(57)【要約】  本願は、ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス（ＷＮＶ）ポリペプチドおよびそのフラグメントに関する多様な組成物、ならびに本明細書に記載のＷＮＶポリペプチドの発現をコード、指令するか、またはＷＮＶポリペプチドを産生するポリヌクレオチド、ベクターおよび形質転換された宿主細胞を提供する。本明細書では、個体における免疫応答を起こすためにポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用する方法、またはＷＮＶ特異的もしくは中和抗体の存在を検出する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  配列番号５、９、１１、１３もしくは１５を含んでなる単離された、精製された、および／または組み換えポリペプチド；
ｂ）  配列番号５、９、１１、１３、１５に記載のポリペプチドのフラグメント、または「ＹからＺ」である配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のフラグメントであって、Ｙは指定配列のＮ−末端アミノ酸であり、そしてＺは表９、１０、１１、もしくは１２のいずれか１つに記載の特定の配列のＣ−末端アミノ酸であるフラグメント、または表１５もしくは１６に記載のポリペプチドのフラグメント；
ｃ）  個体に投与する場合中和抗体応答を生じる、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチド、または配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチドのフラグメント；
ｄ）  異種ポリペプチド配列をさらに含んでなる、ａ）、ｂ）またはｃ）に記載のポリペプチド；
ｅ）  ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）に記載の植物由来のポリペプチド；
ｆ）  キャリア、およびａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）のいずれか１つに記載のポリペプチドを含んでなる組成物であって、前記キャリアは、緩衝液中に懸濁されていてもよい植物、哺乳動物もしくは細菌発現系由来の細胞材料、アジュバントまたは薬学的に許容可能な賦形剤を含んでなる組成物；
ｇ）  配列番号５、９、１１、１３もしくは１５を含んでなるポリペプチドをコードするか、または（ｂ）または（ｃ）に記載の配列番号５、９、１１、１３もしくは１５の１つもしくはそれ以上のポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４０％かつ５０％未満のＧ＋Ｃ含有量または表１３に記載のＧ＋Ｃ含有量を有してもよいポリヌクレオチド配列；
ｈ）  配列番号１に少なくとも７０％（または表１４において特定されるパーセンテージ）同一であり、配列番号２を含んでなるポリペプチドをコードし、そして約４０％〜約５０％の間のＧ＋Ｃ含有量（または表１３において特定される特定のＧ＋Ｃ含有量）を有するポリヌクレオチド配列；
ｉ）  （ｇ）または（ｈ）に記載のポリヌクレオチド配列のポリヌクレオチド配列少なくとも８連続ヌクレオチド；
ｊ）  配列番号３、４、６、７、８、１０、１２、もしくは１４、または配列番号３、４、６、７、８、１０、１２、もしくは１４の少なくとも８連続ヌクレオチドのフラグメントを含んでなるポリヌクレオチド配列；
ｋ）  （ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、または（ｊ）に記載のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド；
ｌ）低、中もしくは高ストリンジェンシー下で、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｉ）または（ｋ）に記載のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｍ）  （ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｉ）または（ｋ）に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子構築物；
ｎ）  （ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）もしくは（ｌ）に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物を含んでなるベクター；
ｏ）  （ｎ）に記載のベクター、（ｍ）に記載の遺伝子構築物、または（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）もしくは（ｋ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞；
ｐ）  （ｎ）に記載のベクター、（ｍ）に記載の遺伝子構築物、または（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）もしくは（ｋ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック植物、植物細胞、または植物部分；あるいは
ｑ）  （ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）もしくは（ｌ）に記載のポリヌクレオチド、および任意選択的に、標識またはマーカーを含んでなるプローブ、
を含んでなる、組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが植物細胞において産生され、
ａ）  前記ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含んでなる組み換えベクターで植物細胞を形質転換して、形質転換植物細胞を形成すること；
ｂ）  前記ポリペプチドの発現に適切な条件下で前記形質転換植物細胞を培養すること；および
ｃ）  前記形質転換植物細胞から前記ポリペプチドを回収すること
を含んでなる、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントが異種ポリペプチド配列に融合される、請求項２または３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに対して個体を免疫するための方法であって、前記個体において免疫応答を誘導するのに十分な量の組成物を投与することを含んでなり、前記組成物は：キャリア、および（ｉ）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５；（ｉｉ）個体に投与する場合中和抗体応答を生じる、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチド、または配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチドのフラグメント；（ｉｉｉ）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５の少なくとも５連続アミノ酸のフラグメント；あるいは（ｉｖ）表９、１０、１１、１２、１５、もしくは１６に記載のフラグメントを含んでなるポリペプチドを含んでなり、前記ポリペプチドもしくはフラグメントは、感染性ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに対する免疫防御応答または感染性ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスを中和する抗体応答を誘導する、方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドフラグメントが異種ポリペプチド配列に融合される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドまたはそのフラグメントが、植物産生ポリペプチドまたは植物産生ポリペプチドフラグメントである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス（ＷＮＶ）株に対する免疫応答を誘導する方法であって：（Ａ）：（ｉ）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５；（ｉｉ）個体に投与する場合中和抗体応答を生じる、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチド、または配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチドのフラグメント；（ｉｉｉ）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５の少なくとも５連続アミノ酸のフラグメント；あるいは（ｉｖ）表９、１０、１１、１２、１５、もしくは１６に記載のフラグメントを含んでなるポリペプチドをコードする核酸配列（ここで、前記ポリペプチドもしくはフラグメントは、感染性ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに対する免疫防御応答または感染性ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに対する中和抗体応答を誘導する）；（Ｂ）：配列番号５、９、１１、１３もしくは１５；（ｉｉ）個体に投与する場合中和抗体応答を生じる、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチド、または配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチドのフラグメント；（ｉｉｉ）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５の少なくとも５連続アミノ酸のフラグメント；または（ｉｖ）表９、１０、１１、１２、１５、もしくは１６に記載のフラグメントを含んでなるポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなるウイルスベクター（ここで、前記ポリペプチドもしくはフラグメントは、感染性ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに対する免疫防御応答または感染性ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに対する中和抗体応答を誘導する）；あるいは（Ｃ）：配列番号５、９、１１、１３もしくは１５；（ｉｉ）個体に投与する場合中和抗体応答を生じる、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチド、または配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチドのフラグメント；（ｉｉｉ）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５の少なくとも５連続アミノ酸のフラグメント；または（ｉｖ）表９、１０、１１、１２、１５、もしくは１６に記載のフラグメントを含んでなる少なくとも１つのポリペプチド（ここで、前記ポリペプチドもしくはフラグメントは、感染性ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに対する免疫防御応答または感染性ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに対する中和抗体応答を誘導する）を個体に、前記動物において免疫応答を誘導するのに十分な量で投与することを含んでなる、方法。
【請求項８】
前記方法が、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５；（ｉｉ）個体に投与する場合中和抗体応答を生じる、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチド、または配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチドのフラグメント；（ｉｉｉ）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５の少なくとも５連続アミノ酸のフラグメント；あるいは（ｉｖ）表９、１０、１１、１２、１５、もしくは１６に記載のフラグメントを含んでなるポリペプチドを含んでなる組成物の投与によって、前記動物の免疫応答を追加免疫することをさらに含んでなり、前記ポリペプチドもしくはフラグメントは、感染性ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに対する免疫防御応答または感染性ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに対する中和抗体応答を誘導する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドのフラグメントが、異種ポリペプチド配列に融合される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドの前記ポリペプチドまたはフラグメントが植物由来であるか、またはトランスジェニック植物もしくは植物部分から得られる、請求項７、８または９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが原核細胞または真核細胞において調製される、請求項４、５、８または９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
抗体をポリペプチドに結合させる方法であって、抗体を含有するサンプルと、ａ）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５を含んでなる単離された、精製された、および／または組み換えポリペプチド；ｂ）配列番号５、９、１１、１３、１５に記載のポリペプチドのフラグメント、または「ＹからＺ」である配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のフラグメント（ここで、Ｙは指定配列のＮ−末端アミノ酸であり、そしてＺは表９、１０、１１、もしくは１２のいずれか１つに記載の指定配列のＣ−末端アミノ酸である）、表１５もしくは１６に記載のポリペプチドのフラグメント；ｃ）個体に投与する場合中和抗体応答を生じる、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチド、または配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチドのフラグメント；あるいはｄ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で異種ポリペプチド配列をさらに含んでなるａ）、ｂ）またはｃ）のいずれか１つに記載のポリペプチドを含んでなるポリペプチドとを接触させることを含んでなる、方法。
【請求項１３】
前記抗体−抗原複合体の形成を検出する工程をさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法がイムノアッセイである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記イムノアッセイが、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、側方流動アッセイ、免疫クロマトグラフストラップアッセイ、自動化流動分析、ウエスタンブロット、免疫沈降アッセイ、逆流クロマトグラフィー結合アッセイ、凝集アッセイ、およびバイオセンサからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、同じポリペプチドを含んでなるポリペプチド、あるいは他のウイルスから誘導されるポリペプチドを含んでなるポリペプチドと、ａ）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５を含んでなる単離された、精製された、および／または組み換えポリペプチド；ｂ）配列番号５、９、１１、１３、１５に記載のポリペプチドのフラグメント、または「ＹからＺ」である配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のフラグメント（ここで、Ｙは指定配列のＮ−末端アミノ酸であり、そしてＺは表９、１０、１１、もしくは１２のいずれか１つに記載の指定配列のＣ−末端アミノ酸である）、表１５もしくは１６に記載のポリペプチドのフラグメント；ｃ）個体に投与する場合中和抗体応答を生じる、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチド、または配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチドのフラグメント；あるいはｄ）異種ポリペプチド配列をさらに含んでなるａ）、ｂ）またはｃ）のいずれか１つに記載のポリペプチドから選択される１つもしくはそれ以上のポリペプチドとの組み合わせのアレイを使用して実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドを製造する方法であって：
ａ）  （ｉ）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５；（ｉｉ）配列番号５、９、１１、１３、１５に記載のポリペプチドのフラグメント、または「ＹからＺ」である配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のフラグメント（ここで、Ｙは指定配列のＮ−末端アミノ酸であり、そしてＺは表９、１０、１１、もしくは１２のいずれか１つに記載の指定配列のＣ−末端アミノ酸である）、または表１５もしくは１６に記載のポリペプチドのフラグメント；（ｉｉｉ）個体に投与する場合中和抗体応答を生じる、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチド、または配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチドのフラグメント；あるいはｉｖ）異種ポリペプチド配列をさらに含んでなる（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のポリペプチドを含んでなる少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで細胞を形質転換すること；
ｂ）  前記形質転換植物細胞の増殖および前記ポリペプチドの蓄積を可能にする条件下で、前記形質転換細胞を培養すること；ならびに
ｃ）  前記細胞から前記少なくとも１つのポリペプチドを回収または精製すること
を含んでなる、方法。
【請求項１８】
細胞が、下等植物細胞、単子葉植物細胞、および双子葉植物細胞；原核細胞；または哺乳動物細胞系統からなる群から選択される形質転換植物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
形質転換植物細胞がタバコ細胞系統である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タバコ細胞系統がＮＴ−１である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年１２月２２日に出願されたU.S. Provisional Application Serial No. 60/871,518の利益を要求し、すべての図面、表およびアミノ酸または核酸配列を含むその開示内容は、出典明示により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、ＵＳＤＡ−ＡＲＳ  ＣＲＡＤＡ協定番号５８−３Ｋ９５−Ｍ−１０４０下、政府の支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
抗体によるウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス（ＷＮＶ）中和の理解は、ＷＮＶおよびその近縁の種のセントルイス（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ）脳炎ウイルス、マレー渓谷（Ｍｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ）脳炎ウイルス（ＭＶＥＶ）、および日本脳炎ウイルス、ならびにデングウイルス、黄熱病ウイルス、およびダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）のようなより遠縁の種の研究から生じている。フラビウイルスエンベロープタンパク質の配列において強い類似性が認められることとエンベロープタンパク質内の分子内結合を形成するシステインの位置がほぼ同一であること（非特許文献１）から、すべてのフラビウイルスのエンベロープタンパク質は極めて類似の構造を有するべきであることが示唆される。従って、いずれのフラビウイルスに関する情報についても、一般的に、他のものに適用可能である。
【０００４】
非特許文献２および非特許文献３は、フラビウイルスが、３つのタンパク質のみ、エンベロープタンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）、およびカプシドタンパク質（Ｃ）を含有することを示した。デングウイルスに関する最近の構造研究（非特許文献４）により、このことが確認され、そしてビリオンにおけるこれらのタンパク質の物理的な関連が示された。Ｅタンパク質のみが、ビリオン表面上に暴露される（非特許文献４）。これまでに、ＷＮＶ、ＴＢＥＶ、およびデングのＥタンパク質の３次元構造が解明されている（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。これらは、３つの明確に異なるドメインを有するフィンガー様構造を有し、ドメインＩは、ドメインＩＩおよびＩＩＩの間の中間に存在する。Ｅタンパク質の個々の分子は、分子のペアが反対方向で相互に隣り合わせに横たわり、３つのペアが並んで横たわりながら、ビリオン表面に沿って平坦な状態で横たわる。
【０００５】
フラビウイルスＥのタンパク質は、すべてのウイルスタンパク質を含むゲノム長のポリタンパク質の部分として合成される。それは、続いて、タンパク質切断によりポリタンパク質から遊離される。ポリタンパク質内部の初期の切断は、プレ膜（ｐｒ）およびＭタンパク質にまだ結合しているＥタンパク質を解離し、ｐｒとＭタンパク質の組み合わせは「ｐｒＭ」タンパク質として知られている。生じたｐｒＭ−Ｅタンパク質は、小胞体膜に挿入され、ここで、それは、その成熟した立体構造へフォールディングし始める。ウイルスは、細胞内コンパートメントで表面上のｐｒＭ−Ｅによって組み立てられる。その後の切断は、ＥおよびｐｒＭタンパク質を分離し、ｐｒＭを切断して、成熟Ｍタンパク質を産出する。ｐｒフラグメントはビリオンに組み入れられない。Ｅタンパク質は、グリコシル化配列を有していても、有していなくてもよく、それゆえグリコシル化されてもいても、されていなくてもよい（非特許文献７）。
【０００６】
フラビウイルスは、おそらく、Ｅタンパク質ドメインＩＩＩのＲＧＤ配列と細胞表面インテグリンとの間の相互作用を介して細胞膜に結合し（非特許文献８）、そしてエンドソームを介して進入することにより、細胞に感染する。エンドソームが酸性化する場合、ビリオンのエンベロープタンパク質は、分子内および分子外の立体構造の広範かつ不可逆的な変化を受ける。１８０個の個々のＥタンパク質分子がそれらの二量体から解離し、それらのドメインを再配向し、次いで接合して、ビリオン膜から突出している６０個の三量体スパイクを形成し、スパイクの先端をエンドソーム膜に挿入し、次いでビリオン膜とエンドソーム膜とを融合する三量体スパイクの１２個の五量体環に凝集し、それにより、カプシドは、細胞の細胞質に侵入し、次いで複製を開始することが可能になる（非特許文献９）。ビリオン表面由来の二量体の可溶化が、いくつかの中和関連エピトープを除去することは明らかである（非特許文献１０）が、再構築および三量体形成がどのようにしてＥタンパク質抗原部位を変更するかについては不明である（非特許文献１１）。
【０００７】
Ｅタンパク質のみがビリオン表面上に暴露されるため、無傷（ｉｎｔａｃｔ）な感染性ビリオンに結合し、中和する抗体は、Ｅタンパク質に結合するはずである。このことは、ウイルスから精製されたタンパク質（非特許文献１２）および組み換え系で産生されたウイルスタンパク質（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献２；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）で免疫した動物における中和抗体の発生を示すことにより、ならびに（非特許文献２１；非特許文献１４；非特許文献２２において総説された）Ｅタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いる受動防御実験により証明された。
【０００８】
Ｅタンパク質上のいくつかの領域に結合する抗体は、ウイルスを中和することが予想され、その他の領域に結合する抗体は、ウイルスを中和することが予想され得ない。一次アミノ酸配列に結合する抗体の中和活性と、適切に折りたたまれたＥタンパク質の二次および三次構造に結合するそれらとを区別するために、非特許文献２３は、タンパク質の二次および三次構造を破壊するためのジスルフィド結合の還元が、ＷＮＶ  Ｅタンパク質の中和抗体を生じる能力を取り除いたことを示した。この実験は、中和抗体がＥタンパク質の線状構造ではなく二次および三次立体構造に結合することを強く示唆した。このことを確認するために、非特許文献２４は、ＭＶＥＶ  Ｅタンパク質で推定されるエピトープからペプチドを作製し、たった１つの作製された中和抗体を低いレベルのみで見出した。実際、以後の研究により、モノクローナル抗体は、通常、元々のＥタンパク質または変性したＥタンパク質およびそのペプチドのいずれにも結合することが示されている（非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２４）。元々の構造に結合する抗体のみがウイルスを中和する。
【０００９】
Ｅタンパク質のどの領域が中和抗体により攻撃されるかを正確に示すために、モノクローナル抗体による中和を回避したウイルスの変異が配列決定され、Ｅタンパク質表面上でマッピングされた（非特許文献２７；非特許文献１２；非特許文献２２において総説された）。これらのデータは、おおよその構造モデルの作製を可能にし（非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献２４；非特許文献３１）、続いて、これらを洗練し、変異がＸ線結晶学的方法により定義される３つのすべての構造ドメインにマッピングされることを示した（非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４；非特許文献３５；非特許文献２６；非特許文献３６；非特許文献３７；非特許文献３０）。このことは、抗体が３つのドメインのいずれかに結合することによりフラビウイルスを中和することができることを強く示唆する。それにもかかわらず、ほとんどの研究は、多くの中和モノクローナル抗体が変異の発生を免れたドメインＩＩＩに注目した（非特許文献３８）。ドメインＩＩＩはまた、いくつかの非中和抗体の結合部位である（非特許文献３９）。ドメインＩＩＩは、トリプシン耐性フラグメントとして精製されたビリオンから単離することができるか（非特許文献４０）、または組み換えタンパク質として作製することができる（非特許文献４１）が、中和モノクローナル抗体によるその反応性は、その単一のジスルフィド結合によるその立体構造の維持に依存する。いくつかの抗体は、膜融合移行期中のみにドメインＩ上に暴露されるペプチド（非特許文献４２）またはドメインＩＩＩの立体構造の変化を妨害する部位（非特許文献４３）に結合することにより、ＷＮＶを中和するようである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Nowak, T., and G. Wengler (1987) “Analysis of disulfides present in the membrane proteins of the West Nile flavivirus”Virology 156:127-137.
【非特許文献２】Heinz, F. X., and C. Kunz (1982) “Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus: peptide mapping of large non-structural proteins of European isolates and comparison with other flaviviruses”J Gen Virol 62 (Pt 2):271-285.
【非特許文献３】Heinz, F., and C. Kunz (1977) “Characterization of tick-borne encephalitis virus and immunogenicity of its surface components in mice”Acta Virol 21:308-316.
【非特許文献４】Kuhn, R. J., W. Zhang, M. G. Rossmann, S. V. Pletnev, J. Corver, E. Lenches, C. T. Jones, S. Mukhopadhyay, P. R. Chipman, E. G. Strauss, T. S. Baker, and J. H. Strauss (2002) “Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion”Cell 108:717-725.
【非特許文献５】Mukhopadhyay, S., B. S. Kim, P. R. Chipman, M. G. Rossmann, and R. J. Kuhn (2003) “Structure of West Nile virus”Science 302:248.
【非特許文献６】Rey, F. A., F. X. Heinz, C. Mandl, C. Kunz, and S. C. Harrison (1995) “The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution”Nature 375:291-298.
【非特許文献７】Sanchez, M. D., T. C. Pierson, D. McAllister, S. L. Hanna, B. A. Puffer, L. E. Valentine, M. M. Murtadha, J. A. Hoxie, and R. W. Doms (2005) “Characterization of neutralizing antibodies to West Nile virus”Virology 336:70-82.
【非特許文献８】Lee, E., and M. Lobigs (2000) “Substitutions at the putative receptor-binding site of an encephalitic flavivirus alter virulence and host cell tropism and reveal a role for glycosaminoglycans in entry”J Virol 74:8867-8875.
【非特許文献９】Bressanelli, S., K. Stiasny, S. L. Allison, E. A. Stura, S. Duquerroy, J. Lescar, F. X. Heinz, and F. A. Rey (2004) “Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation”Embo J 23:728-738.
【非特許文献１０】Heinz, F. X., C. W. Mandl, H. Holzmann, C. Kunz, B. A. Harris, F. Rey, and S. C. Harrison (1991) “The flavivirus envelope protein E: isolation of a soluble form from tick-borne encephalitis virus and its crystallization”J Virol 65:5579-5583.
【非特許文献１１】Stiasny, K., S. L. Allison, A. Marchler-Bauer, C. Kunz, and F. X. Heinz (1996) “Structural requirements for low-pH-induced rearrangements in the envelope glycoprotein of tick-borne encephalitis virus”J Virol 70:8142-8147.
【非特許文献１２】Heinz, F. X., and J. T. Roehrig (1990) Flaviviruses, p. 289-305, Immunochemistry of viruses, vol. II. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford.
【非特許文献１３】Bray, M., B. T. Zhao, L. Markoff, K. H. Eckels, R. M. Chanock, and C. J. Lai (1989) “Mice immunized with recombinant vaccinia virus expressing dengue 4 virus structural proteins with or without nonstructural protein NS1 are protected against fatal dengue virus encephalitis”J Virol 63:2853-2856.
【非特許文献１４】Heinz, F. X. (1986) “Epitope mapping of flavivirus glycoproteins”Adv Virus Res 31:103-168.
【非特許文献１５】Jan, L. R., C. S. Yang, L. S. Henchal, H. Sumiyoshi, P. L. Summers, D. R. Dubois, and C. J. Lai (1993) “Increased immunogenicity and protective efficacy in outbred and inbred mice by strategic carboxyl-terminal truncation of Japanese encephalitis virus envelope glycoprotein”Am J Trop Med Hyg 48:412-423.
【非特許文献１６】Konishi, E., S. Pincus, E. Paoletti, R. E. Shope, T. Burrage, and P. W. Mason (1992) “Mice immunized with a subviral particle containing the Japanese encephalitis virus prM/M and E proteins are protected from lethal JEV infection”Virology 188:714-720.
【非特許文献１７】Mason, P. W., S. Pincus, M. J. Fournier, T. L. Mason, R. E. Shope, and E. Paoletti (1991) “Japanese encephalitis virus-vaccinia recombinants produce particulate forms of the structural membrane proteins and induce high levels of protection against lethal JEV infection”Virology 180:294-305.
【非特許文献１８】Men, R. H., M. Bray, and C. J. Lai (1991) “Carboxy-terminally truncated dengue virus envelope glycoproteins expressed on the cell surface and secreted extracellularly exhibit increased immunogenicity in mice”J Virol 65:1400-1407.
【非特許文献１９】Pincus, S., P. W. Mason, E. Konishi, B. A. Fonseca, R. E. Shope, C. M. Rice, and E. Paoletti (1992) “Recombinant vaccinia virus producing the prM and E proteins of yellow fever virus protects mice from lethal yellow fever encephalitis”Virology 187:290-297.
【非特許文献２０】Schlesinger, J. J., J. R. Putnak, and K. H. Eckels (1992) “New approaches to flavivirus vaccine development”Biotechnology 20:289-307.
【非特許文献２１】Heinz, F., and C. Kunz (1977) “Characterization of tick-borne encephalitis virus and immunogenicity of its surface components in mice”Acta Virol 21:308-316.
【非特許文献２２】Roehrig, J. T. (1986) The use of monoclonal antibodies in studies of the structural proteins of togaviruses and flaviviruses, p. 251-278. In S. Schlesinger and M. J. Schlesinger (ed.), The Togaviridae and Flaviviridae. Plenum Press, New York.
【非特許文献２３】Wengler, G., and G. Wengler (1989) “An analysis of the antibody response against West Nile virus E protein purified by SDS-PAGE indicates that this protein does not contain sequential epitopes for efficient induction of neutralizing antibodies”J Gen Virol 70 (Pt 4):987-992.
【非特許文献２４】Roehrig, J. T., A. R. Hunt, A. J. Johnson, and R. A. Hawkes (1989) “Synthetic peptides derived from the deduced amino acid sequence of the E-glycoprotein of Murray Valley encephalitis virus elicit antiviral antibody”Virology 171:49-60.
【非特許文献２５】Guirakhoo, F., F. X. Heinz, and C. Kunz (1989) “Epitope model of tick-borne encephalitis virus envelope glycoprotein E: analysis of structural properties, role of carbohydrate side chain, and conformational changes occurring at acidic pH”Virology 169:90-99.
【非特許文献２６】Holzmann, H., G. Utter, E. Norrby, C. W. Mandl, C. Kunz, and F. X. Heinz (1993) “Assessment of the antigenic structure of tick-borne encephalitis virus by the use of synthetic peptides”J Gen Virol 74 (Pt 9):2031-2035.
