(57)【要約】  抗腫瘍活性を有する式（Ｉ）の新規なカンプトテシン誘導体、その調製方法、抗腫瘍薬としてのその使用およびそれを含む医薬組成物。2010500970.tif 000009
2010500970.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2010500970.tif 000007
（式中、
Ｒは、アルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、ニトリル、アルコキシミノ、アリールオキシミノ、シリルアルキルであり；
Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノアルキルであり；
Ｒ２は、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノアルキル、場合によって保護されたヒドロキシルであり；
ここで、前記アルキル、アルコキシ、アミノアルキルまたはアルコキシミノ基は、直鎖または分岐鎖の、１から８個、好ましくは１から４個の炭素原子を含むことができ、前記アリールオキシミノ基は、５から１０個の炭素原子を含むことができる）
の化合物、医薬的に許容されるその塩、異性体、エナンチオマー、ジアステレオマーおよび対応する混合物。
【請求項２】
ａ）４，５−ジヒドロ−トリアゾール［５，４−ｃ］１６ａ−デオキソカンプトテシン、
ｂ）トリアゾール［５，４−ｃ］１６ａ−デオキソカンプトテシン
からなる群から選択される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
以下のスキーム：
【化２】
2010500970.tif 000008
（スキーム中、
ａ）前駆体ヒドロキシ基の保護；
ｂ）Ｎ，Ｎ−二保護ヒドラジンを用いた５位での誘導化；
ｃ）ピリドン環のチオピリドン環への任意選択の変換；
ｄ）付随した環化を伴う保護基の除去；
ｅ）ピラゾール環の任意選択の芳香族化
であり、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、上記に定義される意味を有し、ＰＧはヒドロキシ保護基である）
に示されるステップ（ａ）〜（ｅ）を実質的に含む、式（Ｉ）の化合物の調製方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の順序を入れ換えた、請求項３に記載の式（Ｉ）の化合物の調製方法。
【請求項５】
式（Ｉ）の化合物を医薬的に許容される担体および賦形剤と一緒に含む医薬組成物。
【請求項６】
経口または非経口投与に適した形態である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
腫瘍の治療のための薬剤の調製のための請求項１または２に記載の化合物の使用または請求項５または６に記載の組成物の使用。
【請求項８】
前記薬剤が、固形腫瘍および白血病、特に、肺、卵巣、乳房、胃、肝臓、前立腺、軟組織肉腫、食道、膵臓、頭頸部、グリア芽細胞腫の腫瘍、慢性および急性骨髄性白血病の治療に使用される、請求項７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍活性を有する新規なカンプトテシン誘導体、その調製方法、抗腫瘍薬としてのその使用およびそれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
カンプトテシンは、カンレンボク［Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔａ（ヌマミズキ科（Ｎｙｓｓａｃｅａｅ））］から抽出されるアルカロイドであり、これは、1966年にWallおよびWaniによって最初に記載された（J. Am. Chem. Soc.1996年、88、3888〜3890頁）。カンプトテシンは、広範なスペクトルの抗腫瘍活性（特に結腸腫瘍および他の固形腫瘍ならびに白血病に対する）があるが、その毒性が高いため治療に使用されておらず、この毒性は、出血性膀胱炎、胃腸毒性および骨髄抑制の形で特に顕在化する。
【０００３】
低毒性および高溶解度を有する化合物を得るために、いくつかのカンプトテシンアナログが合成されている。現在、２つの薬剤、すなわち、ＣＰＴ−１１およびトポテカンが臨床診療において使用されている。他の誘導体、例えば、ベロテカン、ルビテカン、エクサテカン、ギマテカン、ペガモテカン、ルルトテカン、カレニテシン、アフェレテカン、ホモカンプトテシン、ジフロモテカン、および多くのその他のものについて臨床実験が行われている。化合物ＣＰＴ−１１は、１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシン（ＳＮ−３８として通常知られている）の高度に可溶性のプロドラッグであり、多くの固形腫瘍および腹水（結腸直腸、皮膚、胃、肺、子宮頸管、卵巣、非ホジキンリンパ腫）の治療に認可された。
【０００４】
トポテカンは、生理溶液に可溶で、肺、胃、肝臓、卵巣、乳房、前立腺、食道、直腸、軟組織肉腫、頭頸部、グリア芽細胞腫の腫瘍、慢性および急性骨髄性白血病に対して活性な化合物である。しかし、トポカテンは、好中球減少および血小板減少などの重大な副作用を示す。
【０００５】
ルルトテカンは、より可溶性の誘導体であり、頸、卵巣、乳房、結腸直腸、および肺微小細胞腫の腫瘍において活性を有する。しかし、ルルトテカンもまた、血液毒性を有する。
【０００６】
ルビテカンは、膵臓、卵巣および乳房の腫瘍に対して有効な経口使用のためのプロドラッグである。
【０００７】
カンプトテシンおよびそのアナログは、全てのトポイソメラーゼＩ阻害薬と同様に、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬を含む従来の薬剤に耐性を示す腫瘍に対して有効であり；細胞周期全体の間に高いトポイソメラーゼレベルを維持し；多剤耐性（ＰｇｏまたはＭＲＰ）または酵素によって仲介される解毒代謝を誘発しない。
【０００８】
現在、研究は、現在使用されている薬剤よりも低い毒性を有するトポイソメラーゼＩの新規な阻害薬に集中している。
