(57)【要約】  本明細書には、マイクロＲＮＡを含む標的核酸を検出、増幅および標識するための方法ならびに組成物が記載される。
2010500867.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の部分および第２の部分を含む標的核酸の検出方法であって、
（ａ）標的核酸を含む試料を提供すること；および
（ｂ）前記標的核酸をプローブと接触させることを含み、
ここで、前記プローブは前記標的核酸の第１の部分と相補的な第１の部分を含み、前記プローブは前記標的核酸の第２の部分と実質的に相補的な第２の部分を含むものであり、
コントロールと比較した前記標的核酸へのプローブ結合レベルが前記試料中に存在する標的核酸のレベルの指標となる
当該検出方法。
【請求項２】
前記試料が第１の部分および第２の部分を含む同胞核酸（ｓｉｂｌｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）をさらに含み、
前記標的核酸の第１の部分および前記同胞核酸の第１の部分は実質的に同一であり、
前記同胞核酸の第１の部分は前記プローブの第１の部分と実質的に相補的であり、
前記同胞核酸の第２の部分は前記プローブの第２の部分と実質的に相補的である
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸がＲＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡがｍｉＲＮＡである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記標的核酸がｃＤＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸が増幅される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応により増幅が行われる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記フォワードプライマーが配列番号：４１６８〜８３３４のいずれか１つからなる群から選択される配列を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブが標識を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識がフルオロフォアを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識がさらにクエンチャー分子を含み、前記フルオロフォアがプローブ上の前記クエンチャー分子の遠位に存在する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブが配列番号：８３３５〜２０８３５のいずれか１つからなる群から選択される配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が生体試料である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体試料が、血液、血液画分、尿、腹水、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、痰、胸水、羊水、胸部からの分泌物、卵巣嚢胞からの分泌物、精液、株化細胞および組織試料からなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
疾患または健康状態の検出方法であって、
（ａ）標的核酸を含む試料を提供すること；および
（ｂ）請求項１に記載の方法により前記試料中の前記標的核酸のレベルを測定することを含み、
コントロールと比較した前記標的核酸のレベルの差異が疾患または健康状態の指標である
当該検出方法。
【請求項１６】
前記試料が生体試料を含み、該生体試料が血液、血液画分、尿、羊水、腹水、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、痰、胸水、胸部からの分泌物、卵巣嚢胞からの分泌物、精液、株化細胞および組織試料からなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾病が癌である請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
複数の標的核酸の検出方法であって、
各標的核酸が第１の部分および第２の部分を含み、
（ａ）複数の標的核酸を含む試料を提供すること；および
（ｂ）前記標的核酸を複数のプローブと接触させることを含み、
各プローブが前記標的核酸のうちの１つの第１の部分と相補的な第１の部分を含み、各プローブが前記標的核酸のうちの１つの第２の部分と実質的に相補的な第２の部分を含むものであり、
コントロールと比較した各標的核酸への各プローブの結合レベルが前記試料中に存在する各標的核酸のレベルの指標となる
当該検出方法。
【請求項１９】
前記試料がさらに複数の同胞核酸を含み、各同胞核酸が第１の部分および第２の部分を含み、前記プローブの第１の部分が前記同胞核酸の第１の部分と実質的に相補的である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が個人から単離されたＤＮＡであり、前記試料中に存在する各標的核酸のレベルが前記個人の遺伝子型の指標となる請求項１８に記載の方法を含む遺伝子型同定方法。
【請求項２１】
被験者から得られる体液試料中のマイクロＲＮＡ発現同定方法であって、
（ａ）試料からマイクロＲＮＡを含むＲＮＡを提供すること；
（ｂ）ポリアデニル化ＲＮＡの逆転写産物を生成すること；および
（ｃ）フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブを含むポリメラーゼ連鎖反応により工程（ｃ）の逆転写産物を増幅すること
を含む当該同定方法。
【請求項２２】
前記体液試料が、血液、血清、尿、羊水、腹水、唾液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、滲出液、子宮内膜分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、痰、胸水、胸部からの分泌物、卵巣嚢胞からの分泌物および精液からなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プローブがさらにマイナーグルーブバインダー（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記フォワードプライマーが配列番号：４１６８〜８３３４のいずれか１つからなる群から選択される配列を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記プローブが配列番号：８３３５〜２０８３５のいずれか１つからなる群から選択される配列を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）複数のネガティブプローブ；
（ｂ）複数のポジティブプローブ；
（ｃ）複数のスパイクプローブ；および
（ｄ）複数のテストプローブ
を含むバイオチップ。
【請求項２７】
ネガティブプローブがｍｉＲＮＡ*と実質的に相補的な核酸を含む請求項２６に記載のバイオチップ。
【請求項２８】
前記核酸の配列が配列番号：２０８６３〜２０９２５のいずれか１つからなる群から選択される請求項２７に記載のバイオチップ。
【請求項２９】
ポジティブプローブが低分子ＲＮＡと実質的に相補的な核酸を含む、請求項２６に記載のバイオチップ。
【請求項３０】
前記核酸の配列が配列番号：２０９２６〜２０９３７のいずれか１つからなる群から選択される請求項２９に記載のバイオチップ。
【請求項３１】
スパイクプローブがゲノム中の６０個のヌクレオチドからなるいずれの配列とも相補的ではない配列を有する核酸を含む請求項２６に記載のバイオチップ。
【請求項３２】
前記ゲノムがヒト、ラット、ウィルスおよびマウスからなる群から選択される請求項３１に記載のバイオチップ。
【請求項３３】
前記核酸の配列が配列番号：２０９３８〜２０９５１のいずれか１つからなる群から選択される請求項３１に記載のバイオチップ。
【請求項３４】
テストプローブが、
（ａ）ｍｉＲＮＡと実質的に相補的な核酸；および
（ｂ）リンカーを含み、前記テストプローブが４０〜６０個のヌクレオチド
を含む請求項２６に記載のバイオチップ。
【請求項３５】
前記核酸が１６〜２９個のヌクレオチドを含む請求項３４に記載のバイオチップ。
【請求項３６】
前記核酸の配列が配列番号：１〜４１６７のいずれか１つからなる群から選択される請求項３５に記載のバイオチップ。
【請求項３７】
前記リンカーが配列番号：２０９５２〜２１０６３のいずれか１つからなる群から選択される核酸を含む請求項３４に記載のバイオチップ。
【請求項３８】
核酸の検出方法であって、
（ａ）生体試料を提供すること；
（ｂ）請求項２６に記載のバイオチップを前記生体試料と接触させること；および
（ｃ）核酸の濃度を測定することを含み、
コントロールと比較した前記核酸のレベルの差異が前記生体試料中で検出される核酸の指標となる
当該検出方法。
【請求項３９】
前記核酸がｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡからなる群から選択される請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記生体試料がフルオロフォアで標識された核酸を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
標的核酸集団の発現レベルの溶液系測定方法であって、
（ａ）各標的特異的ビーズセットが個別に検出可能なものであり個別ビーズセットと呼ばれる個別の標的核酸に対応する捕捉プローブを含む、標的特異的ビーズセット集団を溶液中に提供すること；
（ｂ）各標的核酸が、対応する個別の標的特異的ビーズセットに特異的に結合しうる対応する検出可能な標的分子へと変換されている、前記標的特異的ビーズセット集団を検出可能な標的分子の集団を含む可能性のある分子集団と溶液中でハイブリダイズさせること；および
（ｃ）標的特異的ビーズにハイブリダイズした検出可能な標的分子を溶液中でスクリーニングして前記標的核酸集団の発現レベルを測定することを含み、
前記スクリーニングがＬｕｍｉｎｅｘアナライザーを用いて行われる
当該測定方法。
【請求項４２】
前記標的特異的ビーズセット集団が、対応する標的核酸セットに結合可能な個別ビーズセットを少なくとも１つ含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的特異的ビーズの集団が、対応する標的核酸セットに結合可能な個別ビーズセットを少なくとも１００個含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的核酸集団がｍＲＮＡの集団である請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的核酸がｍｉＲＮＡの集団である請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｍｉＲＮＡが疾患と関連しており、コントロールと比較した前記ｍｉＲＮＡの発現レベルが疾患関連性の指標となる請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記標的特異的ビーズセットが、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを用いてカルボキシル化Ｌｕｍｉｎｅｘマイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）に結合したアミン修飾捕捉プローブを含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記捕捉プローブがＤＮＡまたはＬＮＡである請求項４１記載の方法。
【請求項４９】
各標的核酸が、
（ａ）ｍｉＲＮＡに少なくとも１つのアダプターを付加して、アダプター−ｍｉＲＮＡ分子を生成する工程；および
（ｂ）前記アダプター−ｍｉＲＮＡ分子を検出可能なように標識して前記標的核酸に対応する検出可能な標的分子を生成する工程を含む工程
により、対応する検出可能な標的分子へと変換されたｍｉＲＮＡである請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記アダプターがビオチンである請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記アダプターが直接化学標識法または酵素末端標識法から選択される１つの方法により付加される請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記アダプター−ｍｉＲＮＡ分子の検出がチラミドシグナル増幅または３ＤＮＡシステムから選択される１つの方法により増幅される請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記アダプターがストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリンを用いて検出可能に標識される請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的核酸に対応する前記検出可能な標的分子が前記標的核酸の転写により生成され、前記転写が前記アダプターを取り込む請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記アダプターがビオチンである請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記アダプター−ｍｉＲＮＡ分子がチラミドシグナル増幅または３ＤＮＡシステムから選択される１つの方法により検出可能に標識される請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記アダプターがストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリンを用いて検出可能に標識される請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
標的核酸集団の発現レベルを溶液中で測定するためのキットであって、
（ａ）各標的特異的ビーズセットが個別に検出可能であり、対象となる個別の標的核酸に対応する捕捉プローブに結合可能なものである、検出可能なビーズセット集団；
（ｂ）対象となる標的核酸を、対応する個別の標的特異的ビーズセットに特異的に結合することになる対応する標的分子に変換するための成分；および
（ｃ）請求項４１に記載の方法を行うための説明書
を含む当該キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、マイクロＲＮＡを含む核酸分子を検出、増幅および標識するための方法ならびに組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の核酸配列の同定および定量は、過去２０年以上に渡って分子生物学の重要な分野である。発現プロファイルは、特定の核酸配列の同定および定量の分野において現在詳細に研究されている。特定の核酸およびその産物を同定、定量する能力は、個別化された医療および薬物耐性の評価といった広範囲の領域を進歩させた。
【０００３】
特定の核酸配列を同定および定量するための種々の方法について多くのことが解明されてきたが、これらの方法は、核酸配列中の小さな変異を同定するための正確さおよび厳格さを欠くものであり、頻繁に偽陽性を生じ、これらの方法を広範囲に応用することができなかった。また、特定の一塩基多型を有する標的核酸を同定する方法は、標的核酸に類似する配列を有する核酸等の他の核酸によるバックグラウンドが高い状態でこれらの標的核酸が存在する場合には、効果的ではないことが証明されている。プローブ設計は、一度に同定可能である種々の変異性核酸の数を制限し、既知の核酸によるバックグラウンドの調節を必要とする。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等の特定の核酸変異体を検出するためのリアルタイムＰＣＲ等の方法と関連したプローブは、ＲＴプライマーへの非特異的結合が起こり、標的配列への十分な感度を欠くため、問題が生じる場合がある。
【０００４】
ｍｉＲＮＡは、遺伝子制御に関与する約２２ヌクレオチドからなる短鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡにターゲッティングして切断または翻訳抑制することにより遺伝子発現を調節する。疾患の発生と進行におけるｍｉＲＮＡの役割は、最近になってようやく理解され始めてきた。調節解除されたｍｉＲＮＡの発現は、これらに限定されないが、胚の奇形や癌といった種々の疾患の発症および進行と関連している。
【０００５】
ｍｉＲＮＡは、そのサイズが小さいため、標準的な方法では同定することが困難であった。大量のＲＮＡを抽出しても、同定されるｍｉＲＮＡの数は限定的なものであった。外見から識別可能な表現型の提示に貢献するｍｉＲＮＡも同定されている。発現アレイのデータによれば、ｍｉＲＮＡは、種々の発生段階または種々の組織で発現することが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
さらに、これらを種々の疾患の治療と診断に広範囲に利用できる可能性から、当該技術分野では、ｍｉＲＮＡを同定、単離、定量する方法を開発する必要性がある（未だ満たされていない）。本発明は、最小量の出発物質しかないような試料等の、種々の試料由来のｍｉＲＮＡを単離、定量するための効率的で高感度な方法および組成物を開示することにより、上記の必要性に取り組むものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
標的核酸の検出方法が提供される。この方法は、標的核酸を含む試料を提供すること、および前記標的核酸をプローブと接触させることを含むことができ、ここで前記標的核酸は第１の部分および第２の部分を含む。前記プローブは、前記標的核酸の第１の部分と相補的な第１の部分、および前記標的核酸の第２の部分と実質的に相補的な第２の部分を含むことができる。標的核酸へのプローブ結合レベルをコントロールと比較し、試料中に存在する標的核酸のレベルの指標とすることができる。
【０００８】
１以上の他の核酸の中から標的核酸を検出する方法も提供される。この方法は、標的核酸および同胞核酸（ｓｉｂｌｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含む試料を提供することを含むことができる。ここで、前記標的核酸は第１の部分および第２の部分を含み、前記同胞核酸は第１の部分および第２の部分を含む。前記方法は、さらに前記標的核酸をプローブと接触させることを含むことができる。前記標的核酸の第１の部分と前記同胞核酸の第１の部分は、実質的に同一である。前記同胞核酸の第１の部分は、前記プローブの第１の部分と実質的に相補的である。前記同胞核酸の第２の部分は、前記プローブの第２の部分と実質的に相補的である。前記標的核酸へのプローブ結合レベルをコントロールと比較し、これを試料中に存在する標的核酸のレベルの指標とすることができる。
【０００９】
試料中の複数の標的核酸を検出する方法も提供される。各標的核酸は第１の部分および第２の部分を含むことができる。この方法は、複数の標的核酸を含む試料を提供すること、および前記標的核酸を複数のプローブと接触させることを含むことができる。前記試料は、複数の同胞核酸を含むことができる。各プローブは、試料中の同胞核酸から標的核酸を区別することを可能とする。各同胞核酸は、第１の部分および第２の部分を含む。同胞核酸の第１の部分は、前記同胞核酸の第１の部分と実質的に相補的である。前記方法の各プローブは、標的核酸のうちの１つの第１の部分と相補的な第１の部分、および標的核酸のうちの１つの第２の部分に実質的に相補的な第２の部分を含むことができる。各標的核酸への各プローブの結合レベルをコントロールと比較し、これを試料中に存在する各標的核酸のレベルの指標とすることができる。
【００１０】
１以上の他の同胞核酸の中から標的核酸を検出する方法も提供される。この方法は、第１の部分および第２の部分を含む標的核酸を含む試料を提供すること、およびこの試料を、第１の部分および第２の部分を含むプローブと接触させることを含むことができる。前記標的核酸の第１の部分は、変異部位を含むことができる。前記同胞核酸も、第１の部分および第２の部分を含むことができる。前記同胞核酸の第１の部分も、変異部位を含むことができる。前記標的核酸の変異部位と前記同胞核酸の変異部位との違いは、わずか１ヌクレオチドであってもよい。前記プローブの第１の部分は、前記標的核酸の変異部位と相補的であるが前記同胞核酸の変異部位とは相補的ではない検出部位を含んでいてもよい。プローブは、前記標的核酸および同胞核酸の両方の第２の部分と実質的に相補的な第２の部分に、増感部位を含むことができる。前記プローブにより、低濃度から高濃度の範囲の実質的に同一な他の同胞核酸の多様なバックグラウンド中での標的核酸を特異的に検出することを可能にすることができる。
【００１１】
前記方法の標的核酸は、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。標的核酸は、細菌、ウィルス、動物またはヒトから単離することができる。標的核酸は増幅してもよい。標的核酸の増幅は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により行うことができる。ここで、前記フォワードプライマーは、配列番号：４１６８〜８３３４のいずれか１つからなる群から選択される配列を含むことができる。前記方法のプローブは標識を含んでいてもよく、この標識はフルオロフォアであってもよい。前記標識は、さらにクエンチャー分子を含んでいてもよい。前記フルオロフォアは、クエンチャー分子の遠位にあってもよい。前記プローブは、配列番号：８３３５〜２０８３５のいずれか１つからなる群から選択される配列を含むことができる。前記方法の試料は、生体試料であってもよい。この生体試料は、血液、血液画分、羊水、尿、腹水、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、痰、胸水、胸部からの分泌物、卵巣嚢胞からの分泌物、精液、株化細胞および組織試料からなる群から選択できる。
【００１２】
疾患または健康状態の検出方法も提供される。この方法は、試料を提供することを含むことができ、前記試料は標的核酸および同胞核酸を有する。前記方法は、さらに標的核酸をプローブと接触させることを含むことができる。前記方法は、コントロールに対する標的核酸レベルの差を測定することを含むことができ、疾患もしくは健康状態、またはウィルスもしくは細菌の感染の有無の指標になる。前記疾患または健康状態は、癌、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎またはヒトパピローマウィルスの感染であってもよい。
【００１３】
個人の遺伝子型同定方法も提供される。この方法は、試料を提供することを含むことができ、ここで前記試料は標的核酸および同胞核酸を有する。この方法は、さらに標的核酸をプローブと接触させることを含むことができる。前記方法は、また、コントロールに対する標的核酸のレベルの差を測定することを含むことができ、この差は個人の遺伝子型の指標になる。
【００１４】
被験者から得られる体液試料中のマイクロＲＮＡ発現を同定する方法も提供される。この方法は、前記試料からのＲＮＡを提供することを含むことができ、前記ＲＮＡはマイクロＲＮＡを含む。前記方法はさらにポリアデニル化ＲＮＡの逆転写産物を生成すること、ならびにフォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブを含むポリメラーゼ連鎖反応により前記逆転写産物を増幅することを含むことができる。前記体液試料は、血液、血清、尿、羊水、腹水、唾液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、痰、胸水、胸部からの分泌物、卵巣嚢胞からの分泌物および精液からなる群から選択される。
【００１５】
前記フォワードプライマーは、配列番号：４１６８〜８３３４のいずれか１つからなる群から選択される配列を含むことができる。前記プローブは、配列番号：８３３５〜２０８３５のいずれか１つからなる群から選択される配列を含むことができる。
【００１６】
バイオチップも提供される。このバイオチップは、複数のプローブを含むことができる。前記プローブは、ネガティブプローブ、ポジティブプローブ、スパイクプローブおよびテストプローブを含むことができる。ネガティブプローブは、ｍｉＲＮＡ*と実質的に相補的な核酸を含むことができる。前記核酸の配列は、配列番号：２０８６３〜２０９２５のいずれか１つからなる群から選択できる。ポジティブプローブは、低分子ＲＮＡと実質的に相補的な核酸を含むことができる。前記核酸の配列は、配列番号：２０９２６〜２０９３７のいずれか１つからなる群から選択できる。スパイクプローブは、ゲノム中の６０ヌクレオチドからなるいずれの配列とも相補的ではない配列を有する核酸を含むことができ、このゲノムは、ヒト、ラット、ウィルスまたはマウスのものであってもよい。前記核酸の配列は、配列番号：２０９３８〜２０９５１のいずれか１つからなる群から選択できる。
【００１７】
テストプローブは、４０〜６０個のヌクレオチドを含むことができる。テストプローブは、ｍｉＲＮＡと実質的に相補的な核酸を含むことができる。前記核酸は、１６〜２９個のヌクレオチドを含むことができる。前記核酸の配列は、配列番号：１〜４１６７のいずれか１つからなる群から選択できる。テストプローブは、リンカーを含むことができる。リンカーは、核酸を含むことができ、この核酸の配列は、配列番号：２０９５２〜２１０６３のいずれか１つからなる群から選択できる。核酸の検出方法も提供することができる。生体試料も提供することができる。前記バイオチップは、前記生体試料と接触させてもよい。核酸のレベルを測定することもできる。コントロールと比較した前記核酸のレベルの差は、前記生体試料において検出される核酸の指標とすることができる。前記核酸は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡであってもよい。前記核酸は、フルオロフォアで標識されていてもよい。
【００１８】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の直接的かつ強力な標識方法も提供される。Ｌｕｍｉｎｅｘ技術によるｍｉＲＮＡの相対レベルを検出、測定する方法、およびこの検出方法をキャリブレーションする方法も提供される。Ｌｕｍｉｎｅｘにより、「溶液系バイオチップ」法が提供される。本明細書に記載される方法は、他の類似するプラットホームにも適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＴａｑＭａｎ ｍｉＲＮＡアッセイの説明図である。ｍｉＲＮＡのＴａｑＭａｎ系リアルタイム定量には、ステム−ループ逆転写（ＲＴ）およびリアルタイムＰＣＲの２つの工程が含まれる。ステム−ループＲＴプライマーは、ｍｉＲＮＡ分子の３’部分に結合し、逆転写酵素により逆転写される。次いで、ＲＴ生成物が、ｍｉＲＮＡ特異的フォワードプライマー、リバースプライマーおよび色素標識ＴａｑＭａｎプローブを含む、従来のＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法により定量される。５’末端の末端付加フォワードプライマーの目的は、ｍｉＲＮＡ分子の配列組成に依存する融解温度（Ｔｍ）を上昇させることである。
