(57)【要約】ある実施形態は、概して、核酸の分析のための方法に関する。本方法は、１つ以上の蛍光標識された核酸と結合するように構成される共鳴構造体を提供するステップと、共鳴構造体上の源から励起光を指向するステップとを含む。また、本方法は、共鳴構造体の表面上にプラズモンを生成するステップを含み、検体は、共鳴構造体のエネルギー集中点に固定される。さらに別の実施形態において、プラズモン構造体が提供される。プラズモン構造体は、金属材料で実装されたナノアンテナを含み、このナノアンテナは、ナノアンテナの一部に隣接して配置される増強領域および遮断層を生成するように構成される。遮断層は、増強領域外側のフルオロフォアの励起を実質的に低減するように構成される。
2010503868.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の分析のための方法であって、
１つ以上の蛍光標識された核酸と結合するように構成される共鳴構造体を提供するステップと、
該共鳴構造体上の源から励起光を指向するステップと、
該共鳴構造体の表面上にプラズモンを生成するステップと、
を包含し、検体は、該共鳴構造体のエネルギー集中点に固定される、方法。
【請求項２】
検体の分析のための方法であって、
検体と結合する共鳴構造体を提供するステップと、
該共鳴構造体上の源から励起光を指向するステップと、
該共鳴構造体の表面上にプラズモンを生成するステップと、
を包含し、該検体は、光活性化可能なリンカーを通して、該共鳴構造体のエネルギー集中点に固定される分子と複合体を形成する、方法。
【請求項３】
前記プラズモンは、単分子配列決定において使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プラズモンは、蛍光相関分光測定法において使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記共鳴構造体は、ナノ粒子である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノ粒子は、ナノライス、ナノロッド、ナノリング、ナノキューブ、ナノシェル、およびナノクレセントのうちの１つである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記プラズモンは、前記ナノクレセントの周辺に生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記共鳴構造体は、孔のアレイである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記プラズモンは、前記孔のアレイ内の孔の表面上に、該孔のアレイ上方に、および該孔を通して、生成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記励起光源は、鈍らな光ファイバの先端である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記励起光源は、前記検体外側に位置付けられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記励起光源は、光ファイバの先端のアレイである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記共鳴構造体は、フォトニックサブ波長導波路を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記共鳴構造体は、２次元フォトニック結晶を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記共鳴構造体は、ナノアンテナである、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記共鳴構造体は、ボウタイ型ナノアンテナである、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ボウタイ型アンテナ上にコーティングを提供するステップをさらに包含し、該コーティングは、実質的に消光を防止する適切な厚さに構成される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記共鳴構造体の前記エネルギー集中点において、光活性化可能なアタッチメントを提供するステップをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記光活性化可能なアタッチメントは、単分子配列決定の一部である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
プラズモン構造体であって、
金属材料で実装され、増強領域を生成するように構成される、ナノアンテナと、
該ナノアンテナの一部に隣接して配置され、該増強領域外のフルオロフォアの励起を実質的に低減するように構成される、遮断層と、
を備える、構造体。
【請求項２１】
前記遮断層は、誘電体によって実装される、請求項２０に記載のプラズモン構造体。
【請求項２２】
金属層をさらに備え、エバネセント波励起領域が、該金属層を通して、ＳＰＲによって生成される、請求項２０に記載のプラズモン構造体。
【請求項２３】
前記エバネセント波励起領域は、ＴＩＲＦによって生成される、請求項２０に記載のプラズモン構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、光集中または増強機構に関し、より具体的には、周辺共鳴空洞上の表面プラズモンに基づいて、高エネルギー場を生成する光集中機構のための方法、装置、およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
