(57)【要約】本発明は、概して免疫グロブリンの医薬製剤分野に関する。具体的には、本発明は、安定した、凍結乾燥された高濃度の免疫グロブリン製剤に関する。本発明は、組換えヒト化抗α４インテグリン抗体であるナタリズマブの安定化された凍結乾燥製剤によって例示される。
2010530003.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性製剤を凍結乾燥することによって調製される安定した凍結乾燥製剤であって、前記水性製剤は、
（ａ）約２０ｍｇ／ｍｌ〜約８０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブと、
（ｂ）約５．５〜約６．５のｐＨを有する緩衝液と、
（ｃ）約２０ｍｇ／ｍｌ〜約８０ｍｇ／ｍｌのショ糖と、
（ｄ）約０．０２〜約０．０８％のポリソルベートと、を含む、
安定した凍結乾燥製剤。
【請求項２】
前記水性製剤は、約３０ｍｇ／ｍｌ〜約８０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブを含む、請求項１に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項３】
前記水性製剤は、約４０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブを含む、請求項２に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項４】
前記緩衝液は、約６．０のｐＨを有する、請求項１に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項５】
前記緩衝液は、ヒスチジンである、請求項１に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項６】
前記ヒスチジンは、約１ｍＭ〜約１２ｍＭの濃度で前記水性製剤中に存在する、請求項５に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項７】
前記ヒスチジンは、約６ｍＭの濃度で前記水性製剤中に存在する、請求項６に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項８】
前記ショ糖は、約２０ｍｇ／ｍｌ〜約８０ｍｇ／ｍｌの濃度で前記水性製剤中に存在する、請求項１に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項９】
前記ショ糖は、約４１ｍｇ／ｍｌの濃度で前記水性製剤中に存在する、請求項８に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項１０】
前記ポリソルベートは、ポリソルベート８０である、請求項１に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項１１】
前記ポリソルベート８０は、約０．０２％〜約０．０８％の濃度で前記水性製剤中に存在する、請求項１０に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項１２】
前記ポリソルベート８０は、約０．０４％の濃度で前記水性製剤中に存在する、請求項１１に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項１３】
前記水性製剤中のナタリズマブ対ショ糖の重量比は、約０．５：１〜約２：１である、請求項１に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項１４】
前記水性製剤中のナタリズマブ対ショ糖の重量比は、約１：１である、請求項１３に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項１５】
前記水性製剤中のショ糖対ナタリズマブのモル比は、約３００：１〜約５００：１である、請求項１に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項１６】
前記水性製剤中のショ糖対ナタリズマブのモル比は、約４００：１〜約５００：１である、請求項１５に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項１７】
前記水性製剤中のショ糖対ナタリズマブのモル比は、約４５０：１である、請求項１６に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項１８】
前記水性製剤は、膨張性薬剤をさらに含む、請求項１に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項１９】
前記水性製剤は、張性調節剤をさらに含む、請求項１に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項２０】
前記水性製剤は、
（ａ）約４０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブと、
（ｂ）約６ｍＭのヒスチジン（ｐＨ約６．０）と、
（ｃ）約４１ｍｇ／ｍｌのショ糖と、
（ｄ）約０．０４％のポリソルベート８０と、を含む、
請求項１に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項２１】
（ｉ）約８０〜約１６０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブと、
（ｉｉ）約６．０のｐＨの約１８ｍＭのヒスチジンと、
（ｉｉｉ）約１２３ｍｇ／ｍｌのショ糖と、
（ｉｖ）約０．１２％のポリソルベート８０と、を含む、安定した再構成製剤であって、前記再構成製剤は、
（ａ）約４０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブと、
（ｂ）約６ｍＭのヒスチジン（ｐＨ約６．０）と、
（ｃ）約４１ｍｇ／ｍｌのショ糖と、
（ｄ）約０．０４％のポリソルベート８０と、を含む、水性製剤を凍結乾燥することによって調製される安定した凍結乾燥製剤から調製されている、再構成製剤。
【請求項２２】
前記安定した再構成製剤は、約１２０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブを含む、請求項２１に記載の安定した再構成製剤。
【請求項２３】
（ａ）約３０〜約６０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブと、
（ｂ）約５．５〜約６．５のｐＨを有する緩衝液と、
（ｃ）約２０〜約５０ｍｇ／ｍｌのショ糖と、
（ｄ）約０．０２〜約０．０８％のポリソルベートと、を含む、
水性製剤を凍結乾燥することによって調製されている凍結乾燥製剤を再構成する工程を含む、安定した再構成製剤を調製するための方法。
【請求項２４】
前記水性製剤は、約４０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２５】
前記水性製剤は、約４０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２６】
前記緩衝液は、約６．０のｐＨを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記緩衝液は、ヒスチジンである、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
前記ヒスチジンは、約１ｍＭ〜約１２ｍＭの濃度で前記水性製剤中に存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヒスチジンは、約６ｍＭの濃度で前記水性製剤中に存在する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３０】
前記ショ糖は、約２０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で前記水性製剤中に存在する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記ショ糖は、約４０ｍｇ／ｍｌの濃度で前記水性製剤中に存在する、請求項３１に記載の安定した凍結乾燥製剤。
【請求項３２】
前記ポリソルベートは、ポリソルベート８０である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリソルベート８０は、約０．０２％〜約０．０８％の濃度で前記水性製剤中に存在する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリソルベート８０は、約０．０４％の濃度で前記水性製剤中に存在する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記水性製剤中のナタリズマブ対ショ糖の重量比は、約０．５：１〜約２：１である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記水性製剤中のナタリズマブ対ショ糖の重量比は、約１：１である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記水性製剤中のショ糖対ナタリズマブのモル比は、約３００：１〜約５００：１である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
前記水性製剤中のショ糖対ナタリズマブのモル比は、約４００：１〜約５００：１である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記水性製剤中のショ糖対ナタリズマブのモル比は、約４５０：１である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記水性製剤は、膨張性薬剤をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項４１】
前記水性製剤は、張性調節剤をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項４２】
前記水性製剤は、
（ａ）約４０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブと、
（ｂ）約６ｍＭのヒスチジン（ｐＨ約６．０）と、
（ｃ）約４１ｍｇ／ｍｌのショ糖と、
（ｄ）約０．０４％のポリソルベート８０と、を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
対象を治療するための方法であって、前記対象に請求項２３に記載の治療有効量の安定した再構成製剤を投与する工程を含み、前記対象は、ナタリズマブを投与することによって治療され得る疾患を有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年６月１４日出願の米国特許仮出願第６０／９２９，１３３号、および２００８年６月１２日出願の米国出願公開第１２／１３８，０７５号に対して、合衆国法典第３５巻第１１９条に基づく優先権を主張し、その全体の内容は、参照としてその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、概して免疫グロブリンの医薬製剤分野に関する。具体的には、本発明は、安定した、凍結乾燥された高濃度の免疫グロブリン製剤に関する。本発明は、組換えヒト化抗α４インテグリン抗体であるナタリズマブの安定化された凍結乾燥製剤によって例示される。
【背景技術】
【０００３】
ヒトへの投与を意図した薬剤調製物は、調製物の使用前の薬物の変化を防止するための安定剤を必要とし得る。タンパク質は、従来の有機および無機薬物より大きく、より複雑であるため（すなわち、タンパク質は複雑な三次元構造に加え、複数の官能基を有する）、タンパク質製剤は特別な問題が生じている。タンパク質の分解経路には、化学的不安定性（新しい化学物質がもたらされる結合形成または切断によるタンパク質の修飾を伴う任意のプロセス）、または物理的不安定性（タンパク質のより高次の構造における変化）を伴い得る。化学的不安定性は、アミド分解、ラセミ化、加水分解、酸化、β脱離、またはジスルフィド交換から生じ得る。物理的不安定性は、例えば変性、凝集、沈殿、または吸着から生じ得る。多くのタンパク質調製物は、非常に薄いまたは高濃度の溶液中で特に不安定であり、タンパク質調製物が保管あるいは出荷される際、しばしばこの不安定性が増す。したがって、タンパク質薬物分野において存在する大きな問題は、タンパク質の安定性および活性の両方を維持する製剤の開発にある。
【０００４】
モノクローナル抗体を含む抗体は、製剤中のそれらの挙動および有効性に関連して、全て互いに様々に異なる。例えば、モノクローナル抗体は、等電点、溶解度、およびモノクローナル抗体が凝集する条件に関して互いに異なる。タンパク質は、製剤中のそれらの挙動および有効性に関して互いに異なり、ある製剤が特定の抗体に対して安定しているかどうかの予測を困難にする。タンパク質製剤における一般的な３つの課題には、タンパク質分解、凝集、アミド分解、および酸化が含まれる。さらに、製剤の安定性に影響を及ぼす多くの異なる反応が同時に生じ、どの反応がどの結果を引き起こしているのかの判断を困難にする。Ｃｌｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，“Ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｃｌｏｓｅ  Ｌｏｏｋ  ａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ”，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１０（４）：３０７−３７７（１９９３）（非特許文献１）を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１０（４）：３０７−３７７（１９９３）
