(57)【要約】  癌を治療するために使用することができるオリゴペプチドを開示する。乳癌、皮膚癌、前立腺癌および多発性骨髄腫（ＭＭ）を含む癌を治療する方法をさらに開示する。これらの方法は、Ｍｅｓｄ遺伝子によってコードされるポリペプチド、またはＭｅｓｄポリペプチドの連続サブ配列を含んでなるオリゴペプチドの投与を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、全長ＭｅｓＤポリペプチド、Ｍｅｓｄポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を共有するポリペプチド、または１０連続アミノ酸〜約７０連続アミノ酸を含んでなるオリゴペプチドからなる群から選択される治療有効量のＭｅｓｄポリペプチドを対象に投与することを含んでなり、ここで、前記オリゴペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３、および配列番号１〜配列番号３２に記載の少なくとも１つの配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、前記ポリペプチドまたは前記オリゴペプチドは、ＷｎｔリガンドのＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６受容体への結合をアンタゴナイズする、方法。
【請求項２】
前記オリゴペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択される配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴペプチドは、配列番号１５および配列番号２１からなる群から選択される配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｍｅｓｄポリペプチドは、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記癌は、乳癌、多発性骨髄腫（ＭＭ）、前立腺癌および皮膚癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
治療を必要とする対象において癌を治療する方法であって、全長ＭｅｓＤポリペプチド、Ｍｅｓｄポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を共有するポリペプチド、または１０連続アミノ酸〜約７０連続アミノ酸を含んでなるオリゴペプチドからなる群から選択されるＭｅｓｄポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含んでなる治療有効量の核酸ベクターを、対象に投与することを含んでなり、ここで、前記オリゴペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３、および配列番号１〜配列番号３８に記載の少なくとも１つの配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、前記ポリペプチドまたは前記オリゴペプチドは、ＷｎｔリガンドのＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６受容体への結合をアンタゴナイズする、方法。
【請求項７】
前記オリゴペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択される配列を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴペプチドは、配列番号１５および配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸ベクターは細胞に含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌は、乳癌、多発性骨髄腫（ＭＭ）、前立腺癌および皮膚癌からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
癌の治療のための医薬品の製造のために約１０連続アミノ酸〜約７０連続アミノ酸までを含んでなるオリゴペプチドの使用であって、ここで、前記オリゴペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３、および配列番号１〜配列番号３８に記載の少なくとも１つの配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、前記オリゴペプチドは、ＷｎｔリガンドのＬＲＰ５受容体および／またはＬＲＰ６受容体への結合をアンタゴナイズする、使用。
【請求項１２】
前記オリゴペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択される配列を含んでなる、請求項１１に記載のオリゴペプチドの使用。
【請求項１３】
前記オリゴペプチドは、配列番号１５および配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１１に記載のオリゴペプチドの使用。
【請求項１４】
前記癌は、乳癌、および多発性骨髄腫（ＭＭ）、前立腺癌および皮膚癌からなる群から選択される、請求項１１に記載のオリゴペプチドの使用。
【請求項１５】
癌の治療のための医薬品の製造のためのポリペプチドまたはオリゴペプチドの使用であって、ここで、前記ポリペプチドまたは前記オリゴペプチドは、表Ｉに記載の全長ＭｅｓＤポリペプチド、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２、および配列番号１〜配列番号３２に記載の少なくとも１つの配列と少なくともの７０％の配列同一性を共有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、前記ポリペプチドまたは前記オリゴペプチドは、ＷｎｔリガンドのＬＲＰ５受容体および／またはＬＲＰ６受容体への結合をアンタゴナイズする、使用。
【請求項１６】
前記癌は、乳癌、多発性骨髄腫（ＭＭ）、前立腺癌および皮膚癌からなる群から選択される、請求項１５に記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年４月３０日に出願された特許文献１（出典明示によってその全体が本明細書に引用される）に対し優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたＲ０１−ＣＡ１００５２０に基づく政府の助成によって行われた。政府は、本発明において所定の権利を有する。
【０００３】
コンピュータ読み取り可能な形態で提出された資料の出典明示による援用
本開示物の一部である配列表は、本発明のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含んでなるコンピュータ読み取り可能な形態および書面による配列表を含む。コンピュータ読み取り可能な形態で記録された配列表の情報は、書面による配列表と同一である。配列表の内容は、本明細書においてその全体が出典明示によって援用される。
【背景技術】
【０００４】
Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節不全は、癌を生じ得る。Ｗｎｔシグナル伝達経路のいくつかの成分は、ヒトの癌における癌遺伝子または腫瘍抑制因子(それぞれ、機能獲得または機能欠失変異を示す)として同定されている。Ｗｎｔシグナル伝達の調節不全は、乳腺前駆細胞の過度の増殖を引き起こし得、そしてこれらの細胞を癌にし易くする。例えば、乳腺におけるＷｎｔシグナル伝達経路の活性化は、乳癌発生を誘導するのに十分であり、そしてＷｎｔ−１の過剰発現は乳癌発生を生じ得る（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国仮出願第６０／９１４，９０２号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Woodward, W.A., et al., J. Cell Sci. 118: 3585-2598, 2005
【非特許文献２】Liu, S., et al., Breast Cancer Res. 86-95, 2005
【非特許文献３】Howe, L.R. and Brown, A.M., Cancer Biol. Ther. 3: 36-41, 2004
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
癌の新たな治療に対する要求が満たされていないことを考慮して、本発明者らは、癌の進行を防止、減速または反転することができるオリゴペプチドを開発した。これらのオリゴペプチドは、ｍｅｓｄ遺伝子（中胚葉発生に寄与することが同定されている遺伝子）、ならびにそのフラグメントによってコードされる全長ポリペプチドを含む。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明者らは、オリゴペプチド（これらのそれぞれは、ｍｅｓｄ遺伝子によってコードされるポリペプチドの連続配列を含んでなるか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる）を開発した。これらの実施形態のオリゴペプチドは、全長ｍｅｓｄポリペプチドまたはそのフラグメントを含んでなり得る。これらの実施形態のオリゴペプチドは、約１０連続アミノ酸長〜約７０連続アミノ酸長までか、または約３０連続アミノ酸長〜約６７連続アミノ酸長までのアミノ酸配列を含んでなるか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。様々な態様において、オリゴペプチドは、以下から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る
ＣＡＤＶＴＬＥＧＱＶＹＰＧＫＧＧＧＳＫＥＫＮＱＴＫＱＥＫＧＫＫＫＫＥＲＤＬＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＫＫＥＥＬ（配列番号１）、
ＣＡＤＶＴＬＥＧＱＶＹＰＧＫＧＧＧＳＱＥＫＮＫＴＫＱＥＫＧＫＫＫＫＥＧＶＰＫＳＲＡＫＶＶＱＥＤＮＲＡＧＮＫＲＥＥＬ（配列番号２）、
ＣＡＤＶＴＬＥＧＱＶＹＰＧＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＱＤＫＧＫＫＫＫＥＧＤＬＫＳＲＳＳＫＥＥＮＲＡＧＮＫＲＥＤＬ（配列番号３）、
ＣＡＥＶＴＬＥＧＱＭＹＰＧＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＰＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲＲＥＤＬ（配列番号４）、
ＣＡＥＶＴＬＥＧＱＭＹＰＧＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＲＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲＲＥＤＬ（配列番号５）、
ＣＡＤＶＴＬＥＧＱＶＹＰＧＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＱＤＫＧＫＫＫＫＥＧＤＬＫＳＲＳＳＫＥＤＮＲＡＲＮＫＲＥＤＬ（配列番号６）、
