(57)【要約】本発明は、ヘキソキナーゼに選択的に結合し、それによってこれらの酵素をミトコンドリアから解離させることを促進する化合物を含む組成物、ならびに、高レベルのミトコンドリア結合ヘキソキナーゼによって特徴づけられる疾病および障害における細胞死を誘導するこのような化合物および組成物の使用方法を提供する。本発明は、さらに、これらの活性を有する分子を検出および同定する方法およびアッセイを開示する。【選択図】なし
2010521149.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗腫瘍効果を有する化合物を同定するためのアッセイであって、前記化合物の活性と抗腫瘍活性を有することが知られるジャスモン酸エステル誘導体の活性を比較することを含み、
前記抗腫瘍活性は、ミトコンドリアからのヘキソキナーゼの解離、電位依存性アニオンチャネルへのヘキソキナーゼ結合に対する干渉、およびヘキソキナーゼへの直接的な結合のうち少なくとも１つにおけるものであり、
前記化合物の活性が前記ジャスモン酸エステル誘導体の活性と比較して同等またはそれより大きいときは、前記化合物の抗腫瘍効果を示すアッセイ。
【請求項２】
前記ジャスモン酸エステル誘導体がジャスモン酸メチルである請求項１記載のアッセイ。
【請求項３】
前記化合物がジャスモン酸メチル以外のジャスモン酸エステル誘導体である請求項１記載のアッセイ。
【請求項４】
抗腫瘍効果を有する化合物を同定するアッセイであって、
前記化合物をミトコンドリアを含む無細胞系に導入する工程と、前記化合物がミトコンドリアからのヘキソキナーゼの解離を誘導する能力を測定する工程と、前記化合物の存在下での前記ヘキソキナーゼの解離を、抗腫瘍活性を有することが知られるジャスモン酸エステル誘導体によって達成される解離と比較する工程とを含み、
前記化合物の存在下での解離が同等またはそれより大きいときは前記化合物の抗腫瘍効果を示すアッセイ。
【請求項５】
前記化合物が選択的に腫瘍細胞死を誘導する請求項４記載のアッセイ。
【請求項６】
前記ジャスモン酸エステル誘導体がジャスモン酸メチルである請求項４記載のアッセイ。
【請求項７】
前記化合物がジャスモン酸メチル以外のジャスモン酸エステル誘導体である請求項４記載のアッセイ。
【請求項８】
抗腫瘍効果を有する化合物を同定するアッセイであって、
少なくとも１つのヘキソキナーゼのサブタイプへの前記化合物の直接的な結合を測定する工程と、当該結合を抗腫瘍活性を有することが知られるジャスモン酸エステル誘導体によって達成される結合と比較する工程とを含み、
前記化合物の存在下での結合が同等またはそれより大きいときは前記化合物の抗腫瘍効果を示すアッセイ。
【請求項９】
前記化合物が選択的に腫瘍細胞死を誘導する、請求項８記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記ジャスモン酸エステル誘導体がジャスモン酸メチルである、請求項８記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記化合物がジャスモン酸メチル以外のジャスモン酸エステル誘導体である、請求項８記載のアッセイ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアッセイによって同定された抗癌性化合物。
【請求項１３】
請求項１２記載の抗癌性化合物および薬理学的に許容できる担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１４】
癌細胞の増殖を阻害するための請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
癌治療のための請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１６】
治療上有効な量の請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアッセイによって同定された化合物に癌細胞を接触させることを含む、被験者における癌細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項１７】
前記被験者がヒトである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
治療上有効な量の請求項１２記載の抗癌性化合物を被験者に投与することによる、被験者における癌治療のための方法。
【請求項１９】
前記被験者がヒトである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
被験者における癌細胞の増殖を阻害する薬物の調製のための請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアッセイによって同定された化合物の使用。
【請求項２１】
前記被験者がヒトである、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
癌治療のための薬物の調製のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアッセイによって同定された化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、候補薬物分子の抗腫瘍効果の判定のためのアッセイに関する。本発明は、具体的には、ヘキソキナーゼに選択的に結合し、それによってこれらの酵素をミトコンドリアから解離させることを促進する化合物の同定方法、このような化合物を含む組成物、ならびに、高レベルのミトコンドリア結合ヘキソキナーゼによって特徴づけられる疾病および障害における細胞死を誘導するためのこのような組成物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（ヘキソキナーゼ）
ヘキソキナーゼは、グルコースを酸化し、続いて、ミトコンドリアによって完全に代謝されて二酸化炭素およびＡＴＰを産生する化合物、または、貯蔵脂肪の合成に用いられる化合物を産生する一連の酵素反応に関与する解糖系における初期酵素かつ鍵酵素である。ヘキソキナーゼのアイソザイムＩ、ＩＩおよびＩＩＩは、電位依存性アニオンチャネルへ特異的に結合することで、ミトコンドリア外膜の外表面に、物理的に結合できる。この結合は、ミトコンドリアを介したアポトーシス細胞死を阻害することが公知である。癌細胞では、ミトコンドリア結合ヘキソキナーゼおよび電位依存性アニオンチャネルに結合したヘキソキナーゼ（主にＩ型およびＩＩ型）が過剰発現している。癌細胞におけるミトコンドリア結合ヘキソキナーゼレベルの上昇は、エネルギー供給の改善およびミトコンドリアを介した細胞死に対する保護によって、癌細胞の増殖率および癌細胞の生存において中心的役割を果たしていることが示唆されている。近年では、ＩＩ型ヘキソキナーゼが、抗癌治療における有望な標的であることが示唆されている（非特許文献１）。
【０００３】
ミトコンドリアは、ＡＴＰを産生でき、細胞代謝を制御できることが周知である。さらに、ミトコンドリアは細胞死の制御において重要な役割を果たす。悪条件に曝露した場合、ミトコンドリアの膜透過性遷移が惹起され得る。膜透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）は、三つの主要素、すなわち、アデニンヌクレオチドトランスロケーター、シクロフィリンＤおよび電位依存性アニオンチャネルに支配される。ＰＴＰＣの開口が遷延された場合、ミトコンドリア内膜電位の散逸、ミトコンドリアのマトリックスの浸透圧性膨潤、続いて、チトクロムｃの遊離、および、ネクローシスまたはアポトーシスによる最終的な細胞死がもたらされる（非特許文献２）。
【０００４】
特許文献１および特許文献２は、哺乳類細胞におけるヘキソキナーゼ酵素を阻害する組成物および方法を開示する。これらの参考文献には、トレハロース−６−リン酸の生成を刺激するタンパク質および、それぞれの遺伝子；ヘキソキナーゼ特異的リボザイムおよび、そのコンストラクトをコードする遺伝子；ならびに（例えば、ミトコンドリアからヘキソキナーゼを置換することによる）ヘキソキナーゼ活性を競合的に減少させる薬剤およびそれぞれの遺伝子、について記載されている。後者の薬剤には、不活性なヘキソキナーゼおよびミトコンドリアの結合機能を維持するその断片ならびに、さらにヘキソキナーゼ活性をグルコキナーゼ活性に置換するヘキソキナーゼ−グルコキナーゼキメラが含まれる。２型糖尿病のリスクを判定するための予測法における、変質したミトコンドリアの機能についての指標は、特許文献３に開示されている。
【０００５】
（ジャスモン酸エステル）
ジャスモン酸エステルファミリーの植物ストレスホルモンは、抗癌能を備えていることが既に見出されている（非特許文献３；非特許文献４）。ジャスモン酸エステルは、小さな疎水性分子であり、腫瘍を有する動物の生存を延長することができる。ジャスモン酸エステルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの両方で、癌患者由来の細胞の癌細胞株に対する細胞毒性を示した。重要なことに、ジャスモン酸エステルは、正常細胞によりも癌細胞に対して選択的な毒性を有する。白血病細胞株Ｍｏｌｔ−４では、ジャスモン酸メチル（ＭＪ）の細胞傷害性は、転写非依存性かつ翻訳非依存性であることが示された。さらに、ジャスモン酸エステルは、薬剤耐性の表現型を克服し、抗転移効果を示した（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。
【０００６】
哺乳類の癌治療のためのジャスモン酸エステルの使用は、特許文献４で開示されている。具体的には、ジャスモン酸エステルは、乳癌、前立腺癌、皮膚癌および血液癌由来の種々のヒト癌細胞に対して直接的な細胞毒性を有することが示された。ジャスモン酸エステルは、ヒト白血病Ｍｏｌｔ−４細胞死を誘発する一方、正常リンパ球を損傷しない。特に、ジャスモン酸メチルは、マウスにおけるリンパ腫細胞の発生を阻害するのに有効であることが示された（非特許文献５）。さらに、特許文献５によれば、ジャスモン酸エステルは、健常赤血球を損傷しない。
【０００７】
特許文献６は、新規なハロゲン化ジャスモン酸エステル誘導体、これを含む医薬組成物、ならびに癌細胞増殖の減少および癌治療のための当該医薬組成物の使用を開示する。
【０００８】
特許文献７および特許文献８は、ジャスモン酸エステル化合物の化学的誘導体、その調製方法、これを含む医薬組成物、ならびにこれらの化合物および組成物の（特に、哺乳類（とりわけヒト）の癌治療の化学療法薬としての）使用方法を開示する。
【０００９】
近年では、ジャスモン酸エステルは、いくつかの異なる癌細胞株の癌細胞におけるミトコンドリアおよび、慢性リンパ性白血病患者のリンパ球の癌細胞におけるミトコンドリアに直接影響することが示されている。ジャスモン酸エステルが作用する提案機構は、ＰＴＰＣを介し、電位依存性アニオンチャネルを経由するというものであり、当該チャネルの開口がジャスモン酸エステルによるミトコンドリア機能不全を誘導することが見出された（非特許文献１０；非特許文献１１）。対照的に、ジャスモン酸エステルは、毒性を示さず、正常リンパ球および非形質転換の３Ｔ３細胞におけるミトコンドリア機能不全も誘導しない（非特許文献５；非特許文献１０）。
【００１０】
電位依存性アニオンチャネルおよびその変異体をコードするポリヌクレオチド、ならびに、ペプチド断片、ペプチド誘導体および類似体を含む電位依存性アニオンチャネル組成物が特許文献９に開示されている。特許文献９は、電位依存性アニオンチャネル組成物をアポトーシス制御のために使用する方法を開示している。
【００１１】
