(57)【要約】 【課題】コレステロール減らした飼料を提供する。【解決手段】  本発明のコレステロールを減らした飼料は、複数の合成粒子を有し、前記各合成粒子は、陰イオン性界面活性剤あるいは非イオン性界面活性剤に化学結合したキトサンを有する。本発明のコレステロール減らした飼料を提供する方法は、（ａ）キトサン粒子を用意するステップと、（ｂ）前記キトサン粒子を、少なくとも１時間、酸に混合して、第１溶液を得るステップと、（ｃ）陰イオン又は非イオンの界面活性剤を有する第２溶液を用意するステップと、（ｄ）前記第１溶液と第２溶液を酸性状態で混合して、前記界面活性剤に化学結合したキトサンを有するキトサン−界面活性剤の合成粒子を得るステップと、（ｅ）前記キトサン−界面活性剤の合成粒子から粉末を生成するステップを有する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロールの低減に有効な混合物において、
前記混合物は、複数の合成粒子を有し、
前記各合成粒子は、陰イオン性界面活性剤あるいは非イオン性界面活性剤に化学結合したキトサンを有する
ことを特徴とする混合物。
【請求項２】
前記陰イオン性界面活性剤は、リン脂質、胆汁塩、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、モノグルセリドのクエン酸ステアリル、ナトリウム又はカルシウム又はステアロリル酸ルクチレート、ステアリル・クエン酸、脂肪酸、脂肪酸塩、モノグルセリドのジアセチル酒石酸、あるいはそれらの化合物から選択される
ことを特徴とする請求項１記載の混合物。
【請求項３】
前記リン脂質は、レシチンを含む
ことを特徴とする請求項２記載の混合物。
【請求項４】
前記非イオン性界面活性剤は、脂肪アルコールである
ことを特徴とする請求項１−３のいずれかに記載の混合物。
【請求項５】
コレステロールの低減に有効な混合物において、
前記混合物は、複数の疎水性合成粒子を有し、
前記各疎水性合成粒子は、陰イオン性界面活性剤あるいは非イオン性界面活性剤に化学結合した陽イオンポリマーを有する
ことを特徴とするコレステロールの低減に使用される混合物。
【請求項６】
前記陽イオンポリマーは、キトサンを含む
ことを特徴とする請求項５記載の混合物。
【請求項７】
前記陽イオンポリマーは、ポリアミンを含む
ことを特徴とする請求項５又は６記載の混合物。
【請求項８】
前記ポリアミンは、ポリリシンまたはポリアクリルアミドを含む
ことを特徴とする請求項５−７のいずれかに記載の混合物。
【請求項９】
前記陰イオン性界面活性剤は、リン脂質、胆汁塩、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、モノグルセリドのクエン酸ステアリル、ナトリウム又はカルシウム又はステアロリル酸ルクチレート、ステアリル・クエン酸、脂肪酸、脂肪酸塩、モノグルセリドのジアセチル酒石酸、あるいはそれらの化合物から選択される
ことを特徴とする請求項５−８のいずれかに記載の混合物。
【請求項１０】
前記リン脂質は、レシチンを含む
ことを特徴とする請求項９記載の混合物。
【請求項１１】
コレステロールの低減に有効な混合物において、
前記混合物は、複数のレシチン−キトサンの合成粒子を有し、
前記各合成粒子は、前記レシチンに化学結合したキトサンを有する
ことを特徴とするコレステロールの低減に使用される混合物。
【請求項１２】
前記混合物は、乾燥混合物であり、
前記乾燥混合物の水分量は、最大１０％ｗ／ｗである
ことを特徴とする請求項１１記載の混合物。
【請求項１３】
前記乾燥混合物は、流動性の粉体(flowing powder)の形態で提供される
ことを特徴とする請求項１２記載の混合物。
【請求項１４】
前記乾燥混合物は、充填性の粉体（packed powder)の形態で提供される
ことを特徴とする請求項１２記載の混合物。
【請求項１５】
前記乾燥混合物は、顆粒状粒子（granular particles）の混合物として提供される
ことを特徴とする請求項１２記載の混合物。
【請求項１６】
前記混合物の合成粒子は、前記混合物の２．５ｇの合成粒子を、塩素酸ナトリウム濃度が０．５％ｗ／ｗを有する１リットルの塩素酸ナトリウム溶液で混合すると、少なくとも１０％の遊離塩素酸ナトリウムを、前記塩素酸ナトリウム溶液から３０分以内に取り除くことができる
ことを特徴とする請求項１１−１５のいずれかに記載の混合物。
【請求項１７】
前記混合物の合成粒子は、前記混合物の２．５ｇの合成粒子を、塩素酸ナトリウム濃度が０．５％ｗ／ｗを有する１リットルの塩素酸ナトリウム溶液で混合すると、少なくとも２０％の遊離塩素酸ナトリウムを、前記塩素酸ナトリウム溶液から３０分以内に取り除くことができる
ことを特徴とする請求項１１−１５のいずれかに記載の混合物。
【請求項１８】
前記混合物の合成粒子は、前記混合物の２．５ｇの合成粒子を、塩素酸ナトリウム濃度が０．５％ｗ／ｗを有する１リットルの塩素酸ナトリウム溶液で混合すると、少なくとも３０％の遊離塩素酸ナトリウムを、前記塩素酸ナトリウム溶液から３０分以内に取り除くことができる
ことを特徴とする請求項１１−１５のいずれかに記載の混合物。
【請求項１９】
前記混合物の合成粒子は、前記混合物の２．５ｇの合成粒子を、塩素酸ナトリウム濃度が０．５％ｗ／ｗを有する１リットルの塩素酸ナトリウム溶液で混合すると、少なくとも４０％の遊離塩素酸ナトリウムを、前記塩素酸ナトリウム溶液から３０分以内に取り除くことができる
ことを特徴とする請求項１１−１５のいずれかに記載の混合物。
【請求項２０】
前記合成粒子のキトサンは、分子量が０．５×１０５−３×１０６ダルトンの範囲にある
ことを特徴とする請求項１１−１９のいずれかに記載の混合物。
【請求項２１】
前記混合物の合成粒子の少なくとも１０質量％は、０．３ミクロン−２ミクロンの間のサイズを有する
ことを特徴とする請求項１１−２０のいずれかに記載の混合物。
【請求項２２】
前記混合物の合成粒子の少なくとも３０質量％は、０．３ミクロン−２ミクロンの間のサイズを有する
ことを特徴とする請求項１１−２０のいずれかに１記載の混合物。
【請求項２３】
前記混合物の合成粒子の少なくとも５０質量％は、０．３ミクロン−２ミクロンの間のサイズを有する
ことを特徴とする請求項１１−２０のいずれかに記載の混合物。
【請求項２４】
前記混合物の合成粒子の少なくとも７０質量％は、０．３ミクロン−２ミクロンの間のサイズを有する
ことを特徴とする請求項１１−２０のいずれかに記載の混合物。
【請求項２５】
前記混合物の合成粒子の少なくとも９０質量％は、０．３ミクロン−２ミクロンの間のサイズを有する
ことを特徴とする請求項１１−２０のいずれかに記載の混合物。
【請求項２６】
前記混合物の合成粒子は０．３ミクロン以下のものは存在せず、
前記混合物の合成粒子の少なくとも１０数量％は、２ミクロン以下のサイズを有する
ことを特徴とする請求項１１−２０のいずれかに記載の混合物。
【請求項２７】
前記混合物の合成粒子は０．３ミクロン以下のものは存在せず、
前記混合物の合成粒子の少なくとも５０数量％は、２ミクロン以下のサイズを有する
ことを特徴とする請求項１１−２０のいずれかに記載の混合物。
【請求項２８】
前記混合物の合成粒子は０．３ミクロン以下のものは存在せず、
前記混合物の合成粒子の少なくとも９０数量％は、２ミクロン以下のサイズを有する
ことを特徴とする請求項１１−２０のいずれかに記載の混合物。
【請求項２９】
（ｉ）前記混合物の合成粒子は、前記混合物の２．５ｇの合成粒子を、塩素酸ナトリウム濃度が０．５％ｗ／ｗを有する１リットルの塩素酸ナトリウム溶液で混合すると、少なくとも１５％の遊離塩素酸ナトリウムを、前記塩素酸ナトリウム溶液から３０分以内に取り除くことができる
（ｉｉ）前記混合物の合成粒子の少なくとも３０質量％は、０．３ミクロン−２ミクロンの間のサイズを有する
ことを特徴とする請求項１１記載の混合物。
【請求項３０】
（ｉ）前記混合物の合成粒子は、前記混合物の２．５ｇの合成粒子を、塩素酸ナトリウム濃度が０．５％ｗ／ｗを有する１リットルの塩素酸ナトリウム溶液で混合すると、少なくとも３５％の遊離塩素酸ナトリウムを、前記塩素酸ナトリウム溶液から３０分以内に取り除くことができる
（ｉｉ）前記混合物の合成粒子の少なくとも３０質量％は、０．３ミクロン−２ミクロンの間のサイズを有する
ことを特徴とする請求項１１記載の混合物。
【請求項３１】
前記合成粒子は、レシチン−キトサンの質量比が、０．２：１と５：１の間にある合成粒子を有する
ことを特徴とする請求項１１−３０のいずれかに記載の混合物。
【請求項３２】
前記合成粒子は、レシチン−キトサンの質量比が、３：１と４：１の間にある合成粒子を有する
ことを特徴とする請求項１１−３０のいずれかに記載の混合物。
【請求項３３】
前記合成粒子のキトサンとレシチンは、イオン相互作用と疎水性相互作用の少なくとも一方により、化学結合されている
ことを特徴とする請求項１１−３２のいずれかに記載の混合物。
【請求項３４】
前記合成粒子のキトサンとレシチンは、共有結合されていない
ことを特徴とする請求項１１−３２のいずれかに記載の混合物。
【請求項３５】
前記合成粒子のキトサンは、５０％から９５％の間のアセチル化度を有する
ことを特徴とする請求項１１−３４のいずれかに記載の混合物。
【請求項３６】
（ｃ）肉、穀物、植物の種子、トウモロコシ、豆果からなるグループから選択された少なくとも１種類の飼料、
を有する
ことを特徴とする請求項１−３５のいずれかに記載の混合物。
【請求項３７】
