(57)【要約】  本発明は、ＣＤ２６のｃＤＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ又は抗ＣＤ２６抗体といった、細胞外マトリックスへのＣＤ２６の結合を阻害する物質を含む、悪性中皮種の治療剤に関する。また、本発明は、前記物質を患者に投与することを含む、悪性中皮種の治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリックスへのＣＤ２６の結合を阻害する物質を含有する、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の治療用の医薬組成物。
【請求項２】
悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍のための成長阻害剤である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記物質がＣＤ２６ ｃＤＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記物質が抗ＣＤ２６抗体である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗ＣＤ２６抗体がモノクローナル抗体である、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗ＣＤ２６抗体が１４Ｄ１０である、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗ＣＤ２６抗体がヒト化抗体である、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ヒト化抗体が１４Ｄ１０由来の可変領域を含む、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ヒト化抗体がAmerican Type Culture Collection (ATCC)の受託番号PTA-7695を有し、s604069.YST-pABMC148(x411)と命名された株により生産される、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗体に特異的なエフェクター細胞を更に含む、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項１１】
抗ＣＤ２６抗体および該抗体に特異的なエフェクター細胞を含有する、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の治療用キット。
【請求項１２】
悪性中皮腫細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍細胞と細胞外マトリックスへのＣＤ２６の結合を阻害する物質とを接触させる工程を含む、悪性中皮腫細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍細胞の増殖阻害方法。
【請求項１３】
前記物質が抗ＣＤ２６抗体又はＣＤ２６ ｃＤＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
悪性中皮腫細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍細胞及びエフェクター細胞と抗ＣＤ２６抗体とを接触させる工程を含む、悪性中皮腫細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍細胞の増殖阻害方法であって、該エフェクター細胞が該抗体に特異的な細胞である、前記方法。
【請求項１５】
前記物質が抗ＣＤ２６抗体又はＣＤ２６ ｃＤＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
悪性中皮腫細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍細胞及びエフェクター細胞と抗ＣＤ２６抗体とを接触させること工程を含む、悪性中皮腫細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍細胞を溶解する方法であって、該細胞の溶解が抗体依存性細胞障害に起因し、該エフェクター細胞が該抗体に特異的な細胞である、前記方法。
【請求項１７】
中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の患者から検体を採取する工程及び該検体におけるＣＤ２６の発現レベルを測定する工程を含む、中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の悪性転換を検出する方法。
【請求項１８】
抗ＣＤ２６抗体を含有する、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の診断剤。
【請求項１９】
抗ＣＤ２６抗体を含有する、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の診断用キット。
【請求項２０】
ＣＤ２６陽性細胞を試験用物質と接触させる工程及び該細胞中のｐ２７の発現レベルを測定する工程を含む、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍を治療するための物質のスクリーニング方法。
【請求項２１】
悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の治療用の医薬組成物の製造における、請求項１〜１０に記載の物質の使用。
【請求項２２】
悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の治療用の請求項１〜１０に記載の物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年３月１４日出願の米国仮出願第６０／８９４，７８６に基づく優先権を主張するものであり、その全てを参照により本明細書に組み込まれるものである。
【０００２】
本発明は、悪性中皮種の治療薬および悪性中皮種の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
悪性中皮種（ＭＭ）は胸膜を覆う中皮細胞から生ずる進行性癌である。ＭＭは、通常、慢性的なアスベスト暴露歴に関連している（非特許文献１）。アスベスト暴露と腫瘍成長との間の長い潜伏期間のため、米国における２５００件の年間発生率が来るべき１０年間で５０％以上増加すると予想されている（非特許文献２）。さらに、世界的規模における発生率は、今後１０年間に相当上昇すると予想されている（非特許文献３）。手術、放射線療法や化学療法を含む現在使用されている治療にもよらず、その予後は平均生存期間４〜１２ヶ月と非常に悪い（非特許文献４）。従来の治療法の効果がないため、新規な治療戦略が早急に開発されることを必要とされている。
【０００４】
ＣＤ２６は、ペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）活性を有する１１０ｋＤａの表面糖タンパク質であり、切断してその機能を変化させえる選択された生物学的因子を壊すことができる（非特許文献５）。ＣＤ２６／ＤＰＰＩＶは、Ｔリンパ球共刺激およびシグナル伝達過程に関与しており（非特許文献６および７）、悪性血液腫瘍におけるトポイソメラーゼＩＩαレベルを制御し（非特許文献８）、ドキソルビシンおよびエトポシドに対する感受性に影響を与える。ＣＤ２６は、種々の組織に発現しており（非特許文献４および９）、ある種のヒトの癌の進行に関与している（非特許文献９−１２）。ＣＤ２６は、ヒトおよびげっ歯類におけるＥＣＭの結合モチーフとしての機能を果たすことも知られている（非特許文献１３および１４）。以前、我々は、ＣＤ２６が悪性中皮種に由来するＣＤ２６陽性ＪＭＮ細胞株を利用して、ＣＤ２６がコラーゲン結合タンパク質であることを報告した（非特許文献１５）。さらに、我々の以前の報告では、抗ＣＤ２６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）がＣＤ２６陽性Ｔ細胞リンパ腫（非特許文献１６および１７）および腎細胞癌（非特許文献１８）の成長を阻害することを示した。
ＣＤ２６の構造は、３つの領域−細胞外領域（その細胞外領域は、membrane-proximalグリコシル化ドメイン、システインに富むドメインおよびＤＰＰＩＶ酵素活性を含む２６０アミノ酸Ｃ末ドメインを含む）、２２残基の疎水性膜貫通領域および６アミノ酸の細胞質領域から成り立っている。我々の以前の報告では、ヒトＣＤ２６の２０アミノ酸の柔軟幹領域から始まる細胞membrane-proximalグリコシル化ドメインを認識する、マウス抗ＣＤ２６ｍＡｂ１４Ｄ１０がＧ１／Ｓ細胞周期停止を含む直接的な抗腫瘍効果およびそれに付随して癌細胞のＥＣＭへの癒着を防ぐことを示した。しかし、システインに富むドメインがみられる、５Ｆ８と名付けられた別のマウス抗ＣＤ２６ｍＡｂは、この生物学的活性を欠いている（非特許文献１８）。
ヒト悪性中皮種（ＭＭ）は明らかな従来治療法に対して高い悪性腫瘍抵抗性があるので、ＭＭにおける新規な標的および新規な治療戦略が早急に開発されることを必要とされている（非特許文献４および１９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＣＤ２６は、鍵細胞内タンパク質との関係を通して腫瘍成長における役割を有する、１１０ｋＤａの細胞表面抗原である。本発明において、我々は、悪性中皮種を伴う患者の組織におけるＣＤ２６の発現を分析し、ＭＭを標的とすることにより、１４Ｄ１０の可変領域に対する高親和性Ｆａｂクローンからなる、新規なヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（ｈｕｍａｂ）の抗腫瘍効果の妥当性を確認し、一方、同時にこの新生物におけるＣＤ２６の機能的役割を示した。特に、本発明において、我々はＣＤ２６が悪性中皮種の細胞表面に高発現しているが、良性中皮種には発現しておらず、ＣＤ２６が悪性腫瘍のマーカーになりうることを示す。重要な事に、ｓｉＲＮＡオリゴトランスフェクションによるＣＤ２６の枯渇は、接着特性の消失の結果であり、ＣＤ２６が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対する結合タンパク質であることを示す。以前、我々は、マウス抗ＣＤ２６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）１４Ｄ１０の結合が、ｐ２７ｋｉｐｌの発現の増強、ＣＤＫ２のダウンレギュレーションおよび網膜芽腫基質の脱リン酸に関与する、直接的な抗腫瘍効果を誘発することを示した。これらデータが得られた事により、今回、我々は、１４Ｄ１０の可変領域に対する高親和性Ｆａｂクローンからなる、新規に開発されたヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（ｈｕｍＡｂ）を分析する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータは、ｈｕｍＡｂが、ｐ２７ｋｉｐｌの集積を介したその直接的な抗腫瘍効果およびＥＣＭに対する結合の破断に加え、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を介した悪性中皮腫細胞の細胞溶解を誘発することを示す。ヒト悪性中皮種細胞を含むマウス異種移殖片モデルを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、ｈｕｍＡｂ治療が、劇的に担癌マウスにおける腫瘍成長を阻害し、その結果、生存を上昇させることを示すものである。以上をまとめると、我々のデータは、抗ＣＤ２６ｈｕｍＡｂ治療がＣＤ２６陽性悪性中皮腫における新規な癌治療薬として臨床使用の可能性があることを示すものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、以下に示される通りである。
（１）細胞外マトリックスへのＣＤ２６の結合を阻害する物質を含有する、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の治療用の医薬組成物。
（２）悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍のための成長阻害剤である、（１）記載の医薬組成物。
（３）前記物質がＣＤ２６ｃＤＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである、（１）記載の医薬組成物。
（４）前記物質が抗ＣＤ２６抗体である、（１）記載の医薬組成物。
（５）前記抗ＣＤ２６抗体がモノクローナル抗体である、（４）記載の医薬組成物。
（６）前記抗ＣＤ２６抗体が１４Ｄ１０である、（４）記載の医薬組成物。
（７）前記抗ＣＤ２６抗体がヒト化抗体である、（４）記載の医薬組成物。
（８）前記ヒト化抗体が１４Ｄ１０由来の可変領域を含む、（７）記載の医薬組成物。
（９）前記ヒト化抗体がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）の受託番号ＰＴＡ−７６９５を有し、ｓ６０４０６９.ＹＳＴ−ｐＡＢＭＣ１４８（ｘ４１１）と命名された株により生産される、（７）記載の医薬組成物。
寄託は、２００６年６月３０日、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定の下でＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＰＴＡ−７６９５と指定された。寄託された試料は、菌株表示がｓ６０４０６９.ＹＳＴ−ｐＡＢＭＣ１４８ （ｘ４１１）を有する、「ヒトＣＤ２６ｃＤＮＡに対するヒト化モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを有するＤＨ５α大腸菌」とされた。
（１０）前記抗体に特異的なエフェクター細胞を更に含む、（４）記載の医薬組成物。
（１１）抗ＣＤ２６抗体および該抗体に特異的なエフェクター細胞を含有する、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の治療用キット。
（１２）悪性中皮腫細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍細胞と細胞外マトリックスへのＣＤ２６の結合を阻害する物質とを接触させる工程を含む、悪性中皮腫細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍細胞の増殖阻害方法。
（１３）前記物質が抗ＣＤ２６抗体又はＣＤ２６ｃＤＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである、（１２）記載の方法。
（１４）悪性中皮腫細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍細胞及びエフェクター細胞と抗ＣＤ２６抗体とを接触させる工程を含む、悪性中皮腫細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞又はその他のCD26の発現を伴う悪性腫瘍細胞の増殖阻害方法であって、該エフェクター細胞が該抗体に特異的な細胞である、前記方法。
（１５）前記物質が抗ＣＤ２６抗体又はＣＤ２６ｃＤＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである、（１４）記載の方法。
（１６）悪性中皮腫細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍細胞及びエフェクター細胞と抗ＣＤ２６抗体とを接触させる工程を含む、悪性中皮腫細胞、肺癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍細胞を溶解する方法であって、該細胞の溶解が抗体依存性細胞障害に起因し、該エフェクター細胞が該抗体に特異的な細胞である、前記方法。
（１７）中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の患者から検体を採取する工程及び該検体におけるＣＤ２６の発現レベルを測定する工程を含む、中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の悪性転換を検出する方法。
（１８）抗ＣＤ２６抗体を含有する、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の診断剤。
（１９）抗ＣＤ２６抗体を含有する、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の診断用キット。
（２０）ＣＤ２６陽性細胞を試験用物質と接触させる工程及び該細胞中のｐ２７の発現レベルを測定する工程を含む、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍を治療するための物質のスクリーニング方法。
（２１）悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の治療用の医薬組成物の製造における、（１）〜（１０）に記載の物質の使用。
（２２）悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の治療用の（１）〜（１０）に記載の物質。
（２３）抗ＣＤ２６抗体及び該抗体に特異的なエフェクター細胞を患者に投与することを含む、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の治療方法。
（２４）患者から試料を収集する工程及び該試料中のＣＤ２６の発現レベルを測定する工程を含む、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌又はその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍の診断方法。
（２４）に記載の方法は、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌またはその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍と初期の肺癌との鑑別診断に有用である。
【発明の効果】
【０００８】
投与される本発明の物質は、ｐ２７ｋｉｐ１発現の亢進および／またはＥＣＭへのＣＤ２６の結合を阻害することにより、悪性中皮腫に対する抗腫瘍効果を示しうる。投与される本発明の物質が該ＣＤ２６抗体である場合、該抗体はエフェクター細胞を利用してＡＤＣＣ誘発性の悪性中皮腫の細胞溶解を起こしうる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】悪性中皮腫におけるＣＤ２６の発現および機能的役割Ａ.類腺腫瘍，活性化中皮細胞およびＭＭにおけるＣＤ２６の免疫化学的局在。ａ, 類腺腫瘍におけるＣＤ２６； ｂ, 活性化中皮細胞におけるＣＤ２６； ｃ,局在化したＭＭにおけるＣＤ２６； ｄ, 高度に分化した乳頭状ＭＭにおけるＣＤ２６； ｅおよびｆ, びまん性ＭＭにおけるヘマトキシリン＆エオジン染色； ｇおよびｈ, びまん性ＭＭにおけるＣＤ２６。びまん性ＭＭにおいて肉腫様ＭＭ（ｆ, ｈ）と上皮様ＭＭ（ｇ, ｉ）の二相性の特徴を示している。示されているパネルは１２枚の連続切片からの代表例である。オリジナルの倍率は１００倍。
【図１Ｂ】ＭＭにおけるＣＤ２６の発現および機能的役割Ｂ．中皮腫細胞株におけるＣＤ２６の表面発現をフローサイトメトリー法によって解析した。赤線、ＣＤ２６のヒストグラムはマウス抗ＣＤ２６モノクローナル抗体（１４Ｄ１０）による染色後、ウサギ抗マウスＩｇｂ ＦＩＴＣコンジュゲートによって染色することによって得られ，淡い色の線はアイソタイプ一致の対照ｍＡｂ（２Ｈ４）の染色によって得られた背景の蛍光を示す対照ヒストグラムである。
【図１Ｃ】ＥＣＭに対するＣＤ２６の接着性。ＣＤ２６欠失ＮＣＩ−Ｈ２４５２細胞（ｓｉ）、スクランブル対照オリゴ導入ＮＣＩ−Ｈ２４５２細胞（ｃｔｌ）、ｐＥＢ６ベクター導入２９３Ｔ細胞（ｖｅｃ）、またはｐＥＢ６−ＣＤ２６導入２９３Ｔ細胞（非特許文献２６）をフィブロネクチン（ＦＮ）、Ｉ型コラーゲン（ＣＬ）、ラミニン（ＬＮ）またはヒアルロナン（ＨＬ）でコーティングされた６０ｍｍディッシュに播種し、１８時間培養した（１ディッシュあたり２×１０６細胞）。ＦＮおよびＣＬはＣＤ２６の細胞外領域への結合タンパク質（ＢＰ）であり、ＨＬはＣＤ４４の結合タンパク質である。癌細胞の接着能はディッシュの底面に付着した細胞の平均数として示し，その結果は視野当たりの細胞数の平均±標準誤差として表現している。接着の値は１回のアッセイにおける３視野での１平方ミリメートル当たりの接着細胞数の平均を計算することによって測定され、３回の測定の平均として表現した。接着細胞数（％）：接着細胞数／（接着細胞数＋非接着細胞数）。
【図１Ｄ】ＣＤ２６の欠失は、ｐ２７ｋｉｐ１の発現亢進を誘導する。ＮＣＩ−Ｈ２４５２細胞およびＪＭＮ細胞にＣＤ２６のｓｉＲＮＡオリゴ（ｓｉ）または対照オリゴ（ｃｔｌ）トランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後に，細胞を回収し、溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ｐ２７ｋｉｐ１、ｐ２１ｃｉｐ１／ｗａｆ１、ＣＤ２６およびＣＤ４４に特異的な抗体によってプローブした。
【図２Ａ】ＭＭの増殖における抗CD26モノクローナル抗体の阻害効果Ａ．ＥＣＭに対する細胞接着の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体の効果。アイソタイプ一致の対照のｍＡｂ（ｉｓｏ）、５Ｆ８、１４Ｄ１０またはヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ抗体（ｈｕｍＡｂ）で処置したＪＭＮ細胞をフィブロネクチン（ＦＮ）、Ｉ型コラーゲン（ＣＬ）、ラミニン（ＬＮ）またはヒアルロナン（ＨＬ）で被覆された６０ｍｍディッシュに播種し、１８時間培養した（１ディッシュあたり２×１０６細胞）。接着細胞数（％）：接着細胞数／（接着細胞数＋非接着細胞数）。
【図２Ｂ】ＪＭＮ ５ｘ１０３細胞／穴を、アイソタイプが一致する対照のｍＡｂ（ｉｓｏ）、５Ｆ８、１４Ｄ１０またはヒト化抗ＣＤ２６モノクローナル抗体（ｈｕｍＡｂ）のいずれかの存在下で９６穴プレート上で培養した。抗体処理２４時間後、電子供与体である１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの存在下での生体内還元による水溶性フォルマザン染色を、材料および方法の記載に従ってマイクロプレートリーダーを用いることによって４５０ｎｍで測定し、成長阻害比は４５０ｎｍにおける光学濃度（ＣＤ）の減少分の百分率（％）として計算した。
【図２Ｃ】ＪＭＮ細胞を、アイソタイプが一致する対照のｍＡｂ（ｉｓｏ）、５Ｆ８、１４Ｄ１０またはヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（ｈｕｍＡｂ）で処置した。抗体処置後１８時間後に、細胞を回収し、溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ｐ２７ｋｉｐ１、ｐ２１ｃｉｐ１／ｗａｆ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリンＤ１、サイクリンＥおよびβアクチンに特異的な抗体によってプローブした。
【図３Ａ】ヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂによるＪＭＮ細胞の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）特異的溶解Ａ．左のパネル；X軸上に表示された各濃度でのヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（ｈｕｍＡｂ）および１４Ｄ１０のＡＤＣＣを試験した。エフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比を５０に固定した。右のパネル；様々なＥ／Ｔ比の存在下でヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（ｈｕｍＡｂ）および１４Ｄ１０のＡＤＣＣを試験した。ｍＡｂの濃度を５μｇ／ｍｌに固定した。健康ドナーからのＮＫ細胞をエフェクター細胞として用いた。
【図３Ｂ】ＡＤＣＣ効果における擬似的なエフェクター細胞として、ヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（ｈｕｍＡｂ）および１４Ｄ１０の架橋（ＸＬ）法を利用した。上の３つのパネルはそれぞれ架橋した１４Ｄ１０、完全体ｈｕｍＡｂ、架橋したｈｕｍＡｂを示す。補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を試験するために、ヒト血清を利用した。下の３つのパネルは、１４Ｄ１０と血清、ｈｕｍＡｂと血清、およびｈｕｍＡｂと熱非動化血清を示す。Ｘ軸はアネキシンＶを表示している。Ｙ軸はヨウ化プロピジウムを表示している。
【図３Ｃ】架橋した１４Ｄ１０、完全体ｈｕｍＡｂ、架橋したｈｕｍＡｂのいずれかで前処理したＪＭＮ細胞（上の３つのパネル）、または１４Ｄ１０プラス血清、ｈｕｍＡｂプラス血清、およびｈｕｍＡｂプラス熱非動化血清のいずれかで前処理したＪＭＮ細胞（下の３つのパネル）において活性化カスパーゼ３を評価した。
【図４Ａ】ヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏでの直接作用：ＡＤＣＣ欠失モデル  ６週齢のメスＮＯＤ ＳＣＩＤマウスを処理前日に抗アシアロＧＭ１ポリクローナル抗血清によって前処置した。Ａ．皮下腫瘍形成能についてヒト化抗ＣＤ２６モノクローナル抗体の効果を評価した。ＪＭＮ細胞（１ｘ１０６）をマウスの左側腹に皮下接種した。マウスは腫瘍塊が可視となった（サイズ５ｍｍ）癌細胞接種後１４日目にアイソタイプが一致する対照のｍＡｂ（ｉｓｏ、ｎ＝４）、５Ｆ８（ｎ＝４）、１４Ｄ１０（ｎ＝４）またはヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（ｈｕｍＡｂ、ｎ＝４）の腫瘍内投与によって処置した。各ｍＡｂは週３回、１回の注射ごとに１０μｇを投与した。
【図４Ｂ】最初のｍＡｂ処理の後３５日目の皮下腫瘍形成能モデルにおける代表的な摘出標本。
【図４Ｃ】腫瘍転移モデルにおけるヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂの効果を評価した。ＪＭＮ細胞（１ｘ１０５）を各群のマウスに経静脈注射した。マウスは癌細胞注射の日にアイソタイプが一致する対照のｍＡｂ（ｉｓｏ、ｎ＝４）、５Ｆ８（ｎ＝４）、１４Ｄ１０（ｎ＝４）またはヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（ｈｕｍＡｂ、ｎ＝４）の静脈内投与によって処置した。各ｍＡｂは週３回、１回の注射ごとに１０μｇを投与した。
【図５Ａ】ヒト化抗ＣＤ２６モノクローナル抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの直接および間接作用：マウスＡＤＣＣ表現モデル本実験では６週齢メスＢａｌｂマウスを用いた。Ａ．皮下腫瘍形成能についてヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂの効果を評価した。ＪＭＮ細胞（１ｘ１０６）をマウスの左側腹に皮下接種した。マウスは腫瘍塊が可視となった（サイズ５ｍｍ）癌細胞接種後１４日目にアイソタイプが一致する対照のｍＡｂ（ｉｓｏ、ｎ＝４）、５Ｆ８（ｎ＝４）、１４Ｄ１０（ｎ＝４）またはヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（ｈｕｍＡｂ、ｎ＝４）の腫瘍内投与によって処置した。各ｍＡｂは週３回、１回の注射ごとに１０μｇを投与した。
