(57)【要約】  裂傷、亀裂、破裂及び／又は層間剥離に対する抵抗性を増加させるための、自然の、変性していない組織の治療方法であって、組織中の架橋を増加させる試薬の効果的な量と少なくとも組織の一部とを接触させる工程を含んでなる方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
裂傷、亀裂、破裂及び／又は層間剥離に対する抵抗性を増加させるための、自然の、変性していない組織の治療方法であって、組織中の架橋を増加させる試薬の効果的な量と少なくとも組織の一部とを接触させる工程を含んでなる方法。
【請求項２】
前記組織が線維性のコラーゲン組織である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記線維性のコラーゲン組織が椎間板又は膝関節間軟骨の線維輪である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上の架橋剤を用いる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試薬が非毒性である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記架橋試薬は、少なくとも０．００１％（０．０１ｍｇ／ｍｌ）のヒト組み替え型トランスグルタミナーゼ、少なくとも０．０１％（０．１ｍｇ／ｍｌ）の精製された動物性肝臓トランスグルタミナーゼ、少なくとも０．２５％のゲニピン、少なくとも０．１％のプロアントシアニジン、少なくとも１００ｍＭのＥＤＣ、少なくとも５０ｍＭの非酵素剤、少なくとも０．００１％のリシルオキシダーゼのうちから選択される１つ以上の薬剤を含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記物質が非酵素剤である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試薬が酸化体、緩衝剤、又はこれらの組み合わせを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酸化体が過酸化水素、過炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、アミノ酸ヒドロペルオキシド又は過ホウ酸塩であり、緩衝剤が重炭酸ナトリウム又はリン酸塩である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記非酵素剤は、少なくとも１００ｍＭのリボース、少なくとも１００ｍＭのＬ−トレオース、少なくとも５０ｍＭのメチルグリオキサル、少なくとも５０ｍＭのグリオキサールのうちから選択される１つ以上を含むものである請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記物質が０．１Ｍの尿素溶液中に存在する請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記架橋剤が十分に非細胞毒性の担体媒体中に存在する請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記担体媒体のｐＨが健全な組織環境と実質的に同じになるように調整される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記担体媒体が燐酸塩緩衝生理食塩溶液である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
線維性のコラーゲン組織が椎間板の線維輪であり、前記試薬が後方又は後側方椎間板の中央部の置換を防止するために効果的である請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
線維性のコラーゲン組織が椎間板の線維輪であり、前記工程が核増加の移植又は装置の交換と同時、又はその前に、又はその後に、前記組織と前記試薬とを接触させることである請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織の劣化の原因となる有害な力学的負荷環境下での組織、例えば、コラーゲン組織の治療方法に関する。種々の実施形態において、本発明は、線維組織（変質した椎間板や周囲の組織や変性膝半月板）を支持している負荷、核置換や核増加のような移植された素材や装置のはみ出しや排除の防止、組織を引き裂くことへの抵抗性の改善及び椎間板ヘルニアを予防する方法と装置、疲労抵抗性を改善する方法、他の進行性の脊髄変形と同様の脊柱側弯症における進行性の変形力及び湾曲進行に対する抵抗性、疲労、引き裂き阻害物質及び関節安定剤として効果的な非毒性架橋試薬、透過性や特異性をより増加させることによって椎間板の中央部の生物活性のための環境を改善する方法と装置、水力と高分子透過性及び椎間板の外側領域の拡散性、の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有害な力学的負荷環境は、様々な様式でコラーゲン組織の劣化の原因となる。例えば、疲労とは、反復して加えられる負荷に起因する素材の弱化によるものである。疲労破壊とは、単純に、反復的な負荷が素材を弱化させたことによる本来の最高負荷レベル未満での破壊である。骨では、生物学的回復と疲労という２つのプロセスが対立しており、一般的に回復が支配的である。椎間板では、後方線維輪の力学的な劣化の有病性（Ｏｓｔｉ  １９９２）は、疲労が支配的なプロセスであることを示唆するものである。活発な組織反応（適合、回復）は、成熟した椎間板輪状素材の場合には、大きな役割を果たしていない。椎間板は、髄核（ＮＰ）又は核、線維輪（ＡＦ）又は輪、及び軟骨性終板の３つの部位から構成される。内側輪及び外側核の特性は、進行性の変質、より線維質になる核、及び水分量の減少を調和することである。同様に、外側核と内側輪の間の境界は、次第に消えることが知られており、進行中の変質によって不明瞭になる。基本的に無血管の構造であるため、その限られた数の生細胞の栄養素に関して、椎間板は、拡散に依拠している。加齢に伴う変化は、拡散を妨害し、おそらく、細胞の生存性及び生合成機能を低下させる要因である（Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３，Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒ１９９５）。加齢に伴う細胞数及び細胞機能の低下は、マトリックスに対する力学的損傷を回復する細胞の能力を損なわせる。酵素分解後の核内でのマトリックスの再生は、達成されたが、機能的な輪状素材の再生は未だ実現されていない。
【０００３】
このように、回復又は再生の限定された能力に関連して、非外傷性の生理的な反復負荷が加えられたときに、後方椎間板組織が劣化及び疲労破壊に対して脆弱であることが研究によって示されている。穏やかな生理的反復負荷が加えられた後方椎間板組織の弾力性−可塑性（Ｈｅｄｍａｎ  ９９）及び粘弾性（Ｈｅｄｍａｎ  ００）素材特性は、劣化することが従来の研究によって示されている。最大引張り強度の３０％の規模の反復負荷によって僅か２０００サイクルで素材特性の顕著な劣化が生じた。Ｇｒｅｅｎ（１９９３）は、外側輪の検体の対応付けられたペアの最大引張り強度及び疲労寿命を研究した。垂直方向の引張りの反復的なピークが対応付けられたペア対照の４５％を超えると、１０，０００サイクル未満で疲労破壊が起こり得ることを見出した。更に、Ｐａｎｊａｂｉ（１９９６）らは、破壊を起こさない程度の単一サイクルの負荷を膝の前十字靱帯に与えることによって、靱帯の弾性特性（負荷変形）が変化することを見出した。Ｏｓｔｉ（１９９２）は、輪裂傷及び輪亀裂が主に椎間板の後方領域に見られることを見出した。Ａｄａｍｓ（１９８２）は、僅かに変質した椎間板が過屈曲された場合に、後に突出する傾向があることを証明し、また、屈曲の際に激しい負荷を受けると外側後方輪が垂直方向に過度に引き伸ばされるので疲労破壊が腰部椎間板に生じ得ることを示した。椎間板の突出は、中央部の移動及び突出に伴う線維輪又は椎間板の外側部位、髄核物質の裂傷及び亀裂を含む。分析研究によって、層間剥離を引き起こす層間剪断応力は、椎間板の後方領域で最も高いことが明らかとされている（Ｇｏｅｌ  １９９５）。これら従来のデータは、１）後方椎間板及び後方縦靱帯に変質的な変化のリスクがあること、及び、２）変質の機構には、亀裂、裂傷及び層間剥離を伴う屈曲疲労が関連していることを示している。
【０００４】
異なる種類のコラーゲン組織の力学的な劣化は、脊柱側弯症及び他の進行性の脊髄変形で起こる。脊柱側湾症とは、しばしば原因不明の主に脊柱の異常な側方への（或いはその他の）湾曲又は変形を表す。進行性の脊髄変形は、付随の脊柱計装のあるなしにかかわらず、後に神経減圧法処置のような外科的な骨の除去や後の脊柱の破壊を生じさせる。骨脊柱の破壊自体は、外傷や年齢に関連した骨粗鬆症や骨希薄と同じ結果を生じさせる可能性がある。平背症候群として知られる腰部脊柱での脊柱後弯症変形（表面的な凹みの損失や表面的な凸部の増加）は、脊柱固定術や脊柱計装の取り付け（特に長期間で多層の外科的な構成の場合）に対して、しばしば起こる後遺症である。深刻な湾曲及び進行性の湾曲の進行は、呼吸器機能（これに限定されない）など、多くの他の健康疾患を引き起こし得る。更に、そのライフスタイルも悪影響を受け、身体的な美しさが失われる。多くの人々（女性の約２％、男性の約０．５％）が脊柱側湾症に冒されている。脊柱側湾症の８０％超は、原因不明（即ち、突発的）である。突発性の脊柱側湾症の約８０％は、若い思春期の成人に発症する。変形の発生は、年齢によって増大する。湾曲の進行を抑制するための外部ギプスのような既存の従来のアプローチは、取り扱い難く、或いは、動きを制限し、そして、議論された有用性がある。重度の湾曲の外科的矯正は、回復期間が長く集中的なものとなる場合があり、術後のギプスが必要で、また、多くの他の術後の問題を伴う。
【０００５】
脊柱変形の他の形態としては、脊柱すべり症が一般に脊柱の腰部の下方で生じている。脊柱すべり症は、隣接レベルに関連して一部の脊柱レベルのずれを含む。進行性のすべり症は、坐骨神経痛と疼痛を引き起こす。外科的な処置は、特に、すべり位置ズレ量やすべり角度が大きいとき、進行性のすべりを防ぐ選択肢の一つである。しかしながら、外科が示すポイントへ進行するすべりを防止する非外科的な方法は、従来は有効でない。
【０００６】
脊柱側湾症及び他の進行性の脊柱変形の現在の治療は、ギプスと手術とからなる。整形外科ギプスの目的は、脊柱の変形の増大を防ぐことであり、既存の変形を正すことではない。ギプスは、期待される量の骨格成長が残っており、湾曲大きさが２５〜４０°の範囲にある子供に一般的に使用される。外部ギプスは、治療の標準として、通常使用される。しかし、外部ギプスの有効性について議論がある。胴体に適用するギプスの負荷に対応する脊柱に与えられる力の大きさは、直接定量することができない。胴体に与えられる力がより大きくなると、ギプスに接触している組織に対して病状が引き起こされ得る。いくつかの研究では、約８０％の罹患した子供においてギプスが湾曲の進行を停止させるのに有効であることを示唆している。しかし、選択肢が湾曲の進行を観測するだけなのは、不適当であるから、湾曲自体、又は、他の要素により湾曲の進行が停止するこれらの湾曲のパーセントは、一般的でない。
【０００７】
天然のコラーゲン架橋は、コラーゲン組織、特に、椎間板を安定化させる上で重要な役割を果たす。還元可能な（新しく形成された）架橋量が著しく高いのは、脊柱側弯症の椎間板の凹状の側より凸状の側であることが見出されている（Ｄｕａｎｃｅ，ｅｔ  ａｌ．１９９８）。同様に、Ｇｒｅｖｅ（１９８８）らは、同時に湾曲が増大している脊柱側弯症の鶏の椎間板で還元可能な架橋の統計的な増加量を見出した。これは、脊柱側湾症の椎間板の凸状側の高められた引張り環境に応じて生じる細胞の仲介による架橋増加が自然の何らかの形態であることを示唆する。Ｇｒｅｖｅらは、脊柱側湾症の鶏の軟骨において、発育の極めて初期の段階では還元可能な架橋が少数であることも見出した。彼らは、発育の後期の段階では架橋の数がより少なくならないので、コラーゲン架橋の違いが原因とならないことを結論づけた。実際、その後、脊柱側湾症の湾曲が進行していた場合には、おそらくは湾曲に応答して、コラーゲン架橋の数が統計的に有意に増加していた。Ｇｒｅｖｅらの結論ではないが、これは、脊柱側弯症の湾曲の進行を引き起こすのに十分長期間、発育過程で架橋がほとんど枯渇されており、脊柱側弯症の湾曲は、架橋のレベルを正常より高くする細胞応答によって後に修繕されたものと解釈することができる。これらの研究は、天然に存在するコラーゲン架橋の存在が、脊柱側弯症の脊柱において進行する劣化の抑制や椎間板組織の力学的安定性に重要であり得ることを示唆している。
