(57)【要約】  高温で長期間使用するための骨形成タンパク質の液体製剤を提供する。より具体的には、本発明は、体温以下の温度で、少なくとも３０日間、タンパク質に安定性を提供する、ｒｈＧＤＦ−５、トレハロース、及び１種又はそれ以上の生体適合性賦形剤、を含む液体製剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性溶液中のＧＤＦ−５と、６０ｗ／ｖ％のトレハロースと、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール及びアスパラギン酸カリウムからなる群から選択される少なくとも１種の追加の賦形剤と、を含む、組成物。
【請求項２】
前記アミノ酸が、β−アラニン、Ｌ−グリシン、及びＬ−プロリンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アミノ酸が、約０．２５〜約５ｗ／ｖ％の量で存在するβ−アラニンを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記β−アラニンが０．５ｗ／ｖ％の量で存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１種の追加の賦形剤が、約０．１〜約３ｗ／ｖ％の量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記トリアルキルアンモニウム塩が、トリエチルアンモニウムヒドロクロリドである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１種の追加の賦形剤が、約０．２５〜約５ｗ／ｖ％の量で存在するアミノ酸、及び、約０．１〜約３ｗ／ｖ％の量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１種の追加の賦形剤が、約０．５ｗ／ｖ％の量で存在するβ−アラニン、及び、約０．１ｗ／ｖ％の量で存在するトリエチルアンモニウムヒドロクロリドを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記熱ショックタンパク質が、約０．１〜約０．２ｗ／ｖ％の量で存在するＨＳＰ７０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１種の追加の賦形剤が、約０．５ｗ／ｖ％の量で存在するβ−アラニン、及び、約０．１ｗ／ｖ％の量で存在するタウリンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記追加の賦形剤が、約０．５ｗ／ｖ％の量で存在するベタインである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
酸性溶液中のＧＤＦ−５を提供することと、ある量のトレハロースを添加して、６０ｗ／ｖ％のトレハロース溶液を提供することと、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール及びアスパラギン酸カリウムからなる群から選択される少なくとも１種の追加の賦形剤を添加することと、を含む、ＧＤＦ−５溶液を安定化する方法であって、前記ＧＤＦ−５溶液は、クロマトグラフィーによる、タンパク質のメインピークの少なくとも８０％の保存により証明されるように、３７℃以下の温度で少なくとも３０日間安定化される、方法。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、高温で長期間用いるための、骨形成タンパク質の液体製剤に関する。より具体的には、本発明は、３７℃以下の温度で、３０日間以上安定である製剤を提供するための、ｒｈＧＤＦ−５、トレハロース、及び、１種又はそれ以上の生体適合性賦形剤を含む液体製剤に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
ＧＤＦ−５は、タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーのサブクラスである、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のメンバーである。ＧＤＦ−５は、リー（Lee）（米国特許第５，８０１，０１４号）により、最初にマウスから単離されたｍＧＤＦ−５を含む、数種の変異体、及び突然変異体を含む。