(57)【要約】  表面プラズモン共鳴による測定で２００ｐＭ未満の親和定数（Ｋ０）でヒトインターロイキン４受容体α（ｈＩＬ−４Ｒα）に結合する単離されたヒト抗体又はその抗体フラグメント。
2010505418.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴による測定で約２００ｐＭまたはそれ以下、好ましくは約１５０ｐＭまたはそれ以下のＫDでｈＩＬ−４Ｒ（配列番号１）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、２１１、２２７、２４３、２５９、２７５、２９１、３０７、３２３、３３９、３５５、３７１、３８７、３９１、３９５、３９９、４０３、４０７、４１１、４１５、４１９、４２３、４２７、４３１、４３５、４３９、４４３、４４７、４５１、４５５、４５９、４６３、４６７、４７１、４７５、４７９、４８３、４８７、４９１、４９５、４９９、５０３、５０７、５１１、５１５、５１９、５２３、５２７、５３１、５３５、５３９、５４３、５４７、５５１、５５５、５５９、５６３、５６７、５７１、５７５、５７９及び５８１から選択された重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに
配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３０、１５５、１７１、１８７、２０３、２１９、２３５、２５１、２６７、２８３、２９９、３１５、３３１、３４７、３６３、３７９、３８９、３９３、３９７、４０１、４０５、４０９、４１３、４１７、４２１、４２５、４２９、４３３、４３７、４４１、４４５、４４９、４５３、４５７、４６１、４６５、４６９、４７３、４７７、４８１、４８５、４８９、４９３、４９７、５０１、５０５、５０９、５１３、５１７、５２１、６２５、５２９、５３３、５３７、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６１、５６５、５６９、５７３及び５７７から選択された軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）
を含む請求項１に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
配列番号３／１１、１９／２７、３５／４３、５１／５９、６７／７５、８３／９１、９９／１０７、１１５／１２３、１３１／１３９、１４７／１５５、１６３／１７１、１７９／１８７、１９５／２０３、２１１／２１９、２２７／２３５、２４３／２５１、２５９／２６７、２７５／２８３、２９１／２９９、３０７／３１５、３２３／３３１、３３９／３４７、３５５／３６３、３７１／３７９、３８７／３８９、３９１／３９３、３９５／３９７、３９９／４０１、４０３／４０５、４０７／４０９、４１１／４１３、４１５／４１７、４１９／４２１、４２３／４２５、４２７／４２９、４３１／４３３、４３５／４３７、４３９／４４１、４４３／４４５、４４７／４４９、４５１／４５３、４５５／４５７、４５９／４６１、４６３／４６５、４６７／４６９、４７１／４７３、４７５／４７７、４７９／４８１、４８３／４８５、４８７／４８９、４９１／４９３、４９５／４９７、４９９／５０１、５０３／５０５、５０７／５０９、５１１／５１３、５１５／５１７、５１９／５２１、５２３／５２５、５２７／５２９、５３１／５３３、５３５／５３７、５３９／５４１、５４３／５４５、５４７／５４９、５５１．５５３、５５５／５５７、５５９／５６１、５６３／５６５、５６７／５６９、５７１／５７３、５７５／５７７、５７９／５９及び５８１／５９から選択されたＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む請求項１又は２に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
好ましくは配列番号５１／５９、２５９／２６７、２７５／２８３、２９１／２９９、５７９／５９又は５８１／５９から選択されたＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含む請求項３に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8（配列番号５８２）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１であって、式中Ｘ1＝Ｇｌｙ、Ｘ2＝Ｔｙｒ又はＰｈｅ、Ｘ3＝Ｔｈｒ又はＩ、Ｘ4＝Ｐｈｅ、Ｘ5＝Ａｓｎ又はＡｒｇ、Ｘ6＝Ｓｅｒ、Ｘ7＝Ｔｙｒ及びＸ8＝Ｇｌｙであり、
式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8（配列番号５８３）のアミノ酸配列を含む
重鎖ＣＤＲ２であって、式中Ｘ1＝Ｉｌｅ、Ｘ2＝Ｓｅｒ又はＡｒｇ、Ｘ3＝Ｔｈｒ又はＴｙｒ、Ｘ4＝Ｔｙｒ又はＡｓｐ、Ｘ5＝Ａｓｎ又はＧｌｙ、Ｘ6＝Ｇｌｙ又はＳｅｒ、Ｘ7＝Ｌｙｓ又はＡｓｎ及びＸ8＝Ｔｈｒであり、
式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14−Ｘ15−Ｘ16−Ｘ17−Ｘ18−Ｘ19−Ｘ20−Ｘ21（配列番号５８４）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３であって、式中Ｘ1＝Ａｌａ又はＶａｌ、Ｘ2＝Ａｒｇ又はＬｙｓ、Ｘ3＝Ａｓｐ又はＧｌｕ、Ｘ4＝Ｇｌｙ又はＧｌｕ、Ｘ5＝Ａｌａ又はＡｒｇ、Ｘ6＝Ａｒｇ又はＳｅｒ、Ｘ7＝Ｉｌｅ又はＧｌｙ、Ｘ8＝Ｖａｌ又はＳｅｒ、Ｘ9＝Ｖａｌ又はＴｒｐ、Ｘ10＝Ａｌａ又はＰｈｅ、Ｘ11＝Ｇｌｙ又はＡｓｐ、Ｘ12＝Ｔｈｒ又はＰｒｏ、Ｘ13＝Ｔｈｒ又は非存在、Ｘ14＝Ｐｒｏ又は非存在、Ｘ15＝Ｔｙｒ又は非存在、Ｘ16＝Ｔｙｒ又は非存在、Ｘ17＝Ｔｙｒ又は非存在、Ｘ18＝Ｇｌｙ又は非存在、Ｘ19＝Ｍｅｔ又は非存在、Ｘ20＝Ａｓｐ又は非存在及びＸ21＝Ｖａｌ又は非存在であり、
式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6（配列番号５８５）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１であって、式中Ｘ1＝Ｇｌｎ、Ｘ2＝Ａｓｐ又はＡｌａ、Ｘ3＝Ｉｌｅ、Ｘ4＝Ｓｅｒ又はＡｓｎ、Ｘ5＝Ａｓｎ又はＩｌｅ及びＸ6＝Ｔｒｐ又はＰｈｅであり、
式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3（配列番号５８６）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２であって、式中Ｘ1＝Ａｌａ又はＶａｌ、Ｘ2＝Ａｌａ又はＴｈｒ及びＸ3＝Ｓｅｒであり、そして
式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9（配列番号５８７）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３であって、式中Ｘ1＝Ｇｌｎ、Ｘ2＝Ｇｌｎ、Ｘ3＝Ａｌａ又はＴｙｒ、Ｘ4＝Ａｓｎ、Ｘ5＝Ｓｅｒ、Ｘ6＝Ｐｈｅ又はＨｉｓ、Ｘ7＝Ｐｒｏ、Ｘ8＝Ｉｌｅ又はＴｒｐ及びＸ9＝Ｔｈｒであること、
を含む請求項１に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
重鎖ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ３を含む請求項１に記載の抗体又は抗原結合性フラグメントであって、
重鎖ＣＤＲ３ドメインは、配列番号９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３、１６９、１８５、２０１、２１７、２３３、２４９、２６５、２８１、２９７、３１３、３２９、３４５、３６１及び３７７からなる群より選択され、そして
軽鎖ＣＤＲ３ドメインは、配列番号１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、１６１、１７７、１９３、２０９、２２５、２４１、２５７、２７３、２８９、３０５、３２１、３３７、３５３、３６９及び３８５からなる群より選択される、抗体又は抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
配列番号５、２１、３７、５３、６９、８５、１０１、１１７、１３３、１４９、１６５、１８１、１９７、２１３、２２９、２４５、２６１、２７７、２９３、３０９、３２５、３４１、３５７及び３７３からなる群より選択された重鎖ＣＤＲ１ドメイン、
配列番号７、２３、３９、５５、７１、８７、１０３、１１９、１３５、１５１、１６７、１８３、１９９、２１５、２３１、２４７、２６３、２７９、２９５、３１１、３２７、３４３、３５９及び３７５からなる群より選択された重鎖ＣＤＲ２ドメイン、
配列番号１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、２０５、２２１、２３７、２５３、２６９、２８５、３０１、３１７、３３３、３４９、３６５及び３８１からなる群より選択された軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、並びに
配列番号１５、３１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１４３、１５９、１７５、１９１、２０７、２２３、２３９、２５５、２７１、２８７、３０３、３１９、３３５、３５１、３６７及び３８３からなる群より選択された軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、
をさらに含む請求項６に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
ＨＣＶＲ配列及びＬＣＶＲ配列由来のＣＤＲを含む請求項１に記載の抗体又は抗原結合性フラグメントであって、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列が、５１／５９、５７９／５９、５８１／５９、２５９／２６７、２７５／２８３及び２９１／２９９からなる群より選択される、抗体又は抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１１】
ＩＬ−４受容体に特異的に結合する抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントを産生するための宿主−ベクター系であって、好適な宿主細胞中に請求項１０に記載のベクターを含む宿主−ベクター系。
【請求項１２】
請求項１１に記載の宿主−ベクター系であって、宿主細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はＣＨＯ細胞のうちの１つから選択された原核生物細胞又は真核生物細胞である宿主−ベクター系。
【請求項１３】
抗ＩＬ−４Ｒ抗体又はその抗原結合性フラグメントの産生方法であって、抗体又はそのフラグメントを生産し得る条件下で、請求項１１又は１２に記載の宿主−ベクター系の細胞を増殖させる工程、及びそのように発現された抗体又はフラグメントを回収する工程を含む方法。
【請求項１４】
ヒトのＩＬ−４媒介性疾患又は障害を減弱又は阻害するために使用する薬剤の製造において、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントの使用。
