(57)【要約】Apo-B100 の発現を調節するための、Apo-B100 遺伝子に向けられた短いオリゴヌクレオチドが提供される。Apo-B100 発現の調節のため、および Apo-B100 発現に関連する疾患の処置のためにこれらの化合物を使用する方法が提供される。該オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドおよびロックされた核酸を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全部で 10-15 の核酸塩基からなり、該核酸塩基の配列が配列番号 1 に存在する連続的なサブ配列に対応し、少なくとも 2 または少なくとも 3 のヌクレオチド類縁体を含むオリゴマー化合物。
【請求項２】
核酸塩基の配列が、5' から 3' 方向へ、i) 領域 A: 一続きの 2-4 のヌクレオチド類縁体、ii) これに続く領域 B: 一続きの 6-11 のヌクレオチド (例えば DNA ヌクレオチド)、iii) これに続く領域 C: 一続きの 2-4 のヌクレオチド類縁体、および所望により iv) １または２のヌクレオチド (D) を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
12-15 核酸塩基の長さを有する、前記請求項のいずれか１に記載の化合物。
【請求項４】
12、13 または 14 核酸塩基の長さを有する、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
核酸塩基配列の核酸塩基単位間の核酸塩基間結合基が、ホスホロチオエートまたはホスホジエステル結合基のいずれかから独立に選択される、請求項 1-4 のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
ヌクレオチド類縁体が、2'-O-アルキル-RNA モノマー、2'-アミノ-DNA モノマー、2'-フルオロ-DNA モノマー、LNA モノマー、アラビノ核酸 (ANA) モノマー、2'-フルオロ-ANA モノマー、HNA モノマー、INA モノマーからなる群から独立に選択される、請求項 1-5 のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記ヌクレオチド類縁体の少なくとも１つが、ロックされた核酸 (LNA) である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
全てのヌクレオチド類縁体が LNA である、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
LNA が、ベータ-D-オキシ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNA、ベータ-D-アミノ-LNA およびベータ-D-チオ-LNA から選択される、請求項 6-8 のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
核酸塩基配列が、配列番号 5、9 または 13 からなる群から選択される、請求項 1-9 のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
配列番号 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 および 40 からなる群; および/または配列番号 41-49 からなる群から選択される、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
配列番号 16、17、26 および 34 からなる群から選択される、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
配列番号 26 である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項 1-13 のいずれか一項に記載の化合物および該化合物に共有結合した少なくとも１の非ヌクレオチドもしくは非ポリヌクレオチド部分を含む複合体。
【請求項１５】
請求項 1-13 のいずれか一項において定義される化合物または請求項 14 において定義される複合体と、医薬上許容される希釈剤、担体もしくは補助剤とを含む、医薬組成物 。
【請求項１６】
医薬としての使用のための、請求項 1-13 のいずれか一項において定義される化合物または複合体。
【請求項１７】
Apo-B100 の異常なレベルまたはこれに関連する疾患もしくは症状の処置のための医薬を製造するための、請求項 1-13 のいずれか一項において定義される化合物または請求項 14 において定義される複合体の使用。
【請求項１８】
Apo-B100 の異常なレベルまたはこれに関連する疾患もしくは症状の処置のための、請求項 1-13 のいずれか一項に記載の化合物または請求項 14 に記載の複合体を含む医薬。
【請求項１９】
前記 Apo-B100 の異常なレベルが、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症または高脂血症からなる群から選択される医学的症状の存在と関連する、請求項 17 または 18 に記載の使用または医薬。
【請求項２０】
前記請求項のいずれか一項において定義される医薬組成物または複合体を、必要としている対象に投与する工程を含む、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症および高脂血症から選択される疾患または症状に罹患している対象を処置する方法。
【請求項２１】
請求項 1-14 のいずれか一項において定義される医薬組成物または複合体を、対象、例えばアテローム性動脈硬化、高コレステロール血症または高脂血症からなる群から選択される医学的症状に罹患している対象に投与する工程を含む、アポリポタンパク質 B を下方制御する方法。
【請求項２２】
アポリポタンパク質 B (ApoB) の mRNA を下方制御するよう請求項 1-13 のいずれか一項の化合物または請求項 14 の複合体を細胞に投与する工程を含む、ApoB を発現している細胞において ApoB を下方制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、Apo-B100 の発現を調節するために提供される、Apo-B100 遺伝子に対して向けられるオリゴヌクレオチドに関する。Apo-B100 発現の調節のためおよび Apo-B100 発現に関連する疾患の処置のためにこれらの化合物を使用する方法が提供される。該オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドおよびロックされた核酸を含む。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
引用によって本明細書に取り込まれている WO2007/031081 の背景セクションを参照されたい。
【０００３】
今日まで、アポリポタンパク質 B の機能を阻害することを目指す戦略は、Lp(a) アフェレーシス、抗体、抗体断片およびリボザイムに限られている。さらに、PCT 公開公報 WO 00/97662、WO 03/11887 および WO 2004/44181 において、生物安定性(biostability)の低いおよび/または結合親和性の低いアンチセンスオリゴヌクレオチドが開示され、クレームされている。
【０００４】
結果的として、アポリポタンパク質 B の機能に効果的に拮抗し、その結果、血漿 Lp(a) レベルを低下させることができるさらなる物質に対する要求が存在し続けている。
【０００５】
本発明は、効果的なロックされた核酸 (LNA) のオリゴマー化合物、およびアポリポタンパク質 B の別のアイソフォームである ApoB-48 の阻害を含む、アポリポタンパク質 B の発現、ApB-100 を調節するための方法におけるその使用を提供する。 
【発明の概要】
【０００６】
本発明の概要
本発明は、全部で 10-15 の核酸塩基からなるオリゴマー化合物(オリゴマー)であって、前記化合物の核酸塩基配列が配列番号 1 に存在し、前記化合物が少なくとも 2 または少なくとも 3 のヌクレオチド類縁体を含む化合物を提供する。
【０００７】
本発明は、全部で 10-15 の核酸塩基からなり、該核酸塩基の配列が配列番号 1 に存在する連続的サブ配列に対応し、少なくとも 2 または少なくとも 3 のヌクレオチド類縁体を含むオリゴマー化合物を提供する。
【０００８】
本発明は、本発明の化合物および前記化合物に共有結合した少なくとも１の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含む複合体を提供する。
【０００９】
本発明は、本発明の化合物または複合体、および医薬上許容される希釈剤、担体または補助剤(adjuvant)を含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、医薬としての使用のための、本発明の化合物または複合体を提供する。
【００１１】
本発明は、Apo-B100 の異常なレベルまたはそれと関連する疾患もしくは症状の処置のための医薬を製造するための、本発明の化合物または複合体の使用を提供する。
【００１２】
本発明は、Apo-B100 の異常なレベルまたはそれと関連する疾患もしくは症状、例えば アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症または高脂血症の処置のための、本発明の化合物または本発明の複合体を含む医薬を提供する。
【００１３】
本発明は、本発明の医薬組成物または複合体または医薬を必要としている対象に投与する工程を含む、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症および高脂血症から選択される疾患または症状を患っている対象を処置する方法を提供する。
【００１４】
本発明は、本発明による医薬組成物または複合体または医薬を、対象、例えばアテローム性動脈硬化、高コレステロール血症または高脂血症からなる群から選択される医学的症状を患っている対象に投与する工程を含む、アポリポタンパク質 B を下方制御する方法を提供する。
【００１５】
本発明は、ApoB mRNA を発現している細胞においてアポリポタンパク質 B (ApoB) mRNA を下方制御する方法であって、前記 ApoB mRNA を下方制御するよう本発明の化合物を前記細胞へ投与する工程を含む方法を提供する。
【００１６】
本発明は、ApoB タンパク質を発現している細胞においてアポリポタンパク質 B (ApoB) タンパク質を下方制御する方法であって、前記 ApoB タンパク質を下方制御するよう本発明の化合物を前記細胞へ投与する工程を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
図の簡単な説明 
【図１】ハウスキーピング遺伝子 GAPDH に対して規準化された qPCR によって apoB-100 mRNA 発現を測定し、生理食塩水群に対し相対的に示した。マウス (n = 3 または 5) に 3 日連続して投与し、最後の投与後 24 時間で屠殺し、肝臓を単離して解析した。
【図２】異なる長さのオリゴを投与した後、屠殺時(3日目)における血清コレステロールレベル。
【図３】ハウスキーピング遺伝子 GAPDH に対して規準化された qPCR によって apoB-100 mRNA 発現を測定し、生理食塩水群に対し相対的に示した。マウス (n = 5) に１回投与し、投与後異なる日に屠殺し、肝臓を単離して解析した。
【図４】ABX pentra キットを用いて、屠殺時(1、3、5、6 および 8 日目)において測定した血清総コレステロール、n = 5。
【図５】ハウスキーピング遺伝子 GAPDH に対して規準化された qPCR によって apoB-100 mRNA 発現を測定し、生理食塩水群に対し相対的に示した。マウス (n = 5) に１回投与し、投与後異なる日に屠殺し、肝臓を単離して解析した。
【図６】ABX pentra キットを用いて、屠殺時(1、3、5、6、8 および 16 日目)において測定した血清総コレステロール、n = 5。