【０００８】
これらの研究は、完全性やエラスチンに関連している架橋量及びコラーゲン素材の力学的完全性における役割を果たす弾性線維網について、定量化されていないことに着目することが重要である。主に椎間板のようなコラーゲン組織の架橋の利益のいくつかは、コラーゲン組織内のエラスチン、弾性線維網、及び、他のタンパク質（リンク蛋白質など）の効果に帰属する。コラーゲン分子及びコラーゲン線維の分子内、分子間及び原線維間の架橋は、劣化、分裂及び変形に対する抵抗性、増加した透過性を含むコラーゲン組織及び関節機構の利益となると同様に、エラスチンが関与するコラーゲン分子及びコラーゲン線維の分子内、分子間及び原線維間の架橋及び弾性線維網は、コラーゲン組織、関節機構及び栄養素摂取に利益を提供する。実際、コラーゲン架橋を増加させる効果の同じ試薬は、エラスチン及び弾性線維網、又は、組織タンパク質に関与する架橋を増加させる。
【０００９】
内因性（天然に存在している−酵素的由来及び酵素によらない加齢）及び外因性のコラーゲン架橋は、コラーゲン（負荷支持組織）の強度及び剛性を増加させる（Ｗａｎｇ  １９９４，  Ｃｈａｃｈｒａ  １９９６，Ｓｕｎｇ  １９９９ａ，Ｚｅｅｍａｎ  １９９９，Ｃｈｅｎ  ２００１）。Ｓｕｎｇ（１９９９ｂ）は、天然に存在している架橋剤（ｇｅｎｉｐｉｎ）が、他の架橋試薬と比較したときに、最大引張り強度及び靭性を増加させることを見出した。ゲニピンは、より一般的に使用される他の架橋試薬と比較して、細胞毒性が有意に低いことも実証されている。粘弾性特性に関して、Ｌｅｅ（１９８９）は、アルデヒド固定がウシの心膜において応力緩和及びクリープを低減することを見出した。近年、天然に存在するコラーゲン架橋は、組織を保護し、且つエネルギーを浪費する「犠牲的結合」を与えると言われている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．２００１）。現在、外因性の架橋の能力がヒステリシスの粘弾性特性を減少させる能力、又は、コラーゲン組織がエネルギーを貯蔵する能力を増加させる能力を有することについて、公知の文献は、存在しない。従って、コラーゲン架橋を増加することによって、脊柱側弯症の脊柱中の椎間板を安定化するための身体自身の努力を高める生化学的方法を見出す必要がある。
【００１０】
椎間板の中央領域中の生物学的活性に対する環境が不良であれば、コラーゲン組織の力学的劣化も起こり得る。劣化した、損傷した又はその他の破壊を受けた組織の回復及び再生において、細胞、サイトカインと呼ばれる特殊なタンパク質、並びに合成及び自然の基質又は骨格を使用することを目的として、ヒト組織工学は、急速に発展しつつある分野となっている。椎間板に関しては、ヒト組織工学のような生物学的解決法は、中程度に変性した椎間板の厳しい無酸素（酸欠）、無血管（存在したとしても、直接的な血液供給は極めて少ない）環境によって妨げられている。椎間板は、主として、日周期の圧力駆動流体流、線維輪を介した拡散及びよく血管新生された脊柱骨に椎間板を接続する軟骨性終板を介した拡散によって、栄養素を受け取り、細胞老廃物を廃棄することが知られている。椎間板の軟骨性終板は、石灰化によって透過性を喪失する一方、椎間板自体は、老化した基質分子及び細胞老廃物が蓄積されることによって動きが妨げられた状態となる。椎間板の透過性のこのような喪失は、椎間板の内部中央領域である髄核内の細胞への栄養素の流動及びその細胞からの老廃物の流動を効果的に減少させる。このような椎間板への栄養の流動の喪失は、細胞機能の喪失、細胞の老化の原因となると共に、ｐＨレベルも下降して、細胞機能がさらに損なわれ、細胞死の原因となることもある（Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒ  １９９５，Ｈｏｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｕｒｂａｎ  ２００１）。Ｈｏｒｎｅｒ及びＵｒｂａｎは、グルコース供給の低下が生存細胞の減少を導くように、栄養上の制約によって、生存細胞の密度が制御されることを示した。Ｂｏｙｄ−Ｗｈｉｔｅ及びＷｉｌｌｉａｍｓ（１９９６）は、基底膜の架橋が、血清アルブミン、架橋されたアルブミン及び４つの異なる分子サイズの一連のフルオレセインイソチオシアネートデキストランなど高分子に対する膜の透過性を増加させることを示した。この中で、椎間板（非常に特異で基底膜より複雑なコラーゲン組織）の線維輪及び／又は終板の架橋の増加は、椎間板の内部領域に存在する細胞へのグルコースや他の栄養上の高分子の流動及び係る細胞からの老廃物の流動を増加させることを示唆されている。
【００１１】
椎間板ヘルニアは、線維輪の亀裂、断裂又は裂傷、後に続く引き裂かれた組織を通って後方又は後側方椎間板の中央部の置換を含む。変形や置換した椎間板の突出は、神経根及び／又は脊髄を圧迫し得る。臨床症状は、背中の痛み、脚の痛みを含む神経根症、座骨神経痛及び筋力低下を含む脱出性の椎間板と関連付けられる。椎間板ヘルニアの治療は、通常、突出した部分の椎間板及び神経及び脊髄の圧迫の疑いがある他の組織の切除から構成されている。椎間板は、線維輪の外側を貫く裂傷の前には、神経要素を強力に圧迫しながら後側に隆起する。約１０年間は、通常、始めに僅かな背中の痛み及び神経根の症状の急性的な発生を分離する。現在、変性、輪裂傷、核移動、ヘルニア及び坐骨神経痛を防止する有用な治療はない。
【００１２】
同様に、新たな核増加又は置換の技術は、転位及び突出又は移植した物質や装置の排除を防止するため、外科的に弱まった線維輪の統合性に頼るものである。これらの物質及び装置は、通常、椎間板変性（Ｇａｌａｎｔｅ  ＨＩＩ）の早い段階で患者のために標的にされる（線維輪の劣化の減少は、これらの移植の成功のための輪保全への依存のためである）。しかしながら、線維輪は、椎間板の中央領域にこれらの物質や装置を移植するために、通常、更に傷つけられる。臨床データは、現時点では、移植片移動や突出がこの種の治療での主な合併症の一つであると示唆している。いくつかの核置換術で突出の高い割合（最も臨床経験がある装置で１０％、他のもので２０〜３０％）が報告されている。従って、核増加や核置換の装置の移植の後又は同時に、輪分裂に抵抗するための方法に対する必要性が存在する。通常の生理的な負荷は、移植された装置や素材を置換したり、椎間板の中央部や核領域へ突出させたり、排除したりすることができる。この結果、輪分裂に対する抵抗性を改善する治療は、優れた椎間板の突出を防止することに有用であると共に、椎間板の増強や核置換の処置に対する補助剤としても有用である。
【００１３】
現在、自然な、変性していないコラーゲン組織に対する力学的な劣化を軽減することができる治療は、存在していない。事実、他のコラーゲン組織疲労の阻害剤は提案されていない。従って、ヒト体内のコラーゲン組織の疲労に対する抵抗性を向上させる方法、その他、ヒトのコラーゲン組織（特に、椎間板の後輪状部領域）の力学的劣化を軽減する方法に対する必要性が存在する。さらに、不自然な椎間板の伸長側（凸状側）に対する適切な領域の治療によって、脊柱側弯症の湾曲の進行や他の進行性の脊髄の変形に対する抵抗性を増加させ、透過性、特に、椎間板の外側領域の水力、高分子透過性及び拡散率を改善させ、更に、椎間板輪の全部又は一部及び椎間板の軟骨性の終板、椎間板輪及び椎間板の中央部分内の細胞への栄養素（例えば、グルコース及び他の栄養上の高分子）の流動、その細胞からの老廃物の流動を向上させる必要性が存在する。
【００１４】
脊柱後弯症の変形を含める椎骨の骨折、椎骨の圧迫骨折に繋がる脊髄の変形は、変形を減少させるための椎骨の高い回復処置（脊柱後弯形成術）に繋がる、脊柱内のスペースへセメントのような素材を注入すること（椎骨形成術）によって、時々、治療される。不自然な椎間板の伸長側の増強性及び改善性の弾性特性によって張力帯抑制を増加させる相補的な処置は、変形の進行と同様に変形の発生を防ぐのに有益である。張力帯特性の改善は、このようにして、脊柱カラムを安定化させ、内部の装置、自然な支えとなる。
【００１５】
本発明のさらなる利点及び新しい特徴の一部が、以下の記述中に記載されており、以下の説明を検討することによって、当業者に明らかとなり、又は本発明の実施によって理解されるであろう。本発明の利点は、添付の特許請求の範囲に具体的に指摘されている手段、組み合わせ、組成物、方法、装置及び適用トレイを使用することによって、実現及び達成することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｂｏｙｄ−Ｗｈｉｔｅ，Ｊ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＪＣ，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ：ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ＡＧＥ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５：３４８−３５３，１９９６．
【非特許文献２】Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒ，ＪＡ，Ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ，Ｓｐｉｎｅ，２０：１３０７−１４，１９９５．
【非特許文献３】Ｃｈａｃｈｒａ，Ｄ，Ｇｒａｔｚｅｒ，ＰＦ，Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｃ  Ａ，Ｌｅｅ，ＪＭ，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｕｎｉａｘｉａｌ  ｓｔｒｅｓｓ  ｏｎ  ｒａｔｅ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１７：１８６５−７５，１９９６．
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ，ＡＣ，Ｔｅｍｐｌｅ，ＭＭ，Ｎｇ，ＤＭ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ＣＤ，ＤｅＧｒｏｏｔ，Ｊ，Ｖｅｒｚｉｊｌ，Ｎ，ｔｅＫｏｐｐｅｌｅ，ＪＭ，Ｓａｈ，ＲＬ，Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｌｔｅｒｓ  ｔｅｎｓｉｌｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ，４７．ｓｕｐ．ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ｐ．１２８，２００１．
【非特許文献５】Ｄｕａｎｃｅ，ＶＣ，Ｃｒｅａｎ，ＪＫＧ，Ｓｉｍｓ，ＴＪ，Ａｖｅｒｙ，Ｎ，Ｓｍｉｔｈ，Ｓ，Ｍｅｎａｇｅ，Ｊ，Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，ＳＭ，ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ，Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｉｎ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｓｃｏｌｉｏｓｉｓ，Ｓｐｉｎｅ，２３：２５４５−５１，１９９８．
【非特許文献６】Ｇｒｅｖｅ，Ｃ，Ｏｐｓａｈｌ，Ｗ，Ｒｅｉｓｅｒ，Ｋ，Ａｂｂｏｔｔ，Ｕ，Ｋｅｎｎｅｙ，Ｃ，Ｂｅｎｓｏｎ，Ｄ，ａｎｄ  Ｒｕｃｋｅｒ，Ｒ，Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｓｃｏｌｉｏｔｉｃ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，９６７：２７５−２８３，１９８８．