【請求項１５】
疾患又は障害を処置する方法であって、この疾患又は障害は、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメントの投与によってヒトインターロイキン４（ｈＩＬ−４）活性が除去、阻害又は減少されることにより改善、寛解又は阻害される、方法。
【請求項１６】
疾患又は障害が、関節炎、ヘルペス状、慢性突発性蕁麻疹、強皮症、過形成性瘢痕、ホウィップル病、良性前立腺肥大、肺障害、炎症性障害、アレルギー反応、川崎病、鎌状赤血球症、チャーグ−ストラウス症候群、グレーヴズ病、子癇前症、シェーグレン症候群、自己免疫性リンパ球増殖性症候群、自己免疫性溶血性貧血、バレット食道、自己免疫性ブドウ膜炎、結核及びネフローゼから選択される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
インターロイキン４（ＩＬ−４、Ｂ細胞刺激因子又はＢＳＦ−１としてもまた公知である）は、表面免疫グロブリンに対して指向される低濃度の抗体に応じてＢ細胞の増殖を刺激する能力によって最初は特性決定された。ＩＬ−４は、Ｔ細胞、マスト細胞、顆粒球、巨核球及び赤血球の増殖刺激を含む広範囲の生物活性を有することが示されている。ＩＬ−４は、休止中のＢ細胞においてクラスＩＩ主要組織適合性複合体分子の発現を誘導しており、そして刺激されたＢ細胞によるＩｇＥ及びＩｇＧ１アイソタイプの分泌を増強している。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−４の生物活性は、ＩＬ−４に特異的な細胞表面受容体によって媒介されている。ヒトＩＬ−４受容体α（ｈＩＬ−４Ｒ）（配列番号１）は、例えば特許文献１、２及び３に記載されている。ｈＩＬ−４Ｒに対する抗体は、特許文献４に記載されている。
【０００３】
ＩＬ−４の生物活性は、ＩＬ−４に特異的な細胞表面受容体によって媒介されている。ヒトＩＬ−４受容体α（ｈＩＬ−４Ｒ）（配列番号１）は、例えば特許文献１、２及び３に記載されている。ｈＩＬ−４Ｒに対する抗体は、特許文献４及び５に記載されている。
【０００４】
ヒト治療に有用な抗体を産生する方法としては、キメラ抗体及びヒト化抗体の作製が挙げられる（例えば、特許文献６を参照のこと）。例えば、ヒト抗体を産生し得る非ヒトトランスジェニックマウスの作製方法を記載している特許文献７（Ａｂｇｅｎｉｘ）及び特許文献８（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（これらの刊行物の両方は、参照によって本明細書に明確に組み込まれる）を参照のこと。
【０００５】
ｈＩＬ−４Ｒに対する抗体の使用方法は、特許文献９、１０及び１１に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，５９９，９０５号
【特許文献２】米国特許第５，７６７，０６５号
【特許文献３】米国特許第５，８４０，８６９号
【特許文献４】米国特許第５，７１７，０７２号
【特許文献５】米国特許第７，１８６，８０９号
【特許文献６】米国特許第６，９４９，２４５号
【特許文献７】ＷＯ  ９４／０２６０２
【特許文献８】米国特許第６，５９６，５４１号
【特許文献９】米国特許第５，７１４，１４６号
【特許文献１０】米国特許第５，９８５，２８０号
【特許文献１１】米国特許第６，７１６，５８７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５−１９３３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第一の局面において、本発明は、ヒトインターロイキン４受容体（ｈＩＬ−４Ｒ）に特異的に結合するヒト抗体、好ましくは組換えヒト抗体を提供する。このヒト抗体は、高親和性でｈＩＬ−４Ｒに結合すること、及びｈＩＬ−４活性を中和する能力によって特徴付けられるものである。具体的な実施態様において、ヒト抗体は、ｈＩＬ−４Ｒに結合するｈＩＬ−１３／ｈＩＬ−１３Ｒ１複合体を阻止し得るものであり、従ってｈＩＬ−１３によるシグナル伝達を阻害するものである。この抗体は全長であり得るか（例えば、ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体）、又は抗原結合性部分のみ含み得るものであり（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2若しくはｓｃＦｖフラグメント）、そして機能性を生じさせるように（例えば、残留するエフェクター機能を排除するように）修飾され得るものである（非特許文献１）。
【０００９】
一実施態様において、本発明は、表面プラズモン共鳴による測定でおよそ２００ｐＭ以下のＫDでｈＩＬ−４Ｒ（配列番号１）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。より具体的な実施態様において、この抗体又はその抗原結合性部分は、約１５０ｐＭ未満又は約５０ｐＭ未満又は約２０ｐＭ未満のＫDを示す。種々の実施態様において、この抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＳＴＡＴ６ルシフェラーゼバイオアッセイによる測定で約２００ｐＭ以下のＩＣ50でｈＩＬ−４活性を阻止する。より具体的な実施態様において、この抗体又は抗原結合性フラグメントは、ルシフェラーゼバイオアッセイによる測定で約１５０ｐＭ以下又は約１００ｐＭ以下又は約５０ｐＭ以下ですらあるＩＣ50を示す。種々の実施態様において、この抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＳＴＡＴ６ルシフェラーゼバイオアッセイによる測定で約１００ｐＭ以下のＩＣ50でｈＩＬ−１３活性を阻止する。より具体的な実施態様において、この抗体又は抗原結合性フラグメントは、約７５ｐＭ以下又は約５０ｐＭ以下又は約２０ｐＭ以下ですらあるＩＣ50を示す。
【００１０】
第二の局面において、本発明の抗体は、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、２１１、２２７、２４３、２５９、２７５、２９１、３０７、３２３、３３９、３５５、３７１、３８７、３９１、３９５、３９９、４０３、４０７、４１１、４１５、４１９、４２３、４２７、４３１、４３５、４３９、４４３、４４７、４５１、４５５、４５９、４６３、４６７、４７１、４７５、４７９、４８３、４８７、４９１、４９５、４９９、５０３、５０７、５１１、５１５、５１９、５２３、５２７、５３１、５３５、５３９、５４３、５４７、５５１、５５５、５５９、５６３、５６７、５７１、５７５、５７９及び５８１からなる群より選択された重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、又はその実質的に類似の配列を含む。
【００１１】
第三の局面において、本発明の抗体は、配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３０、１５５、１７１、１８７、２０３、２１９、２３５、２５１、２６７、２８３、２９９、３１５、３３１、３４７、３６３、３７９、３８９、３９３、３９７、４０１、４０５、４０９、４１３、４１７、４２１、４２５、４２９、４３３、４３７、４４１、４４５、４４９、４５３、４５７、４６１、４６５、４６９、４７３、４７７、４８１、４８５、４８９、４９３、４９７、５０１、５０５、５０９、５１３、５１７、５２１、６２５、５２９、５３３、５３７、５４１、５４５、５４９、５５３、５５７、５６１、５６５、５６９、５７３及び５７７からなる群より選択された軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、又はその実質的に類似の配列を含む。
【００１２】
一実施態様において、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、配列番号３／１１、１９／２７、３５／４３、５１／５９、６７／７５、８３／９１、９９／１０７、１１５／１２３、１３１／１３９、１４７／１５５、１６３／１７１、１７９／１８７、１９５／２０３、２１１／２１９、２２７／２３５、２４３／２５１、２５９／２６７、２７５／２８３、２９１／２９９、３０７／３１５、３２３／３３１、３３９／３４７、３５５／３６３、３７１／３７９、３８７／３８９、３９１／３９３、３９５／３９７、３９９／４０１、４０３／４０５、４０７／４０９、４１１／４１３、４１５／４１７、４１９／４２１、４２３／４２５、４２７／４２９、４３１／４３３、４３５／４３７、４３９／４４１、４４３／４４５、４４７／４４９、４５１／４５３、４５５／４５７、４５９／４６１、４６３／４６５、４６７／４６９、４７１／４７３、４７５／４７７、４７９／４８１、４８３／４８５、４８７／４８９、４９１／４９３、４９５／４９７、４９９／５０１、５０３／５０５、５０７／５０９、５１１／５１３、５１５／５１７、５１９／５２１、５２３／５２５、５２７／５２９、５３１／５３３、５３５／５３７、５３９／５４１、５４３／５４５、５４７／５４９、５５１．５５３、５５５／５５７、５５９／５６１、５６３／５６５、５６７／５６９、５７１／５７３、５７５／５７７、５７９／５９及び５８１／５９からなる群より選択されたＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む。好ましい実施態様において、この抗体又は抗体フラグメントは、配列番号５１／５９、２５９／２６７、２７５／２８３、２９１／２９９、５７９／５９又は５８１／５９から選択されたＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含む。
【００１３】
第四の局面において、本発明は、ＨＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、この核酸分子は、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、３９０、３９４、３９８、４０２、４０６、４１０、４１４、４１８、４２２、４２６、４３０、４３４、４３８、４４２、４４６、４５０、４５４、４５８、４６２、４６６、４７０、４７４、４７８、４８２、４８６、４９０、４９４、４９８、５０２、５０６、５１０、５１４、５１８、５２２、５２６、５３０、５３４、５３８、５４２、５４６、５５０、５５４、５５８、５６２、５６６、５７０、５７４、５７８及び５８０からなる群より選択されたヌクレオチド配列又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に同一の配列である。
【００１４】
第五の局面において、本発明は、ＬＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、この核酸分子は、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１２９、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３８８、３９２、３９６、４００、４０４、４０８、４１２、４１６、４２０、４２４、４２８、４３２、４３６、４４０、４４４、４４８、４５２、４５６、４６０、４６４、４６８、４７２、４７６、４８０、４８４、４８８、４９２、４９６、５００、５０４、５０８、５１２、５１６、５２０、５２４、５２８、５３２、５３６、５４０、５４４、５４８、５５２、５５６、５６０、５６４、５６８、５７２及び５７６からなる群より選択された配列又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に同一の配列である。
