(57)【要約】  細胞増殖システムおよび使用方法が提供される。細胞増殖システムは、中空繊維細胞成長チャンバー、ならびに第１のおよび第２の循環ループ（キャピラリー内ループおよびキャピラリー外ループ）を一般に含み、これらのループは、それぞれ中空繊維の内部および中空繊維の外側に連結される。着脱可能流れ回路および細胞を増殖する方法も提供される。【選択図】    図１Ａ
2010519937.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、細胞増殖システム：
ａ）次を含む、第１の液体循環経路
ｉ）少なくとも対向する末端を備える第１の液体流路、ここにおいて、前記第１の液体流路の第１の対向する末端は中空繊維膜を含む細胞成長チャンバーの第１のポートに流動的に連結されており、前記第１の液体流路の第２の末端は前記細胞成長チャンバーの対向する末端に流動的に連結されており、前記第１の液体流路は、前記中空繊維膜のキャピラリー内部分に流動的に連結されている、および
ｉｉ）前記第１の液体流路に実施可能な状態で連結する第１の流れ制御器；
ｂ）次を含む、第２の循環経路
ｉ）少なくとも対向する末端を備える第２の液体流路、ここにおいて、前記第２の液体流路の第１の対向する末端は前記細胞成長チャンバーの第３のポートに流動的に連結されており、前記第２の液体流路の第２の対向する末端は前記細胞成長チャンバーの第４のポートに流動的に連結されており、前記第２の液体流路は、前記中空繊維膜のキャピラリー外部分に流動的に連結されており；および
ｉｉ）前記第２の閉回路経路に実施可能な状態で連結する第２の液体制御器；
ｃ）液体を前記第１の循環経路に流すための、前記第１の循環経路に流動的に連結する第１の液体注入路；および
ｄ）少なくとも１つの前記第１のまたは第２の循環経路に流動的に連結する第１の液体排出路；および。
【請求項２】
前記第１の液体注入路または前記第１の液体排出路の１つに実施可能な状態で連結されている第３の液体制御器を更に含む、請求項１に記載の細胞増殖システム。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、ここにおいて、前記第１の液体制御器および第２の液体制御器が、ポンプ、バルブならびにポンプおよびバルブの組み合わせから成る群からそれぞれ独立に選択される細胞増殖システム。
【請求項４】
請求項２１に記載の細胞増殖システムであって、ここにおいて、前記第３の液体制御器が、ポンプ、バルブまたはポンプおよびバルブの組み合わせから成る群から選択される細胞増殖システム。
【請求項５】
請求項２に記載の細胞増殖システムであって、ここにおいて、前記第３の液体制御器が前記第１の液体注入路に実施可能な状態で連結し、前記第１の液体排出路に実施可能な状態で連結した第４の液体制御器をさらに含む細胞増殖システム。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、少なくとも対向する末端を備える第３の液体経路を更に含み、ここにおいて、前記第３の液体経路の第１の対向する末端は第１の循環経路に流動的に連結しており、第３の液体経路の第２の対向する末端は前記第２の循環経路に流動的に連結している細胞増殖システム。
【請求項７】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、前記第３の液体制御器がポンプおよびバルブを含む細胞増殖システム。
【請求項８】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、前記細胞成長チャンバーが、前記第１の液体流路における培地が、前記細胞成長チャンバーの前記第２の液体流路と反対の方向に流れるよう構成されている細胞増殖システム。
【請求項９】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、前記細胞成長チャンバーが、前記第１の液体流路における培地が、前記細胞成長チャンバーの前記第２の液体流路と同一の方向に流れるよう構成されている細胞増殖システム。
【請求項１０】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、対向する末端を有するコネクター流れ経路を更に含み、前記コネクター流れ経路の一末端は前記第１の液体流路に流動的に連結しており、前記コネクター流れ経路の第２の末端は前記第２の液体流路に流動的に連結している細胞増殖システム。
【請求項１１】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、前記第２の循環経路に流動的に連結し、第５の液体制御器に実施可能な状態で連結している第２の液体補給ラインを更に含む細胞増殖システム。
【請求項１２】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、ここにおいて、前記第２の液体補給ラインは、前記第１の循環路経路に流動的に連結しており、第５の液体制御器に実施可能な状態で連結している細胞増殖システム。
【請求項１３】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、前記第１のまたは第２の液体流路はガス交換器を含む細胞増殖システム。
【請求項１４】
請求項１３に記載の細胞増殖システムであって、前記第２の液体流路は前記ガス交換器を含む細胞増殖システム。
【請求項１５】
請求項１３に記載の細胞増殖システムであって、前記ガス交換器が、ガス交換器ハウジングに配置されたガス交換器注入ポートおよびガス交換器排出ポート、前記ガス交換器注入ポートおよび前記ガス交換器排出ポートにそれぞれが流動的に連結した多数のガス交換器中空繊維、ならびに、前記ガス交換器中空繊維の外側と前記ガス交換器ハウジングとの間におけるガス交換器ガス空間を含む細胞増殖システム。
【請求項１６】
請求項１３に記載の細胞増殖システムであって、前記ガス交換器が、ガスを前記ガス空間に流すための、前記ガス交換器ハウジングに設置されるガス注入ポートおよびガス排出ポートを更に含む細胞増殖システム。
【請求項１７】
更にロッカーを含む、請求項１に記載の細胞増殖システム。
【請求項１８】
請求項１７に記載の細胞増殖システムであって、前記ロッカーが、前記細胞成長チャンバーを、前記細胞成長チャンバーの中心軸の周りに回転させる細胞増殖システム。
【請求項１９】
請求項１７に記載の細胞増殖システムであって、前記ロッカーが、前記細胞成長チャンバーを、前記成長チャンバーの中心軸に垂直な軸の周りに回転させる細胞増殖システム。
【請求項２０】
以下を含む、細胞増殖システムの一部に装着されるよう構成される着脱可能流れ回路：
ａ）少なくとも対向する末端を備える第１の液体流路を含む第１の循環経路、ここにおいて、前記第１の液体流路の第１の末端は細胞成長チャンバーの第１の末端に流動的に連結するよう構成されており、前記第１の液体流路の第２の末端は前記細胞成長チャンバーの対向する末端に流動的に連結するよう構成されている；
ｂ）少なくとも対向する末端を備える第２の液体流路、ここにおいて、前記第２の液体流路の一末端は前記細胞成長チャンバーに流動的に連結するよう構成されており、前記第２の液体流路の第２の対向する末端は前記細胞成長チャンバーに流動的に連結するよう構成されている。
【請求項２１】
前記液体流路に流動的に連結された第１の液体注入路を更に含む、請求項２０に記載の流れ回路。
【請求項２２】
少なくとも１つの前記第１のまたは第２の液体流路に流動的に連結された第１の液体排出路を更に含む、請求項２１に記載の流れ回路。
【請求項２３】
以下を含む、請求項１に記載の細胞増殖システムにおいて細胞の集団を増殖する方法：
請求項１に記載の細胞増殖システムの第１の液体流路に細胞を添加すること；
前記細胞をインキュベートし、増殖した細胞の集団を作製すること。
【請求項２４】
前記増殖した細胞の集団の少なくとも一部を収集することを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が幹細胞である請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が接着性幹細胞である請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が非接着性幹細胞である請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、細胞成長チャンバーに関連する細胞増殖システム（ＣＥＳ）およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願は、米国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下、米国仮出願第６０／８９２，９０８号（２００７年３月５日出願）；第６０／８９２，９６６号（２００７年３月５日出願）；第６０／８９２，９１１号（２００７年３月５日出願）；第６０／８９２，９７７号（２００７年３月５日出願）；第６０／９１１，３９３号（２００７年４月１２日出願）；第６０／９１１，５９４号（２００７年４月１３日出願）；および第６０／９７１，４９４号（２００７年９月１１日出願）の利益を請求し、これらの出願は、その全体が本願に援用される。
【０００３】
ＣＥＳは、細胞を増殖させ、生育させおよび分化させるために使用される。いくつかの既知の細胞増殖システムが当該分野で既知である。例えば、米国特許第５，１６２，２２５号および米国特許第６，００１，５８５号は、細胞増殖のために設計された細胞増殖システムについて一般的に記載している。
【０００４】
様々な潜在的な治療および療法における、幹細胞の可能性は特別な注目を得ている。ドナー細胞から増殖した幹細胞は、損傷を受けたまたは欠損のある組織を修復または交換するために使用でき、且つ、広範囲の疾病のための広い臨床応用を有する。再生医療分野における近年の前進は、幹細胞が、高い増殖速度および自己再生能力、非分化の状態の維持といったユニークな特性および特定の条件下で特殊化した細胞に分化する能力を有することを実証したことである。
【０００５】
細胞増殖システムは、幹細胞並びにその他の種の細胞を生育するために使用することができる。接着細胞ならびに非接着細胞の生育および様々な細胞種の共培養のために使用できる細胞増殖システムに対する必要性が存在する。柔軟なシステムにおいて、細胞に十分な栄養を供給し、代謝物質を除去し並びに細胞増殖の助けになる生理化学的環境を供給する能力は、継続する課題である。本願の開示は、これらおよびその他の必要性に取り組む。
【発明の概要】
【０００６】
一側面において、本願開示は、少なくとも対向する末端を備える第１の液体流路を有する第１の循環経路を含むＣＥＳに関する。第１の液体流路の対向する末端は、細胞成長チャンバーに配列された多くの中空繊維の対向する末端と流動的に連結されており、液体は、第１の循環経路を通って循環して流れることができる。第１の流れ制御器は、第１の液体流路に実施可能な状態で繋がっている。
【０００７】
細胞増殖システムはさらに第２の循環経路を含む。第２の循環経路は、少なくとも対向する末端を備える第２の液体流路を含む。第２の液体流路の第１および第２の末端は、細胞成長チャンバーと流動的に連結されている。第２の液体流路の一部は、細胞成長チャンバーにおいて、１以上の膜の対向する面と流動的に接触している。第２の液体制御器は、第２の閉回路経路に実施可能な状態で繋がっている。
【０００８】
細胞増殖システムは、さらに、第１の循環経路と流動的に連結され且つ第３の液体制御器に実施可能な状態でつながれた第１の液体補給ラインを含む。細胞増殖システムは、さらに、第１のまたは第２の循環経路と流動的に連結されている第１の液体排出路を含む。様々な実施態様において、第１の液体注入路または第１の液体排出路は、第３の液体流れ制御器に実施可能な状態で連結されている。
【０００９】
様々な実施態様において、ＣＥＳは、第１の液体循環経路における液体培地が第２の液体流路における液体培地の方向と反対の方向に流れるように（「向流」）構成することができる。あるいは、ＣＥＳは、第１の液体循環経路における液体培地が第２の液体流路における液体培地と同じ方向に流れるように（「並流」）構成することができる。
【００１０】
様々な付加的な側面において、ＣＥＳは、ＣＥＳを大気に暴露することなく培地を第１のまたは第２の液体循環経路に添加する構成にできる。
【００１１】
その他の側面において、ＣＥＳはさらに酸素付加器を含む。特定の変形例において、酸素付加器は、酸素付加器ハウジングにおいて配列された、酸素付加器注入および排出口を含む。酸素付加器は、第１の循環経路または第２の循環経路の一部でありえる。酸素付加器は、これにより、酸素および／またはその他のガスを第１のまたは第２の液体循環経路に供給する。