【非特許文献７】Ｈｏｒｎｅｒ  ＨＡ．Ｕｒｂａｎ  ＪＰ．２００１  Ｖｏｌｖｏ  Ａｗａｒｄ  Ｗｉｎｎｅｒ  ｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｓｕｐｐｌｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｐｕｌｐｏｓｕｓ  ｏｆｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ．Ｓｐｉｎｅ．２６：２５４３−９，２００１．
【非特許文献８】Ｌｅｅ，ＪＭ，Ｈａｂｅｒｅｒ，ＳＡ，Ｂｏｕｇｈｎｅｒ，ＤＲ，Ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ：Ｉ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｌｄｅｈｙｄｅｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｅｎｓｉｌｅ  ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：４５７−４７５，１９８９．
【非特許文献９】Ｓｕｎｇ，ＨＷ，Ｃｈａｎｇ，Ｙ，Ｃｈｉｕ，ＣＴ，Ｃｈｅｎ  ＣＮ，Ｌｉａｎｇ，ＨＣ．Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ａｏｒｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｆｉｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０（１９）：１７５９−７２，１９９９，（ａ）
【非特許文献１０】Ｓｕｎｇ，ＨＷ，Ｃｈａｎｇ，Ｙ，Ｃｈｉｕ，ＣＴ，Ｃｈｅｎ，ＣＮ，Ｌｉａｎｇ，ＨＣ，Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ  ｆｉｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓ．４７：１１６−１２６，１９９９，（ｂ）
【非特許文献１１】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＪＢ，Ｋｉｎｄｔ，ＪＨ，Ｄｒａｋｅ，Ｂ，Ｈａｎｓｍａ，ＨＧ，Ｍｏｒｓｅ，ＤＥ，ａｎｄ  Ｈａｎｓｍａ，ＰＫ，Ｂｏｎｅ  ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｔｉｍｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｂｏｎｄ  ｒｅｆｏｒｍｉｎｇ  ｔｉｍｅ，Ｎａｔｕｒｅ，４１４：７７３−６，２００１．
【非特許文献１２】Ｗａｎｇ，ＸＤ，Ｍａｓｉｌａｍａｎｉ，ＮＳ，Ｍａｂｒｅｙ，  ＪＤ，Ａｌｄｅｒ，ＭＥ，Ａｇｒａｗａｌ，ＣＭ，Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｒａｃｔｕｒｅ  ｔｏｕｇｈｎｅｓｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｙ  ｎｏｔ  ｂｅ  ｒｅｆｌｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ，ｐｏｒｏｓｉｔｙ，ａｎｄ  ｔｅｎｓｉｌｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｂｏｎｅ，２３：６７−７２，１９９８．
【非特許文献１３】Ｚｅｅｍａｎ  Ｒ．Ｄｉｊｋｓｔｒａ  ＰＪ．ｖａｎ  Ｗａｃｈｅｍ  ＰＢ．ｖａｎ  Ｌｕｙｎ  ＭＪ．Ｈｅｎｄｒｉｋｓ  Ｍ．Ｃａｈａｌａｎ  ＰＴ．Ｆｅｉｊｅｎ  Ｊ．Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｌ  ｓｈｅｅｐ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｕｓｉｎｇ  １，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４６（３）：４２４−３３，１９９９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
ヒトの体内の自然な、変性されてないコラーゲン組織を架橋試薬に接触させることによって、力学的劣化に対するその組織の抵抗性を改善させる方法を提供することが本発明の一つの目的である。
【００１８】
コラーゲン架橋を増加することによって老齢する椎間板を安定化する身体自体の努力を高めることによって、椎間板組織の進行性の力学的劣化を抑える方法を提供することも本
発明の別の目的である。
【００１９】
生きたヒトの体内の組織への架橋試薬の直接接触を促進するために、通常のアルデヒド固定剤に比べて毒性が大幅に低い架橋試薬を使用する方法を提供することも、本発明の別の目的である。
【００２０】
ゲニピン（ゲニポシド）又はプロアンスロシアニジン（バイオフラボノイド）などの適切な濃度の非毒性架橋試薬（又は架橋試薬の混合物）に生きたヒト椎間板組織を直接接触させることによって、変性していない椎間板輪状組織の架橋を増加することが、本発明の別の目的である。
【００２１】
選択した組織中へ、例えば、その湾曲や脊柱の潜在的な湾曲を含んだ椎間板の凸状側への針を用いた直接注入、又は、担体ゲル又は軟膏、若しくは処理が施された膜又はパッチなどの逐次継続放出性送達システムの標的組織中又は標的組織上への直接配置など、非細胞毒性架橋試薬の最小限の浸潤性送達のための治療法を提供することが本発明の別の目的である。
【００２２】
効果的な疲労阻害剤として使用することができる非毒性架橋試薬から構成される組成物も、本発明の別の目的である。
【００２３】
コラーゲン架橋を増加することによって、脊柱側弯症及び力学的に不十分な脊柱中の椎間板を安定化するための身体自身の努力を高める生化学的方法を提供することが、本発明の別の目的である。
【００２４】
脊柱側弯症の湾曲、又は、潜在的或いは進行性の変形に関与する椎間板の凸状又は伸張側に非毒性架橋試薬を注入することによって、脊柱側弯症、又は力学的に不十分な脊柱の変形した関節に変形させる力が適用された後の増加した角度が残っている屈曲ヒステリシス（完全な負荷−除負荷サイクルでのエネルギー損失）を減少することによって、すなわち、変形を増加させる負荷からの「回復」特性を増加することによって、この安定性の増強を生じさせることが本発明の別の目的である。
【００２５】
潜在的な又は進行性の変形湾曲に関与する椎間板の凸状側に非毒性架橋試薬を注入することによって、脊柱側弯症の又は力学的に不十分な又は潜在的に変形した又は変形性の脊柱の屈曲弾性エネルギーの保存及び復帰（弾力性）を増加させることによって、この安定性の増強を引き起こすことが本発明の別の目的である。
【００２６】
潜在的に又は進行性の変形湾曲に関与する椎間板の凸状側に非毒性架橋試薬を注入することによって、脊柱側弯症の又は力学的に不十分な又は潜在的に変形した又は変形性の脊柱の屈曲剛性（変形を増加させる屈曲に対する抵抗性）を増加させることによって、かかる安定性の増強を引き起こすことが、本発明の別の目的である。
【００２７】
コラーゲン架橋を増加させることによって、椎間板の外側領域、線維輪及び／又は、軟骨性終板の透過性、特に、水力、高分子透過性及び拡散率を増大させ、これにより、流体、溶質及び中断している粒子の流動を改善して、輪内の細胞、椎間板の中央領域（即ち、髄核）内の細胞へのグルコース及び栄養性の高分子などの栄養素の流動、及び、細胞からの老廃物の流動を改善することが本発明の別の目的である。
【００２８】
コラーゲン架橋を増加させることによって、椎間板の中央部の細胞の生物学的生存力を強化することが本発明の別の目的である。
【００２９】
コラーゲン架橋の増加によって、椎間板と膝半月板の線維輪などのコラーゲン組織の裂傷抵抗性を増加させることを本発明の他の目的とする。
【００３０】
組織の亀裂及び裂傷への抵抗性を増加させることによって、椎間板核の素材、核の増大、置換材料または装置の排除又は突出を防止することを本発明の他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明は、ゲニピンやプロアンスロシアニジンやバイオフラボノイドなど又は、リボースやトレオースなどの糖類、又は、代謝の副生成物及びグリオキサールやメチルグリオキサルなどの終末糖化産物（ＡＧＥｓ）、又は、リシルオキシダーゼ（ＬＯ）酵素（精製された形状又は組み替えられた形状のどちらか）などの酵素、又は、トランスグルタミナーゼ（Ｔｇａｓｅ）、又は、ＬＯ又はＴｇａｓｅプロモーター、又は、外部支持の必要性を排除すること或いは増大させる脊柱側湾の或いは力学的に不十分な或いは潜在的に変形性の或いは変形性の脊柱の椎間板の安定性を改善するためのエポキシ或いはカルボジイミドなどの非細胞毒性架橋試薬を使用する。好ましくは、架橋試薬は、少なくとも０．００１％（０．０１ｍｇ／ｍｌ）のヒト組み替え型トランスグルタミナーゼ、少なくとも０．０１％（０．１ｍｇ／ｍｌ）の精製された動物性肝臓トランスグルタミナーゼ、少なくとも０．２５％のゲニピン、少なくとも０．１％のプロアントシアニジン、少なくとも１００ｍＭのＥＤＣ、少なくとも１００ｍＭのリボース、少なくとも１００ｍＭのＬ−トレオース、少なくとも５０ｍＭのメチルグリオキサル、少なくとも５０ｍＭのグリオキサール、０．１Ｍの尿素溶液中に少なくとも０．００１％のリシルオキシダーゼのうちから選択される薬剤、又は、その組み合わせを含む。リボース、Ｌ−トレオース、メチルグリオキサル及びグリオキサールのような非酵素的試薬の場合には、その試薬は、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、アミノ酸ヒドロペルオキシド、過ホウ酸塩などの酸化体、又は、重炭酸ナトリウム、リン酸塩などの緩衝剤、又は、いくつかの酸化体及び緩衝剤の組み合わせを含むことが望ましい。更に、前記架橋試薬には、担体媒体中の架橋剤が含まれる。
【００３２】
力学的劣化に対するコラーゲン組織の抵抗性を改善させる本発明の方法は、コラーゲン組織の少なくとも一部を有効量の架橋試薬に接触させる工程を含む。架橋試薬と接触するコラーゲン組織は、椎間板の一部又は同類の膝関節間軟骨のような線維状コラーゲン組織であることが好ましい。その組織と架橋試薬との接触は、選択した組織中に針を使用して直接注入することで行なわれる。或いは、その組織と架橋試薬との接触は、ゲル若しくは軟膏、又は処理が施された膜若しくはパッチなどの逐次継続放出性送達システムの標的組織中又は標的組織上への直接配置によって行なわれる。接触は、例えば、浸漬又は散布によってなされ得る。
【００３３】
変形を増加させる屈曲においてエネルギー損失が少ないこと、又は、既存の又は潜在的な変形を増加させる方向での屈曲サイクルにおけるヒステリシスが少ないことは、より大量のエネルギーが貯蔵されたこと及び屈曲前の形状の即座の回復という形態で回復できることを意味する。ヒステリシスが大きいほど、負荷前の形状への回復が遅くなり、従って、変形された関節に対する変形モーメントが増加する傾向が大きくなり（変形が増加することで、変形モーメントが増大する）、従って、変形が増大する傾向が大きくなる。
【００３４】
架橋試薬の注入のための適切な位置は、当業者であれば可能であるように、罹患組織の三次元的回復を使用すること、及び、潜在的な又は進行性の変形又は進行性の脊柱側弯症の湾曲の進行を最大限抑制するためにこれらの試薬の最適な配置を推奨するアルゴリズムとこれらの復元とを組み合わせることで決定される。架橋剤の使用に好ましい位置のこのような三次元的描写は、利用可能な患者の様々な種類の医療画像を取り込む特注コンピュータソフトウェアで製作するのが最善であり、ラップトップコンピュータ又は専門機器などのコンピュータによって駆動される表示装置上に表示するのが最善である。更に、椎間板、又は隣接する骨性組織、被覆組織若しくは靭帯組織上の適切な領域への試薬の使用を促進するために、誘導可能な関節鏡タイプの装置が使用され、又は、開発され、又は、改良され得る。
【００３５】
次いで、本発明は、椎間板（その終板を含む）の外側領域の透過性を改善して、椎間板の中央領域への及び中央領域からの流体及び溶質の流動の増加を与え、これにより、この中央領域中の細胞への栄養素及び該領域からの老廃物の流出を改善させるための非細胞毒性架橋試薬の新規使用にも関する。好ましくは、架橋試薬で連絡されるべきコラーゲン組織は、膝半月板などの椎間板又は同様の線維状のコラーゲン組織の一部である。これらの試薬は、好ましくは、注入されるか、又は、別の方法で椎間板の外側の輪状領域の大部分及び椎間板の上下の終板に適用される。更に、誘導可能な関節鏡タイプの装置は、椎間板上の適切な領域への試薬の使用を容易にするために開発され得る。