【非特許文献２７】Heinz, F. X., R. Berger, W. Tuma, and C. Kunz (1983) “A topological and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick-borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies”Virology 126:525-537.
【非特許文献２８】Cammack, N., and E. A. Gould (1986) “Topographical analysis of epitope relationships on the envelope glycoprotein of yellow fever 17D vaccine and the wild type Asibi parent virus”Virology 150:333-341.
【非特許文献２９】Kolaskar, A. S., and U. Kulkarni-Kale (1999) “Prediction of three-dimensional structure and mapping of conformational epitopes of envelope glycoprotein of Japanese encephalitis virus”Virology 261:31-42.
【非特許文献３０】Mandl, C. W., F. Guirakhoo, H. Holzmann, F. X. Heinz, and C. Kunz (1989) “Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model”J Virol 63:564-571.
【非特許文献３１】Roehrig, J. T., J. H. Mathews, and D. W. Trent (1983) “Identification of epitopes on the E glycoprotein of Saint Louis encephalitis virus using monoclonal antibodies”Virology 128:118-126.
【非特許文献３２】Cecilia, D., and E. A. Gould (1991) “Nucleotide changes responsible for loss of neuroinvasiveness in Japanese encephalitis virus neutralization-resistant mutants”Virology 181:70-77.
【非特許文献３３】Gao, G. F., M. H. Hussain, H. W. Reid, and E. A. Gould (1994) “Identification of naturally occurring monoclonal antibody escape variants of louping ill virus”J Gen Virol 75 (Pt 3):609-614.
【非特許文献３４】Hasegawa, H., M. Yoshida, T. Shiosaka, S. Fujita, and Y. Kobayashi (1992) “Mutations in the envelope protein of Japanese encephalitis virus affect entry into cultured cells and virulence in mice”Virology 191:158-165.
【非特許文献３５】Holzmann, H., K. Stiasny, M. Ecker, C. Kunz, and F. X. Heinz (1997) “Characterization of monoclonal antibody-escape mutants of tick-borne encephalitis virus with reduced neuroinvasiveness in mice”J Gen Virol 78 (Pt 1):31-37.
【非特許文献３６】Jiang, W. R., A. Lowe, S. Higgs, H. Reid, and E. A. Gould (1993) “Single amino acid codon changes detected in louping ill virus antibody-resistant mutants with reduced neurovirulence”J Gen Virol 74 (Pt 5):931-935.
【非特許文献３７】Lin, B., C. R. Parrish, J. M. Murray, and P. J. Wright (1994) “Localization of a neutralizing epitope on the envelope protein of dengue virus type 2”Virology 202:885-890.
【非特許文献３８】Beasley, D. W., and A. D. Barrett (2002) “Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein”J Virol 76:13097-13100.
【非特許文献３９】Sanchez, M. D., T. C. Pierson, D. McAllister, S. L. Hanna, B. A. Puffer, L. E. Valentine, M. M. Murtadha, J. A. Hoxie, and R. W. Doms (2005) “Characterization of neutralizing antibodies to West Nile virus”Virology 336:70-82.
【非特許文献４０】Winkler, G., F. X. Heinz, and C. Kunz (1987) “Characterization of a disulphide bridge-stabilized antigenic domain of tick-borne encephalitis virus structural glycoprotein”J Gen Virol 68 (Pt 8):2239-2244.
【非特許文献４１】Mason, P. W., J. M. Dalrymple, M. K. Gentry, J. M. McCown, C. H. Hoke, D. S. Burke, M. J. Fournier, and T. L. Mason (1989) “Molecular characterization of a neutralizing domain of the Japanese encephalitis virus structural glycoprotein”J Gen Virol 70 (Pt 8):2037-2049.
【非特許文献４２】Kanai R, Kar K, Anthony K, Gould LH, Ledizet M, Fikrig E, Koski RA, Modis Y. (2006) “Crystal structure of West Nile virus envelope glycoprotein reveals viral surface epitopes”J Virol. Aug 30; [Epub ahead of print]
【非特許文献４３】Nybakken et al., 2005
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願は、ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス（ＷＮＶ）ポリペプチドおよびそのフラグメントに関する多様な組成物、ならびに本明細書に記載のＷＮＶポリペプチドの発現をコード、指令するか、またはＷＮＶポリペプチドを産生するポリヌクレオチド、ベクターおよび形質転換された宿主細胞を提供する。本明細書では、個体における免疫応答を生じさせるためのポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いる方法、またはＷＮＶ特異的もしくは中和抗体の存在を検出する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、WO 97/48819に記載のキャッサバベインモザイクウイルス（ｃａｓｓａｖａ  ｖｅｉｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＣｓＶＭＶ）プロモーターおよびオープンリーディングフレーム３’非翻訳領域、ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ００４９３）ｖ１を含有するプラスミドｐＤＡＢ２４０６を示す。ＣｓＶＭＶプロモーターとＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１との間に位置する、独特な部位、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩを、目的の遺伝子を挿入するために用いた。
【図２】図２は、ベクターｐＤＡＢ２４１８を表す。ｐＤＡＢ２４１８は、ＲＢ７マトリックス付着領域（ＭＡＲ）（U.S. Patent No. 5,773,689；U.S. Patent No. 5,773,695；U.S. Patent No. 6,239,328、WO 94/07902、およびWO 97/27207）および植物転写単位を含み、ここで、植物選択マーカーホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）（U.S. Patent Nos:5,879,903；5,637,489；5,276,268；および5,273,894）は、ＡｔＵｂｉ１０プロモーター（Sun C.-W. et al., 1997；Norris, S.R. et al., 1993；Callis, J. et al, 1995）により促進され、下流にＡｔｕＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３（US5428147；Barker, R.F., et al., 1983；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ００４９３）が配置される。ＲＢ７  ＭＡＲ遺伝子と植物ＡｔＵｂｉ１０プロモーターとの間に位置する独特なＮｏｔＩ部位を、ＣｓＶＭＶプロモーター、目的の遺伝子、およびＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含むｐＤＡＢ２４０６から遺伝子フラグメントをクローニングするために使用した。
【図３】図３は、改変された基本バイナリー（ｂａｓｉｃ  ｂｉｎａｒｙ）ベクター、ｐＤＡＢ２４０７を示す。このバイナリーベクターを、ｐＢＢＶ（基本バイナリーベクター）の独特なＢａｍＨＩ部位においてＡｇｅＩリンカーを付加し、Ｔ−ＤＮＡ境界間でＷＮＶ抗原と選択マーカー発現カセットのＡｇｅＩ／ＡｇｅＩ連結を可能にすることにより構築した。
【図４】図４は、ＥＲ標的ｖ２およびＫＤＥＬ残留のｖ３シグナル（配列番号１２）を有する、タバココドンでバイアス化された（ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓｅｄ）ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス膜およびエンベロープペプチド（バージョン２）からなるキメラタンパク質をコードするウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス双子葉（ｄｉｃｏｔ）バイナリーベクターｐＤＡＢ２４７５を表す。
【図５】図５は、ＥＲ標的ｖ２およびＫＤＥＬ残留ｖ３シグナル（配列番号８）を有するタバココドンでバイアス化された、ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスプレ膜ｖ２、膜およびエンベロープペプチドｖ２からなるキメラタンパク質をコードする双子葉バイナリーベクター（ｐＤＡＢ２４７８）を示す。
【図６】図６は、ＥＲ標的ｖ２およびＫＤＥＬ残留ｖ３シグナル（配列番号１０）を有するタバココドンでバイアス化されたウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスプレ膜ｖ２、膜ｖ２、およびエンベロープペプチドからなるキメラタンパク質をコードする双子葉バイナリーベクター、ｐＤＡＢ２４８１に関する。
【図７】図７は、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）技術により９つのバイナリー構築物を構築するのに用いた目的ベクター、ｐＤＡＢ３７３６を表す。
【図８】図８は、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）技術により９つのバイナリー構築物を構築するのに用いたドナーベクター、ｐＤＡＢ３９１２を表す。
【図９】図９は、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）技術により９つのバイナリー構築物を構築するのに用いたドナーベクター、ｐＤＡＢ３９１４を表す。
【図１０】図１０は、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）技術により９つのバイナリー構築物を構築するのに用いたドナーベクター、ｐＤＡＢ３９１６を表す。
【図１１】図１１は、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）技術により９つのバイナリー構築物を構築するのに用いたドナーベクター、ｐＤＡＢ３７２４を表す。
【図１２】図１２は、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）ＷＮＶ  ＭＥバイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９２０を示す。ｐＤＡＢ３９２０は、Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２／ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３  ／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａをコードする。
【図１３】図１３は、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９２２を示す。ｐＤＡＢ３９２２は、以下のエレメント：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＡｔｕＭＡＳ  ４ＯＣＳプロモーターｖ４／１５ｋＤａゼインＥＲ  ｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有する。
【図１４】図１４は、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスバイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９２４を表す。ｐＤＡＢ３９２４ベクターは、以下のエレメント：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／Ａｔ  Ｕｂｉ１０プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｌ０５３６３）ｖ２／１５ｋＤａゼインＥＲ  ｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有する。
【図１５】図１５は、以下のエレメント：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２／１５ｋＤａゼインＥＲシグナルｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有するＧａｔｅｗａｙ（商標）バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９２７に関する。
【図１６】図１６は、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９２９を提供する。ｐＤＡＢ３９２９は、Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２／Ｎｔ  ｏｓｍ  ５’ＵＴＲ  ｖ３／１５ｋＤａゼインＥＲ  ｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３／Ｎｔ  ｏｓｍ  ３’ＵＴＲ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有する。
【図１７】図１７は、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９３４である。このベクターは、以下のエレメント：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲ／ＫＤＥＬｖ３／ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ３／１５ｋＤａゼインＥＲシグナルｖ２（配列番号１４）／ＡｔｕＭＡＳ  ４ＯＣＳプロモーターｖ４／１５ｋＤゼインＥＲシグナルｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有する。
【図１８】図１８は、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９４１を示す。ｐＤＡＢ３９４１は、以下の成分：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２／１５ｋＤゼインＥＲ  ｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ３プロモーターｖ２／１５ｋＤゼインＥＲ  ｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ３−ＫＤＥＬｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有する。
【図１９】図１９は、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９４３を提供する。このベクターは、以下のエレメント：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＣｓＶＭＶｖ２／改変されたグリコシル化部位（ｖ５）を有するＷＮＶ  Ｍ  ｖ２  Ｅ／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有する。
【図２０】図２０は、ＥＬＩＳＡにより検出されるごとく、ｐＤＡＢ２４７５（ＥＲ標的化、ＭＥバージョン２、ＫＤＥＬ）で形質転換された１４日目のカルス事象のＥタンパク質発現を提供する。
【図２１】図２１は、ＥＬＩＳＡにより検出されるごとく、ｐＤＡＢ２４７８（ＥＲ標的化、ｐｒＭＥバージョン２、ＫＤＥＬ）で形質転換された１４日目のカルス事象のＥタンパク質発現を提供する。
【図２２】図２２は、ＥＬＩＳＡにより検出されるごとく、ｐＤＡＢ２４８１（ＥＲ標的化、改変されたグリコシル化部位を有するｐｒＭＥ（バージョン４）、ＫＤＥＬ）で形質転換された１４日目のカルス事象のＥタンパク質発現を提供する。
【図２３】図２３は、ｐＤＡＢ２４７５、ｐＤＡＢ２４７８、およびｐＤＡＢ２４８１で形質転換された事象間の発現レベルを比較する。ｐＤＡＢ２４７５に由来する有意に高いタンパク質回収能を図に示す。
【図２４】図２４は、ウエスタンブロットにより分析した選択事象由来のサンプル（１４日目のカルス）を示す。ｐＤＡＢ２４７５事象の多くから、真正の成熟ビリオンＥタンパク質の予想される〜５４ｋＤａサイズで、全長Ｅタンパク質が検出された。
【図２５】図２５は、ｐＤＡＢ２４７８構築物により検出された全長Ｅタンパク質を発現する事象がより少なかったことを示す。
【図２６】図２６は、ｐＤＡＢ２４８１構築物により検出された全長Ｅタンパク質を発現する事象がより少なかったことを示す。
【図２７】図２７は、ｐＤＡＢ３９２０、ｐＤＡＢ３９２２、ｐＤＡＢ３９２４、ｐＤＡＢ３９２７、ｐＤＡＢ３９２９、ｐＤＡＢ３９４３、ｐＤＡＢ３９３４およびｐＤＡＢ３９４１のすべての事象の１４日目のカルス由来のＥＬＩＳＡの結果を比較する。
【図２８】図２８は、ウエスタンブロットにより分析したｐＤＡＢ３９２０およびｐＤＡＢ３９２２の事象由来の１４日目のカルスサンプルを示す。
【図２９】図２９は、ウエスタンブロットにより分析したｐＤＡＢ３９２４およびｐＤＡＢ３９２７の事象由来の１４日目のカルスサンプルを示す。
【図３０】図３０は、ウエスタンブロットにより分析したｐＤＡＢ３９２９およびｐＤＡＢ３９３４の事象由来の１４日目のカルスサンプルを示す。
【図３１】図３１は、１０リットルのＳＴＲ発酵実施中（バッチＩＤ  ＷＮＶ  ＳＲＤ０５００６）のＷＮＶ事象１６２２−２０７のオンライン発酵プロファイルを示す。撹拌器の速度低下により、発酵終了時付近の酸素取り込み率が減少した。
【図３２】図３２は、バッチＩＤ  ＷＮＶ  ＳＲＤ０５００６の発酵残存物分析を提供する。
【図３３】図３３は、バッチＩＤ  ＷＮＶ  ＳＲＤ０５００７の発酵残存物分析を提供する。
【図３４】図３４は、組み換えウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス事象１６２２−２０７および１６２２−２１０について、９日間にわたり調べられるごときタバコ（Ｎ．ｔｏｂａｃｕｍ）ＮＴ−１懸濁細胞におけるＭＥ産生の反応速度を示す。２１８時間（９．０８日間；Ｘ軸の時間から４２時間の前播種期間を差し引く）の１０リットル撹拌タンクリアクタ発酵中のＷＮＶエンベロープタンパク質の産生を示す。ＭＥ事象１６２２−２１０および１６２２−２０７の最大容積生産性は、それぞれ、播種後１６４時間（２０６−４２時間）、および１８８時間（２３０−４２時間）に生じた。
【図３５】図３５は、マウス臨床モデル研究（研究Ｉ）由来のＷＮＶ血清中和力価の図示を提供する。図を、＞２５６０の中和力価を２５６０に変更し、そして＜２０の力価を２０に変更し、各処置グループの血清中和幾何平均力価（ＧＭＴ）を算出することにより作製した。
【図３６】図３６は、異なる抗原の用量および異なるアジュバントを用いた処方（研究ＩＩ）により示される変動性の応答を示す。
【００１３】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ｐｒＭ−、Ｍ−、およびＥ−ペプチドをコードするＧｅｎＢａｎｋ受入ＡＦ１９６８３５由来のウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスのフラミンゴ単離体の元々のＤＮＡ配列（バージョン１）である。元々のＷＮＶ  ｐｒＭ−Ｍ−Ｅペプチドをコードする領域は、２００４塩基長であり、ｐｒＭペプチド（塩基１〜２７６）、Ｍ−ペプチド（塩基２７７〜５０１）およびＥ−ペプチド（塩基５０２〜２００４）をコードする。
【００１４】
配列番号２は、配列番号１によりコードされる元々のｐｒＭ−、Ｍ−、およびＥ−ペプチドのアミノ酸配列である。ｐｒＭペプチドはアミノ酸１〜９２であり、Ｍ−ペプチドはアミノ酸９３〜１６７であり、Ｅ−ペプチドはアミノ酸１６８〜６６８である。
【００１５】
配列番号３は、ｐｒＭ−、Ｍ−およびＥ−ペプチドのタバコ最適化ＤＮＡ配列（バージョン２）である。配列番号３は２００４塩基長であり、ｐｒＭ−ペプチドは塩基１〜２７６によりコードされ、Ｍ−ペプチドは塩基２７７〜５０１によりコードされ、Ｅ−ペプチドは塩基５０２〜２００４によりコードされる。
【００１６】
配列番号４は、変異Ｎ−グリコシル化部位を伴うｐｒＭ−、Ｍ−およびＥ−ペプチドのタバコ最適化ＤＮＡ配列（バージョン４）である。プロリンコドンはｎｔ９６７〜９６９であり、配列は２００４塩基長である。ｐｒＭ−ペプチドは塩基１〜２７６によりコードされ、Ｍ−ペプチドは塩基２７７〜５０１によりコードされ、Ｅ−ペプチドは塩基５０２〜２００４によりコードされる。
【００１７】
配列番号５は、配列番号４によりコードされ、変異Ｎ−グリコシル化部位を含有するｐｒＭ−、Ｍ−、およびＥ−ペプチドのアミノ酸配列である。プロリン残基は３２３位であり、配列は６６８アミノ酸長である。ｐｒＭ−ペプチドはアミノ酸１〜９２であり、Ｍ−ペプチドはアミノ酸９３〜１６７であり、Ｅ−ペプチドはアミノ酸１６８〜６６８である。
【００１８】
配列番号６は、Ｍ−およびＥ−ペプチドをコードするタバコ最適化ＤＮＡ配列（バージョン２）である。配列は１７２８塩基長であり、Ｍ−ペプチドは塩基１〜２２５によりコードされる。Ｅ−ペプチドは塩基２２６〜１７２８によりコードされる。
【００１９】
配列番号７は、Ｍ−およびＥ−ペプチドをコードするタバコ最適化ＤＮＡ配列（バージョン３）である。この配列は１７２８塩基長であり、Ｍ−ペプチドは塩基１〜２２５によりコードされる。Ｅ−ペプチドは塩基２２６〜１７２８によりコードされる。
【００２０】
配列番号８は、１５ｋＤａゼインＥＲ標的シグナルペプチド、ｐｒＭ−、Ｍ−およびＥ−ペプチド（バージョン２）、ならびにＫＤＥＬを含むキメラタンパク質をコードするタバコ最適化ＤＮＡ配列である。配列は２１０６塩基長であり、１５ｋＤａのＥＲ標的シグナルは塩基１〜６６によりコードされる。ｐｒＭ−ペプチドは塩基６７〜３４２によりコードされ、Ｍ−ペプチドは塩基３４３〜５６７によりコードされ、Ｅ−ペプチドは塩基５６８〜２０７０によりコードされ、ＫＤＥＬ  ＥＲ残留シグナルは塩基２０７１〜２０８２によりコードされ、６フレーム停止は塩基２０８３〜２１０６に位置する。
【００２１】
配列番号９は、配列番号８によりコードされるキメラ融合タンパク質のアミノ酸配列である。融合タンパク質は、６９４アミノ酸長であり、１５ｋＤａゼインＥＲ標的ペプチド（アミノ酸１〜２２）、ｐｒＭ−ペプチド（アミノ酸２３〜１１４）、Ｍ−ペプチド（アミノ酸１１５〜１８９）、Ｅ−ペプチド（アミノ酸１９０〜６９０）、Ｎ−グリコシル化部位（アミノ酸３４３〜３４５）およびＫＤＥＬ  ＥＲ残留シグナル（アミノ酸６９１〜６９４）を含有する。
【００２２】
配列番号１０は、１５ｋＤａゼインＥＲ標的シグナルペプチド、変異Ｎ−グリコシル化部位を伴うｐｒＭ−、Ｍ−およびＥ−ペプチド（バージョン４）、ならびにＫＤＥＬを含むキメラタンパク質をコードするタバコ最適化ＤＮＡ配列である。配列は２１０６塩基長であり、１５ｋＤａのＥＲ標的シグナルは塩基１〜６６によりコードされ、ｐｒＭ−ペプチドは塩基６７〜３４２によりコードされ、Ｍ−ペプチドは塩基３４３〜５６７によりコードされ、Ｅ−ペプチドは塩基５６８〜２０７０によりコードされ、ＫＤＥＬ  ＥＲ残留シグナルは塩基２０７１〜２０８２によりコードされ、６フレーム停止は塩基２０８３〜２１０６に位置する。
【００２３】
配列番号１１は、配列番号１０によりコードされるキメラ融合タンパク質のアミノ酸配列である。ポリペプチドは６９４アミノ酸長であり、１５ｋＤａゼインＥＲ標的ペプチドはアミノ酸１〜２２に位置する。ｐｒＭ−ペプチドはアミノ酸２３〜１１４において見出され、Ｍ−ペプチドはアミノ酸１１５〜１８９において見出され、Ｅ−ペプチドはアミノ酸１９０〜６９０において見出され、変異Ｎ−グリコシル化部位はアミノ酸３４３〜３４５に存在し、ＫＤＥＬ  ＥＲ残留シグナルはアミノ酸６９１〜６９４に存在する。
【００２４】
配列番号１２は、１５ｋＤａゼインＥＲ標的シグナルペプチド、Ｍ−およびＥ−ペプチド（バージョン２）ならびにＫＤＥＬを含むキメラタンパク質をコードするタバコ最適化ＤＮＡ配列である。配列は１８３０塩基長であり、１５ｋＤａのＥＲ標的シグナルは塩基１〜６６によってコードされ、Ｍ−ペプチドは塩基６７〜２９１によりコードされ、Ｅ−ペプチドは塩基２９２〜１７９４によりコードされ、ＫＤＥＬ  ＥＲ残留シグナルは塩基１７９５〜１８０６によりコードされ、６フレーム停止は塩基１８０７〜１８３０を含んでなる。
【００２５】
配列番号１３は、配列番号１２によってコードされるキメラ融合タンパク質のアミノ酸配列である。この配列は６０２アミノ酸長であり、１５ｋＤａゼインＥＲ標的ペプチドはアミノ酸１〜２２である。Ｍ−ペプチドはアミノ酸２３〜９７に位置し、Ｅ−ペプチドはアミノ酸９８〜５９８に位置し、ＫＤＥＬ  ＥＲ残留シグナルはアミノ酸５９９〜６０２において見出される。
【００２６】
配列番号１４は、１５ｋＤａゼインＥＲ標的シグナルペプチド、Ｍ−およびＥ−ペプチド（バージョン３）ならびにＫＤＥＬを含むキメラタンパク質をコードするタバコ最適化ＤＮＡ配列である。この配列は１８３２塩基長であり、１５ｋＤａのＥＲ標的シグナルは塩基６〜６８によりコードされ、Ｍ−ペプチドは塩基６９〜２９３によりコードされ、Ｅ−ペプチドは塩基２９４〜１７９６によりコードされ、ＫＤＥＬ  ＥＲ残留シグナルは塩基１７９７〜１８０８によりコードされ、６フレーム停止は塩基１８０９〜１８３２を含んでなる。
【００２７】
配列番号１５は、配列番号１４によってコードされるキメラ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列は６０１アミノ酸長であり、１５ｋＤａゼインＥＲ標的ペプチドはアミノ酸１〜２１である。Ｍ−ペプチドはアミノ酸２２〜９６に位置し、Ｅ−ペプチドはアミノ酸９７〜５９７に位置し、ＫＤＥＬ  ＥＲ残留シグナルはアミノ酸５９８〜６０１において見出される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本願は、以下の非制限的組成物、ならびに免疫原性ポリペプチドの産生においてこれらの組成物を用いる方法および個体において免疫応答を誘導する方法を提供する。それゆえ、本発明は、以下を含んでなる多様な組成物を提供する：
ａ）  配列番号５、９、１１、１３もしくは１５を含んでなる単離された、精製された、および／または組み換えポリペプチド；
ｂ）  配列番号５、９、１１、１３、１５に記載のポリペプチドのフラグメント、または「ＹからＺ」である配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のフラグメント（ここで、Ｙは指定配列のＮ−末端アミノ酸であり、そしてＺは指定配列のＣ−末端アミノ酸である）。それ故、配列番号５では、各フラグメントは、５連続アミノ酸〜６６７連続アミノ酸長の間であり得る。配列番号９および１１の５〜６９３連続アミノ酸の間を含有する各フラグメントは、本発明によって特に考慮される。同様に、配列番号１３では、５〜６０１連続アミノ酸の間の各ポリペプチドフラグメントは、本発明によって特に考慮される。さらに、配列番号１５の５〜６００連続アミノ酸の間に及ぶ各ポリペプチドフラグメントもまた、本発明によって特に考慮される。フラグメント「ＹからＺ」（ここで、Ｙは指定配列のＮ−末端アミノ酸であり、そしてＺは指定配列のＣ−末端アミノ酸である）を、配列番号５については表９、配列番号９および１１については表１０、配列番号１３については表１１そして配列番号１５については表１２に提供する。本出願に記載のポリペプチドフラグメントは、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５の全長ポリペプチドの対応する生物活性と実質的に同じである少なくとも１つの生物活性を有する。他の多様な例示的なポリペプチドフラグメントを、表１５または１６に記載する；
ｃ）  個体に投与する場合中和抗体応答を生じる、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチド、または配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のいずれか１つに記載のＥ−ペプチドのフラグメント；
ｄ）  異種ポリペプチド配列をさらに含んでなる、具体例ａ）、ｂ）またはｃ）のいずれか１つに記載のポリペプチド；
ｅ）  具体例ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれか１つに記載の植物由来のポリペプチド；
ｆ）  キャリア、およびａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）のいずれか１つに記載のポリペプチド（ここで、前記キャリアは、（任意選択的に、緩衝液中に懸濁される）植物、哺乳動物もしくは細菌発現系由来の細胞材料、アジュバントまたは薬学的に許容可能な賦形剤である）を含んでなる組成物；
ｇ）  配列番号５、９、１１、１３もしくは１５を含んでなるポリペプチドをコードするか、または（ｂ）または（ｃ）に記載の配列番号５、９、１１、１３もしくは１５の１つもしくはそれ以上のポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列（任意選択的に、ここで、前記ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４０％および５０％未満のＧ＋Ｃ含有量または表１３に記載のＧ＋Ｃ含有量を有する）；
