(57)【要約】【課題】インビトロおよびインビボのｓｉＲＮＡの有効な代替デリバリーシステムを提供すること。【解決手段】低分子量キトサンオリゴマーは、自己集合してｓｉＲＮＡをナノサイズ粒子にすることができ、酵素分解に対して保護を提供し、インビトロで長時間にわたって安定な遺伝子サイレンシングに関与することができた。ｓｉＲＮＡの低分子量キトサンとの複合体を処方する際の構造変数の制御は、インビトロおよびインビボのｓｉＲＮＡの有効な代替デリバリーシステムを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）３０から３００の範囲の重合度（ＤＰｎ）を有する低分子量キトサン（ここで、前記低分子量キトサンの脱アセチル化度は９０％を超える）と、
（ｂ）オリゴヌクレオチド
の複合体を含む組成物。
【請求項２】
化学的または酵素的方法を用いて高分子量キトサンから前記低分子量キトサンを得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記低分子量キトサンの脱アセチル化度が９５％を超える、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記低分子量キトサンの脱アセチル化度が９９％を超える、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が本質的に正味の正電荷比を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ターゲティングリガンドおよび安定剤を用いて前記低分子量キトサンを誘導体化する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、宿主細胞中に導入されるとその機能を発現するサイレンシング配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ分子、アンチセンス分子、リボザイム、およびミクロＲＮＡからなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が３．５から８．０の範囲のｐＨを有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が７．１から７．６の範囲のｐＨを有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
（ａ）低分子量キトサンを水性溶媒と接触させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の水溶液をオリゴヌクレオチドと水性溶媒中で混合するステップと、
（ｃ）前記組成物のｐＨを３．５〜８．０の範囲に維持するステップと、
を含む、請求項１に記載の組成物の調製法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）で製造された生成物溶液の体積を減じて、所望の濃度の組成物を得ることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸を哺乳動物に投与する方法であって、前記哺乳動物中に請求項１に記載の組成物を導入することを含む方法。
【請求項１４】
前記組成物を哺乳動物に、肺、鼻、口腔、眼、頬、舌下、局所、直腸、または膣経路によって粘膜組織に投与することにより導入する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物を、非経口経路（静脈内、筋肉内、皮内、頭蓋内、髄腔内、皮下、もしくは心臓内投与）による粘膜下組織への投与、あるいは内臓器官、血管、または手術中に露出する他の体表面もしくは体腔への投与により哺乳動物中に導入する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、哺乳動物の少なくとも１つの細胞の内部でその機能を発現できるオリゴヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物を予防または治療するための医薬を製造することを含む請求項１に記載の組成物を使用する方法であって、前記医薬が請求項１に記載の組成物を含む方法。
【請求項１８】
インビボまたはインビトロ診断法において使用することを含む、診断薬として請求項１に記載の組成物を使用する方法。
【請求項１９】
悪性腫瘍、自己免疫疾患、遺伝性疾患、病原性感染症および他の疾患を予防または治療するための遺伝子療法、アンチセンス療法、または遺伝子ワクチン接種において使用される医薬の製造における請求項１７に記載の組成物の使用であって、
ａ）肺、鼻、口腔、眼、頬、舌下、直腸、もしくは膣経路により粘膜組織へ、
ｂ）静脈内、筋肉内、皮内、頭蓋内、髄腔内、皮下、もしくは心臓内投与である非経口経路により粘膜下組織へ、あるいは
ｃ）内臓器官、血管、または手術中に露出する他の体表面もしくは体腔へ、の投与によって、哺乳動物中に前記組成物を導入することを含む使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に核酸デリバリーおよび遺伝子発現の分野に関する。特に、本発明はオリゴヌクレオチド、特に低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の新規非ウイルスデリバリーシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による標的遺伝子発現の特異的下方調節を含む自然のメカニズムである［１］。ＲＮＡｉはゲノム機能解析ならびにターゲットスクリーニングおよびインビトロでの検証において十分に確立された手段になりつつある［２、３］。さらに重要なことには、ｓｉＲＮＡベースの医薬の開発は、複合疾患、例えば糖尿病、癌、およびウイルス感染症の治療法の発見に有望である［４〜７］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】［１］  Ｍｅｉｓｔｅｒ  Ｇ，  Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ，Ｎａｔｕｒｅ．  ４３１（７００６）  （２００４）  ３４３−９．
【非特許文献２】［２］  Ｓａｃｈｓｅ  Ｃ，  Ｋｒａｕｓｚ  Ｅ，  Ｋｒｏｎｋｅ  Ａ，  Ｈａｎｎｕｓ  Ｍ，  Ｗａｌｓｈ  Ａ，  Ｇｒａｂｎｅｒ  Ａ，  Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ  Ｄ，  Ｄｏｒｒｉｓ  Ｄ，  Ｔｒｕｄｅｌ  Ｃ１  Ｓｏｎｎｉｃｈｓｅｎ  Ｂ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒｓ，  Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ：  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｔｈｗａｙｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３９２（（２００５）  ２４２−７７．」
【非特許文献３】［３］  Ｄａｌｌａｓ  Ａ，  Ｖｌａｓｓｏｖ  ＡＶ，  ＲＮＡｉ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｍｏｎｉｔ．  １２（４）  （２００６）  ＲＡ６７−７４．
【非特許文献４】［４］  Ｃｅｊｋａ  Ｄ，  Ｌｏｓｅｒｔ  Ｄ，  Ｗａｃｈｅｃｋ  Ｖ，  Ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  （ｓｉＲＮＡ）：  ｔｏｏｌ  ｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ？，  Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ  （Ｌｏｎｄ）．  １１０（１）  （２００６）  ４７−５８．
【非特許文献５】［５］  Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ  ＢＲ，  ＬｙＩｅ  Ｒ，  Ｑｉａｎ  Ｋ，  Ａｒｎｏｌｄ  ＡＳ，  Ｃｈｅｎｇ  Ｈ，  Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ＭＡ，  Ｚｈａｎｇ  ＹＣ，  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎｔｏ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｓｉｌｅｎｃｅｓ  Ｆａｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５８０（２）  （２００６）  ５５３−６０．
