(57)【要約】【課題】本発明は、腎疾患および腎炎を処置および予防するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、ＴＬＲ２の機能および発現の阻害剤として機能する化合物の投与により腎疾患および腎不全を処置するための方法を提供する。【解決手段】本発明の第１の態様によれば、腎炎および腎疾患に関与するＴＬＲ２発現細胞または組織におけるＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の１つ以上の生物学的活性を減少させる方法であって、前記細胞または組織におけるＴＬＲ２の１つ以上の生物学的活性を減少させるのに十分な量で、ＴＬＲ２活性またはＴＬＲ２発現の拮抗薬と、前記細胞または組織とを接触させる工程を含む方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎疾患または腎炎に関与するＴＬＲ２発現細胞または組織におけるＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の１つ以上の生物学的活性を減少させる方法であって、
前記細胞または組織におけるＴＬＲ２の１つ以上の生物学的活性を減少させるのに十分な量で、ＴＬＲ２活性または発現の拮抗薬と、前記細胞または組織とを接触させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記ＴＬＲ２発現細胞は、尿細管上皮細胞、ボーマン嚢の上皮細胞、腎臓糸球体壁細胞、腎臓糸球体有足細胞、近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄薄部細胞、腎臓遠位尿細管細胞、腎臓集合管細胞からなる群より選択される細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触させる工程は、細胞溶解物、再構成系または培養物中の細胞において起こる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記接触させる工程は、被験体に存在する細胞または組織で起こる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体は、腎不全または腎障害を有するか、あるいはそれらの危険性があるヒト患者である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＬＲ２は、ヒトまたはマウスＴＬＲ２である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＬＲ２拮抗薬は、ヒトＴＬＲ２に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＬＲ２拮抗薬は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質および低分子化合物からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＬＲ２拮抗薬は、ヒトＴＬＲ２に特異的に結合している抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体は、ＴＬＲ２に特異的に結合しているヒト、ヒト化、キメラ、合成、ラクダ、サメまたは生体外の抗体、あるいはそれらのいずれか由来の結合断片からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および断片からなる群より選択される抗体結合断片である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体分子は、２つの完全な重鎖、および２つの完全な軽鎖、またはそれらの抗原結合断片を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＬＲ２拮抗薬は、ヒトＴＬＲ２の細胞外ドメインによって規定されるエピトープに結合する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＬＲ２拮抗薬は、ヒトＴＬＲ２のアミノ酸配列のアミノ末端およびカルボキシル末端由来のアミノ酸残基を含む不連続エピトープに結合する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＬＲ２拮抗薬は、配列番号２のアミノ酸残基１９〜３９、または５３８〜５４９を含むＴＬＲ２上のエピトープに結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴＬＲ２拮抗薬は、ＴＬＲ２タンパク質をコードする核酸の発現を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＴＬＲ２拮抗薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ分子からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
腎障害を処置および／または予防するための方法であって、前記方法は、
Ｔｏｌｌ様受容体２の機能を調節する治療有効量の薬剤を提供する工程、および
そのような処置を必要とする被験体に前記化合物を投与する工程を含む、方法。
【請求項１９】
ＴＬＲ２機能を調節する前記薬剤は、ＴＬＲ２拮抗薬である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＴＬＲ２拮抗薬は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質および低分子化合物からなる群より選択される結合化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＴＬＲ２拮抗薬は、抗体またはその抗体由来の結合断片である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または合成抗体からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体は、ヒトＴＬＲ２に対する、ヒト、ヒト化、ラクダ、生体外で産生した抗体からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥからなる群より選択されるアイソタイプである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴＬＲ２拮抗薬は、約１０−７Ｍ〜約１０−１１Ｍの解離定数（Ｋｄ）でＴＬＲ２に存在する阻害エピトープに結合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＴＬＲ２拮抗薬は、ヒトＴＬＲ２の細胞外ドメインによって規定されるエピトープに結合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体は、ヒトＴＬＲ２のアミノ酸配列のアミノ末端およびカルボキシル末端由来のアミノ酸残基を含む不連続エピトープに結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体は、配列番号１のアミノ酸残基１９〜３９、または５３８〜５４９を含むＴＬＲ２上のエピトープに結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴＬＲ２拮抗薬は、配列番号１のアミノ酸残基１９〜３９、または５３８〜５４９を含むＴＬＲ２上のエピトープに結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
ＴＬＲ２調節薬剤は、組み換えＴｏｌｌ様受容体２の可溶性形態である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
ＴＬＲ２の前記可溶性形態は、二次タンパク質に結合したＴＬＲ２タンパク質上の細胞外ドメインを実質的に含む融合タンパク質である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＬＲ２の前記可溶性形態は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはその断片であり、前記断片は、配列番号５のアミノ酸配列の生物学的活性を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＴＬＲ２調節薬剤は、ＴＬＲ２タンパク質の発現を阻害する阻害核酸である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３４】
前記阻害核酸タンパク質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＴＬＲ２調節薬剤は、ＴＬＲ２発現細胞における１つ以上のＴＬＲ２生物学的活性を減少または阻害させるために前記被験体に投与され、前記細胞は、尿細管上皮細胞、ボーマン嚢の上皮細胞、腎臓糸球体壁細胞、腎臓糸球体有足細胞、近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄薄部細胞、腎臓遠位尿細管細胞、腎臓集合管細胞からなる群より選択される細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３６】
前記腎障害は、腎疾患、慢性腎不全、急性腎不全、異種腎毒性腎炎、糸球体腎炎、糸球体の硬化、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病性ネフロパシー、および糖尿病性ネフロパシーからなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記腎障害は、免疫グロブリンＡネフロパシー、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、非増殖性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、微小変化型疾患、原発性巣状分節状糸球体硬化症、線維性糸球体腎炎、イムノタクトイド糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎、進行性糸球体腎炎、抗ＧＢＭ疾患、腎虚血、抗好中球細胞質抗体に関連する疾患を含む腎臓血管炎、ループス腎炎クリオグロブリン血症関連糸球体腎炎、細菌性心内膜炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、感染後糸球体腎炎、Ｃ型肝炎疾患、糖尿病性ネフロパシー、ミロイドーシス（ｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、高血圧性腎硬化症、多発性骨髄腫由来軽鎖疾患、続発性巣状分節状糸球体硬化、および高血圧性腎硬化症からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＴＬＲ２は、ヒトＴＬＲ２またはマウスＴＬＲ２である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３９】
治療有効量の少なくとも１つの二次治療化合物を投与する工程をさらに含み、前記二次治療化合物は、免疫抑制剤化合物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項４０】
前記二次治療化合物は、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、代謝拮抗物質、抗ＣＤ２抗体または関連結合断片、抗ＣＤ２０抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムスまたはＦＴＹ７２０からなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記薬剤は、前記二次治療化合物と同時に投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記薬剤は、前記二次治療化合物の投与と連続して投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記薬剤は、前記二次治療化合物の投与と別に投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
腎障害の処置および予防に使用するための医薬組成物であって、少なくとも１つの薬理学的に許容できる担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／または補助剤と共にＴｏｌｌ様受容体２の機能または発現を調節する薬剤を含む、医薬組成物。
【請求項４５】
前記薬剤は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または抗体断片、アプタマー、融合タンパク質およびペプチド模倣物からなる群より選択されるＴＬＲ２拮抗薬である、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
ＴＬＲ２調節薬剤は、ＴＬＲ２受容体の可溶性形態である、請求項４４または請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記薬剤は、ＴＬＲ２のｍＲＮＡまたはＴＬＲ２の遺伝子産物の発現を阻害する阻害核酸ベースの化合物である、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記組成物は、二次治療化合物をさらに含む、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記二次治療化合物は、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、代謝拮抗物質、抗ＣＤ２抗体または関連結合断片、抗ＣＤ２０抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムスまたはＦＴＹ７２０からなる群より選択される、免疫抑制剤化合物である、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
腎炎および腎疾患の処置のための医薬を調製するためのＴｏｌｌ様受容体２の機能または発現を調節する薬剤の使用。
【請求項５１】
前記腎疾患は、腎疾患、慢性腎不全、急性腎不全、異種腎毒性腎炎、糸球体腎炎、糸球体の硬化、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病性ネフロパシー、および糖尿病性ネフロパシーからなる群より選択される、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
前記薬剤は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質および低分子化合物からなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記薬剤は、ヒトＴＬＲ２に特異的に結合している抗体である、請求項５０に記載の使用。
【請求項５４】
前記抗体は、ＴＬＲ２に特異的に結合しているヒト、ヒト化、キメラ、合成、ラクダ、サメまたは生体外の抗体、あるいはそれらのいずれか由来の結合断片からなる群より選択される、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
前記抗体は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および断片からなる群より選択される抗体結合断片である、請求項５３に記載の使用。
【請求項５６】
前記抗体分子は、２つの完全な重鎖、および２つの完全な軽鎖、またはそれらの抗原結合断片を含む、請求項５３に記載の使用。
【請求項５７】
前記薬剤は、ヒトＴＬＲ２の細胞外ドメインによって規定されるエピトープに結合するＴＬＲ２拮抗薬である、請求項５０に記載の使用。
【請求項５８】
前記薬剤は、ヒトＴＬＲ２のアミノ酸配列のアミノ末端およびカルボキシル末端由来のアミノ酸残基を含む不連続エピトープに結合するＴＬＲ２拮抗薬である、請求項５０に記載の使用。
【請求項５９】
前記薬剤は、配列番号２のアミノ酸残基１９〜３９、または５３８〜５４９を含むＴＬＲ２上のエピトープに結合する、ＴＬＲ２拮抗薬である、請求項５０に記載の使用。
【請求項６０】
前記薬剤は、ＴＬＲ２タンパク質をコードする核酸の発現を阻害する、請求項５０に記載の使用。
【請求項６１】
前記薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ分子からなる群より選択される、請求項６０に記載の使用。
【請求項６２】
前記薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態である、請求項５０に記載の使用。
【請求項６３】
Ｔｏｌｌ様受容体２の前記可溶性形態は、配列番号５に規定されるアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載の使用。
【請求項６４】
腎疾患を処置するのに使用するためのＴｏｌｌ様受容体２の機能または発現を調節する薬剤。
【請求項６５】
前記腎疾患は、腎疾患、慢性腎不全、急性腎不全、異種腎毒性腎炎、糸球体腎炎、糸球体の硬化、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病性ネフロパシー、および糖尿病性ネフロパシーからなる群より選択される、請求項６４に記載の薬剤。
【請求項６６】
前記薬剤は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質および低分子化合物からなる群より選択される、請求項６４に記載の薬剤。
【請求項６７】
前記薬剤は、ヒトＴＬＲ２に特異的に結合している抗体である、請求項６４に記載の薬剤。
【請求項６８】
前記抗体は、ＴＬＲ２に特異的に結合しているヒト、ヒト化、キメラ、合成、ラクダ、サメまたは生体外の抗体、あるいはそれらのいずれか由来の結合断片からなる群より選択される、請求項６７に記載の薬剤。
【請求項６９】
前記抗体は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および断片からなる群より選択される抗体結合断片である、請求項６７に記載の薬剤。
【請求項７０】
前記抗体分子は、２つの完全な重鎖、および２つの完全な軽鎖、またはそれらの抗原結合断片を含む、請求項６７に記載の薬剤。
【請求項７１】
前記薬剤は、ヒトＴＬＲ２の細胞外ドメインによって規定されるエピトープに結合するＴＬＲ２拮抗薬である、請求項６７に記載の薬剤。
【請求項７２】
前記薬剤は、ヒトＴＬＲ２のアミノ酸配列のアミノ末端およびカルボキシル末端由来のアミノ酸残基を含む不連続エピトープに結合するＴＬＲ２拮抗薬である、請求項６７に記載の薬剤。
【請求項７３】
前記薬剤は、配列番号２のアミノ酸残基１９〜３９、または５３８〜５４９を含むＴＬＲ２上のエピトープに結合する、ＴＬＲ２拮抗薬である、請求項６７に記載の薬剤。
【請求項７４】
前記薬剤は、ＴＬＲ２タンパク質をコードする核酸の発現を阻害する、請求項６４に記載の薬剤。
【請求項７５】
前記薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ分子からなる群より選択される、請求項６４に記載の薬剤。
【請求項７６】
前記薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態である、請求項６４に記載の薬剤。
【請求項７７】
Ｔｏｌｌ様受容体２の前記可溶性形態は、配列番号５に規定されるアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載の薬剤。
【請求項７８】
腎障害の間に生じるＴｏｌｌ様受容体２によって媒介される炎症および関連する細胞、組織または臓器の損傷を抑制する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、前記方法は、
Ｔｏｌｌ様受容体２に対する結合特異性を有するリガンドと共に、膜結合Ｔｏｌｌ様受容体２受容体を提供する工程、
候補化合物をＴｏｌｌ様受容体２と接触させる工程、
Ｔｏｌｌ様受容体２をＴｏｌｌ様受容体２リガンドに曝露する工程、
Ｔｏｌｌ様受容体２に対する前記Ｔｏｌｌ様受容体２リガンドの結合を測定する工程、
を含み、前記Ｔｏｌｌ様受容体２リガンドによるＴｏｌｌ様受容体２の結合の阻害は、前記候補化合物がＴｏｌｌ様受容体２の活性化およびシグナル伝達の調節因子であることを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎疾患を処置および予防するための組成物および方法に関する。特に、腎臓の糸球体の炎症によって特徴付けられる糸球体腎炎などの状態を処置するための方法であって、前記方法は、受容体であるＴｏｌｌ様受容体２の機能に拮抗する化合物の使用を含む、方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
各々の腎臓は約１００万のネフロンから構成される。ネフロンの構成要素である糸球体は、並行する毛細血管の塊から構成され、この構造はボーマン嚢といわれている。糸球体の機能は、水および血液由来の溶質を濾過することである。
【０００３】
糸球体腎炎は、糸球体の炎症によって特徴付けられる腎臓の疾患である。糸球体の炎症は糸球体機能を損ない、これにより、正常な糸球体濾過に対する破壊を生じる毛細血管の狭小化または遮断がもたらされる。
【０００４】
糸球体腎炎は、タンパク尿として知られる状態の、尿に流れる大量のタンパク質を生じる場合がある。糸球体腎炎のさらなる症状としては、過剰血液尿素窒素（尿毒症）、血尿、高脂血症、糸球体濾過率の減少、低アルブミン血症および脂肪尿が挙げられ得る。
【０００５】
糸球体腎炎の現在の治療としては、副腎皮質ステロイドおよび／または非ステロイド系抗炎症薬の投与が挙げられる。より重症例の場合、血液透析または臓器移植が必要とされる場合がある。しかしながら、このような治療は多くの理由のために十分でない。副腎皮質ステロイドを使用する場合、これは、糸球体腎炎の処置に通常利用される治療であり、この処置は、長期ステロイド投与から生じる場合がある患者の免疫抑制を制限するために注意深く管理されなければならない。さらに、負担のある、または長期間の透析、あるいは移植手術および臓器拒絶に関する危険性もまた、これらの治療を望まれないものにする。
【０００６】
従って、糸球体腎炎の間、炎症糸球体を予防または処置し、従来の処置の不都合な点および副作用を被らないようにするために、炎症糸球体を標的とすることができる治療的処置についての切迫した必要性が存在する。
【０００７】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、先天性免疫応答を活性化するのに重要な役割を有するパターン認識受容体のファミリーを形成する。１１種のＴｏｌｌ様受容体が、今までヒトにおいて同定されている。Ｔｏｌｌ様受容体ファミリーのメンバーは、１０種〜１５種のＴｏｌｌ様受容体を有するほとんどの哺乳動物種で高度に保存される。各々のＴｏｌｌ様受容体は、特異的病原体関連分子シグネチャーを認識する。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２、ＣＤ２８２、ＴＬＲ−２）は、ペプチドグリカン、リポタンパク質、およびリポタイコ酸によって活性化され得る。Ｔｏｌｌ様受容体は、各々の二量体が異なるリガンド特異性を有するホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかを形成することが知られている。ＴＬＲ２は、ＴＬＲ１またはＴＬＲ６のいずれか、および一部の場合において、膜結合性受容体複合体を形成するために、場合によりＴＬＲ１０も有するヘテロ二量体を形成する。加えて、Ｔｏｌｌ様受容体２の細胞外ドメインは、循環系およびまた哺乳動物の乳においてもＣＤ１４タンパク質と可溶性ヘテロ二量体を形成することが知られている。
【０００８】
Ｔｏｌｌ様受容体２に対するリガンド結合は、ＴＩＲＡＰ（Ｔｏｌｌ−インターロイキン−１受容体ドメイン含有アダプタータンパク質）としても公知であるＭｙＤ８８およびＭａｌ（ＭｙＤ８８−アダプター様）などの細胞質アダプタータンパク質に関与する下流のシグナル伝達を生じる。
【０００９】
Ｔｏｌｌ様受容体２と、Ｔｏｌｌ様受容体２誘導シグナル伝達および免疫系活性化との関係は、炎症および免疫介在性疾患の進行における重要な媒介物としてのＴｏｌｌ様受容体２に関与している。従って、Ｔｏｌｌ様受容体２シグナル伝達経路の調節に関する重要な治療目的が存在する。Ｔｏｌｌ様受容体２によって媒介される細胞内シグナル伝達は、先天性免疫系の活性化を生じる。しかしながら、一部の場合において、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化後に生じる先天性免疫系の活性化は、炎症および免疫介在疾患を引き起こす際の要因であることが示されている。従って、多数の治療アプローチは、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化の後に生じるＴｏｌｌ様受容体２によって媒介される細胞内シグナル伝達を抑制することによって、ＴＬＲ−２リガンド結合を阻害、またはリガンド結合後のＴｏｌｌ様受容体２の機能活性を抑制しようとしている。
【００１０】
