(57)【要約】自己触媒的である（即ち、温度、ｐＨ、イオン強度などの反応条件の改変を必要とせずに、１回のサイクルの産物を次のサイクルで用いて自動的にサイクルさせることができる）標的核酸配列の複数のコピーを合成する新規な方法が開示されている。特に、副産物の出現を減少させると同時に確実かつ効率的である核酸増幅方法が開示されている。通常、こうした方法では、標的核酸の１種のセンスのみを標的にするプライミングオリゴヌクレオチド、３’末端からのポリメラーゼ伸長が阻止されるように改変されたプロモータオリゴヌクレオチド、及び、任意選択的に、プライマー伸長反応を停止させる手段を用いて、副産物の形成を低下又は実質的に排除しながら、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子をインビトロで増幅させる。今回開示した方法では、副産物の出現が最低限に抑えられるか実質的に排除されることによって高水準の特異性がもたらされる。
2010520750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列の複数のコピーを合成する方法であって、該方法は以下：
該標的配列の３’末端に対してそこからプライマー伸長反応を開始させることができるようにハイブリッド形成するプライミングオリゴヌクレオチドで、ＤＮＡ標的配列を含む標的核酸を処理する工程；
ＤＮＡポリメラーゼを用いるプライマー伸長反応において該プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させて第１のＤＮＡプライマー伸長産物を得る工程であって、該第１のプライマー伸長産物の少なくとも一部は該標的配列に対して相補性であるものとする、工程；
第１及び第２の領域を含むプロモータオリゴヌクレオチドで該第１のプライマー伸長産物を処理する工程であって、該第１の領域は、該標的配列の５’末端の領域に対応し、かつ、該第１のプライマー伸長産物とハイブリッドを形成してプロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッドを形成する塩基配列を含むものとし、そして該第２の領域は、ＲＮＡポリメラーゼのための、該第１の領域の５’側にあるプロモータを含むものとし、ここで該プロモータオリゴヌクレオチドはそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されるものとする工程；
該プロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッドから、該プロモータを認識してそこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用いて該第１のプライマー伸長産物の少なくとも一部に対して相補性の複数の第１のＲＮＡ産物を転写する工程であって、ここで該第１のＲＮＡ産物の塩基配列は、該第１のプライマー伸長産物が規定された３’末端を有する場合に、該方法が該標的配列の５’末端に隣接するかその近傍の該標的核酸に結合する結合分子で該標的核酸を処理することをさらに含むことを条件とし、かつ、該プライミングオリゴヌクレオチドが、該標的核酸とハイブリッドを形成し、かつ、該標的核酸とハイブリッドを形成させた場合に酵素活性によって選択的に分解されるＲＮＡ領域を含まないことをさらに条件として、該標的配列の塩基配列と実質的に同一であるものとする、工程
を含む方法。
【請求項２】
ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含む該方法に供されるどのオリゴヌクレオチドもそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該方法における該ＤＮＡポリメラーゼの活性が該第１のプライマー伸長産物の形成に実質的に限定される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該プライミングオリゴヌクレオチドがデオキシヌクレオチド及び／又はその類似体からなる請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該プロモータオリゴヌクレオチドがその３’末端に位置するブロッキング部分を含むように改変される請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該プロモータオリゴヌクレオチドの該ブロッキング部分が改変ヌクレオチド、３’から５’の方向性を有するヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列、３’アルキル基、３’２’−ジデオキシヌクレオチド、３’コルジセピン、３’アルカン−ジオール残基、３’非ヌクレオチド部分、該標的配列に対して非相補性のヌクレオチド配列、核酸結合蛋白質及びこれらの混合物からなる群から選ばれる置換基を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該プロモータオリゴヌクレオチドが該第１及び第２の領域の間又はこれらに隣接して配置された挿入配列をさらに含み、かつ、該プロモータオリゴヌクレオチド中に該挿入配列が存在することにより該ＲＮＡ産物の形成速度が高められる請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
プライマー伸長反応において該プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させる前に、該標的核酸を含む二本鎖複合体を該複合体を変性させるのに十分な条件に曝す工程をさらに含む請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該条件が加熱を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該標的核酸が二本鎖複合体の形をとり、かつ、該方法がプライマー伸長反応において該プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させる前に、該複合体を、該複合体を変性させるのに十分な条件に曝すことを含まない請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該第１のＲＮＡ産物を該プライミングオリゴヌクレオチドで処理することにより、プライマー伸長反応が該プライミングオリゴヌクレオチドから開始され得るようなプライミングオリゴヌクレオチド：第１のＲＮＡ産物ハイブリッドを形成させる工程；
該ＤＮＡポリメラーゼを用いるプライマー伸長反応において該プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させることにより該第１のＲＮＡ産物に対して相補性の第２のＤＮＡプライマー伸長産物を得、該第２のプライマー伸長産物は該第１のＲＮＡ産物の５’末端に対して相補性の３’末端を有するものとする工程；
該第１のＲＮＡ産物を選択的に分解する酵素を用いて該第１のＲＮＡ産物から該第２のプライマー伸長産物を分離する工程；
該第２のプライマー伸長産物を該プロモータオリゴヌクレオチドで処理することによりプロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッドを形成させる工程；
該プロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッド中の第２のプライマー伸長産物の３’末端を伸長させることにより該プロモータオリゴヌクレオチドの該第２の領域に対して相補性の配列を付加する工程;及び、
該プロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッドから、該ＲＮＡポリメラーゼを用いて該第２のプライマー伸長産物に対して相補性の複数の第２のＲＮＡ産物を転写し、該第２のＲＮＡ産物の塩基配列は該標的配列の塩基配列と実質的に同一であるものとする工程、
をさらに含む請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該プライミングオリゴヌクレオチドがＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素を用いて伸長される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該酵素がＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有し、かつ、該酵素が逆転写酵素以外の酵素である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該プライミングオリゴヌクレオチドから上流の該標的核酸とハイブリッドを形成することによってそこからのプライマー伸長反応を開始させることを可能にするディスプレーサオリゴヌクレオチドで該標的核酸を処理する工程、及び該ＤＮＡポリメラーゼを用いるプライマー伸長反応において該ディスプレーサオリゴヌクレオチドを伸長させることにより、標的核酸から該第１のプライマー伸長産物を置換する第３のＤＮＡプライマー伸長産物を得る工程をさらに含む請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
該方法における該ＤＮＡポリメラーゼの活性が該第１、第２及び／又は第３のプライマー伸長産物の形成に実質的に限定される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの５’領域が該標的核酸に対する該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるための１以上の改変を含み、かつ、該改変が該ディスプレーサオリゴヌクレオチドのプライマー伸長反応における伸長を妨げない請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
該改変が該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端との間隔を少なくとも１５塩基分とる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該改変がＬＮＡである請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
該ディスプレーサオリゴヌクレオチドが、該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基が該プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端塩基に隣接するように該標的核酸とハイブリッドを形成する請求項１４乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
該ディスプレーサオリゴヌクレオチドが、該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基が該プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端塩基から５乃至３５塩基隔てるように該標的核酸とハイブリッドを形成する請求項１４乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
該標的核酸が、該標的核酸を該ディスプレーサオリゴヌクレオチドで処理する前に該プライミングオリゴヌクレオチドで処理される請求項１４乃至２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
該第１のプライマー伸長産物が、該標的核酸を該ディスプレーサオリゴヌクレオチドで処理する前に形成される請求項１４乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
該標的核酸が、該標的核酸にＤＮＡポリメラーゼを作用させる前に該プライミングオリゴヌクレオチド及び該ディスプレーサオリゴヌクレオチドで処理される請求項１４乃至２１に記載の方法。
【請求項２４】
該プライミングオリゴヌクレオチド及び該ディスプレーサオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１種の３’末端を１以上のキャップで処理し、各該キャップは該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端の少なくとも３塩基に対して相補性の塩基領域を含むものとし、各該キャップの５’末端塩基は該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基に対して相補性であるものとし、並びに各該キャップはそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されるものとする工程をさらに含む請求項１４乃至２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
各該キャップが該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端の８個以下の塩基に対して相補性である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
各該キャップが、各該キャップが該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成する場合に、該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドと該プロモータオリゴヌクレオチドとの間の非特異的なハイブリッド形成を阻止する請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
各該キャップがその3’末端に位置するブロッキング部分を含むように改変されたキャッピングオリゴヌクレオチドである請求項２４乃至２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
該キャップの少なくとも１つの３’末端が該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合され、かつ、該少なくとも１つのキャップが該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端とループを形成してハイブリッドを形成する請求項２４乃至２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
該少なくとも１つのキャップがリンカー領域を介して該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドに結合される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該リンカー領域が少なくとも５個のヌクレオチドを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該リンカー領域が少なくとも５個の無塩基ヌクレオチドを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
該標的核酸を該結合分子で処理する工程及び該プロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッド中の該第１のプライマー伸長産物の３’末端を伸長させることにより該プロモータオリゴヌクレオチドの該第２の領域に対して相補性の配列を付加する工程をさらに含む請求項１乃至３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
該結合分子がその３’末端に位置するブロッキング部分を有するオリゴヌクレオチドを含むことにより、そこからのＤＮＡ合成の開始を阻止する請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該結合分子がＬＮＡを含む請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
該結合分子が停止オリゴヌクレオチドである請求項３２乃至３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
該停止オリゴヌクレオチドの５’末端が該プロモータオリゴヌクレオチドの該第１の領域の５’末端の少なくとも２塩基に対して相補性である請求項３２乃至３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
該停止オリゴヌクレオチドの５’末端が該プロモータオリゴヌクレオチドの該第１の領域の５’末端の少なくとも３個で１０個以下の塩基に対して相補性である請求項３２乃至３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
該結合分子が改変オリゴヌクレオチドである請求項３２乃至３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
該改変オリゴヌクレオチドが消化オリゴヌクレオチドである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該第１のプライマー伸長産物をエクステンダーオリゴヌクレオチドで処理し、該エクステンダーオリゴヌクレオチドは該プロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッドの該プロモータオリゴヌクレオチドに対して３’側の該第１のプライマー伸長産物の領域とハイブリッドを形成し、その結果エクステンダーオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッドが形成されるものとする工程をさらに含む請求項１乃至３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
該エクステンダーオリゴヌクレオチドがその３’末端に位置するブロッキング部分をさらに含むことによりそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
該エクステンダーオリゴヌクレオチドが、該エクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端が該プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端塩基のヌクレオチド３個以内の間隔をとるように、該第１のプライマー伸長産物とハイブリッドを形成する請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
該エクステンダーオリゴヌクレオチドが該プロモータオリゴヌクレオチドに隣接した該第１のプライマー伸長産物とハイブリッドを形成する請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４４】
該標的配列の該複数コピーの存在又は量を測定する工程をさらに含む請求項１乃至４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
該標的配列の該複数コピーの存在又は量が検出可能な標識を有する検出プローブを用いて測定される請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
該標的配列の該複数コピーの存在又は量が該第１のＲＮＡ産物の転写後に測定される請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
該標的配列の該複数コピーの存在又は量が、該第１のＲＮＡ産物が転写されつつある時に測定される請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
該プローブが自己ハイブリッド形成プローブであり、一対の相互作用標識を含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
該方法が実質的に一定の温度で実施される請求項１乃至４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
ＤＮＡ標的配列を増幅させるのに使用するためのキットであって、ＤＮＡ標的配列の３’末端に対してそこからプライマー伸長反応を開始させることができるようにハイブリッド形成するプライミングオリゴヌクレオチド並びに第１及び第２の領域を含むプロモータオリゴヌクレオチドを含み、該第１の領域は該標的配列の５’末端の領域に対応し、かつ、該プライミングオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー伸長産物の３’領域とハイブリッドを形成する塩基配列を有するものとし、該第２の領域はＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータであり、該第１の領域に対して５’側に位置しているものとし、かつ、該プロモータオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含む該キットに含まれるどのオリゴヌクレオチドもそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されることを条件とし、該キットが制限エンドヌクレアーゼを含まないことを条件とし、さらに、該プライミングオリゴヌクレオチドが、該標的核酸とハイブリッドを形成し、かつ、該標的核酸とハイブリッドを形成させた場合に酵素活性により選択的に分解されるＲＮＡ領域を含まないことを条件として、そこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されるものとするキット。
【請求項５１】
該プライミングオリゴヌクレオチドがデオキシヌクレオチド及び／又はその類似体からなる請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
該プロモータオリゴヌクレオチドがその３’末端に位置するブロッキング部分を含むように改変される請求項５０又は５１に記載のキット。
【請求項５３】
該プロモータオリゴヌクレオチドの該ブロッキング部分が改変ヌクレオチド、３’から５’の方向性を有するヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列、３’アルキル基、３’２’−ジデオキシヌクレオチド、３’コルジセピン、３’アルカン−ジオール残基、３’非ヌクレオチド部分、該標的配列に対して非相補性のヌクレオチド配列、核酸結合蛋白質及びこれらの混合物からなる群から選ばれる置換基を含む請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
該プロモータオリゴヌクレオチドが該第１及び第２の領域の間又はこれらに隣接して配置された挿入配列をさらに含み、かつ、該プロモータオリゴヌクレオチド中に該挿入配列が存在することにより該ＲＮＡ産物の形成速度が高められる請求項５０乃至５３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５５】
二本鎖ＤＮＡ複合体を一本鎖にするための化学的変性剤をさらに含む請求項５０乃至５４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５６】
ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素をさらに含み、該キットは該ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素以外の酵素を含まないものとする請求項５０乃至５５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５７】
ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有する、逆転写酵素以外の酵素をさらに含む請求項５０乃至５５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５８】
該プライミングオリゴヌクレオチドから上流側に該標的配列を含む標的核酸とハイブリッドを形成することによってプライマー伸長反応がそこから開始され得るディスプレーサオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項５０乃至５７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５９】
該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの５’領域が該標的核酸に対する該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるための１つ以上の改変を含み、かつ、該改変が該ディスプレーサオリゴヌクレオチドのプライマー伸長反応における伸長を妨げない請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
該改変が該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端との間隔を少なくとも１５塩基分とる請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
該改変がＬＮＡである請求項５９又は６０に記載のキット。
【請求項６２】
該ディスプレーサオリゴヌクレオチドが、該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基が該プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端塩基に隣接するように該標的核酸とハイブリッドを形成する請求項５８乃至６１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６３】
該ディスプレーサオリゴヌクレオチドが、該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基が該プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端塩基から５乃至３５塩基隔てるように該標的核酸とハイブリッドを形成する請求項５８乃至６１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６４】
該プライミングオリゴヌクレオチド及び該ディスプレーサオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１種がその３’末端とハイブリッドを形成したキャップを含み、該キャップは該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端の少なくとも３塩基に対して相補性の塩基領域を含むものとし、該キャップの５’末端塩基は該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基に対して相補性であるものとし、並びに該キャップはそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されるものとする請求項５８乃至６３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６５】
該キャップが該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端の８個以下の塩基に対して相補性である請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
該キャップが、各該キャップが該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成する場合に、該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドと該プロモータオリゴヌクレオチドとの間の非特異的なハイブリッド形成を阻止する請求項６４又は６５に記載のキット。
【請求項６７】
該キャップがその３’末端に位置するブロッキング部分を含むように改変されたキャッピングオリゴヌクレオチドである請求項６４乃至６６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６８】
該キャップの３’末端が該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合され、かつ、該キャップが該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端とループを形成してハイブリッドを形成する請求項６４乃至６７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６９】
該キャップがリンカー領域を介して該プライミングオリゴヌクレオチド又は該ディスプレーサオリゴヌクレオチドに結合される請求項６８に記載のキット。
【請求項７０】
該リンカー領域が少なくとも５個のヌクレオチドを含む請求項６９に記載のキット。
【請求項７１】
該リンカー領域が少なくとも５個の無塩基ヌクレオチドを含む請求項６９に記載のキット。
【請求項７２】
該標的配列の５’末端に隣接するかその近傍の該標的配列を含む標的核酸に結合する結合分子をさらに含む請求項５０乃至７１に記載のキット。
【請求項７３】
該結合分子が、その３’末端に位置するブロッキング部分を有するオリゴヌクレオチドを含むことによりそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止される請求項７２に記載のキット。
【請求項７４】
該結合分子がＬＮＡを含む請求項７２又は７３に記載のキット。
【請求項７５】
該結合分子が停止オリゴヌクレオチドである請求項７２乃至７４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７６】
該停止オリゴヌクレオチドの５’末端が該プロモータオリゴヌクレオチドの該第１の領域の５’末端の少なくとも２塩基に対して相補性である請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
該停止オリゴヌクレオチドの５’末端が該プロモータオリゴヌクレオチドの該第１の領域の５’末端の少なくとも３個で１０個以下の塩基に対して相補性である請求項７５に記載のキット。
【請求項７８】
該結合分子が改変オリゴヌクレオチドである請求項７２乃至７４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７９】
該改変オリゴヌクレオチドが消化オリゴヌクレオチドである請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
エクステンダーオリゴヌクレオチド：プライマー伸長産物ハイブリッドが形成されるように、該プロモータオリゴヌクレオチド：プライマー伸長産物ハイブリッドの該プロモータオリゴヌクレオチドに対して３’側の該プライマー伸長産物の領域とハイブリッドを形成するエクステンダーオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項５０乃至７９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８１】
該エクステンダーオリゴヌクレオチドが、その３’末端に位置するブロッキング部分をさらに含むことにより、そこからのＤＮＡ合成の開始が阻止される請求項８０に記載のキット。
【請求項８２】
該エクステンダーオリゴヌクレオチドが、該エクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基が該プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端塩基のヌクレオチド３個以内の間隔をとるように、該プライマー伸長産物とハイブリッドを形成する請求項８０又は８１に記載のキット。
【請求項８３】
該エクステンダーオリゴヌクレオチドが該プロモータオリゴヌクレオチドに隣接した該プライマー伸長産物とハイブリッドを形成する請求項８０又は８１に記載のキット。
【請求項８４】
該標的配列とハイブリッドを形成する検出プローブをさらに含む請求項５０乃至８３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８５】
該検出プローブが検出可能な標識を含む請求項８４に記載のキット。
【請求項８６】
該プローブが一対の相互作用標識を有する自己ハイブリッド形成プローブである請求項８４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年８月２６日に出願された継続中の米国特許出願第１１／２１３，５１９号の一部継続出願である。米国特許出願第１１／２１３，５１９号は、２００４年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／６０４，８３０号および２００４年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／６３９，１１０号の利益を主張し、それぞれの出願の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、単独で、又は核酸の均一もしくは不均一な混合物の(大きなもしくは小さな)成分として存在させることができる特定の核酸配列、即ち「標的配列」の複数のコピーを作製するための方法、反応混合物、組成物及びキットに関する。上記核酸の混合物は、診断的検査、血液製剤のスクリーニング、食物、水、工業もしくは環境試験、調査研究、クローニングなどの他のプロセス用の試薬もしくは材料の調製又は他の目的のために採取されるサンプル中に存在するものとすることができる。特定の核酸配列の選択的な増幅は、特異性を維持しながら診断的及び他の検出アッセイの感度を上げ、各種研究方法の感度、利便性、精度及び信頼性を増し、並びに種々の目的のために特定オリゴヌクレオチドの十分な供給をもたらすのに有用である。
【背景技術】
【０００３】
特定の核酸配列の検出及び／又は定量化は、微生物を同定して分類し、感染症を診断し、遺伝的異常を検出して特性化し、癌と関連づけられる遺伝子変化を特定し、病気に対する遺伝的罹病性を研究し、及び各種の治療に対する効果を測定するための重要な技術である。このよう方法は、食料品、水、工業及び環境サンプル、種子ストック、並びに特定の微生物の存在を監視する必要があると思われる他の種類の材料において微生物を検出して定量するのにも有用である。犯罪容疑者を特定し、父親論争を解決し、系図及び系統樹を構築し、種々の生命体の分類に役立てるために核酸配列間の関連性の分析が行われている法医科学、人間学、考古学及び生物学において別の用途が見出される。
【０００４】
核酸配列を検出及び／又は定量するいくつかの方法が当該分野で公知である。こうした方法としては、標識プローブとのハイブリッド形成、及び標識プローブとのハイブリッド形成と組み合わせたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）の各種変更が挙げられる。例えば、Ｍｕｌｌｉｓほか、“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ，Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”米国特許第４，６８３，１９５号；Ｍｕｌｌｉｓ、“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”米国特許第４，６８３，２０２号；Ｍｕｌｌｉｓほか、“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ，Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”米国特許第４，８００，１５９号；非特許文献１；及び非特許文献２を参照されたい。いくつかの異なる極端な温度間の反応温度の繰り返しサイクルを必要とすることはＰＣＲ法の欠点である。ＰＣＲの使い勝手をよくするためには、高価なプログラム可能な熱サイクル装置を必要とする。さらに、転写媒介性増幅（ＴＭＡ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を用いて、標的配列の複数のＲＮＡコピーが自己触媒的にさらにコピーを生ずる実質的に一定の温度、イオン強度及びｐＨの条件下で標的核酸配列の複数のコピーを自己触媒的に合成することができる。例えば、Ｋａｃｉａｎほか、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”米国特許第５，３９９，４９１号及びＫａｃｉａｎほか、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”米国特許第５，８２４，５１８号を参照されたい。なお、これらの特許のそれぞれの内容は引用により本明細書に組み込まれている。ＴＭＡは、臨床、環境、法医学及び同様のサンプル中の特定の核酸配列を定量するためのアッセイ、プローブのクローニング及び作製を含む目的のために核酸標的配列のコピーを作製するのに有用である。ＴＭＡは、有効性が証明された確実で高感度の増幅系である。ＴＭＡはＰＣＲをベースとした増殖系に付随する問題の多くを解決している。特に、温度サイクルを必要としない。別の転写ベースの増幅法がＭａｌｅｋほか、“Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ，”米国特許第５，１３０，２３８号；Ｄａｖｅｙほか、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ，”米国特許第５，４０９，８１８号；Ｄａｖｅｙほか、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  （ＲＮＡ），”米国特許第５，４６６，５８６号；Ｄａｖｅｙほか、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ，”米国特許第５，５５４，５１７号；Ｂｕｒｇほか、“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，���米国特許第６，０９０，５９１号；及びＢｕｒｇほか、“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”米国特許第６，４１０，２７６号に開示されている。
【０００５】
高感度核酸増幅系の固有の結果は副産物の出現である。副産物としては、系によってはその増幅反応を阻害することにより特異性を低下させることがある分子が挙げられる。これは、プライマー伸長産物及び転写産物の形成に必要なプライマー及び酵素を含む限られた増幅資源が副産物の形成に転用されるためである。時として、副産物の出現により種々の分子技術による単位複製配列の産生の分析が困難になることもある。
【０００６】
従って、副産物の出現を抑えることにより特異性を増大させ、増幅産物の検出及び定量を向上させる、実質的に一定の温度、イオン強度及びｐＨの条件下で標的核酸配列の複数のコピーを自己触媒的に合成する確実な核酸増幅系が当該分野でなお求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｕｌｌｉｓほか、（１９８７年）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５５：ｐ．３３５−３５０
【非特許文献２】Ｍｕｒａｋａｗａほか、（１９８８年）  ＤＮＡ  ７：ｐ．２８７−２９５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、自己触媒的である（即ち、温度、ｐＨ、イオン強度などの反応条件の改変を必要とせずに、１回のサイクルの産物を次のサイクルで用いて自動的にサイクルさせることができる）標的配列の複数のコピーを合成する新規な方法にある。特に、本発明は、副産物の出現を減少させると同時に確実かつ効率的である核酸増幅方法を開示する。この方法では、プライミングオリゴヌクレオチド、それからのＤＮＡ合成の開始を阻止するよう改変されたプロモータオリゴヌクレオチド（例えば、３’ブロッキング部分を含む）及び、任意選択的に、ディスプレーサオリゴヌクレオチド、結合分子及び／又は３’ブロック化エクステンダーオリゴヌクレオチドを用いてインビトロでＲＮＡもしくはＤＮＡ分子を増幅する。この開示した方法に用いるプライマーは標的核酸の１個のセンスのみを標的にする。本発明の方法では、副産物の出現が最低限に抑えられるか実質的に排除されることによって高水準の特異性がもたらされる。さらに、副産物が出現すると、各種分子検出技術による増幅反応の分析が困難になる可能性がある。本発明では、この問題をできる限り少なくするか実質的に除去することによって高水準の感度が得られる。
