(57)【要約】  本発明は、式ｘ−ｓ−ｓ−ｙの新規なメルカプトプリン誘導体、例えば、Ｓ−アリルチオ−６−メルカプトプリン及びＳ−アリルチオ−６−メルカプトプリン９−リボシド、並びにその医薬品組成物を提供する。これらの化合物は、非常に効率的な抗増殖薬であり、したがって、様々な疾患又は障害、特に増殖性、炎症性、皮膚、及び免疫性の疾患又は障害の治療に役立てることができる。
2010520194.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ
の化合物、及び医薬品として許容されるその塩
（上式で、Ｘは、下記の一般式のプリン残基であり：
【化１】
2010520194.tif 000011
式中、
Ｒ１からＲ３は、それぞれ独立に、共有結合、又はＨ、ハロゲン、ＳＨ、ＮＲ５Ｒ６、Ｏ−ヒドロカルビル、Ｓ−ヒドロカルビル、ヘテロアリール、非置換ヒドロカルビル、置換されたヒドロカルビルであってハロゲン、ＣＮ、ＳＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ５、ＳＲ５、ＮＲ５Ｒ６、若しくはヘテロアリールによって置換されたヒドロカルビル、又は炭水化物残基から選択され、但し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、Ｈ若しくはヒドロカルビルであり、又はＲ５及びＲ６は、これらが結合する窒素原子と一緒になって、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択された１〜２個のさらなるヘテロ原子を任意選択で含有する５又は６員飽和複素環を形成し、追加の窒素は、置換されておらず、又はハロゲン、ヒドロキシル、若しくはフェニルによって置換されたアルキルによって置換されており、但し、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の１つは共有結合であることを条件とするものであり；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、炭水化物残基、又はＮＲ５Ｒ６であり、但し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、Ｈ若しくはヒドロカルビルであり、又はＲ５及びＲ６は、これらが結合する窒素原子と一緒になって、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択された１〜２個のさらなるヘテロ原子を任意選択で含有する５又は６員飽和複素環を形成し、追加の窒素は、置換されておらず、又はハロゲン、ヒドロキシル、若しくはフェニルによって置換されたアルキルによって置換されており；
Ｙは、ヘテロアリール、非置換ヒドロカルビル、又は置換されたヒドロカルビルであってハロゲン、ＣＮ、ＳＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ７、ＳＲ７、ＮＲ７Ｒ８、若しくはヘテロアリールによって置換されたヒドロカルビルであり、但し、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、Ｈ若しくはヒドロカルビルであり、又はＲ７及びＲ８は、これらが結合する窒素原子と一緒になって、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択された１〜２個のさらなるヘテロ原子を任意選択で含有する５又は６員飽和複素環を形成し、追加の窒素は、置換されておらず、又はハロゲン、ヒドロキシル、若しくはフェニルによって置換されたアルキルによって置換されており；
破線は、８位の炭素原子と７位の窒素原子又は９位の窒素原子との間の二重結合を示し、但し、二重結合が８位の炭素原子と７位の窒素原子との間にある場合、Ｒ４は９位にあり、二重結合が８位の炭素原子と９位の窒素原子との間にある場合、Ｒ４は７位にあることを条件とし；
「ヒドロカルビル」は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール、及び（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルから選択された、飽和若しくは不飽和の、直鎖状若しくは分岐状の、環式若しくは非環式の、又は芳香族基を意味し；
「ヘテロアリール」は、Ｏ、Ｓ、及びＮからなる群から選択された１から３個のヘテロ原子を含有する、単環又は多環式ヘテロ芳香環から得られた基を意味するものである）。
【請求項２】
Ｒ１からＲ３の１個が共有結合であり、Ｒ１からＲ３のその他の２個が、それぞれ独立に、Ｈ、ＳＨ、ハロゲン、ヒドロカルビル、Ｏ−ヒドロカルビル、又はＳ−ヒドロカルビルであり、但し、ヒドロカルビルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル又はＮＲ５Ｒ６であり、但し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、Ｈ若しくはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、又はＲ５及びＲ６は、これらが結合する窒素原子と一緒になって、酸素、窒素、又は硫黄から選択された１個のさらなるヘテロ原子を任意選択で含有する６員飽和複素環を形成し、Ｒ４はＨ又は炭水化物残基であり、Ｙはヒドロカルビルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１からＲ３の１個が共有結合であり、Ｒ１からＲ３のその他の２個が、それぞれ独立に、Ｈ、クロロ、ＳＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、又は−ＮＲ５Ｒ６であり、但し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ４はＨ又は単糖残基であり、ＹはＣ２〜Ｃ６アルケニル又はアルキニルである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記単糖残基が５又は６員単糖残基である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１からＲ３の１個が共有結合であり、Ｒ１からＲ３のその他の２個が、それぞれ独立に、Ｈ、クロロ、ＳＨ、メチル、又はジメチルアミノであり、Ｒ４がＨ又はリボシド残基であり、ＹがＣ３アルケニル又はアルキニルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２が共有結合である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１が共有結合である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ３が共有結合である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ２が共有結合であり、Ｒ１が、Ｈ、ＳＨ、メチル、又はジメチルアミノであり、Ｒ３が、Ｈ、ＳＨ、又はメチルであり、Ｒ４がＨ又は５員単糖残基であり、Ｙがアリル又はプロパルギルである、請求項６に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１が共有結合であり、Ｒ２が、Ｈ、ＳＨ、メチル、又はジメチルアミノであり、Ｒ３が、Ｈ、ＳＨ、又はメチルであり、Ｒ４がＨ又は５員単糖残基であり、Ｙがアリル又はプロパルギルである、請求項７に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ３が共有結合であり、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、Ｈ、ＳＨ、メチル、又はジメチルアミノであり、Ｒ４がＨ又は５員単糖残基であり、Ｙがアリル又はプロパルギルである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ２が共有結合であり、Ｒ１及びＲ３がそれぞれＨであり、Ｒ４がＨ又はリボシド残基であり、Ｙがアリル又はプロパルギルである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１が共有結合であり、Ｒ２及びＲ３がそれぞれＨであり、Ｒ４がＨ又はリボシド残基であり、Ｙがアリル又はプロパルギルである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ３が共有結合であり、Ｒ１及びＲ２がそれぞれＨであり、Ｒ４がＨ又はリボシド残基であり、Ｙがアリル又はプロパルギルである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ２が共有結合であり、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４がそれぞれＨであり、Ｙがアリルである、Ｓ−アリルチオ−６−メルカプトプリン（以下、ＳＡ−６ＭＰと呼ぶ）である、請求項１２に記載の化合物、及び医薬品として許容されるその塩。
【請求項１６】
Ｒ２が共有結合であり、Ｒ１及びＲ３がそれぞれＨであり、Ｒ４がリボシド残基であり、Ｙがアリルである、Ｓ−アリルチオ−６−メルカプトプリン９−リボシド（以下、ＳＡ−６ＭＰＲと呼ぶ）である、請求項１２に記載の化合物、及び医薬品として許容されるその塩。
【請求項１７】
請求項１に記載の化合物、又は医薬品として許容されるその塩、及び医薬品として許容される担体を含む、医薬品組成物。
【請求項１８】
増殖性疾患若しくは障害、炎症性疾患若しくは障害、皮膚疾患若しくは障害、又は免疫疾患若しくは障害から選択された疾患又は障害を治療するための、請求項１７に記載の医薬品組成物。
【請求項１９】
前記増殖性疾患又は障害が癌である、請求項１８に記載の医薬品組成物。
【請求項２０】
前記癌が白血病である、請求項１９に記載の医薬品組成物。
【請求項２１】
前記炎症性疾患又は障害が、クローン病、潰瘍性大腸炎、ベーチェット病、多発筋炎、ライター症候群、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、又は脈管炎から選択され；前記皮膚疾患又は障害が乾癬であり；前記免疫疾患又は障害が、多発筋炎、全身性エリテマトーデス、又は臓器移植後の拒絶反応から選択された自己免疫疾患又は障害である、請求項１８に記載の医薬品組成物。
【請求項２２】
前記化合物が、Ｓ−アリルチオ−６−メルカプトプリン又はＳ−アリルチオ−６−メルカプトプリン９−リボシドである、請求項１７から２１までのいずれか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項２３】