【図７】ハウスキーピング遺伝子 GAPDH に対して規準化された qPCR によって apoB-100 mRNA 発現を測定し、生理食塩水群に対し相対的に示した。マウス (n = 5) に 1 または 5 mg/kg を 3 日連続して投与し、最後の投与後 24 時間(3日目)で屠殺し、肝臓を単離して解析した。
【図８】ABX pentra キットを用いて、屠殺時(3日目)において測定した血清総コレステロール、n = 5。
【図９】1、2.5 または 5 mg/kg/用量の配列番号 26 を、A: 週に１回 (0、7、14、21、28、35、42日目) または B: ２週に１回 (0、14、28 および 42日目) 投与した後の、対照群(生理食塩水)のパーセンテージとして示される血清総コレステロール。全ての動物を、1.投与の後 49 日で屠殺する。データを平均±SDとして示す、n=7。
【図１０】超遠心分離によって血漿から分離された A) 非 HDL および B) HDL 画分中の総コレステロール。C57BL/6J マウスに配列番号 26 を週に１回、1、2.5 または 5 mg/kg で投与し、投与後１週間、次回の投与の直前に血漿をサンプリングした。データは平均±SD を示し、生理食塩水対照群に対し相対的に示される、n=5。
【図１１】超遠心分離によって血漿から分離された A) 非 HDL および B) HDL 画分中の総コレステロール。C57BL/6J マウスに配列番号 26 を２週に１回、1、2.5 または 5 mg/kg で投与し、投与後１週間または２週間で血漿をサンプリングした。データは平均±SD を示し、生理食塩水対照群に対し相対的に示される、n=5。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の詳細な説明
米国仮出願 60/896,419 および 60/977,409 は、引用により本明細書に取込まれる。
【００１９】
オリゴマー化合物
本発明は、生産される機能的タンパク質の数の減少を引き起こす、アポリポタンパク質 B (例えば Apo-B100 および/または ApoB-48) をコードする核酸分子の機能の阻害における使用のために、オリゴマー化合物、特にアンチセンス オリゴヌクレオチドを採用する。
【００２０】
本発明は、アポリポタンパク質 B (Apo-B100/Apo-B48) の発現を調節するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、アポリポタンパク質 B を標的とする特定のモチーフにわたるオリゴヌクレオチド化合物に関する。これらのモチーフは、配列番号 2-15 であり、特に配列番号 5、9 および 13 である。オリゴヌクレオチド化合物を含む LNA の特定の設計も開示する。特に好ましい化合物は、配列番号 17-40、および/または 41-49、特に配列番号 16、17、26 および 34 である。本発明の化合物は、アポリポタンパク質(apoliprotein) の mRNA およびタンパク質発現の強力な阻害剤である。
【００２１】
本明細書において用いる場合、“標的核酸”の用語は、Apo-B100 をコードする DNA、かかる DNA から転写される RNA (pre-mRNA および mRNA および mRNA 編集を含む)、およびかかる RNA から得られる cDNA をも包含する。
【００２２】
“標的タンパク質”は、哺乳類のアポリポタンパク質 B、好ましくはヒトのアポリポタンパク質 B である。ApoB-100 および ApoB-48 は両者とも同じ遺伝的配列から生じるため、本発明のオリゴマー化合物は、アポリポタンパク質 B のいずれかまたは両方の形態、ならびに ApoB-100 をコードする mRNA、および Apo-B48 をコードする RNA 編集形態の両方の下方調節のために用いられ得ると認められる。
【００２３】
本明細書において用いる場合、“遺伝子”の用語は、エキソン、イントロン、非コード 5' および 3' 領域および調節エレメントを含む遺伝子、ならびにその現在知られている全ての変異体および解明される可能性があるあらゆるさらなる変異体を意味する。
【００２４】
本明細書において用いる場合、“mRNA”の用語は、標的にされた遺伝子の現在知られている１または複数の mRNA 転写産物、および同定される可能性があるあらゆるさらなる転写産物を意味する。
【００２５】
本明細書において用いる場合、“調節”の用語は、遺伝子発現の増大(刺激)または減少(阻害)のいずれかを意味する。本発明においては、阻害が遺伝子発現調節の好ましい形態であり、mRNA が好ましい標的である。
【００２６】
本明細書において用いる場合、アンチセンス化合物を特定の標的核酸へ“標的化する”との用語は、アンチセンス化合物が目的とする標的に結合し、その機能を調節できるような方法で、アンチセンス オリゴヌクレオチドを細胞、動物またはヒトに提供することを意味する。
【００２７】
“オリゴマー”の用語と互換的である“オリゴマー化合物”、“オリゴヌクレオチド”、“オリゴ”、および“オリゴヌクレオチド化合物”の用語は、本発明において、オリゴマー、すなわち核酸ポリマー(例えばリボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)) または当該技術分野において公知のそれらの核酸類縁体、好ましくはロックされた核酸(LNA)、またはそれらの混合物をいう。この用語は、天然の核酸塩基、糖およびヌクレオシド間(骨格)結合で構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能するかまたは特定の改善された機能を持つ非天然の部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。全体にまたは部分的に改変されまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、かかるオリゴヌクレオチドのいくつかの望ましい特性、例えば、細胞膜を透過する能力、細胞外および細胞内ヌクレアーゼに対する良好な耐性、核酸標的に対する高い親和性および特異性のため、しばしば天然の形態よりも好ましい。例えば、上記の特性に関して、LNA 類縁体は特に好ましい。そのため、非常に好ましい態様において、本発明の“オリゴマー化合物”、“オリゴヌクレオチド”、“オリゴ”、“オリゴマー”、および“オリゴヌクレオチド化合物”の用語は、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類縁体単位、例えば LNA 単位の両方で構築され、10-15 の間の(連続的な)ヌクレオチド/ヌクレオチド類縁体の重合性化合物(オリゴマー)を形成する化合物である。
【００２８】
オリゴマー化合物は、好ましくは、‘アンチセンス オリゴヌクレオチド’および‘アンチセンス インヒビター’とも称されるアンチセンス オリゴマー化合物である。
【００２９】
アンチセンス インヒビターは、一本鎖のオリゴヌクレオチドである。一本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは標的核酸の対応する領域に相補的である。
【００３０】
通常、一本鎖の‘アンチセンス’オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の mRNA と特異的に相互作用し、例えば RNaseH メカニズムを介して mRNA の標的化された分解を引き起こすか、あるいは翻訳を妨げる。
【００３１】
“単位”の用語は、モノマーであると理解される。
【００３２】
本発明のオリゴマー化合物は、１または複数のアポリポタンパク質 B メッセンジャー RNA および/または哺乳類のアポリポタンパク質 B (Apo-B) DNA のセンス鎖もしくは相補鎖にハイブリダイズすることができる。NCBI 受入番号 NM_000384 は、ヒト アポリポタンパク質 B の mRNA 配列を提供する。本発明のオリゴマー化合物は、好ましい態様において、前記ヒト アポリポタンパク質由来の mRNA 核酸標的を含む、NCBI 受入番号 NM_000384 に開示される核酸、またはその逆相補によってコードされるヒト アポリポタンパク質にハイブリダイズできることが非常に好ましい。
【００３３】
“少なくとも[整数]”の用語は、該整数、例えば 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 等よりも大きいかまたはそれと等しい整数を含む。
【００３４】
興味深い態様において、本発明の化合物の 3' 末端は、ヌクレオチド類縁体ではなくヌクレオチドを含む。
【００３５】
好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸、例えば ApoB mRNA に対してハイブリダイズし、少なくとも 30℃、例えば少なくとも 37℃、例えば少なくとも 40℃、少なくとも 50℃、少なくとも 55℃、または少なくとも 60℃の Tm で二本鎖を形成することができる。一つの側面において、Tm は 37℃から80℃の間、例えば 50 から 70℃の間である。一つの側面において、Tm は 30℃から40℃の間である。
【００３６】
Tm の測定
pH 7.0 の 10 mM リン酸ナトリウム/100 mM NaCl/0.1 nM EDTA 中における化合物の 3 μM 溶液を、pH 7.0 の 10 mM リン酸ナトリウム/100 mM NaCl/0.1 nM EDTA 中における 3 μM の濃度のその相補的な DNA または RNA オリゴヌクレオチドと 90℃で１分間混合し、室温まで冷却する。次いで、25 から 95 ℃の範囲において、1℃/分の加熱速度で 260 nm における吸収を測定することによって二本鎖の融解曲線を決定する。Tm を、融解曲線の一次微分の極大として測定する。
【００３７】
一つの態様において、本発明のオリゴマー化合物は、哺乳類の ApoB をコードする DNA を標的にし得る。
【００３８】
“核酸塩基”の用語は、本明細書において用いる場合、天然ヌクレオチド、例えば DNA および RNA ヌクレオチド(単位)、およびヌクレオチド類縁体(単位)と称される非天然ヌクレオチドの両方をいう。
【００３９】
配列
本発明は、10-15 の、例えば 11-15、12-15、13-15、特に 12-14 の核酸塩基からなり、核酸塩基の配列が配列番号 1 に存在するオリゴマー化合物に向けられている。かかる配列の一覧は、表 1 に提供される。一つの態様において、配列番号 1 に存在する配列のうち好ましいグループは、配列番号 4 -15 である。
【００４０】
これらの好ましいオリゴマー化合物がそれに対して相補的である、標的中の配列モチーフ(“ホットスポット”と称される)は、標的化のために好ましい部位である。配列表中で言及されるモチーフは DNA 配列として言及される − しかし、これらは、化合物の連続的な配列において同じ配列または塩基のサブ配列を保持している他のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体をいい得ることに注意すべきである。
【００４１】
本発明は、全部で 10-15 の核酸塩基からなり、該核酸塩基の配列が配列番号 1 に存在し、少なくとも 2 または少なくとも 3 のヌクレオチド類縁体を含むオリゴマー化合物を提供する。
【００４２】
適切には、本発明のオリゴマー化合物は、長さが全部で 10-15 の核酸塩基の連続的な核酸塩基配列からなる。
【００４３】
一つの態様において、核酸塩基の配列は、配列番号 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 (モチーフ配列)、またはそれらの対応するサブ配列からなる群から選択される。
【００４４】
‘対応するサブ配列’とは、本発明のオリゴマーが配列番号 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 からなる群から選択されるそれぞれの配列よりも短いが、該オリゴマー中に存在する塩基の連続的な配列が、該それぞれの配列の中に見出される状況をいう。
【００４５】