【００１５】
一実施態様において、本発明の抗体は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２、３７０／３７８、３８６／３８８、３９０／３９２、３９４／３９６、３９８／４００、４０２／４０４、４０６／４０８、４１０／４１２、４１４／４１６、４１８／４２０、４２２／４２４、４２６／４２８、４３０／４３２、４３４／４３６、４３８／４４０、４４２／４４４、４４６／４４８、４５０／４５２、４５４／４５６、４５８／４６０、４６２／４６４、４６６／４６８、４７０／４７２、４７４／４７６、４７８／４８０、４８２／４８４、４８６／４８８、４９０／４９２、４９４／４９６、４９８／５００、５０２／５０４、５０６／５０８、５１０／５１２、５１４／５１６、５１８／５２０、５２２／５２４、５２６／５２８、５３０／５３２、５３４／５３６、５３８／５４０、５４２／５４４、５４６／５４８、５５０／５５２、５５４／５５６、５５８／５６０、５６２／５６４、５６６／５６８、５７０／５７２、５７４／５７６、５７８／５９及び５８０／５９からなる群より選択されたヌクレオチド配列対によってコードされたＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む。好ましい実施態様において、この抗体又は抗体フラグメントは、配列番号５０／５８、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、５７８／５８又は５８０／５８から選択されたヌクレオチド配列によってコードされたＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含む。
【００１６】
第六の局面において、本発明は、ｈＩＬ−４Ｒに特異的に結合する抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントを特徴とし、これは、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び３つの軽鎖相補性決定領域を含み、
重鎖ＣＤＲ１は、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8（配列番号５８２）のアミノ酸配列を含み、式中Ｘ1＝Ｇｌｙ、Ｘ2＝Ｔｙｒ又はＰｈｅ、Ｘ3＝Ｔｈｒ又はＩ、Ｘ4＝Ｐｈｅ、Ｘ5＝Ａｓｎ又はＡｒｇ、Ｘ6＝Ｓｅｒ、Ｘ7＝Ｔｙｒ及びＸ8＝Ｇｌｙであり、
重鎖ＣＤＲ２は、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8（配列番号５８３）のアミノ酸配列を含み、式中Ｘ1＝Ｉｌｅ、Ｘ2＝Ｓｅｒ又はＡｒｇ、Ｘ3＝Ｔｈｒ又はＴｙｒ、Ｘ4＝Ｔｙｒ又はＡｓｐ、Ｘ5＝Ａｓｎ又はＧｌｙ、Ｘ6＝Ｇｌｙ又はＳｅｒ、Ｘ7＝Ｌｙｓ又はＡｓｎ及びＸ8＝Ｔｈｒであり、
重鎖ＣＤＲ３は、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14−Ｘ15−Ｘ16−Ｘ17−Ｘ18−Ｘ19−Ｘ20−Ｘ21（配列番号５８４）のアミノ酸配列を含み、式中Ｘ1＝Ａｌａ又はＶａｌ、Ｘ2＝Ａｒｇ又はＬｙｓ、Ｘ3＝Ａｓｐ又はＧｌｕ、Ｘ4＝Ｇｌｙ又はＧｌｕ、Ｘ5＝Ａｌａ又はＡｒｇ、Ｘ6＝Ａｒｇ又はＳｅｒ、Ｘ7＝Ｉｌｅ又はＧｌｙ、Ｘ8＝Ｖａｌ又はＳｅｒ、Ｘ9＝Ｖａｌ又はＴｒｐ、Ｘ10＝Ａｌａ又はＰｈｅ、Ｘ11＝Ｇｌｙ又はＡｓｐ、Ｘ12＝Ｔｈｒ又はＰｒｏ、Ｘ13＝Ｔｈｒ又は非存在、Ｘ14＝Ｐｒｏ又は非存在、Ｘ15＝Ｔｙｒ又は非存在、Ｘ16＝Ｔｙｒ又は非存在、Ｘ17＝Ｔｙｒ又は非存在、Ｘ18＝Ｇｌｙ又は非存在、Ｘ19＝Ｍｅｔ又は非存在、Ｘ20＝Ａｓｐ又は非存在及びＸ21＝Ｖａｌ又は非存在であり、
軽鎖ＣＤＲ１は、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6（配列番号５８５）のアミノ酸配列を含み、式中Ｘ1＝Ｇｌｎ、Ｘ2＝Ａｓｐ又はＡｌａ、Ｘ3＝Ｉｌｅ、Ｘ4＝Ｓｅｒ又はＡｓｎ、Ｘ5＝Ａｓｎ又はＩｌｅ及びＸ6＝Ｔｒｐ又はＰｈｅであり、
軽鎖ＣＤＲ２は、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3（配列番号５８６）のアミノ酸配列を含み、式中Ｘ1＝Ａｌａ又はＶａｌ、Ｘ2＝Ａｌａ又はＴｈｒ及びＸ3＝Ｓｅｒであり、そして
軽鎖ＣＤＲ３は、式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9（配列番号５８７）のアミノ酸配列を含み、式中Ｘ1＝Ｇｌｎ、Ｘ2＝Ｇｌｎ、Ｘ3＝Ａｌａ又はＴｙｒ、Ｘ4＝Ａｓｎ、Ｘ5＝Ｓｅｒ、Ｘ6＝Ｐｈｅ又はＨｉｓ、Ｘ7＝Ｐｒｏ、Ｘ8＝Ｉｌｅ又はＴｒｐ及びＸ9＝Ｔｈｒであることを特徴としている。
【００１７】
第七の局面において、本発明は、重鎖ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体又は抗原結合性フラグメントを提供し、この重鎖ＣＤＲ３ドメインは、配列番号９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３、１６９、１８５、２０１、２１７、２３３、２４９、２６５、２８１、２９７、３１３、３２９、３４５、３６１及び３７７からなる群より選択され、そしてこの軽鎖ＣＤＲ３ドメインは、配列番号１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、１６１、１７７、１９３、２０９、２２５、２４１、２５７、２７３、２８９、３０５、３２１、３３７、３５３、３６９及び３８５からなる群より選択される。好ましい実施態様において、この重鎖ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号５７及び６５、２６５及び２７３、２８１及び２８９、並びに２９７及び３０５の配列対から選択される。
【００１８】
さらなる実施態様において、本発明は、配列番号５、２１、３７、５３、６９、８５、１０１、１１７、１３３、１４９、１６５、１８１、１９７、２１３、２２９、２４５、２６１、２７７、２９３、３０９、３２５、３４１、３５７及び３７３からなる群より選択された重鎖ＣＤＲ１ドメイン又はその実質的に類似の配列；配列番号７、２３、３９、５５、７１、８７、１０３、１１９、１３５、１５１、１６７、１８３、１９９、２１５、２３１、２４７、２６３、２７９、２９５、３１１、３２７、３４３、３５９及び３７５からなる群より選択された重鎖ＣＤＲ２ドメイン又はその実質的に類似の配列；配列番号９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３、１６９、１８５、２０１、２１７、２３３、２４９、２６５、２８１、２９７、３１３、３２９、３４５、３６１及び３７７からなる群より選択された重鎖ＣＤＲ３ドメイン又はその実質的に類似の配列；配列番号１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、２０５、２２１、２３７、２５３、２６９、２８５、３０１、３１７、３３３、３４９、３６５及び３８１からなる群より選択された軽鎖ＣＤＲ１ドメイン又はその実質的に類似の配列；配列番号１５、３１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１４３、１５９、１７５、１９１、２０７、２２３、２３９、２５５、２７１、２８７、３０３、３１９、３３５、３５１、３６７及び３８３からなる群より選択された軽鎖ＣＤＲ２ドメイン又はその実質的に類似の配列；並びに配列番号１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、１６１、１７７、１９３、２０９、２２５、２４１、２５７、２７３、２８９、３０５、３２１、３３７、３５３、３６９及び３８５からなる群より選択された軽鎖ＣＤＲ３ドメイン又はその実質的に類似の配列を含むヒト抗体又は抗体フラグメントを特徴とする。好ましい実施態様において、この抗体又は抗原結合性フラグメントは、配列番号５３、５５、５７の重鎖ＣＤＲ及び配列番号６１、６３、６５の軽鎖ＣＤＲ；配列番号２６１、２６３、２６５の重鎖ＣＤＲ及び配列番号２６９、２７１、２７３の軽鎖ＣＤＲ；配列番号２７７、２７９、２８１の重鎖ＣＤＲ及び配列番号２８５、２８７、２８９の軽鎖ＣＤＲ；並びに配列番号２９３、２９５、２９７の重鎖ＣＤＲ及び配列番号３０１、３０３、３０５の軽鎖ＣＤＲを含む。
【００１９】
第八の局面において、本発明は、ＨＣＶＲ由来の３つのＣＤＲ及びＬＣＶＲ由来の３つのＣＤＲを含む抗体又は抗原結合性フラグメントを提供し、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲは、５１／５９、５７９／５９、５８１／５９、２５９／２６７、２７５／２８３及び２９１／２９９からなる群より選択される。
【００２０】
一実施態様において、本発明は、重鎖ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ３を含むヒト抗体又は抗体フラグメントを特徴とし、この重鎖ＣＤＲ３は、配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４、３６０及び３７６からなる群より選択されたヌクレオチド配列によってコードされ、そして軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２、３６８及び３８４からなる群より選択されたヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２１】
さらなる実施態様において、本発明は、配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０、３５６及び３７２からなる群より選択されたヌクレオチド配列又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に同一の配列によってコードされた重鎖ＣＤＲ１ドメイン；配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２、３５８及び３７４からなる群より選択されたヌクレオチド配列又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に同一の配列によってコードされた重鎖ＣＤＲ２ドメイン；配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４、３６０及び３７６からなる群より選択されたヌクレオチド配列又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に類似の配列によってコードされた重鎖ＣＤＲ３ドメイン；配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８、３６４及び３８０からなる群より選択されたヌクレオチド配列又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に類似の配列によってコードされた軽鎖ＣＤＲ１ドメイン；配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０、３６６及び３８２からなる群より選択されたヌクレオチド配列又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に類似の配列によってコードされた軽鎖ＣＤＲ２ドメイン；並びに配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２、３６８及び３８４からなる群より選択されたヌクレオチド配列又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に類似の配列によってコードされた軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むヒト抗体又は抗体フラグメントを特徴とする。好ましい実施態様において、この抗体又は抗原結合性フラグメントは、配列番号５２、５４、５６のヌクレオチド配列によってコードされた重鎖ＣＤＲ及び配列番号６０、６２、６４のヌクレオチド配列によってコードされた軽鎖ＣＤＲ；配列番号２６０、２６２、２６４のヌクレオチド配列によってコードされた重鎖ＣＤＲ及び配列番号２６８、２７０、２７２のヌクレオチド配列によってコードされた軽鎖ＣＤＲ；配列番号２７６、２７８、２８０のヌクレオチド配列によってコードされた重鎖ＣＤＲ及び配列番号２８４、２８６、２８８のヌクレオチド配列によってコードされた軽鎖ＣＤＲ；並びに配列番号２９２、２９４、２９６のヌクレオチド配列によってコードされた重鎖ＣＤＲ及び配列番号３００、３０２、３０４のヌクレオチド配列によってコードされた軽鎖ＣＤＲを含む。