【図５Ｂ】最初のｍＡｂ処理の後３５日目の皮下腫瘍形成性モデルにおける摘出標本の代表的なヘマトキシリン・エオジン染色像。ａ、アイソタイプが一致する対照のｍＡｂ（ｘ１００）；ｂ、アイソタイプが一致する対照のｍＡｂ（ｘ６００）；ｃ、５Ｆ８（ｘ１００）；ｄ、５Ｆ８（ｘ６００）；ｅ、１４Ｄ１０（ｘ１００）；ｆ、１４Ｄ１０（ｘ６００）；ｇ、ヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（ｘ１００）；ｈ、ヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（ｘ６００）。白い破線は腫瘍（Ｔ）と死滅組織（Ｄ）との間の境界線を表示している。
【図５Ｃ】ヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏでの直接および間接作用：マウスＡＤＣＣ表現モデルＣ．腫瘍転移モデルにおけるヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂの効果を評価した。ＪＭＮ細胞（１ｘ１０５）を各群のマウスに経静脈注射した。マウスは癌細胞注射の日にアイソタイプが一致する対照のｍＡｂ（ｉｓｏ、ｎ＝４）またはヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（ｈｕｍＡｂ、ｎ＝４）の静脈内投与によって処置した。各ｍＡｂは週３回、１回の注射ごとに１０μｇを投与した。
【図５Ｄ】腫瘍転移モデルの遠隔転移形成におけるヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂの効果を評価した。ＪＭＮ細胞（１ｘ１０５）を各群のマウスに経静脈注射した。マウスは癌細胞注射の日にアイソタイプが一致する対照のｍＡｂ（レーン１、ｎ＝４）、５Ｆ８（レーン２、ｎ＝４）、１４Ｄ１０（レーン３、ｎ＝４）またはヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（レーン４、ｎ＝４）の静脈内投与によって処置した。各ｍＡｂは週３回、１回の注射ごとに１０μｇを投与した。癌細胞注射後３５日目にはマウスを安楽死させ、肺および肝臓の多発性転移像形成を計数した。
【図６】ヒト化抗ＣＤ２６モノクローナル抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの直接および間接作用：ヒトＡＤＣＣ表現モデル  本実験では６週齢のメスＮＯＧ ＳＣＩＤマウスを用いた。マウスはそれぞれヒトエフェクター細胞（ＨｕＥＣ）移植群と、ＨｕＥＣ陰性群の二つの群に分けた。全てのマウスをＨｕＥＣ処理２日前に抗アシアロＧＭ１ポリクローナル抗血清腹腔内投与によって前処置した。ＨｕＥＣはエフェクター：標的比＝１０：１で腹腔内投与によって移植した。ＨｕＥＣ移植の１日後にＪＭＮ細胞（１ｘ１０６）をマウスの腹腔に移植した。後者の群は処置しなかった。全てのマウスをヒト標準ＩｇＧ＋ＨｕＥＣ（Ｈ−ＩｇＧ＋ＨｕＥＣ、ｎ＝４）、１４Ｄ１０（ｎ＝４）、１４Ｄ１０＋ＨｕＥＣ（ｎ＝４）、ヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ（ｈｕｍＡｂ、ｎ＝４）またはヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ＋ＨｕＥＣ（ｈｕｍＡｂ＋ＨｕＥＣ、ｎ＝４）によって処置した。癌細胞移植後１、３および５日後に、各ｍＡｂを１回の注射ごとに１０μｇの量で腹腔内投与した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書中に組み入れられる刊行物、特許、特許出願、インターネットサイトおよびアクセッション番号/データベース配列(ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含む)は全て、あたかも、それぞれの個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイトまたはアクセッション番号/データベース配列が具体的かつ個々に参照により示されるのと同程度に、これらの文献の全文が参照により本明細書中に組み入れられる。
【００１１】
本発明は、細胞外マトリックスへのＣＤ２６の結合を阻害する物質を含む悪性中皮腫を治療するのための医薬組成物を提供する。前記物質の例は、抗ＣＤ２６抗体などの新規なポリペプチドならびにＣＤ２６ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡを標的とするｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００１２】
本発明は、抗ＣＤ２６抗体、抗ＣＤ２６抗体の断片、および抗ＣＤ２６抗体に関連するその他のポリペプチドなどの新規なポリペプチドを提供する。ある実施態様において、抗ＣＤ２６抗体はヒト化抗ＣＤ２６抗体である。前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドもまた提供される。前記ポリヌクレオチドを含む、ベクターおよび宿主細胞もまた提供される。本発明のポリペプチドを含む医薬組成物などの組成物もまた提供される。前記ポリペプチドの製造方法もまた提供される。さらに、ＣＤ２６を発現する細胞の増殖の阻害またはＣＤ２６の発現を伴う状態の治療もしくは診断における前記ポリペプチド又は前記ポリペプチドを含む医薬組成物の使用方法をさらに提供する。
【００１３】
実施態様が「を含む（comprising）」という語句で本明細書において記載されている場合はいずれにおいても、「からなる（consisting of）」および／または「実質的に〜からなる（consisting essentially of）」という用語で記載されている他の類似の実施態様も提供されるものと解される。
【００１４】
一般的方法
本発明の実施（practice）は、別段の指示がない限りは、当該技術分野の当該技術分野の技術常識の範囲内において、（組換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学的な従来からの方法を用いるであろう。そのような技術としては、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition」 (Sambrook ら著、1989年) Cold Spring Harbor 出版；「Oligonucleotide Synthesis」 (MJ. Gait編、1984年)；「Methods in Molecular Biology」、Humana出版；「Cell Biology: A Laboratory Notebook」(J.E. Cellis編、1998年) Academic出版；「Animal Cell Culture」（R.I. Freshney編、1987年）；「Introduction to Cell and Tissue Culture」 (J.P. Mather 、P.E. Roberts著、 1998年) Plenum出版；「Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures」 (A. Doyle、 J.B. Griffiths、D.G. Newell編、1993-1998年) J. Wiley and Sons；「Methods in Enzymology」 (Academic Press, Inc.)；「Handbook of Experimental Immunology」 (D.M. Weir、CC. Blackwell編)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」 (J.M. Miller、M.P. Calos編、1987年)；「Current Protocols in Molecular Biology」 (F.M. Ausubelら編、1987年)；「PCR： The Polymerase Chain Reaction」、 (Mullisら編、1994年)；「Current Protocols in Immunology」 (J.E. Coliganら編、1991年)；「Short Protocols in Molecular Biology」(Wiley、Sons著、1999年)；「Immunobiology」 (CA. Janeway、P. Travers著、1997年)；「Antibodies」(P. Finch、1997年)；「Antibodies: a practical approach」(D. Catty編、IRL出版、1988-1989年)；「Monoclonal antibodies: a practical approach」(P. Shepherd、C. Dean編、Oxford University Press、2000年)；「Using antibodies: a laboratory manual」(E. Harlow、D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999年)；「 The Antibodies」(M. Zanetti、J.D. Capra編、Harwood Academic Publishers、1995年)などの文献に十分に説明されている。
【００１５】
定義
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する、少なくとも１つの抗原認識部位を介して、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、前記用語は、完全体のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、それらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）、１本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の修飾構造体が含まれる。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）などの抗体の任意のクラスを含み、特定のクラスである必要は無い。重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列により、免疫グロブリンは、異なるクラスに分類される。５つの主な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらの幾つかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２というサブクラス（アイソタイプ）にさらに細分化されうる。異なるクラスの免疫グロブリンの対応する重鎖の定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれている。異なるクラスの免疫グロブリンごとのサブユニット構造および３次元構造は、よく知られている。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一抗体のポピュレーションから得られる抗体のことをいう。すなわち、そのポピュレーションに含まれる個々の抗体は、若干存在しうる可能性のある天然の突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に対するものであり、非常に特異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗原を含む典型的なポリクローナル抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基を標的とするものである。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体ポピュレーションから得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして解されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、米国特許第4,816,567号に記載されるような組換えＤＮＡ法により調製されうる。モノクローナル抗体は、例えば、McCaffertyら，1990年，Nature，348：552-554記載の技術を用いて作成されるファージライブラリーからも単離できる。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「ヒト化」抗体は、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むそれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合性部分配列等）である、非ヒト（例えば、マウス）の抗体の形態のことをいう。幾つかのヒト化抗体は、受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト由来残基により置換されている。幾つかのヒト化抗体は、所望の特異性、親和性および／または能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）由来の少なくとも１つ、通常２つの可変領域を含むが、１つ以上のＦｖフレームワーク領域の残基および／または１つ以上のＦｖＣＤＲ残基が対応するヒト残基（即ち、ヒト抗体配列由来の残基）により置換されている。最も一般的には、少なくとも複数のＦｖフレームワーク領域の残基は、ヒト化抗体の１つ以上の可変領域において置換されているであろう。さらに、ヒト化抗体は、受容体抗体でも移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含みうるが、抗体性能の更なる改良および最適化をするための残基を含みうる。
【００１８】
幾つかのヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変領域を実質的に全て含み、それらの可変領域において、ＣＤＲの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、そしてＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲである。幾つかのヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変領域の実質的に全てを含み、それらの可変領域において、ＣＤＲのアミノ酸残基の大部分が非ヒト化免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、そしてＦＲのアミノ酸残基の１つ以上がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲである。ヒト化抗体は、最も好ましくは、ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）またはドメイン（一般的にはヒト免疫グロブリン）の少なくとも一部を含むであろう。幾つかのヒト化抗体は、国際公開公報第９９／５８５７２号に記載されるような修飾されたＦｃ領域を有する。ヒト化抗体の幾つかの形態は、元々の抗体に対して変更された１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６）のＣＤＲを有し、このＣＤＲは元々の抗体の１つ以上のＣＤＲに「由来する」１つ以上のＣＤＲとも呼ばれる。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」は、ヒトにより生産された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、および/またはヒト抗体の作製のための当技術分野で知られているかもしくは本明細書中に開示される任意の技術を使用して作製された抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも1つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも1つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。そのような例の1つは、マウス軽鎖ポリペプチドおよびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で知られている様々な技術を用いて生産することができる。一実施態様において、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択される(Vaughanら, 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314、Sheetsら, 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162、HoogenboomおよびWinter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381、Marksら, 1991, J. Mol. Biol., 222:581)。
【００２０】
ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリンが部分的にまたは完全に不活性化された形質転換動物、例えばマウスに導入することにより作製することができる。このアプローチは、米国特許第5,545,807号；5,545,806号；5, 569,825号；5,625,126号；5,633,425号；および5,661,016号に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を生産するヒトＢリンパ球の不死化により調製することができる(そのようなＢリンパ球は個体から回収してもよいし、またはin vitroで免疫してもよい)。例えば、Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985), Boernerら, 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95、および米国特許第5,750,373号を参照。ある実施態様では、ヒト抗体は、「完全にヒト型」であり、これは抗体がヒト重鎖ポリペプチドおよびヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を意味する。
【００２１】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーについて参照するため、本明細書中ではほぼ同義に使用される。ポリマーは直鎖状または分枝していてもよく、ポリマーは修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、ポリマーは非アミノ酸により中断されてもよい。その用語はまた、天然の修飾アミノ酸ポリマー、或いは、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合等の任意の他の操作または修飾等の介入により、修飾アミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸(たとえば、非天然型アミノ酸等を含む)の1つ以上の類似体を含むポリペプチドおよび当技術分野で知られている他の修飾体もまた本定義の範囲に含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づくので、ポリペプチドが一本鎖または会合鎖として存在し得ると解される。
【００２２】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書中においてほぼ同義に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指すものであり、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および/またはそれらの類似体、またはＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマー中に組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの構築前または後に与えてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分と結合させる等、重合後にさらに修飾されてもよい。
【００２３】
他の種類の修飾は、例えば、「ｃａｐｓ法」、類似体を伴う1つ以上の天然ヌクレオチドの置換、例えば、無電荷結合（uncharged linkage）(例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カバメート等)を有するヌクレオチド間修飾および有電荷結合（charged linkage）(例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するヌクレオチド間修飾、例えば、タンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジン等)などのペンダント部分を含むヌクレオチド間修飾、インターカレーター(例えば、アクリジン、ソラレン等)を有するヌクレオチド間修飾、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等)を含むヌクレオチド間修飾、アルキル化剤を含むヌクレオチド間修飾、修飾された結合(例えば、αアノマー核酸等)を有するヌクレオチド間修飾等のヌクレオチド間修飾、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形を含む。さらに、糖に普通存在する任意の水酸基は、例えば、ホスホン酸基もしくはリン酸基により置換されてもよく、標準的な保護基により保護されてもよく、または更なるヌクレオチドに対する更なる結合のために活性化されてもよく、あるいは固体担体に結合されてもよい。
【００２４】
５'および３'末端のＯＨは、リン酸化されているか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換されていてもよい。他の水酸基もまた、標準的な保護されている基に誘導化されてもよい。ポリヌクレオチドもまた、例えば、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−アリルリボース、２’−フルオロリボース、または２’−アジドリボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロース、またはリキソース等のエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシド等の脱塩基ヌクレオシド類似体といった、当技術分野で一般に知られている類似した形のリボースまたはデオキシリボース糖を含むことができる。1つ以上のホスホジエステル連結は、別の連結基と置換されてもよい。これらの別の連結基は、リン酸エステルが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」）、「（Ｏ）ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ'、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」)により置換され、ここで、各ＲまたはＲ'は、独立して、Ｈ、またはエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含む、置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）であるアルキル基である、実施態様を含むがこれらに限定されるものではない。ポリヌクレオチドにおけるすべての連結が同一である必要があるとは限らない。先の記載は、本明細書中において参照される、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む全てのポリヌクレオチドに対して適用される。
【００２５】
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域、それぞれの単独または組み合わせを参照する。重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られている３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている４つのフレームワーク領域(ＦＲ)からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲにより、極近傍に保持されており、他方の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するためには少なくとも２つの技術がある:（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ(例えば、KabatらSequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD))；および（２）抗原−抗体複合体の結晶構造学的研究に基づくアプローチ(Al-lazikaniら (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948))。さらに、これらの２つのアプローチの組合せが、ＣＤＲを決定するために当該技術分野で時々使用される。
【００２６】
抗体の「定常領域」は、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域、それぞれの単独のまたは組み合わせを参照する。
【００２７】
抗体もしくはポリペプチドに(本明細書中において同義に使用される)「優先的に結合する」または「特異的に結合する」エピトープは、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、特異的結合または優先的結合を決定するための方法もまた、当該技術分野でよく知られている。分子が、別の細胞もしくは物質と反応するかまたは相互作用するよりも、特定の細胞もしくは物質と、より頻繁に、より急速に、より長時間持続して、および/またはより大きな親和性で反応するかもしくは相互作用する場合、分子は、「特異的な結合」または「優先的な結合」を示すと言われる。抗体が他の物質に結合するよりも、より大きな親和性、結合活性で、より迅速に、および/またはより長時間持続して結合する場合、抗体は、標的に、「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、特異的にまたは優先的に１つのＣＤ２６エピトープに結合する抗体は、他のＣＤ２６エピトープまたは非ＣＤ２６エピトープに結合するよりも、より大きな親和性、結合活性で、より迅速に、および/またはより長時間持続してこのＣＤ２６エピトープに結合する抗体である。例えば、第１の標的に特異的にまたは優先的に結合する抗体(または部分またはエピトープ)は、第２の標的に特異的にまたは優先的に結合するかもしれないし、あるいは結合しないかもしれないということも、この定義から解釈される。このように、「特異的な結合」または「優先的な結合」は、必ずしも排他的な結合を(含むことはできるが)必要としない。一般には、結合についての参照は優先的な結合を意味するが、必ずしもそうとは限らない。