【００１２】
その他の様々な側面において、本願開示は、細胞増殖システムにおける細胞を増殖する方法に関する。一般に、細胞はＣＥＳの第１の液体流路に添加される。細胞は、その後、増殖した細胞の集団を生産するのに適した条件下で培養される。その後、この増殖した集団を収集することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、細胞増殖システムの一実施態様の流れ図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、細胞増殖システムの一実施態様の流れ図を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、細胞増殖システムの別の実施態様の流れ図を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、図１Ｂと同様のＣＥＳの実施態様を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＣＥＳの操作の際に、細胞成長チャンバーを回転または水平方向に移動するためのロッキング装置を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、細胞増殖システムの一実施態様の流れ図を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、細胞成長チャンバーの中空繊維細胞成長チャンバー実施態様の側面図を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａの中空繊維細胞成長チャンバー実施態様の断面側面図を示す。
【図３】図３は、ＭＳＣのフラスコ調製サンプルにおける、コロニー数の関数としての間葉系幹細胞（ＭＳＣ）倍加時間（α）を示す。
【図４】図４は、ＭＳＣコロニーの数に対する骨髄齢の効果を示す。
【図５】図５は、ＭＳＣ倍加時間（アルファ）に対する骨髄齢の効果を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、図１ＤのＣＥＳをプライミングするためのフローチャートプロトコールを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図１ＤのＣＥＳをプライミングするためのフローチャートプロトコールを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、図１ＤのＣＥＳをプライミングするためのフローチャートプロトコールを示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、図１ＤのＣＥＳをプライミングするためのフローチャートプロトコールを示す。
【図７】図７は、図１ＤのＣＥＳを排出するためのフローチャートプロトコールを示す。
【図８】図８は、図１ＤのＣＥＳにおいてドリップチャンバーＤ１を満たすためのフローチャートプロトコールを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、図１ＤのＣＥＳにおいて第１のおよび第２の液体循環経路にて培地を交換するためのフローチャートプロトコールを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図１ＤのＣＥＳにおいて第１のおよび第２の液体循環経路にて培地を交換するためのフローチャートプロトコールを示す。
【図１０】図１０は、図１ＤのＣＥＳの細胞成長チャンバーに細胞を充填するためのフローチャートプロトコールを示す。
【図１１】図１１は、図１ＤのＣＥＳの細胞成長チャンバーに細胞を充填するためのフローチャートプロトコールを示す。
【図１２】図１２は、図１ＤのＣＥＳに骨髄細胞を充填するためのフローチャートプロトコールを示す。
【図１３】図１３は、図１ＤのＣＥＳにおいて細胞を生育するためのフローチャートプロトコールを示す。
【図１４】図１４は、図１ＤのＣＥＳから細胞を収集するためのフローチャートプロトコールを示す。
【図１５】図１５は、図１ＤのＣＥＳから細胞を収集するためのフローチャートプロトコールを示す。
【図１６】図１６は、図１ＤのＣＥＳの細胞成長チャンバーをロッキングするためのフローチャートプロトコールを示す。
【図１７】図１７は、図１ＤのＣＥＳの細胞成長チャンバーからガスを除去するためのフローチャートプロトコールを示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、図１ＤのＣＥＳの中空繊維バイオリアクターにおける細胞成長のための異なる細胞成長プロトコールを使用するために試験される細胞表面マーカーの発現レベルを示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、図１ＤのＣＥＳの中空繊維バイオリアクターにおける細胞成長のための異なる細胞成長プロトコールを使用するために試験される細胞表面マーカーの発現レベルを示す。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、図１ＤのＣＥＳの中空繊維バイオリアクターにおける細胞成長のための異なる細胞成長プロトコールを使用するために試験される細胞表面マーカーの発現レベルを示す。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本願の開示は、一般に、細胞増殖システムおよびその使用方法に関する。
【００１５】
細胞増殖システム（ＣＥＳ）の典型的な概略図は、図１Ａに示される。ＣＥＳ１０は、第１の液体循環経路１２および第２の液体循環経路１４を含む。第１の液体流路１６は、中空繊維細胞成長チャンバー２４（ここでは「バイオリアクター」とも言及される）と流動的に連結されている少なくとも対向する末端１８および２０を有する。特に、対向する末端１８は、細胞成長チャンバー２４の第１の注入２２と流動的に連結されており、対向する末端２０は、細胞成長チャンバー２４の第１の出口２８と流動的に連結されている。第１の循環経路１２における液体は、細胞成長チャンバー２４に配置された中空繊維膜５０の中空繊維の内部を通って流れる。（細胞成長チャンバーおよび中空繊維膜は、以下に詳述する）。さらに、第１の液体流れ制御器３０は、実施可能な状態で第１の液体流路１６に接続され、第１の循環経路１２における液体の流れを制御する。
【００１６】
第２の液体循環経路１４は、第２の液体流路３４、細胞成長チャンバー２４および第２の液体流れ制御器３０３２を含む。第２の液体流路３４は、少なくとも対向する末端３６および３８を有する。第２の液体流路３４の対向する末端３６および３８は、それぞれ細胞成長チャンバー２４の注入口４０および排出口４２に流動的に連結されている。細胞成長チャンバー２４を通って流れる液体は、細胞成長チャンバー２４中の中空繊維膜５０の外部に接している。第２の液体循環経路１４は、第２の液体流れ制御器３２に実施可能な状態で接続される。
【００１７】
第１のおよび第２の液体循環経路１２および１４は、したがって、中空繊維膜５０によって細胞成長チャンバー２４内で分離されている。第１の液体循環経路１２における液体は、細胞成長チャンバーにおける中空繊維のキャピラリー内（「ＩＣ」）の空間を流れる。第１の循環経路１２は、したがって「ＩＣループ」と言及される。第２の循環経路１４における液体は、細胞成長チャンバーにおけるキャピラリー外（「ＥＣ」）の空間を流れる。第２の液体循環経路１４は、したがって「ＥＣループ」と言及される。第１の液体循環経路１２における液体は、第２の液体循環経路１４における液体の流れに対して、並流または向流の方向に流れることができる。
【００１８】
液体注入路４４は、第１の液体循環経路１２と流動的に連結されている。液体注入路４４は第１の液体循環経路１２へと液体を流し、一方、液体排出路４６は液体をＣＥＳ１０から排出させる。第３の液体流れ制御器４８は、液体注入路４４と実施可能な状態で連結されている。あるいは、第３の液体流れ制御器４８は、第１の排出路４６に連結し得る。
【００１９】
ここに使用される液体流れ制御器は、ポンプ、バルブ、クランプまたはそれらの組み合わせでありえる。複数のポンプ、バルブおよびクランプは、任意の組み合わせで準備することができる。様々な実施態様において、液体流れ制御器は、蠕動ポンプであり、または、蠕動ポンプを含む。更なる実施態様において、液体循環経路、注入口および排出口は、任意の材料の管材料で構築することができる。
【００２０】
様々な構成要素は、ここにおいて、「実施可能な状態で連結されている」と言及される。ここに使用される「実施可能な状態で連結されている」とは、実施可能な様式で相互につながれた構成要素を指し、これは、構成要素が直接つながれた実施態様および付加的な構成要素が、２つのつながった構成要素の間に置かれる実施態様を包含する。「実施可能な状態で連結されている」構成要素は、「流動的に連結されている」状態でありえる。「流動的に連結されている」とは、構成要素が、それらの間を液体が輸送され得るように相互につながっていることを指す。「流動的に連結されている」とは、付加的な構成要素が２つの流動的に連結されている構成要素の間に配列されている実施態様並びに直接接続される構成要素を包含する。流動的に連結されている構成要素は、液体と接触しないがシステムを操作するその他の構成要素と接触する構成要素（例えば、チューブの外面を圧搾することでフレキシブルチューブを通して液体を送る蠕動ポンプ）を含むことができる。
【００２１】
一般に、緩衝液、タンパク質含有液および細胞含有液を含む、任意の種類の液体が、様々な循環経路、注入路および排出路を通って流れることができる。ここに使用される「液体」、「培地」および「液体培地」は互換的に使用できる。
【００２２】
細胞成長チャンバー
細胞増殖システムの細胞成長チャンバーは、一般に、第１のおよび第２の液体循環経路を分離する、多くの半浸透性の中空繊維で構成された中空繊維膜を含む。
【００２３】
典型的な細胞成長チャンバーを図２に示す。当該図は、中空繊維細胞成長チャンバー２００の断面側面図である。細胞成長チャンバー２００は、細胞成長チャンバーハウジング２０２によって束ねられている。細胞成長チャンバーハウジング２０２はさらに、４つの口またはポート：注入口２０４、排出口２０６、注入口２０８および排出口２１０を含む。
【００２４】
第１の循環経路における液体は、注入口２０４を通って細胞成長チャンバー２００に入り、多数の中空繊維のキャピラリー内側（様々な実施態様において、中空繊維膜のキャピラリー内（「ＩＣ」）側または「ＩＣ空間」と称される）へ入り且つ通過し、排出口２０６から細胞成長チャンバー２００を出る。「中空繊維」、「中空繊維キャピラリー」および「キャピラリー」という用語は互換的に使用される。多数の中空繊維は総体として「膜」と言及される。第２の循環経路における液体は、注入口２０８を通って細胞成長チャンバーに入り、中空繊維の外側（膜の「ＥＣ側」または「ＥＣ空間」と言及される）に接触し、排出口２０６２１０を通って出口細胞成長チャンバー２００から出る。細胞は、第１の循環経路または第２の循環経路内に包含させることができ、膜のＩＣ側またはＥＣ側のいずれかに存在し得る。
【００２５】
細胞成長チャンバーハウジング２０２は円筒形のものとして描かれているものの、それは当該分野で既知のその他の形とすることもできる。細胞成長チャンバーハウジング２０２は、任意の種類の生物学的適合性高分子材料で作ることができる。様々なその他の細胞成長チャンバーハウジングは、形およびサイズにおいて異なってよい。
【００２６】
当業者であれば、細胞成長チャンバーという用語は、ＣＥＳ中で生育または増殖される全ての細胞が、細胞成長チャンバーにおいて生育することを示唆しないということを認識できるだろう。多くの実施態様において、接着細胞は成長チャンバーに配置された膜に付着することができ、または、連結された管材料内で生育してもよい。非接着細胞（「懸濁細胞」とも言及される）も生育できる。細胞は、第１のまたは第２の液体循環経路内のその他の領域において生育できる。
【００２７】
