(57)【要約】  Ｆｃ含有タンパク質、例えば抗体の特性が、Ｆｃ含有タンパク質を発現する細胞株をシアリダーゼをコードするベクター配列でトランスフェクトすることにより、Ｆｃ領域中のオリゴ糖のシアリル化を改変することにより制御される。修飾されたＦｃ含有タンパク質は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ受容体の１もしくは複数に対する親和性、ＡＤＣＣ活性、マクロファージもしくは単球活性化、血清半減期およびアビディティを制御することが望まれる疾患または状態に治療的用途を有する。【選択図】図１３
2010514448.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ含有分子を発現するように操作された哺乳動物細胞を含んでなる培養物中にシアリダーゼ酵素活性を提供する方法であって、シアリダーゼ酵素活性が可能なポリペプチドをコードするベクターで哺乳動物の操作された細胞をトランスフェクトすることを含んでなり、ここでポリペプチドは培養物中にＦｃ含有分子と一緒に分泌され、これによりＦｃ含有分子のグリカンがポリペプチドのシアリダーゼ酵素活性により作用され得る、上記方法。
【請求項２】
ベクターがアースロバクター  ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼ酵素Ａの触媒ドメインをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｆｃ含有分子が抗体であり、そして哺乳動物細胞株がＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、ＹＢ２／０もしくはＹ３、骨髄腫もしくはリンパ腫細胞、またはその誘導体、不死化もしくは形質転換細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗体が抗−ＴＮＦα抗体であり、そして細胞株がＣ１６８Ｍである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
シアリダーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターであって、ベクターがＦｃ含有分子を発現している哺乳動物細胞培養物中でシアリダーゼ酵素活性を有するポリペプチドを発現することができる上記発現ベクター。
【請求項６】
シアリダーゼ酵素がアースロバクター  ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）のシアリダーゼ酵素Ａであり、そして哺乳動物細胞株がＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、ＹＢ２／０もしくはＹ３、骨髄腫もしくはリンパ腫細胞、またはその誘導体、不死化もしくは形質転換細胞からなる群から選択される、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
ベクターがシグナル配列、プロモーター配列および抗生物質耐性を含んでなる請求項５に記載のベクター。
【請求項８】
シグナル配列がヒト成長ホルモンシグナル配列であり、プロモーター配列がＣＭＶプロモーター配列であり、そして抗生物質耐性がネオマイシンである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
細胞株中で発現するＦｃ含有分子の特性を制御する方法であって、細胞株をシアリダーゼ酵素をコードするベクターでトランスフェクトすることによりＦｃ領域中のオリゴ糖のシアリル化を下げることを含んでなり、ここで発現されるＦｃ含有分子が減少した量のシアル酸残基を含んでなる、上記制御方法。
【請求項１０】
制御されるＦｃ含有分子の特性が、多様に局在する標的タンパク質についての分子のアビディティー；ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡの１もしくは複数のＦｃガンマ受容体に対する親和性；ＡＤＣＣ活性；マクロファージもしくは単球の活性化；および血清半減期である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ベクターがアースロバクター  ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒ
ｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼ酵素Ａ触媒ドメインをコードする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
Ｆｃ含有分子が抗体であり、そして哺乳動物細胞株がＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、ＹＢ２／０もしくはＹ３、骨髄腫もしくはリンパ腫細胞、またはその誘導体、不死化もしくは形質転換細胞からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
抗体が抗−ＴＮＦα抗体であり、そして細胞株がＣ１６８Ｍである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｆｃ含有分子が標的に対して特異的な結合ドメインを有し、該標的が固定化標的である請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
Ｆｃ含有分子が標的に対して特異的な結合ドメインを有し、該標的が細胞の表面上で発現される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
請求項９ないし１５のいずれかに記載の方法により生産または改変されたＦｃ含有タンパク質。
【請求項１７】
タンパク質が、腫瘍学関連障害、慢性疾患もしくは感染性疾患の処置に指示される、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
感染性疾患が、ウイルスおよび細菌の一方もしくは双方を含んでなる抗体にオプソニン化された細胞または粒子のＦｃＲ媒介型消失が関与し、そして慢性疾患には長期処置を必要とする請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
タンパク質が、組換え発現されたモノクローナル抗体を含んでなり、抗体がレクチンアフィニティクロマトグラフィーを使用して濃縮された特定の糖型を有する請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２０】
タンパク質が、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーの１もしくは複数を使用して精製された、組換え発現されたモノクローナル抗体である、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２１】
アフィニティクロマトグラフィーがレクチンアフィニティクロマトグラフィーである請求項２０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
タンパク質が、増強されたレベルのアシアリル化モノクローナル抗体を有する、遺伝子的に操作された宿主細胞中で発現されたモノクローナル抗体である、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２３】
製薬学的に許容され得る担体と組合せた請求項１６ないし２２のいずれか１項に記載のタンパク質を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項２４】
疾患もしくは状態の処置もしくは診断のための、請求項２３に記載の組成物を使用する方法。
【請求項２５】
上記タンパク質が、癌腫、リンパ腫、肉腫および骨髄腫よりなる群から選択される腫瘍
性疾患の処置に使用される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記タンパク質が、乾癬、慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病および全身性エリテマトーデスからなる群から選択される炎症性障害の処置に使用される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
タンパク質が、角膜もしくは網膜の血管新生が関与する障害の処置に使用される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
本明細書に記載されるいずれかの発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｆｃ受容体と相互作用する治療用タンパク質、例えば抗体の生産方法に関し、ここでオリゴ糖鎖の組成は、その標的に対する抗体のアビディティーならびにＦｃ受容体の結合親和性について至適化され、これによりグリコシル化抗体を生産するための非至適化法と比べた時に、該抗体のエフェクター機能活性を至適化する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
抗体は先天免疫で重大な役割を演じている可溶性血清糖タンパク質である。重鎖定常領域中の保存された位置で全ての天然に産生される抗体の炭水化物構造は、アイソタイプにより異なる。各アイソタイプは異なる多数のＮ−結合オリゴ糖構造を有し、それらはタンパク質の集成、分泌もしくは機能的活性に多様に影響を及ぼす（非特許文献１）。図１および２を参照すれば、結合されたＮ−結合オリゴ糖の構造はプロセシングの程度に依存してかなり変動し、そして高マンノース、ならびに分岐ＧｌｃＮＡｃおよび核フコース残基を持つかまたは持たない複雑な二分岐オリゴ糖を包含し得る（非特許文献１）。典型的に、モノクローナル抗体でさえ複数の糖型（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）として存在するような、特定のグリコシル化部位に結合されたコアオリゴ糖構造の不均質なプロセシングが存在する。同様に、抗体のグリコシル化の大きな差違が抗体産生細胞株間で存在し、そしてなお小さな差違が異なる培養条件下で増殖された所定の一細胞株について見られることが示された。
【０００３】
グリカン（定常基）上のシアル酸は抗体以外の糖タンパク質の血清半減期の延長において重要であることが知られている（非特許文献２）。これまで、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）に対するシアル酸の役割は十分に理解されていない。Ｍａｂの血清半減期はとりわけ長命であり、そしてＦｃ融合タンパク質の構築は、治療用タンパク質、例えばタンパク質エンテラセプトの開発における有用な戦略と判明している。
【０００４】
抗体およびＴ細胞受容体分子は、特異的細胞表面受容体結合（その結合が細胞応答を調節する）の原因となる領域を有する。免疫系ではこれらの機能は体液性および細胞性と分類される。抗体はしばしば体液性および細胞性免疫機構を結びつけるアダプター分子と称され、すなわち体液性応答は主として標的抗原への高親和性結合が可能な成熟分泌型循環抗体に帰される。細胞性応答は、ａｂ−ａｇ複合体の結合、およびエフェクター細胞へのａｂ−ａｇ複合体結合の結果としての細胞メディエーターの放出により引き起こされる下流の後続の細胞の活性化の結果に帰される。これらの細胞応答は、標的の中和、オプソニン化および感作（抗原が細胞の表面上に表示される場合）、肥満細胞の感作および補体の活性化を包含する。細胞標的、すなわち細胞表面抗原については、これらのエフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として一般に知られるものに至る。
【０００５】
抗体アイソタイプ（例えばＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧ）の間で、ＩｇＧが最も豊富であり、ＩｇＧ１サブクラスが大きな程度および範囲のエフェクター機能を表す。ＩｇＧ１型の抗体は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性がしばしば重要と思われる癌免疫療法で最も一般に使用される抗体である。構造的に、ＩｇＧのヒンジ領域およびＣＨ２ドメインが抗体エフェクター機能で主要な役割を演じている。（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの二量体化により形成される）Ｆｃ領域に存在するＮ−結合オリゴ糖がエフェクター機能に影響を及ぼす。共有結合したオリゴ糖は複雑な二分岐型構造であり、そして高度に不均質である（図１および２を参照されたい）。Ａｓｎ２９７の保存されたＮ−結合グリコシル化部位は各ＣＨ２ドメイン中に存する。成熟抗体中で、Ａｓｎ２９７に結合された２個の複雑な二分岐オリゴ糖はＣＨ２ドメイン間に埋没されて、ポリペプチド骨格と広範な接触点を形成する。ＡＤＣＣのようなエフェクター機能を抗体が媒介するのにそれらの存在が不可欠であることが見出された（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献１）。
【０００６】
種々の宿主細胞に生産されたものを含んでなるＦｃ部分抗体または抗体誘導化構造を修飾する不均質なオリゴ糖は、末端糖として主にシアル酸、フコース、ガラクトースおよびＧｌｃＮＡｃ残基を含有する（非特許文献５）。特に露出されたガラクトース、コアのフコースおよび分岐したＧｌｃＮＡｃ残基のようなこれらの末端糖のいくつかが、分子のＦｃ部分の構造に影響を及ぼし、そしてこれにより抗体のエフェクター機能を改変することが示された。Ｆｃ受容体として知られている細胞表面受容体への結合、ならびにＣ１ｑ補体タンパク質を含む多様なリガンドへの結合に依存するＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性のようなエフェクター機能は、付加されたグリカンの組成により改変できる（非特許文献６）。Ｆｃで付いたＮ−結合グリカンの大多数は、有意な程度までシアリル化されてはいない（非特許文献７）。
【０００７】
ヒトＩｇＧおよび他の組換え生産されたＩｇＧ中に見出される主要構造は、露出したＧａｌ残基を含むかまたは含まない複雑な二分岐構造である（図１）。研究目的ならびに生物製剤生産の目的で組換え抗体を発現するために現在使用されている多くの哺乳動物宿主細胞がある。宿主細胞種の起源ならびに培養条件が、組換えで発現された分子に付加されるグリカンの程度および構造に変動を生じることができる。抗体の組換え発現用に一般に使用されている２つの宿主細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）およびマウス骨髄腫細胞（ｓｐ２／０、６５３、ＮＳ０）である。ＣＨＯ細胞はシアル酸グリカンをほとんど欠く組換え抗体を発現する一方、グリカンは９９％フコシル化される。フコースの存在は低減したＦｃ−ガンマＩＩＩ受容体、したがってＡＤＣＣの主要な因子となることが示されてきた。マウス骨髄腫細胞は最高５０％のシアル酸を含む組換え抗体を発現するが、一般にフコースは少ない。上に述べたように、これらの差異はインビボで抗体活性に有意な効果を及ぼす可能性がある。
【０００８】
従って、治療用抗体に随伴するグリカンのシアリル化を、回収後の処理を必要とせずに、そして同時にシアル酸含量に関して合理的に均一な構造を提供する様式で減少できることが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．とＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６−３２（１９９７）
【非特許文献２】Ｓｔｏｃｋｅｒｔ，Ｒ．Ｊ．（１９９５）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７５、５９１−６０９
【非特許文献３】Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：８１３−８２２（１９９５）
【非特許文献４】Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．１６３：５９−７６（１９９８）
【非特許文献５】Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０００．１０（５）：４７７−８６
【非特許文献６】Ｐｒｅｓｔａ  Ｌ．２００３．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．１３（４）：５１９−２５
【非特許文献７】Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ＥＥ  ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１６４（８）：４１７８−８４
【発明の概要】
【００１０】
発明の要約
本発明は、Ｆｃ含有分子、とりわけ減少したシアル酸含量の抗体治療薬を生産するために有用な方法、宿主細胞ならびに発現ベクターおよびプラスミドを含んでなる。より詳細には本発明は操作されたシアリダーゼコード配列をコードする発現プラスミドを含んでなり、このプラスミドはいったん抗体を分泌する宿主細胞株に導入されれば、宿主細胞がシアリダーゼ活性を有するポリペプチドを分泌できるようにする。１つの態様では、プラスミド中のコード配列はアースロバクター  ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）のシアリダーゼの触媒ドメインをコードする。本発明のさらなる観点では、アースロバクター  ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）のシアリダーゼの触媒ドメインを含んでなる宿主細胞は、翻訳された触媒ドメインを培養基に分泌する。
【００１１】
本発明は、Ｆｃ領域中のオリゴ糖のシアリル化を最少にすることを含んでなる、Ｆｃ含有分子の特性の制御方法を含んでなり、これにより多様に局在化された標的タンパク質に対する分子のアビディティーならびにＦｃガンマ受容体、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ受容体の１もしくは複数に対する親和性；ＡＤＣＣ活性；マクロファージもしくは単球活性化；ならびに血清半減期が最適化される。
【００１２】
また本発明は、Ｆｃドメイン中で最大にシアリル化されたＮ−結合オリゴ糖を含有する抗体のようなＦｃ含有分子の高度に均質なバッチの調製法にも関する。それは、Ｆｃオリゴ糖中にシアル酸を含む抗体ならびにＦｃオリゴ糖中にシアル酸を含まない抗体について濃縮された抗体のバッチの精製にさらに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒトＩｇＧ中で見出される最大のオリゴ糖構造の図解である。
【図２】チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で生産される組換えＩｇＧ中に見出される主要なオリゴ糖構造を表す。
【図３】Ｆｃオリゴ糖のＨＰＬＣ分析の結果を示す。Ｎ−結合オリゴ糖を、ＰＮＧアーゼＦ酵素で処理することにより抗体から最初に遊離した。遊離されたオリゴ糖をアントラニル酸で標識し、そして、標識されたオリゴ糖をゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。精製された標識オリゴ糖をＨＰＬＣにより分析して、示されるクロマトグラムをもたらした。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、２種の異なる形式によるＫ５６２細胞上のヒトＦｃγＲＩＩへの多様なＡｂ１：ＴＮＦ免疫複合体の結合を示すグラフである。（Ａ）Ａｂ６（Ａｂ５に特異的なマウスモノクローナルＡｂ）と複合体形成した固定量の１２５Ｉ標識ヒトＩｇＧ１  Ａｂ５の存在下で、Ａｂ１およびＴＮＦの非標識複合体の量を変動させて細胞に添加することにより測定される競合結合。（Ｂ）１２５Ｉ標識ＴＮＦと複合体形成するＡｂ１の量を変動させてＫ５６２細胞に添加することにより測定される直接結合。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、ＮＫ細胞のＦｃγＲＩＩＩａ：Ａｂ１の天然のグリコシル化バリアント（Ａ）；Ａｂ５の天然のグリコシル化バリアント（Ｂ）；Ａｂ１のレクチンカラム画分（Ｃ）；およびＡｂ２のレクチンカラム画分（Ｄ）への結合について、固定濃度の放射標識抗ＦｃγＲＩＩＩａ  ｍＡｂ  ３Ｇ８と競合するのに使用した多様な試験Ａｂ調製物を用いたＦｃγＲＩＩＩａ結合実験のグラフである。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、シアル酸含量が異なるＡｂ１、それらの細胞表面上でＴＮＦを過剰発現するＫ２標的細胞、およびＦｃγＲを発現するヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を使用して実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイの結果を示すグラフである。（Ａ）Ａｂ１の天然のグリコシル化バリアント、（Ｂ）Ａｂ５の天然のグリコシル化バリアント、（Ｃ）ＷＧＡレクチン親和性に基づく分画後のシアル酸含量が異なるＡｂ１の３種の下位ロットおよび酵素的脱グリコシル化した（Ｇｎｏ）Ａｂ１の比較、（Ｄ）未処理のＡｂ１サンプルおよび完全にシアリル化されたＡｂ１  Ｇ２Ｓ２サンプル、もしくはＡｂ７アイソタイプを一致させた陰性対照Ａｂの比較。サンプルは三重で分析し（誤差の棒はｓ．ｄ．を表す）、そして、示される結果はバリアントの各対の３回の独立の実験を代表する。これらの試験サンプル間の活性の差違は、追加二乗和Ｆ検定により決定されるとおり、有意であった（グラフＡ、ＣおよびＤについてＰ＜０．０００１；グラフＢについてＰ＝０．００１６）。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、Ｕ−９３７細胞上のヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）受容体への種々のＩｇＧ抗体サンプルの競合結合を示すグラフである（Ａ）Ａｂ１  Ｇ２（完全にガラクトシル化されかつシアリル化されていない）およびＡｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｈｉ）（完全にガラクトシル化されかつ完全にシアリル化された）はシアル酸の非存在および存在によってのみ異なる、（Ｂ）Ａｂ３の２種の異なるロットは荷電したオリゴ糖種（シアル酸含有種）の量が異なり、全オリゴ糖の２％もしくは４２％のいずれかである。