【発明の概要】
【０００６】
具体的には、本発明は、安定した、凍結乾燥された高濃度の免疫グロブリン製剤に関する。本製剤の調製には、予備凍結乾燥水性製剤の調製、乾燥凍結工程、および再構成工程を含む、３つの工程が存在する。
【０００７】
本発明は、水性製剤を凍結乾燥することによって調製される安定した凍結乾燥製剤を対象とし、水性製剤は、緩衝液、ポリソルベート、およびショ糖中の約４０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリンを含有する。本発明の好ましい実施形態において、予備凍結乾燥水性製剤は、（ａ）約３０ｍｇ／ｍｌ〜約６０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブと、（ｂ）約５．５〜約６．５のｐＨを有する緩衝液と、（ｃ）約２０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌのショ糖と、（ｄ）約０．０２％〜約０．０８％のポリソルベートと、を含有する。より好ましい実施形態において、予備凍結乾燥水性製剤は、（ａ）約４０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブと、約６ｍＭのヒスチジン（ｐＨ約６．０）と、約４１ｍｇ／ｍｌのショ糖と、（ｄ）約０．０４％のポリソルベート８０と、を含有する。
【０００８】
凍結乾燥製剤は、免疫グロブリンの安定性を保持し、ヒト対象への投与を意図した免疫グロブリンが、最終生成物において凝集物および／または微粒子を形成するのを防止する。本凍結乾燥製剤は、室温で少なくとも３ヶ月間、好ましくは６ヶ月間、より好ましくは１年間安定である。また、凍結乾燥製剤は、１年間、好ましくは２年間、２〜８℃で安定である。本凍結乾燥製剤は、１０分未満の短い再構成時間を有し、再構成後は筋肉内、皮下、静脈内、または腹腔内注射等の非経口投与に好適である。
【０００９】
凍結乾燥製剤は、液体により、約８０〜１６０ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリン濃度を含有する透明な溶液に再構成される。好ましい実施形態において、再構成製剤は、（ｉ）約８０ｍｇ／ｍｌ〜約１６０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブと、（ｉｉ）約６．０のｐＨの約１８ｍＭのヒスチジンと、（ｉｉｉ）約１２３ｍｇ／ｍｌのショ糖と、（ｉｖ）約０．１２％のポリソルベート８０とを含有する。より好ましい実施形態において、再構成製剤は、約１２０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブを含有する。
【００１０】
本発明の予備凍結乾燥製剤は、適切な乾燥パラメータを使用して凍結乾燥することができる。約−２５℃の一次乾燥相温度および約８０ｍＴｏｒｒ〜約１２０ｍＴｏｒｒの圧力、ならびに約２０℃の二次乾燥相および約８０ｍＴｏｒｒ〜１２０ｍＴｏｒｒの圧力の乾燥パラメータが好ましい。
本発明は、再構成製剤の作製および使用方法をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】３０℃における高分子量種の形成を示す。
【図２】４０℃における高分子量種の形成を示す。
【図３】予備凍結乾燥溶液中の、３０℃における低分子量種の形成を示す。
【図４】予備凍結乾燥溶液中の、４０℃における低分子量種の形成を示す。
【図５】高分子量種および低分量種の両方の形成による、５℃におけるモノマーの総消失率を示す。
【図６】高分子量種および低分量種の両方の形成による、３０℃におけるモノマーの総消失率を示す。
【図７】高分子量種および低分量種の両方の形成による、４０℃におけるモノマーの総消失率を示す。
【図８】５℃における凍結乾燥製剤中のモノマーの経時的消失を示す。
【図９】３０℃における凍結乾燥製剤中のモノマーの経時的消失を示す。
【図１０】４０℃における凍結乾燥製剤中のモノマーの経時的消失を示す。
【図１１】３０℃における、各製剤に対する低分子量種の形成を示す。
【図１２】４０℃における、各製剤に対する低分子量種の形成を示す。
【図１３】予備凍結乾燥製剤中の、４０℃における高分子量種の形成を示す。
【図１４】５℃における凝集物の形成によるモノマーの消失を示す。
【図１５】３０℃における凝集物の形成によるモノマーの消失を示す。
【図１６】４０℃における凝集物の形成によるモノマーの消失を示す。
【図１７】４０℃における予備凍結乾燥試料中の高分子量種の形成を示す。
【図１８】４０℃における予備凍結乾燥試料中の低分子量種の形成を示す。
【図１９】高分子量種および低分量種の両方の形成による、４０℃におけるモノマーの総消失率を示す。
【図２０】４０℃における再構成時間を示す。
【図２１】４０℃における凍結乾燥試料中の高分子量種の形成を示す。
【図２２】４０℃における凍結乾燥試料中の低分子量種の形成を示す。
【図２３】高分子量種および低分量種の両方の形成による、４０℃におけるモノマーの総消失率を示す。
【図２４】（Ａ）は５℃における予備凍結乾燥試料中の高分子量種の形成を示す。（Ｂ）は５℃における予備凍結乾燥試料中の低分子量種の形成を示す。（Ｃ）は５℃における予備凍結乾燥試料中のモノマーの消失を示す。
【図２５】４０℃における凍結乾燥試料中の高分子量種の形成を示す。
【図２６】（Ａ）は再構成試料中の、４０℃における高分子量種の形成を示す。（Ｂ）は再構成試料中の、４０℃における低分子量種の形成を示す。（Ｃ）は再構成試料中の、４０℃におけるモノマーの消失を示す。（Ｄ）は再構成時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．定義
本明細書で使用されるとき、「免疫グロブリン」という用語には、抗体および抗体断片（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｃ、（Ｆａｂ’）２等）、ならびに抗体の他の遺伝子操作された部分が含まれるが、それらに限定されない。その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要なクラスがある。これらのうちのいくつかは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ならびにＩｇＡｌおよびＩｇＡ２等の、サブクラス（アイソタイプ）にさらに分割することができる。
【００１３】
「抗体」という用語は、最も広義の意味において使用され、具体的には、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、モノクローナル抗体（作動薬および拮抗薬抗体を含む）、ポリエピトープに特異性がある抗体組成物、および抗体断片（例えばＦａｂ、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ、およびＦｖ）を対象とする。「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、霊長類化抗体、および遺伝子操作を介して生成される他の抗体を含むことを意図する。
【００１４】
本明細書で使用されるとき、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の固体群から得られる抗体を指し、すなわち、その個体群を構成する個々の抗体が、少量で存在し得る可能性がある自然発生的な一時変異またはグリコシル化変異形を除いて同一である。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な個体群から得られるという抗体の性質を表し、いずれかの特定の方法による抗体の生成を必要すると解釈されるものではない。また、「モノクローナル抗体」という用語には、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、一方鎖の残りの部分は、別の種に由来するまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびにそれらが所望の生物学的活性を呈する限りそのような抗体の断片における、対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）も含まれる。非ヒト（例えばマウス、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ等）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合サブ配列等）である。
【００１５】
「ナタリズマブ」という用語は、ＡＮ１００２２６（抗体コード番号）としても知られる抗体を指し、ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）（商標名、正式にはアンテグレン（登録商標））中の活性成分である。「ナタリズマブ」という用語は、米国一般名（ＵＳＡＮ）（医薬用物質に与えられる正式な非専売名または一般名）である。ナタリズマブは、組換えヒト化抗α４インテグリン抗体である。ナタリズマブは、ＩｇＧ４抗体である。参照として組み込まれる米国特許第５，８４０，２９９号は、日常的な合成および分子生物学的方法を用いた、ナタリズマブを含む組換えヒト化抗α４インテグリン抗体の作製方法を記述している。
【００１６】
「凍結乾燥」、「凍結乾燥された」、および「フリーズドライされた」という用語は、乾燥する材料をまず凍結し、次いで真空環境中で昇華により氷または凍結した溶媒を除去するプロセスを指す。保管時に凍結乾燥された生成物の安定性を高めるために、１つ以上の賦形剤を予備凍結乾燥製剤に含むことができる。
「医薬製剤」という用語は、活性成分が有効であることを可能にする形態にあり、該製剤が投与される対象にとって毒性のあるさらなる成分を含有しない調製物を指す。
【００１７】
「薬剤として許容される」賦形剤（媒体、添加物）とは、用いられる有効用量の活性成分を提供するために対象哺乳動物に合理的に投与することができるものである。
「再構成時間」とは、凍結乾燥製剤を溶液で粒子を含まない透明な溶液に再水和するために必要とされる時間である。
【００１８】
「安定した」製剤とは、その中のタンパク質が、保管時にその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を本質的に保持するものである。タンパク質の安定性を測定するための種々の分析技術が当技術分野において利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）、およびＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）に概説される。安定性は、選択される時間の間、選択される温度で測定することができる。
【００１９】
「安定した」凍結乾燥免疫グロブリン製剤とは、冷蔵温度（２〜８℃）で少なくとも１２ヶ月間、好ましくは２年間、より好ましくは３年間、または室温（２３〜２７℃）で少なくとも３ヶ月間、好ましくは６ヶ月間、より好ましくは１年間、有意な変化が観察されない凍結乾燥された抗体製剤である。安定性の基準は、以下の通りである。ＳＥＣ−ＨＰＬＣで測定される抗体モノマーの１０％以下が分解される。好ましくは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで測定される抗体モノマーの５％以下が分解される。再水和された溶液は、視覚分析で無色、または透明〜わずかに乳白色の間である。製剤の濃度、ｐＨ、および重量モル浸透圧濃度は、＋／−１０％以下の変化を有する。効力は、対照の７０〜１３０％以内、好ましくは８０〜１２０％以内である。１０％以下のクリッピングが観察される。好ましくは、５％以下のクリッピングが観察される。１０％以下の凝集が形成される。好ましくは、５％以下の凝集が形成される。
【００２０】
免疫グロブリンは、色および／または透明度の目視検査時に、あるいはＵＶ光散乱、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、および動的光散乱によって測定される、凝集、沈殿、および／または変性に有意な増加が示されなければ、医薬製剤中で「物理的安定性を保持する」。タンパク質高次構造の変化は、タンパク質三次構造を決定する蛍光分光法、およびタンパク質二次構造を決定するＦＴＩＲ分光法によって、評価することができる。
【００２１】
免疫グロブリンは、有意な化学的変質を示さなければ、医薬製剤中で「化学的安定性を保持する」。化学的安定性は、タンパク質の化学的に変質した形態を検出および定量化することにより判断することができる。しばしばタンパク質の化学構造を変質する分解プロセスには、加水分解またはクリッピング（サイズ排除クロマトグラフィおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の方法によって評価される）、酸化（質量分析法またはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＭＳを併用するペプチドマッピング等による方法によって評価される）、アミド分解（イオン交換クロマトグラフィ、キャピラリー等電点電気泳動、ペプチドマッピング、イソアスパラギン酸の測定等の方法によって評価される）、ならびに異性化（イソアスパラギン酸含有量の測定、ペプチドマッピング等によって評価される）が挙げられる。
