(57)【要約】本発明は、補体因子Ｈ由来のショートコンセンサスリピート（ｆＨ由来のＳＣＲ）及び病原菌を特異的に認識する結合分子を含む、補体活性化構築物に関する。より具体的には、ｆＨ由来のＳＣＲは、ＳＣＲ７、ＳＣＲ９、ＳＣＲ１３、ＳＣＲ１８〜２０及び人工ＳＣＲ（ａＳＣＲ）からなる群より選択される。さらに、病原菌の感染又は病原菌の感染に関連する病的状態の予防、治療又は改善の処置のための補体に基づくアプローチをスクリーニングするためのインビボ法が記載される。
2010526528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）補体因子Ｈ由来ショートコンセンサスリピート（ｆＨ由来のＳＣＲ）；および
（ｂ）病原菌を特異的に認識する結合分子
を含み、前記ｆＨ由来ＳＣＲがヘパリンに結合可能なポリペプチドを含む、ショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項２】
前記ｆＨ由来ＳＣＲが、ＳＣＲ７、ＳＣＲ９、ＳＣＲ１３及びＳＣＲ１８〜２０、又は前記ｆＨ由来ＳＣＲ７、ＳＣＲ９、ＳＣＲ１３及びＳＣＲ１８〜２０の機能性フラグメントからなる群より選択されるか、或いは人工ＳＣＲ（ａＳＣＲ）である、請求項１に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項３】
前記病原菌が、ウイルス又は細菌である、請求項１又は２に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項４】
前記ウイルスが、二本鎖ＤＮＡウイルス、一本鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルス、マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルス、逆転写ＲＮＡウイルス及び逆転写ＤＮＡウイルスからなる群より選択される、請求項３に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項５】
前記二本鎖ＤＮＡウイルスが、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ロゼオロウイルス、ヒトヘルペスウイルス７型及びカポジ肉腫関連ウイルスからなる群より選択される、請求項４に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項６】
前記プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスが、コロナウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス及びダニ媒介性脳炎ウイルスからなる群より選択される、請求項４に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項７】
前記マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスが、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、狂犬病ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス及びリンパ性脈絡髄膜炎ウイルスからなる群より選択される、請求項４に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項８】
前記逆転写ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである、請求項４に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項９】
前記レトロウイルスが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）；マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）；フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＶ）；ネコ白血病ウイルス；ネコ肉腫ウイルス；ウシ白血病ウイルス；ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）；ウシ免疫不全ウイルス；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）及びスプーマウイルスからなる群より選択される、請求項８に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項１０】
前記逆転写ＤＮＡウイルスがＢ型肝炎ウイルスである、請求項４に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項１１】
前記結合分子が、抗体分子、レセプター分子、アプタマー又はＤＡＲＰｉｎ或いはそれらのリガンド結合フラグメントを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項１２】
前記抗体分子が、
（ａ）前記病原菌がＣ型肝炎ウイルスであり、表１に記載されるクローンＨＣＶ−ＡＢ  ６８；
（ｂ）前記病原菌が黄熱病ウイルスであり、表１に記載されるクローン２Ｄ１２；
（ｃ）前記病原菌がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、表１に記載されるクローン２Ｆ５、２Ｇ１２、３Ｄ６、４Ｅ１０  ＩｇＧ１又は４Ｅ１０  ＩｇＧ３；
（ｄ）前記病原菌がフレンドマウス白血病ウイルス（ＦＶ）あり、表１に記載されるクローン＃４８；
（ｅ）前記病原菌が麻疹ウイルスであり、表１に記載されるクローンＨＡ  ｃｌ．５５；
（ｆ）前記病原菌が狂犬病ウイルスであり、表１に記載されるクローンｍＡｂ  ５７；
（ｇ）前記病原菌がエプスタイン・バーウイルスであり、表１に記載されるクローン７２Ａ１；及び
（ｈ）前記病原菌がＣ型肝炎ウイルスであり、表１に記載されるクローンＨ２５Ｂ１０
からなる群より選択されるモノクローナル抗体である、請求項１１に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項１３】
前記レセプター分子が、ＣＤ４レセプターである、請求項１１に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項１４】
前記補体因子Ｈ由来ショートコンセンサスリピート（ｆＨ由来ＳＣＲ）と前記結合分子が共有結合又は非共有結合している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項１５】
前記補体因子Ｈ由来ショートコンセンサスリピート（ｆＨ由来ＳＣＲ）及び前記結合分子が一本鎖多機能ポリペプチドに含まれる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項１６】
前記ｆＨ由来ＳＣＲが、
（ａ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０又は配列番号３２に含まれるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチド或いはそれらの機能性フラグメント；
（ｂ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０又は配列番号３２に含まれるアミノ酸配列と少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチドであって、前記ポリペプチドが前記病原菌の補体因子Ｈ結合部位に結合する能力がある、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９又は配列番号３１に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド或いはそれらの機能性フラグメント；
（ｄ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９又は配列番号３１に含まれるポリヌクレオチドとハイブリダイズすることの可能なポリヌクレオチドの相補的配列によりコードされるポリペプチドであって、前記ポリペプチドが前記病原菌の補体因子Ｈ結合部位に結合する能力がある、ポリペプチド；並びに
（ｅ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９又は配列番号３１に含まれる核酸配列に少なくとも６０％同一である核酸分子によりコードされるポリペプチドであって、前記ポリペプチドが前記病原菌の補体因子Ｈ結合部位に結合する能力がある、ポリペプチド：
からなる群より選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項１７】
前記ｆＨ由来ＳＣＲが、配列番号４又は配列番号２２に含まれるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチド或いはそれらの機能性フラグメントを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載のポリヌクレオチド又は請求項１９に記載のベクターをトランスフェクトされた細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載の細胞を培養すること、及び前記ポリペプチドを培養物から単離することを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）の調製のための方法。
【請求項２２】
前記ｆＨ由来ＳＣＲと前記結合分子をカップリングすることを含む、請求項１〜の１７いずれか一項に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）の調製のための方法。
【請求項２３】
前記ｆＨ由来ＳＣＲが、スルホスクシンイミジル  ４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート（スルホ−ＳＭＰＢ）化学架橋を用いて前記結合分子とカップリングされている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｆＨ由来のＳＣＲが、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を形成することにより、又は抗体−抗原複合体を形成することにより前記結合分子と結合している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）を含む組成物。
【請求項２６】
所望により、医薬品として許容される担体をさらに含む医薬組成物である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
所望により、適切な検出手段をさらに含む診断用組成物である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
病原菌の感染又は病原菌の感染に関連する病的状態の予防、治療又は改善のための医薬組成物の調製のための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）の使用。
【請求項２９】
病原菌の感染又は病原菌の感染に関連する病的状態の予防、治療又は改善のための医薬組成物として使用するための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【請求項３０】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）又は請求項２５又は２６に記載の組成物をこのような予防又は治療を必要とする哺乳類に投与することを含む、病原菌の感染又は病原菌の感染に関連する病的状態の予防、治療又は改善のための方法。
【請求項３１】
前記哺乳類がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記病原菌が、ウイルス又は細菌である、請求項２８に記載の使用、請求項２９に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物或いは請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ウイルスが、二本鎖ＤＮＡウイルス；一本鎖ＤＮＡウイルス；二本鎖ＲＮＡウイルス；プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルス；マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルス；逆転写ＲＮＡウイルス；及び逆転写ＤＮＡウイルスからなる群より選択される、請求項３２に記載の使用、ショートコンセンサスリピート−抗体構築物又は方法。
【請求項３４】
前記二本鎖ＤＮＡウイルスが、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ロゼオロウイルス、ヒトヘルペスウイルス７型及びカポジ肉腫関連ウイルスからなる群より選択される、請求項３３に記載の使用、ショートコンセンサスリピート−抗体構築物又は方法。
【請求項３５】
前記プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスが、コロナウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス及びダニ媒介性脳炎ウイルスからなる群より選択される、請求項３３に記載の使用、ショートコンセンサスリピート−抗体構築物又は方法。
【請求項３６】
前記マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスが、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、狂犬病ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス及びリンパ性脈絡髄膜炎ウイルスからなる群より選択される、請求項３３に記載の使用、ショートコンセンサスリピート−抗体構築物又は方法。
【請求項３７】
前記逆転写ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである、請求項３３に記載の使用、ショートコンセンサスリピート−抗体構築物又は方法。
【請求項３８】
前記レトロウイルスが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）；マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）；フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＶ）；ネコ白血病ウイルス；ネコ肉腫ウイルス；ウシ白血病ウイルス；ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）；ウシ免疫不全ウイルス；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；及びスプーマウイルスからなる群より選択される、請求項３７に記載の使用、ショートコンセンサスリピート−抗体構築物又は方法。
【請求項３９】
前記逆転写ＤＮＡウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルスである、請求項３３に記載の使用、ショートコンセンサスリピート−抗体構築物又は方法。
【請求項４０】
前記ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項２８に記載の使用、請求項２９に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物或いは請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項４１】
病原菌の感染に関連する前記病的状態が、後天性免疫不全症状群（ＡＩＤＳ）、重度急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、Ｃ型肝炎感染症及びインフルエンザからなる群より選択される、請求項２８に記載の使用、請求項２９に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物或いは請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、請求項１９に記載のベクター又は請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補体因子Ｈ由来のショートコンセンサスリピート（ｆＨ由来ＳＣＲ）及び病原菌を特異的に認識する結合分子を含む補体活性化構築物に関する。より具体的には、ｆＨ由来ＳＣＲは、ＳＣＲ７、ＳＣＲ９、ＳＣＲ１３、ＳＣＲ１８〜２０及び人工ＳＣＲ（ａＳＣＲ）からなる群より選択される。さらに、病原菌の感染又は病原菌の感染に関連する病的状態の予防、治療又は改善の処置のための、補体に基づくアプローチをスクリーニングするためのインビボ法が記載される。
【背景技術】
【０００２】
動物ウイルス、例えば動物ＲＮＡウイルスなどは、ヒト血清により不活化されて溶解することができる（Takeuchi (1994) J Virol. 68: 8001-7; Cooper (1976) J Exp Med. 144: 970-84; Bartholomew (1978) J Immunol. 121: 1748-51; Bartholomew (1978) J Exp Med. 147: 844-53; Sherwin (1978) Int J Cancer. 21(1): 6-11; Jensen (1979) Hamatol Bluttransfus. 23: 501-3; Kobilinsky (1980) Infect Immun. 29(1): 165-70); Dierich (1996): 「Immunology of HIV infection」, 編者: S. Gupta, New York, Plenum Press, 365-376を参照のこと）。この中和化特性は、ヒト補体に媒介される。また、ヒトレトロウイルス、例えばヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などはこの補体系を活性化させる。これらのウイルスは、感染の急性期の間に既に古典的経路を誘発し、その結果Ｃ３フラグメントのウイルス表面への沈着をもたらす（Ebenbichler (1991) J Exp Med. 174: 1417-24; Stoiber (2001) Immunol Reviews 180:168-76; Saifuddin (1995) AIDS Res Hum Retroviruses 11: 1115-22; Stoiber (1997) Annu Rev Immunol. 15: 649-674）。
【０００３】
