(57)【要約】本発明者らは、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、およびＮｏｔｃｈ４からなる群より選択されるタンパク質から誘導されたペプチドに対して患者を免疫化することによって患者における癌を治療する方法を開示する。本発明者らはさらに、上記のようなペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を開示する。加えて、本発明者らは、Ｎｕｍｂ１、Ｎｕｍｂ２、Ｎｕｍｂ３、およびＮｕｍｂ４からなる群より選択されるタンパク質から誘導されたペプチドに対して患者を免疫化することによって患者における癌を治療する方法を開示する。本発明者らはまた、上記のようなペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、およびＮｏｔｃｈ４からなる群より選択されるタンパク質から誘導されたペプチドに対して患者を免疫化する工程を包む、患者における癌を治療する方法。
【請求項２】
前記ペプチドが、
【化６７】
2010520280.tif 000074
からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、Ｎｏｔｃｈ１２７４−２８２（配列番号１０）、Ｎｏｔｃｈ１１９３８−１９４３（配列番号１１）、Ｎｏｔｃｈ１１９３８−１９４６（配列番号１２）、Ｎｏｔｃｈ１１９３８−１９４７（配列番号１３）、Ｎｏｔｃｈ１１９４０−１９４８（配列番号１４）、Ｎｏｔｃｈ１１９４０−１９４９（配列番号１５）、Ｎｏｔｃｈ１１９４４−１９５５（配列番号１６）、Ｎｏｔｃｈ１１９４７−１９５５（配列番号１７）、Ｎｏｔｃｈ１２１１１−２１２０（配列番号１９）、Ｎｏｔｃｈ１２１１２−２１２０（配列番号２０）、Ｎｏｔｃｈ１２１１３−２１２０（配列番号２１）、Ｎｏｔｃｈ２１−２０（配列番号２２）、Ｎｏｔｃｈ２７−１５（配列番号２４）、Ｎｏｔｃｈ２２７１−２８５（配列番号２６）、Ｎｏｔｃｈ２２７１−２８６（配列番号２７）、Ｎｏｔｃｈ２２７７−２８５（配列番号２８）、Ｎｏｔｃｈ２２７７−２８６（配列番号２９）、Ｎｏｔｃｈ２１９４０−１９４８（配列番号３１）、Ｎｏｔｃｈ２１９４０−１９４９（配列番号３２）、Ｎｏｔｃｈ２１９９１−２００３（配列番号３３）、Ｎｏｔｃｈ２１９９５−２００３（配列番号３４）、およびＮｏｔｃｈ２１９９７−２００３（配列番号３５）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病およびリンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肝臓癌、胃癌、明細胞腎細胞癌腫、および結腸癌からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、およびＮｏｔｃｈ４からなる群より選択されるタンパク質から誘導されたペプチド；および
薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが、
【化６８】
2010520280.tif 000075
からなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ペプチドが、Ｎｏｔｃｈ１２７４−２８２（配列番号１０）、Ｎｏｔｃｈ１１９３８−１９４３（配列番号１１）、Ｎｏｔｃｈ１１９３８−１９４６（配列番号１２）、Ｎｏｔｃｈ１１９３８−１９４７（配列番号１３）、Ｎｏｔｃｈ１１９４０−１９４８（配列番号１４）、Ｎｏｔｃｈ１１９４０−１９４９（配列番号１５）、Ｎｏｔｃｈ１１９４４−１９５５（配列番号１６）、Ｎｏｔｃｈ１１９４７−１９５５（配列番号１７）、Ｎｏｔｃｈ１２１１１−２１２０（配列番号１９）、Ｎｏｔｃｈ１２１１２−２１２０（配列番号２０）、Ｎｏｔｃｈ１２１１３−２１２０（配列番号２１）、Ｎｏｔｃｈ２１−２０（配列番号２２）、Ｎｏｔｃｈ２７−１５（配列番号２４）、Ｎｏｔｃｈ２２７１−２８５（配列番号２６）、Ｎｏｔｃｈ２２７１−２８６（配列番号２７）、Ｎｏｔｃｈ２２７７−２８５（配列番号２８）、Ｎｏｔｃｈ２２７７−２８６（配列番号２９）、Ｎｏｔｃｈ２１９４０−１９４８（配列番号３１）、Ｎｏｔｃｈ２１９４０−１９４９（配列番号３２）、Ｎｏｔｃｈ２１９９１−２００３（配列番号３３）、Ｎｏｔｃｈ２１９９５−２００３（配列番号３４）、およびＮｏｔｃｈ２１９９７−２００３（配列番号３５）からなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
Ｎｕｍｂ１、Ｎｕｍｂ２、Ｎｕｍｂ３、およびＮｕｍｂ４からなる群より選択されるタンパク質から誘導されたペプチドに対して患者を免疫化する工程を包含する、患者における癌を治療する方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、
【化６９】
2010520280.tif 000076
からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが、Ｎｕｍｂ１８７−９５（配列番号３６）、Ｎｕｍｂ１８８−９５（配列番号３７）、Ｎｕｍｂ１１３１−１４９（配列番号３８）、Ｎｕｍｂ１１３８−１４９（配列番号３９）、Ｎｕｍｂ１１３９−１４７（配列番号４０）、Ｎｕｍｂ１４４２−４５３（配列番号４１）、Ｎｕｍｂ１４４３−４５１（配列番号４２）、Ｎｕｍｂ１５９２−６０６（配列番号４３）、およびＮｕｍｂ１５９４−６０２（配列番号４４）からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病およびリンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肝臓癌、胃癌、明細胞腎細胞癌腫、および結腸癌からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Ｎｕｍｂ１、Ｎｕｍｂ２、Ｎｕｍｂ３、およびＮｕｍｂ４からなる群より選択されるタンパク質から誘導されたペプチド；ならびに
薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドが、
【化７０】
2010520280.tif 000077
からなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドが、Ｎｕｍｂ１８７−９５（配列番号３６）、Ｎｕｍｂ１８８−９５（配列番号３７）、Ｎｕｍｂ１１３１−１４９（配列番号３８）、Ｎｕｍｂ１１３８−１４９（配列番号３９）、Ｎｕｍｂ１１３９−１４７（配列番号４０）、Ｎｕｍｂ１４４２−４５３（配列番号４１）、Ｎｕｍｂ１４４３−４５１（配列番号４２）、Ｎｕｍｂ１５９２−６０６（配列番号４３）、およびＮｕｍｂ１５９４−６０２（配列番号４４）からなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、Ｎｕｍｂ１、Ｎｕｍｂ２、Ｎｕｍｂ３、およびＮｕｍｂ４からなる群より選択されるタンパク質から誘導されたペプチドに対する抗体を含む組成物を患者に投与する工程を包む、患者における癌を治療する方法。
【請求項１６】
前記ペプチドが、
【化７１】
2010520280.tif 000078
からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドが、Ｎｏｔｃｈ１２７４−２８２（配列番号１０）、Ｎｏｔｃｈ１１９３８−１９４３（配列番号１１）、Ｎｏｔｃｈ１１９３８−１９４６（配列番号１２）、Ｎｏｔｃｈ１１９３８−１９４７（配列番号１３）、Ｎｏｔｃｈ１１９４０−１９４８（配列番号１４）、Ｎｏｔｃｈ１１９４０−１９４９（配列番号１５）、Ｎｏｔｃｈ１１９４４−１９５５（配列番号１６）、Ｎｏｔｃｈ１１９４７−１９５５（配列番号１７）、Ｎｏｔｃｈ１２１１１−２１２０（配列番号１９）、Ｎｏｔｃｈ１２１１２−２１２０（配列番号２０）、Ｎｏｔｃｈ１２１１３−２１２０（配列番号２１）、Ｎｏｔｃｈ２１−２０（配列番号２２）、Ｎｏｔｃｈ２７−１５（配列番号２４）、Ｎｏｔｃｈ２２７１−２８５（配列番号２６）、Ｎｏｔｃｈ２２７１−２８６（配列番号２７）、Ｎｏｔｃｈ２２７７−２８５（配列番号２８）、Ｎｏｔｃｈ２２７７−２８６（配列番号２９）、Ｎｏｔｃｈ２１９４０−１９４８（配列番号３１）、Ｎｏｔｃｈ２１９４０−１９４９（配列番号３２）、Ｎｏｔｃｈ２１９９１−２００３（配列番号３３）、Ｎｏｔｃｈ２１９９５−２００３（配列番号３４）、Ｎｏｔｃｈ２１９９７−２００３（配列番号３５）、Ｎｕｍｂ１８７−９５（配列番号３６）、Ｎｕｍｂ１８８−９５（配列番号３７）、Ｎｕｍｂ１１３１−１４９（配列番号３８）、Ｎｕｍｂ１１３８−１４９（配列番号３９）、Ｎｕｍｂ１１３９−１４７（配列番号４０）、Ｎｕｍｂ１４４２−４５３（配列番号４１）、Ｎｕｍｂ１４４３−４５１（配列番号４２）、Ｎｕｍｂ１５９２−６０６（配列番号４３）、およびＮｕｍｂ１５９４−６０２（配列番号４４）からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌が、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病およびリンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肝臓癌、胃癌、明細胞腎細胞癌腫、および結腸癌からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、抗癌剤および放射性同位元素からなる群より選択される治療分子をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療分子が、前記抗体の重鎖定常領域に共有結合されている、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、癌治療の分野に関する。より詳細には、本発明は、アップレギュレーション、過剰発現、またはＮｏｔｃｈ、Ｎｕｍｂ、もしくはその両方の脱抑制によって特徴付けられる癌を治療するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｏｔｃｈは、多くの細胞系譜において、細胞運命特定の制御、および増殖と分化の間のバランスの維持に関与している原形質膜受容体である（１、２）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、多くの生理学的プロセスにおいて重要であり、Ｎｏｔｃｈの分布は種々の血液癌および固形癌に関与している。
【０００３】
最もよい例は、Ｎｏｔｃｈの変異と、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病およびリンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）との間の連関である。Ｔ−ＡＬＬ腫瘍細胞のサブセットにおいて、（７、９）染色体点座は、Ｎｏｔｃｈ１の３’位をＴ細胞受容体Ｊβ遺伝子座に融合する。これは、短縮型Ｎｏｔｃｈ１タンパク質を生じ、これは、構成的に活性かつ異常に発現される（３）。加えて、（７、９）転座とは独立したＮｏｔｃｈ１の活性化変異が、ヒトのＴ−ＡＬＬ症例の５０％を超えて見出されてきた（４）。
【０００４】
異常なＮｏｔｃｈシグナル伝達はまた、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、肝臓癌、胃癌、および結腸癌を含む固形腫瘍において報告されているが、遺伝子損傷の証拠はなかった（５〜７）。Ｎｏｔｃｈは、癌の型、存在する他のシグナル伝達経路、および活性化されるＮｏｔｃｈ受容体の同一性に依存して、発癌性または腫瘍抑制性のいずれかの役割を果たす可能性がある。
【０００５】
しかしながら、乳癌を含む大部分の症例においては、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は腫瘍増殖を促進する（８）。Ｎｏｔｃｈの発癌性の役割についての１つのメカニズムは、分化を妨害し、幹細胞表現型を維持するその能力から駆動され得るというものである。幹細胞および癌細胞は、無限の増殖および未分化などの共通の特徴を共有している。さらに、幹細胞および腫瘍細胞における自己再生は、ソニックヘッジホッグ、Ｗｎｔ、およびＮｏｔｃｈを含む同様の経路によって調節されている。腫瘍細胞は、正常な幹細胞から誘導され癌は、治療に対して抵抗性がある「癌幹細胞」を有することが可能である（９）。
【０００６】
胚形成における非対称的な細胞分裂の間、Ｎｏｔｃｈの活性は、細胞の運命の決定因子であるＮｕｍｂによって生物学的に拮抗される（１１、１２）。非対称的な細胞分裂は、分化した娘細胞および未分化娘細胞における幹細胞の分裂から構成される。Ｎｕｍｂはまた、多くの成熟哺乳動物細胞においても発現されている（１３）。成熟細胞は対称的に分裂し、Ｎｕｍｂは有糸分裂において対称的に分配される。対称的な分配は、Ｎｕｍｂが不活性であり、またはさらなる機能を有することを示唆する。Ｎｕｍｂ／Ｎｏｔｃｈ拮抗作用は、正常な乳房柔組織の分裂の制御と関連する。正常な乳房柔組織は、常に変わることなく、強力かつ均一なＮｕｍｂ染色を発現している。対照的に、腫瘍は顕著に不均一性を示し、多くの場合において、Ｎｕｍｂ免疫反応性の完全な非存在を示す（１４（非特許文献１）、１５（非特許文献２））。
【０００７】
この情報およびさらなる情報に基づいて、ＮｏｔｃｈのＮｕｍｂ媒介調節の破壊（遮断または阻害による）は、天然に存在する乳癌の原因となる役割を果たしていると考えられる。８０％の乳癌が、腫瘍細胞の５０％でＮｕｍｂの免疫反応性を示す。このように、すべての乳癌のほぼ半分でＮｕｍｂレベルが減少している。Ｎｕｍｂ発現レベルと、攻撃性疾患の公知の指標である腫瘍悪性度およびＫｉ６７標識指標との間で、強力な逆相関が見出された（１４（非特許文献１））。低レベルＮｕｍｂは、ＭＧ１３２などのプロテアソーム阻害剤を用いる処理によって高レベルまで回復されることが報告された（１４（非特許文献１））。研究された乳癌におけるＮｕｍｂレベルの減少は、一般的に増加したプロテオソーム活性の結果であるとは見られなかった。プロテオソーム性分解によってもまた調節される他の細胞タンパク質の基底レベルが同じ実験条件下で影響を受けなかったからであるが、この問題はさらなる研究を必要としている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｅｃｅ  ＳおよびＳａｎｔｏｌｉｎｉ  Ｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００４）１６７：２１５〜２１
【非特許文献２】Ｓｔｙｌｉａｎｏｕ  Ｓ、Ｃｌａｒｋｅ  ＲＢおよびＢｒｅｎｎａｎ  Ｋ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００６）６６：１５１７〜２５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの実施形態において、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、およびＮｏｔｃｈ４からなる群より選択されるタンパク質から誘導されたペプチドに対して患者を免疫化することによって、患者における癌を治療する方法に関する。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明は、上記のようなペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物に関する。
【００１１】
１つの実施形態において、本発明は、Ｎｕｍｂ１、Ｎｕｍｂ２、Ｎｕｍｂ３、およびＮｕｍｂ４からなる群より選択されるタンパク質から誘導されたペプチドに対して患者を免疫化することによって、患者における癌を治療する方法に関する。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明は、上記のようなペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物に関する。
【００１３】
１つの実施形態において、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、Ｎｕｍｂ１、Ｎｕｍｂ２、Ｎｕｍｂ３、およびＮｕｍｂ４からなる群より選択されるタンパク質から誘導されたペプチドに対する抗体を含む組成物を患者に投与することによって、患者における癌を治療する方法に関する。
【００１４】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせた、これらの図面の１つ以上の参照によって、より良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｎｏｔｃｈ１Ｃ末端アミノ酸１９０２−２１４３（Ａ、Ｂ）およびＮｕｍｂ１ホスホチロシン結合ドメイン（ＰＴＢ）（Ｃ、Ｄ）の分子モデル。（Ｂ、Ｄ）はこれらの分子の電荷を示し、赤色は正電荷を示し、青色は負電荷を示す。ペプチドＮｏｔｃｈ１−１９４７、Ｎｏｔｃｈ１−２１１２、およびＮｕｍｂ１−８７の位置は（Ａ、Ｃ）に示す。
【図２】ＭＣＦ７乳癌細胞株およびＳＫ−ＯＶ−３卵巣癌細胞株に対するＮｏｔｃｈ１の発現。（Ａ、Ｂ、Ｃ）細胞はアイソタイプ対照抗体で染色した。（Ｄ、Ｅ、Ｆ）細胞をＮｏｔｃｈ１に対する抗体で染色した。ＭＣＦ７（Ａ、Ｄ）、ＳＫ−ＯＹ−３（Ｂ、Ｅ）、およびＳＫ−ＬＭＳ−１平滑筋肉腫（Ｃ、Ｆ）。
【図３】ＴＡＬ−１の増殖の反応速度論。新鮮に単離されたＴＡＬ−１を１５０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−Ｓで培養した。低濃度のＩＬ−２で大部分の細胞は最初の（ｆｉｓｔ）８日間で死滅した。その後、生存している細胞は数が増加した。
