(57)【要約】本発明は、Lp-PLA2の阻害によって神経変性疾患および神経学的に関連する障害を治療および阻止するために有用な組成物および方法を提供する。この組成物および方法は、異常な血液脳関門(BBB)機能を有する疾患および障害、例えば透過可能なBBBのある神経変性疾患、例えば、限定されないが、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病および血管性認知症を治療および阻止するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患または障害を発症した、または発症する危険性のある対象を識別する段階、ならびに神経変性疾患の治療および/または阻止の必要がある対象に、Lp-PLA2タンパク質の活性および/または発現を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階を含む、対象における神経変性障害または疾患を治療および/または阻止する方法。
【請求項２】
神経変性疾患または障害が、アルツハイマー病、血管性認知症、パーキンソン病およびハンチントン病からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
対象がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
血管性認知症を発症した、または発症する危険性のある対象を識別する段階、ならびに必要がある対象に、Lp-PLA2タンパク質の活性および/または発現を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階を含む、血管性認知症を発症した、または発症する危険性のある対象を治療および/または阻止する方法であって、Lp-PLA2タンパク質の阻害により血管性認知症の症状が減少するかまたは止まる、方法。
【請求項５】
血管性認知症がアルツハイマー病と関連する、請求項4記載の方法。
【請求項６】
異常な血液脳関門を有する、またはその危険性のある対象を識別する段階、ならびに必要がある対象に、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階を含む、対象における異常な血液脳関門と関連する疾患または障害を治療および/または阻止する方法。
【請求項７】
異常なBBBが透過性血液脳関門である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
疾患または障害が神経変性疾患または障害である、請求項6記載の方法。
【請求項９】
疾患または障害が血管性認知症である、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
神経変性疾患または障害が、アルツハイマー病である、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
神経変性疾患または障害が、アルツハイマー病、血管性認知症、パーキンソン病およびハンチントン病からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
脳におけるβアミロイド蓄積を有する、またはその危険性のある対象を識別する段階、ならびに必要がある対象に、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階を含む、対象の脳におけるβアミロイド蓄積を減少させる方法であって、Lp-PLA2タンパク質の阻害により脳におけるβアミロイド蓄積の症状が減少するか、または止まる、方法。
【請求項１３】
βアミロイドがAβ1-42である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
(i)アルツハイマー病を有するまたは発症する可能性について対象をスクリーニングする段階、
(ii) 対象に、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階
を含む、必要な対象において、アルツハイマー病を治療および/または阻止する方法であって、Lp-PLA2タンパク質の阻害によりアルツハイマー病の症状が減少し、対象が、段階(i)により決定された、アルツハイマー病を発症する増大した危険性または可能性を有すると識別される、方法。
【請求項１５】
アルツハイマー病を発症する対象の危険性を評価する段階を含む、アルツハイマー病を発症する危険性を阻止し、または減少させるための方法であって、対象がアルツハイマー病を発症する危険性を有する場合、臨床医が対象にLp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質による処置を受けるように指示する、方法。
【請求項１６】
作用物質が小分子、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマーまたはそれらの変異体もしくはフラグメントである、請求項1、4、6、12、14または15記載の方法。
【請求項１７】
核酸作用物質がRNAi作用物質である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
RNAi作用物質が、siRNA、shRNA、miRNA、dsRNAもしくはリボザイムまたはそれらの変異体である、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
小分子が、1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)-アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オンもしくはSB480848またはそれらの塩である、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
小分子が、N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミドまたはそれらの塩である、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
小分子が、N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミドまたはそれらの塩である、請求項16記載の方法。
【請求項２２】
小分子が、メチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートまたはそれらの塩である、請求項16記載の方法。
【請求項２３】
Lp-PLA2を阻害する作用物質を含む薬学的組成物の投与後、対象の認知機能を評価する段階をさらに含む、請求項1、4、6、12、14または15記載の方法。
【請求項２４】
脳血流または血液脳関門機能を評価することにより、治療をモニタリングする段階をさらに含む、請求項1、4、6、12、14または15記載の方法。
【請求項２５】
対象に別の治療薬を投与する段階をさらに含む、請求項1、4、6、12、14または15記載の方法。
【請求項２６】
別の治療薬が、ARICEPTまたはドネペジル、COGNEXまたはタクリン、EXELONまたはリバスチグミン、REMINYLまたはガランタミン、抗アミロイドワクチン、Aβ低下療法、メンタルエクササイズ、または刺激である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
対象が哺乳動物である、請求項1、4、6、12、14または15記載の方法。
【請求項２８】
対象がヒトである、請求項4記載の方法。
【請求項２９】
対象がヒトである、請求項6記載の方法。
【請求項３０】
対象がヒトである、請求項12記載の方法。
【請求項３１】
対象がヒトである、請求項14または15記載の方法。
【請求項３２】
哺乳動物がヒトである、請求項27記載の方法。
【請求項３３】
神経変性疾患または障害を治療および/または阻止するための薬剤を調製するための、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は一般的には神経変性疾患および障害を治療および/または阻止するための方法、より詳細には、LP-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質を使用する、異常な血液脳関門透過性と関連する神経変性疾患の治療および/または阻止に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
以前、当技術分野において血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(PAFアセチルヒドロラーゼ)としても公知である、リポタンパク質関連ホスホリパーゼA2(LP-PLA2)は、リポタンパク質脂質またはリン脂質の加水分解に関連するホスホリパーゼA2酵素のスーパーファミリーの一員である。リンパ球、単球、マクロファージ、Tリンパ球およびマスト細胞を含む、損傷への全身炎症応答において重要な役割を果たすいくつかの細胞により分泌されている。
【０００３】
LDLのその酸化形態への変換中、LP-PLA2は、酸化的に修飾されたホスファチジルコリンのsn-2エステルの加水分解に関与し、リゾホスファチジルコリンおよび酸化的に修飾された脂肪酸が提供される。LP-PLA2は酸化LDLと関連する切断リン脂質のsn2部位を加水分解する。その結果、2つの炎症細胞ホーミングメディエータ(非エステル化脂肪酸(NEFA)およびLYSO PC)が生成する。NEFAおよびLYSO PCはどちらも単球を循環させるための化学誘引物質であり、マクロファージの活性化において重要な役割をし、酸化ストレスを増加させ、ならびにTリンパ球の機能および即時型応答に影響を与える。Lp-PLA2はヒトおよびブタではLDL分子にリポタンパク質Bを介して結合され、動脈壁内に入った時点で、酸化LDLはLp-PLA2による加水分解を受けやすくなる。
【０００４】
Lp-PLA2作用のこれらの生成物はどちらも、単球を循環させるための強力な化学誘引物質である。そのようなものとして、この酵素は動脈内における、コレステロールエステルが負荷された細胞の蓄積に関与し、アテローム性動脈硬化の初期段階と関連する特徴的な「脂肪線条」を引き起こすと考えられ、Lp-PLA2酵素の阻害はこの脂肪線条の蓄積を阻止するのに有用であり(リゾホスファチジルコリンの形成の阻害により)、アテローム性動脈硬化の治療に有用である可能性がある。
【０００５】
さらに、Lp-PLA2はLDL酸化において直接的な役割を果たすことが提案されている。これは、酸化過程全体に寄与し、増強するLp-PLA2作用のポリ不飽和脂肪酸誘導過酸化脂質生成物のためである。この考えに従うと、Lp-PLA2阻害剤はLDL酸化を阻害する。そのため、Lp-PLA2阻害剤は酵素活性と共に脂質過酸化が関連する任意の障害、例えば、アテローム性動脈硬化および糖尿病などの状態に加えて、関節リウマチ、心筋梗塞および再灌流傷害などの他の状態において、一般的な用途を有する。
【０００６】
多くの神経障害の臨床管理は、神経変性疾患、外傷性神経疾患または破壊性神経疾患の進行性の性質、ならびに有効な薬剤の限られた効果および重篤な副作用により挫折している。ハンチントン病、アルツハイマー病、重篤な発作性疾患(例えば、てんかんおよび家族制自律神経失調症)などの状態は、状態を緩和または治癒させるための最も標準的な薬理学的試みを回避した。
【０００７】
進行性脳機能障害である、認知症では、徐々に毎日の活動が限られてくる。認知症の最も周知の型はアルツハイマー病である。65歳を超える人口の約10%、80歳を超える人口の約40%が発症する。米国では約450万人の人々が現在、この障害に苦しんでおり；この人口統計学的集団は本発明者らの社会では最も速く増加している部分であることから、その数は数年のうちには急激に上昇すると予測されている。2050年までには、予防処置が有効にならなければ、アルツハイマー病の米国人の数は3倍(460〜1400万)になると予測され、USにおけるこの疾患を有する人々を看護するための費用は毎年、1000億ドルを超えると考えられる。この流行病は社会に対し、ヒトの苦痛および金銭的な費用という観点から、非常に大きな意味を有する。
【０００８】
血管性認知症は、心血管疾患および心血管病的変化の結果としての、虚血、虚血-低酸素、または出血性脳病変に起因する認知機能の損失と規定される。例えば、G.C. Roman、Med. Clin. North. Am., 86, pp. 477-99(2002)（非特許文献1）を参照されたい。血管性認知症は、慢性の進行性障害である。血管性認知症の症状としては、認知欠損、頭痛、不眠および記憶喪失が挙げられる。血管性認知症は、複数のラクナ(lacunes)、および低灌流病変、例えば、境界域梗塞および虚血性脳室周囲白質脳症(ビンスワンガー病)により引き起こされる可能性がある。G.C.Roman、上記を参照されたい。中国、日本および韓国などのアジア諸国では、血管性認知症は認知症患者の60%を超えるものにおいて観察されている。
【０００９】
血管性認知症の治療は典型的には、危険因子(すなわち、高血圧、糖尿病、高脂肪食、喫煙、高フィブリノーゲン血症、高ホモシステイン血症、起立性低血圧、不整脈)の管理を含む。G.C.Roman、上記を参照されたい。研究者らはまた、ホルモン補充療法およびエストロゲン補充療法が女性における認知症の発症を遅らせるどうかについても調べている。E.Hogervorst et al., Cochrane Detabase Syst. Rev., 3, CD003799(2002)（非特許文献2）を参照されたい。しかしながら、そのようなホルモン補充療法は負の副作用を有する。
【００１０】
さらに、血管性認知症に対してはアスピリンが広く処方されているが、アスピリンが血管性認知症患者を治療するのに実際に効果的であるという証拠は非常に限られている。P.S.Williams et al., Cochrane Database Syst. Rev., 2, CD001296(2000)（非特許文献3）を参照されたい。ニモジピンは血管性認知症患者において短期利益を示す薬物として示されているが、長期抗認知症薬としては証明されていない。J.M. Lopez-Arrieta and J. Birks, Cochrane Database Syst. Rev.,3, CD000147(2002)（非特許文献4）を参照されたい。さらに、ピラセタムの臨床効果データは、認知症または認知機能障害の治療におけるこの薬物の使用をサポートしていない。L.Flicker and G. (irimley Evans, Cochrane Database Syst. Rev.,2, CD001011(2001)（非特許文献5）。
【００１１】
今日まで、いずれの治療も血管性認知症を阻止し、またはアルツハイマー病を止めることができない。疾患の初期および中期段階の人々に対し、現在の薬物(Cognex、Aricept、Exelon、Razadyne、Namenda)は限られた期間いくらかの症状を軽減することができる。脳の炎症がアルツハイマー病の一因となる可能性があるので、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID、Vioxx、Aleve、Cerebrex)を臨床試験で試験したが、利益は見られなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】G.C. Roman、Med. Clin. North. Am., 86, pp. 477-99(2002)
【非特許文献２】E.Hogervorst et al., Cochrane Detabase Syst. Rev., 3, CD003799(2002)
【非特許文献３】P.S.Williams et al., Cochrane Database Syst. Rev., 2, CD001296(2000)
【非特許文献４】J.M. Lopez-Arrieta and J. Birks, Cochrane Database Syst. Rev.,3, CD000147(2002)
【非特許文献５】L.Flicker and G. (irimley Evans, Cochrane Database Syst. Rev.,2, CD001011(2001)
【発明の概要】
【００１３】
概要
本発明は、Lp-PLA2の阻害、例えば、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性の阻害による神経変性疾患および障害を治療および/または阻止するための方法に関する。特定の態様では、本発明の方法による治療および/または阻止に適した神経変性疾患は、異常な血液脳関門(BBB)機能と関連し、例えば、透過性BBBのある神経変性疾患であり、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病および血管性認知症などを含むが、それらに限定されない。
【００１４】
1つの態様では、本明細書で開示した方法は、神経変性疾患の治療および/または阻止の必要がある対象に、Lp-PLA2を阻害する作用物質、例えばLp-PLA2の発現および/またはLp-PLA2のタンパク質活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階を含む。本発明は疾患のいずれの特定の段階(例えば、初期または進行)にも限定されるものではない。
【００１５】
いくつかの態様では、本明細書で開示されているように、BBB漏出を阻止する方法は、Lp-PLA2の阻害、例えば、Lp-PLA2の発現の阻害および/またはLp-PLA2のタンパク質活性の阻害により提供される。したがって、いくつかの態様は、酵素活性をブロックすることによりLp-PLA2を阻害する方法を提供し、いくつかの態様は、Lp-PLA2 RNAの発現を減少および/または下方制御することによりLp-PLA2を阻害する方法を提供する。いくつかの態様では、BBB漏出またはBBB透過性の阻止および/または減少により、神経変性疾患または障害に関連する症状の阻止および/または減少が得られる。
【００１６】
1つの局面では、本明細書で開示した方法は、神経変性疾患の治療および/または阻止の必要がある対象に、Lp-PLA2タンパク質の活性および/または発現を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階を含む、対象における神経変性障害または疾患を治療および/または阻止する方法を提供する。そのような態様では、そのような神経変性疾患または障害は、ある神経変性疾患または障害であり得、例えば、アルツハイマー病、血管性認知症、パーキンソン病およびハンチントン病であり得るが、それらに限定されない。別の態様では、神経変性疾患または障害は異常な血液脳関門と関連する。さらに別の態様では、Lp-PLA2タンパク質の活性または発現を阻害する作用物質を投与された対象はヒトである。
【００１７】
別の態様では、本発明は、対象に、Lp-PLA2タンパク質の活性および/または発現を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階を含む、血管性認知症の危険性のある対象を治療および/または阻止する方法であって、Lp-PLA2タンパク質の阻害により血管性認知症の症状が減少するか、または止められる、治療および/または阻止方法を提供する。いくつかの態様では、血管性認知症はアルツハイマー病と関連する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、対象に、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階を含む、必要な対象において異常な血液脳関門に関連する疾患または障害を治療および/または阻止する方法を提供する。いくつかの態様では、異常なBBBは透過性血液脳関門であり、さらに別の態様では、疾患または障害は神経変性疾患または障害である。そのような神経変性疾患または障害は、例えば、血管性認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病などであるが、それらに限定されない。
【００１９】
別の態様では、本発明は、対象に、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階を含む、対象の脳において「Aβ」蓄積とも呼ばれるβアミロイドを減少させる方法であって、Lp-PLA2タンパク質の阻害により脳中のβアミロイド蓄積の症状が減少し、または止められる、減少方法を提供する。いくつかの態様では、βアミロイドはAβ-42である。
【００２０】
いくつかの態様では、Lp-PLA2を阻害する作用物質は、Lp-PLA2タンパク質の発現を阻害することができ、例えば、Lp-PLA2 RNAの翻訳を阻害し、Lp-PLA2タンパク質の産生を阻害することができる。別の態様では、Lp-PLA2を阻害する作用物質は、Lp-PLA2タンパク質活性を阻害することができる。本明細書で開示した方法において使用するために任意の作用物質が含まれる。いくつかの態様では、作用物質は小分子、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマーまたはそれらの変異体もしくはフラグメントとすることができる。いくつかの態様では、作用物質は核酸作用物質であり、例えば、限定されないがRNAi剤であり、例えば、siRNA、shRNA、miRNA、dsRNAもしくはリボザイムまたはそれらの変異体であるが、それらに限定されない。
【００２１】
いくつかの態様では、Lp-PLA2を阻害する作用物質は小分子であり、例えば、Lp-PLA2タンパク質の小分子可逆または不可逆阻害剤であるが、それに限定されない。いくつかの態様では、そのような小分子はピリミジオン系化合物である。いくつかの態様では、Lp-PLA2の小分子阻害剤は、例えば、1-(N-(2-ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)-アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン(SB480848としても公知)またはその塩であるが、それらに限定されない。いくつかの態様では、Lp-PLA2の小分子阻害剤は、例えば、N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミドまたはその塩であるが、それらに限定されない。いくつかの態様では、Lp-PLA2の小分子阻害剤は、例えば、N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミドまたはその塩であるが、それらに限定されない。いくつかの態様では、Lp-PLA2の小分子阻害剤は、例えば、メチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]-アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートまたはその塩であるが、それらに限定されない。
【００２２】
いくつかの態様では、神経変性疾患により認知機能の低下が引き起こされる場合、例えば神経変性疾患が、例えば、アルツハイマー病および/または血管性認知症である場合、本明細書で開示した方法を使用して疾患を治療および/または阻止する方法は、さらに、Lp-PLA2の発現および/または活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物の投与後、対象の認知機能を評価する段階を含むことができる。
【００２３】
別の態様では、本明細書で開示した方法は、神経変性疾患を治療および/もしくは阻止するための、ならびに/または対象における異常BBBを治療および/もしくは阻止するためのものであり、本方法はさらに、脳血流または血液脳関門機能を評価することにより治療をモニタリングする段階を含むことができる。そのような方法は、当業者により実施することができるが、例えば、CSF中のタウおよびAβ-42の存在を評価することに限定されない。
【００２４】
対象が、Lp-PLA2阻害剤を含む薬学的組成物を投与される、いくつかの態様では、本方法はさらに、対象に追加の治療薬、例えば、限定はされないが神経変性障害の治療において使用される治療薬を投与する段階を含むことができる。例えば、神経変性障害が、例えば、アルツハイマー病である場合、対象はさらに、アルツハイマー病の治療のための治療薬、例えば、限定はされないがARICEPTまたはドネペジル、COGNEXまたはタクリン、EXELONまたはリバスティグミン、REMINYLまたはガランタミン、抗アミロイドワクチン、Aβ低下療法、メンタルエクササイズまたは刺激を投与されることが可能である。
【００２５】
いくつかの態様では、神経変性疾患を治療および/または阻止するための、本明細書で開示した方法は、対象、例えば哺乳動物対象に適用することができる。いくつかの態様では、対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】DM/HCにより誘発される出血およびBBB漏出の証拠を示す。図1Aは対照脳では出血がないことを示し、これに比べ、図1Bでは、DM/HC脳中の脳が示され、黒色の矢印は血管の外側の炎症細胞を示し、白色の矢印は内皮細胞の表面上での炎症細胞の付着の増加を示す。図1Cは、対照動物では血管透過性がないこと、BBBが無傷であることを示し、これに比べ、図1DではDM/HC動物の脳中のBBB漏出が示されており、CおよびDの矢印は、微小血管の周りの免疫グロブリン(Ig)-陽性「漏出クラウド」の境界を示す。
【図２】DM/HC脳中の漏出Igがニューロンに結合し、樹状突起崩壊を誘発することを示す。左および右の図は、神経細胞体から現れる樹状突起幹の「らせん状形態」により明らかにされるように、特徴的な樹状突起崩壊を有するIg陽性(Ig-pos)ニューロンを示す。
【図３】DM/HCにより誘発された星状細胞活性化の証拠を示し、DM/HC処置動物の脳中の「病気ニューロン」に近接した活性化された星状細胞に対するマーカーとしてGFAP免疫染色を示す。
【図４】ニューロンおよび局所脳微小血管系における、DM/HCにより誘発されたAβ-42蓄積の証拠を示す。図4Aは、Aβ-42に対し著しく免疫陽性であるニューロンおよび、血管平滑筋層中のAβ-42の沈着(脳血管アミロイドーシス)を示す細動脈を示し、図4BはAβ-42に対し免疫陽性であるニューロンが樹状突起退縮を示す「らせん状樹状突起」を有することを示す。
【図５】Lp-PLA2阻害剤がBBB漏出およびニューロンへのIg結合を阻止することを示す。図5A〜Fは処置無しのDM/HC動物由来の脳のBBB悪化(透過性)の代表的な像であり(n=6)、図5G〜LはLp-PLA2阻害剤で処置したDM/HC動物由来の脳中の、相当する領域の無傷のBBBの代表的な像である(n=6)。図5A〜Fは、図5G〜Lと比較した、局所脳微小血管系から脳組織への大量のIg漏出およびニューロンへのIgの結合を示す。
【図６】Lp-PLA2阻害剤が、血管からの血漿成分(Igを含む)の流出をブロックすることにより、DM/HC動物においてニューロンの健康を保つことを示す。結果的に、IgはLp-PLA2阻害剤で処置されたDM/HC動物動物では血管の内腔に閉じ込められ、細動脈壁およびニューロンの両方がIgに対し免疫陰性とされる。
【図７】Lp-PLA2阻害剤がニューロンにおけるAβ-42蓄積を阻止することを示す。図7A〜Fは処置無しのDM/HC動物由来の脳のAβ-42免疫染色の代表的な像であり(n=6)、図7G〜LはLp-PLA2阻害剤で処置したDM/HC動物由来の脳中の相当する領域におけるAβ-42免疫染色の代表的な像である(n=6)。図7A〜Fで示されるように、Aβ-42の免疫反応性の増加は、図7G〜LのAβ42に対する免疫陰性ニューロンと比較した、Aβ-42のニューロンへの結合およびニューロン内での蓄積を示す。
【図８】Lp-PLA2阻害剤が脳血管アミロイドーシスを減少させたことを示す。図8Aは、処置無しのDM/HC動物由来の脳における細動脈の平滑筋細胞層でのAβ-42免疫染色を示し(すなわち、脳血管アミロイドーシス)、これと比較して、図8BはLp-PLA2阻害剤で処置したDM/HC動物由来の脳の、相当する領域における細動脈Aβ-42免疫染色がほとんどない、または全くないことを示す。
【図９】ブタ脳の代表的な象を示し、図9Aでは完全に無傷の脳を示し、図9Bでは正中線に沿って半側切断され、矢印は、脳幹および海馬の位置、ならびに免疫組織化学解析のために使用される脳領域の格子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
本明細書で開示されるように、本発明者らは、BBB漏出および透過性ならびに出血を含む血管性認知症の病理学的特徴の傾向がある動物は、Lp-PLA2阻害剤で処置された場合、BBB透過性の徴候および症状の減少ならびに異常BBBの減少を示すことを発見した。例えば、Lp-PLA2阻害剤で処置された動物は、BBB透過性の減少、グリア細胞の活性化の減少、および神経損傷の減少を示した。特に、Lp-PLA2阻害剤で処置された動物はまた、脳および脳血管系におけるアミロイド蓄積、例えばβ-アミロイド(またはAβ-42)蓄積の減少を有した。そのため、本発明者らは、神経変性疾患および障害、特に異常な血液脳関門機能と関連する神経変性疾患または障害、例えば、BBB透過性またはBBB透過性の増加を伴う神経変性疾患の治療および/または阻止においてLp-PLA2阻害剤を使用することができることを発見した。そのような疾患としては、例えば、血管性認知症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２８】
定義
便宜上、本出願全体(明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲を含む)で使用される特定の用語を、ここにまとめる。特に記載がなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２９】
本明細書で使用される「神経変性疾患」という用語は、神経組織および/または神経組織機能の段階的なおよび進行性の損失により特徴づけられる様々な中枢神経系障害を示す。神経変性疾患はあるクラスの神経障害または疾患であり、この場合、神経疾患は、段階的な、および進行性の神経組織の損失、および/または変化した神経機能、典型的には神経組織の段階的な、および進行性の損失の結果としての神経機能の減少により特徴づけられる。本明細書で記載される方法を使用する阻止および/または治療に適した神経変性疾患は、異常な血液脳関門、例えば、透過性血液脳関門が存在する神経変性疾患である。欠陥のある血液脳関門が存在する神経変性疾患の例としては、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、血管性認知症などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３０】
「血管性認知症」という用語はまた、当技術分野において「多発脳梗塞性認知症」とも呼ばれ、脳内の血管病変に至る全ての異なる機序により引き起こされる症候群を示す。血管性認知症の主なサブタイプは、例えば、血管性の軽度認知機能障害、多発脳梗塞性認知症、戦略的単発脳梗塞を伴う血管性認知症(視床、前大脳動脈、頭頂葉または帯状回に影響する)、出血病変による血管性認知症、小血管疾患(例えば、ラクナ病変による血管性認知症およびビンスワンガー病を含む)および血管性認知症を伴う混合型アルツハイマー病である。
【００３１】
「疾患」または「障害」という用語は、本明細書では互換的に使用され、身体または器官のいくつかの状態における、機能の実施を中断または妨害する、および/または不快、機能不全、困難、または実に死などの症状を苦しむ人に、または人と接触するものに引き起こす、任意の変化を示す。疾患または障害はまた、ジステンバー、病的状態、不快、病弊、不調、疾病、苦情、インダーディスポジョン(inderdisposion)または見せかけに関する可能性がある。
【００３２】
「血液脳関門」または「BBB」という用語は、本明細書では互換的に使用され、血管が脳組織を通過する時に、血管内に存在する血液と脳組織の間で交換されるものを厳しく制限し、厳密に調節する、透過性バリアを示すために使用される。血液脳関門成分は、全ての血管の最内側の内張りを形成する内皮細胞、BBBと構造的に関連する隣接する内皮細胞間の密着結合、内皮細胞の基底膜、および血管の暴露された外表面のほとんど全てを被覆する近くの星状細胞の拡張足突起を含む。BBBは、Ig、抗体、補体、アルブミンおよび薬物などのほとんどの大分子および小分子を含む血液中のほとんどの物質が脳組織に入らないようにする。
【００３３】
「異常BBB」という用語は、機能障害性BBBを示すために使用され、例えば、この場合、BBBは、普通、機能性BBBが通過させる分子、例えば、栄養素および糖類を通過させない。異常BBBはまた、BBBが、普通に機能するBBBが典型的に排除する分子に対し透過性である場合も示すことができ、これは典型的には、本明細書では「BBB透過性」と呼ばれる。
【００３４】
「BBB透過性」または「透過性BBB」という用語は、普通、当業者によって「漏出性BBB」と呼ばれる。これらの用語は本明細書では互換的に使用され、損なわれたBBB完全性および増加した血管透過性を示す。例えば、透過性BBBは、無傷なBBBが普通、脳組織から排除する分子、例えば、Ig分子、補体タンパク質、血清アルブミンおよび多くの他のタンパク質がBBBを通過することを許す。透過性BBBの存在を決定するアッセイ法は、例えば、BBBが普通に機能している場合(すなわち、BBBが透過性でない場合)血管の内腔に普通制限される、脳組織中の血管外Igの存在を評価するものであり得る。
【００３５】
「作用物質」という用語は、普通存在しない、または細胞に投与されたレベルでは存在しない任意の実体を示す。作用物質は下記からなる群から選択することができる：化学物質；小分子；核酸配列；核酸類似体；タンパク質；ペプチド；アプタマー；抗体；またはそれらのフラグメント。核酸配列はRNAまたはDNAとすることができ、一本鎖または二本鎖とすることができ、下記を含む群より選択することができる：対象タンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸類似体、例えばペプチド-核酸(PNA)、偽相補性PNA(pc-PNA)、ロックド核酸(LNA)など。そのような核酸配列としては、例えば転写抑制因子、アンチセンス分子、リボザイム、小さな抑制核酸配列として機能する、例えば、タンパク質をコードする核酸配列、例えば限定はされないがRNAi、shRNAi、siRNA、マイクロRNAi(mRNAi)、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられるが、それらに限定されない。タンパク質および/もしくはペプチドまたはそのフラグメントは、任意の対象タンパク質とすることができ、例えば、下記であるが、それらに限定されない：変異タンパク質；治療タンパク質およびトランケートタンパク質、ここで、タンパク質は普通細胞内には存在せず、またはより低いレベルで発現される。タンパク質はまた、下記を含む群より選択することができる：変異タンパク質、遺伝子工学により合成されたタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ミディボディ(midibody)、ミニボディ(minibody)、トリアボディ(triabody)、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾タンパク質およびそれらのフラグメント。また、作用物質は、核酸配列の細胞内への導入およびその転写により、細胞内でLp-PLA2の核酸および/またはタンパク質阻害剤の産生が引き起こされる結果、細胞内にあるものとすることができる。いくつかの態様では、作用物質は任意の化学物質、実体または部分であり、限定はされないが、合成および天然の非タンパク性実体が含まれる。ある態様では、作用物質は化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分は非置換または置換アルキル、芳香族、またはヘテロ環部分を含み、マクロライド、レプトマイシンおよびそれらの関連天然生成物または類似体が挙げられる。作用物質は所望の活性および/または特性を有することが公知であるものとすることができ、または様々な化合物のライブリーから選択することができる。
【００３６】
本明細書で使用されるように「阻害する」という用語は、Lp-PLA2タンパク質またはその変異体もしくは同族体の発現または活性がある程度まで減少され、および/または当面は、所望の効果を発生させるのに十分であることを意味する。活性の減少は、触媒活性を減少させる、またはLp-PLA2の補助因子を阻害する、または、ある程度の結合力でLp-PLA2に結合することを含む、Lp-PLA2の1つまたは複数の特性に影響することによる可能性があり、結果的に、神経変性障害または透過性BBBなどの異常BBBを治療または阻止する。特に、Lp-PLA2の阻害は、Lp-PLA2阻害に対するアッセイ法を用いて、例えば、限定はされないが本明細書で開示するLp-PLA2タンパク質に対するバイオアッセイ法を用いて、決定することができる。
【００３７】
本明細書で使用されるように、「Lp-PLA2」という用語は、本明細書で開示した方法により阻害されるタンパク質標的を示す。Lp-PLA2はLp-PLA2およびリポタンパク質関連ホスホリパーゼA2と互換的に使用され、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（PAFアセチルヒドロラーゼ）として当技術分野において以前に公知である。ヒトLp-PLA2は、アクセッション番号：U20157(SEQ ID NO:1)またはRef Seq ID:NM_005084(SEQ ID NO:2)に対応する核酸によりコードされ、およびヒトLp-PLA2はアクセッション番号：NP_005075(SEQ ID NO:3)に対応するタンパク質配列に対応し、これらは米国特許出願第5,981,252号において開示されており、該出願は参照により本明細書に全体が特定的に組み入れられる。
【００３８】
本明細書で使用されるように、nRNAi分子、例えばsiRNAまたはmiRNAの活性に関する「遺伝子サイレンシング」または「遺伝子サイレンシングされた」という用語は、miRNAまたはRNA干渉分子の存在しない細胞で見られるmRNAレベルの少なくとも約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%の、標的遺伝子に関する、細胞中の、mRNAレベルの減少を指す。1つの好ましい態様では、mRNAレベルは少なくとも約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%だけ減少する。
【００３９】
本明細書で使用されるように、「RNAi」という用語は、任意の型の干渉RNAを示し、siRNAi、shRNAi、内在性ミクロRNAおよび人工ミクロRNAが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、RNAの下流プロセシングの機序に関係なく、siRNAとして前に識別された配列を含む(すなわち、siRNAはmRNAの切断に至るインビボプロセシングの特定の方法を有すると考えられるが、そのような配列は本明細書で記載したフランキング配列との関連でベクターに組み入れることができる)。
【００４０】
本明細書で使用されるように、「siRNA」という用語は、二本鎖RNAを形成する核酸を指し、この二本鎖RNAは、siRNAが標的遺伝子、例えばLp-PLA2、として、同じ細胞中に存在または発現された場合、ある遺伝子または標的遺伝子の発現を減少または阻害する能力を有する。二本鎖RNA siRNAは、相補鎖により形成させることができる。1つの態様では、siRNAは二本鎖siRNAを形成することができる核酸を示す。siRNAの配列は、全長標的遺伝子、またはその配列に対応することができる。典型的には、siRNAは少なくとも約15〜50ヌクレオチドの長さである(例えば、二本鎖siRNAの各相補配列は約15〜50ヌクレオチドの長さであり、二本鎖siRNAは約15〜50塩基対の長さ、好ましくは約19〜30塩基ヌクレオチド、好ましくは約20〜25ヌクレオチドの長さ、例えば、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドの長さである)。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「shRNA」または「低分子ヘアピン型RNA」(ステムループとも呼ばれる)という用語は、ある型のsiRNAである。1つの態様では、これらのshRNAは短い、例えば、約19〜約25ヌクレオチドのアンチセンス鎖から構成され、約5〜約9ヌクレオチドのヌクレオチドループおよび類似のセンス鎖が続く。また、センス鎖はヌクレオチドループ構造に先行することができ、アンチセンス鎖がこれに続くことができる。
【００４２】
本明細書で使用されるように、「ミクロRNA」または「miRNA」という用語は、本明細書で互換的に使用され、内在性RNAであり、これらのいくつかは転写後レベルでタンパク質コード遺伝子の発現を調節することが公知である。内在性ミクロRNAは、mRNAの産生利用を調節することができる、ゲノム中に自然に存在する低分子RNAである。人工ミクロRNAという用語は、内在性ミクロRNA以外の、任意の型のRNA配列を含み、これは、mRNAの産生利用を調節することができる。ミクロRNA配列は、Lim, et al., Genes & Development, 17, p.991-1008(2003)、Lim et al Science 299, 1540(2003)、Lee and Ambros Science, 294, 862(2001)、Lau et al., Science 294, 858-861(2001)、Lagos-Quintana et al, Current Biology, 12, 735-739(2002)、Lagos Quintana et al, Science 294, 853-857(2001)、およびLagos-Quintana et al, RNA, 9, 175-179(2003)などの出版物において記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。複数のミクロRNAはまた、前駆体分子中に組み入れることができる。さらに、miRNA-様ステムループをビヒクルとして細胞内で発現させることができ、人工miRNAおよび低分子干渉RNA(siRNA)が、miRNAおよびまたはRNAi経路を介して内在性遺伝子の発現を調節する目的で送達される。
【００４３】
本明細書で使用されるように、「二本鎖RNA」または「dsRNA」という用語は、2つの鎖から構成されるRNA分子を示す。二本鎖分子は、一本鎖RNA分子から構成されるものを含み、これはそれ自体上での二重戻しにより二本鎖構造を形成する。例えば、プレ-miRNAと呼ばれる(Bartel et al. 2004. Cell 116:281-297)一本鎖miRNAが誘導される前駆分子のステムループ構造はdsRNA分子を含む。
【００４４】
「患者」、「対象」および「個体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、予防処置を含む処置が提供される動物、特にヒトを示す。本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトおよびヒトではない動物を示す。「ヒトではない動物」および「ヒトではない哺乳動物」という用語は、本明細書において互換的に使用され、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えばヒトではない霊長類(特に、高等霊長類)、ヒツジ、イヌ、齧歯類(例えば、マウスまたはラット)、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、およびヒトではない哺乳動物、例えば、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。1つの態様では、対象はヒトである。別の態様では、対象は疾患モデルとしての実験動物または動物代用物である。
