(57)【要約】  本発明は、皮膚組職から分離された皮膚由来の幹細胞を含有する神経疾患治療用の細胞治療剤及び皮膚由来の幹細胞を神経細胞に分化させる方法を提供する。本発明による神経疾患治療用の細胞治療剤は、神経細胞損傷によって起きるパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症及び腦卒症、局所貧血及び脊髓損傷による神経疾患などの治療に効果的であり、自家細胞の移植が可能で副作用を最小化させうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚組職から分離された皮膚由来の幹細胞を含有することを特徴とする神経疾患治療用の細胞治療剤。
【請求項２】
神経疾患は、
パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症及び腦卒症、局所貧血及び脊髓損傷による神経疾患からなる群から選択されたということを特徴とする請求項１に記載の細胞治療剤。
【請求項３】
次の段階を含む皮膚由来の幹細胞を神経細胞または神経前駆細胞に分化させることを特徴とする方法：
（ａ）皮膚組職から皮下脂肪を除去し、皮膚由来の幹細胞を収得する段階、
（ｂ）前記分離された皮膚由来の幹細胞をＢＤＮＦ及びｂＦＧＦで構成された群から選択された何れか一つ以上の分化促進因子を含有する神経分化培地で培養して神経球を形成させる段階、
（ｃ）前記神経球を培養して神経細胞または神経前駆細胞に分化させる段階。
【請求項４】
分化された神経細胞または神経前駆細胞は、Ｎｅｓｔｉｎ、ＧＦＡＰ、ＴｕＪ、ＴｒｋＢ、ＭＡＰ２、ＮＳＥ、ＮｅｕＮ、ＢＤＮＦ、ＳＤＦ１、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦＲ２及びＭＢＰで構成された群から選択された何れか一つ以上の遺伝子を発現することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法で皮膚由来の幹細胞で分化された神経細胞または神経前駆細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の神経細胞または神経前駆細胞を含有する神経疾患治療用の細胞治療剤。
【請求項７】
神経疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症及び腦卒症、局所貧血及び脊髓損傷による神経疾患からなる群から選択されたということを特徴とする請求項６に記載の細胞治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚由来の幹細胞（ＳＰＣｓ）を含有する神経疾患治療用の細胞治療剤に係り、より詳細には、皮膚組職から分離された皮膚由来の幹細胞を含有する神経疾患治療用の細胞治療剤及び前記皮膚由来の幹細胞を神経細胞に分化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、自家生長能と長期的な生存力及び多種の細胞や組職に分化することができる潜在力とを有している細胞である。胚発生段階で得られる全分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）を有する胚芽細胞（ＥＳ  ｃｅｌｌｓ）は、分化潜在力は無限であるが、奇形腫を誘発できるという危険性と倫理的な問題だけではなく、細胞治療剤としての活用時に発生する免疫学的問題など今後乗り越えなければならない問題が散在している。幸いに、胚芽幹細胞能に比べることができる成体幹細胞が人体の多くの臓器から発見され、中胚葉性起源の骨髓、脂肪、臍帯血などで中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）などが分離されて活発に報告されている。しかし、中間葉幹細胞の場合、神経細胞への全分化効率がかなり低いという大きな短所がある。
【０００３】
現在、国内外的に幹細胞を利用した難病についての細胞治療研究が活発に進められているが、幹細胞が、パーキンソンやアルツハイマーのような脳疾患と脊椎損傷、肝硬化、糖尿、心筋梗塞症など広範囲に研究結果が報告されている実情である。
【０００４】