ｈ）  配列番号１に少なくとも７０％（または表１４において指定される百分率）同一であり、配列番号２を含んでなるポリペプチドをコードし、そして約４０％〜約５０％の間のＧ＋Ｃ含有量（または表１３において指定される特定のＧ＋Ｃ含有量）を有するポリヌクレオチド配列；
ｉ）  （ｇ）または（ｈ）に記載のポリヌクレオチド配列のポリヌクレオチド配列少なくとも８連続ヌクレオチド；
ｊ）  配列番号３、４、６、７、８、１０、１２、もしくは１４、または配列番号３、４、６、７、８、１０、１２、もしくは１４の少なくとも８連続ヌクレオチドのフラグメントを含んでなるポリヌクレオチド配列；
ｋ）  （ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、または（ｊ）に記載のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド；
ｌ）  低、中もしくは高ストリンジェンシー下で、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｉ）または（ｋ）に記載のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｍ）  （ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｉ）または（ｋ）に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子構築物；
ｎ）  （ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）もしくは（ｌ）に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物を含んでなるベクター；
ｏ）  （ｎ）に記載のベクター、（ｍ）に記載の遺伝子構築物、または（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）もしくは（ｋ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞；
ｐ）  （ｎ）に記載のベクター、（ｍ）に記載の遺伝子構築物、または（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）もしくは（ｋ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック植物、植物細胞、または植物部分；あるいは
ｑ）  （ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）もしくは（ｌ）によるポリヌクレオチド、および任意選択的に、標識またはマーカーを含んでなるプローブ。
【００２９】
本発明に関して、用語「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、同義的に使用することができるが；しかし、本発明は、天然の形態のポリペプチドにかかわるものではない、即ち、それらは、それらの天然の環境では存在しないが、ポリペプチドは、天然の供給源からの精製によって単離もしくは入手されていてもよく、あるいは遺伝子操作によって調製された宿主細胞から入手されていてもよい（例えば、ポリペプチド、またはそれらのフラグメントは、宿主細胞もしくは化学合成によって組み換え的に産生される）と理解すべきである。本発明によるポリペプチドはまた、以下に記載するような非天然アミノ酸を含有してもよい。用語「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」はまた、本明細書において、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって、一方が他方に接続された一連の残基（典型的に、Ｌ−アミノ酸）を指し示すのに用いられる。リンカーエレメントは、以下に記載のように、ペプチド結合を介するか、または化学結合（例えば、ヘテロ二官能性化学リンカーエレメント）を介して、本発明のポリペプチドに結合されうる。さらに、用語「アミノ酸」および「残基」は、同義的に使用することができる。
【００３０】
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方に関して、用語「連続的」は、本願を通して用語「連続」または語句「連続スパン」と同義的に使用することができる。それ故、いくつかの具体例において、ポリヌクレオチドフラグメントは、少なくともＸヌクレオチドの連続スパンと称されてもよく、ここで、Ｘは、５からはじまる任意の整数であり；本明細書に記載のフラグメントの上限は、特定のポリペプチド（例えば、配列番号９を含んでなるポリペプチド）をコードする全長配列において見出されるヌクレオチドの総数より１ヌクレオチド少ない。例えば、ポリペプチドフラグメントは、「少なくともＸアミノ酸の連続スパン」と称されてもよく、ここで、Ｘは、５からはじまる任意の整数であり；そのようなポリペプチドフラグメントの上限は、特定のポリペプチド（例えば、配列番号５の６６７、配列番号９および１１の６９３、配列番号１３の６０１アミノ酸ならびに配列番号１５の６００アミノ酸）の全長配列において見出されるアミノ酸の総数より１アミノ酸少ない。本明細書で用いられるように、用語「整数」は、数学的な意味における整数（ｗｈｏｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ）を指す。
【００３１】
「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は同義的に使用することができ、本発明によると、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは前記ＤＮＡの転写産物（例えば、ＲＮＡ分子）のいずれかを意味するものと理解される。また、本発明は、それらの天然の環境または天然の状態におけるゲノムのポリヌクレオチド配列にかかわらないことを理解すべきである。本発明の核酸、ポリヌクレオチド、またはヌクレオチド配列は、イオン交換クロマトグラフィー、分子サイズ排除クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない分離方法によって、あるいは増幅、サブトラクティブハイブリダイゼーション、クローニング、サブクローニングもしくは化学合成、またはこれらの遺伝子操作方法の組み合わせのような遺伝子操作方法によって、単離、精製（または部分的に精製）することができる。用語「ポリヌクレオチドワクチン」および「ＤＮＡワクチン」もまた、本明細書において同義的に使用してもよい。
【００３２】
用語「含んでなる」、「からなる」および「から本質的になる」は、それらの標準的な意味に従って定義される。各用語に関連する特定の意味に結びつけるために、本出願を通して、これらの用語を相互に置き換えることもできる。語句「単離された」または「生物学的に純粋な」は、それがその元々の状態において見出される場合、通常、材料に付随する成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。それ故、本発明の単離されたペプチドは、好ましくは、それらのｉｎ  ｓｉｔｕでの環境において、通常、ペプチドに付随する材料を含有しない。「連結」または「結合」は、組み換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、および静電結合を含むが、これらに限定されないペプチドを機能的に結合するための当該技術分野において公知の任意の方法を指す。
【００３３】
それ故、本発明は、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５を含んでなるポリペプチドおよび／または配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のポリペプチドフラグメントを提供する。本発明によるポリペプチドフラグメントは、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５の少なくとも５個の連続アミノ酸の連続スパンを含んでなる。本発明によるポリペプチドフラグメントは、少なくとも５個の連続アミノ酸から配列番号５、９、１１、１３もしくは１５の全長ポリペプチドより１アミノ酸少ない長さの任意の整数であり得る。配列番号５のフラグメントは、限界値を含む５〜６６７の間の連続アミノ酸の任意の数（整数）を含有することができる。配列番号９または１１について、ポリペプチドフラグメントは、限界値を含む５〜６９３の間の連続アミノ酸の任意の数（整数）である。配列番号１３について、ポリペプチドフラグメントは、限界値を含む５〜６０１の間の連続アミノ酸の任意の数（整数）である。配列番号１５について、ポリペプチドフラグメントは、限界値を含む５〜６００の間の連続アミノ酸の任意の数（整数）である。
【００３４】
本発明の各ポリペプチドフラグメントはまた、そのＮ末端およびＣ末端位置に関して記載することもできる。さらに、本明細書に記載のポリペプチドフラグメントの具体例は、「少なくとも」、「同等な」、「同等またはそれより少ない」、「より少ない」、「少なくとも＿であるが、＿より多くない」または「ＹからＺ」であってもよく、ここで、Ｙは特定配列のＮ−末端アミノ酸であり、Ｚは特定配列のＣ−末端アミノ酸であり、フラグメントは少なくとも５アミノ酸長であり、ＹおよびＺは、本明細書で開示される各ポリペプチドの対応するフラグメント長を特定する表（表９、１０、１１、１２、１５、および１６［表に列挙した位置は、添付の配列表で提供されるアミノ酸位置に対応する］を参照のこと）において同定されるそれらの整数により特定される（またはそれらから選択される）任意の整数である。表１０から明らかなように、配列番号９および１１のフラグメントのＮ−末端アミノ酸は１〜６９０の任意の整数であり得、Ｃ−末端アミノ酸は、（限界値を含む５〜６９４の間の連続アミノ酸の任意の数（整数）であるフラグメント長に依存する）５〜６９４の任意の整数である。（表９で示される）配列番号５のフラグメントについて、Ｎ−末端アミノ酸は１〜６６４の任意の整数であり得、Ｃ−末端アミノ酸は、（限界値を含む５〜６６７の間の連続アミノ酸の任意の数（整数）であるフラグメント長に依存する）５〜６６７の任意の整数である。（表１１で示される）配列番号１３のフラグメントについて、Ｎ−末端アミノ酸は１〜５９８の任意の整数であり得、Ｃ−末端アミノ酸は、（限界値を含む５〜６０１アミノ酸の間の連続アミノ酸の任意の数（整数）であるフラグメント長に依存する）５〜６０２の任意の整数である。（表１２で提供される）配列番号１５について、Ｎ−末端アミノ酸は１〜５９７の任意の整数であり得、Ｃ−末端アミノ酸は、（限界値を含む５〜６００アミノ酸の間の連続アミノ酸の任意の数（整数）であるフラグメント長に依存する）５〜６０１の任意の整数である。他で特に示さない限り、本発明のいずれの具体例を記載するのに使用されるすべての範囲が含まれ、所定のポリペプチドのフラグメントは任意の整数の長さであり得るが、但し、ポリペプチドフラグメントの長さは、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５において同定されるポリペプチドより少なくとも１アミノ酸短いことに注意する。この概念を示すために、表１２によって提供される５９８アミノ酸長である４つのフラグメントを提供する。それ故、多様なポリペプチドフラグメントが次のように定義される：ここで、Ｙは配列番号１５の１位であり、Ｚは配列番号１５の５９８位である（ペプチドは５９８アミノ酸長である）；ここで、Ｙは配列番号１５の２位であり、Ｚは配列番号１５の５９９位である（ペプチドは５９８アミノ酸長である）；ここで、Ｙは配列番号１５の３位であり、Ｚは配列番号１５の６００位である（ペプチドは５９８アミノ酸長である）；ここで、Ｙは配列番号１５の４位であり、Ｚは配列番号１５の６０１位である（ペプチドは５９８アミノ酸長である）。
【００３５】
本発明はまた、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５の特定の残基に及ぶ（連続スパンまたは少なくとも５個の連続アミノ酸の連続スパンを含んでなる）多様なポリペプチドフラグメントを提供する。配列番号９および１１では、好適なフラグメントは、１〜２２位のアミノ酸の少なくとも１個［即ち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくはすべての２２個のアミノ酸］、配列番号９または１１の３４３〜３４５位のアミノ酸の少なくとも１個、２個もしくは３個、および配列番号９または１１に記載のアミノ酸６９１〜６９４の少なくとも１個、２個、３個もしくはすべての４個を含む少なくとも５個の連続アミノ酸のフラグメントを含む。アミノ酸のこれらの組み合わせのうちのいくつかを例示する非限定的な例を、表１５または１６に記載する。配列番号５では、特定の具体例は、アミノ酸３２３に及ぶ少なくとも５個の連続アミノ酸のそれらのフラグメントのいずれかを提供する。配列番号１３では、本発明の多様な具体例は、配列番号１３の１〜２２位のアミノ酸の少なくとも１個；および／または配列番号１３の５９９〜６０２位のアミノ酸の少なくとも１個、２個、３個、もしくは４個に及ぶか、あるいはこれらを含む少なくとも５個の連続アミノ酸のポリペプチドフラグメントを提供する。配列番号１５に関して、例示的ポリペプチドフラグメントは、配列番号１５の１〜２１位および／または５９８〜６０１位のアミノ酸の少なくとも１個に及ぶか、あるいはこれらを含むポリペプチドフラグメントを含む。また、さらなるポリペプチドフラグメントを表１５および１６に記載する。本発明のいくつかの態様では、好適なポリペプチドフラグメントは、配列番号５、９、１１、１３または１５において同定される完全なＥ−ペプチド配列である。
【００３６】
本明細書に記載のフラグメントは、（トリプシン、キモトリプシン、もしくはコラゲナーゼのような）タンパク質分解酵素または臭化シアン（ＣＮＢｒ）のような化学試薬で本発明のポリペプチドを切断することにより入手することができる。あるいは、ポリペプチドフラグメントは、高酸性環境、例えば、ｐＨ２．５で作製することができる。そのようなポリペプチドフラグメントは、化学合成によっても、または本発明による発現ベクターで形質転換された宿主を使用しても、等しく良好に調製することができる。形質転換された宿主細胞は、ポリペプチドフラグメントの調節および／または発現のための適切なエレメントの制御下で、これらのフラグメントの発現を可能にする核酸を含有する。
【００３７】
一定の好適な具体例では、本明細書において開示するポリペプチドのフラグメントは、そのフラグメントが由来する全長ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的特性または生物活性を残留する（そのようなフラグメントはまた、「生物学的に活性なフラグメント」とも称され得る。それ故、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５により提供されるポリペプチドの全長ポリペプチドとフラグメントの両方は、１つもしくはそれ以上の以下の特性または生物学的活性：１）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５に特異的な抗体に特異的に結合する；２）ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに感染した動物もしくは人において見いだされる抗体および／またはウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）感染性ウイルス（ウイルスが宿主もしくは標的細胞に感染する能力）を中和する抗体に特異的に結合する能力；ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに感染した動物またはヒトから単離または誘導されるＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ抗原に関して、Ｔ細胞受容体（ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）および／またはＨＴＬ（ヘルパーＴリンパ球受容体））に結合し、活性化する能力；３）動物またはヒトにおいてウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに対する免疫応答を誘導する能力；４）動物またはヒトにおいてウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに対する防御免疫応答を誘導する能力；ならびに／あるいは５）１つもしくはそれ以上の前記ポリペプチドで免疫した動物／個体においてウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス中和抗体（中和抗体とも称される）の産生を誘導する能力を有する。
【００３８】
植物発現系が、本願において提供されるポリペプチド、またはそのフラグメントの産生に用いられる場合、精製されたポリペプチドを含んでなる組成物は、植物細胞成分（例えば、細胞壁、植物細胞膜の細胞マトリックスおよび炭水化物など）または植物細胞マトリックス成分を含むことができる。同様に、真核細胞または原核細胞発現系が、本発明のポリペプチド、またはそのフラグメントの産生に用いられる場合、それぞれの各発現系の細胞膜または細胞壁成分は、部分的に精製されたポリペプチドを含んでなる組成物中に存在してもよい。
【００３９】
本発明のポリペプチド（もしくはそのフラグメント）は、単量体または多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、およびより高い多量体）であってもよい。従って、本発明は、本発明のポリペプチドの単量体および多量体、それらの調製、ならびにそれらを含有する組成物に関する。本明細書に記載の多量体ポリペプチドは、疎水結合、親水結合、イオン結合および／または共有結合により形成されてもよく、ならびに／あるいは例えば、リポソーム形成により間接的に連結されていてもよい。それ故、１の具体例では、本発明のポリペプチドが溶液中で相互に接触する場合、例えば、ホモ二量体またはホモ三量体のような本発明の多量体が形成される。別の具体例では、本発明のポリペプチドが溶液中で（本発明の融合タンパク質における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）本発明のポリペプチドに対する抗体と接触する場合、例えば、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体のような本発明のヘテロ多量体が形成される。他の具体例では、本発明の多量体は、本発明のポリペプチドとの共有結合および／または本発明のポリペプチド間の共有結合によって形成される。そのような共有結合の１つの非限定的な例は、Ｉｇ重鎖に融合された配列番号５、９、１１、１３もしくは１５（またはそのフラグメント）を含んでなるポリペプチドを含んでなる本発明の融合タンパク質によって提供されるような免疫グロブリン重鎖間のジスルフィド結合の形成である（例えば、U.S. Patent No. 5,478,925（その開示内容は出典明示により全体が本明細書に援用される）を参照のこと）。共有結合した多量体を形成することが可能な融合タンパク質の別の例は、オセテオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）である（例えば、International Publication No. WO 98/49305（出典明示によりその全体が本明細書に援用される）を参照のこと）。別の具体例では、本発明の２つもしくはそれ以上のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して結合される。例として、U.S. Patent No. 5,073,627（本明細書において参考として援用される）に記載のペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーにより分離される本発明の多数のポリペプチドを含んでなるタンパク質は、従来の組み換えＤＮＡ技術を用いて産生されてもよい。
【００４０】
他の多量体ポリペプチドは、本発明のポリペプチドをロイシンジッパーまたはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合させることにより形成させることができる。ロイシンジッパーおよびイソロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタンパク質の多量体形成を促進するポリペプチドである。本発明の可溶性多量体タンパク質を産生するのに適当なロイシンジッパードメインの非限定的な例は、出典明示より援用されるＰＣＴ出願  WO 94/10308に記載のものである。溶液中で二量体化または三量体化するポリペプチド配列に融合された本発明のポリペプチドを含んでなる組み換え融合タンパク質は、適当な宿主細胞において発現され、生じた可溶性多量体融合タンパク質は、当該技術分野で公知の技術を用いて培養上清から回収される。
【００４１】
多量体ポリペプチドはまた、当該技術分野において公知の化学的技術を使用して、作製することができる。例えば、本発明の多量体に含有されることが所望されるポリペプチドは、当該技術分野において公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋させてもよい（例えば、出典明示によりその全体が本明細書に援用されるU.S. Patent Number 5,478,925を参照のこと）。さらに、多量体ポリペプチドは、多量体ポリペプチドを構築するのに用いられるポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間にジスルフィド結合を導入することにより作製することができる（例えば、出典明示によりその全体が本明細書に援用されるU.S. Patent No. 5,478,925を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインもしくはビオチンの付加により慣用的に改変されてもよく、当該技術分野において公知の技術を適用して、１つもしくはそれ以上のこれらの改変されたポリペプチドを含有する多量体を作製してもよい（例えば、出典明示によりその全体が本明細書に援用されるU.S. Patent No. 5,478,925を参照のこと）。さらに、当該技術分野において公知の他の技術を適用して、本発明の多量体に含有されることが所望されるポリペプチド成分を含有するリポソームを作製してもよい（例えば、出典明示によりその全体が本明細書に援用されるU.S. Patent No. 5,478,925を参考のこと）。
【００４２】
本明細書において提供されるポリペプチド、ならびにそのフラグメントは、さらに、フラグメントの他の分子、アミノ酸、またはポリペプチド配列への結合を容易にするリンカーエレメント（Ｌ）を含んでなり得る。また、アフィニティー精製プロトコルの使用のために、リンカーを使用して、ポリペプチド、またはそのフラグメントを固相支持体マトリックスに結合させることができる。本発明の実施に適当な「リンカー」の非限定的な例として、（イリノイ州、ロックフォードのＰｉｅｒｃｅにより市販されるもののごとき）化学リンカー、またはポリペプチドの結合組み合わせを可能にするペプチドが挙げられる（出典明示により全体が本明細書に援用されるU.S. Patent Nos. 6,121,424、5,843,464、5,750,352、および5,990,275を参照のこと）。
【００４３】
他の具体例では、リンカーエレメント（Ｌ）は、アミノ酸配列（ペプチドリンカー）であり得る。いくつかの具体例では、ペプチドリンカーは、１つもしくはそれ以上の以下の特徴を有する：ａ）それは、（相互に）連結するポリペプチドの自由な回転を可能にする；ｂ）それは、プロテアーゼによる消化（切断）に耐性または感受性である；ならびにｃ）それは、互いに結合するポリペプチドに相互作用しない。様々な具体例では、本発明による多量体構築物はペプチドリンカーを含み、ペプチドリンカーは５〜６０アミノ酸長である。より好ましくは、ペプチドリンカーは１０〜３０アミノ酸長であり；なおより好ましくは、ペプチドリンカーは１０〜２０アミノ酸長である。いくつかの具体例では、ペプチドリンカーは１７アミノ酸長である。
【００４４】
本発明における使用に適当なペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、ＴｈｒおよびＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸から構成される。好ましくは、ペプチドリンカーはＧｌｙ−Ｓｅｒエレメントを含む。好適な具体例では、ペプチドリンカーは、（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｙを含んでなり、ここで、ｙは１、２、３、４、５、６、７、または８である。他の具体例は、（（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）を含んでなるペプチドリンカーを提供する。一定の好適な具体例では、ｙは３、４、または５の値である。他の好適な具体例では、ペプチドリンカーは、（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）ｙまたは（（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）ｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）を含んでなり、ここで、ｙは１、２、３、４、５、６、７、もしくは８である。一定の好適な具体例では、ｙは３、４、または５の値である。切断可能なリンカーエレメントを所望する場合、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａまたはエンテロキナーゼ（カリフォルニア州、サンディエゴのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような１つもしくはそれ以上の切断可能なリンカー配列を、単独または上記のリンカーとの組み合わせで使用することができる。
【００４５】
本発明の多量体構築物はまた、任意選択的に、他のエレメントが散在する一連の反復エレメントを含んでなることができる。当業者に理解されるように、反復エレメントが多量体ポリペプチドにおいて生じる順番はそれほど重要ではなく、本明細書に記載の反復エレメントのいずれの配置が、本発明により提供されうる。それ故、本発明による「多量体構築物」は、任意選択的に、（化学リンカーエレメントまたはアミノ酸リンカーエレメントのいずれか一方の）リンカーエレメントによって一緒に結合される一連のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを含んでなる多量体ポリペプチドを提供することができる。
【００４６】
本発明による融合タンパク質は、１つもしくはそれ以上の異種ポリペプチド配列（例えば、本発明のポリペプチドの精製を容易にするタグ（例えば、出典明示により全体を本明細書に援用するU.S. Patent No. 6,342,362；それぞれ、出典明示により全体を本明細書に援用するAltendorf et al., (1999-WWW, 2000)；Baneyx, (1999)；Eihauer et al., (2001)；Jones et al. (1995)；Margolin (2000)；Puig et al., (2001)；Sassenfeld (1990)；Sheibani (1999)；Skerra et al., (1999)；Smith (1998)；Smyth et al., (2000)；Unger (1997)を参照のこと）、またはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（カリフォルニア州、ラ・ホイヤ）、ＮＯＶＡＧＥＮ（ウィスコンシン州、マディソン）、ＱＩＡＧＥＮ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、バレンシア）、もしくはＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州、サンディエゴ）のごとき製造業者から市販されているタグを含んでなる。
【００４７】
他の具体例では、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号５、９、１１、１３、１５またはそのフラグメント）を、アジュバント活性を有する異種ポリペプチド配列（ポリペプチドアジュバント）に融合させることができる。このようなポリペプチドの非限定的な例として、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）（例えば、出典明示により全体が本明細書に援用されるU.S. Patent No. 6,524,825を参照のこと）が挙げられる。
【００４８】
本発明はまた、本発明によるポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを提供し、ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに対する免疫応答を誘発することが可能なペプチドであって、前記免疫応答が、前記ポリペプチドのフラグメントに反応性の成分（Ｂ細胞、抗体、および／または細胞性免疫応答の成分（例えば、ヘルパー、細胞傷害性、および／またはサプレッサーＴ細胞）の成分）を提供するものであるペプチド；本明細書で開示される無傷な全長の改変されていないポリペプチド；あるいはポリペプチドのフラグメントおよび本明細書で開示される無傷な全長の改変されていないポリペプチドの両方を含む。一定の具体例は、ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス中和抗体を産生する抗体応答を誘導する方法を提供する。
【００４９】
本願はまた、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５（またはそのフラグメント）を含んでなる少なくとも１つの単離された、組み換え、または精製されたポリペプチドおよび少なくとも１つのさらなる成分を含んでなる組成物を提供する。本発明の多様な態様では、さらなる成分は、固相支持体（例えば、マイクロタイターウェル、磁気ビーズ、非磁気ビーズ、アガロースビーズ、ガラス、セルロース、プラスチック、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ニトロセルロース、ナイロン、またはポリスルホン）である。さらなる成分はまた、当業者に公知の薬学的に許容可能な賦形剤またはアジュバントであり得る。本発明のいくつかの態様では、固相支持体は、本発明のポリペプチドのアレイ、または本発明の様々なポリペプチドの組み合わせを含んでなるポリペプチドのアレイを提供する。本発明の他の態様は、植物細胞成分（例えば、細胞壁、植物細胞膜の細胞マトリックスおよび炭水化物など）または植物細胞マトリックス成分を含む精製されたポリペプチドを含んでなる組成物を提供する。同様に、真核細胞または原核細胞発現系が本出願により提供されるポリペプチドまたはポリペプチドのフラグメントの産生に用いられる場合、それぞれの各発現系の細胞膜または細胞壁成分は、部分的に精製されたポリペプチドを含んでなる組成物中に存在してもよい。
【００５０】
本発明はまた、個体において免疫応答を誘導するのに十分な量で本発明によるポリペプチドを含んでなる組成物の個体への投与を含んでなる、個体において免疫応答を誘発するための方法を提供する。いくつかの具体例では、「防御」または「治療的免疫応答」が個体において誘導される。「防御免疫応答」または「治療的免疫応答」は、感染性ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスを中和するか、またはＣＴＬ（もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞）および／またはＨＴＬ（もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞）を誘導する抗体産生の誘導、ならびに／あるいは個体における病態、副作用もしくは進行を予防、減少または少なくとも部分的に停止させる抗体応答を指す。例えば、防御免疫応答が誘導されている個体は、死亡率の減少を示し、および／または免疫されていないコントロール個体と比較して、ウイルス出芽の減少を示すことができる。防御免疫応答はまた、ヘルパーＴ細胞（またはＣＤ４＋Ｔ細胞）の刺激により促進された抗体応答を含んでもよい。個体において免疫応答を誘導するさらなる方法は、出典明示によりその全体が本明細書で援用されるU.S. Patent No. 6,419,931において教示されている。ＣＴＬという用語は、本願を通して、ＣＤ８＋Ｔ細胞と同義的に使用することができ、ＨＴＬという用語は、ＣＤ４＋Ｔ細胞と同義的に使用することができる。
【００５１】