腎疾患の病理学に関して、Ｔｏｌｌ様受容体２は、糸球体腎炎などの免疫介在性腎疾患の進行および再発に関連する抗原特異的適応免疫応答の誘導に関与することが示されている。具体的には、リポペプチドであるＴｏｌｌ様受容体２リガンドが、Ｔｏｌｌ様受容体２依存性の様式で、腎毒性腎炎を悪化させ得ることが示されている。Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化は、血清中のＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３などの増加した量の抗原特異的ＩｇＧアイソタイプを示し、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３は糸球体内に沈着するように見える。増加したＣＤ４＋陽性Ｔ細胞湿潤もまた、糸球体に観測された。それにもかかわらず、今まで、Ｔｏｌｌ様受容体２経路を阻害することが、免疫介在性腎障害を処置するための基盤を与えることを示唆する証拠が存在しなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
多数の実験の後に、本発明者らは驚くべきことに、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体２リガンド結合を阻害することによって、または活性化Ｔｏｌｌ様受容体２によって媒介される細胞内シグナル伝達を阻害することによって、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能に拮抗する化合物が、腎臓における炎症のレベルを低下させることを確認した。本発明者らは、かかる化合物が、腎臓の炎症状態を処置するため、特に糸球体腎炎などの状態を処置するために本発明において有用であることを確認した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、Ｔｏｌｌ様受容体２に存在し、Ｔｏｌｌ様受容体２に対するリガンド結合を阻害する少なくとも１つの結合エピトープに結合特異性を有する抗体、またはその機能的結合断片の使用により、Ｔｏｌｌ様受容体２リガンド結合を阻害することが、好中球の産生を抑制、ならびに糸球体腎炎の発症の間に典型的に上昇するタンパク尿および血栓症を抑制できることを示した。従って、このような作用を媒介する化合物は、Ｔｏｌｌ様受容体２によって媒介される活性化および下流のＴＬＲ−２によって誘導される細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の態様によれば、腎炎および腎疾患に関与するＴＬＲ２発現細胞または組織におけるＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の１つ以上の生物学的活性を減少させる方法であって、
前記細胞または組織におけるＴＬＲ２の１つ以上の生物学的活性を減少させるのに十分な量で、ＴＬＲ２活性またはＴＬＲ２発現の拮抗薬と、前記細胞または組織とを接触させる工程を含む方法が提供される。
【００１３】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２発現細胞または組織は、腎臓の細胞または組織である。本発明の特定の実施形態において、ＴＬＲ２発現細胞は、限定されないが、尿細管上皮細胞（ＴＥＣ）、ボーマン嚢の上皮細胞、腎臓糸球体壁細胞、腎臓糸球体有足細胞、近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄薄部細胞、腎臓遠位尿細管細胞、または腎臓集合管細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞種類であってもよい。
【００１４】
特定の実施形態において、接触させる工程は、細胞溶解物、再構成系または培養物中の細胞において起こる。特定の実施形態において、接触させる工程は、被験体に存在する細胞または組織で起こる。特定の実施形態において、ＴＬＲ２は、ヒトＴＬＲ２、マウスＴＬＲ２、または任意の他の哺乳動物種由来のＴＬＲ２であってもよい。
【００１５】
特定の実施形態において、この方法は、腎炎または腎疾患を有するか、あるいは有する危険性のあるヒト被験体で実施される。
【００１６】
本明細書に定義する場合、用語「腎炎および腎疾患」は、腎臓内の炎症の発生によって実質的に特徴付けられるか、または腎臓内の炎症の発生が、主に腎臓以外の身体の部位に影響を与える疾患もしくは炎症状態によって引き起こされる全ての状態にまで及ぶ。特に、炎症は、限定されないが、糸球体、ボーマン嚢またはボーマン嚢腔を含む部位で生じ得る。典型的に、炎症は、腎臓機能の少なくとも部分的な機能障害および／または腎不全を生じる。
【００１７】
さらに、用語「腎炎および腎疾患」は、「腎臓病」をさらに含んでもよく、用語、腎臓病とは、一般に、ヒトにおける少なくとも１つの腎臓の障害を指し、その障害は腎臓の機能を損なうか、または低下させ、これは、例えば、タンパク質の尿への漏出によって、または窒素性老廃物の排出によって生理的に特徴付けられる。腎臓病はまた、糸球体または尿細管に対する損傷などの腎臓の主用な病理、タンパク質の保持などの生物学的機能を行う腎臓の能力に悪影響を与える、膵臓などの別の臓器に対する損傷に起因し得る。従って、ヒトにおける腎臓病は、他の臓器に影響を与え得る疾患状態の直接または間接的な作用であってもよい。腎臓に影響を与える疾患の例は、腎臓を特に標的としないが、糖尿病および全身性狼瘡である。用語、腎疾患および腎臓病は、本明細書において、用語「腎臓の疾患」と交換可能に使用される。例えば、腎疾患は、腎臓皮質または腎臓髄質のいずれかにおける糸球体、尿細管または間質組織に対するいくらかの変化、損傷、または外傷の結果に起因し得るか、またはそれらの外傷の結果であってもよい。
【００１８】
腎臓病はまた、進行性腎臓病であってもよい。本明細書に使用する場合、用語「進行性腎臓病」とは、腎臓機能の損失を生じるある期間（例えば、数日、数週、数ヶ月、数年）にわたる腎臓の任意の疾患を指す。本明細書に定義する場合、用語「腎臓機能」は一般に、タンパク質を保持し、それによって、タンパク尿（例えば、アルブミン尿）を防ぐ能力などの腎臓の生理的特性を指す。腎臓機能は、例えば、糸球体濾過率（例えば、クレアチニンクリアランス）、尿、例えば、アルブミン尿中のタンパク質の排出量、血中尿素窒素、血清または血漿クレアチニン、あるいはそれらの任意の組み合わせによって評価されてもよい。
【００１９】
用語「腎炎および腎疾患」の意味に含まれる特定の状態の例としては、限定されないが、慢性腎不全、急性腎不全、異種腎毒性腎炎、糸球体腎炎、糸球体の硬化、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病性ネフロパシーであって、その糖尿病性ネフロパシーは、肝臓の硬化に付随して起こる糖尿病性ネフロパシー、糸球体腎炎であって、その糸球体腎炎は肝臓の硬化に付随して起こる糸球体腎炎を含む、限定されないが、腎障害が挙げられる。
【００２０】
特定のさらなる実施形態において、腎炎および腎疾患は、腎臓細胞および／または腎臓機能に影響を与える免疫介在疾患に関連してもよい。かかる状態としては、限定されないが、免疫グロブリンＡネフロパシー、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、非増殖性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、微小変化型疾患、原発性巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、線維性糸球体腎炎、イムノタクトイド糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎、進行性糸球体腎炎、抗ＧＢＭ疾患、腎虚血、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）（例えば、ヴェゲナー肉芽腫症）に関連する疾患を含む腎臓血管炎、ループス腎炎クリオグロブリン血症関連糸球体腎炎、細菌性心内膜炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、感染後糸球体腎炎、Ｃ型肝炎疾患、糖尿病性ネフロパシー、ミロイドーシス（ｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、高血圧性腎硬化症、多発性骨髄腫由来軽鎖疾患、続発性巣状分節状糸球体硬化、および高血圧性腎硬化症が挙げられ得る。
【００２１】
用語「腎炎および腎疾患」はまた、急性腎不全を含む。急性腎不全（「ＡＲＦ」）とは、乏尿（１日あたり５００ｍＬ未満）を有するか、または有さない、急性で、確実に増大する高窒素血症に関連する臨床状態を指す。ＡＲＦの原因は、３つの診断区分：腎前性（不十分な腎灌流）；腎後性（閉塞）；および腎性に分類され得る。ＡＲＦの病態生理学は、複雑で多因子性である。現在の概念は、ＡＲＦが、直接的な尿細管障害、腎虚血または管内閉塞に起因する可能性があることを示唆する。臨床的に、ＡＲＦは、減少した糸球体濾過ならびに代謝老廃物、水、および電解質の減少した分泌を生じる。体液過剰、電解質不均衡および尿毒症性症候群は、臓器機能不全を生じる。臓器機能不全は、最終的に死をもたらす場合がある。
【００２２】
ＴＬＲ２活性またはＴＬＲ２発現の拮抗薬はまた、ＴＬＲ２調節薬剤のことを指される場合がある。本発明のＴＬＲ２調節薬剤はＴＬＲ２機能を阻害し、それによって、腎不全の原因となるＴＬＲ２媒介性、または依存性病態生理学的メカニズムを防止するように作用する。かかる病態生理学的メカニズムの例としては、直接的な尿細管障害、腎虚血、および管内閉塞が挙げられる。
【００２３】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、尿細管上皮細胞（ＴＥＣ）および／またはボーマン嚢の上皮細胞などの腎臓の細胞集団を特異的に標的化できるように被験体に投与される。腎臓またはその細胞に対するＴｏｌｌ様受容体２調節薬剤の直接的な標的化により、被験体におけるＴｏｌｌ様受容体２の機能の全体的な抑制が回避される。治療に対するこの標的化されたアプローチは、腎臓におけるＴｏｌｌ様受容体２によって媒介される炎症を抑制することが望まれる場合であるが、腎臓以外の部位でＴｏｌｌ様受容体２の活性を下方制御することが望まれない場合に、特に効果的であり得、これにより、腎臓以外の部位における潜在的な免疫抑制をもたらす。本発明のＴＬＲ２調節化合物を腎臓の細胞に方向づけるために使用され得る標識化合物または標的分子などの化合物は、当業者に公知である。かかる標的化は、典型的に、標的化されるべき細胞に特異的であるリガンドまたは細胞表面マーカーについての結合特異性を有する結合剤を含むことを意味する。
【００２４】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質、アプタマーおよび低分子化合物からなる群より選択される。
【００２５】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は抗体分子である。典型的に、抗体は、ヒトＴＬＲ２に存在するエピトープに対する結合特異性を有する。特定の実施形態において、抗体分子、またはその抗体分子由来の結合断片は、ＴＬＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸残基を含むエピトープに対する結合特異性を有する。特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、ヒトＴＬＲ２のアミノ酸配列のアミノ末端およびカルボキシル末端由来のアミノ酸残基を含む不連続エピトープに結合する。特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、配列番号２に規定されるＴＬＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸残基１９〜３９、または５３８〜５４９を含むＴＬＲ２上のエピトープに結合する。
【００２６】
特定の実施形態において、抗体は、ＴＬＲ２に特異的に結合しているヒト、ヒト化、キメラ、合成、ラクダ、サメまたは生体外の抗体からなる群より選択される。さらなる実施形態において、本発明は、上述の抗体のいずれかに由来する抗体結合断片にまで及ぶ。特定の実施形態において、抗体は、Ｆａｂ、ｓｃＦＶ、Ｆｖ、またはｄＡｂ断片からなる群より選択される抗体結合断片である。特定の実施形態において、抗体分子は、２つの完全な重鎖、および２つの完全な軽鎖、またはその抗原結合断片を含む。特定の実施形態において、抗体は、アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭである。抗体がアイソタイプＩｇＧである実施形態において、その抗体はサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３であってもよい。
【００２７】
特定の実施形態において、抗体は、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体（ハイブリドーマクローンＴ２．５，ＨｙＣｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｂ．ｖ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，ＵＳＡ：カタログ番号１０５４由来のマウスＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）抗体）、またはそのヒト化型である。
【００２８】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、ＴＬＲ２タンパク質をコードする核酸の発現を阻害する。かかる実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ分子からなる群より選択されてもよい。
【００２９】
本発明のさらなる態様によれば、腎障害の処置および／または予防のための方法が提供され、その方法は、
Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の機能または発現を調節する治療有効量の薬剤を提供する工程と、
前記化合物を、かかる処置を必要とする被験体に投与する工程と、を含む。
【００３０】
特定の実施形態において、腎障害は、腎疾患、腎炎状態、慢性腎不全、急性腎不全、異種腎毒性腎炎、糸球体腎炎、糸球体の硬化、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病性ネフロパシーであって、その糖尿病性ネフロパシーは、肝臓の硬化に付随して起こる糖尿病性ネフロパシー、および糸球体腎炎であって、その糸球体腎炎は肝臓の硬化に付随して起こる糸球体腎炎からなる群のうちの少なくとも１つである。
【００３１】
特定の実施形態において、腎障害は、腎臓の細胞および／または腎臓機能に影響を与える免疫介在性疾患に関連する。かかる障害としては、限定されないが、免疫グロブリンＡネフロパシー、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、非増殖性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、微小変化型疾患、原発性巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、線維性糸球体腎炎、イムノタクトイド糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎、進行性糸球体腎炎、抗ＧＢＭ疾患、腎虚血、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）（例えば、ヴェゲナー肉芽腫症）に関連する疾患を含む腎臓血管炎、ループス腎炎クリオグロブリン血症関連糸球体腎炎、細菌性心内膜炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、感染後糸球体腎炎、Ｃ型肝炎疾患、糖尿病性ネフロパシー、ミロイドーシス（ｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、高血圧性腎硬化症、多発性骨髄腫由来軽鎖疾患、続発性巣状分節状糸球体硬化、および高血圧性腎硬化症が挙げられ得る。
【００３２】
特定のさらなる実施形態において、腎障害は、上述に記載されるいずれかの腎炎状態または疾患、あるいはさらに上述に記載されるいずれかの腎疾患に関連してもよい。
【００３３】
本明細書に定義する場合、用語「機能を調節する」とは、薬剤がＴｏｌｌ様受容体２の１つ以上の生物学的機能活性を調節することを意味する。特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能の調節は、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能の活性化の阻害および／またはＴｏｌｌ様受容体２によって媒介される下流の細胞内シグナル伝達の阻害もしくは抑制に関連する。調節はさらに、Ｔｏｌｌ様受容体２タンパク質の発現、またはＴｏｌｌ様受容体２をコードする遺伝子の発現の抑制にまで及んでもよい。
【００３４】
本明細書に定義する場合、ＴＬＲ２の発現または機能を調節する「薬剤」は、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化、発現もしくは機能を抑制または遮断する化合物である。特定の実施形態において、「薬剤」は、リガンドの結合またはＴｏｌｌ様受容体２に対する結合化合物を阻害もしくは遮断するＴＬＲ２拮抗化合物であってもよい。例えば、「薬剤」は、Ｔｏｌｌ様受容体２の細胞外ドメインに結合する抗体などのＴｏｌｌ様受容体２結合薬剤であってもよく、前記薬剤は、ＴＬＲ２についての結合特異性を有するＴＬＲ２を活性化するリガンドの結合を阻害する。さらに、「薬剤」は、リガンド結合および／またはＴｏｌｌ様受容体２の活性化後にＴｏｌｌ様受容体２によって媒介される細胞内シグナル伝達を阻害または抑制する化合物であってもよい。「薬剤」はさらに、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体２タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害することによって、Ｔｏｌｌ様受容体２の発現を調節してもよい。
【００３５】
特定の実施形態において、「Ｔｏｌｌ様受容体２の機能または発現を調節する薬剤」は、結合特異性を有するか、またはＴｏｌｌ様受容体２に特異的に結合する結合化合物であってもよい。特定の実施形態において、結合化合物は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、アプタマー、低分子化合物、および植物由来化合物などの天然に存在する化合物からなる群より選択される。
【００３６】
特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能または発現を調節する薬剤は、リガンド結合部位以外の部位でＴｏｌｌ様受容体２に特異的に結合する結合化合物であり、これにより、結合する際に、Ｔｏｌｌ様受容体２の作動薬結合の阻害を生じるＴｏｌｌ様受容体２の構造の変化を引き起こす。典型的に、前記結合部位は、ＴＬＲ２の細胞外ドメインに位置する。
【００３７】
用語「特異的に結合する」または「結合特異性」とは、ＴＬＲ２調節薬剤またはＴＬＲ２結合化合物が、非標的エピトープに結合するより高い親和性でＴＬＲ２に存在する標的エピトープに結合する能力を指す。特定の実施形態において、用語「特異的に結合する」とは、非標的エピトープについての結合親和性より少なくとも１０、５０、１００、２５０、５００、または１０００倍高い結合親和性でＴＬＲ２に存在する標的エピトープに対する薬剤の結合を指す。特定の実施形態において、結合親和性は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。代替の実施形態において、親和性は、ＢＩＡコアアッセイによって決定される。あるいは、結合親和性は、速度論的方法によって決定されてもよい。特定の実施形態において、親和性は、平衡／溶液方法によって決定される。
【００３８】
一実施形態によれば、ＴＬＲ２拮抗薬などのＴＬＲ２結合薬剤を含むＴＬＲ２調節因子は、例えば、少なくとも約１０７Ｍ−１、典型的に約１０８Ｍ−１、より典型的に約１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１またはそれ以上の親和定数を有する高い親和性でＴＬＲ２に結合し；そしてＴＬＲ２応答細胞および／または組織における１つ以上のＴＬＲ２生物学的活性を調節、例えば、減少および／または阻害する。
【００３９】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、腎臓の細胞、特に糸球体またはボーマン嚢で発現されたＴｏｌｌ様受容体２に標的化される。本発明の方法および組成物を用いて調節、例えば、阻害または減少され得る例示的なＴＬＲ２活性としては、限定されないが、以下のうちの１つ以上が挙げられる：（ｉ）ＴＬＲ２発現を阻害または抑制すること、（ｉｉ）ＴＬＲ２リガンド結合および関連するＴＬＲ２活性化を阻害すること、ならびに（ｉｉｉ）ＴＬＲ２によって媒介される細胞内シグナル伝達を阻害または抑制すること。
【００４０】
従って、さらなる態様において、本発明は、ＴＬＲ２応答細胞および／または組織（例えば、腎臓の細胞または組織）におけるＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の機能を調節する（例えば、１つ以上の生物学的活性を調節する）方法を提供する。この方法は、ＴＬＲ２応答細胞または組織の機能、あるいはその細胞または組織におけるＴＬＲ２の生物学的活性を調節するのに十分な量で、ＴＬＲ２応答細胞および／またはＴＬＲ２応答組織と、ＴＬＲ２調節薬剤、例えば、ヒトＴＬＲ２活性または発現の拮抗薬などのＴＬＲ２結合化合物とを接触させる工程を含む。一実施形態において、ＴＬＲ２調節因子とＴＬＲ２応答細胞とを接触させる工程は、生体外、例えば、細胞溶解物または再構成系において行われてもよい。あるいは、前記方法は、培養物中の細胞、例えば、生体外（ｉｎ−ｖｉｔｒｏまたはｅｘ−ｖｉｖｏ）で実施されてもよい。例えば、精製された細胞または組み換え細胞などの細胞は、生体外で培養されてもよく、接触させる工程は、ＴＬＲ２調節因子を培地に加えることによって行われてもよい。典型的に、ＴＬＲ２応答細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。一部の実施形態において、ＴＬＲ２応答組織は、腎臓の組織、またはそれに関連する細胞集団である。特定のさらなる実施形態において、この方法は、例えば、生体内プロトコルの一部として、またはヒトなどの動物被験体、またはさらに生体内の動物モデルなどの被験体に存在する細胞で実施されてもよい。前記生体内プロトコルは、治療的または予防的であってもよく、炎症モデルは、例えば、腎炎または腎疾患、過剰発現したＴＬＲ２、あるいはＴＬＲ２受容体の変異または欠失を有する動物モデルなどの遺伝子操作されたモデルであってもよい。生体内での方法に関して、単独、または別の薬剤と組み合わせてＴＬＲ２調節因子は、被験体におけるＴＬＲ２発現、あるいは１つ以上のＴＬＲ２によって媒介される活性または機能を調節するのに十分な量で、腎疾患または腎炎、あるいは腎臓病または正常な腎臓の生理学的機能の不全を生じる状態を罹患する被験体に投与されてもよい。特定の実施形態において、被験体に投与されるＴＬＲ２調節因子の用量は、１つ以上のＴＬＲ２活性（例えば、本明細書に記載される１つ以上のＴＬＲ２生物学的活性）を変更、例えば、減少または阻害するのに必要とされるＴＬＲ２調節因子の量を生体外（ｉｎ−ｖｉｔｒｏまたはｅｘ−ｖｉｖｏ）で試験することにより投与前に決定されてもよい。
【００４１】
１つ以上のＴＬＲ２生物学的活性を阻害、減少または縮小することが望まれる特定の実施形態において、ＴＬＲ２応答細胞および／または組織は、例えば、被験体にＴＬＲ２拮抗薬を投与することによってＴＬＲ２拮抗薬と接触される。一実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、例えば、ＴＬＲ２ポリペプチドまたはｍＲＮＡと相互作用するか、またはそれらに結合して、１つ以上のＴＬＲ２活性を減少または阻害する。典型的に、拮抗されるＴＬＲ２は、哺乳動物ＴＬＲ２（またはその機能的変異体）、例えば、ヒトＴＬＲ２またはマウスＴＬＲ２である。特定の実施形態において、拮抗されるＴＬＲ２は、図１９（配列番号１）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＣ  ３４１３３（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に規定される７８４のアミノ酸全長ヒトＴｏｌｌ様受容体配列を含む）に規定されるヒトＴＬＲ２配列、または図２０（配列番号２）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ＿０３６０３５（Ｍｕｓ筋肉））に規定されるアミノ酸配列を含むマウスＴＬＲ２配列もしくはその一部、および／または実質的にそれらと相同的な配列、または、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる配列および／もしくはそれらと実質的に相同的な配列を含む。
【００４２】
本明細書に定義する場合、用語「Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化」とは、リガンドによるＴｏｌｌ様受容体２の結合を意味し、ここで、そのリガンドは作動薬として作用し、細胞内シグナル伝達カスケードを誘導するためにＴｏｌｌ様受容体２を活性化する。Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化およびシグナル伝達の後に媒介される細胞内シグナル伝達は、炎症性免疫応答を媒介する転写因子の活性化および遺伝子の発現を生じる。