標識ヌクレオチドを使用する非段階的単分子配列決定（自励、または光不安定性（photo labile）ブロッカーの利用のいずれか）では、取り込まれるヌクレオチドに付随する標識が、適切に観察され得るように、標識ヌクレオチド由来のバックグラウンドを低減するための方法を作用させる必要がある。いくつかの以前に記載された方法として、ゼロモード導波路、光不安定性リンカーを消光するステップと組み合わせたプラズモン共鳴、酵素とヌクレオチドとの間のＦＲＥＴ対、ＴＩＲＦと組み合わせた排除層(exclusionlayer)、および類似の他の技術を含む。
【０００３】
従来の方法は、欠点および不利点を有する。例えば、典型的方法は、典型的には、狭い面積内で励起光を遮断するステップを伴う。この励起光は、典型的には、高価な大型レーザを必要とする。さらに、本方法は、信号品質を劣化させる膨大な量のバックグラウンドノイズを生成し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
ある実施形態は、概して、核酸の分析のための方法に関する。本方法は、１つ以上の蛍光標識された核酸と結合するように構成される共鳴構造体を提供するステップと、共鳴構造体上の源から励起光を指向するステップとを含む。また、本方法は、共鳴構造体の表面上でプラズモンを生成するステップを含み、検体は、共鳴構造体のエネルギー集中点に固定される。
【０００５】
別の実施形態は、概して、検体の分析のための方法に関する。本方法は、検体と結合する共鳴構造体を提供するステップと、共鳴構造体上の源から励起光を指向するステップとを含む。また、本方法は、共鳴構造体の表面上にプラズモンを生成するステップを含み、検体は、光活性化可能なリンカーを通して、共鳴構造体のエネルギー集中点に固定される分子と複合体を形成する。
【０００６】
さらに別の実施形態は、概して、プラズモン構造体に関する。プラズモン構造体は、金属材料で実装されたナノアンテナを含み、このナノアンテナは、ナノアンテナの一部に隣接して配置される増強領域および遮断層を生成するように構成される。遮断層は、増強領域外側のフルオロフォアの励起を実質的に低減するように構成される。
【０００７】
本実施形態の種々の特徴は、付随の図面と併せて検討される際、以下の発明を実施するための形態を参照して、より理解されることによって、さらに完全に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の実施形態による、ナノ粒子の一種である、例示的ナノライス（naonorice）を示す。
【図２】別の実施形態による、例示的ナノクレセント(nanocrescent)を示す。
【図３】図３Ａは、ナノクレセントの強度画像を示す。図３Ｂは、従来のゼロモード導波路を示す。図３Ｃは、ある実施形態による、共鳴構造体の別の実施形態を示す。
【図４】さらに別の実施形態による、サブ波長(subwavelength)孔アレイを示す。
【図５】サブ波長孔アレイのエネルギーパターンの近接場走査顕微鏡画像を示す。
【図６】さらに別の実施形態による、鈍端(blunt tip)光ファイバを示す。
【図７】さらに別の実施形態による、平面フォトニック導波路構造体を示す。
【図８】平面フォトニック導波路構造体の強度プロファイルを示す。
【図９】２次元フォトニック結晶のある実施形態を示す。
【図１０】ある実施形態による、例示的ナノアンテナを示す。
【図１１】例示的ボウタイ型アンテナを示す。
【図１２】一連のフラクタル状のナノアンテナを示す。
【図１３】図１３Ａ−Ｂは、さらに別の実施形態による、コーティングされたボウタイ型アンテナを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義
以下の用語は、以下に詳述される種々の実施形態を説明するために使用される。
【００１０】
プラズモン共鳴は、光学的振動数における自由電子またはプラズモンの集団振動として定義され得る。
【００１１】
表面プラズモンは、表面に拘束され、ポラリトンを生じる光と強く相互作用するプラズモンである。プラズモンは、正の誘電率を有する材料と、負の誘電率を有する材料との界面で生じる（通常、金属またはドープ誘電体）。
【００１２】
共鳴構造体は、小さな領域の高い局所的な電場を生成するために、光エネルギーを集中させる構造体の形状に沿って、プラズモン共鳴を使用するナノアンテナまたはナノ粒子等の構造体をいい得る。
【００１３】
蛍光増強比（ＦＥＲ）は、共鳴構造体要素を伴わず、他のすべての変数は一定である同等サイズの領域から収集される光子と比較した、共鳴構造体要素に付随する励起領域から収集される蛍光光子の比率をいい得る。
【００１４】
用語「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」あるいは「核酸」は、交換可能に使用可能であって、ヌクレオチドモノマーの単鎖または二本鎖ポリマーを含み、これらとしては、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合連鎖（linkage）、またはヌクレオチド間類似体によって結合される２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、ならびに付随する対イオン、例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋等が挙げられる。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドからもっぱら構成され得るか、リボヌクレオチドからもっぱら構成され得るか、またはそのキメラ混合物から構成され得る。ポリヌクレオチドは、核酸塩基および糖類似体から構成され得る。