例えば、中空繊維２１２の末端は、接続材料（ここにおいて「ポッティング」または「ポッティング材料」とも言及される）によって細胞成長チャンバーの側面に収める（ｂｅ  ｐｏｔｔｅｄ）ことができる。ポッティングは、中空繊維の中への培地および細胞の流れを妨害せず、ＩＣ注入口を通って細胞成長チャンバーに流れる液体が中空繊維にのみ流れる限り、中空繊維２１２を束ねるのに適した任意の材料であり得る。典型的なポッティング材料は、ポリウレタンまたはその他の適した結合または粘着性の構成要素を含むが、これらに限定されない。様々な実施態様において、中空繊維およびポッティングは、それぞれの末端において中空繊維の中心軸に垂直にカットし、ＩＣ側面へおよびＩＣ側面から液体を流してよい。末端キャップ２１４および２１６は、細胞成長チャンバーの末端に配置される。
【００２８】
注入口２０８を介して細胞成長チャンバー２００に入る液体は、中空繊維の外側に接する。中空繊維細胞成長チャンバーのこの部分は、「キャピラリー外（ＥＣ）空間」と言及される。小さな分子（例えば水、酸素、乳酸塩など）は、中空繊維の内部からＥＣ空間へまたはＥＣ空間からＩＣ空間へ、中空繊維を通って拡散することができる。成長因子のような大きな分子量の分子は、典型的に、大きすぎるため中空繊維を通り抜けることができず、中空繊維のＩＣ空間に残る。細胞がＩＣ空間で生育する実施態様において、ＥＣ空間は、細胞に栄養素を供給する培地の貯蔵器として使用され、かつ細胞の新陳代謝の副産物を除去する。培地は必要に応じて交換されてよい。培地は、また、必要に応じて酸素付加器を通って循環し、ガスが交換されてよい。
【００２９】
様々な実施態様において、細胞は、シリンジの使用を含む様々な方法の何れによっても中空繊維に充填することができる。細胞は、また、細胞成長チャンバーと流動的に連結されているバッグといった液体容器から細胞成長チャンバーへ導入してよい。
【００３０】
中空繊維は、繊維のキャピラリー内空間（すなわち中空繊維内腔の内部）で細胞が増殖することを可能にする構成とされる。中空繊維は、実質的に中空繊維内腔を通る培地の流れを妨害することなく、内腔にて細胞接着ができる程度に十分大きい。様々な実施態様において、中空繊維の内径は、１００００、９０００、８０００、７０００、６０００、５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、９００、８００、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０または１００ミクロン以上であり得る。同様に、中空繊維の外側の直径は、１００００、９０００、８０００、７０００、６０００、５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、９００、８００、７００、６５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０または１００ミクロン以下であり得る。中空繊維の肉厚は、小さな分子の拡散を可能にするために十分な程度である。
【００３１】
中空繊維が細胞成長チャンバーの注入および排出口と流動的に連結されている限り、任意の数の中空繊維を細胞成長チャンバー内で使用することができる。様々な実施態様において、細胞成長チャンバーは、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００または１２０００以上の多数の中空繊維を含むことができる。その他の実施態様において、細胞成長チャンバーは、１２０００、１１０００、１００００、９０００、８０００、７０００、６０００、５０００、４０００、３０００または２０００以下の多数の中空繊維を含むことができる。その他の様々な実施態様において、中空繊維の長さは、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００または９００ミリメートル以上であり得る。特定の好ましい実施態様において、細胞成長チャンバーは、平均長２９５ｍｍ、平均内径２１５ミクロンおよび平均外径３１５ミクロンの約９０００の中空繊維を含む。
【００３２】
中空繊維は、細胞成長チャンバー注入口から細胞成長チャンバー排出口まで液体を輸送することが可能な繊維の形成に十分なサイズを形成できる何れかの材料で構成することができる。様々な実施態様において、中空繊維は、接着幹細胞（例えばＭＳＣ）といった特定の種の細胞に結合可能なプラスチック製接着材料で構成することができる。様々なその他の実施態様において、中空繊維は、接着表面を形成するために、フィブロネクチンといった化合物で処理することができる。
【００３３】
特定の実施態様において、中空繊維は、半浸透性の生物学的適合性高分子材料で作られてよい。使用可能なそのような高分子材料の１つは、ポリアミド、ポリアリールエーテルスルホンおよびポリビニルピロリドンの混合物（ここにおいて「ＰＡ／ＰＡＥＳ／ＰＶＰ」と言及される）である。半透膜は、ＥＣ空間とＩＣ空間との間における膜を介した、栄養素、廃棄物および溶解ガスの移動を可能にする。様々な実施態様において、中空繊維膜の分子移動の特徴は、成長因子、サイトカイニン等といった細胞増殖に必要な高価な試薬の中空繊維からの喪失を最小化し、一方で、代謝廃棄生成物が、膜を通って中空繊維内腔側へ拡散して除去されることを可能にするよう選択される。
【００３４】
特定の変形例において、それぞれのＰＡ／ＰＡＥＳ／ＰＶＰ中空繊維の１つの外層は、定義された表面の粗さを有する均質で孔の開いた構造によって特徴付けられる。孔の口は０．５−３ｕｍのサイズの範囲であり、繊維の外表面上の孔の数は、１ｍｍ２あたり１０，０００から１５０，０００の範囲である。この外層の厚さは約１〜１０ｕｍである。それぞれの中空繊維における次の層は、スポンジ構造の形態を有した第２の層であり、本発明の好ましい実施態様において、約１〜１５ｕｍの厚さである。この第２の層は、外層の支持として役立つ。第２の層の次の第３の層は、フィンガー様構造の形態を有する。この第３の層は、機械的安定性および高い空隙容量を提供し、これは、膜を通した分子の輸送に対する非常に低い抵抗性を膜に与える。使用の際、フィンガー様空隙は、液体で満たされ、液体は、より低い空隙容量を有するスポンジ充填構造のマトリックスよりも、拡散および対流のためのより低い抵抗性を与える。この第３の層は、２０〜６０ｕｍの厚さを有する。
【００３５】
更なる実施態様において、中空繊維膜は、６５−９５重量％の少なくとも１つの疎水性ポリマーおよび５−３５重量％の少なくとも１つの親水性ポリマーを含み得る。疎水性ポリマーは、ポリアミド（ＰＡ）、ポリアラミド（ＰＡＡ）、ポリアリールエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリアリールスルホン（ＰＡＳＵ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエーテル、ポリウレタン（ＰＵＲ）、ポリエーテルイミドおよび上記のポリマーのうちの任意の共重合体混合物、例えばポリエーテルスルホンまたはポリアリールエーテルスルホンおよびポリアミドの混合物から成る群から選択してよい。付加的な実施態様において、親水性ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリコールモノエステル、水可溶性セルロース化合物誘導体、ポリソルベートおよびポリエチレン−ポリプロピレン酸化物共重合体から成る群から選択してよい。
【００３６】
細胞成長チャンバーにて増殖する細胞の種に応じて、重合体繊維は、細胞増殖および／または膜への細胞の接着の増強するために、フィブロネクチンといった物質で処理してよい。
【００３７】
細胞増殖システム
図２に示されるような細胞成長チャンバーは、細胞増殖システムのその他の構成要素と実施可能な状態で連結されている。
【００３８】
図１Ｂは、より詳細な細胞増殖システム１００を示す。ＣＥＳ１００は、第１の液体循環経路１２６（「キャピラリー内（ＩＣ）ループ」とも言及される」）および第２の液体循環経路１６６を含む。液体の流れの経路は管材料および管材料コンジット（Ｔｙｇｏｔｈａｎｅ，  Ｓｔ．  Ｇｌｏｂａｉｎ）から構築され、バルブ、ポンプ（ＴＲＩＭＡ，  Ｇａｍｂｒｏ）およびその他の構成要素と共に作動する。
【００３９】
細胞成長チャンバー１０２の排出口１５８は、管材料を介して注入口１５６と流動的に連結されており、細胞成長チャンバー１０２と共に第１の液体循環経路１２６を形成する。図１Ｂに示される実施態様において、第１の液体循環経路１２６は、細胞成長チャンバー１０２を通って液体が循環するよう構成される。第１の液体循環経路１２６は、液体が、細胞成長チャンバー１０２、サンプルコイル１６０、ポンプ１４２を通って流れ、細胞成長チャンバー１０２に戻るように構成することができる。細胞は、細胞成長チャンバー１０２から洗い出されまたは中空繊維膜に沿って再分配され得る。
【００４０】
第１の液体循環経路１２６は、さらにサンプルコイル１６０を含む。サンプルコイル１６０は、第１の液体循環経路１２６における液体のサンプルを取得し且つ試験することを可能とする。
【００４１】
ＣＥＳ１００はさらに、第２の液体循環経路１６６（「キャピラリー外ループ」または「ＥＣループ」とも言及される）を含む。第２の液体循環経路１６６は、ポンプ１６８、温度メーター１７０および酸素付加器１０４を含む。第２の液体流路は、酸素付加器注入口１７２に接続され、酸素付加器排出口１７４内に出る。酸素付加器排出口１７４は、注入口１６２によって細胞成長チャンバー１０２に連結しており、細胞成長チャンバー排出口１６４から細胞成長チャンバー１０２を出る。第２の液体循環経路１６６は、液体が、バルブ１３８を通ってドリップチャンバー１８６に流れ、ポンプ１６８に戻るように構成することができる。
【００４２】
第２の液体循環経路１６６は、細胞成長チャンバー１０２における細胞にガスを供給し、さらに細胞が作りだす廃棄代謝物の除去を可能にする。ガスは、フィルタ１５０および１５２を介して、酸素付加器１０４に流れ、且つそこから流れでる。フィルタ１５０および１５２は、酸素付加器または関連する培地の汚染を予防する。培地は、酸素付加器１０４に含まれる繊維を通して、酸素付加器注入口１７２に流れ込み、排出口１７４を通って出る。酸素は、ガス注入口１７６において酸素付加器１０４に入る。酸素付加器におけるガスの濃度は、所望の任意の濃度に出来る。ガスは酸素付加器における繊維を介して拡散する。
【００４３】
第２の液体循環経路１６６に含まれる液体培地は、ガス注入口１７６を通して中へ流れるガスと平衡状態にある。培地に入る酸素の量は、ガス濃度の制御により制御することができる。培地へ拡散する前の気相における酸素のモルパーセント（ここにおいて「体積モル濃度」とも言及される）は、典型的に０％、５％、１０％または１５％以上である。あるいは、ガス中の酸素の体積モル濃度モルパーセントは、２０％、１５％、１０％または５％以下である。特定の好ましい実施態様において、酸素の体積モル濃度は５％である。当該分野にて既知の様々な酸素付加器を同様に使用することができる。任意の商用酸素付加器を使用することができる。好ましい特定の実施態様において、酸素付加器は、１８２０の数、２８０μｍの繊維内径、３８６μｍの繊維外径および１６ｍＬのキャピラリー内液体体積を有する中空繊維を有する。
【００４４】
ＣＥＳ１００は第１の液体注入路１２４を含む。第１の液体注入路１２４は、ドリップチャンバー１８０およびポンプ１８２を含む。液体培地および／または細胞は、ＥＣ培地容器１０６から、バルブ１０７を通って；ＩＣ液体培地容器１０８からバルブ１０９を通って；通気バッグ１１０から、バルブ１１１を通って；または細胞注入バッグ１１２からクランプ１１３を通って流れる。ＩＣ液体培地容器１０８、ＥＣ培地容器１０６、通気バッグ１１０または細胞注入バッグ１１２のそれぞれは、ここに議論されるような液体培地容器である。ＩＣ培地は、一般に、第１の循環経路１２６において循環する培地を指す。ＥＣ培地は、一般に、第２の循環経路１６６において循環する培地を指す。
【００４５】
ドリップチャンバー１８０は、ガスのポケット（例えば気泡）の細胞成長チャンバー１０２への到達の予防を助ける。超音波センサーは、ドリップチャンバー１８０の入り口ポート１２８および出口ポート１３０の付近に配置することができる。入り口ポート１２８におけるセンサーは、ドリップチャンバー１８０における液体が、ＥＣ培地容器１０６、ＩＣ培地容器１０８、通気バッグ１１０、細胞注入バッグ１１２または関連する管材料に逆流することを防ぐ。出口ポート１３０におけるセンサーは、ガスがセンサーの底に達した場合にポンプ１８２を停止し、ガス泡が細胞成長チャンバー１０２に達することを予防する。
【００４６】
ＣＥＳ１００はさらに第２の液体注入路１１４を含む。バルブ１１５が開らいたとき、ポンプ１９０は、第２の液体注入路１１４から第２の液体循環経路１６６へ液体をくみ出すことができる。接続路１１６は、第１の循環経路および第２の循環経路を接続する。ポンプ１１８は、接続路１１６を介して、第２の液体注入路１１４から第１の液体循環経路１２６へと液体をくみ出すことができる。あるいは、液体は、第１の液体循環経路１２６および第２の液体循環経路１６６の間で送り出されることができる。