【非特許文献６】［６］  Ｄｅｖｉ  ＧＲ１  ｓｉＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，（２００６）．
【非特許文献７】［７］  Ｎｉｓｈｉｔｓｕｊｉ  Ｈ，  Ｋｏｈａｒａ  Ｍ，  Ｋａｎｎａｇｉ  Ｍ，  Ｍａｓｕｄａ  Ｔ，  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｈｏｒｔ−  ｏｒ  Ｌｏｎｇ−Ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８０（１５）  （２００６）  ７６５８−６６．
【非特許文献８】［８］  Ｓｉｏｕｄ  Ｍ，  Ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，  Ｅｘｐｅｒｔ  ＯｐｉｎＤｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ２（４）  （２００５）  ６３９−５１．
【非特許文献９】［９］  Ｅｌｍｅｎ  Ｊ，  Ｔｈｏｎｂｅｒｇ  Ｈ，  Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇ  Ｋ，  Ｆｒｉｅｄｅｎ  Ｍ，  Ｗｅｓｔｅｒｇａａｒｄ  Ｍ，  Ｘｕ  Ｙ，  Ｗａｈｒｅｎ  Ｂ，  Ｌｉａｎｇ  Ｚ，  Ｏｒａｍ  Ｈ，  Ｋｏｃｈ  Ｔ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒｓ，  Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  （ＬＮＡ）  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｓｉＲＮＡ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３（１）  （２００５）  ４３９−４７．
【非特許文献１０】［１０］  Ｃｈｅｎ  Ｘ，  Ｄｕｄｇｅｏｎ  Ｎ，  Ｓｈｅｎ  Ｌ，  Ｗａｎｇ  ＪＨ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．  １０（８）  （２００５）  ５８７−９３．
【非特許文献１１】［１１］  Ｌｏｒｅｎｚ  Ｃ，  Ｈａｄｗｉｇｅｒ  Ｐ，  Ｊｏｈｎ  Ｍ，  Ｖｏｒｎｌｏｃｈｅｒ  ＨＰ，  Ｕｎｖｅｒｚａｇｔ  Ｃ，  Ｓｔｅｒｏｉｄ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌｓ，  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．  １４（１９）  （２００４）  ４９７５−７．
【非特許文献１２】［１２］  Ｄａｌｂｙ  Ｂ，  Ｃａｔｅｓ  Ｓ，  Ｈａｒｒｉｓ  Ａ，  Ｏｈｋｉ  ＥＣ，  Ｔｉｌｋｉｎｓ  ＭＬ，  Ｐｒｉｃｅ  ＰＪ，  Ｃｉｃｃａｒｏｎｅ  ＶＣ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  ｒｅａｇｅｎｔ：  ｐｒｉｍａｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ，  ｓｉＲＮＡ，  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ３３（２）  （２００４）  ９５−１０３．
【非特許文献１３】［１３］  Ｈａｓｓａｎｉ  Ｚ，  Ｌｅｍｋｉｎｅ  ＧＦ，  Ｅｒｂａｃｈｅｒ  Ｐ，  Ｐａｌｍｉｅｒ  Ｋ，  Ａｌｆａｍａ  Ｇ，  Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉ  Ｃ，  Ｂｅｈｒ  ＪＰ，  Ｄｅｍｅｎｅｉｘ  ＢＡ，  Ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ａｔ  ｐｉｃｏｍｏｌａｒ  ｌｅｖｅｌｓ，  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  ７（２）  （２００５）  １９８−２０７．
【非特許文献１４】［１４］  Ｓａｎｔｅｌ  Ａ，  Ａｌｅｋｕ  Ｍ，  Ｋｅｉｌ  Ｏ，  Ｅｎｄｒｕｓｃｈａｔ  Ｊ，  Ｅｓｃｈｅ  Ｖ，  Ｆｉｓｃｈ  Ｇ，  Ｄａｍｅｓ  Ｓ，  Ｌｏｆｆｌｅｒ  Ｋ，  ＦｅｃｈｔｎｅｒＭ，  Ａｒｎｏｌｄ  Ｗ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒｓ，  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｉＲＮＡ−ｌｉｐｏｐｌｅｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  （２００６）．
【非特許文献１５】［１５］  Ｐｉｒｏｌｌｏ  ＫＦ，  Ｚｏｎ  Ｇ，  Ｒａｉｔ  Ａ，  Ｚｈｏｕ  Ｑ，  Ｙｕ  Ｗ，  Ｈｏｇｒｅｆｅ  Ｒ，  Ｃｈａｎｇ  ＥＨ，  Ｔｕｍｏｒ−  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｎａｎｏｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １７（１）  （２００６）  １１７−２４．
【非特許文献１６】［１６］  Ｊａａｓｋｅｌａｉｎｅｎ  Ｉ，  Ｐｅｌｔｏｌａ  Ｓ，  Ｈｏｎｋａｋｏｓｋｉ  Ｐ，  Ｍｏｎｋｋｏｎｅｎ  Ｊ，  Ｕｒｔｔｉ  Ａ，  Ａ  ｌｉｐｉｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎｄ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｉｚｅ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．  １０（３）  （２０００）  １８７−９３．
【非特許文献１７】［１７］  Ｕｒｂａｎ−Ｋｌｅｉｎ  Ｂ，  Ｗｅｒｔｈ  Ｓ，  Ａｂｕｈａｒｂｅｉｄ  Ｓ，  Ｃｚｕｂａｙｋｏ  Ｆ，  Ａｉｇｎｅｒ  Ａ，  ＲＮＡｉ−  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  （ＰＥＩ）−ｃｏｍｐＩｅｘｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １２（５）  （２００５）  ４６１−６．
【非特許文献１８】［１８］  Ｚｈｏｕ  Ｊ，  Ｗｕ  Ｊ，  Ｈａｆｄｉ  Ｎ，  Ｂｅｈｒ  ＪＰ，  Ｅｒｂａｃｈｅｒ  Ｐ，  Ｐｅｎｇ  Ｌ，  ＰＡＭＡＭ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，  Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  （Ｃａｍｂ）．２２）  （２００６）  ２３６２−４．
【非特許文献１９】［１９］  Ｌｅｎｇ  Ｑ，  Ｓｃａｒｉａ  Ｐ，  Ｚｈｕ  Ｊ，  Ａｍｂｕｌｏｓ  Ｎ，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｐ，  Ｍｉｘｓｏｎ  ＡＪ，  Ｈｉｇｈｌｙ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＨＫ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ，  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  ７（７）（２００５）  ９７７−８６．
【非特許文献２０】［２０］  Ｒｅｇｎｓｔｒｏｍ  Ｋ，  Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎ  ＥＧ，  Ｋｏｐｉｎｇ−Ｈｏｇｇａｒｄ  Ｍ，  Ｔｏｒｓｔｅｎｓｓｏｎ  Ｅ，  Ｎｙｂｌｏｍ  Ｈ，Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ  Ｐ，  ＰＥＩ  −  ａ  ｐｏｔｅｎｔ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｈａｒｍｌｅｓｓ，  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｉｘｅｄ  Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ＦａｓＬ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １０（１８）  （２００３）  １５７５−８３．