【図８】完全にシアリル化された（Ｇ２Ｓ２）もしくは非修飾であった融合タンパク質（ＦｃＰ１）の投与後の時間とＦｃ部分の血清濃度の間の関係を示すグラフである。
【図９】記載する酵素的方法により完全にシアリル化されたＡｂ２  Ｇ２Ｓ２もしくは完全にアシアリル化されたＡｂ２  Ｇ２の投与後の時間とＦｃ部分の血清濃度の間の関係を示すグラフである。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは放射標識Ａｂすなわち（Ａ）Ａｂ１の天然のバリアント、（ｂ）Ａｂ５の天然のバリアント、（Ｃ）Ａｂ１のレクチンカラム画分バリアントおよび（Ｄ）Ａｂ２のレクチンカラム画分バリアントとの競合結合による、細胞表面上の標的リガンドに対する親和性に関するＡｂ調製物中のシアル酸の影響を示すグラフである。サンプルは２連もしくは４連で試験し、そして示される結果は３もしくは４回の独立の実験を代表する。これらの試験サンプル間の結合の差違は、追加二乗和Ｆ検定により決定されるとおり有意であった（グラフＡ、ＣおよびＤについてＰ＜０．０００１）。
【図１１】図１１ＡおよびＢは、ＥＩＡプレートに被覆した標的リガンドに対する親和性に関するＡｂ調製物中のシアル酸の影響を示すグラフである。すなわち（Ａ）ＴＮＦへのＡｂ１の天然のバリアントの結合、（Ｂ）抗Ｉｄ抗体へのＡｂ２結合。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、表面結合されたＡｂすなわち（Ａ）Ａｂ１の天然のバリアント、（Ｂ）Ａｂ１  １のレクチンカラム画分のバリアントおよび（Ｃ）Ａｂ２のレクチンカラム画分のバリアントに対する、放射標識可溶性抗原として提示される標的リガンドに対する親和性に関するＡｂ調製物中のシアル酸の影響を示すグラフである。放射標識Ａｇおよび１００倍過剰の未標識Ａｇとの並行インキュベーションを、非特異的結合を測定するために行った。サンプルは３連で試験した。
【図１３】示す元のベクターｐ２８１５にクローニングするために使用する制限酵素部位を含むｈＧＨ（ヒト成長ホルモン）シグナル配列に連結されたアースロバクター  ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）のシアリダーゼＡの触媒ドメインを発現するように構築された発現プラスミドｐ３６２９の概略図である。
【図１４】分泌されるシアリダーゼ触媒ドメインを発現する細胞株；クローン３、５、１２、１３および１７に由来する精製抗体の抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を表すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
略語
α１，３ＧＴ、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ；α２，３ＳＴ、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ；β１，４ＧＴ、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ；ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞傷害；ＡＴＣＣ、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）；ＢＡＴＤＡ、ビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２”−テルピリジン−ｙ，ｙ”−ジカルボキシレート；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＣＤ培地、既知組成培地；ＣＤＣ、補体依存性細胞傷害；ＣＭＰ−Ｓｉａ、シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸；ＤＭＥＭ、ダルベッコ改良イーグル培地；Ｅ：Ｔ、エフェクター細胞対標的細胞比：ＦＢＳ、ウシ胎児血清；ＥＳＩ−ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化質量分析。ＮＫ細胞、ナチュラルキラー細胞；ＩｇＧ、免疫グロブリンＧ；ＩＭＤＭ、イスコフ改良ダルベッコ培地；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、マトリックス支援レーザー／脱離イオン化飛行時間質量分析；ＭＨＸ、マイコフェノール酸、ヒポキサンチン、キサンチン；ＮＡＮＡ、シアル酸のＮ−アセチルノイラミン酸異性体；ＮＧＮＡ、シアル酸のＮ−グリコリルノイラミン酸異性体；ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞；ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞；ＰＢＳ、リン酸緩衝化生理食塩水；ＰＮＧアーゼＦ、ペプチドＮグリコシダーゼＦ；ＲＰ−ＨＰＬＣ、逆相高速液体クロマトグラフィー；ＲＴ、室温；Ｓｉａ、シアル酸；ＵＤＰ−Ｇａｌ、ウリジン二リン酸ガラクトース；ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン。
【００１５】
定義
用語「ＡＤＣＣ活性」は抗体依存的細胞傷害性を表し、そして非感作エフェクター細胞による抗体が媒介する標的細胞破壊の現象を意味する。標的細胞の同一性は変動するが、これはＦｃ受容体活性化を行うことができるＦｃドメインもしくはＦｃドメインの部分を有する結合した表面免疫グロブリンＧを持たなければならない。エフェクター細胞はＦｃ受容体を有する「キラー」細胞である。これは標的細胞の同一性に依存して、例えば従来のＢ−もしくはＴ−細胞マーカーを欠くリンパ球、または単球、マクロファージ、または多核白血球でよい。反応は補体非依存性である。本発明の抗体または他のＦｃ含有タンパク質のＡＤＣＣ活性は、そのＡＤＣＣ媒介型殺細胞を示す能力が、実質的に類似の配列の抗体もしくはタンパク質、および代替的宿主細胞により生産されるＦｃドメインの能力より優る場合、「増強されている」。ＡＤＣＣ活性は標準的なインビボまたはインビトロの殺細胞アッセイ、例えば本明細書で検討するアッセイで測定することができる。好ましくは増強されたＡＤＣＣ活性を有する本発明の抗体は、代替的な宿主細胞で生産された参照抗体より低い用量で、かつ／またはより短期間で同じ効果（腫瘍細胞の増殖の防止または抑制）を達成する。好ましくは本発明の範囲内の抗体の能力と参照抗体との間の差異は、例えば選択された標準的なクロム放出ＡＤＣＣアッセイで並行して比較することにより測定した時、少なくとも約１．５倍、より好ましくは少なくとも約２倍、さらにより好ましくは少なくとも約３倍、最も好ましくは少なくとも約５倍である。
【００１６】
本明細書で使用される「親和性」（ａｆｆｉｎｉｔｙ）という用語は、その同族の結合パートナーに対する単純な一価リガンドの結合定数（例えば抗原もしくはエピトープに対するＦａｂの結合）の尺度であることを意図している。親和性は、限定されるものでないが、例えばプラズモン共鳴（ＢｉａＣｏｒｅ）によりオンおよびオフ速度（それぞれｋｏｎおよびｋｏｆｆ）を測定することを包含するいくつかの方法で測定することができ、そして全体的会合（Ｋａｓｓ）もしくは解離定数（ＫＤ）（ここでＫａｓｓはｋｏｎ／ｋｏｆｆであり、そしてＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎである）として表すことができる。またＫＤは、例えば結合パートナーへのリガンドの結合が半飽和である濃度を測定することにより経験的にも測定することができる。ＫＤの別の測定方法は、１種の結合体もしくはリガンドを標識（ｌａｂｅｌｅｄ）もしくは標識（ｔａｇｇｅｄ）し、かつ一定濃度で保持する一方、試験結合体もしくはリガンドの濃度を変えて添加して、競合してその同族の結合パートナーから標識物質を離し、標識が半分だけ減少する濃度を決定することによる競合アッセイによる。
【００１７】
本明細書で使用する「アビディティー」（ａｖｉｄｉｔｙ）という用語は、リガンドおよび結合パートナー双方が多価であることができ、かつ複数の会合および解離反応に対する傾向が特定の一リガンドに対して同時に起こり得る限り、結合パートナーに結合された
まま留まるリガンドの傾向の尺度であることを意図している。従ってアビディティーは既知の親和性をもつ結合パートナーの多価コンホメーションの見かけの親和性の増大により測定することができる。
【００１８】
本明細書で使用される「Ｆｃ含有タンパク質」もしくは「Ｆｃ含有分子」という用語は、１個のリガンド結合ドメインおよび少なくとも１個の免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する単量体、二量体もしくはヘテロ二量体タンパク質を指す。ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは該タンパク質／分子（例えば抗体）の二量体領域の少なくとも一部分を形成し得る。
【００１９】
「抗体」という用語は、抗体、それらの消化フラグメント、特定部分およびバリアントを包含することを意図し、これらには限定するわけではないが、抗体ミメティックスを含み、すなわち抗体もしくはその特定フラグメントもしくは部分の構造および／もしくは機能を模倣し、かつ限定されるわけでないがＦｃ受容体（例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）およびＦｃＲｎ）への結合、補体（例えばＣ１ｑ）への結合、ＡＤＣＣならびにＣＤＣを含むＦｃ媒介型機能を保持する抗体の部分を含んでなる。
【００２０】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、リガンド結合ドメインが、動物抗体の少なくとも１つの重もしくは軽鎖抗体可変ドメインの少なくとも１つに対する実質的相同性を保持する、特定の形態のＦｃ含有融合タンパク質である。
【００２１】
本明細書で使用する抗体もしくは抗体類似体の「エフェクター機能」は、病原体もしくは異常な細胞、例えば腫瘍細胞が破壊され、そして身体から除去されるプロセスである。先天および適応免疫応答は、ＡＤＣＣ、ＣＡ（補体活性化）、Ｃ１ｑ結合およびオプソニン化を含め、病原体を排除するためにほとんど同じエフェクター機能を使用する。
【００２２】
本明細書で使用する「宿主細胞」は、抗体および抗体フラグメントを含むタンパク質、タンパク質フラグメント、または目的のペプチドを生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を指す。宿主細胞には限定するわけではないが、培養された細胞、例えば哺乳動物の培養された細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞またはバブリドーマ細胞、酵母細胞および昆虫細胞があるが、トランスジェニック動物または培養した組織内に含まれる細胞も含んでなる。
【００２３】
「シアル酸」という用語は９炭素のカルボキシル化糖の１ファミリーの任意のメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーはＮ−アセチルノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オニックＩ酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃもしくはＮＡＮＡと略記される）である。このファミリーの第二のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されているＮ−グリコリル−ノイラミン酸（ＮＧＮＡ、Ｎｅｕ５ＧｃもしくはＮｅｕＧｃ）である。この形態はげっ歯類および微生物起源の糖タンパク質中で優勢である。第三のシアル酸ファミリーメンバーは２−ケト−３−デオキシノヌロソン酸（ＫＤＮ）（Ｎａｄａｎｏら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９（１９９０））である。また９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃもしくは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ−Ｃ６アシルＮｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−置換シアル酸も包含される。シアル（ｓｔａｔｉｃ）酸ファミリーの総説については、例えばＶａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２５−４０（１９９２）；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９９２））を参照されたい。
【００２４】
説明
Ｆｃオリゴ糖のシアリル化のレベルがＦｃγ受容体に対する組換え産生された治療用抗体の親和性を変えて該抗体の生物学的作用の多様な局面の調節をもたらすことが、予期せぬことに見出された。より具体的には、高度にシアリル化されたＡｂが、低親和性受容体ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）に対する有意に低下した親和性を有し、また、ＦｃγＲＩＩＩＡが関連受容体であると考えられているインビトロＡＤＣＣアッセイで有意に低下した活性を有することが見い出だされた。高度にシアリル化されたＡｂが、高親和性Ｆｃγ受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に対する増大された親和性を有すること、および完全にシアリル化されたＦｃ含有タンパク質が、アシアリル化もしくは部分的シアリル化Ｆｃ含有タンパク質に比較して短縮した血清半減期を有することがさらに見い出された。Ｆｃオリゴ糖からのシアル酸の除去（または不存在もしくは低下されたレベル）が、それらの標的分子に対する組換え生産された治療用抗体のアビディティーを高めることがさらに見い出された。これらの知見および支持する情報は、米国特許仮出願第６０／６９５，７６９号、同第６０／８０９，１０６号および同第６０／８４１，１５３号明細書に記載された。
【００２５】
いずれか１つの論理に束縛されることは望まないが、オリゴ糖から荷電した静的基の除去は、抗体構造全体に、より大きな柔軟性を可能にすると解釈でき、この柔軟性は一方に対するもう一方の関係で２個の結合ドメインの潜在的相互作用範囲（ｓｐｈｅｒｅ）を拡大する。２種の抗原エピトープに二価で結合するＡｂの能力は、エピトープの到達可能性、方向、密度および移動性にもまた依存する。シアリル化の抗原結合の効果は、ウイルスもしくは細菌の表面抗原、およびさらにホモポリマーである可溶性抗原を認識するＡｂにもまた関係し得ると注目すべきである。なぜなら幾つかのＡｂは１より多くの抗原に結合するだけでなく、幾つかの抗原もまた１より多くのＡｂに結合される可能性がある可溶性免疫複合体内で、Ａｂの柔軟性は個々のＡｂ分子がどの程度まで二価で結合するかを決定できるからである。
【００２６】
本発明は、Ｆｃのオリゴ糖のシアリル化の改変および改変されたＦｃ含有分子によるＦｃ含有分子の特性の制御方法を含んでなる。シアル酸は生理学的ｐＨで正味の負の荷電を有し、そして従ってＦｃに結合した炭水化物中のシアル酸の存在は、三次元構造、そしてこれゆえにＣＨ２ドメインのコンホメーションを変え、それにより多様なリガンドもしくは受容体に対するＦｃ結合に影響を及ぼすと期待され得る。改変されたＦｃ含有分子は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ受容体の１もしくは複数に対する親和性、ＡＤＣＣ活性、マクロファージもしくは単球活性化、ならびに血清半減期に影響を及ぼす。
【００２７】
シアリル化された形態のＦｃ含有タンパク質の濃縮
シアル酸含量が異なる特定のＦｃ含有タンパク質のサブロット（ｓｕｂｌｏｔ）を製造するための１つの取り組みは、Ｆｃ含有タンパク質調製物をシアリル化およびアシアリル化双方の分子を包含する不均質なＦｃオリゴ糖と一緒にし、そしてそれをシアリル化およびアシアリル化オリゴ糖に対する区別的な親和性を有する固定されたレクチンを含有するカラムに通すことである。結合しない通過物（Ｔ、素通り）すなわちカラム非結合画分を結合画分（Ｂ、結合）から分離でき、後者は溶出緩衝液がカラムを通過する間に回収される。弱結合画分すなわちカラム保持画分（Ｒ、保持）を、例えば、元のサンプルバッファーでのカラムの継続的洗浄の間に溶出してＦｃ含有タンパク質を収集することにより別個に収集することもまた可能となり得る。使用されるレクチンに依存して、非結合画分は、結合する画分より高いか、もしくは低いシアル酸含量を有する可能性がある。
【００２８】
シアリル化もしくはアシアリル化Ｆｃ含有タンパク質について濃縮できるレクチンの例は、末端シアル酸を持つオリゴ糖に特異的に結合するイヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）由来のレクチン（ＭＡＡ）、および末端シアル酸もしくは末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）いずれかをもつオリゴ糖を特異的に結合するレクチンであるコムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）である。別の例は、末端ガラクトースをもつオリゴ糖に結合するレクチンであるリシンＩ（ＲＣＡ）である。後者の例では、非結合通過画分がシアリル化Ｆｃ含有分子について濃縮され得る。
【００２９】
Ｆｃ含有タンパク質の酵素的修飾
シアル酸含量が異なるＦｃ含有タンパク質のサブロットを調製するための代替の一アプローチは、Ｆｃ含有タンパク質調製物の一部分をシアリダーゼ酵素で処理して、それによりシアル酸を除去することである。生じるアシアリル化物質を、生物学的活性の差違について、元の部分的シアリル化物質と比較することができる。元のＦｃ含有タンパク質ロット中のシアル酸含量が高いほど、生物学的活性のいずれかの差違を検出する機会が多くなる。例えば、元のタンパク質調製物中のＦｃオリゴ糖の１０％のみがシアル酸を含有した場合、オリゴ糖の０〜１％がシアル酸を含有する場合にシアリダーゼ処理後の生物学的活性の差違を検出することは困難となり得る。シアリダーゼ処理の前後のＦｃ含有タンパク質の生物学的活性を比較することは、シアリダーゼ処理がフコシル化およびアフコシル化オリゴ糖の異なる分布をもたらす場合に、より困難になる可能性がある。なぜならフコースレベルは、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性およびＡＤＣＣ活性のようなある種の生物学的活性に対する顕著な効果を有するからである。例えば、オリゴ糖の３０％から０％までのシアル酸含量の低下が、５％から１５％まで増大するアフコシル化オリゴ糖の比率をもたらすならば、ＡＤＣＣ活性の差違をシアル酸含量の低下のみに帰することが可能でないからである。フコシル化およびアフコシル化オリゴ糖の相対比率に対するシアリダーゼ処理のこうした効果は、シアル酸残基を除去するためのシアリダーゼによる処理前のフコシル化およびアフコシル化オリゴ糖のシアリル化の差違により可能である（そして観察された）。
【００３０】
Ｆｃ領域中に存在するオリゴ糖のシアリル化はインビトロでグリコシル化法を使用してもまた達成することができる。こうした方法を使用して、最大にシアリル化された糖型の抗体サンプルを達成することが可能である。この知見に基づき、最大にシアリル化された糖型の抗体もしくは他のＦｃ含有構築物は、アシアリル化もしくは過小シアリル化抗体と比較して短縮された血清半減期を有することができる。従って本発明の方法は、抗体もしくは免疫グロブリンＦｃ領域を含有する他の組換えタンパク質構築物を含んでなる糖型の均質性、および該抗体もしくは構築物のインビボでの機能の局面の双方を制御するための任意の手段を提供する。
【００３１】
グリコシルトランスフェラーゼはもちろんオリゴ糖を合成するように機能する。それらは優れた立体化学および位置化学の配置をもつ特定の生成物を生じる。グリコシル残基の転移はオリゴ糖もしくは多糖の伸長もしくは合成をもたらす。シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼなどを包含する多数のグリコシルトランスフェラーゼ型が記述されている。
【００３２】