本出願に関して、個体は、トリ、ならびに／あるいは類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒト、サルまたはイヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ウサギ、フェレット、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジのごとき愛玩（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ）動物（ペット）のごとき哺乳動物を指すが、これらだけに限定されない。鳥類またはトリは、本明細書では、典型的に、翼に改変された前肢、鱗状の肢、くちばしを有し、硬い殻の卵で子を産む鳥綱の温血脊椎動物メンバーとして定義される。本明細書の目的のために、トリの好適な群は、愛玩ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、アヒル、ガチョウ、ハクチョウ、コーニッシュゲームヘンおよびペットとして飼われるかまたは動物園の展示のための珍しい鳥類である。
【００５２】
投与することまたは投与するは、個体の体への物質の導入として定義され、経口、経鼻、眼、直腸、膣および非経口経路を含む。組成物は、皮下（ＳＱ）、筋肉内（ＩＭ）、静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、皮内（ＩＤ）、経皮（ＴＤ）、または経鼻、眼、経口、もしくは直腸粘膜を含むが、これらに限定されない任意の投与経路を介して個々に、または他の薬剤との組み合わせで投与されてもよい。
【００５３】
個体に投与される組成物は、任意選択的に、アジュバントを含有してもよく、免疫原の被験体への送達のために、当該技術分野で知られるいずれかの手法で送達されてもよい。組成物はまた、E.W. Martin’s Remington’s Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, PAに記載のような、例えば、薬学的に許容可能なキャリアを含む任意のキャリアで処方されてもよい。好適な具体例では、組成物は、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、またはアルミニウム（ａｌｕｍ）で処方されてもよい。本発明の実施において使用することができる他の非限定的な例として：油−水エマルジョン、Ｐｏｌｙｇｅｎ、Ｃａｒｂｉｇｅｎ（Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９７４Ｐ  ＮＦ）またはＴｉｔｅｒ−Ｍａｘ（ＢｌｏｃｋコポリマーＣＲＬ−８９４１、スクアレンおよび独特なマイクロ粒子安定剤）が挙げられる。
【００５４】
他の具体例では、本発明は、ウエスタンブロット形式または当業者に公知の標準的なイムノアッセイに基づき、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５を含んでなるか、これらから本質的に構成されるか、またはこれらからなるポリペプチドを利用する診断アッセイを提供する。例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、側方流動分析、逆流クロマトグラフィー結合アッセイ（例えば、出典明示により全体が本明細書に援用されるU.S. Pat. No. 5,726,010を参照のこと）、免疫クロマトグラフストラップアッセイ、自動化流動分析、およびペプチド含有バイオセンサを利用するアッセイのような抗体に基づくアッセイを、本発明によって提供されるポリペプチド（またはそのフラグメント）に結合する抗体の検出に用いてもよい。アッセイおよびアッセイを行うための方法は当該技術分野において周知であり、方法は、本発明のポリペプチドに結合する抗体の存在について、生物学的サンプル（例えば、血清、血漿、もしくは血液）を定性的（抗体の有無）または定量的（本発明のポリペプチドを用いて調製される標準曲線に対するサンプルの比較）に試験してもよい。
【００５５】
抗体に基づくアッセイは、４つのタイプ：直接結合アッセイ、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、および置換アッセイを考えることができる。直接結合アッセイでは、抗体または抗原のいずれか一方を標識し、形成される複合体の数を測定する手段である。サンドイッチアッセイでは、少なくとも３つの成分の複合体（例えば、抗体−抗原−抗体）の形成を測定する。競合アッセイでは、標識された抗原と標識されていない抗原が抗体への結合について競合し、結合されるかまたは遊離される成分のいずれか一方が測定される。置換アッセイでは、標識された抗原が抗体に予め結合され、標識されていない抗原が受容体に結合され、次いで標識されていない抗原が受容体から結合され標識された抗原と置き換わる時のシグナルの変化を測定する。
【００５６】
側方流動分析は、U.S. Patent No. 5,712,170および前記文献中で引用される参考文献の教示により行うことができる。U.S. Patent No. 5,712,170およびおよび前記文献中で引用される参考文献は、出典明示によりそれらの全体が本明細書に援用される。置換アッセイおよび置換アッセイを行うのに有用なフロー免疫センサについては：Kusterbeck et al., (1990)；Kusterbeck et al., (1990a)；Ligler et al., (1992)；Ogert et al., (1992)に記載されており、それらのすべてはまた、出典明示によりそれらの全体が本明細書に援用される。置換アッセイおよびフロー免疫センサはまた、U.S. Patent No. 5,183,740に記載されており、これもまた、出典明示より全体が本明細書に援用される。置換イムノアッセイは、小分子を検出するために使用されるほとんどの競合イムノアッセイとは異なり、抗原濃度の増加に伴って陽性シグナルを生じることができる。
【００５７】
本発明はまた、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５、またはその抗体結合フラグメント）に抗体を結合させる方法であって、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で、抗体を含有するサンプルとポリペプチドとを接触させることを含んでなる、上記方法を提供する。これらの方法は、さらに、前記抗体−抗原複合体の形成を検出する工程を含んでなることができる。この方法の多様な態様では、イムノアッセイは、サンプル中のウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス特異的抗体の検出のために行われる。そのようなイムノアッセイの非限定的な例として、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、側方流動アッセイ、免疫クロマトグラフストラップアッセイ、自動化流動分析、ウエスタンブロット、免疫沈降アッセイ、逆流クロマトグラフィー結合アッセイ、凝集アッセイ、およびバイオセンサが挙げられる。本発明のさらなる態様は、ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに特異的な抗体を検出する上記の方法を行う場合、ポリペプチドのアレイの使用を提供する（アレイは、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５に記載のポリペプチド（またはそのフラグメント）のうちの少なくとも１つを含有することができ、また、同一のまたは異なるウイルス由来の他のポリペプチドを含有することができる）。
【００５８】
本発明はまた、本発明のポリペプチドに結合する抗体に関する。具体的には、本明細書に記載のポリペプチドに免疫特異的である抗体が考えられる。様々な具体例では、他の既知のウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスポリペプチドと交差反応しない抗体が好適である。特に好適な抗体は、ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスの既知の株に由来するポリペプチドに対して産生される抗体と交差反応しない。本発明の抗体は、当該技術分野で知られる一般的な材料と方法を使用して調製することができる（例えば、Monoclonal Antibodies:  Principles and Practice, 1983；Monoclonal Hybridoma Antibodies:  Techniques and Applications, 1982；Selected Methods in Cellular Immunology, 1980；Immunological Methods, Vol. II, 1981；Practical Immunology, and Kohler et al., 1975；Letchworth and Appleton, 1984を参照のこと）。これらの抗体は、さらに、固相支持体、キャリアもしくは薬学的に許容可能な賦形剤、または標識のような１つもしくはそれ以上のさらなる成分を含むことができる。
【００５９】
用語「抗体」は、所望される生物活性、特に中和活性を示す限り、（全長モノクローナル抗体を含む）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを含む。「抗体フラグメント」は、全長抗体の部分、一般的に、その抗原結合または可変領域を含んでなる。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）；線状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。特に好適な本発明による抗体は、当該技術分野において改変されていない公知のＷＮＶポリペプチドに結合しない抗体である。
【００６０】
本明細書に記載の用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、その集団を含んでなる個々の抗体が少量存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて同一であるものを指す。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して極めて特異的である。さらに加えて、典型的に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物と比較して、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるものとして抗体の特徴を示し、いずれの特定の方法による抗体の産生を要すると解釈されるべきではない。例えば、本発明により用いられるモノクローナル抗体は、Kohler et al., (1975）により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組み換えＤＮＡ法（例えば、U.S. Patent No. 4,816,567を参照のこと）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al. (1991)およびMarks et al. (1991)に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００６１】
本明細書に記載のモノクローナル抗体として、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において対応する配列に同一もしくは相同である一方、鎖の残りの部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において対応する配列に同一もしくは相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにかかる抗体のフラグメントが挙げられる（U.S. Patent No. 4,816,567；およびMorrison et al., (1984))。また、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５に記載のポリペプチド、またはそのフラグメントに特異的に結合するヒト化抗体も含まれる（例えば、出典明示により全体が本明細書に援用され、ヒト化抗体を作製する方法を教示するU.S. Patent Nos. 6,407,213または6,417,337を参照のこと）。
【００６２】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含んでなり、ここで、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、ｓＦｖが抗原結合に所望される構造を形成することを可能にしている。ｓＦｖの総説については、Pluckthun (1994)を参照のこと。
【００６３】
用語「二重特異性抗体」は、２つの抗原−結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなる。二重特異性抗体は、例えば、EP 404,097；WO 93/11161；およびHolliger et al. (1993)により詳細に記載されている。用語「線状抗体」は、Zapata et al. (1995)に記載の抗体を指す。
【００６４】
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定され、分離および／または回収された抗体である。その天然環境の混入した成分は、抗体の診断または治療用途を妨げる材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好適な具体例では、抗体は、（１）ローリー法により調べられる場合、抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは、９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシーケネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によりＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（３）クマシーブルー、または好ましくは、銀染色を使用する、還元または非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一性となるまで、精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないため、単離された抗体には、組み換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕにおける抗体も含まれる。しかし、通常では、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００６５】
上述に記載されるように、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は同義的に使用することができ、本発明により、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは前記ＤＮＡの転写産物（例えば、ＲＮＡ分子）のいずれかを意味するものと理解される。
【００６６】
２０．００％〜９９．９９％の間の同一性パーセントの範囲は、０．０１％の間隔で、２０．００％〜９９．９９％（この値を含む）の間の分画百分率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）のいずれについても、記載要件およびサポート要件を含み、提供するものとみなされる。これらの百分率は純粋な統計であり、２つの核酸配列間の差異は、無作為かつ配列長全体にわたって分布し得る。例えば、相同配列は、本発明の配列と、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセントの同一性パーセントを示すことができる。典型的に、同一性パーセントは、全長の元々のおよび／または天然に存在するポリヌクレオチドを参考にして算出される。２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する用語「同一」または「同一性」パーセントは、同一であるか、あるいは配列比較アルゴリズムを使用するかまたは手動アラインメントおよび目視検査によって測定されるように、比較ウインドウにわたり最大の対応について比較され、アラインされる場合、同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定された百分率を有する２つもしくはそれ以上の配列または部分配列を指す。
【００６７】
タンパク質および核酸配列相同性の両方は、当該技術分野において公知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて評価されてもよい。かかるアルゴリズムおよびプログラムとして、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、およびＣＬＵＳＴＡＬＷが挙げられるが、決してこれらに限定されるわけではない（Pearson et al., 1988；Altschul et al., 1990；Thompson et al., 1994；Higgins et al., 1996；Gish et al., 1993）。配列比較は、典型的に、製造業者により提供される初期設定パラメータを用いるか、または出典明示により全体が本明細書に援用される上記の参考文献に記載のパラメータを用いて行われる。
【００６８】
「相補的」ポリヌクレオチド配列は、本明細書で用いられるように、一般的に、二本鎖核酸分子（ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、またはＲＮＡ−ＲＮＡ）における特定のプリンと特定のピリミジンの間の水素結合から生じる配列を指す。主な特異的な対合は、グアニンとシトシンおよびアデニンとチミンまたはウラシルである。「相補的」ポリヌクレオチド配列はまた、「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列または「アンチセンス配列」と称されうる。
【００６９】
配列相同性および配列同一性はまた、高ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、および／または低ストリンジェンシー下のハイブリダイゼーション実験により決定することができる。様々な程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを用いることができる。条件がより厳しいほど、二重鎖形成に必要とされる相補性も大きくなる。条件の厳しさは、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間などによって制御することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、低、中、または高ストリンジェンシー条件下で、例えば、Keller and Manak (1987)に記載されるような当該技術分野において周知の技術によって行われる。
【００７０】
例えば、３２Ｐ標識遺伝子特異的プローブによるサザンブロット上の固定化されたＤＮＡのハイブリダイゼーションは、一般的な方法により実施することができる（Maniatis et al., 1982）。一般に、ハイブリダイゼーションおよび以後の洗浄は、例示されたポリヌクレオチド配列に対して相同性を有する標的配列の検出を可能にする中〜高ストリンジェンシー条件下で行うことができる。二本鎖ＤＮＡ遺伝子プローブでは、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ変性ＤＮＡ中でＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より２０〜２５℃低い温度で一晩行うことができる。融解温度は、以下の式により記載される（Beltz et al., 1983）。
【００７１】
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−６００／塩基対における二重鎖の長さ。
【００７２】
洗浄は、典型的に以下のように行う：
（１）室温で１５分間、１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、２回（低ストリンジェンシー洗浄）；
（２）Ｔｍ−２０℃で１５分間、０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、１回（中ストリンジェンシー洗浄）。
【００７３】
オリゴヌクレオチドプローブでは、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ変性ＤＮＡ中で、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より１０〜２０℃低い温度で一晩行うことができる。オリゴヌクレオチドプローブのＴｍは、以下の式によって決定することができる：
Ｔｍ（℃）＝２（Ｔ／Ａ塩基対数）＋４（Ｇ／Ｃ塩基対数）  （Suggs  et al., 1981）。
【００７４】
洗浄は、典型的に以下のように行うことができる：
（１）室温で１５分間、１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、２回（低ストリンジェンシー洗浄）；
２）ハイブリダイゼーション温度で１５分間、１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、１回（中ストリンジェンシー洗浄）。
【００７５】
一般に、塩および／または温度を変更して、ストリンジェンシーを変えることができる。標識ＤＮＡフラグメント＞７０塩基長もしくはその付近では、以下の条件を使用することができる：
低：  １もしくは２×ＳＳＰＥ、室温
低：  １もしくは２×ＳＳＰＥ、４２℃
中：  ０．２×もしくは１×ＳＳＰＥ、６５℃
高：  ０．１×ＳＳＰＥ、６５℃。
【００７６】
別の非限定的な例として、高ストリンジェンシーの条件を用いる手順はまた、次のとおりに実施することができる：ＤＮＡを含有するフィルターのプレ−ハイブリダイゼーションが、８時間〜１晩、６５℃で、６×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中で行われる。フィルターが、４８時間、好適なハイブリダイゼーション温度である６５℃で、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有するプレ−ハイブリダイゼーション混合物中でハイブリダイズされる。代替的に、ハイブリダイゼーション工程は、６５℃、ＳＳＣ緩衝液、０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．０５Ｍクエン酸Ｎａに対応する１×ＳＳＣの存在下で、実施することができる。その後、フィルター洗浄が、３７℃で、１時間、２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ、および０．０１％ＢＳＡを含有する溶液において行われ、続いて、０．１×ＳＳＣ中、５０℃での洗浄を４５分間行うことができる。代替的に、フィルター洗浄は、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、または０．５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、または０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液において、６８℃で１５分間間隔で実施することができる。洗浄工程後、ハイブリダイズしたプローブは、オートラジオグラフィーにより検出可能である。用いられてもよい高ストリンジェンシーの他の条件は、当該技術分野において周知であり、出典明示によりその全体が本明細書に援用されるSambrook et al. (1989)およびAusubel et al. (1989)中で引用されている。
【００７７】
中ストリンジェンシーの条件を用いる手順の別の非限定的な例は、以下のとおりである：ＤＮＡを含有するフィルターをプレ−ハイブリダイズし、次いで、６０℃の温度、５×ＳＳＣ緩衝液および標識プローブの存在下で、ハイブリダイズさせる。その後、フィルター洗浄を２×ＳＳＣを含有する溶液において、５０℃で実施し、ハイブリダイズしたプローブは、オートラジオグラフィーにより検出可能である。用いられてもよい中ストリンジェンシーの他の条件は、当該技術分野において周知であり、出典明示によりその全体が本明細書に援用されるSambrook et al. (1989)およびAusubel et al. (1989)中で引用されている。
【００７８】
二本鎖形成および安定性は、ハイブリッドの二本鎖の間の実質的な相補性に依存し、上述のごとく、ある程度のミスマッチが許容されうる。それゆえ、本発明のプローブ配列として、変異（単一および複数の両方）、欠失、記載される配列の挿入、およびそれらの組み合わせが含まれ、ここで、前記変異、挿入および欠失は、目的の標的ポリヌクレオチドとの安定なハイブリダイズの形成を可能にする。変異、挿入および欠失は、所定のポリヌクレオチド配列において、多くの方法で生じ得るものであって、これらの方法は当業者に公知である。他の方法も将来公知になり得る。
【００７９】
制限酵素が目的ＤＮＡ配列の機能的フラグメントを得るのに用いることができることもまた、当該技術分野において周知である。例えば、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼは、ＤＮＡの時間で制御された限定的消化（一般に、「ｅｒａｓｅ−ａ−ｂａｓｅ」手順と称される）のために利便的に用いることができる。例えば、Maniatis et al. (1982);Wei et al. (1983)を参照のこと。
【００８０】
本発明は、さらに、本発明のポリヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなる。本発明によるポリヌクレオチド配列の代表的なフラグメントは、それが由来する配列の少なくとも５個の連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１２個の連続するヌクレオチド、なおより好ましくは、少なくとも１５、１８、もしくは少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを有する任意のヌクレオチドフラグメントを意味するものと理解される。本明細書に記載のフラグメントの上限は、特定のポリペプチド（例えば、配列番号５のポリペプチドのようなポリペプチド）をコードする全長配列において見出されるヌクレオチドの総数である。
【００８１】
いくつかの具体例では、本発明は、ストリンジェンシー条件の様々な条件（例えば、高または中または低ストリンジェンシー）下で、本発明によるヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能なそれらのフラグメントを含み；本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズするフラグメントは、任意選択的に、以下に記載されるように標識することができる。
【００８２】
本発明は、１の具体例において、形質転換された宿主細胞またはウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスに感染していることが疑わしい個体から単離される細胞において、本発明による核酸の存在の同定のための方法を提供する。これらの変化する具体例において、本発明は、サンプルと、本発明の核酸（ポリヌクレオチド）（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくは他の核酸）とを接触させることを含んでなる、（個体または細胞培養から得られる）サンプル中の核酸の検出を提供する。好適な具体例では、ポリヌクレオチドは、任意選択的に、検出系において標識され、使用されるプローブである。核酸の検出のための多くの方法が存在し、検出のための適当な方法のいずれもが本発明に包含される。核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式として、１）核ランオンアッセイ、２）スロットブロットアッセイ、３）ノーザンブロットアッセイ（Alwine et al., 1977）、４）磁性粒子分離、５）核酸もしくはＤＮＡチップ、６）逆ノーザンブロットアッセイ、７）ドットブロットアッセイ、８）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、９）ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（Melton et al., 1984）およびテキサス州、オースチンのＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．の１９９８年カタログに記載のもの、１０）リガーゼ連鎖反応、１１）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、１２）逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ（Berchtold, 1989）、１３）ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）あるいは他の技術およびアッセイの適当な組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これらの検出方法論における使用に適当な標識として、１）放射性標識、２）酵素標識、３）化学発光標識、４）蛍光標識、５）磁気標識、または以下に記載のものを含むが、これらだけに限定されない他の適当な標識が挙げられる。これらの方法論および標識は、当該技術分野において周知であり、当業者に広く利用可能である。同様に、標識を核酸に取り入れる方法もまた、当業者に周知である。
【００８３】
それ故、本発明はまた、標的配列またはその標的配列から作製される増幅産物（ａｍｐｌｉｃｏｎ）とのハイブリダイゼーションのための検出プローブ（例えば、開示するポリヌクレオチド配列のフラグメント）を提供する。そのような検出プローブは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００個のヌクレオチドの連続的な（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）／連続（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ）スパンを含んでなる。標識プローブまたはプライマーは、放射性化合物または上記のような別のタイプの標識（例えば、１）放射性標識、２）酵素標識、３）化学発光標識、４）蛍光標識、もしくは５）磁気標識）で標識される。代替的に、標識されていないヌクレオチド配列は、プローブまたはプライマーとして直接使用されてもよいが；しかし、一般的には、配列が、放射性元素（３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉ）またはビオチン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン、５−ブロモ−デオキシウリジン、もしくはフルオレセインのような分子で標識されて、多くの応用に用いることができるプローブが提供される。
【００８４】
本発明のポリヌクレオチドはまた、アレイまたは固相支持体に結合するポリヌクレオチドを用いる遺伝子発現の定性および定量分析に使用することもできる。本明細書で用いられるように、用語アレイは、全長ポリヌクレオチド、または遺伝子発現の特異的検出を可能にするのに十分な長さのポリヌクレオチドの１、２、または３次元的配列を意味する。好ましくは、フラグメントは、少なくとも１５ヌクレオチド長である。より好ましくは、フラグメントは、少なくとも１００ヌクレオチド長である。より好ましくは、フラグメントは１００ヌクレオチド長より大きい。いくつかの具体例では、フラグメントは、５００ヌクレオチド長より大きくてもよい。
【００８５】
例えば、遺伝子発現の定量分析は、Schena et al. (1995, 1996)により記載されるような相補的ＤＮＡマイクロアレイにおいて、本発明の全長ポリヌクレオチド、またはそのフラグメントを用いて行われてもよい。ポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、ＰＣＲにより増幅され、次いでシリル化顕微鏡スライド上でアレイされる。プリントしたアレイを湿潤チャンバ内でインキュベートして、アレイエレメントの再水和を可能にし、０．２％ＳＤＳ中で１分間を１回、水中で１分間を２回、次いで５分間、水素化ホウ素ナトリウム溶液中で１回リンスする。アレイを水中に２分間、９５℃で潜没させ、０．２％  ＳＤＳに１分間移し、水で２回リンスし、空気乾燥させ、次いで２５℃で暗所に貯蔵する。
