(57)【要約】本発明は、異常または好ましくない細胞増殖、特に、腫瘍成長に関連する内皮細胞増殖の処置に関する。本組成物は、一つ以上の抗癌剤と組み合わせて抗転移剤を含む。好ましい実施態様では、抗転移剤は、ＮＡＰタンパクである。ある特定実施態様では、ＮＡＰタンパクは、Ｘａ因子の選択的抑制を示す。Ｘａ因子抑制性ＮＡＰタンパクは、ＮＡＰ５およびＮＡＰ６から選ばれることが好ましい。好ましい実施態様では、ＮＡＰタンパクは、Ｘａ因子、または触媒的に活性、または不活性な、その誘導体が存在する場合、ＶＩＩａ因子／組織因子（ｆＶＩＩａ／ＴＦ）複合体の選択的抑制を示す。
2010503696.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を処置する方法であって、処置を要する対象に対し、抗癌剤およびＮＡＰタンパクを投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記癌が結腸直腸癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌がメラノーマである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が肺癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗癌剤が化学療法剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化学療法剤がＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗癌剤が標的化された抗癌剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標的化された抗癌剤がベバシズマブである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗癌剤および前記ＮＡＰタンパクが同時に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＡＰタンパクが、前記抗癌剤の前に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＡＰタンパクが、前記抗癌剤に次いで投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＮＡＰタンパクが、式ＩＩＩのＮＡＰドメインを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮＡＰタンパクがｒＮＡＰｃ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＡＰタンパクがｒＮＡＰｃ２／プロリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＡＰタンパクが皮下に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
結腸直腸癌の処置を要するヒト対象において結腸直腸癌を処置する方法であって、該対象に対し、ｋｇ体重当たり約１から約１０μｇの用量範囲で皮下注入を通じて毎週２回ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏを投与すること、および、次いで、該対象にＦＯＬＦＯＸを投与することを含む、方法。
【請求項１９】
ベバシズマブを投与することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍転移を低減または抑制するための方法であって、低減または抑制を要する対象に対し、抗癌剤およびＮＡＰタンパクを投与することを含む、方法。
【請求項２１】
前記抗癌剤が化学療法剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
前記化学療法剤がＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗癌剤が標的化された抗癌剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的化された抗癌剤がベバシズマブである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗癌剤および前記ＮＡＰタンパクが同時に投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＮＡＰタンパクが、前記抗癌剤の前に投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＮＡＰタンパクが、前記抗癌剤に次いで投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＮＡＰタンパクが、式ＩＩＩのＮＡＰドメインを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＮＡＰタンパクがｒＮＡＰｃ２である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＮＡＰタンパクがｒＮＡＰｃ２／プロリンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＮＡＰタンパクが皮下に投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が哺乳動物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
腫瘍負荷量を低減するための方法であって、低減を要する対象に対し、抗癌剤およびＮＡＰタンパクを投与することを含む、方法。
【請求項３５】
前記抗癌剤が化学療法剤である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記化学療法剤がＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗癌剤が標的化された抗癌剤である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記標的化された抗癌剤がベバシズマブである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗癌剤および前記ＮＡＰタンパクが同時に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＮＡＰタンパクが、前記抗癌剤の前に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＮＡＰタンパクが、前記抗癌剤に次いで投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＮＡＰタンパクが、式ＩＩＩのＮＡＰドメインを有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＮＡＰタンパクがｒＮＡＰｃ２である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＮＡＰタンパクがｒＮＡＰｃ２／プロリンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＮＡＰタンパクが皮下に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象が哺乳動物である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
哺乳動物において望ましくない内皮細胞の増殖を阻止するための方法であって、阻止を要する対象に対し、抗癌剤およびＮＡＰタンパクを投与することを含む、方法。
【請求項４９】
前記抗癌剤が化学療法剤である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記化学療法剤がＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗癌剤が標的化された抗癌剤である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記標的化された抗癌剤がベバシズマブである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗癌剤および前記ＮＡＰタンパクが同時に投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＮＡＰタンパクが、前記抗癌剤の前に投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＮＡＰタンパクが、前記抗癌剤に次いで投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＮＡＰタンパクが、式ＩＩＩのＮＡＰドメインを有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＮＡＰタンパクがｒＮＡＰｃ２である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＮＡＰタンパクがｒＮＡＰｃ２／プロリンである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＮＡＰタンパクが皮下に投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項６０】
前記対象が哺乳動物である、請求項４８に記載の方法。
【請求項６１】
前記哺乳動物がヒトである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
癌を処置するための方法であって、処置を要する対象に対し、抗転移剤および抗癌剤を投与することを含む、方法。
【請求項６３】
前記抗転移剤がＮＡＰタンパクである、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記ＮＡＰタンパクがｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗癌剤が化学療法剤である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記化学療法剤がＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗癌剤が標的化された抗癌剤である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記標的化された抗癌剤がベバシズマブである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記抗転移剤および前記抗癌剤が同時に投与される、請求項６２に記載の方法。
【請求項７０】
前記抗転移剤が、前記抗癌剤の前に投与される、請求項６２に記載の方法。
【請求項７１】
前記抗転移剤が、前記抗癌剤に次いで投与される、請求項６２に記載の方法。
【請求項７２】
前記対象が哺乳動物である、請求項６２に記載の方法。
【請求項７３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
抗癌剤と、ＮＡＰタンパクと、緩衝剤、薬学的に受容可能な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、および防腐剤から成る群から選ばれる一つ以上の成分とを含む薬学的組成物。
【請求項７５】
約０．５から約２ｍｇ／ｍｌのＮＡＰタンパク、約５０ｍＭから約１００ｍＭのリン酸ナトリウム、および約５０ｍＭから約１００ｍＭの塩化ナトリウムを含み、ｐＨが約７．０である、水性薬学的組成物。
【請求項７６】
１ｍｇ／ｍｌのＮＡＰタンパク、６５ｍＭのリン酸ナトリウム、および８０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項７５に記載の薬学的組成物。
【請求項７７】
前記ＮＡＰタンパクがｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏである、請求項７４または７５に記載の薬学的組成物。
【請求項７８】
（ａ）ＮＡＰタンパクを含む容器；（ｂ）抗癌剤を含む容器；および、容器（ａ）および（ｂ）の内容物を組み合わせて、薬学的に受容可能な処方物を提供するための指示書を含むキット。
【請求項７９】
前記処方物が癌処置用である、請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
前記ＮＡＰタンパクがｒＮＡＰｃ２である、請求項７８に記載のキット。
【請求項８１】
前記ＮＡＰタンパクがｒＮＡＰｃ２／プロリンである、請求項７８に記載のキット。
【請求項８２】
ｒＮＡＰｃ２／プロリンが、約１ｍｇ／ｍｌで提供される、請求項７７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００６年９月１３日に出願された、米国仮特許出願第６０／８４４，５５１号への優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、抗癌剤と組み合わせて抗転移剤を用いることによって癌を処置するための組成物および方法に関する。
【０００３】
（配列表）
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列は、配列表に掲載され、ＩＢＭ  ＰＣ，Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ２０００オペレーティングシステムにおいて２００７年８月３１日午前１０：０２：１０に作製された、“ＮＵＶＯ−２９ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”−６．８１ＫＢ（６９８１バイト）と表示されるファイルの中に電子的に提出される。“ＮＵＶＯ−２９ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”という表題のこの配列表の全体を、参照により本出願に含める。
【背景技術】
【０００４】
細胞増殖は、全ての生物の体内において進行する正常な過程であり、正規の細胞周期を維持するために微妙にバランスされる、多くの因子およびシグナルを含む過程である。正常細胞は、成熟が達成されるまで分裂を続けるが、それは、損傷または死亡細胞を置き換えるのに必要なだけ行われるにすぎない。正常な細胞増殖が、妨げられたり、何らかの形で損なわれると、その結果は、一連の生物機能に影響を及ぼす可能性がある。増殖の撹乱は、各種シグナル伝達化学物質の欠乏または過剰、または、環境変化の存在、またはその両方など、多様な因子によって起こる可能性がある。
【０００５】
癌とは、一般に、一つの器官または組織タイプにおける細胞の、無統制な、異常な増殖であって、隣接組織、または生体の他の部分に拡散することが可能な無統制な、異常な細胞増殖によって引き起こされる疾患を指す。癌細胞は、一緒に集まって塊となる固体腫瘍を形成することもあるし、あるいは、白血病などのように、分散細胞として存在することもある。癌細胞は、それらが、分裂し続け、多くの場合近隣細胞を押し退け、生体の他の部分にまで拡散するので、しばしば悪性と呼ばれる。悪性癌細胞は、ある器官から別の器官、または、生体の一部から他の部へ拡散する傾向を示すが、これによって、過剰増殖はするが、他の器官、または生体の他の部分へは拡散しない良性腫瘍細胞とは区別される。通常、悪性癌細胞は、血流またはリンパ系を通じて、生体の他の部分へ転移、拡散し、そこにおいて、増殖し、新規腫瘍を形成するが、このことが、癌を、重大で、多くの場合、致命的疾患とする。ここ数年、癌の診断および処置において大きな改善が見られたけれども、多くの人々が、各種の癌において、転移、および、当代の治療に対して耐性を持つ癌のために毎年死んでいる。癌に対する通例処置として、化学療法、放射線療法、手術、生物学療法（すなわち、ワクチン、または標的治療）、またはこれらの組み合わせが挙げられる。しかしながら、ある種の癌は、化学療法などの処置に対して全く反応しないか、最小の反応しか示さない。さらに、当代処置のあるもの、例えば、手術は、癌のタイプによっては、生存を約束する選択肢とはならない可能性がある。
【０００６】
一旦癌の診断が確定されたならば、重要な問題は、該疾患が限局するか、または、リンパ節および遠隔器官に拡散しているかどうかである。患者のほぼ５０％において、一次腫瘍の外科的切除は無効である。なぜなら、腫瘍が、外科切除で取りきれるほどの大きさであった頃にもう既に転移が起きてしまっているからである（非特許文献１；非特許文献２）。転移性腫瘍は、いくつかの器官、および、同じ器官の異なるいくつかの領域に局在する可能性があり、これは、手術、放射線、薬剤、または生物療法による完全摘出を困難にする。さらに、器官の微小環境も、治療に対する腫瘍細胞の反応（非特許文献３）ばかりでなく、有害な副作用は起こさないが、細胞を破壊するには十分な量として腫瘍局部に送達されなければならない、抗癌剤の効率（非特許文献４）に顕著な影響を及ぼす。さらに、転移性癌の処置は、癌細胞の生物学的複雑性、および、大抵の通例抗癌剤に対して耐性を持つ腫瘍細胞の急速な出現のために大きく妨げられる（非特許文献４）。
【０００７】
一次および二次（転移）腫瘍の増殖に関与する、数多くの生物学的過程の一つは、新規血管形成、すなわち、腫瘍の増殖を支える新規血管の新生である。この血管新生は、通常、新血管形成と呼ばれる（非特許文献５；非特許文献６）。直径約１−２ｍｍの腫瘍は、通常、拡散を通じて栄養素を受容する可能性があるが、さらにそれ以上の増殖は、通常、新血管形成による十分な血液補給の発達に依存する。したがって、新血管形成の抑制は、腫瘍に対する血液補給を妨げることによって、転移を下げる、または阻止するための有効な方法を提供する可能性がある。動物モデルにおける実験から、腫瘍転移の萌芽は、凝固依存性過程であることが示唆された（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。いくつかの実験は、組織因子／ＶＩＩａ因子複合体が、腫瘍増殖および新血管形成を支持する可能性を示唆する（非特許文献１０；非特許文献１１）。非特許文献１２は、飽くまでも報告ではあるが、マウスモデルにおいて、ｒＮＡＰｃ２およびＴＦＰＩが肺癌腫瘍およびメラノーマ腫瘍の増殖を下げると報告する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｕｇａｒｂａｋｅｒ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９７９）９７：６２３−３２
【非特許文献２】Ｆｉｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｌｃｈ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂｌ．Ｓｕｒｇ．（１９８７）２４：１２９−２０９
【非特許文献３】Ｆｉｄｌｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９８５）４５：４７１４−２６
【非特許文献４】Ｆｉｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｐｏｓｔｅ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（１９８５）１２：２０７−１３
【非特許文献５】Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９８６）４６：４６７−７３
【非特許文献６】Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９８９）３２０：１２１１−２
【非特許文献７】Ｐａｌｕｍｂｏら、Ｂｌｏｏｄ（２０００）９６：３３０２−３３０９
【非特許文献８】Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９９８）７９：１０４１−１０４７
【非特許文献９】Ｅｓｕｍｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９１）５１：４５４９−４５５６
【非特許文献１０】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ａｎｄ  Ｒｉｃｋｌｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（２００２）９：４０１−４０６
【非特許文献１１】Ｒｕｆら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．（２０００）２１：２８９−２９２
【非特許文献１２】Ｈｅｍｂｒｏｕｇｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００３）６３：２９９７−３０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
腫瘍増殖または転移を低減または抑制するための、新規組成物および処置を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、処置を要する対象において、有害な内皮細胞増殖を阻止または低減する方法であって、一つ以上の抗癌剤と組み合わせて抗転移剤を投与することを含む方法を提供する。好ましい実施態様では、抗転移剤は、ＮＡＰタンパクである。ある特定実施態様では、ＮＡＰタンパクは、Ｘａ因子の選択的抑制を示す。Ｘａ因子抑制性ＮＡＰタンパクは、ＮＡＰ５およびＮＡＰ６から選ばれることが好ましい。好ましい実施態様では、ＮＡＰタンパクは、Ｘａ因子、または触媒的に活性、または不活性な、その誘導体が存在する場合、ＶＩＩａ因子／組織因子（ｆＶＩＩａ／ＴＦ）複合体の選択的抑制を示す。より好ましくは、ｆＶＩＩａ／ＴＦ選択的抑制ＮＡＰタンパクは、ｒＮＡＰｃ２およびｒＮＡＰｃ２／プロリンから選ばれる。もっとも好ましくは、ｆＶＩＩａ／ＴＦ選択的抑制ＮＡＰタンパクは、ｒＮＡＰｃ２／プロリンである。ある特定実施態様では、抗癌剤は、化学療法剤、例えば、ＦＯＬＦＯＸ、またはＦＯＬＦＩＲＩ、または、その他の、５−フルオロウラシル由来治療剤である。別の実施態様では、抗癌剤は、放射線治療剤である。さらに別の実施態様では、抗癌剤は、ＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩ、およびモノクロナール抗体（すなわち、ベバシズマブ）などの、標的化された抗癌剤の組み合わせである。