癌細胞におけるミトコンドリアの成分および機能は、正常細胞と比較して、ＰＴＰＣ構成成分、膜電位およびＡＴＰ産生を含む多くの面で異なる（非特許文献１）。これらの相違点が、癌細胞に対するジャスモン酸エステルの選択的活性の原因となっているのかもしれない。ジャスモン酸エステルは、癌細胞におけるＡＴＰ細胞内含有量の著しい低下を引き起こすことも示された。この低下は、正常細胞では検出されない（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献１２）。さらに、ジャスモン酸メチルの細胞毒性効果に対する特定の細胞型の感受性と、その細胞で誘導されたＡＴＰ欠乏の度合の間に正の相関が存在することが見出された（非特許文献１２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，８５４，０６７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８９１，７１７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１４０，０６７号明細書
【特許文献４】米国特許第６，４６９，０６１号明細書
【特許文献５】国際公開第０２／０８０８９０号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０５／０５４１７２号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０７／０６６３３６号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０７／０６６３３７号パンフレット
【特許文献９】国際公開第０６／０９５３４７号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｍａｔｈｕｐａｌａ  Ｓ．Ｐ．、Ｋｏ  Ｙ．Ｈ．、およびＰｅｄｅｒｓｅｎ  Ｐ．Ｌ．（２００６）。Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ  ＩＩ：Ｃａｎｃｅｒ’ｓ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｄｇｅｄ  ｓｗｏｒｄ  ａｃｔｉｎｇ  ａｓ  ｂｏｔｈ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ  ａｎｄ  ｇａｔｅｋｅｅｐｅｒ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ  ｗｈｅｎ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５：４７７７〜４７８６。
【非特許文献２】Ｇａｌｕｚｚｉ  Ｌ．、Ｌａｒｏｃｈｅｔｔｅ  Ｎ．、Ｚａｍｚａｍｉ  Ｎ．、およびＫｒｏｅｍｅｒ  Ｇ．（２００６）。Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５，４８１２〜４８３０。
【非特許文献３】Ｉｓｈｉｉ  Ｙ．、Ｋｉｙｏｔａ  Ｈ．、Ｓａｋａｉ  Ｓ．、およびＨｏｎｍａ  Ｙ．（２００４）。Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｊａｓｍｏｎａｔｅｓ，ｐｌａｎｔ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ。Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １８、１４１３〜１４１９。
【非特許文献４】Ｋｉｍ  Ｊ．Ｈ．、Ｌｅｅ  Ｓ．Ｙ．、Ｏｈ  Ｓ．Ｙ．、Ｈａｎ  Ｓ．Ｉ．、Ｐａｒｋ  Ｈ．Ｇ．、Ｙｏｏ  Ｍ．Ａ．、およびＫａｎｇ  Ｈ．Ｓ．（２００４）。Ｍｅｔｈｙｌ  ｊａｓｍｏｎａｔｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｘ／Ｂｃｌ−ＸＳ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−３  ｖｉａ  ＲＯＳ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａ５４９  ｃｅｌｌｓ。Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．１２、１２３３〜１２３８。
【非特許文献５】Ｆｉｎｇｒｕｔ  Ｏ．、およびＦｌｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．（２００２）。Ｐｌａｎｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ。Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １６，６０８〜６１６。
【非特許文献６】Ｆｉｎｇｒｕｔ  Ｏ．、Ｒｅｉｓｃｈｅｒ  Ｄ．、Ｒｏｔｅｍ  Ｒ．、Ｇｏｌｄｉｎ  Ｎ．、Ａｌｔｂｏｕｍ  Ｉ．、Ｚａｎ−Ｂａｒ  Ｉ．、およびＦｌｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．（２００５）。Ｊａｓｍｏｎａｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｎｏｎａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｐ５３−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌｓ。Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４６，８００〜８０８。
【非特許文献７】Ｈｅｙｆｅｔｓ  Ａ．、およびＦｌｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．（２００７）。Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌ  ｊａｓｍｏｎａｔｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ２−ｄｅｏｘｙ−ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ。Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．５０、３００〜３１０。
【非特許文献８】Ｆｌｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．（２００５）。Ｊａｓｍｏｎａｔｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ。Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  １６，９１１〜９１６。
【非特許文献９】Ｒｅｉｓｃｈｅｒ  Ｄ．、Ｈｅｙｆｅｔｓ  Ａ．、Ｓｈｉｍｏｎｙ  Ｓ．、Ｎｏｒｄｅｎｂｅｒｇ  Ｊ．、Ｋａｓｈｍａｎ  Ｙ．、およびＦｌｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．、（２００７）。Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｊａｓｍｏｎａｔｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ。Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５０、７３８〜７４９。
【非特許文献１０】Ｒｏｔｅｍ  Ｒ．、Ｈｅｙｆｅｔｓ  Ａ．、Ｆｉｎｇｒｕｔ  Ｏ．、Ｂｌｉｃｋｓｔｅｉｎ  Ｄ．、Ｓｈａｋｌａｉ  Ｍ．、およびＦｌｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．（２００５）。Ｊａｓｍｏｎａｔｅｓ：ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ａｃｔｉｎｇ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５，１９８４〜１９９３。
【非特許文献１１】Ｒｏｂｅｙ  Ｒ．Ｂ．、およびＨａｙ  Ｎ．（２００６）。Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅｓ，ｎｏｖｅｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｋｔ。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５、４６８３〜４６９６。
【非特許文献１２】Ｇｏｌｄｉｎ  Ｎ．、Ｈｅｙｆｅｔｓ  Ａ．、Ｒｅｉｓｃｈｅｒ  Ｄ．、およびＦｌｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．（２００７）。Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＡＴＰ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｊａｓｍｏｎａｔｅ  ｆａｍｉｌｙ。Ｊ．  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂ．３９，５１〜５７。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
抗腫瘍活性を有する薬物候補の同定のための高信頼性のアッセイに対して、未だ対処されていないニーズが残っている。このようなアッセイは、公知の抗癌療法の有害な副作用をほとんど伴わず、有効な抗癌剤を同定するために使われ得るものである。さらに、成立した腫瘍の進行の予防もしくは退縮の誘導における改善された結果を生じ、または転移を予防する新規な治療剤についての未だ対処されていないニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、天然または合成のジャスモン酸エステルと特定の特異的標的分子の相互作用に基づくアッセイを提供する。特に、本発明は、候補薬物分子の活性をヘキソキナーゼをミトコンドリアから解離することが知られる、あるジャスモン酸エステルの活性と比較することによって、候補薬物分子の抗腫瘍効果を判定するためのアッセイを開示する。このアッセイによって同定された抗癌性薬物候補分子、および当該分子を癌細胞の増殖を阻害するために用いる方法も同様に開示される。
【００１６】
本発明は、部分的に、ヘキソキナーゼおよびその電位依存性アニオンチャネルとの結合体がジャスモン酸エステルの分子標的を構成するという予期せぬ発見に基づく。本発明において、初めて、ジャスモン酸メチル（ＭＪ）がヘキソキナーゼをミトコンドリアから解離させ、ＭＪが直接的にヘキソキナーゼに結合することで、電位依存性アニオンチャネルへのヘキソキナーゼ結合に干渉することが開示された。さらに、ジャスモン酸メチルはミトコンドリアに結合するヘキソキナーゼのみを撹乱するため、正常細胞の代謝にはほとんど影響しない。
【００１７】
第一の態様によれば、本発明は、ヘキソキナーゼのミトコンドリアからの解離、電位依存性アニオンチャネルへのヘキソキナーゼ結合に対する干渉、およびヘキソキナーゼへの直接的な結合のうち少なくとも１つにおいて、化合物の活性と抗腫瘍活性を有することが知られるジャスモン酸エステル誘導体の活性を比較することを含む、抗腫瘍効果を有する化合物を同定するためのアッセイであって、当該化合物の活性が、ジャスモン酸エステル誘導体の活性と比較して同等またはジャスモン酸エステル誘導体より高いときは、当該化合物の抗腫瘍効果を示すアッセイを提供する。
【００１８】