【００４５】
本明細書で使用されるように「遺伝子」という用語は、転写および/または翻訳制御配列および/またはコード領域および/または非翻訳配列(例えば、イントロン、5’-および3’-非翻訳配列および制御配列)を含むゲノム遺伝子とすることができる。遺伝子のコード領域はアミノ酸配列または機能性RNA、例えば、tRNA、rRNA、触媒RNA、siRNA、miRNA、およびアンチセンスRNAをコードするヌクレオチド配列とすることができる。遺伝子はまた、任意で5’-または3’-非翻訳配列が結合されたコード領域(例えば、エクソンおよびmiRNA)に対応するmRNAまたはcDNAとすることができる。遺伝子はまた、インビトロで産生され、コード領域の全てもしくは一部および/またはそれに結合された5’-または3’-非翻訳配列を含む、増幅された核酸分子とすることができる。
【００４６】
本明細書で使用されるように「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」という用語は、共有結合により結合された少なくとも2つのヌクレオチドを意味する。当業者により認識されるように、一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列を規定する。このように、核酸はまた、描写した一本鎖の相補鎖を含む。当業者により認識されるように、同じ目的のため、与えられた核酸として、核酸の多くの変異体を使用することができる。このように、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその相補体を含む。また、当業者により認識されるように、一本鎖はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で、標的配列にハイブリダイズすることができるプローブのためのプローブを提供する。このように、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリダイズするプローブを含む。
【００４７】
核酸は一本鎖または二本鎖とすることができ、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含むことができる。核酸はDNA、ゲノムおよびcDNAの両方、RNA、またはハイブリッドとすることができ、この場合、核酸はデオキシリボ-およびリボ-ヌクレオチドの組みあわせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組みあわせを含むことができる。核酸は化学合成法により、または組換え法により得ることができる。
【００４８】
核酸は一般にホスホジエステル結合を含むが、少なくとも1つの異なる結合、例えば、ホスホラミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはO-メチルホスホロアミジト結合ならびにペプチド核酸骨格および結合を有することができる核酸類似体を含めることができる。別の核酸類似体は、正の骨格；非イオン性骨格；および非リボース骨格を有するものを含み、米国特許第5,235,033および同第5,034,506号で記載されているものが挙げられ、これらの特許は参照により組み入れられる。1つまたは複数の非天然の、または修飾されたヌクレオチドを含む核酸もまた、核酸の1つの定義の中に含まれる。修飾されたヌクレオチド類似体は、例えば、核酸分子の5’-末端および/または3’-末端に配置させることができる。ヌクレオチド類似体の代表的な例は、糖-または骨格-修飾リボヌクレオチドから選択することができる。しかしながら、核酸塩基-修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然の核酸塩基の代わりに非天然の核酸塩基、例えば、5-位で修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば、5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン；8位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば、8-ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、7-デアザ−アデノシン；O-およびN-アルキル化ヌクレオチド、例えばN6-メチルアデノシンを含むリボヌクレオチドが適していることに注意すべきである。2’OH基は、H、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2またはCNから選択される基により置換することができ、ここで、RはC〜C6アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはF、Cl、BrまたはIである。リボース-リン酸骨格の修飾は、様々な理由のために実施することができ、例えば、そのような分子の生理学的環境における、またはバイオチップ上のプローブとしての安定性および半減期を増加させるためである。天然の核酸および類似体の混合物を製造することができ；また、異なる核酸類似体の混合物、ならびに天然の核酸および類似体の混合物を製造することができる。
【００４９】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、複製基点を含む核酸配列を示す。ベクターはプラスミド、バクテリオファージ、バクテリア人工染色体または酵母人工染色体とすることができる。ベクターはDNAまたはRNAベクターとすることができる。ベクターは自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかとすることができる。
【００５０】
本明細書で使用されるように「治療する」という用語は、透過性BBBおよび/または血管性認知症および/またはアルツハイマー病の状態、疾患または障害の少なくとも1つの有害作用または症状を減少または軽減することを含む。本明細書で使用されるように、治療するという用語は、アルツハイマー病の症状および/または生化学マーカーが少なくとも10%だけ減少することを示すために使用される。例えば、限定はされないが、アルツハイマー病の生化学マーカーの減少、例えば、アミロイド斑沈着の10%の減少、またはグリア細胞の活性化の減少、例えば、GFAPを発現する細胞の10%の減少は本明細書で開示した方法による効果的な治療であると考えられる。別の例として、症状の減少、例えば、記憶喪失速度の10%の減速、または記憶減退速度の停止、または記憶喪失の10%の減少、または記憶の10%の改善はまた、本明細書で開示した方法による効果的な治療であると考えられる。
【００５１】
本明細書で使用されるように「有効量」という用語は、疾患および障害の少なくとも1つの症状、例えば欠陥BBBまたは血管性認知症の症状または障害を減少させるまたは止める治療薬または薬学的組成物の量を示す。例えば、本明細書で開示した方法を用いた有効量は、疾患または障害の症状、例えば血管性認知症またはBBB透過性を少なくとも10%だけ減少させるのに十分な量であると考えられる。本明細書で使用されるように有効量はまた、疾患の症状の発現を阻止し、もしくは遅らせる、症状疾患の過程を変化させる(例えば、限定はされないが、疾患の症状の進行を遅らせる)、または疾患の症状を逆行させるのに十分な量を含む。
【００５２】
本明細書で使用されるように「投与する」および「導入する」という用語は、互換的に使用され、本明細書で開示したLp-PLA2を阻害する作用物質を、作用物質が所望の部位に少なくとも部分的に局在化するようにする方法または経路により対象内に入れることを示す。本発明の化合物は、対象において効果的な治療をもたらす任意の適当な経路により投与することができる。
【００５３】
「ベクター」という用語は、結合される別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を示すために「プラスミド」と互換的に使用される。ベクターは、操作により結合された遺伝子および/または核酸配列の発現を誘導することができるベクターは、本明細書では、「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えDNA技術において役立つ発現ベクターはしばしば、「プラスミド」形態であり、プラスミドは環状二本鎖DNAループを示し、ベクター形態では、染色体に結合されない。本発明の異なる態様では別の発現ベクターを使用することができ、例えば、限定はされないが、プラスミド、エピソーム、バクテリオファージまたはウイルスベクターであり、そのようなベクターは宿主ゲノムに組み入れられ、または特定の細胞中で自己複製することができる。等価の機能を果たす、当業者に公知の発現ベクターの別の形態も使用することができる。発現ベクターはDNAをコードする安定発現または一過性発現のための発現ベクターを含む。
【００５４】
冠詞「1つの(「a」、および「an」)」は本明細書では、1つのまたは1つを超える(すなわち、少なくとも1つの)の、冠詞の文法的対象を示すために使用される。例として、「1つの要素」は1つの要素または1つを超える要素を意味する。
【００５５】
Lp-PLA2：一般的な情報
Lp-PLA2はまた、当技術分野では別名として、Lp-PLA2、LDL-PLA2、リポタンパク質関連ホスホリパーゼA2、PLA2G7、ホスホリパーゼA2(VIII族)、または血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(PAFアセチルヒドロラーゼまたはPAFAH)と呼ばれる。ヒトLp-PLA2はGenBankアクセッション番号：U20157(SEQ ID NO:1)またはRef Seq ID:NM_005084(SEQ ID NO:2)に対応する核酸によりコードされ、およびヒトLp-PLA2はGenBankアクセッション番号：NP_005075(SEQ ID NO:3)に対応するタンパク質配列に対応し、これらは米国特許出願第5,981,252号において開示されており、該出願は参照により本明細書に全体が特定的に組み入れられる。
【００５６】
ホスホリパーゼA2酵素リポタンパク質関連ホスホリパーゼA2(Lp-PLA2)、その配列、単離および精製、酵素をコードする単離した核酸、および酵素をコードするDNAで形質転換させた組換え宿主細胞はWO 95/00649(SmithKline Beecham plc)において開示されており、これは参照により全体が特定的に本明細書に組み入れられる。同じグループからのその後の出版物はさらに、この酵素を記載し(Tew D et al, Arterioscler Thromb Vas Biol 1996:16;591-9)、この場合、LDL-PLA2と呼ばれており、後の特許出願(WO 95/09921、Icos Corporation)およびNatureにおける関連出版物(Tjoelker et al, vol 374, 6 April 1995, 549)は、Lp-PLA2と本質的に同じ配列を有する酵素PAF-AHを記載している。
【００５７】
Lp-PLA2は、低密度リポタンパク質(LDL)のその酸化形態への変換中、ホスファチジルコリンのリゾホスファチジルコリンへの変換に関与することが示されている。酵素は酸化ホスファチジルコリンのsn-2エステルを加水分解し、リゾホスファチジルコリンおよび酸化修飾された脂肪酸を与えることが公知である。Lp-PLA2作用の生成物はどちらもリゾホスファチジルコリンと共に生物学的に活性であり、特に、それに帰するいくつかのアテローム生成促進活性を有し、単球走化性および内皮障害の誘発が挙げられ、それらの両方ともが、動脈壁内での単球誘導マクロファージ蓄積を促進する。
【００５８】
本発明者らは、BBB漏出により特徴づけられる障害になりやすい動物は、Lp-PLA2阻害剤で処置した場合、無傷のBBBおよびBBB透過性の徴候の減少を示すことが見出されたことを発見した。Lp-PLA2阻害剤で処置したそのような動物はまた、阻害剤で処置していない動物に比べ、血管性認知症の徴候の減少、ならびに脳組織および脳を巡る血管中のβ-アミロイドの蓄積の減少を示した。そのため、Lp-PLA2阻害剤はBBB透過性を有する疾患および障害、例えば、限定はされないが神経変性疾患を治療および/または阻止するために使用することができる。本明細書で開示した方法を使用する治療および/または阻止に適した神経変性疾患の例としては、血管性認知症、アルツハイマー病、ならびに他の神経変性疾患、例えば、ハンチントン病およびパーキンソン病が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５９】
Lp-PLA2を阻害する作用物質
いくつかの態様では、本発明はLp-PLA2の阻害に関する。いくつかの態様では、阻害はLp-PLA2をコードする核酸転写物の阻害であり、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)の阻害である。別の態様では、Lp-PLA2の阻害はLp-PLA2の遺伝子産物、例えば、Lp-PLA2のポリペプチドもしくはタンパク質、またはそのアイソフォームの発現の阻害および/または活性の阻害である。本明細書で使用されるように、「遺伝子産物」という用語は、遺伝子から転写されたRNA、または遺伝子によりコードされ、もしくはRNAから翻訳されたポリペプチドを示す。
【００６０】
いくつかの態様では、Lp-PLA2の阻害は作用物質による。任意の作用物質を使用することができ、例えば、核酸、核酸類似体、ペプチド、ファージ、ファージミド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、リボソーム、アプタマー、抗体、有機もしくは無機の小分子もしくは大分子、または任意のそれらの組みあわせであるが、それらに限定されない。いくつかの態様では、本発明の方法において有用な作用物質としては、Lp-PLA発現の阻害剤、例えばLp-PLAをコードするmRNAの阻害剤として機能する作用物質が挙げられる。
【００６１】
本明細書で開示した方法において有用な作用物質はまた、遺伝子発現を阻害する(すなわち、遺伝子の発現を抑制および/または抑圧する)ことができる。そのような作用物質は当技術分野では、「遺伝子サイレンサー」と呼ばれ、普通当業者に公知である。例としては、核酸配列、RNA、DNA、または核酸類似体が挙げられるが、それらに限定されず、一本鎖または二本鎖とすることができ、対象タンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸、核酸類似体、例えば限定はされないが、ペプチド-核酸(PNA)、偽相補性PNA(pc-PNA)、ロックド核酸(LNA)およびそれらの誘導体などを含む群より選択することができる。核酸作用物質としては、例えば、転写抑制因子、アンチセンス分子、リボザイム、小さな抑制核酸配列として機能する、タンパク質をコードする核酸配列、例えば限定はされないがRNAi、shRNAi、siRNA、マイクロRNAi(miRNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６２】
本明細書で使用されるように、Lp-PLA2発現の阻害剤および/またはLp-PLA2タンパク質機能の阻害として本発明で有用な作用物質は任意の型の実体とすることができ、例えば、限定はされないが、化学物質、核酸配列、核酸類似体、タンパク質、ペプチドまたはそれらのフラグメントである。いくつかの態様では、作用物質は任意の化学物質、実体または部分であり、限定はされないが、合成および天然の非タンパク性実体が含まれる。ある態様では、作用物質は化学部分を有する小分子である。例えば、いくつかの態様では、化学部分は本明細書で開示されるピリミジオン系化合物である。
【００６３】
別の態様では、本明細書で開示した方法において有用な作用物質はタンパク質および/もしくはペプチドまたはそれらのフラグメントであり、これらは、Lp-PLA2の遺伝子発現またはLp-PLA2タンパク質の機能を阻害する。そのような作用物質としては、例えば、タンパク質変異体、変異タンパク質、治療タンパク質、トランケートタンパク質およびタンパク質フラグメントが挙げられるが、それらに限定されない。タンパク質作用物質はまた、変異タンパク質、遺伝子工学により合成されたタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ミディボディ、ミニボディ、トリアボディ、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾タンパク質およびそれらのフラグメントを含む群より選択することができる。
【００６４】
また、Lp-PLA2阻害剤として、本明細書で開示した方法において有用な作用物質は、化学物質、小分子、大分子または実体もしくは部分とすることができ、限定はされないが、合成および天然の非タンパク性実体が含まれる。ある態様では、作用物質は本明細書で開示した化学部分を有する小分子である。
【００６５】
小分子
いくつかの態様では、Lp-PLA2を阻害する作用物質は小分子である。Lp-PLA2の不可逆および可逆阻害剤を本発明の方法で使用することができる。
【００６６】
Lp-PLA2の不可逆阻害剤は、特許出願WO 96/13484、WO 96/19451、WO 97/02242、WO 97/217675、WO 97/217676、WO 97/41098、およびWO 97/41099(SmithKline Beecham plc)において開示されており、これらは参照により本明細書に全体が特定的に組み入れられ、とりわけ、酵素Lp-PLA2の阻害剤である、様々なシリーズの4-チオニル/スルフィニル/スルホニルアゼチジノン化合物を開示する。これらは不可逆のアシル化阻害剤である(Tew et al, Biochemistry, 37, 10087, 1998)。
【００６７】
ヒトにおいて有効なLp-PLA2阻害剤は、当業者に普通に公知であり、評価を受けているもの、例えば、II相臨床試験を含む前臨床および臨床評価を受けているものが挙げられる。多くの出願がSmithKline Beechamおよびその後継者であるGlaxo SmithKlineにより提出され、公開されている。同じ者に譲渡された関連する公開された出願のリストは、下記であり、これらは参照により本明細書に全体が特定的に組み入れられる：WO 01/60805、WO 02/30904、WO 03/016287、WO 00/66567、WO 03/042218、WO 03/042206、WO 03/042179、WO 03/041712、WO 03/086400、WO 03/087088、WO 02/30911、WO 99/24420、WO 00/66566、WO 00/68208、WO 00/10980、およびWO 2005/021002。さらに、米国仮特許出願第60/829,328号および同第60/829,327号に言及するが、これらはどちらも2006年10月13日に出願され、これらもまた、参照により本明細書に全体が特定的に組み入れられる。
【００６８】
本明細書で開示した方法において有用な別のLp-PLA2阻害剤は公開された特許出願、例えば、WO 2006063791-A1、WO 2006063811-A1、WO 2006063812-A1、WO 2006063813-A1、全てBayer Healthcareの名の下；およびKorea Res. Inst. Bioscience & Biotechnologyに付与されたUS2006106017-A1において記載されており、これらは参照により本明細書に全体が特定的に組み入れられる。Lp-PLA2阻害剤はまた、公知の作用物質を含み、例えば、限定されないが、ナイアシン(www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=6724568を参照されたい)およびフェノフィブラート(www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=14817756&taxid=19を参照されたい)と共のスタチンの使用が挙げられる。
【００６９】
上記段落で示した出願は全て、参照により本明細書に組み入れられる。これらの文献において開示された化合物のいずれかまたは全てが、例えば、血管性認知症およびアルツハイマー病を含むがそれらに限定されない神経変性疾患および障害、ならびに、異常BBBが起こる開示された別の神経変性疾患の予防または治療に対し有用であると考えられる。実施例において例証されるように、本明細書で記載されるBBB透過性および神経変性疾患のブタモデルは、当業者により、開示した化合物または他のLp-PLA2阻害剤、例えば、抗体、またはRNAiのいずれが本明細書で主張した神経変性疾患または障害の治療または阻止に有効であるかを決定するために使用されることができる。いくつかの態様では、Lp-PLA2を阻害する作用物質は、BBB透過性を軽減することに対する効果に対し、動物モデルで評価することができる。例えば、本明細書の実施例で開示した高血糖症および高コレステロール血症のブタモデルを使用することができ、この場合、BBB透過性が異常であり、例えば、BBBが透過性であり、ここで、BBB透過性は当業者に普通に公知の方法によりLp-PLA2に対する阻害剤の存在下で、および阻害剤無しで評価することができる。いくつかの態様では、例えば、米国特許第6,884,591号に開示されているように、BBB機能に対するマーカーを使用することができ、この特許は参照により全体が組み入れられる。
【００７０】
特定の態様では、参照により本明細書に全体が特定的に組み入れられる米国特許第6,649,619号および同第7,153,861号(および国際特許出願WO 01/60805)、ならびに米国特許第7,169,924号、参照により本明細書に全体が特定的に組み入れられる(および国際特許出願WO 02/30911)、において開示されているLp-PLA2阻害剤は血管性認知症、例えばアルツハイマー病および/またはBBB透過性の障害の予防または治療のための本明細書で開示した方法において有用である。いくつかの態様では、参照により本明細書に全体が組み入れられる米国特許公開第2005/0033052A1、ならびに国際特許出願WO 02/30904、WO 03/042218、WO 03/042206、WO 03/042179、WO 03/041712、WO 03/086400、およびWO 03/87088で開示されているLp-PLA2阻害剤は可逆Lp-PLA2阻害剤である。
【００７１】
式(I)
WO 01/60805において開示されている、一群の可逆Lp-PLA2阻害剤を使用することができ、WO 01/60805から米国特許第6,649,619号および同第7,153,861号が生じ、これらは参照により本明細書に全体が組み入れられ、WO 01/60805の開示内容は、本文書で示されているかのように、完全に本明細書に組み入れられる。対象の化合物のより狭い群はWO 01/60805において記載され、米国特許第6,649,619号および同第7,153,861において主張されている式(I)のものであり、すなわち下記のものであるかまたはその薬学的に許容される塩である：
2010526805.tif 000002
式中、
RaおよびRbはこれらが付着しているピリミジン環炭素原子と共に、縮合5-員炭素環を形成し；
R2は1〜3のフッ素原子により置換されるフェニルであり；
R3はNR8R9により置換されるメチルまたはC(1〜3)アルキルであり；または
R3はHet-C(0〜2)アルキルであり、ここで、HetはNを有する5-〜7-員ヘテロ環であり、ここで、Nは非置換であり、またはC(1〜6)アルキルにより置換され；
R4およびR5は共に、4-(4-トリフルオロメチルフェニル)フェニル部分を形成し；
同じかまたは異なるものとすることができるR8およびR9は水素、またはC(1〜6)アルキルからなる群より選択され；
XはSである。
【００７２】
さらにいっそう関心対象であるものは下記化合物、または、これらの化合物の薬学的に許容される塩であり、それらは全て式(I)の範囲内にあり、上記出願および特許において開示されている：
1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン、本明細書で記載したブタ研究で使用される；
1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(2,3-ジフルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン；
1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(3,4-ジフルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン；
1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(2,3,4-トリフルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン；
1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(2-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン；
1-(N-メチル-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン；
1-(N-(2-(1-ピペリジノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン；
1-(N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン；
1-(N-(2-エチルアミノ-2-メチルプロピル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン；
N-(2-tert-ブチルアミノエチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン；
1-(N-(1-メチルピペリジン-4-イル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン；
1-(N-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン；
1-(N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン；
1-(N-(2-(エチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン。
【００７３】
これらの化合物を調製するための方法は言及した文書において開示されている
1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)-アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オンを製造するための第2の方法は、出願WO 03/016287(米国特許公開第20050014793A1号)において見出すことができ、この出願は参照により全体が本明細書に組み入れられる。
【００７４】
式(II)
本発明の方法を実施するのに有用である可能性のある化合物の別の群がWO 02/30911において開示されており；米国特許第7,169,924号がこの国際出願に対応する。どちらも完全に本明細書に組み入れられる。その場合の一般式は、ここで式(II)として示すが、下記の通りである：
2010526805.tif 000003
式中、
R1は、C(1〜6)アルキル、C(1〜6)アルコキシ、C(1〜6)アルキルチオ、ヒドロキシ、ハロゲン、CN、およびモノ〜パーフルオロ-C(1〜4)アルキルから選択される同じかまたは異なるものとすることができる、1、2、3または4つの置換基で置換されてもよいアリール基であり；
R2は、ハロゲン、C(1〜3)アルキル、C(1〜3)アルコキシ、ヒドロキシC(1〜3)アルキル、C(1〜3)アルキルチオ、C(1〜3)アルキルスルフィニル、アミノC(1〜3)アルキル、モノ-またはジ-C(1〜3)アルキルアミノC(1〜3)アルキル、C(1〜3)アルキルカルボニルアミノC(1〜3)アルキル、C(1〜3)アルコキシC(1〜3)アルキルカルボニルアミノC(1〜3)アルキル、C(1〜3)アルキルスルホニルアミノC(1〜3)アルキル、C(1〜3)アルキルカルボキシ、C(1〜3)アルキルカルボキシC(1〜3)アルキルであり；および
R3は、水素、ハロゲン、C(1〜3)アルキル、またはヒドロキシC(1〜3)アルキルであり；または
R2およびR3は、これらが付着しているピリミドン環炭素原子と共に縮合5-または6-員炭素環を形成し；または
R2およびR3は、これらが付着しているピリミドン環炭素原子と共に、ハロゲン、C(1〜4)アルキル、シアノ、C(1〜6)アルコキシ、C(1〜6)アルキルチオまたはモノ〜パーフルオロ-C(1〜4)アルキルから選択される同じかまたは異なるものとすることができる、1、2、3または4つの置換基で置換されてもよい、縮合ベンゾまたはヘテロアリール環を形成し；
R4は水素、非置換とすることができ、またはヒドロキシ、ハロゲン、OR7、COR7、カルボキシ、COOR7、CONR9R10、NR9R10、NR7COR8、モノ-またはジ-(ヒドロキシC(1〜6)アルキル)アミノおよびN-ヒドロキシC(1〜6)アルキル-N-C(1〜6)アルキルアミノから選択される1、2または3つの置換基で置換することができるC(1〜6)アルキルであり；または
R4はHet-C(0〜4)アルキルであり、ここで、HetはNおよび任意でOまたはSを有する5-〜7-員ヘテロ環であり、ここで、Nは、ヒドロキシ、ハロゲン、OR7、COR7、カルボキシ、COOR7、CONR9R10またはNR9R10から選択される1、2または3つの置換基で置換されてもよいCOR7、COOR7、CONR9R10、またはC(1〜6)アルキルにより置換することができ、例えば、ピペリジン-4-イル、ピロリジン-3-イルであり；
R5はC(1〜6)アルキル、C(1〜6)アルコキシ、C(1〜6)アルキルチオ、アリールC(1〜6)アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、CN、COR7、カルボキシ、COOR7、NR7COR8、CONR9R10、SO2NR9R10、NR7SO2R8、NR9R10、モノ〜パーフルオロ-C(1〜4)アルキルおよびモノ〜パーフルオロ-C(1〜4)アルコキシから選択される、同じかまたは異なるものとすることができる、1、2、3または4つの置換基で置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール環であり；
R6は、C(1〜18)アルキル、C(1〜18)アルコキシ、C(1〜6)アルキルチオ、C(1〜6)アルキルスルホニル、アリールC(1〜6)アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、CN、COR7、カルボキシ、COOR7、CONR9R10、NR7COR8、SO2NR9R10、NR7SO2R8、NR9R10、モノ〜パーフルオロ-C(1〜4)アルキルおよびモノ〜パーフルオロ-C(1〜4)アルコキシ、またはC(5〜10)アルキルから選択される、同じかまたは異なるものとすることができる、1、2、3または4つの置換基でさらに置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール環であり；
R7は水素またはC(1〜12)アルキル、例えばC(1〜4)アルキル(例えば、メチルまたはエチル)であり；
R8は水素、OC(1〜6)アルキル、またはC(1〜12)アルキル、例えばC(1〜4)アルキル(例えば、メチルまたはエチル)であり；
同じかまたは異なるものとすることができるR9およびR10は、それぞれ、水素、もしくはC(1〜12)アルキルから選択され、または、R9およびR10はそれらが付着している窒素と共に、任意で、酸素、窒素および硫黄から選択される1つまたは複数の別のヘテロ原子を含んでもく、かつヒドロキシ、オキソ、C(1〜4)アルキル、C(1〜4)アルキルカルボキシ、アリール、例えばフェニル、またはアラルキル、例えばベンジルから選択される1つまたは2つの置換基で置換されてもよい、5〜7員環、例えばモルホリンまたはピペラジンを形成し；ならびに
Xはメチルおよびエチルから選択される1、2または3つの置換基で置換されてもよいC(2〜4)アルキレン、またはCH=CHである。
【００７５】
式(II)の全ての塩は同様に、本発明の治療法において使用することができる。
【００７６】
WO 02/30911において式(I)に対して示されているように、R1はハロ、C1〜C6アルキル、トリフルオロメチルまたはC1〜C6アルコキシから選択される、同じかまたは異なるものとすることができる1、2、3または4つの置換基で置換されてもよいフェニル基とすることができる、本明細書の式(II)の化合物は特に関心対象である。より詳細には、フェニルは非置換であり、または1、2、3もしくは4つのハロゲン置換基、特に、1〜3つのフルオロ基、および最も特定的には、2,3-ジフルオロ、2,4-ジフルオロまたは4-フルオロにより置換される。
【００７７】
本明細書では式(II)の別の態様は、Yが-CH2CH2-である場合である。
【００７８】
さらに、R2が、初期設定で水素であるか、または、ハロ、C1〜C6アルキル、モノ〜パーフルオロC1〜C4アルキル、モノ〜パーフルオロC1〜C46アルコキシ、もしくはC1〜C6アルコキシであり；特にモノ〜パーフルオロC1〜C4アルキル、モノ〜パーフルオロC1〜C4アルコキシ、もしくはC1〜C6アルコキシである、式(II)の化合物が関心対象である。R2が、水素以外であり、(R2)nにおけるnは1、2または3であり、置換パターンがメタおよび/またはパラ、特にパラ、すなわち、4-位置換基である、式(II)の化合物が特に関心対象である。R2が4-トリフルオロメチルまたは4-トリフルオロメトキシである化合物も参照されたい。
【００７９】
R3およびR4は、同じかまたは異なるものとすることができ、メチル、エチル、n-プロピル、またばn-ブチルである。R3およびR4が同じであり、メチルまたはエチルである、本明細書の式(II)の化合物が特に関心対象であり；メチルが特に関心対象である。
【００８０】
R5は水素、直鎖、または分枝であるC(1〜6)アルキルとすることができる。メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、iso-ブチル、t-ブチル、n-ペンチルまたはn-ヘキシルが特に関心対象である。
【００８１】
本明細書の式(II)の化合物には、下記の化合物の別のサブグループが含まれることは認識されるであろう：
R1は2,3ジフルオロにより置換されたフェニルであり；
R2およびR3は、これらが付着しているピリミジン環炭素原子と共に、縮合5-員シクロペンテニル環を形成し、
R4は2-(ジエチルアミノ)エチルであり；
R5はフェニルであり；
R6は4位でトリフルオロメチルにより置換されたフェニル、または5-位でトリフルオロメチルにより置換されたチエン-2-イルであり；および
Xは(CH2)2である。
【００８２】
関心対象である本明細書の式(II)の特定の化合物は下記の通りである：
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-エチルアミノ-2-メチル-プロピル)-2-(2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-t-ブチルアミノエチル)-2-(2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチル-ピペリジン-4-イル)-2-(2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-(2-(4-フルオロ-2-(トリフルオロメチル)フェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-(2-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-(2-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
(+/-)-N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-フェニル-プロピル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-(2-(2,4-ジフルオロフェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-(2-(2,5-ジフルオロフェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-(2-(3,4-ジフルオロフェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-(2-(2-フルオロフェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-(2-(3-フルオロフェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-(2-(3-クロロフェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-(2-(4-クロロフェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-(2-(4-メチルフェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-(2-(4-(トリフルオロメチル)フェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-(2-(4-メトキシフェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-(2-(2-(4-(トリフルオロメトキシ)フェニル)-エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル)-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
または、重酒石酸塩のいずれかの遊離塩基、もしくは他の薬学的に許容される塩。
【００８３】
さらに、WO 02/30904において開示されている式(III)の化合物または薬学的に許容されるそれらの塩が関心対象である：
2010526805.tif 000004
式中、
R1は、C(1〜6)アルキル、C(1〜6)アルコキシ、C(1〜6)アルキルチオ、ヒドロキシ、ハロゲン、CN、モノ〜パーフルオロ-C(1〜4)アルキル、モノ〜パーフルオロ-C(1〜4)アルコキシアリール、およびアリールC(1〜4)アルキルから選択される同じかまたは異なるものとすることができる、1、2、3または4つの置換基で置換されてもよいアリール基であり；
R2は、ハロゲン、C(1〜3)アルキル、C(1〜3)アルコキシ、ヒドロキシC(1〜3)アルキル、C(1〜3)アルキルチオ、C(1〜3)アルキルスルフィニル、アミノC(1〜3)アルキル、モノ-またはジ-C(1〜3)アルキルアミノC(1〜3)アルキル、C(1〜3)アルキルカルボニルアミノC(1〜3)アルキル、C(1〜3)アルコキシC(1〜3)アルキルカルボニルアミノC(1〜3)アルキル、C(1〜3)アルキルスルホニルアミノC(1〜3)アルキル、C(1〜3)アルキルカルボキシ、C(1〜3)アルキルカルボキシC(1〜3)アルキルであり；および
R3は、水素、ハロゲン、C(1〜3)アルキル、またはヒドロキシC(1〜3)アルキルであり；または
R2およびR3は、これらが付着しているピリドン環炭素原子と共に縮合5-または6-員炭素環を形成し；または
R2およびR3は、これらが付着しているピリドン環炭素原子と共に、ハロゲン、C(1〜4)アルキル、シアノ、C(1〜3)アルコキシC(1〜3)アルキル、C(1〜4)アルコキシ、またはC(1〜4)アルキルチオまたはモノ〜パーフルオロ-C(1〜4)アルキルから選択される同じかまたは異なるものとすることができる、1、2、3または4つの置換基で置換されてもよい、縮合ベンゾまたはヘテロアリール環を形成し；
R4は水素、非置換とすることができ、またはヒドロキシ、ハロゲン、OR7、COR7、カルボキシ、COOR7、CONR9R10、NR9R10、NR7COR8、モノ-またはジ-(ヒドロキシC(1〜6)アルキル)アミノおよびN-ヒドロキシC(1〜6)アルキル-N-C(1〜6)アルキルアミノから選択される1、2または3つの置換基で置換することができるC(1〜6)アルキルであり；または
R4はHet-C(0〜4)アルキルであり、ここで、HetはNおよび任意でOまたはSを有する5-〜7-員ヘテロ環であり、ここで、Nは、ヒドロキシ、ハロゲン、OR7、COR7、カルボキシ、COOR7、CONR9R10またはNR9R10から選択される1、2または3つの置換基で置換されてもよいCOR7、COOR7、CONR9R10、またはC(1〜6)アルキルにより置換することができ、例えば、ピペリジン-4-イル、ピロリジン-3-イルであり；
R5はC(1〜6)アルキル、C(1〜6)アルコキシ、C(1〜6)アルキルチオ、アリールC(1〜6)アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、CN、COR7、カルボキシ、COOR7、NR7COR8、CONR9R10、SO2NR9R10、NR7SO2R8、NR9R10、モノ〜パーフルオロ-C(1〜4)アルキルおよびモノ〜パーフルオロ-C(1〜4)アルコキシから選択される、同じかまたは異なるものとすることができる、1、2、3または4つの置換基で置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール環であり；
R6は、C(1〜6)アルキル、C(1〜6)アルコキシ、C(1〜6)アルキルチオ、C(1〜6)アルキルスルホニル、アリールC(1〜6)アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、CN、COR7、カルボキシ、COOR7、CONR9R10、NR7COR8、SO2NR9R10、NR7SO2R8、NR9R10、モノ〜パーフルオロ-C(1〜4)アルキルおよびモノ〜パーフルオロ-C(1〜4)アルコキシ、またはC(5〜10)アルキルから選択される、同じかまたは異なるものとすることができる、1、2、3または4つの置換基でさらに置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール環であり；
R7およびR8は独立して、水素またはC(1〜12)アルキル、例えばC(1〜4)アルキル(例えば、メチルまたはエチル)であり；
R9およびR10は同じかまたは異なるものとすることができ、それぞれ、水素、もしくはC(1〜12)アルキルから選択され、または、R9およびR10はそれらが付着している窒素と共に、任意で、酸素、窒素および硫黄から選択される1つまたは複数の別のヘテロ原子を含んでもく、かつヒドロキシ、オキソ、C(1〜4)アルキル、C(1〜4)アルキルカルボキシ、アリール、例えばフェニル、またはアラルキル、例えばベンジルから選択される1つまたは2つの置換基で置換されてもよい、5〜7員環、例えばモルホリンまたはピペラジンを形成し；ならびに
