(57)【要約】少なくとも一つの第１の核酸を少なくとも一つの細胞のゲノムに部位特異的に組み込む方法であって、以下からなる方法：第１のatt部位に連結されるレポーター核酸構造物により前記ゲノムを形質転換すること；少なくとも一つの組み込まれたレポーター核酸構造物を有する少なくとも一つの第１の形質転換細胞を選択すること；前記少なくとも一つの第１の核酸および相同組換えを媒介する酵素を前記細胞に導入すること、そこで、前記少なくとも一つの第１の核酸は、前記第１のatt部位に相補的である少なくとも一つの第２のatt部位からなる；そして、少なくとも一つの第１の核酸を、少なくとも一つの安定して組み込まれた細胞を生産する前記第１のatt部位に組み込むのに十分な条件下に前記細胞を維持すること。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの第１の核酸を少なくとも一つの細胞のゲノムに部位特異的に組み込む方法であって、
該ゲノムを第１のatt部位に連結されるレポーター核酸構造物により形質転換すること；
少なくとも一つの組み込まれたレポーター核酸構造物を有する少なくとも一つの第１の形質転換細胞を選択すること；
該少なくとも一つの第１の核酸および相同組換えを媒介する酵素を該細胞に導入すること、ここで該少なくとも一つの第１の核酸は、該第１のatt部位に相補的である少なくとも一つの第２のatt部位を含む；および
該少なくとも一つの第１の核酸を、少なくとも一つの安定して組み込まれた細胞を生産する該第１のatt部位に組み込むのに十分な条件下に該細胞を維持すること
を含む、方法。
【請求項２】
少なくとも一つの第１の核酸がコード配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
コード配列が円形の構造物に存在する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
円形の構造物が発現カセットである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
発現カセットが、細菌性の複製起源をさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一つの核酸が制御領域を含む、請求項２記載の方法。
【請求項７】
制御領域がプロモーターである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
プロモーターがコード配列に操作可能に連結され、該コード配列が生産物をコードする、請求項６記載の方法。
【請求項９】
生産物がＲＮＡ分子である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
生産物がポリペプチドである、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが免疫グロブリンの重鎖またはその断片を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドが免疫グロブリンの軽鎖またはその断片を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
レポーター核酸構造物が選択可能なマーカーをコードする、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
選択可能なマーカーがポジティブまたはネガティブな選択を提供する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
選択可能なマーカーを発現すること、選択工程の少なくとも一つの第１の形質転換細胞によって生産される選択可能なマーカーの量を、選択工程の少なくとも一つの第２の形質転換細胞によって生産される選択可能なマーカーの量と比較することをさらに含み、ここで第１および第２の形質転換細胞が同じ選択可能なマーカーを生産するところの、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
相同組換えを媒介する酵素が、相同組換えを媒介する酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット上でコードされ、ここで該発現カセットが少なくとも一つの細胞に導入されるところの、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
相同組換えを媒介する酵素が、λバクテリオファージ・インテグラーゼ、ΦＣ３１ファージ・リコンビナーゼ、ＴＰ９０１―１ファージ・リコンビナーゼ、Ｒ４ファージ・リコンビナーゼ、メガ・ヌクレアーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｃｒｅ様リコンビナーゼ、ＦｌｐリコンビナーゼおよびＲリコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
第１のatt部位がattP組換え部位である、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
第２のatt部位がattB組換え部位である、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも一つの細胞が哺乳動物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも一つの細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
レポーター核酸構造物が、さらに第３および第４のatt部位を含み、ここで該第３および第４のatt部位を導入工程の相同組換えを媒介する酵素と接触させると、該レポーター核酸構造物がゲノムから取り出されるように、該第３および第４のatt部位が該レポーター核酸構造物に関して置かれ、ここで第１のatt部位が少なくとも一つの細胞のゲノムにおいて形質転換されたままであるところの、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
第３のatt部位がattP組換え部位である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
第４のatt部位がattB組換え部位である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも一つの安定に組み込まれた細胞を、該生産物を発現するのに十分な条件下に維持することをさらに含む、請求項８記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも一つの細胞のゲノム・ホットスポットを同定する方法であって、
第１および第２の細胞のゲノムを、第１のatt部位に連結されるレポーター核酸構造物を用いて形質転換すること、ここで該レポーター核酸は選択可能なマーカーをコードし；
該選択可能なマーカーを発現させ、少なくとも一つの第１の形質転換細胞によって生産される選択可能なマーカーの量を少なくとも一つの第２の形質転換細胞によって生産される選択可能なマーカーの量と比較すること、ここで該第１および第２の形質転換細胞が同じ選択可能なマーカーを生産し；および
少なくとも１つの組み込まれたレポーター核酸構造物を有する少なくとも一つの第１の形質転換細胞を、第１および第２の形質転換細胞によって生産される選択可能なマーカーの量を比較することによって選択すること
を含む、方法。
【請求項２７】
選択可能なマーカーがポジティブまたはネガティブな選択を提供する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
レポーター核酸構造物が、相同組換えを媒介する酵素の存在下、第１の細胞および第２の細胞に形質転換される、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