他の変異体としては、ｈＧＤＦ−５、及びＬＡＰ−４としても知られている（トリアントフィロー（Triantfilo）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２，３３８〜３４５（２００１））、ＧＤＦ−５のヒト型である、ＭＰ５２（国際公開第９５／０４８１９号）；また、ｈＧＤＦ−５の対立遺伝子タンパク質変異体である、ＣＤＭＰ−１（国際公開第９６／１４３３５号）；また、細菌で製造される組み換えヒト型である、ｒｈＧＤＦ−５（欧州特許第０９５５３１３号）；また、ｒｈＧＤＦ−５の単量体変異体である、ｒｈＧＤＦ−５−Ａｌａ８３；ｈＧＤＦ−５／ＣＤＭＰ−１様タンパク質の総称である、ＢＭＰ−１４；また、世界保健機関により指定された国際名である、ラドテルミン（Radotermin）；また、ＭＰ５２の高分子量タンパク質変異体である、ＨＭＷ  ＭＰ５２’ｓ；また、分子間架橋に関与するシステイン残基がアラニンで置換されている単量体バージョンである、Ｃ４６５Ａ；また、Ｎ４４５Ｔ、Ｌ４４１Ｐ、Ｒ４３８Ｌ、及びＲ４３８Ｋを含む、他の活性単一アミノ酸置換突然変異体が挙げられる。本出願の目的のために、用語「ＧＤＦ−５」は、タンパク質の全ての変異体及び突然変異体を含むことを意味し、ｒｈＧＤＦ−５は、１１９個のアミノ酸を有する代表的なメンバーである。
【０００３】
ＢＭＰファミリーの全てのメンバーは、カルボキシ末端活性ドメインを含む共通構造特性を共有し、３つの分子内ジスルフィド結合と１つの分子間ジスルフィド結合を作製するシステイン残基の高度に保存されたパターンを共有する。活性型は、単一ファミリーメンバーのジスルフィド結合したホモ二量体、又は２種の異なるメンバーのヘテロ二量体のいずれであってもよい（マサック（Massague）ら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：９５７  （１９９０）；サンパス（Sampath）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６５：１３１９８（１９９０）；セレステ（Celeste）ら、ＰＮＡＳ  ８７：９８４３〜４７（１９９０）；米国特許第５，０１１，６９１号、及び米国特許第５，２６６，６８３号を参照のこと）。タンパク質の適切な折り畳み、及びこれらのジスルフィド結合の形成は、生物学的機能に必須であり、誤った折り畳みは不活性凝集体、及び断片の切断を導く。
【０００４】
タンパク質の分解及び安定化は、広く文献に記載されており、抗凍結剤及び浸透圧調節剤としてのデキストラン、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、スクロース、及びトレハロースのような賦形剤の使用は詳細に記録されている（例えば、アラカワ（Arakawa）ら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，４６，３０７〜３２６（２００１）、ワン（Wang）ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  １８５，１２９〜１８８（１９９９）による、及びトレハロースについてはクロー（Crowe）ら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４３，８９〜１０５（２００１）による、タンパク質の安定性に関する総説を参照のこと）。ＧＤＦ−５の凍結乾燥製剤を保護するための賦形剤の使用はまた、イチカワ（Ichikawa）らによる米国特許出願公開第２００４０１３２６５３号、チョウ（Zhou）らによる米国特許出願公開第２００６０２８６１７１号、及びガリガパティ（Garigapati）らによる米国特許出願第６０／８７０，０３２号にも記載されている。凍結乾燥は、一般的に用いられているプロセスであり、サンプルをフリーズドライして、水を取り除き、保管用の固体ケーキを得ることを含み、このケーキは後の使用時に再水和することができる。ＧＤＦ−５のようなタンパク質の場合、凍結、乾燥、及び水による再水和は全て、タンパク質の構造、及び一体性に対して別々の傷害及び問題を表す。
【０００５】
タンパク質トロポニンの溶液を安定化させるための製剤中における充填剤としてのトレハロースの使用は、フラー（Flaa）らにより、米国特許第６，１６５，９８１号に記載されている。トレハロースを用いる抗体の安定化もまた、ラム（Lam）らにより、米国特許第６，１７１，５８６号、及び同第６，９９１，７９０号等に記載されている。これらのタンパク質は、ＧＤＦ−５と構造的類似性をほとんど共有せず、他のタンパク質に対して適応する製剤の使用は、ＧＤＦ−５の安定化における使用では必ずしも予測可能ではない。
【０００６】