【００４７】
当業者は、第１の液体循環経路１２６における液体は、第２の液体循環経路１６６における液体と同じ方向（並流）または第２の液体循環経路１６６の反対方向（すなわち向流）のいずれかで、細胞成長チャンバー１０２を通って流れることができるということを認識するだろう。
【００４８】
第１の液体循環経路１２６は、フラッシュライン１３２を通して第１の液体注入路１２４に連結している。フラッシュラインはバルブ１３３を含み、それはその他のバルブおよびポンプと共同して開閉することができ、培地を第１の液体注入路１２４にまたは第１の液体注入路１２４から流すことができる。
【００４９】
同様に、第１のおよび第２の液体流路は液体接続路１３９によって接続されている。バルブ１３１は液体接続路１３９に配置される。バルブ１３１を開き、ＣＥＳ１００中で１以上のポンプを使用することにより、液体は、第１の液体循環経路１２６と第２の液体循環経路１６６との間に移動することができる。
【００５０】
細胞は細胞収集路１３４を介して収集することができる。細胞収集路１３４は、ジャンクション１８８にて、細胞収集バッグ１４０および第１の液体循環経路１２６と流動的に連結されている。細胞収集路１３４はクランプ１１７を使用して閉じることができる。細胞成長チャンバー１０２からの細胞は、細胞収集路１３４を通して細胞収集バッグ１４０に送ることができる。当業者は、クランプ１１７は、様々な実施態様において、バルブ、ポンプまたはそれらの組み合わせで交換し、またはそれらと組み合わせることができると認識するだろう。
【００５１】
ＣＥＳの様々な構成要素を、インキュベータ１９９内に含むことができる。インキュベータ１９９は、細胞および培地を一定温度に維持する。
【００５２】
液体排出路１３６はドリップチャンバー１８６に連結している。液体排出路１３６はドリップチャンバー１８６から廃棄物バッグ１４８に培地を送る。
【００５３】
ここで使用される「培地バッグ」、「通気バッグ」および「細胞注入バッグ」という用語は任意であり、それらの位置はその他のバッグと切り替えることができる。例えば、通気バッグ１１０は、ＩＣ培地容器１０８または細胞バッグ１１２と交換することができる。インプットおよびアウトプットのコントロールおよびパラメーターは、その後、変化に適応させるために調節することができ、その他の培地または構成要素を、明示される培地バッグ、通気バッグまたは細胞注入バッグにかかわらず、それぞれのバッグに添加することができる。さらに、ドリップチャンバーの位置、またはドリップチャンバーから独立したセンサーは、注入口１５６の前にＣＥＳの任意の位置に存在し得ることが留意される。
【００５４】
当業者はさらに、図１ＢのＣＥＳにおけるポンプおよびバルブは、液体流れ制御器として役立つことを認識するだろう。様々な実施態様において、第１の液体循環経路および第２の液体循環経路が液体を循環させるように構成され、流体インプット経路が液体を添加できるように構成されていれば、液体流れ制御器は、任意の順で、ポンプ、バルブまたはそれらの組み合わせとできる。
【００５５】
ＣＥＳは付加的な構成要素を含むことができる。例えば、１以上のポンプループ（図示せず）を、ＣＥＳの蠕動ポンプの位置に加えることができる。蠕動ポンプは、管材料の外面に実施可能な状態で接続され、管材料の外面を収縮させて管材料を通して液体を押し出すことで、流体の流れ経路を通して液体を送り出す。ポンプループは、ポリウレタン（ＰＵ）（Ｔｙｇｏｔｈａｎｅ  Ｃ−２１０Ａとして入手可能）、ネオプレンベースの材料（例えばＡｒｍａｐｕｒｅ，  Ｓｔ．  Ｇｏｂａｉｎ）、またはその他の適切な材料で作ってよい。あるいは、管材料のラインのまとめ且つ蠕動ポンプのための管材料ループを含んでよいカセットを、使い捨て用品の一部として含めてもよい。ＣＥＳの１以上の構成要素をカセットに含めて、管材料の組織化を助けることができる。
【００５６】
様々な実施態様において、ＣＥＳは、ｐＨといった培地特性並びにグルコース、乳酸塩および酸素といった細胞性代謝物質の検知のためのセンサーを含むことができる。センサーは、ＩＣまたはＥＣループの任意の位置にて、ＣＥＳと実施可能な状態で連結できる。任意の様々な市販されるｐＨ、グルコースまたは乳酸塩センサーを使用することができる。
【００５７】
図１Ｃは、ＣＥＳのその他の実施態様を示す。ＣＥＳ３００は、第１の液体循環経路３０２（「キャピラリー内（ＩＣ）ループ」とも言及される）および第２の液体循環経路３０４（「キャピラリー外ループ」または「ＥＣループ」とも言及される）を含む。
【００５８】
第１の液体流路３０６は、細胞成長チャンバー３０８と流動的に連結され、第１の液体循環経路３０２を形成する。液体は、注入口３１０を通って細胞成長チャンバー３０８に流れ込み、細胞成長チャンバー３０８内で中空繊維を通り、排出口３０７から出る。圧力計３１７は、細胞成長チャンバー３０８を出る培地の圧力を測定する。培地は、培地の流速を制御するために使用されるバルブ３１３およびポンプ３１１を通って流れる。培地のサンプルは、作動中は、サンプルポート３０５またはサンプルコイル３０９から得ることができる。第１の液体循環経路に配置された圧力／温度計３１５は、作動中の培地の圧力および温度の検知を可能にする。その後、培地は注入口３１０に戻り、液体循環経路３０２が完成する。細胞成長チャンバー３０８内で増殖した細胞は、細胞成長チャンバー３０８から洗い流すことが可能であり、または、更なる増殖のために中空繊維内に戻すことができる。
【００５９】
第２の液体循環経路３０４は、ループで細胞成長チャンバー３０８と流動的に連結されている第２の液体流路３１２を含む。第２の液体循環経路３０４における液体は、注入口３１４を介して細胞成長チャンバー３０８に入り、排出口３１６を介して細胞成長チャンバー３０８を出る。培地は、細胞成長チャンバー３０８における中空繊維の外側に接し、小さな分子の中空繊維内へのおよび中空繊維からの拡散を可能にする。
【００６０】
第２の循環経路に配置された圧力／温度計３１９は、培地が細胞成長チャンバー３０８のＥＣ空間に入る前における、培地の圧力および温度の測定を可能にする。圧力計３２１は、第２の循環経路における培地が細胞成長チャンバーを出た後における、当該培地の圧力の測定を可能にする。
【００６１】
細胞成長チャンバー３０８の排出口３１６を出た後、第２の液体循環経路３０４における液体は、ポンプ３２０およびバルブ３２２を通って酸素付加器３１８に向かう。第２の液体流路３１２は、酸素付加器注入口３２４および酸素付加器排出口３２６を介して、酸素付加器３１８と流動的に連結されている。作動中、液体培地は、酸素付加器注入口３２４を介して酸素付加器３１８に流れ込み、酸素付加器排出口３２６を介して酸素付加器３１８を出る。
【００６２】
酸素付加器３１８は、ＣＥＳにおいて、培地に酸素を付与する。様々な実施態様において、第２の液体循環経路３０４における培地は、酸素付加器に入るガスと平衡状態にある。酸素付加器は当該分野で既知の任意の酸素付加器であり得る。ガスは、フィルタ３２８を介して酸素付加器３１８に流れ込み、フィルタ３３０を通って酸素付加器３１８から流れ出る。フィルタ３２８および３３０は、酸素付加器３１８および関連する培地の汚染を低減しまたは予防する。
【００６３】
ＣＥＳ３００のために示された配置において、第１の循環経路３０２および第２の循環経路３０４における液体培地は、同じ方向（並流配置）で細胞成長チャンバー３０８を通って流れる。当業者は、ＣＥＳ３００は向流の形態で構成することもできると認識するだろう。当業者は、それぞれの注入および排出口は、細胞成長チャンバーにおいて、任意の位置に配置できると認識するだろう。
【００６４】
細胞および液体培地は、第１の液体注入路３３２を介して液体循環経路３０２に導入することができる。液体容器３３４および液体容器３３６は、それぞれバルブ３３８および３４０を介して、第１の液体注入路３３２と流動的に連結されている。同様に、細胞容器３４２は、バルブ３４３を介して、第１の液体循環経路３０２と流動的に連結されている。細胞および液体は、熱交換器３４４、ポンプ３４６を通って進み、ドリップチャンバー３４８に入る。ドリップチャンバー３４８は、第１の循環経路３０２と流動的に連結されている。ドリップチャンバー３４８からのオーバーフローは、バルブ３５２を介してオーバーフローライン３５０から、ドリップチャンバー３４８を流れ出る。
【００６５】
付加的な液体は、液体容器３５４および液体容器３５６から、第１のまたは第２の液体循環経路３０２および３０４に添加できる。液体容器３５４は、バルブ３５８と流動的に連結されており、当該バルブは、第１の液体注入路３６０を介して第１の液体循環経路３０２と流動的に連結されている。第１の液体流路はバルブ３６４を含む。あるいは、液体容器３５４は、第２の液体注入路３６２と流動的に連結されている。同様に、液体容器３５６は、バルブ３６６と流動的に連結されており、当該バルブは、第１の液体注入路３６０を介して第１の液体循環経路３０２と流動的に連結されている。あるいは、液体容器３６４は、第２の液体注入路３６２と流動的に連結されている。
【００６６】
第２の液体注入路３６２は、液体がドリップチャンバー３７０に入る前にポンプ３６８を通って流れることができるように構成される。第２の液体注入路３６２は第２の液体循環経路３０４に続く。オーバーフロー液体は、オーバーフローライン３７２を経由し、バルブ３７４を通って廃棄物容器３７６に流れ出ることができる。
【００６７】
第２の液体注入路３６２は、液体がドリップチャンバー３７０に入る前にポンプ３６８を通って流れることができるように構成される。第２の液体注入路３６２は第２の液体循環経路３０４に続く。オーバーフロー液体は、オーバーフローライン３７２を経由して、バルブ３７４を通って廃棄物容器３７６に流れ出る。
【００６８】
細胞は細胞収集路３７８を介して収集できる。細胞成長チャンバー３０８からの細胞は、細胞を含む培地を、細胞収集路３７８を通して細胞収集バッグ３８０に送り出すことで収集できる。
【００６９】
第１のおよび第２の液体循環経路３０２および３０４は、接続路３８４によって接続される。バルブ３８６が開かれる場合、培地は、第１のおよび第２の循環経路３０２および３０４の間を、接続路３８４を通って流れることができる。同様に、ポンプ３９０は、第１のおよび第２の液体循環経路３０２および３０４の間を、別の接続路３８８を通って培地を送ることができる。
【００７０】
ＣＥＳの様々な構成要素は、インキュベータ３９９内に含めることができる。インキュベータ３９９は、細胞および培地を一定温度に維持する。
【００７１】
当業者は、任意の数の液体容器（例えば培地バッグ）を、任意の組み合わせで、ＣＥＳと流動的に連結することができると認識するだろう。ドリップチャンバーの位置、またはドリップチャンバーから独立したセンサーは、注入口３１０の前において、ＣＥＳの任意の位置に置くことができることに留意される。
【００７２】
ＣＥＳは付加的な構成要素を含むことができる。例えば、１以上のポンプループ（図示せず）を、ＣＥＳの蠕動ポンプの位置に加えることができる。ポンプループはポリウレタン（ＰＵ）（Ｔｙｇｏｔｈａｎｅ  Ｃ−２１０Ａとして入手可能）で作られていてよい。あるいは、管材料ラインを組織化し、蠕動ポンプのための管材料ループを含んでもよいカセットを、使い捨て物の一部として含めてもよい。
【００７３】
ロッキング装置
ＣＥＳは、回転性および／または横方向性ロッキング装置に取り付けることで、細胞成長チャンバーを細胞増殖システムのその他の構成要素に対して動かすまたは「揺り動かす（ｒｏｃｋ）」よう形成される装置を含むことができる。図１Ｅはそのような装置の１つを示しており、この中で、バイオリアクター４００は、回転するように、２つの回転性振盪構成要素および横方向振盪構成要素に接続されている。
【００７４】
第１の回転性ロッキング装置構成要素４０２は、バイオリアクターの中心軸４１０を中心にバイオリアクターを回転させる。および、横方向性ロッキング装置４０４に、側面に接続されている。回転性ロッキング装置構成要素４０２は、バイオリアクター４００に回転するよう連結している。回転性ロッキング装置は、そして、バイオリアクターの中心軸４１０を中心にバイオリアクター４００を回転させる。回転は、時計回りまたは反時計回りに生じうる。バイオリアクター４００は、時計回りまたは反時計回りの方向で、中心軸４１０を中心に単一の方向に連続的に回転できる。あるいは、バイオリアクター４００は、中心軸４１０を中心に最初に時計回り、次に反時計回りのように、交互の様式で回転できる。