相同組換えを媒介する酵素が、λバクテリオファージ・インテグラーゼ、ΦＣ３１ファージ・リコンビナーゼ、ＴＰ９０１―１ファージ・リコンビナーゼ、Ｒ４ファージ・リコンビナーゼ、メガ・ヌクレアーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｃｒｅ様リコンビナーゼ、ＦｌｐリコンビナーゼおよびＲリコンビナーゼからなる群より選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
第１のatt部位がattP組換え部位である、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
レポーター核酸がさらに第２のatt部位に結合される、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
第２のatt部位がattB組換え部位である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも一つの細胞が哺乳動物細胞である、請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも一つの細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
レポーター核酸構造物がさらに第３および第４のatt部位を含み、ここで該第３および第４のatt部位を相同組換えを媒介する酵素の存在下で接触させると、レポーター核酸構造物がゲノムから取り出されるように、該第３および第４のatt部位が該レポーター核酸構造物に関して置かれ、ここで第１のatt部位が少なくとも一つの細胞のゲノムにおいて形質転換されたままであるところの、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
該第３のatt部位がattP組換え部位である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
第４のatt部位がattB組換え部位である、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
レポーター核酸が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも一つの核酸を少なくとも一つの細胞のゲノムに部位特異的に組み込む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
異種タンパク質は、細菌、酵母、及び、哺乳類の発現システムを含む様々な細胞発現系において発現される。たとえば、モノクローナル抗体（IgＧアイソタイプ）は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＮＳＯ、雑種細胞、および、骨髄腫細胞、または、それらの誘導体のような宿主システムを含む様々な発現系を用いて生産される。これらの発現系の多くにおいて、目的とする異種タンパク質の全部又は一部をコードする核酸配列が宿主細胞のゲノムに挿入される。目的とする異種タンパク質の発現量は、宿主細胞のゲノムの中の、どこに該タンパク質をコードする核酸が挿入されるかに依存することが多い。
【０００３】
そのような部位特異的な組換え酵素は、哺乳動物細胞の大きなゲノムの中にさえ、典型的には存在しない、長いＤＮＡ認識部位を有している。しかし、組換え酵素の偽部位、すなわち、組換え酵素の野生型の結合部位と有意な程度の同一性を有する部位が、これらのゲノムの中に存在することが、最近、明らかにされた（Thyagarajan, B., et al., Gene 244, 47-54（2000））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Thyagarajan, B.ら、Gene 244, 47-54（2000）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、異種タンパク質をコードする核酸配列を哺乳動物の部位特異的ゲノムに指定することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、異種生成物、例えば異種ポリペプチドをコードする核酸、例えば異種ポリヌクレオチドをゲノム・ホットスポットに部位特異的に指定し、それによって、宿主細胞において生産される異種生産物を増加するための方法を開示する。
【０００７】
本発明の一つの態様には、少なくとも一つの第１の核酸を少なくとも一つの細胞のゲノムに部位特異的に組み込む方法であって、
該ゲノムを第１のatt部位に連結されるレポーター核酸構造物により形質転換し、
少なくとも一つの組み込まれたレポーター核酸構造物を有する少なくとも一つの第１の形質転換細胞を選択し、
該少なくとも一つの第１の核酸および相同組換えを媒介する酵素を該細胞に導入し、ここで該少なくとも一つの第１の核酸が該第１のatt部位に相補的な少なくとも一つの第２のatt部位を含み、および
少なくとも一つの安定に組み込まれた細胞を生産する該第１のatt部位に、該少なくとも一つの第１の核酸を組み込ませるのに十分な条件で該細胞を維持することを含む、方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
用語集
本願明細書において使用するとき、「ゲノム・ホットスポット」とは、形質転換された核酸が、同じゲノムの他の位置において形質転換されるときに同じ異種生産物の産生レベルと比較したときに、より多くの異種生産物、例えば、これに制限されないが、ＲＮＡまたはポリペプチドを発現する細胞のゲノムの位置をいう。例えば、宿主細胞におけるゲノムの１つの位置で形質転換を、他の位置での形質転換と比較した場合、異種ポリペプチドをコードしている核酸が異種ポリペプチドをより多くの量で発現することを見出すことができる。別のゲノム・ホットスポットのための別名には、オープンクロマチンおよび活性クロマチンが含まれるが、これらに限定されない。オープン、活性クロマチンとは、非凝縮された状態にあって、したがって遺伝子発現を誘導する転写制御因子にアクセス可能であるクロマチンをいう。このような転写的に活性なクロマチンは、ユークロマチンと称されてもよい。
【０００９】
本願明細書において使用するとき、「att部位」は、部位特異的な組換え部位を意味する。バクテリオファージは、ファージ・att部位（attP）として公知のファージ染色体上の部位と細菌性att部位（attB）として公知の細菌染色体上の部位の間に部位特異的組換えによって宿主染色体に組み込まれる。その組換えイベントにより、attLおよびattRとして称される２つの雑種att部位の形成がもたらされる。
【００１０】
本願明細書において使用するとき、「相補的att部位」は、相同組換えを媒介する酵素が存在するときに、互いに組み換わることができる２つ以上のatt部位を意味する。
【００１１】
本願明細書において使用するとき、「偽部位」とは、相同組換えを媒介する酵素によって認識されるＤＮＡ塩基配列であって、その認識部位は、野生型酵素認識配列から一つ以上の塩基対において異なり、および／または、内因性の配列としてゲノム中に存在し、リコンビナーゼの野生型認識配列が属するゲノムとは異なるものをいう。
【００１２】
「偽attP部位」または「偽attB部位」は、それぞれ、ファージ組換え酵素の野生型ファージまたは細菌性付着部位配列と類似する偽部位をいう。「偽att部位」は、偽attP部位または偽attB部位のいずれかを指すことができる、より一般的な用語である。
【００１３】
本願明細書において使用するとき、ゲノムへの「天然の」組換え部位とは、自然に細胞のゲノムで起こる組換え部位を意味する（すなわち、その部位は、例えば、組換え手段によって、ゲノムに導入されない。）
【００１４】
本願明細書において使用するとき、「エンハンサ／プロモータ」とは、（1）結合部位をＲＮＡポリメラーゼおよび関連する転写制御因子（プロモータ）に提供することによって転写の開始を引き起こして、および／または、（2）それらの発現を強化するために遺伝子と相互作用する調節性ＤＮＡ要素（エンハンサ）からなるＤＮＡの領域を意味する。プロモータの例は、これに限定されないが、ｃｍｖ最初期プロモータ／エンハンサ、ベータグロビン・プロモータ、ニワトリ肉腫ウイルス末端反復配列プロモータ／エンハンサおよび伸張因子αプロモータ／エンハンサを含む。
