(57)【要約】  アルファ−ＭＳＨ活性およびナトリウム利尿ペプチド活性を示す二機能性ホルモンを記載する。本二機能性ホルモンは、例えば、ナトリウム利尿ペプチド関連ホルモン活性を有する第二ドメインに共有結合で連結された、アルファ−ＭＳＨ関連ホルモン活性を有する第一ドメインを含む。本発明の二機能性ホルモンは、例えば、腎臓関連疾患または状態、例えば急性腎不全（ＡＲＦ）または急性腎臓損傷（ＡＫＩ）の予防および／または治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アルファ−ＭＳＨペプチドもしくはそのフラグメント、変異体、またはフラグメントの変異体を含む第一ドメイン（前記フラグメント、変異体またはフラグメントの変異体は、アルファ−ＭＳＨ関連ホルモン活性を有する）；および
（ｂ）前記第一ドメインに共有結合で連結された第二ドメイン（前記第二ドメインは、ナトリウム利尿ペプチドもしくはそのフラグメント、変異体、またはフラグメントの変異体を含み、該フラグメント、変異体またはフラグメントの変異体は、ナトリウム利尿ペプチド関連ホルモン活性を有する）
を含む、二機能性ホルモン。
【請求項２】
前記第一ドメインが、配列番号：１のアルファ−ＭＳＨペプチドであるとき、前記第二ドメインが、前記ナトリウム利尿ペプチド関連ホルモン活性を有するフラグメント、変異体またはフラグメントの変異体であり、および前記第二ドメインが、配列番号：２、３、４または５のナトリウム利尿ペプチドである場合、前記第一ドメインが、前記アルファ−ＭＳＨ関連ホルモン活性を有するフラグメント、変異体またはフラグメントの変異体である、請求項１に記載の二機能性ホルモン。
【請求項３】
前記第一ドメインが、配列番号：１のペプチドの少なくとも４アミノ酸のフラグメント、または該フラグメントとの少なくとも７５％の相同性を有する該フラグメントの変異体を含む、請求項１に記載の二機能性ホルモン。
【請求項４】
前記アルファ−ＭＳＨペプチドの変異体が、配列番号：１のアミノ酸配列との少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の二機能性ホルモン。
【請求項５】
前記第一ドメインが、式Ｉのアミノ酸配列（配列番号：４７）：
Ｘ２−Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｘ３        （Ｉ）
（式中、
Ｘ１は、Ｌ−ＰｈｅまたはＤ−Ｐｈｅであり；
Ｘ２は、Ｅ、Ｍ−Ｅであるか、非存在であり；
Ｘ３は、Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｘ４、Ｇ−Ｋ−Ｐ、Ｇ−Ｋ、Ｇであるか、非存在であり；
Ｘ４は、Ｍ、ＶまたはＮｌｅである）
を含む、請求項１または２に記載の二機能性ホルモン。
【請求項６】
前記第一ドメインが、
（ｉ）Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｘ４（配列番号：４８）；
（ｉｉ）Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：１７）；
（ｉｉｉ）Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：４９）；
（ｉｖ）Ｅ−Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：５０）；または
（ｖ）Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ（配列番号：２０）
（この場合、Ｘ１は、Ｌ−ＰｈｅまたはＤ−Ｐｈｅであり、およびＸ４は、Ｍ、ＶまたはＮｌｅである）
を含む、請求項３に記載の二機能性ホルモン。
【請求項７】
前記第一ドメインが、
（ｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｖ（配列番号：５１）；
（ｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ（配列番号：５２）；
（ｉｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ（配列番号：５３）；
（ｉｖ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ（配列番号：５４）；
（ｖ）Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：１１）；
（ｖｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：５５）；
（ｖｉｉ）Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ（配列番号：５６）；
（ｉｘ）Ｅ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：５７）；または
（ｉｖ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ（配列番号：６）
（この場合、ｆは、Ｄ−フェニルアラニンである）
を含む、請求項４に記載の二機能性ホルモン。
【請求項８】
前記第一ドメインが、
（ｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｖ（配列番号：５１）；
（ｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ（配列番号：５２）；
（ｉｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ（配列番号：５３）；
（ｉｖ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ（配列番号：５４）；
（ｖ）Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：１１）；
（ｖｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：５５）；
（ｖｉｉ）Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ（配列番号：５６）；
（ｉｘ）Ｅ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：５７）；または
（ｉｖ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ（配列番号：６）
（この場合、ｆは、Ｄ−フェニルアラニンである）
から成る、請求項５に記載の二機能性ホルモン。
【請求項９】
前記第二ドメインが、配列番号：２、配列番号：３、配列番号４または配列番号：５の少なくとも１５アミノ酸のフラグメント、または該フラグメントとの少なくとも７５％の相同性を有する該フラグメントの変異体を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の二機能性ホルモン。
【請求項１０】
前記ナトリウム利尿ペプチドの変異体が、配列番号：２、配列番号：３、配列番号４または配列番号：５のアミノ酸配列との少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の二機能性ホルモン。
【請求項１１】
第二ドメインが、式ＩＩのアミノ酸配列（配列番号：５８）：
Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｘ８−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｘ９      （ＩＩ）
を含み、この式中、
Ｘ５は、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ、Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓであるか、非存在であり；
Ｘ６は、Ｃであり；
Ｘ７は、Ｈであるか、非存在であり；
Ｘ８は、ＭまたはＮｌｅであり；
Ｘ９は、Ｓ−Ｃ−Ｙ−ＲまたはＧ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙであり；この場合、
Ｘ６のＣ残基は、Ｘ９のＣ残基と共にジスルフィド架橋を形成しており；および
Ｘ５が、Ｎｌｅであるとき、前記第一ドメインは、該第二ドメインのＮ末端側にある、
請求項１から１０のいずれか一項に記載の二機能性ホルモン。
【請求項１２】
前記第二ドメインが、
（ｉ）Ｍ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置２および１３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２２）；
（ｉｉ）Ｎｌｅ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置２および１３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２３）；
（ｉｉｉ）Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１および１７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２４）；
（ｉｖ）Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１および１７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２５）；
（ｖ）Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置５および２１のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２６）；
（ｖｉ）Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置７および２３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：５９）；または
（ｖｉｉ）Ｍ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置２および１８のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６０）
を含む、請求項１１に記載の二機能性ホルモン。
【請求項１３】
前記第二ドメインが、
（ｉ）Ｍ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置２および１３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２２）；
（ｉｉ）Ｎｌｅ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置２および１３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２３）；
（ｉｉｉ）Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１および１７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２４）；
（ｉｖ）Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１および１７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２５）；
（ｖ）Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置５および２１のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２６）；
（ｖｉｉ）Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置７および２３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：５９）；または
（ｖｉｉｉ）Ｍ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置２および１８のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６０）
から成る、請求項１２に記載の二機能性ホルモン。
【請求項１４】
前記第一ドメインが、前記第二ドメインのＮ末端側にある、請求項１から１３のいずれか一項に記載の二機能性ホルモン。
【請求項１５】
二機能性ホルモンのアミノ末端残基が、Ｃ２〜Ｃ１６アシル基でアシル化される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の前記二機能性ホルモン。
【請求項１６】
二機能性ホルモンのアミノ末端残基が、アセチル化される、請求項１５に記載の前記二機能性ホルモン。
【請求項１７】
二機能性ホルモンのカルボキシ末端残基が、アミド化される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の前記二機能性ホルモン。
【請求項１８】
前記第一および第二ドメインが、ペプチド結合によって共有結合で連結される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の前記二機能性ホルモン。
【請求項１９】
前記二機能性ホルモンが、
（ｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置９および２０のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６１）；
（ｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置９および２５のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６２）；
（ｉｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置９および２０のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６３）；
（ｉｖ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置９および２５のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６４）；
（ｖ）Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１２および２８のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６５）；
（ｖｉ）Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１０および２６のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６６）；
（ｖｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１０および２６のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６７）；または
（ｖｉｉｉ）Ｅ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１１および２７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６９）
（この場合、ｆは、Ｄ−フェニルアラニンである）
を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の二機能性ホルモン。
【請求項２０】
前記二機能性ホルモンが、
（ｉ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ−ＮＨ２（この場合、位置９および２０のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３１）；
（ｉｉ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置９および２５のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３３）；
（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ−ＮＨ２（この場合、位置９および２０のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３４）；
（ｉｖ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置９および２５のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３５）；
（ｖ）Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置１２および２８のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３６）；
（ｖｉ）Ａｃ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置１０および２６のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３８）；
（ｖｉｉ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置１０および２６のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３９）；または
（ｖｉｉｉ）Ａｃ−Ｅ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置１１および２７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：４２）
（この場合、
Ａｃは、アミノ末端アセチル化を表し、
ＮＨ２は、カルボキシ末端アミド化を表し；および
ｆは、Ｄ−フェニルアラニンである）
から成る、請求項１９に記載の二機能性ホルモン。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の二機能性ホルモンと医薬的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項２２】
被験体における腎障害を予防および／または治療するための、請求項１から２０のいずれか一項に記載の二機能性ホルモン。
【請求項２３】
被験体における高血圧を予防および／または治療するための、請求項１から２０のいずれか一項に記載の二機能性ホルモン。
【請求項２４】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の二機能性ホルモンと医薬的に許容される担体とを含む、被験体における腎障害を予防および／または治療するための医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の二機能性ホルモンと医薬的に許容される担体とを含む、被験体における高血圧を予防および／または治療するための医薬組成物。
【請求項２６】
被験体における腎障害を予防および／または治療するための方法であって、（ａ）請求項１から２０のいずれか一項に記載の二機能性ホルモンまたは（ｂ）請求項２１に記載の組成物、の少なくとも一方の有効量を該被験体に投与することを含む方法。
