(57)【要約】  本発明は、ガンの処置に有用な腫瘍細胞の成長を抑制するために、クラスＩおよびクラスＩＩＢヒストンデアセチラーゼに対する組み合わせ活性を持つプロテアソームインヒビターとヒストンデアセチラーゼインヒビターの組み合わせ物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアソームインヒビターおよび、Ｒ４が水素またはハロから選択される式（Ｉ）
【化１】
2010503636.tif 000014
のヒストンデアセチラーゼインヒビター、その製薬学的に許容され得る酸または塩基付加塩および立体化学的異性体の組み合わせ物。
【請求項２】
式（Ｉ）のヒストンデアセチラーゼインヒビターが、化合物番号１ａ、化合物番号３０および化合物番号３９
【表１】
2010503636.tif 000015
から選択される請求項１に記載の組み合わせ物。
【請求項３】
式（Ｉ）のヒストンデアセチラーゼインヒビターが化合物番号１ａ（ＪＮＪ２６４８１５８５）
【化２】
2010503636.tif 000016
である請求項１または２に記載の組み合わせ物。
【請求項４】
プロテアソームインヒビターがボルテゾミブである請求項１ないし３のいずれかに記載の組み合わせ物。
【請求項５】
プロテアソームインヒビターおよび式（Ｉ）のヒストンデアセチラーゼインヒビターを１もしくは複数の製薬学的担体と一緒に含んでなる製薬学的組成物の形態である請求項１ないし４のいずれかに記載の組み合わせ物。
【請求項６】
同時、別個または順次に使用するための請求項５に記載の組み合わせ物。
【請求項７】
医学的治療に使用するための請求項１ないし５のいずれかに記載の組み合わせ物。
【請求項８】
腫瘍細胞の成長を抑制する薬剤の製造のための請求項１ないし５のいずれかに記載の組み合わせ物の使用。
【請求項９】
急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄細胞性白血病、急性骨髄性白血病、急性単球性白血病、リンパ腫、慢性Ｂ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、急性転化における慢性骨髄性白血病、バーキットリンパ腫および多発性骨髄腫を処置する薬剤を製造するための、ヒストンデアセチラーゼインヒビター単独での、またはプロテアソームインヒビターとの組み合わせ物での使用であって、該ヒストンデアセチラーゼインヒビターが式（Ｉ）
【化３】
2010503636.tif 000017
式中、Ｒ４は水素またはハロから選択される
の化合物、その製薬学的に許容され得る酸または塩基付加塩および立体化学的異性体である上記使用。
【請求項１０】
上記薬剤が薬剤耐性急性リンパ芽球白血病、薬剤耐性急性骨髄性白血病、薬剤耐性急性前骨髄細胞性白血病、薬剤耐性急性骨髄性白血病、薬剤耐性急性単球性白血病、薬剤耐性リンパ腫、薬剤耐性慢性Ｂ細胞白血病、薬剤耐性慢性骨髄性白血病、急性転化における薬剤耐性慢性骨髄性白血病、薬剤耐性バーキットリンパ腫および薬剤耐性多発性骨髄腫の処置用である請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
上記薬剤がボルテゾミブ耐性多発性骨髄腫の処置用である請求項９および１０に記載の使用。
【請求項１２】
ヒストンもしくは他のタンパク質の高アセチル化の誘導または該アセチル化により機能的に調節されるタンパク質の誘導がヒトのガンの処置に有益な効果を有する、請求項８ないし１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
請求項１ないし３のいずれかに定義する式（Ｉ）のヒストンデアセチラーゼインヒビターを、単独で、またはプロテアソームインヒビターとの組み合わせで、特性決定する方法であって、サンプル中のヒストンもしくは他のタンパク質のアセチル化の誘導、または該アセチル化により機能的に調節されるタンパク質の誘導の量を測定することを含んでなる上記方法。
【請求項１４】
請求項１ないし３のいずれかに定義する式（Ｉ）のヒストンデアセチラーゼインヒビターを、単独で、またはプロテアソームインヒビターとの組み合わせで特性決定する方法であって、サンプル中の
ａ）ヒストン３のアセチル化の誘導、ヒストン４のアセチル化の誘導またはｐ２１の誘導、および
ｂ）アルファ−チューブリンのアセチル化の誘導、Ｈｓｐ９０のアセチル化の誘導またはＨｓｐ７０の誘導
の量を測定することを含んでなる上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラスＩおよびクラスＩＩヒストンデアセチラーゼに対する組み合わせ活性を持つヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）インヒビターに関する。本発明はそれらを含んでなる組み合わせ物および組成物、ならびにそれら薬剤、例えばリンパ腫および白血病のような造血腫瘍を抑制するための薬剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＤＡＣ酵素のファミリーは同定されたそれらの最初の基質、すなわち核ヒストンタンパク質にちなんで名付けられた。ヒストンタンパク質（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４）は８量体複合体を形成し、凝縮されたクロマチン構造を確立するためにその回りにＤＮＡヘリックスが巻き付いている。ヒストンのアセチル化状態はアセチル化するヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）とヒストンテイルの脱アセチル化の原因となるＨＤＡＣ酵素により支配される力学的平衡関係にある。ＨＤＡＣ酵素の阻害はヌクレオソームのヒストンテイルのアセチル化を促進し、より転写が可能なクロマチン構造となり、これは次いで細胞増殖、アポトーシスおよび分化のような細胞のプロセスに関与する改変された遺伝子発現を導く。最近では、さらに多くの非ヒストンＨＤＡＣ基質が同定されている。
【０００３】
発癌性転写因子と連動して、脱調節された一定の（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｎｄ
ｃｏｎｓｔａｎｔ）ＨＤＡＣのクロマチンへの再集合が急性前骨髄細胞性白血病（ＡＰＬ）、非ホジキンリンパ腫および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のような白血病およびリンパ腫の特異的形態で見いだされる。タンパク質レベルでのＨＤＡＣ１のアップレギュレーションは、疾患が悪性の病変および十分に分化したアンドロゲン応答性の前立腺腺ガンから表現型的に脱分化したアンドロゲン無反応性前立腺ガンへと進行する時に前立腺ガン細胞で観察された。さらに大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）で腫瘍サプレッサーの損失により誘発される増大したＨＤＡＣ２発現がヒト結腸ガン体外移植組織のほとんどで見いだされる。
【０００４】
ガンにおけるＨＤＡＣ／ＨＡＴ活性の平衡と一致して、ＨＤＡＣインヒビターはインビトロで広いスペクトルのヒト腫瘍細胞株で、細胞周期の停止、終末分化（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）および／またはアポトーシスを誘導し、新脈管形成を阻害し、そしてインビボではヌードマウスでのヒト異種移植モデルにおいて、抗腫瘍活性を現すことが示された。
【０００５】
ＨＤＡＣファミリーの酵素は通常、３つのクラス、すなわちクラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩに分類される。クラスＩおよびＩＩのみが主に現在、臨床的開発においてＨＤＡＣインヒビターの効果を媒介すると思われてきた。
【０００６】
ＨＤＡＣファミリーメンバー１〜３および８からなるクラスＩ群のＨＤＡＣは、腫瘍細胞の増殖に重要であることが示された。
【０００７】
特異的プロモーターを静まらせる（ｓｉｌｅｎｃｅ）ためにクラスＩのＨＤＡＣを利用する広い様々な転写因子の中で最もよく知られている例は、ＨＤＡＣ３のみにそれらのリガンドの不存在下で結合する核ホルモン受容体のクラスであり、すなわち転写的サイレンシング状態を維持する。この複合体はリガンド−依存的様式、例えばレチノイド、エスト
ロゲン、アンドロゲン等により解離し、遺伝子発現および分化をもたらす。別の重要な例はサイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ２１ｗａｆ１,cｉｐ１のＨＤＡＣ１−依存性サイレンシングである。ＨＤＡＣインヒビターの抗増殖効果におけるｐ２１ｗａｆ１,ｃｉｐ１誘導の重大な役割は、親のＨＣＴ−１１６細胞に比べてｐ２１ｗａｆ１,ｃｉｐ１欠失細胞でＨＤＡＣインヒビタートリコスタチンＡ（ＴＳＡ）に対して６倍増大した耐性を示す実験により証明された。さらに本物の腫瘍サプレッサー遺伝子とは異なり、ｐ２１ｗａｆ１,ｃｉｐ１は腫瘍細胞中に偏在し、そしてＨＤＡＣインヒビターにより誘導される。