【００３６】
本発明によると、組織の裂傷に対する抵抗性を増加させるための組織の治療方法が提供される。本発明は、椎間板ヘルニアに抵抗するための変性した椎間板の治療方法を提供する。また、本発明は、有効な裂傷抑制剤である非毒性架橋組成を提供する。本発明は、椎間板の中央の核領域に移植された素材や装置の移動、排除又は突出に抵抗するための方法を提供する。また、本発明は、組織の裂傷を妨げる又は防止するための膝半月板の治療方法を提供する。
【００３７】
本発明による、裂傷に対するコラーゲン組織の抵抗性を改善する方法は、架橋試薬の有効量と少なくともコラーゲン組織の一部とを接触するステップを含む。好ましくは、架橋試薬と接触するコラーゲン組織は、膝半月板などの椎間板又は同様の線維状のコラーゲン組織の一部である。前記組織と架橋試薬との接触は、選択された組織中への針を使用する直接注入によってなされる。或いは、前記組織と架橋試薬との接触は、ゲル又は軟膏などの逐次継続放出性送達システムの配置、又は、標的組織の中又は上への処理が施された膜又はパッチの直接配置によってなされる。また、接触は、例えば、浸漬又は散布によってもなされる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明によれば、組織の劣化に寄与する有害な力学的負荷環境の組織を治療するための方法を提供する。有害な力学的負荷環境は、疲労の別名で知られる正常な生理的反復負荷、又は、ズレとして知られる正常な持続的若しくは姿勢負荷（典型的に反復性の性質であり、従って、疲労の一形態である）からなる。本発明は、疲労抵抗性を改善させるために、変性した椎間板を治療する方法を提供する。本発明は、有効な疲労阻害剤である非毒性架橋組成物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】後部の椎間板の応力緩和におけるゲニピン架橋治療（Ｇ１＝０．０３３ｇ／ｍｏｌ、Ｇ２＝０．３３ｇ／ｍｏｌ）の効果を示す応力緩和（Ｎ）とサイクル数との関係のグラフ。
【図２】後部の椎間板の硬度又は透過抵抗性におけるゲニピン架橋治療（Ｇ１＝０．０３３ｇ／ｍｏｌ、Ｇ２＝０．３３ｇ／ｍｏｌ）の効果を示すＢｒｉｎｎｅｌＦｓ硬度指数とサイクル数との関係のグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、コラーゲン組織の少なくとも一部を有効量の架橋試薬に接触させる工程を含み、力学的劣化に対するヒト体内のコラーゲン組織の抵抗性を改善させる方法を提供する。本発明の一実施形態において、本発明の方法は、コラーゲン架橋を増加することで老化した椎間板を安定化する身体自体の努力を強化させて椎間板組織の進行性の力学的劣化を減らす方法も提供する。本実施形態において、この力学的劣化は、生理的レベルの反復負荷に応答して生じる。
【００４１】
本発明の架橋試薬は、特に制限されない。実質的に非細胞毒性であり、コラーゲン物質の効果的な架橋物質であることが知られる任意の架橋試薬を使用し得る。前記架橋試薬は、生きたヒト体内組織への架橋試薬の直接的な接触を促進するために、実質的に非細胞毒性であることが必要である。好ましくは、前記架橋試薬は、一般的なアルデヒド固定剤と比べて、十分に低い細胞毒性を示す。より好ましくは、非細胞毒性架橋試薬が使用される。
【００４２】
候補架橋試薬の細胞毒性が最小であることを確認するために、ヒトで使用する前に適切な細胞毒性検査が使用されるであろう。好ましくは、椎間板の繊維状及びゼラチン状組織に近い組織から得られた細胞株を使用する、細胞毒性の組織特異性生体外検査、マウスの結合組織（Ｆ８９５−８４（２００１）ｅ１  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｇａｒ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、又はチャイニーズハムスター卵巣（ＡＳＴＭ  Ｅ１２６２−８８（１９９６）Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌ／Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  Ｇｕａｎｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）に適用される標準形態の組織特異性的生体外検査は、最小の細胞毒性を有することが知られる任意の具体的な架橋試薬の組み合わせの毒性レベルを評価するために実施すべきである。
これらの生体外検査に続いて、ヒトで使用する前に、同様に、生体内動物検査を行うべきである。
【００４３】
架橋試薬は、少なくとも一つの架橋剤を含む。本発明に従って選択された架橋剤が、コラーゲン物質の効果的な架橋物質である。架橋試薬中に使用される場合、有効な架橋物質とは、架橋物質がコラーゲン組織の一部と接触したときに、コラーゲン組織中の架橋の数を増加させるものである。効果的な架橋物質は、治療される組織の疲労抵抗性を改善させ、反復性の生理的負荷から生じる物質特性劣化を減少させ、組織の裂傷に対する抵抗性を増加させ、進行性の変形に抵抗し、組織の透過性を増加させ、又は疲労負荷に起因する治療される組織の粘弾性特性の増加を抑制する。同様に、効果的な架橋物質は、治療される組織の疲労負荷に起因する弾力性−可塑性特性の減少を抑制し得る。
【００４４】
本発明によれば、この方法は、生きたヒト体内組織への架橋試薬の直接接触を促進するために、通常のアルデヒド固定剤に比べて細胞毒性が十分に低い架橋試薬の特有の製剤形態を使用するであろう。ビオフラビノイド及びゲニポシドが最小の細胞毒性を有する効果的な架橋剤であることが示されている。同様に、糖（例えば、リボース又はトレオース）溶液、代謝の副産物、グリオキサールやメチルグリオキサルなどの終末糖化産物（ＡＧＥｓ）は、非酵素的糖化によって産生された架橋（天然に産生された架橋、ペントシジンが一例である）の数を増加させることが示されている。リジルオキシダーゼは、未成熟な及び成熟した内因性の（天然に存在する）コラーゲン架橋の形成に関与する、天然に産生される酵素である。椎間板環状組織の架橋を増加させるために使用される方法には、生きたヒト椎間板組織を、ゲニピン又はプロアンソシアニジン（ビオフラビノイド）、リボース若しくはトレオースなどの糖、代謝の副産物及びグリオキサールやメチルグリオキサルなどの終末糖化産物（ＡＧＥｓ）、リジルオキシダーゼ（ＬＯ）酵素（精製された形態又は組換えられた形態）、トランスグルタミナーゼ（Ｔｇａｓｅ）、ＬＯ又はＴｇａｓｅプロモーター、エポキシ或いはカルボジイミドなどの適切な濃度の最小限の細胞毒性の架橋試薬と直接接触させることが含まれる。好ましくは、架橋試薬は、少なくとも０．００１％（０．０１ｍｇ／ｍｌ）のヒト組み替え型トランスグルタミナーゼ、少なくとも０．０１％（０．１ｍｇ／ｍｌ）の精製された動物性肝臓トランスグルタミナーゼ、少なくとも０．２５％のゲニピン、少なくとも０．１％のプロアントシアニジン、少なくとも１００ｍＭのＥＤＣ、少なくとも１００ｍＭのリボース、少なくとも１００ｍＭのＬ−トレオース、少なくとも５０ｍＭのメチルグリオキサル、少なくとも５０ｍＭのグリオキサール、０．１Ｍの尿素溶液中に少なくとも０．００１％のリシルオキシダーゼのうちから選択される薬剤、又は、これらの組み合わせを含む。リボース、Ｌ−トレオース、メチルグリオキサル及びグリオキサールのような非酵素的試薬の場合には、その試薬は、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、アミノ酸ヒドロペルオキシド、過ホウ酸塩などの酸化体、又は、重炭酸ナトリウム、リン酸塩などの緩衝剤、又は、いくつかの酸化体及び緩衝剤の組み合わせを含むことが好ましい。一つ以上の架橋剤を使用してもよい。
【００４５】
前記架橋試薬は、架橋剤の他に担体媒体を含む。前記架橋剤は、架橋試薬を形成するために担体媒体中に溶解され、又は懸濁される。一実施形態において、架橋剤は、非細胞毒性且つ生体適合性の担体媒体中に溶解される。担体媒体は、組織又は周辺組織への実質的な損傷なしに、生きたヒト体内組織への架橋試薬の接触を媒介するため、実質的に非細胞毒性であることが必要とされる。好ましくは、選択される担体媒体は、水、より好ましくは、生理食塩水である。好ましくは、前記担体媒体のｐＨは、健康な組織環境と同じ又は類似するように調整される。より好ましくは、前記担体媒体は、緩衝化される。本発明の一実施形態では、前記担体媒体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【００４６】
架橋剤が担体媒体中に溶解される場合の担体媒体中の架橋剤の濃度は、特に限定されない。この濃度は、組織の架橋を増加させるのに有効であり、同時に、実質的に非細胞毒性であり続ける任意の量である。
【００４７】
本発明によれば、前記架橋試薬は、天然の変性していないコラーゲン組織の一部と接触される。本明細書において、使用されるコラーゲン組織は、コラーゲンの相当量から構成される身体中の構造支持組織又は負荷支持組織と定義される。例えば、椎間板、関節軟骨、関節間軟骨、線維軟骨、靭帯、腱、骨及び皮膚が含まれる。一般に、架橋試薬と接触されるべきコラーゲン組織の部分は、負荷の影響を受ける組織の部分である。更に、コラーゲン組織に少なくとも幾らかの劣化が起こる場合には、架橋試薬と接触されるべき組織の部分は、少なくとも劣化或いは変形された組織の部分である。好ましくは、負荷の影響を受ける全体部分、又は、劣化或いは変形されている全体部分が、前記架橋試薬に接触される。さらに、負荷の影響を受けるコラーゲン組織の隣接部分も、架橋試薬と接触され得る。
【００４８】
本発明に従って、特に使用可能なコラーゲン組織には、椎間板及び関節軟骨又は膝半月板などの線維軟骨が含まれる。コラーゲン組織が椎間板である場合には、架橋試薬によって良好に接触される椎間板の部分は、後線維輪及び後外側線維輪である。
【００４９】
コラーゲン組織の選択された部分は、非毒性架橋試薬の有効量と接触されなければならない。「有効量」とは、治療される組織の部分に対して力学的な効果を有するのに十分な架橋試薬の量である。具体的には、架橋試薬の「有効量」とは、治療される組織の疲労抵抗性を改善させ、反復性の生理的負荷に起因する物質特性の劣化を減少させ、組織の裂傷に対する抵抗性を増加させ、変形力に対する抵抗性を増加させ、組織の透水率を増加させ、又は疲労負荷による組織の粘弾性特性の増加を低減させ、又は疲労負荷による組織の弾力性−可塑性特性の減少を低減させるのに十分な量である。実施例１，２，３，４及び５に関して本明細書に記載されている、粘弾性検査、裂傷検査、変形抵抗検査、透水率検査、及び／又は弾力性−可塑性検査に従って、有効量が決定され得る。
【００５０】
本発明の方法は、コラーゲン組織の少なくとも一部を有効量の架橋試薬と接触させることを含む。接触は、数多くの方法で実施され得る。好ましくは、コラーゲン組織の接触は、非細胞毒性架橋試薬の最小の侵襲的送達のための手段によって実施される。好ましくは、前記組織と前記架橋試薬との接触は、針を使用して、選択した組織へ直接注入することによって実施される。好ましくは、前記組織と前記架橋試薬との接触は、単一の注入位置又は最小数の注入位置からの注入によって実施される。好ましくは、架橋溶液量は、針及び注射器を用いて、標的とされた組織中に直接注入される。好ましくは、十分な数の注入は、処理すべきコラーゲン組織の部分の全範囲で達成されるように、処理すべき組織の部分に沿って行われる。
【００５１】
あるいは、前記組織と前記架橋試薬との接触は、前記標的組織中又は標的組織上への逐次継続放出伝達システムの直接配置によって実施される。使用し得る一つの逐次継続放出送達システムは、処理が施された膜又はパッチである。試薬含有パッチは、シリンダ中に入れられ、カニューレを通じて組織範囲に経皮的に挿入され、広げられ、生物学的接着又は吸収性固定道具（縫合又は錨）を用いて、標的とされる組織の周辺に接着される。
【００５２】
使用し得る他の逐次継続放出送達システムは、ゲル又は軟膏である。ゲル又は軟膏は、分解可能であり、標的とされる組織の外部に適用され得る粘性の担体である。
【００５３】
接触は、ある量の架橋溶液を関節包又は滑液包中に注入できる浸漬又は散布（関節包内の浸漬又は散布など）によって実施され得る。
【００５４】