ＣＡＥＶＴＬＥＧＱＭＹＰＧＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＧＫＫＫＥＧＤＰＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲＲＥＤＬ（配列番号７）、
ＣＡＤＶＴＬＥＧＱＶＹＰＧＫＧＡＤＧＳＥＫＧＲＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＫＤＡＥＫＳＫＳＳＨＥＤＮＲＡＮＱＴＥＲＧ（配列番号８）、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫ（配列番号９）、
ＫＧＧＧＳＱＥＫＮＫ（配列番号１０）、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＱ（配列番号１１）、
ＫＧＧＧＳＫＥＲＱＬ（配列番号１２）、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＱＤＫＧＫＫＫＫＥＧＤＬＫＳＲＳＳＫＥＥＮＲ（配列番号１３）、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＱＤＫＧＫＫＫＫＥＧＤＬＫＳＲＳＳＫＥＥＮＲＡＧＮＫ（配列番号１４）、
ＱＶＹＰＧＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＱＤＫＧＫＫＫＫＥＧＤＬＫＳＲＳＳＫＥＥＮＲＡＧＮＫＲＥＤＬ（配列番号１５）、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＰＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲ（配列番号１６）、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＲＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲ（配列番号１７）、
ＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＰＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲＲＥＤＬ（配列番号１８）、
ＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＲＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲＲＥＤＬ（配列番号１９）、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＰＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲ（配列番号２０）、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＲＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲ（配列番号２１）、
ＱＭＹＰＧＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＰＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲＲＥＤＬ（配列番号２２）、
ＥＧＤＰＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲ（配列番号２３）、
ＥＧＤＲＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲ（配列番号２４）、
ＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＰＫＰＲＡＳ（配列番号２５）、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫ（配列番号２６）、
ＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＲＫＰＲＡＳ（配列番号２７）、
ＫＥＤＮＲＡＧＳＲ（配列番号２８）および
ＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫ（配列番号２９）。
【０００９】
いくつかの態様では、オリゴペプチドは、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＱＤＫＧＫＫＫＫＥＧＤＬＫＳＲＳＳＫＥＥＮＲＡＧＮＫ（配列番号１４）、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＰＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲ（配列番号２０）、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＲＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲ（配列番号２１）および
ＱＭＹＰＧＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＰＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲＲＥＤＬ（配列番号２２）
からなる群から選択される配列を含んでなり得る。
【００１０】
いくつかの態様では、オリゴペプチドは、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＱＤＫＧＫＫＫＫＥＧＤＬＫＳＲＳＳＫＥＥＮＲＡＧＮＫ（配列番号１４）
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＰＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲ（配列番号２０）、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＲＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲ（配列番号２１）および
ＱＭＹＰＧＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＰＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲＲＥＤＬ（配列番号２２）
からなる群から選択される配列から本質的になり得る。
【００１１】
いくつかの態様では、オリゴペプチドは、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＱＤＫＧＫＫＫＫＥＧＤＬＫＳＲＳＳＫＥＥＮＲＡＧＮＫ（配列番号１４）
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＰＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲ（配列番号２０）、
ＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＲＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲ（配列番号２１）および
ＱＭＹＰＧＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＰＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲＲＥＤＬ（配列番号２２）
からなる群から選択される配列からなり得る。
【００１２】
いくつかの態様では、少なくとも約１０連続アミノ酸長〜約７０連続アミノ酸長までである本発明のオリゴペプチドは、配列番号１〜配列番号３８に記載の配列のオリゴペプチドと比較して、１つもしくは複数の位置で保存的アミノ酸置換を含むことができる。様々な態様において、本発明のオリゴペプチドは、ＷｎｔリガンドのＬＲＰ５受容体および／またはＬＲＰ６受容体への結合をアンタゴナイズする生化学的特性を示すことができる。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、ポリペプチドが、ＷｎｔリガンドのＬＲＰ５受容体および／またはＬＲＰ６受容体への結合をアンタゴナイズする１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換によって示されるポリペプチドのアミノ酸と１つもしくは複数のアミノ酸が異なる全長ｍｅｓｄポリペプチドを含む。
【００１４】
関連する態様では、本発明はまた、配列番号１〜配列番号３２に記載のポリペプチドと、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％の配列同一性、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％の配列同一性、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有し、そしてまたＷｎｔがＬＲＰ５受容体および／またはＬＲＰ６受容体に結合するのを阻害するオリゴペプチドを含む。様々な実施形態において、オリゴペプチドは、実質的に純粋なオリゴペプチドまたは単離されたオリゴペプチドであり得、実質的に純粋なもしくは単離された全長Ｍｅｓｄポリペプチドまたはその一部、例えば、配列番号１〜配列番号３２に記載の配列を有するオリゴペプチド、または表Ｉに記載の全長Ｍｅｓｄポリペプチドもしくは配列番号１〜配列番号３２に記載のオリゴペプチドの配列に関して、保存的置換を有するオリゴペプチドを含む。
【００１５】
【表１−１】
2010526090.tif 000002
【００１６】
【表１−２】
2010526090.tif 000003
【００１７】
様々な態様において、Ｍｅｓｄポリペプチドまたはその一部の配列は、少なくとも約１０連続アミノ酸を含んでなり、そして非限定的な例として、脊椎動物、例えば、魚、爬虫類、両生類、例えば、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、トリ、例えば、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）または哺乳動物、例えば、ヒトもしくはげっ歯類、例えば、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）を含む任意の動物由来のｍｅｓｄ遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはその一部の配列であり得、但し、配列は、Ｍｅｓｄポリペプチドまたは配列番号１〜配列番号３８に記載の少なくとも１つの配列と、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％の配列同一性、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％の配列同一性、もしくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を共有し、そしてまた、ＷｎｔがＬＲＰ５受容体および／またはＬＲＰ６受容体、例えば、癌細胞上で発現されるＬＲＰ５受容体および／またはＬＲＰ６受容体に結合するのを阻害する。様々な態様において、Ｍｅｓｄポリペプチドまたはオリゴペプチドは、少なくとも約２０連続アミノ酸、少なくとも約３０連続アミノ酸、または少なくとも３７連続アミノ酸長であって、全長遺伝子までであり得る。様々な態様において、ポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＷｎｔリガンドのＬＲＰ５受容体および／またはＬＲＰ６受容体への結合をアンタゴナイズする。