本発明で有用であるグリコシルトランスフェラーゼには、例えば、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）もしくは他の細菌起源のもの、ならびに、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒトおよび昆虫ならびにウイルス起源のもののような、α−シアリルトランスフェラーゼ、α−グルコシルトランスフェラーゼ、α−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−フコシル−トランスフェラーゼ、α−マンノシルトランスフェラーゼ、α−キシロシルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ、β−シアリルトランスフェラーゼ、β−グルコシルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β−フコシルトランスフェラーゼ、β−マンノシルトランスフェラーゼ、β−キシロシルトランスフェラーゼおよびβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニルトランスフェラーゼがある。好ましくは、グリコシルトランスフェラーゼは、膜結合ドメインが欠失している短縮バリアントのグリコシルトランスフェラーゼ酵素である。
【００３３】
例となるガラクトシルトランスフェラーゼには、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．１５１、例えばＤａｂｋｏｗｓｋｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３）およびＹａｍａｍｏｔｏら  Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：２２９−２３３（１９９０）を参照されたい）、ならびにα（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．３８）がある。シアリルトランスフェラーゼのような他のグリコシルトランスフェラーゼを使用することができる。
【００３４】
しばしばシアリルトランスフェラーゼと称されるα（２，３）シアリルトランスフェラーゼを、シアリルラクトースもしくはより高次構造の製造に使用することができる。この酵素はＣＭＰ−シアル酸からシアル酸（ＮｅｕＡｃ）をＧａｌ残基に転移し、２種の糖間にα結合の形成を伴う。糖間の結合（連結）は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位の間である。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．６）と称される例示的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸をＧａｌβ１→３Ｇｌｃ二糖もしくは配糖体の非還元末端Ｇａｌに転移する。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６：３１５９（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：１３８４５（１９８２）およびＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２１０１１（１９９２）を参照されたい。別の例示的α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．４）は、シアル酸を二糖もしくは配糖体の非還元末端Ｇａｌに転移する。Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４：４４４４（１９７９）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２１００４（１９９２）を参照されたい。さらに例となる酵素にはＧａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ  α−２，６シアリルトランスフェラーゼ（Ｋｕｒｏｓａｗａら  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５−３８１（１９９４）を参照されたい）がある。
【００３５】
本発明のオリゴ糖の調製でとりわけ有用な他のグルコシルトランスフェラーゼは、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ合成酵素、ＯＣｈ１およびＰｍｔ１を包含するマンノシルトランスフェラーゼである。
【００３６】
さらに他のグルコシルトランスフェラーゼは、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８９（１９９２）およびＳｍｉｔｈら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４））ならびにポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３））を包含するＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼがある。適するＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼには、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ  １７６：６０８（１９９１））、ＧｎＴＩＩおよびＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら  Ｊ．Ｂｉｏｌｃｈｅｍ．１１３：６９２（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））がある。
【００３７】
方法が工業的規模で実施される態様について、グリコシルトランスフェラーゼを支持体に固定することが有利となり得る。この固定は、生成物のバッチからの酵素の除去および引き続いて該酵素の再使用を容易にする。グリコシルトランスフェラーゼの固定化は、例えば、トランスフェラーゼをその膜結合ドメインから取り出し、そしてその場所にセルロース結合ドメインを結合することにより成すことができる。当業者は、他の固定化方法もまた使用することができ、そして入手可能な文献に記述されていると理解するであろう。
【００３８】
本質的にアクセプター基質は、特定のグリコシルトランスフェラーゼが特異性を表す末端糖残基を有する任意の単糖もしくはオリゴ糖であることができるので、基質はその非還元端の位置で置換され得る。従って配糖体アクセプターは単糖、オリゴ糖、蛍光標識した糖、もしくはアミノグリコシド抗生物質、ガングリオシドのような糖誘導体、または抗体および他のＦｃ含有タンパク質を包含する糖タンパク質であり得る。好ましい態様の一群において、配糖体アクセプターは、オリゴ糖、好ましくはＧａｌβ（１−３）ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ（１−４）ＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎα（１，３）Ｍａｎ、Ｍａｎα（１，６）ＭａｎもしくはＧａｌＮＡｃβ（１−４）−マンノースである。とりわけ好ましい態様では、オリゴ糖アクセプターはＦｃ含有タンパク質のＣＨ２ドメインに結合されている。
【００３９】
活性化された糖基質、すなわち糖−ヌクレオシドリン酸の使用は、グリコトランスフェラーゼ反応と同時に再生反応（再利用系としてもまた知られる）を使用することのいずれかにより回避し得る。例えば、例えば米国特許第６，０３０，８１５号明細書に教示されるとおり、ＣＭＰ−シアル酸再利用系は、それがα（２，３）シアリルトランスフェラーゼの存在下でシアリルトランスフェラーゼアクセプターと反応してシアリル糖を形成する際に、ＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を補給するためにＣＭＰ−シアル酸合成酵素を利用する。本発明で有用なＣＭＰ−シアル酸再生系は、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、ヌクレオシド三リン酸（例えばアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、リン酸ドナー（例えばホスホエノールピルビン酸もしくはアセチルリン酸）、リン酸をリン酸ドナーからヌクレオチド二リン酸に転移することが可能なキナーゼ（例えばピルビン酸キナーゼもしくは酢酸キナーゼ）、および末端リン酸をヌクレオシド三リン酸からＣＭＰに転移することが可能なヌクレオシド一リン酸キナーゼ（例えばミオキナーゼ）を含んでなる。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸合成酵素は、活性化されたシアル酸の除去が合成の前進速度を維持するようにはたらくため、ＣＭＰ−シアル酸再生系の一部としてもまた見ることができる。修飾されたＣＭＰ−シアル酸合成酵素の酵素の遺伝子を含んでなるファージミドを使用するシアリル化手順でのシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日公開の国際特許出願第ＷＯ９２／１６６４０号パンフレットに開示されている。
【００４０】
オリゴ糖調製の代替的方法は、米国特許第５，９５２，２０３号明細書に教示されるとおり、グリコシルトランスフェラーゼ、およびドナー糖としての糖ヌクレオチドの必要性を未然に防ぐドナー糖としての活性化されたグリコシル誘導体の使用を介する。活性化グリコシル誘導体は、高価な糖ヌクレオチド、通常は、ヌクレオチドリン酸が糖の１位にα結合されているヌクレオチド二リン酸糖もしくはヌクレオチド一リン酸糖である天然に存在する基質に対する代替として作用する。
【００４１】
有用である活性化された配糖体誘導体は、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、トシル酸エステル、メシル酸エステル、トリフレートエステルなどのような活性化された脱離基を包含する。活性化された配糖体誘導体の好ましい態様は、フッ化グリコシルおよびグリコシルメシレートを包含し、フッ化グリコシルがとりわけ好ましい。フッ化グリコシルの中で、フッ化α−ガラクトシル、フッ化α−マンノシル、フッ化α−グルコシル、フッ化α−フコシル、フッ化α−キシロシル、フッ化α−シアリル、フッ化α−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニル、フッ化α−Ｎ−アセチルガラクトサミニル、フッ化β−ガラクトシル、フッ化β−マンノシル、フッ化β−グルコシル、フッ化β−フコシル、フッ化β−キシロシル、フッ化ベータ−シアリル、フッ化β−Ｎ−アセチルグルコサミニルおよびフッ化β−Ｎ−アセチルガラクトサミニルが最も好ましい。
【００４２】
フッ化グリコシルは、最初に糖をアセチル化し、次いでそれをＨＦ／ピリジンで処理することにより、遊離糖から調製することができる。アセチル化したフッ化グリコシルは、メタノール中で穏やかな（触媒的）塩基（例えばＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）との反応により脱保護できる。加えて、多くのフッ化グリコシルは商業的に入手可能である。他の活性化されたグリコシル誘導体は、当業者に既知の慣習的方法を使用して調製できる。例えば、グリコシルメシレートは、完全にベンジル化したヘミアセタールの形態の糖の塩化メシルでの処理、次いでベンジル基を除去するための触媒的水素化により調製できる。
【００４３】
反応のさらなる成分は触媒量のヌクレオシドリン酸もしくはその類似体である。本発明での使用に適するヌクレオシド一リン酸には、例えば、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）およびチミジン一リン酸（ＴＭＰ）がある。本発明による使用に適するヌクレオシド三リン酸には、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、イノシン三リン酸（ＩＴＰ）およびチミジン三リン酸（ＴＴＰ）がある。好ましいヌクレオシド三リン酸はＵＴＰである。好ましくは、ヌクレオシドリン酸はヌクレオシド二リン酸、例えばアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、イノシン二リン酸（ＩＤＰ）およびチミジン二リン酸（ＴＤＰ）がある。好ましいヌクレオシド二リン酸はＵＤＰである。上記の通り、本発明はヌクレオシドリン酸の類似体でもまた実施し得る。適する類似体には、例えばヌクレオシド硫酸およびスルホン酸を包含する。なお他の類似体には単純なリン酸、例えばピロリン酸がある。
【００４４】
ヒドロキシル化された形態のシアル酸が優位を占める（ＮＧＮＡ）例えばマウス細胞中で産生される組換えタンパク質の修飾手順は、タンパク質をシアリダーゼで処理してＮＧＮＡ型シアル酸を除去すること、次いで試薬ＵＤＰ−Ｇａｌおよびβ１，４Ｇａｌトランスフェラーゼを使用して高度に均質なＧ２糖型を生じる酵素的ガラクトシル化である。調製物はその後、場合により、高度に均質なＧ２Ｓ２糖型を生じるために試薬ＣＭＰ−ＮＡＮＡおよびアルファ−２，３シアリルトランスフェラーゼで処理することができる。抗体またはＦｃ含有分子のＦｃ領域に付けられたグルカンからシアル酸残基の除去もしくは排除が望ましい場合、シアリダーゼを使用することができる。特異性が変動する多くのシアリダーゼが文献で知られている。可溶性ＣＨＯ細胞のシアリダーゼが同定され（Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４：３６７−３７３）、そして培養基への漏出があるならば、組換えタンパク質のグルカン上のシアル酸の細胞外除去の原因となり得る。このようにシアル酸基の付加および除去は、ＣＨＯ細胞株により生産されるタンパク質上で変動し、そして異質のグリカン構造の原因となり得る組換えタンパク質の生産中に起こり得る可能性がある。
【００４５】
シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）は、人間に対する様々な種の細菌から単離され、そしてクローン化され、基質、例えば糖タンパク質、糖脂質およびガングリオシドおよび結合に対して変動する特異性を持つ。静的基、例えばヒドロキシル化（ＮＧＮＡ）もしくは非ヒドロキシル化ノイラミン酸、およびα２，３−、α２，６−もしくはα２，８でよく、そして内部の残基に連結した分枝シアル酸であり得る結合の型に対して広い特異性を持つ酵素には：ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）由来のもの、およびアースロバクター  ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）由来のシアリダーゼ（シアリダーゼＡ、Ｎ−アセチルノイラミン酸グリコヒドロラーゼ（ｇｌｙｃｏｂｙｈｄｒｏａｌｓｅ）：ＥＣ３．２．１．１８）がある。精製された酵素は例えばカリフォルニア州、サンレアンドロのプロザイム（Ｐｒｏｚｙｍｅ）から市販されている。Ａ．ウレアファシエンスのシアリダーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｕｎｄｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ．Ａｐｐｌ．Ｂｏｃｈｅｍ  ４１：２２５−２３１によりクローン化された（ＮＣＢＩ寄託番号ＡＹ９３４５３９）。
【００４６】
当該技術分野で周知の方法を使用して、細胞外オリゴ糖に作用することができる酵素を分泌する宿主細胞は、例えば分泌されたエンドグルカナーゼにより放出される発酵糖によりエタノールを生産することができる培養について米国特許第７，０２６，１５２号明細書に教示されているように構築することができる。Ｌｕｎｄｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（同上）では、短縮された形のシアリダーゼＡを発現させ、これは組換えエリスロポイエチンムテインからシアル酸残基を除去できた。治療用抗体または他のＦｃ含有タンパク質を発現し、そして同時にその発現したタンパク質を細胞外培地で脱シアリル化することができる哺乳動物の宿主細胞を操作することは示されたことがなかった。出願人の本発明は、可溶性形態のシアリダーゼＡが抗体生産細胞により同時に発現され、そしてそのような細胞の培養物から回収される生じた抗体産物は、それらのＦｃ部分の分子中に減少したシアル酸含量を有することを示す。そのように生産されたシアル酸が至適化された抗体は、通常の細胞株により生産される抗体と比べて増強したＡＤＣＣ活性を有する。
【００４７】
シアル酸バリアントの構造の特徴付け
シアル酸バリアントを含有するオリゴ糖の構造の特徴付けのため、抗体調製物を包含する糖タンパク質調製物をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦで処理してＮ−結合オリゴ糖を遊離させた。酵素ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）はアスパラギンに結合したオリゴ糖を切断する。遊離されたオリゴ糖を、記述されるとおり（Ａｎｕｍｕｌａ，Ｋ．Ｒ．とＤｈｕｍｅ  ＳＴ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９８  Ｊｕｌ；８（７）：６８５−９４を参照されたい）アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）で蛍光標識し、精製し、そしてＨＰＬＣにより分析した。図３に示されるとおり、クロマトグラム中でＧ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ２Ｓ１およびＧ２Ｓ２として分離されるオリゴ糖を検出し、そして定量できる。グリカンを天然に欠く、またはグリカンが化学的もしくは酵素的に奪われたアグリコシル化種をＧｎｏと称する。
【００４８】
シアル酸バリアントの生物学的特徴付け
Ｆｃ含有タンパク質は数種の公知のインビトロアッセイにより機能性について比較できる。とりわけ、Ｆｃγ受容体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩファミリーのメンバーに対する親和性は興味深い。これらの測定は、組換えの可溶性形態の受容体もしくは細胞と会合した形態の受容体を使用して行うことができる。加えて、ＦｃＲｎ（ＩｇＧの延長された循環半減期の原因である受容体）に対する親和性は、例えば組換えの可溶性ＦｃＲｎを使用するＢＩＡｃｏｒｅにより測定できる。ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤＣアッセイのような細胞に基づく機能アッセイは、特定のバリアント構造の機能的な結果の見込みに関する洞察を提供する。一態様において、ＡＤＣＣアッセイは、一次エフェクター細胞として作用するＮＫ細胞を有するよう構成され、それによりＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に対する機能的効果を反映する。食作用アッセイもまた、スーパーオキシドもしくは炎症メディエーター放出のような細胞応答を測定するアッセイが成し得るように、種々のバリアントの免疫エフェクター機能を比較するために使用できる。
【００４９】
親和性およびアビディティーアッセイ
天然に多価である抗体を、標的タンパク質への結合の多様なパラメータを決定するために試験できる。見かけのＫｄを決定するための慣習的一形式は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免
疫吸着アッセイ）もしくはＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）である。「ＥＬＩＳＡ」は、間接検出法を使用して固体支持体上で実施される結合アッセイを意味するために一般に使用されるようになった。一般にＥＬＩＳＡでは、可溶性被検体を、固相反応体に特異的に結合した後に溶液から除去する。該方法で、固相反応体は、抗原もしくは抗体をプラスチック製マイクロタイタープレートに吸着させることにより調製し；他の方法では、固相反応体は細胞に会合した分子である。全部のプロトコールで、固相試薬を、酵素に共有結合させた二次もしくは三次反応体とインキュベーションする。非結合結合体を洗浄することにより除去し、そして発色もしくは蛍光発生基質を添加する。結合された酵素結合体により基質が加水分解されると、着色したもしくは蛍光の産物が生成される。最後に生成物を視覚的にもしくはマイクロタイタープレートリーダーで検出する。生成されるシグナルの強度は試験混合物中の当初の被検体の量に比例する。
【００５０】
固相アッセイの一変形において、抗原は、例えば、抗原上の無関係なドメインを認識する固定した捕捉抗体を使用して、または標的タンパク質に操作された「標識」例えばポリヒスチジン配列に結合する抗体もしくは他のリガンドを使用することにより、間接的に固定もしくは捕捉できる。
【００５１】
表面抗原に対する抗体の結合の代替的測定方法は、細胞表面上に抗原を（天然にもしくは遺伝子操作により）発現する全細胞を使用することによる。細胞を、一次抗体を含有する試験溶液とインキュベートする。非結合の抗体を洗い流し、次いで細胞を一次抗体に特異的な抗体に結合した酵素とインキュベーションする。非結合の酵素結合体を洗い流し、そして基質溶液を添加する。結合した一次抗体のレベルは基質加水分解の量に比例する。これは、単位容量あたりの細胞の数が一定に保持される場合に定量的となる。あるいは検出は、放射標識リガンドを使用して、上記の直接結合もしくは競合により行う。ＥＬＩＳＡアッセイのプロトコールは例えばＡｕｓｅｂｅｌ，ＦＭら  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００３  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃに見い出される。
【００５２】
結合速度、会合速度および解離速度は、プラズモン表面共鳴により検出される固相結合体もしくはリガンドならびに移動溶液相結合体もしくはリガンドを使用するＢＩＡｃｏｒｅ技術を使用しても測定できる。
【００５３】
エフェクター機能の評価方法