第二の態様では、本発明は、化合物をミトコンドリアを含む無細胞系に導入し、ヘキソキナーゼのミトコンドリアからの解離を誘導する化合物の能力を測定し、当該化合物の存在下でのヘキソキナーゼの解離を、抗腫瘍活性を有することが知られる、同等の濃度のジャスモン酸エステル誘導体によって達成される解離を比較することを含む、抗腫瘍効果を有する化合物を同定するためのアッセイであって、当該化合物の存在下での解離が同等またはそれより大きいときは、当該化合物の抗腫瘍効果を示すアッセイを提供する。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は、少なくとも１つのヘキソキナーゼのサブタイプへの化合物の直接的な結合を測定し、この結合を、同等の濃度の抗腫瘍活性を有することが知られるジャスモン酸エステル誘導体によって達成される結合を比較することを含み、当該化合物の存在下での結合が同等またはそれより大きいときは当該化合物の抗腫瘍効果を示す、抗腫瘍効果を有する化合物を同定するためのアッセイを提供する。現在の好ましい実施形態では、当該化合物は腫瘍細胞死を選択的に誘導する。
【００２０】
ある実施形態によれば、抗腫瘍活性を有することが知られるジャスモン酸エステル誘導体は、当該技術分野で公知のように、ジャスモン酸メチルまたは合成ジャスモン酸エステル誘導体である。
【００２１】
他の実施形態では、本発明は、ジャスモン酸メチル以外のジャスモン酸エステル誘導体である、抗腫瘍効果を有する候補薬物分子の同定のためのアッセイを提供する。もう１つの実施形態では、本発明は、非ペプチド有機小分子である抗腫瘍効果を有する候補薬物分子の同定のためのアッセイを提供する。
【００２２】
ある実施形態では、本発明は悪性細胞に対する高い特異性を有する小分子（例えば、非ペプチド分子）の同定のための優れたアッセイを提供する。ある実施形態によれば、当該小分子は、分子量が約２，０００グラム／ｍｏｌ未満（すなわち、ＭＷが約２０００未満）であり、より好ましくは、約１，５００グラム／ｍｏｌ未満（すなわち、ＭＷが約１，５００未満）であり、最も好ましくは約１，０００グラム／ｍｏｌ未満（すなわち、ＭＷが約１，０００未満）である。本発明のアッセイで同定された化合物は、天然に存在するものであってもよいし、合成のものでもよく、または天然成分および合成成分の両方を含むことができる。
【００２３】
従って、本発明は、候補薬物分子の抗腫瘍効果を判定するためのアッセイを提供する。さらに他の実施形態では、本発明は候補薬物分子の活性を、ジャスモン酸メチルの活性と、下記のうち少なくとも１つの点で比較することを含むアッセイによって同定した抗癌剤の候補分子を提供する：ヘキソキナーゼのミトコンドリアからの解離、電位依存性アニオンチャネルへのヘキソキナーゼ結合に対する干渉、およびヘキソキナーゼへの直接的な結合。
【００２４】
本発明のアッセイで同定された抗癌剤の候補分子は、その活性および有効性について、当該技術分野において公知のいずれの方法によっても試験できる。ある実施形態によれば、当該候補薬物は、経口投与に適した形態（例えば、液剤、懸濁剤、シロップ、乳剤、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ペレット、顆粒剤および散剤）、非経口投与に適した形態（例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、経皮、皮下または腹腔内）、局所投与に適した形態（例えば、軟膏、ゲル、クリーム）、吸入投与に適した形態または坐薬による投与に適した形態で試験できる。
【００２５】
ある実施形態では、本発明は、医薬組成物で投与される候補薬物を提供する。現在の好ましい実施形態では、本発明の候補薬物は、さらに薬理学的に許容できる担体または希釈剤を含む組成物として投与される。
【００２６】
ある実施形態では、本発明はさらに、治療上有効な量の本願明細書に記載されるアッセイによって同定された化合物に癌細胞を接触させることを含む、癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
【００２７】
さらに、本発明は、本願明細書に記載されるように、被験者に治療上有効な量の本発明の化合物を投与することによる、被験者における癌治療の方法を提供する。ある実施形態では、当該化合物は医薬組成物として投与される。好ましくは、本発明の化合物は、薬理学的に許容できる担体または希釈剤をさらに含む組成物として投与される。
【００２８】
他の実施形態によれば、本発明のアッセイで同定された化合物は、下記を含む（しかしこれらに限定されない）種々の癌に対して有効である：細胞腫、肉腫、腺腫、肝細胞癌、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、ガングリオン細胞芽腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、ラブドセリオサルコーマ（ｒｈａｂｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、胆管癌、黒色腫、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞および非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、直腸癌、甲状腺癌、頭頚部癌、脳癌、末梢神経腫瘍、中枢神経腫瘍、神経芽細胞腫、子宮内膜癌、リンパ増殖性疾患、全種類の白血病細胞を含む造血器腫瘍およびリンパ腫（急性骨髄性白血病、急性骨髄球性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、肥満細胞白血病、多発性骨髄腫、骨髄リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫を含む）、ならびに上記全ての転移。
【００２９】
もう１つの態様によれば、本発明は、癌細胞の増殖の阻害のための本発明のアッセイによって同定された化合物を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、当該医薬組成物は、さらに薬理学的に許容できる担体または希釈剤を含む。他の実施形態では、本発明は、癌治療のための本発明のアッセイによって同定された化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
さらにもう１つの態様によれば、本発明は、被験者における癌細胞の増殖の阻害のための本発明のアッセイによって同定された化合物の使用に関する。他の実施形態では、癌治療のための本発明のアッセイによって同定された化合物の使用も本発明の範囲内である。１つの実施形態では、当該被験者は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態および適用性の全範囲は、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の精神および範囲中の様々な変更および改変は、当該詳細な説明から当業者に明らかとなるため、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるものの、例証する目的のみで示されることは理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、ＣＴ−２６腫瘍のミトコンドリア分画からヘキソキナーゼ（ＨＫ）を解離する。ジャスモン酸メチル（ＭＪ；３ｍＭ）は、ヘキソキナーゼを時間依存的様式で解離する。
【図１Ｂ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、ＣＴ−２６腫瘍のミトコンドリア分画からヘキソキナーゼ（ＨＫ）を解離する。ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、用量依存的様式で、３０分間のインキュベーションの間、ヘキソキナーゼを解離する。０．５ｍＭ  Ｇ６Ｐを陽性対照とした。
【図１Ｃ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、ＣＴ−２６腫瘍のミトコンドリア分画からヘキソキナーゼ（ＨＫ）を解離する。同様の実験からミトコンドリア分画の上清を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗−ＨＫＩ抗体および抗−ＨＫＩＩ抗体で調べた。
【図２Ａ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）を種々の癌細胞から単離したミトコンドリア分画から解離させる。Ｍｏｌｔ−４細胞のミトコンドリア分画。
【図２Ｂ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）を種々の癌細胞から単離したミトコンドリア分画から解離させる。ＢＣＬ−１のミトコンドリア分画。
【図２Ｃ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）を種々の癌細胞から単離したミトコンドリア分画から解離させる。Ｂ１６腫瘍のミトコンドリア分画。
【図２Ｄ】実験における上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗−ＨＫＩ抗体および抗−ＨＫＩＩ抗体で調べた際の図である。
【図２Ｅ】実験における上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗−ＨＫＩ抗体および抗−ＨＫＩＩ抗体で調べた際の図である。
【図２Ｆ】実験における上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗−ＨＫＩ抗体および抗−ＨＫＩＩ抗体で調べた際の図である。
【図３】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、ＣＴ−２６腫瘍のミトコンドリア分画から単離したチトクロムｃの時間依存的な遊離を引き起こす。ミトコンドリア分画を、３ｍＭ  ジャスモン酸メチル（ＭＪ）で、表示された時間処理し、ペレットにした。遊離したチトクロムｃを特異的抗体で調べた。
【図４Ａ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、細胞のＡＴＰを、６０分間の曝露で枯渇させた。ＣＴ２６細胞（中塗りの四角）、Ｍｏｌｔ−４細胞（中塗りの菱形）、Ｂ１６細胞（白抜きの三角）およびＢＣＬ１細胞（白抜きの円）を表示されたジャスモン酸メチル（ＭＪ）濃度に曝露し、細胞のＡＴＰレベルを測定した。
【図４Ｂ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、細胞のＡＴＰを、６０分間の曝露で枯渇させた。ＣＴ２６細胞（左）およびＭｏｌｔ−４細胞（右）をジャスモン酸メチル（ＭＪ；３ｍＭ）に曝露した。トリパンブルー色素排除アッセイ試験の後、細胞数を計測した。白色および青色は、それぞれ生細胞および死細胞を示している。
【図５】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、ヘキソキナーゼ−Ｉ−電位依存性アニオンチャネルの相互作用を撹乱する。電位依存性アニオンチャネルは脂質平面二重層に再構成した。０から−２０ｍＶまたは−４０ｍＶの電圧ステップに対する電流を、ヘキソキナーゼ−Ｉ（ＨＫ−Ｉ；２０ｍＵ／ｍｌ）の添加前および添加１０分後に記録した。表示されたように、ジャスモン酸メチル（ＭＪ；３ｍＭ）を添加し、電流を１０分後に記録した。
【図６Ａ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、ヘキソキナーゼに、特異的かつ用量依存的様式に結合している。ジャスモン酸メチルは、ヘキソキナーゼに用量依存的様式に結合している。番号１は、６ｍＭ  ＭＪを示している。番号２は３ｍＭ  ＭＪを示している。番号３は１．５ｍＭ  ＭＪを示している。番号４は０．７５ｍＭ  ＭＪを示している。灰色の線は０．３７５ｍＭ  ＭＪを示している。