コラーゲン組織を支持する負荷の力学的劣化の形態は、前記組織の裂傷を含む。第二実施形態では、本発明は、線維状のコラーゲン組織の処理のための方法及び装置に関する。特に、裂傷に影響されるコラーゲン組織は、椎間板及び膝半月板などの関節軟骨又は線維軟骨を含む。コラーゲン組織が椎間板である場合、架橋試薬によって接触される椎間板の一部は、後部及び後部側方の線維輪であることが好ましい。また、治療される組織が椎間板を含んでいる場合、本発明は、椎間板ヘルニアの防止のための方法と装置に関する。本発明は、椎間板組織の裂傷、特に、髄核物質の排除につながる線維輪の放射状の裂傷を防ぐための従来のアプローチとして使用される。
【００５５】
本実施形態の一側面は、椎間板ヘルニアになる前に、自然な椎間板組織を非毒性架橋試薬に接触させることによって、組織の裂傷抵抗性を改善する方法を提供する。本実施形態は、前記組織に非毒性架橋試薬を接触させることによって、ヘルニアが既に起こっている場合の裂傷抵抗性を改善する方法を提供する。本実施形態のもう一つの側面は、半月板の部分的な裂傷の後の自然な膝半月板組織の裂傷抵抗性を改善する方法を提供する。また、本実施形態は、半月板の裂傷の前の自然な膝半月板組織の裂傷抵抗性を改善する方法を提供する。
【００５６】
本実施形態では、有効量の架橋試薬は、標的組織、好ましくは、裂傷が多く起こることが知られている組織の領域で、架橋を形成する量である。椎間板組織の場合では、治療は、裂傷に対する抵抗性が椎間板ヘルニアの防止のために増加されるように、線維輪の後部及び後外側領域にあるのが好ましい。膝半月板組織の場合では、組織は、既存の部分断裂の領域及び半月板組織の周囲で治療されることが好ましい。また、膝半月板組織は、全体が治療されることが好ましい。中間の関節間軟骨だけ又は側部の関節間軟骨だけが影響を受けるなら、中間の、そして、側部の関節間軟骨を扱うことができます。また、一方の膝の半月板組織が影響を受けるなら、反対側の膝の半月板組織で架橋治療をするかもしれない。
【００５７】
好ましくは、本実施形態に従った方法は、適切な濃度の非毒性架橋試薬を適切な組織に接触させるために、一連の注入のような、非細胞毒性架橋試薬の最小限の侵襲的送達によって、罹患した椎間板、膝半月板組織、軟骨性組織、骨性組織、関節包組織又は靱帯組織に対して使用する。本発明のこの面は、これらの組織の進行中の裂傷及び劣化を防ぐため、及び椎間板の場合には、その後の椎間板ヘルニアを防ぐための従来のアプローチにおいて使用される。
【００５８】
好ましくは、本実施形態に係る治療方法は、標的組織中又は標的組織上への逐次継続放出送達システム（埋め込まれた小丸薬又は逐次継続放出カプセル、又は処理が施された膜若しくはパッチなど）の直接配置など、非細胞毒性架橋試薬を最小限の侵襲的送達のための手段を取り込む。更に、椎間板、又は膝半月板、又は隣接する軟骨性組織、骨性組織、関節包組織或いは靭帯組織上の適切な領域への試薬の使用を促進するために、誘導可能で関節鏡タイプの装置が開発され得る。本発明のこの側面は、これらの組織の裂傷及び劣化を防ぐために、及び椎間板の場合には、その後の椎間板ヘルニアを防ぐために従来のアプローチにおいて使用される。
【００５９】
第３実施形態では、本発明は、核置換又は核増加タイプの処置を組み合わせたその後の
半月板の治療のための方法及び装置に関する。髄核置換又は髄核増大の技術は、移動及び突出の防止、又は移植された素材や装置の排除のために外科的に弱められた線維輪の保全による。本発明は、核増加装置又は核置換装置の移植の後又は同時の輪裂傷に抵抗するために使用される。本発明は、移植された素材の突出を防止するために注入可能な核置換又は核増加の材料が架橋試薬と結合されるようにする方法と装置を提供する。本実施形態は、椎間板及びの中央領域への架橋試薬の送達を伴い、架橋試薬に直接接触しているより中央の組織輪と共に架橋の完全な進行を引き起こす。或いは、本発明は、核置換又は核増加の手順としてほとんど同時に行なわれた線維輪の別々の架橋治療を提供する。或いは、本発明は、核置換又は核増加の処置を行なった線維輪の架橋治療を提供する。また、本発明は、核素材又は核装置の移植前の線維の治療を提供する。
【００６０】
本実施形態において、有効量の架橋試薬とは、標的組織、好ましくは、核置換移植素材又は核置換移植装置を囲む線維輪のすべてで、また、好ましくは、移植の外科的な導入で形成された欠陥を囲む領域で、また、好ましくは、軟骨脊柱終板、関節包及び靱帯組織を含む周囲の組織で、裂傷に対する繊維輪の抵抗性が高まるように架橋を形成する量である。
【００６１】
好ましくは、本実施形態の方法は、非細胞毒性の架橋試薬の最小限の侵襲的送達を使用する。最小限の侵襲的送達は、適切な濃度の非毒性架橋試薬を適切な組織に接触させるために、核置換や核増加の処置を受けたか、受けるか、受け取るであろう椎間板又は椎間板に隣接した標的組織への一連の注入を含む。本発明のこの面は、核置換装置又は核置換素材の移植の前後の線維輪の更に深刻な裂傷を防ぐために、また、移植素材や装置の移動、又は排除、又は突出を防ぐために従来のアプローチにおいて使用される。
【００６２】
他の最小限の侵襲的送達は、埋め込まれた小丸薬、又は逐次継続放出カプセル、又は処理が施された膜、又はパッチなどの逐次継続放出送達システムの標的組織中、又は標的組織上への直接配置を含む。更に、椎間板、又は隣接する軟骨性組織、骨性組織、関節包組織或いは靭帯組織上の適切な領域への試薬の使用を促進するために、誘導可能で関節鏡タイプの装置を開発することができる。本発明のこの面は、核置換装置又は核置換素材の移植の前後の線維輪の更に深刻な裂傷を防ぐために、また、移植素材や装置の移動、又は排除、又は突出を防ぐために従来のアプローチにおいて使用される。
【００６３】
本発明の第４実施形態は、脊柱側湾症の脊柱、又は、リスタティック脊柱などの力学的に不十分な又は潜在的に変形した他の脊柱（少なくとも一部分が部分的に滑っている椎間板を含む）における椎間板を安定させる椎弓切除術などの神経の減圧法、又は後の脊柱計装導入に従う身体自身の努力を高める方法及び装置を提供する。椎間板に対する力学的劣化の形態は、脊柱の進行性の湾曲の一部として起こる。例えば、脊柱側弯症における脊柱湾曲進行は、脊柱の断片の負荷のない湾曲の増加に関わる。この湾曲の増加に伴って、脊柱に対する、重力によって誘導された屈曲モーメントも付随して増加し、既に罹患したこれらの関節の湾曲を増加させるように作用する。これは、持続した又は静止したタイプの負荷と考えることもでき、負荷の期間は、日々の直立活動の期間に等しいが、脊柱側弯症の湾曲の進行に関連した「反復的」又は疲労負荷は、日々の重力による負荷、及び受動的、能動的な筋肉及び結合組織によって作動される負荷と、何日にもわたって脊柱に与えられるそれらの有効モーメントとから構成される。変形が増加すると、「モーメントアーム」（与えられた力がモーメントを生成する距離）が増加するにつれて変形モーメントが増加する。脊柱側弯症の支持及び他の脊柱変形の支持の基礎を成す論拠は、これらの変形力及びモーメントに抵抗して、骨及び結合組織中の細胞の負荷環境に影響を与えること、及び湾曲の進行に抵抗することである。本発明は、脊柱の進行性の湾曲を防ぐために、従来のアプローチにおいて使用することが可能であり、残りの椎間板を矯正の喪失に対して安定化するための矯正手術に対する補助として使用することができる。本発明は、単独で、又は外部支持と共に使用することができる。
【００６４】
本実施形態の一側面は、脊柱側弯症脊柱中の椎間板組織を一又は複数の非毒性架橋試薬と接触させることによって、脊柱側弯症、又は力学的に不十分な、或いは潜在的に変形した、或いは変形している、脊柱すべり症（滑った椎間板）などの脊柱中の椎間板組織の安定性を改善させ、湾曲及び滑りの伸長（凸状）側のコラーゲン架橋を増加させる細胞の努力を補助する方法を提供する。
【００６５】
本実施形態において、有効量の架橋試薬とは、好ましくは、脊柱の湾曲又は潜在的な脊柱の湾曲の先端又は先端付近にある椎間板の凸状側で、変形を増加させる屈曲ヒステリシスの少なくとも一つが減少され、弾性エネルギーの保存と返還が増加され、変形増加屈曲剛性が増加されるように標的組織に架橋を形成する量である。
【００６６】
好ましくは、本実施形態に係る方法は、適切な組織を、適切な濃度の非毒性架橋試薬と接触させるために、罹患した椎間板及び隣接する骨、関節包または靭帯組織の伸長（凸状）側への、一連の注入などの、非細胞毒性架橋試薬の最小限の侵襲的送達を使用する。注入のための適切な位置は、既存の技術で可能であるように、罹患組織の三次元的描写を使用し、進行性の脊柱の湾曲の進行を最大限抑制するために、これらの試薬の最適な配置を推奨するアルゴリズムとこれらの復元を組み合わせて、決定される。架橋剤の使用に好ましい位置のこのような三次元的描写は、患者の医療画像を取り込む特注のコンピュータソフトウェアで製作されるのが最善であると共に、ラップトップコンピュータ又は専門機器などのコンピュータによって駆動される表示装置上に表示するのが好ましい。本発明のこの側面は、脊柱側弯症の脊柱の継続的湾曲、及び他の進行性の変形を防ぐために、従来のアプローチにおいて使用され、残りの椎間板を矯正の喪失に対して安定化するための矯正手術に対する補助として使用される。
【００６７】
好ましくは、本実施形態に係る治療方法は、標的組織中又は標的組織上への逐次継続放出送達システム（埋め込まれた丸薬又は逐次継続放出カプセル、又は被処理膜若しくはパッチなど）の直接配置など、非細胞毒性架橋試薬を最小限の侵襲的送達のための手段を取り込む。更に、椎間板、又は隣接する骨性組織、関節包組織又は靭帯組織上の適切な領域への試薬の使用を促進するために、誘導可能な関節鏡タイプの装置が開発され得る。
本発明のこの側面は、脊柱の継続的湾曲を防ぐために、従来のアプローチにおいて使用され、残りの椎間板を矯正の喪失に対して安定化するための矯正手術に対する補助として使用される。これは、単独で、又は外部支持と共に使用される。
【００６８】
椎間板の中央部分への拡散の減少は、椎間板中の細胞機能の喪失及び椎間板の劣化と強い関連がある。この拡散能力の喪失は、椎間板の軟骨性終板（上及び下）の線維輪及び椎間板の外側領域の線維輪の両方に作用する。本発明の第５実施形態は、コラーゲン組織の透過性、及び架橋試薬の１つ又は１つ以上の使用によるコラーゲン架橋の増加による栄養素の流動をサポートするための負荷を増加させる方法及び装置を提供する。本発明は、椎間板の外側領域（線維輪及び／又は軟骨性終板）の架橋の増加によって作用される椎間板の中央領域中及び中央領域外（即ち、髄核）への流動の増加を示すように、椎間板の様々な領域の水分補給の変化を増加させる。架橋による変化は、椎間板の外側領域の水力学的透過性を増加させ、椎間板の中央領域への及び中央領域からの溶質移動を増加させる。本発明は、膝半月板組織の外側領域の水力学的透過性を増加させ、膝半月板の内側領域への又は内側領域からの溶質運送を増加させる。
【００６９】
本実施形態の一側面は、コラーゲン架橋を増加させることによって、椎間板の外側領域（線維輪及び軟骨性終板）の透過性を増大させ、これにより、椎間板の中央領域（即ち、髄核）への及び椎間板の中央領域又は髄核からの流体の流動を改善する方法を提供する。
【００７０】
本実施形態の第二の側面は、コラーゲン架橋を増加させることによって、外側椎間板の透過性を増加させ、及び前記中央領域中の細胞への栄養素の流動を増大させるために椎間板の中央領域への流体の流動を増加させ、椎間板の中央領域からの細胞老廃物及び劣化したマトリックス分子の流動を増加させる方法を提供する。
【００７１】
本実施形態の第三の側面は、コラーゲン架橋を増加させることによって、椎間板の中央
領域中の細胞の生物学的生存力、又はサイトカインなどの細胞刺激剤の有効性を増加させる方法を提供する。
【００７２】
本実施形態は、椎間板の中央領域からの老廃産物の流出を改善させながら、椎間板の中央領域への栄養成分の流動を改善する方法を提供する。このような流動の改善は、架橋試薬のこの外側領域への使用によって引き起こされた椎間板の外側領域の透過性の増大によって引き起こされる。本実施形態は、膝半月板の中央領域への栄養素の流動を改善しながら、中央領域からの老廃物の流出を改善する方法を提供する。
【００７３】