治療用Ｆｃ含有タンパク質の消失および従って薬物動態における抗体グリコシル化の役割は最低限と思われ；循環からのＩｇＧ除去の原因であると考えられる新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合は、抗体のＦｃ部分上でＮ−結合オリゴ糖の欠如により乱されない（ｕｎｐｅｒｔｕｒｂｅｄ）ようである。
【００５４】
ＩｇＧ抗体媒介型免疫応答を細胞のエフェクター機能とを結びつけるＩｇＧ  Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、Ｆｃγ受容体、すなわちＦｃＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃＲＩＩ（ＣＤ３２）（ＦｃＲＩＩＡおよびＦＣＲＩＩＢ双方）ならびにＦｃＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を包含する。３種全てが単球上に提示されて見い出される。しかしながら、多様な標的細胞上のこれらの受容体の生成は差別的にかつ他の因子に応答して起こるようである。従って、Ｆｃγ受容体に対するグリコシル化修飾型のＦｃ含有生物治療薬の親和性の測定は、高められたエフェクター機能を予測するための１つの適切な測定である。
【００５５】
Ｆｃグリカン中に低レベルのフコースを含むヒトＩｇＧ１  Ａｂは、ヒトＣＤ１６  ＦｃＲに対するより大きい親和性、そしてヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を使用したＡＤＣＣアッセイで劇的に高められたインビトロ活性を有することが報告された（Ｓｈｉｎｋａｗａら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８（５）：３４６６−３４７３、２００３；Ｓｈ
ｉｅｌｄｓら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（３０）：２６７３３−２６７４０、２００２；Ｕｍａｎａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：１７６−１８０、１９９９）。
【００５６】
インビトロＡＤＣＣアッセイを使用したエフェクター機能の評価方法は、定量的様式で実施できる。従って、標的およびエフェクター細胞株を正しく選択し、そして細胞が分裂し続けられないこと、または内容物、例えば５１Ｃｒの放出のいずれかにより殺細胞を評価することにより、同族リガンドを提示する細胞の破壊を引き起こす結合した抗体の能力を測定するためのインビトロアッセイを設計できる。標的細胞は、本発明の抗体、抗体フラグメントもしくは融合タンパク質の標的リガンドを通常発現する細胞株であるか、または標的タンパク質をその表面上で発現し、そして保持するよう操作できる。このような操作された細胞株の一例がＫ２細胞、すなわち成熟サイトカインのアミノ酸１−１２の欠失の導入により膜貫通形態として留まる組換えヒトＴＮＦをその表面上で安定に発現するＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞株である（Ｐｅｒｅｚら、Ｃｅｌｌ  ６３：２５１−２５８、１９９０）。この細胞株は、抗ＴＮＦ抗体、抗体フラグメント、またはＦｃドメインもしくはＦｃドメイン活性を有する操作された抗ＴＮＦαを標的とする融合タンパク質のＡＤＣＣ活性の改変を評価するのに有用である。
【００５７】
インビトロＡＤＣＣ活性アッセイのためのエフェクター細胞は、ヒトもしくは他の哺乳動物起源（ｓｏｕｒｃｅ）のＰＢＭＣ（末梢血単球細胞）でよい。ＰＢＭＣエフェクター細胞は、承認された方法によりドナーから採血した後に新鮮な状態で単離し得る。使用できる他の単球もしくはマクロファージ細胞は、腹腔滲出液のような滲出液由来のものである。
【００５８】
細胞の免疫機能を測定するためのインビボモデルもまた利用可能である。例えば、Ｔ細胞活性化は抗体Ｆｃドメインが特異的Ｆｃγ受容体と結合する様式に依存するので、抗ＣＤ３抗体を使用してマウスでのＴ細胞活性化を測定できる。インビトロで、ＣＣケモカイン受容体４に対するキメラヒトＩｇＧ１  Ａｂの高フコースおよび低フコース変更体の抗腫瘍活性を比較し、それらのインビトロＡＤＣＣ活性の差違は観察されなかった（マウスエフェクター細胞を使用して）が、低フコースＡｂはインビボでより強力な効力を示した。ヒトエフェクター細胞は提供されず、そしてマウスは内因性ＮＫ細胞を保持する（Ｎｉｗａら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：２１２７−２１３３、２００４）。ヒトＮＫ細胞上のＣＤ１６受容体はＩｇＧ１  Ａｂのフコースレベルに対して高められた感受性を示したので、これらのデータは、ヒトエフェクター細胞で研究されたものとは明らかに異なる機構がマウスで作動していることを示唆する。１つの可能性はより最近発見されたマウスＣＤ１６−２受容体である（Ｍｅｃｈｅｔｉｎａら  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  ５４：４６３−４６８、２００２）。マウスＣＤ１６−２の細胞外ドメインは、より良く知られているマウスＣＤ１６受容体よりもヒトＣＤ１６Ａに対して有意に高い配列同一性（６５％）を有し、それが結合するＩｇＧのフコースレベルに対してマウスＣＤ１６よりも感受性であり得ることを示唆する。報告されたマウスマクロファージ様Ｊ７７４細胞中でのその発現は、ＣＤ１６−２を発現するマウスマクロファージがＮｉｗａら（２００４）により記述された低フコースＡｂによるより大きな抗腫瘍活性の原因となり得る可能性と一致する。従って、マウスエフェクター細胞へのヒトＩｇＧ１型Ｆｃ含有タンパク質によるＦｃ受容体結合の実験は予測的でない。
【００５９】
タンパク質製造方法
Ｆｃ含有タンパク質の製造に関与する多様な方法が、シアル酸を含むＦｃオリゴ糖構造に影響し得る。一態様において、Ｆｃ含有タンパク質を分泌する宿主細胞は高熱処理（例えば５６℃３０分間）に前以てかけられなかった血清、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で培養される。これは、それらの細胞から分泌されるＦｃ含有タンパク質からシアル酸を除去できる活性なシアリダーゼ酵素の血清中での天然の存在により、シアル酸を含有しないかもしくは非常に少量のシアル酸を含有するＦｃ含有タンパク質を生じることができる。別の態様において、Ｆｃ含有タンパク質を分泌する細胞は応用（例えば治療的適応症）のためにＦｃ含有タンパク質が高レベルのシアル酸を有するように、高熱処理にかけられ、それによりシアリダーゼ酵素を不活性化させた血清の存在下で、または血清もしくはシアリダーゼ酵素を含有しうる他の培地成分の不存在下のいずれかで培養される。
【００６０】
別の態様において、至適なシアル酸含量に好都合となるＦｃ含有タンパク質を精製し、そしてさらに処理するために使用する条件が確立されている。例えば、シアル酸は酸不安定性であるため、低ｐＨ環境への長時間の曝露（例えばプロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶出後、もしくはウイルス不活性化過程の間）は、同時にシアル酸含量の低下につながりる可能性がある。
【００６１】
宿主細胞の細胞操作
本明細書に記載するように、組換えＦｃ含有タンパク質もしくはモノクローナル抗体の発現に選択される宿主細胞は、限定するわけではないが免疫グロブリンＣＨ２ドメイン中のタンパク質を装飾するオリゴ糖部分の組成の変動を含む最終組成への重要な要因である。従って、本発明の一つの観点では、所望の治療用タンパク質を発現する産生細胞の使用および／もしくは開発のために適切な宿主細胞の選択が関与する。
【００６２】
一態様において、宿主細胞はシアリルトランスフェラーゼが天然に欠損している、すなわちそれを欠く細胞である。別の態様において、宿主細胞はシアリルトランスフェラーゼを欠くように遺伝子的に修飾もしくは処理されている。さらなる一態様において、宿主細胞は、低下したもしくは検出不可能なレベルのシアリルトランスフェラーゼを発現するよう選択された誘導体宿主細胞である。さらに別の態様において、宿主細胞はＣＭＰ−シアル酸合成酵素（シアル酸を抗体に転移するためにシアリルトランスフェラーゼにより使用されるシアル酸の供給源であるＣＭＰ−シアル酸の形成を触媒する酵素）を天然に欠くか、またはそれを欠くように遺伝子的に修飾もしくは処理されている。関連する態様において、宿主細胞はピルビン酸合成酵素（ピルビン酸からシアル酸を形成する酵素）を天然に欠くものであるか、またはそれを欠くように遺伝子的に修飾もしくは処理することができる。
【００６３】
付加的な態様において、宿主細胞は、該細胞で発現される抗体がガラクトースを欠くように、ガラクトシルトランスフェラーゼを天然に欠くものであるか、またはそれを欠くように遺伝子的に修飾もしくは処理され得る。ガラクトースなしでは、シアル酸は結合されるない。別の態様において、宿主細胞は、生産の間に抗体からシアル酸を除去するシアリダーゼ酵素を天然に過剰発現できるか、または過剰発現するように遺伝子的に修飾され得る。こうしたシアリダーゼ酵素は、抗体が分泌される前に細胞内で抗体に作用することができ、または培地に分泌され、そして培地に既に分泌された抗体に作用できる。改変されたグリコシラーゼを持ち、そして改変さられた炭水化物組成を持つ糖タンパク質を発現する細胞株の選択方法は記述されている（Ｒｉｐｋａ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ、１９８６．Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  １２：５１−６２；第ＵＳ２００４／０１３２１４０号明細書）。強化されたＡＤＣＣを生じる改変されたグリコシル化パターンをもつ抗体を生産するための宿主細胞の操作方法は、例えば米国特許第６，６０２，８６４号明細書に教示されており、ここで、宿主細胞は少なくとも１つの糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ、特にβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサムニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする核酸を持つ。
【００６４】
宿主細胞のグリコシル化特性を宿主細胞のグリコシルトランスフェラーゼの操作を介して遺伝子的に操作することへの他の取り組みは、欧州特許第ＥＰ１，１７６，１９５号明細書に教示されるように活性（具体的にはα１，６フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ
８遺伝子産物））を排除または抑制することが関与する。当業者には上に引用した特定の例以外で宿主細胞の操作方法を実施することは明らかである。さらに、操作される宿主細胞は哺乳動物起源のものでよく、あるいは骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫もしくは植物細胞、またはそれらのいずれかの誘導体、不死化もしくは形質転換細胞から選択できる。
【００６５】
別の態様において、シアル酸結合に必要とされる酵素の活性の抑制または排除方法は、ｓｉＲＮＡ、遺伝子ノックアウトによるような遺伝子サイレンシング、または結合しかつその酵素活性を阻害する酵素に特異的な細胞内Ａｂもしくはペプチドの同時発現によるような酵素阻害剤の付加、および他の既知の遺伝子工学技術よりなる群から選択できる。別の態様において、シアル酸結合を遮断する酵素、または既に結合されているシアル酸を除去するシアリダーゼ酵素の発現もしくは活性を高める方法は、組換え酵素遺伝子でのトランスフェクション、酵素ＲＮＡの合成を高める転写因子のトランスフェクション、もしくは酵素ＲＮＡの安定性を高める遺伝子修飾（全部、精製される生成物中でより低レベルのシアル酸をもたらすシアリダーゼのような酵素の強化された活性につながる）よりなる群から選択できる。別の態様において、特異的な酵素阻害剤を細胞培養基に添加できる。
【００６６】
抗体
本出願に記載する抗体は、限定するわけではないがヒト、マウス、ウサギ、ラット、齧歯類、霊長類のような哺乳動物、またはそれらのいずれかの組み合わせを含むことができ、またはそれらに由来することができ、そして単離されたヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳動物、キメラ、ヒト化および／もしくはＣＤＲ移植抗インテグリン抗体、免疫グロブリン、切断生成物、ならびにそれらの他の特定部分およびバリアントを包含する。また本発明は、本明細書に記載するように当該技術分野で既知であるものと一緒に組み合せた、抗体をコードするかもしくは相補的な核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製剤、装置、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、ならびにそれらの作成および使用方法に関する。
【００６７】
本発明はさらに、抗原、サイトカイン、インテグリン、抗体、増殖因子、細胞系統および分化のマーカーである表面抗原、ホルモン、受容体もしくはその融合タンパク質、血液タンパク質、凝固に関与するタンパク質、それらのいずれかのフラグメント、および前述のいずれかの構造もしくは機能的類似体に結合するＣＨ２ドメイン中のグリコシル化が可能な免疫グロブリンもしくはそのフラグメントを発現する細胞、細胞株および細胞培養物を提供する。好ましい態様において、免疫グロブリン、そのフラグメントもしくは誘導体は標的細胞の表面上の抗原を結合する。とりわけ好ましい態様では、標的細胞は腫瘍細胞、腫瘍脈管構造の細胞もしくは免疫細胞である。特定の態様では、免疫グロブリン、そのフラグメントまたは誘導体はＴＮＦ、インテグリン、Ｂ細胞抗原または組織因子に結合する。
【００６８】
さらに別の態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は、増殖因子もしくはホルモンを含んでなる融合タンパク質を検出可能に発現し得る。本発明により企図される増殖因子の例には、限定する訳ではないが、ヒト成長因子、血小板由来増殖因子、上皮細胞成長因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、骨形成タンパク質、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子、またはグルカゴン様ペプチド、およびそれらのいずれかの構造もしくは機能的類似体を挙げることができる。
【００６９】
本発明の単離された抗体は、ＡＤＣＣ活性をもつ抗体アイソタイプ、とりわけヒトＩｇＧ１（例えばＩｇＧ１  κおよびＩｇＧ１  λ）を有するものを包含し、そして、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３も多少は好ましく、あるいはＦｃドメイン中の特定の残基で改変さられた残基を含有するハイブリッドアイソタイプが他の種からのそれらの対（ｃｏｕｎｔｅｒ
ｐａｒｔ）である。抗体は完全長抗体（例えばＩｇＧ１）であり得るか、または抗原結合部分、およびＡＤＣＣ、補体活性化およびＣ１ｑ結合を含むエフェクター機能を導き出すことが可能なＦｃの部分もしくはドメインのみを含むことができる。
【００７０】
さらに、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物により生産される免疫グロブリンフラグメントには、限定する訳ではないが、Ｆｃまたは他のＣＨ２ドメイン含有構造およびそれらのいずれかの構造もしくは機能的類似体を含むことができる。一つの態様において、免疫グロブリンフラグメントは二量体の受容体ドメイン融合ポリペプチドである。特定の態様では、二量体の受容体ドメイン融合ポリペプチドはエタネルセプトである。エタネルセプトは、皮下に投与され、そして患者の血清中のＴＮＦαに結合し、そしてそれを生物学的に不活性にする、組換えの可溶性ＴＮＦα受容体分子である。エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５キロダルトン（ｐ７５）の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分よりなる二量体融合タンパク質である。エタネルセプトのＦｃ成分はＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域を含有するが、しかしＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを含有しない。
【００７１】
本発明の細胞株を使用して製造し易い他の生成物には、他の型の動物細胞株により現在製造され、そしてグリコシル化されることが可能なＣＨ２を有する治療用もしくは予防用タンパク質を包含する。細胞表面上の標的抗原に結合する治療用のグリコシル化されたＣＨ２ドメイン含有タンパク質がとりわけ好ましく、その細胞型の能力を奪うか、または身体から排除することが望ましい。多数のこうした治療用抗体が、ヒトＩｇＧ１、とりわけヒトＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでなるＩｇＧ１、重鎖を含有するよう操作される。こうした治療用タンパク質は、限定する訳ではないが以下に本明細書で記載するものを含むことができる。
【００７２】
現在ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）として販売されるインフリキシマブ。インフリキシマブは、１４９，１００ダルトンのおよその分子量をもつキメラＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。これはヒト定常およびマウス可変領域から構成される。インフリキシマブは１０１０Ｍ−１の会合定数でヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ（α））に特異的に結合する。インフリキシマブは、可溶性および膜貫通の形態のＴＮＦ（α）に高い親和性で結合することによりＴＮＦ（α）の生物学的活性を中和し、そしてＴＮＦ（α）とその受容体との結合を阻害する。インフリキシマブにより結合された膜貫通ＴＮＦ（α）を発現する細胞は、インビトロもしくはインビボで溶解され得る。インフリキシマブは、慢性関節リウマチ、クローン病および強直性脊椎炎の処置に指示される。インフリキシマブは、静脈内注入として与えられる３〜５ｍｇ／ｋｇの用量、次いで処置されるべき疾患に依存してその後同様な２、６および／もしくは８週の用量、ならびに８週ごとの間隔で追加的に与えられる。
【００７３】
ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（商標）として販売される）は、活性化されたリンパ球の表面上で発現されるヒト高親和性インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体のαサブユニット（ｐ５５  α、ＣＤ２５もしくはＴａｃサブユニット）に特異的に結合する、組換えＤＮＡ技術により生産された免疫抑制性ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ダクリズマブは、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植化マウス−ヒトキメラ抗体である。ヒト配列は、ヒトＩｇＧ１の定常ドメインおよびＥｕ骨髄腫抗体の可変フレイムワーク領域由来であった。マウス配列はマウス抗Ｔａｃ抗体のＣＤＲ由来であった。ダクリズマブは、腎移植を受けている患者の急性臓器拒絶の予防に指示され、そして一般に、シクロスポリンおよびコルチコステロイドを包含する免疫抑制的処方の一部として使用される。
【００７４】
バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（商標）として販売される）は、活性化されたＴリンパ球の表面上のインターロイキン−２受容体（α）−鎖（ＩＬ−２Ｒ（α）、ＣＤ２５
抗原としてもまた知られる）に特異的に結合し、そして遮断する免疫抑制剤として機能する、組換えＤＮＡ技術により生産されるキメラ（マウス／ヒト）モノクローナル抗体である。アミノ酸配列に基づき、タンパク質の計算される分子量は１４４キロダルトンである。それは、ヒト重および軽鎖定常領域遺伝子（ＩｇＧ１）、ならびにＩＬ−２Ｒ（α）に選択的に結合するＲＦＴ５抗体をコードするマウス重および軽鎖可変領域遺伝子を含有するプラスミドを発現するよう遺伝子的に操作された、樹立されたマウス骨髄腫細胞株の醗酵から得られる糖タンパク質である。バシリキシマブは、シクロスポリンおよびコルチコステロイドを包含する免疫抑制的処方の一部として使用される場合に、腎移植を受けている患者での急性臓器拒絶の予防に指示される。
【００７５】
アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（商標）として販売される）は、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に特異的な組換えヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。アダリムマブは、ヒト由来重および軽鎖可変領域ならびにヒトＩｇＧ１  κ定常領域をもつ抗体をもたらすファージディスプレイ技術を使用して創製された。ＨＵＭＩＲＡ（商標）は、１もしくは複数のＤＭＡＲＤに対する不十分な応答を有した、中程度ないし重度に活動性の関節リウマチを伴う成人患者で、構造の損傷の徴候および症状を低下させ、そしてその進行を抑制するために指示される。ＨＵＭＩＲＡ（商標）は単独でまたはＭＴＸもしくは他のＤＭＡＲＤと組合せで使用できる。
【００７６】
リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）として販売される）は、正常および悪性Ｂリンパ球の表面上で見出されるＣＤ２０抗原に向けられた、遺伝子的に操作されたキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。抗体は、マウス軽および重鎖可変領域配列およびヒト定常領域配列を含有するＩｇＧ１  κ免疫グロブリンである。リツキシマブは、およそ８．０ｎＭのＣＤ２０抗原に対する結合親和性を有する。リツキシマブは再発性もしくは難治性の低グレードもしくは濾胞性ＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫を伴う患者の処置に指示される。ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）は４もしくは８用量にわたり週１回３７５ｍｇ／ｍ２  ＩＶ注入で与えられる。
【００７７】
トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）として販売される）は、ヒト上皮細胞成長因子受容体２タンパク質ＨＥＲ２の細胞外ドメインに、細胞に基づくアッセイで高親和性（Ｋｄ＝５ｎＭ）で選択的に結合する、組換えＤＮＡ由来ヒト化モノクローナル抗体である。この抗体は、ＨＥＲ２に結合するマウス抗体（４Ｄ５）の相補性決定領域とともにヒトフレイムワーク領域を含有するＩｇＧ１  κである。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮは、患者の腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現し、そして彼らの転移性疾患に対し１もしくは複数の化学療法処方を受けている転移性乳癌の患者の処置に単剤療法として指示される。パクリタキセルとの組合せのＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）は、患者の腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現し、そして彼らの転移性疾患に対し化学療法を受けたことがない転移性乳癌の患者の処置に指示される。推奨される投薬用量は、９０分注入として投与される４ｍｇ／ｋｇトラスツズマブの初期負荷用量、および初期負荷用量が十分に耐容される場合に３０分の注入として投与し得る２ｍｇ／ｋｇトラスツズマブの週１回の維持用量である。
【００７８】
アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（商標）として販売される）は、２１〜２８ｋＤの細胞表面糖タンパク質ＣＤ５２に向けられる組換えＤＮＡ由来ヒト化モノクローナル抗体（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）である。アレムツズマブは、本質的に、全部のＢおよびＴリンパ球、単球、マクロファージおよびＮＫ細胞の大多数、顆粒球の一亜集団、および男性生殖器官の組織の表面上に存在する非調節抗原ＣＤ５２に結合する。Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ抗体は、ヒト可変フレイムワークおよび定常領域、ならびにマウス（ラット）モノクローナル抗体からの相補性決定領域をもつＩｇＧ１  κである（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｇ）。Ｃａｍｐａｔｈは、アルキル化剤で処置され、そしてフルダラビン療法に失敗した患者のＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の処置に指示される。Ｃａｍｐａｔｈの有効性の決
定は全体応答率に基づく。Ｃａｍｐａｔｈは、当初１日に２時間のＩＶ注入として投与される３ｍｇで与えられ；一旦耐容されれば、１日用量を１０ｍｇに増加させ、そして耐えられるまで継続すべきである。この用量レベルに一旦耐容されれば、Ｃａｍｐａｔｈ  ３０ｍｇの維持用量を開始することができ、そして１２週まで週あたり３回投与できる。大部分の患者で、３０ｍｇへの増加は３〜７日で達成し得る。
【００７９】
オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（商標）として販売される）は、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に選択的に結合する組換えヒト化ＩｇＧ１（κ）モノクローナル抗体である。オマリズマブは、肥満細胞および好塩基球の表面上の高親和性ＩｇＥ受容体（Ｆｃ（ε）ＲＩ）へのＩｇＥの結合を阻害する。Ｆｃ（ε）ＲＩを持つ細胞上の表面結合型ＩｇＥの減少は、アレルギー応答のメディエーターの放出の程度を制限する。オマリズマブでの処置はまた、アトピー患者で好塩基球上のＦｃ（ε）ＲＩ受容体の数も減少させる。オマリズマブは、通年性空気アレルゲンに対する陽性の皮膚試験もしくはインビトロ反応性を有し、そしてその症状が吸入コルチコステロイドで十分に制御されない、中等度から重度の持続性喘息の成人および青年（１２歳以上）に指示される。オマリズマブは１５０ないし３７５ｍｇの用量で２もしくは４週ごとにＳＣ投与される。
【００８０】
エファリズマブ（ＲＡＰＴＩＶＡ（商標））は、ヒトＣＤ１１ａに結合する免疫抑制性組換えヒト化ＩｇＧ１  κアイソタイプモノクローナル抗体である。エファリズマブは、全白血球上で発現される白血球機能抗原−１（ＬＦＡ−１）の（α）サブユニットＣＤ１１ａに結合し、そしてＣＤ１１ａの細胞表面発現を減少させる。エファリズマブは、細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）へのＬＦＡ−１の結合を阻害して、それにより他の細胞型への白血球の接着を阻害する。ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１との間の相互作用は、Ｔリンパ球の活性化、内皮細胞へのＴリンパ球の接着、および乾癬性皮膚を含む炎症の部位へのＴリンパ球の移動を包含する複数の過程の開始および維持に寄与する。リンパ球の活性化および皮膚への輸送は慢性の尋常性乾癬の病態生理学である役割を演じている。乾癬性皮膚では、ＩＣＡＭ−１の細胞表面発現が内皮およびケラチノサイト上で上方制御されている。ＣＤ１１ａは、Ｂリンパ球、単球、好中球、ナチュラルキラー細胞および他の白血球の表面上でもまた発現されている。従って、エファリズマブがＴリンパ球以外の細胞の活性化、接着、移動および数に影響を及ぼす可能性が存在する。ＲＡＰＴＩＶＡ（商標）の推奨用量は、単回の０．７ｍｇ／ｋｇ  ＳＣ馴化用量、次いで１ｍｇ／ｋｇの週１回のＳＣ用量（合計２００ｍｇを超えない最大単回用量）である。
【００８１】
別の態様において、本発明の細胞株は、免疫グロブリンに由来しないがしかしＦｃ含有タンパク質の定義内にあるポリペプチドを発現するように安定にトランスフェクトされるか、または別の方法で操作されている。
【００８２】
本発明の抗体およびタンパク質をコードする核酸は、当該技術分野で公知のいくつかの方法で派生させることができる。一つの観点において、抗体は本発明のペプチドでマウスを免疫感作することにより調製されるハイブリドーマから都合よく得られる。したがって抗体は当該技術分野で公知のハイブリドーマ技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州ニューヨーク（１９９７−２００１）（各々引用により全部、本明細書に編入する）を参照されたい）のいずれを使用しても得ることができる。
【００８３】
抗体の標的結合部分、典型的には抗体の可変重および／もしくは可変軽ドメインの別の都合のよい派生方法では、例えばファージライブラリーで創製されるこうした結合ドメインのライブラリーからこれらの部分を選択する。ファージライブラリーは、無作為オリゴヌクレオチドのライブラリー、または免疫感作した動物もしくはヒトのＢ細胞からのような目的の配列を含有するポリヌクレオチドのライブラリーを挿入することにより創製できる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７）。抗体ファージライブラリーは、１ファージ中に重および軽鎖可変領域対を含有し、一本鎖ＦｖフラグメントもしくはＦａｂフラグメントの発現を可能にする（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら  ２０００、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１（８）３７１−８）。ファジェミドライブラリーの多様性を操作して、追加の望ましいヒトモノクローナル抗体を調製し、そして続いて同定するようにライブラリーのモノクローナル抗体の免疫特異性を増大かつ／または改変することができる。例えば（Ｈ）鎖および（Ｌ）鎖免疫グロブリン分子をコードする遺伝子を、集成された免疫グロブリン分子中に新たなＨＬ対を創製するように無作為に混合（シャッフル）することができる。加えて、ＨおよびＬ鎖をコードする遺伝子のいずれかもしくは双方を、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）中で突然変異を誘発でき、そして続いて所望の親和性および中和能力についてスクリーニングできる。抗体ライブラリーは、１もしくは複数のヒトフレイムワーク配列を選択し、そしてヒト抗体レパートリー由来のＣＤＲカセットの集合物を導入するか、または設計された変動を介することにより合成で創製できる（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ  ａｎｄ
ｖｏｎ  Ｒｕｄｅｎ  ２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：５９８−６０２）。多様性の位置はＣＤＲに制限されないが、しかし、可変領域のフレイムワークセグメントもまた包含でき、あるいはペプチドのような抗体可変領域以外を含んでもよい。
【００８４】
抗体可変領域以外を包含し得る標的結合成分の他のライブラリーは、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイおよび細菌ディスプレイである。リボソームディスプレイは、タンパク質をＲＮＡに結合したままｍＲＮＡをそれらの同族のタンパク質へ翻訳する方法である。核酸のコーディング配列はＲＴ−ＰＣＲにより回収される（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ら  １９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１、９０２２）。酵母ディスプレイは、膜結合α−アグルチニン酵母接着受容体ａｇａ１およびａｇａ２（接合型系の一部）の融合タンパク質の構築に基づく（Ｂｒｏｄｅｒら  １９９７．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：５５３−７）。細菌ディスプレイは、細胞膜もしくは細胞壁と会合する輸送された細菌タンパク質への標的の融合に基づく（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ２００２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、７９：４９６−５０３）。
【００８５】
ハイブリドーマ技術に比較して、ファージおよび他の抗体ディスプレイ法は、インビトロで、かつ抗原に対する宿主の影響の可能性またはその逆の制限なしに、抗原標的に対する選択を操作する機会を提供する。
【００８６】
宿主細胞
本明細書に記載する宿主細胞は、該抗体のオリゴ糖含量に規定されたシアル酸含量をもつ特定の抗体を生産することが可能な宿主細胞を含んでなる。
【００８７】
連続的ゲノムＤＮＡ配列から転写される大部分の遺伝子と異なり、抗体遺伝子は、生殖系列で広く分離されうる遺伝子セグメントから集成される。とりわけ、重鎖遺伝子は、抗
体の可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）および結合部（Ｊ）／定常（Ｃ）領域をコードする３個のゲノムセグメントの組換えにより形成される。機能的軽鎖遺伝子は２個の遺伝子セグメント（一方はＶ領域をコードし、そしてもう一方はＪ／Ｃ領域をコードする）を連結することにより形成される。重鎖およびκ  軽鎖双方の遺伝子座は、１０００ｋｂを楽に越えて広がると推定される多くのＶ遺伝子セグメント（推定値は数百と数千の間で変動する）を含有する。対照的にλ遺伝子座ははるかに小さく、そしてマウスで第１６染色体上のおよそ３００ｋｂに広がることが示されている。これは２個の可変遺伝子セグメントおよび４個の結合部／定常（Ｊ／Ｃ）領域遺伝子セグメントよりなる。機能的遺伝子の形成にはＶとＪ／Ｃ要素との間の組換えを必要とする。
【００８８】
抗体が天然に生産されるＢ細胞中で、再配列された重およびκ  軽鎖双方の遺伝子の転写の制御は、Ｖ領域の上流の組織特異的プロモーターおよびＪ−Ｃイントロン中に位置する組織特異的エンハンサー双方の活性に依存する。これらの要素は相乗的に作用する。また、第二のＢ細胞特異的エンハンサーがκ  軽鎖の遺伝子座中に同定されている。このさらなるエンハンサーはＣｋａｐｐａの９ｋｂ下流に位置する。従って、抗体発現遺伝子のハイブリドーマの不死化方法は、親Ｂ細胞系統の内因性プロモーターおよびエンハンサー配列に頼る。あるいは、本発明の核酸は、本発明の抗体をコードする内因性ＤＮＡを含有する宿主細胞中で、（操作により）スイッチを入れることにより宿主細胞中で発現させることができる。こうした方法は、例えば米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号および同第５，７３３，７６１号明細書（引用により全部、本明細書に編入する）に記載されるとおり、当該技術分野で公知である。
【００８９】
抗体のゲノムＤＮＡの人工的ベクターへのクローニングは、抗体を発現することができる宿主細胞の別の創製方法である。しかしながら、強力なプロモーターの後のモノクローナル抗体の発現は、高産生細胞株を同定し、かつより高収量モノクローナル抗体を得る機会を増大させる。本発明の抗体は、例えば当該技術分野で公知である組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）中で生産され得る。
【００９０】
多様な異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングおよび発現のための系が公知である。適する宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母およびバキュロウイルス系、ならびにトランスジェニック植物および動物を包含する。異種ポリペプチドの無傷のグリコシル化タンパク質の発現のために、当該技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、ＮＳＯマウス黒色腫細胞ならびに誘導細胞株、例えばＳＰ２／０、ＹＢ２／０（ＡＴＣ  ＣＲＬ−１６６２）ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ）、ヒト胚性網膜細胞ＰｅｒＣ．６細胞、ｈｅｐ  Ｇ２細胞、ＢＳＣ−１（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６）、および例えばバージニア州マナサスのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から入手可能な多くの他の細胞を包含する。一般的な好ましい一細菌宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００９１】
ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ２１、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０）、マウスＬｔｋ−細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞のような哺乳動物細胞は、異種遺伝子の安定発現に頻繁に使用されてきた。Ｃｏｓ（ＣＯＳ−１  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０；ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）およびＨＥＫ２９３のような細胞株は組換えタンパク質の一過性発現に慣例に使用されている。
【００９２】
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞には、それらの高発現率により、Ｓｐ２／０、ＹＢ２／０（ＡＴＣ  ＣＲＬ−１６６２）、ＮＳＯ、およびＰ３
Ｘ６３．Ａｇ８．６５３（例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４）のような骨髄腫細胞を含む。特にＮＳＯ骨髄腫細胞と使用するために好ましい別の発現系は、国際公開第ＷＯ８７／０４４６２号、同第ＷＯ８９／０１０３６号パンフレットおよび欧州特許第ＥＰ３３８，８４１号明細書に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、抗体は宿主細胞中での該抗体の発現、またはより好ましくは宿主細胞が増殖する培地中への該抗体の分泌を可能とするのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより生産される。抗体は、標準的タンパク質精製法を使用して培地から回収できる。
【００９３】
ＣＨＯ−Ｋ１およびＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞ＤＧ４４およびＤＵＫ−Ｂ１１（Ｇ．Ｕｒｌａｕｂ，Ｌ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎ、１９８０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７、４２１６−４２２０）は、例えば薬物メトトレキサート（ＭＴＸ）を使用して、選択可能な増幅可能マーカーＤＨＦＲの取り込みにより目的の遺伝子の増幅が可能になる（Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：５３７−５６６）ので、高レベルタンパク質生産に使用される。ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を、組換えｍＡｂを高レベルで生産させるために成功裏に使用できる。ＤＨＦＲ−ＣＨＯは、抗ＭＣＰ−１抗体を８０〜１１０ｍｇの１０６細胞−１日−１もしくは２００ｍｇの１０６細胞−１日−１以上の速度で生産しうる。多様なプロモーター、例えばｂ−アクチンプロモーター、ヒトＣＭＶ  ＭＩＥプロモーター、Ａｄウイルス主後期プロモーター（ＭＬＰ）、ＲＳＶプロモーター、およびマウス白血病ウイルスＬＴＲが、これらのＣＨＯ細胞中でＨおよびＬ鎖の発現を得るために使用されてきた。２種のＩｇ鎖が独立した選択可能／増幅可能マーカーとともに２種の異なるプラスミドにより運ばれるｍＡｂ発現のための多数のベクターが文献に記述されている。ＤＨＦＲマーカーに連結された１つの抗体鎖、例えばＨ鎖、およびＮｅｏｒマーカーを持つＬ鎖発現カセット、もしくはその逆のベクターを、スピナーフラスコ中で１８０ｍｇまでのヒト化ｍＡｂ  Ｌ−１  ７日−１を得るために使用できる。最初の選択およびその後の増幅に使用される方法は変動する可能性があり、そして当業者に公知である。一般に高レベルのｍＡｂ発現は、以下の段階：すなわち候補クローンの初期選択およびその後の増幅、同時選択（例えばＨ鎖およびＬ鎖双方の発現ベクターがＤＨＦＲ発現ユニットを持つ場合）、および増幅、多様な増幅可能なマーカーを使用する共増幅、ならびに大量培養での初期選択および増幅、次いで個々の高発現クローンを同定するための希釈クローニングを使用して得ることができる。組込み部位はＨ鎖およびＬ鎖発現の効率ならびにｍＡｂ発現全体に影響する可能性があるため、２個のＩｇ鎖発現ユニットが縦列に配置されている単一のベクターが創製された。これらのベクターは、Ｎｅｏｒのようなドミナント選択性マーカーおよびＤＨＦＲ発現カセットも持つ。総説については、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．によるＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．１９９９中、Ｇａｎｇｕｌｙ，Ｓ．  ａｎｄ  Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓを参照されたい。
【００９４】
Ｃｏｃｋｅｔｔら（１９９０．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８、６６２−６６７）は、ＣＨＯ細胞中での異種遺伝子の高レベル発現のためにＧＳ系を開発した。ｃＤＮＡ（ｈＣＭＶプロモーターの転写制御下）およびＧＳミニ遺伝子（ＳＶ４０後期プロモーターの制御下）を含有する発現ベクターのＣＨＯ−Ｋ１細胞へのトランスフェクション（次いで２０ｍＭないし５００ｍＭ  ＭＳＸでの選択）を使用して、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ系の収量に匹敵する収量で本発明の抗体を発現するクローンを生じることができる。ＧＳ系は、欧州特許第０  ２１６  ８４６号、同第０  ２５６  ０５５号および同第０  ３２３  ９９７号明細書、ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号明細書と関連して、全体的または部分的に検討されている。
【００９５】
本発明を概説してきたが、本発明の態様は以下の実施例でさらに開示される。
【実施例１】
【００９６】
抗体のガラクトシル化およびシアリル化の酵素的改変