動物血清により不活化されるとはいえ、ＨＴＬＶ又はＨＩＶによる補体カスケードの活性化は、ヒト血清でインキュベートすると部分的なウイルス溶解(virolysis)しかもたらさないようである（Stoiber (1997) 前掲; Sullivan (1996) J Immunol 157: 1791-1798; Dierich (1996) Nature Med 2: 153-155）。ヒト補体に対するこの内在的な抵抗の原因は、宿主細胞由来のタンパク質であり、これは出芽過程の間にＨＩＶにより獲得される（Frank (1996) AIDS 10: 1611-20）。これらには、補体活性化のレギュレーター（ＲＣＡ）、例えば補体系をダウンレギュレートするＣＤ４６（ＭＣＰ）、ＣＤ５５（ＤＡＦ）又はＣＤ５９がある（Montefiori (1994) Virology 205: 82-92; Saifuddin (1995) J Exp Med. 182: 501-509; Schmitz (1995) J Clin Invest. 96: 1520-6; Marschang (1995) Eur J Immunol. 25: 285-290; Takeftnan (1998) Virology 46: 370-378）。
【０００４】
レトロウイルスのその自然宿主の補体に対する内在的な抵抗は、一般的な現象を表していると思われる。マウスレトロウイルスは、マウス血清に抵抗性であるが、その他の種、例えばヒト、ネコ又はヒツジの補体により効率的に破壊される（Spear (1991) Immunology 73: 377-82 及び自身の未発表の知見）。同様に、上に考察されるように、ＨＩＶはヒト補体の影響を受けないが、動物血清により数分以内に溶解される。従って、レトロウイルスは、類似するが種特異的な保護機構に適応して、それらの自然宿主における補体活性化を、ウイルス溶解を誘導するために必要な閾値より下に保ってきた。そのために、オプソニン化したビリオンはレトロウイルス感染宿主に蓄積する。
【０００５】
これまでに、ウイルスが液相中で補体因子Ｈ（ｆＨ）に結合することが示されている。ｆＨは補体活性化（ＲＣＡ）の負のレギュレーターであるので、上記ｆＨ結合は、ウイルス粒子、例えばＨＩＶの補体に誘導される溶解に対して重要な保護を促進する（Stoiber (1996) J Exp Med. 183: 307-310）。ｆＨ枯渇血清でＨＩＶをインキュベートすると、ＨＩＶ特異的抗体の存在下で最高８０％の補体依存性ウイルス溶解がもたらされるため、ウイルスの保護のためのｆＨの重要な役割は明白である（Stoiber (1996)前掲）。
【０００６】
共通するＲＣＡモチーフは、約６０アミノ酸（ａａ）の反復、すなわちショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）又は補体コンセンサスリピート（ＣＣＲ）である（Takeuchi (1994)前掲）。ｆＨは、２０のＳＣＲ単位に組織化される（Prodinger (2004) : Fundamental Immunology, 編者: WE. Paul, Lippincott- Raven Publishers）。ｆＨの最初の５つのＳＣＲは、Ｃ３ｂ不活性化のためのコファクターとしての機能を果たす「崩壊促進活性」を有する（Prodinger (2004)前掲）。ＳＣＲ７、９、１８〜２０及びおそらくＳＣＲ１３は、ｆＨと、負に帯電した表面成分、例えばヘパリンとの結合を媒介する（Prodinger (2004) 前掲; Cheng (2006) MoI Immunol. 43: 972-9）。ｆＨと負に帯電した宿主細胞の結合は、宿主自体の補体によって誘導される損傷からの宿主細胞の保護に寄与する。
【０００７】
EP-A1 0 854 150号には、１００アミノ酸未満のペプチド鎖であり、ＣＦＨ（ｆＨ）−結合領域と結合が可能な、病原菌誘導性疾患の治療のための試薬が記載されている。しかし、これらのペプチドもなお、ある種の不都合な点があり、さらに良い治療選択肢が望まれていることが示され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許EP-A1 0 854 150号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Takeuchi著、「ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(J Virol.)」第68巻、第8001-7頁、1994年
【非特許文献２】Cooper著、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン(J Exp Med.)」第144巻、第970-84頁、1976年
【非特許文献３】Bartholomew著、「ジャーナル・オブ・イムノロジー(J Immunol.)」第121巻、第1748-51頁、1978年
【非特許文献４】Bartholomew著、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン(J Exp Med.)」第147巻、第844-53頁、1978年
【非特許文献５】Sherwin著、「インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー(Int J Cancer.)」、第21巻(1)、第6-11頁、1978年
【非特許文献６】Jensen著、「Hamatol Bluttransfus. 」第23巻、第501-3頁、1979年
【非特許文献７】Kobilinsky著、「インフェクション・アンド・イムニティー(Infect Immun.)」第29巻(1)、第165-70頁、1980年
【非特許文献８】Dierich著、「HIV感染の免疫学(Immunology of HIV infection)」第365-376頁、S.Gupta編、プレナム・プレス社(Plenum Press)、ニューヨーク、1996年
【非特許文献９】Ebenbichler著、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン(J Exp Med.)」第174巻、第1417-24頁、1991年
【非特許文献１０】Stoiber著、「Immunol Reviews」第180巻、第168-76頁、2001年
【非特許文献１１】Saifuddin著、「AIDS Res Hum Retroviruses」第11巻、第1115-22頁、1995年
【非特許文献１２】Stoiber著、「アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー(Annu Rev Immunol.)」第15巻、第649-674頁、1997年
【非特許文献１３】Sullivan著、「ジャーナル・オブ・イムノロジー(J Immunol.)」第157巻、第1791-1798頁、1996年
【非特許文献１４】Dierich著、「ネイチャー・メディシン(Nature Med)」第2巻、第153-155頁、1996年
【非特許文献１５】Frank著、「エイズ(AIDS)」第10巻、第1611-20頁、1996年
【非特許文献１６】Montefiori著、「ヴァイロロジー(Virology)」第205巻、第82-92頁、1994年
【非特許文献１７】Saifuddin著、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン(J Exp Med.)」第182巻、第501-509頁、1995年
【非特許文献１８】Schmitz著、「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(J Clin Invest.)」第96巻、第1520-6頁、1995年
【非特許文献１９】Marschang著、「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー(Eur J Immunol.)」第25巻、第285-290頁、1995年
【非特許文献２０】Takeftnan著、「ヴァイロロジー(Virology)」第46巻、第370-378頁、1998年
【非特許文献２１】Spear著、「イムノロジー(Immunology)」第73巻、第377-82頁、1991年
【非特許文献２２】Stoiber著、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン(J Exp Med.)」第183巻、第307-310頁、1996年
【非特許文献２３】Prodinger著、「Fundamental Immunology」WE.Paul編、リッピンコット−レイブン出版(Lippincott-Raven Publishers)、2004年
【非特許文献２４】Cheng著、「モレキュラー・イムノロジー(Mol Immunol.)」第43巻、972-9頁、2006年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の根底にある技術的問題は、病原菌の感染又は病原菌の感染に関連する病的状態又は癌のような増殖性疾患に関連する状態の予防、治療又は改善のための有効な手段及び方法を提供することである。上記の技術的問題に対する解決策は、特許請求の範囲に特徴づけられる実施形態をもたらすことにより実現される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、本発明は、
（ａ）補体因子Ｈ由来ショートコンセンサスリピート（ｆＨ由来ＳＣＲ）；及び
（ｂ）病原菌を特異的に認識する結合分子
を含み、上記ｆＨ由来ＳＣＲがヘパリンと結合可能なポリペプチドを含む、ショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）に関する。
【００１２】
一実施形態では、上記ｆＨ由来のＳＣＲは、ＳＣＲ７、ＳＣＲ９、ＳＣＲ１３、ＳＣＲ１８〜２０及び人工ＳＣＲ（ａＳＣＲ）、又は上記ｆＨ由来のＳＣＲ７、ＳＣＲ９、ＳＣＲ１３、ＳＣＲ１８〜２０及びａＳＣＲの機能性フラグメントからなる群より選択される。
【００１３】
本発明に従って用いられるＳＣＲ−Ａｂ構築物は、本明細書において定義される補体因子Ｈ由来のショートコンセンサスリピートに加えて、病原菌を特異的に認識する結合分子をさらに含む。以下の明細書及び添付される実施例中に記述されるように、本発明に従って、意外にも本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物が極めて予想しない方法でインビトロで病原菌を溶解可能であることが見出された。それとは対照的に、病原菌特異的結合分子を含まないＳＣＲ由来のポリペプチドは、同じ条件下で病原菌の溶解を誘導できなかった。従って、本発明の実施形態は、ＥＰ−Ａ１  ０  ８５４  １５０号などの先行技術の欠点を克服する。また、本明細書に記載されるＳＣＲ−Ａｂ構築物がインビボでの病原菌感染の治療に有用であることも見出された。実施例に記述されるように、病原菌特異的結合分子を欠くＳＣＲ構築物又は病原菌特異的結合分子に結合していないＳＣＲ構築物はあまり効果的でなく、且つ、部分的も機能しない。これらの本発明の構築物は、癌及び／又は増殖性障害への医学的介入においても有用であり、これらの実施形態では癌細胞、腫瘍細胞又は悪性細胞に特異的に結合するか、或いはこれら細胞を認識する結合分子が使用できる；以下の項目も参照のこと。そのために、病原菌感染宿主細胞又は癌細胞、悪性細胞若しくは腫瘍細胞のような悪性細胞を阻害及び／又は排除することが望まれる医療機関において、本明細書に記載される本発明の薬学的概念が使用されることも想定される。
【００１４】
そのために、本発明は、
（ａ）補体因子Ｈ由来ショートコンセンサスリピート（ｆＨ由来ＳＣＲ）；及び
（ｂ）癌細胞を特異的に認識する結合分子
を含み、上記ｆＨ由来ＳＣＲがヘパリンと結合可能なポリペプチドを含む、ショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）にも関する。
【００１５】
一実施形態では、上記ｆＨ由来のＳＣＲは、ＳＣＲ７、ＳＣＲ９、ＳＣＲ１３及びＳＣＲ１８〜２０、又は上記ｆＨ由来のＳＣＲ７、ＳＣＲ１３、ＳＣＲ１８〜２０及び人工ＳＣＲ（ａＳＣＲ）の機能性フラグメントからなる群より選択される。
【００１６】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、特定の種類の腫瘍の治療に有望な展望を提供する（Reichert (2007) Nat Rev Drug Discov 6:349-356）。血管新生調節増殖因子、例えばＶＥＧＦなど又は腫瘍抗原を標的化するｍＡｂは、従来の薬物と併用される場合により強い治療効力を可能にし、それにより古典的な化学療法スキームと新しい免疫療法の概念（すなわち化学免疫療法）とを一体化させる。乳癌においてＨｅｒ２／Ｎｅｕを標的化すること、リンパ腫においてＣＤ２０を標的化すること、並びに胃腸癌においてＥＧＦＲ及びＶＥＧＦを標的化することは、化学療法単独と比較して生存期間を延長させることが既に証明されており、そのために、これらの癌種に関して重要なさらなる治療選択肢を示す（Reichert (2007) 前掲）。さらに、原発腫瘍の外科的切除後のＨｅｒ２／Ｎｅｕ過剰発現乳癌での補助療法(adjuvant setting)においてＨｅｒ２／Ｎｅｕの細胞外エピトープに対して指向される抗体（トラスツズマブ）を試験する臨床研究から得たデータは、死亡の危険性のおよそ３０％の低下を証明した。このことは補助的な化学療法単独と比較した場合非常に重要である。
【００１７】
これらのデータは、腫瘍負荷が最小限の（すなわち、固形原発腫瘍の切除後に微小転移又は残留腫瘍細胞のある）患者に適用した場合、ｍＡｂが最も有望な治療法であるという考えを支持する。ｍＡｂの顕著な効力にもかかわらず、そのヒト癌における臨床上の有効性は、最適からかけ離れている（Holz (1998) Recent Results Cancer Res 146:214-218）。そのため、放射性免疫複合体又は二重特異性抗体の適用を含むいくつかの戦略が、それらの臨床上の有効性を高めるために前臨床モデル並びに臨床試験において、現在試験されている（Reichert (2007) 前掲）。
【００１８】
ｍＡｂと腫瘍細胞の結合は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣＣ）及び補体媒介性溶解による腫瘍細胞の破壊を結果としてもたらすことができる、補体活性化を誘導すると考えられる（Durrant (2001). Curr Opin Investig Drugs 2:959-966）。しかし、正常な細胞に似た腫瘍は、ある種の腫瘍に過剰発現される補体活性化のレギュレーター（ＲＣＡ）により、補体誘導性損傷から保護されるので、これらの補体媒介性エフェクター機能は制限される （Durrant (2001)前掲）。これらのＲＣＡには、膜に固定されたレギュレーター、例えばＣＤ４６（ＭＣＰ）、ＣＤ５５（ＤＡＦ）又はＣＤ５９、さらには因子Ｈ（ｆＨ）のような液相中のＲＣＡがある（Bjorge (2005) Br J Cancer 9:895-905; Prodinger (2004) Complement.: Fundamental Immunology. 編者: Paul WE, Lippincott-Raven Publishers）。
【００１９】
ｆＨが数種類の腫瘍の保護に果たす重大な役割は、卵巣、肺及び結腸癌細胞について示されている（Prodinger (2004) loc.cit.; Ajona (2007) J Immunol 178:5991-5997; Fedarko (2000) J Biol Chem 275(22): 16666- 16672; Kinders (1998) Clin Cancer Res 4:2511-2520）。
【００２０】
説明したように、ＲＣＡの共通のモチーフは、約６０のアミノ酸（ａａ）の反復で、ショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）又は補体コンセンサスリピートと呼ばれる（Prodinger (2004) 前掲）。ｆＨは、２０のＳＣＲ単位に組織化される（Prodinger (2004) 前掲）。ｆＨの最初の５つのＳＣＲは、「崩壊促進活性」を示し、Ｃ３ｂ不活性化を促進する（Prodinger (2004) 前掲）。ＳＣＲ７、９、１８〜２０及びおそらくＳＣＲ１３は、ｆＨと、負に帯電した表面成分、例えばヘパリンスルフェートとの結合を媒介する（Prodinger (2004) 前掲）。ｆＨと負に帯電した宿主細胞との結合は、宿主自体の補体によって誘導される損傷からの宿主細胞の保護に寄与する。
【００２１】
ＲＣＡのみでなく、負に帯電した表面構造も、ある種の腫瘍においてアップレギュレートされるので（Fedarko (2000) 前掲）、ｆＨは高い選択性で腫瘍表面に結合し、それにより、補体の誘導する溶解に対する保護に寄与する。本明細書において例示されるように、ＲＣＡ、例えばｆＨのブロッキングによってｍＡｂ療法の有効性は増大する。
【００２２】
本明細書において、用語「ショートコンセンサスリピート」、「ＳＣＲ」「補体コンセンサスリピート」又は「ＣＣＲ」は、補体活性のレギュレーター（ＲＣＡ）をコードするポリヌクレオチド又はアミノ酸配列から推定することのできる、コンセンサスリピートモチーフに関する。特に、ＲＣＡと負に帯電した成分、例えばヘパリンの結合を媒介するＳＣＲは、本発明の状況において関連があり得る。一実施形態では、本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物に含まれるＳＣＲは、ＳＣＲ７、ＳＣＲ９、ＳＣＲ１３、ＳＣＲ１８〜２０及び人工ＳＣＲ（ａＳＣＲ）またはそれらの機能性フラグメントからなる群より選択されるｆＨ由来のＳＣＲであってもよい。しかし、ＳＣＲが、補体活性化のダウンレギュレートに関連する「崩壊促進活性」も有し得ることに注意されたい。
【００２３】
本明細書において、用語「人工ショートコンセンサスリピート」、「人工ＳＣＲ」又は「ａＳＣＲ」は、天然に存在しない補体活性のレギュレーター（ＲＣＡ）であるアミノ酸配列（又はこのようなアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列）に関する。「人工ＳＣＲ」は、本明細書において、天然に存在しないＲＣＡと負に帯電した成分、例えばヘパリンとの結合を媒介する。従って、「ａＳＣＲ」は、特に、ヘパリンと結合可能である、ｆＨの人工誘導体又は補体調節タンパク質ファミリーの関連タンパク質を表す。ヘパリン結合部位として機能し、且つ、「人工ＳＣＲ」を負に帯電した表面成分に結合させるのに寄与するアミノ酸モチーフは当分野で公知である；数ある中でも、Ｓｍｉｔｈ（２０００）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４：５６５９−５６６６及びＧｈｅｂｒｅｍａｒｉａｍ（２００５）  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０５６：１１３−１２２を参照のこと。従って、「人工ＳＣＲ」／「ａＳＣＲ」は、基本的なアミノ酸残基、例えばＲ又はＫのクラスターを含む繰り返し配列を含んでもよく、その結果、「Ｘ」が任意の天然に存在するアミノ酸である、配列モチーフ「Ｒ／Ｋ−Ｘ−Ｒ／Ｋ」が得られる。さらに、ヘパリンと結合可能なｆＨ由来のタンパク質は、９％を上回る正に帯電したアミノ酸で構成されており、全体の等電点（ｐＩ）は７．０より大きいことが当分野に記載されている（Smith (2000) J Virol 74:5659-5666）。ヘパリン結合人工ＳＣＲ又はそのフラグメントが病原菌の溶解を誘導する能力は、本明細書の以下の記載のように、及び特に添付の実施例中に記載されるインビトロ溶解アッセイを用いて試験することができる。
【００２４】