【請求項２７】
前記腎障害が、急性腎臓損傷である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記腎障害が、術後腎臓損傷または機能障害である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記術後腎臓損傷または機能障害が、弁修復のための心肺バイパス手術、大動脈瘤、臓器移植、開心術または冠動脈移植に起因する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記投与が、静脈内注入によるものである、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記静脈内注入が、約１ｎｇ／ｋｇ／分から約１０μｇ／ｋｇ／分の速度でのものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
被験体における高血圧を予防および／または治療するための方法であって、（ａ）請求項１から２０のいずれか一項に記載の二機能性ホルモンまたは（ｂ）請求項２１に記載の組成物、の少なくとも一方の有効量を該被験体に投与することを含む方法。
【請求項３３】
被験体における腎障害を予防および／または治療するための薬物の調製のための、（ａ）請求項１から２０のいずれか一項に記載の二機能性ホルモンまたは（ｂ）請求項２１に記載の組成物、の少なくとも一方の使用。
【請求項３４】
被験体における腎障害を予防および／または治療するための、（ａ）請求項１から２０のいずれか一項に記載の二機能性ホルモンまたは（ｂ）請求項２１に記載の組成物、の少なくとも一方の使用。
【請求項３５】
被験体における高血圧を予防および／または治療するための、（ａ）請求項１から２０のいずれか一項に記載の二機能性ホルモンまたは（ｂ）請求項２１に記載の組成物、の少なくとも一方の使用。
【請求項３６】
被験体における高血圧を予防および／または治療するための薬物の調製のための、（ａ）請求項１から２０のいずれか一項に記載の二機能性ホルモンまたは（ｂ）請求項２１に記載の組成物の少なくとも一方の使用。
【請求項３７】
前記腎障害が、急性腎臓損傷である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記腎障害が、術後腎臓損傷または機能障害である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記術後腎臓損傷または機能障害が、弁修復のための心肺バイパス手術、大動脈瘤、臓器移植、開心術または冠動脈移植に起因する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記二機能性ホルモンまたは組成物が、静脈内注入による投与に適応させたものである、請求項３３から３９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４１】
前記二機能性ホルモンまたは組成物が、約１ｎｇ／ｋｇ／分から約１０μｇ／ｋｇ／分の速度での静脈内注入による投与に適応させたものである、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
薬物の調製のための、（ａ）請求項１から２０のいずれか一項に記載の二機能性ホルモンまたは（ｂ）請求項２１に記載の組成物、の少なくとも一方の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、合衆国法典３５巻１１９条（ｅ）項のもと、２００７年７月６日に出願された米国特許仮出願番号６０／９４８，２９２の利益を主張するものである。当該仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、一般には、ホルモン活性を示す新規化合物およびその使用に関し、ならびに特に、二機能性ホルモン活性を示す新規化合物、および例えば急性腎不全（ＡＲＦ）および急性腎臓損傷（ＡＫＩ）などの腎臓関連疾患または状態の予防および／または治療のための、それらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
急性腎不全（ＡＲＦ）は、尿量の減少によって顕示される、数時間から数日にわたる急激な腎機能低下である。窒素老廃物が蓄積し、その結果、電解質および体液恒常性を著しく変化させる。急性腎不全は、虚血性損傷または直接腎毒性を誘導する多種多様な臨床状態または薬物療法の結果として生じ得る。大手術手順、感染、ショック、分娩後出血および不適当な腎潅流が尿量減少の原因となる場合もある。急性腎不全は、血清クレアチニンの上昇によって診断される。重症患者の場合、その高異化状態が、窒素老廃物の急増（血液尿素窒素（ＢＵＮ）の増加によって表される）、および体液過負荷につながる体液平衡の激しい変動を引き起こす場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＡＲＦなどの腎臓関連疾患または病気の予防または治療のための手順およびアプローチの特定が、引き続き必要とされている。
【０００５】
本明細書は、多数の文献を引用しており、それらの内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一般には、ホルモン活性を示す新規化合物およびその使用に関し、ならびに特に、二機能性ホルモン活性を示す新規化合物およびそれらの使用に関する。
【０００７】
第一の態様において、本発明は、
（ａ）アルファ−ＭＳＨペプチドもしくはそのフラグメント、変異体、またはフラグメントの変異体を含む第一ドメイン（前記フラグメント、変異体またはフラグメントの変異体は、アルファ−ＭＳＨ関連ホルモン活性を有する）；および
（ｂ）前記第一ドメインに共有結合で連結された第二ドメイン（前記第二ドメインは、ナトリウム利尿ペプチドもしくそのフラグメント、変異体、またはフラグメントの変異体を含み、該フラグメント、変異体またはフラグメントの変異体は、ナトリウム利尿ペプチド関連ホルモン活性を有する）
を含む、二機能性ホルモンを提供する。
【０００８】
１つの実施形態において、第一ドメインが、配列番号：１のアルファ−ＭＳＨペプチドであるとき、第二ドメインは、ナトリウム利尿ペプチド関連ホルモン活性を有するフラグメント、変異体またはフラグメントの変異体であり、および第二ドメインが、配列番号：２、３、４または５のナトリウム利尿ペプチドであるとき、第一ドメインは、アルファ−ＭＳＨ関連ホルモン活性を有するフラグメント、変異体またはフラグメントの変異体である。
【０００９】
１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、配列番号：１のペプチドの少なくとも４アミノ酸のフラグメント、または該フラグメントとの少なくとも７５％の相同性を有する該フラグメントの変異体を含む。
【００１０】
１つの実施形態において、上述のアルファ−ＭＳＨペプチドの変異体は、配列番号：１のアミノ酸配列との少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１１】
１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、式Ｉのアミノ酸配列（配列番号：４７）：
Ｘ２−Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｘ３        （Ｉ）
を含み、この式中、
Ｘ１は、Ｌ−ＰｈｅまたはＤ−Ｐｈｅであり；
Ｘ２は、Ｅ、Ｍ−Ｅであるか、非存在であり；
Ｘ３は、Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｘ４、Ｇ−Ｋ−Ｐ、Ｇ−Ｋ、Ｇであるか、非存在であり；
Ｘ４は、Ｍ、ＶまたはＮｌｅである。
【００１２】
１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、
（ｉ）Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｘ４（配列番号：４８）；
（ｉｉ）Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：１７）；
（ｉｉｉ）Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：４９）；
（ｉｖ）Ｅ−Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：５０）；または
（ｖ）Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ（配列番号：２０）
を含み、この場合、Ｘ１は、Ｌ−ＰｈｅまたはＤ−Ｐｈｅであり、およびＸ４は、Ｍ、ＶまたはＮｌｅである。
【００１３】
１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、
（ｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｖ（配列番号：５１）；
（ｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ（配列番号：５２）；
（ｉｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ（配列番号：５３）；
（ｉｖ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ（配列番号：５４）；
（ｖ）Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：１１）；
（ｖｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：５５）；
（ｖｉｉ）Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ（配列番号：５６）；
（ｉｘ）Ｅ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：５７）；または
（ｉｖ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ（配列番号：６）
を含み、この場合、ｆは、Ｄ−フェニルアラニンである。
【００１４】
１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、
（ｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｖ（配列番号：５１）；
（ｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ（配列番号：５２）；
（ｉｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ（配列番号：５３）；
（ｉｖ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ（配列番号：５４）；
（ｖ）Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：１１）；
（ｖｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：５５）；
（ｖｉｉ）Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ（配列番号：５６）；
（ｉｘ）Ｅ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：５７）；または
（ｉｖ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ（配列番号：６）
から成り、この場合、ｆは、Ｄ−フェニルアラニンである。
【００１５】
１つの実施形態において、上述の第二ドメインは、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５の少なくとも１５アミノ酸のフラグメント、または該フラグメントとの少なくとも７５％の相同性を有する該フラグメントの変異体を含む。
【００１６】
１つの実施形態において、上述のナトリウム利尿ペプチドの変異体が、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５のアミノ酸配列との少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１７】
１つの実施形態において、上述の第二ドメインは、式ＩＩのアミノ酸配列（配列番号：５８）：
Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｘ８−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｘ９      （ＩＩ）
を含み、この式中、
Ｘ５は、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ、Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓであるか、非存在であり；
Ｘ６は、Ｃであり；
Ｘ７は、Ｈであるか、非存在であり；
Ｘ８は、ＭまたはＮｌｅであり；
Ｘ９は、Ｓ−Ｃ−Ｙ−ＲまたはＧ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙであり；この場合、
Ｘ６のＣ残基は、Ｘ９のＣ残基と共にジスルフィド架橋を形成しており；および
Ｘ５が、Ｎｌｅであるとき、前記第一ドメインは、該第二ドメインのＮ末端側にある。
【００１８】
１つの実施形態において上述の第二ドメインは、
（ｉ）Ｍ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置２および１３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２２）；
（ｉｉ）Ｎｌｅ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置２および１３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２３）；
（ｉｉｉ）Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１および１７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２４）；
（ｉｖ）Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１および１７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２５）；
（ｖ）Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置５および２１のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２６）；
（ｖｉ）Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置７および２３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：５９）；または
（ｖｉｉ）Ｍ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置２および１８のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６０）
を含む。
【００１９】
１つの実施形態において、上述の第二ドメインは、
（ｉ）Ｍ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置２および１３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２２）；
（ｉｉ）Ｎｌｅ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置２および１３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２３）；
（ｉｉｉ）Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１および１７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２４）；
（ｉｖ）Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１および１７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２５）；
（ｖ）Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置５および２１のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２６）；
（ｖｉ）Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置７および２３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：５９）；または
（ｖｉｉ）Ｍ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置２および１８のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６０）
から成る。
【００２０】
１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、前記第二ドメインのＮ末端側にある。
【００２１】
１つの実施形態において、上述の二機能性ホルモンのアミノ末端は、Ｃ３〜Ｃ１６アシル基でアセチル化またはアシル化される。
【００２２】
１つの実施形態において、上述の二機能性ホルモンのカルボキシ末端残基は、アミド化される。
【００２３】
１つの実施形態において、上述の第一および第二ドメインは、ペプチド結合によって共有結合で連結される。
【００２４】
１つの実施形態において、上述の二機能性ホルモンは、
（ｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置９および２０のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６１）；
（ｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置９および２５のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６２）；
（ｉｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置９および２０のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６３）；
（ｉｖ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置９および２５のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６４）；
（ｖ）Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１２および２８のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６５）；