【０００８】
ヒストンだけがクラス−Ｉ  ＨＤＡＣの基質ではない。例えばＨＤＡＣ１〜３は腫瘍サプレッサーｐ５３を脱アセチル化し、これは結果的にユビキチン化され、そして分解される。細胞周期の停止およびアポトーシスを含めｐ５３は有力な腫瘍サプレッサーであるので、このタンパク質を低レベルに維持することは腫瘍細胞の生存および制御されていない増殖ができる鍵となる。
【０００９】
クラスＩＩ  ＨＤＡＣは２つのサブクラスに分類することができる：クラスＩＩａはＨＤＡＣ４，５，７，９およびＨＤＡＣ９スプライスバリアントＭＩＴＲを含む。クラスＩＩｂはＨＤＡＣ６およびＨＤＡＣ１０を含んでなり、これらは両方とも２つのＨＤＡＣドメインを有する。クラスＩＩａ  ＨＤＡＣは生来のヒストンデアセチラーゼ活性を保有しないが、それらはクラスＩ  ＨＤＡＣ複合体および転写因子／ＤＮＡ複合体の両方と会合するので架橋因子（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）として機能することにより遺伝子発現を調節する。
【００１０】
クラス−ＩＩｂのメンバーであるＨＤＡＣ６は、それがＨｓｐ９０デアセチラーゼと同定されたことにより注目された。ＨＤＡＣインヒビターＬＡＱ８２４およびＬＢＨ５８９はＨｓｐ９０の脱アセチル化を誘導するが、トラポキシン（ｔｒａｐｏｘｉｎ）および酪酸ナトリウムは誘導しないことが示された。Ｈｓｐ９０デアセチラーゼは、プロ−サバイバル（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）およびプロ−プロリファラティブ（ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）なクライアント（ｃｌｉｅｎｔ）タンパク質に会合したＨｓｐ９０の分解を生じる。重要な例にはＨｅｒ−２、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、グルココルチコイド受容体、変異体ＦＬＴ−３、ｃ−ＲａｆおよびＡｋｔがある。Ｈｓｐ９０に加えて、ＨＤＡＣ６もチューブリンの脱アセチル化を媒介し、これはストレス条件下で微小管の不安定化を生じる。
【００１１】
ＨＤＡＣ６の生物学的役割は、特異的なＨＤＡＣ６の低分子インヒビターであるチューバシン（ｔｕｂａｃｉｎ）がα−チューブリンの高アセチル化（ｈｙｐｅｒａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）を引き起こし、そして細胞周期の進行に影響を及ぼすことなく細胞の運動性を低下させるという事実によりさらに確認された。ＨＤＡＣ６のα−チューブリンデアセチラーゼドメインのみを阻害するチューバシンは、ＨＳＰ９０のアセチル化に最少の増加を生じるだけである。
【００１２】
符合して、ＨＤＡＣ６はエストラジオールが刺激するＭＣＦ−７乳癌細胞の細胞移動にも重要となることが分かった。
【００１３】
最後にＨＤＡＣ６はミスフォールドした（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ）タンパク質の細胞での処理（ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）およびこれらを細胞質から排除することに重要な役割を果たす。
【００１４】
発現または活性のいずれかのレベルで、ＨＤＡＣにより調節される細胞周期調節タンパク質は多数であるため、ＨＤＡＣインヒビターの抗増殖的効果を単一の作用機序と結び付
けることはできない。ＨＤＡＣ阻害は、増殖阻害、分化およびアポトーシスに関与する多くの経路に及ぼす協調した効果が、腫瘍形成および成長のような異質な病状の処置に有利であることを証明できる抗ガン療法に特定の見込みを有する。
【００１５】
長年の研究で、ＨＤＡＣは発癌現象に重要な役割を果たすだけでなく、多くの非悪性分化プロセスにも役割を果たすことが明らかになった。これはクラス−ＩＩａ４、５、７および９で最も明らかである。例えばＨＤＡＣ７はＴ細胞の胸腺成熟において重要な役割を果たすことが示唆される一方、ＨＤＡＣ４は軟骨細胞肥大および軟骨内骨形成の調節と結び付けられてきた。しかしほとんどの関心が、筋肉分化におけるクラス−ＩＩａＨＤＡＣの役割に向けられた。ＨＤＡＣ４、５、７および９はすべて筋細胞エンハンサー因子２（ＭＥＦ２）の転写的コーリプレッサーである結果として、筋細胞（筋肉細胞）の分化を抑制する。
【００１６】
ＨＤＡＣインヒビターで見られる最も多くの毒性は、軽度から中程度の骨髄抑制である。さらに多くの臨床試験で副作用として悪心／吐き気、疲労および下痢の特徴がある。
【００１７】
２００３年９月１８日に公開された特許文献１は、とりわけＨＤＡＣインヒビターＲ３０６４６５を開示する。
【００１８】
【化１】
2010503636.tif 000002
【００１９】
２００６年２月２日に公開された特許文献２は以下のマーカッシュ式
【００２０】
【化２】
2010503636.tif 000003
【００２１】
式中、ｎ、ｍ，Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ＸおよびＹは該明細書で定義される意味を有する
を持つ化合物、そのＮ−オキシド形、製薬学的に許容され得る付加塩および立体化学的異性体の調製、配合および製薬学的特性を記載する。
【００２２】
しかしＨＤＡＣインヒビター療法の可能性は、単一剤での使用をしのいでる。ＨＤＡＣインヒビターにより影響を受ける分子経路により、ＨＤＡＣインヒビターは組み合わせ実験の有望な候補となる。
【００２３】
効力および／または毒性を考慮して単独または他の治療薬との組み合わせのいずれかで、クラス−ＩおよびクラスＩＩｂ  ＨＤＡＣに及ぼす組み合わせ効果を持つ臨床的な利点を提供できるインヒビターの必要性が存在する。
【００２４】
またプロテアソームの阻害は、ガン療法で最近開発された重要な戦略を表す。プロテア
ソームは細胞周期の調節に関与するタンパク質の分解に役割を果たす、すべての細胞に存在する多酵素複合体である。ｐ５３、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼｐ２１ｗａｆ１,ｃｉｐ１を含む多数の重要な調節タンパク質が、ユビキチン−プロテアソーム経路により細胞周期中に一時的に分解される。これらタンパク質の整然とした分解には、細胞が細胞周期を介して進行し、そして有糸分裂を受ける必要がある。さらにユビキチン−プロテアソーム経路は転写調節に必要である。
【００２５】
特許文献３、４、５、６および７は、プロテアソームインヒビターとして有用なペプチド硼酸エステルおよび酸化合物を開示する。化合物の１つであるＮ−ピラジンカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシン硼酸（ＰＳ−３４１、現在ではボルテゾミブまたはＶｅｌｃａｄｅ（ミレニウム：Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）として知られている）は、ヒトの腫瘍異種移植モデルで抗腫瘍活性を有し、そして再発した難治性の多発性骨髄腫患者の処置に認可を受け、そして現在ではさらに血液性ガンならびに充実性腫瘍を含むさらなる兆候で臨床試験中である。ボルテゾミブはミスフォールドした、およびそうでなく傷害を受けたタンパク質の構築を引き起こすことにより細胞死を誘導し、これにより例えばＢａｘ−もしくは反応性酸素種に依存的なメカニズムを介してアポトーシスのミトコンドリア経路を活性化する。
【００２６】
ボルテゾミブは、アグリソーム（ａｇｇｒｅｓｏｍｅ）と呼ばれる構造にユビキチン−結合タンパク質の封鎖を引き起こす。アグリソームは恐らくユビキチン−化したタンパク質を分解するためにリソソームに運搬することによりプロテアソーム阻害に応答して活性化される細胞保護（ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）応答に参加すると思われる。
【００２７】
ボルテゾミブが誘導するアグリソームの形成は、ＨＤＡＣインヒビターであるＳＡＨＡ（スベロイルアニリドヒドロキサム酸）を使用して破壊することができた。またはＳＡＨＡは、インビトロでのアポトーシスおよびインビボで正常位の膵臓ガン異種移植モデルで相乗効果を示す（非特許文献１）。
【００２８】
また別のＨＤＡＣインヒビターであるＬＡＱ８２４は、ボルテゾミブと相乗的レべルの細胞死を示す（非特許文献２）。
【００２９】
ＳＡＨＡおよびＬＡＱ８２４とボルテゾミブとの相乗的効果は、それらのＨＤＡＣ６阻害活性に関連付けられた。
【００３０】