対照的に、室温又は更には体温のような高温で長期間安定であるＧＤＦ−５の液体溶液の調製は、凍結乾燥及び再構成するとき、凍結、乾燥及び再水和とははっきり異なる別々の１組の問題を提示する。水の除去、賦形剤の結晶化、並びにタンパク質鎖、その水素及びスルフィド結合、及び三次構造の局所的微環境における変化に由来する、タンパク質構造に対する生化学的傷害はもはや問題ではなく、むしろ問題は熱力学的運動の増加に由来する。これは、酸化、脱アミド、加水分解、及び主に不活性化機構としてのタンパク質のアミノ酸の切断の速度上昇を導き、小断片及び、凍結乾燥プロセスで一般的に観察される凝集体より少ない量の凝集体を有する、不活性親分子を生成する。逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｐ−ＨＰＬＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、電気泳動のような他の方法より、タンパク質の純度及び安定性のより信頼できる指標であると思われる。
【０００７】
したがって、室温又はそれ以上の温度で、液体溶液のためのＧＤＦ−５のようなタンパク質を安定化するために必要な戦略及び化学は、凍結乾燥のためのものとは異なる処方を必要とする場合がある。ＧＤＦ−５は、２〜８℃にて長期間溶液中で安定ではなく、典型的には−６０〜−８０℃の温度で保管される。ＧＤＦ−５は、中性ｐＨで可溶性ではなく、典型的には、酸性溶液中で可溶化され、それにより酸加水分解の可能性が高まる。
【０００８】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
長期間保管及び高温での使用のための、安定なＧＤＦ−５液体製剤の調製における、上述の制限及び複雑な問題を考慮して、新規及び有効な製剤が必要とされている。
【０００９】
〔課題を解決するための手段〕
本発明は液体タンパク質製剤である。製剤は、ＢＭＰ、トレハロースの少なくとも５０ｗ／ｖ％溶液、並びに、３７℃以下の温度で少なくとも３０日間保存するため、クロマトグラフィーのメインピークの少なくとも８０％を保持することにより証明されるように、ＢＭＰを安定化するのに十分な量の、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール、及びアスパラギン酸カリウムから成る群から選択される少なくとも１種の追加の賦形剤を含む。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、ＢＭＰ、トレハロースの少なくとも５０ｗ／ｖ％溶液、並びにアミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール、及びアスパラギン酸カリウムから成る群から選択される少なくとも１種の追加の賦形剤を有するＢＭＰ溶液を安定化する方法である。
【００１１】
本発明のタンパク質製剤は、骨形成タンパク質の保管及び使用が望ましい全ての用途で用いることができる。室温又は体温での骨形成タンパク質の保管及び使用は、これらの製剤の有用な用途を提示する。表１は、試験した異なる製剤及び結果の概要を示す。
【００１２】
【表１−１】
2010532368.tif 000002
【表１−２】
2010532368.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】３７℃で３０日及び６０日後のｒｐ−ＨＰＬＣによる、また３７℃で３０日後のＳＥＣによる、製剤番号１８、１９、２１、２３及び３７の比較安定性。
【図２】３７℃で３０日後の、ｒｐ−ＨＰＬＣによる製剤１８の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、更なるピークが存在しないことにより、９４％であると示される。
【図３】３７℃で３０日後の、ｒｐ−ＨＰＬＣによる製剤３７の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、更なるピークが存在しないことにより、９３％であると示される。
【図４】３７℃で３０日後の、ｒｐ−ＨＰＬＣによる製剤３５の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、分解を示す更なるピークの存在により、５９％であると示される。
【図５】３７℃で６０日後の、ｒｐ−ＨＰＬＣによる製剤２１の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、更なるピークが存在しないことにより、９１％であると示される。
【図６】３７℃で６０日後の、ｒｐ−ＨＰＬＣによる製剤２９の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、分解を示す追加のピークの存在により、５３％であると示される。
【図７】３７℃で１２日後の、ＳＥＣによる製剤１２の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、わずかな分解を示す小さな更なるピークの存在により、８２％であると示される。