（ｖｉ）Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１０および２６のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６６）；
（ｖｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１０および２６のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６７）；
（ｖｉｉｉ）Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ（この場合、位置７および２３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６８）；または
（ｉｘ）Ｅ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１１および２７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６９）
を含み、この場合、ｆは、Ｄ−フェニルアラニンである。
【００２５】
１つの実施形態において、上述の二機能性ホルモンは、
（ｉ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ−ＮＨ２（この場合、位置９および２０のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３１）；
（ｉｉ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置９および２５のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３３）；
（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ−ＮＨ２（この場合、位置９および２０のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３４）；
（ｉｖ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置９および２５のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３５）；
（ｖ）Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置１２および２８のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３６）；
（ｖｉ）Ａｃ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置１０および２６のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３８）；
（ｖｉｉ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置１０および２６のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３９）；
（ｖｉｉｉ）Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−ＮＨ２（この場合、位置７および２３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：４０）；または
（ｉｘ）Ａｃ−Ｅ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置１１および２７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：４２）
から成り、この場合、
Ａｃは、アミノ末端アセチル化を表し、
ＮＨ２は、カルボキシ末端アミド化を表し；および
ｆは、Ｄ−フェニルアラニンである。
【００２６】
もう１つの態様において、本発明は、上述の二機能性ホルモンと医薬的に許容される担体とを含む組成物を提供する。
【００２７】
もう１つの態様において、本発明は、被験体における腎障害を予防および／または治療するための、上述の二機能性ホルモンを提供する。
【００２８】
もう１つの態様において、本発明は、被験体における高血圧を予防および／または治療するための、上述の二機能性ホルモンを提供する。
【００２９】
もう１つの態様において、本発明は、上述の二機能性ホルモンと医薬的に許容される担体とを含む、被験体における腎障害を予防および／または治療するための医薬組成物を提供する。
【００３０】
もう１つの態様において、本発明は、上述の二機能性ホルモンと医薬的に許容される担体とを含む、被験体における高血圧を予防および／または治療するための医薬組成物を提供する。
【００３１】
もう１つの態様において、本発明は、被験体における腎障害を予防および／または治療するための方法を提供し、この方法は、（ａ）上述の二機能性ホルモンまたは（ｂ）上述の組成物、の少なくとも一方の有効量を該被験体に投与することを含む。
【００３２】
１つの実施形態において、上述の投与は、静脈内注入によるものである。さらなる実施形態において、上述の静脈内注入は、約１ｎｇ／ｋｇ／分から１０μｇ／ｋｇ／分の速度でのものである。
【００３３】
もう１つの態様において、本発明は、被験体における高血圧を予防および／または治療するための方法を提供し、この方法は、（ａ）上述の二機能性ホルモンまたは（ｂ）上述の組成物、の少なくとも一方の有効量を該被験体に投与することを含む。
【００３４】
もう１つの態様において、本発明は、被験体における腎障害を予防および／または治療するための薬物の調製のための、（ａ）上述の二機能性ホルモンまたは（ｂ）上述の組成物の少なくとも一方の使用を提供する。
【００３５】
もう１つの態様において、本発明は、被験体における腎障害を予防および／または治療するための、（ａ）上述の二機能性ホルモンまたは（ｂ）上述の組成物の少なくとも一方の使用を提供する。
【００３６】
もう１つの態様において、本発明は、被験体における高血圧を予防および／または治療するための、（ａ）上述の二機能性ホルモンまたは（ｂ）上述の組成物の少なくとも一方の使用を提供する。
【００３７】
もう１つの態様において、本発明は、被験体における高血圧を予防および／または治療するための薬物の調製のための、（ａ）上述の二機能性ホルモンまたは（ｂ）上述の組成物の少なくとも一方の使用を提供する。
【００３８】
１つの実施形態において、上述の腎障害は、急性腎臓損傷である。
【００３９】
もう１つの実施形態において、上述の腎障害は、術後腎臓損傷または機能障害である。
【００４０】
さらなる実施形態において、上述の術後腎臓損傷または機能障害は、弁修復のための心肺バイパス手術、大動脈瘤、臓器移植、開心術または冠動脈移植に起因する。
【００４１】
１つの実施形態において、上述の二機能性ホルモンまたは組成物は、静脈内注入による投与に適応させたものである。さらなる実施形態において、上述の静脈内注入は、約１ｎｇ／ｋｇ／分から１０μｇ／ｋｇ／分の速度でのものである。
【００４２】
本発明の他の目的、利点および特徴は、添付の図面に関連して単なる例として与える、本発明の特定の実施形態についての以下の非限定的説明を読むと、より明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
添付の図面に関して、
【図１】次のことを示す図である。（Ａ）ボーラス用量で静脈内注射した漸増用量のペプチド（配列番号：２および３３）の血圧に対する効果。ベースライン平均動脈圧（ＭＡＰ）（図１Ａにおいて「Ｂ」によって示す）からの変化率としてデータをプロットした。（Ｂ）前記ペプチドの単回用量（３０μｇ／ｋｇ／時での注入）の血圧に対する効果。１時間にわたってＭＡＰを記録した。それらのデータを時間（分）の関数としての基礎ＭＡＰからの変化率としてプロットしている。＃２＝天然ＡＮＰ（配列番号：２）、＃３３＝配列番号：３３の二機能性ホルモン。
【図２】ＳＤラットにおける高血圧に対する本二機能性ホルモンの効果を示す図である。
【図３】腎虚血後の急性腎臓機能障害に対する本二機能性ホルモンでの予防的処置の効果を示す図である。腎動脈クランプ前に１時間および後に１時間、ペプチド＃２または＃３３を１５μｇ／ｋｇ／時で注入した。種々の時点で血漿クレアチニンおよび尿素を判定した。食塩水処置群に対する有意性についてボンフェローニ検定を用いる二元配置ＡＮＯＶＡによりデータを分析した（群あたりｎ＝３；ｓａｌ  ｎ＝６）。
【図４】腎虚血後の急性腎臓機能障害に対する本二機能性ホルモンでの治療的（すなわち、損傷後）処置の効果を示す図である。腎虚血のラットモデルにおいて腎クランプの除去後２時間、ペプチド＃２または＃３３を注入した。示されている時点で血液サンプルを採取し、血漿クレアチニンおよび尿素を判定した。食塩水処置群に対する有意性についてボンフェローニ検定を用いる二元配置ＡＮＯＶＡによりデータを分析した（群あたりｎ＝３；ｓａｌ  ｎ＝６）。
【図５】腎虚血後の急性腎臓機能障害に対する本二機能性ホルモンの長期注入の効果を示す図である。腎動脈クランプを除去した後、腹腔内埋Ａｌｚｅｔ（商標）ミニポンプを使用して２つの用量でペプチド＃２または＃３３を注入した（２ＭＬ１；送達速度  １０μＬ／時）。示されている時点で血漿クレアチニンおよびＢＵＮを判定した。食塩水処置群に対する有意性についてボンフェローニ検定を用いる二元配置ＡＮＯＶＡによりデータを分析した（群あたりｎ＝３；ｓａｌ  ｎ＝６）。
【図６】腎虚血を３０分間受けたラットの腎臓における好中球マーカー（ＣＤ１１ｂ）、細尿管損傷マーカー（ＫＩＭ−１）、および炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β）ならびにタンパク質負荷マーカー（β−アクチン）の免疫化学的同定を示す図である。Ａｌｚｅｔ（商標）ミニポンプを使用して、２４時間、１５μｇ／ｋｇ／時の注入速度で二機能性ホルモン＃３３を注入した。それらのタンパク質を特異的抗体で同定した。（Ａ）ウエスタンブロット。（Ｂ）それらのマーカーの相対存在度を示すヒストグラム。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の開示
本発明は、新規二機能性ホルモンに、ならびに例えば、急性腎不全（ＡＲＦ）または急性腎臓損傷（ＡＫＩ）などの腎関連疾患または状態の予防および／または治療のための、それらの使用に関する。本二機能性ホルモンは、α−ＭＳＨ（α−メラニン細胞刺激ホルモン）受容体に対する、およびナトリウム利尿ペプチド受容体の少なくとも１つに対する生物活性を示す。
【００４５】
従って、１つの態様において、本発明は、
（ａ）アルファ−ＭＳＨペプチドもしくはそのフラグメント、変異体、またはフラグメントの変異体を含む第一ドメイン（前記フラグメント、変異体またはフラグメントの変異体は、アルファ−ＭＳＨ関連ホルモン活性を有する）；および
（ｂ）前記第一ドメインに共有結合で連結された第二ドメイン（前記第二ドメインは、ナトリウム利尿ペプチドもしくはそのフラグメント、変異体、またはフラグメントの変異体を含み、該フラグメント、変異体またはフラグメントの変異体は、ナトリウム利尿ペプチド関連ホルモン活性を有する）
を含む、二機能性ホルモンを提供する。
【００４６】
１つの実施形態において、第一ドメインが、配列番号：１のアルファ−ＭＳＨペプチドであるとき、第二ドメインは、ナトリウム利尿ペプチド関連ホルモン活性を有するフラグメント、変異体またはフラグメントの変異体であり、および前記第二ドメインが、配列番号：２、３、４または５のナトリウム利尿ペプチドである場合、前記第一ドメインは、アルファ−ＭＳＨ関連ホルモン活性を有するフラグメント、変異体またはフラグメントの変異体である。
【００４７】
本発明は、ナトリウム利尿ペプチド関連生物活性を有する第二ドメインに共有結合で連結された、アルファ−ＭＳＨ関連生物活性を有する第一ドメインを含む、二機能性ホルモンも提供し、この場合、（ｉ）前記第一ドメインは、完全長（すなわち、天然）アルファ−ＭＳＨペプチドである、（ｉｉ）前記第二ドメインは、完全長（すなわち、天然）ナトリウム利尿ペプチドではない、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方である。
【００４８】
メラノコルチンは、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ（１−３９））、α−メラニン細胞刺激ホルモン（（α−ＭＳＨ（１−１３））および関連アミノ酸配列（β−およびγ−ＭＳＨを含む）を含む、プロオピオメラノコルチン由来哺乳動物ペプチドホルモンである。メラノコルチンペプチドは、強力な抗炎症／抗サイトカイン活性を有する（Ｌｉｐｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｔａｎｉａ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：１４０−１４５，１９９７）。メラノコルチンは、メラノコルチン受容体（ＭＣＲ）の刺激によってそれらの活性の少なくとも一部を生じさせる。メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）活性は、タイプ１から５のメラノコルチン受容体（ＭＣＲ１〜ＭＣＲ５）の結合および活性に、ある程度、起因する。
【００４９】
α−ＭＳＨは、幾つかの組織および細胞において発現されることが公知であるタイプ１受容体（ＭＣＲ１）に大きな親和性で結合する。より低い親和性であるが、β−ＭＳＨ、γ−ＭＳＨおよびＡＣＴＨも、ＭＣＲ１に結合する。ＭＣＲ２は、ＡＣＴＨにのみ結合し、いずれのＭＳＨペプチドにも結合しないと報告されている。γ−ＭＳＨは、ＭＣＲ３受容体に高い親和性で結合し、β−ＭＳＨは、ＭＣＲ４受容体に高い親和性で結合する。
【００５０】
α−ＭＳＨが、
１−好中球走化活性の阻害（Ｃａｔａｎｉａ，Ａ．Ｎ．ら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１７：６７５−６７９，１９９６）；
２−ＬＰＳ治療によって誘導されるサイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦ−α）放出の阻害；
３−細菌内毒素に応じてのＴＮＦ−αの阻害（Ｗｏｎｇ，Ｋ．Ｙ．ら，Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，４：３７−４１，１９９７）；
４−実験的炎症性腸疾患の炎症減少（Ｒａｊｏｒａ，Ｎ．ら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１８：３８１−３８５，１９９７）；
５−虚血誘発急性腎不全（Ｓｔａｒ，Ｒ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９２：８０１６−８０２０，１９９５）；
６−皮膚微小血管内皮細胞からのＩＬ−８放出の増加（Ｈａｒｔｍｅｙｅｒ，Ｍ．Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５９：１９３０−１９３７，１９９７）
をはじめとする、炎症プロセスの主要な形態を阻害することは証明されており（Ｌｉｐｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｔａｎｉａ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ，１８：１４０−１４５，１９９７）；α−ＭＳＨ作用は、マクロファージ、好中球および腎細管をはじめとする様々な細胞タイプにおいて発現されるメラノコルチン受容体によって媒介される。
【００５１】
ナトリウム利尿ペプチドは、３つの異なる遺伝子によって合成され（Ｆｌｙｎｎ  ＴＧ．Ｐｒｏ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２１３：９８−１０４，１９９６；Ｌｅｖｉｎ  ＥＲら，Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ．Ｍｅｄ  ３３９：３２１−３２８，１９９８；Ｏｇａｗａ  Ｙ  ら，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ｐｈｙｓｉｏｌ．２２：４９−５３，１９９５；Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ  Ａ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６０：２２９−２５５，１９９１）、その後、３つの異なるプロホルモン［すなわち、１２６アミノ酸ＡＮＰ、１０８アミノ酸脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、および１２６アミノ酸Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）プロホルモン］（Ｌｅｖｉｎ  ＥＲら，Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ．Ｍｅｄ  ３３９：３２１−３２８，Ｖｅｓｅｌｙ  ＤＬ  Ａｔｒｉａｌ  Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ，ＮＪ：Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，１９９２，１−２５６）として貯蔵される、ペプチドの１つのファミリーの一部である。
【００５２】
１２６アミノ酸の中で、ＡＮＰプロホルモンは、動物とヒトの両方において血圧低下、ナトリウム利尿、利尿および／またはカリウム利尿特性を有する、４つのペプチドホルモンである。これらのペプチドホルモンは、そのプロホルモンのＮ末端で始まるそれらのアミノ酸配列による番号が付けられており、次のとおりである：
−前記プロホルモンの残基１−３０：長期作用性ナトリウム利尿ペプチド（ＬＡＮＰ）；
−前記プロホルモンの残基３１−６７：血管拡張因子；
−前記プロホルモンの残基７９−９８：カリウム利尿ペプチド；および
−前記プロホルモンの残基９９−１２６：ＡＮＰ。
【００５３】
一方、ＢＮＰおよびＣＮＰ遺伝子は、それぞれ、それらそれぞれのプロホルモン、すなわちＢＮＰおよびＣＮＰ、の中で１つのペプチドホルモンしか合成しないようである。
【００５４】
主として心臓動脈筋細胞から得られる循環ホルモンである動脈ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）は、塩分および水分恒常性ならびに血圧の制御に一定の役割を果たす。加えて、ＡＮＰは、血管拡張薬であり、ナトリウム利尿および利尿を促進する、糸球体濾過増加、ナトリウム再吸収阻害および腎血流再分布をはじめとする、腎臓に対する直接作用も有する。
【００５５】
ウロジラチンは、ナトリウム利尿ペプチドファミリーの腎臓由来メンバーであり、同じＡＮＰプロホルモンから形成され、ならびにアミノ酸配列９５−１２６から成る。Ｎ末端の４つのアミノ酸を除き、それはＡＮＰ（９９−１２６）と同一である。ウロジラチンは、腎臓におけるナトリウムおよび水の取り扱いの重要な調節因子であり、ならびにうっ血性心不全（ＣＨＦ）を有する患者におけるナトリウム排泄の媒介因子であるようである。
【００５６】
ＢＮＰは、健常なヒトではＡＮＰと同様の生物学的作用を生じさせる。正常な男性におけるＢＮＰを注入すると、ナトリウム排泄の２倍の増加、血漿レニン、アンギオテンシンＩＩおよびアルドステロン分泌の５０％減少が生じた。ＰｒｏＢＮＰのＣ末端からの３２アミノ酸配列の切断の結果、血漿中で生理活性形態であるヒトＢＮＰ（７７−１０８）が得られる。
【００５７】
ＣＮＰは、他のナトリウム利尿ペプチドと同様の心血管作用を誘導する。プロＣＮＰから末端アミノ酸配列１０５−１２６が切断されて、ＣＮＰの生物活性形態を生じる。