上記で定義された増殖性疾患若しくは障害、炎症性疾患若しくは障害、皮膚疾患若しくは障害、又は免疫疾患若しくは障害から選択された疾患又は障害を治療するための、請求項１に記載の化合物又は医薬品として許容されるその塩の使用。
【請求項２４】
増殖性疾患若しくは障害、炎症性疾患若しくは障害、皮膚疾患若しくは障害、又は免疫疾患若しくは障害から選択された疾患若しくは障害を治療するための方法であって、請求項１に記載の化合物又は医薬品として許容されるその塩の治療有効量を、必要がある個体に投与するステップを含む方法。
【請求項２５】
前記増殖性疾患又は障害が癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記癌が白血病である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記炎症性疾患又は障害が、クローン病、潰瘍性大腸炎、ベーチェット病、多発筋炎、ライター症候群、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、又は脈管炎から選択され；前記皮膚疾患又は障害が乾癬であり；前記免疫疾患又は障害が、多発筋炎、全身性エリテマトーデス、又は臓器移植後の拒絶反応から選択された自己免疫疾患若しくは障害である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なメルカプトプリン誘導体、及びその医薬品組成物に関する。メルカプト誘導体は、様々な疾患又は障害、特に、増殖性、炎症性、皮膚、及び自己免疫性の疾患又は障害の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｅｌｉｏｎ他（１９５２）によって最初に合成された６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、並びにこれと代謝的に関係のある化合物、例えばアザチオプリン、６−メルカプトプリンリボシド（６−ＭＰＲ、チオイノシンとしても知られる）、６−チオ尿酸、６−メチルメルカプトプリン（６−ＭＭＰ）、６−メチル−チオイノシン５’−モノホスフェート、及び６−チオグアニン（６−ＴＧ）などは、アデニン及びグアニンの構造的類似体であり、したがって、この種類の化合物の治療的な、特に抗増殖的な性質が、長い間認識されてきた。
【０００３】
事実、６−ＭＰ及び６−ＭＰＲは、デオキシチオＧＴＰの直接置換により複製後のさらなる修飾及びミスマッチを引き起こすことによって、又はｄｅ  ｎｏｖｏプリン生合成の阻害によって、核酸合成を妨げる、細胞毒性プロドラッグである（Ｋａｒｒａｎ、２００６）。
【０００４】
これらの化合物の中で、６−ＭＰ、アザチオプリン、及び６−ＭＰＲは、最も卓越した治療薬であり、したがって現在、癌（特に白血病）、炎症性腸疾患（特に、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、乾癬性関節炎、乾癬、ライター症候群、ベーチェット病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、及び全身性血管炎などの様々な病状の治療に使用されている。アザチオプリンはさらに、臓器移植後の拒絶反応の予防に使用される（Ｃａｒｒｏｌｌ他、２００３；Ｗａｔｔｅｒｓ及びＭｃＬｅｏｄ、２００３；Ｄｕｂｉｎｓｋｙ、２００４）。
【０００５】
メルカプトプリンの様々な類似体が考案されてきたが、これらには主に治療上の欠点があり、特に、用量規定毒性という欠点がある。特に、これらの類似体の投与が行われる治療は、出生異常の高い発生率、及び長期間にわたって使用する場合には、骨髄抑制、肝臓障害、薬剤性肺炎及び膵炎などの有害な副作用をしばしば伴う。
【０００６】
チオプリンは、３つの競合的酵素経路によって酵素的に変換されたプロドラッグであり：その第１のキサンチンオキシダーゼは、６−ＭＰの酸化を触媒して生物学的に不活性な代謝産物、チオ尿酸にし；第２のヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）は、６−チオイノシンモノホスフェートの形成を触媒し、これをさらに、細胞性酵素によってチオグアニンヌクレオチドへと変換してもよく、次いでポリメラーゼによってＤＮＡに直接組み込んでもよいものであり；第３のチオプリンメチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）は、６−ＭＰ及び６−チオイノシンモノホスフェートから６−メチルメルカプトプリン（ＭｅＭＰ）及びＳ−メチル−チオイノシン５’−モノホスフェート（ＭｅＴＩＭＰ）へのＳ−メチル化をそれぞれ触媒する。後者は、ホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼ、ｄｅ  ｎｏｖｏプリン生合成の第１のステップの強力な阻害剤であり、それによって、プリン欠乏が引き起こされる（Ｋａｒｒａｎ、２００６；Ｃｏｕｌｔｈａｒｄ及びＨｏｇａｒｔｈ、２００５；Ｋｒｙｎｅｔｓｋｉ及びＥｖａｎｓ、１９９９；Ｃａｒａ他、２００４）。
【０００７】
このように、６−ＭＰ、６−ＭＰＲ、及びこれらの様々な誘導体は、特に増殖性及び炎症性の疾患及び障害の分野において、並外れた治療可能性を有するが、これらの実施は、主に上述のようなそれらの細胞毒性及び／又は不十分な薬物動態が原因で、しばしば制限される。このように、メルカプトプリンの生物活性を保有する可能性があり且つそれと同時に様々な治療でのこれら化合物の使用に伴う制限を回避することができる、新規な治療薬の必要性が広く認識されており且つそのような治療薬を有することが非常に有利と考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明によれば、メルカプトプリン誘導体、例えばＳ−アリルチオ−６−メルカプトプリン及びＳ−アリルチオ−６−メルカプトプリン９−リボシドは、６−メルカプトプリン及び６−メルカプトプリンリボシドの場合とそれぞれ同等の又は優れているＤＮＡ合成阻害作用を有すると共に、後者のそれぞれの単独での投与に関連した制限をさらに回避する、非常に効率的な抗増殖薬であることが見出された。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって一態様では、本発明は、一般式
Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ
の化合物、及び医薬品として許容されるその塩に関する
（上式で、Ｘは、下記の一般式のプリン残基であり：
【化１】
2010520194.tif 000003
式中、Ｒ１からＲ３は、それぞれ独立に、共有結合、又はＨ、ハロゲン、ＳＨ、ＮＲ５Ｒ６、Ｏ−ヒドロカルビル、Ｓ−ヒドロカルビル、ヘテロアリール、非置換ヒドロカルビル、ハロゲン、ＣＮ、ＳＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ５、ＳＲ５、ＮＲ５Ｒ６、若しくはヘテロアリールによって置換されたヒドロカルビル、又は炭水化物残基から選択され、但し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、Ｈ若しくはヒドロカルビルであり、又はＲ５及びＲ６は、これらが結合する窒素原子と一緒になって、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択された１〜２個のさらなるヘテロ原子を任意選択で含有する５又は６員飽和複素環を形成し、追加の窒素は、置換されておらず、又はハロゲン、ヒドロキシル、若しくはフェニルによって置換されたアルキルによって置換されており、但し、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の１つは共有結合であることを条件とするものであり；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、炭水化物残基、又はＮＲ５Ｒ６であり、但し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、Ｈ若しくはヒドロカルビルであり、又はＲ５及びＲ６は、これらが結合する窒素原子と一緒になって、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択された１〜２個のさらなるヘテロ原子を任意選択で含有する５又は６員飽和複素環を形成し、追加の窒素は、置換されておらず、又はハロゲン、ヒドロキシル、若しくはフェニルによって置換されたアルキルによって置換されており；
Ｙは、ヘテロアリール、非置換ヒドロカルビル、又はハロゲン、ＣＮ、ＳＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ７、ＳＲ７、ＮＲ７Ｒ８、若しくはヘテロアリールによって置換されたヒドロカルビルであり、但し、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、Ｈ若しくはヒドロカルビルであり、又はＲ７及びＲ８は、これらが結合する窒素原子と一緒になって、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択された１〜２個のさらなるヘテロ原子を任意選択で含有する５又は６員飽和複素環を形成し、追加の窒素は、置換されておらず、又はハロゲン、ヒドロキシル、若しくはフェニルによって置換されたアルキルによって置換されており；
破線は、８位の炭素原子と７位の窒素原子又は９位の窒素原子との間の二重結合を示し、但し、二重結合が８位の炭素原子と７位の窒素原子との間にある場合、Ｒ４は９位にあり、二重結合が８位の炭素原子と９位の窒素原子との間にある場合、Ｒ４は７位にあることを条件とするものである）。
【００１０】
別の態様では、本発明は、上記で定義された化合物、又は医薬品として許容されるその塩、及び医薬品として許容される担体を含む、医薬品組成物に関する。
【００１１】
本発明の化合物及び医薬品組成物は、増殖性疾患若しくは障害、炎症性疾患若しくは障害、皮膚疾患若しくは障害、又は免疫疾患若しくは障害から選択された、疾患若しくは障害の治療に使用してよい。
【００１２】
したがって、別の態様では、本発明は、増殖性疾患若しくは障害、炎症性疾患若しくは障害、皮膚疾患若しくは障害、又は免疫疾患若しくは障害から選択された、疾患若しくは障害の治療のための、上記で定義された化合物又は医薬品として許容されるその塩の使用に関する。
【００１３】
本発明はさらに、増殖性疾患若しくは障害、炎症性疾患若しくは障害、皮膚疾患若しくは障害、又は免疫疾患若しくは障害から選択された、疾患若しくは障害を治療するための方法を提供し、前記方法は、上記で定義された化合物又は医薬品として許容されるその塩の治療有効量を、必要がある個体に投与するステップを含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】エタノール中でのＳ−アリルチオ−６−メルカプトプリン（以下、ＳＡ−６ＭＰ）のスペクトル分析を示す図である。図中の挿入図は、ＳＡ−６ＭＰのＨＰＬＣ溶出パターンを示す。吸光度は、２１０ｎｍでモニタした。