ポリヌクレオチドは、典型的には、例えば、当技術分野においてオリゴヌクレオチドと一般に称される場合、５〜４０の数モノマー単位から、数千モノマーヌクレオチド単位の大きさの範囲である。別に記載がない限り、ポリヌクレオチド配列と言う場合は常に、ヌクレオチドは、左から右に５’から３’の順番であって、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示すことを理解されるであろう。標識ポリヌクレオチドは、５’末端、３’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間連鎖、糖類、アミノ、硫化物、ヒドロキシル、またはカルボキシルにおける修飾を含み得る。例えば、参考として本明細書に援用されるＬｅｅらの米国特許第６，３１６，６１０  Ｂ２号を参照されたい。同様に、他の修飾も、適切とみなされる指示部位においてなされ得る。
【００１５】
便宜上および例証目的として、本発明の原理は、その例示的実施形態を主に参照することによって説明される。しかしながら、当業者は、同一原理が、あらゆる種類の検出システムに等しく適用され、それらにおいて実装可能であって、いずれのそのような変形例も、本発明の真の精神および範囲から逸脱しないことを容易に認識するであろう。さらに、以下の発明を実施するための形態では、特定の実施形態を図示する付随の図面に対して参照がなされる。電気的、機械的、論理的、および構造的変更は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、実施形態になされてもよい。したがって、以下の発明を実施するための形態は、限定的意味としてとらえられるべきではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によって定義される。
【００１６】
いくつかの実施形態は、概して、表面プラズモンの使用を通して、高エネルギー場を生成するためのシステム、装置、および方法に関し、表面プラズモンは、共鳴空洞の周辺に位置する。より具体的には、共鳴空洞は、金属ナノ粒子で実装されてもよい。例えば、ナノライスは、検体溶液内に配置され、限定空間内における事象の検出を促進し得る。励起光は、プラズモン、すなわち、ナノライスの表面上の限局性高エネルギー場を生成し、次いで、検体に適用し得る。金属ナノ粒子の他の実施例は、ナノロッド（nanorod）、ナノリング(nanoring)、ナノキューブ(nanocube)、ナノシェル(nanoshell)およびナノクレセントであり得る。ナノ粒子は、サイズおよび態様が可変であって、このことによって、ナノ粒子の吸収スペクトルおよび生成されたプラズモンのエネルギーを変動させるようにナノ粒子を調整することができる。限局性プラズモン共鳴を生成する実施形態は、次いで、単分子検出および蛍光相関分光測定法（fluorescentcorrelation spectrometry）（「ＦＣＳ」）等の用途において使用されてもよい。他の用途として、単分子配列決定および多分子配列決定を含む。
【００１７】
別の実施形態は、概して、プラズモン共鳴が、孔アレイ内の孔の１つを囲む周辺表面上で生成され、したがって、利用可能なエネルギーを向上させるとともに、小体積内にそれを配置するような適切な厚さおよび材料のサブ波長孔アレイに関する。励起光は、孔アレイの表面に指向される。光の一部は、反射され得るか、または孔アレイ内の孔に入り得るが、エネルギーの大部分は、孔の周辺の表面に衝突する光に結合される。光の結合は、孔内の、孔を通っての、および／または孔上方の平面表面におけるプラズモン共鳴を生成する。類似実施形態は、プラズモン共鳴が維持されるような適切な誘電体材料を含んでもよい。
【００１８】
さらに別の実施形態は、概して、サブ波長導波路として使用されるフォトニック結晶（photonics crystal）に関する。より具体的には、類似サブ波長孔アレイは、標的検体を保持してもよい。フォトニック結晶の導波路は、励起光を指向し、高価なレーザ光の再利用を可能にする。
【００１９】
さらに別の実施形態は、概して、プラズモンエネルギーを限局されたスポットに集中させるためのナノアンテナに関する。例えば、円形ナノアンテナが作製可能である。円形ナノアンテナの特性の１つは、エネルギーを中心に集中させ、したがって、限局された領域内のプラズモン強度を増大させることである。ナノアンテナの別の実施例は、ボウタイ型ナノアンテナである。また、ナノアンテナは、レシーバとしても使用可能である。したがって、分子を消光するとともに、発光を収集するために使用可能である。これらの金属構造体はすべて、フルオロフォアが十分近接している場合、蛍光を消光する。望ましくない消光を防止するために、フルオロフォアは、薄い（約５〜２０ｎｍ）誘電体層を使用して、金属から離間することが可能である。そのような層は、ガラス、プラスチック、またはＰＥＧ等の化学コーティングから成ることができる。厚さは、完全に消光されないが、集中させたプラズモンの体積から大幅に離間しないように、フルオロフォアを離間するために十分であるべきでる。図１３Ａおよび１３Ｂに示されるように、選択的に表面を被覆し、ナノアンテナから離れた領域により大きな厚さを提供することが可能である。これは、エバネセント波励起領域の指数関数的減衰の急勾配部分に低蛍光材料を配置することによって、バックグラウンドを最小限にすることができる。２００６年５月１６日出願の米国仮出願第６０／８００，４４０号（これは、参考として、その全体が本明細書に援用される）に教示されるように、エバネセント波領域は、ＳＰＲまたはＴＩＲＦによって生成可能である。
【００２０】