【００５８】
ＡＮＰおよびＢＮＰの大部分の生物学的作用は、グアニル酸シクラーゼ結合細胞表面受容体、Ａ−受容体（ＮＰＲ−Ａ）によって媒介される（Ｇａｒｂｅｒｓ，ＤＬ，Ｃｅｌｌ  １９９２，７１：１−４）。ＣＮＰは、Ｂ−受容体（ＮＰＲ−Ｂ）、もう１つのグアニル酸シクラーゼ結合ＮＰ受容体、の特異的リガンドである（Ｍａａｃｋ  Ｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９２，５４：１１−２７）。第三の受容体、いわゆるＮＰクレアランス受容体（ＮＰＲ−Ｃ）、は、ＡＮＰ、ＢＮＰおよびＣＮＰを結合する。全身のＮＰのクリアランスにおける主要な役割（Ｍａａｃｋ  Ｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９２，５４：１１−２７）に加えて、ＡＮＰの幾つかの作用がＮＰＲ−Ｃ受容体によって媒介されることも報告されている（Ｍａａｃｋ  Ｔ，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  １９９６，４９：１７３２−１７３７）。ＮＰ受容体への結合に加えて、ナトリウム利尿ペプチドは、中性エンドペプチダーゼによるタンパク質分解によってもクリアランスされる。ナトリウム利尿ペプチド受容体の３つサブタイプ（ＮＰＲ−Ａ、ＲＮＰ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃ）すべてが、腎系および心臓をはじめとする多様な組織において発現されることは立証されている（Ｎｕｎｅｚ，ＤＪＲら，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９２，９０：１９６６−１９７１）。
【００５９】
α−ＭＳＨ、ＡＮＰ、ウロジラチン、ＢＮＰおよびＣＮＰの天然アミノ酸配列を下の表１に示す。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
用語「アミノ酸」は、本明細書において用いる場合、ペプチドの合成類似体を作製するためにペプチド化学において用いられる天然アミノ酸ならびに他のアミノ酸（例えば、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、核酸配列によってコードされないアミノ酸、など）のＬ異性体とＤ異性体の両方を含む。天然アミノ酸の例としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンなどが挙げられる。他のアミノ酸としては、例えば、ノルロイシン、ノルバリン、シクロヘキシルアラニン、ビフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、オルト、パラおよびメタ位がアルコキシ、ハロゲンまたは窒素基で置換されているフェニルアラニンなどが挙げられる。これらのアミノ酸は、生物化学／ペプチド化学の分野において周知である。
【００６２】
「生物活性」または「生体活性」または「活性」または「生体機能」は、本明細書では同じ意味で用いており、ペプチドホルモンもしくは二機能性ホルモンによってまたはその任意のフラグメントによって直接または間接的に果たされる機能を指す。生物活性としては、例えば、ホルモン受容体への結合、およびホルモン応答／活性の惹起が挙げられる。
【００６３】
アルファ−ＭＳＨ関連生物活性は、一般に、天然アルファ−ＭＳＨの生物（例えば、ホルモン）活性、例えば、抗炎症および／または抗サイトカイン活性を指す。ナトリウム利尿ペプチド関連生物活性は、一般に、天然ＡＮＰ、天然ＢＮＰ、天然ＣＮＰまたは天然ウロジラチンのホルモン活性のうちの１つ、例えば、血圧低下、ナトリウム利尿、利尿、血管拡張薬および／またはカリウム利尿活性を指す。アルファ−ＭＳＨ関連生物活性（例えば、アルファ−ＭＳＨ受容体結合活性）の判定は、例えば、実施例２において説明するような、ＭＣＲ１受容体発現性細胞を使用するインビトロアッセイによって行うことができる。ナトリウム利尿ペプチド関連生物活性（例えば、ナトリウム利尿ペプチド受容体結合活性）の判定は、実施例２において説明するような、ＡＮＰ受容体発現性細胞を使用するインビトロアッセイによって行うことができる。
【００６４】
本明細書において用いる場合、用語「フラグメント」は、ペプチドの活性（例えば、アルファ−ＭＳＨペプチドまたはナトリウム利尿ペプチド関連ホルオン活性）を保持する、ペプチドの一部分／セグメントを指す。用語変異体は、野生型ペプチド（例えば、アルファ−ＭＳＨペプチドおよび／もしくはナトリウム利尿ペプチド）またはそのフラグメントと比較して少なくとも１つの修飾を有するドメインを指す。
【００６５】
複数の実施形態において、前記修飾は、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、置換または化学的修飾である。前記修飾は、例えば、（例えば、１から１０個の）連続したまたは連続していないアミノ酸の欠失、（例えば、１から１０個の）アミノ酸の置換、天然アミノ酸（Ｌ−アミノ酸）の対応するＤ−アミノ酸による１つ以上の置換、その配列の、例えば１、２、３またはそれ以上のアミノ酸による延長である場合もある。
【００６６】
１つの実施形態において、上述の置換（単数または複数）は、保存アミノ酸置換である。
【００６７】
本明細書において用いる場合、用語「保存アミノ酸置換」（または、時として、「保存的アミノ酸置換」）は、関連した機能を実質的に喪失せずに行うことができる、ペプチド内の所定の位置におけるあるアミノ酸での別のアミノ酸の置換を指す。そのような変更を行う場合、側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらのサイズ、電荷、疎水性、親水性など、に基づいて同様のアミノ酸残基の置換を行うことができ、ならびにそのような置換を常例的試験によってそのペプチドの機能に対するそれらの影響についてアッセイすることができる。
【００６８】
一部の実施形態では、あるアミノ酸残基で類似の親水性値（例えば、プラスまたはマイナス２．０以内の値）を有する別のものを置換する保存アミノ酸置換を行うことができ、この場合、Ｔｙｒ（−１．３）またはＰｒｏ（−１．６）などの約−１．６のヒドロパシー指数を有するアミノ酸であり得る以下のものをアミノ酸残基に割り当てる（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されている）：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０）；Ａｓｐ（＋３．０）；Ｇｌｕ（＋３．０）；Ｓｅｒ（＋０．３）；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｎ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｐｒｏ（−０．５）；Ｔｈｒ（−０．４）；Ａｌａ（−０．５）；Ｈｉｓ（−０．５）；Ｃｙｓ（−１．０）；Ｍｅｔ（−１．３）；Ｖａｌ（−１．５）；Ｌｅｕ（−１．８）；Ｉｌｅ（−１．８）；Ｔｙｒ（−２．３）；Ｐｈｅ（−２．５）；およびＴｒｐ（−３．４）。
【００６９】
他の実施形態では、あるアミノ酸残基を同様のヒドロパシー指数（例えば、プラスまたはマイナス２．０以内の値）を有する別のもので置換する保存アミノ酸置換を行うことができる。そのような実施形態では、それぞれのアミノ酸残基に、その疎水性および電荷特性に基づき、次のようにヒドロパシー指数を割り当てることができる：Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（−０．４）；Ｔｈｒ（−０．７）；Ｓｅｒ（−０．８）；Ｔｒｐ（−０．９）；Ｔｙｒ（−１．３）；Ｐｒｏ（−１．６）；Ｈｉｓ（−３．２）；Ｇｌｕ（−３．５）；Ｇｌｎ（−３．５）；Ａｓｐ（−３．５）；Ａｓｎ（−３．５）；Ｌｙｓ（−３．９）；およびＡｒｇ（−４．５）。
【００７０】
他の実施形態では、あるアミノ酸残基で同じクラス内の別ものを置換する保存アミノ酸置換を行うことができ、この場合、前記アミノ酸を、次のように、非極性、酸性、塩基性おおび中性クラスに分ける：非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；中性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ。
【００７１】
保存的アミノ酸変更としては、Ｌ−アミノ酸の保存的置換ばかりでなく、Ｌ−アミノ酸の対応するＤ−アミノ酸による、保存的Ｄ−アミノ酸による、または天然非遺伝子コード化形態のアミノ酸による置換を挙げることができる。天然非遺伝子コード化アミノ酸としては、ベータ−アラニン、３−アミノ−プロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、アルファ−アミノイソ酪酸、４−アミノ−酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ヒドロキシプロリン、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、２−ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、ベータ−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルリシン、２−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、２，４−ジアミノ酪酸、ｐ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、システイン酸、イプシロン−アミノへキサン酸、デルタ−アミノ吉草酸、または２，３−ジアミノ酪酸が挙げられる。
【００７２】
他の実施形態において、保存的アミノ酸変更としては、親水性もしくは疎水性、サイズもしくは体積、または電荷の考慮に基づく変更が挙げられる。アミノ酸は、一般に、主としてそのアミノ酸側鎖の特性に依存して、疎水性または親水性と特性付けすることができる。Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２，１９８４）の正規化コンセンサス疎水性尺度に基づき、疎水性アミノ酸は、ゼロより大きい疎水性を示し、親水性アミノ酸は、ゼロより小さい親水性を示す。遺伝子コード化疎水性アミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＭｅｔおよびＴｒｐが挙げられ、ならびに遺伝子コード化親水性アミノ酸としては、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ，およびＬｙｓが挙げられる。
【００７３】
疎水性または親水性アミノ酸は、それらの側鎖の特徴に基づいてさらに細分することができる。例えば、芳香族アミノ酸は、１つ以上の置換基を含有することがある少なくとも１つの芳香族またはヘテロ芳香族環を含有する側鎖を有する疎水性アミノ酸である。
【００７４】
非極性アミノ酸は、生理的ｐＨで電荷を有さず、且つ、２個の原子によって共同で共有される一対の電子が一般にそれら２つの原子のそれぞれによって等しく保持される結合を有する側鎖（すなわち、その側鎖は極性でない）を伴う疎水性アミノ酸である。遺伝子コード化非極性アミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、およびＭｅｔが挙げられる。非極性アミノ酸は、脂肪族炭化水素鎖を有する疎水性アミノ酸である脂肪族アミノ酸を含むように、さらに細分することができる。遺伝子コード化脂肪族アミノ酸としては、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅが挙げられる。
【００７５】
極性アミノ酸は、生理的ｐＨで電荷を有さないが、２個の原子によって共同で共有される一対の電子がそれらの原子の一方によってより接近して保持される側鎖を有する親水性アミノ酸である。遺伝子コード化極性アミノ酸としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎが挙げられる。
【００７６】
酸性アミノ酸は、７未満の側鎖ｐＫａ値を有する親水性アミノ酸である。典型的に、酸性アミノ酸は、水素イオンの喪失のため、生理的ｐＨで負電荷を有する側鎖を有する。遺伝子コード化酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。塩基性アミノ酸は、７より大きい側鎖ｐＫａ値を有する親水性アミノ酸である。典型的に、塩基性アミノ酸は、ヒドロニウムイオンとの会合のため、生理的ｐＨで正電荷を有する側鎖を有する。遺伝子コード化塩基性アミノ酸としては、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓが挙げられる。
【００７７】
上の分類は、絶対的ではなく、アミノ酸は、１つより多くのカテゴリーで分類することができる。加えて、アミノ酸は、公知の挙動およびもしくは明記するアッセイに基づく固有の化学的、物理的または生物学的特性に基づいて、または以前に同定されたアミノ酸と比較して、分類することができる。アミノ酸は、アミノ酸様側鎖を有する二官能性部分も包含し得る。
【００７８】
保存的変更としては、例えばアミノ酸の官能性側基の反応による、化学的誘導体化部分での非誘導体化残基の置換も挙げることができる。
【００７９】
上で概説した置換に加えて、類似の側鎖官能性をもたらす合成アミノ酸も、前記ペプチドに導入することができる。例えば、芳香族アミノ酸をＤ−またはＬ−ナフチルアラニン、Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン、Ｄ−またはＬ−２−チエニルアラニン、Ｄ−またはＬ−１−、２−、３−、または４−フェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−３−チエニルアラニン、Ｄ−またはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン、Ｄ−ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−ｐ−ビフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−ｐ−メトキシビフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−２−インドール（アルキル）アラニン、およびＤ−またはＬ−アルキルアラニンで置換することができ、この場合のアルキル基は、置換または非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ−ブチル、およびイソ−ペンチルから成る群より選択される。
【００８０】
ホスホノ−または硫酸化（例えば、−ＳＯ３Ｈ）アミノ酸（これらは、非限定的な例とみなすべきである）によってもたらされるような負で電荷を有する非カルボキシレートアミノ酸を作ることができる。
【００８１】
他の置換としては、アルキル基と任意の天然アミノ酸を化合させることによって作られる、非天然アルキル化アミノ酸を挙げることができる。リシンおよびアルギニンなどの塩基性天然アミノ酸は、そのアミン（ＮＨ２）官能基をアルキル基で置換することができる。さらに他の置換は、アスパラギンまたはグルタミンのニトリル誘導体（例えば、ＣＯＮＨ２官能基の代わりにＣＮ−部分を含有するもの）、およびメチオニンのスルホキシド誘導体を含む。加えて、ペプチドにおける任意のアミド結合を、ケトメチレン、ヒドロキシエチル、エチル／還元アミド、チオアミドまたは逆アミド部分、（例えば、（−Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２−）、（−ＣＨＯＨ）−ＣＨ２−）、（ＣＨ２−ＣＨ２−）、（−Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−）、または（（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−）についての−ＮＨ−（−Ｃ＝Ｏ））によって置換することができる。
【００８２】
他の修飾も本発明の二機能性ホルモンの変異体の定義の中に包含される。例えば、１つ以上のアミノ酸を欠失させることによってペプチドのサイズを減少させることができ、および／または非ペプチド結合を含むアミノ酸模倣物またはジペプチド擬態を使用することができる。これらの目的で分子骨格、例えば、ベンゾジアゼピン、アゼピン、置換ガンマラクタム環、ケト−メチレン擬似ペプチド、β−ターンジペプチドコアおよびβ−アミノアルコールを使用する例は、ペプチド化学者には公知であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．２３）Ｗ．Ｍ．Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ（ｅｄ．）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌｓ．１  ＆  ２，Ａ．Ａｂｅｌｌ（Ｅｄ）に記載されている。
【００８３】
従ってペプチドの共有結合性修飾は、本発明の範囲内に包含される。そのような修飾は、例えば、選択された側鎖または末端残基と反応させることがでる有機誘導体化剤とポリペプチドの標的アミノ酸残基を反応させることによって、二機能性ホルモンに導入することができる。実例として、限定としてではなく、化学的誘導体の以下の例を提供する。
【００８４】
システイニル残基をアルファ−ハロアセテート（および対応するアミン）、例えば２−クロロ酢酸またはクロロアセトアミド、と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得ることができる。ヒスチジル残基は、例えばｐＨ５．５〜７．０で、ジエチルプロカーボネートなどの化合物との反応によって誘導体化することができる。この薬剤は、ヒスチジル側鎖に比較的特異的であるからであり、ｐ−ブロモフェナンシルブロマイドも使用することができ、例えば、この場合、その反応は、好ましくは、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中、ｐＨ６．０で行われる。リシニルおよびアミノ末端残基をコハク酸または他のカルボン酸無水物などの化合物と反応させることができる。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適する試薬としては、化合物、例えば、イミドエステル、例えばピコリンイミド酸メチル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロハイドライド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
【００８５】
アルギニル残基は、公知の方法段階に従って１つまたは幾つかの従来の試薬、それらの中でも、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリン、と反応させることによって修飾することができる。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのため、一般にはアルカリ性条件で行われる。さらに、これらの試薬は、アルギニンイプシロン−アミノ基ばかりでなくリシンの基とも反応し得る。チロシニル残基の特異的修飾、例えば、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシニル残基にスペクトル標識を導入するための修飾、は、本質的に周知である。Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシニル種および３−ニトロ誘導体を形成することができる。