【００４３】
特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能または発現を調節する薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体２とＴｏｌｌ様受容体２の作動薬との相互作用を阻害する。
【００４４】
特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化および／またはシグナル伝達を抑制する調節薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体２の拮抗薬として作用する化合物である。典型的に、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能の拮抗は、Ｔｏｌｌ様受容体２に対するリガンド結合が防がれる方法において、Ｔｏｌｌ様受容体２に対するＴｏｌｌ様受容体２結合剤の結合により達成される。このＴｏｌｌ様受容体２のリガンド結合の阻害は、多くの手段、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体２のリガンド結合部位を部分的または完全に遮断すること、あるいは例えば、結合を妨げるＴｏｌｌ様受容体２のリガンド結合部位の三次構造の構造変化に起因するＴｏｌｌ様受容体２のリガンド結合を防ぐ方法で変化されるＴｏｌｌ様受容体２のリガンド結合部位を生じるＴｏｌｌ様受容体２に結合または会合する際の構造変化を誘導することによって達成されてもよい。
【００４５】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、ＴＬＲ２に存在する少なくとも１つのエピトープに結合し、ここで、このエピトープに対する結合は、ＴＬＲ２機能、典型的に活性化またはＴＬＲ２によって媒介される下流のシグナル伝達の阻害を生じる。本明細書に定義する場合、「エピトープ」とは、低分子、抗体などの結合化合物によって認識され、結合され得るＴＬＲ２タンパク質由来の複数のアミノ酸残基を指す。エピトープは一般に、化学的に活性な表面基を含み、特異的な三次元構造特性、および特異的電荷特性を有する。
【００４６】
典型的に、ＴＬＲ２調節薬剤は、阻害エピトープまたは抑制エピトープとして公知のエピトープに結合することによりＴＬＲ２の機能活性を拮抗する。「阻害」または「抑制」エピトープとは、低分子または抗体などの結合化合物によって結合された場合、例えば、ＴＬＲ２作動薬によるＴＬＲ２の結合を阻止する結合化合物に起因してＴＬＲ２の生物学的活性の損失を生じるＴＬＲ２に存在するエピトープを意味する。ＴＬＲ２に存在し、ＴＬＲ２機能に拮抗するために結合化合物によって結合されるエピトープは、５以上のアミノ残基を含んでもよい。
【００４７】
特定の実施形態において、本発明のＴＬＲ２調節薬剤は、連続エピトープを認識する。さらなる実施形態において、エピトープは、配列番号１に規定される成熟Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）タンパク質のＮ末端（アミノ末端）およびＣ末端（カルボキシ末端）部分の両方由来の残基を含む不連続エピトープである。特定の実施形態において、エピトープは、Ｔｏｌｌ様受容体２の５８６アミノ酸配列から決定される残基１９〜３９を含んでもよく、前記アミノ酸は、ＫＥＥＳＳＮＱＡＳＬＳＣＤＲＮＧＩＣＫＧＳ（配列番号３）である。さらに、結合エピトープは、配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端領域に存在するＴｏｌｌ様受容体２のアミノ酸残基５３８〜５４９をさらに含んでもよく、この配列は、アミノ酸ＣＳＣＥＦＬＳＦＴＱＥＱＱ（配列番号４）を含む。ＴＬＲ２調節薬剤結合部位はさらに、配列番号１のアミノ酸残基１９〜３９、または５３８〜５４９、あるいは配列番号１のアミノ酸残基１９〜３９、または５３８〜５４９によって規定され得る。
【００４８】
Ｔｏｌｌ様受容体２の機能活性の減少、阻害または拮抗は、Ｔｏｌｌ様受容体２が、Ｔｏｌｌ様受容体１、Ｔｏｌｌ様受容体６またはＴｏｌｌ様受容体４もしくはＴｏｌｌ様受容体１０などの別のＴｏｌｌ様受容体とヘテロ二量体を形成するか否かに関わらず、起こり得る。用語「Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化および下流の媒介性シグナル伝達」とは、活性化されたＴＬＲ２によって誘導されるいずれかの細胞内シグナル伝達経路を意味する。シグナル伝達経路は、ＴＬＲ２特異的経路であってもよいか、または例えば、転写因子ＮＦ−κＢなどの免疫反応の介在物質の活性化の一因となるＴＬＲ２以外の受容体の活性化によって、例えば、シグナル伝達経路が他の源によって活性化され得る「共有された」シグナル伝達経路であってもよい。
【００４９】
ＴＬＲ２は、少なくとも２つの機能的ヘテロ二量体に二量体化することが知られている。通常、ＴＬＲ２は、Ｔｏｌｌ様受容体１またはＴｏｌｌ様受容体６のいずれかとヘテロ二量体を形成することが知られている。さらにヘテロ二量体は、ＴＬＲ２と、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４、ＴＬＲ−４）およびＴｏｌｌ様受容体１０（ＴＬＲ１０、ＴＬＲ−１０）との間に形成されてもよい。この二量化は、異なる微生物由来のリガンドによるＴＬＲ２の結合を生じる識別に関連すると考えられる。さらに、ＴＬＲ２の細胞外ドメインは、循環系および哺乳動物の乳においてＣＤ１４と可溶性ヘテロ二量体を形成することができる。
【００５０】
本発明者らは、驚くべきことに、ＴＬＲ２によって媒介される腎臓の炎症を抑制するのに包括的である治療的アプローチを提供するために、二量体がＴＬＲ１、ＴＬＲ６、ＴＬＲ４またはＴＬＲ１０と形成されるか否かに関わらず、ＴＬＲ２に対する結合特異性を有する結合化合物を提供することが望ましいことを確認した。これに関して、多数の実験の後に、本発明者らは、結合される場合、ＴＬＲ２の機能的活性の全体的な抑制を生じる、ＴＬＲ２タンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方に存在するアミノ酸残基からなる立体構造の不連続エピトープを同定し、これにより、ＴＬＲ２の機能は、ヘテロ二量体を形成するのに関連するいずれのＴＬＲ  ＴＬＲ２にも関係なく、阻害される。従って、ＴＬＲ２拮抗薬によるこのエピトープの結合は、ＴＬＲ２がＴＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６またはＴＬＲ１０とヘテロ二量体を形成するか否かに関わらず、ＴＬＲ２の機能を抑制する。
【００５１】
従って、特定のさらなる実施形態において、本発明によって与えられるＴｏｌｌ様受容体２の機能または発現を調節する薬剤は、以下の特性のうちの少なくとも１つを有し得る：（ｉ）それはモノクローナル抗体である、（ｉｉ）それはヒト由来または生体外で産生された抗体である、（ｉｉｉ）それは配列番号３および／または配列番号４のアミノ酸を含む立体構造の不連続エピトープに結合し、ヘテロ二量体がＴＬＲ２と、ＴＬＲ１、ＴＬＲ６、ＴＬＲ４またはＴＬＲ１０との間に形成されるか否かに関わらず、ＴＬＲ２機能の抑制を媒介する、（ｉｖ）それは少なくとも１０−６Ｍの親和定数（Ｋａ）でＴＬＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸によって規定されるエピトープに結合する。
【００５２】
特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能または発現を調節する薬剤は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、低分子化合物、および天然化合物からなる群のうちの少なくとも１つより選択される。
【００５３】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２の機能を調節する薬剤は、ＴＬＲ２作動薬または上述の結合化合物のうちのいずれかなどのＴＬＲ２拮抗薬である。
【００５４】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、組み換えＴｏｌｌ様受容体２の可溶性形態であってもよい。特に、ＴＬＲ２の可溶性形態は、二次タンパク質に結合されるＴＬＲ２タンパク質上の細胞外ドメインのアミノ酸残基を実質的に含む融合タンパク質であってもよい。特定の実施形態において、二次タンパク質は、免疫グロブリン由来のＦｃドメイン、またはその断片であってもよい。
【００５５】
特定のさらなる実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、ＴＬＲ２タンパク質の発現を阻害する阻害核酸である。特定の実施形態において、阻害核酸タンパク質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択される。
【００５６】
特定の実施形態において、本発明の方法は、腎臓のＴＬＲ２発現細胞または組織における１つ以上のＴＬＲ２生物学的活性を減少または阻害させるために、ＴＬＲ２調節薬剤を被験体に投与するために使用される。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明の方法は、被験体における慢性腎不全または腎臓臓器移植に起因し得る虚血再灌流障害を処置または予防するために使用されてもよい。
【００５８】
特定の実施形態において、本発明の方法は、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能または発現を調節する薬剤と共に、治療的に有効量の少なくとも１つの二次治療化合物を投与するさらなる工程を含んでもよい。前記二次治療化合物は、例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、代謝拮抗物質、抗ＣＤ２抗体または関連結合断片、抗ＣＤ２０抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムスまたはＦＴＹ７２０からなる群より選択される免疫抑制化合物であり得る。
【００５９】
特定の実施形態において、二次治療薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能または発現を調節する薬剤の投与と同時に、連続して、または別個に投与されてもよい。
【００６０】
本発明のなおさらなる態様によれば、腎炎または腎疾患の処置および予防に使用するための医薬組成物が提供され、前記組成物は、少なくとも１つの薬理学的に許容できる担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／または補助剤と共に、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能または発現を調節する薬剤を含む。
【００６１】
特定の実施形態において、腎炎は、腎臓病、急性腎不全、慢性腎不全または糸球体腎炎などの腎臓の別の関連する炎症状態を含む腎疾患、あるいは上述のいずれかの他の状態からなる群より選択される状態である。
【００６２】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または抗体断片、アプタマー、融合タンパク質またはペプチド模倣物からなる群より選択されるＴＬＲ２拮抗薬である化合物である。
【００６３】
特定の実施形態において、抗体は、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体（ハイブリドーマクローンＴ２．５，ＨｙＣｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｂ．ｖ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，ＵＳＡ：カタログ番号１０５４由来のマウスＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）抗体）、またはそのヒト化型である。
【００６４】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、ＴＬＲ２受容体、またはその断片の可溶性形態である。ＴＬＲ２の前記可溶性形態は、組み換え手段によって産生されてもよい。特定の実施形態において、ＴＬＲ２の前記可溶性形態は、ＴＬＲ２またはその断片の細胞外ドメインを含んでもよい。
【００６５】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、ＴＬＲ２の発現を阻害する阻害核酸ベースの化合物である。
【００６６】
特定の実施形態において、医薬組成物は、限定されないが、グルココルチコイド、特にサイトカインの発現を抑制するグルココルチコイド；アルキル化剤などの細胞増殖抑制剤、メトトレキサートなどの代謝拮抗物質；ＯＫＴ−３、抗ＣＤ２０抗体、抗ＴＮＦ−α抗体インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））またはアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（商標））などの抗ＣＤ３抗体などの抗体または関連結合断片；シクロスポリン、タクロリムスまたはシロリムスなどのイムノフィリンで作用する薬剤化合物；あるいはＦＴＹ７２０またはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、血管拡張剤、利尿薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、β遮断薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、カルシウムチャンネル遮断薬、抗凝固剤、チクロピジンもしくは硫酸クロピドグレルなどのアデノシン二リン酸受容体拮抗薬、ビバリルジン、アルガトロバンもしくはヘパリンなどの糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体拮抗薬、βアドレナリン受容体作動薬、抗血栓溶解剤、抗酸化剤、およびα遮断薬のうちの少なくとも１つ以上を含む治療的心臓血管化合物などの低分子からなる群のうちの少なくとも１つであり得る化合物である、限定されないが、免疫抑制剤などの少なくとも１つの二次治療薬剤をさらに含んでもよいか、またはそれらと共に投与されてもよい。
【００６７】
特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２調節薬剤は、１日あたり被験体の体重の約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で被験体に経口投与される。特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２調節薬剤の用量は、１日あたり約１００ｍｇ〜１日あたり約１０００ｍｇである。特定のさらなる実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２調節薬剤の用量は、１日あたり約２００ｍｇ〜１日あたり約３００ｍｇである。特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２調節薬剤は、哺乳動物の体重の約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で被験体に非経口投与される。
【００６８】
特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２調節薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体２のレベルおよび／または活性を下方制御するのに十分な期間、かつ十分な条件下で被験体に投与される。
【００６９】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、ＴＬＲ２遺伝子の発現を遮断することによって、またはＴＬＲ２タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を可能にすることによって、ＴＬＲ２の発現を阻害する阻害核酸ベースの化合物である。特定の実施形態において、阻害核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択されてもよい。
【００７０】
本明細書に定義する場合、Ｔｏｌｌ様受容体２の遺伝子発現に関連して使用される場合、用語「遮断する」および「遮断している」とは、Ｔｏｌｌ様受容体２タンパク質の発現を生じる少なくとも１つの遺伝子の発現のサイレンシングを意味する。遺伝子サイレンシングは、遺伝子操作以外の機構によって遺伝子の発現をオフにする。遺伝子サイレンシングは、転写レベルまたは転写後レベルで媒介されてもよい。転写遺伝子サイレンシングは、転写装置に対して隔絶される遺伝子を生じ得、例えば、ヒストン修飾によって媒介され得る。転写後遺伝子サイレンシングは、破壊される遺伝子のｍＲＮＡに起因し、従って、本発明の場合のＴＬＲ２タンパク質において、タンパク質などの活性遺伝子産物を回避する。
【００７１】
従って、本発明のこの態様の一実施形態において、ＴＬＲ２遺伝子の発現およびそれによるＴＬＲ２タンパク質の発現を遮断するために、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）薬剤、例えば、干渉リボ核酸（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）またはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡなどのその転写鋳型などの有効量の阻害核酸分子を、被験体に存在する少なくとも１つの細胞型、組織または臓器に投与するための方法が提供される。
【００７２】
特定のさらなる実施形態において、阻害核酸分子はアンチセンスＲＮＡ分子であってもよい。アンチセンスは遺伝子発現の抑制を引き起こし、ｍＲＮＡに物理的に結合する一本鎖ＲＮＡ断片を含み、これにより、ｍＲＮＡ翻訳を遮断する。阻害核酸として使用するための適切な核酸を調製するための技術は、当業者に周知である。
【００７３】
本発明のさらなる態様によれば、腎疾患および腎炎を処置するための医薬を調製する際のＴｏｌｌ様受容体２タンパク質の発現を遮断する阻害核酸の使用が提供される。
【００７４】
本発明のさらなる態様は、腎疾患および腎炎を処置するための医薬組成物を提供し、その組成物は、少なくとも１つの薬理学的に許容できる担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／または補助剤と共に、Ｔｏｌｌ様受容体２の発現を遮断する治療有効量の阻害核酸を含む。
【００７５】
特定の実施形態において、阻害核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡからなる群より選択される。特定の実施形態において、医薬組成物は、上記の少なくとも１つのさらなる免疫抑制化合物をさらに含んでもよい。
【００７６】
Ｔｏｌｌ様受容体２の発現を遮断する阻害核酸として使用するための適切な核酸を調製するための技術は、当業者に周知である。
【００７７】
さらなる態様において、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２に対する結合特異性を有する少なくとも１つのアプタマーの提供にまで及び、これにより、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能的活性の遮断または抑制を引き起こす。適切なアプタマーを選択するための技術は、当業者に周知であり、例えば、ＳＥＬＥＸ技術を用いる。
【００７８】
従って、種々のさらなる実施形態において、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２またはＴｏｌｌ様受容体２遺伝子産物に対する結合特異性を有する核酸リガンドを同定および単離する方法にまで及び、その方法は、
（ａ）核酸の候補混合物を提供する工程と、
（ｂ）Ｔｏｌｌ様受容体２を発現する細胞と、前記候補核酸混合物とを接触させる工程と、
（ｃ）他の候補核酸と比べてＴｏｌｌ様受容体２に対して増加した親和性を有する核酸を選択する工程と、
（ｄ）Ｔｏｌｌ様受容体２に対する親和性を有する少なくとも１つの核酸を提供するために、前記選択された核酸を増幅させる工程と、
（ｅ）Ｔｏｌｌ様受容体２に対して高親和性および特異性を有する増幅した核酸から少なくとも１つの核酸を選択する工程と、を含む。
【００７９】
本発明者らはさらに、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能の抑制が、膜結合Ｔｏｌｌ様受容体２に結合し、活性化できるＴＬＲ２結合リガンドの量を減少させることによって達成され得ることを確認した。膜結合Ｔｏｌｌ様受容体２に結合できるリガンドの量の減少は、Ｔｏｌｌ様受容体２によって媒介されるシグナル伝達、それにより、ＴＬＲ２によって媒介される炎症免疫反応の活性化の下方制御を生じる。特に、本発明者らは、Ｔｏｌｌ様受容体２によって媒介される炎症反応の活性化の抑制において、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態またはその機能的断片のいずれかである可溶性ペプチドの有用性を確認した。前記抑制は、ＴＬＲ２結合リガンドの結合のためのＴＬＲ２の膜結合形態と競合するＴｏｌｌ様受容体２の可溶性形態またはＴｏｌｌ様受容体２の切断非膜形態に起因する。この競合的結合は、Ｔｏｌｌ様受容体２のリガンドに利用可能なＴＬＲ２の効果的な「仕上げ（ｍｏｐｐｉｎｇ  ｕｐ）」の可溶性形態または切断形態を生じ、これは、ＴＬＲ２の可溶性形態に対するＴＬＲ２のリガンドの結合に起因し、膜結合ＴＬＲ２に結合して、活性化するのに利用可能なＴＬＲ２のリガンドのプールは枯渇する。膜結合Ｔｏｌｌ様受容体２の結合および活性化の関連する減少は、Ｔｏｌｌ様受容体２によって媒介される炎症性免疫応答の下方制御を生じる。
【００８０】
従って、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態の投与は、腎炎および腎疾患の間に組織損傷の原因となる炎症性免疫反応を抑制するための方法において有用性を有する。
【００８１】
ヒトＴｏｌｌ様受容体２の細胞外ドメイン（外部ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ））のアミノ酸配列は、配列番号５（図２１）として本明細書に提供される。Ｔｏｌｌ様受容体２のヒト形態の細胞外ドメインは、５８７アミノ酸残基、特に配列番号１およびまたＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＣ  ３４１３３（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に規定されるように、規定７８４アミノ酸の完全長ヒトＴｏｌｌ様受容体配列のアミノ酸１〜５８７を含む。本明細書に定義する場合、ＴＬＲ２の外部ドメインは、細胞外スペースにわたるＴＬＲ２の膜結合形態の一部である。
【００８２】
本発明の特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤がＴＬＲ２の可溶性形態である場合、ＴＬＲ２の可溶性形態は、組み換え技術によって調製されてもよい。Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態は、典型的に、ＴＬＲ２の細胞外ドメインのみを含み、従って、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＣ  ３４１３３に規定されるＴｏｌｌ様受容体２の細胞内および膜貫通ドメインは存在しない。特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態は、配列番号１に示されるように規定されるヒトＴｏｌｌ様受容体２の配列のアミノ酸１〜５８７を含み得る。可溶性Ｔｏｌｌ様受容体２の配列は、１以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって修飾され得る。従って、特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態は、配列番号１において本明細書に規定されるＴｏｌｌ様受容体２の決定された膜結合形態の細胞外ドメイン由来である。さらなる実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態は、配列番号１において本明細書に規定されるＴｏｌｌ様受容体２のアミノ酸配列に結合した完全長の膜の切断形態由来であり、前記切断形態は、（ｉ）可溶性であり、（ｉｉ）Ｔｏｌｌ様受容体２の膜結合形態に存在する少なくとも１つのエピトープに対する結合特異性を有するリガンドによって結合できる機能特性を示す。