【００１８】
他の態様では、本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達が改変される癌の治療の方法を含む。一実施態様では、本方法は、癌と診断されたヒト患者のような治療を必要とする対象に、Ｍｅｓｄポリペプチド、表Ｉに記載の治療有効量のＭｅｓｄポリペプチド、または少なくとも約１０連続アミノ酸長〜約７０連続アミノ酸長までであるオリゴペプチドを投与することを含んでなり、そして配列番号１〜配列番号３２に記載の配列、あるいは少なくとも１０連続アミノ酸長〜約７０連続アミノ酸長までを含んでなり、そして表Ｉに記載のＭｅｓｄポリペプチドまたは配列番号１〜配列番号３８に記載の少なくとも１つの配列と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％の配列同一性、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％の配列同一性、もしくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を共有する配列を含んでなる。関連する態様では、癌は、ヒトまたはネズミＭｅｓｄポリペプチドのような哺乳動物のＭｅｓｄポリペプチドを含む表Ｉに記載のポリペプチドのような全長Ｍｅｓｄポリペプチドを対象に投与することによって、治療することができる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、癌は、ヒトまたはネズミＭｅｓｄポリペプチドのような哺乳動物Ｍｅｓｄポリペプチドを含む表Ｉに記載のポリペプチドのような全長Ｍｅｓｄポリペプチドと少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％の配列同一性、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％の配列同一性、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を共有するポリペプチドを対象に投与することによって、治療することができる。
【００２０】
他の様々な態様では、本発明者らは、Ｍｅｓｄポリペプチド、または本明細書に記載のｍｅｓｄ遺伝子によってコードされるポリペプチド由来の配列を含んでなるオリゴペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されるプロモーターを含んでなるベクターを開発した。様々な態様において、ベクターは、プラスミドまたはウイルスであり得、そしてプロモーターは、真核生物プロモーターまたは原核生物プロモーターであり得る。これらのベクターは、例えば、宿主細胞もしくは宿主微生物におけるインビトロでの発現によって、オリゴペプチドをエクスビボで発現させるために使用することができ、あるいは本発明に記載のベクターを投与することによって、または治療を必要とする対象に、ベクターを含んでなり、そして全長ＭｅｓｄポリペプチドもしくはＭｅｓｄオリゴペプチドを産生する細胞を投与することなどによって、治療に使用することができる。そのような実施形態では、ベクターは、Ｍｅｓｄポリペプチドまたはオリゴペプチドをコードするプロモーターおよび核酸に加えて、ポリペプチドまたはオリゴペプチドをコードするものに連結される配列を含んでなり得、そして当業者に公知のリーダーペプチド配列のような細胞からのポリペプチドまたはオリゴペプチド輸送もしくは分泌を促進するアミノ酸配列をコードする。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、Ｍｅｓｄが、細胞表面において高い親和性で成熟ＬＲＰ６に結合することを示す。
【図２】図２は、Ｍｅｓｄが、成熟ＬＲＰ５およびＬＲＰ６に結合するが、LDLRファミリーの他のメンバーには有意には結合しないことを示す。
【図３】図３は、ＭｅｓｄのＣ−末端領域が、ＬＲＰ６との相互作用に必要であることを示す。
【図４】図４は、ＭｅｓｄのＣ−末端領域が、ＬＲＰ６結合性に必要かつ十分であることを示す。
【図５】図５は、Ｍｅｓｄのカルボキシ末端領域が、ＬＲＰ６フォールディングに必要であることを示す。
【図６】図６は、ＬＲＰ６が、構成的に活性なエンドサイトーシス受容体ではないことを示す。
【図７】図７は、ＬＲＰ６が、制限されたレベルのＭｅｓｄ分解を示すことを示す。
【図８】図８は、３９ｋＤａの分化した分子シャペロン受容体関連タンパク質ＲＡＰがＬＲＰ６に結合し、そして部分的にＭｅｓｄ結合性と競合することを示す。
【図９】図９は、Ｍｅｓｄが、ＤＫＫ１がＬＲＰ６に結合するのを阻害することを示す。
【図１０】図１０は、ＭｅｓｄポリペプチドまたはＭｅｓｄオリゴペプチドが、両方ともＬＲＰ５に結合し、そしてＤＫＫ１のＬＲＰ５またはＬＲＰ６のいずれかへの結合を阻害することができることを示す。
【図１１】図１１は、ＴＣＦ／ＬＥＦ−ｌｕｃレポーター構築物で安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、Ｗｎｔ−３Ａを伴わずに、またはＷｎｔ−３Ａ＋示されたインヒビター（Ｍｅｓｄおよび／またはＤｋｋ１）を伴って１６時間、３７℃で処理した結果を示す。Ｗｎｔシグナル伝達は、生細胞イメージングシステムを使用して、ルシフェラーゼ活性を定量することによって測定した。
【図１２】図１２は、乳腺過形成を示すＭＭＴＶ−ＬＲＰ６トランスジェニックマウスを示す。ＭＭＴＶ−ＬＲＰ６トランスジェニックマウスは、ＭＭＴＶプロモーターによって駆動される乳腺上皮細胞におけるＬＲＰ６ｃＤＮＡの過剰発現によって、作製した。１４週齢のＷＴ（パネルＡ、Ｃ）またはＭＭＴＶ−ＬＲＰ６処女マウス（パネルＢ、Ｄ）のいずれかの同腹仔由来の乳腺を、ホールマウント染色によって分析した。ＭＭＴＶ−ＬＲＰ６マウスの乳腺過形成（低倍率視野のパネルＢおよび高倍率視野のパネルＤ）に留意すること。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
Ｗｎｔ受容体は、腫瘍性タンパク質の候補であり、哺乳動物低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）関連タンパク質（ＬＲＰ）ファミリーの２つのメンバー、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６の変異型は、最近、細胞培養においてＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を構成的に活性化することが可能であることが示されている。本知見は、ＭｅｓｄのようなＬＲＰ５およびＬＲＰ６特異的インヒビターを利用して、細胞表面においてＷｎｔシグナル伝達を阻害する。
【００２３】
本明細書に記載の方法および組成物は、当業者に周知の実験技術を利用し、そしてSambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001；Spector, D. L. et al., Cells: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998; Harlow, E., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999、およびAusubel, F. M., et al., ed., Current Protocols in Molecular Biologyのような実験マニュアルにおいて見出すことができる。本明細書において開示する治療の薬学的組成物および方法について、剤形および投与レジメンを、例えば、Remington: the Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro ed. 19th ed. 1995)；Hardman, J.G., et al., Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, McGraw-Hill, 1996；およびRowe, R.C., et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Fourth Edition, Pharmaceutical Press, 2003のような標準的な参考文献に記載の当業者に既知の標準的方法を使用して、決定することができる。
【００２４】
本発明者は、癌細胞が、改変されたＷｎｔシグナル伝達を示す、限定されないが、乳癌、多発性骨髄腫（ＭＭ）、前立腺癌および皮膚癌のような癌を含む癌を治療するために使用することができる実質的に純粋なオリゴペプチドを開示する。理論によって制限されることなく、本発明者は、Ｍｅｓｄポリペプチドが、Ｗｎｔリガンドが（ＬＤＬＲ）関連タンパク質−５（ＬＲＰ５）および（ＬＤＬＲ）関連タンパク質−６（ＬＲＰ６）に結合するのを阻害することができることを見出した。従って、Ｍｅｓｄポリペプチドまたはその機能的フラグメントは、癌を治療するため、および２００６年１１月７日に出願されたUS Patent application 11/557,292に記載のように、骨の健康を増加するために使用することができる。理論によって制限されることなく、本発明者は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）関連タンパク質−５（ＬＲＰ５）および（ＬＤＬＲ）関連タンパク質−６（ＬＲＰ６）（両方ともＬＤＬＲファミリーのメンバーである）によるシグナル伝達は、細胞外Ｗｎｔリガンドによる阻害に供されると考えられる。最近、ＬＤＬＲファミリーのメンバーに対する分化したシャペロン（マウスではＭｅｓｄ（中胚葉発生）、そしてショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ではＢｏｃａと呼ばれる）が同定された（Culi, J., Cell 112: 343-354, 2003；Hsieh, J.C., Cell 112: 355-367, 2003）この新たなシャペロンは、Ｗｎｔ／Ｗｇシグナル伝達経路のＬＲＰ５／ＬＲＰ６共受容体のフォールディングに必要であるため、発見された。しかし、本発明者は、Ｍｅｓｄが、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６のフォールディングを仲介するだけではなく、それがまた、細胞表面において成熟ＬＲＰ５またはＬＲＰ６に結合することが可能であり、そしてＷｎｔリガンドのようなリガンドの結合をアンタゴナイズすることを見出した。加えて、本発明者は、リガンド−結合アンタゴナイズ活性が、Ｍｅｓｄポリペプチドのカルボキシ末端領域由来のＭｅｓｄのサブ配列を含んでなるオリゴペプチドにおいて見出されることを決定した。
【００２５】