【００８６】
ｍＲＮＡは、生物学的サンプルから単離され、プローブが１回の逆転写により調製される。プローブを、１４×１４ｍｍガラスカバースリップ下の１ｃｍ２マイクロアレイに、６〜１２時間、６０℃でハイブリダイズさせる。アレイを、５分間、２５℃で低ストリンジェンシー洗浄緩衝液（１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）において洗浄し、次いで、１０分間、室温で高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）において洗浄する。アレイを、０．１×ＳＳＣ中、カスタムフィルターセットを具備する蛍光レーザー走査装置を用いて走査する。２つの独立したハイブリダイゼーションの比の平均を求めることにより正確な発現差異測定が得られる。
【００８７】
生物学的サンプルに存在するポリヌクレオチドの定量分析もまた、Pietu et al. (1996)に記載の相補的ＤＮＡアレイで行うことができる。本発明のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、ＰＣＲ増幅され、膜上にスポットされる。次いで、多様な組織または細胞に由来する生物学的サンプルを起源とするｍＲＮＡは、放射性ヌクレオチドで標識される。制御された条件におけるハイブリダイゼーションと洗浄後、ハイブリダイズしたｍＲＮＡを、ホスホ−イメージング（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｉｍａｇｉｎｇ）またはオートラジオグラフィーによって検出する。複製実験が行われ、次いで異なって発現されるｍＲＮＡの定量分析が実施される。
【００８８】
代替的に、本発明のポリヌクレオチド配列はまた、ＤＮＡチップのような分析系で用いられてもよい。ＤＮＡチップおよびそれらの用途は、当該技術分野において周知であり（例えば、出典明示により全体が本明細書に援用されるU.S. Patent Nos. 5,561,071；5,753,439；6,214,545；Schena 1996；Bianchi et al., 1997；を参照のこと）、および／またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サンタクララ）のような製造業者により提供される。加えて、本発明の核酸配列は、核酸分析手順における分子量マーカーとして使用することができる。
【００８９】
本発明はまた、以下を含んでなる組成物を提供する：
ａ）  配列番号５、９、１１、１３もしくは１５を含んでなるポリペプチドをコードするか、または表９、１０、１１、１２、１５、もしくは１６に記載の配列番号５、９、１１、１３もしくは１５の１つもしくはそれ以上のポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列。本発明の様々な態様では、これらのポリヌクレオチドは、少なくとも４０％かつ５０％より少ないＧ＋Ｃ含有量または表１３に記載のＧ＋Ｃ含有量を有することができる；
ｂ）  配列番号１に少なくとも７０％（または表１４で特定される百分率）同一であり、配列番号２を含んでなるポリペプチドをコードし、約４０％〜約５０％の間のＧ＋Ｃ含有量（または表１３で特定される特異的なＧ＋Ｃ含有量）を有するポリヌクレオチド配列；
ｃ）  （ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチド配列のポリヌクレオチド配列少なくとも８個の連続ヌクレオチド；
ｄ）  配列番号３、４、６、７、８、１０、もしくは１２、または配列番号３、４、６、７、８、１０、もしくは１２の少なくとも８個の連続ヌクレオチドのフラグメントを含んでなるポリヌクレオチド配列；
ｅ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）に記載のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド；
ｆ）  低、中もしくは高ストリンジェンシー下で、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に記載のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｇ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子構築物；
ｈ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）もしくは（ｇ）に記載のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物を含んでなるベクター；
ｉ）  （ｈ）に記載のベクター、（ｇ）に記載の遺伝子構築物、または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）もしくは（ｅ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞；
ｊ）  （ｈ）に記載のベクター、（ｇ）に記載の遺伝子構築物、または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）もしくは（ｅ）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック植物、植物細胞、または植物部分；あるいは
ｋ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）もしくは（ｆ）によるポリヌクレオチド、任意選択的に、標識またはマーカーを含んでなる、プローブ。
【００９０】
本発明はまた：ａ）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５、またはそのフラグメントを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；ｂ）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５、または配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のフラグメントを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約２０％〜９９．９９％同一性を有するポリヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドが、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５、またはそのフラグメントを含んでなるポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを有するポリヌクレオチド配列；ｃ）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５、または配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のフラグメントを含んでなるポリペプチドに対して少なくとも約２０％〜９９．９９％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドが、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５、またはそのフラグメントを含んでなるポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを有するポリヌクレオチド配列；ｄ）配列番号５、９、１１、１３もしくは１５を含んでなるポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列であって、前記フラグメントが、配列番号５、９、１１、１３もしくは１５のポリペプチドの活性の少なくとも１つを有するポリヌクレオチド配列；ｅ）配列番号３、４、６、７、８、１０、１２、もしくは１４を含んでなるポリヌクレオチド配列；ｆ）配列番号３、４、６、７、８、１０、１２、もしくは１４のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約２０％〜９９．９９％同一性を有するポリヌクレオチド配列；ｇ）多量体構築物をコードするポリヌクレオチド配列；あるいはｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、もしくは（ｇ）に記載のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドを含んでなる、遺伝子構築物を提供する。本発明の遺伝子構築物はまた、プロモーターおよびエンハンサー、任意選択的に、選択マーカーのようなさらなる調節エレメントを含有することができる。
【００９１】
本明細書に記載の遺伝子構築物もしくは調節エレメントに作動可能に連結された上述のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターまたは発現カセットもまた、本発明の範囲内にある。ベクターおよび発現カセットは、さらなる転写制御配列をも含有してもよい。ベクターおよび発現カセットは、さらに、選択マーカーを含んでもよい。発現カセットは、生物体に同時形質転換されるために、制御エレメントに作動可能に連結された少なくとも１つのさらなる遺伝子を含有してもよい。代替的に、さらなる遺伝子および制御エレメントは、複数の発現カセット上で提供することができる。そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下にある本発明の配列の挿入のための複数の制限部位と一緒に提供される。発現カセットは、さらに、制御エレメントに作動可能に連結された選択マーカー遺伝子を含有してもよい。
【００９２】
発現カセットは、５’−３’方向の転写において、転写および翻訳開始領域、本発明のＤＮＡ配列、ならびに転写および翻訳終結領域を含む。転写開始領域、プロモーターは、宿主細胞に対して元々もしくはアナログ、または外来性もしくは異種であってもよい。さらに、プロモーターは、天然の配列であってもよく、あるいは合成配列であってもよい。「外来性」は、転写開始領域が転写開始領域が導入される元々の植物には見出されないことが意図される。本明細書で用いられるように、キメラ遺伝子は、コーディング配列に対して異種である転写開始領域に作動可能に連結されたコーディング配列を含んでなる。
【００９３】
本発明の別の態様は、本明細書で教示されるポリヌクレオチド配列のクローニングおよび／または発現のためのベクターを提供する。ワクチンベクターを含む本発明のベクターはまた、所定の宿主細胞における前記ヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能にするのに必要なエレメントを含むことができる。ベクターは、プロモーター、翻訳の開始および終結のためのシグナル、ならびに転写の調節に適当な領域を含有することができる。一定の具体例では、ベクターは、宿主細胞において安定的に維持することができ、任意選択的に、翻訳されたタンパク質の分泌を指令するシグナル配列を含有することができる。これらの異なるエレメントは、使用する宿主細胞により選択される。ベクターは、宿主ゲノムに組み込みことができるか、または、任意選択的に自律的に複製するベクターであり得る。
【００９４】
本発明はまた、本明細書において開示するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはペプチドフラグメントの発現を提供するものであって、ポリペプチドの発現を可能にし、任意選択的に、発現したポリペプチドを回収する条件下で、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞の培養を含んでなる。
【００９５】
開示されたポリヌクレオチド配列はまた、タンパク質またはペプチドが組み換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主で発現できるように、第２の核酸配列により調節されうる。例えば、タンパク質またはペプチドの発現は、当該技術分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御されてもよい。発現を制御するのに用いられてもよいプロモーターとして、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Benoist and Chambon 1981）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含有されるプロモーター（Yamamoto et al., 1980）、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., 1981）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., 1982）；β−ラクタマーゼプロモーター（Villa-Kamaroff et al., 1978）、もしくはｔａｃプロモーター（deBoer et al., 1983）のようなプロモーターを含有する真核細胞ベクター；“Useful proteins from recombinant bacteria”in Scientific American, 1980, 242:74-94も参照のこと；ノパリンシンテターゼプロモーター領域（Herrera-Estrella et al., 1983）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Gardner et al., 1981）、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrella et al., 1984）を含んでなる植物発現ベクター；Ｇａｌ  ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、および／またはアルカリホスファターゼプロモーターのような酵母または真菌由来のプロモーターエレメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
本発明によるベクターは、例えば、プラスミドのベクターまたはウイルス由来である。特定の具体例では、開示されるポリヌクレオチド配列内に含有されるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、１つもしくはそれ以上の複製開始点、および任意選択的に、１つもしくはそれ以上の選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含んでなるベクターが使用される。発現ベクターは、所望される宿主細胞における遺伝子発現を含む遺伝子発現を制御する調節配列を含んでなる。本発明のポリペプチドの発現のための典型的なベクターとして、ｐＥＴタイプのプラスミドベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）もしくはｐＢＡＤプラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または以下の実施例において提供されるベクターが挙げられる。さらに加えて、本発明によるベクターは、本発明のポリヌクレオチド配列をクローニングまたは発現させるために宿主細胞を形質転換するのに有用である。
【００９７】
本発明はまた、本発明によるベクターにより形質転換された宿主細胞を包含する。これらの細胞は、上記で定義したベクターに挿入されたヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、次いで、本発明のポリヌクレオチド配列の複製および／または発現を可能にする条件下で前記細胞を培養することにより得られてもよい。
【００９８】
宿主細胞は、例えば、細菌細胞（グラム陰性もしくはグラム陽性）、酵母細胞（例えば、サッカロマイセス・セレビセエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））、動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）、植物細胞、および／またはバキュロウイルスベクターを使用する昆虫細胞のような真核細胞あるいは原核細胞系から選択されてもよい。いくつかの具体例では、ポリペプチドの発現のための宿主細胞として、U.S. Patent Nos. 6,319,691、6,277,375、5,643,570、または5,565,335（それぞれの各特許文献内で引用されるすべての参考文献を含めて、それぞれその全体が出典明示により援用される）において教示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
さらに加えて、挿入された配列の発現を調節するか、または所望される特定の様式で遺伝子産物を改変および加工する宿主細胞株が選択されてもよい。一定のプロモーターからの発現は、所定の誘導物質の存在下で上昇させることができ；それにより、遺伝学的に改変されたポリペプチドの発現が制御され得てもよい。さらに加えて、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳ならびに翻訳後プロセシングおよび修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化）の特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。発現される外来タンパク質の所望される修飾およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞系統または宿主系を選択することができる。例えば、細菌系における発現は、非グリコシル化コアタンパク質産物を産生するのに用いることができる。酵母における発現は、グリコシル化産物を産生する。哺乳動物細胞における発現は、異種タンパク質の「元々の」グリコシル化を確実にすることに用いることができる。さらに加えて、異なるベクター／宿主発現系は、異なる程度でプロセシング反応を生じ得る。
【０１００】
制御エレメントに作動可能に連結された本明細書で開示される１つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド、またはその生物学的に活性なフラグメントを含んでなる、１つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列、遺伝子構築物、ベクター、または発現カセットを含有する形質転換植物細胞、トランスジェニック種子、トランスジェニック植物部分およびトランスジェニック植物が提供される。本明細書で用いられるように、用語「植物」は、藻類および高等植物（樹木を含むがこれらに限定されない）を含む。それ故、藻類、単子葉植物、および双子葉植物は、本発明の遺伝子構築物、発現カセット、または本発明によるベクターで形質転換されてもよい。一定の好適な具体例では、タバコ植物またはタバコ細胞系統が、本発明による遺伝子構築物で形質転換される。
【０１０１】
それゆえ、本出願で考察される組成物または免疫プロトコルの生成に有用なポリペプチドは、配列番号５、９、１１、１３、１５、もしくはそのフラグメントを含んでなる（から本質的になる、もしくはからなる）ポリペプチドを発現するように遺伝学的に改変されたトランスジェニック植物細胞から生じるか、または得ることができる。例えば、その内容は出典明示により全体が本明細書に援用されるU.S. Patent Pub. No: 2004/0268442 A1を参照のこと。
【０１０２】
トランスジェニック植物は、植物細胞培養物、植物細胞系統、植物組織培養物、下等植物、単子葉植物、双子葉植物、または形質転換植物細胞もしくはプロトプラストに由来するそれらの子孫もしくは部分として本明細書で定義されるものであって、形質転換植物のゲノムは、研究室技術により誘導される外来ＤＮＡを含有し、同じ種の元々のトランスジェニックではない植物細胞には本来存在しないものである。「トランスジェニック植物」および「形質転換植物」という用語は、ＤＮＡが外因性ＤＮＡ分子を含有する植物を定義する同義語として当該技術分野において使用されている。適宜、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、形質転換された植物、植物細胞または植物部分における発現のために最適化することができる。すなわち、目的の種に対応する種に好適なコドンを使用して、遺伝子を合成することができる。例えば、植物に好適な遺伝子を合成するための方法が、当該技術分野において利用可能である。例えば、出典明示により本明細書に援用されるU.S. Patent Nos. 5,380,831および5,436,391、ならびにMurray et al. (1989)を参照のこと。
【０１０３】
植物においてポリペプチドを発現させるための遺伝子カセットの構築は、Sambrook et al. (1989)；およびAusubel et al. (1987)で開示される方法のような周知の方法を利用して容易に達成される。
【０１０４】
本発明の構築物を調製する際に、多様なＤＮＡフラグメントは、適した配向において、適切であれば、適したリーディングフレームにおいてＤＮＡ配列を提供するように、操作され得る。アダプターまたはリンカーは、ＤＮＡフラグメントを接続するために用いてもよく、または他の操作は、簡便な制限部位を提供すること、過分のＤＮＡの取り出し、制限部位の取出しなどに関与し得る。
【０１０５】
多様な工程を行う際に、所望される宿主細胞への以後の導入のためにプロモーター／目的の遺伝子を含有するベクターを増幅するように、クローニングが用いられる。広範なクローニングベクターが利用可能であり、ここで、クローニングベクターは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  （Ｅ．  ｃｏｌｉ））において機能的である複製系および形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む。例示的ベクターとして、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系列、ｐＡＣＹＣ１８４、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系列（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などが挙げられる。それ故、配列は、適切な制限部位でベクターに挿入され得、生じるプラスミドを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０１、ＪＭ１０１およびＤＨ５α）を形質転換し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は適切な栄養培地において増殖され、そして細胞は回収および溶解され、そしてプラスミドが回収される。解析は、配列解析、制限酵素解析（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、電気泳動などに関与し得る。それぞれの操作後、最終的構築物におい使用すべきＤＮＡ配列は、制限酵素処理（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）され、そして次の配列に接続され得、ここで、部分的構築物のそれぞれは、同じまたは異なるプラスミドにクローニングされ得る。
【０１０６】
ベクターは利用可能であるか、または植物細胞の形質転換のために容易に調製することができる。一般に、プラスミドまたはウイルスベクターは、所定の宿主において異種のＤＮＡ配列の維持および発現に必要なすべてのＤＮＡ制御配列を含有すべきである。そのような制御配列として、一般的に、リーダー配列、および翻訳開始シグナルコドンをコードするＤＮＡ配列、翻訳ターミネーターコドン、ならびにメッセンジャーＲＮＡプロセシングを制御する３’ＵＴＲシグナルをコードするＤＮＡ配列が挙げられる。任意の特定の種において発現を最適化するための適切なエレメントの選択は、本開示内容の教義を利用する当業者の問題である。最後に、ベクターは、望ましくは、ベクターを含有する宿主細胞の同定を可能にする表現型特性を提供することが可能であるマーカー遺伝子を有するべきである。
【０１０７】
植物細胞に挿入される外来コーディング配列の活性は、挿入物に隣接する内因性植物ＤＮＡの影響に依存する。一般的に、異種遺伝子の挿入は、任意の形質転換技術を使用して無作為であるようであるが；しかし、植物細胞へのＤＮＡの部位特異的組み換えを伴う植物を産生させるための技術が存在する（WO91/09957を参照のこと）。プロモーターの制御下で所望される１つまたは複数の配列の発現を生じる任意の方法または方法の組み合わせが許容可能である。
【０１０８】
本発明は、植物細胞を形質転換するための特定の任意の方法に限定されない。ＤＮＡを植物細胞に導入するための技術は、当業者に周知である。外来ＤＮＡを植物細胞に送達するための４つの基本的な方法が記載されている。化学的方法（Graham and van der Eb, 1973；Zatloukal et al., 1992）；マイクロインジェクション（Capecchi, 1980）、エレクトロポレーション（Wong and Neumann 1982；Fromm et al., 1985；U.S. Pat. No. 5,384,253）および遺伝子銃（Johnston and Tang, 1994；Fynan et al., 1993）を含む物理的方法；ウイルス方法（Clapp, 1993；Lu et al., 1993；Eglitis and Anderson 1988；Eglitis et al., 1988）；ならびに受容体仲介方法（Curiel et al., 1991；Curiel et al., 1992；Wagner et al., 1992）。
【０１０９】
エレクトロポレーションによるＤＮＡの植物細胞への導入は、当業者に周知である。ペクチン分解酵素のような植物細胞壁分解酵素は、非処置細胞よりエレクトロポレーションによる形質転換をより受け易いレシピエント細胞にするために使用される。エレクトロポレーションによって形質転換を行うために、細胞の懸濁培養物のような脆い組織、または胚状カルス（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｃａｌｌｕｓ）、または未熟な胚または他に由来する組織のいずれかを直接用いてもよい。一般的に、ペクチン分解性酵素で標的植物材料の細胞壁を部分的に分解するか、または制御された様式で機械的に損傷することが必要である。そのような処置された植物材料は、エレクトロポレーションによって容易に外来ＤＮＡを収容する。
【０１１０】
外来形質転換用ＤＮＡを植物細胞に送達するための別の方法は、マイクロプロジェクタイルボンバードメントによる。この方法では、微小粒子が外来ＤＮＡで被覆され、そして推進力によって細胞に送達される。そのような微粒子は、典型的に、タングステン、金、白金、および類似の金属からなる。マイクロプロジェクタイルボンバードメントの利点は、プロトプラストの単離（Cristou et al.,1988）も、またアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染に対する感受性のいずれも必要としないことである。加速によりＤＮＡをトウモロコシ細胞に送達するための方法の例示的実施態様がＢｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍであり、懸濁液において培養したトウモロコシ細胞で被覆されたフィルター表面上のスクリーンを介してＤＮＡまたは細胞で被覆された粒子を推進するために使用することができる。スクリーンは、粒子が大きな凝集体としてレシピエント細胞に送達されないように、粒子を分散する。ボンバードメントでは、懸濁液中の細胞を、フィルターまたは固体培養培地に集中させることが好ましい。あるいは、未熟な胚または他の標的細胞を、固体培養培地上に整列してもよい。衝撃しようとする細胞を、マクロプロジェクタイル停止プレートの下方の適切な距離に置く。ボンバードメント形質転換では、最大数の安定した形質転換体を得るために、プレボンバードメント培養条件およびボンバードメントパラメータを最適化することができる。ボンバードメントのための物理および生物学的パラメータは、この技術において重要である。物理的要因としては、ＤＮＡ／マイクロプロジェクタイル沈降の操作に関与するものまたはマイクロプロジェクタイルのいずれかの飛行および速度に影響を及ぼすものがある。生物学的因子としては、衝撃前および衝撃直後の細胞の操作に関与する総ての工程、衝撃に関連する損傷の軽減に役立つ標的細胞の浸透圧調整、ならびにまた、線状化ＤＮＡまたは無傷なスーパーコイル状プラスミドのような形質転換用ＤＮＡの性質が挙げられる。
【０１１１】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介トランスファーは、ＤＮＡをあらゆる植物組織に導入することができ、プロトプラストからの無傷な植物体を再生せる必要性がなくなるため、外来ＤＮＡを植物細胞に導入するための応用範囲の広い系である。ＤＮＡを植物細胞に導入するためにアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を仲介して植物体に組み込むベクターを使用することは、当該技術分野において周知である。例えば、Fraley et al. (1985)およびRogers et al. (1987)に記載の方法を参照のこと。さらに、Ｔｉ−ＤＮＡの組み込みは、比較的正確なプロセスであり、再配列はほとんど起こらない。トランスファーしようとするＤＮＡの領域は、境界配列によって定義され、Spielmann et al. (1986)およびJorgensen et al. (1987)に記載されているように、通常、介在するＤＮＡが植物ゲノムに挿入される。
【０１１２】
最新のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ならびにアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）での複製が可能であり、簡便な操作を可能にする。さらに、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介遺伝子トランスファー用ベクターにおける最近の技術的進歩により、ベクターにおける遺伝子および制限部位のアレンジメントが改善され、多様なタンパク質またはポリペプチドを発現することが可能なベクターの構築を容易にしている。挿入されたポリペプチドコーディング遺伝子の直接発現のためのプロモーターに隣接する簡便なマルチリンカー領域およびポリアデニル化部位は、本目的に適している。さらに、形質転換には、武装化されたおよび武装解除されたＴｉ遺伝子の両方を含有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用することができる。
【０１１３】
植物プロトプラストの形質転換は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処置、エレクトロポレーション、およびこれらの処置の組み合わせに基づく方法を使用して達成することができる（例えば、Potrykus et al., 1985；Marcotte et al., 1988を参照のこと）。これらの系の異なる植物種への応用は、プロトプラストから特定の種を再生する能力に依存する。
【０１１４】
一旦、植物細胞を形質転換し、選択し、そして抗原発現について確認したら、場合によって、稔性植物体全体を再生することが可能である。これは、選択される植物種にかなり依存する。多数の植物種を再生するための方法は、文献に報告されており、そして当業者に周知である。本発明の実施のために、培養し、そして一般的に非常に長い再生工程を回避することによって、迅速にスケールアップすることができる植物細胞系統を形質転換することが好適である。加えて、植物細胞培養物の使用は、オープンフィールドでの産生を回避し、遺伝子逃避および食品汚染の可能性を顕著に減少する。これらの系統は、培養における取り扱いに対して特に感受性であり、迅速に形質転換され、安定に組込まれた事象を産生し、そして凍結保存に従うため、ＮＴ−１およびＢＹ−２のようなタバコ懸濁細胞培養（An, 1985）が好適である。
【０１１５】
タバコ懸濁細胞系統、ＮＴ−１は、本発明の実施に適する。ＮＴ−１細胞は、本来、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）Ｌ．ｃｖ．ｂｒｉｇｈｔ  ｙｅｌｌｏｗ２から開発された。ＮＴ−１細胞系統は広範に使用され、容易に利用可能である；尤も、いずれのタバコ懸濁細胞系統も本発明の実施と矛盾しない。以下の実施例における使用に適するＮＴ−１細胞は、受託番号ＡＴＣＣ番号７４８４０下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから利用可能である。また、U.S.Patent No.6,140,075（その全体が出典明示によって本明細書に援用される）を参照のこと。
