好ましい態様において、オリゴマーペプチドは、個々のペプチドのコピーがアミノ-カルボキシル-アミノ-カルボキシルの縦列配置で配置されて発現される。
【００８７】
従来のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）クローニング技術を用いて、ペプチドをコードする単離DNA配列を作出することができる。PCR増幅に用いられるポリメラーゼは、PCR増幅過程の間の配列ミスを減らすために、StrategeneのPfuUltra（商標）ポリメラーゼのような高い忠実度を有するべきである。制限消化部位がPCRプライマーに組み入れられてもよく、クローニングベクターまたは発現ベクターへの左右不同の連結を容易にするために、5' PCRプライマーおよび3' PCRプライマーに異なる制限消化部位が使われることが好ましい。pUC19、pBR322、pBluescriptベクター（Stratagene Inc.）、またはInvitrogen Inc.のpCR TOPO（登録商標）のような汎用のクローニングベクターをクローニングに使用することができる。
【００８８】
あるいはC-ペプチドをコードする単離DNA配列をpCR（登録商標）-TOPO、pCR（登録商標）-Blunt II-TOPO、pENTR/D-TOPO（登録商標）、およびpENTR/SD/D-TOPO（登録商標）のようなInvitrogenトポイソメラーゼ補助TAベクターでのTOPO（登録商標）クローニング法を用いて、ベクターに連結することもできる。pENTR/D-TOPO（登録商標）もpENTR/SD/D-TOPO（登録商標）もともに、Gateway（登録商標）発現ベクターへの5'→3'方向でのC-ペプチドDNAコード配列のクローニングを可能にする方向性TOPO導入（entry）ベクターである。5'→3'方向での方向性クローニングは、プロモーターがC-ペプチドDNAコード配列の5' ATG開始コドンの上流にあるような、タンパク質発現ベクターへのC-ペプチドDNA配列の一方向性の挿入を容易にし、プロモーターによって駆動されるタンパク質の発現を可能にする。C-ペプチドDNAコード配列を保有する組換えベクターは、XL1 Blue、SURE（Stratagene）、およびTOP-10細胞（Invitrogen）など、一般的なクローニング大腸菌（E. coli）にトランスフェクトされ増殖されうる。
【００８９】
次いで、得られたC-ペプチドDNAコード配列を保有する組換えベクターを、部位特異的変異導入のようなさらなる分子生物学的操作に用いて、C-ペプチドの中に特異的なアミノ酸突然変異および置換を作出し、かくしてC-ペプチドの変種型を産生することができ、または哺乳類細胞株、昆虫細胞株、酵母細胞、細菌細胞、および植物細胞からなる群より選択される宿主細胞を用いた種々のタンパク質発現系でのタンパク質合成のためのタンパク質発現ベクターまたはウイルスベクターに、サブクローニングすることができる。アミノ酸突然変異の例は、セリンからプロリンの突然変異およびグルタミン酸に代わるロイシンの置換である。部位特異的変異導入は、StratageneのQuikChange（登録商標）部位特異的変異導入キットを、製造元の使用説明書にしたがって用いて、または当技術分野において公知の任意の方法を用いて、行うことができる。
【００９０】
好ましい態様において、ベクターは、原核細胞または真核細胞発現に適合した発現ベクターである。発現ベクターに対する適合は、組換えタンパク質の効率的なタンパク質発現を容易にするように想定されうる。典型的には、適合は、限定のためではなく例として、細胞/組織特異的発現を仲介する転写制御配列（プロモーター配列）の提供を含む。これらのプロモーター配列は、細胞/組織特異的な、誘導性または構成性のものでありうる。
【００９１】
プロモーターは、当技術分野において認識されている用語であり、明確にするために、限定のためではなく例としてのみ提供される以下の特徴を含む。エンハンサー要素は、遺伝子の転写開始部位の5'側によく見られるシス作用性の核酸配列である（エンハンサーは遺伝子配列の3'側に見られるか、または場合によりイントロン配列に位置することもあり、それゆえ位置に依存しない）。エンハンサーは、エンハンサーが連結される遺伝子の転写の速度を増大するように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサー要素に特異的に結合することが示されているトランス作用性の転写因子（ポリペプチド）に応答する。転写因子（David S. Latchman, Academic Press Ltd, San DiegoによるEukaryotic Transcription Factorsを参照されたい）の結合/活性は、限定のためではなく例として、中間代謝産物または環境エフェクタを含むいくつかの環境信号に応答する。プロモーター要素は同様に、転写開始部位を選択するように機能する、いわゆるTATAボックスおよびRNAポリメラーゼ開始選択（RIS）配列を含む。これらの配列は同様に、とりわけ、RNAポリメラーゼによる転写開始選択を容易にするように機能するポリペプチドに結合する。
【００９２】
適合には、真核細胞または原核細胞宿主のどちらかにおける前記ベクターの維持をともに容易にする選択可能なマーカーおよび自律複製配列の提供も含まれる。自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターといわれる。
【００９３】
ベクターにコードされる遺伝子の発現を容易にする適合には、転写終結/ポリアデニル化配列の提供が含まれる。これには、2シストロン性または多シストロン性の発現カセットに配列され、ベクターにコードされた遺伝子の発現を最大にするように機能する、内部リボソーム侵入部位（IRES）の提供も含まれる。
【００９４】
発現ベクターおよび発現系
一つの態様において、本発明は、例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞、または植物細胞より選択される宿主細胞を用いたタンパク質発現系から産生される、組換えC-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドの発現および精製のため、C-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドをコードするDNAコード配列を保有する発現ベクターを提供する。
【００９５】
一つの態様において、C-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドを発現する組換えベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レトロウイルス、およびレンチウイルスに由来するものを含むがこれらに限定されない当技術分野において公知の任意のウイルスベクターでありうる。組換えウイルスは、遺伝子発現研究および治療的適応のための多用途な系をもたらす。
【００９６】