“対応している(corresponding to)”および“対応する”の用語は、オリゴマーの核酸塩基配列(連続的な核酸塩基配列)と、i) 核酸標的、例えば ApoB 標的タンパク質をコードする mRNA の逆相補、および/または ii) 本明細書において提供されるヌクレオチドの配列、例えば配列番号 1-15 からなる群の等価な(equivalent)ヌクレオチド配列との間の比較をいう。ヌクレオチド類縁体は、その等しいまたは対応するヌクレオチドと直接に比較される。そのため、一つの態様において、“対応している”／“対応する”の用語は、本発明のオリゴマー化合物のヌクレオチドおよびヌクレオチド類縁体の組合せ配列(combined sequence)またはそのサブ配列と、アポリポタンパク質 B の核酸配列(すなわち核酸標的)の等価なヌクレオチド配列との間の比較をいう。
【００４６】
“対応するヌクレオシド/ヌクレオチド類縁体”および“対応するヌクレオシド/ヌクレオチド”の用語は、ヌクレオシド/ヌクレオチド類縁体およびヌクレオシド/ヌクレオチドにおける窒素塩基が同一であることを示すよう意図される。例えば、ヌクレオチドの 2-デオキシリボース単位がアデニンに結合している場合、“対応するヌクレオシド類縁体”は、アデニンに結合した(2-デオキシリボースと異なる)ペントース単位を含有する。
【００４７】
“核酸”の用語は、２以上のヌクレオチドの共有結合によって形成される分子として定義される。“核酸”および“ポリヌクレオチド”の用語は、本明細書において互換的に用いられる。例えば、DNA および RNA は核酸である。
【００４８】
一つの態様において、本発明の化合物は、配列番号 17、18、19、20、21、22、23、24 および 25 からなる群から選択される。
【００４９】
一つの態様において、本発明の化合物は、配列番号 26、27、28、29、30、31、32 および 33 からなる群から選択される。
【００５０】
一つの態様において、本発明の化合物は、配列番号 34、35、36、37、38、39 および 40 からなる群から選択される。
【００５１】
一つの態様において、本発明の化合物は、配列番号 16、17、26 および 34; または 17、26 および 34 からなる群から選択される。
【００５２】
一つの態様において、本発明の化合物は、配列番号 41 - 49 からなる群から選択される。
【００５３】
ギャップマー
好ましい態様において、本発明の化合物の核酸塩基配列は、5' から 3' 方向へ、i) 領域 A: 一続きの 2-4 のヌクレオチド類縁体、ii) これに続く領域 B: 一続きの 6-11 のヌクレオチド (例えば DNA ヌクレオチド)、iii) これに続く領域 C: 一続きの 2-4 のヌクレオチド類縁体、および所望により iv) １または２のヌクレオチド (D) を含むかまたはこれらから成る。
【００５４】
一つの態様において、領域 A は、1 ヌクレオチド類縁体の長さを有する。一つの態様において、領域 A は、2 ヌクレオチド類縁体の長さを有する。一つの態様において、領域 A は、3 ヌクレオチド類縁体の長さを有する。一つの態様において、領域 A は、4 ヌクレオチド類縁体の長さを有する。一つの態様において、領域 C は、1 ヌクレオチド類縁体の長さを有する。一つの態様において、領域 C は、2 ヌクレオチド類縁体の長さを有する。一つの態様において、領域 C は、3 ヌクレオチド類縁体の長さを有する。一つの態様において、領域 C は、4 ヌクレオチド類縁体の長さを有する。一つの態様において、領域 B は、7 から 10 ヌクレオチド(例えば DNA ヌクレオチド)の間、例えば 8 または 9 ヌクレオチド(例えば DNA ヌクレオチド)の長さを有する。一つの態様において、本発明の化合物は、12 から 15 核酸塩基の長さを有する。一つの態様において、本発明の化合物は、12、13 または 14 核酸塩基の長さを有する。一つの態様において、ギャップマーは、5' から 3' 方向へ、式 D-A-B-C のものでありうる。
【００５５】
ヌクレオシド間結合
一つの態様において、本発明の化合物の核酸塩基配列は、ホスフェート基、ホスホジエステル基、ホスホロチオエート基およびボラノホスフェート基からなる群から選択される核酸塩基間結合の群を含み、ヌクレオシド間結合は、-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O- であり得る。一つの態様において、ヌクレオシド間結合は、ホスフェート基および/またはホスホロチオエート基である。特定の態様においては、全てのヌクレオチドがホスホロチオエート基を含む。一つの態様において、ヌクレオチドのいくつかまたは全てが、ホスホロチオエート基によって互いに結合する。適切には、全てのヌクレオチドが、ホスホロチオエート基によって互いに結合する。
【００５６】
一つの態様において、本発明の化合物の核酸塩基配列の核酸塩基単位間の核酸塩基間結合の基は、ホスホロチオエートまたはホスホジエステル結合基のいずれかから独立に選択される。
【００５７】
一つの態様において、領域 A は、２つのヌクレオチド類縁体単位間、またはヌクレオチド類縁体単位とヌクレオチド単位との間の少なくとも１のホスホジエステル結合を含む。この文脈において、ヌクレオチド類縁体とヌクレオチド単位の間の結合基が領域 A と B の間の結合基をいうことが理解されるであろう。
【００５８】
一つの態様において、領域 C は、２つのヌクレオチド類縁体単位間、またはヌクレオチド類縁体単位とヌクレオチド単位との間の少なくとも１のホスホジエステル結合を含む。この文脈において、ヌクレオチド類縁体とヌクレオチド単位の間の結合基が領域 B と C の間の結合基をいうことが理解されるであろう。
【００５９】
一つの態様において、領域 B のヌクレオチドの間のヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエートである。一つの態様において、A の 3'ヌクレオチド類縁体と領域 B の 5'ヌクレオチドとの間の核酸塩基間結合は、ホスホロチオエートである。
【００６０】
一つの態様において、領域 B の 3'ヌクレオチドと領域 C の 5'ヌクレオチド類縁体との間の核酸塩基間結合は、ホスホロチオエートである。一つの態様において、A の 3'ヌクレオチド類縁体と領域 B の 5'ヌクレオチドとの間の核酸塩基間結合は、ホスホジエステルである。一つの態様において、領域 B の 3'ヌクレオチドと領域 C の 5'ヌクレオチド類縁体との間の核酸塩基間結合は、ホスホジエステルである。一つの態様において、領域 A の２つの 5'ヌクレオチド類縁体間の核酸塩基間結合は、ホスホジエステルである。一つの態様において、領域 C の２つの 3'ヌクレオチド類縁体間の核酸塩基間結合は、ホスホジエステルである。一つの態様において、領域 A の２つの 3'ヌクレオチド類縁体間の核酸塩基間結合は、ホスホジエステルである。一つの態様において、領域 C の２つの 5'ヌクレオチド類縁体間の核酸塩基間結合は、ホスホジエステルである。一つの態様において、領域 A は 4 ヌクレオチド類縁体の長さを有し、領域 A の中央の２つのヌクレオチド類縁体間の核酸塩基間結合は、ホスホジエステルである。一つの態様において、領域 C は 4 ヌクレオチド類縁体の長さを有し、領域 C の中央の２つのヌクレオチド類縁体間の核酸塩基間結合は、ホスホジエステルである。一つの態様において、本発明の化合物中に存在するヌクレオチド類縁体間の全ての核酸塩基間結合は、ホスホジエステルである。
【００６１】
一つの態様、例えば、適切であると称され、且つ具体的には示されていない上記の態様において、残りの全ての核酸塩基間結合はホスホジエステルまたはホスホロチオエートのいずれかであり、または別の態様においてはそれらの混合である。一つの態様において、全ての核酸塩基間結合基は、ホスホロチオエートである。
【００６２】
ヌクレオチド類縁体
本明細書において用いる場合、“ヌクレオチド類縁体”の用語は、非天然ヌクレオチドをいい、例えば一つの好ましい態様において、リボース単位が 2-デオキシリボースと異なり、および/または窒素塩基が A、C、T および G と異なり、および/またはヌクレオシド間のホスフェート結合基が異なる。ヌクレオシド類縁体の具体的な例は、例えば Freier & Altmann; Nucl. Acid Res.、1997、25、4429-4443 および Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development、2000、3(2)、293-213 によって、ならびに模式図 1 において記載される:
【化１】
2010521193.tif 000002
ホスホロチオエート(phosphorthioate)
【化２】
2010521193.tif 000003
2'-O-メチル
【化３】
2010521193.tif 000004
2'-MOE
【化４】
2010521193.tif 000005
2'-フルオロ
【化５】
2010521193.tif 000006
2'-AP
【化６】
2010521193.tif 000007
HNA
【化７】
2010521193.tif 000008
CeNA
【化８】
2010521193.tif 000009
PNA
【化９】
2010521193.tif 000010
モルホリノ
【化１０】
2010521193.tif 000011
2'-F-ANA
【化１１】
2010521193.tif 000012
2'-(3-ヒドロキシ)プロピル
【化１２】
2010521193.tif 000013
3'-ホスホロアミダート
【化１３】
2010521193.tif 000014
ボラノホスフェート
模式図 1
【００６３】
本発明のオリゴヌクレオチドにおける使用のための適切なヌクレオチド類縁体は、以下からなる群から独立に選択される: 2'-O-アルキル-RNA モノマー、2'-アミノ-DNA モノマー、2'-フルオロ-DNA モノマー、LNA モノマー、アラビノ核酸(ANA)モノマー、2'-フルオロ-ANA モノマー、HNA モノマー、INA モノマー。
【００６４】
2'-O-メトキシエチル-RNA、2'-フルオロ-DNA モノマー および LNA が好ましく、そのようなものとして本発明のオリゴヌクレオチドは、これら３つの型の類縁体から独立に選択されるヌクレオチド類縁体を含んでもよく、または該３つの型から選択される１つの型のみで構成されてもよい。最も好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、LNA ヌクレオチド類縁体およびヌクレオチド(RNA または DNA、最も好ましくは DNA ヌクレオチド)のみを含む。
【００６５】
一つの態様において、本発明の化合物内、例えば領域 A および C 内に存在するヌクレオチド類縁体は、以下からなる群から独立に選択される: 2'-O-アルキル-RNA モノマー、2'-アミノ-DNA モノマー、2'-フルオロ-DNA モノマー、LNA モノマー、アラビノ核酸(ANA)モノマー、2'-フルオロ-ANA モノマー、HNA モノマー、INA モノマー。
【００６６】
一つの態様において、ヌクレオチド類縁体は、2'-MOE-RNA (2'-O-メトキシエチル-RNA)、2'フルオロ-DNA、および LNA からなる群から独立に選択される。
【００６７】
一つの態様において、前記ヌクレオチド類縁体の少なくとも１つは、ロックされた核酸(LNA)である。
【００６８】
一つの態様において、前記ヌクレオチド類縁体の少なくとも１つは 2'-MOE-RNA であり、例えば 2、3、4、5、6、7 または 8 の 2'-MOE-RNA 核酸塩基単位である。
【００６９】
一つの態様において、前記ヌクレオチド類縁体の少なくとも１つは 2'-フルオロ DNA であり、例えば 2、3、4、5、6、7 または 8 の 2'-フルオロ-DNA 核酸塩基単位である。
【００７０】
一つの態様において、ヌクレオチド類縁体のうち 2、3、4、5、6、7 または 8 つが LNA であり、残りのヌクレオチド類縁体はいずれも、本明細書で言及したヌクレオチド類縁体の群から選択され得る。
【００７１】
本発明のオリゴマー化合物は、好ましくは少なくとも２または少なくとも３のヌクレオチド類縁体を含む。少なくとも２または少なくとも３のヌクレオチド類縁体は、好ましくはロックされた核酸ヌクレオチド類縁体(LNA)であり、かかるヌクレオチド類縁体を含むオリゴマー化合物は、本明細書において“LNA オリゴマー化合物”、“LNA オリゴヌクレオチド化合物”および“LNA オリゴヌクレオチド”と称される。
【００７２】
一つの態様において、全てのヌクレオチド類縁体は LNA である。