総合すると、本発明に従う、本発明のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）に含まれる人工ＳＣＲ（又はそのフラグメント）は、（ｉ）表面が露出した反復性Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒモチーフ（ここで、「Ｘ」は任意の天然に存在するアミノ酸である）を含み；（ｉｉ）９％を上回る正に帯電したアミノ酸を含み；且つ／又は（ｉｉｉ）７．０より大きい全体の等電点（ｐＩ）を有し得る。本発明に従う人工ＳＣＲの一例は、本明細書の下文に配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含んでもよく、配列番号３１に含まれるポリヌクレオチドによりコードされてもよい。だが、当業者は、例えば、本明細書に記載される、ヘパリン結合を試験するためのインビトロアッセイ及び／又は本明細書に記載されるインビトロ溶解アッセイを用いることにより、本明細書に提供されるようなＳＣＲ−Ａｂ構築物中で有用なさらなる人工ＳＣＲを容易に使用し、且つ、入手する立場にある。
【００２５】
本明細書において、本発明のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）に含まれる用語「結合分子」は、（ａ）潜在的結合パートナー（１又は複数）と特異的に相互作用することが可能であり、それにより、複数の異なる分子のプールから潜在的結合パートナー（１又は複数）のみが結合するか又はそれが有意に結合する程度まで、潜在的結合パートナー（１又は複数）と複数の異なる分子とを可能性のある結合パートナー（１又は複数）として区別できる分子に関する。結合分子と潜在的結合パートナーの結合を測定するための方法は当分野で公知であり、例えばＢｉａｃｏｒｅ装置を使用することにより日常的に実施することができる。
【００２６】
ＥＰ−Ａ１  ０  ８５４  １５０号には、ｆＨ由来の病原菌結合ペプチド鎖が、好ましくはＳＣＲ１３領域由来の配列を含み、一方、ｆＨのＳＣＲ７領域が除去されることが教示される。ＥＰ−Ａ１  ０  ８５４  １５０号は、本発明に記載されるようなＳＣＲ−Ａｂ構築物を提供しないし、示唆もしていない。驚くべきことに（且つ、この従前の教示とは対照的に）、本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物も、特に、ＳＣＲ７、ＳＣＲ９、ＳＣＲ１８〜２０及び人工ＳＣＲ（ａＳＣＲ）を含む、その他のｆＨ由来ＳＣＲ配列を含み得る。
【００２７】
一実施形態では、本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物に含まれるようなｆＨ由来のＳＣＲは、本明細書の以下に配列番号４、２２、２４、６、２６、８、３０又は３２で示されるアミノ酸配列或いはそれらの機能性フラグメントを含み得る：
【化１−１】
2010526528.tif 000003
【化１−２】
2010526528.tif 000004
【００２８】
上記アミノ酸配列の配列番号４、２２、２４、６、２６、８、３０及び３２は、それぞれ、配列番号３、２１、２３、５、２５、７、２９及び３１に含まれるポリヌクレオチドによりコードされ得る：
【化２−１】
2010526528.tif 000005
【化２−２】
2010526528.tif 000006
【００２９】
当業者には、本発明が、本明細書に提供される具体的なショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）配列に制限されないことは明白である。
【００３０】
一実施形態では、本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物に含まれるｆＨ由来ＳＣＲは、上記の配列番号３、２１、２３、５、２５、７、２９及び３１に含まれるポリヌクレオチドと、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの相補的配列によりコードされるポリペプチドを含んでもよく、上記ＳＣＲはｆＨ結合部位に結合可能である。
【００３１】
別の実施形態では、本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物に含まれるｆＨ由来ＳＣＲは、配列番号４、２２、２４、６、２６、８、３０又は３２に含まれるアミノ酸配列に少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列によりコードされるか、又は配列番号３、２１、２３、５、２５、７、２９又は３１に含まれる核酸配列に少なくとも６０％同一である核酸分子よりコードされるポリペプチドを含んでもよく、上記ポリペプチドは、上記病原菌の補体因子Ｈ結合部位に結合可能である。
【００３２】
さらに別の実施形態では、本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物に含まれるｆＨ由来ＳＣＲは、配列番号４、２２、２４、６、２６、８又は３０に含まれるアミノ酸によりコードされるか、或いは、配列番号３、２１、２３、５、２５、７又は２９に含まれる核酸配列のオーソログである核酸分子によりコードされる、ポリペプチドのオーソログを含んでもよく、上記ポリペプチドは、上記病原菌の補体因子Ｈ結合部位に結合可能である。所与のポリペプチドのオーソログを同定するための方法は、本明細書に記載されるハイブリダイゼーション法をはじめ、当分野で周知である。
【００３３】
さらに別の実施形態では、本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物に含まれるｆＨ由来ＳＣＲは、配列番号４又は配列番号２２に含まれるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチド或いはそれらの機能性フラグメントを含んでもよい。
【００３４】
最も好ましい実施形態では、本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物に含まれるｆＨ由来ＳＣＲをコードするアミノ酸配列に含まれる塩基性アミノ酸残基は交換されない。塩基性アミノ酸残基は、リジン、アルギニン及びヒスチジンである。
【００３５】
ＳＣＲ又はそのフラグメントがｆＨ結合部位に結合可能であるかどうかを試験するのに適切な方法は、当分野で公知である。ｆＨの結合は、特に、ＳＣＲと負の表面成分、例えばヘパリンとの結合によって媒介される（Prodinger (2004、前掲；Cheng (2006) 前掲）。したがって、ｆＨ由来ＳＣＲ又は本発明の状況において有用な機能性フラグメントの同定は、本明細書の以下の実施例に記載されるようなヘパリン結合実験を用いて達成されてもよい。ヘパリンに結合可能なさらなるｆＨ由来ＳＣＲの一例は、ＳＣＲ９である。ヘパリン結合性ＳＣＲ又はそのフラグメントが病原菌の溶解を誘導する能力は、本明細書の以下の実施例に記載されるようなインビトロ溶解アッセイを用いて試験することができる。しかしながら、他のＳＣＲ結合アッセイまたはインビトロ溶解アッセイもまた、本明細書に記載されるような本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物におけるｆＨ由来ＳＣＲポリペプチド配列の使用のためにそれらｆＨ由来ＳＣＲポリペプチド配列を試験するのに有用であり得ることを当業者は承知している。
【００３６】
用語「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズする」は、本明細書において、ストリンジェントな又はストリンジェントでない条件下でのハイブリダイゼーションに関連し得る。さらに指定されない場合、条件はストリンジェントでないことが好ましい。上記ハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」,Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、又はＨｉｇｇｉｎｓ及びＨａｍｅｓ（編）「Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，（１９８５）に記載される従来のプロトコールに従って確立することができる。条件の設定は十分に当業者の技量の範囲内であり、当分野で記載されるプロトコールに従って決定することができる。従って、特異的にハイブリダイズする配列のみの検出は、通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件、例えば６５℃にて０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを必要とする。相同配列又は必ずしも相補的でない配列の検出のためのストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件は、６５℃にて６×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳに設定されてもよい。周知の通り、プローブの長さ及び決定される核酸の組成は、ハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメータを構成する。上の条件の変形は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑制するために用いる代替のブロッキング試薬を含めること及び／又は置換することによって実現することができることに注意されたい。典型的なブロッキング試薬としては、デンハート試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、及び市販されている独自の配合物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬を含めることは、適合性の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の修正を必要とし得る。ハイブリダイズする核酸分子も上記の分子のフラグメントを含む。このようなフラグメントは、少なくとも１２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１８、より好ましくは少なくとも２１ヌクレオチドの、より好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド及び最も好ましくは少なくとも６０ヌクレオチドの長さを有する、ｆＨ由来ＳＣＲまたはその機能性フラグメントをコードする核酸配列を示し得る。さらに、上述の核酸分子のいずれかとハイブリダイズする核酸分子としてはまた、これら分子の相補性フラグメント、誘導体及び対立遺伝子変異体が挙げられる。その上、ハイブリダイゼーション複合体とは、相補的なＧ及びＣ塩基間、並びに相補的なＡ及びＴ塩基間の水素結合の形成による、２つの核酸配列間の複合体を指す；これらの水素結合は、塩基スタッキング相互作用によりさらに安定化され得る。これらの２つの相補的な核酸配列は、逆平行立体配置において水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成されるか（例えば、Ｃｏｔ又はＲｏｔ分析）、または溶液中に存在する１つの核酸配列と固相支持体上に固定化されているもう一つ核酸配列（例えば、細胞が固定されている膜、フィルタ、チップ、ピン又はスライドガラス）との間に形成される。用語「相補的な」又は「相補性」とは、許容できる塩条件及び温度条件下での、塩基対合することによるポリヌクレオチドの自然な結合を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、「部分的」（一部の核酸のみが結合する）であってもよく、一本鎖分子の間に全体的な相補性が存在する場合には完全であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に有意な効果を有する。これは核酸鎖間の結合に依存する増幅反応において特に重要である。
【００３７】
用語「ハイブリダイズする配列」とは、好ましくは、上に記載されるような抗体分子をコードする核酸配列と、少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、特に好ましいものは少なくとも８０％、より特に好ましいものは少なくとも９０％、さらにより特に好ましいものは少なくとも９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％の同一性の配列を提示する配列を指す。さらに、用語「ハイブリダイズする配列」とは、好ましくは、少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、特に好ましいものは少なくとも８０％、より特に好ましいものは少なくとも９０％、さらにより特に好ましいものは少なくとも９５％及び最も好ましくは少なくとも９７％の同一性を有する、ｆＨ由来ＳＣＲまたはその機能性フラグメントをコードする配列を指す。
【００３８】
本発明によると、２又はそれ以上の核酸又はアミノ酸配列の関連における用語「同一の」又は「パーセント同一性」とは、当分野で公知の配列比較アルゴリズムを用いるか又は手動のアラインメント及び目視検査によって測定して比較ウィンドウ又は指定領域にわたって比較される場合および最大一致で整列される場合に、同一である２以上の配列もしくは部分配列、又は同一であるアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列の特定のパーセンテージ（例えば、６０％又は６５％の同一性、好ましくは、７０〜９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有する配列もしくは部分配列を指す。例えば、６０％〜９５％又はそれ以上の配列同一性を有する配列は、実質的に同一と見なされる。そのような定義は試験配列の相補体にも適用される。好ましくは記載される同一性は、少なくとも約１５〜２５アミノ酸長又はヌクレオチド長の領域にわたって、より好ましくは、約５０〜１００アミノ酸長又はヌクレオチド長の領域にわたって存在する。当業者であれば、例えば、当分野で公知の、アルゴリズム、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680）又はＦＡＳＴＤＢ（Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245）に基づくものなどを用いて配列間のパーセント同一性を決定する方法が分かるであろう。
【００３９】
ＦＡＳＴＤＢアルゴリズムは一般に、配列内部の適合しない欠失又は付加、すなわちギャップをその計算に考慮しないが、これは手作業で訂正して％同一性の過大評価を回避することができる。しかしながら、ＣＬＵＳＴＡＬＷはその同一性の計算に配列ギャップを考慮する。当業者には、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムも利用可能である（Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389-3402; Altschul, J. MoI. Evol. 36 (1993), 290-300; Altschul, J. MoI. Biol. 215 (1990), 403-410）。核酸配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムはデフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、及び１０の期待値（Ｅ）を用いる。ＢＬＯＳＵＭ６２採点マトリックス（Henikoff Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 89, (1989), 10915）は、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖の比較を用いる。
【００４０】
さらに、本発明はまた、上記のハイブリダイズする分子の配列と比較してその配列が縮重している核酸分子に関する。本発明に従って用いられる場合、用語「遺伝子コードの結果として縮重している」とは、遺伝コードの冗長性に起因して、異なるヌクレオチド配列が同じアミノ酸をコードすることを意味する。
【００４１】
所与のｆＨ由来ＳＣＲ配列中のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基が、例えば、配列番号４、２２、２４、６、２６、８、３０及び３２のいずれかのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列中の特定の位置に対応するかどうかを決定するため、当業者は当分野で周知の手段及び方法、例えばアライメントを、手動で、又は、用語「ハイブリダイゼーション」の定義及び相同性の程度に関連して以下でさらに言及されるようなコンピュータプログラムを用いて、使用することができる。
【００４２】
例えば、ベーシックローカルアライメントサーチツールＢＬＡＳＴ（Altschul (1997), 前掲; Altschul (1993), 前掲; Altschul (1990), 前掲）を表わすＢＬＡＳＴ２．０は、局所的な配列のアライメントを検索するのに使用することができる。上に考察されるように、ＢＬＡＳＴは、配列類似性を決定するためのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成する。アライメントの局所的性質のため、ＢＬＡＳＴは正確な一致を決定する際、又は類似する配列を同定する際に特に有用である。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本ユニットは、高スコアのセグメント対(Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｐａｉｒ：ＨＳＰ）である。ＨＳＰは、任意ではあるが等しい長さの２つのフラグメント配列から成り、そのアライメントは局所的に最大であり、そのアライメントスコアは、ユーザーが設定し閾値又はカットオフスコアに一致するか又はそれを上回る。ＢＬＡＳＴアプローチは、クエリー配列とデータベース配列の間のＨＳＰを探すこと、見つかった任意の一致の統計的有意性を評価すること、及びユーザーが選択した有意性の閾値を満たす一致のみを報告することである。パラメータＥは、データベース配列の一致を報告するための統計的に有意な閾値を確立する。Ｅは全データベース検索の範囲内でＨＳＰ（又はＨＳＰの組）の起こる可能性(chance occurrence)の期待頻度の上限境界と解釈される。その一致がＥを満たす、あらゆるデータベース配列がプログラム出力に報告される。
【００４３】
ＢＬＡＳＴを用いる同様のコンピュータ技術（Altschul (1997), 前掲；Altschul (1993), 前掲；Altschul (1990), 前掲）は、ヌクレオチドデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ又はＥＭＢＬで同一であるか又は関連する分子を検索するために用いられる。この解析は、多重膜系ハイブリダイゼーションよりもはるかに速い。加えて、コンピュータ検索の感度を変更して特定の一致が完全な一致か又は類似として分類されるかどうか決定することができる。検索の基礎は、下式：
【化３】
2010526528.tif 000007