さらに腫瘍の増殖に対するプロテアソームインヒビターの阻害効力を上げること、およびまた患者に対する有害な毒性の副作用の危険性を減らすために、そのような作用物質の投薬用量を下げることが必要とされている。
【００３１】
現在、アセチル化の程度と腫瘍応答との相関の確固たるデータは利用できていない。以下に記載するＨＤＡＣインヒビターまたは該ＨＤＡＣインヒビターを含んでなる組み合わせ物により生じるヒストンおよび非ヒストン基質のアセチル化の程度を定量する迅速、簡略かつ容易に再現可能な方法は、それらの将来に重要となるだろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３２】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１４８５３６５号明細書
【特許文献２】国際公開第２００６／０１０７５０号パンフレット
【特許文献３】欧州特許出願公開第７８８３６０号明細書
【特許文献４】欧州特許出願公開第１３１２６０９号明細書
【特許文献５】欧州特許出願公開第１６２７８８０号明細書
【特許文献６】米国特許第６０６６７３０号明細書
【特許文献７】米国特許第６０８３９０３号明細書
【非特許文献】
【００３３】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００６；６６：（７）３７７３−３７８１
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００５；２８０：（２９）２６７２９−２６７３４
【発明の概要】
【００３４】
本発明の目的は、以下に記載する種類のＨＤＡＣインヒビターおよびプロテアソームインヒビターとＨＤＡＣインヒビターとの治療用組み合わせ物を提供することであり、これらは強固かつ特徴的なアセチル化効果、クラス−ＩおよびクラスＩＩ−ｂ  ＨＤＡＣ双方の阻害、腫瘍細胞増殖に対する有利な阻害効果、および望ましくない低い副作用を有する可能性がある。
【００３５】
したがって本発明により我々はプロテアソームインヒビターと式（Ｉ）
【００３６】
【化３】
2010503636.tif 000004
【００３７】
式中、Ｒ４は水素またハロから選択される
のＨＤＡＣインヒビター、その製薬学的に許容され得る酸または塩基付加塩および立体化学的異性体の組み合わせ物を提供する。
【００３８】
興味深い化合物は、Ｒ４がフルオロである式（Ｉ）の化合物である。
【００３９】
さらに興味深い化合物は、Ｒ４がインドールの４もしくは７位にある式（Ｉ）の化合物である。
【００４０】
好適な式（Ｉ）の化合物は、国際公開第２００６／０１０７５０号パンフレットに示す番号に対応する化合物番号１ａ、化合物番号３０および化合物番号３９である。
【００４１】
【表１】
2010503636.tif 000005
【００４２】
他の好適な式（Ｉ）の化合物は、Ｒ４が水素である化合物である。
【００４３】
最も好適な化合物は、化合物番号１ａ
（ＪＮＪ２６４８１５８５）
【００４４】
【化４】
2010503636.tif 000006
【００４５】
またはその製薬学的に許容され得る付加塩である。
【００４６】
置換基から二環式環系へ引かれた線は、結合が二環式環系の任意の適切な環の原子へ結合できることを示している。
【００４７】
前記定義および以下で使用するハロはフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードの総称である。
【００４８】
本明細書で使用する用語「ヒストンデアセチラーゼ」および「ＨＤＡＣ」はヒストンのＮ−末端でリシン残基のε−アミノ基からアセチル基を除去する酵素の任意の１つのファミリーを表わすことを意図する。文脈により示されない限り、用語［ヒストン」は任意の種からのＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４およびＨ５を包含する任意のヒストンタンパク質を指すことを意味する。ヒトのＨＤＡＣタンパク質または遺伝子産物は限定するわけではないが、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５，ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、ＨＤＡＣ−８、ＨＤＡＣ−９、ＨＤＡＣ−１０およびＨＤＡＣ−１１を包含する。ヒストンデアセチラーゼはまた、原生動物またはカビ・真菌源から誘導することができる。
【００４９】
用語「ヒストンデアセチラーゼインヒビター」または「ヒストンデアセチラーゼのインヒビター」とは、ヒストンデアセチラーゼと相互反応し、そしてその活性、より詳細にはその酵素活性を阻害することができる化合物を同定するために使用する。ヒストンデアセチラーゼの酵素活性を阻害することは、ヒストンもしくは他のタンパク質基質からアセチル基を除去するためのヒストンデアセチラーゼの能力を減少させることを意味する。好ま
しくはそのような阻害は特異的であり、すなわちヒストンデアセチラーゼインヒビターは、何か他の無関係な生物学的効果を生じるために必要なインヒビターの濃度より低い濃度でヒストンもしくは他のタンパク質基質からアセチル基を除去するためのヒストンデアセチラーゼの能力を減少させる。
【００５０】
用語「クラスＩおよびクラスＩＩｂ  ＨＤＡＣに対する組み合わせ活性を持つＨＤＡＣインヒビター」または「クラスＩおよびクラスＩＩ−ｂ  ＨＤＡＣの阻害」とは、他のクラスのＨＤＡＣ酵素、例えばクラスＩＩａの阻害を生じるために必要とされるインヒビターの濃度よりも低い濃度で、あるいは何か他の関係する生物学的効果の阻害を生じるために必要なインヒビターの濃度より低い濃度で、クラスＩ  ＨＤＡＣファミリーメンバー（ＨＤＡＣ１〜３または８）およびクラスＩＩｂ  ＨＤＡＣファミリーメンバー（ＨＤＡＣ６または１０）の双方の酵素活性を減少させる化合物を同定するために使用する。
【００５１】
本明細書で使用する用語「プロテアソーム」および「ユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）」は、ＵＰＳ中のすべての成分の構造および機能の任意の１つを指すことを意図し、それらには限定するわけではないが：
ａ）ユビキチン（Ｕｂ）およびユビキチン−様タンパク質（Ｕｌｐ）；ｆ．ｅ．ＳＵＭＯ、ＮＥＤＤ８、ＩＳＧ１５等、
ｂ）ユビキチンモノマー、Ｋ４８結合ポリユビキチン鎖、Ｋ６３結合ポリユビキチン鎖等、
ｃ）Ｅ１ユビキチン−活性化酵素；ｆ．ｅ．Ｅ１Ｕｂ、Ｅ１ＳＵＭＯ、Ｅ１ＮＥＤＤ８、Ｅ１ＩＳＧ１５等、
ｄ）Ｅ１ユビキチン−活性化酵素のサブユニット；ｆ．ｅ．ＡＰＰＢＰ１、ＵＢＡ３、ＳＡＥ１、ＳＡＥ２等、
ｅ）Ｅ２ユビキチン−結合酵素（ｃｏｊｕｇａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）；ｆ．ｅ．ＵＢＣ９、ＵＢＣ１２、ＵＢＣ８等
ｆ）Ｅ３ユビキチンリガーゼ；ｆ．ｅ．ＲＩＮＧ−フィンガーＥ３ｓ、単純なＲＩＮＧ−フィンガーＥ３ｓ、クリン（ｃｕｌｌｉｎ）に基づくＲＩＮＧ−フィンガーＥ３ｓ、ＲＢＸ１／ＲＢＸ２依存性Ｅ３ｓ、ＨＥＣＴ−ドメインＥ３ｓ、Ｕ−ボックスＥ３ｓ等、
ｇ）ＳＣＦ（ＳＫＰ１−クリン１−Ｆ−ボックス）Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体、ｆ．ｅ．ＳＣＦＳＫＰ２、ＳＣＦＢ−ＴＲＣＰ、ＳＣＦＦＢＷ７等、
ｈ）クリン、ｆ．ｅ．ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＵＬ３、ＣＵＬ４、ＣＵＬ５等、
ｉ）Ｆ−ボックスタンパク質、ｆ．ｅ．ＳＫＰ２、Ｂ−ＴＲＣＰタンパク質、ＦＢＷタンパク質等、
ｊ）他の基質特異的アダプター、ｆ．ｅ．ＢＴＢタンパク質、ＳＯＣＳ−ボックスタンパク質、ＤＤＢ１／２、ＶＨＬ等、
ｋ）プロテアソーム、その成分等
ｌ）メタロイソペプチダーゼＲＰＮ１１、プロテアソームリッドのサブユニット等、ＵＰＳ標的の分解前にそれらを脱ユビキチン化する、
ｍ）メタロイソペプチダーゼＣＳＮ５、ＣＯＰ９−シグナロソーム複合体のサブユニット等、クリンからＮＥＤＤ８を除去する原因、
ｎ）Ｅ１ユビキチン−活性化酵素による活性化工程、ここでＵｂ／Ｕｌｐは最初にそのＣ−末端グリシン残基でアデニル化されるようになり、次いで再度そのＣ−末端でチオールエステルとして荷電するようになる、
ｏ）Ｕｂ／ＵｌｐのＥ１ユビキチン−活性化酵素からＥ２ユビキチン−結合酵素への転移ｐ）ユビキチン−結合体の認識、
ｑ）基質−ユビキチン複合体のプロテアソームへの転移および結合、
ｒ）ユビキチン除去、または
ｓ）基質分解
を含む。
【００５２】