別の態様において、本発明は、C-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドを発現する発現ベクターを含んだ宿主細胞を提供する。発現宿主細胞は、いくつかの供給源のいずれか、例えば、細菌、例えば大腸菌、酵母、哺乳類、昆虫、および植物細胞、例えばクラミドモナス（Chlamydomonas）に由来しうる。別の態様において、組換えC-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドは、無細胞発現系に適した発現ベクターから産生することができる。クローニングベクターから、C-ペプチドDNAコード配列を、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞、もしくは植物細胞、またはウサギ網状赤血球発現系のような無細胞発現系におけるC-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドの発現に適した組換え発現ベクターにサブクローニングすることができる。サブクローニングは、PCRクローニング、制限消化とその後の連結、またはGateway（登録商標）LRおよびBPクロナーゼ（商標）酵素混合物を用いたλファージに基づく部位特異的組換えのものなどの組換え反応によって達成することができる。サブクローニングは、C-ペプチドDNA配列の5' ATG開始コドンが発現ベクター中のプロモーターの下流にあるように、一方向性であるべきである。あるいは、pENTR/D-TOPO（登録商標）、pENTR/SD/D-TOPO（登録商標）（方向性導入ベクター）、またはInvitrogenのGateway（登録商標）Technology pENTR（導入）ベクターのいずれかに、C-ペプチドDNA配列がクローニングされる場合、単一の組換え反応における哺乳類細胞、大腸菌、昆虫、および酵母それぞれでのタンパク質発現のために、種々のGateway（登録商標）発現（目的）ベクターに、C-ペプチドDNA配列を移入することもできる。Gateway（登録商標）目的ベクターの中には、各宿主細胞に感染することによって、宿主細胞でのC-ペプチド-結合タンパク質の異種発現を可能にする、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レトロウイルス、およびレンチウイルスの構築のためにデザインされているものもある。Gateway（登録商標）技術では、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼの代わりにλファージに基づく部位特異的組換えを用いて、関心対象の遺伝子を発現ベクターに挿入する。DNA組換え配列（attL、attR、attBおよびattP）ならびにλ組換え反応を媒介するLRおよびBPクロナーゼ（商標）酵素混合物は、Gateway（登録商標）技術の基礎である。目的ベクターへの遺伝子の移入は、たった2段階だけで達成される: 段階1: pENTR/D-TOPO（登録商標）のような導入ベクターにキメラDNA配列をクローニングする。段階2: キメラDNA配列を含有する導入クローンを、適切なGateway（登録商標）発現ベクター（目的ベクター）およびGateway（登録商標）LRクロナーゼ（商標）酵素混合物と、インビトロにおいて混合する。大腸菌、昆虫細胞、哺乳類細胞、および酵母での、タンパク質発現用のGateway（登録商標）発現ベクターが存在する。att部位間の部位特異的組換え（attR×attLおよびattB×attP）によって、発現ベクターおよび副産物が生じる。発現ベクターは、目的ベクターバックボーンの中に組み換えられたC-ペプチドDNAコード配列を含有する。大腸菌における形質転換および選択の後、発現ベクターは適切な宿主での発現のためにいつでも使用できる。
【００９７】
発現ベクターは、その各宿主細胞での効率的な遺伝子の転写および翻訳のために、プロモーター配列、リボソーム認識および結合TATAボックス、ならびに3' UTR AAUAAA転写終結配列など、必要な5'上流および3'下流調節要素を有するべきである。発現ベクターは、発現された組換えC-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドに組み入れられる6×ヒスチジン、V5、チオレドキシン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、c-Myc、VSV-G、HSV、FLAG、マルトース結合ペプチド、金属結合ペプチド、HA、および「分泌」シグナル（ミツバチメリチン、α-因子、PHO、Bip）などのさらなる配列を有してもよい。さらに、それらが必要とされなくなってから、それらの酵素的除去を容易とするためにこれらの配列の後に酵素消化部位が組み入れられることもある。これらのさらなる配列は、C-ペプチドもしくはオリゴマーC-ペプチド発現の検出に、親和性クロマトグラフィーによるタンパク質精製に、宿主細胞質中での組換えタンパク質の溶解性の増強に、および/または発現された組換えC-ペプチドもしくはオリゴマーC-ペプチドを、培地の中へ、原核生物細菌のペリプラズムもしくは酵母細胞のスフェロプラストの中へ分泌するのに有用である。組換えC-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドの発現は、宿主細胞において構成性であってよく、またはそれは、例えば、硫酸銅、ガラクトースのような糖、メタノール、メチルアミン、チアミン、テトラサイクリン、バキュロウイルスによる感染、および（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）IPTG、ラクトースの安定的な合成類似体で誘導されてもよい。
【００９８】
発現ベクターおよび宿主細胞の例は、BL21、BL21（DE3）、およびAD494（DE3）pLysS、Rosetta（DE3）、ならびにOrigami（DE3）（Novagen）のような大腸菌宿主細胞でのタンパク質発現用のpETベクター（Novagen）、pGEXベクター（Amersham Pharmacia）、およびpMALベクター（New England labs. Inc.）; CHO、COS、HEK-293、Jurkat、およびMCF-7のような哺乳類細胞株での発現用の強力なCMVプロモーターに基づくpcDNA3.1（Invitrogen）およびpCIneoベクター（Promega）; 哺乳類細胞でのアデノウイルスを介した遺伝子移入および発現用の複製能力のないアデノウイルスベクターpAdeno X、pAd5F35、pLP-Adeno-X-CMV（Clontech）、pAd/CMV/V5-DEST、pAd-DESTベクター（Invitrogen）; 哺乳類細胞でのレトロウイルスを介した遺伝子移入および発現用のClontech Retro-X（商標）システムで用いられるpLNCX2、pLXSN、およびpLAPSN; 哺乳類細胞でのレンチウイルスを介した遺伝子移入および発現用のpLenti4/V5-DEST（商標）、pLenti6/V5-DEST（商標）、およびpLenti6.2/V5-GW/lacZ（Invitrogen）; 哺乳類細胞でのアデノ随伴ウイルスを介した遺伝子移入および発現用のpAAV-MCS、pAAV-IRES-hrGFP、およびpAAV-RCベクター（Stratagene）のようなアデノウイルス随伴ウイルス発現ベクター; ヨウトガ（Spodopera frugiperda）9（Sf9）およびSf11昆虫細胞株での発現用のBACpak6バキュロウイルス（Clontech）およびpFastBac（商標）HT（Invitrogen）; ショウジョウバエシュナイダー（Drosophila Schneider）S2細胞での発現用のpMT/BiP/V5-His（Invitrogen）; ピキアパストリス（Pichia pastoris）での発現用のピキア発現ベクターpPICZα、pPICZ、pFLDα、およびpFLD（Invitrogen）、ならびにP.メタノリカ（P. methanolica）での発現用のベクターpMETαおよびpMET; 酵母サッカロマイセスセレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）での発現用のpYES2/GSおよびpYD1（Invitrogen）ベクターである。クラミドモナスレインハルティ（Chlamydomonas reinhardtii）における異種タンパク質の大規模発現の最近の進歩が、Griesbeck C. et. al. 2006 Mol. Biotechnol. 34:213-33およびFuhrmann M. 2004, Methods Mol Med. 94:191-5によって記載されている。外来異種コード配列は、相同組換えによって、核、葉緑体、およびミトコンドリアのゲノムに挿入される。スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンに対する耐性を与える、最も用途の広い葉緑体選択可能なマーカー・アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（aadA）を保有する葉緑体発現ベクターp64を用い、葉緑体において外来タンパク質を発現することができる。藻類にベクターを導入するために、微粒子銃・遺伝子銃法が用いられる。葉緑体へのその導入の際、外来DNAは、遺伝子銃粒子から放出され、相同組換えを通じて葉緑体ゲノムに組み込まれる。