として定義される積スコアであり、２つの配列間の類似の程度と、一致した配列の長さとの両方を考慮する。例えば、積スコアが４０での一致は、１〜２％の誤差の範囲内で完全一致となり、積スコアが７０での一致は完全一致となる。類似する分子は通常１５〜４０の間の積スコアを示すものを選択することにより同定されるが、それより低いスコアは関連分子を同定することができる。配列アラインメントを生成できるプログラムの別の例は、当分野で公知のＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Thompson, Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680）又はＦＡＳＴＤＢ（Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245）である。
【００４４】
本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物に含まれる結合分子は、抗体分子、レセプター分子、アプタマー、ＤＡＲＰｉｎなどからなる群より選択され得る。当業者は、本明細書に提供されるＳＣＲ−Ａｂ構築物中で有用な特定の結合分子を容易に使用し、且つ入手する立場にある。
【００４５】
本発明の状況において、用語「抗体分子（１又は複数）」又は「抗体（１又は複数）」には、完全な免疫グロブリン分子のような抗体分子（１又は複数）、例えばＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＧ、同様にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４など、並びにこのような免疫グロブリン分子の一部、例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、キメラＦ（ａｂ）２若しくはキメラＦａｂ’フラグメント、キメラＦａｂフラグメント又は単離されたＶＨ若しくはＣＤＲ領域が含まれる（上記単離されたＶＨ若しくはＣＤＲ領域は、例えば対応する「フレームワーク（１又は複数）」に統合されるか又は操作されるべきである）。従って、用語「抗体分子」は、免疫グロブリンの既知のイソ型及び改変型、例えば一本鎖抗体又は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＡＢ／ｓｃＦｖ）又は二重特異性抗体構築物も包含し、上記イソ型及び改変型は、ウイルス粒子の表面上の１つの抗原を特異的に認識する少なくとも１つの抗原結合部位を含んでいるとして特徴付けられる。上記のイソ型又は改変型の具体例は、ＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨの形式のｓｃ（一本鎖）抗体であり得る。同様に、二重特異性ｓｃＦｖ、例えばＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ、ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ、ＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨの形式のものも想定される。用語「抗体分子（１又は複数）」には、ダイアボディー、及び、抗体Ｆｃドメインを少なくとも１つの抗原結合部分／ペプチドに結合した媒体として含む分子、例えばＷＯ００／２４７８２号に記載されるようなペプチボディ(peptibodies)も含まれる。用語「抗体フラグメント」にも、操作されて改変された抗体エフェクター機能物、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす、このようなフラグメントが含まれる。
【００４６】
一実施形態では、本発明のＳＣＲ−Ａｂは、以下の表１に含まれる抗体分子に由来する抗原結合ドメインを含む。
【表１】
2010526528.tif 000008
【００４７】
さらに、当業者は、その他の適切な抗体分子を容易に使用し、且つ入手する立場にある。例えば、病原菌の表面抗原に特異的に結合することが既知の抗体分子は、本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物に含まれる結合分子として使用することができる。或いは、適切な抗体分子を、当分野で公知の標準法を用いて惹起させてもよい、特に、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照のこと。
【００４８】
別の実施形態では、本発明のＳＣＲ−Ａｂは、本明細書の上文に提供される表１に記載されるとおりの２Ｆ５、２Ｇ１２、３Ｄ６、４Ｅ１０  ＩｇＧ１及び４Ｅ１０  ＩｇＧ３からなる群より選択される抗体分子に含まれるような抗原結合ドメインを含む。
【００４９】
用語「レセプター分子」は、本明細書において、特異的リガンドに結合可能なタンパク質又はそのフラグメントに関する。リガンドとレセプター分子との結合は、その通常の細胞の状況において、リガンドに対する細胞応答を開始させる。しかし、本発明では、有用なレセプター分子はまた、細胞応答を開始させることのできないレセプターのリガンド結合部分しか含まない可能性もある。当業者は、病原菌関連リガンドに結合可能なレセプター分が、本発明の状況において特に有用であることを認識する。限定されない例では、病原菌関連リガンドに結合可能なレセプター分子は、ＣＤ４レセプター、好ましくはヒトＣＤ４レセプターであり得る。病原菌関連リガンドに結合可能なその他のレセプター分子としては、ケモカインレセプター、例えば、（ヒト）ＣＸＣＲ４レセプター又は（ヒト）β−ケモカインレセプターＣＣＲ５が挙げられる。さらに、当業者は、本明細書に記載されるようなＳＣＲ−Ａｂ構築物において有用なレセプター分子のその他の例を容易に同定することができる。用語「アプタマー」は、本明細書において、標的分子に特異的に結合可能な核酸分子に関する。アプタマーは、通例、ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、改変されたＲＮＡ又は改変されたＤＮＡ分子を含む。アプタマーの調製は当分野で周知であり、それには、特に、結合部位を同定するためのコンビナトリアルＲＮＡライブラリーの使用を伴う（Gold (1995), Ann. Rev. Biochem 64, 763-797）。
【００５０】
用語「ＤＡＲＰｉｎ」は、本明細書において、当分野で公知のようなアンキリンリピートを含む、デザインされた結合タンパク質に関する（Kohl (2003), PNAS 100, 1700-1705, Forrer (2003), FEBS letters 539, 2-6）。高度に特異的なＤＡＲＰｉｎは、ＷＯ０２／２０５６５号に記載されるように、例えばリボソームディスプレイ技術を使用することによりＤＡＲＰｉｎライブラリーをスクリーニングすることによって、作成することができる（Hanes (1997), PNAS 94, 4937-4942）。だが、当業者は、その他のデザインされたリピートタンパク質ライブラリー（ＤＲＰライブラリー）、例えばロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ライブラリーを、本発明の状況において有用な結合分子をスクリーニングするために用いてもよいことを認識する。
【００５１】
本明細書において、「特異的に認識する」又は「特異的に結合する」とは、結合分子と標的分子の結合を指し、このような分子は、所与の抗原に結合する抗体分子であってもよく、所与のリガンドなどに結合するレセプター分子であってもよい。質量作用の法則によれば、結合−平衡は、標的分子の濃度［ｔ］、結合分子の濃度［ｂ］及び結合分子−標的分子複合体の濃度［ｂｔ］に依存する。そのため、平衡定数Ｋｄは、［ｔ］×［ｂ］／［ｂｔ］として定義される。本明細書に記載されるようなＳＣＲ−Ａｂ構築物に含まれる結合分子のリガンド結合は、例えば約１０−１３〜１０−６Ｍの親和性（Ｋｄ）で、例えば約１０−１３〜１０−７Ｍの親和性で、例えば約１０−１３〜１０−８Ｍの親和性で、例えば約１０−１３〜１０−９Ｍの親和性で起こり得る。以前に考察したように、所与の病原菌の結合分子との関連での、用語「特異的に認識する／結合する」は、特に対応する抗体（又はそのフラグメント若しくは誘導体）を含む。
【００５２】
それとは対照的に、内在性ｆＨの細胞に対するＫｄは比較的高い。従って、内在性ｆＨのうちごく少量のみが細胞表面に結合し、表面のｆＨからの交換は速い。ｆＨ由来ＳＣＲのＫｄ値は、全ｆＨ分子に関する範囲と同じ範囲内であると予想される。既に記載されるＳＣＲ構築物、例えばＥＰ−Ａ１  ０  ８５４  １５０号に記載されるものは、本明細書に定義されるような病原菌特異的結合分子を含まず、そして、その結果、病原菌又は病原菌感染細胞に対して実質的に低い親和性（Ｋｄ）を示す。結果的に、細胞に結合するために内在性ｆＨに競合するため、且つｆＨ−病原菌相互作用を十分に阻止するために、比較的多量の個別のＳＣＲ構築物が必要である；特に、添付される図５及び７を参照のこと。
【００５３】
本明細書に記載されるようなＳＣＲ−Ａｂ構築物は、含まれる結合分子を介して、病原菌及び／又は病原菌感染細胞上に露出した病原菌関連タンパク質に高い親和性で選択的に結合する。従って、ｆＨ由来ＳＣＲ構築物は、結合分子のＫｄによってのみ解離し、病原菌及び／又は病原菌感染細胞の表面に「拘束される」と考えられる。理論に縛られるわけではないが、本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物に含まれるｆＨ由来ＳＣＲ領域は、病原菌及び／又は病原菌感染細胞の表面から宿主由来のｆＨを移動させると考えられる。これは、結果として補体活性化のｆＨ媒介性阻害の終了を導き、最終的に病原菌及び／又は病原菌感染細胞の補体媒介性溶解となると考えられる。
【００５４】
本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物に含まれるｆＨ由来ＳＣＲと結合分子は、共有結合されてもよい。ｆＨ由来ＳＣＲと結合分子との共有結合は、上記ｆＨ由来ＳＣＲ及び上記結合分子が共有結合（１又は複数）により結合されている１分子をもたらす。共有結合は、特に、本明細書において例示される化学物質を介する交差結合(cross-binding)により得られる、電子対を原子間で共有することを特徴とする化学結合である。しかしながら、本明細書に開示されるような構築物、すなわち、補体因子由来ショートコンセンサスリピート、及び病原菌を特異的に認識する／結合する、共有結合した結合分子を含むＳＣＲ−Ａｂの組換え生産も想定される。
【００５５】
或いは、本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物に含まれるｆＨ由来ＳＣＲと結合分子とは非共有結合してもよい。非共有結合としては、当分野で公知であり、限定されるものではないが、タンパク質−タンパク質相互作用の結果としてのタンパク質分子の会合が挙げられる。本発明の状況において、ｆＨ由来ＳＣＲと結合分子とを結合するために有用であり得る非共有結合の限定されない例としては、ビオチン／ストレプトアビジン複合体、レクチン／糖タンパク質複合体及び抗体−抗原複合体が挙げられる。さらに、当業者は、本明細書に記載されるようなＳＣＲ−Ａｂ構築物を生成するための、ｆＨ由来ＳＣＲと結合分子を非共有結合させるために有用なその他の非共有結合／複合体を容易に識別することが可能である。
【００５６】
一実施形態では、ｆＨ由来ＳＣＲと結合分子とは、一本鎖多機能性ポリペプチドに含まれる。例えば一本鎖ＳＣＲ−Ａｂ構築物は、ＳＣＲ由来ドメイン（１又は複数）及び結合分子ドメイン（１又は複数）を含むポリペプチド（１又は複数）で構成されてもよい。上記ドメインは、ポリペプチドリンカーによって連結され、ここで、上記リンカーは上記ＳＣＲ由来ドメイン（１又は複数）と上記結合分子ドメイン（１又は複数）の間に配置される。
【００５７】
本明細書に記載されるようなＳＣＲ−Ａｂ構築物は、病原菌を特異的に認識し、ここで、上記病原菌はウイルス又は細菌であってもよい。上記ウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルス、一本鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルス、マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルス、逆転写ＲＮＡウイルス及び逆転写ＤＮＡウイルスからなる群より選択されてもよい。上記二本鎖ＤＮＡウイルスとしては、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ロゼオロウイルス、ヒトヘルペスウイルス７型又はカポジ肉腫関連ウイルスを挙げることができる。上に定義されるようなプラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスとしては、限定されるものではないが、コロナウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス又はダニ媒介性脳炎ウイルスが挙げられる。上に定義されるようなマイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスとしては、限定されるものではないが、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、狂犬病ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス又はリンパ性脈絡髄膜炎ウイルスが挙げられる。上記逆転写ＲＮＡウイルスはレトロウイルスであってもよく、ここで、上記レトロウイルスは、例えば、ラウス肉腫ウイルス；（ＲＳＶ）マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）；フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＶ）；ネコ白血病ウイルス；ネコ肉腫ウイルス；ウシ白血病ウイルス；ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）；ウシ免疫不全ウイルス；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）及びスプーマウイルスからなる群より選択され得る。本明細書の上記に定義されるような逆転写ＤＮＡウイルスとしては、限定されるものではないが、Ｂ型肝炎ウイルスが挙げられる。
【００５８】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるようなＳＣＲ−Ａｂ構築物をコードするポリヌクレオチドに関する。上記ＳＣＲ−Ａｂをコードするポリヌクレオチドは、例えば、限定されるものではないが、一本鎖多機能性ポリペプチドに含まれるｆＨ由来ＳＣＲ及び結合分子をコードするポリヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、核酸分子、例えばＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。上記核酸分子は一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、ベクターに含まれてもよい。
【００５９】
さらに、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチド又はベクターで細胞をトランスフェクトすることが想定される。さらに、さらなる実施形態では、本発明は、発現の際に上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。上記ポリヌクレオチドを当分野で公知の適切な発現制御配列に融合させて、ポリペプチドの適切な転写及び翻訳を確実にしてもよい。このようなベクターは、さらなる遺伝子、例えば適切な宿主細胞において、且つ適切な条件下で上記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子を含み得る。
【００６０】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるｆＨ−ＳＣＲ−構築物をコードするポリヌクレオチドが発現制御配列に動作可能なように連結されて原核生物又は真核細胞での発現を可能にする、組換えベクターに含まれる。上記ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドの翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳類細胞での発現を確実にする調節エレメントは、当業者に周知である。それらは通常、転写の開始を確実にする調節配列、並びに、所望により転写の終結及び転写物の安定化を確実にするポリ−Ａシグナルを含む。付加的な調節エレメントには、転写エンハンサー及び翻訳エンハンサー、並びに／或いは天然に付随する(naturally-associated)プロモーター領域又は異種プロモーター領域が含まれ得る。原核生物宿主細胞での発現を可能にする、考えられる調節エレメントには、例えば、大腸菌のＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターが含まれ、真核生物宿主細胞での発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母のＡＯＸ１又はＧＡＬ１プロモーター、或いは、哺乳類及びその他の動物細胞のＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサー又はグロビンイントロンである。転写の開始を担うエレメントのほかに、このような調節エレメントにはまた、転写終結シグナル、例えばポリヌクレオチドの下流のＳＶ４０−ポリ−Ａ部位又はｔｋ−ポリ−Ａ部位も含まれ得る。当業者に周知の方法が組換えベクター構築するために使用され得る；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９），「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌ（１９８９），「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．に記載される技法を参照のこと。このような状況において、適切な発現ベクターは当分野で公知であり、例えばＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３、ｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、又はｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）である。さらに、使用する発現系に応じて、ポリペプチドを細胞内コンパートメントに導くか、又はそれを培地中に分泌することの可能なリーダー配列を、本発明のポリヌクレオチドのコード配列に加えてもよい。
【００６１】