【非特許文献２１】［２１］  Ｃｈｅｎ  ＨＴ，  Ｎｅｅｒｍａｎ  ＭＦ，  Ｐａｒｒｉｓｈ  ＡＲ，  Ｓｉｍａｎｅｋ  ＥＥ，  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，  ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ，  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｅｌａｍｉｎｅ，  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  １２６（３２）  （２００４）  １００４４−８．
【非特許文献２２】［２２］  Ｏｍｉｄｉ  Ｙ，  Ｂａｒａｒ  Ｊ，  Ａｋｈｔａｒ  Ｓ，  Ｔｏｘｉｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２（４）（２００５）  ４２９−４１．
【非特許文献２３】［２３］  Ｒｏｙ  Ｋ，  Ｍａｏ  ＨＱ，  Ｈｕａｎｇ  ＳＫ，  Ｌｅｏｎｇ  ＫＷ，  Ｏｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｔｏｓａｎ−ＤＮＡ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｅａｎｕｔ  ａｌｌｅｒｇｙ，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ５（４）  （１９９９）  ３８７−９１．
【非特許文献２４】［２４］  Ｋｏｐｉｎｇ−Ｈｏｇｇａｒｄ  Ｍ，  Ｔｕｂｕｌｅｋａｓ  Ｉ，  Ｇｕａｎ  Ｈ，  Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｋ，  Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｍ，  Ｖａｒｕｍ  ＫＭ，  Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ  Ｐ，  Ｃｈｉｔｏｓａｎ  ａｓ  ａ  ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−  ｐｒｏｐｅｒｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ａｆｔｅｒ  ｌｕｎｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ８（１４）  （２００１）  １１０８−２１．
【非特許文献２５】［２５］  Ｋｏｐｉｎｇ−Ｈｏｇｇａｒｄ  Ｍ，  Ｖａｒｕｍ  ＫＭ，  Ｉｓｓａ  Ｍ，  Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ  Ｓ，  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＢＥ，  Ｓｔｏｋｋｅ  ＢＴ，  Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ  Ｐ，  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｈｉｔｏｓａｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｅａｓｉｌｙ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １１（１９）  （２００４）  １４４１−５２．
【非特許文献２６】［２６］  Ｚｈａｎｇ  Ｗ，  Ｙａｎｇ  Ｈ，  Ｋｏｎｇ  Ｘ，  Ｍｏｈａｐａｔｒａ  Ｓ，  Ｓａｎ  Ｊｕａｎ−Ｖｅｒｇａｒａ  Ｈ，  Ｈｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｇ，  Ｂｅｈｅｒａ  Ｓ，  Ｓｉｎｇａｍ  Ｒ，  Ｌｏｃｋｅｙ  ＲＦ，  Ｍｏｈａｐａｔｒａ  ＳＳ，  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｓｉＲＮＡ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ＮＳｌ  ｇｅｎｅ，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  １１（１）  （２００５）  ５６−６２．
【非特許文献２７】［２７］  Ｉｓｓａ  ＭＭ，  Ｋｏｐｉｎｇ−Ｈｏｇｇａｒｄ  Ｍ，  Ｔｏｍｍｅｒａａｓ  Ｋ，  Ｖａｒｕｍ  ＫＭ，  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＢＥ，Ｓｔｒａｎｄ  ＳＰ，  Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ  Ｐ，  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ａｆｔｅｒ  ｌｕｎｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  （２００６）．
【非特許文献２８】［２８］  Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ，  Ｈａｒｂｏｒｔｈ  Ｊ，  Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ  Ｗ１  Ｙａｌｃｉｎ  Ａ，  Ｗｅｂｅｒ  Ｋ，  Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ，Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，  Ｎａｔｕｒｅ．  ４１１（６８３６）  （２００１）  ４９４−８．
【非特許文献２９】［２９］  Ｔｏｍｍｅｒａａｓ  Ｋ，  Ｋｏｐｉｎｇ−Ｈｏｇｇａｒｄ  Ｍ，  Ｖａｒｕｍ  ＫＭ，  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＢＥ，  Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ  Ｐ，  Ｓｍｉｄｓｒｏｄ  Ｏ，  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｔｏｓａｎｓ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｒａｎｃｈｅｓ，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ．  ３３７（２４）  （２００２）  ２４５５−６２．
【非特許文献３０】［３０］  Ｈｏｎｋａｋｏｓｋｉ  Ｐ，  Ｊａａｓｋｅｌａｉｎｅｎ  Ｉ，  Ｋｏｒｔｅｌａｈｔｉ  Ｍ，  Ｕｒｔｔｉ  Ａ，  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｒｕｇ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＣＡＲ），  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  １８（２）  （２００１）  １４６−５０．
【非特許文献３１】［３１］  Ｂｏｕｓｓｉｆ  Ｏ，  Ｌｅｚｏｕａｌｃ’ｈ  Ｆ，  Ｚａｎｔａ  ＭＡ，  Ｍｅｒｇｎｙ  ＭＤ，  Ｓｃｈｅｒｍａｎ  Ｄ，  Ｄｅｍｅｎｅｉｘ  Ｂ，  Ｂｅｈｒ  ＪＰ，  Ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９２（１６）  （１９９５）  ７２９７−３０１．
【非特許文献３２】［３２］  Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ  Ｋ，  Ｊａａｓｋｅｌａｉｎｅｎ  Ｉ，  Ｓｙｒｊａｎｅｎ  Ｋ，  Ｕｒｔｔｉ  Ａ，  Ｓｙｒｊａｎｅｎ  Ｓ，  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｃａｎｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  １１（８）  （１９９４）  １１２７−３１．