【００８３】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２の膜結合形態由来の細胞内および／または膜貫通ドメインに関連するアミノ酸残基の置換に加えて、少なくとも１つの欠失および／または置換がさらに、相同タンパク質を形成するためにＴＬＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸残基に対してなされてもよい。ＴＬＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸残基に対する任意の数の欠失および／または置換は、得られるペプチドがＴＬＲ２の膜結合形態に存在する少なくとも１つのエピトープに結合できるリガンドに結合できる限り、なされてもよい。Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態はまた、配列番号５のアミノ酸に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の相同性を有する配列を含んでもよい。かかる相同性は、整列アルゴリズムの使用などの当業者に周知である多くの方法によって決定されてもよい。特に、２つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）によって記載され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から利用可能であるＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて、２つのタンパク質のアミノ酸配列を比較することによって決定されてもよい。ＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２，１９８１）によって改訂されたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のアラインメント法を利用する。
【００８４】
特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態（ｓＴＬＲ２）は、腎臓、または特に、炎症状態の疾患病因に関与する少なくとも１つの特定の細胞型、例えば、尿細管上皮細胞（ＴＥＣ）および／またはボーマン嚢の上皮細胞に標的化されてもよい。このようなｓＴＬＲ２の標的化は利点がある。なぜなら、ｓＴＬＲ２の全身投与が、ＴＬＲ２受容体の全体的な免疫抑制、それによって、一部の場合において望ましくない場合があるＴＬＲ２によって媒介されるシグナル伝達を生じる可能性があるためだからである。
【００８５】
ｓＴＬＲ２の可溶性形態の標的化は、融合タンパク質の形成によって与えられてもよく、前記融合タンパク質は、可溶性ＴＬＲ２タンパク質、最も典型的には、上述のＴＬＲ２の細胞外ドメイン、またはその一部であり、これは、二次ペプチド、典型的に、免疫グロブリンのＦｃドメイン、例えば、免疫グロブリンの重鎖、典型的に、ヒト免疫グロブリンに結合される。Ｆｃドメインは、治療タンパク質の循環半減期を長引かせるために広範に使用されている。融合タンパク質は、その半減期、または効果を向上させるためにさらに修飾されてもよい。かかる修飾を媒介するための多くの技術は当業者に公知であり、例えば、ＰＥＧ化、またはタンパク質の三次構造のリフォールディングがある。
【００８６】
本発明のさらなる態様は、Ｔｏｌｌ様受容体２の膜結合形態によって媒介される機能、発現またはシグナル伝達を抑制する薬剤を含む医薬品と共に、前記医薬品の投与のための指示書を含むキットを提供し、前記キットは、腎疾患または腎炎を有する被験体の処置において有用性を有する。典型的に、前記薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態である。
【００８７】
本発明はさらに、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能を抑制することによって、腎炎および腎疾患の原因となるＴＬＲ２活性化およびＴＬＲ２によって媒介される免疫応答を防止できる化合物を同定するのに使用するためのスクリーニングアッセイにまで及ぶ。
【００８８】
本発明のなおさらなる態様は、腎障害または腎疾患に関連するＴｏｌｌ様受容体２によって媒介される炎症を抑制する化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供し、その方法は、
膜結合Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的に結合しているリガンドと共に、膜結合Ｔｏｌｌ様受容体２受容体を提供する工程と、
候補化合物をＴｏｌｌ様受容体２と接触させる工程と、
Ｔｏｌｌ様受容体２をＴｏｌｌ様受容体２のリガンド作動薬に曝露する工程と、
Ｔｏｌｌ様受容体２に対するＴｏｌｌ様受容体２のリガンド作動薬の結合を測定する工程とを含み、Ｔｏｌｌ様受容体２リガンドによるＴｏｌｌ様受容体２の結合の阻害は、前記候補化合物がＴｏｌｌ様受容体２の活性化およびシグナル伝達の調節因子であることを示す。
【００８９】
本発明のさらなる態様は、腎炎および腎疾患を処置するための、ＴＬＲ２によって媒介される炎症反応を抑制するための医薬品における本発明の上記の態様に従って同定された調節因子の使用を提供する。
【００９０】
本発明のさらなる態様は、腎炎および腎疾患の処置に使用するための本発明のための前述のアッセイ方法によって同定された調節因子を提供する。
【００９１】
特定の実施形態において、薬剤は、腎疾患を処置するのに使用するためにＴｏｌｌ様受容体２の機能または発現を調節する。特定の実施形態において、腎疾患は、腎疾患、慢性腎不全、急性腎不全、異種腎毒性腎炎、糸球体腎炎、糸球体の硬化、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病性ネフロパシー、および糖尿病性ネフロパシーからなる群より選択される。
【００９２】
特定の実施形態において、薬剤は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質、および低分子化合物からなる群より選択される。特定の実施形態において、薬剤は、ヒトＴＬＲ２に対する結合特異性を有する抗体である。特定の実施形態において、抗体は、ＴＬＲ２に特異的に結合しているヒト、ヒト化、キメラ、合成、ラクダ、サメまたは生体外の抗体、あるいはそれらのいずれか由来の結合断片からなる群より選択される。
【００９３】
特定の実施形態において、薬剤は、ヒトＴＬＲ２の細胞外ドメインによって規定されるエピトープに結合するＴＬＲ２拮抗薬である。特定の実施形態において、薬剤は、ヒトＴＬＲ２のアミノ酸配列のアミノ末端およびカルボキシル末端由来のアミノ酸残基を含む不連続エピトープに結合するＴＬＲ２拮抗薬である。
【００９４】
本発明のこの態様の特定の実施形態において、薬剤は、ＴＬＲ２タンパク質をコードする核酸の発現を阻害する。特定の実施形態において、薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ分子からなる群より選択される。
【００９５】
本発明のこの態様の特定の実施形態において、薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態である。典型的に、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態は、配列番号５に記載されるアミノ酸配列、またはその断片を含む。
【００９６】
本発明者らは、ＴＬＲ２によって媒介されるシグナル伝達および免疫応答の活性化が、サイトカインＩＬ−８のレベルの上方制御を生じることを確認した。このサイトカインの発現は、腎炎、および腎炎によって引き起こされる疾患状態の進行を刺激するのに重要な炎症性メディエータの１つであるとして本発明者らによって確認されている。
【００９７】
従って、本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの腎臓の細胞型によって、Ｔｏｌｌ様受容体２によって媒介されるＩＬ−８の産生を抑制する方法を提供し、この方法は、
Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の機能的活性または発現を調節する治療有効量の薬剤を提供する工程と、
かかる処置を必要とする被験体に前記薬剤を投与する工程と、を含む。
【００９８】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質、アプタマーおよび低分子化合物からなる群より選択されるＴＬＲ２拮抗薬である。特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、抗体分子である。さらなる実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、融合タンパク質、例えば、ＴＬＲ２の可溶性断片を含む融合タンパク質である。特定のさらなる実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを阻害する阻害核酸である。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、３０ｍｇ／ｋｇの腹腔内（ｉ．ｐ．）のプレドニゾロン（ｐｒｅｄ）、ＰＢＳコントロール（ＰＢＳ）、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）のアイソタイプコントロール抗体（ｃｏｎｔ）または１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）の抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ３０１（ｏｐｎ３０１）のいずれかで処置した後に、１０μｇのリポペプチドＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４で免疫化したＣ５７ＢＬ／６  Ｔｏｌｌ様受容体２欠損マウスの抽出した腎臓から得られた糸球体の断面における１つの糸球体あたりの好中球の数を示すドットプロットグラフを示す。
【図２】図２は、３０ｍｇ／ｋｇの腹腔内（ｉ．ｐ．）のプレドニゾロン（ｐｒｅｄ）、ＰＢＳコントロール（ＰＢＳ）、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）のアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、または１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）の抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ３０１（ｏｐｎ３０１）のいずれかで処置した後に、２時間、１０μｇのリポペプチドＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４で免疫化したＣ５７ＢＬ／６  Ｔｏｌｌ様受容体２欠損マウス由来の腎臓の組織切片を示す。
【図３】図３は、３０ｍｇ／ｋｇの腹腔内（ｉ．ｐ．）のプレドニゾロン（ｐｒｅｄ）、ＰＢＳコントロール（ＰＢＳ）、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）のアイソタイプコントロール抗体（ｃｏｎｔ）または１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）の抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ３０１（ｏｐｎ３０１）のいずれかで処置した後に、１０μｇのリポペプチドＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４で免疫化したＣ５７ＢＬ／６  Ｔｏｌｌ様受容体２欠損マウス由来の循環好中球のドットプロットグラフを示す。
【図４】図４は、３０ｍｇ／ｋｇの腹腔内（ｉ．ｐ．）のプレドニゾロン（ｐｒｅｄ）、ＰＢＳコントロール（ＰＢＳ）、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）のアイソタイプコントロール抗体（ｃｏｎｔ）または１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）の抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ３０１（ｏｐｎ３０１）のいずれかで処置した後に、１０μｇのリポペプチドＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４で免疫化したＣ５７ＢＬ／６  Ｔｏｌｌ様受容体２欠損マウス由来の全白血球のドットプロットグラフを示す。
【図５】図５は、３０ｍｇ／ｋｇの腹腔内（ｉ．ｐ．）のプレドニゾロン（ｐｒｅｄ）、ＰＢＳコントロール（ＰＢＳ）、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）のアイソタイプコントロール抗体（ｃｏｎｔ）または１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）の抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ３０１（ｏｐｎ３０１）のいずれかで処置した後に、１０μｇのリポペプチドＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４で免疫化したＣ５７ＢＬ／６  Ｔｏｌｌ様受容体２欠損マウス由来のアルブミン尿／２４時間のドットプロットグラフを示す。
【図６】図６は、３０ｍｇ／ｋｇの腹腔内（ｉ．ｐ．）のプレドニゾロン（ｐｒｅｄ）、ＰＢＳコントロール（ＰＢＳ）、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）のアイソタイプコントロール抗体（ｃｏｎｔ）または１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）の抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ３０１（ｏｐｎ３０１）のいずれかで処置した後に、１０μｇのリポペプチドＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４で免疫化したＣ５７ＢＬ／６  Ｔｏｌｌ様受容体２欠損マウス由来の血栓症スコアのドットプロットグラフを示す。
【図７】図７は、３０ｍｇ／ｋｇの腹腔内（ｉ．ｐ．）のプレドニゾロン（ｐｒｅｄ）、ＰＢＳコントロール（ＰＢＳ）、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）のアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、または１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉ．ｖ．）抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ３０１（ｏｐｎ３０１）のいずれかで処置した後に、２４時間、１０μｇのリポペプチドＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４で免疫化したＣ５７ＢＬ／６  Ｔｏｌｌ様受容体２欠損マウス由来の腎臓の組織切片を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、腎虚血／再灌流の１日および５日後に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、（ｉｖ）１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＬＲ２  ＯＰＮ３０１モノクローナル抗体、および（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの処置群（１群あたりｎ＝６）由来のマウスの腎臓における尿素（ｍｍｏｌ／Ｌ）の測定のドットプロットグラフを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、腎虚血／再灌流の１日および５日後に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、（ｉｖ）１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＬＲ２  ＯＰＮ３０１モノクローナル抗体、および（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの処置群（１群あたりｎ＝６）由来のマウスの腎臓におけるクレアチニン（ｍｍｏｌ／Ｌ）の測定のドットプロットグラフを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、腎虚血／再灌流の１日後に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、（ｉｖ）１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＬＲ２  ＯＰＮ３０１モノクローナル抗体、および（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの処置群（ｎ＝６）由来のマウスの尿細管障害を示す代表的な組織学的腎臓切片を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、腎虚血／再灌流の１日後に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、（ｉｖ）１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＬＲ２  ＯＰＮ３０１モノクローナル抗体、および（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの処置群（ｎ＝６）由来のマウスの損傷した尿細管の割合の半定量的スコアのドットプロットグラフを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、腎虚血／再灌流の１日後に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、（ｉｖ）１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＬＲ２  ＯＰＮ３０１モノクローナル抗体、および（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの処置群（１群あたりｎ＝６）由来のマウスの腎臓におけるマクロファージ湿潤の割合のドットプロットグラフを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、腎虚血／再灌流の１日後に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、（ｉｖ）１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＬＲ２  ＯＰＮ３０１モノクローナル抗体、および（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの処置群（１群あたりｎ＝６）由来のマウスの腎臓におけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）（Ｕ／ｍｇタンパク質）の蓄積のドットプロットグラフを示す。
【図１１】図１１は、腎虚血／再灌流の１日後に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、および（ｉｖ）１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＬＲ２  ＯＰＮ３０１モノクローナル抗体、および（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの処置群（１群あたりｎ＝６）における、腎虚血／再灌流の１日後のマウスの腎臓における脂質過酸化反応の指標として使用されるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）産生（ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質）を示すドットプロットグラフを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、腎虚血／再灌流の１日および５日後の工程１の処置群（１群あたりｎ＝４）由来のマウスの腎臓における尿毒症（尿素（ｍｍｏｌ／Ｌ））の測定のドットプロットグラフを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、腎虚血／再灌流の１日および５日後の工程１の処置群（１群あたりｎ＝４）由来のマウスの腎臓におけるクレアチニン血症（クレアチニン（ｍｍｏｌ／Ｌ））の測定のドットプロットグラフを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、腎虚血／再灌流の１日および５日後の工程１の処置群（１群あたりｎ＝４）由来のマウスの尿細管損傷を示す代表的な組織学的腎尿細管切片のドットプロットグラフを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、腎虚血／再灌流の１日および５日後の工程１の処置群（１群あたりｎ＝４）由来のマウスの損傷した尿細管の割合の半定量的スコアのドットプロットグラフを示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、腎虚血／再灌流の１日および５日後に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、（ｉｖ）１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ３０１、および（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの工程２の処置群（１群あたりｎ＝６）由来のマウスの腎臓における尿毒症（尿素（ｍｍｏｌ／Ｌ））の測定のドットプロットグラフを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、腎虚血／再灌流の１日および５日後に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、（ｉｖ）１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ３０１、および（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの工程２の処置群（１群あたりｎ＝６）由来のマウスの腎臓におけるクレアチニン血症（クレアチニン（ｍｍｏｌ／Ｌ））の測定のドットプロットグラフを示す。
【図１５】図１５は、腎虚血／再灌流の１日および５日後に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、（ｉｖ）１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ３０１、および（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの工程２の処置群（１群あたりｎ＝６）由来のマウスにおける好中球由来のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）（Ｕ／ｍｇタンパク質）の蓄積のドットプロットグラフを示す。
【図１６】図１６は、腎虚血／再灌流の１日および５日後に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、（ｉｖ）１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ３０１、および（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの工程２の処置群（１群あたりｎ＝６）におけるマウスの腎臓における脂質過酸化反応の指標として使用されるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）産生（ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質）を示すドットプロットグラフを示す。
【図１７】図１７は、腎虚血／再灌流の１日および５日後に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、（ｉｖ）１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ３０１、および（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの工程２の処置群（１群あたりｎ＝６）由来のマウスの尿細管に対する損傷の半定量的スコアのドットプロットグラフを示す。
【図１８Ａ】図１８（Ａ）は、腎虚血／再灌流の０日に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、（ｉＶ）１０ｍｇ／ｋｇのＯＰＮ３０１ｍＡｂおよび（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの工程２の処置群（１群あたりｎ＝６）由来のマウスの腎臓におけるμ−ＧＳＴμｇ／Ｌの蓄積のドットプロットを示す。
【図１８Ｂ】図１８（Ｂ）は、腎虚血／再灌流の１日後に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、（ｉＶ）１０ｍｇ／ｋｇのＯＰＮ３０１ｍＡｂおよび（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの工程２の処置群（１群あたりｎ＝６）由来のマウスの腎臓におけるμ−ＧＳＴμｇ／Ｌの蓄積のドットプロットを示す。