本発明の実施形態は、概して、小体積、すなわち、サブ波長寸法内に高エネルギー場を生成することに関する。一実施形態は、ナノ粒子を利用する。固体金属ナノ粒子（すなわち、均一組成およびナノメートル寸法の固体単一金属球）は、独特の光学特性を有することが知られている。特に、金属ナノ粒子（特に、貨幣金属）は、著しい光学共鳴を示す。このいわゆるプラズモン共鳴は、金属球内の伝導電子の入射電磁場への集合的な結合による。この共鳴は、入射電磁放射の波長に対するナノ粒子の半径に依存した、吸収または散乱によって支配され得る。このプラズモン共鳴に付随するのは、金属ナノ粒子の表面上の強力な局所電場増強である。
【００２１】
しかしながら、固体金属ナノ粒子の多くの用途を実現する際の深刻かつ実際的制限は、技術的に重要な波長にプラズモン共鳴を位置付けることが不可能なことである。例えば、直径１０ｎｍの固体の金ナノ粒子は、中心が５２０ｎｍであるプラズモン共鳴を有する。このプラズモン共鳴は、粒子径または特定の包埋媒体を変更することによって、約３０ナノメートルを超えて制御可能にシフトさせることはできない。
【００２２】
故に、複合ナノ粒子は、ほぼ所望の波長を中心とするプラズモン共鳴を可能にするように加工されている。図１は、本発明の実施形態による、ナノ粒子の一種である例示的ナノライスを示す。
【００２３】
図１に示されるように、ナノライス１００は、米粒と類似形状である。ナノライス１００は、ヘマタイトと呼ばれ、金で覆われる非伝導性酸化鉄から作製され得る。シェルの厚さ、ナノライスの長さ、およびコアの幅は、プラズモン共鳴の特定の周波数を生成するように操作可能である。ナノライス１００のための作製方法は、Ｈｕｉ  ＷａｎｇらのＮａｎｏｒｉｃｅ：  Ａ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，６（４），８２７−８３７，２００６（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）に記載されている。
【００２４】
いくつかの実施形態では、励起光源（図示せず）は、ナノライス１００に指向されてもよい。励起光源は、レーザ、レーザダイオード、発光ダイオード（ＬＥＤ）、紫外線バルブ、および／または白色光源であり得る。プラズモンは、ナノライス１００の金属表面上を横切る光学周波数における自由電子の集合振動である。ナノライス１００の表面上のプラズモンは、光の周波数が、プラズモン振動の周波数と共鳴すると、光を電気エネルギーに変換することができる。この共鳴効果は、粒子の周囲で放射する高強度の局所的な電場を生成することができる。故に、図１はまた、ナノライス１００の粒子の端部近傍のプラズモン共鳴によって生成される強力なエネルギー場を示す。ナノライスの独特の形状によって、棒状および球状粒子において以前に測定されたものよりも強力な電場が可能となる。
【００２５】
故に、ナノライス１００は、検体内に位置付けられてもよい。励起光は、ナノ粒子に指向され、小体積内でプラズモンを生成することができる。プラズモンを生成するこの方法は、退色（bleaching）が、従来の方法ほど迅速に生じないという副次的な利点を有する。ナノ粒子は、フルオロフォアの蛍光寿命を低減させ、退色前の蛍光光子放出率および放出される光子の総数を増加させる。
【００２６】
他の実施形態では、他のナノ構造体が、ナノライスの代わりに使用可能である。例えば、ユーザ要件に応じて、ナノロッド、ナノリング、ナノキューブ、およびナノシェルが使用可能である。各ナノ構造体は、それぞれ独自の共鳴波長、電場の強度、生成される電場数等を示す。
【００２７】
図２は、例示的ナノクレセント２００の２つの図を示す。図２００Ａは、ナノクレセント２００の３次元図を表し、２００Ｂは、軸２０５によって二分されるナノクレセント２００の断面図を表す。ナノクレセント２００は、一方の側から除去された円形部を有する金属シェル２１０を含み得る。金属シェル２１０は、金、鉄、銀、および／またはそれらの組み合わせによって実装されてもよい。ナノクレセント２００の作製の際、金属は、誘電体コアの大部分上に蒸着される。誘電体コアは、次いで、除去される。
【００２８】
誘電体コアの除去後、ナノクレセント２００は、シェルから除去された円形領域２１５を有する球状物体となり得る。図２００Ｂでは、ナノクレセント２００の断面は、先鋭部となって示される。しかしながら、２００Ａの図から、先鋭部は、実際は、円形の一部である。
【００２９】
種々の実施形態に従って、励起光は、円形領域２１５に指向され、円形領域２１５の周囲上の表面プラズモンは、励起光と結合し、共鳴場を生成することができる。要するに、ナノクレセント２００は、共鳴構造体として機能することが可能であり、したがって、このことは、単分子配列決定、ハイブリダイゼーション等の用途、または従来のシステムと比較して、バックグラウンドクラッターが低減された小粒子を検出することを目的とする他の用途に適用され得る。さらに、励起光の角度またはナノクレセント２００の配向は、生成されるプラズモンの数、ならびにプラズモンの効率および位置に影響を及ぼす。
【００３０】
ナノクレセント２００は、ＬｉｕらのＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｎａｎｏｃｒｅｓｃｅｎｔｓ  Ａｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ  Ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００５，１７，２１３１−２１３４、およびＵＣ  ＢｅｒｋｅｌｅｙのＬｕｋｅ  Ｐ．ＬｅｅらのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００５，１７，２６８３−２６８８（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）に記載されるように実装され得る。