【非特許文献３３】［３３］  Ｈｏｗａｒｄ  ＫＡ，  Ｒａｈｂｅｋ  ＵＬ，  Ｌｉｕ  Ｘ，  Ｄａｍｇａａｒｄ  ＣＫ，  Ｇｌｕｄ  ＳＺ，  Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＭＯ，Ｈｏｖｇａａｒｄ  ＭＢ，  Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ａ，  Ｎｙｅｎｇａａｒｄ  ＪＲ，  Ｂｅｓｅｎｂａｃｈｅｒ  Ｆ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒｓ，  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ／ｓｉＲＮＡ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，  ＭｏＩ  Ｔｈｅｒ．  （２００６）．
【非特許文献３４】［３４］  Ｋａｔａｓ  Ｈ．  Ａｌｐａｒ  ＨＯ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  （２００６）．
【非特許文献３５】［３５］  Ｊａｎｅｓ  ＫＡ，  Ｃａｌｖｏ  Ｐ，  Ａｌｏｎｓｏ  ＭＪ，  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒａｉｄｅ  ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒ  Ｒｅｖ．４７（１  ）  （２００１  ）  ８３−９７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
核酸の他の形態、例えばプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）に関しては、不十分な血清安定性、インビボでの好ましくない薬物動態学、および効率的でない細胞取り込みが依然として遺伝子サイレンシング用途を成功させるための主な課題となっている［非特許文献８］。このような課題を部分的に克服するための一つの方法は、ヌクレアーゼ分解に対する耐性ならびに改善された細胞取り込みを示す、化学的に修飾されたｓｉＲＮＡを使用することである［非特許文献９〜１１］。別の方法は、ポリカチオンベースのｓｉＲＮＡ処方を使用することを含む。例えば、カチオン性脂質ベースの処方は、ｓｉＲＮＡのインビトロおよびインビボデリバリーに有効であることが示された［非特許文献１２〜１５］。対照的に、カチオン性ポリマーは、当初オリゴヌクレオチドデリバリーには適さないと考えられていた［非特許文献１６］。しかし、最近の研究により、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーおよびポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）をｓｉＲＮＡデリバリーに使用できることが示された［非特許文献１７〜１９］。オリゴヌクレオチドのデリバリーシステムとしてのカチオン性ポリマーの有効性について反対の説明がたてられ、ｐＤＮＡについて最適化された条件下で送達された。さらに、いくつかの報告では、将来的な臨床応用の妨げになり得るような上述のポリカチオンのインビボ特性に対して懸念が提起されている［非特許文献２０〜２２］。したがって、ｓｉＲＮＡデリバリーのための非毒性かつ有効なベクターについての研究が期待される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、（ａ）３０から３００の範囲の数平均重合度（ＤＰｎ）を有する低分子量キトサン（ここで、低分子量キトサンの脱アセチル化度は９０％を超える）と、（ｂ）オリゴヌクレオチドの複合体を含む組成物を包含する。請求項１に記載の組成物は、高分子量キトサンから化学的または酵素的方法を用いて得られる低分子量キトサンを含む。低分子量キトサンの脱アセチル化度は９５％を超え、最も好ましくは９９％を超える。さらに、組成物は本質的に正味の正電荷比を有する。低分子量キトサンはターゲティングリガンドおよび安定剤を用いて誘導体化される。オリゴヌクレオチドは、宿主細胞中に導入されるとその機能を発現するサイレンシング配列を含む。オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ分子、アンチセンス分子、リボザイム、およびミクロＲＮＡからなる群から選択される。本発明の組成物は、３．５から８．０の範囲、さらに好ましくは７．１から７．６の範囲のｐＨを有する。
【０００６】
本発明はさらに、（ａ）低分子量キトサンを水性溶媒に暴露するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の水溶液を水性溶媒中でオリゴヌクレオチドと混合するステップと、（ｃ）組成物のｐＨを３．５〜８．０の範囲、さらに好ましくは７．１から７．６の範囲に維持するステップと、を含む、本発明の組成物の調製法も包含する。本発明はまた、組成物を調製する方法であって、ステップ（ｂ）の後に、ステップ（ｂ）で得られた生成物溶液の体積を減じて、所望の濃度の組成物を得る方法も想定する。
【０００７】
本発明はまた、核酸を哺乳動物に投与する方法であって、開示された組成物を用い、組成物を哺乳動物中に導入することを含む方法も包含する。組成物を哺乳動物中に導入する方法は、肺、鼻、口腔、眼、頬、舌下、局所、直腸、または膣経路により粘膜組織に投与することによって行われる。別法として、非経口経路（静脈内、筋肉内、皮内、頭蓋内、髄腔内、皮下、または心臓内）による粘膜下組織への投与、あるいは内臓器官、血管、または手術中に露出する他の体表面もしくは体腔への投与により、組成物を哺乳動物中に導入する。本発明の方法は、開示された組成物を哺乳動物に投与することを含み、これによりオリゴヌクレオチドは哺乳動物の少なくとも１つの細胞の内部でその機能を発現できる。本発明はまた、哺乳動物の予防または治療用医薬として調製された開示組成物を使用する方法も包含する。これらの使用は、悪性腫瘍、自己免疫疾患、遺伝性疾患、病原性感染症、および他の疾患を予防または治療するための遺伝子療法、アンチセンス療法、または遺伝子ワクチン接種を含むが、これらに限定されない。さらに、本発明は、開示された組成物をインビボまたはインビトロ診断法において用いられる診断薬として使用することを包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ｓｉＲＮＡ処方の物理的安定性（Ａ）およびＲＮａｓｅ  Ａ保護（Ｂ）を示す図である。直鎖ＤＰｎ８５キトサンを配合したｓｉＲＮＡ複合体は、試験した両ｐＨ値および全ての電荷比で最高の物理的安定性を示した。全ての選択されたポリカチオンは、ＲＮａｓｅ  Ａによる酵素分解からｓｉＲＮＡを保護することができた。アガロースゲル電気泳動法に関して、１００ｎｇのｓｉＲＮＡを各ウェル中にロードした。キトサンＤＰｎ１８処方については３０：１（＋／−）および６０：１（＋／−）の電荷比で複合体を処方した。ＰＥＩ処方については１５：１（＋／−）の電荷比を使用し、一方、リポフェクタミン２０００とのｓｉＲＮＡの複合体は２：１（＋／−）の重量比で処方した。３回の独立した実験からの代表的ゲルを示す。
【図２】正常ＨＥＫ２９３細胞（Ａ）および安定してルシフェラーゼを発現するＨＥＫ２９３細胞（２９３−Ｌｕｃ）（Ｂ、Ｃ）におけるｓｉＲＮＡのインビトロデリバリーを示す図である。特異的ｓｉＲＮＡ−ＬｕｃをｐＬｕｃ（Ａ）またはｐＧＦＰ（Ｃ）とともに同時トランスフェクトした場合に、対照の未処理細胞と比較して、著しいルシフェラーゼサイレンシングが達成された。ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃを単独で２９３−Ｌｕｃ細胞（Ｂ）に送達した場合に、ルシフェラーゼ阻害の有効性が減少した。ルシフェラーゼ遺伝子発現をトランスフェクションの４８時間後に分析した。ｐＤＮＡデリバリーについてあらかじめ最適化されたキトサンを使用して（分岐ＤＰｎ３４）［２７］、１０：１の電荷比で処方されたｓｉＲＮＡとの複合体を形成した。ＰＥＩ複合体については５：１（＋／−）の電荷比を使用し、ｓｉＲＮＡのＬＦ２０００との複合体は２：１（＋／−）の重量比で処方した。遺伝子発現の結果を、平均値±Ｓ．Ｄ．；ｎ＝４として表す。
【図３】オリゴヌクレオチドと複合体形成した直鎖（Ａ）および分岐（Ｂ）キトサンの構造変数が、２９３−Ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼサイレンシング活性に及ぼす影響を示す図である。鎖長および電荷比は、３４モノマー単位よりも長い鎖長（３４モノマー単位よりも高い数平均重合度）を有する直鎖キトサンを用いて形成される複合体について重要ではないようであるが、分岐キトサン複合体が関与する有効なルシフェラーゼサイレンシングは、より長いキトサン鎖長およびより高い電荷比の点から、より高い電荷密度を必要とする。１５０ｎＭ（１００ｎｇ／ウェル）のｓｉＲＮＡ濃度を使用した。ルシフェラーゼ遺伝子発現をトランスフェクションの４８時間後に分析した。キトサン複合体を３０：１（＋／−）の電荷比で処方した。遺伝子発現結果を平均値±Ｓ．Ｄ．；ｎ＝４として表す。