前記混合物のタンパク質由来の栄養価と炭水化物由来の栄養価の合計は、前記混合物の１ｇ当たり少なくとも２カロリーである
ことを特徴とする請求項３６記載の混合物。
【請求項３８】
前記混合物内の前記飼料の重量と前記合成粒子の重量と重量比は、少なくとも１００：１であり、
前記合成粒子は、前記飼料と均一に混合されている
ことを特徴とする請求項３６，３７のいずれかに記載の混合物。
【請求項３９】
（ａ）請求項１−３５のいずれかに記載の混合物を、肉と穀物と植物の種子とトウモロコシと豆果からなるグループから選択された少なくとも１種類の飼料と混合するステップ
を有する
ことを特徴とする飼料混合物の製造方法。
【請求項４０】
請求項３６記載の混合物を、鳥、豚、牛、馬、猫、羊、犬からなるグループから選択された動物に与えるステップ
を有する
ことを特徴とする動物に飼料を与える製造方法。
【請求項４１】
（ａ）キトサン粒子を用意するステップと、
（ｂ）前記キトサン粒子を、少なくとも１時間、酸に混合して、第１溶液を得るステップと、
（ｃ）陰イオン又は非イオンの界面活性剤を有する第２溶液を用意するステップと、
（ｄ）前記第１溶液と第２溶液を酸性状態で混合して、前記界面活性剤に化学結合したキトサンを有するキトサン−界面活性剤の合成粒子を得るステップと、
（ｅ）前記キトサン−界面活性剤の合成粒子から粉末を生成するステップ
を有する
ことを特徴とする合成粒子の方法。
【請求項４２】
（ａ）キトサン粒子を用意するステップと、
（ｂ）前記キトサン粒子を、少なくとも１時間、酸に混合して、第１溶液を得るステップと、
（ｃ）レシチンを含む第２溶液を用意するステップと、
（ｄ）前記第１溶液と第２溶液を酸性状態で混合して、前記レシチンに化学結合したキトサンを有するキトサン−レシチンの合成粒子を得るステップと、
（ｅ）前記キトサン−レシチンの合成粒子から粉末を生成するために、乾燥させるステップ
を有する
ことを特徴とする合成粒子の製造方法。
【請求項４３】
（ｉ）前記混合したキトサン粒子は、低分子量のキトサン粒子で、その重量は、０．３×１０５と１．５×１０５ダルトンの間の重量を有し、
（ｉｉ）前記ステップ（ｂ）は、少なくとも１時間行われる
ことを特徴とする請求項４１又は４２記載の製造法。
【請求項４４】
（ｉ）前記混合したキトサン粒子は、中分子量のキトサン粒子で、その重量は、１．５×１０５と５×１０５ダルトンの間の重量を有し、
（ｉｉ）前記ステップ（ｂ）は、少なくとも２時間行われる
ことを特徴とする請求項４１又は４２記載の製造法。
【請求項４５】
（ｉ）前記混合したキトサン粒子は、高分子量のキトサン粒子で、その重量は、０．５×１０６と３×１０５ダルトンの間の重量を有し、
（ｉｉ）前記ステップ（ｂ）は、少なくとも３時間行われる
ことを特徴とする請求項４１又は４２記載の製造法。
【請求項４６】
前記ステップ（ｂ）は、少なくとも２０時間行われる
ことを特徴とする請求項４１又は４２記載の製造法。
【請求項４７】
前記ステップ（ｄ）は、以下のグループから選択された少なくとも１つのステップを有する：
（ｉ）スプレー乾燥ステップ
（ｉｉ）凍結乾燥ステップ
ことを特徴とする請求項４１−４６のいずれかに記載の製造法。
【請求項４８】
前記ステップ（ｄ）は、前記ステップ（ｄ）の前に、第１溶液と第２溶液が十分混合するよう、少なくとも２分間−３０分間の期間行い、その間の平均温度は、４０℃以下である
ことを特徴とする請求項４１−４７のいずれかに記載の製造法。
【請求項４９】
前記期間は、最大２０分である
ことを特徴とする請求項４８記載の製造法。
【請求項５０】
前記平均温度は、３０℃以下である
ことを特徴とする請求項４８−４９のいずれかに記載の製造法。
【請求項５１】
前記ステップ（ｄ）は、前記ステップ（ｄ）の前に、第１溶液と第２溶液が十分混合するよう、少なくとも２分間−１０分間の期間行い、その間の平均温度は、５０℃以下である
ことを特徴とする請求項４１−４７のいずれかに記載の製造法。
【請求項５２】
前記平均温度は、４５℃以下である
ことを特徴とする請求項５１記載の製造法。
【請求項５３】
前記ステップ（ｄ）は、前記形成された合成粒子の少なくとも１０質量％が、０．３ミクロン−２ミクロンの間の大きさを有するような、温度と期間で行われる
ことを特徴とする請求項４１−５２のいずれかに記載の製造法。
【請求項５４】
前記ステップ（ｄ）は、前記形成された合成粒子の少なくとも５０質量％が、０．３ミクロン−２ミクロンの間の大きさを有するような、温度と期間で行われる
ことを特徴とする請求項４１−５２のいずれかに記載の製造法。
【請求項５５】
前記ステップ（ｄ）は、前記形成された合成粒子の少なくとも７０質量％が、０．３ミクロン−２ミクロンの間の大きさを有するような、温度と期間で行われる
ことを特徴とする請求項４１−５２のいずれかに記載の製造法。
【請求項５６】
前記酸は、乳酸とグルタミン酸からなるグループから選択された有機酸である
ことを特徴とする請求項４１−５５のいずれかに記載の製造法。
【請求項５７】
前記第２溶液は、水溶液の形態で用意される
ことを特徴とする請求項４１−５６のいずれかに１記載の製造法。
【請求項５８】
前記第１溶液の前記混合物のキトサンの濃度は、０．２５％ｗ／ｗから１％ｗ／ｗの間である
ことを特徴とする請求項４１−５７のいずれかに１記載の製造法。
【請求項５９】
前記第１溶液の前記混合物のキトサンの濃度は、０．１％ｗ／ｗから２％ｗ／ｗの間である
ことを特徴とする請求項４１−５７のいずれかに１記載の製造法。
【請求項６０】
前記第２溶液の前記混合物のレシチンの濃度は、１．２５％ｗ／ｗから５．０％ｗ／ｗの間である
ことを特徴とする請求項４１−５９のいずれかに１記載の製造法。
【請求項６１】
前記第２溶液の前記混合物のレシチンの濃度は、０．１％ｗ／ｗから７．５％ｗ／ｗの間である
ことを特徴とする請求項４１−５９のいずれかに１記載の製造法。
【請求項６２】
前記ステップ（ｂ）の酸のｐＨは、３．５に調整される
ことを特徴とする請求項４１−６１のいずれかに１記載の製造法。
【請求項６３】
（ｆ）前記第１溶液と第２溶液からなる前記混合物のｐＨを７に調整するステップ
をさらに有する
ことを特徴とする請求項４１−６２のいずれかに記載の製造法。
【請求項６４】
（ｇ）前記第１溶液と第２溶液の混合物を３０分間放置し、その後、粒子を取り除くために濾過するステップ
をさらに有する
ことを特徴とする請求項４１−６２のいずれかに記載の製造法。
【請求項６５】
（ｈ）前記取り除いた粒子を酸性媒体中に再縣濁するステップ
をさらに有する
ことを特徴とする請求項６４記載の製造法。
【請求項６６】
前記キトサンの疎水性を増すことにより、前記キトサンにより人間以外の動物のコレステロールを低減する
ことを特徴とする人間以外の動物のコレステロールを減らす方法。
【請求項６７】
前記疎水性は、キトサンを陰イオン性界面活性剤あるいは非イオン性界面活性剤と反応させることにより、増加させる
ことを特徴とする請求項６６記載の製造法。
【請求項６８】
人間以外の動物の脂肪を低減させる、前記請求項のいずれかに記載の混合物又は方法を使用することを特徴とする混合物の使用方法。
【請求項６９】
人間以外の動物の肥満治療を行う、前記請求項のいずれかに記載の混合物又は方法を使用する
ことを特徴とする混合物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疎水性マイクロ粒子を含有する混合物に関する。この疎水性マイクロ粒子は、陰イオン性あるいは非イオン性の界面活性剤（例、レシチン（lecithin））に化学結合された正にチャージされた（正電荷を持つ）ポリマー（例、キトサン(polysaccharide)のような多糖類）を含む。この混合物は、動物（例えば、鳥、鶏あるいはあらゆる種類の哺乳類）のコレステロールを減らすのに有効である。本発明は、この混合物の製造方法と使用方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは、血流と身体組織の細胞膜に見出されるステロール脂質（sterol lipid）である。コレステロールの化学構造式は次のとおりである。
式１
2010511403.tif 000003
【０００３】
コレステロールは、３つの領域からなる。即ち、右端の炭化水素（ＣＨ２）のテールと、４個の炭化水素リングを有する中央のリング構造領域と、左端のヒドロキシル基（ＨＯ）である。このヒドロキシル基には極性(polar)があり、これによりコレステロールが水に溶ける。リング領域とテール領域は無極性(non-polar)であり、有機溶剤には溶けるが、水には溶けない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７０６７１４６号明細書
【特許文献２】米国特許第６８１４９７５号明細書
【特許文献３】米国特許出願第２００５００７９２０４号明細書
【特許文献４】ヨーロッパ特許第１２３３６８２号明細書
【特許文献５】米国特許第６３２３１８９号明細書
【特許文献６】ヨーロッパ特許第１１００３４４号明細書
【特許文献７】米国特許出願第２００５０１７５７６３号明細書
【特許文献８】米国特許出願第２００５０１００６１９号明細書
【特許文献９】米国特許第５７５３２６４号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Luhman et al, Poultry Science 69:852-855 (1990); Mori, et al., J.