本実施形態に係る方法は、一連の注入や、標的組織中若しくは標的組織上への埋め込まれた丸薬又は逐次継続放出カプセル、又は処理が施された膜若しくはパッチなど逐次継続放出送達システムの直接配置などの非細胞毒性架橋試薬の最小限の侵襲的送達を使用する。更に、適切な標的領域への試薬の使用を促進するために、誘導可能な関節鏡タイプの装置が開発され得る。これらの送達方法は、外側領域（即ち、椎間板輪又は半月板輪）の架橋治療によって、椎間板又は半月板の中央領域への流体の流動、溶質移動、栄養素の供給及び老廃物の除去を増加させるための従来のアプローチにおいて使用される。これらの送達方法は、移植又は他の方法で治療された細胞の生存力を改善するための、椎間板及び半月板の生物活性の増加に作用させるための椎間板のヒト組織工学治療に不可欠な補助として機能する。ヒト組織工学治療、及び細胞又はサイトカインが基礎となる方法は、幾つかの派生（内因性又は外因性、胎芽性又は非胎芽性、筋由来、脂肪由来など）の幹細胞の移植、増殖因子の遺伝子治療送達、付着増殖要素があるマトリクスの移植、増殖因子の直接利用、移植組織又は移植細胞の移植、異種移植組織又は異種移植細胞の移植、椎間板又は半月板中の生物活性の増加を促進することを含む。さらに、これらの送達方法は、椎間板、髄核、又は膝半月板の中央領域への拡散を増加させる目的でヒト組織工学タイプの治療が使用されない場合に、使用されるであろう。
【００７４】
ここで治療された方法及び組成物は、力学的劣化に対するヒト体内のコラーゲン組織の抵抗性を恒久的に改善させる必要はないことを銘記すべきである。人が一日当たり２〜２０回の垂直前方屈曲を経験すると仮定すると、コラーゲン組織の架橋試薬との接触に付随して増加された疲労、変形及び裂傷に対する抵抗性、及び透過性の増加は、時間が経過するにつれて減少する。しかしながら、好ましくは、疲労、変形及び裂傷に対して増加された抵抗性、及び透過性の増加は、生理的な力学的劣化なしに、数ヶ月から数年の期間にわたって持続する。このような状況下では、疲労、変形、裂傷に対する増加された抵抗性、及び増加された透過性を維持するのに十分な期間で上述の治療を繰り返すことが可能である。上記仮定を用いると、前記接触は、疲労、変形、裂傷に対する増加された抵抗性、及び増加された透過性を維持するために、周期的に繰り返される。幾つかの治療については、接触の間隔は、ある１個人の約１年に相当すると推定される。従って、単一の治療又は繰り返しの注入／治療を用いて、本発明の方法は、長期間にわたって、コラーゲン組織の力学的劣化を最小限に抑える。
【００７５】
本発明の別の側面は、椎間板の安定化を改善するため、力学的劣化に対するコラーゲン組織の抵抗性を改善するため、椎間板の透過性を増大させるため、椎間板への及び椎間板からの流体の流動を改善するため、並びに椎間板中の細胞の生物学的生存力を増加させるため、装置又は「試薬及び使用トレイ」として上記架橋剤を使用することに関する。「試薬及び適用トレイ」は、無菌であり、無菌のパッケージ内に収容される。必要且つ適切で、予め測定された試薬、溶媒及び使い捨て送達装置の全ては、適切に包装された無菌「試薬及び適用トレイ」を収容する外部パッケージの中に一緒に梱包される。試薬、溶媒及び送達装置を収容するこの無菌トレイは、内表面上が無菌であるプラスチックケース中に収容される。このトレイは、適切な使用位置を示唆するために必要とされるコンピュータハードウェア及びソフトウェアパッケージとは分離して入手可能にされる。
【実施例】
【００７６】
＜実施例１及び２＞
生後４ヶ月のウシの脊柱１０本から、３３の腰部椎間関節を得た。この椎間関節は、未処理対照−１２試料、ゲニピン処理１（Ｇ１）−６試料、ゲニピン処理２（Ｇ２）−１３試料という３つのグループに無作為に分けられた。Ｇ１処理では、０．０３３％濃度のゲニピンを加えたＰＢＳ中に、試料全体が７２時間浸漬された。同様に、Ｇ２処理では、０．３３％濃度のゲニピンを加えたＰＢＳ中に、試料全体が７２時間浸漬された。ＰＢＳ中の０．３３％のゲニピンは、１０倍のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）５０ｍＬを蒸留水で１０倍に希釈して、５００ｍＬ（５００ｍｇ）のＰＢＳとし、ゲニピン１．６５ｇ中に混合して、０．３３％（ｗｔ％、ｍｇ／ｍｇ）溶液を得ることによって作製された。心膜及び腱組織試料を用いた以前の試験には、組織を架橋することによって、組織膨潤（組織の中への水の浸透圧流入）の減少が実証された。幾つかの対照は、疲労試験の前に、浸漬されなかった。他の対照は、生理食塩水の溶液中に、７２時間浸漬された。浸漬されたゲニピンと０．９％生理食塩水の浸漬された対照との間で、外側輪の水和が等しいことを確定するために、水塊喪失実験が行われた。処理の選択は、脊柱及びレベルによって無作為化された。次いで、力学的試験を容易にするために、試料の脊柱末端がポリウレタン中に入られた。
【００７７】
圧痕試験及び圧縮／屈曲疲労のサイクルは、表１に示されている順序で実施された。
【００７８】
【表１】
2010520235.tif 000003
【００７９】
負荷計画中の所定の時点で、以下のように粘弾性的特性を明らかとするために、圧痕試験が使用された。応力緩和データは、直径３ｍｍの半球形圧痕装置を１０Ｎになるように傾斜負荷し、その後、生じた応力の減少（応力緩和と称される）を記録しながら、６０秒間変位を維持することによって集められた。圧痕試験は、傾斜負荷データから得た硬度指数（圧痕に対する抵抗性）を計算することによって、弾力性−可塑性特性を決定するためにも使用された。硬度測定値を記録する前に、組織に１０回圧痕が繰り返された（６０秒／サイクル、最初の１０Ｎ負荷での変位に対する）。
【００８０】
この試験プロトコルは、２つの原理に基づいている。第１に、粘弾性効果は、反復負荷と共に、漸近的に減少する。第２に、硬度測定値は、組織の負荷歴に対して敏感に反応する。しかしながら、この効果は、１０回の負荷サイクルの後に、無視できる。これらの効果を最小限に抑えるために、予め圧痕されていない組織から、粘弾性データ（応力緩和）が集められた。交互に、反復して負荷がかけられた（前処理が施された）組織から、弾力性−可塑性データ（硬度）が集められた。この場合、反復圧痕は、変化する粘弾性特性の硬度測定に対する望ましくない効果（即ち、反復性の欠如）を減らすことを意図された。これらの試験の手順は、負荷歴及び位置の変更を伴う測定の反復性に対するいくつもの予備実験から得られた。
【００８１】
最初の圧痕試験の後、試料に２００Ｎ、３０００サイクル、０．２５Ｈｚの速度で屈曲−圧縮の反復性の負荷が与えられた。その負荷は、横断面中の試料の中間点に対して４０ｍｍ前方の位置で、横断面に対して垂直に与えられた。疲労サイクルに続いて、圧痕試験データの２巡目が集められる。この手順は、２つの疲労負荷サイクルのために行なわれた。全ての試験の間、試料の水分含有量を維持するために、生理食塩水で湿らせたガーゼにこの試料は包まれた。疲労サイクル及び非破壊的圧痕試験は、ＭＴＳ  Ｔｅｓｔ  Ｓｔａｒデータ収集システムを備えた、ＭＴＳ８５８．０２  二軸、卓上、１０ｋＮ能サーボ水圧式物体試験ステーション（ＭＴＳ，Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｒｉｅ，ＭＮ）上で行われた。幾つかの統計的指標は、結果の有意性を評価するために計算された。処理及び疲労サイクルの数に起因する効果を確認するために、入れ子式二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）が使用された。データの性質がノンパラメトリックなので、処理が、１）組織の前サイクリングの力学的パラメータに影響しなかった、又は２）疲労負荷に起因する、弾力性−可塑性及び粘弾性力学的パラメータの変化（劣化）の量に影響しなかったという帰無仮説を評価するために、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙのノンパラメトリック順位和検定が使用された。統計的有意性に対する信頼レベルは、ｐ＜０．０５に設定された。
【００８２】
入れ子式二元配置分散分析によって、粘弾性（応力緩和）力学的パラメータ及び弾力性−可塑性（硬度）力学的パラメータの両方が、疲労サイクル及び処理タイプによって、独立した影響を受けることが決定された。これらの統計結果は、表２に示されている。
【００８３】
応力緩和試験の結果は、図１にグラフで示されている。
【００８４】
架橋処理によって、応力緩和曲線の最初のシフトの下降が引き起こされた。応力緩和が高いほど、より激しく劣化した組織が付随するので、これは、有益な効果を表しているであろう（Ｌｅｅ  １９８９）。Ｇ１及びＧ２処理群の最初の前疲労緩和は、対照の前疲労緩和より、それぞれ２６％及び１９％低かった（ｐ＝０．００９及びｐ＝０．０２６）。６０００回の非外傷性負荷サイクル後の応力緩和の変化によって実証されたところによると、疲労抵抗性も劇的に改善した。Ｇ２処理された椎間板に対する６０００回の疲労サイクルに起因する応力緩和の変化は、対照における変化の１／３未満であった（ｐ＝０．０４４）。しかしながら、これより低い濃度のゲニピンは、同様の疲労抵抗性の改善をもたらさなかった。
【００８５】
硬度試験の結果は、図２にグラフで示されている。Ｇ２架橋処理によって、硬度データの初期シフトの上昇が、引き起こされた。硬度の喪失が組織中の構造的完全性の喪失を示唆するように、これは、有益な効果を表す。Ｇ２処理群の当初の疲労前硬度は、対照群より１７％大きかった（ｐ＝０．０２６）。しかしながら、この有益な効果は、３０００回の疲労サイクルの前に徐々に損なわれるようであり、３０００回と６０００回のサイクルの間の、硬度の変化は、２つの群で実質的に同じである（Ｇ２＝−０．９４、対照＝−１．０１）。
【００８６】
【表２】
2010520235.tif 000004
【００８７】
上記データは、反復性の非外傷性負荷に起因する、椎間板組織の弾性的及び粘弾性的な力学的負荷を定量化する。これらの実験の結果は、非毒性架橋試薬がコラーゲン組織（即ち、椎間板）中の物質特性の疲労関連の負荷を減少することを立証する。０．３３ｇ／ｍｏｌ濃度のゲニピン中のウシ椎間板組織を浸漬することによって、粘弾性的劣化の１／３を超える減少がもたらされた。試験される処方は、弾性的な力学的特性（硬度）の改善を３０００回の試験サイクルまで維持することができなかった。
【００８８】
平均的なヒトが、その脊柱円板に対する同等量の損耗を経験するのに要する時間を正確に推測することが困難である。確かに、記載した試験によって課される力学的劣化に加えて、試験環境に起因するこれらの死亡した組織の（自然的な）劣化が存在する。負荷が与えられなかった対照は、物質特性のこのような「自然的な」劣化が僅かであることを示した。試験を通じて試料を湿った状態に保ち、負荷頻度を加速することによって、この自然的な劣化を最小限に抑える手段が取られた。同時に、負荷頻度は、組織の過熱を防ぐために生理的な限界以内に保たれた。これらの手段は、死後組織の生体外の力学的試験に対する標準的なプロトコルに寄与することに留意すべきである。ヒトが、直立、前方屈曲を一日に２〜２０回経験すると仮定すれば、これらのデータは、概ね、数ヶ月から数年の生理的な力学的劣化に対応する。
【００８９】
記載した処理は、この負荷規模で、例えば、３０００回の疲労サイクルによって相当する期間で反復することができた。上記仮定を使用すると、このサイクル数は、幾つかの個体に対する約１年に相当すると推定することができる。従って、単一の処理又は反復注入／処理を用いて、個体は、長期間にわたって、それらの椎間板の力学的劣化を最小限に抑えることができ得る。別の選択肢は、直接に適用される処理されたパッチ、ゲル又は軟膏などの逐次継続放出送達システムを含むであろう。
【００９０】
＜実施例３及び実施例３ａ＞
処理前と比較して、組織の側方屈曲安定性に影響させるために、細胞毒性が最小である公知の架橋試薬の様々な処方を椎間板輪状組織に片側だけに適用する効果を評価する実験が行なわれた。
【００９１】
実験では、それぞれの断片が３つの腰部椎間関節（運動断片）、４つの椎骨及び介在する３つの椎間板から構成される５つのウシ脊柱断片を使用した。その茎は、切断され、後方突起が除去された。その断片は、０．３３％がゲニピン架橋された群の重量、０．５％がゲニピン群、０．６６％がゲニピン群、及び０．６６％がゲニピン＋０．１％プロアンソシアニジン群へと無作為に分割された。
各群は、１つの３運動断片試料からなる。処理前の各脊柱は、それ自体の対照として使用された。測定の反復可能性を決定するために、幾つかの非処理試料及び処理試料に対して反復試験が行われた。文献に報告された特定の組織の細胞毒性に基づいて、細胞毒性が最小の公知の架橋試薬の適切な濃度と組み合わせがさらに選択された。この点で、糖溶液（リボース及び１トレオース）、代謝の副産物（メチルグリオキサル及びグリオキサールなど）及び自然に生じる酵素（リジルオキシダーゼ及びトランスグルタミナーゼなど）は、本質的に非細胞毒性であると予想される。組織劣化を防ぐために適切な無菌操作及び抗生物質を用いて、新鮮な非凍結動物組織に対して同様の試験が行われる。非酵素的糖化架橋を誘導するために、無菌培養の期間中、新鮮な椎間板の中に糖溶液が片側性に注入される。