用語「プロテアソームインヒビター」および「ユビキチン−プロテアソーム系のインヒビター」とは、ＵＰＳ中の正常な、改変した、高活性（ｈｙｐｅｒ−ａｃｔｉｖｅ）な、または過剰発現した成分と相互作用することができ、そしてその活性、より詳細にはその酵素活性を阻害することができる化合物を同定するために使用する。ＵＰＳ酵素活性を阻害することはＵＰＳ成分がその活性を達成する能力を下げることを意味する。好ましくはそのような阻害は特異的であり、すなわちプロテアソームインヒビターは何か他の無関係な生物学的効果を生じるために必要なインヒビターの濃度より低い濃度でＵＰＳの成分の活性を減少させる。ＵＰＳ成分の活性のインヒビターには限定するわけではないが：
ａ）Ｕｂ／Ｕｌｐのアデニル化部位への接近を遮断することにより、またはＡＴＰの接近を遮断することによるＵｂもしくはＵｌｐアデニル化のインヒビター；ｆ．ｅ．イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）（グリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）；ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））等、
ｂ）Ｅ３またはＥ３複合体とＥ２との相互作用の破壊物、
ｃ）Ｅ３またはＥ３複合体上の基質と基質相互作用ドメインとの間の相互作用の妨害物、例えばｐ５３（基質）とＭＤＭ２（ＲＩＮＧ−フィンガーＥ３）との間の相互作用を遮断すること、ｆ．ｅ．ヌトリン（ｎｕｔｌｉｎｓ）（ＭＤＭ２への結合による）、ＲＩＴＡ（ｐ５３のＮ末端への結合による）等、
ｄ）Ｅ３リガーゼ複合体の妨害物、
ｅ）ユビキチンリガーゼに対する基質の人工的リクルーター（ｒｅｃｒｕｉｔｅｒ）、ｆ．ｅ．プロタクス（ｐｒｏｔａｃｓ）等、
ｆ）プロテアソームおよびその成分のインヒビター、ｆ．ｅ．ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ（ｃａｒｆｉｌｚｏｍｉｂ）、ＮＰＩ−００５２、Ｂｓｃ２１１８等、
ｇ）ユビキチン／Ｕｌｐ除去のインヒビター、例えばメタロイソペプチダーゼＲＰＮ１１およびＣＳＮ５のインヒビター、あるいは
ｈ）ポリユビキチン鎖を修飾すること、ｆ．ｅ．ユビスタチン（ｕｂｉｓｔａｔｉｎ）等、を含む。
【００５３】
本明細書で上に挙げたような製薬学的に許容できる酸付加塩は、式（Ｉ）の化合物が形成することができる治療的に活性な無毒の酸付加塩形態を含んでなることを意味する。塩基性特性を有する式（Ｉ）の化合物は、適当な酸で該塩基形態を処理することによりそれらの製薬学的に許容できる酸付加塩に転化させることができる。適当な酸は、例えばハロゲン化水素酸、例えば塩酸もしくは臭化水素酸；硫酸；硝酸；リン酸等のような無機酸；または例えば酢酸、トリフルオロ酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸（すなわちブタン二酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノ−サリチル酸、パモ酸等の酸のような有機酸を含んでなる。
【００５４】
酸性の特性を有する式（Ｉ）の化合物は、適当な有機または無機塩基で該酸形態を処理することによりそれらの製薬学的に許容できる塩基形態の塩に転化させることができる。適当な塩基塩形態は、例えばアンモニウム塩、アルカリおよびアルカリ土類金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩等、有機塩基との塩、例えばベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ヒドラバミン塩および例えばアルギニン、リシン等のようなアミノ酸との塩を含んでなる。
【００５５】
また酸または塩基付加塩という用語は、式（Ｉ）の化合物が形成することができる水和物および溶媒付加物形態を含んでなる。このような形態の例は例えば、水和物、アルコラート等である。
【００５６】
本明細書でこれまでに使用した式（Ｉ）の化合物の立体化学的異性体形態という用語は
、式（Ｉ）の化合物が有することができる、互換性ではない、同一配列により結合した同じ原子からなり、しかし異なる三次元構造を有するすべての可能な化合物を表わす。別に言及または指摘しない限り、化合物の化学名は、該化合物が有することができるすべての可能な立体化学的異性体の混合物を包含する。該混合物は該化合物の基礎的分子構造のすべてのジアステレオマーおよび／またはエナンチオマーを含有することができる。純粋な形態または互いの混合物双方の式（Ｉ）の化合物のすべての立体化学的異性体が本発明の範囲内に包含されるものとする。
【００５７】
式（Ｉ）の幾つかの化合物はまた、それらの互変異性体で存在することができる。このような形態は前記の式中に明白には示されていないが、本発明の範囲内に包含することを意図している。
【００５８】
これから使用する場合はいつも、「式（Ｉ）の化合物」という用語は、製薬学的に許容できる酸または塩基付加塩およびすべての立体異性体形態を包含することを意味する。
【００５９】
本発明にしたがい特に好適なプロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブである。ボルテゾミブはミレニウムからＶｅｌｃａｄｅという商用名で販売されており、そして欧州特許出願公開第７８８３６０号、同第１３１２６０９号、同第１６２７８８０号、米国特許第６０６６７３０号および同第６０８３９０３号明細書に記載されているように調製することができる。
【００６０】
また本発明は例えば腫瘍細胞の成長を阻害するための医学療法に使用するための本発明の組み合わせ物に関する。
【００６１】
また本発明は腫瘍細胞の成長を阻害するための製薬学的組成物を調製するための本発明の組み合わせ物の使用に関する。
【００６２】
また本発明は、患者に有効量の本発明の組み合わせ物を投与することを含んでなるヒト患者における腫瘍細胞の成長の抑制法に関する。
【００６３】
さらに本発明は有効量の本発明の組み合わせ物を投与することにより形質転換細胞を包含する細胞の異常な成長を抑制する方法を提供する。細胞の異常な成長は正常な制御機序と独立した細胞成長（例えば、接触阻止の喪失）を意味する。これは癌細胞の成長停止、終末分化および／またはアポトーシスを引き起こすことにより直接に、そして腫瘍細胞の移動、侵襲および生存、または腫瘍の新脈管形成を抑制することにより間接的の双方による腫瘍の成長の抑制を包含する。
【００６４】
本発明はまた、このような処置を要する個体、例えば哺乳動物（そしてより詳細にはヒト）に、有効量の本発明の組み合わせ物を投与することにより、腫瘍の成長を抑制する方法を提供する。特に本発明は有効量の本発明の組み合わせ物の投与により腫瘍の成長を抑制する方法を提供する。本発明は膵臓ガン、リンパ系統の血液腫瘍、例えば急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄細胞性白血病、急性骨髄性白血病、急性単球性白血病、リンパ腫、慢性Ｂ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、急性転化における慢性骨髄性白血病、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガン、非ホジキンリンパ腫、メラノーマ、前立腺ガン、乳ガンおよび結腸ガンの処置に特に応用することができる。抑制することができる他の腫瘍の例には、限定するわけではないが甲状腺濾胞腺ガン、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉性腫瘍（例えば繊維肉腫および横紋筋肉腫）、奇形芽腫、神経芽細胞腫、神経膠原腫、皮膚の良性腫瘍（例えば、角化棘細胞腫）、腎臓ガン、卵巣ガン、膀胱ガンおよび表皮ガンがある。
【００６５】
また本発明はこのような処置を要する個体、例えば哺乳動物（そしてより詳細にはヒト）に、有効量の式（Ｉ）のヒストンデアセチラーゼインヒビターを投与することにより、急性リンパ芽球白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄細胞性白血病、急性骨髄性白血病、急性単球性白血病、リンパ腫、慢性Ｂ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、急性転化における慢性骨髄性白血病、バーキットリンパ腫および多発性骨髄腫を処置する方法を提供する。
【００６６】
また本発明はこのような処置を要する個体、例えば哺乳動物（そしてより詳細にはヒト）に、有効量の式（Ｉ）のヒストンデアセチラーゼインヒビターを単独で、またはプロテアソームインヒビターと組み合わせて投与することにより、限定するわけではないがリンパ系統の血液腫瘍のような薬剤耐性腫瘍、例えば薬剤耐性急性リンパ芽球白血病、薬剤耐性球骨髄性白血病、薬剤耐性急性前骨髄細胞性白血病、薬剤耐性急性骨髄性白血病、薬剤耐性急性単球性白血病、薬剤耐性リンパ腫、薬剤耐性慢性Ｂ細胞白血病、薬剤耐性慢性骨髄性白血病、急性転化における薬剤耐性慢性骨髄性白血病、薬剤耐性バーキットリンパ腫および薬剤耐性多発性骨髄腫を処置する方法を提供する。本発明は特に薬剤耐性多発性骨髄腫の処置、より詳細にはプロテアソームインヒビターに耐性の多発性骨髄腫、さらに詳細にはボルテゾミブに耐性の多発性骨髄腫の処置に応用することができる。