【図１Ｂ】エタノール中でのＳ−アリルチオ−６−メルカプトプリン９−リボシド（以下、ＳＡ−６ＭＰＲ）のスペクトル分析を示す図である。図中の挿入図は、ＳＡ−６ＭＰＲのＨＰＬＣ溶出パターンを示す。吸光度は、２１０ｎｍでモニタした。
【図２Ａ】［３Ｈ］チミジンの組込みによって決定された、異なる濃度（０〜２００μＭの６ＭＰ又はＳＡ−６ＭＰ）で処理したＤａｕｄｉ細胞の増殖を示す図である。未処理細胞は、対照として使用した（１００％）。細胞は、３７℃で１６時間処理した。示される値は、平均±ＳＥＭである。
【図２Ｂ】［３Ｈ］チミジンの組込みによって決定された、異なる濃度（０〜２００μＭの６ＭＰ又はＳＡ−６ＭＰ）で処理したＨｅｌａ細胞の増殖を示す図である。未処理細胞は、対照として使用した（１００％）。細胞は、３７℃で１６時間処理した。示される値は、平均±ＳＥＭである。
【図２Ｃ】［３Ｈ］チミジンの組込みによって決定された、異なる濃度（０〜２００μＭの６ＭＰ又はＳＡ−６ＭＰ）で処理したＮ８７細胞の増殖を示す図である。未処理細胞は、対照として使用した（１００％）。細胞は、３７℃で１６時間処理した。示される値は、平均±ＳＥＭである。
【図３Ａ】ＭＤＲ  ＨＴ−２９細胞に対する６−ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰの致死効果を示す図である。細胞を、プロドラッグと共に３７℃で１６時間インキュベートし、トリパンブルー及びプロピジウムヨウ素（ＰＩ）で染色した。トリパンブルー排除試験後に細胞をカウントし、生存細胞のパーセンテージを計算した。或いは、生存可能なＰＩ染色細胞のパーセンテージを、ＦＡＣＳ分析によって決定した。示される値は、平均±ＳＤである。生存率の値は、未処理の細胞（＊）とは著しく異なっている（ｐ＜０．０５）。
【図３Ｂ】Ｈｅｌｌａ細胞に対する６−ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰの致死効果を示す図である。細胞を、プロドラッグと共に３７℃で１６時間インキュベートし、トリパンブルー及びプロピジウムヨウ素（ＰＩ）で染色した。トリパンブルー排除試験後に細胞をカウントし、生存細胞のパーセンテージを計算した。或いは、生存可能なＰＩ染色細胞のパーセンテージを、ＦＡＣＳ分析によって決定した。示される値は、平均±ＳＤである。生存率の値は、未処理の細胞（＊）とは著しく異なっている（ｐ＜０．０５）。
【図３Ｃ】Ｄａｕｌｉ細胞に対する６−ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰの致死効果を示す図である。細胞を、プロドラッグと共に３７℃で１６時間インキュベートし、トリパンブルー及びプロピジウムヨウ素（ＰＩ）で染色した。トリパンブルー排除試験後に細胞をカウントし、生存細胞のパーセンテージを計算した。或いは、生存可能なＰＩ染色細胞のパーセンテージを、ＦＡＣＳ分析によって決定した。示される値は、平均±ＳＤである。生存率の値は、未処理の細胞（＊）とは著しく異なっている（ｐ＜０．０５）。
【図３Ｄ】Ｂ−ＣＬＬ細胞に対する６−ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰの致死効果を示す図である。細胞を、プロドラッグと共に３７℃で１６時間インキュベートし、トリパンブルー及びプロピジウムヨウ素（ＰＩ）で染色した。トリパンブルー排除試験後に細胞をカウントし、生存細胞のパーセンテージを計算した。或いは、生存可能なＰＩ染色細胞のパーセンテージを、ＦＡＣＳ分析によって決定した。示される値は、平均±ＳＤである。生存率の値は、未処理の細胞（＊）とは著しく異なっている（ｐ＜０．０５）。
【図４】ＰＩ染色を使用した、細胞死の評価を示す図である。ＭＤＲ  ＨＴ−２９細胞を、６−ＭＰ又はＳＡ−６ＭＰ（１５０μＭ）の存在下、３７℃で１６時間培養し、プロピジウムヨウ素（ＰＩ）で染色した。処理済み細胞の画像を、位相差顕微鏡法により観察して、通常の成長パターン（Ｔ、上部パネル）及びＰＩで染色された死細胞を示す処理済み細胞の蛍光画像（Ｆ、下部パネル）を決定した。
【図５Ａ】未処理の細胞である、慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞（Ｂ−ＣＬＬ）の、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。細胞を、アネキシン−Ｃｙ５で染色し、ＦＡＣＳにより分析した。様々な薬物濃度でのアポトーシス細胞のパーセンテージを、分析結果の右上部分に重ね合わせた。
【図５Ｂ】未処理の細胞に対して、５０μＭの６ＭＰにより３７℃で１６時間処理した慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞（Ｂ−ＣＬＬ）の、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。細胞を、アネキシン−Ｃｙ５で染色し、ＦＡＣＳにより分析した。様々な薬物濃度でのアポトーシス細胞のパーセンテージを、分析結果の右上部分に重ね合わせた。
【図５Ｃ】未処理の細胞に対して、１００μＭの６ＭＰにより３７℃で１６時間処理した慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞（Ｂ−ＣＬＬ）の、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。細胞を、アネキシン−Ｃｙ５で染色し、ＦＡＣＳにより分析した。様々な薬物濃度でのアポトーシス細胞のパーセンテージを、分析結果の右上部分に重ね合わせた。
【図５Ｄ】未処理の細胞に対して、１５０μＭの６ＭＰにより３７℃で１６時間処理した慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞（Ｂ−ＣＬＬ）の、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。細胞を、アネキシン−Ｃｙ５で染色し、ＦＡＣＳにより分析した。様々な薬物濃度でのアポトーシス細胞のパーセンテージを、分析結果の右上部分に重ね合わせた。
【図５Ｅ】未処理の細胞に対して、５０μＭのＳＡ−６ＭＰにより３７℃で１６時間処理した慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞（Ｂ−ＣＬＬ）の、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。細胞を、アネキシン−Ｃｙ５で染色し、ＦＡＣＳにより分析した。様々な薬物濃度でのアポトーシス細胞のパーセンテージを、分析結果の右上部分に重ね合わせた。
【図５Ｆ】未処理の細胞に対して、１００μＭのＳＡ−６ＭＰにより３７℃で１６時間処理した慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞（Ｂ−ＣＬＬ）の、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。細胞を、アネキシン−Ｃｙ５で染色し、ＦＡＣＳにより分析した。様々な薬物濃度でのアポトーシス細胞のパーセンテージを、分析結果の右上部分に重ね合わせた。
【図６Ａ】種々の濃度（０〜１５０μＭ）の６−ＭＰ又はＳＡ−６ＭＰにより３７℃で１６時間処理した慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞（Ｂ−ＣＬＬ）における、アポトーシス細胞のパーセンテージを示す図である。アポトーシス細胞は、アネキシンによるＦＡＣＳ分析を使用して測定し、細胞死は、トリパンブルー試験を使用して測定した。
【図６Ｂ】種々の濃度（０〜１５０μＭ）の６−ＭＰ又はＳＡ−６ＭＰにより３７℃で１６時間処理した慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞（Ｂ−ＣＬＬ）における、死細胞のパーセンテージを示す図である。アポトーシス細胞は、アネキシンによるＦＡＣＳ分析を使用して測定し、細胞死は、トリパンブルー試験を使用して測定した。
【図７Ａ】Ｄａｕｄｉ細胞系における細胞増殖に対する、６−ＭＰ、６−ＭＰＲ、ＳＡ−６ＭＰ、及びＳＡ−６ＭＰＲの影響を示す図である。細胞を、種々の濃度（０〜１５０μＭ）のプロドラッグと共に、３７℃で１６時間インキュベートし、抗増殖作用について、ＸＴＴアッセイを使用して評価した。示される値は、平均±ＳＥＭである。
【図７Ｂ】Ｎ８７細胞系における細胞増殖に対する、６−ＭＰ、６−ＭＰＲ、ＳＡ−６ＭＰ、及びＳＡ−６ＭＰＲの影響を示す図である。細胞を、種々の濃度（０〜１５０μＭ）のプロドラッグと共に、３７℃で１６時間インキュベートし、抗増殖作用について、ＸＴＴアッセイを使用して評価した。示される値は、平均±ＳＥＭである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、一態様では、上記で定義された一般式Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙの、メルカプトプリン誘導体に関する。
【００１６】
上記で論じたように、様々なメルカプトプリンはこれまで、特に抗増殖薬として、有益な治療活性をもたらすことが示されている。これらのメルカプトプリンは、プリン様骨格及びそこに結合する、例えば骨格の炭素原子に結合する１個又は複数の遊離チオール基を有するなど、共通の構造的特徴を共有する。
【００１７】
本明細書で使用される「プリン様」骨格という句は、互いに縮合するピリミジン環及びイミダゾール環からなる構造、並びにその類似体を指す。プリン様類似体の例には、ピリミジン環の代わりにピラジン、ピリジン又はフェニル環を用いた、並びに／或いはイミダゾール環の代わりにフラン環及びピロール環などを用いた構造が含まれる。
【００１８】
メルカプトプリンに関して本明細書で使用される「類似体」という用語は、メルカプトプリンの化学的及び／又は構造的特徴を共有し、したがって例えば、体内での核酸合成を阻止することが可能な化合物を指す。
【００１９】
「誘導体」という用語は、その主な構造的特徴を維持しながら化学的修飾を受けている化合物について記述する。そのような化学的修飾には、例えば、１個若しくは複数の置換基及び／又は１個若しくは複数の官能性部分の置換が含まれる。
【００２０】
本明細書で使用される「ハロゲン」という用語には、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードが含まれ、好ましくはクロロである。
【００２１】
