(57)【要約】  本発明は、高い効率で、容易に実行でき、工業的レベルで適用可能な、クロストリジウム菌においてＤＮＡ配列を置換または削除する新規の方法に関する。本方法はクロストリジウム菌において、所定のやり方をもって、数個の遺伝子座を改変するのに有益である。本方法は、少なくとも二つのマーカー遺伝子をもつ複製ベクターに基づいている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム菌における相同組み換えにより標的ＤＮＡ配列を置換する法であって、
−前記菌株を、
−クロストリジウム菌で複製可能な複製起点、および
−置換カセットの組み換えを可能にする、標的ＤＮＡ配列のまわりの選択された領域と相同な２つの配列に挟まれた第１のマーカー遺伝子を含んでなる置換カセット、および
−第２のマーカー遺伝子、
を含んでなるベクターで形質転換すること、
−第１のマーカー遺伝子を発現する、前記カセットがゲノムに組み込まれた菌株を選別すること、
−第２のマーカー遺伝子を発現しない、前記ベクターが除去された菌株を選択すること、
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記第２のマーカー遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第２のマーカー遺伝子が、カウンターセレクション可能なマーカーである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記カウンターセレクション可能なマーカーが、不在または欠失された非必須の遺伝子の活性を回復させる遺伝子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記カウンターセレクション可能なマーカーが、ｕｐｐ遺伝子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが、前記ベクターを除去した菌株のネガティブ選択を可能とする第３のマーカーを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ベクターが、エンドヌクレアーゼでの消化によって除去される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターが、制限エンドヌクレアーゼで認識され、同時に、使用されるクロストリジウム菌株のゲノムに不在のＤＮＡ配列を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記の使用されるクロストリジウム菌株が、ベクターに存在する制限部位に特異的で、任意に誘導可能なプロモータの制御下で発現する、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼをそのゲノム上に有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のマーカー遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のマーカー遺伝子が、２つのリコンビナーゼ標的部位に挟まれている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のマーカー遺伝子が、相同組み換え事象が起こった後、リコンビナーゼの作用によって除去される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リコンビナーゼが、菌株に導入された第２のベクターによって運ばれた遺伝子によって発現される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リコンビナーゼ標的部位が、ＦＲＴ配列であり、前記リコンビナーゼがＦＬＰリコンビナーゼである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
標的ＤＮＡ配列のまわりの領域に相同な前記配列が、組み換え事象に用いられる塩基対の最大１０％までの変異を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記の形質転換されるクロストリジウム菌が、制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を欠失される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記の形質転換されるクロストリジウム菌が、ＤＮＡ分解酵素をコードする遺伝子を欠失される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記の形質転換されるクロストリジウム菌が、ｕｐｐ遺伝子を欠失される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
クロストリジウム菌株が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｊｅｉｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ（現Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ（現Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ（現Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）の中から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記クロストリジウム菌株が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記の形質転換されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ株が、Δｃａｃ１５である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記の形質転換されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ株が、Δｕｐｐである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記の形質転換されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ株が、ΔＣａｃ１５Δｕｐｐである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