【００６７】
「薬剤耐性多発性骨髄腫」という用語には、限定するわけではないが、サリドマイド、デキサメタゾン、レブリミド（ｒｅｖｌｉｍｉｄ）、ドキソルビシン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、パミドロネート、メルファラン、デフィブロチド（ｄｅｆｉｂｒｏｔｉｄｅ）、プレドニゾン、ダリナパルジン（ｄａｒｉｎａｐａｒｓｉｎ）、ベリノスタット（ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ）、ボリノスタット（ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）、ＰＤ０３３２９９１、ＬＢＨ５８９、ＬＡＱ８２４、ＭＧＣＤ０１０３、ＨｕＬｕｃ６３、ＡＺＤ６２４４、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ、Ｐ２７６−００、プリチデプシン（ｐｌｉｔｉｄｅｐｓｉｎ）、ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）、タネスピマイシン（ｔａｎｅｓｐｉｍｙｃｉｎ）、エンザスタウリン（ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ）、ペリホシン（ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ）、ＡＢＴ−７３７またはＲＡＤ００１の群から選択される１もしくは複数の薬剤に対して耐性の多発性骨髄腫を含む。また用語「薬剤耐性多発性骨髄腫」という用語は、再発した、または難治性多発性骨髄腫も含む。
【００６８】
「薬剤耐性」という用語は、先天的耐性または後天的耐性を示す状態を意味する。「先天的耐性」とは限定するわけではないがアポトーシス、細胞発達およびＤＮＡ修復を含む関連する経路において重要な遺伝子のガン細胞中での特徴的発現プロファイルを意味し、これはガン細胞の正常な対応物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）と比べた時、ガン性細胞のより迅速な成長能力に貢献する。「後天的耐性」とは、腫瘍の形成および進行において起こる、薬剤に対するガン細胞の感受性に影響を及ぼし得る多機能的現象を意味する。後天的耐性には限定するわけではないが：薬剤−標的における改変、減少した薬剤の蓄積、細胞内の薬剤分布の改変、低下した薬剤−標的相互作用、上昇した解毒応答、細胞−周期の脱調節、上昇した傷害−ＤＮＡ修復、および低下したアポトーシス応答のようないくつかのメカニズムによることができる。該メカニズムの幾つかは同時に起こることができ、かつ／または互いに相互作用することができる。それらの活性化および／または不活性化は遺伝的または後成の出来事によるか、あるいはオンコウイルスタンパク質の存在による可能性がある。後天的耐性は個別の薬剤に対して生じ得るが、異なる化学的構造および異なる作用機序を持つ多くの種々の薬剤に対してより広く生じる可能性もある。この耐性の形態を多剤耐性と呼ぶ。
【００６９】
本発明に従う組み合わせ物は他の治療目的、例えば、
ａ）癌を処置するための腫瘍の照射前、期間中または後に、本発明に従う化合物を投与することによる放射線治療に対する腫瘍の増感化、
ｂ）慢性関節リウマチ、変形性関節炎、若年性関節炎、痛風、多発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎および全身性紅斑性狼瘡のような関節症および骨病理学的状態を処置すること、
ｃ）血管増殖障害、アテローム性動脈硬化症および再狭窄を含む平滑筋細胞増殖を抑制すること、
ｄ）潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー性鼻炎、移植片対宿主病、結膜炎、喘息、ＡＲＤＳ、ベーチェット病、移植拒絶反応、蕁麻疹、アレルギー性皮膚炎、円形脱毛症、強皮症、発疹、湿疹、皮膚筋炎、にきび、糖尿病、全身性紅斑性狼瘡、川崎病、多発性硬化症、気腫、嚢胞性繊維症および慢性気管支炎のような炎症状態および皮膚の状態を処置すること、
ｅ）子宮内膜症、子宮筋腫、機能不全性子宮出血および内膜肥厚を処置すること、
ｆ）網膜および脈絡膜血管に影響する血管疾患を含む眼内血管新生を処置すること、
ｇ）心臓機能不全を処置すること、
ｈ）ＨＩＶ感染症の処置のような免疫抑制状態を抑制すること、
ｉ）腎機能不全を処置すること、
ｊ）内分泌障害を抑制すること、
ｋ）糖新生機能不全を抑制すること、
ｌ）神経病理学、例えばパーキンソン病、または認識障害をもたらす神経病理学、例えばアルツハイマー病またはポリグルタミン関連ニューロン疾患を処置すること、
ｍ）精神障害、例えば精神分裂症、双極性障害、鬱病、心配症および精神病を処置すること、
ｎ）神経筋肉病理、例えば筋萎縮性側索硬化症を抑制すること、
ｏ）脊髄筋萎縮症を処置すること、
ｐ）遺伝子の発現を強化することにより処置に有効な他の病理的状態を処置すること、
ｑ）遺伝子治療を促進すること、
ｒ）脂質生成を抑制すること、
ｓ）マラリアのような寄生虫病を処置すること、
に使用することができる。
【００７０】
従って本発明は薬剤としての使用のための上記組み合わせ物、ならびに１もしくは複数の前記状態を処置するための薬剤を製造するためにクラスＩおよびクラスＩＩｂ  ＨＤＡＣに対して組み合わせた活性を持つ単独の、またはプロテアソームインヒビターと組み合わせた式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターの使用を開示する。
【００７１】
本発明は急性リンパ芽球白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄細胞性白血病、急性骨髄性白血病、急性単球性白血病、リンパ腫、慢性Ｂ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、急性転化における慢性骨髄性白血病、バーキットリンパ腫および多発性骨髄腫を処置する薬剤の製造のために、クラスＩおよびクラスＩＩｂ  ＨＤＡＣに対して組み合わせた活性を持つ単独または組み合わせ物のいずれかの式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターの使用を開示する。
【００７２】
または本発明は、限定するわけではないがリンパ系統の血液腫瘍のような薬剤耐性腫瘍、例えば薬剤耐性急性リンパ芽球白血病、薬剤耐性急性骨髄性白血病、薬剤耐性急性前骨髄細胞性白血病、薬剤耐性急性骨髄性白血病、薬剤耐性急性単球性白血病、薬剤耐性リンパ腫、薬剤耐性慢性Ｂ細胞白血病、薬剤耐性慢性骨髄性白血病、急性転化における薬剤耐性慢性骨髄性白血病、薬剤耐性バーキットリンパ腫および薬剤耐性多発性骨髄腫を処置する薬剤の製造のために、クラスＩおよびクラスＩＩｂ  ＨＤＡＣに対して組み合わせた活性を持つ単独または組み合わせ物のいずれかの式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターの使用を開示する。
【００７３】
さらに本発明は薬剤耐性多発性骨髄腫、より詳細にはプロテアソームインヒビターに耐性の多発性骨髄腫、さらに詳細にはボルテゾミブに耐性の多発性骨髄腫を処置する薬剤の製造のために、クラスＩおよびクラスＩＩｂ  ＨＤＡＣに対して組み合わせた活性を持つ単独または組み合わせ物のいずれかの式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターの使用を開示する。
【００７４】
プロテアソームインヒビターおよび式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターを同時に（例えば、別個のまたは単位組成物中で）またはいずれかの順序で順次に投与することができる。後者の場合は、２種の化合物は確実に、有利なまたは相乗的効果が達成されるために十分な期間内および量および様式で投与される。組み合わせ物の各成分に対して好ましい方法および投与の順序および各投薬用量および計画は、投与される特定のプロテアソームインヒビターおよびＨＤＡＣインヒビター、組み合わせ物の投与経路、処置される特定の腫瘍および処置される特定の宿主に依存すると考えられる。投与の最適な方法および順序およびに投薬用量および投与計画は、従来の方法を使用し、そして本明細書に説明される情報を考慮して、当業者が容易に決定することができる。
【００７５】