【図１８Ｃ】図１８（Ｃ）は、腎虚血／再灌流の５日後に測定した、（ｉ）偽処置、（ｉｉ）ＰＢＳ−ビヒクル、（ｉｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（コントロールＡｂ）、（ｉＶ）１０ｍｇ／ｋｇのＯＰＮ３０１ｍＡｂおよび（ｖ）６ｍｇ／ｋｇのパーギリンの工程２の処置群（１群あたりｎ＝６）由来のマウスの腎臓におけるμ−ＧＳＴμｇ／Ｌの蓄積のドットプロットを示す。
【図１９】図１９は、ヒトＴｏｌｌ様受容体２のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図２０】図２０は、ヒトＴｏｌｌ様受容体２のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２１】図２１は、ヒトＴｏｌｌ様受容体２の細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の機能または発現を阻害する薬剤、あるいは腎疾患および腎炎を処置、特にＴｏｌｌ様受容体２のシグナル伝達によって媒介される糸球体の炎症および腎疾患を処置または予防するためのかかる薬剤を使用する方法に関する。
【０１０１】
ＴＬＲ２の結合エピトープに対する親和性および結合特異性を有するＴＬＲ２拮抗結合化合物などのＴＬＲ２調節薬剤は、腎臓に影響を与える多くの免疫媒介性および疾患状態の阻害において有用性を有する。このように、本発明は、腎臓を標的とするか、または腎臓の機能に影響を与える免疫媒介性、炎症性および病原性状態を処置および予防するための組成物および方法を提供する。
【０１０２】
特定の実施形態において、病原性状態は、細菌性病原体によって媒介される感染状態である。細菌性病原体は、グラム陽性細菌であっても、またはグラム陰性細菌であってもよい。特定の実施形態において、細菌性病原体は敗血症の原因となる細菌であり、前記組成物および方法は、敗血症または敗血症性ショック、例えば、グラム陰性敗血症などの状態から生じる腎臓に関連する炎症の処置において有用性を有する。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」とは、特異的結合リガンド、この場合においてＴｏｌｌ様受容体２のリガンド作動薬によって結合され得る高分子の一部、この場合においてＴＬＲ２タンパク質、または関連タンパク質に関する。エピトープは、ポリペプチド配列内に含まれるアミノ酸残基の隣接配列または非隣接配列から規定され得る。用語「隣接エピトープ（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、エピトープを規定するポリペプチド内の直線状の一連のアミノ酸残基からなるエピトープを規定する。「非隣接エピトープ（ｎｏｎ−ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、配列が非直線状である一連のアミノ酸残基からなるエピトープであり、それによって、その残基はポリペプチド配列の長さに沿って不連続様式で間隔があいているか、または集合している。不連続（ｎｏｎ−ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）エピトープは、アミノ酸残基が２つの直線状配列に集合する不連続エピトープであり得るか、または不連続エピトープは、エピトープの一因となる残基が、ポリペプチドの長さに沿って配列された直線状アミノ酸配列の３以上の集団で与えられる不連続散在性エピトープであり得る。
【０１０４】
（抗体）
「抗体」は、天然または部分的もしくは完全に合成的に産生される免疫グロブリンである。この用語はまた、結合ドメイン、つまり抗体結合ドメイン、またはそれに相同的である結合ドメインを有する任意のポリペプチド、タンパク質またはペプチドを含む。これらは天然源由来であってもよいか、またはそれらは部分的もしくは完全に合成的に産生されてもよい。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプおよびそれらの同形のサブクラスならびにＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、および二重特異性抗体などの抗原結合ドメインを含む断片である。
【０１０５】
さらなる実施形態において、その抗体は、ラクダ抗体、特にラクダ重鎖抗体であり得る。さらに、その抗体断片は、ラクダ重鎖抗体由来のドメイン抗体またはナノボディであり得る。さらなる実施形態において、その抗体は、サメ抗体またはサメ由来の抗体であり得る。
【０１０６】
特定の実施形態において、その抗体は「単離抗体」である。これは抗体が、（１）通常見出される少なくとも一部のタンパク質を含まず、（２）同じ源、例えば、同じ種由来の他のタンパク質を実質的に含まず、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、または（４）天然に発生しないことを意味する。
【０１０７】
抗体は多くの方法で修飾され得るため、用語「抗体」は、必要とされる特異性で結合ドメインを有する任意の結合メンバーまたは物質を含むと解釈されるべきである。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、またはその断片、誘導体、機能的等価物もしくは相同体であり得る。この用語は、天然または完全もしくは部分的に合成であろうとなかろうと、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む。従って、別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメイン、または等価物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、欧州特許出願公開０，１２０，６９４号および欧州特許出願公開０，１２５，０２３号に記載される。
【０１０８】
抗体の定常領域は任意の適切な免疫グロブリンサブタイプであり得るが、抗体サブタイプがＩｇＧ１であることが好ましい。しかしながら、代替の実施形態において、抗体のサブタイプは、ヒト免疫グロブリン分子が使用されるクラスＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥであり得る。そのような抗体はさらに、任意のサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に属し得る。
【０１０９】
全抗体の断片は抗原結合の機能を実施し得る。そのような結合断片の例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１抗体ドメインからなるＦａｂ断片；単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの連結したＦａｂ断片を含む二価断片；一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインを結合させて抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーによって連結される；または遺伝子融合によって構築される多価もしくは多特異的断片であり得る二重特異性抗体である。
【０１１０】
本発明において使用するための抗体またはポリペプチドの断片は、例えば、ＴＬＲ２特異的抗体の断片であり、一般に、少なくとも５〜７の隣接アミノ酸、しばしば少なくとも約７〜９の隣接アミノ酸、典型的に少なくとも約９〜１３の隣接アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０〜３０またはそれ以上の隣接アミノ酸、および最も好ましくは少なくとも約３０〜４０またはそれ以上の連続アミノ酸のアミノ酸残基の伸長を意味する。
【０１１１】
このような抗体またはポリペプチド、あるいはＴＬＲ２特異的抗体の断片の「誘導体」とは、タンパク質のアミノ酸配列を変化させること、例えば、タンパク質をコードする核酸の操作によって、あるいはタンパク質それ自体を変化させることによって修飾された抗体またはポリペプチドを意味する。天然アミノ酸配列のこのような誘導体は、１つ以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失および／または置換を含み得るが、好ましくは、ＴＬＲ２結合活性を有するペプチドを与える。好ましくは、このような誘導体は、２５以下のアミノ酸、より好ましくは１５以下、さらにより好ましくは１０以下、なおより好ましくは４以下、最も好ましくは１または２のアミノ酸のみの挿入、付加、欠失および／または置換を含む。
【０１１２】
用語「抗体」は、「ヒト化」されている抗体を含む。ヒト化抗体を作製する方法は、当該分野において公知である。方法は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号に記載されている。ヒト化抗体は、ＴＬＲ２特異的抗体およびヒト抗体の定常領域などのモノクローナル抗体の超可変領域を有する修飾された抗体であってもよい。このように、結合メンバーはヒト定常領域を含んでもよい。
【０１１３】
超可変領域以外の可変領域はまた、ヒト抗体の可変領域由来であっても、および／またはＴＬＲ２特異的抗体などのモノクローナル抗体由来であってもよい。このような場合において、全可変領域は、マウスモノクローナル抗体、ＴＬＲ２特異的抗体由来であり得、その抗体はキメラ化されたといわれる。キメラ抗体を作製するための方法は、当該分野において公知である。このような方法は、例えば、Ｂｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）およびＣａｂｉｌｌｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）によって米国特許に記載されるものが挙げられる。例えば、それぞれ、米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号を参照のこと。
【０１１４】
元の抗体の特異性を保有する他の抗体またはキメラ分子を産生するために、モノクローナルおよび他の抗体を利用すること、ならびに組み換えＤＮＡ技術の技術を使用することが可能である。このような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域、または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域プラスフレームワーク領域に導入することを含み得る。例えば、欧州特許出願公開第０，１８４，１８７号、英国特許出願公開第２，１８８，６３８Ａ号または欧州特許出願公開第０，２３９，４００号を参照のこと。ハイブリドーマまたは他の抗体産生細胞は、産生された抗体の結合特異性を変化させ得るか、または変化させ得ない遺伝子操作または他の変更に供されてもよい。
【０１１５】
特定の実施形態において、本発明のＴＬＲ２阻害化合物またはＴＬＲ２結合化合物が抗体である場合、その抗体は治療有効量で被験体に投与される。特定の実施形態において、治療有効量は、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００ｐｇ／ｋｇおよび５００ｐｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇから選択される範囲の抗体を含む。
【０１１６】
（抗体の産生）
本発明によって提供される抗体は、多くの手段によって提供され得る。例えば、ファージディスプレイベースのバイオパニングアッセイなどの組み合わせスクリーニング技術が、本発明の結合エピトープに対する結合特異性を有するアミノ酸配列を同定するために使用され得る。このようなファージディスプレイバイオパニング技術は、糸状菌の表面上の抗体結合断片のディスプレイを介して、免疫選択を模倣する手順において適切なエピトープ結合リガンドを同定する方法で利用されるファージディスプレイライブラリーの使用を含む。特異的結合活性を有するファージが選択される。選択されたファージはその後、キメラ、ＣＤＲ移植、ヒト化またはヒト抗体の産生に使用され得る。
【０１１７】
さらなる実施形態において、その抗体は、培養物中の連続細胞株によって抗体分子を産生する任意の適切な方法を用いて産生され得るモノクローナル抗体である。適切な方法は当業者に周知であり、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７．１９７５）の方法が挙げられる。キメラ抗体またはＣＤＲ移植抗体はさらに、本発明の範囲内で提供される。特定の実施形態において、本発明の抗体は、宿主細胞における組み換えＤＮＡの発現によって産生され得る。
【０１１８】
さらなる実施形態において、ヒト化抗体もまた提供される。ヒト化抗体は、米国特許第５，５８５，０８９号に記載されるＷｉｎｔｅｒの方法によって産生され得る。
【０１１９】
特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、トランスジェニック動物、例えば、優先的に発現されるヒト重鎖および軽鎖をコードする遺伝子座で内因性マウス免疫グロブリン遺伝子の発現を欠失または抑制するために遺伝子操作されているトランスジェニックマウスを用いて産生されたヒト抗体であり得、これにより、完全なヒト抗体の産生を生じる。
【０１２０】
特定のさらなる実施形態において、その結合化合物は、抗体、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）などの抗体結合断片由来の結合断片である。
【０１２１】
特定のさらなる実施形態において、結合化合物は、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、合成された抗体もしくは合成抗体、融合タンパク質、またはそれらの断片、あるいは天然もしくは合成キメラ化合物またはペプチド模倣物を含む。
【０１２２】
本発明のＴｏｌｌ様受容体２エピトープに対する親和性および結合特異性を有する抗体を産生するための方法論は、以上に記載される。
【０１２３】
本発明の、および本発明に使用するための抗体（複数も含む）断片はまた、キメラ合成によって完全または部分的に産生され得る。その抗体は、十分に確立されている標準的な液相、または好ましくは固相ペプチド合成法に従って容易に調製され得る。その概要は広範に利用でき、当業者に周知である。さらに、それらは、液相法または固相、液相および溶液化学の任意の組み合わせによって溶液中で調製され得る。
【０１２４】
本発明における使用に適切な抗体（複数も含む）断片を産生する別の簡便な方法は、発現系における核酸の使用により、それらをコードする核酸を発現することである。
【０１２５】
本発明に従って使用するための核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、完全または部分的に合成され得る。好ましい態様において、本発明において使用するための核酸は、上記の本発明の抗体（複数も含む）断片をコードする。当業者は、本発明の抗体（複数も含む）断片をさらに提供するそのような核酸に対して置換、欠失および／または付加を決定できる。
【０１２６】
本発明で使用するための抗体（複数も含む）断片をコードする核酸配列は、本明細書に含まれる情報および参考文献ならびに当該分野において公知の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９２）を参照のこと）、所定の核酸配列および利用可能なクローンを用いて当業者によって容易に調製され得る。これらの技術は、（ｉ）例えば、ゲノム源由来のそのような核酸の試料を増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学合成、または（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製を含む。抗体断片をコードするＤＮＡは、コードＤＮＡを利用すること、発現される部分のいずれかの側で適切な制限酵素認識部位を同定すること、およびＤＮＡ由来の前記部分を切断することを含む、当業者に公知の任意の適切な方法で産生され、使用され得る。次いで、その部分は、標準的な市販の発現系における適切なプロモーターに作動可能に連結され得る。別の組み換えアプローチは、適切なＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡの関連部分を増幅させることである。配列に対する修飾は、例えば、修飾されたペプチドの発現を生じさせるため、または核酸を発現するために使用される宿主細胞におけるコドン選択を考慮するために、部位特異的突然変異誘発法を用いてなされ得る。
【０１２７】
核酸は、上記の少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物として含まれ得る。この構築物は、上記の１つ以上の構築物を含む組み換え宿主細胞内に含まれ得る。発現は、適切な条件下で、核酸を含む組み換え宿主細胞を培養することによって簡便に達成され得る。発現によって産生した後、抗体（複数も含む）断片は、任意の適切な技術を用いて単離および／または精製され得、次いで、適切な場合に使用され得る。
【０１２８】
種々の異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニングおよび発現するための系は周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母、昆虫およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドを発現するための当該分野において利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞が挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主はＥ．ｃｏｌｉである。Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における抗体（複数も含む）断片の発現は、当該分野において確立されている。培養物中の真核細胞における発現もまた、結合メンバーを産生するための選択肢として当業者に利用可能である。
【０１２９】
抗体を産生するための一般的技術は当業者に周知であり、そのような方法は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；米国特許第４，３７６，１１０号；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（これらの内容は本明細書に参照として援用される）に議論されている。
【０１３０】
組み換え抗体分子を調製するための技術は、上記の参考文献および例えば、欧州特許０，６２３，６７９号および欧州特許０，３６８，６８４号（これらは本明細書に参照として援用される）にも記載されている。
【０１３１】
本発明の特定の実施形態において、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする挿入を含む組み換え核酸が利用される。定義により、そのような核酸は、コーディング一本鎖核酸、前記コーディング核酸およびその相補的核酸からなる二本鎖核酸、またはそれらの相補的（一本鎖）核酸それ自体を含む。
【０１３２】
さらに、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、天然重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメイン、あるいはそれらの変異体をコードする真の配列を有する酵素的または化学的に合成された核酸であり得る。
【０１３３】
組み換えＤＮＡ技術は、本発明の抗体を改良するために使用され得る。従って、キメラ抗体は、診断または治療用途においてその免疫原性を減少させるために構築され得る。さらに、例えば、ブタなどのトランスジェニック生物内の免疫原性は、抗体をヒト化する類似の技術のＣＤＲ移植によって抗体を変化させることにより最小化され得る。そのような技術の例は、Ｗｉｎｔｅｒによる欧州特許０，２３９，４００号に記載される。受容者内の免疫原性を減少させるために、本発明は、ヒト定常ドメインに融合される抗体の重鎖可変ドメインをコードする挿入を含む組み換え核酸を使用し得る。同様に、本発明は、ヒト定常ドメインκまたはλ領域に融合される抗体の軽鎖可変ドメインをコードする挿入を含む組み換えＤＮＡに関する。
【０１３４】
さらに、抗体は、抗体遺伝子の変異誘発によって産生されて、抗体の５個の人工レパートリーを産生され得る。この技術は抗体ライブラリーの調製を可能にする。抗体ライブラリーは市販されてもいる。従って、本発明は有利に、本発明のエピトープに対する特異性を有する結合分子を同定するために、免疫グロブリン源として、免疫グロブリンの人工レパートリー、好ましくは人工ｓｃＦｖレパートリーを利用する。
【０１３５】
（抗体選択系）
本発明のエピトープに結合でき、従って本発明の方法に使用され得る免疫グロブリンは、当業者に公知の任意の技術を用いて同定され得る。そのような免疫グロブリンは、簡便に、免疫グロブリンポリペプチドの人工レパートリーを含むライブラリーから単離され得る。「レパートリー」とは、複数の結合特異性を与えるために、核酸レベルで、ランダム、準ランダムまたは１つ以上の鋳型分子の直接変異によって産生される分子のセットをいう。レパートリーを産生するための方法は、当該分野において十分に特徴付けられている。
【０１３６】
任意のライブラリー選択系が本発明と併せて使用され得る。多くのライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコルは、ファージディスプレイ技術が典型例であるように、当該分野において公知である。種々のペプチド配列が糸状バクテリオファージの表面で表示されるそのようなシステムは、生体外での選択および標的抗原に結合する特異的抗体断片の増幅のための抗体断片（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作製するのに有用であると証明されている。ＶＨおよびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、それらをＥ．ｃｏｌｉの周辺質のスペースに方向付けるリーダーシグナルをコードする遺伝子断片に連結され、その結果として得られた抗体断片は、バクテリオファージの表面に、典型的にバクテリオファージコートタンパク質（例えばｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）との融合として表示される。あるいは、抗体断片は、ラムダファージカプシド（ファージ本体）の外面に表示される。ファージベースのディスプレイ系の利点は、それらが生物学系であるため、選択されたライブラリーメンバーが、細菌細胞において選択されたライブラリーメンバーを含むファージを増殖させることによって簡単に増幅され得ることである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列は、ファージまたはファージミドベクターに含まれ、配列決定、発現およびその後の遺伝子操作は、比較的、連続して進められる。
【０１３７】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびラムダファージ発現ライブラリーを構築するための方法は、当該分野において周知である（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８  ５５２−５５４）。１つの特に有益なアプローチは、ｓｃＦＶファージディスプレイライブラリーの使用である（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡを参照のこと）。
【０１３８】
ファージまたは他のクローンライブラリーの使用の代替案は、核酸、好ましくは、選択された標的、例えば、本発明のＴＬＲ２エピトープで免疫化された動物のＢ細胞由来のＲＮＡを使用することである。
【０１３９】
Ｖ領域およびＣ領域のｍＲＮＡの単離により、ＦａｂまたはＦｖなどの抗体断片が細胞内に発現することを可能にする。つまり、ＲＮＡは、免疫化された動物のＢ細胞から、例えば、免疫化されたマウスの脾臓、またはラマの循環Ｂ細胞から単離され、ＰＣＲプライマーが、ＲＮＡプールから選択的にＶＨおよびＶＬ  ｃＤＮＡを増幅させるために使用される。従って、得られたＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦＶ抗体を作製するために結合される。ＰＣＲプライマー配列は、公開されたＶＨおよびＶＬ配列に基づいてもよい。
【０１４０】
（ペプチド模倣物）
ペプチド模倣物またはペプチド模倣薬などのペプチド類似物は、鋳型ペプチドの代表的な特性を有する非ペプチド化合物である。そのようなペプチド類似物は、典型的に、コンピューターによる分子モデリングを用いて開発される。本発明のＴＬＲ２結合エピトープに対する親和性および結合特異性を有するペプチドに構造的に類似するペプチド模倣物は、類似の診断的、予防的および治療的効果を媒介するために使用され得る。
【０１４１】
ペプチド模倣物は、典型的に、鋳型ペプチドと構造的に類似しているが、当該分野において周知である方法によって、別の結合と置換される１つ以上のペプチド結合を有する。例えば、本発明のＴＬＲ２エピトープに対する結合特異性を有するペプチドは、アミド結合置換、非ペプチド部分の導入、または骨格環化を含むように修飾され得る。適切に、システインが存在する場合、この残基のチオールが、遊離硫酸基の損傷を防止するためにキャップされる。ペプチドはさらに、プロテアーゼ攻撃からペプチドを保護するために天然配列から修飾され得る。