本発明のオリゴペプチドは、約１０連続アミノ酸〜約７０連続アミノ酸までを含んでなり、ここで、ペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。配列は、限定されないが、ヒト、マウス、イヌ、ウシ、チンパンジー、オランウータンおよびラットのような多様な種のゲノムに含まれるｍｅｓｄ遺伝子によってコードされるＭｅｓｄポリペプチド由来の配列を表す。本明細書において使用する用語「オリゴペプチド」は、ペプチド結合によって接続された少なくとも２つのアミノ酸を含んでなる分子を指し、そして用語「ポリペプチド」は、遺伝子、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡによってコードされるような全長アミノ酸配列を含んでなる分子を指す。様々な実施形態では、本発明の実質的に純粋なオリゴペプチドは、少なくとも２０または少なくとも３０連続アミノ酸〜約６７アミノ酸までを含んでなり得る。本発明の配列を、表ＩＩに示すが、これは、５４〜６７連続アミノ酸のオリゴペプチド配列を示し、そして表ＩＩＩは、１０〜４６アミノ酸のオリゴペプチド配列を示す。本発明のオリゴペプチドは、非限定的な例として、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成、あるいは非限定的な例として、オリゴペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを合成し、そしてオリゴヌクレオチドをベクターに挿入するか、または制限酵素消化、リガーゼによるライゲーション、および／もしくはポリメラーゼ連鎖反応技術を使用してｃＤＮＡの一部をベクターにサブクローニングすることを含む分子クローニング法のような当業者に周知の標準的な技術を使用して、合成することができる。オリゴペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含んでなるベクターを、トランスフェクションまたは形質転換によって細胞に挿入し、そして当業者に周知の方法を使用して、細胞において発現させることができる。オリゴペプチドは、当業者に周知の標準的な技術によって、単離および／または精製することができる。
【００２６】
【表２】
2010526090.tif 000004
【００２７】
【表３】
2010526090.tif 000005
【００２８】
保存的置換を含んでなる本発明のオリゴペプチドでは、そのような置換は、当該技術分野において規定されているような類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリー由来であり得る。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）ならびに芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。生来のアミノ酸配列内のアミノ酸に対する保存された置換基は、天然に存在するアミノ酸が属するファミリーの他のメンバーから選択することができる。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、１つもしくは複数のアミノ酸の欠失もしくは挿入によって、本明細書に記載のポリペプチドまたはオリゴペプチド配列のアミノ酸と１つもしくは複数のアミノ酸が異なるポリペプチドおよびオリゴペプチドを含んでなる。
【００３０】
従って、本発明の実施形態では、オリゴペプチドは、約１０アミノ酸長〜６７アミノ酸長までであり得る。配列は、表ＩＩまたは表ＩＩＩに記載の任意の配列を含んでなり得、および／または配列番号１〜配列番号３８から選択される任意の配列を含み得る。さらに加えて、オリゴペプチドの配列は、配列番号１〜配列番号３８の少なくとも１つの配列と少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を共有する配列であり得、そしてオリゴペプチドを、細胞膜に含まれるＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６のようなＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６と接触させる場合、成熟細胞表面タンパク質ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６と、Ｗｎｔリガンドのような細胞外リガンドとの結合をアンタゴナイズ、阻害または阻止する生化学的特性を有する。さらに加えて、オリゴペプチドの配列は、配列番号１〜配列番号３８の少なくとも１つの配列と少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性を共有する配列であり得、そしてＷｎｔシグナル伝達をアンタゴナイズする生化学的特性をさらに有し得る。様々な実施形態において、保存的置換を、オリゴペプチド配列において行うことができる（例えば、イソロイシンのような異なる疎水性アミノ酸によるバリンのような疎水性アミノ酸の置換）。アミノ酸の保存的置換を同定および選択するための方法は、当業者に周知である（例えば、Pearson, W.R., Methods Enzymol. 266: 227-258, 1996を参照のこと）。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、本発明者は、配列番号１〜配列番号３８から選択される配列を含んでなるオリゴペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含んでなる核酸ベクターを開示する。いくつかの態様では、オリゴペプチドまたはポリペプチド配列は、配列番号１〜配列番号３８の少なくとも１つと少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％の配列同一性、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％の配列同一性、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を共有する配列であり得る。これらの実施形態のプロモーターは、真核生物のプロモーター（即ち、哺乳動物細胞の真核細胞もしくは酵母細胞のような微生物真核細胞の環境において転写を支持することができるプロモーター）または原核生物プロモーター（即ち、細菌のような原核細胞の環境において転写を支持することができるプロモーター）であり得る。本発明のベクターに使用することができるプロモーターの非限定的な例として、アクチンプロモーター、酵母メタロチオネイン遺伝子由来のＣＵＰ１プロモーター、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期またはマウスα２（Ｉ）−コラーゲン遺伝子由来のプロモーター−エンハンサーエレメント、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロンオペレーター／プロモーターが挙げられる。ベクターは、例えば、バキュロウイルスもしくはバクテリオファージのような例えば、プラスミドまたはウイルスであり得る。加えて、いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載のベクターを含んでなる細胞を包含する。ベクターを含んでなるすべての細胞は、ベクターのプロモーターが作動可能である細胞、例えば、ｌａｃオペロン／プロモーターを含んでなるプラスミドを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、またはバキュロウイルスベクターを有する昆虫細胞であり得る。
【００３２】
様々な実施形態において、本発明は、治療に必要な対象において癌を治療する方法を含む。これらの実施形態の方法は、治療有効量のＭｅｓｄポリペプチド、Ｍｅｓｄポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性を共有するポリペプチド、または１０連続アミノ酸〜約７０連続アミノ酸を含んでなるオリゴペプチドを対象に投与することを含み、ここで、オリゴペプチドは、配列番号１〜配列番号３８、および配列番号１〜配列番号３８に記載の少なくとも１つの配列と少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性を共有する配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、ポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＬＲＰ５と接触する場合、ＷｎｔリガンドのＬＲＰ５受容体および／またはＬＲＰ６受容体への結合をアンタゴナイズする。いくつかの態様では、癌は、乳癌および多発性骨髄腫（ＭＭ）、前立腺癌および皮膚癌、またはこれらの特徴を有する任意の癌であり得る。これらの方法はまた、インビトロまたはエクスビボで細胞もしくは組織に適用することができる。加えて、いくつかの態様では、本方法はまた、上記のようなベクター、または本明細書に記載のオリゴペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された真核生物のプロモーターを含んでなるベクターを含んでなるヒト細胞のようなベクターを含んでなる細胞を、治療を必要とする対象に投与することを含む。非限定的な例では、ヒト細胞は、ベクターで形質転換され、標準的な細胞培養技術を使用してインビトロで増殖させ、そしてドナーに戻される対象由来の細胞であり得る。
【００３３】
本発明の治療有効量のポリペプチド、オリゴペプチドまたはベクターは、Herfindal, Gourley and Hart, Williams and Wilkins, ed. Clinical Pharmacy and Therapeutics, Williams & Wilkins, 1988；Goodman, L.S. and Gilman, A., ed. The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw Hall; 2005；Kalant, H., and Roschlau, W.H.E., ed., Principles of Medical Pharmacology, Mosby, Incorporated. 1989；J.T. DiPiro, R.L. et al., ed. Pharmacotherapy: A Pathophysiologic Approach, McGraw Hill Medical Publishing, 2005；Ascione, Principles of Scientific Literature Evaluation Critiquing Clinical Drug Trials, American Pharmacists Association, 2001；およびRemington, The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 2005のような標準的な薬学テキストに見出されるような当該技術分野において周知の方法を使用して、決定することができる。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例は、本発明の非限定的な例示を提供する。実施例のいくつかは、本発明が機能し得る方法についての結論を含み得る一方、本発明者は、これらの結論に拘束されることを意図しないが、可能性のあるもののみ説明を記載した。過去形の使用によって示さない限り、実施例の提示は、実験もしくは手順が、行われた、または行われなかったこと、あるいは結果が実際に得られた、または得られなかったことを意味しない。