【図２】図２は、Ｓｈｉ ａｎｄ Ｃｈｉａｎｇ（２００５）の方法の略図である。全ＲＮＡを抽出後、ポリアデニル化反応が行われる。次に、特異的末端に連結したポリ（Ｔ）アダプターを用いて反応生成物を逆転写してｃＤＮＡを作製する。この段階の後、フルオロフォアとしてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、生成物の蓄積が定量される。
【図３】図３は、本発明により提供される検出方法の略図である。この例における標的ｍｉＲＮＡは、ヒトｌｅｔ−７ａファミリーに由来する。
【図４】図４は、本発明により提供される別の検出方法の略図であり、ここでは、ポリアデニル化された標的核酸の逆転写の際にアダプターにより導入された配列とプローブとの間に塩基ミスマッチが存在する。この例における標的ｍｉＲＮＡは、ヒトｌｅｔ−７ａファミリーに由来する。
【図５】図５は、標的核酸の検出方法の略図である。３つの核酸が示されており、各核酸は、第１の部分（「１」で示される）、および第２の部分（「２」で示される）を含む。標的核酸は文字Ｔで示され、プローブは文字Ｐで示され、同胞核酸は文字Ｓで示される。２つの核酸部分の間の直線状の矢印は、これら２つの部分の配列が同一または相補的であることを示す。２つの部分の間の破線状の矢印は、これら２つの部分の配列が実質的に同一または実質的に相補的であることを示す。標的核酸および同胞核酸の第１の部分は実質的に同一であるが、標的核酸および同胞核酸の第２の部分は同一である。プローブおよび標的核酸の第２の部分は実質的に相補的であり、プローブおよび同胞核酸の第２の部分においても同様である。プローブの第１の部分は、標的核酸の第１の部分と同一であるが同胞核酸とは実質的に相補的であるに過ぎないので、このような実質的な相補性により、プローブは同胞核酸から標的核酸を区別することができる。
【図６】図６は、５種類の異なったスパイクを、濃度を段階上昇させながら用いて測定されたＬｕｍｉｎｅｘアッセイの感度を示す。標識にはＵＬＳ技術を用いて行い、ビーズのカップリングにはＡｍｂｉｏｎ社製プローブセットを用いた。この系は、０．０６ ｆｍｏｌのｍｉＲＮＡまでを感知し、２オーダーの範囲で直線性を有することが分かる。結果は、対数スケールで表す。
【図７】図７は、異なる濃度のビオチン標識スパイクを用いて測定されたアッセイの感受性を示す。Ｅｘｉｑｏｎ ＬＮＡプローブセットをビーズのカップリングに用いた。この系は、０.１ ｆｍｏｌのｍｉＲＮＡまでを感知し、試験した全範囲において、最大で１０ ｆｍｏｌまで直線性を示すことが分かる。結果は、対数スケールで表す。
【図８】図８は、標識され、種々のＬｅｔ−７ファミリーメンバーとカップリングしたビーズの混合物とハイブリダイズしたｌｅｔ−７ａ合成ｍｉＲＮＡを用いて試験された特異性を示す。この系の特異性は、配列間の類似性、ミスマッチの数、ミスマッチの配列における位置およびミスマッチの特性（どのヌクレオチドが変化しているか）に比例相関する。
【図９】図９は、ハイブリダイゼーション温度を上昇させながら行った図８と同様の特異性試験を示す。ハイブリダイゼーション温度を上昇させることで非特異的なｌｅｔ−７ｃ結合が著しく減少するが、特異的シグナルは僅かな影響しか受けない。
【図１０】図１０は、標識およびハイブリダイゼーションの再現性を示す。ヒトの胎盤ＲＮＡを２つの個別の実験で標識し、ハイブリダイズした。
【図１１】図１１は、１００種類のｍｉＲＮＡセットの発現プロファイルを示す。新鮮な組織から単離したヒト脳および胎盤ＲＮＡを標識し、ＬＮＡ修飾プローブを有するカップルビーズとハイブリダイズした。脳または胎盤に特異的なｍｉＲＮＡが検出され、これらを図に示す。結果は、対数スケールで表す。
【図１２】図１２は、１００種類のｍｉＲＮＡセットの発現プロファイルを示す。新鮮な組織から単離したヒト脳および胎盤ＲＮＡを標識して、Ａｍｂｉｏｎ プローブセット由来の非修飾プローブを有するカップルビーズとハイブリダイズした。脳または胎盤に特異的なｍｉＲＮＡが検出され、これらを図に示す。結果は、対数スケールで表す。
【図１３】図１３は、ｍｉＲＮＡの発現差異差次的発現を示す。ホルマリン固定してパラフィン包埋した（ａ）肺の正常組織および腫瘍組織、ならびに（ｂ）膀胱の正常組織および腫瘍組織からＲＮＡを抽出した。ｍｉＲＮＡの発現プロファイリングは先の記載と同様に行った。差次的に発現するｍｉＲＮＡは、グラフ上にマークされている。結果は、対数スケールで表す。
【図１４】図１４は、２種類のビオチン標識スパイクに対して行ったチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）反応を示し、一方は濃度を上昇させ（Ｃ１）、もう一方は一定の濃度（Ｃ２）で行った。ＴＳＡ有りまたはＴＳＡ無しでの両シグナルの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
表１は、全生物種由来のＳａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｉＲＢａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅのｒｅｌｅａｓｅ ８.２に示される全ｍｉＲＮＡの検出に要する配列を示す。この表の欄は以下の通りである。「ｍｉＲＮＡ名」は、標的核酸であるＳａｎｇｅｒ ｍｉＲＮＡを示す。「生物種」は、そのｍｉＲＮＡが発見された生物種名を示す。「ＭＩＤ」は、ｍｉＲＮＡの配列番号を示す。「ＦＤ−Ｐ」は、標的核酸の増幅に用いたフォワードプライマーの配列番号を示しており、このプライマーの配列は、ｍｉＲＮＡの最初の（ｍｉＲＮＡの５’末端から）１６ヌクレオチドおよび５’オーバーハング末端（ＣＡＧＴＣＡＴＴＴＧＧＧ；配列番号：２０８３９）を含む。「プローブ１」は、標的核酸、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応で用いたプローブの配列番号を示し、このプローブの配列は、ｍｉＲＮＡの３’末端と相補的な８個のヌクレオチド、および事前の標的ｍｉＲＮＡ逆転写時に付加されるアダプター配列と相補的な１５個のヌクレオチドを含む。アダプター配列に相補的な１５個のヌクレオチドは、５’−ＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：２０８４５）である。「プローブ２」は、「プローブ１」と類似するが、ｍｉＲＮＡの５’末端に対してヌクレオチド１つ分だけシフトした点のみにおいてプローブ１とは異なるプローブの配列番号を示す。「プローブ３」は、「プローブ２」と類似するが、ｍｉＲＮＡの５’末端に対してヌクレオチド１つ分だけシフトした点のみにおいてプローブ２とは異なるプローブの配列番号が示されている。
【００２１】
本明細書においては、標的核酸の検出方法が提供される。この方法は、標的核酸を、該標的核酸に対して少なくとも１つのミスマッチを有するプローブと接触させることを含む。このミスマッチにより、プローブが、標的核酸と実質的に同一であるがわずか１ヌクレオチドだけ標的核酸と異なるような別の核酸から標的核酸を区別することを可能とすることができる。プローブが他の実質的に同一な核酸から標的核酸を区別する能力は、プローブと他の実質的に同一な核酸との間にある少なくとも１つの付加的なミスマッチの存在に起因する場合がある。前記方法により、低濃度から高濃度に存在する実質的に同一な他の核酸の多様なバックグラウンド中で標的核酸を特異的に検出することを可能にすることができる。
【００２２】
また、とりわけ診断および予後診断目的に有用であり得る方法ならびに組成物も提供される。
【００２３】
本発明のその他の態様は、本発明に関する以下の記載により当業者に明らかなものとなるであろう。
【００２４】
１．定義
本発明の材料および方法を開示、記載する前に、本明細書で使用する用語が特定の形態のみを記載することを目的としており、何らの制限を設けることも意図していないことが理解されるべきである。本明細書および添付する請求の範囲で使用する場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という単数形には、他に明確に記載のない限り、複数の指示対象も含まれることに留意すべきである。本明細書における数値範囲の記載については、各数値間にある各数値も同様の正確さを有することは明確に意図されている。例えば、６〜９の範囲であれば、６および９に加えて、７および８の数値も意図されており、６.０〜７.０の範囲であれば、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７、６.８、６.９および７.０の数値も明確に意図される。
【００２５】
ａ．動物
本明細書で用いられる「動物」は、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、ならびにマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、類人猿およびヒト等の哺乳類を意味する場合がある。
【００２６】
ｂ．ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ
本明細書で用いられる「ａｎｔｉ−ＲＮＡ」とは、例えばｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ*に結合すること（例えば、アンチセンスまたはＲＮＡサイレンシング）、または標的結合部位に結合することにより、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ*の活性を阻害することができるＲＮＡである。ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡは、合計５〜１００個または１０〜６０個のヌクレオチドを含むことができる。また、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡは、少なくとも合計５〜４０個のヌクレオチドを含むことができる。ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡの配列は、（ａ）ｍｉＲＮＡに結合してその活性を抑制する目的で、ｍｉＲＮＡの５’側に実質的に相補的な少なくとも５個のヌクレオチド、およびｍｉＲＮＡの５’末端の標的部位の隣接領域と実質的に同一な少なくとも５〜１２個のヌクレオチド、または（ｂ）ｍｉＲＮＡが標的に結合する能力を阻害する目的で、ｍｉＲＮＡの３’側と実質的に同一な少なくとも５〜１２個のヌクレオチド、およびｍｉＲＮＡの３’末端の標的部位の隣接領域と実質的に相補的な少なくとも５個のヌクレオチドを含むことができる。
【００２７】
ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡの配列は、その内容が本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／３８４,０４９号、第１１／４１８,８７０号または第１１／４２９,７２０号に開示されるａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡの配列、またはその変異体を含むことができる。
【００２８】
ｃ．付着
本明細書で用いられる、プローブまたは固相担体に関する「付着」または「固定化」は、プローブと固相担体との間の結合が、結合、洗浄、解析および除去の条件下で十分に安定であることを意味する場合がある。前記結合は、共有結合でも非共有結合でもよい。共有結合は、プローブと固相担体との間に直接形成されてもよく、架橋剤または固相担体もしくはプローブのいずれか、またはその両方の分子上に特定の反応基を含ませることにより形成することができる。非共有結合は、静電的相互作用、親水性相互作用および疎水性相互作用の１種以上であってもよい。非共有結合には、ストレプトアビジン等の分子の担体への共有結合、およびビオチン標識プローブのストレプトアビジンへの非共有的結合が含まれる。固定化には、共有結合相互作用と非共有結合相互作用との組合せも含むことができる。
【００２９】
ｄ．生体試料
本明細書で用いられる「生体試料」とは、核酸を含む生体組織または体液の試料を意味する場合がある。このような試料には、これらに限定されないが、動物から単離された組織または体液が含まれる。生体試料は、生検試料および剖検試料等の組織切片、組織学的目的で採取された冷凍切片、毛髪および皮膚も含むことができる。生体試料には、動物組織もしくは患者組織由来の外植片、ならびに初代培養細胞および／または形質転換培養細胞も含まれる。生体試料は、血液、血液画分、血漿、血清、尿、胸水、粘液、腹水、羊水、大便、涙、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、痰、卵巣嚢胞からの分泌物、精液、胸部からの分泌物、株化細胞または組織試料であってもよい。生体試料は、動物から細胞試料を取り出すことにより提供される得るが、既に単離された（例えば、別の人物により、別の時間に、および／または別の目的で単離された）細胞を用いること、または本明細書に記載する方法をｉｎ ｖｉｖｏで行うことによっても得ることができる。処置された、または転帰歴を有する組織等の保存用組織（例えば、ホルマリン固定されてパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）組織）を用いることもできる。
【００３０】
ｅ．相補
本明細書で用いられる、核酸に関する「相補」または「相補的」とは、ヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間でのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対を意味する場合がある。
【００３１】
ｆ．検出
「検出」とは、試料中のある成分の存在を検出することを意味する場合がある。また、検出とは、ある成分が存在しないことを検出することを意味する場合もある。また、検出とは、ある成分のレベルを、定量的または定性的に測定することを意味する場合もある。
【００３２】
ｇ．差次的発現
「差次的発現」とは、細胞内および組織内、ならびに細胞間および組織間における、時間的遺伝子発現パターンおよび／または細胞内遺伝子発現パターンの定性的差異または定量的差異を意味する場合がある。したがって、差次的に発現する遺伝子は、例えば正常組織対疾患組織の比較で、活性化または不活性化のようにその発現が定性的に異なりうる。遺伝子は、他の状態と比べて、ある状態において発現がオンまたはオフになることができ、２以上の状態を比較することが可能となる。定性的に制御された遺伝子は、ある状態または細胞種の範囲内で発現パターンを示すことができ、これは標準的技術により検出することができる。ある遺伝子は、ある状態またはある細胞種で発現するが、両方では発現されない場合がある。また、例えば、発現増加して転写産物量が増大したり、発現減少して転写産物量が減少したりするように発現調節されて、発現の差異が定量性を示す場合もある。発現の差異の程度は、発現アレイ、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、ノーザン解析、リアルタイムＰＣＲ、およびＲＮａｓｅ保護等の標準的な評価技術により定量できる程度であればよい。
【００３３】
ｈ．遺伝子
本明細書で用いられる「遺伝子」とは、転写制御配列および／または翻訳制御配列、および／または翻訳領域、および／または非翻訳配列（例えば、イントロン、５’および３’非翻訳配列）を含む天然遺伝子（例えば、ゲノム）または合成遺伝子であってもよい。遺伝子の翻訳領域は、アミノ酸配列またはｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等の機能的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列であってもよい。遺伝子は、任意に５’もしくは３’非翻訳配列を連結した形で含む、翻訳領域（例えば、エクソンやｍｉＲＮＡ）に相当するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され、翻訳領域および／またはこれに連結した５’もしくは３’非翻訳配列の全部または一部を含む、増幅された核酸分子であってもよい。
【００３４】
ｉ．グルーブバインダー／マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）
「グルーブバインダー（ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）」および／または「マイナーグルーブバインダー（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）」は互換性を持って使用することができ、二本鎖ＤＮＡの副溝に、通常は配列特異的に適合する低分子を指す。マイナーグルーブバインダーは、半月状の形状をとることができる長く平らな分子であってもよく、しばしば水分子と置換して、二重螺旋の副溝にちょうど適合する。マイナーグルーブバインダー分子は、通常、フラン環、ベンゼン環またはピロール環等のねじれの無い結合により連結された複数の芳香族環を含むことができる。マイナーグルーブバインダーは、ネトロプシン、ジスタマイシン、ベレニル（ｂｅｒｅｎｉｌ）、ペンタミジン、およびその他の芳香族ジアミジン等の抗生物質、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＳＮ ６９９９、クロモマイシンおよびミトラマイシン等のオーレオリン系抗腫瘍薬、ＣＣ−１０６５、ジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド（ＤＰＩ3）、１,２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシレート（ＣＤＰＩ3）、ならびにその内容が参照により本明細書に組み込まれているＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ２ｄ ｅｄ., Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ａｎｄ Ｇａｉｔ, ｅｄｓ., Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ, １９９６およびＰＣＴ国際公開公報０３／０７８４５０に記載されるような関連化合物および類似体であってもよい。マイナーグルーブバインダーは、プライマー、プローブ、ハイブリダイゼーションタグ相補体、またはこれらの組合せの成分であってもよい。マイナーグルーブバインダーは、結合するプライマーまたはプローブのＴｍを上昇させるので、これらのプライマーおよびプローブを高温でも効果的にハイブリダイズさせることができる。
【００３５】
ｊ．同一性
本明細書において、二以上の核酸またはポリペプチド配列の関係における「同一」または「同一性」は、これらの配列が、特定の領域において同一である残基を特定の割合で有することを意味する場合がある。この割合は、２つの配列を最適な状態でアライメントし、特定の領域における２つの配列を比較して、両配列間で同一の残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を得て、一致した位置の数をその特定の領域中の位置の合計数で割って、得られた値に１００を掛けることで配列同一性の割合を得ることができる。２つの配列が異なる長さであるかまたはアライメントによって１以上の突出末端が生じて、比較される特定領域にたった１つの配列のみが含まれる場合は、前記１つの配列の残基は、計算では分母には含められるが分子には含められない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）とは等価なものとして考慮されることができる。同一性は、手作業、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ ２.０等のコンピューターによる配列アルゴリズムを使用することにより決定することができる。
【００３６】
ｋ．標識
本明細書で用いられる「標識」とは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段または他の物理学的手段により検出可能な組成物を意味する場合がある。例えば、有用な標識には、32Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで通常用いられるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテン、およびその他の検出可能な物質が挙げられる。標識は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６,５４１,６１８号に記載されるようなフルオロフォアであってもよい。標識は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６,５４１,６１８号に記載されるような、別の標識の近傍に存在する場合に他の標識の検出可能なシグナル量を低下させるクエンチャー分子であってもよい。標識は、核酸およびタンパク質にいずれの位置で挿入されてもよい。
【００３７】
ｌ．ｍｉＲＮＡ
本明細書で用いられる「ｍｉＲＮＡ」は、ｍＲＮＡ配列を阻害可能なＲＮＡ配列を意味する場合がある。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ*またはその変異体を含むことができる。ｍｉＲＮＡ配列は、１３〜３３個、１８〜２４個または２１〜２３個のヌクレオチドを含むことができる。ｍｉＲＮＡは、少なくとも合計５〜４０個のヌクレオチドを含むことができる。ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最初の１３〜３３個のヌクレオチドであってもよい。ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最後の１３〜３３個のヌクレオチドであってもよい。ｍｉＲＮＡの配列は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／３８４,０４９号、第１１／４１８,８７０号または第１１／４２９,７２０号に開示されるｍｉＲＮＡの配列またはその変異体を含むことができる。
【００３８】
ｍ．核酸
本明細書で用いられる「核酸」、「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、相互に共有結合で連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する場合がある。一本鎖の記載により、相補鎖の配列も定義されることになる。したがって、核酸には、記載された一本鎖の相補鎖も含まれる。核酸の多くの変異体を、任意の核酸と同一の目的に用いることができる。したがって、核酸には、実質的に同一な核酸およびこれに相補的な核酸も含むことができる。一本鎖からはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズすることができるプローブが提供される。したがって、核酸には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも含まれる。
【００３９】
核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、二本鎖配列の部分および一本鎖配列の部分の両方を含んでいるものであってもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡであってもよく、核酸がデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニン等の塩基の組合せを含むハイブリッドであってもよい。核酸は、一本鎖として合成してもよく、合成遺伝子を用いて細胞内（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで）で発現させてもよい。核酸は、化学合成法または組換え法により得ることができる。
【００４０】
核酸は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願第１１／４２９,７２０号、第１１／３８４,０４９号、第１１／４１８,８７０号、第１１／４２９,７２０号、国際公開公報ＰＣＴ／ＩＢ０５／０２３５２およびＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２７０２に記載されているようなｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはＰｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡであってもよい。
【００４１】