【図４】（Ａ）ペプチド（ｄＮＰ）でパルスしていないＨＬＡ−Ａ２−ＩｇＧ二量体で染色したＴＡＬ−１を陰性二量体対照として使用した。（Ｂ）Ｎｏｔｃｈ１−２１１２ペプチドＨＬＡ−Ａ２−ＩｇＧ二量体（ｄＮｏｔｃｈ１−２１１２）で染色したＴＡＬ−１。（Ｃ）ＴＡＬ−１染色Ｎｕｍｂ１−８７−ＨＬＡ−Ａ２ペプチド二量体（ｄＮｕｍｂ１−８７）。Ｂと比較して、ＴＣＲｈｉＰｅｒｈｉ細胞数の３．３倍増加していることに注目のこと。（Ｄ）ＡＥＳ１−ＨＬＡ−Ａ２−ＩｇＧペプチド二量体で染色したＴＡＬ−１。（Ｅ−Ｈ）パーフォリンに対する抗体で染色したＴＡＬ−１。（Ｇ）Ｎｕｍｂ１−８７−ＴＣＲ＋細胞は、最大量のパーフォリンを有する。
【図５】（Ａ−Ｄ）ＴＡＬ−２においてゲートされたすべての分析。（Ａ）ペプチド（ｄＮＰ）でパルスしていないＨＬＡ−Ａ２−ＩｇＧ二量体で染色したＴＡＬ−１を陰性二量体対照として使用した。（Ｂ）Ｎｏｔｃｈ１−１９４７ペプチドＨＬＡ−Ａ２−ＩｇＧ二量体（ｄＮｏｔｃｈ１−１９４７）で染色したＴＡＬ−２、（Ｃ）Ｎｏｔｃｈ１−２１１２−ＨＬＡ−Ａ２−ＩｇＧ二量体（ｄＮｏｔｃｈ２１１２）で染色したＴＡＬ−２、（Ｄ）Ｎｕｍｂ１−８７−Ｊ−ＩＬＡ−Ａ２−ｌｇＧペプチド二量体（ｄＮｕｍｂ１−８７）で染色したＴＡＬ−２、（Ｅ−Ｈ）大型サイズＴＡＬ−２の分析。（Ｅ）ｄＮＰ、（Ｆ）Ｎｏｔｃｈ１−１９４７、（Ｇ）Ｎｏｔｃｈ１−２１１２、（Ｈ）Ｎｕｍｂ１−８７は、ＴＣＲ１ａの数が３倍増加している。
【図６−１】癌細胞株でのＥＳＡ、ＣＤ４４、およびＣＤ２４の発現。ゲムシダビンのあるなしで培養した細胞をＥＳＡについてゲートした。ＣＤ４４およびＣＤ２４を分析した。ＥＳＡ＋ＣＤ４４高ＣＤ２４低／−集団は比較的高く、ＰＡＮＣ−１およびＡｓＰＣ−１に対するＧＥＭ処理によるこれらのマーカーの発現の示差的な変化がなかった。ＢＲ−Ｃ系統ＭＣＦ７のＥＳＡ＋ＣＤ４４高ＣＤ２４低／−細胞は、ＣＳｔ−Ｃｓとして知られており、その集団はＧＥＭ処理に伴って増加する。（Ａ）ＰＡＮＣ−１；（Ｂ）ＭＣＦ７；（Ｃ）ＳＫＯＶ−３；（Ｄ）ＭＩＡ  ＰａＣａ−２；（Ｅ）ＭＣＦ７。
【図６−２】癌細胞株でのＥＳＡ、ＣＤ４４、およびＣＤ２４の発現。ゲムシダビンのあるなしで培養した細胞をＥＳＡについてゲートした。ＣＤ４４およびＣＤ２４を分析した。ＥＳＡ＋ＣＤ４４高ＣＤ２４低／−集団は比較的高く、ＰＡＮＣ−１およびＡｓＰＣ−１に対するＧＥＭ処理によるこれらのマーカーの発現の示差的な変化がなかった。ＢＲ−Ｃ系統ＭＣＦ７のＥＳＡ＋ＣＤ４４高ＣＤ２４低／−細胞は、ＣＳｔ−Ｃｓとして知られており、その集団はＧＥＭ処理に伴って増加する。（Ａ）ＰＡＮＣ−１；（Ｂ）ＭＣＦ７；（Ｃ）ＳＫＯＶ−３；（Ｄ）ＭＩＡ  ＰａＣａ−２；（Ｅ）ＭＣＦ７。
【図６−３】癌細胞株でのＥＳＡ、ＣＤ４４、およびＣＤ２４の発現。ゲムシダビンのあるなしで培養した細胞をＥＳＡについてゲートした。ＣＤ４４およびＣＤ２４を分析した。ＥＳＡ＋ＣＤ４４高ＣＤ２４低／−集団は比較的高く、ＰＡＮＣ−１およびＡｓＰＣ−１に対するＧＥＭ処理によるこれらのマーカーの発現の示差的な変化がなかった。ＢＲ−Ｃ系統ＭＣＦ７のＥＳＡ＋ＣＤ４４高ＣＤ２４低／−細胞は、ＣＳｔ−Ｃｓとして知られており、その集団はＧＥＭ処理に伴って増加する。（Ａ）ＰＡＮＣ−１；（Ｂ）ＭＣＦ７；（Ｃ）ＳＫＯＶ−３；（Ｄ）ＭＩＡ  ＰａＣａ−２；（Ｅ）ＭＣＦ７。
【図７】（Ａ）ＮＫＧ２ＤリガンドＭＩＣＡおよびＭＩＣＢを発現する細胞数はＧｅｍ耐性およびＦＵ耐性ＭＩＡ  ＰａＣａ−２において増加した。ＭＩＣ−Ａ／Ｂ＋細胞はＰＴＸ耐性細胞の数を増加しなかった。（Ｂ）薬物耐性陽性対照ＭＣＦ−７細胞を用いると同様の結果であった。白色ピークは？ＥＳＡ＋細胞？を表し、黒色ピークはＭＩＣ−Ａ／Ｂ＋細胞を示す。ＭＩＣＡ−Ａ／Ｂ＋細胞％は下線で示す。ＭＩＣＡ−Ａ／Ｂ＋細胞数の増加は、薬物対生細胞あたりのＭＩＣ−Ａ／Ｂ密度の増加と並行していなかった。
【図８】膵臓細胞株は、その数が薬物耐性集団にいて増加しているＣＤ１３３＋細胞を含む。ＣＳＣマーカー（ＣＤ４４＋ＣＤ２４低、ＣＤ４４＋ＣＤ１３３＋、およびＣＤ２４低ＣＤ１３３＋）の発現を共有する集団はゲムシダビンを用いる処理後に増加した。（＊）は実質的に２倍より多い増加である。（白色）未処理細胞、（黒色）薬物対生細胞。ＭＣＦ−７およびＳＫＯＶ３はＣＤ４４、ＣＤ２４、およびＥＳＡマーカーのための陽性対照として使用した。薬物対生細胞の選択およびＣＳＣ表現の細胞の定量は、材料および方法に記載されるように作成した。（Ａ）ＥＳＡ＋ＣＤ４４高ＣＤ２４低およびＣＤ１３３＋集団は、Ｍｉａ−ＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ−１、ＭＣＦ７、およびＳＫＯＶ３の全体の集団と比較して、３〜５倍ＧＥＭ耐性集団が増加したが、ＡｓＰＣ−１では増加しなかった。（Ｂ）大量のＤＬＬ４拡大細胞はＣＤ４４低ＣＤ２４低、およびＣＤ２４低表現型であった。（Ｃ）比較結果をＣＤ４４＋ＣＤ１３３＋表現型について観察した。（Ｄ）比較結果をＣＤ２４低ＣＤ１３３＋表現型について観察した。
【図９−１】ゲムシタビンで生存している細胞は、Ｍｉａｐａｃａ−２およびＭＣＦ−７独特な生存経路の成分を活性化している。（Ａ）ＮＩＣＤおよびＢｃｌ−２発現は、未処理（ＵＴ）Ｍｉａｐａｃａ−２と比較して、Ｇｅｍ耐性ＭＩＡ  ＰａＣａ−２において増加した。（Ｂ）ＮＥＣＤ発現は増加し、ＮＩＣＤ発現はＭＣＦ７細胞において減少した。２回の実験の内の１つを示す。（Ｃ、Ｄ）Ｇｅｍ耐性ＭＣＦ−７におけるＮＥＣＤ発現の発現のダイアグラムは、Ｎｕｍｂｓ、ＮｕｍｂＬ、およびＢｃｌ−２の量の減少と並行していた。各タンパク質の発現レベルは、同じゲル中で分離された同じサンプル中のアクチンレベルと比例させて標準化した。以下の式を使用して計算した：発現指数＝サンプル中の特定のタンパク質の光学密度／同じサンプル中のタンパク質のαアクチン密度。ＭＣＦ７細胞中のＢｃｌ−２の発現は１０分間曝露したメンブレンから示される；ＭＩＡ  ＰａＣａ−２中のＢｃｌ−２は３分間のみ曝露した同じメンブレンから示される。ＭＣＦ７はＭＩＡ  ＰａＣａ−２よりも少ない量のＢｃｌ−２を有した。ＭＣＦ７細胞中のＢｃｌ−２のＥ．Ｉ．は、３分間の曝露における光学密度値から計算した。タンパク質の量の決定は、比率の減算｛（ＮＥＣＤ：ＮｕｍｂＬ）−ＧＥＭ耐性  対  ＮＥＣＤ：ＮｕｍｂＬ）−ＧＥＭ感受性｝が２よりも高いかまたは低い；すなわち、倍数増加、または倍数減少であるという場合に、実質的であると見なした。ＮＥ、ＮＥＣＤ；ＮＩ、ＮＩＣＤ；Ｎ−Ｌ、ＮｕｍｂＬ、Ｎ−Ｓ、ＮｕｍｂＳ。
【図９−２】ゲムシタビンで生存している細胞は、Ｍｉａｐａｃａ−２およびＭＣＦ−７独特な生存経路の成分を活性化している。（Ａ）ＮＩＣＤおよびＢｃｌ−２発現は、未処理（ＵＴ）Ｍｉａｐａｃａ−２と比較して、Ｇｅｍ耐性ＭＩＡ  ＰａＣａ−２において増加した。（Ｂ）ＮＥＣＤ発現は増加し、ＮＩＣＤ発現はＭＣＦ７細胞において減少した。２回の実験の内の１つを示す。（Ｃ、Ｄ）Ｇｅｍ耐性ＭＣＦ−７におけるＮＥＣＤ発現の発現のダイアグラムは、Ｎｕｍｂｓ、ＮｕｍｂＬ、およびＢｃｌ−２の量の減少と並行していた。各タンパク質の発現レベルは、同じゲル中で分離された同じサンプル中のアクチンレベルと比例させて標準化した。以下の式を使用して計算した：発現指数＝サンプル中の特定のタンパク質の光学密度／同じサンプル中のタンパク質のαアクチン密度。ＭＣＦ７細胞中のＢｃｌ−２の発現は１０分間曝露したメンブレンから示される；ＭＩＡ  ＰａＣａ−２中のＢｃｌ−２は３分間のみ曝露した同じメンブレンから示される。ＭＣＦ７はＭＩＡ  ＰａＣａ−２よりも少ない量のＢｃｌ−２を有した。ＭＣＦ７細胞中のＢｃｌ−２のＥ．Ｉ．は、３分間の曝露における光学密度値から計算した。タンパク質の量の決定は、比率の減算｛（ＮＥＣＤ：ＮｕｍｂＬ）−ＧＥＭ耐性  対  ＮＥＣＤ：ＮｕｍｂＬ）−ＧＥＭ感受性｝が２よりも高いかまたは低い；すなわち、倍数増加、または倍数減少であるという場合に、実質的であると見なした。ＮＥ、ＮＥＣＤ；ＮＩ、ＮＩＣＤ；Ｎ−Ｌ、ＮｕｍｂＬ、Ｎ−Ｓ、ＮｕｍｂＳ。
【図１０】（Ａ、Ｂ）ＵＴ−Ｍｉａｐａｃａ−２と比較したＧｅｍ耐性ＭＩＡＰａＣａ−２の形態学的変化。ＵＴ−ＭＩＡＰａＣａ−２は円形形状細胞であるが（Ａ）、しかしながら、これらはゲムシタビンを用いる処理後に、長い触手を有する紡錘体形状細胞に変形する（Ｂ）。Ｇｅｍ耐性ＭＣＦ−７細胞中での細胞あたりのＭＩＣＡ−Ａ／Ｂ  Ａｇ細胞の低レベル発現。白色ピーク、アイソタイプ対照Ａｂ；暗いピーク、ＭＩＣ−Ａ／Ｂ特異的Ａｂ。
【図１１】（Ａ）ＳＫＯＶ３．Ａ２細胞は、Ｎｕｍｂ−１ペプチド活性化ＰＢＭＣに対してＮｕｍｂ−１（８７−９５）ペプチドを提示する。Ｎｕｍｂ−１ペプチドによるＩＦＮ−ｇ産生は、Ｎｏｔｃｈペプチド活性化ＰＢＭＣによるよりも、ＰＢＭＣを２倍実質的に高く活性化した。４８時間において、ＩＦＮｇの量は２種のＮｏｔｃｈペプチド活性化細胞株によって産生され、非特異的にＩＬ−２活性化された細胞株は低くかつ同様であったことに注目のこと。Ｎｏｔｃｈパプチド、２１１２−２１２０のみが、プロテオソームによるＮｏｔｃｈ消化後にＨＬ−Ａ２によって提示可能である（プログラムｐａｐｒｏｃ．ｄｅ）。（Ｂ）ＳＫＯＶ３におけるＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂタンパク質発現のウェスタン分析。Ｎｕｍｂ  Ｓ／Ｌは、ＭＣＦ−７におけるよりもＳＫＯＶ３において有意に多い量で発現されるが、Ｍｉａｐａｃａ−２においては同様の量である。Ｎｕｍｂの一部はリン酸化されている。小部分のＮｕｍｂはＳｅｒ２８３がおいてリン酸化されている。大部分のＮｕｍｂはＳｅｒ２６４がリン酸化されている。ＮＥＣＤはｍＡｂｓ−ｓｃｃ３２７５（Ｎｏｔｃｈ分子全体を認識する）、およびＨ１３１（ＮＩＣＤの１００および８０ｋＤａにそれぞれ対応する２つのポリペプチドを検出する）を用いて検出される。（Ｃ）Ｎｕｍｂ−１（８７−９５）ペプチド活性化細胞へのＮｕｍｂ−１（８７−９５）ペプチドの提示は、ＰＫＣファミリーメンバー、およびより低い程度では、ＭＡＰＫキナーゼによって媒介されるリン酸化に依存する。ＰＩ３Ｋは、ペプチド提示に関与していないようである。広範なスペクトルのＰＫＣキナーゼ阻害剤、スタウロスポリンを用いるＳＫＯＶ３．Ａ２の処理は、指標細胞株によるＩＦＮ−ｇを消滅させたが、ＰＩ３Ｋ阻害剤ウォートマリン（ＷＴ）ではそうではなかった。黒記号は２４時間測定を示し、白記号は４８時間測定を示す。
【図１２】ＭＣＦ−７は未処理であるか（ＵＴ、Ｇｅｍ感受性）、またはゲムシタビン（３００ｎＭ  ゲムシタビン、３日間、続いて、１００ｎＭ  ゲムシタビン、さらに５日間、Ｇｅｍ耐性）。ＣＤ２４陰性／低細胞の増加であって、ＣＤ２４低およびＣＤ２４高細胞のＭＦＩではないことに注目のこと。この実験は同じ条件で反復し、データを確認した（データ示さず）。
【図１３】癌−幹様細胞（Ｃ−Ｓｔ−Ｃ）は癌細胞塊を生じる。
【図１４】オーロラＡの過剰発現によって引き起こされる発癌の提案されているメカニズム。
【図１５Ａ】Ｎｏｔｃｈは癌細胞増殖を活性化した。
【図１５Ｂ】免疫選択後のＮｕｍｂの機能的修復。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１つの実施形態において、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、およびＮｏｔｃｈ４からなる群より選択されるタンパク質から誘導されたペプチドに対して患者を免疫化することによって、患者における癌を治療する方法に関する。
【００１７】
１つの実施形態において、本発明は、Ｎｕｍｂ１、Ｎｕｍｂ２、Ｎｕｍｂ３、およびＮｕｍｂ４からなる群より選択されるタンパク質から誘導されたペプチドに対して患者を免疫化することによって、患者における癌を治療する方法に関する。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、Ｎｕｍｂ１、Ｎｕｍｂ２、Ｎｕｍｂ３、およびＮｕｍｂ４からなる群より選択されるタンパク質から誘導されたペプチドに対する抗体を含む組成物を患者に投与することによって、患者における癌を治療する方法に関する。
【００１９】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいては単一のＮｏｔｃｈ受容体および２つのリガンド（ＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅ）が存在している。哺乳動物においては４種の受容体および５種のリガンドが存在している。Ｎｏｔｃｈ１〜４は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｏｔｃｈのホモログであり；Ｄｅｌｔａ様−１、−３、および−４（Ｄ１１１、Ｄ１１３、Ｄ１１４）はＤｅｌｔａのホモログであり；Ｊａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２（Ｊａｇ１およびＪａｇ２）はＳｅｒｒａｔｅのホモログである。
【００２０】
各Ｎｏｔｃｈ受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインからなる全長前駆体タンパク質として合成される。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、通常、２つの隣接する細胞間のリガンド受容体結合によって活性化される。この相互作用は、その細胞外ドメイン中で、切断部位、Ｓ２を露出して、受容体におけるコンホメーションの変化を誘導する。メタロプロテアーゼＴＮＦα転換酵素（ＴＡＣＥ）および／またはＫｕｚｂａｎｉａｎによる切断後、Ｎｏｔｃｈ受容体は、切断部位Ｓ３において膜内タンパク質分解を受ける。γセクレターゼ複合体によって媒介されるこの切断は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（Ｎ−ＩＣＤ）を遊離させ、次いで、これは、核に移行してＮｏｔｃｈ標的遺伝子を活性化する。γセクレターゼ機能の阻害は、Ｎｏｔｃｈ受容体の最終的な切断を妨害し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を遮断する。Ｎ−ＩＣＤ切断の非存在下において、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子の転写は、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるＨａｉｒｌｅｓｓの抑制因子（再組換えシグナル結合タンパク質ｊｋ（ＲＢＰ−ｊｋ）ホモログ）によって媒介されるリプレッサー複合体によって阻害される。
【００２１】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける最近の研究は、Ｈａｉｒｌｅｓｓ経路の正準の抑制因子とは独立してＮｏｔｃｈがシグナル伝達可能であることを示唆している。しかしながら、これが脊椎動物に当てはまるか否かは明らかではない。筋原細胞株および発生しつつあるトリ神経堤からのいくつかの初期の証拠は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達がドミナントネガティブなＨａｉｒｌｅｓｓの抑制因子の存在下で起こり得るが、さらなる性格付けが、脊椎動物における代替的な下流の経路を確立するために必要であることを示唆している（１０）。
【００２２】
本発明のＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、およびＮｏｔｃｈ４は哺乳動物タンパク質であり、１つの実施形態において、ヒトタンパク質である。１つの実施形態において、Ｎｏｔｃｈ１は配列番号１で示される配列を有する。１つの実施形態において、Ｎｏｔｃｈ２は配列番号２で示される配列を有する。１つの実施形態において、Ｎｏｔｃｈ３は配列番号３で示される配列を有する。１つの実施形態において、Ｎｏｔｃｈ４は配列番号４で示される配列を有する。
【００２３】
哺乳動物Ｎｕｍｂは、４種のスプライシングアイソフォーム、Ｎｕｍｂ１〜Ｎｕｍｂ４を有し、これらは、Ｃ末端のプロリンリッチ領域（ＰＲＲ）における４９アミノ酸挿入（５ｋＤａ）の存在または非存在に基づいて、２つの型（ＮｕｍｂＬおよびＮｕｍｂＳ）に分けられる。
【００２４】
１つの実施形態において、Ｎｕｍｂ１は配列番号５で示される。１つの実施形態において、Ｎｕｍｂ２は配列番号６で示される。１つの実施形態において、Ｎｕｍｂ３は配列番号７で示される。１つの実施形態において、Ｎｕｍｂ４は配列番号８で示される。
【００２５】
本明細書で使用される「ペプチド」は、約５〜約５０アミノ酸を含む任意のオリゴマーを指す。「ペプチド」は、ペプチドがそのペプチドのアミノ酸配列のサブ配列と少なくとも約９５％の同一性を有する場合に、タンパク質から「誘導される」。１つの実施形態において、タンパク質から誘導されたペプチドは、そのタンパク質のアミノ酸配列のサブ配列と、少なくとも約９６％の同一性、例えば、約９７％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性、９９．５％の同一性、または９９．９％の同一性を有してもよい。本明細書で使用される場合、「から誘導される」とは、ペプチドがタンパク質のタンパク質分解によって産生されなければならないとは言及しないし、そのことを暗示することもない。ペプチドは、タンパク質のタンパク質分解によって、タンパク質のアミノ酸配列を考慮した化学合成、ペプチドをコードする核酸配列を発現する生物の使用によって、または当該分野において公知である他の技術によって、製造されてもよい。
【００２６】
１つの実施形態において、ペプチドは、ＤＧＶＮＴＹＮＣ（配列番号９）、ＲＹＳＲＳＤ（配列番号１１）、ＬＬＥＡＳＡＤ（配列番号１８）、ＬＬＤＥＹＮＬＶ（配列番号２１）、ＭＰＡＬＲＰＡＬＬＷＡＬＬＡＬＷＬＣＣＡ（配列番号２２）、ＮＧＧＶＣＶＤＧＶＮＴＹＮＣ（配列番号２５）、ＤＧＶＮＴＹＮＣＲＣＰＰＱＷＴＧ（配列番号３０）、ＲＭＮＤＧＴＴＰＬＩ（配列番号３２）、およびＬＫＮＧＡＮＲ（配列番号３５）からなる群より選択される。
【００２７】