【００１５】
本願明細書において使用するとき、「哺乳動物細胞」とは、連続的な固定に従属して、または、サスペンションで成長ができ、また、組換えタンパク質の発現を補助することができる哺乳動物細胞系を意味する。哺乳動物細胞の例には、これに制限されないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、PerC6、SP2/0、NS0、HeLa、コッカスパニエル雌犬腎臓（Madin-Darby Canine Kidney）、COS細胞、ベビーハムスター腎臓細胞およびNIH 3T3細胞が含まれる。
【００１６】
本願明細書において使用するとき、「レポーター核酸構造物」は、選択可能なマーカーを生産する核酸配列を意味する。選択可能なマーカーは、これに限定されないが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）、ネオマイシン（neo）、Genticin、ヒグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシンおよびアンピシリンを含む抗生物質耐性遺伝子、β-ガラクトシダーゼ、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼの分泌された形状、β‐グルクロニダーゼ、酵母で選択可能なマーカーleu 2-dおよびURA3、アポトーシス抵抗性遣伝子およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００１７】
「宿主細胞」は、これに限定されはないが、単離された、および／または、異種のポリヌクレオチド配列によって導入された（例えば、形質転換された、感染された、遺伝子導入された）、または、導入（例えば、形質転換、感染、遺伝子導入）が可能な、哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、または、微生物の細胞を含む細胞である。
【００１８】
「形質転換されて」または「形質転換している」は、周知のように、単離された、および／または、異種のＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ＤＮＡ‐ＲＮＡハイブリッドの導入、または、そのようなＤＮＡまたはＲＮＡの他の安定な導入による微生物のゲノムまたはエピソームの変更である。
【００１９】
「遺伝子導入されて」または「遺伝子導入している」は、周知のように、単離された、および／または、異種のＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド（これに限定されないが、組換えＤＮＡまたはＲＮＡを含む。）の宿主細胞または微生物への導入である。
【００２０】
「同一性」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのための、場合によっては、下記の（1）および（2）において設けられているアルゴリズムを使用して算出した比較を意味する。
【００２１】
（1）ポリヌクレオチドの同一性は、所与の配列のヌクレオチドの総数と１００で割られるパーセント同一性を定めている整数を乗算し、そして、その結果を前記配列のヌクレオチドの前記総数から減算することによって算出される、すなわち、
【数１】
2010514416.tif 000002
ここで、ｎｎはヌクレオチドの変更数であり、ｘnは所与の配列のヌクレオチドの総数であり、ｙは、９５％については０．９５、９７％については０．９７または１００％については１．００であり、そして、●は、ある乗算演算子のための記号であり、そして、そこにおいて、ｘnおよびｙのいかなる非整数結果も、それをｘnから減算する前に最も近い整数まで切り捨てられる。ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の変更は、このコード配列のナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を発生させることができ、そして、これによって、このような変更にしたがって、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを変更する。
【００２２】
（2）ポリペプチドの同一性は、アミノ酸の総数と１００で割ったパーセント同一性を定めている整数を乗算し、そしてその結果をアミノ酸の前記総数から減算することによって算出される、すなわち、
【数２】
2010514416.tif 000003
ここで、ｎａはアミノ酸の変更数であり、ｘａはその配列のアミノ酸の総数であり、ｙは、９５％については０．９５、９７％については０．９７または１００％については１．００であり、そして、●は、ある乗算演算子のための記号でありそして、そこにおいて、ｘａ  およびｙのいかなる非整数結果も、それをｘａ  から減算する前に最も近い整数まで切り捨てられる。
【００２３】
「異種の（異種な）」は、次を意味する；（ａ）単離によって微生物から得られて、例えば、遺伝子操作またはポリヌクレオチド転移を介して、他の微生物にもたらされる、および／または、（ｂ）自然の中に存在するそれら以外の手段によって微生物から得られ、細胞融合、誘発された交配またはトランスジェニック操作を介して、他の微生物にもたらされる。異種材料は、例えば、それが導かれる微生物または細胞と同じ種またはタイプまたは異なる種またはタイプから得られることができる。
【００２４】
「単離された」は、その本来の周囲の状況から変化された、または、取り出されている、または、その両方の、自然の状態から「人の手によって」変化された、を意味する。例えば、生体系に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ではないが、しかし、その自然の状態の共存している材料から切り離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「分離された」であり、これに限定されないが、細胞がポリヌクレオチドまたはポリペプチドが分離された細胞と同じ種またはタイプの場合であっても、そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドがその細胞に再び導入される場合を含む。
【００２５】
核酸は、それが他の核酸一次構造と機能的な関係にあるときに、「操作可能に連結され」ている。例えば、それがポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能な状態で連結される；それが配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモータまたはエンハンサはコード配列に操作可能な状態で連結される；または、それが翻訳を容易にするように配置される場合、リボソーム結合部位はコード配列に操作可能な状態で連結される。通常、「操作可能な状態で連結される」は、連結されているＤＮＡ塩基配列が隣接していること、そして、分泌リーダーの場合、隣接し、また、リーダーフェーズの中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサは、隣接する必要はない。連結は、便利な制限部位でライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００２６】