【図４】直鎖低分子量キトサンのｓｉＲＮＡ濃度依存性および相対的有効性を示す図である。より低いｓｉＲＮＡ濃度（１５〜３０ｎｇ／ウェル、２２〜４４ｎＭ／ウェルのｓｉＲＮＡ濃度に等しい）で、直鎖ＤＰｎ８５低分子量キトサンは、ルシフェラーゼ発現を対照未処理２９３−Ｌｕｃ細胞の７２〜９５％にノックダウンすることにより最高の有効性を示した。ルシフェラーゼ遺伝子発現をトランスフェクション４８時間後に分析した。キトサン複合体を３０：１（＋／−）の電荷比で処方した。遺伝子発現結果を平均値±Ｓ．Ｄ．；ｎ＝４として表す。
【図５】ルシフェラーゼサイレンシング活性に対する血清の効果を示す図である。試験した様々なポリカチオン処方のうち、全ての直鎖キトサンおよび分岐ＤＰｎ８５は、トランスフェクション培地中１０％血清の存在下で、２９３−Ｌｕｃ細胞においてそのルシフェラーゼサイレンシング活性を保持していた。１５０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を使用した。ルシフェラーゼ遺伝子発現をトランスフェクションの４８時間後に分析した。ｓｉＲＮＡ複合体を低分子量キトサンおよびＰＥＩについて、それぞれ３０：１および１５：１（＋／−）の電荷比で処方した。ｓｉＲＮＡのＬＦ２０００との複合体を２：１（＋／−）の重量比で処方した。遺伝子発現結果を平均値±Ｓ．Ｄ．；ｎ＝４として表す。
【図６】ｓｉＲＮＡ処方の細胞毒性を示す図である。細胞内デヒドロゲナーゼ活性（細胞内毒性の尺度）を、直接、または２９３−Ｌｕｃ細胞を様々なｓｉＲＮＡ処方でトランスフェクションした２４時間後にＭＴＴ法により測定した。ＰＥＩおよびＬＦ２０００と対照的に、細胞形態および細胞内デヒドロゲナーゼ活性はどちらも、直鎖ＤＰｎ８５を配合したｓｉＲＮＡ複合体でトランスフェクションした後に保持されていた。ＬＦ２０００複合体はトランスフェクション直後に著しい毒性を示したが、細胞生存性はトランスフェクションの２４時間後に回復した。１５０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を使用した。ｓｉＲＮＡ複合体を、低分子量キトサンおよびＰＥＩについてそれぞれ、３０：１および１５：１（＋／−）の電荷比で処方した。ｓｉＲＮＡのＬＦ２０００との複合体を２：１（＋／−）の重量比で処方した。遺伝子発現結果を平均値±Ｓ．Ｄ．；ｎ＝４〜５として表す。
【図７】２９３−Ｌｕｃ細胞（Ａ、Ｂ、Ｃ）およびインビトロで安定してルシフェラーゼを発現するＳＫＯＶ−３細胞（Ｄ）におけるルシフェラーゼサイレンシングの経時変化を示す図である。２９３−ＬｕｃおよびＳＫＯＶ−３−Ｌｕｃ細胞のどちらにおいても、ＤＰｎ８５を有する直鎖キトサンは、早発性および５日間継続する持続性ルシフェラーゼサイレンシング動態に関して最良のルシフェラーゼサイレンシング動態を示し、このことは細胞内でのインタクトｓｉＲＮＡの安定な放出を示唆する。４４ｎＭ（３０ｎｇ／ウェル）のｓｉＲＮＡ濃度を使用した。ｓｉＲＮＡ複合体を低分子量キトサンおよびＰＥＩについてそれぞれ３０：１および１５：１（＋／−）の電荷比で処方した。ｓｉＲＮＡのＬＦ２０００との複合体を２：１（＋／−）の重量比で処方した。遺伝子発現結果を平均値±Ｓ．Ｄ．；ｎ＝４として表す。（配列表の簡単な説明）  配列番号１：ｓｉＧＬ３（センス、５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’；  配列番号２：アンチセンス、５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’）はルシフェラーゼ遺伝子を標的とする未修飾ｓｉＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ）であり、ＭｅｄＰｒｏｂｅ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）から注文した［非特許文献２８］。
【０００９】
配列番号３：ミスマッチングｓｉＲＮＡ；ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ非ターゲティングｓｉＲＮＡ＃１（ｓｉＣＯＮｌ；センス、Ｓ’−ＵＡＧＣＧＡＣＵＡＡＡＣＡＣＡＵＣＡＡＵＵ−３’；
配列番号４：アンチセンス、５’−ＵＵＧＡＵＧＵＧＵＵＵＡＧＵＣＧＣＵＡＵＵ−３’）は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）から注文した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
キトサンは、（１−４）結合２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコース（ＧＩｃＮ）およびＮ−アセチル化類似体２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコース（ＧＩｃＮＡｃ）からなる直鎖二元多糖類のファミリーであって、生体適合性カチオン性ポリマーであり、プラスミドｐＤＮＡ遺伝子デリバリーに適していることが証明されている［非特許文献２３〜２７］。明確な分子量分布を有する直鎖および分岐キトサンオリゴマーを用いて、インビトロおよびインビボで非常に有効な遺伝子デリバリーが得られている［非特許文献２５、２７］。キトサン−オリゴマーベースの複合体は、粘度の減少をはじめとする改善された物理的特性を有し、凝集する傾向が低かった。これらの複合体は、改善された細胞取り込み、早発性、および高レベルのインビボ遺伝子発現をはじめとする改善された有効性も有していた。
【００１１】
本発明では、新規ｓｉＲＮＡデリバリーシステムにおいて潜在的に低分子量（７〜１７ｋＤａ）であり、本質的に完全に脱アセチル化（９９％超脱アセチル化）されたキトサンが実現されている。リポフェクタミン２０００（ＬＦ２０００）およびＰＥＩ（直鎖および分岐）を対照として用いて、物理的安定性および低分子量キトサンを配合されたｓｉＲＮＡ複合体のＲＮａｓｅ分解に対する耐性を調べた。ｓｉＲＮＡデリバリーに関するほとんどの報告においては、非生理学的関連または非関連ｐＤＮＡをｓｉＲＮＡ処方中に組み入れるために、同時トランスフェクション法を用いる。したがって、本発明者らは、インビトロで安定してルシフェラーゼを発現する細胞系において様々なポリカチオンによるｓｉＲＮＡデリバリーの有効性に対して、このような組み入れが及ぼす影響をまず調べた。本発明者らは次に、ｓｉＲＮＡ処方および低分子量キトサンの複合体における処方および構造を調べた。さらに詳細には、低分子量キトサンの構造変数（鎖長および分岐）、処方パラメータ（電荷比、ｓｉＲＮＡ濃度）、および血清の効果の役割を調べ、インビトロの遺伝子サイレンシング活性の有効性と相互に関連づけた。様々なｓｉＲＮＡ処方の細胞毒性を、ルシフェラーゼ遺伝子サイレンシングのインビトロ動態と比較した。
【００１２】
この研究により、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の新規デリバリーシステムとしての低分子量キトサンの可能性が実証された。対照としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびリポフェクタミン２０００（ＬＦ２０００）を使用して、様々な鎖長のキトサンをｓｉＲＮＡと複合体形成させ、これらの物理的安定性および酵素分解に対する保護を調べた。ｓｉＲＮＡ複合体の細胞毒性およびルシフェラーゼ遺伝子サイレンシング活性を、インビトロで安定してルシフェラーゼを発現する２９３細胞（２９３−Ｌｕｃ）において調べた。ｓｉＲＮＡ複合体のルシフェラーゼサイレンシング活性に対するキトサン構造変数ならびに処方パラメータの影響も調べた。低分子量キトサンは、複合体化して、ｓｉＲＮＡを物理的に安定なナノ粒子（３４〜８６ｎｍ）にすることができ、これはＲＮａｓｅ分解に対して保護を提供した。より長いキトサン鎖および／または低分子量キトサンおよびｓｉＲＮＡ間のより高い電荷比によりもたらされる多数の正電荷の重要性は、インビトロで最高のルシフェラーゼサイレンシング活性に関与することが証明された。ＰＥＩおよびＬＦ２０００と異なり、低分子量キトサンを配合したｓｉＲＮＡ複合体は、そのルシフェラーゼサイレンシング活性を保持していた。トランスフェクション培地は１０％血清を含んでいた。低分子量キトサンもＰＥＩおよびＬＦ２０００と比較して最小の細胞毒性を示した。８５モノマー単位の数平均重合度（ＤＰｎ）（ＤＰｎ８５）を有する低分子量キトサンは、ルシフェラーゼ遺伝子発現の２９３−Ｌｕｃ細胞中で５日間維持される９５％サイレンシングを得るために４４ｎＭ程度の低いｓｉＲＮＡ濃度しか必要としなかった。これらをもとに、本発明者らの発見から、ｓｉＲＮＡの有効な代替デリバリーシステムとしての低分子量キトサンが実証される。本発明者らは以前に、かなり鎖長の短い（１８〜３４モノマー単位）本質的に完全に脱アセチル化された低分子量キトサンがインビボおよびインビトロのｐＤＮＡデリバリーに最適であることを記載した［非特許文献２５、２７］。本研究において、本発明者らは、インビトロでｓｉＲＮＡデリバリーシステムとして本質的に完全に脱アセチル化されたキトサンオリゴマーの構造・物性関係に関して記載する。この目的のために、様々な鎖長の直鎖および三糖類置換（分岐）キトサンオリゴマーを選択した。本発明者らは、ｐＤＮＡデリバリーと対照的に、３４モノマー単位よりも長い直鎖キトサンオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡと物理的に安定な複合体を形成し、インビトロでルシフェラーゼを発現するＨＥＫ２９３（２９３−Ｌｕｃ）細胞における最高のルシフェラーゼサイレンシング活性に関与することを見いだした。明らかに、構造・物性関係は、ｓｉＲＮＡおよびｐＤＮＡ間でかなり異なる。この違いは、ｓｉＲＮＡ分子が、ｐＤＮＡよりもより短く、柔軟性が低く、負電荷密度が低いことで説明できる。このように、ｓｉＲＮＡを複合体化して物理的に安定で有効なナノ粒子にすることは、ポリカチオンとのより強力なイオン相互作用を必要とする［非特許文献１８、３３］。