【００９２】
４点側方屈曲試験は、負荷及び変位をデジタルに記録しながら、特注の固定具を有するＭＴＳ  ８５８物質試験システムを用いて行われた。まず、この試料は、筋肉及び他の無負荷支持組織が除去された後、末端の椎骨は、四角形の型中の高さの半分までポリエチレン中に入られた。次いで、脊柱の側方が垂直面に配置されるように、容器に入れた前記脊柱断片は、底の２つのローラー上に置かれた。屈曲負荷は、中央の２つの断片の椎骨と接触した２つの上方ローラーによって作動された。ローラー上での試料の処理前及び処理後の位置が同様に確保されるように、注意を払った。４点屈曲の属性として、試験試料の中央領域（２つの上方ローラー間の中央椎間板を含む）は、均一に分配された剪断負荷及び屈曲モーメントを有する。１００Ｎ（０．５ｍｍ／ｓ）までの傾斜負荷は、処理の前及び架橋処理後の両方の各脊柱への右及び左側方屈曲に適用された。
【００９３】
架橋試薬は、脊柱の一方の側方へ２〜３の注入を行うことによって、各脊柱試料中の各椎間板に送達された。各注入は、１ｃｃの試薬から構成された。２６ゲージの皮下針を使用した。処理された前記断片は、最終試験の前に、湿ったペーパータオル中に包まれて閉じた容器中に３６時間放置された。試験後、試薬によって接触された組織の領域を視覚的に立証するために、椎間板は、横に切断された。
【００９４】
側方屈曲及び側方屈曲安定性に対する抵抗性は、２つの措置（一方は弾力性−可塑性、他方は粘弾性）によって評価された。第１は、０．１〜１００Ｎの変形力での変形量によって明らかとされる中立ゾーン（低負荷）屈曲剛性である。第２は、組織によって失われ又は貯蔵されなかったヒステリシス又は屈曲エネルギーであった。貯蔵され及び変換された歪みエネルギー又は屈曲エネルギーの量と比較して、ヒステリシスが小さいほど、又はヒステリシスのパーセンテージが低いほど、変形された位置に残らず、屈曲から回復する大きい能力に対応する。それは、より粘性の高い反応と比較して、より弾力性があり、バネのような反応をすることも反映する。
【００９５】
注入は、椎間板輪の約半分（右半分又は左半分）に架橋試薬を効果的に分配した。表３を参照。中立ゾーンの屈曲剛性は、処理された側が引っ張られた状態にあるときのみ、処理によって一貫して増加した。剛性増加の平均規模は、１２％であり、０．１％のプロアンソシアニジンを加えた０．６６％ゲニピン処理の場合には、２６％増加した。ヒステリシスは、処理された側が引っ張られた状態にあるときのみ、処理によって一貫して減少した。ヒステリシスの平均減少は３１％であり、０．１％のプロアンソシアニジンを加えた０．６６％ゲニピン処理の場合には、３７％減少した。
【００９６】
【表３】
2010520235.tif 000005
【００９７】
これらの結果は、最小限の非毒性架橋試薬による架橋増強は、脊柱側弯症の脊柱において予想されるような変形力に対する椎間板の不安定性を効果的に軽減することを示している。安定化効果は、０．１％プロアンソシアニジンを加えた０．６６％ゲニピン処理で、より大きいことが観察された。従って、屈曲エネルギーの粘弾性損失を減少させ、及び椎間板の回復を増加させる（ヒステリシスを低くする）ことによって、並びに脊柱の処理される側を引っ張られた状態に置く方向で屈曲剛性を増加させることによって、注入可能な非毒性架橋増加が、効果的に、他の進行性の脊柱変形と同様に、脊柱側弯症の屈曲の進行に抵抗する。
【００９８】
＜実施例４＞
浸漬期間の前後で、椎間板の異なる領域（髄核、内側輪及び外側線維輪）の水和状態の変化を測定することによって、持続的な圧縮負荷、及び再浸漬、異なる領域への流体の流動及び異なる領域からの流体流動が決定される。対照椎間板と、最小限の細胞毒性を有することが知られている架橋試薬で処理された椎間板との間で、これらの測定を比較することによって、本発明者らは、流体の流動及び透過性に対する架橋処理の効果を認めた。
【００９９】
合計２４のウシ（生後４ヶ月のウシ）の椎間板は、本研究のために使用された。椎間板組織の３つの異なる領域（髄核、内側線維輪及び外側線維輪）の水分含有量が試験された。水和状態の変化は、微量天秤（感度０．１ｍｇ）を用いて試料を秤量することによって測定した。水分含有量（Ｍ）は、以下のようにして計算した。
Ｍ＝（湿潤重量−乾燥重量）／湿潤重量＝ｇ（Ｈ２Ｏ）／ｇ（湿潤重量）
【０１００】
乾燥手順は、９０℃の温度に制御されたオーブン中に、試料を２４時間置くことからなる。
【０１０１】
試料は、４つの試験に分割された。
【０１０２】
１．グループＡ：３つの試料がこのグループに属した。これは、対照グループとしての役割を果たした。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中に試料を１日間浸漬した後、水和分析が行われた。
【０１０３】
２．グループＢ１：４つの試料がこのグループに属した。１日間のＰＢＳ浸漬に加え、対照より２日多く、試料をＰＢＳ中に浸漬した後、水和分析が行われた。
【０１０４】
グループＢ２：５つの試料がこのグループに属した。１日間のＰＢＳ浸漬に加え、０．３３％のゲニピン溶液中に試料が２日間浸漬された後、水和分析が行われた。
【０１０５】
３．グループＣ、一定した昼間の少量の圧縮負荷（ずれ）をシミュレートした。
【０１０６】
グループＣ１：３つの試料がこのグループに属した。試料は、ＰＢＳ中に３日間浸漬された後、素材試験機によって、７５０Ｎの圧縮を１時間与えた。椎間板は、前記素材試験機の負荷ラムに付けられた２つのローラーによって生じる５度の屈曲姿勢で圧縮された。水和分析は、クリープ負荷の直後に行われた。
【０１０７】
グループＣ２：３つの試料がこのグループに属した。試料は、１日間のＰＢＳ浸漬後に、０．３３％のゲニピン溶液中に２日間浸漬され、７５０Ｎの圧縮負荷で同一のクリープ負荷が行われた。水和分析は、クリープ負荷の直後に行われた。
【０１０８】
４．グループＤでは、ヒトが横になった姿勢の際に、夜間に通例的に起こる圧縮負荷の期間後における水の吸収がシミュレートされた。
【０１０９】
グループＤ１：試料は、３日間ＰＢＳ溶液中に浸漬された後、１時間の７５０Ｎのクリープ負荷が与えられた。クリープ負荷の後、試料は、１  ＰＢＳの入った容器中に、さらに１日配置された後、水和分析が行われた。
【０１１０】
グループＤ２：３つの試料が含められ、ＰＢＳ浸漬の１日後に、０．３３％ゲニピン溶液中に２日間浸漬された。次いで、１時間の７５０Ｎのクリープ負荷が与えられた。試料は、さらに１日間ＰＢＳ中に配置され、続いて、水和分析が行われた。
【０１１１】
表４を参照。一般に、クリープ負荷は、流体を組織から放出させ、クリープの後、流体の再吸収が起こる。本発明に関する結果は、ゲニピン架橋試薬で処理された椎間板中の中央核領域中への流体の流動及び中央核領域からの流体の流動が対照に比べて、計６４％の増加があるというものであった。
【０１１２】
【表４】
2010520235.tif 000006
【０１１３】
これらの結果は、椎間板組織の架橋の増加が、椎間板の中央領域中への流体流動及び中
央領域からの流体流動の増加を生じさせることを実証している。このような椎間板核への流体流動は、細胞及びマトリックス老廃物の除去を増加させたことと同様に、この処理が椎間板の中央領域中の細胞に供給された栄養成分の増加をもたらすことを示す。
【０１１４】
＜実施例５＞
牛の腰（Ｔ１２−Ｌ５）椎間板からの試料を周辺に並べられた１０の線維輪は、２つのグループに分割されて、０．１５ＭのＰＢＳ又は０．１５ＭのＰＢＳに０．３３％のゲニピンを加えた溶液に２日間浸漬された。一軸の素材検査システムに取り付けられた特注の負荷固定具は、既存の正目に置かれた金属シリンダの運動に対して垂直に輪試料を保持するために設計された。そして、シリンダは、外部の層に向かって放射状に（薄層に垂直に）引かれた。時間に依存する力と置換データは、同時に取得された。裂傷抵抗性は、裂傷の領域単位の引き裂きエネルギーによってノーマライズされたピーク力及び試料の厚さによってノーマライズされたピーク力の２つの方法で定量化された。グループ間の違いは、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙのノンパラメトリックテストを使用することで分析された。
【０１１５】
ノーマライズされたピーク力は、対照及びゲニピン架橋グループ（ｐ＝０．０７６）のそれぞれに対して２３．９及び４２．７Ｎ／ｍｍであった。裂傷領域あたりの総エネルギーは、対照及びゲニピングループ（ｐ＝０．０４７，図１）に対して１９．０及び４０．２ｍＪ／ｍｍΛ２であった。
【０１１６】
線維輪の細胞外素材の架橋増加は、ピーク力及び放射状の裂傷を増殖するために必要な総エネルギーを約倍にするのがわかった。線維輪の注入可能な架橋増加は、髄核のヘルニアや核置換装置又は素材の排除を含むか否かに関わらず、椎間板の中央領域の含有量を損失させる劣化負荷を防ぐか、または減速させる。
【０１１７】
＜比較例６＞
背痛の患者の従来の外科的でない治療及び架橋試薬（生理食塩水（０．１５Ｍ）中の４００ｍＭのＬ−トレオースや生理食塩水中に２００ｍＭのメチルグリオキサルを含む溶液や、２００ｍＭのグリオキサールの溶液や、２００ｍＭＥＤＣの溶液や、０．１Ｍ尿素生理食塩水中に５０−１００μｇのリシルオキシダーゼを含む溶液や、生理食塩水中に５０μｇ／ｍｌの人組換え型トランスグルタミナーゼを含む溶液や、生理食塩水中に２００μｇ／ｍｌの精製された動物肝臓トランスグルタミナーゼを含む溶液など）の有効量を罹患椎間板へ注入することによって、椎間板劣化のサインをＭＲＩやレントゲン写真に表示することのうち一つは、最初に実行される。この治療は、悪化した椎間板関節を安定化するため、耐久性（疲労抵抗性）及び罹患椎間板組織の裂傷抵抗性を増加させるため、劣化した椎間板への栄養素の流動及び劣化した椎間板からの老廃物の流動を改善するため、椎間板の再水和作用と椎間板の高さのその後の増加を可能にするため、罹患椎間板を通る負荷伝達を変化させるため、椎間板への更なる退行性変化を防ぐため、正常な荷重負荷による椎間板素材の移動及びヘルニアを潜在的に予防するため、椎間板への外部の神経要素に対する圧力を潜在的に軽減するため、椎間板への神経終末に対する圧力を潜在的に軽減するため、背痛の症状の発生を減少させるため、に実行される。架橋試薬の注入は、医師によって適切に判断されるなら、鎮痛剤やステロイドの標準的な注入を伴うことができる。
【０１１８】
＜実施例７＞
一つは、隣接した椎間板の全部又は一部を架橋試薬（生理食塩水（０．１５Ｍ）中の４００ｍＭのＬ−トレオースや、生理食塩水中に２００ｍＭのメチルグリオキサルを含む溶液や、２００ｍＭのグリオキサールの溶液や、２００ｍＭのＥＤＣの溶液や、０．１Ｍ尿素生理食塩水中に５０−１００μｇリシルオキシダーゼを含む溶液や、生理食塩水中に５０μｇ／ｍｌの人組換え型トランスグルタミナーゼを含む溶液や、生理食塩水中に２００μｇ／ｍｌの精製された動物肝臓トランスグルタミナーゼを含む溶液など）によって治療することによる後の変形や隣接した断片変性を最小にするために脊柱計装導入を受けた患者を治療することができる。外科的な器具の導入後、直ちに又は手術後数日以内に、架橋試薬は、器具を取り付けられたレベルに隣接して椎間板の全体に注入される。選択された組織に架橋試薬を到達させるために、蛍光透視法や他のイメージ手段が使用され得る。時間がかかった場合、多層の胸腰部安定性、劣等性の隣接（後側）腰椎間板は、潜在的な脊柱前弯症の損失を防止するために治療され、そして、優位性は、（頭に向かって）隣接する。単一又は多層融合又は非融合（人口椎間板移植や動的安定性など）の場合、隣接椎間板レベルは、加速された椎間板関節の劣化（隣接椎間板症候群）を防止するために治療される。
【０１１９】
＜比較例８＞