【図６Ｂ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、ヘキソキナーゼに、特異的かつ用量依存的様式に結合している。ジャスモン酸メチルはヘキソキナーゼに結合するが、Ｒｂ  ＩｇＧには結合しない。番号１は６ｍＭ  ＭＪを示している。番号２は３ｍＭ  ＭＪを示している。番号３および番号４はＲｂ  ＩｇＧを示している。
【図６Ｃ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、ヘキソキナーゼに、特異的かつ用量依存的様式に結合している。ジャスモン酸（ＪＡ）はヘキソキナーゼには結合しない。番号３は６ｎＭ  ＪＡを示している。番号４は３ｍＭ  ＪＡを示している。６ｍＭ  ＭＪ（番号１）および３ｍＭ  ＭＪ（番号２）は、陽性対照として供した。実線および点線の矢印は、それぞれ、分析物の注入の開始点および終点を示している。
【図７Ａ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、ヘキソキナーゼをマウスの脳のミトコンドリア分画から解離させる。ＭＪ（３ｍＭ）は、時間依存的様式で、ヘキソキナーゼを解離する。
【図７Ｂ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、ヘキソキナーゼをマウスの脳のミトコンドリア分画から解離させる。ＭＪはヘキソキナーゼを、３０分間のインキュベーションで、用量依存的様式で、解離させる。Ｇ６Ｐを陽性対照として供した。
【図８Ａ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、マウスの脳のミトコンドリア分画の膨潤を引き起こすが、マウスの肝臓のミトコンドリア分画の膨潤は引き起こさない。マウスの脳のミトコンドリア分画。
【図８Ｂ】ジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、マウスの脳のミトコンドリア分画の膨潤を引き起こすが、マウスの肝臓のミトコンドリア分画の膨潤は引き起こさない。マウスの肝臓のミトコンドリア分画。ジャスモン酸メチル（ＭＪ；１ｍＭ、四角）、ジャスモン酸（ＪＡ；１ｍＭ、三角）、またはバッファー（円）をミトコンドリアに投与し、光学密度をモニターした。タキソール（７０μＭ、星印）を陽性対照として供した（Ｖａｒｂｉｒｏ、２００１）。
【図９Ａ】ヘキソキナーゼの過剰発現は、ジャスモン酸メチルによって誘導されたＡＴＰ欠乏および細胞傷害から保護する。ＣＴ２６細胞に、ヘキソキナーゼＩＩ発現ベクター（灰色）または対照プラスミド（白色）を形質移入した。ＡＴＰ測定の前の、ジャスモン酸メチル（ＭＪ）曝露。
【図９Ｂ】ヘキソキナーゼの過剰発現は、ジャスモン酸メチルによって誘導されたＡＴＰ欠乏および細胞傷害から保護する。ＣＴ２６細胞に、ヘキソキナーゼＩＩ発現ベクター（灰色）または対照プラスミド（白色）を形質移入した。細胞傷害測定の前の、ジャスモン酸メチル（ＭＪ）曝露。
【図９Ｃ】ヘキソキナーゼの過剰発現は、ジャスモン酸メチルによって誘導されたＡＴＰ欠乏および細胞傷害から保護する。ＣＴ２６細胞に、ヘキソキナーゼＩＩ発現ベクター（灰色）または対照プラスミド（白色）を形質移入した。細胞傷害測定の前の、スタウロスポリン曝露。データは、３回反復したうちの代表である。
【図１０】ジャスモン酸メチルと比較した場合の新規化合物によるヘキソキナーゼ解離能の比較は、腫瘍細胞死を引き起こす新規化合物の能力を示している。各化合物のヘキソキナーゼ解離活性（縦軸）と、そのＭｏｌｔ−４細胞に対する細胞傷害性についてのＩＣ５０（横軸）の間の相関。Ａ〜Ｆは、６つの異なるジャスモン酸エステル誘導体を示している。ＭＪ＝ジャスモン酸メチル。直線的相関性を分析し、Ｒ２因子を用いて評価した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、特異的細胞内標的に基づく新規なアッセイであって、あるジャスモン酸エステルが細胞代謝を妨害し、それによって、正常細胞集団に著しい悪影響を及ぼすことなく特異的に悪性細胞死を引き起こすという発見に基づくアッセイを提供する。本発明は、さらに、これらの新規に同定された細胞内の標的を通じて特異的抗癌活性を発現する新規な小分子を同定し、選択するためのアッセイを提供する。
【００３４】
１つの実施形態では、本発明は、重要な新しいクラスの選択的な抗癌剤としてのジャスモン酸エステルに関する。いずれの作用の理論または機構とも結び付けられることなく、ジャスモン酸エステルは、少なくとも部分的には、ミトコンドリアのヘキソキナーゼおよび細胞基質の解糖系を含む他のＡＴＰ生成経路の撹乱を介して作用すると思われると考えられた。ジャスモン酸メチルの細胞毒性効果に対する所定の細胞型の感受性と、その結果としてその細胞で誘導されたＡＴＰの減少の間の正の相関は、ピルビン酸塩およびオリゴマイシン（それぞれ、酸化的リン酸化の基質および阻害剤）に非依存的であることが見出された。このことは、ミトコンドリアのＡＴＰ生成へのジャスモン酸メチルの効果は強力であり不可逆的であることを示唆している。逆に、解糖基質のグルコースは、ジャスモン酸メチルに誘導されたＡＴＰの低下に対する保護作用を示したが、他方で、解糖阻害剤２−デオキシグルコースは、ジャスモン酸メチルと組み合わせた場合、相乗効果を示した（Ｆｉｎｇｒｕｔ、２００５；Ｈｅｙｆｅｔｓ、２００７）。
【００３５】
ジャスモン酸エステルによって誘導された細胞死に関する経路を同定することで、ジャスモン酸エステルが抗癌剤として有効である臨床状況の選択が可能となり、また、臨床医がその潜在的副作用を評価することが可能となる。さらに、これらの抗癌剤が相互作用する標的分子の同定により、より強力なジャスモン酸エステル誘導体の合理的設計、および同一または類似の標的分子と相互作用する他の有機小分子の特徴づけまたは設計が可能となる。
【００３６】
１つの態様によれば、本発明は、候補薬物分子の活性をジャスモン酸メチルの活性と、下記のうち少なくとも１つの点で比較することを含む、候補薬物分子の抗腫瘍効果の判定のためのアッセイを提供する；ヘキソキナーゼのミトコンドリアからの解離、電位依存性アニオンチャネルへのヘキソキナーゼ結合の阻害、およびヘキソキナーゼへの直接的な結合の阻害。さらに、本発明は、非ペプチド有機小分子の有効な抗腫瘍効果についてのアッセイを提供する。
【００３７】
もう１つの態様によれば、本発明は、本発明において開示されたいずれか１つのアッセイによって同定された抗癌剤の候補分子を提供する。抗癌剤の候補分子は、続いて、当該技術分野におけるいずれの公知の方法によっても、活性および有効性を試験し得る。
【００３８】
他の実施形態によれば、当該候補薬物は、経口投与（例えば、液剤、懸濁剤、シロップ、乳剤、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ペレット、顆粒剤および散剤）、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、経皮、皮下または腹腔内）、局所投与（例えば、軟膏、ゲル、クリーム）、吸入投与または坐薬による投与に適した形態で試験できる。
【００３９】
さらに、当該候補薬物は、さらにいずれの許容できる希釈剤および／または担体を含む医薬組成物として試験できる。担体は、従来用いられてきたいずれのものでもよく、好ましい投与経路に応じて選択し得る。例となる適切な担体には、ラクトース、グルコース、ブドウ糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水およびメチルセルロースが含まれるが、これらに限定されない。候補薬物には、さらに、滑沢剤（タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油など）、湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、界面活性剤、乳化剤および懸濁剤、保存剤（ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピルなど）、甘味剤、香味剤、着色料、緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）、崩壊剤、湿潤剤（ｍｏｉｓｔｅｎｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）および浸透圧の調整のための薬剤（塩化ナトリウムなど）が含まれ得る。他の医薬担体は、滅菌液（水、および石油、動物、植物または合成起源の油（ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む油など）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶剤であり得る。水は、医薬組成物が静脈内に投与される場合に、好ましい担体である。生理食塩水およびブドウ糖水溶液およびグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に、注射液に利用できる。
【００４０】
本発明はさらに、癌細胞を、本願明細書に記載されるアッセイによって同定された、治療上有効な量の化合物に接触させることを含む、癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。「癌細胞の増殖の阻害」という用語は、本発明の構成においては、下記のうち少なくとも１つの減少を意味する：対照と比較した細胞数（壊死性、アポトーシス性または他のいずれの種類の細胞死またはそれらの組み合わせでもよい細胞死による）；細胞増殖率の減少、すなわち、細胞数の総数は増加し得るが、対照における増加よりも低いレベルまたは低い割合である；細胞の総数が変化しなくとも、対照と比較した場合の細胞の感染度の減少（例えば、軟寒天アッセイによる判定による）；分化の遅れた細胞型から分化の進んだ細胞型への進行；腫瘍化の減速；あるいは、１つの段階から次段階への癌細胞の進行緩徐化。
【００４１】
さらに、本発明は、被験者に、本願明細書に記載される本発明のアッセイ系によって同定された化合物を、治療上有効な量投与することによる、被験者における癌治療の方法を提供する。本発明の構成における「癌治療」という用語は、下記のうち少なくとも１つを含む：癌の成長率の減少（すなわち、依然として増殖しているが、より遅い速度である癌）；腫瘍増殖の増殖休止、すなわち、腫瘍増殖の停止、および、好ましくは、腫瘍の減少または大きさの縮小。この用語はまた、転移数の減少、形成される新しい転移数の減少、１つの段階から他の段階への癌の進行の緩徐化、および癌によって誘導された血管新生の減少、を含む。最も好ましくは、腫瘍は完全に除去される。さらにこの用語に含まれるのは、治療を受けている被験者の生存期間の延長、疾病進行の時間の延長、腫瘍退縮などである。この用語はまた、予防状態の予防、または腫瘍の収縮に感受性のある個体の予防を含む。
【００４２】
本願明細書で用いられる「治療上有効な量」とは、化合物を投与された被験者に対して薬効を呈するのに十分な化合物の量を意味する。本発明の構成における「癌」という用語は、固形腫瘍または非固形腫瘍の形態の全種類の新生物を含み、悪性および前悪性の病態をともに含み、これらの転移を含む。癌は２つの方法で分類され得る。癌が生じた組織の種類（組織型）によるもの、および原発部位または癌が最初に生じた身体における部位によるもの、である。組織学の分類および命名法の国際標準は、国際疾病分類−腫瘍学、第３版である。
【００４３】