【０００９】
開環カンプトテシン誘導体は、高いタンパク結合（特にアルブミンとの）および腫瘍組織における低分布を示す。結果として、この製品は体内に蓄積し、腫瘍は影響されにくい。
【００１０】
反対に、そのラクトン型の高い親油性は、細胞膜（特に赤血球）へのカンプトテシン誘導体の付着を促進し、組織／血漿分布比に影響を与える。このため、研究は、以下の２つの代替手法に集中している：ａ）良好な可溶性をなお有する低タンパク結合製品の設計；ｂ）極めて低い用量でも治療効果を有する高度に効力のある製品の設計。
【００１１】
７−、９−、１０−および１１−位での修飾は、良好な耐容性を示すが、その形成が化合物の抗腫瘍活性の原因となるＤＮＡ−トポイソメラーゼＩ−カンプトテシンの三重複合体の安定性に影響を与えないことが一般に判明した。
【００１２】
２０Ｒ配置を有する製品は、天然配置と一致する、２０Ｓ配置を有する製品に比べて、不活性であるかまたは非常に活性が低いことが判明した。
【００１３】
一般に、５位での修飾は、三重複合体の形成に不利と考えられており、一方ピリドン環ＤおよびＥでの修飾は、この製品の活性に有害であることが報告された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc.1996年、88、3888〜3890頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の開示
第１の態様において、本発明は、一般式Ｉ：
【００１６】
【化１】
2010500970.tif 000003
【００１７】
（式中、
Ｒは、アルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、ニトリル、アルコキシミノ、アリールオキシミノ、シリルアルキルであり；
Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノアルキルであり；
Ｒ２は、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノアルキル、場合によって保護されたヒドロキシルであり；
ここで、該アルキル、アルコキシ、アミノアルキルまたはアルコキシミノ基は、直鎖または分岐鎖の、１から８個、好ましくは１から４個の炭素原子を含むことができ、該アリールオキシミノ基は、５から１０個の炭素原子を含むことができる）
のカンプトテシン誘導体、医薬的に許容されるその塩、異性体、エナンチオマー、ジアステレオマー、および対応する混合物に関する。
【００１８】
本発明の化合物は、低いタンパク結合および良好な溶解度ならびに非常に低い用量でも高い効力を示す。
【００１９】
本発明の化合物の調製のために好ましい合成経路は、以下のスキームに説明され、以下のステップを実質的に含む：
ａ）前駆体ヒドロキシ基の保護
ｂ）Ｎ，Ｎ−二保護ヒドラジンを用いた５位での誘導化
ｃ）ピリドン環のチオピリドン環への任意選択の変換
ｄ）付随した環化を伴う保護基の除去
ｅ）ピラゾール環の任意選択の芳香族化。
【００２０】
【化２】
2010500970.tif 000004
【００２１】
スキームにおいて、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、上記の意味を有し、ＰＧはヒドロキシ保護基である。
【００２２】
ヒドロキシルは、容易に切断できるアシル基、好ましくはトリクロロアセテートおよびＴｒｏｃ、またはシリル基、好ましくはトリエチルシリルによって好ましくは保護される。
【００２３】
保護ヒドラジンを用いた５位での誘導化は、前駆体を強有機塩基、例えば、ＬｉＨＭＤＳで処理し、得られたカルバニオンをアザジカルボキシレート、例えば、ジ−ｔ−ブトキシアザジカルボキシレートまたはジベンジルオキシアザジカルボキシレートと反応させることによって得ることができる。ピリドン環のチオピリドン環への変換は、２，４−ビス（４−メトキシフェニル）−１，２，３，４−ジチアホスフェタン−２，４−ジスルフィド（ローソン試薬として一般に知られている）（Cava P.M.ら、Tetrahedron 1985年、41、5061頁;Cherkasov RAら、Tetrahedron 1985年、41、2567頁;Ghattas AAGら、Sulfur Lett. 1982年、1、69頁;Yde Bら、Tetrahedron 1984年、40、2047頁）または同等の試薬との反応によって得ることができる。ローソン試薬が好ましい。
【００２４】
チオピリドンへの任意選択の変換の目的は、ヒドラジンが脱保護化された後直ちに閉環を促進することである。しかし、例えばチオカルボニルのようなピリジンカルボニルの活性化がたとえなくても、該閉環反応は自然に起こり、かつ即時であることが観察された。
【００２５】
ヒドロキシ保護基がシリルであり、窒素におけるそれらがカルバメートである場合、それらは、トリフルオロ酢酸で通常除去される。代替手順において、ステップｂ）とｃ）は入れ換えることができる。
【００２６】
本発明の化合物は、腫瘍細胞の広範なスペクトルについて細胞毒性アッセイで試験した。一例として、比較としてカンプトテシンならびに薬剤トポテカンおよびＳＮ−３８を用いて、式（Ｉ）の２つの化合物に関するＮＣｌ−Ｈ４６０細胞株（ＮＳＣＬ癌）について細胞毒性データを報告する：
【００２７】
【表１】
2010500970.tif 000005
【００２８】
最も活性な化合物は、活性濃度および損傷持続を測定するＤＮＡ切断アッセイにおいて評価した（「実施例」の項を参照）。驚くべきことに、式（Ｉ）の誘導体は、有効な細胞毒性活性を維持しながら、対照標準（特に、トポテカンおよびカンプトテシン）に比べて、ＤＮＡ複製の阻止についてより高い持続を示す。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物を医薬的に許容される担体および賦形剤と一緒に含む医薬組成物に関する。化合物（Ｉ）の経口または非経口投与に適した医薬形態は、固形、好ましくはカプセル、錠剤および顆粒剤、または液体、好ましくは注射剤もしくは輸液でありうる。
【００３０】