【００３１】
図３Ａは、ナノクレセントの強度画像を示す。図３に示されるように、金属が円形を形成する場合、電場は最大である。
【００３２】
図３Ｂは、小励起体積を生成するための装置３０５を示す。図３Ｂに示されるように、装置３０５は、基材３１５を通して、励起源からエネルギー３１０を受容する。エネルギーは、エバネセント領域（図示せず）を生成し、検体３２０を覆う。小励起領域は、励起光を遮断する遮蔽材料３２５によって、検体３２０の周囲に維持される。この装置３０５は、高出力レーザの使用を必要とし、相当量のバックグラウンドおよび付随するノイズを生成し得る。
【００３３】
図３Ｃは、図１〜３Ａに関連して記載された共鳴構造体の使用を伴う、汎用実施形態を示す。より具体的には、共鳴装置３３０は、図示されない増強共鳴構造体の近傍のレーザ励起を強力に向上させることによって、小励起体積３３５を生成するように構成されることが可能である。ＦＥＲは、装置３０５に優る改良点を示し得る。さらに、励起源のための出力要件は低減され、バックグラウンドおよび付随するノイズを軽減する。
【００３４】
図４は、さらに別の実施形態による、サブ波長孔アレイ４００を示す。図４に示されるように、孔アレイ４００は、プラズモン共鳴が、孔アレイ４００内の孔を通して生成され得るように、当業者に既知の厚さおよび材料で作製され得る。実施例は、孔径６０ｎｍでの４８８ｎｍのプラズモン共鳴である。励起光源は、４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザであってもよい。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ナノライスまたはナノクレセント等のナノ粒子、あるいはボウタイ型等の他のナノアンテナはまた、孔の近傍に、もしくは孔間の共鳴点に配置され、アレイ４００内のプラズモン共鳴出力をさらに向上させてもよい。これは、プラズモンを狭い面積内にさらに集中または増強させるために行われてもよい。また、ナノ粒子またはナノアンテナは、孔を充填または部分的に充填する誘電体材料上に配置され得、かつ、プラズモンをさらに集中させる目的のために、孔を充填しないかもしくは部分的にも充填しない誘電体材料上の孔内に配置され得る。
【００３６】
図５は、アレイ４００のエネルギーパターンの近接場走査顕微鏡画像５００を示す。図５に示されるように、画像５００は、孔５０５を明るい光として、背景５１０を実質的に暗く示す。
【００３７】
図６は、さらに別の実施形態による、鈍端光ファイバ６００を示す。この先端の構造は、米国特許第５，８１２，７２４号（これは、参考として本明細書に援用される）に記載されている。図６に示されるように、鈍端光ファイバ６００は、光ファイバ６００の一端上に、クラッディングによって平坦である先端６０５（図示せず）を有する。他の実施形態では、先端６０５は、クラッディング上に隆起するが、図６に示されるように、鈍らにされ得る。この光ファイバ６００は、先端６０５の表面上にコーティング層６１０と、光遮蔽層６１０の表面の最前部以外の光遮蔽コーティング層６１０の表面の領域上に耐食コーティング層６１５とを有する。先端６０５の最前部は、光遮蔽コーティング層６１０および耐食コーティング層６１５から露出する開口６２０を有する。光遮蔽コーティング層６１０は、例えば、アルミニウムから形成され、厚さ約８００ｎｍを有する。開口６２０は、直径、例えば、４０ｎｍを有する。
【００３８】
種々の実施形態では、鈍端光ファイバ６００は、ナノ粒子を含有する標的検体外に配置され得る。励起光から生じるプラズモンからのエバネセント波は、次いで、標的検体内に通過可能である。他の実施形態では、鈍端光ファイバ６００は、突出先端を有する光学的な先端と交換し、先細の光ファイバのアレイに構成されてもよい。
【００３９】
図７は、さらに別の実施形態による、平面フォトニック導波路構造体７００を示す。図７に示されるように、平面フォトニック導波路構造体７００は、ＭａｉｅｒらのＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＳＰＩＥ  Ｖｏｌ．８４１０およびＬｏｎｃａｒらのＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｇｈｔｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１０のＤｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）に記載されるように実装され得る。平面フォトニック導波路構造体７００は、以前に記載された実施形態の一部のための点光源の代わりに、線光源として構成可能である。例えば、ナノ粒子または孔アレイである。
【００４０】
図８は、平面フォトニック導波路構造体のプロファイルの強度を示す。導波路構造体は、フォトレジストを使用して実装され、対向する軸におけるストリップ内の開口部をパターン化することができる。いくつかの実施形態では、孔も同様に使用可能である。アタッチメントの光活性化は、その結果、消失フォトレジストとプラズモン導波路との交点において生じるであろう。
【００４１】
さらに、ナノアンテナ、ナノ粒子、コロイド粒子、または量子ドット（quantum dot）は、導波路７００等のプラズモン導波路に近接して配置され、したがって、導波路とナノ粒子との間の直接結合を可能にし得る。フォトニック結晶構造は、コーナー周囲の光の屈曲を可能にし、したがって、遠視野顕微鏡（farfield  microscope）の視野にわたって、光を前後にラスタさせる。これによって、視野全体に指向されるため、光エネルギーを再利用することができる。加えて、エネルギーは、導波路の経路に限局され、望ましくないバックグラウンドを低減する。複数導波路を使用して、効率的に広い面積を網羅することが可能である。