「ポリヌクレオチド」とは、変更されていないＲＮＡまたはＤＮＡまたは変更されたＲＮＡまたはＤＮＡでもよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリ・デオキシリボヌクレオチドを一般に意味する。「ポリヌクレオチド」は、一般的に、一本鎖および二本鎖のＤＮＡであって、一本鎖および二本鎖の領域または一本鎖、二本鎖および三本鎖の領域、一本鎖および二本鎖のＲＮＡの混成であるＤＮＡ、および、ＲＮＡは、一本鎖および二本鎖の領域の混成、一本鎖でもよいＤＮＡおよびＲＮＡからなるハイブリッド分子であり、さらに典型的には、二本鎖、または、三本鎖、または、一本鎖と二本鎖の領域の混成のこという。さらに、本願明細書において用いられるとき、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、または、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方のからなる三重鎖の領域をいう。そのような領域における鎖は、同一の分子または異なる分子からのものでもよい。この領域は、一つまたはそれ以上の分子の全てを含むことができるが、より典型的には、幾つかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。本願明細書において用いられるとき、「ポリヌクレオチド」という用語も、上記のように、一つ以上の修飾された塩基からなるＤＮＡまたはＲＮＡを含む。このように、その用語が本願明細書において意味されるとき、安定性または他の理由のために修正される主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、「ポリヌクレオチド」である。さらに、その用語が本願明細書において使われるとき、通常でない塩基、例えば、イノシンまたは修飾塩基、例えば、２つの例を命名するためのトリチル塩基からなるＤＮＡまたはＲＮＡは、ポリヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多くの修飾がなされていることは、明らかであろう。本願明細書において使用されるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、ウイルスおよび細胞（例えば、単純なおよび複雑な細胞を含む）に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態と同様に、このような化学的に、酵素的に、または、代謝的に修正された形態を包含する。「ポリヌクレオチド」も、しばしばオリゴヌクレオチドとして指される短いポリヌクレオチドを包含する。
【００２７】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合によってそれぞれに接続される２つ以上のアミノ酸からなるいかなるペプチドまたはタンパク質をいう。「ポリペプチド」は、一般に、ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと称される短鎖、および、一般にタンパク質と称される長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、２０の遺伝子でコードされたアミノ酸とは別のアミノ酸からなることができる。「ポリペプチド」は、自然なプロセス（例えば処理および他の翻訳後修飾）によって、しかし、化学的修飾技術によっても修飾されるものも含む。かかる修飾は、基本テキストおよび、より詳細な研究論文、ならびに膨大な研究文献にて詳しく記載されており、それらは当業者に周知である。いうまでもなく、修飾の同じタイプは、所与のポリペプチドのいくつかの部位で、同じであるか様々な程度に存在してもよい。また、所与のポリペプチドは、多くの種類の修飾からなることができる。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を包含するポリペプチドのどこでも起こり得る。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋性、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、共有結合的架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ―カルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解性処理、リン酸エステル化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質吸着、硫酸化、グルタミン酸の酸基のγ―カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボシル化、セレノイル化、硫酸化、トランスファーRNAを介したアミノ酸の蛋白質への付加、例えば、アルギニン化およびユビキチン結合を含む。例えば、PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990) および Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Aｎｎ. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992)参照。ポリペプチドは、分枝を有するまたは有さず、分岐されるか、または、環式でもよい。環式、分岐および分岐円形のポリペプチドは、翻訳後の自然な過程から生じる場合があって、同様に、完全に合成的な方法によって製造されることができる。
【００２８】
「組換え発現系」は、本発明のシステムまたはその部分、または、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産のために宿主細胞または宿主細胞溶菌液に導入（例えば、遺伝子導入、感染、形質転換）された本発明のポリヌクレオチドをいう。
【００２９】
本願明細書において使用するとき、「安定して組み込まれた」または「安定な組み込み」は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに、目的の異種核酸を組み込まれた（の組み込み）を意味し、それによって、長期の再生産可能な発現が達成される。
【００３０】
本願明細書において使われるとき、「変異体」は、それぞれ基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、基本的特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的変異体は、ヌクレオチド配列において、もう一方の基準のポリヌクレオチドと異なる。変異体のヌクレオチド配列の変更は、基準のポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドのアミノ酸配列を変える、または変えなくてもよい。後述するように、ヌクレオチドの変更は、基準配列によってコード化されるポリペプチドにおいて、アミノ酸の置換、付加、削除、融合タンパク質およびトランケーションに結果としてなる場合がある。典型的なポリペプチドの変異体は、もう一つの基準のポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。通常、基準のポリペプチドおよび変異体の配列が全体的に密接に類似および、多くの領域において同一であるように、違いは制限される。変異体および基準のポリペプチドは、一つ以上の置換、付加により、任意の組合せによって、アミノ酸配列において異なることができる。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコード化されるものであるか、または、なくてもよい。本発明は、本発明のポリペプチドのそれぞれの変異体を含み、それは、保存的なアミノ酸の置換によって基準から変化するポリペプチドであって、それによって、残基は、似た特徴を有するもう一方によって置換される。典型的なそのような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間；ＳｅｒおよびＴｈｒの間；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの間；ＡｓｎおよびＧｌｎの間；そして、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの間；または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒである。とくに、5-10、1-5、1-3、1-2または1つのアミノ酸が、任意の組合せで、置換、削除、または、付加される変異体が好ましい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、例えば、対立遺伝子変異体のような自然に発生するものでもよく、または、自然に発生することが公知でない変異体でもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非自然に生じる変異体は、突然変異誘起技術によって、直接合成によって、および、当業者に知られている他の組換え方法によってなされることができる。