【００７３】
一つの態様において、全てのヌクレオチド類縁体は PNA でない。
【００７４】
一つの態様において、本発明の化合物内に存在する LNA ヌクレオチド類縁体は、ベータ-D-オキシ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNA、ベータ-D-アミノ-LNA および ベータ-D-チオ-LNA から選択される。
【００７５】
好ましくは、オリゴマー化合物、例えばアンチセンス オリゴヌクレオチドは、LNA および DNA 単位の両方を含み得る。好ましくは、LNA および DNA 単位を合わせた合計は、11、12、13 および 14 を含む 10-15 の間である。
【００７６】
一つの態様において、LNA を含む本発明のオリゴマー化合物、例えばアンチセンス オリゴヌクレオチド内における全ての LNA C 残基は、5'メチル-シトシンである。
【００７７】
ロックされた核酸 (LNA)
“LNA”の用語は、“ロックされた核酸”として知られる二環性ヌクレオチド類縁体をいう。該用語は LNA モノマーをいい得、または“LNA オリゴヌクレオチド”の文脈において用いられる場合には、１以上のかかる二環性ヌクレオチド類縁体を含有するオリゴヌクレオチドをいう。本発明のオリゴヌクレオチド化合物において用いられる LNA は、好ましくは一般式 I の構造およびその塩基性塩および酸付加塩を有する：
【化１４】
2010521193.tif 000015
[式中、X は -O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)- から選択される;
B は、水素、所望により置換された C1-4-アルコキシ、所望により置換された C1-4-アルキル、所望により置換された C1-4-アシルオキシ、天然または非天然の核酸塩基、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基(chelating group)、レポーター基、およびリガンド(ligand)から選択される;
P は、後に続くモノマーまたは 5'-末端基とのヌクレオシド間結合のためのラジカルの位置を示し、かかるヌクレオシド間結合または 5'-末端基は所望により、置換基 R5 または等しく適用できる(equally applicable)置換基 R5* を含む;
P* は、先行するモノマーまたは 3'-末端基とのヌクレオシド間結合を示す;
R4* および R2* は共に、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、および >C=Z から選択される 1-4 の基/原子からなるビラジカルを示し、
ここで、Z は O、S、および N(Ra)から選択され、
Ra および Rb は各々独立して水素、所望により置換された C1-12-アルキル、所望により置換された C2-12-アルケニル、所望により置換された C2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、シクロアルキル、シクロアルキルオキシ-カルボニル、シクロアルキルオキシ、シクロアルキルカルボニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルオキシ-カルボニル、ヘテロシクロアルキルオキシ、ヘテロシクロアルキルカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ、トリス(C1-6-アルキル)アンモニウム、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド(carbamido)、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基およびリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは所望により置換されてもよく、２つのジェミナルな置換基 Ra および Rb は共に、所望により置換されたメチレン(=CH2)を示し得るか、または共に所望により -O-、-S- および -(NRN)- から選択される１以上のヘテロ原子/基によって分断され(interrupted)および/または終結させられる(terminated) 1-5 炭素原子のアルキレン鎖からなるスピロ ビラジカルを形成し得、ここで RN は水素および C1-4-アルキルから選択され、そして、
置換基 R1*、R2、R3、R5、R5*、R6 および R6* の各々は、水素、所望により置換された C1-12-アルキル、所望により置換された C2-12-アルケニル、所望により置換された C2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、シクロアルキル、シクロアルキルオキシ-カルボニル、シクロアルキルオキシ、シクロアルキルカルボニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルオキシ-カルボニル、ヘテロシクロアルキルオキシ、ヘテロシクロアルキルカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド(carbamido)、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基およびリガンドから独立に選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは所望により置換されてもよく、２つのジェミナルな置換基は共に、オキソ、チオキソ、イミノまたは所望により置換されたメチレンを示し得るか、または共に所望により -O-、-S- および -(NRN)- から選択される１以上のヘテロ原子/基によって分断されおよび/または終結させられる 1-5 炭素原子のアルキレン鎖からなるスピロ ビラジカルを形成し得、ここで、RN は水素および C1-4-アルキルから選択され、２つの隣接した(ジェミナルでない)置換基は二重結合をもたらすさらなる結合を示し得; RN* は、それが存在し、かつビラジカルに含まれない場合には、水素および C1-4-アルキルから選択される;]
【００７８】
一つの態様において、R5* は H、-CH3、-CH2-CH3、-CH2-O-CH3 および -CH=CH2 から選択される。
【００７９】
一つの態様において、R4* および R2* は共に、-C(RaRb)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、-C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-N(Rc)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-、-C(RaRb)-N(Rc)-O-、および -C(RaRb)-S-、-C(RaRb)-C(RcRd)-S- から選択されるビラジカルを示し、ここで、Ra、Rb、Rc、Rd、Re および Rf は各々、水素、所望により置換された C1-12-アルキル、所望により置換された C2-12-アルケニル、所望により置換された C2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、シクロアルキル、シクロアルキルオキシ-カルボニル、シクロアルキルオキシ、シクロアルキルカルボニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルオキシ-カルボニル、ヘテロシクロアルキルオキシ、ヘテロシクロアルキルカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド(carbamido)、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNA インターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基およびリガンドから独立に選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは所望により置換されてもよく、２つのジェミナルな置換基は共に、所望により置換されたメチレン(=CH2)を示し得るか、または共に所望により -O-、-S-、および -(NRN)- から選択される１以上のヘテロ原子/基によって分断されおよび/または終結させられる 1-5 炭素原子のアルキレン鎖からなるスピロ ビラジカルを形成し得、ここで、RN は水素および C1-4-アルキルから選択される。
【００８０】
さらなる態様において、R4* および R2* は共に、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、-CH2-N(CH3)-、-CH2-CH2-O-、-CH2-CH(CH3)-、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH(CH3)-、-CH=CH-CH2-、-CH2-O-CH2-O-、-CH2-NH-O-、-CH2-N(CH3)-O-、-CH2-O-CH2-、-CH(CH3)-O-、-CH(CH2-O-CH3)-O-から選択されるビラジカルを示す。
【００８１】
全てのキラル中心は、R または S のいずれかの配向で見出され得る。
【００８２】
好ましくは、本発明のオリゴマーにおいて用いられる LNA は、少なくとも１つの、以下の式のいずれかの LNA 単位を含む：
【化１５】
2010521193.tif 000016
【化１６】
2010521193.tif 000017
【化１７】
2010521193.tif 000018
[式中、Y は -O-、-S-、-NH- または N(RH)である; Z および Z* は独立に、ヌクレオシド間結合、末端基または保護基から選択される; B は、天然または非天然のヌクレオチド塩基部分を構成し、RH は、水素および C1-4-アルキルから選択される。]
【００８３】
“チオ-LNA”の用語は、上記の式における Y が S を表すロックされたヌクレオチドを含む。チオ-LNA は、ベータ-D および アルファ-L の両方の立体配置であり得る。
【００８４】
“アミノ-LNA”の用語は、上記の式における Y が -N(H)-、および N(RH)- から選択され、RH が水素および C1-4-アルキルから選択される、ロックされたヌクレオチドを含む。アミノ-LNA は、ベータ-D および アルファ-L の両方の立体配置であり得る。
【００８５】
“オキシ-LNA”の用語は、上記の式における Y が -O- を表すロックされたヌクレオチドを含む。オキシ-LNA は、ベータ-D および アルファ-L の両方の立体配置であり得る。
【００８６】
“ENA”の用語は、上記の式における Y が -CH2-O- (ここで -CH2-O- の酸素原子は、塩基 B に対して 2'位に結合する)であるロックされたヌクレオチドを含む。ENA は、ベータ-D および アルファ-L の両方の立体配置であり得る。
【００８７】
好ましい態様において、LNA はベータ-D-オキシ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNA、ベータ-D-アミノ-LNA およびベータ-D-チオ-LNA から選択され、特にベータ-D-オキシ-LNA である。
【００８８】
特に好ましい LNA 単位を、模式図 2 に示す:
【化１８】
2010521193.tif 000019
β-D-オキシ-LNA
【化１９】
2010521193.tif 000020
α-L-オキシ-LNA
【化２０】
2010521193.tif 000021
β-D-チオ-LNA
【化２１】
2010521193.tif 000022
β-D-ENA
【化２２】
2010521193.tif 000023
β-D-アミノ-LNA
模式図 2
【００８９】
一つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物において用いられるロックされた核酸(LNA)は、下記の一般式の構造を有する:
【化２３】
2010521193.tif 000024