【００９９】
組換えアデノウイルスを作出するための簡単な系が、He TC. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998によって示されている。関心対象の遺伝子を、シャトルベクター、例えばpAdTrack-CMVに最初にクローニングする。得られたプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼPme Iで消化することにより、直線化し、その後、アデノウイルスバックボーンプラスミド、例えばStratageneのAdEasy（商標）Adenoviral Vector SystemのpAdEasy-1とともに、大腸菌BJ5183細胞に同時に形質転換する。組換えアデノウイルスベクターを、カナマイシン耐性について選択し、制限エンドヌクレアーゼ分析によって組換えを確認する。最後に、直線化された組換えプラスミドを、アデノウイルスパッケージング細胞株、例えばHEK 293細胞（E1で形質転換したヒト胎児腎臓細胞）または911（E1で形質転換したヒト胎児網膜細胞）（Human Gene Therapy 7:215-222, 1996）にトランスフェクトする。組換えアデノウイルスが、HEK 293細胞内に作出される。
【０１００】
一つの態様において、本発明は、分裂および非分裂哺乳類細胞のどちらかでの、C-ペプチド結合タンパク質の送達および発現用の組換えレンチウイルスを提供する。HIV-1に基づくレンチウイルスは、モロニー白血病ウイルス（Moloney Leukemia Virus; MoMLV）に基づくレトロウイルス系よりも広い宿主域を、効果的に形質導入することができる。組換えレンチウイルスの調製は、InvitrogenのViraPower（商標）レンチウイルス発現（Lentiviral Expression）システムとともに、pLenti4/V5-DEST（商標）、pLenti6/V5-DEST（商標）、またはpLentiベクターを用いて達成することができる。
【０１０１】
一つの態様において、本発明は、C-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドの発現用の組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベクターを提供する。一つの態様において、組換えタンパク質の大規模産生からヒト細胞株に感染させるためC-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドをコードするrAAVベクターを用いることができる。別の態様において、HIVに感染した対象にベクターを投与することができる。rAAVベクターを用いて、多くの異なるヒトおよび非ヒト細胞株または組織を含め広範囲の宿主細胞に、遺伝子を送達することができる。AAVは非病原性であり、免疫反応を引き起こさないため、多数の前臨床試験で優れた安全性プロファイルが報告されている。rAAVは広範囲の細胞型を形質導入することが可能であり、形質導入は活性な宿主細胞分裂に左右されない。ウイルス粒子108個/mlを超える高力価が上清中で容易に得られ、さらなる濃度ではウイルス粒子1011〜1012個/mlが得られる。導入遺伝子は宿主ゲノムに組み込まれるので、発現は長期かつ安定である。
【０１０２】
AAV-2以外の別のAAV血清型を用いることで（Davidson et al（2000）, PNAS 97（7）3428-32; Passini et al（2003）, J. Virol 77（12）:7034-40）、異なる細胞指向性および形質導入能の増大が実証された。脳腫瘍に関して、脳への新規の注射技術、具体的には対流増加送達（CED; Bobo et al（1994）, PNAS 91（6）:2076-80; Nguyen et al（2001）, Neuroreport 12（9）: 1961-4）の開発によって、AAVベクターで脳の大部分を形質導入する能力が大幅に高められた。
【０１０３】
AAVベクターの大規模調製は、サブコンフルエントな293細胞の50×150 mmプレートへの、パッケージング細胞株: C-ペプチドDNAコード配列を保有するAAVベクター、AAV repおよびcap遺伝子を含有するAAV RCベクター、ならびにアデノウイルスヘルパープラスミドpDF6の3プラスミドの同時トランスフェクションによってなされる。細胞をトランスフェクションから3日後に収集し、ウイルスを3回の凍結融解サイクルによってまたは超音波処理によって放出する。
【０１０４】
次いでAAVベクターを、ベクターの血清型に依り、異なる2通りの方法によって精製する。AAV2ベクターは、ヘパリンに対するその親和性に基づき一段階の重力流カラム精製法によって精製される（Auricchio, A., et. al., 2001, Human Gene therapy 12;71-6; Summerford, C. and R. Samulski, 1998, J. Virol. 72:1438-45; Summerford, C. and R. Samulski, 1999, Nat. Med. 5: 587-88）。AAV2/1およびAAV2/5ベクターは、現在は、3回連続のCsCl勾配によって精製されている。
【０１０５】
発現および精製
一つの態様において、本発明は、C-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドを発現した組換えベクターを単離宿主細胞に導入する段階、組換えタンパク質の産生を可能にする条件の下で細胞を増殖させる段階、およびそのようにして産生された組換えタンパク質を回収する段階を含む、C-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドを産生する方法を提供する。本明細書において記載される方法は、当技術分野において公知である細菌細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、およびクラミドモナス（chymadomonas）細胞でのタンパク質精製のような、種々の細胞に基づく発現系での、C-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドの発現および精製を提供する。タンパク質発現は構成性であってよく、または硫酸銅、ガラクトースのような糖、メタノール、メチルアミン、チアミン、テトラサイクリン。もしくはIPTGのような誘導物質により誘導性であってもよい。タンパク質が宿主細胞において発現された後に、発現されたタンパク質を精製のため遊離させるように宿主細胞を溶解する。