【００３１】
「微生物」は、（1）これに限定されないが、以下を含む原核生物
（ａ）ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、ボルデテラ、コリネバクテリウム、マイコバクテリウム、ナイセリア、ヘモフィルス、アクチノマイセス、ストレプトマイセス、ノカルジア、エンテロバクター、エルシニア、フランシセラ、パスツレラ、モラクセラ、アシネトバクター、エリシペロトリックス、ブランハメラ、アクチノバシラス、ストレプトバシラス、リステリア、カリマトバクテリウム、ブルセラ、バシラス、クロストリジウム、トレポネーマ、エシェリキア、サルモネラ、Ｋｌｅｉｂｓｉｅｌｌａ、ビブリオ、プロテウス、エルウィニア、ボレリア、レプトスピラ、スピリルム、カンピロバクター、シゲラ、レジオネラ、シュードモナス、アエロモナス、リケッチア、クラミジア、ボレリアおよびミコプラズマの属メンバー、および、さらに、これに限定されないが、グループＡストレプトコッカス、グループＢストレプトコッカス、グループＣストレプトコッカス、グループＤストレプトコッカス、グループＧストレプトコッカス、ストレプトコッカス  ニューモニアエ、ストレプトコッカス  ピオジェネス、ストレプトコッカス  アガラクティエ、ストレプトコッカス  フェカーリス、ストレプトコッカス  フェシウム、ストレプトコッカス  デュランス、ナイセリア  ゴノロエエ、ナイセリア  メニンジティディス、スタフィロコッカス  アウレウス、スタフィロコッカス  エピデルミディス、コリネバクテリウム  ジフセリエ、ガードネレラ  バジナリス、マイコバクテリウム  ツベルクローシス、マイコバクテリウム  ボビス、マイコバクテリウム  ウルセランス、マイコバクテリウム  レプレ、アクチノマイセス  イスラエリー、リステリア  モノサイトゲネス、ボルデテラ  ペルタシス、ボルデテラ  パラパツシス、ボルデテラ  ブロンキセプチカ、エシェリシア  コリ、シゲラ  ディセンテリエ、ヘモフィルス  インフルエンザ、ヘモフィルス  エジプチウス、ヘモフィルス  パラインフルエンザ、ヘモフィルス  デユクレイイ、ボルデテラ、サルモネラ  チフィ、シトロバクター  フレウンディ、プロテウス  ミラビリス、プロテウス  ブルガリス、エルシニア・ペスチス、クレブシエラ  ニューモニエ、セラチア  マーセセンス、セラチア  リクファシエンス、ビブリオ  コレラ、シゲラ  ディセンテリ、シゲラ  フレキシネル、シュードモナス  アエルギノーザ、フランシセラ  ツラレンシス、ブルセラ  アボーティス、バシラス  アンスラシス、バシラス  セレウス、クロストリジウム  パーフリンゲンス、クロストリジウム  テタニ、クロストリジウム  ボツリナム、トレポネーマ  パリヅム、リケッチア  リケッチイおよびクラミジア トラコモナスの種またはグループのメンバー、
（ｂ）これに限定されないが、アーキアバクターを含む、アーキア属、および、
（2）単細胞または糸状の真核生物、これに限定されないが、以下のものを含む；原生動物、真菌、サッカロミセス、クルイベロマイセス、または、カンジダの属メンバー、およびサッカロミセス  セレビシエ、クルイベロマイセス  ラクティスまたはカンジダ  アルビカンスの種メンバー。
【００３２】
本願明細書において使用するとき、「１種類の異種性に発現されたポリペプチド」は、修飾されたおよび修飾されていない異種性に発現されたポリペプチドの全てを含め、宿主細胞において異種性に発現されたポリペプチドのすべての変異体を意味する。
【００３３】
本願明細書において使用するとき、「修飾された異種性に発現されたポリペプチド」は、それについて、前記ポリペプチドの少なくとも一つのアミノ酸が化学修飾からなる、いかなる異種性に発現されたポリペプチドまたはその変異体も意味する。化学修飾は、これに限定されないが、メチオニン酸化、グリコシル化、グルコノイル化、Ｎ末端グルタミン環化およびアミド分解、および、アスパラギン・アミド分解を包含してもよい。
【００３４】
本願明細書において使用するとき、「組換え抗体」は、そのすべての修飾されたおよび修飾されていない抗体および／またはその断片またはその変異体を含み、抗体のすべての変異体および／または組換え発現系から宿主細胞において発現されるその断片を意味する、組換え抗体の化学修飾は、これに限定されないが、メチオニン酸化、グリコシル化、グルコノイル化、Ｎ末端グルタミン環化およびアミド分解、および、アスパラギン・アミド分解を包含してもよい。
【００３５】
本願明細書において、「抗体」という用語は最も幅広い意味において使われ、とくにモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、マルチ特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、そして、所望の生物活性を示す範囲の抗体フラグメントを包含する。
【００３６】
抗体は、一般的に、ジスルフィド結合によって結合される２つの重鎖および２つの軽鎖からなる。各軽鎖は、ジスルフィド結合によってそれぞれの重鎖に結合される。各重鎖は、一端で多くの不変領域が続く可変領域を有する。各軽鎖は、一端で可変領域、その他端で不変領域を有する。軽鎖可変領域は、重鎖の可変領域によって整列配置される。軽鎖不変領域は、重鎖の第１の不変領域によって整列配置される。軽および重鎖の不変領域は、直接、抗体を抗原に結合することに関係していない。
【００３７】
本願明細書において使用するとき、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、例えば、可能性ある自然に生じる突然変異（それは、小さい量で存在するかもしれない）を除いて、同一の集団からなる個々の抗体をいう。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に向けられ、高度に特異的である。さらに、一般的に、異なるエピトープに向けられる異なる抗体を含むポリクロナール抗体試薬とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに向けられる。
【００３８】
「抗体フラグメント」は、完全長抗体の一部、一般には、抗原結合またはその可変領域からなる。抗体フラグメントの例は、Fab, Fab', F（ab'）2およびＦｖ断片；二重特異性抗体（diabody）；線形抗体；単鎖抗体分子および抗体フラグメントから形成されるマルチ特異性抗体を含む。
【００３９】
「抗原を結合している断片」という用語は、抗原と特異的に結合する抗体の領域をいう。
【００４０】
「免疫グロブリン単一可変領域」という言葉は、他のＶ部位または領域の抗原またはエピトープと特異的に結合する抗体可変部（例えば、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）をいう；しかしながら、その用語が本願明細書において使われるとき、免疫グロブリン単一可変領域は、他の部位または領域が単一免疫グロブリン可変領域によって抗原結合のために必要とされない可変部または可変領域と一緒の形態（例えば、ホモマルチマまたはヘテロマルチマ）に存在することがある。（すなわち、ここで、免疫グロブリン単一可変領域は、さらなる可変領域と独立して、抗原を結合する。）「免疫グロブリン単一可変領域」は、単離された抗体単一可変領域ポリペプチドだけでなく、抗体単一可変領域ポリペプチド配列の一つ以上のモノマーからなるより大きいポリペプチドも含む。その用語が本願明細書において使用されるとき、「抗体領域」または「ｄＡｂ」は「免疫グロブリン単一可変領域」ポリペプチドと同じである。本願明細書において使用されるとき、免疫グロブリン単一可変領域ポリペプチドは、哺乳類の免疫グロブリン単一可変領域ポリペプチド（ヒトでもよいが、また、齧歯動物（例えば、WO00/29004にて開示したように、それらの全部においてその内容をここに参考文献として組み入れる）またはラクダ科の動物のＶＨＨ  ｄＡｂｓを含む）をいう。ラクダ科の動物ｄＡｂｓは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含む種から誘導される免疫グロブリン単一可変領域ポリペプチドで、それは、軽鎖が自然に欠けている重鎖抗体：ＶＨＨからなる。ＶＨＨ分子は、免疫グロブリンＧ分子より約１０倍小さく、そして、単一ポリペプチドとして、それらは非常に安定であり、極度のｐＨおよび温度条件に抵抗する。