本発明のアッセイで同定された化合物は、広範囲な癌（細胞腫、肉腫、腺腫、肝細胞癌、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、ガングリオン細胞芽腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、ラブドセリオサルコーマ（ｒｈａｂｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、胆管癌、黒色腫、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞および非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、直腸癌、甲状腺癌、頭頚部癌、脳癌、末梢神経腫瘍、中枢神経腫瘍、神経芽細胞腫、子宮内膜癌、リンパ増殖性疾患、全種類の白血病細胞を含む造血器腫瘍、および、リンパ腫（急性骨髄性白血病、急性骨髄球性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、肥満細胞白血病、多発性骨髄腫、骨髄リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫を含む）、ならびに上記全ての転移を含むが、これらに限定されない）に対して有効である。
【００４４】
本発明の範囲には、癌細胞の増殖の阻害方法、および哺乳類に本願明細書で開示されたアッセイによって同定された化合物を治療上有効な量投与することによる、哺乳類の癌の治療方法が含まれる。１つの実施形態では、当該哺乳類はヒトである。しかし、本発明はまた、本発明の化合物を非ヒト哺乳類、例えば、動物用医薬品において用いることを意図する。
【００４５】
本発明は、悪性細胞に対して高い特異性を有する非ペプチド小分子の同定のための優れたアッセイを提供する。本願明細書において用いる「小分子」は、分子量が約２，０００グラム／ｍｏｌ未満（すなわち、ＭＷが約２，０００未満）、さらに好ましくは約１，５００グラム／ｍｏｌ未満（すなわち、ＭＷが約１，５００未満）、最も好ましくは約１，０００グラム／ｍｏｌ未満（すなわち、ＭＷが約１，０００未満）である組成物または化合物を指すことを意味する。本発明のアッセイで同定された化合物は、天然に存在するものであってもよいし、合成のものでもよく、または天然成分および合成成分の両方（炭水化物、脂質および他の非ペプチド有機分子を含むが、これらに限定されない）を含むことができる。１つの実施形態では、本発明の方法によって同定される新規な小分子は、これらを発見するためのアッセイに用いた基準ジャスモン酸エステル誘導体化合物よりも強力である。従って、これらは、悪性細胞に対して高度の特異性を有する細胞毒性効果を示す。
【００４６】
本発明の原理は、下記の非限定的な実施例によって示される。
【実施例】
【００４７】
（材料）
全ての試薬は、特に明記しない限り、シグマケミカルズ社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（米国、ミズーリ州、セントルイス）から購入した。ジャスモン酸メチル（ＭＪ）およびジャスモン酸（ＪＡ）を、エタノールに溶解し、５００ｍＭ  ストック溶液を得た。さらに、培養培地またはアッセイバッファーで希釈した。試験におけるエタノールの最終濃度は、０．６％は超えなかった。表面プラズモン共鳴実験のため、ジャスモン酸メチルをＤＭＳＯで希釈し、５００ｍＭ  ストック溶液を得た。タキソールを米国ミードジョンソン社（ＭｅａｄＪｏｈｎｓｏｎ）から購入した。ヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴＰ）をバイオラッド  ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（米国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）から購入した。セライトをＢＤＨ社（英国、ドーセット州、プール）から購入した。ＰＥＧＦＰ  プラスミドをクロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（米国、カルフォルニア州）から購入した。ＰｃＤＮＡ３．１  プラスミドをインビトロジェン社（米国、カルフォルニア州）から購入した。ＰｃＤＮＡ３．１  ＨＫＩＩは、Ｊ．Ｅ．Ｗｉｌｓｏｎ博士（ミシガン大学）のご厚意により提供を受けた。
【００４８】
（動物）
メスのウィスターラット、およびオスのＩＣＲマウスを脳および肝臓の抽出のために用いた。オスのＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬマウス（７〜８週齢）は、テルアビブ大学（イスラエル）における、繁殖コロニーから得て、ＢＣＬ１白血病細胞、Ｂ１６腫瘍およびＣＴ２６腫瘍を増殖させるために用いた。動物の飼育および実験は、テルアビブ大学のガイドラインに従って行い、施設内動物実験および飼育委員会の承認を受けた。マウスは、ケージ内で、標準飼料および飼育条件下で飼育した。
【００４９】
（癌細胞株および腫瘍）
ＣＴ２６マウス結腸癌細胞株、Ｂ１６マウス黒色腫細胞株、ＢＣＬ１マウスＢ細胞白血病細胞株およびＭｏｌｔ−４ヒトＴリンパ性白血病細胞株は、ＡＴＣＣ（米国、メリーランド州、ロックビル）から購入した。細胞は、加湿した環境下で、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。ＣＴ２６細胞およびＢ１６細胞を、１０％  ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ  ｍｌ−１  ペニシリン、１００μｇ  ｍｌ−１  ストレプトマイシン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムおよび１：１００希釈の非必須アミノ酸（全て、バイオロジカル  インダストリーズ社（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、イスラエル、から購入した）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（バイオロジカル  インダストリーズ社、イスラエル、ベイトヘメック（Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ））で維持した。Ｍｏｌｔ−４およびＢＣＬ１細胞を、１０％  ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ  ｍｌ−１  ペニシリンおよび１００μｇｍｌ−１  ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（バイオロジカル  インダストリーズ社、イスラエル）で維持した。
【００５０】
ＢＣＬ１細胞を、ＨｅｙｆｅｔｓおよびＦｌｅｓｃｈｅｒ（２００７）が記載したように、ＢＡＬＢ／ｃマウスの体内で増殖させた。ＢＣＬ１細胞の抽出：１００μｌ  ＰＢＳ中１０６  ＢＣＬ１細胞（ＢＣＬ１白血病を保有するＢＡＬＢ／ｃマウスから抽出したばかりのもの）を、マウスに対し、腹腔内（ｉ．ｐ．）に接種し、腫瘍を増殖させた。４週後、マウスを麻酔下で屠殺し、脾臓を抽出した。細胞を脾臓分散物によって抽出した。ＲＢＣを、ＲＢＣ溶解バッファー（シグマ社）を用いて破壊した。固形腫瘍の調製：１００μｌ  ＰＢＳ中１０６  ＣＴ２６細胞またはＢ１６細胞を両側腹部に皮下注射した。腫瘍を直径１０〜１２ｍｍに達したところで、壊死の兆候のない状態で切除した。
【００５１】
（細胞傷害測定）
細胞死をトリパンブルー色素排除アッセイによって判定した。所定の実験が完了した後、細胞を０．１％  トリパンブルーで２〜５分間インキュベーションし、死細胞（染料を排除しない細胞）の割合を、顕微鏡下で測定した（Ｆｉｎｇｒｕｔ、２００２）。もう１つの方法として、細胞傷害をヘマカラー染色を用いて判定した。所定の実験の完了後、細胞を染色し、死（解離した）細胞の割合（％）を分光光度的に測定した。
【００５２】
（ＡＴＰレベルの測定）
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）発光細胞生存率（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）アッセイ（プロメガ社、米国、ウィスコンシン州、マディソン）を用いた（Ｆｉｎｇｒｕｔ、２００５）。所定の実験が完了した後、プレートを室温まで平衡化した。ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含むＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）試薬を各ウェルに加え、プレートをオービタルシェーカー上で２分間混合し、細胞溶解を誘導した。ＡＴＰ、Ｍｇ２＋および酸素分子の存在下で、ルシフェリンの一酸化（ｍｏｎｏ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）がルシフェラーゼによって触媒され、発光シグナルを生じた。次いで、細胞を１０分間、室温でインキュベーションし、発光シグナルを安定させた。発光を、コダック  デジタルサイエンス  イメージステーション  ４４０ＣＤを用いて記録した。発光は、ＡＴＰ濃度に正比例していた。ＡＴＰ欠乏（対照に対する％）を次の方法で算出した：｛（対照細胞の発光−薬剤で処理した細胞の発光）／対照細胞の発光｝×１００。
【００５３】
（ミトコンドリア分画の抽出）
ミトコンドリア分画を、機械的な溶解および分画遠心法によって調製した。全ての工程は、氷上で行った。細胞または抽出した組織は、ＰＢＳで洗浄し、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を添加したばかりの抽出バッファー（２５０ｍＭ  スクロース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ  ７．２）中で均一化して破壊した。細胞または組織に、グラムあたり、４倍量の抽出バッファーを入れた。破砕物の量を抽出バッファーで２倍量にし、組織および細胞残渣ならびに核を、遠心分離（１，０００ｇ、１０分間）でペレットにした。上清を、さらに１３，０００ｇで、１０分間で２度回転させた。小胞体の層を除去した。ペレット（ミトコンドリア分画と命名）を適切なバッファー（ミトコンドリア分画を調製するアッセイによる）中で懸濁した。ミトコンドリア分画は、速やかに使用するか、または−１９６℃で保存した。
【００５４】
（ヘキソキナーゼ解離アッセイ）
異なる薬剤によってミトコンドリア分画から解離されるヘキソキナーゼの量を測定するため、ミトコンドリアを着目している薬剤とともにインキュベーションし、遠心分離によってペレットにした。上清のヘキソキナーゼ活性（すなわち、解離したヘキソキナーゼの活性）を、３４０ｎｍで分光光度的に測定した。反応は、ピルビン酸塩キナーゼによってＡＤＰがピルビン酸の形成のために消費され、乳酸脱水素酵素によってＮＡＤＨでピルビン酸が還元され、ヘキソキナーゼによるＡＤＰ形成に関係がある。簡単に言えば、ミトコンドリアをインキュベーションバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．４、０．２５Ｍ  スクロース、１０ｍＭ  グルコース、５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．２ｍｇ／試験、１００μＬ／試験）に懸濁し、下記に記載のようにインキュベーションした。ミトコンドリア結合ヘキソキナーゼを遠心分離（２０，０００ｇ、１０分間、４℃）で沈殿させた。上清分画のヘキソキナーゼ活性をピルビン酸キナーゼ（１Ｕ／ｍｌ）、乳酸脱水素酵素（１Ｕ／ｍｌ）、ＡＴＰ（１ｍＭ）、ホスホ（エノール）ピルベート（１ｍＭ）、ＮＡＤＨ（０．１８ｍｇ／ｍｌ）を添加したばかりの反応バッファー（２５０μＬ；２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  グルコース）でアッセイした。これらの条件下では、アッセイ混合物に直接的に加えたジャスモン酸メチルもジャスモン酸もヘキソキナーゼ活性に影響しなかった。
【００５５】