【００１１】
本発明は、処置を要する対象において、癌を処置する方法であって、一つ以上の抗癌剤と組み合わせて抗転移剤を含む方法を提供する。好ましい実施態様では、抗転移剤は、ＮＡＰタンパクである。ある特定実施態様では、ＮＡＰタンパクは、Ｘａ因子の選択的抑制を示す。Ｘａ因子抑制性ＮＡＰタンパクは、ＮＡＰ５およびＮＡＰ６から選ばれることが好ましい。好ましい実施態様では、ＮＡＰタンパクは、Ｘａ因子、または触媒的に活性、または不活性な、その誘導体が存在する場合、ＶＩＩａ因子／組織因子（ｆＶＩＩａ／ＴＦ）複合体の選択的抑制を示す。より好ましくは、ｆＶＩＩａ／ＴＦ選択的抑制ＮＡＰタンパクは、ｒＮＡＰｃ２およびｒＮＡＰｃ２／プロリンから選ばれる。もっとも好ましくは、ｆＶＩＩａ／ＴＦ選択的抑制ＮＡＰタンパクは、ｒＮＡＰｃ２／プロリンである。ある特定実施態様では、抗癌剤は、化学療法剤、例えば、ＦＯＬＦＯＸ、またはＦＯＬＦＩＲＩ、または、その他の、５−フルオロウラシル由来治療剤である。別の実施態様では、抗癌剤は、放射線治療剤である。さらに別の実施態様では、抗癌剤は、ＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩ、およびモノクロナール抗体（すなわち、ベバシズマブ）などの、標的化された抗癌剤の組み合わせである。さらに別の実施態様では、本方法は、結腸直腸癌の処置のために使用される。さらに別の実施態様では、本方法は、メラノーマの処置のために使用される。さらに別の実施態様は、乳癌、前立腺癌、または肺癌の処置を実現する。
【００１２】
本発明はさらに、処置を要する対象において、腫瘍転移を低減または抑制する方法であって、一つ以上の抗癌剤と組み合わせて抗転移剤を投与することを含む方法を提供する。好ましい実施態様では、抗転移剤は、ＮＡＰタンパクである。ある特定実施態様では、ＮＡＰタンパクは、Ｘａ因子の選択的抑制を示す。Ｘａ因子抑制性ＮＡＰタンパクは、ＮＡＰ５およびＮＡＰ６から選ばれることが好ましい。好ましい実施態様では、ＮＡＰタンパクは、Ｘａ因子、または触媒的に活性、または不活性な、その誘導体が存在する場合、ＶＩＩａ因子／組織因子（ｆＶＩＩａ／ＴＦ）複合体の選択的抑制を示す。より好ましくは、ｆＶＩＩａ／ＴＦ選択的抑制ＮＡＰタンパクは、ｒＮＡＰｃ２およびｒＮＡＰｃ２／プロリンから選ばれる。もっとも好ましくは、ｆＶＩＩａ／ＴＦ選択的抑制ＮＡＰタンパクは、ｒＮＡＰｃ２／プロリンである。ある特定実施態様では、抗癌剤は、化学療法剤、例えば、ＦＯＬＦＯＸ、またはＦＯＬＦＩＲＩ、または、その他の、５−フルオロウラシル由来治療剤である。別の実施態様では、抗癌剤は、放射線治療剤である。さらに別の実施態様では、抗癌剤は、ＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩ、およびモノクロナール抗体（すなわち、ベバシズマブ）などの、標的化された抗癌剤の組み合わせである。
【００１３】
本発明はさらに、腫瘍負荷量の低減を要する対象において、腫瘍負荷量を低減する方法であって、一つ以上の抗癌剤と組み合わせて抗転移剤を投与することを含む方法を提供する。好ましい実施態様では、抗転移剤は、ＮＡＰタンパクである。ある特定実施態様では、ＮＡＰタンパクは、Ｘａ因子の選択的抑制を示す。Ｘａ因子抑制性ＮＡＰタンパクは、ＮＡＰ５およびＮＡＰ６から選ばれることが好ましい。好ましい実施態様では、ＮＡＰタンパクは、Ｘａ因子、または触媒的に活性、または不活性な、その誘導体が存在する場合、ＶＩＩａ因子／組織因子（ｆＶＩＩａ／ＴＦ）複合体の選択的抑制を示す。より好ましくは、ｆＶＩＩａ／ＴＦ選択的抑制ＮＡＰタンパクは、ｒＮＡＰｃ２およびｒＮＡＰｃ２／プロリンから選ばれる。もっとも好ましくは、ｆＶＩＩａ／ＴＦ選択的抑制ＮＡＰタンパクは、ｒＮＡＰｃ２／プロリンである。ある特定実施態様では、抗癌剤は、化学療法剤、例えば、ＦＯＬＦＯＸ、またはＦＯＬＦＩＲＩ、または、その他の、５−フルオロウラシル由来治療剤である。別の実施態様では、抗癌剤は、放射線治療剤である。さらに別の実施態様では、抗癌剤は、ＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩ、およびモノクロナール抗体（すなわち、ベバシズマブ）などの、標的化された抗癌剤の組み合わせである。
【００１４】
本発明はさらに、抗転移剤、および一つ以上の抗癌剤の組み合わせを含む製剤組成物に関する。好ましい実施態様では、抗転移剤はＮＡＰタンパクである。
【００１５】
本発明はさらに、一つ以上の薬学的に受容可能な担体材料の存在下、または不在下に、抗転移剤、好ましくはＮＡＰタンパク、および抗癌剤を含む組成物に関する。
【００１６】
本発明はさらに、癌などの増殖性疾患の処置において、組み合わせとして活動する、抗転移剤および抗癌剤の両方にとって十分な期間、該処置を要する対象に対し、同時的、または時間変動的な投与を実現する。ある好ましい実施態様では、抗転移剤はＮＡＰタンパクである。
【００１７】
本発明のさらにもう一つの目的は、抗転移剤、および一つ以上の抗癌剤を含む組成物であって、筋肉内、静脈内、経皮的、経口的、または皮下に投与が可能な、薬学的に受容可能な担体をさらに含む組成物を提供することである。
【００１８】
本発明はさらに、薬学的に受容可能な形において、治療的有効量の抗転移剤および一つ以上の抗癌剤を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａは、ｒＮＡＰｃ２のアミノ酸配列（配列番号３）である。図１Ｂは、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏのアミノ酸配列（配列番号４）である。
【図２】ベヒクルコントロールのパーセントで表した、異種移植結腸腫瘍の体積（白色バー）または腫瘍重量（黒色バー）に及ぼす、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ、５−ＦＵ、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋５−ＦＵ、またはｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋５−ＦＵ＋ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）の作用。
【図３】異種移植結腸腫瘍体積（ｍｍ３）に及ぼす、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ、５−ＦＵ、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋５−ＦＵ、またはｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋５−ＦＵ＋ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）の時間経過。
【図４】動物の体重に及ぼす、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ、５−ＦＵ、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋５−ＦＵ、またはｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋５−ＦＵ＋ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）の時間経過。
【図５】ベヒクルコントロールのパーセントで表した、異種移植結腸腫瘍の体積（白色バー）または腫瘍重量（黒色バー）に及ぼす、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、またはｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）＋５−ＦＵの作用。
【図６】異種移植結腸腫瘍体積（ｍｍ３）に及ぼす、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、またはｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）＋５−ＦＵの時間経過。
【図７】動物の体重に及ぼす、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、またはｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）＋５−ＦＵの時間経過。
【図８】ＣＴ２６結腸癌細胞を注入されたマウスにおける肺転移巣の数に対する、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏの用量反応。
【図９】ＣＴ２６結腸癌細胞を注入されたマウスの肺質量に対する、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏの用量反応。
【図１０】ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞を注入されたマウスにおける肝転移の程度に及ぼす、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ、ＣＰＴ−１１、またはＣＰＴ−１１＋ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏの作用。
【図１１】ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞を注入されたマウスにおける肝臓湿潤重量に及ぼす、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ、ＣＰＴ−１１、またはＣＰＴ−１１＋ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏの作用。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本明細書で使用される表題は、読み易いように与えられるものであって、いかなる意味でも本発明の記述を限定するものと見なしてはならない。
【００２１】
Ｉ．定義
本明細書において別様に定義しない限り、本発明に関連して使用される科学および技術用語は、当該技術分野において通常の技能を有する当業者によって普通に理解される意味を持つ。さらに、文脈から別様に要求されない限り、単数形は複数形を含み、複数形は単数形を含む。別様に指示されない限り、核酸は、左から右に５’から３’方向に書かれ；アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシ方向に書かれる。
【００２２】
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）のために、標準技術が使用される。酵素反応および精製技術は、メーカーの仕様にしたがって、または、当該技術分野において普通に行われるように、または、本明細書に説明される通りに実行される。先行技術および手順は、当該技術分野において周知の通例法にしたがって、かつ、本明細書を通じて引用され、論じられる、各種一般的な、およびより専門的な参照資料に記載される通りに一般的に実行される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９），Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２），および、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９０）を参照されたい。なお、これらの全体を、全ての目的のために、引用により本明細書に含める。本明細書において分析化学、合成有機化学、および医用および製薬化学に関連して使用される専門用語、検査手順および技術は、当該技術分野で周知で、一般的に使用されるものである。化学合成、化学的分析、製薬調製、処方、および送達、および患者の処置のためには、標準的技術が使用される。
【００２３】
本開示にしたがって使用される場合、下記の用語は、別様に指示しない限り、下記の意味を持つものと理解しなければならない。
【００２４】
「ある」または「該」という用語は、文脈から不適切でない限り、一つ以上を意味し、複数形を含む。
【００２５】
「ポリペプチド」または「タンパク」という用語は、天然タンパク、すなわち、天然の、非組み換え細胞によって生産されるタンパク、または、遺伝子工学的に加工された細胞、すなわち組み換え細胞によって生産されるタンパクのアミノ酸配列を有する巨大分子を意味し、天然タンパクのアミノ酸配列を有する分子、または、該天然配列の一つ以上のアミノ酸について、その欠失、それへの付加、および／または、それとの置換を有する分子を含む。「ポリペプチド」および「タンパク」という用語は、特定的に、ＮＡＰタンパク、または、ＮＡＰタンパク、ＮＡＰ５、ＮＡＰ６、ｒＮＡＰｃ２、およびｒＮＡＰｃ２／プロリンの、一つ以上のアミノ酸について、その欠失、それへの付加、および／またはそれとの置換を有する配列を包含する。「ポリペプチド断片」または「断片」という用語は、完全長の天然タンパクと比べ、アミノ末端欠失、カルボキシ末端欠失、および／または内部欠失を有するポリペプチドを指す。このような断片はさらに、天然タンパクと比べ、修飾アミノ酸を含んでもよい。ある実施態様では、断片は、約５から５００アミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００アミノ酸長であってもよい。
【００２６】
「単離タンパク」という用語は、対象タンパクが、（１）通常共に見られる、少なくともある他のタンパクを含まないこと、（２）同じ供給源、例えば、同じ生物種から得られる他のタンパク類を事実上含まないこと、（３）異なる生物種の細胞によって発現されること、（４）天然では関連する、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、またはその他の物質の少なくとも約５０％から分離されること、（５）天然では関連しないポリペプチドと動作可能的に関連すること（共有的、または非共有的相互作用によって）、または、（６）天然では起こらないこと、を意味する。そのような単離タンパクをコードするものは、合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはその他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。単離タンパクは、その治療的、診断的、予防的、研究上の、またはその他の用途を妨げると考えられる、天然環境で認められる、タンパクまたはポリペプチド、またはその他の汚染物質を事実上含まないことが好ましい。
【００２７】
ポリペプチドの「変異体」とは、別のポリペプチド配列と比べ、そのアミノ酸配列について、一つ以上のアミノ酸残基が、それに挿入、それから欠失、および／またはそれと置換される、アミノ酸配列を意味する。本発明の変異体は、融合タンパクを含む。
【００２８】
ポリペプチドの「誘導体」とは、挿入、欠失、または置換変異体とは異なる方式で、例えば、別の化学成分に対する接合を介して、化学的に修飾されるポリペプチドを意味する。
【００２９】
本発明のポリペプチドは、ＮＡＰタンパクの配列、またはその断片と事実上同一であるように修飾されてもよいことを理解しなければならない。ポリペプチド配列同士は、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムによってデフォールトのギャップウェイトを用いて最適整列させた場合、それらが、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を共有する場合、それらは「事実上同一」である。ある実施態様では、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけが異なる。保存的アミノ酸置換とは、類似側鎖を有する残基同士の相互交換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有する、アミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンを含み；脂肪族ヒドロキシル側鎖を含むアミノ酸群は、セリンおよびトレオニンを含み；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンを含み；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを含み；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、およびヒスタジンを含み；酸性側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンを含む。好ましい保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、アスパラギン酸−グルタミン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００３０】
本明細書において論じるように、本発明のＮＡＰタンパクのアミノ酸配列における僅かな変動は、アミノ酸配列におけるその変動が、少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を維持する限り、本発明によって包含されるものと見なされる。あるアミノ酸変化が機能的ペプチドの出現を招くかどうかは、そのポリペプチド誘導体の特異的活性を定量することによって簡単に決めることが可能である。アッセイは、本明細書の実施例５において詳述される。
【００３１】
本発明のＮＡＰタンパクの断片または類縁体は、当該技術分野において通常の技能を有する当業者によって簡単に調製することが可能である。断片または類縁体のアミノおよびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界近くに出現することが好ましい。
【００３２】
構造および機能ドメインは、該ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを、一般公開または私企業配列データベースと比較することによって特定することが可能である。
【００３３】
公知の構造および／または機能を持つ他のタンパクに現れる、配列モチーフ、または予測タンパク立体配座ドメインを特定するには、コンピュータ化比較法が使用される。折り畳まれて公知の三次元構造を取る、タンパク配列を特定する方法は、当該技術分野で既知である。Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１）。
【００３４】
「有効量」という用語は、用量および必要期間において、所望の治療的または予防的成績を実現するのに有効な量を意味する。新形成細胞増殖低下の観点から見た抗転移剤の「有効量」は、ある癌細胞または腫瘍細胞の増殖を、ある程度低減させることが可能な量を意味する。この用語は、癌または腫瘍細胞の、増殖抑制、細胞静止性、および／または細胞毒性作用、および／またはアポトーシスを誘発することが可能な量を含む。
【００３５】
腫瘍の処置に関連した「治療的有効量」とは、下記の作用：（１）腫瘍増殖の、緩慢化を含む、ある程度の抑制、および完全な増殖停止；（２）腫瘍細胞の数の減少；（３）腫瘍サイズの低下；（４）抹消器官に向かう腫瘍細胞浸潤の抑制（すなわち、低減、緩慢化、または完全停止）；（５）転移の抑制（すなわち、低減、緩慢化、または完全な停止）；（６）腫瘍の後退または拒絶をもたらす可能性はあるが、必要とはされない抗腫瘍反応の強化、または、（７）障害に関連する一つ以上の症状のある程度の解除、の内の一つ以上を誘発することが可能な量を意味する。この治療的有効量は、個人の病状、年齢、性別、および体重、並びに、一つ以上の抗癌剤と組み合わされる抗転移剤の、該個人において所望の反応を誘発する能力などの要因に応じて変動してもよい。さらに、「治療的有効量」は、何らかの有毒または有害作用がある場合、治療的有益作用がそれを上回る量である。
【００３６】
「癌を処置する」および「癌の処置」という語句は、癌細胞の複製を減らす、下げる、または抑制すること、癌の拡散（転移癌の形成）を減らす、下げる、または抑制すること、腫瘍の数を減らすこと（すなわち、腫瘍負荷量を下げること）、生体における癌様細胞の数を減らすか、または下げること、外科切除、またはその他の抗癌療法後において癌の再発を阻止すること、または、癌によって引き起こされる病状を緩和または寛解すること、を意味する。
【００３７】
「抗腫瘍活性」という用語は、治療中に起こる、細胞増殖率の低下、したがって、異常細胞の成長速度の下降を意味する。抗腫瘍活性はさらに、腫瘍サイズの低下も包含する。このような活性は、公認動物モデル、例えば、ヒトのＢ細胞リンパ腫に関する、Ｎａｍａｌｗａ  ａｎｄ  Ｄａｕｄｉ異種移植モデルを用いて評価することが可能である。これらの動物モデルの記述については、例えば、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １２：２０２９−２０３３（１９９８）を参照されたい。
【００３８】
「腫瘍」という用語は、悪性良性を問わず、液状または固形状を問わず、全ての新生細胞成長または増殖、および、全ての、前癌および癌様細胞および組織を意味する。
【００３９】