【００２８】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチドインサートを取り込むベクターのレシピエントになりうるか、または既にレシピエントになっている、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、子孫は、自然の、偶発的な、または計画的な突然変異により、(形態学的においてまたはゲノムＤＮＡ相補体において)本来の親細胞と必ずしも同一でなくてもよい。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドでｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクションした細胞を含む。
【００２９】
「単離された」、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然には見つけられない形態をしているポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、もはや、天然には見つけられない形態にまで精製されたものを含む。ある実施態様では、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は実質的に純粋である。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「治療」は、有益な、または所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的において、有益な、または所望の臨床結果は、検出可能または検出不可能のいずれにせよ、１つ以上の症状の軽減、疾患の範囲の縮小、疾患の安定化した(すなわち、悪化していない)状態、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の回復または寛解、および緩解(部分的または全体)を含むが、これらに限定されるものではない。「治療」は、仮に治療を受けなかった場合の見込まれた余命に対して、余命を延ばすことも意味している。
【００３１】
「有効量」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の臨床結果を達成するのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与で投与することができる。本発明の目的において、本明細書中に記載される抗ＣＤ２６抗体などのポリペプチドの有効量は、ＣＤ２６発現に関連する状態の進行を回復させる、安定化する、逆行させる、緩徐化する、および/または遅延させるのに十分な量である。当該技術分野で理解されるように、例えば、抗ＣＤ２６抗体の有効量は、とりわけ、患者病歴、ならびに使用される抗ＣＤ２６抗体の種類(および/または量)などの他の要因に変動または依存してもよい。当業者に対する本開示により明らかなように、これらの原理は、ポリペプチドの実施態様に適用される。
【００３２】
本明細書中において「対象」としても参照される「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、家畜(雌ウシ等)、スポーツ動物、ペット(ネコ、イヌ、およびウマ等)、霊長類、マウス、およびラットを含むが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「ベクター」は、宿主細胞における1つ以上の目的の遺伝子または配列を導入することができ、好ましくは発現することができる、構築物を意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、裸の（naked）ＤＮＡ発現ベクターもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドベクターもしくはファージベクター、カチオン縮合剤と結合したＤＮＡ発現ベクターもしくはＲＮＡ発現ベクター、リポソームにカプセル化されたＤＮＡ発現ベクターもしくはＲＮＡ発現ベクターならびにプロデューサー細胞などの特定の真核細胞中が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される担体」または「医薬的に許容される賦形剤」は、有効成分と組み合わせた場合に、その有効成分が生物活性を維持可能であり、送達された際に被験体の免疫系と非反応性であり、被験体に対して無毒性である任意の材料を含む。例として、リン酸緩衝食塩水、水、油/水エマルジョン等のエマルジョン、および様々な種類の湿潤剤などのあらゆる標準的な医薬の担体が含まれるが、これらに限定されるものではない。噴霧投与または非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝食塩水または生理食塩水(0.9%)である。そのような担体を含む組成物は、よく知られている従来法により、処方される(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18thedition, A. Gennaro編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990およびRemington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000を参照のこと)。
【００３５】
抗ＣＤ２６抗体
ある実施態様において、本明細書において記載されるポリペプチドは、好ましくは、１つ以上のペプチドに結合する。これらペプチドは、ヒトＣＤ２６の領域である。ある実施態様において、本明細書において記載されるポリペプチドは、マウスモノクローナル抗体１４Ｄ１０と同じエピトープに結合する。ある実施態様において、本明細書において記載されるポリペプチドは、競合アッセイにおいて、ヒトＣＤ２６に対するマウスモノクローナル抗体１４Ｄ１０の結合を遮断する能力がある。ある実施態様において、本明細書において記載されるポリペプチドは、競合アッセイにおいてヒトＣＤ２６に対するマウスモノクローナル抗体１Ｆ７の結合を遮断する能力がある。
【００３６】
親和性を決定するための方法は、当該技術分野で知られている。例えば、結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー、ＫｉｎＥｘＡバイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫測定法（ＩＧＥＮ社）、蛍光消光、蛍光転移、および/または酵母ディスプレイを使用して決定してもよい。結合親和性は、適切なバイオアッセイを用いてスクリーニングされることもありうる。
【００３７】
ＣＤ２６に対する抗体の結合親和性を決定するための１つの方法は、抗体の単官能性Ｆａｂ断片の親和性を測定することである。単官能性Ｆａｂ断片を得るために、抗体、例えば、ＩｇＧは、パパインで切断されるか、または組換え技術によって発現させることができる。モノクローナル抗体の抗ＣＤ２６ Ｆａｂ断片の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（商標）、ＢＩＡｃｏｒｅ社、Ｐｉｓｃａｗａｙ、ＮＪ）により決定することができる。供給業者の取扱説明書に従って、ＳＡチップ(ストレプトアビジン)は使用される。ビオチン化されたＣＤ２６を、ＨＢＳ−ＥＰ(100mM HEPES pH7.4、150ｍＭ NaCl、3mM EDTA、0.005% P20)中に希釈し、0.005mg/mLの濃度でチップ上に注入することができる。  個々のチップチャネルを横切る可変的な流動時間を使用して、抗原密度の２つの範囲が達成される：詳細な動力学的試験のためには１０〜２０応答ユニット（ＲＵ）、濃度のためには５００〜６００ＲＵ。Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液および４Ｍ ＮａＣｌ（２：１）の混合物は、結合したＦａｂを効率的に除去する一方で、２００回以上の注入に対してチップ上のＣＤ２６の活性を保つ。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液は、ランニング緩衝液として全てのＢＩＡｃｏｒｅアッセイに使用することができる。精製したＦａｂ試料の階段希釈溶液（０．１〜１０×見積もられたＫＤ）を１００μＬ/分で２分間注入し、３０分までの解離時間が通常許容される。Ｆａｂタンパク質の濃度は、既知濃度(アミノ酸分析により決定された)の標準的なＦａｂを使用して、ＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳働により決定することができる。反応速度の結合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを使用して、１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにデータをフィットさせることにより（Ｌｏｆａｓ ＆ Ｊｏｈｎｓｓｏｎ， １９９０）同時に得られる。平衡解離定数（ＫＤ）値はｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出される。
【００３８】
ある実施態様において、本発明は、ＣＤ２６を発現する細胞の増殖を阻害する、抗体などのポリペプチドを包含する。本発明はまた、ポリペプチドが、ＣＤ２６発現に関連する状態（疾患または障害等）、例えば悪性中皮腫、の治療に有用である実施態様も包含する。ある実施態様では、本発明のポリペプチド（例えば抗体）は、1つ以上の次の特徴を有していてもよい：（ａ）ＣＤ２６に結合する、（ｂ）ＣＤ２６活性を調節する、（ｃ）Ｇ１／ＳチェックポイントでＣＤ２６＋細胞の細胞周期を停止させる、（ｄ）ＣＤ２６を発現する細胞（例えば、悪性中皮腫）の増殖を阻害する、（ｅ）ＣＤ２６の細胞外マトリックスに対する結合を阻害する、および/または（ｆ）ＣＤ２６発現に関連する状態の治療に有用である。ある実施態様において、ＣＤ２６の発現に関連する状態は、ＣＤ２６の過剰発現に関連する疾患または障害である。ある実施態様においては、ＣＤ２６の発現に関連する状態は、少なくとも部分的には、ＣＤ２６により媒介されるものである。ある実施態様において、ＣＤ２６の発現に関連する状態は、ＣＤ２６が発現している細胞の増殖に関連する状態である。ある実施態様において、前記疾患または障害は、癌（例えば、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌またはＣＤ２６の発現を伴うその他の悪性腫瘍）、自己免疫疾患もしくは自己免疫障害、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、または炎症性疾患もしくは炎症性障害である。
【００３９】
ある実施態様において、本発明の抗体は、配列番号８−１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１−７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の両方を含む。ある実施態様では、本発明の抗体は、配列番号８−１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１−７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００４０】
ある実施態様において、ポリペプチドは、配列番号１−１４のうちいずれか１つのアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸、少なくとも８個の連続するアミノ酸、少なくとも約１０個の連続するアミノ酸、少なくとも約１５個の連続するアミノ酸、少なくとも約２０個の連続するアミノ酸、少なくとも約３０個の連続するアミノ酸、または少なくとも約５０個の連続するアミノ酸を含む。
【００４１】
本発明は、さらに、本明細書にに記載されるようなのポリペプチド配列（例えば、配列番号１−７、配列番号８−１４、配列番号：１５、および配列番号：１６のいずれか１つ）の断片を含む、ポリペプチドを提供する。ある実施態様において、ポリペプチドは、本明細書においてに記載されるようなされるポリペプチド配列の断片であって、少なくとも約５０個のアミノ酸、少なくとも約７５個のアミノ酸、または少なくとも約１００個のアミノ酸の長さの断片を含む。
【００４２】
配列番号：１５
EVQLVX1SGX2X3X4X5QPGX6X7LRLX8CX9ASGX10X11LX12TYGVHWVRQAPGKGLE WX13GVIWGX14GRTDYDX15X16FMSRVTISX17DX18SKX19TX20YLQX21NSLRAEDTAV YYCX22RX23RHDWFDYWGQGTTVTVSS、
【００４３】
上記配列中、Ｘ１はＥまたはＱであり、Ｘ２はＡまたはＧであり、Ｘ３はＧまたはＥであり、Ｘ４はＬまたはＶであり、Ｘ５はＶ、Ｋ、またはＥであり、Ｘ６はＧまたはＥであり、Ｘ７はＴまたはＳであり、Ｘ８はＴまたはＳであり、Ｘ９はＴまたはＫであり、Ｘ１０はＦまたはＹであり、Ｘ１１はＳまたはＴであり、Ｘ１２はＴ、Ｎ、またはＳであり、Ｘ１３はＶまたはＭ、Ｘ１４はＧまたはＤ、Ｘ１５はＡまたはＳであり、Ｘ１６はＡまたはＳであり、Ｘ１７はＫまたはＲであり、Ｘ１８はＮまたはＴであり、Ｘ１９はＳまたはＮであり、Ｘ２０はＶまたはＡであり、Ｘ２１はＭまたはＬであり、Ｘ２２はＶ、Ｍ、またはＴであり、そしてＸ２３はＮまたはＳである。
【００４４】
配列番号１６
XIIX2X3TQSPSSLSX4X5X6GX7RX8TIX9CX10ASQX1 1IRNX12LNWYQQKPGQAPRLLIY YSSNLXI3X14GVPX15RFSGSGSGTDFTLTISRLX16X17EDX18AX19YYCQQSX20KLPX21TFGSGTKVEIK,
【００４５】
上記配列中、Ｘ１はＤまたはＥであり、Ｘ２はＬまたはＥであり、Ｘ３はＭまたはＬであり、Ｘ４はＡまたはＶであり、Ｘ５はＳまたはＴであり、Ｘ６はＬ、Ｐ、またはＡであり、Ｘ７はＤまたはＥであり、Ｘ８はＶまたはＡであり、Ｘ９はＴまたはＳであり、Ｘ１０はＳまたはＲであり、Ｘ１１はＧまたはＤであり、Ｘ１２はＳまたはＮであり、Ｘ１３はＨまたはＱであり、Ｘ１４はＳまたはＴであり、Ｘ１５はＳ、Ｄ、またはＡであり、Ｘ１６はＥまたはＱであり、Ｘ１７はＰまたはＡであり、Ｘ１８はＦまたはＶであり、Ｘ１９はＴ、Ａ、またはＩであり、Ｘ２０はＩまたはＮであり、そしてＸ２１はＦまたはＬである。
【００４６】
表１は、Ｘ３７６  （配列番号：１）、Ｘ３７７（配列番号：２）、Ｘ３７８（配列番号：３）、Ｘ３７９（配列番号：４）、Ｘ３８０（配列番号：５）、Ｘ３８１（配列番号：６）、およびＸ３９４（配列番号：７）であるヒト化ＶＬ変異体のアミノ酸配列を示す。Ｋａｂａｔ番号および配列番号を付したスキームは、軽鎖可変領域が一致する。
【００４７】
表２は、Ｘ３８４（配列番号：８）、Ｘ３８５（配列番号：９）、Ｘ３８６（配列番号：１０）、Ｘ３８７（配列番号：１１）およびＸ３８８（配列番号：１２）、Ｘ３９９（配列番号：１３）およびＸ４２０（配列番号：１４）であるヒト化ＶＨ変異体のアミノ酸配列を示す。配列番号およびＫａｂａｔ番号スキームの両方を示す。Ｋａｂａｔ番号スキームは、８２ａ、８２ｂ、および８２ｃを含む。
【００４８】
【表１】
2010521418.tif 000002
【００４９】
【表２】
2010521418.tif 000003
【００５０】
本発明は、さらに、配列番号１７またはそれらの断片もしくは変異体を含むポリペプチド（例えば、抗体）を提供する。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、配列番号１７を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、シグナル配列を除く配列番号１７を含む（当業者は、ある実施態様において、ポリペプチドのシグナル配列がポリペプチドから切断されるものであることを容易に理解するであろう）。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、配列番号１７の可変領域を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは配列番号１７に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の同一性を有する、ポリペプチド（またはそれらの断片）を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、配列番号１７の断片であって、少なくとも約１０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約７５アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸の長さの断片を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤ２６に結合する。
【００５１】
重鎖（配列番号１７）
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEVQLVESGAGVKQPGGTLRLTCTASGFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWGDGRTDYDAAFMSRVTISKDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCMRNRHDWFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【００５２】
本発明は、さらに、配列番号１８、またはそれらの断片もしくは変異体を含むポリペプチド（例えば、抗体）を提供する。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、配列番号１８を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、シグナル配列を除く配列番号１８を含む。（当業者は、ある実施態様において、ポリペプチドのシグナル配列がポリペプチドから切断されるものであることを容易に理解するであろう。）ある実施態様において、前記ポリペプチドは、配列番号１８の可変領域を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは配列番号１８に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の同一性を有する、ポリペプチド（またはそれらの断片）を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、配列番号１８の断片であって、少なくとも約１０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約７５アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸の長さの断片を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、配列番号１８、またはそのフラグメントもしくは変異体をさらに含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、ヒトＣＤ２６に結合する。例えば、ある実施態様において、前記ポリペプチドは、それぞれがシグナル配列の無い配列番号１７を含む少なくとも１本の重鎖（例えば、２本の重鎖）、およびそれぞれがシグナル配列の無い配列番号１８を含む少なくとも１本の軽鎖（例えば、２本の軽鎖）を含む抗体である。
【００５３】
軽鎖（配列番号１８）
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDILLTQSPSSLSATPGERATITCRASQGIRNNLNWYQQKPGQAPRLLIYYSSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDVAAYYCQQSIKLPFTFGSGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【００５４】
別の側面において、本発明は、YSLRWISDHEYLY（配列番号１９；ペプチド６）、LEYNYVKQWRHSY（配列番号２０；ペプチド３５）、TWSPVGHKLAYVW（配列番号２１；ペプチド５５）、LWWSPNGTFLAYA（配列番号２２；ペプチド８４）、RISLQWLRRIQNY（配列番号２３；ペプチド１３２）、YVKQWRHSYTASY（配列番号２４；ペプチド３７）、EEEVFSAYSALWW（配列番号２５；ペプチド７９）、DYSISPDGQFILL（配列番号２６；ペプチド２９）、SISPDGQFILLEY （配列番号２７；ペプチド３０）、およびIYVKIEPNLPSYR （配列番号２８；ペプチド６３）からなる群から選択される１つ以上のペプチドに結合する抗体等のポリペプチドを提供する。ある実施態様において、本発明のポリペプチドは、優先的に前記ペプチドの１つ以上に結合する。これらのペプチドは、ヒトＣＤ２６の領域である。ある実施態様において、本発明のポリペプチドは、ヒトＣＤ２６の他の領域に対応する１つ以上のペプチドと比べて、YSLRWISDHEYLY （配列番号１９；ペプチド６）、LEYNYVKQWRHSY（配列番号２０；ペプチド３５）、TWSPVGHKLAYVW（配列番号２１；ペプチド５５）、LWWSPNGTFLAYA（配列番号２２；ペプチド８４）、RISLQWLRRIQNY（配列番号２３；ペプチド１３２）、YVKQWRHSYTASY（配列番号２４；ペプチド３７）、EEEVFSAYSALWW（配列番号２５；ペプチド７９）、DYSISPDGQFILL（配列番号２６；ペプチド２９）、SISPDGQFILLEY（配列番号２７；ペプチド３０）、およびIYVKIEPNLPSYR（配列番号２８；ペプチド６３）からなる群から選択される、１つ以上のペプチドに優先的に結合する。
【００５５】
ある実施態様において、本発明のポリペプチド（例えば、抗体）は、次のそれぞれのペプチドに結合する：YSLRWISDHEYLY（配列番号１９；ペプチド６）；LEYNYVKQWRHSY（配列番号２０；ペプチド３５）；TWSPVGHKLAYVW（配列番号２１；ペプチド５５）；LWWSPNGTFLAYA（配列番号２２；ペプチド８４）；およびRISLQWLRRIQNY（配列番号２３；ペプチド１３２）に結合する。ある他の実施態様において、ポリペプチドは、次のそれぞれのペプチド：YSLRWISDHEYLY（配列番号１９；ペプチド６）；TWSPVGHKLAYVW（配列番号２１；ペプチド５５）；RISLQWLRRIQNY（配列番号２３；ペプチド１３２）；YVKQWRHSYTASY（配列番号２４；ペプチド３７）；およびEEEVFSAYSALWW（配列番号２５；ペプチド７９）。ある実施態様において、本発明のポリペプチドは、次のそれぞれのペプチドに結合する：DYSISPDGQFILL（配列番号２６；ペプチド２９）；SISPDGQFILLEY（配列番号２７；ペプチド３０）；およびTWSPVGHKLAYVW（配列番号２１；ペプチド５５）。ある他の実施態様において、本発明のポリペプチドは、次のそれぞれのペプチドに結合する：DYSISPDGQFILL（配列番号２６；ペプチド２９); SISPDGQFILLEY（配列番号２７；ペプチド３０）；TWSPVGHKLAYVW（配列番号２１；ペプチド５５）；およびIYVKIEPNLPSYR（配列番号２８；ペプチド６３）。ある実施態様において、本発明のポリペプチドは、特定のペプチドに優先的に結合する。
【００５６】
競合アッセイを用いて、２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識することにより同じエピトープに結合するかどうか決定することができる。通常、抗原は、マルチウェルプレート上に固定され、非標識抗体が標識抗体の結合を遮断する性能が測定される。そのような競合アッセイのための一般的な標識は、放射性標識または酵素標識である。さらに、当業者に知られているエピトープマッピング技術を用いることにより、抗体が結合するエピトープを決定することができる。
【００５７】
ある実施態様において、本明細書においてに記載されるようなされているポリペプチドは、１つ以上の定常領域を含む。ある実施態様において、本明細書においてに記載されるようなされているポリペプチドは、ヒトの定常領域を含む。ある実施態様において、定常領域は、重鎖の定常領域である。別の実施態様においては、定常領域は、軽鎖の定常領域である。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、ヒトの定常領域に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％の同一性を有する定常領域を含む。ある実施態様において、本明細書においてに記載されるようなされているポリペプチド（例えば、抗体）は、Ｆｃ領域を含む。ある実施態様において、前記ポリペプチドは、ヒトのＦｃ領域を含む。ある実施態様において、本明細書において記載されているポリペプチド（例えば、抗体）は、ヒトのＦｃ領域に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％の同一性を有するＦｃ領域を含む。
【００５８】
ある実施態様において、本明細書において記載されている抗体は、ＩｇＧ抗体である。ある実施態様において、前記抗体は、ＩｇＧ１抗体である。別の実施態様において、前記抗体は、ＩｇＧ２抗体である。ある実施態様において、前記抗体は、ヒトＩｇＧ抗体である。
【００５９】
本発明は、単量体、二量体、および多量体の形態の抗体を提供する。例えば、二重特異性抗体、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体は、本明細書において開示された抗体を使用して調製することができる（例えば、Sureshら, Methods in Enzymology, 1986, 121, 210参照のこと）。従来より、二重特異性抗体の組換え生産は、異なる特異性を有する２つの重鎖を含む、２組の免疫グロブリンの重鎖−軽鎖ペアの共発現に基づいていた（Millstein、Cuello, Nature, 1983, 305, 537-539）。
【００６０】
二重特異性抗体を作製するための１つのアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変領域（抗体‐抗原結合部位）は、免疫グロブリンの定常領域に融合している。好ましくは、前記融合部分は、少なくともヒンジ部、ＣＨ２およびＣＨ３領域の部分を含む、免疫グロブリンの重鎖定常領域を伴う。軽鎖の結合に必須な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を少なくとも1つの融合部分に有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡおよび所望の場合には免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に同時形質移入される。構築において使用される３つのポリペプチド鎖の不等比が最適収量を提供する実施態様において、これら３つのポリペプチドの相互比（mutual proportion）を高い柔軟性で調製することが可能になる。
少なくとも２つのポリペプチドの等比での発現が高収率をもたらすか、または比率が特に重要ではない場合には、１つの発現ベクターに２つまたは３つ全てのポリペプチドのコード配列を挿入してもよい。
【００６１】
1つのアプローチとして、一方のアームの第１の結合特異性を有するハイブリッド型免疫グロブリン重鎖、ならびに他方のアームのハイブリッド型重鎖-軽鎖ペア（第２の結合特異性を有する）から構成される二重特異性抗体が挙げられる。この非対称の構造（二重特異性抗体分子の半分の部分だけに免疫グロブリン軽鎖を有する）により、所望でない免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物を分離することが容易になる。このアプローチは、１９９４年３月３日に公開された国際公開公報第94/04690号に記載されている。
【００６２】