本発明の適切に配合された化合物は、固形腫瘍および白血病、特に、肺、卵巣、乳房、胃、肝臓、前立腺、軟組織肉腫、頭頸部、食道、膵臓、結腸、直腸、グリア芽細胞腫の腫瘍、慢性および急性骨髄性白血病の治療に使用されうる。
【００３１】
実施例
実施例Ｉ  ２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシン
カンプトテシン（０．１００ｇ、０．２８７ミリモル）を不活性雰囲気下で無水ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）に懸濁させ、得られた懸濁液にイミダゾール（０．９８０ｇ、１．４４ミリモル）を加える。この混合物を１０分間攪拌し、その後、その中にトリエチルシリルクロリド（ＴＥＳ−Ｃｌ）（０．１９３ｍＬ、１．１５ミリモル）を滴下し、続けて、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．０４０ｇ、０．２８７ミリモル）を添加する。４６時間後、この反応混合物を真空下で蒸発させる（反応剤の完全消失したＴＬＣ対照、溶出液ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ＝３０／１）。その後、この固形物をＣＨ2Ｃｌ2に再溶解させ、Ｈ2Ｏおよび飽和ＮＨ4Ｃｌで洗浄する。水相をＣＨ2Ｃｌ2（２×１０ｍＬ）で抽出する。有機相を合わせて、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、そして真空下で濃縮し、それにより淡黄色固体として所望の生成物（０．１３３ｇ、０．２８７ミリモル）を得る。
【００３２】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）δ  ８．３７（ｓ，１Ｈ，Ａｒ，Ｈ−７）、８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ａｒ）、７．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ａｒ）、７．８２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ａｒ）、７．６５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ａｒ）、７．５７（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１４）、５．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ，Ｈ−１７）、５．２９（ｓ，２Ｈ，Ｈ−５）、５．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ，Ｈ−１７）、２．００〜１．８４（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１９）、１．０３〜０．９３（ｍ，１２Ｈ）、０．８０〜０．７１（ｍ，６Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ  １７１．７、１５７．６、１５２．５、１５１．５、１４９．０、１４５．９、１３０．９、１３０．４、１３０．０、１２８．４、１２８．１、１２８．０、１２７．９、１１８．９、９４．４、７５．３、６６．０、５０．０、３３．２、７．９、７．２、６．４。
【００３３】
実施例ＩＩ  ５−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシンの調製
カンプトテシン２０−ＯＴＥＳ（０．１００ｇ、０．２１６ミリモル）を不活性雰囲気下で攪拌しながら無水ＴＨＦ（６ｍＬ）に溶解し、次いで、−７８℃の温度に冷却し、その中にＴＨＦ中１．０ＭのＬｉＨＭＤＳ溶液（０．２８１ｍＬ、０．２８１ミリモル）を滴下する。２０分後、無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中ジ−ｔｅｒｔ−ブチルアゾジカルボキシレート（ＤＴＢＡＣ）（０．０７５ｇ、０．３２４ミリモル）を添加する。−７８℃で４時間後、反応剤の消失をＴＬＣ（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／１）によってモニターする。２つのジアステレオマーの形成を観察する。反応を飽和ＮＨ4Ｃｌの添加によってクエンチする。水相をＣＨ2Ｃｌ2（３×１５ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせて、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、そして真空下で濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／１）によって精製し、それにより２つの異性体の混合物（０．１４５ｇ、０．２１０ミリモル、９７％）を得る。２つの異性体を、さらなるクロマトグラフィーによって分離する。溶出の順序で：
第１ジアステレオマー：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）δ  ８．８０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ａｒ）、８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ａｒ）、８．０１（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ａｒ）、７．９０〜７．７１（ｍ，２Ｈ，Ａｒ）、７．７０〜７．４５（ｍ，２Ｈ，Ａｒ＋Ｈ−１４）、６．５２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ｈ−５）、５．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，Ｈ−１７）、５．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，Ｈ−１７）、２．０３〜１．８１（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１９）、１．７９〜１．０８（ｂｒ  ｓ，１８Ｈ）、１．０６〜０．９２（ｍ，１２Ｈ）、０．８０〜０．７０（ｍ，６Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ  １７１．７、１５７．８、１５５．５、１５５．５、１５２．０、１５２．０、１５１．２、１４９．４、１４５．０、１３２．１、１３０．６、１３０．０、１２８．７、１２８．４、１２７．９、１１９．９、９８．２、８２．７、８１．５、７９．７、７５．２、６５．７、３３．２、２８．３、２７．６、７．７、７．２、６．４。