核酸は、一般的にホスホジエステル結合を含むが、核酸には、例えば、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合またはＯ−メチルホスホロアミダイト結合等の少なくとも１つの異なる結合、ならびにペプチド核酸骨格および結合を有する核酸類似体が含むことができる。他の類似体核酸には、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５,２３５,０３３号および第５,０３４,５０６号に記載されるような、陽性骨格（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）、非イオン性骨格（ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）および非リボース骨格（ｎｏｎ−ｒｉｂｏｓｅ ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）を有する核酸が含まれる。１以上の非天然ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含む核酸も、核酸の１つの定義に含まれる。修飾ヌクレオチド類似体は、例えば、核酸分子の５’末端および／または３’末端に位置することができる。ヌクレオチド類似体の典型的な例は、糖修飾リボヌクレオチドまたは骨格修飾リボヌクレオチドから選択できる。しかし、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然核酸塩基の代わりに、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン等の５位が修飾されたウリジンまたはシチジン；８−ブロモグアノシン等の８位が修飾されたアデノシンおよびグアノシン；７−デアザアデノシン等のデアザヌクレオチド；Ｎ６−メチルアデノシン等のＯ−アルキル化ヌクレオチドおよびＮ−アルキル化ヌクレオチド等の非天然核酸塩基を含む核酸塩基修飾リボヌクレオチドが適切であることに留意すべきである。２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ2、ＮＨＲ、ＮＲ2またはＣＮから選択される基で置換されてもよく、ここで、Ｒは、炭素数１〜６のアルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。修飾ヌクレオチドは、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれているＫｒｕｔｚｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ（Ｏｃｔ．３０．２００５）、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ ４３２:１７３−１７８（２００４）および米国特許公開公報第２００５０１０７３２５号に記載されるような、ヒドロキシプロリノール結合によりコレステロールと共有結合したヌクレオチドも含むことができる。修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸には、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許公開公報第２００２０１１５０８０号に記載されるような、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）（ＬＮＡ）を含むことができる。更なる修飾ヌクレオチドおよび修飾核酸については、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許公開公報第２００５０１８２００５号記載されている。リボース−リン酸骨格の修飾は、例えば、生理学的環境下におけるこれらの分子の安定性および半減期を増加させるため、細胞膜間での分散を促進するため、またはバイオチップ上のプローブとするため、といった種々の理由により行うことができる。天然核酸と類似体との混合物を作製すること；もしくは、種々の核酸類似体の混合物、および天然核酸と類似体の混合物を作製することができる。
【００４２】
核酸は、１０〜３０,０００個のヌクレオチド、１０〜２５,０００個のヌクレオチド、１０〜２０,０００個のヌクレオチド、１０〜１０,０００個のヌクレオチド、１０〜５,０００個のヌクレオチド、１０〜２,５００個のヌクレオチド、１０〜１,０００個のヌクレオチド、１０〜２５０個のヌクレオチド、１０〜１００個のヌクレオチド、および１０〜５０個のヌクレオチドの長さを有していてもよい。核酸は、少なくとも１０、１１、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５〜４０、４０〜７０、８０〜１２５、１２５〜１７５、１７５〜２００または２００〜２５０個のヌクレオチドの長さを有していてもよい。
【００４３】
ｎ．ｐｒｅ−ｍＲＮＡ
本明細書で用いられる「ｐｒｅ−ｍＲＮＡ」とは、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*を含むｍＲＮＡ配列を意味する場合がある。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜９０個、６０〜８０個または６０〜７０個のヌクレオチドから構成することができる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの５’末端および３’末端から０〜１６０個のヌクレオチドを除いたｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列であってもよい。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／３８４,０４９号、第１１／４１８,８７０号または第１１／４２９,７２０号に開示されるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列の配列またはその変異体を含むことができる。
【００４４】
ｏ．ｐｒｉ−ｍＲＮＡ
本明細書で用いられる「ｐｒｉ−ｍＲＮＡ」は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*を含むｍＲＮＡ配列を意味する。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列は、その変異体を含むことができる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／３８４,０４９号、第１１／４１８,８７０号または第１１／４２９,７２０号に開示されるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列またはその変異体を含むことができる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜３０,０００個、５０〜２５,０００個、１００〜２０,０００個、１,０００〜１,５００個または８０〜１００個のヌクレオチドから構成されることができる。
【００４５】
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ヘアピン構造を形成することができる。ヘアピンは、実質的に相補的な第１核酸配列および第２の核酸配列を含むことができる。第１および第２の核酸配列は、３７〜５０個のヌクレオチドであってもよい。第１および第２の核酸配列は、８〜１２個のヌクレオチドからなる第３の配列により分離されていてもよい。ヘアピン構造は、その内容が参照により本明細書に組み込まれているＨｏｆａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅｆ. Ｃｈｅｍｉｅ １２５: １６７−１８８（１９９４）に記載される、初期状態のパラメーターでのＶｉｅｎｎａアルゴリズムで計算される−２５ Ｋｃａｌ／モル未満の自由エネルギーを有していてもよい。ヘアピンは、４〜２０、８〜１２または１０個のヌクレオチドの末端ループを含むことができる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、少なくとも１９％のアデノシンヌクレオチド、少なくとも１６％のシトシンヌクレオチド、少なくとも２３％のチミンヌクレオチド、および少なくとも１９％のグアニンヌクレオチドを含むことができる。
【００４６】
ｐ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本明細書で用いられる「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が、第２の核酸配列（例えば、標的）に対して、例えば核酸の複合混合物の状態でハイブリダイズする条件を意味する場合がある。ストリンジェントな条件とは、配列に依存しており、状況に応じて異なるものである。ストリンジェント条件は、所定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低い温度になるよう選択することができる。Ｔｍは、標的に相補的なプローブのうち５０％が、平衡状態（標的配列が過剰量に存在する場合、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態を保っている）で標的配列にハイブリダイズする温度（所定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下）であってもよい。ストリンジェントな状態は、ｐＨ ７.０〜８.３において塩濃度がナトリウムイオン約１.０ Ｍ未満、例えば約０.０１〜１.０ Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、約１０〜５０個のヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、約５０個のヌクレオチドを超える長さ）では少なくとも約６０℃である条件であってもよい。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加により得ることができる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性のシグナルは、バックグラウンドのハイブリダイゼーションに対して、少なくとも２〜１０倍の強さであってもよい。典型的なストリンジェント条件には、以下が含まれる：５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または、５ｘ ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーション、ならびに０.２×ＳＳＣおよび０.１％ ＳＤＳ中で６５℃での洗浄。
【００４７】
ｑ．実質的に相補的
本明細書で用いられる「実質的に相補的」とは、第１の配列が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０〜４０、４０〜６０、６０〜１００個またはこれを超えるヌクレオチドからなる領域において、第２の配列の相補鎖と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するか、または、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する場合がある。
【００４８】
ｒ．実質的に同一
本明細書で用いられる「実質的に同一」とは、第１の配列と第２の配列が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０〜４０、４０〜６０、６０〜１００個もしくはこれを超えるヌクレオチドまたはアミノ酸からなる領域において、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するか、または、核酸の場合、第１の配列が、第２の配列の相補鎖と実質的に相補的であるかどうかを意味する場合がある。
【００４９】
ｓ．標的核酸
本明細書で用いられる「標的核酸」とは、別の核酸により結合すうることができる酸またはその変異体を意味する場合がある。標的核酸は、ＤＮＡ配列であってもよい。標的核酸は、ＲＮＡであってもよい。標的核酸は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはＰｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡを含むことができる。標的核酸は、標的ｍｉＲＮＡ結合部位またはその変異体を含むことができる。１以上のプローブが標的核酸に結合してもよい。標的結合部位は、５〜１００個または１０〜６０個のヌクレオチドを含むことができる。標的結合部位は、合計で５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６１、６２または６３個のヌクレオチドを含むことができる。標的部位の配列は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／３８４,０４９号、第１１／４１８,８７０号または第１１／４２９,７２０号に開示される標的ｍｉＲＮＡ結合部位の配列のうち少なくとも５ヌクレオチドを含むことができる。
【００５０】
ｔ．変異体
本明細書で用いられる「変異体」とは、核酸に関するものであり、（ｉ）基準となるヌクレオチド配列の一部；（ｉｉ）基準となるヌクレオチド配列の相補体またはその一部の相補体；（ｉｉｉ）基準となる核酸またはその相補体に実質的に同一な核酸；または（ｉｖ）基準となる核酸、その相補体、またはこれらと実質的に同一な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味する場合がある。
【００５１】
２．プローブ
本明細書においてはプローブも提供される。プローブは、核酸を含むことができる。プローブは、８〜５００、１０〜１００または２０〜６０ヌクレオチドの長さを有していてもよい。プローブは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０または３００ヌクレオチドの長さを有していてもよい。プローブは、１８〜２５個のヌクレオチドからなる核酸を含むことができる。
【００５２】
プローブは、１種以上の化学結合、通常は、水素結合形成を介した相補的な塩基対形成を介して相補的配列の標的核酸に結合可能なものであってもよい。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによっては、プローブ配列と完全な相補性を欠く標的配列に結合することができる。プローブは、一本鎖であっても、部分的に一本鎖および部分的に二本鎖であってもよい。プローブの鎖の数（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）は、標的配列の構造、組成および特性により決定される。プローブは、直接的に標識されていても間接的に標識されていてもよい。
【００５３】
ａ．リンカー配列
プローブは、さらにリンカーを含むことができる。リンカーは、長さ１０〜６０ヌクレオチドであってもよい。リンカーは、長さ２０〜２７ヌクレオチドであってもよい。リンカーは、プローブが合計で長さ４５〜６０ヌクレオチドとなるのに十分な長さを有していてもよい。リンカーは、安定な二次構造を形成できなくてもよく、それ自体でフォールディングできなくてもよく、またはプローブに含まれる核酸の非リンカー部分でフォールディングできなくてもよい。リンカーの配列は、プローブの非リンカー核酸が由来する動物のゲノム中に存在していなくてもよい。リンカーは、表２に示す配列（配列番号：２０９５２〜２１０６３）から選択できる。
表２  リンカー配列
【表１】
2010500867.tif 000003
【表２】
2010500867.tif 000004
【表３】
2010500867.tif 000005
【００５４】
ｂ．テストプローブ
プローブは、テストプローブであってもよい。テストプローブは、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡに相補的な核酸配列を含むことができる。テストプローブの配列は、表３に示す配列（配列番号：１〜４１６７）から選択できる。
【００５５】
ｃ．ネガティブプローブ
プローブは、ネガティブプローブであってもよい。ネガティブプローブは、生体試料中に存在しない核酸配列を含んでいてもよい。ネガティブプローブは、ｍｉＲＮＡ*に相補的であってもよい。ネガティブプローブの配列は、表４に示す配列（配列番号：２０８６３〜２０９２５）から選択できる。
表４  ネガティブコントロールプローブ
【表４】
2010500867.tif 000006
【表５】
2010500867.tif 000007
【００５６】
ｄ．ポジティブプローブ
プローブは、ポジティブプローブであってもよい。ポジティブプローブは、低分子ＲＮＡに相補的であってもよい。低分子ＲＮＡは、哺乳動物細胞等の動物細胞内に存在していてもよい。低分子ＲＮＡは、２００ヌクレオチド未満の長さを有する。低分子ＲＮＡは、リボソームＲＮＡでもよい。核酸の配列は、表５の配列（配列番号：２０９２６〜２０９３７）から選択できる。
表５  ポジティブコントロールプローブ
【表６】
2010500867.tif 000008
【００５７】
ｅ．スパイクプローブ
プローブは、スパイクプローブであってもよい。スパイクプローブは、ゲノム中の２０〜１００個の連続するヌクレオチド（例えば、６０個）に相補的ではない配列を含むことができる。前記ゲノムは、動物ゲノムであってもウィルスゲノムであってもよい。動物は、ヒト、マウスまたはラットであってもよい。スパイクプローブの配列は、表６に挙げられいる配列（配列番号：２０９３８〜２０９５１）から選択できる。
表６  スパイクプローブ
【表７】
2010500867.tif 000009
【００５８】
３．バイオチップ
バイオチップも提供される。バイオチップは、本明細書に記載する１つのプローブまたは複数のプローブが付着した固相担体を含むことができる。プローブは、ストリンジェントな条件下で標的配列にハイブリダイズ可能である。プローブは、担体上の空間的に定められた位置に付着することができる。標的配列１つ当たり、オーバーラップするプローブ、または特定の標的配列の別の部分に対するプローブ等の１以上のプローブを用いてもよい。プローブは、単一の疾患と関連する標的配列にハイブリダイズ可能なものであってもよい。バイオチップは、ネガティブプローブ、ポジティブプローブ、スパイクプローブ、テストプローブ、またはこれらの組合せを含むことができる。
【００５９】
プローブは、当業者に理解されるように、多様な方法でバイオチップに付着できる。プローブは、最初に合成してその後にバイオチップに付着させることも、バイオチップ上で直接合成することもできる。
【００６０】
固相担体は、プローブの付着もしくは会合に適した個別の特定部位を含むように修飾することができ、少なくとも１種類の検出方法に適した材料である。担体の典型的な例には、ガラス、修飾ガラスもしくは機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、スチレンおよび他の材料の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）Ｊ等を含む）、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、例えば、シリコーンおよび修飾シリコーン、カーボン、金属、無機ガラスならびにプラスチック等のシリカもしくはシリカ系素材が含まれる。担体は、はっきりと蛍光を発していなくとも、光学的に検出できるものでもよい。
【００６１】
担体は、平坦であってもよいが、他の構成を有する担体を用いることもできる。例えば、プローブは、試料容量を最小化するための流動試料解析用にチューブの内側表面上に配置することができる。同様に、担体は、特定のプラスチックで作られた独立気泡フォームを含む軟質フォームのように柔軟性を有するものでもよい。
【００６２】
バイオチップおよびプローブは、これら二者を付着させるために化学官能基で誘導体化することができる。例えば、バイオチップまたはプローブは、これらに限定されないが、アルデヒド基、アミン基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、オキソ基またはチオール基等の化学官能基で誘導体化することができる。これらの官能基を用いることにより、プローブ上の官能基を用いて、直接的にまたはリンカーを用いて間接的にプローブを付着させることができる。５’末端、３’末端または内部のヌクレオチドのいずれかを介して固相担体にプローブを付着させることができる。プローブは、５’アミノ修飾剤Ｃ１２または３’末端アミノ修飾剤Ｃ６等の官能基を含むことができる。
【００６３】
固相担体に非共有結合によりプローブを付着させることもできる。例えば、ビオチン標識オリゴヌクレオチドを作製し、これをストレプトアビジンでコーティングした表面に共有結合により結合させることで、結合を形成することもできる。または、プローブは、光重合やフォトリソグラフィー等の技術を用いて表面上で合成することもできる。
【００６４】
４．標的核酸の検出方法
本明細書においては、標的核酸の検出方法も提供される。図５は、この方法の略図である。この方法は、あるプローブ（以下、「プローブ」）を用いて、実質的に同一な核酸（以下、「同胞核酸」）からある標的核酸（以下、「標的核酸」）を特異的に検出および区別することを含むことができる。同胞核酸は、部位（以下、「変異部位」）において標的核酸と異なっていてもよく、前記部位はわずか１個のヌクレオチドを含むものでもよい。
【００６５】
プローブ、標的核酸および同胞核酸のそれぞれは、第１の部分および第２の部分を含むことができる。標的核酸、同胞核酸およびプローブの第１の部分は全て、それぞれの核酸の５’末端側に位置していてもよく、または全て、それぞれの核酸の３’末端側に位置していてもよい。反対に、標的核酸、同胞核酸およびプローブの第２の部分は全て、それぞれの核酸の３’末端側に位置していてもよく、または全て、それぞれの核酸の５’末端側に位置していてもよい。本明細書に提供される方法は、プローブの前記２つの部分と標的核酸の対応する前記２つの部分との間、およびプローブの前記２つの部分と同胞核酸の対応する前記２つの部分との間のハイブリダイゼーションの強度に基づいている。
【００６６】
ａ．標的核酸および同胞核酸
標的核酸の第１の部分は、同胞核酸の第１の部分と配列が実質的に同一であり、変異部位においてわずか１ヌクレオチドだけ異なっていてもよい。標的核酸の第２の部分は、同胞核酸の第２の部分と配列が同一であってもよい。
【００６７】
ｂ．プローブと標的核酸の間の相互作用
プローブの第１の部分および標的核酸の第１の部分は相補的であってもよい。プローブの第２の部分および標的核酸の第２の部分も実質的に相補的であってもよい。
【００６８】
ｃ．プローブと同胞核酸の間の相互作用
プローブの第１の部分および同胞核酸の第１の部分は、実質的に相補的であってもよい。プローブの第２の部分および同胞核酸の第２の部分は実質的に相補的であってもよい。
【００６９】
ｄ．プローブを使用した同胞核酸からの標的核酸の区別
理論に束縛されるわけではないが、プローブの第２の部分と同胞核酸の第２の部分との間の実質的な相補性により、プローブの第１の部分と同胞核酸の第１の部分との間のミスマッチに対するプローブの感度が増加し、全体としてプローブと同胞核酸との間のハイブリダイゼーション効率が悪くなるという効果を生じることができる。反対に、プローブの第２の部分と標的核酸の第２の部分との間の実質的な相補性により、プローブの第１の部分は、相補的な標的核酸の第１の部分に、より効率的に結合できるようになる。プローブおよび同胞核酸の第１の部分間および第２の部分間の実質的な相補性により、プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションと比べてプローブと同胞核酸との間のハイブリダイゼーションは全体としてより弱いものになりうる。したがって、プローブは、標的核酸（その第１の部分はプローブの第１の部分に相補的である）を特異的に検出することができ、同胞核酸から標的核酸を区別することができる。本明細書に記載する方法により、低濃度から高濃度の範囲の実質的に同一な別の核酸の多様なバックグラウンド中で標的核酸を特異的に検出することを可能にすることができる。
【００７０】
ｅ．標的核酸
本明細書においては、試料中の、第１の部分および第２の部分を含む標的核酸を検出する方法が提供される。標的核酸は、アダプター配列を含むことができる。アダプター配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応において、核酸の検出および増幅に用いられることが当該技術分野においてよく知られている。
【００７１】
ｆ．同胞核酸
本明細書においては、標的核酸を同胞核酸から区別する、標的核酸の検出方法が提供される。同胞核酸は、第１の部分および第２の部分を含むことができる。同胞核酸の第２の部分は、標的核酸の第２の部分と同一であってもよい。同胞核酸の第１の部分は、標的核酸の第１の部分と実質的に同一であってもよい。同胞核酸の第１の部分は、変異部位を含むことができる。
【００７２】
ｇ．変異部位
標的核酸の第１部位は、変異部位を含むことができる。同胞核酸の第１の部分も、変異部位を含むことができる。変異部分は、標的核酸と同胞核酸との間で異なっていてもよい。変異部位は、実質的に同一な同胞核酸間で異なっていてもよい。変異部位は、たった１つのヌクレオチドから構成されていてもよい。標的核酸の変異部位と、その核酸の変異部位との違いは、わずか１ヌクレオチドだけであってもよい。
【００７３】
（１）遺伝子ファミリー
標的核酸と同胞核酸は、同一の遺伝子ファミリーのメンバーであってもよい。遺伝子ファミリーは、複数の遺伝子を含むことができる。これらの遺伝子は、進化学的に関連していてもよい（すなわち、祖先遺伝子を共通している）。これらの遺伝子は共通の配列モチーフおよび構造を有していてもよい。これらの遺伝子は、配列が実質的に同一であってもよい。これらの配列は、遺伝子ファミリーの遺伝子間で異なっている変異部位を含むことができる。
【００７４】
これらの遺伝子は、リボザイム、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードするＲＮＡ遺伝子であってもよい。例えば、ｍｉＲＮＡであるＬｅｔ−７ａをコードするヒト遺伝子とＬｅｔ−７ｃをコードするヒト遺伝子とは、配列上１ヌクレオチド異なっている。
【００７５】
遺伝子ファミリーは、そのアミノ酸配列が、少なくとも２０個のアミノ酸からなる比較対象に対して少なくとも２５％の配列同一性を有する、少なくとも１つのポリペプチドドメインをコードする遺伝子の集合体であってもよい。このようなドメインは、遺伝子重複または進化の結果として共通祖先を介して関連している場合がある。当該技術分野では多くのポリペプチドドメインが知られており、例えば、ＥＧＦドメイン、イムノグロブリンドメイン、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、カドヘリン様ドメイン、デスエフェクタードメイン（ｄｅａｔｈ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ）（ＤＥＤ）等が含まれる。
【００７６】
遺伝子ファミリーは、少なくとも１つの高度に保存された領域を共有するポリペプチドをコードしていてもよい。ポリペプチドが、５個のアミノ酸からなる比較対象に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する場合、または１０個のアミノ酸からなる比較対象に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する場合には、２つのポリペプチドは「高度に保存された領域」を共有することになる。
【００７７】
（２）多型
変異部位は、多型を含んでいてもよい。本明細書で用いられる「多型」とは、ある集団における２以上の遺伝学的に決定された選択的配列またはアレルの発生を意味する場合がある。多型は、１つのヌクレオチド（すなわち、１塩基多型またはＳＮＰ）を含むことができ、このヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵであってもよい。多型は、小規模な挿入または欠失を含むことができる。多型は、疾患もしくは健康状態と関連しているか、またはこれらの原因となる場合がある。多型は、薬物治療等の薬剤に対する個人の応答性と関連している場合もある。多型は、遺伝子のコーディング領域もしくは非コーディング領域に認められる場合もあり、遺伝子の間の遺伝子間領域に認められる場合もある。多型は、突然変異である場合もある。突然変異は、非同義変異（すなわち、サイレント変異）であってもよく、同義変異（例えば、ミスセンス、非センスまたはノンセンス変異）であってもよい。突然変異は、遺伝子のスプライシングまたは制御に変化をもたらす場合もある。
【００７８】