上記を踏まえて、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、従来遺伝子工学に用いられるベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージに関する。好ましくは、上記ベクターは、発現ベクター及び／又は遺伝子移入ベクター若しくは遺伝子ターゲティングベクターである。ウイルス、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、疱疹ウイルス、又はウシパピローマウイルスに由来する発現ベクターを、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを標的化された細胞集団の中に送達するために用いてもよい。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、細胞宿主の種類によって異なる、周知の方法により宿主細胞の中に移動させることができる。このような方法には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）（前掲）、及びＡｕｓｕｂｅｌ（１９８９）（前掲）に記載される技法が含まれる。従って、塩化カルシウムトランスフェクションは、一般に原核細胞に利用され、一方、リン酸カルシウム処置又はエレクトロポレーションはその他の細胞宿主に使用され得る；Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上記）を参照のこと。さらなる代替法として、本発明のポリヌクレオチド及びベクターは、標的細胞への送達のためのリポソーム中に再構成することができる。宿主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチド又はベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、又は染色体外で維持されるかのいずれかであってもよい。
【００６２】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されるようなＳＣＲ−Ａｂ構築物の調製のための方法を含む。本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物は、組換えによって、例えば本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物をコードする記載のポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞を培養し、上記構築物を培養物から単離することにより、作製されてもよい。本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物は、任意の適切な細胞培養系で作製されてもよく、それには、限定されるものではないが、真核細胞、例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris）酵母株Ｘ−３３又はＣＨＯ細胞が含まれる。当分野で公知のさらなる適切な細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などの細胞株受託機関から入手可能である。用語「真核生物の」は、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳類細胞を含むことを意味する。形質転換宿主は、発酵槽で増殖させ、当分野で公知の技法に従って培養して最適な細胞増殖を実現することができる。さらなる実施形態では、本発明は、このようにして本発明の細胞をポリペプチドの発現に適切な条件下で培養すること、及びポリペプチドを細胞又は培地から単離することを含む、上記ポリペプチドの調製のための方法に関する。
【００６３】
従って、本発明のポリペプチドは、増殖培地、細胞溶解物又は細胞膜画分から単離することができる。発現した本発明のポリペプチド単離及び精製は、硫酸アンモニウム沈降、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む任意の従来手段によるものであってもよく、且つ、例えば、例えば本発明のポリペプチドのタグに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体の使用を伴ってもよい；Ｓｃｏｐｅｓ  （１９８２），「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。タンパク質は、例えば、添付される実施例に記載されるように、Ｎｉ−ＮＴＡ−カラムを用いることにより、そのＨｉｓ−ｔａｇを介して精製することができる（Mack (1995), PNAS 92, 7021-7025）。製薬用途には、少なくとも約９０〜９５％の均質性の実質的に純粋なポリペプチドが好ましく、９８〜９９％又はそれ以上の均質性が最も好ましい。組換え生産手順に用いる宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されても非グリコシル化されてもよい。
【００６４】
本明細書に記載されるショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）の調製のための方法は、本明細書に記載されるｆＨ由来ＳＣＲと結合分子とのカップリングも含み得る。例えば、ｆＨ由来ＳＣＲは、添付の実施例に記載されるように、スルホスクシンイミジル  ４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート（スルホ−ＳＭＰＢ）化学架橋を用いることにより、結合分子とカップリングされ得る。さらに、当業者は本明細書に記載されるようなＳＣＲ−Ａｂ構築物を生成する際に有用なその他の化学架橋剤を容易に同定することが可能である。このような架橋試薬の限定されない例を以下の表２に記載する。
【表２−１】
2010526528.tif 000009
【表２−２】
2010526528.tif 000010
【表２−３】
2010526528.tif 000011
【００６５】
従って、いずれの従来の架橋手順を本明細書に記載されるＳＣＲ−Ａｂ構築物を調製するために適用してもよく、それには、限定されるものではないが、タンパク質−タンパク質相互作用、例えばビオチン−ストレプトアビジン複合体又は抗体−抗原複合体の形成によるものが含まれる。
【００６６】
さらなる実施形態では、本発明のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）は、組成物に含まれる。上記組成物は、１又はそれ以上の本明細書に提供されるＳＣＲ−Ａｂ構築物を含んでもよい。上記組成物は、所望により医薬品として許容される担体及び／又は希釈剤をさらに含む、医薬組成物であってもよい。本明細書に記載されるＳＣＲ−Ａｂ構築物の、病原菌の感染又は病原菌の感染に関連する病的状態の予防、治療又は改善のための医薬組成物の調製のための使用も想定される。上記病原菌は、本明細書の上文に定義されるようなウイルス又は細菌であってもよい。
【００６７】
ショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）について、それに含まれる補体因子Ｈ由来のショートコンセンサスリピート（ｆＨ由来ＳＣＲ）と結合分子とが非共有結合していることは当業者には明白であり、上記ｆＨ由来ＳＣＲ及び上記結合分子は同時に又は順次に投与されてもよい。本明細書以下において例示されるように、例えば、結合分子が最初に投与され、その後、ｆＨ由来ＳＣＲの投与が続く。従って、例えば、病原菌に特異的に結合する結合分子は、ｆＨ−ＳＣＲに特異的に会合し、本明細書に記載される非共有結合性ショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）を形成する。そのため、本発明の組成物は、補体因子Ｈ由来ショートコンセンサスリピート（ｆＨ由来ＳＣＲ）と結合分子との両方が独立に存在する組成物も含む。
【００６８】
本発明はまた、核酸分子（ポリヌクレオチド）、ベクター、並びに上記核酸分子（ポリヌクレオチド）を含むトランスフェクト細胞、医学的アプローチ（例えば細胞に基づく遺伝子治療アプローチ又は核酸に基づく遺伝子治療アプローチなど）におけるベクターの使用に関する。
【００６９】
上記ウイルスベクターは、遺伝子治療に特に適している。治療用遺伝子をエキソビボ又はインビボ技法により細胞の中に導入することに基づく遺伝子治療は、遺伝子導入の最も重要な適用の一つである。インビトロ又はインビボ遺伝子治療に適切なベクター、方法又は遺伝子送達系、並びにベクター系は、文献に記載されており、当業者に公知である；例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１９９６），５３４−５３９；Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９（１９９６），９１１−９１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６（１９９２），８０８-８１３，Ｉｓｎｅｒ，Ｌａｎｃｅｔ  ３４８（１９９６）、３７０−３７４；Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７７（１９９５），１０７７−１０８６；Ｏｎｏｄｕａ，Ｂｌｏｏｄ  ９１（１９９８），３０−３６；Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（１９９８），２２４３−２２５１；Ｖｅｒｍａ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９（１９９７），２３９−２４２；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２（Ｓｕｐｐ．１９９８）、２５−３０；Ｗａｎｇ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４（１９９７），３９３−４００；Ｗａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１９９６），７１４−７１６；ＷＯ９４／２９４６９号；ＷＯ９７／００９５７号；米国特許第５，５８０，８５９号；米国特許第５，５８９，４６６号；米国特許第４，３９４，４４８号、米国特許第２００７／０８６９８５号、米国特許第２００７／０８２３８８号、米国特許第２００７／０７１７７０号、米国特許第２００７／００３５２２号  米国特許第２００７／０４８２８５号（又は対応するＥＰ１７５７７０３号）又はＷＯ２００４／１１１２４８号、並びにその中で引用されている参照文献を参照されたい。適切な媒体／送達媒体は、特に、ＷＯ２００７／０２２０３０号、ＷＯ２００７／０１８５６２号に開示される。特にリンパ細胞(lymphatic cell)及び／又は組織で使用するためにさらに適切な遺伝子治療構築物は当分野で公知である；Ｌｉ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０８２（２００６）１７２−９を参照されたい。
【００７０】
さらに別の実施形態では、本発明は、病原菌の感染又は病原菌の感染に関連する病的状態の予防、治療又は改善のための方法に関し、さらなる実施形態では、癌のような増殖性障害の治療のための腫瘍細胞、癌細胞及び／又は悪性細胞を認識又はそれに結合する異なる結合分子の使用に関し、このような予防又は治療を必要とする哺乳類（ここで、上記哺乳類はヒトである）に、本明細書の上記又は下記項目中に記載されるようなショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）を投与することを含む。好ましい実施形態では、上記ウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり得る。病原菌の感染に関連する病的状態の例としては、限定されるものではないが、ＨＩＶ感染に関連する後天性免疫不全症状群（ＡＩＤＳ）、コロナウイルス感染に関連する重度急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染に関連する急性／慢性Ｃ型肝炎又はインフルエンザウイルス感染に関連するインフルエンザが挙げられる。
【００７１】
記載されるように、病原菌感染宿主細胞、又は癌細胞のような悪性細胞を阻害及び／又は排除することが望まれる医療機関において、本明細書に記載される本発明の薬学的概念が使用されることも想定される。上記実施形態では、本発明のＳＣＲ−Ａｂに含まれる結合分子は、癌細胞、悪性細胞及び／又は腫瘍細胞を特異的に認識するか、又はそれに特異的に結合する。
【００７２】
したがって（そして代替として）、本発明に従って用いる予定のＳＣＲ−Ａｂ構築物は、癌細胞、悪性細胞又は腫瘍細胞を特異的に認識するか又はそれに結合する結合分子を、本明細書において定義される補体因子Ｈ由来のショートコンセンサスリピートに加えて含んでもよい。本明細書の以下及び添付の実施例に記述されるように、本発明に従って、本発明の特定のＳＣＲ−Ａｂ構築物が、驚くことにインビトロで非常に予想せぬ方法で癌細胞を溶解可能であることが見出された。
【００７３】
上記癌細胞、悪性細胞又は腫瘍細胞は、任意の癌又は腫瘍種から誘導され得る。一実施形態では、癌細胞又は悪性細胞は、限定されるものではないが、乳癌細胞、バーキットリンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、結腸直腸癌細胞、転移性結腸直腸癌細胞、非ホジキンリンパ腫細胞、肺癌細胞、慢性リンパ性白血病細胞、微小転移又は残留腫瘍細胞からなる群より選択される。好ましくは、癌細胞又は悪性細胞、腫瘍細胞は、微小転移又は残留腫瘍から誘導され得る。
【００７４】
本明細書に記載されるような癌細胞を特異的に認識する抗体分子を含むショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）は、被験体において癌性疾患の予防、治療又は改善に有用である。好ましくは、上記被験体はヒトである。
【００７５】
本明細書において、癌性疾患は、限定されるものではないが、乳癌、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌、非ホジキンリンパ腫、肺癌、慢性リンパ性白血病から選択され得る。好ましくは、癌性疾患は、微小転移又は残留腫瘍から生じる。
【００７６】
癌性疾患の治療に有用な、本明細書に記載されるショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）に含まれる抗体分子は、限定されるものではないが、ＣＤ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ｅｒｂＢ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＩＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＴＡＧ−７２、ＴＡＬ−６、ＴＲＡＩＬＲ及びＶＥＧＦＲからなる群より選択されるエピトープを認識するモノクローナル抗体からなる群より選択されてもよい。上記の抗原を特異的に認識する抗体分子は当分野で周知である。本発明の組成物は固体であっても液体であってもよく、特に、粉末（１又は複数）、錠剤（１又は複数）、溶液（１又は複数）又はエアロゾル（１又は複数）の形態であってもよい。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図される使用に応じて、さらなる生物活性物質を含み得ることが想定される。このような物質は、消化器系に作用する抗生物質、抗ウイルス薬又は薬物であり得る。
【００７７】
適切な（医薬）組成物の投与は、様々な方法により、例えば、非経口、皮下、腹腔内、局所、気管支内、肺内及び鼻腔内の投与、及び、局所治療が望ましい場合には、病巣内の投与により達成されてもよい。非経口投与には、腹腔内、筋肉内、皮内、皮下静脈内又は動脈内の投与が含まれる。特に好ましいものは、上記投与が、例えば脳動脈内の部位までの送達又は直接脳組織内への、注射および／または送達により実施されることである。本発明の組成物はまた、例えば、病原菌に感染している具体的な器官などの外部若しくは内部の標的部位への微粒子銃送達により、直接標的部位に投与されてもよい。
【００７８】
適切な医薬担体、賦形剤及び／又は希釈剤の例は当分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、乳濁液、例えば油／水エマルジョン、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。このような担体を含む組成物は、周知の従来法により処方することができる。適切な担体は、本発明のＳＣＲ−Ａｂ構築物と組み合わせる場合に、含まれるＳＣＲ−Ａｂ構築物の生物活性を保持する、あらゆる材料を含んでもよい；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編を参照のこと。非経口投与用の製剤には、滅菌水若しくは非水性溶液、懸濁液、及び乳濁液が含まれてもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油など、及び注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳濁液又は懸濁液が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は固定油を挙げることができる。静脈用媒体としては、流体及び栄養補液、電解質補液（リンゲルのデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。また、防腐剤及びその他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなどが存在してもよい。加えて、本発明の医薬組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の血清アルブミン又は免疫グロブリンなどの、タンパク質性担体を含んでもよい。
【００７９】
これらの医薬組成物は、適切な用量で被験体に投与されてもよい。投与計画は主治医と臨床学的要因により決定される。医学分野で周知のように、１名の患者に対する投薬量は多くの要因によって決まり、それには患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与回数及び投与経路、全体的な健康、及び同時に投与されているその他の薬物が含まれる。薬学的に活性な物質は、１用量あたり１μｇ〜２０ｍｇ／体重ｋｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／体重ｋｇ、例えば０．５ｍｇ〜５ｍｇ／体重ｋｇの量で存在してもよい。投与計画が持続注入である場合は、それは１μｇ〜１０ｍｇ／体重キログラム／分の範囲内であるべきである。さらに、示される模範的範囲以下又は以上の用量も、特に上述の要因を考慮して想定される。
【００８０】
本明細書に記載されるような医薬組成物は、短時間作用型、急速放出型、長時間作用型、又は持続放出型となるよう処方され得る。故に、医薬組成物は、緩徐放出又は制御放出にも適し得る。持続放出製剤は、当分野で周知の方法を用いて調製されてもよい。持続放出製剤の適切な例としては、マトリックスが造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ヒドロゲル、ポリラクチド、分解性乳酸−グリコール酸共重合体及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。持続放出製剤に含まれるＳＣＲ−Ａｂ構築物の、起こり得る生物活性の損失及び起こり得る結合特性の変化は、適当な添加剤を用いることにより、含水量を制御することにより、及び、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより、防ぐことができる。