【図８】３７℃で３０日後の、ＳＥＣによる製剤１８の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、更なるピークが存在しないことにより、９８％であると示される。
【図９】３７℃で１４日後の、ｒｐ−ＨＰＬＣによる、６０ｗ／ｖ％のトレハロースのみを含むＧＤＦ−５サンプルの安定性。タンパク質の保存は、主なピークと、分解を示す追加のピークの存在により、７５％であると示される。
【図１０】ＧＤＦ−５の参照標準（製剤ではない）のクロマトグラフ。
【図１１】新たに調製したＧＤＦ−５標準溶液、新たに調製した製剤番号１８の溶液、及び３７℃に６０日間曝露した後の製剤番号１８の溶液の活性間の相関。タンパク質の活性の保存は、曲線の比較類似性により示される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明で用いてよい骨形成タンパク質としては、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ１２及びＢＭＰ−１４、並びにその全ての変異体及び突然変異体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいＢＭＰは、ＭＰ５２としても知られているｒｈＧＤＦ−５である。
【００１５】
本明細書では、長期間高温で水溶液中のＢＭＰ分子の安定性を提供する組成物として有用な数種の製剤が提供される。本発明の目的のために、用語「室温」及び「周囲温度」は、互換的であると理解され、およそ１８〜２５℃の温度を有する通常のオフィス又は研究室の温度を意味し；用語「体温」は、およそ３７℃の温度である、ヒトの正常な体温を意味し；「冷却温度」とは、およそ２〜８℃の温度を意味し；用語「凍結」はおよそ−４℃〜−２０℃の温度を意味する。
【００１６】
ＢＭＰの安定性は、ｒｐ−ＨＰＬＣ及びＳＥＣのような種々の分析方法により示され、ＢＭＰ分子の化学的純度、及びひいては製剤の性能を決定するためのあいまいな生物学的アッセイに依らない。本発明の目的のために、用語「安定性」及び「純度」は互換的であり、ｒｐ−ＨＰＬＣ又はＳＥＣクロマトグラフィーによりＢＭＰの特徴を記載することを意味し、親分子の保存の測定値としてのメインピークの曲線下面積を指す。生物学的アッセイは、また、安定性を、ＢＭＰの生物学的活性と相互に関係させるために実施される（図１１を参照のこと）。
【００１７】
本発明の製剤は、ＢＭＰ、酸性溶液中のトレハロースの少なくとも５０ｗ／ｖ％溶液、並びにアミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール、及びアスパラギン酸カリウムから成る群から選択される少なくとも１種の追加の賦形剤を含む。トレハロースは、溶液及び凍結乾燥製剤中のタンパク質に安定性を提供する周知の賦形剤であるが、それ自体で体温でのＧＤＦ−５の液体溶液に長期間の安定性を与えるには不十分である。これは、図１０に示す標準クロマトグラフと比較したとき、３７℃の温度で１４日間の保存後の、図９のｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラフではメインピークが減少し、追加のピークが現れたことにより証明される。
【００１８】
トレハロースの溶解度は、６８．９ｇ／１００ｇＨ２Ｏ（ヒガシヤマ（（Higashiyama）、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．７４，１２６３〜１２６９（２００２）であると報告されている。５０ｗ／ｖ％および６０ｗ／ｖ％のトレハロース溶液を用い、数種の賦形剤及びその組み合わせを詳細に調べて、３７℃以下の温度で３０日以上保管した後、ｒｐ−ＨＰＬＣ又はＳＥＣクロマトグラフ中のメインピークにより証明されるように、タンパク質の純度が少なくとも８０％保持される、安定な液体ＢＭＰ溶液を提供する製剤が見出された。多くの実験の後、この目的を満たすのに価値がある賦形剤の特定の組み合わせが見出されている。また、種々の製剤のｐＨを上昇させて、タンパク質の酸加水分解及び切断の可能性を最小限に抑えることが試みられた。所望のｐＨ範囲は、約２．５〜約７．０であり、より好ましくは約４．０〜約６．０である。ｐＨ値がより低いと、より速い速度でタンパク質の酸加水分解を導く傾向があり、ｐＨ値がより高いと、タンパク質の不溶解性をもたらす傾向がある。その生体適合性のために、塩酸が好ましく、０．５〜約３ミリモルの値が好ましいが、約１０ミリモルまでのより高い値のＨＣｌは許容可能である。本発明の製剤中で他の生体適合性酸を用いてもよいことが、当業者には明らかであろう。
【００１９】