異なる基Ｒ１からＲ８の定義のいずれかにおける「ヒドロカルビル」という用語は、飽和又は不飽和でよく、直鎖状又は分岐状でよく、環状又は非環状でよく、又は芳香族でもよい炭素及び水素原子のみを含有する基を指し、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール、及び（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルを含む。
【００２２】
「Ｃ１〜Ｃ２０アルキル」という用語は、典型的には、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状の炭化水素基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、２，２−ジメチルプロピル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、及びｎ−オクチルなどを含む。Ｃ１〜Ｃ６アルキル基が好ましく、メチル及びエチルが最も好ましい。「Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル」及び「Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル」という用語は、典型的には、２〜２０個の炭素原子及び１つの二重又は三重結合をそれぞれ有する直鎖状又は分岐状の炭化水素基を意味し、エテニル、プロペニル、３−ブテン−１−イル、２−エテニルブチル、及び３−オクテン−１−イルなどと、プロピニル、２−ブチン−１−イル、及び３−ペンチン−１−イルなどを含む。Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基が好ましい。「Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル」という用語は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アダマンチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル、及びビシクロ［２．２．１］ヘプチルなどの環式又は二環式ヒドロカルビル基を意味する。「Ｃ６〜Ｃ１４アリール」という用語は、フェニルやナフチルなどの炭素環式芳香族基を示し、「アル（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル」という用語は、ベンジルやフェネチルなどのアリールアルキル基を示す。
【００２３】
基Ｒ１からＲ３の１個又は複数が、Ｏ−ヒドロカルビル若しくはＳ−ヒドロカルビルであり、又はＯＲ５若しくはＳＲ５によって置換されたヒドロカルビルであり、但し、Ｒ５がヒドロカルビルである場合、前記ヒドロカルビルのそれぞれは、好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキル、最も好ましくはメチル若しくはエチルであり、又はアリール、最も好ましくはフェニルであり、又はアラルキル、最も好ましくはベンジル基である。
【００２４】
基Ｙが、ＯＲ７又はＳＲ７基によって置換されたヒドロカルビルであり、但し、Ｒ７がヒドロカルビルである場合、前記ヒドロカルビルのそれぞれは、好ましくはＣ２〜Ｃ８アルケニル又はアルキニルであり、より好ましくはＣ２〜Ｃ６アルケニル又はアルキニルであり、最も好ましくはアリル又はプロパルギル基である。
【００２５】
これらの基とＮＲ５Ｒ６及びＮＲ７Ｒ８において、Ｒ５からＲ８は、それぞれ独立にＨ若しくは上記で定義されたヒドロカルビルであり、又はこれらが結合するＮ原子と一緒になって、飽和した、好ましくは５若しくは６員複素環であって、任意選択で窒素、酸素、及び硫黄から選択された１若しくは２個のさらなるヘテロ原子を含有する複素環を形成する。そのような環は、例えば１個若しくは２個のＣ１〜Ｃ６アルキル基で、又は１個のアリル若しくはヒドロキシアリル基で、その環の、例えばピペラジン環の第２の窒素原子の位置で置換されていてもよい。基ＮＲ５Ｒ６及びＮＲ７Ｒ８の例には、限定するものではないがアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、フェニルメチルアミノ、ピロリジノ、ピペリジノ、テトラヒドロピリジノ、ピペラジノ、エチルピペラジノ、ヒドロキシエチルピペラジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、及びチアゾリノなどが含まれる。
【００２６】
「ヘテロアリール」という用語は、芳香族の不飽和特性を有する、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群から選択された１から３個のヘテロ原子を含有した単環式又は多環式の環から得られた基を指す。ヘテロアリールの非限定的な例には、ピロリル、フリル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリルチアゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、１，３−ベンゾジオキシニル、ピラジニル、ピリミジニル、１，３，４−トリアジニル、１，２，３−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル、チアジニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、インドリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジル、ピリド［１，２−ａ］ピリミジニル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズオキサゾリルが含まれる。ヘテロアリール環は、置換されていてもよい。多環式ヘテロ芳香環が置換される場合、その置換は、ヘテロ環又は炭素環式環で行われてよいことを、理解すべきである。
【００２７】
背景のセクションにおいて詳述したように、ＲＮＡのリボヌクレオチド構成ブロックに類似しているメルカプトプリンリボシドは、体内での核酸合成を妨げることができる。したがって、本発明の好ましい実施形態によれば、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１個は、炭水化物残基である。
【００２８】
「炭水化物」という用語は、炭素、水素、及び酸素原子を含有する分子について記述する。炭水化物は、環状又は直鎖状であり、飽和又は不飽和であり、置換され又は置換されていなくてもよい。好ましくは炭水化物残基は、１個又は複数の糖残基を含む。
【００２９】
本明細書で使用される「糖残基」という句は、単糖、オリゴ糖、及び多糖を含めた糖部分の任意の残基を包含する。或いは、糖は、グルコシド、エーテル、エステル、酸、及びアミノ糖などであるがこれらに限定することのない、糖誘導体にすることができる。
【００３０】
単糖は、加水分解によってさらに分解することができない単一の糖分子からなる。単糖の例には、限定するものではないがペントースが含まれ、例えば限定するものではないがアラビノース、キシロース、及びリボースなどが含まれる。
【００３１】
オリゴ糖は、糖単位からなる鎖である。当技術分野及び本明細書で一般に定義されるように、オリゴ糖は、最大９個の糖単位からなる。オリゴ糖の例には、限定するものではないがスクロース、マルトース、ラクトース、及びセロビオースなどの二糖；限定するものではないがマンノトリオース、ラフィノース、及びメレジトースなどの三糖；及びアミロペクチンやＳｙａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ（ＳｉａＬｅｘ）などの四糖が含まれるが、これらに限定するものではない。
【００３２】
本明細書で使用される「多糖」という用語は、分子当たり少なくとも１０個の糖単位及び最大で数百さらには数千もの単糖単位からなる化合物であって、グリコシド結合によって１つに保持され且つその分子量が約５０００ダルトンから数百万ダルトンまでに及ぶものを指す。一般的な多糖単位の例には、限定するものではないが、デンプン、グリコーゲン、セルロース、アラビアガム、寒天、及びキチンが含まれる。
【００３３】
一実施形態では、炭水化物残基は糖残基であり、好ましくは単糖残基であり、より好ましくは５又は６員単糖残基であり、最も好ましくはリボシド残基である。最も好ましい実施形態では、Ｒ４がリボシド残基であり、したがって本発明によるプリン残基はプリンリボヌクレオチドと同様の構造、即ちＲＮＡの構成ブロックを有するようになるが、したがってＲＮＡ合成を妨げることができ、抗増殖作用を示すことができる。
【００３４】
本発明によるプリン残基は、ピリミジン環の様々な位置で、即ち２、６、又は８位で、ジスルフィド結合を介して上記で定義されたＹに結合していてもよい。
【００３５】
一実施形態では、プリン残基は、ジスルフィド結合を介してピリミジン環の６位でＹに結合し、即ちＲ２は共有結合である。
【００３６】
別の実施形態では、プリン残基は、ジスルフィド結合を介してピリミジン環の２位でＹに結合し、即ちＲ１は共有結合である。
【００３７】
他の実施形態では、プリン残基は、ジスルフィド結合を介してメルカプトプリンの８位でＹに結合し、即ちＲ３は共有結合である。
【００３８】
好ましい実施形態では、Ｒ２が共有結合であり、Ｒ１はＨ、ＳＨ、メチル、又はジメチルアミノであり、Ｒ３はＨ、ＳＨ、又はメチルであり、Ｒ４はＨ又は５員単糖残基であり、Ｙはアリル又はプロパルギルである。より好ましい実施形態では、Ｒ２が共有結合であり、Ｒ１及びＲ３はそれぞれＨであり、Ｒ４はＨ又はリボシド残基であり、Ｙはアリル又はプロパルギルである。
【００３９】
その他の好ましい実施形態では、Ｒ１が共有結合であり、Ｒ２はＨ、ＳＨ、メチル、又はジメチルアミノであり、Ｒ３はＨ、ＳＨ、又はメチルであり、Ｒ４はＨ又は５員単糖残基であり、Ｙはアリル又はプロパルギルである。より好ましい実施形態では、Ｒ１が共有結合であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれＨであり、Ｒ４はＨ又はリボシド残基であり、Ｙはアリル又はプロパルギルである。
【００４０】
他の好ましい実施形態では、Ｒ３が共有結合であり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、ＳＨ、メチル、又はジメチルアミノであり、Ｒ４はＨ又は５員単糖残基であり、Ｙはアリル又はプロパルギルである。より好ましい実施形態では、Ｒ３が共有結合であり、Ｒ１及びＲ２はそれぞれＨであり、Ｒ４はＨ又はリボシド残基であり、Ｙはアリル又はプロパルギルである。
【００４１】