【００８１】
さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図される使用に応じて、さらなる生物活性物質を含み得ることが想定される。例えば、ＨＩＶ−感染症に罹患している患者において、このような物質は、免疫系に作用する薬物、抗ウイルス薬治療、特に、ＨＩＶ−治療（例えば、ＨＡＡＲＴ）及びＡＩＤＳ管理で用いられる薬物及び／又は抗炎症薬であり得る。ＨＡＡＲＴ療法は、３種類の抗ウイルス薬のカクテルからなる。これらの種類は、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬（ＮＮＲＴＩ）及びプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）である。通常、ほぼ検出不能なレベルまでウイルス負荷量を減少させるために、優先的に２つ以上の種類から２〜４種の薬物が組み合わされる。感染患者をＨＡＡＲＴで早期治療することにより、ＣＣＲ５の使用からＣＸＣＲ４のようなその他のケモカインレセプターへのウイルス菌株の移行が防止される（Connor (1997) J. Exp. Med. 185, 621-628）。本発明に開示されるような構築物は、ＨＡＡＲＴに加えて、静脈内に、皮下に、及び／又は脳脊髄液の中に投与することができる。本発明の構築物と組み合わせるための他の薬剤には、特に、インテグラーゼ阻害剤、例えばラルテグラビルが含まれる。
【００８２】
さらなる実施形態では、本明細書に含まれる組成物は、所望により、適切な検出手段をさらに含む、診断用組成物であってもよい。
【００８３】
さらに別の実施形態では、本発明は、定義されるような少なくとも１つのＳＣＲ−Ａｂ構築物を含むキットを提供する。有利には、本発明のキットは、所望により、医学的、科学的又は診断のアッセイ及び目的の実施に必要なバッファー（１又は複数）、保存溶液及び／又は残りの試薬若しくは材料をさらに含む。さらに、本発明のキットの一部は、個別にバイアル又は瓶に、或いは、容器又は複数容器ユニットと組み合わせて包装することができる。一実施形態では、上記キットは、補体因子Ｈ由来ショートコンセンサスリピート（ｆＨ由来ＳＣＲ）と結合分子との両方が１つの容器に独立して存在する、本発明に従うショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）を含んでもよい。別の実施形態では、上記補体因子Ｈ由来のショートコンセンサスリピート（ｆＨ由来ＳＣＲ）と結合分子は、２つ以上の容器に独立に存在し、含まれるｆＨ由来ＳＣＲと含まれる結合分子とを接触させた後に、共有結合したＳＣＲ−Ａｂ又は非共有結合したＳＣＲ−Ａｂが形成される。
【００８４】
本発明のキットは、特に、本発明の方法を実行するために、有利に用いることができ、本明細書で言及される多様な用途に、例えば、診断キットとして、研究ツール又は医用ツールとして、用いることができる。その上、本発明のキットは、科学的、医学的及び／又は診断の目的に適切な検出手段を含んでもよい。キットの製造は、当業者に公知の標準的手順に従うことが好ましい。
【００８５】
上記の記述に加えて、本発明はまた、癌性疾患、腫瘍疾患及び／又は過形成疾患の医学的介入に特に有用な以下の項目にも関する。
【００８６】
項目１．（ａ）補体因子Ｈ由来ショートコンセンサスリピート（ｆＨ由来ＳＣＲ）；及び
（ｂ）癌細胞、悪性細胞又は腫瘍細胞を特異的に認識する又はそれらに特異的に結合する結合分子、を含み、上記ｆＨ由来ＳＣＲが、ヘパリンに結合可能なポリペプチドを含む、ショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）
【００８７】
項目２．上記ｆＨ由来のＳＣＲが、ＳＣＲ７、ＳＣＲ９、ＳＣＲ１３及びＳＣＲ１８〜２０、又は上記ｆＨ由来のＳＣＲ７、ＳＣＲ９、ＳＣＲ１３及びＳＣＲ１８〜２０の機能性フラグメントからなる群より選択されるか、或いは人工ＳＣＲ（ａＳＣＲ）である、項目１に従うショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【００８８】
項目３．上記癌細胞、悪性細胞又は腫瘍細胞が、乳癌細胞、バーキットリンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、結腸直腸癌細胞、転移性結腸直腸癌細胞、非ホジキンリンパ腫細胞、肺癌細胞、慢性リンパ性白血病細胞、微小転移又は残留腫瘍細胞からなる群より選択される、項目１又は２に従うショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【００８９】
項目４．上記結合分子が、抗体分子、レセプター分子、アプタマー又はＤＡＲＰｉｎ或いはそれらのリガンド結合フラグメントを含む、項目１〜３のいずれか１項目のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【００９０】
項目５．上記抗体分子が、ＣＤ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ｅｒｂＢ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＩＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＴＡＧ−７２、ＴＡＬ−６、ＴＲＡＩＬＲ及びＶＥＧＦＲからなる群より選択されるエピトープを認識するモノクローナル抗体である、項目４のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【００９１】
項目６．上記補体因子Ｈ由来ショートコンセンサスリピート（ｆＨ由来ＳＣＲ）及び上記結合分子が共有結合又は非共有結合している、項目１〜５のいずれか１項目のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【００９２】
項目７．上記補体因子Ｈ由来ショートコンセンサスリピート（ｆＨ由来ＳＣＲ）及び上記結合分子が一本鎖多機能ポリペプチドに含まれる、項目１〜５のいずれか１項目のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【００９３】
項目８．上記ｆＨ由来のＳＣＲが、
（ａ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０又は配列番号３２に含まれるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチド或いはそれらの機能性フラグメント；
（ｂ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０又は配列番号３２に含まれるアミノ酸配列と少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチドであって、上記ポリペプチドが上記病原菌の補体因子Ｈ結合部位に結合する能力がある、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９又は配列番号３１に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド或いはそれらの機能性フラグメント；
（ｄ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９又は配列番号３１に含まれるポリヌクレオチドとハイブリダイズすることの可能なポリヌクレオチドの相補的配列によりコードされるポリペプチドであって、上記ポリペプチドが上記病原菌の補体因子Ｈ結合部位に結合する能力がある、ポリペプチド；並びに
（ｅ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９又は配列番号３１に含まれる核酸配列と少なくとも６０％同一である核酸分子によりコードされるポリペプチドであって、上記ポリペプチドが上記病原菌の補体因子Ｈ結合部位に結合する能力がある、ポリペプチド：
からなる群より選択される、項目１〜７のいずれか１項目のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【００９４】
項目９．上記ｆＨ由来ＳＣＲが、配列番号４又は配列番号２２に含まれるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチド或いはそれらの機能性フラグメントを含む、項目１〜８のいずれか１項目のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【００９５】
項目１０．項目１〜９のいずれか１項目のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）をコードするポリヌクレオチド。
【００９６】
項目１１．項目１０のポリヌクレオチドを含むベクター。
【００９７】
項目１２．項目１０のポリヌクレオチド又は項目１１のベクターをトランスフェクトされた細胞。
【００９８】
項目１３．項目１１の細胞を培養すること、及び上記ポリペプチドを培養物から単離することを含む、項目１〜９のいずれか１項目のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）の調製のための方法。
【００９９】
項目１４．上記ｆＨ由来ＳＣＲと上記結合分子とをカップリングすることを含む、項目１〜９のいずれか１項目のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）の調製のための方法。
【０１００】
項目１５．上記ｆＨ由来のＳＣＲが、スルホスクシンイミジル  ４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート（スルホ−ＳＭＰＢ）化学架橋を用いて上記結合分子とカップリングされている、項目１４の方法。
【０１０１】
項目１６．上記ｆＨ由来のＳＣＲが、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を形成することにより上記結合分子と連結されている、項目１４の方法。
【０１０２】
項目１７．項目１〜９のいずれか１項目のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）を含む組成物。
【０１０３】
項目１８．所望により、医薬品として許容される担体をさらに含む医薬組成物である、項目１７の組成物。
【０１０４】
項目１９．所望により、適切な検出手段をさらに含む診断用組成物である、項目１７の組成物。
【０１０５】
項目２０．癌性疾患の予防、治療又は改善のための医薬組成物の調製のための、項目１〜９のいずれか１項目のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）の使用。
【０１０６】
項目２１．癌性疾患の予防、治療又は改善のための医薬組成物として使用するための、項目１〜９のいずれか１項目のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）。
【０１０７】
項目２２．項目１〜９のいずれか１項目のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）或いは項目１８又は１９の組成物をこのような予防又は治療を必要とする哺乳類に投与することを含む、癌性疾患の予防、治療又は改善のための方法。
【０１０８】
項目２３．上記哺乳類がヒトである、項目２２に従う方法。
【０１０９】
項目２４．上記癌性疾患が、乳癌、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌、非ホジキンリンパ腫、肺癌又は慢性リンパ性白血病であるか、或いは、微小転移又は残留腫瘍から生じる、項目２０の使用、項目２０のショートコンセンサスリピート−抗体構築物或いは項目２２又は２３の方法。
【０１１０】
項目２５．項目１〜９のいずれか１項目のショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）、項目１０のポリヌクレオチド、項目１０のベクター又は項目１７〜１９のいずれか１項目の組成物を含む、キット。
【０１１１】
病原菌に対して産生された結合分子及び対応するショートコンセンサスリピート−抗体構築物に関して本明細書の上記に提供される実施形態は、必要な変更を加えて、癌細胞／悪性細胞／腫瘍細胞を特異的に認識する、且つ／又は、それらに特異的に結合する結合分子を含むショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）に関連する、上記に提供される項目に適用される。
【０１１２】
全ての実施形態において、本発明のＳＣＲ−Ａｂは、医学的／薬学的介入に特に有用であることが想定される。従って、そのような医学的／薬学的介入を必要とする被験体は、本発明の構築物／化合物で治療してもよい。治療される予定の被験体は、哺乳類、特に、ヒトであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】単離されたｆＨ由来のＳＣＲ２、７及び１３のドットブロット解析による検出を表す図である。
【図２】ＳＣＲ７でのカップリング手順の後、表１に記載されるとおりの結合分子２Ｇ１２、４Ｅ１０、３Ｄ６及び２Ｆ５を含むＡｂ−ＳＣＲ構築物を、還元条件下、１２％ ＳＤＳ−ｐａｇｅゲルでのウエスタンブロット解析を用いて調べた図である。構築物は、ＳＣＲを認識するＨＲＰ標識抗ＨＩＳ−ｔａｇ−ｍＡｂにより可視化した。重鎖と軽鎖の双方が５０ｋＤ又は２５ｋＤから、結合分子＋カップリングしたＳＣＲの分子量にそれぞれ相当する約６０ｋＤ及び３５ｋＤにそれぞれ変化した。
【図３】塩勾配でヘパリンカラムから溶出した画分のスロットブロット分析を表す図である。
【図４】ＳＤＳ−ｐａｇｅ電気泳動ゲルの銀染色による、塩勾配でヘパリンカラムから溶出した画分の分析を表す図である。
【図５】ｆＨ枯渇血清によるＭＭＴＶの溶解を示すグラフである。単離したウイルスを、正常マウス血清（ＮＭＳ；深緑及びシアン色の線）とともに、入力対照として何も補充しないＲＰＭＩ  １６４０（赤及び緑色の線）又はｆＨ枯渇血清と呼ばれる、５％未満のｆＨを含有するＮＭＳ（茶及び青色の線）中でインキュベートした。全ての血清は、ＲＰＭＩ  １６４０に１：１０で希釈した。残留ＭＭＴＶ（マウス補体に溶解されない）のＲＮＡを単離し、逆転写酵素リアルタイム−ＰＣＲにより増幅した。Ｃｔ値の約３．３の増加は、ウイルス力価の約１ ｌｏｇの減少に相当する。従って、対照血清のＣｔ値が約２０．２（赤及びピンク色の線、Ｃｔ値２０．０、２０．４）から３６．５（ピンク及び青色の線、Ｃｔ値３７．３及び３５．７）に増加したため、ｆＨ枯渇血清（Δ−ｆＨ血清）はＭＭＴＶの量を５ ｌｏｇ超に減少させる。
【図６】ＳＣＲ−Ａｂ構築物によるＦＶの溶解を示すグラフである。単離したウイルスを、正常マウス血清（ＮＭＳ；赤及び茶色の線）とともに、入力対照として何も補充しないＲＰＭＩ  １６４０（シアン及びピンク色の線）又はＡｂ＃４８とカップリングされたＳＣＲ７を含有するＮＭＳ（ＳＣＲ７Ａｂ＃４８；茶及び青色の線）中でインキュベートした。全ての血清は、ＲＰＭＩ  １６４０に１：１０で希釈した。残留ＦＶ（これはマウス補体に溶解されなかった）のＲＮＡを単離し、逆転写酵素リアルタイム−ＰＣＲにより増幅した。Ｃｔ値の約３．３の増加は、ウイルス力価の約１ ｌｏｇの減少に相当する。従って、対照血清のＣｔ値が約１７．０（赤及び茶色の線、Ｃｔ値１７．０、１７．０）から２３．３（茶及び青色の線、Ｃｔ値２３．２及び２３．４）に増加したため、ＳＣＲ−Ａｂ構築物はＦＶの量を２ ｌｏｇ超に減少させる。
【図７】ＦＡＣＳ解析により決定した、ＦＶ感染マウスの脾臓における感染細胞の量を示す図である。感染動物において、細胞の約１５％がＦＶ−抗原陽性であり、一方、ウイルス特異的抗体Ａｂ＃４８とカップリングしたＳＣＲ７、１３及び１８〜２０でさらに処理した場合に感染細胞の量は大幅に減少した。対照構築物（ＳＣＲ２−Ａｂ＃４８）も感染細胞のわずかな減少を示した、これはおそらくＡｂに媒介されたものであろう。
【図８】ｆＨ由来ＳＣＲ７によるＨＩＶの溶解を示す図である。ＨＩＶを、ＮＨＳ、ＨＩＶ特異的ｍＡｂ  ３Ｄ６とカップリングしたＳＣＲ７（構築物）、カップリングせずに混合したＳＣＲ及び抗体３Ｄ６（ＳＣＲ７＋３Ｄ６）又は単離抗体（３Ｄ６）とともにインキュベートした。界面活性剤（Ｉｇｅｐａｌ）は１００％の溶解を示す。
【図９】ｆＨ由来構築物の存在下での感染アッセイを示す図である。溶解の後、サンプルを末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に適用し、５日間インキュベートした。ＮＨＳは細胞の活発な感染を誘導したが、構築物は産生したＨＩＶの量を大幅に減少させた。カップリングしていない化合物の混合物には、効果がなかった。ウイルス複製を、感染後５日目に標準的なｐ２４  ＥＬＩＳＡにより定量化した。この場合もやはり、ＳＣＲと抗体とのカップリングは、ウイルス力価の効率的な減少のための前提の必要条件(pre-requisite)であった。
【図１０】ＳＣＲ９又はＳＣＲ７によるＨＩＶ−１の溶解を示す図である。ＨＩＶ−１を、ＳＣＲ７若しくはＳＣＲ９を含有するＮＨＳ（ＲＰＭＩ  １６４０に１：１０で希釈）又はさらなる補充のないＮＨＳ（ＲＰＭＩ  １６４０に１：１０で希釈）とともにインキュベートした。さらに対照としてＩｇｅｐａｌ（１００％溶解）及び熱失活ＮＨＳ中のＨＩＶ（ＨＩＶ、バックグラウンド溶解）を用いた。ＨＩＶ又はＮＨＳでインキュベートしたＨＩＶと比較して、ＳＣＲ７又はＳＣＲ９を添加することにより、ＨＩＶの活発なウイルス溶解が誘導された。従って、ＳＣＲ９も抗体のエフェクター機能を改善できる。
【図１１】ｆｈ由来ＳＣＲ１３によるＭＨＶの溶解を示す図である。コロナウイルスファミリーのメンバーであるマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）を、正常マウス血清（ＮＭＳ；ライン４，５）とともに、或いは対照ＳＣＲを含有するＮＭＳ（ライン６，７）又はＳＣＲ１３を含むＮＭＳ（ライン８，９）中でインキュベートした。４５分間のインキュベーションの後、残留ＭＨＶ（マウス補体に溶解されず）のＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲで増幅して、ＭＨＶ特異的なＰＣＲ産物を３８０ｂｐ前後で検出した。対照構築物又はＮＭＳはウイルスＲＮＡを減少させることができなかったが、ＳＣＲ１３はＭＨＶの完全な破壊を誘導した。この実験は、ＳＣＲ１３がレトロウイルス（ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＶ、ＭＭＴＶ）のみでなく、その他のファミリーのウイルスでも効果的であることを示す。
【図１２】ｆＨ由来ＳＣＲ  ７による腫瘍細胞の溶解を示す図である。ＳＯＫ３−細胞（ヒト卵巣腺癌細胞）を、ｆＨ由来ＳＣＲ（ＳＣＲ７）の不在下（左）又は存在下（右）で、ヒト血清とともにインキュベートした。Ｃ３沈着（ＦＬ−１）及びＰＩ染色（ＦＬ−２）により、ＳＣＲが多くのＣ３沈着を誘導し、腫瘍細胞の溶解を１３％から２４％に増加させたことが示された。
【図１３】ｆＨ由来ＳＣＲの存在による、Ｂ細胞カウント数の減少を示す図である。ヒトＢリンパ球バーキットリンパ腫細胞株のＲａｊｉ細胞の量は、抗ＣＤ２０抗体の不在下で、ｆＨ由来ＳＣＲを予め存在させた場合に大幅に減少した。この効果は、抗ＣＤ２０を抗ＩｇＧ抗体で架橋するとさらに強化された。