トレハロースに加えて、トリメチルアンモニウムＮ−オキシド二水和物（ＴＭＡＯ）を種々の濃度で試験したところ、広くタンパク質の安定性に対して有害な影響が見られた。０．１ｗ／ｖ％のＴＭＡＯの添加は、メインピークの許容可能な８６％の保持率を提供したが、ＴＭＡＯ濃度の上昇はタンパク質の安定性の低下を導いた（製剤１〜４）。ともに０．５ｗ／ｖ％のβ−アラニン含量を有する製剤１５と１７との比較では、０．１ｗ／ｖ％のＴＭＡＯの添加は、タンパク質の安定性を８９％から８４％に低下させた。ラフィノース及びミオイノシトールを含む他の製剤では、ＴＭＡＯの添加はまた、タンパク質の安定性に有害な影響を示した。３％のラフィノース及び１％のミオイノシトールの製剤は満足のいく性能を有していたが、添加するＴＭＡＯの量を増加させると、タンパク質の安定性に更に有害な影響を与えた（製剤１０〜１３を参照のこと）。
【００２０】
熱ショックタンパク質は当該技術分野において既知であり、熱応力によりいくつかの生物系を安定化することができる（例えば、ナカモト（Nakamoto）ら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２月；６４（３）：２９４〜３０６（２００７）を参照のこと）。熱ショックタンパク質７０を、ＧＤＦ−５を含む６０％のトレハロース溶液中の０．１及び０．２ｗ／ｖ％の濃度で試験したところ、それぞれメインピークを９２％及び９１％保持する許容可能な結果を示した。
【００２１】
トリメチルアンモニウムヒドロクロリド（ＴＭＡ）は周知の賦形剤であり、種々の濃度で数種の製剤中のトレハロースと併用して、またβ−アラニンと併用して試験した。ＴＭＡは、５０％トレハロース溶液を有していた製剤３６を除いて、試験した全ての製剤で満足のいく結果を残した。ＴＭＡの望ましくない強い臭気のために、トリエチルアンモニウムヒドロクロリド（ＴＥＡ）の、ＴＭＡの好適な代替物としての可能性を調べた。製剤１８と２１との直接比較では、ＴＥＡは実際ＴＭＡの好適な代替物であり、図２及び５により証明されるように、優れたタンパク質の安定性を提供することを示す。実際に、図５は、ＴＥＡを含む製剤２１が、３７℃で６０日後、メインピークの保持率が９１％であるという、試験した全ての製剤の中で最良の全体的な長期性能を提供した。
【００２２】
ベタインは、アンモニウムイオン又はホスホニウムイオンのような、正荷電カチオン官能基を有し、またカルボキシル基のような負荷電官能基を有する、任意の中性化学化合物である。これらの化合物は双極性イオンとして存在し、生物系で有機浸透圧調節物質として機能し、有用な賦形剤である。歴史的に、用語ベタインは、テンサイで発見されて以来、化合物トリメチルグリシンのために確保されている。トリメチルグリシンヒドロクロリドは、本発明の代表的なベタインであり、トレハロース及び他の賦形剤と併用して、０．５ｗ／ｖ％の濃度で数種の製剤において許容可能な性能を示した（製剤２３、２４、２８及び３２を参照のこと）。
【００２３】
アミノ酸は、緩衝能を提供することが既知であり、本発明の賦形剤として用いることが想到される。好適なアミノ酸の例としては、緩衝剤として有用な代表的なアミノ酸として、アラニン、グリシン、プロリン、リジン、アルギニン、及びヒスチジンの異性体が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸は個々に又は組み合わせて用いられ、緩衝能を提供できる。β−アラニンを数種の製剤においてアミノ酸緩衝剤として試験したところ、広く有益な性質を有することが見出された。トレハロース、及びβ−アラニンを含む製剤は、０．２５〜２ｗ／ｖ％（製剤１４、１５及び３４）であるが、１％及び５％溶液（製剤３３及び３５）ではないβ−アラニン濃度で許容可能な結果をもたらした。０．５％のβ−アラニン、及び０．１％のタウリン、を含む製剤１９では優れた結果が得られ、ｒｐ−ＨＰＬＣ及びＳＥＣの両方で３７℃にて３０日後、９０％を超える安定性を示し、６０日後８８％の安定性を示した。０．５％のベタイン、１％のＴＥＡ及び０．５％のＬ−プロリン及びアスパラギン酸カリウムをそれぞれ含む製剤２３では、３７℃にて３０日後、優れた結果が得られ、９０％を超える安定性を示したが、６０日後の安定性は７８％であった。許容可能な結果が得られたＬ−プロリン及びアスパラギン酸カリウムを利用する他の製剤としては、３７℃で３０日後、それぞれ８２％及び８３％であった、製剤２４及び２８が挙げられる。
【００２４】
ｒｐ−ＨＰＬＣのメインピークにより示されるタンパク質の安定性と、ＧＤＦ−５タンパク質の生物活性との間の相関を確認するために、製剤を６０日間３７℃に曝露した後、製剤１８を標準ＧＤＦ−５タンパク質溶液と比較し、また時間０の製剤とも比較した。ＧＤＦ−５の生物活性を、骨髄間質細胞株Ｗ−２０−１７上で様々な濃度のＧＤＦ−５を用いて測定した。比色分析により測定したとき、ＧＤＦ−５の量が増加すると、Ｗ−２０−１７中のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）が増加した。図１１では、時間０及び３７℃で６０日後の製剤番号１８のＡＬＰバイオアッセイを、新たに調製した賦形剤を含まない標準ＧＤＦ−５溶液と比較した。３本の曲線は全て類似の特性を示し、製剤は時間０では活性を低下させず、３７℃で６０日後活性タンパク質を提供することを示す。