「癌」および「癌様」という用語は、通常、無統制細胞成長によって特徴づけられる、哺乳動物における生理的状態を指すか、または、そのような状態を記述するのに使用される。癌とは、細胞の、異常な、無統制な増殖によって引き起こされるいくつかの病態のいずれかを指す。「癌細胞」と呼ばれる、癌を引き起こすことが可能な細胞は、いくつかの特徴的性質、例えば、無統制増殖、不滅性、転移能、急速な成長および増殖速度、およびいくつかの典型的形態特徴を有する。多くの場合、癌細胞は、腫瘍の形を取るが、癌細胞はさらに、単独で存在する場合もあるし、あるいは、白血病細胞のように、非腫瘍形成癌細胞である場合もある。癌細胞は、いくつかある方法、例えば、ただしこれらに限定されないが、腫瘍（単数または複数）の存在の検出（例えば、臨床的または放射線学的手段によって）、腫瘍内、または他の生物サンプル（例えば、組織バイオプシー）の細胞検査、癌を指示する血液マーカーの測定（例えば、ＣＡ１２５、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＨＣＧ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＬＤＨ、ＮＳＥ、およびその他）、および、癌を指示する遺伝子型の検出（例えば、ＴＰ５３、ＡＴＭなど）のいずれかによって検出することが可能である。しかしながら、前述の検出法の一つ以上における陰性結果は必ずしも癌の不在を示すことにはならない。例えば、癌処置に対し完全反応を示した患者であっても、その後の再発によって示されるように、癌を持っている可能性がある。癌の例としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、上皮癌、リンパ腫、芽細胞種、肉腫、および白血病が挙げられる。
【００４０】
一つ以上の別の薬剤と「組み合わせた」投与は、抗転移剤および抗癌剤の両方を、癌などの増殖性疾患の処置のため共同作用させるために、同時（共時）的に、または、共同作用のために十分なものである限り、任意の順序で継時的に投与することを含む。
【００４１】
「相加的」という用語は、別々の成分、例えば、抗転移剤および抗癌剤の集合作用であって、共同作用の結果が、個別の作用の合計となる集合作用を意味する。
【００４２】
「相乗作用」という用語は、別々の成分、例えば、抗転移剤および抗癌剤の集合作用であって、共同作用の結果が、個別の作用の合計よりも大きくなる、すなわち、相加作用よりも大きくなる集合作用を意味する。
【００４３】
「抗癌剤」という用語は、癌などの細胞増殖性障害の処置に使用することが可能な任意の薬剤であって、例えば、細胞傷害剤、化学療法剤、放射線治療および放射線治療剤、標的化された抗癌剤、および免疫治療剤などを含む。
【００４４】
「抗転移剤」という用語は、癌細胞の転移を抑制、低下、または減少させる物質を意味する。抗転移剤としては、血管形成、組織因子の活性、ＶＩＩａ因子活性、または、組織因子／ＶＩＩａ因子複合体活性を抑制または低下する物質が挙げられる。実例として、ＶＥＧＦ阻害剤、抗ＶＥＧＦ抗体（すなわち、ベバシズマブ、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、非抗凝固性ヘパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ、例えば、ＬＯＶＥＮＯＸ（登録商標））、抗組織因子抗体、ＣＲＡ−５（抗ｆＶＩＩａ）、ＢＭＳ２６２０８４、ＴＴＰ８８９、タンパクＣ、ＡＰＣ（Ｄｒｏｔｒｅｃｏｇｉｎ）、ｓＴＭ、Ｉｄｒａｐａｒｉｎｕｘ、ＤＸ９０６５ａ、ＢＡＹ５９−７９３９、ＬＹ−５１，７７１７、ＢＭＳ−５６２２４７、ＤＵ−１７６ｂ、オタミキサバン、ラザキサバンなどが挙げられる。
【００４５】
「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能を低減または抑制するか、および／または、細胞の破壊を引き起こす物質を意味する、すなわち、該物質は、細胞に対して有毒である。通常、該物質は、生きている生物から得られる天然分子である。細胞傷害剤の例としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、細菌の、小型分子トキシンまたは酵素的活性トキシン（例えば、Ｄｉｐｈｔｅｒｉａトキシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエンドトキシンおよびエキソトキシン、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシンＡ）、真菌（例えば、α−サルシン、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モデシン、ビスカミン、ヨウシュウヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウィルス性タンパク、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、大麦トキシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク、ジアンチンタンパク、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ｍｅｒｉｃａｎａタンパク（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセン）、または動物、例えば、細胞傷害性ＲＮアーゼ、例えば、細胞外すい臓ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ、およびその断片および／または変異体などが挙げられる。
【００４６】
「化学療法剤」という用語は、癌細胞の成長、増殖、および／または生存を、非特異的に減少または抑制する化合物を意味する。このような化学的薬剤は、しばしば、細胞成長または分裂に必要な細胞内プロセスを指向するので、一般に、急速に成長分裂する癌様細胞に対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合するので、細胞が有糸分裂を始めることができないようにする。一般に、化学療法剤は、癌様細胞、または癌様になりそうに見える細胞を抑制するか、または抑制するように設計される、任意の化学薬剤を含むことが可能である。このような薬剤は、組み合わせて、例えば、ＣＨＯＰ処方物として投与されることが多く、かつもっとも有効であることが多い。
【００４７】
本発明によって対象と見なされる化学療法剤の例としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、アルキル化剤、例えば、チオテパ、およびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、シクロフォスファミド；アルキルスルフォン酸塩、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ；エチレンイミンおよびメチルアメラミン、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンフォスフォルアミド、トリチレンチオフォスフォルアミド、およびトリメチロロメラミンなど；アセトゲニン（特に、ブラタシン、およびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類縁体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９−アミノカンプトテシンなど）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類縁体など）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類縁体、ＫＷ−２１８９、およびＣＢ１−ＴＭ１など）；エレウセロビン；パンクラティスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロールナファジン、コロフォスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン；抗生物質、例えば、エネジン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１およびカリケアマイシンオメガ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照）；ダインマイシン、ダインマイシンＡなど；エスペラマイシン；および、ネオカルジノスタチン発色団および関連発色タンパクエネジン抗生物性発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（例えば、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注入剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、および、デオキシドキソルビシンなど）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸、ノガラマイシ���、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポツフィロマイシン、プロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝剤、例えば、メトトレキセート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフル（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類縁体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトトレキセート；プリン類縁体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類縁体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗アドレナール剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタン；葉酸補強剤、例えば、フロリン酸；アセグラトン；アルドフォスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン；エリプチニウム酢酸塩；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；イオニダイニン；マイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）ポリサッカリド複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（“Ａｒａ−Ｃ”）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルの、アルブミン加工ナノ粒子処方剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））、およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類縁体、例えば、シスプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；レウコボビン；ベイノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）；レチノイド、例えば、レチン酸；上記のいずれかの、製薬的に受容可能な塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【００４８】
さらに、有用なものとして、上記の二つ以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ（シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニソンの組み合わせ）の外、ＣＨＯＰの構成成分単独、または、該構成成分の各種組み合わせ、例えば、ＣＯ、ＣＨ、ＣＰ、ＣＯＰ、ＣＨＯ、ＣＨＰ、ＨＯ、ＨＰ、ＨＯＰ、ＯＰなど；ＣＨＯＰおよびブレオマイシン（ＣＨＯＰ−ＢＬＥＯ）；シクロフォスファミドおよびフルダラビン；シクロフォスファミド、ミトキサントロン、プレドニソン、およびビンクリスチン；シクロフォスファミド、デキサメタゾン、ドキソルビシン、およびビンクリスチン（ＣＡＶＤ）；ＣＡＶ；シクロフォスファミド、ドキソルビシン、およびプレドニソン；シクロフォスファミド、ミトキサントロン、プレドニソン、およびビンクリスチン（ＣＮＯＰ）；シクロフォスファミド、メトトレキセート、レウコボリン、およびシタラビン（ＣＯＭＬＡ）；シクロフォスファミド、デキサメタゾン、ドキソルビシン、およびプレドニソン；シクロフォスファミド、プレドニソン、プロカルバジン、およびビンクリスチン（ＣＯＰＰ）；シクロフォスファミド、プレドニソン、およびビンクリスチン（ＣＯＰおよびＣＶＰ−１）；シクロフォスファミドおよびミトキサントロン；エトポシド；ミトキサントロン、イフォスファミド、およびエトポシド（ＭＩＶ）；シタラビン；メチルプレドニソロンおよびシスプラチン（ＥＳＨＡＰ）；メチルプレドニソロン、シタラビン、およびシスプラチン（ＥＳＡＰ）；フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、およびＧ−ＣＳＦ（ＦＬＡＧ）；イリノテカン、５−ＦＵ（ＩＦＬ）；オキサリプラチン、５−ＦＵ、レウコボリン（ＦＯＬＦＯＸ）；オキサリプラチン、イリノテカン（ＩＲＯＸ）；レウコボリン、５−ＦＵ、イリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）；メトトレキセート、レウコボリン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、ブレオマイシン、およびプレドニソン（ＭＡＣＯＰ−Ｂ）；メトトレキセート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、およびデキサメタゾン（ｍ−ＢＡＣＯＤ）；プレドニソン、シクロフォスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキセート、およびレウコボリン（ＰＲＯＭＡＣＥ−ＣＹＴＡＢＯＭ）；エトポシド、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン、およびブレオマイシン（ＶＡＣＯＰ−Ｂ）；フルダラビンおよびミトキサントロン；シスプラチン、シタラビン、およびエトポシド；デサメタゾン、フルダラビン、およびミトキサントロン；クロラムブシルおよびプレドニソン；ブスルファンおよびフルダラビン；ＩＣＥ；ＤＶＰ；ＡＴＲＡ；イダルビシン、ｈｏｅｌｚｅｒ化学治療処方剤；ＬａＬａ化学治療処方剤；ＡＢＶＤ；ＣＥＯＰ；２−ＣｄＡ；ＦＬＡＧおよびＩＤＡ（後続のＧ−ＣＳＦ処置付きまたは無し）；ＶＡＤ；ＭおよびＰ；Ｃ−Ｗｅｅｋｌｙ；ＡＢＣＭ；ＭＯＰＰ；シスプラチン、シタラビン、およびデキサメタゾン（ＤＨＡＰ）、および、それ以外の、公知の化学治療処方剤がある。さらに、これらの化学療法剤の調製および投与スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９２）に記載される。
【００４９】
本定義にさらに含まれるものは、癌の成長を増進する可能性のあるホルモンの作用を調節、低減、阻止、または抑制するように作用する抗ホルモン剤であって、多くの場合、循環または全身処置の形を取る。これら自身がホルモンであってもよい。例としては、抗エストロゲン、および、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）であって、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＸ（登録商標）タモキシフェンなど）、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））など；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方調節剤（ＥＲＤ）；エストロゲン受容体拮抗剤、例えば、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））；卵巣を抑制または機能停止するように働く薬剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）作用剤、例えば、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン、およびトリプテレリン；他の抗アンドロゲン剤、例えば、フルタミド、ニルタミド、およびビカルタミド；および副腎におけるエストロゲン生産を調節する酵素アロマターゼを抑制する、アロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、フォルメスタニー、ファドロゾール、ボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、およびアナストロゾル（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））が挙げられる。さらに、化学療法剤の、この定義の中には、ビスフォスフォネート、例えば、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）、またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；および、トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、細胞の異常増殖に関わるシグナル伝達経路の遺伝子発現を抑制するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）；ワクチン、例えば、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン、および遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ラパチニブジトシレート（ＥｒｂＢ−２およびＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小型分子阻害剤、別名ＧＷ５７２０１６）；ＣＯＸ−２阻害剤、例えば、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）、４−（５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルフォンアミド；および、上記のいずれかの、薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体が含まれる。
【００５０】
「放射線治療」または「放射線治療剤」という用語は、癌を抱える対象に対する、放射能または放射性化合物の投与を意味する。放射線照射は、癌細胞などの分裂細胞の増殖を抑制する。この治療は、放射性同位元素（例えば、リン−３２、銅−６７、砒素−７７、ロジウム−１０５、パラジウム−１０９、銀−１１１、錫−１２１、ヨウ素−１２５または１３１、ホルミウム−１６６、ルテニウム−１７７、レニウム−１８６または１８８、イリジウム−１９４、金−１９９、アスタチウム−２１、イットリウム−９０、サマリウム−１５３、またはビスマス−２１２）からの照射を含んでもよい。放射線治療は、全身被爆であってもよいし、または、生体の特異的部位または組織、例えば、肺、結腸、または前立腺などに局所的に向けられてもよい。
【００５１】
「標的化された抗癌剤」という用語は、特異的タンパク、脂質、またはその他の細胞成分を指向する分子を意味する。このような標的化された抗癌剤としては、抗原を標的とする、モノクロナール抗体またはその他の型の抗体（例えば、断片、単一鎖抗体、二重特異性抗体）、または分子（例えば、ペプチボディ）が挙げられる。このような、免疫治療標的性抗体の例としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、トシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）、ゲムツズマブオゾガミシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、イブリツモマブチウキセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、ミトモマブ（ＢＥＣ２）、Ｃ２２５、ＯｎｃｏＬｙｍ、エプラツズマブ（Ｌｙｍｐｈｏｃｉｄｅ）、オレゴボマブ（ＯＶＡＲＥＸ（登録商標）、ＶｉＲｅｘｘ，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）、リンツズマブ（ＳＭＡＲＴ  Ｍ１９５）、アポリズマブ（ＳＭＡＲＴ  １Ｄ１０）、ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）が挙げられる。さらに、「標的化された抗癌剤」という用語によって捕捉されるものは、イムノトキシンである。「イムノトキシン」とは、抗体、または抗体様トキシン接合体であって、該抗体に対して相同な抗原を担う、特異的標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を破壊することが意図される接合体を意味する。このような抗体に結合されるトキシンの例としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）、遮断リシン（ｂｌＲ）、サポリン（ＳＡＰ）、アメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク（ＰＡＰ），およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシン（ＰＥ）、および、放射性同位元素など、その他の有毒化合物、および、前述のような、その他の化学療法剤が挙げられる。