同じクロストリジウム菌株において、相同組み換えによって二つ以上の標的遺伝子を置換する方法であって、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法が２回以上連続して行われる、方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法によって得られる、組み換えクロストリジウム菌株。
【請求項２６】
ｃａｃ１５遺伝子が欠失された、請求項２５に記載の組み換えクロストリジウム菌株。
【請求項２７】
ｕｐｐ遺伝子が欠失された、請求項２５に記載の組み換えクロストリジウム菌株。
【請求項２８】
ｃａｃ１５遺伝子およびｕｐｐ遺伝子両方が欠失された、請求項２５に記載の組み換えクロストリジウム菌株。
【請求項２９】
請求項１〜１５のいずれか一項で定義されるようなベクター。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
クロストリジウム菌（Clostridia）は、グラム陽性、嫌気性、低ＧＣ含量細菌であり、溶媒、特にブタノール、エタノールおよびアセトンだけでなく、１，３プロパンジオールのようなジオール、酢酸、酪酸、乳酸といった有機酸、およびワクチンを生産する能力のため工業的に広く利用されている。
【０００２】
組み換えクロストリジウム菌の構築は、当分野における開発の重要な部分である。クロストリジウム菌株は工業的能力の向上のために遺伝子的に改変される。
【０００３】
これらの改変を実行するために、相同的組み換えはあらゆる種の生物において最も多く用いられる技法である。いくつかの微生物における形質転換および相同的組み換えは、技術的に詳しく説明されている。例えば、（Datenko and Wanner; PNAS, 2000）および（Fabret et al.,Molecular Microbiology, 2002）を参照。
【０００４】
クロストリジウム菌は本来形質転換が可能ではなく、現在形質転換のために利用できる方法は効率が悪く、複数の変異を導入することができない。このことは、当分野において工業的開発を妨げてきた。
【０００５】
クロストリジウム菌は、通常、外来ＤＮＡを形質転換のために細胞に導入する前後に、外来ＤＮＡを分解する細胞外ＤＮＡ分解酵素および制限酵素を生産する。この生物では、大腸菌および酵母など多くの微生物ではうまくいくＰＣＲ断片の導入に基づいた従来の方法が実行可能でない。なぜなら、組み換えられるＤＮＡ構築物の細胞外および細胞内半減期が、著しく短く、組み換え効率が一般に低いからである。他の生物においては、これらの困難は、宿主内複製するベクターを用いること、故に組み換え事象の可能性を増加させることによって回避されてきた。それでもなお、組み換え事象の後、その時点で完全な目的ＤＮＡ配列を持つベクターが除去されなければならない。この問題は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ（Biswas et al, J Bacteriol., 1993）においては、非許容温度で除去されうる温度感受性レプリコンを用いることによって解決された。これらの性質を持つベクターで、現在クロストリジウム菌に利用できるものはない。従って、クロストリジウム菌において、これまで、変異体の構築は著しく労力を要し、多くの場合成功しなかった。
【０００６】
クロストリジウム菌における遺伝子の不活性化は、次の文献に報告されている（表１参照）。
【表１】
2010505398.tif 000002
【０００７】
クロストリジウム菌において、遺伝子の不活性は、目的菌株で複製可能でない環状ＤＮＡを用いた形質転換によって、これまで実行されてきた。クロストリジウム菌に存在するＤＮＡ分解酵素およびＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼは、導入されたＤＮＡを急速に分解し、この属における組み換え効率は一般にあまり高くないので、変異体の獲得は著しく労力を要するものであった。
【０００８】
加えて、これまで記述されてきた組み換え菌株（上記参照）は、すべてＭＬＳまたはクロラムフェニコール耐性であり、組み換え事象がおこった後、対応するマーカー遺伝子は、取り除かれることができない。これは、可能な組み換えの数を、この細菌で使用可能な耐性マーカーの数、最大３に制限する。更に、これら細菌の工業的利用にとって、培養培地への抗生物質耐性遺伝子の放出を避ける為に、マーカーの無い菌株を得ることは有益であるかもしれない。
【０００９】
その上、１回の組み換事象によって得られたこれら菌株では、選択圧力なしで培養された場合に安定でないという不利な点をもつものがいくつかある。
【００１０】
従って、同じ菌株で連続したＤＮＡ配列置換を可能にし、その結果、遺伝子的に安定でマーカーの無い組み換えクロストリジウム菌を得る、高い効率で、組み換え株を選択する工程が容易であるクロストリジウム菌の形質転換の方法が、依然として、最新技術において必要である。
【００１１】
本発明は、実行が容易で、工業的レベルで適用可能な、クロストリジウム菌においてＤＮＡ配列を置換または削除する新規な方法に関する。この方法はクロストリジウム菌において、所定のやり方をもって、数個の遺伝子座を改変するのに有益である。
【００１２】
この方法は、高効率でクロストリジウム菌を形質転換するのに有益な複製ベクターに基づく。
【００１３】
この新しい方法で、耐性カセットをゲノムから除去し、これをＤＮＡ配列置換の連続した巡回において再利用することによって、数に制限のない変異が、ゲノムに導入されうる。
【００１４】
複数の変異を効率的にクロストリジウム菌へ導入することで、業界は現存の工業的菌株を向上し、新しいプロセスを開発することができるはずである。
【本発明の詳細の説明】
【００１５】
本発明は、クロストリジウム菌において相同組み換えにより標的ＤＮＡ配列を置換するための方法を提供する。該方法は、
−前記菌株を、
−クロストリジウム菌における複製を可能とする複製起点、および
−置換カセットの組み換えを可能にする、目的遺伝子配列のまわりの選択された領域と相同な２つの配列に挟まれた第１のマーカー遺伝子を含んでなる置換カセット、および
−第２のマーカー遺伝子、
を含んでなるベクターで形質転換すること、
−第１のマーカー遺伝子を発現する、前記カセットがゲノムに組み込まれた菌株を選択すること、
−第２のマーカー遺伝子を発現しない除去された前記ベクターを持つ菌株を選択すること、
を含んでなる。
【００１６】
本発明を実現するすべての分子生物学技法は、（Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, by Sambrook, Fritsch, and Maniatis）に十分に説明されている。