【００３５】
実施例１
本実施例は、Ｍｅｓｄが、細胞表面において成熟ＬＲＰ６に結合することを示す。
【００３６】
Ｍｅｓｄが、細胞表面において、ＬＤＬＲファミリーのほとんどのメンバーに高い親和性で結合するかどうかを調べるために、本発明者らは、ＬＲＰ６  ｃＤＮＡを安定にトランスフェクトした細胞で細胞表面リガンド結合実験を実施した。検出不可能なレベルのＬＲＰ６を発現するヒトＨＴ１０８０細胞を、ウイルスベクター単独（ｐＬＮＣＸ２）またはＬＲＰ６  ｃＤＮＡ（Li, Y., Oncogene 23: 9129-9135, 2004）を含有するベクターで形質導入し、そして１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ結合に使用した（図１Ａ）。１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ（５ｎＭ）は、ＬＲＰ６を発現するＨＴ１０８０細胞と共に４℃で２時間のインキュベーション後、最大結合に到達した（図１Ａ）。過剰の非標識Ｍｅｓｄ（５００ｎＭ）の含有により、この結合は完全に消失した。コントロール細胞（ｐＬＮＣＸ２）では、有意な１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ結合は認められなかった。＞６．４ｎＭの濃度で、Ｍｅｓｄ特異的結合の飽和が認められた（図１Ｂ）。結合データのＳｃａｔｃｈａｒｄ分析は、Ｍｅｓｄが、約３．３ｎＭのＫｄでＬＲＰ６に結合することを示した（図１Ｃ）。ＬＲＰ６に対するＭｅｓｄのこの親和性は、ＬＲＰに対するＲＡＰの親和性に匹敵する（Iadonato, S.P., Biochem. J. 296: 867-875, 1993）。
【００３７】
図１において例示されるように、Ｍｅｓｄは、細胞表面において高い親和性で成熟ＬＲＰ６に結合する。（Ａ）ＬＲＰ６形質導入ＨＴ１０８０細胞およびコントロール細胞への１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ（５ｎＭ）結合の時間経過。アッセイは、５００ｎＭのＭｅｓｄ（非特異的）の非存在（全体）または存在において、示した期間、４℃で行った。（Ｂ）ＬＲＰ６形質導入ＨＴ１０８０細胞およびコントロール細胞への１２５Ｉ−Ｍｅｓｄの飽和結合。アッセイは、５００ｎＭのＭｅｓｄの非存在（全体）または存在（非特異的）において、示した濃度で３時間、４℃で行った。（Ｃ）ＢにおけるデータのＳｃａｔｃｈａｒｄプロット。すべての値は、エラーバーで示される標準偏差を有する３回反復決定の平均である。
【００３８】
本実施例およびすべての以後の実施例では、以下の材料および方法を使用した：
【００３９】
材料
ヒト組み換えＤＫＫ１タンパク質およびマウス組み換えＷｎｔ３ａタンパク質は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ由来であった。ヒト組み換えＲＡＰタンパク質を、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）発現ベクターにおいて発現させ、そして先に記載のように単離した（Bu et al., 1993）。モノクローナル抗Ｍｙｃ抗体９Ｅ１０は、Ｒｏｃｈｅ由来であった。ヒトＬＲＰに対するモノクローナル抗体８Ｇ１は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ由来であった。モノクローナル抗ＨＡ抗体については、先に記載されている（Li, Y., J. Biol. Chem. 275: 17187-17194, 2000）。ポリクローナルウサギ抗ＬＤＬＲを、組み換えヒトＬＤＬＲ１−２９４フラグメントをウサギに免疫することによって産生させた。ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体およびＥＣＬシステムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ由来であった。全長ヒトＬＲＰ５  ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｃＤＮＡ３．１Ｃ−Ｍｙｃ−ｈＬＲＰ５および全長ヒトＬＲＰ６  ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＣＳ−Ｍｙｃ−ｈＬＲＰ６は、それぞれ、Ｃｉｎｄｙ  ＢａｒｔｅｌｓおよびＣｈｒｉｓｔｏｆ  Ｎｉｅｈｒｓ由来であった。キャリアを含まないＮａ１２５Ｉは、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入した。ＩＯＤＯ  ＧＥＮはＰｉｅｒｃｅ由来であった。先に記載のＩＯＤＯ  ＧＥＮによる方法を使用することによって、タンパク質をヨウ素化した（Li, Y., J. Biol. Chem. 275: 17187-17194, 2000）。
【００４０】
細胞株および細胞培養
ＬＲＰ６形質導入ＨＴ１０８０細胞およびコントロール細胞については、先に記載されており（Li et al., 2004）、これを、１０％ウシ胎児血清および３５０ｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ培地において培養した。ヒトＬＤＬＲ関連タンパク質（ＬＲＰ）ミニレセプターｍＬＲＰ４によって安定にトランスフェクトされたＬＲＰ−ｎｕｌｌ  ＣＨＯ細胞、ｍＬＲＰ４末端変異ｍＬＲＰ４末端欠失（細胞質側末端を有さないｍＬＲＰ４）、ヒトＬＤＬＲ関連タンパク質１Ｂ（ＬＲＰ１Ｂ）ミニレセプターｍＬＲＰ１Ｂ４、ヒトＶＬＤＬＲ、またはヒトアポＥＲ２については、先に記載されており（Li, Y., J. Biol. Chem. 275: 17187-17194, 2000；Li et al., 2001；Liu et al., 2001）そして、１０％ウシ胎児血清および３５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＨａｍのＦ−１２培地において培養した。ＬＲＰおよび／またはＬＤＬＲ欠損マウス胚から遺伝的に誘導されたマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）の組は、Ｊｏａｃｈｉｍ  Ｈｅｒｚ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｄａｌｌａｓから得た（Willnow, J. Cell Sci. 107: 719-726., 1994；Narita, M., J. Biochem. 132: 743-749, 2002）。これらは、ＭＥＦ−１（ＷＴ）、ＭＥＦ−２（ＬＲＰ欠損）、ＭＥＦ−３（ＬＤＬＲ欠損）、およびＭＥＦ−４（ＬＲＰおよびＬＤＬＲ−二重欠損）であり、そして１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭにおいて培養する。Ｕ８７、ＭＣＦ−７、およびヒト大動脈平滑筋細胞の培養条件については、先に記載されている（Li, Y., FEBS Lett. 555: 346-350, 2003）。ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＴＣＣ由来であり、そして１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭにおいて培養した。
【００４１】
組み換えＭｅｓｄタンパク質の調製
全長マウスＭｅｓｄ  ｃＤＮＡを使用した。マウスＭｅｓｄの野生型および変異型を、ポリメラーゼ連鎖反応によって作製し、そしてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位において発現ベクターｐＥＴ−３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。サブクローニングしたＤＮＡ配列の完全性を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。Ｎ末端においてポリヒスチジン金属結合末端を有する組み換え融合タンパク質を産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）において、ｐＥＴ−３０（＋）Ｍｅｓｄから組み換えタンパク質を過剰発現させ、そして製造者のプロトコルに従い、Ｎｏｖａｇｅｎ由来のＨｉｓ−Ｂｉｎｄ  Ｋｉｔｓにより精製した。すべての組み換えＭｅｓｄタンパク質は、Ｍｅｓｄシグナルペプチドを欠如する。
【００４２】
ウエスタンブロッティング
ＬＤＬＲファミリーメンバーの発現について調べるために、６ウェルプレートにおいて培養した細胞を、０．５ｍｌ溶解緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００および１ｍＭのＰＭＳＦを含有するリン酸緩衝食塩水）により、４℃で３０分間、溶解した。等量のタンパク質を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜へ移した後、第一抗体およびセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート第二抗体との連続インキュベーションを、６０分間、室温で行った。次いで、ＥＣＬシステムを使用して、免疫反応性タンパク質を検出した。
【００４３】
細胞質β−カテニンレベルを調べるために、６ウェルプレート中の細胞を、Ｍｅｓｄで、様々な濃度において、９０分間、３７℃で処理した。氷冷ＰＢＳで洗浄後、細胞を回収し、そしてガラス製Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーにおいて、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＰＭＳＦ、および１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤（５００μｌ／ウェル）からなる緩衝液中で均質化した。ホモジネートを１０分間、５００ｇで遠心分離し、そして上清を、さらに、１００，０００ｇ、４℃で９０分間、遠心分離した。得られる上清を細胞質画分と命名した。次いで、β−カテニンレベルを、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のβ−カテニン特異的抗体を使用するウエスタンブロッティングによって調べた。ＥＣＬシステムを使用して、免疫反応性タンパク質を検出した。免疫応答性のバンドを示すフィルムを、Ｋｏｄａｋ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＣ１２０  Ｚｏｏｍ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃａｍｅｒａで走査し、そしてバンドの強度を、Ｋｏｄａｋ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ１Ｄ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで分析した。