X および Y は、-O-、-S-、-N(H)-、N(R)-、-CH2- もしくは -CH- (二重結合の一部である場合)、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-、-CH2-CH2- もしくは -CH2-CH- (二重結合の一部である場合)、-CH=CH- の基から独立に選択され、ここで R は水素および C1-4-アルキルから選択される; Z および Z* は、ヌクレオシド間結合、末端基または保護基から独立に選択される; B は、天然または非天然の核酸塩基を構成する; そして不斉基は、いずれかの配向において見出され得る。
【００９０】
LNA ヌクレオチド類縁体の構成要素(例えば β-D-オキシ-LNA、β-D-チオ-LNA、β-D-アミノ-LNA および α-L-オキシ-LNA)は、確立され公開された手順に従って調製することができる − 例えば、引用により本明細書に取込まれている WO2007/031081 を参照されたい。
【００９１】
好ましくは、本発明のオリゴマーにおいて用いられる LNA は、-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O- から選択されるヌクレオシド間結合を含み、ここで RH は水素および C1-4-アルキルから選択される。
【００９２】
本明細書において用いる場合、“DNA インターカレーター”の用語は、DNA もしくは RNA のらせん、二重鎖または三重鎖の間に介入することができる基を意味する。(DNA インターカレーターの機能的部分の例は、アクリジン、アントラセン、キノン、例えばアントラキノン、インドール、キノリン、イソキノリン、ジヒドロキノン、アントラサイクリン、テトラサイクリン、メチレンブルー、アントラサイクリノン(anthracyclinone)、ソラレン、クマリン、エチジウムハライド、ダイネマイシン(dynemicin)、金属錯体、例えば 1,10-フェナントロリン-銅、トリス(4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン)ルテニウム-コバルト-エンジイン、例えばカリチアマイシン(calcheamicin)、ポルフィリン、ジスタマイシン、ネトロプシン(netropcin)、ビオロゲン、ダウノマイシンである。) 特に興味深い例は、アクリジン、キノン、例えばアントラキノン、メチレンブルー、ソラレン、クマリン、およびエチジウムハライドである。
【００９３】
本明細書において、“光化学的に活性な基”の用語は、光の照射を受けると化学反応を起こすことができる化合物を包含する。この官能基の具体例は、キノン、特に 6-メチル-1,4-ナフト(naphto)キノン、アントラキノン、ナフトキノンおよび 1,4-ジメチル-アントラキノン、ジアジリン、芳香族アジド、ベンゾフェノン、ソラレン、ジアゾ化合物、ならびにジアジリノ化合物である。
【００９４】
本明細書において、“熱化学的に反応性の基”は、他の基と熱化学的に誘導される共有結合形成を起こすことができる官能基として定義される。熱化学的に反応性の基の機能的部分の具体例は、カルボン酸、カルボン酸エステル、例えば活性化エステル、カルボン酸ハライド、例えば酸フルオライド、酸クロライド、酸ブロマイドおよび酸ヨーダイド、カルボン酸アジド、カルボン酸ヒドラジド、スルホン酸、スルホン酸エステル、スルホン酸ハライド、セミカルバジド、チオセミカルバジド、アルデヒド、ケトン、一級アルコール、二級アルコール、三級アルコール、フェノール、アルキルハライド、チオール、ジスルフィド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、ヒドラジン、エポキシド、マレイミドならびにボロン酸誘導体である。
【００９５】
本明細書において、“キレート基”の用語は、１より多い結合部位を含み、同時に１より多い結合部位を介して別の分子、原子またはイオンに高頻度で結合する分子を意味する。キレート基の機能的部分の例は、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、アミノホスホン酸、等である。
【００９６】
本明細書において、“レポーター基”の用語は、それ自体でまたは検出系(detection series)の一部として検出可能な基を意味する。レポーター基の機能的部分の例は、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光性の基(電磁放射、例えば特定の波長の光またはX線を吸収することができ、その後、吸収されたエネルギーをより長い波長の放射として再放出する基; 具体例は、ダンシル(5-ジメチルアミノ)-1-ナフタレンスルホニル)、ドキシル(DOXYL)(N-オキシl-4,4-ジメチルオキサゾリジン)、プロキシル(PROXYL)(N-オキシル-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン)、テンポ(TEMPO)(N-オキシル-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン)、ジニトロフェニル、アクリジン、クマリン、Cy3 および Cy5 (Biological Detection Systems、Inc. の商標)、エリスロシン(erytrosine)、クマル酸、ウンベリフェロン、テキサスレッド(Texas Red)、ローダミン、テトラメチルローダミン、Rox、7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1-ジアゾール(NBD)、ピレン、フルオレセイン、ユーロピウム、ルテニウム、サマリウム、および他の希土類金属である)、放射性同位元素標識、化学発光標識(化学反応中の光の放出を介して検出可能な標識)、スピン標識(生物学的分子に結合した、電子スピン共鳴分光法の使用によって検出可能なフリーラジカル(例えば置換された有機ニトロキシド)または他の常磁性プローブ(例えば Cu2+、Mg2+))、酵素(例えばペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼ)、抗原、抗体、ハプテン(抗体と結合することができるが、それ自身では免疫応答を惹起することができない基、例えばペプチドおよびステロイドホルモン)、例えば以下のような、細胞膜貫通のための輸送系: 脂肪酸残基、ステロイド部分(コレステロール)、ビタミン A、ビタミン D、ビタミン E、葉酸、特定の受容体に対するペプチド、飲食作用を媒介する基、上皮増殖因子(EGF)、ブラジキニン、ならびに 血小板由来増殖因子(PDGF)である。特に興味深い例は、ビオチン、フルオレセイン、テキサスレッド(Texas Red)、ローダミン、ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ルテニウム、ユーロピウム、Cy5 および Cy3 である。
【００９７】
本明細書において、“リガンド”とは、結合するものを意味する。リガンドは、例えば以下の官能基: 芳香族基 (例えばベンゼン、ピリジン、ナフタレン(naphtalene)、アントラセン、およびフェナントレン)、ヘテロ芳香族基 (例えばチオフェン、フラン、テトラヒドロフラン、ピリジン、ジオキサン、およびピリミジン)、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸ハライド、カルボン酸アジド、カルボン酸ヒドラジド、スルホン酸、スルホン酸エステル、スルホン酸ハライド、セミカルバジド、チオセミカルバジド、アルデヒド、ケトン、一級アルコール、二級アルコール、三級アルコール、フェノール、アルキルハライド、チオール、ジスルフィド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、ヒドラジン、エポキシド、マレイミド、所望により１以上のヘテロ原子、例えば酸素原子、窒素原子、および/または硫黄原子で分断されまたは終結させられた C1-C20 アルキル基を包含し得、所望により芳香族または一不飽和/多価不飽和の炭化水素、ポリオキシエチレン、例えばポリエチレングリコール、オリゴ/ポリアミド、例えばポリ-β-アラニン、ポリグリシン、ポリリジン、ペプチド、オリゴ糖/多糖、オリゴ/ポリリン酸、毒素、抗生物質、細胞毒およびステロイドを含み、“親和性リガンド”、すなわち特定のタンパク質、抗体、多糖およびオリゴ糖ならびに他の生体分子上の部位に対して特異的な親和性を有する官能基または生体分子をも包含し得る。
【００９８】
複合体
本発明はまた、本発明の化合物および該化合物に共有結合した少なくとも１の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含む複合体を提供する。引用により本明細書に取り込まれている PCT/DK2006/000512 は、適切なリガンドおよび複合体を提供する。
【００９９】
本発明の一つの態様において、オリゴヌクレオチドは、例えばオリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを増大させるために用いられ得るリガンド/複合体に結合し得る。この結合は末端の位置 5'/3'-OH において起こり得るが、リガンドは糖および/または塩基においても起こり得る。3'-OH は、コレステロール結合に好ましい部位である。
【０１００】
好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、生体内での取り込みを改善(improvise)する部分、例えばコレステロールと結合する。
【０１０１】
したがって、オリゴマー化合物は、オリゴマー化合物が二量体のまたは樹状の構造に配列され得るように、例えば、ペプチド核酸(PNA)、タンパク質(例えば標的タンパク質に対する抗体)、巨大分子、低分子量の原薬(drug substance)、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー(例えばポリエチレングリコール)、ミセルを形成する基、抗体、炭水化物、受容体に結合する基、ステロイド、例えばコレステロール、ポリペプチド、インターカレート剤、例えばアクリジン誘導体、長鎖アルコール、デンドリマー、リン脂質および他の親油性の基またはそれらの組み合わせ等を含む非ヌクレオチドもしくは非ポリヌクレオチド部分と結合し得るかまたはキメラを形成し得る。
【０１０２】
複合体に関する一つの態様において、非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分は、ステロール基、例えばコレステロールからなるかまたはこれを含む。
【０１０３】
他のかかる非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分は、これらに限定されないが、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル-s-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール(dodecandiol)もしくはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム 1,2-ジ-o-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-h-ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分を含む。
【０１０４】
本発明のオリゴマーはまた、活性な原薬、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤または抗生物質に結合し得る。
【０１０５】
医薬組成物
本発明はさらに、本発明の化合物もしくは本発明の複合体および医薬上許容される希釈剤、担体もしくは補助剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１０６】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物を含む医薬組成物および他の組成物が、本発明によって提供される。
【０１０７】
医薬組成物は、一つの態様において、少なくとも１のコレステロールを低下させる化合物をさらに含み得る。
【０１０８】