種々の宿主細胞を溶解する方法は、「Sample Preparation-Tools for Protein Research」EMD BioscienceにおよびCurrent Protocols in Protein Sciences（CPPS）に掲載されている。好ましい精製方法は、ヒスチジンタグの付いたC-ペプチド結合タンパク質に対するニッケル、コバルト、または亜鉛親和性樹脂を用いたイオン-金属親和性クロマトグラフのような親和性クロマトグラフィーである。ヒスチジンタグの付いた組換えタンパク質を精製する方法は、そのTalon（登録商標）コバルト樹脂を用いるClontechにより、およびそのpETシステムマニュアル、第10版においてNovagenにより記載されている。別の好ましい精製戦略は、免疫親和性クロマトグラフィーによるものであり、例えば、抗myc抗体結合樹脂を用いて、mycタグの付いたC-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドを親和性精製することができる。トロンビンおよびエンテロキナーゼのようなセリンプロテアーゼを用いた酵素消化により、ヒスチジンまたはmycタグからC-ペプチド結合タンパク質が切断され遊離され、親和性樹脂からC-ペプチド結合タンパク質が遊離される一方で、ヒスチジンタグおよびmycタグは親和性樹脂に付着されたままである。
【０１０６】
細胞に基づく発現系に加えて、無細胞発現系も企図される。無細胞発現系は、タンパク質の折り畳みに有利に働く反応条件の容易な変更、産物毒性に対する感受性の低下、ならびに反応容量および工程所要時間の低減による、迅速な発現スクリーニングまたは大量のタンパク質産生のような高処理戦略に対する適合性を含め、従来の細胞に基づく発現方法に比べていくつかの利点を提供する。無細胞発現系ではプラスミドまたは線状DNAを用いることができる。さらに、翻訳効率の改善により、mgタンパク質/ml反応混合物を超える収量が得られている。
【０１０７】
一つの態様において、連続的な無細胞翻訳系を用いて、C-ペプチドまたはオリゴマーC-ペプチドを産生することができる。高い収量でタンパク質を産生できる連続的な無細胞翻訳系はSpirin AS. et. al., Science 242:1162（1988）によって記載されている。この方法では、全反応混合物にわたるアミノ酸、アデノシン三リン酸（ATP）およびグアノシン三リン酸（GTP）を含んだ供給緩衝液の連続流のデザインならびに翻訳されたポリペプチド産物の連続的除去を用いる。この系では大腸菌溶解物を用いて無細胞の連続供給緩衝液をもたらす。この連続流系は原核生物発現ベクターとも真核生物発現ベクターとも適合する。内在性膜タンパク質EmrE多剤輸送体の大規模な無細胞による産生は、Chang G. el. al., Science 310:1950-3（2005）によって記載されている。
【０１０８】
他の市販の無細胞発現系は、効率的な転写・翻訳共役反応のため大腸菌に基づくインビトロ系を利用して、最大でミリグラム量の活性な組換えタンパク質を試験管反応の形式で産生するExpressway（商標）Cell-Free Expression Systems（Invitrogen）; 同様に大腸菌に基づくインビトロ系を用いるRapid Translation System（RTS）（Roche Applied Science）; およびウサギ網状赤血球に基づくインビトロ系を用いるTNT Coupled Reticulocyte Lysate Systems（Promega）を含む。
【０１０９】
オリゴマーペプチドを形成するための化学的架橋
本明細書に記載のオリゴマーペプチドへの個々の単離ペプチドの物理的連結は、当技術分野において周知の化学的結合手順によって、例えばペプチド連結の作出、縮合剤の使用によって、および周知の二官能性架橋試薬の利用によって達成することができる。結合は、どんな介在基も伴わない連結、例えば、直接的なペプチド連結を含め、直接的であってよく、または間接的であってもよく、この場合に連結にはタンパク質もしくはペプチド、例えば、血漿アルブミンまたは他のスペーサー分子のような、介在成分が含まれる。例えば、連結はヘテロ二官能性またはホモ二官能性架橋剤、例えば、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、N-スクシンイミジル3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）および誘導体、ビス-マレイミド、4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレートなどを介することができる。
【０１１０】
架橋結合は、結合される分子の反応基を利用することにより外因的な架橋剤なしで達成することもできる。ペプチド分子を化学的に架橋結合する方法は、当技術分野において一般的に公知であり、いくつかのヘテロ二官能性剤およびホモ二官能性剤が、例えば、米国特許第4,355,023号、同第4,657,853号、同第4,676,980号、同第4,925,921号および同第4,970,156号、ならびにImmuno Technology Catalogue and Handbook, Pierce Chemical Co.（1989）に記載されており、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。そのような結合は、架橋結合を含めて、ペプチドオリゴマーまたはそれに結合された実体、例えば治療剤、および関心対象の物質を結合できる成分などの所望の機能に実質的に影響を与えないように行われるべきである。
【０１１１】
個々のペプチドの結合はペプチドのN末端またはC末端を介した連結により達成され、それぞれ、N連結ペプチドオリゴマーまたはC連結ペプチドオリゴマーをもたらすことができる。
【０１１２】
代替的なリンカーを用いて、例えば化学的タンパク質架橋剤を用いて、ペプチドを連結できることは当業者には明らかであろう。例えば、ホモ二官能性架橋剤、例えばジスクシンイミジル-スベルイミデート-ジヒドロクロリド; ジメチル-アジピミデート-ジヒドロクロリド; 1,5,-2,4ジニトロベンゼンまたはヘテロ二官能性架橋剤、例えばN-ヒドロキシスクシンイミジル2,3-ジブロモプロピオネート; 1エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロリド; およびスクシンイミジル4-[n-マレイミドメチル]-シクロヘキサン-1-カルボキシレート。
【０１１３】
処方物および組成物
一つの態様において、本明細書において記載される本発明は、オリゴマーペプチドおよび/またはオリゴマーC-ペプチド阻害剤の組成物と、薬学的に許容される担体とを含んだ薬学的組成物を含む。
【０１１４】
薬学的組成物の剤形は、その調製の方法とともに、製薬分野および美容分野において周知である（HARRY'S COSMETICOLOGY（Chemical Publishing, 7th ed. 1982）; REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES（Mack Publishing Co., 18th ed. 1990）を参照のこと）。そのような調製物で用いるのに望ましい他の成分は、保存料、共溶媒、粘度増強剤、担体などを含む。担体それ自体または担体に溶解される成分は、保湿特性、洗浄特性、または抗炎症/抗掻痒特性を含めて、それ自体の緩和特性または治療特性を有することができる。浸透促進剤は、例えば、界面活性剤; ジメチルスルホキシドおよび他のスルホキシド、ジメチルアセトアミドおよびピロリドンのような、ある種の有機溶媒; 複素環アミンのある種のアミド、グリコール（例えばプロピレングリコール）; プロピレンカーボネート; オレイン酸; アルキルアミンおよび誘導体; さまざまなカチオン性、アニオン性、非イオン性および両性の界面活性剤などでありうる。