【０１１６】
多くの植物細胞培養技術および実験室規模の振盪フラスコから数千リットルのバイオリアクター容器までの範囲の系が記載されており、植物細胞培養の分野において周知である。例えば、Fischer, R. et al (1999)およびDoran, P. (2000)を参照のこと。形質転換植物細胞を所望される嵩（ｍａｓｓ）まで培養した後、それらを回収し、穏やかに洗浄し、そして破砕に適する緩衝液に配置する。異なる多くの緩衝液が本発明に適合可能である。一般に、緩衝液は、膜結合タンパク質を可溶化するための界面活性剤を伴うまたは伴わない中性ｐＨ値または中性ｐＨ値付近の水性等張性緩衝生理食塩水である。適切な緩衝液として、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、およびＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）を含有するＰＢＳが挙げられる。
【０１１７】
一具体例では、音波処理によって細胞を破砕することができる。洗浄した細胞を、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５．０ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌ（１容積の緩衝液あたりの洗浄した湿重量細胞）の範囲で、緩衝液中に配置する。多くの市販の音波処理装置が本発明と合致し、そして音波処理時間は、約５〜約２０秒間、好ましくは、約１５〜約２０秒間の範囲である。得られる細胞フラグメントは、数（ｆｅｗ）ミクロン〜数（ｓｅｖｅｒａｌ）百ミクロンのサイズの範囲であり得、そしてポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントを暴露する。
【０１１８】
本発明はまた、免疫応答または防御免疫応答を誘発するために用いることができるＤＮＡワクチン組成物に関する。本発明の本態様では、本明細書において提供されるポリペプチド（もしくはそのフラグメント）をコードする組み換えＤＮＡまたはｍＲＮＡを含んでなる組成物の量を、前記個体において免疫応答または防御免疫応答を誘発するのに十分な量で個体に投与する。シグナル配列は、目的の抗原をコードする核酸から欠失させてもよく、そして当該技術分野において公知の方法に従って、免疫応答の誘導のために、個体をモニターしてもよい。「防御免疫応答」または「治療的免疫応答」は、ＣＴＬ（もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＨＴＬ（もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞）、および／あるいはいくつかの方法で、病態、副作用もしくは進行を防止するかまたは少なくとも部分的に停止する抗原に対する防御体液性免疫応答を指す。本発明に関して、そのような防御または治療的応答は、免疫していない個体と比較して、免疫した個体における生存率の増加（死亡率の減少）、またはウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスでチャレンジした免疫した個体におけるウイルス排出の減少を提供する。
【０１１９】
別の具体例では、本発明は、本発明のポリペプチド抗原、またはその組成物と併用してのポリヌクレオチド（ＤＮＡ）ワクチンの投与をさらに含んでなる。好適な具体例では、抗原は、ポリヌクレオチドワクチンとして投与されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。特に好適な具体例として、ポリペプチド抗原は、ポリヌクレオチドワクチンの初期投与後のブースターとして投与される。
【０１２０】
本発明のさらなる具体例は、当業者に公知の「プライム−ブースト（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ）」ワクチン接種レジメンを使用する、本明細書において開示する新規ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス抗原（例えば、本明細書に記載のポリペプチドおよびペプチドフラグメントを参照のこと）に対する免疫応答の誘導を提供する。本発明のこの態様では、本発明のＤＮＡワクチンまたはポリペプチド抗原が、個体の免疫応答を「刺激」するのに十分な量で投与される。次いで、個体の免疫応答は、次の投与を介して「追加免疫」される：１）（任意選択的に、免疫刺激分子および／またはアジュバントとの併用で）本発明のペプチド、ポリペプチド、および／または全長ポリペプチド抗原のうちの１つまたはこれらの組み合わせ；あるいは２）同じかまたは任意選択的に異なる本明細書に記載の抗原構築物、および／またはペプチド抗原のうちの１つもしくはそれ以上をコードする核酸を含有するウイルスベクター。本発明のいくつかの代替的具体例では、免疫刺激分子をコードする遺伝子は、個体の免疫応答を「追加免疫」するために使用されるウイルスベクターに組み入れられ得る。例示的な免疫刺激分子として、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１５、Ｉｌ−１６、Ｉｌ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＭＳＦ、ＦＬＴ−３リガンド、ＥＧＦ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ；例えば、ａＦＧＦ（ＦＧＦ−１）、ｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、もしくはＦＧＦ−７）、インスリン様増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β）；白血病阻害因子（ＬＩＦ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；オンコスタチンＭ；幹細胞因子（ＳＣＦ）；トランスフォーミング増殖因子（例えば、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、またはケモカイン（例えば、限定されないが、ＢＣＡ−１／ＢＬＣ−１、ＢＲＡＫ／Ｋｅｃ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ３、ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ、エオタキシン−１、エオタキシン−２／ＭＰＩＦ−２、エキソダス−２／ＳＬＣ、フラクタルカイン／ニューロタクチン、ＧＲＯａｌｐｈａ／ＭＧＳＡ、ＨＣＣ−１、Ｉ−ＴＡＣ、リンホタクチン／ＡＴＡＣ／ＳＣＭ、ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ／ＳＴＣＰ−１、ＡＢＣＤ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２α／ＧＲＯβ、ＭＩＰ−３α／エキソダス／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３β／エキソダス−３／ＥＬＣ、ＭＩＰ−４／ＰＡＲＣ／ＤＣ−ＣＫ１、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１α、ＴＡＲＣ、もしくはＴＥＣＫ）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの免疫刺激分子をコードする遺伝子は当業者に公知であり、そしてコーディング配列は、多様な特許データベース、好適に利用可能なデータベース（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて見出される核酸およびタンパク質データベース）、科学文献、またはＧｅｎｚｙｍｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ、またはＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，  Ｉｎｃ．のような会社より作成されるカタログ［例えば、１９９５  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｃａｔａｌｏｇ，  Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  マサチューセッツ州；２００２もしくは１９９５  Ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ  （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）；または２００２  Ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，  Ｉｎｃ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）（本明細書に記載のすべての参考文献を含め、それぞれその全体が出典明示によって援用される）を参照のこと］に引用される科学文献を含むさまざまな供給源から入手され得る。
【０１２１】
ＤＮＡワクチンを個体に導入する方法は、当業者に周知である。例えば、ＤＮＡは、骨格筋または他の体細胞組織に注入することができる（例えば、筋肉内注入）。カチオン性リポソームまたは遺伝子銃のような微粒子銃を使用して、ＤＮＡワクチンを送達することができる。あるいは、イオントフォレーシスおよび経皮伝達のための他の手段を、ＤＮＡワクチンの個体への導入のために使用することができる。
【０１２２】
本発明に使用するためのウイルスベクターは、ウイルスの感染性を破壊せずに新たな遺伝子を導入するために欠失されたウイルスゲノムの一部を有し得る。本発明のウイルスベクターは、典型的に、非病原性ウイルスである。実施者の随意で、プロフェッショナルな抗原提示細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞）のような特定の細胞タイプに感染するようなウイルスベクターを選択することができる。あるいは、個体において任意の細胞に感染することが可能であるウイルスベクターを選択することができる。本発明に使用するたのに適切な例示的ウイルスベクターとして、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、鶏痘ウイルス、高度に弱毒化されたワクシニアウイルス（例えば、アンカラ（Ａｎｋａｒａ）またはＭＶＡ［改変ワクシニアアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）］）、レトロウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。好適な具体例では、ウイルスベクターは、アンカラ（Ａｎｋａｒａ）またはＭＶＡである。
【０１２３】
ワクシニアウイルス発現ベクターの構築のための一般的ストラテジーは、当該技術分野において公知である［例えば、Smith and Moss, 1984；U.S. Patent No. 4,738,846（その全体が本明細書において出典明示によって援用される）を参照のこと］。Sutter and Moss (1992)およびSutter et al. (1994)は、構築を開示し、そして本発明においてウイルスベクターとして使用することができる非複製組み換え体アンカラ（Ａｎｋａｒａ）ウイルス（ＭＶＡ）をベクターとして使用している。
【０１２４】
本発明のポリヌクレオチドを含んでなる組成物は、市販されている適切な核酸ワクチンベクター（プラスミド）（例えば、Ｖｉｃａｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）またはこれも市販されている他の核酸ベクター（プラスミド）（例えば、Ｖａｌｅｎｔｉ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、カリフォルニア州）を含むことができる。あるいは、ウイルスベクターおよび本発明によるポリヌクレオチドを含んでなる組成物は、本発明によって提供される。加えて、組成物は、薬学的に許容可能なキャリア、例えば、生理食塩水を含むことができる。薬学的に許容可能なキャリアは当該技術分野において周知であり、そしてまた市販されている。例えば、そのような許容可能なキャリアについては、Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ’ｓ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡに記載されている。
【０１２５】
本明細書において言及し、または引用したすべての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、それらが本明細書の明白な教義と矛盾しない程度で、すべての図および表を含むそれらの全体が出典明示によって援用される。
【０１２６】
以下の実施例では、本発明を実施するための手順について例示する。これらの実施例は、限定的であるものとして解釈されるべきではない。他に示さない限り、すべてのパーセンテージは重量によるものであり、すべての溶媒混合割合は容積によるものである。
【実施例】
【０１２７】
実施例１−植物における発現のための核酸配列の最適化
背景  植物における異種遺伝子の発現のより高いレベルを得るために、遺伝子のタンパク質コーディング配列が植物細胞においてより効率的に発現されるように、それを再操作することが好適であり得る。タバコは、遺伝子の発現レベルおよび植物体におけるコードされたタンパク質のレベルを増加するために、形質転換前に、異種タンパク質コーディング領域を再設計することが好適であるような植物である。従って、哺乳動物ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の設計におけるさらなる工程は、最適な発現のための異種遺伝子の再操作である。
【０１２８】
タバコにおける発現のための哺乳動物ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の再操作のための１つの動機は、元々の哺乳動物ウイルス遺伝子のＧ＋Ｃ含有量が最適でないことによる。例えば、多くの元々の哺乳動物ウイルス遺伝子の低いＧ＋Ｃ含有量（および結果的に高いＡ＋Ｔ含有量への傾斜）は、高度にＡ＋Ｔに富むことが公知である植物遺伝子制御配列を模倣または複製する配列の作製を生じる。植物に導入される遺伝子のＤＮＡ内のいくつかのＡ＋Ｔに富む配列の存在（例えば、ＴＡＴＡボックス領域は、通常、遺伝子プロモーターに見出される）は、遺伝子の異常な転写を生じ得る。一方、転写されたｍＲＮＡ（例えば、ポリアデニル化シグナル配列（ＡＡＵＡＡＡ）、またはプレ−ｍＲＮＡスプライシングに関与する小さな核ＲＮＡに相補的な配列）に存在する他の調節配列の存在は、ＲＮＡ不安定性をもたらし得る。従って、タバコ発現のための哺乳動物ウイルスタンパク質をコードする遺伝子（より好ましくは、植物最適化遺伝子と称される）の設計における１つの目的は、タバコ遺伝子コーディング領域の平均に近いＧ＋Ｃ含有量を有するＤＮＡ配列を作製することである。哺乳動物ウイルスタンパク質をコードする植物最適化遺伝子の設計における別の目的は、配列の変異が翻訳を妨害しないＤＮＡ配列を作製することである。
【０１２９】
１３４３個のタバコ遺伝子のコーディング領域のＧ＋Ｃ含有量は、４３．６％と算出されている。従って、哺乳動物ウイルスタンパク質をコードする異種遺伝子を設計する場合、約４４％に近いＧ＋Ｃ含有量を達成することが好適である。
【０１３０】
遺伝子暗号の重複／縮重によって付与される可塑性（即ち、いくつかのアミノ酸は、１を超えるコドンによって指定される）のため、異なる生物体または生物体のクラスでは、ゲノムの進化に伴い、重複コドンの使用頻度が異なってくる。この「コドンバイアス」は、タンパク質コーディング領域の平均塩基組成に反映される。例えば、比較的低いＧ＋Ｃ含有量を伴う生物体は、重複コドンの第３の位置においてＡまたはＴを有するコドンを利用するが、一方、より高いＧ＋Ｃ含有量を有するものは、第３のコドン位置においてＧまたはＣを有するコドンを利用する。特に、少数派コドンに対応するチャージしたｔＲＮＡの相対量が低い場合、ｍＲＮＡ内の「少数派」コドンの存在は、そのｍＲＮＡの絶対的な翻訳速度を減少し得ると考えられる。この概念を広げると、個々の少数派コドンによる翻訳速度の減少は、少数派コドンが複数あると少なくとも加算的になる。従って、相対的に高い含有量の少数派コドンを有するｍＲＮＡは、対応して低い翻訳速度を有する。このような速度の影響は、その後、低いレベルのコードされたタンパク質に現れる。
【０１３１】
タバコにおける（またはワタ、トウモロコシ、またはダイズのような別の植物における）発現のために哺乳動物ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の操作を支援するために、タバコ遺伝子（または他の関連植物の遺伝子）のコドンバイアスを決定することができる。タバコ遺伝子タンパク質コーディング領域のコドンバイアスを、そのタンパク質をコードするために植物が使用する統計的コドン分布によって表し、そして表１に示す（単一のアミノ酸を指定する各コドンを使用してそのアミノ酸をコードする（パーセンテージでの）頻度として表す）。植物に最も好適なコドンを決定し、ならびに複数の選択が存在する場合、好適なコドンの第２、第３、または第４の選択を決定する。次いで、哺乳動物ウイルスタンパク質のアミノ酸配列をコードする新たなＤＮＡ配列を設計することができるが、植物の（第１の好適な、第２の好適な、第３の好適な、もしくは第４の好適な）コドンの置換によって、新たなＤＮＡ配列は、元々の哺乳動物ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ配列（タンパク質をコードする）とは異なり、タンパク質アミノ酸配列内の各位置で適切なアミノ酸を指定する。次いで、新たな配列を、改変によって作製され得る制限酵素認識部位について分析することができる。同定された部位は、関連のコドンを、第１、第２、第３、または第４の選択の好適コドンで置き換えることによって、さらに改変する。目的の遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼす配列における他の部位は、エキソン：イントロンジャンクション（５’もしくは３’）、ポリＡ付加シグナル、またはＲＮＡポリメラーゼ終結シグナルを含む。改変された配列をさらに分析し、そしてさらに改変して、ＴＡまたはＣＧダブレットの頻度を減少し、そしてＴＧまたはＣＴダブレットの頻度を増加する。これらのダブレットに加えて、［Ｇ＋Ｃ］もしくは［Ａ＋Ｔ］の約５連続残基を超える配列ブロックは、配列の転写または翻訳に影響を及ぼす。従って、これらの配列ブロックはまた、第１または第２の選択などのコドンを、選択した他の好適なコドンで置き換えることによって改変される。稀にしか使用されないコドンは、遺伝子設計において実質的な程度で含めないが、コドン組成自体とは異なる設計基準（例えば、制限酵素認識部位の付加または欠失）を適合する必要がある場合にのみ、使用される。
【０１３２】
上記の方法は、遺伝子が植物において最適に発現されるように、当業者が、特定の植物に外来性である改変された遺伝子を設計することを可能にする。方法は、US Patent Number 5,380,831およびpatent application WO 97/13402にさらに記載および例示されている。
【０１３３】
それ故、哺乳動物ウイルスタンパク質をコードする植物最適化遺伝子を設計するために、特定の１つもしくは複数の植物の遺伝子配列から編集したコドンバイアスの表から確立した重複遺伝子暗号を利用して、前記タンパク質のアミノ酸配列をコードするようにＤＮＡ配列を設計する。得られるＤＮＡ配列は、より高い程度のコドン使用多様性、所望の塩基組成を有し、戦略的に配置された制限酵素認識部位を含有することができ、そして遺伝子の転写、または産物ｍＲＮＡの翻訳を妨害し得る配列を欠く。それ故、本発明のタンパク質／遺伝子に機能的に均等である合成遺伝子を使用して、植物を含む宿主を形質転換することができる。合成遺伝子の生成に関するさらなる指針は、例えば、U.S. Patent No. 5,380,831において見出すことができる。
【０１３４】
一旦、前記ＤＮＡ配列を紙面上またはインシリコで設計したら、実際のＤＮＡ分子を、研究室で合成して、配列上、設計された配列に正確に対応させることができる。そのような合成ＤＮＡ分子をクローニングすることができ、そうでなければ、それらがあたかも天然または元々の供給源から誘導されたが如く、正確に操作することができる。
【０１３５】
ＷＮＶ  ｐｒＭ−Ｍ−Ｅペプチドのタバコバイアス化コーディング領域の設計ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスのフラミンゴ単離体のゲノム配列全体を、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＦ１９６８３５として開示する。ウイルスのｐｒＭ−、Ｍ−およびＥ−ペプチドをコードする元々のウイルスゲノムの部分の２００４塩基対（ｂｐ）ＤＮＡ配列を、ヌクレオチド１〜２７６（ｐｒＭ−ペプチド）、２７７〜５０１（Ｍ−ペプチド）、および５０２〜２００４（Ｅ−ペプチド）により配列番号１［配列番号１は、ＡＦ１９６８３５の塩基４６６〜２４６９を含んでなる］において表す。本実施例１の目的のために、元々のヌクレオチド配列をバージョン１と称する。配列番号１によってコードされるｐｒＭ−、Ｍ−およびＥ−ペプチドのアミノ酸配列を、配列番号２として示す。配列番号１の元々のゲノムＤＮＡ配列を調べることにより、最適な植物発現に有害と考えられるいくらかの配列モチーフの存在、ならびにタバコにおける発現の非最適コドン組成が示された。タバコにおけるこれらの組み換えタンパク質の産生を改善するために、配列番号２のｐｒＭ−、Ｍ−、およびＥ−ペプチドをコードする「タバコ最適化」ＤＮＡ配列（配列番号３）を開発した。
【０１３６】
配列番号１における元々のコーディング領域配列および配列番号３におけるタバコ最適化コーディング領域によってコードされるｐｒＭ−、Ｍ−、およびＥ−ペプチド（配列番号２）は同一である。対照的に、ｐｒＭ−、Ｍ−およびＥ−ペプチドをコードする元々のウイルスＤＮＡ配列およびタバコ最適化ＤＮＡ配列は、僅か７８．７％同一である。
【０１３７】
改変されたＮ−グリコシル化部位を伴うＷＮＶ  ｐｒＭ−Ｍ−Ｅペプチドのタバコバイアス化コーディング領域の設計。多様な糖またはオリゴ糖がタンパク質分子に結合し得ること（そのようなプロセスは、集合的にグリコシル化と称される）、および哺乳動物に導入される場合、組成およびそのような糖部分の提示は、タンパク質の抗原性に影響を及ぼし得ることは、植物タンパク質生化学の分野内において公知である。短いアミノ酸配列、アスパラギン−Ｘａａ−セリン、およびアスパラギン−Ｘａａ−スレオニン（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／ＴｈｒまたはＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔと略称され、ここで、ＸａａおよびＸは、タンパク質において通常見出される２０種類のアミノ酸のいずれかを表す）は、タンパク質上のグリコシル化連結のためのアクセプター部位としての役割を果たし得、ここで、糖は、Ａｓｎ（Ｎ）残基に結合することがさらに公知である。Ｎ−グリコシル化アクセプター配列Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒは、配列番号２におけるアミノ酸３２１〜３２３として見出され、そしてＥ−ペプチドの既知のＮ−グリコシル化部位である。配列番号４は、ｐｒＭ、Ｍ−およびＥ−ペプチドをコードするタバコ最適化ＤＮＡ配列を開示し、ここで、元々のＥ−ペプチドのＮ−グリコシル化アクセプター配列Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＳｅｒをコードするＤＮＡ配列は、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏをコードするように変異されている。それ故、配列番号３と配列番号４との間の唯一の差異は、塩基９６７〜９６９におけるＡＧＣセリンコドンからプロリンＣＣＡコドンへの置換である。Ｎ−グリコシル化アクセプター配列を欠き、そして配列番号４によってコードされる変異タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号５として開示する。
【０１３８】
タバコバイアス化ＷＮＶ  Ｍ−およびＥ−ペプチドコーディング領域バージョン２。いくつかの有用性のために、ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスのＭ−およびＥ−ペプチドのみをコードするＤＮＡ配列を利用することが望ましい。タバコ細胞における発現のために、それは、これらのペプチドをコードする配列番号３の部分（即ち、配列番号３の塩基２７７〜２００４）を使用するのに十分である。それ故、ＷＮＶ  Ｍ−およびＥ−ペプチドをコードするタバコバイアス化コーディング領域の配列を、配列番号６として示す。この配列は、配列番号２の残基９３〜６６８をコードする。Ｍ−およびＥ−ペプチドをコードする元々のウイルスＤＮＡ配列（配列番号１の塩基２７７〜２００４）およびＭ−およびＥ−ペプチドをもコードする配列番号６のタバコ最適化ＤＮＡ配列は、僅か７８．４％同一である一方、コードされるタンパク質は１００％同一である。
【０１３９】
タバコバイアス化ＷＮＶ  Ｍ−およびＥ−ペプチドコーディング領域バージョン３の設計。より高いレベルの所望されるタンパク質を産生するために、タンパク質をコードする単一コピーを超える遺伝子を植物細胞に導入することは、しばしば、望ましくかつ有利である。個別のコピー数のタンパク質コーディング領域は、個別のプロモーターおよび関連する転写制御エレメントの発現制御下で、各コピーで導入してもよく、またはそれらは、単一の二方向性植物プロモーターの発現制御下で単位として導入してもよい。いずれの場合においても、個別のタンパク質コーディング領域が非同一のＤＮＡ配列を有することが望ましくかつ有利である。これには、２つもしくはそれ以上の生物学的理由がある。第１に、大きな複製したＤＮＡ配列は、分子クローニング宿主（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））としてまたは植物形質転換（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））において使用される多くの細菌株において不安定であることが公知である。それ故、同一タンパク質を指定する非同一のコーディング領域の供給は、有害な再配置および／または欠失がこれらの操作中に生じる機会を低減する。第２に、トランスジェニック植物における複製した高度に異種のコーディング領域の発現が、遺伝子スプライシングのような機構を経験し得ることが考えられる。それ故、同一タンパク質を指定する非同一のコーディング領域の導入は、より高いレベルの（およびより安定な）タンパク質産生のより大きな機会を提供する。
【０１４０】
上記で概略した原理を使用して、ＷＮＶ  Ｍ−およびＥ−ペプチドのための第２のタバコ最適化コーディング領域を設計し、そして配列番号７として開示する。配列番号７によってコードされるタンパク質は、配列番号１の元々の配列の塩基２７７〜２００４によってコードされ、そして配列番号６に開示される先のタバコ最適化バージョンによってもまたコードされるタンパク質（即ち、配列番号２の残基９３〜６６８）に同一であることを強調する。配列番号７において開示する第２のタバコ最適化配列と配列番号１における元々の配列の塩基２７７〜２００４および配列番号６における第１のタバコ最適化バージョンとの比較により、それは、対応する元々のＷＮＶ配列に７４．６％同一であり、そして第１のタバコ最適化バージョンに６９．４％同一であることが示される。それ故、異なる植物最適化コーディング領域設計間において実質的なＤＮＡ配列多様性を作製し得る一方、コードされるタンパク質のアミノ酸配列、全体的なコドン組成、および植物遺伝子発現に有害であり得る配列の不在の制限内になお留まることは明らかである。本発明のこのような特徴を、表２に例示し、これは、開示する３つのＤＮＡ配列の異なるコドン組成を示す。
【０１４１】
タバコ最適化ＷＮＶ  ｐｒＭ−、Ｍ−およびＥ−ペプチドコーディング領域のさらなる改変。増大レベルの異種タンパク質は多くの変数に依存し、その変数うちの１つはタンパク質が翻訳中または翻訳後に指向される細胞内局在であることは、トランスジェニック植物遺伝子発現の分野において、当業者に公知である。さらに、異種タンパク質の小胞体（ＥＲ）への転位置は、タンパク質の蓄積に対してポジティブな効果を有し得、そしてタンパク質のアミノ末端への短いＥＲターゲティングペプチドの付加によって、異種タンパク質がＥＲ内の蓄積に対して標的化され得ることもさらに公知である。トウモロコシの１５キロダルトン（ｋＤａ）のゼインタンパク質は、そのようなＥＲターゲティングペプチドを所有し、そして異種タンパク質のアミノ末端への１５ｋＤａゼインＥＲターゲティングペプチドの結合が、単子葉細胞ならびに双子葉細胞のＥＲへのそのタンパク質の輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を生じ得ることが示されている。異種タンパク質のアミノ末端にＥＲターゲティングペプチドを結合させる最も率直な方法は、翻訳時に両方のドメインを含有する（キメラ）融合タンパク質を作製する単一のオープンリーディングフレームにおいて、両方のエレメント（ＥＲターゲティングペプチドおよびタンパク質コーディング領域）をコードするタンパク質コーディング領域を構築することである。所定の短いペプチド配列は、ＥＲ局在タンパク質のカルボキシ末端に存在する場合、ＥＲ内のそれらのタンパク質の残留を指令することができ、それ故、ＥＲ内での効率的なタンパク質蓄積およびグリコシル化を提供することが、当該技術分野において当業者にさらに公知である。１つのそのようなＥＲ残留シグナルペプチドは、アミノ酸配列リジン−アスパラギン酸−グルタミン酸−ロイシン（ＫＤＥＬと略称される）である。それ故、３つのすべてのエレメント（ＥＲターゲティングペプチド配列、異種タンパク質コーディング領域配列、およびＥＲ残留シグナル配列）をコードし、３つのすべてのドメインを、アミノ末端からカルボキシ末端へ列挙した順に含有する（キメラ）融合タンパク質を翻訳時に産生する単一のオープンリーディングフレームを構築することによって、異種タンパク質のＥＲへの転位置およびＥＲ内でのその残留を容易にし得る。
【０１４２】
異種タンパク質のコーディング領域に隣接する（または内に含まれる）所定のヌクレオチド配列エレメントが異種タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳に影響を及ぼし得ることもまた、植物の導入遺伝子発現の分野において当業者に周知である。ｍＲＮＡの翻訳に影響を及ぼす１つのそのような配列エレメントは、翻訳開始コドンＡＵＧ（ＤＮＡコードではＡＴＧ）の周りのヌクレオチド配列である。タバコを含む双子葉植物では、最適な翻訳開始配列コンテキストは、ＡＴＧの直ぐ後にヌクレオチドＧＣを含むことが公知である。普遍的な遺伝子暗号では、ＧＣＮはアラニンを指定するコドンを表す。それ故、最適な翻訳開始コドンコンテキストは、ＡＴＧＧＣＮ（メチオニン−アラニンをコードする）として指定される。双子葉ｍＲＮＡにおける翻訳開始コドンＡＴＧより前の最適は配列コンテキストは、ＡＡＡＣＡによって表されることもさらに公知である。最終的に、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームが少なくとも１つの翻訳終結コドン（即ち、普遍的なＤＮＡ遺伝子暗号においてＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）で終結することが必須であり、そして複数の翻訳終結コドンが、タンパク質コーディング領域（＋１フレームと呼ばれる）と同じフレームだけではなく、二本鎖ＤＮＡにおいて可能な他の５つのリーディングフレームにおいても存在することが、なおより好適である。
【０１４３】
配列番号８は、上記のエレメントを組み入れる完全なタバコ最適化キメラタンパク質コーディング領域のＤＮＡ配列を開示し、１５ｋＤａゼインＥＲターゲティングシグナルペプチド、タバコ最適化ｐｒＭ−、Ｍ−およびＥ−ペプチドコーディング領域（配列番号３として開示する）、およびタバコ最適化ＫＤＥＬ  ＥＲ残留シグナルをコードするタバコ最適化配列を含んでなる。配列番号８によってコードされるキメラ融合タンパク質を、配列番号９として開示する。配列番号８によってコードされ、そして配列番号９に示されるＥＲターゲティングシグナルは、２位にアラニン残基が付加されていることが元々のトウモロコシ１５ｋＤａゼインＥＲターゲティングペプチド配列と異なり、上記のコンセンサス翻訳開始コドン配列コンテキストを蓄積する。