適切なコレステロールを低下させる化合物は、胆汁酸塩捕捉樹脂 (例えばコレスチラミン、コレスチポール、およびコレセベラム塩酸塩)、HMGCoA-レダクターゼ インヒビター (例えばロバスタチン、セリバスタチン、プラバスタチン(prevastatin)、アトルバスタチン、シンバスタチン、およびフルバスタチン)、ニコチン酸、フィブリン酸誘導体 (例えばクロフィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、ベザフィブラート、およびシプロフィブラート)、プロブコール、ネオマイシン、デキストロチロキシン、植物スタノール エステル、コレステロール吸収阻害剤 (例えば、エゼチミブ)、インプリタピド、胆汁酸トランスポーター(頂端(apical)ナトリウム依存性胆汁酸トランスポーター)の阻害剤、肝臓 CYP7a のレギュレーター、エストロゲン補充療法剤 (例えば、タモキシフェン)、および抗炎症剤(例えば、グルココルチコイド)からなる群から選択され得る。スタチンとの組み合わせが、特に好ましい。
【０１０９】
スタチンの例は、アトルバスタチンTM、セリバスタチンTM、フルバスタチンTM、ロバスタチンTM、メバスタチンTM、ピタバスタチンTM、プラバスタチンTM、ロスバスタチンTM、およびシンバスタチンTM を含む。
【０１１０】
本発明の化合物とスタチンの併用は、スタチン投与量の低減を可能にし得、その結果、例えば筋肉痛、筋けいれん、消化管症状、肝酵素の異常(derangement)、筋炎、ミオパシー、筋肉崩壊の産物が腎臓にダメージを与える場合に急性腎不全を引き起こし得る横紋筋融解症(骨格筋の病的崩壊)を含む、通常の用量のスタチンに伴う副作用を克服し得る。
【０１１１】
両親媒性カルボン酸のクラスであるフィブラートは、スタチンとフィブラート(fribrate)の併用に関して報告されている横紋筋融解症の頻度の増大にもかかわらず、スタチンの使用としばしば組み合わされる化合物の代替となるクラスである。そのため、本発明の組成物は、フィブラート(firbrate)をさらに含んでもよく、所望によりスタチンを含んでもよい。
【０１１２】
別の態様において、本発明の組成物は、第１の核酸を標的とする１以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第２の核酸標的を標的とする１以上のさらなるアンチセンス化合物を含有し得る。
【０１１３】
本発明の方法において、２以上の組み合わされた化合物(combined compound)が、一緒にまたは逐次的に用いられ得る。
【０１１４】
本発明はまた、本発明のオリゴマー化合物と、血清コレステロールレベルを調節することができるさらなる化合物、例えば PCSK9 モジュレーター、特に PCSK9 の核酸標的を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド(オリゴマー) − 例えば、引用により本明細書に取り込まれている PCT/EP2007/060703 に開示されるものとを含む医薬組成物を提供する。
【０１１５】
本発明はまた、本発明のオリゴマー化合物と、血清コレステロールレベルを調節することができるさらなる化合物、例えば FABP4 モジュレーター、特に FABP4 の核酸標的を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド(オリゴマー) − 例えば、引用により本明細書に取り込まれている米国仮出願第60/969,016号に開示されるものとを含む医薬組成物を提供する。
【０１１６】
適用
細胞または組織を１以上の本発明のオリゴヌクレオチド化合物または組成物と接触させることを含む、細胞または組織におけるアポリポタンパク質 B の発現を調節する方法がさらに提供される。治療上または予防上有効な量の１以上の本発明のオリゴヌクレオチド化合物または組成物を投与することによって、アポリポタンパク質 B の発現に関連する疾患もしくは症状を有するかまたはこれに罹りやすいと疑われる動物またはヒトを処置する方法も開示される。さらに、アポリポタンパク質 B の発現の阻害のため、およびアポリポタンパク質 B の活性に関連する疾患の処置のためにオリゴヌクレオチド化合物を使用する方法が提供される。かかる疾患の例は、様々な型の HDL/LDL コレステロール不均衡; 脂質異常症、例えば家族性混合型高脂血症(FCHL)、後天性高脂血症、高コレステロール血症(hypercholestorolemia); スタチン抵抗性高コレステロール血症; 冠動脈疾患(CAD)、冠動脈心疾患(CHD)、アテローム性動脈硬化である。
【０１１７】
本発明は、Apo-B100 の異常なレベルまたはこれに関連する疾患もしくは症状の処置のための医薬を製造するための、本明細書で定義される化合物または複合体の使用をさらに提供する。
【０１１８】
本発明は、Apo-B100 の異常なレベルまたはこれに関連する疾患もしくは症状の処置のための、本発明の化合物または複合体を含む医薬をさらに提供する。
【０１１９】
一つの態様において、Apo-B100 の異常なレベルに関連する疾患および症状は、以下からなる群から選択され得る: アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症または高脂血症。
【０１２０】
本発明は、本明細書で定義される医薬組成物または複合体を、必要としている対象に投与する工程を含む、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症および高脂血症から選択される疾患もしくは症状に罹患している対象を処置する方法をさらに提供する。
【０１２１】
本発明は、本明細書で定義される医薬組成物または複合体を、対象、例えばアテローム性動脈硬化、高コレステロール血症または高脂血症からなる群から選択される医学的症状に罹患している対象に投与する工程を含む、アポリポタンパク質 B を下方制御する方法をさらに提供する。
【０１２２】
塩
オリゴマー化合物は、様々な医薬上許容される塩の状態で採用され得る。本明細書において用いる場合、該用語は、LNA オリゴヌクレオチドの所望の生物学的活性を保持し、最小の望ましくない中毒作用しか示さない塩をいう。かかる塩の非限定的な例は、有機アミノ酸と共に形成され得、金属カチオン、例えば亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウム等と共に、またはアンモニア、N,N-ジベンジルエチレン-ジアミン、D-グルコサミン、テトラエチルアンモニウムもしくはエチレンジアミンから形成されるカチオンと共に形成される塩基付加塩; または組み合わせ、例えばタンニン酸亜鉛塩等であり得る。
【０１２３】
かかる塩は、ホスホジエステル(phosphorodiester)基および/またはホスホロチオエート基を有するオリゴマー化合物から形成され、例えば、適切な塩基との塩である。これらの塩は、例えば、元素の周期律表の Ia、Ib、IIa および IIb 族 の金属から得られる無毒性の金属塩、特に、適切なアルカリ金属塩、例えばリチウム、ナトリウムもしくはカリウム塩、またはアルカリ土類金属塩、例えばマグネシウムもしくはカルシウム塩を含む。それらは、亜鉛およびアンモニウム塩をさらに含み、適切な有機アミン、例えば非置換またはヒドロキシル置換のモノ-、ジ-もしくはトリ-アルキルアミン、特にモノ-、ジ-もしくはトリ-アルキルアミンと共に、または四級アンモニウム化合物と共に、例えば N-メチル-N-エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、モノ-、ビス-もしくはトリス-(2-ヒドロキシ-低級アルキル)アミン、例えばモノ-、ビス-もしくはトリス-(2-ヒドロキシエチル)アミン、2-ヒドロキシ-tert-ブチルアミンまたはトリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン、N,N-ジ-低級アルキル-N-(ヒドロキシ-低級アルキル)アミン、例えば N,N-ジメチル-N-(2-ヒドロキシエチル)アミンまたはトリ-(2-ヒドロキシエチル)アミン、または N-メチル-D-グルカミン、または四級アンモニウム化合物と共に形成される塩、例えばテトラブチルアンモニウム塩をも含む。リチウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩またはカリウム塩が好ましく、ナトリウム塩が特に好ましい。
【０１２４】
プロドラッグ
一つの態様において、LNA オリゴヌクレオチドは、プロドラッグの形態であり得る。オリゴヌクレオチドはその性質上(by virtue)負に帯電したイオンである。細胞膜の親油性の性質のため、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みは、中性のまたは親油性の対応物(equivalent)に比べて少ない。この極性“障害(hindrance)”は、プロドラッグのアプローチを用いることによって回避できる(例えば Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140 を参照)。このアプローチにおいて、オリゴマー化合物は、投与される時にオリゴマー化合物が中性であるよう、保護される方法で調製される。これらの保護基は、 LNA オリゴヌクレオチドが細胞に取り込まれる時に除去され得るように設計される。かかる保護基の例は、S-アセチルチオエチル(SATE) または S-ピバロイルチオエチル(t-ブチル-SATE)である。これらの保護基はヌクレアーゼ耐性であり、細胞内で選択的に除去される。
【０１２５】
本発明の態様
以下の態様は、本明細書で言及される本発明の特徴と組み合わせることができる:
【０１２６】
1. 全部で 10-15 の核酸塩基からなり、該核酸塩基配列が配列番号 1 に存在し、少なくとも 2 または少なくとも 3 のヌクレオチド類縁体を含むオリゴマー化合物。
【０１２７】
2. 核酸塩基配列が、5'から 3'方向へ、i) 領域 A: 一続きの 2-4 のヌクレオチド類縁体、ii) これに続く領域 B: 一続きの 6-11 のヌクレオチド (例えば DNA ヌクレオチド)、iii) これに続く領域 C: 一続きの 2-4 のヌクレオチド類縁体、および所望により iv) １または２のヌクレオチド (D) を含む、態様 1 の化合物。
【０１２８】
3. 領域 A が、2 ヌクレオチド類縁体の長さを有する、態様 2 の化合物。
【０１２９】
4. 領域 A が、3 ヌクレオチド類縁体の長さを有する、態様 2 の化合物。
【０１３０】
5. 領域 A が、4 ヌクレオチド類縁体の長さを有する、態様 2 の化合物。
【０１３１】
6. 領域 C が、2 ヌクレオチド類縁体の長さを有する、態様 2-5 のいずれかの化合物。
【０１３２】
7. 領域 C が、3 ヌクレオチド類縁体の長さを有する、態様 2-5 のいずれかの化合物。
【０１３３】
8. 領域 C が、4 ヌクレオチド類縁体の長さを有する、態様 2-5 のいずれかの化合物。
【０１３４】
9. 領域 B が、7 から 10 ヌクレオチド(例えば DNA ヌクレオチド)の間、例えば 8 または 9 ヌクレオチド(例えば DNA ヌクレオチド)の長さを有する、態様 2-8 のいずれかの化合物。
【０１３５】
10. 12 から 15 核酸塩基の長さを有する、前記の態様のいずれかの化合物。
【０１３６】
11. 12、13 または 14 核酸塩基の長さを有する、態様 10 の化合物。
【０１３７】
12. 前記核酸塩基配列がホスフェート基、ホスホジエステル基、ホスホロチオエート基およびボラノホスフェート基からなる群から選択される核酸塩基間結合基を含み、該ヌクレオシド間結合が -O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O- であり得る、前記の態様のいずれかの化合物。
【０１３８】
13. 核酸塩基配列の核酸塩基単位間の核酸塩基間結合基が、ホスホロチオエートまたはホスホジエステル結合基のいずれかから独立に選択される、態様 1-12 のいずれかの化合物。
【０１３９】
14. 領域 A が、２つのヌクレオチド類縁体単位間、またはヌクレオチド 類縁体単位とヌクレオチド単位との間の少なくとも１のホスホジエステル結合を含む、態様 12 または 13 の化合物。
【０１４０】
15. 領域 C が、２つのヌクレオチド類縁体単位間、またはヌクレオチド類縁体単位とヌクレオチド単位との間の少なくとも１のホスホジエステル結合を含む、態様 12-14 のいずれかの化合物。
【０１４１】