脊椎損傷疾患は、一種のミエリン破壊性中枢神経系疾患中の一つに分類される。損傷されたミエリンは、自家オリゴ前駆細胞系または自家神経幹細胞の増殖、分化、移動などで回復が可能である。しかし、このような自発的過程は、損傷された部位を十分に回復するには不足で、完全な回復のためには、オリゴ前駆細胞または分化されたミエリン生成神経前駆細胞を外部から注入する細胞治療過程が必須である。神経細胞または神経前駆細胞の増殖と分化移動の調節は、体外での細胞培養方法の最適化過程によって効率的に実行される。一方、その治療効率を極大化させるために、特定サイトカインを過発現させることができるベクターを開発及び用いて遺伝子及び細胞治療方法をともに適用する方法もある。
【０００５】
皮膚由来の幹細胞は、神経細胞とともに外胚葉性基幹細胞に属し、組職損傷を被った当事者の皮膚組職からの細胞採取が可能であり、分離培養法が難しくないという長所がある。それだけではなく、皮膚由来から分離した幹細胞は、相当量の細胞数を培養過程を通じて安定的に増殖させて得られることができ、培養した基質細胞は中胚葉性組職だけではなく、肝、神経細胞などの外・内胚葉性組職にも分化が可能であると知られている。このような皮膚幹細胞の無限な分化可能性をよく活用して、それを利用した疾患の治療への接近のために体外培養または分化条件を適切に調節し、さらに確立した実験動物疾患モデルを対象に細胞及び遺伝子を同伴した細胞治療方法の構築に重要な材料として活用することができるが、今まで皮膚幹細胞を用いて疾患治療に使った例としては、皮膚幹細胞を分離して人工皮膚を製造した例はあるが（特許文献１）、神経細胞への分化を誘導して神経疾患治療に適用した例はない実情である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】大韓民国特許公開１０−２００６−００１６５４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これにより、本発明者は、前記幹細胞を用いて、神経疾患を治療しようと鋭意努力した結果、皮膚有来の幹細胞をマウス脊髓損傷モデルに移植する場合、高い神経細胞分化能を表わして、効率的に脊髓損傷が回復されることを確認し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明の主な目的は、神経細胞への全分化効率が高い皮膚由来の幹細胞を含有する神経疾患治療用の細胞治療剤を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記皮膚由来の幹細胞を神経細胞に分化させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を果たすための本発明は、皮膚組職から分離された皮膚由来の幹細胞を含有する神経疾患治療用の細胞治療剤を提供する。
【００１１】
本発明はまた、（ａ）皮膚組職から皮下脂肪を除去し、皮膚由来の幹細胞を収得する段階と、（ｂ）前記分離された皮膚由来の幹細胞をＢＤＮＦ及びｂＦＧＦで構成された群から選択された何れか一つ以上の分化促進因子を含む神経分化培地で培養して神経細胞に分化させる段階と、を含む皮膚由来の幹細胞を神経細胞に分化させる方法を提供する。
【００１２】
本発明において、前記分化された神経細胞は、Ｎｅｓｔｉｎ、ＧＦＡＰ、ＴｕＪ、ＭＡＰ２、ＮＳＥ、ＮｅｕＮ、ＢＤＮＦ、ＳＤＦ１、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦＲ２及びＭＢＰで構成された群から選択された何れか一つ以上の遺伝子を発現することを特徴とする。
【００１３】
本発明はまた、前記方法で皮膚由来の幹細胞で分化された神経細胞及び前記神経細胞を含有する神経疾患治療用の細胞治療剤を提供する。
【００１４】
本発明において、前記神経疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症及び腦卒症、局所貧血及び脊髓損傷による神経疾患からなる群から選択されたということを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、神経細胞への全分化効率が高い皮膚由来の幹細胞を含有する神経疾患治療用の細胞治療剤を提供する効果がある。本発明による神経疾患治療用の細胞治療剤は、神経細胞損傷によって起きるパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症及び腦卒症、局所貧血及び脊髓損傷による神経疾患などの治療に効果的であり、自家細胞の移植が可能で副作用を最小化させうる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明による皮膚由来の幹細胞の継代培養による生長時間変化を示すグラフである。