さらに本発明は、ガンに罹患している患者の処置に同時、別個または順次に使用するための組み合わせ調製物として、第１の有効成分として式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターおよび第２の有効成分としてプロテアソームインヒビターを含有する生成物に関する。
【００７６】
当業者は以下に提示される試験結果から有効量を容易に決定することができるであろう。一般に治療に有効量の式（Ｉ）の化合物およびプロテアソームインヒビターは０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、そして特に０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であろうと予想される。必要用量を１日全体で適当な間隔を空けて２、３、４回またはそれ以上の分割量として投与することが適当かも知れない。該分割量は例えば、単位剤形当たり０．５〜５００ｍｇ、そして特に１０ｍｇ〜５００ｍｇの有効成分を含有する単位剤形として調製することができる。
【００７７】
それらの有用な薬理学的特性を考慮すると、本発明の組み合わせ物の成分、すなわちプロテアソームインヒビターおよびＨＤＡＣインヒビターは、投与目的に対して種々の製薬学的形態に調製することができる。成分は個々の製薬学的組成物に別個に、または双方の成分を含有する単位製薬学的組成物に配合することができる。ＨＤＡＣインヒビターは当業者に既知の方法、特に本発明で言及し、そして参照により引用された公開特許明細書に記載されている方法に従い製薬学的組成物を調製し、そしてそれに配合することができる。  しだかって本発明はまた、プロテアソームインヒビターおよび式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターを１もしくは複数の製薬学的担体と一緒に含んでなる製薬学的組成物に関する。本発明にしたがい使用するための製薬学的組成物を調製するためには、有効成分として、有効量の塩基もしくは酸付加塩形態の特定の化合物を、製薬学的に許容できる担体と均一な混合物に合わせ、その担体は投与のために所望される調製状態に応じて広範な形態を採ることができる。これらの製薬学的組成物は望ましくは、好ましくは、経口、直腸内、皮下または非経口注射による投与に適した単位剤形である。例えば、経口投与形態の組成物を調製する際には、懸濁物、シロップ、エリキシルおよび液剤のような経口液体調製物の場合には、例えば水、グリコール、油、アルコール等；あるいは散剤、ピル、カプセルおよび錠剤の場合にはデンプン、糖、カオリン、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等のような固形の担体、のような任意の通常の製薬学的媒質を使用することができる。それらの投与の容易性のために、錠剤およびカプセルが最も有利な経口投与単位形態を表わし、その場合は固形の製薬学的担体が明らかに使用される。非経口組成物に対しては、例えば、溶解度を補助するための他の成分を包含することができるが、担体は通常、少なくとも大部分は滅菌水を包んでなる。例えば注射用液を調製することができ、ここで担体は生理食塩水、グルコース溶液または生理食塩水とグルコース溶液の混合物を含んでなる。注射用懸濁液もまた調製することができ、この場合は適当な液体の担体、懸濁剤等を使用することができるる。皮下投与に適した組成物中では、担体は場合により、皮膚に有意な悪影響を引き起こさない、少量の任意の性状の適当な添加剤と場合により組み合わせた、透過性促進剤および／または適当な湿潤化剤を含んでなる。該添加剤は皮膚への投与を容易にし、かつ／または所望の組成物を調製する補助になり得る。これらの組成物は種々の方法で、例えば経皮パッチとして、スポット−オン剤としてまたは軟膏として投与することができる。
【００７８】
投与の容易性および投薬の均一性のためには、前記の製薬学的組成物を単位剤形に調製することが特に有利である。本明細書および請求の範囲で使用される単位剤形は、各単位が要求される製薬学的担体と一緒に所望の治療効果をもたらすように計算された、前以て決定された量の有効成分を含有する単位剤形として適した物理的に分割された単位を意味する。このような単位剤形の例は錠剤（刻み目付きまたはコート錠を包含する）、カプセル、ピル、散剤分包、ウエファー、注射液または懸濁液、小匙１杯、大匙１杯等、およびそれらの分割された複数物である。
【００７９】
組み合わせ物中の各成分の必要とされる用量を投与するために、処置の過程で適切な間隔を空けて２、３、４またはそれ以上の分割用量を投与することが適切となり得る。この分割用量は単位剤形あたり各々の場合で独立して０．０１〜５００ｍｇ、例えば０．１〜２００ｍｇ、そして特に１〜１００ｍｇの有効成分をを含有する単位剤形として配合することができる。
【００８０】
用語「ヒストンまたは他のタンパク質のアセチル化の誘導」とは、限定するわけではないがヒストン、例えばヒストン３、ヒストン４等；チューブリン、例えばアルファ−チューブリン等；熱ショックタンパク質、例えばＨｓｐ９０等のようなＨＤＡＣ基質のアセチル化状態の誘導を意味する。
用語「アセチル化により機能的に調節されるタンパク質の誘導」とは、限定するわけではないが、例えばＨｓｐ７０の誘導、ｐ２１の誘導のような２次的効果を意味する。
【００８１】
また本発明は式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターを単独で、またはプロテアソームインヒビターと組み合わせて特性を決定する方法に関し、この方法はサンプル中のヒストンもしくは他のタンパク質のアセチル化の誘導、または該アセチル化により機能的に調節されるタンパク質の誘導の量を測定することを含んでなる。さらに詳細には本発明は式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターを単独で、またはプロテアソームインヒビターと組み合わせて特性を決定する方法に関し、この方法はサンプル中の
ａ）ヒストン３のアセチル化の誘導、ヒストン４のアセチル化の誘導またはｐ２１の誘導、および
ｂ）アルファ−チューブリンのアセチル化の誘導、Ｈｓｐ９０のアセチル化の誘導またはＨｓｐ７０の誘導
の量を測定することを含んでなる。
さらに詳細には本発明は、ａ）の下での誘導を得るために必要な濃度がｂ）の下での誘導を得るための濃度と同じ範囲にある上記方法に関する。  
【００８２】
サンプル中のヒストンもしくは他のタンパク質のアセチル化の誘導、または該アセチル化により機能的に調節されるタンパク質の誘導の量の測定には、処置に応答する患者の同定を包含し、すなわちヒトのガンの処置に有益な効果を有することができる。
【００８３】
サンプル中のヒストンもしくは他のタンパク質の高アセチル化の誘導、または該アセチル化により機能的に調節されるタンパク質の誘導の量の測定には、患者における処置の効力のモニタリングを包含し、すなわちヒトのガンの処置に有益な効果を有することができる。
【００８４】
サンプル中のヒストンもしくは他のタンパク質のアセチル化の誘導、または該アセチル
化により機能的に調節されるタンパク質の誘導の量の測定には、処置に対する治療的応答を予測することを包含し、すなわちヒトのガンの処置に有益な効果を有することができる。
【００８５】
したがって本発明はまた、単独またはプロテアソームインヒビターと組み合わせてクラスＩおよびクラスＩＩｂ  ＨＤＡＣに対する組み合わせ活性を持つ式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターの使用に関し、ここでヒストンもしくは他のタンパク質の高アセチル化の誘導、または該アセチル化により機能的に調節されるタンパク質の誘導は、ヒトのガンの処置に有益な効果を有する。
【００８６】
サンプルは該ＨＤＡＣインヒビターまたは該組み合わせ物で処置された細胞に由来することができる。またサンプルは、障害に影響を受けた組織に由来することができ、および／または式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターまたはプロテアソームインヒビターと式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターとの組み合わせ物で処置した個体に由来することができる。
【００８７】
細胞は該ＨＤＡＣインヒビターもしくは該組み合わせ物と接触した培養細胞でよい。該インヒビターもしくは該組み合わせ物は細胞の成長培地に加えることができる。細胞は組織に由来するか、および／または該インヒビターもしくは該組み合わせ物で処置された個体に由来してもよい。
【００８８】
好ましくは特性決定法はインビトロで行われる工程のみを含んでなる。したがってこの態様に従い、ヒトもしくは動物の身体から組織材料を得る工程は本発明に包含されない。
【００８９】