【非特許文献２】J. Nutr. 2000; 130:2753-2759
【非特許文献３】Michel, RC et al. Biopolymers 53:19 - 39, 2000
【非特許文献４】Reed WF et al. Ber Bunzen Phys Chem 100: 685-695, 1996
【非特許文献５】Fredheim GE et al. Biomacromolecules 4:232-239, 2003
【非特許文献６】J. Am. College Nutrition 2002; 21(5): 428-433
【非特許文献７】Lipids. 1976 Dec; 11(12): 830-2
【非特許文献８】Magdassi et al. of the Hebrew University, Jerusalem, Israel (see, for example, G. Nizri and S. Magdassi: Solubilization of hydrophobic molecules in nanoparticles formed by polymer-surfactant interactions, J. Colloid Interface Sci. 291, 169-174 (2005)
【非特許文献９】Paul et al. Journal of Biological Chemistry, pp. 73-82, 1948
【０００６】
医療関係者は、コレステロールの摂取を減らすよう推奨している。その理由は、ＬＤＬ血中コレステロールレベルが高く（高コレステロール血症）なると、心臓や脳に血液を供給する動脈の壁にコレステロールが徐々に堆積する。これによりプラークが形成され動脈を詰まらせる。これはアテローム性動脈硬化症として知られている。このプラーク近傍にできる血塊（血栓）は、心筋の一部に流れる血流を妨げ、心臓発作を引き起こす。この血栓が脳の一部へ流れる血流を遮断すると脳卒中が起きる。高レベルのＬＤＬコレステロール（１６０ｍｇ／ｄＬ以上）は、心臓病のリスクを増やすことになる。
【０００７】
鶏卵は、非常に高いコレステロール源（大きな鶏卵１個当たり約２８０ｍｇ）である。多くの医療関係者は、高コレステロールの血清濃度を有する人の食事から鶏卵を排除するよう勧告している。従って、高いコレステロールレベルの人にとって、鶏卵は、食事からほとんど排除されている。これは不合理なことである。その理由は、鶏卵は、タンパク質、ビタミン、ミネラルあるいは他の栄養素の源であり、これらの品質、栄養、濃度は高いが、価格は安いからである。
【０００８】
鶏卵の栄養価が高いために、家禽の研究者は、コレステロールを余り含まない鶏卵を産む鶏を得ようとしている。かつて試みられた１つのシステムは、異質の有害化学物質を鶏卵を産む鶏に日々与えることでる。鶏に合成ホルモンを注射して、コレステロールレベルを減らすようにもしている。このアプローチは、人間の血中のコレステロールレベルは、ホルモン、カルシウム・イオン、マグネシウム・イオン、ナイアシンの高いドーズ量、他のビタミン類、甲状腺活性物質の使用により、医学的に制御できるという治験に基づくものである。予想されるように、このような鶏の飼育方法は、多くの不都合な症例を引き起こし、副作用もある。
【０００９】
薬剤は、全血中のコレステロールを低下させたり、動物のＨＤＬ／ＬＤＬ比率を改善する際には、食料のサプリメントとしての費用対効果が低い。
【００１０】
全コレステロールレベルを低減し、ＨＤＬ／ＬＤＬの比率を改善する１つの方法は、動物特に鶏に、ある種の化合物を飼料として与えることである。この化合物は、排便を引き起こす下部小腸により再吸収されるのを阻止するような胆汁塩(bile salts)を封鎖する化合物である。胆汁酸の排便量が増えると、肝臓がより多くの胆汁酸を生成するようになる。その際、コレステロールを、その製造に際し基質（substrate）して用いている。ＬＤＬ異化作用（catabolism）における結果得られた促進は、血中のコレステロール量を減らす効果があり、ＨＤＬ／ＬＤＬ比率を改善する効果がある。
【００１１】
キトサン（chitosan）は、唯一の天然派生物で、正電荷を持つ多糖類である。またキトサンは、キチン質の脱アセチル化（deacetylation of chitin）により生成される。このキチン質は、天然のバイオポリマーであり、細胞骨格（cytoskeleton: 細胞質に存在し微小管・微小繊維などからなる格子配列構造；細胞の構造の支持あるいは他の細胞構成成分の輸送装置として働く)と海洋生物（甲殻網、エビ、カニ、真菌等）の堅い殻に見出される。キトサンの化学構造式は次のとおりである。
式２
2010511403.tif 000004
【００１２】
キトサンは、小動物（例、特にマウスとラット）の血中コレステロールと胆汁脂質(bile lipid)を吸収できる。これにより、これらの分子の血中レベルを引き下げる（非特許文献２）。多くの研究結果では、キトサンは、悪玉コレステロールＬＤＬのレベルを低下させ、善玉コレステロールＨＤＬを上昇させる独自の機能があり、これにより、ＨＤＬ／ＬＤＬ比率を改善する。
【００１３】
キトサンは、生体適合性、無毒性、非免疫原性であり、医療、薬剤、化粧品の分野で使用されている。
【００１４】
キトサンの可溶形態は、正電荷を持つアミノ基（amino group）を有する。このアミノ基は、陰イオン性混合物とイオン結合し、タンパク質と脂肪酸を含む。さらにキトサンは、疎水性結合（hidrophobic bond）を形成する。
【００１５】
キトサンを水溶液の形態で使用するために、結晶構造の分解を行わなければならない。水和した結晶性キトサン（hydrated crystalline chitosan）においては、水分子は、キトサンのシートの間でカラム（columns）を形成し、ポリマー・チェーン(高分子鎖またはポリマー鎖)の間のウォーター・ブリッジ（水の分子間に溶媒化）を形成することにより、この構造体を安定化させる。水素結合は、弱有機酸（week organic acid: 例、酢酸）を用いると、キトサンの分解プロセスの間に、破壊される。
【００１６】
高分子電解質粉末（polyelectrolyte powders）の分解メカニズムには、球状粒構造体（spherical grain structure）の形成が関与すると考えられている。純水においては、この分解メカニズムは、粒子周囲にゲル層が急速に形成され、その後、ポリマー・チェーンがゆっくりと溶剤中に解放することが関与している。会合体（aggregate）を離脱するポリマー・チェーンのゆっくりとしたプロセスは、荷電した個々のポリマーと電気的に中性の会合体の間で形成される誘引的電位（attractive potentila）の効果に起因すると説明されている。
【００１７】
高分子電解質の分解に要する平衡時間は、多くの場合数時間あるいは数日かかることがある。
【００１８】
キトサン溶液を拡散する時間は、１２−２４時間かかると報告されている（非特許文献３，４）。
【００１９】
コレステロールは、胆汁酸の前駆体（precursorof bile acid）である。この前駆体は、ステロイド酸(steroid acid)である。このステロイド酸は、主に哺乳類の胆汁の中に見出され、親水性と疎水性の両面を持つ。キトサンは、胆汁酸を吸収することにより、血中コレステロールを減らし、これにより胆汁酸のさらなる合成に際し、コレステロールの使用を増やし、その結果血中からコレステロールを除去する。
【００２０】
キトサンとグルコマンナン（Glucomannan:  商標：英国 Cantassium社製の食欲抑制剤；食物繊維の塊りで、水といっしょに服用すると胃の中で大きく膨張しこんにゃく状になる物質)を含む食物繊維のサプリメントは、ラット（特許文献２）と人間（特許文献６）の血中コレステロールを減らすことが示されている。しかし植物繊維のサプリメントは、人間のコレステロール低下作用を得るためには、大量に必要であり、１日当たり１５カプセル（コレステロールとグルコマンナンをそれぞれ１日あたり１．２ｇ）の摂取が必要である。人体研究結果によれば、これでも、全血清コレステロールは、僅か７％下がるだけであり、ＬＤＬコレステロールは１０％下がるだけである。
【００２１】
特許文献１−４は、コレステロールを減らす食べ物を用意するにあたり、キトサンとエリタデニン(eritadenine: コレステロールを下げる物質でシイタケ特有の成分)との同時使用を教示している。
【００２２】
特許文献５、６は、体重調整のために、安定したキトサンを含有する液状縣濁液を教示している。
【００２３】
特許文献７は、炭水化物の形態での支持材料からなるリン脂質を含有する安定したマトリックス例えば、キトサンを教示している。特許文献８は、コレステロールを低下させるサプリメントを教示する。このサプリメントは、キトサンとリン脂質とを含み、さらにコレステロールの生合成（biosynthesis）を阻止する化合物と、コレステロールの代謝を増加する化合物も教示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
キトサンは、胃の中でコレステロールを減らすことはできない。その理由は、キトサンは、胆汁塩が存在しない（小腸にのみ存在し胃には存在しない）場合には、乳化していない脂質（non-emulsofied fat ）を吸収できないからである。さらに、キトサンは、分解して、胃における酸の状態を正に荷電するが、これは官能アミノ基に起因する。高電化ポリマーは、負電荷を持つ物質（例えば、リン脂質）と強く反応する。この負電荷を持つ物質は、胃の中に存在し一部飽和する。その結果、胃を通過した後、負電荷を持つ胆汁酸と相互作用できる正電荷を持つ基を有するキトサンの吸収量は、減る。
【００２５】
未飽和キトサンを小腸に分配する量を増やし、動物（鳥類あるいは哺乳類）の血中コレステロールを減らす混合物を得ることが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明のコレステロールの低減に有効な混合物は、複数の合成粒子を有する。前記各合成粒子は、陰イオン性界面活性剤あるいは非イオン性界面活性剤に化学結合したキトサンを有する。
【００２７】
本発明の一実施例によれば、前記陰イオン性界面活性剤は、リン脂質(hpospholipid)、胆汁塩(bile salt)、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(sodium lauryl ether sulfate)、モノグルセリドのクエン酸ステアリル(citric acid esters of monoglyceride)、ナトリウム又はカルシウム又はステアロリル酸ルクチレート(sodium, calcium or acid stearoyl lactylate)、ステアリル・クエン酸(stearyl citrate)、脂肪酸、脂肪酸塩、モノグルセリドのジアセチル酒石酸(diacetyl tartaric acid esters of monoglycerides)、あるいはそれらの化合物から選択される。
【００２８】
本発明の一実施例によれば、前記リン脂質は、レシチンを含む。前記非イオン性界面活性剤は、脂肪アルコール（fatty alcohol）である。
【００２９】
本発明の一実施例によれば、本発明のコレステロールの低減に有効な混合物は、複数の疎水性合成粒子を有し、前記各疎水性合成粒子は、陰イオン性界面活性剤あるいは非イオン性界面活性剤に化学結合した陽イオンポリマーを有する。