【００２２】
免疫グロブリンは、所定の時点の免疫グロブリンの生物学的活性が、医薬製剤が調製された時点において呈される生物学的活性の所定の範囲内である場合、医薬製剤中で「その生物学的活性を保持する」。免疫グロブリンの生物学的活性は、例えば抗原結合検定によって決定することができる。
【００２３】
「等張の」という用語は、該当する製剤がヒト血液と本質的に同一である浸透圧を有することを意味する。等張製剤は、概して約２７０〜３２８ｍＯｓｍの浸透圧を有する。わずかに低張な圧力は２５０〜２６９ｍＯｓｍであり、わずかに高張な圧力は３２８〜３５０ｍＯｓｍである。浸透圧は、例えば蒸気圧、または氷凍結型の浸透圧計を使用して測定することができる。
【００２４】
「緩衝液」という用語は、凍結乾燥前に溶液のｐＨを許容可能な範囲に維持する薬剤を包含し、ヒスチジン、コハク酸塩（ナトリウムまたはカリウム）、リン酸塩（ナトリウムまたはカリウム）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ジエタノールアミン、クエン酸塩（ナトリウム）、グルコン酸塩、および他の有機酸緩衝液が挙げられる。
【００２５】
「張性調節剤」には、浸透圧を調節するために使用することができるＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２等の塩が挙げられる。さらに、凍結保護剤（ｃｒｙｐｒｏｔｅｃａｎｔ）、溶解保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、および／またはショ糖、マンニトール、グリシン等の膨張性薬剤が、張性調節剤として機能し得る。
【００２６】
本発明の文脈において、免疫グロブリンの「治療有効量」とは、免疫グロブリンが有効である治療に対して、疾患の予防または治療に有効な量を指す。「疾患」とは、免疫グロブリンを用いた治療から利益を得るであろう任意の状態である。これには、哺乳動物を問題の疾患に罹患しやすくする病態を含む、慢性および急性の疾患または疾病が含まれる。好ましくは、疾患とは、ナタリズマブ等のα４インテグリンを認識して結合する免疫グロブリンによって治療および／または予防され得るものである。
【００２７】
「治療」とは、療法的治療、および予防または阻止措置の両方を指す。治療を必要とする者には、すでに疾患を有する者、ならびに疾患が予防されるべき者が挙げられる。
【００２８】
「保存料」とは、製剤中に含むことができ、その中の細菌作用を本質的に減少させ、これにより例えば多用途製剤の生成を促進する化合物である。可能性のある保存料の例には、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、および塩化ベンゼトニウムが挙げられる。保存料の他の種類には、フェノール、ブチル、およびベンジルアルコール等の芳香族アルコール類、メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン類、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールが挙げられる。
【００２９】
「患者」または「対象」という用語は、任意の哺乳動物を含むことを意図する。「哺乳動物」は、治療を目的とする、哺乳動物として分類される任意の動物を指し、ヒト、家畜、および飼育動物、ならびにイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等の動物園、運動競技用、または愛玩動物を含むが、それらに限定されない。好ましくは、哺乳動物はヒトである。好ましくは、哺乳動物において治療される疾病または状態とは、治療有効用量のナタリズマブが投与されると調子が和らげられるものである。
【００３０】
２．免疫グロブリン製剤
本発明の組成物は、凝集物および微粒子の形成を最小限に抑え、確実に溶液中の免疫グロブリンが長期間その免疫反応性を維持するようにする。該組成物は、中性または酸性ｐＨ（約５．５〜約６．５）を有する緩衝液中の免疫グロブリン、ショ糖、およびポリソルベートを含有する予備凍結乾燥水性製剤から調製される、無菌の薬剤として許容される凍結乾燥製剤を含む。
【００３１】
好ましい実施形態において、免疫グロブリンは、約３０〜約６０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約４０〜約５０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約４０ｍｇ／ｍｌの濃度で予備凍結乾燥製剤中に存在する。好ましい免疫グロブリンは、ＩｇＧ抗体、より好ましくはＩｇＧ４抗体、さらに好ましくはヒト化組換えＩｇＧ４抗体、最も好ましくはナタリズマブである。
【００３２】
予備凍結乾燥製剤中では、ｐＨ約５．５〜約６．５の緩衝液が使用される。好ましくは、ｐＨは約６．０である。好適な緩衝液の例には、ヒスチジン、コハク酸塩（コハク酸ナトリウム等）、グルコン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸緩衝液が挙げられる。好ましい予備凍結乾燥製剤は、ヒスチジン、好ましくは約１〜約１２ｍＭのヒスチジンを含有する。さらに好ましい予備凍結乾燥製剤は、約６ｍＭのヒスチジンを含有する。
【００３３】
また、予備凍結乾燥製剤はショ糖も含有する。ショ糖の好適な濃度は、約２０〜約５０ｍｇ／ｍｌの範囲内、好ましくは約４１ｍｇ／ｍｌである。
また、予備凍結乾燥製剤は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０（すなわちそれぞれＴｗｅｅｎ２０およびＴｗｅｅｎ８０）、およびポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）等のポリソルベートも含有する。好ましい実施形態において、ポリソルベートはポリソルベート８０である。ポリソルベートは、好ましくは約０．０２〜約０．０８％、より好ましくは約０．０４％の重量／容積濃度で存在する。
【００３４】
予備凍結乾燥製剤中の免疫グロブリン対ショ糖の重量比は、好ましくは約２：１〜約０．５：１の範囲内、より好ましくは約１：１である。免疫グロブリン対ショ糖のモル比は、約３００：１〜約５００：１、好ましくは約４００：１〜５００：１、より好ましくは約４５０：１である。
【００３５】
セリン、グリシン、およびマンニトール等の良好な凍結乾燥ケーキ特性を提供する膨張性薬剤を、本組成物に任意選択的に添加することができる。また、これらの薬剤は製剤の張性に寄与し、凍結融解プロセスに対して保護を提供し、長期的安定性を改善し得る。さらに、張性調節剤を製剤に添加して、浸透圧を調節することができる。製剤は、１つ以上の保存料をさらに含有し得る。
【００３６】
好ましい予備凍結乾燥製剤とは、約４０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブ、約６ｍＭのヒスチジン（ｐＨ約６）、約０．０４％のポリソルベート８０、および約４１ｍｇ／ｍｌのショ糖を含有する製剤である。上記の予備凍結乾燥製剤は凍結乾燥されて乾燥かつ安定した粉末を形成し、これはヒトへの投与に好適な粒子を含まない溶液に容易に再構成され得る。
【００３７】
凍結乾燥は、その生物学的活性を保存するために医薬生成物の調製においてしばしば使用されるフリーズドライプロセスである。液体組成物を調製し、次いで凍結乾燥させて、乾燥したケーキ状の生成物を形成する。該プロセスは、概して、氷を除去するために真空中で予め凍らせた試料を乾燥させ、非水成分を損なわずに、粉末状またはケーキ状の物質の形態に残す工程を伴う。凍結乾燥された生成物は、生物学的活性を消失することなく、長期に渡りかつ高温で保管することができ、適切な希釈剤を添加することにより、粒子を含まない溶液に容易に再構成することができる。適切な希釈剤は、生物学的に許容可能であり、凍結乾燥粉末が完全に溶解できる任意の液体であり得る。水、特に無菌の発熱物質を含まない水は、抗体の安定性に影響を及ぼし得る塩または他の化合物を含まないため、好ましい希釈剤である。凍結乾燥の利点は、含水量が、長期保管時の生成物の不安定性につながる種々の分子事象を大幅に減少する程度まで減少されることである。また、凍結乾燥された生成物は、出荷の物理的刺激を容易に耐えることができる。再構成された生成物は粒子を含まず、したがって事前に濾過せずに投与することができる。
【００３８】
本発明の予備凍結乾燥製剤は、適切な凍結および乾燥パラメータを使用して凍結乾燥することができる。例えば、パラメータには、約１０〜３０分間、約１０℃〜約−１０℃を保持する予備凍結が含まれ得る。凍結パラメータには、約４５分〜約７５分の間に渡って−５０℃〜−７０℃の凍結が含まれ得る。さらなる凍結工程のためのパラメータには、−４０℃〜約−６０℃における凍結が含まれ得る。乾燥パラメータには、約−１０℃〜−３０℃、約４０ｍＴｏｒｒ〜約１２０ｍＴｏｒｒの圧力の一次乾燥相温度、ならびに約４０ｍＴｏｒｒ〜１２０ｍＴｏｒｒの圧力を用いる約１０℃〜約２５℃における二次乾燥相が含まれ得る。好ましい総周期時間は、約６０〜１００時間である。好ましい凍結乾燥周期には、予備凍結工程、凍結工程、一次乾燥工程、および二次乾燥工程が含まれ得る。凍結乾燥周期に関して考慮すべき事項には、凍結温度、圧力、一次乾燥、二次乾燥、および周期時間が挙げられる。
【００３９】
例えば、好ましい凍結乾燥周期パラメータは、以下の通りであり得る。
まず、予備凍結として、０℃で１５分間保持。
凍結するために、６０分に渡って−６０℃まで下降。−６０℃で６０分間保持。
さらなる凍結工程で、−５０℃に上昇させて３０分間保持。
一次乾燥のために、圧力を５０ｍＴｏｒｒに落として４５分に渡って−１５℃に上昇。−１５℃および５０ｍＴの圧力で５４時間保持。
二次乾燥のために、３５分に渡って２０℃に上昇させ、２４時間保持。
総周期時間は８２時間である。
【００４０】
この凍結乾燥された生成物は、免疫グロブリンの免疫学的活性の安定性を保持し、ヒト対象への投与を意図した免疫グロブリンの最終生成物における物理的および化学的分解を防ぐ。
凍結乾燥された生成物は、粒子を含まない溶液を生じさせるために、使用時に希釈剤（例えば滅菌水または生理食塩水）中で再水和される。再構成された抗体溶液は、周囲温度で凍結乾燥ケーキを長期に渡って保管した後でさえも、粒子を含まない。再構成された溶液は、対象に非経口的に、好ましくは筋肉内もしくは皮下に投与することができる。
【００４１】
凍結乾燥された生成物の重要な特徴は、再構成時間、または生成物を再水和するために要する時間である。非常に迅速かつ完全な再水和を可能にするためには、高度に多孔性の構造を持つケーキを有することが重要である。ケーキ構造は、タンパク質濃度、賦形剤の種類および濃度、ならびに凍結乾燥周期のプロセスのパラメータを含む、多くのパラメータの関数である。概して再構成時間はタンパク質濃度が増加するにつれて増加し、したがって短い再構成時間は高濃度の凍結乾燥抗体製剤の開発における重要な目標である。長い再構成時間は、タンパク質をより濃縮された溶液により長く曝露するため、生成物の品質を低下し得る。さらに、使用者側では、生成物が完全に再水和されるまで生成物を投与することができない。これは、生成物が微粒子を含まず、正しい薬用量が投与され、その無菌性が影響を受けないことを確実にするためである。したがって、１０分未満の再水和時間等の迅速な再水和は、患者および医師により利便性を供する。
【００４２】
凍結乾燥された生成物では、標的タンパク質濃度で製剤を凍結乾燥し、生成物を出発充填容積と同量で再構成することにより、所望の薬用量を得ることができる。また、所望の薬用量は、大量の希釈された製剤を凍結乾燥し、それをより少量で再構成することによって得ることもできる。例えば、所望の生成物薬用量が１ｍＬの製剤中の１００ｍｇのタンパク質である場合、製剤は、１ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬ、２ｍＬの５０ｍｇ／ｍｌ、または４ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質製剤の液体構成で凍結乾燥することができる。全ての場合において、最終生成物は、１ｍＬの希釈剤で再構成し、１００ｍｇ／ｍＬの標的タンパク質濃度を得ることができる。しかしながら、予備凍結乾燥製剤中のタンパク質濃度が減少すると、充填容積は比例して増加する。これに付随して凍結乾燥周期（特に一次乾燥時間）の長さが増加し、したがって生成物の費用が著しく増大する。例えば、１ｍＬの充填容積（バイアル中１ｍｍの高さ）の凍結材料がその遊離水の昇華に約１時間を要する場合、１０ｍＬの充填容積（１０ｍｍの高さ）の凍結生成物は、約１０時間の一次乾燥時間を要する。したがって、凍結乾燥プロセスがより効率的となるように、濃縮された予備凍結乾燥製剤（約４０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリン濃度）を有することは有利である。
【００４３】
本発明は、免疫グロブリンの生物学的、物理的、および化学的安定性を保持する乾燥製剤に効率的かつ効果的に凍結乾燥される、高濃度の予備凍結乾燥免疫グロブリン製剤（約４０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ）を提供する。乾燥製剤は、室温で少なくとも３ヶ月間、好ましくは６ヶ月間安定である。乾燥製剤は、約８０ｍｇ／ｍｌ〜約１６０ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリンを含有する粒子を含まない溶液に、１０分未満の短時間で再構成することができる。そのような高濃度の抗体溶液は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下注射等の非経口投与ができる状態になっている。
