(57)【要約】  本発明は、下記式（Ｉ）で表わされる化合物、薬学的に許容される塩、プロドラックおよび／または溶媒和物の、アディポネクチンレベルの変化を示す疾患、またはアディポネクチンタンパク質レベルを変更することが必要となる疾患の治療用の医薬品の製造のための使用に関する。2010535706.tif 000025
2010535706.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表わされる化合物、薬学的に許容される塩、プロドラックおよび／または溶媒和物の、アディポネクチンレベルの変化を示す疾患、またはアディポネクチンタンパク質レベルを変更することが必要となる疾患の治療用の医薬品の製造のための使用：
2010535706.tif 000020
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素原子、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＣＮ、置換または非置換のアリール基、好ましくは置換または非置換のフェニル基、直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基、および基（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ８，（ここで、ｎは１、２および３から選択される整数であり、Ｒ８は水素原子または直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基である）から選択され、
基Ｘは、下記：
−３位で結合している、式（Ａ）のインダゾール：：
2010535706.tif 000021
および
−２位で結合している、式（Ｂ）のピリジン：
2010535706.tif 000022
（式中、
Ｒ３は、水素原子および直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基から選択され、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基およびハロゲンから選択される）から選択されるものである）。
【請求項２】
前記アディポネクチンレベルの変化を示す疾患、またはアディポネクチンタンパク質レベルを変更することが必要となる疾患が、糖尿病、肥満、メタボリック症候群、動脈硬化性心血管病、脂質異常症、および脂肪異栄養症から選択されるものである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記疾患が、脂質異常症、および脂肪異栄養症から選択されるものである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ１およびＲ２が、独立して、水素原子、直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基、および基（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ８（ここで、ｎは１、２、または３であり、Ｒ８が水素原子、直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基である）から選択されるものでる、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ１およびＲ２の少なくとも一つが水素原子である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
Ｒ１およびＲ２が水素原子である、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
ｎが１である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
Ｒ１がＣＨ２ＣＯ２Ｒ８（ここでＲ８は水素原子またはメチルである）である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
Ｒ２がアルキル基であり、好ましくはメチルである、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７が水素原子である、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
式（Ｉ）の化合物は下記の化合物から選択されるものである、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の使用：
2010535706.tif 000023
【請求項１２】
式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、プロドラックおよび／または溶媒和物：
2010535706.tif 000024
【請求項１３】
請求項１２において定義された式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラックおよび／または溶媒和物と、および少なくとも一種の薬学的に許容される担体、アジュバンド、および／またはビヒクルとを少なくとも含んでなる、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１２において定義された式（Ｉ）の化合物、その化粧料において許容できる塩、プロドラックまたは溶媒和物と、少なくとも一つの薬学的に許容しうる担体、アジュバンド、および／またはビヒクルとを含んでなる化粧料組成物。
【請求項１５】
請求項１２において定義された式（Ｉ）の化合物の、医薬品としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アディポネクチンレベルの変化を示す、あるいはアディポネクチンタンパク質レベルを変更することが必要となる、糖尿病、肥満、メタボリック症候群、動脈硬化性心血管病、脂質異常症、または脂肪異栄養症などのような疾患または状態の治療用の医薬の製造のための、Ｎ−（２−チアゾリル）−アミド誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪組織は、アディポカイン（adipokines）と呼ばれる、多様な代謝的に活性な重要なタンパク質を分泌する、重要な内分泌器官である。いくつかの知られているアディポカインには、レプチン、腫瘍壊死因子（TNF）α、インターロイキン（IL）−６、アジプシン、およびアディポネクチンがある。ほとんどのアディポカインが脂肪細胞により、そのものとして分泌されるが、いくつかは、脂肪組織において他の細胞種から分泌される。
【０００３】
アディポネクチンは、白色脂肪組織によって合成されるタンパク質であり、比較的高い血中濃度（２−３０μｇ／ｍｌ）で循環して、それはブドウ糖と脂質代謝において重要な役割を有する。いくつかの研究により、アディポネクチンとインスリン感受性との関係が示されている。また、アディポネクチンと心血管疾患との関係も立証されている。
【０００４】
アディポネクチンは４つのドメインから成る、２４７アミノ酸のタンパク質（Ｍｒ  ３０  ｋＤａ）である。最初のドメインは、脂肪細胞の外へホルモンの分泌を許すアミノ末端基領域に位置するシグナル・ペプチドであり、２番目のドメインは種において異なる２８アミノ酸領域であり、３番目のドメインは、２２のグリシン−Ｘ−チロシンのトリプレットによって形成されたコラーゲン様領域であり、そして最後のカルボキシ末端領域の球状ドメインからなる。
【０００５】
アディポネクチン分子は、含脂肪細胞の中で翻訳後修飾を受けて、多量体に分類される、三量体、六量体、および高分子量のオリゴマーとなる。通常、単量体のアディポネクチンは血流中に検出されない。
【０００６】
低い血中アディポネクチンレベルは、糖尿病、メタボリック症候群、脂質異常症、脂肪異栄養症、そして動脈硬化性心血管病などのような、不利な代謝状態と関連している。これらの疾患においては、また、アディポネクチンｍＲＮＡの発現の減少が血中および脂肪組織中において見出されており、これは含脂肪細胞機能の変化によるものであると考えられている。
【０００７】