最も好ましい実施形態では、本発明の化合物は６−メルカプトプリンから得られ、したがって、Ｒ２が共有結合の化合物である。これらの化合物の代表的な例には、限定するものではないが、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４がそれぞれＨであり、Ｙがアリルであり、即ち、本明細書ではＳＡ−６ＭＰとも省略されるＳ−アリルチオ−６−メルカプトプリンである化合物と；Ｒ１及びＲ３がそれぞれＨであり、Ｒ４がリボシドであり、Ｙがアリルであり、即ち、本明細書ではＳＡ−６ＭＰＲとも省略されるＳ−アリルチオ−６−メルカプトプリン９−リボシドである化合物とが含まれる（以下のスキーム１参照）。
【００４２】
アリシン、即ちニンニクから得られる生物学的に活性な化合物は、一かけらのニンニクを押し潰すことによって、したがって酵素アリイナーゼをその基質、アリイン（Ｓ−アリル−Ｌ−システインスルホキシド）に曝すことによって、生成される（Ｓｔｏｌｌ及びＳｅｅｂｅｃｋ、１９５１）。アリシンは、多くの健康上有益な効果をもたらすことが知られており、その中でも抗菌、抗真菌、及び抗寄生虫活性（Ｋｏｃｈ及びＬａｗｓｏｎ、１９９６）、抗高血圧活性（Ｅｌｋａｙａｍ他、２０００）、心血管系危険因子に対する治療的な効果（Ｅｉｌａｔ他、１９９５；Ａｂｒａｍｏｖｉｔｚ他、１９９９；Ｇｏｎｅｎ他、２００５）、抗炎症活性（Ｌａｎｇ他、２００４）、及び抗癌活性（Ｋｏｃｈ及びＬａｗｓｏｎ、１９９６；Ａｇａｒｗａｌ、１９９６；Ｈｉｒｓｃｈ他、２０００；Ｍｉｒｏｎ他、２００３；Ａｒｄｉｔｔｉ他、２００５）をもたらすことが知られている。
【００４３】
アリシンは、遊離チオール基と素早く反応して生体膜に容易に浸透する（Ｒａｂｉｎｋｏｖ他、１９９８、２０００；Ｍｉｒｏｎ他、２０００）寿命の短い化合物であり、したがって、種々の代謝経路に影響を及ぼす点で効果を発揮する（Ａｇａｒｗａｌ、１９９６）。しかし、アリシンは非常に不安定であるので、生体外でヒト血液中に投与した場合（Ｆｒｅｅｍａｎ及びＫｏｄｅｒａ、１９９５）と生体内でラットに投与した場合（Ｌａｃｈｍａｎｎ他、１９９４）との両方において、それらの投与から数分で、血液中で素早く分解し、したがってその治療効果は、胃腸管に近い標的に限定される。
【００４４】
先に開示したように、アリルメルカプトグルタチオン（ＧＳＳＡ）（Ｍｉｒｏｎ他、２０００；Ｒａｂｉｎｋｏｖ他、２０００）、Ｓ−アリルメルカプトシステイン（ＣＳＳＡ）、及びＳ−アリルメルカプトカプトプリル（ＣＰＳＳＡ）（Ｍｉｒｏｎ他、２００４）などのアリシン誘導体は、アリシンの場合と同様の抗酸化及びＳＨ−修飾活性を保有するが、より穏やかである。特に、Ｎ８７細胞（ヒト胃腺癌細胞系）及びＣＢ２（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）の１６時間のアリシン処理によって、用量に応答する手法でＤＮＡ合成及び細胞増殖が阻害され（Ｍｉｒｏｎ他、２００３）、且つアリシンがＢ−ＣＬＬ細胞にアポトーシスを誘発することが、開示された。
【００４５】
以下の実施例１に示されるように、ＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲは、以下のスキーム１に図示されるように、６−ＭＰ又は６−ＭＰＲをそれぞれ、水性溶媒中でアリシンと反応させることによって、容易に調製された。
【００４６】
反応は、穏やかな塩基性条件下、例えば７．２〜８．５の範囲の塩基性ｐＨを有する緩衝液の存在下で、行うことが好ましい。本発明の化合物を調製する方法は、さらに、得られた化合物を反応混合物から単離するステップと、任意選択で、知られている精製方法のいずれかによって、得られた化合物を精製するステップを含んでよい。実施例１で具体的に記述されるように、反応混合物からの化合物の単離は、反応混合物の冷却後に形成された沈殿物を収集することによって行われ；その沈殿物の収集は、水：エタノールの混合物からの再結晶によって行った。
【００４７】
本発明による化合物は、同じチオール化反応を行うのでアリシンのアセチレノ（プロパルギル）類似体、ジプロパルギルジチオスルフィネートから調製することもできる。
【００４８】
本発明の化合物はさらに、Ａｎｔｏｎｉｏｗ及びＷｉｔｔ（２００７）によって記述される、非対称ジスルフィドの調製に使用される任意のその他の調製方法によって調製してもよい。
【００４９】
スキーム１：６−ＭＰ及び６−ＭＰＲとのアリシン反応
【化２】
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【００５０】
実施例２に示されるように、ＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲの両方は、非常に効率的な抗増殖薬として作用することがわかった。具体的には、どちらの化合物も、非共役化合物、即ち６−ＭＰ、６−ＭＰＲ、及びアリシンの場合と同等か又は優れているＤＮＡ合成阻害効果を発揮することが、示された。さらに、これらの化合物で様々な癌細胞を治療する間、ＳＡ−６ＭＰで治療した細胞では、非共役メルカプトプリン６−ＭＰで治療した癌細胞に比べ、高い致死効果及びアポトーシスＢ−ＣＬＬ細胞のパーセンテージの著しい増加が観察された。Ｂ−ＣＬＬ細胞でアポトーシスを誘発する本発明の化合物の高い効力は、これらの化合物が、白血病を治療する治療薬として非常に効率的であることを示す。これらの化合物の治療効力は、さらに、様々な癌細胞の代謝活性の阻害によって示され、これは癌細胞範囲の約９０％であることがわかった。
【００５１】
まとめると、２種の新たな６−ＭＰ類似体、ＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲが、合成され特徴付けられた。いくつかの癌細胞系に対するこれら新たなプロドラッグの生物学的作用が評価され、ＸＴＴアッセイから得られたＩＣ５０値は、ＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲに対する細胞の脆弱性を示す。様々なタイプの白血病細胞は、新しい薬物に対して高い感受性を示したが、接着細胞系はそれほど感受性が無かった。
【００５２】
細胞の生存及び増殖に対するＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲの生物学的作用を、親反応体の場合と比較し、濃度依存性があることを見出した。ＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲは共に、試験をした全ての細胞系に対し、当初のプロドラッグの場合よりも強力な悪影響を発揮することがわかったが、ほとんどの細胞系において、ＳＡ−６ＭＰとＳＡ−６ＭＰＲの抗増殖活性の間には、ＳＡ−６ＭＰが有利であるが、ごく僅かな差があった。しかし、ＭＯＬＴ４及びジャーカット細胞は、試験がなされるその他の細胞系に比べ、６−ＭＰよりも６−ＭＰＲに対してより感受性があった。６−ＭＰ耐性ＭＯＬＴ４細胞がメチルメルカプトプリンリボシド（ｍｅＭＰＲ）に対して高い感受性を示し（Ｆｏｔｏｏｈｉ他、２００６）、ｍｅＭＰＲに関する明確な輸送経路及び６−ＭＰの場合のバイパスの存在が示唆されることを考慮すると、「逆転した」感受性に関する可能性ある説明は、６−ＭＰ耐性メカニズムに在ると考えられる。耐性細胞は、非耐性細胞に比べ、ｄｅ  ｎｏｖｏプリン合成に関わるいくつかのタンパク質をコード化するｍＲＮＡのレベル、並びにリボヌクレオシド三リン酸のレベルに関し、著しい低下を示した。
【００５３】
６−メルカプトプリン及びアリシンを組み合わせた活性は、各親化合物に比べて新たな誘導体の抗増殖能力を増大させるが、おそらくはアリシン分子の二重の効力によってアリシンの抗増殖活性を超えないと予測された可能性がある。しかし、６−ＭＰ及び６−ＭＰＲの抗増殖特性は改善された。
【００５４】
増大したＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲの効力は、親プロドラッグ、即ちそれぞれ６−ＭＰ及び６−ＭＰＲに比べ、３つの動作メカニズムに帰することができる：
（ｉ）両方の部分を組み合わせた性質、即ち、核酸合成を妨げるヌクレオチド類似体であるメルカプトプリンと、アリシンから得られたアリルメルカプト残基とを組み合わせた性質は、細胞内の少ないグルタチオン及びその他の不可欠な遊離ＳＨ基の欠乏を引き起こし、それによってアポトーシスをもたらす（Ｍｉｒｏｎ他、２００７）。両方の効果は、新しいプロドラッグによって発揮されることが示された；Ｄａｕｄｉ、Ｈｅｌａ、及びＮ８７細胞でのＤＮＡ合成の阻害と、アポトーシスＢ−ＣＬＬ細胞の数の増加；
（ｉｉ）新しいプロドラッグの、より高い疎水性によって、親分子に比べてより良好な細胞内へ浸透が可能になる。その結果、より大量の６−ＭＰ又は６−ＭＰＲが、グルタチオンとアリルチオ−プロドラッグとの間の細胞内反応から放出される；
（ｉｉｉ）６−ＭＰ及び６−ＭＰＲは遊離ＳＨを有し、これが酸化すると、Ｓ−Ｓ架橋によって接続された不活性ダイマー（プリン−Ｓ−Ｓ−プリン）を形成する（Ｇｏｙａｌ他、２００１）。不活性６−ＭＰダイマーは、確かに、６−ＭＰ処理細胞系の媒体中に見られたが、ＳＡ−６ＭＰ処理細胞の媒体中には見られなかった。チオプリン分子の一部のみがその活性形態で生ずるという事実は、高いプロドラッグ濃度が必要であることを説明している。新しい誘導体のアリルチオ部分は、遊離ＳＨをそのような酸化から保護する。細胞減少環境に進入した後に初めて、混合ジスルフィドＳＡ−６ＭＰが切断され、それによって、より低い濃度でより高い効率がもたらされた。提案された、細胞内でのＳＡ−６ＭＰと遊離チオールとの反応に関するメカニズムを、以下のスキーム２に示す。
【００５５】
試験がなされた全ての化合物の最も高い抗増殖活性は、アリシンによって生じた（Ｍｉｒｏｎ他、２００３、２００７；Ａｒｄｉｔｔｉ他、２００５）。原位置でのアリシン生成による目標とされた死滅は、複雑な手順であり（Ｍｉｒｏｎ他、２００３；Ａｒｄｉｔｔｉ他、２００５）、またその他の投与手段には欠点があるので、その６−ＭＰ及び６−ＭＰＲとの組合せは、現在のところ最も実現可能な処理である。
【００５６】
前述の事項に鑑み、本発明の化合物は、メルカプトプリンによって治療可能な病状の治療において、効率的に且つ有益に利用することができると結論付けられる。さらに、本発明の化合物が、ジスルフィド結合を介してアリル基に結合されたプリン残基である場合、本発明の化合物はさらに、アリシンによって治療可能な病状の治療で利用することができる。
【００５７】
スキーム２：ＳＡ−６ＭＰと遊離チオールとの反応に関して提案されたメカニズム
【化３】
2010520194.tif 000005
【００５８】
したがって別の態様では、本発明は、上記で定義された化合物、又は医薬品として許容されるその塩、及び医薬品として許容される担体を含む、医薬品組成物に関する。
【００５９】