【００３０】
前記陽イオンポリマーは、キトサンを含む。前記陽イオンポリマーは、ポリアミンを含む。前記ポリアミン(polyamine)は、ポリリシン(polylysine)またはポリアクリルアミド(polyacrylamide)を含む。
【００３１】
前記陰イオン性界面活性剤は、リン脂質、胆汁塩、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、モノグルセリドのクエン酸ステアリル、ナトリウム又はカルシウム又はステアロリル酸ルクチレート、ステアリル・クエン酸、脂肪酸、脂肪酸塩、モノグルセリドのジアセチル酒石酸、あるいはそれらの化合物から選択される。前記リン脂質は、レシチンを含む。
【００３２】
本発明のコレステロールの低減に有効な混合物は、複数のレシチン−キトサンの合成粒子を有し、前記各合成粒子は、前記レシチンに化学結合したキトサンを有する。本発明の一実施例によれば、前記混合物は、乾燥混合物であり、前記乾燥混合物の水分量は、最大１０％ｗ／ｗである。
【００３３】
本発明の一実施例によれば、前記乾燥混合物の水分量は、最大２０％ｗ／ｗである。また、前記乾燥混合物の水分量は、最大３０％ｗ／ｗである。前記乾燥混合物の水分量は、アプリケーションに依存する。前記乾燥混合物は、流動性の粉体(flowing powder)の形態で提供される。前記乾燥混合物は、充填性の粉体（packed powder)の形態で提供される。前記乾燥混合物は、顆粒状粒子（granular particles）の混合物として提供される
【００３４】
本発明の一実施例によれば、前記混合物の合成粒子は、前記混合物の２．５ｇの合成粒子を、塩素酸ナトリウム濃度が０．５％ｗ／ｗを有する１リットルの塩素酸ナトリウム溶液で混合すると、少なくとも１０％の遊離塩素酸ナトリウムを、前記塩素酸ナトリウム溶液から３０分以内に取り除くことができる。
【００３５】
本発明の一実施例によれば、前記混合物の合成粒子は、前記混合物の２．５ｇの合成粒子を、塩素酸ナトリウム濃度が０．５％ｗ／ｗを有する１リットルの塩素酸ナトリウム溶液で混合すると、少なくとも２０％の遊離塩素酸ナトリウム(free sodium cholate)を、前記塩素酸ナトリウム溶液から３０分以内に取り除くことができる。
【００３６】
本発明の一実施例によれば、前記混合物の合成粒子は、前記混合物の２．５ｇの合成粒子を、塩素酸ナトリウム濃度が０．５％ｗ／ｗを有する１リットルの塩素酸ナトリウム溶液で混合すると、少なくとも３０％の遊離塩素酸ナトリウムを、前記塩素酸ナトリウム溶液から３０分以内に取り除くことができる。
【００３７】
本発明の一実施例によれば、前記混合物の合成粒子は、前記混合物の２．５ｇの合成粒子を、塩素酸ナトリウム濃度が０．５％ｗ／ｗを有する１リットルの塩素酸ナトリウム溶液で混合すると、少なくとも４０％の遊離塩素酸ナトリウムを、前記塩素酸ナトリウム溶液から３０分以内に取り除くことができる。
【００３８】
本発明の一実施例によれば、前記合成粒子のキトサンは、分子量が０．５×１０５−３×１０６ダルトンの範囲にある。
本発明の一実施例によれば、前記混合物の合成粒子の少なくとも１０質量％は、０．３ミクロン−２ミクロンの間のサイズを有する。
本発明の一実施例によれば、前記混合物の合成粒子の少なくとも３０質量％は、０．３ミクロン−２ミクロンの間のサイズを有する。
本発明の一実施例によれば、前記混合物の合成粒子の少なくとも５０質量％は、０．３ミクロン−２ミクロンの間のサイズを有する。
本発明の一実施例によれば、前記混合物の合成粒子の少なくとも７０質量％は、０．３ミクロン−２ミクロンの間のサイズを有する。
本発明の一実施例によれば、前記混合物の合成粒子の少なくとも９０質量％は、０．３ミクロン−２ミクロンの間のサイズを有する。
本発明の一実施例によれば、前記混合物の合成粒子は０．３ミクロン以下のものは存在せず、前記混合物の合成粒子の少なくとも１０数量％は、２ミクロン以下のサイズを有する。
本発明の一実施例によれば、前記混合物の合成粒子は０．３ミクロン以下のものは存在せず、前記混合物の合成粒子の少なくとも５０数量％は、２ミクロン以下のサイズを有する。
【００３９】
本発明の一実施例によれば、前記混合物の合成粒子は０．３ミクロン以下のものは存在せず、前記混合物の合成粒子の少なくとも９０数量％は、２ミクロン以下のサイズを有する。
【００４０】
本発明の一実施例によれば、（ｉ）前記混合物の合成粒子は、前記混合物の２．５ｇの合成粒子を、塩素酸ナトリウム濃度が０．５％ｗ／ｗを有する１リットルの塩素酸ナトリウム溶液で混合すると、少なくとも１５％の遊離塩素酸ナトリウムを、前記塩素酸ナトリウム溶液から３０分以内に取り除くことができる。（ｉｉ）前記混合物の合成粒子の少なくとも３０質量％は、０．３ミクロン−２ミクロンの間のサイズを有する
ことを特徴とする請求項１１記載の混合物。
【００４１】
本発明の一実施例によれば、（ｉ）前記混合物の合成粒子は、前記混合物の２．５ｇの合成粒子を、塩素酸ナトリウム濃度が０．５％ｗ／ｗを有する１リットルの塩素酸ナトリウム溶液で混合すると、少なくとも３５％の遊離塩素酸ナトリウムを、前記塩素酸ナトリウム溶液から３０分以内に取り除くことができる。（ｉｉ）前記混合物の合成粒子の少なくとも３０質量％は、０．３ミクロン−２ミクロンの間のサイズを有する。
【００４２】
本発明の一実施例によれば、前記合成粒子は、レシチン−キトサンの質量比が、０．２：１と５：１の間にある合成粒子を有する。
本発明の一実施例によれば、前記合成粒子は、レシチン−キトサンの質量比が、３：１と４：１の間にある合成粒子を有する。
本発明の一実施例によれば、前記合成粒子のキトサンとレシチンは、イオン相互作用と疎水性相互作用の少なくとも一方により、化学結合されている。
本発明の一実施例によれば、前記合成粒子のキトサンとレシチンは、共有結合されていない。
本発明の一実施例によれば、前記合成粒子のキトサンは、５０％から９５％の間のアセチル化度（acetylation）を有する。
【００４３】
本発明の一実施例によれば、混合物は、（ｃ）肉（牛肉、鶏の肉、これらは、ドッグフード、キャッツフードに適切である）、穀物（小麦、大麦、これらは、鶏の餌、馬の餌に適切である）、植物の種子、トウモロコシ（鶏の餌に適切である）、豆果（大豆、大豆製品、これらは、鶏の餌に適切である）からなるグループから選択された少なくとも１種類の飼料を有する。
【００４４】
前記混合物のタンパク質由来の栄養価と炭水化物由来の栄養価の合計は、前記混合物の１ｇ当たり少なくとも２カロリーである。
【００４５】
前記混合物内の前記飼料の重量と前記合成粒子の重量と重量比は、少なくとも１００：１であり、前記合成粒子は、前記飼料と均一に混合されている。
ことを特徴とする請求項３６，３７のいずれかに記載の混合物。
【００４６】
本発明の一実施例によれば、本発明の飼料混合物の製造方法は、（ａ）上記の混合物を、肉と穀物と植物の種子とトウモロコシと豆果からなるグループから選択された少なくとも１種類の飼料と混合するステップを有する。
【００４７】
混合比は、いかなるものでもよい。例えば、混合物の最大１％、最大０．５％、最大０．３％、最大１％が、合成粒子である。
ここに開示した混合物を動物に当てる方法が開示される。本発明の一実施例によれば、動物は、鳥、豚、牛、馬、猫、羊、犬からなるグループから選択される。
【００４８】
本発明の合成粒子の方法は、（ａ）キトサン粒子を用意するステップと、（ｂ）前記キトサン粒子を、少なくとも１時間、酸に混合して、第１溶液を得るステップと、（ｃ）陰イオン又は非イオンの界面活性剤を有する第２溶液を用意するステップと、（ｄ）前記第１溶液と第２溶液を酸性状態で混合して、前記界面活性剤に化学結合したキトサンを有するキトサン−界面活性剤の合成粒子を得るステップと、（ｅ）前記キトサン−界面活性剤の合成粒子から粉末を生成するステップを有する。
【００４９】
本発明の合成粒子の方法は、（ａ）キトサン粒子を用意するステップと、（ｂ）前記キトサン粒子を、少なくとも１時間、酸に混合して、第１溶液を得るステップと、（ｃ）レシチンを含む第２溶液を用意するステップと、（ｄ）前記第１溶液と第２溶液を酸性状態で混合して、前記レシチンに化学結合したキトサンを有するキトサン−レシチンの合成粒子を得るステップと、（ｅ）前記キトサン−レシチンの合成粒子から粉末を生成するために、乾燥させるステップを有する。
【００５０】
本発明の一実施例によれば、（ｉ）前記混合したキトサン粒子は、低分子量のキトサン粒子で、その重量は、０．３×１０５と１．５×１０５ダルトンの間の重量を有し、（ｉｉ）前記ステップ（ｂ）は、少なくとも１時間行われる。
本発明の一実施例によれば、（ｉ）前記混合したキトサン粒子は、中分子量のキトサン粒子で、その重量は、１．５×１０５と５×１０５ダルトンの間の重量を有し、（ｉｉ）前記ステップ（ｂ）は、少なくとも２時間行われる。
【００５１】
本発明の一実施例によれば、（ｉ）前記混合したキトサン粒子は、高分子量のキトサン粒子で、その重量は、０．５×１０６と３×１０５ダルトンの間の重量を有し、（ｉｉ）前記ステップ（ｂ）は、少なくとも３時間行われる。
【００５２】
本発明の一実施例によれば、前記ステップ（ｂ）は、少なくとも２０時間行われる。
本発明の一実施例によれば、前記ステップ（ｄ）は、以下のグループから選択された少なくとも１つのステップを有する：（ｉ）スプレー乾燥ステップ：（ｉｉ）凍結乾燥ステップ。
【００５３】
前記ステップ（ｄ）は、前記ステップ（ｄ）の前に、第１溶液と第２溶液が十分混合するよう、少なくとも２分間−３０分間の期間行い、その間の平均温度は、４０℃以下である。
【００５４】
本発明の一実施例によれば、前記期間は、最大２０分である。
本発明の一実施例によれば、前記平均温度は、３０℃以下である。
ことを特徴とする請求項４８−４９のいずれかに記載の製造法。
【００５５】
本発明の一実施例によれば、前記ステップ（ｄ）は、前記ステップ（ｄ）の前に、第１溶液と第２溶液が十分混合するよう、少なくとも２分間−１０分間の期間行い、その間の平均温度は、５０℃以下である。
【００５６】
本発明の一実施例によれば、前記平均温度は、４５℃以下である。
本発明の一実施例によれば、前記ステップ（ｄ）は、前記形成された合成粒子の少なくとも１０質量％が、０．３ミクロン−２ミクロンの間の大きさを有するような、温度と期間で行われる。
本発明の一実施例によれば、前記ステップ（ｄ）は、前記形成された合成粒子の少なくとも５０質量％が、０．３ミクロン−２ミクロンの間の大きさを有するような、温度と期間で行われる。
本発明の一実施例によれば、前記ステップ（ｄ）は、前記形成された合成粒子の少なくとも７０質量％が、０．３ミクロン−２ミクロンの間の大きさを有するような、温度と期間で行われる。
本発明の一実施例によれば、前記酸は、乳酸とグルタミン酸からなるグループから選択された有機酸である。
本発明の一実施例によれば、前記第２溶液は、水溶液の形態で用意される。
【００５７】
本発明の一実施例によれば、前記第１溶液の前記混合物のキトサンの濃度は、０．２５％ｗ／ｗから１％ｗ／ｗの間である。
本発明の一実施例によれば、前記第１溶液の前記混合物のキトサンの濃度は、０．１％ｗ／ｗから２％ｗ／ｗの間である。
本発明の一実施例によれば、前記第２溶液の前記混合物のレシチンの濃度は、１．２５％ｗ／ｗから５．０％ｗ／ｗの間である。
本発明の一実施例によれば、前記第２溶液の前記混合物のレシチンの濃度は、０．１％ｗ／ｗから７．５％ｗ／ｗの間である。
本発明の一実施例によれば、前記ステップ（ｂ）の酸のｐＨは、３．５に調整される。