【００２５】
１つの実施形態では、本発明は、酸性溶液中の少なくとも５０ｗ／ｖ％のトレハロース、ＢＭＰ、及び約０．１〜約５ｗ／ｖ％の濃度で存在するトリアルキルアンモニウム塩の製剤を含む。好ましい実施形態では、トリアルキルアンモニウム塩は、トリメチルアンモニウムヒドロクロリド、トリエチルアンモニウムヒドロクロリド、又はこれらの組み合わせであってよいが、当業者は、本発明の均等物であると考えられるアルキル基、塩又はアルキル基及び塩、又は両方の軽微な置換又は修正を理解するであろう。
【００２６】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも５０ｗ／ｖ％のトレハロース、ＢＭＰ、及び約０．２５〜約５ｗ／ｖ％の量で存在する少なくとも１種のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、少なくとも１種のアミノ酸は、β−アラニンであり、約０．５ｗ／ｖ％の量で存在する。別の実施形態では、少なくとも１種のアミノ酸は、グリシン及びβ−アラニンの組み合わせであり、それぞれ約０．１〜約２．５ｗ／ｖ％の量で存在する。好ましい実施形態では、β−アラニンは約０．２５％の量で存在し、グリシンは約０．２５ｗ／ｖ％の量で存在する。別の実施形態では、アミノ酸はＬ−グリシン、Ｌ−プロリン及びＬ−アラニンの組み合わせであり、それぞれ約０．１〜約２．５ｗ／ｖ％の量で存在する。
【００２７】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも５０ｗ／ｖ％のトレハロース、ＢＭＰ、及び約０．１〜約０．２ｗ／ｖ％の量で存在する熱ショックタンパク質を含む。好ましい実施形態では、熱ショックタンパク質は、熱ショックタンパク質７０であり、約０．１ｗ／ｖ％の量で存在する。
【００２８】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも５０ｗ／ｖ％のトレハロース、ＢＭＰ、約０．２５〜約５ｗ／ｖ％の量で存在するβ−アラニン、及び約０．０１〜約１ｗ／ｖ％量で存在するタウリンを含む。好ましい実施形態では、β−アラニンは約０．５ｗ／ｖ％の量で存在し、タウリンは約０．１ｗ／ｖ％の量で存在する。
【００２９】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも５０ｗ／ｖ％のトレハロース、ＢＭＰ、約０．２５〜約５ｗ／ｖ％の量で存在するβ−アラニン、及び約０．１〜約５ｗ／ｖ％量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む。好ましい実施形態では、β−アラニンは約０．５ｗ／ｖ％の量で存在し、トリアルキルアンモニウム塩はトリエチルアンモニウムヒドロクロリドであり、約０．１ｗ／ｖ％の量で存在する。
【００３０】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも５０ｗ／ｖ％のトレハロース、ＢＭＰ、約１〜約５ｗ／ｖ％の量で存在するラフィノース、及び約０．１〜約３ｗ／ｖ％量で存在するミオイノシトールを含む。好ましい実施形態では、ラフィノースは約３ｗ／ｖ％の量で存在し、ミオイノシトールは約１ｗ／ｖ％の量で存在する。
【００３１】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも５０ｗ／ｖ％のトレハロース、ＢＭＰ、約０．２５〜約５ｗ／ｖ％の量で存在するβ−アラニン、約０．１〜約５ｗ／ｖ％の量で存在するトリエチルアンモニウムヒドロクロリド、約０．１〜約３ｗ／ｖ％の量で存在するＬ−プロリン、及び約０．１〜約３ｗ／ｖ％の量で存在するアスパラギン酸カリウムを含む。好ましい実施形態では、β−アラニンは約０．５ｗ／ｖ％の量で存在し、トリエチルアンモニウムヒドロクロリドは約１ｗ／ｖ％の量で存在し、Ｌ−プロリンは約０．５ｗ／ｖ％の量で存在し、アスパラギン酸カリウムは約０．５ｗ／ｖ％の量で存在する。
【００３２】
以下の実施例は、いくつかの種々の実施形態及び本発明の効果を例示するが、当業者は、本発明の範囲及び目的から逸脱することなく、他の類似の実施形態を作製できることを理解するであろう。
【実施例】
【００３３】