【０００９】
一実施態様において、本発明は、標的核酸の複数のコピーを合成する方法であって、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸をプライミングオリゴヌクレオチド及び結合分子（例えば、停止オリゴヌクレオチド又は消化オリゴヌクレオチド）で処理し、このプライミングオリゴヌクレオチドは上記標的配列の３’末端とハイブリッドを形成することによりそこからプライマー伸長反応を開始させることが可能となるものとし、かつ、上記結合分子は上記標的配列の５’末端に隣接するかその近傍の標的核酸に結合するものとする（「に隣接」とは、この結合分子が、上記標的配列の５’末端塩基に近く、この標的配列の十分５’側にあるこの標的核酸の塩基に結合することを意味している）工程、上記プライミングオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）を用いるプライマー伸長反応において伸長させて上記標的配列に対して相補性のＤＮＡプライマー伸長産物を得、このプライマー伸長産物は上記結合分子により決定される３’末端を有するものとし、このプライマー伸長産物の３’末端は上記標的配列の５’末端に対して相補性であるものとする工程、上記標的配列を選択的に分解する酵素（例えば、ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する酵素）を用いて上記標的配列から上記プライマー伸長産物を分離する工程、第１及び第２の領域を含むプロモータオリゴヌクレオチドで上記プライマー伸長産物を処理し、この第１の領域はこのプライマー伸長産物の３’領域とハイブリッドを形成してプロモータオリゴヌクレオチド：プライマー伸長産物ハイブリッドを形成するものとし、第２の領域はＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含み、第１の領域に対して５’側に位置するものとし、このプロモータオリゴヌクレオチドはそれからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されるものとする（例えば、ブロッキング部分がこのプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端に位置し、ポリメラーゼ伸長を阻止する）工程、上記プロモータオリゴヌクレオチド：プライマー伸長産物ハイブリッド中のプライマー伸長産物の３’末端を伸長して上記プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域に対して相補性の配列を付加する工程、並びに、上記プロモータオリゴヌクレオチド：プライマー伸長産物ハイブリッドから、上記プロモータオリゴヌクレオチドのプロモータを認識してそこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用い、上記プライマー伸長産物に対して相補性の複数のＲＮＡ産物を転写する工程を含む方法に関する。この実施態様によれば、得られるＲＮＡ産物の塩基配列は上記標的配列の塩基配列と実質的に同一である。この実施態様の好ましい態様において、ＤＮＡポリメラーゼの活性は上記プライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物の形成に実質的に限定される。この実施態様のさらに別の好ましい態様では、この方法における副産物の形成は、上記プロモータオリゴヌクレオチドがそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されなかった場合よりも実質的に少ない。この実施態様のさらに別の好ましい態様では、上記増幅反応に用いられるオリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含む場合には、このオリゴヌクレオチドはそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるようにその３’末端にブロッキング部分をさらに含む。
【００１０】
本発明の第２の実施態様は、標的配列の複数のコピーを合成する方法であって、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸を、この標的配列の３’末端とハイブリッドを形成することによりプライマー伸長反応をそこから開始させることができるプライミングオリゴヌクレオチドで処理する工程、このプライミングオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)を用いるプライマー伸長反応において伸長させて不確定の３’末端を有し、かつ、その標的配列に対して相補性の塩基領域を含む第１のＤＮＡプライマー伸長産物を得る工程、上記第１のプライマー伸長反応に対して相補性の上記標的核酸の部分を選択的に分解する酵素、例えばＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する酵素を用いて上記標的核酸から上記第１のＤＮＡプライマー伸長産物を分離する工程、上記第１のプライマー伸長産物を、第１及び第２の領域を含むプロモータオリゴヌクレオチドで処理し、この第１の領域は上記第１のプライマー伸長産物の３’領域とハイブリッドを形成してプロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッドを形成するものとし、この第２の領域はＲＮＡポリメラーゼのプロモータを含み、上記第１の領域に対して５’側にあるものとし、上記プロモータオリゴヌクレオチドはそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されるものとする（例えば、ブロッキング部分が、上記プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端にあり、ポリメラーゼ伸長を阻止する）工程、並びに、上記プロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッドから、上記プロモータを認識してそこからの転写を開始させるＲＮＡポリメラーゼを用いて上記第１のプライマー伸長産物の少なくとも一部に対して相補性の複数の第１のＲＮＡ産物を転写し、得られる第１のＲＮＡ産物の塩基配列は上記標的配列の塩基配列と実質的に同一であるものとする工程を含む方法に関する。この実施態様の好ましい態様において、この方法におけるＤＮＡポリメラーゼの活性は上記プライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物の形成に実質的に限定される。この実施態様のさらに別の好ましい態様では、この方法における副産物の形成は、上記プロモータオリゴヌクレオチドがそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるようには改変されなかった場合よりも少ない。この実施態様のさらに別の好ましい態様によれば、上記増幅反応に用いられるオリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含む場合には、そのオリゴヌクレオチドはその３’末端にあってそこからのＤＮＡ合成の開始を阻止するブロッキング部分をさらに含む。
【００１１】
好ましくは、この実施態様は、さらに、上記プロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物から転写された第１のＲＮＡ産物を上記のプライミングオリゴヌクレオチドで処理してこのプライミングオリゴヌクレオチドからプライマー伸長反応を開始させることができるようにプライミングオリゴヌクレオチド：第１のＲＮＡ産物ハイブリッドを形成させる工程、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）を用いるプライマー伸長反応において上記プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させて上記第１のＲＮＡ産物に対して相補性の第２のＤＮＡプライマー伸長産物を得、この第２のプライマー伸長産物は上記第１のＲＮＡ産物の５’末端に対して相補性の３’末端を有するものとする工程、上記第１のＲＮＡ産物を選択的に分解する酵素（例えばＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する酵素）を用いてこの第１のＲＮＡ産物から上記第２のプライマー伸長産物を分離する工程、この第２のプライマー伸長産物を上記のプロモータオリゴヌクレオチドで処理することによって上記プロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッドを形成させる工程、上記プロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッド中の第２のプライマー伸長産物の３’末端を伸長させて上記プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域に対して相補性の配列を付加する工程、並びにプロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッドから、ＲＮＡポリメラーゼを用いて上記第２のプライマー伸長産物に対して相補性の複数の第２のＲＮＡ産物を転写させ、この第２のＲＮＡ産物の塩基配列は上記標的配列の塩基配列と実質的に同一であるものとする工程に関する。
【００１２】
本発明の第３の実施態様は、標的配列の複数のコピーを合成する方法であって、ＤＮＡ標的配列を含む標的核酸を、第１及び第２の領域を含むプロモータオリゴヌクレオチドで処理し、この第１の領域は上記標的配列の３’末端とハイブリッドを形成してプロモータオリゴヌクレオチド：標的核酸ハイブリッドを形成するものとし、第２の領域はＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含み、上記第１の領域の５’側に位置するものとし、上記プロモータオリゴヌクレオチドはそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されるものとする（例えば、ブロッキング部分がこのプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する）工程、上記プロモータオリゴヌクレオチド：標的核酸ハイブリッドから、上記プロモータを認識してそこからの転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用いて上記標的配列に対して相補性の塩基領域を含む複数の第１のＲＮＡ産物を転写する工程、上記第１のＲＮＡ産物の３’領域とハイブリッドを形成することによりそこからプライマー伸長反応を開始させることができるプライミングオリゴヌクレオチドでこの第１のＲＮＡ産物を処理する工程、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）を用いるプライマー伸長反応において上記プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させて上記第１のＲＮＡ産物の少なくとも一部に対して相補性のＤＮＡプライマー伸長産物を得、このプライマー伸長産物は上記第１のＲＮＡ産物の５’末端に対して相補性の３’末端を有するものとする工程、上記第１のＲＮＡ産物を選択的に分解する酵素（例えば、ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する酵素）を用いて上記第１のＲＮＡ産物から上記プライマー伸長産物を分離する工程、上記プライマー伸長産物を上記のプロモータオリゴヌクレオチドで処理してプロモータオリゴヌクレオチド：プライマー伸長産物ハイブリッドを形成させる工程、並びに上記プロモータオリゴヌクレオチド：プライマー伸長産物ハイブリッドから、ＲＮＡポリメラーゼを用いてこのプライマー伸長産物に対して相補性の複数の第２のＲＮＡ産物を転写させ、この第２のＲＮＡ産物の塩基配列は上記標的配列の塩基配列に対して実質的に相補性であるものとする工程を含む方法に関する。この実施態様の好ましい態様では、この方法における上記ＤＮＡポリメラーゼの活性は上記プライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物の形成に実質的に限定される。この実施態様のさらに別の好ましい態様では、この方法における副産物の形成は上記プロモータオリゴヌクレオチドがそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるようには改変されなかった場合よりも実質的に少ない。この実施態様のさらに別の好ましい態様によれば、上記増幅反応に用いられるオリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含む場合には、そのオリゴヌクレオチドはその３’末端に位置してそこからのＤＮＡ合成の開始を阻止するブロッキング部分をさらに含む。さらに、この実施態様のいずれの方法にも、上記のプロモータオリゴヌクレオチド：プライマー伸長産物ハイブリッド中のプライマー伸長産物の３’末端を伸長させてこのプロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域に対して相補性の配列を付加する工程を含めることができる。
【００１３】
本発明の第４の実施態様は、標的配列の複数のコピーを合成する方法であって、ＤＮＡ標的配列を含む標的核酸をプライミングオリゴヌクレオチドで処理し、このプライミングオリゴヌクレオチドは上記標的配列の３’末端とハイブリッドを形成することによりそこからプライマー伸長反応を開始させることが可能となるものとする工程、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）を用いたプライマー伸長反応において上記プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させて第１のＤＮＡプライマー伸長産物を得、この第１のプライマー伸長産物の少なくとも一部分は上記標的配列に対して相補性であるものとする工程、このプライマー伸長産物を第１及び第２の領域を含むプロモータオリゴヌクレオチドで処理し、この第１の領域は、上記標的配列の５’末端の領域に対応し、かつ、上記第１のプライマー伸長産物とハイブリッドを形成してプロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッドを形成する塩基配列を含むものとし、上記第２の領域はＲＮＡポリメラーゼのプロモータを含み、上記第１の領域の５’側にあるものとし、上記プロモータオリゴヌクレオチドはそこからのＤＮＡ合成が阻止されるように改変されるものとする（例えば、ブロッキング部分がこのプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端に位置し、ポリメラーゼ伸長を阻止する）工程、並びに、上記プロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッドから、上記プロモータオリゴヌクレオチド中のプロモータを認識してそこからの転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用いて上記第１のプライマー伸長産物の少なくとも一部に対して相補性の複数の第１のＲＮＡ産物を転写する工程を含む方法に関する。ただし、上記第１のプライマー伸長産物が規定された３’末端を有する場合には、上記方法は上記標的配列の５’末端に隣接するかその近傍の上記標的核酸に結合する結合分子で上記標的核酸を処理する工程をさらに含む。さらに、上記プライミングオリゴヌクレオチドは、上記標的核酸とハイブリッドを形成し、かつ、この標的核酸とハイブリッドを形成させた場合に酵素活性により選択的に分解されるＲＮＡ領域を含まないことを前提とする。この実施態様によれば、得られる第１のＲＮＡ産物の塩基配列は上記標的配列の塩基配列と実質的に同一である。この実施態様の好ましい態様では、上記標的核酸は、プライマー伸長反応において上記プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させる前に変性を受けるのに十分な条件（例えば、加熱及び／又は化学的変性剤）にさらされる二本鎖複合体の一部である。この実施態様の別の好ましい態様では上記ＤＮＡポリメラーゼの活性は上記プライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物の形成に実質的に限定される。この実施態様のさらに別の好ましい態様では、この方法における副産物の形成は上記プロモータオリゴヌクレオチドがそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるようには改変されなかった場合よりも実質的に少ない。この実施態様のさらに別の好ましい態様では、上記増幅反応に用いられるオリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含む場合には、そのオリゴヌクレオチドはその３’末端に位置してそこからのＤＮＡ合成の開始を阻止するブロッキング部分をさらに含む。好ましくは、この実施態様の方法は、さらに、上記プロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物から転写された第１のＲＮＡ産物を上記のプライミングオリゴヌクレオチドで処理してこのプライミングオリゴヌクレオチドからプライマー伸長反応を開始させることができるようにプライミングオリゴヌクレオチド：第１のＲＮＡ産物ハイブリッドを形成させる工程、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）を用いたプライマー伸長反応において上記プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させて上記第１のＲＮＡ産物に対して相補性の第２のＤＮＡプライマー伸長産物を得、この第２のプライマー伸長産物は上記第１のＲＮＡ産物の５’末端に対して相補性の３’末端を有するものとする工程、上記第１のＲＮＡ産物を選択的に分解する酵素（例えば、ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する酵素）を用いてこの第１のＲＮＡ産物から上記第２のプライマー伸長産物を分離する工程、この第２のプライマー伸長産物を上記のプロモータオリゴヌクレオチドで処理することによってプロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッドを形成させる工程、上記プロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッド中の第２のプライマー伸長産物の３’末端を伸長させて上記プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域に対して相補性の配列を付加する工程、並びにプロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッドから、ＲＮＡポリメラーゼを用いて上記第２のプライマー伸長産物に対して相補性の複数の第２のＲＮＡ産物を転写させ、この第２のＲＮＡ産物の塩基配列は上記標的配列の塩基配列と実質的に同一であるものとする工程に関する。
【００１４】
この実施態様の方法の別の態様は、上記標的核酸を結合分子（例えば、停止オリゴヌクレオチド又は消化オリゴヌクレオチド）で処理し、この結合分子は上記標的配列の５’末端に隣接するかその近傍の上記標的核酸に結合するものとする（上記に示したように、「に隣接」という語句は、この結合分子が、上記標的配列の５’末端塩基に近く、この標的配列に対して十分５’側にあるこの標的核酸の塩基配列に結合することを意味している）工程を含む。上記標的核酸は、ＤＮＡポリメラーゼを用いるプライマー伸長反応において上記プライミングオリゴヌクレオチドの伸長を開始させる前に、上記結合分子で処理することが好ましい。この態様では、上記第１のプライマー伸長産物は上記結合分子によって決定される３’末端を有し、このプライマー伸長産物の３’末端は上記標的配列の５’末端に対して相補性であるものとする。上記方法のこの態様は、上記プロモータオリゴヌクレオチドを上記第１のプライマー伸長産物とハイブリッド形成させた後、このプロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッド中の第１のプライマー伸長産物の３’末端を伸長させてこのプロモータオリゴヌクレオチドの上記第２の領域に対して相補性の配列を付加する工程をさらに含む。
【００１５】
この実施態様の方法のさらに別の態様は、上記標的核酸をディスプレーサオリゴヌクレオチドで処理し、このディスプレーサオリゴヌクレオチドは上記プライミングオリゴヌクレオチドから上流の標的核酸とハイブリッドを形成することによってそこからプライマー伸長反応を開始させることを可能にするものとする（これに関連して、「上流」という用語はこのディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端が上記プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに対して５’側にあることを意味する）工程、及び、次いでＤＮＡポリメラーゼを用いるプライマー伸長反応において上記ディスプレーサオリゴヌクレオチドを伸長して、上記標的核酸からの上記第１のＤＮＡプライマー伸長産物と置換する第２のＤＮＡプライマー伸長産物を得る工程を含む。好ましい態様では、上記ＤＮＡポリメラーゼの活性は、上記のディスプレーサオリゴヌクレオチド及びプライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物の形成に実質的に限定される。
【００１６】
上記の実施態様のいずれかを実施するのに適した試薬及び条件については実施例の部に記載されている。
【００１７】
本発明の方法は、臨床、食物、水、工業、環境、法医学及び類似のサンプルにおいて特定の核酸標的配列を検出及び／又は定量するための、或いは各種用途の特定標的配列のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの多数のコピーを作製するさめのアッセイの構成要素として用いることができる。（本明細書に用いている「コピー」という用語は、上記標的配列と同じ又は反対のセンスを有する増幅産物のことを言う。）こうした方法は、クローニング又はプローブ作製又は配列決定用ＲＮＡ及びＤＮＡコピーの作製に用いることもできる。
【００１８】
上記の実施態様のプライミングオリゴヌクレオチドには、そこからのＤＮＡ合成の開始を阻止するために、こうしたプライミングオリゴヌクレオチドのうちの１種で標的核酸又はＲＮＡ産物を処理する前にその３’末端とハイブリッド形成させた塩基領域を含むキャップを任意選択的に付加する。（本明細書に用いている「プライミングオリゴヌクレオチド」という用語にはディスプレーサオリゴヌクレオチドを含めている。）  プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端塩基（即ち、最も３’側の塩基）にキャップの５’末端塩基（即ち、最も５’側の塩基）をハイブリッド形成させる。しかしながら、こうしたキャップは、標的核酸、プライマー伸長産物又はＲＮＡ産物によってプライミングオリゴヌクレオチドから優先的に外されるように設計される。本発明のキャップはキャッピングオリゴヌクレオチド単体の形をとってもよく、又はリンカーを介してプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に結合させてもよい。キャッピングオリゴヌクレオチドは、そこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変される（例えば、その３’末端にブロッキング部分を含む）ことが好ましい。
【００１９】
標的核酸又はその相補体に対するプライミングオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるために、このプライミングオリゴヌクレオチドがプライマー伸長反応において伸長されるのを妨げず、又はこのプライミングオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成している鋳型ＲＮＡの切断を実質的に妨げない限り、プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に、この標的核酸又はＲＮＡ産物へのこのプライミングオリゴヌクレオチドの結合特性（例えば、ハイブリッド形成又は塩基スタッキング）を向上させる１つ以上の改変部位を含ませることができる。こうした改変部位はプライミングオリゴヌクレオチドの３’末端との間隔を少なくとも１５塩基分とり、最も好ましくは、このプライミングオリゴヌクレオチドの最も５’側の３又は５個のヌクレオチドに限定された領域をとる。好ましい改変部位としては２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド及び「ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）」又は「ロックドヌクレオシドアナログ（ＬＮＡ：Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ）」が挙げられる。Ｂｅｃｋｅｒほか、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒｓ，”米国特許第６，１３，０３８号；Ｉｍａｎｉｓｈｉほか、“Ｂｉｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，”米国特許第６，２６８，４９０号；及びＷｅｎｇｅｌほか、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，”米国特許第６，６７０，４６１号を参照されたい。上記引用文献のそれぞれの内容は引用により本明細書に組み込まれている。
【００２０】
上記の方法に用いるプロモータオリゴヌクレオチドには、ＲＮＡ産物が形成される速度を高めるために選択した挿入配列をさらに含ませることができる。この挿入配列は、好ましくは５乃至２０ヌクレオチド長であり、上記プロモータオリゴヌクレオチドの第１及び第２の領域の間又はこれらに隣接して配置する。本発明の好ましい挿入配列としては、配列番号１
【００２１】
【化１】
2010520750.tif 000003
【００２２】
の塩基配列及び配列番号２
【００２３】
【化２】
2010520750.tif 000004
【００２４】
の塩基配列が挙げられる。
【００２５】
上記方法のいずれにおいてもエクステンダーオリゴヌクレオチドを含ませることによって増幅速度に影響を与えることもできる。エクステンダーオリゴヌクレオチドは、好ましくは１０乃至５０ヌクレオチド長であり、このエクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端がプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端に隣接するか、その近傍にくるように鋳型ＤＮＡとハイブリッド形成するよう設計する。このエクステンダーオリゴヌクレオチドはそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変する（例えば、３’末端ブロッキング部分を含ませる）ことが好ましい。
【００２６】
上記の方法の用途によっては、上記結合分子に、上記プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域の５’末端と重なり合う５’末端を有するオリゴヌクレオチドを含ませることができる。上記プロモータオリゴヌクレオチドとこの結合分子とのハイブリッド形成を限定するために、このプロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域の５’末端は、このプロモータオリゴヌクレオチドの上記結合分子とのハイブリッド形成を妨げるためにこの結合分子の５’末端とのミスマッチを十分数含むよう合成することができる。一般的に単一のミスマッチで十分であるはずであるが、上記プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域で必要とされる不安定化ミスマッチの数は、上記の重なり合う領域の長さ及び塩基組成によって決まることになる。
【００２７】
上記方法の適応に際しては、上記プライマー伸長産物又は第１のプライマー伸長産物を上記プロモータオリゴヌクレオチドで処理する前にこのプロモータオリゴヌクレオチドから上記ブロッキング部分を放出させることができる。このブロッキング部分の放出を容易にするために、オリゴデオキシヌクレオチドと予めハイブリッド形成させた反応混合物にこのプロモータオリゴヌクレオチドを供給する。このオリゴデオキシヌクレオチドは、十分な数の連続するリボヌクレオチドを含む上記プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域の３’領域とハイブリッドを形成することにより、この３’領域のリボヌクレオチドを切断することができる酵素活性の存在下に上記プロモータオリゴヌクレオチドから上記ブロッキング部分を放出させる。このリボヌクレオチドの切断時には、上記オリゴデオキシヌクレオチドも上記プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域から放出され、この第１の領域の残りの非切断部分は上記のプライマー伸長産物又は第１のプライマー伸長産物とハイブリッドを形成する。リボヌクレオチドの３’セクションは、少なくとも６つの連続するリボヌクレオチドを含むことが好ましく、上記オリゴデオキシヌクレオチドは、リボヌクレオチドの３’セクションと同じ長さであり、かつ、これに対して完全に相補性であることが好ましい。このオリゴデオキシヌクレオチドは、これ単独の分子であっても、リンカーによって上記プロモータオリゴヌクレオチドに結合されていてもよい。
【００２８】
本発明はさらに、上記の方法を実施するのに有用な反応混合物に関する。本発明の反応混合物には、上記の方法を実施するために必要な各成分、又は成分間のいくつかの副次的組合せを添加することができる。
【００２９】
本発明の方法で使用する材料及び／又は試薬は、キット（例えば、臨床研究室もしくは犯罪研究室用の診断キット又は一般的な研究室用途の核酸増幅キット）の部分として組み込むことができる。従って、本発明は、本発明の方法を実施するのに必要な成分の一部又は全部を備えるキット及び上記に開示した方法を実施するために書面又は電子形式で提供される使用説明書を包含する。こうした成分としては、例えば、オリゴヌクレオチド、結合分子、ストック溶液、酵素、陽性及び陰性対照標的配列、検出試薬、容器（例えば、試験管、キュベット、カセット、プレート、マイクロ流体デバイスなど）が挙げられる。
【００３０】
本発明の特定の実施態様は、上記増幅反応混合物中の上記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ産物の存在又は量を測定するための１種以上の検出プローブを含む。プローブは、この増幅反応後にＲＮＡ及び／又はＤＮＡ産物を検出（即ち、終点検出）するように、或いはこの増幅反応中にＲＮＡ及び／又はＤＮＡ産物を検出（即ち、リアルタイム検出は上記反応混合物中のプローブ：単位複製配列複合体に関連するシグナルの量を定期的に測定するものである）するように設計することができる。従って、こうしたプローブは、上記増幅反応の前、増幅反応中又は増幅反応の完了時に、上記反応混合物に供給することができる。上記の最初の２つの方法におけるＲＮＡ産物のリアルタイム検出の場合、上記第１のプライマー伸長反応が開始した（即ち、増幅酵素の添加）後に上記プローブを上記反応混合物に供給することが望ましいと考えられる。何故なら、プローブがＲＮＡ産物ではなく上記標的配列に結合することにより、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）が上記プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させることができる速度が遅くなると考えられるからである。
【００３１】
プローブは、検出を容易にするために１以上の結合標識を有することが好ましい。
【００３２】
本発明はさらに、本明細書に記載したプライミングオリゴヌクレオチド、プロモータオリゴヌクレオチド、停止オリゴヌクレオチド、ディスプレーサオリゴヌクレオチド、キャッピングオリゴヌクレオチド、エクステンダーオリゴヌクレオチド及び検出プローブを含む種々のオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡ（及びこれらの類似体）とすることができ、いずれの場合にも、本発明がＤＮＡオリゴヌクレオチドのＲＮＡ等価物及びＲＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ等価物を包含することは言うまでもない。以下に記載した好ましいプライミングオリゴヌクレオチド、ディスプレーサオリゴヌクレオチド及び検出プローブを除いて、以下の諸段落に記載したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼ存在下の合成反応におけるその関与が阻止されるように改変する（例えば、その３’末端にブロッキング部分を含ませる）ことが好ましい。
【００３３】
標的核酸がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）５’非翻訳領域を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、ＴＪ、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３
【００３４】
【化３】
2010520750.tif 000005
【００３５】
のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号４
【００３６】
【化４】
2010520750.tif 000006
【００３７】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３２個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号５
【００３８】
【化５】
2010520750.tif 000007
【００３９】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号４又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３２個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。
【００４０】
標的核酸がＨＣＶ  ５’非翻訳領域を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号６
【００４１】
【化６】
2010520750.tif 000008
【００４２】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３１個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号６の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号６又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３１個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。
【００４３】
上記標的核酸がＨＣＶ  ５’非翻訳領域を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号７
【００４４】
【化７】
2010520750.tif 000009
【００４５】
の塩基配列、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、非ヒト核酸）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１０、１３又は１５個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号７の塩基配列、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号７の塩基配列、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１３又は１５個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。上記標的核酸がＨＣＶ  ５’非翻訳領域を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大４０又は５０塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号８
【００４６】
【化８】
2010520750.tif 000010
【００４７】
の塩基配列、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、非ヒト核酸）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１８、２０又は２２個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号８の塩基配列、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号８の塩基配列、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１８、２０又は２２個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。上記標的核酸がヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ：ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）ｐｏｌ遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、ＴＪ、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号９
【００４８】
【化９】
2010520750.tif 000011
【００４９】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３１個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。このプロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号１０
【００５０】
【化１０】
2010520750.tif 000012
【００５１】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号９の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３１個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。
【００５２】
上記標的核酸がＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号１１
【００５３】
【化１１】
2010520750.tif 000013
【００５４】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１１の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。
【００５５】