細胞は通常、ヒストンもしくは他のタンパク質のアセチル化の誘導または該アセチル化により機能的に調節されるタンパク質の誘導を測定するために採用される方法に適する条件下で処理されることになる。処理には均一化、抽出、固定、洗浄および／または透過性（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ）とすることを含むことができる。処理の方法はヒストンもしくは他のタンパク質のアセチル化の誘導または該アセチル化により機能的に調節されるタンパク質の誘導を測定するために使用される方法に大部分が依存する。サンプルは患者の生検材料に由来するものでよい。生検材料はさらに処理されて、ヒストンもしくは他のタンパク質のアセチル化の誘導または該アセチル化により機能的に調節されるタンパク質の誘導を測定するために使用される方法に適する条件中のサンプルを生じることができる。
【００９０】
タンパク質のアセチル化の量、または誘導されたタンパク質の量は、抗体を使用により測定することができる。
【００９１】
本明細書で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリンまたは同じ結合特異性を有するその誘導体を表す。本発明に従い使用される抗体はモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗血清に由来するか、もしくはそれを構成する抗体でよい。用語「抗体」はさらにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖもしくはｓｃＦｖフラグメントのような誘導体を意味する。抗体またはその誘導体は天然起源でよく、あるいは（半）合成的に生産されてもよい。
【００９２】
当該技術分野で一般的に知られているウエスタンブロッティングを使用することができる。細胞材料または組織を均一化し、そして変性および／または還元剤で処理してサンプルを得ることができる。サンプルはタンパク質の分離するためにポリアクリルアミドゲルに乗せ、続いて膜に移すか、または固相に直接スポットとして付けることができる。次いで抗体をサンプルと接触させる。１もしくは複数回の洗浄工程後、結合した抗体は当該技術分野で知られている技術を使用して検出される。
【００９３】
組織材料、例えば充実性腫瘍の薄片を固定および透過性とした後に免疫組織化学を使用することができ、次いで抗体をサンプルとインキュベーションし、そして１もしくは複数回の洗浄後に結合した抗体が検出される。
【００９４】
ヒストンもしくは他のタンパク質のアセチル化の誘導または該アセチル化により機能的に調節されるタンパク質の誘導の量は、ＥＬＩＳＡにより測定することができる。様々な形式のＥＬＩＳＡを構想することができる。１つの形式では、抗体がマイクロタイタープレートのような固相に固定化され、続いて非特異的結合部位がブロックされ、そしてサンプルとインキュベーションされる。別の形式では、最初にサンプルを固相と接触させて、サンプル中に含まれるアセチル化および／または誘導されたタンパク質を固定化する。ブロッキングおよび場合により洗浄した後、抗体を固定化したサンプルと接触させる。
【００９５】
ヒストンもしくは他のタンパク質のアセチル化の誘導または該アセチル化により機能的に調節されるタンパク質の誘導の量は、フローサイトメトリーにより測定することができる。細胞、例えば細胞培養細胞または血液細胞または骨髄に由来する細胞を固定化そして透過性として、抗体がアセチル化および／または誘導されたタンパク質に到達するようにする。任意の洗浄およびブロッキング工程の後、抗体を細胞を接触させる。次いでアセチル化および／または誘導されたタンパク質に結合した抗体を有する細胞を測定するために、当該技術分野で知られている手順に従いフローサイトメトリーを行う。
【００９６】
ＨＤＡＣインヒビターまたはプロテアソームインヒビターと式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターとの組み合わせ物が活性を有するかどうかを決定するために、参照サンプル中のタンパク質のアセチル化またはタンパク質の誘導の量を測定することができ、ここで参照サンプルは該ＨＤＡＣインヒビターまたは該組み合わせ物で処理されていない細胞に由来する。サンプルおよび参照サンプル中のタンパク質のアセチル化の量および／または誘導されたタンパク質の量の測定は、平行して行うことができる。細胞培養細胞の場合、２つの細胞組成物が準備され、その１つは該ＨＤＡＣインヒビターまたは該組み合わせ物で処理され、一方もう１つは未処理のままである。続いて両組成物がさらに処理され、そして各々のタンパク質のアセチル化の量および／または誘導されたタンパク質の量が測定される。あるいはＨＤＡＣインヒビターまたはプロテアソームインヒビターと式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターの組み合わせ物がその活性を有するかどうかを測定するために、細胞増殖の阻害を測定することができる。
【００９７】
患者の場合、サンプルは式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターまたはプロテアソームインヒビターと式（Ｉ）のＨＤＡＣインヒビターとの組み合わせ物で処置した患者に由来する。したがって参照サンプルは該ＨＤＡＣインヒビターまたは該組み合わせ物で処置されていない同じ障害を持つ別の患者、あるいは健康な個体に由来する。参照サンプルが誘導される組織は、サンプルが誘導される組織に対応する。例えばサンプルが乳癌患者の腫瘍組織に由来する場合、参照サンプルも乳癌患者の腫瘍組織に由来するか、または健康な個体の乳房組織に由来する。またサンプルおよび参照サンプルは同じ個体に由来するものでよいと考えられる。この場合、参照サンプルが誘導される組織は個体を該ＨＤＡＣインヒビターまたは該組み合わせ物で処置する前または後に個体から得られた。組織は処置前に得て、処置の中断後にインヒビター処置の処置後効果の可能性を排除することが好ましい。
【実施例】
【００９８】
実施例の部
Ａ．薬理学的実施例
細胞毒性または生存に関する比色アッセイを使用して、Ａ２７８０腫瘍細胞に対して測定された式（Ｉ）の化合物の細胞活性について（Ｍｏｓｍａｎｎ  Ｔｉｍ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：５５−６３，１９８３
）、参照は国際公開第２００６／０１０７５０号パンフレットの実施例の部に対して作成する。
【００９９】
ＨＤＡＣインヒビターの抗増殖効果は、ＨＤＡＣファミリーメンバー１〜３および８からなるクラスＩ  ＨＤＡＣの阻害と関連づけられてきた。Ｒ３０６４６５、ＳＡＨＡ、ＬＢＨ−５８９およびＬＡＱ−８２４と比較した場合に、ＪＮＪ２６４８１５８５がＡ２７８０細胞から免疫沈降したＨＤＡＣ１に及ぼす活性およびその有効性（ｐｏｔｅｎｃｙ）は、実施例Ａ．１に見いだすことができる。Ｒ３０６４６５、ＳＡＨＡ、ＬＢＨ−５８９およびＬＡＱ−８２４と比較した場合に、ＪＮＪ２６４８１５８５がＨＤＡＣ８ヒト組換え酵素に及ぼす活性およびその有効性は実施例Ａ．２に見いだすことができる。
【０１００】
さらにＲ３０６４６５がＨＤＡＣ１基質のヒストン３（Ｈ３）およびヒストン４（Ｈ４）のアセチル化状態をモジュレートするかどうかを調査した。またＡ２７８０卵巣ガン細胞中のサイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ２１ｗａｆ１,ｃｉｐ１の誘導も調査した。ｐ２１ｗａｆ１,ｃｉｐ１はヒストンのアセチル化の結果として抑制され、そしてＨＤＡＣインヒビターに応答して細胞周期の停止の誘導に重要な役割を果たす（実施例Ａ．３を参照にされたい）。
【０１０１】
ＨＤＡＣ６の阻害およびＨＤＡＣ１対ＨＤＡＣ６に関する化合物の相対的有効性を評価するために、その基質であるチューブリンのアセチル化およびＨｓｐ９０のアセチル化の結果であるＨｓｐ７０の誘導をモニタリングした（実施例Ａ．４を参照にされたい）。
【０１０２】
実施例Ａ：式（Ｉ）の化合物のクラスＩ−特異性およびアセチル化効果
実施例Ａ．１：Ａ２７８０細胞から免疫沈降したＨＤＡＣ１酵素の阻害
ＨＤＡＣ１活性のアッセイには、ＨＤＡＣ１をＡ２７８０細胞溶解物から免疫沈降させ、そして示した濃度曲線のＨＤＡＣインヒビターと、およびＨ４ペプチドの［３Ｈ］アセチル−標識フラグメント（５０，０００ｃｐｍ）［ビオチン−（６−アミノヘキサン酸）Ｇｌｙ−Ａｌａ−（アセチル［３Ｈ］Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＮＨ２］（アマシャムフィルマシアバイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）とインキュベーションした。ＨＤＡＣ活性は遊離アセチル基の放出を測定して評価した。結果は３回の独立した実験に関する平均ＩＣ５０値±ＳＤとして表す。