１つの実施形態において、上記ペプチドは、Ｎｏｔｃｈ１２７４−２８２（配列番号１０）、Ｎｏｔｃｈ１１９３８−１９４３（配列番号１１）、Ｎｏｔｃｈ１１９３８−１９４６（配列番号１２）、Ｎｏｔｃｈ１１９３８−１９４７（配列番号１３）、Ｎｏｔｃｈ１１９４０−１９４８（配列番号１４）、Ｎｏｔｃｈ１１９４０−１９４９（配列番号１５）、Ｎｏｔｃｈ１１９４４−１９５５（配列番号１６）、Ｎｏｔｃｈ１１９４７−１９５５（配列番号１７）、Ｎｏｔｃｈ１２１１１−２１２０（配列番号１９）、Ｎｏｔｃｈ１２１１２−２１２０（配列番号２０）、Ｎｏｔｃｈ１２１１３−２１２０（配列番号２１）、Ｎｏｔｃｈ２１−２０（配列番号２２）、Ｎｏｔｃｈ２７−１５（配列番号２４）、Ｎｏｔｃｈ２２７１−２８５（配列番号２６）、Ｎｏｔｃｈ２２７１−２８６（配列番号２７）、Ｎｏｔｃｈ２２７７−２８５（配列番号２８）、Ｎｏｔｃｈ２２７７−２８６（配列番号２９）、Ｎｏｔｃｈ２１９４０−１９４８（配列番号３１）、Ｎｏｔｃｈ２１９４０−１９４９（配列番号３２）、Ｎｏｔｃｈ２１９９１−２００３（配列番号３３）、Ｎｏｔｃｈ２１９９５−２００３（配列番号３４）、およびＮｏｔｃｈ２１９９７−２００３（配列番号３５）からなる群より選択される。
【００２８】
１つの実施形態において、上記ペプチドは、ＬＷＶＳＡＤＧＬ（配列番号３７）、ＣＲＤＧＴＴＲＲＷＩＣＨＣＦＭＡＶＫＤ（配列番号３８）、ＲＷＩＣＨＣＦＭＡＶＫＤ（配列番号３９）、ＲＷＬＥＥＶＳＫＳＶＲＡ（配列番号４１）、およびＶＤＤＧＲＬＡＳＡＤＲＨＴＥＶ（配列番号４３）からなる群より選択される。
【００２９】
１つの実施形態において、上記ペプチドは、Ｎｕｍｂ１８７−９５（配列番号３６）、Ｎｕｍｂ１８８−９５（配列番号３７）、Ｎｕｍｂ１１３１−１４９（配列番号３８）、Ｎｕｍｂ１１３８−１４９（配列番号３９）、Ｎｕｍｂ１１３９−１４７（配列番号４０）、Ｎｕｍｂ１４４２−４５３（配列番号４１）、Ｎｕｍｂ１４４３−４５１（配列番号４２）、Ｎｕｍｂ１５９２−６０６（配列番号４３）、およびＮｕｍｂ１５９４−６０２（配列番号４４）からなる群より選択される。
【００３０】
上記ペプチドは、生理食塩水のような薬学的に受容可能なキャリアであって、とりわけ当該分野において公知であるものも含む組成物の成分であってもよい。
【００３１】
上記ペプチドは、それに対する抗体を産生するために使用することができる。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（一般的に「抗体」）の産生および精製のための方法は当該分野において公知である。１つの実施形態において、上記ペプチドは、抗体がペプチドに対して産生可能であるような様式でＨＬＡ−Ａ−Ａ２分子と共有結合される。
【００３２】
一旦、産生および精製されると、ペプチドに対する抗体は、癌を治療するために患者に直接的に投与可能であり、または他の物質とともに組成物を形成して、癌を治療するために患者に投与可能である組成物を生じることが可能である。１つの実施形態において、抗体は、抗癌剤および放射性同位元素からなる群より選択される治療分子とともに組成物を形成可能である。例示的な抗癌剤としては、とりわけ、以下が挙げられるがこれらに限定されない：パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社からタキソール（Ｔａｘｏｌ）として市販されている）、ドキソルビシン（商品名アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）としてもまた公知）、ビンクリスチン（商品名オンコビン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）、ビンカサール（Ｖｉｎｃａｓａｒ）ＰＥＳ、およびビンクレックス（Ｖｉｎｃｒｅｘ）として公知）、アクチノマイシンＤ、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、デカルバジン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトザントロン（ｍｉｔｏｚａｎｔｒｏｎｅ）、オキサリプラチン、プロカルバジン、ステロイド、ストレプトゾシン、タキソテレ、タモゾロミド、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポテカン、トレオスルファン、ＵＦＴ（ウラシル−テグフル（ｔｅｇｕｆｕｒ））、ビンブラスチン、およびビンデシン。
【００３３】
癌治療の当該分野において公知である放射性同位元素には、とりわけ以下が含まれるがこれらに限定されない：１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、２２１Ａｔ、２２５Ａｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、９９Ｒｅ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、または１５３Ｓｍ。
【００３４】
抗体が治療分子とともに組成物に形成される場合、１つの実施形態において、上記治療分子は、抗体の重鎖の定常領域に共有結合される。１つの実施形態において、上記治療分子は、例えば、以下によって共有結合可能である：（ｉ）スルフヒドリル（−ＳＨ）含有置換基を治療分子に加えること；（ｉｉ）重鎖の定常領域にスルフヒドリル含有置換基を有する抗体を調製すること；および（ｉｉｉ）抗体および治療分子を、それらのスルフヒドリル含有置換基を通して反応させ、治療分子と抗体の重鎖の定常領域の間で−Ｓ−Ｓ−結合を形成すること。
【００３５】
１つの実施形態において、ペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物は、当該分野において公知である、アルムニウム塩、ＱＳ２１、ＭＦ５９、またはビノソームなどの、アジュバントをさらに含んでもよい。
【００３６】
上記ペプチドは、もしあれば、ペプチドに対する抗体の形成を誘発することを当業者が予測するような様式で、薬学的に受容可能なキャリアとともに患者に投与可能である。ワクチン接種の方法は当該分野において周知である。ペプチドの投与は、ＮｏｔｃｈまたはＮｕｍｂのアップレギュレーション、過剰発現、または脱抑制によって特徴付けられる任意の癌を治療するために使用可能である。１つの実施形態において、上記癌は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病およびリンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肝臓癌、胃癌、明細胞腎細胞癌腫、および結腸癌からなる群より選択される。
【００３７】
「ペプチドに対する免疫化」およびこの語句のバリエーションは、抗体が抗原としてのペプチドを認識する、患者の免疫系による１つ以上の抗体の作製の誘導をいう。理論によって束縛されることはないが、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、およびＮｏｔｃｈ４からなる群より選択されるタンパク質から誘導されるペプチドに対して患者を免疫化することによって、すなわち、ペプチドに対する抗体の作製を誘導することによって、Ｎｏｔｃｈのアップレギュレーション、過剰発現、または脱抑制によって特徴付けられる癌に罹患している少なくともある患者が治療可能であり、すなわち、腫瘍サイズまたは癌細胞の計数の少なくとも部分的な減少を経験することが考えられる。
【００３８】
１つの実施形態において、上記ペプチドは、投与後に抗体がペプチドに対して産生可能であるような様式で、投与前にＨＬＡ−Ａ２分子と共有結合される。
【００３９】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下に続く実施例において開示されている技術は、本発明の実施において十分に機能するために、本発明者によって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると見なされ得ることが当業者によって理解されるべきである。しかしながら、本開示に鑑みて、開示される特定の実施形態において多くの変更が行われ得、本発明の技術思想および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似の結果がなお得られることを、当業者は理解するべきである。
【実施例】
【００４０】
（実施例１）
要約：Ｎｏｔｃｈは、多くの細胞系譜において、細胞運命特定の制御、および増殖と分化の間のバランスの維持に関与している原形質膜受容体である。Ｎｏｔｃｈの破壊は、種々の血液癌および固形癌に関連付けられてきた。Ｎｕｍｂもまた、多くの成熟哺乳動物細胞において発現されている。成熟細胞は対称的に分裂し、Ｎｕｍｂは有糸分裂において対称的に分配される。Ｎｕｍｂ媒介性Ｎｏｔｃｈ調節は、天然に存在する乳癌において原因となる役割を果たしていると考えられている。乳癌におけるＮｕｍｂレベルの減少は、プロテオソーム性分解によって調節されている。
【００４１】
本発明者らは、Ｎｕｍｂタンパク質によるＮｏｔｃｈの調節されないネガティブ制御がＮｕｍｂのプロテオソーム性分解の結果であるならば、Ｎｕｍｂの分解はＭＨＣ−Ｉ分子によって提示される輸送されるペプチドを生成し得ると推論している。驚くべきことに、本発明者らは、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、およびＮｕｍｂ１から自然に処理されたペプチドの候補をほとんど発見しなかった。ペプチドＮｏｔｃｈ１（２１１２−２１２０）およびＮｕｍｂ１（８７−９５）を特異的に認識したＴＤＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞は、卵巣癌患者の腹水中で提示された。これらの細胞の多くは分化しており、高レベルのパーフォリンを発現していた。
【００４２】
Ｎｏｔｃｈ１の天然の免疫原性、特に、Ｎｕｍｂ１のそれは、腫瘍の進行の間に克服される免疫学的監視のメカニズムを示唆する。ＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂからの腫瘍抗原を用いる免疫治療は、癌患者の治療のために重要であるはずである。
【００４３】
緒言：Ｎｏｔｃｈは、多くの細胞系譜において、細胞運命特定の制御、および増殖と分化の間のバランスの維持に関与している原形質膜受容体である（１、２）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は多数の生理学的プロセスにおいて重要であり、Ｎｏｔｃｈの破壊は種々の血液癌および固形癌に関連付けられてきた。
【００４４】
最もよい例は、Ｎｏｔｃｈの変異と、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病およびリンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）との間の連関である。Ｔ−ＡＬＬ腫瘍細胞のサブセットにおいて、（７、９）染色体点座は、Ｎｏｔｃｈ１の３’位をＴ細胞受容体Ｊβ遺伝子座に融合する。これは、短縮型Ｎｏｔｃｈ１タンパク質を生じ、これは構成的に活性かつ異常に発現される（３）。加えて、（７、９）転座とは独立した、Ｎｏｔｃｈ１の活性化変異が、ヒトのＴ−ＡＬＬ症例の５０％を超えて見出されてきた（４）。
【００４５】
異常なＮｏｔｃｈシグナル伝達はまた、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、肝臓癌、胃癌、および結腸癌を含む固形腫瘍において報告されているが、遺伝子損傷の証拠はなかった（５〜７）。Ｎｏｔｃｈは、癌の型、存在する他のシグナル伝達経路、および活性化されるＮｏｔｃｈ受容体の同一性に依存して、発癌性または腫瘍抑制性のいずれかの役割を果たす可能性がある。
【００４６】
しかしながら、乳癌を含む大部分の症例においては、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は腫瘍増殖を促進する（８）。Ｎｏｔｃｈの発癌性の役割についての１つのメカニズムは、分化を妨害し、幹細胞表現型を維持するその能力から駆動され得るというものである。幹細胞および癌細胞は、無限の増殖および未分化などの共通の特徴を共有している。さらに、幹細胞および腫瘍細胞における自己再生は、ソニックヘッジホッグ、Ｗｎｔ、およびＮｏｔｃｈを含む同様の経路によって調節されている。腫瘍細胞は、正常な幹細胞から誘導され、癌は、治療に対して抵抗性がある「癌幹細胞」を有することが可能である（９）。
【００４７】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいては単一のＮｏｔｃｈ受容体および２つのリガンド（ＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅ）が存在している。哺乳動物においては、本概説の焦点である４個の受容体および５種のリガンドが存在している。Ｎｏｔｃｈ１〜４はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｏｔｃｈのホモログであり；Ｄｅｌｔａ様−１、−３、および−４（Ｄ１１１、Ｄ１１３、Ｄ１１４）はＤｅｌｔａのホモログであり；Ｊａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２（Ｊａｇ１およびＪａｇ２）はＳｅｒｒａｔｅのホモログである。
【００４８】
各Ｎｏｔｃｈ受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインからなる全長前駆体タンパク質として合成される。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、通常、２つの隣接する細胞間のリガンド受容体結合によって活性化される。この相互作用は、その細胞外ドメイン中で、切断部位、Ｓ２を露出して、受容体におけるコンホメーションの変化を誘導する。メタロプロテアーゼＴＮＦα転換酵素（ＴＡＣＥ）および／またはＫｕｚｂａｎｉａｎによる切断後、Ｎｏｔｃｈ受容体は、切断部位Ｓ３において膜内タンパク質分解を受ける。γセクレターゼ複合体によって媒介されるこの切断は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（Ｎ−ＩＣＤ）を遊離させ、次いで、これは、核に移行してＮｏｔｃｈ標的遺伝子を活性化する。γセクレターゼ機能の阻害は、Ｎｏｔｃｈ受容体の最終的な切断を妨害し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を遮断する。Ｎ−ＩＣＤ切断の非存在下において、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子の転写は、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるＨａｉｒｌｅｓｓの抑制因子（再組換えシグナル結合タンパク質ｊｋ（ＲＢＰ−ｊｋ）ホモログ）によって媒介されるリプレッサー複合体によって阻害される。
【００４９】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける最近の研究は、Ｈａｉｒｌｅｓｓ経路の正準の抑制因子とは独立してＮｏｔｃｈがシグナル伝達可能であることを示唆している。しかしながら、これが脊椎動物に当てはまるか否かは明らかではない。筋原細胞株および発生しつつあるトリ神経堤からのいくつかの初期の証拠は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達がドミナントネガティブなＨａｉｒｌｅｓｓの抑制因子の存在下で起こり得るが、さらなる性格付けが、脊椎動物における代替的な下流の経路を確立するために必要であることを示唆している（１０）。
【００５０】
胚形成における非対称的な細胞分裂の間、Ｎｏｔｃｈの活性は、細胞の運命の決定因子であるＮｕｍｂによって生物学的に拮抗される（１１、１２）。非対称的な細胞分裂は、分化した娘細胞および未分化娘細胞における幹細胞の分裂から構成される。Ｎｕｍｂはまた、多くの成熟哺乳動物細胞においても発現されている（１３）。成熟細胞は対称的に分裂し、Ｎｕｍｂは有糸分裂において対称的に分配される。対称的な分配は、Ｎｕｍｂが不活性であり、またはさらなる機能を有することを示唆する。Ｎｕｍｂ／Ｎｏｔｃｈ拮抗作用は、正常な乳房柔組織の分裂の制御と関連する。正常な乳房柔組織は、常に変わることなく、強力かつ均一なＮｕｍｂ染色を発現している。対照的に、腫瘍は顕著に不均一性を示し、多くの場合において、Ｎｕｍｂ免疫反応性の完全な非存在を示す（１４、１５）。
【００５１】
この情報およびさらなる情報に基づいて、ＮｏｔｃｈのＮｕｍｂ媒介調節の破壊（遮断または阻害による）は、天然に存在する乳癌の原因となる役割を果たしていると考えられる。８０％の乳癌が、腫瘍細胞の５０％でＮｕｍｂの免疫反応性を示す。このように、すべての乳癌のほぼ半分でＮｕｍｂレベルが減少している。Ｎｕｍｂ発現レベルと、攻撃性疾患の公知の指標である腫瘍悪性度およびＫｉ６７標識指標との間で、強力な逆相関が見出された（１４）。低レベルＮｕｍｂは、ＭＧ１３２などのプロテアソーム阻害剤を用いる処理によって高レベルまで回復されることが報告された（１４）。研究された乳癌におけるＮｕｍｂレベルの減少は、一般的に増加したプロテオソーム活性の結果であるとは見られなかった。プロテオソーム性分解によってもまた調節される他の細胞タンパク質の基底レベルが同じ実験条件下で影響を受けなかったからであるが、この問題はさらなる研究を必要としている。
【００５２】
本発明者らは、Ｎｕｍｂタンパク質によるＮｏｔｃｈの調節されないネガティブ調節がＮｕｍｂプロテアソーム分解の結果であるならば、Ｎｕｍｂの分解は、抗原プロセシングと関連するトランスポーター（ＴＡＰ）によって輸送され、かつＭＨＣ−Ｉ分子によって提示されるペプチドを生成し得ると推論している。これらのＭＨＣ−Ｉ  Ｎｕｍｂペプチド複合体を認識するＴ細胞は、健常個体において寛容化または除去される可能性がある。さらに、Ｎｏｔｃｈの分解がそのシグナル伝達のために必要とされる場合には、Ｎ−ＩＣＤの分解もまた、Ｎｏｔｃｈペプチドを生成するはずである。Ｎｏｔｃｈフラグメントのいくつかがプロテアソームによって分解される場合、これらもまた、ＭＨＣ−Ｉ分子によって提示される可能性がある。ＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂペプチドが寛容原性ではない場合には、このようなペプチドのための受容体を有する活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞が、癌患者の中でインビボで検出されるはずである。本研究は、この仮説に取り組むために実施した。