２つの共有結合した抗体を含む、ヘテロ結合抗体もまた、本発明の範囲内である。このような抗体は、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)、またはＨＩＶ感染の治療のために使用されている（国際公開公報第91/00,360号および第92/200,373号；欧州特許第03089号)。ヘテロ結合抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製されてもよい。適切な架橋剤および架橋技術は、当該技術分野でよく知られており、米国特許第4,676,980号に記載されている。
【００６３】
特定の実施態様では、本明細書中に記載される抗体は、抗体断片である。例えば、ある実施態様において、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’‐ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦ（ａｂ’）２からなる群から選択される。ある実施態様において、抗体は、Ｆａｂである。様々な技術が抗体断片の生産のために開発されている。これらの断片は、完全体の抗体のタンパク質消化を介して得ることができ（例えば、Morimotoら, 1992, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117およびBrennanら, 1985, Science 229:81を参照のこと）、または組換宿主細胞により直接生産することもできる。例えば、Ｆａｂ’‐ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に結合させることによってＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Carterら, 1992, Bio/Technology 10:163-167）。別の実施態様において、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ'）２分子の組み立てを促進するロイシンジッパーGCN4を使用して形成される。他のアプローチによれば、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２の断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離される。
【００６４】
ある実施態様において、本発明の抗体は、その一本鎖（ＳｃＦｖ）、変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、diabody、線状抗体、一本鎖抗体、および任意の他の修飾された立体配置の免疫グロブリン分子である。
【００６５】
一本鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを使用して、軽鎖および/または重鎖可変領域を連結することにより作製される。Birdら(1988) Science 242:423-426。連結ペプチドの例は、一方の可変領域のカルボキシ末端および他方の可変領域のアミノ末端との間約３．５ｎｍを架橋する、(GGGGS)3(配列番号２９)である。他の配列のリンカーも設計および使用されている。Birdら(1988)。リンカーは、次に薬物の固定または固体担体に対する固定などの付加的機能のために修飾することができる。一本鎖変異体は、組換技術または合成技術のいずれによっても生産することができる。scFvを合成技術で生産する場合には、自動合成機を使用することができる。scFvを組換え技術で生産する場合には、scFvをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドを、適切な宿主細胞、酵母(yeast)細胞、植物細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞などの真核生物、または大腸菌などの原核生物に導入することができる。目的のscFvをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどのルーチン操作により作製することができる。その結果生じるscFvは、当該技術分野で知られている標準的なタンパク質精製技術を使用して単離することができる。
【００６６】
diabodyなどの他の形態の一本鎖抗体もまた包含される。diabodyは、VHドメインおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現する二価の二重特異性抗体であるが、同一鎖上でこれら２つのドメインが対形成するのには短すぎるリンカーを使用しており、そのために、強制的に、これらのドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対形成せざるを得ず、２つの抗原結合部位が作り出される（例えば、Holliger, P.ら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, R. J.ら(1994) Structure 2:1121-1123を参照のこと）。
【００６７】
本発明は、本明細書中に記載される抗体または他のポリペプチドに対する修飾を包含するが、このような修飾の例としては、該抗体または他のポリペプチドの特性に著しく影響を与えない、機能的に等価な抗体および増強もしくは減弱された活性を有する変異体が挙げられる。修飾の原理は、抗体だけではなくポリペプチドにも適用されることが理解される。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野においてルーチン操作であり、本明細書中に詳細に記載される必要はない。修飾されたポリペプチドの例は、アミノ酸残基の保存的置換、著しく機能活性を悪化させない１以上のアミノ酸の欠失もしくは付加、または化学的類似体の使用を伴うポリペプチドを含む。
【００６８】
アミノ酸配列の挿入または付加は、長さが１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでのアミノ末端および/またはカルボキシル末端での融合ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内の挿入を含む。末端の挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグに融合した抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のＮ末端またはＣ末端への、抗体の血清半減期を延長させる酵素もしくはポリペプチドの融合を含む。
【００６９】
置換変異体では、抗体配列または他のポリペプチド配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が取り除かれ、その場所に異なる残基が挿入されている。置換的変異導入によって最も効果が得られる部位にはＣＤＲが含まれるが、ＦＲの変更も意図される。保存的置換を表３の表題：「保存的置換」に示す。そのような置換が生物活性の変化をもたらす場合、表３の「例示的置換」と命名されるか、または、さらにアミノ酸クラスに関して以下に記載されるような、より実質的な変化を導入して生成物をスクリーニングしてもよい。
【００７０】
【表３】
2010521418.tif 000004
【００７１】
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えばシートもしくはヘリックスコンホメーションなどの、置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の容積の維持に対する修飾の効果を著しく変化させる置換を選択することにより達成される。天然状態で存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づく次のグループに分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
（２）中性親水性：Cys、Ser、Thr；
（３）酸性：Asp、Glu；
（４）塩基性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Gly、Pro；および
（６）芳香族：Trp、Tyr、Phe。
【００７２】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを他のクラスと交換することによりなされる。より保存的な置換は、あるクラスの１メンバーを同一クラスの他のメンバーと交換することを含む。
【００７３】
抗体の適切な立体構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基を置換することにより（通常はセリンと置換）、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋形成を妨ぐことができる。反対に、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合、システイン結合を抗体に付加することにより、抗体の安定性を向上させることができる。
【００７４】
アミノ酸修飾は、１つ以上のアミノ酸の変化または修飾から可変領域等の領域の完全な再設計にわたる。可変領域における変化は、結合親和性および/または特異性を変化させることができる。ある実施態様において、１〜５個以下の保存的なアミノ酸置換がＣＤＲドメイン内でなされる。他の実施態様において、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換がＣＤＲ３ドメイン内でなされる。さらなる別の実施態様において、ＣＤＲドメインはＣＤＲＨ３および/またはＣＤＲ Ｌ３である。
【００７５】
修飾もまた、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、ならびに、例えば、異なる糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの他の翻訳後修飾を有するポリペプチドも含む。抗体は、それらの定常領域における保存された位置でグリコシル化される（JefferisおよびLund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128；WrightならびにMorrison, 1997, TibTECH 15:26-32）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Boydら, 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318、WittweおよびHoward, 1990, Biochem. 29:4175-4180）ならびに糖タンパク質の立体構造および提示される三次元表面構造に影響を与え得る糖タンパク質の部分間の分子内相互作用（HefferisおよびLund, 前掲、WyssおよびWagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416）に影響を与える。所定の糖タンパク質は、オリゴ糖により、特異的認識構造に基づいて、ある種の分子を標的とする場合がある。抗体のグリコシル化もまた、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）に影響を与えることが報告されている。特に、二分しているGlcNAcの形成を触媒する糖転移酵素であるβ（１,４）‐Ｎ‐アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をテトラサイクリン制御下で発現させるＣＨＯ細胞では、ＡＤＣＣ活性が向上したと報告された（Umanaら, 1999, Nature Biotech. 17:176-180）。
【００７６】
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ‐結合型またはＯ‐結合型のいずれかである。Ｎ‐結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する糖質部分の結合を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン‐Ｘ‐セリン、アスパラギン‐Ｘ‐スレオニン、およびアスパラギン‐Ｘ‐システイン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する糖質部分を酵素的に付加するための認識配列である。このように、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチドに存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ‐結合型グリコシル化は、Ｎ‐アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの糖質の、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を意味するが、５‐ヒドロキシプロリンまたは５‐ヒドロキシリジンが使用されてもよい。
【００７７】
抗体に対するグリコシル化部位の付加は、抗体が、上記トリペプチド配列の１つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変させることにより都合よく達成される（Ｎ‐結合型グリコシル化部位のための）。改変はまた、本来の抗体の配列に対する１つ以上のセリン残基もしくはスレオニン残基による、付加または置換によりなされてもよい（Ｏ‐結合型グリコシル化部位のための）。
【００７８】
抗体のグリコシル化パターンもまた、根本的なヌクレオチド配列を改変せずに改変されてもよい。グリコシル化は、抗体を発現するために使用される宿主細胞に大きく依存する。考えられる治療法として、組換え糖タンパク質、例えば、抗体の発現のために使用される細胞の種類が天然の細胞であることは稀であるため、抗体のグリコシル化パターンの多様性を予想することができる（例えば、Hseら, 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070を参照のこと）。
【００７９】
宿主細胞の選択に加え、抗体の組換え生産の間にグリコシル化に影響を与える要因は、増殖様式、培地配合、培養密度、酸素添加、ｐＨ、精製スキーム等を含む。様々な方法が、特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを改変するために提唱されてきたが、これらにはオリゴ糖生産に関与する特定の酵素を導入するか過剰発現させることが含まれる（米国特許第5,047,335号、第5,510,261号、および第5,278,299号）。グリコシル化または特定の種のグリコシル化は、酵素により、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）を使用して、糖タンパク質から取り除くことができる。さらに、組換え宿主細胞は、特定の種の多糖のプロセシングが欠損するように遺伝子改変することができる。これら技術および類似する技術は、当該技術分野でよく知られている。
【００８０】
修飾の他の方法としては、当該技術分野で知られているカップリング技術の使用が挙げられ、そのような技術の例としては、酵素による手段、酸化的置換およびキレート化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。修飾を用いることにより、例えば、免疫測定法のための標識を付加することができる。修飾されたポリペプチドは、当該技術分野で確立された手順を使用して作製され、当該技術分野で知られている標準的なアッセイを使用してスクリーニングすることができるが、そのうちの幾つかの方法を以下および実施例に記載する。
【００８１】
他の抗体修飾は、1999年11月18日に公開された国際公開公報第99/58,572号に記載されるように修飾された抗体を含む。これらの抗体は、標的分子に対して指向した結合ドメインに加え、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの全てまたは一部に対して実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、著しい補体依存性溶解、または標的の細胞媒介性の破壊なしに、標的分子に結合する能力がある。ある実施態様において、エフェクタードメインは、FcRnおよび/またはFcγRIIbに特異的に結合することができる。これらは、通常、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。このように修飾された抗体は、慢性型の抗体療法において使用するのに特に適しており、従来の抗体療法に対する炎症および他の有害反応を回避するものである。
【００８２】
ある実施態様において、本発明のポリペプチドは、結合体である。例えば、ある実施態様において、ポリペプチドは、化学療法剤、放射性核種、免疫療法剤、サイトカイン、ケモカイン、造影剤、毒素、生物学的作用剤、酵素阻害剤、または抗体などの他の薬剤と結合している。
【００８３】
ある実施態様において、抗体等の本発明のポリペプチドは、水溶性のポリマー部分と結合している。前記ポリペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ‐ＰＥＧ、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等と結合していてもよい。前記ポリペプチドは、分子上の無作為な位置、または分子上の予め決定した位置で修飾してもよく、そして１つ、２つ、または３つ以上の結合部分を含んでいてもよい。前記ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分枝状または非分枝状のものであってもよい。ある実施態様において、前記部分は、リンカーを介してポリペプチドに結合される。ある実施態様において、前記結合部分は、動物体内でのポリペプチドの循環半減期を増加させる。抗体を含むポリペプチドに対するＰＥＧなどのポリマーの結合方法は、当該技術分野でよく知られている。ある実施態様において、前記ポリペプチドはＰＥＧ化された抗体などのＰＥＧ化されたポリペプチドである。
【００８４】
本発明は、親和性の成熟した実施態様を含む。例えば、親和性成熟抗体は、当該技術分野で知られている方法により生産することができる（Marksら, 1992, Bio/Technology, 10:779-783；Barbasら, 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813；Schierら, 1995, Gene, 169:147-155；Yeltonら, 1995, J. Immunol., 155:1994-2004；Jacksonら, 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9；Hawkinsら, 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896；および国際公開公報第2004/058184号）。候補となる親和性成熟抗体は、BIAcore表面プラズモン共鳴分析を使用したスクリーニング方法ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含む当該技術分野で知られている任意の選択方法を含む、当技術分野で知られている任意の方法を使用して、改善および/または改変された結合親和性に基づいてスクリーニングまたは選択することができる。
【００８５】
モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein, 1975, Nature 256:495により記載されているような、ハイブリドーマ法を使用して調製してもよい。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、通常、免疫剤で免疫することにより、該免疫剤に特異的に結合する抗体を生産するか、または生産可能なリンパ球が誘発される。あるいは、リンパ球はｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫してもよい。
【００８６】
本発明のモノクローナル抗体(および他のポリペプチド)もまた、米国特許第4,816,567号に記載されるような、組換えＤＮＡ法により作製されてもよい。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、モノクローナル抗体の重鎖もしくは軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用といった、従来方法を使用して単離および配列決定がなされる。単離後に、ＤＮＡは発現ベクターに組み込まれ、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、または該発現ベクターが導入されない限り免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクションされることにより、該組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成が達成される。
【００８７】
ある実施態様において、本発明のポリペプチド（例えば、抗体）は、細菌、酵母、植物、昆虫、および哺乳類を含むがこれらに限定されるものでない、任意の生物または任意の生物に由来する細胞において発現される。細胞の特定の型は、Drosophila melanogaster細胞、Saccharomyces cerevisiaeおよびその他の酵母、大腸菌、Bacillus subtilis、ＳＦ９細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、Neurospora、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｈｅｌａ細胞、繊維芽細胞、シュワン腫セルライン、不死化哺乳類骨髄およびリンパ系セルライン、Ｊｕｒｋａｔ細胞、肥満細胞およびその他の内分泌および外分泌細胞、ならびに神経細胞を含むがこれらに限定されるものではない。
【００８８】
ポリペプチドの生産に有用な様々なタンパク質発現系、ベクター、および細胞培地は、当業者に知られている。例えば、以下を参照：国際公開公報第03/054172号、第04/009823号、および第03/064630号（これらの全文は参照によって本明細書中に組み込まれる）。ある実施態様において、グルタミン合成酵素（ＧＳ）発現系は、本発明のポリペプチド（例えば、抗体）の発現に使用される。
【００８９】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、発現した後に、当業者に知られた方法に従って精製または単離される。精製方法の例としては、電気泳動的、分子生物学的、免疫学的ならびにクロマトグラフィー的手法が挙げられ、そのような手法としては、イオン交換、疎水親和性、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、および等電点電気泳動が挙げられる。必要な精製の程度は、ポリペプチドの用途により変更しうる。実施態様によっては、精製は不要である。
【００９０】
ＤＮＡは、例えば、免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を共有結合的に連結することにより修飾されうる。そのようにして、本明細書中に開示されるモノクローナル抗体の結合特異性を有する、「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。通常、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインによって置換されるか、または本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインによって置換されることにより、ＣＤ２６の１つの表面エピトープに対する特異性を有する１つの抗原結合部位および異なる抗原もしくはＣＤ２６エピトープに対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラの二価抗体が作り出される。
【００９１】
本発明は、ヒト化抗体も包含する。治療抗体は、投与された抗体に対する免疫応答を誘発することが部分的な原因となって、副作用をしばしば誘発する。その結果、薬効の低下、標的抗原を有する細胞の減少、および望ましくない炎症反応が起こりうる。上記を回避するために、組換え抗ＣＤ２６ヒト化抗体を作製してもよい。抗体のヒト化の一般原理は、抗体の抗原結合部分の基本的な配列を維持すること含み、一方、抗体の非ヒト残部の少なくとも一部分をヒト抗体配列と交換することを含む。モノクローナル抗体をヒト化するための４つの従来からの一般的なステップは、（１）出発抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列ならびに推定アミノ酸配列を決定すること、（２）ヒト化抗体を設計する、つまり、ヒト化する工程において、いずれの抗体フレームワーク領域もしくは残基および/またはＣＤＲ残基を使用するのかを決定すること、（３）実際のヒト化する方法論/技術、ならびに（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現を含むが、これらに限定されるものではない。抗体がヒトにおける臨床試験および治療において使用される場合、免疫応答を回避するために、定常領域も組換え技術によってヒト定常領域により近づけることができる。例えば、米国特許第5,997,867号および第5,866,692号を参照のこと。
【００９２】
組換えヒト化抗体において、Ｆｃγ部分を修飾することにより、Ｆｃγ受容体および補体免疫系との相互作用を回避することができる。そのような抗体の調製技術は、国際公開公報第99/58572号に記載される。
【００９３】
非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部位を含む、多くの「ヒト化」抗体分子が報告されており、それらの例としては、げっ歯類Ｖ領域とそれらに関連した相補性決定領域（ＣＤＲ）とがヒト定常ドメインに融合したものが挙げられる。例えば、Winterら，Nature 349:293-299 (1991) ; Lobuglioら，Proc. Nat. Acad. ScI USA 86:4220-4224 (1989); Shawら，J Immunol. 138:4534-4538 (1987);およびBrownら，Cancer Res. 47:3577-3583 (1987)を参照のこと。他の参考文献には、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合前にヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）に組み込まれたげっ歯類ＣＤＲが記載されている。例えば、Riechmannら，Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyenら，Science 239:1534-1536 (1988);およびJonesら，Nature 321 :522-525 (1986)参照のこと。もう１つの参考文献には、組換えベニアリングされたげっ歯類フレームワーク領域に支持されたげっ歯類ＣＤＲが記載されている。例えば、欧州特許公開第519,596号を参照のこと。これらの種類の「ヒト化」分子は、ヒト移植患者におけるそれらの部分の治療適用の期間および有効性を制限するげっ歯類抗ヒト抗体分子に対する不要な免疫学的応答を最小限にするために設計されている。他の利用可能な抗体のヒト化方法は、Daughertyら，Nucl. Acids Res., 19:2471-2476 (1991)ならびに米国特許第6,180, 377号；第6,054,297号；第5,997,867号；第5,866,692号；第6,210,671号；第6,350,861号；および国際公開公報第01/27160号中に開示されている。