脂質量が増えるに従い、その濃度が増加する他のアディポカインと異なって、循環アディポネクチンレベルは肥満者において逆説的に減少し、循環アディポネクチンレベルが体格指数（BMI）と、そして体脂肪率に逆比例する（Arita Y et al., “Paradoxical decrease of an adipose-specific protein, adiponectin, in obesity”, Biochem Biophys Res Commun 1999; 257 (1): 79-83; Cnop M et al., “Relationship of adiponectin to body fat distribution, insulin sensitivity and plasma lipoproteins: evidence or independent roles of age and sex”, Diabetologia 2003; 46 (4): 459-469; Kern PA et al., “Adiponectin expression from human adipose tissue: relation to obesity, insulin resistance, and tumor necrosis factor-alpha expression”, Diabetes 2003; 52 (7): 1779-1785）。
【０００８】
さらに、いくつかの研究が、プラズマアディポネクチンレベルとインスリン感受性との相関関係を示している（Berg AH et al., “The adipocyte-secreted protein Acrp30 enhances hepatic insulin action”, Nat Med 2001; 7 (8): 947-953; Combs TP et al., “Induction of adipocyte complement-related protein of 30 kilodaltons by PPARgamma agonists: a potential mechanism of insulin senitization”, Endocrinology 2002; 143 (3): 998-1007; Hotta K et al., “Circulating concentrations of the adipocyte protein adiponectin are decreased in parallel with reduced insulin sensitivity during the progression to type 2 diabetes in rhesus monkeys”, Diabetes 2001; 50 (5): 1126-1133; Steffes MW et al. “Serum adiponectin in young adults - interactions with central adiposity, circulating levels of glucose, and insulin resistance: the CARDIA study”, Ann Epidemiol 2004; 14 (7): 492-498; Weyer C et al.,“Hypoadiponectinemia in obesity and type 2 diabetes: close association with insulin resistance and hypernsulinemia”, J Clin Endocrinol Metab 2001; 86 (5): 1930-1935）。
【０００９】
実際に、アディポネクチンレベルの減少が、糖尿病自体の進行の前に、インシュリン耐性を示すことを、いくつかの研究が示している（例えば、上記したHotta K et al.）。他の研究は複数の民族において、高いアディポネクチンレベルを、２型糖尿病の進行のリスク低下と関連づけた（Daimon M et al., “Decreased serum levels of adiponectin are a risk factor for the progression to type 2 diabetes in the Japanese Population: the Funagata study”, Diabetes Care 2003; 26 (7): 2015-2020; Lindsay RS et al., “Adiponectin and development of type 2 diabetes in the Pima Indian population”, Lancet 2002; 360 (9326): 57-58; Spranger J et al., “Adiponectin and protection against type 2 diabetes mellitus”, Lancet 2003; 361 (9353): 226-228）。
【００１０】
また、アディポネクチンレベルの減少と、冠状動脈性心臓病とが関連づけられている（Hotta K et al. “Plasma concentrations of a novel, adipose-specific protein, adiponectin, in type 2 diabetic patients.”Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000; 20 (6): 1595-1599; Pischon T et al.,“Plasma adiponectin levels and risk of myocardial infarction in men.” JAMA 2004; 291 (14): 1730-1737）。二番目の研究は、アディポネクチンレベルの高い被験者において、心筋梗塞のリスクがかなり減少していることを示した。いくつかの研究が、アディポネクチンと心血管系危険因子との関係を調べている（Hotta K et al. “Plasma concentrations of a novel, adipose-specific protein, adiponectin, in type 2 diabetic patients.” Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000; 20 (6): 1595-1599; Shetty GK et al, “Circulating adiponectin and resistin levels in relation to metabolic factors, inflammatory markers, and vascular reactivity in diabetic patients and subjects at risk for diabetes” Diabetes Care 2004; 27  (10): 2450-2457; Mantzoros CS et al, “Circulating adiponectin levels are associated with better glycemic control, more favorable lipid profile, and reduced inflammation in women with type 2 diabetes”, J Clin Endocrinol Metab 2005; 90 (8): 4542-4548; Schulze MB et al., “Relationship between adiponectin and glycemic control, blood lipids, and inflammatory markers in men with type 2 diabetes”, Diabetes Care 2004; 27 (7): 1680-1687）。これらの結果は、アディポネクチンが、アテローム性動脈硬化症において重要な役割を果たしていることを示唆している。
【００１１】
糖尿病および皮下脂肪萎縮症マウスへのアディポネクチンの投与が、インスリン感受性の改善を示している。野生型マウスとマウスの１型と２型糖尿病モデルにおいて、アディポネクチンの腹膜注射が血糖値のかなりの減少を引き起こした（Berg AH et al., “The adipocyte-secreted protein Acrp30 enhances hepatic insulin action”, Nat Med 2001, 7 (8): 947-953;）。アディポネクチン球状ドメインの全身性注入によって、動物肥満、糖尿病、および皮下脂肪萎縮症モデルにおいて同様の結果が得られた（Yamauchi T et al.,“The fat-derived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity”, Nat Med 2001, 7 (8): 941-946）。