【００１７】
本発明の文脈において用いられる、目的ＤＮＡ遺伝子配列の「置換」という語は、本来の配列と異なる配列が目的ＤＮＡ配列の遺伝子座に導入されることを意味する。
【００１８】
本発明によると、ＤＮＡ配列は遺伝子または遺伝子間配列として定義される。共にプロモータまたは制御配列を含んでなりうる。
【００１９】
「標的ＤＮＡ配列」という表現は、当業者によって選択されるいかなる対象の遺伝子、遺伝子間領域、プロモータまたは制御配列を意味する。特に、例えば細胞代謝に係わる酵素など対象のタンパク質をコードする遺伝子を意味する。
【００２０】
置換・挿入されるＤＮＡ配列は遺伝子をコードしていても、していなくてもよい。標的遺伝子、プロモータ、制御配列および／または抗生物質耐性遺伝子または色を発する酵素などのマーカーの変異した配列でも良い。二つの相同領域を隔てる距離によって、置換された配列より長くても短くても良い。
【００２１】
挿入により、目的遺伝子の発現は、普通は乱されたり、一部または完全に抑制されたり、または増加される。元のＤＮＡ配列に類似しているが変異を含む配列で標的ＤＮＡ配列を置換することは、変異されたタンパク質、プロモータまたは制御配列の実際の発現を導く。
【００２２】
標的ＤＮＡ配列の置換が結果として前記ＤＮＡ配列の完全な除去を付与する場合、遺伝子は「欠失された」としてみなされる。
【００２３】
「相同組み換え」という表現は、ＤＮＡのセグメントを同一領域（相同性）またはほとんど同じ領域を有する他のＤＮＡに置換することの事象を指す。この事象は、またＤＮＡ交差とも呼ばれる。
【００２４】
「形質転換」という語は、細胞による外来の核酸の取り込みを意味し、この新しい遺伝子の獲得は、一時的（遺伝子を運ぶベクターが取り除かれる場合）または永久的（外来ＤＮＡが染色体に組み込まれる場合）である。
【００２５】
「ベクター」という語は、遺伝子またはカセットを運ぶ染色体外要素を意味し、通常環状２本鎖ＤＮＡ分子の形であるが、１本鎖ＤＮＡ分子でもあり得る。「ベクター」および「プラスミド」という語は区別無く用いられる。
【００２６】
本発明によるベクターは複製ベクターである。少なくとも一つの複製起点を、好ましくは数個の複製起点を含み、該ベクターを異なる種で機能させる。
【００２７】
特に、好ましいベクターは、
−大腸菌で機能するＯｒｉ、
−クロストリジウム菌で機能する、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｐＩＭ１３からのＲｅｐＬ（Mermelstein et al, Biotechnology, 1992）
の２つの複製起点を含みうる。
【００２８】
「標的ＤＮＡ配列と相同な配列」という表現は、標的配列の選択された領域に高い配列類似を有する配列を指す。
【００２９】
「マーカー遺伝子」という語は、クロストリジウム菌において機能する調整要素の制御のもとで、マーカーたんぱく質をコードしている配列を指す。そのようなタンパク質は、当技術分野では周知である。例えば、当業者は抗生物質耐性遺伝子、蛍光もしくは発色マーカー、または独立栄養性のマーカーを利用することができる。有益なマーカーの例は下記に示される。
【００３０】
組み換え事象が起こった後、ベクターはその時点で完全な標的ＤＮＡ配列を有し、ひいては、除去されなければならない。複製ベクターの除去は、通常、コロニーの連続培養で起こり、続いて、そのベクターが除去されたコロニーがネガティブまたはポジティブ選択される。ベクターの除去は、また、ベクターに存在するＤＮＡ配列を特異的に切断するエンドヌクレアーゼを用いた、プロセスの能動的なステップでもあり得る。いったんベクターが取り除かれると菌株は第２のマーカー遺伝子をもはや発現せず、菌株はこの性質に基づいて選択することができる。
【００３１】
本発明の特定の実施態様において、第２のマーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子である。有用な抗生物質耐性遺伝子のうち、当業者はどれが最も適切か知っているであろう。例えば、次の遺伝子を使用することができる。クロラムフェニコールおよびチアンフェニコールに対する耐性を与えるＣａｔＰ遺伝子、またはエリスロマイシン耐性を付与するＭＬＳＲ遺伝子である。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様において、第２のマーカー遺伝子はカウンターセレクション可能なマーカー遺伝子である。
【００３３】
カウンターセレクション可能な（counter-selectable）マーカー遺伝子は、関連した基質の存在といったある条件のもとでは、その存在が宿主生物にとって致死的である遺伝子である。カウンターセレクション可能なマーカー遺伝子は、プラスミドの消失に対するポジティブ選択として用いることができる。
【００３４】
好ましくは、カウンターセレクション可能なマーカー遺伝子は、不在（absent）または欠失された（deleted）非必須の内在性遺伝子の活性を回復させる遺伝子である。
【００３５】
最も多く用いられるカウンターセレクション可能なマーカー遺伝子は、蔗糖、ストレプトマイシンまたはフザリン酸感受性を付与する遺伝子である。それらは、いくつかの細菌株において、変異株またはワクチン株を構築するのに利用されてきた。詳細は、Reyat et al., 1998, Infection and Immunityによる総説を参照。クロストリジウム菌で用いられるカウンターセレクション可能なマーカー遺伝子としては、５−フルオロ−ウラシル（５−ＦＵ）、γ（ガンマ）グルタミルヒドラジド（ＧＢＳ）、８−アゾ−２，６−ジアミノプリン（８ＡＤＰ）に対する感受性を付与する遺伝子が挙げられる。
【００３６】
好ましい実施態様において、カウンターセレクション可能なマーカーは、５−フルオロ−ウラシル（５−ＦＵ）の毒性のある産物への形質転換を促進するウラシル  ホスホリボシル−トランスフェラーゼをコードするｕｐｐ遺伝子である。Ｕｐｐ活性を有する細胞は５−ＦＵ培地では生育できない。
【００３７】
形質転換されたクロストリジウム菌がΔｕｐｐの場合、ひいては、形質転換の前およびベクターの除去の後、５−ＦＵ含有培地で生育することが可能でありこのカウンターセレクション可能なマーカーの利用は特に有用である。ベクターを除去された菌株はポジティブに選択され得る。
【００３８】
５−ＦＵの存在下でｕｐｐ遺伝子に生じうるサプレッサー変異体は、時にプラスミドの消失に関して誤った仮定を導きうる。本発明の好ましい実施態様において、ベクターは、２回目の菌株の選択が抗生物質感受性になるように、更に第３のマーカー、好ましくは抗生物質耐性遺伝子を含んでなる。このネガティブ選択は、ｕｐｐ遺伝子に基づいたポジティブ選択に加えて用いることができる。