【図２】本発明による皮膚由来の幹細胞の分化能を確認したものである。Ａは脂肪細胞への分化を確認したものであり、ＢはＶｏｎ  Ｋｏｓａ染色を通じて骨細胞への分化を確認したものであり、ＣはサフラニンＯ染色を通じて軟骨細胞への分化を確認したものである。
【図３】本発明による皮膚由来の幹細胞の神経細胞への分化能を免疫化学的方法で確認した結果を表わしたものである。
【図４】本発明による皮膚由来の幹細胞の神経細胞への分化能をＲＴ−ＰＣＲ方法で確認した結果を表わしたものである。
【図５】本発明による皮膚由来の幹細胞を移植した脊椎損傷マウスモデルの回復程度を表わしたものであって、ＡはＢＢＢスコアを表わしたものであり、Ｂは傷部位の体積変化を表わしたものである。
【図６】本発明による皮膚由来の幹細胞を移植した脊椎損傷マウスモデルの組職を観察した写真であって、Ａは電子顕微鏡で観察した写真であり、ＢはＨ＆Ｅ染色した組職を表わしたものである。
【図７】本発明による皮膚由来の幹細胞を移植した脊椎損傷マウスモデルの組職を免疫化学的な方法で確認したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１８】
本発明において、神経細胞または神経前駆細胞への分化は、神経細胞分化標識因子であるＮｅｓｔｉｎ、ＧＦＡＰ、ＴｕＪ、ＭＡＰ２、ＮＳＥ、ＮｅｕＮ、ＢＤＮＦ、ＳＤＦ１、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦＲ２またはＭＢＰをコーディングする遺伝子の発現または前記タンパク質の生産によって確認した。
【００１９】
本発明で“皮膚由来の幹細胞（ｓｋｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ；ＳＰＣ）”は、動物の皮膚で分離した自家皮膚由来の幹細胞で脂肪細胞、造骨細胞、軟骨細胞、神経細胞などの多様な組職の細胞に分化が可能な細胞を意味する。
【００２０】
本発明で“オリゴ細胞”は、神経細胞（星状細胞、神経、オリゴ細胞）に属する一つの下位グループで今後神経細胞を取り囲んでいる構造のミエリンを形成する前駆細胞を意味し、ミエリン層が破壊されて運動神経細胞が死滅されることによって発生する疾患である脊椎疾患の場合、オリゴ細胞を利用したミエリンの再形成誘導が重要である。
【００２１】
本発明では、マウス由来の皮膚由来の幹細胞を（ｍｏｕｓｅ  ｓｋｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ、ｍＳＰＣｓ）を分離培養して、該培養された皮膚由来の幹細胞の培養及び増殖特性を糾明し、外胚葉性神経細胞への効率的な分化条件を確立した。
【００２２】
該確立された分化条件及び培養方法でオリゴ前駆細胞に効率的に全分化させた皮膚幹細胞由来の神経前駆細胞を利用したミエリン破壊性疾患の治療効果を評価するために、脊椎損傷疾患モデルを樹立した。
【００２３】
前記確立された脊椎損傷マウスモデルに皮膚由来の幹細胞を移植する方法は、通常使われる細胞移植方法が使われ、望ましくは、静脈注入と脊椎内に直接注入する方法とを使うことができ、さらに望ましくは、静脈注射する方法を使うことができる。
【００２４】
脊椎疾患マウスモデルでの細胞移植及び治療結果によれば、細胞移植後にかなりの症状の好転効果が表われ、移植した相当数の細胞が成熟した神経細胞（神経細胞及びミエリン）に分化された結果を表わした。それだけではなく、移植した皮膚由来の幹細胞のまた他の役割で周辺に存在する脊椎由来の神経幹細胞の損傷部位への移動に最も重要な役割をする物質を分泌して、これらの移動、分化及びこれらの神経細胞的機能をさらに有する成熟細胞で効率的に誘導して脊椎損傷疾患の機能回復にも相当な寄与をすると判断される。
【００２５】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲が、これら実施例に限らないということは、当業者にとって自明である。
【００２６】