本発明の一実施例によれば、本発明の方法は、（ｆ）前記第１溶液と第２溶液からなる前記混合物のｐＨを７に調整するステップをさらに有する。
本発明の一実施例によれば、前記ステップ（ｂ）の酸のｐＨは、３．５に調整される。
本発明の一実施例によれば、本発明の方法は、（ｇ）前記第１溶液と第２溶液の混合物を３０分間放置し、その後、粒子を取り除くために濾過するステップ
をさらに有する
本発明の一実施例によれば、前記ステップ（ｂ）の酸のｐＨは、３．５に調整される。
本発明の一実施例によれば、本発明の方法は、（ｈ）前記取り除いた粒子を酸性媒体中に再縣濁するステップ
をさらに有する。
【００５８】
本発明の一実施例によれば、前記キトサンの疎水性を増すことにより、前記キトサンにより人間以外の動物のコレステロールを低減する
本発明の一実施例によれば、前記疎水性は、キトサンを陰イオン性界面活性剤あるいは非イオン性界面活性剤と反応させることにより、増加させる
本発明の一実施例によれば、人間以外の動物の脂肪を低減させる、前記請求項のいずれかに記載の混合物又は方
本発明の一実施例によれば、人間以外の動物の肥満治療を行う、前記請求項のいずれかに記載の混合物又は方法を使用する。
【００５９】
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語は、当業者が通常理解する意味を有する。本明細書に開示したものと類似または同一の方法または材料は、本発明の実施およびテストでも使用できる。本明細書において、従来と異なる定義をした場合には、本明細書の定義、用語が優先する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】キトサン−レシチン合成粒子を製造する方法を表すフローチャート。
【図２】キトサン−レシチン合成粒子を製造する方法を表すフローチャート。
【図３】リン酸塩緩衝液内の合成粒子の分散と安定性を表す写真の図。
【図４】リン酸塩緩衝液内の合成粒子の分散と安定性を表す写真の図。
【図５】キトサン−レシチンの合成粒子により、コール酸ナトリウム溶液から遊離コール酸ナトリウムを取り除く状態を表すグラフと表。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
本発明は、疎水性マイクロ粒子を含有するコレステロールの処理に有効な混合物に関する。この疎水性マイクロ粒子は、陰イオン性あるいは非イオン性の界面活性剤（例、レシチン）に化学結合された陽イオン性ポリマー（例、キトサン）を含む。
【００６２】
合成粒子内のキトサンと界面活性剤とは、化学結合されて合成粒子を形成する。この化学結合は、粒子の乾燥の間、陽イオン性ポリマーと陰イオン性界面活性剤との間のイオン性相互作用と、ポリマーの疎水性領域とレシチンの脂質分との間の疎水性相互作用に起因しておきる。陽イオン性ポリマーと非イオン性界面活性剤との間の相互作用は、非イオン性相互作用が関与する。
【００６３】
本発明の一実施例において、陽イオン性ポリマーと陰イオンポリマーとは、互いに共有結合していない。
本発明の一実施例において、合成粒子は、レシチンに化学結合しているキトサンを含む。
本発明の合成粒子は、コレステロールの低減に有益である。
【００６４】
特に、本発明の合成粒子は、鶏に投与した時（例えば、家禽の飼料に混合して投与した時）には、鶏のコレステロールを減らすのに役立ち、更にこの鶏の産んだ鶏卵内のコレステロールの低減に役立つ。その結果、鶏の卵（以下、鶏卵と称する）は、栄養価も高く値段が安く、肝臓と大動脈のコレステロールのレベルに対し、悪影響を有さない。
【００６５】
理論的な議論に縛られる訳ではないが、本発明の一実施例においては、合成粒子は同時に３つの特徴を有する。この実施例において、合成粒子は、（ｉ）胆汁酸を腸内で結合できる疎水性粒子であり、（ｉｉ）腸内のｐＨで、例えば粒子に起因して部分的に安定した縣濁液を形成でき、（ｉｉｉ）胃の中で溶ける。
【００６６】
前述したように、胆汁のコレステロールは、胆汁酸の前駆体ある。疎水性粒子を腸内に導入することにより、胆汁酸を腸から押し出すことができる。この疎水性粒子は、腸内である期間縣濁可能である。時間が経つと、合成粒子を摂取した動物のコレステロールを減らすのに役立つと考えられている。かくして前記３つの特性の内の第１の特性は、腸内で胆汁酸と結合／結合するのに有効である。
【００６７】
上記の３つの特徴の内の第２の特徴においては、合成粒子は、人間の腸内に入ると、胆汁塩との相互作用が起こる間、この合成粒子は短時間腸内の媒体内で安定した粒子縣濁物として留まる。この合成粒子は、その後、胆汁塩との塊として沈殿する。かくして胆汁塩は、疎水性相互作用を介してポリマー内に捕獲されて、腸を通過する間は、加水分解の作用を受けることはない。
【００６８】
合成粒子が縣濁液の中に滞留する時間は、胆汁塩との相互作用が可能な十分な時間でなければならない。少なくとも部分的に安定した溶液を形成することのできない粒子は、腸液内の急激な綿状沈殿（flocculation）を受け、その結果、胆汁塩の結合と捕獲が起こらない。
【００６９】
この特性は、例えば、粒子のサイズに起因する。かくして本発明の一実施例においては、粒子は、そのサイズが０．３−３ミクロンのマイクロ粒子である。
【００７０】
上記した３つの特徴の内の第３の特徴に関し、本発明の一実施例においては、合成粒子は、胃の中で溶け易く、人間の小腸内に胆汁酸を結合するのに有効な形態で、分配されるなければならない。この実施例においては、合成粒子は安定しており、人間の胃の中の環境内では、反応性ではなく、その結果、可溶性で未飽和の形態で、小腸内に分配される。
【００７１】
疎水性の議論
前述したようにキトサンは、正電荷を持つ多糖（多数の糖類を含む炭水化物）ポリマーであり、消化されず、その結果、排便される。
【００７２】
レシチンは、乳化剤／洗浄剤（emulsifier/detergent）として特徴づけられ、小腸でのその吸収を阻止する胆汁塩を結合する（非特許文献７）。レシチンは、低価格で、自然のもので、糖脂質、トリグリセリド（triglycerides: グリセリンの３個のヒドロキシル基が脂肪酸と結合したエステル)と負電荷を持つリン脂質の混合物である。本発明の一実施例は、リン脂質内で豊富なレシチンを用いるが、より高い中性脂質の通常のレシチン、または異なる脂質組成のレシチンを用いることもできる。
【００７３】
特定の理論にこだわる訳ではないが、本発明者は次のことを仮定した。陰イオン性界面活性剤は、キトサン分子を、疎水性テール領域との相互作用を介して、化学結合する。その結果、腸内のｐＨで水に溶けない荷電されていないキトサン−界面活性剤の合成粒子の形成が可能である。またキトサンの疎水性は、ある種の動物例えば鶏における胆汁酸への結合力を増加させる。
【００７４】
本発明者は、次のように考える。キトサンによる小動物内の胆汁酸の吸収は、正電荷を持つキトサン・ポリマー（これは他の正電荷を持つ血漿タンパクと競合する）と負電荷を持つ胆汁酸との間の非特定のイオン相互作用の結果として、発生する。キトサンの胆汁酸の疎水性面への結合は、遥かに特殊である。
【００７５】
本発明者は次のことを仮定した。陰イオン性界面活性剤は、疎水性テール領域との相互作用により、キトサン分子を吸収する。その結果、腸内のｐＨでは水に溶けない荷電されていないキトサン分子が形成される。またキトサンの疎水性は、ある種の動物例えば鶏における胆汁酸への結合力を増加させる。
【００７６】
本発明により、キトサン粒子の疎水性を向上させる方法が得られた。これは、界面活性剤（例、レシチン）と化学結合したキトサンの「合成」粒子を提供することにより、行われる。
【００７７】
理論に拘る訳ではないが、本発明の合成粒子は、強力な疎水領域を有し、疎水領域は、胃内の酸性状態で溶けることができ、液体の形態で小腸内に入り、マイクロ粒子が胆汁塩を結合し、その後沈殿する。
【００７８】
非特許文献８によれば、ポリ陽イオン性ポリマーを陰イオン性界面活性剤と混合すると、静電気相互作用がナノ粒子の沈殿となる。このような粒子は、疎水性分子を溶融化できるが、これはポリ陽イオン性ポリマー内の疎水性ポケットの形成に起因する。しかし、著者（マグダッシ）は、人間のコレステロールを減らすために、キトサンを含む疎水性マイクロ粒子の使用については示唆も教示もしていない。さらに著者は、ナノ粒子（nanoparticles）についてのみ研究したが、マイクロ（微小）粒子（microparticles）については研究していない。
【００７９】
前記著者は、特許文献９において、以下のことを開示している。オイルの正電荷を持つキトサン含有水性乳液を準備し、ここで、水性キトサン溶液を、陰イオン性の乳化剤を含む水中油型乳液（oil-in-water smulsion ）に添加して、非可溶性の界面活性剤−キトサン錯体を生成する。この乳化剤はレシチンを含む。この特許文献９の目的は、オイルを安定化することであり、キトサンとレシチンの粒子は形成されておらず、むしろレシチンの安定した乳液を最初に形成し、その後それにキトサンを添加している。マグダッシにより用いられたキトサン対レシチンの比率は、０．５：０．３３である。このプロセスはｐＨ６で実行された。特許文献９に記載された乳液のｐＨが７以上となると、使用されたキトサンとレシチンの比率においては、キトサンの沈殿は、胆汁酸との相互作用が発生する前に、直ちに起きる。
【００８０】
意外なことに、正電荷を持つポリマー（例、キトサン）と陰イオン性もしくは非イオン性界面活性剤（例、レシチン）を含む混合物は、合成疎水性マイクロ粒子を提供する。キトサンは、胃の中で正電荷を持つ分子とのイオン相互作用を受けない。その結果、キトサンは、胆汁酸を結合できる状態で、腸内に分配される。
【００８１】
本発明の実施例により提供される混合物は、胆汁塩と相互作用ができる粒子を含み、粒子を破壊しレシチンと相互作用する遊離胆汁塩による消化と分解を阻止するために、少なくとも部分的に安定し溶けない縣濁液の形態で、小腸を通過する錯体を形成する。
【００８２】
このようなマイクロ粒子を含む混合物は、胆汁酸を結合する際に極めて有効であり、これにより様々な動物のＬＤＬコレステロールレベルを減らすことができる。
【００８３】
本発明の一実施例の合成粒子は、胃の酸性状態の中で可溶性であり、人間の小腸の高いｐＨ環境内で縣濁した粒子を形成する。このような粒子は、胆汁塩と相互作用する。この相互作用は、胆汁塩の疎水性の部分との疎水性相互作用であり、その結果、沈殿して可溶性でない塊を形成する。この塊内に胆汁塩が捕獲される。この効果を達成するために、合成粒子は十分に疎水性であり、胆汁塩の疎水性領域との強い疎水性相互作用を提供する。
【００８４】
本発明の一実施例においては、合成粒子は、人間の腸内に入ると、胆汁塩との相互作用が起こりながら、この合成粒子は短時間腸の媒体内で安定した粒子縣濁物として留まる。この合成粒子は、その後、胆汁塩との塊として沈殿する。かくして胆汁塩は、疎水性相互作用を介してポリマー内に捕獲されて、腸を通過する間は、加水分解の作用を受けることはない。
【００８５】
合成粒子が縣濁液の中に滞留する時間は、胆汁塩との相互作用が可能な十分な時間でなければならない。少なくとも部分的に安定した溶液を形成することのできない粒子は、腸液内の急激な綿状沈殿（flocculation）を受け、その結果、胆汁塩の結合と捕獲は起こらない。
【００８６】
かくして本発明の一実施例によれば、本発明の粒子は、腸内の媒体中で少なくとも部分的に安定した縣濁を提供し、十分に強い疎水性を発揮して、胆汁塩の疎水性領域と強く反応して、胆汁塩を有する沈殿物を形成する。