【００３９】
本発明の好ましい実施態様において、組み換え事象が起こった後、ベクターはエンドヌクレアーゼでの切断によって除去される。好ましくは、ベクターは、制限エンドヌクレアーゼで認識され、同時に、用いられたクロストリジウム菌種のゲノムにはないＤＮＡ配列を有する。従って、ベクターは、クロストリジウム菌ゲノムの完全な状態を損なうことなしに特異的に破壊される。
【００４０】
制限エンドヌクレアーゼは、特異的な塩基配列の位置、制限エンドヌクレアーゼ部位で、ＤＮＡ分子を切断する酵素である。当分野の専門家は、対象のクロストリジウム菌のゲノムでどの制限エンドヌクレアーゼ部位が欠けているかを決定することができる。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍで適用できる可能性のある制限エンドヌクレアーゼは、ＡｓｃＩ，  ＦｓｅＩ，  ＮｏｔＩ，  ＳｆｉＩ，  ＳｒｆＩである。別の実施態様において、Ｉ-ＳｃｅＩ，  ＨＯ，  またはＩ-ＣｒｅＩのような大きな（１２−４５ｂｐ）ＤＮＡ標的部位を認識するメガヌクレアーゼを使用することができる。
【００４１】
本発明の好ましい実施態様において、形質転換されるクロストリジウム菌株は、そのゲノム上に、ベクター上に存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を認識するエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を少なくとも一つ有する。制限エンドヌクレアーゼの発現は、誘導可能なプロモータの制御下であってもよい。
【００４２】
誘導可能なプロモータは、対応するインデューサーを付加することによって標的配列の条件的な発現を可能にするＤＮＡ要素である。例えば、当分野の専門家に周知であるクロストリジウム菌の誘導可能なプロモータ系は、Girbal et al., 2003 Appl.  Env. Microbiol. 69:4985-8に記述されている。
【００４３】
組み換え事象が起こった後、およびベクターが除去された菌株のスクリーニングの前に、制限エンドヌクレアーゼの発現が誘導されうる。制限エンドヌクレアーゼが、クロストリジウム菌に存在するベクターを切断し、ベクターの除去となる。
【００４４】
菌株にベクターを導入する前に、制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子はゲノムに挿入されてもよい。
【００４５】
本発明の別の実施態様において、環状ＤＮＡと比べより良く組み換えられることが知られている直鎖ＤＮＡの細胞内の量を増加することによって、制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、プラスミドの除去の前に、組み換えの頻度も増加しうる。
【００４６】
本発明の特定の実施態様において、第１のマーカー遺伝子は、置換カセットの中央に導入される抗生物質耐性遺伝子である。
【００４７】
本発明の特定の実施態様において、第１のマーカー遺伝子は形質転換されたクロストリジウム菌株のゲノムから取り除かれてよい。特に、第１のマーカー遺伝子は、２つのリコンビナーゼ標的部位に挟まれ、次いで、相同組み換えの事象が起こった後、リコンビナーゼの作用によって除去されうる。
【００４８】
本発明の有利な実施態様において、リコンビナーゼは、対応遺伝子を運ぶ第２のベクターによって発現され、そのベクターは、クロストリジウム菌に形質転換によって導入される。
【００４９】
好ましくは、組み換え標的部位はＦＲＴ配列である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＦＬＰリコンビナーゼは、ＦＲＴ（ＦＬＰ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｔａｒｇｅｔ；ＦＬＰリコンビナーゼ標的）配列と呼ばれる特定の３４塩基対ＤＮＡ配列で活性である。これらＦＲＴ部位が２つ存在する場合、ＦＬＰ酵素は、ＤＮＡに２本鎖切断をつくり、第１のＦＲＴの末端を第２の標的配列の末端で交換し、次に、その交換鎖を再び結合する。このプロセスでその２つの部位の間に位置するＤＮＡの欠失となる。
【００５０】
本発明を実施する具体的な方法において、標的遺伝子配列のまわりの選択された領域と相同な配列は、組み換え事象に用いられるＤＮＡ断片を構成する塩基対の最大１０％までの変異を含みうる。
【００５１】
本発明の有利な実施態様において、形質転換されるクロストリジウム菌株は、制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子が欠失される。これら菌株は、事前のｉｎ ｖｉｖｏプラスミドメチル化無しに容易に形質転換可能であるという長所がある。
【００５２】
本発明の別の有利な実施態様において、形質転換されるクロストリジウム菌株は、細胞外ＤＮＡ分解酵素をコードする遺伝子が欠失される。
【００５３】
本発明の他の有利な実施態様において、形質転換されるクロストリジウム菌は、ｕｐｐ遺伝子が欠失される。
【００５４】
本発明の別の有利な実施態様において、トランスフォームされるクロストリジウム菌株は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｊｅｉｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ（現Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ  （現Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ（現Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）の中から選択される。
【００５５】
好ましいクロストリジウム菌株は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍである。
【００５６】
本発明の好ましい実施態様において、形質転換されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ菌株は、制限エンドヌクレアーゼＣａｃ８２４Ｉをコードする遺伝子が欠失されたΔＣａｃ１５株である。この菌株は事前のｉｎ ｖｉｖｏプラスミドメチル化無しに容易に形質転換が可能であるという長所がある。
【００５７】