メルカプトプリンによって治療可能な現在知られている病状の例には、限定するものではないが、増殖性疾患及び障害、特に白血病、炎症性疾患及び障害、皮膚疾患及び障害、免疫疾患及び障害が含まれる。アリシンによって治療可能であることが現在知られている病状の例には、限定するものではないが、心血管疾患及び心血管危険因子、高血圧、癌などの増殖性疾患及び障害、細菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、及び真菌感染が含まれる。
【００６０】
このように、一実施形態では、本発明の医薬品組成物は、増殖性疾患又は障害、炎症性疾患又は障害、皮膚疾患又は障害、或いは免疫疾患又は障害から選択された、疾患又は障害の治療のためのものである。そのような使用に好ましい化合物は、Ｒ２が共有結合であり、Ｒ１及びＲ３がそれぞれＨであり、Ｒ４がＨ又はリボシド残基であり、Ｙがアリルである化合物、即ちそれぞれＳＡ−６ＭＰ又はＳＡ−６ＭＰＲ、又は医薬品として許容されるその塩である。
【００６１】
本明細書で使用される「増殖性疾患又は障害」という用語は、増大した細胞増殖を特徴とする疾患又は障害を指す。本発明によって予防又は治療することができる細胞増殖状態には、例えば、癌などの悪性腫瘍及び良性腫瘍が含まれる。
【００６２】
本発明の化合物で治療することができる増殖性疾患又は障害は、多形性膠芽腫、未分化星状細胞腫、星状細胞腫、上衣腫、乏突起膠腫、髄芽腫、髄膜腫、肉腫、血管芽細胞腫、及び松果体実質腫などの脳腫瘍；メラノーマ及びカポジ肉腫などの皮膚癌；パピローマ、ブラストグリオーマ、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星状細胞腫、頭部癌、頚部癌、膀胱癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、及びバーキットリンパ腫などの癌でよい。
【００６３】
以下の実施例のセクションに示されるように、ＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲは共に、癌性血液細胞の成長を阻害し且つ／又は死滅させるのに非常に効果的であり、したがってこれらの化合物は、白血病の治療に特に効果的であることがわかった。
【００６４】
その他の非癌性増殖障害も、本発明の化合物を使用して治療可能である。そのような非癌性増殖障害には、例えば、狭窄、再狭窄、ステント内狭窄、血管移植片再狭窄、関節炎、リウマチ様関節炎、糖尿病性網膜症、血管形成、肺線維症、肝硬変、アテローム性動脈硬化症、糸球体腎炎、糖尿病性ネフロパシー、血栓性微小血管障害症候群、及び移植による拒絶反応が含まれる。
【００６５】
本発明の化合物で治療することができる炎症性疾患又は障害には、例えば、多発筋炎、敗血性／毒素性ショック、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、全身性エリテマトーデス、皮膚炎（接触過敏症）、腹膜炎症、遅延型過敏反応、再灌流障害、火傷、移植による拒絶反応、慢性炎症性疾患、出血性外傷性ショック、転移などが含まれる。特に、本明細書に記述される複合体は、クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、ベーチェット病、多発筋炎、ライター症候群、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、及び脈管炎を含むがこれらに限定することのない、慢性炎症性疾患及び障害の治療に有用である。
【００６６】
本発明の化合物で治療することができる皮膚疾患又は障害には、限定するものではないが、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、及びその他の湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、扁平苔癬、天疱瘡、類天疱瘡、表皮水疱症、蕁麻疹、血管性水腫、血管炎、紅斑、皮膚好酸球増加症、エリテマトーデス、及びにきびが含まれる。本明細書に記述される化合物は、特に、乾癬の治療に有用である。
【００６７】
本明細書で使用される「免疫疾患又は障害」という用語は、免疫反応、細胞性若しくは体液性の免疫反応、又はその両方の発生に伴い、且つ／又は免疫系に影響を及ぼす、任意の疾患又は障害を指す。免疫疾患及び障害の例には、炎症性疾患及び障害、アレルギー及び自己免疫疾患が含まれる。
【００６８】
免疫疾患の非限定的な例には、例えば多発性硬化、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）、異染性白質萎縮症、炎症性脱髄多発神経根障害、ペリツェウス−メルツバッハー病、及びギラン−バレー症候群など、中枢神経系の脱髄プロセスを特徴とする脱髄疾患が含まれる。
【００６９】
「自己免疫疾患」という用語は、一般に、罹患患者、例えば器官特異的自己免疫疾患（免疫応答は、例えば内分泌系、造血系、皮膚、心肺系、神経筋系、中枢神経系などを特に対象とする）、又は全身性自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、多発筋炎、移植による拒絶反応などの患者に通常は存在する抗原に対して、免疫応答が発生する免疫疾患を指す。本明細書に記述される化合物は、多発筋炎、全身性エリテマトーデス、又は臓器移植後の拒絶反応などの自己免疫疾患又は障害の治療に特に有用である。
【００７０】
本発明によって提供される医薬品組成物は、従来の技法によって、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、１９９５に記載されているものによって、調製することができる。組成物は、固体、半固体、又は液体の形でよく、さらに、医薬品として許容される充填剤、担体、又は希釈剤と、その他の不活性成分、及び賦形剤を含んでよい。さらに、医薬品組成物は、複合体を持続放出させるために設計することができる。組成物は、任意の適切な経路によって、例えば静脈内、経口、非経口、経直腸、又は経皮的に投与することができる。投薬量は、患者の状態に依存することになり、施術者によって適切であると見なされるように決定されることになる。
【００７１】
投与経路は、適切な又は所望の動作部位に活性化合物を効果的に輸送する任意の経路でよく、経口経路が好ましい。固体担体が経口投与に使用される場合、その製剤は、錠剤化してもよく、粉末若しくはペレットとして硬質ゼラチンカプセル内に入れてもよく、又はロゼンジの形にすることができる。液体担体を使用する場合、製剤は、シロップ、エマルジョン、又は軟質ゼラチンカプセルの形をとっても良い。タルク及び／又は炭水化物担体若しくは結合剤などを有する錠剤、糖衣丸、又はカプセルは、経口施用に特に適している。錠剤、糖衣丸、又はカプセルに好ましい担体には、ラクトース、コーンスターチ、及び／又はジャガイモデンプンが含まれる。
【００７２】
このように、さらに別の態様では、本発明は、増殖性疾患又は障害、炎症性疾患又は障害、皮膚疾患又は障害、或いは免疫疾患又は障害から選択された疾患又は障害を治療するための、上記で定義された化合物又は医薬品として許容されるその塩の使用に関する。
【００７３】
他の態様では、本発明は、増殖性疾患又は障害、炎症性疾患又は障害、皮膚疾患又は障害、或いは免疫疾患又は障害から選択された疾患又は障害を治療するための方法であって、上記で定義された化合物又は医薬品として許容されるその塩の治療有効量を、必要がある個体に投与するステップを含む方法を提供する。
【００７４】
本発明の方法で使用される好ましい化合物は、ＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲ、又は医薬品として許容されるその塩である。
【００７５】
次に本発明を、以下の非限定的な実施例により例示する。
【実施例】
【００７６】
材料及び方法
材料及び概略的方法
２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウムヒドロキシド（ＸＴＴ）、６−メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、ジューテロコロロホルム（ＣＤＣｌ３）、フェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）、及びプロピジウムヨウ素（ＰＩ）を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。［メチル−３Ｈ］チミジンは、Ａｍｅｒｓｈａｍ（ＵＫ）から購入した。
【００７７】
アリインを、前述のように合成した（Ｓｔｏｌｌ及びＳｅｅｂｅｃｋ、１９５１）。アリシンは、固定化したアリイナーゼカラムに合成アリインを付着させることによって生成し（Ｍｉｒｏｎ他、２００６）、濃度を前述のようにＨＰＬＣによって決定した（Ｍｉｒｏｎ他、２００２）。２−ニトロ５−チオ−安息香酸（ＮＴＢ）を、前述のように調製した（Ｍｉｒｏｎ他、１９９８）。
【００７８】
質量スペクトルを、ＥＳＩ−Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅを使用して、下記の条件でＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ＬＣＺ  ４０００  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｍｅｎｔで記録した：サンプルを５μｌ／分で直接注入し、窒素流を３６０リットル／時に維持し；使用した毛管は４．１６ＫＶであり；コーン電圧は４３Ｖ、抽出器電圧は４Ｖであり；ソースブロック温度は１００℃に維持し、脱溶媒温度は１５０℃に維持し；ＬＭ  ＲＥＳ  １４．４；ＨＭ  ＲＥＳ  １４．４；及びイオンエネルギー０．５であった。ＮＭＲ実験は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ−５００分光計で行った。ＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲを、約５〜１０ｍＭでＣＤＣｌ３に溶解した。これらの完全な割当ては、１Ｄ（１Ｈ、１３Ｃ、ＤＥＰＴ）及び２Ｄ（ｇｓ−ＣＯＳＹ、ｇｓ−ＨＳＱＣ）ＮＭＲ実験の組合せを使用して決定した。６−ＭＰ誘導体のＨＰＬＣ分析は、流量が０．５５ｍｌ／分である０．０１％のトリフルオロ酢酸を含有する水に溶かしたメタノール（６０％）を使用して、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ−１８（７μｍ）カラムで行い、その吸光度を２１０ｎｍで検出した。純粋なＳ−アリルチオ−６−メルカプトプリン誘導体の濃度も、４１２ｎｍでεＭ１４１５０Ｍ−１ｃｍ−１を使用して、ＮＴＢにより決定した（Ｍｉｒｏｎ他、１９９８）。
【００７９】
細胞培養、細胞生存、及びアポトーシスアッセイ