XはC(2〜4)アルキレン基(メチルおよびエチルから選択される1、2または3つの置換基で置換されてもよい)、CH=CH、(CH2)nSまたは(CH2)nOであり、ここで、nは1、2または3である。
【００８４】
R2およびR3が、これらが付着しているピリドン環炭素原子と共に、ハロゲン、C(1〜4)アルキル、シアノ、C(1〜4)アルコキシまたはC(1〜4)アルキルチオ、またはモノ〜パーフルオロ-C(1〜4)アルキルから選択される同じかまたは異なるものとすることができる、1、2、3または4つの置換基で置換されてもよい、縮合ベンゾまたはヘテロアリール環を形成する、式(III)の化合物が特に関心対象である。好ましくは、R1は、ハロゲン、C(1〜6)アルキル、トリフルオロメチル、C(1〜6)アルコキシ、好ましくは、1〜3のフルオロ、より好ましくは、2,3-ジフルオロで置換されてもよいフェニルである。R4の代表的な例としては、1-位が、メチル、イソプロピル、1-(2-メトキシエチル)、1-(2-ヒドロキシエチル)、t-ブトキシカルボニルまたはエトキシカルボニルメチルにより置換されたピペリジン-4-イル；2位がアミノエチルで置換されたエチル；1-エチルピペリジニルメチル；ピペリジン-4-イル；3-ジエチルアミノプロピル；4-ピロリジン-1-イルブチルおよび1-エチルピロリジン-3-イルが挙げられる。好ましくは、R4は1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル、1-メチルピペリジン-4-イルまたは1-エチルピロリジン-3-イルである。R5の代表的な例としてはフェニルおよびピリジルが挙げられる。好ましくは、R5はフェニルである。R6の代表的な例としては、ハロゲン、またはトリフルオロメチル、好ましくは4-位で、およびヘキシルで置換されてもよいフェニルが挙げられる。好ましくは、R6は4位がトリフルオロメチルにより置換されたフェニルである。R6の別の代表的な例としては、1または複数のC(1〜3)アルキルにより置換されたフェニルが挙げられる。好ましくは、R6は4-位がエチルにより置換されたフェニルである。好ましくは、R5およびR6は共に4-(フェニル)フェニルまたは2-(フェニル)ピリジニル置換基を形成し、この場合、遠く離れたフェニル環は、ハロゲンまたはトリフルオロメチルにより、好ましくは4-位で置換されてもよい。好ましくは、XはC(2〜4)アルキレン、より好ましくはC(2〜3)アルキレン、最も好ましくは、(CH2)2、またはCH2Sである。
【００８５】
本明細書の式(III)を有する化合物の群には、下記の化合物の別のサブグループが含まれることは認識されるであろう：
R1は2,3ジフルオロにより置換されたフェニルであり；
R2およびR3は、これらが付着しているピリドン環炭素原子と共に、縮合ベンゾまたはピリド環を形成し、
R4は1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イルであり；
R5およびR6は共に4-(フェニル)フェニル置換基を形成し、この場合、遠く離れたフェニル環は、トリフルオロメチルにより、好ましくは4-位で置換され；ならびに
XはCH2Sまたは(CH2)2である。
【００８６】
式(III)の下記化合物、またはその遊離塩基、もしくは別の薬学的に許容される塩が関心対象である：
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-5,6-トリメチレン-ピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(1-メチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-メチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-エチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[5-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-2-メチル-7-オキソ-7H-チアゾロ[4,5-b]ピリジン-4-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
(±)N-(1-エチルピロリジン-3-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
(±)N-(1-エチルピロリジン-3-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド二塩酸塩；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミドモノパラトルエンスルホネート；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド一塩酸塩；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド二塩酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(4-フルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(4-フルオロベンジルチオ)-4-オキソ-5,6-トリメチレンピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-5,6-トリメチレンピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(4-フルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(3,4-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2-フルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(3-クロロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル)]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル)]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ピロリジン-1-イルエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ピペリジン-1-イルエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)7-フルオロ-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-5-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-2-メチル-7-オキソ-7H-チエノ[3,2-b]ピリジン-4-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-5,6-ジメチル-4-オキソ-4H-ピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-5-エチル-4-オキソ-4H-ピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-メチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-チエノ[3,4-b]ピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ピロリジン-1-イルエチル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[6-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-2-メチル-4-オキソ-4H-ピラゾロ[3,4-b]ピリジン-7-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イルメチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(3-ジエチルアミノプロピル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(4-ピロリジン-1-イルブチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(3-ジエチルアミノプロピル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(4-ピロリジン-1-イルブチル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[5-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-7-オキソ-7H-チエノ[3,2-b]ピリジン-4-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[5-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-2-メチル-7-オキソ-7H-チアゾロ[4,5-b]ピリジン-4-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-エチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-エチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-イソプロピルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-イソプロピルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-メチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-メチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エトキシカルボニルメチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(3’,4’-ジメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-(t-ブトキシカルボニル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(3’,4’-ジフルオロビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[6-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-チエノ-[2,3-b]ピリジン-7-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-メチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3,4-トリフルオロフェニルエチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[6-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-2-メチル-4-オキソ-2,4-ジヒドロピラゾロ[3,4-b]ピリジン-7-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[6-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-2-エチル-4-オキソ-2,4-ジヒドロピラゾロ[3,4-b]ピリジン-7-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[6-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-2-イソプロピル-4-オキソ-2,4-ジヒドロピラゾロ[3,4-b]ピリジン-7-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-エチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-2-[5-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-2-メチル-7-オキソ-7H-チアゾロ[4,5-b]ピリジン-4-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[5-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-2-メチル-7-オキソ-7H-チアゾロ[4,5-b]ピリジン-4-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-5,6-トリメチレンピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-メチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-5,6-トリメチレンピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-5,6-トリメチレンピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-5,6-トリメチレンピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[5-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-2-メチル-7-オキソ-2,7-ジヒドロピラゾロ[4,3-b]ピリジン-4-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[5-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-1-メチル-7-オキソ-1,7-ジヒドロピラゾロ[4,3-b]ピリジン-4-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-5,6-トリメチレンピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-7-メチル-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-7-メチル-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-メチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-7-メチル-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-7-メチル-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-7-メチル-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-メチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-5,6-トリメチレンピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-5,6-トリメチレンピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-5,6-トリメチレンピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-5,6-トリメチレンピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-5,6-テトラメチレンピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-メチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-クロロビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-メチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-クロロビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-クロロビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-クロロビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-クロロビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[6-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-2-メチル-4-オキソ-4H-ピラゾロ[3,4-b]ピリジン-7-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(1-(t-ブトキシカルボニル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(1-エチルピペリジン-4-イル)-2-[6-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-2-(2-メトキシエチル)-4-オキソ-4H-ピラゾロ[3,4-b]ピリジン-7-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[4-オキソ-2-(2-(2,3,4-トリフルオロフェニル)エチル)-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(3-フルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-5,6-トリメチレンピリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-[1,8]ナフチリジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩；
N-(2-エチルアミノエチル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(2-エチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(1-(2-ヒドロキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩。
【００８７】
式(IV)
式(IV)の化合物、またはその薬学的に許容される塩もまた関心対象である：
2010526805.tif 000005
式中、
R1は非置換の、または、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシ、C1〜C6アルキルチオ、アリールC1〜C6アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、CN、COR6、COOR6、NR6COR7、CONR8R9、SO2NR8R9、NR6SO2R7、NR8R9、ハロC1〜C4アルキル、およびハロC1〜C4アルコキシからなる群より選択される同じかまたは異なるものとすることができる1、2、3もしくは4つの置換基で置換された、アリール基であり；
WはCHおよびXはNであり、またはWはNおよびXはCHであり、WおよびXはどちらもCHであり、またはWおよびXはNであり；
YはC2〜C4アルキルであり；
R2は水素、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシ、C1〜C6アルキルチオ、アリールC1〜C6アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、CN、COR6、カルボキシ、COOR6、NR6COR7、CONR8R9、SO2NR8R9、NR6SO2R7、NR8R9、モノ〜パーフルオロ-C1〜C6アルキル、またはモノ〜パーフルオロ-C1〜C6アルコキシであり；
nは0〜5であり；
R3はC1〜C4アルキルであり；
R4はC1〜C4アルキルであり；
R5は水素、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、ハロC1〜C4アルキル、C3〜C8シクロアルキル、C3〜C8シクロアルキル、C3〜C8シクロアルキルC1〜C4アルキル、C5〜C8シクロアルケニル、C5〜C8シクロアルケニルC1〜C4アルキル、3〜8員ヘテロシクロアルキル、3〜8員ヘテロシクロアルキルC1〜C4アルキル、C6〜C14アリール、C6〜C14アリールC1〜C10アルキル、ヘテロアリール、またはヘテロアリールC1〜C10アルキルであり；ここで、各基は任意で1回または複数回、C1〜C6アルコキシ、C1〜C6アルキルチオ、アリールC1〜C6アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、CN、NR8R9、またはハロC1〜C4アルコキシである同じおよび/または異なる基によるものであり；
R6およびR7は独立して水素またはC1〜C10アルキルであり；
R8およびR9は同じかまたは異なり、水素もしくはC1〜C10アルキルであり、またはR9およびR10はこれらが付着している窒素と共に、任意で酸素、窒素および硫黄から選択される1つまたは複数の別のヘテロ原子を含み、ヒドロキシ、オキソ、C1〜C4アルキル、C1〜C4アルキルカルボキシ、アリールおよびアリールC1〜C4アルキルからなる群より選択される1つまたは2つの置換基で置換されてもよい5〜7員環を形成する。
【００８８】
式(IV)の範囲から任意の規定した置換基および/またはそれらの列挙したラジカルを排除しようとするものではないが、下記R基および関連するラジカルが特に関心対象である。
【００８９】
R1に関しては、ハロ、C1〜C6アルキル、トリフルオロメチルまたはC1〜C6アルコキシから選択される同じかまたは異なるものとすることができる1、2、3もしくは4つの置換基で置換されてもよいフェニル基とすることができる。より詳細には、フェニルは非置換であり、または1、2、3もしくは4つのハロゲン置換基、特に、1〜3のフルオロ基、および最も特定的には、2,3-ジフルオロ、2,4-ジフルオロまたは4-フルオロで置換される。
【００９０】
式(I)の別な態様はYが-CH2CH2-である場合である。
【００９１】
本発明はまた、R2が初期設定で水素であり、または、ハロ、C1〜C6アルキル、モノ〜パーフルオロC1〜C4アルキル、モノ〜パーフルオロC1〜C46アルコキシ、もしくはC1〜C6アルコキシであり；特にモノ〜パーフルオロC1〜C4アルキル、モノ〜パーフルオロC1〜C4アルコキシ、もしくはC1〜C6アルコキシである、式(I)の化合物を提供する。R2が、水素以外であり、(R2)nにおけるnは1、2または3であり、置換パターンがメタおよび/またはパラ、特にパラ、すなわち、4-位置換基である、化合物が特に関心対象である。例示化合物として、R2が4-トリフルオロメチルまたは4-トリフルオロメトキシであるものが挙げられる。
【００９２】
R3およびR4は、同じかまたは異なるものとすることができ、メチル、エチル、n-プロピル、またばn-ブチルである。R3およびR4が同じであり、メチルまたはエチルである、式(I)の化合物が特に関心対象であり；メチルが特に関心対象である。
【００９３】
R5は水素、直鎖、または分枝であるC(1〜6)アルキルとすることができる。メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、iso-ブチル、t-ブチル、n-ペンチルまたはn-ヘキシルが特に関心対象である。
【００９４】
上記化合物のいずれも結晶または非結晶形態で調製することができ、結晶の場合、溶媒和、例えば水和させることができる。本発明は化学量論的溶媒和物(例えば、水和物)をその範囲内に含む。
【００９５】
本明細書で記載した化合物のうちのある化合物は1つまたは複数のキラル原子を含むことができ、または、そうでなければ、2つの鏡像異性体として存在することができる。本明細書で記載した方法において有用な化合物は、鏡像異性体混合物、および精製した鏡像異性体または鏡像異性的に強化された混合物を含む。式(I)〜(IV)により示される化合物の個々の異性体、ならびに任意の全体的に、または部分的に平衡化されたそれらの混合物もまた、本発明の範囲内に含まれる。本発明はまた、請求した化合物の個々の異性体を、1つまたは複数のキラル中心が反転されたその異性体との混合物として、カバーしている。また、請求した化合物の任意の互変異性体および互変異性体混合物が、式(I)〜(IV)の化合物の範囲内に含まれることは理解される。異なる異性体形態は、従来の方法により互いに分離または分割することができ、または従来の合成法もしくは立体特異的あるいは非対称合成により任意のある異性体を得ることができる。
【００９６】
式(I)、(II)、(III)および(IV)の化合物の合成
式(I)、(II)および(III)の化合物を調製するための方法は特許文献において公表されている。例えば、式(I)を製造するための方法はWO 01/60805およびWO 03/016287において見出すことができる。式(II)の化合物を製造するための方法はWO 02/30911において記載されている。式(III)の化合物を製造するための方法はWO 02/30904において記載されている。この文献は式(IV)の化合物を製造するための方法、米国特許仮出願第60/829,328号および同第60/829,327号からコピーした方法を提供し、これらの仮出願は参照により本明細書に特定的に組み入れられる。
【００９７】
合成のいくつかの実施例を下記で提供する。本明細書の実施例における化合物のいくつかの一般的な群の間で識別するために、式(I)に関連する材料を「合成アプローチ(I)-1の実施例」と表示し(以下参照のこと)、式(II)に対しては、「合成アプローチ(II)-1の実施例」と表示し(以下参照のこと)、式(III)に対しては、「合成アプローチ(III)-1の実施例」と表示し(以下参照のこと)、ならびに、式(I)に対しては、「合成アプローチ(IV)-1の実施例」と表示する(以下参照のこと)。
【００９８】
式(I)の合成
式(I)の化合物は、WO 01/60805に開示されている、過程スキームIにより調製することができる。
【００９９】
スキーム1
2010526805.tif 000006
ここで、
L3はC(1〜6)アルキル基、例えばメチルであり；
R15はC(1〜6)アルキル基、例えばエチルまたはt-ブチルであり；
L1、L2、Ra、Rb、Rc、R2、R3、R4、R5、n、X、YおよびZはWO 01/60805で規定される通りである。
【０１００】
対象の式(I)の化合物を製造するための例示的な反応は下記の通りである。
【０１０１】
合成アプローチ(I)-1(a)の実施例
1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニル-メチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン
2010526805.tif 000007
WO 01/60805の中間体B69(87.1g、0.26mol)をジクロロメタン(2.9リットル)に懸濁させた。1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(35.2g、0.26mol.)および1-(3-ジメチルアミノピロリル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(99.7g、0.52mol.)を添加し、懸濁液を45分間撹拌し、これにより完全な溶液が得られた。WO 01/60805の中間体A30(91.2g、0.26mol)を、ジクロロメタン(100ml)に溶解した溶液として5分にわたり添加し、溶液を4時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム溶液：水混合物(1:1、1リットル)を添加し、溶液を10分間撹拌した。有機相を分離し、飽和塩化アンモニウム：水混合物(1:1、1リットル)で抽出し、抽出物はpH6であった。有機相を分離し、酢酸(10ml)を含む水(1リットル)で抽出し、抽出物はpH5であった。ジクロロメタン層を分離し、飽和炭酸ナトリウム溶液：水：飽和塩類混合物(1:3:0.2、1リットル)、pH10.5で、その後、飽和塩類溶液：水混合物(1:1、1リットル)で抽出した。褐色溶液を、脱色木炭(35g)の存在下、無水硫酸上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空で除去すると、暗褐色フォームが得られた。フォームを酢酸イソプロピル(100ml)に溶解し、溶媒を真空で除去した。暗褐色のゴム状残渣を沸騰酢酸イソプロピル(500ml)に溶解させ、室温で冷却し、種子形成させ、一晩中撹拌した。生成した淡クリーム色の固体を濾過して除去し、酢酸イソプロピル(100ml)で洗浄した。固体をシンターで1時間吸引乾燥させ、その後酢酸イソプロピル(400ml)から再結晶化させた。一晩中撹拌した後、形成した固体を濾過して除去し、酢酸イソプロピル(80ml)で洗浄し、真空で乾燥させると標題化合物が得られた、110g、63.5%収率。
2010526805.tif 000008
mp125℃(DSC-非対称吸熱による)
【０１０２】
合成アプローチ(I)-1(b)の実施例
1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニル-メチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン重酒石酸塩
WO 01/60805の実施例1の方法により、WO 01/60805の中間体A30およびB69から調製した。
2010526805.tif 000009
C36H38F4N4O2Sでは666が必要である。
【０１０３】
合成アプローチ(I)-1(c)の実施例
1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニル-メチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン塩酸塩
実施例(I)-1(a)由来の遊離塩基(3.00g、0.0045mol)を撹拌しながらイソプロパノール(30ml)に懸濁させ、45℃まで温めると、透明な溶液が得られた。溶液をその後、周囲温度まで冷却し、濃塩酸(0.40ml、0.045mol)を添加した。得られたスラリーをその後周囲温度で35分間撹拌し、その後0℃まで35分間冷却した。スラリーをその後濾過し、イソプロパノール(10ml)で、続いてヘプタン(30ml)で洗浄し、その後、真空下で乾燥させると標題化合物が白色固体として得られた(3.00g、95%)。
2010526805.tif 000010
【０１０４】
式(II)の合成
式(II)の化合物の製造方法ならびに上記指名化合物に対する中間体および最終生成物の例の記載は公開された国際出願WO 02/30911において見出すことができ、この出願は参照により本明細書に組み入れられる。本発明において有用な化合物を製造するための最終段階法は実施例(II)-1である。
【０１０５】
合成アプローチ(II)-1の実施例
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロシクロペンタピリミジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド重酒石酸塩
2010526805.tif 000011
ジクロロメタン(10ml)に溶解したN,N-ジエチル-N’-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)-エタン-1,2-ジアミン(WO 02/30911における中間体D4)(0.50g、1.44mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド(0.56g、1.45mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(0.12g)および2-(2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)-エチル]-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロシクロペンタピリミジン-1-イル)-酢酸(WO 02/30911における中間体C1)(0.48g、1.44mmol)の溶液を周囲温度で一晩中撹拌し、その後、ジクロロメタン(30ml)で希釈し、重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、蒸発させた。残渣をクロマトグラフィー(10gシリカカートリッジ、酢酸エチル-アセトン)により精製すると、標題化合物が黄色フォーム(遊離塩基)として得られた(0.50g、52%)。
2010526805.tif 000012
37H39F5N4O2では666が必要である。
【０１０６】
d-酒石酸(0.09g、0.60mmol)を、メタノール(10ml)に溶解した遊離塩基(0.40g、0.60mmol)の溶液に撹拌しながら添加した。得られた溶液を蒸発させると、塩が得られた(0.49g)。
2010526805.tif 000013
C37H39F5N4O2Sでは666が必要である。
【０１０７】
この過程、またはWO 02/30911で記載されている他の過程に従い、式(II)の構造を有する上記で指名した別の化合物を調製することができる。
【０１０８】
式(III)の合成
式(III)の化合物の全体の合成を、WO 02/30904で提示されるように、下記スキームIIIで示す。
【０１０９】
スキームIII
2010526805.tif 000014
【０１１０】
このスキームについて説明すると、エステル(IV)は通常、式中、R11は上記で規定された通りであり、例えば、(VI)はt-ブチルブロモアセテートまたはエチルブロモアセテートである(VI)を使用し、塩基、例えば、THFに溶解されたBuLiまたはN-メチルピロリジノン(NMP)に溶解された水素化ナトリウムの存在下で、(V)をN-1アルキル化することにより調製される(工程c)。
【０１１１】
XがCH2Sである場合、重要な中間体(IV)は、(XX)を、ヨウ化トリメチルスホキソニウムを水素化ナトリウムにより低温で処理することにより生成させたジメチルオキソスルホニウムメチリドと反応させることにより合成することができ、硫黄イリド(XXII)が得られる(工程q)。その後、(XXII)をジイソプロピルアミンの存在下、二硫化炭素で、続いて、R1CH2−L4、式中、L4は脱離基である、で処理すると、中間体(IV)が得られる(工程r)。
【０１１２】
あるいは、XがCH2Sである場合、R1 X置換基はピリジン(VIII)またはピリジンN-オキシド(XIV)のいずれかの上での脱離基L2(例えばCl)の置き換えにより導入することができ(工程e)、2-置換ピリジン(VII)および(XV)が得られる。(VII)または(XV)の4-ピリドン(V)への変換は、4-酸素の脱保護により(例えば、エタノール水溶液中である場合、R12がアリルである場合、(Ph3P)3RhClを使用して)(工程d)、続いて、(XVI)では、Pd/Cの存在下、酢酸中で水素を用いる、N-オキシド置換基の除去(工程k)により達成される。ピリジン(VIII)またはピリジンN-オキシド(XIV)は工程(i)、(h)、(g)、(f)および(j)により調製することができ、ここで、
(j)は(VIII)のジクロロメタンに溶解したm-クロロ過安息香酸による処理であり；
(f)は(IX)のDMFに溶解したR12OH(X)、式中、R12はアリルである、および水素化ナトリウムによる処理であり；
(g)は(XI)のオキシ塩化リンによる処理であり；
(h)は(XII)の加熱しながらのHCl水溶液による処理であり；
(i)は(XIII)のアルコールに溶解したジ低級アルキルマロネートおよびナトリウムアルコキシドによる処理(ここで、R13はC(1〜6)アルキルであり、典型的にはR13＝Etである)であり；および
R1-CH2SH(XIX)は、典型的にはチオアセテートから調製され、これは対応するアルキルブロミドR1-CH2Brから形成される。
【０１１３】
あるいは、XがCH2Sであり、R2およびR3がそれらが付着しているピリドン環炭素原子と共に縮合ベンゾ環を形成する場合、中間体(IV)は公知の開始材料から、工程(s)、(c)および(v)により合成することができ、ここで、
(s)はメルドラム酸(XXIII)の水素化ナトリウムによる低温での処理、続いて、フェニルイソチオシアネートによる反応、その後のR1CH2−L4による処理であり；
(c)は上記で記載した通りであり；
(v)は(XXV)のトリフルオロ酢酸による処理である。
【０１１４】
Xがアルキレンである場合、工程(m)および(h)(中間体(XVII)、(XVIII))または工程(n)および(p)(中間体(XIX)、(XX)、(XXI))を使用することが好ましく、ここで、
(h)は例えば、(XVII)R14=ClのHCl水溶液およびジオキサンによる処理、または、例えば、工程(d)の条件を使用したR14=OR12の脱保護による、4-置換ピリジンの4-ピリドンへの変換であり；
(m)は例えば、X=YCH2CH2である場合の、2-メチルピリジン(XVIII)の、THF中での、R1-Y-CH2−L4(XVI)、L4は脱離基である、および強塩基、例えばBuLiを用いた処理による、2-アルキルピリジンの鎖延長である。
【０１１５】
別の経路では、3-エステル基は中間体(XIX)R15=C(1〜6)アルキルから、ビフェニルエーテル中で加熱することにより除去され、ここで、R15=tBuであり(工程n)；中間体(XIX)は、2,6-ジオキソ-1,3-オキサジン(XX)およびエステル(XXI)から、塩基、例えばDMFに溶解されたNaHまたはジクロロメタンに溶解された1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エンを用いた処理により形成される。
【０１１６】
公知の開始材料からの(XX)の合成は、工程(w)および(c)または工程(y)および(c)を介して達成することができ、ここで、
(w)は(XXVII)の、THFに溶解したアジドトリメチルシランによる処理であり；
(y)は(XXVI)のホスゲンによる処理であり；
(c)は上記で記載した通りである。
【０１１７】
式(III)の化合物の製造方法のさらなる詳細および解説については、WO02/30904を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１８】
合成アプローチ(III)-1の実施例
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド
2010526805.tif 000015
遊離塩基は中間体E1および中間体A42から、溶媒としてジクロロメタンの代わりにDMFを使用することを除き、WO02/30904における実施例1の方法により調製した。この材料1.97gを酢酸n-ブチル(10ml)から結晶化させると標題化合物が得られた(1.35g)。
2010526805.tif 000016
C40H38F5N3O3Sでは735が必要である。
【０１１９】
式(IV)の合成
下記フローチャートは本発明の化合物を製造するための過程を示す。
2010526805.tif 000017
【０１２０】
さらに、読者は、このフローチャートで提示されている中間体のいくつかを調製するのに有用とすることができる化学に対しては、公開されたPCT出願WO 03/016287を参照する。それらの化学は、この場合に有用である程度まで、本明細書で完全に提示されているかのように、参照により本明細書に組み入れられる。さらに、上記の、公開されたPCT出願WO 01/60805、WO 02/30911、WO 02/30904、WO 03/042218、WO 03/042206、WO 03/041712、WO 03/086400、およびWO 03/087088、ならびに共に係属中の米国特許仮出願第60/829,328号および同第60/829,327号、どちらも2006年10月13日に出願、において提示されている合成が参照される。前記ページの経路における、中間体、試薬、溶媒、時間、温度、など、それら以外を用いることにより、式(IV)の化合物を調製することを、読者が望む程度まで、これらの公開されたPCT出願および共に係属中の米国特許出願は有用な助言を提供することができる。これらの出願における化学が本発明の化合物を製造するのに関連する程度まで、それらの材料は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２１】
中間体(IV)-A1{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミン
2010526805.tif 000018
この化合物の調製がWO 02/30911において中間体D7として記載されている。
【０１２２】
中間体(IV)-A2({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミン塩酸塩
2010526805.tif 000019
エタノール(2000ml)および濃塩酸(100ml)に溶解した4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニルカルボニトリル({4-[(トリフルオロメチル)オキシ]フェニル}ボロン酸から、4’-トリフルオロメチル類似体、WO 02/30911の中間体D6に対し記載されているものと類似の方法により調製)(66.6g)の溶液を、パールマン触媒(10g)上、25psiで、還元が完了するまで、水素化した。セライトを通して濾過することにより触媒を除去し、その後、溶媒を真空で除去すると所望の生成物が得られた。
LCMS Rt=2.212分；m/z[M+H]+=251.0
【０１２３】
式(IV)を製造するための中間体
中間体(IV)-A3
メチル2-メチル-2-(4-オキソ-1-ピペリジニル)プロパノアート
2010526805.tif 000020
メチル2-ブロモ-2-メチルプロパノアート(80.87ml、5当量)、4-ピペリドン塩酸塩一水和物(19.6g、1当量)、アセトニトリル(200ml)および炭酸カリウム(69.1g、4当量)の混合物を、還流しながら、窒素下、機械的に撹拌しながら17.5時間加熱し、その後、氷浴中で冷却し、その後、ジエチルエーテル(100ml)を添加した。混合物を、セライトを通して濾過し、続いてフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、10〜50%酢酸エチルを含むヘキサン)および生成物画分の蒸発を実施すると、所望の生成物が黄色油として得られた(14.28g)。
2010526805.tif 000021
【０１２４】
中間体(IV)-A4
エチル2-メチル-2-(4-オキソ-1-ピペリジニル)プロパノアート
2010526805.tif 000022