【００１３】
本発明者らの研究において本質的に完全に脱アセチル化された低分子量キトサンと配合されたｓｉＲＮＡ複合体の粒子サイズ（１００ｎｍ未満）は意外にも脂質、ＰＬＬ、および高分子量キトサン（８５％脱アセチル化）について以前に記載されているよりもかなり小さかった［非特許文献３３、３４］。これは、本質的に完全に脱アセチル化されたキトサン主鎖上のさらに高い電荷密度が原因であり得る。加えて、低分子量キトサンの改善された溶解度および減少した粘度は、ｓｉＲＮＡ複合体の小さな粒子サイズの一因となり得る［非特許文献３５］。従来の知見と一致して、ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃを無関係なｐＤＮＡ（ｐＧＦＰ）と一括してシングルパッケージとして同時トランスフェクションすることにより、インビトロでの２９３−Ｌｕｃ細胞において顕著なルシフェラーゼサイレンシング活性が得られた［非特許文献１７］。しかし、本発明者らは、ｐＤＮＡがｓｉＲＮＡ処方から除外された場合に、遺伝子サイレンシング活性が著しく損なわれることを証明した。したがって、本発明者らは、高い負の電荷密度を有する巨大分子であるｐＤＮＡの存在は、改善された協力的相互作用により様々なポリカチオンとのｓｉＲＮＡ複合体形成の有効性に著しく貢献すると結論づける。
【００１４】
本発明者らは、より長いキトサン鎖および／またはより高い電荷比に関して高い電荷密度は、物理的に安定な複合体を生成するだけでなく、インビトロで最も有効な遺伝子サイレンシングをもたらすことも証明した。本発明者らの発見は、ＰＡＭＡＭデンドリマーについて報告されている従来の結果とよく一致する。この従来の結果では、より多い生成数、より高い電荷比、そしてより高いｓｉＲＮＡ濃度（１００ｎＭ）が、ｓｉＲＮＡ／デンドリマー複合体によって得られるより良好な複合体形成および遺伝子サイレンシング活性のために必要であった［非特許文献１８］。同様の高濃度のｓｉＲＮＡはＬＦ２０００ベースの処方についても推奨された［非特許文献１２］。本発明において、最も有効な低分子量キトサン（直鎖ＤＰｎ８５）は、２９３−Ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現の９５％を超えるサイレンシングを得るためには、４４ｎＭ程度の低いｓｉＲＮＡ濃度しか必要としなかった。
【００１５】
さらに、この研究における実験条件下で、長い直鎖低分子量キトサンを配合したｓｉＲＮＡ複合体は、トランスフェクション培地中１０％血清の存在下でそのルシフェラーゼサイレンシング活性を保持していた。保持されたサイレンシング活性についての最も可能性が高い理由は、これらの複合体が、ＰＥＩおよびＬＦ２０００と対照的に、このような比較的高い血清濃度で凝集に対抗でき、これは向上したコロイド安定性を反映し得る。より短い分岐したキトサンオリゴマーは減少した遺伝子サイレンシング活性を示すという知見は、電荷密度が減少した結果として損なわれたｓｉＲＮＡ複合体化、およびキトサン主鎖とｓｉＲＮＡとの間の電荷相互作用の立体障害によって説明できる。
【００１６】
高分子量キトサンを配合したｓｉＲＮＡ複合体の報告されている最小細胞毒性と一致して、本発明者らはこの研究において、高いｓｉＲＮＡ濃度（１５０ｎＭ）を処方において使用した場合でさえも、ＤＰｎ８５低分子量キトサンでのトランスフェクション後に、２９３−Ｌｕｃ細胞がこれらの細胞内デヒドロゲナーゼ活性を保持することを証明した［３３］。低分子量キトサンは、ＰＡＭＡＭデンドリマーについてすでに公開された結果と比べてかなり低い細胞毒性を示し、ここで５０〜１００ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度の使用は、細胞生存性における著しい減少（６０〜５０％）に至る。
【００１７】
最後に、直鎖低分子量キトサンを配合したｓｉＲＮＡ複合体は、ＰＥＩについてすでに報告されているものと比較して、早発性および持続性ルシフェラーゼサイレンシング活性を示した［非特許文献１７］。ＤＰｎ８５キトサンオリゴヌクレオチドの改善された動態は、小さなナノサイズのｓｉＲＮＡ複合体の改善された細胞取り込みおよびインタクトｓｉＲＮＡの持続的細胞内放出の結果と推定される。
【００１８】
２．物質および方法
２．１．物質
サイトメガロウイルスプロモーターおよびホタルルシフェラーゼ（ｐＬｕｃ）または緑色蛍光タンパク質（ｐＧＦＰ）を含むＧＭＰグレードのプラスミド（ｇＷｉｚ（商標））をＡｌｄｅｖｒｏｎ、Ｆａｒｇｏ、ＮＤ、ＵＳＡから購入した。リポフェクタミン２０００（ＬＦ２０００）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。直鎖ＰＥＩ；ＥｘＧｅｎ  ５００（２２ｋＤａの分子量）をＦｅｒｅｍｅｎｔａｓ、Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。分岐ＰＥＩ（２５ｋＤａの分子量）をＡｌｄｒｉｃｈ  Ｓｗｅｄｅｎ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎから購入した。
【００１９】
２．２．ｓｉＲＮＡ二本鎖
配列番号１：ｓｉＧＬ３（センス、５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’；
配列番号２：アンチセンス、５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’）は、ルシフェラーゼ遺伝子（ｓｉＳＮＡ−Ｌｕｃ）を標的とする未修飾ｓｉＲＮＡ二本鎖であり、ＭｅｄＰｒｏｂｅ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）から注文した［非特許文献２８］。
【００２０】
配列番号３：ミスマッチングｓｉＲＮＡ；ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ非ターゲティングｓｉＲＮＡ＃１（ｓｉＣＯＮｌ；センス、５’−ＵＡＧＣＧＡＣＵＡＡＡＣＡＣＡＵＣＡＡＵＵ−３’；
配列番号４：アンチセンス、５’−ＵＵＧＡＵＧＵＧＵＵＵＡＧＵＣＧＣＵＡＵＵ−３’）をＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）から注文した。
【００２１】
２．３．低分子量キトサン
様々な鎖長の完全脱Ｎ−アセチル化（脱アセチル化度＞９９．８％；ＦＡ＜０．００１）直鎖および７％三糖類置換低分子量キトサン（分岐キトサン）を記載されているようにして調製し、特性化した［非特許文献２５、２９］。３４、５０および８５モノマー単位の数平均重合度（ＤＰｎ）を有する低分子量キトサンを全体にわたって使用した。多角レーザー光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより鎖長分布を分析した。
【００２２】
２．４．細胞
ヒト胎児腎臓細胞系ＨＥＫ２９３（２９３細胞）をＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡから入手した。ホタルルシフェラーゼを発現する、安定してルシフェラーゼを発現するＨＥＫ２９３（２９３−Ｌｕｃ細胞）はフィンランドのクオピオ大学薬学部のＰａａｖｏ  Ｈｏｎｋａｋｏｓｋｉ博士から贈られた［３０］。安定してルシフェラーゼを発現する卵巣癌細胞系（ＳＫＯＶ−３−Ｌｕｃ）もドイツ、マールブルグのフィリップス大学薬理学および毒物学部のＡｃｈｉｍ  Ａｉｇｎｅｒ博士から贈られた［１７］。全ての細胞を供給者の推奨にしたがって維持した。
【００２３】
２．５．ｓｉＲＮＡ複合体の処方