【０１１５】
一つの態様において、剤形は、本質的に非毒性かつ非治療性である薬学的に許容される担体を含む。そのような担体の例としてはイオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸塩のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または硫酸プロタミンのような電解質、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質およびポリエチレングリコールが挙げられる。いかなる投与にも、従来のデポー形態が使用されることが適当である。そのような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入剤形、鼻用スプレイ、舌下錠、および徐放性調製物を含む。徐放性組成物の例の場合、米国特許第3,773,919号、同第3,887,699号、欧州特許第58,481A号、欧州特許第158,277A号、カナダ特許第1176565号、U. Sidman et al., Biopolymers 22:547（1983）およびR. Langer et al., Chem. Tech. 12:98（1982）を参照されたい。一体型または貯蔵型マイクロカプセル、デポーインプラント、浸透圧ポンプ、小胞、ミセル、リポソーム、経皮パッチ、イオン泳動装置および別の注射用剤形のような、種々の制御放出形をこの目的に使用することができる。
【０１１６】
タンパク質は、通常、約0.1 mg/ml〜100 mg/mlの濃度で処方されるであろう。インビボで生物製剤を発現するために遺伝子を保有するウイルスベクターは、ウイルスベクター粒子106〜1×1014個/適用/患者の範囲内であるべきである。
【０１１７】
一つの態様において、抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸; 低分子量（約10残基未満の）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド; 血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのような、タンパク質; ポリビニルピロリドンのような親水性重合体; グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジンまたはアルギニンのような、アミノ酸; 単糖類、二糖類、およびセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の糖質; EDTAのようなキレート剤; ならびにマンニトールまたはソルビトールのような糖アルコールを含め、他の成分を薬学的処方物に添加することができる。
【０１１８】
一つの態様において、治療的投与に用いられる薬学的処方物は無菌でなければならない。無菌性は滅菌ろ過膜（0.2ミクロンの膜）を通したろ過によって容易に達成される。オリゴマーペプチドは、通常、凍結乾燥された形態で保存され、または熱変性および酸化的変性に対して高度に安定であれば水溶液として保存されることができる。オリゴマーペプチド調製物のpHは、典型的には、約6〜8であるが、もっと高いまたはもっと低いpH値が場合によっては適切であることもある。
【０１１９】
本明細書において記載される薬学的組成物は、薬学的処方物において全身に投与することもできる。好ましい処方物は同様に、無菌食塩水または乳酸加リンゲル液である。乳酸加リンゲル液は、血液と等張の溶液であり、静脈内投与を対象とする。全身経路は、経口、非経口、鼻孔吸入、気管内、くも膜下腔内、頭蓋内、および直腸内の経路を含むが、これらに限定されることはない。薬学的処方物は、無菌食塩水または乳酸加リンゲル液であることが好ましい。治療的適応のため、本明細書において記載される調製物は、ヒトに急速静注薬として静脈内に投与されうるか、またはある期間にわたって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所もしくは吸入の経路によって、持続注入により投与されうるものを含め、薬学的に許容される剤形で、哺乳類、好ましくはヒトに投与される。噴霧器による鼻孔吸入向けにオリゴマーペプチドを処方することができる。オリゴマーペプチドをコードするウイルスベクターが、噴霧器とともに用いるために処方されてもよい。これらの用途の場合、錠剤、腸溶性錠剤またはカプセル、顆粒、粉末、カプセル、およびスプレイなどさらなる従来の薬学的調製物が選択的に必要とされることもある。そのような処方物において、結合剤、湿潤剤、高圧ガス、滑沢剤、および安定剤などの、さらなる従来の添加物が必要とされることもある。一つの態様において、本明細書において記載される治療用組成物は、早期肺がんの気管内遺伝子治療処置について記載されているものなどの、カチオン性リポソーム処方物に処方される（Zou Y. et. al., Cancer Gene Ther. 2000 May;7（5）:683-96）。リポソーム処方物は患者の肺への送達に向けてエアロゾルで用いるのにとりわけ適している。ベクターDNAおよび/またはウイルスは、融合性リポソーム・ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、低レベル（5〜10 mol%）のカチオン性脂質を含有する「安定化プラスミド-脂質粒子」（SPLP）に封入され、ポリエチレングリコール（PEG）コーティングによって安定化されることができる（Zhang Y. P. et. al. Gene Ther. 1999, 6:1438-47）。発現プラスミドおよびウイルスを治療用物質として処方する際の他の技術は、Martin Schleef（Editor）December 2005, Wiley Publisherによる「DNA-Pharmaceuticals: Formulation and Delivery in Gene Therapy, DNA Vaccination and Immunotherapy」およびMartin Schleef（Editor）May 2001による「Plasmids for Therapy and Vaccination」に見出され、それらの文献は参照として本明細書に組み入れられる。一つの態様において、ウイルスベクターの投与量はウイルスベクター粒子106〜1014個/適用/患者である。
【０１２０】
投与の経路、剤形、および有効量は、オリゴマーペプチドの効力、および遺伝子治療に用いられる発現ベクターとウイルスベクター、ならびにそれらの物理化学的特性によって変わる。適切な投与量の選択は十分、通常の知識を有する医師の技術の範囲内である。
【０１２１】
本発明を、限定するものと解釈されるべきではない以下の例によってさらに例証する。本出願を通じて引用される全ての参考文献の内容、ならびに図面および表は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２２】
本発明は、本明細書において記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬などに限定されず、したがって変化しうることが理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、特定の態様を記載する目的のためだけであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定するよう意図されるものではない。
【０１２３】