【００２２】
本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗ｈＩＬ−４Ｒ抗体を包含する。いくつかの適用において、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾、すなわち例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増大させるために、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠失した抗体が有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照のこと）。他の適用において、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を修飾するために、ガラクトシル化の修飾が行われ得る。
【００２３】
第九の局面において、本発明は、本発明の宿主細胞を培養することによって得られる本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントの作製方法のようにして、本発明の核酸分子を保有する組換え発現ベクター及びこのようなベクターが包含されている宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、原核生物細胞かもしれないし真核生物細胞かもしれず、好ましくはこの宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞又は哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞である。
【００２４】
第十の局面において、本発明は、ｈＩＬ−４Ｒに特異的に結合する組換えヒト抗体及び受容可能な担体を含む組成物を特徴とするものである。
【００２５】
第十一の局面において、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合性部分を用いたｈＩＬ−４活性の阻害方法を特徴としている。具体的な実施態様において、本発明の抗体はまた、ｈＩＬ−４Ｒに結合するｈＩＬ−１３／ｈＩＬ−１３Ｒ１複合体を阻止する。一実施態様において、この方法は、ｈＩＬ−４Ｒを本発明の抗体又はその抗原結合性部分と接触させる工程を含み、その結果ｈＩＬ−４又はｈＩＬ−４／ｈＩＬ−１３活性が阻害される。別の実施態様において、この方法は、ｈＩＬ−４又はｈＩＬ−４／ｈＩＬ−１３活性の阻害によって寛解される障害を患うヒト被験体に、本発明の抗体又はその抗原結合性部分を投与する工程を含む。処置される障害は、ｈＩＬ−４又はｈＩＬ−４／ｈＩＬ−１３活性の除去、阻害又は減少によって改善、寛解、阻害又は防止されるすべての疾患又は状態である。
【００２６】
本発明によってさらに包含されるものは、ヒトのＩＬ−４媒介性疾患又は障害を減弱又は阻害するために使用する薬剤の製造において、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントを使用することである。
【００２７】
本発明の抗体又は抗体フラグメントによって処置されるＩＬ−４媒介性又は関連障害としては、例えば、関節炎（化膿性関節炎を含む）、ヘルペス状、慢性突発性蕁麻疹、強皮症、過形成性瘢痕、ホウィップル病、良性前立腺肥大、肺障害、例えば、軽度、中程度又は重篤な喘息、炎症性障害、例えば、炎症性腸疾患、アレルギー反応、川崎病、鎌状赤血球症、チャーグ−ストラウス症候群、グレーヴズ病、子癇前症、シェーグレン症候群、自己免疫性リンパ球増殖性症候群、自己免疫性溶血性貧血、バレット食道、自己免疫性ブドウ膜炎、結核及びネフローゼが挙げられる。
【００２８】
他の目的及び利点は、続く詳細な説明の概説から明白になる。
【００２９】
（図１Ａ〜Ｃ）ＯＣＴＥＴTMベースの逐次結合アッセイを用いて作製された抗体結合プロフィール評価に係る図である。図１（Ａ）は、結合した抗原に曝露された第一の抗体がコントロール抗体であるときに得られた結果を示す棒グラフである。図１（Ｂ）は、結合した抗原に曝露された第一の抗体がＶＡＢ１６Ｆ３−１であるときのものである。図１（Ｃ）は、結合した抗原に曝露された第一の抗体がＶＡＫ５Ｈ４−４であるときのものである。第二の抗体：１＝コントロール；２＝ＶＸ４Ｅ７−９；３＝ＶＸ３Ｆ７−６；４＝ＶＡＢ１６Ｇ−１；５＝ＶＡＢ１６Ｆ３−１；６＝ＶＡＢ１５Ｃ８−１７；７＝ＶＡＢ１１Ｇ８−１；８＝ＶＡＢ１０Ｃ１−５；９＝ＶＡＢ１０Ｇ８−１９；１０＝ＶＡＢ８Ｇ１０−１；１１＝ＶＡＢ７Ｂ９−３；１２＝ＶＡＢ６Ｃ１０−１４；１３＝ＶＡＢ５Ｃ５−１１；１４＝ＶＡＢ３Ｂ４−１０；１５＝ＶＡＢ４Ｄ５−３；１６＝ＶＡＢ１Ｈ１−２；１７＝ＶＡＫ５Ｈ４−４；１８＝ＶＡＫ７Ｇ８−５；１９＝ＶＡＫ８Ｇ１１−１３；２０＝ＶＡＫ９Ｃ６−１１；２１＝ＶＡＫ１０Ｇ６−７；２２＝ＶＡＫ１１Ｄ４−１；２３＝ＶＡＫ１２Ｂ１１−９；及び２４＝ＶＡＫ１０Ｇ１２−５。白棒は、第一の抗体の結合レベルを示し、黒棒は、第二の抗体によるさらなる結合を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】結合した抗原に曝露された第一の抗体がコントロール抗体であるときに得られた抗体結合プロフィール評価に係る図である。
【図１Ｂ】結合した抗原に曝露された第一の抗体がＶＡＢ１６Ｆ３−１であるときに得られた抗体結合プロフィール評価に係る図である。
【図１Ｃ】結合した抗原に曝露される第一の抗体がＶＡＫ５Ｈ４−４であるときに得られた抗体結合プロフィール評価に係る図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の方法を記載する前に、記載される特定の方法及び実験条件は変化し得るものであるので、本発明は、このような方法及び条件に限定されないことを理解すべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施態様のみを記載する目的のためだけにあり、限定されることは意図されないこともまた理解すべきである。
【００３２】
別段の規定がない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語及び科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有するものである。本明細書に記載される方法及び材料と類似又は等価のすべてのものが本発明の実施又は試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料をここに記載する。
【００３３】
定義
本明細書で使用される用語「ヒトＩＬ４Ｒ」（ｈＩＬ−４Ｒ）は、インターロイキン４（ＩＬ−４）に特異的に結合するヒトサイトカイン受容体、ＩＬ−４Ｒα（配列番号１）をいうことが意図される。用語「ヒトインターロイキン１３」（ｈＩＬ−１３）は、ＩＬ−１３受容体に特異的に結合するサイトカインをいい、そして「ｈＩＬ−１３／ｈＩＬ−１３Ｒ１複合体」は、ｈＩＬ−１３Ｒ１複合体に結合するｈＩＬ−１３によって形成される複合体をいい、この複合体は、ｈＩＬ−４受容体に結合して、生物活性を開始させる。
【００３４】
本明細書で使用される用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子をいうことが意図される。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと短縮）及び重鎖定常領域を含む。この重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと短縮）及び軽鎖定常領域を含む。この軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた超可変性領域にさらに細分され得るものであり、これはフレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられたより保存された領域に散在している。各々のＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列した３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成されている。
【００３５】
本明細書で使用される用語、抗体の「抗原結合性部分」（又は単に「抗体部分」若しくは「抗体フラグメント」）は、抗原に特異的に結合する能力を保持する１つ又はそれ以上の抗体のフラグメント（例えば、ｈＩＬ−４Ｒ）をいう。抗体の抗原結合性機能は、全長抗体のフラグメントによって遂行され得ることが示されている。用語、抗体の「抗原結合性部分」に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ１及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦ（ａｂ）’フラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）2フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ２４１：５４４−５４６）；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるにもかかわらず、単一の隣接した鎖として作製し得る合成リンカーによる組換え方法を用いて連結され得るものであり、これにおいてＶＬ及びＶＨ領域が一対となって一価の分子を形成する（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）。このような一本鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合性部分」に包含されることが意図される。一本鎖抗体の他の形態、例えば二重特異性抗体（Ｄｉａｂｏｄｙ）がまた包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８を参照のこと）。