実施例１：バルクトレハロース６０ｗ／ｖ％溶液の調製：１６５．７８ｇのトレハロース二水和物（ＭＷ  ３７８．３４）を注意深く計量し、２５０ｍＬの大きさのきれいな溶液測定用フラスコに移し、それに１ｍｍｏｌのＨＣｌを、印のすぐ下までゆっくりと添加した。混合物を振盪により十分混合し、６０℃の温水中で加温した。更に１ｍｍｏｌのＨＣｌを添加することにより容積を２５０ｍＬにし、全ての結晶を完全に溶解させ、次いで溶液を０．２μｍのフィルタを通して濾過した。この溶液を、製剤の調製に用いた。類似の方法で、５０％トレハロース溶液を用いて、製剤３２及び３６の５０ｗ／ｖ％溶液を作製した。
【００３４】
実施例２：本発明の組成物の調製の非限定的な例は以下の通りである（製剤番号１９）：１６５．７８ｇのトレハロース二水和物（ＭＷ  ３７８．３４）を注意深く計量し、きれいな２５０ｍＬの溶液測定用フラスコに移し、それに１ｍｍｏｌのＨＣｌを、印のすぐ下までゆっくりと添加して、６０ｗ／ｖ％溶液を作製した。混合物を振盪により十分混合し、６０℃の温水中で加温した。更に１ｍｍｏｌのＨＣｌを添加することにより容積を印まで増やし、トレハロースの結晶を全て完全に溶解させ、次いで溶液を０．２２μｍのフィルタを通して濾過した。１０ｍＬの６０％トレハロース溶液に、５１ｍｇのβ−アラニン、及び１０ｍｇのタウリンを添加した。混合物をかき混ぜ、それに、溶液中の１０００μｇ（１ｍｇ）のｒｈＧＤＦ−５を添加した。製剤のタンパク質濃度を紫外線により測定し、所望の濃度が達成されていることを保証し、必要に応じて溶媒又はタンパク質を添加することにより調整した。
【００３５】
実施例３：好ましい実施形態では、本発明の製剤を以下のように調製した（製剤番号２１）：１６５．７８ｇのトレハロース二水和物（ＭＷ  ３７８．３４）を注意深く計量し、２５０ｍＬの大きさのきれいな溶液測定用フラスコに移し、それに１ｍｍｏｌのＨＣｌを、印のすぐ下までゆっくりと添加して、６０ｗ／ｖ％溶液を作製した。混合物を振盪により十分混合し、６０℃の温水中で加温した。更に１ｍｍｏｌのＨＣｌを添加することにより容積を印まで増やし、トレハロースの結晶を全て完全に溶解させ、次いで溶液を０．２２μｍのフィルタを通して濾過した。１０ｍＬの６０％トレハロース溶液に、５０ｍｇのβ−アラニン、及び１０ｍｇのトリエチルアンモニウムヒドロクロリド（ＴＥＡ）を添加した。混合物をかき混ぜ、それに、溶液中の１０００μｇ（１ｍｇ）のｒｈＧＤＦ−５を添加した。製剤のタンパク質濃度を紫外線により測定し、所望の濃度が達成されていることを保証し、必要に応じて溶媒又はタンパク質を添加することにより調整した。
【００３６】
実施例４：好ましい実施形態では、本発明の製剤を以下のように調製した（製剤番号３２）：５５．２７ｇのトレハロース二水和物（ＭＷ  ３７８．３４）を注意深く計量し、１００ｍＬの大きさのきれいな溶液測定用フラスコに移し、それに１ｍｍｏｌのＨＣｌを、印のすぐ下までゆっくりと添加して、５０ｗ／ｖ％溶液を作製した。混合物を振盪により十分混合し、６０℃の温水中で加温した。更に１ｍｍｏｌのＨＣｌを添加することにより容積を印まで増やし、トレハロースの結晶を全て完全に溶解させ、次いで溶液を０．２２μｍのフィルタを通して濾過した。１０ｍＬの５０％トレハロース溶液に、５０ｍｇのベタインを添加した。混合物をかき混ぜ、それに、溶液中の１０００μｇ（１ｍｇ）のｒｈＧＤＦ−５を添加した。製剤のタンパク質濃度を紫外線により測定し、所望の濃度が達成されていることを保証し、必要に応じて溶媒又はタンパク質を添加することにより調整した。
【００３７】
用いた材料及び設備
１．１  トレハロース二水和物、フェロ−ファンスチエール（Ferro-Pfanstiehl）＃Ｔ−１０４−１−ＭＣ
１．２  グリシン、超高純度等級、Ｊ．Ｔ．ベーカー（Baker）＃４０５９−００
１．３  β−アラニン、９９％、アルドリッチ（Aldrich）＃２３９７２０
１．４  １２Ｍ  ＨＣｌ、ＥＭサイエンス（EM Science）＃ＨＸ０６０３Ｐ／５（濃縮貯蔵試薬）
１．５  トリメチルアミンＮ−オキシド二水和物（ＴＭＡＯ）、シグマ（Sigma）＃Ｔ０５１４
１．６  トリメチルアンモニウムヒドロクロリド（ＴＭＡ）、９８％、アルドリッチ（Aldrich）＃Ｔ７２７６１
１．７  トリエチルアンモニウムヒドロクロリド（ＴＥＡ）、フルカ（Fluka）＃９０３５０
１．８  タウリン、９９％、シグマ（Sigma）＃Ｔ０６２５
１．９  ベタイン、シグマ（Sigma）＃Ｂ３５０１
１．１０  ミオイノシトール、９９％、シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich）＃１５１２５
１．１１  Ｄ−（＋）−ラフィノース五水和物、９８％、シグマ（Sigma）＃Ｒ０２５０
１．１２  ＨＳＰ７０、シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich）＃Ｈ７２８３−１ＭＧ
１．１３  濾過ユニット、２５０ｍＬ、０．２２マイクロメートル膜、ナルジーン（Nalgene）＃５６８−００２０