（ウエスタンブロット）
ヘキソキナーゼレベルの分析のため、上記のヘキソキナーゼ解離アッセイと同様に実験を行い、上清分画中の非結合のヘキソキナーゼをＦｉｎｇｒｕｔ（２００５）が記載したように抽出した。試料をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル（７％）電気泳動によって分離し、次いで、免疫ブロットを行った。ブロットは、特異的抗−ＨＫＩ抗体または抗−ＨＫＩＩ抗体（１：３００、サンタクルーズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、  米国、カルフォルニア州）を用いて調べた。ヘキソキナーゼ−抗体複合体をＨＲＰ標識抗体（１：１０，０００、サンタクルーズバイオテクノロジー社、米国、カルフォルニア州）で染色した。高感度化学発光（ＥＣＬ）試薬（バイオロジカル  インダストリーズ社、イスラエル、ベイトヘメック）を加え、ブロットをＥＣＬフィルム（イーストマン  コダック、米国、ニューヨーク州、ロチェスター）に曝露した。
【００５６】
（ミトコンドリア分画から遊離したチトクロムｃの測定）
単離したばかりのミトコンドリア分画（１００μＬ中、最終濃度は２ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で、試験される薬剤（例えば、ジャスモン酸メチル）とともに、ＫＣｌベースの呼吸バッファー（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｂｕｆｆｅｒ）（１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ  ヘペス、ｐＨ  ７．４；Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ、２００２）中でインキュベーションした。コハク酸カリウム（５ｍＭ）を呼吸基質として加えた（Ａｚｏｕｌａｙ−Ｚｏｈａｒ、２００４）。チトクロムｃ遊離の測定のため、ミトコンドリア分画を２０，０００×ｇで１０分間、４℃でペレットにした。ペレットを４０分間、溶解バッファー（２０ｍＭ  トリス  ＨＣｌ、ｐＨ  ８、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８、１％  トリトンＸ−１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル：シグマ社）とともに氷上でインキュベーションした（Ｆｉｎｇｒｕｔ、２００５）。ペレットライセートおよび上清を１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース膜にエレクトロブロットした。チトクロムｃを特異的抗体（１：１０００、ＢＤファーミンゲン社（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、カリフォルニア州、サンディエゴ）で検出した。抗原抗体複合体を西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗体（１：１０，０００、サンタクルーズバイオテクノロジー社、カリフォルニア州）および高感度化学発光（ＥＣＬ）試薬（ＥＺ−ＥＣＬ、バイオロジカル  インダストリーズ社、イスラエル、ベイトヘメック）で染色し、ＥＣＬフィルム（イーストマンコダック社、米国、ニューヨーク州、ロチェスター）に曝露した。
【００５７】
（ミトコンドリアの膨潤アッセイ）
単離したばかりのミトコンドリア分画を抽出バッファーで洗浄し、ＥＤＴＡを除去し、５ｍＭ  コハク酸カリウム、ｐＨ  ７．２を添加したばかりの膨潤バッファー（２２０ｍＭ  マンニトール、７０ｍＭ  スクロース、１５０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．２、０．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ７．２；１００μＬ中に０．２ｍｇ）中で再懸濁した。各成分にはナトリウムは含まれない。試験される試薬（例えば、ジャスモン酸メチル）を加える前に光学密度を５４０ｎｍの波長で２〜５分間モニターし、その後さらに２０分間モニターした。
【００５８】
（ヘキソキナーゼ精製）
ラット脳のＨＫ−Ｉを下記のように精製し、強固に結合したＨＫ−Ｉを含む粗製脳ミトコンドリアを１．２ｍＭ  グルコース−６−リン酸および０．５ｍＭ  Ｋ−ＥＤＴＡとともにインキュベーションし、酵素を可溶性分画に遊離させた。さらに、ＨＫ−Ｉの精製をチバクロンブルーアガロース（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））のアフィニティークロマトグラフィーで行った。精製した酵素を濃縮し、０．５ｍＭ  Ｋ−ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  グルコース、１ｍＭ  ジチオスレイトールおよび１０ｍＭ  Ｋ−ヘペス、ｐＨ  ７．８で、アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ）の装置および５０，０００Ｄａ分子量カットオフ膜（スペクトラム社（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、タイプＣ）を用いて洗浄した。濃縮した酵素（最大１ｍｇ／ｍｌ；３０〜６０ユニット／ｍｇ）を液体窒素中で凍結させ、使用まで−８０℃で保存した（Ａｚｏｕｌａｙ−Ｚｏｈａｒ、２００４）。
【００５９】
（ジャスモン酸エステルとＨＫの相互作用についての表面プラズモン共鳴分析）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は金属表面における分子結合の現象を、局所的な屈折率の変化を検出することで測定する光バイオセンサー技術である。ＳＰＲは、固定化されたバイオ分子（リガンド）および溶液相の分析物の相互作用の研究に理想的な表面感作技術である。バイオセンサー反応は、結合分析物量に正比例する。小さい分子量の分析物の検討における、従来技術（蛍光または酵素結合免疫吸着アッセイなど）に対しての、ＳＰＲの利点は、分析物の標識または多段階の検出手順（サンドウィッチアッセイ）が必要でなく、無標識かつ直接的な分析物を検出することである。また、ＳＰＲは、広範囲な結合親和性について分析物を検出できる。
【００６０】
ＰｒｏｔｅＯｎ−ＥＰ５（バイオラッド社、米国、カルフォルニア州、ハーキュリーズ）システムを用いたＳＰＲを、ジャスモン酸メチルとヘキソキナーゼの直接的な相互作用を検討するため用いた。このシステムにより、リガンドと分析物の相互作用を、６×６の型式で、リアルタイムで測定できる。精製したラット脳ＨＫＩおよびウサギ免疫グロブリンＧ（Ｒｂ  ＩｇＧ；リガンド）を、１０ｍＭ  酢酸Ｎａ（それぞれ、ｐＨ  ４および４．５）で希釈し、３７．５ｍｇ／ｍｌ  Ｎ−エチル−Ｎ’−（３’ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩および７．５ｍｇ／ｍｌ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化したＧＬＭセンサー表面に結合させた。ＨＫＩおよびＩｇＧを、チップを１００μｇ／ｍｌに飽和させるために加えた。次いで、チップ上に残った反応基を１Ｍ  エタノールアミン（ｐＨ  ８．５）で不活性化した。飽和状態のヘキソキナーゼの基本的シグナルは、８２００と９０００相対的単位（ＲＵ）の間であり、Ｒｂ  ＩｇＧでは〜１０５００ＲＵである。ジャスモン酸メチルおよびジャスモン酸（分析物）を、ランニングバッファー（０．００５％  Ｔｗｅｅｎおよび５％  ＤＭＳＯを添加したＰＢＳ×１）に希釈し、センサーチップに、様々な濃度で注入した。全ての実験は、流量５０μｌ／分、２５℃で行った。結果は、少なくとも３実験のセンソグラムの代表である。最大の相対的単位は、約６０ＲＵである。シグナルは適切な陰性対照を用いて正規化した。
【００６１】
（電位依存性アニオンチャネルの精製）
電位依存性アニオンチャネルを、Ａｚｏｕｌａｙ−Ｚｏｈａｒ（２００４）が記載したように精製した。簡単に言えば、ラットの肝臓のミトコンドリア（２００ｍｇのタンパク質）を３０分間、０℃（５ｍｇ／ｍｌ）で、１０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．０、０．１５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５μｇ／ｍｌ  ロイペプチンおよび０．０５％  ラウリル（ジメチル）アミンオキシド（ＬＤＡＯ）を含む溶液でインキュベーションした。４４，０００ｇ、２０分の遠心分離の後に、ペレットを２％  ＬＤＡＯを含む上記溶液で、５ｍｇ／ｍｌに再懸濁した。４４，０００ｇ、３０分の遠心分離の後に、ＬＤＡＯで抽出した電位依存性アニオンチャネルを乾燥したヒドロキシアパタイト／セライト（２：１、重量／重量）カラム（０．０８ｇ／ｍｇのタンパク質）にアプライし、１０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  リン酸ナトリウムおよび２％  ＬＤＡＯを含むバッファーで溶出した。電位依存性アニオンチャネルを含む分画（クマシーブルー染色によって同定）を回収し、１０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．４で５倍に希釈し、１０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ７．４、および０．５％  ｎ−オクチル  β−Ｄ−グルコピラノシド（バヒェムＡＧ社（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ））で前平衡化したＣＭ−セルロースカラムに充填した。次いで、充填したカラムを同じ平衡化バッファーで洗浄し、電位依存性アニオンチャネルを０．４Ｍ  ＮａＣｌを含む同じバッファーで溶出した。
【００６２】
（電位依存性アニオンチャネルの記録および分析）
電位依存性アニオンチャネルを脂質平面二重層（ＰＬＢ）に再構成し、Ａｚｏｕｌａｙ−Ｚｏｈａｒ（２００４）が記載したように記録し、分析した。簡単に言えば、ＰＬＢは、ｎ−デカンに溶解した大豆アソレクチン（ａｓｏｌｅｃｔｉｎ）（５０ｍｇ／ｍｌ）から調製した。精製した電位依存性アニオンチャネル（約１ｎｇ）をシス側と定義した容器に加えた。１またはいくつかのチャネルをＰＬＢに挿入した後、さらなる取り込みを阻害するために、シス側容器（ｃｉｓ  ｃｈａｍｂｅｒ）を２０容量の溶液で洗浄することで、過剰なタンパク質を除去した。電流を、電位固定下で、二重層電位  ＢＣ−５２５Ｂ  増幅器（ワーマー  インスツルメンツ社（Ｗａｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、米国、コネティカット州、ハムデン）を用いて記録した。電流を膜のトランス側（接地）について測定した。電流を、１ｋＨｚで、ベッセルフィルタ（フレクエンシーデバイス社（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、米国、マサチューセッツ州、ハーバーヒル）を用いて、ローパスフィルターにかけ、デジデータ（Ｄｉｇｉｄａｔａ）１２００−インターフェースボードおよびＰＣＬＡＭＰ６  ソフトウェア（アクソンインスツルメンツ社（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）、米国、カルフォルニア州、ユニオンシティー）を用いてオンラインでデジタル化した。
【００６３】
（形質移入実験）
ＣＴ２６細胞に、ＦｕＧｅｎｅ  ＨＤ形質移入試薬（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、スイス、バーゼル）を用いて、製造者の使用説明書に従い、ｐｃＤＮＡ３−ＨＫＩＩまたはｐｃＤＮＡ３を形質移入し、次いで、Ｇ４１８を用いた選択をした。