【００４４】
好ましい再構成された生成物は、約８０ｍｇ／ｍｌ〜約１６０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブ、より好ましくは約１２０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブと、約１２３ｍｇ／ｍｌのショ糖と、約０．１２％のポリソルベート８０と、約ｐＨ６．０の約１８ｍＭのヒスチジンとを含有する。
【００４５】
３．分析方法
生成物の安定性を評価するための分析方法には、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、動的光散乱試験（ＤＬＳ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、イソアスパラギン酸定量化、効力、３４０ｎｍのＵＶ、ＵＶ分光法、およびＦＴＩＲが挙げられる。ＳＥＣ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎ．，８３：１６４５−１６５０，（１９９４）；Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１１：４８５（１９９４）；Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏ．Ａｎａｌ．，１５：１９２８（１９９７）；Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏ．Ａｎａｌ．，１４：１１３３−１１４０（１９８６））は、生成物中のモノマー率を測定し、可溶性凝集物の量の情報が得られる。抗体の効力または生物学的固有性は、その抗原に結合するその能力によって測定することができる。抗体のその抗原への特異的結合は、例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）等の免疫測定法等の、当業者に既知である任意の方法により定量化することができる。以下の方法は、当業者に周知である生成物の安定性を評価するための、単に例示的方法であるにすぎない。一例として、３４０ｎｍのＵＶで３４０ｎｍの散乱光強度を測定し、可溶性および不溶性の凝集物の量に関する情報が得られる。ＵＶ分光法は２７８ｎｍの吸光度を測定し、タンパク質濃度の情報が得られる。ＦＴＩＲ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，４５：２３１（１９９８）；Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１２：１２５０（１９９５）；Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎ．，８５：１２９０（１９９６）；Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎ．，８７：１０６９（１９９８））は、アミド一領域のＩＲスペクトルを測定し、タンパク質二次構造の情報が得られる。特定の分析方法について、実験の項でさらに説明する（上記を参照）。
【００４６】
４．再構成製剤の使用
本発明の再構成された免疫グロブリン製剤は、既知の方法に従って、免疫グロブリンを用いた治療を必要とする哺乳動物に投与することができる。これらの方法には、大量瞬時投与としての静脈内投与、または筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、もしくは吸入経路による、ある期間に渡る持続注入が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい実施形態において、免疫グロブリン製剤は、筋肉内または皮下投与によって哺乳動物に投与される。典型的な日用量は、約１μｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ対象重量以上、より好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ対象重量、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ対象重量、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇ対象重量、最も好ましくは約３ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇ対象重量の範囲であり得る。典型的には、医師は、所望の効果を達成する薬用量に到達するまで、免疫グロブリンを投与する。本療法の経過は、従来の方法および検定によって容易に監視することができる。
【００４７】
免疫グロブリンの適切な薬用量は、例えば治療される状態、状態の重症度および経過、免疫グロブリンが予防目的あるいは治療目的で投与されるのか、以前の療法、患者の病歴および免疫グロブリンへの応答、使用される免疫グロブリンの種類、担当医の裁量に依存する。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する薬用量に到達するまで、免疫グロブリンを投与する。本療法の経過は、従来の検定によって容易に監視することができる。
【００４８】
免疫グロブリンは、一度にまたは一連の治療に渡り、患者に好適に投与され、診断以降任意の時点で患者に投与され得る。免疫グロブリンは、単一治療として、または問題の治療に有用な他の薬物または療法と併用して投与され得る。本明細書で使用されるとき、場合、２つ（以上）の薬剤は、２つの薬剤が同時に投与されるか、または薬剤が同時期に作用するような様式で独立して投与される時、組み合わせて投与されるとされる。例えば、本発明のナタリズマブ製剤は、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病、および他のα４介在性疾病の治療のための他の治療薬または理学療法と組み合わせて投与することができる。
本発明を以下の実施例でさらに例証するが、本発明はそれらの中で記載される特定の手順の範囲に限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４９】
実施例１
ナタリズマブの、高濃度の再構成された凍結乾燥製剤と液体製剤との比較研究を、カニクイザルで行った。研究結果は、ナタリズマブの再構成された凍結乾燥製剤が、液体製剤と非常に類似した、予期された薬物動態学的および薬力学的プロファイルを生成したことを示した。
【００５０】
ナタリズマブの高濃度の液体および再構成された凍結乾燥製剤を、それらのそれぞれの薬物動態／薬力学的プロファイル、相対的生物学的利用能、皮下（ＳＣ）および筋肉内（ＩＭ）投薬後の局所耐性を比較するように評価した。液体高濃度製剤（１５０ｍｇ／ｍＬ）および再構成された凍結乾燥（１２０ｍｇ／ｍＬ）高濃度製剤の両方を、１日目にそれぞれ血管外経路により投与し、それらの薬物動態／薬力学的プロファイルを３６日目まで通して評価した。また、３０ｍｇの単一用量の市販の液体ナタリズマブも１日目に投与し、高濃度製剤の相対的生物学的利用能を決定した。３６日目にＳＣおよびＩＭ投与群の動物に２回目の注射を投与し、局所耐性を判定するために３９日目に注射部位の生検を行った。
【００５１】
被検物質の市販の液体ナタリズマブ、液体高濃度ナタリズマブ、および凍結乾燥高濃度ナタリズマブは、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃにより供給された。再構成された凍結乾燥ナタリズマブの再構成流体、注射用滅菌水が、水溶液として供給された。各投薬日に保存被検物質の新しいバイアルを使用し、適切な濃度の投薬溶液を生じるように製剤化した。
３０匹の実験的に無処置のカニクイザル（雄１５匹および雌１５匹）を、以下の表１に示すように５つの投与群に割り当てた。
【００５２】
【表１】
2010530003.tif 000003
【００５３】
研究前のベースライン値と比較して、全ての群で、末梢血リンパ球（より少ない程度で、好酸球、好塩基球、および未分類細胞）における薬理学関連の増加が認められ、被検物質の予期された薬力学的効果であると見なされた。冒された白血球細胞のレベルの上昇は、概して、市販の製剤のより低いＩＶ用量（典型的には８日目から１５日目まで通して）に対して、ナタリズマブのより高いＳＣおよびＩＭ用量（例えば８日目から３６日目まで通して）を受けた個々の動物においてより長い期間持続した。しかしながら、被検物質、雌雄の別、または投与経路の、液体対凍結乾燥の高濃度製剤の関数としての、応答の規模または期間における一貫したまたは明白な差異はなかった。
【００５４】
平均Ｔｍａｘは、市販の液体ＩＶ投与群で最も急速に達成され、高濃度製剤全体でＳＣ群よりもＩＭ群でより急速であった。平均Ｃｍａｘ値は、市販の液体ＩＶ投与群と比較すると、経路全体で用量比例よりも低く、血管外に投与された場合、高濃度製剤全体で一貫していた。平均ｔｌ／２値は、経路にかかわらず、全投与群に渡って一貫していた。
【００５５】
平均ＡＵＣｌａｓｔおよびＡＵＣｉｎｆの両方が、完全な吸収（すなわち１００％の相対的生物学的利用能）を示し、製剤にかかわらず、ＳＣおよびＩＭ投与群において用量比例よりも高く、また、血管外に投与された場合、製剤全体で非常に一貫していた。
【００５６】
循環リンパ球数、およびより低い程度で好酸球、好塩基球、および未分類細胞数において、予期された被検物質に関連する増加が見られ、研究前のベースラインと比較して全投与群に存在した。これらの結果は、α４インテグリン飽和プロファイルと一致し、ナタリズマブの薬理学的効果に起因する。冒された白血球細胞数の増加の期間は用量に依存し、典型的には、市販の液体製剤を静脈内に受けた群（典型的には８日目〜１５日目）と比較して、液体高濃度ナタリズマブおよび凍結乾燥高濃度ナタリズマブ処理群（例えば８日目〜最高３６日目）について高かった。ナタリズマブの高濃度液体と再構成された凍結乾燥製剤との間で、これらの白血球細胞個体群における変化に対して一貫した差異は観察されず、投与経路（皮下または筋肉内注射）もしくは動物の雌雄の別に関連すると見なされた差異は全くなかった。
【００５７】
要約すれば、１２０ｍｇの用量（再構成された凍結乾燥製剤）でのカニクイザルにおける皮下および筋肉内注射後、再構成された凍結乾燥高濃度ナタリズマブ製剤は、良好な耐性を示し、末梢血リンパ球数において予期された薬理学関連の増加を生成し、これは、市販の液体製剤の３０ｍｇの単回静脈内投与後と匹敵し、しかしわずかに長く持続した。
【００５８】
実施例
ナタリズマブは、現在、１〜２時間かけてＩＶ点滴で送達されている。これは、患者の病院または指定点滴センターへの訪問を必要とする。ナタリズマブの送達をより簡便にするためには、皮下投与が所望される。低濃度のバルク原薬から、次いで高濃度に再構成することができる凍結乾燥製剤を開発することは有利であった。本明細書に記載される本研究は、ショ糖を賦形剤として使用し、安定性に対する種々の出発および最終タンパク質濃度の効果をスクリーニングするために考案された（研究Ａ）。本研究の第２部は、他の周知の溶解保護剤および賦形剤のタンパク質安定性に対する効果について、それらをスクリーニングするために考案された（研究Ｂ）。また、充填容積および再構成容積の観点からの製造可能性について実現可能である溶液を調べる努力もなされた。
【００５９】
研究Ａでは、４つの製剤を調製し、予備凍結乾燥バルクおよび凍結乾燥ケーキの双方について、出発タンパク質濃度および最終タンパク質濃度の実時間および加速安定性に対する効果を調べた。４つの全ての予備凍結乾燥製剤が、５℃において最長６ヶ月の保持時間の、予備凍結乾燥バルクとして使用されるのに十分な安定性を呈した。２つの凍結乾燥製剤が、さらなる製剤開発の候補として見なされるのに十分な製剤特徴および安定性を呈した。これらの製剤のうちの１つは、タンパク質対ショ糖の１：１の重量比を有する、４０ｍｇ／ｍＬの出発濃度および１００ｍｇ／ｍＬの再構成濃度から成った。第２の候補製剤は、タンパク質対ショ糖の２：１の重量比を有する、５０ｍｇ／ｍＬの出発濃度および２００ｍｇ／ｍＬの再構成濃度から成った。双方の製剤は、ヒスチジン緩衝液およびポリソルベート８０を含有した。
【００６０】
さらに、現在のナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））製剤と同一の賦形剤プロファイルを有する高濃度の液体製剤を調製した。この製剤は、アミド分解速度は凍結乾燥製剤においてよりも急速であったが、５℃で、さらなる開発の候補とみなされるのに十分な凝集物形成に対する安定性を示した。この製剤は、加速温度において、凍結乾燥製剤において同程度では観察されなかった、低分子量の分解生成物を形成する傾向を示した。
【００６１】
実験計画
材料
本研究に使用されたナタリズマブは、Ｂｉｏｇｅｎｌｄｅｃにより供給され、２００３年２月に製造されたナタリズマブから調製された。本材料は製剤化およびバイアル化されており、したがってこれらの製剤研究に使用する前に本材料を貯え、ポリソルベート８０を除去する必要があった。手短に述べると、これは、低イオン強度、高ｐＨ（１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５）の緩衝液へ膜分離することにより、達成された。本材料をこれらの条件下でＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに結合させ、次いでｐＨ６で、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４０ｍＭのＮａＣｌを使用して溶出した。次いで、カラム溶出液を６ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６）に膜分離し、さらなる製剤化の前に７０〜１００ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【００６２】