【００５２】
「免疫治療剤」という用語は、免疫増強剤または免疫抑制剤であり、癌を含む疾病および障害を処置するのに有用な化合物を意味する。このような薬剤としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、各種サイトカインおよびリンフォカイン、例えば、ＴＦＧ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、いくつかのインターロイキン類、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、およびこれらの分子のムテイン；インターロイキン、例えば、ただしこれらに限定されないが、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、および、これらのムテイン；コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦのムテイン；腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−β、およびこれらの分子のムテインが挙げられる。
【００５３】
「標識」および「検出可能標識」という用語は、検出が可能な分子を指し、例えば、ただしこれらに限定されないが、放射性同位元素、蛍光剤、半導体ナノ粒子、化学発光剤、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、染料、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、またはハプテン）などが挙げられる。「蛍光剤」という用語は、検出可能範囲の蛍光を示すことが可能な物質、またはその部分を指す。本発明において使用してよい標識の特定例としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、およびα−またはβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。
【００５４】
本明細書で用いられる「対象」という用語は、哺乳動物、例えば、ただしこれらに限定されないが、家庭内および農場動物、動物園、遊猟、またはペット動物、例えば、ウシ、サル、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、またはヒトを意味する。好ましくは、この哺乳動物はヒトである。対象は、ヒトの患者であってもよい。
【００５５】
「生物サンプル」という用語は、対象から単離される、組織または液体サンプル、例えば、ただしこれらに限定されないが、血液、血漿、血小板、血清、大便物質、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ液、脳脊髄液、皮膚サンプル、皮膚の分泌物、汗腺、腸管、および生殖泌尿器管、涙、唾液、乳汁、血球、器官、バイオプシー、および、インビトロ細胞培養構成成分のサンプル、例えば、ただしこれらに限定されないが、培養媒体における、細胞および組織、例えば、組み換え細胞を育成することによって得られる調整媒体、および細胞成分を指す。上に詳述したサンプルは、供給源から直接取得された形状を必ずしも取る必要はない。例えば、サンプルは、使用前に処理すること、分析の前に、例えば、加熱、遠心などによって処理することが可能である。
【００５６】
「薬学的に受容可能な」ベヒクル、担体、またはアジュバントという語句は、使用する用量および濃度では、レシピエント患者が耐容することが可能な、非毒性薬剤を意味する。多くの場合、薬学的担体は、水性のｐＨ緩衝液である。このような薬剤の、代表的、非限定的例としては、ヒトの血清アルブミン、ゼラチン、イオン交換分子、アルミナ、レシチン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、グリシン、抗酸化剤、例えば、アルコルビン酸、ソルビン酸カリウム、および他の有機酸、および、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミンが挙げられる。好適なベヒクルは、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、親水性ポリマー、例えば、ポリビニールピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン；モノサッカリド、ジサッカリド、および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリンなど；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトール、またはソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム；および／または、非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ，ＵＳＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）（ＢＡＳＦ，Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ，ＵＳＡ）。他の好適な薬剤は、当業者には周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照されたい。このような組成物を調製する実際の方法も、当業者には既知であるか、または明白である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照されたい。
【００５７】
「Ｘａ因子」、“ｆＸａ，”または“ＦＸａ”は、同義であり、プロトロンビナーゼ複合体の一部として酵素トロンビンを形成するように働く、血液凝固酵素カスケード内のセリンプロテアーゼを意味する。
【００５８】
「触媒的に不活性なｆＸａ誘導体」という用語は、チモーゲンＸ因子（“ｆＸ”または“ＦＸ”）の外、他の、触媒的に不活性なｆＸａ誘導体を含む。
【００５９】
「抑制活性」という語句は、作用を受ける分子の活性を低下するか、または減少することを意味する。
【００６０】
「Ｘａ因子の抑制活性」という語句は、その基質に対する、ｆＸａの触媒活性を抑制する、低下する、または減少する活性を意味する。
【００６１】
「Ｘａ因子選択的抑制活性」という語句は、他の関連酵素、例えば、他のセリンプロテアーゼと比べ、Ｘａ因子に対して選択的な抑制活性を意味する。
【００６２】
「Ｘａ因子阻害剤」という語句は、Ｘａ因子抑制活性を有する化合物を意味する。
【００６３】
「ＶＩＩａ因子／組織因子」、または「組織因子／ＶＩＩａ因子」、または、“ｆＶＩＩａ／ＴＦ，”または“ＦＶＩＩａ／ＴＦ，”または“ＴＦ／ｆＶＩＩａ”は同義であり、セリンプロテアーゼ凝固因子ＶＩＩａ（ｆＶＩＩａ）および非酵素タンパク組織因子（ＴＦ）の酵素的に活性な複合体であって、定められた組成のリン脂質膜の表面において集合される複合体を意味する。
【００６４】
「ｆＶＩＩａ／ＴＦ抑制活性」、または「ＴＦ／ｆＶＩＩａ抑制活性」という語句は、ｆＸａ、または触媒的に不活性なｆＸａ誘導体（チモーゲンｆＸを含む）の存在下に、ｆＶＩＩａ／ＴＦ複合体の触媒活性を抑制、低下、または低減する活性を意味する。
【００６５】
「ｆＶＩＩａ／ＴＦ選択的抑制活性」という語句は、他の関連酵素、例えば、セリンプロテアーゼ、例えば、ｆＶＩＩａおよびｆＸａなどに比べ、ｆＶＩＩａ／ＴＦに対して選択的である抑制活性を意味する。
【００６６】
「ｆＶＩＩａ／ＴＦ阻害剤」という語句は、ｆＸａ、または触媒的に不活性なｆＸａ誘導体の存在下に、ｆＶＩＩａ／ＴＦ抑制活性を有する化合物を意味する。
【００６７】
「セリンプロテアーゼ」という語句は、アミド結合を触媒的に切断するヒスタジン、アスパラ銀酸、およびセリンの三体（トライアッド）があり、この三体の中のセリン残基が、この触媒的切断に共有的に関与するが、そのような三体を含む、一般的三次元フォールドを有する酵素を意味する。セリンプロテアーゼは、この触媒的三体の中のセリン残基をジイソプロピルフルオロフォスフェート（ＤＦＰ）によって共有的に修飾することによって触媒的に不活性とされる。
【００６８】
「プロトロンビナーゼ」という用語は、セリンプロテアーゼ血液凝固因子Ｘａ（ｆＸａ）および非酵素タンパク因子Ｖａ（ｆＶａ）の触媒活性複合体で、定められた組成のリン脂質膜の表面において集合される複合体を意味する。
【００６９】
「抗凝固活性」という語句は、血漿の凝固を含む、血液の凝固を抑制、低下、または低減する活性を意味する。
【００７０】
「選択的」、「選択性」、およびそれらの変化形は、ある酵素に対する化合物または組成物の活性に関して使用される場合、該化合物または組成物は、指定の酵素を、他の関連酵素に対する抑制の度合いよりも少なくとも１０倍の強度をもって抑制することを意味する。この場合、この化合物または組成物の活性は、この指定の酵素に対して「選択的」である。
【００７１】
“ＮＡＰ５”または“ＮＡＰ６”は、ＮＡＰファミリーの単離タンパクを意味する。ＮＡＰ５およびＮＡＰ６の調製および配列は、米国特許第５，８６６，５４２号に記載される。
【００７２】
“ｒＮＡＰｃ２”という用語は、ＮＡＰファミリーの組み換えタンパクを意味する。ｒＮＡＰｃ２の調製および配列は、米国特許第５，８６６，５４２号および本明細書の図１Ａ（ｒＮＡＰｃ２のアミノ酸配列）に記載される。
【００７３】
「ｒＮＡＰｃ２／プロリン」、“ｒＮＡＰｃ／ｐｒｏ”、および“ｒＮＡＰｃ２ｐ”は、ｒＮＡＰｃ２のアミノ酸配列を有する組み換えタンパクであるが、ｒＮＡＰｃ２配列のＣ末端にプロリン残基を付加するように修飾された組み換えタンパクを意味する（本明細書の図１Ｂ参照）。
【００７４】
下記のサブセクションにおいて、本発明の各種局面がさらに詳細に説明される。
【００７５】
ＩＩ．ＮＡＰタンパク
各種実験的転移腫瘍モデルにおける研究から、転移するためには、腫瘍細胞は、一次的腫瘍部位から、血流またはリンパ系に入り、遠隔器官に移動し、微小血管内で停止し、血管から溢出し、その二次部位において成長することが明らかにされている。この多段階プロセスにおいて、トロンビン生成およびフィブリン形成が重要な役割を演じているようである。下記の理論によって拘束されることを望むものではないが、循環の中にまんまと入り込んだ癌細胞の多くは、血液の渦流によって急速に排除されるため、生存を図るために、腫瘍細胞は、互いに、または血小板およびリンパ球などの宿主細胞と共に、凝集する傾向を持つと考えられている。これらの細胞は、多くの場合、フィブリンによってコートされる、多細胞塞栓（血栓とも呼ばれる）を形成する。これらの血栓は、腫瘍細胞を、機械的力から保護し、該腫瘍細胞と、標的器官の微小血管との相互作用を安定化すると考えられている。さらに、腫瘍細胞表面におけるトロンビン生成は、微小血管の内皮細胞の血管拡張、内皮細胞基質の分解、および、細胞−細胞接着分子、例えば、内皮細胞表面における、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、Ｐ−およびＥ−セレクチンの発現を誘発することによって血管溢出を助長する。
【００７６】
組織因子（ＴＦ）は、細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内ドメインから成る、４５ｋＤの膜貫通糖タンパクである（Ｂａｃｈ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３：３３９（１９９８）を参照）。ＴＦは、ＶＩＩ因子に結合し、アロステリックに活性化し（ｆＶＩＩａ）、この複合体ＴＦ／ＶＩＩａは、ＩＸおよびＸ因子の活性化を通じてトロンビン生成に与り、生理的条件下における血液凝固の主要起動因子である。さらに、ＴＦは、結腸直腸、メラノーマ、および肺癌を含む、多くの癌によって過剰発現され、ＴＦのレベルは、悪性の進行と正の相関を持つ。ＴＦは、転移および新血管形成の細胞内シグナル伝達の外、トロンビン生成および病理的血栓形成においても決定的役割を果たす。ＴＦ発現は、各種プロ炎症サイトカインによって誘発され、かつ、ＴＦは、血管内細胞、例えば、単球および内皮細胞によって合成はされないが、血管損傷後、血液凝固カスケード反応を活性化することによってその発現が誘発される。したがって、炎症、血液凝固、および血管形成は、相互に依存し合うプロセスであり、これらのプロセスは、血流を介する転移において必須の役割を演じていると考えられる。
【００７７】
本発明は、異常な、または有害な細胞増殖によって仲介されるか、または該細胞増殖と関連する疾患およびプロセスを処置するための方法を提供する。組成物は、一つ以上の抗癌剤と組み合わせて投与される、ある抗転移剤の全て、または活性断片を含む、単離された天然または合成分子、例えば、タンパク、ペプチド、またはタンパク断片を含む。好ましい実施態様では、抗転移剤は、ＮＡＰタンパクである。ＮＡＰタンパクは、少なくとも一つのＮＡＰドメインの存在によって特徴づけられ、セリンプロテアーゼ抑制および／または抗凝固活性を示す。このＮＡＰドメインが、このタンパクの、観察される抗凝固活性に与ると考えられている。さらに、ｒＮＡＰｃ２は、新血管形成の強力な抑制因子であることが示されている（Ｈｅｍｂｒｏｕｇｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：２９９７−３０００（２００３））。
【００７８】
本発明のいくつかのＮＡＰタンパクは、凝固カスケードの中の特定成分、例えば、ｆＸａ、またはｆＶＩＩａ／ＴＦ複合体の抑制に向けた特異性を示す。ＮＡＰタンパクＮＡＰ５およびＮＡＰ６は、それぞれ、一つのＮＡＰドメインを持ち、Ｘａ因子の選択的抑制を示す。ｒＮＡＰｃ２およびｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏは、それぞれ、単一ＮＡＰドメインを持ち、ｆＸａ、またはその触媒的活性または不活性誘導体が存在する場合、ｆＶＩＩａ／ＴＦ複合体の選択的抑制を示す。本発明の一局面によれば、他の抗癌剤と組み合わせた、これらの阻害剤は、有害な細胞増殖を低下または抑制し、それによって腫瘍負荷量および転移を下げることによって癌に対する処置として用いられる。
【００７９】
Ａ．Ｘａ因子抑制活性を有するＮＡＰタンパク
米国特許第５，８６６，５４２号は、「線虫抽出抗凝固タンパク（ＮＡＰタンパク）」と名づけられる一群のタンパクを記載する。その一クラスは、Ｘａ因子抑制活性を持つと記述される。このタンパククラスは、Ｘａ因子抑制活性を有し、一つ以上のＮＡＰドメインを持つ単離タンパクを含む。ここに各ＮＡＰドメインは、配列：Ｃｙｓ−Ａ１−Ｃｙｓ−Ａ２−Ｃｙｓ−Ａ３−Ｃｙｓ−Ａ４−Ｃｙｓ−Ａ５−Ｃｙｓ−Ａ６−Ｃｙｓ−Ａ７−Ｃｙｓ−Ａ８−Ｃｙｓ−Ａ９−Ｃｙｓ−Ａ１０（「式ＩＩ」）を含み、前式において、
（ａ）Ａ１は、７から８個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり；
（ｂ）Ａ２はアミノ酸配列であり；
（ｃ）Ａ３は、３個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり；
（ｄ）Ａ４はアミノ酸配列であり；
（ｅ）Ａ５は、３から４個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり；
（ｆ）Ａ６はアミノ酸配列であり；
（ｇ）Ａ７はアミノ酸配列であり；
（ｈ）Ａ８は、１１から１２個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり；
（ｉ）Ａ９は、５から７個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり；
（ｊ）Ａ１０はアミノ酸配列であり；上式において、Ａ２、Ａ４、Ａ６、およびＡ１０は、独立に選ばれた数の、独立に選ばれたアミノ酸残基を有し、各配列は、各ＮＡＰドメインが、合計で、約１２０アミノ酸残基より少なくなるように選ばれる。
【００８０】
本発明のこの局面による好適なＮＡＰタンパクは、少なくとも一つのＮＡＰドメインを有する。好ましいのは、ＮＡＰ５（配列番号１）およびＮＡＰ６（配列番号２）のＮＡＰドメインと事実上同じ、少なくとも一つのＮＡＰドメインを有するポリペプチドである。ＮＡＰドメインＮＡＰ５およびＮＡＰ６は、それぞれ、一つのＮＡＰドメインを持つが、本発明のこの局面によれば好ましいＮＡＰタンパクである。ＮＡＰ５およびＮＡＰ６は、元々鉤虫Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃａｎｉｎｕｍから単離された、７７アミノ酸タンパク（配列番号１）および７５アミノ酸タンパクである（配列番号２）。
【００８１】
本発明のこの局面の一実施態様による、好ましいＮＡＰタンパクは、Ａ２が３から５個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり、Ａ４が６から１９個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり、Ａ６が３から５個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり、Ａ１０が５から２５個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であるタンパクである。
【００８２】
本発明のこの局面の、もう一つの好ましい実施態様では、Ａ３は、Ａ３ａおよびＡ３ｂが、独立に選ばれるアミノ酸残基である、配列Ｇｌｕ−Ａ３ａ−Ａ３ｂを有する。より好ましくは、Ａ３ａは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、およびＴｈｒから成る群から選ばれ、Ａ３ｂは、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、およびＡｒｇから成る群から選ばれる。
【００８３】
本発明のこの局面の別の好ましい実施態様では、Ａ４は、合計残高として陰イオン電荷を有するアミノ酸配列である。
【００８４】
本発明のこの局面によれば、好ましいＡ７アミノ酸残基は、ＶａｌまたはＩｌｅである。
【００８５】
本発明の個の局面のもう一つの好ましい実施態様は、Ａ８が、アミノ酸配列Ａ８ａ−Ａ８ｂ−Ａ８ｃ−Ａ８ｄ−Ａ８ｅ−Ａ８ｆ−Ａ８ｇ（配列番号５）を含む実施態様であり、前式において、
（ａ）Ａ８ａは、Ａ８における最初のアミノ酸残基であり；
（ｂ）Ａ８ａおよびＡ８ｂの少なくとも一つは、ＧｌｕまたはＡｓｐから成る群から選ばれ；
（ｃ）Ａ８ｃからＡ８ｇは、独立に選ばれるアミノ酸残基である。
【００８６】
好ましくは、Ａ８ｃはＧｌｙであり、Ａ８ｄは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＬｅｕから成る群から選ばれ、Ａ８ｅはＴｙｒであり、Ａ８ｆはＡｒｇであり、Ａ８ｇは、ＡｓｐおよびＡｓｎから選ばれる。
【００８７】
ＮＡＰタンパクＮＡＰ５およびＮＡＰ６は、Ａ１０において、アミノ酸配列Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ（配列番号６）を含み、本発明のこの実施態様による好ましいＮＡＰタンパクである。
【００８８】
一実施態様では、本発明は、ｆＸａ抑制活性を有する、好適なＮＡＰタンパクであって、
（ａ）Ａ３は、Ａ３ａおよびＡ３ｂが、独立に選ばれるアミノ酸残基である、配列Ｇｌｕ−Ａ３ａ−Ａ３ｂを有し；
（ｂ）Ａ４は、合計残高として陰イオン電荷を有するアミノ酸配列であり；
（ｃ）Ａ７は、ＶａｌおよびＩｌｅから成る群から選ばれ；
（ｄ）Ａ８は、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ（配列番号７）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（配列番号８）、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ（配列番号９）、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（配列番号１０）、およびＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ（配列番号１１）から成る群から選ばれるアミノ酸配列であり；および、
（ｅ）Ａ１０は、Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ（配列番号６）、Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ（配列番号１２）、Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号１３）、およびＭｅｔ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（配列番号１４）から成る群から選ばれるアミノ酸配列である、
ＮＡＰタンパクを使用する方法を主題とする。
【００８９】
一つ以上の抗癌剤と組み合わせて、ｆＸａ抑制活性を有する、これらのＮＡＰタンパクの一つ以上と、薬学的に受容可能な担体とを含む、薬学的組成物の使用が、本実施態様によって考慮の対象とされる。本発明の方法にしたがって使用されるＮＡＰタンパクは、少なくとも一つのＮＡＰドメインを有する。ＮＡＰドメインＮＡＰ５（配列番号１）およびＮＡＰ６（配列番号２）は、それぞれ、一つのＮＡＰドメインを持つが、本発明のこの局面によれば好ましいＮＡＰタンパクである。
【００９０】
別の好ましい実施態様では、本発明の方法において使用するのに好適なＮＡＰタンパクは、
（ａ）Ａ３は、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ、Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、およびＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓから成る群から選ばれ；
（ｂ）Ａ４は、合計残高として陰イオン電荷を有するアミノ酸配列であり；
（ｃ）Ａ７はＶａｌまたはＩｌｅであり；