【図１４】例示的人工(artifical)ＳＣＲ（ａＳＣＲｉ）の精製を示す図である。最適化したＳＣＲをＰ．パストリス系で発現させ、標準法によってヘパリンカラム(colums)により精製した。精製した産物を、ウエスタンブロット解析により同定し、例となるａＳＣＲのＨｉｓ−ｔａｇに対するＰＯＸ−標識抗体の結合を介して可視化した。ブロットにより、濃縮した単量体及び二量体の例示的ａＳＣＲを表す、２つのブロードなバンドが示される。このバンドのスミアはタンパク質のグリコシル化によるものである。結合したタンパク質は、高塩バッファー（溶出液）で溶出後にヘパリンカラムから放出された。フロースルー（ＦＴ）中にａＳＣＲは見出されなかった。
【図１５】ａＳＣＲによるＨＩＶ−１の溶解を示す図である。ＨＩＶ−１を、例示的人工ＳＣＲ（ａＳＣＲｉ）を様々な濃度で含有するＮＨＳ（ＲＰＭＩ  １６４０に１：１０で希釈）又はＮＨＳ（ＲＰＭＩ  １６４０に１：１０で希釈）とともにインキュベートした。全てのサンプルは、補体活性化を促進するために１:５００希釈にてＨＩＶ−１特異的ｍＡｂ  ２Ｇ１２をさらに含んだ。さらなる対照として、Ｉｇｅｐａｌ（１００％溶解）及び熱失活ＮＨＳ中のＨＩＶ（ｈｉＮＨＳ、バックグラウンド溶解）を使用した。ＨＩＶ又はＮＨＳでインキュベートしたＨＩＶと比較して、ａＳＣＲｉを等モル量で添加してもＣｏＭＬは促進されなかったが（ａＳＣＲ−１）、１２０倍過剰（ｆＨに対して）で添加すると、ＨＩＶの活発なウイルス溶解を誘導し、ウイルスをほぼ１００％まで除去した（ａＳＣＲ−１２０）。従って、抗体とカップリングした場合、人工ＳＣＲもエフェクター機能を改善できる。
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
本発明及びその多くの利点のさらなる理解をもたらす、以下の例示的なものとなる限定されない実施例により、本発明をさらに説明する。
【０１１５】
以下の例は本発明を例示する。
【実施例】
【０１１６】
実施例１：ショートコンセンサスリピート−抗体構築物の調製
補体因子Ｈ由来のショートコンセンサスリピート（ｆＨ−ＳＣＲ）ＳＣＲ２、ＳＣＲ７、ＳＣＲ９、ＳＣＲ１３及びＳＣＲ１８〜２０をコードする遺伝子配列を含むコドン最適化プラスミドを、ＧｅｎｅＡｒｔより購入した。
【０１１７】
ＳＣＲ２、ＳＣＲ７、ＳＣＲ９、ＳＣＲ１３及びＳＣＲ１８〜２０をコードするＳＣＲポリヌクレオチド配列を、次のプライマーセット（Ｍｅｔａｂｉｏｎ製プライマー）を用いて増幅した。
【化４−１】
2010526528.tif 000012
【化４−２】
2010526528.tif 000013
【０１１８】
合成ＳＣＲであるｍＳＣＲ２、ｍＳＣＲ７、ｈＳＣＲ７、ｈＳＣＲ９、ｍＳＣＲ１３、ｈＳＣＲ１３、ｍＳＣＲ１８〜２０及びｈＳＣＲ１８〜２０（全てＧｅｎｅＡｒｔ）を、次のプロトコール（Ｂｒｉｌｌａｎｔ  ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ  Ｑ−ＰＣＲ、ＢｉｏＲａｄ）を用いてリアルタイムＰＣＲにより増幅した（ＢｉｏＲａｄ）。
【化５】
2010526528.tif 000014
【０１１９】
ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動（２％ ＴＡＥ）により分析し、特異的なバンドを抽出し、精製した（ゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）。サンプルを特異的な酵素で消化させ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、それらのきまったベクターに連結した（また、適切な酵素で消化させた）。以下のリストに、クローニングの詳細の概要を示す。
ｍＳＣＲ２          ｐＰＩＣＺαＡ中、制限部位：EcoRI(5’側)及びXbaI(3’側)
ｍＳＣＲ７          ｐＰＩＣＺαＡ中、制限部位：EcoRI(5’側)及びXbaI(3’側)
ｈＳＣＲ７          ｐＰＩＣＺαＡ中、制限部位：EcoRI(5’側)及びXbaI(3’側)
ｈＳＣＲ９          ｐＰＩＣＺαＡ中、制限部位：EcoRI(5’側)及びXbaI(3’側)
ｍＳＣＲ１３        ｐＰＩＣＺαＡ中、制限部位：EcoRI(5’側)及びXbaI(3’側)
ｈＳＣＲ１３        ｐＰＩＣＺαＡ中、制限部位：KpnI (5’側)及びXbaI(3’側)
ｍＳＣＲ１８〜２０  ｐＰＩＣＺαＣ中、制限部位：ClaI (5’側)及びXbaI(3’側)
ｈＳＣＲ１８〜２０  ｐＰＩＣＺαＡ中、制限部位：EcoRI(5’側)及びXbaI(3’側)
【０１２０】
ＰＣＲの結果、以下のポリヌクレオチド配列からなり、ＥｃｏＲＩ制限部位を５’末端に（下線）、且つ、ＸｂａＩ（ＳＣＲ２、７、９、１３及びヒトＳＣＲ１８〜２０）又はＣｌａＩ制限部位（マウスＳＣＲ１８〜２０）を３’末端に（二重下線）含む、合成ＤＮＡ分子が得られた。
【化６−１】
2010526528.tif 000015
【化６−２】
2010526528.tif 000016
【０１２１】
ＳＣＲ２、ＳＣＲ７、ＳＣＲ９、ＳＣＲ１３及びヒトＳＣＲ１８〜２０をコードする上記のポリヌクレオチドを、ＥｃｏＲＩ（５’側）及びＸｂａＩ（３’側）クローニング部位を介してｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。マウスＳＣＲ１８〜２０は、ＥｃｏＲＩ（５’側）及びＣｌａＩ（３’側）クローニング部位を介してｐＰＩＣＺαＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。配列決定により正確なリーディングフレームを確認した。ベクターを、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）酵母菌株Ｘ−３３に製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってトランスフェクトし、ゼオシンを用いて陽性選択した。陽性の酵母クローンを３０℃にて９６時間培養し、１％ メタノールを繰り返し添加することにより（２４時間毎）発現を誘導した。クローン発現をドットブロット法により分析した。
【０１２２】
得られる補体因子Ｈ由来のショートコンセンサスリピート（ｆＨ−ＳＣＲ）ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列により定義される：
【化７−１】
2010526528.tif 000017
【化７−２】
2010526528.tif 000018
【０１２３】
ＳＣＲを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）に推奨されるようにＮｉＮＴＡ−カラムを介して酵母上清から精製した。スロットブロットで陽性の画分（図１参照）を、ＰＢＳに対して透析した。
【０１２４】
フレンドマウス白血病ウイルス（ＦＶ）の外被タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体クローン＃４８；（Ａｂ＃４８；Ｃｈｅｓｅｂｒｏら（１９８１）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １１２（１）：１３１−４４）を、製造業者のプロトコールに従って、Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によりハイブリドーマ細胞の上清から精製した。
【０１２５】
等モル量のｆＨ−ＳＣＲ及びＡｂ＃４８抗体分子を、スルホ−ＳＭＰＢを製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ）に推奨されるように用いて架橋した。得られるショートコンセンサスリピート−抗体構築物（ＳＣＲ−Ａｂ）を、スピンフィルター（Ｚｅｂａ）によって精製した。成功した、ｆＨ−ＳＣＲとＡｂ＃４８抗体分子との架橋を、ウエスタンブロッティングにより解析した（図２参照）。
【０１２６】
実施例２：ＳＣＲ結合実験
生成されたＳＣＲが負に帯電した表面に結合することを示すため、トランスフェクトし、誘導した酵母菌株の上清をヘパリンカラムに適用した。このため、２０ｍｌ ｈＳＣＲ１８〜２０を遠心分離し、得られる上清（ＳＮ）をｄＨ２Ｏで１：２に希釈し、滅菌濾過した（０．２μｍ滅菌フィルタ）。処理したＳＮを、以下のプロトコールに従って１ｍｌ ＨｉＴｒａｐヘパリンカラム（ＧＥヘルスケア）及びＰｈａｒｍａｃｉａ  ＦＰＬＣ−Ｓｙｓｔｅｍを用いてヘパリンアフィニティークロマトグラフィーに適用した。
カラム：ＨｉＴｒａｐヘパリンＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
バッファーＡ：１／３ＰＢＳ
バッファーＢ：１×ＰＢＳ＋１Ｍ ＮａＣｌ
流速：１ｍｌ／分
ロード：３×４０ｍｌ 調製上清（１：２ Ｈ２Ｏ）
洗浄：バッファーＡ
勾配：線形  最大１００％  バッファーＢ  →１０分間保持
平衡化：バッファーＡ
【化８】
2010526528.tif 000019
【０１２７】
フロースルーを回収し、２回リロードした。カラムを低塩バッファー（１／３  ＰＢＳ）で広範囲に洗浄し、５０ｍＭから１Ｍ ＮａＣｌ（高塩バッファー：１Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳ）までの範囲の線形の塩勾配を総容積１００ｍｌで用いて、結合したタンパク質を溶出した。２ｍｌの個別の画分を回収し、スロットブロッティングによりｈＳＣＲ１８〜２０の存在をアッセイした。（ポリクローナル血清ヤギ−抗ヒトＦＨ  １：１．０００（Ｑｕｉｄｅｌ）；ウサギ−抗ヤギＨＲＰ複合体  １：２．０００（Ｄａｋｏ）（図３））。回収した画分の純度を調べるため、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１５％）の銀染色を行った（図４）。スロットブロットで陽性の画分は、３２ｋｄ前後の予想したバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに示した。３２前後のスミアはＳＣＲのグリコシル化によるものである。
【０１２８】
実施例３：ｆＨ枯渇血清によるインビトロ溶解
単離したＦＶウイルスを、正常マウス血清（ＮＭＳ）とともに、入力ウイルス対照として何も補充しないＲＰＭＩ  １６４０又はｆＨ枯渇血清と呼ばれる、５％未満のｆＨを含有するＮＭＳ（Δ−ｆＨ−血清）中でインキュベートした。全ての血清は、ＲＰＭＩ  １６４０に１：１０で希釈した。残留ＭＭＴＶ（マウス補体に溶解されなかった）のＲＮＡを単離し、逆転写酵素リアルタイム−ＰＣＲにより増幅した。ウイルスを遠心分離により単離し（Ｈｅｒｍｌｅ  Ｚ３８２Ｋ、Ｒｏｔｏｒ  ２２０．８７Ｖ０１、１ｈ／２５．０００ｇ／４℃）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。このため、ウイルスＲＮＡをウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で単離した。インビトロアッセイからの、又は血清から明らかになった、５μｌの溶出ＲＮＡを以下のプロトコールに従うリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの鋳型として得た：ＰＣＲ−ＭｉｘにはＲＴ−ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ、ｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素、ヌクレアーゼフリー水（ｉＳｃｒｉｐｔワンステップＲＴ−ＰＣＲキット、ＢｉｏＲａｄ）、Ｆ−ＭｕＬＶ  ｅｎｖ特異的蛍光性ＰＣＲプローブ（５'−ＦＡＭ  ＡＣＴ  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＣＣＧ、Ｍｅｔａｂｉｏｎ）、上流プライマー５’−ＡＡＧＴＣＴＣＣＣＣＣＣＧＣＣＴＣＴＡ−３’（配列番号１７）及び下流プライマー５’−ＡＧＴＧＣＣＴＧＧＴＡＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴ−３’（配列番号１８）が含まれた。ウイルスＲＮＡを、次のＰＣＲサイクルプロファイルを用いてｃＤＮＡに転写した：４５℃３０分、９５℃１５秒、６０℃３０秒（ｉＣｙｃｌｅｒ，ＢｉｏＲａｄ）。リアルタイムＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ増幅は、ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、ＢｉｏＲａｄ  ｉＳｃｒｉｐｔワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応ミックス（ＢｉｏＲａｄ）により２５μｌ反応混合物中で行った。グループ間の比較は臨界閾値（Ｑ値）の差を用いて行った。実験は二重反復で行った。Ｃｔ値の約３．３の増加は、ウイルス力価の約１ ｌｏｇの減少に相当する；次の表３を参照。
【表３】
2010526528.tif 000020
【０１２９】
従って、対照血清のＣｔ値がＣｔ２４．５から３３．０まで増加したため、ｆＨ枯渇血清は、ＦＶの量を約３ ｌｏｇ減少させる。
【０１３０】
同様に、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）は、別のマウスレトロウイルスであるが、補体に効率的に溶解され、ウイルス力価は約５ ｌｏｇ減少する；図５及び下の表４を参照のこと。
【表４】
2010526528.tif 000021
【０１３１】
Ｃｔ値はＲＴ−ＰＣＲにより、以下のプロトコールに従って決定した：ＭＭＴＶを、ＲＮＡｓｅの存在下、何も補充しないＲＰＭＩ  １６４０中の、ＮＭＳ又はｆＨ枯渇血清（最終希釈１:１０）とともに３７℃にて１５分間インキュベートした。ＲＮＡｓｅを不活性するためのウイルスＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）からＡＶＬバッファーを添加して溶解を停止させた。ＲＮＡ単離は、キットの中で製造業者の記載する通りに行った。溶解後のＭＭＴＶの量を定量化するため、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＱＲＴ−ＰＣＲキットを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを４５℃にて３０分間行い、それに続いてＳｙｂｒＧｒｅｅｎの存在下でｃＤＮＡのＰＣＲを行った。
【０１３２】
以下のプライマーを使用した。
ＭＭＴＶフォワード：５’−ＴＣＴＴＴＴＧＣＧＣＡＣＡＡＣＣＣＡＴＣＡＡ−３’（配列番号１９）
ＭＭＴＶリバース：５’−ＡＡＧＧＣＣＡＴＧＴＴＴＧＴＴＡＡＧＧＧＣ−３’（配列番号２０）
ｃＤＮＡは、次のＰＣＲサイクルプロファイルを用いて増幅した：５０サイクルで９５℃１５秒、６０℃３０秒（ｉＣｙｃｌｅｒ，ＢｉｏＲａｄ）。実験は二重反復で行った。
【０１３３】
実施例４：ＳＣＲ−Ａｂ構築物に誘導されるインビトロ溶解
本明細書に記載されるＳＣＲ−Ａｂ構築物が補体依存性溶解を強化する能力を、最初にインビトロ溶解アッセイを用いて証明した。そのために、フレンドウイルスの１０３脾臓 フォーカス形成単位（ＳＦＦＵ）を、ＳＣＲ７、ＳＣＲ１３、ＳＣＲ１８〜２０又はＳＣＲ２を含有する構築物、Ａｂ＃４８抗体とＳＣＲ７の非カップリング混合物（Ａｂ＃４８単独／ＳＣＲ単独）、抗体単独（Ａｂ＃４８単独）又はＳＣＲ単独（ＳＣＲ単独）と１０倍過剰で混合し、正常マウス血清（ＮＭＳ）とともに１：１０希釈中３０分間インキュベートした。対照として、ｆＨ枯渇マウス血清（ｆＨ枯渇ＮＭＳ）を使用した。ウイルスを遠心分離により単離し（Ｈｅｒｍｌｅ  Ｚ３８２Ｋ，Ｒｏｔｏｒ  ２２０．８７Ｖ０１、１ｈ／２５．０００ｇ／４℃）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。このため、ウイルスＲＮＡをウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で単離した。インビトロアッセイから、又は血清から明らかになった、いずれかの５μｌの溶出ＲＮＡを、以下のプロトコールに従うリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの鋳型として得た：ＰＣＲ−ＭｉｘにはＲＴ−ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ、ｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素、ヌクレアーゼフリー水（ｉＳｃｒｉｐｔワンステップＲＴ−ＰＣＲキット、ＢｉｏＲａｄ）、Ｆ−ＭｕＬＶ ｅｎｖ特異的蛍光性ＰＣＲプローブ（５'−ＦＡＭ  ＡＣＴ  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＣＣＧ、Ｍｅｔａｂｉｏｎ）、上流プライマー５’−ＡＡＧＴＣＴＣＣＣＣＣＣＧＣＣＴＣＴＡ−３’（配列番号１７）及び下流プライマー５’−ＡＧＴＧＣＣＴＧＧＴＡＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴ−３’（配列番号１８）が含まれた。ウイルスＲＮＡは、次のＰＣＲサイクルプロファイルを用いてｃＤＮＡに転写した：４５℃３０分、９５℃１５秒、６０℃３０秒（ｉＣｙｃｌｅｒ，ＢｉｏＲａｄ）。リアルタイムＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ増幅は、ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、ＢｉｏＲａｄ  ｉＳｃｒｉｐｔワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応ミックス（ＢｉｏＲａｄ）で、２５μｌ 反応混合物中で行った。実験は二重反復で行った。
【０１３４】
次の表５に示される結果は、ＳＣＲがＦＶ特異的抗体分子とカップリングしているの時のみＦＶが溶解されることを明らかに示している。ＳＣＲ７に対して架橋したＡｂ＃４８（ＳＣＲ７−Ａｂ＃４８）分子を一例として図６に示す。低い濃度であっても、ＳＣＲ−Ａｂ構築物はｆＨ枯渇マウス血清と同様にウイルス力価を減少させた；下表５を参照のこと。
【表５】
2010526528.tif 000022
【０１３５】
対照的に、非カップリングのＳＣＲ（ＳＣＲ単独）とＡｂ＃４８（Ａｂ＃４８単独）との混合物は補体媒介性溶解（ＣｏＭＬ）を誘導できなかった（表５）。ＳＣＲ１３又はＳＣＲ１８〜２０がＡｂ＃４８に架橋された構築物は同様に挙動し、ＣｏＭＬを誘導した（データは示さず）。
【０１３６】
実施例５：ＳＣＲ−Ａｂ構築物のインビボ評価
さらに、本明細書に記載されるＳＣＲ−Ａｂ構築物を、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて（このマウス系統はＦＶ感染に非常に感受性が高いため）インビボで試験した。
【０１３７】
そういう理由で、５μｇの個別のＳＣＲ−Ａｂ構築物を、氷上で総容積５００μｌのＦＶ（５００ＳＦＦＵ／動物）と３０分間混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙより購入）に尾静脈を介して適用した。対照動物に、何も補充しないＰＢＳ５００μｌ中５００ＳＦＦＵのＦＶを与えた。