【００９４】
抗体をヒト化するさらなる例示的な方法は、国際公開公報第02/084277号および米国特許公開公報第2004/0,133,357号中に記載され、それら両方の全文が本明細書中に参照により組み込まれる。
【００９５】
さらに他の代替において、特異的ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するよう操作された市販されているマウスを使用することにより完全ヒト抗体を得ることができる。より望ましい(例えば、完全にヒト抗体)またはより頑強な免疫応答を生じるよう設計されたトランスジェニック動物もまた、ヒト化抗体またはヒト抗体の作製に使用されてもよい。そのような技術の例は、アブジェニクス社(フリーモント、カリフォルニア州)からのXenomouse(商標)ならびにメダレックス社(プリンストン、ニュージャージー州)からのHuMAb-Mouse(登録商標)およびTC Mouse(商標)である。
【００９６】
他の代替では、抗体は、ファージディスプレイ技術により組換えで作製されてもよい。例えば、米国特許第5,565,332号；第5,580,717号；第5,733,743号および第6,265,150号、ならびにWinterら, Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)を参照のこと。あるいは、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348:552-553 (1990))は、ヒト抗体およびヒト抗体断片を、未免疫ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産するために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄ等の糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーなコートタンパク質遺伝子内にインフレームでクローニングされ、機能的抗体断片としてファージ粒子の表面上に表示される。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、機能的特性に基づいて抗体を選択することは、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子を選択することにもなる。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性の幾つかを擬似している。ファージディスプレイは様々な方式で実行することができる。参考のために、例えば、Johnson, Kevin S.およびChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993)を参照のこと。ファージディスプレイには、複数のＶ遺伝子セグメント供給源を使用することができる。
【００９７】
Clacksonら, Nature 352:624-628 (1991)は、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを、免疫されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから単離した。未免疫ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを、構築することができ、多様なアレイの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体を、Markら, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)またはGriffithら, EMBO J. 12:725-34 (1993)により記載される技術に本質的に従って単離することができる。天然の免疫応答において、抗体遺伝子は高率で突然変異を蓄積する(体細胞性超変異)。導入された変化の幾つかは高度な親和性を付与することとなり、高親和性の表面免疫グロブリンを表示するＢ細胞は優先的に複製され、続く抗原チャレンジの際に分化する。この天然のプロセスは、「チェインシャフリング」として知られている技術を用いることにより模倣することができる。Marksら, Bio/Technol. 10:779-783 (1992))。この方法において、ファージディスプレイにより得られた「初代の」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖のV領域遺伝子を、未免疫ドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然変異体(レパートリー)のレパートリーと順次置換することにより向上させることができる。この技術により、ｐＭ〜ｎＭの範囲の親和性を有する抗体および抗体断片の生産が可能になる。非常に多量のファージ抗体レパートリー(「全ライブラリーの母体」としても知られている)を作製するための戦略は、Waterhouseら, Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993)に記載されている。
【００９８】
ヒト抗体が、出発げっ歯類抗体と同程度の親和性および特異性を有する場合には、遺伝子シャフリングを用いることにより、げっ歯類抗体からヒト抗体を誘導することもできる。「エピトープインプリンティング」とも参照されるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術により得られたげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖のＶドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置換され、げっ歯類ヒトキメラが作り出される。抗原に基づく選択は、機能的抗原結合部位を再建することができるヒト可変領域の単離をもたらす。つまり、エピトープは、パートナーの選択を支配（インプリント）する。残存するげっ歯類Vドメインを置換するために上記方法を繰り返すと、ヒト抗体が得られる(1993年4月1日に公開された国際公開公報第9306213号を参照されたい)。ＣＤＲ移植によるげっ歯類抗体の従来のヒト化とは異なり、この技術は、げっ歯類由来のフレームワークまたはＣＤＲ残基を有していない完全にヒト型の抗体を提供する。上記の議論はヒト化抗体に関係するものであるが、議論された一般的な原理は、たとえばイヌ、ネコ、霊長動物、ウマ、およびウシでの使用のための抗体のカスタマイズに適用可能であることは明らかである。
【００９９】
キメラ抗体またはハイブリッド抗体もまた、架橋剤を使用する方法を含む、合成タンパク質化学の公知の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することができる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することにより構築することができる。この目的に適した試薬の例としては、イミノチオラートおよびメチル‐４‐メルカプトブチルイミダートが挙げられる。
【０１００】
一本鎖Ｆｖ断片はまた、Iliadesら, 1997, FEBS Letters, 409:437-441に記載されるように生産されてもよい。様々なリンカーを使用した、そのような一本鎖断片のカップリングは、Korttら, 1997, Protein Engineering, 10:423-433に記載されている。抗体の組換え生産および組換え操作についての様々な技術は、当該技術分野でよく知られている。
【０１０１】
一局面において、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドの製造方法を提供する。ある実施態様において、その方法は、宿主細胞において本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させることを含む。ある実施態様において、その方法は抗体の製造方法であり、宿主細胞において(例えば細胞培養)、1つ以上のポリヌクレオチドを発現させることを含み、この場合、抗体の各鎖は、少なくとも1つのポリヌクレオチドによりコードされている。ある実施態様において、前記1つ以上のポリヌクレオチドは同じベクター上に存在する。他の実施態様において、前記1つ以上のポリヌクレオチドは個別のベクター上に位置する。ある実施態様において、本明細書に記載されるポリペプチドの製造方法は、該ポリペプチドを発現する宿主細胞から該ポリペプチドを単離する工程をさらに含む(例えば、宿主細胞が増殖している細胞培養から単離する等)。
【０１０２】
ＣＤ２６ ｍＲＮＡおよび/またはＣＤ２６ ｃＤＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ
ＣＤ２６を標的とするｓｉＲＮＡを含む組成物およびその方法は、特に腫瘍形成疾患治療の目的で、ＣＤ２６が細胞外マトリックスへ結合するのを阻害する目的で好適に利用される。本発明のｓｉＲＮＡは、そのＲＮＡｉを介してＣＤ２６のｍＲＮＡｓの分解を引き起こし、その結果としてＣＤ２６遺伝子産物であるタンパク質を生成させないようにするか、あるいはその生成量を減少させると考えられている。
【０１０３】
したがって、本発明は、単離されたｓｉＲＮＡを提供し、それらは標的ｍＲＮＡおよび/または標的ｃＤＮＡにターゲッティングした約１７ヌクレオチドから約２９ヌクレオチドの長さの短い二本鎖ＲＮＡ、好ましくは約１９〜約２５ヌクレオチドの短い二本鎖ＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、標準的なワトソン・クリック塩基対相互作用(以下に「塩基対」)によってアニーリングしたセンスＲＮＡ鎖と相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。さらに以下に詳細に記載するように、センス鎖は標的ｍＲＮＡおよび/または標的ｃＤＮＡの中に含まれる標的配列と同じ核酸配列を含む。
【０１０４】
本発明のｓｉＲＮＡのセンスとアンチセンス鎖は、２本の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含むか、あるいは２つの相補的な部分が一本鎖の「ヘアピン」領域によって共有結合され、塩基対を形成した単一分子を含むことができる。特定理論によって拘束される訳ではないが、後者タイプのｓｉＲＮＡ分子のヘアピン部は「ダイサー」タンパク質(または、同等物)によって細胞内で切断され、個々の塩基を形成する2本のＲＮＡ分子からなるｓｉＲＮＡを形成すると考えられる。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、「単離された」は、人為的介入によりで天然の状態から変化したか、あるいは分離されたことを意味する。例えば、生物体内に天然状態で存在するｓｉＲＮＡは、「単離された」状態にはなく、合成ｓｉＲＮＡ、あるいは天然状態で共存する物質から部分的あるいは完全に分離したｓｉＲＮＡを「単離された」という。単離されたｓｉＲＮＡは実質的に精製された状態で存在する場合もあり、あるいは、例えばｓｉＲＮＡが導入された細胞等のように非天然の環境下で存在する場合もある。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、「標的ｍＲＮＡ」および「標的ｃＤＮＡ」は、それぞれヒトのＣＤ２６ ｍＲＮＡおよびヒトのＣＤ２６ ｃＤＮＡ、それらの変異体または選択的スプライシング型を意味する。
【０１０７】
また、ＲＴ-ＰＣＲを用いることにより、選択的スプライシング型のＣＤ２６ ｍＲＮＡを同定することもできる。ＲＴ-ＰＣＲでは、当業者に周知の方法を用いて、病変組織由来のｍＲＮＡを逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換する。そして、３'非翻訳領域に位置するフォワード・プライマー、および５'非翻訳領域に位置するリバース・プライマーを用いて、ｃＤＮＡの全体のコード配列をＰＣＲで増幅する。選択的スプライシング型かどうかは、その増幅産物によって解析できる。例えばアガロース・ゲル電気泳動により、正常にスプライシングされたｍＲＮＡから予想されるサイズと増幅産物のサイズとを比較することによって、選択的スプライシングを解析することができる。増幅産物のサイズに変化があった場合には、選択的スプライシング産物を示している可能性がある。
【０１０８】
本発明のｓｉＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、または組換えで作製されたＲＮＡを含み、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換、および/または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる変異ＲＮＡも含み得る。そのような変異とは、ｓｉＲＮＡの末端あるいはｓｉＲＮＡの１以上の内部ヌクレオチドに対する非ヌクレオチド物質の付加を含み、siRNAにヌクレアーゼ消化に対する抵抗性を付与する修飾を含み得る。
【０１０９】
本発明の１本鎖あるいは２本鎖ｓｉＲＮＡは、３'オーバーハングも含み得る。本明細書で使用する場合、３'オーバーハングは、ＲＮＡ鎖の３'末端から伸びた少なくとも１つの非対ヌクレオチドのことをいう。
【０１１０】
したがって、１つの実施態様において、本発明のｓｉＲＮＡは、 １〜約６つのヌクレオチドの長さ、好ましくは１〜約５つのヌクレオチドの長さで、より好ましくは１〜およそ４つのヌクレオチドの長さ、特に好ましくは約２〜約４つのヌクレオチドの長さの少なくとも１つの３'オーバーハング(リボヌクレオチドかデオキシヌクレオチドを含む)を含む。
【０１１１】
ｓｉＲＮＡ分子の両鎖が３'オーバーハングを含む実施態様では、各鎖において、オーバーハングの長さが同じか、または異なり得る。最も好ましい実施態様としては、３'オーバーハングがｓｉＲＮＡの両鎖に存在し、長さが２つのヌクレオチドである。例えば、本発明のｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸("TT")またはジウリジル酸("UU")の３'オーバーハングを含み得る。
【０１１２】
また、本ｓｉＲＮＡの安定性を高めるために、３'オーバーハングの分解に対して安定化させることもできる。１つの実施態様として、そのオーバーハング中にアデノシンまたはグアノシンヌクレオチド等のプリンヌクレオチドを入れることによってオーバーハングを安定化させることが挙げられる。あるいは、例えば３'オーバーハング中のウリジンヌクレオチドの２'-デオキシチミジンによる置換のような、修飾されたアナログによるピリミジンヌクレオチドの置換は許容されＲＮＡｉ分解効率に影響を与えない。
【０１１３】
ある実施態様では、本発明のｓｉＲＮＡは、配列AA（N19）TTあるいはNA（N21）を含み、ここでNは、任意のヌクレオチドである。これらのｓｉＲＮＡは約３０−７０％のＧＣを含み、好ましくは約５０％のＧＣである。センスｓｉＲＮＡ鎖の配列は、それぞれ（N19）TTあるいはN21(すなわち、３〜２３の位置)に対応する。後者の場合、センスｓｉＲＮＡの３'末端はTTに変換される。この配列変換の原則は、センスとアンチセンス鎖の３'オーバーハング配列組成に関して左右対称の二本鎖分子を作製することである。その時、アンチセンスＲＮＡ鎖をセンス鎖の位置１〜２１に対する相補鎖として合成される。
【０１１４】
これらの実施態様における23-ntのセンス鎖の位置１がアンチセンス鎖によって配列特有な様式で認識されないため、意図的にアンチセンス鎖の最も3'側のヌクレオチド残基を選ぶことが可能である。しかしながら、一般に、アンチセンス鎖の終わりから二番目のヌクレオチド（どんな実施態様でも23-ntセンス鎖の位置２に相補的である）は、一般的に標的配列に相補的である。
【０１１５】
本発明のｓｉＲＮＡは、どんな標的ｍＲＮＡおよび/または標的ｃＤＮＡ配列(「標的配列」)でもその中の約１９−２５連続ヌクレオチドの任意な範囲を標的とすることができる。例えば、Tuschl Tらの２００２年１０月１１日に改訂された「ｓｉＲＮＡユーザーガイド」に、ｓｉＲＮＡのために標的配列を選択する技術が記載されている（これらの文献の全文が参照により本明細書中に組み入れられる）。「ｓｉＲＮＡユーザーガイド」は、Thomas Tuschl博士（細胞生化学部門、AG 105、生物物理化学・マックスプランク研究所、37077  Gottingen、ドイツ）によって運営されるウェブサイトを通じて利用可能で、マックスプランク研究所のウェブサイトにアクセスし、「ｓｉＲＮＡ」というキーワードで検索することにより、見つけることが可能である。従って、本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は標的ｍＲＮＡ中の約１９〜約２５ヌクレオチドの連続的範囲と同一のヌクレオチド配列を含む。
【０１１６】
一般に、標的ｍＲＮＡ上の標的配列は目標ｍＲＮＡに対応する所定のｃＤＮＡ配列から選択でき、望ましくは、開始コドンから50-100nt下流(すなわち、３’方向に)の位置から始まる。しかしながら、標的配列は５'か３'の非翻訳領域、または開始コドンの近くの領域に位置していてもよい。
【０１１７】
例えば、ＣＤ２６ ｃＤＮＡ配列の適切な標的配列はアクセッション番号 NM_001935から取得できる。
【０１１８】
従って、この配列を標的とする発明のｓｉＲＮＡであって、３’ｕｕオーバーハング（オーバーハングは太字で示されている）を各鎖に有するｓｉＲＮＡ、は以下の通りである：
センス：5'-GAAAGGUGUCAGUACUAUU TT-3'（配列番号３０)、
アンチセンス：3'-TT CUUUCCACAGUCAUGAUAA-5'（配列番号３１）
【０１１９】
本発明のｓｉＲＮＡは、当業者に周知の多くのテクニックを使用して入手できる。例えば、当該分野で周知の方法を利用してｓｉＲＮＡを化学的に合成するか、または組換えで作製できる。
【０１２０】
好ましくは、適切に保護されたリボヌクレオシド  ホスホルアミダイトと従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用し、本発明のsiRNAを化学的に合成する。ｓｉＲＮＡは、２個の別々の相補的なＲＮＡ分子として、または2つの相補的な領域を有する単一のＲＮＡ分子として合成され得る。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の業者としては、Proligo(ハンブルク、ドイツ)、ピアス・ケミカル(Perbio Scienceの一部、ロックフォード111、米国)等が挙げられる。
【０１２１】
あるいは、任意の適切なプロモーター使用により組換え型の環状、または直鎖状ＤＮＡプラスミドからｓｉＲＮＡを発現できる。プラスミドからｓｉＲＮＡを発現させるのに適切なプロモーターとしては、例えば、U6あるいはHl RNA pol IIIプロモーター配列およびサイトメガロウィルスプロモーター配列が挙げられる。他の適切なプロモーターを選択することは、当該技術分野の技術常識の範囲内である。本発明の組換え型プラスミドは、特定の組織または特定の細胞内環境においてｓｉＲＮＡを発現させるための誘導または制御プロモーターも含み得る。
【０１２２】
組換え型プラスミドから発現したｓｉＲＮＡは、標準的テクニックによって培養細胞発現系から単離されるか、あるいは新生血管形成部位またはその近辺においてｉｎ  ｖｉｖｏで細胞内で発現され得る。組換え型プラスミドを用いて本発明のｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に送達する方法については、以下で更に詳細に議論する。
【０１２３】
本発明のｓｉＲＮＡは、２個の別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する単一のＲＮＡ分子として組換え型プラスミドから発現され得る。
【０１２４】
本発明のｓｉＲＮＡを発現するのに適切なプラスミドの選択、ｓｉＲＮＡを発現させる核酸配列をプラスミドに挿入する方法、および組換え型プラスミドを目的の細胞に送達する方法は、当該技術分野の技術常識の範囲内である。例えば、Tuschl、T.(2002)、Nat. Biotechnol. 20:446 448; Brummelkamp T  R ら (2002) Science 296: 550-553;  Miyagishi  M  ら (2002) Nat Biotechnol. 20:497 500;  Paddison P J ら (2002) Genes Dev. 16: 948 958; Lee N Sら(2002) Nat Biotechnol. 20: 500 505;およびPaulC P、ら(2002) Nat Biotechnol. 20: 505−508（これらの文献の全文が参照により本明細書中に組み入れられる）。
【０１２５】
生体内の血管新生部位あるいはその近くの部位の細胞内で本発明のｓｉＲＮＡを組換え型のウイルスベクターから発現させることもできる。本発明の組換え型ウイルスベクターは、本発明のｓｉＲＮＡをコードする配列と該ｓｉＲＮＡ配列を発現させるための適切なプロモーターとを含む。適切なプロモーターとは、例えば、U6かHl  RNA  pol IIIプロモーター配列、およびサイトメガロウィルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターを選択することは、当該技術分野の技術常識の範囲内である。本発明の組換え型ウイルスベクターもまた、特定の組織または特定の細胞内環境においてｓｉＲＮＡを発現させるための誘導あるいは制御プロモーターを含んでいてもよい。組換え型プラスミドを用いて本発明のｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に送達する方法については、以下で更に詳細に議論する。
【０１２６】
本発明のｓｉＲＮＡは、相補的な２個の別々のＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する単一のＲＮＡ分子として組換え型ウイルスベクターから発現させることが可能である。
【０１２７】
発現させるｓｉＲＮＡ分子のコード配列の導入可能なウイルスベクターならば、例えば、アデノウィルス(ＡＶ)；アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)；レトロウイルス(例えば、レンチウイルス(ＬＶ)、Rhabdoviruses、ネズミ科白血病ウイルス)；ヘルペスウイルス等、任意のウイルスベクターを使用できる。ウイルスベクターのトロピズムを、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質または他の表面抗原で偽型して、修飾することもできる。例えば、本発明のＡＡＶベクターは、水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)、狂犬病、エボラ、Mokola等の表面タンパク質で偽型できる。
【０１２８】
本発明の使用に適した組換え型ウイルスベクターの選択、ベクターにｓｉＲＮＡを発現させる核酸配列を挿入するための方法、および目的の細胞にウイルスベクターを導入する方法は、当該技術分野の技術常識の範囲内である。例えば、Domburg R(1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988)，Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; および Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30 を参照（これらの文献の全文が参照により本明細書中に組み入れられる）。
【０１２９】
特定の標的配列を含むｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を引き起こさせる能力は、細胞内ＲＮＡやタンパク質レベル測定用の標準的テクニックを用いて評価し得る。例えば、本発明のｓｉＲＮＡを培養細胞に送達し、ノーザンブロットやドットブロット法または定量的ＲＴ−ＰＣＲによって標的ｍＲＮＡのレベルを測定できる。あるいは、ＥＬＩＳＡやウェスタンブロットによって培養細胞中のＣＤ２６タンパク質のレベルを測定できる。
【０１３０】
特定標的配列を含むｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解もまた、ＲＯＰかＣＮＶマウスモデルなどの新血管新生動物モデルを用いて評価可能である。例えば、ｓｉＲＮＡ投与前後のＲＯＰまたはＣＮＶマウスの新血管新生の面積を測定することができる。
【０１３１】
上記で議論したように、本発明のｓｉＲＮＡはそのＣＤ２６ ｍＲＮＡおよび/またはＣＤ２６ ｃＤＮＡ、あるいは選択的スプライシング型、変異体またはそれらの類縁を標的とし、ＲＮＡｉ媒介性分解を引き起こす。本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解により、ＣＤ２６遺伝子の機能的遺伝子産物の産生量が減少する。このように、本発明は、標的ｍＲＮＡおよび/または標的ＣＤ２６ ｃＤＮＡが分解されるような、有効量の本発明のｓｉＲＮＡを対象に投与することを含む、対象内のＣＤ２６発現を阻害する方法を提供する。ＣＤ２６遺伝子産物は血管新生の開始および維持に必要であるため、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡおよび/または標的ＣＤ２６ ｃＤＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解による対象内の血管新生の阻害方法も提供する。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、「対象」は、ヒトまたはヒトではない動物を含む。好ましくは、対象はヒトである。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、ｓｉＲＮＡの「有効量」は、目標ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を引き起こすのに十分な量、または対象の血管新生の進行を阻害するのに十分な量である。
【０１３４】
標的ｍＲＮＡおよび/または標的ＣＤ２６ ｃＤＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解は、上に記載されるｍＲＮＡおよび/またはｃＤＮＡかタンパク質を単離および定量する標準的テクニックによって、対象の細胞中の目標ｍＲＮＡあるいはタンパク質レベルを測定することにより検出できる。
【０１３５】
腫瘍形成の阻害は、対象内の病原性または非病原性の腫瘍形成の進行を直接測定することにより評価できる：例えば、本発明のｓｉＲＮＡ処理前後に腫瘍サイズを観測することによる。腫瘍の大きさが同じままであるか、または減少していれば、腫瘍形成の阻害効果が示されたことになる。対象の腫瘍の大きさを観察および測定するテクニックは、当該技術分野の技術常識の範囲内である。
【０１３６】
本発明のｓｉＲＮＡが半化学量論的な量で標的ｍＲＮＡおよび/または標的ｃＤＮＡを分解(その結果、腫瘍形成を阻害)し得ることが理解される。特定理論によって拘束される訳ではないが、本発明のｓｉＲＮＡは触媒作用によって標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすものと考えられる。このように、標準の抗腫瘍治療と比較した場合、著しく少量のｓｉＲＮＡを腫瘍部位かその近くに送達させるだけで治療効果が得られる。
【０１３７】