多型マーカーまたは多型部位は、多様性が生じる部位である。マーカーは、少なくとも２種類のアレルを有していてもよく、それぞれは、１％を超える頻度で発生していてもよく、任意の集団では、１０％または２０％を超える頻度で発生していてもよい。多型は、１以上の塩基の変化、挿入、反復または欠失を含んでいてもよい。多型遺伝子座は、たった１つの塩基対からなる場合もある。多型マーカーは、制限酵素断片長多型、タンデム反復数（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純配列反復およびＡｌｕ等の挿入因子が含むことができる。最初に同定されたアレル型は、参照型として任意に命名され、その他のアレル型は、選択的アレルまたは変異アレルとして命名される。任意の集団で最も高頻度に見られるアレル型は、野生型とも呼ばれる。２倍体生物は、ホモ接合またはヘテロ接合のアレル型である。２対立遺伝子多型（ｄｉａｌｌｅｌｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）は２種類の形態を有する。３対立遺伝子多型（ｔｒｉａｌｌｅｌｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）は３種類の形態を有する。１塩基多型（ＳＮＰｓ）も多型に含むことができる。
【００７９】
１塩基多型（ＳＮＰｓ）とは、ヒトの集団において２つの選択的塩基が認識できる頻度（１％超）で生じる位置を言い、これはヒトの遺伝子に最も頻繁に見られる変異型である。この部位には、そのアレルの高度保存配列（例えば、その集団の１／１００未満または１／１０００未満のメンバーにおいて変異が見られる配列）が、先または後に続いていてもよい。１塩基多型は、多型部位において１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されることにより生じる場合がある。塩基転移は、あるプリンが別のプリンに置き換わるか、またはあるピリミジンが別のピリミジンに置き換わることである。塩基転換は、プリンがピリミジンに置き換わること、またはこの逆の場合もある。１塩基多型は、標準アレルに対してヌクレオチドが欠失していることまたはヌクレオチドが挿入されていることにより生じてもよい。
【００８０】
ｈ．プローブ
本明細書においては、プローブが標的核酸を特異的に検出する標的核酸の検出方法が提供される。プローブは、第１の部分および第２の部分を含むことができる。プローブの第１の部分は、標的核酸の第１の部分に相補的であってもよい。プローブの第２の部分は、標的核酸の第２の部分と実質的に相補的であってもよい。プローブは、標的核酸と相補的なヌクレオチドを、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個含むことができる。プローブは、同胞核酸にも実質的に相補的であってもよい。プローブは、同胞核酸と相補的なヌクレオチドを、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個含むことができる。
【００８１】
プローブは、６８〜７０℃の融解温度を有することができる。プローブは、増幅反応で用いることができる。その反応は、ＰＣＲであってもよい。ＰＣＲ反応には、フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブを含むことができる。ＰＣＲ反応には、プローブおよび標的核酸に結合するリバースプライマーを複合体で含むことができ、プローブの５’末端は、リバースプライマーの３’末端に対して、５、６、７、８、９、１０または１１ヌクレオチド分上流に位置していてもよい。
【００８２】
プローブは、標識を含むことができる。プローブは、２つ以上の核酸を含んでいてもよい。プローブは、マイナーグルーブバインダーを含んでいてもよい。
【００８３】
（１）検出部位
プローブの第１の部分は、検出部位を含むことができる。検出部位は１個のヌクレオチドを含んでいてもよい。検出部位は、複数のヌクレオチドを含んでいてもよい。検出部位は、標的核酸の変異部位に相補的であってもよい。検出部位は、同胞核酸の変異部位に非相補的であってもよい。検出部位は、プローブの５’末端または３’末端に位置していてもよい。例えば、検出部位は、プローブの５’末端から２、３、４、５、６、７または８塩基離れていてもよく、または検出部位は、プローブの３’末端から２、３、４、５、６、７または８塩基離れていてもよい。検出部位は、標的核酸に相補的な、８〜１０個のヌクレオチドであってもよい。
【００８４】
（２）増感部位
プローブの第２の部分は、増感部位を含むことができる。増感部位は、標的核酸に対して非相補的であってもよい。増感部位は、同胞核酸に対して非相補的であってもよい。増感部位は、検出部位から離れた位置にあってもよい。増感部位は、プローブと同胞核酸の第１の部分との間の付加的なミスマッチに対してプローブを増感し、プローブと同胞核酸との間のハイブリダイゼーション効率が悪くなるという全体的効果を生じることができる。反対に、プローブと標的核酸との間のより効率的なハイブリダイゼーションという全体的効果のために、プローブの増感部位によってプローブの第１の部分を相補的な標的核酸の第１の部分に効率的に結合させうる。増感部位は、５’末端、３’末端またはプローブの両末端間等のいずれかの部位であって、検出部位から離れたいずれの部位に存在することができる。増感部位は、１個のヌクレオチドを含んでいてもよい。増感部位は、複数のヌクレオチドを含んでいてもよい。増感部位は、１〜２０個のヌクレオチドを含むことができる。増感部位は、ポリ（Ａ）結合領域を含んでいていてもよい。ポリ（Ａ）結合領域は、ｃＤＮＡのポリ（Ａ）に相補的であってもよい。
【００８５】
ｉ．バックグラウンド核酸
本明細書においては、標的核酸を特異的に検出し、バックグラウンド核酸から標的核酸を区別する方法も提供される。バックグラウンド核酸は、複数の核酸を含むことができる。バックグラウンド核酸は、同胞核酸を含むことができる。バックグラウンド核酸は、多様な非標的核酸および非同胞核酸を含むことができる。バックグラウンド核酸は、標的核酸と同一でなくても、実質的に同一でなくてもよい。
【００８６】
５．標的核酸の作製方法
本明細書においては、標的核酸の作製方法も提供される。標的核酸は、標的核酸の第２の部分に位置するアダプター配列を含むことができる。アダプター配列を用いることで、標的核酸の第２の部分とプローブの第２の部分との間に非相補性を生じさせることができる。アダプター配列は、増感部位に非相補的な配列を含んでいてもよい。
【００８７】
アダプター配列は、１２〜３０個のヌクレオチドを含むことができる。アダプター配列は、合成配列を含むことができる。アダプター配列は、標的核酸が単離される動物のゲノムに含まれるいかなる配列とも非同一な配列も含むことができる。アダプター配列は、標的核酸にライゲーションされていてもよい。アダプター配列は、ＰＣＲにより標的核酸に付加してもよい。ＰＣＲは、アダプター配列と相補的な配列を含むアダプタープライマーを含んでいてもよい。アダプター配列は、ポリ（Ａ）配列を含んでいてもよい。
【００８８】
ａ．ＲＮＡからの標的核酸の作製方法
（１）ＲＮＡ抽出／ポリアデニル化
標的核酸は、ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡの標的配列を単離および増幅する方法には、全ＲＮＡの抽出、ポリアデニル化反応および逆転写（ＲＴ）反応が含まれる。標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、Ｐｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡであってもよい。ＲＮＡは、ポリアデニル化されていてもよい。ポリアデニル化は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼにより行うことができる。ポリアデニル化は、ポリ（Ａ）末端付加キットを用いて行うこともできる。ポリアデニル化は、その内容が参照により本明細書に組み込まれているＳｈｉ ａｎｄ Ｃｈｉａｎｇ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ, ２００５;３９（４）:５１９−２５の方法により行うこともできる。ポリアデニル化により、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０個のアデノシンを標的に付加することができる。
【００８９】
（２）逆転写
ｃＤＮＡの標的配列は、標的ＲＮＡの逆転写により作製することがきる。ｃＤＮＡの作製方法は、ポリアデニル化ＲＮＡ、または、アダプター配列がライゲーションされたＲＮＡの逆転写であってもよい。ｃＤＮＡは、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／３８４,０４９号に概説される方法により合成することができる。
【００９０】
（ａ）ＲＮＡにライゲーションされたアダプター配列を用いた逆転写
逆転写の前に、ＲＮＡをアダプター配列にライゲーションすることができる。ライゲーション反応は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼにより行い、アダプター配列をＲＮＡの３’末端にライゲーションすることができる。次いで、アダプター配列の３’末端に相補的な配列を含むプライマーを用いて逆転写（ＲＴ）反応を行うことができる。
【００９１】
（ｂ）ＲＮＡにライゲーションされたポリアデニル化配列を用いた逆転写
５’アダプター配列を含むポリ（Ｔ）プライマーを用いた逆転写（ＲＴ）反応において、ポリアデニル化ＲＮＡを用いることができる。ポリ（Ｔ）配列は、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の連続したチミンを含むことができる。逆転写プライマーは、以下の配列のうち１つを含んでいてもよい：
５’ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＣＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ ３’
５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＣＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’
５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’
ここで、ＶはＡ、ＣおよびＧの混合物、Ｎは４種類のヌクレオチド全ての混合物である。
【００９２】
（３）ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡの逆転写産物は、標的核酸および５’末端配列に相補的な少なくとも１５個の核酸を含む特異的なフォワードプライマー；アダプター配列の３’末端に相補的なリバースプライマー；ならびに標的核酸と相補的な少なくとも８個の核酸を含むプローブを用いたリアルタイムＰＣＲにより増幅することができる。プローブは、アダプター配列の５’末端と部分的に相補的であってもよい。
【００９３】
ｂ．標的核酸のＰＣＲ
標的核酸の増幅方法も本明細書に記載される。増幅は、ＰＣＲを含む方法により行うことができる。ＰＣＲ反応の第１サイクルは、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃または６０℃のアニーリング温度を有していてもよい。第１サイクルは、１〜１０サイクルを含んでいてもよい。ＰＣＲ反応の残りのサイクルは、６０℃で行われてもよい。残りのサイクルは、２〜４０サイクルを含んでいてもよい。アニーリング温度により、ＰＣＲの感度をより高めることもできる。ＰＣＲは、より高いストリンジェンシーを有するＰＣＲ用鋳型として機能できる、より長い生成物を生成することができる。
【００９４】
（１）フォワードプライマー
ＰＣＲ反応は、フォワードプライマーを含むことができる。フォワードプライマーは、標的核酸と同一な１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のヌクレオチドを含むことができる。
【００９５】
フォワードプライマーの３’末端は、標的核酸と同胞核酸との間の配列の差異に感受性があってもよい。
【００９６】
フォワードプライマーは、５’オーバーハング末端を含んでいてもよい。前記５’末端は、フォワードプライマーの融解温度を上昇させることができる。前記５’末端の配列は、標的核酸が単離された動物のゲノムと同一でない配列を含むことができる。前記５’末端の配列は、合成されたものであってもよい。前記５’末端は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のヌクレオチドを含むことができる。５’オーバーハング末端は、５’−ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧ−３’の配列を含んでいてもよい。５’オーバーハング末端は、５’−ＣＡＧＴＣＡＴＴＴＧＧＧ−３’の配列を含んでいてもよい。フォワードプライマーは、表７の「ＦＤ−Ｐ」欄に含まれる配列番号に示される配列に対応する配列を含むことができる。
【００９７】
（２）リバースプライマー
ＰＣＲ反応は、リバースプライマーを含むことができる。リバースプライマーは、標的核酸に相補的なものであってもよい。リバースプライマーは、アダプター配列と相補的な配列を含んでいてもよい。アダプター配列に相補的な配列は、１２〜２４個のヌクレオチドを含むことができる。リバースプライマーは、５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣ−３’の配列を含んでいてもよい。
【００９８】
６．疾患および健康状態の発現解析
本明細書においては、疾患または病的状態と関連する標的核酸の同定方法が提供される。標的核酸は、変異部位を含んでいてもよい。変異部位は、疾患、病的状態または体質と関連するものであってもよい。体質は、色、身長、大きさまたは素因等のいずれの同定可能な状態であってもよい。前記方法は、標的核酸をプローブと接触させることを含むことができる。コントロールと比較した、標的核酸へのプローブ結合レベルは、疾患、病的状態または体質の指標とすることができる。
【００９９】
例えば、コントロールと比較した標的核酸のレベル（または発現レベル）の検出により、高解像で高感度なデータセットを得ることができ、このデータは、診断、予後診断、治療、薬物開発、遺伝薬理学、バイオセンサー開発および他の関連分野において用いることができる。
【０１００】
前記方法により得られる発現プロファイルは、多くの標的核酸と関連した、試料の状態の「フィンガープリント」とすることができる。２つの状態において特定の標的配列が同様に発現していても、同時に数多くの標的核酸を評価することにより、その細胞の状態に特徴的な遺伝子発現プロファイルを得ることができる。すなわち、正常な組織を疾患組織から区別することができる。既知の異なる疾患状態における組織の発現プロファイルを比較することにより、これら各段階と関連する標的核酸に関する情報を得ることができる。次に、診断を行うかまたは確認することにより、組織試料が正常組織の発現プロファイルまたは疾患組織の発現プロファイルを有するかを判断することができる。これにより、関連した状態の分子診断が可能になる。
【０１０１】
疾患関連標的核酸の発現レベルは、多くの意味で情報となる。例えば、コントロールとの比較における疾患関連標的核酸の差次的発現は、患者がその疾患を患っているという診断に利用することができる。疾患関連標的核酸の発現レベルは、患者の治療状態および疾患状態をモニターするために利用することもできる。さらに、疾患関連標的核酸の発現レベルに基づき、疾患と関連して、特定の発現プロファイルを変化させたり発現プロファイルを抑制したりする薬物候補のスクリーニングを行うことができる。
【０１０２】
標的核酸を含む試料を、該標的核酸と十分に相補的なプローブと接触させてコントロールレベルを上回るプローブへのハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸を検出し標的核酸のレベルを測定することができる。
【０１０３】
標的核酸は、試験対象の標的核酸をナイロンメンブラン等の固相担体上に固相化し、標識プローブを試料にハイブリダイズさせることにより検出することができる。標的核酸は、標識プローブを固相担体に固相化し、標識標的核酸を含む試料をハイブリダイズさせることにより検出できる。洗浄により非特異的にハイブリダイズしたものを除去した後、標識を検出することができる。
【０１０４】
その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／３８４,０４９号に記載される方法によれば、生体試料中においても標的核酸を検出することができる。
【０１０５】
また、標的核酸は、透過化処理した細胞または組織試料を標識プローブと接触させて標的核酸とハイブリダイゼーションすることにより、ｉｎ ｓｉｔｕで検出することができる。洗浄により非特異的に結合したプローブを除去して、標識を検出することができる。
【０１０６】
これらのアッセイは、その内容がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５,６８１,７０２号；５,５９７,９０９号；５,５４５,７３０号；５,５９４,１１７号；５,５９１,５８４号；５,５７１,６７０号；５,５８０,７３１号；５,５７１,６７０号；５,５９１,５８４号；５,６２４,８０２号；５,６３５,３５２号；５,５９４,１１８号；５,３５９,１００号；５,１２４,２４６号；および５,６８１,６９７号に概説されているように、複数のプローブの使用を含む、直接ハイブリダイゼーションアッセイであっても、サンドイッチアッセイを含んでいてもよい。
【０１０７】
上記に概説されているような、高度、中程度、低度のストリンジェンシーを有する条件を含む、種々のハイブリダイゼーション条件を用いることができる。アッセイは、プローブがターゲットのみにハイブリダイゼーションできるストリンジェント条件下で行うことができる。ストリンジェンシーは、これらに限定されないが、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度、ｐＨまたは有機溶媒濃度等の熱力学的変数である工程パラメーターを変化させることで調節することができる。
【０１０８】
ハイブリダイゼーション反応は、種々の方法により行うことができる。反応成分は、同時に加えても、異なる順序で連続的に添加してもよい。さらに、反応は、種々の試薬を含むことができる。これらには、塩、バッファー、アルブミン等の中性タンパク質、界面活性剤等が含まれ、これらを用いることで至適なハイブリダイゼーションおよび検出が容易となり、ならびに／または非特異的相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を減少させることができる。試料の調製方法および標的の純度に応じて、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤および抗菌剤等の、アッセイの効率を改善する他の試薬を適宜用いることができる。
【０１０９】
ａ．診断
診断方法も提供される。前記方法は、生体試料中の疾患関連標的核酸の差次的発現レベルを検出することを含むことができる。この試料は、患者に由来していてもよい。患者における疾患状態の診断により、予後診断と治療戦略の選択が可能になる。さらに、一時的に発現する疾患関連標的核酸を測定することにより、細胞の発生段階を分類することができる。
【０１１０】
標識プローブの組織アレイへのｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを行うこともできる。個人の試料とスタンダードのフィンガープリントを比較した場合、当業者は、この知見に基づいて、診断、予後診断または予測を行うことができる。また、診断の指標となる遺伝子は、予後診断の指標となる遺伝子と異なる場合があることも理解されるべきである。さらに、細胞の状態の分子プロファイリングにより、応答状態または不応答状態を区別したり、結果を予測したりできる。例えば、診断方法は、生体試料中の癌関連標的核酸の差次的レベルを検出することを含むことができる。癌関連標的核酸の供給源は、未制御細胞増殖を特徴とする癌細胞であってもよい。癌細胞の例は、乳癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、黒色腫および脳腫瘍由来の細胞を含むことができる。
【０１１１】
ｂ．遺伝子型同定
本明細書においては、本明細書に記載するプローブを用いてＳＮＰ等の多型を検出する遺伝子型同定方法も提供される。本明細書で用いられる「遺伝子型同定」とは、個人がゲノム中の１以上の位置に保持する遺伝子情報を決定することを意味する場合がある。例えば、遺伝子型同定には、個人が保持するいずれのアレルもしくはアリル群が単一のＳＮＰに相当するのかを決定すること、または個人が保持するいずれのアレルもしくはアリル群が複数のＳＮＰに相当するのかを決定することを含むことができる。遺伝子型は、個人において存在する、１以上の多型部位での対立遺伝子のアイデンティティーである場合がある。
【０１１２】
（１）ヒトの疾患と健康状態
遺伝子型同定は、疾患または健康状態に対するヒトの素因の測定のために行ってもよい。例えば、遺伝子型同定は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第７,１２７,３５５号に記載されるように用いることもできる。また、遺伝子型同定は、薬物治療または他の治療に対する個人の応答性を予測するために用いることもできる。
【０１１３】
（２）ウィルスＲＮＡ
遺伝子型同定は、例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウィルスまたはヒトパピローマウィルス等のウィルスゲノム中の変異の存在を検出するために行ってもよい。このような遺伝子型同定の例は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６,７９７,４６４号および同第６,６５３,０８１号ならびに米国特許公開公報第２００５０１１２５５４号および同第２００５０１４３７９号に見出される。
【０１１４】
（３）病原性微生物
遺伝子型同定は、細菌の抗生物質耐性等の、細菌の種類および変異を検出するために行ってもよい。例えば、遺伝子型同定は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６,９１３,７５３号に記載されるようなものであってもよい。
【０１１５】
７．薬物スクリーニング
治療薬のスクリーニング方法も提供される。前記方法は、疾患関連核酸を発現可能な病的細胞を候補治療薬と接触させること、および疾患関連標的核酸の発現プロファイルに対する薬物候補の効果を評価することを含むことができる。差次的に発現する標的核酸が同定されたら、種々のアッセイを実行することできる。試験化合物は、疾患関連核酸の遺伝子発現を調節する能力に関してスクリーニングすることができる。調節には、遺伝子発現の上昇および抑制の両方が含まれる。
【０１１６】
試験化合物または候補薬物は、タンパク質、オリゴペプチド、低分子量有機分子、多糖、ポリヌクレオチド等の、疾患表現型または疾患関連核酸の発現を直接的または間接的に変化させる能力について試験されるいずれの分子でもよい。候補薬物には、例えば、１００ダルトン超および約５００、１,０００、１,５００、２,０００または２,５００ダルトン未満の分子量を有する低分子量有機分子等、数多くの化学的分類が含まれる。候補化合物は、タンパク質との構造的相互作用、特に、水素結合に必要な官能基を含んでいてもよく、通常は、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくは、少なくとも２つのこれら化学官能基を含んでいてもよい。候補薬剤は、１以上の上記官能基で置換された、環式炭素構造もしくは複素環構造および／または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含んでいてもよい。候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体、構造類似体または組み合わせ等の生体分子においても見出される。
【０１１７】
疾患関連核酸に結合する能力またはその活性を修飾する能力に関して、潜在修飾薬のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングしてもよい。コンビナトリアルライブラリーは、試薬等の多数の化学構成要素を組み合わせることによる、化学合成または生物学的合成のいずれかにより作製される多様な化学物質の集合体であってもよい。
【０１１８】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製とスクリーニングについては、当業者によく知られている。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーには、これらに限定されないが、ペプチドをコードするペプチドライブラリー；ベンゾジアゼピン；ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド等のダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）；ビニル性ポリペプチド；低分子化合物ライブラリーの類似有機合成物；オリゴカルバミン酸；および／またはペプチジルホスホン酸、核酸ライブラリー、ペプチド核酸ライブラリー、抗体ライブラリー、炭水化物ライブラリーならびに低分子量有機分子ライブラリー等が含まれる。
【０１１９】
８．遺伝子サイレンシング
細胞、組織または器官内の標的遺伝子の発現を低下させる方法も提供される。標的遺伝子の発現は、本明細書に記載する標的ｍＲＮＡの１以上の結合部位に実質的に相補的な配列を含む核酸を発現させることによって減少させることができる。核酸は、ｍｉＲＮＡまたはその変異体であってもよい。核酸は、プロセッシングを受けてｍｉＲＮＡを生じることができる、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはその変異体であってもよい。発現ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ上の実質的に相補的な結合部位にハイブリダイズし、これによってＲＩＳＣ介在性の遺伝子サイレンシングを活性化することができる。ｍｉＲＮＡの過剰発現を用いた研究の例としては、その内容が参照により本明細書に組み込まれているＹｅｋｔａ ｅｔ ａｌ ２００４, Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４−５９４が挙げられる。当業者であれば、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６,５０６,５５９号および第６,５７３,０９９号に記載されるＲＮＡｉ法等の当該技術分野でよく知られるアンチセンス法により標的遺伝子の発現を阻害したり、ｍｉＲＮＡの活性を阻害したりするために本明細書に記載する核酸を用いることもできることを理解するであろう。