【００１２】
また、アディポネクチンの過剰発現の効果もまた動物モデルにおいて研究されている。球形のアディポネクチンを過剰発現する遺伝子導入マウスは、高脂肪食で引き起こされたインシュリン耐性に対して抵抗性を示した（Yamauchi T et al., “Globular adiponectin protected ob/ob mice from diabetes and ApoEdeficient mice from atherosclerosis”, J Biol Chem 2003, 278 (4): 2461-2468）。慢性的に高いアディポネクチンレベルを示す他の遺伝子導入マウスは、脂質クリアランスの増加を、インシュリン介在型の内因性ブドウ糖生産の抑圧とともに示した（Combs TP et al., “A transgenic mouse with a deletion in the collagenous domain of adiponectin displays elevated circulating adiponectin and improved insulin sensitivity”, Endocrinology 2004, 145 (1): 367-383）。別のアテローム性動脈硬化症マウスモデルにおいて、球形アディポネクチンが、アテローム性動脈硬化症から守ることが示された（Yamauchi T et al., “Globular adiponectin protected ob/ob mice from diabetes and ApoEdeficient mice from atherosclerosis”, J Biol Chem 2003, 278 (4): 2461-2468）。
【００１３】
動物モデルへのアディポネクチンの直接投与により示された有用さにもかかわらず、アディポネクチンの大きい立体構造のため、さらに翻訳後プロセシングの必要性のため、ヒトに直接アディポネクチンを投与することは複雑になる。それゆえ、化合物を投与し、アディポネクチン発現を活性化し、生体内のアディポネクチン発現を活性化することへの希求が存在する。そのような化合物の例として、いくつかの研究が、チアゾリンジオン類による治療がヒトにおいて循環アディポネクチンレベルを増加させることを明らかにしている。これはロシグリタゾン（rosiglitazone）によって観察された（Combs TP et al., “Induction of adipocyte complement-related protein of 30 kilodaltons by PPARgamma agonists: a potential mechanism of insulin sensitization”, Endocrinology 2002 143 (3): 998-1007; Tiikkainen M et al., “Effects of rosiglitazone and metformin on liver fat content, hepatic insulin resistance, insulin clearance, and gene expression in adipose tissue in patients with type 2 diabetes”, Diabetes 2004, 53 (8): 2169-2176）。同様に、ピオグリタゾン（pioglitazone）についても観察された（Hirose H et al., “Effects of pioglitazone on metabolic parameters, body fat distribution, and serum adiponectin levels in Japanese male patients with type 2 diabetes”, Metabolism 2002, 51 (3): 314-317）。また、トログリタゾン（troglitazone）についても観察された（Phillips SA et al., “Modulation of circulating and adipose tissue adiponectin levels by antidiabetic therapy”, Diabetes 2003, 52 (3): 667-674; Maeda N et al.,“PPARgamma ligands increase expression and plasma concentrations of adiponectin, an adipose-derived protein”, Diabetes 2001, 50 (9): 2094-2099; Yu JG et al., “The effect of thiazolidinediones on plasma adiponectin levels in normal, obese, and type 2 diabetic subjects”, Diabetes 2002, 51 (10): 2968-2974）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、アディポネクチン発現を引き起こす化合物を提供することにあり、糖尿病、肥満、メタボリック症候群、動脈硬化性心血管病、脂質異常症、脂肪異栄養症などの病気の治療用の医薬の製造への使用を可能とすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第一の態様によれば、本発明は、式（Ｉ）の化合物：
2010535706.tif 000003
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素原子、ハロゲン、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＣＮ、置換または非置換アリール基、好ましくは置換または非置換フェニル基、直鎖Ｃ１−Ｃ６、および基（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ８アルキル基（ここで、ｎは１、２、および３から選択される整数であり、Ｒ８は水素原子、または直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基である）から選択されるものを表わし、
基Ｘは、下記：
−３位で結合している、式（Ａ）のインダゾール：
2010535706.tif 000004
および
−２位で結合している、式（Ｂ）のピリジン：
2010535706.tif 000005
（式中、
Ｒ３は、水素原子および直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基から選択され、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基およびハロゲンから選択される）から選択されるものである）、
その薬学的に許容される塩、プロドラックおよび／または溶媒和物の、アディポネクチンレベルの変化を示す疾患、あるいはアディポネクチンタンパク質レベルを変更することが必要となる疾患の治療用の医薬の製造のための使用である。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、アディポネクチンレベルの変化を示す疾患、あるいはアディポネクチンタンパク質レベルを変更することが必要となる疾患が、糖尿病、肥満、メタボリック症候群、動脈硬化性心血管病、脂質異常症、および脂肪異栄養症から選択されるものである。より望ましくは、病気は脂質異常症および脂肪異栄養症から選択される。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、本発明は、式（Ｉ）の化合物に関し、それは：
2010535706.tif 000006
、
その薬学的に許容される塩、プロドラックおよび／または溶媒和物である。
【００１８】