本発明の別の好ましい実施態様において、形質転換されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ菌株は、ｕｐｐ遺伝子が欠失された、Δｕｐｐと呼ばれる株である。結果として、ｕｐｐ遺伝子を運ぶベクターでその株を形質転換することは、５-ＦＵ培地に感受性のある株の選択を可能にし、もはや５-ＦＵ培地に感受性のない、プラスミドを消失した株のポジティブ選択を可能にする。
【００５８】
形質転換されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ菌株は、また、ΔＣａｃ１５Δｕｐｐでもありうる。
【００５９】
本方法は、同じクロストリジウム菌株で２つ以上の標的遺伝子を、相同組み換えによる連続した置換のために有利に用いられる。
【００６０】
本発明は、また、本発明によるプロセスによって獲得されやすい組換えクロストリジウム菌株にも関する。本発明によるプロセスは、ｃａｃ１５遺伝子が欠失された株（Δｃａｃ１５株）、ｕｐｐ遺伝子が欠失された株（Δｕｐｐ株）、およびｃａｃ１５遺伝子とｕｐｐ遺伝子が共に欠失された株（ΔＣａｃ１５Δｕｐｐ株）といった組み換えクロストリジウム菌株を獲得するのに、有利に用いられる。
【００６１】
本発明は、また、上記のように、株を形質転換するためのベクターにも関する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ｐＵＣ１８-ＦＲＴ-ＭＬＳ２ベクターのマップ。
【図２】ｐＣｏｎｓ２-１ベクターのマップ。
【図３】ｐＣＩＰ２-１ベクターのマップ。
【図４】ｐＣｏｎｓ：：ＵＰＰベクターのマップ。
【図５】ｐＣＬＦ１ベクターのマップ。
【図６】クロストリジウム菌における削除方法の概略図。                          次のステップが逐次的に実行される。                                            Ａ-標的ＤＮＡ配列のまわりの２つの選択された領域の増幅。１、２、３、４はＰＣＲプライマーを示す。                                                        Ｂ-得られたＰＣＲ断片のクローニングベクターｐＴＯＰＯへのクローニング。    Ｃ-ＰＣＲプライマーに存在するＳｔｕＩ制限酵素部位へのマーカーの挿入。      Ｄ-ｐＣＯＮＳ２．１のＢａｍＨＩ部位への置換カセットのクローニング：ｐＲＥＰ  ｃｌｏ  Ｙベクターの構築                                                  Ｅ-ｐＲＥＰ  ｃｌｏ  Ｙベクターを用いたクロストリジウム菌の形質転換        Ｆ-継代培養中の二重交差のよる置換カセットの染色体組み込み                  Ｇ-ＥｒｙＲおよびＴｈｉａｍＳ表現型のクローンの選別                        Ｈ-遺伝子置換およびプラスミド消失を検証するためのＰＣＲ分析                または、                                                                    Ｄ’-  ｐＣＯＮＳ：：ＵＰＰのＢａｍＨＩ部位への置換カセットのクローニング：ｐＲＥＰ  ｃｌｏ  Ｙ：ＵＰＰベクターの構築                                  Ｅ’-  ｐＲＥＰ  ｃｌｏ  Ｙ：ＵＰＰベクターを用いたクロストリジウム菌Δｕｐｐの形質転換                                                                Ｆ’-継代培養中の二重交差のよる置換カセットの染色体組み込み                Ｇ’-  ＥｒｙＲおよび５-ＦＵＲ（ＴｈｉａｍＳ）表現型のクローンの選別        Ｈ’-遺伝子置換およびプラスミド消失を検証するためのＰＣＲ分析
【実施例】
【００６３】
実施例１：ベクターの構築
１．１  ｐＵＣ１８-ＦＲＴ-ＭＬＳ２の構築
このプラスミドは、クロストリジウム菌で機能し、２つのＦＲＴ部位および２つのＳｔｕＩ部位に挟まれているＭＬＳｒ遺伝子を含有しており、置換カセットの構築に有用である。逆ＰＣＲ法（ＩＰＣＲ）を、Ｐｗｏ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用いて、ｐＫＤ４を鋳型プラスミドとし（Datsenko and Wanner, 2000）、オリゴヌクレオチドＰＫＤ４．１およびＰＫＤ４．２をプライマーとして、実行し、ＦＲＴ部位を含むがＫｍｒマーカーを含まないプラスミドの領域を増幅した。この平滑末端断片を、後にｐＥＴＳＰＯプラスミド（Harris et al, 2002, J. Bacteriol）のＨｉｎｄＩＩＩ消化およびクレノウ処理の後に得られたＭＬＳｒ遺伝子に連結する。次いで、対応プラスミド（ｐＫＤ４-Ｅｒｙ１）を、２つのＦＲＴ部位および２つのＳｔｕＩ部位に挟まれているＭＬＳｒ遺伝子をオリゴヌクレオチドＦＲＴ-ＭＬＳＲ-ＦおよびＦＲＴ-ＭＬＳＲ-Ｒをプライマーとし、Ｐｗｏ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応において増幅するための鋳型として用いた。この断片を、ＳｍａＩで消化したｐＵＣ１８に直接クローンし、ｐＵＣ１８-ＦＲＴ-ＭＬＳ２プラスミドを得た。（図１）
ＰＣＲプライマー：
【化１】
2010505398.tif 000003
【００６４】
１．２  ｐＣｏｎｓ２．１の構築
このプラスミドは、クロストリジウム菌で機能するｐＩＭ１３複製起点（ローリング・サークル型複製機構）、チアンフェニコール耐性を付与するｃａｔＰ遺伝子、および置換カセットのクローニングのための特有のＢａｍＨＩ部位を含む。このプラスミドをｐＥＴＳＰＯプラスミド（Harris et al, 2002, J. Bacteriol）から2段階の手順で構築し、ポリリンカーの一部およびその他の部位の中でもＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位を除去した。ＩＰＣＲをＰｗｏ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドＰＣＯＮＳＡｃｃＩおよびＰＣＯＮＳＥｃｏＲＩをプライマーとし、ｐＥＴＳＰＯを鋳型プラスミドとして行い、ＰＣＲ産物をリン酸化し、結合する。大腸菌の形質転換の後、ｐＣｏｎｓ０プラスミドを得た。次に、このプラスミドを、ＢａｍＨＩで消化し、ｓｐｏ０Ａカセットを除去し、適切なＤＮＡ断片を精製および結合し、プラスミドｐＣｏｎｓ２-１を得た。ｐＣｏｎｓ２-１のマップを図２に示す。
ＰＣＲプライマー：
【化２】
2010505398.tif 000004
【００６５】
１．３  ｐＣＩＰ２−１ベクターの構築