上記標的核酸がＨＩＶ  ｏｌ遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号１２
【００５６】
【化１２】
2010520750.tif 000014
【００５７】
の塩基配列、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、非ヒト核酸）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１３、１５又は１７個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号１２の塩基配列、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号１２、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１３、１５又は１７個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。
【００５８】
上記標的核酸がヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ：  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）Ｅ６及びＥ７遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号１３
【００５９】
【化１３】
2010520750.tif 000015
【００６０】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。このプロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号１４
【００６１】
【化１４】
2010520750.tif 000016
【００６２】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号１３又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。
【００６３】
上記標的核酸がＨＰＶ  Ｅ６及びＥ７遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号１５
【００６４】
【化１５】
2010520750.tif 000017
【００６５】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５又は１９個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号１５の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１５又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５又は１９個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。
【００６６】
上記標的核酸がＨＰＶ  Ｅ６及びＥ７遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号１６
【００６７】
【化１６】
2010520750.tif 000018
【００６８】
又はその相補体の塩基配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、非ヒト核酸）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１５、１７又は１９個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号１６又はその相補体の塩基配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号１６又はその相補体であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１５、１７又は１９個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。標的核酸が西ナイルウイルス（ＷＮＶ：Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  Ｖｉｒｕｓ）非構造蛋白質５遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、ＴＪ、Ｔｉ又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号１７
【００６９】
【化１７】
2010520750.tif 000019
【００７０】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。このプロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号１８
【００７１】
【化１８】
2010520750.tif 000020
【００７２】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号１７又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。
【００７３】
標的核酸がＷＮＶ非構造蛋白質５遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号１９
【００７４】
【化１９】
2010520750.tif 000021
【００７５】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０又は２３個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号１９の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１９又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０又は２３個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。
【００７６】
標的核酸がＷＮＶ非構造蛋白質５遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号２０
【００７７】
【化２０】
2010520750.tif 000022
【００７８】
、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、非ヒト核酸）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１４、１６又は１８個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号２０、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号２０、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１４、１６又は１８個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。
【００７９】
標的核酸がＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号２１
【００８０】
【化２１】
2010520750.tif 000023
【００８１】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は３０個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。このプロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号２２
【００８２】
【化２２】
2010520750.tif 000024
【００８３】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号２１又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は３０個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。標的核酸がＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号２３
【００８４】
【化２３】
2010520750.tif 000025
【００８５】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２９個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号２３の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号２３又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２９個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。
【００８６】
標的核酸がＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号２４
【００８７】
【化２４】
2010520750.tif 000026
【００８８】
、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、非Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ核酸）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１９、２２又は２４個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号２４、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号２４、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１９、２２又は２４個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。
【００８９】
標的核酸がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、ＴＪ、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号２５
【００９０】
【化２５】
2010520750.tif 000027
【００９１】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５又は３６個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。このプロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号２６
【００９２】
【化２６】
2010520750.tif 000028
【００９３】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号２５又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５又は３６個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。標的核酸がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号２７
【００９４】
【化２７】
2010520750.tif 000029
【００９５】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３１個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。このプロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号２８
【００９６】
【化２８】
2010520750.tif 000030
【００９７】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号２７又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３１個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。
【００９８】
標的核酸がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号２９
【００９９】
【化２９】
2010520750.tif 000031
【０１００】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号２９の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号２９又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。
【０１０１】
標的核酸がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号３０
【０１０２】
【化３０】
2010520750.tif 000032
【０１０３】
、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ複合生物に由来する核酸ではないもの）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１８、２０又は２２個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号３０、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号３０、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１８、２０又は２２個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。
【０１０４】
標的核酸がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号３１
【０１０５】
【化３１】
2010520750.tif 000033
【０１０６】
、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ複合生物に由来する核酸ではないもの）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも２２、２５又は２８個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号３１、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号３１、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも２２、２５又は２８個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、フルオロフォア／クエンチャー色素対を含ませる。標的核酸がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号３２
【０１０７】
【化３２】
2010520750.tif 000034
【０１０８】
、その相補体、又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列の塩基配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ複合生物に由来する核酸ではないもの）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１８、２０又は２２個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号３２、その相補体、又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列の塩基配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号３２、その相補体又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１８、２０又は２２個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。
【０１０９】
標的核酸がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（例えば、メチシリン耐性株）のｏｒｆＸ遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３
【０１１０】
【化３３】
2010520750.tif 000035
【０１１１】
のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号３３
【０１１２】
【化３４】
2010520750.tif 000036
【０１１３】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２９個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。このプロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号３４
【０１１４】
【化３５】
2010520750.tif 000037
【０１１５】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号３などのプロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号３３又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２９個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。
【０１１６】
標的核酸がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（例えば、メチシリン耐性株）のｏｒｆＸ遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号３５
【０１１７】
【化３６】
2010520750.tif 000038
【０１１８】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２６個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号３５の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号３５又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２６個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。標的核酸がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（例えば、メチシリン耐性株）のｏｒｆＸ遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号３６
【０１１９】
【化３７】
2010520750.tif 000039
【０１２０】
の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２６個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号３６の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。
【０１２１】
上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号３６又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２６個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。標的核酸がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（例えば、メチシリン耐性株）のｏｒｆＸ遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号３７
【０１２２】
【化３８】
2010520750.tif 000040
【０１２３】
、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１０、１２、１５又は１７個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブの標的結合領域の塩基配列は、配列番号３８の塩基配列、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で、後述のように、「分子ビーコン」又は「分子トーチ」のような、その末端間の自己ハイブリッド形成によるヘアピン分子を形成することが可能なものとすることができる。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、１対の相互作用蛍光標識を含ませる。本発明の一部を構成しない増幅反応の場合、上記のプロモータオリゴヌクレオチドに対してそのプロモータ配列を排除するように改変することができ、及び／又は上記プライミングオリゴヌクレオチドに対してプロモータ配列を含むように改変することができる。さらに、標的配列に対する所望の特異性を得ることができる場合には、上記のプロモータオリゴヌクレオチド及び／又はプライミングオリゴヌクレオチドを改変して検出プローブとして用いることができる。また、上記の検出プローブは増幅用オリゴヌクレオチドとしての使用に適したものとすることができる。
【０１２４】
この発明の他の特徴と利益とは、その好ましい実施態様に関する下記の説明及び特許請求の範囲から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１Ａ】本発明の１つの一般的な方法を示す図である。
【図１Ｂ】本発明の１つの一般的な方法を示す図である。
【図１Ｃ】本発明の１つの一般的な方法を示す図である。
【図１Ｄ】本発明の１つの一般的な方法を示す図である。
【図２Ａ】ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドに対して３’側の伸長産物とエクステンダーオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成をさらに含む、図１Ａの一般的な方法を示す図である。
【図２Ｂ】ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドに対して３’側の伸長産物とエクステンダーオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成をさらに含む、図１Ｂの一般的な方法を示す図である。
【図２Ｃ】ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドに対して３’側の標的配列とエクステンダーオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成をさらに含む、図１Ｃの一般的な方法を示す図である。
【図２Ｄ】ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドに対して３’側の標的配列とエクステンダーオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成をさらに含む、図１Ｄの一般的な方法を示す図である。
【図３】３’ブロッキング部分を有するプロモータオリゴヌクレオチドの使用効果を示す変性アガロースゲルを示す図である。
【図４−１】図４Ａは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを完全に含むように改変した停止オリゴヌクレオチドの存在下のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ系における増幅産物のリアルタイム累積を示す図である。この反応のための投入標的核酸は０コピーであった。図４Ｂは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを完全に含むように改変した停止オリゴヌクレオチドの非存在下のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ系における増幅産物のリアルタイム累積を示す図である。この反応のための投入標的核酸は０コピーであった。
【図４−２】図４Ｃは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを完全に含むように改変した停止オリゴヌクレオチドの存在下のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ系における増幅産物のリアルタイム累積を示す図である。この反応のための投入標的核酸は１００コピーであった。図４Ｄは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを完全に含むように改変した停止オリゴヌクレオチドの非存在下のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ系における増幅産物のリアルタイム累積を示す図である。この反応のための投入標的核酸は１００コピーであった。
【図４−３】図４Ｅは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを完全に含むように改変した停止オリゴヌクレオチドの存在下におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ系における増幅産物のリアルタイム累積を示す図である。この反応のための投入標的核酸は１０００コピーであった。図４Ｆは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを完全に含むように改変した停止オリゴヌクレオチドの非存在下におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ系における増幅産物のリアルタイム累積を示す図である。この反応のための投入標的核酸は１０００コピーであった。
【図５】プライマー依存性副産物の形成を示す図である。
【図６】図６Ａは、副産物形成を制限するためのキャップの使用を示す図である。このキャップおよびプライミングオリゴヌクレオチドは別々の分子である。図６Ｂは、副産物形成を制限するためのキャップの使用を示す図である。このキャップおよびプライミングオリゴヌクレオチドは互いに連結している。
【図７】図７Ａは、副産物形成におけるキャッピングオリゴヌクレオチドの効果を示す非変性アガロースゲルの図である。鋳型の添加なしの反応を示す。図７Ｂは、副産物形成におけるキャッピングオリゴヌクレオチドの効果を示す非変性アガロースゲルの図である。鋳型を添加した反応を示す。
【図８】本発明の方法による、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ系における増幅産物のリアルタイム蓄積を示す図である。この標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、これを陰性対照に対して４コピーレベルで調べた。
【図９Ａ】本発明の方法による、特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ系における増幅産物のリアルタイム蓄積を示す図である。この系における標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、系は陰性対照に対して標的の１０，０００コピーで調べた。この系では図１Ｄの方法を用いた。
【図９Ｂ】本発明の方法による、特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ系における増幅産物のリアルタイム蓄積を示す図である。この系における標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、系は陰性対照に対して標的の１０，０００コピーで調べた。図９Ａに用いた成分のうち停止オリゴヌクレオチドを除外した。
【図９Ｃ】本発明の方法による、特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ系における増幅産物のリアルタイム蓄積を示す図である。この系における標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、系は陰性対照に対して標的の１０，０００コピーで調べた。図９Ａに用いた成分のうちディスプレーサオリゴヌクレオチドを除外した。
【図９Ｄ】本発明の方法による、特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ系における増幅産物のリアルタイム蓄積を示す図である。この系における標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、系は陰性対照に対して標的の１０，０００コピーで調べた。図９Ａに用いた成分のうちプライミングオリゴヌクレオチドを除外した。
【図９Ｅ】本発明の方法による、特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ系における増幅産物のリアルタイム蓄積を示す図である。この系における標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、系は陰性対照に対して標的の１０，０００コピーで調べた。この図の方法では変性工程を除外した。
【発明を実施するための形態】
【０１２６】
本発明によれば、特定の核酸標的配列の検出及び／又は定量のためのアッセイに用いるそのような核酸標的配列の増幅のための、並びに各種用途の特定標的配列のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの多数のコピーの作製のための新規な方法、反応混合物、組成物並びにキットが提供される。特に、本発明の実施態様では、特異性および感度が増強された核酸標的配列の増幅方法が提供される。本発明の増幅方法は、標的核酸の１種のセンスのみを標的にするプライミングオリゴヌクレオチドを用いて実施するのが好ましく、この増幅方法に用いる他の全てのオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼがこれらを伸長することができないように、それらの３’末端にブロッキング部分を含むことが好ましい。
【０１２７】
定義
以下の用語は、特に反対の意味に明記されない限り、以下の意味を有する。用語「１つの」（「ａ」または「ａｎ」）ものとは、１以上のそのものを指すことに留意されたい。例えば、「１つの核酸（ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」は、１以上の核酸を表すものと解釈される。従って、用語「１（つ）」（「ａ」または「ａｎ」））、「１（つ）以上」（「ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ」）および「少なくとも１（つ）」（「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ」）は、本明細書では同じ意味で用いることがある。
【０１２８】
１．核酸
「核酸」という用語は、単数の「核酸」及び複数の「核酸」を包含するものであり、２個以上のヌクレオチド、ヌクレオシド又は核酸塩基（例えば、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド）が共有結合した任意の鎖を意味する。核酸としては、ＤＮＡ又はＲＮＡのウイルスゲノム又はその一部、細菌ゲノム又はその一部、真菌、植物もしくは動物ゲノム又はそれらの一部、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ或いは合成ＤＮＡ又はＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。核酸は、線状（例えば、ｍＲＮＡ）、環状（例えば、プラスミド）又は分枝状の形、及び二本鎖又は一本鎖の形で供給することができる。核酸には、核酸の機能又は挙動を変えるために塩基を改変（例えば、核酸にさらにヌクレオチドが付加されるのをブロックするために３’末端にジデオキシヌクレオチドを付加）したものを含めることができる。本明細書に用いている核酸の「配列」という用語は、核酸を構成する塩基の配列のことを指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では核酸鎖を意味して用いることがある。本出願の全体を通じて、核酸は、５’末端および３’末端を有するものとして表される。標準的な核酸、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡは、通常、「５’側から３’側へ」、即ち、伸びている核酸の３’末端にヌクレオチドを付加することによって合成される。
【０１２９】
「ヌクレオチド」は、リン酸基、五炭糖および窒素塩基からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡ中に存在する五炭糖はリボースである。ＤＮＡでは、五炭糖は２’−デオキシリボースである。この用語は、そのようなサブユニットのアナログ、例えば、リボースの２’位にメトキシ基（２’−Ｏ−Ｍｅ）を有するものをも包含する。本明細書に用いている用語「Ｔ」残基を含有するメトキシオリゴヌクレオチドは、リボース部分の２’位にメトキシ基及びそのヌクレオチドの塩基位置にウラシルを有する。
【０１３０】
「非ヌクレオチドユニット」は、ポリマーのハイブリッド形成に有意に関与しないユニットである。そのようなユニットは、例えば、ヌクレオチドとのいかなる有意な水素結合に関与してはならず、５つのヌクレオチド塩基またはそれらの類似体の１つを成分として有するユニットを除外することになる。
【０１３１】
２．オリゴヌクレオチド
本明細書に用いている「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」という用語は、単数の「オリゴヌクレオチド」及び複数の「オリゴヌクレオチド」を包含するものであり、本発明の増幅方法及びそれに続く検出方法において試薬として用いる２個以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基またはこれらの関連化合物の任意のポリマーのことを意味する。このオリゴヌクレオチドはＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はこれらの類似体とすることができる。用語オリゴヌクレオチドは、その試薬に特有の機能を表すのではなく、むしろ、本明細書に記載したそのような試薬全てを対象として含むように総称的に用いる。オリゴヌクレオチドは、種々様々な機能を果たすことができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドが相補鎖とハイブリッドを形成することができ、さらに核酸ポリメラーゼの存在下で伸長され得る場合には、プライマーとして機能することができ、オリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含み、転写を可能にする場合には、プロモータとなることができ、オリゴヌクレオチドが適切な位置に置かれ、及び／又は改変される場合には、ハイブリッド形成を阻止し、又はプライマー伸長を妨げるように機能することができる。以下に本発明の特定のオリゴヌクレオチドについてさらに詳細に説明する。本明細書に用いているオリゴヌクレオチドは事実上任意の長さとすることができ、増幅反応または増幅反応の増幅産物の検出におけるその特定の機能によってのみ限定される。特定の配列及び化学構造のオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の技術、例えば、化学的もしくは生化学的合成、及び細菌性もしくはウイルス性ベクターなどの組換え核酸分子からのインビトロもしくはインビボ発現によって作製することができる。本開示が意味するオリゴヌクレオチドは、単に、野生型染色体ＤＮＡ又はそのインビボ転写産物からなるものではない。
【０１３２】
オリゴヌクレオチドは、所与の改変が所与のオリゴヌクレオチドの所望の機能に適合する限り、任意の方法で改変することができる。所与の改変が本発明の任意のオリゴヌクレオチドに適切なもの、又は望ましいものであるかどうかは、当業者であれば容易に確認することができる。改変としては、塩基の改変、糖の改変又は骨格の改変が挙げられる。塩基の改変としては、アデニン、シチジン、グアノシン、チミン及びウラシルの他に以下の塩基の使用が挙げられるが、これらに限定されるものではない：Ｃ−５プロピン、２−アミノアデノシン、５−メチルシチジン、イノシン、並びにｄＰ及びｄＫ塩基。ヌクレオシドサブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボース及びこれらの類似体とすることができ、例えば、リボフラノシル部分に対して２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドが挙げられる。Ｂｅｃｋｅｒほか、米国特許第６，１３０，０３８号を参照されたい。他の糖改変としては、２’−アミノ，２’−フルオロ，（Ｌ）−α−スレオフラノシル及びペントプラノシル（ｐｅｎｔｏｐｕｒａｎｏｓｙｌ）の改変が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらのヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合、改変された結合などの結合、又はオリゴヌクレオチドとその相補性標的核酸とのハイブリッド形成を妨げない非ヌクレオチド部分によって連結させることができる。改変された結合としては、標準的なホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合のような異なる結合に置き換えられた結合が挙げられる。これらの核酸塩基サブユニットは、例えば、ＤＮＡの天然のデオキシリボースホスフェート骨格を偽ペプチド骨格（例えば、カルボキシメチルリンカーによって核酸塩基サブユニットを中央の第二級アミンに結合させる２−アミノエチルグリシン骨格）で置き換えることによって結合させることができる。（偽ペプチド骨格を有するＤＮＡ類似体は、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」と呼ばれ、Ｎｉｅｌｓｅｎほか、“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，”米国特許第５，５３９，０８２号に開示されている。）他の結合の改変としては、モルホリノ結合が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１３３】
本発明によって想定されているオリゴヌクレオチド又はオリゴマーとしては、二環式および三環式のヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体を含有する核酸類似体（ＬＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。Ｉｍａｎｉｓｈｉほか、米国特許第６，２６８，４９０号及びＷｅｎｇｅｌほか、米国特許第６，６７０，４６１号を参照されたい。本発明では、改変されたオリゴヌクレオチドがその目的とする機能を果たす、例えば、緊縮ハイブリッド形成条件下もしくは増幅条件下で標的核酸とハイブリッドを形成し、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼと相互作用することにより伸長もしくは転写を開始することができるということを条件として、任意の核酸類似体を想定している。検出プローブの場合、こうした改変オリゴヌクレオチドは、緊縮ハイブリッド形成条件下に上記標的核酸と優先的にハイブリッドを形成することができることも必要である。