第三の態様によれば、本発明は、上で定義された式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容できる塩、プロドラックまたは溶媒和物と、少なくとも一つの薬学的に許容しうる担体、アジュバンド、および／またはビヒクルとを含んでなる医薬組成物に向けられる。
【００１９】
他の態様によれば、本発明は、上で定義された式（Ｉ）の化合物、その化粧料において許容できる塩、プロドラックまたは溶媒和物と、少なくとも一つの薬学的に許容しうる担体、アジュバンド、および／またはビヒクルとを含んでなる化粧料組成物に向けられる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において、次の用語は以下に示す意味を有する。
【００２１】
「直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル」という用語は、炭素と水素原子から成る直線的な炭化水素基に関し、不飽和を含まず、１から６つの炭素原子を有し、単結合によって分子の残りに結合するものである。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、およびヘキシルが挙げられる。
【００２２】
「アリール」という用語は、フェニル基、ナフチルまたはアントラシル（anthracyl）、望ましくはフェニル基、などのような芳香族炭化水素基に関する。
【００２３】
「Ｃ１−Ｃ６アルコキシ」という用語は、式-ＯＲａ（ここで、Ｒａは上記のアルキル基を表す）に関し、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシなどである。
【００２４】
特に断らない限り、本発明において使用される化合物には、一つ以上の同位体が濃縮された原子の存在においてのみ相違する化合物を含んでいることが意図される。例えば、水素が重水素または三重水素と置換されただけ、または炭素１３または１４が濃縮された炭素または窒素１５が濃縮された窒素の置換がされただけの化合物は、本発明の範囲に包含される。
【００２５】
「その薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラック」という用語は、受容者に投与されたとき、（直接または間接的に）本明細書において記載の化合物を提供する塩、溶媒和物またはプロドラックに関する。それにもかかわらず、本発明の範囲には、薬学上許容されない塩も認められ、それは、それらが薬学上許容される塩の製造に有用であることがあるからである。塩、プロドラック、および誘導体は、従来技術として知られている方法によって調製することができる。「薬学的に許容できる」とは、好ましくは、ヒトに投与されたとき、生理的に許容され、アレルギー反応または胃の異状や、めまいなどの好ましくない反応を通常引き起こさない分子または組成物を意味する。「薬学的に許容される」という用語は、それが連邦か州の政府の監督官庁によって承認されるか、または動物、特にヒトにおける使用のための米国薬局方または別の一般に認識された薬局方に記載されていることを意味する。
【００２６】
例えば、上述の化合物の薬学的に許容できる塩は、従来知られた化学的手法によって、塩基性または酸性のユニットを含む上述の化合物から調製される。そのような塩は、通常、例えば、水または有機溶媒またはそれらの混合物中において、適当な塩基性または酸性の化学量論的な量と、遊離の酸性または塩基性の形のこれら化合物との反応によって調製される。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルなどの非水性溶媒が好ましい。酸付加塩の例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩などの鉱酸付加塩が含まれ、有機酸付加塩には、例えば酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、蓚酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、およびｐ−トルエンスルホン酸塩が含まれる。アルカリ性付加塩の例としては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウム、アルミニウム、およびリチウムなどの無機塩が含まれ、有機アルカリ塩には、例えばエチレンジアミン、エタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジアルキレンエタノールアミン、グルカミンおよび塩基性アミノ酸塩が含まれる。
【００２７】
「プロドラック」という用語は、溶解度またはバイオアベイラビリティのような物理化学的性質のいくつかを（医薬用途のために）変えるために、追加の化学基の置換または付加のような化学的誘導を受けた化合物と定義され、例えば、活性化合物から派生された、エステルまたはエーテルであって、受容者に投与された後に、活性化合物自体を生じさせるものである。所定の化合物からプロドラックを調製する方法の広く知られた方法は当業者に知られており、またKrogsgaard-Larsen et al., Textbook of Drug Design and Discovery, Taylor & Francis（April 2002）に例えば記載されている。本発明において「溶媒和物」という用語は、非共有結合を通して、別の分子（おそらくは極溶剤）が結合した、本発明による化合物のいかなる形をも意味するものと理解される。溶媒和の例としては、水和物、アルコラート、例えばメタノール和物が含まれる。
【００２８】
特に好ましいプロドラックとしては、それが患者に投与されたとき（例えば、経口投与された化合物がよりすばやく血中に吸収されるのを許容する）、本発明による化合物のバイオアベイラビリティを向上させるものであるか、あるいは原種に関連して、原化合物の生体の部分（例えば、脳またはリンパ系）における分布を増加させるものが好ましい。
【００２９】
本発明おいて使用される化合物は、遊離の化合物または溶媒和物（例えば、水和）のいずれかの結晶であってよく、そしていずれの形態も本発明の範囲に包含される。一般に、溶媒和物化の方法は当業界において知られている。適切な溶媒和物は、薬学的に許容される溶媒和物である。特定の態様にあっては、溶媒和物は水和物である。
【００３０】
塩、溶媒和物、およびプロドラックは、当業界において知られている方法によって調製できる。それが薬学的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラックの調製に有用であることから、薬学的に許容されない塩、溶媒和物またはプロドラックも本発明の範囲に包含される。
【００３１】
式（Ｉ）の化合物、それらの塩または溶媒和物は、好ましくは薬学的に許容される剤形または実質的に純粋な剤形である。薬学的に許容される剤形は、希釈剤および賦形剤のような医薬品添加物とともに、正常な投与量レベルにおいて毒性であると考えられるいかなる材料も含まず、薬学的に許容できる純度水準を有しているととりわけ理解される。医薬のための純度は、好ましくは５０％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。好ましい態様において、式（Ｉ）の化合物、その塩、溶媒和物またはプロドラックは９５％以上である。
【００３２】
上述した式（Ｉ）によって表される、本発明において用いられる化合物には、不斉中心の存在による鏡像異性体、または複数の結合の存在に頼る異性体（例えば、Ｚ、Ｅ）が含まれる。本発明の範囲には、個々の異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、およびそれの混合物が含まれる。
【００３３】
本発明の好ましい態様において、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素原子、直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル、および基（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ８（ここでｎは１、２、または３を表し、Ｒ８は水素原子および直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキルから選択されるものを表す）から選択されるものを表す。
【００３４】