【０１２０】
遺伝子サイレンシングの標的は、第２のタンパク質のサイレンシングを起こすようなタンパク質であってもよい。標的遺伝子の発現を抑制することにより、第２のタンパク質の発現を上昇させることができる。ｍｉＲＮＡ発現の効果的な抑制の例には、その内容が参照により本明細書に組み込まれているＥｓａｕ ｅｔ ａｌ ２００４ ＪＢＣ ２７５−５２３６１；およびＣｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ ２００５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ３３−１２９０に記載される研究が挙げられる。
【０１２１】
９．遺伝子亢進
細胞、組織または器官内の標的遺伝子の発現を増加させる方法も提供される。標的遺伝子の発現は、本明細書に記載するｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはその変異体に実質的に相補的な配列を含む核酸を発現させることによって増加させることができる。核酸は、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡであってもよい。ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとハイブリダイズし、それによってその遺伝子抑制活性を低下させることができる。標的遺伝子中の結合部位の一部に実質的に相補的な核酸を、核酸の結合部位への結合がｍｉＲＮＡの結合を阻害するように発現させることによって、標的核酸の発現を増加させることもできる。
【０１２２】
１０．治療薬
発生障害に関連した疾患または障害の調節方法も提供される。この疾患または障害は、前立腺癌や肝癌等の癌であってもよい。一般的に、本明細書に記載する核酸分子は、前記核酸分子と少なくとも部分的に相補的な遺伝子の発現の調節剤として用いることができる。さらに、ｍｉＲＮＡ分子は、治療薬のスクリーニング方法における標的となってもよく、例えば、ｍｉＲＮＡ分子の阻害または活性化が、増殖またはアポトーシス等の細胞分化プロセスを調節してもよい。さらにまた、癌遺伝子、多剤耐性遺伝子または別の治療標的遺伝子等の標的特異性を改変するために、既存のｍｉＲＮＡ分子を配列改変ｍｉＲＮＡ分子の製造の出発物質として用いることもできる。さらにまた、プロセッシングされて治療関連標的に対する二本鎖ｓｉＲＮＡを生じるよう、ｍｉＲＮＡ分子を修飾することができる。さらにまた、ｍｉＲＮＡ分子を、組織の再プログラム方法に用いることも可能であり、例えば、ｍｉＲＮＡ分子の発現によって、分化した株化細胞を異なる種類の細胞または幹細胞に形質転換させることもできる。
【０１２３】
１１．Ｌｕｍｉｎｅｘ検出法
標的核酸またはｍｉＲＮＡの検出方法には、本明細書において議論される多数の工程が含まれる。全ＲＮＡを組織から抽出する。短鎖ＲＮＡ画分をＹＭ１００カラムを用いて濃縮する。低分子ＲＮＡ画分は、種々の方法（例えば、ビオチン標識）により標識することができる。これと並行して、ｍｉＲＮＡアンチセンスＤＮＡ、またはアミン修飾ロックド核酸（ＬＮＡ）プローブを、ＥＤＣを用いてカルボキシル化した色コードＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェア（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ ｃｏｌｏｒ−ｃｏｄｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｘ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）（ビーズ）に結合させることによって、各混合物が１００種類のｍｉＲＮＡプローブを含み、各プローブが異なる特異的な分光的特徴もしくは色を有するビーズとカップリングしたカップリングビーズ混合物を作製することができる。ビーズは、Ｌｕｍｉｎｅｘアナライザーで差次的に検出可能な、別個の１００種類のセットとして調製することができる。次いで、標識ｍｉＲＮＡはプローブ結合色素ビーズの混合物とハイブリダイズしてもよい。ハイブリダイズしたｍｉＲＮＡ結合ビーズ混合物はストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン色素で処理してもよい。反応は、Ｌｕｍｉｎｅｘアナライザーを用いて分析することできる。レーザーにより、各マイクロスフェア粒子ならびにｍｉＲＮＡに結合したレポーター色素を同定する内部色素が励起される。各ビーズ上の色素の中間強度は、組織内の特定のＲＮＡの発現に比例し得る。
【０１２４】
ｍｉＲＮＡもしくはプローブまたは標的核酸は、以下のようにラベルすることができる：
【０１２５】
１２．直接標識：
ａ．化学標識
例には、ｍｉＲＮＡのビオチン標識にＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｍｉｃｒｏｍａｘ キットの一部を用いたＵＬＳ技術が含まれる。この方法により、ｍｉＲＮＡはその長さに沿ってビオチン標識される。この方法は、再現性を有し、強力であることがわかる。
【０１２６】
ｂ．Ｋｒｅａｔｅｃｈ化学標識キット
この方法では、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒと類似する技術でｍｉＲＮＡもしくはプローブまたは標的核酸がビオチン標識されるが、感度がある程度低いことが示された。
【０１２７】
ｃ．酵素末端標識
例には、ジヌクレオチドのビオチン系物質（ｐＣＵ−ｂｉｏ）とのライゲーションが含まれる。
【０１２８】
１３．シグナル増幅
ａ．ＴＳＡ
チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）により、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体が結合した１つのビオチンから、その場でビオチンの数が増幅される。チラミドビオチン基質は、ＨＲＰにより加工され、その場で沈殿する不溶性ビオチンを生じ、適切なマイクロスフェア上にビオチンのクラスターを作り出す。
【０１２９】
ｂ．Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ
当該方法は、大量のビオチン分子が結合した分岐ＤＮＡの３ＤＮＡシステムを利用するものであり、少量の出発物質しか入手できない場合のｍｉＲＮＡ検出に有用である。
【０１３０】
１４．転写：
ａ．直接転写
当該方法では、ＲＮＡの直線増幅のための、ビオチン標識された転写産物が作り出される。当該方法では、標的核酸からビオチン標識された転写産物を作り出すことができる。
【０１３１】
ｂ．ＳｅｎｓｅＡｍｐ ｐｌｕｓ
当該方法は、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅキットを用いたｍｉＲＮＡ増幅を利用する。本明細書には複数の態様が記載されており、以下の非限定的な実施例により例示されている。
【０１３２】
１５．可能な用途
Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を用いた低分子ＲＮＡ検査は、迅速で信頼性の高い技術であり、一度に多数の試料に対してハイスループット様式で適用できる。このシステムは、感度と特異性が高く、したがって、基礎生物学研究、診断および治療のための、ｍｉＲＮＡまたは標的核酸の広範囲な検証およびプロファイリングに適用することができる。この技術は再現性が高いため、信頼性の高いものとなっている。
【０１３３】
本明細書において提供される方法は、細胞において新規に予測されたｍｉＲＮＡを確認するために用いることができる。また、他の短鎖ＲＮＡの検証および発現プロファイリングに用いることもできる。また、治療または研究用途において、細胞における導入ｓｉＲＮＡ（阻害性ＲＮＡ）の発現の発現レベルを検証するためにも用いることができる。また、癌細胞および正常細胞におけるｍｉＲＮＡの差異の発見、体液および生検に含まれる癌細胞の早期検出、癌の段階の予後診断、潜在的な生存率および治療に対する応答性の予測、適切な抗癌治療の決定または治療化合物候補のスクリーニングのために転移癌の組織由来を決定するための細胞、組織および体液中のｍｉＲＮＡの発現検査に用いることができる。また、組織の発生および分化を研究するための、胚由来試料におけるｍｉＲＮＡプロファイリングに用いることもできる。
【０１３４】
１６．キット
キットも提供され、このキットは、本明細書に記載する核酸の他に、以下に記載するもののいずれかもしくは全てを含むことができる：アッセイ用試薬、バッファー、プローブおよび／またはプライマー、ならびに滅菌生理食塩水または他の医薬的に許容可能なエマルジョンおよび懸濁基剤。これに加え、キットは、本明細書に記載される方法を実施するための指示（例えば、プロトコル）を含む説明書を含むことができる。
【０１３５】
例えば、キットは、標的核酸配列の増幅、検出、同定または定量用のキットであってもよい。キットは、ポリ（Ｔ）プライマー、フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブを含むことができる。
【実施例】
【０１３６】
実施例１
標的核酸の作製方法
以下に、ｍｉＲＮＡから標的核酸を作製する方法を記載する。培養ＣＨＯ細胞から全ＲＮＡを単離・抽出した。ポリアデニル化によりアダプター配列を作製するか、または逆転写前にアダプター配列をアダプター配列にライゲーションした。次いで、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼによりライゲーション反応を行い、ＲＮＡの３’末端にアダプター配列をライゲーションした。
【０１３７】
アダプター配列の３’末端に相補的な配列を含むプライマーを用いて逆転写（ＲＴ）反応を行った。逆転写プライマー（オリゴｄＴプライマー）を、以下の配列の１つから選択した：
５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＣＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’（配列番号：２０８３
５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’（配列番号：２０８３
５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＣＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’（配列番号：２０８５３）
５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’（配列番号：２０８５
５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’（配列番号：２０８５
５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＣＣＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’（配列番号：２０８５
５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’（配列番号：２０８５
５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＣＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’（配列番号：２０８５
ここで、ＶはＡ、ＣおよびＧの混合物であり、Ｎは４種類のヌクレオチド全ての混合物である。ＲＮＡの逆転写産物は、標的核酸および５’末端配列に相補的である特異的フォワードプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ反応により増幅した。フォワードプライマーは、配列５’−ＣＡＧＴＣＡＴＴＴＧＧＧ−３’（配列番号：２０８３９）または表７の「ＦＤ−Ｐ」欄に含まれる配列番号に対応する配列から選択した。
【０１３８】
リバースプライマーもアダプター配列の５’末端に相補的な配列から選択した。リバースプライマーは、５’−ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣ−３’（配列番号：２０８５９）であった。プローブは、アダプター配列の３’末端と部分的に相補的であった。
【０１３９】
次に、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応の第１サイクルのアニーリング温度は５８℃であった。第１サイクルは、５サイクルである。ＰＣＲ反応の残りのサイクルは、６０℃であった。残りのサイクルは、３５サイクルであった。標的核酸は、５’−ＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴ−３’（配列番号：２０８４０）の配列を用いて、上記の方法により作製した。
【０１４０】
実施例２
標的核酸検出用プローブ
ここでは、標的核酸検出用プローブについて記載する。５’−ＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：２０８４５）の配列を用いてポリアデニル化ｃＤＮＡに対するプローブを作製した。この配列には、標的結合領域に相補的な配列が連結されており、これによってプローブが標的核酸のアダプター配列の３’末端に部分的に相補的であることが確実となる。合成された標的結合領域には、３種類の変異があり、各変異は、標的核酸に対して１ヌクレオチドだけシフトしている。
【０１４１】
配列５’−ＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴ−３’（配列番号：２０８４０）を含む標的核酸に結合可能な３種類の変異を用いたが、これらは以下の配列を含んでいる：
プローブ＿ｖ１
５’−ＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＴＡＴＡＣ−３’（配列番号：２０８４６）
プローブ＿ｖ２
５’−ＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＣＴＡＴＡＣＡ−３’（配列番号：２０８４７）
プローブ＿ｖ３
５’−ＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＴＡＣＡＡ−３’（配列番号：２０８４８）
【０１４２】
標的結合領域の配列は、３’末端に「Ａ」を有していてはいけない。例えば、配列５’−ＴＧＡＴＴＧＧＴＡＣＧＴＣＴＧＴＧＧＧＴＡＧＡ−３’（配列番号：２０８４９）を含む標的核酸に結合可能なプローブの３種類の変異は、以下の配列を含む：
プローブ＿ｖ１
５’−ＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号：２０８５０）
プローブ＿ｖ２
５’−ＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＣＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号：２０８５１）
プローブ＿ｖ３
５’−ＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＡＣＡＧＡ−３’（配列番号：２０８５２）
【０１４３】
プローブは、表７の「プローブ１」、「プローブ２」または「プローブ３」の欄に含まれる配列番号の配列に相当する配列を用いて設計することも可能である。
【０１４４】
実施例３
１ヌクレオチドの違いの検出：ｌｅｔ−７ａ対ｌｅｔ−７ｄ
実施例１に記載する方法により、１ヌクレオチドだけ異なるヒトＬｅｔ−７ファミリーのメンバーであるｍｉＲＮＡを検出した。このファミリーの２つのメンバーの配列は、以下の通りである：
ｈｓａ−Ｌｅｔ−７ａ  ５’−ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’（配列番号：２０８４０）
ｈｓａ−Ｌｅｔ−７ｃ  ５’−ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＧＧＵＵ−３’（配列番号：２０８４１）
ｈｓａ−Ｌｅｔ−７ｄ  ５’−ＡＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＣＡＵＡＧＵ−３’（配列番号：２０８４２）
【０１４５】
（ｉ）上記に記載した逆転写プライマーのアダプター配列とミスマッチを有さない（すなわち、０ミスマッチ）５’−ＣＣＧ配列、および（ｉｉ）Ｌｅｔ−７ａの３’末端と完全にマッチする配列、を有するマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）プローブをリアルタイムＰＣＲで用いた（図３）。リアルタイムＰＣＲの際に０ミスマッチプローブを定量することにより、Ｌｅｔ−７ａのｍｉＲＮＡが、Ｌｅｔ−７ｃから区別できないことが分かった。これは、３.５０Ｅ-０５ｎｇ／μｌの濃度でＬｅｔ−７ａおよびＬｅｔ−７ｃにおいて、それぞれ２３.４３および２３.７３の同程度のサイクル域値（ＣT）が観察されたことによっても示された（表７）。
【０１４６】
しかしながら、アダプター配列と１つのミスマッチを有するＬｅｔ−７ａ特異的ＭＧＢプローブを用いることにより（図４）、対応するＣTの差異で示されるように、リアルタイムＰＣＲでＬｅｔ−７ａとＬｅｔ−７ｃとを区別することが可能であった（表７）。１つのミスマッチを有するＬｅｔ−７ａ特異的プローブにより検出されたＬｅｔ−７ａおよびＬｅｔ−７ｃのＣTは、３.５０Ｅ-０５ｎｇ／μｌの濃度で、４０サイクルの後に、それぞれ２８.３および検出不能値（ＮＤ）であった。
【０１４７】
非常に類似性の高いｍｉＲＮＡ（Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｃおよびＬｅｔ−７ｄ）を混合した場合でさえも、高い特異性は残っていた。表８Ａに示すように、混合物中で検出されたＣTは、各ｍｉＲＮＡについて個別に検出されたＣTとほぼ一致していた。
【０１４８】
上記の方法は、アダプター配列に対して２つの５’ミスマッチを有するＬｅｔ−７ａ特異的ＭＧＢプローブを用いて試験した場合にも成功した。表７に示すように、２つのミスマッチを有するＬｅｔ−７ａ特異的プローブにより、３.５０Ｅ-０４ｎｇ／μｌの濃度においてＬｅｔ−７ａおよびＬｅｔ−７ｃの差次的検出が可能であったが、１つのミスマッチを有するＬｅｔ−７ａ特異的プローブの場合と比べてＣTが上昇していた。
表７  Ｌｅｔ−７ａプローブによるＬｅｔ−７ファミリーメンバーの検出
【表８】
2010500867.tif 000010
【０１４９】
表８Ａには、アダプター配列と比べて１つのミスマッチを有するＬｅｔ−７ｃ特異的プローブが、Ｌｅｔ−７ａまたはＬｅｔ−７ｄのＣTと比べて低いＣTでＬｅｔ−７ｃを検出することが示されており、したがって、Ｌｅｔ−７ｃと他のファミリーメンバーとを区別する能力が実証されている。同様に、１つのミスマッチを有するＬｅｔ−７ｄ特異的プローブは、Ｌｅｔ−７ａまたはＬｅｔ−７ｃのＣTと比べて低いＣTでＬｅｔ−７ｄを検出した。
表８Ａ  Ｌｅｔ−７ファミリプローブによるＬｅｔ−７ファミリーメンバーの検出
【表９】
2010500867.tif 000011
【０１５０】
上記の方法は、表２Ｂに示す種々の部位においてｃＤＮＡアダプター配列とのミスマッチを含むオリゴｄＴプライマー（配列番号：２０８５３〜２０８５６）を用いた試験でも成功した。
【０１５１】
表７および表８Ａ、Ｂに記載される結果は、本明細書で記載するプローブまたはオリゴｄＴプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにより、配列においてたった１つのヌクレオチドだけ異なる標的核酸を差次的に検出可能であることを示している。
表８  異なる位置にミスマッチを含むオリゴｄＴプライマーを用いたＬｅｔ−７ファミリーメンバーの検出
【表１０】
2010500867.tif 000012
【表１１】
2010500867.tif 000013
【０１５２】
実施例  １ヌクレオチドの違いの検出：ｍｉＲ−９９ａ対ｍｉＲ−１００
実施例１および２に記載の方法と同様の方法によりリアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−９９ａとｍｉＲ−１００との間の１ヌクレオチドの違いも検出した。ｍｉＲＮＡの配列は以下の通りである：
ｍｉＲ−９９ａ：５’−ＡＡＣＣＣＧＵＡＧＡＵＣＣＧＡＵＣＵＵＧＵＧ−３’（配列番号：２０８４３）
ｍｉＲ−１００：５’−ＡＡＣＣＣＧＵＡＧＡＵＣＣＧＡＡＣＵＵＧＵＧ−３’（配列番号：２０８４４）
【０１５３】
表９に示すように、ｃＤＮＡアダプター配列に対して１つのミスマッチを有するが、ｍｉＲ−９９ａに対してはミスマッチを有していないプローブは、同一のＲＮＡ濃度で、ｍｉＲ−１００と比べて約９サイクル低いＣTでｍｉＲ−９９を認識した。
【０１５４】
反対に、ｃＤＮＡアダプター配列に対して１つのミスマッチを有するが、ｍｉＲ−１００に対してはミスマッチを有していないプローブは、ｍｉＲ−９９に対して検出されたＣTと比べて約５サイクル低いＣTでｍｉＲ−１００を認識した。本発明の方法の高い特異性は、非常に類似度の高いｍｉＲＮＡを混合した場合でも維持される（表９）。
表９  ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１００の検出
【表１２】
2010500867.tif 000014
【０１５５】
実施例５
標的核酸の検出感度
リアルタイムＰＣＲの感度を試験した。ｍｉＲ−１２２ａ特異的プローブを用いて実施例１および２に記載する方法により、リアルタイム逆転写ＰＣＲにより、異なるＲＮＡ供給源（脳、肝臓、およびＨｅＬａ細胞またはこれらの混合物）から肝臓に特異的なｍｉＲＮＡであるｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａを増幅した。逆転写反応１回あたりのＲＮＡの初期量は、０.５ｎｇの全ＲＮＡであった。脳の全ＲＮＡの量は増加したが、肝臓の全ＲＮＡ量は減少した（表１０に挙げられる比率に従って）。
【０１５６】
表１０に示すように、肝臓特異的ｍｉＲＮＡの発現を検出した。肝臓以外（脳、ＨｅＬａ）のＲＮＡ供給源からはシグナルは検出されなかったが、肝臓ＲＮＡからは検出された。さらに、肝臓ＲＮＡの量を半分に減らした場合、関連分子数が少なくなるまで（約２０分子未満）、ＣTが１上昇した。さらに、僅かに０.０３１２５％のＲＮＡプールしか肝臓から得られない場合であっても、９９.９６８７５％の無関係なＲＮＡのバックグラウンド中でｍｉＲ−１２２ａが検出された。このような感度は、他の既知の方法では達成されていない。
表１０  異なる供給源に由来するＲＮＡ中のｍｉＲ−１２２ａの検出
【表１３】
2010500867.tif 000015
【０１５７】
実施例６
多様なＲＮＡバックグラウンド中の合成ｍｉＲ１２４ａの検出
特定標的核酸の検出を、低濃度の標的ヌクレオチド配列が高濃度の核酸バックグラウンド中に存在する場合において行うことにより、実施例１および２に記載する方法の感度を試験した。バックグラウンドであるＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡ ０.０５ｎｇに対して少量の合成ｍｉＲ−１２４ａを、ｍｉＲ−１２４ａ標的核酸配列の最終濃度が２.３５×１０-6 ｆｍｏｌ〜１.１６×１０-9 ｆｍｏｌとなるように添加した。各濃度につき、５つの重複する系で試験を行った。平均ＣTおよび標準偏差を計算した。表１１は、ＨｅＬａ細胞由来のバックグラウンドＲＮＡが、４７.６１ＣTのシグナルを与えたことを示す。高濃度においては、合成１２４ａ−ＲＮＡの量が半分に減少した場合、ＣTは約１増加した。バックグラウンドシグナルを超えるシグナルを与えた合成１２４ａ−ＲＮＡの最少量は、１.８６×１０-8 ｆｍｏｌである。
表１１  多様なＲＮＡバックグラウンド中の合成ｍｉＲ−１２４ａの検出
【表１４】
2010500867.tif 000016
【０１５８】
実施例７
ヒト血清中の異なるｍｉＲＮＡ標的配列の検出
次いで、実施例１および２に記載する方法を、ヒト血清中の多くのｍｉＲＮＡ標的配列の検出に応用した。ＬＳバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をＭｉｒｖａｎａキット（Ａｍｂｉｏｎ社）と組み合わせて用いて、３名の個人の血清試料から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ精製のために、対象番号５および７から３００μｌの容量の血清を得て、対象番号６からは１５０μｌの血清を得た。上記に記載する方法による各ＰＣＲ反応およびハイブリダイゼーション反応には、合計で１０％の精製ＲＮＡを用いた。ｍｉＲ標的配列に特異的なプローブを、以下の表１２に示した。表１２は、ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびＬｅｔ−７ｄ等の異なるマイクロＲＮＡが、血清試料中で特異的に検出可能であったことを示す。表１２からは、ヒト血清等の生体液から種々のｍｉＲＮＡ標的配列を、抽出、単離および検出することが可能なことが示唆される。
表１２  ヒト血清中の異なるマイクロＲＮＡ標的配列の検出
【表１５】
2010500867.tif 000017
【０１５９】
実施例８
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織中の異なるｍｉＲＮＡ標的配列の検出
膀胱、前立腺および大腸転移を有する肝臓由来のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織からＲＮＡを単離した。
【０１６０】
１ｍｌのキシレン（Ｂｉｏｌａｂ社）を１〜２ｍｇの組織に添加し、５７℃で５分間インキュベートし、１０,０００ｇで２分間遠心した。上清を取り除き、１ｍｌのエタノール（１００％）（Ｂｉｏｌａｂ社）を添加した。１０,０００ｇで１０分間遠心した後、上清を捨て、前記洗浄工程を繰り返した。１０〜１５分間風乾した後、５００μｌのバッファーＢ（ＮａＣｌ １０ｍＭ、Ｔｒｉｓ ｐＨ７.６、５００ｍＭ、ＥＤＴＡ ２０ｍＭ、ＳＤＳ １％）および５μｌのプロテイナーゼＫ（５０ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ社）を添加した。４５℃で１６時間インキュベーションを行った後、１００℃で７分間のプロテイナーゼＫの失活を行った。酸性フェノールクロロホルム（１：１）（Ｓｉｇｍａ社）で抽出を行った後、最大速度にて４℃で１０分間遠心分離を行い、上相を新しいチューブに移して、３倍量の１００％エタノール、０.１倍量のＮａＯＡｃ（ＢｉｏＬａｂ社）および８μｌのグリコーゲン（Ａｍｂｉｏｎ社）を添加して−２０℃で一晩静置した。
【０１６１】
最大速度にて４℃で４０分間遠心分離を行い、１ｍｌのエタノール（８５％）で洗浄して乾燥させた後、ＲＮＡを４５μｌのＤＤＷに再懸濁した。
【０１６２】