この構築において、ｐＣｏｎｓ２-１由来のｐＩＭ１３複製起点は、θ型複製機構を有するプラスミドであるｐＳＯＬ１プラスミドの複製起点で置換した。この目的の為に、ｐＳＯＬ１プラスミドの複製起点を、Ｐｗｏ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用いて、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの全ＤＮＡを鋳型とし、オリゴヌクレオチドｏｒｉ-３-Ｄおよびｏｒｉ-４-Ｒをプライマーとして、ＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物をｐＣＲ-ＢｌｕｎｔＩＩ-ＴＯＰＯでクローンし、得られたプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、２．２ｋｂの断片を精製した。同様に、ｐＣｏｎｓ２．１プラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、２．４ｋｂの断片を精製し、ｐＳＯＬ１の複製起点を含む２．２ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片と結合し、プラスミドｐＣＩＰ２‐１を得た（図３）。
ＰＣＲプライマー：
【化３】
2010505398.tif 000005
【００６６】
１．４  ｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐベクターの構築
ＣａｔＰプロモータの制御のもとに発現したｕｐｐをもつ人工的なオペロンを構築するために、自身のリボソーム結合部位（ｒｂｓ）をもつｕｐｐ遺伝子を、ｐＣｏｎｓ２．１  のＣａｔＰのすぐ下流のＢｃｇＩ部位にクローンした。このようにして、ｕｐｐ遺伝子をプラスミド消失のカウンターセレクション可能なマーカーとする更なる欠失実験において、Δｃａｃ１５Δｕｐｐ菌株でのｕｐｐ遺伝子の染色体組み込みを可能にする相同領域は導入されなかった。
【００６７】
ｒｂｓを持つｕｐｐ遺伝子を、Ｃ．  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍゲノムＤＮＡから、オリゴヌクレオチドＲＥＰ-ＵＰＰ  ＦおよびＲＥＰ-ＵＰＰ  Ｒをプライマーとして、ＰＣＲ（Ｐｆｕ）増幅した。６６４ｂｐのＰＣＲ−産物を、ＰｖｕＩＩによって消化し、ＢｃｇＩによって消化し、平滑末端にするためＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理したｐＣｏｎｓ２．１にクローンした。この方法で、ｐＣｏｎｓ：：ＵＰＰ複製ベクターを得た（図４参照）。
ＰＣＲプライマー：
【化４】
2010505398.tif 000006
【００６８】
１．５  ｐＣＬＦ１ベクターの構築
Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍでの高発現を可能にするＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のチオラーゼ（ｔｈｌ）遺伝子からのプロモータおよびＲＢＳの制御のもと、ＦＬＰリコンビナーゼをコードするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰ１遺伝子を、ｐＣｏｎｓ２．１ベクターにクローンした。
ＦＬＰ１遺伝子を、オリゴヌクレオチドＦＬＰ１-ＤおよびＦＬＰ１-Ｒをプライマーとし、ｐＣＰ２０プラスミド（Datsenko and Wanner, 2000）を鋳型として、ＰＣＲ（Ｐｆｕ）増幅した。
ＰＣＲプライマー：
【化５】
2010505398.tif 000007
【００６９】
ＦＬＰ１−Ｄは、ＢａｍＨＩ部位およびｔｈｌのＲＢＳ配列を含む５’末伸長を有する。
ＦＬＰ１−ＲはＰＣＲ産物の３’末にＳｆｏＩ部位を導入した。
ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＳｆｏＩで消化し、あらかじめ同じ酵素で消化したｐＳＯＳ９５発現ベクターに直接クローンし、ｐＥＸ-ＦＬＰ１（６２８１ｂｐ）プラスミドを得た。
ＦＬＰ１発現カセットを含むｐＥＸ-ＦＬＰ１のＳａｌＩ断片（１５８５ｂｐ）をｐＣＯＮＳ２．１のＳａｌＩ部位にクローンし、ｐＣＬＦ１（４８７８ｂｐ）を得た（図５）。
【００７０】
実施例２：  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍにおけるｃａｃ８２４Ｉ制限酵素をコードするｃａｃ１５０２遺伝子の欠失
本方法の概略図は図６を参照。
Ｃａｃ８２４Ｉをコードする遺伝子（ＣＡＣ１５０２）を挟む２つのＤＮＡ断片を、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを用い、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来の全ＤＮＡを鋳型とし、２つの特定のオリゴヌクレオチド対（表２参照）をプライマーとして、ＰＣＲ増幅した。プライマー対ＣＡＣ  １Ｂ-ＣＡＣ  ２  およびＣＡＣ  ３-ＣＡＣ  ４Ｂを用いて、１４９３ｂｐおよび９９９ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。プライマーＣＡＣ  １ＢおよびＣＡＣ  ４ＢはＢａｍＨＩ部位を導入し、プライマーＣＡＣ  ２  およびＣＡＣ  ３は、ＳｔｕＩ部位を導入する相補的５’末端伸長配列を有する。ＤＮＡ断片ＣＡＣ  １Ｂ-ＣＡＣ  ２  およびＣＡＣ  ３-ＣＡＣ  ４Ｂを、プライマーＣＡＣ  １ＢおよびＣＡＣ  ４Ｂを用いたＰＣＲ融合実験で結合し、得られた断片を、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ-Ｂｌｕｎｔベクターにクローンし、ｐＴＯＰＯ：ｃａｃ１５を得た。ｐＴＯＰＯ：ｃａｃ１５の特有のＳｔｕＩ部位に、ＦＲＴ配列を両側に持つ抗生物質耐性ＭＬＳｒ遺伝子をもつｐＵＣ１８-ＦＲＴ-ＭＬＳ２の１３７２ｂｐのＳｔｕＩ断片を導入した。得られたプラスミドをＢａｍＨＩで消化して得られたｃａｃ１５０２置換カセットを、ＢａｍＨＩ部位でｐＣｏｎｓ２-１にクローンし、ｐＲＥＰＣＡＣ１５プラスミドを得て、ｐＣＩＰ２．１にクローンし、ｐＣＩＰＣＡＣ１５を得た。
【００７１】