以下の細胞系を使用した：Ｎ８７、ヒト胃腺癌細胞系；Ｈｅｌａ  ＨｔＴＡ−１細胞、ヒト頚癌細胞系、結腸ＨｔＴＡ−１（Ｇｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ、１９９２）及びＭＤＲ  ＨＴ−２９、ヒト結腸腺癌細胞系。これらの細胞を、抗生物質及び１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）が補われたＤｕｌｂｅｃｃｏ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用して単層に成長させ；その他の細胞全てを懸濁液中で成長させ；その中でも、確立された細胞系は、ＨＬ６０、ヒト白血球前骨髄球性白血病；Ｕ９３７、ヒト骨髄単核細胞：ＭＯＬＴ４、急性リンパ芽球性白血病から得られたＴ−リンパ芽球性細胞系；Ｊｕｒｋａｔ、ヒトＴ細胞、リンパ芽球様細胞；Ｄａｕｄｉ、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫から得られたＢ−リンパ芽球様細胞系などである。Ｂ−ＣＬＬ、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、書面による同意書によるＲａｉステージＩＶの患者から引き出された、ヘパリン化全血から得た。血液細胞を、フィコール密度勾配遠心分離にかけ、単核細胞を所望の濃度に希釈した。懸濁液中の細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、抗生物質、及び１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）が補われたＲＰＭＩ−１６４０中で維持した。
【００８０】
細胞増殖を、生細胞による可溶生ホルマザン化合物へのテトラゾリウム塩の還元に基づき、９６ウェルプレートで、ＸＴＴ生死判別試験によって決定した。細胞（１００００〜１５０００細胞／ウェル）を、９６ウェルプレートに播いた。様々な濃度の６−ＭＰ、６−ＭＰＲ、及びそれらのＳ−アリルチオ誘導体と共に１６時間インキュベーションした後、５０μｌのＸＴＴ／ＰＭＳ混合物（５０μＭ  ＰＭＳ、０．１％ＸＴＴ、培地中）を細胞に添加した。３７℃で３〜４時間インキュベーションした後、サンプルの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダで４５０ｎｍで測定した。ＸＴＴ／ＰＭＳ溶液を添加する前に、ＳＤＳ（１％、１０μｌ／ウェル）を参照ウェルに添加した。
【００８１】
ＤＮＡ合成に対する６−ＭＰの影響を、ＤＮＡへの［メチル−３Ｈ］チミジンの組込みによって評価した。細胞を用いた実験の全ては、少なくとも３回ずつ実施した。接着細胞（Ｎ８７、Ｈｅｌａ  ＨｔＴＡ−１、及びＭＤＲ  ＨＴ−２９）を、１００００細胞／ウェル（９６ウェルプレート）又は６００００細胞／ウェル（２４ウェルプレート）で播いた。懸濁液中の細胞（Ｂ−ＣＬＬ、Ｄａｕｄｉ、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＯＬＴ４、及びＵ９３７細胞）を、１５０００細胞／ウェル（９６ウェルプレート）又は１０００００細胞／ウェル（２４ウェルプレート）で播いた。接着細胞を、播いた後に３７℃で６時間成長させ、その後、処理した。［メチル−３Ｈ］チミジンの組込みの評価のために、細胞を、様々な濃度の６−ＭＰ誘導体で、３７℃で１６時間、［メチル−３Ｈ］チミジン（０．８〜１．０μＣｉ／ウェル）の存在下で処理した。次いで、プレートを凍結させた（−２０℃、１時間）。接着細胞を、収集する前にトリプシン処理した。懸濁液中の細胞は、凍結細胞を解凍した後に直接収集した。
【００８２】
種々の濃度の６−ＭＰ誘導体で処理した（１６時間、３７℃）Ｂ−ＣＬＬ細胞でのアポトーシス分析は、ＦＡＣＳ分析によって行った。Ｂ−ＣＬＬ細胞を、ＦＩＴＣ−ＣＤ１９抗ヒト抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）と共に、４℃で２０分間インキュベートした。結合していない抗体を洗い落とした後、サンプルを、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２（ＨＢＳ）を含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４緩衝液中で、５μｌのアネキシン−Ｃｙ５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）と共に、室温で１０分間インキュベートした。その後、結合していないアネキシンを洗い落とし、サンプルを、ＦＡＣＳアナライザ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用して分析した。リンパ球をカウントし、前方及び側方散乱でそれらのサイズに応じてゲート制御した。
【００８３】
細胞死は、トリパンブルー染料排除試験又はピロピジウムヨウ素（ＰＩ）の組込みによってモニタした。処理した細胞を、ＰＩ（２μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で２０分間インキュベートし、ＨＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で検査し、蛍光活性化細胞分別を使用するフローサイトメトリーで分析した（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用する、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）。単層細胞をトリプシン処理し、ＨＢＳで洗浄した後に、ＦＡＣＳ分析を行った。
【００８４】
統計分析
生存及び増殖の結果を、平均値±ＳＤ（ｎ＝３〜６）として表した。各細胞系ごとに、その結果を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、その後、ボンフェローニ事後試験を使用して、使用した薬物の因子及びそれらの様々な濃度に関して分析し、ｐ＜０．０５を有意と見なした。ＩＣ５０値（平均±ＳＥＭ）を、薬物濃度に対する生存度曲線の線形範囲から得た（ＸＴＴアッセイ）。
【００８５】
（実施例１）
Ｓ−アリルチオ−６−メルカプトプリン（ＳＡ−６ＭＰ）及びＳ−アリルチオ−６−メルカプトプリン９−リボシド（ＳＡ−６ＭＰＲ）の合成
Ｓ−アリルチオ−６−メルカプトプリン（ＳＡ−６ＭＰ）を、上述のスキーム１に示したように、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）及びアリシンを反応させることによって調製した。６−ＭＰ（１ミリモル）をエタノール（１００ｍｌ）に溶かした溶液を、室温で、アリシン（０．５５ミリモル）の水溶液（５５ｍｌ）に添加した。ｐＨを、０．０２５Ｍまで（最終濃度）の固体のＮａＨＣＯ３を使用して、８．０〜８．４に調節した。反応速度を、６−ＭＰがもはや検出されなくなるまで（約１０時間）ＨＰＬＣ分析によってモニタした。エタノールを回転蒸発によって一部除去し、僅かに濁った溶液を４℃で保存した。結晶化した生成物、ＳＡ−６ＭＰを、濾過によって収集し、冷水で洗浄し、乾燥した。濾液からエタノールを除去した後に、２回目の収集を行い、４℃で保存して沈殿させた。全体的な収率は８０％であった。沈殿物をエタノール中に再度溶解し、水を添加した後に、再結晶を行った。
【００８６】
Ｓ−アリルチオ−６−メルカプトプリン９−リボシド（ＳＡ−６ＭＰＲ）を、上述のスキーム１に示したように、６−メルカプトプリンリボシド（６−ＭＰＲ）及びアリシンを反応させることによって調製した。６−ＭＰＲ（０．６ミリモル）を０．０４Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（４０ｍｌ）に溶かした溶液を、アリシン（０．３５ミリモル）を５０％エタノール（１０ｍｌ）の溶かした溶液に、室温で添加した。反応を４時間進行させ、４℃で保存した。反応速度をＨＰＬＣ分析によりモニタした。生成物である白色沈殿物を濾過によって収集した。２回目の収集は、エタノールの除去後に行い、４℃で保存した。全体的な収率は８５％であった。再結晶を、上述の通り行った。
【００８７】
ＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲの合成は、質量分析（エレクトロスプレーイオン化、ＥＳＩ）及びＮＭＲによって確認した。ＳＡ−６ＭＰ（分子量２２４）は、オフホワイトの結晶であり、エタノール中２８３ｎｍで最大吸光度を示しており、ＥＭ２８３は１３７８０Ｍ−１ｃｍ−１であった。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ（％）＝［Ｍ＋Ｈ］＋＝２２５．２（４０）；ＤＭＳＯ＝７９（１００）。ＳＡ−６ＭＰＲは、白色結晶として現れ（ＥＳＩ−ＭＳ：分子量３５６）、エタノール中での２８４ｎｍ  ＥＭ２８４でのその最大吸光度は、１４２４０Ｍ−１ｃｍ−１であった。ＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲのＨＰＬＣ滞留時間は、図１Ａから１Ｂに示されるようにそれぞれ８．７及び７．３分であった。ＮＭＲ分析を、以下の表１に示す。ＣｌｏｇＰ値（疎水性分配係数）は、６−ＭＰ：０．８２３；ＳＡ−６ＭＰ：１．３４４；６−ＭＰＲ：−１．１９１；ＳＡ−６ＭＰＲ０．９０であった。
【００８８】
表１：ＣＤＣｌ３におけるＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲの１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ化学シフト
【表１】
2010520194.tif 000006
【００８９】
（実施例２）
細胞系におけるＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲの生物活性
様々な細胞系に対する６−ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰの抗増殖効果を、ＤＮＡ内への［３Ｈ］チミジンの組込みを決定することによって評価した。０〜２００μＭの６−ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰを、材料及び方法で記述したように、［３Ｈ］チミジンの存在下、９６ウェルプレートで培養したＤａｕｄｉ、Ｈｅｌａ、及びＮ８７細胞に添加した。図２Ａ〜２Ｃに示されるように、ＳＡ−６ＭＰは、６−ＭＰよりも非常に高い効力でＤＮＡ合成を阻害し、試験が成された全ての細胞系では、処理によって、細胞増殖の用量依存性阻害をもたらした。さらに示されるように、プロドラッグの感受性は、細胞型依存性である。したがって、ＳＡ−６ＭＰで処理したＤａｕｄｉ細胞では、Ｎ８７細胞での１００μＭ及びＨｅｌａ細胞での１１０μＭに比べ、５０％の阻害が約２０μＭで観察された。６−ＭＰは、同じ濃度では増殖阻害を引き起こさなかった。