【０１４４】
配列番号１０は、上記のエレメントを組み入れる第２の完全なタバコ最適化キメラタンパク質コーディング領域のＤＮＡ配列を開示し、１５ｋＤａゼインＥＲターゲティングシグナルペプチド、配列番号４において開示する変異Ｎ−グリコシル化アクセプター部位を含むタバコ最適化ｐｒＭ−、Ｍ−およびＥ−ペプチドコーディング領域、およびタバコ最適化ＫＤＥＬ  ＥＲ残留シグナルをコードするタバコ最適化配列を含んでなる。配列番号１０によってコードされるＥＲターゲティングシグナルは、配列番号８において開示するものと同じである。配列番号１０によってコードされるキメラ融合タンパク質を、配列番号１１として開示する。
【０１４５】
配列番号１２は、上記のエレメントを組み入れる第３の完全なタバコ最適化キメラタンパク質コーディング領域のＤＮＡ配列を開示し、１５ｋＤａゼインＥＲターゲティングシグナルペプチド、配列番号６として開示するタバコ最適化Ｍ−およびＥ−ペプチドコーディング領域、およびタバコ最適化ＫＤＥＬ  ＥＲ残留シグナルをコードするタバコ最適化配列を含んでなる。配列番号１２によってコードされるＥＲターゲティングシグナルは、配列番号８において開示するものと同じである。配列番号１２によってコードされるキメラ融合タンパク質を、配列番号１３として開示する。
【０１４６】
配列番号１４は、上記のエレメントを組み入れる第４の完全なタバコ最適化キメラタンパク質コーディング領域のＤＮＡ配列を開示し、１５ｋＤａゼインＥＲターゲティングシグナルペプチド、配列番号７として開示するタバコ最適化Ｍ−およびＥ−ペプチドコーディング領域、およびタバコ最適化ＫＤＥＬ  ＥＲ残留シグナルをコードするタバコ最適化配列を含んでなる。配列番号１４によってコードされるＥＲターゲティングシグナルは、配列番号８において開示するものと同じである。配列番号１４によってコードされるキメラ融合タンパク質を、配列番号１５として開示する。
【０１４７】
配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４において開示するＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ分子は、業者（ＰｉｃｏＳｃｒｉｐｔ；Ｈｏｕｓｔｏｎ、テキサス州）によって合成され、そして得られた分子を、標準的な分子生物学的技術によって植物発現および形質転換ベクターにクローニングした。
【０１４８】
実施例２−植物発現ベクター構築
双子葉バイナリー構築物。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介植物形質転換のための３つの双子葉バイナリーベクター、ｐＤＡＢ２４７５、ｐＤＡＢ２４７８、およびｐＤＡＢ２４８１を、プラスミドｐＤＡＢ２４０６、ｐＤＡＢ２４１８、およびｐＤＡＢ２４０７に基づいて構築した。ｐＤＡＢ２４０６（図１）は、WO 97/48819に記載のキャッサバベインモザイクウイルス（ｃａｓｓａｖａ  ｖｅｉｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＣｓＶＭＶ）プロモーターおよびオープンリーディングフレーム３’非翻訳領域、ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ００４９３）ｖ１を含有する。目的の遺伝子を挿入するために使用した独特な部位、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩは、ＣｓＶＭＶプロモーターとＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１との間に局在する。ｐＤＡＢ２４１８（図２）は、ＲＢ７マトリックス結合領域（ＭＡＲ）（U.S. Patent No. 5,773,689；U.S. Patent No. 5,773,695；U.S. Patent No. 6,239,328、WO 94/07902、およびWO 97/27207）ならびに植物転写単位を含有し、ここで、植物選択マーカーホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）（U.S. Patent Nos: 5,879,903；5,637,489；5,276,268；および5,273,894）は、ＡｔＵｂｉ１０プロモーター（Sun C.-W. et al., 1997；Norris, S.R. et al., 1993；Callis, J. et al, 1995）によって誘導され、そして下流では、ＡｔｕＯＲＦ１  ３’  ＵＴＲ  ｖ３（US5428147；Barker, R.F., et al., 1983；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ００４９３）によって隣接される。ＲＢ７  ＭＡＲ遺伝子と植物ＡｔＵｂｉ１０プロモーターとの間に局在する独特なＮｏｔＩ部位は、ＣｓＶＭＶプロモーター、目的の遺伝子、およびＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１を含有するｐＤＡＢ２４０６から遺伝子フラグメントをクローニングするために使用した。
【０１４９】
改変された基本バイナリーベクター、ｐＤＡＢ２４０７（図３）は、ｐＢＢＶの独特なＢａｍＨＩ部位においてＡｇｅＩリンカーを添加し、Ｔ−ＤＮＡ境界間でのＷＮＶ抗原および選択マーカー発現カセットのＡｇｅＩ／ＡｇｅＩ連結を可能にすることによって組み立てられた。
【０１５０】
ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス双子葉（ｄｉｃｏｔ）バイナリーベクターｐＤＡＢ２４７５（図４）は、ＥＲターゲティングｖ２およびＫＤＥＬ残留ｖ３シグナル（配列番号１２）を伴うタバココドンバイアス化（ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓｅｄ）ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス膜およびエンベロープペプチド（バージョン２）からなるキメラタンパク質をコードする。より具体的には、植物転写単位（ＰＴＵ）は：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２／１５ｋＤａゼインＥＲシグナルｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／ＡｔｕＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／Ｔ−境界Ａを含む。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ’ｓ  ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにおけるＰｉｃｏＳｃｒｉｐｔから得られるように、一次構築物をＤＡＳＰＩＣＯ２０と呼ぶ。そのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ骨格ベクターから１５ｋＤａ  ＥＲシグナルｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３遺伝子を単離するために、ＤＡＳＰＩＣＯ２０をＮｃｏＩ／ＳａｃＩで消化し、次いで、Ｔ４リガーゼによりＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位においてｐＤＡＢ２４０６プラスミドに挿入し、ここで、遺伝子フラグメントは、ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２と、ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１との間に挟まれ、中間ベクターｐＤＡＢ２４７３を生じた。適切な挿入を伴うクローンを確認するために、単離されたＤＮＡをＮｃｏＩ／ＳａｃＩで切断し、ゲル電気泳動により同定し、そしてバルクアップした。ＥＲシグナル−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬおよびＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲを含有するＣｓＶＭＶプロモーター発現カセットを、ＮｏｔＩによりｐＤＡＢ２４７３から取り出し、そしてＲＢ７  ＭＡＲｖ３の下流およびＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２−ＰＡＴ  ｖ３−ＡｔｕＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ選択マーカーカセットの上流のｐＤＡＢ２４１８のＮｏｔＩ部位においてＴ４連結を行い、中間ベクターｐＤＡＢ２４７４において植物転写単位（ＰＴＵ）を形成した。次いで、ＡｇｅＩ消化を使用して、ＰＴＵ成分をｐＤＡＢ２４７４から切り出し、逆配向でｐＤＡＢ２４０７のＡｇｅＩ部位に連結して、最終双子葉バイナリーベクター、ｐＤＡＢ２４７５を得、ここで、ＰＴＵエレメントは、Ｔ−ＤＮＡ境界ＡおよびＢによって隣接される。
【０１５１】
双子葉バイナリーベクター、ｐＤＡＢ２４７８（図５）は、ＥＲターゲティングｖ２およびＫＤＥＬ残留ｖ３シグナル（配列番号８）を伴うタバココドンバイアス化ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスプレ膜ｖ２、膜およびエンベロープペプチドｖ２からなるキメラタンパク質をコードする。より具体的には、２つのＰＴＵは：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２／１５ｋＤａゼインＥＲシグナルｖ２−ｐｒＭＥｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／ＡｔｕＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／Ｔ−境界Ａを含む。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ’ｓ  ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにおけるＰＩＣＯＳＣＲＩＰＴから得られるように、一次構築物をＤＡＳＰＩＣＯ２１と呼ぶ。その骨格ベクターからＥＲシグナルｖ２−ｐｒＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３遺伝子を単離するために、ＤＡＳＰＩＣＯ２１をＮｃｏＩ／ＳａｃＩで消化した。次いで、ＥＲシグナルｖ２−ｐｒＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３遺伝子フラグメントを、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位においてｐＤＡＢ２４０６プラスミドにＴ４が連結し、ここで、遺伝子フラグメントは、ＣｓＶＭＶプロモーターおよびＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲによって隣接され、中間ベクターｐＤＡＢ２４７６を生じた。適切な挿入を伴うクローンを確認するために、単離されたＤＮＡをＮｃｏＩ／ＳａｃＩで切断し、ゲル電気泳動により同定し、そしてバルクアップした。ＥＲシグナルｖ２−ｐｒＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３およびＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲを含有するＣｓＶＭＶプロモーター発現カセットを、ＮｏｔＩによりｐＤＡＢ２４７６から取り出し、そしてＲＢ７  ＭＡＲｖ３遺伝子の下流およびＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２−ＰＡＴ  ｖ３−ＡｔｕＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ選択マーカーカセットの上流のｐＤＡＢ２４１８のＮｏｔＩ部位においてＴ４リガーゼを使用して連結し、中間構築物ｐＤＡＢ２４７７の植物転写単位（ＰＴＵ）を形成した。次いで、ＡｇｅＩにより、ＰＴＵ成分をｐＤＡＢ２４７７から切り出し、逆配向でｐＤＡＢ２４０７のＡｇｅＩ部位に連結して、最終双子葉ベクター、ｐＤＡＢ２４７８を得、ここで、ＰＴＵ成分は、Ｔ−ＤＮＡ境界ＡおよびＢによって隣接される。
【０１５２】
双子葉バイナリーベクター、ｐＤＡＢ２４８１（図６）は、ＥＲターゲティングｖ２およびＫＤＥＬ残留ｖ３シグナル（配列番号１０）を伴うタバココドンバイアス化ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスプレ膜ｖ２、膜ｖ２、およびエンベロープペプチドからなるキメラタンパク質をコードする。より具体的には、ＰＴＵ単位は：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２／１５ｋＤａゼインＥＲシグナルｖ２−変異Ｎ−グリコシル化部位を伴うＷＮＶ  ｐｒＭ  ｖ２  Ｅ  ｖ４−ＫＤＥＬ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／ＡｔｕＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／Ｔ−境界Ａを含む。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ’ｓ  ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにおけるＰＩＣＯＳＣＲＩＰＴから得られるように、一次構築物をＤＡＳＰＩＣＯ２２と呼ぶ。ＥＲシグナルｖ２−変異Ｎ−グリコシル化部位を伴うＷＮＶ  ｐｒＭ  ｖ２  Ｅ  ｖ４−ＫＤＥＬ  ｖ３遺伝子をその骨格ベクターから単離するために、ＤＡＳＰＩＣＯ２２をＮｃｏＩ／ＳａｃＩで消化し、そしてゲル精製した。次いで、ＥＲシグナルｖ２−変異Ｎ−グリコシル化部位を伴うＷＮＶ  ｐｒＭ  ｖ２  Ｅ  ｖ４−ＫＤＥＬ  ｖ３遺伝子フラグメントを、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位においてｐＤＡＢ２４０６プラスミドにＴ４リガーゼによって挿入し、ここで、遺伝子フラグメントは、ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２とＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１との間に挟まれ、中間ベクターｐＤＡＢ２４７９を生じた。挿入を伴うクローンを確認するために、単離されたＤＮＡをＮｃｏＩ／ＳａｃＩで切断し、ゲル電気泳動により同定し、そしてバルクアップした。ＥＲシグナルｖ２−変異Ｎ−グリコシル化部位を伴うＷＮＶ  ｐｒＭ  ｖ２  Ｅ  ｖ４−ＫＤＥＬ  ｖ３およびＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲを含有するＣｓＶＭＶプロモーター発現カセットを、ＮｏｔＩにより  ｐＤＡＢ２４７９から取り出し、そしてＲＢ７  ＭＡＲｖ３遺伝子の下流およびＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２−ＰＡＴ  ｖ３−ＡｔｕＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ選択マーカーカセットの上流のｐＤＡＢ２４１８のＮｏｔＩ部位において連結し、中間構築物ｐＤＡＢ２４８０のＰＴＵ成分を形成した。次いで、ＡｇｅＩにより、ＰＴＵ成分をｐＤＡＢ２４８０から切り出し、逆配向でｐＤＡＢ２４０７のＡｇｅＩ部位に連結して、最終双子葉ベクター、ｐＤＡＢ２４８１を得、ここで、ＰＴＵカセットは、Ｔ−ＤＮＡ境界ＡおよびＢによって隣接される。すべての最終構築物を、はじめに、制限消化によって確認し、続いて、Ｔ−ＤＮＡ境界間を配列決定して、実際のおよび予想される配列が同一であることを確認した。
【０１５３】
Ｇａｔｅｗａｙ（商標）双子葉バイナリー構築物。Ｇａｔｅｗａｙ（商標）  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、複数のバージョンのＭＥペプチド、プロモーター、ならびにプロモーターおよびＵＴＲに対する目的の遺伝子の配向を含有する次の９つのＷＮＶ  ＭＥ双子葉バイナリーベクターをクローニングするために使用した。目的およびドナーベクターの両方を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ  Ｇａｔｅｗａｙ（商標）  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙプロトコルに従って作製した。１つの目的ベクター、ｐＤＡＢ３７３６（図７）、および４つのドナーベクター、ｐＤＡＢ３９１２（図８）、ｐＤＡＢ３９１４（図９）、ｐＤＡＢ３９１６（図１０）、およびｐＤＡＢ３７２４（図１１）は、９つのバイナリー構築物を組み立てるために使用したＧａｔｅｗａｙ（商標）構築物の骨格を構成する。
【０１５４】
目的ベクターｐＤＡＢ３７３６をｐＤＡＢ２４０７（図３）から誘導し、これは、ＬＲクロナーゼ反応においてエントリークローンと組み換えて、発現クローンを作製するａｔｔＲ部位を含有する。さらに、ｐＤＡＢ３７３６は、複数コピーのＴ−ＤＮＡ境界Ａを有する。境界Ａおよび境界Ｂ領域内に、ＲＢ７マトリックス結合領域（ＭＡＲ）およびＧａｔｅｗａｙ（商標）クローニング部位ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２が存在する。エントリーベクターｐＤＡＢ３９１２（図８）は、ＣｓＶＭＶプロモーターおよびＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲカセットを含有する。プロモーターとＵＴＲとの間にＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位が局在し、ここで、目的の遺伝子が挿入された。カセットは、エントリークローンの作製のために、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）クローニング部位ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２によって隣接される。別のエントリーベクター、ｐＤＡＢ３９１４（図９）は、ΔＭＡＳ  ４ＯＣＳプロモーター（ＡｔｕＭａｓプロモーター）ｖ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ００４９３）およびＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲカセットを含有する。さらに、プロモーターとＵＴＲとの間に、クローニング部位、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位が存在し、ここで、目的の遺伝子が挿入された。カセットは、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２部位によって隣接される。他のドナーベクターと同様に、ｐＤＡＢ３９１６（図１０）は、ＡｔＵｂｉ１０プロモーターおよびＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲカセットを含有するＧａｔｅｗａｙ（商標）構築物である。プロモーターとＵＴＲとの間にＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位が存在し、ここで、目的の遺伝子が挿入された。カセットは、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）クローニング部位、ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２部位によって隣接される。Ｇａｔｅｗａｙドナーベクター、ｐＤＡＢ３７２４（図１１）は、ＣｓＶＭＶプロモーター、続いて、連続的に、Ｎｔ  Ｏｓｍｏｔｉｎ  ５’ＵＴＲ  ｖ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｓ４００４６）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子（Jefferson, 1987）、およびＮｔ  Ｏｓｍ  ３’ＵＴＲ  ｖ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｓ４００４６）を含有する。カセットは、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２部位によって隣接される。ＧＵＳ遺伝子と境界をなす制限部位、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩを、ＧＵＳを目的の遺伝子で置き換えるために使用した。
【０１５５】
Ｇａｔｅｗａｙ（商標）  ＷＮＶ  ＭＥバイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９２０（図１２）は、ＰＴＵ単位：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２／ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３  ／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有する。ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２ペプチドの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって達成した。ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２配列のみに対して刺激し、そして順方向プライマーのＮｃｏＩ部位および逆方向プライマーのＳａｃＩ部位からなるＰＣＲプライマー（順方向：５’ａｇａ  ｇａａ  ｃｔａ  ｇｔａ  ａａａ  ａｇｇ  ａｇａ  ａａｔ  ｃｃａ  ｔｇｇ  ｃｔｔ  ｃｃｃ  ｔｇａ  ｃａｇ  ｔｇｃ  ａａａ  ｃｔｃ  ａｔｇ  ３’；逆方向：５’Ｃｃｃ  ｔｃｇ  ａｇｇ  ｇａｇ  ｃｔｃ  ｔｔａ  ｔｃａ  ｃｔｔ  ａｇｃ  ａｔｇ  ａａｃ  ａｔｔ  ｔａｃ  ａｇ  ３’）を使用することによって、ＭＥペプチドから、ＤＡＳＰＩＣＯ２０（配列番号１２）由来のＥＲ  ｖ２ターゲティングおよびＫＤＥＬ  ｖ３残留配列を取り出した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ  ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングプロトコルを使用して、ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２  ＰＣＲ産物を直接ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターにクローニングして、ｐＤＡＢ３９１８を形成した。次いで、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ消化を使用して、ＴＯＰＯ骨格からＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２遺伝子を単離し、そしてＴ４リガーゼを使用して、ｐＤＡＢ３９１２のＮｃｏＩ／ＳａｃＩ部位に連結して、エントリークローン、ｐＤＡＢ３９１９を形成した。ｐＤＡＢ３９１９を、ｐＤＡＢ３７３６に対してＬＲクロナーゼ処理して、ｐＤＡＢ３９２０を形成した。
【０１５６】
Ｇａｔｅｗａｙ（商標）バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９２２（図１３）は、次のエレメント：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＡｔｕＭＡＳ  ４ＯＣＳプロモーターｖ４／１５ｋＤａゼインＥＲ  ｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有する。ＤＡＳＰＩＣＯ２０（配列番号１２）のＥＲシグナルｖ２−ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３ペプチドを、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩによってその骨格プラスミドから取り出した。次いで、切り出した遺伝子フラグメントをｐＤＡＢ３９１４のＮｃｏＩ／ＳａｃＩ部位に挿入して、ＡｔｕＭＡＳ  ４ＯＣＳプロモーターｖ４とＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１との間に目的の遺伝子が挟まれたエントリークローン、ｐＤＡＢ３９２１を形成した。次いで、ｐＤＡＢ３９２１を、ｐＤＡＢ３７３６目的ベクターに対してＬＲクロナーゼ処理して、発現およびバイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９２２を形成した。
【０１５７】
Ｇａｔｅｗａｙ（商標）ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスバイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９２４（図１４）は、次のエレメント：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／Ａｔ  Ｕｂｉ１０プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ０５３６３）ｖ２／１５ｋＤａゼインＥＲ  ｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有する。ＤＡＳＰＩＣＯ２０（配列番号１２）のＥＲシグナルｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３ペプチドを、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩによってその骨格プラスミドから取り出した。次いで、切り出した遺伝子フラグメントをｐＤＡＢ３９１６のＮｃｏＩ／ＳａｃＩ部位に挿入して、Ａｔ  Ｕｂｉ１０  ｖ２プロモーターとＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１との間に目的の遺伝子が挟まれたエントリークローン、ｐＤＡＢ３９２３を形成した。次いで、ｐＤＡＢ３９２３を、ｐＤＡＢ３７３６目的ベクターと共にＬＲクロナーゼ処理して、双子葉バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９２４を形成した。
【０１５８】
Ｇａｔｅｗａｙ（商標）バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９２７（図１５）は、次のＰＴＵエレメント：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２／１５ｋＤａゼインＥＲ  ｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有する。ＥＲシグナルｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２ペプチドの増幅を、ＰＣＲによって達成した。ＥＲシグナルｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２配列のみに対して刺激し、そしてクローニング目的のために、順方向プライマーのＮｃｏＩ部位および逆方向プライマーのＳａｃＩ部位からなるＰＣＲプライマー（順方向：５’ｃａｔ  ｇｃｃ  ａｔｇ  ｇｃｔ  ａａｇ  ａｔｇ  ｇｔｃ  ａｔｔ  ｇｔｇ  ｃｔｔ  ｇｔｔ  ｇｔｇ  ｔｇｃ  ３’；逆方向：５’ｃｃｃ  ｔｃｇ  ａｇｇ  ｇａｇ  ｃｔｃ  ｔｔａ  ｔｃａ  ｃｔｔ  ａｇｃ  ａｔｇ  ａａｃ  ａｔｔ  ｔａｃ  ａｇ３’）を使用することによって、ＭＥ  ｖ２ペプチドから、ＤＡＳＰＩＣＯ２０（配列番号１２）由来のＫＤＥＬ  ｖ３残留配列を取り出した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ  ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングプロトコルを使用して、ＥＲシグナルｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２ＰＣＲ産物を直接ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターにクローニングして、ｐＤＡＢ３９２５を形成した。次いで、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩを使用して、そのＴＯＰＯ骨格プラスミドからＥＲシグナルｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２遺伝子を単離し、そしてＴ４リガーゼを使用して、ｐＤＡＢ３９１２のＮｃｏＩ／ＳａｃＩ部位に連結して、エントリークローン、ｐＤＡＢ３９２６を形成した。ｐＤＡＢ３９２６を、目的ベクター、ｐＤＡＢ３７３６と共にＬＲクロナーゼ処理して、最終バイナリーベクターｐＤＡＢ３９２７を形成した。
【０１５９】
Ｇａｔｅｗａｙ（商標）バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９２９（図１６）は、次のＰＴＵ単位：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２／Ｎｔ  ｏｓｍ  ５’ＵＴＲ  ｖ３／１５ｋＤａゼインＥＲ  ｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３／Ｎｔ  ｏｓｍ  ３’ＵＴＲ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有する。ＤＡＳＰＩＣＯ２０（配列番号１２）のＥＲシグナルｖ２−ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３ペプチドを、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩによってその骨格プラスミドから取り出した。次いで、Ｔ４リガーゼを使用して、切り出した遺伝子フラグメントをｐＤＡＢ３７２４のＮｃｏＩ／ＳａｃＩ部位（図１１）に挿入して、ＣｓＶＭＶ／Ｎｔ  ｏｓｍ  ５’ＵＴＲとＮｔ  ｏｓｍ  ３’ＵＴＲ  ｖ３／ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲとの間に目的の遺伝子が挟まれたエントリークローン、ｐＤＡＢ３９２８を形成した。ｐＤＡＢ３９２８およびｐＤＡＢ３７３６目的ベクターとのＬＲクロナーゼ反応により、バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９２９を生成させた。
【０１６０】
Ｇａｔｅｗａｙ（商標）バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９３４（図１７）は、次のエレメント：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲ／ＫＤＥＬｖ３／ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ３／１５ｋＤａゼインＥＲシグナルｖ２（配列番号１４）／ＡｔｕＭＡＳ  ４ＯＣＳプロモーターｖ４／１５ｋＤゼインＥＲシグナルｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ１    ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有する。この構築物の作製のために、多段階クローニングプロセスは、ＰＣＲ産物に隣接するＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有したプライマー（順方向：５’ｃｃｃ  ａａｇ  ｃｔｔ  ｇｇｇ  ｔｇｔ  ｃｃａ  ａｃａ  ｇｔｃ  ｔｃａ  ｇｇｇ  ｔｔａ  ａｔｇ  ｔｃ３’；逆方向：ｃｃｃａ  ａｇｃｔ  ｔｇｇ  ｇ  ｔｇｇ  ｃａｃ  ｇｔｇ  ａｇｇ  ｔｃｃ  ａｔｇ  ｃｇｇ  ｃｔｇ  ｃ）を使用する構築物ｐ５０１（Murai and Kemp, 1982）からのＯＲＦ２５／２６  ポリＡ  ＵＴＲの増幅を含んだ。次いで、ＯＲＦ２５／２６ポリＡ  ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターにクローニングして、ｐＤＡＢ３９３０を生成した。ＤＡＳＰＩＣＯ２０（配列番号１２）のＥＲシグナルｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３を、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩによってその骨格プラスミドから取り出し、Ｔ４リガーゼを使用して、ＮｃｏＩ／ＳａｃＩ部位においてｐＤＡＢ３９１４に挿入して、ｐＤＡＢ３９３１を形成した。ＳａｃＩＩを使用して、そのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ骨格からＤＡＳＰＩＣＯ７２（ＰｉｃｏＳｃｒｉｐｔ、配列番号１４）のＥＲシグナルｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ３−ＫＤＥＬを取り出し、次いで、遺伝子フラグメントをＳａｃＩＩ部位において逆配向でｐＤＡＢ３９３１に挿入して、ｐＤＡＢ３９３２を形成した。ＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＤＡＢ３９３０からＯＲＦ２５／２６ポリＡ  ＰＣＲ産物を切り出した。次いで、ＯＲＦ２５／２６Ｐｏｌｙ  Ａ  ＵＴＲを、逆配向で、ｐＤＡＢ３９３２にそのＨｉｎｄＩＩＩ部位において挿入して、エントリークローン、ｐＤＡＢ３９３３を形成した。ｐＤＡＢ３９３３を、ｐＤＡＢ３７３６に対してＬＲクロナーゼ処理して、発現およびバイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９３４を形成した。