他の態様において、本発明において用いられる式（Ｉ）の化合物において基Ｒ１およびＲ２の少なくとも一つは水素原子である。
【００３５】
他の態様において、Ｒ１およびＲ２は水素原子である。
他の態様において、ｎは１である。
【００３６】
他の態様においてＲ１はＣＨ２ＣＯ２Ｒ８（ここでＲ８は水素原子またはメチルである）である。
他の態様において、Ｒ２はアルキル基であり、好ましくはメチルである。
他の態様において、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は水素原子である。
【００３７】
さらに他の好ましい態様において、式（Ｉ）の化合物は下記の化合物から選択されるものである。
2010535706.tif 000007
【００３８】
本発明において用いられる式（Ｉ）の化合物は、対応する式（II）および式（III）のピリジンまたはインダゾール酸と、式（Ｖ）のチアゾールとのカップリングを含む合成ルートにより調製することができる：
2010535706.tif 000008
（式中、
Ｒ３は水素原子および直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基から選択され、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立して水素原子、直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基、直鎖Ｃ１−Ｃ６アルコキシおよびハロゲンから選択される）、
2010535706.tif 000009
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素原子、ハロゲン、基−ＮＯ２、基−ＮＨ２、基−ＣＮ、直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキルおよび基（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ８（ここで、ｎは１、２、および３から選択される整数であり、Ｒ８は水素原子および直鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル基から選択される）から選択されるものである）。
式（II）、式（III）および式（Ｖ）の化合物は市販されている。
【００３９】
特にひとつの態様によれば、式（Ｉ）において基Ｘがインダゾールである場合、これは以下の方法により調製される。１．５等量のＣＤＩ（Ｎ，Ｎ’−カルボキシルジイミダゾール）をＴＨＦ（テトラヒドロフラン）に溶解させたものを、対応する式（III）の３−イミダゾールの乾燥ＴＨＦ溶液に加える。得られた混合物を４〜５時間、撹拌しながら放置する。時間経過後、ＴＨＦに溶解した式（Ｖ）の対応するチアゾール類を添加し、反応液を室温で１０〜１２時間撹拌しながら放置する。反応時間が終了したら、溶液をジクロロメタンで希釈し、水で何回か洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶液を蒸留し、粗生成物を得る。この粗生成物をカラムクロマトグラフィーにて精製し、洗浄または再結晶を適宜行う。
【００４０】
他の態様において、基Ｘがピリジンである式（Ｉ）の化合物である場合、これは以下の方法により調製される。１．５等量のＣＤＩ（Ｎ，Ｎ’−カルボキシルジイミダゾール）をＴＨＦ（テトラヒドロフラン）に溶解させたものを、ピコリン酸の乾燥ＴＨＦ溶液に加える。得られた混合物を４〜５時間、撹拌しながら放置する。時間経過後、ＴＨＦに溶解した式（Ｖ）の対応するチアゾール類を添加し、反応液を室温で１０〜１２時間撹拌しながら放置する。反応時間が終了したら、溶液をジクロロメタンで希釈し、水で何回か洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶液を蒸留し、粗生成物を得る。この粗生成物をカラムクロマトグラフィーにて精製し、適宜溶離液を変えて、目的の生成物を得る。
【００４１】
さらに他の態様において、本発明によれば下記の式（Ｉ）の化合物：
2010535706.tif 000010
その薬学的に許容される塩、プロドラックおよび／または溶媒和物が提供される。
【００４２】
本発明によれば、さらに医薬組成物が提供され、この医薬組成物は本発明の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラックと、少なくとも一つの薬学的に許容される担体、アジュバンドおよび／またはビヒクルとを含み、患者に投与されるものである。
【００４３】
他の態様において、アディポネクチンレベルの変化を示す疾患、あるいはアディポネクチンタンパク質レベルを変更することが必要となる疾患の予防および／または治療のための、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、プロドラックおよび／または溶媒和物を、治療上の有効量で含み、一以上の薬学的に許容される担体、アジュバンドおよび／またはビヒクルとともに適切な医薬組成物の形態とされる。
【００４４】
「担体、アジュバンドおよび／またはビヒクル」という用語は、活性化合物とともに投与される分子または物質を意味する。そのような担体、アジュバンドおよび／またはビヒクルには、水性または油性の滅菌液があり、石油、動物、植物または合成されたものが含まれ、さらにピーナッツ油、大豆油、鉱油、胡麻油などが挙げられ、さらに医薬品添加物、崩壊剤、湿潤剤、希釈剤が含まれる。好ましい医薬担体は、E.W. Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【００４５】
医薬組成物は、いかなる適切な方法により投与されてよく、例えば、経口、非経口（例えば、皮下、腹膜内、静脈、筋肉内など）、直腸投与などにより投与され、典型的には、対象疾患の慢性であるとの本質より経口により投与される。
【００４６】
一つの態様において、この医薬組成物は経口投与用の、固形または液体の調剤形態であることができる。経口投与用医薬形態の具体例としては、タブレット、カプセル、粒状、液剤、乳化剤などが挙げられ、それらはバインダー、希釈剤、崩壊剤、平滑剤、湿潤剤などの慣用されている医薬品添加物を含むことができて、慣用方法により調製することができる。また、この医薬組成物は非経口的投与のための形態とすることができ、適当な剤形の無菌の、例えば、凍結乾燥された製品、乳化剤、または溶液の投与形態とすることができ、ここでこの医薬組成物は、緩衝剤、界面活性剤などを含むことができる。いかなる場合も、選択された投与医薬形態に従って、医薬品添加物は選択される。投与用医薬およびその調製についての種々の医薬形態の概説が、C. Fauli i Trilloによる「Tratado de Farmacia Galenica(10th Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones)」にある。
【００４７】
治療用途のためには、式（Ｉ）の化合物は好ましくは薬学的に許容されるまたは実質的に純粋な医薬形態とされる。すなわち、式（Ｉ）の化合物は、薬学的に許容できる医薬品添加物を除き、薬学的に許容できる純度を有し、かつ正常な投与量レベルで毒性であると考えられていた材料を含まない。式（Ｉ）の化合物の純度は、好ましくは５０％以上であり、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。好ましい態様において、それらは９５％以上である。
【００４８】
投与される、式（Ｉ）の化合物の治療のために有効な量は、一般に、治療される個人において、いくつかの因子のなかで、その個人が病んでいる疾患への感受性、投与経路などに依存する。それゆえ、本発明において言及した投与量は、当業者に対するガイドラインであるとみなすべきであり、後者は投与量を前述の変数に応じて変化させる。しかしながら、式（Ｉ）の化合物は、１日１回またはそれ以上投与され、例えば、１日１、２、３または４回投与され、典型的な１日の投与量は、０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重の間で、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ体重／日とされる。
【００４９】