１．１４  無菌、２５０ｍＬ、正方形ＰＥＴＧ媒質瓶、ナルジーン（Nalgene）＃２０１９−０２５０
１．１５  ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計、ベックマン−カウンター（Beckman-Coulter）ＤＵ８００、ＩＤ＃４９４２０３
１．１６  ｒｈＧＤＦ−５：使用前に２〜８℃で解凍する
１．１７  注入用の水、バクスター（Baxter）＃２Ｂ０３０６
１．１８  ｒｐ−ＨＰＬＣ：ウォーターズ（Waters）モデル２５９６、バイダック（Vydac）２１８ＴＰ５２、Ｃ１８カラム、０．３ｍＬ／分にて水中の０．１５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ及びアセトニトリル中の０．１５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡで溶出された。溶出されたピークは、２１４ｎｍでモニタした。
１．１９  ＳＥＣ：ウォーターズ（Waters）モデル２５９６、トーソー・バイオサイエンス（TOSOH Bioscience）カタログ番号０８５４０、０．５ｍＬ／分にて水中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ及び４５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで溶出タンパク質のピークは２８０ｎｍでモニタした。
【００３８】
上記実施例で記載した方法に類似の方法で、表１に列挙した製剤を調製した。製剤は、ｒｐ−ＨＰＬＣにより、またいくつかの選択サンプルではＳＥＣにより特徴付けたとき、高温で長期間にわたってｒｈＧＤＦ−５タンパク質分子を安定化する能力について評価した。
【００３９】
〔実施態様〕
（１）  酸性溶液中のＧＤＦ−５と、６０ｗ／ｖ％のトレハロースと、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール及びアスパラギン酸カリウムからなる群から選択される少なくとも１種の追加の賦形剤と、を含む、組成物。
（２）  前記アミノ酸が、β−アラニン、Ｌ−グリシン、及びＬ−プロリンからなる群から選択される、実施態様１に記載の組成物。
（３）  前記アミノ酸が、約０．２５〜約５ｗ／ｖ％の量で存在するβ−アラニンを含む、実施態様２に記載の組成物。
（４）  前記β−アラニンが０．５ｗ／ｖ％の量で存在する、実施態様３に記載の組成物。
（５）  前記少なくとも１種の追加の賦形剤が、約０．１〜約３ｗ／ｖ％の量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む、実施態様１に記載の組成物。
（６）  前記トリアルキルアンモニウム塩が、トリエチルアンモニウムヒドロクロリドである、実施態様５に記載の組成物。
（７）  前記少なくとも１種の追加の賦形剤が、約０．２５〜約５ｗ／ｖ％の量で存在するアミノ酸、及び、約０．１〜約３ｗ／ｖ％の量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む、実施態様１に記載の組成物。
（８）  前記少なくとも１種の追加の賦形剤が、約０．５ｗ／ｖ％の量で存在するβ−アラニン、及び、約０．１ｗ／ｖ％の量で存在するトリエチルアンモニウムヒドロクロリドを含む、実施態様７に記載の組成物。
（９）  前記熱ショックタンパク質が、約０．１〜約０．２ｗ／ｖ％の量で存在するＨＳＰ７０である、実施態様１に記載の組成物。
（１０）  前記少なくとも１種の追加の賦形剤が、約０．５ｗ／ｖ％の量で存在するβ−アラニン、及び、約０．１ｗ／ｖ％の量で存在するタウリンを含む、実施態様１に記載の組成物。
（１１）  前記追加の賦形剤が、約０．５ｗ／ｖ％の量で存在するベタインである、実施態様１に記載の組成物。
（１２）  酸性溶液中のＧＤＦ−５を提供することと、ある量のトレハロースを添加して、６０ｗ／ｖ％のトレハロース溶液を提供することと、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール及びアスパラギン酸カリウムからなる群から選択される少なくとも１種の追加の賦形剤を添加することと、を含む、ＧＤＦ−５溶液を安定化する方法であって、前記ＧＤＦ−５溶液は、クロマトグラフィーによる、タンパク質のメインピークの少なくとも８０％の保存により証明されるように、３７℃以下の温度で少なくとも３０日間安定化される、方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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