当業者であれば、対象のサイズや重さ、腫瘍形成あまたは疾患浸透の範囲、対象の年令、健康状態、性別、投与経路などの要素、および投与が局所投与または全身投与かを考慮することによって、対象に投与すべき本発明のｓｉＲＮＡの有効量を容易に決定できる。一般に、本発明のｓｉＲＮＡの有効量は、腫瘍形成部位またはその近傍の細胞内濃度として、約１ナノモーラー(ｎＭ)から約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭから約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭから約１０ｎＭの範囲である。これより多いかまたは少ない量のｓｉＲＮＡを投与してもよいことも意図される。
【０１３８】
本発明の方法は、血管新生疾患に関連する新脈管形成、すなわち、その病因が不適切または非制御状態の新脈管形成と関連する疾患を阻害することもできる。例えば、ほとんどの癌性固形腫瘍は、該腫瘍部位中やその周辺で新脈管形成を促進することによって、腫瘍自身に適切な血液供給を作り出す。この腫瘍誘導性の新脈管形成は、腫瘍成長にしばしば必要とされ、また転移性の細胞を血流に浸潤させることにもなる。
【０１３９】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、悪性中皮腫に関連する固形腫瘍；例えば、乳癌、肺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、腹部癌、大腸癌、大腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、神経膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、網膜細胞芽腫、ウィルム腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌(例えば、黒色腫)、リンパ腫、および血液癌の増殖または転移を抑制する目的で使用される。
【０１４０】
血管新生疾患を治療するために、本発明のｓｉＲＮＡは本発明のｓｉＲＮＡと異なる医薬品との併用で対象に投与してもよい。あるいは、血管新生疾患を治療するように設計された別の治療法と組み合わせて本発明のｓｉＲＮＡを対象に投与してもよい。例えば、中皮腫治療または腫瘍転移抑制に現在用いられている治療法(例えば、放射線治療、化学療法、および外科手術)との併用で、本発明のｓｉＲＮＡを投与してもよい。好ましくは、腫瘍治療のために、放射線治療と併用、あるいは、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシンまたはもしくはタモキシフェンなどの化学療法薬と併用で、本発明のｓｉＲＮＡは対象に投与される。
【０１４１】
本発明の方法では、裸のｓｉＲＮＡの状態、送達試薬と併用した状態、あるいはｓｉＲＮＡを発現する組換え型プラスミドまたはウイルスベクターとしての状態のいずれかで、本発明のｓｉＲＮＡを対象に投与し得る。
【０１４２】
本発明のｓｉＲＮＡとの併用投与に適切な送達試薬には、Mirus Transit TKO脂肪親和性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン(例えば、ポリリジン)またはリポソームが含まれる。好ましい送達試薬はリポソームである。
【０１４３】
リポソームは、腫瘍組織などの特定の組織へのｓｉＲＮＡの送達を補助し、またｓｉＲＮＡの血液半減期を増加させ得る。本発明において使用に適したリポソームは、一般的に、コレステロールなどの中性または陰電荷のリン脂質とステロールを含む標準的なベシクル形成脂質から調製される。一般に、脂質の選択には、リポソームの所望のサイズや血流における半減期などの要素を考慮して行われる。例えば、Szokaら（1980）Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467; 米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号、および第5,019,369号（これらの文献の全文が参照により本明細書中に組み入れられる）に記載されているように、リポソームの調製には様々な方法が知られている。
【０１４４】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを封入するリポソームは、そのリポソームを悪性中皮腫細胞または組織に対してターゲッティングさせることが可能なリガンド分子を含む。そのようなリガンドとしては、ＣＤ２６に結合するモノクローナル抗体といった腫瘍細胞によく発現している受容体に結合するリガンドが好ましい。
【０１４５】
本発明のｓｉＲＮＡを封入するリポソームは、例えば、オプソニン化抑制部分を構造表面に結合させることによって、単核球マクロファージおよび細網内皮系によるクリアランスを回避できるように修飾されていることが特に好ましい。１つの実施態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分とリガンドの両方を含み得る。
【０１４６】
本発明のリポソーム調製に使用するためのオプソニン化阻害部分は、通常、リポソーム膜に結合する巨大分子の親水性ポリマーである。本明細書で使用する場合、例えば、脂質可溶性アンカーが膜自体へインターカレーションするか、あるいは直接膜の脂質の活性基に結合することによって、オプソニン化阻害部分が化学的または物理的に膜へ付着している場合、オプソニン化阻害部分がリポソーム膜に「結合している」という。これらのオプソニン化阻害作用を有す親水性ポリマーは、マクロファージ・単核球システム(「ＭＭＳ」)および細網内皮系(「ＲＥＳ」)でリポソームの取り込みを著しく減少させる保護的な表層を形成する。例えば、米国特許第4,920,016号に記載されている（この文献の全文が参照により本明細書中に組み入れられる）。このように、オプソニン化阻害部分が修飾されたリポソームは、修飾されていないリポソームよりはるかに長時間循環系に存在し続ける。この理由で、そのようなリポソームは場合によっては「ステルス」リポソームと呼ばれる。
【０１４７】
ステルスリポソームは、多孔性の、または、「透過性の高い」微小血管から栄養供給を受ける組織に蓄積することが知られている。このように、微小血管の構造的欠陥を特徴とする例えば固形癌などの標的組織には、効率的にこれらのリポソームが蓄積するだろう。Gabizonら(1988)P.N.A.S., USA, 18:6949 53を参照のこと。さらに、ステルスリポソームは、ＲＥＳにおける取り込みを減少させるため、肝臓および脾臓における蓄積を著しく抑制させ、その結果として毒性を低下させる。このように、オプソニン化抑制部分によって修飾されている本発明のリポソームは、本発明のｓｉＲＮＡを腫瘍細胞に送達し得る。
【０１４８】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは約500〜約40,000ダルトン、より好ましくは約2,000〜約20,000の分子量の水溶性ポリマーである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)またはポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)誘導体；例えば、メトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびＰＥＧまたはＰＰＧステアリン酸塩；ポリアクリルアミドまたはポリ‐Ｎ‐ビニルピロリドンなどの合成ポリマー；直線状、分枝状、または樹状のポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えば、カルボキシ基またはアミノ基が化学的に結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドが含まれる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧもしくはメトキシＰＰＧの共重合体、またはそれらの誘導体もまた適切である。さらに、オプソニン化を阻害しているポリマーは、ＰＥＧのブロック共重合体、およびポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミンまたはポリヌクレオチドの何れか１つであり得る。オプソニン化を阻害するポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含む天然の多糖類、例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン；アミノ化している多糖類またはオリゴ糖類(直鎖状または分枝状)；あるいはカルボキシル化した多糖類またはオリゴ糖類、例えば、カルボキシル基の結合を有するカルボン酸誘導体との反応によるもの、であってもよい。
【０１４９】
好ましくは、オプソニン化を阻害する部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはそれの誘導体である。ＰＥＧあるいはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、場合により「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれる。
【０１５０】
多数の周知の手法の何れかによって、オプソニン化阻害部分をリポソーム膜と結合させることが可能である。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジルエタノールアミンの脂質可溶性アンカーに結合した後に、膜に結合させることができる。同様に、デキストラン重合体は、６０℃で30:12でテトラヒドロフランと水を含む溶剤混合物とNa(CN)BH3を用い、還元的アミノ化を介してステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０１５１】
医薬組成物とキット
本発明は、さらに、本明細書中に記載されたポリペプチド(例えば、抗体)および/またはポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。例えば、本発明は、本明細書中に記載されたポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。該ポリペプチドを構成するキットもまた提供する。
【０１５２】
ある実施態様において、前記医薬組成物は、本明細書中に記載されたポリペプチドと医薬的に許容される賦形剤(また、本明細書中では「医薬的に許容される担体」としても参照される)を含む。ある実施態様では、前記医薬組成物に含まれるポリペプチドは、抗体である。ある実施態様では、前記医薬組成物に含まれるポリペプチドは、ヒト化抗体である。
【０１５３】
本発明の範囲内の医薬組成物は、生物学的に活性または不活性な他の化合物を含んでいてもよい。
【０１５４】
医薬組成物は、上記のように、本発明のポリペプチドがｉｎ  ｓｉｔｕで生成されるように１つ以上の前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでいてもよい。上記に注記したように、前記ＤＮＡは、核酸発現系、バクテリアおよびウイルス発現システムを含む、当業者に周知の任意の様々な送達系内に存在し得る。例えば、Rolland, 1998, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198、およびそこに引用されている参考文献に記載されているように、多数の遺伝子導入のテクニックが、当該技術分野において周知である。適切な核酸発現系は、患者体内での発現させるために必要なＤＮＡ(適切なプロモーターや終止シグナルなど)配列を含む。
【０１５５】
好ましい実施態様において、非病原性(欠損)であって、複製可能なウイルスの使用を伴うウイルス発現系(例えば、ワクシニアもしくは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウィルス)を使用して前記ＤＮＡを導入することができる。例えば、適切な系は、以下に開示されている：Fisher-Hochら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA  86: 317-321; Flexnerら、1989、Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103; Flexner ら、1990、Vaccine 8: 17-21;米国特許第4,603,112号、第4,769,330号および第5,017,487号; 国際公開公報第89/01973; 米国特許第4,777,127号; GB2,200,651; EP0,345,242; 国際公開公報第91/02805; Berkner-Biotecvhniques 6: 616-627、1988; Rosenfeld ら，Science 252: 1991，431-434; Kollsら，1994、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219; Kass-Eisler ら，1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11498-11502; Guzman ら，1993、Circulation  88: 2838-2848; Guzmanら，1993，Cir. Res. 73:1202-1207。そのような発現系にＤＮＡを組み入れるためのテクニックは、当業者に周知である。ＤＮＡは、例えば、Ulmerら，Science 259:1745-1749の記載、およびCohen 1993, Science 259: 1691-1692に論評されているように、「裸の（naked）」状態であってもよい。裸のＤＮＡの取り込み量は、効率的に細胞内に輸送される生物分解性ビーズへＤＮＡをコーティングすることによって増加させることができる。
【０１５６】
当業者に周知の任意の適切な担体が本発明の医薬組成物に用いられ得るが、投与方法によって担体のタイプは異なる。本発明の組成物は、例えば、局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、あるいは筋肉内の投薬を含む適切な投与方法によって処方され得る。好ましくは、皮下注射などの非経口的投与のために、担体は、水、生理食塩水、アルコール、脂質、ワックス、または緩衝剤を含む。経口投与のためには、上記の担体またはマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウムなどの固体キャリアの何れも使用することができる。生物分解性マイクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ポリグリコール酸塩）も、本発明の医薬品組成のための担体として使用され得る。適切な生物分解性マイクロスフェアは、例えば、米国特許第4,897,268号および5,075,109号に開示されている。
【０１５７】
また、そのような組成物は、緩衝剤(例えば、中性緩衝生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水)、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、スクロース、もしくはデキストラン)、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、もしくはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡもしくはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバンド(例えば、水酸化アルミニウム)、および/または保存剤も含まれ得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥品として製剤してもよい。化合物は、周知の技術を用いてリポソーム中に封入することができる。
【０１５８】
本明細書中に記載される組成物は、徐放製剤(すなわち、投与後に化合物の持続放出を可能にするカプセルまたはスポンジのような製剤)の一部として投与してもよい。一般に、そのような製剤は、周知の技術を用いて調製され、例えば、経口、直腸、または皮下への移植、あるいは希望の標的部位への移植によって投与され得る。徐放性製剤は、担体マトリックスで分散された状態および/または律速膜によって囲まれたリザーバー内に含まれる状態で、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体を含んでいてもよい。そのような製剤において使用される担体は、生物適応性を示すものであり、そして場合によっては生物分解性物質でもある。好ましくは、前記製剤は、比較的一定レベルで有効成分を放出させるものである。徐放製剤中に含まれる活性成分の量は、移植部位、放出速度と予想放出持続時間、および処置する状態の性質に依存する。
【０１５９】
ある実施態様において、本発明のポリペプチドもまた、例えば、コアセルベーション技術、または界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタシアラート）マイクロカプセル）、コロイド性ドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）により調製されるマイクロカプセル中、あるいはマクロエマルジョン中に封入されていてもよい。そのような技術
は、Remington's Pharmaceutical Sciences,第１８版, A. Gennaro編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990年;およびRemington, The Science and Practice of Pharmacy 第２０版 Mack Publishing, 2000年に開示されている。抗体の血清中半減期を増加させるために、米国特許第5,739,277号で記載されているように、抗体(特に抗体フラグメント)にサルベージ受容体結合エピトープを組み込むことができる。例えば、本明細書で使用する場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血中半減期の増加に寄与するＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【０１６０】
本明細書中に開示された抗体は、イムノリポソームとして製剤することができる。抗体を含有するリポソーム は、EpsteinらProc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)、HwangらProc. Natl. Acad. Sci. USA  77:4030(1980)、ならびに米国特許第4,485,045および第4,544,545号に記載されている当該分野で周知の方法によって調製される。循環時間が増加したリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ−ＰＥ)を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法を用いて調製され得る。リポソームを一定のポアサイズを有すフィルターから押し出して望ましい直径のリポソームを得る。更に、MartinらJ.Biol.Chem.257:286-288(1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介して本発明の抗体のＦａｂ'断片をリポソームに結合させることができる。
【０１６１】
また、本明細書中に記載されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を含むキットや製品も提供される。
【０１６２】
ある実施態様では、前記製品は、ラベルを付けた容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、および試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。ある実施態様では、容器は、ＣＤ２６発現細胞の識別または定量、ＣＤ２６発現細胞の増殖阻害、あるいはＣＤ２６発現と関連する疾患の治療に有用な組成物を含有する。ある実施態様では、容器のラベルは、その組成物がＣＤ２６発現細胞の識別または定量、ＣＤ２６発現細胞の増殖阻害、あるいはＣＤ２６発現と関連する疾患の治療に有効な組成物であることを示す。
【０１６３】
ある実施態様では、本発明のキットは、上記の容器を含む。他の実施態様では、本発明のキットは、上記の容器および緩衝剤を含む第２の容器を含む。ある実施態様では、キットは、該キットに含まれるポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用説明を含む取扱説明書を含む。
【０１６４】
本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドは、上述の通りである。そのような組換えプラスミドもまた、直接投与してもよく、あるいはMirus Transit LTl 脂肪親和性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン、ポリカチオン(例えば、ポリリジン)またはリポソームを含む適切な送達試薬との併用で投与してもよい。本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えウイルスベクターについても上述の通りであり、このようなベクターを患者の腫瘍領域へ送達するための方法は、当該技術分野の技術常識の範囲内である。
【０１６５】
本発明のｓｉＲＮＡは、腫瘍領域またはその近辺組織の細胞へｓｉＲＮＡを送達するのに適した任意の方法によって対象に投与され得る。例えば、ｓｉＲＮＡは、遺伝子銃、エレクトロポレーション、あるいは他の適切な非経口または腸内投与経路で投与され得る。
【０１６６】
適切な経腸投与経路としては、経口、直腸、または鼻腔内送達が挙げられる。
【０１６７】
適切な非経口投与ルートは、血管内投与(例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル留置)；周囲組織および組織内への注射(例えば、腫瘍周囲および腫瘍内注射、網膜内注射、または網膜周囲注射)；皮下注射(injection)または皮下注入(infusion)を含む沈着（浸透圧ポンプによるもの）；例えば、カテーテルまたは他のプレースメント装置(例えば、多孔性、非多孔性、もしくはゼリー状の材料を含む坐薬またはインプラント)による新血管新生部位あるいはその近辺の領域への直接投与；および吸入を含む。ｓｉＲＮＡの注射または注入は、腫瘍部位もしくはその周辺に投与されることが好ましい。
【０１６８】
本発明のｓｉＲＮＡは、単回または複数回で投与され得る。本発明のｓｉＲＮＡの投与が注入による場合、注入は、単回持続投与量であってもよく、または複数回注入によって送達されてもよい。薬剤の直接的組織内注射は、腫瘍部位またはその周辺に行われる。腫瘍部位あるいは周辺組織へ薬剤を複数回注射することが、特に好ましい。
【０１６９】
当業者であれば、容易に、本発明のｓｉＲＮＡを特定の対象に投与するための適切な投与計画を決定できる。例えば、腫瘍部位あるいはその周辺への単回注射または沈着として、ｓｉＲＮＡを１回で対象に投与してもよい。あるいは、ｓｉＲＮＡは、約３〜約２８日間、より好ましくは約７〜約１０日間の期間にわたり１日１回または２回、対象に投与してもよい。好ましい投与計画では、ｓｉＲＮＡは、７日間にわたって１日１回腫瘍部位またはその周辺に注射される。投与計画が複数回投与となる場合には、対象に投与されるｓｉＲＮＡの有効量は、投与計画全体で投与されるｓｉＲＮＡの総量を含むものと解釈される。
【０１７０】
本発明のｓｉＲＮＡは、対象への投与前に、当該分野で周知の技術に従って、医薬組成物として処方されることが好ましい。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌および発熱物質不含として特徴付けられる。本明細書で使用する場合、「医薬製剤」は、ヒトおよび獣医用途の製剤を含む。本発明の医薬組成物を調製するための方法は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Science,第１７版, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載されているように当該技術分野の範囲内であり、それらの全体が参照により本明細書中に引用される。
【０１７１】
本発明の医薬製剤は、生理学的に許容される担体媒体と混合された状態で、本発明のｓｉＲＮＡ(例えば、重量で０．１から９０％)、または該ｓｉＲＮＡの生理学的に許容される塩を含む。好ましい生理学的に許容されるキャリア媒体としては、水、緩衝液、生理食塩水、０．４％の食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
【０１７２】
また、本発明の医薬組成物は、従来の医薬品賦形剤および/または添加剤も含み得る。適切な医薬品賦形剤としては、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、およびｐＨ調整剤が挙げられる。適切な添加剤としては、生理学的に生体適合性を示す緩衝剤(例えば、トロメタミン塩酸塩)、キレート剤(例えば、ＤＴＰＡもしくはＤＴＰＡ−ビスアミド)またはカルシウムキレート錯体(例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド)の添加、あるいは、任意に、カルシウム塩またはナトリウム塩(例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、または乳酸カルシウム)の添加を含む。本発明の医薬組成物は、液体の形態での使用用に包装されてもよく、あるいは凍結乾燥されてもよい。
【０１７３】
固体組成物のために、従来の非毒性の固体担体を使用できる；例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等。
【０１７４】
例えば、経口投与用ための固体医薬組成物は、上記に記載された任意の担体および医薬品添加物、ならびに１種類以上の本発明のｓｉＲＮＡを１０−９５％、好ましくは２５％−７５％含み得る。エアゾール(吸入)投与のための医薬組成物は、上記のリポソームに封入された１種類以上の本発明のｓｉＲＮＡを０．０１−２０重量％、好ましくは１重量％−１０重量％と噴霧剤とを含み得る。所望に応じて、担体も含有させることも可能である（例えば、鼻腔内投与用にはレシチン）。
【０１７５】
ポリペプチドを使用する方法
本発明のポリペプチド(抗体等)は、診断法および治療方法、診察方法、悪性細胞の溶解方法、ならびに悪性疾患を治療するための物質をスクリーニングするための方法を含む様々な適用に有用であるが、これらに限定されるものではない。本発明は、ＣＤ２６発現細胞の増殖を阻害する方法も提供する。
【０１７６】
本発明の抗体およびポリペプチドは、ＣＤ２６発現に関連する状態（疾患または障害等）の検出、診断、および/またはモニタリングに用いることができる。ある実施態様では、ＣＤ２６発現に関連する状態は、異常なＣＤ２６の発現に関連した状態である。例えば、ある実施態様では、ＣＤ２６発現に関連する状態は、ＣＤ２６発現の変化または異常(ある実施態様では、ＣＤ２６発現量の増加もしくは減少（正常サンプルとの比較において）、ならびに／または不適切な発現、例えば、通常ＣＤ２６を発現しない組織および／もしくは細胞内での発現、または通常ＣＤ２６を発現する組織もしくは細胞内でのＣＤ２６発現の欠如)に関連する状態である。ある実施態様では、ＣＤ２６の発現に関連する状態は、ＣＤ２６の過剰発現に関連する状態である。ＣＤ２６の過剰発現としては、通常ＣＤ２６を発現している細胞または組織において、それらの細胞または組織内での通常のＣＤ２６の発現レベルと比較して、ＣＤ２６の発現量が増加していること、および通常ＣＤ２６を発現していない組織または細胞内でＣＤ２６が発現していることの両方が含まれるものと理解される。ある実施態様では、ＣＤ２６発現に関連する状態は、少なくとも部分的にＣＤ２６により媒介される。ある実施態様では、ＣＤ２６発現に関連する状態は、ＣＤ２６発現細胞に関連する状態である。ある実施態様では、ＣＤ２６発現に関連する状態は、ＣＤ２６発現細胞の増殖に関連する状態である。ある実施態様では、ＣＤ２６発現細胞の増殖は、異常増殖である。本発明の診断方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行ってもよい。