ＲＮＡ濃度を測定し、その濃度に応じてＤＮａｓｅ Ｔｕｒｂｏ（Ａｍｂｉｏｎ社）を添加した（ＲＮＡ １０μｇあたりＤＮａｓｅ １μｌ）。室温で３０分間インキュベーションを行い、酸性フェノールクロロホルムで抽出して沈殿させた後、ＲＮＡを４５μｌのＤＤＷに再懸濁した。再度ＲＮＡ濃度を測定し、その濃度に応じてＤＮａｓｅ Ｔｕｒｂｏ（Ａｍｂｉｏｎ社）を添加した（ＲＮＡ １０μｇあたりＤＮａｓｅ １μｌ）。室温で３０分間インキュベーションを行い、酸性フェノールクロロホルムで抽出して沈殿させた後、ＲＮＡを２０μｌのＤＤＷに再懸濁した。
【０１６３】
上記に記載する方法による各ＰＣＲ反応およびハイブリダイゼーション反応には、合計で１０％の精製ＲＮＡを用いた。ｍｉＲ標的配列に特異的なプローブを、以下の表１３に示す。表１３は、ＦＦＰＥ試料中でも異なるマイクロＲＮＡが特異的に検出可能であったことを示す。表１３は、ＦＦＰＥ組織から種々のマイクロＲＮＡ標的配列を、抽出、単離および検出することが可能であることを示す。
表１３  （ＦＦＰＥ）組織中の異なるマイクロＲＮＡ標的配列の検出
【表１６】
2010500867.tif 000018
【０１６４】
実施例９
羊水中の異なるｍｉＲＮＡ標的配列の検出
帝王切開手術中に２０ｍｌの羊水（非胎便性）を２本の１５ｍｌ試験管に回収した。４℃、１０００ｇで１０分間遠心分離を行って細胞を回収した。上清を回収してエッペンドルフチューブに４００μｌの容量で分注し、−８０℃で冷凍した。細胞ペレットをＰＢＳで再懸濁し、同様の条件で再度遠心分離した。次いでペレットを０.５ｍｌのバッファーＡ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社のＥＺ−ＲＮＡ ＩＩキットに付属）に再懸濁し、エッペンドルフチューブに移して−８０℃で保存した。
【０１６５】
ＥＺ−ＲＮＡ ＩＩキット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ 社、イスラエル）を製造元のプロトコルに従って用いて羊膜細胞画分からＲＮＡを回収した。
【０１６６】
羊水上清のＲＮＡは、以下のように抽出した：
【０１６７】
１００μｌの試料を、予め加熱した０.８ｍｌの抽出用溶液（ＮａＣｌ、０.１Ｍ；Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８、１０ｍＭ；ＤＴＴ、４０ｍＭ；ＥＤＴＡ ｐＨ８、１０ｍＭ；ＳＤＳ ７０ｍＭ；プロテイナーゼＫ、０.６５ｍｇ／ｍｌ）中で５６℃、１時間インキュベーションを行った。コントロールとしてスパイクを添加した。
【０１６８】
３Ｍ ＮａＯＡｃ ９０μｌおよび酸性フェノール：クロロホルム １ｍｌを添加した。２層に分離するまで４℃でのインキュベーションを行った（少なくとも２０分間）。１６,０００ｇにて室温で２０分間遠心分離を行った。水相（約１ｍｌ）を新しいチューブに移した。８μｌのグリコーゲンおよび３倍量のＥＴＯＨを添加して、−２０℃で一晩沈殿させた。最大速度にて４℃で４０分間遠心分離を行った。
【０１６９】
ペレットを８５％ＥＴＯＨで洗浄して６５℃で乾燥させ、４３μｌのＤＤＷに再懸濁した。２μｌのＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ社）および５μｌのバッファーを添加し、３７℃で１時間インキュベーションを行った。
【０１７０】
酸性フェノール：クロロホルムで抽出を行った後、ペレットを２０μｌのＤＤＷに再懸濁した。
【０１７１】
実施例１および２に記載する方法による各ＰＣＲ反応およびハイブリダイゼーション反応には、１００μｌの羊水から単離したＲＮＡを用いた。
【０１７２】
表１４は、６名の個人から得た羊水試料中においても異なるマイクロＲＮＡが特異的に検出可能であったことを示す。表１４には、羊水試料から種々のマイクロＲＮＡ標的配列を抽出、単離および検出することが可能なことが初めて示されている。
表１４  羊水中の異なるマイクロＲＮＡ標的配列の検出
【表１７】
2010500867.tif 000019
【０１７３】
実施例１０
ヒトの尿中の異なるｍｉＲＮＡ標的配列の検出
尿（５００μｌ）からのｍｉＲＮＡ抽出に用いたプロトコルは、実施例９に記載されたものと同様である。表１５は、ヒトの尿試料中においても異なるマイクロＲＮＡが特異的に検出可能であったことを示す。表１５には、ヒトの尿から種々のマイクロＲＮＡ標的配列を抽出、単離および検出することが可能なことが初めて示されている。
表１５  ヒトの尿中の異なるマイクロＲＮＡ標的配列の検出
【表１８】
2010500867.tif 000020
【０１７４】
実施例１１
唾液、胸水および胸部分泌物中の異なるｍｉＲＮＡ標的配列の検出
唾液、胸水および胸部分泌物からのｍｉＲＮＡ抽出に用いたプロトコルは、実施例９に記載されたものと同様であるが、僅かに変更を加えた。抽出される唾液ＲＮＡの純度を高めるため、プロテイナーゼＫとのインキュベーションを３時間に延長し、ＲＮＡは、−８０℃で一晩沈殿させた。
【０１７５】
表１６Ａ−Ｂは、ヒトの唾液、胸水および胸部分泌物中においても異なるマイクロＲＮＡを特異的に検出可能であったことを示す。表１６には、ヒトの唾液、胸水および胸部分泌物から種々のマイクロＲＮＡ標的配列を抽出、単離および検出することが可能なことが初めて示されている。
表１６  ヒトの唾液中の異なるマイクロＲＮＡ標的配列の検出
【表１９】
2010500867.tif 000021
表１６Ｂ  胸水および胸部分泌物中の異なるマイクロＲＮＡ標的配列の検出
【表２０】
2010500867.tif 000022
【０１７６】
実施例１２
標的核酸の検出のためのｅｃｌｉｐｓｅプローブの使用
ＭＧＢ ｅｃｌｉｐｓｅプローブは、マイナーバインダー部分を含んでおり、これによって短いプローブを非常に高い特異性で用いることが可能になる。これらは５’末端にマイナーグルーブバインダーおよびフルオロフォア（またはクエンチャー）を有し、３’末端にクエンチャー（またはフルオロフォア）を有する短い直鎖状プローブであり、実施例３で用いたＭＧＢ分子（ＴａｑＭａｎ ＭＧＢプローブ）とは反対の方向性を有する。マイナーグルーブバインダーにより、Ｔａｑポリメラーゼがプローブを切断するエキソヌクレアーゼ活性を阻害することができる。
【０１７７】
先のＭＧＢプローブを用いたのと同様の条件での定量的リアルタイムＰＣＲ反応においてｅｃｌｉｐｓｅＭＧＢ分子を用いた。ＰＣＲ用オリゴｄＴプライマーおよびプローブの配列を以下に示す。
プローブＬｅｔ７Ａ２１：ＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＴＡＴＡＣ（配列番号：２０８６０）
プローブＬｅｔ７Ｃ２１：ＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＣＡＴＡＣ（配列番号：２０８６１）
ｅｃｌｉｐｓｅ反応に用いたＲＴプライマー配列：
ＲＴ１０：ＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ（配列番号：２０８６２）
【０１７８】
アダプター配列と１つのミスマッチを有するＬｅｔ−７ａまたはＬｅｔ−７ｃに特異的なｅｃｌｉｐｓｅ ＭＧＢプローブを用いることにより、それらに対応するＣTの差異に示されるように、リアルタイムＰＣＲによってＬｅｔ−７ａとＬｅｔ−７ｃとを区別することが可能になった（表１７）。
表１７  ｅｃｌｉｐｓｅ ＭＧＢプローブによるＬｅｔ−７ファミリーメンバーの検出
【表２１】
2010500867.tif 000023
【０１７９】
実施例１３
ｍｉＲＮＡの予測
ｍｉＲＮＡを予測するため、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第６０／５２２，４５９、第１０／７０９，５７７号および第１０／７０９，５７２号に記載される方法と同様の計算論的アプローチを用いて、全ヒトゲノムに渡って潜在的なｍｉＲＮＡコーディング遺伝子を調査した。つまり、全ヒトゲノムの非タンパク質コーディング領域を、ヘアピン構造に基づいて調査した。予測上のヘアピンおよび潜在的なｍｉＲＮＡについて、熱力学的安定性、構造上の特徴および前後関係の特徴に基づいてスコアリングした。アルゴリズムは、既に有効性が実証されているサンガーデータベースにあるｍｉＲＮＡを用いてキャリブレーションした。その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１には、コンピューターによるスクリーニングで予測された各ヘアピン（「ＨＩＤ」）が記載されている。また、米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１には、各ヘアピンのゲノム上の位置（「ヘアピン位置」）が列挙されている。ゲノム上の位置のフォーマットは、＜ｃｈｒ＿ｉｄ＞＜ｓｔｒａｎｄ＞＜ｓｔａｒｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ＞という連結である。例えば、１９＋１３５４６００００は、１９番染色体の＋鎖、開始位置１３５４６００００を指す。２３〜２５番染色体は、それぞれ、Ｘ染色体、Ｙ染色体およびミトコンドリアＤＮＡを指す。染色体上の位置は、ＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ３５ バージョン１（３５．１）に基づいてＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍで作製された、ＵＣＳＣ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）によるヒトゲノムのｈｇ１７アセンブリーに基づいている。
【０１８０】
米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１には、そのヘアピンが、進化を通じて保存されているかどうか（「Ｃ」）も記載されている。ヘアピンは、ｐｈａｓｔＣｏｎｓデータを用いて、保存（「Ｙ」）または非保存（「Ｎ」）として同定した。ｐｈａｓｔＣｏｎｓデータは、チンパンジー、マウス、ラット、イヌ、ニワトリ、カエルおよびゼブラフィッシュのゲノムに対するヒトゲノム中での各ヌクレオチドの進化上の保存の尺度であり、ＢｌａｓｔＺによる各々の種におけるベスト・イン・ゲノム・ペアワイズ・アライメント（ｂｅｓｔ−ｉｎ−ｇｅｎｏｍｅ ｐａｉｒ ｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を用いたｐｈｙｌｏ−ＨＭＭおよび、これに続く８種類のゲノムのｍｕｌｔｉＺアライメントに基づいている（Ｓｉｅｐｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ １１，４１３−４２８，２００４ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３，１０３−１０７，２００３）。ヘアピンステム中のいずれかの１５ヌクレオチド配列において、７種類の種に対する平均ｐｈａｓｔＣｏｎｓ保存スコアが、少なくとも０．９であれば、そのヘアピンは保存されているものとして記載される（Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｈａｄｏｗｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｇｅｎｅｓ．Ｃｅｌｌ １２０，２１−２４，２００５）。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１には、各ヘアピンについてのゲノムタイプ（「Ｔ」）も、遺伝子間（「Ｇ」）、イントロン（「Ｉ」）またはエクソン（「Ｅ」）として記載されている。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１には、予測されたそれぞれのｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*の配列番号（「ＭＩＤ」）も記載されている。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１には、各ヘアピンの予測スコアグレード（「Ｐ」）が、Ｈｏｆａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ ｆ．Ｃｈｅｍｉｅ １２５：１６７−１８８，１９９４．）に記載されるように、０〜１のスコア（１：ヘアピンの信頼性が最も高い）で記載されている。グレードがゼロまたはない場合、そのグレードは、ｐ値が＜０．０５である、より低い値のＰａｌＧｒａｄｅに変換される。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１には、各Ｐスコアの値についてバックグラウンドのヘアピンを差し引いて計算したｐ値（「Ｐｖａｌ」）も記載されている。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１に示すように、Ｐｖａｌが＞０．０５となる場合はほとんど認められない。これらの各ケースにおいて、ヘアピンは高度に保存されているかまたは確認されている（Ｆ＝Ｙ）。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１には、ｍｉＲＮＡが発現解析により確認されたかどうか（「Ｅ」）も記載されている：この欄は、故意に開けたままにした。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１には、ｍｉＲＮＡが配列決定により確認されたかどうか（「Ｓ」）（Ｙ＝はい、Ｎ＝いいえ）も記載されている。予想されるｍｉＲＮＡと配列決定したｍｉＲＮＡとの間に配列の差異が認められる場合、配列決定した配列を予想配列とする。ｍｉＲＮＡを配列決定できないまたはｍｉＲＮＡの発現を検出できないことは、必ずしもｍｉＲＮＡが存在しないことを意味しているのではないことに留意すべきである。このような非検出ｍｉＲＮＡは、試験対象ではなかった組織中で発現している可能性がある。これに加え、このよう非検出ｍｉＲＮＡは、試験対象組織中でも、試験細胞とは異なる段階または異なる条件下で発現している可能性がある。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１には、少なくとも１種類の疾患において、ｍｉＲＮＡが差次的発現を示したかどうか（「Ｄ」）（Ｙ＝はい、Ｎ＝いいえ）も記載されており、このことは、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表２に詳細に示されている。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１には、ヒトもしくはマウスで検出されたかまたはヒトで予測されたようにＳａｎｇｅｒ ＤＢ Ｒｅｌｅａｓｅ ８（２００５年２月）（ｈｔｔｐ：／／ｎａｒ．ｏｕｐｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／）にｍｉＲＮＡが存在していたかどうか（「Ｆ」）（Ｙ＝はい、Ｎ＝いいえ）も記載されている。上記で議論したように、サンガーデータベースに記載されるｍｉＲＮＡは、予測アルゴリズムの要素およびアウトプット用のコントロールである。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１には、お互いが５０００ヌクレオチド以内に存在するヘアピンの遺伝子位置クラスター（「ＬＣ」）も記載されている。同一のＬＣを有する各ｍｉＲＮＡは、同一の遺伝子クラスターを共通して有している。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１には、正確にマッチする２〜７個のシードによりｍｉＲＮＡをグループ分けするシードクラスター（ｓｅｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒ）（「ＳＣ」）も記載されている。同一のＳＣを有する各ｍｉＲＮＡは、同一のシードを有する。５〜６ヌクレオチドのシード長であってもｍｉＲＮＡ活性に十分であるという議論については、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２０；１５−２０（２００５）を参照されたい。
【０１８１】
実施例１４
標的遺伝子の予測
次に、実施例１３のコンピューターによるスクリーニングで予測されたｍｉＲＮＡを用い、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第６０／５２２，４５９、第１０／７０９，５７７号および第１０／７０９，５７２号に記載される方法と類似する２種類の計算論的アプローチをｍｉＲＮＡの予測に用いて、標的遺伝子とその結合部位を予測した。
【０１８２】
その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表４には、コンピューターによるスクリーニングで予測された各ｍｉＲＮＡ（「ＭＩＤ」）およびそのヘアピン（ＨＩＤ）の標的遺伝子が記載されている。標的遺伝子の名称は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｌｅａｓｅ １６（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ；Ｐｒｕｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３３（１）：Ｄ５０１−Ｄ５０４，２００５；Ｐｒｕｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１６（１）：４４−４７，２０００；およびＴａｔｕｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１５（７−８）：５３６−４３，１９９９）に基づく。標的遺伝子は、ＵＴＲ上のシードの下流に「Ａ」を有する７ヌクレオチドのｍｉＲＮＡシード（２〜８番目の位置）に完全に相補的にマッチすることおよび／またはシードの上流のヌクレオチド（全部で８ヌクレオチド）が完全にマッチすることに基づいて同定した。標的遺伝子の同定に関する議論については、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２０：１５−２０，（２００５）を参照されたい。ｍｉＲＮＡによるＵＴＲへの結合に十分なシードの議論については、Ｌｉｍ ａｕ ｅｔ ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ ２００５）およびＢｒｅｎｎｅｃｋ ｅｔ ａｌ，（ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ２００５）を参照されたい。次に、少なくとも３０個のヌクレオチドからなるＵＴＲを含む標的遺伝子のみを含ませることでフィルターを掛けた標的遺伝子のデータセットを用いることで結合部位を予測した。一つの遺伝子について複数の転写産物が存在した場合には、結合部位スクリーニングでは、最長の転写産物のみを考慮にした。合計で１６，６５６種類の転写産物がデータセットに含まれた。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表４には、各ｍｉＲＮＡ（ＭＩＤ）から予測された各標的遺伝子の予測結合部位の配列番号が記載されている。結合部位の配列には、結合部位の５’および３’側の２０個のヌクレオチドが含まれる。結合部位が２つのエクソンを含む場合、この配列は、両末端はスプライシングされたｍＲＮＡ上に位置するが、結合部位の５’および３’側の２０個のヌクレオチドが含まれる。その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表５には、標的遺伝子によるｍｉＲＮＡ（「ＭＩＤ」）／ヘアピン（「ＨＩＤ」）と疾患との関係が示されている。疾患名はＯＭＩＭに基づく。前記ヘアピンが位置している宿主遺伝子を疾患と合理的に関連付けることの議論については、Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｂａｒｔｅｌ，ＲＮＡ，１１：２４１−２４７（２００５）およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１４：１９０２−１９１０（２００４）を参照されたい。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表５には、疾患と関連するｍｉＲＮＡ標的遺伝子の数（「Ｎ」）が示されている。また、米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表５には、疾患と関連する遺伝子の総数（「Ｔ」）も示されており、この総数は、ｍｉＲＮＡに対する結合部位を有すると予測された遺伝子に基づく。米国特許出願第��１／４２９，７２０号の表５には、Ｔに対するＮのパーセンテージ（「Ｐ」）と超幾何学的解析によるｐ値（「Ｐｖａｌ」）も示されている。その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表８には、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表５および米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表９〜１１に記載される疾患の疾患コードが示されている。超幾何学的解析については、Ｓｃｈａｕｍ’ｓ Ｏｕｔｌｉｎｅ ｏｆ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ＩＩ：Ｉｎｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓを参照されたい。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表９には、標的配列（「遺伝子名」）と疾患（「疾患コード」）との関係が示されている。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１０には、ｍｉＲＮＡ（「ＭＩＤ」）／ヘアピン（「ＨＩＤ」）、既知のＳＮＰｓと疾患との関係が示されている。ＳＮＰは、ヘアピンの配列中に同定されたものである。これらヘアピンのｍｉＲＮＡについては、米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表４に記載されるそれらの全ての標的遺伝子をまとめた。これらの遺伝子については、ＯＭＩＭに記載される疾患と関連性を有するかどうかを検討した。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表９に記載される各ｍｉＲＮＡの関連疾患の数字コードは、米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１０に示されている。疾患コードは、米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表８に基づく。標的遺伝子が、米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表９に示す疾患と関連性を有しない場合、ＳＮＰデータは示されない。各ＳＮＰ（「ＳＮＰ＿Ｉｄ」）は、ＮＣＢＩ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｕｉｌｄ ３５．１に基づくＮＣＢＩデータベースｄｂＳＮＰ ＢＵＩＬＤ １２４によって同定している。各ＳＮＰのゲノム上の位置（「ＳＮＰ＿ｌｏｃａｔｉｏｎ」）は、連結式「＜ｃｈｒ＿ｉｄ＞：＜ｓｔａｒｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ＞」により提供される。例えば、「１９：１３５４６０５６９」は、１９番染色体、＋鎖、開始位置１３５４６０５６９を意味する。変異は、ＳＮＰとみなされるが、数多くの変異が数個のヌクレオチドの範囲にわたる（例えば、小規模な挿入、欠失、マイクロサテライト等）。ＳＮＰと疾患との関連性の議論については、Ｓｗｉｂｅｒｔｕｓ（Ｂｌｏｏｄ １９９６）およびＦｒｉｔｔｉｔｔａ（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００１）を参照されたい。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１１には、ｍｉＲＮＡ（「ＭＩＤ」）、ヘアピン（「ＨＩＤ」）、ＳＮＰ同定番号（「ＳＮＰ＿Ｉｄ」）、ＳＮＰの位置（「ＳＮＰ＿ｌｏｃａｔｉｏｎ」）、遺伝子および疾患の関連性が示されている。ＳＮＰの同定と位置決定については、米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表１０の記載に従って定義される。記載されているＳＮＰは、ＯＭＩＭデータベース中の疾患と関連することが判明したｍｉＲＮＡ標的遺伝子中に位置するもののみである。「遺伝子」には、ＳＮＰが位置している遺伝子の名称が示されている。
【０１８３】
実施例１５
ｍｉＲＮＡの差次的発現
１．配列決定
ヘアピン（「ＨＩＤ」）を確認するため、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第６０／５２２，４５９号、第１０／７０９，５７７号および第１０／７０９，５７２号に記載される方法と同様の配列決定法により多数のｍｉＲＮＡを評価した。その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表３には、示されている組織（「組織」）における、ｍｉＲＮＡ（「ＭＩＤ」）の配列決定により確認されたヘアピン（「ＨＩＤ」）が示されている。その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表６には、組織の数字コードが示されている。
【０１８４】
２．差次的発現
実施例１３で予測されたヘアピンおよびｍｉＲＮＡの確認を行うため、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第６０／５２２，４５９号、第１０／７０９，５７７号および第１０／７０９，５７２号に記載される方法と同様のハイスループットマイクロアレイを用いて、種々の組織における発現（対コントロール）の検出を行った。マイクロアレイ画像の解析には、Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（バージョン７．１．１、Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いた。次いで、上記に記載する方法と同様の方法を用いて種々の疾患組織におけるｍｉＲＮＡの差次的発現を解析した。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表２には、示されている疾患について、正常組織との比較における疾患関連発現（「Ｒ」）の比率が示されている。これら疾患の疾患コードが、米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表７に示されている。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表２には、正規化したシグナルの統計解析（「ＲＰｖａｌ」）が示されている。各プローブのシグナルは、その中央値の強度として設定した。シグナルは、バックグラウンドレベル４００から飽和レベル６６，０００の範囲である。２チャンネルのハイブリダイゼーションを行い、Ｃｙ３シグナルをＣｙ５シグナルと比較し、ここで、蛍光を入れ替えてチップを行い（ｆｌｕｏｒ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｃｈｉｐ）（正常対疾患）、プローブシグナルはその平均シグナルに設定した。最初に対数変換（ｌｏｇ２）を行い、その後に二次多項式グラフを適用した。正規化の後、各ｍｉＲＮＡおよび疾患についてｔ検定を行った。ｐ値は、重複実験における同程度またはこれを超えるシグナル比の出現率に基づいて評価した。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表２にはｐ値が＜０．０５のｍｉＲＮＡが示されている。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表２には、各解析に用いた試料の総数（「Ｎ」）が示されている。米国特許出願第１１／４２９，７２０号の表２に示す差次的発現の解析は、多数のｍｉＲＮＡの発現が、疾患組織において有意に変化することを示す。