【００８６】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホルニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応によって、選択的に修飾することができる。さらに、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパルチルおよびグルタミル残基を、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に転化させることができる。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、多くの場合、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化され得る。本発明におけるペプチドの他の修飾としては、公知の方法段階による、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、主鎖アミド残基のメチル化（またはＮ−メチルアミノ酸での置換）、ならびに、場合によっては、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化を挙げることができる。
【００８７】
前記ペプチドに脂肪酸（例えば、Ｃ６〜Ｃ１８）を共有結合で取付けることによって、追加の生物学的特性、例えば、プロテアーゼ耐性、血漿タンパク質結合、血漿半減期増加、細胞内浸潤など、を付与することができる。二機能性ホルモンの修飾についての上の説明は、アプローチの範囲も、操作することができる可能な修飾の範囲も限定しない。
【００８８】
複数の実施形態において、本二機能性ホルモンの第一ドメインは、直接（例えば、ペプチド結合によって）、または適するリンカー部分、例えば、アミノ酸１個以上のリンカー（例えば、ポリグリシンリンカー）もしくは別のタイプの化学的リンカー（例えば、炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、ＰＥＧなど）によって、第二ドメインに共有結合で連結させることができる（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ参照）。１つの実施形態では、１つ以上の追加のドメイン（例えば、生物活性を有するドメイン）を第一ドメインと第二ドメインの間に挿入することができる。１つの実施形態では、第一ドメインと第二ドメインは、ペプチド結合によって共有結合で連結される。
【００８９】
１つの実施形態において、第一ドメインは、アルファ−ＭＳＨの天然配列（配列番号：１）と比較して少なくとも１つの修飾を含む。
【００９０】
１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、配列番号：１のペプチドの少なくとも４アミノ酸のフラグメント、または該フラグメントとの少なくとも７５％の相同性を有する該フラグメントの変異体を含む。
【００９１】
もう１つの実施形態において、アルファ−ＭＳＨの上述の変異体は、配列番号：１のアミノ酸配列との少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９２】
「相同性」および「相同（性）の」は、２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、アラインされた配列内のそれぞれの位置を比較することによって決定することができる。核酸間またはアミノ酸配列間の相同度は、それらの配列が共有する位置における同一のまたはマッチするヌクレオチドまたはアミノ酸の数の関数である。この用語を本明細書において用いる場合、ある核酸またはアミノ酸配列と別の配列は、それら２つの配列が実質的に同一であり、それらの配列の機能的活性が保存される場合、「相同（性）」である（本明細書において用いる場合、用語「相同（性）の」は、進化上関連のあることを意味しない）。２つの核酸またはアミノ酸配列は、（ギャップを許容して）最適にアラインされたとき、それらが少なくとも約７５％の配列類似性または同一性を共有する場合、またはそれらの配列が被定義機能的モチーフを共有する場合、「実質的に同一」と見なされる。代替実施形態において、最適にアラインされた実質的に同一の配列における配列類似性は、少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％であり得る。本明細書において用いる場合、配列間の相同性の所与の百分率は、最適にアラインされた配列における配列同一度を意味する。「関連のない」または「非相同（性）」配列は、本明細書に記載する配列との４０％未満の同一性、しかし好ましくは約２５％未満の同一性を共有する。
【００９３】
同一性の比較のための配列の最適なアラインメントは、様々なアルゴリズム、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索法、およびこれらのアルゴリズムのコンピュータでの実施（例えば、米国、ウィスコンシン州、マディソン、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐのｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）を用いて行うことができる。配列同一性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて（出版物記載デフォルト設定を用いて）決定することもできる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して入手することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインしたときに何らかの正の値の閾スコアＴとマッチするまたはそれを満たす照会配列内の長さＷの短いワードを特定することにより、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に特定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる。最初の近傍ワードヒットは、より長いＨＳＰを見つける検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、それらのワードヒットをそれぞれの配列に沿って両方向に拡張する。それぞれの方向でのワードヒットの拡張は、以下のパラメータを満たしたとき停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値からＸ量低下する；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積のため、累積スコアがゼロ以下になる；またはいずれかの配列の末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決める。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９）アラインメント（Ｂ）、１０（または１または０．１または０．０１または０．００１または０．０００１）の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を用いることができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いる二配列間の統計的類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に発生する確率の指標となる。本発明の代替実施形態において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、試験配列の比較での最小和確率が約���未満、好ましくは約０．１未満、さらに好ましくは約０．０１未満および最も好ましくは約０．００１未満である場合、実質的に同一と見なされる。
【００９４】
実質的に相補性の核酸は、ある分子の補体が他の分子と実質的に同一である核酸である。２つの核酸配列が実質的に相補性である代替指標は、それら２つの配列が、中等度にストリンジェントな、または好ましくはストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。中等度にストリンジェントな条件下でのフィルター結合配列へのハイブリダイゼーションを、例えば、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃で行い、および洗浄を０．２×ＳＣＣ／０．１％ＳＤＳ中、４２℃で行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ），１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ａｔ  ｐ．２．１０．３参照）。あるいは、ストリンジェントな条件下でのフィルター結合配列へのハイブリダイゼーションを、例えば、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃で行い、および洗浄を０．１×ＳＣＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃で行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ），１９８９の上記文献参照）。ハイブリダイゼーション条件は、対象となる配列に依存して公知の方法に従って変更することができる（Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  −−  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。一般に、ストリンジェントな条件は、被定義イオン強度およびｐＨで特定の配列についての熱融点より約５℃低くなるように選択される。
【００９５】
１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、式Ｉのアミノ酸配列（配列番号：４７）：
Ｘ２−Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｘ３        （Ｉ）
を含み、この式中、
Ｘ１は、Ｌ−ＰｈｅまたはＤ−Ｐｈｅであり；
Ｘ２は、Ｅ、Ｍ−Ｅであるか、非存在であり；
Ｘ３は、Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｘ４、Ｇ−Ｋ−Ｐ、Ｇ−Ｋ、Ｇであるか、非存在であり；
Ｘ４は、Ｍ、ＶまたはＮｌｅである。
【００９６】
さらなる実施形態において、上述の第一ドメインは、
（ｉ）Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｘ４（配列番号：４８）；
（ｉｉ）Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：１７）；
（ｉｉｉ）Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：４９）；
（ｉｖ）Ｅ−Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：５０）；または
（ｖ）Ｈ−Ｘ１−Ｒ−Ｗ（配列番号：２０）
を含み、この場合、Ｘ１は、Ｌ−ＰｈｅまたはＤ−Ｐｈｅであり、およびＸ４は、Ｍ、ＶまたはＮｌｅである。
【００９７】
１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、１０以下のアミノ酸を含有する。もう１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、９以下のアミノ酸を含有する。１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、８以下のアミノ酸を含有する。１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、７以下のアミノ酸を含有する。１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、６以下のアミノ酸を含有する。１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、５以下のアミノ酸を含有する。
【００９８】
１つの実施形態において、上述の第一ドメインは、
（ｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｖ（配列番号：５１）；
（ｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ（配列番号：５２）；
（ｉｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ（配列番号：５３）；
（ｉｖ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ（配列番号：５４）；
（ｖ）Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：１１）；
（ｖｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：５５）；
（ｖｉｉ）Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ（配列番号：５６）；
（ｉｘ）Ｅ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ（配列番号：５７）；または
（ｉｖ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ（配列番号：６）
から成り、この場合、ｆは、Ｄ−フェニルアラニンである。
【００９９】
１つの実施形態において、前記第一ドメインがその二機能性ホルモンのＮ末端部分に位置する場合、そのアミノ末端残基は、Ｃ２〜Ｃ１６アシル基でアシル化される。さらなる実施形態において、前記アミノ末端残基は、アセチル化される。
【０１００】
本発明による二機能性ホルモンの第一ドメインのアミノ酸配列の代表的な例を表Ｉに記載する。
【０１０１】
【表２】
2010532323.tif 000003
【０１０２】
１つの実施形態において、本発明の二機能性ホルモンの第二ドメインは、ＡＮＰの天然配列（配列番号：２）、ウロジラチンの天然配列（配列番号：３）、ＢＮＰの天然配列（配列番号：４）またはＣＮＰの天然配列（配列番号：５）と比較して少なくとも１つの修飾を含む。
【０１０３】
１つの実施形態において、前記第二ドメインは、配列番号：２、配列番号：３、配列番号４または配列番号：５の少なくとも１５アミノ酸のフラグメント、または該フラグメントとの少なくとも７５％の相同性を有する該フラグメントの変異体を含む。
【０１０４】
１つの実施形態において、ナトリウム利尿ペプチドの上述の変異体は、配列番号：２、配列番号：３、配列番号４または配列番号：５のアミノ酸配列との少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
１つの実施形態において、前記第二ドメインは、式ＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号：７２）：
Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｘ８−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｘ９      （ＩＩＩ）
を含み、この式中、
Ｘ５は、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ、Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓであるか、非存在であり；
Ｘ６は、Ｅ、ＤまたはＣであり；
Ｘ７は、Ｈであるか、非存在であり；
Ｘ８は、ＭまたはＮｌｅであり；
Ｘ９は、Ｓ−Ｋ−Ｙ−Ｒ、Ｓ−Ｃ−Ｙ−ＲまたはＧ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙであり；この場合、
Ｘ６がＣであり、且つ、Ｘ９がＳ−Ｃ−Ｙ−ＲまたはＧ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙであるときには、Ｘ６のＣ残基は、Ｘ９のＣ残基と共にジスルフィド架橋を形成しており；
Ｘ６がＥまたはＤであり、Ｘ９がＳ−Ｋ−Ｙ−Ｒであるときには、Ｘ９のＫ残基は、Ｘ６のＥまたはＤ残基と共にラクタム架橋を形成している。
【０１０６】
もう１つの実施形態において、前記第二ドメインは、式ＩＩのアミノ酸配列（配列番号：５８）：
Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｘ８−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｘ９      （ＩＩ）
を含み、この式中、
Ｘ５は、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ、Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓであるか、非存在であり；
Ｘ６は、Ｃであり；
Ｘ７は、Ｈであるか、非存在であり；
Ｘ８は、ＭまたはＮｌｅであり；
Ｘ９は、Ｓ−Ｃ−Ｙ−ＲまたはＧ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙであり；この場合、
Ｘ６のＣ残基は、Ｘ９のＣ残基と共にジスルフィド架橋を形成しており；および
Ｘ５が、Ｎｌｅであるとき、前記第一ドメインは、前記第二ドメインのＮ末端側にある。
【０１０７】
１つの実施形態において、前記第二ドメインは、式ＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号：７１）：
Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｘ８−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｘ９      （ＩＩＩ）
を含み、この式中、
Ｘ５は、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ、Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓであるか、非存在であり；
Ｘ６は、ＥまたはＤであり；
Ｘ７は、Ｈであるか、非存在であり；
Ｘ８は、ＭまたはＮｌｅであり；
Ｘ９は、Ｓ−Ｋ−Ｙ−Ｒであり；この場合、
Ｘ９のＫ残基は、Ｘ６のＥまたはＤ残基と共にラクタム架橋を形成している。
【０１０８】
１つの実施形態において、上述の第二ドメインは、２５以下のアミノ酸を含有する。もう１つの実施形態において、上述の第二ドメインは、２４以下のアミノ酸を含有する。もう１つの実施形態において、上述の第二ドメインは、２３以下のアミノ酸を含有する。もう１つの実施形態において、上述の第二ドメインは、２２以下のアミノ酸を含有する。もう１つの実施形態において、上述の第二ドメインは、２１以下のアミノ酸を含有する。もう１つの実施形態において、上述の第二ドメインは、２０以下のアミノ酸を含有する。もう１つの実施形態において、上述の第二ドメインは、１９以下のアミノ酸を含有する。もう１つの実施形態において、上述の第二ドメインは、１８以下のアミノ酸を含有する。もう１つの実施形態において、上述の第二ドメインは、１７以下のアミノ酸を含有する。もう１つの実施形態において、上述の第二ドメインは、１６以下のアミノ酸を含有する。