【００７５】
ＣＥＳは、回転軸４１２を中心にバイオリアクター４００を回転させる第２の回転性振盪構成要素を含むこともできる。回転軸４１２はバイオリアクター４００の中点を通り、中心軸４１０に垂直である。バイオリアクター４００は、時計回りまたは反時計回りの方向に回転軸４１２を中心に、単一の方向に連続的に回転することができる。あるいは、バイオリアクター４００は、最初に時計回り、次に反時計回りで、交代の様式で回転軸４１２を中心に回転することができる。様々な実施態様において、バイオリアクター４００は、回転軸４１２を中心に回転することができ、および、重力に対して水平または垂直の方向で位置することができる。
【００７６】
横方向振盪構成要素４０４は、バイオリアクター４００の側面方向に連結している。横方向振盪構成要素４０４の平面は、ｘおよびｙ方向で、横方向に動く。それゆえ、中空繊維内の細胞含有培地の動きによって、バイオリアクターにおける細胞の沈降は低減される。
【００７７】
ロッキング装置の回転性および／または横方向性の移動は、装置内の細胞の沈降を低下させることができ、バイオリアクターの一部に細胞がトラップされる傾向を低下させることができる。細胞成長チャンバーに細胞が沈降する速度は、ストークスの法則に従って、細胞と懸濁培地との間の密度差に比例する。特定の実施態様において、上述するように繰り返される休止（総計時間は３０秒）を有する１８０度の回転（高速）は、非接着性赤血球細胞を懸濁した状態に維持する（データは示さず）。約１８０度の最小回転が好ましい；しかしながら、３６０度以内またはそれ以上の回転も使用できる。異なる振盪構成要素を別々に使用でき、または任意の組み合わせで組み合わせることができる。例えば、中心軸４１０を中心にバイオリアクター４００を回転させる振盪構成要素を、軸４１２を中心にバイオリアクター４００を回転させる振盪構成要素と組み合わせることができる。同様に、異なる軸を中心とする時計回りおよび反時計回りの回転を、任意の組み合わせで独立して行なうことができる。
【００７８】
ロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）をインキュベーションシステム内に含むことができる。一般に、インキュベーションシステムは、特定の温度に構成要素を維持するよう設計される。
【００７９】
着脱可能流れ回路
さらに、着脱可能流れ回路（ここにおいて「着脱可能循環モジュール」とも言及される）が提供される。着脱可能流れ回路は、ＣＥＳにおけるより常設的な固定された一部に備え付けられるよう構成された細胞増殖モジュールの一部である。一般に、ＣＥＳの固定部分は蠕動ポンプを含む。様々な実施態様において、ＣＥＳの固定部分はバルブおよび／またはクランプを含むことができる。
【００８０】
着脱可能流れ回路は、少なくとも対向する末端を有する第１の液体流路を含むことができる。第１の末端は、細胞成長チャンバーの第１の末端と流動的に連結されるよう構成され、第１の液体流路の第２の末端は、細胞成長チャンバーの対向する末端と流動的に連結されるよう構成される。
【００８１】
同様に、着脱可能流れ回路は、少なくとも２つの対向する末端を有する第２の液体流路を含むことができる。着脱可能流れ回路の一部は、酸素付加器および／またはバイオリアクターと流動的に連結されるように構成することができる。着脱可能流れ回路は、酸素付加器および細胞成長チャンバーと流動的に連結されるように形成される第２の液体流路を含むことができる。
【００８２】
様々な実施態様において、着脱可能流れ回路は、液体流れ制御器に着脱可能で且つ使い捨て可能なように取り付けられる。着脱可能流れ回路は、ＣＥＳの一部に接続される着脱可能液体導管（例えばフレキシブルチューブ）を含み得る。図１Ｂ１Ｆに関して、着脱可能流れ回路は、第１の液体循環経路１２６の管材料を含むが、ポンプ１４２を含まない。着脱可能流れ回路は、さらにフラッシュライン１３２の管材料を含み得るが、バルブ１３３を含まない。着脱可能流れ回路はさらに、第１の循環経路１２６をフラッシュライン１３２および第１の液体注入路１２４に接続する管材料を含み得る。その他の様々な置換において、着脱可能流れ回路は、培地注入バッグ１０６および１０８、通気バッグ１１０および細胞注入バッグ１１２をドリップチャンバー１８０に接続する管材料を含み得る。着脱可能流れ回路は、第１の循環経路１２６に細胞収集バッグ１４０を接続する管材料を含むこともできる。
【００８３】
同様に、着脱可能流れ回路は、第２の循環経路１６６を構築する管材料を含むことができる。例えば、管材料は、細胞成長チャンバー１０２ならびにドリップチャンバー１８６に酸素付加器１０４を接続する管材料を含むことができる。着脱可能流れ回路は液体注入路１１４を含むこともできる。
【００８４】
更なる実施態様において、着脱可能流れ回路は、細胞成長チャンバー、酸素付加器ならびに培地および細胞を含むためのバッグを含むことができる。様々な実施態様において、構成要素は相互に接続させるまたは分離させることができる。あるいは、着脱可能流れ回路は、バルブ、ポンプといった液体流れ制御器およびそれらの組み合わせに接続されるよう構成される１以上の部分を含むことができる。蠕動ポンプが使用される変形例において、着脱可能循環モジュールは、管材料の蠕動部分の周囲に装着されるよう構成される蠕動性ループを含み得る。様々な実施態様において、蠕動性ループは、循環経路、注入路および排出路と流動的に連結されるよう構成できる。
【００８５】
着脱可能流れ回路は、キットにおいて、その組み立てのための指示書またはポンプおよびバルブといった液体流れ制御器への付属物と組み合わせることができる。
【００８６】
ＣＥＳのプライミング（Ｐｒｉｍｉｎｇ）
細胞の添加の前に、ＣＥＳは、ＣＥＳの作動を準備するために培地で「プライミング（ｐｒｉｍｅｄ）」することができる。
【００８７】
ＣＥＳのプライミングは、図１ＢのＣＥＳ１００をさらに参照して記述される。第１の液体循環経路１２６は、細胞成長チャンバー１０２がＣＥＳ１００に装着される前にプライミングされる。培地は、ＥＣ培地容器１０６からバルブ１０７を通って流れ、ドリップチャンバー１８０に入り、第１の液体注入路１２４を通ってジャンクション１８４に流れる。ドリップチャンバー１８０は、その後、培地で満たされる。
【００８８】
第１の液体循環経路１２６は、その後、ＩＣＥＣ培地でプライミングされる。培地は、ドリップチャンバー１８０からフラッシュライン１３２に送られる。培地は、また、第１の液体循環経路１２６を通り、ジャンクション１８４に流れる。
【００８９】
細胞成長チャンバー１０２は、次に、注入口１５６を下流方向へおよび排出口１５８を上流方向に向けることにより、システムに無菌的に接続される。培地は、第２の液体注入路１１４および第１の液体注入路１２４を通って送られる。空気は細胞成長チャンバー１０２から通気バッグ１１０へ送られる。特定のプロトコールが下記に述べられる。
【００９０】
第２の液体循環経路１６６は、その後プライミングされる。第２の液体循環経路１６６における培地は、酸素付加器１０４、注入口１６２、排出口１６４を通り、および、酸素付加器１０４を通って流れ、第２の循環経路１６６が完成する。特定のプロトコールが下記に述べられる。
【００９１】
ＣＥＳのプライミングについての変形例を使用することができる。例えば、ＣＥＳは、ＣＥＳ１００に備えられた細胞増殖システムでプライミングすることができる。ＥＣ培地容器１０６またはＩＣ培地容器１０８からの培地を使用することができる。一般に、ガスポケットがシステムで生ずるのを予防するために、培地がシステムに加えられる。
【００９２】
培地交換
ＩＣまたはＥＣループのいずれかで循環する培地は、ＣＥＳから細胞を除去することなく、新鮮な培地と交換することができる。ＩＣ培地は新鮮なＩＣ培地と交換することができ、ＥＣ培地は新鮮なＥＣ培地と交換することができる。
【００９３】
一実施態様において、培地は、使用済み培地を細胞成長チャンバーにおける中空繊維膜を通して除去することで交換できる（ここにおいて「限外ろ過」と言及される）。好ましい様々な実施態様において、限外ろ過は、ＰＡ／ＰＡＥＳ／ＰＶＰで構築される中空繊維を有する細胞成長チャンバーを使用して行われる。図１Ｂに関して、新鮮な培地はドリップチャンバー１８０に供給され、その後、ジャンクション１８４へと流される。使用済み培地の使用済みの少なくとも一部は、細胞成長チャンバー１０２の中空繊維を通って拡散して第２の循環経路１６６に入ることで（「ＥＣループ」）、第１の循環経路１２６を出る。使用済み培地はドリップチャンバー１８６に入り、液体排出路１３６を介してシステムから廃棄物バッグ１４８に流される。限外ろ過は、接着および非接着細胞の両方に使用できるが、非接着細胞を増殖させる場合に好ましい方法である。一般に、タンパク質のような大きな分子は、大きすぎるため中空繊維膜を通り抜けることができない。限外ろ過法は、システムから大きな分子を除去する能力を制限することができる。
【００９４】
あるいは、使用済み培地は、コネクター流れ経路１３９を介して除去することができる。新鮮な培地はドリップチャンバー１８０に供給される。バルブ１３１を開き、使用済み培地は、コネクター流れ経路１３９を介して第１の循環経路１３９  １２６を出る。使用済み培地はドリップチャンバー１８６に集められる。使用済み培地は、その後、液体排出路１３６を介してシステムから廃棄物バッグ１４８に流しだされる。ＥＣ培地はドリップチャンバー１８６を通って廃棄物バッグ１４８に送ることができる。
【００９５】
使用済みＥＣ培地は、新鮮なＥＣ培地で交換することもできる。図１Ｂに関して、液体は、ＥＣ培地容器１０６からバルブ１１５を通して流れ、ポンプ１９０およびポンプ１６８を介してＥＣループに流れる。
【００９６】
ＩＣループおよびＥＣループにおける全体積の培地は、システムから細胞を除去することなく、容易に交換することができる。小さな体積の培地またはその他の溶液相化合物も同様にシステムに添加することができる。培地交換の複数の方法は、さらに、細胞成長チャンバー中空繊維に付着した細胞を除去することなく、培地を交換することができる。
【００９７】
ＣＥＳへの細胞の導入
細胞は、多数の方法によってＣＥＳに添加することができる。
【００９８】
第１の例示的方法では、上記の通り培地交換の限外ろ過と同様の様式で、細胞を限外ろ過（「ハイフラックス」とも言及される）によってＣＥＳ１００に添加できる。細胞注入バッグ１１２からの細胞は、ドリップチャンバー１８０に導入される。ＥＣおよび／またはＩＣ培地とともに、細胞成長チャンバー１０２に細胞含有培地を押し込んで、高い流量でドリップチャンバー１８０に添加される。続いて、過剰体積のＥＣおよび／またはＩＣ培地（「追培地」）をドリップチャンバー１８０に充填し、当該培地は、細胞成長チャンバー１０２を通って流れる。追培地は細胞に適した任意の培地であり得る（例えばＩＣ培地、ＥＣ培地またはリン酸緩衝液溶液（ＰＢＳ））。細胞は細胞成長チャンバー１０２の中空繊維中で分散される。
【００９９】
接着細胞（例えば間葉系幹細胞、またはＭＳＣ）は中空繊維内腔への接着に基づいて選択することができる。中空繊維内腔は接着材料で造ることができる。あるいは、中空繊維は細胞接着を引き起こすためのフィブロネクチンで処理することができる。
【０１００】
第２の典型的な方法において、培地上に細胞を「受動的に充填」することによってＣＥＳに導入することができる。細胞はドリップチャンバー１８０から細胞成長チャンバー１０２に導入される。培地の流れはジャンクション１８８で停止される。細胞および追培地の体積は、細胞が第１の液体循環経路１２６を出ないことを確認するためにモニターされる。
【０１０１】
細胞増殖
細胞はＩＣループまたはＥＣループのいずれかの中で生育（「増殖」）させることができる。接着および非接着懸濁細胞を増殖させることができる。
【０１０２】
一実施態様において、細胞成長チャンバー繊維の内腔はフィブロネクチンで覆うことができる。二価の陽イオンフリー（例えば、カルシウムおよびマグネシウムフリー）のＰＢＳがシステムに添加される。接着細胞を細胞成長チャンバー１０２に導入した後、それらは中空繊維に接着するのに十分な時間、インキュベートされる。ＩＣおよびＥＣ培地は、十分な栄養素を細胞に確実に供給するために循環される。
【０１０３】
ＩＣループおよびＥＣループの流速は特定の値に調節することができる。様々な実施態様において、ＩＣループおよびＥＣループの流速は、独立に、２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００ｍＬ／分とすることができる。図１ＢのＣＥＳの様々な実施態様において、ＩＣ循環ループのための好ましい流速は１０−２０ｍＬ／分であり、ＥＣ循環ループの好ましい流速は毎分２０−３０ｍＬである（培地を酸素付加器１０４を通して流し、酸素レベルを回復することを可能にする）。ポンプ１９０は、任意に、低い流速（例えば毎分０．１．ｍＬ）でＣＥＳに付加的な培地を送り込み、チューブおよび酸素付加器１０４を通って蒸発する培地を交換する。様々な実施態様において、ＥＣループは細胞の廃棄物を除去し、ＩＣループは培地中に成長因子を含む。