【０１４２】
適切に、本発明のペプチドおよび本発明に使用するためのペプチドはさらに、少なくとも１つのＣ末端および／またはＮ末端キャッピング、ならびに／あるいはシステイン残基キャッピングを用いて修飾され得る。
【０１４３】
適切に、本発明のペプチドおよび本発明に使用するためのペプチドは、アセチル基を用いてＮ末端残基でキャップされ得る。適切に、本発明のペプチドおよび本発明に使用するためのペプチドは、アミン基を用いてＣ末端でキャップされ得る。適切に、システインのチオール基は、アセトアミドメチル基を用いてキャップされる。
【０１４４】
本発明のエピトープおよびその断片を規定するポリペプチドの発現、単離および精製は、任意の適切な技術によってなされ得る。
【０１４５】
ポリペプチドを産生するための方法は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で、ポリペプチドをコードする組み換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養すること、次いでその培養物から発現したポリペプチドを回収することを含む。当業者は、発現されたポリペプチドを精製するための手順が、利用される宿主細胞のタイプなどの要因に従って変化し、そのポリペプチドが細胞内、膜結合または可溶性形態であろうとなかろうと、その宿主細胞から分泌されることを理解するだろう。
【０１４６】
任意の適切な発現系が利用されてもよい。ベクターは、本発明のポリペプチドまたは断片をコードするＤＮＡを含み、哺乳動物、トリ、微生物、ウイルス、細菌、または昆虫遺伝子由来のものなどの適切な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結される。ヌクレオチド配列は、調節配列がＤＮＡ配列に機能的に関連する場合、作動可能に連結される。従って、プロモーターヌクレオチド配列は、そのプロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を制御する場合、ＤＮＡ配列に作動可能に連結される。形質転換体が同定される所望（Ｅ．ｃｏｌｉ）の宿主細胞、および選択遺伝子において複製する能力を与える複製起点は、発現ベクターに一般的に導入される。
【０１４７】
さらに、適切なシグナルペプチド（天然または異種）をコードする配列は、発現ベクターに導入され得る。シグナルペプチド（分泌腺リーダー）についてのＤＮＡ配列は、フレームにおいて本発明の核酸配列と融合され得、その結果、そのＤＮＡは最初に転写され、ｍＲＮＡがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳される。意図される宿主細胞において機能するシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。そのシグナルペプチドは、翻訳の間、ポリペプチドから開裂されるが、細胞からのポリペプチドの分泌を可能にする。
【０１４８】
ポリペプチドを発現するための適切な宿主細胞は、高等真核細胞および酵母を含む。原核細胞系もまた、適切である。哺乳動物細胞、および特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、宿主細胞としての使用のために特に好ましい。哺乳動物、原核生物、酵母、菌類および昆虫細胞の宿主を用いて使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８６）（ＩＳＢＮ  ０４４４９０４０１８）に記載されている。
【０１４９】
（低分子）
種々のさらなる態様において、本発明は、ＴＬＲ２活性に拮抗する化合物を同定するのに使用するためのスクリーニングおよびアッセイ方法に関する。特定のさらなる態様は、同定された化合物にまで及び、従って、前記結合化合物は、本発明のエピトープに対する親和性および結合特異性を有する。
【０１５０】
ＴＬＲ２受容体のリガンドとして同定される物質はペプチドであってもよいか、または天然の非ペプチド、例えば、上記のペプチド模倣物であってもよい。しかしながら、非ペプチド「低分子」は、しばしば、多くの生体内の薬理学的用途に好ましい。従って、本発明に使用するためのＴＬＲ２結合化合物の模倣薬または模倣剤は、薬理学的用途のために設計され得る。
【０１５１】
公知の薬理学的に活性な化合物に対する模倣薬の設計は、「鉛」化合物に基づく薬理学の開発に対する公知のアプローチである。これは、活性化合物を合成することが難しいか、または費用がかかる場合、あるいは特定の投与方法が不適切な場合に望まれ得る。例えば、ペプチドは消化管に存在するプロテアーゼによって分解されるため、経口組成物および投与のための活性因子として十分に適さない。模倣薬の設計、合成および試験は、標的特性について多数の分子をランダムにスクリーニングすることを避けるために使用され得る。
【０１５２】
所定の標的特性を有する化合物からの模倣薬の設計に一般に利用されるいくつかの工程が存在する。最初に、標的特性を決定する際に決定的および／または重要である化合物の特定の部分が決定される。ペプチドの場合、これは、ペプチドのアミノ酸残基を体系的に変化させることにより、例えば、順に各アミノ酸残基を置換することによりなされ得る。化合物の活性領域を構成する残基のこれらの部分は、その「活性基」として公知である。
【０１５３】
一旦、活性基が決定されると、その構造は、様々な範囲の源、例えば、分光技術、Ｘ線回折データおよびＮＭＲからのデータを用いて、その物理的特性、例えば、立体化学、結合、サイズおよび／または電荷に従ってモデル化される。コンピューター分析、類似マッピング（原子間の結合よりむしろ、電荷および／または活性基の量をモデル化する）および他の技術もまた、このモデル化プロセスに使用され得る。
【０１５４】
このアプローチの変形において、ＴＬＲ２結合化合物の三次元構造がモデル化される。これは、リガンドおよび／または結合パートナーが、結合の際に構造を変化する場合に特に有用であり得、そのモデルの模倣薬の設計を考慮に入れることができる。
【０１５５】
次いで、鋳型分子が選択され、その鋳型分子上で活性基を模倣する化学基が組み込まれ得る。その鋳型分子およびそれに組み込まれた化学基は簡便に選択され得、その結果、模倣薬は、合成しやすく、薬理学的に許容される可能性があり、生体内で分解せず、一方で鉛化合物の生物学的活性も保持する。このアプローチによって見出される模倣薬（複数も含む）は、次いで、それらが標的特性を有するかどうか、またはそれらがどの程度まで標的特性を示すかを調べるためにスクリーニングされ得る。次いで、さらなる最適化または修飾が、生体内または臨床試験についての１つ以上の最終模倣物に到達するように実施され得る。
【０１５６】
特定の実施形態において、模倣薬結合化合物は、薬物スクリーニング計画に使用される天然または合成化合物であってもよい。いくつかの特徴付けられた、または特徴付けられていない成分を含む植物の抽出物も使用され得る。
【０１５７】
ＴＬＲ２に対する親和性および結合特異性を有する候補結合化合物は、ＴＬＲ２の機能的活性を調節するために単離および／または精製、製造ならびに／あるいは使用されてもよい。
【０１５８】
なおさらなる態様において、本発明は、エピトープに結合するか、またはエピトープに結合するリガンドの活性を調節するそれらの能力についての潜在的に膨大な数の異なる物質を試験する効果的な方法を提供する組み合わせライブラリー技術（Ｓｃｈｕｌｔｚ，ＪＳ（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１２：７２９−７４３）の使用にまで及ぶ。活性の調節についてのスクリーニングの前、およびスクリーニング時に、試験物質が、例えば、（コード核酸から酵母において発現され得るポリペプチドおよび試験物質の両方を必要とする）酵母２ハイブリッド法においてポリペプチドと相互作用する能力についてスクリーニングされ得る。これは、ポリペプチドの活性を調節する実際の能力について物質を試験する前に粗いスクリーニングとして使用され得る。
【０１５９】
本発明のアッセイに加えられ得る試験物質または化合物の量は、通常、使用される化合物のタイプに依存して試行錯誤によって決定される。典型的に、約０．０１〜１００ｎＭ濃度の推定阻害化合物、例えば、０．１〜１０ｎＭが使用され得る。ペプチドが試験物質である場合、より高い濃度が使用され得る。
【０１６０】
（併用医薬）
上記のように、本発明は併用治療にまで及び、組成物または方法は、急性腎不全、慢性腎不全または腎疾患の原因となり得る免疫応答を抑制するのに役立つ少なくとも１つのさらなる治療化合物と組み合わせて投与されるＴＬＲ２の機能的活性を阻害する結合化合物の投与に関する。
【０１６１】
典型的に、一次および二次治療組成物は同時に与えられる。特定の実施形態において、一次治療組成物（すなわち、ＴＬＲ２の機能的活性に拮抗する結合化合物）および二次治療化合物は同時に投与される。特定のさらなる実施形態において、それらは連続して投与される。
【０１６２】
特定の実施形態において、併用治療は、サイトカイン阻害剤（例えば、限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１５の阻害剤）、および腫瘍壊死因子の阻害剤、増殖因子阻害剤、免疫抑制因子、抗炎症剤、酵素阻害剤、代謝阻害剤、細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤のうちの少なくとも１つと共に被験体に同時投与されるＴＬＲ２機能的阻害剤を含み得る。
【０１６３】
当業者は、併用治療の被験体への投与が、治療的に有効な効果を達成して関連させるために、被験体へのより少ない用量の治療薬の投与を可能にするという点で有益であり得ることを理解するだろう。より少ない併用用量の投与により、被験体が少ない毒性レベルにしか曝露されないという結果も生じる。さらに、本発明によって提供される併用治療の一部として投与される二次治療化合物は、異なる経路を標的とし、治療の全体的な効果を相乗的に向上する可能性がある。効果の向上により、投与され、それによって関連する毒性を減少させる、より少ない用量の必要性を再び生じる。
【０１６４】
本発明のＴＬＲ２阻害化合物と共に投与するための適切な二次治療化合物を同定および選択する際に、前記二次治療化合物は、腎炎および腎疾患を生じる炎症反応の異なる段階で免疫応答を調節するような化合物に基づいて選択され得る。このような二次化合物としては、限定されないが、可溶性受容体、ペプチド阻害化合物、低分子、融合タンパク質またはリガンド、抗体、および抗炎症性効果を媒介するサイトカインが挙げられ得る。
【０１６５】
（投与）
本発明のモノクローナル抗体または融合タンパク質は単独で投与され得るが、好ましくは、意図される投与経路に依存して選択される一般に適切な薬理学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物として投与される。適切な薬理学的担体の例としては、水、グリセロール、エタノールなどが挙げられる。
【０１６６】
本発明のモノクローナル抗体または融合タンパク質は、任意の適切な経路を介して処置を必要とする患者に投与され得る。本明細書に定義する場合、組成物が、注射または注入により非経口的に投与されることが好ましい。非経口投与のための好ましい経路の例としては、限定されないが、静脈内、心臓内、動脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、経粘膜的、吸入または経皮的が挙げられる。
【０１６７】
投与経路はさらに、局所的および腸内、例えば、粘膜（肺を含む）、経口、経鼻、直腸を含み得る。
【０１６８】
特定の実施形態において、組成物は、注射可能組成物として送達可能である。静脈内、筋肉内、皮内または皮下適用に関して、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容できる水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー液、または乳酸化リンガー液などの等張性ビヒクル用いて適切な溶液を十分に調製できる。保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および／または他の添加剤が、必要な場合、含まれ得る。
【０１６９】
組成物はまた、ミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子送達系または血液を含む特定の組織に配置される徐放性製剤を介して投与され得る。
【０１７０】
本発明に従って使用され得る上記の技術およびプロトコルならびに他の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ；第２０版  ＩＳＢＮ  ０−９１２７３４−０４−３ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃら，第７版  ＩＳＢＮ  ０−６８３３０５−７２−７（それらの全開示は本明細書に参照として援用される）に見出され得る。
【０１７１】
組成物は、好ましくは、「治療有効量」で個体に投与され、これは、その組成物が投与される個体に有益であることを示すのに十分である。投与される実際の用量、ならびに投与速度および投与期間は、処置される状態の性質および重症度、ならびに処置される患者の年齢、性別および体重、および投与経路などの要因に依存し、それらを考慮して決定され得る。さらに、組成物の特性、例えば、その結合活性および生体内での血漿中の半減期、製剤中の融合タンパク質の濃度、ならびに送達の経路、部位および速度が考慮されるべきである。
【０１７２】
投薬計画は、本発明の組成物の単回投与またはその組成物の複数回の管理上の投与を含んでもよい。その組成物はさらに、本発明の融合タンパク質が処置するために投与される状態の処置に使用される他の治療薬および医薬と連続して、または別々に投与されてもよい。
【０１７３】
被験体に投与され得る投与計画の例は、限定されないが、１μｇ／ｋｇ／日〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日を含む群から選択され得る。
【０１７４】
本発明のＴＬＲ２のエピトープ結合化合物は、好ましくは、「治療有効量」で個体に投与され、これは個体に有用性を示すのに十分である。
【０１７５】
投与される実際の量、ならびに投与速度および期間は、処置されるものの性質および重症度に依存する。処置の処方箋、例えば、投薬量などの決定は、最終的に、一般開業医および他の医師の責任および決定の範囲内であり、典型的に、処置される疾患、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および医師に公知の他の要因が考慮される。
【０１７６】
他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明の当業者によって一般に理解される意味を有する。
【０１７７】
文脈が他に要求しない限り、明細書全体にわたって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、あるいは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、記載される整数または整数の群を包含するが、いかなる他の整数または整数の群も排除しないことを示すことが理解されるだろう。
【０１７８】
本明細書で使用する場合、「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」などの用語は、文脈が他に明確に要求しない限り、単数形および複数形の指示対象を含む。従って、例えば、「活性な薬剤」または「薬理学的に活性な薬剤」に対する言及は、単一の活性な薬剤および組み合わせた２つ以上の異なる活性な薬剤を含み、一方、「担体」に対する言及は、２つ以上の担体の混合物および単一の担体などを含む。
【０１７９】
本発明の融合タンパク質のポリペプチド構成要素を記載するために使用される命名は、従来の実務に従い、アミノ基（Ｎ）は各アミノ酸残基の左に提示され、カルボキシ基は右に提示される。
【０１８０】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」との語句は、天然および合成アミノ酸の両方、ならびにＤおよびＬアミノ酸の両方を含むことを意図する。合成アミノ酸はまた、限定されないが、アミドなどの塩、およびアミノ酸誘導体を含む化学的に修飾されたアミノ酸を含む。本発明のポリペプチド内に存在するアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化またはそれらの生物学的活性に悪影響を与えずに循環半減期を変化させ得る他の化学基での置換によって修飾され得る。
【０１８１】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合またはアイソスターなどの修飾されたペプチド結合による一連の少なくとも２つのアミノ酸共有結合を記載するために本明細書に交換可能に使用される。ペプチドまたはタンパク質を含み得るアミノ酸の最大数に制限は課されない。さらに、用語ポリペプチドは、ペプチドの断片、類似体および誘導体にまで及び、前記断片、類似体または誘導体は、その断片、誘導体または類似体が誘導されるペプチドと同じ生物学的機能活性を保持する。
【０１８２】
さらに、本明細書で使用する場合、用語「融合タンパク質」はまた、融合ポリペプチド、融合ペプチドなどの意味を取り得るか、または免疫抱合体ともいわれ得る。用語「融合タンパク質」は、２つ以上のサブユニット分子、典型的に、ポリペプチドが、共有結合または非共有結合されている分子をいう。
【０１８３】
本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」または「治療的に有効な量」とは、腎臓におけるＴＬＲ２によって媒介される炎症を抑制するか、あるいはＴＬＲ２によって媒介される腎疾患もしくはその少なくとも１つの症状またはそれに関連する状態の重症度を減少、および／または改善するのに必要とされる本発明の薬剤、結合化合物、低分子、融合タンパク質またはペプチド模倣物の量を意味する。
【０１８４】
本明細書で使用する場合、用語「予防的に有効な量」とは、本発明の化合物の投与後、被験体における腎臓のＴＬＲ２によって媒介される炎症または腎疾患、あるいはそれらのうちの少なくとも１つの症状の初期の発現、進行または再発を予防するのに必要とされる組成物の量に関する。
【０１８５】
本明細書で使用する場合、用語「処置」ならびに「処置する」および「処置している」などの関連用語は、ＴＬＲ２媒介性状態の少なくとも１つの症状の進行、重症度および／または持続の減少を意味し、前記減少または改善は、本発明のＴＬＲ２結合エピトープに対する特異性を有する結合化合物の投与に起因する。従って、用語「処置」とは、被験体に有益であり得る任意の投薬計画をいう。この処置は、既存の状態に関してであってもよいか、または予防的（予防的治療）であってもよい。処置は、治療的、軽減的または予防的効果を含んでもよい。本明細書において「治療的」および「予防的」処置に対する言及は、それらの最も広い状況とみなされるべきである。用語「治療的」とは、被験体が完全に回復するまで処置されることを必ずしも意味するわけではない。同様に、「予防的」とは、被験体が最終的に疾患状態にかからないことを必ずしも意味するわけではない。
【０１８６】
本明細書で使用する場合、用語「被験体」とは、動物、好ましくは、哺乳動物、特にヒトをいう。特定の実施形態において、その被験体は哺乳動物、特にヒトである。用語「被験体」は、本明細書で使用する場合、用語「患者」と交換可能である。
【０１８７】
本発明は、ここで、例示の目的のために提供されて、本発明を限定すると解釈されるべきではない以下の実施例を参照して記載される。
【実施例】
【０１８８】
（実施例１  糸球体炎症に対するＴｏｌｌ様受容体２作動薬の効果）
（方法）
腎毒性抗体を産生するための方法、血球計算、組織学的処理、組織学の評価は、Ｂｒｏｗｎ  ＨＪ，Ｌｏｃｋ，ＨＲ，Ｓａｃｋｓ  ＳＨ，Ｒｏｂｓｏｎ  ＭＧ  ＴＬＲ２  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６，１７７（３）：１９２５−１９３１（この内容は本明細書に参照として援用される）に開示されている。本実施例を実施する際にこれらの方法に従った。
【０１８９】
（マウス）
年齢、性別、および体重が一致した野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスをＨａｒｌａｎ（Ｈａｒｌａｎ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｂｉｃｅｓｔｅｒ，Ｏｘｏｎ，ＵＫ）から得た。使用した全てのマウスは、実験の開始時に９〜１０週齢であった。動物実験を、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅの規定に従って実施した。ＴＬＲ２欠損マウスの遺伝子型をＰＣＲによって確認した。
【０１９０】
（促進的な腎毒性腎炎の誘導）
マウスの糸球体抽出物をＢｒｏｗｎらに以前に記載されるように作製し、血清は、Ｍｉｃｒｏｐｈａｒｍ（Ｌｌａｎｄｙｓｕｌ，ＵＫ）によってヒツジで調製された。腎毒性血清（ＮＴＳ）を、５６℃で３０分間、熱で不活性化し、使用するまで１２０℃にてアリコート中で凍結した。マウスを、３１０μｌのＰＢＳ中の８０μｌの水酸化アルミニウムゲル（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）とともに与えられた２００  １ｇの正常ヒツジＩｇＧ、１０μｌのＤＭＳＯ中の１００  １ｇのＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４（ＥＭＣ  Ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、または１０μｌのＤＭＳＯ単独を用いて腹腔内で免疫化した。これらの全ての組成物は、単一の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射として与えた。５日後、マウスに、疾患を誘発するために尾静脈を介して１６０μｌのＮＴＳの注射を与えた。リポペプチドおよびＮＴＳの用量は、他の生体内での研究および本発明者ら独自の予備的研究に使用したものに基づいた。疾患誘発の１４日後、マウスを殺傷し、血清のために失血させて、腎臓を回収した。１４日前に健康障害の兆候を示した何匹かのマウスは、地方条例に従って人道的に殺傷した。
【０１９１】
（糸球体損傷の組織学的分析）
腎臓試料を、ブアン液（Ｂｏｕｉｎ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）において４時間固定し、ホルマリンに移し、次いでパラフィン内で処理し、包埋した。断片を０．５μｍの厚さに切断し、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）試薬で染色した。次いで、全ての試料を、ＰＡＳ陽性物質の量の同定によって糸球体血栓症について盲目的に評価した。合計で、５０の糸球体を糸球体血栓症の兆候に関して各マウスについて評価し、スコアを以下のように各々に対して評価した：悪性度０、ＰＡＳ陽性物質なし；悪性度１、２５％；悪性度２、２５〜５０％、悪性度３、５０〜７５％、および悪性度４、７５〜１００％。次いで、各々のマウスについて平均糸球体血栓症スコアを計算した。断片をまた、糸球体半月について盲目的に評価した。合計で５０の糸球体を評価し、半月体（ボーマン嚢腔における細胞の２つ以上の層）の数を割合として評価した。
【０１９２】
（糸球体炎症の免疫組織化学的分析）
糸球体組織構造を、ＮＴＳでの疾患誘導の２時間および２４時間後に評価した。腎臓を、ブアン液において固定し、過ヨウ素酸シッフ試薬で染色した。２時間で、５０の糸球体の断面あたりの好中球（それらの特有の核形態によって同定した）の数を計測した。２４時間後、糸球体血栓症の量を、過ヨウ素酸シッフ陽性物質の量の同定により評価した。合計で、５０の糸球体を糸球体血栓症の兆候に関して各動物について評価し、スコアを以下のように割り当てた：悪性度０、過ヨウ素酸シッフ陽性物質なし；悪性度１、２５％未満；悪性度２、２５〜５０％；悪性度３、５０〜７５％；悪性度４、７５〜１００％。好中球および糸球体血栓症についてスコアした全ての断片は非常に盲目的に扱った。
【０１９３】
（アルブミン尿）
マウスを、採尿のために２４時間、代謝ケージに収容した。尿中アルブミン濃度を、放射状免疫拡散法により測定した。アルブミンについての放射状免疫拡散アッセイの感度は０．０５ｍｇ／ｍｌであった。尿試料を１：４０に希釈したので、値は標準曲線に位置した。
【０１９４】
雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＨａｒｌａｎから得た。体重は以下の表１に記載した。
【０１９５】
【表１】
2010532334.tif 000003
【０１９６】
１０μｇのリポペプチドＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４（ＥＭＣ微小採取）を含む２００μｌの腎毒性血清を、尾静脈を介して静脈内に投与した。この２時間前に、マウスを以下のように処置した。
【０１９７】
１〜５群に、腹腔内（ｉｐ）経路を介して、２．７３ｍｇ／ｍｌで発熱物質を含まない滅菌ＰＢＳに溶解した３０ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロンを与えた。従って、１９０μｌ＝５１９μｇを、１７．３ｇの平均体重に基づいて全てのマウスに与えた。
【０１９８】
６〜１０群に、静脈内に１９０μｌの発熱物質を含まない滅菌ＰＢＳを与えた。
【０１９９】