【０１３８】
１週間後、動物を屠殺し、次のパラメータを決定した：脾臓の感染中心（感染中心アッセイ）及び脾臓の感染細胞（ＦＡＣＳ解析）。
【０１３９】
感染マウスからの脾臓細胞の系列希釈を、感受性のマウスｄｕｎｎｉ細胞の上に置き、３日間共培養し、エタノールで固定し、Ｆ−ＭｕＬＶエンベロープ特異的Ｍａｂ７２０（Dittmer (1998) J Virol 72:6554-8）により染色し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ及び基質で現像して、感染細胞の病巣を検出した。
【０１４０】
脾臓の感染中心の決定により、負に帯電した表面に結合しているＳＣＲを含んでいた構築物が感染を減少できたことが明らかとなった。対照構築物（ＳＣＲ２−Ａｂ＃４８）、又はＡｂ及びＳＣＲ（陽性対照）のいずれも不在下での感染は、ＦＶ感染に対する保護を誘導しなかったが、ＳＣＲ７、１３、又は１８〜２０或いはＳＣＲ７、１３、１８〜２０の混合物（ミックス）を含有するＳＣＲ−Ａｂ構築物は、感染中心を３ ｌｏｇ以下に減少させた；本明細書の以下に記載される表６を参照のこと。
【表６】
2010526528.tif 000023
【０１４１】
従って、ＳＣＲ７、１３又は１８〜２０がウイルス特異的Ａｂとカップリングされた場合のみ、感染中心の量は、いずれの構築物も含まない対照ＳＣＲと比較して大幅に減少した（約３ ｌｏｇ）；表６を参照のこと。予想したように、非感染対照マウス（陰性対照）は、このアッセイにおいてＦＶ特異的シグナルを示さなかった。
【０１４２】
二組目の実験では、未カップリングのＳＣＲとＡｂ＃４８との混合物（Ａｂ＃４８単独／ＳＣＲ７単独；等モル量のＡｂ及びＳＣＲ、合計５μｇ）を動物に尾静脈を介して適用した。６時間後、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、尾静脈を介して再びＦＶで感染させた（５００ＳＦＦＵ）。1週間後、動物を屠殺し、マウスの感染を上記のように判定した。
【０１４３】
レポーター細胞株での脾臓の感染中心の力価測定（titration）（ＩＣ−アッセイ）、及び未カップリングのＳＣＲとウイルス特異的Ａｂとの混合物で処置した感染動物のＦＡＣＳ解析による感染中心の検出を、以下に列挙して表７に示す。
【表７】
2010526528.tif 000024
【０１４４】
予想したように、未カップリングのＳＣＲとＡｂ＃４８との混合物は効果がなかった。脾臓における感染細胞の量も、ＩＣアッセイにおける感染中心も、いずれの構築物もない対照の設定、Ａｂ＃４８単独、Ａｂ＃４８と対照ＳＣＲ２、又はＳＣＲ７、１３若しくは１８〜２０とＡｂ＃４８との未カップリングの混合物と比較してもあまり減少しなかった；表７を参照。
【０１４５】
脾臓におけるＦＶ感染細胞の量を判定するため、ＦＡＣＳ解析を行った。脾臓細胞の懸濁液を、感染細胞の表面のＦ−ＭｕＬＶ  ｇｌｙｃｏ−Ｇａｇを認識するビオチン化モノクローナル抗体クローン＃３４；（Ａｂ＃３４；Chesebro et al. (1981) Virology 112(1): 131-44）とともにインキュベートした。洗浄段階の後、脾臓細胞をＦＩＴＣ結合ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ）とともにインキュベートした。蛍光シグナルを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いるＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで解析した。
【０１４６】
脾臓におけるウイルス負荷量を、ＦＡＣＳ解析で感染細胞のパーセントを測定すること及びレポーター細胞株を用いる脾臓細胞の力価測定により測定する。ＦＡＣＳ解析により、構築物不在時（ＦＶ、感染細胞１５％）又はＡｂ＃４８とカップリングした対照ＳＣＲ（感染細胞７％、図７を参照）と比較して、ＳＣＲ−Ａｂ構築物がＦＶ感染細胞の量を減少させること（脾臓における感染細胞の０．５〜２．５）が示された。
【０１４７】
実施例６：ＳＣＲ−Ａｂ構築物に誘導されるインビトロ溶解
架橋ＳＣＲ−３Ｄ６構築物によるＣｏＭＬの誘導を判定するため、ＨＩＶ−１をＲＰＭＩ−中でＳＣＲ−３Ｄ６とともに氷上で約１０分間プレインキュベートした。ＮＨＳを１:１０希釈で添加した。素早く１μｇ／μｌ ＲＮＡｓｅ  Ａを添加し、サンプルを３７℃にて１時間インキュベートした。未カップリング化合物（図８中のＳＣＲ７構築物）に対するＳＣＲ−３Ｄ６の効果を比較するため、一部のサンプルに未カップリングのＳＣＲ及びＡｂ（ＳＣＲ７＋３Ｄ６）、又はＳＣＲを含まないＡｂ単独（３Ｄ６；図８）を含めた。陽性対照としてＲＰＭＩ中１％ Ｉｇｅｐａｌを加えて１００％溶解を判定した。陰性対照として、１つのサンプルに何も補充しない入力ウイルスを含め、１つのサンプルは入力ウイルス及びＮＨＳから構成された。インキュベーションの後、ウイルスを１５０００ｒｐｍにて６０分間ペレット化した。ウイルスペレットのＲＮＡを、ウイルスＲＮＡ−単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）で製造業者の推奨する通りに単離し、Ｂｉｏｒａｄ製のＴａｑｍａｎ−Ｋｉｔを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ＰＣＲ−Ｍｉｘには、ｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素、ヌクレアーゼフリー水、ＨＩＶ特異的ＭＧＢ−プローブ（５’−ＦＡＭ−ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＧＧＧ  Ａ−ｍｇｂ−３'、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、上流プライマー５’−ＡＴＧ  ＴＴＡ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＡＴ  ＧＡ−３’（配列番号４３；Ｍｅｔａｂｉｏｎ）、下流プライマー５’−ＣＴＡ  ＴＧＴ  ＣＡＣ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＴＴＧ  ＧＴ−３’（配列番号４４；Ｍｅｔａｂｉｏｎ）及びウイルスＲＮＡ鋳型を含めた。増幅プロファイルは５０℃で１０分、及び９８℃で５分から開始した。その後に続く５０サイクルは９５℃、１５秒、５４℃で３０秒間であった。反応は、４０μｌの反応混合物中において二重反復で行った。
【０１４８】
実施例７：ＳＣＲ９に誘導されるＨＩＶ−１のインビトロ溶解
ＳＣＲ９によるＣｏＭＬの誘導を判定するため、ＨＩＶ−１ウイルスをＲＰＭＩ−培地中で１：１０希釈の正常ヒト血清（ＮＨＳ）とともに氷上で約１０分間インキュベートした。素早く１μｇ／μｌ ＲＮＡｓｅ  Ａを添加し、サンプルを３７℃にて１時間インキュベートした。その他のＳＣＲに対するＳＣＲ９の効果（図１０中のＳＣＲ９）を比較するため、未カップリングＳＣＲ７を含めた。両方のＳＣＲを、その系のｆＨの含量に対して計算して３００モル過剰にて適用した。陽性対照としてＲＰＭＩ−培地中１％ Ｉｇｅｐａｌを加えて１００％溶解を判定した。陰性対照として、１つのサンプルに熱不活性化血清を含む入力ウイルス（図１０中の入力対照）を含め、１つのサンプルは入力ウイルス及びＮＨＳから構成された。インキュベーションの後、ウイルスを１５０００ｒｐｍにて６０分間ペレット化した。ウイルスペレットのＲＮＡを、ウイルスＲＮＡ−単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）で製造業者の推奨する通りに単離し、Ｂｉｏｒａｄ製のＴａｑｍａｎ−Ｋｉｔを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ＰＣＲ−Ｍｉｘには、ｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素、ヌクレアーゼフリー水、ＨＩＶ特異的ＭＧＢ−プローブ（５’−ＦＡＭ−ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＧＧＧ  Ａ−ｍｇｂ−３'、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、上流プライマー５’−ＡＴＧ  ＴＴＡ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＡＴ  ＧＡ−３’（配列番号４３；Ｍｅｔａｂｉｏｎ）、下流プライマー５’−ＣＴＡ  ＴＧＴ  ＣＡＣ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＴＴＧ  ＧＴ−３’（配列番号４４；Ｍｅｔａｂｉｏｎ）及びウイルスＲＮＡ鋳型が含まれた。増幅プロファイルは５０℃で１０分、及び９８℃で５分から開始した。その後に続く５０サイクルは９５℃、１５秒、５４℃で３０秒間であった。反応は、４０μｌの反応混合物中において二重反復で行った。実施例４、５及び６を考えると、ＳＣＲ９と病原菌特異的結合分子のカップリングは、本発明によれば、さらに高い活性をもたらすと考えられる。
【０１４９】
実施例８：ＳＣＲ構築物の存在下でのＨＩＶ−１感染アッセイ
上記の通りの溶解実験の後（初期ウイルス濃度は４０ｎｇ ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３  ｐ２４等価物を含んだ）、ペレット化したサンプル（Ｈｅｒｍｌｅ  Ｚ３８２Ｋ，Ｒｏｔｏｒ  ２２０．８７Ｖ０１、１ｈ／２５．０００ｇ／４℃）を再懸濁し、ＩＬ−２及び１０％ ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ中、１０００００ＰＢＭＣを含有するＵ底９６穴プレートに移した。次に、プレートを３７℃にて一晩インキュベートした。翌日、細胞を洗浄し、新鮮培地に再懸濁した。１０μｌの各サンプルを採取し、１％ Ｉｇｅｐａｌ中１：１０に溶解し、ｐ２４  ＥＬＩＳＡ実験用に−８０℃にて保存した。これらのサンプルを感染０日とした。さらなるサンプルを、感染５日目及び１０日目に採取した。産生したウイルスの量を記載されるようにｐ２４−ＥＬＩＳＡにより測定した（Stoiber (1996) 前掲）。ＨＩＶ−１感染アッセイの結果を図９に表す。
【０１５０】
実施例９：インビトロＭＨＶ−溶解−アッセイ
コロナウイルスファミリーのメンバーである、マウス肝炎ウイルスＡ５９（ＭＨＶ；３×１０８プラーク形成単位を有する２０μｌのストック）を、ＮＭＳを１：５希釈で添加する前にＳＣＲ１３又はＳＣＲ２（ＳＣＲ対照、両方ともに１００倍過剰）とともにインキュベートした。サンプルは３７℃にて３０分間インキュベートした。溶解したウイルスのＲＮＡをＲＮＡｓｅに消化させた。４℃にて１３０００ｒｐｍでの１時間の遠心分離の後、上清を廃棄し、残った非溶解ＭＨＶのペレットを何も補充しないＲＰＭＩに再懸濁し、その後にＱＩＡＧＥＮキットを製造業者の推奨するとおりに用いてウイルスＲＮＡを単離した。単離ＲＮＡを、以下のプロファイルを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した（上流プライマー５’−ＴＣＣＴＧＧＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＴＴＡＣＣＣＡＧ−３’（配列番号４５）、下流プライマー５’−ＣＴＧＡＧＧＣＡＡＴＡＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＣ−３’（配列番号４６））。
サイクル１    １×    ５０．０℃    １０分間
サイクル２    １×    ９４．０℃    ５分間
サイクル３    ３５×  ９４．０℃    ３０秒間
５８．０℃    ３０秒間
７２．０℃    ４０秒間
【０１５１】
増幅したウイルスｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に適用し、エチジウムブロマイドで可視化した。図１０中、３８０ｂｐの予想したバンドが矢印で強調される。対照構築物又はＮＭＳはウイルスＲＮＡを減少させることができなかったが、ＳＣＲ１３はＭＨＶの完全な破壊を誘導した。この実験は、ＳＣＲ１３がレトロウイルス（ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＶ、ＭＭＴＶ）によってのみでなく、その他のウイルスファミリーのウイルスでも効果的であることを示す。実施例４、５及び６を考えると、ＳＣＲ１３と病原菌特異的結合分子とのカップリングは、本発明によれば、さらに高い活性をもたらすと考えられる。
【０１５２】
実施例１０：ＳＣＲ７−Ａｂの組合せによる腫瘍細胞の細胞溶解
ＳＯＫ３−細胞（１×１０６／ｍｌ）を、ＨＥＲ２／ｎｅｕの細胞外ドメインに特異的な抗体（腫瘍細胞に対するｍＡｂ（ＰＢＳ中１：１００希釈））とともにインキュベートし、洗浄後、補体の供給源として正常ヒト血清に晒した（ＮＨＳ、ＲＰＭ中１：１０；３７℃にてＩ３０分）。サンプルには加えてＳＣＲ７（データ１２）、又は対照ＳＣＲ２（データ１１）を含めた。サンプルには、ｆＨの血清濃度が５００μｇ／ｍｌであることを考慮して６０倍モル過剰量を含めた。再び洗浄した後、Ｃ３ｃに対するＦＩＴＣ−標識抗体を氷上で３０分間加えた（１：５００）後、さらなる洗浄ステップを続けた。サンプルをヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とともにインキュベートし、洗浄し、３％ ホルムアルデヒドを添加したＰＢＳで固定した。Ｃ３（ＦＬ−１−Ｈ）及びＰＩ染色（ＦＬ２Ｈ）の沈着をＦＡＣＳ解析により判定し、ＦＡＣｓ  Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により解析した。実施例４、５及び６を考えると、ＳＣＲ７と腫瘍細胞特異的結合分子のカップリングは、本発明によれば、さらに高い活性をもたらすと考えられる。
【０１５３】
実施例１１：ＳＣＲ−Ａｂの組合せによるヒトＢリンパ球バーキットリンパ腫細胞株の破壊
Ｒａｊｉ細胞（５×１０５）をＳＣＲ７又はＳＣＲ９とともに３７℃にて１時間それぞれインキュベートした（ｆＨと比較して５０倍過剰（図１３中で７−５０及び９−５０として示される））。示される場合、細胞を抗ＣＤ２０抗体（抗ｈＣＤ２０；Ｄａｋｏ）で先にインキュベートし、抗ＩｇＧと架橋した（ｍＩｇＧ；Ｄａｋｏ；図１３の２番目及び３番目のデータブロック）。両抗体をＲＰＭＩ中の１：５０希釈に用いた。洗浄後、ＮＨＳ（ＲＰＭＩ中１：１０）を添加し、サンプルを再び１時間インキュベートした。一部のサンプルにおいて、ＮＨＳを除くか（図１３の中央のブロック）、熱失活（ｈｉ）ＮＨＳに置き換えた。サンプルを再び洗浄し、１０％ ＦＣＳを含有する５００μｌ ＲＰＭＩとともに細胞培養インキュベーター（３７℃  ５％ ＣＯ２）中で一晩インキュベートした。次に、細胞を再び洗浄し、死細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色して、ＦＡＣＳ解析において生存細胞にゲートをかけた。生存細胞の量をＦＡＣＳ（１分）で計数し、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により解析した。実施例４、５及び６を考えると、ＳＣＲ７又はＳＣＲ９と腫瘍細胞特異的結合分子のカップリングは、本発明によれば、さらに高い活性をもたらすと考えられる。
【０１５４】
実施例１２：人工ＳＣＲ（ａＳＣＲ）の調製
例示的人工ショートコンセンサスリピート（ａＳＣＲ／；配列番号３２）をコードする遺伝子配列を含むコドン最適化プラスミドを、ＧｅｎｅＡｒｔより購入した。ａＳＣＲｉをｐＰＩＣＺαＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＣｌａＩ（５’側）及びＮｏｔＩ（３’側）クローニング部位を介してクローニングした。正確なリーディングフレームを配列決定により確認した。ベクターを、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）酵母菌株Ｘ−３３に製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってトランスフェクトし、ゼオシンを用いて陽性選択した。陽性の酵母クローンを３０℃にて９６時間培養し、０．５％ メタノールを繰り返し添加することにより（１２時間毎）発現を誘導した。クローン発現をドットブロット法により分析した。
【０１５５】
例示的人工ＳＣＲ（ａＳＣＲｉ）とヘパリンの結合を、次の変形を用いて分析した。結合したタンパク質を高塩バッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌを含有するＰＢＳ）により、勾配によるのではなくこのバッファーを直接適用することにより溶出した。画分をＰＢＳに対して透析し、濃縮した後、ウエスタンブロットにより分析した。ａＳＣＲｉはｆＨ配列を表さなかったので、ポリクローナル血清ヤギ−抗ヒトＦＨを、ａＳＣＲｉのＣ末端でｈｉｓ−ｔａｇを認識する直接ＰＯＸ−標識した抗ＨＩＳ抗体（１：２０００、Ｓｉｇｍａ）に置き換えた。図１４中のブロットは、濃縮した単量体（１５〜１８ｋＤ）及び二量体のａＳＣＲ（３０〜３６ｋＤ）を表す２つのブロードなバンドを示し、スミアはタンパク質のグリコシル化によるものである。結合したタンパク質を、高塩バッファー（溶出液）での溶出後にヘパリンカラムから放出した。フロースルー（ＦＴ）中にａＳＣＲは見出されなかった。
【０１５６】
実施例１３：人工ＳＣＲ（ａＳＣＲ）により誘導される補体媒介性溶解
人工ＳＣＲによる補体媒介性溶解（ＣｏＭＬ）の誘導を判定するため、ＨＩＶ−１を、ＲＰＭＩ−培地中、１:１０希釈の正常ヒト血清（ＮＨＳ）及び１：５００希釈のモノクローナルＨＩＶ特異的抗体２Ｇ１２（Ｐｏｌｙｍｕｎ，Ｖｉｅｎｎａ）とともに氷上で約１０分間インキュベートした。次に、サンプルを３７℃にて１時間インキュベートした。配列番号３１を有するａＳＣＲを等モル量で、且つその系のｆＨの含量に対して計算した１２０モル過剰で適用した。陽性対照としてＲＰＭＩ−培地中１％ Ｉｇｅｐａｌを加えて１００％溶解を判定した。陰性対照として、１つのサンプルに熱不活性化血清を含む入力ウイルス（図１５中のｈｉＮＨＳ）を含め、１つのサンプルは入力ＨＩＶ−１及びＮＨＳ及び２Ｇ１２から構成された（図１５中のＮＨＳ）。インキュベーションの後、ウイルスを１５０００ｒｐｍにて６０分間ペレット化した。ＣｏＭＬに起因して、ウイルス内のｐ２４タンパク質は上清に放出され、溶解の誘導の出力(read out)として用いることができる。ｆＨに対して等モル量のａＳＣＲを使用すると、ＣｏＭＬの増加は観察できなかった（ａＳＣＲ-１；図１５）。２０倍過剰では既に、実質的なＣｏＭＬが誘導された（示さず）。ａＳＣＲ濃度の増加につれて、ＨＩＶのＣｏＭＬはさらに強化され、結果として１２０倍過剰でほぼ１００％となった（ａＳＣＲ-１２０；図１５）。従って、ａＳＣＲは病原菌特異的Ａｂとカップリング又は連結された場合にＣｏＭＬを効率的に誘導することができる。実施例４、５及び６を考えると、人工ＳＣＲ９と病原菌特異的結合分子のカップリングは、本発明によれば、さらに高い活性をもたらすと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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