【００３６】
本明細書で使用される「中和」抗体又は「阻止」抗体は、ｈＩＬ−４Ｒとの結合が、ｈＩＬ−４及び／又はｈＩＬ−１３の生物活性の阻害を生じさせる抗体をいうことが意図される。このｈＩＬ−４及び／又はＩＬ−１３の生物活性の阻害は、当該分野で公知のｈＩＬ−４及び／又はｈＩＬ−１３生物活性の１つ又はそれ以上の指標、例えばｈＩＬ−４及び／又はＩＬ−１３誘導性の細胞活性化並びにｈＩＬ−４ＲとのｈＩＬ−４結合を測定することによって評価され得る（以下の実施例を参照のこと）。
【００３７】
「ＣＤＲ」すなわち相補性決定領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と名付けられたより保存された領域内に散在した超可変性領域である。本発明の抗ｈＩＬ−４Ｒ抗体又はフラグメントの異なる実施態様において、ＦＲは、ヒト生殖細胞系配列と同一であるかもしれないし、自然に又は人工的に修飾されるかもしれない。
【００３８】
本明細書で使用される用語「表面プラズモン共鳴」は、例えばＢＩＡｃｏｒｅTMシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ）を用いてバイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより実時間相互作用解析を可能にする光学現象をいう。
【００３９】
用語「エピトープ」は、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域の特定の抗原結合性部位と相互作用する抗原決定基である。１つの抗原は、１を超えるエピトープを有し得る。エピトープは、立体構造的又は直線的のいずれかであり得る。立体構造的なエピトープは、直線的なポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並んだアミノ酸によって産生される。直線的なエピトープは、ポリペプチド鎖の隣接するアミノ酸残基によって産生される。ある特定の状況では、エピトープは、抗原上のサッカリド部分、ホスホリル基又はスルホニル（ｓｕｆｏｎｙｌ）基を含み得る。
【００４０】
核酸又はそのフラグメントをいうときの用語「実質的な同一性」又は「実質的に同一な」は、妥当なヌクレオチド挿入又は欠失を別の核酸（又はその相補鎖）と最適に整列させるとき、任意の周知の配列同一性アルゴリズム、例えば以下で議論されるＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧａｐによって測定すると、少なくとも約９５％そしてより好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド塩基においてヌクレオチド配列が同一であることを示している。
【００４１】
ポリペプチドに適用する用語「実質的な類似性」又は「実質的に類似の」は、例えば、デフォルトギャップ量（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）を用いたＧＡＰプログラム又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムによって最適に整列されるとき、２つのペプチド配列が、少なくとも９５％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味している。好ましくは、同一ではない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換だけ異なるものである。「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されるものである。一般に、保存的なアミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を実質的に変化させない。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、パーセント配列同一性又は類似性の程度は、置換の保存的性質を補正して上方に調整され得る。この調整を行う手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照のこと。類似の化学的性質を備えた側鎖を有するアミノ酸基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパルテート及びグルタメート、並びに（７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニンが挙げられる。好ましい保存的なアミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタメート−アスパルテート及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３  ４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列の正値を有するすべての変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列の非負値を有するすべての変化である。
【００４２】
ポリペプチドの配列類似性（これはまた配列同一性ともいわれる）は、代表的には、配列分析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、種々の置換、欠失及び他の修飾（保存的なアミノ酸置換を含む）に割り当てられた類似性の尺度を用いて、類似の配列を整合させる。例えばＧＣＧソフトウェアは、デフォルトパラメータを使用して、密接に関連したポリペプチド間、例えば異なる生物種由来の相同ポリペプチド、又は野生型タンパク質とその突然変異タンパク質間の配列相同性又は配列同一性を決定し得るプログラム、例えばＧａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔを含む。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、デフォルトパラメータ又は推奨パラメータを用いたＦＡＳＴＡ（ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１のプログラム）を使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡ（例えばＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、照会配列と検索配列との間の最も重複した領域の整列化及びパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）前出）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較するときには、別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いたコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照のこと。
【００４３】
ヒト抗体の調製
ヒト抗体の作製方法としては、例えば、ＶｅｌｏｃｉｍｍｕｎｅTM（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅTMテクノロジー（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１；Ａｂｇｅｎｉｘ）、「ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチ及びファージディスプレイ（そして例えば、ＵＳ  ５，５４５，８０７、ＵＳ  ６，７８７，６３７を参照のこと）が挙げられる。ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅTMテクノロジー（ＵＳ  ６，５９６，５４１）は、選択された抗原に対して高い特異性の完全なヒト抗体の作製方法を包含している。
【００４４】
げっ歯類は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）前出；Ｍａｌｉｋ及びＬｉｌｌｅｈｏｊ（１９９４）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＣＡを参照のこと）によって免疫され得る。好ましい実施態様において、ｈＩＬ−４Ｒ抗原は、マウスに直接投与され、これは、免疫応答を刺激するためのアジュバント、例えばフロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント、ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント系（Ｓｉｇｍａ）又はＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）（Ｏ’Ｈａｇａｎ（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪを参照のこと）とともに、ヒトＩｇ重鎖可変領域及びκ軽鎖可変領域（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅTM、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．；ＵＳ  ６，５９６，５４１）の両方をコードするＤＮＡ座を含んでいる。アジュバントは、局所デポーに抗原を隔絶することによってポリペプチドの急速な分散を防止し得、そして宿主の免疫応答を刺激し得る因子を含み得る。ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅTMテクノロジーは、内因性のマウス定常領域座に作動可能に連結されたヒト重鎖及び軽鎖の可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの作製に関与し、その結果このマウスは、抗原刺激に応じてヒト可変領域及びマウス定常領域を含む抗体を産生する。この抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡが単離され、ヒト重鎖及び軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。次いでこのＤＮＡは、完全なヒト抗体を発現し得る細胞内で発現される。具体的な実施態様において、この細胞はＣＨＯ細胞である。
【００４５】
抗体は、補体の固定（補体依存性細胞傷害）（ＣＤＣ）及び抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への関与を通じた細胞の死滅よりはむしろ、リガンド−受容体相互作用の阻止又は受容体成分の相互作用の阻害において治療的に有用であり得る。抗体の定常領域は、補体を固定し、そして細胞依存性細胞傷害を媒介する抗体の能力に重要である。従って、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞傷害性を媒介することが望ましいか否かに基づいて選択され得る。
【００４６】