【００５３】
材料と方法：
予測アルゴリズムを有する候補ＭＨＣ−Ｉ結合ペプチドの同定。本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＨＬＡ−ＤＲ分子を結合可能であるペプチドを同定するために以下のプログラムを使用した：（１）ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃへのペプチド結合を予測するためのＢＩＭＡＳ（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ．）（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｃｉｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ）（１６）；（２）ＰＡＰＲＯＣ（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ）、ＰＡＰＲＯＣは実験的な切断データに基づく、ヒトおよび酵母の２０Ｓプロテアソームによる切断のための予測ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｐｒｏｃ２．ｄｅ／ｐａｐｒｏｃｌ／ｐａｐｒｏｃｌ．ｈｔｍｌ）、および（３）ＭＨＣ−ＩＩ結合ペプチドの予測のためのＴＥＰＩＴＯＰＥプログラム、このプログラムはＪｕｒｇｅｎ  Ｈａｍｍｅｒ博士（Ｒｏｃｈｅ）から入手可能である（ｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｏｍｅ．ｃｏｍ）（１７、１８）。
【００５４】
生成されるプロテアソームの予測およびＭＨＣ−Ｉ結合ペプチドを同定するために、本発明者らは、ＮＣＢＩからＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、およびＮｕｍｂ１のアミノ酸配列をダウンロードした。これらのアクセッション番号は、それぞれ、Ｎｏｔｃｈ１（ＮＭ＿０１７６１７）、Ｎｏｔｃｈ２（ＮＭ＿０２４４０８）、およびＮｕｍｂ１（Ｐ４９７５７）である。本発明者らは、ヒトプロテオソーム野生型１、２、および３によって産生されたペプチドを同定した。
【００５５】
ペプチド候補ＣＤ８＋細胞エピトープを含むＮｏｔｃｈ１領域およびＮｕｍｂ１領域の三次元タンパク質構造モデルは、Ｓｗｉｓｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｐｒｏｇｒａｍを使用してダウンロードした。Ｓｗｉｓｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｐｒｏｇｒａｍは、完全に自動化されたタンパク質構造相同性モデリングプログラムであり、ＥｘＰＡＳｙウェブサーバーを介して（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／）、またはプログラムＤｅｅｐ  Ｖｉｅｗ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｄｂ−  Ｖｉｅｗｅｒ、ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｄｂｖｌ）からアクセス可能である（１９）。ペプチドが配置されているＮｏｔｃｈ１領域およびＮｕｍｂ１領域の分子モデルは、図１（Ａ〜Ｄ）に示される（２０〜２２）。
【００５６】
細胞株。本発明者らは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手したヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３、およびヒト平滑筋肉腫細胞株ＳＫ−ＬＭＳ−１を使用した。すべての細胞株は、１０％  ＦＣＳ、１００単位／ｍｌ  ペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で増殖させた。細胞は処理前に８０％のコンフルエンシーまで単層で増殖させた。
【００５７】
リンパ球培養。リンパ球は、ＨＬＡ−Ａ２＋卵巣癌患者からのヘパリン処理腹水から、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によって単離した。分離後、本発明者らは、本発明者が記載したように、１週間、１０％  ＦＣＳおよび３００ＩＵ  ＩＬ−２（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地を用いてリンパ球を培養した（２３、２４）。
【００５８】
合成ペプチド。以下のペプチドを本研究において使用した：Ｎｏｔｃｈ１（１９４７−１９５５、ＲＬＬＥＡＳＡＤＡ）、Ｎｏｔｃｈ１（２１１２−２１２０、ＲＬＬＤＥＹＮＬＶ）、Ｎｕｍｂ１（８７−９５、ＶＬＷＶＳＡＤＧＬ）、Ｇｌｉｌ（５８０−５８８、ＧＬＭＰＡＱＨＹＬ）、およびＡＥＳＩ（１２８−１３７、ＬＰＬ  ＴＰＬＰＶＧＬ）。これらのすべてのペプチドは、ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｍ．Ｄ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＭａｒｔｉｎ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ博士によって合成された。アミノ酸は、Ｒａｉｎｉｎ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で、標準的なＮ−（９−フルオレニル）メトキシ−カルボニルペプチドケミストリーを使用して、ＣＯＯＨ末端から連続的な様式でカップリングを行い、高速液体クロマトグラフィーによって精製した。ペプチドの純度は９５％〜９７％の範囲であった。ペプチドは１０％  ＤＭＳＯを有するＰＢＳに溶解し、本発明者らが記載するように使用するまで、１ｍｇ／ｍｌのアリコートで−２０℃にて保存した（２３）。
【００５９】
フローサイトメトリー。腫瘍細胞上でのＮｏｔｃｈ１分子の発現を調べるために、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍで前処理し、細胞内染色のためにＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって洗浄した細胞を、抗Ｎｏｔｃｈ１モノクローナル抗体−ＰＥ（フィコエリトリン）標識およびＰＥ結合体化マウスモノクローナルアイソタイプコントロール抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｎｉｉｎｇｅｎ）で染色し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒを、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ）およびＦｌｏｗ−Ｊｏプログラム（Ｍａｃバージョン８．１１  Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ，ＯＲ）とともに使用して分析した（２５）。
【００６０】
本発明者らは、同じリガンドを用いるインビトロ刺激に際してＣＴＬ分化におけるＴＣＲ密度の役割を評価するために各ペプチドと反応性である高濃度／多数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞を同定した。１０１よりも高い平均蛍光密度（ＭＦＩ）を有する抗原四量体／二量体を用いる細胞染色を通常含むＴＣＲ＋集団は、３つの集団に分割し、１つは、１０１〜１０２のＭＦＩ（ＴＣＲ）を有する抗原パルスしたＨＬＡ−Ａ２／ＩｇＧ二量体（二量体）を用いて染色し、他のものは、１０２〜１０３のＭＦＩ（ＴＣＲ）を有する抗原パルスした二量体を用いて染色し、他のものは１０３〜１０４のＭＦＩ（ＴＣＲ）を有する抗原パルスした二量体を用いて染色した。これらの集団は、本発明者らが記載したように、それぞれ、ＴＣＲ低、ＴＣＲ中、ＴＣＲ中と称する（２６）。
【００６１】
Ｔ細胞：ペプチド−ＨＬＡ−Ａ２−ＩｇＧ二量体相互作用。Ｎｏｔｃｈ１（１９４０−１９４８）、Ｎｏｔｃｈ１（２１１２−２１２０）、Ｎｕｍｂ１（８７−９５）、Ｇｌｉ１（５８０−５８８）、およびＡＥＳＩ（１２８−１３７）に特異的なＴＣＲの発現は、ＨＬＡ−Ａ２−ＩｇＧ−二量体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して決定した。ペプチド負荷二量体は、本発明者らが以前に記載したように調製した（２３）。この二量体でのリンパ球の染色は、以前に記載されたように実施した（２４、２７、２８）。
【００６２】
同じ細胞をまた、この二量体とは異なる蛍光色素：フルオレセイン  イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、およびＰＥに結合体化された特異的抗体を使用して、ＣＤ８抗原の発現およびパーフォリン（エフェクターポア形成酵素）の存在について染色した。対応するペプチド負荷二量体を反応する細胞は、それぞれ、Ｎｏｔｃｈ１−１９４０−ＴＣＲ＋細胞、Ｎｏｔｃｈ１−２１１２−ＴＣＲ＋、Ｎｕｍｂ１−８７−ＴＣＲ＋、およびＧｌｉ１−８７−ＴＣＲ＋細胞と称する。ペプチドを負荷していないコントロールＨＬＡ−Ａ２−ＩｇＧ二量体を反応させた細胞はｄＮＰ−ＴＣＲ＋細胞と称する。
【００６３】
結果：
プロテアソーム処理ペプチドの選択。候補免疫原性ＮｕｍｂペプチドおよびＮｏｔｃｈペプチドの予備分析は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ結合予測アルゴリズムに基づいて、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、およびＮｕｍｂ１からのペプチドが、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ分子に結合することを同定した。結果は、非常に大量のペプチドを示し、これは、いくつかのＭＨＣ−Ｉへの潜在的な結合因子である。非常に大量のＭＨＣ−Ｉ結合ペプチドは、ペプチド選択を困難にした。本発明者らは、以下に結合する潜在能力を有するペプチドを検索および同定した：（ａ）コーカサス人および中国人においてより高い頻度で発現されているＨＬＡ−Ａ２、（ｂ）日本人においてより高い頻度で発現されているＨＬＡ−Ａ２、および（ｃ）アフリカ系米国人にいてＨＩＶに対するＴ細胞応答と関連していると報告されているＨＬＡ−Ａ３３（２９）。本発明者らはまた、他のＨＬＡ−Ａ２集団におけるよりも、ＨＬＡ−Ａ２＋アフリカ系米国人においてより頻度が高い（２５％）ＨＬＡ−Ａ２．５への潜在的な結合因子を調べた（３０）。
【００６４】
自己／腫瘍（ＴＡ）−抗原の免疫優勢は、ＭＨＣ−Ｉへの抗原の結合親和性によって常に決定されるわけではない。実際は、免疫原性ペプチドのいくつかは（Ｃ８５、ＭＡＲＴ−１）、ＨＬＡ−Ａ２に対して非常に弱い結合因子である。内因性に処理される、本発明者らの免疫原性ペプチドの選択の機会を改善するために、本発明者らは、プロテオソーム消化予測分析を実施した（１８）。表１の結果は、ＨＬＡ分子のいずれかに結合すると予測されるもののうちで非常に少ないＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、およびＮｕｍｂ１ペプチドのみが、内部のタンパク質のプロテアソーム消化によってもまた生成可能であることを示す。実際は、Ｎｏｔｃｈ１からの２種のペプチドのみ、およびＮｕｍｂ１からの１種のみが、結合することが予測されているこれらのＭＨＣ−Ｉ対応物と類似していた。
【００６５】
【表１】
2010520280.tif 000002
ａ）ＭＨＣ−１を結合可能であるペプチドを生成する予想プロテアソームは、プログラムＰＡＰＲＯＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｐｒｏｃ２．ｄｅ／ｐａｐｒｏｃ１／ｐａｐｒｏｃ１．ｈｔｍｌ）を用いて同定した。
ｂ）消化型は、プログラムＰＡＰＲＯＣによって１、２、および３と称するタンパク質分解特異性（ｓｐｅｒｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）を示す。
ｃ）「／」はペプチドの消化の位置および得られた生成物を示す。
ｄ）Ｎ／Ａは「利用不可」、結合したペプチドがないことを示す。
【００６６】
表１の結果は、ペプチドＮｏｔｃｈ１（２１１２−２１２０）およびＮｏｔｃｈ１（２７４−２８２）が、プロテオソームによって処理され、それぞれ、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ３３によって、８量体として提示されることを示す。Ｎ末端およびＣ末端のアンカーモチーフの位置に基づいて、Ｎｏｔｃｈ１（２１１２−２１２０）のみがＨＬＡ−Ａ２と複合体を形成し得る。香味深いことに、Ｎｏｔｃｈ１（２１１２−２１２０）はまた、ＨＬＡ−Ａ２．１よりも低い親和性ではあるが、Ａ２．５もまた結合し得る。それゆえに、Ｎｏｔｃｈ１（２１１２−２１２０）は、それぞれ、Ａ２．１およびＡ２．５を発現する、コーカサス人およびアフリカ系米国人のための共通の／共有されているエピトープであり得る。
【００６７】
完全に異なる結果をＮｏｔｃｈ２ペプチドについて得た。ペプチドＮｏｔｃｈ２（１９４０１９４８）のみが、プロテアソームによって消化され、ＨＬＡ−Ａ２４による１０量体として提示されることが可能である。このペプチドおよびすべての他のＮｏｔｃｈ１ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２またはアフリカ系米国人集団における応答と関連する組織適合性遺伝子産物のいずれかによって提示不可能である。しかしながら、Ｎｏｔｃｈ２（１９４０−１９４８）は、プロテアソームによって生成され、ＨＬＡ−Ａ２．５によって提示されることが可能である。それゆえに、Ｎｏｔｃｈ２（１９４０−１９４８）は、ＨＬＡ−Ａ２４とＨＬＡＡ２．５と関連して腫瘍によって提示可能である。Ｎｏｔｃｈ２（１９４０−１９４８）はＮｏｔｃｈ１（１９４７−１９５５）とは配列が異なっていることもまた強調されるべきである。
【００６８】
結果はＮｕｍｂについて驚くべきものであった。Ｎｕｍｂ１ペプチド（８７−９５）は、プロテアソームによって消化され、ＨＬＡ−Ａ２．１によって８量体として提示可能である。Ｎｕｍｂペプチド４４３−４５１は、ＨＬＡ−Ａ２．１によって提示され、１２量体として提示可能であり、従って、その免疫原性は、エキソペプチダーゼによるトリミングに依存する可能性がある。
【００６９】
天然の免疫原性ペプチドの検出。プロテオソームによって不完全に消化されたペプチドが修復可能であるか否かに取り組むために、本発明者らは、新たな候補免疫原を操作した。Ｎｏｔｃｈ２（１９４０−１９４８）およびＮｕｍｂ（４４３−４５１）などの９アミノ酸長を超えるペプチドは、提示前にＮ末端およびＣ末端でトリミング可能である。修復を操作するために、本発明者らは、同じ最小９アミノ酸エピトープを保持し、隣接する残基を修飾した。修飾は、Ｎｏｔｃｈ／Ｎｕｍｂ隣接残基を、他のタンパク質からの隣接残基で置き換えることによって行った。これは、ＨＬＡ−Ａ２と関連する、最小ＣＴＬエピトープの提示を可能にする。結果は、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｕｍｂ１からのＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドのみがプロテオソーム性消化後に提示可能であったことを示す（表２）。
【００７０】
【表２】
2010520280.tif 000003
（＊）ＲＭＨＨＤＩおよびＲＳＰＱＬは上記のＮｏｔｃｈ１ペプチドの隣接残基である。
（＊＊）すべての得られた残基はＨＬＡ−Ａ２に対して非常に低い親和性を有する。
ＨＬＡ−Ａ２結合スコアは：１４７．６９７（９量体）、０．０７５（１０量体）、および１１．８６１（１０量体）である。太字および斜字体は配列中の置換を示す。
【００７１】
これらのタンパク質のどれがインビボで抗原性であるかを同定するために、本発明者らは、ペプチドＮｏｔｃｈ１（１９４７−１９５５）、Ｎｏｔｃｈ１（２１１２−２１２０）、およびＮｕｍｂ１（８７−９５）を特異的に認識可能であるＴＣＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を決定した。プロテオソーム性消化によって生成されることが知られているＡＥＳＩペプチド（１２８−１３７）は、インビボ免疫原性のための陰性対照として使用した。プロテオソーム性消化によっては生成されないＧｌｉ１ペプチド（５８０−５８８）は、陰性対照として使用した。ベースラインＴＣＲ＋細胞数はｄＮＰ二量体を用いて決定した。本発明者らは、進行した疾患を有する患者からの卵巣腫瘍関連リンパ球中で、高い、中程度、または低い親和性を有するＴＣＲを有するＣＤ８＋細胞の存在を調べた。
【００７２】