（ｄ）Ａ８は、Ａ８ａ−Ａ８ｂ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ（配列番号１５）、Ａ８ａ−Ａ８ｂ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（配列番号１６）、Ａ８ａ−Ａ８ｂ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ（配列番号１７）、Ａ８ａ−Ａ８ｂ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（配列番号１８）、およびＡ８ａ−Ａ８ｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ（配列番号１９）から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含み；
（ｅ）Ａ９は、５個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり；および、
（ｆ）Ａ１０は、Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ（配列番号６）、Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ（配列番号１２）、Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号１３）、およびＭｅｔ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（配列番号１４）から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含む、ＮＡＰタンパクである。
【００９１】
一つ以上の抗癌剤と組み合わせて、ｆＸａ抑制活性を有する、これらのＮＡＰタンパクの一つ以上と、薬学的に受容可能な担体とを含む、薬学的組成物の使用は、本実施態様によって考慮の対象とされる。本発明の方法にしたがって使用されるＮＡＰタンパクは、少なくとも一つのＮＡＰドメインを有する。ＮＡＰドメインＮＡＰ５（配列番号１）およびＮＡＰ６（配列番号２）は、それぞれ、一つのＮＡＰドメインを持つが、本発明のこの実施態様によれば好ましいＮＡＰタンパクである。
【００９２】
前述の、ｆＸａ抑制活性を有する、いくつかの好ましいＮＡＰタンパクは、線虫種から得られる。好ましい線虫種は、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃａｎｉｎｕｍ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃｅｙｌａｎｉｃｕｍ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ、Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ、およびＨｅｌｉｇｏｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ  ｐｏｌｙｇｙｒｕｓから成る群から選ばれる。これらのＮＡＰタンパクは、組み換え手段によって調製されてもよく、そうなると好都合である。特に好ましいのは、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃａｎｉｎｕｍから得られるＮＡＰタンパクＮＡＰ５（配列番号１）およびＮＡＰ６（配列番号２）である。
【００９３】
Ｂ．ＶＩＩａ因子／ＴＦ抑制活性を有するＮＡＰタンパク
米国特許第５，８６６，５４２号は、「線虫抽出抗凝固タンパク（ＮＡＰタンパク）」と名づけられる一群のタンパクを記載する。その一クラスは、ＶＩＩａ因子／ＴＦ抑制活性を持つと記述される。このタンパククラスは、ＶＩＩａ因子／ＴＦ抑制活性を有し、一つ以上のＮＡＰドメインを持つ単離タンパクを含む。ここに各ＮＡＰドメインは、配列：Ｃｙｓ−Ａ１−Ｃｙｓ−Ａ２−Ｃｙｓ−Ａ３−Ｃｙｓ−Ａ４−Ｃｙｓ−Ａ５−Ｃｙｓ−Ａ６−Ｃｙｓ−Ａ７−Ｃｙｓ−Ａ８−Ｃｙｓ−Ａ９−Ｃｙｓ−Ａ１０（「式ＩＩＩ」）を含み、前式において、
（ａ）Ａ１は、７から８個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり；
（ｂ）Ａ２はアミノ酸配列であり；
（ｃ）Ａ３は、３個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり；
（ｄ）Ａ４はアミノ酸配列であり；
（ｅ）Ａ５は、３から４個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり；
（ｆ）Ａ６はアミノ酸配列であり；
（ｇ）Ａ７はアミノ酸配列であり；
（ｈ）Ａ８は、１１から１２個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり；
（ｉ）Ａ９は、５から７個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり；
（ｊ）Ａ１０はアミノ酸配列であり；上式において、Ａ２、Ａ４、Ａ６、およびＡ１０は、独立に選ばれた数の、独立に選ばれたアミノ酸残基を有し、各配列は、各ＮＡＰドメインが、合計で、約１２０アミノ酸残基より少なくなるように選ばれる。
【００９４】
本発明のこの局面による好適なＮＡＰタンパクは、少なくとも一つのＮＡＰドメインを有する。好ましいのは、ｒＮＡＰｃ２（配列番号３、図１Ａ）のＮＡＰドメインと事実上同じ、少なくとも一つのＮＡＰドメインを有するポリペプチドである。ＮＡＰタンパクｒＮＡＰｃ２は、一つのＮＡＰドメインを有し、本発明のこの局面によれば好ましいＮＡＰである。同様に好ましいのは、ｒＮＡＰｃ２／プロリン（配列番号４、図１Ｂ）である。ｒＮＡＰｃ２は、元々鉤虫Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃａｎｉｎｕｍから単離された、天然ポリペプチドである。この組み換えタンパクは、単一鎖の、非糖化の、８５アミノ酸タンパクである。ｒＮＡＰｃ２の抗凝固活性は、血液凝固塊形成を招くプロセスの起動に与る、ＴＦ／ｆＶＩＩａ複合体を抑制する能力をそれが持つことによる。この複合体を抑制することによって、ｒＮＡＰｃ２は、ＰＡＲ−２活性をブロックし、トロンビン生成を阻止する。ｒＮＡＰｃ２／プロリンは、ｒＮＡＰｃ２の配列を有する組み換えタンパクであるが、Ｃ末端にプロリン残基を付加させたものである（配列番号４）。
【００９５】
好ましいＮＡＰタンパクは、Ａ２が３から５個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり、Ａ４が６から１９個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり、Ａ６が３から５個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であり、Ａ１０が５から２５個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列であるタンパクを含む。
【００９６】
ある好ましいＮＡＰタンパクでは、Ａ３は、Ａ３ａおよびＡ３ｂが、独立に選ばれるアミノ酸残基である、配列Ａｓｐ−Ａ３ａ−Ａ３ｂを有する。より好ましくは、Ａ３は、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓである。
【００９７】
ある好ましいＮＡＰタンパクでは、Ａ４は、合計残高として陰イオン電荷を有するアミノ酸配列である。
【００９８】
同様に好ましいのは、Ａ５が、Ａ５ａからＡ５ｄまで独立に選ばれるアミノ酸残基である、配列Ａ５ａ−Ａ５ｂ−Ａ５ｃ−Ａ５ｄ（配列番号２０）を有するＮＡＰタンパクである。好ましくは、Ａ５ａはＬｅｕであり、Ａ５ｃはＡｒｇである。
【００９９】
ある好ましいＮＡＰタンパクでは、好ましいＡ７アミノ酸残基はＶａｌまたはＩｌｅであり、より好ましくはＶａｌである。
【０１００】
ある好ましいＮＡＰタンパクは、Ａ８が、アミノ酸配列Ａ８ａ−Ａ８ｂ−Ａ８ｃ−Ａ８ｄ−Ａ８ｅ−Ａ８ｆ−Ａ８ｇ（配列番号５）を含むＮＡＰタンパクであり、前式において、
（ａ）Ａ８ａは、Ａ８における最初のアミノ酸残基であり；
（ｂ）Ａ８ａおよびＡ８ｂの少なくとも一つは、ＧｌｕまたはＡｓｐから成る群から選ばれ；
（ｃ）Ａ８ｃからＡ８ｇは、独立に選ばれるアミノ酸残基である。
【０１０１】
好ましくは、Ａ８ｃはＧｌｙであり、Ａ８ｄは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＬｅｕから成る群から選ばれ、Ａ８ｅはＴｙｒであり、Ａ８ｆはＡｒｇであり、Ａ８ｇは、ＡｓｐおよびＡｓｎから選ばれる。好ましいＡ８ｃ−Ａ８ｄ−Ａ８ｅ−Ａ８ｆ−Ａ８ｇ配列は、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（配列番号８）である。
【０１０２】
一実施態様では、本発明は、ＶＩＩａ／ＴＦ抑制活性を有する、好適なＮＡＰタンパクであって、
（ａ）Ａ３は、Ａ３ａおよびＡ３ｂが、独立に選ばれるアミノ酸残基である、配列Ａｓｐ−Ａ３ａ−Ａ３ｂを有し；
（ｂ）Ａ４は、合計残高として陰イオン電荷を有するアミノ酸配列であり；
（ｃ）Ａ５は、Ａ５ａからＡ５ｄまで、独立に選ばれるアミノ酸残基である、配列Ａ５ａ−Ａ５ｂ−Ａ５ｃ−Ａ５ｄ（配列番号２０）を有し；
（ｄ）Ａ７は、ＶａｌおよびＩｌｅから成る群から選ばれる、
ＮＡＰタンパクを使用する方法を主題とする。
【０１０３】
一つ以上の抗癌剤と組み合わせて、ＶＩＩａ因子／ＴＦ抑制活性を有する、これらのＮＡＰタンパクの一つ以上と、薬学的に受容可能な担体とを含む、薬学的組成物の使用が、本実施態様によって考慮の対象とされる。本発明の方法にしたがって使用されるＮＡＰタンパクは、少なくとも一つのＮＡＰドメインを有する。ＮＡＰタンパクｒＮＡＰｃ２およびｒＮＡＰｃ２／プロリンは、それぞれ、一つのＮＡＰドメインを持つが、本発明のこの局面によれば好ましいＮＡＰタンパクである。
【０１０４】
別の好ましい実施態様では、本発明の方法において使用するのに好適なＮＡＰタンパクは、
（ａ）Ａ３は、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓであり；
（ｂ）Ａ４は、合計残高として陰イオン電荷を有するアミノ酸配列であり；
（ｃ）Ａ５は、Ａ５ａからＡ５ｄまで独立に選ばれるアミノ酸残基である、配列Ａ５ａ−Ａ５ｂ−Ａ５ｃ−Ａ５ｄ（配列番号２０）を有し；
（ｄ）Ａ７はＶａｌであり；
（ｅ）Ａ８は、Ａ８ａおよびＡ８ｂの少なくとも一方がＧｌｕまたはＡｓｐである、Ａ８ａ−Ａ８ｂ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（配列番号１６）を含む、ＮＡＰタンパクである。
【０１０５】
さらに、一つ以上の抗癌剤と組み合わせた、これらのＮＡＰタンパクと、薬学的に受容可能な担体とを含む、薬学的組成物の使用も、本実施態様によって考慮の対象とされる。これらのＮＡＰタンパクは、少なくとも一つのＮＡＰドメインを有する。ＮＡＰタンパクｒＮＡＰｃ２（配列番号３）およびｒＮＡＰｃ２／プロリン（配列番号４）は、それぞれ、一つのＮＡＰドメインを持つが、本発明のこの実施態様によれば好ましいＮＡＰタンパクである。
【０１０６】
前述の、ＶＩＩａ因子／ＴＦ抑制活性を有する、いくつかの好ましいＮＡＰタンパクは、線虫種から得られる。好ましい線虫種は、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃａｎｉｎｕｍ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃｅｙｌａｎｉｃｕｍ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ、Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ、およびＨｅｌｉｇｏｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ  ｐｏｌｙｇｙｒｕｓから成る群から選ばれる。これらのＮＡＰタンパクは、組み換え手段によって調製されてもよく、そうなると好都合である。特に好ましいのは、ＮＡＰタンパクｒＮＡＰｃ２およびｒＮＡＰｃ２／プロリンである。ｒＮＡＰｃ２は、組み換え法を用いＡｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃａｎｉｎｕｍから得られた。
【０１０７】
米国特許第５，８６６，５４２号は、ｒＮＡＰｃ２およびｒＮＡＰｃ２／プロリンを含む、組み換えＮＡＰタンパクの調製を記載する。
【０１０８】
ＩＩＩ．併用治療
本発明は、腫瘍成長または腫瘍転移を低減または抑制するための方法であって、治療を必要とする対象に対し、一つ以上の抗癌剤と一緒に、有効量の抗転移剤を投与することを含む方法に関する。抗癌剤は、抗転移剤の投与の前、該投与と同時、該投与と重複させて、または該投与に続けて投与してもよい。さらに、抗転移剤と抗癌剤とは、一組成物として、または別々の組成物として投与してもよい。
【０１０９】
本発明の考慮の対象とされる併用治療は、有害な内皮細胞増殖の低減または抑制、癌発生の低減、癌再発の低減または阻止、または、癌の伝播または転移の低減または阻止に有用である場合がある。抗転移剤と、一つ以上の抗癌剤の併用治療は、既成癌の縮小、例えば、既存の癌細胞の低減、および／または、腫瘍負荷量の低減、または、癌の少なくとも一つの症状または副作用の緩和のために使用してもよい。したがって、併用治療は、抗転移剤、好ましくはＮＡＰタンパク、もっとも好ましくはｒＮＡＰｃ２／プロリンと、抗癌剤、例えば、ただしこれらに限定されないが、細胞傷害剤、化学療法剤、標的化された抗癌剤、癌ワクチン、抗血管形成剤、サイトカイン、ホルモン治療、放射線治療、および抗転移剤などを含む、一つ以上の抗癌剤との投与に関する。
【０１１０】
本発明の方法によれば、各処置（すなわち、抗転移剤および抗癌剤）が別々に実施された場合に観察される作用において、併用結果が相加的であるための要件は無い。一般に、少なくとも相加的作用が望ましいが、単一治療の一方を上回る、増加的抗腫瘍作用が認められるならば、それがどのようなものであれ有益である。さらに、本発明は、相乗作用を発揮するために併用処置を要しない。
【０１１１】
本発明にしたがって併用治療を実行するためには、一つ以上の抗癌剤と組み合わせた抗転移剤は、治療を要する対象に対し、該対象において抗癌活性をもたらすのに効果的な方法で投与してよい。抗転移剤および抗癌剤は、腫瘍環境において望み通りにその併合的存在および併合作用をもたらすのに有効な量として、かつ、該作用をもたらすのに有効な期間提供される。この目標を達成するために、抗転移剤および抗癌剤は、対象に対し、同時に、単一組成物として、または、異なる投与ルートによる二つ以上の異なる組成物として投与してよい。
【０１１２】
それとは別に、抗転移剤は、例えば、数分から数週に亘る間隔を置いて、抗癌剤処置に先行しても、または、後発してもよい。抗癌剤および抗転移剤が対象に別々に投与されるある実施態様では、各送達時間の間の時間間隔は、該抗癌剤および抗転移剤が、腫瘍に対して併合作用を及ぼすことが可能となるように選ばれる。ある特定実施態様では、抗癌剤および抗転移剤は共に、それぞれの送達の約５分から約２週以内に投与されることが考えられる。
【０１１３】
さらに別の実施態様では、抗転移剤および抗癌剤の投与の間には、数日（２、３、４、５、６、または７日）、数週（１、２、３、４、５、６、７、または８週）、または数ヶ月（１、２、３、４、５、６、７、または８ヶ月）が経過してもよい。抗転移剤、および一つ以上の抗癌剤（併用治療）は、１回、２回、または、少なくとも、病態が処置、緩和、または治癒されるまでの期間投与されてもよい。好ましくは、併用治療は、複数回投与される。この併用治療は、１日３回から、６ヶ月毎に１回投与されてもよい。投与は、スケジュールにそって、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、２日毎に１回、３日毎に１回、１週に１回、２週毎に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、６ヵ月毎に１回行ってもよいし、あるいは、ミニポンプを通じて連続的に投与してもよい。この併用治療剤は、経口、粘膜、頬内、鼻腔内、吸引、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、腫瘍内、または局所ルートを通じて投与してもよい。併用治療剤は、腫瘍部位から離れた部位において投与してもよい。併用治療剤は、一般に、腫瘍が存在する限り、該併用治療によって、腫瘍または癌の成長の停止、または重量または体積の減少が誘起されることを条件に投与される。
【０１１４】
一実施態様では、癌を処置するために、抗転移剤が、短い処置サイクルの間一つ以上の抗癌剤と組み合わせて癌患者に投与される。抗癌剤による処置の持続時間は、使用される特定の抗癌剤に応じて変動してよい。本発明はさらに、不連続投与、または、いくつかの部分的投与に分割される毎日の投与を考慮の対象とする。ある特定の抗癌剤のための、適切な処置時間は、当業者によって認識されるが、本発明は、各抗癌剤のための最適処置スケジュールに関する連続評価を考慮の対象とする。
【０１１５】
ある特定実施態様では、抗転移剤は、皮下注入によって週に２回対象に投与される。次いで、抗転移剤の初回投与の約２週間後、抗癌剤が投与される。併用治療の各サイクルは約２週かかると考えられる。併用治療の持続時間は、１、２、３、４以上のサイクルを要してもよい。好ましい実施態様では、抗転移剤は、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏであり、抗癌剤は、化学療法剤併用ＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩである。ある特定実施態様では、抗癌標的化された抗癌剤ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＡＴＩＮ（登録商標））が、ＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩの外に投与される。
【０１１６】
本発明は、併用治療剤が投与される、少なくとも１サイクル、好ましくは１サイクルを超える処置を考慮の対象とする。１サイクルの適切な期間は、サイクル数、サイクル間の間隔同様、当業者によって認識される。本発明は、各抗転移剤および抗癌剤のための最適処置スケジュールに関する連続評価を考慮の対象とする。
【０１１７】
本発明はさらに、抗転移剤または抗癌剤いずれかの、１回を超える投与を提供する。抗転移剤および抗癌剤は相互交換的に投与されてもよいし、あるいは、毎日交互に、または毎週交互に投与されてもよいし、あるいは、一連の抗転移処置が施された後、抗癌剤治療の１回以上の処置が施されてもよい。
【０１１８】
当該技術分野において通常の技能を有する当業者であれば理解するように、化学療法剤の適切な用量は、一般に、単独か、または他の化学療法剤と組み合わせて投与される、臨床治療において使用される用量の近傍にある。単に例示として挙げるのであるが、ＦＯＬＦＩＲＩは、２時間輸液としてロイコボリン静注（２００ｍｇ／ｍ２）、９０分輸液としてイリノテカン（１８０ｍｇ／ｍ２）、次いで、５−ＦＵのボーラス注入（４００ｍｇ／ｍ２）および５−ＦＵの４６時間輸液（２４００ｍｇ／ｍ２）、これを２週間毎に１回の繰り返しから成る。ＦＯＬＦＯＸは、１日目、５−ＦＵと同時に、２時間輸液としてロイコボリン静注（２００ｍｇ／ｍ２）、および２時間輸液としてオキサリプラチン（８５ｍｇ／ｍ２）、次いで、５−ＦＵのボーラス注入（４００ｍｇ／ｍ２）および５−ＦＵの４６時間輸液（２４００ｍｇ／ｍ２）、これを２週間毎に１回の繰り返しから成る。ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））による追加処置は、初回投与において、９０分に亘る、５ｍｇ／ｋｇのベバシズマブの静注投与、および、よく耐容されるならば、ベバシズマブは、次回投与において６０分投与し、維持投与として３０分投与してもよく、これを、２週間毎に１回繰り返す。
【０１１９】
本発明はさらに、抗転移剤と放射線治療（すなわち、腫瘍細胞内に局所的にＤＮＡ損傷を誘発するための任意の機構であって、例えば、γ照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子発射など）の組み合わせを提供する。腫瘍細胞に対する放射性同位元素の指向性送達による併用治療も考慮の対象とされるが、標的化された抗癌剤、またはその他の標的手段と組み合わせて使用されてもよい。通常、放射線治療は、約１から約２週間の期間に亘ってパルスとして投与される。放射線治療は、頭部および頸部癌を有する対象に対し、約６から７週間投与してもよい。必要に応じて、放射線治療は、単一投与、または複数の、連続投与として投与されてもよい。
【０１２０】
本発明はさらに、免疫治療剤による併用療法を提供する。この併用法では、抗転移剤と共に種々のサイトカインを用いてよい。サイトカインは、臨床的適応症、例えば、患者の状態および該サイトカインの相対的毒性に適合させた、標準的処方にしたがって投与される。さらに、転移を阻止または抑制するためにウテログロビンを使用してもよい（米国特許第５，６９６，０９２号、なお、引用により本明細書に含める）