精製した抗体サンプルを酵素的方法を介してガラクトシル化するため、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（ミズーリ州セントルイス）から得たウシβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（β１，４ＧＴ）およびＵＤＰ−Ｇａｌを抗体サンプルに加える。組換えラット肝α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（α２，３ＳＴ）、組換えα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α１，３ＧＴ）およびＣＭＰ−Ｓｉａはカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。ＰＮＧアーゼＦはニューイングランドバイラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州ビバリー）またはプロザイム（カリフォルニア州サンレアンドロ）またはセレクションバイオサイエンス（Ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）（カリフォルニア州プレザントヒル）から得た。肺炎双球菌（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのβ−ガラクトシダーゼおよびβ−グルコサミニダーゼはプロザイムまたはセレクションバイオサイエンスいずれかから得た。ウシ腎からのβ−ガラクトシダーゼおよび全部の他の酵素はプロザイムまたはセレクションバイオサイエンスのいずれかからであった。ＮＡＰ−５およびＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムはファルマシアバイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ニュージャージー州ピスカタウェイ）からであった。全部の他の試薬は分析等級のものであった。
【００９７】
酵素で脱グリコシル化した形態（Ｇｎｏと称される）のＡｂ１を、Ｆｃ免疫エフェクター機能を欠く対照抗体として役立つように調製した。このバリアントは、Ａｂ１（１．０ｍＬのバッファー中約１０ｍｇ）を１００ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ７．０）中に取り、そしてそれを１０００ＵのＰＮＧアーゼＦで３７℃にて２４時間処理することにより調製した。酵素の別のアリコートを添加し、そしてインキュベーションをさらに２４時間継続した。脱グリコシル化Ａｂ１をＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムを使用して精製し、そしてＰＢＳ、ｐＨ７．０中に配合した。Ｇｎｏ糖型は、脱グリコシル化を確認するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより特徴付けした。
【００９８】
実験室で操作したＡｂ調製物に加えて、ここで「天然のバリアント」と称される、シアル酸含量が天然に異なるＡｂのサブロットも比較した。非修飾抗体は、元のロットからの物質をＰＢＳにバッファー交換した後にＡｂ１  ＰＢＳと名付けた。ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体Ａｂ、Ａｂ１およびＡｂ３（ここで対のメンバーはそれらを調製するために使用した生産方法が明らかに異なるため、Ｆｃシアリル化の程度が異なる）を使用した（しかし同じ宿主細胞型により製造した）。Ａｂ１バリアント、Ａｂ１−２０およびＡｂ１−２９はそれぞれ２０％および２９％のシアリル化グリカンを含有し、そしてＡｂ５バリアント、Ａｂ５−２０およびＡｂ５−２６はそれぞれ０％および２６％のシアリル化グリカンを含有した。それ以外は、各対のメンバーは、同じアミノ酸配列、同じレベルのＦｃフコシル化および分岐ＧｌｃＮＡｃ含量（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析）、ならびに同じ低レベルのＡｂ凝集物（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により＜１％）を有した。
【００９９】
多様なバイオアッセイで使用したＡｂおよびＦｃ含有タンパク質調製物、ならびにそれらが誘導された様式の要約を表１に要約する。
【０１００】
【表１】
2010514448.tif 000003
【０１０１】
試験サンプルは全てヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する。Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３およびＡｂ５はヒトＩｇＧ１およびκ定常領域を伴うモノクローナルＩｇＧ  Ａｂである。Ａｂ１はヒトＴＮＦに特異的な完全にヒトのＡｂであり、そしてＡｂ２はヒトＴＮＦに特異的なマウス／ヒトキメラＡｂである。Ａｂ３はヘテロ二量体の
炎症前サイトカインのサブユニットの１つに特異的な完全にヒトのＡｂである。全４種のＡｂはトランスフェクトしたＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞中で発現された。Ａｂ５はヘテロ二量体の細胞表面受容体の１サブユニットに向けられた完全にヒトの抗体である。ＦｃＰ１はヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでなる二量体融合タンパク質である。
【０１０２】
Ｇ２糖型は、１００ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ７．０）中のＩｇＧサンプル（１．０ｍＬバッファー中約１０ｍｇ）を５０ミリ単位のβ１，４ＧＴ、５μｍｏｌのＵＤＰ−Ｇａｌおよび５μｍｏｌのＭｎＣｌ２に３７℃で２４時間さらすことにより調製した。酵素の別のアリコートおよびＵＤＰ−Ｇａｌを添加し、そして混合物を３７℃でさらに２４時間インキュベーションした。再ガラクトシル化ＩｇＧサンプルを、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムを使用して精製した。オリゴ糖をＰＮＧアーゼＦにより遊離させ、そして以下に記載するようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびＨＰＬＣにより特徴付けした。
【０１０３】
Ｇ２Ｓ２糖型は、製造元が推薦するプロトコールに従ってＮＡＰ−５カラムを使用して１００ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ７．０）中（１．０ｍＬバッファー中〜１０ｍｇ）にＩｇＧサンプルを入れることにより作成した。この溶液に、それぞれ５０ミリ単位のβ１，４ＧＴおよびα２，３ＳＴ、ならびにそれぞれ５μｍｏｌのＵＤＰ−Ｇａｌ、ＣＭＰ−Ｓｉａ（ＮＡＮＡ異性体）およびＭｎＣｌ２を加えた。混合物を３７℃でインキュベーションした。２４時間後に、酵素の別のアリコートをヌクレオチド糖と一緒に加え、そして混合物を３７℃でさらに２４時間インキュベーションした。Ｇ２Ｓ２糖型のＩｇＧサンプルを上述のとおり精製した。１種の特定のＡｂ１  Ｇ２Ｓ２ロット、Ａｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｌｏ）について、元は結合していたシアル酸が、おそらく混入するシアリダーゼにより貯蔵の間にその後喪失された。分析は、Ａｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｌｏ）中のＦｃオリゴ糖の３０％のみがシアル酸を含有し、一方、Ａｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｈｉ）中のオリゴ糖の約９５％がシアル酸を含有することを示した。
【０１０４】
Ａｂ調製物のグリカン構造を多様な方法により分析した。無傷のＩｇＧ  ＡｂのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを実施するため、ＩｇＧサンプルを１０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．０中に入れ、そして〜１ｍｇ／ｍＬバッファーまで濃度を調節した。約２μｌのＩｇＧ溶液を２μｌのマトリックス溶液（マトリックス溶液は、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中５０％アセトニトリル１．０ｍｌに１０ｍｇのシナピン酸を溶解することにより調製した）と混合し、そしてこの溶液２ｍｌを標的に負荷し、そして風乾した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳはアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）（カリフォルニア州フォスターシティ）からのＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ装置を使用して得た。
【０１０５】
遊離されたＦｃグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を実施するため、インビトログリコシル化反応前および後に、ＩｇＧサンプル（〜５０μｇ）を１０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（５０μｌ）ｐＨ７．０中でＰＮＧアーゼＦで３７℃で４時間消化した。消化は反応混合物を５０％酢酸（〜５μｌ）で酸性化することにより停止し、次いで以前に記載されたように（Ｐａｐａｃら、１９９６；Ｐａｐａｃら、１９９８；Ｒａｊｕら、２０００）カチオン交換樹脂カラムを通過させた。酸性および中性のオリゴ糖の混合物を含有するこれらのサンプルを、アプライドバイオシステムズ（カリフォルニア州フォスターシティ）からのＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ装置を使用して、いたるところに記載されているように（Ｐａｐａｃら、１９９６；Ｐａｐａｃら、１９９８；Ｒａｊｕら、２０００）、陽および陰イオンモードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。
【０１０６】
ＦｃグリカンのＨＰＬＣ分析は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（約５０μｌ）ｐＨ７．０中でＩｇＧサンプル（〜５０μｇ）をＰＮＧアーゼＦで３７℃にて４〜８時間消
化することにより行った。アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）を用いた遊離オリゴ糖の誘導体化は記載されているように（Ａｎｕｍｕｌａ  ＫＲ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００  Ｊｕｌ  １５；２８３（１）：１７−２６を参照されたい）実施した。簡単に説明すると、メタノール中４％酢酸ナトリウム３Ｈ２Ｏ（重量／容量）および２％ホウ酸（重量／容量）の溶液を最初に調製した。次いで誘導体化試薬は、〜３０ｍｇのアントラニル酸（アルドリッチ：Ａｌｄｒｉｃｈ）および〜２０ｍｇのシアノホウ水素化ナトリウム（アルドリッチ）を１．０ｍｌのメタノール−酢酸ナトリウム−ホウ酸溶液に溶解することにより新たに調製した。ＩｇＧ由来オリゴ糖（２０〜５０μｌの水中３ｎｍｏｌ未満）を、「Ｏ」リング付きの１．６ｍｌポリプロピレン製ねじ蓋凍結バイアル中で０．１ｍｌのアントラニル酸（ＡＡ）試薬溶液と混合し、そしてきつく蓋をした。バイアルをオーブンもしくは加熱ブロック（Ｒｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍ、ピアス：Ｐｉｅｒｃｅ）中８０℃で１〜２時間加熱した。バイアルを室温に冷却した後にサンプルを水で希釈して、容量を約０．５ｍｌとした。誘導体化オリゴ糖は、ＮＡＰ−５カラムを使用することにより精製した。
【実施例２】
【０１０７】
低親和性細胞Ｆｃ受容体への結合
エフェクター細胞上のＦｃ受容体のいくつかの型のうち、Ｆｃｇａｍｍａ型ＩＩおよびＩＩＩは、低または中程度の親和性の受容体と考えられる。一般に単量体結合は親和性が低すぎて検出できないか、または非常に低レベルで検出され得る。例えばＦｃｇａｍｍａ型ＩＩＡへの単量体ＩｇＧの結合は、測定することがより困難である。これらの受容体は免疫複合体に結合するように機能し、それら複合体は、それらの多価の性質により、おそらく該複合体の遅いオフ速度により、より激しく（ａｖｉｄｌｙ）に結合する。
【０１０８】
唯一のＦｃγ受容体としてＦｃγＲＩＩＡを発現するヒトＫ５６２細胞を、２つの型の結合アッセイに使用して、Ｆｃグリカン中のシアル酸含量の変動がこの低親和性ヒトＦｃγ受容体への結合に影響を及ぼすかどうかを試験した。単量体ＩｇＧに対して低い親和性を有するＦｃγＲＩＩＡへの結合の十分なアビディティーを得るため、抗ＴＮＦ試験Ａｂをホモ三量体ＴＮＦと２：１のモル比（痕跡量のみの遊離Ａｂもしくは遊離ＴＮＦをもたらすことが示された比）で混合することにより、免疫複合体を調製した。免疫複合体への依存性は、Ｋ５６２細胞への放射標識Ａｂ２単独の結合が１μｇ／ｍｌまでの濃度で検出可能でなかったが、Ａｂ２：ＴＮＦ複合体が０．０２μｇ／ｍｌで有意の結合を示した時に具体的に説明された（データは示さず）。
【０１０９】
競合結合形式。２組のＩｇＧ免疫複合体、すなわち抗Ｖ領域特異的なヒト以外のＡｂおよびＡｂ５と複合体を形成する無関係な特異性をもつヒトＩｇＧ１抗体を含有する標識複合体を調製した。標識複合体を創製するため、ヒトＩｇＧ１および軽鎖κ定常領域をもつハムスターＶ領域を含むキメラモノクローナルＡｂを、以前に記載された（Ｋｎｉｇｈｔら、１９９３）ＩＯＤＯ−ＧＥＮ試薬を使用してヨウ化した。次いでハムスター−ヒトキメラのＶ領域イディオタイプに特異的なラットＩｇＧ２ａモノクローナルＡｂを、ＰＢＳ中で１：１のモル比で３０分間混合して、放射標識免疫複合体の形成を可能にした。ラット抗Ｉｄは、複合体が脱グリコシル化したハムスター−ヒトキメラを用いて作成された時にほとんど結合が起こらなかったため、ＦｃγＲＩＩＡ結合に直接寄与しないことが示された。一方、非修飾キメラＡｂとの複合体は高レベルの結合を示した（データは示さず）。加えて、１つの免疫複合体が他の免疫複合体に結合する可能性を示すことができる別の免疫複合体を作成するために使用した作用剤の間に、検出可能な交差反応性は存在しなかった（データは示さず）。
【０１１０】
試験複合体について、Ａｂ１のシアル酸バリアントをヒトＴＮＦホモ三量体と、ＰＢＳ中２：１のモル比（非常にわずかな非結合Ａｂおよび非結合ＴＮＦを生じることが光散乱
分析により示された）で室温にて３０分間混合した。一組の実験で、２０および２９パーセントのシアル酸を含むＡｂ１の天然のバリアントの複合体を相互と比較した。第二の組の実験で、Ａｂ１−２９：ＴＮＦ複合体を、レクチンカラムで増強した調製物Ａｂ１−４３：ＴＮＦ複合体と比較した。双方の場合で、対照複合体は、抗体がグリカンを酵素的に奪われていたＡｂ１−Ｇｎｏ：ＴＮＦであった。
【０１１１】
ヒトＫ５６２細胞を９６ウェルプレートに、ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中で３×１０５細胞／ウェルで播種した。固定量の放射標識抗体複合体を変動する量の試験抗体複合体に加え、そして合わせた混合物を、各ウェルが最終濃度０．１μｇ／ｍｌのヨウ化抗体複合体を含有するようにＫ５６２細胞に加えた。プレートを４℃で１６〜１８時間インキュベーションし、その後ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳで３回洗浄することにより非結合Ａｂを除去し、そして細胞に結合したカウント数を、ガンマカウンターを使用して測定した。
【０１１２】
結果。非標識競合体免疫複合体の量が増加すると、放射標識免疫複合体による結合が益々阻害された。シアル酸バリアント、非修飾Ａｂ１（２９％シアリル化）およびＡｂ１  ＭＡＡＢ（４３％シアリル化）は、より高度にシアリル化されたＡｂとの複合体が、ＦｃγＲＩＩへの同程度の結合を生じるために、より少なくシアリル化されたＡｂ１との複合体より５ないし１０倍高濃度で必要とされたことを示した（図４Ａ）。９％シアル酸含量だけ異なる（２０対２９）Ａｂ１の天然のバリアントについて、この差違はより少なくシアリル化された調製物（示さず）に対して約４倍高いアビディティーであった。従って、マウス骨髄腫宿主細胞中での組換え発現の結果としてこのヒトＩｇＧ１上でのＮＧＮＡ異性体の形態のシアル酸の存在は、ヒトＦｃγＲＩＩに対する免疫複合体のアビディティーを低下させた。
【０１１３】
Ｋ５６２細胞への免疫複合体の結合。Ａｂ１試験サンプルを、固定した２：１のモル比で１２５Ｉ標識ヒトＴＮＦと混合し、次いで生じた免疫複合体の量を変えて、９６ウェル培養プレート中の３×１０５  Ｋ５６２細胞に加えた。Ａｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｈｉ）：ＴＮＦ複合体（完全にシアリル化されたＡｂ）に対するＡｂ１  Ｇ２：ＴＮＦ複合体（非シアリル化複合体）の比較は、完全にシアリル化されたＡｂがはるかにより小さいアビディティーで結合し、高度にシアリル化されたバリアントは、同程度の結合を達成するためにアシアリル化バリアントより１０倍高濃度で必要とされた（図４Ｂ）ことを示した。これらの結果は、インビトロでの酵素的修飾により導入したシアル酸のＮＡＮＡ異性体の存在が、安定性の低下したＡｂ：ＴＮＦ複合体によるか、Ｆｃ受容体に対する定常領域の親和性を低下させることによるか、もしくは双方により、標的（ＴＮＦ）への結合親和性の低下に帰することができる、ヒトＦｃγＲＩＩに対する抗体のアビディティーを低下させたことを示す。
【０１１４】
細胞ＦｃγＲＩＩＩａへのＡｂ結合。ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）上のＦｃγＲＩＩＩａへのＡｂ結合を分析するため、ヒトＰＢＭＣを上述されたとおり単離し、そしてＮＫ細胞単離キット（ミニティバイオテック：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用した磁性細胞分取によりＮＫ細胞をＰＢＭＣから単離した。ＮＫ細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中ウェルあたり１×１０５細胞で９６ウェルプレート中で５％ＣＯ２を含む３７℃で一夜培養した。抗ＦｃγＲＩＩＩａ  ｍＡｂ  ３Ｇ８２２（ＢＤ  バイオサイエンス  ファミンゲン：Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、Ｉｏｄｏｇｅｎチューブ（ピアス：Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して１１μＣｉ／μｇの比活性まで１２５Ｉで標識した。ヨウ化ｍＡｂ  ３Ｇ８を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ中で量を変動させた非標識競合体Ａｂと前混合し、そしてＡｂ混合物を０．３μｇ／ｍｌのヨウ化３Ｇ８の最終濃度のためＮＫ細胞に添加した。細胞を４℃で１６時間インキュベーションし、次いでＰＢＳで４回洗浄することにより未結合のＩｇＧを除去した。細胞に結合したＣＰＭ数を、ガンマカウンターを使用して測定した。
【０１１５】
２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｕ−９３７培地）中で培養したＵ−９３７細胞（ＦｃγＲ発現を高めるよう前処理されていない）を、５０μｌのＵ−９３７培地中ウェルあたり３×１０５細胞を有するように９６ウェルプレートに播種した。Ａｂ２（ヒトＩｇＧ１）を１７μＣｉ／μｇの比活性まで１２５Ｉで標識した。ヨウ化Ａｂ２  Ａｂを、Ｕ−９３７培地中で変動する量の非標識競合体Ａｂ２サンプルと前混合した。次いで５０μｌのＡｂ混合物を全ウェル中で０．２μｇ／ｍｌのヨウ化Ａｂ３の最終濃度を有するように５０μｌのＵ−９３７細胞に添加した。細胞を４℃で１６時間インキュベーションし、そしてＵ−９３７培地で３回洗浄することにより未結合のＡｂを除去した。細胞に結合したＣＰＭ数を、ガンマカウンターを使用して測定した。
【０１１６】
ＡｂバリアントがＦｃγＲＩＩＩａに対して示差別的親和性を示すかどうかを試験するため、新たに単離したＮＫ細胞を健康ヒトドナーから単離し、そして放射標識ｍＡｂ  ３Ｇ８（Ｆｃとの結合について競合する抗ＦｃγＲＩＩＩａ  Ａｂ）および競合体として非標識Ａｂを含む競合結合実験で使用した。遊離の複合体形成されないＡｂを、Ｆｃシアル酸含量により影響され得る可溶性免疫複合体それら自身の安定性の差違により結果が混乱されないように（我々の未発表データ）、免疫複合体（一般に、ＦｃγＲＩＩＩａへのはるかに大きな結合を示す）の代わりに使用した。該結果は、Ａｂ１のより多くシアリル化された天然のバリアントＡｂ１−２９が、ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩａに対して低下した親和性を有し、同程度の結合を達成するのにＡｂ１−２０より４倍高濃度で必要とされることを示した（図５Ａ）。Ａｂ５の天然のバリアントで類似の差違が存在し、Ａｂ５−２６はｍＡｂ  ３Ｇ８に対し同程度まで競合するのにＡｂ５−０より５倍高濃度で必要とされた（図５Ｂ）。類似の結果が、少なくとも２名の他の血液ドナーからのＮＫ細胞を使用する場合に各実験で得られた（データは示さず；ＦｃγＲＩＩＩａのアロタイプは決定されない）。これらの結果は、より高レベルのシアリル化がＦｃγＲＩＩＩａに対するＩｇＧの親和性を下げることができ、従ってＡＤＣＣ活性で観察された低下にほぼ確実に寄与したことを示した。
【０１１７】