エチル2-ブロモ-2-メチルプロパノアート(48.3ml、5当量)、4-ピペリドン塩酸塩一水和物(100g、1当量)、アセトニトリル(1216ml)および炭酸カリウム(353g、4当量)の混合物を、還流しながら、窒素下、機械的に撹拌しながら20時間加熱し、その後、氷浴中で冷却し、その後、ジエチルエーテル(約1400ml)を添加した。混合物を、セライトを通して濾過し、真空で蒸発させ、その後、過剰のブロモエステルを蒸留して除去した(50℃静止ヘッド温度/10 Torr)。フラッシュクロマトグラフィー(シリカ、5〜30%酢酸エチルを含むヘキサン)および生成物画分の蒸発により、粗生成物が黄色油として得られた。いくらかの残ったブロモエステル汚染物質を除去するために、これを酢酸エチルと2M塩酸水溶液との間で分配させた。有機層を廃棄し、水層を炭酸ナトリウムで塩基性化し、塩化ナトリウムで飽和させ、酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を乾燥および蒸発させると、所望の生成物が黄色油として得られた(54.7g)。
2010526805.tif 000023
【０１２５】
中間体(IV)-A5
1,1-ジメチルエチル2-メチル-2-(4-オキソ-1-ピペリジニル)プロパノアート
2010526805.tif 000024
1,1-ジメチルエチル2-ブロモ-2-メチルプロパノアート(8.0g、1.1当量)、4-ピペリドン塩酸塩(5.0g、1当量)、アセトン(50ml)および炭酸カリウム(13.0g、3当量)の混合物を、還流下、撹拌しながら24時間加熱し、その後、濾過し、濾液を蒸発させた。粗残渣を次の工程で、精製せずに使用した。
ES+MS m/z[M+H-tBu]+=186.1
【０１２６】
中間体(IV)-B1
メチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート
2010526805.tif 000025
メチル2-メチル-2-(4-オキソ-1-ピペリジニル)プロパノアート(中間体A3)(14.28g、1当量)、{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミン(中間体A1)(19.6g、0.85当量)、DCE(300ml)、酢酸(3.8ml、0.90当量)およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(20.7g、1.25当量)の混合物を、室温で窒素下、17.5時間撹拌した。炭酸ナトリウム水溶液(2M溶液、過剰)を添加し、4時間撹拌し、その後、混合物を、ジエチルエーテルおよびTHFの混合物で抽出した。有機抽出物を水および塩類溶液で逆洗し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、シリカゲルパッドを通して濾過し、これを2.5%メタノールを含むDCMですすいだ。真空で蒸発させた後、粗生成物をエーテル/ヘキサンから、最後に氷浴温度で結晶化させ、乾燥後、白色固体が得られた(20.9g)。
LCMS Rt=2.070分；m/z[M+H]+=435.2
2010526805.tif 000026
【０１２７】
中間体(IV)-B2
エチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート
2010526805.tif 000027
エチル2-メチル-2-(4-オキソ-1-ピペリジニル)プロパノアート(中間体A4)(25.6g、1.2当量)、{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミン(中間体A1)(31.1g、1.0当量)、DCE(400ml)および酢酸(6.3ml、1.1当量)の混合物を、室温、窒素下で撹拌した。ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(33.5g、1.5当量)を添加し、19時間撹拌し続けた。炭酸ナトリウム水溶液(2M溶液、過剰)を添加し、1.5時間撹拌し、その後、混合物を、ジエチルエーテルおよびTHFの混合物で抽出した。有機抽出物を水および塩類溶液で逆洗し、シリカゲルパッドを通して濾過し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空で蒸発させた。所望の生成物が白色固体として得られ(44.2g)、これをさらに精製せずに使用した。
LCMS Rt=2.194分；m/z[M+H]+=449.3
2010526805.tif 000028
【０１２８】
中間体(IV)-B3
エチル2-メチル-2-{4-[({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}プロパノアート
2010526805.tif 000029
エチル2-メチル-2-(4-オキソ-1-ピペリジニル)プロパノアート(中間体A4)(1.09g、1.2当量)、({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミン塩酸塩(中間体A2)(1.28g、1.0当量)、DCE(21ml)および酢酸(0.27ml、1.1当量)の混合物を、室温、窒素下で撹拌した。ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(1.42g、1.5当量)を添加し、3時間撹拌し続けた。炭酸ナトリウム水溶液(2M溶液、過剰)を添加し、45分間撹拌し、その後、混合物を、ジエチルエーテル/THFおよび水の混合物で分配させた。有機抽出物を水および塩類溶液で逆洗し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空で蒸発させた。所望の生成物が淡黄色固体として得られ(2.14g)、これをさらに精製せずに使用した。
LCMS Rt=2.244分；m/z[M+H]+=465.3
【０１２９】
中間体(IV)-B4
1,1-ジメチルエチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート
2010526805.tif 000030
1,1-ジメチルエチル2-メチル-2-(4-オキソ-1-ピペリジニル)プロパノアート(中間体A6)(370mg、1.2当量)、{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミン(中間体A1)(397mg、1当量)、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(400mg、1.5当量)、DCM(10ml)および酢酸(0.076ml、1当量)の混合物を合わせ、室温で、LCMSによりアミン開始材料の消失が確認されるまで(約18時間)、撹拌した。炭酸ナトリウム水溶液を添加し、その後、DCMで抽出した。有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮すると、固体が得られ(420mg)、これをさらに精製せずに使用した。
LCMS Rt=2.24分；m/z[M+H]+=477.3
【０１３０】
中間体(IV)-C1
[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]酢酸
2010526805.tif 000031
この化合物の調製は、WO 02/30911において中間体C43として記載されている。
【０１３１】
中間体(IV)-C2
[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1,8-ナフチリジン-1(4H)-イル]酢酸
2010526805.tif 000032
この化合物の調製は、WO 02/30904において中間体E21として記載されている。
【０１３２】
中間体(IV)-C3
[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]酢酸
2010526805.tif 000033
この化合物の調製は、WO 02/30911において中間体C45として記載されている。
【０１３３】
中間体(IV)-C4
エチル[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸
2010526805.tif 000034
エチル(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリド[2,3-d]ピリミジン-1(2H)-イル)アセテート(WO 02/30911、中間体B52)(40.8g、1.2当量)および3-(2,4-ジフルオロフェニル)-プロパンイミドアミド(2,3-ジフルオロ異性体、WO 02/30911の中間体A1〜A3に対して記載されたものと類似の方法により製造)(30.0g、1当量)を150℃油浴中で25分間縮合させ、その後、水浴中で室温まで急冷した。クロマトグラフィー(シリカ、粗生成物をDCMに負荷し、50〜100%の酢酸エチルを含むヘキサンで溶離)により、所望の生成物が得られた(43.56g)。
LCMS Rt=2.521分；m/z[M+H]+=374.1
2010526805.tif 000035
【０１３４】
中間体(IV)-C5
[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸
2010526805.tif 000036
この化合物の調製は、WO 02/30911において中間体C35として記載されている。
【０１３５】
中間体(IV)-C5
[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸
2010526805.tif 000037
エチル[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセテート(中間体C1)(32.76g、1当量)をエタノール(350ml)および水(70ml)に溶解し、氷中で冷却し、その後、水酸化リチウム水溶液(2M溶液、43.42ml、0.99当量)を添加した。2時間、室温で撹拌し続けた。溶液を真空で濃縮し、残渣を水(700ml)および飽和重炭酸ナトリウム水溶液(50ml)に再び溶解し、その後、酢酸エチル(200ml)で洗浄した。水層を、2M塩酸で酸性化しpH2とし、沈殿を濾過して除去し、氷水(50ml)で洗浄し、真空で乾燥させる(50℃、16時間)と、所望の生成物が得られた(23.2g)。
2010526805.tif 000038
【０１３６】
実施例(IV)-1
メチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000039
[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]酢酸(中間体C1)(100mg、1当量)、メチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート(中間体B1)(130mg、1.03当量)、DIPEA(0.1ml、3.6当量)、アセトニトリル(2ml)およびHATU(130mg、1.4当量)の混合物を室温で1時間撹拌し、その後、蒸発させ、アセトニトリルに再び溶解させた。逆相HPLC(調製法A)による精製により、メチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートが得られた(128mg)。
LCMS Rt=2.686分；m/z[M+H]+=761.3
2010526805.tif 000040
【０１３７】
遊離塩基を、L-酒石酸(1.675g、1.0当量)を1度に添加することにより、重酒石酸塩に変換し、30分間室温で撹拌した。溶液を真空で濃縮するとオフホワイトの粉末が得られ、これを真空オーブン内、室温で乾燥させた。
【０１３８】
合成アプローチ(IV)-2の実施例
メチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1,8-ナフチリジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000041
[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1,8-ナフチリジン-1(4H)-イル]酢酸(中間体C2)(100mg、1当量)、カルボニルジイミダゾール(50mg、1.05当量)、およびジメチルアセトアミド(4ml)の混合物を60℃で30分間撹拌し、その後、メチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート(中間体B1)(132mg、1.05当量)を添加し、温度を80℃まで2時間上昇させた。さらに、カルボニルジイミダゾール(0.5当量)を添加し、80℃で15時間撹拌し続けた。冷却後、粗混合物を逆相HPLC(調製法A)に適用すると、メチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1,8-ナフチリジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートが得られた(99mg)。
LCMS Rt=2.845分；m/z[M+H]+=761.3
2010526805.tif 000042
【０１３９】
これを、合成アプローチ(I)の実施例に対して記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１４０】
合成アプローチ(IV)-3の実施例
エチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000043
[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]酢酸(中間体C1)(115mg、1当量)、エチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート(中間体B2)(150mg、1当量)、HATU(151mg、1.2当量)、DMF(2.7ml)およびDIPEA(0.17ml、3当量)の混合物を室温で5時間振盪させた。反応混合物を酢酸エチル/メタノールと重炭酸ナトリウム水溶液との間で分配させ、その後、有機層を塩類溶液で洗浄し、乾燥させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカ、3〜4%のメタノールを含むDCM)により、エチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートが白色固体として得られた(190mg)。
LCMS Rt=2.55分；m/z[M+H]+=775.3
2010526805.tif 000044
【０１４１】
これを、合成アプローチ(I)の実施例において記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１４２】
合成アプローチ(IV)-4の実施例
エチル2-{4-[{[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]アセチル}({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000045
[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]酢酸(中間体C1)(124mg、1.2当量)、エチル2-メチル-2-{4-[({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}プロパノアート(中間体B3)(139mg、1当量)、DMF(1.2ml)およびDIPEA(0.16ml、3当量)の混合物を室温で30分間振盪させ、その後、HATU(176mg、1.5当量)を添加し、4時間振盪し続けた。逆相HPLC(調製法B)により、エチル2-{4-[{[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]アセチル}({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}-2-メチルプロパノアートが白色固体として得られた(174mg)。
LCMS Rt=2.77分；m/z[M+H]+=791.3
2010526805.tif 000046
【０１４３】
これを、合成アプローチ(I)の実施例において記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１４４】
合成アプローチ(IV)-5の実施例
メチル2-[4-({[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000047
[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]酢酸(中間体C3)(100mg、1当量)、メチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート(中間体B1)(130mg、1.03当量)、DIPEA(0.1ml、2当量)、アセトニトリル(2ml)およびHATU(130mg、1.4当量)の混合物を室温で1時間撹拌し、その後、蒸発させ、アセトニトリルに再び溶解させた。逆相HPLC(調製法B)により精製すると、メチル2-[4-({[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートが得られた(126mg)。
LCMS Rt=2.698分；m/z[M+H]+=761.3
2010526805.tif 000048
【０１４５】
これを、合成アプローチ(I)の実施例において記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１４６】
合成アプローチ(IV)-6の実施例
エチル2-[4-({[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000049
[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]酢酸(中間体C3)(120mg、1当量)、エチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート(中間体B2)(204mg、1.3当量)、DMF(1.4ml)およびDIPEA(0.183ml、3当量)の混合物を室温で振盪させ、その後、HATU(206mg、1.5当量)を激しくかき混ぜながら添加し、1.5時間振盪し続けた。さらに中間体D5(12mg、0.1当量)を添加し、その後、2日間振盪し続けた。逆相HPLC(調製法B)により、エチル2-[4-({[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートが白色固体として得られた(173mg)。
LCMS Rt=2.751分；m/z[M+H]+=775.3
2010526805.tif 000050
【０１４７】
これを、合成アプローチ(I)の実施例において記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１４８】
合成アプローチ(IV)-7の実施例
エチル2-{4-[{[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]アセチル}({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000051
[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]酢酸(中間体C3)(114mg、1.1当量)、エチル2-メチル-2-{4-[({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}プロパノアート(中間体B3)(139mg、1当量)、DMF(1.2ml)およびDIPEA(0.16ml、3当量)の混合物を室温で振盪させ、その後、HATU(176mg、1.5当量)を激しくかき混ぜながら添加し、30分間振盪し続けた。さらに中間体D5(21mg、0.2当量)を添加し、続いて、1時間後にさらにHATU(23mg、0.2当量)を添加し、その後、18時間振盪し続けた。逆相HPLC(調製法B)により、エチル2-{4-[{[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]アセチル}({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}-2-メチルプロパノアートが白色固体として得られた(149mg)。
LCMS Rt=2.793分；m/z[M+H]+=791.3
2010526805.tif 000052
【０１４９】
これを、合成アプローチ(II)の実施例において記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１５０】
合成アプローチ(IV)-8の実施例
2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1,8-ナフチリジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパン酸トリフルオロアセテート
2010526805.tif 000053
1,1-ジメチルエチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート(中間体B4)(1当量)、[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1,8-ナフチリジン-1(4H)-イル]酢酸(中間体C2)(1.2当量)、DIPEA(3当量)およびDMF(1.0ml)の混合物を室温で5分撹拌する。HATU(1.5当量)を1度に添加し、さらに5分撹拌する。粗反応混合物を濃縮し、シリカプラグを通して濾過し、アセトンで溶離し、蒸発させると、粗1,1-ジメチルエチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1,8-ナフチリジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートが得られる。
【０１５１】
プロパノアートを、単離せずに、TFAおよびDCMの1:1混合物に溶解し、RTで4時間撹拌する。蒸発および分取HPLC(方法A)により標記化合物が得られる。
【０１５２】
従来の手段により別の塩を調製することができる。遊離塩基はまた、従来の手段により調製することができる。
【０１５３】
合成アプローチ(IV)-9の実施例
2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパン酸トリフルオロアセテート
2010526805.tif 000054
1,1-ジメチルエチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート(中間体B4)(1当量)、[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]酢酸(中間体C1)(1.2当量)、DIPEA(3当量)およびDMF(1.0ml)の混合物を室温で5分撹拌する。HATU(1.5当量)を1度に添加し、さらに5分撹拌する。粗反応混合物を濃縮し、シリカプラグを通して濾過し、アセトンで溶離し、蒸発させると、粗1,1-ジメチルエチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートが得られる。
【０１５４】
プロパノアートを、単離せずに、TFAおよびDCMの1:1混合物に溶解し、RTで4時間撹拌する。蒸発および分取HPLC(方法A)により標記化合物が得られる。
【０１５５】
合成アプローチ(IV)-10の実施例
メチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート
2010526805.tif 000055
[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸(中間体D1)(20.7g、1.3当量)、メチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート(中間体B1)(20.0g、1.3当量)、DIPEA(24.0ml、3当量)およびDMF(184ml)の混合物を機械的に撹拌し、その後、HATU(27.1g、1.5当量)を1度に添加し、2時間撹拌し続けた。反応混合物をジエチルエーテル/THF(1:1)と炭酸ナトリウム(1M、過剰)との間で分配させた。有機層を水および塩類溶液で洗浄し、乾燥し、蒸発させた。クロマトグラフィーを3つのシリカカラム上で連続して実施した(最初に3:1EtOAc/ヘキサン；第2に2%MeOHを含むDCM；第3に1:1 EtOAc/ヘキサン〜100%EtOAc)。生成物画分を蒸発させると、所望の生成物がアモルファスのピンク固体として得られた(27.5g)。
LCMS Rt=2.702分；m/z[M+H]+=762.3
【０１５６】
結晶化：メチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート(8.0g)およびエタノール(200ml)の混合物を、完全に溶解するまで温めた。溶液を24時間室温で磁気的に撹拌し、その後、濾過し、7.5gの固体を収集した。これらの溶媒和結晶を、窒素ブリードを有する60℃の真空オーブンに入れ、真空を約630Torrで24時間保持すると、非溶媒和の結晶、標題化合物が得られた(7.15g)、m.p.150℃。
2010526805.tif 000056
下記図1を参照されたい。
【０１５７】
合成アプローチ(IV)-11の実施例
メチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000057
メチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート(8.5g、1当量)をメタノール(100ml)に懸濁させ、固体が溶解するまで、50℃まで温めた。L-酒石酸(1.675g、1.0当量)を1度に添加し、30分間室温で撹拌した。溶液を真空で濃縮するとオフホワイトの粉末が得られ、これを室温の真空オーブン内で乾燥させた。
LCMS Rt=2.697分；m/z[M+H]+=762.3
2010526805.tif 000058
【０１５８】
合成アプローチ(IV)-12の実施例
エチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000059
[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸(中間体D1)(116mg、1当量)、エチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート(中間体B2)(150mg、1当量)、HATU(151mg、1.2当量)、DMF(2.72ml)およびDIPEA(0.17ml、3当量)の混合物を室温で3.25時間振盪させた。反応混合物を酢酸エチル/メタノールと重炭酸ナトリウムとの間で分配させ、有機層を塩類溶液で洗浄し、乾燥し、活性炭(250mg)で処理した。フラッシュクロマトグラフィー(シリカ、3〜4%のメタノールを含むDCM)により、エチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートが白色固体として得られた(178mg)。
LCMS Rt=2.58分；m/z[M+H]+=776.3
2010526805.tif 000060
【０１５９】
これを、合成アプローチ(II)の実施例に対し記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１６０】
合成アプローチ(IV)-13の実施例
エチル2-{4-[{[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000061
[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸(中間体D1)(114mg、1.1当量)、エチル2-メチル-2-{4-[({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}プロパノアート(中間体B4)(139mg、1当量)、DMF(1.2ml)およびDIPEA(0.16ml、3当量)の混合物を室温で30分間振盪させ、その後、HATU(176mg、1.5当量)を添加し、3時間振盪し続けた。逆相HPLC(調製法B)により、エチル2-{4-[{[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソ-1(4H)-キナゾリニル]アセチル}({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}-2-メチルプロパノアートが白色固体として得られた(166mg)。
LCMS Rt=2.87分；m/z[M+H]+=792.3
2010526805.tif 000062
【０１６１】
これを、合成アプローチ(II)の実施例に対し記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１６２】
合成アプローチ(IV)-14の実施例
1-メチルエチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000063
1-メチルエチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート(中間体B3)(420mg、1当量)、[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸(中間体D1)(300mg、1当量)、HATU(396mg、1.2当量)、DIPEA(0.22ml、1.5当量)およびDMF(3.0ml)の混合物を室温で30分間撹拌させた。粗反応混合物を直接、逆相HPLC(調製法A)に適用すると、1-メチルエチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートが得られた(171mg)。
LCMS Rt=2.837分；m/z[M+H]+=790.3
2010526805.tif 000064
【０１６３】
これを、合成アプローチ(II)の実施例に対し記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１６４】
合成アプローチ(IV)-15の実施例
1-メチルエチル2-{4-[{[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000065
1-メチルエチル2-メチル-2-{4-[({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}プロパノアート(中間体B5)(80mg、1当量)、[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸(中間体D1)(67mg、1当量)、HATU(400mg、5当量)、DIPEA(0.22ml、1.5当量)およびDMF(2.0ml)の混合物を室温で30分間撹拌した。粗反応混合物を直接、逆相HPLC(調製法A)に適用すると、1-メチルエチル2-{4-[{[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}-2-メチルプロパノアートが得られた(25mg)。
LCMS Rt=2.952分；m/z[M+H]+=806.4
2010526805.tif 000066
【０１６５】
これを、合成アプローチ(II)の実施例に対し記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１６６】
合成アプローチ(IV)-16の実施例
メチル2-[4-({[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000067
[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,4-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸(中間体D2)(100mg、1当量)、メチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート(中間体B1)(130mg、1.03当量)、DIPEA(0.16ml、3当量)、アセトニトリル(2ml)およびHATU(130mg、1.2当量)の混合物を室温で1時間撹拌し、その後、蒸発させ、アセトニトリルに再び溶解した。逆相HPLC(調製法B)により精製すると、メチル2-[4-({[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートが得られた(145mg)。
LCMS Rt=2.716分；m/z[M+H]+=762.3
2010526805.tif 000068
【０１６７】
これを、合成アプローチ(II)の実施例に対し記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１６８】
合成アプローチ(IV)-17の実施例
エチル2-[4-({[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000069
[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,4-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸(中間体D2)(120mg、1当量)、エチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート(中間体B2)(198mg、1.3当量)、DMF(1.4ml)およびDIPEA(0.178ml、3当量)の混合物を室温で1.5時間振盪させ、その後、HATU(200mg、1.5当量)を激しくかき混ぜながら添加し、1.5時間振盪し続けた。さらに中間体D2(12mg、0.1当量)を添加し、その後、2日間振盪し続けた。逆相HPLC(調製法B)により、エチル2-[4-({[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートが白色固体として得られた(170mg)。
LCMS Rt=2.827分；m/z[M+H]+=776.3
2010526805.tif 000070
【０１６９】
これを、合成アプローチ(II)の実施例に対し記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１７０】
合成アプローチ(IV)-18の実施例
エチル2-{4-[{[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000071
[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,4-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸(中間体D2)(114mg、1.1当量)、エチル2-メチル-2-{4-[({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}プロパノアート(中間体B4)(139mg、1当量)、DMF(1.2ml)、およびDIPEA(0.16ml、3当量)の混合物を室温で振盪させ、その後、HATU(176mg、1.5当量)を激しくかき混ぜながら添加し、2時間振盪し続けた。逆相HPLC(調製法B)により、エチル2-{4-[{[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}-2-メチルプロパノアートが白色固体として得られた(149mg)。
LCMS Rt=2.801分；m/z[M+H]+=792.3
2010526805.tif 000072
【０１７１】
これを、合成アプローチ(II)の実施例に対し記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１７２】
合成アプローチ(IV)-19の実施例
1-メチルエチル2-[4-({[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000073
1-メチルエチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート(中間体B3)(70mg、1当量)、[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,4-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸(中間体D2)(52.2mg、1当量)、HATU(69mg、1.2当量)、DIPEA(0.04ml、1.5当量)およびDMF(1.0ml)の混合物を室温で10分間撹拌した。粗反応混合物を直接、逆相HPLC(調製法A)に適用すると、1-メチルエチル2-[4-({[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートが得られた(20mg)。
LCMS Rt=2.910分；m/z[M+H]+=790.4
2010526805.tif 000074
【０１７３】
これを、合成アプローチ(II)の実施例に対し記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１７４】
合成アプローチ(IV)-20の実施例
1-メチルエチル2-{4-[{[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}-2-メチルプロパノアート2,3-ジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000075
1-メチルエチル2-メチル-2-{4-[({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}プロパノアート(中間体B5)(80mg、1当量)、[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,4-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸(中間体D2)(57mg、1当量)、HATU(76mg、1.2当量)、DIPEA(0.04ml、1.5当量)およびDMF(1.0ml)の混合物を室温で10分間撹拌した。粗反応混合物を直接、逆相HPLC(調製法A)に適用すると、1-メチルエチル2-{4-[{[2-[2-(2,4-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}-2-メチルプロパノアートが得られた(47mg)。
LCMS Rt=2.909分；m/z[M+H]+=806.4
2010526805.tif 000076
【０１７５】
これを、合成アプローチ(II)の実施例に対し記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１７６】
合成アプローチ(IV)-21の実施例
メチル2-{4-[{[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}-2-メチルプロパノアートジヒドロキシブタンジオエート(塩)
2010526805.tif 000077
メチル2-メチル-2-{4-[({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}プロパノアート(中間体B6)(145mg、1当量)、[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸(中間体D1)(122mg、1当量)、DIPEA(0.084ml、1.5当量)およびDMF(2.0ml)の混合物を室温で5分間撹拌した。HATU(160mg、1.3当量)を1度に添加し、さらに1時間、窒素下で撹拌した。粗反応混合物を直接、逆相HPLC(調製法A)に適用すると、メチル2-{4-[{[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}({4’-[(トリフルオロメチル)オキシ]-4-ビフェニリル}メチル)アミノ]-1-ピペリジニル}-2-メチルプロパノアートが得られた(116mg)。
LCMS Rt=2.721分；m/z[M+H]+=778.3
2010526805.tif 000078
【０１７７】
これを、合成アプローチ(II)の実施例に対し記載したものと類似の方法により、重酒石酸塩に変換した。
【０１７８】
合成アプローチ(IV)-22の実施例
2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパン酸トリフルオロアセテート
2010526805.tif 000079
1,1-ジメチルエチル2-メチル-2-[4-({[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]プロパノアート(中間体B7)(150mg、1当量)、[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]酢酸(中間体D1)(130mg、1.2当量)、DIPEA(0.164ml、3当量)およびDMF(1.0ml)の混合物を室温で5分間撹拌した。HATU(180mg、1.5当量)を1度に添加し、さらに5分間撹拌した。粗反応混合物を濃縮し、シリカプラグを通して濾過し、アセトンで溶離し、蒸発させると、粗1,1-ジメチルエチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートが得られた。
LCMS Rt=2.823分；m/z[M+H]+=804.4
【０１７９】
この中間体を、精製せずに、TFAおよびDCMの1:1混合物に溶解し、RTで4時間撹拌した。蒸発および分取HPLC(方法A)により、所望の2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパン酸トリフルオロアセテートが得られた(70mg)。
LCMS Rt=2.554分；m/z[M+H]+=748.2
2010526805.tif 000080
【０１８０】
従来の方法により他の塩を調製することができる。遊離塩基もまた、従来の手段により調製することができる。
【０１８１】
いくつかの態様では、本明細書で開示した方法においてLp-PLA2の阻害剤として有用な化合物は、下記の通りである：
1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)-アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン、「SB480848」またはUSAN名「ダラプラディブ」とも呼ばれ、ピリミドン系化合物であり、Lp-PLA2の可逆阻害剤であり、本明細書の実施例で使用される；
N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロシクロペンタピリミジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；
N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；および
メチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアート。
【０１８２】