【００４２】
他の実施形態では、Ａｌｔｕｇらの２００６年４月ＩＥＥＥ  ＬＥＯＳ  ＮｅｗｓｌｅｔｔｅｒのＰｈｏｔｏｎｉｃ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｎａｎｏ−ｃａｖｉｔｙ  Ａｒｒａｙｓ（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）に記載される、２次元フォトニック結晶を使用して、適切な２次元強度プロファイルを生成することができる。図９は、２次元フォトニック結晶９００の実施形態を示す。
【００４３】
図１０は、ある実施形態による、例示的ナノアンテナ１０００を示す。図１００に示されるように、ナノアンテナ１０００は、プラズモンエネルギーを限局されたスポットに集中させるように構成される円形ナノアンテナである。ナノアンテナ１０００は、誘電体材料上に配置され得る。励起光が、ナノアンテナ１０００上に指向されるため、ナノアンテナ１０００は、プラズモンをアンテナ１０００の中心に指向する。
【００４４】
この種の円形ナノアンテナ１０００は、１組の、基材材料上の第２の材料の円形帯（swath）と交互に配置される、同心円形である第１の材料帯として実装されてもよい。図１０に示される実施形態では、円形ナノアンテナ１０００の中心は、第１の材料で実装され、第２の材料は存在しない。円形ナノアンテナ１０００の他の実施形態は、材料の順番を逆にしてもよく、その中心は、第１の材料と交互になった第２の材料によって実装される。他の実施形態は、あらゆる励起光を遮断する第２の材料によって実装される円形ナノアンテナを含み、したがって、バックグラウンドおよび付随するノイズを低減することができる。
【００４５】
図１１は、ボウタイ型ナノアンテナ１１００を示す。図１１に示されるように、ボウタイ型ナノアンテナ１１００は、電磁的に透過性の基材１１０５を備えることができ、その上に、アンテナ構造体１１１０が支持される。アンテナ構造体１１１０は、それぞれ伝導性アーム１１１５および１１２０を含む、ボウタイ型アンテナを備える。末端１１２５および１１３０では、伝導性アーム１１１５および１１２０は、横断寸法ｄを有するギャップ１１３５によって分離される。要するに、伝導性アーム１１１５および１１２０は、双極子様アンテナを形成する。対数周期（log-periodic）、螺旋、スロットアンテナ等の他のアンテナ構造体も、本発明に対し功を奏するであろう。ボウタイ型アンテナのさらなる詳細は、米国特許第５，６９６，３７２号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）に記載されている。
【００４６】
ギャップ１１３５は、伝導性アーム１１１５および１１２０の末端１１２５と１１３０との間の放出「領域」を形成する。末端１１２５と１１３０との間の横断寸法「ｄ」は、入射電磁エネルギーの波長よりも小さい。
【００４７】
入射エネルギーは、光学範囲内の波長を有することが好ましいが、しかしながら、本発明は、非光学波長用途にも等しく適用可能であることを理解されたい。
【００４８】
図１１を再び見ると、ギャップ１１３５によって分離される末端１１２５および１１３０が、静電容量を構成することが分かるであろう。ギャップ１１３５の静電容量をアンテナ構造体により効率的にインピーダンス整合させ、そこへのエネルギーの結合を改善するためには、インダクタ１１４０を領域１１３５と並列に接続し、同調回路を生成することが好ましい。本質的な考えは、アンテナインピーダンスを、ギャップ１１３５に形成される双極子放射体の放射抵抗に整合させることである。伝導性アーム１１１５および１１２０の角度１１４５は、所望の周波数に応じて、種々の角度で実装されてもよい。
【００４９】
図１２は、ナノフラクタル状のアンテナパターンの選択を示す。フラクタル種の選択は、ユーザ所望の性能特徴に依存し得る。他の実施形態では、フラクタル状のナノアンテナはまた、線形双極子であることができる。
【００５０】
さらに他の実施形態では、ナノアンテナ１０００、１１００、１２００はまた、レシーバとしても使用可能である。したがって、これらのアンテナを使用して、分子を消光するとともに、放射を収集することが可能である。
【００５１】
図１３Ａ−Ｂは、概して、バルク基材または誘電体材料上ならびにナノアンテナ上のコーティングの使用に関する、別の実施形態を示す。図１３Ａ−Ｂに示されるように、断面図に示される被覆された増強構造体１３００は、基材１３０５を含む。基材１３０５は、エバネセント領域１３２５を生成するために、または随意に、ＴＩＲＦの代わりに、プラズモン共鳴を使用するために、金属層（図示せず）を使用して、実装されてもよい。厚いコーティング１３１０は、ある領域が、厚いコーティング１３１０がない状態で残されるように、基材１３０５に適用されてもよい。厚いコーティング１３１０は、エバネセント波エネルギーの大部分を含むエバネセント領域１３２５を上回る誘電体材料によって実装可能である。
【００５２】
開放領域では、ボウタイ型アンテナ１３１５を形成可能である。他の実施形態では、他のフラクタル状のナノアンテナが使用されてもよい。さらに他の実施形態では、以前に記載された共鳴構造体を開放領域内に配置可能である。薄いコーティング１３２０は、共鳴構造体を覆う開放領域に内に蒸着されてもよい。別様に、薄いコーティングは、表面全体に配置されてもよく、より厚いコーティングは、随意に、後に追加されてもよい。薄いコーティング１３２０は、消光と励起との間の均衡を最適化するように選択される厚さを有する、同一または別の誘電体材料であってもよい。
【００５３】