卵巣癌におけるＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂのタンパク質およびリガンドの存在の意義は、発癌の間に、成熟卵巣血管系と血管形成性新生血管の両方を含む、卵巣血管のサブセット中でＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂが発現されているという事実に起因する（３１）。卵巣中でのこれらの発現は、内皮細胞と血管関連壁細胞の両方において見出された（３２）。腫瘍血管形成は、Ｎｏｔｃｈを含む生理学的血管形成と同じ経路の多くを含む。これは、ヒト腫瘍サンプルとマウス異種移植片の両方において示されてきた。インサイチュハイブリダイゼーションおよび定量的な（ｐｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ポリメラーゼ連鎖反応（ｐＰＣＲ）によって測定すると、０１１４ｍＲＮＡは、腎臓または乳房サンプルにおいては検出不可能であったが、ヒト明細胞腎細胞癌腫および乳癌の血管系においては高度に発現されていた。腫瘍サンプルの中では、０１１４発現はｍＲＮＡレベルでＹＥＧＦと正の相関があった（３３）。異種移植片研究において、０１１４を発現しないヒトＭＣＦ７細胞株が腫瘍を生じ、それらの血管系の中で高レベルのマウス０１１４を発現した（３４）。現在、腫瘍における０１１４の研究は、良好なモノクローナル抗体の欠如によって妨害されている。免疫組織化学によって０１１４タンパク質レベルの測定を可能にする抗体を開発するための研究が進行中である。
【００７３】
分化を調節するＮｏｔｃｈ経路の構成要素は腺癌においてより頻繁に発現されるのに対して、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄは腺腫においてより頻繁であった（３５）。ｑＰＣＲは、腺腫と比較して卵巣腺癌においてＮｏｔｃｈ１  ｍＲＮＡが減少していることを明らかにした。Ｎｏｔｃｈ１細胞外タンパク質の発現は良性腫瘍および悪性腫瘍において同様であった（３５）。ＨＥＳ−１タンパク質は、１８／１９卵巣癌および境界型腫瘍において強力に発現されることが見出されたが、腺腫においてはそうではなかった。従って、Ｎｏｔｃｈ経路の構成要素のいくつかは、腺腫と癌腫の間で示差的に発現されている（３６）。
【００７４】
別々の実験において、本発明者らは、ＡＥＳ１がＳＫ−ＯＶ−３（卵巣癌細胞）およびＳＫＢＲ３（乳癌細胞）において強力に発現されることを見出した。腫瘍細胞に対するＮｏｔｃｈの発現を調べるために、本発明者らは、Ｎｏｔｃｈ１および対応するアイソタイプ対照に対する抗体を使用して、ＳＫ−ＯＶ−３、ＭＣＦ７、およびＳＫ−ＬＭＳ−１悪性平滑筋肉腫を染色した。図２の結果（Ａ〜Ｆ）は、ＳＫ−ＯＶ−３およびＭＣＦ７がＮｏｔｃｈ１を発現するが、ＳＫ−ＬＭＳ−ＩはＮｏｔｃｈ１を発現しないことを示す。
【００７５】
本発明者らは、非活性化クローンの拡大を回避するために、低濃度のＩＬ−２とともに卵巣腹水を培養した。図３は、腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）の増殖の反応速度論を示す。本発明者らは、ＣＤ８＋Ｎｕｍｂ１−８７−ＴＣＲ＋細胞が患者番号１からの培養腹水に存在することを見出しており、これは、Ｎｏｔｃｈ１−２１１２−ＴＣＲ＋、およびＡＥＳ１−１２８−ＴＣＲ＋細胞よりも多い数であった（図４Ｂ〜Ｄ）。Ｎｕｍｂ−ＴＣＲ＋ＣＤ８＋細胞はパーフォリンを発現し、これは、これらの細胞がインビボで分化したことを示した（図４Ｇ）。パーフォリンの発現は、２つのシグナル：１つはＴＣＲから、他方はＩＬ−２から、によって成業されていることが言及されるべきである。あらゆる特異性のＴ細胞が、同じ量のＩＬ−２中で培養されたので、本発明者らの結果は、パーフォリン発現の違いは、抗原による活性化に起因する。
【００７６】
Ｎｏｔｃｈ１−ＴＣＲ＋細胞およびＮｕｍｂ−ＴＣＲ＋細胞が他の患者からの腹水に存在するか否かに取り組むために、本発明者らは、４例のさらなるＨＬＡ−Ａ２＋からの卵巣−ＴＡＬを用いて実験を反復した。表３、および図５は、患者番号２、４、および５
が、Ｎｏｔｃｈ１−２１１２ＴＣＲ＋、およびＮｕｍｂ１−８７−ＴＣＲ＋ＣＤ８＋細胞を含んでいたことを示す。Ｎｏｔｃｈ１−２１１２−ＴＣＲ＋、Ｎｕｍｂ１−８７  ＴＣＲ＋細胞は、ＩＬ−２を用いる培養３週間後には、患者３からの培養腹水中でもはや検出されなかった（表３）。これは、これらの細胞が、他のＴ細胞集団の増殖のために、拡大しなかったかまたは希釈されたかのいずれかであることを示している。
【００７７】
【表３】
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（＊）ベースライン対照ｄＮＰと反応性である陽性細胞％よりも有意に高く（２倍）、特異性対照Ｎｏｔｃｈ１（１９４７）−ＴＣＲ＋細胞よりも高い。卵巣ＴＡＬを、３００ＩＵ  ＩＬ−２を含む培地中で１週間培養した。
【００７８】
特異的ＴＣＲの密度に基づいてＣＤ８＋集団を特徴付けするために、本発明者らは、ＴＣＲ高細胞、ＴＣＲ中細胞、およびＴＣＲ低細胞の存在を調べた。図５ＤおよびＨは、患者２における有意な数のＮｕｍｂ１−８７−ＴＣＲ低ＣＤ８＋細胞の存在を、対照、ベースライン対照と相互作用した細胞、空の二量体（ｄＮＰ−ＴＣＲ＋細胞）、および陰性対照、Ｎｏｔｃｈ１−１９４７ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２二量体を相互作用した細胞と比較して示す。Ｎｏｔｃｈ−２１１２−ＴＣＲ＋細胞の少しの増加もまた存在した（図５ＣおよびＧ）。これらの結果は、大きなブラストサイズの集団の中で、ＣＤ８＋細胞の別個の分析において確認した（図５Ｇおよび５Ｈ）。大きなブラストサイズＴ細胞は、活性な細胞合成を有し、分裂するリンパ球である。同様の結果は患者５でも観察され、この患者における違いは、Ｎｕｍｂ１−８７−ＴＣＲ高ＣＤ８＋細胞は、対照のｄＮＰ−ＨＬＡ−Ａ２−ＩｇＧ二量体と反応性である細胞よりも２．４５倍多かった。Ｎｏｔｃｈ  １−２１１２ＴＣＲ中細胞もまた、ベースライン対照、ｄＮＰと反応性である細胞よりも１．６３倍多く存在した（表３）。患者４においては、本発明者らは、ベースライン、ＮＰ二量体と相互作用した細胞と比較して、２．６１倍多いＮｏｔｃｈ１−２１１２−ＴＣＲ中細胞を見出した（表３）。これらの結果は、４例すべての卵巣患者からのすべての腹水が、Ｎｏｔｃｈ１−２１１２ペプチドおよび／またはＮｕｍｂ１−８７ペプチドのＴＣＲを有する細胞を含んだことを示す。
【００７９】
それゆえに、ペプチドＮｏｔｃｈ１−２１１２およびＮｕｍｂ１−８７は、インビボで産生されるのみならず、卵巣癌患者の腹水中でインビボでＣＤ８＋細胞を活性化する。
【００８０】
考察：本研究において、本発明者らは、卵巣癌患者においてＣＤ８＋細胞についてのインビボで天然の免疫原である、ＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂから候補ペプチドを同定した。候補ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３３、およびＨＬＡ−Ｃｗ４分子へのそれらの結合モチーフに基づいて選択した。さらなるストリンジェンシーのパラメーターとして、本発明者らは、プロテオソームによって産生される候補天然免疫原性ペプチドを同定した。第３に、プロテオソームによって産生されると同定されたペプチドとして、本発明者らは「修復可能」ペプチドのみを選択した。「修復可能」ペプチドのみが、ＡＰＣ中で腫瘍Ａｇの前駆体を送達するＤＮＡおよびＲＮＡベクターによって発現可能である。
【００８１】
驚くべきことに、本発明者らは、各タンパク質からの非常に少ない天然の免疫原性ペプチド、およびＨＬＡ−Ａ２と関連して提示される各々１つのみを見出した。天然に免疫原性であるペプチドは、新規かつ感度の高い方法によって同定した。本発明者らは、ＴＡ／ペプチド負荷したＡ２−ＩｇＧ二量体を使用し、本発明者らは、ペプチドを負荷していない陰性対照二量体を用いる染色と比較することによって、卵巣ＴＡＬの認識の特異性を決定した。これらのリンパ球の分化は、パーフォリンの発現および細胞あたりのパーフォリン（ＭＦＩとして）の量を測定することによって決定した。本発明者らは、５例の患者のうちの２例が、Ｎｏｔｃｈ１−２１１２に特異的なＴＣＲを発現するＣＤ８＋パーフォリン細胞を活性化し、５例のうちの３例が、Ｎｏｔｃｈ１−８７に特異的なＴＣＲを発現するＣＤ８＋パーフォリン細胞を活性化したことを見出した。これらのＣＤ８＋細胞は、腫瘍を認識するＴ細胞の公知の低ＴＣＲ密度よりも、より高密度のＴＣＲを発現した。本発明者らの結果は、卵巣癌免疫治療のためのＮｏｔｃｈ１−２１１２ペプチドおよびＮｕｍｂ１−８７ペプチドの使用を予測する。
【００８２】
ＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂは、卵巣癌のみならず、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、および結腸癌においてもまた発現される（５〜７、３７）。特異的免疫治療標的化により、これらの分子は、これらの抗原を発現する腫瘍の除去において有効であり得る。最近、ＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂは、癌細胞の分化および転移の潜在能力を制御することが示された。ＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂを標的とする免疫治療は、化学療法耐性であるのみならず、患者の死亡を迅速にもたらす肝臓および膵臓の癌の治療選択にすぐになるという可能性がある。
【００８３】
本研究の結果はまた、ＨＬＡ−Ａ２系に向けた免疫原性ＴＡの選択性を示す。ＨＬＡ−Ａ２スーパータイプには、ＨＬＡ−Ａ２（サブタイプ１〜７）に加えて、ＨＬＡ−Ａ６８．２、およびＨＡＬＬ６９．１が含まれる。しかしながら、プロテオソーム性消化の結果がＨＬＡ−Ａ２サブタイプの親和性と比較された場合には、ＨＬＡ−Ａ２．５のみが、ＨＬＡ−Ａ２．１と同じペプチドを提示可能であった。ＨＬＡ−Ａ２．５は、ヒト起源と関連して、祖先の対立遺伝子と見なされている。しかしながら、ＨＬＡ−Ａ２．５によって提示可能であるＮｕｍｂ１ペプチドは、癌に対する予防を付与しないようである。ＨＬＡ−Ａ２．５およびＨＫＡ−Ａ２４と関連するＮｏｔｃｈ２ペプチドのみが、ある程度の予防を付与する可能性がある。次に、Ｎｏｔｃｈ１がコーカサス人における予防のために有意であるのに対して、Ｎｏｔｃｈ２は、何人かのアフリカ系米国人において癌の予防のために有意であるだろうか？
ＨＬＡ−Ａ２．１とのＮｏｔｃｈ１およびＮｕｍｂ１の関連性は、コーカサス人およびヒスパニックにおける癌予防のために有意である可能性がある。次に、肝臓および膵臓の癌からの予防は、最初はＮｕｍｂ１により、次にはＮｏｔｃｈ１による、免疫学的監視の冗長性に起因するのだろうか？
ＨＬＡ−Ａ２４へのペプチド結合は、提示のためにネガティブに選択した。本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２４への潜在的な結合と、プロテオソーム消化による産生の両方として、１０量体Ｎｏｔｃｈ２（１９４０−１９４９）のみを見出した。ＨＬＡ−Ａ２４と結合したＮｏｔｃｈ１ペプチドおよびＮｕｍｂ１ペプチドのいずれもポジティブに選択されなかった。ＨＬＡ−Ａ２４産物は、東南アジア人に高頻度でプレセットされており、特に、日本において最も高頻度である（３８）。
【００８４】
異なる民族的グループの中で癌の発生率には明確に違いがある。例えば、結腸直腸癌の発生率は、世界中で少なくとも２５倍の変動が存在する。その最高の発生率は北米、オーストラリア／ニュージーランド、西ヨーロッパにおいてであり、、男性では、とりわけ、日本においてであり（１００，０００人あたり４９．３人）；発生率はアフリカおよびアジアで低い傾向があり（例えば、中国は男性で１００，０００人あたり１５．６人）、南アメリカの南部地域では中間である。胃癌については、胃癌の地理学的分布は、国の間での広い変動によって特徴付けられ；高リスク地域には、東アジア（例えば、日本−年齢標準頻度６２．１）、西ヨーロッパ、ならびに中南米の地域が含まれる。発生率は、男性では、南アジア、北部および東部アフリカ、北米（例えば、年齢標準頻度はわずか７．４）、ならびにオーストラリアおよびニュージーランドにおいて低い。膵臓癌はＵＳＡおよび日本で最高であるのに対して（それぞれ、１００，０００人あたり１１．８人および１０．９人）、アフリカおよび中国では最低である（それぞれ、１００，０００人あたり２．１人および６．３人）。多くの要因、例えば、食事、環境、習慣（喫煙および飲酒の履歴）、および遺伝がこの変動に寄与している。免疫遺伝は、確かに、寄与している要因の１つであり得る（３９）。
【００８５】
このような要因には、食事の成分や、名目上同じ成分の食事においては、食事の中での代謝および組織再生の経路に干渉する化合物の存在が含まれる可能性がある。
【００８６】
ペプチドワクチンを用いる、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｕｍｂに対する免疫療法の開発は、急速に致死的な癌を発症する高いリスクを有する集団のために有用であり得る。
【００８７】
Ｐａｒｋらは、Ｎｏｔｃｈ−３が卵巣癌において過剰発現されていると報告した（３７）。本発明者らは，ＨＬＡ−Ａ２分子に結合し、Ｉ型プロテアソーム酵素活性によって消化されるが、ＩＩ型またはＩＩＩ型によってはほとんど消化されないか、全く消化されない、６種のＮｏｔｃｈ−３ペプチドを見出した。Ｎｏｔｃｈ−３ペプチドは、癌免疫療法の良好な標的であり得る。
【００８８】
（実施例２）
緒言
正常な発生の間に、幹細胞再生は、周囲の幹細胞環境からのシグナルによって調節される。幹細胞集団の拡大は、特定のニッチまたは期間が形成されるときに停止する。この事象は、転移性の形質転換を暗示しない。多数の両性腫瘍が同様の理由のために拡大可能であるからである。ＮｏｔｃｈおよびＨｅｄｇｅｈｏｇなどの、正常細胞の自己再生を調節する経路の相互の影響の解明が進行中である（４０）。
【００８９】
癌細胞は、活性化発癌遺伝子（例えば、Ｒａｓ、ＢＣｒ−Ａｂｌなど）とともに、調節解除されたＮｏｔｃｈおよびＨｅｄｇｅｈｏｇを含む。化学療法および放射線療法は衆生細胞を抹殺することが期待されているが、転移は、癌幹細胞（Ｃｓｔ−Ｃ）の特徴を有する腫瘍細胞が、化学療法および放射線療法に耐性である腫瘍細胞の集団の中に隠れていることを示唆している。癌細胞の増殖潜在性は、正常な幹細胞の能力と非常に類似している。この潜在能力は、対称的な細部分裂、およびアンカー非依存的な細胞増殖として説明できた（４１）。発癌性Ｒａｓ変異が蓄積する場合に、正常な幹細胞が悪性幹細胞（癌幹細胞）に変化する可能性がある（４２）。
【００９０】
膵臓癌は、世界中で５番目に多い癌である。その非常に高い死亡率の理由は、早期診断の手段が欠けていること、初期診断の時点で切除不能であること、および切除後の迅速な再発が含まれる。外科的切除は、局所的拡大および転移のために、膵臓癌細胞においては治療の選択肢であることはまれである。進行した膵臓癌を有する患者にとって、化学療法などの治療の選択肢は限られており、ゲムシタビン（ＧＥＭ）が現在の標準的な治療である（４３、４４）。多くの臨床試験が組み合わせ化学療法を研究したが、進行した膵臓癌患者の予後の有意な改善を提供する戦略は同定されていない。新たな治療アプローチが必要とされている（４５〜４９）。１つのブレイクスルー点は、化学療法に抵抗性があるＣＳｔ−Ｃを標的とすることかもしれない。
【００９１】
細胞表面マーカーＣＤ４４およびＣＤ２４減（ＣＤ２４低）の発現によって特徴付けられる乳癌細胞（ＢＲ−Ｃ）は、ＣＳｔ−Ｃ機能的特性を有する（５０）。ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋膵臓癌細胞は、免疫不全マウスにおいて腫瘍を形成する。ＣＤ４４は、ＣＳｔ−Ｃのために重要であり得る。なぜなら、ＣＤ４４のレベルは、転移の間の癌細胞のホーミングと相関したからである（５２）。ＣＤ１３３（プロミニン−１）の発現は、神経Ｓｔ−Ｃと脳ＣＳｔ−Ｃの間を区別した（５３）。ＣＤ１３３＋結腸癌細胞は、ＣＤ１３３−細胞とは異なり、指数関数的に増殖した（５４、５５）。正常な前立腺幹細胞もまた、ＣＤ１３３を発現するが、しかしながら、ＣＤ４４＋／α２β１高／ＣＤ１３３＋表現型を有するＣＤ１３３は、ＣＳｔ−Ｃ特性を有する（５６）。
【００９２】
これらの知見は、化学療法剤がＣＳｔ−Ｃマーカーを発現する細胞を抹殺するかという疑問を惹起した。本発明者らは、ＧＥＭが、ＰＣ、ＢＲ−Ｃ、および上皮卵巣癌（ＢＯＶＣ）系統において、ＣＤ４４＋ＣＤ１３３＋、およびＣＤ２４低ＣＤ１３３＋細胞をポジティブに選択することを見出した。ＧＭＥ耐性（ＧＥＭ耐性）ＰＣ、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２は、ＮＥＣＤおよびＮＩＣＤの発現において、ＧＥＭ耐性ＢＲ−Ｃ、ＭＣＦ７とは異なっていた。ＧＥＭ耐性細胞のＤＬＬ４活性化は、含まれる培地よりも、ＣＤ４４＋ＣＤ２４低細胞の２〜３倍高い拡大を生じた。Ｎｏｔｃｈ＋およびＣＤ４４＋ＣＤ２４低細胞は、ＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂペプチド活性化ＰＢＭＣによって、およびより少ない程度では、ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣによって抹殺された。
【００９３】
材料と方法
細胞株および材料。ヒト癌細胞株ＰＣ（ＭＩＡ−ＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ−１、およびＡｓＰＣ−１）、ＢＲ−Ｃ細胞株（ＭＣＦ７）、卵巣癌（ＳＫＯＶ−３）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。すべての細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／Ｌ  ペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で、９５％加湿空気および５％二酸化炭素、３７℃で培養した。
【００９４】