【０１３４】
本発明のためのオリゴヌクレオチドの設計および配列は、下記のように、その機能によって決まるが、一般に、いくつかの変動要素を考慮に入れておく必要がある。最も重要なものには、長さ、融解温度（Ｔｍ）、特異性、系における他のオリゴヌクレオチドとの相補性、Ｇ／Ｃ含有量、ポリピリミジン（Ｔ、Ｃ）またはポリプリン（Ａ、Ｇ）ストレッチ、および３’末端配列がある。上記及び他の変動要素を制御することは、オリゴヌクレオチド設計の標準的かつ公知の態様であり、多数の候補オリゴヌクレオチドから最適なものをスクリーニングするために種々のコンピュータプログラムを容易に利用することができる。オリゴヌクレオチド（または他の核酸）の３’末端は、下記のように、ブロッキング部分を用いて種々の方法でブロックすることができる。「ブロック化」オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ−もしくはＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼによるその３’末端へのヌクレオチドの付加により伸長させてＤＮＡの相補鎖を生成させることができない。従って、「ブロック化」オリゴヌクレオチドは、「プライミングオリゴヌクレオチド」にはなり得ない。
【０１３５】
本開示に用いている一群の特定配列「から選ばれる配列「を含む」、この配列「からなる」又はこの配列「から本質的になる」核酸配列を有するオリゴヌクレオチド」という語句は、このオリゴヌクレオチドが、基本的および新規な特徴として、緊縮ハイブリッド形成条件下に、その群の列挙された核酸配列のうちの１つの正確な相補体を有する核酸と安定的にハイブリッドを形成することができることを意味している。正確な相補体は、対応するＤＮＡ又はＲＮＡ配列を包含する。「核酸配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチド」という語句は、その言及されたオリゴヌクレオチドが、その基準核酸配列に十分類似し、その結果、そのオリゴヌクレオチドが、緊縮ハイブリッド形成条件下で同標的核酸配列とハイブリッドを形成するという点でその基準核酸配列と同様なハイブリッド形成特性を有することを意味する。本発明の「実質的に対応する」オリゴヌクレオチドが上記の言及された配列から変化してもなお、同標的核酸配列とハイブリッドを形成し得ることは、当業者であれば理解されよう。この核酸からの変化量は、その配列内の同一塩基の割合、またはそのプローブもしくはプライマーとその標的配列との間の完全に相補的な塩基の割合によって示すことができる。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、こうした塩基同一性または相補性の割合が１００％乃至約８０％である場合に、基準核酸配列に実質的に対応する。好ましい実施態様では、この割合は、１００％乃至約８５％である。より好ましい実施態様では、この割合は、１００％乃至約９０％とすることができ、別の好ましい態様では、この割合は、１００％乃至約９５％である。許容不能なレベルの非特異的なハイブリッド形成をもたらすことなく特定の標的核酸とのハイブリッド形成を可能にするために、種々の相補性の割合においてハイブリッド形成条件に対して様々な変更を加えることが必要とも考えられることは、当業者であれば理解されよう。
【０１３６】
３．ブロッキング部分
本明細書に用いている「ブロッキング部分」とは、核酸ポリメラーゼがオリゴヌクレオチドもしくは他の核酸を伸長させることができないようにそのオリゴヌクレオチドもしくは他の核酸の３’末端を「ブロックする」ために使用される物質である。ブロッキング部分は、小分子、例えば、リン酸基もしくはアンモニウム基であってもよく、又は改変ヌクレオチド、例えば、３’２’ジデオキシヌクレオチド、３’デオキシアデノシン５’三リン酸（コルジセピン）その他の改変ヌクレオチドであってもよい。別のブロッキング部分としては、例えば、３’末端に遊離のヒドロキシル基が存在しないように３’から５’の方向性を有するヌクレオチドもしくは短いヌクレオチド配列の使用、３’アルキル基、３’非ヌクレオチド部分（例えば、Ａｒｎｏｌｄほか、”Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ”，米国特許第６，０３１，０９１号（この内容は、引用により本明細書に組み込まれている）を参照されたい）、ホスホロチオエート、アルカンジオール残基、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、３’末端の３’ヒドロキシル基を欠くヌクレオチド残基、または核酸結合蛋白質の使用が挙げられる。上記の３’ブロッキング部分は、３’から５’の方向性を有するヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列、または３’非ヌクレオチド部分を含み、３’２’−ジデオキシヌクレオチドも遊離のヒドロキシル基を有する３’末端も含まないことが好ましい。３’ブロッキングオリゴヌクレオチドを調製する別の方法については当業者には公知である。
【０１３７】
４．結合分子
本明細書に用いている「結合分子」とは、ＤＮＡプライマー伸長産物を所望の長さに制限する（即ち、プライマー伸長産物が概ね規定された３’末端を有する）ように、所望の標的配列の５’末端に隣接するかその近傍の標的核酸とハイブリッドを形成するか、それとも結合する物質である。本明細書に用いている「規定された３’末端」という語句は、結合分子の非存在下で生じるプライマー伸長反応に当てはまるようにプライマー伸長産物の３’末端が全く不確定ではなく、プライマー伸長産物の３’末端が小範囲の塩基内で概ね分かることを意味する。特定の実施態様において、結合分子は塩基領域を含む。この塩基領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡキメラ分子、又はこれらの類似体とすることができる。塩基領域を含む結合分子は、本明細書に記載したような１種以上の方法で改変することができる。例示的な塩基領域としては、下記のような停止及び消化オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の実施態様では、結合分子には、例えば、十分な親和性及び特異性によってＲＮＡと結合することによりＤＮＡプライマー伸長産物を所定の長さに限定することができる蛋白又は薬物を含ませることができる。
【０１３８】
５．停止オリゴヌクレオチド
本発明において、「停止オリゴヌクレオチド」とは、標的配列５’末端の近傍の標的核酸のある領域に対して相補性の塩基配列を含むことにより、プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸のプライマー伸長を「停止させ」、それによって、この新生核酸鎖に規定された３’末端をもたらすオリゴヌクレオチドである。停止オリゴヌクレオチドは、上記新生核酸鎖に所望の３’末端をもたらすのに十分な位置で上記標的核酸とハイブリッドを形成するように設計する。停止オリゴヌクレオチドの位置決めは、その設計に応じてフレキシブルである。停止オリゴヌクレオチドは改変しても改変しなくてもよい。特定の実施態様において、停止オリゴヌクレオチドは少なくとも１種の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いて合成する。こうした改変ヌクレオチドは、相補二重鎖の熱安定性がより高いことが分かった。この２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を増大させることにより、改変オリゴヌクレオチドの半減期を増大させるようにも機能する。例えば、Ｍａｊｌｅｓｓｉほか、（１９８８年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６：ｐ．２２２４−９を参照されたい。なお、この文献の内容は引用により本明細書に組み込まれている。２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドに加えて、又はこれの代わりに、本明細書の他の箇所に記載した他の改変を利用することができる。例えば、停止オリゴヌクレオチドにＰＮＡ又はＬＮＡを含ませることができる。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｊ  ＭｏＩ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  １３，４４−５３を参照されたい。なお、この文献の内容は引用により本明細書に組み込まれている。本発明の停止オリゴヌクレオチドは、伸長を阻止するためにその３’末端にブロッキング部分を含むことが、必要ではないが、好ましい。停止オリゴヌクレオチドには、ポリメラーゼによる新生核酸の更なる伸長を停止させるようにこのオリゴヌクレオチドに連結させて蛋白又はペプチドを含ませることができる。本発明の停止オリゴヌクレオチドは、通常、少なくとも１０塩基長であり、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さまで伸ばすことができる。本明細書には適切かつ好ましい停止オリゴヌクレオチドを記載した。停止オリゴヌクレオチドは、通常又は必ず３’ブロッキング部分を含むが、「３’−ブロック化」オリゴヌクレオチドが必ずしも停止オリゴヌクレオチドではないことに留意されたい。本発明の他のオリゴヌクレオチド、例えば、プロモータオリゴヌクレオチドおよびキャッピングオリゴヌクレオチドも、通常又は必ず３’ブロック化される。
【０１３９】
６．改変オリゴヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）／消化オリゴヌクレオチド
改変オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長産物の３’末端が決定されるメカニズムをもたらす。通常、改変オリゴヌクレオチドは、標的配列の５’末端の近傍において１以上の塩基とハイブリッドを形成し、改変酵素、例えばヌクレアーゼによるプライマー伸長の停止を容易にするモチーフを含む。或いは、改変オリゴヌクレオチドは、標的配列の３’末端の近傍でハイブリッドを形成し、特定の改変酵素又はその後プライマー伸長を停止させることができる化学物質に繋がれた塩基領域を含むことができよう。
【０１４０】
特異的な改変オリゴヌクレオチドの１つは消化オリゴヌクレオチドである。消化オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、好ましくは少なくとも約６個のデオキシリボヌクレオチドのストレッチで構成される。この消化オリゴヌクレオチドは鋳型ＲＮＡとハイブリッドを形成し、このＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡは、本明細書に記載したような選択的ＲＮＡｓｅ、例えば、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有する酵素によって消化される。
【０１４１】
７．プロモータオリゴヌクレオチド／プロモータ配列
当該分野では公知であるが、「プロモータ」は、核酸に結合するためのシグナルとしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「トランスクリプターゼ」）によって認識され、特定の部位においてＲＮＡの転写を開始させる特殊な核酸配列である。結合のためには、一般には、そのようなトランスクリプターゼは、伸長反応を介してプロモータ配列を含む領域において二本鎖にされたＤＮＡを必要とすると考えられていたが、本発明者らは、ＲＮＡの効率的な転写は二本鎖プロモータが鋳型核酸を用いる伸長反応によって形成されない条件下でさえも起こり得ることを明らかにした。鋳型核酸（転写されるべき核酸）は、二本鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写促進の効率が顕著に異なり得る種々様々なプロモータ配列を認識する。ＲＮＡポリメラーゼがプロモータ配列に結合して転写を開始する場合、このプロモータ配列は、転写される配列の一部ではない。従って、それによって生成されるＲＮＡ転写産物は、この配列を含まないことになる。
【０１４２】
本発明において、「プロモータオリゴヌクレオチド」とは、第１の領域および第２の領域を含み、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されたオリゴヌクレオチドのことを言う。本発明のプロモータオリゴヌクレオチドの上記「第１の領域」は、鋳型ＤＮＡとハイブリッドを形成する塩基配列を含み、このハイブリッド形成配列は、プロモータ領域の３’側に位置するが、必ずしもプロモータ領域に隣接しない。本発明のプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成部分は、通常、少なくとも１０ヌクレオチド長であり、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド長またはそれ以上の長さまで伸長させることができる。上記「第２の領域」は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含む。本発明のプロモータオリゴヌクレオチドは、そのプロモータオリゴヌクレオチドがＲＮＡ依存性又はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、逆転写酵素、によって伸長させることができず、好ましくは上記のように、その３’末端にブロッキング部分を含むように設計される。本明細書には、好適かつ好ましいプロモータオリゴヌクレオチドを記載した。
【０１４３】
本発明のプロモータオリゴヌクレオチドは、第１の領域のリボヌクレオチド含有セクションに結合したオリゴデオキシヌクレオチドを含む反応混合物に供給することができる。このリボヌクレオチド含有セクションは上記第１の領域の３’末端もしくはその近傍に位置する少なくとも６個の連続するリボヌクレオチドを含むことが好ましく、上記オリゴデオキシヌクレオチドは上記第１の領域のリボヌクレオチド含有セクションと同じ長さであり、かつこのセクションに対して完全に相補性であることが好ましい。ＲＮＡ：ＤＮＡ二核酸二重鎖のＲＮＡを切断することができる酵素（例えば、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性）を作用させると、上記プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端のブロッキング部分が放出され、上記第１の領域の残りは、鋳型ＤＮＡとのハイブリッド形成に利用可能な一本鎖の形をとる。上記第１の領域の残りの非切断部分は、上記のように、長さが１０乃至５０ヌクレオチド長であることが好ましい。本発明のプロモータオリゴヌクレオチドを本明細書に開示した方法で用いることにより、上記標的配列内の変動領域間又は反応混合物中に存在すると考えられる標的配列と非標的核酸との間（例えば、一塩基多型（「ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ」）又は近縁の微生物もしくは株間のミスマッチ）を識別することができる。標的核酸と高度の配列同一性を共有するプライマー伸長産物又は核酸がプロモータオリゴヌクレオチドの標的結合部分との１以上の塩基ミスマッチを含有する場合、こうしたミスマッチ塩基の相補体が転写産物に組み込まれた後、これらのミスマッチ塩基は、初回及び／又はその後繰り返されるプライマー伸長において複製されることにより増幅反応の効率及び感度に影響を及ぼす。さらに、プロモータオリゴヌクレオチドの標的結合部分とプライマー伸長産物との間のミスマッチは逆転写酵素の存在下の二本鎖プロモータ配列の形成を妨害することにより増幅反応の効率にさらに影響を及ぼすことがある。増幅反応に対するこうした悪影響を利用することにより、プロモータオリゴヌクレオチドが標的とする領域において配列変化を示す核酸間を識別することができる。
【０１４４】
８．挿入配列
本明細書に用いている「挿入配列」は、プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域（即ち、鋳型結合部分）と第２の領域との間に位置する配列である。挿入配列は、長さが５乃至２０ヌクレオチド長であることが好ましく、より好ましくは６乃至１８ヌクレオチド長、最も好ましくは６乃至１２ヌクレオチド長である。プロモータオリゴヌクレオチド中に挿入配列を含めると、ＲＮＡ増幅産物が形成される速度が増大する。本明細書に例示的な挿入配列を記載している。
【０１４５】
９．エクステンダーオリゴヌクレオチド
エクステンダーオリゴヌクレオチドは、プロモータオリゴヌクレオチドの上記第１の領域の３’末端に隣接するかその近傍の鋳型ＤＮＡとハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドである。エクステンダーオリゴヌクレオチドは、このエクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基がプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端塩基の３、２もしくは１塩基以内にあるように、鋳型ＤＮＡとハイブリッド形成させることが好ましい。エクステンダーオリゴヌクレオチドおよびプロモータオリゴヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとハイブリッドを形成させる場合には、エクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基をプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端塩基に隣接させることが最も好ましい。エクステンダーオリゴヌクレオチドの伸長を阻止するため、通常、３’末端にブロッキング部分を含ませる。エクステンダーオリゴヌクレオチドの長さは１０乃至５０ヌクレオチド長であることが好ましく、より好ましくは２０乃至４０ヌクレオチド長、最も好ましくは３０乃至３５ヌクレオチド長である。
【０１４６】
１０．プライミングオリゴヌクレオチド
プライミングオリゴヌクレオチドは、少なくともその３’末端が鋳型核酸に対して相補性であり、この鋳型とハイブリッドを形成して、ＲＮＡ依存性もしくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる合成の開始に適切なプライミングオリゴヌクレオチド：鋳型ハイブリッドを生じるオリゴヌクレオチドである。プライミングオリゴヌクレオチドは、その３’末端に共有結合される複数のヌクレオチドの付加によって伸長され、これらのヌクレオチドは鋳型に対して相補性である。その結果がプライマー伸長産物である。本発明のプライミングオリゴヌクレオチドの長さは、通常、少なくとも１０ヌクレオオチド長であり、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド長またはそれ以上の長さまで伸長することができる。本明細書には適切かつ好ましいプライミングオリゴヌクレオチドを記載した。周知である実質的にすべてのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）は、ＤＮＡ合成を開始するためにオリゴヌクレオチドが一本鎖鋳型とハイブリッドを形成すること（「プライミング」）を必要とするが、ＲＮＡ複製および転写（ＤＮＡからＲＮＡのコピー）は一般的にプライマーを必要としない。プライミングオリゴヌクレオチドには、その機能上、ＤＮＡポリメラーゼ存在下に伸長を阻止する３’ブロッキング部分を含ませることができない。プライミングオリゴヌクレオチドは、標的核酸と優先的にハイブリッドを形成し、この標的核酸とハイブリッド形成した場合にリボヌクレアーゼがこれを切断することができないように設計することが好ましい。
【０１４７】
１１．ディスプレーサオリゴヌクレオチド
「ディスプレーサオリゴヌクレオチド」とは、標的配列の３’末端とハイブリッド形成した近傍のプライミングオリゴヌクレオチド（本明細書では「フォワードプライミングオリゴヌクレオチド」と称する）より上流側にある鋳型核酸とハイブリッドを形成するプライミングオリゴヌクレオチドである。「上流側」とは、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端がフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの３’末端に対して５’側の鋳型核酸と複合体を形成することを意味する。この鋳型核酸とハイブリッド形成させる場合、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基はフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端塩基に隣接させるか、これから隔てることが好ましい。さらに好ましくは、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基をフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端塩基から５乃至３５塩基隔てる。ディスプレーサオリゴヌクレオチドは、フォワードプライミングオリゴヌクレオチドと同時に、又はフォワードプライミングオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とハイブリッドを形成する時間を十分とった後に、反応混合物に供給することができる。フォワードプライミングオリゴヌクレオチドの伸長は、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの反応混合物への供給の前又はこの供給の後に開始することができる。増幅条件下で、このディスプレーサオリゴヌクレオチドは鋳型依存性に伸長されることにより、この鋳型核酸と複合体が形成される上記フォワードプライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物と置換する。一旦標的核酸から置換されると、このフォワードプライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物はプロモータオリゴヌクレオチドとの複合体形成に利用可能となる。上記のフォワードプライミングオリゴヌクレオチド及びディスプレーサオリゴヌクレオチドはいずれも標的核酸と優先的にハイブリッドを形成する。
【０１４８】
１２．キャップ又はキャッピングオリゴヌクレオチド
本明細書に用いている「キャップ」は、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端に対して相補性のオリゴヌクレオチドを含み、このキャップの５’末端塩基は上記プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端とハイブリッドを形成する。本発明によるキャップは、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端と優先的にハイブリッドを形成する（例えば、プロモータオリゴヌクレオチドとはハイブリッドを形成しない）が、プライミングオリゴヌクレオチドと標的核酸とがハイブリッドを形成することによりこのキャップが置換されるように設計する。キャップはキャッピングオリゴヌクレオチド単体の形をとることができ、又はこれはリンカー領域を介してプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に連結させることにより増幅条件下でプライミングオリゴヌクレオチドとステム−ループ構造を形成させることができる。このようなリンカー領域には、通常のヌクレオチド、無塩基ヌクレオチドもしくはその他の点で改変されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド領域を含めることができる。本明細書により詳細に記載されるように、適切なキャップの長さは、少なくとも３塩基長であり、約１４塩基未満の長さである。代表的なキャップの長さは約５乃至７塩基長である。
【０１４９】
１３．プローブ
「プローブ」又は「検出プローブ」とは、検出しようとする標的配列の各センスを含有する増幅産物の領域に対して部分的もしくは完全に相補性の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことによって緊縮ハイブリッド形成条件下でこれとハイブリッドを形成する分子を意味する。当業者であれば理解されようが、プローブは、単一の核酸分子又はその類似体を、人間が介入しなければ天然には存在しない（例えば、異種核酸を用いて組み換えられるか、単離されるか、ある程度精製された）形態で含む。
【０１５０】
本発明のプローブは、標的とされる領域の外側に別のヌクレオチド類を、そのようなヌクレオチド類が緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成に実質的に影響を及ぼさず、検出プローブの場合には、標的配列との優先的なハイブリッド形成を妨げない限り、有することができる。また、標的捕捉配列（一般的には、ポリＡ、ポリＴまたはポリＵテイルのようなホモポリマー区域）、プロモータ配列、ＲＮＡ転写のための結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位のような非相補配列も含ませることができ、又は、この非相補配列には、上記プローブもしくは上記標的核酸又はこれらの両者に触媒活性部位もしくはヘアピン構造のような所望の二次もしくは三次構造を付与する配列を含ませることができる。上記プローブは、少なくとも１種の検出可能な標識を含むことが好ましい。上記プローブは、少なくとも１種の検出可能な標識を含むことが好ましい。この標識は、任意の適切な標識物質とすることができ、このようなものとして放射性同位体、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、リン光分子、電気化学発光分子、発色団、上記の条件下で標的核酸と安定にハイブリッドを形成することができない塩基配列領域、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に好ましい一実施態様において、この標識はアクリジニウムエステルである。こうしたプローブには、そのプローブが標的配列とハイブリッドを形成したかどうかによって異なるシグナルを発する相互作用標識を含ませることができる。相互作用標識の例としては、酵素／基質、酵素／補因子、ルミネッセント／クエンチャー、ルミネッセント／アダクト、色素二量体、およびフォレスターエネルギー転移対が挙げられる。本発明の特定のプローブは標識を含まない。例えば、非標識「捕捉」プローブを用いて標的配列又はその複製物を濃縮することができ、次いでこれを第２の「検出」プローブによって検出することができる。例えば、Ｗｅｉｓｂｕｒｇほか、“Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，”米国特許第６，５３４，２７３号を参照されたい。なお、この特許の内容は、引用により本明細書に組み込まれている。検出プローブは通常標識されるが、特定の検出技術を用いれば、増幅産物の検出のためにこのプローブを標識する必要がない。例えば、Ｎｙｇｒｅｎほか、“Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、米国特許第６，０６０，２３７号を参照されたい。
【０１５１】
「安定な」または「検出のために安定な」とは、反応混合物の温度が核酸二重鎖の融解温度よりも少なくとも２℃低いことを意味する。反応混合物の温度は、核酸二重鎖の融解温度よりも少なくとも５℃低いことがより好ましく、核酸二重鎖の融解温度よりも少なくとも１０℃低いことがさらにより好ましい。
【０１５２】
「優先的にハイブリッドを形成する」とは、緊縮ハイブリッド形成条件下において、本発明のプローブが標的配列の各センスを含有する増幅産物とハイブリッドを形成して安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成し、同時に安定なプローブ：非標的ハイブリッドの形成を最小限に抑えることを意味する。従って、プローブが非標的配列に対してよりも十分高い程度に標的配列又はその複製物とハイブリッドを形成することにより、当業者が増幅時に形成される標的配列のＲＮＡ複製物または相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を正確に定量することができるようになる。特定の配列のプローブは、化学合成、組換え核酸分子からのインビボもしくはインビトロ発現などの当業者に周知の技術によって作製することができる。プローブの長さは１０乃至１００ヌクレオチド長であることが好ましく、より好ましくは１２乃至５０塩基長、さらにより好ましくは１８乃至３５塩基長である。
【０１５３】
１４．ハイブリッドを形成する／ハイブリッド形成
核酸ハイブリッド形成とは、完全にもしくは部分的に相補性のヌクレオチド配列を有する２本の核酸鎖が所定の反応条件下で一体となり安定な２本鎖ハイブリッドを形成する過程である。いずれか一方の核酸鎖をデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）又はこれらの類似体とすることができる。従って、ハイブリッド形成はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド又はこれらの類似体の生成に関係する。この二本鎖構造体（ハイブリッドと呼ばれることがある）の２本の構成鎖は、水素結合によって結合される。これらの水素結合は、最も一般的には、一本鎖核酸に塩基のアデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴもしくはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含むヌクレオチド間で形成されるが、塩基対はこれらの「標準的」対のメンバーではない塩基間でも形成され得る。非標準的塩基対については当該分野で公知である。（例えば、ＲＯＧＥＲ  Ｌ．Ｐ．  ＡＤＡＭＳ  ＥＴＡＬ．、ＴＨＥ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  （第１１版、１９９２年）を参照されたい。）
「緊縮ハイブリッド形成条件」又は「緊縮条件」とは、特定の検出プローブが、標的配列の各センスを反応混合物中に存在する他の核酸を上回って含む増幅産物とハイブリッドを形成することができる条件のことを言う。こうした条件が、プローブのＧＣ含量および長さ、ハイブリッド形成温度、ハイブリッド形成用試薬または溶液の組成並びに求められるハイブリッド形成特異性の程度を含む要因によって異なることは明瞭に理解されよう。特定の緊縮ハイブリッド形成条件について以下の開示において示した。
【０１５４】
「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」または「二重鎖」とは、二本鎖の水素結合領域を含む核酸構造であって、各鎖が他方の鎖に対して相補性であるものとし、この領域が限定されない例として挙げられる化学発光もしくは蛍光の光検出、オートラジオグラフィー、又はゲル電気泳動を含む手段により検出するのに緊縮ハイブリッド形成条件下で十分安定であるものとする核酸構造を意味する。このようなハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖分子を含むことができる。
【０１５５】
「相補性」とは、２つの一本鎖核酸の類似の領域のヌクレオチド配列又は同じ一本鎖核酸の２つの異なる領域のヌクレオチド配列が、その一本鎖領域同士が緊縮ハイブリッド形成又は増幅条件下で共に安定な二本鎖水素結合領域としてハイブリッドを形成するのを可能にするヌクレオチド組成を有することを意味する。一方の一本鎖領域のヌクレオチドの連続する配列が、他方の一本鎖領域のヌクレオチドの類似配列と、ＡがＵもしくはＴと対になりＣがＧと対になるように一連の「標準的」水素結合塩基対を形成することができる場合、これらのクレオチド配列は「完全に」相補性である。
【０１５６】
「優先的にハイブリッドを形成する」とは、緊縮ハイブリッド形成条件下で特定の相補的なヌクレオチド配列がハイブリッドを形成して他の安定性の低い二重鎖よりも優先的に安定なハイブリッドを形成することを意味する。
【０１５７】
１５．「核酸」同一性
特定の実施態様において、本発明の核酸は、基準核酸の連続する塩基領域と少なくとも８０％、９０％または１００％同一である連続する塩基領域を含む。短い核酸、例えば、本発明の特定のオリゴヌクレオチドの場合、「照会」核酸の塩基配列と基準核酸の塩基配列との間の同一性の程度は手動のアラインメントによって測定することができる。「同一性」は、比較対象の核酸の糖および骨格領域に関係なく、窒素塩基の配列だけを比較することによって測定する。従って、照会:基準塩基配列アラインメントは、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、あるいはこれらの任意の組み合わせ又は類似体とすることができる。等価なＲＮＡおよびＤＮＡ塩基配列は、（ＲＮＡの）ウリジン残基を（ＤＮＡの）チミジン残基で置き換えることによって比較することができる。
【０１５８】
１６．標的核酸／標的配列
「標的核酸」は、増幅対象の「標的配列」を含む核酸である。標的核酸は、本明細書に記載したように、ＤＮＡまたはＲＮＡとすることができ、一本鎖又は二本鎖のいずれかとすることができる。この標的核酸は、標的核酸以外に、増幅されないこともあり得る他の配列を含むことができる。代表的な標的核酸としては、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、真菌ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、ウイルス、細菌もしくは真核生物細胞由来のｒＲＮＡ、ｔＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又は染色体ＤＮＡが挙げられる。標的核酸は、実行される増幅アッセイの目的に基づいて、任意の数の供給源から単離することができる。標的核酸の供給源としては、犯罪の証拠に由来する臨床標本（例えば、血液、尿、唾液、糞便、精液又は髄液）、環境サンプル（例えば、水又は土壌サンプル）、食物、工業サンプル、ｃＤＮＡライブラリー、あるいは全細胞ＲＮＡに由来する標本が挙げられるが、これらに限定されるものではない。「単離された」とは、標的核酸を含むサンプルがその天然の環境から取得されることを意味するが、この用語は、精製のいかなる程度も暗示するものではない。必要な場合、本発明の標的核酸は、本発明の種々のオリゴヌクレオチドと相互作用させるために利用することができる。これには、例えば、細胞から標的核酸を放出させるために細胞溶解または細胞透過化処理を行った後、一連の単離および洗浄工程などの１つ以上の精製工程を行うことを含めることができる。例えば、Ｃｌａｒｋほか、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｗｉｄｅ  Ｒａｎｇｅ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，”  米国特許第５，７８６，２０８号を参照されたい。なお、この特許の内容は引用により本明細書に組み込まれている。このことは、サンプルが、例えば、血液サンプル中に存在するヘムなどの増幅反応を妨害し得る成分を含有すると考えられる場合に特に重要である。Ｒｙｄｅｒほか、“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｒｏｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ，”  米国特許第５，６３９，５９９号を参照されたい。なお、この特許の内容は引用により本明細書に組み込まれている。増幅のために種々の供給源から標的核酸を調製する方法は、当業者には公知である。本発明の標的核酸は、本明細書に記載した増幅反応の前にある程度精製することができるが、他の場合では、サンプルは、さらなる操作を全く行わずに増幅反応に加える。
【０１５９】
「標的配列」という用語は、増幅させることになる標的核酸の特定のヌクレオチド配列のことを言う。この「標的配列」は、本発明のプロセス中にオリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモータオリゴヌクレオチド）が複合体化した複合配列を含む。標的核酸が元々一本鎖である場合、「標的配列」という用語は、標的核酸に存在するような「標的配列」に対して相補性の配列をも指す。「標的核酸」が元々二本鎖である場合、「標的配列」という用語は、センス（＋）鎖およびアンチセンス（−）鎖の両方を指す。標的配列を選択する際、関連のない、又は密接に関連する標的核酸同士を識別するために「独特の」配列を選択する必要があることは、当業者であれば理解されよう。当業者であれば理解されようが、「独特の」配列は試験環境から判断する。少なくとも検出プローブによって認識される配列は（本明細書の他の箇所でより詳細に記載したが）、試験対象の環境において独特である必要があるが、考えられる全ての配列の範囲内で独特である必要はない。さらに、標的配列は検出プローブによる認識のための「独特の」配列を含む必要があるが、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモータオリゴヌクレオチドは必ずしも「独特の」配列を認識している訳ではない。一部の実施態様では、類縁生物のファミリーに共通する標的配列、例えば、サンプル中に存在する可能性のある全てのＨＩＶ株に共通する配列、を選択することが望ましいことがある。他の場合では、近縁の生物同士、例えば、病原性及び非病原性Ｅ．ｃｏｌｉ、を識別するために、極めて特異的な標的配列、又は少なくとも検出プローブによって認識される非常に特異的な領域を有する標的配列が選択されることになる。本発明の標的配列は、任意の実用的な長さとすることができる。標的配列は、最小限、プライミングオリゴヌクレオチド（又はその相補体）とハイブリッドを形成する領域、プロモータオリゴヌクレオチド（又はその相補体）のハイブリッド形成領域とハイブリッドを形成する領域、及び検出のために使用される領域、例えば、本明細書の他の箇所でより詳細に記載した、検出プローブとハイブリッドを形成する領域を含む。検出プローブとハイブリッドを形成する領域は、プライミングオリゴヌクレオチド（又はその相補体）とハイブリッドを形成する領域あるいはプロモータオリゴヌクレオチド（又はその相補体）のハイブリッド形成領域と重なり合うかこれらの領域内に含まれてもよい。
【０１６０】
上記の最小限の要件の他に、標的配列の最適な長さは、いくつかの考慮すべき事項、例えば、配列中の二次構造又は自己ハイブリッド形成領域の量、によって決まる。最適な長さの決定は、型どおりの最適化方法を用いて当業者により容易に達成される。通常、本発明の標的配列の長さは約１００ヌクレオチド長から約１５０乃至約２５０ヌクレオチド長の範囲である。その最適又は好ましい長さは、様々な条件下で異なると考えられ、こうした条件は、本明細書に記載した方法によって当業者が容易に調べることができる。「単位複製配列」という用語は、増幅工程において生成し、標的配列内に含有される配列と実質的に相補性であるか同一である核酸分子のことを言う。
【０１６１】
１７．鋳型
「鋳型」とは、核酸ポリメラーゼによってコピーされることになる核酸分子である。鋳型は、このポリメラーゼに応じて一本鎖、二本鎖又は部分的に二本鎖とすることができる。この合成されたコピーは、その鋳型、または二本鎖鋳型もしくは部分的に二本鎖の鋳型のうちの少なくとも一方の鎖に対して相補性である。ＲＮＡおよびＤＮＡはいずれも、通常、５’から３’の方向に合成され、核酸二重鎖の２つの鎖は、その２つの鎖の５’末端がその二重鎖の正反対の端部にある（その結果、必然的に３’末端もそのようになる）ように整列化される。本発明では「標的配列」は常に「鋳型」であるが、鋳型は二次的なプライマー伸長産物および増幅産物を含むこともできる。