【００３４】
第２ジアステレオマー：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）δ  ８．７９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ａｒ）、８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ａｒ）、８．０１（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ａｒ）、７．８５〜７．７６（ｍ，２Ｈ，Ａｒ）、７．６５（ｂｒ  ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ａｒ）、７．５２（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１４）、６．５４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ｈ−５）、５．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，Ｈ−１７）、５．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，Ｈ−１７）、２．０３〜１．８２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１９）、１．７６〜１．０８（ｂｒ  ｓ，１８Ｈ）、１．０４〜０．９２（ｍ，１２Ｈ）、０．８０〜０．７０（ｍ，６Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ  １７１．５、１５７．９、１５５．５、１５５．５、１５２．３、１５２．０、１５１．２、１４９．４、１４５．１、１３２．１、１３０．６、１３０．０、１２８．７、１２８．４、１２７．９、１１９．９、９８．２、８２．９、８１．５、７９．６、７５．２、６５．８、３３．３、２８．３、２７．４、７．８、７．２、６．４。
【００３５】
実施例ＩＩＩ  ５−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＨ−カンプトテシン第１ジアステレオマーの調製
５−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシン（０．０５０ｇ、０．０７２ミリモル）第１ジアステレオマーを不活性雰囲気下で攪拌しながら無水ＴＨＦ（４ｍＬ）に溶解し、その後、その中にＥｔ3Ｎ・３ＨＦ（０．０８８ｍＬ、０．５４２ミリモル）を滴下する。この反応混合物を室温で３５時間反応させ、反応剤の消失をＴＬＣによってモニターする（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／２）。溶媒を真空下で蒸去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／２）によって精製し、それにより淡黄色固体として所望の化合物（０．０４１ｇ、０．０７１ミリモル、９８％）を得る。
【００３６】
この生成物をＣＨ2Ｃｌ2／ペンタン＝１／５０から結晶化によってさらに精製する。
【００３７】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）δ  ８．７７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ａｒ）、８．１６（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ａｒ）、７．９７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ａｒ）、７．８６〜７．５０（ｍ，４Ｈ，Ａｒ）、６．５１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ｈ−５）、５．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ，Ｈ−１７）、５．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ，Ｈ−１７）、３．８６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、２．００〜１．８０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１９）、１．７９〜１．１３（ｂｒ  ｓ，１８Ｈ）、１．０３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｍｅ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ  １７３．７、１５７．９、１５５．５、１５５．５、１５２．１、１５１．３、１５０．７、１４９．６、１４５．７、１３２．３、１３０．７、１２９．９、１２８．７、１２７．９、１２７．６、１２０．０、９７．９、８２．８、８１．６、７９．７、７２．７、６６．１、３１．８、２８．３、２７．７、７．７。
【００３８】
実施例ＩＶ  ５−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＨ−カンプトテシン第２ジアステレオマーの調製