式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、プロドラック、および／または溶媒和物、さらにはそれらを含む医薬組成物は、アディポネクチンレベルの変化を示す疾患、あるいはアディポネクチンタンパク質レベルを変更することが必要となる疾患の予防および／または治療のために有用な追加の医薬とともに用いられてもよい。この追加の医薬は、同じ医薬組成物を構成するものとされても、また別の医薬組成物とされて、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、プロドラック、および／または溶媒和物を含む医薬組成物と、同時に、または非同時投与のために提供されてもよい。
【００５０】
本発明の範囲において、「アディポネクチンレベルの変化を示す疾患、あるいはアディポネクチンタンパク質レベルを変更することが必要となる疾患」との表現は、血中において測定されるアディポネクチンレベルが、正常と考えられる範囲を外れるいかなる疾患、障害または状態にも関し、ここで正常と考えられる範囲とは、それらの疾患に罹患していないヒトの母集団における血中アディポネクチン濃度の平均値として得ることができるものであり、あるいはアディポネクチンレベルの変更が改善を引き起こす疾患、障害または状態に関する。これら疾患は、好ましくは、糖尿病、肥満、メタボリック症候群、動脈硬化性心血管病、脂質異常症、および脂肪異栄養症から選択されるものである。
【００５１】
本発明の他の態様によれば、アディポネクチンレベルの変化を示す疾患または状態、あるいはアディポネクチンタンパク質レベルを変更することが必要となる疾患または状態の治療または予防方法が提供され、この方法は、そのような治療を必要とする患者に、治療上有効量の少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物またはその医薬組成物を投与することを含んでなる。
【００５２】
そのような疾患または状態は、好ましくは、糖尿病、肥満、メタボリック症候群、動脈硬化性心血管病、脂質異常症、および脂肪異栄養症から選択されるものである。
【００５３】
本明細書において、「治療」または「治療する」とは、これら疾患またはこれら疾患に関連する一またはそれ以上の症状を、予防するか軽減するかまたは取り除くために、本発明による化合物の処方物を投与することを意味する。「治療」とは、また、疾患の生理的な後遺症を予防するか、軽減するか、または取り除くことを含む。
【００５４】
本明細書において、「軽減する」とは、治療患者の、主観的（患者または患者に対する感覚）、そして客観的（測定値）の双方のいかなる状況の改善をも意味するものと理解される。
【００５５】
本発明を実施例によって以下でさらに説明する。これら説明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００５６】
例１：１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸のチアゾール−２−イルアミド化合物（化合物１）の合成
2010535706.tif 000011
Ｎ、Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（４．５ｍｏｌ、７２９ｍｇ）のＴＨＦ溶液を、３−イミダゾールカルボン酸（３ｍｍｏｌ、４８６．５ｍｇ）の乾燥ＴＨＦに添加する。得られた混合物を４〜５時間、撹拌しながら放置する。時間経過後、２−アミノチアゾール（３ｍｍｏｌ，３００．５ｍｇ）のＴＨＦ溶液を加え、反応液を室温で１０〜１２時間撹拌しながら放置する。反応時間が終了したら、溶液をジクロロメタンで希釈し、水で何回か洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶液を蒸留し、粗生成物を得る。この粗生成物を、溶離液としてアセテート／ヘキサン＝１／２を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製する。
乾燥生成物を白色結晶として得た（純度９８％−１００％）。重量１８０ｍｇ。
収率（Ｙ．）：２４％
ＨＰＬＣ−Ｍｓ：ｔｒ：９．３（ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ，５０／５０），Ｍ＋．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８．２（ｄ）；７．７（ｄ）；７．５（d-thiazole）；７．４（ｍ）；７．３（ｍ）；７．３（d-thiazole）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６０．５；１５７．５；１４１．１；１３７．７；１３６．３；１２６．９；１２２．８；１２１．８；１１３．６；１１１．０
【００５７】
例２：１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸  （５−メチル−チアゾール−２−イル）アミド（化合物５）の合成
2010535706.tif 000012
Ｎ、Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（４．５ｍｏｌ、７２９ｍｇ）のＴＨＦ溶液を、３−イミダゾールカルボン酸（３ｍｍｏｌ、４８６．５ｍｇ）の乾燥ＴＨＦに添加する。得られた混合物を４〜５時間、撹拌しながら放置する。時間経過後、２−アミノ−５−メチル−チアゾール（３ｍｍｏｌ，３４２．５ｍｇ）のＴＨＦ溶液を加え、反応液を室温で１０〜１２時間撹拌しながら放置する。反応時間が終了したら、溶液をジクロロメタンで希釈し、水で何回か洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶液を蒸留し、粗生成物を得る。この粗製生物をＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ混合溶液に再溶解させたところ、全く不溶の白色沈殿が現れる。これをろ過して、メタノールで数回洗浄し、目的物を粉末状の白色結晶として得た（２２３．５ｍｇ，Ｙ．２９％）。
ＨＰＬＣ−Ｍｓ：ｔｒ：９．３（ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ，５０／５０），Ｍ＋．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：８．２（ｄ）；７．７（ｄ）；７．５（ｍ）；７．３（ｍ）；７．２（s-thiazole）；２．３９（s-CH3-thiazole）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１６０．５３；１５５．７；１４４．１；１３６．４；１３４．７；１２６．８；１２６．３；１２２．７；１２１．７；１２１．０；１１．０
【００５８】
例３：ピリジン−２−カルボン酸  （５−メチル−チアゾール−２−イル）アミド（化合物４）の合成
2010535706.tif 000013
Ｎ、Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（４．５ｍｏｌ、７２９ｍｇ）のＴＨＦ溶液を、ピコリン酸（３ｍｍｏｌ、３６９ｍｇ）の乾燥ＴＨＦに添加する。得られた混合物を４〜５時間、撹拌しながら放置する。時間経過後、２−アミノ−５−メチル−チアゾール（３ｍｍｏｌ，３４２．５ｍｇ）のＴＨＦ溶液を加え、反応液を室温で１０〜１２時間撹拌しながら放置する。反応時間が終了したら、溶液をジクロロメタンで希釈し、水で何回か洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶液を蒸留し、粗生成物を得る。この粗生成物を、溶離液としてエチルアセテート／ヘキサン＝１／１を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製する。目的物を白色固形物として得る（純度９９％）。重量４９０ｍｇ．Ｙ．：７４％
ＨＰＬＣ−Ｍｓ：ｔｒ：９．４（ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ，５０／５０），Ｍ＋．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：８．７４（ｍ，１Ｈ）；８．２３（ｍ，１Ｈ）；８．０５（ｔ  ｄ，１Ｈ）；７．６５（ｄｄ，１Ｈ）；７．１８（ｍ，１Ｈ−ｔｈｉａｚｏｌｅ）；２．４５（ｄ，３Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：１６３．７；１５８．０；１５０．２；１４９．３；１３９．２；１３５．８；１２９．６；１２８．８；１２３．９；１１．４