【００４１】
本願明細書において使用するとき、「生産量」は、溶液中（例えば、培養液または溶菌混合液またはバッファ）の生産物（例えば、異種性に表されたポリペプチド）の濃度を指して、mg/Lまたはg/Lとして表されることができる。生産量の増加は、定義済の２セットの条件下、生産された生産物の濃度における絶対的または相対的な増加であるということができる。
【００４２】
本願明細書において使用するとき、「収獲されている」細胞とは、細胞培養からの細胞の収集をいう。細胞は、それらを培養液から分離するために、収獲の間に濃縮されることができる（たとえば遠心または濾過によって）。収獲細胞は、細胞内材料（例えば、これに限られないが、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド）を得るために細胞を溶解させる工程をさらに含むことができる。細胞形質成分（これに限定されないが、例えば、異種性に発現されたポリペプチドを含む）は、培養の間、細胞から放出されるということは、当業者によって理解されなければならない。このように、細胞が収獲された後、目的の生産物（例えば、異種性に発現されたポリペプチド）は培養液中に維持されることができる。
【００４３】
本発明の一つの態様において、少なくとも一つの第１の核酸を少なくとも一つの細胞のゲノムに部位特異的に組み込む方法であって、
該ゲノムを第１のatt部位に連結されるレポーター核酸構造物により形質転換させ、
少なくとも一つの組み込まれたレポーター核酸構造物を有する少なくとも一つの第１の形質転換細胞を選択し、
該少なくとも一つの第１の核酸および相同組換えを媒介する酵素を該細胞に導入し、ここで該少なくとも一つの第１の核酸は、該第１のatt部位に相補的である少なくとも一つの第２のatt部位を含み、および
該少なくとも一つの第１の核酸を、少なくとも一つの安定して組み込まれた細胞を生産する該第１のatt部位に組み込むのに十分な条件下に該細胞を維持する
ことを含む、方法が提供される。
【００４４】
もう一つの態様においては、第１の核酸は、円形の構造物に存在するコード配列からなる。円形の構造物は、さらに細菌性の複製起源からなる発現カセットであることができる。第１の核酸は、プロモータである制御領域からなることもできる。当業者は、これに限定されないが、ｃｍｖ最初期プロモータ／エンハンサ、ベータグロビン・プロモータ、ニワトリ肉腫ウイルス末端反復配列プロモータ／エンハンサ、伸張因子αプロモータ／エンハンサおよび免疫グロブリン・プロモータのような従来技術において周知のさまざまなプロモータ／エンハンサ領域を理解する。プロモータは前記コード配列に操作可能な状態で連結されることができ、そして、前記コード配列は生産物をコード化する。異種性に発現された生産物の例は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む。ポリペプチドは、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の全体またはそれらの断片からなることができる。前記生産物を発現するのに十分な条件下、前記少なくとも一つの安定に組み込まれた細胞を維持することをさらに含む方法も、また提供される。前記少なくとも一つの細胞は、哺乳類の細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞または遺伝的に変異されたチャイニーズハムスター卵巣細胞）でもよい。
【００４５】
レポーター核酸構造物が選択可能なマーカーをコード化する方法も、また、提供される。そのような選択可能なマーカーは、ポジティブであるかネガティブの選択を提供する。前記選択可能なマーカーを発現すること、そして、第１および第２の形質転換細胞が同じ選択可能なマーカーを生産する選択工程の少なくとも一つの第２の形質転換細胞によって生産される選択可能なマーカーの量を有する選択工程の少なくとも一つの第１の形質転換細胞によって生産できる選択可能なマーカーの量を比較することからなる方法も、また、提供される。従来技術において理解されているように、選択可能なマーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン（neo）、ジェネティシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシンおよびアンピシリンを含む）、β-ガラクトシダーゼ、蛍光タンパク質、ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼの分泌された形態、β‐グルクロニダーゼ、酵母選択可能なマーカーleu2-dおよびＵＲＡ３、アポトーシス抵抗性遣伝子およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むが、これに限定されるものではない。また、従来技術において理解されているように、細胞は、様々な手段によってソートされることができ、これに限定されないが、選択可能なマーカーの発現を検出できる外観検査またはセルソータ、例えば、BD FACS Ariaを含む。
【００４６】
この方法の相同組換えを媒介する酵素は、前記相同組換えを媒介する酵素をコード化しているポリヌクレオチドからなる発現カセットにコード化されることができ、そこにおいて、前記発現カセットは宿主細胞に導入される。相同組換えを媒介する酵素の例は、以下からなる：λバクテリオファージ・インテグラーゼ、φＣ３１ファージ・リコンビナーゼ、ＴＰ９０１―１ファージ・リコンビナーゼ、Ｒ４ファージ・リコンビナーゼ、メガ・ヌクレアーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｃｒｅのようなリコンビナーゼ、ＦｌｐリコンビナーゼおよびＲリコンビナーゼ。
【００４７】
att部位は、これに限定されないが、野生型attB、野生型attP、偽attBおよび偽attPを含むことが従来技術において理解される。バクテリオファージは、ファージatt部位（attP）として公知のファージ染色体上の部位と細菌性att部位（attB）として公知の細菌染色体上の部位の間に、インテグラーゼ酵素によって媒介される部位特異的組換えによって宿主染色体に組み込まれる。組換事象の結果は、attＬおよびattＲとして称される２つのハイブリッドのatt部位の形成である。若干の脊椎動物のゲノムで見つかる偽att部位は、自然のatt部位に十分なホモロジを有するので、インテグラーゼによって媒介される組み換えが発生することができる。本発明の第１のatt部位は、例えば、attP組換え部位でもよく、他方、第２のatt部位は、それに相補的であり、したがって、attB組換え部位でもよい。
【００４８】
もう一つの態様においては、前記レポーター核酸構造物が、さらに、第３および第４のatt部位を含むものであり、前記第３および第４のatt部位が、前記レポーター核酸構造物に関して正しい位置に置かれ、前記レポーター核酸構造物が、前記第３および第４のatt部位を、前記ゲノムから取り除かれる導入工程の組換えを媒介する酵素に接触させることによって、前記ゲノムから取り出されるものであり、そして、前記第１のatt部位が、前記ゲノムにおいて形質転換されたままである方法が提供される。前記第４のatt部位は、attB組換え部位でもよく、前記第３のatt部位は、attP組換え部位でもよい。
【００４９】
本発明のもう一つの態様において、少なくとも一つの細胞のゲノム・ホットスポットを特定するための、次の工程からなる方法が提供される；
第１のatt部位に連結されるレポーター核酸構造物により第１および第２の細胞のゲノムを形質転換すること（ここで、前記レポートされた核酸は、前記選択可能なマーカーをコードする）；