【０１６２】
１８．ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、鋳型ＤＮＡから相補性ＤＮＡコピーを合成する酵素である。その例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、又はバクテリオファージＴ４、Ｐｈｉ−２９、Ｍ２、もしくはＴ５由来ＤＮＡポリメラーゼがある。本発明のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、細菌もしくはバクテリオファージから単離された天然の酵素、または組み換え技術によって発現された酵素とすることができ、或いは特定の望ましい特徴（例えば、熱安定性）、又は種々の鋳型改変体からＤＮＡ鎖を認識もしくは合成する能力を有するように設計された改変型又は「進化」型とすることができる。公知の全てのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、合成を開始するために相補性プライマーを必要とする。適切な条件下で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは鋳型ＲＮＡから相補性ＤＮＡコピーを合成し得ることが知られている。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下で説明する）もまた、通常、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
【０１６３】
１９．ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（トランスクリプターゼ）
「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」又は「トランスクリプターゼ」は、通常は二本鎖であるプロモータ配列を有する二本鎖もしくは部分的に二本鎖のＤＮＡ分子から、複数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。このＲＮＡ分子（「転写物」）は、プロモータのすぐ下流の特定の位置から始まって、５’から３’の方向に合成される。トランスクリプターゼの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３およびＳＰ６由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがある。
【０１６４】
２０．ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）
「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」又は「逆転写酵素」（「ＲＴ」）は、鋳型ＲＮＡから相補性ＤＮＡコピーを合成する酵素である。公知の全ての逆転写酵素は、鋳型ＤＮＡから相補性ＤＮＡコピーを作製する能力をも有するので、これらはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼでもＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼでもある。ＲＴはＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を示すこともできる。Ｍａｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスに由来する逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）が好ましい。鋳型ＲＮＡ及び鋳型ＤＮＡの両方を用いて合成を開始するには、プライマーが必要とされる。
【０１６５】
２１．選択的ＲＮＡｓｅ
本明細書に用いている「選択的ＲＮＡｓｅ」とは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解するが、一本鎖ＲＮＡも二本鎖ＲＮＡも二本鎖ＤＮＡも分解しない酵素である。例示的な選択的ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡｓｅ  Ｈである。同じもしくは類似の活性を有するＲＮＡｓｅ  Ｈ以外の酵素も、本発明で想定されている。選択的ＲＮＡｓｅはエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼとすることができる。ほとんどの逆転写酵素は、そのポリメラーゼ活性に加えてＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有する。しかしながら、付随するポリメラーゼ活性を伴わないＲＮＡｓｅ  Ｈの他の供給源が入手可能である。分解されると、ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からＲＮＡが分離し得る。或いは、選択的ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡの部分が融解し、又は酵素がＲＮＡの部分を巻き戻すことを可能にするように種々の位置で単純にＲＮＡを切断することができる。本発明のＲＮＡ標的配列またはＲＮＡ産物を選択的に分解する他の酵素があり得ることは、当業者には容易に理解されよう。
【０１６６】
２２．センス／アンチセンス鎖（単数または複数）
核酸合成の議論は、核酸二重鎖の２つの相補鎖を名付ける用語を採用することによって大いに単純化かつ明確になる。従来から、蛋白質又は構造ＲＮＡを生成するために用いられる配列をコードする鎖は「センス（＋）」鎖と呼ばれ、その相補体は「アンチセンス（−）」鎖と呼ばれている。多くの場合、いずれの鎖も機能することができ、その結果、一方に「センス」、他方に「アンチセンス」の名称を割り当てるのは任意なものとならざるを得ないことが現在知られている。それでも、この用語は、核酸の配列の方向性を示すのに非常に有用であり、本明細書ではその目的で用いることになる。
【０１６７】
２３．系の特異性
増幅系との関連での「特異性」という用語は、本明細書では、配列及びアッセイ条件によって標的配列と非標的配列とを識別する能力を表す増幅系の特徴を意味して用いている。核酸増幅に関しては、一般的に、特異性は、下記により詳細に説明する、副産物の数に対して産生される特定の単位複製配列の数の割合（即ち、シグナル対ノイズ比）を意味する。
【０１６８】
２４．感度
「感度」という用語は、本明細書では、核酸増幅反応を検出又は定量することができる精度を意味して用いている。増幅反応の感度は、一般的に、その増幅系で確実に検出することができる標的核酸の最小コピー数の目安であり、例えば、利用される検出アッセイおよび増幅反応の特異性、即ち、副産物に対する特定の単位複製配列の割合によって決まる。
【０１６９】
２５．増幅条件
「増幅条件」とは、本発明による核酸増幅を可能にする条件を意味する。増幅条件は、一部の実施態様では、本明細書に記載した「緊縮ハイブリッド形成条件」よりも低緊縮性とすることができる。本発明の増幅反応で用いるオリゴヌクレオチドは、増幅条件下でその対象とする標的とハイブリッドを形成するが、緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成することもあれば形成しないこともある。一方、本発明の検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブリッドを形成する。下記の実施例のセクションでは本発明に従って標的核酸配列を増幅するための好ましい増幅条件を示すが、本発明に従って核酸増幅を行うために許容される他の条件については用いられる具体的な増幅方法に応じて当業者が容易に確認することができよう。
【０１７０】
本発明は、高い特異性および感度でＲＮＡ又はＤＮＡ標的配列の多数のＲＮＡコピーを合成する自己触媒増幅法を提供する。本発明の重要な特徴は、増幅時の副産物の生成がごくわずかであることである。副産物の例としては、オリゴヌクレオチドダイマーおよび自己複製分子が挙げられる。標的核酸は、増幅の対象となる標的配列を含む。標的配列は、プライミングオリゴヌクレオチド、プロモータオリゴヌクレオチド、及び任意選択的に結合分子（例えば、停止オリゴヌクレオチドもしくは改変オリゴヌクレオチド（以下により詳細に説明する））、及び／又は天然の標的核酸末端によって両端で規定される標的核酸の領域であり、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む。本発明のプロモータオリゴヌクレオチドは、そこからのＤＮＡの合成が阻止されるように改変される。このプロモータオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼの存在下のプライマー伸長を阻止するためにその３’末端に結合させたブロッキング部分を含むことが好ましい。実際には、本発明では、プロモータを含む、増幅反応において存在するオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも約８０％は３’ブロッキング部分をさらに含む。別の実施態様では、プロモータを含む、増幅反応に供給されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％は、３’ブロッキング部分を含むようにさらに改変される。特定の実施態様では、プロモータ配列を含む、本発明の増幅反応に用いるいずれのオリゴヌクレオチドも３’末端ブロッキング部分をさらに含む必要がある。
【０１７１】
本発明の一実施態様は、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸の増幅を含む。図１Ａ及び図１Ｂを参照されたい。標的核酸は、所望のＲＮＡ標的配列に対して不確定の３’末端及び５’末端を有する。この標的核酸は、上記ＲＮＡ標的配列の３’領域に対して十分に相補性の塩基領域を有するプライミングオリゴヌクレオチドで処理することによりこれとハイブリッドを形成する。図１Ａ及び図１Ｂの工程１を参照されたい。プライミングオリゴヌクレオチドは、当業者に公知のプライマー設計法に従って、任意の所望の標的配列の適切な領域とハイブリッドを形成するように設計する。適切なプライミングオリゴヌクレオチドについては本明細書でさらに詳細に説明する。本発明のプライミングオリゴヌクレオチドには、任意選択的に、標的配列とハイブリッドを形成する領域に対して５’側に位置する非ハイブリッド形成塩基領域を含めることができるが、本発明では、プライミングオリゴヌクレオチドの５’領域には、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモータ配列を含めない。さらに、プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端には、プライミングオリゴヌクレオチドのプライミング機能又はプライミングオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成している鋳型ＲＮＡの切断を実質的に妨害しない限り、後でさらに十分述べるように、標的配列またはＲＮＡ増幅産物に対するプライミングオリゴヌクレオチドの結合特性（例えば、ハイブリッド形成または塩基スタッキング）を改善する１以上の改変部位を含めることができる。ヌクレオシド三リン酸並びに緩衝剤、塩及び補因子の存在下に、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端を、鋳型としてＲＮＡ標的配列を用いる伸長反応において適切なＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（「逆転写酵素」））によって伸長させることにより、鋳型ＲＮＡに対して相補性のＤＮＡプライマー伸長産物が得られる。図１Ａ及び図１Ｂの工程２及び３を参照されたい。
【０１７２】
このＤＮＡプライマー伸長産物を、鋳型ＲＮＡを分解する酵素を用いて鋳型ＲＮＡから（少なくとも部分的に）分離する。図１Ａ及び図１Ｂの工程４を参照されたい。好適な酵素は、即ち、「選択的ＲＮＡｓｅ」はＲＮＡ：ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖に作用する酵素であり、このようなものとしてはＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を含む酵素が挙げられる。一部の逆転写酵素はＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を含み、このような酵素としてモロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）および鳥類の骨髄芽細胞症ウイルス（「ＡＭＶ」）由来のものが挙げられる。この方法によれば、上記選択的ＲＮＡｓｅは、逆転写酵素のＲＮＡｓｅ  Ｈ活性として、又は別の酵素として、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡｓｅ  ＨもしくはＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＲＮＡｓｅ  Ｈとして供給される。ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖に存在するＲＮＡを選択的に分解する他の酵素も用いることができる。
【０１７３】
一部の特定の実施態様では、本発明の方法は、上記のように標的核酸を処理して、ＤＮＡプライマー伸長産物の長さを特定の所望の長さに限定する工程をさらに含む。このような長さの限定は、通常、所望の標的配列の５’末端に隣接するかこれの近傍にあるＲＮＡ標的核酸とハイブリッドを形成するかそれとも結合する「結合分子」を用いることにより実施する。図１Ａの工程１を参照されたい。
【０１７４】
特定の実施態様において、結合分子は塩基領域を含む。この塩基領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡキメラ分子又はこれらの類似体とすることができる。塩基領域を含む結合分子は、本明細書中の他の箇所に記載したように、１種以上の方法で改変することができる。好適な結合分子としては、ＲＮＡに結合してその結合領域を越えるプライマー伸長を阻止する停止オリゴヌクレオチドもしくは停止蛋白質を含む結合分子、又は改変分子（例えば、消化オリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成したＲＮＡ標的の部分の加水分解を誘導する「消化」オリゴヌクレオチドのような改変オリゴヌクレオチド）もしくはＲＮＡ標的を切断する配列特異的ヌクレアーゼを含む結合分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の停止オリゴヌクレオチドは、標的配列の５’末端に隣接するか、これの近傍にあるか、又はこれと重なり合う領域の標的核酸に対して十分に相補性の５’塩基領域を有することによって標的核酸とハイブリッドを形成する。特定の実施態様において、停止オリゴヌクレオチドは１以上の改変ヌクレオチドを含むように合成する。例えば、本発明の特定の停止オリゴヌクレオチドは、１以上の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含むか、又はもっぱら２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで合成される。例えば、Ｍａｊｌｅｓｓｉほか、（１９９８年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２６：ｐ．２２２４−２２２９を参照されたい。本発明の停止オリゴヌクレオチドは、通常、停止オリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼのためのプライマーとして機能することを阻止するために、その３’末端にブロッキング部分を含む。一部の実施態様では、本発明の停止オリゴヌクレオチドの５’末端は、標的配列の５’末端の少なくとも約２個のヌクレオチドと重なり、これらに対して相補性である。通常、本発明の停止オリゴヌクレオチドの５’末端は、標的配列の５’末端の少なくとも３個、４個、５個、６個、７個又は８個のヌクレオチドと重なり合い、これらに対して相補性であるが、こうなるのは標的配列の５’末端の約１０個以下のヌクレオチドとである。（本発明に用いている「末端」という用語は、オリゴヌクレオチド、核酸もしくは核酸領域の５’末端塩基もしくは３’末端塩基を含む、それぞれ、オリゴヌクレオチド、核酸または核酸領域の５’領域もしくは３’領域のことを指す。）本明細書では好適な停止オリゴヌクレオチドについて、さらに詳細に記載する。
【０１７５】
停止オリゴヌクレオチドが標的配列と重なり合う５’塩基領域を有する限りにおいては、停止オリゴヌクレオチドのプロモータオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を最小限に抑えるか阻止するために、プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域の５’末端中に１箇所以上の塩基ミスマッチを導入することが望ましいと考えられる。何故なら、停止オリゴヌクレオチド：プロモータオリゴヌクレオチドハイブリッドが形成されると、増幅反応の速度に悪影響が及ぶと考えられるからである。一般には、重なり合う部分の領域中の１個の塩基ミスマッチで十分である筈であるが、必要とされる正確な数は、重なり合う領域の長さ及び塩基組成並びに増幅反応の条件などの要因によって決まることになる。改変プロモータオリゴヌクレオチドに上記の利点が考えられるにもかかわらず、プロモータオリゴヌクレオチドの第一の領域に変異を加えると、このプロモータオリゴヌクレオチドが増幅用の鋳型として低品質なものになる可能性があることに注意する必要がある。さらに、所与の増幅系において、停止オリゴヌクレオチド：プロモーターオリゴヌクレオチドハイブリッドを形成させると、有利なことに、プライマー伸長に利用可能な３’末端を有するプライミングオリゴヌクレオチド：プロモーターオリゴヌクレオチドハイブリッドの形成を阻止又は妨害することが完全に可能である。図５（プライマー依存性副産物の形成）を参照されたい。
【０１７６】
改変オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長産物の３’末端が決定されるメカニズムをもたらす。改変オリゴヌクレオチドは、改変酵素、例えばヌクレアーゼによるプライマー伸長の停止を容易にする、ＲＮＡ標的配列の５’末端の近傍に１個以上の塩基を含むモチーフをもたらすことができる。
【０１７７】
或いは、改変オリゴヌクレオチドが特異的改変酵素又は化学物質に繋がれることにより、プライマー伸長の停止が可能となるとも考えられる。
【０１７８】
特異的改変酵素の１つは消化オリゴヌクレオチドである。消化オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、好ましくは少なくとも約６個のデオキシリボヌクレオチドのストレッチで構成される。この消化オリゴヌクレオチドは鋳型ＲＮＡとハイブリッドを形成し、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡが、本明細書に記載したような選択的ＲＮＡｓｅ、例えば、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性によって消化される。
【０１７９】
次いで、規定された３’末端または不確定の３’末端のいずれかを有する、一本鎖ＤＮＡプライマー伸長産物または「第１の」ＤＮＡプライマー伸長産物を、ＤＮＡプライマー伸長産物の３’〜領域に対してこれとハイブリッドを形成させるのに十分相補性の第１の領域、並びにＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ）のためのプロモータを含む第２の領域（第一の領域に対して５’側、例えば、第１の領域の直ぐ５’側又は第１の領域から間隔を開けた５’側にあり、プロモータオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡポリメラーゼのためのプライマーとして機能することを阻止するように改変されている（例えば、プロモータオリゴヌクレオチドが、その３’末端に結合させたブロッキング部分を含む））を含むプロモータオリゴヌクレオチドを用いて処理する。図１Ａ及び図１Ｂの工程５を参照されたい。所望のハイブリッド形成「第１の領域」を特定すると、当業者であれば、型どおりの手順のみによって好適なプロモータオリゴヌクレオチドを構築することができる。プロモータ領域が所与のＲＮＡポリメラーゼによる認識に必要とされる特定のヌクレオチドを有することは、当業者なら容易に理解されよう。さらに、プロモータ配列に特定のヌクレオチド変更（挿入配列の使用を含む）を行うと、所与の酵素によるプロモータの機能化が改善されるとも考えられる。
【０１８０】
挿入配列は、プロモータオリゴヌクレオチドの第1の領域と第2の領域との間に配置すると、増幅速度を増大させる働きをする。増幅速度の増大はいくつかの要因に起因すると考えられる。第一に、挿入配列は、プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端とプロモータ配列との間の距離を増加させるので、プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端に結合したポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）が、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列への結合を妨げる可能性が低くなり、それによって、転写が開始され得る速度が増大する。第二に、選択された挿入配列は、それ自体が、転写のための鋳型として標的配列よりも良好に機能することによって転写速度を高めることができる。第三に、ＲＮＡポリメラーゼは、挿入配列において転写を開始するので、鋳型としてＲＮＡ転写産物を用いてプライミングオリゴヌクレオチドにより合成されたプライマー伸長産物は、プライマー伸長産物の３’末端方向に挿入配列の相補体を含むことになる。プロモータオリゴヌクレオチドは、より大きな標的結合領域（すなわち、挿入配列の相補体を含むもの）を用意することによって、より速くプライマー伸長産物に結合し、それによって、追加のＲＮＡ転写産物がより速く産生されることが可能となる。
【０１８１】
挿入配列は、好ましくは、５〜２０ヌクレオチド長であり、分子内折り畳みおよび増幅反応混合物中に存在する他のオリゴヌクレオチドとの分子間結合を最小限に抑えるように設計する必要がある。二次構造を最小化するのを支援するプログラムは、当該分野で公知であり、このようなものとしては最隣接熱力学則を用いて、ＲＮＡおよびＤＮＡの二次構造を予測するための、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｚｕｃｋｅｒのｍｆｏｌｄソフトウェアが挙げられる。
【０１８２】
Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｚｕｃｋｅｒのｍｆｏｌｄソフトウェアの最新のバージョンは、ＵＲＬ中にハイパーテキスト転送プロトコル（ｈｔｔｐ）を用いた、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄにおいて、Ｗｅｂ上でアクセス可能である。現在好ましい挿入配列としては、配列番号３のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列と組み合せた、配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列が挙げられる。Ｉｋｅｄａほか、（１９９２年）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：ｐ．２６４０−２６４９を参照されたい。他の有用な挿入配列は、当該分野で公知のインビトロ選択法を用いて特定することができる。
【０１８３】
プロモータ配列中に変化を有するプロモータオリゴヌクレオチドのアッセイについては、当業者が型どおりの方法を用いて容易に行うことができる。さらに、異なるＲＮＡポリメラーゼを利用することが望ましい場合には、プロモータオリゴヌクレオチド中のプロモータ配列を異なるプロモータにより容易に置換することができる。異なるプロモータ配列の置換は、十分に、当業者の理解および能力の範囲内にある。本発明では、増幅反応混合物に供給されるプロモータオリゴヌクレオチドは、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変され、好ましくは、その３’末端に結合させたブロッキング部分を含むことに留意されたい。改変オリゴヌクレオチド及びキャッピングオリゴヌクレオチド、さらには、本発明の方法において使用されるプローブも、任意選択的に、これらの３’末端に結合させたブロッキング部分を含む。
【０１８４】
停止オリゴヌクレオチドを用いる場合、プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域は、ＤＮＡプライマー伸長産物の所望の３’末端と、実質的ではあるが、必ずしも正確ではない精度でハイブリッドを形成するように設計する。次いで、プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域を鋳型としての役割を果たさせることにより、第１のＤＮＡプライマー伸長産物をさらに伸長させてプロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域（即ち、プロモータ配列を含む領域）に対して相補性の塩基領域を付加してこのプロモータを二本鎖にすることができる。図１Ａの工程６及び７を参照されたい。プロモータを認識するＲＮＡポリメラーゼは、プロモータ配列に結合してＤＮＡプライマー伸長産物に対して相補性の複数のＲＮＡのコピーの転写を開始するが、こうしたコピーは標的配列と実質的に同一である。「実質的に同一」とは、複数のＲＮＡのコピーが、例えば、「標的配列」の境界、転写開始点、又はプライミングオリゴヌクレオチドがプライマー領域の５’側に追加のヌクレオチド（例えば、本明細書中に記載した連結された「キャップ」）を含むかどうかによって、標的配列に対して５’側もしくは３’側のいずれかのヌクレオチドを増やすことができ、又は標的配列に対して５’側もしくは３’側のいずれかのヌクレオチドを減らすことができる。標的配列がＤＮＡである場合、本明細書では、そのＲＮＡコピーの配列は、標的配列に対して「実質的に同一」であるものとして記載している。また一方、ＤＮＡ標的配列のチミジン残基の代わりにウリジン残基を有するＲＮＡ配列も、やはり「実質的に同一」な配列を有することは言うまでもない。このようにして生成したＲＮＡ転写物は、更に調節を加えることなく、上記の系において自動的に再利用させることができる。従って、この反応は、自己触媒的である。結合分子、又はプライマー伸長反応を停止させる他の手段を用いない実施態様では、プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域は、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端の５’側であると考えられる第１のＤＮＡプライマー伸長産物の特定の領域とハイブリッドを形成するように設計するが、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端は不確定であるので、プロモータオリゴヌクレオチドがハイブリッドを形成する領域は、おそらく、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の実際の３’末端ではないであろう。この実施態様では、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の少なくとも３’末端の塩基がプロモータオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成しないことは一般的に言えることである。図１Ｂの工程５を参照されたい。従って、この実施態様において、第１のＤＮＡプライマー伸長産物がさらに伸長されて二本鎖プロモータを形成する可能性は低いことになる。
【０１８５】
本発明者らは、意外にも、鋳型核酸を伸長させることにより二本鎖プロモータを形成させることが第１のＤＮＡプライマー伸長産物に対して相補性のＲＮＡの転写の開始を可能にするのに必要ではないことを発見した。図１Ｂの工程６を参照されたい。得られる「第１の」ＲＮＡ産物は、標的配列と実質的に同一であり、転写開始点により規定される５’末端と、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の５’末端により規定される３’末端とを有する。図１Ｂの工程７を参照されたい。図１Ｂに示したように、十分な数の第１のＲＮＡ産物が生成されて、更に調節を加えなくてもこの系において自動的に再利用される。プライミングオリゴヌクレオチドは、第１のＲＮＡ産物の３’末端とハイブリッドを形成し、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて、第２のＤＮＡプライマー伸長産物を形成する。停止オリゴヌクレオチド又は他の結合分子を用いることなく形成される第１のＤＮＡプライマー伸長産物とは異なり、第２のＤＮＡプライマー伸長産物は、第１のＲＮＡ産物の５’末端に対して相補性の、規定された３’末端を有する。図１Ｂの工程８乃至１０を参照されたい。第２のＤＮＡプライマー伸長産物は、鋳型ＲＮＡを選択的に分解する酵素を用いて、（少なくとも部分的に）鋳型ＲＮＡから分離させる。図１Ｂの工程１１を参照されたい。次いで、一本鎖の第２のＤＮＡプライマー伸長産物を上記のプロモータオリゴヌクレオチドで処理すると、プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域が鋳型の働きをし、その結果、第２のＤＮＡプライマー伸長産物がさらに伸長されて、プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域に対して相補性の塩基領域（すなわち、プロモータ配列を含む領域）が付加され、プロモータが二本鎖になる。図１Ｂの工程１２乃至１４を参照されたい。プロモータを認識するＲＮＡポリメラーゼは、プロモータ配列に結合し、第２のＤＮＡプライマー伸長産物に対して相補性であり、かつ標的配列と実質的に同一である複数の「第２の」ＲＮＡ産物の転写を開始する。図１Ｂの工程１５を参照されたい。このようにして生成された第２のＲＮＡ転写物は、さらに調節を加えなくても、上記の系において自動的に再利用される。従って、この反応は自己触媒的である。図１Ｂの工程７乃至１５を参照されたい。
【０１８６】
別の実施態様において、本発明は、ＤＮＡ標的配列を含む標的核酸から、標的配列の複数のコピーを合成する方法に関する。図１Ｃにこの実施態様を図示した。標的核酸は、一本鎖ＤＮＡ、部分的一本鎖ＤＮＡ、又は二本鎖ＤＮＡのいずれかとすることができる。ＤＮＡが二本鎖である場合、このＤＮＡは、増幅の前に、変性させるか、部分的に変性させる。ＤＮＡ標的核酸は、規定された３’末端を有する必要はない。一本鎖ＤＮＡ標的核酸、部分的一本鎖ＤＮＡ標的核酸、又は変性ＤＮＡ標的核酸は、上記のようなプロモータオリゴヌクレオチドで処理する。プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域は、所望の標的配列の３’領域における標的配列の特定の領域とハイブリッドを形成するように設計するが、標的核酸の３’末端は、標的配列の３’末端とコターミナル（ｃｏｔｅｒｍｉｎａｌ）である必要はないので、プロモータオリゴヌクレオチドがハイブリッドを形成する領域は、標的核酸配列の３’末端又はその近傍にもない可能性が高いことになる。図１Ｃの工程１を参照されたい。従って、プロモータオリゴヌクレオチドのプロモータ領域は、一本鎖のままである可能性が高いことになる。
【０１８７】
上述のように、本発明者らは、意外にも、プロモータ配列が対応するＲＮＡポリメラーゼにより認識され、この際、ＤＮＡ標的配列に対して相補性のＲＮＡの転写を開始するためには、プロモータオリゴヌクレオチド上の一本鎖プロモータ配列が鋳型核酸の伸長により二本鎖プロモータを形成する必要がないことを発見した。図１Ｃの工程２を参照されたい。得られる「第１のＲＮＡ産物」は、プロモータのための転写開始点により規定される５’末端を有するが、３’領域は、不確定のままであることになる。図１Ｃの工程３を参照されたい。次いで、こうした第１のＲＮＡ産物は、プライミングオリゴヌクレオチドで処理する。プライミングオリゴヌクレオチドは、所望の標的配列の５’領域に対して相補的な位置において、第１のＲＮＡ産物の領域とハイブリッドを形成し、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて、ＤＮＡプライマー伸長産物を形成する。図１Ｃの工程４乃至６を参照されたい。このＤＮＡプライマー伸長産物は、プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端と重なる５’末端と、第一のＲＮＡ産物の５’末端と重なる３’末端とを有する。図１Ｃの工程６を参照されたい。ＤＮＡプライマー伸長産物は、上記のように、鋳型ＲＮＡを選択的に分解する酵素を用いて、その鋳型ＲＮＡから（少なくとも部分的に）分離させる。図１Ｃの工程７を参照されたい。次いで、ＤＮＡプライマー伸長産物を上記のプロモータオリゴヌクレオチドで処理すると、プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域が鋳型の働きをし、その結果、ＤＮＡプライマー伸長産物がさらに伸長されて、プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域に対して相補性の塩基領域（すなわち、プロモータ配列を含む領域）が付加され、プロモータが二本鎖になる。図１Ｃの工程８乃至１０を参照されたい。プロモータを認識するＲＮＡポリメラーゼは、プロモータ配列に結合し、ＤＮＡプライマー伸長産物に対して相補性の複数のＲＮＡ産物の転写を開始する。図１Ｃの工程１１を参照されたい。こうした「第２のＲＮＡ産物」の配列は、所望の標的配列に対して実質的に相補性である。このようにして生成されたＲＮＡ産物は、さらに調節を加えなくても、上記の系において自動的に再利用される。従って、この反応は自己触媒的である。図１Ｃの工程３乃至１１を参照されたい。
【０１８８】
さらに別の実施態様において、本発明は、ＤＮＡ標的配列を含む標的核酸から、標的配列の複数のコピーを合成する方法に関する。図１Ｄにこの実施態様の一態様を示した。この実施態様における増幅の前の標的核酸は、一本鎖、部分的一本鎖、又は二本鎖のいずれかとすることができる。標的配列を含有する標的核酸の領域が二本鎖であれば、増幅の前に変性又は部分変性させてこの標的配列をプライミングオリゴヌクレオチドに接触可能にする。図１Ｄの工程１を参照されたい。変性は熱、高ｐＨ及び／又は低イオン強度によって行うことができる。（有用な化学的変性剤としては、イミダゾール、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、尿素及び／又は水酸化ナトリウムが挙げられる。）上記接触可能な標的配列は、後述のようにプライミングオリゴヌクレオチドで処理し、これを標的配列の３’末端とハイブリッド形成させる。図１Ｄの工程２を参照されたい。ヌクレオシド三リン酸並びに緩衝剤、塩及び補因子の存在下に、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端を、鋳型としてＤＮＡ標的配列を用いる伸長反応においてＤＮＡポリメラーゼによって伸長させることにより、鋳型に対して相補性の第１のＤＮＡプライマー伸長産物が得られる。図１Ｄの工程３及び４を参照されたい。この実施態様の一態様では、標的配列の５’末端に隣接して、又はこれの近傍で標的核酸とハイブリッドを形成させるか、それとも結合させることにより上記第１のＤＮＡプライマー伸長産物の長さを限定する結合分子を含ませる。この結合分子は、ＤＮＡ標的配列を含有する標的核酸に適切な、本明細書に記載した結合分子のうちのいずれかとすることができるが、好ましくは停止オリゴヌクレオチドである。図１Ｄの工程２乃至４を参照されたい。停止オリゴヌクレオチドの１つの利点は、これが、第１のＤＮＡプライマー伸長産物上に規定された３’末端を創出するのに制限エンドヌクレアーゼの使用を必要としないことである。
【０１８９】
鋳型から上記第１のＤＮＡプライマー伸長産物を分離するために、本実施態様の別の態様において、標的核酸をディスプレーサオリゴヌクレオチドで処理することができる。図１Ｄの工程５を参照されたい。このディスプレーサオリゴヌクレオチドはプライミング機能を有し、プライミングオリゴヌクレオチド（この実施態様では「フォワードプライミングオリゴヌクレオチド」と称する）より上流側にある標的核酸とハイブリッドを形成するように設計されている。「上流側」とは、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端がフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの３’末端より上流側にある標的核酸とハイブリッドを形成することを意味する。従って、ディスプレーサオリゴヌクレオチド及びフォワードプライミングオリゴヌクレオチドは標的核酸の重複又は異なる領域とハイブリッドを形成することができる。好ましい実施態様では、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端は、標的核酸を基準にしてフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に隣接させるか、これから最大５乃至３５塩基隔てる（即ち、上記のディスプレーサオリゴヌクレオチド及びプライミングオリゴヌクレオチドの両者を標的核酸とハイブリッド形成させた場合、標的核酸は、このディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基とプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端塩基との間にある最大５乃至３５個の連続する非結合ヌクレオチドを有する）。このディスプレーサオリゴヌクレオチドは、一般に１０乃至５０ヌクレオチド長であり、ディスプレーサオリゴヌクレオチドのプライミング機能を実質的に妨害しない限り、標的核酸に対するディスプレーサオリゴヌクレオチドの結合特性（例えば、ハイブリッド形成または塩基スタッキング）を改善する１以上の改変部位を含むことができる。ディスプレーサオリゴヌクレオチド及びフォワードプライミングオリゴヌクレオチドは同じ条件下で標的核酸とハイブリッドを形成するように設計する。標的核酸は、フォワードプライミングオリゴヌクレオチドが標的核酸とハイブリッドを形成する時間を十分とった後に、ディスプレーサオリゴヌクレオチドで処理することが好ましい。或いは、標的核酸をディスプレーサオリゴヌクレオチド及びフォワードプライミングオリゴヌクレオチドで処理した後に、ディスプレーサオリゴヌクレオチド及びフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの各３’末端を伸長するのに適したポリメラーゼをこの混合物に作用させる。ＤＮＡポリメラーゼの存在下でディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端を鋳型依存性に伸長させて標的核酸から第１のＤＮＡプライマー伸長産物と置換する第２のＤＮＡプライマー伸長産物を形成させることによってこれをプロモータオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に利用可能にする。図１Ｄの工程６及び７を参照されたい。別のアプローチにおいて、プロモータオリゴヌクレオチドが、例えば、ＤＮＡブリーシング（例えば、ＡＴリッチ領域）、低塩条件及び／又はＤＭＳＯ及び／又は浸透圧調節物質（例えば、ベタイン）の使用により促進されるスタンド侵入によって第１のＤＮＡプライマー伸長産物にアクセスする条件を確立することができた。この実施態様のプロモータオリゴヌクレオチドは前記のものと同じであり、同様に、プロモータオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼのためのプライミングオリゴヌクレオチドとして機能するのを妨げるように改変されている（例えば、このプロモータオリゴヌクレオチドはその３’末端にブロッキング部分を含む）。