キトサンを滅菌ＭｉｌｌｉＱ水中にｐＨ６．２で溶解させ、続いて滅菌濾過することにより、キトサンストック溶液（０．２ｍｇ／ｍｌ）を調製した。キトサン、次いでｓｉＲＮＡストック溶液またはｓｉＲＮＡ／ｐＤＮＡ（同時トランスフェクションの場合）を、記載されているように、ボルテックスミキサー（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＲＥＡＸ  ２０００、レベル４、Ｋｅｂｏ  Ｌａｂ、Ｓｐａｎｇａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上で強力に撹拌する間に滅菌ＭｉｌｌｉＱ水に添加することにより、キトサン複合体を処方した［２５］。１μｇのｐＤＮＡまたはｓｉＲＮＡあたり、次の量の様々なキトサンを使用して、１：１（＋／−）の電荷比でキトサン複合体を調製した：０．５８μｇの直鎖キトサン、７％のＡ−Ａ−Ｍで置換された０．６９μｇのキトサン（分岐キトサン）［２５、２７］。記載されているように、ボルテックスミキサー上で強力に撹拌する間に、ＰＥＩ溶液をｓｉＲＮＡストック溶液またはｓｉＲＮＡ／ｐＤＮＡ（トランスフェクションの場合）に添加することにより、ＰＥＩのｓｉＲＮＡ複合体を調製した［非特許文献３１］。処方をトランスフェクション前に、約１０分間室温で放置した。ＬＦ２０００複合体を形成するために、ｓｉＲＮＡストック溶液またはｓｉＲＮＡ／ｐＤＮＡ（同時トランスフェクションの場合）をボルテックスミキサー上で強力に撹拌する間、キトサン溶液に添加した。ｓｉＲＮＡおよびＬＦ２０００溶液をどちらもトランスフェクション培地ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉで希釈した。ＬＦ２０００複合体をトランスフェクション前に約３０分間室温で放置した。予備実験に基づいて、ＰＥＩ複合体については１５：１（＋／−）の電荷比およびＬＦ２０００複合体については２：１（＋／−）の重量比を選択し、全体にわたって使用した（データは不図示）。
【００２４】
２．６．ゲル遅延度アッセイ
アガロースゲル遅延度アッセイを用いてｓｉＲＮＡ複合体の物理的安定性を調べた。４０ｍＭのＴＡＥ緩衝液中４％アガロース（ＭｅｔａＰｈｏｒ（登録商標）Ａｇａｒｏｓｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ、ＵＳＡ）を記載されているようにして用いた［非特許文献２５］。複合体化ｓｉＲＮＡの酵素分解に対する保護を、この複合体を１．５ＵのＲＮａｓｅ  Ａ（Ａｍｂｉｏｎ、ＵＫ）とともに３０〜９０分間記載されているようにしてインキュベートした後に調べた［非特許文献１８］。インキュベーション後、複合体をヘパリン（５ｍｇ／ｍｌ）で解離させ、アガロース遅延度アッセイを用いてｓｉＲＮＡの完全性を調べた。ストック溶液から得られたｓｉＲＮＡを対照として使用した。
【００２５】
２．７．キトサンポリプレックスのサイズ測定
記載されているようにしてＮａｎｏｓｉｚｅｒ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を用いた光子相関分光法により複合体のサイズを測定した［非特許文献２５］。複合体をＭｉｌｌｉＱ水中５μｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ濃度で調製した。すべての測定を２５℃で行った。
【００２６】
２．８．インビトロトランスフェクション実験
トランスフェクション実験の２４時間前に、ＨＥＫ２９３（２９３、２９３−Ｌｕｃ）細胞およびＳＫＯＶ−３−Ｌｕｃ細胞を９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）中に播種して、トランスフェクション当日に８０〜９０％の細胞密集度を得た。トランスフェクションをｐＨ７．４で無血清培地（ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉａ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＡＢ、  Ｔａｂｙ、Ｓｗｅｄｅｎ）中、または１０％血清（ＦＢＳ）の存在下で行った。マンニトールの添加により等張性（３００ｍＯｓｍ／ｋｇ）を得た。細胞を予熱したＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、５０μｌのｓｉＲＮＡ複合体処方を各ウェルに添加した。同時トランスフェクション実験において、各ウェルあたり０．３３μｇのｐＤＮＡ（ｐＬｕｃまたはｐＧＦＰ）を使用した。ミスマッチ（対照）ｓｉＲＮＡをすべてのインビトロ実験に含めた。５時間のインキュベーション後、処方を取り出し、０．２ｍｌの新鮮な培地を添加した。２日を超える実験については１日おきに培地を交換した。トランスフェクション後２４〜１２０時間の範囲の事前に特定された時点で、細胞を予熱したＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、ルシフェラーゼ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で溶解させた。ルシフェラーゼ遺伝子発現を次に照度計（Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ＰｈＬ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて測定した。発現されたルシフェラーゼの量を、ホタルルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて作成した標準曲線から決定した。
【００２７】
２．９．細胞内デヒドロゲナーゼ活性（ＭＴＴ法）
様々なｓｉＲＮＡ処方の２９３−Ｌｕｃ細胞における細胞内デヒドロゲナーゼ活性（細胞毒性の尺度）に対する影響を、記載されたようなＭＴＴ法により評価した［３２］。簡単に言うと、２９３−Ｌｕｃ細胞を前述のようにトランスフェクトした。５時間のトランスフェクション後、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中溶液を添加した。４時間後、１００μｌの酸−イソプロパノール（０．０４Ｍのイソプロパノール中ＨＣＬ）を添加することにより、ホルマザン結晶を溶解させた。プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ｓａｆｉｒｅ２、Ｔｅｃａｎ  Ａｕｓｔｒｉａ  ＧｍｂＨ、Ｇｒｏｄｉｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて６９０でバックグラウンド補正をして、５７０ｎｍで吸光度を測定した。同じようにして処理した培地に関して装置を０吸光度に設定した。処理細胞の細胞内デヒドロゲナーゼ活性を対照（未処理）細胞の細胞内デヒドロゲナーゼ活性と関連させ、次式から計算した：
％相対的細胞内デヒドロゲナーゼ活性＝［Ａ（試験）＊１００／Ａ（対照）］
式中、Ａ（試験）およびＡ（対照）はそれぞれ処理細胞および対照細胞の吸光値である。別のセットアップにおいては、細胞を培地中でトランスフェクション後２４時間成長させた。次に、これらをＭＴＴ試薬で処理して、様々な処方の遅延毒性を試験した。
【００２８】
２．１０．データ分析
四連試料を用いて最低２回実験を行った。全てのデータを平均値±標準偏差として表す。平均値間の統計的差を、ＡＮＯＶＡを用いて調べた。グループ平均間の差は、ｐ＜０．０５で有意であると見なした。
【００２９】
物理的安定性および酵素保護
本発明者らは、様々な鎖長の直鎖および分岐キトサンオリゴマーがｓｉＲＮＡと安定な複合体を形成できる能力をゲル遅延度アッセイにおいてまず調べた。より高い電荷比で、より長い直鎖オリゴヌクレオチドと配合された複合体のみがｐＨ８．０（電気泳動緩衝液に通常用いられるｐＨ）でｓｉＲＮＡを保持した（図１Ａ）。８５モノマー単位（ＤＰπ８５）の数平均重合度（ＤＰｎ）を有する直鎖低分子量キトサンは、試験した全ての電荷比で最高の物理的安定性をもたらした。対照的に、ゲル緩衝液のｐＨが７．４に低下した場合、試験したすべての低分子量キトサンはｓｉＲＮＡと安定な複合体を形成することができた。高いｐＨ値での分岐および短鎖キトサンオリゴマーのｓｉＲＮＡ処方の減少した物理的安定性は、ポリカチオンのより高い電荷密度を示唆し、物理的に安定な複合体を形成するために低分子量キトサンと配合され、あらかじめ最適化されたｐＤＮＡ複合体と比べて、より強力なｓｉＲＮＡとの相互作用が必要とされる［非特許文献２５、２７］。
【００３０】
酵素分解は遺伝子サイレンシング活性の制限因子であり得るので、本発明者らは選択された低分子量キトサンがＲＮａｓｅ  Ａによる酵素分解からｓｉＲＮＡを保護する能力も調べた（３０〜９０分のインキュベーション期間を用いた）。
【００３１】