ヒト免疫グロブリンは、ヒンジ異成分と結合する２つの形態で存在し得る。第一の形態において、免疫グロブリン分子は、約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４つの鎖の構造を含み、これにおいて二量体は、鎖間重鎖ジスルフィド結合によって互いに保持されている。第二の形態において、この二量体は、鎖間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、そして共有結合した軽鎖及び重鎖からなる約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ））。これらの形態は、アフィニティー精製の後であっても分離することは極めて困難である。種々のインタクトなＩｇＧアイソタイプにおいて第二の形態が出現する頻度は、抗体のヒンジ領域のアイソタイプに関連した構造差に起因しているが、これに限定されない。実際、ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて典型的に観察されるレベルまで第二の形態の出現を有意に減少させ得るのである（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０：１０５）。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２又はＣＨ３領域に１つ又はそれ以上の突然変異を有する抗体を包含しており、これは、例えば産生の際に所望の抗体形態の収量を改善することが望ましいものであり得る。
【００４７】
本発明の抗体は、好ましくはＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅTMテクノロジーを用いて調製される。内因性の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域が、対応するヒト可変領域で置換されるトランスジェニックマウスは、目的の抗原で誘発され、そして抗体を発現するマウスからリンパ細胞（例えばＢ細胞）が回収される。このリンパ細胞は、骨髄腫細胞系と融合されて不死のハイブリドーマ細胞系が調製され得るのであり、そしてこのようなハイブリドーマ細胞系がスクリーニング及び選択され、目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定する。重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡが単離され得、そして望ましいアイソタイプの重鎖及び軽鎖の定常領域に連結され得る。このような抗体タンパク質は、細胞内、例えばＣＨＯ細胞内で産生され得る。あるいは、抗原特異的なキメラ抗体又は軽鎖及び重鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、抗原特異的なリンパ球から直接単離され得る。
【００４８】
一実施態様において、このトランスジェニックマウスは、１８までの機能的なヒト可変性重鎖遺伝子及び１２までの機能的なヒト可変性κ軽鎖遺伝子を含む。別の実施態様において、このトランスジェニックマウスは、３９までのヒト可変性重鎖遺伝子及び３０までのヒト可変性κ軽鎖遺伝子を含む。なお別の実施態様において、このトランスジェニックマウスは、８０までのヒト可変性重鎖遺伝子及び４０までのヒト可変性κ軽鎖遺伝子を含む。
【００４９】
一般に本発明の抗体は、極めて高い親和性を有しており、固相に固定化されるか又は溶液中で測定されるかのいずれかの抗原との結合によって測定されるとき、代表的には約１０-9から約１０-12ＭのＫDを有する。
【００５０】
最初に、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体が単離される。以下に記載されるように、この抗体は特徴付けられ、そして、望ましい特性（ｈＩＬ−４Ｒとの結合親和性、ｈＩＬ−４ＲへのｈＩＬ−４結合を阻止する能力及び／又はヒトタンパク質に対する選択性を含む）に対して選択される。マウスの定常領域は、所望のヒト定常領域と置換されて、本発明の完全なヒト抗体、例えば、野生型又は修飾されたＩｇＧ４若しくはＩｇＧ１（例えば、配列番号５８８、５８９、５９０）を作製する。選択された定常領域は、特定の用途に従って変化し得るが、高親和性の抗原結合及び標的特異性の特性は、可変領域に存在するものである。
【００５１】
エピトープマッピング及び関連テクノロジー
特定のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、常用の交差阻止（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アッセイ、例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  １９８８  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編に記載されるものが行われ得る。他の方法としては、アラニン走査突然変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−６３）又はペプチド切断分析が挙げられる。さらに、エピトープ除去、エピトープ抽出及び抗原の化学修飾のような方法が利用され得る（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：９：４８７−４９６）。
【００５２】
抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としてもまた公知の修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）は、化学的又は酵素的に修飾された抗原表面に対する各々の抗体の結合プロフィールの類似性に従って、同じ抗原に対して指向される多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分類する方法である（米国特許出願公開番号２００４／０１０１９２０）。各々のカテゴリーは、別のカテゴリーによって表されるエピトープと明確に異なるか又は部分的に重複するかのいずれかの独特のエピトープを反映し得る。このテクノロジーにより、遺伝的に同一な抗体の迅速なフィルタリングが可能になり、その結果特徴付けは、遺伝的に異なる抗体に焦点を合わせられ得る。ハイブリドーマスクリーニングに適用されるとき、ＭＡＰは、所望の特性を有するまれなハイブリドーマクローンの同定を容易にし得る。ＭＡＰを用いて、本発明のｈＩＬ−４Ｒ抗体を異なるエピトープに結合する抗体群に選別し得る。
【００５３】
固定化された抗体の構造を変化させるのに有用な薬剤は、酵素、例えばタンパク質分解酵素及び化学薬品である。抗原タンパク質は、バイオセンサーチップ表面上又はポリスチレンビーズ上のいずれかに固定化され得る。後者は、例えば多重ＬｕｍｉｎｅｘTM検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，ＴＸ）のようなアッセイを用いてプロセシングされ得る。ＬｕｍｉｎｅｘTMの能力は、１００までの異なるタイプのビーズに対して多重分析を処理するものであるので、ＬｕｍｉｎｅｘTMは、種々の修飾を有するほとんど無制限の抗原表面を提供することになり、抗体エピトーププロファイリングの点でバイオセンサーアッセイを超えた改善された解決をもたらしている。
【００５４】
治療のための投与及び処方
本発明に従った治療実体の投与は、好適な担体、賦形剤及び移送、送達、許容性などを改善するために製剤に組み込まれる他の薬剤を用いて達成され得る。多数の適切な製剤は、あらゆる薬剤師に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３，２０ｔｈ  ｅｄ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）に見出され得る。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ろう、油、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有小胞（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油型及び油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル並びにカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。上述の混合物のすべてが、本発明に従った処置及び治療に適切であり得るが、但し製剤中の活性成分は、製剤によって不活性化されなく、そしてこの製剤は、投与経路と生理学的に適合性であり、かつ許容される。薬剤師に周知の賦形剤及び担体に関連したさらなる情報については、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”  ＰＤＡ（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１及びその中の引用もまた参照のこと。
【００５５】
本発明の治療分子は、適応症に適切な様式、例えば、非経口的、局所的又は吸入によって患者に投与され得る。注射の場合、例えば、関節内経路、静脈内経路、筋肉内経路、病巣内経路、腹腔内経路又は皮下経路を介して、ボーラス注射又は持続注入によって拮抗薬が投与され得る。移植片からの経皮送達及び徐放として、疾患又は損傷部位への局所投与が意図される。吸入による送達としては、例えば、経鼻又は経口吸入、噴霧器の使用、エーロゾル形態での拮抗薬の吸入などが挙げられる。他の選択肢としては、点眼剤；丸剤、シロップ、ロゼンジ又はチューインガムを含む経口剤；並びに局所用製剤、例えばローション、ゲル、スプレー及び軟膏が挙げられる。
【００５６】
特定の投薬量及び投与の頻度は、投与経路、処置されるべき疾患の性質及び重症度、状態が急性であるか慢性であるか、そして患者のサイズ及び全身症状のような因子に従って変化し得る。適切な投薬量は、関連分野で公知の手順、例えば用量増加研究を伴い得る臨床試験によって決定され得る。本発明の治療分子は、一度又は反復性であり得る。特定の実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは、少なくとも１カ月以上の期間にわたって、例えば１カ月、２カ月若しくは３カ月又は無期限の期間でさえ投与される。慢性状態の処置に関しては、長期間の処置が一般に最も有効である。しかし急性状態の処置に関しては、より短い期間、例えば１〜６週間の投与で十分であり得る。一般に、患者が、選択された指標に関するベースラインを超える医学的に関連した改善程度を示すまで、治療薬が投与される。本発明の治療分子を用いた処置の間及び／又は後に、ＩＬ−４のレベルがモニターされ得る。ＩＬ−４血清レベルの測定方法は、当該分野で公知であり、例えばＥＬＩＳＡによるものなどがある。
【００５７】
治療的使用及び併用療法
本発明の抗体及び抗体フラグメントは、ＩＬ−４活性を減少させることによって改善、阻害又は寛解される疾患及び障害の処置に有用である。これらの障害としては、ＩＬ−４の異常若しくは過剰な発現、又はＩＬ−４産生に対する異常な宿主応答によって特徴付けられるものが挙げられる。抗体又は抗体フラグメントによって処置されるＩＬ−４関連障害としては、例えば、関節炎（化膿性関節炎を含む）、ヘルペス状、慢性突発性蕁麻疹、強皮症、過形成性瘢痕、ホウィップル病、良性前立腺肥大、肺障害、例えば喘息（軽度、中程度又は重篤）、炎症性障害、例えば、炎症性腸疾患、アレルギー反応、川崎病、鎌状赤血球症、チャーグ−ストラウス症候群、グレーヴズ病、子癇前症、シェーグレン症候群、自己免疫性リンパ球増殖性症候群、自己免疫性溶血性貧血、バレット食道、自己免疫性ブドウ膜炎、結核、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、線維症及びネフローゼが挙げられる（Ｕ．Ｓ．７，１８６，８０９を参照のこと）。