【００８７】
本発明者の行った実験によれば、本発明のレシチン対キトサンの粒子による胆汁塩の吸収は、疎水性の程度と粒子のサイズに影響されることが分かった。疎水性の程度は、粒子内のレシチンの濃度とそこで使用されるレシチンの種類で制御される。
【００８８】
粒子のサイズとその分布についての議論
本発明者は、ある実施例においては、０．３−２ミクロンの範囲のサイズの粒子を、他の実施例においては、０．３−１．５ミクロンの範囲のサイズの粒子を開示する。これらは、腸内のｐＨに入った時に少なくとも部分的に安定した縣濁液を形成し、その後、胆汁塩を結合（バインド）する。
【００８９】
如何なる混合物においても、合成粒子の粒子サイズは、混合物のあらゆる粒子につて同一ではない。ある所定の混合物は、粒子サイズの特定の分布を有する。
【００９０】
本発明の一実施例においては、粒子のある最小の割合は、例えば、０．３−２ミクロンの範囲の粒子サイズを有し、あるいは他の実施例では、０．３−１．５ミクロンの粒子サイズを有する。理論に縛られる訳ではないが、このサイズの範囲は、腸内に導入された時に、粒子が部分的に安定した縣濁を形成できるために、有効である。かくして大きな粒子は、胆汁酸を結合する前に沈殿し、胆汁酸を腸から排除するのに有効でない。小さな粒子は、完全に安定した縣濁を形成するが、「胆汁酸との結合後最終的に沈む」ために有効でない場合があり、また小腸から胆汁酸を駆逐／放出するのにも有効でない。さらにまた小さな粒子は、酵素による消化により曝され易くなる。
【００９１】
かくして本発明の一実施例においては、上記のサイズの範囲の粒子は、胆汁塩を除去するのに有効である。それゆえに本発明の一実施例においては、錯体粒子のある最小割合は、重量またはその数で、目標サイズの範囲内にあるサイズを有する。本発明の開示によれば、粒子サイズの数の分布と粒子サイズの質量分布は、サンプルの少なくとも０．１ｇまたは０．５ｇまたは１ｇを含む「マクロ・サンプル(macrosample)」と称する。
【００９２】
合成粒子を製造する方法の第１実施例
図１において、同図はキトサン−レシチンの合成粒子を製造する方法を表すフローチャートを示す。ステップＳ２０１において、第１溶液を生成する。これは、キトサン１．５％ｗ／ｗを０．７５％ＨＣＬに溶かし、１時間以上混合する。
【００９３】
本発明の一実施例においては、あとで形成される合成粒子が胃の中で溶けるために、必要な最小混合時間がある。本発明の一実施例においては、「低分子量」のキトサンに対しては、１時間の最小混合時間が必要であり、「中分子量」のキトサンに対しては、２時間の最小混合時間が必要であり、「高分子量」のキトサンに対しては、３時間の最小混合時間が必要である。
【００９４】
ｌ
一実施例においては、混合時間は、混合の「強さ」に依存する。例えば、激しい混合では短時間でよく、緩やかな混合では多くの時間が必要である。
一実施例においては、ステップＳ２０１の混合は、少なくとも２０時間行われる。
ステップＳ２０３においては、７．５％ｗ／ｗのレシチンが水に溶解し、第２溶液を形成する。
【００９５】
ステップＳ２０５において、溶液を所定の比率で混合する。最終的に形成される合成粒子内のキトサンのレシチンに対する比率は、第１溶液と第２溶液の比率を制御することにより制御される。ステップＳ２０５において、合成粒子は溶液で形成される。
【００９６】
ステップＳ２０７において、合成粒子を含む混合溶液を噴霧乾燥して、粉末形態に変える。合成粒子のサイズは、ステップＳ２０５の溶液の温度を制御することにより、かつ噴霧乾燥するステップＳ２０７の前に溶液中に粒子が残存する時間を制御することにより制御される。
【００９７】
本発明者は、第１溶液と第２溶液を１５分間２５℃で混合すると、良好な結果が得られることを見出した。所望の０．３−１．５ミクロンの粒子又は所望の０．３−２ミクロンの粒子が、大部分を占める。
【００９８】
理論に拘る訳ではなく、キトサンとレシチンを混合することにより生成される粒子のサイズは、混合時間を長くし反応温度を上げることにより、増加することが分かった。大き過ぎる粒子は、ｐＨ７では十分安定せず、腸内のｐＨにおいては、胆汁塩の結合が発生する前に沈殿してしまう。長くかつ高い温度で混合すると、大き過ぎる合成粒子が発生してしまう。
かくして一実施例においては、ステップＳ２０５の混合時間は、最大５分で、温度は５０℃である。あるいは１０分間で４０℃である。
【００９９】
合成粒子を製造する方法の第２実施例
図２において、ステップＳ２０１とＳ２０３は、図１の方法と同じである。ステップＳ２０５において、溶液を所定の比率で混合する。例えば、レシチン対キトサンの質量比率は、３：１から４：１の間である。この時点で、キトサンとレシチンは、イオン結合している。
【０１００】
ステップＳ３０１において、ｐＨを７に上げる。これによりキトサンとレシチンの間の第２結合（即ち、疎水性結合）の形成が容易となり、沈殿を容易にする。これは約３０分間行われる。
【０１０１】
ステップＳ３０５において、綿状物(flocculate)を遠心分離し、濾過し、ペレットを得る。ステップＳ２０５−Ｓ３０５を繰り返して、粒子の濃度を高める（ステップＳ３０９）。ステップＳ３１３において、ペレットを酸性のｐＨ内で再度縣濁する。ステップＳ２０７において、粒子を噴霧乾燥して、粉末形状にする。
【０１０２】
合成粒子を飼料と混合する方法
合成粒子を栄養価の高い動物用飼料（即ち、タンパク質から得られたカロリーと／または炭水化物から得られたカロリーの高い栄養価密度の飼料）と混合する。一実施例においては、飼料は家禽の飼料である。この飼料は、０．１％と１％（ｗ／ｗ）の間の合成粒子を含む。
【０１０３】
他の実施例においては、栄養価密度の高い飼料は、家禽用飼料あるいは動物用飼料あるいはその組み合わせである（例えば、若鶏、クランブル、生長植物、産鶏卵鶏、マッシュ（穀粒、ふすま、ひき割りなどを混ぜ、湯で煮て溶かした馬牛その他家畜の飼料）、ペレット、まき餌、幼動物飼料（発育促進のための）である）。一般的に飼料の成分は、アミノ酸、ふすまカルシウム、濃厚飼料（穀物・豆かす・油かすなど）、トウモロコシ、元素（elements)、胚芽、穀物、粗粒砂岩（鳥が消化を助けるために食べる砂その他の粒状物）、ケルプ（コンブ目・ヒバマタ目の漂着性の大型褐藻）、シャープス（ふすまなどを混ぜた粗くひいた資料用穀物）、ミネラル、タンパク質、trace elements(微量元素)、ビタミンで、その内１つもしくはそれ以上の成分を含み、少なくとも１００ｇ当たり１００キロカロリーを有する。飼料は、合成粒子で栄養価を高め飼養する動物に応じ異なる。
【０１０４】
他の界面活性剤
本発明の一実施例によれば、陰イオン性又は非イオン性の界面活性剤が使用される。陰イオン性界面活性剤の一例は、リン脂質、胆汁塩、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(sodium lauryl ether sulfate)、クエン酸エステル系モノグリセリド(citric acid esters of monoglycerides)、ナトリウム、カルシウムまたはステアロイル乳酸(acid stearoyl lactylate)、クエン酸ステアリル(stearyl citrate)、脂肪酸または塩、ジアセチル酒石酸エステル・モノグリセリド(diacetyl tartaric acid esters of monoglycerides)、あるいはそれらの組み合わせを含む。非イオン性界面活性剤の一例は、セチル・アルコールとオレイル・アルコールを含む。
【０１０５】
一実施例によれば、陰イオン性界面活性剤は、リン脂質、レシチン（ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine））を含む、これは１、２-ジアシル-スズ-グリセロ-３-ホスファチジルコリンあるいはホスファチジルコリン（PtdCho)で、その化学構成は次式で表される。
式３
2010511403.tif 000005
【０１０６】
用語「レシチン」は、化学分野、生化学分野で使用される場合には、市場で使われている場合とは異なる意味を持つ。化学分野においては、レシチンはホスファチジルコリンであり、市場で用いられる場合には、レシチンは、中性脂質（neutral lipid）と極性脂質（polar lipid ）の天然混合物を指す。ホスファチジルコリンは、極性の脂質であり、市販のレシチン内に濃度は２０−９０％ある。市販されているレシチン製品の大部分は、約２０％のホスファチジルコリンを含む。
【０１０７】
ホスファチジルコリンを含むレシチンは、野菜、動物、微生物から生成され、主に野菜から生成される。大豆、ヒマワリ、セイヨウアブラナの種子（菜種）は、市販されているレシチンの主要な植物源である。大豆は最も一般的な物である。食物用のレシチンは、ＧＲＡＳ（Generally Recognized as Safe: 米国食品医薬品局合格証；食品に有害成分が含まれていないことを米国食品医薬局（ＦＤＡ）が判定を下す）と見なされる。鶏卵の黄身のレシチンは、栄養サプリメントのレシチンの主要源ではない。鶏卵自体は、６８％から７２％のホスファチジルコリンを含み、大豆は、２０％から２２％のホスファチジルコリンを含む。
【０１０８】
植物と動物から得られたホスファチジルコリンの脂肪酸組成（makeups）は異なる。飽和脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸は、大豆レシチンの１９〜２４％を占め、モノ不飽和脂肪オレイン酸は９〜１１％で、リノール酸は５６〜６０％、アルファリノール酸は６〜９％を資する。鶏卵の黄身のレシチンでは、飽和脂肪酸、パルミチン酸、ステアリン酸は、鶏卵のレシチンの４１〜４６％を占め、オレイン酸は３５〜３８％、リノール酸は１５〜１８％、アルファリノール酸は０〜１％とそれぞれ占める。不飽和脂肪酸は、主にグリセリンの第二炭素あるいは中炭素と結合する。
【０１０９】
レシチンは、他の界面活性剤に対し幾つかの利点がある。例えば、レシチンは、胆汁塩錯体の生来部分であり、安く、かつ胆汁酸で十分認識できる。
【０１１０】
好ましくは、陰イオン性界面活性剤は、レシチン（ホスファチジルコリン）とリン脂質とを含む。このリン脂質は、鶏卵の黄身または大豆から分離されたリン脂質の画分（phosphatide fraction）の主要成分である。レシチンは、他の界面活性剤に対し幾つかの利点がある。例えば、レシチンは、胆汁塩錯体の不可欠な要素であり、安くかつ胆汁酸で十分認識できる。
【０１１１】
本発明の実施例において、キトサンに代わる物として、他の正電荷を持つ適宜のポリマーを用いることができる。この正電荷を持つポリマーの一例は、ポリアミン、例えば、ポリリシン（polylysine）とポリアミドアニン（polyamidoanine）である。本発明の実施例によれば、高分子量のキトサンを使用するのが好ましい。その理由は、低分子量のキトサンは、疎水性が低く、それゆえに本発明の混合物では余り有効ではない。高分子量のキトサンの好ましい範囲は、５×１０５−３×１０６ダルトンである。
【０１１２】
合成粒子内のレシチンのキトサンに対する比率は、幾つかのファクターに基づいて変わる。例えば、キトサンの分子量または使用されるレシチンの種類である。本発明の一実施例においては、この比率は、例えば、１：０．２〜５：１の範囲である。リン脂質を多量に含むレシチンを使用する場合には、この範囲は、例えば、０．２：１、０．２５：１、０．４：１、０．６：１、１：１、１．２：１、２：１、２．８：１、３：１、４：１、５：１である。より好ましくは、この範囲は、３：１〜４：１の範囲であり、例えば、３：１、３．３：１、３．５：１、３．７：１、４：１である。