【０１０３】
【表２】
2010503636.tif 000007
【０１０４】
実施例Ａ．２：ＨＤＡＣ８ヒト組換え酵素の阻害
ヒト組換えＨＤＡＣ８阻害に関して、ＨＤＡＣ８比色／蛍光活性アッセイ／薬剤探査キット（バイオモル：Ｂｉｏｍｏｌ；Ｃａｔ．ｎｒ．ＡＫ−５０８）を使用した。結果は３回の独立した実験に関する平均ＩＣ５０値（ｎＭ）±ＳＤとして表す。アッセイは２連で
行い、そしてＩＣ５０の標準誤差をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（グラフパッドソフトウェア：Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して算出した。
【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
実施例Ａ．３：細胞性ＨＤＡＣ１基質のアセチル化およびｐ２１ｗａｆ１、ｃｉｐ１の誘導
ヒトＡ２７８０卵巣ガン細胞を０、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００および３０００ｎＭの化合物と２４時間インキュベーションした。
【０１０７】
全細胞溶解物を調製し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。アセチル化Ｈ３およびＨ４ヒストンのレベル、Ｈ３タンパク質の全レベルおよびｐ２１ｗａｆ１、ｃｉｐ１タンパク質のレベルは、ウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗体を使用し、続いて強化した化学発光（ＥＣＬ）検出により検出した。
【０１０８】
アセチル化Ｈ３およびＨ４ヒストンのレベルは、アップステートバイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｃａｔ．ｎｒ．０６−２９９および０６−８６６）からの抗体で検出し、Ｈ３タンパク質の全レベルはアブカム（Ａｂｃａｍ）（Ｃａｔ．ｎｒ．ａｂ１７９１）からの抗体で検出し、そしてｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１タンパク質のレベルはトランスダクションラボラトリー（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）からの抗体（Ｃａｔ．ｎｒ．Ｃ２４４２０）で検出した。抗体の適切な希釈物を室温で１〜２時間、または４℃で一晩インキュベーションした。等しい付加を管理するために、ブロットを剥がし、そしてマウスモノクローナル抗−アクチンＩｇＭ抗体（Ａｂ−１、オンコジーン  リサーチ  プロダクツ：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で再度プロービィングした。核タンパク質の抽出の効率を管理するために、ブロットを剥がし、そして抗−ラミン（ｌａｍｉｎ）Ｂ１（ザイメッド：Ｚｙｍｅｄ；Ｃａｔ．ｎｒ．３３，２０００）で再度プロービィングした。次いでタンパク質−抗体複合体を化学発光（ピアスケミカル社：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）または蛍光（オディッセイ：Ｏｄｙｓｓｅｙ）により製造元の使用説明に従い視覚化した。実験は３回行った。
【０１０９】
【表４】
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【０１１０】
実施例Ａ．４．チューブリンのアセチル化およびＨｓｐ７０の誘導
ヒトＡ２７８０卵巣ガン細胞を０、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００および３０００ｎＭの化合物と２４時間インキュベーションした。
【０１１１】
全細胞溶解物を調製し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。全およびアセチル化チューブリンのレベルは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）からの抗体を使用して検出した：クローンＤＭ１Ａ（Ｃａｔ．ｎｒ．Ｔ９０２６）および６−１１１Ｂ（Ｃａｔ．ｎｒ．Ｔ６７９３）。Ｈｓｐ７０タンパク質はストレスゲン（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）からの抗体（Ｃａｔ．ｎｒ．ＳＰＡ−８１０）、続いてＥＣＬ検出により検出した。抗体の適切な希釈物を室温で１〜２時間、または４℃で一晩インキュベーションした。等しい付加を管理するために、ブロットを剥がし、そしてマウスモノクローナル抗−アクチンＩｇＭ（Ａｂ−１、オンコジーン  リサーチ  プロダクツ）で再度プロービィングした。核タンパク質の抽出効率を管理するために、ブロットを剥がし、そして抗−ラミンＢ１（ザイメッド：Ｃａｔ．ｎｒ．３３，２０００）で再度プロービィングした。次いでタンパク質−抗体複合体を化学発光（ピアスケミカル社）または蛍光（オディッセイ）により製造元の使用説明に従い視覚化した。実験は３回行った。
【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
実施例Ｂ：ヒト血液腫瘍細胞増殖の阻害
ヒト血液腫瘍細胞株の一団を対象としたＪＮＪ２６４８１５８５の抗−増殖活性の評価はオンコデザイン（Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎ）（ディジョン、フランス）に外注した。腫瘍細胞は細胞懸濁液として対応する適切な培養基中で３７℃にて加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で成長させた。マイコプラズマを含まない腫瘍細胞を９６−ウェルの平底マイクロタイトレーションプレートに播種し、３７℃で２４時間、１０％ＦＣＳを含有する培養基中でインキュベーションした。次いで腫瘍細胞を賦形剤（対照）または濃度を上昇させたＪＮＪ２６４８１５８５（５種類の濃度＊）、ボルテゾミブ（５種類の濃度＊）または種々の比率の両薬剤の組み合わせ物に暴露した。次いで細胞をさらに７２時間インキュベーションした。化合物（１もしくは複数）の細胞傷害性は、４９０ｎｍでの吸収の測定による標準ＭＴＳアッセイにより明らかとなった。化合物の相互作用（相乗性、相加性または拮抗性）は多剤効果分析により算出し、そしてＣｈｏｕ  ＆  Ｔａｌａｌａｙにより記載された方法論に従い中央値方程式原理（ｍｅｄｉａｎ  ｅｑｕａｔｉｏｎ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）により行った［ＣＨＯＵ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．２２：２７−５５；ＣＨＯＵ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｉｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．２：３７１−３７９；ＣＨＯＵ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｉｎ  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ
ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｉｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ．：６１−１０２；ＣＨＯＵ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８６：１５１７−１５２４］。
＊単一薬剤として使用した各薬剤の抗増殖活性の事前の測定に基づき、濃度は選択した各細胞株に５０％阻害を越えないように選んだ。
【０１１４】
実施例Ｂ．１．：ＪＮＪ２６４８１５８５によるヒト血液腫瘍細胞増殖の阻害
【０１１５】
【表６】
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【０１１６】
実施例Ｂ．２．；ボルテゾミブによるヒト血液腫瘍細胞増殖の阻害
【０１１７】
【表７】
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【０１１８】
実施例Ｂ．３．；ボルテゾミブと組み合わせたＪＮＪ２６４８１５８５によるヒト血液腫瘍細胞増殖の阻害
【０１１９】
【表８】
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【国際調査報告】
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