薄いコーティング１３２０は、消光を防止するために、フルオロフォアから離し、厚さ５乃至２０ｎｍであるように構成可能である。厚いコーティング１３１０は、最高強度のＴＩＲＦ（全内部反射蛍光）の体積へのフルオロフォアのアクセスを遮断する、適切な（基材に対し）より低い屈折率の材料から作製され得る。故に、バックグラウンドおよび付随するノイズは、低減するが、排除されない。
【００５４】
すべての開示された実施形態に対し、標的ＤＮＡ、プライマー、または酵素は、最高エネルギー強度の領域内の表面に付着可能である。このアタッチメントを生成する方法の１つは、光活性ビオチン等の光活性アタッチメントを利用することができる。低強度の光レベルでは、分子は、優先的に、構造上の最高エネルギー点に付着されるであろう。励起または放出は、単独で、あるいは遠視野顕微鏡、ＴＩＲＦ、プラズモン共鳴等の他の従来の方法、または構造体へのエネルギーを提供するための結合の他の方法と組み合わせて、開示された方法を使用することができる。ＴＩＲＦまたはプラズモン共鳴の使用は、非常に薄い層に対する励起を最小限にし、望ましくないバックグラウンドを低減する。ＴＩＲＦ励起から生じるエバネセント波の透過深度は、入射角度の関数であって、透過は、臨界角で最大となり、基材と励起光との間の角度の減少に伴って下降する。したがって、透過深度を、ひいては、エバネセント波によって励起される溶液の体積を最小限にするためには、角度を最小限にすることが好ましい。例えば、これは、対物レンズの最縁部に組み込まれるレーザを利用する高ＮＡ  ＴＩＲＦ対物レンズを使用して、達成可能である。
【００５５】
デバイスは、単分子蛍光のために使用されてもよい。デバイスを使用して、励起波長の代わりに、アンテナ／ナノ粒子の波長を使用する色素から２光子放出を生成してもよい。２光子放出は、光子の放出に先立って、分子を励起する２光子を必要とする。２光子放出によって、生成された蛍光は、励起よりも低い波長であって、基材、光学要素、および他の非特異的蛍光の背景蛍光の容易な濾過を可能にする。さらに、２光子放出が生じる確立は、励起出力の二乗の関数であって、したがって、デバイスが、１００の光学増強を有する場合、共鳴増強領域内のフルオロフォアは、実際は、共鳴増強領域内ではないフルオロフォアの１０，０００倍励起され、フルオロフォア近傍からバックグラウンドを大幅に低減する可能性がある。したがって、ＤＮＡ配列決定だけではなく、小体積が励起されることが望ましい多くの他の種類の用途のためにも使用可能である。
【００５６】
本発明は、その例示的実施形態を参照して説明されたが、当業者は、真の精神および範囲から逸脱することなく、記載された実施形態に種々の修正を成すことができるであろう。本願で使用された用語および説明は、例示のみを目的として記載され、制限を意図するものではない。特に、本方法は、実施例によって説明されたが、本方法のステップは、図示されたものと異なる順番で、または同時に行われてもよい。当業者は、これらおよび他の変形例が、以下の請求項およびその等価物によって定義される精神および範囲内において可能であることを認識するであろう。
【図１】
2010503868.tif 000003
【図２】
2010503868.tif 000004
【図３Ａ】
2010503868.tif 000005
【図３Ｂ】
2010503868.tif 000006
【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2010503868.tif 000010
【図７】
2010503868.tif 000011
【図８】
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【図９】
2010503868.tif 000013
【図１０】
2010503868.tif 000014
【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年5月26日(2009.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の分析のための方法であって、
１つ以上の蛍光標識された核酸と結合するように構成される共鳴構造体を提供するステップと、
該共鳴構造体上の源から励起光を指向するステップと、
該共鳴構造体の表面上にプラズモンを生成するステップと、
を包含し、検体は、該共鳴構造体のエネルギー集中点に固定される、方法。
【請求項２】
検体の分析のための方法であって、
検体と結合する共鳴構造体を提供するステップと、
該共鳴構造体上の源から励起光を指向するステップと、
該共鳴構造体の表面上にプラズモンを生成するステップと、
を包含し、該検体は、光活性化可能なリンカーを通して、該共鳴構造体のエネルギー集中点に固定される分子と複合体を形成する、方法。
【請求項３】
前記プラズモンは、単分子配列決定において使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プラズモンは、蛍光相関分光測定法において使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記共鳴構造体は、ナノ粒子である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノ粒子は、ナノライス、ナノロッド、ナノリング、ナノキューブ、ナノシェル、およびナノクレセントのうちの１つである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
プラズモン構造体であって、
金属材料で実装され、増強領域を生成するように構成される、ナノアンテナと、
該ナノアンテナの一部に隣接して配置され、該増強領域外のフルオロフォアの励起を実質的に低減するように構成される、遮断層と、
を備える、構造体。
【請求項８】
前記遮断層は、誘電体によって実装される、請求項７に記載のプラズモン構造体。