【０１０９】
１つの実施形態において、前記第二ドメインは、
（ｉ）Ｍ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置２および１３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２２）；
（ｉｉ）Ｎｌｅ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置２および１３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２３）；
（ｉｉｉ）Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１および１７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２４）；
（ｉｖ）Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１および１７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２５）；
（ｖ）Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置５および２１のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２６）；
（ｖｉ）Ｎｌｅ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｋ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置２のＥ残基および位置１３のＫ残基は、ラクタム架橋を形成している）（配列番号：７０）；
（ｖｉｉ）Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置７および２３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：５９）；または
（ｖｉｉｉ）Ｍ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置２および１８のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６０）
を含む。
【０１１０】
１つの実施形態において、前記第二ドメインは、
（ｉ）Ｍ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置２および１３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２２）；
（ｉｉ）Ｎｌｅ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置２および１３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２３）；
（ｉｉｉ）Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１および１７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２４）；
（ｉｖ）Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１および１７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２５）；
（ｖ）Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置５および２１のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：２６）；
（ｖｉ）Ｎｌｅ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｋ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置２のＥ残基および位置１３のＫ残基は、ラクタム架橋を形成している）（配列番号：７０）；
（ｖｉｉ）Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置７および２３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：５９）；または
（ｖｉｉｉ）Ｍ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置２および１８のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６０）
から成る。
【０１１１】
本発明による二機能性ホルモンの第二ドメインのアミノ酸配列の代表的な例を下の表ＩＩに記載する。
【０１１２】
【表３】
2010532323.tif 000004
【０１１３】
複数の実施形態において、前記第一および第二ドメインは、Ｃ末端がＮ末端に連結される場合もあり、Ｃ末端がＣ末端に連結される場合もあり、Ｎ末端がＮ末端に連結される場合もあり、またはＮ末端がＣ末端に連結される場合もある。１つの実施形態では、前記第一ドメイン（アルファ−ＭＳＨペプチド）および第二ドメイン（ナトリウム利尿ペプチド）のそれぞれがＮ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸を有し、前記第一ドメインのＣ末端アミノ酸が、前記第二ドメインのＮ末端アミノ酸に共有結合で連結される。１つの実施形態において、前記第一ドメインは、前記第二ドメインのＮ末端側にある。
【０１１４】
複数の実施形態において、前記Ｎおよび／またはＣ末端アミノ酸を、アミド化、アセチル化、アシル化、または当該技術分野において公知の他の修飾によって修飾することができる。１つの実施形態では、前記二機能性ホルモンのアミノ末端残基（すなわち、そのペプチドのＮ末端の遊離アミノ基）が（例えば、分解に対する保護のために）修飾される。１つの実施形態において、前記修飾は、Ｃ２〜Ｃ１６アシル基でのアシル化であり、さらなる実施形態において、前記修飾は、アセチル化である。
【０１１５】
１つの実施形態では、前記二機能性ホルモンのカルボキシ末端残基（すなわち、そのペプチドのＣ末端のカルボキシル基）が（例えば、分解に対する保護のために）修飾される。１つの実施形態において、前記修飾は、アミド化である。
【０１１６】
１つの実施形態において、上述の二機能性ホルモンは、約１００以下のアミノ酸を含有する。さらなる実施形態において、上述の二機能性ホルモンは、約９０以下のアミノ酸を含有する。さらなる実施形態において、上述の二機能性ホルモンは、約８０以下のアミノ酸を含有する。さらなる実施形態において、上述の二機能性ホルモンは、約７０以下のアミノ酸を含有する。さらなる実施形態において、上述の二機能性ホルモンは、約６０以下のアミノ酸を含有する。さらなる実施形態において、上述の二機能性ホルモンは、約５０以下のアミノ酸を含有する。さらなる実施形態において、上述の二機能性ホルモンは、約４０以下のアミノ酸を含有する。さらなる実施形態において、上述の二機能性ホルモンは、約３０以下のアミノ酸を含有する。さらなる実施形態において、上述の二機能性ホルモンは、約２０から約３０の間のアミノ酸を含有する。
【０１１７】
１つの実施形態において、前記二機能性ホルモンは、
（ｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置９および２０のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６１）；
（ｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置９および２５のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６２）；
（ｉｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ（この場合、位置９および２０のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６３）；
（ｉｖ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置９および２５のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６４）；
（ｖ）Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１２および２８のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６５）；
（ｖｉ）Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１０および２６のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６６）；
（ｖｉｉ）Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１０および２６のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６７）；
（ｖｉｉｉ）Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ（この場合、位置７および２３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６８）；または
（ｉｘ）Ｅ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ（この場合、位置１１および２７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：６９）
を含み、この場合、ｆは、Ｄ−フェニルアラニンである。
【０１１８】
１つの実施形態において、前記二機能性ホルモンは、
（ｉ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ−ＮＨ２（この場合、位置９および２０のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３１）；
（ｉｉ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｍ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置９および２５のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３３）；
（ｉｉｉ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｙ−Ｒ−ＮＨ２（この場合、位置９および２０のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３４）；
（ｉｖ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｎｌｅ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置９および２５のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３５）；
（ｖ）Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置１２および２８のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３６）；
（ｖｉ）Ａｃ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置１０および２６のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３８）；
（ｖｉｉ）Ａｃ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置１０および２６のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：３９）；
（ｖｉｉｉ）Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−ＮＨ２（この場合、位置７および２３のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：４０）；または
（ｉｘ）Ａｃ−Ｅ−Ｈ−ｆ−Ｒ−Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｎ−Ｓ−Ｆ−Ｒ−Ｙ−ＮＨ２（この場合、位置１１および２７のＣ残基は、ジスルフィド架橋を形成している）（配列番号：４２）
から成り、この場合、
Ａｃは、アミノ末端アセチル化を表し、
ＮＨ２は、カルボキシ末端アミド化を表し；および
ｆは、Ｄ−フェニルアラニンである。
【０１１９】
本発明は、上述の二機能性ホルモンの医薬的に許容される塩をさらに含む。
【０１２０】
本発明の二機能性ホルモンは、該二機能性ホルモンをコードする核酸を含む宿主細胞における発現（組換え発現）によって、または化学合成（例えば、固相ペプチド合成）によって、生産することができる。ペプチドは、当該技術分野において周知の自動固相手順によって容易に合成することができる。「Ｔ−ｂｏｃ」または「Ｆｍｏｃ」手順を利用することにより、適切な合成を行うことができる。固相合成についての技術および手順は、例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｂｙ  Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。あるいは、例えば、Ｌｉｕら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：９３３−９３６，１９９６；Ｂａｃａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１８８１−１８８７，１９９５；Ｔａｍら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４５：２０９−２１６，１９９５；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ  ａｎｄ  Ｋｅｎｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：２２１−２２５，１９９２；Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｔａｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：４１４９−４１５３，１９９４；Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｔａｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６５８４−６５８８，１９９４；およびＹａｍａｓｈｉｒｏ  ａｎｄ  Ｌｉ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３１：３２２−３３４，１９８８に記載されているようなセグメント縮合によって、ペプチドを作製することができる。ペプチドの合成に有用な他の方法は、Ｎａｋａｇａｗａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７０８７−７０９２，１９８５に記載されている。Ｄ−またはＬ−配置の合成ペプチドを作製するために、ペプチド合成サービスの民間プロバイダーを利用することもできる。そのようなプロバイダーとしては、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ（ケンタッキー州、ルーイヴィル）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州、フォスターシティー）、Ａｎａｓｐｅｃ（カリフォルニア州、サンホゼ）、およびＣｅｌｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ（マサチューセッツ州、ボストン）が挙げられる。
【０１２１】
標準的な方法を用いる組換えＤＮＡ技術を用いて、遺伝子コードによってコードされた天然アミノ酸を含むペプチドおよびペプチド類似体を作製することもできる。組換え技術によって生産されたペプチドを、当該技術分野において周知の方法を用いて修飾することができる（例えば、Ｎ末端アシル化［例えば、アセチル化］、Ｃ末端アミド化、ペプチド内のループの環化／形成［例えば、Ｃｙｓ残基間でのジスルフィド結合の形成による］）。従って、複数の実施形態において、本明細書に記載する二機能性ホルモンが、遺伝子コードによってコードされた天然アミノ酸を含有する場合、その二機能性ホルモンを、組換え法を用いて生産することができ、および、複数の実施形態において、今述べた修飾（例えば、アシル化、アミド化、環化）に付すことができる。従って、もう１つの態様において、本発明は、上述の二機能性ホルモンをコードする核酸をさらに提供する。本発明は、上述の核酸を含むベクターも提供する。さらにもう１つの態様において、本発明は、上述の核酸および／またはベクターを含む細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。本発明は、例えば当該技術分野において周知の培養基、生産、単離および精製方法を用いて、本発明のペプチドまたは二機能性ホルモンを発現／生産するための、上に記載したものなどの組換え発現系、ベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。
【０１２２】
そのようなベクターは、１つ以上の転写調節配列に作動可能に連結されているそのようなペプチドをコードすることができる核酸配列を含む。１つの実施形態において、前記ペプチドは、その精製を助長するドメイン（例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ）を含有する融合タンパク質である。核酸は、安定したまたは一過的発現のための標準的な組換え技術を用いて、発現用の細胞に導入することができる。本発明の核酸分子は、天然または非天然ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体をはじめとする２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を含む場合がある。
【０１２３】
「組換え発現」は、組換え技術によるペプチドまたはポリペプチド（例えば、二機能性ホルモン）の生産を指し、この場合、一般に、ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を適する発現ベクターに挿入し、そしてまたそのベクターを用いて宿主細胞を形質転換／トランスフェクトして、タンパク質を生産する。タンパク質またはポリペプチドに言及するときの用語「組換え」は、分子生物学技術によって作られた組換え核酸構築物を使用して発現されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質分子を指す。組換え核酸構築物は、本来結紮されないまたは本来は異なる位置で結紮される核酸配列に結紮される、または該核酸配列に結紮されるように操作される、ヌクレオチドを含む場合がある。従って、核酸構築物を「組換え」と呼ぶことは、その核酸分子が、遺伝子工学を用いて、すなわち人間の介入によって、操作されたことを示す。組換え核酸構築物は、例えば、形質転換／トランスフェクションによって宿主細胞に導入することができる。そのような組換え核酸構築物は、同じ細胞種に由来する配列を含む場合もあり、または単離され、その宿主細胞種の細胞に導入された、異なる宿主細胞種に由来する配列を含む場合もある。組換え核酸構築物配列は、宿主細胞の最初の形質転換の結果として宿主細胞ゲノムに組み込まれた状態になる場合もあり、またはその後の組換えおよび／もしくは修復事象の結果として宿主細胞ゲノムに組み込まれた状態になる場合もある。