【０１７７】
本議論においては、抗体について典型的な言及がなされるが、本議論は、本発明のポリペプチドにも関係することが理解されるべきである。
【０１７８】
診断用途において、抗体は、典型的には、ラジオアイソトープ、蛍光標識、および様々な酵素基質ラベル体等の検出可能な部分で標識されるであろうが、標識の例はこれらに限定されるものではない。抗体への標識の結合方法は、当該分野で周知である。本発明の他の実施態様では、本発明の抗体を標識する必要はなく、これらの抗体の存在は、本発明の抗体に結合する標識された抗体を用いて検出できる。
【０１７９】
本発明の抗体は、競合的結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどの、任意の公知のアッセイ方法において使用できる。Zola,モノクローナル抗体: A Manual of Techniques、pp.147-158  (CRC Press, 1987)。
【０１８０】
本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングなどのｉｎ  ｖｉｖｏでの診断アッセイに使用してもよい。一般に、抗体を放射性核種(111In、99Tc、14C、131I、125I、または3H等)で標識することにより標的細胞または組織を免疫シンチグラフィーを使用して検出できる。
【０１８１】
本発明の抗体は、当該分野で周知の技術に従って、病理学研究における染色試薬として使用してもよい。
【０１８２】
別の局面において、本発明は、ＣＤ２６発現細胞の増殖を阻害する方法を提供する。ＣＤ２６発現細胞の増殖阻害は、部分的な増殖阻害ないし完全な増殖阻害を含む、観察可能なあらゆるレベルの阻害を含む。ある実施態様では、細胞増殖は、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または約１００％阻害される。本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行ってもよい。ある実施態様では、方法は、細胞を本明細書中に記載されるポリペプチド(例えば、抗体)と接触させる工程を含む。一般には、細胞を細胞増殖を阻害するのに十分な量のポリペプチドと接触させることになる。
【０１８３】
本明細書中に記載されている局面のある実施態様では、ＣＤ２６発現細胞は、ヒト細胞である。ある実施態様では、ＣＤ２６発現細胞は、癌細胞である。ある実施態様では、ＣＤ２６発現細胞は、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌またはその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍である。ある実施態様では、腫瘍細胞は、悪性または良性である。
【０１８４】
本発明の抗体は、悪性中皮腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌もしくは他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍を治療、診断または阻害するために、該抗体に特異的なエフェクター細胞と併用して用いてもよい。
【０１８５】
細胞増殖の阻害を評価する方法は、当該分野で公知であり、ＭＴＴアッセイが挙げられる(例えば、Aytacら(2003) British Journal of Cancer 88: 455-462、Hoら(2001) Clinical Cancer Research 7: 2031-2040、Hansen ら(1989)J.Immunol. Methods, 119: 203-210、およびAytacら(2001) Cancer Res 61: 7204-7210を参照。)。 また、ＭＴＴアッセイの例は、以下の実施例２（Ｇ）、３（Ｄ）、および５にも提供される。
【０１８６】
更に、本発明は、対象におけるＣＤ２６発現に関連する状態の治療方法を提供する。ある実施態様において、対象におけるＣＤ２６発現に関連する状態の治療法は、本明細書中に記載されるポリペプチド（例えば、抗体）を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む。ある実施態様では、ＣＤ２６発現に関連する状態はＣＤ２６の異常発現に関連する。ある実施態様では、ＣＤ２６発現に関連する状態は、ＣＤ２６発現の変化または異常(ある実施態様では、ＣＤ２６発現量の増加もしくは減少（正常サンプルとの比較において）、ならびに／または不適切な発現、例えば、通常ＣＤ２６を発現しない組織および／もしくは細胞内での発現、または通常ＣＤ２６を発現する組織もしくは細胞内でのＣＤ２６発現の欠如)に関連する状態である。ある実施態様では、ＣＤ２６の発現に関連する状態は、ＣＤ２６の過剰発現に関連している状態である。ある実施態様では、ＣＤ２６発現に関連している状態は、少なくとも部分的にＣＤ２６によって媒介される。ある実施態様では、ＣＤ２６発現に関連する状態は、ＣＤ２６発現細胞に関連する状態である。ある実施態様では、ＣＤ２６発現に関連する状態は、ＣＤ２６発現細胞の増殖に関連する状態である。ある実施態様では、ＣＤ２６発現細胞の増殖は、異常が認められる。ある実施態様では、ＣＤ２６発現細胞は、Ｔ細胞である。ある実施態様において、ＣＤ２６発現細胞は、腫瘍細胞であり、該腫瘍細胞は、悪性または良性のものであってもよい、。(更なるＣＤ２６発現細胞は上記に記載されている。)
【０１８７】
ある実施態様では、対象におけるＣＤ２６発現に関連する状態は、増殖性疾患である。ある実施態様では、対象におけるＣＤ２６の発現に関連する状態は、癌である。ある実施態様において、癌は、悪性中皮種、肺癌、腎臓癌、肝臓癌またはその他のＣＤ２６の発現を伴う悪性腫瘍である。
【０１８８】
本明細書中に記載された方法(治療方法を含む)は、単一部位あるいは複数部位への単一の時点あるいは複数の時点における単回直接注射によってなされれてもよい。投与はまた、複数部位へほぼ同時に行ってもよい。投与頻度は、治療過程の上で決定および調整され、達成が望まれる結果に基づく。場合によっては、本発明のポリペプチド(抗体を含む)、ポリヌクレオチド、および医薬組成物の徐放持続製剤が適切であり得る。徐放を達成するための様々な製剤や装置は、当該分野で周知である。
【０１８９】
患者、対象、または個体は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジなどの哺乳動物を含む。対象は、好ましくは、ヒトであり、疾患に罹患しているかもしくは現在症状を呈していてもよく、または疾患に罹患しておらずもしくは現在症状を呈していなくてもよい。
【０１９０】
抗体は、好ましくは、担体；好ましくは医薬的に許容される担体に含まれた状態で哺乳動物に投与される。適切な担体およびそれらの製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences，第１８版，A.Gennaro編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990年およびRemington, The Science and Practice of Pharmacy 第２０版 Mack Publishing, 2000年に記載されている。通常、適切量の医薬的に許容される塩が製剤に用いることにより該製剤に等張性を有することになる。担体の例としては、生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。これらの溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。更に、担体としては、抗体を含有する固体の疎水性ポリマー製の半透性マトリクスなどの徐放製剤が挙げられ、そのマトリクスは、例えば、フィルム、リポソームまたはマイクロ粒子などの造形品の形態にある。例えば、投与される抗体の投与経路および濃度に依存して、ある異種の担体がより好ましくなる場合があることは、当業者には明らかであろう。
【０１９１】
抗体は、哺乳動物に注射(例えば、全身、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、門脈内)によって投与されてもよく、または有効な形態での血流への送達を確実にするその他の方法（例えば、注入）によって投与されてもよい。抗体は、局所で治療効果を得るために、組織内単離灌流などの単離灌流法でも投与してもよい。静脈注射が好ましい。
【０１９２】
本発明のポリペプチド(例えば、抗体)を投与するための有効用量およびスケジュールは、経験的に決定され、そのような決定方法は当該技術分野の技術常識の範囲内である。当業者であれば、投与すべき抗体の用量が、例えば、抗体を接種する哺乳動物、投与経路、使用する抗体の具体的な種類および前記哺乳動物に投与される他の薬剤に依存して変わることを理解するであろう。抗体のための適切な用量を選択する際のガイダンスは、抗体の治療用途に関する文献、例えば、Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferroneら編、 Noges Publications, Park Ridge, N. J., 1985, チャプター22およびpp. 303-357; Smithら, Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haberら編, Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389に記載されている。単独で使用される抗体１日当たりの典型的な投与量は、前述の要素にもよるが、１日当たり約1μg/体重kgから１００ｍｇ／体重kgまたはそれ以上までの範囲であってもよい。一般に、以下のいずれの投与量が使用されてもよい：少なくとも約５０ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１０ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約３ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約７５０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約５００μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約２５０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１００μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約５０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１μｇ／体重ｋｇの投与量、またはこれを上回るの投与量が投与される。
【０１９３】
ある実施態様では、１つより多くの抗体が存在してもよい。そのような組成物は、本発明の少なくとも１種類、少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類の異なる(ポリペプチドを含む)抗体を含んでいてもよい。
【０１９４】
ポリペプチドは、哺乳動物に有効量の他の１つ以上の治療薬と併用投与されてもよい。ポリペプチドは、連続的または同時に、他の1つ以上の治療薬と投与されてもよい。ポリペプチドおよび治療薬の量は、例えば、どのような種類の薬剤を使用するか、治療される病理学的状態、ならびに投与スケジュールおよび投与経路に依存するが、一般的には、仮に該ポリペプチドおよび該治療薬を個別に使用する場合より少ない量になるであろう。
【０１９５】
哺乳動物への抗体の投与後、哺乳動物の生理状態は、当業者に周知の様々な方法でモニターすることができる。
【０１９６】
上記の投与および用量の原理は、本明細書中に記載されたポリペプチドに対して適用され得る。
【０１９７】
本発明のポリペプチド(抗体を含む)をコードするポリヌクレオチドは、本発明の抗体またはポリペプチドの所望の細胞における送達および発現のために使用してもよい。発現ベクターが使用することにより抗体を直接発現させることができることは明らかである。該発現ベクターは、全身、腹腔内、静脈、筋肉内、皮下、くも膜下、心室内、経口、腸内、非経口、鼻腔内、皮内、あるいは吸入投与で投与できる。例えば、発現ベクターの投与方法としては、局所または全身投与が挙げられ、注射、経口投与、粒子銃もしくはカテーテル投与、および局所的投与が挙げられる。当業者は、ｉｎ  ｖｉｖｏで外因性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与に精通している。例えば、米国特許第6,436,908号、第6,413,942号、および第6,376,471号を参照のこと。
【０１９８】
本発明のポリペプチドまたは抗体をコードするポリヌクレオチドを含む治療用組成物の標的送達を用いてもよい。受容体を介したＤＮＡ送達技術は、例えば、Findeisら、Trends Biotechnol. (1993)11:202; Chiouら、Gene Therapeutics： Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wuら、J. Biol. Chem. (1988) 263: 621; Wuら、J. Biol. Chem. (1994) 269: 542; Zenkeら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1990) 87: 3655; WuらJ. Biol. Chem. (1991) 266: 338に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療組成物は、遺伝子療法プロトコルにおいて、局所投与ではＤＮＡ量で約１００ｎｇから約２００ｍｇの範囲で投与される。遺伝子治療プロトコルにおいて、約５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μgから約２ｍｇ、約５μgから約５００μg、および約２０μgから約１００μgの濃度範囲のＤＮＡを使用してもよい。本発明の治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて送達され得る。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス由来または非ウイルス由来のものであってもよい(一般的記載については、Jolly，Cancer Gene Therapy(1994)1:51；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5:845; Connelly，Human Gene Therapy(1995)1:185; およびKaplitt，Nature Genetics(1994)6:148を参照のこと)。そのようなコード配列の発現は、内因性の哺乳動物由来または異種由来のプロモーターを用いて誘導することができる。コード配列の発現は、本質的なものであってもよく、または制御されたものであってもよい。
【０１９９】
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のためのウイルスベースのベクターは、当該分野で周知である。代表的なウイルスベースのビヒクルは、組換え型レトロウイルス(例えば、国際公開公報第90/07936号;国際公開公報第94/03622号;国際公開公報第93/25698号;国際公開公報第93/25234号;国際公開公報第93/11230号;国際公開公報第93/10218号;国際公開公報第91/02805号;米国特許第5,219,740号および4,777,127号；英国特許第2,200,651号；およびEP 0 345 242号を参照のこと)、アルファ・ウイルスベースのベクター（例えば、Sindbisウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス(ATCC VR-67; ATCC VR-1247)、Ross Riverウイルス(ATCC VR-373; ATCC VR-1246)およびベネズエラウマ脳炎ウイルス(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター (例えば、国際公開公報第94/12649号、国際公開公報第93/03769号; 国際公開公報第93/19191号;国際公開公報第94/28938号;国際公開公報第95/11984号および国際公開公報第95/00655号を参照のこと)を含むが、これらに限定されるものではない。また、Curiel，Hum. Gene Ther. (1992) 3:147に記載されるような、失活したアデノウィルスに結合したＤＮＡの投与を用いてもよい。
【０２００】
非ウイルス性送達ビヒクルおよびその方法を用いることもでき、その例としては、単独で失活したアデノウィルスへ結合した、または結合していないポリカチオン性の凝縮ＤＮＡ（例えば、Curiel, Hum, Gene Ther.,(1992)3:147を参照のこと）；リガンド結合DNA（例えば、Wu, J. Biol. Chem., (1989) 264:16985を参照のこと）；真核細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第5,814,482号;国際公開公報第95/07994号;国際公開公報第96/17072号;国際公開公報第95/30763号、および国際公開公報第97/42338号を参照のこと）および細胞膜との核電荷中和もしくは融合が挙げられるが、これらに限定されるものではない。裸のＤＮＡを用いてもよい。代表的な裸のＤＮＡ導入方法は、国際公開公報第90/11092号および米国特許第5,580,859号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして機能しうるリポソームは、米国特許第5,422,120号；国際公開公報第95/13796号；国際公開公報第94/23697号；国際公開公報第91/14445号およびEP 0 524 968号に記載されている。追加的アプローチは、Philip, Mol Cell Biol.(1994)14:2411およびWoffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994)91:1581に記載されている。
【０２０１】
以下において、本発明を非限定的な実施例で例示する。
【実施例】
【０２０２】
材料および方法
試薬および抗体
抗ＣＤ２６マウスｍＡｂ(ＩｇＧｌ)１４Ｄ１０、５Ｆ８、および抗ＣＤ４５ ＲＡマウスｍＡｂ(ＩｇＧｌ)２Ｈ４は、以前に記載した（非特許文献２０および２１)ように、当研究室で開発されたものであり、後者を対照として使用した。正常なヒトＩｇＧ(Sigma Aldrich, St. Louis, ミズーリ州)も対照として使用した。ヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂは、１４Ｄ１０コード配列から構築した。簡単に説明すると、前記エピトープに対する高い結合親和力を有する幾つかのＦａｂクローンを選択した。それらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイを用いて、生物学的有効性について試験した。それらのうちの一つをヒト化抗ＣＤ２６ｍＡｂ(ｈｕｍＡｂ)として構築するために選択した。ＰＫＢα／Ａｋｔ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃｙｃｌｉｎＥ、およびβアクチンに対するマウスｍＡｂをCell Signaling Technology Inc.(Beverly、マサチューセッツ州)から入手し、そしてｐ２７ｋｉｐ１、ｐ２１ｃｉｐｌ／ｗａｆｌ、ｃｙｃｌｉｎＤｌ、および活性ｃａｓｐａｓｅ ３に対するマウスｍＡｂをBD PharMingen(レキシントン、ケンタッキー州)から入手した。抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的ヤギＦ(ａｂ’)２フラグメントおよび抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的ヤギＦ(ａｂ’）２フラグメントをJackson ImmunoResearch (West Grove, ペンシルベニア州)から入手した。
【０２０３】
細胞培養とトランスフェクション
ＪＭＮ細胞は、Brenda Gerwin博士(Laboratory of Human Carcinogenesis, National Institute of Health, Bethesda, メリーランド州)から謹呈された。ＮＣＩ−Ｈ２４５２細胞および２９３Ｔ細胞は、American Type Culture Collection(Rockville, メリーランド州)から入手した。ＪＭＮ細胞株およびＮＣＩ−Ｈ２４５２細胞株は、悪性中皮腫の患者から採取した。１０％の熱非動化牛胎児血清(ＦＢＳ) 、ペニシリン(１００ ｕｎｉｔｓ/ｍｌ)およびストレプトマイシン(１００μｇ/ｍｌ)(Life Technologies Inc.、Gaithersburg, メリーランド州)、またはＧ４１８(５００μｇ/ｍｌ)(Sigma-Aldrich, St. Louis, ミズーリ州)を含有するＲＰＭＩメディウム(Life Technologies Inc.、Grand Island, ニューヨーク州)で、すべての細胞を生育した。ＦｕＧＥＮＥ６試薬(Roche Diagnostics, Indianapolis, インディアナ州)を使用してｐＥＢ６ベクター(非特許文献２２)にサブクローニングした完全長のＣＤ２６を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ｐＥＢ６ベクターはY.Miwa博士(筑波大学、茨城、日本)から謹呈された。
【０２０４】
２−(２−メトキシ−４−ニトロフェニル)−３−(４−ニトロフェニル)−５−(２，４−ジスルホフェニル)−２Ｈ−テトラゾリウムのアッセイ
総体積１００μＬ（１ウェルあたり５ｘ１０３個の細胞）の培養液中で、細胞を単独またはｈｕｍＡｂ(０．１、１．０もしくは１０μｇ/ｍｌ)もしくは２Ｈ４(０．１、１．０もしくは１０μｇ/ｍｌ)の存在下で培養した。３７℃で２４時間のインキュベーションの後、２−(２−メトキシ−４−ニトロフェニル)−３−(４−ニトロフェニル)−５−(２，４−ジスルホフェニル)−２Ｈ−テトラゾリウム(生化学工業、東京、日本)を各ウェルに加えた。更に２時間のインキュベーションの後、電子伝達体である１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムの存在下での生体還元の後に水溶性ホルマザン染料をマイクロプレートリーダー(BioRad、Hercules、カリフォルニア州)を使用し４５０ｎｍで測定した。全てのサンプルを3つの重複する系で試験した。測定値は、3つの重複するウェルの平均値で表示し、その平均標準誤差（ＳＥ）は１５以内であった。
【０２０５】
免疫組織化学
免疫組織化学において、１２人の患者の外科標本（７名からのＭＭ、３名からの反応性中皮腫細胞、および２名からの類腺腫瘍）を評価した。それぞれに対して、癌とその隣接している非新生物組織の両方を含む１０％ホルマリン固定パラフィン包埋標本を作製した。パラフィン包埋組織を、それぞれキシレンおよびエタノールを使用して脱ろうおよび再水和した。スライドを脱パラフィンし、次に、抗原回復のために１０分間１０ｍＭクエン酸塩緩衝液(ｐＨ６．０)中でマイクロ波プロセッサにて加熱した。３％(ｖｏｌ/ｖｏｌ)ＢＳＡでブロッキング後、スライドを一次抗体(抗ＣＤ２６ ｍＡｂ)と共に４℃で終夜インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、二次抗体をビオチンでラベル化し、３０分間適用した。ストレプトアビジン−ＬＳＡ増幅法を３０分間行った後にペルオキシダーゼ/ジアミノベンジジン基質/クロマゲンで処理した。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。２人の異なる病理学者が、得られた結果の妥当性を点検した。全てのヒト標本は、慶応義塾大学（東京、日本）病理学教室から入手するとともに、全ての患者から治験審査委員会(ＩＲＢ)の形式に沿ったインフォームドコンセントを得た。
【０２０６】
内因性ＣＤ２６の欠損
内因性ＣＤ２６を欠損させるため、ＣＤ２６ ｃＤＮＡ(アクセッション番号NM_001935)を標的とするｓｉＲＮＡ−オリゴをタカラバイオのデザインサイト(http://www.takara-bio.co.jp/RNAi.htm) に従って作製した（センス鎖: 5'-GAAAGGUGUCAGUACUAUU TT-3’(配列番号３０)およびアンチセンス鎖:3'-TT CUUUCCACAGUCAUGAUAA-5'(配列番号３１)）。そしてヒトＣａｓ−Ｌを標的としたスクランブル対照ｓｉＲＮＡ−オリゴ（センス鎖: 5'-UAAUUAGGGUCGGGUAAAC TT-3’(配列番号３２)とアンチセンス鎖: 3'-TTAUUAAUCCCAGCCCAUUUG-5'(配列番号３３)）を対象として用いた。TransIT-TKO（登録商標）トランスフェクション試薬(Mirus Bio Corporation、Madison、ウィスコンシン州)をメーカーのプロトコルに従って用いてＣＤ２６ ｓｉＲＮＡオリゴ（ｓｉＣＤ２６）をトランスフェクションした。
【０２０７】
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよびイムノブロッティング
全細胞溶解液の調製と細胞分画は、他に記載されているように行った（非特許文献２３）。タンパク質サンプルをSDS-PAGEで泳動し、ポリビニリデンジフルオリド膜(Immobilon-P; Millipore、Bedford、マサチューセッツ州)に転写した。対応するｍＡｂで特異的抗原をプローブし、次いで、ＨＲＰ結合の二次Ｉｇ（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, ニュージャージー州）でプローブした。ウエスタンブロット産物を増強化学発光法（ＥＣＬ法）（NEN, Boston, マサチューセッツ州）により可視化した。
【０２０８】
抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)