遺伝子デリバリー要件にしたがって、試験した全ての低分子量キトサンならびに正の対照（ＰＥＩおよびＬＦ２０００）は、ＲＮａｓｅ  Ａにより完全に分解される裸のｓｉＲＮＡと比べて酵素分解に対して保護をもたらした（図１Ｂ）。直鎖ＤＰｎ８５およびＬＦ２０００を配合した複合体を破壊するためにはヘパリンとともにより長いインキュベーション時間（２時間）が必要であり、このことは試験した他のポリカチオンと比べて向上した物理的安定性を反映する（データは不図示）。
【００３２】
粒子サイズ
ｓｉＲＮＡ処方の粒子サイズはこれらの組織分布および細胞取り込みに大きく影響を及ぼし得るので、したがって、本発明者らは低分子量キトサンを配合したｓｉＲＮＡ複合体の粒子サイズを調べた。表１は低分子量キトサンがｓｉＲＮＡと自己集合してナノサイズ粒子（３４〜８６ｎｍ）になることを示す。得られた粒子のサイズは成分の＋／−電荷比に依存していた。小粒子サイズ（３４〜４６ｎｍ）は最低の電荷比１０：１（＋／−）で得られたが、より高い電荷比を使用した結果、比較的大きな粒子サイズ（６１〜８６ｎｍ）が得られた。粒子サイズを光子相関分光法により決定した。
【００３３】
【表１】
2010503640.tif 000002
【００３４】
同時トランスフェクトされ、安定して発現された標的のサイレンシングの比較
ほとんどのインビトロ実験において、ｓｉＲＮＡ分子はそれらのｐＤＮＡ標的と同時に送達（同時トランスフェクション）されるので、本発明者らは、同じレポーター配列（ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃ）を標的とするｓｉＲＮＡと合わせたホタルルシフェラーゼレポーター（ｐＬｕｃ）をコードするｐＤＮＡのパッケージを送達する低分子量キトサンの有効性を、対照としてミスマッチ（非サイレンシング）ｓｉＲＮＡを用いてまず試験した。トランスフェクションを２９３細胞（ルシフェラーゼレポーターを発現しない）において、ｐＤＮＡ用量、最も有効な低分子量キトサンおよび電荷比の最適化トランスフェクション（本発明者らの実験室でｐＤＮＡデリバリーについて最適化した）下で行った［非特許文献２７］。分岐ＤＰｎ３４キトサンオリゴマーまたはＬＦ２０００により送達されるｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃは、対照処方（ｐＬｕｃのみ）と比較してルシフェラーゼ発現の著しいノックダウン（８５〜９０％）をもたらした（図２Ａ）。ルシフェラーゼ発現における非有意阻害が両デリバリーシステムのミスマッチｓｉＲＮＡに関して観察された。
【００３５】
しかし、そのかわりに、ルシフェラーゼを安定して発現する２９３−Ｌｕｃ細胞へと選択されたポリカチオンにより同じ条件下でｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃが排他的に送達された場合（遺伝子サイレンシング用途により関連する場合）に、非常に低いルシフェラーゼサイレンシング活性が得られ、ルシフェラーゼ発現において顕著なサイレンシングを得るためにはより高いｓｉＲＮＡ濃度が必要であった（図２Ｂ）。
【００３６】
同時トランスフェクション技術が２９３−Ｌｕｃ細胞における遺伝子サイレンシング活性に対して影響を及ぼし得るかどうかを調べるために、無関係のプラスミド（ｐＧＦＰ）を前述の試験された同じｓｉＲＮＡ−ＬＵＣ処方中に組み入れた。２９３細胞において得られるパターンと同様に、分岐キトサンオリゴマー、ＰＥＩおよびＬＦ２０００は、最低のｓｉＲＮＡ濃度（１〜３０ｎｇ／ウェル、１．５〜４０ｎＭ／ウェルに等しい）（図２Ｃ）でルシフェラーゼ発現において顕著なノックダウン（４０〜８５％）に関与した。ｐＤＮＡをｓｉＲＮＡ処方中に組み入れること（同時トランスフェクション）により、遺伝子サイレンシング活性に対して正の影響が得られた。これらの結果は、ｓｉＲＮＡデリバリーの処方要件はｐＤＮＡとの要件と異なり、インビトロでのポリカチオンによる有効なｓｉＲＮＡデリバリーについて特徴づけられる重要なパラメータが存在することを示唆する。
【００３７】
低分子量キトサンの構造変数および処方パラメータの遺伝子サイレンシング活性に対する影響
ａ）鎖長、主鎖分岐および電荷比
キトサン構造および処方パラメータの低分子量キトサンによるｓｉＲＮＡデリバリーに対する影響を調べるために、本発明者らは、２９３−Ｌｕｃ細胞においてｓｉＲＮＡ複合体が関与するルシフェラーゼ発現のインビトロサイレンシングに対する鎖長、分岐および電荷比の影響をまず調べた。直鎖キトサンに関して、３４モノマー単位より長い鎖長を有するキトサンは電荷比と独立して顕著なルシフェラーゼサイレンシングに関与した（図３Ａ）。分岐キトサンオリゴマーを配合した複合体が関与するルシフェラーゼサイレンシングは電荷比および鎖長の両方に依存していた（図３Ｂ）。より長い分岐キトサンオリゴマーに関して、より高い電荷比はキトサン主鎖の分岐（置換）の負の効果を相殺し得る。これらの結果は、低分子量キトサンの高い電荷密度が物理的に安定な複合体をもたらすだけでなく、インビトロで有効なｓｉＲＮＡ処方ももたらすことを強調する。
【００３８】
ｂ）ｓｉＲＮＡ濃度および直鎖低分子量キトサンの相対的有効性
次のステップにおいて、様々な直鎖低分子量キトサン（一定の電荷比）を配合した複合体のルシフェラーゼサイレンシング活性に対するｓｉＲＮＡ濃度の影響を２９３−Ｌｕｃ細胞において調査した。最低のｓｉＲＮＡ濃度（１５〜５０ｎｇ／ウェル、２２〜７３ｎＭ／ウェルに等しい）で、直鎖ＤＰｎ８５複合体は、ルシフェラーゼ発現を対照未処理細胞の７２〜９５％にノックダウンすることによって最高の効力を示した（図４）。ＤＰｎ１８を除いて、試験した直鎖キトサンの複合体は、ｓｉＲＮＡ濃度が７０から３００ｎｇ／ウェル（１０３〜４４０ｎＭ／ウェル）に増加した場合に、匹敵するルシフェラーゼサイレンシング特性を示した。直鎖の、より長鎖の低分子量キトサンを配合した複合体の効力がより高いことは、最高の遺伝子サイレンシング活性の達成におけるｓｉＲＮＡ処方の物理的安定性の役割を裏付ける。
【００３９】
血清の存在下でのインビトロトランスフェクション
本発明者らは、様々なｓｉＲＮＡ処方の有効性に対するトランスフェクション培地中の血清の効果も調査した。３４〜８５モノマー単位の範囲のＤＰ値を有する直鎖キトサンおよび分岐ＤＰｎ８５キトサンオリゴマーを配合したｓｉＲＮＡ複合体は、２９３−Ｌｕｃ細胞中、１０％血清の存在下で遺伝子サイレンシング活性を保持していた（図５）。対照的に、ＰＥＩおよびＬＦ２０００を配合したｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング活性は損なわれた。有効性が損なわれる一つの可能な理由は、トランスフェクション中の粒子凝集である。
【００４０】
インビトロ細胞毒性
より高いルシフェラーゼサイレンシング効率が増加した細胞毒性の結果でないことを保証するために、本発明者らは、比較的高濃度のｓｉＲＮＡ（１５０ｎＭ）を配合した様々なポリカチオン複合体の、細胞形態および細胞内デヒドロゲナーゼ活性に対する影響を、ＭＴＴ法を用いて調査した。５時間のトランスフェクション後、直鎖ＤＰｎ８５を配合したｓｉＲＮＡ複合体において、細胞形態および細胞内デヒドロゲナーゼ活性（細胞毒性の尺度）に対する影響は観察されなかった（図６）。対照的に、ＰＥＩおよびＬＦ２０００に関して著しい毒性効果が観察され、直鎖ＰＥＩについて毒性は最高であった。ＬＦ２０００複合体で処理された細胞は２４時間後にその細胞内デヒドロゲナーゼ活性を回復したが、ＰＥＩで処理された細胞は２４時間後にデヒドロゲナーゼ活性においてさらなる減少を示した。これらの結果は、直鎖ＤＰｎ８５低分子量キトサンの急性細胞毒性は、比較的高濃度のｓｉＲＮＡが使用された場合でさえも、ＰＥＩおよびＬＦ２０００よりも低いことを示す。
【００４１】
インビトロでのＲＮＡｉの動態
最後に、ｓｉＲＮＡ−Ｌｕｃの２９３−Ｌｕｃ細胞へのデリバリー後のルシフェラーゼサイレンシング時間経過を調査した。３４〜８５モノマー単位の範囲のＤＰ値を有する低分子量キトサン、ＰＥＩおよびＬＦ２０００を試験した。ＤＰｎ１８キトサンは、さらに長いキトサンよりも有効でないため（図４）、含めなかった。直鎖ＤＰｎ８５を配合したｓｉＲＮＡ複合体はルシフェラーゼサイレンシングの早発性に関与し、この場合、１日後に著しい効果が検出され（７０％）、２日後に最大（９２％）に達した（図７Ａ）。遺伝子サイレンシング活性は５日間持続し、このことはインタクトなｓｉＲＮＡが細胞内で安定して放出されることを示唆する。分岐キトサンオリゴマーはこれらの直鎖カウンターパートと比較して有効性が低いルシフェラーゼサイレンシング動態を示した（図７Ｂ）。ＬＦ２０００およびＰＥＩは、低分子量キトサンが関与するものよりも低い遺伝子サイレンシング効果を示した（図７Ｃ）。別の細胞系（ＳＫＯＶ−３−Ｌｕｃ）におけるルシフェラーゼサイレンシング動態は、２９３−Ｌｕｃ細胞におけるものと類似した結果をもたらした（図７Ｄ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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