【００６４】
（統計解析）
結果は、少なくとも３つの独立した実験の平均値±標準誤差として示した。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡ検定を用いて評価した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなし、それぞれのグラフ中でアスタリスクの印を付けた。
【００６５】
（ヘキソキナーゼ−ミトコンドリア結合体は、ジャスモン酸メチルの分子標的である）
（実施例１）
ジャスモン酸メチルはヘキソキナーゼを癌細胞のミトコンドリア分画から解離する。ジャスモン酸メチルは、ミトコンドリアを、ＰＴＰＣ依存様式で直接的に撹乱させる（Ｒｏｔｅｍ、２００５）。ジャスモン酸メチルが、ＣＴ−２６腫瘍から単離したミトコンドリア分画からヘキソキナーゼを解離させることができるかを判定するために、異なる時間で処理したミトコンドリア分画の上清のヘキソキナーゼ活性を測定した。ＣＴ−２６腫瘍のミトコンドリア分画を、１０、３０または６０分間、種々の試薬とともに、３７℃でインキュベーションした。非結合のヘキソキナーゼ活性を測定し、自然に解離したヘキソキナーゼの活性（対照）と比較した。ジャスモン酸メチルは、ヘキソキナーゼを、時間依存的様式で解離した（図１Ａ）。さらに、３０分間のインキュベーションの間に行った分析は、ジャスモン酸メチルによるヘキソキナーゼの解離は用量依存的であることを示した（図１Ｂ）。逆に、ジャスモン酸メチルのより少ない細胞傷害性誘導体である、ジャスモン酸（Ｆｉｎｇｒｕｔ、２００２）は、ミトコンドリア分画からのヘキソキナーゼの解離をそれほど示さなかった。
【００６６】
ミトコンドリアのヘキソキナーゼの物理的な解離を確認するため、同様の調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜にエレクトロブロットし、抗−ＨＫＩ抗体および抗−ＨＫＩＩ抗体で調べた。ＨＫＩおよびＨＫＩＩの両方の遊離が示された（図１Ｃ）。
【００６７】
ミトコンドリア分画からのヘキソキナーゼの解離は、ＣＴ−２６結腸癌に限られない。異なる癌細胞から単離したミトコンドリア分画、すなわち、Ｍｏｌｔ−４細胞、ＢＣＬ−１白血病細胞およびＢ１６黒色腫を３０分間、３７℃でインキュベーションし、非結合のヘキソキナーゼの活性を測定し、自然に（対照）解離したヘキソキナーゼの活性と比較した。ジャスモン酸メチルは、ヘキソキナーゼを３つの異なる癌細胞から単離したミトコンドリア分画から解離させた（図２Ａ〜２Ｃ）。これらの実験における上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗−ＨＫＩ抗体および抗−ＨＫＩＩ抗体で調べた。ヘキソキナーゼの種々の癌細胞のミトコンドリア分画からの解離を、さらに確認した（図２Ｄ〜２Ｆ）。
【００６８】
（実施例２）
ミトコンドリアの損傷およびＡＴＰ欠乏は、ミトコンドリア分画からのヘキソキナーゼの遊離と同時に生じた。ＣＴ−２６腫瘍から単離されたミトコンドリア分画からのチトクロムｃの遊離は、ミトコンドリアからヘキソキナーゼを解離するために必要であったのと同じ期間内（１５〜６０分間）に生じた（図３）。ジャスモン酸メチルは、ＣＴ−２６腫瘍の単離されたミトコンドリア分画からのチトクロムｃの時間依存的な遊離を引き起こした。遊離を特異的抗体を用いて調べた。
【００６９】
細胞のＡＴＰレベルと、ミトコンドリア分画からのヘキソキナーゼの遊離との間の相関を検討するため、異なる癌細胞、すなわち、Ｍｏｌｔ−４細胞、ＢＣＬ−１白血病細胞およびＢ１６黒色腫を種々の濃度のジャスモン酸メチルに曝露した。図４Ａは、全ての３種の異なる癌細胞株が、６０分間のジャスモン酸メチルへの曝露の間に、有意かつ用量依存的に細胞のＡＴＰの減少を呈することを示している。ＣＴ２６細胞およびＭｏｌｔ−４細胞を、次いで、２４穴プレートに播種した。ＣＴ２６細胞を、一晩接着させた。細胞を、ジャスモン酸メチル（ＭＪ；３ｍＭ）に、１時間曝露した。トリパンブルー色素排除アッセイ試験を行い、細胞数を計測した。過度のＡＴＰ欠乏にも関らず、３ｍＭ  ジャスモン酸メチルに曝露された細胞は、依然として６０分後も生存した（図４Ｂ）。Ｍｏｌｔ−４細胞は、ＣＴ２６腫瘍細胞に対して感度の上昇を示したが、両方の細胞株で、ＡＴＰ欠乏が細胞死に先行して現れた。
【００７０】
（実施例３）
ジャスモン酸メチルはヘキソキナーゼ−Ｉによって閉じられた脂質二重層に再構成された電位依存性アニオンチャネルを再開口する。哺乳類のＨＫＩおよびＨＫＩＩは、電位依存性アニオンチャネルを通じてミトコンドリアの外膜に結合する（Ａｚｏｕｌａｙ−Ｚｏｈａｒ、２００４；Ｒｏｂｅｙ、２００６）。ジャスモン酸メチルの、脂質平面二重層に再構成された、精製したミトコンドリアの電位依存性アニオンチャネルのチャネル活性に対する効果を、電位固定下で検討した（Ａｚｏｕｌａｙ−Ｚｏｈａｒ、２００４）。電位依存性アニオンチャネル活性のモニターは、ヘキソキナーゼおよび他の薬剤との、電位依存性アニオンチャネルの相互作用を試験する定法である（Ｓｈｏｓｈａｎ−Ｂａｒｍａｔｓ、２００５）。電位依存性アニオンチャネルは、脂質平面二重層に再構成された。０から−２０ｍＶまたは−４０ｍＶの電圧ステップに対する電流を、０．５Ｍ  ＮａＣｌの対称溶液中で、ヘキソキナーゼ−Ｉ（ＨＫ−Ｉ；２０ｍＵ／ｍｌ）の添加前および添加１０分後に記録した。表示した時点で、３ｍＭ  ジャスモン酸メチル（ＭＪ）を加え、電流を１０分後に記録した。破線は、零電流および最大電流レベルを示している（図５）。データは、３回反復したうちの代表である。濃度３ｍＭのジャスモン酸メチルは、保持電位０ｍＶから−４０ｍＶの電圧ステップに対する電位依存性アニオンチャネルを通る電流について何の効果も示さなかった。相対的に小さい膜電位（−２０ｍＶ）では、コンダクタンスは、記録のうち１２０分までは一定のままだった（図５）。しかし、精製ＨＫ−Ｉを添加した場合、開口チャネルは低電導状態で安定した。電位依存性アニオンチャネルに対するＨＫ−Ｉの上記効果は、ジャスモン酸メチルの添加によって逆転し、ヘキソキナーゼと電位依存性アニオンチャネルとの相互作用を撹乱するジャスモン酸メチルの能力を示している。再構成された電位依存性アニオンチャネルが−４０ｍＶに曝露されたとき、同様の結果が得られた。ＨＫ−Ｉは、電位依存性アニオンチャネルの閉鎖を促進させ、低電導状態で安定させた。同様に、ジャスモン酸メチルの添加は、ＨＫ−Ｉによって閉じられたチャネルを再開口させる（図５）。
【００７１】
（実施例４）
ジャスモン酸メチルは、ヘキソキナーゼと、特異的かつ用量依存的様式で相互作用する。ジャスモン酸メチルの、ヘキソキナーゼとの可能性のある直接の相互作用を調べるため、リアルタイム表面プラズモン共鳴分析を行った。ジャスモン酸メチルは、精製ラット脳ＨＫＩに、用量依存的様式で結合することが見出された（図６Ａ）。しかし、解離定数の決定は、ジャスモン酸メチルのランニングバッファーへの溶解性が制限されていたため、出来なかった。図６Ｂは、無関係なタンパク質のＲｂ  ＩｇＧ（番号３および番号４）を、ヘキソキナーゼ（番号１および番号２）の代わりに用いることにより、結合の特異性を立証したことを示している。
【００７２】
さらに、ジャスモン酸メチルの特異性を示すため、ジャスモン酸メチルよりも低い細胞傷害性を有し（Ｆｉｎｇｒｕｔ、２００２；Ｆｉｎｇｒｕｔ、２００５；Ｒｏｔｅｍ、２００５）、より少ない程度でミトコンドリアを撹乱し、かつ、ジャスモン酸メチルよりも、ヘキソキナーゼをミトコンドリア分画から解離するのには有効でないことが示された（図１Ｃ）ジャスモン酸を、同様の条件で試験した。図６Ｃは、ジャスモン酸は、ヘキソキナーゼに、これらの条件下では全く結合しなかったことを示している（番号３および番号４対番号１および番号２のジャスモン酸メチル）。従って、ジャスモン酸メチルは、ヘキソキナーゼと特異的な様式で相互作用する。
【００７３】
（ヘキソキナーゼとミトコンドリアの相互作用の解離は、ジャスモン酸メチルに誘導されたミトコンドリア毒性および細胞傷害性を媒介する）
（実施例５）
ジャスモン酸メチルは、ヘキソキナーゼリッチなミトコンドリア中で膨潤を選択的に誘導する。ジャスモン酸メチルの結合ヘキソキナーゼ解離能と、ミトコンドリアの損傷との間の関係の一貫性を検討するため、ジャスモン酸メチルをマウスの脳内で、マウスの肝臓と比較して試験した。比較は、マウスの脳とマウスの肝臓におけるミトコンドリアのヘキソキナーゼ量の既知の差によって行った。当該技術分野では、脳のミトコンドリア分画は結合ヘキソキナーゼに富み、肝臓のミトコンドリア分画は基本的に結合ヘキソキナーゼを欠くということが実証されている（Ｗｉｌｓｏｎ、１９９５）。第一に、ジャスモン酸メチルの、マウスの脳から単離されたミトコンドリア分画からヘキソキナーゼを解離する能力は、時間依存的および用量依存的の両方であることが示された（それぞれ図７Ａおよび図７Ｂ）。ミトコンドリア分画は、１０、３０または６０分間、３７℃でインキュベーションした。非結合ヘキソキナーゼ活性を測定し、自然に（対照）解離されたヘキソキナーゼ活性と比較した。そのため、ジャスモン酸メチルが、マウスの脳および肝臓から単離されたミトコンドリア分画の膨潤を誘導する能力を試験した。上述の関係から予測されるように、ジャスモン酸メチルおよび、わずかな程度だがジャスモン酸は、脳のミトコンドリア分画の膨潤を引き起こすが（図８Ａ）、肝臓のミトコンドリア分画の膨潤は引き起こさなかった（図８Ｂ）。
【００７４】
（実施例６）
ヘキソキナーゼの過剰発現は、ジャスモン酸メチルで誘導された細胞傷害から保護する。ヘキソキナーゼの過剰発現の、ジャスモン酸メチルの作用に対する効果を検討するため、ＣＴ２６細胞に、プラスミド、ｐｃＤＮＡ３−ＨＫＩＩまたはｐｃＤＮＡ３（それぞれ、過剰発現したヘキソキナーゼＩＩおよび対照プラスミドをコードしている）を形質移入した（Ｚａｉｄ、２００５）。細胞を９６穴プレートに播種し、接着させた。細胞をジャスモン酸メチルにＡＴＰ測定（図９Ａ）の前に６０分間曝露し、ヘマカラー（ｈｅｍａｃｏｌｏｒ）法による細胞傷害測定の前に２４時間曝露した（図９Ｂ）。図９Ａおよび図９Ｂに示されるように、６０分の細胞ＡＴＰレベルの枯渇、および一晩のジャスモン酸メチルによって誘導された細胞傷害はともに、細胞内で減少し、対照（白色）に比べ、ヘキソキナーゼＩＩ（灰色）の高発現を伴った。さらに、ヘマカラー法による細胞傷害測定の前に、３．７５μＭ  スタウロスポリン（陽性対照；Ａｚｏｕｌａｙ−Ｚｏｈａｒ、２００４）に３時間曝露することによって誘導した細胞傷害は、同様に、ヘキソキナーゼＩＩの過剰発現によって減少した（図９Ｃ）。
【００７５】
（実施例７）
ジャスモン酸メチルと比較した新規化合物によるヘキソキナーゼ解離は、腫瘍細胞死を引き起こす能力と相関した。ジャスモン酸メチルと比較した、新規化合物がミトコンドリアからヘキソキナーゼを解離させる能力と、ジャスモン酸メチルと比較した、腫瘍細胞死を引き起こす能力との間の相関を検討した。一連の、２０００ダルトン未満の分子量を有する６種の有機的に合成された化合物（ジャスモン酸エステル誘導体）（化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）を、腫瘍細胞のミトコンドリアからヘキソキナーゼを解離させる能力について上述のように分析した。次いで、それらの化合物を、ジャスモン酸メチル（ＭＪ）とともに、ヘキソキナーゼ解離を引き起こす能力について順序を付けた。
【００７６】
これらの化合物の抗腫瘍活性は、さらに、Ｍｏｌｔ−４細胞に対する細胞傷害活性を分析することで、評価した。ヘキソキナーゼ解離と、順序付けた化合物Ａ〜Ｆおよびジャスモン酸メチルの誘導された腫瘍細胞死の間との相関を、Ｍｏｌｔ−４細胞に対する細胞傷害性の関数としてヘキソキナーゼ解離活性をプロットして評価した。図１０は、ジャスモン酸メチルと比較したこれらの化合物のヘキソキナーゼ解離能と、腫瘍細胞死を引き起こす能力との間の強い相関を示している。