試薬は以下の通り購入した：塩酸ゲムシタビン（ゲムザール（Ｇｅｍｚａｒ）（登録商標、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、パクリタキセル（タキソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、フルオレセイン  イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合体化マウス抗ヒト上皮特異的抗原（ＥＳＡ）モノクローナル抗体（Ｂｉｏｍｅｄａ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合体化マウス抗ＣＤ４４モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＦＩＴＣ結合体化マウス抗ＣＤ４４モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）結合体化マウス抗ＣＤ２４モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＦＩＴＣ結合体化マウス抗ＣＤ２４モノクローナル抗体（Ａｂｅａｍ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＰＥ結合体化マウス抗ＭＩＣＡ／Ｂ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ＡＰＣ結合体化マウス抗ＣＤ１３３／２抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）および組換えヒトデルタ様タンパク質４（ＤＬＬ４）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。
【００９５】
抗癌薬物による腫瘍細胞株の増殖の阻害。ＩＣ５０は、本発明者ら記載したように、ＧＥＭ、ＰＴＸ、およびＦＵとの７２時間の曝露後に、古典的な３−（４，５−ジメチルトリアゾリル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイによって決定した（７３）。
【００９６】
フローサイトメトリー分析。すべての細胞は、Ｇｅｍとともに、２×ＩＣ５０ゲムシタビンで、１０日間培養した。培養細胞（２×１０５）を冷ＰＢＳ中で洗浄し、続いて、２０μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で、氷上にて１時間ブロッキングした。この工程は、染色の間に免疫グロブリンの非特異的結合を阻害するために必要であった。次いで、細胞を、ＥＳＡ、ＣＤ４４、およびＣＤ２４に対する抗体で三重染色した。分析は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて実施した。細胞をＥＳＡ＋集団でゲートした。ＣＤ２４およびＣＤ４４の発現をゲートしたＥＳＡ＋細胞中で本発明が記載したように試験した（２６）。ＥＳＡ＋、ＣＤ４４高、およびＣＤ２４低／−細胞の集団は、全細胞および全ＥＳＡ＋細胞のパーセントとして計算した。すべての細胞株もまた、ＭＩＣ−Ａ／ＢおよびＣＤ１３３で染色し、上記のように分析した。他の実験において、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２およびＭＣＦ７は、２倍ＩＣ５０濃度のＧＥＭ、ＰＴＸ、またはＦＵとともに、続いて、０．７倍ＩＣ５０濃度で３日間で培養し、上記のように染色および分析した。
【００９７】
ＤＬＬ４によるＧＥＭＲｅｓ  ＭＣＦ７の刺激。ＧＥＭＲｅｓ  ＭＣＦ７は、０．３μＭ  ＧＥＭで７週間の培養後に得た。ＭＣＦ７は、ＤＬＬ４の存在下または非存在下で、エストラジオール、線維芽細胞増殖因子を含む培地中で２４時間刺激した（４０）。
【００９８】
ＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂペプチドを用いるＨＬＡ−Ａ２  ＰＢＭＣの刺激。天然の免疫原性ＮｏｔｃｈＮＩＣＤ（２１１２−２１２０）およびＮｕｍｂ  １−ＰＴＢドメインペプチド（８７−９５）を、本発明者らが記載したように同定した（Ｉｓｈｙｉａｍａ  ２００７）。非接着ＰＢＭＣは、本発明者らが記載したように、ペプチドパルスした自系未熟ＤＣを用いて活性化した（２６）。
【００９９】
ウェスタンブロット分析。生ＭＩＡ−ＰａＣａ−２、ＭＣＦ７、およびＳＫＯＶ−３の細胞溶解物を、培養物のトリプシン処理後に、本発明者らが記載したように（７４）調製した。この手順は、死滅した細胞および死滅しかけた細胞を除外する。細胞タンパク質は，ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ポリビニリデンジフルオリドメンブレンに移した。免疫ブロッティングおよび定量を、本発明者らが記載したように実施した（７４）。
【０１００】
結果
ＰＣ系統Ｍｉａ−ＰａＣａ−２およびＰＡＮＣ−１の薬物感受性は、ＢＲ−Ｃ系統ＭＣＦ７のそれと同様である。抗癌薬物耐性細胞を選択するために、本発明者らは、ＰＣ系統ＭＩＡ−ＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ−１、ＡｓＰＣ−１；ＢＲ−Ｃ系統、ＭＣＦ７；およびＥＯＶＣ系統に対するＧＥＭ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、およびパクリタキセル（ＰＴＸ）の細胞毒性を定量した。３種すべての薬物が癌治療のために有効であった。ＧＥＭは、フェーズＩＩＩ臨床試験において、５−ＦＵよりも、ＰＣに対して少し良好な臨床的利点を提供する（４４、４５）。ＰＴＸもまた、ＰＣに対して試されたが
しかしながら、ＧＥＭと比較して、改善を示さなかった。
【０１０１】
表１は、７２時間で５０％細胞増殖を阻害した薬物濃度（ＩＣ５０）を示す。ＩＣ５０の最も広い分散は、８００（ＰＡＮＣ−１）〜１５，２００ｎＭ（ＡｓＰＣ−１）の範囲である５−ＦＵについて見出された。ＰＴＸのＩＣ５０は３．９〜１８．３ｎＭの狭い範囲であった。多くのＰＴＸ耐性ＡｓＰＣ−１のＩＣ５０は、多くのＰＴＸ感受性ＰＡＮＣ−１のそれよりも４倍より大きかった。Ｍｉａ−ＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ−１、およびＭＣＦ７は、ＧＥＭに対して同様の高い耐性を示し、それぞれ、３００、３５０、および４３０ｎＭのＩＣ５０であった。ＡｓＰＣ−１およびＳＫＯＶ−３は、ＧＥＭ感受性（ＧＥＭ感受性）であり、２０ｎＭでＩＣ５０であった。それゆえに、Ｍｉａ−ＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ−１、およびＭＣＦ７において、３種の薬物のＩＣ５０は同様であった。
【０１０２】
【表４−１】
2010520280.tif 000005
【０１０３】
【表４−２】
2010520280.tif 000006
＊ＤＬＬ４での刺激の際に総細胞数の４５％＜増加。＊＊ゲムシタビンなしと比較して、ゲムシタビンを用いる選択後に、ＢＲ−ＣＳｔ−Ｃの集団の２．７〜２．８倍の増加
【０１０４】
【表５】
2010520280.tif 000007
ＥＳＡ＋ＣＤ４４＋ＣＤ２４低、ＣＤ４４＋ＣＤ１３３＋およびＣＤ２４低ＣＤ１３３＋細胞は、薬物に対するＰＣ、ＢＲ−Ｃ、およびＥＯＶＣの耐性を増加した。乳房腫瘍からのＥＳＡ＋ＣＤ４４高ＣＤ２４低細胞は、ＣＳｔ−Ｃの機能的特徴を有している（５０）。脳腫瘍、前立腺癌、および結腸癌からのＣＤ１３３＋細胞は、ＣＳｔ−Ｃであると見なされている（５３〜５６）。抗癌薬物がＣＳｔ−Ｃ表現型を有する集団を増加させるという仮説に取り組むために、本発明者らは、ＧＥＭの存在下または非存在下で培養したＰＣ系統上でのこれらのマーカーの発現を試験した。表１Ｃならびに図６および７Ａ、Ｂは、ＥＳＡの発現が、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２およびＰＡＮＣ−１を除いた癌系統の大部分において高かったことを示す。ＥＳＡ＋細胞はＧＥＭ耐性細胞を増加した。ＥＳＡ＋ＣＤ４４高ＣＤ２４低集団は、ＡｓＰＣ−１を除いたすべてのＧＥＭ耐性細胞において増加した。
【０１０５】
ＥＳＡ＋ＣＤ４４高ＣＤ２４低およびＣＤ１３３＋集団は、Ｍｉａ−ＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ−１、ＭＣＦ７、およびＳＫＯＶ３における全体の集団と比較して、３〜５倍、ＧＥＭ耐性集団を増加したが、ＡｓＰＣ−１においては増加しなかった（図８Ａ）。ＧＥＭとともに培養した生ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞の形態学的外見は、円形から、紡錘型または長い触手を有する細胞に変化した（図１０Ａ、Ｂ）。これらの外見は、ヒト膵臓幹細胞の型と類似であった（５７）。
【０１０６】
ＥＳＡ＋ＣＤ４４高ＣＤ２４低集団は、ＧＥＭ耐性Ｍｉａ−ＰａＣａ−２およびＭＣＦ７で増加したので、本発明者らは、他の化学療法剤が同様の効果を有したか否かを調べた。ＣＳｔ−Ｃ集団は、ＧＥＭおよび５−ＦＵで処理されたＭＩＡ−ＰａＣａ−２において増加したが、ＰＴＸ処理では増加しなかった（図７Ａ）。例えば、３．０×１０６Ｍｉａ−ＰａＣａ−２細胞から開始し、１．３、３．３、３．４、および８．１×１０６細胞を、ＧＥＭ、ＰＴＸ、５−ＦＵ、および薬物なしでそれぞれ収集した。０．６、０．４、１．６、および８．７×１０６ＭＣＦ−７を、それぞれ、ＧＥＭ、ＰＴＸ、５−ＦＵ、および薬物なしで、３×１０６ＭＣＦ−７細胞の培養後に収集した。ＧＥＭおよび５−ＦＵは、ＭＣＦ７とＭｉａ−ＰａＣａ−２の両方においてＣＳｔ−様−Ｃ集団増加したが、ＰＴＸはＭＣＦ７中のそれを増加した（図７Ｂ）。
【０１０７】
化学療法薬物は、薬物耐性細胞中でＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する集団を増加する。
【０１０８】
薬物耐性癌細胞は、細胞免疫エフェクターに対してより感受性があるという仮説に取り組むために、本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＭＩＣ−Ａおよび−Ｂの発現を定量した（５８、５９）。ＥＳＡ＋ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞を、ＭＩＣ−Ａ／Ｂについて分析した。ＭＣＦ７細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ２４、およびＭＩＣ−Ａ／Ｂを用いて分析した（図７Ｂ）。なぜなら、ほぼすべての（９５％以上）ＭＣＦ７細胞がＥＳＡを発現したからである。
【０１０９】
ＭＩＣ−Ａ／Ｂは、未処理ＭＩＡ−ＰａＣａ−２の２８．９％で存在した。ＧＥＭ耐性および５−ＦＵ耐性Ｍｉａ−ＰａＣａ−２細胞は、３倍より多く、ＭＩＣ−Ａ／Ｂの発現を有意に増加した（図７Ａ）。多くのＥＳＡ＋ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞は、ＭＩＣ−Ａ／Ｂを豊富に発現した。ＣＳｔ−様−Ｃは、あらゆる抗癌薬物に対して耐性であるＭＣＦ７の完全な集団の中で増加した。しかしながら、ＭＩＣ−Ａ／Ｂの発現は、ＣＤ４４およびＣＤ２４の発現と相関しなかった。
【０１１０】
ゲムシタビンは、より高いＮＥＣＤを有するＭＣＦ１細胞、およびより高いＮＩＣＤを有するＭＩＡ−ＰａＣａ−２を選択する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、正常な関西部の生存および増殖を促進する。Ｎｏｔｃｈシグナルは、短縮型細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）によって媒介され、これは、核における転写を活性化する。Ｎｕｍｂは、Ｎｏｔｃｈの分解を誘導することによってＮｏｔｃｈシグナル伝達と拮抗する（６０、１３）。哺乳動物Ｎｕｍｂは４種のスプライシングアイソフォームを有し、これらは、Ｃ末端のプロリンリッチ領域（ＰＲＲ）における４９アミノ酸挿入（５ｋＤａ）の存在または非存在に基づいて、２つの型（ＮｕｍｂＬおよびＮｕｍｂＳ）に分けられる。ＮｕｍｂＬまたはＮｕｍｂＳがＮｏｔｃｈの顕著なアンタゴニストであるか否かは不明である。ＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂタンパク質の発現を特徴付けするために、本発明者らは、ＧＥＭのあるなしで培養した生ＭＩＡ−ＰａＣａ−２およびＭＣＦ７の溶解物中でのタンパク質の定量的免疫ブロット分析を実施した（図９）。
【０１１１】
ＧＥＭ感受性細胞と比較して、Ｎｏｔｃｈ細胞外ドメイン（ＮＥＣＤ）発現は、ＧＥＭ耐性ＭＩＡ−ＰａＣａ−２において１８％、およびＭＣＦ７において７３％増加した。対照的に、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２（３５％）においてはわずかに増加したが、ＭＣＦ７においては３９％減少した。ＮｕｍｂＬ発現は、ＧＥＭ耐性ＭＩＡ−ＰａＣａ−２において５０％増加したが、ＧＥＭ耐性ＭＣＦ７において２９％減少した。対照的に、ＮｕｍｂＳは、ＧＥＭ耐性ＭＩＡ−ＰａＣａ−２とＭＣＦ７の両方において１８％減少した。結果は、ＧＥＭ耐性ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞が機能的なＮＩＣＤ量を有意に増加したのに対して、ＭＣＦ７は、ＮｕｍｂＬの同時の減少とともにＮＥＣＤを増加した。本発明者らの結果は、ＧＥＭ耐性ＭＣＦ７のＮｏｔｃｈリガンドに対する感受性は、ＧＥＭ耐性ＭＩＡ−ＰａＣａ−２のそれよりも高いことを示す。
【０１１２】
ＧＥＭ耐性におけるＤＬＬ４によるＮｏｔｃｈシグナル伝達の活性化はＣＳｔ−Ｃを増加させる。デルタ様タンパク質４（ＤＬＬ４）は、Ｎｏｔｃｈ受容体の内皮性活性化リガンドである（６１、６２）。多くの（＞９０％）のＧＥＭ耐性ＭＣＦ７細胞はＧ１（休止）期にあった。これらの実際の細胞数は時間とともに減少した。本発明者らは、可溶性ＤＬＬ４を用いて、ＧＥＭ耐性ＭＣＦ７においてＮｏｔｃｈシグナル伝達を活性化した。ＤＬＬ４は、ＧＥＭの非存在下および存在下で増殖を活性化した。ＤＬＬ４＋ＧＥＭは、ＤＬＬ４単独と比較して、ＣＳｔ−Ｃ集団をほぼ３倍、選択的に拡大した（表１Ｃ）。多数のＤＬＬ４拡大細胞は、ＣＤ４４低ＣＤ２４低およびＣＤ２４高表現型であった（図８Ｂ）。このような細胞は、これらの接着が乏しいので、高い転移の潜在性があると記載されてきた（６３）。
【０１１３】
ＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂペプチド活性化ＰＢＭＣは、ＣＤ４４高ＣＤ２４低およびＮｏｔｃｈ＋細胞を抹殺する。ＭＣＦ７がＭＩＣ−Ａ／Ｂ、Ｎｏｔｃｈ、およびＮｕｍｂタンパク質を発現するという知見は、ＭＣＦ７がＩＬ−２活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ならびにＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂペプチド活性化ＰＢＭＣに対して感受性があるか否かという疑問を惹起した。データ（示さず）は、ＭＣＦ７を有する健常ＨＬＡ−Ａ２一致ドナーからの、ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣを用いる免疫選択が、ＮＩＣＤ＋ＭＣＦ７細胞の数を３６％減少したことを示す。Ｎｏｔｃｈ１１２１２−２１２０ペプチド活性化ＰＢＭＣは、ＮＩＣＤ＋細胞の数を５０％減少したのに対し、Ｎｕｍｂ８７−９５ペプチド刺激ＰＢＭＣは、ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣと同様の非特異的効果を媒介した。それゆえに、ペプチド活性化ＰＭＢＣの一部は、ＨＬＡ−２によって提示されるＮｏｔｈｃ−ＮＩＣＤ領域からのペプチドを認識した。
【０１１４】
活性化ＰＢＭＣがＣＳｔ−様−Ｃの拡大を阻害したか否かを同定するために、本発明者らは、同じ活性化ＰＢＭＣとともに、ＧＥＭ耐性およびＧＥＭ感受性ＭＣＦ７を同時培養した。データ（示さず）は、ＭＣＦ７細胞が、ＩＬ−２活性化されかつＮｏｔｃｈ−１２１１２−２１２０＋ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣとの同時培養の間に、数が減少しなかったことを示す。Ｎｕｍｂ８７−９５＋ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣは、ＩＬ−２−ＰＢＭＣと比較して、ＭＣＦ７およびＣＤ４４高ＣＤ２４低ＭＣＦ７の数を有意に減少した。
【０１１５】
ＧＥＭ耐性ＭＣＦ７が同じ免疫エフェクターに対して感受性があったか否かに取り組むために、本発明者らは実験を反復した。データ（示さず）は、ＧＥＭ耐性細胞がゆっくりと増殖し、５日間で５０％のみ数が増加したことを示す。免疫エフェクターとの同時培養は、ＭＣＦ７増殖を完全に阻害した。対照的に、ＣＤ４４高ＣＤ２４低細胞は非常にゆっくりと増殖し、これらは、免疫エフェクターの非存在下では、５３，０００細胞〜６０，０００細胞まで増加し、ＩＬ−２活性化およびＩＬ−２プラスペプチド活性化ＰＢＭＣを用いる免疫選択後には、非選択ＧＥＭ耐性ＭＣＦ７と比較して、２倍より多く数が有意に減少した。ＩＬ−２活性化またはペプチド活性化ＰＢＭＣとの同時培養後に、ＧＥＭ耐性ＭＣＦ７の生存の有意な違いはなかった。
【０１１６】
結果は、ＧＥＭ耐性ＭＣＦ７上でのＭＩＣ−Ａ／Ｂ発現の増加と一貫している。活性化ＮＫおよびＣＴＬなどの細胞免疫エフェクター上のＮＫＧ２Ｄ受容体は、ＭＩＣ−Ａ／Ｂの認識によって、腫瘍の抹殺の効率を増幅する（５９）。しかしながら、ＭＣＦ７とＭＩＡ−ＰａＣａ−２の両方のＧＥＭ耐性細胞は、ＭＩＣ−Ａ／Ｂ発現を増加し、天然の免疫単独が、それを発現しないいくつかの細胞を放置した。
【０１１７】
非特異的細胞性免疫はＧＥＭ耐性細胞に対して有効であるが、ＣＳｔ−様−Ｃは脱出し得る。なぜなら、ＭＩＣ−Ａ／Ｂは、特に、ＣＳｔ−様−Ｃ上で発現されなかったからである。ＣＳｔ−様−Ｃを含むＧＥＭ耐性細胞は、Ｇ１停止を維持および克服するためにＮｏｔｃｈシグナル伝達を必要とする。Ｎｏｔｃｈ−１２１１２−２１２０活性化ＰＢＭＣはＮｏｔｃｈ＋細胞を除去可能である。本発明者らの結果は、ＣＳｔ−様−Ｃに対するＧＥＭをとりわけ含む化学療法後に、後天的な特異的かつ天然の免疫治療の見通しを支持する。