操作例の場合を除き、または他に指定されている場合、本明細書において用いられる成分の量または反応条件を表す全ての数は、いかなる場合でも、「約」という用語によって修飾されるものと理解されるべきである。「約」という用語は、百分率と関連して用いられる場合、平均値±1%を意味することができる。
【０１２４】
実施例
導入
C-ペプチドは、CD4-gp120相互作用からヘアピン三量体形成までの動態のなかでgp41を阻害する。結果として、その効力は結合親和性に左右されるだけでなく、C-ペプチドとgp41の会合速度および感受性の中間状態の存続期間のような動的パラメータによっても影響を受ける。これらの動的パラメータ（ウイルス株および感染可能な標的細胞に依るバラツキ）は、T20およびC37の効力を低ナノモル域に抑制する傾向がある。T20およびC37の密着結合性の変種は、同じナノモルの効力で野生型ウイルスを阻害する傾向がある。
【０１２５】
C-ペプチドに対する耐性は、少なくとも二つの異なる機構を通じて現れる。一つ目は直接的であり、はるかに多く見られる: 耐性ウイルスはHXB2配列中のgp41 HR1領域の中に、特にアミノ酸番号543と552との間の配列QLLSGIVQQQ（SEQ. ID. NO. 13）の中に、T20およびC37の結合親和性を実質的に低減する突然変異を蓄積する傾向がある。二つの多く見られる耐性プロファイルはQLLSDTVQQQ（SEQ. ID. No. 14）およびQLLSGIEQQQ（SEQ. ID. No. 15）であり、この場合に導入されたAspまたはGluの負電荷がT20およびC37の結合を実質的に破壊するように思われる。それほど多くは見られない二つ目の耐性プロファイルは、gp41のHR2領域中の突然変異を含む。このプロファイルの背後にある機構は十分に確認されていないが、異なるgp41阻害剤（5-Helix）に関する研究活動から、突然変異のサブセットがgp41中間状態の存続期間を減らし、それによってC-ペプチドがgp41に結合するほかない時間量を少なくしてしまうことが示唆される。この突然変異のサブセットには、Asn637およびThr639によって形成される保存されたグリコシル化部位が含まれる。
【０１２６】
実験手順
C-ペプチド合成
本研究において利用される組換えC37は、HXB2またはJRFL Envのいずれか由来のHR2残基番号625-661を含有する（HXB2配列による付番）。C37組換えポリペプチド変種に対する発現ベクターを、QuickChange部位特異的変異導入（Stratagene）によって作出し、読み取り枠全体を配列決定することによって確認した。同様に既述（Root, M., et. al.,（2001）Science 291, 884-888）の、C-ペプチドC37およびその変種（N637K、T639I、N637K/T639IおよびT639S）は、組換えにより発現されたヘアピン三量体構築体（CGG-NC 1.1）の切断の後に、逆相高圧液体クロマトグラフィー（rpHPLC）によって得た。T20は、Proteomics/Peptide Synthesis Facility of the Kimmel Cancer Center（Thomas Jefferson University, Philadelphia）において標準的なFmoc化学を用いて合成した。脱塩されたペプチドを、Vydac C-18カラムおよび0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水中でのアセトニトリルの直線勾配を用いたrpHPLCによって、均質になるまで精製した。精製T20およびC37ペプチドの同一性を、SELDI-TOF質量分析（Ciphergen）を用いて確認した。全てのポリペプチドの濃度を、6 MグアニジンHCl（GuHCl）中280 nmでの吸光度により決定した（Edelhoch, H., 1967, Biochemistry 6, 1948-1954）。
【０１２７】
C37ペプチドを、100 mMリン酸カリウム、pH 7.2/10 mM MgSO4中1 mlあたりタンパク質4 mgに希釈し、0.4 mlのアリコットに分割した。50 μMの終濃度までDMSOにMTS-3-MTS（5Å）または3,6,9,12,15-ペンタオキサヘプタデカン-1,17-ジイルビス-メタンチオスルホネート（MTS-17-O5-MTS; 21Å）を加えた後に、サンプルを室温で1時間インキュベートした。同じ容量のDMSOを対照サンプルに加えた（終濃度0.25%）。5 mMの終濃度までメタンチオスルホン酸メチルを加えることにより、架橋反応を終わらせた。10,000×gで2分間の遠心分離によって収集した後に、小胞を100 mMリン酸カリウム（pH 7.2）/10 mM MgSO4で2回洗浄し、同じ緩衝液0.4 mlに再懸濁した。各サンプルのアリコット（40 μl）をSDS/グリセロール/18% PAGEに供した。
【０１２８】
阻害アッセイ法およびウイルス感染アッセイ法
全てのウイルス感染性および細胞-細胞融合実験は、Chan, D., et. al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15613-15617に記載のように行った。手短に言えば、ウイルス感染を阻害する際のC-ペプチドの効力を、Malashkevich, V. N., et. al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 9134-9139によって記載されているように、組換えルシフェラーゼを発現するHIV-1を用いて決定した。ウイルスを産生するために、リン酸カルシウムを用いて、外被欠損HIV-1ゲノムNL43LucR-E-（21）およびHXB2 gp160発現ベクターpCMVHXB2 gp160を、293T細胞に同時にトランスフェクトした。低速遠心分離によってウイルス上清から細胞残屑を取り除き、これを用いて、0〜200 nMに及ぶ各種濃度のC-ペプチドの存在下、HOS-CD4/融合細胞（N. Landau, National Institutes of Health AIDS Reagent Program）に感染させた。感染から48時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性をWallac（Gaithersburg, MD）AutoLumat LB953ルミノメータで測定した。IC50は、ペプチドを欠いた対照サンプルと比べて活性の50%減少をもたらすペプチド濃度である。各ペプチドに対し、3回の実験のデータを、Langmuir方程式[y = k/（1 +（ [ペプチド]/IC50）]、（式中、y = ルシフェラーゼ活性およびkはスケーリング定数である）]にあてはめてIC50値を得た。
【０１２９】
0〜200 nMに及ぶ各種濃度のペプチドの存在下において、HXB2外被発現細胞株チャイニーズハムスター卵巣[HIVe]（クローン7d2）（22）を、CD4発現細胞株HeLa-CD4-LTR-Beta-gal（M. Emerman, National Institutes of Health AIDS Reagent Program）と共培養することにより、融合細胞形成を評価した。細胞融合によって、HeLa-CD4-LTR-Beta-gal指標細胞株から核ガラクトシダーゼの発現が起こる。共培養から15時間後に、単層を発色基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル--D-ガラクトシドで染色し、少なくとも3つのガラクトシダーゼ陽性の核を含有する多核細胞を数えることによって、融合細胞形成を定量化した。各ペプチドに対し、3回の実験のデータを、Langmuir方程式にあてはめてIC50値を得た。