【００５８】
本発明は、抗ＩＬ−４Ｒ抗体又は抗体フラグメントが第二の治療剤と併用して投与される併用療法を包含する。同時投与及び併用療法は、同時に生じる投与に限定されないが、抗ＩＬ−４Ｒ抗体又は抗体フラグメントが、少なくとも１つの他の治療剤を患者に投与することを伴う処置過程の間に少なくとも１回投与される処置レジメンを含む。第二の治療剤は、吸入又は他の適切な手段によって送達され得る別のＩＬ−４拮抗薬、例えば別の抗体／抗体フラグメント、又は可溶性のサイトカイン受容体、ＩｇＥ拮抗薬、抗喘息薬物（コルチコステロイド、非ステロイド薬、β作用薬、ロイコトリエン拮抗薬、キサンチン、フルチカゾン、サルメテロール、アルブテロール）であり得る。具体的な実施態様において、本発明の抗ＩＬ−４Ｒ抗体又は抗体フラグメントは、ＩＬ−１拮抗薬、例えばリロナセプト（ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）又はＩＬ−１３拮抗薬とともに投与され得る。第二の薬剤は、アレルギー性炎症性疾患、例えば喘息及びアレルギーのような障害を処置するために、１つ又はそれ以上のロイコトリエン受容体拮抗薬を含み得る。ロイコトリエン受容体拮抗薬の例としては、モンテルカスト、プランルカスト及びザフィルルカストが挙げられるがこれらに限定されない。第二の薬剤としては、サイトカイン阻害剤、例えば１つ又はそれ以上のＴＮＦ（エタネルセプト、ＥＮＢＲＥＬTM）、ＩＬ−９、ＩＬ−５又はＩＬ−１７拮抗薬が挙げられ得る。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物をどのように作製し、そしてどのように使用するかについての完全な開示及び記述を当業者に与えるために述べられるものであり、本発明者らが本発明であるとみなしている範囲を限定することは意図されない。使用される数（例えば、量、温度など）に関する正確さを確実にする試みがなされているが、いくらかの実験誤差及び逸脱は把握されるべきである。別段の指示がない限り、部は質量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧又は大気圧付近である。
【００６０】
実施例１．ヒトＩＬ−４受容体に対するヒト抗体の作製
ヒトＩｇ重鎖可変領域及びκ軽鎖可変領域の両方をコードするＤＮＡ座を含むマウス（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅTM、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．；米国特許第６，５９６，５４１号）を、ヒトＩＬ−４Ｒ（ｈＩＬ−４Ｒ、配列番号１）で免疫した。アジュバント中の精製抗原を直接注射によるか、又はｈＩＬ−４ＲのＤＮＡ配列をＤＮＡプラスミドに提供することによって間接的にｈＩＬ−４Ｒが投与され、このＤＮＡプラスミドは、ｈＩＬ−４Ｒ遺伝子を含み、そしてインビボで抗原ポリペプチドを産生するための宿主の細胞性タンパク質発現機構を用いてｈＩＬ−４Ｒを発現する。最適な免疫応答を得るために、引き続いて３〜４週間毎に動物をブーストし、そして抗−抗原応答の進行を評価するために、各ブーストの後に１０回血液を抜き取った。
【００６１】
マウスが最大の免疫応答を達成したときに、抗体発現性Ｂ細胞を収集し、そしてマウス骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを形成させた。特異性、抗原結合親和性及びｈＩＬ−４ＲへのｈＩＬ−４結合を阻止する効力に関して、ハイブリドーマ又はトランスフェクト細胞の馴化培地をスクリーニングすることによって、機能的に望ましいモノクローナル抗体を選択した（以下に記載）。
【００６２】
望ましい抗原結合親和性、効力及び／又はｈＩＬ−４ＲへのｈＩＬ−４結合を阻止する能力を示す選択された抗体としては、（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）：ＶＸ  ４Ｅ７−９（配列番号３／１１；３８７／３８９；３９１／３９３）；ＶＸ  ３Ｆ７−６（配列番号１９／２７；３９５／３９７；３９９／４０１）；ＶＡＢ  １６Ｇ１−１（配列番号３５／４３；４０３／４０５；４０７／４０９）；ＶＡＢ  １６Ｆ３−１（配列番号５１／５９，４１１／４１３，４１５／４１７，５７９／５９及び５８１／５９）；ＶＡＢ  １５Ｃ８−１７（配列番号６７／７５，４１９／４２１，４２３／４２５）；ＶＡＢ  １３Ａ１−６（配列番号８３／９１，４２７／４２９，４３１／４３３）；ＶＡＢ  １１Ｇ８−１（配列番号９９／１０７，４３５／４３７，４３９／４４１）；ＶＡＢ  １０Ｇ８−１９（配列番号１１５／１２３，４４３／４４５，４４７／４４９）；ＶＡＢ  １０Ｃ１−５（配列番号１３１／１３９，４５１／４５３，４５５／４５７）；ＶＡＢ  ８Ｇ１０−１（配列番号１４７／１５５，４５９／４６１，４６３／４６５）；ＶＡＢ  ７Ｂ９−３（配列番号１６３／１７１，４６７／４６９，４７１／４７３）；ＶＡＢ  ６Ｃ１０−１４（配列番号１７９／１８７，４７５／４７７，４７９／４８１）；ＶＡＢ  ５Ｃ５−１１（配列番号１９５／２０３，４８３／４８５，４８７／４８９）；ＶＡＢ  ３Ｂ４−１０（配列番号２１１／２１９，４９１／４９３，４９５／４９７）；ＶＡＢ  ４Ｄ５−３（配列番号２２７／２３５，４９９／５０１，５０３／５０５）；ＶＡＢ  １Ｈ１−２（配列番号２４３／２５１，５０７／５０９，５１１／５１３）；ＶＡＫ５Ｈ４−４（配列番号２５９／２６７，５１５／５１７，５１９／５２１）；ＶＡＫ７Ｇ８−５（配列番号２７５／２８３，５２３／５２５，５２７／５２９）；ＶＡＫ８Ｇ１１−１３（配列番号２９１／２９９，５３１／５３３，５３５／５３７）；ＶＡＫ９Ｃ６−１１（配列番号３０７／３１５，５３９／５４１，５４３／５４５）；ＶＡＫ１０Ｇ６−７（配列番号３２３／３３１，５４７／５４９，５５１／５５３）；ＶＡＫ１１Ｄ４−１（配列番号３３９／３４７，５５５／５５７，５５９／５６１）；ＶＡＫ１２Ｂ１１−９（配列番号３５５／３６３，５６３／５６５，５６７／５６９）；並びにＶＡＫ１０Ｇ１２−５（配列番号３７１／３７９，５７１／５７３，５７５／５７７）が挙げられる。
【００６３】
実施例２．抗原結合親和性の測定
ｈＩＬ−４Ｒに関して選択された抗体の結合親和性（ＫD）を、実時間バイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅTM２０００）を用いて測定した。手短に言えば、捕獲された抗体表面を形成するためにヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ＩｇＧとＢＩＡｃｏｒｅTMチップとの直接的な化学結合を通じて作成されたＧＡＭ  ＩｇＧポリクローナル抗体表面上で抗体を捕獲した。種々の濃度（１２．５ｎＭ〜０．６２５ｎＭの範囲）の単量体ｈＩＬ−４Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は二量体ｈＩＬ−４Ｒ−ｈＦｃを、捕獲された抗体表面上に注入した。抗体との抗原結合及び結合した複合体の解離を、実時間でモニターした。平衡解離定数（ＫD）及び解離速度定数を、ＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて動態解析を行うことにより確認した。ＢＩＡ評価ソフトウェアをまた用いて、抗原／抗体複合体解離の半減期（Ｔ1/2）を計算した。結果を表１に示した。コントロール：完全なヒト抗ＩＬ−４Ｒ抗体（米国特許第７，１８６，８０９号；配列番号１０及び１２）。選択された抗体は、１ｎＭより低いＫDで二量体受容体に結合し得る高親和性抗体を含むことが動態解析の結果から明らかになった。マウス又はサル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＩＬ−４Ｒのいずれかに対する抗ｈＩＬ−４Ｒ抗体の結合親和性をまた試験した。選択された抗体は、（１）マウスＩＬ−４Ｒと交差反応せず；そして（２）サルＩＬ−４Ｒに結合できないか、又は極めて低い親和性でサルＩＬ−４Ｒに結合するかのいずれかであった。
【００６４】
【表１】
2010505418.tif 000003
【００６５】
ＥＬＩＳＡベースの溶液競合アッセイを用いて、抗体−抗原結合親和性をまた評価した。手短に言えば、抗体（１又は３．３ｎｇ／ｍｌの精製タンパク質）を、０〜１０μｇ／ｍｌの範囲の段階希釈の抗原タンパク質（単量体又は二量体）と前もって混合した。次いで、抗体及び抗原混合物の溶液を、室温で２〜４時間インキュベートして、結合の平衡状態に到達させた。次いで、定量サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、混合物中の遊離抗体を測定した。手短に言えば、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐTMプレート（ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ
Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）を、４℃で一晩ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−４Ｒ−ｈＦｃタンパク質でコーティングし、その後ＢＳＡで非特異的結合を阻止した。次いで、この抗体−抗原混合物溶液を、コーティングされたＭａｘｉｓｏｒｂTMプレートに移し、その後１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、そしてプレートに結合した抗体を、コントロール抗体に対するＨＲＰ−結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）又はＨＲＰ−結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出し、そして発色基質、例えばＢＤ  ＯｐｔＥＩＡTM（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて発色させた。１Ｍリン酸又は硫酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍでの吸光度を記録し、そしてＧｒａｐｈＰａｄTM  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析した。溶液中の抗原濃度に対するシグナルの依存性を、４つのパラメーターフィット分析で分析し、そして溶液中に抗原が存在しない抗体サンプルからのシグナルの５０％減少を達成するのに必要な抗原濃度、ＩＣ50として報告した。上記のようにＩＣ50を測定し、そして表２に要約した。好ましい実施態様において、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、ＥＬＩＳＡ溶液競合アッセイによる測定で、二量体ｈＩＬ−４Ｒに関して約２０ｐＭ以下のＩＣ50、そして単量体ｈＩＬ−４Ｒに関して約１５０ｐＭ以下又は約１００ｐＭ以下のＩＣ50を示した。
【００６６】
【表２】
2010505418.tif 000004
【００６７】
実施例３．ｈＩＬ−４及びｈＩＬ−４Ｒ相互作用の阻害