同じ実験をレクチン分画により派生したバリアントの対で行った場合は、しかしながら、より多くシアリル化されたバリアントが、より少なくシアリル化されたバリアントとちょうど同様に、およびおそらくわずかにより良好に、ＦｃγＲＩＩＩａを結合することが見られた（図５Ｃおよび５Ｄ）。この２対の天然のバリアントおよび２対のレクチン由来のバリアントでの異なる結果の理由は知られていないが、しかし、良好な可能性は、存在するシアル酸残基の位置の差違が存在することである。
【実施例３】
【０１１８】
インビトロ  ＡＤＣＣアッセイ
抗ＴＮＦ  Ａｂの標的細胞は、成熟ＴＮＦのアミノ酸１−１２の欠失の導入により膜貫通形態に留まる、その表面上で組換えヒトＴＮＦを安定に発現するＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞株を含んだ（Ｐｅｒｅｚら、１９９０）。Ｋ２細胞を、熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ
Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸およびＭＨＸを含有するイスコフ培地中で培養した。培地および補充物はギブコ（Ｇｉｂｃｏ）（インビトロジェン：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。細胞は２〜３日ごとに１：５で継代した。アッセイの日にＫ２細胞を遠心分離し、そしてＰＢＳで１回洗浄した。細胞を培養基で約１×１０６細胞／ｍｌに調整し、そして１５マイクロリットルのＢＡＴＤＡ蛍光標識試薬（Ｄｅｌｆｉａ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性試薬キット中）（パーキン−エルマーライフサイエンス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を５ｍｌの細胞に添加した（Ｂｌｏｍｂｅｒｇら、１９９６）。細胞を３７℃で３０分間インキュベーションし、次いでＰＢＳで１０００ｒｐｍ、５分で２回洗浄した。ＰＢＭＣエフェク
ター細胞と混合する直前に、標的細胞を遠心し、そして１％ＢＳＡを含有するイスコフ培地に２×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０１１９】
ＰＢＭＣエフェクター細胞は、健康ドナーからの血液をヘパリン処理したヴァキュテーナーに収集し、そしてＰＢＳで２倍に希釈した後に単離した。３０ｍｌの希釈血液を、５０ｍｌコニカルチューブ中１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（アマシャム：Ａｍｅｒｓｈａｍ、スウェーデン・ウプサラ）の上部に重ね、そして室温（ＲＴ）で１５００ｒｐｍ、３０分で遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する界面（バフィ層）を収集し、そしてＰＢＳで２回洗浄し、そして１２００ｒｐｍ、１０分、ＲＴで遠心分離した。細胞を、５％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび０．１ｍＭ非必須アミノ酸を含有するイスコフ培地に再懸濁した。ＰＢＭＣは、４℃にてＯＫＴ３（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ、オルトファーマシューティカル：Ｏｒｔｈｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）で一夜被覆し、そしてＰＢＳですすいだ１００ｍｍ組織培養皿（コーニング：Ｃｏｒｎｉｎｇ）上でインキュベーションすることにより、３７℃、５％ＣＯ２でおよそ４時間活性化した。ＰＢＭＣを集め、１％ＢＳＡを含有するイスコフ培地で１回洗浄し；計数し、そして約１×１０７細胞／ｍｌまで再懸濁した。
【０１２０】
陰性対照バリアントＡｂ１  Ｇｎｏを含むＡｂ１の試験サンプルをイスコフ−１％ＢＳＡ培地で連続希釈した。５０マイクロリットルの標的細胞（〜１０，０００）および１００マイクロリットルの抗体を丸底９６ウェルプレート（コーニング）に加えた。５０マイクロリットルのエフェクター細胞（〜５００，０００細胞）を混合物に加え、そしてプレートを１０００ｒｐｍで５分間ＲＴで遠心分離した。Ｅ：Ｔの比は通常５０：１であったが、ときに３５：１を使用した。バックグラウンド蛍光のため、ウェルをエフェクター細胞、標的細胞および培地とインキュベーションした。最大の蛍光のため、１０マイクロリットルの溶解溶液（Ｄｅｌｆｉａ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キットから）をバックグラウンドウェルに添加した。ＡＤＣＣアッセイのため、細胞を３７℃、５％ＣＯ２でおよそ２時間インキュベーションした。２０マイクロリットルの上清を９６ウェル平底プレート（コーニング）に移した。２００マイクロリットルのユーロピウム溶液（Ｄｅｌｆｉａ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キット）を添加し、そしてプレートをプレート振とう器上にＲＴで１０分間置いた。時間解析蛍光計ＥｎＶｉｓｉｏｎ装置（パーキン−エルマーライフサイエンス）で蛍光を測定した。各サンプル中の特異的溶解のパーセントを、以下の式：特異的放出％＝（［実験放出−自発放出］÷［最大放出−自発放出］）×１００に従って計算した。
【０１２１】
シアル酸の影響の初期評価は、２対の天然のバリアントのインビトロ  ＡＤＣＣ活性に焦点を当てた。Ａｂ１−２９およびＡｂ１−２０は濃度を変えて、ユーロピウム標識したＡｇ１発現標的細胞とインキュベーションした。図６Ａに示されるとおり、細胞傷害活性の明瞭な差違が存在し、より高レベルのＦｃシアリル化を含むＡｂ１−２９は、同程度まで細胞溶解を誘発するためにＡｂ１−２０よりおよそ７倍高濃度で必要とされた。この結果は、シアリル化糖型について濃縮されたＡｂ１サブロットＡｂ１  ＭＡＡＢが未改変Ａｂ１  ＰＢＳより効力が低いことを示した。Ａｂ１  ＰＢＳ−２９％サンプルと同一量の溶解を達成するために約３倍の多いＡｂ１  ＭＡＡＢ−４３％物質が必要とされた。Ａｇ５発現標的細胞を用いた実験は、Ａｂ２の天然のバリアントの対について同じパターンを示した。検出可能なシアル酸を含まないＡｂ２−０バリアントと同程度の細胞溶解を達成するために、約６倍高濃度のＡｂ２−２６が必要とされた（図６Ｂに示されるとおり）。従って、ＡＤＣＣのこの尺度に対する天然のグリコシル化変動の影響はＡｂもしくは標的特異的でない。
【０１２２】
レクチンに基づく分画後のそれらのシアル酸含量が異なるＡｂ１のサブロットのＡＤＣＣ活性を比較するための代表的実験で、Ａｂ１  ＭＡＡＢ（４３％シアリル化）をそれが
由来した非修飾Ａｂ１ロット（Ａｂ１  ＰＢＳ）と比較した。シアル酸含量が異なったＡｂ１サブロットを比較するための第二実験で、Ａｂ１  ＷＧＡＴ（２９％シアリル化）、Ａｂ１  ＷＧＡＲ（４０％シアリル化）およびＡｂ１  ＷＧＡＢ（３２％シアリル化）を互いに比較した。
【０１２３】
アッセイの結果は、Ａｂを調製した様式に関係なく、シアル酸含量とＡＤＣＣアッセイでの効力の間の逆相関もまた示す（図６Ｃ）。すなわち、未改変Ａｂ１とほぼ同一量のシアル酸を含有するＡｂ１  ＷＧＡＴは、非修飾Ａｂ１と同じ活性を示した。しかしＷＧＡで調製した画分は、シアル酸含量の増加とともに効力を喪失した（図６Ｃ）。
【０１２４】
一実験で、シアル酸含量の差異がさらに顕著な２つのサンプル、すなわち酵素で修飾したＡｂ１  Ｇ２（０％シアリル化）およびＡｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｈｉ）（約９５％シアリル化）を比較した。新しいＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ中での密度遠心分離により単離した。１００ｍｌの容量中の５×１０５  ＰＢＭＣを、未処理Ａｂ１、Ａｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｈｉ）（完全にガラクトシル化かつシアリル化）、またはＡｂ７（アイソタイプを一致させた陰性対照Ａｂ）の量を変えて、およそ１０分間前インキュベーションした。表面結合した組換えヒトＴＮＦを発現するＫ２細胞を、２００ｍＣｉの５１Ｃｒで標識することにより標的として使用した。標識した細胞をＰＢＭＣ／Ａｂ混合物に加え、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、そして３７℃で４時間インキュベーションした。このインキュベーション時間（４時間）は、一般にＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）を発現するマクロファージによるよりむしろＦｃγＲＩＩＩＡを発現するＮＫ細胞（ＰＢＭＣ細胞の集団内）により誘導される主要な細胞溶解を示すことが知られている。次いで細胞上清中の放射活性数を、Ｔｏｐｃｏｕｎｔを使用して測定した。示される結果（図６Ｄ）は、異なるドナーからのＰＢＭＣを使用して行った２回の独立した実験を代表し、そして完全にシアリル化されているＡｂとほぼ脱シアリル化されているものの間の細胞溶解の効力に１０倍以上の変化を示す。
【０１２５】
Ａｂ調製物の他の対もまたＡＤＣＣアッセイで比較した。ガラクトシル化Ａｂ２から調製したＷＧＡレクチン画分を、Ａｇ２発現標的細胞を使用するＡＤＣＣアッセイで評価した。再度、より多くシアリル化された物質の活性がより低かったが、シアル酸含量のそれらの劇的な差違（５％対６７％）にもかかわらず、それらのＥＣ５０値には４倍の差違が存在しただけであった。対照的に、Ａｂ１から作成したＷＧＡレクチン画分は４１％シアリル化バリアントを示し、同程度の細胞溶解を達成するために２９％シアリル化バリアントよりおよそ６倍高濃度であることを必要とした。
【０１２６】
試験したこれら三種全てのＡｂの結果は、より高レベルのＦｃシアル酸がＡＤＣＣ活性の低下と関連したことを一貫して示した。定量的ではないが、ＡＤＣＣ活性とＡｂ調製物のシアル酸含量の変化の規模の間の相違には、４種のＡｂ１バリアントの一団内に一貫した関係が存在し、ここでＥＣ５０値は、Ａｂ１−２０、Ａｂ１−２９、Ａｂ１−ＷＧＡ−２９およびＡｂ１−ＷＧＡ−４１についてそれぞれ典型的に０．３ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌであった。レクチン画分での結果もまた、シアリル化Ａｂ調製物が変動するレベルのＡＤＣＣ活性をもつ分子種を含有することを確認した。Ａｂ３−０およびＡｂ３−２６を除き、ここで分析したバリアントには、達成された最大レベルの溶解の差違を示す傾向がなかったことに注目すべきである。
【０１２７】
ＡＤＣＣ活性の本測定方法はＦｃγＲＩＩＩＡ陽性ＮＫ細胞により主に媒介されるため、このデータは、Ｆｃオリゴ糖中のシアル酸の存在がＦｃγＲＩへの結合を高める一方で、その存在がＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を有意に減少させることを意味する。
【実施例４】
【０１２８】
高親和性の細胞Ｆｃ受容体への結合
高親和性のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）へのシアル酸含量の異なった試験Ａｂの結合を、ヒト単球細胞株Ｕ−９３７細胞で競合結合形式を使用して測定した。Ｕ−９３７細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中、Ｔフラスコ内で培養し、そして３７℃で５％ＣＯ２を含むインキュベータ内にて維持した。マウス／ヒトＩｇＧ１キメラＡｂであるＡｂ２を、ＩＯＤＯ−Ｇｅｎ前被覆ヨウ化チューブを使用して１７．２ｍＣｉ／ｍｇの比活性までヨウ化した。Ｕ−９３７細胞を６×１０６細胞／ｍｌで新鮮培地に再懸濁し、次いでウェルあたり３×１０５細胞の密度でフィルター付きＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ９６ウェル組織培養プレートに播種した。細胞はより高いＦｃγＲ発現を誘導するために前処理しなかった。ヨウ化Ａｂ２を、５０μｌの容量中で、希釈剤として培地を使用して、量を変えた非標識Ｍａｂ競合体（試験サンプル）と前混合した。次いで混合物を０．２ｎｇ／ｍｌの最終のヨウ化Ａｂ２濃度を生じるように、Ｕ−９３７細胞の５０μｌ培養物に添加した。次いで細胞を４℃で１６時間インキュベーションした。培地で洗浄することおよびプレート真空システムを使用して３回吸引することにより非結合ＩｇＧを除去した。細胞に結合したカウント数を、ガンマカウンターを使用して測定した。
【０１２９】
図７Ａは、Ａｂ１  Ｇ２（シアル酸なし）に比較して、Ａｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｈｉ）（〜９５％シアリル化）が５〜１０倍高い親和性でＵ−９３７細胞上の高親和性ＦｃＲ（ＣＤ６４）に結合した、すなわち、Ａｂ１  Ｇ２Ｓ２（ｈｉ）はヨウ化Ａｂ２結合の同程度の阻害を生じるためにわずか１／５〜１／１０の濃度で必要とされたことを示す。Ａｂ１  Ｇ２は未処理Ａｂ１と検出可能な差違を示さず（データは示さず）、後者は多様な糖型の不均質な混合物であり、その大部分はＡｂ１  Ｇ２サンプルより少ないガラクトース（すなわちＧ０およびＧ１糖型）を含有する。
【０１３０】
図７Ｂは、荷電したオリゴ糖種（シアル酸含有種）の量が異なる、リゴ糖全体の２％もしくは４２％のいずれかであるＡｂ３の異なる２ロットが、より高いシアル酸含量を有すると特徴付けられるロットがＦｃγＲＩに対してより高い親和性を有することを同様に示すことを表す。
【０１３１】
Ａｂ１およびＡｂ５の２対の天然のグリコシル化バリアントについて、より高いシアル酸含量をもつ抗体調製物によるＮＫ細胞ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の低下（実施例３、図５ＡおよびＢ）を観察した後に、この効果が負に荷電したシアル酸と負に荷電した細胞表面との間の単純な静電反発による可能性を考慮した。しかしながら、ヒトＵ−９３７細胞上のＦｃγＲＩ受容体に対する結合親和性に対するシアル酸含量の逆の効果は、Ａｂ５もしくは他のＡｂについての同じパターンに従わなかった（データは示さず）。
【０１３２】
２種のＡｂ１サンプルはＮＡＮＡの形態のシアル酸の不存在／存在が異なる一方、２つのＡｂ３サンプルはＮＧＮＡの形態のシアル酸（マウス宿主細胞中で産生される）の量が異なると考えられることに注目すべきである。
【実施例５】
【０１３３】
血清半減期の測定
本実施例では、マウス骨髄腫細胞中で発現される抗体可変領域配列ならびにヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合されたＮ末端ペプチドを含んでなるＦｃ含有融合タンパク質を、完全にシアリル化された（Ｇ２Ｓ２）形態を形成するよう処理した。正常な雌ＣＤ１ラット（処置群あたり４匹）に、５％シアリル化されたＦｃオリゴ糖を含む非修飾の形態のＦｃＰ１の静脈内注入を与えたか、あるいは完全なシアリル化変更体（〜９８％シアリル化）を雌のＣＤ１ラット群に別個に静脈内注入したかのいずれかであった。１時間、５時間、２４時間、７２時間、７日、１４日および２１日に後眼窩採血により集め、次いでＣＯ２麻酔した動物から心穿刺により２８日目に終末部の採血をした。血液サンプルから血清を調製し、そして血清中のヒトＦｃの濃度を比色ＥＬＩＳＡを使用して測定した。簡潔には、９６ウェルＥＩＡプレートをポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ抗体で最初に被覆した。血清サンプルの変動する希釈物をウェル中室温で１時間インキュベーションした。非結合タンパク質は洗浄より除去し、そして結合したヒトＦｃを、酵素複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体、次いで適切な色基質を使用して検出した。
【０１３４】
試験の結果を図８に示す。計算された曲線下面積（ＡＵＣ）は、非修飾抗体について９５±１．６日・ｎｇ／ｍｌ×１０−３および４８±１．９日・ｎｇ／ｍｌ×１０−３であった。これは、Ｆｃオリゴ糖中のより高度なシアリル化が、正常ラットでより高速な消失と関連することを示した。
【０１３５】
第二の実験で、正常マウスに、完全アシアリル化（Ｇ２）もしくは完全シアリル化（Ｇ２Ｓ２）のいずれかとなるように酵素的に修飾したＡｂ２の単回の３ｍｇ／ｋｇ用量を注入した。血清中のヒトＦｃは上記の比色ＥＬＩＳＡを使用して監視し、そして測定した。この実験の結果を図９に示す。およそ１週間後に、Ａｂ２  Ｇ２Ｓ２はマウスの血清からより迅速に消失し始め、そして２０日までに血清中に残存するＡｂ２  Ｇ２Ｓ２はＡｂ２−Ｇ２濃度よりおよそ１０００倍少なかった。
【０１３６】
マウスの全身循環からＡｂ１シアル酸バリアントの消失。シアル酸含量の影響の別の直接測定は、Ａｂ１に結合したグリカン種の不均質混合物を含有するサンプルの注入後の血清から、個々のグリコシル化種の消失速度を定量化することにより行った。
【０１３７】
同じ不均質にグリコシル化されたＡｂ１の調製物を、１８匹の正常な８〜１０週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスに２０ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．注入した。血液を３日目に６匹のマウスから、１４日目に別の６匹のマウスから、そして２８日目に最後の６匹のマウスから収集した。血清を各血液サンプルから調製し、そしてＡｂ１  Ｖ領域に特異的な抗Ｉｄ親和性カラムを使用してＡｂ１を血清から再精製した。次いで再精製したＡｂ１サンプルのＦｃグリカン構造をＨＰＬＣ分析により分析し、そして多様な糖型の相対比率を本明細書に前述された通りに決定した。
【０１３８】
シアル酸を欠くガラクトシル化糖型（Ｇ２Ｓ０）が、マウスで４週間にわたりその相対的豊富さを維持する一方、１シアル酸を含むグリカンを含有するＡｂ糖型（Ｇ２Ｓ１）および２シアル酸を含む糖型（Ｇ２Ｓ２）はより速い速度で消失することが分かった。従って、完全にシアリル化されたＦｃ含有タンパク質は、アシアリル化または部分的シアリル化組成物より短い血清半減期を有する。
【実施例６】
【０１３９】
シアル酸含量および抗体のアビディティー
本明細書に記載される結果は、Ｆｃドメイン（二量体化したヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）のＦｃグリカンのシアル酸含量の変化がタンパク質全体に影響するという理論を裏付ける。グリコシル化Ｆｃを含んでなる抗体および融合タンパク質の二価性に関して、この効果は特異的標的に対するタンパク質のアビディティーに明示され得る。本実施例の実験は、この理論を試験し、そしてさらに標的結合親和性に対するシアル酸含量の特定の効果を示すために実施した。
【０１４０】
細胞表面抗原への結合。上記のＡＤＣＣアッセイで使用したものと同じＡｇ発現細胞株を、結合アッセイで使用して、それらの抗原結合アビディティーのシアル酸バリアント間での差違について試験した。アッセイは、固定濃度に保った放射標識Ａｂ（Ａｂ１、Ａｂ２もしくはＡｂ５のいずれか）の１種を、変動する量の未標識試験Ａｂの存在下でＡｇ発現細胞とインキュベーションする競合形式で実施した。Ｉｏｄｏｇｅｎ法により調製したヨウ化Ａｂは一般に１０μＣｉ／μｇの比活性であった。
【０１４１】
表面ＴＮＦを発現する細胞をウェルあたり５０，０００細胞、およびＡｇ２発現細胞をウェルあたり１８０，０００細胞で、５％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地中、９６ウェル組織培養プレートに播種した。適切な１２５Ｉ標識Ａｂを滴定量の試験Ａｂと前混合し、そして混合物を適切なＡｇ発現細胞に加えた。プレートをＲＴで２時間インキュベーションして細胞へのＡｂ結合を可能にした。次いで細胞をＩＭＤＭ、５％ＦＢＳで３回洗浄して非結合Ａｂを除去し、そして細胞に結合したカウント数をガンマカウンターを使用して測定した。
【０１４２】
Ａｂ５バリアントについて、Ａｇ５発現細胞を、５０μｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ中ウェルあたり１８６，０００細胞で９６ウェル組織培養プレートに播種した。１２５Ｉ標識Ａｂ２を滴定量の試験Ａｂと前混合し、そして５０μｌの混合物をＡｇ発現細胞に添加した。プレートを４℃で１６時間インキュベーションして細胞上の抗原へのＡｂ結合を可能にした。次いで細胞をＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳで３回洗浄して非結合Ａｂを除去し、そして細胞に結合したカウント数を、ガンマカウンターを使用して測定した。サンプルは２連もしくは４連で試験し、そして結果は３もしくは４回の独立した実験を代表する。これらの試験サンプル間の結合の差違は、追加二乗和（ｅｘｔｒａ  ｓｕｍ  ｏｆ  ｓｑｕａｒｅ）Ｆ検定により決定されるとおり有意（グラフａ、ｃおよびｄについてＰ＜０．０００１）であった。
【０１４３】
結果を、図１０Ａ〜Ｄに示す：競合体としての非標識のＡｂ１天然バリアントの存在下でのＡｇ１発現細胞への放射標識Ａｂ１の結合（図１０Ａ）；競合体としての未標識のＡｂ５天然バリアントの存在下でのＡｇ５発現細胞への放射標識Ａｂ５による結合（図１０Ｂ）；競合体としての未標識のＡｂ１のレクチン由来バリアントの存在下でのＡｇ１発現細胞への放射標識Ａｂ１による結合（図１０Ｃ）：競合体としての未標識のＡｂ３のレクチン由来バリアントの存在下でのＡｇ３発現細胞への放射標識Ａｂ３による結合（図１０Ｄ）に示す。
【０１４４】