【０１０４】
ＣＥＳは、増殖条件および基準の変化において、多くの融通性を提供する。細胞は、培地を連続的に循環させることにより、ＩＣループに懸濁した状態を維持することができる。あるいは、培地循環を停止し、細胞を沈降させることができる。新鮮な培地は、限外ろ過によってＩＣループに添加し、細胞を除去することなく過剰量を提供することができる。ＥＣ培地の循環は、ガス、栄養素、廃棄生成物の交換を可能とし、細胞を除去することなく新たな培地の添加を可能にする。
【０１０５】
増殖した細胞は、接着細胞、非接着細胞、または、当該分野における細胞の任意の組み合わせの共培養物を含む。
【０１０６】
細胞収集
接着細胞の収集のために、ＩＣおよびＥＣ培地は、二価陽イオンフリー培地（例えば二価陽イオンフリーＰＢＳ）と交換される。その後、トリプシンが第１の循環経路１２６に充填され、一定時間（例えば９−１０分）接着細胞とインキュベートされる。その後、トリプシンをシステムから洗い出す。細胞成長チャンバーを通る流速を上昇させることで、剪断力を細胞に適用し、細胞成長チャンバーから放出される接着細胞を、細胞収集路１３４を介して細胞収集バッグ１４０に送る。
【０１０７】
非接着細胞を増殖させる場合、細胞を、循環するＩＣ回路から洗い流すことができる。接着細胞は細胞成長チャンバー１０２に残り、一方で非接着細胞は除去される。
【０１０８】
ＣＥＳは様々な細胞増殖方法を行なうために使用することができる。
【０１０９】
一実施態様において、播種した細胞の集団を増殖することができる。細胞は、ＣＥＳに導入されまたは接種される。特定の状況において、中空繊維の内腔は、細胞が接着できるように条件を整えることができる。その後、細胞を細胞成長チャンバーに添加し、接着細胞は中空繊維に接着し、一方非接着細胞（例えば造血性幹細胞、またはＨＳＣ）は接着しない。非接着細胞はシステムから洗い流すことができる。一定期間のインキュベーションの後、接着細胞を放出させ収集することができる。
【０１１０】
幹細胞、前駆細胞および完全に文化した細胞は、いずれも増殖させることができる。
【実施例】
【０１１１】
以下の非限定的な例は、ＣＥＳ操作の様々な側面を例示する。
【０１１２】
例１
５０ｍＬ骨髄を、図１Ｂに示されるＣＥＳの中空繊維グロースチャンバーに充填した。
【０１１３】
細胞注入バッグ１０８は、５０ｍＬ骨髄をＩＣ培地で１：１に希釈することで作製し、ドリップチャンバー１８０に接続した。３００ｍＬのＥＣ培地を別々に準備した。
【０１１４】
第２の循環経路１６６（すなわちＥＣループ）を、第２の循環経路１６６にＥＣ培地が循環する条件とし、一方で少量のＥＣ培地を加えて、気泡の形成、またはシステムから蒸発する管材料交換液体の崩壊を予防した。循環システムのガス濃度、ｐＨおよび温度を、適切な機能を確実にするために測定した。
【０１１５】
細胞成長チャンバー１０２の中空繊維の内腔を、上記のとおり限外ろ過によってフィブロネクチンで覆った。その後、骨髄を含む溶液をシステムに添加した。細胞成長チャンバー１０２に実施可能な状態で接続されたロッカーを、細胞の損失を最小化するために作動させた。中空繊維が詰まるのを予防し、残留する細胞のドリップチャンバーからのすすぎを助けるため、残留する骨髄を収集バッグに洗い出した。
【０１１６】
その後、骨髄細胞を毎分２０ｍＬでＩＣループを通して循環させ、且つ、ＥＣ培地をＥＣループを通して循環させた。システム内のガス泡の形成および気化によるチューブ崩壊を予防するために、少量の培地をＩＣループおよびＥＣループの両方に定期的に添加した。
【０１１７】
培地を、培地交換により周期的に取り替えた。ＥＣ培地を作製し、ＥＣ培地容器１０６に置いた。ドリップチャンバー１８０はＥＣ培地を注ぎ補充した。その後、ＥＣ培地を第１の液体循環経路１２６（すなわちＩＣループ）に添加した。ＥＣ培地がドリップチャンバー１８０から完全に除去されるまで、細胞を収集バッグ１４０に洗い流した。
【０１１８】
その後、ＩＣ培地でドリップチャンバー１８０を３回洗い流すことで、ＩＣ培地をＣＥＳ１００に添加した。
【０１１９】
例２
ＭＳＣをＣＥＳに充填した。
【０１２０】
ＣＥＳを例１に記載されるとおりに作製した。培地を、ＣＥＳ１００の第１および第２の循環経路１２６および１６６の両方に添加した。５０ｍＬのＩＣ培地中に懸濁したＭＳＣを含む細胞注入バッグ１１２を作製し、ドリップチャンバー１８０に備え付けた。ＥＣ培地容器１０６をドリップチャンバー１８０および第２の液体注入路１１４に接続した。細胞をドリップチャンバー１８０に充填した。ポンプ１８２を高い流速に設定し、細胞を細胞成長チャンバー１０２に流した。その後、タンパク質含有ＩＣ培地の５０ｍＬの追培地を、ドリップチャンバー１８２に充填し、細胞成長チャンバー１０２に充填した。
【０１２１】
ＥＣ培地を、第２の循環経路１６６（ＥＣループ）を通して２０ｍＬ／分の流速で循環させた。第１の循環流れ経路１２６（ＩＣループ）における培地は、毎分１０ｍＬの流速で循環させ、細胞集団を増殖させた。
【０１２２】
例３
接着細胞をＣＥＳから収集した。
【０１２３】
ＩＣおよびＥＣ培地は、上記の培地交換の節において記述したように、二価陽イオンフリーＰＢＳと交換した。トリプシンを細胞成長チャンバー１０２に添加し、９−１０分間、接着細胞とインキュベートさせた。トリプシンをシステムから急速に洗い出し、流速を増加させることで、細胞成長チャンバー１２６の中空繊維に剪断力を適用した。中空繊維から放出された接着細胞は、第１の循環経路を停止し、収集バッグ１４０への細胞を含む培地を送ることにより、細胞成長チャンバー１２６から洗い流した。
【０１２４】
非接着細胞を収集するために、トリプシンを添加せず、細胞を第１の循環経路１２６から細胞収集バッグ１４０に洗い出した。接着細胞は細胞成長チャンバーの中空繊維に付着して残り、一方非接着細胞は収集された。
【０１２５】
例４
非接着細胞をＣＥＳに充填した。
【０１２６】
図１Ｂに関して、細胞を、細胞注入バッグ１１２からドリップチャンバー１８０に向けて、培地中に充填した。その後、細胞を、ポンプ１８２により、細胞成長チャンバー１０２にゆっくりと送った。流速は、細胞が細胞成長チャンバー１０２の中空繊維に沈降できるよう調節した。すべての細胞がドリップチャンバー１８０から細胞成長チャンバー１０２に送られるまで、細胞が充填するにつれて、流速を降下させて着実に圧力を減少させた。
【０１２７】
あるいは、非接着細胞を限外ろ過によってＣＥＳに充填する。細胞は細胞注入バッグ１１２からドリップチャンバー１８０へ移動した。ポンプ１８２は、細胞を細胞成長チャンバー１０２に送り、そこを通して第１の循環経路１２６に送る。
【０１２８】
続いて、細胞を、培地交換によって細胞成長チャンバー中で濃縮する。ＩＣ培地をドリップチャンバー１８０から第１の循環経路１２６に添加する。ポンプ１８２は、培地を、注入口１５６を通して細胞成長チャンバー１０２へ送る。同時に、ポンプ１４２は、培地を、排出口１５８を通して細胞成長チャンバー１０２に送る。過剰な培地は、中空繊維を通して、第２の循環経路１６６に拡散する。非接着細胞は、このように、培地が両方向から細胞成長チャンバー１０２に流れることにより、細胞成長チャンバー１０２の中空繊維中で濃縮される。
【０１２９】
好ましい流速は、細胞成長チャンバーの中空繊維に入ることができる合成ビーズを使用して試験することができる。ビーズは、異なる細胞種に対応する異なるサイズおよび密度を有し得る。循環速度をゆっくりと低下させ、細胞成長チャンバー１０２におけるビーズの分布を測定し、流速がビーズ分布を変化させたかどうか判断した。
【０１３０】
様々な実施態様において、接着および非接着細胞を同時に生育することができる。１つの代わりの例において、接着細胞を充填し、細胞成長チャンバー１０２に接着させることができる。その後、懸濁細胞を、第１の循環経路１２６に添加する。第２の代わりの例において、懸濁細胞を、最初に細胞成長チャンバー１０２に充填し、細胞成長チャンバー１２６の中空繊維の表面を覆わせ、これによって接着細胞増殖および／または接着を促進する。第３の代わりの例において、懸濁細胞を、最初にＣＥＳに添加し、特定の期間生育させる。その後、懸濁細胞を除去し、接着細胞をシステムに添加し、ＣＥＳの中空繊維への接着を行わせる。その後、新鮮な懸濁細胞を添加し、接着細胞と同時に生育する。
【０１３１】
その他の代わりの例では、懸濁細胞および接着細胞を、細胞成長チャンバーの異なる側で生育する。例えば、接着細胞はＩＣ側面で生育できおよび懸濁細胞はＥＣ側面で生育でき、またはその逆とすることができる。接着および懸濁細胞（例えばＭＳＣおよびＨＳＣ）は、このように、分離して維持できるが、膜を介した互いの液体のやりとりを維持できる。接着細胞および懸濁細胞は、さらに、細胞成長チャンバーのＩＣ側およびＥＣ側の両方で相互に生育できる。
【０１３２】
例５
非接触細胞をＣＥＳ内で増殖させた。
【０１３３】
一連のプロトコールを、図１Ｄに示される中空繊維ＣＥＳの実施態様の様々な機能のために開発した（図１Ｄに示されるＣＥＳの実施態様は、図１Ｂに示されるＣＥＳの実施態様に実質的に類似する）。図１Ｄは、特定のポンプ（Ｐ１−Ｐ５）、バルブ（Ｖ１ａ、Ｖ１ｂ、Ｖ２ａ、Ｖ４、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８およびＶ９）、クランプ（Ｃ１およびＣ２）、サンプルポート（Ｓ１−Ｓ３）、ドリップチャンバー（Ｄ１およびＤ２）、温度計Ｔ１−Ｔ３、ならびに圧力計ＰＲ１およびＰＲ２を有する実施態様を開示する。様々なプロトコールが、ドリップチャンバーのプライミング、排水および充填、第１および第２の液体循環経路間での液体培地の交換、細胞の充填、増殖、収集、ならびに、システムからの空気の除去のために開発された。
【０１３４】
図６−１７は、ＣＥＳを使用する典型的な過程を示す流れ図を示す。それぞれのブロックダイヤグラムは、圧力（単位は毎分ｍＬ）、バルブの開閉、圧力計、および様々な構成要素の接続を示す。
【０１３５】
図６は、図１ＤのＣＥＳのプライミングのための流れ図プロトコールを示す。ＣＥＳを、最初にＥＣ培地でプライミングした。ＥＣ培地を、ポンプＰ３およびＰ１によって、ＥＣ培地バッグからＥＣループへ送った。ドリップチャンバーＤ１をＥＣ培地で充填した。ポンプＰ４およびＰ５によって、ＩＣループを通してＥＣ培地を送り、過剰のＥＣ培地をドリップチャンバーＤ２に流れ込ませた。バイオリアクターをシステムに取り付け、重力に対して垂直に方向づけ、ポンプＰ３およびＰ５によって、ＩＣループ（バイオリアクターを含む）およびＥＣループをＥＣ培地で満たした。廃棄物バッグをＣＥＳの上に掛け、ポンプＰ２およびＰ３によって、ＥＣループに培地を送り込んだ。その後、ポンプＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ５（高い流速で）によって、システムを通して培地を送り、過剰な培地を、バルブＶ７を通してドリップチャンバーＤ２に流れさせた。
【０１３６】
図７は、図１ＤのＣＥＳに対してドリップチャンバーＤ１から培地を添加するための流れ図プロトコールを示す。ドリップチャンバーＤ１を、ＩＣ培地、ＥＣ培地および細胞を含む任意のソースから選ばれた培地で満たした。その後、３つの個々のプロトコールのうちの１つを行うことができる。第１のプロトコールでは、ドリップチャンバーＤ１から、新たな培地を、バルブＶ６を通してＩＣループに送り、過剰な培地を、バルブＶ７を通してＩＣループから排出する。第２のプロトコールでは、培地を、バイオリアクターを通して送り込み、バルブＶ７からシステムを出て、ドリップチャンバーＤ２に向かわせる。第３のプロトコールでは、高い流速でバイオリアクターの中空繊維膜を通して培地を送り込み、バルブＶ８を通してシステムから培地を排出してドリップチャンバーＤ２に送ることにより、新たな培地を限外ろ過により使用済み培地に交換する。その後、ドリップチャンバーＤ２における培地を、廃棄物バッグに流れさせた。
【０１３７】
図８は、ドリップチャンバーＤ１を満たすプロトコールを示す。ＩＣ培地、ＥＣ培地または培地に含まれる細胞のいずれかを、それぞれ、ＩＣ培地バッグ、ＥＣ培地バッグまたは細胞注入バッグから添加した。選択した培地または細胞を含むバッグからドリップチャンバーＤ１を分離するバルブまたはクランプを開いた。その後、培地または細胞をドリップチャンバーＤ１に流した。ドリップチャンバーＤ１が満たされた時、ＩＣ培地、ＥＣ培地または細胞注入バッグへのバルブを閉めた。