５−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシン（０．０５０ｇ、０．０７２ミリモル）第２ジアステレオマーを不活性雰囲気下で攪拌しながら無水ＴＨＦ（４．５ｍＬ）に溶解し、その後、その中にＥｔ3Ｎ・３ＨＦ（０．０８８ｍＬ、０．５４２ミリモル）を滴下する。この反応混合物を室温で３５時間反応させ、反応剤の消失をＴＬＣによってモニターする（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／２）。溶媒を真空下で蒸去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／２）によって精製し、それにより淡黄色固体として所望の化合物（０．０４０ｇ、０．０６９ミリモル、９６％）を得る。
【００３９】
この生成物をＣＨ2Ｃｌ2／ペンタン＝１／５０から結晶化によってさらに精製する。
【００４０】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）δ  ８．７９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ａｒ）、８．２２（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ａｒ）、７．９９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ａｒ）、７．８８〜７．５０（ｍ，４Ｈ，Ａｒ）、６．５３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ｈ−５）、５．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ，Ｈ−１７）、５．２６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ，Ｈ−１７）、３．８０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、２．００〜１．８０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１９）、１．７９〜１．１３（ｂｒ  ｓ，１８Ｈ）、１．０３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｍｅ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ  １７３．６、１５７．９、１５５．４、１５５．４、１５２．１、１５１．３、１５０．８、１４９．５、１４５．６、１３２．３、１３０．８、１２９．８、１２８．７、１２７．９、１２７．８、１１９．８、９８．０、８３．０、８１．５、７９．７、７２．７、６６．３、３１．８、２８．３、２７．７、７．８。
【００４１】
実施例Ｖ  ５−ジベンジルオキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシンの調製
カンプトテシン２０−ＯＴＥＳ（０．１００ｇ、０．２１６ミリモル）を不活性雰囲気下で攪拌しながら無水ＴＨＦ（６ｍＬ）に溶解し、次いで、−７８℃の温度に冷却し、その中にＴＨＦ中１．０ＭのＬｉＨＭＤＳ溶液（０．２８１ｍＬ、０．２８１ミリモル）を滴下する。２０分後、無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中ジベンジルアゾジカルボキシレート（０．０９７ｇ、０．３２４ミリモル）を添加する。−７８℃で３時間後、温度を放置して２５℃まで上昇させ、反応剤の消失をＴＬＣ（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／１）によってモニターする。２つのジアステレオマーの形成を観察する。室温で９０分後、反応を飽和ＮＨ4Ｃｌの添加によってクエンチする。水相をＣＨ2Ｃｌ2（３×１５ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせて、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、そして真空下で濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝４／１次いで７／２）によって精製し、それにより淡黄色固体（０．１６１ｇ、０．２１２ミリモル、９８％）を得る。２つの異性体をさらなるクロマトグラフィーによって分離する。溶出の順に：
第１ジアステレオマー：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）δ  ８．７０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ａｒ）、８．３９（ｂｒ  ｓ  １Ｈ，Ａｒ）、８．２２（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ａｒ）、７．９５（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ａｒ）、７．８３（ｂｒ  ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ａｒ）、７．６５（ｂｒ  ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ａｒ）、７．６４〜７．００（ｍ，１１Ｈ，Ａｒ＋Ｈ−１４）、６．４９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ｈ−５）、５．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ，Ｈ−１７）、５．４７〜４．４４（ｍ，５Ｈ）、１．９８〜１．８２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１９）、１．０２〜０．８９（ｍ，１２Ｈ）、０．８０〜０．７０（ｍ，６Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ  １７１．６、１５８．０、１５６．３、１５６．３、１５３．０、１５２．２、１５１．０、１４９．６、１４４．８、１３５．３、１３２．１、１３０．６、１３０．０、１２８．６〜１２７．８（１１Ｃ）、１１９．９、９８．４、７９．５、７５．２、６８．４、６７．９、６５．６、３３．０、７．９、７．２、６．４。