化学物質および試薬
本研究で使用された全ての化学物質および試薬は、注記されていない限りＶＷＲから購入し、ＡＣＳ以上のグレードであった。入手可能である場合には、ＵＳＰグレードの試薬を賦形剤として使用した。ポリソルベート８０は、Ｓｉｇｍａ（目録番号Ｐ６４７４）から購入し、野菜由来および低過酸化物であった。
【００６３】
研究Ａの製剤
賦形剤および活性成分の保存液を希釈して表２：研究Ａの製剤パラメータに示す所望の濃度にして、以下の製剤を調製した。全ての製剤をｐＨ６に調製した。
【００６４】
【表２】
2010530003.tif 000004
【００６５】
研究Ｂの製剤
賦形剤および活性成分の保存液を希釈して表３：研究Ｂの製剤パラメータに示す所望の濃度にして、以下の製剤を調製した。全ての製剤がｐＨ６であった。
【００６６】
【表３】
2010530003.tif 000005
【００６７】
方法
製剤の調製
溶液を滅菌濾過し、示される通りガラス製滅菌バイアルに充填した。予備凍結乾燥分析用の全ての試料および３９４４−１８Ｌを２ｃｃのバイアルに０．５ｍＬで充填し、栓をし、キャップをした。凍結乾燥する調製物を５ｃｃのＫｉｍｂｌｅバイアルに、製剤３９４４−１８Ａ―２．５ｍＬ、製剤３９４４−１８Ｂ―１．２５ｍＬ、製剤３９４４−１８Ｃ―２ｍＬ、製剤３９４４−１８Ｄ―１．５ｍＬの容積に充填した。研究Ｂ用の全ての製剤を、５ｃｃのＫｉｍｂｌｅバイアルに２ｍＬで充填した。
【００６８】
凍結乾燥周期
研究Ａについて、バイアルを−２０℃で凍結した。凍結乾燥器が正常に機能せず、温度が週末の間−７０℃に落ちた。その後凍結乾燥周期の再開を試み、再凍結の前に３〜４℃へ温度が上昇した。凍結乾燥器を再起動し、周期を継続した。一次乾燥を、−２０℃で２０時間、１００ｍＴｏｒｒの真空で行った。次いで、温度を３時間に渡って２０℃に上昇させ、二次乾燥のために３０時間１００ｍＴｏｒｒで保持した。
【００６９】
研究Ｂについて、確実に均一に凍結するように、バイアルを−５０℃で２時間凍結した。次いで、１００ｍＴｏｒｒの真空下で２０分間−４０℃の温度にした。次いで、温度を１００ｍＴｏｒｒの真空で２０分に渡って−２５℃に上昇させ、２０時間一次乾燥を続行した。棚温度を１０時間に渡ってゆっくりと２０℃に上昇させ、１００ｍＴｏｒｒで二次乾燥を開始し、次いで４時間２０℃で保持した。
【００７０】
研究設定
予備凍結乾燥液体のバイアル、高濃度液体対照、および凍結乾燥ケーキを、５、３０、および４０℃に置いた。４０℃で保管した試料を２、４、８、および１２週で検定した。３０℃で保管した試料は３、６、９、および１２週で検定した。５℃で保管した試料は４、８、および１２週に検定した。一部の製剤について、３０℃および５℃において追加のバイアルを６ヶ月および１年で分析した。全ての製剤を凍結乾燥前および後に、ゼロ時点で検定した。
【００７１】
検定
試料は、以下の方法で検定した。全ての時点で全ての検定が行われてはいない。予備凍結乾燥試料のゼロ時点を除いて、各検定につき２組のバイアルを試料採取した。
【００７２】
目視検査による外観
全ての試料を視覚的に検査し、その外観を記録した。凍結乾燥ケーキは、色、均一性、頑健性、および再融解の痕跡について調べた。液体および再構成試料は、色、透明度、および微粒子の存在について調べた。
【００７３】
残留水分および再構成時間
凍結乾燥ケーキは、ゼロ時点でカールフィッシャーを用いて残留水分について検定した（ＢＯＰ  ０００−０１２９０）。再構成時間は、適量のＤＩ水を添加し、その後静かにかき混ぜて測定した。ケーキが完全に溶解する時間を記録した（ＥＯＰ  ０００−０１２９２）。
【００７４】
濃度
全ての試料の濃度を測定した。ナタリズマブ偽薬を使用して、試料を１ｍｇ／ｍＬに希釈した。Ｖａｒｉａｎ  ３００Ｂｉｏ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒおよび２００ｎｍ／分の１ｃｍの光路長キュベットを使用して、ＵＶ吸光度を４００〜２４０ｎｍで走査した。ラムダ最大値の吸光度を記録し、その値を１．４９８（ナタリズマブの吸光係数）で割り、適切に希釈することで調整して濃度を測定した。
【００７５】
混濁度
適切な試料の３００〜４００ｎｍの吸光度を、１０ｍｍの小容量キュベット（Ｓｔａｒｎａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｃ．目録番号１６．１６０−Ｑ−１０＼Ｚ２０）を使用して測定した。３６０ｎｍで記録された値を報告した。
【００７６】
サイズ排除クロマトグラフィ
モノマー、高分子量種、ダイマー、および低分子量種の量は、Ｂｉｏｇｅｎ  ＳＯＰ  ２２ｄ．５０５の修正形態を使用して測定した。試料を適切なカラムに充填し、充填容積はカラム上で約４００μｇの質量を配分するように調整した。また、参照材料の充填質量も同程度に調整した。２１５および２８０ｎｍの両方の検出を記録したが、主ピークは２１５ｎｍでは目盛りの範囲外であったため、本明細書で報告された計算には２８０ｎｍの痕跡を使用した。
【００７７】
陽イオン交換クロマトグラフィ
陽イオン交換クロマトグラフィを行った。クロマトグラフィシステムにおける差異のため、勾配を主ピークが９〜１２分で溶出するようにわずかに修正した。使用されたシステムはバイナリポンプであったため、各組の分析後に高塩濃度洗浄のみ行った。いずれのピークの高塩濃度洗浄においても、遅い保持時間で溶出する証拠はなかった。高塩濃度洗浄は各試料後には行われなかったため、再平衡時間は７分に短縮した。
【００７８】
効力
選択された試料の効力は、ＶＣＡＭ可溶化液検定（ＡＡＭ  ００１−００９６５）、およびジャーカット細胞検定（ＡＡＭ  ００１−００７００）によって分析した。
【００７９】
研究Ａの結果
本研究は、凍結乾燥ケーキパラメータ、再構成時間、および安定性に対する初期タンパク質濃度および最終タンパク質濃度の双方の効果を調べるための、スクリーニング研究として設計された。予備研究は、ショ糖がナタリズマブに対する十分な短期的溶解保護特性を提供し、一方マンニトールはそうしないことを示していた。このため、初期スクリーニングはショ糖を溶解保護剤として用いて行った。また、初期の研究はナタリズマブの最適なｐＨがｐＨ６であることも示していた。このｐＨで緩衝するためには、リン酸塩、クエン酸塩、およびヒスチジン緩衝液が最も一般的に使用される。リン酸緩衝液は、凍結時にｐＨが変化するため、タンパク質の凍結乾燥に使用するには最適ではない。クエン酸塩緩衝液は、一部の皮下製剤中での注射に際して、痛みに関与するとされている。その結果、好ましい緩衝液種としてヒスチジンを選択した。初期濃度は、製剤の調製を簡略化し、再構成後に最終濃度を３０ｍＭ以下に維持するように６ｍＭに固定した。研究３Ａについて、タンパク質に十分な保護を与え、また最終濃度を０．１％以下に維持することが示されているため、ポリソルベート８０の濃度は予備凍結乾燥溶液中０．０２％に維持した。ショ糖の濃度は、等張に近い最終溶液をなお維持しながら、タンパク質対糖の１：１〜２：１の重量比を維持するように選択した。
【００８０】
予備凍結乾燥および液体製剤
別表の表は、全ての製剤について記録された全ての結果を含む。目視検査では、全ての製剤の外観は、無色で透明から乳白色、目視による微粒子は全くなかった。予期された通り、乳白度はタンパク質濃度が上昇するにつれて幾分上昇した。分析の変動内でタンパク質濃度の変化を示した試料はなく、傾向は観察されなかった。３６０ｎｍの吸光度で測定された混濁度は、研究の６ヶ月間（５℃）または１２週間（３０℃）に渡り、変化を示さなかった。４０℃における予備凍結乾燥試料は、４０、５０、および７５ｍｇ／ｍＬの試料について、経時的に混濁度のわずかな上昇を示した。２０ｍｇ／ｍＬの予備凍結乾燥試料および高濃度液体は、４０℃の試料中でこの傾向を示さなかった。
【００８１】
全ての製剤についてダイマー、高分子量の凝集物、および低分子量種の形成を観測した。表形式の結果を、別表の表に示す。図１および２は、３０℃および４０℃における高分子量種の形成を示す。５℃では、６ヶ月間の保管の間、いずれの製剤においても高分子量種のレベルに変化はなかった。
【００８２】
５℃のデータを本明細書に示す。３０℃における結果は（図１）、１２週間の保管後、いずれの予備凍結乾燥製剤についても高分子量種の形成における傾向を示さなかった。高濃度液体製剤は、３０℃における６ヶ月間の保管期間に渡り、高分子量種の明確な増加を示した。
【００８３】
４０℃では、予備凍結乾燥製剤中、高分子量種の形成は４週間の保管後まで開始が見られなかった。その後、高分子量種の量は増加し続ける。高イオン強度の高濃度液体製剤は、高分子量種のより低い開始率を示したが、量は、４０℃における３ヶ月の研究に渡って一定した割合で増加したようである。
【００８４】
図３および４は、予備凍結乾燥溶液中の、３０℃および４０℃における低分子量種の形成を示す。３ヶ月間の保管の間、３０℃における低分子量種のレベルにはごく小さな変化しかなかったが、明確な上昇傾向が見られた。６ヶ月では、高濃度液体のみを検定した。その時点では、ほぼ６％の、相当量の低分子量種が存在した。
【００８５】
４０℃における保管の間、低分子量種の形成には明確な傾向があった。この温度での形成率は、より高濃度の試料がより急速な形成を示し、幾分濃度依存性であると思われた。また、３０℃および４０℃における低分子量種の形成は、高分子量種の形成よりも速い速度で進行し、液体試料の重要な分解経路になっていると思われた。
【００８６】
５℃で保管された試料について、６ヶ月の期間に渡り低分子量種の割合にはほとんど変化がなかった。本データは別表には示すが、本明細書には図示していない。全ての予備凍結乾燥製剤は、約０．６〜０．９％の初期レベルから６ヶ月で０．１５％になった。高濃度液体は、５℃における６ヶ月間の保管後でさえも、いずれの低分子量種も示さなかった。
【００８７】
図５、６、および７は、高分子量種および低分子量種の両方の形成により、それぞれの温度のモノマーの総消失率を示す。２〜８℃では、本質的にモノマー率に変化はなかった。これは、これらの製剤のいずれもが、２〜８℃における最長６ヶ月の保管の間、予備凍結乾燥製剤として好適に安定しているであろうことを示している。また、高濃度液体製剤も２〜８℃で変化を示さなかった。３０℃における試料は、モノマーのほんのわずかな減少を示す。この変化は、低分子量種の形成によるものである。また、これは、これらの製剤のいずれもが、周囲温度でプロセシングを可能にする十分な安定性を呈することを示している。高濃度液体は、６ヶ月で、低分子量種の増加と同時であるモノマーの消失を示す。全ての製剤が、試験された３ヶ月間に渡って４０℃においてモノマーの消失を示した。消失速度は、１００ｍｇ／ｍＬの液体および７５ｍｇ／ｍＬの予備凍結乾燥製剤が最も急速な消失速度を示し、タンパク質濃度と大まかに相関するようである。低分子量種の形成による分解機構のさらなる究明により、この分解経路のより良好な安定化が提供され得る。
【００８８】
選択された試料を陽イオン交換クロマトグラフィで分析した。全ての場合で、結果は、時間および温度に基づく保管で、より酸性種（アミド分解）への変化を示した。種々の予備凍結乾燥製剤の間で差異はなかった。アミド分解は、概してｐＨ、イオン強度、および特定の緩衝液種の影響を受けるため、この結果は予期される。高濃度液体製剤の分解は、５℃では予備凍結乾燥製剤と有意に異ならなかった。しかしながら、３０℃および４０℃の両方で有意に速い分解を示した。これは、恐らく高イオン強度およびリン酸塩緩衝液の存在によるものである。
【００８９】
凍結乾燥製剤
表５〜１２は、凍結乾燥製剤として５、３０、および４０℃で保管された試料の安定性についての結果を示す。全ての製剤を４０℃で１２週間、３０℃および５℃で６ヶ月間保管した。さらに、製剤３９４４−１８Ｂおよび３９４４−１８Ｃは、３０℃および５℃において１年後に分析した。
【００９０】
残留水分について、初期時点で製剤を分析した。残留水分は、恐らく凍結乾燥周期中に遭遇した問題によって、所望よりも高かった。これらの試料の残留水分は、５〜６％の範囲であった。
【００９１】
再構成時間が測定され、出発および最終タンパク質濃度と直接相関した。７５ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液から凍結乾燥されたケーキは、再構成に平均１５〜２０分を要した。５０ｍｇ／ｍＬから凍結乾燥された試料は、平均６〜７分を要し、４０ｍｇ／ｍＬからは５〜６分、２０ｍｇ／ｍＬからは４〜５分を要した。該値は不定であったが、保管時間または温度に関していずれの傾向も示さなかった。
【００９２】
再構成バイアルを外観について調べた。全ての試料は透明から乳白色であり、無色で粒子を含まなかった。３０℃で１年間保管された２つの製剤が、幾分わずかに黄色を示した。混濁度を、３６０ｎｍの吸光度の関数として測定した。４０℃で１２週間保管された場合、全ての製剤が混濁度の上昇を示した。３０℃で最長１２ヶ月間保管された場合、全ての製剤が混濁度にそれほど有意ではない上昇を示した。製剤３９４４−１８Ｃを除き、５℃で最長１年間保管された場合、全ての製剤が混濁度のわずかな上昇を示した。（別表Ｅ〜Ｈの表を参照）。材料の手充填および再構成に固有の正常な変動外には、タンパク質濃度における変化は観察されなかった。
【００９３】