【００５９】
例４：ピリジン−２−カルボン酸チアゾール−２−イル−アミド（化合物３）の合成
2010535706.tif 000014
Ｎ、Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（４．５ｍｏｌ、７２９ｍｇ）のＴＨＦ溶液を、ピコリン酸（３ｍｍｏｌ、３６９ｍｇ）の乾燥ＴＨＦに添加する。得られた混合物を４〜５時間、撹拌しながら放置する。時間経過後、２−アミノ−チアゾール（３ｍｍｏｌ，３００．５ｍｇ）のＴＨＦ溶液を加え、反応液を室温で１０〜１２時間撹拌しながら放置する。反応時間が終了したら、溶液をジクロロメタンで希釈し、水で何回か洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶液を蒸留し、粗生成物を得る。この粗生成物を、溶離液としてエチルアセテート／ヘキサン＝１／１を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製する。目的物を白色固形物として得る（純度１００％）。重量３９８．５ｍｇ．Ｙ．：６５％
ＨＰＬＣ−Ｍｓ：ｔｒ：８．８（ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ，５０／５０），Ｍ＋．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：８．７３（ｍ，１Ｈ）；８．２４（ｍ，１Ｈ）；８．０５（ｔ  ｄ，１Ｈ）；７．６５（ｄｄ，１Ｈ）；７．５０（ｄ，1H-thiazole）；７．２１（ｄ，1H-thiazole）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：１６４．０；１５９．８；１５０．２；１４９．３；１３９．３；１３８．８；１２８．８；１２３．９；１１５．３
【００６０】
例５：｛２−［（ピリジン−２−カルボニル）−アミノ］−チアゾール−４−イル｝−酢酸メチルエステル（化合物２）の合成
2010535706.tif 000015
Ｎ、Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（４．５ｍｏｌ、７２９ｍｇ）のＴＨＦ溶液を、ピコリン酸（３ｍｍｏｌ、３６９ｍｇ）の乾燥ＴＨＦに添加する。得られた混合物を４〜５時間、撹拌しながら放置する。時間経過後、（２−アミノチアゾール−４−イル）酢酸メチルエステル（３ｍｍｏｌ，５１６．５ｍｇ）のＴＨＦ溶液を加え、反応液を室温で１０〜１２時間撹拌しながら放置する。反応時間が終了したら、溶液をジクロロメタンで希釈し、水で何回か洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶液を蒸留し、粗生成物を得る。この粗生成物を、溶離液として酢酸エチル／ヘキサン＝２／１を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製する。目的物を白色固形物として得る（純度１００％）。重量３５４．５ｍｇ．Ｙ．：４３％
ＨＰＬＣ−Ｍｓ：ｔｒ：９．１（ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ，５０／５０），Ｍ＋．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：８．６２（ｍ，１Ｈ）；８．２８（ｍ，１Ｈ）；７．９９（ｔｄ，１Ｈ）；７．５０（ｄｄ，１Ｈ）；６．８（ｓ，１Ｈ−ｔｈｉａｚｏｌｅ）；３．７５（ｓ，３Ｈ）；３．７６（ｓ，２Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１７０．６；１６１．８；１５７．２；１４８．４；１４７．５；１４３．８；１３７．６；１２７．２；１２２．６；１１１．０
【００６１】
例６：生物学的評価
下記の化合物を評価した。
2010535706.tif 000016
【００６２】
以下のプロトコルに従って、化合物１−５の、肥満、２型糖尿病、およびアテローム性動脈硬化症（ＯＤＡ代謝病）に対する治療効果の能力を分析した。
−ＯＤＡ病の進展の鍵となる遺伝子のヒトプロモータが安定に組み込まれたセルラインを得て、
−商業的ヒトゲノムＤＮＡから始めて、標的遺伝子のヒトプロモータ配列を増幅し、
−レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた、プロモータ配列の転写活性が知られている適当なベクターに、上記プロモータをクローニングし、
−プロモータそれぞれについて、それがレポーターベクターにクローニングされた安定したセルラインを得て、
−当該セルラインにおいて、本願発明の化合物についてスクリーニング試験を行い、
−プロモータの転写活性を変更する、ある種の化合物から得られた効果を適切に確認する。
選択されたセルラインは、マウス筋肉組織からの筋原細胞に対応するＣ２Ｃ１２である。
【００６３】
１日日、細胞をＰ６（６ｗｅｌｌ）の培地に撒く。この場合、１ｗｅｌｌあたり１６万のＣ２Ｃ１２細胞がＤＭＥＭ＋１０％の完全な牛胎児血清（ＦＢＳ）に撒かれる。
【００６４】
２日目、細胞は、目的構造物（プロモータ＋レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ））を含んでなるプラスミドの２．５μｇと、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＨ１ｃプラスミドの０．５μｇと共トランスフェクションされる。用いられた共トランスフェクションは以下のとおりである。
【００６５】
ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社）：  １：３  比，  μｇ  ＤＮＡ：  μｌ  Ｔｒａｎｓｆａｓｔ
１  上述のＤＮＡと、培地ＤＭＥＭ（１ｗｅｌｌあたりの６００μｌ）と混合する。  反応は５分間室温でインキュベートする。
２  ＴｒａｎｓＦａｓｔ試薬を上記混合物に加え、１５分間室温でインキュベートする。
３  時間経過後、ｗｅｌｌから培地を除き、細胞に上記トランスフェクション量を滴下する。
４  混合物を１時間３７℃でインキュベートし、トランスフェクション混合液を除き、完全培地を加える。
【００６６】
ＧＦＰ（「緑色蛍光タンパク質」）レポーター遺伝子とβ−ガラクトシダーゼを用い、目的構造物と同一の条件下で、二重の陽性対照が常にトランスフェクションプロセスにおいて用いられる。これらの２つのレポーター遺伝子は、さらに以下で説明されるように、さらにトランスフェクションプロセスの効率を見積もることになる。
【００６７】
３日目に、トランスフェクション効率が以下のように観察される。
ａ）蛍光顕微鏡を用いたＧＦＰ遺伝子発現を通じて：蛍光を発する細胞（それらを観測している間、対応するフィルタを使用する）は、正しくレポーター遺伝子が導入された、すなわちそれらが正しくトランスフェクトされた。
ｂ）染色された細胞を顕微鏡観察することができる特定の染色キットとともに、β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現を通じて観察された。レポーター遺伝子が導入された細胞は、反応基質を用いると、上記化学反応の結果として青い色を発生させる。
【００６８】
この方法はともに、何パーセントの細胞においてトランスフェクトが成功したかを（それぞれそれらがＧＦＰまたはβ−ガラクトシダーゼが導入されたかに従い、緑色または青となり）見積もることを可能にする。その延長線上で、用いられた条件が同一であるなら、我々の目的構造物において、トランスフェクションが何パーセント成功したかに適用できる。
【００６９】
４０−６０％を高トランスフェクションと考えると、またそのパーセンテージが達成された場合に限ると、１／１００および１／１５０のパッセージが、既に新しいＰ６プレートに撒かれた細胞（「希釈」）においてなされる。ｗｅｌｌ単位で加えられたハイグロマイシンの量は７００μｇ／ｍｌ（１．３３ｍＭ）である。
【００７０】
Ｐ６に撒かれた細胞について、異なった薬物濃度に対するハイグロマイシン抵抗曲線が、適切な量の医薬をスクリーニングし選択するためにあらかじめ作成される。
【００７１】