さらに別の実施態様では、抗転移剤は、癌ワクチンと組み合わせて投与される。癌ワクチンの例としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、自己細胞または組織、非自己細胞または組織、癌胎児性抗原、アルファ−フェトプロテイン、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン、ＢＣＧ様ワクチン、メラノサイト系統タンパク（例えば、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、チロシナーゼ、広く共有される腫瘍特異的抗原（例えば、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ｐ１５）、腫瘍特異的、突然変異抗原（例えば、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４）、非メラノーマ抗原（例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（乳癌および卵巣癌）、ヒトパピローマウィルス−Ｅ６、Ｅ７（子宮頸癌）、ＭＵＣ−１（乳癌、卵巣癌、およびすい臓癌）が挙げられる。ヒト腫瘍抗原は、Ｔ細胞などのリンパ球によって認識される（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６２８−３６（１９９６））。癌ワクチンは、精製調製品である必要はない。
【０１２１】
さらに別の実施態様では、抗転移剤は、ホルモン処置と関連させて投与される。
【０１２２】
別の実施態様では、抗転移剤は、一つ以上の抗血管形成剤と組み合わせて投与される。
【０１２３】
抗転移剤は、間接的標識法を用いて核種に接合されてもよく、その場合、キレート剤が、タンパクに共有的に付着し、少なくとも一つの核種が、該キレート剤の中に挿入される。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ａｎｄ  Ｍｅａｓｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ａｐｐｌ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．Ｂ．１８：５８９−６０３（１９９１）に記載されるキレート剤および核種を参照されたい。それとは別に、抗転移剤は、直接的標識法を用いて標識されてもよく、その場合、核種などの標識は、タンパクに（通常、アミノ酸残基を介して）直接共有的に付着する。例えば、そのペプチドは、生合成してもよく、あるいは、例えば、水素の代わりにフッ素１９を含むアミノ酸前駆体を用いる化学的アミノ酸合成によって合成してもよい。標識、例えば、テクネチウム−９９ｍまたはヨウ素−１２３、レニウム−１８６、レニウム−１８８、およびインジウム−１１１は、ペプチド中のシステインを介して付着させることが可能である。イットリウム−９０は、リジン残基を介して付着させることが可能である。ヨウ素−１２３を組み込むためには、ヨウ素源法（Ｆｒａｎｋｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７（１９７８））を使用することが可能である。
【０１２４】
抗転移剤と細胞傷害剤の接合体は、各種の、二官能性タンパク結合剤、例えば、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシニミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタールアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ボス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン、２，６−ジイソシアネート）、および、ビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作製される。例えば、リシン免疫トキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）の記載にしたがって調製することが可能である。
【０１２５】
さらに、本発明は、抗転移剤が、プロドラグを細胞傷害剤に変換する酵素に連結される実施態様を提供する。この酵素は、非毒性プロドラグを切断して有毒薬剤に変換し、これが、腫瘍細胞の死をもたらす。好適なプロドラグ酵素としては、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、大腸菌由来のキサンチン−グアニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）遺伝子、または大腸菌のシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、または、ヒポキサンチンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）が挙げられる。酵素および会合プロドラグ分子の、さらに別の代表的例としては、アルカリフォスファターゼ、および各種有毒リン酸化化合物、例えば、リン酸フェノールマスタード、リン酸ドキソルビシン、リン酸マイトマイシン、およびリン酸エトポシド；β−ガラクトシダーゼ、およびＮ−［４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）ベニルオキシカルボニル］−ダウノルビシン；アゾレダクターゼ、およびアゾベンゼンマスタード；β−グルコシダーゼ、およびアミグダリン；β−グルクロニダーゼ、およびフェノールマスタード−グルクロニド、およびエピルビシン−グルクロニド；カルボキシペプチダーゼＡ、およびメトトレキセート−アラニン；シトクロームＰ４５０、およびシクロフォスファミドまたはイフォスファミド；ＤＴジアフォラーゼ、および５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミド（ＣＢ１９５４）（Ｃｏｂｂら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８：１５１９（１９６９），Ｋｎｏｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１２：１９５（１９３３））；β−グルタミルトランスフェラーゼ、およびβ−グルタミルｐ−フェニレンジアミンマスタード；ニトロレダクターゼ、およびＣＢ１９５４，または４−ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体；グルコースオキシダーゼ、およびグルコース；キサンチンオキシダーゼ、およびヒポキサンチン；および、プラスミン、およびペプチジル−ｐ−フェニレンジアミン−マスタードが挙げられる。
【０１２６】
抗転移剤、および、一つ以上の小型分子トキシン、例えば、カルケアマイシン、マイタンシノイド、トリコテセン、およびＣＣ１０６５、および、トキシン活性を持つ、これらトキシンの誘導体も、本発明の考慮の対象とされる。
【０１２７】
ＶＩＩ．薬学的組成物
Ａ．例示処方物
ある実施態様では、本発明はさらに、抗転移剤、および一つ以上の抗癌剤を、下記：薬学的に受容可能な希釈剤；担体；可溶化剤；乳化剤；防腐剤；および／またはアジュバント、の内の一つ以上と一緒に含む組成物を提供する。この組成物は、有効量の抗転移剤および／または抗癌剤を含んでもよい。したがって、医薬品の製剤組成物の調製について本発明において提供される、抗転移剤、および一つ以上の抗癌剤の使用も含まれる。この組成物は、癌などの各種疾患の処置に使用することが可能である。
【０１２８】
抗転移剤は、種々の剤形、例えば、ただしこれらに限定されないが、溶液または縣濁液、錠剤、丸剤、散剤、座剤、ポリマーミクロカプセルまたはミクロベシクル、リポソーム、および注入液または輸液として処方してよい。好ましい剤形は、投与方式、および標的とする特定の疾患または障害に依存する。組成物はさらに、当該技術分野で周知の、薬学的に受容可能なベヒクル、担体、またはアジュバントを含むことが好ましい。
【０１２９】
薬学的組成物のために受容可能な処方成分は、使用される用量および濃度においてレシピエントに対し無毒である。提供される抗転移剤および抗癌剤の外に、本発明による組成物は、該組成物の、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、匂い、滅菌性、安定性、溶解または放出速度、吸着度または浸透度を修飾、維持、または保存するための成分を含んでもよい。薬学的組成物を処方するための好適な物質としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）；抗菌剤；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、酢酸塩、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、またはその他の有機酸）；増量剤（例えば、マンニトール、またはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；複合体形成剤（例えば、カフェイン、ポリビニールピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）；充填剤；モノサッカリド；ジッサカリド；およびその他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；着色剤、芳香剤、および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニールピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成カウンターイオン（例えば、ナトリウム）；防腐剤（例えば、ベンザルコニウムクロリド、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロールヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトール、またはソルビトール）；縣濁剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニックス、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル）；安定性強化剤（例えば、スクロース、またはソルビトール）；等張性強化剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウムまたはカリウム、マンニトールソルビトール）；送達ベヒクル；希釈剤；賦形剤、および／または製薬アジュバントが挙げられる。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。なお、これを、引用により本明細書に含める。
【０１３０】
薬学的組成物における主要ベヒクルまたは担体は、性質として、水性であっても、非水性であってもよい。この組成物にとって好適なベヒクルまたは担体としては、場合によって非経口投与用組成物において普通の、その他の物質が添加される、注射用水、生理食塩水、または人工脳脊髄液が挙げられる。中性に緩衝される生理食塩水、または血清アルブミンと混ぜ合わせた生理食塩水は、さらに別の例示ベヒクルである。抗転移剤、および一つ以上の抗癌剤を含む組成物は、所望の純度を持つ選ばれた組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形状を取る最適処方剤と混ぜ合わせることによって保存用に調製されてもよい。さらに、抗転移剤および抗癌剤は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて、凍結乾燥体として処方してもよい。
【０１３１】
処方成分は、投与部位において受容可能な濃度として存在する。緩衝剤は、組成物を、生理的ｐＨ、または、それよりやや低いｐＨ、通常、約４．０から約８．５、またはそれとは別に、約５．０から８．０のｐＨ範囲内に維持するように使用すると有利である。薬学的組成物は、約ｐＨ６．５−８．５のＴＲＩＳ緩衝剤、または、約ｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含むことが可能であり、さらにソルビトール、またはそれに代わる好適な置換体を含んでもよい。
【０１３２】
インビボ投与に使用される薬学的組成物は、通常、滅菌性である。滅菌は、滅菌ろ過膜によるろ過によって実現してもよい。組成物を凍結乾燥する場合は、滅菌は、凍結乾燥および再構成の前、または後に実行してよい。非経口投与用組成物は、凍結乾燥状、または溶液状で保存してよい。ある実施態様では、非経口組成物は、滅菌性アクセスポートを備えた容器、例えば、静注液バッグ、または、皮下注射針による刺入が可能なストッパーを備えたバイアル、または、すぐに注入に使用が可能な、あらかじめ充填された滅菌シリンジの中に納められる。
【０１３３】
治療用途における抗転移剤の作用時間を調節するために、さらに別の製剤法を用いてもよい。放出調節調剤は、ポリペプチドと複合体を形成するか、または該ポリペプチドを吸着するポリマーを用いることによって調製することが可能である。例えば、生体適合性ポリマーとしては、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニール）の基質、および、ステアリン酸ダイマーおよびセバシン酸の、ポリ無水物コポリマーの基質が挙げられる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４４６（１９９２）。このような基質からのポリペプチドの放出速度は、該タンパクの分子量、該基質におけるポリペプチドの量、および、分散粒子のサイズに依存する。Ｓａｌｔｚｍａｎら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、上記。他の固体剤形は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５に記載される。
【０１３４】
上記組成物は、従来の送達方式、例えば、ただしこれらに限定されないが、静脈内、腹腔内、経口、リンパ系内、皮下投与、動脈内、筋肉内、胸膜腔内、硬膜下腔内などの送達方式、および、局所カテーテルによる還流によって投与することが可能である。さらに、問題の腫瘍に対する局所投与も、本発明の考慮の対象とされる。眼内投与のためには点眼薬を使用することが可能である。組成物を注入によって投与する場合、該投与は、連続輸液によるか、または単一または複数ボーラスによって実行してよい。非経口投与のために、抗転移剤は、薬学的に受容可能なベヒクルにおいて所望の抗転移剤および抗癌剤を含む、発熱物質非含有、非経口的に受容可能な水溶液として投与されてよい。非経口注入用に特に好適なベヒクルは、抗転移剤および一つ以上の抗癌剤が、適切に保存される、滅菌等張液として処方される、滅菌蒸留水である。
【０１３５】
一旦本発明の薬学的組成物が処方されたならば、該組成物は、溶液、縣濁液、ゲル、乳液、固体、または脱水または凍結乾燥粉末として、滅菌バイアルの中に保存されてよい。この処方剤は、そのまますぐに使用が可能な剤形として、あるいは、投与前に再構成される剤形（例えば、凍結乾燥）として保存してもよい。
【０１３６】
特定実施態様では、抗転移剤は、凍結液体組成物、または凍結乾燥組成物として処方してもよい。抗転移剤の外、この凍結液体および凍結乾燥組成物はさらに、増量／浸透圧剤を含んでもよい。マンニトールを、約２から約１０重量／体積（Ｗ／Ｖ）％の濃度で取り込むことが好ましい。
【０１３７】
望むなら、薬学的組成物に通例として用いられる安定剤、例えば、スクロース、トレハロース、またはグリシンを用いてもよい。通常、このような安定剤は、例えば、約０．１％から約０．５％（Ｗ／Ｖ）範囲の少量が加えられる。さらに、界面活性安定剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、またはＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ，ＵＳＡ）を、通例の量加えてもよい。
【０１３８】
凍結される、好ましい液体組成物は、可溶化ＮＡＰタンパクの外に、約７．０のｐＨにおいて、約５０ｍＭから約１００ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、および、約５０ｍＭから約１００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含む。
【０１３９】
ある特定実施態様では、凍結液体組成物は、約７．０のｐＨにおいて、約１ｍｇ／ｍｌの濃度のＮＡＰタンパク、好ましくはｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ、約６５ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、および、約８０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含む。
【０１４０】
本発明による全ての組成物において、ＮＡＰタンパクは、約０．５ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌの濃度、好ましくは約１ｍｇ／ｍｌの濃度として存在する。
【０１４１】
本薬学的組成物を処方するために使用される成分は、好ましくは高純度であり、有害な危険性のある汚染物質を事実上含まない（例えば、少なくとも、国内食品（ＮＦ）等級、一般に少なくとも分析級、およびより典型的には少なくとも製薬級）。さらに、インビボ用途のために意図される組成物は、通常滅菌性である。使用前にある化合物を合成しなければならない程度に応じて、通常、得られる産物は、合成または精製過程の際に発生する可能性のある、有毒の危険性がある因子、特にエンドトキシンを事実上含まない。非経口投与用組成物も滅菌性で、事実上等張で、ＧＭＰ条件下で作製される。
【０１４２】
ある実施態様では、抗転移剤は、体外（エクスビボ）で投与されてもよい。このような場合、患者から取り出された細胞、組織、または器官は、抗転移剤に暴露されるか、または抗転移剤と共に培養される。次に、この培養細胞は、元の患者または別の患者の体内に戻されるか、または他の目的のために使用される。
【０１４３】
ある実施態様では、抗転移剤は、本明細書に記載されるものと同様の方法を用いて、遺伝子工学的に加工された細胞を対象の中に植え込むことによって送達することが可能で、それによって該ポリペプチドは発現し、分泌される。このような細胞は、動物またはヒトの細胞であってもよく、自己性、同種、または異種であってもよく、または恒久化されてもよい。免疫反応の機会を減らすために、細胞は、周囲組織への浸潤を避けるようカプセル封入されてもよい。封入材料は、通常、タンパク産物（単数または複数）の放出は許すが、患者の免疫系、または、周囲組織からの他の分解性因子による細胞の破壊は阻止する、生体適合性、半透ポリマー封入剤または膜である。
【０１４４】
Ｂ．用量
通常、抗転移剤、または抗転移剤を含む薬学的組成物の投与は、低用量レベルで始め、治療有効量を定めると考えられる、所望の治療作用が実現されるまで、用量レベルを増大させる。本発明の化合物の場合、単独、または薬学的組成物の一部として、その用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇと１ｍｇ／ｋｇ体重の間、好ましくは約１と１００μｇ／ｋｇ体重の間、もっとも好ましくは１と１０μｇ／ｋｇ体重の間にある。
【０１４５】
治療的有効用量は、当業者によって容易に決定されるが、病気の重度および進行、患者の健康および処置に対する反応、患者の年齢、体重、身長、性別、既往歴、および治療担当医の判断に依存する。
【０１４６】
ＶＩＩＩ．治療的使用
本発明は、一つ以上の抗癌剤と組み合わせて抗転移剤を投与することによって癌を処置する（すなわち、不快な内皮細胞増殖を低減または低下するか、または、転移を低減または低下する）ための方法を提供する。
【０１４７】
さらに、本発明によって処置が可能な腫瘍として、固相腫瘍／悪性腫瘍（すなわち、上皮癌）、局所的な進行腫瘍、およびヒトの軟部組織肉腫が挙げられる。上皮癌は、周囲組織に浸潤（侵入）し、リンパ系転移を含む転移癌を発生させる、上皮細胞由来悪性新生物を含む。腺癌は、腺組織由来で、それと認めることが可能な腺構造を形成する上皮癌である。癌のもう一つの広い区分は肉腫を含む。これは、胎児の結合組織のように、細胞が、線維性または均一な物質の中に埋め込まれる腫瘍である。本発明はさらに、骨髄またはリンパ系の癌、例えば、白血病、リンパ腫、および、通常、腫瘍塊としては現れず、血管またはリンパ毛細管系に分布する、その他の癌の処置をも可能とする。
【０１４８】
本発明による処置に対し反応が可能な癌または腫瘍細胞のタイプとしては、例えば、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、骨髄腫、ホジキン病、おおび、非ホジキンリンパ腫、消化器癌、例えば、食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、結腸直腸新生物と関連するポリープ、すい臓癌、および胆嚢癌など、副腎皮質癌、ＡＣＴＨ生産腫瘍、膀胱癌、脳癌、例えば、脳内腫瘍、神経芽細胞腫、星状細胞性脳腫瘍、グリオーマ、および中枢神経系の、転移性腫瘍細胞浸潤、ユーイング肉腫、口腔癌および咽頭癌を含む頭部および頸部癌、腎細胞上皮癌を含む腎臓癌、肝臓癌、小細胞および非小細胞肺癌を含む肺癌、悪性の腹膜浸出液、悪性の胸膜浸出液、皮膚癌、例えば、悪性メラノーマ、ヒト皮膚のケラチノサイトの腫瘍進行、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、および血管周囲細胞腫など、中皮腫、カポジ肉腫、骨腫を含む骨癌、および線維肉腫および骨肉腫などの肉腫、女性生殖管の癌、例えば、子宮癌、子宮内膜癌、卵巣癌、卵巣（胚細胞）癌、および、卵胞における固体腫瘍、膣癌、外陰部癌、および子宮頸癌；乳癌（小細胞および腺管）、陰茎癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、精巣癌、甲状腺癌、トロフォブラスト新生物、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。
【０１４９】