本明細書の実施例で使用される、1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)-アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン、AKA SB480848；N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロシクロペンタピリミジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミド；およびメチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートの薬学的に許容される塩もまた、本明細書で開示した方法で使用するためのLp-PLA2阻害剤として有用である。
【０１８３】
Lp-PLA2の核酸阻害剤
いくつかの態様では、Lp-PLA2を阻害する作用物質は核酸である。Lp-PLA2の核酸阻害剤は、例えば、限定はされないが、RNA干渉誘導分子、例えば、限定はされないが、siRNA、dsRNA、stRNA、shRNA、およびそれらの修飾変異体であり、ここで、RNA干渉分子はLp-PLA2の遺伝子発現を停止させる。いくつかの態様では、Lp-PLA2の核酸阻害剤はアンチセンスオリゴ核酸、または核酸類似体であり、例えば、限定はされないが、DNA、RNA、ペプチド-核酸(PNA)、または偽相補的PNA(pc-PNA)、またはロックド核酸(LNA)などである。別の態様では、核酸はDNAまたはRNA、および核酸類似体、例えばPNA、pcPNAおよびLANである。核酸は一本鎖または二本鎖とすることができ、対象のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、PNAなどを含む群から選択することができる。そのような核酸配列としては、限定はされないが、転写抑制因子として作用するタンパク質をコードする核酸配列、アンチセンス分子、リボザイム、低分子阻害核酸配列、例えば、限定はされないが、RNAi、shRNAi、siRNA、ミクロRNAi(mRNAi)、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。
【０１８４】
いくつかの態様では、一本鎖RNA(ssRNA)、真核細胞において内因的に見出されるRNAの型を使用して、RNAi分子を形成させることができる。細胞ssNRA分子は、メッセンジャーRNA(および前駆体プレメッセンジャーRNA)、核内低分子RNA、核内低分子RNA、トランスファーRNAおよびリボソームRNAを含む。二本鎖RNA(dsRNA)は、サイズ依存免疫応答を含み、そのため、30bpよりも大きなdsRNAはインターフェロン応答を活性化し、一方、より短いdsRNAはダイサー酵素の下流の細胞の内在性RNA干渉機構に送り込まれる。
【０１８５】
Lp-PLA2は、Lp-PLA2ポリペプチドの発現を阻害することにより、または当業者に周知の「遺伝子サイレンシング」法により、減少させることができる。
【０１８６】
RNA干渉(RNAi)は、選択した標的ポリペプチドの発現を阻害するための強力なアプローチを提供する。RNAiは低分子干渉RNA(siRNA)二本鎖を使用し、これは選択的分解のために標的ポリペプチドをコードするメッセンジャーRNAを標的とする。遺伝子発現のsiRNA-依存転写後サイレンシングは、siRNAにより案内された部位での標的メッセンジャーRNA分子の切断を含む。
【０１８７】
RNA干渉(RNAi)は進化的に保存された過程であり、この場合、標的遺伝子と同一の、または非常に類似する配列のRNAの発現または導入により、標的遺伝子から転写されたメッセンジャーRNA(mRNA)の発現特異的分解または特異的転写後サイレンシング(PTGS)が得られ(Coburn, G. and Cullen, B.(2002) J. of Virology 76(18):9225を参照されたい)、これにより、標的遺伝子の発現が阻害される。1つの態様では、RNAは二本鎖RNA(dsRNA)である。この過程は、植物、無脊椎動物、および哺乳動物細胞において記載されている。事実上、RNAiはdsNRA-特異的エンドヌクレアーゼダイサーにより惹起され、これは、長いdsRNAのsiRNAと呼ばれる二本鎖フラグメントへの発展的切断を促進する。siRNAは、標的mRNAを認識し、切断するタンパク質複合体(「RNA導入サイレンシング複合体」または「RISC」と呼ばれる)に組み入れられる。RNAiはまた、核酸分子、例えば合成siRNAまたはRNA干渉剤を導入することにより惹起させることができ、標的遺伝子の発現が阻害または停止される。本明細書で使用されるように、「標的遺伝子発現の阻害」は、RNA干渉が誘導されていない状況と比べた場合の、標的遺伝子の発現または標的遺伝子によりコードされるタンパク質のタンパク質活性もしくはレベルの任意の減少を含む。減少は、RNA干渉剤により標的とされていない、標的遺伝子の発現または標的遺伝子によりコードされたタンパク質の活性もしくはレベルに比べた場合、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%もしくは99%またはそれ以上とすることができる。
【０１８８】
「短鎖干渉RNA」(siRNA)は、本明細書では「低分子干渉RNA」とも呼ばれ、例えばRNAiにより、標的遺伝子の発現を阻害するように作用する作用物質として規定される。siRNAは化学的に合成することができ、インビトロ転写により産生させることができ、または宿主細胞内で産生させることができる。1つの態様では、siRNAは約15〜約40ヌクレオチドの長さ、好ましくは約15〜約28ヌクレオチド、より好ましくは約19〜約25ヌクレオチドの長さ、より好ましくは約19、20、21、22、または23ヌクレオチドの長さの二本鎖RNA(dsRNA)分子であり、各々の鎖上に約0、1、2、3、4、または5ヌクレオチドの長さを有する3’および/または5’オーバーハングを含むことができる。オーバーハングの長さは2つの鎖の間では関係はなく、すなわち、1つの鎖上のオーバーハングの長さは第2の鎖のオーバーハングの長さには依存しない。好ましくは、siRNAは、標的メッセンジャーRNA(mRNA)の分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)により、RNA干渉を促進することができる。
【０１８９】
siRNAはまた、低分子ヘアピン型(ステムループとも呼ばれる)RNA(shRNA)を含む。1つの態様では、これらのshRNAは短い(すなわち、約19〜約25ヌクレオチド)アンチセンス鎖、続いて約5〜約9ヌクレオチドのヌクレオチドループ、および類似のセンス鎖から構成される。また、センス鎖はヌクレオチドループ構造に先行することができ、アンチセンス鎖がこれに続くことができる。これらのshRNAは、プラスミド、レトロウイルス、レンチウイルスに含まれている可能性があり、例えば、pol III U6プロモータ、または別のプロモータから発現させることができる(例えば、全体が参照により本明細書に組み入れられる、Stewart, et al.(2003) RNA Apr;9(4)：493-501を参照されたい)。
【０１９０】
RNA干渉剤の標的遺伝子または配列は細胞遺伝子またはゲノム配列、例えば、Lp-PLA2配列とすることができる。siRNAは、標的遺伝子もしくはゲノム配列、またはそのフラグメントに本質的に相同とすることができる。この状況において使用されるように、「相同」という用語は、標的mRNA、またはそのフラグメントに対し実質的に同一であり、十分相補的であり、または類似し、標的のRNA干渉を実施するものとして規定される。天然RNA分子の他に、標的配列の発現を阻害または干渉するのに適したRNAとしては、RNA誘導体および類似体が挙げられる。好ましくはsiRNAはその標的と同一である。
【０１９１】
siRNAは好ましくは、1つの配列のみを標的とする。RNA干渉剤、例えばsiRNAの各々は、例えば、発現プロファイリングにより、潜在的なオフターゲット効果に対しスクリーニングすることができる。そのような方法は当業者に公知であり、例えば、Jackson et al, Nature Biotechnology 6:635-637, 2003において記載されている。発現プロファイリングの他に、オフターゲット効果を有する可能性のある潜在的な配列を識別するために、配列データベースの同様の配列に対する潜在的な標的配列をスクリーニングすることもできる。例えば、Jacksonら(Id.)15によれば、またはおそらく、配列相同性の11という少ない近接するヌクレオチドがオフターゲット転写物のサイレンシングを誘導するのに十分である。そのため、任意の公知の配列比較法、例えばBLASTにより、配列相同性分析を用い、潜在的オフターゲットサイレンシングを避けるために、提案したsiRNAを最初にスクリーニングすることができる。
【０１９２】
siRNA分子は、RNAのみを含む分子に限定する必要はなく、例えば、さらに、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを含み、また、リボース糖分子が別の糖分子または同様の機能を実施する分子で置換されている分子で置換されている分子をも含む。さらに、ヌクレオチド残基間の非天然結合、例えばホスホロチオエート結合を使用することができる。例えば、RNAにおいて見られる天然のD-リボヌクレオシドの代わりにD-アラビノフラノシル構造を含むsiRNAを、本発明によるRNAi分子において使用することができる(米国特許第5,177,196号)。別の実施例は、ヌクレオシドの糖と複素環塩基との間のo-結合を含むRNA分子を含み、この結合はヌクレアーゼ抵抗性および密接な相補鎖結合を、2’-O-メチルリボース、アラビノースおよび特にD-アラビノースを含むオリゴヌクレオチドに類似するオリゴヌクレオチド分子に提供する(米国特許第5,177,196号)。
【０１９３】
RNA鎖は、レポーター基の反応性官能基、例えばフルオロフォアで誘導体化することができる。特に有用な誘導体は、RNA鎖の1つまたは複数の末端、典型的にはセンス鎖の3’末端で修飾される。例えば、3’末端の2’ヒドロキシルは様々な基により容易に、および選択的に誘導体化することができる。
【０１９４】
別の有用なRNA誘導体は修飾された炭化水素部分、例えば2’O-アルキル化残基または2’-O-メチルリボシル誘導体および2’-O-フルオロリボシル誘導体を有するヌクレオチドを組み入れる。RNA塩基もまた修飾することができる。標的配列の発現を阻害または干渉するのに有用な任意の修飾塩基を使用することができる。例えば、ハロゲン化塩基、例えば5-ブロモウラシルおよび5-ヨードウラシルを組み入れることができる。塩基はまたアルキル化することができ、例えば、7-メチルグアノシンをグアノシン残基の代わりに組み入れることができる。成功した阻害が得られる非天然の塩基もまた組み入れることができる。
【０１９５】
最も好ましいsiRNA修飾は2’-デオキシ-2’-フルオロウリジン、またはホスファチジルエステルもしくは様々な数のホスホロチオエート結合のいずれかを含むロックド核酸(LNA)ヌクレオチドおよびRNA二本鎖を含む。そのような修飾は当業者には公知であり、例えば、Braasch et al., Biochemistry, 42:7967-7975,2003において記載されている。siRNA分子に対する有用な修飾のほとんどが、アンチセンスオリゴヌクレオチド技術に対し確立されている化学を使用して導入させることができる。好ましくは、修飾は、最小2’-O-メチル修飾を含み、好ましくはそのような修飾は排除される。修飾はまた、好ましくはsiRNAの自由5’-ヒドロキシル基の修飾を排除する。
【０１９６】
3’もしくは5’末端のいずれか、または両方に共有結合により付着している様々な「テール」を有するsiRNAおよびmiRNA分子もまた当技術分野において公知であり、本発明の方法を用いて送達されるsiRNAおよびmiRNA分子を安定化するために使用することができる。一般的に言えば、RNA分子の3’または5’末端に付着された挿入基、様々な種類のレポーター基および親油性基は当業者に周知であり、本発明の方法により有用である。本発明により有用な修飾RNA分子の調製に適用することができる3’-コレステロールまたは3’-アクリジン修飾オリゴヌクレオチドの合成の記載は、例えば、下記論文において見出すことができる：Gamper, H.B., Reed, M.W., Cox, T., Virosco, J.S., Adams, A.D., Gall, A., Scholler, J.K., and Meyer, R.B.(1993)Facile Preparation and Exonuclease Stability of 3’-Modified Oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res. 21 145-150;およびReed, M.W., Adams, A.D., Nelson, J.S., and Meyer, R.B.,Jr.(1991)Acridine and Cholesterol-Derivatized Solid Supports for Improved Synthesis of 3’-Modified Oligonucleotides. Bioconjugate Chem. 2 217-225(1993)。
【０１９７】
Lp-PLA2発現を標的とするのに有用な別のsiRNAは容易に設計および試験することができる。したがって、本明細書で記載した方法に対し有用なsiRNAは、Lp-PLA2遺伝子と相同である、約15〜約40または約15〜約28ヌクレオチドの長さのsiRNAを含む。好ましくはLp-PLA2を標的とするsiRNA分子は約19〜約25ヌクレオチドの長さを有する。より好ましくは、Lp-PLA2を標的とするsiRNA分子は約19、20、21、または22ヌクレオチドの長さを有する。Lp-PLA2を標的とするsiRNA分子はまた3’ヒドロキシル基を含むことができる。Lp-PLA2を標的とするsiRNA分子は一本鎖または二本鎖とすることができ；そのような分子は平滑末端化することができ、またはオーバーハング端(例えば、5’、3’)を含むことができる。特定の態様では、RNA分子は二本鎖であり、平滑末端化されるか、またはオーバーハング末端を有する。
【０１９８】
1つの態様では、Lp-PLA2を標的とするRNA分子の少なくとも1つの鎖は約0〜約6ヌクレオチド(例えば、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオチド)の長さの3’オーバーハングを有する。別の態様では、3’オーバーハングは約1〜約5のヌクレオチド、約1〜約3のヌクレオチドおよび約2〜約4のヌクレオチドの長さである。1つの態様では、Lp-PLA2を標的とするRNA分子は二本鎖であり、1つの鎖は3’オーバーハングを有し、別の鎖は平滑末端化させる、またはオーバーハングを有することができる。Lp-PLA2を標的とするRNA分子が二本鎖であり、どちらの鎖もオーバーハングを含む態様では、オーバーハングの長さは各鎖に対し同じかまたは異なるものとすることができる。特定の態様では、本発明のRNAは約19、20、21、または22のヌクレオチドを含み、これらは対になっており、約1〜約3、特に約2のヌクレオチドのオーバーハングをRNAの両方の3’末端で有する。1つの態様では、3’オーバーハングは分解に対し安定化させることができる。好ましい態様では、RNAはプリンヌクレオチド、例えばアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドを含むことにより、安定化される。また、ピリミジンヌクレオチドの修飾類似体による置換、例えば、ウリジン2ヌクレオチド3’オーバーハングの2’-デオキシチミジンによる置換は許容され、RNAiの有効性に影響しない。2’ヒドロキシルが存在しないと、組織培地中のオーバーハングのヌクレアーゼ抵抗性が著しく増強される。
【０１９９】
Lp-PLA2mRNAは、siRNAを使用してうまく標的とされており、そのようなsiRNAまたはそれらを調製するためのベクターは、例えばInvitrogenから市販されている。いくつかの態様では、そのようなLp-PLA2 siRNAを使用するLp-PLA2タンパク質の発現および/またはノックダウンの評価は、市販のキット、例えば限定はされないが、diaDexusからのPLACアッセイ法を使用して決定することができる。他のものは、標的mRNAの公知の配列に基づき、当業者により容易に調製される可能性がある。誤解を避けるために、ヒトLp-PLA2 cDNAの配列は、例えば、GenBankアクセッション番号：U20157(SEQ ID NO:1)またはNM_005084(SEQ ID NO:2)で提供される。U20157の配列は下記の通りである(SEQ ID NO:1)：
2010526805.tif 000081
【０２００】
siRNA配列は、siRNAのアンチセンス(ガイド)鎖のRISCへの取り込みが最大となるように選択され、これにより、RISCの分解に対しヒトLp-PLA2 mRNAを標的とする能力が最大となる。これは、アンチセンス鎖の5’末端で最も低い結合自由エネルギーを有する配列を走査することにより達成することができる。より低い自由エネルギーにより、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖の5’末端の巻き戻しが増強され、これにより、確実に、アンチセンス鎖がRISCにより取り込まれ、ヒトLp-PLA2 mRNAの配列特異的切断が誘導される。
【０２０１】
好ましい態様では、siRNAまたは修飾されたsiRNAが薬学的に許容される担体中で送達される。別の担体作用物質、例えばリポソームを薬学的に許容される担体に添加することができる。
【０２０２】
別の態様では、siRNAは、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)をコードするベクターを薬学的に許容される担体中で個体の器官中の細胞に送達させることにより送達される。shRNAは、例えば、Lp-PLA2を標的とすることができるsiRNAに転写された後、細胞により変換される。1つの態様では、ベクターは調節可能なベクター、例えばテトラサイクリン誘導ベクターとすることができる。
【０２０３】
1つの態様では、本明細書で記載した方法において使用されるRNA干渉剤は、静脈注射、例えば水力学的注射後、ベクターを使用せずに、インビボで細胞により能動的に取り込まれ、RNA干渉剤、例えば、本発明の方法で使用されるsiRNAの有効なインビボ送達が示される。
【０２０４】
本発明の方法において使用されるRNA干渉剤、例えばsiRNAまたはshRNAの送達のための別の戦略、例えば、ベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターによる送達もまた採用することができる。そのようなベクターは、例えば、Xiao-Feng Qin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,100:183-188において記載されているように使用することができる。別の送達法は、RNA干渉剤を塩基性ペプチド、例えば、TATペプチドのフラグメントとコンジュゲートもしくは混合することにより塩基性ペプチドを使用し、カチオン性脂質と共に混合し、または製剤化して粒子とする、RNA干渉剤、例えば、本発明のsiRNAまたはshRNAの送達を含む。
【０２０５】
上記の通り、dsRNA、例えばsiRNAまたはshRNAは、誘導ベクター、例えばテトラサイクリン誘導ベクターを使用して送達させることができる。例えば、Wang et al. Proc. Natl. Acad. Sci.100:5103-5106において記載されている、pTet-Onベクターを使用する方法を使用することができる(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)。いくつかの態様では、ベクターはプラスミドベクター、ウイルスベクター、または外来配列の挿入および真核細胞への導入のために適合された任意の他の適したビヒクルとすることができる。ベクターは、アゴニストまたはアンタゴニスト核酸分子のDNA配列のRNAへの転写を誘導することができる発現ベクターとすることができる。ウイルス発現ベクターは、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、エプスタイン・バーウイルス-、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス-およびアデノ関連ベクターまたは上記のいずれかのハイブリッドウイルスを含む群から選択することができる。1つの態様では、ベクターはエピソームである。適したエピソームベクターの使用は、対象において、高いコピー数の染色体外DNAでアンタゴニスト核酸分子を維持する手段を提供し、これにより、染色体組み込みの潜在的な効果が排除される。
【０２０６】
本明細書で開示した方法において有用なRNA干渉分子および核酸阻害剤は、任意の公知の技術、例えば直接化学合成を使用して、組換えダイサータンパク質またはショウジョウバエ胚ライセートへの暴露によるより長い二本鎖RNAのプロセシングにより、S2細胞に由来するインビトロシステムにより、ファージRNAポリメラーゼ、RNA-依存RNAポリメラーゼ、およびDNA系ベクターを使用して、製造することができる。細胞ライセートまたはインビトロプロセシングの使用はさらに、その後に短い、例えば21〜23ヌクレオチドのsiRNAをライセートから単離する段階、などを含む可能性がある。化学合成は通常、2本の一本鎖RNA-オリゴマーを製造し、続いて、2つの一本鎖オリゴマーをアニールして二本鎖RNAにすることにより進行する。別の実施例は、siRNAの化学および酵素合成を教示する、WO 99/32619およびWO 01/68836で開示されている方法を含む。さらに、多くの商用サービスが、特異的なsiRNAを設計し、製造するために使用することができる(例えば、QIAGEN Inc., Valencia, CAおよびAMBION Inc., Austin, TXを参照されたい)。
【０２０７】
いくつかの態様では、作用物質は、Lp-PLAの発現および/またはLp-PLA2タンパク質の活性を阻害するタンパク質またはポリペプチドまたはRNAiである。そのような実施形態では、細胞は(例えば、相同組み換えにより)修飾することができ、例えば、天然のプロモータを全体的に、または部分的に、異種プロモータの全てもしくは一部で置換することにより、そのような作用物質の発現を増加させることができ、そのため、細胞はLp-PLA2の天然阻害剤、例えば、Lp-PLA2のタンパク質またはmiRNA阻害剤をより高いレベルで発現する。異種プロモータは、作用物質をコードする所望の核酸に操作可能に結合されるような様式で挿入される。例えば、Transkaryotic Therapies, Inc.によるPCT国際公開第WO 94/12650号、Cell Genesys, Inc.によるPCT国際公開第WO 92/20808号、およびApplied Research SystemsによるPCT国際公開第WO 91/09955号を参照されたい。細胞はまた、誘導調節エレメントの制御下、作用物質を含む、内在性遺伝子を発現するように操作することができ、この場合、内在遺伝子の調節配列は、相同組換えにより置換することができる。遺伝子活性化技術は、Chappelに付与された米国特許第5,272,071号；Sherwinらに付与された米国特許第5,578,461号；SeldenらによるPCT/US92/09627(WO 93/09222)；およびSkoultchiらによるPCT/US90/06436(WO 91/06667)において記載されている。作用物質は、形質転換宿主細胞を、miRNAを発現させるのに適した培養条件下で培養することにより調製することができる。得られた、発現された作用物質はその後、そのような培養物(すなわち、培地または細胞抽出物から)から、公知の精製過程、例えばゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製することができる。Lp-PLA2のペプチドまたは核酸作用物質阻害剤の精製はまた、タンパク質に結合する作用物質を含むアフィニティカラム；コンカナバリンA-アガロース、ヘパリン-トヨパール(商標)またはシバクロムブルー3GAセファロースなどの親和性樹脂上での1つまたは複数のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルなどの樹脂を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む1つまたは複数の工程；免疫親和性クロマトグラフィー、または相補cDNAアフィニティクロマトグラフィーを含むことができる。
【０２０８】
1つの態様では、Lp-PLA2の核酸阻害剤は、合成により、例えば、当業者に公知の任意の合成法により核酸を化学的に合成することにより、得ることができる。Lp-PLA2の合成された核酸阻害剤はその後、当技術分野において公知の任意の方法により精製することができる。核酸の化学合成のための方法としては、ホスホトリエステル、ホスフェートまたはホスホラミダイト化学を使用するインビトロ化学合成および固相技術、またはデオキシヌクレオシドH-ホスホネート中間体を介するものが挙げられるが、それらに限定されない(Bhongleに付与された米国特許第5,705,629号を参照されたい)。
【０２０９】
例えば、ヌクレアーゼ安定性の増加が望ましいいくつかの状況においては、核酸類似体および/または修飾されたヌクレオシド間結合を有する核酸が好ましい可能性がある。修飾されたヌクレオシド間結合を含む核酸はまた、当技術分野において周知の試薬および方法を用いて合成することができる。例えば、ホスホネートホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートメトキシエチルホスホロアミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレン-スルフィド(-CH2-S-CH2)、ジイネチレン-スルホキシド(-CH2-SO-CH2)、ジメチレン-スルホン(-CH2-SO2-CH2)、2’-O-アルキル、および2’-デオキシ-2’-フルオロ’ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む核酸を合成する方法が、当技術分野において周知である(Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90:543-584；Schneider et al., 1990, Tetrahedron Lett. 31:335および本明細書で引用した参考文献を参照されたい)。Cookらに付与された米国特許第5,614,617号および同第5,223,618号、Acevedoらに付与された同第5,714,606号、Cookらに付与された同第5,378,825号、Buhrらに付与された同第5,672,697号および同第5,466,786号、Cookらに付与された同第5,777,092号、De Mesmackerらに付与された同第5,602,240号、Cookらに付与された同第5,610,289号、およびWangに付与された同第5,858,988号もまた、増強されたヌクレアーゼ安定性および細胞取り込みのための核酸類似体を記載する。
【０２１０】
shRNA分子を含む合成siRNA分子は、当業者に公知の多くの技術を用いて得ることができる。例えば、siRNA分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、適当に保護したリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のDNA/RNA合成機を使用することにより、化学的に合成することができ、または組み換え技術により生成させることができる(例えば、Elbashir, S.M. et al.(2001) Nature 411:494-498；Elbashir, S.M.,W. Lendeckel and T. Tuschl(2001)Genes & Development 15:188-200；Harborth, J. et al.(2001)J.Cell Science 114:4557-4565；Masters, J.R.et al.(2001)Proc. Natl. Acad. Sci., USA 98:8012-8017；およびTuschl, T. et al.(1999)Genes & Development 13:3191-3197を参照されたい)。また、いくつかの商用RNA合成供給者が有効であり、Proligo(Hamburg, Germany)、Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA)、Pierce Chemical(Perbio Scienceの一部、Rockford, IL, USA)、Glen Research(Sterling, VA, USA)、ChemGenes(Ashland, MA, USA)、およびCruachem(Glasgow, UK)が挙げられるが、それらに限定されない。そのようなものとして、siRNA分子は合成するのにそれほど困難ではなく、RNAiに対して適した量で容易に提供される。さらに、dsRNAは、プラスミドベクター、レトロウイルスおよびレンチウイルスによりコードされるステムループ構造として発現させることができる(Paddison, P.J.et al.(2002)Genes Dev.16:948-958；McManus, M.T. et al.(2002)RNA 8:842-850；Paul, C.P. et al.(2002)Nat. Biotechnol. 20:505-508；Miyagishi, M. et al.(2002) Nat. Biotechnol. 20:497-500；Sui, G. et al.(2002)Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:5515-5520；Brummelkamp, T. et al.(2002)Cancer Cell 2:243；Lee, N.S., et al.(2002) Nat. Biotechnol. 20:500-505；Yu, J.Y., et al.(2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:6047-6052；Zeng, Y., et al.(2002)Mol.Cell 9:1327-1333；Rubinson, D.A., et al.(2003)Nat. Genet. 33:401-406；Stewart, S.A., et al.(2003)RNA 9:493-501)。これらのベクターは一般に、dsRNAの上流にpolIIIプロモータを有し、センスおよびアンチセンスRNA鎖を別々におよび/またはヘアピン構造として発現することができる。細胞内では、ダイサーは低分子ヘアピン型RNA(shRNA)をプロセシングし、有効なsiRNAにする。
【０２１１】
本発明のsiRNA分子の標的領域は、開始コドンの約25〜50ヌクレオチド、約50〜75ヌクレオチド、または約75〜100ヌクレオチド下流から開始する、ある標的遺伝子配列、例えば、Lp-PLA2コード配列から選択される。ヌクレオチド配列は5’または3’ UTRおよび開始コドンに隣接する領域を含むことができる。本発明のsiRNA分子を設計する1つの方法は、23ヌクレオチド配列モチーフAA(N19)TTを識別し(ここで、Nは任意のヌクレオチドとすることができる)、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%または75%のG/C量を有するヒットを選択することを含む。配列の「TT」部分は任意である。また、そのような配列が見出されない場合、モチーフNA(N21)を用いて調査を拡張することができ、ここで、Nは任意のヌクレオチドとすることができる。この状況では、センスsiRNAの3’末端はTTに変換することができ、センスおよびアンチセンス3’オーバーハングの配列組成に対し対称二本鎖の生成が可能になる。アンチセンスsiRNA分子はその後、23ヌクレオチド配列モチーフのヌクレオチド位置1〜21に対する相補体として合成することができる。対称3’TTオーバーハングの使用は、確実に、低分子干渉リボヌクレオタンパク質粒子(siRNP)を、センスおよびアンチセンス標的RNA-切断siRNPの比が大体等しくなるように形成するのに好都合である可能性がある(Elbashir et al.(2001)上記およびElbashir et al.2001上記)。NCBI、BLAST、DerwentおよびGenSeqを含むがそれらに限定されない配列データベースの解析、ならびに市販のオリゴ合成ソフトウエア、例えばOligoengine(登録商標)もまた、確実に1つの遺伝子のみが標的とされるように、ESTライブラリーに対しsiRNA配列を選択するために使用することができる。
【０２１２】
RNA干渉剤の送達：RNA干渉剤、例えばsiRNA、またはRNA干渉剤を含むベクターを標的細胞(例えば、中枢神経系および末梢神経系の細胞に対しては、脳の細胞または他の所望の標的細胞)に送達する方法としては、例えば、(i)RNA干渉剤、例えばsiRNAを含む組成物の注入、または(ii)細胞、例えば脳の細胞のRNA干渉剤、例えばsiRNAを含む組成物との直接接触が挙げられる。別の態様では、RNA干渉剤、例えばsiRNAは直接、任意の血管、例えば、静脈、動脈、細静脈または細動脈に、例えば水力学的注入またはカテーテル法により注入することができる。いくつかの態様では、Lp-PLA2作用物質、例えばLp-PLA2 siRNAは特定の器官、例えば肝臓、骨髄に送達させることができ、または全身投与することができる。
【０２１３】
投与は、単回投与により、または2回もしくはそれ以上の投与により実施することができる。RNA干渉剤は薬学的に許容される担体中で送達される。1つまたは複数のRNA干渉剤を同時に使用することができる。RNA干渉剤、例えば、Lp-PLA2 mRNAを標的とするsiRNAは、単独で、または別のRNA干渉剤、例えば、siRNA、例えば、別の細胞遺伝子に誘導されるsiRNAと組み合わせて送達させることができる。Lp-PLA2 siRNAはまた、神経変性疾患または障害を治療または阻止するのに使用される別の薬剤と組み合わせて投与することができる。
【０２１４】
1つの態様では、特定の細胞がRNA干渉により標的とされ、RNA干渉の非特異的標的により引き起こされるRNA干渉の潜在的な副作用は制限される。方法は、例えば、RNA干渉を効果的に細胞内に送達させるために使用される、細胞標的部分およびRNA干渉結合部分を含む複合体または融合分子を使用することができる。例えば、抗体-プロタミン融合タンパク質はsiRNAと混合されると、siRNAに結合し、選択的にsiRNAを、抗体により認識される抗原を発現する細胞内に送達し、その結果、抗原を発現する細胞のみで遺伝子発現のサイレンシングが起こる。siRNAまたはRNA干渉誘導分子結合部分はタンパク質または核酸結合ドメインまたはタンパク質のフラグメントであり、結合部分は標的部分の一部に融合される。標的部分の位置は、コンストラクトのカルボキシル-末端もしくはアミノ末端のいずれか、または融合タンパク質の中央にある可能性がある。
【０２１５】
Xia, H. et al.(2002) Nat Biotechnol 20(10):1006)に記載されているように、ウイルス媒介送達機構もまた、siRNAを細胞にインビトロおよびインビボで送達するために使用することができる。Rubinson, D.A., et al., (2003) Nat. Genet. 33:401-406およびStewart, S.A., et al.((2003) RNA 9:493-501)に記載されているように、shRNAのプラスミド-またはウイルス-媒介送達機構もまた、shRNAを細胞にインビトロおよびインビボで送達するために使用することができる。
【０２１６】
RNA干渉剤、例えば、siRNAはまた、血管または血管外循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液を介して細胞内に導入させることができる。
【０２１７】
特別なRNA干渉剤の用量は、特別な標的遺伝子のRNA干渉、例えば、翻訳後遺伝子サイレンシング(PTGS)を実施し、これにより、標的遺伝子発現の阻害または標的遺伝子によりコードされるタンパク質の活性もしくはレベルの阻害が引き起こされるのに必要な量である。
【０２１８】
RNAi分子は完全にはその標的配列に一致する必要がないことも公知である。しかしながら、好ましくは、siRNAのアンチセンス(ガイド)鎖の5’および中央部分は完全に、標的核酸配列に相補的である。
【０２１９】
したがって、本発明においてLp-PLA2の核酸阻害剤として機能するRNAi分子は、例えば、限定はされないが、非修飾および修飾二本鎖(ds)RNA分子であり、低分子一時RNA(stRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、ミクロRNA(miRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)が含まれる(例えば、Baulcombe, Science 297:2002-2003, 2002)。dsRNA分子、例えばsiRNAはまた3’オーバーハング、好ましくは3’UUまたは3’TTオーバーハングを含むことができる。1つの態様では、本発明のsiRNA分子は、約30〜40塩基、約40〜50塩基、約50塩基またはそれ以上を超えるssRNAを含むRNA分子を含まない。1つの態様では、本発明のsiRNAはその長さの約25%を超えて、約50%を超えて、約60%を超えて、約70%を超えて、約80%を超えて、約90%を超えて、二本鎖である。いくつかの態様では、Lp-PLA2の核酸阻害剤は、Lp-PLA2 mRNAに結合し、その発現を阻害する任意の作用物質であり、ここで、Lp-PLA2 mRNAまたはSEQ ID NO:1または2によりコードされる核酸の転写産物の発現が阻害される。
【０２２０】
本発明の別の態様では、Lp-PLA2を阻害する作用物質は触媒性核酸コンストラクト、例えば、リボザイムであり、これらはRNA転写物を切断することができ、これにより、野生型タンパク質の産生が阻止される。リボザイムは、リボザイム触媒部位に隣接する標的と相補的な配列の2つの領域のおかげで、特別な配列を標的とし、これとアニールする。結合後、リボザイムは部位特異的な様式で標的を切断する。例えば、Lp-PLA2またはホモログまたはそれらの変異体の切断に対し、本明細書で記載されている遺伝子産物の配列を特異的に認識し、切断するリボザイムの設計および試験は、当業者に周知の技術により達成することができる(例えば、Lleber and Strauss, (1955) Mol Cell Biol 15:540.551、その開示は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０２２１】
Lp-PLA2のタンパク質およびペプチド阻害剤
いくつかの態様では、Lp-PLA2を阻害する作用物質はタンパク質および/またはペプチド阻害剤またはLp-PLA2の阻害剤のフラグメント、例えば、限定はされないが変異タンパク質；治療タンパク質および組換えタンパク質である。タンパク質およびペプチド阻害剤はまた、例えば、変異タンパク質、遺伝子組換えタンパク質、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾タンパク質およびそのフラグメントを含むことができる。
【０２２２】
いくつかの態様では、Lp-PLA2を阻害する作用物質はLp-PLA2のドミナントネガティブ変異体、例えばLp-PLA2の非機能性変異体である。
【０２２３】
抗体
いくつかの態様では、本発明の方法において有用な遺伝子および/遺伝子産物の阻害剤としては、例えば、抗体が挙げられ、モノクローナル、キメラ、ヒト化、および組換え抗体ならびにそれらの抗原-結合フラグメントが含まれる。いくつかの態様では、Lp-PLA2酵素の阻害剤として中和抗体を使用することができる。抗体は動物、例えばウサギまたはマウス体内で、抗原で免疫化することにより容易に産生される。免疫化マウスは、ハイブリドーマの製造のためのB細胞源を提供するのに特に有用であり、これらが培養され、多量のモノクローナル抗体が産生される。
【０２２４】
本発明の1つの態様では、本明細書で識別された遺伝子産物に対する阻害剤は、抗体分子または抗体分子のエピトープ結合部分などとすることができる。抗体は、広範囲の標的抗原およびハプテンに対し、高い結合力および特有の特異性を提供する。本発明の実施において有用なモノクローナル抗体は、全抗体およびそのフラグメントを含み、従来の技術、例えばハイブリドーマ合成、組換えDNA技術およびタンパク質合成により生成される。
【０２２５】
有用なモノクローナル抗体およびフラグメントは任意の種(ヒトを含む)に由来するものとすることができ、または1つを超える種由来の配列を使用するキメラタンパク質として形成させることができる。本発明によれば、ヒトモノクローナル抗体または「ヒト化」マウス抗体もまた使用される。例えば、マウスモノクローナル抗体は、マウスFv領域(すなわち、抗原結合部位を含む)またはその相補的な決定領域をヒト定常ドメインおよびFc領域をコードするヌクレオチド配列と遺伝子組換えすることにより「ヒト化」することができる。ヒト化標的部分は、宿主レシピエントにおいて抗体またはポリペプチドの免疫活性を減少させるものと認識され、欧州特許出願第0,411,893 A2号において開示されたものと同様に半減期の増加および有害な免疫反応の可能性の減少が可能となる。マウスモノクローナル抗体は好ましくはヒト化形態で使用されるべきである。抗原結合活性は、抗体の可変部(Fv)の軽鎖および重鎖上に配置された6つの相補的な決定領域(CDR)のアミノ酸(各々3)の配列および高次構造により決定される。短いペプチドスペーサ配列により連結された軽鎖の可変領域(VL)および重鎖の可変領域(VH)から構成される、25-kDaの一本鎖Fv(scFv)分子は今日までに開発された最も小さな抗体フラグメントである。scFVに対する遺伝子を含む繊維状ファージの表面上でscFv分子を表示するための技術が開発された。広範囲の抗原特異性を有するscFV分子がscFvファージライブラリの単一の大きなプールに存在する可能性がある。本発明の方法において有用な、高親和性モノクローナル抗体およびそのキメラ誘導体のいくつかの例が、欧州特許出願EP186,833；PCT特許出願WO 92/16553；および米国特許第6,090,923号において記載されている。
【０２２６】
キメラ抗体は異なる動物種由来の2つまたはそれ以上のセグメントまたは部分により特徴づけられる免疫グロブリン分子である。一般に、キメラ抗体の可変領域は非ヒト哺乳動物抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来し、免疫グロブリン定常部はヒト免疫グロブリン分子に由来する。好ましくは、両方の領域および組みあわせは、日常的に決定されるように、低い免疫原性を有する。
【０２２７】