プラスミドｐＲＥＰＣＡＣ１５およびｐＣＩＰＣＡＣ１５を生体内でメチル化し、電気穿孔法で、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍを形質転換するのに用いた。ペトリ皿上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択の後、各形質転換体のひとつのコロニーを、４０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含む液体合成培地で２４時間培養し、その後、抗生物質無しの液体２ＹＴＧに継代培養した。適切な希釈物を、４０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含む強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）上にプレートした。ｐＲＥＰＣＡＣ１５およびｐＣＩＰＣＡＣ１５ベクターを消失した組み込み体を選択するために、エリスロマイシン耐性クローンを、４０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＲＣＡと５０μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含むＲＣＡとの両方にレプリカプレートした。所望の表現型の数個のコロニーが、ｐＲＥＰＣＡＣ１５形質転換体に得られたが、そのようなコロニーはｐＣＩＰＣＡＣ１５形質転換体では得られなかった。このことは、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍにおいて  ｐＣＩＰＣＡＣ１５のθ型複製機構は、ローリングサークル型機構より、二重交差を促進するのに好ましくないことを示している。エリスロマイシン耐性クローンおよびチアンフェニコール感受性クローンの遺伝子型をＰＣＲ分析で検証した。（ＣＡＣ１５置換カセットの外側に位置するプライマーＣＡＣ  ０およびＣＡＣ  ５ならびにｃａｃ１５０２の内側に位置するプライマーＣＡＣ  ＤおよびＣＡＣ  Ｒを用いた。）ｐＲＥＰＣＡＣ１５を消失したΔｃａｃ１５：：ｍｌｓＲ菌株を単離した。
【００７２】
Δｃａｃ１５：：ｍｌｓＲ菌株を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＦｌｐリコンビナーゼをコードするＦＬＰ１遺伝子を発現するｐＣＬＦ１で形質転換した。ペトリ皿上で形質転換およびチアンフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）耐性の選択の後、ひとつのクローンを５０μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含む合成液体培地で培養し、適切な希釈物を、５０μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含むＲＣＡ上にプレートした。チアンフェニコール耐性クローンを、４０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＲＣＡと５０μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含むＲＣＡとの両方にレプリカプレートした。エリスロマイシン感受性およびチアンフェニコール耐性をもつクローンの遺伝子型はプライマーＣＡＣ  ０およびＣＡＣ  ５Ｂを用いてＰＣＲ分析で検証した。
ｐＣＬＦ１を放出するために、エリスロマイシン感受性およびチアンフェニコール耐性を持つΔｃａｃ１５菌株の２４時間培養を２回連続して行った。ｐＣＬＦ１を消失したΔｃａｃ１５菌株を、エリスロマイシンとチアンフェニコール両方への感受性に従って、単離した。その菌株を、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＭＧＣΔｃａｃ１５と呼ぶ。
【表２】
2010505398.tif 000008
【００７３】
実施例３：  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍΔｃａｃ１５におけるウラシルホスホリボシル−トランスフェラーゼをコードするｕｐｐ遺伝子の欠失
ｕｐｐ（ＣＡＣ２８７９）の上流および下流の２つのＤＮＡ断片を、Ｐｗｏ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用いて、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来の全ＤＮＡを鋳型とし、２つの特異的オリゴヌクレオチド対をプライマーとして（表３参照）ＰＣＲ増幅した。プライマー対ＵＰＰ  １-ＵＰＰ  ２  およびＵＰＰ  ３-ＵＰＰ  ４を用いて、１１０３ｂｐおよび１１０５ｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。プライマーＵＰＰ  １およびＵＰＰ  ４はＢａｍＨＩ部位を導入し、プライマーＵＰＰ  ２  およびＵＰＰ  ３は、ＳｔｕＩ部位を導入する５’末端伸長配列を有する。ＤＮＡ断片ＵＰＰ  １-ＵＰＰ  ２  およびＵＰＰ  ３-ＵＰＰ  ４を、プライマーＵＰＰ  １およびＵＰＰ  ４を用いたＰＣＲ融合実験で結合し、得られた断片を、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ-Ｂｌｕｎｔベクターでクローンし、ｐＴＯＰＯ：ｕｐｐを得た。ｐＴＯＰＯ：ｕｐｐの特有のＳｔｕＩ部位に、ＦＲＴ配列を両側に持つ抗生物質耐性ＭＬＳｒ遺伝子を有するｐＵＣ１８-ＦＲＴ-ＭＬＳ２の１３７２ｂｐのＳｔｕＩ断片を導入した。得られたプラスミドをＢａｍＨＩ消化して得られたｕｐｐ置換カセットを、ｐＣｏｎｓ２-１のＢａｍＨＩ部位にクローンし、ｐＲＥＰＵＰＰプラスミドを得た。
【００７４】
プラスミドｐＲＥＰＵＰＰを、事前のｉｎ ｖｉｖｏメチル化無しに、電気穿孔法でＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＭＧＣΔｃａｃ１５株を形質転換するのに用いた。ペトリ皿上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択の後、ひとつのコロニーを、４０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン入りの液体合成培地２４時間培養し、その後、抗生物質無しの液体２ＹＴＧに継代培養した。適切な希釈物を、４０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＲＣＡ上にプレートした。ｐＲＥＰＵＰベクターを消失した組み込み体を選択するために、エリスロマイシン耐性クローンを、４０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＲＣＡと５０μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含むＲＣＡとの両方にレプリカプレートした。エリスロマイシン耐性およびチアンフェニコール感受性クローンの遺伝子型をＰＣＲ分析で検証した。（ＵＰＰ置換カセットの外側に位置するプライマーＵＰＰ  ０およびＵＰＰ  ５並びにＵＰＰの内側に位置するプライマーＵＰＰ  ＤおよびＵＰＰ  Ｒを用いた。）ｐＲＥＰＵＰＰを消失したΔｃａｃ１５Δｕｐｐ：：ｍｌｓＲ菌株を単離した。先のｃａｃ１５０２欠失を、第１の実施例で前記のように確認した。前記Δｃａｃ１５Δｕｐｐ：：ｍｌｓＲ菌株は、Δｃａｃ１５菌株の５０μＭ  に対し、４００μＭ  の５−ＦＵ  に耐性がある。