【００７７】
具体的な実施形態についての上述の記載は、本発明の一般的性質を完全に明らかにしているため、他者は、当業者における知識（本願明細書で引用した参考文献の内容を含む）を用いることで、過度の実験をすることなく、本発明の一般概念から逸脱することなく、このような具体的な実施形態を容易に改変および／または種々の応用例のために適合できる。従って、このような適合および改変は、本願明細書に示された教示および指針に基づき、開示された実施形態の均等物の意義および範囲に含まれることを意図する。本願明細書における表現または用語は、説明を目的とするものであって、限定するものではないため、本願明細書における用語または表現は当業者によって、本願明細書に示された教示および指針を踏まえて、当業者の知識と組み合わせて解釈されることになることが理解されるだろう。
【００７８】
（参考文献）
Ａｚｏｕｌａｙ−Ｚｏｈａｒ  Ｈ．、Ｉｓｒａｅｌｓｏｎ  Ａ．、Ａｂｕ−Ｈａｍａｄ  Ｓ．およびＳｈｏｓｈａｎ−Ｂａｒｍａｔｚ  Ｖ．（２００４）。Ｉｎ  ｓｅｌｆ−ｄｅｆｅｎｃｅ：ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｌｏｓｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７７，３４７〜３５５。
Ｆｉｎｇｒｕｔ  Ｏ．、およびＦｌｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．（２００２）。Ｐｌａｎｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ。Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １６，６０８〜６１６。
Ｆｉｎｇｒｕｔ  Ｏ．、Ｒｅｉｓｃｈｅｒ  Ｄ．、Ｒｏｔｅｍ  Ｒ．、Ｇｏｌｄｉｎ  Ｎ．、Ａｌｔｂｏｕｍ  Ｉ．、Ｚａｎ−Ｂａｒ  Ｉ．、およびＦｌｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．（２００５）。Ｊａｓｍｏｎａｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｎｏｎａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｐ５３−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌｓ。Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４６，８００〜８０８。
Ｆｌｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．（２００５）。Ｊａｓｍｏｎａｔｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ。Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  １６，９１１〜９１６。
Ｇａｌｕｚｚｉ  Ｌ．、Ｌａｒｏｃｈｅｔｔｅ  Ｎ．、Ｚａｍｚａｍｉ  Ｎ．、およびＫｒｏｅｍｅｒ  Ｇ．（２００６）。Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５，４８１２〜４８３０。
Ｇｏｌｄｉｎ  Ｎ．、Ｈｅｙｆｅｔｓ  Ａ．、Ｒｅｉｓｃｈｅｒ  Ｄ．、およびＦｌｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．（２００７）。Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＡＴＰ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｊａｓｍｏｎａｔｅ  ｆａｍｉｌｙ。Ｊ．  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂ．３９，５１〜５７。
Ｈｅｙｆｅｔｓ  Ａ．、およびＦｌｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．（２００７）。Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌ  ｊａｓｍｏｎａｔｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ２−ｄｅｏｘｙ−ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ。Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．５０、３００〜３１０。
Ｉｓｈｉｉ  Ｙ．、Ｋｉｙｏｔａ  Ｈ．、Ｓａｋａｉ  Ｓ．、およびＨｏｎｍａ  Ｙ．（２００４）。Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｊａｓｍｏｎａｔｅｓ，ｐｌａｎｔ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ。Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １８、１４１３〜１４１９。
Ｋｉｍ  Ｊ．Ｈ．、Ｌｅｅ  Ｓ．Ｙ．、Ｏｈ  Ｓ．Ｙ．、Ｈａｎ  Ｓ．Ｉ．、Ｐａｒｋ  Ｈ．Ｇ．、Ｙｏｏ  Ｍ．Ａ．、およびＫａｎｇ  Ｈ．Ｓ．（２００４）。Ｍｅｔｈｙｌ  ｊａｓｍｏｎａｔｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｘ／Ｂｃｌ−ＸＳ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−３  ｖｉａ  ＲＯＳ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａ５４９  ｃｅｌｌｓ。Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．１２、１２３３〜１２３８。
Ｍａｔｈｕｐａｌａ  Ｓ．Ｐ．、Ｋｏ  Ｙ．Ｈ．、およびＰｅｄｅｒｓｅｎ  Ｐ．Ｌ．（２００６）。Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ  ＩＩ：Ｃａｎｃｅｒ’ｓ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｄｇｅｄ  ｓｗｏｒｄ  ａｃｔｉｎｇ  ａｓ  ｂｏｔｈ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ  ａｎｄ  ｇａｔｅｋｅｅｐｅｒ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ  ｗｈｅｎ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５：４７７７〜４７８６。
Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ  Ｊ．Ｇ．、Ｓｈｕｌｇａ  Ｎ．、およびＨｏｅｋ  Ｊ．Ｂ．（２００２）。Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ  ＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｂａｘ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、７６１０〜７６１８。
Ｒｅｉｓｃｈｅｒ  Ｄ．、Ｈｅｙｆｅｔｓ  Ａ．、Ｓｈｉｍｏｎｙ  Ｓ．、Ｎｏｒｄｅｎｂｅｒｇ  Ｊ．、Ｋａｓｈｍａｎ  Ｙ．、およびＦｌｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．、（２００７）。Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｊａｓｍｏｎａｔｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ。Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５０、７３８〜７４９。
Ｒｏｂｅｙ  Ｒ．Ｂ．、およびＨａｙ  Ｎ．（２００６）。Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅｓ，ｎｏｖｅｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｋｔ。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５、４６８３〜４６９６。
Ｒｏｔｅｍ  Ｒ．、Ｈｅｙｆｅｔｓ  Ａ．、Ｆｉｎｇｒｕｔ  Ｏ．、Ｂｌｉｃｋｓｔｅｉｎ  Ｄ．、Ｓｈａｋｌａｉ  Ｍ．、およびＦｌｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．（２００５）。Ｊａｓｍｏｎａｔｅｓ：ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ａｃｔｉｎｇ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５，１９８４〜１９９３。
Ｓｈｏｓｈａｎ−Ｂａｒｍａｔｚ  Ｖ．、およびＩｓｒａｅｌｓｏｎ  Ａ．（２００５）。Ｔｈｅ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｎ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ／ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ。Ｊ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．２０４、５７〜６６。
Ｖａｒｂｉｒｏ  Ｇ．、Ｖｅｒｅｓ  Ｂ．、Ｇａｌｌｙａｓ  Ｆ．、およびＳｕｍｅｇｉ  Ｂ．  （２００１）。Ｄｉｒｅｃｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｔａｘｏｌ  ｏｎ  ｆｒｅｅ  ｒｅｄｉｃａｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ。Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３１、５４８〜５５８。
Ｗｉｌｓｏｎ  Ｊ．Ｅ．（１９９５）。Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅｓ。Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２６、６５〜１９８。
Ｚａｉｄ  Ｈ．、Ａｂｕ−Ｈａｍａｄ  Ｓ．、Ｉｓｒａｅｌｓｏｎ  Ａ．、Ｎａｔｈａｎ  Ｉ．、およびＳｈｏｓｈａｎ−Ｂａｒｍａｔｚ  Ｖ．（２００５）。Ｔｈｅ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ−１  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ。Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１２、７５１〜７６０。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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