選択可能なマーカーを発現すること、および、少なくとも一つの第２の形質転換細胞によって生産される選択可能なマーカーの量で、少なくとも一つの第１の形質転換細胞によって生産される選択可能なマーカーの量を比較すること（ここで、第１および第２の形質転換細胞が同じ選択可能なマーカーを生産する。）；そして、
少なくとも１つの組み込まれたレポーター核酸を有する少なくとも一つの第１の形質転換細胞を、前記第１および第２の形質転換細胞によって生産される選択可能なマーカーの量を比較することによって選択すること。
【００５０】
一つの態様では、選択可能なマーカーは、ポジティブまたはガティブの選択を提供する。もう一つの態様において、レポーター核酸構造物は、相同組換えを媒介する酵素がある場合には、前記第１の細胞および前記第２の細胞に形質転換される。相同組換えを媒介する酵素は、以下の群から選択されることができる：λバクテリオファージ・インテグラーゼ、ΦＣ３１ファージ・リコンビナーゼ、ＴＰ９０１―１ファージ・リコンビナーゼ、Ｒ４ファージ・リコンビナーゼ、メガ・ヌクレアーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｃｒｅ様リコンビナーゼ、ＦｌｐリコンビナーゼおよびＲリコンビナーゼ。
【００５１】
第１のatt部位は、attP組換え部位でもよい。さらに、レポーター核酸は、第２のatt部位にさらに連結されることができる。第２のatt部位は、attB組換え部位でもよい。形質転換細胞は哺乳動物細胞でもよく、これに限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞を含む。
【００５２】
さらにもう一つの態様において、レポーター核酸構造物は、さらに第３および第４のatt部位からなり、そこにおいて、前記レポーター核酸構造物に関して正しい位置に前記３および第４のatt部位が置かれ、相同組換えを媒介する酵素の存在下、前記第３および第４のatt部位を接触することにより、前記レポーター核酸構造物がゲノムから取り出され、そして、そこにおいて、前記第１のatt部位は、前記少なくとも一つの細胞のゲノムにおいて形質転換されたままである。第３のatt部位はattP組換え部位でもよく、また、第４のatt部位はattB組換え部位でもよい。レポーター核酸は、緑色蛍光タンパク質をコード化することができる。
【００５３】
以下の実施例は、さまざまな本発明の態様を例示する。これらの実施例は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限しない。
【実施例】
【００５４】
実施例１
レポーター・プラスミドＤＮＡベクターの設計および調製物。
レポーター・プラスミドは、以下の遺伝子要素によって組み立てられる：
（ａ）細菌宿主におけるプラスミド複製開始点、例えば、複製起源、および、アンピシリン抵抗性の選択可能なマーカーを要求される遺伝子要素の全てを有するpUC 19baseのプラスミド骨格；次のサブクローニング・工程を可能にするために、ポリリンカーも含まれる。
（ｂ）不安定にされた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コード配列はＣＭＶプロモータとウシ成長ホルモン・ポリＡ付加シグナル配列の間に挿入され、それによって、哺乳類宿主での発現を許容する。
（ｃ）バクテリオファージΦＣ３１インテグラーゼattB部位。
（ｄ）ネオマイシン耐性（ＮＥＯ）コード配列は、ベータグロビン・プロモータとウシ成長ホルモン・ポリＡ付加シグナル配列の間に挿入され、このことにより、哺乳類宿主での発現を許容し、そして、安定な形質転換体の選択可能なマーカーとして使用される。
【００５５】
実施例２
attBでマーカーされた形質転換部ライブラリーの構築
形質転換部ライブラリは、レポーター・プラスミドＤＮＡの10μgをＣＨＯ細胞に形質転換させることによって、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞において作成される。プラスミドＤＮＡは制限酵素処理によって線形化され、そして、切断された生産物はエタノール沈殿され、それから水１０μｌにおいて再懸濁される。ＣＨＯ細胞は、それから線形化ＤＮＡおよびカチオン脂質転移試薬によって形質転換される。
【００５６】
形質転換後、ＣＨＯ細胞は、０．５×１０６セル／ｍｌの細胞密度で播種されて、４８時間の通常の細胞増殖培養液を用いた静置培養の３７°Ｃに維持される。安定して形質転換されるＣＨＯ細胞の選択を媒介するために、４００  μｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）が、それから媒体に加えられる。培養組織は、３週間、または、抵抗するコロニーが現れ始めるまでこれらの条件で維持され、それから週２回の継代接種によって、０．５×１０６セル／ｍＬに維持される。
【００５７】
実施例３
蛍光性活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
ＦＡＣＳは、トップ０．１％の最も高いＧＦＰ発現体を単離するために用いられる。細胞の安定ＣＨＯ形質転換部ライブラリーは、分析フローサイトメータを使用している適当なゲート制御パラメータおよび選別論理ゲートを決めるために、ＧＦＰ蛍光について最初に検査される。
【００５８】
２０×１０６セルは、１ｍｌの新しい溶媒で懸濁され、生きている／死んでいる細胞の除外のためのプロピジウム・ヨウ化物によって染色される。全ての細胞集団は、死細胞および細胞対を除外するためにゲートで制御される。生きた単一細胞の蛍光は調査され、そして、ゲートは別々の管に最も明るい細胞の０.１％を仕分けするために形成される。十分な細胞が蓄積するまで、仕分けされた細胞は細胞増殖培養液において膨張し、そして、第２ラウンドのＦＡＣＳは基本的に前の通り実施されるが、しかし、今回、トップ０．１％の最も明るい細胞はフィーダー層および馴化培地で補充される媒体を含むそれぞれ９６−ウェルに仕分けされる。クローン・コロニーは、３〜４週の培養の後、発生されて、膨張して、フローサイトメトリーを用いたＧＦＰ発現について分析される。ＧＦＰ発現で最も大きなレベルを発現しているクローンは、さらなる分析のために選択される。
【００５９】
実施例４
バクテリオファージΦＣ３１インテグラーゼの変異体の設計および調製物
野生型バクテリオファージΦＣ３１インテグラーゼ翻訳領域は、Geneart, Inc.によってgenbankに寄託された配列から合成され、シャトルベクターにクローンされ、配列決定される。バクテリオファージΦＣ３１インテグラーゼの３つの異形は、以下の通りに組み立てられる：
（ａ）野生型バクテリオファージΦＣ３１インテグラーゼＤＮＡ；
（ｂ）野生型バクテリオファージΦＣ３１インテグラーゼタンパク質をコード化しているバクテリオファージΦＣ３１インテグラーゼＤＮＡを最適化するコドン；そして、
（ｃ）タンパク質のｃ−末端に付加される核移行シグナルペプチドを用いて、野生型バクテリオファージΦＣ３１インテグラーゼタンパク質をコード化しているバクテリオファージΦＣ３１インテグラーゼＤＮＡを最適化するコドン。
合成遺伝子配列は、以下の遺伝子要素を有する哺乳類の発現ベクターにクローンをつくられる：
（ａ）細菌宿主におけるプラスミド複製開始点、例えば、複製起源、および、アンピシリン抵抗性の選択可能なマーカーを要求される遺伝子要素の全てを有するpUC 19baseのプラスミド骨格；次のサブクローニング・工程を可能にするために、ポリリンカーも含まれる。
（ｂ）5’にＣＭＶプロモータが並び、3’にウシ成長ホルモン・ポリＡ付加シグナル配列が並ぶマルチクローニングサイト（それにより、哺乳類宿主の一時的発現を許容する。）
【００６０】
実施例５
誘導された組み込み型ベクターの設計および調製物
誘導された組み込みプラスミドは、以下の遺伝子要素によって組み立てられる：
（ａ）細菌宿主におけるプラスミド複製開始点、例えば、複製起源、および、アンピシリン抵抗性の選択可能なマーカーを要求される遺伝子要素の全てを有するpUC 19baseのプラスミド骨格；次のサブクローニング・工程を可能にするために、ポリリンカーも含まれる。