16. 領域 B のヌクレオチドの間のヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエートである、態様 12-15 のいずれかの化合物。
【０１４２】
17. A の 3'ヌクレオチド類縁体と領域 B の 5'ヌクレオチドとの間の核酸塩基間結合が、ホスホロチオエートである、態様 12-16 のいずれかの化合物。
【０１４３】
18. 領域 B の3'ヌクレオチドと領域 C の 5'ヌクレオチド類縁体との間の核酸塩基間結合が、ホスホロチオエートである、態様 12-17 のいずれかの化合物。
【０１４４】
19. A の 3'ヌクレオチド類縁体と領域 B の 5'ヌクレオチドとの間の核酸塩基間結合が、ホスホジエステルである、態様 10-16 および 18 のいずれかの化合物。
【０１４５】
20. 領域 B の 3'ヌクレオチドと領域 C の 5'ヌクレオチド類縁体との間の核酸塩基間結合が、ホスホジエステルである、態様 10-17 および 19 のいずれかの化合物。
【０１４６】
21. 領域 A の２つの 5'ヌクレオチド類縁体間の核酸塩基間結合が、ホスホジエステルである、態様 12-20 のいずれかの化合物。
【０１４７】
22. 領域 C の２つの 3'ヌクレオチド類縁体間の核酸塩基間結合が、ホスホジエステルである、態様 12-21 のいずれかの化合物。
【０１４８】
23. 領域 A の２つの 3'ヌクレオチド類縁体間の核酸塩基間結合が、ホスホジエステルである、態様 12-22 のいずれかの化合物。
【０１４９】
24. 領域 C の２つの 5'ヌクレオチド類縁体間の核酸塩基間結合が、ホスホジエステルである、態様 12-23 のいずれかの化合物。
【０１５０】
25. 領域 A が 4 ヌクレオチド類縁体の長さを有し、領域 A の中央の２つのヌクレオチド類縁体間の核酸塩基間結合がホスホジエステルである、態様 12-24 のいずれかの化合物。
【０１５１】
26. 領域 C が 4 ヌクレオチド類縁体の長さを有し、領域 C の中央の２つのヌクレオチド類縁体間の核酸塩基間結合がホスホジエステルである、態様 12-25 のいずれかの化合物。
【０１５２】
27. ヌクレオチド類縁体間の全ての核酸塩基間結合がホスホジエステルである、態様 10-26 のいずれかの化合物。
【０１５３】
28. 残りの全ての核酸塩基間結合が、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートのいずれかである、態様 10-27 のいずれかの化合物。
【０１５４】
29. 全ての核酸塩基間結合基がホスホロチオエートである、態様 12 の化合物。
【０１５５】
30. ヌクレオチド類縁体が、以下からなる群から独立に選択される、態様 1-29 のいずれかの化合物: 2'-O-アルキル-RNA モノマー、2'-アミノ-DNA モノマー、2'-フルオロ-DNA モノマー、LNA モノマー、アラビノ核酸(ANA)モノマー(mononmer)、2'-フルオロ-ANA モノマー、HNA モノマー、INA モノマー。
【０１５６】
31. ヌクレオチド類縁体が、2'-MOE-RNA (2'-O-メトキシエチル-RNA)、2'フルオロ-DNA、および LNA からなる群から独立に選択される、態様 30 の化合物。
【０１５７】
32. 前記ヌクレオチド類縁体の少なくとも１つが、ロックされた核酸(LNA)である、態様 30 または 31 の化合物。
【０１５８】
33. 前記ヌクレオチド類縁体の少なくとも１つが、2'-MOE-RNA、例えば 2、3、4、5、6、7 または 8 の 2'-MOE-RNA 核酸塩基単位である、態様 30-32 のいずれかの化合物。
【０１５９】
34. 前記ヌクレオチド類縁体の少なくとも１つが、2'-フルオロ DNA、例えば 2、3、4、5、6、7 または 8 の 2'-フルオロ-DNA 核酸塩基単位である、態様 30-33 のいずれかの化合物。
【０１６０】
35. ヌクレオチド類縁体のうち 2、3、4、5、6、7 または 8 つが LNA であり、残りのヌクレオチド類縁体のいずれもが態様 26-30 のいずれかに記載されるヌクレオチド類縁体の群から選択され得る、態様 30-34 のいずれかの化合物。
【０１６１】
36. 全てのヌクレオチド類縁体が LNA である、態様 32 の化合物。
【０１６２】
37. LNA が、ベータ-D-オキシ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNA、ベータ-D-アミノ-LNA およびベータ-D-チオ-LNA から選択される、態様 30-36 のいずれかの化合物。
【０１６３】
38. 核酸塩基配列が、配列番号 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 からなる群から選択される、態様 1-37 のいずれかの化合物。
【０１６４】
39. 配列番号 17、18、19、20、21、22、23、24 および 25 からなる群から選択される、態様 38 の化合物。
【０１６５】
40. 配列番号 26、27、28、29、30、31、32 および 33 からなる群から選択される、態様 38 の化合物。
【０１６６】
41. 配列番号 34、35、36、37、38、39 および 40 からなる群から選択される、態様 38 の化合物。
【０１６７】
42. 態様 1-41 のいずれかの化合物および該化合物に共有結合した少なくとも１の非ヌクレオチドもしくは非ポリヌクレオチド部分を含む複合体。
【０１６８】
43. 前記非ヌクレオチドもしくは非ポリヌクレオチド部分が、ステロール基、例えばコレステロールからなるかまたはこれを含む、態様 42 の複合体。
【０１６９】
44. 態様 1-40 のいずれかにおいて定義される化合物または態様 42 もしくは 43 において定義される複合体と、医薬上許容される希釈剤、担体もしくは補助剤(adjuvant)とを含む、医薬組成物。
【０１７０】
45. 少なくとも１のコレステロールを低下させる化合物をさらに含む、態様 44 の医薬組成物。
【０１７１】
46. 前記化合物が胆汁酸塩捕捉樹脂 (例えばコレスチラミン、コレスチポール、およびコレセベラム塩酸塩)、HMGCoA-レダクターゼ インヒビター (例えばロバスタチン、セリバスタチン、プラバスタチン(prevastatin)、アトルバスタチン、シンバスタチン、およびフルバスタチン)、ニコチン酸、フィブリン酸誘導体 (例えばクロフィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、ベザフィブラート、およびシプロフィブラート)、プロブコール、ネオマイシン、デキストロチロキシン、植物スタノール エステル、コレステロール吸収阻害剤 (例えば、エゼチミブ)、インプリタピド、胆汁酸トランスポーター(頂端(apical)ナトリウム依存性胆汁酸トランスポーター)の阻害剤、肝臓 CYP7a のレギュレーター、エストロゲン補充療法剤 (例えば、タモキシフェン)、および抗炎症剤(例えば、グルココルチコイド)からなる群から選択される、態様 45 の医薬組成物。
【０１７２】
47. 医薬としての使用のための、態様 1-43 のいずれかにおいて定義される化合物または複合体。
【０１７３】
48. Apo-B100 の異常なレベルまたはこれに関連する疾患もしくは症状の処置のための医薬を製造するための、態様 1-43 のいずれかにおいて定義される化合物または複合体の使用。
【０１７４】
49. Apo-B100 の異常なレベルまたはこれに関連する疾患もしくは症状の処置のための、態様 1-43 のいずれかの化合物または複合体を含む医薬。
【０１７５】
50. 前記 Apo-B100 の異常なレベルが、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症または高脂血症からなる群から選択される医学的症状の存在と関連する、態様 48 または 49 の使用または医薬。
【０１７６】
51. 態様 1-43 のいずれかにおいて定義される医薬組成物または複合体を必要としている対象に投与する工程を含む、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症および高脂血症から選択される疾患または症状に罹患している対象を処置する方法。
【０１７７】
52. 態様 1-43 のいずれかにおいて定義される医薬組成物または複合体を、対象、例えばアテローム性動脈硬化、高コレステロール血症または高脂血症からなる群から選択される医学的症状に罹患している対象に投与する工程を含む、アポリポタンパク質 B を下方制御する方法。
【実施例】
【０１７８】
実施例
実施例 1: モノマーの合成
LNA モノマー構成要素およびその誘導体を、標準的な方法、例えば WO07/031081 において引用される公開された手順および参考文献を用いて調製した。
【０１７９】
実施例 2: オリゴヌクレオチド合成
表 1  本発明のオリゴヌクレオチド化合物
配列番号 16-40 において、大文字はヌクレオチド類縁体単位を示し、下付き文字“s”はホスホロチオエート(phosphorothiote)結合を表す。“s”の不存在は、ホスホジエステル結合を示す。
【０１８０】
【表１−１】
2010521193.tif 000025
【表１−２】
2010521193.tif 000026
【表１−３】
2010521193.tif 000027
【０１８１】
実施例 3: 血漿中のコレステロールレベル
血漿中の総コレステロールレベルを、ABX Pentra からの比色(colometric)アッセイ Cholesterol CP を用いて測定する。酵素的加水分解および酸化の後、コレステロールを測定する。21.5 μL の水を、1.5 μL の血漿に添加した。250 μL の試薬を添加し、5 分以内に 540 nM の波長でコレステロール含量を測定する。各動物についての測定を２回重複して行った。2 倍希釈された対照化合物 (ABX Pentra N control)を用いて、感度および直線性をテストした。バックグラウンドを減算することよって相対的コレステロールレベルを決定し、生理食塩水で処理したマウスの血漿中におけるコレステロールレベルと比較して表した。
【０１８２】
血漿中のリポタンパク質を、超遠心分離によって、密度調整された血漿から HDL 画分および非 HDL 画分に分離した。非 HDL 画分は、主に VLDL および LDL を含む。２つの画分の各々におけるコレステロール含量を、ABX Diagnostics, France からの総コレステロール用の市販のキットを用いて、総コレステロール解析について記載される通りに解析した。
【０１８３】
実施例 4: mRNA レベルの測定
Apo-B100 発現のアンチセンス調節は、当該技術分野において公知の様々な方法でアッセイすることができる。例えば、Apo-B100 mRNA レベルは、例えばノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、またはリアルタイム PCR によって定量化することができる。現在のところ、リアルタイム定量的 PCR が好ましい。RNA 解析は、全細胞 RNA または mRNA について行うことができる。RNA 単離および RNA 解析の方法、例えばノーザンブロット解析は、当該技術分野において常套のものであり、例えば Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons において教授される。
【０１８４】
リアルタイム定量的(PCR)は、BioRAD から市販されている iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System を用いて簡便に達成することができる。リアルタイム定量的 PCR は、当該技術分野において周知の技術であり、例えば Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994 において教授される。
【０１８５】
実施例 5: ApoB-100 mRNA を標的とするオリゴヌクレオチドのスクリーニング(3*5 mg/kg の投与)
本研究において、5 mg/kg/用量を連続して 3 日投与し(静脈内注入で１用量/日)、動物を最後の投与後 24 時間で屠殺した。屠殺時に、肝臓および後眼窩洞血を採取した。コレステロールの解析のため、血清を血液から調製した。肝臓から RNA を単離し、ApoB-100 mRNA の発現を測定した。