【００４２】
第２ジアステレオマー：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）δ  ８．８５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ａｒ）、８．５８（ｂｒ  ｓ  １Ｈ，Ａｒ）、８．２０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ａｒ）、７．９３（ｂｒ  ｓ，Ａｒ）、７．８１（ｂｒ  ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ａｒ）、７．６３（ｂｒ  ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ａｒ）、７．５６〜６．９０（ｍ，１１Ｈ，Ａｒ＋Ｈ−１４）、６．５２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ｈ−５）、５．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，Ｈ−１７）、５．４４〜４．７１（ｍ，５Ｈ）、１．９８〜１．８０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１９）、１．０５〜０．９０（ｍ，１２Ｈ）、０．８１〜０．７０（ｍ，６Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ  １７１．５、１５７．９、１５６．４、１５６．４、１５２．９、１５２．４、１５０．９、１４９．４、１４４．８、１３５．３、１３２．１、１３０．６、１２９．９、１２８．６〜１２７．８（１１Ｃ）、１１９．９、９８．５、７９．３、７５．２、６８．４、６７．８、６５．６、３２．９、７．８、７．２、６．４。
【００４３】
実施例ＶＩ  ５−ジベンジルオキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＨ−カンプトテシン第１ジアステレオマーの調製
５−ジベンジルオキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシン第１ジアステレオマー（０．１４０ｇ、０．１８４ミリモル）を不活性雰囲気下で攪拌しながら無水ＴＨＦ（６ｍＬ）に溶解し、その後、その中にＥｔ3Ｎ・３ＨＦ（０．２２５ｍＬ、１．３８０ミリモル）を滴下する。この反応混合物を室温で５２時間反応させ、反応剤の消失をＴＬＣによってモニターする（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／３）。溶媒を真空下で蒸去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１次いで２／３）によって精製し、それにより淡黄色固体として所望の化合物（０．１１３ｇ、０．１７５ミリモル、９５％）を得る。この生成物をＣＨ2Ｃｌ2／ペンタン＝１／５０から結晶化によってさらに精製する。
【００４４】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）δ  ８．６７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ａｒ）、８．３９（ｂｒ  ｓ  １Ｈ，Ａｒ）、８．１２（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ａｒ）、７．９５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ａｒ）、７．７４（ｂｒ  ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ａｒ）、７．６５〜６．６６（ｍ，１２Ｈ，Ａｒ＋Ｈ−１４）、６．４８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ｈ−５）、５．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｈ−１７）、５．４２〜４．４４（ｍ，５Ｈ）、３．８６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、１．９２〜１．７２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１９）、０．９５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｍｅ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ  １７３．５、１５８．０、１５６．２、１５６．０、１５３．０、１５０．９、１５０．９、１４９．５、１４５．３、１３５．４、１３２．２、１３０．７、１２９．８、１２８．７〜１２７．８（１１Ｃ）、１１９．９、９８．２、７９．６、７２．７、６８．５、６８．０、６５．９、３１．６、７．８。
【００４５】
実施例ＶＩＩ  ５−ジベンジルオキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＨ−カンプトテシン第２ジアステレオマーの調製