【００４４】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートにプレート化した。各ウェルについて、０．１μｇのＴＯＰ−ＦＬＡＳＨＴＣＦルシフェラーゼ構築物（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、０．８μｇのＭｅｓｄ発現ベクター、０．８μｇのＭｅｓｄ変異体発現ベクター、または空のベクターでトランスフェクトした。β−ガラクトシダーゼ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、トランスフェクション効率の内部コントロールとして含めた。４８時間後、細胞を溶解し、そしてルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性の両方を、酵素アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって決定した。Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用するルミノメーターによって、ルシフェラーゼ活性を決定した。ルシフェラーゼ活性を、β−ガラクトシダーゼの活性に対して規準化した。
【００４５】
リガンド結合および分解
細胞（２×１０５）を、アッセイの１日前に、１２ウェルディッシュに播種した。リガンド結合緩衝液（異なる濃度の放射性リガンドを含む０．６％ＢＳＡを含有する最小Ｅａｇｌｅ培地、０．６ｍｌ／ウェル）を、５００ｎＭ非標識ＲＡＰまたは５００ｎＭ非標識Ｍｅｓｄの非存在下または存在下で細胞単層に添加し、続いて、０〜４時間、４℃でインキュベーションした。その後、非結合リガンドを含有するオーバーレイ緩衝液を取り出し、そして細胞単層を洗浄し、そして低ＳＤＳ溶解緩衝液（６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．２％ＳＤＳ、１０％ｖ／グリセロール）で溶解し、そして計数した。各細胞溶解物のタンパク質濃度を、リガンドを含有しないパラレルディッシュにおいて測定した。
【００４６】
記載の方法（Li, Y., J. Biol. Chem. 275: 17187 17194, 2000）を使用して、リガンド分解を実施した。簡単に説明すると、２×１０５個の細胞を、アッセイの１日前に、１２ウェルディッシュに播種した。予め加温したアッセイ緩衝液（放射性リガンドを含む０．６％ＢＳＡを含有する最小Ｅａｇｌｅ培地、０．６ｍｌ／ウェル）を、５００ｎＭ非標識ＲＡＰまたは５００ｎＭＭｅｓｄの非存在下または存在下で細胞単層に添加し、続いて、４時間、３７℃でインキュベーションした。その後、培地重層細胞単層を取り出し、そしてＢＳＡを１０ｍｇ／ｍｌまで、そしてトリクロロ酢酸を２０％まで添加することによってタンパク質を沈殿させた。放射性リガンドの分解を、２０％トリクロロ酢酸に可溶性である重層培地における放射性フラグメントの出現として定義した。エンドサイトーシスＬＲＰ６形質導入ＨＴ１０８０細胞の動態解析を、２×１０５個の細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートにプレート化し、そして１晩培養後、使用した。細胞を、氷冷アッセイ緩衝液（０．６％ＢＳＡを含有する最小Ｅａｇｌｅ培地）で２回濯ぎ、そして１２５Ｉ−抗ＨＡ  ＩｇＧを、１ｎＭ最終濃度で冷アッセイ緩衝液（０．５ｍｌ／ウェル）に添加した。１２５Ｉ抗−ＨＡ  ＩｇＧの結合を、４℃で９０分間、穏やかに振盪させながら行った。非結合１２５Ｉ−抗ＨＡ  ＩｇＧを、冷アッセイ緩衝液で細胞単層を３回洗浄することによって取り出した。氷冷停止／ストリッピング溶液（０．２Ｍ酢酸、ｐＨ２．６、０．１ＭのＮａＣｌ）を、加温を伴わずに１組のプレートに添加し、そして氷上で保持した。次いで、残りのプレートを３７℃の水浴に置き、そして予め３７℃に加温した０．５ｍｌアッセイ緩衝液を迅速に細胞単層に添加して、内在化を開始した。各時間ポイント後、プレートを迅速に氷上に置き、そしてアッセイ緩衝液を冷停止／ストリッピング溶液と置き換えた。細胞表面上に保持される１２５Ｉ−抗ＨＡ  ＩｇＧを、細胞単層と冷停止／ストリッピング溶液との全体で２０分間（１０分間について０．７５ｍｌ、２回）のインキュベーションによって剥がし、そして計数した。次いで、細胞単層を低ＳＤＳ溶解緩衝液で可溶化し、そして計数した。１２５Ｉ−抗ＨＡ  ＩｇＧの合計内在化させ、そして各アッセイ後の細胞表面上の残りを、最大潜在的内在化として使用した。各時間ポイント後に内在化された１２５Ｉ−抗ＨＡ  ＩｇＧの画分を、計算し、そしてプロットした。
【００４７】
細胞表面ＤＫＫ１結合および免疫検出
ヒトＤＫＫ１  ｃＤＮＡ（クローンＭＧＣ：８６８，ＩＭＡＧＥ：３５０８２２２）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し、そしてｐｃＤＮＡ３（ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ）にサブクローニングした。免疫検出を容易にするために、ｃ−ＭｙｃエピトープをＣ末端にふくめた。サブクローニングされたＤＮＡ配列の完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。ヒトＤＫＫ１−馴化培地を、無血清培地におけるｐｃＤＮＡＤＫＫ１−ＭｙｃによるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって生成し、そしてＬＲＰ６形質導入ＨＴ１０８０細胞およびコントロール細胞に、室温で６０分間、１μＭのＭｅｓｄの非存在または存在下で結合させた。次いで、細胞を、４％パラホルムアルデヒドに固定し、抗Ｍｙｃモノクローナル抗体で標識し、そしてＡｌｅｘａ−４８８ヤギ抗マウスＩｇＧで検出した。免疫蛍光を、レーザ走査共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ５００）で検出した。
【００４８】
実施例２
本実施例は、Ｍｅｓｄが成熟ＬＲＰ５  ＡＮＤ  ＬＲＰ６に結合するが、しかし、ＬＤＬＲファミリーの他のメンバーには有意には結合しないことを示す。
【００４９】
Ｍｅｓｄが、ＬＤＬＲファミリーの他のメンバーに結合するかどうかを決定するために、ＬＤＬＲファミリーの異なるメンバーを発現する４つの細胞のグループで、１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ結合分析を実施した（図２）。第１の実験では、ＨＥＫ２９３細胞を、ＬＤＬＲ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６のｃＤＮＡまたは空のｐｃＤＮＡ３ベクターで一過的にトランスフェクトした。第２の実験では、ＬＲＰ−ｎｕｌｌチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ＬＲＰミニレセプターｍＬＲＰ４、ＬＲＰ１ＢミニレセプターｍＬＲＰ１Ｂ４、アポＥＲ２、ＶＬＤＬＲ、または空のｐｃＤＮＡ３ベクターで安定的にトランスフェクトした（Li, Y., J. Biol. Chem. 275: 17187-17194, 2000；Li, Y., J. Biol. Chem. 276: 18000-18006, 2001；Liu, C.X., J. Biol. Chem. 276:28889-28896, 2001）。ｍＬＲＰ４は、リガンド−結合反復の４つのクラスターおよび受容体のＣ末端全体を含む全長ＬＲＰの残基３２７４〜４５２５からなる。ｍＬＲＰ１Ｂ４は、リガンド結合反復の４つのクラスターおよび受容体のＣ末端全体を含む全長ＬＲＰ１Ｂの残基３２７６〜４５９９からなる。ｍＬＲＰ４およびｍＬＲＰ１Ｂ４は、それぞれ、ＬＲＰおよびＬＲＰ１Ｂの機能および輸送を模倣する。第３の実験では、野生型マウス胚性線維芽細胞およびＬＤＬＲ、ＬＲＰ、または両方の遺伝子欠損を有するマウス胚性線維芽細胞（Willnow, T.E., J. Cell Sci. 107: 719-726, 1994；Narita, J. Biochem. 132: 743-749, 2002）を使用した。第４の実験では、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７、ヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ８７、およびヒト大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）を使用した。ＭＣＦ−７細胞は、検出不可能なレベルでＬＲＰを発現するが、一方、Ｕ８７細胞およびＳＭＣは、豊富なＬＲＰを発現する（Li, Y., FEBS Lett. 555: 346-350, 2003）。興味深いことに、これらの受容体が匹敵するレベルで発現される場合、試験したＬＤＬＲファミリーのメンバーのうち、ＬＲＰ６と比較してレベルが低いにもかかわらず、ＬＲＰ５のみが、特異的にＭｅｓｄに結合する（図２Ａ）。ＣＨＯおよびＭＥＦ細胞において試験した場合、ＭｅｓｄがＬＲＰに結合することが示唆される（図２Ｂ、Ｃ）が、Ｕ８７またはＳＭＣ（これらの両方とも豊富なＬＲＰを発現する）への特異的Ｍｅｓｄは最小であった（図２Ｄ）。従って、ＣＨＯおよびＭＥＦ細胞へのＭｅｓｄの特異的結合は、これらの細胞における内因性ＬＲＰ５／ＬＲＰ６に反映し得る。
【００５０】
図２に例示されるように、Ｍｅｓｄは、成熟ＬＲＰ５およびＬＲＰ６に結合するが、ＬＤＬＲファミリーの他のメンバーには有意には結合しない。（Ａ）ヒトＨＡ−標的化ＬＤＬＲ、Ｍｙｃ−標的化ＬＲＰ５、Ｍｙｃ−標的化ＬＲＰ６またはコントロールベクターを一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ（５ｎＭ）の結合。下のパネル、ＬＤＬＲ、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６の発現についてのウエスタンブロット分析。等量の細胞溶解物を、各レーンに適用した。（Ｂ）ＬＲＰミニレセプターｍＬＲＰ４、ＬＲＰ１ＢミニレセプターｍＬＲＰ１Ｂ４、ＶＬＤＬＲ、アポＥＲ２または空のｐｃＤＮＡ３ベクターのみを安定的にトランスフェクトされたＬＲＰ−ｎｕｌｌＣＨＯ細胞への１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ（５ｎＭ）の結合。（Ｃ）野生型マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ−１）またはＬＲＰ（ＭＥＦ−２）、ＬＤＬＲ（ＭＥＦ−３）または両方（ＭＥＦ−４）を遺伝的に欠損するＭＥＦ細胞株への１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ（５ｎＭ）の結合。下のパネル、MEF細胞株におけるＬＲＰおよびＬＤＬＲ発現のウエスタンブロット分析。（Ｄ）ヒト乳癌および多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株ＭＣＦ−７、ヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ８７およびヒト大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）への１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ（５ｎＭ）の結合。下のパネル、これらの細胞株におけるＬＲＰ発現のウエスタンブロット分析。アッセイは、４時間、４℃で、５００ｎＭのＭｅｓｄの非存在（合計）または存在下で行った。値は、エラーバーで示す標準偏差を有する３回反復決定の平均である。