【０１２４】
用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。好ましいベクターの１つのタイプは、エピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、それらが連結されている核酸の自律複製および／または発現が可能なものである。それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指図することができるベクターを本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。
【０１２５】
本発明の組換え発現ベクターは、通常の当業者には公知である、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌにおいて見つけられる、標準的な技術によって構築することができる。ＤＮＡのフラグメントを結紮するために様々な戦略を利用することができ、それらの選択は、ＤＮＡフラグメントの末端の性質に依存し、当業者はそれを容易に決定することができる。本発明のベクターは、細菌および宿主細胞におけるベクター増殖および選択を助長するために他の配列要素も含有する場合がある。加えて、本発明のベクターは、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位についてのヌクレオチドの配列を含む場合がある。選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子などについてのコーディング配列は、当業者に周知である。
【０１２６】
本発明の核酸配列を含む組換えベクターは、宿主細胞に導入することができ、該宿主細胞をとしては、被定義組換え発現ベクターからタンパク質コーディング領域を発現することができる生細胞を挙げることができる。前記生細胞は、培養細胞と生物体内細胞の両方を包含し得る。従って、本発明は、本発明の組換え発現ベクターを含有する宿主細胞も提供する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書では同じ意味に用いている。そのような用語は、特定の被験体を指すばかりでなく、そのような細胞の後代または後代になる可能性のあるものを指す。一定の修飾は、突然変異または環境の影響のいずれかに起因して次の世代で発生する場合があるため、そのような後代は、実際には親細胞と同一でない場合もあるが、それでもなお、本明細書において用いるこの用語の範囲内に包含される。
【０１２７】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって細胞に導入することができる。用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびウイルス媒介トランスフェクションをはじめとする、宿主細胞に外来核酸を導入するための技術を指す。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために適する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））および他の実験マニュアルにおいて見つけることができる。哺乳動物細胞にＤＮＡをインビボで導入する方法も公知であり、それらを用いて、遺伝子療法のために本発明のベクターＤＮＡを被験体に送達することができる。
【０１２８】
「転写調節配列／要素」は、それらが作動可能に連結されているタンパク質コーディング配列の転写を誘導または制御するＤＮＡ配列、例えば、開始および停止シグナル、エンハンサーおよびプロモーター、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、を指す一般用語である。第一の核酸配列と第二の核酸配列とが作動できる関係で配置されているとき、その第一の核酸配列は、その第二の核酸配列と「作動可能に連結されている」。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、そのプロモーターはそのコーディング配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されているＤＮＡ配列は、隣接しており、２つのタンパク質コーディング領域の接合が必要な場合、リーディングフレーム内にある。しかし、例えば、エンハンサーは、一般に、プロモーターから数キロ塩基離れているときに機能し、ならびにイントロン配列は、可変長のものであってよいので、一部のポリヌクレオチド要素は、作動可能に連結されているが隣接していない場合がある。
【０１２９】
本明細書において用いる場合、用語「トランスフェクション」または「形質転換」は、一般に、核酸媒介遺伝子導入によるレシピエントへの、例えば発現ベクターによる、核酸の導入を指す。
【０１３０】
外来核酸（例えば、外因性または異種ＤＮＡ［例えば、ＤＮＡ構築物］）を導入した細胞（例えば、宿主細胞または指標細胞）、組織、器官、または生物は、「形質転換されている」、「トランスフェクトされている」または「遺伝子導入」と見なす。遺伝子導入または形質転換細胞または生物は、その細胞または生物の子孫、および親として遺伝子導入生物を利用する繁殖プログラムから生産され、組換え核酸構築物の存在に起因して改変表現型を示す子孫も含む。従って、遺伝子導入生物は、外来核酸で形質転換された生物であるか、その導入遺伝子を含むような生物の子孫である。導入されたＤＮＡは、その細胞のゲノムの染色体ＤＮＡに組み込まれる場合もあり、あるいはエピソーム的に（例えば、プラスミド上に）維持される場合もある。トランスフェクションの方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９の上記参考文献；Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９４の上記参考文献参照）。
【０１３１】
哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションについて、用いられる発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、ほんの少しの細胞しか外来ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込むことができないことは公知である。これらの要素を同定および選択するために、選択可能マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、対象となる遺伝子と共に宿主細胞に導入することができる。本明細書において用いる場合、用語「選択可能マーカー」は、指標細胞に同定可能な特徴を付与するマーカーを指すために広く用いている。選択可能マーカーの非限定的な例としては、生存力、代謝、増殖、形態などに作用するマーカーが挙げられる。好ましい選択可能マーカーとしては、薬物に対する耐性を付与するもの、例えば、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートが挙げられる。選択可能マーカーをコードする核酸は、そのペプチド化合物をコードするものと同じベクターを用いて宿主細胞に導入することができ、または別のベクターを用いて導入することができる。導入された核酸で安定してトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定することができる（選択可能マーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生き残るが、他の細胞は死滅するであろう）。
【０１３２】
本発明のペプチドは、当該技術分野において周知の多くの技術、例えば、逆相クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動法などによって精製することができる。特定のペプチドまたはペプチド類似体を精製するために用いられる実際の条件は、合成戦略に、および正味の電荷、疎水性、親水性などのような因子に、一部、依存するであろうし、当業者には明白であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製については、例えば、そのペプチドまたはペプチド類似体に特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。
【０１３３】
１つの実施形態において、上述の二機能性ホルモンは、実質的に純粋である。化合物は、自然にそれに付随する成分からそれが分離されているとき、「実質的に純粋である」。典型的に、化合物は、それがサンプル中の全材料の少なくとも重量６０％である、さらに一般的には７５重量％より多い、好ましくは９０重量％を超える、および最も好ましくは９５重量％を超えるとき、実質的に純粋である。従って、例えば、化学合成される、または組換え技術によって生産されるポリペプチドには、一般に、その自然会合成分が実質的にないであろう。核酸分子は、本発明のＤＮＡが由来する生物の天然ゲノム内では通常隣接しているコーディング配列と直接隣接していない（すなわち、それらに共有結合で連結されていない）とき、実質的に純粋である。実質的に純粋な化合物は、例えば、天然源からの抽出によって；ポリペプチド化合物をコードする組換え核酸分子の発現によって；または化学合成によって、得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、ＨＰＬＣなどを用いて測定することができる。
【０１３４】
もう１つの態様において、本発明は、上記二機能性ホルモンと医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。
【０１３５】
もう１つの態様において、本発明は、上記二機能性ホルモンと医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む、被験体における腎障害を予防および／または治療するための医薬組成物も提供する。
【０１３６】
もう１つの態様において、本発明は、上記二機能性ホルモンと医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む、被験体における高血圧を予防および／または治療するための医薬組成物も提供する。
【０１３７】
本発明は、被験体における腎障害を予防および／または治療するための方法をさらに提供し、この方法は、（ａ）上述の二機能性ホルモンまたは（ｂ）上述の医薬組成物のうちの少なくとも一方の有効量を前記被験体に投与することを含む。
【０１３８】
もう１つの態様において、本発明は、被験体における高血圧を予防および／または治療するための方法も提供し、この方法は、（ａ）上述の二機能性ホルモンまたは（ｂ）上述の医薬組成物のうちの少なくとも一方の有効量を前記被験体に投与することを含む。
【０１３９】
本発明は、薬物の調製のための上記二機能性ホルモンの使用にさらに関する。
【０１４０】
もう１つの態様において、本発明は、被験体における腎障害を予防および／または治療するための薬物の調製のための、（ａ）上述の二機能性ホルモンまたは（ｂ）上述の医薬組成物の少なくとも一方の使用を提供する。
【０１４１】
もう１つの態様において、本発明は、被験体における腎障害を予防および／または治療するための、（ａ）上述の二機能性ホルモンまたは（ｂ）上述の医薬組成物の少なくとも一方の使用を提供する。
【０１４２】
もう１つの態様において、本発明は、被験体における高血圧を予防および／または治療するための薬物の調製のための、（ａ）上述の二機能性ホルモンまたは（ｂ）上述の医薬組成物の少なくとも一方の使用を提供する。
【０１４３】
もう１つの態様において、本発明は、被験体における高血圧を予防および／または治療するための、（ａ）上述の二機能性ホルモンまたは（ｂ）上述の医薬組成物の少なくとも一方の使用を提供する。
【０１４４】
「有効量」は、所望の予防および／または治療結果（例えば、腎障害の予防および／または治療）を達成するために、投薬時におよび必要な治療期間にわたって、有効な量を指す。本発明の化合物の有効量は、その個体の疾病状態、年齢、性別および体重ならびにその個体において所望の応答を惹起するその化合物の能力などの因子によって変わり得る。最適な治療応答を生じさせるように薬剤投与レジメンを調整することができる。有効量は、その化合物の任意の毒性または有害な作用よりその治療恩恵作用がまさるものでもある。任意の特定の被験体のための具体的な薬剤投与レジメンは、その個体の必要、およびそれらの組成物を投与するまたは投与を管理する人のプロの判断に従って、経時的に調整することができる。
【０１４５】
本明細書において用いる場合、「医薬的に許容される担体」または「賦形剤」は、生理的に適合性である任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。１つの実施形態において、前記担体は、非経口投与に適する。非経口投与のための製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水または食塩水、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、植物由来の油、または水素化ナフタレンを含有することがある。生体適合性、生体分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを使用して、化合物の放出を制御することができる。本発明の化合物／組成物のための他の潜在的に有用な非経口送達システムとしては、エチレン酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、内埋可能注入システム、およびリポソームが挙げられる。あるいは、前記担体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下または経口投与に適当であり得る。医薬的に許容される担体としては、滅菌水性溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。医薬活性物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。いずれの従来の媒質または薬剤も本活性化合物と不相溶性である場合を除き、本発明の医薬組成物でのそれらの使用が考えられる。補足活性化合物を本組成物に添合することもできる。
【０１４６】
１つの実施形態において、上述の腎障害は、急性腎臓損傷である。本明細書において用いる場合、用語「腎臓損傷」は、「腎損傷」と同義であり、これらの用語を交換可能に用いている。もう１つの実施形態において、上述の腎障害は、術後腎臓損傷または機能障害である。１つの実施形態において、上述の術後腎臓損傷または機能障害は、弁修復のための心肺バイパス手術、大動脈瘤、臓器移植、開心術または冠動脈移植に起因する。
【０１４７】
１つの実施形態において、上述の投与は、静脈内注入によるものである。さらなる実施形態において、上述の静脈内注入は、約１ｎｇ／ｋｇ／分から約１０μｇ／ｋｇ／分の速度でのものである。
【０１４８】
１つの実施形態において、上述の治療は、１つより多くの活性／治療薬（すなわち、組み合わせ）の使用／投与を含む。本発明の予防／治療薬および／または組成物の組み合わせを任意の従来の剤形で（例えば、連続的に、同時に、異なる時点で）投与または併用投与することができる。本発明に関連して、併用投与は、臨床転帰の改善を達成するために調整された治療の過程での１つより多くの治療薬の投与を指す。そのような併用投与は、同一の時間的広がりを持つ、すなわちオーバーラップした期間に行われる、場合もある。例えば、第一の薬剤を、患者に、第二の活性薬剤の投与前に、投与と同時に、投与の前後に、または投与後に投与することができる。１つの実施形態では、それらの薬剤を単一組成物に兼備させること／調合すること、従って、同時に投与することができる。１つの実施形態では、本発明の１つ以上の活性薬剤が、問題の疾患（例えば、腎障害、高血圧）を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤と併用で使用／投与される。
【０１４９】
本発明は、上述の二機能性ホルモンまたは上述の組成物を、被験体における腎臓の状態または高血圧の予防および／または治療のための説示と共に含む、キットまたは包装をさらに提供する。
【０１５０】
１つの実施形態において、上述の被験体は哺乳動物であり、さらなる実施形態ではヒトである。
【０１５１】
本発明を実施するための様式
【０１５２】
本発明を以下の非限定的実施例によってさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【０１５３】
二機能性ホルモンの調製
固相合成
【０１５４】
本発明の二機能性ホルモンは、適切に側鎖が保護されているフルオレニルメトキシカルボニル保護アルファ−アミノ酸および０．７５ｍｍｏｌ／ｇの負荷量を有するベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂（ＢＡＣＨＥＭ  ＡＧ）を使用する固相ペプチド合成アプローチを用いて作った。アミノ酸のカップリング前に、６−アミノへキサン酸およびＲｉｎｋリンカーをその樹脂にカップリングさせ、その後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の［２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート］（ＨＣＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して、１時間、Ｆｍｏｃ−［９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル］保護アミノ酸をカップリングさせた。ＤＭＦ中２０％（ｖ／ｖ）のピペリジンを使用して、１時間、Ｆｍｏｃ脱保護を行った。無水酢酸およびＤＩＥＡを使用して、本発明のペプチドをアセチルでＮ−キャッピングするための一般的な手順を行った。合成の完了後、固相支持体からペプチドを切断し、同時に側鎖を脱保護した。粗製線状ペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリル勾配を用いるＶｙｄａｃ（商標）Ｃ１８−カラムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって、さらに精製した。それらのペプチドを真空乾燥させてアセトニトリルを除去し、０．１％ＴＦＡから凍結乾燥させた。分析用高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって純度を評価し、Ｖｏｙａｇｅｒ（商標）測定器（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を使用するマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）分析によって質量を決定した。
【０１５５】
線状ペプチドの環状ペプチドへの酸化的環化（ジスルフィド）
【０１５６】