scFvの1つの制限は、標的抗原との一価相互作用である。scFvのその標的抗原への結合を改善する最も簡単な方法の1つは、多量体の生成により機能的親和性を増加させることである。同一のscFv分子を会合させてダイアボディ(diabody)、トリアボディおよびテトラボディ(tetrabody)を形成させると、多くの同一のFvモジュールを含むことができる。これらの試薬はそのため、多価であるが、単一特異性である。各々が異なる親Igに由来するVHおよびVLドメインを含む、2つの異なるscFv分子の会合により、完全に機能的な二重特異性ダイアボディが形成される。二重特異性scFVの特有の適用は、2つの部位を同じ標的分子上で、2つの(隣接する)表面エピトープを介して、同時に結合することである。これらの試薬により、単一のscFvまたはFabフラグメントよりも著し結合力利点が得られる。例えば、ミニ抗体、ダイアボディミニ抗体、ミニボディ(minibody)、(scFv)2、ダイアボディおよびトリアボディを含む、多くの多価scFv-系構造が操作されている。これらの分子は広範囲の原子価(2〜4の結合部位)、サイズ(50〜120kDa)、フレキシビリティおよび製造の容易さにわたる。一本鎖Fv抗体フラグメント(scFv)は、VHおよびVLドメインが、少なくとも12残基のポリペプチドリンカーにより接合されている場合、主にモノマーである。モノマーscFVは、全ての条件下、12および25アミノ酸の長さのリンカーを用いると熱力学的に安定である。非共有結合性ダイアボディおよびトリアボディ分子は操作が簡単であり、単一のscFv分子の可変重鎖および可変軽鎖を連結するペプチドリンカーを短くすることにより作成される。scFv二量体は両親媒性らせんにより接合され、これにより高いフレキシビリティ度が提供され、ミニ抗体構造は、二重らせんを介して連結された2つのミニ抗体(4つのscFv分子)を含む二量体二重特異性(DiBi)ミニ抗体を生成するように修飾することができる。遺伝子融合された、またはジスルフィド結合されたscFv二量体は、中間のフレキシビリティ度を提供し、C-末端Gly4Cys配列を添加する直接クローニング技術により作成される。scFv-CH3ミニボディは、IgG CH3ドメインに、直接(LDミニボディ)または非常にフレキシブルなヒンジ領域を介して(Flexミニボディ)接合された2つのscFv分子から構成される。約80kDaの分子量を有すると、これらの二価コンストラクトは抗原に有意に結合することができる。Flexミニボディはマウスにおいて印象的な腫瘍局在化を示す。二重および三重特異性多量体は、異なるscFv分子の会合により形成させることができる。機能的親和性の増加は、Fabまたは一本鎖Fv抗体フラグメント(scFv)フラグメントが複合体化され二量体、三量体またはそれ以上に大きな凝集体とされた場合に、到達することができる。一価scFvおよびFabフラグメントに対する多価scFvの最も重要な利点は、標的抗原への機能的結合親和性(結合力)の増加である。高い結合力には、scFv多量体が別々の標的抗原に同時に結合できることが必要である。scFv単量体と比べた場合のscFvダイアボディに対する機能的親和性の増加は有意であり、主に、オフレートの減少において見られ、これは2つまたはそれ以上の標的抗原への複数の結合および1つのFvが解離した場合の再結合に起因する。そのようなscFv分子が会合して多量体になる場合、単一の標的抗原に対する高い結合力または異なる標的抗���に対する多特異性を有するように設計することができる。抗原への多重結合は、Fvモジュール中での正確な整合および配向に依存する。多価scFv標的における完全な結合力に対しては、抗原結合部位は同じ方向を指していなければならない。多重結合が立体的で可能でなければ、機能的親和性の見かけの増加は、再結合の増加の効果による可能性があり、これは、拡散速度および抗原濃度に依存する。特性を改善する部分とコンジュゲートされた抗体もまた本発明に対し企図される。例えば、インビボでの半減期を増加させるPEGとの抗体コンジュゲートを本発明に対し使用することができる。免疫ライブラリは、未処置または免疫化動物もしくは患者のBリンパ球由来の様々な抗体フラグメントをコードする遺伝子を、PCR増幅に供することにより調製される。免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子ファミリーに対し特異的なオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用する。免疫グロブリン生殖系遺伝子を使用して半合成抗体レパートリーを調製することができ、様々なフラグメントの相補的に決定する領域がPCRにより縮重プライマーを用いて増幅される。これらの単一ポットのライブラリは、多数の抗原に対する抗体フラグメントを1つの単一のライブラリから単離することができるという利点を有する。ファージディスプレイ技術を使用して、抗体フラグメントへの親和性を増加させることができ、すでに存在する抗体フラグメントから、ランダムな、コドンに基づくまたは部位特異的変異誘導により、個々の度マインの鎖を未処置レパートリー由来のフラグメントのものとシャッフルすることにより、または細菌ミューテーター株を使用することにより、新しいライブラリが調製される。
【０２２８】
あるいは、SCID-huマウス、例えば、Genpharmにより開発されたモデルを使用して、抗体、またはそのフラグメントを産生させることができる。1つの態様では、ペプタボディと呼ばれ、多価相互作用の効果を利用することにより作製された、新しい型の高結合力分子が企図される。短いペプチドリガンドを、半合成ヒンジ領域を介して、軟骨オリゴマー基質タンパク質のコイル状-コイルアセンブリドメインと融合させると、結果的に、五量体多価結合分子が得られた。本発明の好ましい態様では、リガンドおよび/またはキメラ阻害剤は、例えば、抗リガンド抗体(Ab)および特異的標的に向かって誘導されるAbの化学結合により作製された、二重特異性抗体を用いることにより組織-または腫瘍-特異的標的を標的とすることができる。化学コンジュゲートの制限を避けるために、細胞表面でリガンドおよび/またはキメラ阻害剤を誘導する組換え二重特異性1本鎖Abの製造のために、抗体の分子コンジュゲートを使用することができる。また、標的部分に付着された2つまたはそれ以上の活性作用物質およびまたは阻害剤を投与することができ、この場合、各コンジュゲートは標的部分、例えば、異なる抗体を含む。各抗体は異なる標的部位エピトープと反応する(同じかまたは異なる標的部位抗原と結合する)。作用物質が付着された異なる抗体は、所望の標的部位に相加的に蓄積する。抗体系または非抗体系標的部分を使用して、リガンドまたは阻害剤を標的部位に送達させることができる。好ましくは、未制御または疾患関連抗原に対する天然の結合剤をこの目的のために使用する。
【０２２９】
Lp-PLA2阻害剤を同定するためのバイオアッセイ法
Lp-PLA2タンパク質の阻害のためのスクリーニング
いくつかの態様では、本発明の方法は、血管性認知症、例えばアルツハイマー病の治療および/またはBBBの透過性に関連する障害の治療のためのLp-PLA2の阻害剤の使用に関する。必要ならば、Lp-PLA2タンパク質を阻害する作用物質を、参照により全体が本明細書に組み入れられる米国特許第5,981,252号において開示されているバイオアッセイ法を用いて評価する。1つのそのようなアッセイ法は、組換えLp-PLA2タンパク質に対する作用物質の効果を試験するものである。1つのアッセイ法では、例えば、組換えLp-PLA2がバキュロウイルス感染Sf9細胞から均一になるまで、亜鉛キレートカラム、ブルーセファロースアフィニティクロマトグラフィーおよびアニオン交換カラムを使用して精製される。精製および限外濾過後、酵素は6mg/ml、4℃で保存することができる。アッセイ緩衝液は、Tris-HCl(50mM)、NaCl(150mM)および1mM CHAPS、pH7.4を室温で含む。結合力は、蛍光分析プレートリーダーを384ウエルマイクロタイタプレートと共に用いて、基質してのN-((6-(2,4-ジニトロフェニル)アミノ)ヘキサノイル)-2-(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボロ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-ペンタノイル)-1-ヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩(PED6、分子プローブカタログ参照番号D-23739)の加水分解に対する、535nmでの発光の増加により測定する。反応は10μlの総体積の阻害剤に酵素(約400pM最終、重量)および基質(5μM最終)を添加することにより開始される。
2010526805.tif 000082
【０２３０】
本明細書で開示した、例えば合成の実施例と題するセクションで開示された化合物を試験し、0.1〜10nMの範囲のIC50値を有することを見出した。
【０２３１】
神経変性疾患または障害の治療のためのLp-PLA2を阻害する作用物質の使用
BBB透過性と関連する障害
理論に縛られることを望んではいないが、BBBは解剖学的関門である他に機能的関門であり、最適CNS機能のための一定環境を維持するのに非常に重要である。代謝物質のほとんど(すなわち、糖およびアミノ酸)が親水性であり、特定の担体輸送システムによってのみ、BBBを横切るが、これらのシステムはBBB内皮細胞の管腔側および反管腔側の両方で発現される。担体および酵素の分布において著しい頂端/基底差が存在し、これにより、特定のBBB内皮が周囲内皮から区別される。BBB透過性の減衰に関連する病態生理および機構の理解については、実質的に進歩している。「病気のBBB」の臨床的な意味は、脳に影響する多くの疾患において起こり、血管透過性の著しい増加が存在するという様式で、BBBが破壊され、または変更される。理論に縛られないが、様々な分子が内皮を通過することができる様々な様式が存在する。これらは損傷した内皮を通る、細胞間経路、血管輸送、または直接経細胞透過を含む。
【０２３２】
異常BBBまたはBBB機能不全は、特別な疾患経過、例えば、神経変性疾患および障害の原因または結果である可能性がある。BBB透過性の増加が報告されている疾患としては、新生物、虚血、高血圧、認知症、てんかん、感染、多発性硬化症、および外傷が挙げられる。疾患のBBB機能に対する効果は二次的に脳血流および脳での血管緊張に影響し、これはさらにBBBを横切る輸送に影響する。
【０２３３】
本明細書で開示されるように、本明細書で開示した作用物質を使用するLp-PLA2の阻害は、BBB透過性が起こるおよび/またはBBB破壊が起きる障害または疾患の治療に有用である。作用物質、例えば、本明細書で開示した作用物質を使用するLp-PLA2の阻害は、無傷のBBBの維持が望ましい障害または疾患の治療または阻止に対し有用である。
【０２３４】
いくつかの態様では、本明細書で開示したLp-PLA2を阻害する作用物質は、神経変性疾患および障害を阻止および治療する際に有用である。神経疾患ならびに神経変性疾患および障害の例としては、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)、血管性認知症、加齢および軽度認知機能障害が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２３５】
別の態様では、本明細書で開示したLp-PLA2を阻害する作用物質は、BBB透過性が、例えば、限定はされないが、下記に対し重要な役割を果たすことが決定されている、または決定することができる疾患を阻止および治療する際に有用である：高浸透圧；酸性pH；火傷後エンセファロパシー；鉛エンセファロパシー；自己免疫性脳炎；多発性硬化症；虚血後再灌流；急性高血圧；マイクロ波照射；肝性エンセファロパシー；発作；腫瘍；発生；多血；低体温；照射後；高圧条件；髄膜炎；リンパうっ滞性エンセファロパシー；糖尿病；ウェルニッケ・コルサコフ症候群；家族性精神遅滞および筋萎縮性側索硬化症(ALS)。
【０２３６】
本明細書で開示したLp-PLA2を阻害する作用物質による治療に適した対象は、疾患の危険性があるが症状を示していない対象(例えば、無症候性対象)、ならびに現在症状を示している対象を含む。アルツハイマー病の場合、十分長く生きていれば、事実上誰もがアルツハイマー病にかかる危険性がある。そのため、本発明の方法は、対象患者の危険性の評価無しで、一般群に予防的に実施することができる。本明細書で開示した方法は、アルツハイマー病の公知の遺伝的危険性を有する個体に対しとりわけ有用である。そのような個体としては、この疾患を経験した親戚を有するもの、および本明細書で開示されたように、遺伝子または生化学マーカーの分析により危険性が決定されたものが挙げられる。
【０２３７】
血管認知症疾患
血管認知症は、多くの異質の病理学的状態により構成され、虚血または出血性脳病変ならびに遅延性低灌流中に発症する病変に起因する。
【０２３８】
血管性認知症の皮質下虚血形態は、血管性認知機能障害および認知症の一般的な型であり、高齢者にける認知機能低下の主原因の1つである。皮質下虚血血管性認知症は、ラクナおよび広範囲の白質病変を引き起こす小血管疾患に起因し、大血管認知症または皮質血管認知症に相当する可能性がある(Roman GC, Neurology. 1993;43:250-260, Roman GC Lancet Neurol. 2002;1:426-436)。皮質下虚血血管性認知症における虚血病変は特に、前頭-皮質下回路に影響し、血管性認知症の主な認知および臨床神経学的効果を説明する観察結果である(Ishii N, Neurologyl 986;36:340-45, Cummings JL, Arch Neurol 1993;50:873-80)。皮質下虚血血管性認知症はまた、持続的な高血圧(de Leeuw FE, Brain. 2002;125:765-772)およびうっ血性心不全による低灌流(Roman GC. Neurol Res. 2004;26:454-458)、心房細動(de Leeuw FE, Neurology. 2000;54:1795-1801)および閉塞型睡眠時無呼吸(Kamba M, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 2001;71;334-339)により引き起こされる。
【０２３９】
高齢者において一般的な所見である、虚血白質病変は、皮質下虚血血管性認知症および認知機能障害における特徴的な病態変化であり、認知機能不全は病変重篤度に関連する(Hachinski VC, Arch Neurol. 1987;4:21-23， Pantoni L, Alzheimer Dis. Assoc. Disord. 1999；13(suppl 13)：S49-S54、de Groot JC, Neurology2001;56:1539-1545)。脳血管白質病変は血管性認知症のいくつかの型、例えば、ビンスワンガー病、脳アミロイド血管症、ならびに皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症(CADASIL)の主要な病態を構成する。これらの脳血管白質病変は、主に深部白質におけるいくつかの動脈または細動脈の重篤な狭窄に起因する、慢性脳高血圧により引き起こされる(Pantoni L, Stroke 1997;28:652-659, de Groot JC, Neurology 2001;56:1539-1545, Roman GC, Neurol. Res. 2004;26:454-458, Capizzano AA, Am J Neuroradiol 2000;21:621-630)。
【０２４０】
アルツハイマー病
アルツハイマー病(AD)は老年認知症に至る進行性疾患である。一般的には、Selkoe, TINS 16, 403-409(1993)；Hardy et al., WO 92/13069;Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438-447(1994)；Duff et al., Nature 373, 476-477(1995)；Games et al., Nature 373, 523(1995)を参照されたい。大まかに言うと、疾患は2つのカテゴリに入れられる：老齢(65+歳)で起こる遅発型および老年期前、すなわち35〜60歳でよく発症する早期発症型。どちらの型の疾患においても、病態は同じであるが、より早い年齢で生じた症例では、β異常がより重篤で、広汎である傾向がある。疾患は、巨視的レベルでは、MRI像において神経損失の直接の結果として見られるような、頭蓋冠からの有意の脳萎縮により、ならびに、脳における2つの型の巨視的病変、老人斑および神経原線維変化により特徴づけられる。老人斑は、幅150μmまでの混乱した神経突起および細胞外アミロイド沈着物を含む領域であり、これらは典型的には中心で濃縮しており、脳組織の切片の顕微鏡分析により視認可能である。神経原線維変化は、対で互いにねじり合わされた2つの線維から構成されるタンパク質の細胞内沈着物である。
【０２４１】
斑の主成分は、Aβまたはβ-アミロイドペプチドと呼ばれるペプチドである。Aβペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質(APP)と呼ばれる前駆体タンパク質の39〜43アミノ酸の内部フラグメントである。APPタンパク質内でのいくつかの変異がアルツハイマー病の存在と相関している。例えば、Goate et al., Nature 349, 704)(1991)(バリン717からイソロイシンへ)；Chartier Harlan et al. Nature 353, 844(1991))(バリン717からグリシンへ)；Murrell et al., Science 254, 97(1991)(バリン717からフェニルアラニンへ)；Mullan et al.,グリシン)；Murrell et al., Science 254, 97(1991)(バリン717からフェニルアラニンへ)；Mullan et al.,Nature Genet. 1, 345(1992)(リシン595-メチオニン596からアスパラギン酸595-ロイシン596へ変化する二重変異)を参照されたい。そのような変異は、APPのAβへのプロセシングの増加または変化、特に、長い形態のAβ(すなわち、Aβ1-42およびAβ1-43)の量の増加へのAPPのプロセシングにより、アルツハイマー病を引き起こすと考えられる。他の遺伝子、例えば、プレセニリン遺伝子、PS1およびPS2における変異は、間接的に、APPのプロセシングに影響し、長い形態のAβの量が増加すると考えられる(Hardy, TINS 20, 154(1997)を参照されたい)。これらの観察結果から、Aβ、特にその長い形態は、アルツハイマー病の原因要素であることが示される。
【０２４２】
β-アミロイドペプチド、またはA4ペプチドとしても公知のAβ(米国特許第4,666,829号；Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131(1984)を参照されたい)は、39〜43アミノ酸のペプチドであり、アルツハイマー病に特徴的な斑の主成分である。Aβは、より大きなタンパク質APPの、βおよびγセクレターゼと呼ばれる2つの酵素によるプロセシングにより生成される(Hardy, TINS 20, 154(1997)を参照されたい)。アルツハイマー病と関連するAPPにおける公知の変異は、βまたはγ-セクレターゼの部位に近接して、またはAβ内で起こる。例えば、717位がAβへのプロセシングにおけるAPPのγ-セレクターゼ切断部位に近接しており、670/671位はβ-セレクターゼ切断部位に近接する。変異は、Aβが形成される切断反応と相互作用し、生成されるAβの42/43アミノ酸形態の量を増加させることにより、AD疾患を引き起こすと考えられる。
【０２４３】
Aβは古典的および選択的補体カスケードの両方を固定および活性化する異常な特性を有する。特に、C1qおよび最終的にはC3biに結合する。この会合により、マクロファージへの結合が促進され、B細胞の活性化が引き起こされる。さらに、C3biはいっそう崩壊し、その後、T細胞依存様式でB細胞上のCR2に結合し、これらの細胞の活性化が10,000増加する。この機構によりAβは、別の抗原よりも過剰に免疫応答を生成することになる。
【０２４４】
アルツハイマー病のほとんどの治療戦略は、典型的には、APPからのAβ42の生成の減少により、および/または脳内のこのペプチドの沈着に直接寄与する源から現存するAβ42レベルを低下させるいくつかの手段により、脳内のAβ42の沈着を減少または排除することを目的とする(De Felice and Ferreira, 2002)。孤発性アルツハイマー病の発症における加齢関連の原因因子の部分的なリストは、細胞内蓄積に有利となる、Aβペプチド産生とそのニューロンからのクリアランスとの間の均衡のシフト、ニューロンによる周囲の細胞外空間へのAβペプチドの分泌の増加、これらの細胞への酸化的損傷のレベルの増加、および全脳低灌流ならびに影響を受けたニューロンにおける関連する代償性代謝シフトを含む(Cohen et al., 1988；Higgins et al., 1990；Kalaria, 2000；Nalivaevaa et al., 2004；Teller et al., 1996；Wen et al., 2004)。
【０２４５】
ニューロンおよび斑内に沈着するAβ42はまた、アルツハイマー病発病中、ニューロンの外側から生じる可能性がある(外因性Aβ42)。血中の可溶性Aβペプチドのレベルは、健康な個体の脳内の間質空間およびCFS中よりも極めて高いことが公知であり(Seubert et al., 1992)、血液は、アルツハイマー病脳内に最終的に沈着する外因性Aβペプチド源である(Zlokovic et al., 1993)。しかしながら、能動的に内皮細胞を横切って輸送される微量のAβを除き、正常で健康な個体における脳組織への血液由来のAβペプチドのアクセスは、血液脳関門(BBB)の完全性により効果的に遮断されることは周知である(Kandimalla et al., 2005；Poduslo et al.,1999)。BBBは、局在化星状細胞の足突起によりさらに支持されている基底膜上に存在する脳内皮細胞から構成される複雑な構造体である(Gloor et al., 2001；Risau et al., 1998)。これは、血液成分の脳組織への通過を厳密に調節し、ほとんど全てのタンパク質および他の巨大分子に対し著しく非透過性であるが、同時に、必須分子の選択的な侵入は可能である(Mayhan,2001)。加齢が、BBBの完全性を損なう可能性のある血管の変性変化と関連することが多くの証拠から明らかになっている。例えば、血管性認知症およびADを含む高齢者における多くのかなり一般的な神経変性疾患が、少なくとも部分的に、脳の微小血管内で発症する脳血管病態から生じている(Breteler, 2000；Buee et al.,1997；de la Torre, 1997；Esiri et al., 1999；Kalaria et al., 1996)。神経血管系と神経変性疾患との間の関係は、アミロイド斑および神経原線維変化を含むアルツハイマー病態が発作病変に近接してその後に発症するという周知の事実である(Jellinger, 2002；Kalaria, 1996；Kalaria, 2002；Natte et al., 1998)。
【０２４６】
アルツハイマー病に対する危険性の遺伝子マーカーとしては、APP遺伝子における変異、特に、それぞれ、HardyおよびSwedish変異と呼ばれる717位ならびに670および671位での変異が挙げられる(Hardy, TINS、上記を参照されたい)。危険性の別のマーカーはプレセニリン遺伝子、PS1およびPS2ならびにApoE4における変異、アルツハイマー病の家族歴、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化である。アルツハイマー病を現在患う対象は、特徴的な認知症、ならびに上記危険因子の存在から認識することができる。さらに、アルツハイマー病を有する対象を識別するには多くの診断検査が有効である。これらには、CSFタウおよびAβ42レベルの測定が含まれる。タウおよびAβ42レベルの上昇は、アルツハイマー病の存在を表す。アルツハイマー病を患う個体はまた、MMSEまたはADRDA基準により診断することができる。分析のための組織試料は典型的には患者由来の血液、血漿、血清、粘液または脳脊髄液である。任意の型のAβペプチド、典型的にはAβ42に対する免疫応答の徴候に対し試料を分析する。免疫応答は、例えば、Aβペプチドに特異的に結合する抗体またはT-細胞の存在から決定することができる。Aβに特異的な抗体を検出するELISA法が実施例セクションで記載されている。
【０２４７】
無症候性患者では、治療は任意の年齢(例えば、10、20、30)で開始することができる。しかしながら、通常、患者が40、50、60または70に到達するまで治療を開始する必要はない。治療は典型的には、ある期間にわたる複数回の投与を必要とする。治療はCSF中のAβペプチドの存在またはBBB透過性を時間経過と共に分析することによりモニタリングすることができる。AβペプチドがCSF中に依然として存在し、またはBBBが透過性もしくは不完全なままである場合、本明細書で開示したLp-PLA2を阻害する作用物質、および/またはアルツハイマー病に対する別の療法による治療を用いてさらに治療することが推奨される。潜在的なダウン症候群患者の症例では、治療は母親に治療薬を投与することにより出産前に、または出生後すぐに開始することができる。
【０２４８】
いくつかの態様では、本明細書で開示したLp-PLA2を阻害する作用物質はまた、一般に別の神経変性疾患または認知機能障害：例えば、認知症、抑鬱、錯乱、クロイツフェルト・ヤコブまたは狂牛病、ハンチントン病、運動協調性の損失、多発性硬化症、パーキンソン病、ピック病および他の脳蓄積障害(例えば、アミロイドーシス、ガングリオドーシス、脂質蓄積障害、ムコ多糖症)、失神、ならびに血管性認知症の治療に有用である。このように、治療は、神経変性疾患により無症状で影響を受ける対象に対して実施することができる；認知機能を改善することができる。治療効果は、脳血流(CBF)および/または脳血液関門(BBB)機能をモニタリングすることにより決定することができる。例えば、CSFにおけるタウまたはAβの存在の測定。いくつかの態様では、例えば、参照により全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第6,884,591号に開示されているように、BBB機能に対するマーカーを使用することができる。いくつかの態様では、BBB機能は、当業者に公知の画像技術を用いて、例えば、高コントラスト性能を備えたMRI装置を用いてモニタリングすることができる。そのような態様では、MRI直前に特定のMRI造影剤の血管注入を実施し、この場合、造影剤は正常なBBBを有する対象では造影剤は血管中に存在したままであり、一方、透過性BBBを有する個体では、造影剤が脳組織に透過し、MRI上に「クラウド」として現れる。この方法を使用して、BBB破壊の位置および程度の定量的測定値を、MRIソフトウエアを使用して決定することができる。したがって、Lp-PLA2阻害剤を用いた治療効果は、本明細書で開示されるように、投与前と比べた場合のLp-PLA2阻害剤の投与後の、「クラウド」の測定可能な減少および/またはBBB破壊の程度の減少を検出することにより決定することができる。
【０２４９】
いくつかの方法は、例えば、ある用量の作用物質を投与する前の対象内のCSF中のβアミロイドのレベルのベースライン値を決定する段階、およびこれを治療後のCSF中のβアミロイドに対する値と比較する段階を必要とする。CSF中のβアミロイドレベルの減少、例えば10%の減少は陽性の治療結果(すなわち、作用物質の投与により、CSF中のβアミロイドの減少が達成された、または増強されたこと)を示す。CSF中のβアミロイドレベルに対する値が有意に変化しない、または増加する場合、陰性の治療効果が示される。一般に、作用物質を用いた初期の治療過程を受けた対象は、本明細書で記載した作用物質を連続投与すると、CSF中のβアミロイドの減少を示す。
【０２５０】
治療効果を決定する別の方法では、対照群について、βアミロイドの対照値(すなわち、平均および標準偏差)を決定する。典型的には、対照群内の個体は、前治療を受けておらず、アルツハイマー病を患っていない。本明細書で開示したLp-PLA2阻害剤を投与した後の対象におけるCSF中のβアミロイドの測定値を、その後、対照値と比較する。対照値に対する対象のCSF中のβアミロイドの減少(すなわち、対象における少なくとも10%のβアミロイドの減少)は陽性の治療結果を示す。有意の減少がないと、陰性の治療効果が示される。
【０２５１】
言い換えれば、例えば、CSF中のβアミロイドの対照値は、CSF中のβアミロイドを減少させるのに有効な治療薬による治療を受けた対象の対照群から決定される。対象におけるCSFβアミロイドの測定値を対照値と比較する。
【０２５２】
別の方法では、本明細書で開示したLp-PLA2を阻害する作用物質による治療を現在受けていないが、以前の治療過程を受けている対象を、CSF中のβアミロイドに対してモニタリングし、治療の再開が必要かどうかを決定する。試験対象におけるCSFβアミロイドの測定値は、以前の治療過程後、対象において以前達成されたCSFβアミロイドのレベルと比較することができる。以前の測定に対するCSFβアミロイドの有意の減少(すなわち、少なくとも10%の減少)は、治療を再開することができることを示す。また、対象におけるCSF中のβアミロイドのレベルは、治療過程を受けた後、対象群で決定されるCSFβアミロイドの対照レベルと比較することができる。また、対象におけるCSF中のβアミロイドのレベルは、疾患の症状がない、特にBBB透過性の症状がない、予防的に治療を受けた対象群、または疾患症状の寛解を示す治療的に処置された対象群における対照値と比較することができる。
【０２５３】
アルツハイマー病の危険性がある、またはアルツハイマー病を有する対象を識別するための方法
本明細書で開示した方法を使用した治療に適した対象としては、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病の危険性があるが、症状を示していない対象、ならびに神経変性疾患の症状を示す対象、例えばアルツハイマー病の症状を有する対象が挙げられる。
【０２５４】
対象は、多くの生化学および遺伝子マーカーに基づき、アルツハイマー病を有するまたは発症する可能性についてスクリーニングすることができる。
【０２５５】
アルツハイマー病に対する遺伝子マーカーを用いて、アルツハイマー病を発症する危険性が増加した対象を診断することもできる。数家族における遺伝子異常は21番染色体に帰着されている(St. George-Hyslop et al., Science 235:885-890, 1987)。1つの遺伝子マーカーは、例えば、APP遺伝子の変異、特にそれぞれ、HardyおよびSwedish変異と呼ばれる717位ならびに670および671位の変異である(Hardy, TINS、上記を参照されたい)。別の危険性マーカーは、プレセニリン遺伝子、PS1およびPS2ならびにApoE4における変異、アルツハイマー病の家族歴、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化である。APP、PS1またはPS2変異を有する対象は、アルツハイマー病を発症する可能性が高い。ApoEは感受性遺伝子であり、ApoEのe4アイソフォーム(ApoE4アイソフォーム)を有する対象は、アルツハイマー病を発症する増加した危険性を有する。ApoE4アイソフォームを有する対象に対する試験は米国特許第6,027,896号において開示されており、これは参照により本明細書に全体が組み入れられる。別の遺伝的なつながりがアルツハイマー病の危険性の増加と関連しており、例えば、ニューロンソーティリン関連受容体SORL1における変動は、遅発型アルツハイマー病を発症する可能性を増加させる可能性を有する(Rogaeva at al, Nat Genet. 2007 Feb;39(2):168-77)。別の潜在的アルツハイマー病感受性遺伝子としては、例えば、ACE、CHRNB2、CST3、ESR1、GAPDHS、IDE、MTHFR、NCSTN、PRNP、PSEN1、TF、TFAMおよびTNFが挙げられ、アルツハイマー病を発症する危険性が増加した対象を識別するために使用され(Bertram et al, Nat Genet. 2007 Jan;39(1)：17-23)、ならびにα-Tカテニン(VR22)遺伝子における変動(Bertram et al, J Med Genet. 2007 Jan;44(1):e63)およびインスリン分解酵素(IDE)である(Kim et al, J Biol Chem. 2007;282:7825-32)。
【０２５６】
簡単な眼の検査に基づいて、アルツハイマー病を発症する危険性の増加した対象を診断することもでき、この場合、白内障および/またはレンズ中のAβの存在により、アルツハイマー病を発症する危険性の増加した対象が識別される。アルツハイマー病を検出するための方法は、Neuroptixからの準弾性光散乱装置の使用(Goldstein et al., Lancet. 2003;12;361:1258-65)、準弾性光散乱(QLS)および蛍光リガンド走査(FLS)およびNeuroptix(商標)QEL走査装置の使用を含み、アルツハイマー病に対する初期診断としてレンズの特定の領域内の沈着物が検査および測定される。そのような非侵襲的眼検査法を使用して、アルツハイマー病を発症する危険性のある対象を診断するための方法は、米国特許第7,107,092号において開示されており、これは参照により全体が本明細書に組み入れられる。
【０２５７】
現在アルツハイマー病を患う個体は、特徴的な認知症、ならびに上記危険因子の存在から認識することができる。さらに、多くの診断試験がADを有する個体を識別するために有効である。これらにはCSFタウおよびA×3b242レベルの測定が含まれる。タウの上昇およびA×3b242レベルの減少はアルツハイマー病の存在を示す。
【０２５８】
アルツハイマー病を臨床的に診断するのに使用される2つの別の「基準」が存在する：DSM-IIIR基準およびNINCDS-ADRDA基準(国立神経疾患・コミュニケーション障害・脳卒中研究所(NINCDS)およびアルツハイマー病および関連障害協会(ADRDA)に対する頭文字である；McKhann et al., Neurology 34:939-944, 1984)。簡単に言うと、DSM-IIIR下でのアルツハイマー病の診断に対する基準は、(1)認知症、(2)一般に進行性の悪化過程を伴う潜行性の発症、および(3)病歴、理学的検査、および臨床検査による認知症の他の全ての特定の原因の排除を含む。DSM-IIIR基準の中では、認知症は「知的能力、例えば、記憶、判断、抽象的思考、および他の高次皮質機能の多面的な損失、ならびに性格および行動の変化」を含むと理解されている(DSM-IIR,1987)。
【０２５９】
対照的に、NINCDS-ADRDA基準は、「高可能性」、「可能性」、および「確定」アルツハイマー病を含む、アルツハイマー病の3つのカテゴリを説明する。「高可能性」アルツハイマー病の臨床診断は、認知症を引き起こすのに十分な他の神経、精神または全身疾患のない、認知症症候群を基になされてもよい。「可能性」アルツハイマー病の臨床診断は、(a)臨床検査により確立され、ミニメンタル試験などの試験により立証された認知症(Foldstein et al., J. Psych. Res. 12:189-198, 1975)；(b)2つまたはそれ以上の認知領域の欠損；(c)記憶および他の認知機能の進行性の悪化；(d)意識障害無し；(e)40歳と90歳の間での発症、65歳以降が最も多い；ならびに(f)認知症の原因となりうる全身疾患または他の脳疾患がない、を含む。アルツハイマー病の確定診断に対する基準は、生検から、または剖検後、得られた病理組織学的証拠を含む。確定アルツハイマー病の確認には、脳生検試料(しばしば、得るのが困難である)からの組織学的検査が必要であるため、アルツハイマー病の初期診断にはほとんど使用されない。
【０２６０】
アルツハイマー病の神経病理学的診断も使用することができ、この場合、神経皮質(前頭葉、側頭葉および頭頂葉)、海馬および扁桃体における斑およびタングルの数が分析される(Khachaturian, Arch. Neurol. 42:1097-1105；Esiri, “Anatomical Criteria for the Biopsy diagnosis of Alzheimer’s Disease,”Alzheimer’s Disease, Curret Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini(eds.),pp. 239-252,1990)。
【０２６１】
アルツハイマー病を診断するには定量的脳波分析(EEG)を使用することもできる。この方法は、アルツハイマー病の診断のためにβ、α、θ、およびδ帯域のフーリエ解析を使用する(Riekkinen et al, “EEG in the Diagnosis of Early Alzheimer’s Disease,” Alzheimer’s Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini (eds.), pp. 159-167, 1990)。
【０２６２】
神経萎縮の程度を定量化することによりアルツハイマー病を診断することもできるが、これは、そのような萎縮がアルツハイマー病の結果として一般に受け入れられるからである。これらの方法の例としては、コンピュータ断層撮影スキャン(CT)、および磁気共鳴画像法(MRI)が挙げられる(Leedom and Miller, “CT, MRI and NMR Spectroscopy in Alzheimer’s Disease,” Alzheimer’s Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini(eds.),pp.297-313, 1990)。
【０２６３】
陽電子放出断層撮影(PET)(Parks and Becker, “Positron Emission Tomography and Neuropsychological Studies in Dementia,”Alzheimer’s Disease’s, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini(eds.),pp.315-327, 1990)、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)(Mena et al., “SPECT Studies in Alzheimer’s Type Dementia Patients,” Alzheimer’s Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini(eds.),pp.339-355, 1990)、およびキセノン吸入法(Jagust et al., Neurology 38:909-912;Prohovnik et al., Neurology 38:931-937；およびWaldemar et al., Senile Dementias：II International Symposium, pp. 399407, 1988)により減少した血流または代謝を測定することによって後側頭頭頂葉大脳皮質における減少した脳血流または代謝を評価することにより、アルツハイマー病を診断することもできる。
【０２６４】
アルツハイマー病を免疫学的に診断することもできる(Wolozin, “Immunochemical Approaches to the Diagnosis of Alzheimer’s Disease,” Alzheimer’s Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini(eds.),pp.217-235, 1990)。Wolozinおよび共同研究者達(Wolozin et al., Science 232：648-650, 1986)は、アルツハイマー病患者の斑および神経タングルで発現される68-kDaタンパク質“A68”と反応するモノクローナル抗体“Alz50”を生成させた。抗体Alz50およびウエスタンブロット分析を使用すると、何人かのアルツハイマー患者においてA68が脳脊髄液(CSF)中で検出されたが、正常な老齢患者のCSFでは検出されなかった(Wolozin and Davies, Ann. Neurol. 22:521-526, 1987)。
【０２６５】
アルツハイマー病の神経化学マーカーを用いてアルツハイマー病を診断することもできる。アルツハイマー病と関連する神経化学マーカーとしては、アセチルコリンエステラーゼレベルの減少(Giacobini and Sugaya, “Markers of Cholinergic Dysfunction in Alzheimer’s Disease,” Alzheimer’s Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini(eds.),pp.137-156, 1990)、ソマトスタチンの減少(Tamminga et al., Neurology 37：161-165,1987)、セロトニンよ5-ヒドロキシインドール酢酸との間の負の関係(Volicer et al., Arch Neurol. 42:127-129,1985)、ホモバニリン酸におけるより大きなプロベネシドに誘導される上昇(Gibson et al., Arch. Neurol. 42:489-492, 1985)、およびニューロン特異的エノラーゼの減少(Cutler et al., Arch. Neurol. 43:153-154, 1986)が挙げられる。
【０２６６】
認知症の危険性に対する、または認知症を有する対象を識別するための方法および/または記憶評価のための方法
現在の標準診療を使用して、様々な型の認知症を診断することができ、診断された時点で、長期にわたり疾患の進行をモニタリングすることができる。1つのそのような方法としては、下記のうちの少なくとも1つが挙げられる；(i)記憶評価、(ii)広範な神経心理学的検査、(iii)老年神経学者による検査および(iv)脳のMRI画像法。疾患の進行は、これらのパラメータの時間に伴う変化により立証される。いくつかの態様では、これらの評価の少なくとも1つのパラメータの変化を使用して、時間に伴う対象におけるLp-PLA2阻害剤の有効性を評価することができる。
【０２６７】
記憶評価、例えば、UMDNJ New Jersey Institute for Successful Agingのプログラムを使用することができる。短期記憶および/または認知機能低下を訴える成人患者が、老人神経学、神経心理学および社会福祉による評価を含む、記憶評価プログラムにおいて見られる。患者は、可能性または高可能性記憶障害または認知症の疑いに基づき、自己言及し、または地域臨床医および医師から指示されることができる。そのような記憶評価では、最初の評価時に、(i)記憶評価、(ii)広範な神経心理学的検査、(iii)老年神経学者による検査および(iv)脳のMRI画像法などの評価全てが同じ日に実施される。神経心理学的検査は、欠陥のアレイおよび重篤度を決定するのを助ける認知機能の広い一覧表を獲得する。これらは判断、洞察、行動、見当識、実行制御、一般的な知能機能、視覚空間機能、記憶および新しい学習能力の評価を含む。抑鬱は、もしあれば、識別される。神経学的評価は認知変化の病歴ならびに一般的な病歴を獲得し、典型的には完全な神経学的検査が実施される。神経学的検査はまた、ビタミンB12、フォレート、基本代謝プロファイル、CBC、TSH、ALT、AST、C-反応性タンパク質、血清ホモシステイン、およびRPRを含む認知症の可逆原因を排除する実験室研究もまた含むことができる。脳画像法は構造的な脳画像、例えば、脳MRIを提供するが、当業者に公知の別の脳画像法を使用することができる。病歴、神経心理学的試験、神経学的検査、臨床検査および神経画像のデータマトリクスを使用して、診断を策定する。
【０２６８】