【００５１】
実施例３
本実施例は、Ｍｅｓｄのカルボキシ末端領域がＬＲＰ６フォールディングに必要であることを示す。
【００５２】
Ｍｅｓｄが細胞表面において成熟ＬＲＰ６に高親和性で結合するのに必要なＭｅｓｄ配列を分析するために、配列を、マウスＭｅｓｄと、異なる種のその相同物との間で比較した。マウスＭｅｓｄの最初の１２アミノ酸が線虫シーノラディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）およびシーノラディティス・ブリグサ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｂｒｉｇｇｓａｅ）において存在しないこと、ならびにマウスＭｅｓｄ、ならびにヒトＭｅｓｄは、そのＣ末端における保存された小胞体残留シグナルの前に約３０アミノ酸を超えるフラグメントを有することが見出された（Culi, J., Cell 112: 343-354, 2003；Hsieh, J.C., Cell 112: 355-367, 2003）。それ故、本発明者らは、Ｎ末端領域、ＭＥＳＤ（１２−１９５）、またはＮ末端およびＣ末端領域の両方、Ｍｅｓｄ（１２−１５５）のいずれか一方を欠如する２つの切断型Ｍｅｓｄ変異体を作製した（図３Ａ）。次いで、これらの変異体が細胞表面ＬＲＰ６に結合する能力を評価した。マウスＭｅｓｄのＮ末端の１１アミノ酸のトランケーションは、ＬＲＰ６結合に影響を及ぼさないが、最後の４０アミノ酸のさらなるトランケーションは、ＬＲＰ６結合を完全に廃止したことが見出された（図３Ｂ）。
【００５３】
実施例４
本実施例は、Ｍｅｓｄの４５アミノ酸が、成熟ＬＲＰ６への結合に必要かつ十分であることを示す。
【００５４】
本実施例では、Ｃ末端領域の最後の４５アミノ酸を含有する切断型Ｍｅｓｄ変異体を作製し（図３Ａ）そして次いで、ＬＲＰ６に対するその結合親和性について分析した。図４に示すように、ＭｅｓｄのＣ−末端領域は、ＬＲＰ６結合に必要かつ十分である。（Ａ）ＬＲＰ６形質導入ＨＴ１０８０細胞およびコントロール細胞への１２５Ｉ−Ｍｅｓｄおよびその変異体Ｍｅｓｄ（１５０−１９５）（５ｎＭ）の結合分析。（Ｂ）ＬＲＰ６形質導入されたＨＴ１０８０細胞への１２５Ｉ−Ｍｅｓｄおよびその変異体Ｍｅｓｄ（１５０−１９５）（５ｎＭ）の結合分析。アッセイは、３時間、４℃で、５００ｎＭのＭｅｓｄまたはその変異体の非存在または存在下で行った。値は、エラーバーによって示される標準偏差を有する３回反復決定の平均である。
【００５５】
実施例５
本実施例は、Ｍｅｓｄのカルボキシ末端領域がＬＲＰ６フォールディングに必要であることを示す。
【００５６】
受容体フォールディングに対するこのＭｅｓｄのＣ−末端領域の役割を決定するために、本発明者らは、Ｃ末端領域（アミノ酸１５６−１９１）を欠如するが、小胞体残留シグナル（ＲＥＤＬ）を保持するＭｅｓｄ変異体（Ｍｅｓｄ＿Ｃ）を作製した（図３Ａ）。次に、本発明者らは、ＬＲＰ６フォールディングに対するＭｅｓｄΔＣの潜在的役割を評価した。ＨＥＫ２９３細胞を、コントロールベクターの同時トランスフェクションを伴うＬＲＰ６のｃＤＮＡ、またはＭｅｓｄもしくはＭｅｓｄΔＣのｃＤＮＡで一過的にトランスフェクトした。定常期レベルのＬＲＰ６を、抗ＭＹＣ抗体を用いるウエスタンブロッティングによって分析した（図５Ａ）。図に示すように、２つの型の受容体、即ち、ＥＲ型および変異型（複雑な糖改変を含有する）が、ＬＲＰ６に認められた。Ｍｅｓｄ同時発現（但し、Ｍｅｓｄ＿Ｃ同時発現ではない）の存在下では、成熟型ＬＲＰ６の量が有意に増加した（図５Ａ）。図５Ａでは、ＨＥＫ２９３細胞を、示されたｃＤＮＡで一過的にトランスフェクトした。細胞溶解物を、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、そして示した抗ＦＬＡＧまたは抗ＨＡ抗体でウエスタンブロットした。
【００５７】
基準Ｗｎｔシグナル伝達の活性化は、β−カテニンの安定下、ならびにリンパ球増強因子（ＬＥＦ）−１およびＴ細胞因子（ＴＣＦ）を含む遺伝子転写から転写調節因子への調節をもたらす。ＴＯＰ−ＦＬＡＳＨルシフェラーゼレポーターは、ＴＣＦ−結合部位を含有し、そしてβ−カテニン／ＴＣＦ複合体によって直接活性化され得る（Korinek et al., 1997）。ＬＲＰ６は、細胞表面受容体であり、そして成熟受容体のみが、細胞表面に到達し、そしてＷｎｔシグナル伝達をモジュレートすることができる（Cong et al., 2004）。次に、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞においてＴＯＰ−ＦＬＡＳＨルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、Ｗｎｔシグナル伝達に対するＭｅｓｄ＿Ｃの効果を調べた。予想どおり、Ｍｅｓｄ同時発現（但し、ＭｅｓｄΔＣ同時発現）は、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写活性を有意に増強した（図５Ｂ）。図５Ｂでは、ＨＥＫ２９３細胞を、ＬＲＰ６、ＭＥＳＤ、ＭｅｓｄΔＣまたは空のｐｃＤＮＡ３ベクターおよびＴＣＦ／ＬＥＦ転写活性レポータープラスミド（ＴＯＰ−ＦＬＡＳＨ）で同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの４８時間後に測定した。値は、エラーバーで示される標準偏差を有する３回反復決定の平均である。まとめると、これらの結果は、ＭｅｓｄのＣ−末端領域がＬＲＰ６フォールディングおよび細胞表面におけるそのシグナル伝達機能に必要であることを示唆する。
【００５８】
実施例６
本実施例は、ＬＲＰ６が構成的に活性なエンドサイトーシス受容体ではなく、そして制限されたレベルのＭｅｓｄ分解を仲介することを示す。
【００５９】
形質膜とエンドサイトーシス区画との間を輸送する細胞表面受容体は、サイトーシスビヒクルへの十分な補給を可能にするそれらの細胞質側末端内にシグナルを含有する。多くの場合（例えば、ＬＲＰおよびＬＤＬＲ）、これらのシグナルは、構成的に活性であり、そしてリガンド結合とは独立して、連続受容体エンドサイトーシスを仲介する。ＬＲＰ６が構成的に活性なエンドサイトーシス受容体であるかどうかを調べるために、ＨＡ−標的化ＬＲＰ６でトランスフェクトされたＨＴ１０８０細胞による受容体エンドサイトーシスの動態解析を実施した。その内在化に対するＬＲＰ６リガンドの潜在的効果を排除するために、本発明者らは、ＬＲＰ６エンドサイトーシスアッセイに１２５Ｉ−抗ＨＡ  ＩｇＧを利用した。ＨＡ−標的化ＬＲＰ６への１２５Ｉ−抗ＨＡ  ＩｇＧの結合は特異的であり、即ち、ＨＴ１０８０コントロール細胞への１２５Ｉ−抗ＨＡ  ＩｇＧの結合は、ＨＴ１０８０−ＬＲＰ６細胞と比較して最小であった（図６Ａ）。本発明者らは、１２５Ｉ−抗ＨＡ  ＩｇＧエンドサイトーシスのポジティブコントロールとしてＨＡ−標的化ＬＲＰミニレセプターｍＬＲＰ４およびネガティブコントロールとしてｍＬＲＰ４末端欠失（細胞質側末端を欠くｍＬＲＰ４）を使用した（Li, Y., J. Biol. Chem. 275: 17187-17194, 2000）。
【００６０】
図６は、ＬＲＰ６が構成的に活性なエンドサイトーシス受容体ではないことを示す。（Ａ）細胞表面ＨＡ−標的化ＬＲＰ６に結合する抗ＨＡ  ＩｇＧ。ＬＲＰ６形質導入ＨＴ１０８０細胞およびコントロール細胞への１２５Ｉ−抗ＨＡ  ＩｇＧ（１ｎＭ）の結合を、９０分間、４℃で行った。（Ｂ）ＬＲＰ６エンドサイトーシス。ＬＲＰ６形質導入ＨＴ１０８０細胞、ｍＬＲＰ４形質導入ＣＨＯ細胞およびｍＬＲＰ４末端欠失形質導入ＣＨＯ細胞を、１ｎＭ１２５Ｉ−抗ＨＡ  ＩｇＧと共に、４℃で９０分間、インキュベートし、次いで、３７℃で示した期間、インキュベートした。内在化された抗ＨＡ  ＩｇＧの量を決定した。値は、示された標準偏差を有する３回反復決定の平均である。興味深いことに、本発明者らは、ＬＲＰ６のエンドサイトーシス速度が極度に遅く、そしてｍＬＲＰ４末端欠失の速度と識別できなかった（図６Ｂ）ことを見出したが、これは、ＬＲＰ６自体が、エンドサイトーシスを開始することができないことを示す。これらのデータから、ＬＲＰ６は、構成的に活性なエンドサイトーシス受容体ではなく、そして制限されたレベルのＭｅｓｄ分解を仲介すると結論された。
【００６１】
実施例７
本実施例は、ＬＲＰ６がＭｅｓｄ取り込みおよび分解をほとんど仲介しないことを示す。
【００６２】
ＬＲＰ６仲介Ｍｅｓｄ取り込みおよび分解を、図７に示す実験において調べた。（Ａ）ＬＲＰ６形質導入ＨＴ１０８０細胞およびコントロール細胞におけるＬＲＰ６仲介１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ（５ｎＭ）分解を、４時間、３７℃、５００ｎＭのＭｅｓｄの非存在または存在下で行った。（Ｂ）ＬＲＰ６形質導入ＨＴ１０８０細胞およびコントロール細胞への１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ（５ｎＭ）結合を、４時間、４℃、５００ｎＭのＭｅｓｄ非存在または存在下で行った。値は、エラーバーで示す標準偏差を有する３回反復決定の平均である。図７に示すように、ＬＲＰ６で形質導入したＨＴ１０８０細胞は、３７℃で４時間のインキュベーション後、３２０ｆｍｏｌｅ／ｍｇ細胞のタンパク質のレベルの１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ分解を示したが、一方、４℃で４時間のインキュベーション後の１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ結合が、１３２０ｆｍｏｌｅ／ｍｇ細胞のタンパク質という高いレベルで検出された。これらの結果は、細胞表面におけるＬＲＰ６へのＭｅｓｄ結合が、有意なエンドサイトーシスを誘発せず、そして結果的に、Ｍｅｓｄ取り込みおよび分解をほとんど検出することができないことを示す。
【００６３】
実施例８
本実施例は、細胞表面ＬＲＰ６へのＭｅｓｄ結合は、細胞質β−カテニンレベルを有意には変更しないことを示す。
【００６４】
β−カテニンは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路において重要な分子である。β−カテニンの細胞質プールは、ＤＮＡ結合タンパク質と相互作用し、そしてＷｎｔシグナル伝達に関与する（Hinck, L., J. Cell Biol. 125, 1327-13401994；Gottardi, C. J., J. Cell Biol. 153: 1049-1060, 2001；Klingelhofer, J., Oncogene 22, 1181-1188, 2003）。細胞表面ＬＲＰ６へのＭｅｓｄ結合が、Ｗｎｔシグナル伝達を直接調節するかどうかを決定するために、本発明者らは、ＨＴ１０８０−ＬＲＰ６細胞における細胞質β−カテニンレベルに対するＭｅｓｄ結合の効果について研究した。これらの実験では、ＬＲＰ６形質導入ＨＴ１０８０細胞を、０．５〜５ｎＭのＭｅｓｄで、２時間、３７℃で処理し、そして細胞質β−カテニンレベルを、抗β−カテニン抗体を使用するウエスタンブロッティングによって調べた。本発明者らは、Ｍｅｓｄ処理時の細胞質β−カテニンレベルの有意な変化を見出さなかった（データ示さず）。結果は、細胞表面ＬＲＰ６へのＭｅｓｄ 結合が、Ｗｎｔシグナル伝達を直接改変しないことを示す。