クローンの入手  続く数日間、細胞は常にハイグロマイシンで維持され、陽性クローンの発生を顕微鏡の下で観察する。顕微鏡の下で観測したとき一つのクローンが１０倍率のレンズを覆っていたならば、そのプレートからそれを単離して、それから安定したセルラインを確立するのに十分な大きさであると考える。安定したセルラインを確立するにあたり、クローンの混合を防止するために、一つのｗｅｌｌにおいて互いに接近していないクローンを選択することが重要である。それぞれのクローンを単離するためのプロトコルは以下のとおりである。
１  培地を除く。
２  ＰＢＳ１ｘにより細胞を２回洗う。
３  各クローンにクローニングリングを（ワセリンともに）置き、クランプとともに押し、その結果ワセリンによりをそれらが付着する。
４  ２０−３０μｌのトリプシンが各リングに添加され、５分間３７℃でインキュベートされる。すべてのクローン細胞が適正にトリプシンと反応したことを確かめ、１００μｌの培地を反応を止めるために加える。
５  リングを動かさないように注意しながら、上下にピペッティングし、そして、Ｐ２４において１ｍｌの培地に到達するのに必要な液を添加する：添加された液は、安定した細胞のスクリーニングを続けるためにはハイグロマイシンを含む培地になる。
【００７２】
Ｐ２４からＰ６に、さらにＰ６からＴ２５に徐々に増やす。Ｔ２５においてクローン細胞がコンフルエントに達したならば、容器を凍結させ、安定に導入されたプロモータの転写活性を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を通じて測定する。本実験において陽性のクローンをハイグロマイシンで維持し続け、定期的にルシフェラーゼを測定して、それらが当該活性を失わないよう制御する。
【００７３】
以下のプロトコルにより、ルシフェラーゼ活性を測定する：
ａ）５００００細胞／ｗｅｌｌおよび１２０００００細胞／ｗｅｌｌにてＰ２４プレートに撒く（同じものを重複作成）。
ｂ）約２４時間後に、細胞から培地を除き、各ｗｅｌｌをＰＢＳ１ｘで洗浄する（ＤＭＥＭはレポーター遺伝子活性の測定に干渉するからである）。
ｃ）１００μｌのルシフェラーゼ展開試薬を、各細胞（Bright-GloTM Luciferase Assay
system- Promega）に加える。この試薬はレポーター遺伝子基質を含み、ルミネッセンスは酵素反応の結果として発生する。レポーター遺伝子を獲得し、その結果標的プロモータを取得した細胞は、前述の基質があるときあるとき発光する。ルシフェラーゼ活性の測定を記録するために、プレートに展開試薬を加える直後３０秒間およびその後２分間に振とうし、液を集め９６穴プレート（Ｐ９６）に移し、照度計で読むことができるようにする。
ｄ）適切なルミネッセンスプログラムが選択され、１ｗｅｌｌあたり少なくとも５秒読み取りが行われ、任意のルミネッセンスユニットがそれぞれの得られたクローンについて、すなわちそれぞれの安定したセルラインごとに、記録される。
【００７４】
反応基質は感光性であることから、各実験で試薬が加えられルシフェラーゼ活性が記録されるか読み取りがなされるまでの時間、プレートは暗所に置かれることが重要である。
【００７５】
スクリーニング試験の実施：  スクリーニングに使用されるクローンは、以下の通りである：Ｃ２Ｃ１２  Ａｄｉｐｏ（アディポネクチンプロモータ）、Ｃ２Ｃ１２  ＵＣＰ３（ＵＣＰ３プロモータ）、Ｃ２Ｃ１２  ＡｄＲ１、（アディポネクチン受容体１のプロモータ）  そして、Ｃ２Ｃ１２  Ｎｍｕ（ｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎプロモータ）。
【００７６】
全てのスクリーニング試験の前、最初に、その実験を行うために適当な細胞数が提供されなければならない。そのために、２Ｔ７５が通常撒かれ（各容器中におよそ１ｘ１０６細胞で）、４日後にコンフレンシーに達して、以下に詳細を記載のスクリーニングプロトコルの準備がなされたことになる。
【００７７】
１  第１日目：１ｗｅｌｌあたり３００００細胞がＰ９６プレートに撒かれる。これらのプレートで、ルミネッセンス信号が増幅され、読み取りが改善される。細胞は１００μｌのハイグロマイシンフリーの培地で培養される。
【００７８】
２  第２日目：播種２４時間後、細胞を化合物１−５で刺激する。
化合物１−５は１、５、および１０μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ２回、以下の図に記載のスクリーニング法により試験される。
2010535706.tif 000017
【００７９】
ベースライン＋ビヒクルの表示：この表示の位置では、試験されるプロモータのベースライン転写活性が、化合物１−５（ビヒクル）が溶解された培地の存在下で記録される。
【００８０】
市販の刺激剤の表示：この表示の位置では、試験されるプロモータの転写活性が、標的プロモータの市販の公知の刺激剤の存在下で記録される。これらのｗｅｌｌは二つの役割を有している。すなわち、ａ）それらは転写開始と選別プロトコルの陽性対照として有用であり、ｂ）評価されるプロモータの活性を増加させる陽性化合物のスクリーニングに際し、参照として有用である。なぜならば、それにより活性化比が与えられるからであり、その活性化比は以下のように算出される。すなわち、市販の刺激剤の存在下でのルミネッセンス信号の増加の平均値を、ビヒクルの存在下で標的プロモータのベースラインにより与えられるルミネッセンス信号の平均値で割ることで得られる。ロシグリタゾン（ＲＧＺ）が、それが文献においてアディポネクチン遺伝子転写活性化剤と報告されたという事実により、最初に市販の刺激剤として選択された。用量反応曲線が、達成された中で転写促進が最も高い濃度（それは２０μＭである）において作成された。ＲＧＺは、次に、ゲニステインやダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）などの他の市販の化合物と置き換えられた。いずれの化合物も、文献において可能性あるＰＰＡＲガンマ刺激剤として記載されている。容量反応曲線が、ＲＧＺと同様に作成された。最も高い標的プロモータの転写促進が得られた濃度は２０μＭであった。
【００８１】
化合物１−５  １０μｇ／ｍｌの表示：この表示の位置では、試験されるプロモータの転写活性が、ｗｅｌｌあたり１、５、そして１０μｇ／ｍｌの本発明による化合物１−５の存在下で二重に記録された。
【００８２】
３．  第４日目：化合物１−５による刺激の４８時間後に、標的プロモータによって指示されたルシフェラーゼ活性が、下記の修正が加えられた、上述のプロトコルに従い展開された：
−細胞から培地を除き、ＰＢＳ１ｘで洗ったのち、４０μｌのルシフェラーゼ展開試薬を各ｗｅｌｌに加えた。
−２分後、Ｐ９６プレートの読み取りを行った。
【００８３】
結果の分析
上述のスクリーニング試験のダイヤグラムを考慮すると、一連のルミネッセンス値、ＲＬＵｓ（「相対的ルシフェラーゼ単位」）が得られ、それは、それぞれの実験において評価される標的プロモータが担っている上述の転写活性化比の算出に用いられる。試験された化合物１−４の存在下でルミネッセンスシグナルの増加を、ベースライン条件下（すなわちビヒクルの存在下）において得られるルミネッセンスシグナルの平均値に対して、比率をプロットする。細胞が市販の活性化剤により処理されたときに、活性化比が２以上となる試験を、有効と判断する。１．２以上の転写活性比がすべての試験した化合物に対して得られ、したがって、それらは陽性化合物であると考えることができた。
【００８４】
最初の評価試験で得られた結果に従い、評価試験が、０．５乃至２５μｇ／ｍｌの間の三つの新たな濃度において繰り返して実施された。
【００８５】
細胞が４つの化合物および市販の活性化剤により処理された細胞について、得られた活性化比は以下のとおりである。
2010535706.tif 000018
【００８６】
化合物が陽性であることが一度示されたならば、用量応答（μＭ）曲線から以下を知ることができる。すなわち、ａ）化合物の存在下でプロモータの最大の転写活性化が得られる濃度、およびｂ）最大値に対して５０％の転写活性が得られる濃度（ＥＣ５０）を知ることができる。得られた結果は以下の通りであった。
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【国際調査報告】
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