１１〜１５群に、アイソタイプコントロール抗体１０ｍｇ／ｋｇを静脈内に与えた。このアイソタイプコントロール抗体は、ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＭＡＢ００２）から購入したマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールであり、このアイソタイプコントロール抗体は、Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）抗原に結合特異性を有する。ＯＤを、０．８６ｍｇ／ｍｌであると示すように、再構成後に調べたので、２００μｌを、１７３μｇに均等にし、全てのマウスに与えた（１７．３ｇの平均体重に基づく）。
【０２００】
１６〜２０群に、抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ３０１、１０ｍｇ／Ｋｇを静脈内に０．９１ｍｇ／ｍｌの用量で、つまり、１９０μｌ＝１７３μｇを全てのマウスに投与した（１７．３ｇの平均体重に基づく）。ＯＰＮ３０１（ＯＰＮ−３０１）は、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体（マウスＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）抗体、クローンＴ２．５，ＨｙＣｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｂ．ｖ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，ＵＳＡ：カタログ番号１０５４）である。上記のマウスを、全白血球数および血液塗抹標本のために、麻酔下で尾静脈から出血させ、次いで、血を抜いた。
【０２０１】
１１〜１５群に、プレドニゾロン３０ｍｇ／ｋｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。２．７３ｍｇ／ｍｌにて発熱物質を含まない滅菌ＰＢＳに溶解した。つまり、２０７μｌ＝５６４μｇを全てのマウスに与えた（１８．８ｇの平均体重に基づく）。
【０２０２】
１６〜２０群に、２０７μｌの発熱物質を含まない滅菌ＰＢＳを静脈内に与えた。
【０２０３】
２１〜２４群に、アイソタイプコントロール抗体（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ００２）１０ｍｇ／ｋｇを静脈内に与えた。ＯＤを、再構成＝０．８６ｍｇ／ｍｌ後に調べた。つまり、２１９μｌ＝１８８μｇを全てのマウスに与えた（１８．８ｇの平均体重に基づく）。
【０２０４】
３６〜４０群に、１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ３０１を与えた。０．９１ｍｇ／ｍｌ、つまり、２０７μｌ＝１８８μｇを全てのマウスに与えた（１８．８ｇの平均体重に基づく）。
【０２０５】
上記の群を、疾患の誘導後すぐに代謝ケージに置き、２４時間後、麻酔下で血を抜いた。統計値をＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェアで実施した。一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を、Ｔｕｋｅｙの事後テストを用いて使用した。アルブミン尿および血栓症データを対数変換後に分析した。
【０２０６】
（結果）
（糸球体の好中球）
ＰＢＳまたはコントロール抗体で処置したマウスより、抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ３０１で前処置したマウスにおいて、２時間で、糸球体においてほとんど好中球は存在しなかった（表１、図１）。好中球の数は、プレドニゾロンで前処置されたマウスにおいて見られたものと同様であり、２時間での代表的な組織構造を図２に示す。
【０２０７】
（循環白血球）
ｏｐｎ３０１で処置したマウスの糸球体に見られた好中球の数のこの減少は、循環好中球の減少に起因しなかった。なぜなら、それらは、ＰＢＳまたはアイソタイプコントロール抗体で処置した群より抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ３０１で処置したマウスにおける方が低くなかったからである（表２、図３）。実際に、抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ３０１で処置したマウスにおいて好中球が多い傾向があり、ｔ検定を、抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ３０１と、アイソタイプコントロール抗体で処置したマウスとを比較するために使用した場合、有意性に到達した（ｐ＝０．０３）。ステロイドで処置したマウスにおける循環好中球の数は、他の群のものより多かった。これは、糸球体の数の顕著な増加が生じたからと考えられる。全血液白血球は、いかなる他の群においてよりも抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ３０１で処置したマウスにおいて多かった（表２、図４）。
【０２０８】
【表２】
2010532334.tif 000004
2010532334.tif 000005
【０２０９】
（アルブミン尿および糸球体血栓症）
ＰＢＳ、アイソタイプコントロール抗体またはステロイド処置したマウスにおいてより、抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ３０１で処置したマウスにおいてアルブミン尿および糸球体血栓症はほとんど存在しなかった（表３ならびに図５および図６）。ステロイドに起因するアルブミン尿の減少は、ＰＢＳまたはコントロール抗体で処置したマウスと比較した場合、有意性に達しなかった。ステロイドで処置したマウスは、コントロール抗体で処置したマウスを除いて、ＰＢＳより血栓症を著しく低下させた。示した数が、合計５０の中でいくらかの血栓症を示す糸球体の数であるため、糸球体血栓症はこのモデルにおいて特徴付けられないことは、留意されるべきである。２４時間での代表的な組織構造を図７に示す。
【０２１０】
【表３】
2010532334.tif 000006
2010532334.tif 000007
【０２１１】
（結論）
抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ３０１は、高用量ステロイドと同等であった糸球体炎症の減少を引き起こした。アルブミン尿および血栓症に対する効果は、ステロイドで見られたものより高かった。
【０２１２】
（実施例２）
（腎虚血）
報告する全ての実験は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｕｉｄｅ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  Ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，ワシントンＤＣ，１９９６）に記載されるように実施し、地域動物ケアおよび使用委員会によって承認され、Ｆｒｅｎｃｈ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  ｔｏ  Ｄｒ  Ｙａｒａ  Ｂａｒｒｅｉｒａ（Ｎ°３１−１２５  ６月８日付け，２００２，有効性＝５年）によって発行された脊椎動物の実験に関する現在の合法的な認可に従った。
【０２１３】
９つの実験群を以下のように使用した：
１）外科手術の１日後に屠殺した偽処置したマウス、ｎ＝６、
２）虚血／１日再灌流の１５分前にＰＢＳビヒクル処置したマウス、ｎ＝６、
３）虚血／１日再灌流の１５分前にアイソタイプコントロール抗体１０ｍｇ／ｋｇで処置したマウス、ｎ＝６（アイソタイプコントロール抗体は、ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入したマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールであり（カタログ番号ＭＡＢ００２）、このアイソタイプコントロール抗体はＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）抗原についての結合特異性を有する）、
４）虚血／１日再灌流の１５分前にＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体１０ｍｇ／ｋｇで処置したマウス、ｎ＝６、
５）虚血／１日再灌流の１５分前にパーギリン６ｍｇ／ｋｇで処置したマウス、ｎ＝６、
６）虚血／５日再灌流の１５分前にＰＢＳビヒクル処置したマウス、ｎ＝６、
７）虚血／５日再灌流の１５分前にアイソタイプコントロール抗体（ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＭＡＢ００２）１０ｍｇ／ｋｇで処置したマウス、ｎ＝６、
８）虚血／５日再灌流の１５分前にＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２抗体１０ｍｇ／ｋｇで処置したマウス、ｎ＝６、
９）虚血／５日再灌流の１５分前にパーギリン６ｍｇ／ｋｇで処置したマウス、ｎ＝６。
【０２１４】
（実験的温腎虚血／再灌流）
温腎虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）実験を、以前の研究から適用した（Ｓｔｏｋｍａｎら、２００５）。つまり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの野生型種を、２．５ｍｌケタミン（Ｋｅｔａｌａｒ  ５０ｍｇ／ｍｌ，Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ；Ｌａｐａｌｉｓｓｅ，フランス）、０．５ｍｌキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ  ２．５％，Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ；Ｌａｐａｌｉｓｓｅ，フランス）、および７ｍｌ  ＮａＣｌ０．９％（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ；Ｌａｐａｌｉｓｓｅ，フランス）の１０μｌ／ｇの混合物で麻酔した。外科手術の間、動物を３５℃のホットプレートに置いた。２ミリメートルの切開後、頸静脈を、考慮した処置の３００μｌ（１分注射）の静脈注射（インスリンシリンジ；ＶＷＲ、Ｆｏｎｔｅｎａｙ−ｓｏｕｓ−Ｂｏｉｓ，フランス）のために曝露した。切開を、止血後に閉じた（５／０  Ｅｔｈｉｃｒｉｎ  ｔｈｒｅａｄ，Ｅｔｈｉｃｏｎ；Ａｕｎｅａｕ，フランス）。３センチメートルの長さで腹部の皮膚および筋肉の切開を実施した；腎茎を曝露し、微細動脈瘤クランプ（ＡＲＥＸ；Ｐａｌａｉｓｅａｕ，フランス）を用いて、３０分間、固定した。クランプの取り付けおよび除去のときに、腎臓を、血流停止および回復のそれぞれについて調べた。腎虚血の持続期間全体を通して、熱の損失を回避し、相対的な腹内圧力を維持するために腹部を包んだ。２層で腹部を閉じ（５／０  Ｅｔｈｉｃｒｉｎ  ｔｈｒｅａｄ，Ｅｔｈｉｃｏｎ；Ａｕｎｅａｕ，フランス）、その時点で、マウスに１ｍｌの滅菌ＮａＣｌ０．９％を補い、体液平衡と容積状態を維持した。最後に、全てのマウスに、鎮痛剤目的のために１０ｍｇ／ｋｇプロフェニド（ｐｒｏｆｅｎｉｄ）５０ｍｇ／ｍｌ（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ；Ｌａｐａｌｉｓｓｅ，フランス）の筋肉内注射を与え、次いで、通気した温室中で３２℃で１２時間、外科手術から回復させた。食物および水を自由に与えた。偽処置したマウスを、クランプを取り付けずに同様の手順に供した。
【０２１５】
実験の終わりに、マウスを、外科手術の１日および５日後、ペントバルビタール（１００μｌ／１０ｇ、Ｃｅｖａ  Ｓａｎｔｅ  Ａｎｉｍａｌｅ；Ｌｉｂｏｕｒｎｅ，フランス）の致死注射により屠殺した。血液試料を、腹部大動脈穿刺によって回収し、凝固のためにチューブに移し（３０分、４℃）、次いで、血漿回収のために遠心分離（１０分、１２００ｒｐｍ、４℃）し、腎機能測定のために使用するまで−８０℃で保存した。腎臓を除去して、組織の調製（半分の腎臓をカルノア液−無水エタノール６０％：クロロホルム３０％：氷酢酸１％に移した）、生化学分析（２つの半分の腎臓を、液体窒素中で即座に凍結（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）し、次いで、ＭＰＯおよびＭＤＡ評価に使用するまで−８０℃で保存した）、およびサイトカイン／ケモカイン測定（半分の腎臓を、液体窒素中で即座に凍結（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）し、次いで、ＣｒｙｏＥｘｐｒｅｓｓ輸送によってスポンサーに送るまで−８０℃で保存した）のために分けた。
【０２１６】
全て、以下の分析は盲目的に行った。
【０２１７】
（腎機能）
腎機能の決定は、Ｒａｎｇｕｅｉｌ病院調査研究による標準的な診断手順に従って、Ｃｏｂａｓ  Ｍｉｒａ生化学分析装置（Ｈｏｒｉｂａ  ＡＢＸ；Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，フランス）での血漿のクレアチニンおよび尿素濃度の評価に基づく。結果を、尿素についてｍｍｏｌ／ｌおよびクレアチニンについてμｍｏｌ／Ｌとして表した。
【０２１８】
（虚血／再灌流障害評価についての組織構造）
カルノア液での２４時間の固定後、標準的な手順に従って半分の腎臓をパラフィンに包埋した。縦３〜４μｍ厚さの組織構造の切断を行い、ＰＡＳで染色した。手短に、断片を、パラフィンからはずし、水に再び戻し、次いで、１０分間、０．５％の過ヨウ素酸溶液中で酸化した（ＤＡＫＯ；Ｔｒａｐｐｅｓ，フランス）。リンス後、シッフ試薬（ＤＡＫＯ；Ｔｒａｐｐｅｓ，フランス）を１０分間加え、次いでシッフ塩基の減少を停止するために微温の水道水で５分間、洗浄した。対比染色を、マイヤー・ヘマトキシリン液（ＤＡＫＯ；Ｔｒａｐｐｅｓ，フランス）で２分間処理し、５分間水道水で洗浄し、次いで、急速に脱水し、染色した。
【０２１９】
損傷した尿細管を、皮髄領域における１０の非重複領域（４００倍）について、影響を受けた尿細管の割合の半定量スコアによって評価した。尿細管膨張、上皮壊死、円柱堆積（ｃａｓｔ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、および刷子縁の損失などの損傷基準を以下のようにし、５点のスケールで評価した：０％損傷について０、１０％未満損傷について１、１０〜２５％損傷について２、２５〜５０％損傷について３、５０〜７５％損傷について４、および７５％より高い損傷について５。
【０２２０】
（マクロファージ湿潤についての免疫組織学）
縦切片をまた、Ｆ４／８０免疫検出のために使用した。手短に、パラフィンを除去した切片を、３％の過酸化水素で１０分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。非特異的抗原部位を飽和した後、切片を、（ｉ）１５分間、マウスＦ４／８０に対するラットモノクローナル抗体（１／４００ｅ−Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，フランス）、（ｉｉ）１５分間、ラットＩｇＧに対するウサギポリクローナル抗体（１／８００ｅ−ＤＡＫＯ；Ｔｒａｐｐｅｓ，フランス）；次いで（ｉｉｉ）２０分間、標識されたＨＲＰ抗ウサギＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ；Ｔｒａｐｐｅｓ，フランス）とともに、加湿した雰囲気下において室温で連続してインキュベートした。
【０２２１】
特定の抗原部位を、ＤＡＢ（ＤＡＫＯ；Ｔｒａｐｐｅｓ，フランス）で明らかにした。切片を、マイヤー・ヘマトキシリン液（ＤＡＫＯ；Ｔｒａｐｐｅｓ，フランス）で対比染色した。免疫組織化学的方法についての陰性コントロールは、一次抗体Ｆ４／８０のコントロールアイソタイプ（ＩｇＧ２ａ，１／４００ｅ−Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，フランス）の使用を含んだ。分析を、各腎臓切片の源を知らない処置者によって実施し、組織学的コードの除去を記録の終わりに実施した。所定の画像内の選択された対象物の定量化を、ＥｘｐｌｏｒａＮｏｖａソフトウェアと合わせたＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌファイルに記録した。結果を、１０の非重複領域（２００倍）の全研究領域について、特定の有色領域の割合（％）で得て、それにより、皮髄境界部において分析マーカーによって占められた表面を表した。
【０２２２】
（酸化的ストレスの指標としてのマロンジアルデヒド産生の評価）
即座に凍結した半分の腎臓を、最初に、ＰＢＳおよびＰＭＳＦ  ２ｍＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）の混合物中で均質化し、次いで、ＭＤＡ濃度を、以前に記載される（Ａｒｕｏｍａら、１９８９）ように、ＭＤＡと２分子のチオバルビツール酸との間の反応由来の特定の色素原化合物の産生を定量化することにより、間接的に測定した。
【０２２３】
手短に、ホモジネートアリコートを、トリクロロ酢酸５％（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）と混合し、遠心分離した（２０分、４０００ｒｐｍ、４℃）。上清を、チオバルビツール酸７８ｍＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）およびＨＣｌ０．０２Ｍに加え、次いで、９５℃で１０分間加熱した。次いで、生成した色素原化合物を、５３５ｎｍ波長で分光光度法で測定した（Ｈｅｌｉｏｓ  β  Ｕｎｉｃａｍ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，フランス）。ＭＤＡビスメチルアセタール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）を外部標準として使用した。結果を、ｎｍｏｌ  ＭＤＡ／ｍｇタンパク質として表した。
【０２２４】
（好中球蓄積に関するミエロペルオキシダーゼ活性）
即座に凍結した半分の腎臓をまた、リン酸カリウム緩衝液５ｍＭの混合物中で均質化して、ペレット化（２０，０００ｇ、４５分、４℃）し、リン酸緩衝液５０ｍＭと臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム０．５％（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）との混合物中に懸濁して置いた。最後の遠心分離（２０，０００ｇ、４５分、４℃）により、酵素活性測定を続けていた上清中のＭＰＯ放出を終了した。
【０２２５】
手短に、ＭＰＯ活性を、リン酸緩衝液５０ｍＭ／ｐＨ６中のｏ−ジアニシジン二塩酸塩０．１６７ｍｇ／ｍＬ（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ；Ｎｏｉｓｙ  ｌｅ  Ｇｒａｎｄ，フランス）および過酸化水素０．１ｍＭを用いることによって間接的に測定した。生成物の吸光度を、４６０ｎｍ波長にて分光光度法で測定した（Ｈｅｌｉｏｓ  β  Ｕｎｉｃａｍ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，フランス）。結果を、タンパク質含有量に対する正規化後にＵ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質として表した。
【０２２６】
（結果の分析および発現）
結果を、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として与えた。一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を、群差内の比較のために使用し、続いて、カラムの全ての対の比較のためにＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を使用した。ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。
【０２２７】
（結果）
（温腎虚血／再灌流の効果）
Ｉ／Ｒの機能的影響を、尿素（図８Ａ）およびクレアチニン（図８Ｂ）などの重要な血漿パラメーターの測定により評価した。Ｉ／Ｒの１日後、偽処置した群と比較して、クレアチニン血症および尿毒症は、非常に増加し、腎機能障害を示した（ＰＢＳ−ビヒクルおよび偽処置群、それぞれにおいて、４７．５４±３．４９ｍｍｏｌ／Ｌ尿素および３７１．８３±２７．３４μｍｏｌ／Ｌクレアチニン対５．２１±０．３２ｍｍｏｌ／Ｌ尿素および４３．０２±１２．０１μｍｏｌ／Ｌクレアチニン；１群につきｎ＝６、＊＊＊Ｐ＜０．０１、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ））。
【０２２８】
機能の損失を、損傷した尿細管の割合によって評価した構造的発見と関連付けた（図９（Ｂ））。両側のＩ／Ｒの１日後、腎臓断片における尿細管損傷の程度は激しく、全皮質乳頭の勾配にまで広がり、髄質の外層だけではなかった（図９Ａ）；（１群につきｎ＝６、＊＊＊Ｐ＜０．０１、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ））。
【０２２９】
Ｉ／Ｒ損傷の重要な特徴の１つは、食細胞湿潤（マクロファージおよび好中球）に関連する急性炎症であるため、Ｆ４／８０免疫染色（図１０（Ａ））およびＭＰＯ活性（図１０（Ｂ））の定量化を実施した。Ｉ／Ｒの１日後、腎組織におけるマクロファージ湿潤およびＭＰＯ活性の増加を、虚血性障害の経時変化と関連付けた（ＰＢＳ−ビヒクルおよび偽処置した群、それぞれにおいて、３．２４±０．２１％  Ｆ４／８０陽性染色および６３．２±９．５５Ｕ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質対０．９１±０．１３％  Ｆ４／８０陽性染色および２０．７２±１．１８  Ｕ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質；＊＊＊Ｐ＜０．０１は偽処置した群と比較し、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１および＃＃＃Ｐ＜０．００１はＰＢＳ−ビヒクル群と比較し、§§§ｐ＜０．００１は、ＯＰＮ３０１  ＣｏｎｔＡｂと比較し、ｐ＜０．０５はＯＰＮ３０１モノクローナル抗体と比較した；１群あたりｎ＝６、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ））。
【０２３０】
酸化ストレス障害の指標として使用したＭＤＡ生成は、基底値と比較して、Ｉ／Ｒの１日後、有意に変化しなかった（ＰＢＳ−ビヒクルおよび偽処置した群、それぞれにおいて、０．０８２±０．００４ｎｍｏｌ  ＭＤＡ／ｍｇタンパク質対０．０８０±０．００５ｎｎｏｍ／ｍｇタンパク質（図１１）；＊＊＊Ｐ＜０．０１はＳｈａｍ処置した群と比較し、＃ｐ＜０．０５および＃＃＃ｐ＜０．００１はＰＢＳ−ビヒクル群と比較し、§ｐ＜０．００１はＯＰＮ３０１  ＣｏｎｔＡｂと比較した；１群につきｎ＝６、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ））。
【０２３１】
腎Ｉ／Ｒの５日後、第２のエンドポイントは、マウスの致死率が２日で約８０％で、４日で１００％であったため、評価しなかった。機能値を考慮すると、虚血３０分後の腎障害は、非常に広がったため、マウスが生存できず、腎機能が回復しなかったという結論に達した。全皮質乳頭の勾配がＩ／Ｒ障害の結果により破壊したので、組織学的分析により、この仮説を確認した。
【０２３２】
（虚血／再灌流の１日後の急性腎不全に対するＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体およびパーギリンの効果）
ＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体の効果をＩ／Ｒの１日後に分析した場合、直面する主な障害は、誘発される損傷の重症度、それによるモデルの厳密性である。実際に、機能的および組織学的観点から、本発明者らは実験群間で区別できなかった（図８および図９）。
【０２３３】
しかしながら、一部のパラメーターは、炎症に関連するもの、すなわち、腎組織におけるマクロファージ湿潤および好中球蓄積などの一部の後押しする示唆を与えた。マクロファージ湿潤を考慮すると（図１０（Ａ））、腎臓切片の免疫組織化学的分析により、ＰＢＳ−ビヒクル群と比較した場合、Ｆ４／８０陽性染色の減少が示された（ＯＰＮ３０１  ｍＡｂおよびＰＢＳ−ビヒクル群、それぞれにおいて、１．３８±０．１１％対３．２４±０．２１％、ｎ＝６、ｐ＜０．００１、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ））。好中球蓄積を考慮すると（図１０（Ｂ））、ＭＰＯ活性レベルは、ＰＢＳ−ビヒクル群と比較した場合、酵素活性の減少を示した（ＯＰＮ３０１  ｍＡｂおよびＰＢＳ−ビヒクル群、それぞれにおいて、２７．３２±１．９５Ｕ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質対６３．２±９．５５Ｕ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質、ｎ＝６、ｐ＜０．０１、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ））。