【請求項９】
金属層をさらに備え、エバネセント波励起領域が、該金属層を通して、ＳＰＲによって生成される、請求項７に記載のプラズモン構造体。
【請求項１０】
前記エバネセント波励起領域は、ＴＩＲＦによって生成される、請求項７に記載のプラズモン構造体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
核酸の分析のための方法であって、
１つ以上の蛍光標識された核酸と結合するように構成される共鳴構造体を提供するステップと、
該共鳴構造体上の源から励起光を指向するステップと、
該共鳴構造体の表面上にプラズモンを生成するステップと、
を包含し、検体は、該共鳴構造体のエネルギー集中点に固定される、方法。
（項目２）
検体の分析のための方法であって、
検体と結合する共鳴構造体を提供するステップと、
該共鳴構造体上の源から励起光を指向するステップと、
該共鳴構造体の表面上にプラズモンを生成するステップと、
を包含し、該検体は、光活性化可能なリンカーを通して、該共鳴構造体のエネルギー集中点に固定される分子と複合体を形成する、方法。
（項目３）
上記プラズモンは、単分子配列決定において使用される、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目４）
上記プラズモンは、蛍光相関分光測定法において使用される、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目５）
上記共鳴構造体は、ナノ粒子である、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目６）
上記ナノ粒子は、ナノライス、ナノロッド、ナノリング、ナノキューブ、ナノシェル、およびナノクレセントのうちの１つである、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目７）
上記プラズモンは、上記ナノクレセントの周辺に生成される、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目８）
上記共鳴構造体は、孔のアレイである、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目９）
上記プラズモンは、上記孔のアレイ内の孔の表面上に、該孔のアレイ上方に、および該孔を通して、生成される、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１０）
上記励起光源は、鈍らな光ファイバの先端である、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１１）
上記励起光源は、上記検体外側に位置付けられる、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１２）
上記励起光源は、光ファイバの先端のアレイである、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１３）
上記共鳴構造体は、フォトニックサブ波長導波路を含む、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１４）
上記共鳴構造体は、２次元フォトニック結晶を含む、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１５）
上記共鳴構造体は、ナノアンテナである、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１６）
上記共鳴構造体は、ボウタイ型ナノアンテナである、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１７）
上記ボウタイ型アンテナ上にコーティングを提供するステップをさらに包含し、該コーティングは、実質的に消光を防止する適切な厚さに構成される、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１８）
上記共鳴構造体の上記エネルギー集中点において、光活性化可能なアタッチメントを提供するステップをさらに包含する、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１９）
上記光活性化可能なアタッチメントは、単分子配列決定の一部である、上記項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目２０）
プラズモン構造体であって、
金属材料で実装され、増強領域を生成するように構成される、ナノアンテナと、
該ナノアンテナの一部に隣接して配置され、該増強領域外のフルオロフォアの励起を実質的に低減するように構成される、遮断層と、
を備える、構造体。
（項目２１）
上記遮断層は、誘電体によって実装される、上記項目に記載のプラズモン構造体。
（項目２２）
金属層をさらに備え、エバネセント波励起領域が、該金属層を通して、ＳＰＲによって生成される、上記項目のうちのいずれかに記載のプラズモン構造体。
（項目２３）
上記エバネセント波励起領域は、ＴＩＲＦによって生成される、上記項目のうちのいずれかに記載のプラズモン構造体。
要旨
ある実施形態は、概して、核酸の分析のための方法に関する。本方法は、１つ以上の蛍光標識された核酸と結合するように構成される共鳴構造体を提供するステップと、共鳴構造体上の源から励起光を指向するステップとを含む。また、本方法は、共鳴構造体の表面上でプラズモンを生成するステップを含み、検体は、共鳴構造体のエネルギー集中点に固定される。
【国際調査報告】
2010503868.tif 000020
2010503868.tif 000021