再構成試料を、低分子量および高分子量の両方の分解生成物の形成について、サイズ排除クロマトグラフィで分析した。低分子量の分解は一部の時点で明らかであったが、形成の傾向があるとは思われなかった。全ての時点での量はいずれの試料でも０．２％より低く、Ｂｉｏｇｅｎｌｄｅｃによる検定の検出限界であると見なされる。分解の主要な経路は、ダイマーおよび高次凝集物の形成を介してであった。経時的なモノマーの消失を図８、９、および１０に示す。４０℃における保管で幾分モノマーの消失があり、製剤３９４４−１８Ｄおよび３９４４−１８Ｃにおいて最も急速な消失であった。製剤３９９４４−１８Ｂおよび３９４４−１８Ａは、より目立たない減少傾向を示す。３０℃で同位の傾向が見られ、３９４４−１８Ｄおよび３９４４−１８Ｃがより急速なモノマーの消失を示す。３９４４−１８Ａおよび３９４４−１８Ｄについては最長６ヶ月間、ならびに３９４４−１８Ｂおよび３９４４−１８Ｃについては最長１年間、５℃でモノマーの消失を示した製剤はない。
【００９４】
選択された試料を陽イオン交換クロマトグラフィで分析した。製剤の間ではいずれの差異も見られなかった。５℃で、７１％の主ピークから６６％の主ピークへの変化があった。酸性ピークの率は長期に渡りほぼ一定のままであったが、塩基性ピークの率は経時的に初期時点の８〜１０％から１年後の１４〜１５％に増加した。３０℃および４０℃の試料は、同一傾向を呈し、塩基性ピークの率が３０℃で１年後に１８〜１９％、４０℃で３ヶ月後に２２〜２６％に到達した。この反応経路を特徴付け、分解種の起源を調べるためのさらなる作業が必要であろう。
【００９５】
研究Ｂの結果
製剤の選択
ショ糖に加えて、ナタリズマブの安定性に対する賦形剤の効果を研究し、研究Ａで見られた結果を検証するために、研究Ｂを設定した。研究Ａからの結果に基づき、４０〜５０ｍｇ／ｍＬの出発濃度が良好なケーキ形成および再構成特徴の双方に最適であると決定された。タンパク質対糖比は、５０ｍｇ／ｍＬの初期濃度で２：１の重量比に固定し、再構成濃度標的は２００ｍｇ／ｍＬとした。さらに、１つの製剤は、４０ｍｇ／ｍＬの出発濃度および１６０ｍｇ／ｍＬの標的再構成濃度で調べた。また、この製剤は１．６：１の重量比のタンパク質対糖比を有した。
【００９６】
製剤３９７６−４Ｃは、研究Ａの３９４４−１８Ｃと同じ製剤を含んだ。予備凍結乾燥溶液の安定性は研究Ａで調べ、Ｂでは繰り返さなかった。文献からの報告では、高濃度のタンパク質溶液に添加した低レベルの塩化ナトリウムが、これらの溶液の粘度の低下を助け得ることが示されている。製剤３９７６−４Ｇは、ＮａＣｌの効果を調べるために１５ｍＭのＮａＣｌを予備凍結乾燥調製物に添加した。ポリソルベート２０（ＰＳ２０）は、タンパク質製剤中で頻繁にポリソルベート８０（ＰＳ８０）の代わりに使用される。製剤３９７６−４Ｈでは、０．０２％のＰＳ８０を当量のＰＳ２０に置き換えた。製剤３９７６−４Ｉでは、当量のトレハロースをショ糖に置き換えた。
【００９７】
予備凍結乾燥製剤
予備凍結乾燥製剤を外観について分析した。保管温度に関わらず、いずれの溶液にも外観への有意な変化は生じなかった。これらは全て無色でわずかに乳白色であり、微粒子は現れなかった。いずれの製剤にもタンパク質濃度の変化はなかった。全ての時点で混濁度を測定した。製剤３９７６−４Ｇについて、初期混濁度測定値は高かったが、その後の時点でかなり一定のままであった。３９７６−４Ｇについて測定された値は他の製剤より全ての温度で高くあり続けたが、いずれの製剤においても混濁度における変化の傾向は観察されなかった。
【００９８】
ダイマーおよび高分子量凝集物の形成、ならびに低分子断片によるモノマーの損失を観測した。先で見られたように、５℃において３ヶ月まで、いずれの試料についてもモノマー率に変化はなかった。また、製剤３９７６−４Ｋも５℃において６ヶ月で分析し、モノマー率に変化を示さなかった。図１１および１２は、それぞれ３０℃および４０℃における各製剤についての低分子量種の形成を示す。すでに見たように、全ての製剤中で、４０℃で低分子量種の実質的な形成があり、より低いタンパク質濃度を有する３９７６−４Ｋ中でわずかに低い形成率であった。これらの結果は、研究Ａで見られたものと同等であった。別様には、この反応に対する賦形剤の効果はないようであった。３０℃で、低分子量種においてわずかな上昇があった。１２週間後に０．２〜０．４％に到達するこの速度も、研究３Ａですでに見たものと同等であった。
【００９９】
ＰＳ２０を含有した３９７６−４Ｈを除き、全ての製剤について４０℃で高分子量種のわずかな増加があった（図１３）。他の温度では、いずれの製剤についても高分子量における変化はなかった。全ての製剤が凝集物の形成に対して安定であり、主な分解経路は昇温での低分子量種の形成であるように思われた。これらの製剤のいずれもが、予備凍結乾燥バルク薬としてのさらなる開発に対して十分に安定であろう。
【０１００】
全ての製剤に初期時点で陽イオン交換クロマトグラフィを行ったが、３９７６−４Ｋにだけは５℃における６ヶ月の保管後に行った。研究Ａで見たように、保管に際し、より酸性種への変化があった。この分解は、ｐＨおよび温度により促進される。
【０１０１】
凍結乾燥製剤
全ての試料を、初期時点で水分、ケーキの外観、および再構成時間について分析した。全てのケーキについて、ケーキの外観は許容可能であった。水分レベルは、５．４％の水分を有した製剤３９７６−４Ｉを除いて概して３〜４％であり、研究Ａにおいてよりもわずかに低かった。全ての時点および温度での全ての試料についての再構成時間は概して許容可能であり、１０〜１４分を要する少数の例外を除いて１０分未満であった。最も低い出発タンパク質濃度を有する製剤３９７６−４Ｋもより急速な再構成時間を示した。再構成時、３９７６−４Ｉおよび３９７６−４Ｇを除いた全ての試料が、全ての温度で最長１２週間、無色でわずかに乳白色から乳白色であった。４０℃における１２週で、３９７６−４Ｉは非常に乳白色であった。３０℃において６週および５℃および４０℃において８週に始まり、３９７６−４Ｇは非常に乳白色であった。再構成中のより少ない起泡および気泡形成の傾向に見られるように、ＮａＣｌの添加は製剤の粘度を低下するように思われたが、これは、溶液の乳白度の有意な上昇も示した。製剤３９７６−４Ｃは、５℃において６ヶ月および１年で分析した。５℃における１年後、３９７６−４Ｃはわずかに黄色を示した。製剤３９７６−４Ｋは、５℃および３０℃における６ヶ月および１年で分析した。製剤３９７６−４Ｋは、３０℃において６ヶ月間の保管後わずかに黄色を示したが、５℃における１年後は示さなかった。
【０１０２】
４０℃において３ヶ月までサイズ排除クロマトグラフィで試料を分析した。５℃および３０℃において試料は３ヶ月まで分析し、その後１年時点で分析を行った。さらに、製剤３９７６−４Ｃおよび３９７６−４Ｋも同様に６ヶ月で分析した。低分子量種の量は全ての試料中で０．２％未満であった。分解の主要な経路は、ダイマーおよび高分子量種の形成によった。図１４、１５、および１６は、各温度の凝集物の形成によるモノマーの消失を示す。全ての温度において、トレハロースを含有する製剤３９７６−４Ｉにおけるモノマーの消失が、他の製剤よりも急速であることが明白である。ＰＳ２０およびＮａＣｌを含有する製剤は、ＰＳ８０と共にショ糖を含有する製剤と同等の分解を示した。製剤３９７６−４Ｋは、全ての温度において最も急速ではないモノマーの消失を示した。この製剤は、より低い出発タンパク質濃度、より低い再構成濃度、およびより高いショ糖対タンパク質比を有した。
【０１０３】
選択された試料を陽イオン交換クロマトグラフィで分析した。本検定からの結果は幾分不定であったが、全ての製剤が５℃における電荷分布における変化に対して安定なままであるように思われた。４０℃で、全ての製剤が主ピークの減少、ならびに酸性および塩基性種の双方の増加を示した。この傾向は、３０℃における１年間の保管後に分析された製剤３９７６−４Ｋからの試料中でも観察された。
５℃および４０℃で保管された製剤３９７６−４Ｋは、８週時点で効力についてＶＣＡＭ可溶化液およびジャーカット細胞検定の両方で分析した。結果を表に示す。
【０１０４】
【表４】
2010530003.tif 000006
【０１０５】
結論
予備凍結乾燥バルク製剤
高濃度液体製剤では５℃において６ヶ月間までモノマーの消失がなかったが、恐らくアミド分解による、酸性種の増加があった。この製剤は、３０℃において６ヶ月間、および４０℃において３ヶ月間、高分子量および低分子量の両方の分解種の形成によりモノマーの消失を示した。現製剤の高タンパク質濃度の液体は、さらに最適化せずには市販の製剤として好適なものとしては十分な長期安定性を呈さない可能性がある。
【０１０６】
３〜６ヶ月間５℃で保管された場合、モノマーのいずれかの有意な損失を示す予備凍結乾燥製剤はなかった。これらの製剤についてのアミド分解の量における変化は、高濃度液体で見られたものと同等であった。３０℃で保管された製剤は、３ヶ月までダイマーおよび高分子量凝集物の増加をほとんどまたは全く示さなかったが、形成された低分子量の断片化種の量の増加があった。４０℃では、低分子量種の増加は高分子量種の増加よりも急速であった。低分子量種の増加の速度は、タンパク質濃度に相関すると思われた。
【０１０７】
一般に、ヒスチジン、ショ糖、およびＰＳ８０と共に５０ｍｇ／ｍＬ以下のタンパク質濃度を含有する製剤は、予備凍結乾燥バルクとしての十分な安定性を示すように思われた。
【０１０８】
凍結乾燥製剤
５０ｍｇ／ｍＬ以下から凍結乾燥され、１００〜２００ｍｇ／ｍＬに再構成された製剤は、全ての温度および時点において、良好なケーキ形成および許容可能な再構成時間を示した。ヒスチジン、ショ糖、およびＰＳ８０を含有する製剤は、５℃において１年間までモノマー損失を有さなかった。これらの製剤の一部は、１年間の保管後に塩基性種のわずかな増加を示したが、この増加は、検定の変動性を鑑み、定量化し難い。昇温でのタンパク質分解の主要な経路は、ダイマーおよび高分子量凝集物の形成であった。ＮａＣｌの添加は粘度を低下させたが、溶液の混濁度の上昇をもたらした。ＰＳ８０のＰＳ２０への置き換えは、安定性に対して効果を有さないように思われたが、一方ショ糖のトレハロースへの置き換えは、凝集物の形成速度を増加した。
【０１０９】
ナタリズマブと共にショ糖、ヒスチジン、およびポリソルベート８０を含有する凍結乾燥製剤は、前臨床および初期臨床研究へ移行するのに十分な安定性を示す。出発タンパク質濃度、ショ糖対タンパク質比、再構成タンパク質濃度、および凍結乾燥周期を最適化するためのさらなる研究を行う。さらに、再構成試料の安定性を調べる。
【０１１０】
【表５】
2010530003.tif 000007
2010530003.tif 000008
2010530003.tif 000009
【０１１１】
【表６】
2010530003.tif 000010
2010530003.tif 000011
2010530003.tif 000012
【０１１２】
【表７】
2010530003.tif 000013
2010530003.tif 000014
2010530003.tif 000015
【０１１３】
【表８】
2010530003.tif 000016
2010530003.tif 000017
2010530003.tif 000018
【０１１４】
【表９】
2010530003.tif 000019
2010530003.tif 000020
2010530003.tif 000021
【０１１５】
【表１０】
2010530003.tif 000022
2010530003.tif 000023
2010530003.tif 000024
【０１１６】
【表１１】
2010530003.tif 000025
2010530003.tif 000026
2010530003.tif 000027
【０１１７】
【表１２】
2010530003.tif 000028
2010530003.tif 000029
2010530003.tif 000030
【０１１８】
【表１３】
2010530003.tif 000031
2010530003.tif 000032
2010530003.tif 000033
【０１１９】
【表１４】
2010530003.tif 000034
2010530003.tif 000035
2010530003.tif 000036
【０１２０】
【表１５】
2010530003.tif 000037
2010530003.tif 000038
2010530003.tif 000039
【０１２１】
【表１６】
2010530003.tif 000040
2010530003.tif 000041
2010530003.tif 000042
【０１２２】
【表１７】
2010530003.tif 000043
2010530003.tif 000044
2010530003.tif 000045
【０１２３】
【表１８】
2010530003.tif 000046
2010530003.tif 000047
2010530003.tif 000048
【０１２４】
【表１９】
2010530003.tif 000049
2010530003.tif 000050
2010530003.tif 000051
【０１２５】
【表２０】
2010530003.tif 000052
2010530003.tif 000053
2010530003.tif 000054
【０１２６】
【表２１】
2010530003.tif 000055
2010530003.tif 000056
2010530003.tif 000057
【０１２７】
実施例３
以下に示すように、わずかに異なる初期タンパク質濃度を有する３つの製剤の凍結乾燥に成功し、５℃における６ヶ月間の保管時、優れた安定性を示した。４０℃における８週間の保管時、これらの製剤の安定性は先に見られた安定性と同等のものだった。また、６ヶ月間５℃で保管された予備凍結乾燥製剤、および５℃または２５℃のいずれかで１週間保管された再構成溶液の安定性も優れていた。４０ｍｇ／ｍＬの出発濃度は、他の製剤よりもわずかに良好な安定性および良好な再構成特徴を示した。しかしながらこの製剤の再構成は、１５０ｍｇ／ｍＬの１ｍＬの提供可能な用量を可能にした。