固相リガンドへのＡｂ結合。組換え可溶性ＴＮＦもしくは抗Ｉｄ２は、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのＡｇもしくは抗Ｉｄ  Ａｂ  ５０μｌを各ウェルに加えること、そしてプレートを４℃で一夜インキュベーションすることにより、ＥＩＡプレートに被覆した。ウェルを洗浄し、次いで非特異的結合を最低限にするため、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０．１２５％ゼラチン５０μｌでＲＴにて１時間前処理した。１２５Ｉ標識Ａｂ１もしくは１２５Ｉ標識Ａｂ３をＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中の滴定量の各試験Ａｂ調製物と前混合し、そして５０μｌの混合物を標的で被覆したウェルに添加した。放射標識Ａｂの最終濃度は全ウェル中で１００ｎｇ／ｍｌであった。プレートをＲＴで２時間インキュベーションして、被覆した標的へのＡｂ結合を可能にした。ウェルを洗浄して非結合Ａｂを除去し、そして、結合したカウント数を、ガンマカウンターを使用して測定した。
【０１４５】
可溶性抗原へのプレート被覆したＡｂの結合。９６ウェルプレートをＡｂ１もしくはＡｂ３のシアル酸バリアントで被覆し、次いで以下の変動する量の放射標識可溶性抗原とインキュベーションした：（ａ）プレートに被覆したＡｂ１の天然のバリアントへの放射標識可溶性Ａｇ１の結合、（ｂ）プレートに被覆したＡｂ１のレクチン分画バリアントへの放射標識可溶性Ａｇ１の結合、および（ｃ）プレートに被覆したＡｂ３のレクチン分画バリアントへの放射標識可溶性Ａｇ３の結合。非特異的結合を測定するため、放射標識Ａｇおよび１００倍過剰の非標識Ａｇとの並行インキュベーションを行った。サンプルは３連で試験した。Ａｂ２バリアントは可溶性Ａｇ２が入手不可能性のため分析しなかった。
【０１４６】
統計学的解析。抗体バリアント間の効力の差違は、ゼロ濃度の一般的プラトーを考えた傾きおよび範囲についての予備検定（すなわち、増加曲線の一般的な「底」および減少曲線の一般的な頂点を検定せずに常に想定する）後に一般的な最小値、最大値および傾きをもつ同時の４パラメータロジスティック回帰を使用する曲線の比較により解析した。有意性検定はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ４の追加二乗和Ｆ検定を用いて行った。＜０．０５のＰ値を有意であるとみなした。ＣＰＭの分析は、ＣＰＭの標準偏差がその平均に比例して増大する（すなわちＣＰＭの変動係数、ＣＶは平均に無関係である）ので、ＣＰＭ２により逆加重した。
【０１４７】
結果
ＡＤＣＣアッセイで使用した同じＡｇ発現標的細胞を用い競合形式で実施した抗原結合実験は、予期せずＡｂ１−２９がＡｂ１−２０より約３倍低い親和性で細胞表面抗原に一貫して結合することを示した（図１０Ａ）。対照的にＡｂ５−２６は、Ａｂ５−０と識別不可能な親和性を示した（図１０Ｂ）。２対のレクチン由来バリアントを用いて実施した同じ分析では、Ａｂ１の天然バリアントに類似の結果を示し、すなわち、より多くシアリル化されたＡｂ１−ＷＧＡ−４１が、同程度の競合結合を達成するために、より少なくシアリル化されたＡｂ１−ＷＧＡ−２９より４〜６倍より高濃度で必要とされ（図１０Ｃ）、そして、より多くシアリル化されたＡｂ２−ＧＴ−ＷＧＡ−６７は、より少なくシアリル化されたＡｂ２−ＧＴ−ＷＧＡ−５より４〜６倍高濃度で必要とされた（図１０Ｄ）。
【０１４８】
興味深いことに、より多量のシアリル化を含むＡｂ１およびＡｂ２により低下した結合の同一パターンが、９６ウェルＥＩＡプレートに固定された標的（可溶性組換え抗原もしくは抗Ｉｄ  Ａｂ）への結合を分析する実験でもまた観察された（図１１ＡおよびＢ）。これらの結果は、Ｆｃシアリル化の程度の差違が抗原ならびにＦｃγＲＩＩＩＡへの結合に影響し得るが、しかしシアリル化の程度は全Ａｂの抗原結合に影響しないことを示した。
【０１４９】
固定化した標的の結合に関するデータから、Ｆｃシアリル化の増大がＡｂのヒンジ領域の柔軟性を低下させるように働き得ると考えられる。細胞表面抗原へのＡｂ１およびＡｂ２結合の場合、低下されたヒンジの柔軟性は、固体支持体もしくは細胞表面上の抗原エピトープの空間に依存して、抗原へのより多い一価結合およびより少ない二価（高アビディティー）結合につながる可能性がある。Ａｂ５のヒンジ領域もまた柔軟性が低下し得るが、柔軟性はこのＡｂがＡｇ５への最大の結合を達成するのに必要とされないかもしれない。
【０１５０】
Ａｂの柔軟性の効果または生来の結合親和性の変化が、Ｆｃシアリル化により影響を及ぼされたかどうかを識別するために、可溶性リガンドへのＡｂの結合を純粋に一価結合親和性の尺度として試験した。この結果は実際に、細胞表面抗原への結合に差違を示した３対のシアル酸バリアントについて、可溶性標的へのそれらの結合にバリアントの対間で観察される検出可能な差違が存在しないことを示した（図１２Ａ〜Ｃ）。合わせて考えると、これらの結果は、固定化された標的（細胞表面もしくはプレート被覆）への結合の差違が各Ｆａｂアームと標的の間の固有の親和性の差違によらないことを示した。従って、固定化した標的へのそれらの結合におけるＡｂ１およびＡｂ２シアル酸バリアント間の差違は、細胞への二価結合の程度の差違による。
【実施例７】
【０１５１】
シアリダーゼを分泌するためのベクターの調製
シアリダーゼ発現プラスミドアッセンブリー。アースロバクター  ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）のシアリダーゼの触媒ドメインをコードする核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ９３４５３９の残基４０〜５３５）
を、その配列に基づき合成した。ヒト成長ホルモンのシグナル配列−アースロバクター  ウレアファシエンスの触媒ドメイン融合体（配列番号１：シグナル配列として最初の２６アミノ酸および触媒ドメインとして残りの４９４アミノ酸を含む）をコードする合成された遺伝子（配列番号２）を、独自のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用してプラスミドｐ２８１５にクローン化した。このプラスミドはＣＭＶプロモーター、分泌に影響を及ぼすためのヒト成長ホルモンシグナル配列のコード配列、および安定な選択のためのネオマイシン耐性遺伝子を有する。ｈＧＨシグナルコード配列（配列番号１）に連結された酵素触媒ドメインに関するコード配列は、制限酵素消化およびシークエンシングにより確認された。
【０１５２】
一過性および安定なトランスフェクション。一過性のトランスフェクションには、ＨＥＫ２９３細胞を１５ｕｇの精製したプラスミドｐ３６２９もしくは対照プラスミド（空のベクター）を用いて、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を使用してトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡおよび９０ｕＬのリポフェクタミン２０００をオプティメン（Ｏｐｔｉｍｅｍ）で希釈し、合わせ、次いで室温にて２０分間インキュベーションした。次いでトランスフェクションカクテルを成長培地中、７０％の集密度のＨＥＫ２９３細胞に一晩加えた。翌日、成長培地を２９３ＳＦＭ培地と交換し、そして細胞は培地の回収および分析のために５日間インキュベーションした。安定なトランスフェクションには、Ｃ１６８Ｍ細胞を、ＢｇｌＩＩでの制限消化により直線化した１０ｕｇのｐ３６２９とエレクトロポレーションにかけた。トランスフェクトした細胞は、７００ｕｇ／ｍＬのジォネティシン抗生物質を含む成長培地に維持して安定なトランスフェクションを選択した。抗生物質耐性クローンを増幅させ、そしてシアリダーゼについてアッセイした。
【０１５３】
シアリダーゼ活性アッセイ。シアリダーゼ活性は２’−（４−メチルウンベリフェリル）−ａ−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を使用してアッセイした。生存可能な細胞培養物からの細胞上清に関する蛍光アッセイは、それを１００ｍＭクエン酸−リン酸バッファー、ｐｈ６．５中、３７℃で２００ｕＬの１５０ｕＭ  ２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸と混合し、次いで２ｍＬの０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を加えて反応を止めることにより行った。励起は３６６ｎｍで、そして発光は４４６ｎｍで行った。蛍光単位は生存可能な細胞カウントに対して標準化した。あるいは培養基中のシアリダーゼ活性は、シアリル化レミケードをトランスフェクトした細胞からの培地と一晩インキュベーションし、そして以下に記載のようにシアル酸についてアッセイすることにより測定した。
【０１５４】
シアル酸測定。シアリダーゼ活性は、細胞培養上清とインキュベーションした後に、精製した抗体からのシアル酸除去についてアッセイすることにより測定した。Ｎ−結合オリゴ糖は、ＩｇＧサンプル（０．１ｍｌ中、０．０５〜０５ｍｇ）を、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．０中で３７℃にて４〜６時間、ＰＮＧアーゼＦで処理することにより放出された。この溶液のアリコート（〜０．０１ｍｌ）を、カチオン交換樹脂を含有するカラムに通し、そして前に記載したようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析した（）。残りのサンプル部分は、アントラニル酸での還元的アミノ化、続いてＡｎｕｍｕｌａに記載されているようにＨＰＬＣによる分析にかけた。簡単に説明すると、４％酢酸ナトリウム３Ｈ２Ｏ（重量／容量）および２％ホウ酸（重量／容量）溶液（メタノール中）を最初に調製した。誘導化試薬は、〜３０ｍｇのアントラニル酸（アルドリッチ）および〜２０ｍｇのシアノホウ水素化ナトリウム（アルドリッチ）を、１．０ｍｌのメタノール−酢酸ナトリウム−ホウ酸溶液に溶解することにより新たに調製した。ＩｇＧ由来オリゴ糖（２０〜５０μｌの水中＜３ｎｍｏｌ）を、０．１ｍｌのアントラニル酸（ＡＡ）試薬溶液と、“Ｏ”リング（シグマ）を備えた１．６ｍｌのポリプロピレン製ネジ式キャップ凍結バイアル中で混合し、そしてきつく蓋をした。バイアルを８０℃に加熱ブロック（Ｒｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍ、ピアス：Ｐｉｅｒｃｅ）中で〜１時間加熱した。バイアルを室温に冷却した後、サンプルを水で希釈して容量を〜０．５ｍｌにした。誘導化オリゴ糖は前に記載したように精製した。
【０１５５】
抗体精製。安定なトランスフェクトされた細胞から発現した組換え抗体は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製された。細胞上清は１０ＸプロテインＡバッファー（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）で１Ｘに希釈し、そして１ｍＬのプロテインＡカラムで精製した。溶出した抗体をＰＢＳ、ｐＨ７．２に透析した後、分析した。
【０１５６】
抗体依存的な細胞の細胞傷害性アッセイ（ＡＤＣＣ）。Ａｂ１およびＡｂ３が関与するアッセイのために、標的細胞はそれぞれＡｇ１およびＡｇ３の膜貫通形を含むＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞をトランスフェクトすることによりセントコール（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）で調製した。Ａｇ１を発現している、およびＡｇ３を発現している両方の細胞を、熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムおよび０．１ｍＭ  非必須アミノ酸を含有するＩＭＤＭ中で培養した。Ａｇ２を発現している接着細胞をＡＴＣＣから得、そして１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸を含有するＤＭＥＭ培地で培養した。すべての細胞を１週間に２回、継代し、そして対数期増殖で維持した。培養基および補充物質はギブコ（インビトロジェン）から購入した。
【０１５７】
アッセイの日に、Ａｇを発現している骨髄腫標的細胞を遠心し、そしてＰＢＳで１回洗浄した。接着Ａｇ２発現標的細胞をトリプシンで外し、そして２回洗浄した。細胞を１×１０６細胞／ｍｌに培養基で調整し、そして１５μｌのＢＡＴＤＡ（（ビスアセトキシメチル）−２、２’：６’２”−ターピリジン−６，６”−ジカルボキシレート）蛍光標識試薬（Ｄｅｌｆｉａ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キット中の、パーキン−エルマー  ライフサイエンス；Ｂｌｏｍｂｅｒ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ）を５ｍｌの細胞に加えた。細胞を３７℃で３０分間、時々振盪しながらインキュベーションし；次いで培地で２回洗浄した。エフェクター細胞と混合する直前に、標的細胞を遠心し、そして２ｘ１０５細胞／ｍｌで培養基中に再懸濁した。
【０１５８】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）エフェクター細胞を健康なドナーのヘパリン処理した血液から分離した。血液サンプルをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、そしてＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（アマシャム）の密度勾配遠心により分離した。遠心後、ＰＢＭＣを集め、２回洗浄し、そして培養基中、３７℃で５％ＣＯ２中で一晩維持した。翌日、ＰＢＭＣを集め、２回洗浄し、そして培地に１ｘ１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０１５９】
細胞傷害性アッセイには、１００μｌの培養基中の抗体希釈物を丸底の９６ウェルプレートに加えた。５０μｌのエフェクター細胞および５０μｌのＢＡＤＴＡ標識標的細胞をＡｂ希釈物に、５０：１のエフェクター対標的細胞比で加えた。プレートを簡単に遠心してエフェクターおよび標的が互いに接触させ、次いで３７℃で２時間、で５％ＣＯ２の雰囲気中でインキュベーションした。インキュベーション後、２０μｌの上清を平底の９６ウェルプレートのウェルに移し、そして２００μｌアリコートのユーロピウム濃縮溶液（Ｄｅｌｆｉａ細胞傷害性キットの）を各ウェルに加えた。プレートを１０分間振盪した後、蛍光を時間解析蛍光計（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）（エン  ビジョン  インスツルメント：Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、パーキン−エルマー）で測定した。特異的な細胞傷害性の割合は、（実験での放出−自然な放出）／最大放出−自然な放出）×１００として算出した。自然な放出は標的をエフェクター細胞の代わりに培地とインキュベーションすることにより、そして最大放出は標的をジギトニンを含有する１０μｌの溶解液（Ｄｅｌｆｉａ  ＥｕＴＤＡ  細胞傷害性キットの）とインキュベーションすることにより測定した。
【０１６０】
結果および考察
発現ベクターｐ３６２９（図１３）を構築し、そしてアースロバクター  ウレアファシエンスのシアリダーゼＡ触媒ドメインを哺乳動物細胞中で発現させる。ヒト成長ホルモンリーダー配列のコード配列は、シアリダーゼＡを細胞外に分泌させるために酵素の触媒ドメインに操作可能に連結した。ＨＥＫ２９３細胞を発現プラスミドで一時的にトランスフェクトし、そして精製した抗−ＴＮＦα抗体についてシアリダーゼ活性のために上清を集めた。抗体は一晩、ｐ３６２９トランスフェクト細胞または対照プラスミドでトランスフェクトした細胞からのコンディショニング培地とインキュベーションした。コンディショニングした上清とインキュベーションした後の抗体から放出されたオリゴ糖のＨＰＬＣ分析は、元の細胞株でトランスフェクトした対照から放出されたグリカンを除き、すべてで検出できなかった。したがってシアリダーゼ活性はｐ３６２９トランスフェクト細胞の上清にのみ存在し、対照のトランスフェト上清には存在しなかった。
【実施例８】
【０１６１】
抗体およびシアリダーゼの同時発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
これら実験の目的は、シアリダーゼ酵素を培養基に分泌することができる宿主細胞株を生成することであり、この細胞はさらに抗体コード配列でトランスフェクトすることにより、脱シアリル化されるグリコシル化抗体を生産する可能性があった。抗体を発現するマウス骨髄腫細胞株Ｃ１６８Ｍを、実施例７で調製したベクターｐ３６２９でトランスフェクトし、そして安定なクローンを選択し、そして上清中のシアリダーゼ活性をスクリーニングした。以下の表２に示すように、この実験では蛍光計でアッセイした（ＭＦＵ）１７のクローンのうち、シアリダーゼ活性に関して６つが陽性であり、そしてシアリダーゼ発現が６週間にわたり持続し、安定なクローンであることが示された。
【０１６２】
【表２】
2010514448.tif 000004
【０１６３】
シアリダーゼＡ陽性クローンからＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製した抗体のさらなる分析は、それらが未だに完全な抗体を発現していることを示し、そしてシアリダーゼの発現が発現レベルに影響しないことを示した。抗体の炭水化物分析は、すべてのクローンが２％未満のシアル酸を含むことを示し、約１５％のシアル酸を有する非シアリダーゼトランスフェクト宿主細胞からの抗体と比較した（表３）。
【０１６４】
【表３】
2010514448.tif 000005
【０１６５】
シアリダーゼを過剰発現しているクローンからのこの低いシアル酸抗体を、ＷＴ  Ｃ１６８Ｍと比べて強化されたＡＤＣＣ活性についてアッセイした（図１４）。表３から分かるように、幾つかのサンプルが野生型の抗−ＴＮＦα抗体よりも低いＥＣ４０および高い最大溶解を示し、低いシアル酸含量がこの抗体の生物学的特性に影響していることを示した。
【０１６６】
アースロバクター  ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）のシアリダーゼＡ酵素の触媒ドメインが、哺乳動物細胞の培養基に分泌するように発現プラスミドが設計された。この分泌された酵素は細胞上清中で活性であり、そしてシアル酸残基を抗体のＦｃ領域に存在するＮ−結合オリゴ糖から除去できる。抗体を発現している細胞株のこの発現構築物での安定なトランスフェクションは、シアリダーゼＡ活性を抗体と一緒に培養上清に分泌するクローンを生じる。これらの細胞培養物から回収した抗体は、ＡＤＣＣ活性における機能的改善に翻訳される低いシアル酸を含む。これらの結果は、この方法が組換え糖タンパク質を発現する宿主細胞を生成するために使用でき、そしてシアリル化が最少になった糖結合体のための培養物を作成するために使用できることを示唆している。
【実施例９】
【０１６７】
シアリダーゼのＣＨＯ発現
ＣＨＯ細胞は生物薬剤の製造に重要な宿主細胞である。ｐ３６２９（図１３）プラスミドは、抗体のような治療用タンパク質の発現のためのベクターでさらにトランスフェクトされ得るＣＨＯ細胞株を安定にトランスフェクトするために使用した。
【０１６８】
ＣＨＯ細胞（Ｃ１８３５Ａ）は、ＦｕＧｅｎｅ６（ロッシュ社：Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．）を使用したＢｇｌＩＩでの制限消化により線状化した３０μｇのｐ３６２９でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は、７００ｕｇ／ｍＬのジェネティシン抗生物質（インビトロジェン社）を含む成長培地中で維持して、安定なトランスフェクション体を選択した。抗生物質耐性クローンをプールし、増幅させ、そしてシアリダーゼ活性についてアッセイした。
【０１６９】
シアリダーゼ活性は、フルオロホアを使用して生存可能な細胞培養物からの細胞上清についてアッセイした。２００ｕＬの細胞上清に、１５０ｕＭの２’−（４−メチルウンベリフェリル）−アルファ−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（１００ｍＭのクエン酸−リン酸バッファー、ｐＨ６．５中）に３７℃で加え、次いで２ｍＬの０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を加えて反応を止めた。励起は３６６ｎｍであり、そして発光は４４６ｎｍであった。蛍光単位（ＦＵ）は、各細胞株に関する個々の蛍光の読み取りを生存可能な全細胞数で割ることにより標準化した。ＦＵで測定した培養基中のシアリダーゼ活性は、表４に示す。
【０１７０】
【表４】
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【０１７１】
選択後、３週および８週のシアリダーゼ活性は一定か、または期間中増加したので、培養上清中へのシアリダーゼ酵素の安定な発現および分泌が確認された。
【０１７２】
本発明は前記の記載および実施例に特に記載された以外にも実施できることは明らかである。本発明の多くの修飾および変形が上記の教示に照らして可能であり、したがって添付する特許請求の範囲内で可能である。
【図１】
2010514448.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図９】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2010514448.tif 000021
【配列表】
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【国際調査報告】
2010514448.tif 000022