【００９０】
並行して、細胞死を評価するために、トリパンブルー染料排除試験を使用した。特に、種々の濃度の６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰを、材料及び方法で記述したように、様々な細胞培養物（Ｄａｕｄｉ及びＨｅｌａ細胞、それぞれ３００００細胞／ウェル）に添加した。細胞をトリパンブルーで染色して、いくつかの濃度の試験済み複合体の致死効果を、死細胞のパーセンテージとしてモニタした。図３Ａ〜３Ｄに示されるように、６−ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰによって誘発される細胞死は、共に濃度及び細胞型依存性であった。特に、ＭＤＲ  ＨＴ−２９及びＨｅｌａ細胞などの単層細胞系は、１００μＭで１６時間にわたる６−ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰ処理に対してほとんど非感受性であり；しかし、１５０μＭ  ＳＡ−６ＭＰで処理した両方の細胞培養物は、未処理の細胞に比べて低い生存度を示し、それぞれ４０％及び６５％であった（それぞれ、図３Ａ〜３Ｂ参照）。２００μＭの６−ＭＰによるＨｅｌａ細胞の処理は、僅かに低下した生存度（７５％）をもたらした。５０μＭのＳＡ−６ＭＰで処理したＤａｕｄｉ細胞では、１６時間後の残留生存度が約２０％であったのに対し、１００μＭよりも高い濃度の６−ＭＰは、細胞生存度に対して有意な効果は示さなかった（図３Ｃ）。Ｂ−ＣＬＬ細胞は、６−ＭＰ処理（１００〜２００μＭ）に対してほとんど非感受性であった。１５０μＭよりも高い濃度のＳＡ−６ＭＰは、残留生存度を７５％まで低下させた（図３Ｄ）。
【００９１】
多剤耐性細胞系に対する６−ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰの毒性効果を決定するために、ＭＤＲ  ＨＴ−２９細胞を、１６時間にわたり１５０μＭの６−ＭＰ又はＳＡ−６ＭＰで、１６時間処理し、次いでＰＩで染色した。図４の上部パネルに示される位相差顕微鏡法から観察することができるように、上皮様成長は、ＳＡ−６ＭＰで処理された細胞において阻害され、それに対して６−ＭＰ処理に関しては、阻害が観察されなかった。この発見は、図４の下部パネルで示される、ＰＩで染色された細胞の蛍光顕微鏡法によってさらに裏付けられ、阻害が細胞死をもたらすことを示した。
【００９２】
６−ＭＰ又はＳＡ−６ＭＰの存在下でインキュベーションした後の、Ｂ−ＣＬＬヒト抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）の生存度の僅かな低下について、さらに調査した。アポトーシスを受ける細胞をモニタするために、材料及び方法で述べたように、Ｂ−ＣＬＬ細胞を様々な濃度の６−ＭＰ又はＳＡ−６ＭＰで処理し且つフローサイトメトリー分析にかけた。選別によれば、０〜１５０μＭの間の範囲の６−ＭＰで１６時間処理したアポトーシス細胞のパーセント数に有意な増加はなく（図５Ａ〜５Ｄ）；しかし、５０及び１００μＭ  ＳＡ−６ＭＰで処理した場合、アポトーシス細胞のパーセント数は、それぞれ３８及び９５％に増加した（図５Ｅ〜５Ｆ）。
【００９３】
図６Ａ〜６Ｂに示されるように、６−ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰによってＢ−ＣＬＬ中で誘発されたアポトーシス（アネキシンによるＦＡＣＳ分析）及び細胞死（トリパンブルー試験）は、同時に生じなかった。
【００９４】
Ｄａｕｄｉ白血病及び単層Ｎ８７細胞に対する様々なプロドラッグの阻害効果を比較した。細胞を、９６ウェルプレートに播き、次いで０〜１５０μＭの６ＭＰ、６ＭＰＲ、ＳＡ−６ＭＰ、又はＳＡ−６ＭＰＲと共に、３７℃で１６時間インキュベートした。ＸＴＴを、３７℃で３時間にわたりウェルに添加した。細胞生存度を、材料及び方法で述べたように、ＥＬＩＳＡリーダを使用して、４５０ｎｍでモニタした。
【００９５】
図７Ａ〜７Ｂに示されるように、６−ＭＰ又は６−ＭＰＲ（０〜１００μＭ）の存在下で成長させたＤａｕｄｉ細胞及びＮ８７細胞は、細胞増殖の有意な損失が無いことを示した。僅かに低下した増殖が、１５０μＭでＮ８７細胞に関して観察された（６−ＭＰ約８０％；６−ＭＰＲ約７５％、ｐ＜０．０５）。６−ＭＰ及び６−ＭＰＲとは対照的に、ＳＡ−６ＭＰは、Ｄａｕｄｉ細胞に対して非常に強力な抗増殖効果を有しており、その増殖を、５０μＭで１５〜３０％に低下させた。同じ濃度で処理したＮ８７細胞では、残留増殖が５０〜６０％であった。５０又は１００μＭのＳＡ−６ＭＰＲで処理したＤａｕｄｉ細胞の残留増殖は、それぞれ６０％及び２５％であり、それに対して５０又は１００μＭのＳＡ−６ＭＰＲで処理したＮ８７細胞では、残留生存度がそれぞれ約７０％及び５５％であった。１５０μＭのＳＡ−６ＭＰＲで処理したＮ８７細胞の増殖には、完全な損失があった。
【００９６】
細胞増殖に対する６−ＭＰ、６−ＭＰＲ、ＳＡ−６ＭＰ、及びＳＡ−６ＭＰＲの濃度効果（ＩＣ５０値）を使用して、様々な細胞系での種々の薬物の効力について評価した。具体的には、懸濁液中の細胞、即ちＤａｕｄｉ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、Ｍｏｌｔ−４、Ｊｕｒｋａｔ、及びＢ−ＣＬＬを、０〜１００μＭのプロドラッグ濃度で試験し、単層細胞、即ちＨｅｌａ  ＨｔＴＡ−１、ＭＤＲ  ＨＴ−２９、及びＮ８７は、０〜２００μＭのプロドラッグ濃度で試験した。どちらの場合も、細胞生存度は、トリパンブルー染料排除アッセイにより決定した。１６時間６−ＭＰ誘導体で処理したものに関するデータを、以下の表２に示す。
【００９７】
表２：癌細胞系における様々な６−ＭＰ誘導体の抗増殖濃度
【表２】
2010520194.tif 000007
ａ生存度の変化は検出されず
ｂ処理済み細胞の生存度は未処理よりも増加（＋２０％）
ｃ決定されず
【００９８】
表２に示されるように、新しい誘導体、ＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲは、細胞毒性の誘導に際し、親薬物、６−ＭＰ、６−ＭＰＲよりもさらにより効果的であることがわかった。さらに、ＳＡ−６ＭＰは、ＳＡ−６ＭＰＲよりも良好な薬剤であった。特に、処理が成された白血病細胞系の中で、最も感受性が高いのはＭｏｌｔ−４細胞系であった。いずれもＴ細胞白血病細胞系であるＭｏｌｔ−４及びＪｕｒｋａｔ細胞は、試験をしたその他の細胞系に比べ、６ＭＰよりも６−ＭＰＲに対してより感受性あがることは、注目すべきことである。ＳＡ−６ＭＰ又はＳＡ−６ＭＰＲでの処理に対する白血病細胞系Ｄａｕｄｉ、ＨＬ−６０、及びＵ９３７の感受性は、類似していた。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＢ−ＣＬＬ細胞は、この処理に対して非常に耐性があった。それにも関わらず、ＦＡＣＳの結果は、進行中のアポトーシスプロセスを示しており（図５Ｅ〜５Ｆ）、より長いインキュベーション時間によって細胞死をもたらすことができることを示唆している。試験をした単層細胞系は、懸濁液中の細胞よりも、ＳＡ−６ＭＰ及びＳＡ−６ＭＰＲに対してそれほど感受性は高くない。
【００９９】
表２に示されるように、試験をした細胞系のほとんどに関して計算された６−ＭＰのＩＣ５０は、薬物に１６時間曝したとき、２００μＭよりも高かった。これは、ｎＭ範囲で報告されたその他の結果に比べ、むしろ高い濃度であるように見えた。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＴ−細胞マイトジェン誘導芽球化に対する６−ＭＰの生体外効果を示す、Ｓｕｇｉｙａｍａ他（２００３）によって先に開示されたように、アザチオプリン（ＡＺ）又は６−ＭＰで処理した４日後のＩＣ５０値は、それぞれ２３０．４±２３１．３及び１４９．５±１２４．９であった。その研究の処理済みの細胞は、この場合に使用されたものとは異なり、したがって曝された時間も異なるので、Ｓｕｇｉｙａｍａ他によって開示された結果を表２に示される結果と比較することは不可能である。しかし、Ｂ−ＣＬＬ細胞をアリシンで４８時間処理したとき、アリシン誘導アポトーシスに関して計算されたＩＣ５０は２０ｎＭであり、それに対して１６時間だけアリシンに曝した結果、約１０００倍高いＩＣ５０が得られた（Ａｒｄｉｔｔｉ他、２００５、図１）。
【０１００】
（実施例３）
大腸炎の処理におけるメルカプトプリン誘導体の効力
この実験では、本発明の化合物の抗炎症活性を、大腸炎のモデルとして結腸の慢性炎症が誘発されたマウスを使用して生体内で試験した。具体的には、慢性炎症を、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の直腸内投与（８０ｍｇ／ｋｇ体重、０．９％ＮａＣｌ中に溶解、３０μｌ／マウス）によって、又はデキストランナトリウムスルフェート（ＤＳＳ、２％ｗ／ｖ）を飲料水に溶かして５日間投与することによって誘発させる。
【０１０１】
マウスを、様々な量の６−ＭＰ若しくは本発明の化合物で、又は対照ビヒクルで処理し、炎症の発症は、大腸炎の誘導後７〜１３日で生じた。大腸炎の発症は、体重及び便の硬さを測定することによって、毎日評価する。実験の終わりに、マウスを頚椎脱臼によって犠牲にする。結腸の長さ及び組織学的パラメータを使用して、様々な治療の効力を評価する。肉眼的病変分析を、前述のように行う（Ｗａｌｌａｃｅ他、１９８９）。
（参考文献）
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2010520194.tif 000009
2010520194.tif 000010
【図１Ａ】
2010520194.tif 000012
【図１Ｂ】
2010520194.tif 000013
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2010520194.tif 000015
【図２Ｃ】
2010520194.tif 000016
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2010520194.tif 000018
【図３Ｃ】
2010520194.tif 000019
【図３Ｄ】
2010520194.tif 000020
【図４】
2010520194.tif 000021
【図５Ａ】
2010520194.tif 000022
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2010520194.tif 000029
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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