【０１９０】
第１のＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端を確定することができる停止オリゴヌクレオチド又は他の結合分子を用いる場合、プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域は、プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域を鋳型としての役割を果たさせることにより、第１のＤＮＡプライマー伸長産物をさらに伸長させてプロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域に対して相補性の塩基領域を付加するのに十分な精度で第１のＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端とハイブリッドを形成するように設計する。図１Ｄの工程８乃至１０を参照されたい。この伸長反応によって上記プロモータ配列を含有する領域は二本鎖になる。このプロモータを認識するＲＮＡポリメラーゼはプロモータ配列に結合して、第１のＤＮＡプライマー伸長産物に対して相補性の複数のＲＮＡコピーの転写を開始するが、この場合、ＲＮＡコピーは、この用語について先に定義したように、標的配列と実質的に同一である。図１Ｄの工程１１及び１２を参照されたい。このようにして生成されたＲＮＡ転写物は、この実施態様の方法で自動的に再利用させることができ、従って、この反応は自己触媒的である。図１Ｄの工程９乃至１７を参照されたい。その後の増幅の繰り返しでは、プロモータオリゴヌクレオチドを含有し、ＲＮＡ転写物に対して相補性である第３のＤＮＡプライマーを形成した後、ＲＮＡ転写物を選択的に分解する酵素（例えば、ＭＭＬＶ又はＡＭＶ由来の逆転写酵素のようなＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素）を用いてこのＤＮＡプライマー伸長産物をＲＮＡ転写物から（少なくとも部分的に）分離する。図１Ｄの工程１３乃至１６を参照されたい。
【０１９１】
プライマー伸長反応を停止させる結合分子又は他の手段を用いない本実施態様の態様では、プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域は、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端の５’側にあると考えられる第１のＤＮＡプライマー伸長産物の特定の領域とハイブリッドを形成するように設計する。第１のＤＮＡプライマー伸長産物の3’末端は不確定であるので、プロモータオリゴヌクレオチドがハイブリッドを形成する領域は、プロモータオリゴヌクレオチドがハイブリッドを形成する領域は、おそらく、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の実際の３’末端ではないであろう。この実施態様では、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の少なくとも３’末端の塩基がプロモータオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成しないことは一般的に言えることである。従って、この実施態様において、第１のＤＮＡプライマー伸長産物がさらに伸長されて二本鎖プロモータを形成する可能性は低いことになる。上述のように、本発明者らは、意外にも、鋳型核酸を伸長させることにより二本鎖プロモータを形成させることが第１のＤＮＡプライマー伸長産物に対して相補性のＲＮＡの転写の開始を可能にするのに必要ではないことを発見した。しかしながら、その後の増幅の繰り返しでは、ＲＮＡ転写物は規定された３’末端を含むことになり、このＲＮＡ転写物に対して相補性のＤＮＡプライマー伸長産物はプロモータオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成し、伸長されてプロモータ配列を含有するプロモータオリゴヌクレオチドの領域に対して相補性の配列が付加される。
【０１９２】
図２Ａ乃至図２Ｄに示したように、本発明者らは、反応混合物にエクステンダーオリゴヌクレオチドを供給することによって増幅速度を向上させることができることを発見した。（図２Ａ及び図２Ｂの各工程５、図２Ｃの工程４及び図２Ｄの工程８。）
エクステンダーオリゴヌクレオチドは、一般に、長さが１０乃至５０ヌクレオチド長であり、プロモータオリゴヌクレオチドより下流の鋳型ＤＮＡ（即ち、ＤＮＡ標的配列、又は本明細書に記載したＤＮＡプライマー伸長産物のうちのいずれか）とハイブリッドを形成する。エクステンダーオリゴヌクレオチドを含める場合、このオリゴヌクレオチドとプロモータオリゴヌクレオチドとが鋳型ＤＮＡとハイブリッドを形成する際、エクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基はプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端塩基の近傍に、又はこれに隣接して位置する。(「に隣接して」とは、両オリゴヌクレオチドが鋳型ＤＮＡとハイブリッドを形成する際に、鋳型ＤＮＡが、プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端塩基とエクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基との間に非結合塩基を有しないことを意味する。)  最も好ましくは、エクステンダーオリゴヌクレオチドは、エクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基が、鋳型ＤＮＡを基準にしてプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端塩基とヌクレオチド3個より多くの間隔をあけない（即ち、鋳型ＤＮＡは、両オリゴヌクレオチドが鋳型ＤＮＡとハイブリッドを形成する際に、プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端塩基とエクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基との間に位置する連続する非結合ヌクレオチドを最大で３個有する）ように、鋳型ＤＮＡとハイブリッドを形成させる。エクステンダーオリゴヌクレオチドがプライマー伸長反応においてプライミングオリゴヌクレオチドとして機能することを阻止するために、エクステンダーオリゴヌクレオチドに３’末端ブロッキング部分を含ませることが好ましい。理論にとらわれることを望まないが、エクステンダーオリゴヌクレオチドの３’末端におけるリン酸は、ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）を、プロモータオリゴヌクレオチドのプロモータ配列からさらに遠くへ引き離すように機能することによって転写におけるＲＮＡポリメラーゼの結合および前進が妨げられるのを最小限に抑えると考えられる。エクステンダーオリゴヌクレオチドが、標的配列内の二次構造を制限することによって、転写反応をさらに促進する可能性もある。
【０１９３】
一態様において、本発明は、核酸増幅反応において副産物の形成を最小限に抑えることに関する。本明細書では、副産物の１種を「オリゴヌクレオチドダイマー」と称する。この副産物は、プライミングオリゴヌクレオチドが増幅反応物において別の核酸（例えば、プロモーターオリゴヌクレオチド）と非特異的に塩基対形成する場合に生じる。プライミングオリゴヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得るので、二本鎖型のプロモータオリゴヌクレオチドが生じる可能性があり、これが非特異的な増幅可能副産物に転写されることがある。プライミングオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドダイマーの形成に関与することを阻止するための１つの選択肢は、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端に短い相補性ヌクレオチド「キャップ」を付加することである。図６Ａ及び図６Ｂを参照されたい。キャップは、プライミングオリゴヌクレオチドと反応物中の他の核酸（例えば、プロモータオリゴヌクレオチド）との間の非特異的ハイブリッド形成を抑えることによって「オリゴヌクレオチドダイマー」副産物の生成をなくすか、もしくはキャップの使用を伴わないこと以外は同一の条件下で行った増幅反応と比較して実質的に抑えると考えられる。本明細書に用いているキャップは、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端の領域に相補性の塩基領域を含み、これは、増幅反応混合物中に導入する前に、プライミングオリゴヌクレオチドと予めハイブリッド形成させておくことが好ましい。適切なキャップの長さは、塩基含量、緊縮条件などによって異なるが、通常、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端における最大３個、６個、９個、１２個、１５個、１８個または２０個の連続するか又は連続しないヌクレオチドとハイブリッドを形成することになる。適切なキャップは５乃至１０塩基長の範囲であることが好ましい。相補性キャップ領域の長さは、いくつかの変動要素（例えば、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端と共に形成される二本鎖ハイブリッドの融解温度）によって決まる。一般的に、効率的なキャップは、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端の領域と、増幅反応物中に存在する他のオリゴヌクレオチドとのどの非特異的反応よりも強く、特異的にハイブリッドを形成するが、プライミングオリゴヌクレオチドと所望のテンプレートとの特異的ハイブリッド形成を優先して直ちに置き換えられることになる。例示的なキャップは、キャップの５’末端塩基がプライミングオリゴヌクレオチドの３’末端塩基とハイブリッドを形成するように、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端の領域とハイブリッドを形成する５乃至７塩基の長さのオリゴヌクレオチドを含むか、これから本質的に成るか、又はこれから成る。通常、キャップは、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端の領域の８個、９個または１０個以下のヌクレオチドとハイブリッドを形成する。
【０１９４】
キャップは、キャッピングオリゴヌクレオチド、即ち、プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に直接又はリンカーを介して結合させた塩基領域の形をとることができる。図６Ａ及び図６Ｂを参照されたい。キャッピングオリゴヌクレオチドは、プライミングオリゴヌクレオチドとは別個のオリゴヌクレオチドとして合成され、通常は、図６Ａに図示したように、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を阻止するためにその３’末端にブロッキング部分を含む。或いは、キャップは、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端の領域に相補性の塩基領域を含み、この塩基領域を、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個のヌクレオチドを含むか、これらから本質的に成るか、又はこれらから成る連結領域を介してプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に接続させる。図６Ｂを参照されたい。通常、この連結領域のヌクレオチドは、無塩基ヌクレオチドである。「無塩基ヌクレオチド」とは、リン酸基および糖基を含むが塩基の基を含まないヌクレオチドを意味する。５’末端に結合するキャップを有するプライミングオリゴヌクレオチドを構築することによってプライミング部分およびキャップの両方を含む単一のオリゴヌクレオチドのみの合成が必要となることでオリゴヌクレオチド合成が簡素化される。
【０１９５】
本明細書に記載したキャップは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下の伸長反応に関与することができる遊離３’−ヒドロキシルを有する、ディスプレーサ及びエクステンダーを含む、反応混合物に供給する他のオリゴヌクレオチドと共に用いることもできる。キャップの重要性は、３’−ヒドロキシルを有するオリゴヌクレオチドの数と共に増す。
【０１９６】
上述の実施態様のいずれかにおいて、標的配列の所望の領域が一旦特定されると、この領域を分析して、選択的ＲＮａｓｅ分解がＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖からのＲＮＡの部分の切断又は除去を最適に生じる箇所を明らかにすることができる。分析を行うことによって、ＡＭＶ逆転写酵素もしくはＭＭＬＶ逆転写酵素に存在するＲＮａｓｅ  Ｈ活性もしくは外から添加されたＲＮａｓｅ活性を有する選択的酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈもしくは他の供給源由来のＲＮａｓｅ活性を有する選択的酵素）又はこれらの組合せによる標的配列のＲＮａｓｅ分解の効果を明らかにすることができる。このような分析の後に、プライミングオリゴヌクレオチドが反応混合物中に存在する選択的ＲＮａｓｅによって実質的に分解されないＲＮＡの部分とハイブリッドを形成するようにプライミングオリゴヌクレオチドを選択することができる。何故なら、プライミングオリゴヌクレオチドの結合部位で実質的な分解が起こると、ＤＮＡ合成の開始が阻害され、プライマーの最適な伸長が妨げられるからである。言い換えると、プライミングオリゴヌクレオチドは、通常、ＲＮＡ標的核酸の領域もしくはＤＮＡ標的核酸の相補体とハイブリッドを形成するように選択し、ＲＮＡが選択的ＲＮａｓｅ分解を受けた場合に、プライマー伸長産物の形成を妨げる分解が実質的に生じないように配置する。
【０１９７】
逆の言い方をすれば、プロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成部位は、ＲＮＡ鎖の十分な分解が生じることによりプロモータオリゴヌクレオチドのＤＮＡ鎖との効率的なハイブリッド形成が可能となるように選択することができる。通常、選択的ＲＮａｓｅ分解によってＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖からＲＮＡの一部分のみが除去され、従って、ＲＮＡ鎖のいくつかの部分は二重鎖中に残ることになる。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖に対する選択的ＲＮａｓｅ分解の結果、ハイブリッドからＲＮＡの小片群が分離する。ＲＮＡが選択的に分解される位置は、標準的ハイブリッド形成分析によって決定することができる。従って、選択的ＲＮａｓｅ分解の後にＤＮＡとより効率的に結合する（即ち、ＲＮＡフラグメントが選択的に除去されている領域に結合する）プロモータオリゴヌクレオチドを選択することができる。
【０１９８】
図１Ａ〜図１Ｄおよび図２Ａ〜図２Ｄは、選択的ＲＮａｓｅ分解後に残り得るＲＮＡ部分を示していない。しかしながら、図１Ａ〜図１Ｄおよび図２Ａ〜図２ＤがＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖からのＲＮＡの完全な除去を示しているとしても、特定の条件下では、実際には部分的な除去しか起こらないことは言うまでもない。実際、図１Ａ〜図１Ｄおよび図２Ａ〜図２Ｄに図示したような増幅は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖の実質的部分が分解されずに残り、従ってプロモータオリゴヌクレオチドおよび／または任意選択的にエクステンダーオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成が妨げられる場合に、阻害される可能性がある。しかしながら、当業者は、本出願及びＫａｃｉａｎほかの米国特許第５，３３９，４９１号に開示された原則及び方法に基づき、本発明の教示に従って、型どおりの修正を行うことによってＲＮＡの増幅のための効果的かつ効率的な手順を得ることができる。
【０１９９】
要約すると、本発明は、反応条件（例えば、温度、イオン強度およびｐＨ）の調節を繰り返すことなく標的核酸から標的配列の複数のコピーを自己触媒的に合成するための方法を提供する。この方法は、反応混合物中に以下を混合する工程を含む：ＲＮＡ標的配列、一本鎖もしくは部分的一本鎖ＤＮＡ標的配列、又は少なくとも部分的に一本鎖にされている二本鎖ＤＮＡ標的配列のいずれかを含む標的核酸；プライミングオリゴヌクレオチド、プロモータオリゴヌクレオチド、並びに任意選択的に、ディスプレーサオリゴヌクレオチド、エクステンダーオリゴヌクレオチド及び／又は結合分子もしくはプライマー伸長反応を停止させるための他の手段（全て上述の通りである）；逆転写酵素又はＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖を選択的に分解する酵素活性（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性）；ならびにプロモータオリゴヌクレオチド中のプロモータ配列を認識するＲＮＡポリメラーゼ。この反応混合物は、核酸増幅に必要な構成成分（例えば、ヌクレオチド三リン酸）、緩衝液、塩および安定化剤をも含む。反応混合物のこれらの成分は、段階的に混合しても、一度に混合してもよい。この反応混合物を、オリゴヌクレオチド：標的核酸が形成される条件下でインキュベートすると、ＤＮＡプライミングおよび核酸合成を、標的配列もしくはその相補体の複数のコピーを生成させるのに十分な時間生じさせることができる。この反応は、反応構成成分（例えば、酵素）の安定性を維持するのに適切な条件下で、増幅反応過程で反応条件の修正もしくは調節することを必要とすることなく行うことが有利である。従って、一部の実施態様の反応は、実質的に等温であり、実質的に一定のイオン強度およびｐＨを含む条件下で行うことができる。
【０２００】
従って、本発明の増幅方法では、プライミングオリゴヌクレオチドの伸長時に生成されるＲＮＡ：ＤＮＡ複合体を分離するための変性工程を繰り返す必要がない。変性工程は、反応混合物の温度を実質的に（一般に室温から約８０℃と約１０５℃との間の温度まで）上げること、そのイオン強度を（通常１０分の１以下に）下げること、又はｐＨを変えること（通常ｐＨ１０以上に上げること）によるような、反応条件の調節を必要とすることになる。反応条件のこのような調節は、酵素活性に有害な影響をもたらす結果、さらに酵素の添加を必要とし、また、更なる核酸合成のために反応混合物を適切な条件に戻すための更なる調節をも必要とする場合が多い。標的核酸が二本鎖ＤＮＡである実施態様では、最初の変性工程を必要とする場合が多い。変性は、上述のように、反応混合物の残りの構成成分を添加する前に、温度、イオン強度、および／またはｐＨを変えることによって実施することができる。一旦、残りの構成成分を添加すると、反応混合物を更に調節する必要はない。
【０２０１】
本発明の方法は、増幅反応における副産物形成を低減させるか、減少させるか、又は実質的に排除するように設計されている。例えば、副産物の低減、減少又は実質的な排除は、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を阻止するように改変されたプロモータオリゴヌクレオチドの利用を介して、通常は、そのプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端にブロッキング部分を含めることによって行う。別の実施態様では、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端にある領域とハイブリッドを形成するキャップを用いることによってオリゴヌクレオチドダイマー形成を阻止することにより副産物形成を低減させるか、減少させるか、又は実質的に排除する。本発明では、プロモータを含む増幅反応において存在するオリゴヌクレオチドのうちのほとんど（例えば、少なくとも約９０％）は、プライマー伸長を阻止するために３’ブロッキング部分をさらに含む。特定の実施態様において、プロモータを含む増幅反応において使用される任意のオリゴヌクレオチド（プロモータオリゴヌクレオチドだけではない）は、３’ブロッキング部分をさらに含む。特定の好ましい実施態様では、増幅反応のために必要な、（使用される場合、ディスプレーサオリゴヌクレオチドを含む）プライミングオリゴヌクレオチド以外のほとんど（例えば、少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％、又は全て）のオリゴヌクレオチドは、３’ブロッキング部分を含む。従って、特定の実施態様では、増幅反応における（全てではないにしても）ほとんどのＤＮＡポリメラーゼ活性は、プライミングオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー伸長産物の形成に限定される。
【０２０２】
本発明の方法において使用されるプロモータオリゴヌクレオチドに組込むのに適切なプロモータ又はプロモータ配列は、核酸配列（天然に存在するか、合成により生成されるか、または制限酵素消化産物であるかのいずれか）であり、この核酸配列は、その配列を認識してこれに結合し、かつ転写プロセスを開始してＲＮＡ転写物が生成されるようにするＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される。代表的で公知の有用なプロモータとしては、特定のバクテリオファージポリメラーゼにより認識されるプロモータ（例えば、バクテリオファージＴ３、ＴＪ及びＳＰ６由来のプロモータ）並びにＥ．ｃｏｌｉ由来のプロモータが挙げられる。その配列は、安定性の付加、または分解プロセスに対する感受性、又は転写効率の増大を付与することができるＲＮＡポリメラーゼの実際の認識部位を越えて伸長するヌクレオチド塩基を、任意選択的に含むことができる。開始配列を認識することができる、周知の利用可能なポリメラーゼが存在するプロモータ配列が、使用するのに特に適切である。
【０２０３】
好適なＤＮＡポリメラーゼとしては、逆転写酵素が挙げられる。特に好適なＤＮＡポリメラーゼとしては、ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素が挙げられる。ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素などの、本発明の方法において使用するのに好適な逆転写酵素は、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有する。実際、本発明の特定の実施態様では、上記逆転写酵素によって増幅反応における唯一の選択的ＲＮＡｓｅ活性が得られ、別の選択的ＲＮＡｓｅを添加しない。しかしながら、状況によっては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡｓｅ  Ｈなどの選択的ＲＮＡｓｅを外から添加することは有用なこともある。外からの選択的ＲＮＡｓｅの添加は、特定の条件下では必要ではないが、例えば、ＡＭＶ逆転写酵素中に存在するＲＮＡｓｅ  Ｈ活性は、反応混合物中に存在する他の成分によって阻害または不活化されることがある。そのような状況では、外からの選択的ＲＮＡｓｅの添加は望ましいと考えられる。例えば、比較的大量の異種ＤＮＡが反応混合物中に存在する場合、ＡＭＶ逆転写酵素の天然のＲＮＡｓｅ  Ｈ活性が、幾分阻害されることがあり、従って、それに応じて生成される標的配列のコピー数は減少することがある。標的核酸が、存在する核酸のうちのほんの少量を構成する（例えば、サンプルが、かなりの量の異種ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む）条件下では、外からの選択的ＲＮＡｓｅを添加することは特に有用である。例えば、Ｋａｃｉａｎほか、米国特許第５，３９９，４９１号を参照されたい。なお、この特許の内容は引用により本明細書に組み込まれている(実施例8参照)。
【０２０４】
上記の方法により生成されるＲＮＡ増幅産物は、上記の機構によって標的配列に関連する別の増幅産物を生成するための鋳型としての機能を果たすことができる。この機構は、自己触媒性であり、本発明の方法による増殖は、反応条件（例えば、温度、ｐＨ、イオン強度など）を繰り返し修正もしくは変更することを必要とせずに、行われる。こうした方法は、高価な熱サイクリング装置を必要とせず、増幅反応過程で酵素または他の試薬を数回添加する必要もない。
【０２０５】
本発明の方法は、臨床、環境、法医学および同様の分野のサンプル中の核酸標的配列を検出及び／又は定量するためのアッセイにおいて、或いは種々の用途のために特定の標的配列から多数のＲＮＡ増幅産物を生成するために、有用である。例えば、本発明は、臨床サンプル（例えば、血液、尿、糞便、唾液、精液、もしくは髄液）、食物、水、実験室サンプル及び／又は産業サンプルを、特定の核酸の有無についてスクリーニングするのに有用である。本発明は、例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物の有無を検出するために使用することができる。本発明は、遺伝子スクリーニングのためのヒト、動物もしくは植物の核酸を検出するのに、又は臨床調査、考古学的研究もしくは社会学的研究においても有用である。
【０２０６】
代表的アッセイでは、増幅対象の標的核酸を含むサンプルを、緩衝剤、塩、マグネシウム、三リン酸、オリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチド、プロモータオリゴヌクレオチド、必要に応じてディスプレーサオリゴヌクレオチド、エクステンダーオリゴヌクレオチド及び／又は結合分子（例えば、停止オリゴヌクレオチド又は消化オリゴヌクレオチド及び／又はキャッピングオリゴヌクレオチド）、並びに他の試薬を含む濃縮緩衝液と混合する。この反応物は、任意選択的に、ある温度（例えば、６０℃乃至１００℃）で標的核酸の全ての二次構造を変性させ、又は二本鎖ＤＮＡ標的核酸を変性させるのに充分な時間、インキュベートすることができる。冷却した後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、そして望ましい場合には別個の選択的ＲＮＡｓｅ（例えば、ＲＮＡｓｅ  Ｈ）を添加し、この反応物を、上記の試薬および他の反応条件に応じて、特定の時間（例えば、約１０分間乃至約１２０分間）、最適温度（例えば、約２０℃乃至約５５℃以上）でインキュベートする。ディスプレーサオリゴヌクレオチドを用いる場合には、これを上記酵素と共に供給して、プライミングオリゴヌクレオチドが、増幅を開始する前に標的核酸とハイブリッドを形成する十分な時間をもたらすことができる。
【０２０７】
増幅産物は、任意選択的に標識した検出プローブのハイブリッドを形成させることによって検出することができ、得られるハイブリッドは任意の通常の方法で測定することができる。特定の標的配列を検出するためのプローブを選択する際の設計基準は、当該分野において公知であり、例えば、Ｈｏｇａｎほか、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，”米国特許第６，１５０，５１７号（その内容は引用により本明細書に組み込まれている）に記載されている。Ｈｏｇａｎは、プローブは、標的配列に対する相同性を最大にし、考えられる非標的配列に対する相同性は最小にするように、設計する必要があることを教示している。非標的配列との安定性を最小にするために、Ｈｏｇａｎは、グアニン及びシトシンがリッチな領域を回避する必要があること、プローブは、可能な限り多くの不安定なミスマッチにまたがる必要があること、及び非標的配列に対して完全な相補性の長さは最小限にする必要があることを、指示している。これとは逆に、そのプローブと標的配列との安定性は、最大にする必要があり、アデニン及びチミンがリッチな領域は回避するべきであり、プローブ：標的ハイブリッドはグアニン及びシトシンの塩基対で終端させるのが好ましく、過剰な自己相補性は一般的に回避されるべきであり、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度は、アッセイ温度よりも約２℃乃至約１０℃高いものとする必要がある。
【０２０８】
具体的には、増幅産物は、ハイブリダイゼーション・プロテクション・アッセイ（「ＨＰＡ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）」）によって検定することができる。ＨＰＡは、標的配列に対して化学発光オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、アクリジニウムエステル標識（「ＡＥ（ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ−ｌａｂｅｌｅｄ）」）プローブ）をハイブリッド形成させ、ハイブリッド形成していないプローブ上に存在する化学発光標識を選択的に加水分解し、残余のプローブからもたらされる化学発光を測定するものである。例えば、Ａｒｎｏｌｄほか、“Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ，”米国特許第５，２８３，１７４号及びＮＯＲＭＡＮ  Ｃ．  ＮＥＬＳＯＮほか、ＮＯＭＳＯＴＯＰＩＣ  ＰＲＯＢＩＮＧ，ＢＬＯＴＴＩＮＧ，ＡＮＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ、第１７章  （Ｌａｒｒｙ  Ｊ．  Ｋｒｉｃｋａ編、第２版１９９５年）（これらの文献のそれぞれは、その全体が引用により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。ＡＥプローブを使用してＨＰＡを実行するための具体的方法は、本明細書中の以下の実施例のセクションに開示した。
【０２０９】
別の実施態様において、本発明は、本明細書に記載の方法による、リアルタイムでの増幅プロセスの定量的評価方法を提供する。「リアルタイム」での増幅プロセスの評価法は、一般に、増幅反応時における反応混合物中のプローブ：単位複製配列複合体に関連するシグナルの量を定期的に測定するものであり、測定した値はサンプル中に最初に存在する標的配列の量を計算するのに用いる。リアルタイム増幅法に基づいてサンプル中に存在する初期の標的配列の量を決定する方法には種々のものがある。このようなものとしては、Ｌｉｇｈｔほか、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎａｌｙｔｅ  ｉｎ  ａ  Ｓａｍｐｌｅ，”  米国特許出願公開第２００６−０２７６９７２  号（段落５０５乃至５４９）、Ｌｅｅほか、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，”米国特許出願公開第２００６−０２８６５８７号、Ｃａｒｒｉｃｋほか、“Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”米国特許出願公開第２００６−０２９２６１９号、Ｗｉｔｔｗｅｒほか、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎａｌｙｔｅ，”米国特許第６，３０３，３０５号及びＹｏｋｏｙａｍａほか、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｓｓａｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ，”米国特許第６，５４１，２０５号に開示されているものが挙げられる。（これらの文献のそれぞれ、又はその示された部分は、引用により本明細書に組み込まれている。）サンプル中に最初に存在した標的配列の量を測定するための別の方法（しかし、これはリアルタイム増幅法には基づかない）が、Ｒｙｄｅｒほか、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｅ−  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ａ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｓｔ−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｔ，”米国特許第５，７１０，０２９号（この特許の内容は引用により本明細書に組み込まれている）に開示されている。本発明は、リアルタイム評価のために特に適切である。何故なら、副産物の生成が、低減、減少、又は実質的に排除されるからである。
【０２１０】
増幅産物は、種々の自己ハイブリッド形成プローブ（そのほとんどは、ステムループ構造を有する）を使用することによって、リアルタイムで検出することができる。このような自己ハイブリッド形成プローブは、このプローブが、自己ハイブリッド形成状態にあるのか、又は標的配列に対するハイブリッド形成によって変化した状態にあるのかに応じて、様々に検出可能なシグナルを発するように標識する。例えば、「分子トーチ」は、異なる自己相補性領域（「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」と呼ばれる）を含む型の自己ハイブリッド形成プローブであり、これらの自己相補性領域は、結合領域（例えば、非ヌクレオチドリンカー）によって接続され、かつ所定のハイブリッド形成アッセイ条件下で互いにハイブリッドを形成する。好ましい実施態様では、分子トーチは、標的結合ドメイン中に１塩基長乃至約１０塩基長の一本鎖塩基領域を含み、鎖置換条件下で増幅産物中に存在する標的配列とのハイブリッド形成に利用できる。この一本鎖領域は、例えば、末端領域又は内部領域（例えば、ループ領域）とすることができる。或いは、上記の鎖置換条件は、この分子トーチの二本鎖末端領域においてブリーシングを引き起こすことによって標的配列とのハイブリッド形成に利用できる一過性一本鎖領域をその末端領域で生じる。標的結合ドメイン中に存在する一本鎖領域に結合し、標的閉鎖ドメインの全てもしくは一部を置換する標的配列の存在下を除いて、鎖置換条件下では、この分子トーチの２つの相補性領域（完全に相補的であっても、部分的に相補的であってもよい）のハイブリッド形成が行われる。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインには、検出可能な標識、又は一対の相互作用標識（例えば、発光標識／クエンチャー標識）を含める。これらの標識は、その分子トーチが標的配列とハイブリッド形成した場合とは異なるシグナルを、その分子トーチが自己ハイブリッド形成した場合に生成し、それによってハイブリッド形成していない分子トーチの存在下に試験サンプル中のプローブ：標的二重鎖の検出が可能となるようにする配置する。分子トーチ類および種々の相互作用標識対がＢｅｃｋｅｒほか、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｏｒｃｈｅｓ，”  米国特許第６，５３４，２７４号に開示されており、その内容は引用により本明細書に組み込まれている。
【０２１１】
自己相補性を示す検出プローブの別の例は、「分子ビーコン」である。分子ビーコンは、標的相補体配列を含む核酸分子と、増幅産物中に存在する標的配列の非存在下にプローブを閉鎖型構造（ｃｌｏｓｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）で保持するアフィニティ対（または核酸アーム）と、そのプローブが閉鎖型構造にある場合に相互作用する標識対とを含む。標的配列と標的相補体配列とをハイブリッド形成させることにより、上記アフィニティ対のメンバーが分離し、これによって、プローブが開放型構造（ｏｐｅｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）へとシフトする。この開放型構造へのシフトは、標識対（これは、例えば、発蛍光団およびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であり得る）の相互作用の低下に起因して、検出可能である。この開放型構成へのシフトは、標識対（例えば、発蛍光団およびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）とすることができる）の相互作用の低下によって検出可能である。分子ビーコンは、Ｔｙａｇｉほか、“Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ，”  米国特許第５，９２５，５１７号及びＴｙａｇｉほか、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｓｕｃｈ  Ｐｒｏｂｅｓ，”  米国特許第６，１５０，０９７号（これらのそれぞれは、引用により本明細書に組み込まれている）に開示されている。
【０２１２】
本発明において使用するための他の自己ハイブリッド形成プローブは、当業者に公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、“Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ａｓｓａｙ，”  米国特許第５，９２８，８６２号（その内容は引用により本明細書に組み込まれている）に開示されているような相互作用標識を有するプローブ結合対は、本発明に使用するのに適するものとすることができる。一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するために使用されるプローブ系も、本発明において利用することができる。別の検出系としては、Ａｒｎｏｌｄほか、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｗｉｔｃｈ，”  米国特許出願公開第ＵＳ２００５−００４２６３８号（その内容は引用により本明細書に組み込まれている）に開示されているような「分子スイッチ」が挙げられる。挿入色素および／または蛍光色素を含むプローブなどの他のプローブは、本発明における増幅産物の検出のために有用とすることができる。例えば、Ｉｓｈｉｇｕｒｏほか、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”  米国特許第５，８１４，４４７号（その内容は引用により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。
【０２１３】
最初の標的配列とそのＲＮＡ転写産物とが同じセンスを共有する本発明の方法では、リアルタイム検出のためにプローブを添加する前に増幅を開始することが望ましいと考えられる。増幅反応を開始する前にプローブを添加すると、増幅速度が遅くなることがある。何故なら、最初の標的配列に結合するプローブが、プライマー伸長の間に置換され、そうでない場合は除去されて、標的配列の相補体を有するプライマー伸長産物を完成させなければならないからである。増幅の開始は、増幅酵素（例えば、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ）の添加によって判断される。
【０２１４】