５−ジベンジルオキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシン第２ジアステレオマー（０．１４０ｇ、０．１８４ミリモル）を不活性雰囲気下で攪拌しながら無水ＴＨＦ（６ｍＬ）に溶解し、その後、その中にＥｔ3Ｎ・３ＨＦ（０．１５０ｍＬ、０．９２１ミリモル）を滴下する。この反応混合物を室温で５５時間反応させ、反応剤の消失をＴＬＣによってモニターする（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／２）。溶媒を真空下で蒸去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１）によって精製し、それにより淡黄色固体として所望の化合物（０．１１３ｇ、０．１７５ミリモル、９５％）を得る。この生成物をＣＨ2Ｃｌ2／ペンタン＝１／５０から結晶化によってさらに精製する。
【００４６】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）δ  ８．７１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ａｒ）、８．３４（ｂｒ  ｓ  １Ｈ，Ａｒ）、８．１８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ａｒ）、７．９４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ａｒ）、７．７９（ｂｒ  ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ａｒ）、７．７０〜６．７０（ｍ，１２Ｈ，Ａｒ＋Ｈ−１４）、６．５２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ｈ−５）、５．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ，Ｈ−１７）、５．４４〜４．４８（ｍ，５Ｈ）、３．８７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、１．９０〜１．７０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１９）、０．９９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｍｅ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ  １７３．４、１５８．０、１５６．３、１５６．１、１５３．０、１５１．０、１５０．９、１４９．６、１４５．３、１３５．５、１３２．３、１３０．８、１２９．８、１２８．７〜１２７．８（１１Ｃ）、１１９．８、９８．４、７９．５、７２．７、６８．５、６７．８、６６．０、３１．６、７．７。
【００４７】
実施例ＶＩＩＩ  ４，５−ジヒドロ−トリアゾール［５，４−ｃ］１６ａ−デオキソカンプトテシンＴＦＡ塩の調製
５−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシン（０．２２５ｇ、０．３２４ミリモル、１：１ジアステレオマー混合物）を不活性雰囲気下で攪拌しながら無水１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）（８ｍＬ）に溶解し、その後、その中にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（０．８９５ｍＬ、１１．６７ミリモル）を滴下する。この反応混合物を室温で２０時間反応させ、反応剤の消失をＴＬＣによってモニターし（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／３）、次いで、４時間還流する。溶媒を真空下で蒸去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ＝３０／１）によって精製し、それによりトリフルオロアセテート塩として所望の化合物（０．０８４ｇ、０．１７８ミリモル、５５％）を得る。２つのジアステレオマーの１：１混合物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、トルエン／ＡｃＯＥｔ＝１／１）によってさらに精製する。
【００４８】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）δ  １０．６１（ｂｒ  ｓ，０．５Ｈ，Ｎ５−ＮＨ＝Ｃ１６ａ）、１０．３９（ｂｒ  ｓ，０．５Ｈ，Ｎ５−ＮＨ＝Ｃ１６ａ）、８．６７（ｓ，１Ｈ，Ａｒ，Ｈ−７）、８．２２〜８．１５（ｍ，１Ｈ，Ａｒ）、７．９６〜７．９２（ｍ，１Ｈ，Ａｒ）、７．８８〜７．７８（ｍ，１Ｈ，Ａｒ）、７．６９〜７．６０（ｍ，２Ｈ，Ａｒ）、６．３８〜６．３６（ｍ，１Ｈ，Ａｒ，Ｈ−５）、５．７２〜５．６２（ｍ，１Ｈ，Ａｒ，Ｈ−１７）、５．３２〜５．２０（ｍ，２Ｈ，Ａｒ，Ｈ−１７＋Ｎ５Ｈ）、４．０８〜３．８６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、１．９６〜１．７４（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１９）、１．０５〜０．９８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｍｅ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ  １７３．８（０．５Ｃ）、１７３．４（０．５Ｃ）、１５９．１、１５９．０、１５６．７（ｑ  ＣＦ3ＣＯＯＨ）、１５６．５（ｑ  ＣＦ3ＣＯＯＨ）１５１．５、１５１．３、１５０．７、１５０．５、１５０．１、１４９．９、１４４．８、１４４．７、１３４．０、１３３．８、１３１．６、１３１．５、１２９．９、１２９．８、１２８．７、１２８．７、１２８．４、１２８．４、１２８．２、１２８．２、１２７．１、１２６．９、１２０．５、１２０．３、９９．１（２Ｃ）、７８．９、７８．６、７２．７、７２．７、６６．０（２Ｃ）、３１．７（２Ｃ）、７．７、７．７。
【００４９】
実施例ＩＸ  トリアゾール［５，４−ｃ］１６ａ−デオキソカンプトテシンの調製