腫瘍細胞のエフェクター細胞依存性溶解に対するｍＡｂをＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ放出アッセイにおいて評価した。NK Cell Isolation Kit II Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach, ドイツ)によって、健常ドナーのＮＫ細胞をＰＢＭＣから単離し、エフェクター細胞として使用した。３７℃、１時間、振とう下で、標的細胞(1×106個の細胞)を１０μＭ Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ (Ｄｏｊｉｎｄｏ、熊本、日本)で標識した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、培地(1×105 細胞/ｍｌ)に再懸濁した。標識した細胞を96ウェルU字型底プレート(50ul/ウェル中、5×103)に分注し、０．１ｐｇ/ｍｌから０．１ｍｇ/ｍｌ（最終濃度）の範囲でｈｕｍＡｂまたは１４Ｄ１０を培地で７倍段階希釈した溶液５０μｌでプレインキュベーション(３７℃、３０分)した。Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ自然放出量を測定するためにｍＡｂの代わりに培地を加えるとともに、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭの最大放出量を測定するためにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００(１％の最終濃度)を加えた。その後、ヒトのエフェクター細胞をウェル(５×１０５ 細胞/ウェル)に加え、細胞を３７℃で終夜インキュベートした。そして、上清をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ放出量の測定のために回収した。特異的溶解の割合を以下の公式を使用して計算した:特異的溶解率（％）＝(実験的放出量−自然放出量)/(最大放出量−自然放出量)×１００。ここで、最大放出量はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えることによって測定し、自然放出量は増感性Ａｂ（sensitizing Ab）およびエフェクター細胞の非存在下で測定した。
【０２０９】
補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）
先の文献に記載されているようにＣＤＣアッセイを実施した(非特許文献２４)。標的細胞を96ウェルU字型底プレートに１x１０５細胞/ウェルで分注し、３０分間、４℃で様々な濃度のｍＡｂとインキュベートした。その後、ヒトの血清を加え、２時間、３７℃で細胞をインキュベートした。ＣＤＣ特異的細胞死およびＡＤＣＣ特異的細胞死の評価をAnnexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(Bio Vision、Mountain View、CA)および活性化カスパーゼ３の検出によって評価した。
【０２１０】
エフェクター欠損のＳＣＩＤマウスにおけるヒト化抗ＣＤ２６ ｍＡｂの抗腫瘍活性の評価
全てのｉｎ  ｖｉｖｏ試験が実験動物委員会（Institute Animal Care and Use Committee）において承認された。６週齢雌のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、チャールズ・リバー(神奈川、日本)から購入し、ｍＡｂ処置の１日前に抗アシアロＧＭｌポリクローナル抗血清２５％(ｖ/ｖ、和光、大阪、日本)を腹腔内投与で前処置した。
腫瘍形成性に対するｈｕｍＡｂの効果を評価するために、ＪＭＮ細胞(１×１０６)をマウスの左横腹の皮下に接種した。腫瘤（５ｍｍの大きさ）が目に見えるようになった癌細胞接種後１４日目に、アイソタイプ一致の対照ｍＡｂ、５Ｆ８、１４Ｄ１０、またはヒト化抗ＣＤ２６ ｍＡｂ（１０μｇ/各注射）の腫瘍内注射でマウスを処置した。各ｍＡｂを１週間に３回投与した。そして、担癌マウスを腫瘍成長と進行について観察した。腫瘍の大きさは、最も大きい垂直方向の直径(x)と最も小さい垂直方向の直径(y)のカリパス測定によって測定し、式V=π/6×xy2によって計算した。
腫瘍転移に対するｈｕｍＡｂの効果を評価するために、ＪＭＮ細胞(１×１０５)を尾静脈内に注入した。次いで、癌細胞注入日から、アイソタイプ一致の対照ｍＡｂ、５Ｆ８、１４Ｄ１０、またはヒト化抗ＣＤ２６ ｍＡｂ（１０μｇ/各注射）の静脈内注射によってマウスを処置した。各ｍＡｂを１週間に３回投与した。累積生存割合はカプラン-マイヤー法で評価した。
【０２１１】
エフェクターが存在するＢａｌｂマウスにおけるヒト化抗ＣＤ２６ ｍＡｂの抗腫瘍活性評価
6週齢雌のＢａｌｂマウスをチャールズ・リバー(神奈川、日本)から購入し、マウスのエフェクター系の結合を維持するために、抗アシアロＧＭｌポリクローナル抗血清処置は行わなかった。
腫瘍形成性に対するｈｕｍＡｂの効果を評価するために、ＪＭＮ細胞(１x１０６)をマウスの左横腹の皮下に接種した。腫瘤（５ｍｍの大きさ）が目に見えるようになった癌細胞接種後１４日目(サイズにおける５ｍｍ)に、アイソタイプ一致の対照ｍＡｂ、５Ｆ８、１４Ｄ１０、またはヒト化抗ＣＤ２６ ｍＡｂ（１０μｇ/各注射）の腫瘍内注射でマウスを処置した。各ｍＡｂを１週間に３回投与した。そして、担癌マウスを腫瘍成長と進行についてモニターした。腫瘍の大きさは、最も大きい垂直方向の直径(x)と最も小さい垂直方向の直径(y)のカリパス測定によって測定し、式V=π/6×xy2によって計算した。
最初のｍＡｂ処置後３５日目に、皮下腫瘍形成モデルにおける切除標本の顕微鏡的特徴評価のため、全てのマウスを安楽死させた。
腫瘍播種に対するｈｕｍＡｂの効果を評価するために、ＪＭＮ細胞(１×１０５)を尾静脈内に注入した。次いで、癌細胞注入日から、アイソタイプ一致の対照ｍＡｂ、またはヒト化抗ＣＤ２６ ｍＡｂ（１０μｇ/各注射）を静脈内注射でマウスに処置した。各ｍＡｂを１週間に３回投与した。累積生存割合は、カプラン-マイヤー法で評価した。更に、ヒト化抗ＣＤ２６ ｍＡｂの遠隔転移形成効果を評価するため、処置したマウスを安楽死させ、肺と肝臓の複数の転移形成を別の腫瘍転移モデルにおいて計算した。ＪＭＮ細胞(１×１０５)を各グループのマウスに静脈内注射した。癌細胞注射日に、アイソタイプが一致する対照のｍＡｂ(レーン１、ｎ＝４)、５Ｆ８(レーン２、ｎ＝４)、１４Ｄ１０（レーン３、ｎ＝４）、またはヒト化抗ＣＤ２６ ｍＡｂ(レーン４、ｎ＝４)をマウスに静脈内注射処置した。各ｍＡｂを１週間に３回投与した。癌細胞注射後の３５日目に、マウスを安楽死させ、肺と肝臓の複数の転移形成を計算した。
【０２１２】
ヒトのエフェクター細胞(ＨｕＥＣ)-移植マウスの構築およびＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ．ＩＬ−Ｒγｎｕｌｌマウスにおける抗腫瘍活性の評価
ＮＯＤ/Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ.ＩＬ−Ｒγｎｕｌｌ(ＮＯＧマウス)を実験動物中央研究所(ＣＩＥＡ)(神奈川、日本)から入手した。ヒトのＰＢＭＣは健常ドナーの末梢血からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ(AXIS-SHIELD, Oslo,ノルウェ−)を使用して単離し、ＨｕＥＣとして使用した。その後、無菌条件下、ＨｕＥＣ(５x１０６)をＰＢＳに懸濁した０．２ｍｌの容量でＮＯＧ−ＳＣＩＤマウスに腹腔内に注入した。但し、マウスは、ＨｕＥＣ注射の１日前に０．２ｍＬの抗アシアロＧＭｌのポリクローナル抗血清２５％(ｖ/ｖ、和光、大阪、日本)の腹腔内投与により前処理した。ＨｕＥＣ注射の１日後にヒトＨｕＥＣを移植したＳＣＩＤマウスへＮＣＩ−Ｈ２４５２細胞(５x１０４)を腹腔内に注入した。１、３、および５日後に、ｈｕｍＡｂを腹腔内に注入した。腹水症腫瘍成長による死亡をモニターするため、マウスを毎日観察した。累積生存割合はカプラン-マイヤー法によって算定した。
【０２１３】
結果
細胞表面ＣＤ２６はヒト悪性中皮腫に高発現している
最初に、患者から外科的に切除されたヒトＭＭ組織におけるＣＤ２６発現レベルを評価した。外科的に切除された原発部位からの１２個の連続標本を細胞表面ＣＤ２６発現について調べた。ＣＤ２６は全てのＭＭ組織で高発現していた(図１Ａ)。類腺腫瘍、または反応性中皮腫細胞においては、ＣＤ２６発現は非常に弱かった(図ｌＡ−a、ｂ)。それに対して、局在化したMM、分化の進行した乳頭のＭＭ、および拡散ＭＭを含む様々な病理タイプのＭＭで、ＣＤ２６が高発現していた(図.ｌＡ-ｃからｈ)。これらの結果は、ＣＤ２６が良性の中皮腫組織ではなく、ＭＭで高発現していることを示唆した。
【０２１４】
ＣＤ２６には細胞外マトリックスへの細胞接着の役割がある
ＭＭ細胞株、ＪＭＮおよびＮＣＩ−Ｈ２４５２は、高い表面ＣＤ２６発現を示した(図１Ｂ)。
ＣＤ２６が、細胞外マトリックス(ＥＣＭ)タンパク質への細胞接着において役割を果たすことが報告されているため(非特許文献１３および２５)、ＣＤ２６が細胞との相互作用において役割を果たすかどうかを調べた。図１Ｃで見られるように、ｓｉＲＮＡオリゴを用いて内因性のＣＤ２６を欠損させたＮＣＩ−Ｈ２４５２は、フィブロネクチンおよびコラーゲンＩを含む細胞外マトリックスタンパク質に結合するＣＤ２６の有意な減少を示した。これらの結果とは対照的に、ＣＤ２６の欠損は、ラミニン(ＣＤ２６への結合能のないＥＣＭのタンパク質)またはヒアルロナン(ＣＤ４４に対するリガンド)に対する結合を変化させなかった(図１Ｃ)。これらの知見の更なる裏づけとして、ｐＥＢ６ベクターにサブクローンした完全長ＣＤ２６ ｃＤＮＡをトランスフェクションした２９３Ｔ細胞が、対照のｐＥＢ６をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞と比べて、より高いフィブロネクチン及びコラーゲンＩへの結合能を示した（図１Ｃ）。そのうえ、ＣＤ２６の欠損は、ｐ２７ｋｉｐ１(図１Ｄ)のアップレギュレーションと関連していた。したがって、これらの知見により、ＣＤ２６が特定のＥＣＭタンパク質への結合分子として作用すること、ならびに接触阻害が、ＣＤ２６の欠損と関連して、観察されたＣＤ２６媒介性のｐ２７ｋｉｐ１(非特許文献２６および２７)のアップレギュレーションに寄与する役割をが果たし得ることが示唆された。
【０２１５】
抗ＣＤ２６ ｍＡｂは細胞のECMへの結合を阻害する
ＣＤ２６がＥＣＭ結合タンパク質であると証明されたため、抗ＣＤ２６ ｍＡｂがＥＣＭに細胞接着を阻害するかどうかを更に評価した。この目的のために、アイソタイプ一致の対照ｍＡｂ、５Ｆ８、１４Ｄ１０、およびヒト化抗ＣＤ２６ ｍＡｂ(ｈｕｍＡｂ)を用いて、ＥＣＭへの細胞接着を阻害する可能性について評価した。図２Ａに示したように、１４Ｄ１０で処置したＪＭＮ細胞およびｈｕｍＡｂで処置したＪＭＮ細胞では、フィブロネクチンとコラーゲンＩに対する結合が減少し、一方、対照ｍＡｂと５Ｆ８(生物学的機能のない抗ＣＤ２６ ｍＡｂ)ではフィブロネクチンやコラーゲンＩに対する結合に影響を及ぼさなかった。更に、１４Ｄ１０およびｈｕｍＡｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの増殖アッセイにおいて用量依存的にＪＭＮ細胞に対して直接増殖阻害を与え、とりわけ、ｈｕｍＡｂは１４Ｄ１０よりも強い増殖抑制効果を示した(図２Ｂ)。重要なことに、１４Ｄ１０およびｈｕｍＡｂは、ｐ２７ｋｉｐ１のアップレギュレーションおよびＣＤＫ２のダウンレギュレーションを引き起こした。これらの結果は、１４Ｄ１０とｈｕｍＡｂの両方が劇的にｐ２７ｋｉｐ１のアップレギュレーションおよびＣＤＫ２のダウンレギュレーションを通して接触阻害に関連した増殖阻害を伝達することを示唆するものであった。
【０２１６】
抗ＣＤ２６ ｍＡｂのヒト化は抗体依存性細胞傷害をもたらす
１４Ｄ１０とｈｕｍＡｂの両方が癌細胞に同様の直接効果を持っている一方、本研究は、ヒトのエフェクター細胞を用いたＡＤＣＣアッセイの利用を通じて、１４Ｄ１０との比較におけるｈｕｍＡｂの生物学的効果の差異に重点を置いた。エフェクター/ターゲット(Ｅ/Ｔ)比を５０に一定に保ったとき、ｈｕｍＡｂで処理したＪＭＮ細胞は、抗体用量依存的にＡＤＣＣを通して特異的溶解を示した(図３Ａ、左パネル)。重要なことに、１４Ｄ１０で処理したＪＭＮ細胞は、ＡＤＣＣ特異的溶解を示さず(図３Ａ、左パネル)、これらの結果によって１４Ｄ１０をヒト化してｈｕｍＡｂにすることにより、ヒトのエフェクター系の関与を介して強力なＡＤＣＣ活性が誘導されることが示唆された。そのうえ、図３Ａ右パネルで見られるように、ｈｕｍＡｂはエフェクター用量依存的にＡＤＣＣ特異的溶解を誘導した。ＪＭＮ(ＮＣＩ−Ｈ２４５２)以外のＣＤ２６陽性ＭＭ株が標的細胞として使用されたときにもこれらの結果が認められた。これらのデータにより、ｈｕｍＡｂが、１４Ｄ１０で見られた標的細胞に対する直接効果以外の新規な生物学的機能、即ちＡＤＣＣ特異的溶解作用を有することが示唆された。ｈｕｍＡｂ媒介性ＡＤＣＣをより詳細に特徴付けるために、Pl-annexinV染色および切断されたカスパーゼ３の検出を用いたアポトーシスアッセイを採用した。これらのアッセイでは、抗ヒトＩｇＧのＦｃγ断片特異的なヤギＦ(ａｂ’)２断片および抗マウスＩｇＧのＦｃγ断片特異的なヤギＦ(ａｂ’)２断片を用いた架橋法により、それぞれをｈｕｍＡｂおよび１４Ｄ１０に対するヒトのエフェクターの擬似体として使用した。図３Ｂ(上側３つのパネル)に見られるように、架橋されたｈｕｍＡｂは遅延型アポトーシスを誘導した一方で、架橋された１４Ｄ１０は遅延型および即時型のどちらのアポトーシスをも誘導しなかった。重要なことに、ｈｕｍＡｂおよび１４Ｄ１０のいずれもが、ヒト補体を使用することによってＣＤＣを誘導しなかったことである(図３Ｂ、下段３個のパネル、補助資料の図1)。これらの結合を更に裏付けるのは、架橋されたｈｕｍＡｂだけがＪＭＮ細胞においてカスパーゼ３の活性化を誘導し、一方、架橋された１４Ｄ１０、ｈｕｍＡｂ＋ヒト補体、および１４Ｄ１０＋ヒト補体のいずれもが、カスパーゼ３の活性化を誘導しなかったことである(図３Ｃ)。したがって、これらの結果は、ｈｕｍＡｂがＣＤＣ特異的溶解ではなく、ＡＤＣＣ特異的溶解を誘導することを示すものであった。
【０２１７】
ヒト化抗ＣＤ２６ ｍＡｂは悪性中皮腫細胞に対する直接的ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を有する
本発明者らは、近年、１４Ｄ１０が固形腫瘍に対する直接的ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す(非特許文献２４)ことを実証したので、ｈｕｍＡｂが同様のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果があるかどうかをさらに調べた。この目的のため、機能的なＢ細胞およびＴ細胞ならびにナチュラルキラー(ＮＫ)細胞活性をほとんど欠損しているＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを使用した(非特許文献２８)。マウスのエフェクター細胞の効果を最小限にするために、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、ｈｕｍＡｂ機能評価を行う前に抗アシアロＧＭｌポリクローナル抗血清で前処置した。図４ＡおよびＢで見られるように、ｈｕｍＡｂおよび１４Ｄ１０は皮下に接種したＪＭＮの腫瘍形成性を減少させたが、腫瘍形成の抑制においてはｈｕｍＡｂがより強力であった。これらの観察された結果により、ｈｕｍＡｂには１４Ｄ１０より強い直接的抗腫瘍効果があることが示唆された。さらに、腫瘍拡散におけるｈｕｍＡｂの直接的抗腫瘍活性を調べるために、ＪＭＮ異種移植モデルにおいて、静脈内投与された抗体の効果を調べた。図４Ｃで見られるように、ｈｕｍＡｂと１４Ｄ１０は、両抗体を静脈内投与した場合、マウスの生存を延長させ、余命の延長という観点では、ｈｕｍＡｂがより効果的であった。以上をまとめると、これらの観察結果により、直接的抗腫瘍活性においてｈｕｍＡｂが、１４Ｄ１０と比較して、より強力であることが示唆された。
【０２１８】
マウスのエフェクター系は抗ＣＤ２６ ｍＡｂの抗腫瘍効果を増強し得る
ｈｕｍＡｂおよび１４Ｄ１０の両方が直接的ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示したことから、次に、抗ＣＤ２６ ｍＡｂ活性により誘導された抗腫瘍作用におけるマウスのエフェクター系の潜在的関与を調べた。この目的のために、強力なＮＫ細胞活性を有するＢａｌｂマウスを我々は利用した。図５Ａで見られるように、ｈｕｍＡｂおよび１４Ｄ１０は、皮下に接種したＪＭＮの腫瘍形成性を減少させた。特筆すべきは、１４Ｄ１０およびｈｕｍＡｂの両方がマウスのエフェクター系の存在下において腫瘍形成を低下させたことである(図５Ａ)。図５Ｂで見られるように、ｈｕｍＡｂを処置した腫瘍および１４Ｄ１０を処置した腫瘍の両方が顕微鏡分析で結果的に死組織として観察された。これらの結果は、ｈｕｍＡｂおよび１４Ｄ１０の両方がマウスのエフェクター系を利用することを示唆するものであり、マウスのエフェクター欠損異種移植モデルにおいてｈｕｍＡｂと１４Ｄ１０との間に差異が観察されたこととは著しく対照的である。。ＪＭＮ細胞の静脈内投与を利用した更なる実験では、ｈｕｍＡｂの静脈内注射がマウスのエフェクター系存在下でマウスの生存を効果的に促進したことを示した(図５Ｃ)。重要なことに、遠隔ＪＭＮの形成はｈｕｍＡｂと１４Ｄ１０の両方で同様に抑制された(図５Ｄ)。これらのデータにより、マウスのエフェクター系が抗ＣＤ２６ ｍＡｂ媒介性の直接的抗腫瘍効果を増強することが示された。
【０２１９】
ヒトのエフェクター系はヒト化抗ＣＤ２６ ｍＡｂの抗腫瘍効果を増強し得る
次に、抗ＣＤ２６ ｍＡｂ誘導性の抗腫瘍作用におけるヒトのエフェクター系の潜在的関与について評価した。この目的のために、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞の活性が有意に欠損しているＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ．ＩＬ−Ｒγｎｕｌｌ(ＮＯＧマウス)をＮＣＩ−Ｈ２４５２異種移植モデル構築に使用した。ヒトのＰＢＭＣをヒトのエフェクター細胞(ＨｕＥＣ)としてこのｉｎ  ｖｉｖｏモデルで使用した。マウスのエフェクター系を完全に欠損させるために、ＮＯＧマウスを腹腔内ＨｕＥＣ移植する前日に、抗アシアロＧＭｌ抗血清で前処理した。図６で見られるように、ｈｕｍＡｂの腹腔内投与によってＨｕＥＣの非存在下でＮＣＩ−Ｈ２４５２異種移植マウス余命が著しく延長された。また、１４Ｄ１０でもマウス生存が延長したが、その効果はＨｕＥＣ非存在下のｈｕｍＡｂよりもはるかに弱かったことに注目すべきである(図６)。これらの結果により、ｈｕｍＡｂがより強い直接的抗腫瘍効果を有すことが示された。重要なことに、ＨｕＥＣの存在下において、１４Ｄ１０の抗腫瘍効果が著しくは変化しなかったのに対して、ｈｕｍＡｂの抗腫瘍効果は増強された。以上の観察された結果により、ＣＤ２６が中皮腫治療のための適切な分子標的であり、そしてｈｕｍＡｂが、少なくとも２つの異なる作用機序、その直接的抗腫瘍活性およびヒトのエフェクター系と連携する能力によって腫瘍増殖を制御することが示唆された。
【０２２０】
考察
本研究において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける抗ＣＤ２６ ｍＡｂの抗腫瘍効果が証明された。重要なことに、本研究結果は、抗ＣＤ２６ ｍＡｂのヒト化により、ｐ２７ｋｉｐ１誘導に関連した接触阻害以外の付加的な抗腫瘍効果が与えられることを示唆している。本研究結果は、ＣＤ２６のヒトＭＭにおけるＥＣＭへの結合タンパク質としての機能的役割を示すものでもある。
免疫組織化学的分析により、ヒトＭＭ細胞が非悪性組織より高レベルの表面ＣＤ２６を発現することが示され、これによってＣＤ２６が癌の成長および進行における役割を担うことが示唆される。ＮＣＩ−Ｈ２４５２におけるｓｉＲＮＡオリゴを使用した内因性ＣＤ２６の欠損により、該細胞のフィブロネクチンおよびコラーゲンＩを含むＥＣＭへの結合の有意な減少がもたらされた結果は特筆すべきである。更に、完全長のＣＤ２６ ｃＤＮＡをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞は、対照のモックトランスフェクトした２９３Ｔ細胞よりもフィブロネクチンおよびコラーゲンＩに対して強い結合親和力を示す。そのうえ、ＣＤ２６の欠損は、ｐ２７ｋｉｐ１のアップレギュレーションを引き起こす。したがって、これらの知見は、ＣＤ２６がＥＣＭへの癌細胞接着に関与していること、ならびに接触阻害が観察されたＣＤ２６欠損により媒介されるｐ２７ｋｉｐ１のアップレギュレーションに対して寄与的な役割を果たすことを示唆するもである。特筆すべき事実としては、接触阻害の間にｐ２７ｋｉｐ１がアップレギュレーションされることが先に報告されていることである（非特許文献２６）。
ＨｕｍＡｂと１４Ｄ１０の両方がｐ２７ｋｉｐ１のアップレギュレーションおよびＥＣＭへの結合阻害を介したＭＭ増殖の直接阻害を示す。したがって、これらの抗ＣＤ２６モノクローナル抗体の使用による結果は上記のｓｉＲＮＡ研究から得られた結果と一致しており、ｈｕｍＡｂと１４Ｄ１０の両方がＭＭの接着性に対して拮抗作用を有することを示すものである。
抗ＣＤ２６ ｍＡｂを介す抗腫瘍効果と関連するエフェクター機能の更なる試験により、１４Ｄ１０ではなくｈｕｍＡｂがＡＤＣＣ誘導性の細胞溶解を誘発することが示される。ＨｕｍＡｂの架橋により、ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ陽性およびＰＩ陽性のポピュレーションが蓄積し、そして活性化カスパーゼ３が切断された。これらのデータは、抗ＣＤ２６ ｍＡｂのヒト化が直接的抗腫瘍効果に加えてＡＤＣＣからより大きな寄与を引き起こすことを示すものである。一方で、ｈｕｍＡｂがＣＤＣ活性を誘導しない正確な理由は、現時点で明らかでないが、理由の１つには、ヒト補体タンパク質に対して拮抗作用を有すＤＡＦおよびＣＤ５９が表面に高発現していることである（データは示されていない）。あるいは、ＣＤＣ活性化の誘導には、本ｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムが適切でない可能性も考えられる。
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを用いた本ｉｎ  ｖｉｖｏ研究において、ｈｕｍＡｂおよび１４Ｄ１０が皮下に接種したＪＭＮ細胞の腫瘍形成能を減少させることが示され、これによって、ｈｕｍＡｂが直接的な抗腫瘍効果も有することが示唆される。また、本結果により、ｈｕｍＡｂが、ＣＤ２６に対してより高い結合親和力を有するために、腫瘍形成の抑制において１４Ｄ１０より強力であることも示唆される。
その一方で、Ｂａｌｂマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、ｈｕｍＡｂおよび１４Ｄ１０が皮下接種したＪＭＮ細胞の腫瘍形成能の抑制において同等の効果を有することを示すものである。これらのデータは、マウスのエフェクター系がｈｕｍＡｂより１４Ｄ１０の抗腫瘍効果を増強する可能性を示唆する。実際に、これらのマウスでは、ｈｕｍＡｂ処置腫瘍検体だけではなく、１４Ｄ１０処置腫瘍検体もまた、腫瘤中の生存細胞の減少を示す。ｈｕｍＡｂと１４Ｄ１０の両方が遠隔転移の形成を抑えることも注目に値し、これらの知見はＣＤ２６が特定のＥＣＭタンパク質に対して結合タンパク質として機能するという本ｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果から部分的に説明され得る。
機能的なマウスのエフェクターを欠損しているＮＯＧ−ＳＣＩＤマウスによるｉｎ  ｖｉｖｏの研究において、ヒトのエフェクター細胞と標的細胞との二重異種移植が、ｈｕｍＡｂを組み合わせた際、標的細胞の単一異種移植の場合よりもマウスをより長く生存させることを示した。これらのデータは、明確に、ｈｕｍＡｂがヒトのエフェクター系と共に二相性の抗腫瘍作用を誘導することを示唆するｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータを実証している。
ＣＤ２６の状態は、癌において変化し、様々な腫瘍の増殖や腫瘍転移能に影響を与え得る。ＣＤ２６陰性は、幾つかの癌発生に関連している一方で、ＣＤ２６陽性はその他の新生物の侵襲的な表現型と関連している。例えば、非小細胞肺癌細胞株では、ＣＤ２６をトランスフェクトした細胞は、形態学的変化を起こし、接触阻害を変化させ、足場非依存的増殖能も低下させる (非特許文献２９)。また、ＣＤ２６再発現は、ｐ２１発現上昇と関連しており、アポトーシスの誘導やＧｌ期での細胞周期停止を引き起こす。Wesleyらは、ＣＤ２６をトランスフェクトしたＤＵ−１４５転移性前立腺癌細胞においてはＣＤ２６／ＤＰＰＩＶの発現によってＣＤＫＩ  ｐ２７ｋｉｐ１の発現が、親株およびベクターをトランスフェクトしたＤＵ１−４５細胞との比較において、４−６倍増大することを報告した(非特許文献３０)。また、卵巣癌のＣＤ２６過剰発現によってＥ−カドヘリンとＭＭＰの組織阻害物質が増加し、結果として侵襲性が減少することも報告されている(非特許文献３１)。従って、ＣＤ２６／ＤＰＰＩＶは上記の場合においては腫瘍のサプレッサーとして機能し、ＣＤ２６／ＤＰＰＩＶのダウンレギュレーションは増殖制御の欠陥につながり得る。対照的に、ＣＤ２６発現はＴ細胞大型顆粒リンパ球白血病(Ｔ−ＬＧＬＬ)において、より侵襲的な臨床経過と関連している(非特許文献３２)。
非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)におけるＣＤ２６発現は、主にＴ−リンパ芽球性リンパ腫(ＬＢＬ)/急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)やＴ細胞ＣＤ３０陽性未分化大型細胞リンパ腫(ＡＬＣＬ)などの侵襲的なサブタイプで見られる。先の報告は、より進行の遅い疾患由来の細胞ではＣＤ４０Ｌが発現しているものの、ＣＤ２６とＣＤ４０Ｌの発現が互いに排他的であることを示した。特筆すべきは、Ｔ細胞ＬＢＬ/ＡＬＬにおけるＣＤ２６発現が生存率の悪化と関連していることである（非特許文献３３）。腎細胞癌（ＲＣＣ）では、ＲＣＣ組織やＣａｋｉ−２、ＶＭＲＣ−ＲＣＷおよびＣａｋｉ−１などのＲＣＣ由来の多くの細胞株の細胞表面上にＣＤ２６が高発現している。そのうえ、抗ＣＤ２６ ｍＡｂを介したＣａｋｉ−２細胞株の増殖害がＧｌ/Ｓ細胞周期停止、ｐ２７ｋｉｐ１発現量の増大、およびＣＤＫ２のダウンレギュレーションと関連している(非特許文献１８)。そこで本研究においては、ＣＤ２６がＭＭ組織において高発現しており、ＣＤ２６陽性のＭＭ細胞株において抗ＣＤ２６ ｍＡｂ処置およびＲＮＡｉによるＣＤ２６のダウンレギュレーションによって接触阻害およびｐ２７ｋｉｐ１アップレギュレーションが誘導されることを示す。
したがって、Ｔ細胞リンパ腫、腎細胞癌および悪性中皮腫などの悪性腫瘍の場合には、ＣＤ２６は、腫瘍増殖に寄与し、浸潤や転移に関与している可能性がある。これまでに知られている複雑な作用から見て、癌におけるＣＤ２６の役割は、各腫瘍のタイプごとに個別に評価する必要がある。
悪性中皮腫は、予後の見通しの悪い侵襲的な新生物であり、化学療法に対する感受性が比較的低い。１つの研究が、系統的に、１９６５年から２００１年６月まで化学療法効果の証拠を再検討し、８８トリートメントアームで８３試験を見出だした(非特許文献３４)。シスプラチンは最もよく作用する単剤で、ドキソルビシンと併用したシスプラチンは、最大応答率(２８．５％の応答率、２１．３−３５．７％の信頼区間)を示した。この報告以来、シスプラチン（cisplatis）/pemetrexed(代謝拮抗物質)の併用あるいはシスプラチン単独を用いたｐｈａｓｅＩＩＩ無作為試験(切断不能の中皮腫の化学療法ナイーブ患者４４８人に対する試験)の結果によって、余命の中央値が、シスプラチン単独治療患者では９．３ヶ月であったが、両方の薬剤で治療された患者では１２．１ヶ月まで延長することが証明された（非特許文献３５）。しかしながら、ＭＭに対する標準的治療法は生存率という観点ではまだ満足できるものではない。したがって、ＭＭの新規な治療方法が緊急に求められている。
したがって、本データによって、本発明の新規なヒト化抗ＣＤ２６ ｍＡｂ ｈｕｍＡｂは、直接的抗腫瘍効果に加え癌細胞をターゲッティングするヒトのエフェクター系も利用可能なため、ＭＭを含む癌治療に対して有効な治療ツールであることが示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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