【００７５】
Δｃａｃ１５Δｕｐｐ：：ｍｌｓＲ菌株を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＦｌｐリコンビナーゼをコードするＦＬＰ１遺伝子を発現するｐＣＬＦ１で形質転換した。ペトリ皿上で形質転換およびチアンフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）耐性を選択の後、ひとつのクローンを５０μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含む合成液体培地で培養し、適切な希釈物を、５０μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含むＲＣＡ上にプレートした。チアンフェニコール耐性クローンを、４０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＲＣＡと５０μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含むＲＣＡとの両方にレプリカプレートした。エリスロマイシン感受性およびチアンフェニコール耐性クローンの遺伝子型は、プライマーＵＰＰ  ０およびＵＰＰ  ５を用いて  ＰＣＲ分析で検証された。ｐＣＬＦ１を消失するために、エリスロマイシン感受性およびチアンフェニコール耐性を持つΔｃａｃ１５Δｕｐｐ菌株の２４時間培養を２回連続して行った。ｐＣＬＦ１を消失したΔｃａｃ１５Δｕｐｐ菌株を、エリスロマイシンとチアンフェニコール両方への感受性を判定し、単離した。
【表３】
2010505398.tif 000009
【００７６】
実施例４：ｕｐｐおよび５−フルオロウラシルをプラスミド消失に対するポジティブ選択として利用したｃａｃ３５３５遺伝子の欠失
Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの第２の制限修飾系をコードするｃａｃ３５３５遺伝子の上流および下流の２つのＤＮＡ断片を、Ｐｗｏ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用い、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来の全ＤＮＡを鋳型とし、二つの特定のオリゴヌクレオチドをプライマーとして（表４参照）、ＰＣＲ増幅した。プライマー対ＲＭ  １-ＲＭ  ２  およびＲＭ  ３-ＲＭ  ４を用いて、１ｋｂｐおよび０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。プライマーＲＭ１およびＲＭ  ４はＢａｍＨＩ部位を導入し、プライマーＲＭ  ２  およびＲＭ  ３は、ＳｔｕＩ部位を導入する相補的５’末端伸長配列を有する。ＤＮＡ断片ＲＭ  １-ＲＭ  ２  およびＲＭ  ３-ＲＭ  ４を、プライマーＲＭ  １およびＲＭ  ４を用いたＰＣＲ融合実験で結合し、得られた断片を、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ-Ｂｌｕｎｔベクターでクローンし、ｐＴＯＰＯ：ｃａｃ３５３５を得た。ｐＴＯＰＯ：ｃａｃ３５３５の特有のＳｔｕＩ部位に、ＦＲＴ配列を両側に持つ抗生物質耐性ＭＬＳｒ遺伝子を有するｐＵＣ１８-ＦＲＴ-ＭＬＳ２の１３７２ｂｐのＳｔｕＩ断片を導入した。得られたプラスミドをＢａｍＨＩで消化した後に得られたＣＡＣ３５３５置換カセットを、ｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐのＢａｍＨＩ部位にクローンし、ｐＲＥＰＣＡＣ３５３５：：ｕｐｐプラスミドを得た。
【００７７】
プラスミドｐＲＥＰＣＡＣ３５３５：：ｕｐｐを、電気穿孔法でＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＭＧＣΔｃａｃ１５Δｕｐｐ株を形質転換するのに用いた。ペトリ皿上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択の後、ひとつのコロニーを、４０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含む液体合成培地で２４時間培養し、１００ｕｌの希釈されてない培地を、４０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンおよび４００μＭの５−ＦＵを含むＲＣＡ上にプレートした。５−ＦＵ耐性がチアンフェニコール感受性に関連することを実証するために、エリスロマイシンおよび５-ＦＵ両方に耐性をもつクローンを、４０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＲＣＡと５０μｇ／ｍｌのチアンフェニコールを含むＲＣＡとの両方にレプリカプレートした。エリスロマイシン耐性でチアンフェニコール感受性のあるクローンの遺伝子型をＰＣＲ分析で検証した。（ｃａｃ３５３５置換カセットの外側に位置するプライマーＲＭ  ０およびＲＭ  ５並びにｃａｃ３５３５遺伝子の内側に位置するプライマーＲＭ  ＤおよびＲＭ  Ｒを用いた。）このように、ｐＲＥＰＣＡＣ３５３５：：ｕｐｐを消失したΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｃａｃ３５：：ｍｌｓＲ菌株を単離した。
【表４】
2010505398.tif 000010
【００７８】
参考文献
2010505398.tif 000011
2010505398.tif 000012
【図１】
2010505398.tif 000013
【図２】
2010505398.tif 000014
【図３】
2010505398.tif 000015
【図４】
2010505398.tif 000016
【図５】
2010505398.tif 000017
【図６】
2010505398.tif 000018
【配列表】
2010505398000001.xml
【国際調査報告】
2010505398.tif 000027
2010505398.tif 000028
2010505398.tif 000029