【０１１８】
考察
本発明者らは、いくつかのＰＣ系統、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ−１、およびＡＳＰＣ−１が、胸部−ＣＳｔ−Ｃ表現型を有する顕著な集団を含んだことを見出した。加えて、試験したすべての系統が、結腸−ＣＳｔ−Ｃマーカーを発現する顕著なサイズの集団を含んだ。膵臓−ＣＳｔ−様−Ｃの表現型特徴付けは、陽性対照胸部ＭＣＦ７と同時に実施した。機能的タンパク質は、しばしば、それらの組織起源とは独立して、癌細胞の特異的な特徴を提供する。
【０１１９】
試験したすべての細胞株の中でＧＥＭに対して最も感受性があったＡｓＰＣ−１は、ＢＲ−ＣＳｔ−Ｃ表現型（ＥＳＡ＋ＣＤ４４高ＣＤ２４低）の大きな集団および結腸−ＣＳｔ−Ｃ表現型の小さな集団を含んだ。この表現型を有する細胞の大きな数の理由は不明である。ＡｓＰＣ−１が腹水から単離されたので、これはＣＳｔ−Ｃ細胞から生じ、これが腹膜後器官から腹水に侵入しかつ浮遊したという可能性があるかもしれない。
【０１２０】
ＣＳｔ−Ｃ表現型を有する集団は、ＧＥＭまたは５−ＦＵを用いる処理によってＭＩＡ−ＰａＣａ−２において増加したが、ＰＴＸでは増加しなかった。しかしながら、ＣＳｔ−Ｃの集団はＡＳＰＣ−１中では同じままであり、ＧＥＭを用いる処理にいては増加しなかった。この変化の欠如は、ＧＥＭのＩＣ５０とは相関しなかった。本発明者らの結果は、膵臓ＣＳｔ−Ｃが維持のために独特な経路を使用することを示した。
【０１２１】
ＧＥＭおよび５−ＦＵはＤＮＡ合成の阻害剤であり、これはＧ０／Ｇ１およびＳ期での停止を誘導し、腫瘍細胞中でアポトーシスを誘発する（６４、６５）。ＰＴＸ阻害剤は、細胞周期のＧ２およびＭ期において遮断することによって細胞分裂を阻害し、細胞質微小管を安定化する。しかしながら、Ｇ１で静止している癌細胞はＧＥＭおよび５−ＦＵで生き残る。なぜなら、これらの核酸合成は最小限であるからである。対照的に、ＰＴＸは、紡錘体の位置に干渉でき、対称的な細胞分裂を生じる。Ｎｕｍｂ局在化は、非対称的な細胞分裂を生じる。ＰＴＸは、ＣＳｔ−Ｃの有糸分裂段階において、対称と非対称の両方の細胞分裂を停止できる。その後、ＣＳｔ−Ｃは生き残り、薬物の分解後に拡大を開始する。Ｎｏｔｃｈ受容体は、３種のデルタの膜貫通リガンド（ＤＬＬｌ、２、および４）ならびに２種のＳｅｒｒａｔｅ（Ｊａｇｇｅｄ−１および２）リガンドによって活性化される（６５）。ＤＬＬ４によるＮｏｔｃｈ活性化は、血管形成の活性化のために顕著であると最近報告された（６１、６２）。Ｎｏｔｃｈの過剰発現はＮｕｍｂ発現と拮抗し、Ｎｕｍｂ機能を抑制する（１４）。それゆえに、ＤＬＬ４は、ＣＳｔ−様−Ｃの対称的な細胞分裂および迅速な拡大をブーストする。
【０１２２】
このプロセスにおけるＧＥＭの役割は何であろうか？ＧＥＭおよび５−ＦＵはＤＮＡおよびＲＮＡ合成の阻害剤であり、これは、新たに合成される鎖に取り込まれる。ＧＥＭおよび５−ＦＵはＧ１期の細胞には影響を与えなかった（６４、６６）。ＰＴＸは、微小管を安定化することによって、Ｇ２Ｍ期をブロックする。Ｇ１で静止している癌細胞は、ＧＥＭ、５−ＦＵ、およびＰＴＸで生き残る。なぜなら、これらの核酸合成は最小限であるからである。ＰＴＸは、紡錘体の位置に干渉でき、対称的な細胞分裂を生じる（６７、６８）。Ｎｕｍｂ局在化は、非対称的な細胞分裂を生じる（６９）。その後、ＣＳｔ−Ｃは生き残り、薬物の分解後に拡大を開始する。Ｎｏｔｃｈ受容体は、３種のデルタの膜貫通リガンド（ＤＬＬｌ、２、および４）ならびに２種のＳｅｒｒａｔｅ（Ｊａｇｇｅｄ−１および２）リガンドによって活性化されるときに、独特なシグナルを明らかに伝達する。Ｎｏｔｃｈリガンドが刺激細胞においてＮＥＣＤのエンドサイトーシスを誘導することが最近報告された（７０）。本発明で使用されるＤＬＬ４などの可溶性リガンドは、別の研究後に、ＣＳ−Ｃの増殖を活性化する際に有効性が少ないはずである（７０）。
【０１２３】
ＧＥＭ耐性ＭＣＦ７およびＭＩＡ−ＰａＣａ−２は、ＮＥＣＤ、ＮＩＣＤ、およびＮｕｍｂＬの密度が異なっており、ＭＣＦ７は、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２よりもＮＥＣＤの密度を増加していた。ＭＣＦ７はＮＩＣＤを減少したのに対して、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２はＮＩＣＤを増加した。ＭＣＦ７がＮｏｔｃｈ受容体の密度を増加させることによって応答するためのそれらの「周到さ」を増加させるのに対して、ＭＩＡ−ＰａＣａ−は、薬物が除去されるときに転写を活性化させるためにより多くのＮＩＣＤを「準備中」に保持すると提案することは魅力的である。ＮｕｍｂＬの減少は「応答準備仮説」と一致している。ＣＳｔ−ＣはＧＥＭ耐性細胞中では少数派（＜３０％）であったので、ＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂ活性化のメカニズムおよび経路を同定するために将来の研究が必要とされている。
【０１２４】
本発明者らは、これらの細胞がどのようにして除去できるかを研究した。本発明者らの最初の顕著な知見は、ＧＥＭ耐性細胞が、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＭＩＣ−ＡおよびＢの発現を増加したことである。ＭＩＣ−Ａ／Ｂの発現の増加は、ＮＫおよびＣＴＬおよびサイトカイン活性化リンパ球に対する癌細胞の感受性を増加させるはずである。この知見は、ＰＣにおける腫瘍抗原ワクチンの有効性に対する最近の知見を支持するための理論的根拠を提供する（７１）。
【０１２５】
本発明者らの２番目の顕著な知見は、ＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂそれ自体が、Ｎｏｔｃｈ−ＮＩＣＤおよびＮｕｍｂペプチドに特異的であるＣＴＬによって標的化可能であることである。ＮＩＣＤペプチドは、シグナル伝達後に分解されたＮＩＣＤから生じる。Ｎｕｍｂペプチドは、Ｎｕｍｂリン酸化後に生成する。このシナリオにおいて、ＧＥＭ耐性腫瘍は、Ｎｕｍｂが分解され、ＣＳ−Ｃ増殖が活性化されるときに、ＣＴＬのための標的となる。さらに、ＮＩＣＤは、癌細胞が「応答準備」状態にある場合、ＣＴＬのための良好な標的になる。両方の系統におけるＮｕｍｂの観察された減少、およびＭＣＦ７におけるＮＩＣＤの減少は、これらの試みが化学療法直後に有効であることを示唆する。ＣＳｔ−Ｃは、照射（７２）および化学療法（本研究）に対して抵抗性があることが最近報告された。自系の腫瘍抗原活性化ＴおよびＮＫ細胞を用いる、進行した膵臓癌を有する患者の輸液は、このような患者の生存を延長する可能性がある。
【０１２６】
（実施例３：ヒト固形腫瘍における癌幹細胞様細胞（ＣＳｔ−Ｃ））
幹細胞（Ｓｔ−Ｃ）は、自己再生能力と、多方向に分化する能力の両方を有する細胞である。幹細胞は、器官の生成および初期発生において必要とされるが、しかしまた、種々の組織の傷害または炎症性損傷の修復および維持の間にも必要とされる。
【０１２７】
ある種の遺伝子、例えば、ＲＡＳの中での変異は、完全な癌表現型を有する細胞を付与するために十分である。癌幹細胞（ＣＳｔ−Ｃ）は、原癌遺伝子における変異の蓄積から生じる。Ｃ−Ｓｔ−Ｃｓは、自己再生が可能であり、インビボで腫瘍増殖を持続し、自己再生的分化の能力を有する、生物学的に区別できるクローンを表す。Ｃ−Ｓｔ−Ｃｓは、血液癌、ならびに乳癌、脳腫瘍、前立腺癌、および結腸癌などの固形腫瘍において同定された。Ｃ−Ｓｔ−Ｃｓは、放射線および多剤耐性ならびにアンカー非依存性増殖などの典型的な悪性の特徴をほとんどすべて有する。従って、古典的な治療様式は、これらの細胞を抹殺するのではなく、Ｃ−Ｓｔ−Ｃｓのための栄養素が豊富なニッチを作製することである。分子標的治療の新たなストラテジーが必要である。本実施例において、本発明者らは、Ｃ−Ｓｔ−Ｃｓの抹殺のための適切な標的に焦点を当てる。
【０１２８】
幹細胞および癌発生の対称型／非対称型分裂
Ｓｔ−Ｃは２つの型の分裂、対称型および非対称型を有する。親のＳｔ−Ｃの対称型細胞分裂は、親のＳｔ−Ｃと同じ能力を有する２つの娘細胞Ｓｔ−Ｃを生じ、Ｓｔ−Ｃの数を増加する。非対称細胞分裂は、１つの同一の娘細胞（自己再生）および分化する１つの娘細胞を生じる。非対称分裂は、細胞内および細胞外のメカニズムによって調節される。最初に、細胞の運命を決定する細胞の構成要素の非対称的分割を決定する。外部要因が、微小環境に対して、娘細胞の非対称的配置を媒介する（Ｓｔ−Ｃニッチおよびシグナルに対する曝露）。
【０１２９】
発生の間に観察される対称的Ｓｔ−Ｃ分裂もまた、創傷治癒および再生の間に一般的である。Ｓｔ−Ｃは、胚性または初期胎児発生の間に、未分化娘細胞のＳｔ−Ｃプールを拡大するために対称的分裂を受ける。対称的Ｓｔ−Ｃ分裂はまた、成体においても観察された。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの卵巣において、成体生殖系列幹細胞は、非対称的に分裂して、ニッチの中に幹細胞の運命を有する１つの娘細胞を保持し、他方を分化させるためにニッチの外部に配置する。しかしながら、雌性生殖系列はＳｔ−Ｃは、対称的に分裂させるため、および実験操作後にさらなるＳｔ−Ｃを再生させるために誘導することができ、ここで、１つのＳｔ−Ｃがニッチから取り出される。
【０１３０】
哺乳動物幹細胞もまた、対称型と非対称型の細胞分裂の間でスイッチを切り換えている。神経と上皮の両方の前駆細胞は、胚性発生の間にＳｔ−Ｃプールを拡大する主として対称的な分裂から、中期から後期の妊娠期間において分化した細胞数を拡大する主として非対称型分裂まで変化する。対称型Ｓｔ−Ｃ自己再生および拡大は、発生の柔軟性および生成の増強を付与する。しかしながら、Ｓｔ−Ｃ自己再生はまた、癌の固有のリスクを含む。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ神経芽細胞は、以下の非対称型局在の結果として非対称的に分裂する：（ｉ）皮質細胞極性決定基（例えば、Ｐａｒｔｎｅｒ  ｏｆ  Ｉｎｓｃｕｔｅａｂｌｅ（ＰＩＮＳ）および非定型プロテインキナーゼＣ（ａ−ＰＫＣ））、（ｉｉ）細胞運命の決定因子（例えば、ＮｕｍｂおよびＰｒｏｓｐｅｒｏ）、および（ｉｉｉ）紡錘糸の規則的な整列。非対称分裂を調節する機構が破壊される場合には、神経芽細胞は対称的に分裂し、腫瘍を形成する。
【０１３１】
ＰＩＮＳを欠く細胞クローンは腫瘍形成性である。ＰＩＮＳと致死性巨大幼虫因子（ＬＧＬ）の両方を欠く二重変異体細胞は、大部分が対称的分裂であり、かつ自己再生する神経芽細胞からなる脳を生成する。細胞の運命の決定因子であるＮｕｍｂまたはＰｒｏｓｐｅｒｏを欠く細胞クローンもまた腫瘍形成性であり、移植後に新たな宿主に増殖可能である。これらの腫瘍細胞は、対称様式の分裂を採用する４０日間で異数体になることが示されてきた。それゆえに、対称的に分裂する能力は、新生物形質転換のための必須条件であり得る。癌は、少なくとも部分的に、対称様式の細胞分裂を採用する能力を反映し得る。
【０１３２】
非対称細胞分裂を促進する機構は、腫瘍抑制において進化の過程で保存された役割を有する。大腸腺腫様ポリポーシス（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ）（ＡＰＣ）遺伝子は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ精原幹細胞の非対称分裂のために必要であり、哺乳動物腸管上皮における重要な腫瘍抑制因子である。ＡＰＣが腸管上皮におけるＳｔ−Ｃによる非対称分裂を調節しているか否かは不明であるが、結腸直腸癌は、腸管上皮Ｓｔ−Ｃのものと顕著に類似している特性を有する。ＬＧＬのヒトホモログ、ＨＵＧＬ−１もまた、癌において頻繁に欠失されており、マウスにおける対応する遺伝子の欠失は、中枢神経系における極性および異形成の損失に導く。Ｎｕｍｂの損失は、乳癌において観察されるＮｏｔｃｈ経路のシグナル伝達の活性化過剰に関与し得る。これらの遺伝子産物は、細胞の極性に対するそれらの効果とは独立している種々のメカニズムを通して腫瘍形成を阻害することができるが、これらの遺伝子が一貫的に腫瘍抑制因子として機能するという事実は、非対称分裂それ自体が癌に対して防御し得ることを示唆する。
【０１３３】
対称型細胞分裂と癌の間の連関についてのさらなる証拠は、ある遺伝子産物が、哺乳動物細胞中で、対称型細胞分裂を誘導することと、発癌遺伝子として機能することの両方が可能であるという観察である。ａＰＫＣは、通常、ＰＡＲ３／６−ａＰＫＣ複合体の一部として、神経芽細胞の頂端皮質に局在する。ａＰＫＣの構成的に活性な改変体の神経特異的発現は、対称的に分裂している神経芽細胞の大きな増加を引き起こす。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける腫瘍発生性の潜在能力と一致して、ａＰＫＣはまた、ヒト肺癌における発癌遺伝子として同定されてきた。従って、非対称型分裂は、発癌を抑制する可能性がある。非対称型分裂に切り換えるためのＳｔ−Ｃの調節は、癌の進行を抑制する可能性がある。
【０１３４】
ＮｏｔｃｈおよびＮｕｍｂは対称型／非対称型の分裂において重要な役割を果たしている
Ｎｏｔｃｈは、核における転写活性化に直接的に関与する細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）を切断後に遊離する膜貫通受容体をコードしている。Ｎｏｔｃｈ活性化は、細胞質シグナルの迅速な活性化を通して、その特異的標的遺伝子：ｈａｉｒｙおよびｓｐｌｉｔ  ３のエンハンサー（Ｈｅｓ３）ならびにソニックヘッジホッグ（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）（Ｓｈｈ）の発現の誘導によって、神経Ｓｔ−Ｃの生存を促進する。Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様４（ＤＬＬ４）は細胞死を迅速に阻害する。Ｎｏｔｃｈリガンドに曝露された細胞は、Ｎｏｔｃｈリガンドへの曝露の延長後、ニューロン、星状細胞、および乏突起膠細胞を生成する潜在能力を保持する。ＤＬＬ４によって分裂されるように刺激された細胞は、未成熟状態の正常脳の柔組織中で長時間生存し、プロ生存分子のアップレギュレーションを示唆する。
【０１３５】
ＮｏｔｃｈアンタゴニストＮｕｍｂは、Ｎｏｔｃｈの量を減少し、Ｎｏｔｃｈシグナルへの娘細胞の応答を修飾する（Ｎｏｔｃｈ高細胞はシグナルを受容し、隣接細胞にそのシグナルを伝達できるのに対し、Ｎｏｔｃｈ低細胞はＮｏｔｃｈシグナルを受容することのみができる）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害は、哺乳動物の非対称型分裂の調節に関与しているようである。齧歯類皮質の発生における未分化の神経前駆細胞は、神経発生のために運命付けられた前駆体に、Ｎｕｍｂを非対称的に分配する。従って、筋細胞におけるＮｕｍｂの非対称的分離は、制御の一般的な様式であり得る。神経芽細胞の非対称型分裂からの層間剥離の間、Ｎｕｍｂおよびいくつかの他のタンパク質は、固有の決定因子として、基底皮質半月（ｃｒｅｓｃｅｎｔ）に同時局在化される。これらのタンパク質は、基底娘細胞またはガングリオン母細胞に分割され、これらは、１回以上分裂し、２つのニューロンまたはニューロンおよびグリア細部を生じる。タンパク質が分割される頂端娘細胞は、神経芽細胞の特性を維持しており、数回のさらなる細胞分裂のラウンドを受けることが可能である。
【０１３６】
Ｎ末端ホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメインは、は、膜にＮｕｍｂを補充する。Ｎｕｍｂ−ＰＴＢドメインは、ＮＩＰ（Ｎｕｍｂ相互作用タンパク質）と特異的に相互作用し、これは、細胞質ゾルから、原形質膜までＮｕｍｂを補充する固有の膜タンパク質である。Ｎｕｍｂ−ＰＴＢドメインはまた、ユビキチン化およびｍＮｕｍｂの分解のためのＥ３リガーゼとして働くＬＮＸ（ＮｕｍｂＸのリガンド）と相互作用し得る。哺乳動物Ｎｕｍｂ（ｍＮｕｍｂ）は４つのスプライシングアイソフォームを有する。これらは、Ｃ末端のプロリンリッチ領域（ＰＲＲ）における５０アミノ酸挿入物の存在または非存在に基づいて２つの型に分けられる。長いＰＲＲドメインを有するヒトアイソフォーム（Ｎｕｍｂ−ＰＲＲＬ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）における初期の神経発生の間の分化に影響を与えることなく、細胞の増殖を促進する。短いＰＲＲドメインを有するアイソフォーム（Ｎｕｍｂ−ＰＲＲＳ）は、幹細胞の増殖を阻害し、ニューロンの分化を促進する。Ｎｕｍｂ−ＰＲＲＳは、Ｎｏｔｃｈの量を減少し、Ｎｕｍｂ−Ｌよりも強力なＮｏｔｃｈシグナル伝達の活性と拮抗する。対照的に、Ｎｕｍｂのネガティブ調節であるユビキチン化は、電荷を有するデカペプチドを含むＰＴＢＬ改変体を標的とする。
【０１３７】
本発明者らは、乳房ＭＣＦ−７、膵臓Ｍｉａｐａｃａ−２、および卵巣ＳＫＯＶ３系統におけるＮｕｍｂＬおよびＮｕｍｂＳの発現の独特のレベルを見出した。Ｎｕｍｂの発現は、Ｃ−Ｓｔ−Ｃの対称型／非対称型分裂の潜在性、およびその癌活性化に対する関連性の指標であり得る。この問題に取り組むためにさらなる研究が必要である。
【０１３８】
多能性因子が標的とするポリコーム基タンパク質標的遺伝子