認知症診断は、2001年に公表された神経学実施パラメータの米国アカデミーのガイドラインに基づくことができる。アルツハイマー病の診断は、NINDS-ADRDA基準に基づくことができる。血管性認知症の診断は、カリフォルニア州AD診断および治療センター基準に基づくことができる。診断的結果を患者および家族にその後のミーティングで連絡することができる。診断的結果が、患者または対象が認知症および/または記憶喪失を有する、またはその可能性があることを示した場合、臨床医は有効量の、本明細書で開示したLp-PLA2阻害剤を用いた治療投与を忠告することができる。しばしば、その後のミーティングではソシアルワーカーの存在がまた、現在および将来の要求を有する患者およびその家族を助け、指示することができる。
【０２６９】
神経変性疾患または障害、例えば血管性認知症またはアルツハイマー病の危険性がある、またはそれらを有する患者を診断する別の方法は、本明細書で開示した方法を使用する、例えばdiaDexusから市販されているPLAC試験を使用する、Lp-PLA2活性および/または発現の測定を含む。
【０２７０】
BBB破壊またはBBB透過の危険性がある、またはそれらを有する対象を識別するための方法
BBB破壊の直接検出は、MRIおよび造影剤の注入を用いて評価することができる。MRIの解像度および特別な造影剤の使用における改善を使用して、BBB透過性を検出することができる。1つの方法では、対象には脳画像法、例えばMRI画像法直前に造影剤を投与する。無傷のBBBの場合、造影剤は脳血管内に閉じ込められ、一方、破壊されたBBBを有する対象では、造影剤は脳組織中に「噴き出し」、これは視認可能とすることができる。このように、対象における脳の位置、BBB破壊のサイズおよびBBB障害の程度、例えば、血管の漏れの程度はBBB透過性の測定可能なパラメータとして直接的に、および定量的に評価することができる。さらに、そのような方法を使用して、Lp-PLA2を阻害する作用物質を用いる対象の治療から得られるこれらのパラメータの任意の改善を評価することができる。BBB破壊の直接可視化およびその関連する脳への血管の漏れは、本明細書で開示した方法では、Lp-PLA2阻害剤でBBB透過性を有する対象を治療する有利な効果をモニタリングするのに有用である。BBB透過性の少なくとも1つの測定可能なパラメータ、例えば、Lp-PLA2阻害剤が投与された対象における位置、BBB破壊のサイズおよび血管の漏れの程度の改善は、Lp-PLA2阻害剤の投与に由来する陽性の結果を示す。BBB透過性のパラメータは、直接視覚化によりモニタリングすることができ、MRI関連画像解析により定量化することができ、本明細書で開示した方法において有用である。
【０２７１】
血管性認知症およびアルツハイマー病のモデルにおけるLp-PLA2阻害剤の評価
いくつかの態様では、Lp-PLA2を阻害する作用物質は、動物モデルにおいて、BBB透過性を軽減する効果に対し評価することができる。例えば、本明細書で開示された高血糖および高コレステロール血症(HG/GC)のブタモデルを使用することができるが、この場合、BBB透過性は害されており、例えば、BBBは透過性であり、ここで、BBB透過性は、当業者に普通に知られている方法により、Lp-PLA2に対する阻害剤の存在下、および不存在下で評価することができる。いくつかの態様では、例えば、米国特許第6,884,591号において開示されているように、BBB機能に対するマーカーを使用することができ、これは参照により全体が本明細書に組み入れられる。
【０２７２】
いくつかの態様では、Lp-PLA2を阻害する作用物質は動物モデルにおいて血管性認知症に対し評価することができ、血管性認知症の発症および治療に対するLp-PLA2阻害剤の効果の分析、ならびに血管性認知症の発症、予後および回復に対する薬物用量の評価が可能になる。
【０２７３】
血管性認知症の動物モデルとしては、例えば、ラットにおける頸動脈の閉塞が挙げられる。例えば、Sarti et al., Persistent impairment of gait performances and working memory after bilateral common carotid artery occlusion in the adult Wistar rat, BEHAVIOURAL BRAIN RESEARCH 136:13-20(2002)を参照されたい。このように、脳血管白質病変は、慢性脳低灌流の結果として、ラット脳において実験的に誘導することができる。このモデルは両方の総頸動脈の永久的な閉塞により作成される。例えば、Wistarラットは麻酔することができ、両側総頸動脈が正中頸部切開により露出され、総頸動脈は絹縫合を用いて両側的に二重連結される。脳血流(CBF)はその後、最初に、連結後対照の約30〜50%だけ減少する。その後、CBF値は、約1週間〜約1ヶ月後、対照の40〜80%の範囲となる。血液脳関門破壊もまた観察され、ならびに白質病変ではマトリクスメタロプロテイナーゼ活性の増加が観察される。これらの変化はヒト脳血管白質病変における変化と非常に類似すると考えられる。さらに、これらの結果から、炎症および免疫学的反応が白質変化の病変形成において重要な役割を果たすことが示唆される。
【０２７４】
そのような生理学的変化は閉塞させた頸動脈ラットモデルにおいて学習および記憶問題と相関する。このように、閉塞動脈を有するラットの歩行性能はベースライに比べ、時間と共に低下しており、例えば、90日で、両側総頸動脈閉塞を有するラットは、偽手術されたラットに比べ、物体認識およびY迷路自発的変化試験に対する性能の減少を有した。このように、両側総頸動脈の永久閉塞による実験的慢性脳低灌流のこのラットモデルは、白質の粗鬆化と共に著しい学習障害に対するモデルとして有用である。このモデルは、慢性脳低灌流の病態生理に対するLp-PLA2を阻害する作用物質の効能を評価し、脳血管疾患を有する患者における認知機能障害および白質病変を阻止するための最適用量および投与計画を決定するためのデータを提供するための有用な道具である。
【０２７５】
血管性認知症を治療または阻止するためのLp-PLA2を阻害する作用物質の効能は、そのため、頸動脈閉塞を有するラットにおける歩行性能、記憶、学習能力ならびに白質病変の発生率および重篤度を観察することにより決定することができる。同様に、Lp-PLA2阻害剤の用量および投与スケジュールは、血管性認知症に対し治療されるヒト患者の記憶および学習能力に準じるように調整することができる。
【０２７６】
いくつかの態様では、Lp-PLA2を阻害する作用物質の最適用量は、Lp-PLA2の活性および/または発現を減少させるもの、例えば、Lp-PLA2遺伝子によりコードされた核酸、例えばmRNAの発現の減少、またはLp-PLA2タンパク質の発現または活性の減少である。別の態様では、Lp-PLA2を阻害する作用物質の最適用量は神経変性疾患または障害を阻止するのに、または神経変性疾患または障害の症状を減少させるのに、最大保護効果を発生させるものである。
【０２７７】
別の態様では、Lp-PLA2を阻害する作用物質の最適用量は、動脈閉塞により引き起こされた損傷組織に対する最大の有利効果を発生させるものである。有効用量は血管性認知症に特徴的な少なくとも1つのマーカー、症状、または組織学的証拠の、少なくとも統計学的に、または臨床的に有意な減衰を引き起こす。血管性認知症に特徴的なマーカー、症状、または組織学的証拠としては、記憶喪失、錯乱、軸索輸送障害、脱髄、メタロプロテイナーゼ(MMP)の誘導、グリア細胞の活性化、リンパ球の浸潤、浮腫ならびに組織損傷およびさらには、血管損傷に至る免疫反応が挙げられる。対照患者または動物が症状または組織損傷の悪化を経験する条件下での、症状の安定化または組織損傷の減少は抑制治療の有効性の1つの指標となる。
【０２７８】
BBB透過性を有する別の疾患、神経変性疾患
いくつかの態様では、本発明で開示した作用物質を使用するLp-PLA2を阻害する作用物質は神経変性疾患および障害を阻止および治療するのに有用である。神経疾患および神経変性の別の例としては、例えば、ポリグルタミンリピート障害、例えばハンチントン病、脊髄小脳失調症(例えば、1、2、3、6、7および17型)、マシャド・ジョセフ病、球脊髄性筋萎縮症(SBMAまたはケネディ病)、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)およびポリグルタミン伸長に起因する他の神経状態、または非コードDNAリピート伸展に由来する疾患、例えば、脆弱X症候群、脆弱XE精神遅滞、フリードライヒ失調症、筋緊張性ジストロフィー、脊髄小脳失調症(8、10および12型)または他の神経変性疾患、例えば、脊髄性筋萎縮症(ウェルドニッヒ・ホフマン病、クーゲルベルク・ヴェランダー病)、ピック病、および海面状脳症が挙げられる。
【０２７９】
本発明で開示した作用物質を使用するLp-PLA2を阻害する作用物質が有用である別の神経変性疾患としては、例えば、加齢性記憶障害、嗜銀性顆粒性認知症、グアムのパーキンソン認知症症候群、自己免疫状態(例えば、ギラン・バレー症候群、ループス)、ビスワンガー病、脳脊髄腫瘍(神経線維腫症を含む)、脳アミロイド血管症(Journal of Alzheimer’s Disease vol 3, 65-73(2001))、脳性麻痺、慢性疲労症候群、皮質基底核変性症、CNS実質の発達性機能障害による状態、脳血管系の発達性機能障害による状態、多発脳梗塞性認知症、皮質下性認知症、レビー小体認知症、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の認知症、異なる組織学が欠如した認知症、ボクサー認知症、difffies石灰化を伴う神経原線維変化、神経変性を含む目、耳および前庭系の疾患(黄斑変性症および緑内障を含む)、ダウン症候群、ジスキネジア(発作性)、ジストニア、本態性振戦、ファール症候群、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、前頭側頭葉変性症、前頭葉認知症、肝性エンセファロパシー、遺伝性痙性対麻痺、水頭症、偽脳腫瘍およびCSF機能障害を伴う他の状態、ゴーシェ病、ハラーホルデン・スパッツ病、コルサコフ症候群、軽度認知機能障害、単量体筋萎縮、運動ニューロン疾患、多系統萎縮症、多発性硬化症および他の脱髄状態(例えば、白質ジストロフィー)、筋痛性脳脊髄炎、ミオクローヌス、化学物質、薬物および毒素により誘導される神経変性、AIDS認知症を含むAIDSの神経症状、エンテロウイルスを含むがそれに限定されない細菌および/またはウイルス感染の神経/認知症状および結果、ニーマン・ピック病、神経原線維変化を伴う非グアム運動ニューロン病、非ケトーシス型高グリシン血症、オリーブ橋小脳萎縮症、眼咽頭型筋ジストロフィー、非麻痺性ポリオおよびポリオ後症候群を含む灰白脊髄炎の神経症状、原発性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病(異型を含む)を含むプリオン病、クールー、致死性家族性不眠症、ゲルストマン・ストライスラー・シェンカー病および他の伝達性海綿状脳症、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、脳炎後パーキンソニズム、進行性筋萎縮症、進行性球麻痺、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、下肢静止不能症候群、レット症候群、サンドホフ病、痙縮、前頭側頭型認知症、線条体黒質変性症、亜急性硬化性全脳炎、亜硫酸オキシダーゼ欠損症、シデナム舞踏病、タングルのみの認知症、テイ・サックス病、トゥレット症候群、血管性認知症、およびウィルソン病が挙げられる。
【０２８０】
本発明で開示した作用物質を使用するLp-PLA2を阻害する作用物質が有用である別の神経変性疾患としては、上記列挙したものではない他の認知症、例えば限定はされないが、他の混合型認知症、前頭側頭型認知症、ピック病、進行性核上性麻痺(PSP)、関連する認知症を伴うパーキンソン病、皮質基底核変性症、多系統萎縮症、HIV-誘導認知症、白質疾患関連認知症、軽度認知機能障害(MCI)が挙げられる。
【０２８１】
いくつかの態様では、本発明で開示した作用物質を使用するLp-PLA2を阻害する作用物質は対象におけるBBB透過性を阻止および治療するのに有用である。BBB透過性が起こる疾患および障害の別の例としては、例えば、多発性硬化症、脳アミロイド血管症、糖尿病性網膜症、プリオン病、筋萎縮性軸索硬化症(ALS)、全身硬直症候群、脊髄小脳失調症、フリードライヒ失調症、毛細血管拡張性運動失調症、延髄脊髄萎縮症(ケネディ症候群)、脊髄性筋萎縮症、ニューロン蓄積症(リポフスチン沈着症)、ミトコンドリア脳筋症、白質ジストロフィー、脊髄ショック/鈍的外傷の神経学的続発症、高血圧脳血管病、例えばラクナ梗塞、スリット出血、高血圧性脳症が挙げられる。BBB透過性はまた、脳腫瘍、例えば「類洞」(別名、高栄養)血管供給を有するものにおいて起こる。
【０２８２】
BBB透過性はまた、連鎖球菌感染に関連する神経学的続発症；連鎖球菌感染に関連する小児自己免疫精神神経障害(PANDAS)、トゥレット症候群、強迫性障害(OCD)において起こる。BBB透過性はまた、下記疾患および障害において起こる；任意の脈管障害を伴う麻酔後神経心理学的機能障害および精神神経障害(例えば、ループス、高血圧、など)。BBB透過性はまた、感染(CNSへの侵入、CNS内での伝播、または感染の確立時点でのCNSへの侵入からの退去のいずれか)、例えばHIV、第三期梅毒、神経ボレリア症(ライム病)、単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)/単純ヘルペスウイルス2型(HSV-2)、水痘帯状疱疹ウイルス(帯状疱疹)、サイトメガロウイルス、灰白脊髄炎、狂犬病、進行性多発性白質脳症、亜急性硬化性全脳炎(麻疹後)、原虫症(トキソプラズマ症、アメーバ症、およびトリパノソーマ症)、リケッチア感染症(チフスおよびロッキー山紅斑熱)、後生動物病(Metazoal disease)、マラリア、および脳炎/髄膜炎を有する対象において起こる。いくつかの態様では、脳炎/髄膜炎敗血症に起因する。
【０２８３】
いくつかの態様では、本発明で開示した作用物質を使用するLp-PLA2を阻害する作用物質は自閉症の、またはその危険性がある対象において起こるBBB透過性を阻止および/または治療するのに有用である。自閉症は主に、社会性の欠損、言語異常およびステレオタイプの繰り返し挙動の発現を特徴とする遺伝的な障害である(American Psychiatric Association, 1994)。神経病理学的および神経画像研究により、脳のサイズおよび重量の増加が報告されている(Bailey et al., 1998；Kemper and Bauman, 1998；Sparks et al., 2002；Herbert et al., 2003；Palmen et al., 2004)。自閉症の脳の多くの研究により、とりわけ、海馬、海馬台および扁桃体における、細胞サイズの全体的な減少および細胞充填密度の増加が報告されており(Kemper and Bauman, 1993)、常在ニューロンは小さな樹状ツリーおよび潜在的で不完全な成熟または抑止された発達を有することが示される。
【０２８４】
自己免疫は自閉症の発病の一因となる可能性があり、この場合、自己抗体のニューロンへの結合により、限界状態で神経発生の正常なパターンが妨害される。脳に対する自己抗体は、自閉症の子供(Singh et al., 1988)、ならびに、脳特異的自己抗体を含むいくつかの自己免疫因子(Gupta et al., 1996；Singh and Rivas, 2004)、リンパ球機能障害(Warren et al., 1996)、異常サイトカイン調節およびウイルス関連(Singh, 2001)において報告されている。SinghおよびRivas(2004)は、自閉症の子供の血清が脳特異的な自己抗体を有し、68人の4〜12歳の自閉症の子供では、尾状核、大脳皮質および小脳に対する抗体が、それぞれ、自閉症の子供の49%、18%および9%で検出されるが、正常な子供では検出されないことを示している。
【０２８５】
別の研究により、トゥレット症候群を有する子供は抗線条体抗体を有すること、これらの抗体をラット線条体に実験的に注入すると、ラットにおいてトゥレット症候群に類似するニューロン機能障害を引き起こされることが示されている(Hallet et al., 2000)。抗ニューロン自己抗体の存在と神経学的疾患との間の強い関係が、下記連鎖球菌感染の症例、例えば、強迫性障害(OCD)、シデナム舞踏病、トゥレット症候群、連鎖球菌に関連する小児自己免疫精神神経障害(PANDAS)、腫瘍随伴病変における子供で、ならびに認知および記憶喪失の両方を示す全身性エリテマトーデスを有する老齢患者で最も劇的に示されている(Swedo et al., 1989；Kalume et al., 2004；Tanaka et al. 2004)。
【０２８６】
自己抗体の脳内ニューロンへのアクセスは、少なくとも正常で健康な個体では、血液脳関門(BBB)の完全性により自然に制限される。抗体が脳ニューロンにアクセスするためには、血液脳関門は欠損しているか、または発達遅延であるかのいずれかである可能性がある。6ヶ月またはその近くの月齢でのBBBの確立、新生児の正常な免疫レパートリーの発達、および神経発達の妨害の間の関係により、最終的に自閉症に至る可能性がある。後期胎児期間および人生の始めの数ヶ月の間、環境信号の受理およびこれらの信号に対する個々の、適当な応答経路を制御する重要な神経経路が確立され、精密化される。この時期でのBBBの形成の発達遅延または欠陥により、ニューロンの血液由来抗ニューロン自己抗体への暴露が可能になり、これにより、正常なニューロン配線パターンが損なわれ、自閉症に至る可能性がある。
【０２８７】
神経変性疾患および/またはBBB透過性のモデルに対するLp-PLA2阻害剤の評価
神経変性疾患の治療に対するLp-PLA2阻害剤の適合性は、神経変性疾患に対する多くの動物モデルのいずれかにおいて評価することができる。例えば、アタキシン-1の拡張されたポリグルタミン反復変異体のトランスジェニックマウスは、脊髄小脳失調症1型(SCA-1)に典型的な失調症を発症することが公知であり(Burright et al., 1995, Cell 82:937-948；Lorenzetti et al., 2000, Hum. Mol. Genet. 9:779-785;Watase, 2002, Neuron 34:905-919)、神経変性疾患の治療または阻止に対するLp-PLA2阻害剤の有効性を決定するのに使用することができる。例えば、ハンチントン病(例えば、Mangiarini et al., 1996, Cell 87:493-506, Lin et al., 2001, Hum. Mol. Genet. 10:137-144を参照されたい)、アルツハイマー病(Hsiao, 1998, Exp. Gerontol, 33:883-889;Hsiao, et al.,1996, Science 274:99-102)、パーキンソン病(Kim et al., 2002, Nature 418:50-56)、筋萎縮性側索硬化症(Zhu et al., 2002, Nature 417:74-78)、ピック病(Lee & Trojanowski, 2001, Neurology 56(Suppl.4):S26-S30、および海綿状脳症(He et al., 2003, Science 299:710-712)に対する別の動物モデルを使用して、同様に、本明細書で開示したLp-PLA2を阻害する作用物質の有効性を評価することができる。
【０２８８】
動物モデルは哺乳動物モデルに限定されない。例えば、ショウジョウバエ系統は多くの変性疾患に対する一般に認められたモデルを提供する(Fortini & IBonini, 2000, Trends Genet. 16:161-167;Zoghbi & Botas, 2002, Trends Genet. 18：463-471において検討されている)。これらのモデルは、変異ハエ遺伝子を有するハエだけでなく、ヒト導入遺伝子を有し、任意で標的変異を有するハエも含む。入手可能なショウジョウバエモデルの中には、例えば、脊髄小脳失調症(例えば、SCA-1(例えば、WO 02/058626を参照されたい)、SCA-3(Warrick et al., 1998, Cell 93:939-949))、ハンチントン病(Kazemi-Esfarjani & Benzer, 2000, Science 287：1837-1840)、パーキンソン病(Feany et al, 2000, Nature 404：394-398；Auluck et al., 2002, Science 295:809-810)、年齢依存性神経変性(Genetics, 2002, 161:4208)、アルツハイマー病(Selkoe et al., 1998, Trends Cell Biol.8：447-453；Ye et al., 1999, J. Cell Biol. 146：1351-1364)、筋萎縮性側索硬化症(Parkes et al., 1998, Nature Genet. 19:171-174)、副腎白質ジストロフィーが存在する。
【０２８９】
モデル生物としてのショウジョウバエの使用は、ショウジョウバエゲノムが、機能が非常によく保存された関連するヒトオルソログを含むので、ヒト神経変性経路の解明において重要な道具となることが証明されている(Rubin, G.M., et al., Science 287：2204-2215(2000))。例えば、キイロショウジョウバエは、神経系機能に関連するヒトAPPと相同の遺伝子を持っている。遺伝子、APP様(APPL)は、ニューロンアイソフォーム、APP695と約40%同一であり(Rosen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86:2478-2482(1988))、同様のヒトAPP695は神経系において排他的に発現される。APPL遺伝子が欠損したハエはヒトAPP遺伝子により救済することができる行動欠陥を示し、2つの遺伝子が2つの生物において同様の機能を有することが示唆される(Luo et al., Neuron 9：595-605(1992))。アルツハイマー病に対するショウジョウバエモデルは、米国特許出願第2004/0244064号、同第2005/0132425号、同第2005/0132424号、同第2005/0132423号、同第2005/0132422号、同第2005/0132421号、同第2005/0108779号、同第2004/0255342号、同第2004/0255341号、同第2004/0250302号において開示されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０２９０】
さらに、細胞および生理学的レベルでヒトにおける疾患状態を厳密に模倣する、ポリグルタミンリピート病(Jackson, G.R., et al., Neuron 21:633-642(1998)；Kazemi-Esfarani, P. and Benzer, S., Science 287:1837-1840(2000);Fernandez-Funez et al., Nature 408：101-6(2000))、パーキンソン病(Feany, M.B. and Bender, W.W., Nature 404:394-398(2000))および他の疾患のショウジョウバエモデルは確立されており、これらの疾患に関連する可能性がある他の遺伝子を識別するのにうまく使用されている。トランスジェニックハエは、歩行運動表現型、行動表現型(例えば、食欲、交配行動、および/または寿命)、および形態表現型(例えば、細胞、器官もしくは付属器の形状、サイズ、もしくは位置；または、ハエのサイズ、形状もしくは成長速度)を含む様々な表現型に至る可能性のある進行性の神経変性を示す。
【０２９１】
化合物を投与された動物を、化合物を投与されていない動物と比較して、症状について評価した。Lp-PLA2阻害剤で処置した動物における、未処置動物と対比した、症状の重篤度の測定可能な変化(すなわち、少なくとも1つの症状の減少、すなわち、10%またはそれ以上の減少)、または症状の発症の遅延は、治療効果を示す。
【０２９２】
例えば、行動試験を実施することにより、記憶および学習に対して動物を評価することができる。当業者に普通に公知の記憶および学習に対する任意の行動試験を使用することができるが、齧歯類動物モデルに対するモーリス水迷路試験に限定されない。未処置動物に対するLp-PLA2阻害剤を投与した動物においてモーリス水迷路試験を実施する能力の測定可能な増加は治療効果を示す。
【０２９３】
BBB疾患または障害の治療に対するLp-PLA2阻害剤の適合性は、BBB異常および/またはBBB透過性が起こる多くの動物モデルのいずれかにおいて評価することができる。使用することができる1つの方法は、血液由来成分、例えばIgまたはアミロイドβ(Aβ)のBBBを横切り、脳内のニューロンと相互作用する能力を評価するものである。血液由来成分、例えばBBBを横切るIgまたはアミロイドβ(Aβ)ペプチドを評価するための、本明細書で開示した方法において有用な1つの方法は、蛍光標識Aβ-42を使用し、Clifford et al., 2007, Brain Research 1142:223-236において記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。この方法では、血液由来Aβペプチドが欠陥BBBを横切る能力が、尾静脈注射を介して、百日咳毒素を用いた処置により透過性とされたBBBを有するマウスに導入されたフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-標識Aβ42およびAβ40を用いて評価された。Aβ40およびAβ42の両方が透過性BBBを横切り、グリア細胞ではなく、あるニューロンサブタイプに選択的に結合し、注入後48時間の脳ではAβ-42陽性ニューロンが広まっていることが示された。対照として、無傷のBBBを有する動物(生理食塩水を注入した対照)は血液由来Aβペプチドが脳内に入ることを遮断した。Lp-PLA2阻害剤の存在下または不存在下で、百日咳毒素の注入後48時間の脳内のAβ42陽性ニューロンおよびFITC-標識Aβ-42を評価することにより、BBB破壊またはBBB透過性の阻止または治療に対するLp-PLA2阻害剤の能力を評価するためにそのような動物モデルを使用することができる。Lp-PLA2阻害剤を投与していない動物と比較した場合の、Lp-PLA2阻害剤を投与した動物における脳内のAβ42陽性ニューロンの減少は、Lp-PLA2阻害剤がBBB透過性を治療および/または阻止するのに有効であることを示す。
【０２９４】
BBB透過性の動物モデルにおいて他の微量分子を使用することもできる。脳組織中の標識された血液由来成分、例えば、蛍光標識または35S標識Aβペプチド、125Iまたは35S標識免疫グロブリン(Ig)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、エバンスブルー、蛍光または磁性ミクロビーズ(Molecular Probes)および異なる分子量のデキストランを検出することができる。
【０２９５】
百日咳毒素はボルデテラ・パータシス(Bordetella pertussis)に由来し、注入後24時間の早さで、数週間までの期間、マウスにおけるBBB透過性を効果的に増加させることが公知であり(Amiel, 1976:Bruckener et al., 2003)、脈絡叢上皮および/または脳毛細血管内皮におけるBBB完全性の破壊に関係づけられる百日咳と関連する神経学的続発症の発症に関与する可能性がある。百日咳毒素はまた、実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)の発症を増強させるために使用されており、これは多発性硬化症のために広く使用されているマウスモデルである(Ben-Num et al., 1997；Linthicum et al., 1982；Yong et al., 1993)。
【０２９６】
組成物の製剤化
化合物、例えば、本明細書で開示したLp-PLA2を阻害する作用物質は薬剤として使用することができ、または本明細書で開示した有用性の1つまたは複数を有する薬学的組成物を製剤化するために使用することができる。化合物はインビトロで培養中の細胞に、インビボで体内の細胞に投与することができ、またはエクスビボで個体の体外の細胞に投与し、後に同じ個体または別の個体の体内に戻すことができる。そのような細胞は脱凝集させることができ、または固体組織として提供することができる。
【０２９７】
化合物、例えば、本明細書で開示したLp-PLA2を阻害する作用物質は、薬剤または他の薬学的組成物を製造するために使用することができる。さらに、薬学的に許容される担体を含むLp-PLA2を阻害する作用物質の使用およびさらに組成物を個体に送達させるのに有用な成分を含む組成物が、当技術分野において公知である。そのような担体および他の成分を本明細書で開示した作用物質に添加することは十分に当技術分野の技術レベルの範囲内である。
【０２９８】
薬学的組成物は、血液脳関門を通過するように、または内皮と直接接触するように適合させた製剤として投与することができる。いくつかの態様では、組成物は全身送達のために適合された製剤として投与してもよい。いくつかの態様では、組成物は特定の器官、例えば、限定はされないが肝臓、骨髄への送達、または全身送達のために適合された製剤として投与してもよい。
【０２９９】
また、薬学的組成物は、細胞培地にエクスビボで添加することができる。活性化合物の他に、そのような組成物は薬学的に許容される担体および、投与を容易にし、および/または取り込みを増強させることが公知の他の成分(例えば、生理食塩水、ジメチルスルホキシド、脂質、ポリマー、親和性に基づく細胞特異的標的系)を含むことができる。組成物はゲル、スポンジ、または他の透過性マトリクスに組み入れることができ(例えば、ペレットまたはディスクとして形成)、持続性局所放出のために内皮に近接して配置することができる。組成物は単回投与で、または異なる時間で投与される複数回投与で、投与することができる。
【０３００】
薬学的組成物は任意の公知の経路により投与することができる。例えば、組成物は、粘膜、肺、局所、または他の限局もしくは全身経路(例えば、経腸または非経口)により投与することができる。本明細書で使用されるように「非経口投与」および「非経口で投与され」という句は、通常、注入による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、限定はされないが、静脈内、筋内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内注射、注入および他の注射または注入技術が挙げられ、それらに限定されない。本明細書で使用されるように「全身投与」、「全身で投与された」、「末梢投与」および「末梢で投与された」という句は、動物の系に入り、このように、代謝および他の同様の過程に供されるような、本明細書で開示した作用物質の投与、例えば、皮下投与を意味する。
【０３０１】
「薬学的に許容される」いう句は、本明細書では、正常な医学的判断の範囲内にあり、人間および動物の組織と接触させて使用するのに適し、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症がなく、妥当な利点/危険性比に見合った、化合物、材料、組成物および/または剤形を示すために使用される。
【０３０２】
本明細書で使用されるように「薬学的に許容される担体」という句は、対象作用物質を1つの器官、または身体の一部から、別の器官、または身体の一部に運搬または輸送するのに関係する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば液体もしくは固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料を意味する。各担体は、製剤の別の成分と適合可能であるという意味で「許容される」でなければならず、例えば、担体は作用物質の治療に対する影響を減少させない。言い換えれば、担体は薬学的に不活性である。
【０３０３】
投与量およびタイミング、製剤、ならびに投与経路における適した選択は、血管性認知症を有する対象、例えばアルツハイマー病またはその危険性のある対象において有利な応答を達成する(すなわち、有効性)、ならびに過度の毒性または他の危害を避ける(すなわち、安全性)という目的で行うことができる。そのため、「有効な」は、所望の効果を達成する条件のルーチン操作を含むそのような選択を示す。
【０３０４】
1日に1回、短い時間にわたって、個体に投与される製剤のボーラス投与は好都合な投与計画である。また、効果的な毎日の用量は、投与目的のために複数の投与に、例えば、1日に2〜12回の投与に分けることができる。薬学的組成物中の活性成分の投与量レベルはまた、個体において、とりわけ脳の血管内皮内またはその周りで、化合物またはその誘導体の一時的または持続的な濃度が達成され、かつ所望の治療応答または保護が得られるように変動させることができる。しかし、所望の治療効果を達成するのに必要とされるものよりも低いレベルで投与を開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増加させることもまた、当技術分野の技術の範囲内である。
【０３０５】
投与されたLp-PLA2を阻害する作用物質の量は、当業者に公知の因子、例えば、化合物の生物活性およびバイオアベイラビリティ(例えば、体内での半減期、安定性、および代謝)；化合物の化学特性(例えば、分子量、疎水性、および溶解度)；投与経路および計画等に依存する。任意の特別な個体に対し達成されるべき特定の用量レベルは、年齢、性別、健康、病歴、体重、1つまたは複数の他の薬物との併用、および疾患の重篤度を含む、様々な因子に依存する可能性があることも理解されるであろう。
【０３０６】
血管性認知症、またはアルツハイマー病または欠陥BBBに関連する疾患の治療に関する、「治療」という用語は、とりわけ、疾患の発症を阻止する、または疾患の過程を変化させる(例えば、限定はされないが、疾患の進行を減速させる)、または疾患の症状を逆行させる、または対象において1つもしくは複数の症状ならびに/または1つもしくは複数の生化学マーカーを減少させる、1つもしくは複数の症状が悪化または進行するのを阻止する、回復を促進するまたは予後を改善する、および/またはそれらのない対象において疾患を阻止する、ならびに既存の疾患の進行を減速もしくは減少させることを示す。ある対象では、症状の改善、その悪化、退行、または進行は、客観的または主観的手段により決定することができる。1つまたは複数の生化学マーカーの修飾、例えば、透過性、脳内の血管外Igの存在、またはCSF中のβアミロイドを測定することができる。
【０３０７】
いくつかの態様では、治療効果は、罹患率または死亡率の改善(例えば、選択した群に対する生存曲線の延長)として測定することができる。予防法(例えば、再発の発生率を阻止または減少させる)もまた、治療と考える。
【０３０８】
いくつかの態様では、治療はまた、他の既存の治療様式、例えばアルツハイマー病の治療のための既存の作用物質、例えば、限定はされないが、ARICEPTまたはドネペジル、COGNEXまたはタクリン、EXELONまたはリバスチグミン、REMINYLまたはガランタミン、抗アミロイドワクチン、Aβ低下療法、メンタルエクササイズまたは刺激との併用を含むことができ：例えば、再検討のために、Zlokovic, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:1533-1660, 2002を参照されたい)。
【０３０９】
いくつかの態様では、本明細書で開示したLp-PLA2を阻害する作用物質は、別の作用物質、例えば、神経変性疾患を阻止および/または治療するための治療薬と組み合わせることができる。そのような作用物質は、神経変性疾患または障害の治療および/または阻止のために現在使用されている、または開発されている、任意の作用物質とすることができ、ここで、作用物質は予防および/または治癒的硬化を有し、および/または神経変性疾患もしくは障害の症状を減少させることができる。
【０３１０】
本明細書で開示したLp-PLA2の阻害剤がアルツハイマー病および/または血管性認知症の阻止および/または治療のために使用される態様では、本明細書で開示したLp-PLA2の阻害剤は、認知症の対症療法として有用であると主張されている当業者に普通に知られている薬剤と組み合わせて使用することができる。そのような薬剤の例としては、コリン作動性伝達を修飾することが公知の作用物質、例えば、M1ムスカリン受容体アゴニストまたはアロステリックモジュレータ、M2ムスカリンアンタゴニスト、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤(例えば、テトラヒドロアミノアクリジン、ドネペジル、ガランタミンおよびリバスチグミン)、ニコチン受容体アゴニストまたはアロステリックモジュレータ(例えば、α7アゴニストもしくはアロステリックモジュレータまたはα4β2アゴニストもしくはアロステリックモジュレータ)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)アゴニスト(例えばPPARγアゴニスト)、5-HT4受容体部分アゴニスト、ヒスタミンH3アンタゴニストおよびインバースアゴニスト、5-HT6受容体アンタゴニストまたは5HT1A受容体アンタゴニスト、AMPA陽性モジュレータ(α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチルイソキサゾール-4-プロピオネート、グルタミン酸受容体サブタイプ)、ならびにN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)受容体アンタゴニストまたはモジュレータ(例えばメマンチン)が挙げられるが、それらに限定されない。
【０３１１】
本明細書で開示したLp-PLA2の阻害剤がアルツハイマー病の治療のために使用されるいくつかの態様では、本明細書で開示したLp-PLA2の阻害剤は、認知症の対症療法として有用であると主張されている上記薬剤および/または疾患修飾剤と組み合わせて使用することができる。疾患修飾剤としては、γセクレターゼ阻害剤およびモジュレータ、ならびにヒトβ-セクレターゼ(BACE)阻害剤が挙げられるが、それらに限定されない。疾患修飾剤はまた、例えば、限定はされないが、γセクレターゼ阻害剤およびモジュレータ、βセクレターゼ(BACE)阻害剤および任意の他の抗アミロイドアプローチであり、能動および受動免疫、例えば、米国特許出願第2005/0170359号において開示されている方法により識別される作用物質、ならびに国際特許出願WO 05/07277、WO 03/104466およびWO 07/028133、ならびに米国特許第6,866,849号、同第6,913,745号において開示されている作用物質が含まれ、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０３１２】
このように、Lp-PLA2を阻害する1つまたは複数の作用物質を1つまたは複数の他の医療処置共に用いる併用療法を実施することができる。
【０３１３】
さらに、治療はまた、Lp-PLA2発現または活性を阻害する複数の作用物質を含むことができる。例えば、他の作用物質は、ナイアシン(http://www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=6724568を参照されたい)およびフェノフィブレート(http://www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=14817756&taxid=19を参照されたい)を伴うスタチンの使用を含む。
【０３１４】
同様に、本発明による診断は、他の診断手順を用いて実施することができる。例えば、血管系、脳、または脊髄(例えば、血管または軟髄膜血管)の内皮は、疾患特異的分子診断キット(例えば、カスタムメイドアレイ、多重QPCR、多重プロテオミクスアレイ)を用いて、遺伝子発現プロファイルの変化に対しアッセイすることができる。さらに、非侵襲的診断手順(例えば、CAT、MRI、SPECT、またはPET)を組み合わせて使用し、診断精度および/または感度を改善することができる。軽度〜中度アルツハイマー病に対してのみ効果的である、またはその進行を減速させるのみの治療に対しては、早期の信頼できる診断がとりわけ有用である。
【０３１５】
対象に投与される量は、好ましくは、投与により生じる利点を上回る毒性効果を誘導しない量である。別の目的は、認識されている標準的治療に比べた場合の、個体における疾患の、数の減少、重篤度の減少、および/またはそうでなければ症状の苦しみの軽減である。
【０３１６】
本発明の調節による化合物の製造は、政府機関(例えば、米国食品医薬品局)による医薬品安全性試験実施基準(GLP)および優良医薬品製造基準(GMP)について規制される。これには、正確で完全な記録、ならびにQA/QCのモニタリングが必要とされる。機関および組織パネルによる患者プロトコルの監視がまた、インフォームドコンセントが得られる；安全性、生物活性、適当な用量、および製品の有効性が複数の段階で研究される；結果が統計学的に有意である；および、倫理指針に従うことを確保するために、想定される。動物モデル使用するプロトコルならびに毒性化学薬品の使用、および規則の順守の同様の監視が必要である。
【０３１７】
Lp-PLA2発現および/または活性を阻害することを目的とする用量、製剤、投与体積、投与計画、および結果を分析するための方法は、変動する可能性がある。このように、最小および最大有効用量は、投与法によって変動する。血管性認知症と関連する臨床および組織学的変化の抑制は、特定の用量範囲内で起きる可能性があるが、これは、投与を受ける生物、投与経路、Lp-PLA2を阻害する作用物質が他の共刺激分子と共に投与されたかどうか、およびLp-PLA2阻害剤投与の特定の投与計画によって変動する。例えば、一般に、鼻内投与では、経口、経腸、直腸、または膣内投与よりも少ない用量が必要である。
【０３１８】
本発明と共に使用するための経口または経腸製剤では、従来の手順に従い、当技術分野で周知の固体担体を用いて錠剤を製剤化することができる。本発明の方法と共に使用される経口製剤のために使用されるカプセルは、任意の薬学的に許容される材料、例えばゼラチンまたはセルロース誘導体から製造することができる。持続放出経口送達系および/または経口投与される剤形のための腸溶コーティングもまた企図されており、例えば、米国特許第4,704,295号、“Enteric Film-Coating Compositions”1987年11月3日に発行；米国特許第4,556,552号、“Enteric Film-Coating Compositions”1985年12月3日に発行；米国特許第4,309,404号、“Sustained Release Pharmaceutical Compositions”1982年1月5日に発行；および米国特許第4,309,406号、“Sustained Release Pharmaceutical Compositions”1982年1月5日に発行、において記載されているものである。
【０３１９】
固体担体の例としては、デンプン、糖、ベントナイト、シリカ、および他の一般に使用される担体が挙げられる。本発明の製剤中において使用することができる担体および希釈剤の別の非制限的な例としては、生理食塩水、シロップ、デキストロース、および水が挙げられる。
【０３２０】
腸溶コート製剤