本発明は、実験的に定められる、いくつかのタイプの癌の処置に関して本明細書において詳細に具体的に説明される。これらの例示の処置では、最新の、標準的インビトロおよびインビボモデルを用いた。これらの方法は、インビボ処置処方において有効であることが期待される因子を特定するために使用することが可能である。しかしながら、本発明の方法は、これらの腫瘍タイプの処置に限定されるものではなく、どの器官系の、どの癌に対しても拡張されることを理解しなければならない。実施例１に明らかにされるように、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏおよび５−ＦＵまたはＡＶＡＳＴＡＴＩＮ（登録商標）の併用治療は、ラットにおける、ヒトの結腸直腸癌モデルの腫瘍サイズを縮小した。
【０１５０】
本発明はさらに、良性または日和見的腫瘍を提示する対象の、防止または予防的処置を提供する。本発明による処置からは、いずれの特定のタイプの腫瘍も排除されないと考えられる。しかしながら、二次的治療剤、特に化学療法剤および標的化された抗癌剤と組み合わせた本発明の使用には、腫瘍細胞のタイプは関連する可能性がある。
【０１５１】
ＩＸ．キット
本発明は、抗転移剤および一つ以上の抗癌剤から成る、単一用量または複数用量の投与単位を生産するためのキットを提供する。キットは、容器、および、該容器の上に付着、または該容器と関連させる標識または包装同封物を含む。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、各種の材料、例えば、ガラスまたはプラスチックによって形成してよい。容器は、病態を処置するのに有効な組成物を保持し、滅菌性アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内輸液バッグ、または、皮下注射針によって刺入が可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。このようなキットは、一般に、適切な容器の中に、抗転移剤および一つ以上の抗癌剤から成る、薬学的に受容可能な処方剤を含む。キットはさらに、診断または併用治療のために、他の薬学的に受容可能な処方剤を含んでもよい。例えば、このキットは、ある範囲の、化学療法剤または放射線治療剤；抗血管形成剤；抗転移剤；標的化された抗癌剤；細胞傷害剤；および／またはその他の抗癌剤の内、いずれか一つ以上を含んでもよい。
【０１５２】
キットは、添加成分付きで、または無しで、抗転移剤および一つ以上の抗癌剤を含む単一容器を有してもよいし、あるいは、キットは、各所望の薬剤に対し別々の容器を有してもよい。併用治療を提供する場合、単一液は、モル当量の組み合わせか、または、一方成分が、他方成分よりも過剰となるようにあらかじめ混ぜ合わせてもよい。それとは別に、キットの抗転移剤および他方の抗癌剤成分は、それぞれ、患者に投与する前、別々の容器に保管してもよい。キットはさらに、滅菌性の、薬学的に受容可能な緩衝剤、または他の希釈剤、例えば、注入用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、およびデキストロース液を含むための、第２／第３容器を含んでもよい。
【０１５３】
キットの成分が、一つ以上の溶液として提供される場合、その溶液は、水溶液であることが好ましく、滅菌性水溶液であることが特に好ましい。しかしながら、キットの成分は、乾燥粉末（単数または複数）として提供されてもよい。試薬または成分が乾燥粉末として提供される場合、該粉末は、適切な溶媒を添加することによって再構成することが可能である。この溶媒も、別の容器に入れて提供されてもよいことが見て取れる。
【０１５４】
キットはさらに、この抗転移剤および抗癌剤を、動物または患者に投与するための手段、例えば、一つ以上の針またはシリンジ、または場合によっては点眼器、ピペット、またはその他の同様の装置であって、処方物を、動物の体内に注入、または生体の患部に塗布することを可能とする装置を含んでもよい。本発明のキットはさらに、通常、バイアルなどと、その他の成分とを、販売用として緊密に閉じ込めて含むための手段、例えば、所望のバイアルおよびその他の装置が設置、保持される、射出成形またはブロー成形のプラスチック容器を含む。
【０１５５】
ラベルまたはパッケージの同封体は、組成物が、癌、例えば、結腸直腸癌を処置するために使用されることを示す。
【０１５６】
本発明が説明された今、下記の実施例は、単に例示のために提供されるものであって、限定のためではない。本発明は、ただ本発明の例示のためだけに提供される、下記の非限定的実施例を参照することによってさらによく理解されよう。下記の実施例は、本発明の好ましい実施態様をより完全に説明するために提示される。しかしながら、これらの実施例を、いかなる意味でも、それよりもさらに広い本発明の範囲を限定するものと見なしてはならない。
【実施例】
【０１５７】
（実施例１）
ヒト結腸直腸癌のマウスモデルにおける、５−ＦＵおよび／またはＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）と組み合わせたｒＮＡＰｃ２の効力
結腸直腸癌における、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）と組み合わせたｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏの作用を定量するために、マウス異種移植結腸直腸腫瘍モデルを用いた。ヒトの結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加ＤＭＥＭ媒体において培養し、ｌｏｇ成長期において収集し、計数し、ＨＢＳＳ緩衝液に再縣濁した。８から１０週齢の雌ヌードマウス（ＮＵ／ＮＵ）について、マウス１匹当たり１００μｌ容量に縣濁させた１×１０７細胞を皮下に接種した。腫瘍は放置し、５０から１００ｍｍ３の平均サイズになるまで成長させ、その後処置を開始した（０日と定義）。ＨＣＴ１１６腫瘍異種移植片担持マウスを、ランダムに各種処置条件に割り当て、処置処方を１４日間続けた。
【０１５８】
マウスは下記のように処置した（６匹マウス／群）
１）ベヒクルコントロール；
２）ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ（３００μｇ／ｋｇ、毎日ＩＰ注入、１４日間）；
３）ＬＯＶＥＮＯＸ（登録商標）（１．５ｍｇ／ｋｇ、毎日ＩＰ注入、１４日間）；
４）５−ＦＵ（１０ｍｇ／ｋｇ、１日置きＩＰ注入、１４日間）；
５）ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（０．５ｍｇ／ｋｇ、週に２回ＩＰ注入、１４日間）；
６）ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋５−ＦＵ；
７）ＬＯＶＥＮＯＸ（登録商標）＋５−ＦＵ；
８）ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）＋５−ＦＵ；
９）ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）；
１０）ＬＯＶＥＮＯＸ（登録商標）＋ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）；および、
１１）ｒＮＡＰｃ２＋５−ＦＵ＋ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）。
【０１５９】
マウスは、１日置きに、体重、病気の兆候（すなわち、出血）、および死亡率を監視した。１４日目、マウスから、ＨＣＴ１１６腫瘍異種移植片を摘出し、その腫瘍について重量と大きさを測定した。腫瘍サイズは下記のように計算した：腫瘍体積（サイズ）＝（長さ）×（幅２）／２（ｍｍ３）。ベヒクルコントロールと比べると、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ単独処置は、腫瘍重量を３１％下げ、５−ＦＵ単独処置は、腫瘍重量を４１％下げ（Ｐ＜０．０５）、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）単独処置は、腫瘍重量を６３％下げた（Ｐ＜０．０５）。さらに、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏおよび５−ＦＵの併用処置は、腫瘍重量を８１％下げた（Ｐ＜０．０５）（図２および５を参照）。前述の処置の時間経過を図３および６に示す。ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏおよびＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）の併用処置は、腫瘍重量を８７％下げた（Ｐ＜０．０５）。この、結腸直腸癌のマウスモデルにおいて使用されたｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏの用量および投与処方は、出血、またはその他の有害作用などの大きな合併症も無く、レシピエントマウスによってよく耐容された（動物の体重に及ぼす処置の作用については図４および７を参照）。ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏおよび５−ＦＵまたはＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）の併用投与の結果から、抗癌剤と組み合わせたｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏは、ヒトの結腸直腸癌の患者の治療において効果的方法となる可能性のあることが示唆される。
【０１６０】
（実施例２）
結腸直腸癌の肺転移に関するマウスモデル
肺への腫瘍転移処置におけるｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏの作用を定量するために、マウス結腸直腸癌−肺転移マウスモデルを用いた。マウスの結腸直腸癌細胞（ＣＴ２６）を、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ  １６４０媒体において培養し、ｌｏｇ成長期において収集し、計数し、ＨＢＳＳ緩衝液に再縣濁した。９から１１週齢の雌同系ＢＡＬＢ／ｃマウスについて、マウス１匹当たり１００μｌ容量に縣濁させた１×１０６細胞を尾静脈注入によって接種した（０日と定義）。ＣＴ２６注入マウスを、ランダムに各種処置条件に割り当て、処置処方を１１日間続けた。
【０１６１】
マウスは下記のように処置した（８匹マウス／群）：
１）無処置コントロール；
２）ＣＴ２６／生理食塩水コントロール；
３）ＣＴ２６／ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ（１０μｇ／ｋｇ／日）；
４）ＣＴ２６／ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ（３０μｇ／ｋｇ／日）；
５）ＣＴ２６／ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ（１００μｇ／ｋｇ／日）；
６）ＣＴ２６／ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ（３００μｇ／ｋｇ／日）；
７）ＣＴ２６／ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ（１ｍｇ／ｋｇ／日）；
８）ＣＴ２６／ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ（２．５ｍｇ／ｋｇ／日）；および、
９）ＣＴ２６／ＬＯＶＥＮＯＸ（登録商標）（１．５ｍｇ／ｋｇ／日、ＩＰ注入）。
【０１６２】
マウスは、１日置きに、体重、病気の兆候（すなわち、出血）、および死亡率を監視した。１１日目、両肺を外科的に摘出し、重量測定し、肺表面の転移巣の数を盲検的にカウントした。他の内臓器官について出血の兆候を調べた。ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏの投与は、生理食塩水コントロールマウスと比べ、用量依存的に、肺表面転移の数を減らし（図８）、肺質量を下げた（図９）。何匹かのマウスでは、肺表面転移は観察されなかった（表１）。マウスにおいて、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏは、２．５ｍｇ／ｋｇ／日まではよく耐容され出血関連の病症も無かった。しかしながら、２．５ｍｇ／ｋｇのｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏおよび１．５ｍｇ／ｋｇのＬＯＶＥＮＯＸ（登録商標）で処置されたマウスの数匹では、内臓器官に若干の局所的出血が認められた。全ての実験群の間で、動物の体重には有意差は観察されなかった。この結果は、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏの投与が、ヒトの結腸直腸癌患者において転移を下げる効果的方法となる可能性のあることを示唆する。
【０１６３】
【表１】
2010503696.tif 000003
この作用がＴＦ依存性であるかどうかを決めるためには、さらにこの実験を、ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いて内因性ＴＦを下方調整したＣＴ２６細胞を用いて実行してもよい。ＴＦ  ｓｈＲＮＡによって形質転換した、マウス結腸直腸癌細胞（ＣＴ２６）を、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ  １６４０媒体において培養し、ｌｏｇ成長期において収集し、計数し、ＨＢＳＳ緩衝液に再縣濁する。９から１１週齢の雌同系ＢＡＬＢ／ｃマウスについて、マウス１匹当たり１００μｌ容量に縣濁させた１×１０６細胞を尾静脈注入によって接種する（０日と定義）。ＣＴ２６注入マウスを、ランダムに各種処置条件に割り当て、処置処方を１１日間続ける。
【０１６４】
マウスは下記のように処置することが可能である（８匹マウス／群）：
１）ＣＴ２６非経口的／生理食塩水；
２）ＣＴ２６非経口的／ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ（１０μｇ／ｋｇ／日）；
３）ＣＴ２６非経口的／ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ（１００μｇ／ｋｇ／日）；
４）ＣＴ２６、ＴＦ  ｓｈＲＮＡ／生理食塩水による；
５）ＣＴ２６、ＴＦ  ｓｈＲＮＡ／ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ（１０μｇ／ｋｇ／日）による；および、
６）ＣＴ２６、ＴＦ  ｓｈＲＮＡ／ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ（１００μｇ／ｋｇ／日）による。
【０１６５】
マウスは、１日置きに、体重、病気の兆候（すなわち、出血）、および死亡率を監視する。１１日目、両肺を外科的に摘出し、重量測定し、肺表面の転移巣の数を盲検的にカウントする。他の内臓器官について出血の兆候を調べる。
【０１６６】
（実施例３）
結腸直腸癌の肝臓転移に関するマウスモデル
肝臓への腫瘍転移処置におけるｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏの作用を定量するために、マウス結腸直腸癌−肝臓転移マウスモデルを用いた。ヒトの結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）を、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ媒体において培養し、ｌｏｇ成長期において収集し、計数し、ＨＢＳＳ緩衝液に再縣濁した。８から１０週齢の雌ヌードマウス（ＮＵ／ＮＵ）について、マウス１匹当たり１００μｌ容量に縣濁させた２×１０６ＨＣＴ１１６細胞を門脈注入によって接種した（０日と定義）。ＨＣＴ１１６注入マウスを、ランダムに各種処置条件に割り当て、処置処方を２８日間続けた。
【０１６７】
マウスは下記のように処置した（８匹マウス／群）：
１）無処置コントロール；
２）ＨＣＴ１１６／ベヒクルコントロール；
３）ＨＣＴ１１６／ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ（３００μｇ／ｋｇ、毎日ＩＰ注入、２８日間）；
４）ＨＣＴ１１６／ＣＰＴ−１１（１００ｍｇ／ｋｇ、週に１回ＩＰ注入、４週間）；および、
５）ＨＣＴ１１６／ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋ＣＰＴ−１１。
【０１６８】
マウスは、１日置きに、体重、病気の兆候（すなわち、出血）、および死亡率を監視した。４２日目、肝臓を外科的に摘出し、重量測定し、肝臓表面の転移巣の数を盲検的にカウントした。他の内臓器官について出血の兆候を調べた。ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏの投与は、ベヒクルコントロールマウスと比べ、肝臓表面転移巣の数を減らし（図１０）、肝臓質量を下げた（図１１）。さらに、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏは、肝臓転移の抑制においてＣＰＴ−１１と共に相乗作用を示した。何匹かのマウスでは、肝臓転移巣は観察されなかった（表２）。
【０１６９】
【表２】
2010503696.tif 000004
全ての実験群の間で、動物の体重に有意差は観察されなかった。この、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ＋ＣＰＴ−１１の併用投与の結果は、抗癌剤と組み合わせたｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏの投与が、ヒトの結腸直腸癌患者において転移を下げる効果的方法となる可能性のあることを示唆する。
【０１７０】
（実施例４）
自発的小腸腫瘍発生進行のマウスモデル
小腸腺癌および腺癌処置におけるｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏの作用を定量するために、マウス自発的小腸新生物マウスモデル：Ｍｉｎマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）を用いた。Ｍｉｎ突然変異は、コドン８５０をロイシン（ＴＴＧ）からアンバー（ＴＡＧ）に変換する、マウスＡＰＣ遺伝子の、常染色体優勢ヘテロノンセンス突然変異である（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：６６８（１９９２））。これは、家系性腺癌ポリープ症を有するヒトの生殖系列に受け継がれるＡＰＣ突然変異、または、大多数の、散発的結腸新生物において体細胞に起こるＡＰＣ突然変異と相同である（Ｊａｃｏｂｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：７１０（１９９６））。このＭｉｎモデルは、初期段階の病巣を標的とする抗癌剤の試験に有用である。なぜなら、主に小腸に見られる腺癌のスコアは、定められた遺伝背景において、僅か１から３ヶ月の内に相当な検出可能サイズに成長するからである（Ｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：３２２（１９９０））。
【０１７１】
４から５週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋、または同系の野生型コントロール（年齢および性別をマッチさせたもの）をランダムに各種処置条件に割り当て、処置処方を１０から１１週続けた。
【０１７２】
マウスは下記のように処置した：
１）野生型／ベヒクルコントロール（マウス３匹）；
２）野生型／ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ（１００μｇ／ｋｇ、毎日ＩＰ注入）（マウス３匹）；
３）ＡｐｃＭｉｎ／＋／ベヒクルコントロール（マウス６匹）；
４）ＡｐｃＭｉｎ／＋／ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏ（マウス６匹）；および
５）ＡｐｃＭｉｎ／＋／ＬＯＶＥＮＯＸ（登録商標）（５００μｇ／ｋｇ、毎日ＩＰ注入）（マウス６匹）。
【０１７３】
マウスは、１日置きに、体重、病気の兆候（すなわち、出血）、および死亡率を監視した。１６週目、小腸を摘出し、近位、中間、および遠位小腸に分割し、「スイスロール」を形成し、分析のために処理した。サンプル採取の２時間前に、マウスに、１匹当たり、４ｍｇのＢｒｄＵを注入した。ｒＮＡＰｃ２の長期投与は、ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスにおいて小腸の腺種および腺癌の形成を抑制した。本実験で用いたｒＮＡＰｃ２の投与処方は、大出血、またはその他の有害作用なども無く、レシピエントマウスによって最大３ヶ月間よく耐容された。これらの結果は、ｒＮＡＰｃ２／ｐｒｏが、他の抗癌治療を強化するための、効果的な抗腫瘍／転移剤となる可能性のあることを示唆する。
【０１７４】
（実施例５）
ＮＡＰタンパク活性の定量アッセイ
ＮＡＰタンパク、その変異体および断片の活性を分析するためには、これらのアッセイのいずれも使用が可能であり、米国特許第６，０９０，９１６号に詳細に記載される。なお、この特許を、引用により全ての目的のために本明細書に含める。
【０１７５】
Ａ．Ｘａ因子アミド分解アッセイ
ｆＸａ触媒活性の阻害剤として活動する、ＮＡＰタンパクの能力は、Ｋｉ＊値によって表される、ヒトのｆＸａによって触媒されるアミド分解活性のＮＡＰタンパク誘発抑制を定量することによって測定される。
【０１７６】
全てのアッセイのために使用した緩衝液はＨＢＳＡである（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン）。
【０１７７】