【０１８６】
異なる長さのオリゴを 5 mg/kg/用量で３用量投与することの、ApoB-100 mRNA 発現に対する効果を、図 1 に示す。配列番号 16 が ApoB-100 mRNA を約 25-30% 下方制御した一方、14-mer の配列番号 17 および 12-mer の配列番号 34 は等しくずっと強力であった − 5 mg/kg の 3 回投与の後、ApoB-100 mRNA を 約 75% 下方制御した。
【０１８７】
3 日目の屠殺時において、血清中の総コレステロールを測定した(図 2)。qPCR からの結果と同様、12-mer の配列番号 34 で最善のまたは最も強力な効果が得られ、14-mer の配列番号 17 がこれに続いた。16-mer(配列番号 16)は、総コレステロールを約 18% 減少させた。
【０１８８】
実施例 6: C57BL/6 雌マウスにおける配列番号 17 および 配列番号 34 の用量反応および作用時間
本研究において、３つの異なる濃度 (10、15 および 25 mg/kg) の配列番号 17 および 配列番号 34 を、ApoB-100 mRNA の発現および血清コレステロールレベルに対する作用時間について試験した。配列番号 17 および配列番号 34 を、10、15 または 25 mg/kg の単回投与として C57BL/6 雌マウスに与えた。投与後、異なる時点(1、3、5 および 8 日)でマウスを屠殺し; 肝臓ならびに血清を、それぞれ ApoB-100 mRNA 発現、肝臓オリゴヌクレオチド濃度ならびにコレステロールおよび ALT について試験した。
【０１８９】
標的 mRNA の下方制御の解析
屠殺時に採取した肝臓を、qPCR によって、ApoB-100 mRNA 発現について解析した。データを Gapdh に対して規準化し、生理食塩水の投与によって得られたデータと比較して表した。10、15 または 25 mg/kg の配列番号 17 または 配列番号 34 の１回投与は、肝臓において ApoB-100 mRNA を下方制御するのに非常に効果的であった(図 3)。投与後２４時間で、配列番号 34 で 90-95% の下方制御が得られた一方、配列番号 17 の投与は、生理食塩水対照群よりも 70-85% 低い ApoB mRNA レベルをもたらした。
【０１９０】
血清コレステロール 
コレステロールを測定するために用いる血清を、屠殺時に採取した。配列番号 17 の投与後２４時間で血清総コレステロールは 25-40% 減少し、配列番号 34 の投与は総コレステロールの 40-55% の減少をもたらした。3 日目において、総コレステロールレベルはさらに減少した: 10、15 または 25 mg/kg の投与後、配列番号 17 は 用量依存的に 70-90% の減少をもたらした。配列番号 34 は、総コレステロールを生理食塩水対照群と比較して 90-95% 減少させた。5-8 日目においては、10 mg/kg で配列番号 17 を投与した群を除いた全ての群において、総コレステロールレベルは増大した(図 4)。
【０１９１】
実施例 7: C57BL/6 雌マウスにおける配列番号 17 および配列番号 34 の用量反応および作用時間
コレステロールについての ED50 値を見出すため、単回投与の配列番号 17 および配列番号 34 を、異なる濃度で C57BL/6J マウスに投与した。単回投与の最大の効果が必ずしも投与後 24 時間で達成されるわけではないことを本発明者らは以前に経験していたため、作用時間も本研究に含めた。実施例 6 において本発明者らは、10、15 または 25 mg/kg の配列番号 34 および 25 mg/kg の配列番号 17 を投与した後、ApoB-100 mRNA を完全に下方制御した。そのため、本発明者らは本研究において、より低い濃度 (1、2.5 および 5 mg/kg) を選択した。
【０１９２】
標的 mRNA の下方制御の解析
屠殺時に採取した肝臓を、qPCR によって、ApoB-100 mRNA 発現について解析した。データを Gapdh に対して規準化し、生理食塩水の投与によって得られたデータと比較して表した。10、15 または 25 mg/kg の配列番号 17 または配列番号 34 の１回投与は、肝臓において ApoB-100 mRNA を下方制御するのに非常に効果的であった(図 5)。1、2.5 または 5 mg/kg の配列番号 17 の単回投与は、5 日の間、ApoB-100 mRNA の用量依存的な下方制御をもたらした。配列番号 34 でも同様の結果が得られた。8 日目において、両方のオリゴヌクレオチドは、2.5 mg/kg の配列番号 34 および 5 mg/kg の配列番号 17 の投与後に、同様の ApoB-100 mRNA 発現、すなわち 75% の減少をもたらした。16 日目においては、5 日目および 8 日目と同様の 75% の ApoB-100 mRNA 下方制御をもたらした 5 mg/kg の配列番号 34 の投与後を除いて、全ての群において mRNA レベルが再び増大した。
【０１９３】
血清コレステロール 
屠殺時に血清を採取し、コレステロールを測定するために用いた。血清総コレステロールレベルは、ApoB-100 の mRNA 発現を反映した; 1 および 2.5 mg/kg での配列番号 17 の投与後 5 日における最善の効果、および 5 mg/kg の投与後 3、5 および 8 日における同様の効果(50% 減少)を有する用量依存的な減少。用量依存効果は、5 mg/kg の投与後 3 日における最善の効果(70% 減少)を有し、その後のコレステロールレベルの増大(8 日目で 60% 減少、および 16 日目で 45% 減少)を伴う配列番号 34 の投与後にも得られた。しかし、配列番号 34 を投与した群におけるコレステロールレベルは、2.5 および 5 mg/kg を投与した群における mRNA 減少に従わなかった。例えば、5 mg/kg の投与が 5-16 日目に ApoB-100 mRNA の約 75% の下方制御をもたらした一方、2.5 mg/kg および 5 mg/kg の投与後のコレステロールレベルは、3 日目から 16 日目までに、70% 減少から 45% 減少にまで増大した。
【０１９４】
実施例 8: ApoB-100 mRNA を標的とするオリゴヌクレオチドのスクリーニング(静脈内注入での３日連続の 3 * 1 または 5 mg/kg の投与)
全て ApoB mRNA を標的とする３つの LNA アンチセンス オリゴヌクレオチド、12-mer の配列番号 34、13-mer の配列番号 26 および 14-mer の配列番号 17 の、1.0 または 5.0 mg/kg の投与(0 日目に１回投与)後の異なる日において、ApoB-100 mRNA に対する効果を試験した。
【０１９５】
標的 mRNA の下方制御の解析
屠殺時に採取した肝臓を、qPCR によって、ApoB-100 mRNA 発現について解析した。データを Gapdh に対して規準化し、生理食塩水の投与によって得られたデータと比較して表した。3 * 1 または 5 mg/kg の配列番号 34、配列番号 17 または 配列番号 26 の投与は、肝臓における ApoB-100 mRNA を下方制御するのに非常に効果的であった(図 7)。1 mg/kg の配列番号 34 または 配列番号 26 の投与は、ApoB-100 mRNA を 60% 下方制御し、5 mg/kg の投与は、両方の化合物について同様の 90% の下方制御をもたらした。3 * 1 mg/kg/用量または 5 mg/kg/用量で投与された配列番号 17 は、標的 mRNA をそれぞれ 50% および 70% 下方制御した。
【０１９６】
血清コレステロール 
屠殺時に、血清用の血液を採取し、コレステロールを測定するために用いた。mRNA 発現についての結果と同様に、配列番号 34 および 配列番号 26 は同様の結果をもたらした: 3*1 mg/kg の投与後の 60% 減少および 3*5 mg/kg/用量の投与後の 約 85-90% 減少。配列番号 17 は少し効力が弱く、3 * 1 または 5 mg/kg/用量の投与後に血清コレステロールをそれぞれ 40% および 70% 減少させた。
【０１９７】
実施例 9: C57BL/6J 雌マウスにおける配列番号 26 の用法(Dose regimen)および効力
本研究において、３つの異なる濃度(1、2.5 および 5 mg/kg)の配列番号 26 を、超遠心分離によって血漿から単離されたリポタンパク質画分における総コレステロールならびに非 HDL および HDL コレステロールに対する効力について試験した。配列番号 26 を、１週間に１回または２週間に１回のいずれかで、6 週間の間、1、2.5 または 5 mg/kg で、静脈内注入によって C57BL/6J 雌マウスに与えた。マウスを、最後の投与(全ての群について 42 日目)の後１週間で屠殺した。血清を毎週１回採取し、総コレステロールならびに非 HDL および HDL コレステロールについて解析した。
【０１９８】
血漿コレステロール/総コレステロール
コレステロールを測定するために用いる血漿を、毎週１回および屠殺時において採取した。
【０１９９】
2.5 および 5 mg/kg/用量で投与された群は、14 日後には 60% の総コレステロール減少を有する定常状態に達したため、１週間に１回の投与は、肝臓中にオリゴヌクレオチドを蓄積させると思われた。1 mg/kg の投与は、28 日後に、40% の総コレステロール減少を有する定常状態をもたらした。２週間に１回の投与では、総コレステロールの 60% の減少を有する揺らぎのない定常状態は、5 mg/kg/用量を 28 日間投与した後(2 回の投与後)に達成された。1 および 2.5 mg/kg で投与された群においては、総コレステロールの揺らぎが最初の投与後 35 日目まで続いたが、該揺らぎは時間と共に小さくなった。そして、定常状態は、これらの濃度においてもおそらく時間と共に確立されるであろう。1 および 2.5 mg/kg/用量については、総コレステロールの減少は、28 日目から 35 日目まで、それぞれ 20-30% の間および 40-50% の間を変動した(図 9 A および B)。
【０２００】
非 HDL および HDL コレステロール
血漿を HDL および非 HDL 画分に分離し、コレステロール含量について別々に解析したところ、１週間に１回の投与 (図 10 A および B) と２週間に１回の投与の間の差が、血漿サンプルを総コレステロール含量について直接解析した場合よりもはっきりと照らし出された。図 11 A および B は、２週間に１回の用法が、毎週注入による効果にほぼ匹敵する非 HDL コレステロールレベルの低下をもたらした一方、２週間に１回の用法による HDL コレステロールへの影響はより穏やかであったことを示す。２週間に１回の注入が、非 HDL コレステロールを低下させるのに十分であったこと、および、毎週注入よりも、高い HDL コレステロールを有する有益なリポタンパク質特性をもたらすことは注目に値する。
【図１】
2010521193.tif 000028
【図２】
2010521193.tif 000029
【図３】
2010521193.tif 000030
【図４】
2010521193.tif 000031
【図５】
2010521193.tif 000032
【図６】
2010521193.tif 000033
【図７】
2010521193.tif 000034
【図８】
2010521193.tif 000035
【図９】
2010521193.tif 000036
【図１０】
2010521193.tif 000037
【図１１】
2010521193.tif 000038
【配列表】
2010521193000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年11月24日(2009.11.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010521193000001.app
【国際調査報告】
2010521193.tif 000064
2010521193.tif 000065
2010521193.tif 000066