本明細書で開示した式(I)〜(IV)のもの等のLp-PLA2阻害剤に関する小さな化学物質を投与するための製剤に関して、1つの特に有用な態様は、腸溶ポリマーケーシングを有するLp-PLA阻害剤を含む錠剤型製剤である。そのような調製物の例はWO 2005/021002において見出すことができる。コア中の活性材料は微粉化または可溶化形態として存在することができる。活性材料の他に、コアは圧縮錠の技術分野で従来使用される添加物を含むことができる。そのような錠剤中の適当な添加物としては、希釈剤、例えば無水ラクトース、ラクトース一水和物、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはそれらの混合物；結合剤、例えば結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピル-セルロース、ポリビニルピロリドン、α化デンプンもしくはアカシアゴムまたはこれらの混合物；崩壊剤、例えば、結晶セルロース(結合剤および崩壊剤機能の療法を実行する)、架橋ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムまたはその混合物；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸、流動促進剤または流動補助剤、例えばコロイドシリカ、タルクまたはデンプン、および安定化剤、例えば乾燥アモルファスシリカ、着色剤、香味剤などが挙げられる。好ましくは、錠剤は希釈剤としてラクトースを含む。結合剤が存在する場合、好ましくは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースである。好ましくは、錠剤は潤滑剤としてステアリン酸マグネシウムを含む。好ましくは錠剤は崩壊剤としてクロスカルメロースナトリウムを含む。好ましくは、錠剤は結晶セルロースを含む。
【０３２１】
希釈剤はコアの10〜80重量%の範囲で存在することができる。希釈剤はコアの0.25〜2重量%の範囲で存在することができる。崩壊剤はコアの1〜10重量%の範囲で存在することができる。結晶セルロースは、存在する場合、コアの10〜80重量%の範囲で存在することができる。
【０３２２】
活性成分は好ましくは、コアの重量の10〜50%、より好ましくはコアの重量の15〜35%を占める(遊離塩基当量として計算)。コアは活性成分の任意の治療的に適した用量レベルを含むことができるが、好ましくは、活性成分の遊離塩基として150mgまでを含む。特に好ましくは、コアは活性成分の遊離塩基として、20、30、40、50、60、80または100mgを含む。活性成分は遊離塩基として、または任意の薬学的に許容される塩として存在することができる。活性成分が塩として存在する場合、重量は、錠剤が、塩の遊離塩基として計算された、所望の量の活性成分を含むように調整される。好ましくは、活性成分は塩酸塩として存在する。
【０３２３】
コアはその成分の圧縮混合物から製造することができる。成分は直接圧縮することができ、または圧縮前に粒状化することができる。そのような顆粒は当技術分野で公知の従来の粒状化過程により形成することができる。別の態様では、顆粒は個々に腸溶ケーシングでコートし、標準カプセルケーシング内に封入することができる。
【０３２４】
コアは、腸溶ポリマーを含むケーシングにより取り囲む。腸溶ポリマーの例は、酢酸フタル酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、メチルセルロースフタレート、エチルヒドロキシセルロースフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、ポリビニルブチレートアセテート、酢酸ビニル-無水マレイン酸コポリマー、スチレン-マレイン酸モノエステルコポリマー、メチルアクリレート-メタクリル酸コポリマーまたはメタクリレート-メタクリル酸-オクチルアクリレートコポリマーである。これらは単独で、もしくは組み合わせて、または上記で言及したもの以外の他のポリマーと共に使用することができる。ケーシングはまた、生体内で分解も可溶化もされない不溶性物質、例えば、アルキルセルロース誘導体、例えばエチルセルロース、架橋ポリマー、例えばスチレン-ジビニルベンゼンコポリマー、ヒドロキシ基を有する多糖、例えばデキストラン、二官能性架橋剤、例えば、エピクロロヒドリン、ジクロロヒドリン、または1、2-、3、4-ジエポキシブタンで処理されたセルロース誘導体を含むことができる。ケーシングはまたデンプンおよび/またはデキストリンを含むことができる。
【０３２５】
好ましい腸溶コーティング材料は、単独で、または可塑剤と共に使用される、市販のEudragit(登録商標)腸溶コーティング、例えば、Eudragit(登録商標)L、Eudragit(登録商標)SおよびEudragit(登録商標)NEである。そのようなコーティングは通常、液体媒質を用いて適用され、可塑剤の性質は媒質が水性か、または非水かに依存する。水性媒質と共に使用するための可塑剤としては、プロピレングリコール、トリエチルシトレート、アセチルトリエチルシトレートまたはCitroflex(登録商標)もしくはCitroflex(登録商標)A2が挙げられる。非水可塑剤としては、これら、ならびにジエチルおよびジブチルフタレートならびにジブチルセバケートが挙げられる。好ましい可塑剤はトリエチルシトレートである。含有される可塑剤の量は当業者には明らかであろう。
【０３２６】
ケーシングはまた粘着防止剤、例えば、タルク、シリカまたはグリセリルモノステアレートを含むことができる。好ましくは、粘着防止剤はグリセリルモノステアレートである。典型的には、ケーシングは約5〜25wt%の可塑剤および約50wt%までの粘着防止剤、好ましくは1〜10wt%の粘着防止剤を含むことができる。
【０３２７】
所望であれば、ポリマーの水性懸濁液を形成するのを助けるために界面活性剤を含有させることができる。可能な界面活性剤の多くの例は当業者に周知である。界面活性剤の好ましい例はポリソルベート80、ポリソルベート20、またはラウリル硫酸ナトリウムである。存在する場合、界面活性剤はケーシングの0.1〜10%、好ましくは0.2〜5%、特に好ましくは0.5〜2%とすることができる。
【０３２８】
1つの態様では、コアと腸溶コーティングとの間にシールコートが含められる。シールコートは腸溶ケーシングを、コア中の任意のアルカリ成分による可能性のある化学攻撃から保護するために使用することができるコーティング材料である。シールコートはまた、より滑らかな表面を提供することができ、これにより、腸溶ケーシングのより容易な付着が可能になる。当業者であれば、適したコーティングに気付くであろう。好ましくは、シールコートはOpadryコーティングで作製され、特に好ましくは、これはOpadry White OY-S-28876である。
【０３２９】
1つの態様では、薬学的に活性な成分は、1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン、またはその塩である。
【０３３０】
WO 2005/021002に記載されているような、そのような腸溶コート製剤の一例は、様々な量の1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オン(この実施例では「活性」と呼ばれる)を、塩酸塩として含む。
【０３３１】
その例では、ラクトース一水和物、結晶セルロース、活性成分、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびクロスカルメロースナトリウムの半分をスクリーニングして10リットルFielder高せん断ブレンダ(任意の適した高せん断ブレンダを使用することができる)に入れ5分間300rpmでチョッパーを外してブレンドした。混合物をその後、ブレンドを続けながら約750mlの水を添加することにより粒状化した。顆粒をGlatt 3/5流動床乾燥機で乾燥させ、ComilによりスクリーニングしてPharmatec 5リットルビンブレンダに入れ、その後、処方で示した任意のラクトース無水物+残りのクロスカルメロースナトリウムと共に5分にわたり20rpmでブレンドした。ステアリン酸マグネシウムをスクリーニングしてブレンダに入れ、混合過程をさらに1分間10rpmで続けた。9.5mm円形正常凸型パンチを取り付けられたRiva Piccollaロータリー式打錠機を用いて潤滑混合物を圧縮した(任意の適した打錠機を使用することができる)。シールコート、その後に腸溶コートが、Manesty 10コーター内で、コート成分の水性懸濁液の噴霧により、コーティングポリマーの製造者により推奨されるコーティング過程に対するパラメータを使用して適用される(また、任意の適したコーターを使用することができる)。
【０３３２】
当業者であれば、これらの材料またはそれらの等価物を用いて、この種の別の腸溶コート調製物を調製することができる。
【０３３３】
実施例
本明細書で示した実施例は、Lp-PLA2の阻害による、神神経変性疾患、例えば、限定はされないが血管性認知症および血液脳関門の障害、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病の阻止および/または治療のための方法および組成物に関する。この出願全体を通して、様々な出版物が参照されている。出版物およびそれらの出版物内で引用されている参考文献の全ての開示内容はその全体が、本出願に引用されることにより組み入れられ、本出願が関連する技術分野の状態がより完全に記載される。下記実施例は本発明に対する特許請求の範囲を制限するものではなく、むしろ、ある態様の典型的な例である。当業者が思いつく、例示した方法における任意の変形は本発明の範囲内に含まれる。
【０３３４】
方法
動物モデル
ヒト様アテローム性動脈硬化を模倣する糖尿病/糖尿病性高コレステロール血症ブタモデル(DM/DC)を開発した。体重25〜30kgおよび年齢〜4ヶ月の飼育場のブタを、125mg/kgのストレプトゾトシン(Sicor Pharmaceuticals, Irvine, CA)の単回静脈注射で糖尿病とした。1〜2週間安定化させた後、血糖値レベルが上昇した(>150mg/dl)動物に、表1で示したようなアテローム生成(高脂肪)食(Animal Specialties, Quakertown, PA)を与え、約250〜800mg/dlのコレステロールレベルを達成した。コレステロールレベルの維持は表2で示した方法により決定した。
【０３３５】
（表１）2.0%コレステロール食のための成分
2010526805.tif 000083
*Purina Mills, LLC, Checkerboard Square, St. Louis, Missouri, 63164, USA.これらの食餌はAnimal Specialties and Provisions, LLC. Quakertown, PA USAにより調製された。
【０３３６】
0.5%コレステロール食では、成分は0.5%コレステロールおよび20%ラードを除き同様である。動物は、年齢3〜5で去勢された雄であり、Archer Farms, Darlington, MDから得られるYorkshireブタとした。これらの食餌はAnimal Specialties and Provisions, LLC. Quakertown, PA USAにより調製された。
【０３３７】
第1〜2日に、動物には正常な固形飼料を与え、続いて、3〜14日に、動物には0.5%コレステロール、2%ラードの食餌を与え、14日には、コレステロールレベルを測定し、それに応じて、食餌を調整し、コレステロールが<300mg/dlである場合、2%コレステロール、10%ラードまで増加させた。DM/HCの誘導後、コレステロールレベルが300〜800mg/dlで安定になるまでコレステロールを測定し、コレステロールの安定化後は、コレステロールを毎月測定した。コレステロールレベルが初期の安定化相後に不安定である場合、動物の食餌を、初期の2週間測定スケジュールに戻した。総コレステロール、LDL、HDL、VLDLおよびトリグリセリドのレベルを含む、毎月のコレステロールレベルを決定した。安定なコレステロールレベルのための動物の食餌の調整は、表2に示される概要にしたがって決定した。
【０３３８】
（表２）コレステロールおよび食餌調整
2010526805.tif 000084
【０３３９】
250〜800mg/dlでコレステロールを安定化した後1ヶ月に、動物を無作為に2つの実験群、処置なしのDM/HC(高血糖症および高コレステロール血症)群および処置群(10mg/kg/日のSB-480848、1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)-アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オンとも呼ばれる)に分けた。動物は無作為化後6ヶ月で屠殺した。動物プロトコルは、ペンシルベニア大学の施設内実験動物委員会により承認されている。
【０３４０】
2つの糖尿病/高コレステロール血症群を評価した：1.DM/HC群および2. Lp-PLA2阻害剤を投与されたDM/HC動物。実験は下記を含んだ：対照群(DM/HC群-17匹のブタ)および実験群(Lp-PLA2阻害剤を投与されたDM/HC動物-20匹のブタ)。さらに、血液コレステロールレベルを実験動物では300〜800mg/dlに維持したが、この範囲は、より良好な試験モデルが提供されるように決定したものである。表4に示されるように、血液コレステロールを全ての動物において隔月を基本にモニタリングし、それに応じて、表2に示されるように、食餌の脂肪量を調整した。コレステロールおよびラードの割合はそれぞれ、0.5〜2%および10〜25%であり、全ての動物が、それらの範囲内のコレステロールおよびラード濃度を含む食餌を受けた。血液試料をベースライン、1ヶ月、3ヶ月、および6ヶ月で取得した。毎回、1mg/kg未満の血液を取得した。隔月の血液コレステロールレベル試験では、総コレステロール、LDL、HDL、VLDLおよびトリグリセリド、血糖、Lp-PLA2および一次骨髄細胞(PBMC)のレベルを試験した(表4を参照されたい)。
【０３４１】
統計的妥当性のために最低要件を正当化するために選択された動物数は、下記の通りの1実験当たりの動物の2群である：表3で示されるように、1.対照群(n=17)；糖尿病および高脂血症；2.実験群(n=20)糖尿病、高脂血症、10mg/kgのLp-PLA2阻害剤を投与。
【０３４２】
体重が25〜35kgの国内飼育場のブタ、Yorkshire雄ブタを地元の飼育場から購入し、獣医の保護下、室内ハウジングに入れた。これらのブタを、試験開始日3〜5日前に去勢した。試験ブタを、30分間の期間で、ストレプトゾシン(125mg/kg)IVを1回投与で注入することにより糖尿病とした。動物が糖尿病にならなかった場合、次の投与(50mg/kg)を実施した。初期低血糖の発症の可能性を回避するために、20gのグルコース粉末を最初の2回の食餌に添加した。血糖値を、グルコメーターを使用して毎日食餌前に最初の14日間、その後は1週間に1度測定した。
【０３４３】
試験動物を対照動物とは別々に収容し、動物間のコルコファギア(colcophagia)による薬物の動物間移行を回避した。全ての動物に毎日2度、アテローム生成食を与え、水は自由に与えた。特注の食餌は0.5および2%のコレステロールならびに10および25%のラードを含み、これらの成分を表1に示す。
【０３４４】
（表３）動物および手順のスケジュール(2つの群に分ける)
2010526805.tif 000085
【０３４５】
（表４）手順の概要
2010526805.tif 000086
【０３４６】
毎日の投与は29日に開始し、その時に、各試験動物には10mg/kg SB-480848の一日用量を与えた(ドッグフード中ボーラス等価物として与えた)。動物は前夜の夜中からNPOとした。動物は196日に安楽死させ、組織を直ちに収集した。
【０３４７】
脳組織標本
動物を安楽死させた後1時間以内に、全脳を取り出した。右半球を10%ホルマリン中で少なくとも1週間固定した。脳組織をその後、スライスし、パラフィンに埋め込んだ。各動物から、総数〜11の組織ブロックを免疫組織化学 (IHC)のために作成した(説明を参照されたい)。左半球から、大脳皮質(複数の位置由来)、海馬および脳幹をRNAおよびタンパク質分析のために保存した。
【０３４８】
ブタ脳組織と比較するために使用した死後のヒト脳組織
臨床的に診断された、散発性ADを有する患者由来の海馬および内嗅皮質(n=21、年齢範囲=72〜84)ならびに正常な、年齢が一致した、神経学的に正常な個体由来の対照組織(n=13、年齢範囲=69〜81)を、Harvard Brain Tissue Resource Center(Belmont, MA)およびCooperative Human Tissue Network(Philadelphia, PA)から取得した。これらの脳に対する死後の間隔は<24時間であり、各脳試料に対するADの病理学的確認を、ADの神経病理学的評価に対する診断基準に関する国立老化研究所およびReagan協会作業部会(1997)により規定された基準に従い実施した。年齢が一致した対照由来の脳試料を同じ基準を用いてスクリーニングした。組織は、前に記載した(D’Andrea et al.；2001；Nagele et al, 2002)老人(アミロイド)斑および神経原線維変化に対し、免疫免疫組織化学的に特徴づけした。対照組織は肉眼的病態を示さず、最小の局在化微視的AD様神経病理を示した。組織を確立されたプロトコルに従い、日常的なパラフィン包埋および切片化に対して処理した。5μmの切片を連続してカットし、SuperFrost Plus+マイクロスライド(Fisher Scientific. Pittsburgh. PA)上に載置し、一晩中乾燥させた。
【０３４９】
ヒトおよびブタ脳組織の組織学および免疫組織化学(IHC)
前に記載したパラフィン包埋組織に対し免疫組織化学的検査を実施した(D’Andrea et al.,2001；Nagele et al, 2002)。簡単に言うと、キシレンを用いてパラフィンを除去し、段階的に濃度が減少する一連のエタノールを通して再水和させた後、Target Buffer(Dako, Carpenturia, CA)中で2分間、切片をマイクロ波処理することにより、タンパク質抗原性を増強させた。また、凍結切片を2分間アセトン中で処理し、その後、空気乾燥させた。0.3% H2O2中で30分間インキュベートした後、切片を30分間正常なブロッキング血清中で処理し、その後、一次抗体と適当な希釈で1時間、室温でインキュベートした。PBS中で完全にすすいだ後、二次ビオチン-標識抗体を30分間適用した。免疫反応を、アビジン-ペルオキシダーゼ-標識ビオチン複合体(ABC, Vector Labs, Foster City, CA)で処理し、切片を3-3-ジアミノベンジリジン-4 HCl(DAB)/H2O2(Biomeda, Foster City, CA)で処理することにより可視化した。切片をヘマトキシリンで軽く対比染色し、段階的に濃度が増加する一連のエタノールを通して脱水し、キシレン中で除去し、Permount内に載置した。対照は非免疫血清、予め吸収された抗体または一次抗体の省略のいずれかで処理した脳切片から構成した。試料をNikon FXA顕微鏡で検査、写真撮影し、デジタル画像をNikon DXM 1200Fデジタルカメラを用いて記録し、Image Pro Plus(Phase 3 Imaging, Glen Mills, PA)イメージングソフトエアを用いて処理した。
【０３５０】
前頭皮質由来の連続する組織学的切片を下記のように染色した：血管構造および出血を明らかにするためのヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)；BBB漏出(血管漏出およびBBB透過性のためのマーカーとしてのブタ免疫グロブリン)、星状細胞の活性化(グリア線維酸性タンパク質)、ならびにニューロンの形態的概観および構造的完全性(微小管結合タンパク質-2)、アミロイド斑(Aβ42)を明らかにするためのIHC。
【０３５１】
実施例1
Lp-PLA2活性の阻害は血管性認知症&アルツハイマー病を阻害する：
DM/HCに誘導される脳内出血および血液脳関門(BBB)障害
BBBの主要機能は、脳に入る、または脳から出て行く物質の正確な制御を維持し、ニューロンが機能する環境の恒常性を維持することである。BBBに欠陥が生じると、通常排除される血液成分が脳組織内に入り、ニューロン機能を妨害し、免疫応答を引き起こし、神経炎症を生じさせる可能性があり、これらは全て血管性認知症およびアルツハイマー病の発症の一因となる。図1に示されるように、対照血管(左)とは対照的に、出血(右上、H&E200倍)およびBBB漏出(右下、ブタ免疫グロブリンに対してはIHC、100倍)がDM/HC脳で見られた。黒色矢印は、血管の外側の炎症細胞(上部)および血管周囲漏出クラウド(右下、BV：血管)を示す。さらに、炎症細胞の内皮細胞への付着が増加する(白色矢印、右上)。IHCを使用して、(i)欠陥BBBに起因する血管漏出を検出し、(ii)漏出した物質の脳組織内での運命を追跡した。ヒトアルツハイマー病(AD)脳で観察されるものと同様に、漏出した免疫グロブリン(Ig)がニューロンに結合し、主樹状トランクの反跳およびねじれにより証明されるように、樹状ツリーの崩壊を引き起こす(すなわち、「らせん状樹状突起」出現)(図2)。
【０３５２】
研究期間の間、Lp-PLA2阻害剤を投与された動物は、対照の未処置動物に比べ、外部刺激に対しより反応性が高く、ケージ内での活動性が増加し、給餌および取り扱いに対しより機敏に応答する傾向があることが観察された。また、同様の血清グルコースおよびコレステロールレベルにもかかわらず、Lp-PLA2阻害剤で処置された動物は、対照動物に比べ、それぞれ、26.9kgおよび30.3kgのベースラインから、体重が増加する(62.5kg対50.9kg対照動物)ことが証明された。Lp-PLA2阻害剤が投与された動物の体重は、より病弱な動物(すなわち、対照の未処置動物)が食べない限りにおいて、それらの全体的に満足できる健康状態であることを直接反映する。Lp-PLA2阻害剤による炎症の阻害により、全身の炎症の状況においてより大きな満足状態および健康が得られる。
【０３５３】
実施例2
DM/HC動物による早期アルツハイマー病の病態の実証
星状細胞の活性化およびニューロン内でのAβ42の細胞内蓄積は、アルツハイマー病(AD)の発生における初期の重要な事象として認識されており、AD患者の脳において十分に証明されている。図3で示されるように、CV危険因子に暴露された後7ヶ月という短い時点で、グリア線維酸性タンパク質(GFAP)の発現の上昇により示されるように、DM/HCは星状細胞の活性化を誘導した。強いGFAP免疫染色を示す星状細胞が、異常な形態を示すニューロンの直ぐ近くで見られた。さらに、ニューロンおよび血管平滑筋細胞(SMC)は、Aβ42に対する抗体により増加した免疫反応性を示した(図4)。注目すべきことに、星状細胞は、Aβ42に対し陰性免疫反応性を示し、Aβ42蓄積はニューロンおよび血管SMCにおいて極めて選択的に起こることが証明された。これらの所見から、ニューロンおよび血管SMCは、Aβ42の蓄積物に対し最も脆弱な細胞であることが証明され、これは、アルツハイマー病の初期段階の患者の脳で観察されることに相当する。Aβ42-陽性ニューロンはまた、病気のニューロンの特徴を示し、それらのいくつかは「らせん状樹状トランク」を示し、ニューロンの樹状ツリーが崩壊過程にあることが示されることに注意することが重要である(図5)。Aβ42(+)ニューロンとは対照的に、Aβ42陰性ニューロンは健康に見えた。
【０３５４】
実施例3
Lp-PLA2活性の阻害によるDM/HC-誘導BBB漏出の減少
図5に示されるように、DM/HCは6匹の全ての動物において広汎なBBB漏出を誘導したが、一方、Lp-PLA2阻害剤で処置した動物はごくわずかなBBB漏出を示した。褐色の染色は、血液成分(この場合Ig)が細動脈から周囲の脳組織中に漏出し、大規模なIgがニューロンへ結合することが示される。対照的に、処置動物では、血管からのIg漏出はなく、Igのニューロンへの結合はなく、樹状突起の崩壊もない(図5および図6)。
【０３５５】
実施例4
Lp-PLA2活性の阻害による、ニューロンにおけるDM/HC-誘導Aβ-42蓄積の阻止、および脳血管アミロイドーシスの最小化
DM/HC動物は、ニューロン内での様々な程度のAβ42蓄積ならびにニューロン損傷を示し(図7、左パネル)、一方、Lp-PLA2阻害剤で処置した動物(図7、右パネル)は、ニューロンAβ-42免疫活性を示さなかった。さらに、病気ニューロンは、未処置動物に比べ処置動物ではほとんど観察されなかった。同様に、Lp-PLA2阻害剤はまた、血管SMCにおけるAβ42蓄積を阻止し、このように、脳血管アミロイドーシスを最小に抑えた(図8)。
【０３５６】
要約すれば、Lp-PLA2の阻害により、代謝危険因子により誘導されるBBB破壊、ニューロンへのIgの結合、およびニューロンでのAβ42蓄積が阻止される。また、Lp-PLA2の阻害により、活性化グリア細胞(例えば、星状細胞活性化)が減少し、脳血管中でのAβ42の沈着(すなわち、脳血管アミロイドーシス)が最小に抑えられた。
【０３５７】
参考文献
本明細書で、および願書全体を通して引用した参考文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ】
2010526805.tif 000087
【図１Ｂ】
2010526805.tif 000088
【図１Ｃ】
2010526805.tif 000089
【図１Ｄ】
2010526805.tif 000090
【図２】
2010526805.tif 000091
【図３】
2010526805.tif 000092
【図４】
2010526805.tif 000093
【図５Ａ】
2010526805.tif 000094
【図５Ｂ】
2010526805.tif 000095
【図５Ｃ】
2010526805.tif 000096
【図５Ｄ】
2010526805.tif 000097
【図５Ｅ】
2010526805.tif 000098
【図５Ｆ】
2010526805.tif 000099
【図５Ｇ】
2010526805.tif 000100
【図５Ｈ】
2010526805.tif 000101
【図５Ｉ】
2010526805.tif 000102
【図５Ｊ】
2010526805.tif 000103
【図５Ｋ】
2010526805.tif 000104
【図５Ｌ】
2010526805.tif 000105
【図６】
2010526805.tif 000106
【図７Ａ】
2010526805.tif 000107
【図７Ｂ】
2010526805.tif 000108
【図７Ｃ】
2010526805.tif 000109
【図７Ｄ】
2010526805.tif 000110
【図７Ｅ】
2010526805.tif 000111
【図７Ｆ】
2010526805.tif 000112
【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
2010526805.tif 000114
【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
2010526805.tif 000116
【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図８】
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【図９】
2010526805.tif 000120
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月7日(2010.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患または障害を発症した、または発症する危険性があると識別された、神経変性疾患の治療および/または阻止の必要がある対象に投与するための、Lp-PLA2タンパク質の活性および/または発現を阻害する作用物質を含む薬学的組成物であって、対象における神経変性障害または疾患を治療および/または阻止する薬学的組成物。
【請求項２】
神経変性疾患または障害が、アルツハイマー病、血管性認知症、パーキンソン病およびハンチントン病からなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項３】
対象がヒトである、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項４】
血管性認知症を発症した、または発症する危険性があると識別された対象に投与するための、Lp-PLA2タンパク質の活性および/または発現を阻害する作用物質を含む薬学的組成物であって、血管性認知症を発症した、または発症する危険性のある対象を治療および/または阻止する薬学的組成物であって、Lp-PLA2タンパク質の阻害により血管性認知症の症状が減少するかまたは止まる、薬学的組成物。
【請求項５】
血管性認知症がアルツハイマー病と関連する、請求項4記載の薬学的組成物。
【請求項６】
異常な血液脳関門を有する、またはその危険性があると識別された対象に投与するための、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物であって、対象における異常な血液脳関門と関連する疾患または障害を治療および/または阻止する薬学的組成物。
【請求項７】
異常なBBBが透過性血液脳関門である、請求項6記載の薬学的組成物。
【請求項８】
疾患または障害が神経変性疾患または障害である、請求項6記載の薬学的組成物。
【請求項９】
疾患または障害が血管性認知症である、請求項6記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
神経変性疾患または障害が、アルツハイマー病である、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
神経変性疾患または障害が、アルツハイマー病、血管性認知症、パーキンソン病およびハンチントン病からなる群より選択される、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
脳におけるβアミロイド蓄積を有する、またはその危険性があると識別された対象に投与するための、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物であって、対象の脳におけるβアミロイド蓄積を減少させる薬学的組成物であって、Lp-PLA2タンパク質の阻害により脳におけるβアミロイド蓄積の症状が減少するか、または止まる、薬学的組成物。
【請求項１３】
βアミロイドがAβ1-42である、請求項12記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
アルツハイマー病を有するまたは発症する可能性についてスクリーニングされた対象に投与するための、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物であって、アルツハイマー病を治療および/または阻止する薬学的組成物であって、Lp-PLA2タンパク質の阻害によりアルツハイマー病の症状が減少し、対象が、スクリーニングにより決定された、アルツハイマー病を発症する増大した危険性または可能性を有すると識別される、薬学的組成物。
【請求項１５】
アルツハイマー病を発症する対象の危険性が評価され、対象がアルツハイマー病を発症する危険性を有する場合に対象に投与するための、アルツハイマー病を発症する危険性を阻止し、または減少させるための薬学的組成物であってLp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
作用物質が小分子、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマーまたはそれらの変異体もしくはフラグメントである、請求項1、4、6、12、14または15記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
核酸作用物質がRNAi作用物質である、請求項16記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
RNAi作用物質が、siRNA、shRNA、miRNA、dsRNAもしくはリボザイムまたはそれらの変異体である、請求項16記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
小分子が、1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)-アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オンもしくはSB480848またはそれらの塩である、請求項16記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
小分子が、N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミドまたはそれらの塩である、請求項16記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
小分子が、N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4’-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミドまたはそれらの塩である、請求項16記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
小分子が、メチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4’-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートまたはそれらの塩である、請求項16記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
Lp-PLA2を阻害する作用物質を含む薬学的組成物の投与後、対象の認知機能が評価される、請求項1、4、6、12、14または15記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
脳血流または血液脳関門機能を評価することにより、治療がモニタリングされる、請求項1、4、6、12、14または15記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
対象に別の治療薬が投与される、請求項1、4、6、12、14または15記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
別の治療薬が、ARICEPTまたはドネペジル、COGNEXまたはタクリン、EXELONまたはリバスチグミン、REMINYLまたはガランタミン、抗アミロイドワクチン、Aβ低下療法、メンタルエクササイズ、または刺激である、請求項25記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
対象が哺乳動物である、請求項1、4、6、12、14または15記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
対象がヒトである、請求項4記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
対象がヒトである、請求項6記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
対象がヒトである、請求項12記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
対象がヒトである、請求項14または15記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
哺乳動物がヒトである、請求項27記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
神経変性疾患または障害を治療および/または阻止するための薬剤を調製するための、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
いくつかの態様では、神経変性疾患を治療および/または阻止するための、本明細書で開示した方法は、対象、例えば哺乳動物対象に適用することができる。いくつかの態様では、対象はヒトである。
[請求項101]
神経変性疾患または障害を発症した、または発症する危険性のある対象を識別する段階、ならびに神経変性疾患の治療および/または阻止の必要がある対象に、Lp-PLA2タンパク質の活性および/または発現を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階を含む、対象における神経変性障害または疾患を治療および/または阻止する方法。
[請求項102]
神経変性疾患または障害が、アルツハイマー病、血管性認知症、パーキンソン病およびハンチントン病からなる群より選択される、請求項101記載の方法。
[請求項103]
対象がヒトである、請求項101記載の方法。
[請求項104]
血管性認知症を発症した、または発症する危険性のある対象を識別する段階、ならびに必要がある対象に、Lp-PLA2タンパク質の活性および/または発現を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階を含む、血管性認知症を発症した、または発症する危険性のある対象を治療および/または阻止する方法であって、Lp-PLA2タンパク質の阻害により血管性認知症の症状が減少するかまたは止まる、方法。
[請求項105]
血管性認知症がアルツハイマー病と関連する、請求項104記載の方法。
[請求項106]
異常な血液脳関門を有する、またはその危険性のある対象を識別する段階、ならびに必要がある対象に、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階を含む、対象における異常な血液脳関門と関連する疾患または障害を治療および/または阻止する方法。
[請求項107]
異常なBBBが透過性血液脳関門である、請求項106記載の方法。
[請求項108]
疾患または障害が神経変性疾患または障害である、請求項106記載の方法。
[請求項109]
疾患または障害が血管性認知症である、請求項106記載の方法。
[請求項110]
神経変性疾患または障害が、アルツハイマー病である、請求項108記載の方法。
[請求項111]
神経変性疾患または障害が、アルツハイマー病、血管性認知症、パーキンソン病およびハンチントン病からなる群より選択される、請求項108記載の方法。
[請求項112]
脳におけるβアミロイド蓄積を有する、またはその危険性のある対象を識別する段階、ならびに必要がある対象に、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階を含む、対象の脳におけるβアミロイド蓄積を減少させる方法であって、Lp-PLA2タンパク質の阻害により脳におけるβアミロイド蓄積の症状が減少するか、または止まる、方法。
[請求項113]
βアミロイドがAβ1-42である、請求項112記載の方法。
[請求項114]
(i)アルツハイマー病を有するまたは発症する可能性について対象をスクリーニングする段階、
(ii) 対象に、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を投与する段階
を含む、必要な対象において、アルツハイマー病を治療および/または阻止する方法であって、Lp-PLA2タンパク質の阻害によりアルツハイマー病の症状が減少し、対象が、段階(i)により決定された、アルツハイマー病を発症する増大した危険性または可能性を有すると識別される、方法。
[請求項115]
アルツハイマー病を発症する対象の危険性を評価する段階を含む、アルツハイマー病を発症する危険性を阻止し、または減少させるための方法であって、対象がアルツハイマー病を発症する危険性を有する場合、臨床医が対象にLp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質による処置を受けるように指示する、方法。
[請求項116]
作用物質が小分子、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマーまたはそれらの変異体もしくはフラグメントである、請求項101、104、106、112、114または115記載の方法。
[請求項117]
核酸作用物質がRNAi作用物質である、請求項116記載の方法。
[請求項118]
RNAi作用物質が、siRNA、shRNA、miRNA、dsRNAもしくはリボザイムまたはそれらの変異体である、請求項116記載の方法。
[請求項119]
小分子が、1-(N-(2-(ジエチルアミノ)エチル)-N-(4-(4-トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)-アミノカルボニルメチル)-2-(4-フルオロベンジル)チオ-5,6-トリメチレンピリミジン-4-オンもしくはSB480848またはそれらの塩である、請求項116記載の方法。
[請求項120]
小分子が、N-(2-ジエチルアミノエチル)-2-[2-(2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル)-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-シクロペンタピリミジン-1-イル]-N-(4'-トリフルオロメチル-ビフェニル-4-イルメチル)アセトアミドまたはそれらの塩である、請求項116記載の方法。
[請求項121]
小分子が、N-(1-(2-メトキシエチル)ピペリジン-4-イル)-2-[2-(2,3-ジフルオロベンジルチオ)-4-オキソ-4H-キノリン-1-イル]-N-(4'-トリフルオロメチルビフェニル-4-イルメチル)アセトアミドまたはそれらの塩である、請求項116記載の方法。
[請求項122]
小分子が、メチル2-[4-({[2-[2-(2,3-ジフルオロフェニル)エチル]-4-オキソピリド[2,3-d]ピリミジン-1(4H)-イル]アセチル}{[4'-(トリフルオロメチル)-4-ビフェニリル]メチル}アミノ)-1-ピペリジニル]-2-メチルプロパノアートまたはそれらの塩である、請求項116記載の方法。
[請求項123]
Lp-PLA2を阻害する作用物質を含む薬学的組成物の投与後、対象の認知機能を評価する段階をさらに含む、請求項101、104、106、112、114または115記載の方法。
[請求項124]
脳血流または血液脳関門機能を評価することにより、治療をモニタリングする段階をさらに含む、請求項101、104、106、112、114または115記載の方法。
[請求項125]
対象に別の治療薬を投与する段階をさらに含む、請求項101、104、106、112、114または115記載の方法。
[請求項126]
別の治療薬が、ARICEPTまたはドネペジル、COGNEXまたはタクリン、EXELONまたはリバスチグミン、REMINYLまたはガランタミン、抗アミロイドワクチン、Aβ低下療法、メンタルエクササイズ、または刺激である、請求項125記載の方法。
[請求項127]
対象が哺乳動物である、請求項101、104、106、112、114または115記載の方法。
[請求項128]
対象がヒトである、請求項104記載の方法。
[請求項129]
対象がヒトである、請求項106記載の方法。
[請求項130]
対象がヒトである、請求項112記載の方法。
[請求項131]
対象がヒトである、請求項114または115記載の方法。
[請求項132]
哺乳動物がヒトである、請求項127記載の方法。
[請求項133]
神経変性疾患または障害を治療および/または阻止するための薬剤を調製するための、Lp-PLA2タンパク質の発現および/または活性を阻害する作用物質の使用。
【国際調査報告】
2010526805.tif 000121