アッセイは、Ｂｏｃｋら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７３：３７５（１９８９）によって記載される方法にしたがって、Ｃｏｒｎｉｎｇマイクロタイタープレートの適切なウェルにおいて、５０μｌのＨＢＳＡ、５０μｌの、ＮＡＰタンパク（０．０２５−２５ｎＭ）のＨＢＳＡ希釈液（または、非抑制速度測定用のためにＨＢＳＡ単独）、および、５０μｌの、ｆＸａ酵素のＨＢＳＡ希釈液（精製ヒトｆＸから調製）を混ぜ合わせることによって行った。なお、上記文献を引用により本明細書に含める。酵素は、アッセイ前に、最終濃度が０．５ｎＭとなるようにＨＢＳＡにおいて希釈した。周囲温で３０分インキュベーションした後、アッセイ前に脱イオン水で作製し、ＨＢＳＡで希釈した基質Ｓ２７６５（Ｎ−アルファ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アルギニル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリドジヒドロクロリド）５０μｌをウェルに加え、これによって２００μｌの最終合計容量および２５０μＭ（約５×Ｋｍ）の最終濃度が得られた。発色性基質の加水分解の初速は、５分間期間に亘って、ＴｈｅｒｍｏＭａｘ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、加えた基質の５％未満が利用される、４０５ｎｍにおける吸光度の変化によって測定した。
【０１７８】
ＮＡＰタンパクを含む、抑制、平衡前、定常速度（Ｖｉ）の、遊離ｆＸａ単独の非抑制速度（Ｖ０）に対する比を、ＮＡＰタンパクの対応濃度に対してプロットした。次に、これらのデータを、緊密結合阻害剤の方程式に直接合致させ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗａｌｓｈ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６１：２０１−３００（１９８８）、なお、これを引用により本明細書に含める）、その結果から、見かけの平衡解離抑制定数Ｋｉ＊を計算する。
【０１７９】
Ｂ．プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイ
ヒト血漿におけるＮＡＰタンパクのエクスビボ抗凝固作用は、各阻害剤の広い濃度範囲に亘って活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）の延長を測定することによって評価される。
【０１８０】
ａＰＴＴおよびＰＴそれぞれの測定は、それぞれ、凝固起動因子として、自動化ａＰＴＴ  ＰＬＡＴＥＬＩＮ（登録商標）（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ，ＵＳＡ）およびＳＩＭＰＬＡＳＴＩＮ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａ）をメーカーの指示にしたがって用い、Ｃｏａｇ−Ａ−Ｍａｔｅ  ＲＡ４自動化凝固計量器（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａ，Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｃｉｔｙ，ＯＫ，ＵＳＡ）を用いて行った。
【０１８１】
アッセイは、急速に解凍した血漿において、各試験ＮＡＰタンパクの、一連の希釈液を作製し、次いで、２００μｌまたは１００μｌの上記参照試薬を、それぞれ、ａＰＴＴまたはＰＴ測定用アッセイ転回ウェルに加えた。それとは別に、ＮＡＰタンパクは、ＨＢＳＡにおいて連続希釈し、各希釈液１０μｌを、Ｃｏａｇ−Ａ−Ｍａｔｅアッセイ転回ウェル中の、１００μｌの正常ヒト血漿に加え、次いで試薬を加えた。
【０１８２】
ＮＡＰタンパクの濃度を、凝固時間に対してプロットし、２倍時間濃度、すなわち、ＰＴまたはａＰＴＴのコントロール凝固時間を２倍にする、ＮＡＰタンパクの特定濃度を計算した。
【０１８３】
Ｃ．プロトロンビナーゼ抑制アッセイ
集められて生理的プロトロンビナーゼ複合体を形成するｆＸａによるプロトロンビンの活性化に対する抑制因子として活動するＮＡＰタンパクの能力は、それぞれの抑制定数Ｋｉ＊を定量することによって評価される。
【０１８４】
プロトロンビナーゼ活性は、あらかじめ形成された、ヒトｆＸａ、ヒトのＶａ因子（ｆＶａ）、およびリン脂質小胞の複合体が、ヒトのプロトロンビンを活性化してトロンビンに変える、共役的アミド分解アッセイによって測定される。この生成されたトロンビンのアミド分解活性は、発色性基質を用いて同時に測定される。発色性基質Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ  ｔ−ＰＡ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ヘキサヒドロチロシン−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド）は、使用前脱イオン水にて再構成される。リン脂質小胞は、界面活性剤の存在下、フォスフォチジルコリン（６７％、ｗ／ｖ）、フォスファチジルグリセロール（１６％、ｗ／ｖ）、フォスファチジルエタノールアミン（１０％、ｗ／ｖ）、およびフォスファチジルセリン（７％、ｗ／ｖ）から成るが、Ｒｕｆら、（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２２２：２０９−２２４（１９９３））の記載の通りに作製される。なお、この文献を引用により本明細書に含める。
【０１８５】
このプロトロンビナーゼ複合体は、ポリプロピレン試験管において、３ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＨＢＳＡ中でｆＶａ、ｆＸａ、およびリン脂質小胞（ＰＬＶ）を１０分間混ぜ合わせることによって形成する。マイクロタイタープレートの適切なウェルにおいて、この複合体５０μｌを、ＨＢＳＡに希釈した５０μｌのＮＡＰタンパク、またはＨＢＳＡ単独（Ｖ０（非抑制速度）測定のため）と混ぜ合わせる。室温で３０分のインキュベーション後、ヒトのプロトロンビン、および、トロンビン用発色性基質、Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ  ｔＰＡを含む基質液を添加することによって反応を起動する。最終容量１５０μｌのＨＢＳＡにおける反応物質の最終濃度は：ＮＡＰ（０．０２５−２５ｎＭ）、ｆＸａ（２５０ｆＭ）、ＰＬＶ（５μＭ）、プロトロンビン（２５０ｎＭ）、Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ  ｔＰＡ（２５０μＭ、５×Ｋｍ）、およびＣａＣｌ２（３ｍＭ）である。
【０１８６】
ｆＸａのプロトロンビナーゼ活性は、実施例５Ａの正確に記載通りに、定常状態において１０分間における（速度）４０５ｎｍでの吸光度の増加として測定する。吸光度の増加は、時間についてＳ字状となる。これは、ｆＸａ含有プロトロンビナーゼ複合体によるプロトロンビン活性化の共役反応、および、その後の、生成されたトロンビンによるＰｅｆａｃｈｒｏｍｅ  ｔＰＡの加水分解を反映する。プロトロンビン活性化の初期速度（Ｖｉ）を決めるために、各ウェルのデータは、以前の記載の通り（Ｃａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｍｅｄ．１９：１５１−１５７（１９８５））、直線的最小二乗回帰分析によって吸光度対時間２の関数として合致させる。ＮＡＰタンパクを含む、抑制、定常状態初期速度（Ｖｉ）の、プロトロンビナーゼｆＸａ単独の非抑制速度（Ｖ０）に対する比を、ＮＡＰタンパクの対応濃度に対してプロットする。これらのデータを、前記実施例５Ａと同様に、緊密結合阻害剤の方程式に直接合致させ、見かけの平衡解離抑制定数Ｋｉ＊を計算する。
【０１８７】
Ｄ．活性特異性決定のためのインビトロ酵素アッセイ
ｆＸａ触媒活性、またはＴＦ／ｆＶＩＩａ活性に対する選択的阻害剤として活動する、ＮＡＰタンパクの能力は、下記の関連セリンプロテアーゼ：トロンビン、Ｘａ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩａ因子、カリクライン、活性化タンパクＣ、プラスミン、組み換え組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔ−ＰＡ）、ウロキナーゼ、キモトリプシン、およびトリプシンの濃度よりも１００倍高濃度のアッセイにおいて、ＮＡＰタンパクが、他の酵素を抑制するかどうかを決定することによって評価される。これらのアッセイはさらに、セリンプロテアーゼ抑制活性を有するＮＡＰタンパクの特異性を決定するためにも使用される。
【０１８８】
酵素抑制アッセイの一般的プロトコール
全てのアッセイに使用される緩衝液はＨＢＳＡである（実施例５Ａ）。全ての基質は、アッセイ前に、脱イオン水で再構成され、次いでＨＢＳＡに希釈される。セリンプロテアーゼ抑制の特異性を決定するためのアミド分解アッセイは、マイクロタイタープレートの適切なウェルにおいて、５０μｌのＨＢＳＡ、ＨＢＳＡに指定の濃度で希釈した５０μｌのＮＡＰタンパク、またはＨＢＳＡ単独（非抑制コントロール速度、Ｖ０）、および、５０μｌの指定の酵素（下記の、指定酵素を参照）混ぜ合わせることによって実施される。周囲温で３０分のインキュベーション後、５０μｌの基質を３重ウェルに加える。合計容量２００μｌのＨＢＳＡにおける反応物質の最終濃度は：ＮＡＰ（７５ｎＭ）、酵素（７５０ｐＭ）、および発色性基質（後述）である。次に、それぞれの酵素について、ＮＡＰを含む試験サンプルの速度（Ｖｉ）は、下記の式：Ｖｉ／Ｖ０×１００によって、非抑制コントロール速度（Ｖ０）のパーセントとして表される。
【０１８９】
特異的酵素アッセイ
（ａ）トロンビンアッセイ
トロンビンの触媒活性は、発色性基質Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ  ｔ−ＰＡ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ヘキサヒドロチロシン−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン）を２５０μＭの最終濃度（約５×Ｋｍ）で用いて定量する。
【０１９０】
（ｂ）Ｘａ因子アッセイ
Ｘａ因子の触媒活性は、発色性基質Ｓ−２７６５（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アルギニン−Ｌ−グリシン−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン）を２５０μＭの最終濃度（約５×Ｋｍ）で用いて定量する。ヒトの精製ｆＸａは、以前に記載される通りに活性化し、調製する（Ｂｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７３：３７５−３８８（１９８９））。
【０１９１】
（ｃ）ＸＩａ因子アッセイ
ＸＩａ因子の触媒活性は、発色性基質Ｓ−２３６６（Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン）を７５０μＭの最終濃度で用いて定量する。
【０１９２】
（ｄ）ＸＩＩａ因子アッセイ
ＸＩＩａ因子の触媒活性は、発色性基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ  ＦＸＩＩａ（Ｈ−Ｄ−ＣＨＴ−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン）を１００μＭの最終濃度で用いて定量する。
【０１９３】
（ｅ）カリクラインアッセイ
カリクラインの触媒活性は、発色性基質Ｓ−２３０２（Ｈ−Ｄ−プロリル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン）を４００μＭの最終濃度で用いて定量する。
【０１９４】
（ｆ）活性化プロテインＣ（ａＰＣ）
活性化プロテインＣの触媒活性は、発色性基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ  ＰＣａ（Ｈ−Ｄ−リシル（−Ｃｂｏ）−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン）を４００μＭの最終濃度（約４×Ｋｍ）で用いて定量する。
【０１９５】
（ｇ）プラスミンアッセイ
プラスミンの触媒活性は、発色性基質Ｓ−２３６６（Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン）を３００μＭ（約４×Ｋｍ）の最終濃度で用いて定量する。
【０１９６】
（ｈ）組み換え組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔ−ＰＡ）
ｒｔ−ＰＡの触媒活性は、基質、Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ  ｔ−ＰＡ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ヘキサヒドロチロシン−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン）を５００μＭの最終濃度（約３×Ｋｍ）で用いて定量する。
【０１９７】
（ｉ）ウロキナーゼ
ウロキナーゼの触媒活性は、基質Ｓ−２４４４（Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン）を１５０μＭの最終濃度（約７×Ｋｍ）で用いて定量する。
【０１９８】
（ｊ）キモトリプシン
キモトリプシンの触媒活性は、発色性基質、Ｓ−２５８６（メトキシ−スクシニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−チロシン−ｐ−ニトロアニリン）を１００μＭの最終濃度（約８×Ｋｍ）で用いて定量する。
【０１９９】
（ｋ）トリプシン
トリプシンの触媒活性は、発色性基質Ｓ−２２２２（Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミル［−メチルエステル］−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン）を３００μＭの最終濃度（約５×Ｋｍ）で用いて定量する。
【０２００】
Ｅ．ＮＡＰによるｆＶＩＩａ／ＴＦ複合体の抑制を測定するためのアッセイ
（ａ）ｆＶＩＩａ／ＴＦ  ｆｌＸ活性化アッセイ
本実施例は、エクスビボプロトロンビン時間アッセイ（実施例５Ｂ）において凝固反応の起動に主要な役割を演じる、ｆＶＩＩａ／ＴＦの触媒複合体の阻害剤として活動するＮＡＰタンパクの能力を測定する。ｒＦＶＩＩａ／ｒＴＦ／ＰＬＶ複合体による、重水素標識ｆｌＸの活性化は、それぞれの内在的抑制定数Ｋｉ＊を定量することによって評価される。
【０２０１】
凍結乾燥、精製、組み換えヒトｆＶＩＩａは、使用前に、ＨＢＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）において再構成する。精製ヒトｆＸおよびｆＸａ（遊離ｆＸａ）は、以前の記載の通りに（Ｂｏｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７３：３７５−３８８（１９８９））、活性化され、調製される。さらに、Ｌ−グルタミル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルギニルクロロメチルケトンによってあらかじめ非可逆的に不活性化された、活性部位遮断ヒトｆＸａ（ＥＧＲ−ＦＸａ）も使用される。
【０２０２】
Ｒｕｆら、（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２２２：２０９−２２４（１９９３））による記載にしたがって、組み換えヒト組織因子（ｒＴＦ）アポタンパクを、界面活性剤の存在下、フォスフォチジルコリン（７５％、ｗ／ｖ）およびフォスフォチジルセリン（２５％、ｗ／ｖ）から成るリン脂質小胞の中に取り込む（ｒＴＦ／ＰＬＶ）。全てのアッセイにおいて使用される緩衝液は、ＨＢＳＡ、すなわち、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＨＢＳである。
【０２０３】
ｒｆＶＩＩａ／ｒＴＦ複合体による、ヒトの３Ｈ−ＩＸ因子（ｆｌＸ）の活性化は、放射線標識活性化ペプチドの放出を測定することによって監視する。精製ヒトｆｌＸは、以前に記載される通り（Ｖａｎ  Ｌｅｎｔｅｎ  ａｎｄ  Ａｓｈｗｅｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：１８８９−１８９４（１９７１））還元性重水素化によって放射標識される。
【０２０４】
Ｋｉ＊定量のためのアッセイは下記のように実施する：ｒｆＶＩＩａおよびｒＴＦ／ＰＬＶは、ポリプロピレン試験管中で混ぜ合わせ、５ｍｍ  ＣａＣｌ２を含むＨＢＳＡにおいて１０分間放置して複合体を形成させる。ｒｆＶＩＩａ／ｒＴＦ／ＰＬＶ複合体の分液は、適切なポリプロピレンミクロ遠心チューブにおいて、ＨＢＳＡに希釈後、ＥＧＲ−ｆＸａ、または、含まれる場合は遊離ｆＸａ、および、各種濃度のＮＡＰタンパクと、またはＨＢＳＡ単独（Ｖ０（非抑制速度）コントロール）と混ぜ合わされる。周囲温で６０分のインキュベーション後、３Ｈ−ＦｌＸの添加によって反応を開始する。４２０μｌのＨＢＳＡにおける反応物質の最終濃度は：ｒｆＶＩＩａ（５０ｐＭ）、ｒＴＦ（２．７ｎＭ）、ＰＬＶ（６．４μＭ）、ＥＧＲ−ｆＸａまたは遊離ｆＸａ（３００ｐＭ）、組み換えＮＡＰタンパク（５−１，５００ｐＭ）、３Ｈ−ＦｌＸ（２００ｎＭ）、およびＣａＣｌ２（５ｍＭ）である。さらに、ｒｆＶＩＩａを除き、前述の反応物質全てを含む、背景コントロール反応を行わせる。
【０２０５】
指定の時点（８、１６、２４、３２、および４０分）で、８０μｌの反応混合液を、０．５％ＢＳＡと共に、等容量の、ＨＢＳに溶解した５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含むエッペンドルフ管に加えて反応を停止させ、この後、１６０μｌの６％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を加える。タンパクを沈殿させ、１６，０００×ｇにおいて４℃で６分遠心することによって上清から分離する。得られた上清に含まれる放射能を、分液を取り出し、Ｓｃｉｎｔｉｖｅｒｓｅ  ＢＤ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆａｉｒｌａｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）に加え、液体シンチレーションカウント法によって定量する。活性化のコントロール速度は、５％未満の重水素標識ｆｌＸが消費される、定常条件下に時間と共に放出される可溶性カウントについて直線的回帰分析を行って定量する。全てのサンプルから背景コントロール（コントロール速度の＜１．０％）を差し引く。ＮＡＰタンパクの存在下における、抑制、定常状態初期速度（Ｖｉ）の、ｒｆＶＩＩａ／ＴＦ単独の非抑制コントロール速度（Ｖ０）に対する比を、ＮＡＰタンパクの対応濃度に対してプロットする。次に、これらのデータを、緊密結合阻害剤の方程式に直接合致させ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗａｌｓｈ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６１：２０１−３００（１９８８））、その式から、見かけの平衡解離抑制定数Ｋｉ＊を計算する。
【０２０６】
（ｂ）ＶＩＩａ因子／組織因子アミド分解アッセイ
ｆＶＩＩａ／ＴＦ複合体のアミド分解活性の阻害剤として活動するＮＡＰタンパクの能力は、活性部位遮断ヒトＸａ因子（ＥＧＲ−ｆＸａ）の存在下および不在下に、それぞれの抑制定数Ｋｉ＊を定量することによって評価される。
【０２０７】
ｒＦＶＩＩａ／ｒＴＦのアミド分解活性は、発色性基質Ｓ−２２８８（Ｈ−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン）を用いて定量する。この基質は、使用前に脱イオン水で再構成される。ｒｆＶＩＩａおよびｒＴＦ／ＰＬＶは、ポリプロピレン試験管中で混ぜ合わせ、３ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＨＢＳＡにおいて１０分間放置して複合体を形成させる。Ｋｉ＊定量のためのアッセイは、マイクロタイタープレートの適切なウェルにおいて、ＨＢＳＡに希釈後、５０μｌのｒｆＶＩＩａ／ｒＴＦ／ＰＬＶ複合体、５０μｌのＥＧＲ−ｆＸａ、および、５０μｌの各種濃度のＮＡＰタンパク、またはＨＢＳＡ単独（Ｖ０（非抑制速度）測定のために）と混ぜ合わされることによって実施される。周囲温で３０分のインキュベーション後、５０μｌのＳ−２２８８を添加することによって反応を開始する。合計容量２００μｌのＨＢＳＡにおける反応物質の最終濃度は：組み換えＮＡＰタンパク（０．０２５−２５ｎＭ）、ｒｆＶＩＩａ（７５０ｐＭ）、ｒＴＦ（３．０ｎＭ）、ＰＬＶ（６．４μＭ）、ＥＧＲ−ｆＸａ（２．５ｎＭ）、およびＳ−２２８８（３．０ｍＭ、３×Ｋｍ）である。
【０２０８】
ｒｆＶＩＩａ／ｒＴＦ／ＰＬＶのアミド分解反応は、５％未満の基質が消費される定常条件下において、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍａｘ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、１０分間での４０５ｎｍにおける吸光度の直線的増加（速度）として測定する。ＮＡＰタンパクの存在下における、抑制、平衡前、定常状態速度（Ｖｉ）の、遊離ｆＸａ単独の非抑制コントロール速度（Ｖ０）に対する比を、ＮＡＰタンパクの対応濃度に対してプロットする。次に、これらのデータを、実施例５Ｅ（ａ）で用いた、緊密結合阻害剤の同じ方程式に直接合致させ、その式から、見かけの平衡解離抑制定数Ｋｉ＊を計算する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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