【０１３０】
野生型配列か、またはC-ペプチドに対する耐性を与える3つの変種配列のうちの1つかどちらかのHXB2 HIV-1株由来のEnvで偽型にしたHIV-1を、HOS-CD4-Lesに感染させた。図1に定義の、Res1およびRes2 Envの配列は、gp41 HR1領域の中に、C-ペプチド結合親和性を低下させる突然変異を含有する。Res3の配列は、gp41 HR2領域の中に、ウイルス膜融合の速度を増強することによって部分的耐性を与える突然変異（N637K）を含有する。IC50（±SEM）値は、示したC-ペプチドの2または3回の独立した滴定の平均値を表す。
【０１３１】
結果
図1Aは、融合タンパク質（FP）、膜貫通領域（TM）、および細胞質尾部（Cyto）との関連でHR1およびHR2領域を示したgp41の模式図を示す。HR1（WT）ならびにHR2（C37およびT20）の配列がそれぞれ、模式図の上および下に太字で示されている。C37配列中のより小さな、イタリック体の残基は、gp41には見られないが、阻害ペプチドには含まれる。HR1配列の上のRes1およびRes2配列は、本研究において用いられた二つのC37-およびT20-耐性株に由来し、ここで二重下線のアミノ酸残基はエスケープ変異を特定している。表示のC37およびT20変種の配列が示されており、残基Asn637からlys637（N→K）への突然変異およびThr639からイソロイシン（T→I）への突然変異が囲われており、付加したC末端Gly-Cysが太字で強調されている。
【０１３２】
作出されたC37変種は、HR1領域の突然変異がもたらした耐性を克服することができた。図2において、菌株HXB2由来の野生型Env（黒四角）またはV549E変異Env（Res1、黒丸）のどちらかで偽型にしたウイルスを利用して、HOS-CD4-Les標的細胞に感染させた。感染はC37（図2A）、C37-KYI（図2B）または（C37-GC)2（図2C）の存在下および非存在下において行われ、ルシフェラーゼ・レポーター構築体の発現によって定量化された。IC50値がグラフに示してある。二つの置換（N637KおよびT639I）を有するC37の変異体変種（以後C37-KYIと表示する）は、gp41 HR1領域の構造模倣体であるN36として公知のN-ペプチドに、野生型C37の場合のKdよりも20倍以上低い推定される平衡解離定数（Kd）40 fMで結合する（図2）。三つのgp41のHr1およびHR2領域は、ウイルスの侵入過程および宿主膜との膜融合に必要であるヘアピン三量体と呼ばれる中間体構造を形成する。図1Bおよび1Cは、gp41のHR1およびHR2と、HR1およびHR2の模倣体ペプチド、N36およびC37ペプチドとの空間的関係を示した。
【０１３３】
C37-KYIはEnvHXB2で偽型にしたウイルスを、C37と同じ効力（IC50およそ1 nM）で阻害するが、変種ペプチドの効力は上記の二つのHR1領域置換という状況でわずかしか減弱されない。対照的に、オリジナルのC37ペプチドのIC50値は40倍〜110倍に増大される。同じKYI置換を有するT20変種は、結合親和性の同様の増大を示した。
【０１３４】
ペプチドのC末端にCys残基を含有するジスルフィド架橋された二量体C37変種（C37-GC）は、HR1領域の突然変異がもたらした耐性を克服することができた（図2C）。阻害データに関する動力学的制限と一致して、架橋された二量体C37-GCペプチドは、単量体C37ペプチドと比べて野生型ウイルスの阻害で有意に良好ではなかった（表1）。しかしながら、架橋ペプチドのIC50は、単量体C37の阻害効力の100倍低下をもたらすHR1領域での耐性突然変異の影響を受けなかった（表1）。耐性ウイルスに対する架橋C37のこの活性の増強は、親和力効果によるものであった: 各C37ペプチド単独では、エスケープ変異のあるHR1領域への結合はより弱かったが、連結された対の結合はこの親和性の消失を克服した。同様に、架橋されたT20は、耐性株Res4（SDTV突然変異を有する）に対し、同じ耐性HIVに対しての単量体T20ペプチドと比べて、20倍を超える阻害活性の増強を示した（表2）。
【０１３５】
抗ウイルス剤に対する耐性は、HIV-1感染の処置において重大な問題である。上記に詳述した改変は、gp41のC-ペプチド阻害剤に共通の耐性プロファイルを克服するための、親和性または親和力の増強を通じて阻害剤の結合強度を増大するための、一般戦略を提示する。この分野では「より良好な」C-ペプチドを探索しているが、それらの基準はこれまで、薬物速度論的特性を改善することおよび野生型ウイルスに対する阻害剤の効力を増強することに主に焦点が置かれてきた。C-ペプチドは、理論的に可能な限り速く野生型gp41と相互作用する可能性が最も高いので、阻害に関する動力学的制限により、野生型ウイルスに対してよい低いIC50を有するC-ペプチドを見つけ出せなかった。このように、本明細書で開発された高親和性C-ペプチド変種は、オリジナルのC37およびT20と同じくらい強力に野生型ウイルスを阻害する。しかしながら、それらはオリジナルのペプチドに耐性のウイルスの阻害で、実質的により良好である。
【０１３６】
特定されている全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用できるそのような刊行物に記載の方法論を記載および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日の前にこれらが単に開示されたことを示しているだけである。この点で、本発明者らが先行発明によってまたはその他任意の理由でそのような開示に先行する資格がないと認めるものと解釈されるべきではない。日付に関する全ての記載またはこれらの書類の内容に関する表現は、本出願者らが入手できる情報に基づいており、これらの書類の日付または内容の正確さに関して何らの承認をなすものではない。
【０１３７】
（表１）野生型および耐性HIV-1株に対するC-ペプチドの阻害効力
2010521478.tif 000034
【０１３８】
（表２）野生型および耐性HIV-1株に対するC-ペプチドの阻害効力
2010521478.tif 000035
ND = 実施せず
【図１Ａ】
2010521478.tif 000042
【図１Ｂ】
2010521478.tif 000043
【図１Ｃ】
2010521478.tif 000044
【図２】
2010521478.tif 000045
【手続補正書】
【提出日】平成21年11月24日(2009.11.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