以下、実施例では、皮膚で分離した幹細胞を直接脊椎損傷マウスモデルに移植して、治療効果を確認したが、皮膚由来の幹細胞を神経細胞または神経前駆細胞に分化させた後、脊椎損傷マウスモデルに移植しても類似した効果が得られるということは当業者に自明である。
【実施例】
【００２７】
〔実施例１：自家皮膚組職から幹細胞の分離及び培養〕
マウスから皮膚由来の幹細胞を分離するために、マウス（６週齢ＩＣＲ、孝昌サイエンス、韓国）の腹部及び背中で皮膚組職を摘出した。該摘出された皮膚組職で皮下脂肪を除去した後、燐酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で洗浄した。
【００２８】
皮下脂肪が除去された皮膚組職に０．０７５％のコラーゲン分解酵素を添加して３７℃で３０分間反応させて皮膚組職で細胞を分離させた。
【００２９】
反応が終了した細胞液に１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、アメリカ）を含むＤＭＥＭ（α−Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）を添加して遠心分離し、基質細胞層を１０％血清（牛胎児血清）を含むＤＭＥＭに浮遊させて一次培養細胞が７０〜８０％の密度に至るまで、４８〜７２時間培養した後、０．０２５％トリプシン溶液を用いて継代培養して、皮膚組職由来の幹細胞を収得した。下記の実施例には、一定に５〜６継代した皮膚幹細胞を使った。
【００３０】
図１は、継代培養回数によるＰＤ（Ｐａｓｓａｇｅ  Ｄｏｕｂｌｉｎｇ）期間の変化を表わしたグラフである。図１に表われたように、前記方法で分離した皮膚由来の幹細胞は、相当量の細胞数を培養過程を通じて安定的に増殖させて得られるということが分かる。
【００３１】
〔実施例２：皮膚組職由来の幹細胞の中胚葉性細胞への分化能確認〕
実施例１で収得された皮膚由来の幹細胞が、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などの中胚葉性細胞に分化することができるか否かを確認するために、前記皮膚由来の幹細胞を組職特異的に分化を誘導する分化培地で培養して分化を誘導した。
【００３２】
脂肪細胞への分化能を確認するためには、脂肪分化因子であるインシュリン（ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｓｉｇｍａ、アメリカ）とデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、Ｓｉｇｍａ、アメリカ）とが含有された脂肪分化培地で培養して分化を誘導させ、骨細胞への分化能を確認するためには、骨分化因子であるグリセロリン酸（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｓｉｇｍａ、アメリカ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ、アメリカ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、Ｓｉｇｍａ、アメリカ）が含有された骨分化培地で培養して分化を誘導させ、軟骨細胞への分化能を確認するためには、軟骨分化因子であるインシュリン、ＴＧＦ−ｂｅｔａ（Ｓｉｇｍａ、アメリカ）、アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、アメリカ）が含有された軟骨分化培地で培養して分化を誘導した。
【００３３】
脂肪細胞の分化程度は、脂肪細胞で生成された脂肪滴を顕微鏡で観察して確認した（図２のＡ）。骨細胞の分化程度はＶｏｎ  Ｋｏｓａ染色によって、Ｃａ＋  ミネラルが沈着されたｂｏｎｅ  ｎｏｄｕｌｅの生成を通じて確認し（図２のＢ）、軟骨細胞の分化程度は、サフラニンＯで染色されたグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ）の存在を通じて確認した（図２のＣ）。
【００３４】
その結果、実施例１で分離した皮膚由来の幹細胞は、中胚葉性組職である脂肪、軟骨及び骨への分化能を有することを確認することができた。
【００３５】
〔実施例３：皮膚組職由来の幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経細胞分化誘導〕