【０１３８】
図９は、図１ＤのＣＥＳにおける、ＥＣおよびＩＣ培地の間の培地交換のための流れ図プロトコールを示す。バルブＶ８、および任意にバルブＶ７およびＶ９を開いた。その後、ＩＣまたはＥＣ培地を、ポンプＰ２、Ｐ３、Ｐ４およびＰ５によってドリップチャンバーＤ１から送った。Ｐ２／Ｐ３およびＰ４／Ｐ５のポンプ速度比率を選択した。特定のＩＣ体積を、ポンプＰ５によってＩＣループに送った。あるいは、特定のＥＣ体積を、ポンプＰ３によってＥＣループに送った。新たな体積の培地を、ポンプＰ５によりバルブＶ８を通してＩＣループのジャンクションＡに向けてドリップチャンバーＤ１から洗い流した。あるいは、特定の体積の培地（この場合１３．５ｍＬ）をシステムに加えた。その後、ポンプを作動し、培地を循環させた。
【０１３９】
図１０は、図１ＤのＣＥＳにおいて、限外ろ過方法によりバイオリアクターに細胞を充填するための流れ図プロトコールを示す。クランプＣ１を開き、細胞をドリップチャンバーＤ１に配置させた。ポンプＰ５により、細胞および培地をドリップチャンバーＤ１からＩＣループに送った。過剰な培地が中空繊維膜を通して流れ、ドリップチャンバーＤ２を介してシステムを離れる。ＩＣまたはＥＣ追培地を選択し、バルブＶ２ａ（ＩＣ培地バッグに対する）またはＶ１ｂおよびＶ１ａ（ＥＣ培地バッグに対する）を開いた。一旦、追培地がシステムに充填されると、ポンプを停止する。
【０１４０】
図１１は、「受動的充填」法によりバイオリアクターに細胞を充填するための流れ図プロトコールを示す。ポンプＰ５を作動させ、ＩＣまたはＥＣ追培地を選択し、バルブＶ２ａ（ＩＣ培地バッグに対する）またはＶ１ｂおよびＶ１ａ（ＥＣ培地バッグに対する）を開いた。細胞注入バッグに対するクランプＣ１を開いた。ポンプＰ５は、低速で、ドリップチャンバーＤ１からバイオリアクターに対して細胞および関連する培地を送った。過剰な培地を、バルブＶ７を介してＩＣループからドリップチャンバーＤ２に流した。続いて、追ＩＣまたはＥＣ培地をシステムに充填し、過剰な培地を、バルブＶ５を通してＩＣループから流した。
【０１４１】
図１２は、図１ＤのＣＥＳにおける骨髄の洗い出しのための流れ図プロトコールを示す。ポンプＰ５の圧力を高い流速でセットし、ポンプＰ２およびＰ３を、Ｐ５に比べて低い流速にセットした。その後、細胞注入バッグ、ＩＣ培地バッグまたはＥＣ培地バッグからの培地を、ドリップチャンバーＤ１に添加した。クランプＣ２を開放して、細胞収集バッグを開いた。ポンプＰ２、Ｐ３およびＰ５は、細胞収集バッグに細胞および関連する培地を送り込んだ。細胞収集バッグを密閉し除去し、Ｖ８およびＶ９を再度開いた。
【０１４２】
図１３は、図１ＤのＣＥＳにおいて、接着細胞を生育するための流れ図プロトコールを示す。バルブＶ８および任意にバルブＶ７およびＶ９を開いた。その後、ＩＣまたはＥＣ培地を、ポンプＰ２、Ｐ３、Ｐ４およびＰ５によってドリップチャンバーＤ１からくみ出した。その後、大量のＩＣおよびＥＣ培地を選択した。ＩＣおよびＥＣ培地を、Ｐ３またはＰ５のいずれかによってシステム送った。その後、バルブＶ８およびＶ９は開いた。
【０１４３】
図１４は、図１ＤのＣＥＳの第１の循環経路（すなわちバイオリアクターおよびポンプＰ４を含むＩＣループ）からの接着または非接着細胞を収集するための流れ図プロトコールを示す。ポンプＰ２、Ｐ３、Ｐ４およびＰ５により、選択した流速で培地を送った。バルブＶ６を開き、クランプＣ２（細胞収集バッグに対する）を開いた。収集体積を選択し、収集バッグへの細胞を汲むのに必要な時間、ポンプを始動した。クランプＣ２を閉め、細胞収集バッグを除去した。
【０１４４】
図１５は、図１ＤのＣＥＳにおいて、バイオリアクターに付着した細胞を収集するための流れ図プロトコールを示す。ポンプＰ２、Ｐ３およびＰ５を、関連する流速で選択した。バルブＶ８を開き、クランプＣ２（細胞収集バッグに対する）を開いた。収集体積を選択し、収穫体積を汲むのに必要な時間、ポンプを始動した。クランプＣ２を閉め、細胞収集バッグを除去した。
【０１４５】
図１６は、図１ＤのＣＥＳにおいて、バイオリアクターに装着されるロッカーを制御するための流れ図プロトコールを示す。ロッカーは、あらかじめ選択された時間バイオリアクターを回転させ、および／または、あらかじめ選択された「ドウェル時間」設定できる。
【０１４６】
図１７は、図１ＤのＣＥＳから空気を除去するための流れ図プロトコールを示す。ポンプＰ５を逆に始動し、培地を、限外ろ過により中空繊維を通して流し、または、バルブＶ７を介してバイオリアクターを通して流した。培地はドリップチャンバーＤ１に集められた。
【０１４７】
例６
中空繊維細胞成長チャンバーにおける間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の初期の付着性および成長率を、ＭＳＣの２つのソースを使用して研究した。
【０１４８】
生育の２日後に収集した新鮮な骨髄からのＭＳＣの回復を測定し、トリプシン処理および収集の後における細胞成長チャンバー中の残りの細胞の数を推定した。細胞成長チャンバーに残る細胞を溶解し、次に、ＬＤＨ量の測定を行った。ＬＤＨ量を基準（すなわち、溶解したＭＳＣに対するＬＤＨ）と比較し、細胞成長チャンバーに残るＭＳＣの最大数を評価した。この方法は、細胞成長チャンバーに残るＭＳＣの数の近似を与えた。
【０１４９】
細胞は、自動細胞カウンターを使用して数えた。細胞の生存率は、色素（トリパンブルーまたはエリトロシンＢ）排除アッセイにより、または、生存率測定能を有した自動カウンターにて決定した。細胞の表現型は、ＦＡＣＳフローサイトメーターにおいて、それぞれのアイソタイプコントロールとともにＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＨＬＡ−ＤＲを使用して、ポストＣＥＳ収集、単一色フローサイトメーター決定にて検出した。細胞の形態は、収集後に決定した。５，０００細胞／ｃｍ２を２４ウェルプレート（ｎ＝３）に播種した。細胞の形態を、接着の１日後および４日後に観察した。
【０１５０】
３つの細胞成長チャンバーおよび２つのＭＳＣソースを試験する４サイト無作為化試験を行った。３つの細胞成長チャンバーを試験した：１）１．７ｍ２  ＰＡ／ＰＡＥＳ／ＰＶＰ膜、２）１ｍ２  ０．５％のＤｅｓｍｏｐａｎ膜、および３）１ｍ２  ２％のＤｅｓｍｏｐａｎ膜。２つのＭＳＣソースは、ａ）骨髄の直接の播種（３つの全細胞成長チャンバーにて試験される）およびｂ）骨髄からのあらかじめ選択されたプラスチック接着ＭＳＣ（最初の２つの細胞成長チャンバー上でのみ試験される）である。
【０１５１】
研究設計は、ＭＳＣの初期の接着および生育、特に、細胞成長チャンバーにおける、初期の播種、接着および生育を観察した。測定された要素は以下を含む：
１．初期のＭＳＣ結合効率、
２．ＭＳＣ倍加時間（α）、
３．一定のαおよび最初のＭＳＣ結合、治療量に対する計画された日数の仮定
４．ＭＳＣの質、特に純度、表現型およびＭＳＣ分化。
【０１５２】
中空繊維膜およびＭＳＣソースオプションは表１に示される。２％のＤｅｓｍｏｐａｎ膜は、直接播種した骨髄（すなわち以前ＭＳＣに選択されていない骨髄）でのみ試験した。その他の膜は、両方の直接の播種した骨髄で、および骨髄由来のあらかじめ選択した接着（Ｔ−７５）ＭＳＣで試験した。
【表１】
2010519937.tif 000003
【０１５３】
図１Ｂに示すＣＥＳを研究に使用した。ＣＥＳを包含するインキュベータを３８℃に設定した。表２は、それぞれの細胞成長チャンバーに従ったプロトコールを示す。プロトコールはそれぞれの試験で同一とした。
【表２】
2010519937.tif 000004
【０１５４】
表３は、Ｔ−２５フラスコで作製したＭＳＣのためのデータを示す。試験サイト３骨髄生成物を試験サイト３で集め、０日でＣＥＳにて使用した。試験サイト４骨髄生成物を試験サイト３によって集め、試験サイト４に一晩かけて送り、そこで、１日目にＣＥＳにて使用した。試験サイト１および試験サイト２の両方は、商業的に購入した骨髄生成物を使用し、一晩送り、１日目にＣＥＳにて使用した。
【０１５５】
ＣＥＳに使用する日において、２つの７８μＬサンプルの骨髄生成物を、２つのＴ−２５フラスコにそれぞれプレーティングした。観察されたコロニーの数、総ＭＳＣおよびＭＳＣ生存率を、プレーティングから７日後に測定した。
【０１５６】
一晩の貯蔵の効果を理解するために、両者の前増殖の日に（特に、試験サイト４に送られた骨髄生成物において、試験サイト３により）および実行後の日に（特に、５０ｍＬ骨髄生成物全体、すなわち１ｍ２  Ｄｅｓｍｏｐａｎ細胞成長チャンバーを使用せずに実行した後に）データを測定した。
【表３】
2010519937.tif 000005
【０１５７】
プロトコールでは、あらかじめ選択された接着ＭＳＣを播種する各々の細胞成長チャンバーに対し、２つのＴ−７５フラスコに３ｘ７８μＬ（２３４μＬ）の骨髄をプレーティングすると定める。プレーティングの１４日後、両Ｔ−７５フラスコを標準的なトリプシン技術を使用して収集した。１つの収集物を細胞成長チャンバーに播種するために使用し、第２の収集物を計測した。（開放時における汚染の可能性を減少するために、サンプルを混合せず、その後分割をしなった）。
【０１５８】
これらのデータを表４に示す。
【表４】
2010519937.tif 000006
【０１５９】
表４は、Ｔ−７５フラスコ、直接播種した細胞成長チャンバーおよびあらかじめ選択されたＭＳＣ細胞成長チャンバーについての、ＭＳＣカウントデータを示す。表４は、さらに、直接播種した細胞成長チャンバーの収集についてのカウントデータおよびあらかじめ選択されたＭＳＣによる細胞成長チャンバー収集についてのカウントデータを示す。すべての直接播種した細胞成長チャンバーは生存可能なＭＳＣを生産することができた一方、試験サイト２はより低い量のＭＳＣを生産した。より低い量の細胞を、Ｔ７５フラスコ作製方法と比較して、０．５％ｄｅｓｍｏｐａｎを使用して試験サイト１および４で測定した。しかしながら全ての細胞が高い生存率を有していた。試験サイト４は、Ｔ７５フラスコと比較して、同等の量の非常に生存率の高いＭＳＣを生産した。
【０１６０】
幹細胞を検出するために、２％のＤｅｓｍｏｐａｎ、０．５％のＤｅｓｍｏｐａｎおよびＰＡ／ＰＡＥＳ／ＰＶＰ中空繊維膜のそれぞれにおいて、様々な幹細胞マーカーを使用した。表５、６および７は、収集のための表現型データを示す。
【表５】
2010519937.tif 000007
【表６】
2010519937.tif 000008
【表７】
2010519937.tif 000009
【０１６１】
表８は、Ｔ−２５フラスコデータのために計算されたＭＳＣ倍加時間（α、アルファ）を示す。この表は、直接のプレーティング幹細胞研究の際に集められた７８μＬの骨髄を使用するＴ−２５フラスコデータをも含む。これらのデータは図３にプロットされる。
【０１６２】
約５０以下のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す骨髄生成物のために、データは２つの群でクラスターに分けられる。より高いアルファを有するそれらのデータの大多数は、試験サイト３に由来する一方で、より低い群からのそれらのデータは、試験サイト３以外のサイトで優勢であったとことを例外として、一般的な特徴は明白ではない。
【０１６３】
両ＣＦＵおよびＭＳＣ倍加時間に対する骨髄齢の効果を示すＴ−２５フラスコのデータを、それぞれ図４および図５に図示する。これらのデータは、７８μＬの骨髄のプレーティングおよび７日後のＣＦＵおよび合計ＭＳＣの計測に一致する。
【０１６４】
図１８は、図１ＤのＣＥＳにおける中空繊維バイオリアクターで生育した細胞のための異なる細胞増殖プロトコールを使用するために試験された、細胞表面マーカーの発現レベルを示す。「直接」は、細胞をバイオリアクターに直接充填したことを指す。「前選択」は、細胞をフラスコで生育し、その後中空繊維バイオリアクターを使用して成育した、ＭＳＣ特徴のために予め選択したことを指す。０．５％は、０．５％のＤｅｓｍｏｐａｎが充填された中空繊維バイオリアクターにて生育した細胞を指す。２％は、２％のＤｅｓｍｏｐａｎが充填されたバイオリアクターで生育された細胞を指す。ＰＡ／ＰＡＥＳ／ＰＶＰは、ＰＡ／ＰＡＥＳ／ＰＶＰ中空繊維バイオリアクターを使用して生育された細胞を指す。
【表８】
2010519937.tif 000010
【図１Ａ】
2010519937.tif 000011
【図１Ｂ】
2010519937.tif 000012