【０１１３】
混合物内のキトサンの濃度は、１％（ｗ／ｗ）以下である。例えば、０．１％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．３％、１．５％、１．７％、２％、２．５％（ｗ／ｗ）である。
混合物内のレシチンの濃度は、０．１％〜７．５％（ｗ／ｗ）の範囲であり、あるいはその中の範囲である。
【０１１４】
本発明のさらなる目的、利点あるいは新たな特徴は、本明細書の実施例を参照することにより当業者には明らかである。ただしこの実施例は、本発明の範囲を制限するものではない。さらにまた様々な実施例また本発明の態様は、上記したとおりである。本発明の特許請求の範囲は、以下の実施例で実験的に支持ートされている。
【０１１５】
本発明のある種の特徴は、ここの実施例に明確に記載されているが、１つの実施例の中で組み合わせとしても示されている。逆に本発明の様々な特徴は、１つの実施例の中にそれぞれ開示されている。
【０１１６】
材料と製造方法
材料
低分子量のキトサン（１００，０００ｇ／ｍｏｌ（ＳＫ−１０）でアセチル化率２０％）と、高分子量のキトサン（２．８×１０６ｇ／ｍｏｌ（ＳＫ−１００）でアセチル化率９％）を、日本にある甲陽ケミカル株式会社から入手した。
部分的に加水分解したレシチンを、これは濃厚なリン脂質（ＨＬ５０ＩＰ）となるが、ドイツにあるカーギル社（米国の穀物商社大手）から入手した。
【０１１７】
準備の方法
ＳＫ−１０キトサン
低分子量ＳＫ−１０キトサン（１％）を０．５％ＨＣＩに入れた溶液と、水にレシチン（１０％）を入れた溶液を、２５℃で２４時間掻き混ぜて、用意した。各溶液のｐＨは、３．２に調整した。
２つの溶液を、１５分間２５℃で、レシチン対キトサン比率が１：１、２：１，３：１、４．１となるように混合して、縣濁液を得た。
【０１１８】
サンプルを取り出してサイズの分布とかくして形成された粒子のゼータ電位（eta potential）を調べた。その結果を表１に示す。
縣濁液は、１時間攪拌し、その後噴霧乾燥機（BUCHI mini spray dryer B-290）に移した。噴霧乾燥機の入口温度は１２０℃であり、吸引器のレベルは７０％で、ポンピングのレベルは２５％であった。
【０１１９】
かくして形成された粉末を最初に塩化水素酸（ｐＨ３．０）で再縣濁して、濃度０．２５％ｗ／ｗのキトサンとレシチンの濃度を変えた粒子の縣濁液を形成した。レシチン対キトサンの様々な比率は次のとおりである。
表１
粉末中のレシチン/SK-10キトサンの比率    分散したレシチンの濃度（％重量）
０．６                                  ０．１５
１．２                                  ０．３
２．８                                  ０．７
４                                      １
５                                      １．２５
【０１２０】
０．２５ｇをかくして得られた粉末のそれぞれから取り出し、２０ｍｌのＨＣＩ（ｐＨ３．０）内で３０分再縣濁して、人間の胃の状態を模擬した。この溶液を、その後、ＮａＯＨと３０ｍｌのリン酸塩緩衝液で中性化した。このリン酸塩緩衝液は、（単位ｎＭ：ミリモルで）１０８ＮａＣｌ、４．７ＫＣｌ、１．８ＮａＨ２ＰＯ４、１５ＮａＨＣＯ３、１．２ＭｇＳＯ４、１．２５ＣａＣｌ２を含む。かくして溶液のｐＨを６．８にし、人間の小腸の状態を模擬した。
粒子の分散と安定性を、リン酸塩緩衝液内で３時間経過後に、デジタルカメラで記録した。その結果を図３に示す。
【０１２１】
ＳＫ−１００キトサン
低分子量ＳＫ−１００キトサン（１％）を０．５％ＨＣＩに入れた溶液と、水にレシチン（１０％）を入れた溶液を、ＳＫ−１０キトサンの場合と同様に用意した。
かくして形成された粉末を最初に塩化水素酸（ｐＨ３．０）で再縣濁して、濃度０．２５％ｗ／ｗのキトサンとレシチンの濃度を変えた粒子の縣濁液を形成した。レシチン対キトサンの様々な比率は、次のとおりである。
表２
粉末中のレシチン/SK-100キトサンの比率    分散したレシチンの濃度（％重量）
１．２５                                ０．３
２                                      ０．５
２．８                                  ０．７
４                                      １
５                                      １．２５
【０１２２】
サンプルを取り出してサイズの分布とかくして形成された粒子のゼータ電位を調べた。その結果を表１に示す。
０．２５ｇをかくして得られた粉末のそれぞれから取り出し、ＨＣＩに再縣濁して、燐酸バッファ液内でｐＨを６．８に調整した。これは、ＳＫ−１０キトサンの場合と同様である。
粒子の分散と安定性を、リン酸塩緩衝液内で、５分経過後（図４Ａ）、３０分経過後（図４Ｂ）、３時間経過後（図４Ｃ）に、デジタルカメラで記録した。
【０１２３】
キトサン−レシチン粒子と胆汁酸との間の相互作用の試験管内モデル
胆汁酸と本発明のキトサン−レシチン粒子の間の相互作用を検証するために、試験管モデルを用意した。これは次の仮定に基づく。可溶性で遊離の胆汁酸派生物であるコール酸ナトリウム（sodium cholate）が粒子により結合され、その結果、上澄み中のコール酸ナトリウムの量が減少する。この方法で上澄み中に残った遊離胆汁酸を測定した。これは様々な比率のレシチン粒子とキトサン粒子をコール酸ナトリウムで混合し、遠心分離し濾過処理した後、溶液中に残存した可溶の未結合のコール酸塩（cholate）から結合されたコール酸塩を取り除いた後に行った。
【０１２４】
リン酸塩緩衝液内のコール酸塩の比色定量分析（colorimetric analysis: 化学物質の色の強度を計測することによってその物質の濃度を決定する方法）を行った。これは非特許文献９に開示されている。この方法を簡単に述べると、コール酸塩を含む酢酸溶液をフルフラール（furfural: アルデヒド基を有する無色・油状の液体；主に合成樹脂・合成繊維の製造、潤滑油精製の際の溶剤に用いる）と硫酸で処理した時、現れる色（発色）基づく。吸収性とコール酸ナトリウム（sodium cholate）の濃度との間の関係を最初に検証する。これにより比色定量分析が、コール酸塩の濃度を測定するのに適宜の方法であることが確認された。その結果を図５に示す。
【０１２５】
０．２５％ｗ／ｗの高分子量のキトサン（ＳＫ−１００）と、０．５％ｗ／ｗのコール酸ナトリウムをレシチンの量を変えて用意した。レシチンとキトサンの比率は以下のとおりである：
表２
粉末中のレシチンとキトサンの比率    分散した状態のレシチンの濃度（％重量）
１．２５                                    ０．３
２                                        ０．５
２．８                                      ０．７
４                                          １
５                                        １．２５
【０１２６】
粒子を上記した方法で準備し、ＨＣＬ内で３０分間縣濁した。その後、この粒子をｐＨ６．８のリン酸塩緩衝液内に移し、コール酸ナトリウムで３０分間混合することによりテスト溶液を準備した。その後、粒子を遠心分離し濾過して、上澄み液内の粒子と遊離コール酸塩とを分離した。その後、比色定量分析を行った。リン酸塩緩衝液内のキトサン−レシチン粒子からなる制御物は、コール酸ナトリウムを持ちいずに、腸内媒体においてある種の吸収があった。比色定量分析の結果を表２に示す。
【０１２７】
家畜を飼養するためのレシチン−キトサン粒子の準備
動物の実験用に使用するために十分な量の粒子を製造するために、１時間当たり１６リットルの噴霧乾燥機を使用した。この噴霧乾燥機を使用したことにより、０．５ｇから１ｋｇの粒子が１日に製造できた。キトサンの溶液（１％）を乳酸内で溶かし、２４時間２５℃で攪拌した。水中のレシチン（１０％）を、２５℃で２４時間攪拌することにより確保した。この溶液のｐＨは３．３に調整された。
この２つの溶液（レシチン：キトサンの比率は、１：１〜４：１）を４５℃で５分間混合した。その後、噴霧乾燥機に移した。レシチン：キトサンの比率が、１：１、２：１、３：１のサンプルを５０％のマルトデキストリン（maltodextrin:麦芽糖を含んだデキストリン；食品添加物）で混合して、乾燥サンプルを得た。３．５：１と４：１のサンプルを８０％のマルトデキストリンで乾燥させた。
【０１２８】
鶏用飼料
表１：鶏の飼料組成
計算上の解析                    鶏の食餌
タンパク質（％）                １７．０
カルシウム（％）                ３．８０
リン（％）                      ０．５３
塩（％）                        ０．３０
熱量（Ｋｃａｌ／１００ｇ）      ２７５
【０１２９】
飼料の混合物
飼料混合物１：ベース飼料のみ
飼料混合物２：０．２５％のドーズ量で混合したキトサン粉末で混合したベース飼料
飼料混合物３：０．４％のドーズ量で混合したキトサン粉末で混合したベース飼料
飼料混合物４：（ｉ）０．１％のドーズ量で混合したキトサン粉末と（ｉｉ）０．１％のドーズ量で混合したレシチン粉末で混合したベース飼料
飼料混合物５：（ｉ）０．１２５％のドーズ量で混合したキトサン粉末と（ｉｉ）０．２％のドーズ量で混合したレシチン粉末で混合したベース飼料
飼料混合物６：（ｉ）０．１２５のドーズ量で混合したキトサン粉末と（ｉｉ）０．３％のドーズ量で混合したレシチン粉末で混合したベース飼料
飼料混合物７：０．２５％のドーズ量で、レシチン：キトサン比率が２：１のキトサン−レシチン粉末で混合したベース飼料
飼料混合物８：０．２５％のドーズ量で、レシチン：キトサン比率が３：１のキトサン−レシチン粉末で混合したベース飼料
飼料混合物９：０．２５％のドーズ量で、レシチン：キトサン比率が３．５：１のキトサン−レシチン粉末で混合したベース飼料
飼料混合物１０：０．２５％のドーズ量で、レシチン：キトサン比率が４：１のキトサン−レシチン粉末で混合したベース飼料
飼料混合物１１：０．４％のドーズ量で、レシチン：キトサン比率が４：１のキトサン−レシチン粉末で混合したベース飼料
飼料は、粗く砕いた飼料であり、全ての混合物に対して同一でＮＲＣ−９４の要件を満たしている。
飼料混合物７、８、９は、５０％のマルトデキストリン（malto-dextrin）で薄めた。
飼料混合物１０、１１は、８０％のマルトデキストリンで薄めた。
【０１３０】
動物実験方法：
１１０羽の鶏を、１０羽の鶏からなる１１のグループに分けた。全ての鶏の年齢は、７４週である。
最初の６つのグループは、対照群（control group: 同一実験で実験要件を加えないグループ）であり、キトサン−レシチン合成粒子のキトサン−レシチン粉末（即ちレシチンに化学結合したキトサンで）を給餌していない。残りの５つのグループには、キトサン−レシチン合成粒子のキトサン−レシチン粉末を給餌した。