【０１２８】
材料
以下の表は、材料およびそれらの供給源を記載する。
【表２２】
2010530003.tif 000058
【０１２９】
【表２３】
2010530003.tif 000059
【０１３０】
ナタリズマブ
本研究に使用されたナタリズマブは、研究３Ａおよび研究３Ｂで使用されたものと同じであった（ＡＱＳ−２１９０）。これらの研究に使用したナタリズマブは、Ｂｉｏｇｅｎｌｄｅｃによって供給されたナタリズマブから調製した。本材料に含まれるポリソルベート８０は、製剤化およびバイアル化されたもので、本製剤研究で使用前に除去した。手短に述べると、材料を低イオン強度、高ｐＨ（１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝８．５）の緩衝液へ膜分離に供した。本材料をこれらの条件下でＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに結合させ、次いで１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６を用いて溶出した。次いで、カラム溶出液を６ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６）に膜分離し、さらなる製剤化の前に７０〜１００ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【０１３１】
化学物質および試薬
本研究で使用された全ての化学物質および試薬は、注記されていない限りＶＷＲから購入し、ＡＣＳ以上のグレードであった。利用可能である場合、ＵＳＰグレードの試薬を賦形剤として使用した。ポリソルベート８０は、Ｓｉｇｍａ（目録番号Ｐ６４７４）から購入し、野菜由来および低過酸化物であった。
【０１３２】
製剤
賦形剤の保存液を希釈し、所望の濃度にして以下の製剤を調製した。全ての製剤がｐＨ６であった。
【０１３３】
【表２４】
2010530003.tif 000060
【０１３４】
方法
製剤の調製
試料製剤を滅菌濾過し、示される通りガラス製滅菌バイアルに充填した。予備凍結乾燥分析用の全ての試料を３ｃｃのバイアルに０．５ｍＬで充填し、栓をし、キャップをした。凍結乾燥される調製物を５ｃｃのＫｉｍｂｌｅバイアルに４．０ｍＬで充填した。
【０１３５】
凍結乾燥周期
凍結相の間、試料を含むバイアルをまず５℃に冷却し、３０分間保持した。次いで、温度を２０分に渡って−５℃に下げ、−５℃で６０分間保持した。凍結の最終段階には、４５分に渡ってバイアルを−４０℃に下げ、この温度で２時間保持し、そのうちの最後の２０分は１００ｍＴｏｒｒの真空にかけた。次いで、１００ｍＴｏｒｒの真空下で温度を２０分に渡って−２５℃に取りながら一次乾燥を行い、そこで３４時間保持した。棚温度を１０時間に渡ってゆっくりと２０℃に上昇させ、１００ｍＴｏｒｒで二次乾燥を開始し、次いで２０℃で６時間保持した。
【０１３６】
研究設定
予備凍結乾燥液体および凍結乾燥ケーキのバイアルを５℃および４０℃に置いた。４０℃で保管された試料を２、４、および８週に検定した。５℃で保管された試料は４週および６ヶ月に検定した。４週時点で、各保管温度からの４本のバイアルを再構成し、その後再構成安定性に１週間、２本のバイアルを５℃に置き、２本のバイアルを２５℃に置いた。全ての製剤を凍結乾燥前および後に、ゼロ時点で検定した。
【０１３７】
検定
試料を以下の方法で検定し、その結果を表２７〜３０に提示する。全ての時点で全ての検定が行われてはいない。予備凍結乾燥試料および凍結乾燥後試料のゼロ時点を除いて、各検定につき２組のバイアルを試料採取した。
【０１３８】
目視検査による外観
全ての試料を視覚的に検査し、その外観を記録した。凍結乾燥ケーキは、色、均一性、頑健性、および再融解の痕跡について調べた。液体および再構成試料は、色、透明度、および微粒子の存在について調べた。
【０１３９】
残留水分および再構成時間
ゼロ時点で、カールフィッシャー電量滴定装置を使用して残留水分について凍結乾燥ケーキを検定した。再構成時間は、適量のＤＩ水を添加し、その後静かにかき混ぜて測定した。ケーキが完全に溶解する時間を記録した。
【０１４０】
濃度
ナタリズマブ偽薬を使用して試料を１ｍｇ／ｍＬに希釈して、全ての試料の濃度を測定した。Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  ３００Ｂｉｏおよび２００ｎｍ／分の１０ｍｍの光路長キュベットを使用して、ＵＶ吸光度を４００〜２５０ｎｍで走査した。ラムダ最大値の吸光度を記録し、その値を１．４９８（ナタリズマブの吸光係数）で割り、適切に希釈することで調整して濃度を測定した。
【０１４１】
混濁度
適切な試料の３００〜４００ｎｍの吸光度を、１０ｍｍの小容量キュベット（Ｓｔａｒｎａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｃ．目録番号１６．１６０−Ｑ−１０＼Ｚ２０）を使用して測定した。３６０ｎｍで記録された値を報告した。
【０１４２】
サイズ排除クロマトグラフィ
試料中のモノマー、高分子量凝集物、ダイマー、および低分子量種の量を、サイズ排除クロマトグラフィで測定した。手短に述べると、試料を適切なカラムに充填し、充填容積はカラム上で約４００μｇの質量を配分するように調整した。また、参照材料の充填質量も同程度に調整した。２１５および２８０ｎｍの両方の検出を記録したが、主ピークは２１５ｎｍでは目盛りの範囲外であったため、計算には２８０ｎｍの痕跡を使用した。結果を表２７〜３０に示す。
【０１４３】
結果
予備凍結乾燥製剤
表２７〜３０は、全ての製剤について記録された結果を含む。目視検査では、全ての製剤の外観は、無色でわずかに乳白色、目視による微粒子は全くなかった。５℃または４０℃では、外観は経時的に変化しなかった。分析の変動内でタンパク質濃度の変化を示した試料はなく、傾向は観察されなかった。３６０ｎｍの吸光度で測定された全ての製剤の混濁度は、５℃において６ヶ月後わずかな上昇を示した。４０℃の予備凍結乾燥試料は、３つの全ての製剤について経時的な混濁度の上昇を示した。
【０１４４】
全ての製剤について、ダイマー、高分子量（凝集物）、および低分子量種の形成を観測した。結果を表および図１７〜１９に示す。
【０１４５】
図１７は、４０℃における高分子量種の形成を示す。予備凍結乾燥製剤中では、高分子量種の形成は４週間の保管後まで開始が見られなかった。８週では、高分子量種の微増が明白であった。
【０１４６】
５℃では、６ヶ月の保管の間、いずれの製剤においても高分子量種のレベルに変化はなかった。本データは別表には示すが、本明細書には図示していない。
【０１４７】
図１８は、４０℃における低分子量種の形成を示す。４０℃における保管の間、低分子量種の形成に明確な傾向があった。また、低分子量種の形成は、高分子量種の形成よりも速い速度で進行すると思われ、これにより液体試料の重要な分解経路になっている。
【０１４８】
５℃で保管された試料について、６ヶ月の期間に渡り低分子量種の割合にはほとんど変化がなかった。本データは別表には示されるが、本明細書には図示していない。全ての予備凍結乾燥製剤は、約０．１１％の初期レベルから６ヶ月で０．１８％になった。ＢｉｏｇｅｎＩｄｅｃは、この検定に対して０．２％のより低い定量限界を示した。そのレベル未満の値は、傾向情報のみのために報告する。
【０１４９】
図１９は、高分子量種および低分子量種の両方の形成による、４０℃におけるモノマーの総消失率を示す。５℃では、本質的にモノマー率の変化はなかった。これは、これらの製剤のいずれもが、予備凍結乾燥製剤として２〜８℃における最長６ヶ月の保管に好適に安定でしているであろうことを示している。
【０１５０】
選択された試料を陽イオン交換クロマトグラフィで分析した。全ての場合で、結果は、時間および温度に基づく保管で、より酸性種（アミド分解）への変化を示した。種々の予備凍結乾燥製剤の間で差異はなかった。アミド分解は、概してｐＨ、イオン強度、および特定の緩衝液種の影響を受けるため、この結果は予期される。このデータを以下の表に示す。
【０１５１】
３つの全ての予備凍結乾燥製剤が、研究３Ａおよび３Ｂでの予備凍結乾燥製剤と類似した結果を示した。
【０１５２】
凍結乾燥製剤
以下の表２５は、１５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に到達するように試験された再構成容積を示す。そして、標的濃度に最も近いと判定された再構成容積を残りの研究に使用した。濃度は、各試料が完全に溶解してから確認した。４０８９−１Ｌ、４０８９−１Ｍ、および４０８９−１Ｎに使用された再構成容積は、それぞれ０．８５、１．０、および１．１ｍＬであった。
【０１５３】
【表２５】
2010530003.tif 000061
【０１５４】
以下の表２６は、再構成試料から１ｍＬの用量を除去する能力を示す。これは、１．１ｍＬに再構成された４０８９−１Ｎについてのみ可能であった。これらのデータは、１５０ｍｇ／ｍＬの１ｍＬの提供可能な最終容積を生成するには、５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で４ｍＬの充填容積が必要であることを示している。
【０１５５】
【表２６】
2010530003.tif 000062
【０１５６】
安定性
目視検査では、全ての製剤が許容可能な凍結乾燥ケーキを有すると思われ、４ｍＬの容積が５ｍＬのバイアル中で凍結乾燥に成功し得ることを証明している。再構成後、全ての製剤の外観は、無色でわずかに乳白色、目視による微粒子は全くなかった。５℃または４０℃では、外観は経時的に変化しなかった。分析の変動内でタンパク質濃度の変化を示した試料はなく、傾向は観察されなかった。３６０ｎｍの吸光度で測定された全ての製剤の混濁度は、５℃において６ヶ月後、約０．０９９〜０．１０４から０．１１１〜０．１１６にわずかに上昇した。４０℃における予備凍結乾燥試料は、全ての製剤について混濁度の経時的上昇を示した。
【０１５７】
凍結乾燥ケーキの水分率は、カールフィッシャー電量滴定装置の測定で４．３〜５．６の範囲であった。４０８９−１Ｌ、４０８９−１Ｍ、および４０８９−１Ｎの平均水分率は、それぞれ４．５、５．２、および４．９であった。これらの試料では水分が比較的高かった。
【０１５８】
本研究の再構成時間は、全て１７分未満であった。図４は、４０℃における再構成時間を示す。４０℃における保管時、再構成時間のわずかな増加傾向があるようである。また、高出発タンパク質濃度の試料も再構成時間が長い傾向を示している。これは、前の研究（研究ＡおよびＢ）でも注目されたことである。
【０１５９】
全ての製剤についてダイマー、高分子量の凝集物、および低分子量種の形成を観測した。表形式の結果を、以下の表に示す。
【０１６０】
図５は、４０℃における高分子量種の形成を示す。この温度での保管の間、明確な高分子量種の形成の傾向がある。凝集物の形成の速度は、製剤４０８９−１Ｌでわずかに遅いようであった。理論に束縛されるものではないが、これは、出発製剤の低タンパク質濃度またはわずかに高いショ糖対タンパク質比のいずれかによるものであり得る。
【０１６１】
５℃では、６ヶ月の保管の間いずれの製剤においても高分子量種のレベルに変化はなく、これは種々の時点のＨＭＷ％に示される。
【０１６２】
図６は、４０℃における低分子量種の形成を示す。低分子量種の形成の急速な増加を呈した予備凍結乾燥試料とは対照的に、凍結乾燥試料は８週に渡り変化を示さなかった。５℃で保管された試料について、６ヶ月の期間に渡り、低分子量種の割合に変化はなかった。本データは別表に示すが、本明細書には図示していない。
【０１６３】
図７は、高分子量種および低分子量種の両方の形成による、４０℃におけるモノマーの総消失率を示す。５℃では、本質的にモノマー率の変化はなかった。これは、これらの製剤のいずれもが、凍結乾燥製剤として２〜８℃における最長６ヶ月の保管に好適に安定でしているであろうことを示している。
【０１６４】
試料は、陽イオン交換クロマトグラフィでも分析した。全ての場合、結果は、４０℃において８週間後、より塩基性種への変化を示した。電荷分布には検定の変動内のほんのわずかな変化しかなかった。また、選択試料は、その時点でより酸性種へのわずかな変化も示した。本データを以下の表の最後の欄に酸性％、主％、および塩基性％として示す。
【０１６５】
再構成安定性
５℃または４０℃のいずれかにおける４週間の保管後、試料を再構成し、次いで再構成安定性に５℃および２５℃に１週間置いた。初期時点および１週時に試験を行った。別表の表は、全ての製剤について記録された全ての結果を含む。目視検査では、全ての製剤の外観は無色でわずかに乳白色であった。２つを除く全ての試料が微粒子を含まないように思われた。「綿毛状」の白色微粒子を含む２本のバイアルを、再構成の前に４０℃で保管し、次いで１週間２５℃で保管した。初期時点の試験のために開封した際、分析者がこれらのバイアルを汚染した可能性がある。分析の変動内でタンパク質濃度の変化を示した試料はなく、傾向は観察されなかった。３６０ｎｍの吸光度で測定された全ての製剤の混濁度は、５℃または２５℃のいずれかにおける１週間後、分析の変動内で変化を示さなかった。
【０１６６】
全ての製剤について、ダイマー、高分子量（凝集物）、および低分子量種の形成を観測した。結果を以下の表に示す。再構成し、５℃または２５℃に１週間置いた後、いずれの製剤においても高分子量種のレベルに変化はなかった。低分子量種のレベルは、再構成後２５℃における保管時わずかに上昇したようであり、５℃における再構成後の保管後は本質的に同じであり続けた。これらの結果は、再構成し、その後５℃または２５℃に１週間置いた場合、全ての製剤が安定なままであろうことを示している。