【００６５】
実施例９
本実施例は、ＲＡＰがＬＲＰ６に結合し、そして部分的にＭｅｓｄ結合に競合することを示す。
【００６６】
受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）は、高い親和性でＬＲＰ、メガリン、ＶＬＤＬＲおよびアポＥＲ２に結合し、そしてより低い親和性でＬＤＬＲに結合する（Bu, G., Int. Rev. Cytol. 209, 79-116. 2001）。ＲＡＰおよびＭｅｓｄが、受容体における同一の、重複するか、または異なる部位に結合するかどうかを決定するために、本発明者らは、これらの２つのシャペロンのＬＲＰ６を安定的に発現するＨＴ１０８０細胞との結合および競合分析を実施した。図８において示されるように、ＲＡＰがＬＲＰ６にも結合するかどうかを決定するために、本発明者らは、４℃でＬＲＰ６を安定に発現するＨＴ１０８０細胞とのＲＡＰ−結合分析を実施した。ベクターを単独で発現するコントロール細胞は、おそらく、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびＬＤＬＲファミリーの内因性受容体によって仲介される中程度のレベルの細胞表面１２５Ｉ−ＲＡＰ結合を示した。過剰の非標識ＲＡＰ（５００ｎＭ）（但し、Ｍｅｓｄ（５００ｎｍ）ではない）の存在は、この結合を完全に排除した（図８Ａ）。コントロール細胞と比較して、ＬＲＰ６発現ＨＴ１０８０細胞は、ＲＡＰ結合の約２０％の増加を示し、そしてこの増加は、過剰の非標識Ｍｅｓｄによって廃止された（図８Ａ）。これらの結果は、ＲＡＰは、相対的に低い親和性で細胞表面ＬＲＰ６に結合することを示唆する。
【００６７】
本発明者らは、様々な濃度の過剰な非標識ＲＡＰまたは５００ｎＭ非標識Ｍｅｓｄの存在下での細胞表面ＬＲＰ６への５ｎＭの１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ（５ｎＭ）の結合を実施した（図８Ｂ）。ＲＡＰは、５００ｎＭのＲＡＰで達成される約６０％阻害を有する用量依存的様式で、１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ結合を阻害したが、一方、同じ濃度の非標識Ｍｅｓｄは、１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ結合の＞９０％を阻害した（図８Ｂ）。１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ（５ｎＭ）取り込みおよび分解が実施された場合、５００ｎＭ非標識Ｍｅｓｄは完全に、一方、５００ｎＭ非標識ＲＡＰのみは、部分的に、１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ分解を阻害した（図８Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＭｅｓｄおよびＲＡＰが、おそらく、異なるが、おそらく、ＬＲＰ６上の隣接する部位に結合することを示唆する。細胞表面ＬＲＰ６へのＲＡＰのより低い親和性もまた、Ｍｅｓｄ結合の阻害においてそのより低い効率に寄与し得る。
【００６８】
図８Ａでは、ＬＲＰ６形質導入ＨＴ１０８０細胞およびコントロール細胞への１２５Ｉ−ＲＡＰ（５ｎＭ）の結合を、４時間、４℃、５００ｎＭのＲＡＰ、または５００ｎＭのＭｅｓｄの非存在（全体）もしくは存在下で行った。図８Ｂでは、ＬＲＰ６形質導入ＨＴ１０８０細胞への１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ（５ｎＭ）の結合を、２時間、４℃、様々な濃度のＲＡＰまたは５００ｎＭのＭｅｓｄ非存在（全体）もしくは存在下で行った。（Ｃ）ＬＲＰ６−仲介１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ（５ｎＭ）分解を、４時間、３７℃、５００ｎＭのＭｅｓｄまたは５００ｎＭのＲＡＰの非存在もしくは存在下で行った。値は、エラーバーによって示される標準偏差を有する３回反復決定の平均である。
【００６９】
これらの実験は、ＲＡＰがＬＲＰ６に結合し、そして部分的にＭｅｓｄ結合に競合することを示す。
【００７０】
実施例１０
本実施例は、Ｍｅｓｄが、細胞表面におけるＬＲＰ６へのリガンド結合をアンタゴナイズすることを示す。
【００７１】
ＲＡＰは、ＬＤＬＲファミリーのメンバーの受容体アンタゴニストであり、そしてＬＤＬＲファミリーメンバーの最も公知のリガンドの結合を阻害することが可能である。ＤＫＫ１は、ＬＲＰ６特異的リガンドおよびアンタゴニストである。Ｍｅｓｄもまた、ＬＲＰ６リガンド結合を阻止することが可能であるかどうかを決定するために、本発明者らは、免疫染色によって、細胞表面ＤＫＫ１結合を調べた。図９に例示されるように、Ｍｙｃ−誘導性ＤＫＫ１は、ＬＲＰ６細胞に結合する（図９Ｂ）が、コントロール細胞には結合しない（図９Ａ）。Ｍｅｓｄの存在は、細胞表面におけるＭｙｃ−ＤＫＫ１のＬＲＰ６への結合を完全に阻止した（図９Ｃ）。これらの実験では、無血清馴化培地が、ヒトＭｙｃ−ＤＫＫ１のｃＤＮＡで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から回収され、そして１μＭのＭｅｓｄの非存在（Ａ、Ｂ）もしくは存在（Ｃ）下で、ＬＲＰ６−形質導入されたＨＴ１０８０細胞（Ｂ、Ｃ）およびコントロール細胞（Ａ）へ結合させた。細胞表面結合Ｍｙｃ−誘導性ＤＫＫタンパク質を固定化し、そして抗Ｍｙｃ抗体による免疫蛍光染色によって検出した。（Ｄ）細胞表面ＬＲＰ６へのＤＫＫ１結合は、Ｍｅｓｄによって阻害される。ＬＲＰ６形質導入ＨＴ１０８０細胞またはコントロール細胞への１２５Ｉ−ＤＫＫ１（５ｎＭ）の結合を、３時間、４℃、５００ｎＭのＲＡＰまたは５００ｎＭのＭｅｓｄの非存在（全体）もしくは非存在下で行った。（Ｅ）ＬＲＰ６仲介ＤＫＫ１分解は、Ｍｅｓｄによって阻害される。ＬＲＰ６−仲介１２５Ｉ−Ｍｅｓｄ（５ｎＭ）分解を、４時間、３７℃、５００ｎＭのＲＡＰまたは５００ｎＭのＭｅｓｄの非存在もしくは存在下で行った。値は、エラーバーによって示される標準偏差を有する３回反復決定の平均である。バー、１０μｍ。予想どおり、Ｍｙｃ−誘導性ＤＫＫ１は、ＬＲＰ６細胞に結合する（図９Ｂ）が、コントロール細胞には結合しない（図９Ａ）。重要なことに、Ｍｅｓｄの存在は、細胞表面におけるＭｙｃ−ＤＫＫ１のＬＲＰ６への結合を完全に阻止した（図９Ｃ）。
【００７２】
上記の結果を確認するために、本発明者らは、１２５Ｉ−ＤＫＫ１の結合および分解について調べた。ＬＲＰ６発現ＨＴ１０８０細胞は、コントロール細胞より有意に高いレベルの１２５Ｉ−ＤＫＫ１結合および分解を示した。増加したＤＫＫ１結合および分解は、過剰の非標識Ｍｅｓｄによって廃止されたが、過剰の非標識ＲＡＰでは廃止されなかった（図９Ｄ、Ｅ）。まとめると、これらの結果は、Ｍｅｓｄが、細胞表面におけるＬＲＰ６へのＤＫＫ１結合を特異的に阻止することができることを示す。
【００７３】
上記の結果を確認するために、本発明者らは、１２５Ｉ−ＤＫＫ１の結合および分解について調べた。ＬＲＰ６発現ＨＴ１０８０細胞は、コントロール細胞より有意に高いレベルの１２５Ｉ−ＤＫＫ１結合および分解を示した。増加したＤＫＫ１結合および分解は、過剰の非標識Ｍｅｓｄによって廃止されたが、過剰の非標識ＲＡＰでは廃止されなかった（図９Ｄ、Ｅ）。まとめると、これらの結果は、Ｍｅｓｄが、細胞表面におけるＬＲＰ６へのＤＫＫ１結合を特異的に阻止することができることを示す。
【００７４】
実施例１１
本実施例は、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６へのＭｅｓｄポリペプチドまたはＭｅｓｄオリゴペプチドの結合を示す。
【００７５】
ＬＲＰ５またはＬＲＰ６のいずれかへのＭｅｓｄポリペプチドおよびＭｅｓｄオリゴペプチドの結合について調べるため、１２５Ｉ−Ｍｅｓｄまたは１２５Ｉ−ＤＫＫ１を使用して、結合アッセイを実施した（図１０）。図１０Ａは、野生型ＭｅｓｄおよびＭｅｓｄオリゴペプチドＫＧＧＧＳＫＥＫＮＫＴＫＰＥＫＡＫＫＫＥＧＤＰＫＰＲＡＳＫＥＤＮＲＡＧＳＲ（配列番号２０）の両方が、ＬＲＰ５への１２５Ｉ−Ｍｅｓｄの結合を約１０倍まで減少することができることを示す一方、図１０Ｃは、Ｍｅｓｄおよびオリゴペプチドの両方が、ＬＲＰ６への１２５Ｉ−Ｍｅｓｄの結合のなお大きな減少を示すことを示す。加えて、１２５Ｉ−ＤＫＫ１を使用する結合アッセイでは、ＬＲＰ５を、Ｍｅｓｄまたはオリゴペプチドのいずれかと接触させた場合、ＬＲＰ５への１２５Ｉ−ＤＫＫ１の結合において小さいが、有意な減少が観察された（図１０Ｂ）一方、ＬＲＰ６が標的であった場合、２倍を超える１２５Ｉ−ＤＫＫ１の結合が観察された（図１０Ｄ）。
【００７６】
これらのデータは、Ｍｅｓｄポリペプチド、および配列番号１９のオリゴペプチドの両方が、ＬＲＰ５に結合し、そしてＬＲＰ５またはＬＲＰ６のいずれかへのＤＫＫ１の結合を阻害することができることを実証する。
【００７７】
実施例１２
本実施例は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＷＮＴシグナル伝達の阻害を示す。
【００７８】
本実施例では、上記のように調製し、そして図１１に示される結果（即ち、ルシフェラーゼ活性）を有する表ＩＶに示されるような処理に供される細胞におけるＴＣＦ／ＬＥＦ−Ｌｕｃアッセイを含んでなるＨＥＫ２９３細胞において、Ｗｎｔシグナル伝達を測定した。
【００７９】
【表４】
2010526090.tif 000006
【００８０】
データは、Ｍｅｓｄタンパク質、Ｍｅｓｄ（１５０−１９５）ペプチド、およびＭｅｓｄ  ＷＴペプチドが、Ｗｎｔシグナル伝達を中程度に阻害し、そしてそれらを、Ｗｎｔ−関連癌の治療に使用するができるが、Ｄｋｋ１は、より強力なインヒビターであることを示す。Ｍｅｓｄはまた、Ｄｋｋ１のインヒビターであるため、それは、二重の利益（即ち、癌の減少および骨の健康の増加）を有する。
【００８１】
実施例１３
ＭＭＴＶ−ＬＲＰ６構築物を作製するため、ヒトＬＲＰ６ｃＤＮＡを、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）と、ＳＶ４０大型Ｔ抗原イントロンおよびポリアデニル化シグナルとの間で、ＭＭＴＶ−ＳＶ４０−Ｂｓｓｋベクターにクローニングした。注入前、構築物を直線化し、そして精製した。トランスジェニックマウスを、ＦＶＢ／Ｎ近交系のバックグランドにおいて作製し、そして初代遺伝子導入動物を、導入遺伝子の存在について、ＰＣＲ試験によって同定した。４つの初代動物を入手し、そしてそれらの子孫を、ＬＲＰ６の発現、Ｗｎｔシグナル伝達の程度、および乳腺形態学について、ホールマウント染色によって、特徴付けた。図１２。
【００８２】
本出願において引用したすべての出版物、特許、特許出願および他の参考文献は、それらの全体が、出典明示によって本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年12月28日(2009.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2010526090.tif 000038
2010526090.tif 000039
2010526090.tif 000040