試験群１には飼料混合物１を給餌し、試験群２には飼料混合物２を給餌した。以下同様である。即ちＮ番目の試験群には、Ｎ番目の飼料混合物を給餌した。ここではＮは、１と１１の間の正整数である。
鶏には１日当たり１２０ｇの飼料を４５日間与えた。実験の間、鶏の生理機能と鶏卵の品質をモニターした。
【０１３１】
鶏における測定
鶏の測定は、以下を測定することにより評価した：
体重：鶏を実験の開始時と終了時に個々に体重を量った。飼料の消費をバタリーケージ（battery cage：鶏などを飼育するためのかご）当たり計算した。１日当たりの死亡数を記録した（生死を記録した）。鶏卵の産出高（雛−１日当たりの産出量）を毎日記録した。飼料の効率と鶏卵の重量を毎週測定した（その日に産出した鶏卵を収集した後に行った）。
【０１３２】
鶏卵の品質の測定
鶏卵の殻の品質−％灰分(ash)を決定した。これは鶏卵の殻の厚さを表す。
鶏卵の殻の品質は以下の方法でテストした。鶏卵の重量を個別に測定し、鶏卵を割り、殻を洗って、室温で鶏卵の重みを決定するため乾燥させて、膜の無い状態で鶏卵の殻の重さを測定した。全ての鶏卵は、ひびの入った鶏卵とチェックした鶏卵とを分けるよう取り扱った。
以下の基準を用いて鶏卵の殻の品質を決定した。
化学的解析：（認証されたＡＯＡＣ方法に従って）
湿度（％）、全コレステロール、黄身のコレステロール、脂肪酸プロファイルＭＵＦＡ、ＰＵＦＡ  ＳＡＴ、ＬＤＬ、ＨＤＬ
【０１３３】
実験結果
粒子サイズとゼータ電位を、様々なレシチン−キトサンの比率（ＳＫ−１０キトサン）で測定した。
形成された粒子サイズとゼータ電位を、様々なレシチン：キトサンの比率のものを以下の表に示す。
サンプル番号                  １        ２        ３        ４        ５      
レシチン濃度（％）            ０．０５  ０．０７  ０．１    ０．３    ０．７
レシチン／キトサン比（ｗ／ｗ）０．２    ０．２５  ０．４    １．２    ２．８
サイズ（ミクロン）            １．２    １．８    １．９５  １．２５  ０．９５
ゼータ電位（ｍＶ）            ＋４３    ＋４２    ＋４２    ＋３９    ＋３３
ゼータ電位は、粒子のチャージ（電荷）を表す。上記表１に示すように、ゼータ電位は、レシチン：キトサンの比率が増加すると減少する。
【０１３４】
様々なレシチン：キトサンの比率（ＳＫ−１００キトサン）の粒子サイズ
以下の表は、レシチンの様々な濃度に対する粒子の大きさを示す。実験においてキトサンの濃度は０．２５％である。レシチン：キトサンの比率は、それぞれ１．２：１、２：１、２．８：１、４：１である。
同表に示すように粒子のサイズは、時間と共にかつレシチン：キトサンの比率が増加すると共に増加する。
表：
レシチン濃度（％）    １５分後の粒子サイズ（ｎｍ）    １時間後の粒子サイズ（ｎｍ）
０．３                    ５１８                            ３８１
０．３                      ２７                            ３７９
０．５                    ５２６                          １０３０
０．５                    ７７１                          １０１０
０．７                    ５７４                            ８６１
０．７                  ２５．２                            ７７３
１                      ９３８                          １２７０
１                      ９０５                          １４６０
１．２５                １１７０                          １１８０
１．２５                １２４０                            ７８５
【０１３５】
様々なレシチン：キトサンの比率における粒子の分散と安定性
図３は、レシチン：キトサンの比率が１：１、２：１、３：１、４：１、５：１のにおけるリン酸塩緩衝液内で３時間後のＳＫ−１０の粒子の分散を示す。
図４Ａ−４Ｃは、リン酸塩緩衝液内で５分後、３０分後、３時間後のＳＫ−１００の粒子の分散を表す。図４Ａ−４Ｃに示すように、粒子は１：１のレシチン：キトサン比率の時に安定し、少なくとも３時間以上時間が経過しても沈殿しなかった。この粒子の平均サイズは、３００−４００ｎｍである。レシチン：キトサンの比率が増加すると、粒子サイズは、数百ｎｍから１または２ミクロンとなり、粒子は、溶液中で安定性を失い沈殿し始めた。
【０１３６】
粒子の沈殿は、レシチン：キトサンの比率の増加に比例して増加する。これは粒子の疎水性部分が増加する結果である。しかし粒子の急速沈殿は、粒子が胆汁酸と相互作用するのに十分な時間を与えることがなく、それゆえに３：１から４：１の混合比率が、好ましい。
【０１３７】
キトサン−レシチン粒子と胆汁酸との間の相互作用の試験管内モデル
胆汁酸と本発明のキトサン−レシチン粒子の間の相互作用を検証するために、試験管モデルを用意した。これは次の仮定に基づく。可溶性で遊離の胆汁酸派生物であるコール酸ナトリウム（sodium cholate）が粒子により結合され、その結果、上澄み中のコール酸ナトリウムの量が減少する。この方法で上澄み中に残った遊離胆汁酸を測定した。これは様々な比率のレシチン粒子とキトサン粒子をコール酸ナトリウムで混合し、遠心分離し濾過処理した後、溶液中に残存した可溶の未結合のコール酸塩（cholate）から結合されたコール酸塩を取り除いた後に行った。
【０１３８】
リン酸塩緩衝液内のコール酸塩の比色定量分析を行った。これは非特許文献９に開示されている。この方法を簡単に述べると、コール酸塩を含む酢酸溶液をフルフラール（furfural: アルデヒド基を有する無色・油状の液体；主に合成樹脂・合成繊維の製造、潤滑油精製の際の溶剤に用いる）と硫酸で処理した時、現れる色（発色）基づく。吸収性とコール酸ナトリウム（sodium cholate）の濃度との間の関係を最初に検証する。これにより比色定量分析が、コール酸塩の濃度を測定するのに適宜の方法であることが確認された。その結果を図５に示す。
【０１３９】
図５に示すように、溶液中のコール酸ナトリウムの濃度（ｍｇ／ｍｌ）と比色定量分析による吸収との間には、線形な関係が見出された。この方法がコール酸塩の濃度の測定に適切な方法であることを示す。
テスト溶液の比色定量分析の結果を以下の表に示す。
表：
レシチン（％）  0.3        0.5      0.7      1          1.25
制御            0.1549    0.1956    0.2235    0.3547    0.2786
処理            0.3182    0.6141    0.6398    0.4024    0.4316
処理-制御       0.1633    0.4185    0.4163    0.0477    0.153
【０１４０】
表に示すように、レシチンの量が増加すると、キトサン：レシチン粒子によるコール酸塩の結合が増加する。その結果、上澄みにコール酸塩が少なくなる。粒子中にレシチンの量が増加すると、粒子の疎水性特徴が増し、これにより、コール酸ナトリウムの疎水性サイトに対する粒子の親和性が改善する。
【０１４１】
上記の表の実験結果から、レシチン：キトサンの比率が２：１と３：１における溶液中に残留するコール酸塩の量（ｍｇ）を計算した。これは、０．４１８５のＯＤは０．７４ｍｇのコール酸ナトリウムに等しいことに基づいて行った。この量の４０％がレシチン：キトサンの比率１：１の溶液で残り、１２％が比率４：１の溶液で残り、３７％が比率５：１の溶液で残る。以下同様に、６０％、８８％、６３％のコール酸塩が、それぞれレシチン：キトサンの比率１：１、４：１、５：１の溶液で吸収される。
【０１４２】
レシチン：キトサンの比率が１：１の粒子に対しては、サイズの影響は疎水性の影響よりも遥かに大きい。その理由は、直径０．４μｍのナノ粒子は、大きな表面積を有するので、これらはより溶け易くなるが、より高い比率で形成された粒子よりも疎水性は低くなる。これらの粒子は、約６０％のコール酸ナトリウムを吸収した。一方で、このナノ粒子により吸収された胆汁塩は、加水分解を受けずに腸内を通過できず、その結果、粒子から急速に分離されて腸内に残る。それゆえに本発明の混合物に対し、マイクロ粒子（microparticle）を用いるのが好ましい。
【０１４３】
結論としては、胆汁塩の吸収度合いを測定する生体外実験は、粒子により捕獲されその後に人体から便として排出される胆汁塩の量の定量化には不十分である。試験管内動物の研究において、糞を通して排出される胆汁塩の量を正確に定量化する必要がある。
【０１４４】
鶏の実験に対する予測結果
鶏の最適な飼料を微調整した後、予測される結果は、鶏卵のＬＤＬ容量を最大３０％減らすことができる。
【０１４５】
以上の説明は、本発明の一実施例に関するもので、この技術分野の当業者であれば、本発明の種々の変形例を考え得るが、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
以上の説明において、用語「Ａ又はＢ」は、「Ａのみ」「Ｂのみ」ならず、ＡとＢの両方を含むと解釈できる。用語「Ａを有する」はＡ以外のものを排除する意はない。
【符号の説明】
【０１４６】
Ｓ２０１：キトサン（１．５％）を０．７５％ＨＣＩ内で溶解し、これを１時間以上混合          して第１溶液を得る。
Ｓ２０３：レシチン７．５％を水中で溶解して第２溶液を得る。
Ｓ２０５：第１溶液と第２溶液を所定の比率（例、キトサン：レシチンが０．２：１から          ５：１の間の比率）でｐＨ３．５で混合する。
Ｓ２０７：噴霧乾燥して粉末形態にする。
Ｓ３０１：ｐＨを７に上げる。
Ｓ３０５：遠心分離または綿状沈殿物を濾過する。
Ｓ３０７：必要に応じステップＳ２０５−Ｓ３０５を繰り返す。
Ｓ３０９：濃縮する。
Ｓ３１３：酸性ｐＨ内で濃縮物を再縣濁する。
図５：    溶液中の遊離コール酸ナトリウムの標準カーブ；横軸（コール酸ナトリウム）
レシチン／キトサンの比（Ｗ.Ｗ）レシチン濃度（％）溶液中の遊離コール酸ナトリウム
１：１                      ０．３              ０．１６３３
２：１                      ０．５              ０．４１８５
３：１                      ０．７              ０．４１６３
４：１                      １                  ０．０４７７
５：１                      １．２５            ０．１５３
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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