【０１８５】
実施例１６
バイオチップ
１．プローブプリンティング
表７に記載する配列（配列番号：１〜４１６７）を有する乾燥マイクロＲＮＡ核酸プローブを３×塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウムバッファー（ＳＳＣ）＋０．００１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）または２×ＳＳＣ＋０．００３５％ＳＤＳ中に核酸の最終濃度が２０μＭまたは１０μＭになるように溶解した。次いで、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（登録商標） ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ ＭｉｃｒｏＧｒｉｄ ＩＩ をＭｉｃｒｏＧｒｉｄの製造元の指示に従って用いてＳｃｈｏｔｔ Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ（登録商標） Ｓｌｉｄｅ Ｅコートされたマイクロアレイスライド上にプローブをスポット（すなわち、プリント）した。プローブをスポットした後、マイクロアレイスライドの製造元の指示に従って、バイオチップに処理を施した。つまり、湿潤箱中で、４２℃で０．５×ＳＳＣを用いてバイオチップを再水和し、直ちに１３０℃のヒートブロック上で３秒間乾燥させ、ブロッキングバッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９、５０ｍＭ エタノールアミン、０．１％ ＳＤＳ）中に浸し、頻繁に混合しながら５０℃で２０分間インキュベートした。次いで、バイオチップを、ヌクレアーゼフリーの水で１分間、２回リンスした。最後にバイオチップを遠心分離によって乾燥させた。
【０１８６】
２．生体試料の調製
新鮮な組織、株化細胞、ホルマリン固定パラフィン包埋ＲＮＡ、および（サイズに応じてＲＮＡを分離するカラム／ゲルを用いた後）低分子ＲＮＡ分子が濃縮された分画化ＲＮＡ由来の全ＲＮＡを、バイオチップにハイブリダイズしたＲＮＡの検出を可能にする蛍光色素で標識した。ＲＮＡは、１分子当たり１種類のフルオロフォアで標識し、異なる低分子ＲＮＡ分子間で標識は均一なものであった。フルオロフォアは、試料中のマイクロＲＮＡの３’末端にＲＮＡリガーゼによって酵素的に結合させた。次いで、以下の試薬を混合した：最大で３．５μＬのＲＮＡ、スパイク １μＬ、１０×ライゲーションバッファー（ＮＥＢ社）１μＬまたはＲＮＡリガーゼバッファー（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）ｐ−ＣＵ−Ｃｙ３／Ｃｙ５* １μＬ、ＤＭＳＯ １．５μＬ、ＲＮＡｓｉｎｅ １μＬ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）１μＬまたはＲＮＡリガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）、最終容量（１０μＬ）までＤＤＷで希釈。*５’ホスフェート−ｒＣｒＵ−３−Ｃｙ３；５’ホスフェート−ｒＣｒ−Ｕ−３−Ｃｙ５（ｒ＝リボ核酸ヌクレオチド）。前記の混合物を、ヒートブロック上で、４０℃で１時間、次いで３７℃で１時間インキュベートするか、または０℃で２〜１６時間、あるいは１６℃で２〜１６時間（少量のＲＮＡの場合）インキュベートした。
【０１８７】
３．バイオチップのハイブリダイゼーション
標識ＲＮＡを以下のようにしてバイオチップにハイブリダイズさせた。Ａｍｂｉｏｎ社（登録商標）の３×ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションバッファーを、少なくとも５分間、７０℃に予備加熱した。プリントしたバイオチップ上に清浄なカバースリップを置いた。ハイブリダイゼーションバッファーを標識ＲＮＡ（ＲＮＡ−Ｃｙ３標識およびＲＮＡ−Ｃｙ５標識）と混合して１×バッファーの最終濃度にし、次いで、この混合物（３０μｌ）をバイオチップ上に注いでプローブを覆った。もしくは、１×バッファーの最終濃度にあるバッファーおよび前記混合物（１１０μｌ）をＡｇｉｌｅｎｔチャンバーベースが付いたＡｇｉｌｅｎｔガスケットスライド上に注いだ。バイオチップを３分間、９５℃に加熱し、次いで、室温で最大速度にて１分間遠心分離することにより室温まで冷却した。最後に、ウォーターバスまたはＡｇｉｌｅｎｔオーブンにおいて、バイオチップを４２℃で１２〜１６時間または４８時間（低量のＲＮＡの場合）標識ＲＮＡ混合物とハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後、バイオチップをバッファーＡ（１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）で室温にて約３０秒間洗浄し、バッファーＢ（０．１×ＳＳＣ）で室温にて３０秒間で２回洗浄し、次いで、遠心分離により乾燥させた。
【０１８８】
４．バイオチップのスキャニングおよび解析
１００％の出力または１００％の後に１０％の出力で１０μｍまたは５μｍの解像度が可能なＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｂｕｎｄｌｅ Ｇ２５６５ＢＡを用いてバイオチップをスキャンした。データは、ＳｐｏｔＲｅａｄｅｒソフトウェアまたはＦｅａｔｕｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを用いて解析した。
【０１８９】
実施例１７
ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアへのＤＮＡプローブのハイスループットカップリング
５．Ｌｕｍｉｎｅｘカップルビーズの調製
カルボキシル化Ｌｕｍｉｎｅｘマイクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＭａｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；カタログ番号 Ｌ１００−Ｃ（１０１−２００）−０１）またはビーズを、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−ＨＣｌ；Ｐｉｅｒｃｅ社、製品番号７７１４９）を用いてアミノ修飾したＤＮＡプローブにカップリングする。ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡプローブセット（Ａｍｂｉｏｎ社；カタログ番号１５６４）由来の、標的ｍｉＲＮＡの逆相補体であるＤＮＡプローブを用いる。プローブは、４２〜４６ヌクレオチド（ｎｔ）長であり、そのうち１８〜２４ｎｔが特異的なｍｉＲＮＡを標的にする。
【０１９０】
カップリング反応は、１．５ｍｌチューブ内で行い、界面活性剤に対して耐性を有する９６ウェルフィルタープレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社；カタログ番号ＭＳＲＬＮ０４１０）を用いて洗浄した。各ＤＮＡプローブの、独自の分光的特徴を有する特定の種類のビーズとのカップリング様式を特定する「結合表」を準備する。カップルビーズ混合物に含まれる各プローブは、したがって、その分光的特徴によって一意的に同定することができる。プローブは、最終濃度０．１ｍＭになるようＤＤＷに再懸濁する。
【０１９１】
ボルテックス撹拌および２０秒間の超音波処理によってビーズを再懸濁する。各反応には２００μｌ（２．５ｘ１０6個のビーズ）を用いる。最大速度で２分間ビーズを遠心分離する。上清を取り除き、ビーズを２５μｌのＭＥＳバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ４．５）に再懸濁し、再度ボルテックス撹拌および超音波処理を行う。
【０１９２】
ビーズに１μｌのプローブ溶液を添加し、この懸濁液をボルテックス撹拌によって混和する。各反応混合物に、新たに懸濁したＥＤＣ（ＤＤＷ中に１０ｍｇ／ｍｌ、事前に室温に温める）を１．５μｌ添加し、この混合物をボルテックス撹拌する。次に、この反応系を、暗室にて室温にて３０分間インキュベートする。再度、１．５μｌの新しいＥＤＣを添加してボルテックス撹拌し、その後、さらに３０分間インキュベーションを行う。１００μｌの水でＳｏｌｖｉｎｅｒｔフィルタープレートを事前に湿らせる。次に、カップリング反応物をチューブからフィルタープレートに移してバキューム吸引する。１５０μｌの０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０をカップリング反応物に添加して、２回バキューム吸引する。次に、１５０μｌの０．１％ＳＤＳを用いて２回連続した洗浄を行う。カップルビーズを５０μｌのＴＥに再懸濁して十分混合する。最後に、カップルビーズ混合物を１．５ｍｌチューブに移し、４℃で保存する。
【０１９３】
カップルビーズ混合物を等量で混合して、１００種類のプローブのそれぞれが独自の分光的特徴を有する異なる種類のビーズ（すなわち、１００種類のビーズ）と結合した１００種類からなるセットを調製する。Ｌｕｍｉｎｅｘを用いて、カップルビーズ混合物セットについてそれぞれのカップルビーズの割合を観察する。１．５×ＴＭＡＣハイブリダイゼーションバッファーを用いて、各カップルビーズについて、１反応系（３３μｌ）当たり１５００個のビーズの最終濃度となるように混合物を希釈する。
【０１９４】
６．ＲＮＡ抽出および品質管理
パラフィン包埋組織もしくは凍結組織または体液（例えば、血液、尿、痰等）からＲＮＡを単離する。抽出工程を最適化して、短鎖ＲＮＡも確実に回収できるようにする。最終段階では、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅフリーの滅菌蒸留脱イオン水（ＤＤＷ）で希釈する。
【０１９５】
ＲＮＡの品質については、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＮＤ−１０００）でＲＮＡ濃度を測定することで評価する。残留塩および有機溶媒、ならびに残留タンパク質は、それぞれ２６０／２３０ｎｍおよび２６０／２８０ｎｍの波長比を測定することで評価する。さらなる品質評価および分解は、アガロース（１．２％）ゲルおよび尿素変性アクリルアミド（１３％）ゲルを用いて行う。
【０１９６】
７．低分子ＲＮＡ画分の濃縮
５μｇのＲＮＡを５０〜１５０μｌのＤＤＷに希釈する。ＲＮＡをＹＭ１００カラム上にアプライする。カラムを１４，０００×Ｇにて４℃で２５分間遠心分離する（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ１００フィルター装置；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社；Ａｍｉｃｏｎ；カタログ番号４２４１３）。次に、流出液を、８μｌの（５０ｍｇ／ｍｌ）グリコーゲン、１０％容量の３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）および３〜４倍量の１００％冷却ＥｔＯＨを用いて、８０℃で１時間、沈殿させる。次に、チューブを最大速度にて４℃で４０分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを８５％冷却ＥｔＯＨで洗浄する。ペレットを乾燥させ、ＤＤＷに再懸濁する。５〜１０％の回収率が期待される。
【０１９７】
８．ＵＬＳ技術を用いたｍｉＲＮＡの化学標識
５μｇの全ＲＮＡから単離した濃縮低分子ＲＮＡを、ＭｉｃｒｏＭａｘ標識検出キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社；カタログ番号ＭＰ５５４５）を用いてビオチン標識する。「ネイキッド（ｎａｋｅｄ）」スパイク（非ヒト配列を有するコントロールＲＮＡ分子、２２ｎｔ長）を、標識工程のコントロールとして添加する（１反応系当たり５〜２０ｆｍｏｌ）。０．５μｌのＡＳＡＰビオチン試薬および２．５μｌのＡＳＡＰ標識バッファーを添加する。最終容量が１０μｌになるようＤＤＷを添加する。
【０１９８】
反応系を十分に混合し、温度制御装置（ＰＣＲ装置）内で、８５℃で３０分間インキュベートし、その後４℃で５分間冷却する。ＫＲＥＡｐｕｒｅ 反応洗浄カラムを事前に２０分間、室温に温める。事前に、カラムを、２ｍｌのマイクロチューブ内で、最大速度で１分間遠心分離し、新しい１．５ｍｌチューブに移す。次にカラムの上部に標識反応物を添加し、最大速度で再度１分間遠心分離する。流出液を回収し、ハイブリダイゼーションに用いるか、または−２０℃で保存する。
【０１９９】
９．ＲＮＡハイブリダイゼーション
各ハイブリダイゼーション反応系には、以下が含まれる：ＭｉｃｒｏＭａｘ−標識ｍｉＲＮＡｓ；ハイブリダイゼーションコントロールとして１〜５ｆｍｏｌの事前にビオチン標識されたスパイク（非ヒト配列を有するコントロールＲＮＡ分子、２２ｎｔ長、５’側にビオチンを含む）；および、ｍｉＲＮＡプローブ核酸にカップルしたＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアの混合物（すなわち、カップルビーズの混合物）。
【０２００】
まず、ＲＮＡをＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー ｐＨ８．０；Ｓｉｇｍａ社、Ｔ−９２８５）で、最終容量が１７μｌになるよう希釈する。次に、ボルテックス撹拌および２０秒間の超音波処理によってカップルビーズの混合物を再懸濁する。１反応系当たり１５００個のカップルビーズを用いたＲＮＡに３３μｌの混合物を添加する。バッファーとカップルビーズのみを含む（すなわち、ＲＮＡを含まない）チューブをバックグラウンドとして用いる。反応系を混合し、８５℃で５分間変性し、次いで５０℃で一晩ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション温度を５５℃まで上昇させて特異性を高めることもできるが、全体のシグナルを低下させる恐れがある。
【０２０１】
１０．Ｌｕｍｉｎｅｘによる測定
ハイブリダイゼーション反応物を、マルチスクリーン９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社；カタログ番号ＭＡＢＶＮ１２１０）に移す。バキューム吸引を行い、各ウェルに×１ ＴＭＡＣハイブリダイゼーションバッファーに希釈した２０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリン（ＰｈｙｃｏＬｉｎｋ社；Ｐｒｏｚｙｍｅ；カタログ番号ＰＪ３１５）を７５μｌ添加する。懸濁液を完全に混和して９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏｗｅｌｌ９６ウェルプレート、ポリカーボネート製；Ｃｏｓｔａｒ社、６５１１）に移す。
【０２０２】
５０℃に１０分間予熱したＬｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰリーダーにプレートを設置し、この装置で解析を行う。二重レーザーによりビーズが識別され結合している物質の量が検出される。Ｌｕｍｉｎｅｘの仕様を以下のように設定する：試料容量：５０μｌ；試料タイムアウト：１００秒；二重判別ゲート：７，５００〜２０，０００。
【０２０３】
実施例１８
ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアへのＬＮＡプローブのハイスループットカップリング
ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡプローブセットを用いる代わりにＥｘｉｑｏｎ ＬＮＡ ｍｉＲＮＡプローブセットを用いる以外は、前述の実施例１７の１〜６項と同様に行う。ＬＮＡプローブを用いる場合、カップルビーズ混合物へのハイブリダイゼーションは、６５℃〜７５℃の温度で行われる。
【０２０４】
実施例１９
ＤＮＡカップルビーズプローブの感度
検出感度を評価するため、前述の実施例１７（４項）に記載のように行うｍｉＲＮＡビオチン標識反応の反応系に、濃度を上昇させた各種「ネイキッド」スパイク（非ヒト配列を有するコントロールＲＮＡ分子、２２ｎｔ長）を添加した。
【０２０５】
実施例２０
感度
濃度を上昇させた各種スパイクをｍｉＲＮＡ標識反応系に添加した。この実験ではＡｍｂｉｏｎ社のプローブセットを用いた。このシステムは、０．０６ ｆｍｏｌのｍｉＲＮＡまでを感知し、２オーダーの範囲で直線性を示した。結果は、対数スケールで表す。図６参照。
【０２０６】
種々の濃度のビオチン標識スパイクをｍｉＲＮＡハイブリダイゼーション反応系に添加した。本実験では、Ｅｘｉｑｏｎ ＬＮＡプローブを用いた。このシステムは、０．１ ｆｍｏｌのｍｉＲＮＡまでを感知し、試験した全範囲（１０ｆｍｏｌを上限）において直線性を示した。結果は、対数スケールで表す。図７参照。
【０２０７】
実施例２１
特異性
Ｌｅｔ−７ａ合成ｍｉＲＮＡを標識し、種々のＬｅｔ−７ファミリーメンバーとカップリングしたビーズの混合物とハイブリダイズさせた。この系の特異性は、配列間の類似性、ミスマッチ数、配列中のミスマッチの位置およびミスマッチの特性（すなわち、どのヌクレオチドが変化したのか）に比例相関していた。図８参照。
【０２０８】
ハイブリダイゼーション温度を上昇させながら同様の実験を行った。図９に示されるように、ハイブリダイゼーション温度を上昇させることで非特異的なｌｅｔ−７ｃ結合が著しく減少したが、特異的シグナルは僅かな影響しか受けなかった。
【０２０９】
実施例２２
再現性
実施例１７〜１９の記載と同様にヒト胎盤を標識してハイブリダイズさせた。図１０は２つの個別の実験の再現性を示す。
【０２１０】
実施例２３
組織特異的ｍｉＲＮＡの同定
新鮮な脳および胎盤組織由来のＲＮＡを標識してカップル混合物にハイブリダイズさせた。１００種類のｍｉＲＮＡセットの発現プロファイルを図１１および図１２に示す。前述したように、脳または胎盤に特異的なｍｉＲＮＡが検出され、これらは図に示されている。結果は、対数スケールで表す。
【０２１１】
図１１は、ＬＮＡ修飾プローブへの結合を表す。
【０２１２】
図１２は、Ａｍｂｉｏｎプローブセット由来の非修飾ＤＮＡプローブへの結合を表す。
【０２１３】
実施例２４
癌組織でのｍｉＲＮＡ発現のプロファイリング
正常または腫瘍のホルマリン固定パラフィン包埋された肺組織および膀胱組織からＲＮＡを抽出した。ｍｉＲＮＡの発現プロファイリングは先の記載と同様に行った。差次的に発現するｍｉＲＮＡは図１３ａ、ｂにマークされている。結果は、対数スケールで表す。
【０２１４】
実施例２５
その他の標識方法の詳細なプロトコル
１．直接標識法
ａ．Ｋｒｅａｔｅｃｈ化学標識
この標識法は、Ｋｒｅａｔｅｃｈ社製のＵＬＳ低分子ＲＮＡ標識キットにより行うことができる。
この標識プロセスは、前述のプロセス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製品の場合）と類似する。
５０ｎｇの低分子ＲＮＡに対して１μｌの試薬である最適比率は維持されるべきである。好ましくは、１０μｌの反応容量に対して少なくとも１２．５μｇの低分子ＲＮＡを用いるべきである。１μｌの×１０バッファーを添加する。
【０２１５】
ｂ．ｐ−ＣＵ−Ｂｉｏライゲーション
ビオチン系物質を用いたジヌクレオチドの酵素的末端標識。異なるライゲーション系を用いてもよい。
【表２２】
2010500867.tif 000024
３０℃で２時間インキュベーションを行い、続いて、８０℃で３分間失活させ、一晩沈殿させる：容量を１５０μｌに増加させ、グリコーゲン ８μｌ、ＮａＯＡｃ １５μｌ、１００％ＥｔＯＨ ５５０μｌを添加する。
５μｌのＤＤＷに再懸濁する。Ｌｕｍｉｎｅｘの前にＴＥ １２μｌを添加する（最終容量：１７μｌ）。
【０２１６】
実施例２６
シグナル増幅法
１．ＴＳＡ（チラミドシグナル増幅法）のプロトコル
開始前に：
１．ビオチン化チラミドを０．３ｍｌのＤＭＳＯに再懸濁する−ストック溶液（４℃で６ヶ月間安定）。
２．×１増幅バッファーを用いてストック溶液を１：５０に希釈する（ワーキング溶液）。
３．ＴＮＴ洗浄バッファー：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、を調製する。
４．ＴＮＢブロッキングバッファー：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ブロッキング試薬、を調製する。
完全に溶解させるため撹拌して加熱する（６０℃を超えないようにする）。
溶液をろ過、分注して４℃で保存する。
【０２１７】
工程：
１．前述のようにマイクロスフェアへのカップリング、ｍｉＲＮＡ化学標識およびハイブリダイゼーションを行う
２．試料を遠心分離してハイブリダイゼーション反応物を洗浄
３．１００μｌのＴＮＢブロッキングバッファーに再懸濁
４．室温で３０分間インキュベート
５．遠心分離
６．ＴＮＢで１：１００に希釈した１００μｌのＳＡ−ＨＲＰに再懸濁
７．室温で３０分間インキュベート
８．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタープレート上へロード
９．ＴＮＴバッファーで３回洗浄（バキューム吸引および懸濁を３回）。
１０．１００μｌのビオチン化チラミドワーキング溶液（×１増幅バッファーを用いてストック溶液を１：５０に希釈−ワーキング溶液）を添加
１１．ピぺッティングにより混合
１２．室温で１０分間インキュベート
１３．ＴＮＴで３回洗浄（１０と同様）
１４．２０μｇ／ｍｌのＳＡＰＥ ７５μｌをＴＭＡＣに添加
１５．５０℃で１０分間インキュベート
１６．Ｌｕｍｉｎｅｘで測定
図１４は、ＴＳＡ反応によりビオチン標識スパイクが増幅される様子を示す。
【０２１８】
２．Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅによるシグナル増幅
ＬｕｍｉｎｅｘプラットホームへのＧｅｎｉｓｐｈｅｒｅシグナル増幅キットの使用プロトコル。（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ社から提供されるプロトコル）
１．全ＲＮＡをＹＭ−１００カラム上に注ぎｍｉＲＮＡ画分を濃縮する。
ａ．マイクロＲＮＡへのポリ（Ａ）末端の付加：
２．
ａ．ｍｉＲＮＡの濃縮画分にネイキッドスパイクを添加する。
ｂ．濃縮マイクロＲＮＡおよびスパイクの容量をヌクレアーゼフリー水（バイアル１０）で１５．５μｌに調整する。アレイの品質にもよるが、品質データを得るには５０ｎｇ〜５００ｎｇの濃縮マイクロＲＮＡが必要となる。
ｃ．以下の式に従って、ＡＴＰ（バイアル４）を１ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で希釈する：
【数１】
2010500867.tif 000025
３．マイクロＲＮＡ １５．５μｌに以下の成分を添加して容量を２５μｌにする：
ａ．５μｌの５×ｍｉＲＮＡ反応バッファー（バイアル２）
ｂ．２．５μｌのＭｎＣｌ２（バイアル３）
ｃ．１μｌの希釈ＡＴＰ（工程２で希釈したバイアル４）
ｄ．１μｌのＰＡＰ酵素（バイアル５）
４．緩やかに混和して遠心分離する。
５．３７℃のヒートブロックで１５分間インキュベート。
【０２１９】
ｂ．末端付加マイクロＲＮＡへの「ｃｐｌＣａｐ０３」捕捉配列のライゲーション
６．２５μｌの末端付加マイクロＲＮＡを短時間遠心分離する。
７．室温で以下の成分を加えて容量を３６μｌにする：
ａ．６μｌの６×「ｃｐｌＣａｐ０３」ライゲーションミックス（バイアル９）
ｂ．２μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（バイアル８）
ｃ．３μｌのヌクレアーゼフリー水（バイアル１０）
８．緩やかに混和して遠心分離する。
９．室温（２０〜２８℃）で３０分間インキュベート。
１０．４μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８を添加して反応を停止させる。短時間ボルテックス撹拌して遠心分離する。
１１．６０μｌの１×ＴＥバッファーを添加して最終容量を１００μｌにする。短時間ボルテックス撹拌して遠心分離する。これがタグ化マイクロＲＮＡである。
【０２２０】
ｃ．タグ化マイクロＲＮＡの精製
１２．以下のように、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ番号２８００６）を用いて、１００μｌのタグ化マイクロＲＮＡを精製する。
ａ．５００μｌのバッファーＰＢを１００μｌの試料に添加してボルテックス撹拌する。短時間、遠心分離する。
ｂ．混合物をＭｉｎＥｌｕｔｅカラムにアプライし、通常の卓上マイクロ遠心器にて１０〜１４，０００×ｇ（約１３，０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離を行う。
ｃ．流出液を捨てる。ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムを同一の回収用チューブにセットする。
ｄ．ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに７５０μｌのバッファーＰＥを加え、１分間遠心分離する。
ｅ．流出液を捨てる。ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムを同一の回収用チューブにセットする。
ｆ．２分間遠心して残留ＰＥバッファーを除去する。
ｇ．ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムを、清浄な、ラベルを付した１．５ｍＬマイクロ遠心チューブにセットする。
ｈ．１０μｌのバッファーＥＢをカラムメンブランの中央部分に加える。室温で２分間インキュベーションを行う。２分間遠心分離する。カラムを捨てて１０μｌの流出液を保存する。これがタグ化マイクロＲＮＡである。
【０２２１】
ｄ．Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ結合、およびタグ化ＬＭＷ ＲＮＡを用いた検出アッセイ
１．適切なＬｕｍｉｎｅｘカップルビーズセット（ミックス）を選択する。