選択された抗体がｈＩＬ−４ＲとのｈＩＬ−４結合を阻止する能力を、ＢＩＡｃｏｒｅTM  ｈＩＬ−４阻害アッセイによってスクリーニングし、そして以下に記載されるように、定量ｈＩＬ−４阻止イムノアッセイによって効力を測定した。結果を表３に要約した。
【００６８】
抗体がｈＩＬ−４Ｒ受容体とのｈＩＬ−４結合を阻止する能力を、表面プラズモン共鳴を用いて測定した。精製ｈＩＬ−４Ｒ−ｈＦｃ分子を、２６０ＲＵの密度でＣＭ−５上に固定化されたヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体によって捕獲して、受容体でコーティングされた表面を調製した。次いで、ヒトＩＬ−４（５０ｎＭで０．２５ｍｌ）を、受容体でコーティングされた表面上に注入し、そして結合したｈＩＬ−４量を記録した（ｈＩＬ−４の第一の注入）。次いで、結合したｈＩＬ−４を、３Ｍ  ＭｇＣｌ2、その後調整
緩衝液のパルスで除去した。次いで、精製抗ｈＩＬ４Ｒ抗体を、受容体表面上に注入し、その後同じ濃度でｈＩＬ−４の第二の注入を行った（ｈＩＬ−４の第二の注入）。あらかじめ形成された抗体と受容体との複合体から生じるｈＩＬ−４結合のパーセント減少を、表３に報告した。
【００６９】
ｈＩＬ−４ＲとのｈＩＬ−４結合を阻止する能力をさらに評価するために、定量イムノアッセイを行った。手短に言えば、２５ｐＭ  ｈＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ溶液を、約５０ｎＭ〜０ｎＭの範囲で段階希釈した抗体タンパク質と前もって混合し、その後室温で１時間インキュベートした。ｈＩＬ−４Ｒに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、（抗体が結合していない）遊離ｈＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ濃度を測定した。ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート上にビオチン化ｈＩＬ−４（０．５μｇ／ｍｌ）を結合させることによって、ｈＩＬ−４Ｒの検出プレートを調製した。前もって結合した抗体−抗原サンプルを、ｈＩＬ−４でコーティングされた検出プレートに移した。室温で１時間のインキュベーション後、検出プレートを洗浄し、そしてＨＲＰ結合体化ヤギ抗ｈＦｃポリクローナル抗体を用いて、プレートに結合したｈＩＬ−４Ｒ−ｈＦｃを検出し、そして発色基質、例えばＢＤ  ＯｐｔＥＩＡTM（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて発色させた。１Ｍリン酸又は硫酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を記録し、そしてＧｒａｐｈＰａｄTM  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析した。プレートに結合したｈＩＬ−４に対して検出可能なＩＬ−４Ｒ−ｈＦｃの５０％を減少させるのに必要な抗体量として、ＩＣ50を測定した。好ましい実施態様において、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、ＥＬＩＳＡによる測定で、２５ｐＭ  ｈＩＬ−４Ｒを阻止するＩＣ50として約５０ｐＭ未満又は約４０ｐＭ未満又は約３０ｐＭ未満又は約２０ｐＭ未満を示した。
【００７０】
【表３】
2010505418.tif 000005
【００７１】
実施例４．インビトロでのｈＩＬ−４の生物学的効果の中和
ＩＬ−４媒介シグナル伝達経路は、文献（例えば、Ｈｅｂｅｎｓｔｒｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．１７（３）：１７３−８８，２００６の概説を参照のこと）に広範に記述されている。ＩＬ−４は、２つの受容体複合体、Ｉ型及びＩＩ型を刺激し得る。Ｉ型受容体複合体は、ＩＬ−４ＲへのＩＬ−４の結合、その後共通のγ鎖のヘテロ二量体化によって形成される。あるいは、ＩＬ４／ＩＬ４Ｒ複合体は、ＩＬ−１３受容体１とヘテロ二量体化して、ＩＩ型受容体複合体を形成し得る。Ｉ型及びＩＩ型複合体の両方とも、主にＳＴＡＴ６を通じてシグナルを伝達する。従って、以下に記載されるように、選択された抗体がＳＴＡＴ６を通じたシグナル伝達を阻止する能力を評価した。
【００７２】
ｈＩＬ−４及びｈＩＬ−１３に対して高い感受性を有する細胞系を確立した。ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＳＴＡＴ６及びＳＴＡＴ６ルシフェラーゼレポータープラスミドで安定にトランスフェクトし、そして増殖培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン）中で維持した。ＳＴＡＴ６でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の増殖培地に１０ｐＭ  ｈＩＬ−４を添加したときに、強いＩＬ−４受容体媒介性応答が達成された。ｈＩＬ−４応答のバイオアッセイとして、細胞をアッセイ培地（Ｏｐｔｉｍｅｍ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）＋０．１％ＦＢＳ）中で１回洗浄し、そしてアッセイ培地８０μＬ中の１ウェル（９６ウェルプレート）当たり１×１０4細胞でプレーティングした。精製抗体をアッセイ培地に段階希釈し（２０ｎＭ〜０の範囲の最終濃度）、そして各々の試験抗体１０μｌを、ｈＩＬ−４  １０μｌ（１０ｐＭの一定の最終濃度）とともに細胞に添加した。次いで、細胞を３７℃で６時間、５％  ＣＯ2でインキュベートした。細胞応答の程度を、ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で測定した。結果を表４に示した。
【００７３】
インビトロでのＩＬ−４依存性の生物活性の阻害をまた、ヒト赤芽球細胞系ＴＦ１又は修飾されたＩＬ−１３Ｒαを過剰発現するＴＦ１細胞系（ＴＦ１／Ａ１２）のいずれかを用いて確認した。このバイオアッセイにおいて、２０，０００個の細胞を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン並びにペニシリン及びストレプトマイシンを含有したＲＰＭＩ  １６４０培地中の９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。０〜５０ｎＭ（最終濃度）の範囲の精製抗体２５μｌを、細胞系ＴＦ１に関して５０ｐＭ、細胞系ＴＦ１／Ａ１２に関して２０ｐＭのいずれかの最終濃度で、ｈＩＬ−４組換えタンパク質２５μｌとともに添加した。次いで、細胞を３７℃で３日間増殖させて、そしてＣＣＫ８キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて最終細胞数を測定した。抗体がＴＦ−１細胞の増殖を阻止する能力を、細胞増殖の５０％減少を達成するのに必要な抗体濃度として表４に報告した。
【００７４】
【表４】
2010505418.tif 000006
【００７５】
実施例５．インビトロでのｈＩＬ−１３の生物学的効果の中和
ＩＬ−４Ｒは、ＩＬ−１３／ＩＬ−１３Ｒ複合体との結合を通じたＩＬ−１３活性のモジュレーターであることが示されているので、上記のＨＥＫ２９３  ＳＴＡＴ６ルシフェラーゼアッセイの改良法（１０ｐＭ  ＩＬ−４の代わりに４０ｐＭ  ｈＩＬ−１３）において、ＩＬ−１３活性を阻止する能力に対して選択された抗体を試験した。上記のＴＦ−１細胞系アッセイにおいて、０〜５０ｎＭの抗体の存在下で１５０ｐＭのｈＩＬ−１３を用いて、ｈＩＬ−１３活性を阻止する効力について抗体をまた評価した。結果を表５に示した。
【００７６】
【表５】
2010505418.tif 000007
【００７７】
実施例６．抗体結合プロフィールの評価
（抗原に結合した）抗体が、異なる抗体の一団がその後同じ抗原に結合する能力に対して有し得る効果を測定することによって、抗体結合プロフィールを確立することができた。例えば、抗原を支持体上に固定化して、抗原でコーティングされた表面を形成させ、この抗原コーティング表面を抗体で飽和させ、次いでこの抗体で飽和された抗原コーティング表面を他の抗体の一団に曝露し得る。抗体で飽和された抗原表面に他の抗体の一団が結合する程度は、抗体結合プロフィールを与える。ＯＣＴＥＴTMベースの逐次結合アッセイを利用して、抗体結合プロフィールを作製した。手短に言えば、２４のストレプトアビジンＨｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＦＡバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）の一群を、３０℃で１０分間、抗原であるビオチン−ｈＩＬ−４Ｒ−ｈＦｃと２μｇ／ｍｌで最初にインキュベートして飽和状態を達成し、そして結合した抗原量を、結合したタンパク質に起因した生物学的層の厚さの変化（ｎｍ）として測定し、これは、波長シフトによって直接測定した。次いで、ビオチン−ｈＩＬ−４Ｒ−ｈＦｃが結合したバイオセンサーを、３０℃で１５分間、第一の抗体（コントロール抗体）と５０μｇ／ｍｌでインキュベートして飽和状態を達成し、そして結合したコントロール抗体量を、生物学的層の厚さの変化（ｎｍ）として測定した。次いで、各々のコントロール抗体に結合したセンサーを、３０℃で１５分間、２４の異なる抗ｈＩＬ−４Ｒ抗体（第二の抗体）の一団のうちの１つと５０μｇ／ｍｌでインキュベートし、そして結合した第二の抗体量を、生物学的層の厚さの変化として測定した。第一の抗体として、ＶＡＢ１６Ｆ３−１又はＶＡＫ５Ｈ４−４抗ｈＩＬ−４Ｒ抗体のいずれかを用いて、同じアッセイを反復した。結果を、図１Ａ〜Ｃに示した。
【００７８】
選択された抗ｈＩＬ−４Ｒ抗体をまた、ウェスタンブロットによって評価した（データは示さず）。手短に言えば、ｈＩＬ−４Ｒ単量体（１レーン当たり２００ｎｇ）及びｍｆＩＬ−４Ｒ  Ｈｉｓタグ化単量体（１レーン当たり２００ｎｇ）を、還元性及び非還元性の両方のサンプル緩衝液を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に電気泳動させた。４つの別々のゲルを、各々ＰＶＤＦ膜に移し、そして各々の膜を、４つの一次抗体：抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＶＡＢ  １６Ｆ３−１、ＶＡＫ  ５Ｈ４−４又はコントロール抗ｈＩＬ−４Ｒ抗体のうちの１つに曝露して、二次抗体としてＨＲＰ−結合体化ヤギ抗ｍＩｇＧ又はＨＲＰ−結合体化ヤギ抗ｈＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ）のいずれかを用いた。３つの抗ｈＩＬ−４Ｒ抗体すべてが、非還元形態のｈＩＬ−４Ｒを認識した。ＶＡＢ  １６Ｆ３−１及びＶＡＫ  ５Ｈ４−４のみが、還元形態のｈＩＬ−４Ｒを検出した。どの抗ｈＩＬ−４Ｒ抗体も、サルＩＬ−４Ｒを検出しなかった。
【図１Ａ】
2010505418.tif 000008
【図１Ｂ】
2010505418.tif 000009
【図１Ｃ】
2010505418.tif 000010
【配列表】
2010505418000001.app
【国際調査報告】
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2010505418.tif 000012
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