（ｂ）抗体の重鎖及び軽鎖コード領域からなる発現カセットであって、それぞれ5’にＣＭＶプロモータが並び、3’にウシ成長ホルモン・ポリＡ付加シグナル配列が並ぶ。
（ｃ）バクテリオファージΦＣ３１インテグラーゼattP部位。および、
（ｄ）5’にグロビン・プロモータが並び、3’にウシ成長ホルモン・ポリＡ認識部位が並ぶ、ジヒドロ葉酸還元酵素翻訳領域からなる発現カセット
【００６１】
実施例６
バクテリオファージΦＣ３１インテグラーゼ発現ベクター（実施例４を参照）および誘導された組み込み型ベクター（実施例５を参照）を用いた、attBでマーカーされた高いＧＦＰを発現するＣＨＯクローン（実施例３を参照）の同時形質転換
実施例５の生産物は、遺伝子発現の高レベルを支持する遺伝子の部位でＧＦＰによって安定して形質転換されるクローンを提供して、バクテリオファージφＣ３１インテグラーゼattB部位との遺伝子連結によって、また、マーカーされる。したがって、標的ベクターの標的とされた組み込みは、バクテリオファージΦＣ３１インテグラーゼ発現ベクター（それは、一過性にバクテリオファージΦＣ３１インテグラーゼ酵素の発現を提供する）および誘導された組み込み型ベクター（それは、前に導入された染色体attB部位に対する相補的であるattP部位を供給する）を有するそのような細胞の同時形質転換によって、その後、実施されることができる。標的とされた組み込みイベントは、それぞれのattBおよびattP部位の分子的な識別、適切なＤＮＡ鎖の切断、ＤＮＡ交差鎖交換および組換え生産物のライゲーションによって、一過性に発現されたバクテリオファージΦＣ３１インテグラーゼによって媒介される。
【００６２】
同時遺伝子導入は、最初にそれぞれ２つのプラスミドの１０μｇを線形化し、エタノール沈殿し、それぞれ10μｌの水で再懸濁し、最後に同時のカチオン脂質転移遺伝子導入により実施される。遺伝子導入の後、ＣＨＯ細胞は、０．５×１０６セル／ｍｌの細胞密度で播種されて、４８時間の通常の細胞増殖培養液を使用している静置培養で３７℃に維持される。標的ベクターの安定組み込みは、それから通常の細胞増殖培養液をヌクレオシドに欠けた細胞増殖培養液に置き換えることによって選択され、そして、それはＤＨＦＲ遺伝子の存在について選択する。培養組織はこれらの条件で、３週間、または、ＤＨＦＲのポジティブのコロニーが現れ始めるまで維持される。新生の培養組織はそれから、週２回の継代接種によって、０．５×１０６セル／ｍＬで際限なく維持される。
【００６３】
実施例７
誘導された組み込みライブラリーのスクリーニング
ＤＨＦＲのポジティブな部位から導かれる、実施例６において得られた組み込みライブラリーは、標的ベクターのランダムな組み込みを受けたクローンの大多数を含み、たぶん、（ＭＡｂ遺伝子の高レベル発現という結果になる標的とされた挿入イベントと同様に）ＭＡｂ遺伝子の低い発現という結果になることが期待される。したがって、ＭＡｂ遺伝子の高レベルを発現している所望のクローンを特定するために、スクリーニング工程が使用される。ＤＨＦＲのポジティブな部位から導かれる組み込みライブラリーは、ＭＡｂ遺伝子産物に特異的な蛍光化抗体で処理されて、洗浄され、ＦＡＣＳで分析される。表層ＭＡｂのために明るく染色される細胞は、比例して高レベルでＭＡｂを発現し、フィーダー層および馴化培地で補充される媒体を含んでいるそれぞれの９６−ウェルに仕分けされる。クローンのコロニーは、３〜４週の培養の後、発生し、膨張して、ＥＬＩＳＡを用いてＭＡｂ発現について分析される。ＭＡｂ発現で最も大きなレベルを表しているクローンは、さらなる分析のために選択される。
【００６４】
実施例８
組み込まれたＤＮＡの増幅
実施例７から得られたクローンは、ＭＡｂ遺伝子の単一コピーだけを収容している。ＤＨＦＲおよびＭＡｂ重鎖および軽鎖遺伝子の遺伝子連結のため、ＭＡｂ遺伝子発現のさらなる強化は、遺伝子の増幅によって得られることができる。選択されたクローンは、５ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）の存在下、９６ウェル培養組織に接種される。ＤＨＦＲ遺伝子の自然発生的な増幅を受けるそれらのＣＨＯ細胞だけは、ＭＴＸに抵抗し、増殖することができ、そして、コロニーを形成する。結果として生じるＭＴＸ耐性コロニーは、それから、前述の通り、ＭＡｂ生産性について選別される。
【００６５】
ＭＴＸ増幅工程は反復して適用されることができ、ＭＸＴの濃度増大を用いるそれぞれの場合において、さらなるＭＡｂの発現レベルに導く。
【００６６】
実施例９
ＣＨＯ細胞の遺伝子導入および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現についての選択
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞は、インテグラーゼΦＣ３１の最適化された異形をコード化している遺伝子からなるプラスミドの存在下または非存在下、非安定化されたＧＦＰタンパク質（ｄｓＧＦＰ、近似の半減期１〜２時間）およびネオマイシンをコード化している遺伝子からなるプラスミドによって遺伝子導入された。遺伝子導入後４８時間、安定なトランスフェクタントについて選択するジェネテシンを含む選択培地にさらされた。細胞は、ジェネテシンを含んでいる媒体で約３週間、インキュベートされ、それに続いて、フローサイトメトリを使用して、安定したトランスフェクタントの大部分の個体群は、ＧＦＰ発現について分析された。
【００６７】
個体群を分析するために、ＧＦＰ発現のさまざまな間隔のゲートが構築された。インテグラーゼΦＣ３１が認められる場合、遺伝子導入は、各ＧＦＰ間隔（表１）で、さらに３４〜７８％のＧＦＰポジティブのイベントを生じ、インテグラーゼφＣ３１がこのシステムで機能的でありことを示している
【００６８】
【表１】
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【００６９】
インテグラーゼΦＣ３１の存在下または非存在下において得られた安定トランスフェクタントの大部分の個体群は、２つの別々の個体群にBD FACS Ariaを使用して仕分けされた。それぞれ、仕分けされた個体群は、Ｐ２（明るい）およびＰ３（薄暗い）として、ＧＦＰ発現に基づく間隔ゲートによって定義された。
【００７０】
仕分けされた個体群は、育てられて、フローサイトメトリを用いたＧＦＰ発現についての分析が続く振とうフラスコに膨張された。その後、ＢＤ  ＦＡＣＳは、高いＧＦＰ発現を有する単一細胞クローンを単離するために用いられた。ＧＦＰの高レベルを発現している細胞のための仕分け基準は、間隔ゲートＰ２を使用して定められた。上記の過程から生成される単一細胞クローンは、振とうフラスコに膨張させることができた。クローンは、それからＧＦＰ発現について分析された。表２は、インテグラーゼの存在下または非存在下における遺伝子導入を介して生成されたそれぞれのクローンのために得られた生データ（各クローンのＧＦＰ発現を意味する）を表す。ΦＣ３１（ＧＦＰ発現２６６６７の平均を意味する）が存在する場合に得られたクローンの質は、ＣＨＯ細胞ゲノム（ＧＦＰ発現７５２の平均を意味する）に、ＧＦＰのランダムな組み込みによって得られたクローンと比較して、はるかに優れている。クローン個体群のイベントの９０％以上がバックグラウンド蛍光より上にある場合、クローンは「ポジティブである」と定められた。その基準に基づいて、２４中の３（１２％）のランダムなＧＦＰは、ポジティブであるとみなされる。これに対して、インテグラーゼΦＣ３１の存在下に生成されるクローンについては、２３中の１２（５２％）は、「ポジティブ」であった。
【００７１】
【表２】
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【００７２】
インテグラーゼΦＣ３１が存在する場合に得られたクローンの質は、インテグラーゼがＧＦＰプラスミドを組み込み、ＣＨＯ細胞ゲノムの範囲内で高い活性のある転写部位から発現することを導くことが可能であることを強く示唆する。対照的に、ゲノムへのＧＦＰカセットのランダムな組み込みは、多くの場合、高いＧＦＰ発現をもたらす結果にはならない。
【国際調査報告】
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