患者がグレードＩ脊柱すべり症（隣接脊柱に関連した一つの椎骨の２５％かより少ない滑り）に悩んでいるなら、従来の外科的な選択肢による、脚の痛みや弱点、又は背痛を含むことにおける神経学的な問題は、神経組織を減圧するために椎弓切除術を行うことを指示する可能性があり、一つは、椎間板の後面、または、変形後の進行を最小にする全体輪への、部分的に「滑った」椎間板への架橋試薬（生理食塩水（０．１５Ｍ）中の４００ｍＭのＬ−トレオースや生理食塩水中に２００ｍＭのメチルグリオキサルを含む溶液や、２００ｍＭのグリオキサールの溶液や、２００ｍＭのＥＤＣの溶液や、０．１Ｍ尿素生理食塩水中に５０−１００μｇのリシルオキシダーゼを含む溶液や、生理食塩水中に５０μｇ／ｍｌの人組換え型トランスグルタミナーゼを含む溶液や、生理食塩水中に２００μｇ／ｍｌの精製された動物肝臓トランスグルタミナーゼを含む溶液など）の注入を含むいくつかの椎弓切除術の処理をされた患者を治療し得る。そのような場合、減圧の処理（椎弓切除術）の前に、又は同時に、又は後に、治療を管理する医師の好みに従って、好ましい、非毒性架橋試薬の複合的な注入が単一の又は複合的な注入場所へ行われる。患者は、数日の活発な運動フォーラムの期間を避けるよう命令されるべきである。架橋処理によって提供された内部安定性は、医師の判断に従った外部の支持などの他の保守的な方法によって増大される。どんな減圧処理の前にも管理されるなら、架橋処理は、潜在的に外科的減圧を含む手術の必要性を避けるように、滑った椎間板の領域の脊柱に安定性を提供する。
【０１２０】
＜実施例９＞
これは、自己幹細胞と架橋処理の移植を含むハイブリッド処理の生体内の動物試験の例である。自己幹細胞を引き出した筋肉細胞は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの４つのグループの力学的に劣化されたラットテールの椎間板の核に注入される。グループの一つは、幹細胞の移植の前に対象とする椎間板へ注入された有効な非毒性架橋試薬（生理食塩水（０．１５Ｍ）中の４００ｍＭのＬ−トレオースや、生理食塩水中に２００ｍＭのメチルグリオキサルを含む溶液や、２００ｍＭのグリオキサールの溶液や、２００ｍＭのＥＤＣの溶液や、０．１Ｍの尿素生理食塩水中に５０−１００μｇのリシルオキシダーゼを含む溶液や、生理食塩水中に５０μｇ／ｍｌの人組換え型トランスグルタミナーゼを含む溶液や、生理食塩水中に２００μｇ／ｍｌの精製された動物肝臓トランスグルタミナーゼを含む溶液など）を有する。他のグループは、幹細胞が移植されるのと略同時に対象とする椎間板に注入された架橋試薬を有する。第３のグループは、幹細胞の移植後の１日目に架橋試薬によって処理された対象とする椎間板を有する。第４のグループは、付随する架橋処理なしで移植された幹細胞を有する。処理の前に、それぞれの候補椎間板は、先の実験で記録されるように、椎間板を劣化させるために、１〜２週間の反復性の力学的負荷（１．２ＭＰａの圧縮屈曲）を受ける。処理に続いて、ラットは、犠牲の前に更に２週間か４週間か８週間か１６週間維持される。犠牲後の組織化学的（コラーゲンＩ／ＩＩ、プロテオグリカンマトリクス含有量、アポトーシス細胞、および炎症細胞を定量化する）、力学的、同化作用の（リアルタイムのＰＣＲ分析は、コラーゲン−１ａｌ、コラーゲン−２ａｌ、および発現を定量化する）及び異化の（ＭＭＰ−３，ＭＭＰ−１３，ＡＤＡＭＴｓ−４ｍＲＮＡマーカー）検定は、４つの期間の架橋されたグループ及び非架橋のグループのための細胞ベースの治療法の有効性、実行可能性及び持続時間を記録して、定量化するために椎間板組織に実行される。
椎間板の架橋増大は、幹細胞の実行可能性、効果の持続時間、劣化した細胞外組織の再生及び修復、椎間板の粘弾性及び弾力性−可塑性の素材特性、及び関節の安定性を改善するはずである。
【０１２１】
＜実施例１０＞
一つは、対象領域内へ又は対象領域に隣接して（一つは、架橋試薬と椎間板の軟骨性終板との接触を促進するための椎間板核及び内側輪の優れた及び劣った性状の注入を予想する）架橋試薬（生理食塩水（０．１５Ｍ）中の４００ｍＭのＬ−トレオースや、生理食塩水中に２００ｍＭのメチルグリオキサルを含む溶液や、２００ｍＭのグリオキサールの溶液や、２００ｍＭのＥＤＣの溶液や、０．１Ｍの尿素生理食塩水中に５０−１００μｇのリシルオキシダーゼを含む溶液や、生理食塩水中に５０μｇ／ｍｌの人組換え型トランスグルタミナーゼを含む溶液や、生理食塩水中に２００μｇ／ｍｌの精製された動物肝臓トランスグルタミナーゼを含む溶液など）を注入することによって、椎間板（好ましくは、終板と線維輪を含む）の添加物治療を伴う変性椎間板（どんな誘導の幹細胞の他の移植、増殖因子の遺伝子療法送達、付着増殖要素があるマトリクスの移植、増殖因子の直接使用、移植された組織や細胞の移植、異種移植組織や異種移植細胞の移植も含む）の細胞やサイトカイン（増殖因子）ベースの治療を受けた或いは受けるであろう患者を治療する。この処理は、椎間板中の細胞への栄養素の流動の増加に影響するように、細胞からの老廃物の除去を増加させるように、細胞の再生及び修復能力を高めるように、また、これによって細胞やサイトカインベースの処理の有効性を改善するように、及び椎間板中の細胞の生存力を改善するように、また、これによって増大している生物活性を維持し、有益な活性の持続時間を増加させるように、管理される。
【０１２２】
＜実施例１１＞
一つは、残っている椎間板輪素材内へ及び椎間板の軟骨性終板の中又は軟骨性終板に隣接して（一つは、架橋試薬と椎間板の軟骨性終板との接触を促進するための椎間板核領域及び内側輪領域の優れた及び劣った性状の注入を予想する）架橋試薬（生理食塩水（０．１５Ｍ）中の４００ｍＭのＬ−トレオースや、生理食塩水中に２００ｍＭのメチルグリオキサルを含む溶液や、２００ｍＭのグリオキサールの溶液や、２００ｍＭのＥＤＣの溶液や、０．１Ｍの尿素生理食塩水中に５０−１００μｇのリシルオキシダーゼを含む溶液や、生理食塩水中に５０μｇ／ｍｌの人組換え型トランスグルタミナーゼを含む溶液や、生理食塩水中に２００μｇ／ｍｌの精製された動物肝臓トランスグルタミナーゼを含む溶液など）を注入することによって、椎間板（好ましくは、終板と線維輪を含む）の添加物治療を伴う変性椎間板（核置換材料や装置の他の移植を含む）の適度な核置換処理を受けた或いは受けるであろう患者を治療し得る。この処理は、輪裂傷抵抗性の増加に影響し、輪内の割れに抵抗し、軟骨性終板を通るように、また、それによって移植された素材や装置の移動やはみ出しや排除を防止するように、輪や椎間板の完全な状態を長期間維持するように、増加した椎間板の高さを維持するように、また、これによって神経組織の圧縮を減少するように、また、より長い持続時間の後処理に関する痛みを減少させるように、管理されるであろう。
【０１２３】
＜実施例１２＞
これは、架橋処理後の死後椎間関節の生体力学的試験の例である。
【０１２４】
単一の牛及び人の死後の胸腰部椎間関節試料は、融合されたか別の方法で器具を取り付けられた断片に隣接する背骨の断片の後弯性変形をシミュレートするために、屈曲−圧縮−前方が組み合わされた反復性の剪断負荷にかけられる。４つの処理グループは、処理されていない対照と比較される。各グループは、胸腰部の脊柱の同様の領域からの５つ以上の死後試料を含む。第１処理グループは、生理食塩水中に４００ｍＭのＬ−トレオース溶液（０．１５Ｍ）の注入によって、輪の後半分が処理される。各椎間板に注入された全量は、１ｍｌである。第２処理グループは、生理食塩水中に４００ｍＭのＬ−トレオース溶液の注入によって、椎間板全体の至る所で処理される。第３のグループは、生理食塩水中に２００ｍＭのメチルグリオキサル溶液の注入によって、椎間板全体の至る所で処理される。第４処理グループは、生理食塩水中に５０−１００μｇの濃度のリシルオキシダーゼ溶液の注入によって、椎間板全体の至る所で処理される。これらの椎間板に注入された全量は、３ｍｌである。異なる架橋処理の予防効果は、架橋処理及び変形負荷の適用の後の回復しない変形量を評価することによって、比較される。１０００サイクルの組み合わされた負荷は、不変的な変形が光電子工学位置測定システムを使用することで測定された後、加えられる。最大負荷及びモーメントは、グループ間で均一である。最大モーメントは、脊柱レベルに応じて、１Ｎｍ〜３Ｎｍである（即ち上側胸部では１Ｎｍ、腰部では３Ｎｍである）。最大剪断負荷は、腰部椎間レベルで、２００Ｎであり、最大圧縮負荷は、５００Ｎである。最大剪断力は、上側胸部レベルで、１００Ｎであり、最大圧縮力は、２５０Ｎである。不変的変形の測定は、未処理の椎間板と平均的に比較して、架橋試料中の変形の減少量を証明すべきである。
【０１２５】
本発明は、本発明の基本的概念が想定され得る様々な様式のうち一部を代表する特定の好ましい実施形態及び代替実施形態について、記載されてきた。当業者が想到し得る、本発明の概念の実施に対するある種の改良や変形は、添付の特許請求の範囲によって定義されている本発明及び均等物の範囲に属する。
【図１】
2010520235.tif 000007
【図２】
2010520235.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月28日(2008.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
裂傷、亀裂、破裂及び／又は層間剥離に対する抵抗性を増加させるために、裂傷、亀裂、破裂及び／又は層間剥離、又は既存の核置換の排除を受ける、自然の、変性していない脊柱椎間板組織の治療方法であって、前記組織中の架橋を増加させる効果的な量の試薬と少なくとも前記組織の一部とを接触させる工程を含んでなる方法。
【請求項２】
前記組織が線維状のコラーゲン組織である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記線維状のコラーゲン組織が椎間板又は膝関節間軟骨の線維輪である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上の架橋剤を用いる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試薬が非毒性である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記架橋試薬は、少なくとも０．００１％（０．０１ｍｇ／ｍｌ）のヒト組み替え型トランスグルタミナーゼ、少なくとも０．０１％（０．１ｍｇ／ｍｌ）の精製された動物性肝臓トランスグルタミナーゼ、少なくとも０．２５％のゲニピン、少なくとも０．１％のプロアントシアニジン、少なくとも１００ｍＭのＥＤＣ、少なくとも５０ｍＭの非酵素剤、少なくとも０．００１％のリシルオキシダーゼのうちから選択される１つ以上の薬剤を含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤が非酵素剤である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試薬が酸化体、緩衝剤、又はこれらの組み合わせを含むものである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酸化体が過酸化水素、過炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、アミノ酸ヒドロペルオキシド又は過ホウ酸塩であり、緩衝剤が重炭酸ナトリウム又はリン酸塩である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記非酵素剤は、少なくとも１００ｍＭのリボース、少なくとも１００ｍＭのＬ−トレオースのうちから選ばれる１つ以上を含むものである請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤が０．１Ｍの尿素溶液中に存在するものである請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記架橋剤が十分に非細胞毒性の担体媒体中に存在するものである請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記担体媒体のｐＨが健全な組織環境と実質的に同一となるように調整される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記担体媒体が燐酸塩緩衝生理食塩溶液である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
線維状のコラーゲン組織が椎間板の線維輪であり、前記試薬が後側又は後外側椎間板の中央部の置換を防止するために効果的である請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
線維状のコラーゲン組織が椎間板の線維輪であり、前記工程が核増加の移植又は装置の交換と同時、又はその前に、又はその後に、前記組織と前記試薬とを接触させることである請求項２に記載の方法。
【国際調査報告】
2010520235.tif 000009
2010520235.tif 000010
2010520235.tif 000011
2010520235.tif 000012