実施例１で収得された皮膚由来の幹細胞をミエリン破壊性疾患である脊椎損傷の治療のための細胞治療剤として使うために、皮膚由来の幹細胞の神経細胞への分化能を確認した。
【００３６】
前記皮膚由来の幹細胞をＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地（ＧＩＢＣＯ、アメリカ）にＢ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ）が含有されている神経細胞培地に、１０μｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（Ｂｒａｉｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ−脳由来の神経成長因子、Ｓｉｇｍａ、アメリカ）及び２０μｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、Ｓｉｇｍａ、アメリカ）成長因子を処理して、４日間浮遊培養して神経球（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）形成を誘導した。前記形成された神経球を気質がコーティングされた培養皿にスプレディングし、オリゴ細胞への分化効率を確認した。
【００３７】
オリゴ細胞への分化効率の評価は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ及び特異的な抗体を利用した免疫化学的方法を用いて、特異的に発現される転写体及びタンパク質を定性、定量して相対的効率を分析して最適化した（図３及び図４）。
【００３８】
転写体分析に活用したプライマー配列は、表１に表わした。
【００３９】
【表１】
2010503727.tif 000002
分化された神経細胞の免疫化学的分析のための一次抗体としてＴｕＪ（Ｓｉｇｍａ、アメリカ）、ＧＦＡＰ（ＤＡＫＯ、アメリカ）を使った。
【００４０】
その結果、皮膚有来の幹細胞で誘導された神経球が、神経細胞特異遺伝子を発現することを確認し、皮膚由来の幹細胞が神経前駆細胞と類似して神経球を形成するだけではなく、免疫化学的方法によってＴＵＪ、ＭＡＰ２ａｂを生体内／生体外で多量発現するということを確認することができて、神経細胞への分化効率が高いということが分かった。それだけではなく、ＭＢＰを発現するミエリンで分化、成熟することができる能力を有することを脊髓疾患組職の免疫組職化学的分析結果が分かった。
【００４１】
〔実施例４：マウスを利用した脊椎損傷動物モデルの確立〕
実施例３で製作した皮膚由来の幹細胞で分化誘導された神経細胞が、ミエリン及び運動神経破壊性疾患で神経組職を回復させることができるか否かを確認するために、脊椎損傷マウスモデルを確立した。
【００４２】
Ｘ線照射及びＥＢ注射方法を利用した脊椎損傷疾患の動物モデル確立は、自発的な損傷回復可能性を最小化することができる方法で評価されている。
【００４３】
運動神経及びミエリン破壊性疾患を誘発したマウス（成体雌ＩＣＲ、６週齢）を対象としてＸ線照射後、臭化エチジウム（ｅｔｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、ＥＢ）を投与する方法によって実行し（Ｋｏｃｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６）、４０ＧｒａｙｓのＸ線を照射して３日後、脊髓Ｔ１０部位を切開して０．３ｍｇ／ｍｌ濃度のＥＢ０．５μｌを直接注射するか、Ｔ１０部位に対して物理的損傷を誘導してミエリン及び運動神経細胞の破壊を誘導した。
【００４４】
運動神経が破壊されたマウスの体重減少量と多様な項目の臨床点数を含めたＢ．Ｂ．Ｂスコア（表２）とを毎日チェックしてミエリン破壊程度を間接的に評価した。
【００４５】
損傷誘導後に表われる過度な免疫反応による移植細胞の生存率低下を避けるために、前記確立されたマウスモデルは、脊椎損傷誘導後に一律的に３日後に幹細胞を移植した。
【００４６】
【表２】
2010503727.tif 000003
【００４７】
〔実施例５：脊椎損傷マウスモデルへの皮膚由来の幹細胞の移植〕
実施例４で確立された脊椎損傷マウスモデルに実施例１で分離した皮膚由来の幹細胞を移植するために、蛍光追跡マーカー（ＣＦＤＡ）で前記皮膚由来の幹細胞を標識した。
【００４８】