【０１６７】
再構成安定性用に５℃で保管された試料は、陽イオン交換クロマトグラフィでも分析した。３つの全ての製剤についての結果は、再構成前のそれらの保管温度に関わらず、１週間後、より酸性種のわずかな増加を示した。再構成前に５℃で保管されていた試料も、１週間の保管後、より塩基性種へのわずかな変化を示した。再構成の前に４０℃で保管された試料は、５℃における１週間の保管後、それほどより塩基性種への変化を示さなかった。これらの変化は非常に軽微であり、タンパク質への実際の変化というよりも検定の変動性をより示している可能性がある。
【０１６８】
結論
前述の研究４は、４ｍＬの容積が５ｍＬのＫｉｍｂｌｅバイアル中での凍結乾燥に成功し得、許容可能なケーキ構造を有することを示した。
【０１６９】
１５０ｍｇ／ｍＬの標的タンパク質濃度を生じると判定された再構成容積は、４０８９−１Ｌ（４０ｍｇ／ｍＬの予備凍結乾燥濃度）については０．８５ｍＬ、４０８９−１Ｍ（４５ｍｇ／ｍＬの予備凍結乾燥濃度）については１．０ｍＬ、および４０８９−１Ｎ（５０ｍｇ／ｍＬの予備凍結乾燥濃度）については１．１ｍＬであった。４０８９−１Ｎは、１ｍＬの用量を提供できる唯一の製剤であり、１．１ｍＬの水が必要とされる最小再構成容積であることを示している。これらの結果を用いて、充填容積、総固体および再構成容積に関して明らかになった最終提示を導くことができる。一般に、より低い初期タンパク質濃度およびより高いショ糖対タンパク質比を有する試料が、より短い再構成時間およびモノマーの消失に関してわずかに良好な安定性を示した。充填容積および再構成容積に基づき、これは、より低い最終タンパク質濃度がより望ましい生成物を生じ得ることを示している。
【０１７０】
再構成安定性は、５℃および２５℃における１週間の保管時、モノマーの消失もなく、安定であることを示した。
【０１７１】
３つの全ての予備凍結乾燥製剤は、６ヶ月に渡り５℃で安定し続けた。しかしながら、４０℃における保管時、全ての製剤が低分子量種の量の増加傾向を示した。その速い形成速度を鑑みると、低分子量種の形成が液体試料における重要な分解経路であると思われる。
【０１７２】
また、凍結乾燥製剤は、５℃で最長６ヶ月安定であることが判明した。４０℃における保管時、高分子量種の量に明確な増加傾向があったが、一方低分子量種の量は同じままであった。これは、高分子量種の形成が凍結乾燥試料におけるより重要な分解経路であることを示している。残留水分レベルおよびショ糖対タンパク質比のさらなる最適化により、安定性が改善されるはずである。
【０１７３】
【表２７】
2010530003.tif 000063
【０１７４】
【表２８】
2010530003.tif 000064
【０１７５】
【表２９】
2010530003.tif 000065
【０１７６】
【表３０】
2010530003.tif 000066
【０１７７】
【表３１】
2010530003.tif 000067
【０１７８】
【表３２】
2010530003.tif 000068
2010530003.tif 000069
【０１７９】
【表３３】
2010530003.tif 000070
【０１８０】
【表３４】
2010530003.tif 000071
【０１８１】
【表３５】
2010530003.tif 000072
2010530003.tif 000073
【０１８２】
【表３６】
2010530003.tif 000074
【０１８３】
【表３７】
2010530003.tif 000075
【０１８４】
ナタリズマブ再製剤化の進展
【表３８】
2010530003.tif 000076
【０１８５】
実施例４
本研究の目的は、実験計画を用いて、ナタリズマブの凍結乾燥が凝集物の形成を防止および最小限に抑えるための、最終タンパク質濃度の効果、および最適なタンパク質対ショ糖比を決定することであった。
【０１８６】
実験計画パラメータ
４０ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を１：１００〜１：５００のタンパク質対ショ糖比で調べた。ポリソルベート８０の濃度は、１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質当たり０．０１％の量で一定に保持され、ヒスチジンは４０ｍｇ／ｍＬのタンパク質当たり１０ｍＭで一定に保持される。出発タンパク質濃度（予備凍結乾燥）は４０ｍｇ／ｍＬになる。バイアルを２ｍＬ充填で充填し、次いで所望の最終タンパク質濃度に再構成した。
摂氏４０℃における短期安定性を０、２、４、および６週時に調べた。
手順：
１．    以下の緩衝液のうちの１つに対して現製剤を膜分離する。次いで、＞４０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に限外濾過する。タンパク質濃度を測定し、４０ｍｇ／ｍＬに希釈する。
ａ．    製剤ＳＡ：１００：１  ショ糖：タンパク質比―最終製剤７、８、９
ｂ．    製剤ＳＢ：３００：１  ショ糖：タンパク質比―最終製剤１、２、５、６、１０
ｃ．    製剤ＳＣ：５００：１  ショ糖：タンパク質比―最終製剤３、４、１１
２．    各製剤の２０本のバイアルを２ｍＬ／バイアルで充填する。これを、４０℃における安定性用に１０本のバイアル、Ｔｇ、水分、ＦＴＩＲ分析、重量モル浸透圧濃度等用にさらなるバイアルに配分する。必要量：
ａ．    製剤ＳＡ：１２０ｍＬ
ｂ．    製剤ＳＢ：２００ｍＬ
ｃ．    製剤ＳＣ：１２０ｍＬ
３．    水分を減少させるために保存的周期を用いてバイアルを凍結乾燥し、所望のタンパク質濃度に再構成する。
ａ．    製剤４、６、８―２ｍＬで４０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に再構成
ｂ．    製剤１、２、５、６、１０―０．８ｍＬで１００ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得るように再構成
ｃ．    製剤１、３、９―０．５ｍＬで１６０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得るように再構成
４．    混濁度、濃度、外観、ＳＥＣについて、２、４、および６週時に４０度での安定性を調べる。０および６週時に、ＩＥＸ、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および酸化等の追加検定を行うことができる。
【０１８７】
【表３９】
2010530003.tif 000077
【０１８８】
【表４０】
2010530003.tif 000078
2010530003.tif 000079
【０１８９】
【表４１】
2010530003.tif 000080
2010530003.tif 000081
【０１９０】
【表４２】
2010530003.tif 000082
2010530003.tif 000083
【０１９１】
【表４３】
2010530003.tif 000084
2010530003.tif 000085
【０１９２】
【表４４】
2010530003.tif 000086
2010530003.tif 000087
【０１９３】
【表４５】
2010530003.tif 000088
2010530003.tif 000089
【０１９４】
【表４６】
2010530003.tif 000090
2010530003.tif 000091
【０１９５】
【表４７】
2010530003.tif 000092
2010530003.tif 000093
【０１９６】
【表４８】
2010530003.tif 000094
2010530003.tif 000095
【０１９７】
【表４９】
2010530003.tif 000096
2010530003.tif 000097
【０１９８】
【表５０】
2010530003.tif 000098
2010530003.tif 000099
【０１９９】
【表５１】
2010530003.tif 000100
【０２００】
【表５２】
2010530003.tif 000101
【０２０１】
【表５３】
2010530003.tif 000102
【０２０２】
【表５４】
2010530003.tif 000103
【０２０３】
【表５５】
2010530003.tif 000104
【０２０４】
【表５６】
2010530003.tif 000105
実施例25A、B、C、およびDも参照のこと。
【０２０５】
【表５７】
2010530003.tif 000106
【０２０６】
実施例５
本明細書に記載される製剤は、ナタリズマブ、ショ糖、ヒスチジン、およびポリソルベート８０を含有する凍結乾燥ケーキである。予備凍結乾燥バルクは、４０ｍｇ／ｍＬの抗体、４１ｍｇ／ｍＬのショ糖、０．０４％のポリソルベート８０、および６ｍＭのヒスチジンＨＣＩ（ｐＨ６．０）を含有する。これをバイアル当たり４ｍＬで充填し、凍結乾燥し、１．０ｍＬの水で１２０ｍｇ／ｍＬ、１２３ｍｇ／ｍＬのショ糖、０．１２％のポリソルベート８０、および１８ｍＭのヒスチジンＨＣＩ（ｐＨ６．０）に再構成した。
【０２０７】
予備凍結乾燥ナタリズマブ組成物は、ＢｉｏｇｅｎＩｄｅｃにより提供された。それをリン酸緩衝生理食塩水に製剤化し、硫酸アンモニウム溶液に処理した。次いで、この材料を製剤緩衝液に膜分離し（ポリソルベートなしで）、４０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。次いで、適当量のポリソルベート８０を添加し、材料をポリプロピレンのビンに滅菌濾過し、充填および凍結乾燥前に２〜８℃で４週間保管した。充填および凍結乾燥は、書面によるバッチ記録を使用して非ＧＭＰ室で行った。充填前に該室を衛生化し、全ての充填作業を層流フード下で行った。Ｖｉｒｔｉｓ  Ｇｅｎｓｉｓ  ２５  ＥＬ凍結乾燥器を使用して凍結乾燥を行った。
【０２０８】
安定性研究は３部門からなり、１つでは推奨保管温度（２〜８℃）で最長１年間、および２５℃の加速温度で最長６ヶ月、予備凍結乾燥ナタリズマブ組成物の安定性を調べた。凍結乾燥組成物のバイアルは、推奨保管温度（２〜８℃）で１２ヶ月間、２５℃で６ヶ月間、および４０℃で３ヶ月間保管した。２〜８℃の部門からの種々の時点のバイアルを再構成し、２〜８℃（推奨温度）および２５℃（加速）の両方で１週間保管した。
外観、Ａ２８０、ｐＨ、非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、陽イオン交換クロマトグラフィ、およびサイズ排除クロマトグラフィについて、品質管理安定性試験を行った。
【０２０９】
材料、方法、および試験時点
以下の試料を試験する。
【表５８】
2010530003.tif 000107
【０２１０】
【表５９】
2010530003.tif 000108
【０２１１】
【表６０】
2010530003.tif 000109
【０２１２】
【表６１】
2010530003.tif 000110
【０２１３】
【表６２】
2010530003.tif 000111
【０２１４】
再構成安定性
以下の時点で４本のバイアルを２〜８℃から抜き、再構成し、次いで２〜８℃および２５℃で１週間置き、再構成された材料の安定性を調べた。分析機器および時間を簡略化するために、これらの試料を予定された時点の１週間前に抜き、再構成し、所望の温度で置き、次いで他の試料と共に検定した。
【０２１５】
【表６３】
2010530003.tif 000112
【０２１６】
データ
別表Ａ：各条件毎に置かれるバイアルの総数。注：２〜８℃の数字には、必要に応じて初期時点の試験が含まれる。
【表６４】
2010530003.tif 000113
【０２１７】
【表６５】
2010530003.tif 000114
【０２１８】
材料、方法、および試験時点
【表６６】
2010530003.tif 000115
【０２１９】
【表６７】
2010530003.tif 000116
【０２２０】
検定に必要な修正
サイズ排除クロマトグラフィは、データ収集がＡ２８０ｎｍの波長で行われることを含むように修正する。
理由：約４０μｇ〜４００μｇのカラム上の質量の増加は必然的に低感度の波長の使用を伴う。
第３．５節  表５：該表は、初期時点の試験、３ヶ月および１２ヶ月もしくは研究終了時に合計４本のバイアルが必要であることを示すように修正される。
理由：この表は、水分試験のためにこれらの時点で２本の追加のバイアルが必要であったことを考慮に入れることを怠っている。本試験は破壊性であり、したがってバイアルの内容物をさらなる使用のために回復することはできない。
【０２２１】
【表６８】
2010530003.tif 000117
【０２２２】
【表６９】
2010530003.tif 000118
2010530003.tif 000119
【０２２３】
【表７０】
2010530003.tif 000120
【０２２４】
【表７１】
2010530003.tif 000121
2010530003.tif 000122
【０２２５】
【表７２】
2010530003.tif 000123
2010530003.tif 000124
【０２２６】
【表７３】
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【０２２７】
【表７４】
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【０２２８】
【表７５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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