前記線状ペプチドを、２０％ＤＭＳＯ／ＨＣｌ  １Ｍ（ｖ／ｖ）の溶液に、約１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。その酸化反応の進行を、分析用Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターした。１２時間後、反応は完了した。その後、分取Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、その溶液を精製した。分析用ＨＰＬＣによって純度を評価し、Ｖｏｙａｇｅｒ（商標）測定器（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を使用してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析により質量を決定した。
【０１５７】
樹脂上でのラクタムへの環化
【０１５８】
線状配列を組み立てた後、パラジウム（０）触媒を使用して、グルタミン酸およびリシン側鎖上の直交保護基、すなわち、それぞれ、Ｇｌｕ（γ−Ｏ−Ａｌｌ）およびＬｙｓ（ε−Ｎ−Ａｌｏｃ）保護基、を除去した。側鎖保護基の除去後（カイザー試験で確認）、ＤＭＦ中、［（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）オキシトリス−（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート］（ＰｙＡＯＰ）での処理によって、遊離アミノおよびカルボキシル側鎖を環化した。負のカイザー試験結果が得られるまで、環化条件を繰り返した。
【０１５９】
種々の二機能性ホルモンを合成した。それらを下の表ＩＩＩに記載する。
【０１６０】
【表４】
2010532323.tif 000005
【実施例２】
【０１６１】
二機能性ホルモンの活性
ＡＮＰ受容体発現性ＬＬＣ−ＰＫ１細胞およびＭＣＲ１受容体発現性Ｂ１６−Ｆ１細胞に関して二機能性ホルモンを試験した。両方の細胞タイプを、刺激２４時間前に、９６ウエルプレートにおいて１．０×１０５細胞／ｍＬの濃度で培養した。刺激前、細胞を２時間、ＤＰＢＳのみの中で飢餓させ、アッセイバッファ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡおよび５００μＭ  ＩＢＭＸを含有するＤＰＢＳ）中で１０分間インキュベートした。１０−６Ｍから１０−１２Ｍの濃度で３０分間のその二機能性ホルモンの用量応答曲線を作成した。上清を収集し、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙからの放射性標識キットを用いてｃＡＭＰ（Ｂ１６−Ｆ１）またはｃＧＭＰ（ＬＬＣ−ＰＫ１）を測定した。これらの実験の結果を表ＩＶに提示する。
【表５】
2010532323.tif 000006
【実施例３】
【０１６２】
ラットの平均動脈圧（ＭＡＰ）に対する本二機能性ホルモンの効果
本二機能性ホルモンのインビボ薬理学を研究するために、ＭＡＰに対するそれらの効果（例えば、降圧効果）を、それらの化合物の漸増用量のボーラス静脈内注射を含むプロトコルで測定した。
【０１６３】
動物
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（雄、３００から３３０ｇの体重）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｉｎｃ．から入手した。１２：１２の昼夜サイクルのもと、標準実験室用飼料で動物を維持した。
【０１６４】
外科手術準備
実験時間の間、ラットをイソフラン２．５％で麻酔した。動物を放射加温装置のもとにおいて体温を３７．５℃に保った。マルチチャンネルレコーダー（ＴＡ２４０  Ｇｏｕｌｄ）に接続した圧変換器（Ｓｔａｔｈａｍ（商標））で継続的に動脈圧を記録するために、頚動脈にカテーテル（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（商標）チューブＰＥ９０）を挿入した。右頚静脈には薬物投与のためのカテーテル（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（商標）チューブＰＥ９０）を挿入した。外科手術準備後、実験プロトコルの開始前に３０分間の安定時間を経過させた。この時間の間に血圧の安定を評価した。ペプチドを静脈内ボーラスによって頚静脈経由で注射した。１０、２０、４０および１００μｇ／ｋｇの用量を注射した。各注射間に１５分の時間を取った。
【０１６５】
投与溶液の調製
ペプチド、配列番号：２（天然ＡＮＰ、図中の＃２）および配列番号：３３の二機能性ホルモン（図中の＃３３）を食塩溶液中、１００μｇ／ｍＬの濃度で毎日新たに作った。そのペプチドを滅菌食塩液で適切に希釈して１０〜１００μｇ／ｋｇ用量にした後、頚静脈内に注射した。ペプチドの３０μｇ／ｋｇ／時の注入用量のために、０．１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）中の保存溶液の希釈物（１００μｇ／ｍＬ）を作り、実験が完了するまで１ｍＬ／時の速度で頚静脈内埋カテーテル（ＰＥ−９０）によって注入した。
【０１６６】
結果
図１Ａに示すように、天然ＡＮＰ（配列番号：２）は、１μｇ／ｋｇのボーラス静脈内用量ででさえＭＡＰの減少を生じさせ、これに対して二機能性ホルモン（配列番号：３３）は、２０μｇ／ｋｇまでの用量で許容された。従って、二機能性ホルモン（配列番号：３３）は、天然ＡＮＰより高い用量で許容される。注入投与レジメンでの効果を研究するために、ペプチドの単回用量（３０μｇ／ｋｇ／時）を静脈内注入によって投与した。図１Ｂに示すように、天然ＡＮＰペプチド（配列番号：２）は、ＭＡＰを急速に低下させ、これに対して、同じ用量での二機能性ホルモン（配列番号：３３）の持続注入は、十分に許容された。
【実施例４】
【０１６７】
ＳＤラットにおける高血圧に対する本二機能性ホルモンの効果
ＢＮＰ（Ｎａｔｒｅｃｏｒ（登録商標））は、高血圧発症時の血圧降下用にＦＤＡによって認可されている。その天然ホモログ、ＡＮＰ、も高血圧発症時に血圧を急速に低下させることが証明されており、治療薬として有用である。レニン−アンギオテンシン系の活性化は、高血圧を含む幾つかの医学的適応に関係づけられている。従って、アンギオテンシンＩＩの持続注入で血圧を上昇させたラットモデルを用い、血圧を低下させる天然ＡＮＰ（図中のペプチド＃２）および配列番号：３３の二機能性ホルモン（図中のペプチド＃３３）の作用強度／効力を、ＳＤラットにおけるそれらのペプチドの静脈内ボーラス注射後に検定した。
【０１６８】
動物
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（雄、３００から３３０ｇの体重）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｉｎｃ．から入手した。１２：１２の昼夜サイクルのもと、標準実験室用飼料で動物を維持した。
【０１６９】
外科手術準備
実験時間の間、ラットをイソフラン２．５％で麻酔した。動物を放射加温装置のもとにおいて体温を３７．５℃に保った。マルチチャンネルレコーダー（ＴＡ２４０  Ｇｏｕｌｄ）に接続した圧変換器（Ｓｔａｔｈａｍ（商標））で継続的に動脈圧を記録するために、頚動脈にカテーテル（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（商標）チューブＰＥ９０）を挿入した。右頚静脈には薬物投与のためのカテーテル（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（商標）チューブＰＥ９０）を挿入した。また、潅流ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）によるアンギオテンシンＩＩ持続注入のために、尾静脈にカテーテル（Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｔ  ２５Ｇ３／４×１２’’、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を挿入した。外科手術準備後、実験プロトコルの開始前に３０分間の安定時間を経過させた。この時間の間に血圧の安定を評価した。尾静脈経由でのアンギオテンシンＩＩ（５ｕｇ／ｋｇ／時）の静脈内注入によって、高血圧を誘導した。血圧を安定させたＡｎｇ  ＩＩ注入の３０分後、ペプチドを静脈内ボーラスによって尾静脈経由で注射した。１００、２００、３００、４００および５００ｕｇ／ｋｇの用量を注射した。各注射間に１５分の時間を取った。
【０１７０】
投与溶液の調製
アンギオテンシンＩＩを食塩液中１００μｇ／ｍＬの濃度で毎日新たに作った。５μｇ／ｋｇ／時での注入の場合、２時間の注入（１ｍＬ／時）のために３０μＬのＡｎｇ  ＩＩ（１００μｇ／ｍＬ）を２ｍＬの食塩水に入れた。食塩溶液中１０００μｇ／ｍＬの濃度のペプチド（＃２および＃３３）も毎日新たに作った。滅菌食塩水でその保存溶液を適切に希釈して、０．２ｍＬの注射容量中の１００〜５００μｇ／ｋｇ用量にした。
【０１７１】
結果
図２に示すように、アンギオテンシンＩＩの注入は、基礎血圧（Ｂａｓ）を約１０〜１５％（Ａｎｇ）急速に上昇させた。天然ＡＮＰ（＃２）のボーラス注射は、１００μｇ／ｋｇの用量で血圧を急速に正常化し、より高い用量（すなわち、２００〜５００μｇ／ｋｇ）では高血圧を生じさせた。３００μｇ／ｋｇまでの二機能性ホルモン（＃３３）の用量は、高血圧を誘導しなかったが、４００μｇ／ｋｇ以上の用量では、二機能性ホルモンは、ＡＮＰのものと同様の効果を有した。
【実施例５】
【０１７２】
腎虚血後の急性腎機能障害に対する本二機能性ホルモンでの予防的処置の効果
腎虚血後の急性腎臓損傷（動物モデルにおいて３０〜６０分間、一方または両方の腎動脈をクランプすることによって再現）は、血流減少をもたらす腎血管収縮と、尿中の尿細管マーカーの上昇およびアポトーシスを含む上皮損傷と、ＩＬ−１などのサイトカインの分泌後の炎症と、その損傷部位への好中球および単球の浸潤との組み合わせを誘発する。
【０１７３】
動物
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（雄、３００から３３０ｇの体重）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｉｎｃ．から入手した。１２：１２の昼夜サイクルのもと、標準実験室用飼料で動物を維持した。
【０１７４】
外科手術準備
実験時間の間、ラットをイソフラン２．５％で麻酔した。動物を放射加温装置のもとにおいて体温を３７．５℃に保った。腎動脈をクランプする前に尾静脈動脈から血液サンプル（０．５ｍＬ）を採取した。動物を麻酔したら、仰臥位に置き、腹壁の右側に１．５ｃｍ側腹切開を行った。その後、右腎を露出させ、尿管、腎動脈および腎静脈を注意深く切除し、結紮した。腎茎を切断した後、腎臓を取り出した。同じ切開を腹壁の左側にも行った。左腎を露出させ、腎血管柄を注意深く切除した。その後、３０または４５分の時間、血管クリップ（Ｍｉｃｒｏ  Ｓｅｒｒｅｆｉｎｅ（商標）、Ｆｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ）をしておくことによって、その腎血管柄を閉塞させた。この腎血管柄クランピングは、急性腎動脈閉塞（ＲＡＯ）を生じさせた。２分間、血管クリップを外した後、その腎臓を虚血および良好な潅流について検定した。その腹壁の創傷を２層で閉じた。筋肉層は、３−０絹糸連続縫合で閉じ、皮膚は、縫合クリップ（Ｆｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ）で閉じた。右腎摘出および左腎動脈クリッピング手順の２１時間後、ラットを尿採取（予め計量したチューブ５０ｍＬ中）のために３時間、代謝ケージに入れた。尿が入っている試験管を計量することによって尿量を測定した。その後、イソフラン２．５％で動物に麻酔した。左腎を取り出し、将来の組織検査のためにホルマリン中で保存した。ヘパリン処理した注射器（３ｍＬ）に心臓穿刺によって血液を採取し、ヘパリンが抗凝血剤として入っている適切なラベルを貼った試験管に直ちに移した。採取後、すべての血液サンプルを氷上で保持し、２分間、１３０００ｒｐｍで遠心した。血漿および尿アリコート（４００μＬ）を取り出し、−８０℃で保管した。
【０１７５】
投与溶液の調製
０．１％ＨＳＡ食塩溶液（９．９６７μＬの食塩水中３０％のＨＳＡ（３３μＬ））中、１００μｇ／１００μＬの濃度のペプチド（＃２および＃３３）も毎日新たに作った。１５μｇ／ｋｇ／時の注入の場合、２時間の注入（１ｍＬ／時）のために９μＬのペプチド（１００μｇ／１００μＬ）を２ｍＬの０．１％ＨＳＡ食塩水に入れた。
【０１７６】
結果
図３に示すように、血漿クレアチニンおよび尿素レベルは、食塩水処置群では時間依存方式で上昇した。両方のペプチドが、それぞれの時点で、クレアチニンおよび血液尿素窒素（ＢＵＮ）の血中濃度の上昇を有意に低下させた。従って、二機能性ホルモン（＃３３）は、予防的に使用したとき、腎臓損傷の減少について天然ＡＮＰ（＃２）と同様に有効である。
【実施例６】
【０１７７】
腎虚血後の急性腎機能障害に対する本二機能性ホルモンでの損傷後処置の効果
損傷後の本ペプチドの短期注入（治療的処置）が腎臓損傷の減少に有益であるかどうかを評価するために、腎動脈クランプ除去後、２時間、ペプチド＃２または＃３３を１５μｇ／ｋｇ／時で注入した。血漿クレアチニンおよび尿素を種々の時点で判定した。動物モデルおよび投与溶液は、上の実施例５において説明したとおりに準備した。
【０１７８】
結果
図４に示すように、血漿クレアチニンおよびＢＵＮレベルは、食塩水処置群では時間依存的様式で上昇した。４時間の時点では両方のペプチドがクレアチニンおよびＢＵＮの上昇を防止したが、より遅い時点（すなわち、２１時間および２７時間）では、腎虚血後のクレアチニンおよびＢＵＮレベルの低下に関して二機能性ホルモン（＃３３）のほうが天然ＡＮＰ（＃２）より有効であった。
【実施例７】
【０１７９】
腎虚血後の急性腎臓機能障害に対する本二機能性ホルモンの長期注入の効果
腎損傷時の腎臓機能に対する本二機能性ホルモンの長期注入の効果を検定するために、腎動脈クランプ除去後、２４時間、ペプチド＃２または＃３３を１．５または１５μｇ／ｋｇ／時で注入した。損傷後２４時間の時点で血漿クレアチニンおよび尿素窒素を判定した。実験手順（動物モデル、投与溶液）は、上の実施例５において説明したものと同じであった。
【０１８０】
結果
天然ＡＮＰ（＃２）と二機能性ホルモン（＃３３）の両方が、２４時間注入後、食塩水処置動物と比較して血漿クレアチニンおよびＢＵＮを有意に減少させた。両方のペプチドで腎虚血の血液マーカーが時間に依存して減少した。クレアチニンおよびＢＵＮレベルのより顕著な減少によって証明されるように、腎障害の結果の改善に関して二機能性ホルモン＃３３のほうが天然ＡＮＰより有効であった（図５）。
【実施例８】
【０１８１】
腎虚血後の炎症および急性腎臓損傷に対する本二機能性ホルモンでの処置の効果
腎虚血は、炎症性マーカー、例えばＩＬ−１β、ＩＬ−１８、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）およびＣＤ１１ｂ（好中球マーカー；組織の好中球浸潤の証拠）、ならびに尿細管上皮マーカー、例えばＫＩＭ−１、ＮＧＡＬおよびＮＡＧの発現増加を惹起する。これらのマーカーは、血清クレアチニンレベルの上昇が観察されるより早く発現されるので、これらのマーカーは非常に興味深い。従って、これらのマーカーに基づく急性腎臓損傷の診断によって、患者のより早期の治療が可能となり、これは、透析の必要性および死亡率の点でより良好な転帰を生じさせることができる。炎症性および尿細管損傷マーカーの発現に対する二機能性ホルモン＃３３の効果を、実施例５において説明した動物モデルを用いて評価した。
【０１８２】
投与溶液の調製
Ａｌｚｅｔ（商標）ミニポンプを使用して、ペプチド＃３３を１５μｇ／ｋｇ／時の注入速度で、２４時間、注入した。
【０１８３】
ウエスタンブロット法
新鮮な腎臓を迅速に切除し、組織ホモジナイザーを用いて氷冷溶解バッファ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０（商標）、０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロール含有Ｃｏｍｐｌｅｔｅ−Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）中で均質化した。氷上での１５分のインキュベーションの後、サンプルを１３，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心し、可溶化タンパク質抽出物を含有する上清を回収した。１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動でタンパク質サンプル（４０ｕｇのタンパク質）を分割し、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に転写した。膜をＴＢＳＴ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中５％の脱脂乳の溶液中で１時間、室温でインキュベートすることによって、非特異的結合を除去した。その後、膜を４℃で一晩、次の一次抗体のいずれかと共にインキュベートした：抗ＫＩＭ−１（１：４００；ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＩＬ−１β（１：５００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、抗ＮＧＡＬ（１：５００；Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、抗ＣＤ１１ｂ／ｃ（１：４００；Ａｂｃａｍ）またはモノクローナル抗β−アクチン（０．５Ａｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）。その後、膜をＴＢＳＴ中で洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲート型二次抗体（０．５μｇ／ｍＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐａｒｍａｃｉａ、Ｂａｉｅ  ｄ’Ｕｒｆｅ，ＱＣ）と共に１時間、室温でインキュベートした。化学発光試薬（ＥＣＬ（商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐａｒｍａｃｉａ）でブロットを処理し、Ｘ−ＯＭＡＴ（商標）（Ｋｏｄａｋ）画像フィルムに露出した。
【０１８４】
結果
図６に示すように、３０分間の腎クランピングは、ＣＤ１１ｂ／ｃ、ＫＩＭ−１およびＩＬ−１β（損傷）の強い発現を惹起した。本二機能性ホルモン（＃３３）の持続注入は、これらのマーカーの発現を減少させ、従って、虚血後の腎損傷および炎症の減少に関するその効力を示した。
【０１８５】
本発明の特定の実施形態によって本発明を上で説明したが、これは、添付の特許請求の範囲において定義する本発明の精神および本質から逸脱することなく変更することができる。
【図１】
2010532323.tif 000007
【図２】
2010532323.tif 000008
【図３】
2010532323.tif 000009
【図４】
2010532323.tif 000010
【図５】
2010532323.tif 000011
【図６】
2010532323.tif 000012
【配列表】
2010532323000001.app
【国際調査報告】
2010532323.tif 000013
2010532323.tif 000014