【図１Ｃ】
2010519937.tif 000013
【図１Ｄ】
2010519937.tif 000014
【図１Ｅ】
2010519937.tif 000015
【図１Ｆ】
2010519937.tif 000016
【図２Ａ】
2010519937.tif 000017
【図２Ｂ】
2010519937.tif 000018
【図３】
2010519937.tif 000019
【図４】
2010519937.tif 000020
【図５】
2010519937.tif 000021
【図６Ａ】
2010519937.tif 000022
【図６Ｂ】
2010519937.tif 000023
【図６Ｃ】
2010519937.tif 000024
【図６Ｄ】
2010519937.tif 000025
【図７】
2010519937.tif 000026
【図８】
2010519937.tif 000027
【図９Ａ】
2010519937.tif 000028
【図９Ｂ】
2010519937.tif 000029
【図１０】
2010519937.tif 000030
【図１１】
2010519937.tif 000031
【図１２】
2010519937.tif 000032
【図１３】
2010519937.tif 000033
【図１４】
2010519937.tif 000034
【図１５】
2010519937.tif 000035
【図１６】
2010519937.tif 000036
【図１７】
2010519937.tif 000037
【図１８Ａ】
2010519937.tif 000038
【図１８Ｂ】
2010519937.tif 000039
【図１８Ｃ】
2010519937.tif 000040
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月5日(2010.1.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、細胞増殖システム（１０）：
ａ）次を含む、第１の液体循環経路（１２）
ｉ）少なくとも対向する末端（１８、２０）を備える第１の液体流路（１６）、ここにおいて、前記第１の液体流路（１６）の第１の対向する末端（１８）は中空繊維膜を含む細胞成長チャンバー（２４）の第１の注入口（２２）に流動的に連結されており、前記第１の液体流路（１６）の第２の対向する末端（２０）は前記細胞成長チャンバー（２４）の第１の排出口（２８）に流動的に連結されており、前記第１の液体流路は、前記中空繊維膜（５０）のキャピラリー内部分に流動的に連結されている、および
ｉｉ）前記第１の液体流路（１６）に実施可能な状態で連結する第１の流れ制御器（３０）；
ｂ）次を含む、第２の液体循環経路（１４）
ｉ）少なくとも対向する末端を備える第２の液体流路（３４）、ここにおいて、前記第２の液体流路（３４）の第１の対向する末端（３６）は前記細胞成長チャンバーの第２の注入口（４０）に流動的に連結されており、前記第２の液体流路の第２の対向する末端（３８）は前記細胞成長チャンバーの排出口（４２）に流動的に連結されており、前記第２の液体流路は、前記中空繊維膜のキャピラリー外部分に流動的に連結されており；および
ｉｉ）前記第２の液体流路（３４）に実施可能な状態で連結する第２の液体制御器（３２）；
ｃ）液体を前記第１の循環経路に流すための、前記第１の循環経路（１２）に流動的に連結する第１の液体注入路（４４）；
ｄ）少なくとも１つの前記第１のまたは第２の循環経路に流動的に連結する第１の液体排出路（４６）；
ｅ）少なくとも対向する末端を有する少なくとも１つの液体接続路（１１６）、ここにおいて、前記液体接続路の第１の対向する末端は前記第１の液体循環経路（１２）に流動的に連結しており、前記液体接続路（１１６）の第２の対向する末端は第２の液体循環経路（１４）に流動的に連結している；および
ｆ）対向する末端を有する少なくとも第２の液体コネクター流れ経路（１３９）、ここにおいて、前記第２の液体コネクター流れ経路の１つの末端は前記第１の液体流路（１６）に流動的に連結しており、前記第２の液体コネクター流れ経路の第２の末端は前記第２の液体流路（３４）に流動的に連結している。
【請求項２】
前記第１の液体注入路（４４）または前記第１の液体排出路（４６）の１つに実施可能な状態で連結されている第３の液体制御器（４８）を更に含む、請求項１に記載の細胞増殖システム。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、ここにおいて、前記第１の液体制御器（３０）および第２の液体制御器（３２）が、ポンプ、バルブならびにポンプおよびバルブの組み合わせから成る群からそれぞれ独立に選択される細胞増殖システム。
【請求項４】
請求項２に記載の細胞増殖システムであって、ここにおいて、前記第３の液体制御器（４８）が、ポンプ、バルブまたはポンプおよびバルブの組み合わせから成る群から選択される細胞増殖システム。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞増殖システムであって、ここにおいて、前記第３の液体制御器（４８）が前記第１の液体注入路（４４）に実施可能な状態で連結し、前記第１の液体排出路（４６）に実施可能な状態で連結した第４の液体制御器をさらに含む細胞増殖システム。
【請求項６】
請求項４に記載の細胞増殖システムであって、前記第３の液体制御器（４８）がポンプおよびバルブを含む細胞増殖システム。
【請求項７】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、ここにおいて、前記細胞成長チャンバー（２４）が、前記第１の液体流路（１６）における培地が、前記細胞成長チャンバーの前記第２の液体流路（３４）と反対の方向に流れるよう構成されている細胞増殖システム。
【請求項８】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、前記細胞成長チャンバー（２４）が、前記第１の液体流路（１６）における培地が、前記細胞成長チャンバーの前記第２の液体流路（３４）と同一の方向に流れるよう構成されている細胞増殖システム。
【請求項９】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、前記第２の循環経路に流動的に連結し、第５の液体制御器に実施可能な状態で連結している第２の液体注入路（１１４）を更に含む細胞増殖システム。
【請求項１０】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、ここにおいて、前記第２の液体注入路（１１４）は、前記第１の循環路経路に流動的に連結しており、第５の液体制御器に実施可能な状態で連結している細胞増殖システム。
【請求項１１】
請求項１に記載の細胞増殖システムであって、前記第１の（１６）または第２の（１４）液体循環経路は酸素付加器（１０４）を含む細胞増殖システム。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞増殖システムであって、前記第２の液体循環経路（１４）は前記酸素付加器（１０４）を含む細胞増殖システム。
【請求項１３】
更にロッカーを含む、請求項１に記載の細胞増殖システム。
【請求項１４】
請求項１３に記載の細胞増殖システムであって、前記ロッカーが、前記細胞成長チャンバーを、前記細胞成長チャンバーの中心軸（４１０）の周りに回転させる細胞増殖システム。
【請求項１５】
請求項１３に記載の細胞増殖システムであって、前記ロッカーが、前記細胞成長チャンバーを、前記成長チャンバーの中心軸に垂直な軸の周りに回転させる細胞増殖システム。
【請求項１６】
以下を含む、請求項１に記載の細胞増殖システムにおいて細胞の集団を増殖する方法：
前記細胞増殖システムの第１の液体循環経路（１２）に細胞を添加すること；
前記細胞をインキュベートし、増殖した細胞の集団を作製すること。
【請求項１７】
前記増殖した細胞の集団の少なくとも一部を収集することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が幹細胞である請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が接着性幹細胞である請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が非接着性幹細胞である請求項１６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
細胞増殖システム（ＣＥＳ）の典型的な概略図は、図１Ａに示される。ＣＥＳ１０は、第１の液体循環経路１２および第２の液体循環経路１４を含む。第１の液体流路１６は、中空繊維細胞成長チャンバー２４（ここでは「バイオリアクター」とも言及される）と流動的に連結されている少なくとも対向する末端１８および２０を有する。特に、対向する末端１８は、細胞成長チャンバー２４の第１の注入口２２と流動的に連結されており、対向する末端２０は、細胞成長チャンバー２４の第１の排出口２８と流動的に連結されている。第１の循環経路１２における液体は、細胞成長チャンバー２４に配置された中空繊維膜５０の中空繊維の内部を通って流れる。（細胞成長チャンバーおよび中空繊維膜は、以下に詳述する）。さらに、第１の液体流れ制御器３０は、実施可能な状態で第１の液体流路１６に接続され、第１の循環経路１２における液体の流れを制御する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
第２の液体循環経路１４は、第２の液体流路３４、細胞成長チャンバー２４および第２の液体流れ制御器３２を含む。第２の液体流路３４は、少なくとも対向する末端３６および３８を有する。第２の液体流路３４の対向する末端３６および３８は、それぞれ細胞成長チャンバー２４の第２の注入口４０および第２の排出口４２に流動的に連結されている。細胞成長チャンバー２４を通って流れる液体は、細胞成長チャンバー２４中の中空繊維膜５０の外部に接している。第２の液体循環経路１４は、第２の液体流れ制御器３２に実施可能な状態で接続される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
液体注入路４４は、第１の液体循環経路１２と流動的に連結されている。液体注入路４４は第１の液体循環経路１２へと液体を流し、一方、液体排出路４６は液体をＣＥＳ１０から排出させる。第３の液体流れ制御器４８は、液体注入路４４と実施可能な状態で連結されている。あるいは、第４の液体流れ制御器（図示せず）は、第１の液体排出路４６に連結し得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
第１の循環経路における液体は、注入口２０４を通って細胞成長チャンバー２００に入り、多数の中空繊維のキャピラリー内側（様々な実施態様において、中空繊維膜のキャピラリー内（「ＩＣ」）側または「ＩＣ空間」と称される）へ入り且つ通過し、排出口２０６から細胞成長チャンバー２００を出る。「中空繊維」、「中空繊維キャピラリー」および「キャピラリー」という用語は互換的に使用される。多数の中空繊維は総体として「膜」と言及される。第２の循環経路における液体は、注入口２０８を通って細胞成長チャンバーに入り、中空繊維の外側（膜の「ＥＣ側」または「ＥＣ空間」と言及される）に接触し、排出口２１０を通って出口細胞成長チャンバー２００から出る。細胞は、第１の循環経路または第２の循環経路内に包含させることができ、膜のＩＣ側またはＥＣ側のいずれかに存在し得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
横方向振盪構成要素４０４は、バイオリアクター４００の側面方向に連結している。横方向振盪構成要素４０４の平面は、ｘおよびｙ方向で、横方向に動く。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
生育の２日後に収集した新鮮な骨髄からのＭＳＣの回復を測定し、トリプシン処理および収集の後における細胞成長チャンバー中の残りの細胞の数を推定した。細胞成長チャンバーに残る細胞を溶解し、ＬＤＨ量の測定を行った。ＬＤＨ量を基準（すなわち、溶解したＭＳＣに対するＬＤＨ）と比較し、細胞成長チャンバーに残るＭＳＣの最大数を評価した。この方法は、細胞成長チャンバーに残るＭＳＣの数の近似を与えた。
【国際調査報告】
2010519937.tif 000041
2010519937.tif 000042
2010519937.tif 000043