本明細書に記載した方法の他に、本発明は、本発明の方法を実施するために必要な試薬のうちの１種以上を含むキットに関する。本発明を実施する際に使用する種々の成分を含むキットは、核酸標的分子の増幅を必要とする任意の手順において使用するために設定することができ、そのようなキットは、種々様々なエンドユーザーのために特別に製造することができる。例えば、血液スクリーニング、疾病診断、環境分析、感染対策、臨床検査、又は他の法医学的分析、遺伝子分析、考古学的分析もしくは社会学的分析、又は一般的実験室用途のために適切なキットを調製することができる。本発明のキットは、本発明に従って核酸増幅を実施するために必要な成分のうちの１種以上を提供する。キットには、１つの特定の標的から核酸を増幅するために適切な試薬を含めてもよく、又は複数の標的を増幅するために適切な試薬を含めてもよい。本発明のキットは、単一のサンプル中の１種以上の核酸標的のリアルタイム検出のための試薬（例えば、上記の１種以上の自己ハイブリッド形成プローブ）をさらに提供することができる。キットは、バイアル、試験管、ウェルなどの１つ以上の容器を厳重に閉じ込めて収容するように区画化されたキャリアを含むことができる。そのような容器のうちの少なくとも１つは、本発明の増幅方法を実施するのに必要な１種以上の成分または成分の混合物を含むことが好ましい。本発明によるキットには、例えば、１つ以上の容器中に、プライミングオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を防止するように改変された（例えば、３’ブロッキング部分を含むように改変された）プロモータオリゴヌクレオチド、結合分子、又はプライマー伸長反応を停止させるための他の手段、及び任意選択的に、本明細書に記載したようなエクステンダーオリゴヌクレオチド及び／又はキャッピングオリゴヌクレオチドを含ませることができる。リアルタイム検出が行われる場合、上記の１つ以上の容器には、単一のサンプル中の少なくとも１種の核酸標的配列のリアルタイム検出のための１種以上の試薬（例えば、上記の１種以上の自己ハイブリッド形成プローブ）を入れることができる。別の容器には、酵素試薬（例えば、逆転写酵素（ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を有するか、有さないもの）と、ＲＮＡポリメラーゼと、任意選択的に別の選択的ＲＮＡｓｅ酵素との混合物）を入れることができる。(ディスプレーサオリゴヌクレオチドを含める場合には、これを上記酵素試薬を含有する容器内に供給することができる。)  これらの酵素は、通常は酵素の安定性を促進する形態で、濃縮形態または使用濃度で供給することができる。上記酵素試薬は凍結乾燥形態で供給することもできる。Ｓｈｅｎほか、“Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”米国特許第５，８３４，２５４号（その内容は引用により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。別の１つ以上の容器には、濃縮形態（例えば、１０×、５０×もしくは１００×）、で、又は使用濃度で増幅試薬を入れることができる。増幅試薬は、増幅反応を実施するために必要な成分（例えば、緩衝液、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ、ＥＤＴＡ、安定剤など）のうちの１種以上を含むことになる。特定の上記成分（例えば、ＭｇＣｌ２およびｒＮＴＰ）を残りの成分とは別々に供給することによって、エンドユーザーは、より最適な増幅反応を達成するためにこれらの試薬を徐々に増やすことが可能になる。別の１つ以上の容器には、１つ以上の任意選択的に標識した検出プローブを含む、増幅産物の検出のための試薬を入れることができる。一部の実施態様では、本発明のキットには、本発明のキットには、エンドユーザーにより実施される試験増幅を確認するために増幅実験において利用することができる、１種以上の陽性対照及び陰性対照標的核酸を含む、１つ以上の容器をも含めることになる。一部の実施態様では、上記した試薬のうちの１種以上は、内部コントロールと組み合わせることができる。これらの試薬のうちの１種以上を、単一チューブまたは他の容器中で組み合わすことも可能である。
【０２１５】
本発明とともに使用するために適切な支持体（例えば、試験管、マルチチューブユニット、マルチウェルプレート、キュベット、軟質容器、遠心分析器に用いるための分析カードもしくはディスクを含むマイクロ流体デバイスなど）も本発明の試薬と共に供給することができる。最後に、本発明のキットには、書面又はＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ及びビデオテープを含む電子的形態で提供される１つ以上の指示書を含ませることができる。本発明のキットには、上述の、又は本明細書の他の箇所に記載されている成分の、事実上あらゆる組み合わせを含ませることができる。当業者であれば認めるであろうが、本発明のキットに含まれる成分は、そのキットの目的とする用途及び対象とするエンドユーザーによって様々に異なることになる。従って、キットは、本願において記載した種々の機能を実施するために具体的に設計することができ、そのようなキットの成分は、それに応じて異なることになる。
【０２１６】
本発明はさらに、プライミングオリゴヌクレオチド、プロモータオリゴヌクレオチド、停止オリゴヌクレオチド、ディスプレーサオリゴヌクレオチド、エクステンダーオリゴヌクレオチド、キャッピングオリゴヌクレオチド及び本明細書に記載の検出プローブを含む種々のオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ、ＲＮＡ，ＤＮＡ：ＲＮＡキメラ、及びこれらの類似体とすることができ、どの場合にでも、本発明は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＲＮＡ等価物、及びＲＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ等価物を包含するものである。好ましいプライミングオリゴヌクレオチド（ディスプレーサオリゴヌクレオチドを含む）及び上記の検出プローブを除き、先に記載したオリゴヌクレオチドはその３’末端にブロッキング部分を含むことが好ましい。
【０２１７】
本発明の検出プローブは、いくつかの代替的方法で、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、核タグ、生体発光標識、挿入色素、または酵素標識を用いて、標識することができる。上記検出プローブには、このプローブを標的配列又はその相補体とハイブリッドを形成させた時に検出可能なシグナルの変化を示す相互作用標識の基を含ませることができる。種々の実施態様において、これらの標識プローブは、任意選択的に、又は好ましくは、少なくとも１つの改変型ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド）を含むように合成し、或いは、これらの標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、任意選択的に、又は好ましくは、もっぱら改変型ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド）で合成される。
【０２１８】
本明細書に記載した方法および組成物に対する他の適切な修正および適合があり得ることは、当業者にとって周知である種々の情報を考慮すれば、本明細書に含まれる本発明の説明から容易に明らかであり、こうした修正および適合が本発明の範囲又はその全ての実施形態から逸脱することなくなされ得ることは、当業者によって理解されよう。以上に本発明を詳細に説明したが、本発明は、以下の実施例によって、より明確に理解されよう。以下の実施例は、もっぱら例証のためにここに記載されたものであり、、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０２１９】
本発明の種々の態様及び実施態様を例示する実施例を以下に示す。これらの実施例は、実際に実施される実験の詳細を正確に反映すると考えられるが、実際に実施される作業と以下に記載される実験の詳細との間には、これらの実験の結果には影響を与えないものの、いくらかの軽微な不一致が存在する可能性がある。こうした実施例がそこに記載されている特定の実施態様に本発明を限定するものではないことは、当業者であれば理解されよう。
【０２２０】
さらに、当業者なら、本明細書に記載の技術、材料及び方法を用いて、任意の標的配列を検出及び／又は定量するための代替的な増幅方法を容易に考案し、最適化することができよう。
【０２２１】
本発明の実施においては、特に示さない限り、当該分野の技術の範囲内にある分子生物学、組換えＤＮＡ、および化学の従来技術を用いる。このような技術については、文献で十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：（１９８９年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ及び  ＩＩ巻（Ｄ．  Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｍｕｌｌｉｓほか、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ１  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．  Ｙ．）；並びにｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌほか、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ボルティモア、メリーランド州（１９８９年）を参照されたい。
【０２２２】
特に示さない限り、以下の実施例のオリゴヌクレオチドおよび改変オリゴヌクレオチドは、種々の方法が当該分野において周知である標準的なホスホラミダイト化学反応を用いて合成した。例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓほか、１５４  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２８７（１９８７年）（その内容は引用により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。
【０２２３】
本明細書に特記しない限り、改変ヌクレオチドは、２’−メチルリボヌクレオチドであり、これをそのホスホラミダイト類似体として合成に用いた。本出願人は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（商標）８９０９  ＤＮＡ合成機（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ）を用いてオリゴヌクレオチドを調製した。種々の試薬を以下の実施例において特定した。これらの試薬としては、増幅試薬、酵素試薬、ハイブリッド形成試薬、選択試薬および検出試薬が挙げられる。これらの試薬の処方およびｐＨ値（関連する場合）は、以下の通りであった。
【０２２４】
増幅試薬：「増幅試薬」は、１１．６ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基緩衝液、１５ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩緩衝液、２２．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２３．３ｍＭ  ＫＣｌ、３．３３％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５ｍＭ  酢酸亜鉛、０．６６５ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．６６５ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．６６５ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．６６５ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．０２％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ  ３００  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ；カタログ番号４８１２６）、５．３２ｍＭ  ＡＴＰ、５．３２ｍＭ  ＣＴＰ、５．３２ｍＭ  ＧＴＰ、５．３２ｍＭ  ＵＴＰ、及び６Ｍ  ＨＣｌ（２２℃でｐＨ７．８１〜８．０）を含んだ。
【０２２５】
酵素試薬：「酵素試薬」は、７０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、１０％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２界面活性剤、１６ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基緩衝液、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１５０ｍＭ  トレハロース、４Ｍ  ＮａＯＨ（ｐＨ７）並びに２２４ＲＴＵ／μＬ  モロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）逆転写酵素、及び１４０Ｕ／μＬ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを含んだ。この場合、１ＲＴＵのＲＴ活性は基質としてｐｏｌｙ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）１２・１８を用いて３７℃２０分でＤＥ８１フィルター結合産物中に１ｎｍｏｌのｄＴＭＰを取り込ませ、１ＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ活性は３７℃２０分で５ｆｍｏｌのＲＮＡ転写物を生成する。
【０２２６】
ハイブリッド形成試薬：「ハイブリッド形成試薬」は、１００ｍＭ  コハク酸、２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、２３０ｍＭ  ＬｉＯＨ、１５ｍＭ  アルドリチオール−２、１．２Ｍ  ＬｉＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＥＧＴＡ、３．０％（ｖ／ｖ）エチルアルコール及び２Ｍ  ＬｉＯＨ（ｐＨ４．７）を含んだ。
【０２２７】
選択試薬：「選択試薬」は、６００ｍＭ  Ｈ３ＢＯ３、１８２ｍＭ  ＮａＯＨ、１％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００界面活性剤、および４Ｍ  ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）を含んだ。
【０２２８】
検出試薬Ｉ：「検出試薬Ｉ」は、１ｍＭ  Ｈ３ＮＯ３および３０ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を含んだ。
【０２２９】
検出試薬ＩＩ：「検出試薬ＩＩ」は、１Ｍ  ＮａＯＨおよび２％（ｗ／ｖ）Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４界面活性剤を含んだ。
【０２３０】
オイル試薬:  「オイル試薬」は、シリコーンオイル（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＰＡ；カタログ番号ＰＳ０３８）を含んだ。
（実施例１）
ブロック化及び非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドの比較
この実験は、Ｃ型肝炎ウイルス（「転写物」）の５’非翻訳領域由来のクローニングされた転写物の領域（「標的領域」）を増幅のための標的とした本発明による増幅法の特異性を評価するために行った。この実験のために、本発明者らは、同一の塩基配列を有する２組のプライミングおよびプロモータオリゴヌクレオチドを調製した。この２組のオリゴヌクレオチドはプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端ブロッキング部分の有無によって異なる。
【０２３１】
各組のプロモータオリゴヌクレオチドは標的領域の５’末端内に含有される配列の相補体を標的とし、配列番号５
【０２３２】
【化３９】
2010520750.tif 000041
【０２３３】
の塩基配列を有したが、配列中、プロモータオリゴヌクレオチドの下線部分はＴ’７プロモータ配列（配列番号３）を構成し、非下線部分はハイブリッド形成配列（配列番号４）を表す。各組のプライミングオリゴヌクレオチドは、標的領域の３’末端内に含有される配列を標的とし、配列番号６の塩基配列を有した。配列番号３８
【０２３４】
【化４０】
2010520750.tif 000042
【０２３５】
の塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成される停止オリゴヌクレオチドもこの増幅方法に加えられる。停止オリゴヌクレオチドは、３’末端ブロッキング部分を有し、標的領域に対してちょうど５’側の転写物の領域を標的とした。停止オリゴヌクレオチドの５’末端とプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列の５’末端とは、６塩基が重なり合う。プロモータオリゴヌクレオチドおよび停止オリゴヌクレオチドの両方の３’末端ブロッキング部分は、３’−ジメチルトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、５’−スクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ；カタログ番号２０−０１０２−０１）を用いて調製される３’−３’結合で構成された。
【０２３６】
増幅のために、７５μＬの上記増幅試薬を、８つの反応チューブの各々に添加した。次いで、この増幅試薬を、３０ｐｍｏｌのプロモータオリゴヌクレオチド、３０ｐｍｏｌのプライミングオリゴヌクレオチドおよび５ｐｍｏｌの停止オリゴヌクレオチドと混合した。１組の４本のチューブに３０ｐｍｏｌの非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド（Ｉ群）を供給し、別の組の４本のチューブに３０ｐｍｏｌのブロック化プロモータオリゴヌクレオチド（ＩＩ群）を供給した。次に、１０００コピー／μＬの転写物を含む１μＬの０．１％（ｗ／ｖ）硫酸ラウリルリチウム（「ＬＬＳ」）緩衝液を、各群の２本のチューブに添加し、一方、各群の残りの２本のチューブを、陰性対照とした。反応混合物に２００μＬのオイル試薬をかけ、次いで、チューブを密閉して５乃至１０秒間水平に手で振盪した後、チューブを６０℃の水浴で１０分間インキュベートした。次いで、チューブを、４１．５℃の水浴に移し、１５分間インキュベートした後に、２５μＬの酵素試薬を各チューブに添加した。酵素試薬を添加した後、チューブを密閉し、水浴から取り出し、５乃至１０秒間、水平に手で振盪して、反応混合物の成分を十分に混合した。チューブを、４１．５℃の水浴に戻し、さらに６０分間インキュベートして、ＭＭＬＶ逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの存在下で標的領域の増幅を促進した。増幅後、チューブを、４１．５℃の水浴から取り出し、１０乃至１５分間、室温で冷却させた。
【０２３７】
各反応混合物の５μＬアリコートを、チューブから取り、２×Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−尿素サンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；カタログ番号ＬＣ６８７６）で１：１に希釈し、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−尿素変性ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カタログ番号ＥＣ６８６５ＢＯＸ）上にロードした。ゲルを、Ｘｃｅｌｌ  Ｓｕｒｅｌｏｃｋ（商標）Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号ＥＩ０００１）によって保持し、脱イオン水で１：４に希釈した５×Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号ＬＣ６６７５）を用いて１８０ボルトで５０分間電気泳動した。その後、ゲルを、１×ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ）溶液中０．５μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドで染色し、ＦｉｓｈｅｒＢｉｏｔｅｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ；Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．ＦＢ−ＴＩＶ−８１６Ａ）上で可視化し、Ｐｏｌａｒｏｉｄ  ６６７フィルムを用いて携帯用のカメラで撮影した。
【０２３８】
この実験の結果を、撮影した図３のゲルに示した。上記の各番号の写真のゲルは、異なるレーンを表し、レーン１は、１００、２００、３００、４００、５００、７５０および１０００塩基のオリゴヌクレオチドのＲＮＡラダーであり、残りのレーンは、以下の反応混合物に対応する：（ｉ）レーン２および３は、Ｉ群（非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド）の転写物含有複製に対応し；（ｉｉ）レーン４および５は、ＩＩ群（ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド）の転写物含有複製に対応し；（ｉｉｉ）レーン６および７は、Ｉ群の転写物陰性複製に対応し；並びに（ｉｖ）レーン８および９は、ＩＩ群の転写物陰性複製。レーン２乃至５の最初の目に見えるバンドは、標的領域の増幅に由来する単位複製配列を構成する。レーン２、３、６および７のバンドの残りは、非特異的増幅産物を構成する。従って、以上の結果から、完全にブロック化されたプロモータオリゴヌクレオチドを用いる増幅のみが特異的であることが分かった。何故なら、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを含む転写物含有又は転写物陰性反応混合物のいずれにおいても目に見える副産物の形成がなかったのに対し、非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを含む転写物含有及び転写物陰性反応混合物のいずれにおいても目に見える副産物が形成されたからである。
（実施例２）
複製分子形成の減少
この実験は、本発明の増幅法においてブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを使用することによって、標準的な転写ベースの増幅手順と比較して複製分子形成の減少が生じる否かを評価するためにデザインした。複製分子は一般に、プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端がヘアピン構造を形成し、ポリメラーゼの存在下で伸長することにより二本鎖プロモータ配列が形成される場合に形成されると考えられている。二本鎖プロモータ配列から転写が開始されると、アンチセンス型のプロモータ配列を含む単位複製配列が形成される。
【０２３９】
この実験では、本発明者らは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ（「標的核酸」）の領域（「標的領域」）を標的とする２種の検出プローブの１種を用いてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＡＴＣＣ番号２５１７７）由来の精製ｒＲＮＡの存在下または非存在下で３’末端がブロックされた、又はブロックされていなプロモータオリゴヌクレオチドを含む増幅反応において複製分子の生成を比較した。ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドおよび非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドは、標的領域の５’末端の相補体内に含まれる配列を標的とした。ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号２６
【０２４０】
【化４１】
2010520750.tif 000043
【０２４１】
の塩基配列を有し、非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号２８
【０２４２】
【化４２】
2010520750.tif 000044
【０２４３】
の塩基配列を有した。但し、各プロモータオリゴヌクレオチドの下線部分は、Ｔ７プロモータ配列（配列番号３）を構成し、下線のない部分は、ハイブリッド形成配列（配列番号２５および配列番号２７）を表す。プライミングオリゴヌクレオチドは、標的配列の３’末端内に含まれる配列を標的し、配列番号２９の塩基配列を有した。配列番号３９
【０２４４】
【化４３】
2010520750.tif 000045
【０２４５】
の塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成される停止オリゴヌクレオチドも含めた。停止オリゴヌクレオチドは、標的領域に対してちょうど５’側の標的核酸の領域を標的とし、３’末端ブロッキング部分を含んだ。停止オリゴヌクレオチドとプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列の５’末端とは、６塩基が重なり合った。ブロックオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドの両方の３’末端ブロッキング部分は、実施例１に記載した３’−３’結合からなった。さらに検出のために、２種の検出プローブを合成した。第１の検出プローブ（「検出プローブＩ」）は、標的領域内に含まれる配列を標的し、配列番号３０
【０２４６】
【化４４】
2010520750.tif 000046
【０２４７】
の塩基配列を有した。第２の検出プローブ（「検出プローブＩＩ」）は、Ｔ７プロモータ配列内に含まれる領域のアンチセンスを標的とし、配列番号４０
【０２４８】
【化４５】
2010520750.tif 000047
【０２４９】
の塩基配列を有した。両方の検出プローブ配列中の星印は、Ａｒｎｏｌｄら、「Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」、米国特許第５，５８５，４８１号（その内容は、引用により本明細書に組み込まれている）に記載されているように、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結される４−（２−スクシニミジルオキシカルボニルエチル）−フェニル−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートアクリジニウムエステル標識（「標準ＡＥ」）の位置を示す。
【０２５０】
全部で８種の異なる増幅反応を５回反復して実施した。増幅反応のために使用した全ての反応チューブに、７５μＬの増幅試薬、続いて、各々５ｐｍｏｌのブロック化プロモータオリゴヌクレオチド又は非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチド、及び停止オリゴヌクレオチドを供給した。２組のチューブに２５０コピー／μＬの標的核酸を含む各２μＬの０．２％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ緩衝液を供給し、もう一方の２組のチューブには標的核酸を供給しなかった。反応混合物に２００μＬのオイル試薬を重畳し、チューブを密閉して、５乃至１０秒間、水平に手で振盪した後、６０℃の水浴中で１０分間、インキュベートした。次いで、チューブを、４１．５℃の水浴に移し、１０分間、インキュベートした後に、２５μＬの酵素試薬を各チューブに添加した。酵素試薬を添加した後、チューブを密閉して、水浴から取り出し、５乃至１０秒間、水平に手で振盪して、反応混合物の成分を十分に混合した。標的配列の増幅を可能にするために、チューブを４１．５℃の水浴に戻し、さらに６０分間インキュベートした。増幅後、チューブを４１．５℃の水浴から取り出し、１０乃至１５分間、室温で冷却させた。
【０２５１】
検出工程を、Ａｒｎｏｌｄほか、”Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ”、米国特許第５，２８３，１７４号に開示されるハイブリダイゼーション・プロテクション・アッセイに従って実施した。この工程において、５２ｆｍｏｌの検出プローブＩまたは１０．２ｆｍｏｌの検出プローブＩＩのいずれかを含む１００μＬのハイブリッド形成試薬を、各チューブに添加した。検出プローブを添加した後、チューブを密閉して、５乃至１０秒間、水平に手で振盪して、６０℃の水浴中で１５分間インキュベートして、検出プローブをその対応する標的配列とハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成させた後、２５０μＬの選択試薬をチューブに添加し、チューブを密閉して、５乃至１０秒間、水平に手で振盪した後、６０℃の水浴中で１０分間インキュベートすることによってハイブリッド形成していないプローブと結合したアクリジニウムエステル標識を加水分解した。このサンプルを少なくとも１０分間、室温で冷却させた後、検出試薬Ｉの自動注入に続いて、検出試薬ＩＩの自動注入を装備したＬＥＡＤＥＲ（登録商標）ＨＣ＋Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（登録商標）（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；カタログ番号４７４７）で分析した。チューブから発されたシグナルを、化学発光の目安である相対発光量（「ＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）」）で測定した。
【０２５２】
結果を、各組の反応条件毎に平均化し、以下の表１に示した。ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを含む上記増幅反応は標的核酸の標的領域を増幅させる時に非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを含む上記増幅反応と同様に機能したことが分かる。しかしながら、転写物の存在下および非存在下の両方において、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを含むそれらの増幅反応では、非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを含む増幅反応の場合よりも、複製分子の生成は実質的に少なかった。
【０２５３】
【表１】
2010520750.tif 000048
【０２５４】
（実施例３）
ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドを用いる増幅アッセイの感度
この実験では、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−８７８）由来の精製された２３Ｓ  ｒＲＮＡ（「標的核酸」）の領域（「標的領域」）を増幅のための標的とする本発明による増幅系の感度を調べた。この実験には、３’末端ブロッキング部分を有するプロモータオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチド、３’末端部分を有する停止オリゴヌクレオチド、及び標識検出プローブを含めた。プロモータオリゴヌクレオチドは、標的配列の５’末端内に含まれる配列の相補体を標的とし、配列番号２２
【０２５５】
【化４６】
2010520750.tif 000049
【０２５６】
の塩基配列を有した。配列中、プロモータオリゴヌクレオチドの下線部分はＴ７プロモータ配列（配列番号３）を構成し、下線のない部分は、ハイブリッド形成配列（配列番号２１）を示す。プライミングオリゴヌクレオチドは、標的領域の３’末端内に含まれる配列を標的とし、配列番号２３の塩基配列を有した。停止オリゴヌクレオチドは、配列番号４１
【０２５７】
【化４７】
2010520750.tif 000050
【０２５８】
の塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成され、標的領域に対してちょうど５’側の標的核酸の領域を標的とした。停止オリゴヌクレオチドとプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列の５’末端とは、４塩基が重なり合った。プロモータオリゴヌクレオチドおよび停止オリゴヌクレオチドの両方の３’末端ブロッキング部分は、実施例１に記載した３’−３’結合からなった。検出プローブは、標的領域内に含まれる配列を標的とし、配列番号２４
【０２５９】
【化４８】
2010520750.tif 000051
【０２６０】
の塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成された。但し、星印は、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合させた標準ＡＥ標識の位置を示す。Ａｒｎｏｌｄほか、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい。
【０２６１】
この実験における増幅は、基本的に実施例１に記載したようにして行った。各増幅反応を３回反復して実施し、標的核酸を、１０、１００、１０００又は１０，０００コピー／μＬを含む０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ緩衝液からの、それぞれ１０、１００、１０００又は１０，０００のコピー数の各組の複製において各反応チューブに添加した。プロモータおよびプライミングオリゴヌクレオチドを各々、３０ｐｍｏｌ／反応量においてチューブに添加し、５ｐｍｏｌの停止オリゴヌクレオチドを各チューブに添加した。検出は、この実験のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓプローブを用いて基本的に実施例２に記載したようにして実施した。この実験の結果を以下の表２に示したが、これにより、この増幅系について１００コピーの感度が示され、１０，０００を超える平均ＲＬＵ値がポジティブな結果となった。
【０２６２】
【表２】
2010520750.tif 000052
【０２６３】
（実施例４）
二本鎖標的配列の増幅
この実施例では、ヒト乳頭腫ウイルス１６型（「ＨＰＶ−１６」）のＥ６およびＥ７遺伝子由来のクローン化二本鎖転写物（「転写物」）の領域（「標的領域」）を増幅のための標的とした本発明による増幅系を調べる。図１Ｃを参照されたい。この実験には、３’末端ブロッキング部分を有するプロモータオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチド、及び標識検出プローブを含めた。このプロモータオリゴヌクレオチドは、標的配列の５’末端内に含まれる配列の相補体を標的とし、配列番号１４
【０２６４】
【化４９】
2010520750.tif 000053
【０２６５】
の塩基配列を有した。配列中、プロモータオリゴヌクレオチドの下線部分は、Ｔ７プロモータ配列（配列番号３）を構成し、下線のない部分は、ハイブリッド形成配列（配列番号１３）を表す。プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端ブロッキング部分は、実施例１に記載される３’−３’結合からなる。プライミングオリゴヌクレオチドは、標的領域の３’末端内に含まれる配列を標的とし、配列番号１５の塩基配列を有した。２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドからなる検出プローブは、配列番号１６
【０２６６】
【化５０】
2010520750.tif 000054
【０２６７】
の塩基配列を有し、標的領域内に含まれる配列を標的とした。星印は、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合した標準ＡＥ標識の位置を示す。Ａｒｎｏｌｄほか、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい。
【０２６８】
この実験の増幅反応を５回反復して実施し、各チューブには、０、５０、１００、５００、１０００又は５０００コピーの転写物を含む７５μＬの増幅試薬を含ませた。各チューブには、４０ｐｍｏｌのプロモータオリゴヌクレオチド及び１５ｐｍｏｌのプライミングオリゴヌクレオチドをも供給した。反応混合物に、２００μＬのオイル試薬を重畳し、次いで、チューブを密閉して、５乃至１０秒間水平に手で振盪した。二本鎖転写物の相補鎖を分離するために、チューブを９５℃で１０分間、ヒートブロック中でインキュベートした。このインキュベーションの終了時に、チューブをヒートブロックから取り出し、５分間氷上で急速に冷却して、プライミングオリゴヌクレオチドと転写物の標的領域との結合を促進した。次いで、チューブを、４１．５℃の水浴中で１０分間、インキュベートした。増幅を開始させるために、２５μＬの酵素試薬をチューブに添加し、次いで、これを密閉して５乃至１０秒間水平に手で振盪して、増幅試薬および酵素試薬を十分に混合した。次いで、チューブを４１．５℃の水浴に戻して１時間のインキュベーションを行うことにより増幅を実施した。
【０２６９】
増幅後、増幅産物の検出を、１００ｆｍｏｌ／反応の検出プローブを用いて、実施例２に記載した方法で実施した。この実験の結果を以下の表２に示したが、これにより、この増幅系について５００コピーの感度が示され、１０，０００以上の平均ＲＬＵ値がポジティブな結果となった。
【０２７０】
【表３】
2010520750.tif 000055
【０２７１】
（実施例５）
ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドと非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドとの比較
この実験の目的は、実施例１のＨＣＶ増幅系において停止オリゴヌクレオチドを含ませることの利点を評価することであった。図１Ａを参照されたい。この実験のために、停止オリゴヌクレオチドの存在下又は非存在下で実施例１の転写物を０または１０コピー含む４種の異なる反応混合物を、１０回反復して用意した。プロモータ、プライミングおよび停止オリゴヌクレオチドは、実施例１で使用したものと同一であった。実施例１とは異なり、この実験には、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドから作製され、増幅のための標的にされる転写物の領域内に含まれる配列を標的とする２種の検出プローブを含ませた。第１の検出プローブは、配列番号７
【０２７２】
【化５１】
2010520750.tif 000056
【０２７３】
の塩基配列を有し、第２の検出プローブは、配列番号８
【０２７４】
【化５２】
2010520750.tif 000057
【０２７５】
を有した。各検出プローブは、「コールド（ｃｏｌｄ）」すなわち非標識型、および「ホット（ｈｏｔ）」すなわち標識された型を有した。（極めて過剰な単位複製配列の存在下にホットプローブが飽和するのを回避するために、この実験ではコールドプローブを使用し、それによって、増幅の範囲を評価することが可能となった。）星印は、非ヌクレオチドリンカーによってホットプローブに結合された標準ＡＥ標識の位置を示す。Ａｒｎｏｌｄほか、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい。
【０２７６】
増幅反応は、基本的に、３０ｐｍｏｌ／反応のプロモータオリゴヌクレオチド並びに各１５ｐｍｏｌ／反応のプライミングオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドを用いて、実施例２に記載の方法で行った。検出は、以下の表４に示した比に相当する量で各１００ｆｍｏｌ／反応の２種のホットプローブ及び２種のコールドプローブを用いて、実施例２に記載したようにして実施した。平均化した結果を、相対発光量（「ＲＬＵ」）で表４に示したが、これにより、停止オリゴヌクレオチドを含む反応混合物のみが、ＨＣＶ増幅系において１０コピーレベルの感度を有したことが分かる。試験した異なるコピーレベルについて表４に示される変動係数値（「％ＣＶ」）は、パーセンテージとしての複製の平均に対するする複製の標準偏差を構成する。
【０２７７】
【表４】
2010520750.tif 000058
【０２７８】
（実施例６）
プロモータオリゴヌクレオチドと停止オリゴヌクレオチドとの間の塩基の重なりの種々の長さ