４，５−ジヒドロ−トリアゾール［５，４−ｃ］１６ａ−デオキソカンプトテシンＴＦＡ塩（０．０２０ｇ、０．０４２ミリモル）を不活性雰囲気下で攪拌しながら無水ＣＨ2Ｃｌ2（４ｍＬ）に溶解し、その後、それに２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン（ＤＤＱ）（０．０２５ｍｇ、０．１１０ミリモル）を添加する。この反応混合物を室温で３１時間反応させ、反応剤の消失をＴＬＣによってモニターする（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ＝３０／１）。反応をＨ2Ｏの添加によってクエンチする。水相をＣＨ2Ｃｌ2（３×１５ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせて、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、そして真空下で濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ＝４５／１）によって精製し、それにより黄色固体（０．０１４ｇ、０．０３９ミリモル、９４％）を得る。
【００５０】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，４００ＭＨｚ）δ  ８．８９（ｓ，１Ｈ，Ａｒ，Ｈ−７）、８．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ａｒ）、８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ａｒ）、７．８８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ａｒ）、７．７９（ｓ，１Ｈ，Ａｒ  Ｈ−１４）、７．６９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ａｒ）、５．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ，Ｈ−１７）、５．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ，Ｈ−１７）、３．８３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、２．００〜１．７４（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１９）、１．０８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｍｅ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１００ＭＨｚ）δ  １７２．６、１５７．４、１５２．５、１５０．８、１４８．９、１４３．７、１３４．９、１３２．５、１３２．４、１３０．０、１２９．５、１２８．７、１２７．５、１２２．６、１２１．４、１０１．２、７２．４、６６．０、３１．６、７．７。
【００５１】
実施例Ｘ  細胞増殖阻害アッセイ
１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地でヒト大細胞肺腫瘍由来のＨ４６０細胞を培養した。細胞感受性は、１時間または７２時間の薬剤暴露後の細胞増殖阻害アッセイによって決定した。対数増殖中の細胞を採取し、６ウェルプレートに２連で播種した。播種から２４時間後、細胞を薬剤に暴露し、薬剤暴露から７２時間後、コールターカウンターで計数してＩＣ50を決定した。ＩＣ50は、未処理対照増殖と比較して細胞増殖を５０％阻害する濃度として定義される。
【００５２】
実施例ＸＩ  トポイソメラーゼ−Ｉ依存性ＤＮＡ破壊アッセイ
７５１−ｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ  ＳＶ４０精製ゲル（Beretta GL、Binaschi M、Zagni AND、Capuani L、Capranico G.、Tethering a type IB topoisomerase to a DNA site by enzyme fusion to a heterologous site-selective DNA-binding protein domain、Cancer Res 1999;59:3689〜97頁）を用いてＤＮＡ破壊を決定した。ＤＮＡ断片は、３’でのみ標識した。ＤＮＡ破壊反応（２０，０００ｃｐｍ／試料）を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．１ｍＭのチオスレイトール、およびヒト組換え酵素（完全長ｔｏｐ１）の２０ｍＬ中で、３７℃で３０分間実施した。０．５％ＳＤＳおよび０．３ｍｇ／ｍＬのプロテインナーゼＫを４２℃で４５分間用いて、反応をブロックした。１０μＭの薬剤と一緒に３０分のインキュベーション後に０．６ＭのＮａＣｌを添加して異なる時間でＤＮＡ損傷持続を試験した。沈殿後、ＤＮＡを変性緩衝液（８０％ホルムアミド、１０ｍＭのＮａＯＨ、０．０１ＭのＥＤＴＡおよび１ｍｇ／ｍＬの色素）中に再懸濁し、その後、変性ゲル（ＴＢＥ緩衝液中７％ポリアクリルアミド）に注いだ。ＤＮＡ破壊レベルの全てを、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｍａｇｅｒモデル４２５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）（Dallavalle S，Ferrari A，Biasotti Bら、Novel 7-oxyiminomethyl camptothecin derivatives with potent in vitro and in vivo antitumor activity、J Med Chem 2001;44:3264〜74頁）によって測定した。
【００５３】
【表２】
2010500970.tif 000006
【国際調査報告】
2010500970.tif 000010
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2010500970.tif 000012