本明細書で用いる場合、「C-ペプチドの変種型」という用語は、それぞれ、一つもしくは複数のアミノ酸、ヌクレオチド塩基対、コドン、イントロン、またはエクソンで修飾されたC-ペプチドを指し（またはそれらをコードする核酸配列を指し）、宿主細胞へのHIV侵入に対するその阻害活性により決定されるように、野生型C-ペプチドの生物活性および細胞機能の少なくとも80%を保持している。すなわち、変種C-ペプチド配列は、gp41遺伝子のC末端HR2ドメイン（Genbankアクセッション番号BD407105、NC_001802、AJ293865）によって規定されるものとはわずかに異なる。変種C-ペプチドの中には保存または非保存アミノ酸残基とともに一つまたは複数のアミノ酸突然変異が存在する。例えば、アミノ酸のセリンはトレオニンに代わって置き換えられることができ、アミノ酸のアスパラギン酸はグルタミン酸に代わって置き換えられることができる。変種C-ペプチドは、一つまたは複数の置換によってアミノ酸配列が異なりうる。好ましい変種の中には、保存的アミノ酸置換により参照ポリペプチドと異なるものも含まれる。そのような置換は、所与のアミノ酸を、似た特徴の別のアミノ酸により置き換えるものである。保存的置換は、脂肪族アミノ酸Ala、Val、Leu、およびIle間での、一方から他方への置換; ヒドロキシル残基SerおよびThrの相互交換; 酸性残基AspおよびGluの交換; アミド残基AsnおよびGln間の置換; 塩基性残基LysおよびArgの交換; ならびに芳香族残基PheおよびTyr間の置換である。以下の非限定的なアミノ酸の列挙は保存的置換（類似）とみなされる: （a）アラニン、セリン、およびトレオニン; （b）グルタミン酸およびアスパラギン酸; （c）アスパラギンおよびグルタミン; （d）アルギニンおよびリジン; （e）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン、ならびに（f）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。最も好ましいのは、その元となる親C-ペプチドと同じ生物学的機能および活性を保持する変種C-ペプチドであり、その機能および活性は宿主細胞へのHIVウイルスの侵入の阻害である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
gp41タンパク質（SEQ. ID. No. 7）のAsn126（gp160前駆体糖タンパク質中のAsn637, SEQ. ID. No. 20）にN→K突然変異を有するC-ペプチド、および／またはgp41タンパク質のThr128（gp160のThr639に対応する）にT→I突然変異を有するC-ペプチドは、変種C-ペプチドと考えられる。例えば、
2010521478.tif 000046
は
2010521478.tif 000047
の変種であり、および
2010521478.tif 000048
は
2010521478.tif 000049
の変種である。gp41のHR2領域のその他の変種C-ペプチドは、米国特許出願第2006/0247416号に記載されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
例えば、C-ペプチドをコードする構築体に関連して本明細書において用いられる「ベクター」という用語は、HIV-1膜貫通糖タンパク質gp41タンパク質のHR2領域、アミノ酸番号114-162（Genbankアクセッション番号BD407105、NC_001802、AJ293865）の全部または一部のコード配列を含む核酸構築体であって、宿主細胞への送達、異なる宿主細胞間での移動のために、または細胞中でのC-ペプチド、オリゴマーC-ペプチド、もしくはそのC-ペプチド変種の発現のためにデザインされた核酸構築体をいう。核酸構築体は、反復HR2領域を有するポリペプチドを発現するために縦列に配列されたHR2領域のコード配列のいくつかのコピーを有することができる。本明細書で用いる場合、ベクターはウイルス性または非ウイルス性であってよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
一つの態様において、オリゴマーペプチドは、個々の単離ペプチドを連結することによって作出することができる。個々のペプチドは、当技術分野において公知の化学的方法によって、または同様に当技術分野において公知の組換え方法によって作出することができる。組換え方法の場合、ペプチドのDNAコード配列は、PCR反応の鋳型としてのHIV-1膜貫通糖タンパク質gp41タンパク質の全HR2領域、アミノ酸番号114-162（Genbankアクセッション番号BD407105、NC_001802、AJ293865）での、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いた増幅によって作出することができる。制限酵素消化部位および/または追加のスペーサーもしくはタグアミノ酸残基を組み入れた特製PCRプライマーを用いて、DNAの連結、組換えタンパク質の発現、およびタンパク質の精製を容易にすることができる。ペプチドの連結をともに容易にするために、DNAコード配列によって、ペプチドにさらなるアミノ酸残基を付加することができる。例えば、アミノ酸のシステインを含有するチオール基およびアミノ酸のリジンを含有するアミン基を付加することができる。チオール基およびアミン基は、架橋反応に有用な反応基を供与する。一つの態様において、さらなるアミノ酸がペプチドの末端に付加される。当技術分野において公知である標準的な組換え分子生物学法を用いて、コード配列の中に追加のアミノ酸を遺伝子工学で作出することができる。さらに、タグを構成する追加のアミノ酸を付加して、ペプチドの発現および精製を容易にすることもできる。そのようなタグの例としては、チオレドキシンの最初の105アミノ酸、縦列の6ヒスチジン-タグ、HA-タグ、およびflag-タグが挙げられる。末端に付加されたシステイン基およびヒスチジン（6×）精製タグを有するそのようなペプチドの例は
2010521478.tif 000050
である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
一つの態様において、HIVウイルスの侵入を阻害するアミノ酸配列
2010521478.tif 000051
またはその断片および/もしくは変種を有する複数のペプチドを含んだタンパク質をコードする単離された核酸構築体が提供され、該複数のペプチドは、ペプチドリンカーによって物理的に連結されている。個々の単離ペプチドを連結することによってオリゴマーペプチドを合成することが可能であるが、当技術分野において公知の組換え方法を用いて、オリゴマーペプチドを合成することができる。ペプチドのDNAコード配列は、PCR反応の鋳型としてHIV-1膜貫通糖タンパク質gp41タンパク質の全部のHR2領域、アミノ酸番号114-162（Genbankアクセッション番号BD407105、NC_001802、AJ293865）を用いたPCRによって増幅することができる。制限酵素消化部位および/または追加のスペーサーもしくはタグアミノ酸残基を組み入れた特製PCRプライマーを用いて、DNAの連結、組換えタンパク質の発現、タンパク質の精製、およびタンパク質の同定を容易にすることができる。次に、ペプチドの増幅されたDNAコード配列を連結して、縦列に連結されたペプチドのいくつかのコード配列を含む単一のコードDNA配列を形成させることができる。2つおよび最大で5つまでのペプチドコード配列が、縦列で連結される。2〜10個のアミノ酸をコードするさらなるアミノ酸コード配列を、隣接ペプチドの各対の間にスペーサー配列として付加することができる。単一のコードDNA配列が転写され翻訳される場合、発現されるポリペプチドは、2〜10個の追加のアミノ酸によってそれぞれが分離された縦列反復のペプチドを含有するであろう。配列に間隔をあけるのに使用される典型的なアミノ酸残基は、グリシン、チロシン、システイン、リジン、プロリン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸などである。好ましい態様において、オリゴマーペプチドは、個々のペプチドのコピーがアミノ-カルボキシル-アミノ-カルボキシルの縦列配置で配置されて発現される。スペーサーとしての2つのグリシン残基と6ヒスチジンタグとを有する、同一ペプチドの2つのコピーを含んだ発現オリゴマーペプチドの例:
2010521478.tif 000052
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010521478000001.app
【国際調査報告】
2010521478.tif 000053
2010521478.tif 000054
2010521478.tif 000055