【０２３４】
アイソタイプコントロール抗体が、マクロファージ湿潤（アイソタイプコントロール抗体およびＰＢＳ−ビヒクル群、それぞれにおいて、２．６９±０．２７％対３．２４±０．２１％  Ｆ４／８０陽性染色、ｎ＝６、ｐ＜０．０５、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ）；図１０（３Ａ））および腎組織における好中球蓄積（アイソタイプコントロール抗体およびＰＢＳ−ビヒクル群、それぞれにおいて、３８．１±７．３４Ｕ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質および６３．２±９．５５Ｕ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質、ｎ＝６、ｐ＜０．０５、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ）；図１０（３Ｂ））を減少させることができるため、固有特性を有するように見えることは、注目すべきことであった。その活性は、マクロファージ湿潤の低下に関して著しくＯＰＮ３０１  ｍＡｂと異なっていたが（アイソタイプコントロール抗体およびＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナ抗体群、それぞれにおいて、２．６９±０．２７％対１．３８±０．１１％  Ｆ４／８０陽性染色；ｎ＝６、ｐ＜０．０００１、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ））、その効果は、ＭＰＯ活性での実験的抗体と著しく異なっていなかった（アイソタイプコントロール抗体およびＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体群、それぞれにおいて、３８．１±７．３４Ｕ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質対２７．３２±１．９５Ｕ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質；ｎ＝６、ｐ＜０．０００１、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ））。
【０２３５】
基準物質処置（パーギリン）は、腎組織における好中球蓄積に対して効果を有さなかった（パーギリンおよびＰＢＳ−ビヒクル群、それぞれにおいて、５３．４８±５．３４Ｕ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質対６３．２０±９．５５Ｕ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質；ｎ＝６；図１０（３Ｂ））。マクロファージ湿潤に対するその作用は、実験的ｍＡｂと同様であった（パーギリンおよびＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体群、それぞれにおいて、１．３９±０．１５％および１．３８±０．１１％  Ｆ４／８０陽性染色、ｎ＝６；図１０（３Ａ））。
【０２３６】
脂質過酸化反応を考慮すると、ＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体の投与により、基礎ＭＤＡレベルにおいて著しい減少がもたらされた（ＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体およびＰＢＳビヒクル群、それぞれにおいて、０．０４８±０．００２ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質対０．０８２±０．００４ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質；ｎ＝６、ｐ＜０．００１、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ）；図１１）。しかしながら、再び、アイソタイプコントロール抗体が、ＭＤＡレベルに対して同様の効果を有することは、考慮されなければならない（アイソタイプコントロール抗体およびＰＢＳ−ビヒクル群、それぞれにおいて、０．０４６±０．００２ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質対０．０８２±０．００４ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質；ｎ＝６、Ｐ＜０．００１、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ）；図１１）。
【０２３７】
パーギリンを用いる基準物質処置に関して、ＭＤＡレベルによって示されるように、虚血／再灌流によって誘発された酸化的ストレスの予想された減少が導かれた（パーギリンおよびＰＢＳ−ビヒクル群、それぞれにおいて、０．０５１±０．００２ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質対０．０８２±０．００４ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質；ｎ＝６、ｐ＜０．００１、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ）；図１１）。
【０２３８】
（結論）
実施例２により、腎臓の温虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）が、尿細管壊死によって主に特徴付けられる全皮質乳頭の勾配に沿った著しい損傷と直接的に関連付けられ得るクレアチニン血症および尿毒症の増加によって特徴付けられる腎機能の大きな損失を誘発したことが示される。このモデルの唯一の批判は、処置効果と機能的または構造的観点との区別ができなかったその重症度であった。実際に、初期の急性腎不全の虚血性病変は可逆ではなかったため、尿細管細胞損失は埋め合わされず、虚血性急性腎不全は、末期腎不全へ急速に発達し、動物は死んだ。しかしながら、マクロファージ湿潤、好中球蓄積、および脂質過酸化反応の指標として使用した一部の生化学マーカーは、虚血腎障害において、ＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体処置の有用性を支持して納得させる結果を示した。実際に、ＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体の有益な効果は、コントロール抗体の顕著な固有特性、特にＭＰＯ活性およびＭＤＡレベルにもかかわらず、これらのパラメーターで示された。
【０２３９】
（実施例３：腎虚血反復研究）
５つの実験群を以下の工程１において使用した：
１）偽処置したマウスを外科手術の１日後に屠殺した、ｎ＝４、
２）２０分の虚血／１日再灌流、ｎ＝４、
３）２０分の虚血／５日再灌流、ｎ＝４、
４）２５分の虚血／１日再灌流、ｎ＝４、
５）２５分の虚血／１日再灌流、ｎ＝４。
【０２４０】
９つの実験群を工程２において使用した：
１）偽処置したマウスを外科手術の１日後に屠殺した、ｎ＝６、
２）虚血／１日再灌流の１５分前にＰＢＳ−ビヒクル処置したマウス、ｎ＝６、
３）２５分虚血／１日再灌流の１５分前にアイソタイプコントロール抗体１０ｍｇ／ｋｇ処置したマウス、ｎ＝６（アイソタイプコントロール抗体は、ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＭＡＢ００２）から購入したマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールであり、このアイソタイプコントロール抗体は、Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）抗原について結合特異性を有する）、
４）２５分の虚血／１日再灌流の１５分前にＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体１０ｍｇ／ｋｇ処置したマウス、ｎ＝６、
５）２５分虚血／１日再灌流の１５分前にパーギリン６ｍｇ／ｋｇ処置したマウス、ｎ＝６、
６）２５分虚血／１日再灌流の１５分前にＰＢＳ−ビヒクル処置したマウス、ｎ＝６、
７）２５分虚血／５日再灌流の１５分前にアイソタイプコントロール抗体（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号ＭＡＢ００２）１０ｍｇ／ｋｇで処置したマウス、ｎ＝６、
８）２５分虚血／５日再灌流の１５分前にＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体１０ｍｇ／ｋｇで処置したマウス、ｎ＝６、
９）２５分虚血／５日再灌流の１５分前にパーギリン６ｍｇ／ｋｇで処置したマウス、ｎ＝６。
【０２４１】
（実験的温腎虚血／再灌流（工程１および２））
手短に、マウスを、２．５ｍｌケタミン（Ｋｅｔａｌａｒ  ５０ｍｇ／ｍＬ，Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ；Ｌａｐａｌｉｓｓｅ，フランス）、０．５ｍｌキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ  ２．５％，Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ；Ｌａｐａｌｉｓｓｅ，フランス）、および７ｍＬ  ＮａＣｌ  ０．９％（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ；Ｌａｐａｌｉｓｓｅ，フランス）の１０μｌ／ｇの混合物で麻酔した。外科手術の間、動物を３５℃のホットプレートに置いた。
【０２４２】
２ミリメートルの切開を右側の頸部の高さで行った後に、頸静脈を、考慮した処置の７０μｌの１分の静脈注射（インスリンシリンジ；ＶＷＲ，Ｆｏｎｔｅｎａｙ−ｓｏｕｓ−Ｂｏｉｓ，フランス）の間、曝露し、次いで止血後に閉じた（５／０  Ｅｔｈｉｃｒｉｎ  ｔｈｒｅａｄ，Ｅｔｈｉｃｏｎ；Ａｕｎｅａｕ，フランス）。工程１においては、頸部注射を実施しなかった。
【０２４３】
３センチメートルの正中線切開を腹部の皮膚に行い、続いて筋肉切開を行った；腎茎を曝露し、微細動脈瘤クランプ（ＡＲＥＸ；Ｐａｌａｉｓｅａｕ，フランス）を用いて２５分間固定した。クランプの取り付けおよび除去の時点で、腎臓を、血流停止および回復のそれぞれについて調べた。腎虚血持続期間の間、腹部を、熱の損失を回避し、相対的な腹内圧力を維持するために包んだ。２層で腹部を閉じ（５／０  Ｅｔｈｉｃｒｉｎ  ｔｈｒｅａｄ，Ｅｔｈｉｃｏｎ；Ａｕｎｅａｕ，フランス）、その時点で、マウスを１ｍＬの滅菌ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）０．９％で補って、体液平衡および容積状態を維持した。最後に、全てのマウスに、鎮痛剤の目的のために１０ｍｇ／ｋｇのプロフェニド５０ｍｇ／ｍＬ（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ；Ｌａｐａｌｉｓｓｅ，フランス）の筋肉内注射を与え、次いで、通気した温室内で３２℃で１２時間、外科手術から回復させた。食物および水を自由に与えた。偽処置したマウスを、固定せずに同様の手順に供した。
【０２４４】
この手順の終わりに、マウスを、外科手術の１日および５日後、ペントバルビタール（１００μＬ／１０ｇ、Ｃｅｖａ  Ｓａｎｔｅ  Ａｎｉｍａｌｅ；Ｌｉｂｏｕｒｎｅ，フランス）の致死注射により屠殺した。
【０２４５】
実施例２に記載される尿素、クレアチニン、ＭＰＯおよびＭＤＡなどの実験方法。
【０２４６】
（結果の分析および発現）
結果を、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として与えた。一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を、群差内の比較のために使用し、続いて、カラムの全ての対の比較のためにＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を使用した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）。ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。
【０２４７】
（結果）
工程１：温腎虚血の最適期間の決定
Ｉ／Ｒの機能的影響を、尿素（図１２（Ａ））およびクレアチニン（図１２（Ｂ）、表４）などの重要な血漿パラメーターの測定により評価した。２０分の虚血持続期間の間、血漿パラメーターレベルの変化は、気づかなかった。しかしながら、２５分の虚血が行われた場合、腎機能の損失、次いで、急性腎不全モデルを特徴付ける回復が得られたことが示された。実際に、２５分の虚血の１日後、尿毒症およびクレアチニン血症は、偽処置した群と比較して著しく増加し、腎機能障害を示した（２５分の虚血１日および偽処置した群、それぞれにおいて、３９．５８±２．２３ｍｍｏｌ／Ｌ尿素および１４２．１８±２０．７４μｍｏｌ／Ｌクレアチニン対６．９９±０．５５ｍｍｏｌ／Ｌ尿素および２３．２０±２．４４μｍｏｌ／Ｌクレアチニン；＊＊＊Ｐ＜０．００１は２５分虚血１日群と比較した；１群あたりｎ＝４；分散分析（ＡＮＯＶＡ）後、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験）。次いで、予想されるように、虚血の５日後、血漿パラメーターレベルは、基底値に戻った（２５分の虚血５日および偽処置した群、それぞれにおいて、１６．１４±４．３７ｍｍｏｌ／Ｌ尿素および３６．８３±５．５２μｍｏｌ／Ｌクレアチニン対６．９９±０．５５ｍｍｏｌ／Ｌ尿素および２３．２０±２．４４μｍｏｌ／Ｌクレアチニン；ｎ＝４）。
【０２４８】
表４：工程１：１日および５日での尿毒症（上）およびクレアチニン血症（下）についての個々のデータおよび平均の結果。
【表４】
2010532334.tif 000008
【０２４９】
これらの機能的変化を、損傷した尿細管の割合によって評価される構造的損傷と関連付けた（図１３、表５）。データを、平均±ＳＥＭとして表した；＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１は２５分の虚血５日の群と比較し、＊＊＊ｐ＜０．００１は２５分の虚血１日の群と比較した；１群あたりｎ＝４；分散分析（ＡＮＯＶＡ）後、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験。両側の虚血の１日後、腎臓断片における尿細管損傷の程度は有意であり、皮髄境界部に限定された。虚血の５日後、尿細管障害は依然として識別できたが、皮質領域に限定され、尿細管再生と関連した。５日目で気づいた病変は、１日目のものほどほとんど重症でなかった；例えば、刷子縁または尿細管細胞の損失および円柱堆積（ｃａｓｔ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、尿細管拡張と比べてほとんど／全く検出されなかった。
【０２５０】
表５：工程１：損傷尿細管の割合のスコアについての個々のデータおよび平均の結果
【表５】
2010532334.tif 000009
【０２５１】
両方のエンドポイントにおけるいかなる機能障害にもかかわらず、２０分の虚血が行われた場合、虚血障害の結果が腎組織で観察されたことは、注目すべきことである。さらに、２５分の虚血が、急性腎不全からの特徴である、機能障害の可逆性と、構造変化とを結びつけるのに必要であり、かつ十分であった。最終的に、２５分と３０分との間の５分間隔が、処置間の識別が可能でない最終段階の腎疾患における急性腎不全モデルを変換するのに十分であった。
【０２５２】
工程２：急性腎不全に対するＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体およびパーギリンの効果
血漿パラメーターは、２５分の虚血後に追跡調査し（図１４（Ａ）および１４（Ｂ））、ＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体が、虚血性障害によって誘発される腎機能障害に対して予防効果を有することが示された。なぜなら、尿毒症およびクレアチニン血症は、陽性コントロール群と比較した場合、虚血１日（Ｄ１）後に増加しなかったからである（抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体Ｄ１およびＰＢＳ−ビヒクルＤ１群、それぞれにおいて、１３．１０±３．１５ｍｍｏｌ／Ｌ尿素および４８．４７±１６．４１μｍｏｌ／Ｌクレアチニン対３１．０５±５．７０ｍｍｏｌ／Ｌ尿素および９９．９７±２５．６４μｍｏｌ／Ｌクレアチニン（表６ＡおよびＢ））。アイソタイプコントロール抗体について（ＯＰＮ３０１ＣｏｎｔＡｂ  Ｄ１およびＰＢＳ−ビヒクルＤ１群、それぞれにおいて、３１．２２±３．３７ｍｍｏｌ／Ｌ尿素および９５．５５±１６．８０μｍｏｌ／Ｌクレアチニン対３１．０５±５．７０ｍｍｏｌ／Ｌ尿素および９９．９７±２５．６４μｍｏｌ／Ｌクレアチニン、ｎ＝６）、およびパーギリンについても観測されなかったので（パーギリンＤ１およびＰＢＳ−ビヒクルＤ１群、それぞれにおいて、３３．７２±５．６４ｍｍｏｌ／Ｌ尿素および１０４．７±２５．２０μｍｏｌ／Ｌクレアチニン対３１．０５±５．７０ｍｍｏｌ／Ｌ尿素および９９．９７±２５．６４μｍｏｌ／Ｌクレアチニン；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１はＰＢＳ−ビヒクルＤ１群と比較し、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１はアイソタイプコントロール抗体Ｄ１群と比較し、§ｐ＜０．０５、§§ｐ＜０．０１、§§§ｐ＜０．００１はパーギリン群と比較した；１群につきｎ＝６；分散分析（ＡＮＯＶＡ）後、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験）、この効果は、ＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体から明確であった。
【０２５３】
表６：工程２：２５分の虚血の１日後、および５日後の尿毒症（Ａ）およびクレアチニン血症（Ｂ）についての個々のデータおよび平均の結果
【表６】
2010532334.tif 000010
【０２５４】
５日で処置間の差はなかった；予測されるように、再生段階が機能的に関与した。炎症、主に腎組織における好中球蓄積に関連するパラメーターを考慮すると（図１５、表７）、虚血の１日後、ＰＢＳ−ビヒクルと群と比較した場合、ＭＰＯ活性の変化がないことが証明された（ＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体Ｄ１およびＰＢＳ−ビヒクルＤ１群、それぞれにおいて、８４．０３±４．１０Ｕ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質対８０．４５±８．６６Ｕ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質；£ｐ＜０．０５、££ｐ＜０．０１はパーギリンＤ５群と比較した。§ｐ＜０．０５はＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体Ｄ５群と比較した。＃Ｐ＜０．０５はＰＢＳ−ビヒクルＤ５群と比較し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１はＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体Ｄ１群と比較した；１群につきｎ＝６；分散分析（ＡＮＯＶＡ）後、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験）。同じエンドポイントにおいて、パーギリンでの基準物質処置は、ＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体と比較した場合、このパラメーターに対して最も強い効果を有した（パーギリンＤ１（１日）およびＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体（ＯＰＮ３０１ｍＡｂ）Ｄ１（１日）群、それぞれにおいて、５７．３７±５．７８Ｕ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質対８４．０３±４．１０Ｕ  ＭＰＯ／ｍｇタンパク質）。虚血の５日後、腎組織におけるＭＰＯ活性は、ＰＢＳ−ビヒクルＤ１群と比較した場合、４つの異なる群で減少した。
【０２５５】
表７：１日および５日後の好中蓄積の指標としてのＭＰＯ活性についての個々のデータおよび平均の結果
【表７】
2010532334.tif 000011
【０２５６】
統計分析を、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）後のＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いて実施した。
【０２５７】
表８：脂質過酸化反応の指標としてのＭＤＡレベルについての個々のデータおよび平均の結果
【表８】
2010532334.tif 000012
【０２５８】
図１７は、組織学的スコアの測定による腎臓における尿細管損傷の程度を示す。両側のＩ／Ｒの１日後、ＯＰＮ３０１  ｍＡｂとの比較に役立つコントロールおよびＰＢＳ−ビヒクル試料における尿細管障害の程度；（１群につきｎ＝６、＊＊＊ｐ＜０．０１、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験を用いるＡＮＯＶＡ）、μ−ＧＳＴμｇ／Ｌ、マウス腎臓における尿細管損傷の指標を、腎虚血／再灌流の０日、１日および５日後に測定した（図１８）。
【０２５９】
（結論）
本研究において、始めに、マウスにおいて、温腎虚血の最適期間は２５分であることが示された。このプロトコルは、１日で明らかな腎機能障害を誘発し、急性腎不全モデルにおいて予想されるように、５日で回復した。構造的観点から、２５分の虚血が行われた場合、尿細管損傷は、１日目に皮髄境界部にのみ限定され、その後、皮質領域に影響を与え、５日目に再生した。第２に、工程２における本発明者らの機能的結果により、ＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体１０ｍｇ／ｋｇでの処置が、虚血の１日後の虚血障害によって誘導される腎機能変化に対する保護および特異的効果を有することが示された。好中球蓄積（ＭＰＯ）および酸化的ストレス（ＭＤＡ）の結果は、ＯＰＮ３０１ｍＡｂ処置のいかなる陽性の効果も現さなかった。しかしながら、本発明者らがまた、偽と虚血−再灌流動物（この動物は異常である）との間の有意差を観測しなかったという事実により、異なる実験条件（例えば、異なる虚血−再灌流の期間）が必要であり得ることが示唆される。さらに、ラットにおけるＩ／Ｒモデルを用いる本発明者らの以前の研究（Ｋｕｎｄｕｚｏｖａら、２００２）とは際立って対照的に、パーギリンでの処置が効果を有さなかったという事実により、種差が考慮されなければならないことが示唆される。結論として、この研究は、急性腎不全、すなわち、虚血１日後の処置におけるＯＰＮ３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体の使用についての概念の最初の証明である。
【図１】
2010532334.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
2010532334.tif 000016
【図５】
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【図６】
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【図７】
2010532334.tif 000019
【図８Ａ】
2010532334.tif 000020
【図８Ｂ】
2010532334.tif 000021
【図９Ａ】
2010532334.tif 000022
【図９Ｂ】
2010532334.tif 000023
【図１０Ａ】
2010532334.tif 000024
【図１０Ｂ】
2010532334.tif 000025
【図１１】
2010532334.tif 000026
【図１２Ａ】
2010532334.tif 000027
【図１２Ｂ】
2010532334.tif 000028
【図１３Ａ】
2010532334.tif 000029
【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
2010532334.tif 000033
【図１６】
2010532334.tif 000034
【図１７】
2010532334.tif 000035
【図１８Ａ】
2010532334.tif 000036
【図１８Ｂ】
2010532334.tif 000037
【図１８Ｃ】
2010532334.tif 000038
【図１９】
2010532334.tif 000039
【図２０】
2010532334.tif 000040
【図２１】
2010532334.tif 000041
【配列表】
2010532334000001.app
【国際調査報告】
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