この実験において、本発明者らは、実施例１のＨＣＶ増幅系において増幅効率に対するブロック化プロモータオリゴヌクレオチドと停止オリゴヌクレオチドとの間の種々の長さの重なりの効果を検討した。反応混合物を４回反復して用意し、各組に０または５０コピーの実施例１の転写物を供給した。存在する場合、プロモータオリゴヌクレオチドと停止オリゴヌクレオチドとの間の重なりの量は、各組の反応混合物について２塩基、４塩基又は６塩基であった。プロモータオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチド及び検出プローブは、実施例５に使用したものと同一であった。コールドプローブおよびホットプローブを４：１の比で使用した。この実験の３つの停止オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成され、以下の塩基配列を有した：（ｉ）配列番号４２
【０２７９】
【化５３】
2010520750.tif 000059
【０２８０】
（２塩基重なり）；（ｉｉ）配列番号４３
【０２８１】
【化５４】
2010520750.tif 000060
【０２８２】
（４塩基重なり）；及び（ｉｉｉ）配列番号３８（６塩基重なり）。
【０２８３】
増幅反応を、３０ｐｍｏｌ／反応のプロモータオリゴヌクレオチド及び各１５ｐｍｏｌ／反応のプライミングオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドを用い、実施例５に記載した方法で反応チューブにおいて行った。検出を、各１００ｆｍｏｌ／反応の２種のホットプローブ、及び各４００ｆｍｏｌ／反応の２種のコールドプローブを用いて、実施例２に記載したようにして実施した。平均化した結果を、相対発光量（「ＲＬＵ」）で表５に示したが、これにより、試験した条件下で、プロモータオリゴヌクレオチドと停止オリゴヌクレオチドとの間の６塩基の重なりが、ＨＣＶ増幅系について最適であることが分かる。当業者であれば、この方法を任意の増幅系に適用して、型どおりの実験以外を用いないで、プロモータオリゴヌクレオチドと停止オリゴヌクレオチドとの間の重なりの最適な量を決定することができよう。
【０２８４】
【表５】
2010520750.tif 000061
【０２８５】
（実施例７）
停止オリゴヌクレオチドの存在下又は非存在下におけるリアルタイム増幅アッセイの比較
この実験は、停止オリゴヌクレオチドが、リアルタイム増幅アッセイにおいて増幅能力を向上させるか否かを明らかにするために行った。この実験のために、本発明者らは、配列番号２８の塩基配列を有する非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、配列番号２９の塩基配列を有するプライミングオリゴヌクレオチド、および配列番号３９の塩基配列を有するブロック化停止オリゴヌクレオチドを含ませた実施例２のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ増幅系を用いた。配列番号３１の塩基配列を有する分子ビーコン検出プローブもまた含ませた。検出プローブを、ＢＨＱ−２  Ｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ＣＰＧ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ；カタログ番号ＣＧ５−５０４２Ｇ−１）を用いてその３’末端に結合させたＢＨＱ−２  Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）Ｄｙｅ、およびＣｙ（商標）５−ＣＥホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社；カタログ番号１０５９１５−９０）を用いてその５’末端に結合させたＣｙ（商標）５Ｄｙｅを含むように合成した。こうした反応は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｗｈｉｔｅ  Ｃｌｉｎｉｐｌａｔｅ  ９６（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ；カタログ番号２８２９８−６１０）のウェル中で行い、各反応ウェルには、０、１００又は１，０００コピーの実施例２の標的核酸を添加した。試験した各コピー数については、停止オリゴヌクレオチドを含む４つの複製、および停止オリゴヌクレオチドを含まない４つの複製が存在した。増幅および検出のために、７５μＬの増幅試薬を各反応ウェルに添加し、続いて、５０コピー／μＬを含む２μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ緩衝液を１組の複製の各チューブに添加し、５００コピー／μＬを含む２μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ緩衝液を、別の組の複製の各チューブに添加した。プロモータオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチド及び、含ませる場合、停止オリゴヌクレオチドを、各々、５ｐｍｏｌ／反応量でチューブに添加し、２ｐｍｏｌ／反応量の検出プローブを各チューブに添加した。標的核酸を、示した量で反応ウェルに供給し、反応混合物に８０μＬのオイル試薬を重畳した。プレートを、ＴｈｅｒｍａｌＳｅａｌ  ＲＴ（商標）フィルム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；製品番号Ｚ３６９６７５）で密閉して、プレートの内容物を、Ｓｏｌｏ  ＨＴ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；型番５１６１５８０）中で６０℃のインキュベーションを１５分間、続いて、このＳｏｌｏ  ＨＴ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ中で４２℃のインキュベーションを１０分間行った。次に、２５μＬの酵素試薬（４２℃に予熱した）を各ウェルに添加して、その内容物を、ピペットを用いて数回混合した。次いで、プレートの内容物を、Ｂｉｏｌｕｍｉｎ（商標）９６０  Ｍｉｃｒｏ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）中で４２℃で１２０分間、インキュベートして、Ｃｙ（商標）５Ｄｙｅチャネルからの蛍光を、１分間隔において時間の関数として観察した。この観察の結果を、グラフとして図４Ａ乃至図Ｆに示したが、これにより、停止オリゴヌクレオチドが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓリアルタイム増幅アッセイにおいて標的配列の増幅を劇的に向上させたことが分かる。
（実施例８）
停止オリゴヌクレオチド対消化オリゴヌクレオチド
この実験では、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド又は非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドの存在下に停止オリゴヌクレオチド又は消化オリゴヌクレオチドを用いて、実施例２のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ増幅系の増幅レベルを比較した。この実施態様の停止オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡに結合して、物理的に逆転写酵素の活性をブロックするように設計したが、ＤＮＡからなる消化オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡに結合してＲＮＡｓｅ  Ｈ活性による基質ＲＮＡの消化を導くように設計した。停止オリゴヌクレオチド又は消化オリゴヌクレオチドを使用すると、規定された３’末端を有する鋳型−相補鎖又はｃＤＮＡが形成される。プロモータオリゴヌクレオチドは、その鋳型結合部分が、鋳型−相補鎖に存在する３’末端配列とハイブリッドを形成することにより、逆転写酵素の存在下に二本鎖プロモータ配列の形成を促進するように設計する。
【０２８６】
実施例２のように、この実験のプロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号２８の塩基配列を有し、プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号２９の塩基配列を有した。停止オリゴヌクレオチドは、配列番号４４
【０２８７】
【化５５】
2010520750.tif 000062
【０２８８】
の塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成され、消化オリゴヌクレオチドは、配列番号４５
【０２８９】
【化５６】
2010520750.tif 000063
【０２９０】
の塩基配列を有した。実施例２で特定した停止オリゴヌクレオチド及びプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列の５’末端は、４塩基が重なり合い、消化オリゴヌクレオチドの５’末端から伸長する最初の１４塩基は、プロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列の最も５’側の１４塩基と重なり合った。ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、停止オリゴヌクレオチド及び消化オリゴヌクレオチドは全て、実施例１に記載される３’−３’結合からなる３’末端ブロッキング部分を含んだ。さらに、検出プローブは、配列番号３２
【０２９１】
【化５７】
2010520750.tif 000064
【０２９２】
の塩基配列を有した。配列中、星印は非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合させた標準ＡＥ標識の部分を示す。Ａｒｎｏｌｄほか、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい。
【０２９３】
全部で６つの異なる反応を、以下の表６に示すように２回反復して実施した。鋳型ポジティブ反応には、各々、実施例２の５０コピー／μＬのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ標的核酸を含む１μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ緩衝液を供給し、鋳型ネガティブ反応には、標的核酸を含ませなかった。増幅および検出は、基本的に、各３０ｐｍｏｌ／反応のプロモータオリゴヌクレオチド及びプライミングオリゴヌクレオチド、５ｐｍｏｌ／反応の停止オリゴヌクレオチド、３０ｐｍｏｌ／反応の消化オリゴヌクレオチド、並びに１０ｆｍｏｌ／反応の検出プローブを用いて、実施例２と同様にして行った。これらの反応の結果は、相対発光量（「ＲＬＵ」）として測定し、表６に示したが、これにより、この増幅系の増幅が、停止オリゴヌクレオチド又は消化オリゴヌクレオチドの存在下で類似していたが、能力は、消化オリゴヌクレオチドを用いるといくらか向上したことが分かる。さらに、この結果から、このコピー数でのこの増幅系における増幅レベルが、消化オリゴヌクレオチドの存在下で向上したことが分かる。
【０２９４】
【表６】
2010520750.tif 000065
【０２９５】
（実施例９）
キャッププライミングオリゴヌクレオチド
この実験では、実施例２のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ増幅系を用いて、副産物形成に対してプライミングオリゴヌクレオチドキャップを含ませることの効果を検討した。「キャップ」は、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端に相補性の短いオリゴヌクレオチドであり、末端の３’−ＯＨ基からの伸長を阻止するための３’末端ブロッキング部分を含む。キャップは、プライミングオリゴヌクレオチドがプロモータオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドダイマー（プライミングオリゴヌクレオチドが、逆転写酵素の存在下において伸長される場合、機能的二本鎖プロモータ配列の形成を生じ得る）を形成することを防ぐために含ませる。図５Ａに示すように、機能的二本鎖プロモータ配列を有するオリゴヌクレオチドダイマーが形成されると、ＲＮＡポリメラーゼの存在下に望ましくない副産物が生成する可能性がある。キャップは、オリゴヌクレオチドダイマー形成を阻害する一方、鋳型配列との特異的なハイブリッド形成によって、プライミングオリゴヌクレオチドから容易に外すことができる。キャップ使用の略図を図６Ａに示した。
【０２９６】
この実験のために、本発明者らは、実施例２のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ標的核酸の存在下または非存在下で２回反復して３つの異なる反応条件を試験した。３つの反応条件の構成要素は、以下のように異なった：（ｉ）第１の組の反応条件には、非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、非キャッププライミングオリゴヌクレオチド及びブロック化停止オリゴヌクレオチドを含めた；（ｉｉ）第２の組の反応条件には、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、非キャッププライミングオリゴヌクレオチド、ブロックオリゴヌクレオチドを含めた；（ｉｉｉ）第３の組の反応条件は、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、３’末端でブロック化キャップとハイブリッド形成させたプライミングオリゴヌクレオチド、及びブロック化停止オリゴヌクレオチドを含めた。実施例２のように、プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号２８の塩基配列を有し、プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号２９の塩基配列を有した。キャップは、配列番号４６
【０２９７】
【化５８】
2010520750.tif 000066
【０２９８】
の塩基配列を有した。停止オリゴヌクレオチドは、配列番号４４
【０２９９】
【化５９】
2010520750.tif 000067
【０３００】
の塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成された。さらに、ブロックされる場合の停止オリゴヌクレオチド及びプロモータオリゴヌクレオチド並びにキャップには全て、実施例１に記載した３’−３’結合からなる３’末端ブロッキング部分を含ませた。
【０３０１】
増幅を開始する前に、プライミングオリゴヌクレオチドおよびキャップを、１：１の比でプライミングオリゴヌクレオチド及びキャップを含む１０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液中で予めハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成を促進するために、溶液を含む反応チューブを、９５℃の水浴中で１０分間インキュベートし、次いで、２時間室温で冷却させた。この予めハイブリッド形成させる工程の後、各３０ｐｍｏｌ／反応のプロモータオリゴヌクレオチド及びキャッププライミングオリゴヌクレオチド、並びに５ｐｍｏｌ／反応の停止オリゴヌクレオチドを用いて実施例２のようにして増幅を行った。この場合、各反応混合物には、１０，０００コピー／μＬの標的核酸を含む１μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ緩衝液も供給した。増幅後、５μＬのサンプルを各チューブから取り、１０×ＢｌｕｅＪｕｉｃｅ（商標）Ｇｅｌ  Ｌｏａｄｉｎｇ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カタログ番号１０８１６−０１５）で１：１に希釈し、これを、ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ）で２倍に希釈し、エチジウムブロマイド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カタログ番号Ｇ５０１８−０４）で予め染色したＥ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｏｍｂ  Ｇｅｌ（４％高分解能アガロース）上にロードした。ゲルを、３０分間８０ボルトでＥ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｂａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号Ｇ５１００−０１）上で電気泳動した。次いで、ゲルを、ＦｉｓｈｅｒＢｉｏｔｅｃｈ（登録商標）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒで可視化し、Ｐｏｌａｒｏｉｄ  ６６７フィルムを用いて携帯用のカメラで撮影した。
【０３０２】
この実験の結果を、図７Ａ（鋳型ネガティブゲル）及び図７Ｂ（鋳型ポジティブゲル）の写真撮影したゲルで示した。写真のゲルの上の数字は、異なるレーンを示し、レーン７はブランク、レーン８は１００塩基対のＲＮＡラダー、レーン９は、２０塩基対のＲＮＡラダーであり、残りのレーンは、以下の反応混合物由来の産物を含む：（ｉ）レーン１及び２は、非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、非キャッププライミングオリゴヌクレオチド及びブロック化停止オリゴヌクレオチドを含む反応混合物に対応する；（ｉｉ）レーン３及び４は、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、非キャッププライミングオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドを含む反応混合物に対応する；並びに（ｉｉｉ）レーン５及び６は、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、キャッププライミングオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドを含む反応混合物に対応する。以上の結果から、プライミングオリゴヌクレオチドをキャッピングすることにより副産物の形成がさらに減少したことが分かる（こうした反応におけるオリゴヌクレオチドダイマーである副産物は、２０マー乃至６０マーの範囲であるのに対し、単位複製配列は、１００塩基長より長い）。
（実施例１０）
ループ状プライミングオリゴヌクレオチド
この実験では、実施例２のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ増幅系における増幅に対するループ状プライミングオリゴヌクレオチドの効果を調べた。ループ状プライミングオリゴヌクレオチドは、実施例９において評価した種々のプライミングオリゴヌクレオチドおよびキャップである。ループ状プライミングオリゴヌクレオチドは、非ヌクレオチドリンカー（例えば、無塩基ヌクレオチド）によって、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端乃至５’末端に結合しているキャップを含む。ループ状プライミングオリゴヌクレオチドの１つの利点は、標的鋳型の非存在下でのプライミングオリゴヌクレオチドとキャップとの再結合が、これら２つのオリゴヌクレオチドが互いにごく接近して維持される場合に、より速いことである。ループ状プライミングオリゴヌクレオチドの別の利点は、別のプライミングオリゴヌクレオチド及びキャップオリゴヌクレオチドの時間を要する合成と対照的に、プライミングオリゴヌクレオチド及びキャップが単一の合成手順で作製することができることである。
【０３０３】
非キャッププライミングオリゴヌクレオチドと種々の長さのキャップを有するループ状プライミングオリゴヌクレオチドとの間の比較を行った。プロモータ、プライミングオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドは、実施例９に使用したものと同一であり、検出プローブは、実施例２に使用した検出プローブＩと同じであった。検出プローブを、実施例５に記載した理由のために、「コールド」及び「ホット」の両形態で反応混合物に供給し、各反応混合物のコールド：ホットプローブ比を２５０：１とした。ループ状プライミングオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有し、配列中、各「ｎ」は、無塩基ヌクレオチド（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；カタログ番号１０−１９２４−ｘｘ）を表す：
【０３０４】
【化６０】
2010520750.tif 000068
【０３０５】
各プライミングオリゴヌクレオチドについて異なる反応混合物を調製し、これらの反応混合物を、１０００コピー／μＬの実施例２のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ標的核酸を含む０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ緩衝液から得られる１０００コピーのこの標的核酸を用い、３回反復して試験した。増幅および検出工程は、各３０ｐｍｏｌ／反応のプロモータオリゴヌクレオチド及びプライミングオリゴヌクレオチド、５ｐｍｏｌ／反応の停止オリゴヌクレオチド、１０ｆｍｏｌ／反応のホットプローブ、並びに２．５ｐｍｏｌ／反応のコールドプローブを用いて、実施例２のようにして行った。チューブからのシグナルを相対発光量（「ＲＬＵ」）として測定し、平均ＲＬＵ値を以下の表７に示した。この結果から、鋳型はループ状プライミングオリゴヌクレオチドを用いて増幅させることができること、４つの無塩基および１つの５塩基キャップを有するループ状プライミングオリゴヌクレオチドはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ増殖系に最適であることが分かる。
【０３０６】
【表７】
2010520750.tif 000069
【０３０７】
（実施例１１）
ループ状プライミングオリゴヌクレオチドとキャップとの比較
この実験では、ループ状プライミングオリゴヌクレオチドのプライマー依存性副産物形成に対する阻害能を評価した。この実験として、実施例１０のループ状プライミングオリゴヌクレオチドＬＰＯ  及びＶＬＰＯ  ＶＩＩを、非キャッププライミングオリゴヌクレオチド及び１４塩基のキャップを有するプライミングオリゴヌクレオチドと比較した。非キャッププライミングオリゴヌクレオチド及びキャッププライミングオリゴヌクレオチドは、実施例１０に用いた非キャッププライミングオリゴヌクレオチドと同じであり、キャップは配列番号５４
【０３０８】
【化６１】
2010520750.tif 000070
【０３０９】
の塩基配列を有した（キャップおよびプライミングオリゴヌクレオチドは、実施例９のように予めハイブリッド形成させた）。停止オリゴヌクレオチドは、実施例１０に用いた停止オリゴヌクレオチドと同じであり、検出プローブは、プライミングオリゴヌクレオチドの相補体を標的とし、配列番号２９
【０３１０】
【化６２】
2010520750.tif 000071
【０３１１】
の塩基配列を有した（配列中、星印は非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合させた標準ＡＥ標識の位置を示す）。Ａｒｎｏｌｄほか、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい。検出プローブに、実施例５に記載した理由のために、「コールド」および「ホット」形態の両方において反応混合物を与え、各反応混合物のコールド：ホットのプローブの比は、４０００：１であった。プロモータ及び停止オリゴヌクレオチドと同様に、キャップは、実施例１に記載した３’−３’結合からなる３’末端ブロッキング部分を有した。
【０３１２】
反応混合物は、全て鋳型を含まず、各プライミングオリゴヌクレオチドについて調製した異なる組の反応混合物に関して３回反復して試験した。増幅および検出工程は、各３０ｐｍｏｌ／反応のプロモータオリゴヌクレオチド及びプライミングオリゴヌクレオチド、５ｐｍｏｌ／反応の停止オリゴヌクレオチド、２０ｆｍｏｌ／反応のホットプローブ、並びに８０ｐｍｏｌ／反応のコールドプローブを用いて、実施例２のようにして行った。チューブからのシグナルを相対発光量（「ＲＬＵ」）として測定し、平均ＲＬＵ値を以下の表９に示した。以上の結果から、キャッププライミングオリゴヌクレオチドはループ状プライミングオリゴヌクレオチドよりも大きな程度に、プライマー依存性の副産物の形成を抑制したが、ループ状プライミングオリゴヌクレオチドを用いると、この増幅系に非キャッププライミングオリゴヌクレオチドを用いた場合よりも、プライマー依存性の副産物形成が少なかったことが分かる。
【０３１３】
【表８】
2010520750.tif 000072
【０３１４】
（実施例１２）
エクステンダーオリゴヌクレオチドの存在下及び非存在下でのＲＮＡ転写物生成の比較
この実験では、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを含む増幅反応混合物における単位複製配列生成に対するエクステンダーオリゴヌクレオチドの効果を調べた。この実験のエクステンダーオリゴヌクレオチドは、ブロック化型又は非ブロック化型とし、配列番号５５
【０３１５】
【化６３】
2010520750.tif 000073
【０３１６】
を有した。配列番号５６
【０３１７】
【化６４】
2010520750.tif 000074
【０３１８】
の塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成される３’末端ブロック化停止オリゴヌクレオチドを含めた。標的核酸「標的」、プライミングオリゴヌクレオチド及びプロモータオリゴヌクレオチドは、実施例１に使用したものと同じであった。この実験に使用した各ブロック化オリゴヌクレオチドのブロッキング部分は、実施例１に記載した３’−３’結合からなる３’末端ブロッキング部分であった。コールドおよびホットプローブを転写産物の検出のために使用し、これは、配列番号７の配列を有した。この実験のホットプローブは、実施例５に使用した第１検出プローブと同一のものであった。
【０３１９】
以下のように６つの群の増幅反応混合物を４回反復して試験した：（ｉ）エクステンダーオリゴヌクレオチドを含まず、標的を含まない（Ｉ群）；（ｉｉ）エクステンダーオリゴヌクレオチドを含まず、１００コピーの標的を含む（ＩＩ群）；（ｉｉｉ）ブロック化エクステンダーオリゴヌクレオチドを含み、標的を含まない（ＩＩＩ群）；（ｉｖ）ブロック化エクステンダーオリゴヌクレオチドを含み、１００コピーの標的を含む（ＩＶ群）；（ｖ）非ブロック化エクステンダーオリゴヌクレオチドを含み、標的を含まない（Ｖ群）；（ｉｖ）非ブロック化エクステンダーオリゴヌクレオチドを含み、１００コピーの標的を含む（ＶＩ群）。６群からの反応チューブには、６ｐｍｏｌのプライミングオリゴヌクレオチド、４ｐｍｏｌのプロモータオリゴヌクレオチド及び０．８ｐｍｏｌの停止オリゴヌクレオチドを含む３０μＬの増幅試薬を充填した。ＩＩＩ群及びＩＶ群の反応チューブには、４ｐｍｏｌのブロック化エクステンダーオリゴヌクレオチドを添加し、Ｖ群及びＶＩ群の反応チューブには、４ｐｍｏｌの非ブロック化エクステンダーオリゴヌクレオチドを添加した。上記のように、ＩＩ群、ＩＶ群及びＶＩ群の反応チューブにはさらに、１００コピーの標的を添加したのに対し、Ｉ群、ＩＩＩ群及びＶ群の反応チューブには、標的を添加しなかった。反応混合物に、２００μＬのオイル試薬を重畳し、次いで、チューブを密閉して１０秒間ボルテックスした後、６０℃の水浴中に１０分間インキュベートした。次いで、チューブを４１．５℃の水浴に移し、１５分間インキュベートした後、１０μＬの酵素試薬を添加した。酵素試薬を添加した後、チューブを再び密閉して、５乃至１０秒間水平に手で振盪して、反応混合物の成分を十分に混合した。チューブを４１．５℃の水浴に戻し、さらに６０分間インキュベートして、標的配列の増幅を可能にした。増幅後、チューブを４１．５℃の水浴から取り出し、２分間、氷水浴中に置いた。
【０３２０】
ＲＮＡ転写産物の検出は、１００ｆｍｏｌ／反応のホットプローブ及び３００ｐｍｏｌ／反応のコールドプローブを用い、基本的に、実施例２に記載したのと同様にして実施した（反応チューブは手で振盪するのではなくボルテックスした）。平均化した結果を、相対発光量（「ＲＬＵ」）で表９に示したが、これにより、この実験のエクステンダーオリゴヌクレオチドが増幅速度の上昇に寄与したことが分かる。試験した異なる反応条件について表９に示される変動係数値（「％ＣＶ」）は、パーセンテージとしての複製の平均に対するする複製の標準偏差を構成する。
【０３２１】
【表９】
2010520750.tif 000075
【０３２２】
（実施例１３）
ＤＮＡ標的配列の増幅
この実験は、二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）内に含まれる標的領域に対する本発明による増幅系の感度を明らかにするために実施した。この実験に用いた例示的なｄｓＤＮＡはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性株のｏｒｆＸ遺伝子に由来するクローン化転写物であった。増幅のために、プライミングオリゴヌクレオチド、ディスプレーサオリゴヌクレオチド、停止オリゴヌクレオチド及びプロモータオリゴヌクレオチドを含ませた。このプライミングオリゴヌクレオチドは標的配列の３’末端内に含まれる配列を標的として配列番号３５の塩基配列を有し、ディスプレーサオリゴヌクレオチドは標的配列に対して５’側の標的配列を含む標的核酸中に存在する配列を標的として配列番号５７の塩基配列
【０３２３】
【化６５】
2010520750.tif 000076
【０３２４】
を有し（配列中、下線を付けた塩基はＬＮＡである）、停止オリゴヌクレオチドは標的領域に対して３’側の標的核酸中に存在する配列を標的として配列番号５８の塩基配列
【０３２５】
【化６６】
2010520750.tif 000077
【０３２６】
を有し（配列中、下線を付けた塩基はＬＮＡである（停止オリゴヌクレオチドは折り畳みを制限するために完全にはＬＮＡで構成されるものではない））、並びに、プロモータオリゴヌクレオチドは配列番号３４
【０３２７】
【化６７】
2010520750.tif 000078
【０３２８】
の塩基配列を有した（配列中、下線部分はＴ７プロモータ配列（配列番号３））であり、残りの部分は標的領域の５’末端内に含まれる配列の相補体を標的とするハイブリッド形成配列（配列番号３３）である）。上記のプロモータオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドのいずれにも実施例１に記載した３’−３’結合からなる３’末端ブロッキング部分を含ませた。検出は配列番号５９
【０３２９】
【化６８】
2010520750.tif 000079
【０３３０】
の塩基配列を有する分子トーチ検出プローブを用いてリアルタイムで実施した。このプローブの塩基配列は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成され、５’−３’を示す１７番目及び１８番目のヌクレオチドを９−炭素リンカーによって互いに結合させた。この検出プローブは、３’−ＤＡＢＣＹＬ  ＣＰＧ（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社、Ａｓｔｏｎ、ＰＡ；カタログ番号Ｎ−９７５６−１０）及び５’末端に結合させた６−ＦＡＭホスホラミダイト（ＢｉｏＧｅｎｅｘ社、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＣＡ；カタログ番号ＢＧＸ−３００８−０１）を用いてＤＡＢＣＹＬ  及びＦＡＭの相互作用標識を含むように合成した。また、このプローブは、５ｐ−３’を示す１７番目と１８番目のヌクレオチドの間に配置した９−炭素リンカー（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ；カタログ番号１０−１９０９−９０）をも含むように合成した。合成したプローブはポリアクリルアミドゲル電気泳動及び逆相ＨＰＬＣにより精製した。このプローブの標的結合部分は配列番号３７からなった。
【０３３１】
この実験の増幅反応はコピー数毎に６回反復して実施し、このために、マイクロタイタープレートの１２箇所の試験ウェルの各々に、４４．１ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．８２％（ｗ／ｖ）のトレハロース、３０．６ｍＭのＭｇＣｌ２、３３ｍＭのＫＣｌ、０．３％（ｖ／ｖ）のエタノール、０．１％（ｗ／ｖ）のメチルパラベン、０．０２％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン、９．４１ｍＭのｒＡＴＰ、１．８ｍＭのｒＣＴＰ、１．１８ｒＧＴＰ、１．８ｍＭのＵＴＰ、０．４７ｍＭのｄＡＴＰ、０．４７ｍＭのｄＣＴＰ、０．４７ｍＭのｄＧＴＰ、０．４７ｍＭのｄＴＴＰ、１５ｐｍｏｌのプライミングオリゴヌクレオチド、８ｐｍｏｌのディスプレーサオリゴヌクレオチド及び０．５ｐｍｏｌの停止オリゴヌクレオチドをｐＨ７．７で含む３０μＬの増幅試薬を供給した。また、各ウェルには０、１０、１００、１，０００又は１０，０００コピーの上記転写物も添加した。プレートはシーリングカードで覆い、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ（登録商標）２  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ；カタログ番号ＣＦＤ３２２０）相当品中で９５℃で１０分間インキュベートして二本鎖転写物を変性させ、次いで４２℃で５分間インキュベートして標的核酸と、プライミングオリゴヌクレオチド、ディスプレーサオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を促進させた。インキュベーション後、プレートを上記検出系から取り出し、各試験ウェルに１０μＬの酵素試薬を添加して増幅を開始させた。この酵素試薬は、５８ｍＭのＨＥＰＥＳ、３．０３％（ｗ／ｖ）のトレハロース、５０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、１．０４ｍＭのＥＤＴＡ、１２０ｍＭのＫＣｌ、１０％（ｗ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１５ｐｍｏｌのプロモータオリゴヌクレオチド、８ｐｍｏｌの検出プローブ、３６０ＲＴＵ／μＬのＭＭＬＶ逆転写酵素（「ＲＴ」）及び８０Ｕ／μＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをｐＨ７．０で含み、１ＲＴＵのＲＴ活性は３７℃２０分間で基質中に１ｎｍｏｌのｄＴを組込み、１ＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ活性は３７℃２０分間で５ｆｍｏｌのＲＮＡ転写物を精製させる。酵素添加後、上記ブレートを予め４４℃に加温したＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ  （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ；カタログ番号５３５５  ２９７１６）上に置き、シーリングカードで覆って１，４００ｒｐｍで３０秒間攪拌した。このプレートを４２℃検出系に戻し、そこでリアルタイムで１００分間、増幅反応を観察し、２４秒毎に蛍光値を測定した。検出は、増幅産物とハイブリッド形成したプローブの構造変化に依存し、これにより検出可能な蛍光シグナルの発生がもたらされる。
【０３３２】
この実験の結果を図８のグラフに示した。図では、分単位の時間をｘ軸にプロットし、相対蛍光シグナルをｙ軸にプロットした。これらのデータから、この増幅系は少なくとも１０００コピーの転写物の感度を有したことが分かる。対照サンプルでは検出可能な増幅が全く認められなかった（転写物０）。
（実施例１４）
ＤＮＡ標的配列を増幅させるための系の比較
二本鎖ＤＮＡ内に含まれる標的領域に対する本発明の各種関連増幅系の感度を比較するために一連の実験を実施した。実施例１３と同様に、この実験に用いた例示的標的核酸はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性株のｏｒｆＸ遺伝子に由来するクローン化転写物であった。この実験に用いたプライミングオリゴヌクレオチドは配列番号３６の塩基配列を有した。残りのオリゴヌクレオチドは実施例１３のものと同じであった。最初の実験を除き、各実験では、実施例１３の以下の構成要素のうちの１種を除外した：（ｉ）停止オリゴヌクレオチド；（ｉｉ）ディスプレーサオリゴヌクレオチド；（ｉｉｉ）プライミングオリゴヌクレオチド；及び（ｉｖ）二本鎖標的を変性させるための加熱。これらの実験は、実施例１３の一般プロトコルに従い、１２回反復して実施した。
各組の複製物は０又は１０００コピーの転写物を含んだ。
【０３３３】
この実験の結果は図９Ａ乃至図９Ｅにグラフで示した。この場合も図中、分単位の時間をｘ軸にプロットし、相対蛍光シグナルをｙ軸にプロットした。
【０３３４】
これらの実験の結果から以下のことが分かる：（ｉ）標的を含む複製物は全て、増幅系が改変されなかった場合、ポジティブであった（図９Ａ参照）；（ｉｉ）標的を含む複製物は全て、反応混合物から停止オリゴヌクレオチドが除外された場合、ポジティブであった（図９Ｂ参照）；（ｉｉｉ）標的を含む１２の複製物のうちの４つは、反応混合物からディスプレーサオリゴヌクレオチドが除外された場合、ポジティブであった（図９Ｃ参照）；（ｉｖ）標的を含む１２の複製物のうち３つは、反応混合物からプライミングオリゴヌクレオチドが除外された場合、ポジティブであった（図９Ｄ参照）；及び（ｖ）標的を含む１２の複製物のうち４つは、二本鎖標的が、酵素添加の前に熱変性条件（即ち、９５℃加熱工程）に曝されない場合、ポジティブであった（図９Ｅ参照）。対照サンプルでは検出可能な増幅が全く認められなかった（転写物０）。
【０３３５】
本発明を特定の好ましい実施態様に関してかなり詳細に説明し、明らかにしてきたが、その他の実施態様についても当業者であれば容易に理解されよう。従って、本発明は、下記に添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる全ての変更態様を含むと判断される。
【図１Ａ】
2010520750.tif 000080
【図１Ｂ】
2010520750.tif 000081
【図１Ｃ】
2010520750.tif 000082
【図１Ｄ】
2010520750.tif 000083
【図２Ａ】
2010520750.tif 000084
【図２Ｂ】
2010520750.tif 000085
【図２Ｃ】
2010520750.tif 000086
【図２Ｄ】
2010520750.tif 000087
【図３】
2010520750.tif 000088
【図４−１】
2010520750.tif 000089
【図４−２】
2010520750.tif 000090
【図４−３】
2010520750.tif 000091
【図５】
2010520750.tif 000092
【図６】
2010520750.tif 000093
【図７】
2010520750.tif 000094
【図８】
2010520750.tif 000095
【図９Ａ】
2010520750.tif 000096
【図９Ｂ】
2010520750.tif 000097
【図９Ｃ】
2010520750.tif 000098
【図９Ｄ】
2010520750.tif 000099
【図９Ｅ】
2010520750.tif 000100
【配列表】
2010520750000001.app
【国際調査報告】
2010520750.tif 000101
2010520750.tif 000102
2010520750.tif 000103
2010520750.tif 000104