前記蛍光マーカーで標識された皮膚由来の幹細胞を前記脊椎損傷マウスモデルのしっぽ静脈に移植した。移植は、細胞を２５−ゲージ注射針を用いてしっぽ静脈に注射して移植した（１ｘ１０６個細胞）。細胞移植後、治療効率を検定するために、一定期間マウスモデルの体重と臨床点数またはＢＢＢスコア（０〜２０点）とを毎日一定時間に測定して正常マウス及び移植していないマウスモデルと相互比較分析して機能回復推移を確認した。その結果、皮膚由来の幹細胞を移植したマウスモデルの場合は、移植４週後、ＢＢＢ点数の２０点満点に１７点に該当するかなり好転された結果を表わして、麻痺状態であった下半身が後足を用いて自由自制で歩行が可能な状態で好転された。一方、マウスモデルに緩衝液を注入した陰性対照群の場合は、疾患の好転状態が全然表われないということが分かった（図５のＡ）。
【００４９】
それだけではなく、皮膚由来の幹細胞を移植したマウスモデルの場合は、移植後に脊椎患部のサイズが対照群に比べて大きく減少したということが分かった（図５のＢ）。
【００５０】
〔実施例６：皮膚有来の幹細胞を移植したマウスモデルの組職学的分析〕
皮膚有来の幹細胞を移植したマウスの脳、脊椎及びその以外の器官を組職学的に分析した。
【００５１】
皮膚有来の幹細胞を移植したマウスモデル、細胞を移植していないマウスモデル及び正常マウスを対象に脳、脊椎及びその以外の器官を４％パラホルムアルデヒドで固定させた後、摘出して一定のサイズ（５μｍ）で切った組職を電子顕微鏡下で比較、観察した。一方、前記組職をパラフィンで固定し、一定に切ってヘマトキシリンエオシンで染色してミエリン破壊程度及び緩和または回復程度を観察した（図６）。
【００５２】
また、移植された細胞の分化程度を観察するために、特定成熟した細胞類型による特異的な抗体であるＧＦＡＰ（ＤＡＫＯ、アメリカ）、ＭＡＰ２ａｂ（Ｓｉｇｍａ、アメリカ）、ＭＢＰ（Ｓｉｇｍａ、アメリカ）及びＣＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、アメリカ）を用いて免疫化学的方法で標識した後、共焦点走査顕微鏡を用いて分析した（図７）。
【００５３】
これと同様に、特定神経組職関連の特異的なタンパク質の発現を量的に比較定量するために、トリゾールを用いて組職の全体ＲＮＡを抽出、精製した後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実行して比較分析した。
【００５４】
その結果、しっぽ静脈を通じて移植した細胞は、非常に早い時間内に血流に乗って注入細胞の４５％ほどの非常に高い比率で脊椎損傷部位に移動し、それ以外の他の器官、すなわち、脳、肺、腎臓、肝などの器官でも発見された。脊椎損傷部位に移動した移植細胞の大部分は、損傷部位の内腔内に位置してｓｃａｒ形成に寄与し、損傷部位で近い周辺組職でも発見された。図６に表われたように、損傷周辺組職での移植細胞の神経細胞またはオリゴ細胞への分化能が比較的高く表われた。このような結果から皮膚由来の幹細胞の神経細胞への全分化による効果だけではなく、皮膚由来の幹細胞が有する成長因子の分泌などによる間接的な機能によっても脊椎損傷回復に有利な影響を与えると判断される。
【００５５】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したが、当業者において、このような具体的技術は、単に望ましい実施例であり、これに本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な特許請求の範囲は、請求項とその等価物によって定義される。本発明の単純な変形ないし変更は、当業者によって容易に利用され、このような変形や変更は、いずれも本発明の領域に含まれると見られる。
【図１】
2010503727.tif 000004
【図２Ａ】
2010503727.tif 000005
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
2010503727.tif 000009
【図５】
2010503727.tif 000010
【図６】
2010503727.tif 000011
【図７】
2010503727.tif 000012
【配列表】
2010503727000001.app
【国際調査報告】
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