２．カップルビーズを１０〜２０秒間ボルテックス撹拌する。
３．ホルムアミド含有または不含の１．５×ＴＭＡＣ（４．５Ｍ ＴＭＡＣ）で、１回の反応当たり１５００個のＬｕｍｉｎｅｘビーズ（ビーズ１種類当たり）を含むようにＬｕｍｉｎｅｘカップルビーズのストックを希釈することによりワーキングＬｕｍｉｎｅｘビーズ混合物を調製する。（留意事項：各反応には、合計で３３μｌのワーキングＬｕｍｉｎｅｘビーズ混合物が必要。）１０〜３０％のホルムアミドをＴＭＡＣ溶液に添加して、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高めることもできる。ＴＭＡＣバッファー中でビーズをボルテックス撹拌する。
４．３３μｌのＬｕｍｉｎｅｘビーズ混合物（上記の工程３で調製）をヌクレアーゼフリーのキャップ付き０．２ｍＬストリップＰＣＲチューブ（ＩＳＣ Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ社、カタログ番号Ｔ−３０３４−１）に添加する。
５．各チューブに、適切なバイオスパイク（ｂｉｏ−ｓｐｉｋｅ）を含む１×ＴＥ ｐＨ８．０で希釈したタグ化ＬＭＷ ＲＮＡ（上記プロトコルで調製）を１７μｌ添加する。２０〜１５０ｎｇ当量（タグ化プロセス前に測定）のＬＭＷ ＲＮＡを添加する。３００ｒｐｍで振とうしながら５０℃（プローブがＬＮＡの場合は６５℃）で１６時間インキュベートする。
６．各チューブから全反応物を、（１×ＰＢＳで）事前に湿らせたＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＢＶフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、カタログ番号ＭＡＢＶＮ１２１０）に移す。
７．バキューム装置を用いて、１×ＴＭＡＣ（５０℃に予熱）でビーズ（フィルタープレート中で）を１回洗浄する。
８．Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅの結合バッファーＩで１．０ｎｇ／μＬに希釈したビオチン標識Ｃａｐ０３デンドリマーを５０μＬ添加する。３００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で２時間インキュベートする。
９．ビーズを５０℃に予熱した１×ＴＭＡＣで１回洗浄する。
１０．１×ＰＢＳで２０ｎｇ／μＬに希釈したＳＡ−ＰＥ（ＰｒｏＺｙｍｅ社）を５０μＬ添加する。３００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で３０分間インキュベーションを行う。
１１．ビーズを１×ＰＢＳで１回洗浄する。
１２．７５μＬの１×ＰＢＳを各ウェルに添加し、ウェルの内容物を別のマイクロタイタープレートに移す。
１３．低ＲＰ１キャリブレーションで調製したＬｕｍｉｎｅｘ １００で解析を行う。
【０２２２】
任意事項：
抗ＰＥビオチン（デンドリマー）試薬
ｍｉＲＮＡのＬｕｍｉｎｅｘアッセイの感度をさらに向上させるため、上記デンドリマー試薬を用いたところ、我々の手法では、多重ビーズアッセイ（６〜１２重）１回当たりに僅か１〜３ｎｇのＬＭＷ ＲＮＡ（５０〜１５０ｎｇの全ＲＮＡに相当）を用いても成功した。抗ＰＥデンドリマー試薬を用いる追加工程はかなり単純であり、本発明のｍｉＲＮＡ Ｌｕｍｉｎｅｘプロトコルの最後（本プロトコルの工程１１の後）に付け加えられる。
工程１２．所望の各ビーズ反応（マイクロタイターウェル）用に、５．５μＬの抗ＰＥビオチン（デンドリマー）試薬を４９．５μＬの結合バッファーＩに添加することにより抗ＰＥビオチンデンドリマーを結合バッファーＩで希釈する。
フィルターマイクロタイタープレート中の各ビーズ反応系に、希釈した抗ＰＥビオチンデンドリマー５０μＬを添加し、３００ｒｐｍで振とうしながら室温で６０分間インキュベートする。
工程１３．ビーズを１×ＰＢＳで１回洗浄する。
工程１４．５０×ＳＡ−ＰＥを１×ＰＢＳで希釈する。各ウェルに５０μＬの希釈ＳＡ−ＰＥを添加し、プレートを５秒間ボルテックス撹拌する。３００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で３０分間インキュベーションを行う。
工程１５．ビーズを１×ＰＢＳで１回洗浄する。
工程１６．１５０μＬの１×ＰＢＳを各ウェルに加える。ピぺッティングによりビーズを５〜６回混和し、次にウェルの内容物を別のマイクロタイタープレートに移す。
工程１７．Ｌｕｍｉｎｅｘ装置で解析を行う。
【０２２３】
実施例２７
転写方法
１．直接転写
この可能性を用いる場合は、ｍｉＲＮＡのセンスプローブセットがマイクロスフェアにカップリングされていなければならない。
直接転写標識法には、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドアダプターのライゲーションおよびビオチン標識ヌクレオチドを用いた転写が含まれる。
１．以下の反応混合物を調製する：
【表２３】
2010500867.tif 000026
２．３７℃で４０分間インキュベート
３．０.５〜２倍量（１２.５μｌ）のローディングミックス（ＳＢ尿素）を添加して反応を停止し、二相アクリルアミド尿素ゲル（すなわち、上相が６％、下相が１３％）で電気泳動する。
４．２００Ｖ、８０ｍＡで約５５分間泳動する。ＲＮＡマーカーに基づき、遊離のアダプターと低分子ＲＮＡの間のゲル部分を切り出す。
５．ｍｉｄｉ ＧｅＢＡｆｌｅｘ（カットオフ値：３５００）を用いて、１２０Ｖ、４０分間、次いで１２０秒間逆方向に電流を流すことによってＲＮＡを０.８ｍｌのＤＤＷに溶出した。
６．４００μｌのＲＮＡに、８μｌのグリコーゲン（５ｍｇ／ｍｌ）、１／１０倍量のＮａｏＡｃおよび３〜４倍量の冷却１００％エタノールを添加してＲＮＡを沈殿させる。−２０℃で一晩保存する。
７．最大速度で４０分間遠心分離し、８５％エタノールで洗浄する。３μｌに再懸濁する。（２本のチューブを用いる場合、一本目を６５℃で３分間再懸濁して、２本目に移し、最初のチューブを２μｌで洗浄して、一つにまとめる）。
８．アニーリングプライマーを添加する。２０ｐ／μｌのストックから１μｌのプローブ１９５７８１７６ ＲＴ−ＤＴ− Ｔ７ ａｖｒｌｌ−ｓｈｏｒｔ。段階的アニーリングを行う。
【０２２４】
Ｔ７− ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔキットを用いて転写産物を調製する。
１．Ｔ７ １０×反応バッファーおよびリボヌクレオチド溶液を室温で融解させる。Ｔ７酵素ミックスを氷上で保存する。室温で反応系を調製する。
２．反応ミックスを以下のように調製する：
【表２４】
2010500867.tif 000027
３．反応系を３７℃で一晩インキュベートする。
４．短時間遠心分離する。
５．鋳型ＤＮＡを除去：
１μｌのＤＮａｓｅ Ｌを添加して十分に混合し、３７℃で１５分間インキュベートする。
６．酸性フェノール：クロロホルム抽出
１２５μｌのヌクレアーゼフリー水、１５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび１５０μｌの酸性フェノール：クロロホルムを添加する。十分に混合する。最大速度で１０分間遠心分離する。
７．ＲＮＡの沈殿：
新しいチューブ内で最上相を８μｌのグリコーゲン（５ｍｇ／ｍｌ）、３.６倍量のエタノール（５５０μｌ）と混合する。−２０℃で一晩（または−８０℃で２時間）保存する。最大速度で４０分間遠心し、８５％エタノールで洗浄して２５μｌに再懸濁する。
８．濃度：
濃度を測定する。
９．遊離ヌクレオチドの精製：
転写産物をＧ−２５カラムにローディングする。
１０．ハイブリダイゼーションコントロール用にｂｉｏ−ＲＮＡスパイクを添加する：
Ｃ−ｌｉｎ４−ｂｉｏ−ＡＳ−ＲＮＡ ５ｆ
Ｃ−ｍｉｒ２−ｂｉｏ−ＡＳ−ＲＮＡ １ｆ
【０２２５】
Ｌｕｍｉｎｅｘカップルミックスを用いたハイブリダイゼーションには以下を用いる：
１．５μｇの転写産物、または
２．０.５μｇの精製転写産物。
【０２２６】
実施例２８
ＳｅｎｓｅＡｍｐ Ｐｌｕｓ（商標）− Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅを用いたマイクロＲＮＡの増幅
１．手順（全ＲＮＡから始める場合）
ａ．マイクロＲＮＡの濃縮：
Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、カタログ番号４２４１３）および通常の卓上マイクロ遠心機。
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８.０で全ＲＮＡ試料を１００μｌに希釈する。
希釈した全ＲＮＡ１００μｌを試料リザーバーに添加する。ピペットチップがメンブランに触れないように留意する。チューブのキャップをしっかりと締めて１３,０００ｇで６分間遠心する。
流出液（約９５μｌ）を回収する。この流出液が、８０〜１００塩基長未満の平均サイズを有する目的のＬＭＷ ＲＮＡである。
濃縮：
Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、カタログ番号４２４０４）および通常の卓上マイクロ遠心機。
上記の工程３で得たＬＭＷ ＲＮＡ（ＹＭ−１００の約９５μｌの流出液）をＹＭ−３試料リザーバーに添加する。ピペットチップがメンブランに触れないように留意する。チューブのキャップをしっかりと締めて１３,０００ｇで３０分間遠心する。
流出液の容量を確認し、流出液の容量がローディング時の容量（約９５μｌ）より６〜８μｌ少ない容量と等しくなるか、または下部のリザーバーに追加した液体がたまらなくなるまで遠心分離を続ける。例えば、９５μｌをＹＭ−３にローディングした場合、流出液は、８７〜８９μｌとなる。
１０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８.０を試料リザーバーに添加して、側面を軽く叩いて穏やかに混和する。
慎重に試料リザーバーを新しい回収チューブに逆さに入れる。１３,０００ｇで３分間遠心して濃縮されたＬＭＷ ＲＮＡを回収する。以下の章のマイクロＲＮＡのポリ（Ａ）末端付加に進む。
【０２２７】
ｂ．マイクロＲＮＡのポリ（Ａ）末端付加
ヌクレアーゼフリー水（バイアル１０）で容量を１８ｍｌに調整する。
以下の式に従って、ＡＴＰ（バイアル１４）を１ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８.０で希釈する。
【数２】
2010500867.tif 000028
例えば、２０００ｎｇのｍｉＲＮＡから開始する場合、ＡＴＰ希釈率＝２５００００÷２０００ｎｇ＝１２５となる。
１ｍｌのＡＴＰ（バイアル１４）を１２５ｍｌの１ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８.０に添加してＡＴＰを１：１２５に希釈する。
以下の成分を１８ｍｌのマイクロＲＮＡに添加して容量を２５ｍｌにする：
２.５ｍｌの１０×反応バッファー（バイアル６）
２.５ｍｌの２５ｍＭ ＭｎＣｌ２（バイアル１７）
１ｍｌの希釈ＡＴＰ（工程２で調製したバイアル１４の希釈物）
１ｍｌのＰＡＰ酵素（バイアル１６）
穏やかに混和して遠心分離する。
３７℃のヒートブロックで１５分間インキュベートする。
【０２２８】
末端付加したマイクロＲＮＡの逆転写
２５ｍｌの末端付加マイクロＲＮＡを短時間遠心分離して氷上に静置する。
１ｍｌのＳｅｎｓｅＡｍｐ ｄＴプライマー（バイアル１）を９ｍｌの０.１×ＴＥに添加してＳｅｎｓｅＡｍｐ ｄＴプライマーを１：１０に希釈する。ボルテックス撹拌して短時間遠心分離する。
氷上にて、２ｍｌの１：１０希釈したＳｅｎｓｅＡｍｐ ｄＴプライマー（工程２で調製したバイアル１希釈物）を添加する。
穏やかに混和して、遠心分離する。
６５℃で１０分間インキュベーションを行った後、直ちに氷上に移して２分間静置する。
氷上にて以下の成分を加えて容量を５０ｍｌにする：
１０ｍｌの５×ファーストストランドバッファー（または逆転写酵素と共に提供される同等のバッファー）
５ｍｌの０.１Ｍ ＤＴＴ（逆転写酵素と共に提供される場合：提供されていない場合には、ヌクレアーゼフリー水を用いる）
２.５ｍｌのｄＮＴＰミックス（バイアル３）
１ｍｌのＳｕｐｅｒａｓｅ−ｉｎ（商標）ＲＮａｓｅ阻害剤（バイアル４）
２ｍｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素、２００ユニット（または同等の逆転写酵素）２.５ｍｌのヌクレアーゼフリー水（バイアル１０）
穏やかに混和し（ボルテックス撹拌はしない）、４２℃で１時間インキュベートする。
８.７５ｍｌの０.５Ｍ ＮａＯＨ／５０ｍＭ ＥＤＴＡを添加して反応を停止させる。短時間ボルテックス撹拌を行って遠心分離する。
留意事項：反応系は、褐色に変化する場合があるが、これは正常なことである。
６５℃で３０分間インキュベートしてｍｉＲＮＡを分解する。
留意事項：反応系は、褐色から無色に変化する場合があるが、これは正常なことである。
１２.５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８.０で反応系を中和する。これがｃＤＮＡである。短時間ボルテックス撹拌して遠心分離する。２８.７５ｍｌの１×ＴＥバッファーを添加して試料量を１００ｍｌにする。
【０２２９】
ｃ．ｃＤＮＡの精製および濃縮
Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、カタログ番号４２４１３）と通常の卓上マイクロ遠心機を用いて１００μｌのｃＤＮＡを精製する。
１００μｌのｃＤＮＡを試料リザーバーに添加する。ピペットチップがメンブランに触れないように留意する。チューブのキャップをしっかりと締めて１３,０００ｇで６分間遠心する。
メンブランに触れることなく、２００μｌの１×ＴＥバッファーを試料リザーバーに添加する。ピぺッティングを５回行って穏やかに混和する。チューブのキャップをしっかりと締めて１３,０００ｇで６分間遠心する。
慎重に試料リザーバーを回収用チューブから取り外す。流出液を捨てる。ＹＭ−１００カラムを同一の回収用チューブに設置する。
メンブランに触れることなく、２００μｌの１×ＴＥバッファーを試料リザーバーに添加する。ピぺッティングを５回行って穏やかに混和する。チューブのキャップをしっかりと締めて１３,０００ｇで６分間遠心する。
慎重に試料リザーバーを回収用チューブから取り外す。回収用チューブを捨てる。
メンブランに触れることなく、５μｌの１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８.０）を試料リザーバーに添加する。リザーバーの側面を軽く叩いて混和する。
慎重に試料リザーバーを新たな回収用チューブに逆さにセットする。１３,０００ｇで３分間遠心する。
チューブの底に回収されたｃＤＮＡの容量（５〜１０μｌ）を記録する。ヌクレアーゼフリー水（バイアル１０）でｃＤＮＡの容量を１０μｌにする。
【０２３０】
第一鎖ｃＤＮＡの末端付加
精製したｃＤＮＡ（１０ｍｌ）を８０℃に１０分間加熱する。直ちに氷上に１〜２分間静置する。短時間遠心分離を行い、氷上に戻す。
各反応系に、氷上で別のチューブにマスターミックス（１０ｍｌ）を調製する：
２ｍｌの１０×反応バッファー（バイアル６）
２ｍｌのヌクレアーゼフリー水（バイアル１０）
４ｍｌの１０ｍＭ ｄＴＴＰ（バイアル５）
２ｍｌのＴｄＴ酵素（バイアル７）
マスターミックスとｃＤＮＡを混合して２０ｍｌの容量にする。緩やかに混和して遠心分離する。３７℃のヒートブロックで３分間インキュベートする。３分間を超えないように留意する。
８０℃に１０分間加熱して反応を停止させる。短時間、遠心分離を行って１〜２分間室温に冷却する。
【０２３１】
ｄ．Ｔ７プロモーター合成
末端付加したｃＤＮＡに２ｍｌのＳｅｎｓｅＡｍｐ Ｔ７鋳型オリゴ（バイアル８）を添加して容量を２２ｍｌにする。短時間ボルテックス撹拌して遠心分離する。
３７℃で１０分間インキュベートして鎖をアニーリングする。
各反応系に以下の成分を添加して容量を２５ｍｌにする：
１ｍｌの１０×反応バッファー（バイアル６）
１ｍｌのｄＮＴＰミックス（バイアル３）
１ｍｌのＫｌｅｎｏｗ酵素（バイアル９）
穏やかに混和して遠心分離する。室温で３０分間インキュベートする。
６５℃で１０分間加熱して反応を停止させる。氷上に静置する。
プロモーター修飾ｃＤＮＡの半分の量（１２.５ｍｌ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応に進む。
後日使用するため、または並行しておこなう増幅反応で使用するために残りの修飾ｃＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０２３２】
ｅ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
１２.５ｍｌのｃＤＮＡを３７℃で１０分間インキュベートして、鎖を再度アニーリングさせる。
Ｔ７ヌクレオチドミックス（バイアル１１）および１０×Ｔ７反応バッファー（バイアル１２）を室温で融解させ、使用時まで室温で保存する。１０×Ｔ７反応バッファー（バイアル１２）を十分にボルテックス撹拌してバッファー成分の沈殿を防ぐ。
各反応系に、室温にて１２.５ｍｌのｃＤＮＡに対して以下の成分を加え、最終容量を２５ｍｌにする：
８.０ｍｌのＴ７ヌクレオチドミックス（バイアル１１）
２.５ｍｌの１０×Ｔ７反応バッファー（バイアル１２）
２.０ｍｌのＴ７酵素ミックス（バイアル１３）
緩やかに混和して遠心分離する。サーマルサイクラー（加熱蓋付き）中で、３７℃で４〜１６時間インキュベートする。または、反応系を３７℃のヒートブロック内で５分間静置して、次に、３７℃のエアハイブリダイゼーションオーブンに移して４〜１６時間静置する。この工程においては反応系の蒸発と濃縮を回避することが不可欠である。
【０２３３】
ｆ．センスＲＮＡの精製
Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮＡクリーンアッププロトコルに従ってＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅキット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ番号７４２０４）を用いてセンスＲＮＡを精製する。溶出には、１４ｍｌのヌクレアーゼフリー水を添加して２分間インキュベートし、次いで遠心する。回収される容量は１２ｍｌ前後となる。
【０２３４】
ｇ．センスＲＮＡの定量
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、カタログ番号Ｒ−１１４９０）を用いてセンスＲＮＡの濃度を測定する。このキットに提供されるリボソームＲＮＡスタンダードを用いて検量線を作成する。１μｌの精製センスＲＮＡを用いて定量を行う。確実に適切な参照用「ブランク」試料を用いることで不正確な濃度測定を回避する。
【０２３５】
実施例２９
ＥＤＣを用いた、プローブのビーズへのハイスルーブットカップリング
バッファー：ＭＥＳバッファー、０.１Ｍ（ｐＨ＝４.５）、Ｔｗｅｅｎ−２０、０.０２％ ＳＤＳ、０.１％ ＴＥ（ｐＨ＝８.０）
１．カップリングプロトコル
カップリングは、ＥＤＣを用いてカルボキシル化ビーズとアミン修飾プローブとの間で行う。
カップリングはチューブ内で行い、界面活性剤に対する耐性を有する９６マルチウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔ）を用いて洗浄する。
１．全てのプローブをＤＤＷに再懸濁して最終濃度を１ｍＭにする。
２．ＤＤＷを用いて全てのプローブについて１：１０希釈液（０.１ｍＭ）を調製する。
３．分取したＥＤＣ粉末は室温になっていなければならない。
４．行うべきカップリング反応の結合表を作成する。
５．符号を付したチューブのセットを用意する。
６．もとのチューブ内でボルテックス撹拌および約２０秒間の超音波処理によりビーズを再懸濁する。
７．それぞれの種類のビーズから２００μｌ（２.５×１０6個のビーズ）を、符号を付した新しいチューブに移す。
８．最大速度で２分間遠心分離する。
９．上清を取り除き、２５μｌのＭＥＳ（ｐＨ＝４.５）に再懸濁する。ボルテックス撹拌し、２０秒間超音波処理する。
１０．１μｌの希釈プローブをビーズに添加する。適切なビーズ／プローブの結合を知るために、先に作成した表を用いる。
１１．ボルテックス撹拌で混和する。
１２．１０ｍｇの分取物を１ｍｌのＤＤＷに懸濁して、濃度１０ｍｇ／ｍｌのＥＤＣを調製する。
１３．各カップル反応系に１.５μｌのＥＤＣを添加してボルテックス撹拌する。
１４．暗室にて室温で３０分間インキュベートする。
１５．新たなＥＤＣ懸濁液の分取物を調製する。
１６．各反応系に再度新たなＥＤＣを１.５μｌ添加してボルテックス撹拌する。
１７．暗室にて室温で３０分間インキュベートする。
１８．Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を１００μｌの水で事前に湿らせる。
１９．事前に作成した表に従ってカップル反応系の内容物をチューブからフィルタープレートに移す。
２０．カップル反応系に１５０μｌの０.０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０を添加する。
２１．プレートをバキューム装置上に静置してバキューム吸引を行う。
２２．再度カップル反応系に１５０μｌの０.０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０を添加する。
２３．再度バキューム吸引を行う。
２４．１５０μｌの０.１％ ＳＤＳを添加してバキューム吸引を行う。
２５．１５０μｌの０.１％ ＳＤＳを再度添加して、再度バキューム吸引を行う。
２６．カップルビーズを５０μｌのＴＥ（ｐＨ＝８.０）に再懸濁し、ピぺッティングにより混和する。
２７．カップルビーズを新しい９６ウェルプレート（フィルター無し）または新たなチューブに移して４℃で保存する。
【０２３６】
２．ｍｉＲＮＡの化学標識−ＭｉｃｒｏＭａｘ ＡＳＡＰ（正確、高感度および厳密）標識キット
工程
１．ＹＭ−１００により５μｇの全ＲＮＡから低分子ＲＮＡを単離する。
２．ネイキッドスパイクセットを添加する。
３．０.５μｌのＡＳＡＰビオチン試薬を添加する。
４．２.５μｌのＡＳＡＰ標識バッファーを添加する。
５．最終容量が１０μｌになるようＤＤＷを添加する。
６．ピぺッティングで混合する。
７．８５℃で３０分間インキュベートする。
８．４℃で５分間冷却する（ＰＣＲ装置を使用）。
９．Ｋｒｅａｐｕｒｅカラムを用いた標識ｍｉＲＮＡの精製：
ａ．カラムを室温にする（２０分間）
ｂ．樹脂を底部に集めるように振る
ｃ．底を折り、２ｍｌのマイクロチューブに設置する。
ｄ．キャップを緩め、１４,０００ｒｐｍで１分間の事前遠心を行う。
ｅ．カラムを新しいマイクロチューブに設置する。
ｆ．樹脂の上部に標識反応物をアプライする。
ｇ．１４,０００で１分間遠心分離する。
ｈ．流出液を回収し、−２０℃で保存するかまたはハイブリダイゼーションに用いる。
【０２３７】
３．Ｌｕｍｉｎｅｘハイブリダイゼーションプロトコル
１７μｌの被標識物質：
標識ＲＮＡ  ＋３３μｌの混合ビーズ
２μｌのＢｉｏ−スパイク  （×１.５ ＴＭＡＣ中）。ビーズ１５００個／反応
×１ ＴＥで容量を１７μｌにする。
１．ボルテックス撹拌および約２０秒間の超音波処理によりマイクロスフェアを再懸濁する。
２．各試料ウェルまたはバックグラウンドウェルに３３μＬのワーキングマイクロスフェアミックスを添加する。反応は、０.５ｍｌチューブ内で行う。
３．各バックグラウンドウェルに１７μＬのＴＥ、ｐＨ ８を添加する。
４．各試料ウェルに標識および事前にビオチン標識したスパイクを含む検査物質を添加し、ＴＥ ｐＨ８.０を添加して最終容量を１７μｌにする。
５．数回ピぺッティングして反応ウェルを緩やかに混和する。
６．チューブを８５℃のＰＣＲ−１００装置（プログラム可能な温度制御装置）に５分間静置して、試料中の二次構造を変性させる。反応チューブを５０℃（ハイブリダイゼーション温度）で一晩インキュベートする。
７．試料を９６ウェルフィルタープレートに移す。バキューム吸引を行う。
８．ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン試料（ＰｈｙｃｏＬｉｎｋ−ＳｔｅｐｔＡｖｉｄｉｎ、カタログ番号ＰＪ３１５）を１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーションバッファーで２０μｇ／ｍｌに希釈することで新たにレポーターミックスを調製する。
９．各ウェルに７５μｌのレポーターミックスを添加して、ピぺッティングを数回行って緩やかに混和し、ＰＣＲプレートに移す。
１０．Ｌｕｍｉｎｅｘ装置内で試料プレートをハイブリダイゼーション温度の５０℃に１０分間戻す。
１１．装置のマニュアルに従って、Ｌｕｍｉｎｅｘアナライザーで、ハイブリダイゼーション温度において５０μｌを分析する。
【０２３８】
参考文献
1. Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. Real−time quantification of microRNAs by stem−loop RT−PCR. Nucleic Acids Res. 2005 Nov 27; 33（20）:e179.
2. Fu HJ, Zhu J, Yang M, Zhang ZY, Tie Y, Jiang H, Sun ZX, Zheng XF. A novel method to monitor the expression of microRNAs. Mol Biotechnol. 2006 Mar; 32（3）: 197−204.
3. Shi R, Chiang VL. Facile means for quantifying microRNA expression by real−time PCR. Biotechniques. 2005 Oct; 39（4）:519−25.
4. Tang F, Hajkova P, Barton SC, Lao K, Surani MA. MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 2006 Jan 24;34（2）:e9.
【図１】
2010500867.tif 000029
【図２】
2010500867.tif 000030
【図５】
2010500867.tif 000031
【図６】
2010500867.tif 000032
【図７】
2010500867.tif 000033
【図８】
2010500867.tif 000034
【図９】
2010500867.tif 000035
【図１０】
2010500867.tif 000036
【図１１】
2010500867.tif 000037
【図１２】
2010500867.tif 000038
【図１３Ａ】
2010500867.tif 000039
【図１３Ｂ】
2010500867.tif 000040
【図１４】
2010500867.tif 000041
【図３】
2010500867.tif 000042
【図４】
2010500867.tif 000043
【配列表】
2010500867000001.app