ポリコーム基（ＰｃＧ）タンパク質は、クロマチン構造の後成的修飾を通して後生動物発生の間に細胞の同一性を維持している転写リプレッサーである。ＰｃＧタンパク質は、胚性幹細胞（Ｅ−Ｓｔ−Ｃ）において発生遺伝子を転写的に抑制し、その発現は、さもなくば分化を促進する。ＰｃＧ結合クロマチンは、ヒストンＨ３のＬｙｓ２７（Ｋ２７）においてトリメチル化されており、転写的にサイレントである。８量体結合転写因子−４（ＯＣＴ４）、ＳＲＹ関連ハイモビリティーグループ（ＨＭＧ）−ボックスタンパク質−２（ＳＯＸ２）、およびホメオドメイン含有転写因子、ＮＡＮＯＧ遺伝子はＰｃＧ標的であり、クロマチン修飾因子が、ＥＳｆ−Ｃ細胞における発生経路を直接的に抑制するためにこれらの３つの多能性調節因子と協調的に作用し得る。ＯＣＴ４は、成体多能性Ｓｔ−Ｃ、ならびにいくつかのヒトおよびラット腫瘍細胞において発現されるが、しかしながら、これらのＳｔ−Ｃの正常に分化した娘細胞においては発現されない。Ｏｃｔ４遺伝子を発現する成体細胞は、潜在的に多能性Ｓｔ−Ｃであり、発癌プロセスの開始と関連性がある。ＳＯＸ２は、転写の調節およびクロマチン構造に関連している。ＳＯＸ２は、線維芽細胞増殖因子−４（Ｆｇｆ４）のエンハンサーＤＮＡ配列上にＯＣＴ４または遍在性ＯＣＴ１タンパク質のいずれかとの三成分複合体を形成することによって、内部細胞塊（ＩＣＭ）およびその子孫または誘導体細胞の調節に関与している。Ｎａｎｏｇは、マウスＥｓｔ−Ｃの細胞再生および多能性のための白血病阻害因子（ＬＩＦ）非依存性能力を付与する。Ｎａｎｏｇは、ＮＫ遺伝子ファミリーのメンバーとの相同性により、ＥＮＫ（初期胚特異的ＮＫ）として最初に記載された。Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡは、始原生殖細胞および胚性幹細胞において存在する。Ｓｔｅｌｌａそれ自体を多能性のマーカーとして考慮したにも関わらず、Ｎａｎｏｇタンパク質はＳｔｅｌｌａ陽性マウス始原生殖細胞においては見出されない。生殖細胞におけるＮａｎｏｇの機能は、それらが成熟するにつれて進行的に消失する。Ｎｎａｏｇは分化を促進する遺伝子の転写を抑制し得る。
【０１３９】
多くの発生の遺伝子と関連するクロマチンコンホメーションは、Ｈ３における阻害性メチル化Ｋ２７と、活性化メチル化Ｋ４ヒストンの両方からなる「ピバレントドメイン」から構成される。これらの二価ドメインは分化した細胞においては失われており、これらがＥＳ細胞の発生学的な柔軟性を維持する際に重要な役割を果たすことを示唆している。従って、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧは、多能性状態における鍵となる発生学的調節因子をサイレンシングするために、ＰｃＧタンパク質と協調して作用し得る。
【０１４０】
ＰｃＧによる遺伝子不活性化は、種々のＰｃＧタンパク質の２つの複合体の共同を必要とする：（ｉ）ポリコーム抑制複合体１（ＰＲＣ）はクロマチンに結合し、公知の遺伝子活性化タンパク質複合体の効果を遮断する、（ｉｉ）ＰＲＣ２はＰＲＣ１を遺伝子を標的とするように導く。ＺｅｓｔｅのエンハンサーについてのＥ（Ｚ）として公知であるＰＲＣ２成分の１つは、メチル（ＣＨ３）基をＫ２７に付加する能力を有し、これは、クロマチンのＨ３の末端のテールに位置している。ヒストン修飾は、その修飾に依存して、遺伝子の活性を調節し、それらをオンまたはオフのいずれかに切り換える際に、主要な役割を果たす。ＰＲＣ２の場合において、ＣＨ３付加は、不活性化される遺伝子にＰＲＣ１を誘引することによって、遺伝子をオフに切り換える。ＰＲＣのメチル化活性は、ＰＲＣ１結合のために必要とされる。
【０１４１】
ショウジョウバエＥ（ｚ）タンパク質のヒト等価物であるＥＺＨ２の発現は、局在化した腫瘍または正常組織におけるよりも、前立腺癌および乳癌の転移においてはるかに高い。癌組織におけるＥＺＨ２の発現は、黒色腫、乳癌、前立腺癌、子宮内膜癌、および胃癌の乏しい予後および悪性の潜在性、例えば、高い増殖、伝播、および侵襲と相関することが報告された。Ｅ（Ｚ）タンパク質の産生を遮断することは、前立腺癌細胞の増殖を阻害した。ＥＺＨ２は、腫瘍抑制遺伝子またはその場所にアンカーされた細胞を維持するタンパク質を作製する遺伝子を阻害し得る。ＥＺＨ２の過剰発現およびＰＲＣ改変体の形成は、未分化細胞ならびに癌細胞において起こる。ＥＺＨ２によって媒介されるヒストンメチル化は、それらの多能性発生状態において幹細胞を維持することを補助する。
【０１４２】
癌は脱分化によって得られる癌幹様細胞から引き起こされ得る
１）多能性因子は、成熟細胞から幹様細胞を作製するために必要とされる。
【０１４３】
いくつかの癌は、幹細胞であることを伴う、脱分化された癌細胞から引き起こすことができる。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮａｎｏｇに加えて、ｃ−ｍｙｃおよびＫｌｆ４もまた、Ｅｓｔ−Ｃ表現型の長期間の維持、および培養中でのＥｓｔ−Ｃの迅速な増殖に寄与する。成体マウス線維芽細胞からの多能性幹細胞の誘導は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４を導入することによって実証され、これは、成熟細胞が特別な状況下で未成熟に戻り得ること、次いで、ある癌細胞は幹細胞であることを維持し得ることを示唆する。これらの因子はいかにして互いに影響を与えるのであろうか？Ｏｃｔ４の発現の増加は、マウスＥｓｔ−Ｃに余分の胚期の外胚葉および中胚葉への分化を引き起こすのに対して、Ｎａｎｏｇの発現の増加は、自己再生および未分化状態の維持を増強する。Ｏｃｔ４の発現の減少は、マウスＥｓｔ−Ｃに栄養外胚葉への分化を引き起こす。これは、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇが独立して操作し、それらの主要な機能は胚性細胞分化の抑制であり得ることを示す。両方のタンパク質からの合わせたシグナルは、原始外胚葉の再生および多能性に導く。８量体およびｓｏｘエレメントは、マウスおよびヒトのＮａｎｏｇ転写のアップレギュレーションのために必要とされる。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮａｎｏｇはさらなる転写因子とともに協働作用する。これらは必須であるが、多能性細胞状態の詳細のためには十分ではない。Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現の上流制御の特徴付けが非常に重要である。
【０１４４】
２）癌細胞は幹細胞であることを獲得し得る。
【０１４５】
癌細胞は、通常は、長い生存、遠くでの転移、および抗癌剤耐性で定義される、悪性の潜在性を有する。Ｃ−Ｓｔ−Ｃｓは、乳癌、脳腫瘍、前立腺癌、および結腸癌において報告された。乳癌、膵臓癌、および卵巣癌は上皮起源であるので、これらは、上皮マーカーＥＳＡを発現する。試験されたある膵臓癌（ＰＣ）系統はＣＳｔ−Ｃに特徴的な表現型：ＣＤ４４＋ＣＤ２４低／−を発現したが、すべての膵臓癌（ＰＣ）系統で発現されるわけではない。驚くべきことに、ＥＳＡ＋ＣＤ４４＋ＣＤ２４低／−集団はゲムシタビン（ＧＥＭ）または５−フルオロウラシル（ＦＵ）を伴う培養後に増加した。ＤＮＡおよびＲＮＡ合成阻害剤ＧＥＭおよび５−ＦＵは、最も有効な抗癌薬物の中に含まれる。薬物および照射によるＣ−Ｓｔ−Ｃｓのポジティブ選択は、２つの仮説に対するサポートをもたらす。第１に、Ｃ−Ｓｔ−Ｃｓは耐性集団において富化されており、なぜなら、これらは、高レベルの抗アポトーシス性分子を発現し、同時にＧ１休止状態であるからである。第２に、紡錘体の位置の変化、すなわち、脱分化の後、ゆっくりとかつ「非対称的に」耐性細胞が分裂することである。これらの仮説は図１３に要約されている。
【０１４６】
Ｃ−Ｓｔ−Ｃの根絶
すべての研究は、Ｃ−Ｓｔ−Ｃが化学療法および放射線療法に耐性であることに同意している。Ｃ−Ｓｔ−Ｃを根絶するための第１の試みは、対称型細胞分裂を促進する遺伝子経路を負に調節することである。上記に列挙したすべての遺伝子およびタンパク質の機能はアンタゴニスト的な遺伝子産物によって負に調節可能である。
【０１４７】
１つの可能性は、癌細胞の中でのＮｏｔｃｈのアンタゴニストの発現にある（図２）。ＮｕｍｂまたはそのＰＴＢドメインをコードするｍＲＮＡは、ネガティブ鎖ＲＮＡベクターから腫瘍細胞中で発現可能である。このようなベクターは、ニューキャスル病ウイルスまたはセンダイウイルスに基づく。不運にも、近年の鳥インフルエンザへの関心がこの試みの魅力を制限している。
【０１４８】
代替案は、活性化経路を正に制御するタンパク質の分解である。哺乳動物オーロラＡは、いくつかの癌におけるその過剰発現、特定の細胞株における増殖を促進するその能力、ならびにレベルの減少が複数の中心体の増殖、有糸分裂の遅延、およびアポトーシスに導くという事実により、発癌遺伝子と呼ばれている。提案するメカニズムを以下に説明する。オーロラ−Ａは、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２を含むＰＣ系統において過剰発現され、経路：ＭＡＰＫ−ＥＲＫ−ＥＴＳ２によって活性化される。哺乳動物オーロラ−Ａがいかにして幹細胞の非対称型分裂および自己再生を調節することかは不明であり、これが、ＰＣ発癌に関与し、Ｒａｓ−またはＭｙｃ−シグナルと協働する。最近の研究は、ＵＢリガーゼＥ３  Ｓｅ１１０の減少が、延長されかつ持続されたオーロラ−Ａシグナルを可能にし、その標的は、癌細胞の自己再生を促進することを見出している。癌細胞におけるＵｂ−リガーゼが助けとなり得る。図１４を参照のこと。
【０１４９】
第２の試みは、非対称型分裂を阻害するために、ＰＫＣおよびａＰＫＣのより特異的な小分子阻害剤を開発することである。このような阻害剤は、異なる状況において重要である。タキソールは微小管の重合に影響を与える。いくつかのタキソール耐性細胞が紡錘糸を再配置するという可能性がある。タキソールで処理された卵巣およびＰＣはＣＤ４４＋ＣＤ２４低細胞の数を増加させた。
【０１５０】
第３の試みは、一見無関係な研究から得られる。ＥＺＨ２タンパク質は、活性特異的腫瘍免疫治療によって標的とされた。ＨＬＡ−Ａ２４様式によって限定されるＥＺＨ２のペプチド配列を認識するＣＴＬを同定した。ＥＺＨ２を用いるワクチン試験は、前立腺癌の患者および脳腫瘍の患者において進行中である。疑問は、高発現ＥＺＨ２が、高いターンオーバー速度を生じるか否かである。このシナリオにおいてのみ、ＥＺＨ２に焦点を当てた免疫療法がＣＳｔ−Ｃを根絶する。図１７Ａ〜１７Ｂを参照のこと。
【０１５１】
本発明者らは、ＮｕｍｂおよびＮｏｔｃｈそれ自体が、活性化ＣＴＬによるＣｓｔ−Ｃの根絶のための適切な標的であると考えている。Ｎｏｔｃｈリガンドによる増殖を活性化するＣｓｔ−Ｃは、Ｎｕｍｂを分解し、提示する。
【０１５２】
ＮｕｍｂペプチドはＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに結合する。これらの複合体は、Ｎｕｍｂペプチド特異的ＣＴＬによって認識および根絶が可能である。代替としては、休止状態にあるＣＳｔ−ＣはＮｏｔｃｈを分解する。腫瘍によって提示されるＮｏｔｃｈペプチド−ＨＬＡ、ＡＢＣ複合体は、Ｎｏｔｃｈペプチド特異的ＣＴＬの標的中のＣｓｔ−Ｃを形質転換する。
【０１５３】
結論
自己再生と多能性の両方の能力として規定されたＳｔ−Ｃの増殖および分化は、対称型／非対称型細胞分裂によって調節される。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、これらの分裂のバランスを取る。Ｎｕｍｂは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の抑制を通してのみならず、固有の予想される決定因子としてのそのアイソフォームを通してもまた、幹細胞分裂において重要な役割を果たしている。ＮｏｔｃｈおよびＭｕｎｂの発現はＣＳｔ−Ｃの転移の潜在能力を示し得る。抗癌薬物は、ＣＳｔ−Ｃを選択または誘導する。ＣＳＴ−Ｃは、維持および拡大するために、多能性因子およびＰｃＧタンパク質を必要とする。それゆえに、Ｎｕｍｂ、Ｎｏｔｃｈ、ＰＫＣ、ａＰＫＣ、およびＥＺＨ２は、化学療法および放射線療法後にＳｔ−Ｃ根絶のための適切な標的であるはずである。
【０１５４】
本明細書で開示され、特許請求されるすべての組成物および方法は、本開示に鑑みて、過度の実験なしで、作製および実行が可能である。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態によって説明されてきたが、本発明の概念、技術思想、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された方法の工程でまたはその工程の順番で、バリエーションがその組成物および方法に適用され得ることは、当業者には明白である。より詳細には、化学的と生理学的の両方で関連している特定の薬剤は、同じまたは類似の結果を達成される場合、本明細書に記載された薬剤の代わりに置換されてもよいことは明白である。すべてのこのような置換物および修飾は当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本明細書の技術思想、範囲、および概念の中にはいると見なされる。
【０１５５】
（参考文献）
以下の参考文献は、これらが、本明細書に示されたものに対する補遺的な、実験手順または他の詳細を提供するという程度まで、参照として本明細書に具体的に組み込まれる。
【０１５６】
【化１】
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【０１５７】
【化２】
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【０１５８】
【化３】
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【０１５９】
【化４】
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【０１６０】
【化５】
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【０１６１】
【化６】
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【０１６２】
【化７】
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【０１６３】
【化８】
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【０１６４】
【化９】
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【０１６５】
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【０１６９】
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【０１７０】
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【０２００】
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【０２１０】
【化５５】
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【０２１１】
【化５６】
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【０２１３】
【化５８】
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【０２１４】
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【０２１６】
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【０２１７】
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【０２１８】
【化６３】
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【０２１９】
【化６４】
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【０２２０】
【化６５】
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【０２２１】
【化６６】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2010520280.tif 000080
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2010520280.tif 000082
【図２】
2010520280.tif 000083
【図３】
2010520280.tif 000084
【図４】
2010520280.tif 000085
【図５】
2010520280.tif 000086
【図６−１】
2010520280.tif 000087
【図６−２】
2010520280.tif 000088
【図６−３】
2010520280.tif 000089
【図７】
2010520280.tif 000090
【図８】
2010520280.tif 000091
【図９−１】
2010520280.tif 000092
【図９−２】
2010520280.tif 000093
【図１０】
2010520280.tif 000094
【図１１】
2010520280.tif 000095
【図１２】
2010520280.tif 000096
【図１３】
2010520280.tif 000097
【図１４】
2010520280.tif 000098
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
2010520280.tif 000100
【配列表】
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【国際調査報告】
2010520280.tif 000101
2010520280.tif 000102
2010520280.tif 000103
2010520280.tif 000104
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2010520280.tif 000106
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