【０１６１】
Ｇａｔｅｗａｙ（商標）バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９４１（図１８）は、次のＰＴＵ成分：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２／１５ｋＤゼインＥＲ  ｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ３プロモーターｖ２／１５ｋＤゼインＥＲ  ｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ３−ＫＤＥＬｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有する。この多段階クローニングプロセスは、ＰＣＲ産物の５’末端におけるＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ部位、および３’末端においてＰＣＲ産物に隣接するＳａｃＩ／ＸｈｏＩ部位を含有するプライマー（順方向：５’ｃｃｃ  ａａｇ  ｃｔｔ  ａｔａ  ａｇａ  ａｔｇ  ｃｇｇ  ｃｃｇ  ｃｔａ  ａａｃ  ｔａｔ  ａｇｃ  ｔｔｃ  ｇｇａ  ｔｔｔ  ｇｇａ  ｇｃｃ  ａａｇ  ｔｃ３’；逆方向：５’ｃｃｇ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ｃｇｇ  ｔｃｃ  ｃｃｇ  ｃｇｇ  ｇｇａ  ｇｃｔ  ｇａａ  ａｔａ  ａａａ  ｃａａ  ｔａｇ  ａａｃ  ａａｇ  ｔａｇ３’）を使用して、別の構築物からＡｔＵｂｉ３  ｖ２プロモーターを増幅することを含んだ。次いで、ＡｔＵｂｉ３  ｖ２ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターにクローニングして、プラスミドｐＤＡＢ３９３５を作製した。ＸｈｏＩリンカー（センス：ｃｇａｔｃｃｇｃｔｃｇａｇｃｇｇｔａｇｇ；アンチセンス：ｇｔｇ  ａｃｃ  ｃｔａ  ｃｃｇ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ｃｇｇ  ａｔｃ  ｇａｇ  ｃｔ）を、ｐＤＡＢ２４０６にＳａｃＩ／ＢｓｔＥＩＩ部位において付加して、ＣｓＶＭＶ  ｖ２プロモーターとＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１との間にＸｈｏＩ部位を導入して、ベクター、ｐＤＡＢ３９３６を作製した。次いで、ｐＤＡＢ３９３６をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断して、ＣｓＶＭＶプロモーターを取り出し、そして骨格ベクターを保持した。ｐＤＡＢ３９３５由来のＰＣＲ産物、ＡｔＵｂｉ３  ｖ２プロモーターをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ部位においてｐＤＡＢ３９３６骨格に連結し、ｐＤＡＢ３９３７を作製した。ＤＡＳＰＩＣＯ２０（配列番号１２）のＥＲシグナルｖ２−ＭＥ  ｖ２−ＫＤＥＬ  ｖ３ペプチドを、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩによってその骨格プラスミドから取り出し、ＮｃｏＩ／ＳａｃＩ部位においてｐＤＡＢ３９１２に連結して、プラスミドベクター、ｐＤＡＢ３９３９を形成した。ＤＡＳＰＩＣＯ７２（配列番号１４）のＥＲシグナルｖ２−ＷＮＶ  ＭＥ  ｖ３−ＫＤＥＬ  ｖ３ペプチドを、ＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩによりそのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ骨格プラスミドから取り出し、そしてｐＤＡＢ３９３７にＳａｃＩＩ／ＸｈｏＩ部位において挿入して、ｐＤＡＢ３９３８を構築した。次いで、ＡｔＵｂｉ３／ＥＲシグナルｖ２−ＭＥ  ｖ３−ＫＤＥＬ  ｖ３／ＯＲＦ２３遺伝子カセットをｐＤＡＢ３９３８からＮｏｔＩによって切り出し、そしてｐＤＡＢ３９３９にＮｏｔＩ部位において挿入して、エントリークローン、ｐＤＡＢ３９４０を形成した。ｐＤＡＢ３９４０および目的ベクター、ｐＤＡＢ３７３６とのＬＲクロナーゼ反応により、バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９４１を形成させた。
【０１６２】
Ｇａｔｅｗａｙ（商標）バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３９４３（図１９）は、次のエレメント：Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７  ＭＡＲ  ｖ３／ＣｓＶＭＶｖ２／改変されたグリコシル化部位（ｖ５）を伴うＷＮＶ  Ｍ  ｖ２  Ｅ／Ａｔｕ  ＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１／ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ  ｖ３／Ａｔｕ  ＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ３／複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを含有する。クローニングプロセスは、ＡｃｃＩおよびＡｖｒＩＩ制限酵素を使用して、ＤＡＳＰＩＣＯ２２（配列番号１０）のＷＮＶ  ｐｒＭ  ｖ２  Ｅ  ｖ４ペプチドの変異Ｎ−グリコシル化部位領域を取り出し、そしてｐＤＡＢ３９１９（ｐＤＡＢ３９２０クローニングストラテジーを指す）にＡｃｃＩ／ＡｖｒＩＩ部位において連結して、エントリークローン、ｐＤＡＢ３９４２を確立することを含んだ。ｐＤＡＢ３９４２を、目的ベクター、ｐＤＡＢ３７３６に対してＬＲクロナーゼ処理して、最終双子葉バイナリープラスミド、ｐＤＡＢ３９４３を作製した。
【０１６３】
すべての最終Ｇａｔｅｗａｙバイナリー構築物を、はじめに、制限消化によって確認し、続いて、Ｔ−ＤＮＡ境界間を配列決定して、実際のおよび予想される配列が同一であることを確認した。
【０１６４】
実施例３−植物発現ベクターによるアグロバクテリウム（ＡＧＲＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭの形質転換
独立して、各ＷＮＶ構築物について、１．５〜３μｇのプラスミドＤＮＡを、５０μｌのＥｌｅｃｔｒｏｍａｘ（登録商標）ＬＢＡ４４０４アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）に添加し、そして穏やかに混合した。混合物を、冷たい０．２ｃｍのＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）キュベット（ＢｉｏＲａｄ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）に移し、そして氷上に置いた。次いで、キュベットを、冷たいＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）ラック（ＢｉｏＲａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）に置き、そして以下の条件でエレクトロポレートした：
キャパシタンス出力              ２５μファラッド
キャパシタンスエクステンダー    ９６０μファラッド
抵抗                            ２００オーム
電圧                            ２．５キロボルト
【０１６５】
エレクトロポレーションの直後、９５０μｌのＳＯＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を添加し、そして混合物をＦａｌｃｏｎ２０５９チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ニュージャージー州）または均等物に移した。次いで、形質転換細胞を２８℃で１時間、インキュベートした。インキュベーション後、５０μｌ、１００μｌ、および２００μｌの細胞を、適切であれば抗生物質を含有する個別のＹＥＰ培地プレート（１リットルの水中１０ｇイースト抽出物、１０ｇペプトン、５ｇのＮａＣｌ、１０ｇスクロース、および１５ｇ寒天）上でプレート化した。プレートを、２８℃で約３６〜４８時間、倒置培養した。単一のコロニーを拾い出し、そして適切であれば抗生物質を含有する５０ｍｌの液体ＹＥＰ（１リットルの水中１０ｇイースト抽出物、１０ｇペプトン、５ｇのＮａＣｌ、および１０ｇスクロース）において、２８℃で約３６時間、増殖させた。Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）低コピーミニ−プレッププロトコル（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州）後、精製したプラスミドＤＮＡを、細菌培養物から調製した。制限消化によって、ＤＮＡ保全を評価した。予想される結合パターンを伴うクローンを同定し、そして５００μｌの細菌培養物を５００μｌの滅菌グリセロール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）に添加し、反転して混合することによって、グリセロールストックを調製した。グリセロールストックをドライアイス上で凍結し、そして−８０℃で貯蔵した。
【０１６６】
実施例４−ＷＮＶタンパク質の発現のためのタバコ（ＮＩＣＯＴＩＡＮＡ  ＴＡＢＡＣＵＭ）細胞培養の安定な形質転換
２ｍｌのＮＴ−１培養物または１ｍｌのパック細胞（ｐａｃｋｅｄ  ｃｅｌｌ）を２５０ｍｌフラスコ中４０ｍｌのＮＴ−１Ｂ培地（表３）に添加することによって、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）ＮＴ−１細胞培養を、１週間のサブ培養サイクル上で無菌的に維持した。懸濁物を、２５±１℃の暗所で、１２５ｒｐｍで維持した。
【０１６７】
ＮＴ−１培養物の形質転換のための調製では、目的の発現ベクターを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の５０％グリセロールストックを使用して、２０〜５００μｌのグリセロールストックを、５０ｍｇ／ｌスペクチノマイシンおよび１００μＭアセトシリンゴンを含有する３０ｍｌのＹＥＰ液体培地（１リットルの水中１０ｇイースト抽出物、１０ｇペプトン、５ｇのＮａＣｌ、および１０ｇスクロース）に添加することによって、液体細菌培養を開始した。細菌培養物を、２８℃の暗所で、１５０〜２００ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．５〜０．６となるまで、インキュベートした。これは、約１８〜２０時間を要した。
【０１６８】
形質転換の当日、ＮＴ−１サブ培養の４日後に、２０ｍＭアセトシリンゴン（エタノール中）を、１ｍｌのＮＴ−１培養物あたり１μｌの濃度で細胞懸濁液に添加した。形質転換効率を増加させるために、滅菌１０ｍｌ標準口径ピペットを介して細胞を２０回上下させることによって、ＮＴ−１細胞を傷つけた。４ミリリットルの懸濁液を１０枚の６０×２０ｍｍペトリプレートのそれぞれに移した。１枚のプレートを別に取っておき、非形質転換コントロールとして使用した。残りの９枚のプレートのそれぞれに、１００μｌのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を添加した。プレートをパラフィンで包み、そして暗所にて、１００ｒｐｍおよび２５±１℃で３日間、インキュベートした。
【０１６９】
トランスジェニック事象もまた、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物の増殖においてアセトシリンゴンを使用せず、また植物細胞形質転換プロセス中にもそれを使用しない代替的方法によって、作製した。４ミリリットルのタバコ懸濁液（無傷）を１０枚の１００×２５ｍｍペトリプレートのそれぞに移した。９枚のプレートのそれぞれに、ＯＤ６００＝１．５±０．２の１００μｌのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を添加し、再度、１枚のプレートを非形質転換コントロールとして保持した。プレートを旋回させて混合し、パラフィンで包み、そして２５±１℃の暗所で、３日間、振盪を伴わずに培養した。
【０１７０】
いずれの形質転換方法の共培養期間後も、すべての液体を取り出し、次いで、細胞を８ｍｌのＮＴＣ培地（オートクレーブ後に添加した５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含有するＮＴ−１Ｂ培地）に再懸濁した。懸濁液の１ミリリットルアリコートを、ＮＴＣ＋Ｂ５培地［オートクレーブ後に５ｍｇ／ｌホスフィノトリシルアラニルアラニン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｙｌａｌａｎｙａｌａｎｉｎｅ）ナトリウム（ビアラホス）を補充し、８ｇ／ｌのＴＣ寒天で固化したＮＴＣ培地］を含有する８枚のペトリプレート（１００×２５ｍｍ）のそれぞれに分配した。パラフィンで包んだまたは包まずに放置したすべての選択プレートを、２５〜２８℃の暗所で維持した。包む前に、過度に湿潤したいずれのプレートからも液体を取り出した。
【０１７１】
２〜８週間後、推定形質転換体は、死滅した非形質転換細胞のバックグランドに対して、カルスの小さなクラスターとして出現した。これらの生存カルスを新鮮ＮＴＣ＋Ｂ５培地に移し、識別番号を割り当て、そして個々の形質転換事象として維持した。プレートを包まずに放置し、２８±１℃の暗所でインキュベートし、そして事象を、新鮮ＮＴＣ＋Ｂ５培地上で、２週間ごとに、合計で３継代サブ培養し、その後、将来のサブ培養のために、カルベニシリンを培地から取り出した。各推定形質転換体の部分を、タンパク質発現解析のために使用した。選択した事象を、カルスとしてバルクアップし、そして懸濁培養で樹立した。
【０１７２】
５００ｍｇの７日齢、増殖トランスジェニックカルスを、２０ｍｌのＮＴ１Ｂ＋１０ｍｇ／ｌビアラホスを含有する１２５ｍＬフラスコに移すことによって、懸濁を開始した。５０ｍｌピペットで３〜５回ピペッティングして、組織を破壊することによって、細胞および液体を混合し、次いで、シェーカー上で、１３０ｒｐｍで、２５±℃の暗所にて撹拌した。１ｍｌのパック細胞を、１２５ｍｌフラスコ中１０ｍｇ／ｌビアラホスを伴う２０ｍｌのＮＴ１Ｂに移すことによって、懸濁物を週単位でサブ培養した。懸濁物を、２５±１℃の暗所で、１２５ｒｐｍで維持した。
【０１７３】
実施例５−ＷＮＶタンパク質発現解析
不活化ＷＮＶ対照標準。公開された方法（Blitvich, et al., 2003）を改変することによって、対照抗原を調製した。ＷＮＶを、約０．０１の感染多重度で、５つのローターボトル中のＶＥＲＯ細胞に播種し、そしてローターラック上、３７℃でインキュベートした。２つの同一ボトルの非播種ＶＥＲＯ細胞に、同じ増殖培地（アール（Ｅａｒｌｅｓ）塩、５％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシンを伴う培地１９９）を供給し、そして同じ条件下でインキュベートした。５日後、播種および非播種細胞を、それらのボトルの内側から掻き取った。培地および細胞を５０ｍｌ遠心チューブに置き、そして２０００ｒｐｍでペレット化した。上清を捨て、そして細胞を１５ｍｌの増殖培地にプールし、そして−８０℃で、均等な５つのアリコートにおいて凍結した。
【０１７４】
感染細胞の１つのチューブおよびコントロール細胞の１つのチューブを、３７℃で融解した。細胞を３５００ｒｐｍで、１０分間、ペレット化し、そして６ｍｌの氷冷ホウ酸塩（ｂｏｒａｔｅ  ｓａｌｉｎｅ）緩衝液（１２０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭホウ酸、２４ｍＭ水酸化ナトリウム、ｐＨ９．０）で２回洗浄し、３５００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離を行った。細胞を９００μｌの０．１％ドデシル硫酸ナトリウムに再懸濁し、次いで、１００μｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００および２ｍｌのホウ酸塩緩衝液を懸濁物に添加した。懸濁物を、２０％出力で、３０秒間、氷上で音波処理し、エッペンドルフチューブに移し、そしてマイクロ遠心分離機において、最高速度で１０分間、遠心分離した。最終的に、上清を、透明なエッペンドルフチューブに、１本のチューブあたり５００μｌで移し、そして−８０℃で凍結した。ＷＮＶ感染材料を含有するエッペンドルフチューブに、「ＷＮＶ／ＶＥＲＯ  Ａｎｔｉｇｅｎ」のラベルを付した。非播種コントロール細胞を含有するエッペンドルフチューブに、「Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＶＥＲＯ  Ａｎｔｉｇｅｎ」のラベルを付した。
【０１７５】
５０μｌおよび２５μｌの量のＷＮＶ／ＶＥＲＯ  Ａｎｔｉｇｅｎを、１５０ｃｍ２フラスコ中ＶＥＲＯ細胞の単層上に播種し、５〜６日間、インキュベートし、次いで培地を新鮮ＶＥＲＯ細胞上に通過させ、そして６日間、インキュベートすることによって、ＷＮＶの不活化を確認した。不活化のために使用した界面活性剤に起因するいくつかのＶＥＲＯ細胞損傷が、第１継代において観察された。第２の継代において細胞変性効果が認められなかったことから、連続的なウイルス不活化が示された。
【０１７６】
ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスＥタンパク質ウエスタンブロット。市販の抗体を使用してＥタンパク質を検出するためのウエスタンブロットプロトコルを開発した。不活化ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス（ＷＮＶ／ＶＥＲＯ  Ａｎｔｉｇｅｎ、５．１μｇ／ｍｌ）を、Ｌｅａｍｍｌｉサンプル緩衝液（１２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール）中に調製し、そして４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質を、エレクトロブロットによって、０．２μｍニトロセルロース膜に移した。膜ブロットを、ブロッキング緩衝液（ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ  Ｂｌｏｃｋｅｒ／Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＡおよびＢ部）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）においてブロックし、続いて、ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスモノクローナル抗体（ブロッキング緩衝液中１：５０００に希釈したＭａｂ８１５１  Ｍｓ  Ｘ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ／Ｋｕｎｊｉｎ  Ｖｉｒｕｓ，  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．，  Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州またはブロッキング緩衝液中１：５００に希釈したＷＮＶ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ７Ｈ２、アフィニティー精製、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州）と共に、少なくとも１時間、インキュベーションを行った。３回の５分間洗浄工程（ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （１６Ｘ），  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）後、ブロットを、検出抗体においてインキュベートした。アルカリホスファターゼ検出ブロットのために、ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ標識抗体（カタログ番号０７５−１８０６，  ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）を、ブロッキング緩衝液中１：１０００に希釈した。西洋ワサビペルオキシダーゼ検出ブロットのために、ヤギ抗西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体（カタログ番号０７４−１８０６，ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）を、ブロッキング緩衝液中１：１０００に希釈した。検出抗体とのインキュベーション後、ブロットを洗浄し、そして適切な基質：バンドを可視化するためのアルカリホスファターゼ検出用ＮＢＴ／ＢＣＩＰ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（カタログ番号５０−８１−０８，ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）または西洋ワサビペルオキシダーゼ用Ｐｉｅｒｃｅ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（カタログ番号３４０８０，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）で展開した。
【０１７７】
ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスＥタンパク質ＥＬＩＳＡ。Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートは、プレートを炭酸緩衝液中２μｇ／ｍｌの濃度のウマ抗ＷＮＶ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＃２１５−００６，Ｗｅｂｓｔｅｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｕｐｐｌｙ，  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、マサチューセッツ州）で、１ウェルあたり１００μｌで被覆することによって、Ｂｅａｃｏｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、メイン州）により調製された。プレートを、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１×ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｐ−１３７９）中１％ＢＳＡ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ジョージア州）でブロックし、乾燥し、そして４℃での貯蔵のために包装した。アッセイの当日、サンプルを充填する前に、プレートを室温まで加温した。ＷＮＶ参照抗原（ＷＮＶ／ＶＥＲＯ  Ａｎｔｉｇｅｎ、５．１μｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳＴ中で２００ｎｇ／ｍｌに希釈した。植物サンプルを、ＰＢＳＴで予め希釈した。２００μｌのサンプルをＡ列の２回反復ウェルに適用し、そして１００μｌのブロッキング緩衝液を残りのウェルに適用することによって、希釈した参照抗原および試験抗原サンプルをプレートに添加した。１ウェルあたり１００μｌを混合および移すことによって、２倍系列希釈を作製した；合計で７回希釈ならびに参照抗原についてはブランクおよび試験サンプルについては４回もしくはそれ以上の希釈。次いで、プレートを、１時間、室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで  ３回洗浄した。モノクローナル抗体（ＷＮＶ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ７Ｈ２、アフィニティー精製、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州、ＰＢＳ−グリセロール中７５μｇ／ｍｌ）を、１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１：５００に希釈し、そして１００μｇ／ウェルで添加し、続いて、１時間、室温でインキュベーションを行った。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ中１：１０，０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体コンジュゲート（ＢｉｏＲａｄ  １７０−６５１６，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）を、１００μｌ／ウェルで添加し、そしてプレートを１時間、室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、そして１００μｌのＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｗｉｎｇｓ、メリーランド州）を各プレートに添加し、そして室温で約５〜１０分間、インキュベートした。反応を、１ＮのＨＣｌで停止した。Ｖｍａｘ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）を使用して、光学密度を、４５０ｎｍ−６５０ｎｍ波長参照で読み取った。データを、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ４．０ソフトウェアにトランスポートし、そしてサンプル定量のために、標準曲線を、４パラメータの算術式に適合した。
【０１７８】
推定形質転換体のスクリーニング。カルスサンプルを、推定形質転換体（実施例４）から、２回反復で、サブ培養後、７日目および１４日目に回収した。先端を切り離した１ｍｌシリンジ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ニュージャージー州）を使用して、各サンプルについて、２００μｌのカルスを、カルスの均質化されたプールから回収した。サンプルを、９６ウェルクラスターチューブボックス（１．２ｍｌチューブ、Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州）に回収し、ドライアイス上で凍結し、そして−８０℃で貯蔵した。
【０１７９】
分析時、サンプルを、Ｋｌｅｃｏビーズビーター（Ｇａｒｃｉａ  Ｍａｃｈｉｎｅ，Ｖｉｓａｌｉａ、カリフォルニア州）を使用して、ＰＢＳ中０．１％ＤＢＤＭ（ｎ−ドデシルｂ−Ｄ−マルトシド、Ｓｉｇｍａ  Ｄ４６１１）において抽出した。２つの鋼鉄製ＢＢ（Ｄａｉｓｙ  ４．５ｍｍ）を、２００μｌのＤＢＤＭ−ＰＢＳを伴う各チューブに追加した。サンプルを、最大速度で４分間、撹拌し、続いて、１０分間、３０００×ｇで遠心分離を行った。上清を、新たなチューブに取り出した。得られたペレットを、再抽出（２００μｌ緩衝液、４分間の撹拌、１０分間のスピン）した。両抽出物由来の上清をプールし、そして分析に使用した。１４日目のカルス由来のサンプルを、１：１０、１：２０、１：４０、１：８０希釈系列で分析した。発現序列の確認のために、７日目のカルスサンプルを、１：４０希釈で分析した。構築物ｐＤＡＢ２４７５、ｐＤＡＢ２４７８、およびｐＤＡＢ２４８１由来の事象の発現スクリーニングの結果を、図２０〜２２に概略する。３つのベクター間における最上位の発現事象の比較（図２３）により、ｐＤＡＢ２４７５からの有意に高いＥタンパク質回収可能性が示された。
【０１８０】
これらの構築物の選択事象由来のサンプルもまた、ウエスタンブロットによって分析した（１４日目のカルス）。構築物間の結合パターンの差異が明確に認められた。ｐＤＡＢ２４７５事象の多くから、予想される約５４ｋＤａサイズで、全長Ｅタンパク質が検出された（図２４）。他のバンド約３５ｋＤａおよびそれ未満についてもまた、再現性のある検出が得られた。ｐＤＡＢ２４７８およびｐＤＡＢ２４８１構築物によって検出された全長Ｅタンパク質を発現する事象がより少なかった（図２５および２６）。
【０１８１】
図２７は、残りの８構築物由来のＥタンパク質発現の比較図である。ＥＬＩＳＡにより検出されるように、すべて、タバコ植物細胞において発現されたＥタンパク質を実証した。さらに、ウエスタンブロット分析は、全長Ｅタンパク質ならびにトランケーションを示した（図２８〜３０）。
【０１８２】
実施例６−植物細胞産生ＷＮＶ抗原のスケールアップ
細胞培養のスケールアップおよび発酵。全長Ｅタンパク質を発現するｐＤＡＢ２４７５およびｐＤＡＢ２４８１構築物由来の形質転換体を、スケールアップのために同定した。個々の事象のタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｂａｃｕｍ）ＮＴ１懸濁培養を、「フラスコパック細胞容積」に基づいて、１２５ｍｌ三角フラスコ中２０ｍｌ稼動体積から７０ｍｌへ、次いで２５０ｍｌフラスコ中１４０ｍｌ全容積へスケールアップした。無菌条件下で１０ｍｌサンプルをウェル混合フラスコ（ｗｅｌｌ  ｍｉｘｅｄ  ｆｌａｓｋ）から血清学用ピペット（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｉｐｅｔｔｅ）に１０ｍｌの最終容積まで吸引することによって、７日間インキュベーション期間後のフラスコパック細胞容積を決定した。３０秒間静止した後、ピペット中の細胞の容積に１０を掛け、そして「フラスコパック細胞容積」として記録して、測定値を遠心分離パック細胞容積（ＰＣＶ）測定値と区別する。フラスコパック細胞容積の正常範囲は、個々の事象についてばらつきがある（１５〜６０％）が、≧１５％のパック細胞容積が１４日間以内に達成されなかった場合、事象を中断した。
【０１８３】
細胞を、７日間フラスコから５％の最終フラスコパック細胞容積へ移すことによって、培養の維持およびスケールアップを実施した。５０％パック細胞容積を伴う培養では、播種転移容積（ｉｎｏｃｕｌｕｍ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｏｌｕｍｅ）は１０％ｖ：ｖであった。すべての三角フラスコ培養は、２６℃で、２インチストローク長を伴うオービタルシェーカー上、１２０ｒｐｍで、７日間、インキュベートした。２，８００ｍｌのフェルンバッハ（Ｆｅｒｎｂａｃｈ）フラスコ（稼動体積１，０００ｍｌ）を利用する発酵を、２インチストローク長を伴うオービタルインキュベーター／シェーカー上、１１０ｒｐｍで７日間、２６℃で行った。１０ｌＢｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｃ１０リットル発酵槽で行った発酵は、２００ｒｐｍの撹拌速度、１分間あたり４リットルの通気量、および２６℃の容器温度で開始した。２００〜４５０ｒｐｍの間で撹拌速度を自動的に増加するＰＩＤ制御ループによって、溶存酸素を３０％より高く維持した。
【０１８４】
発酵槽によって増殖される培養物を、プロセス中に評価および特徴付けするために、１０ｍｌのサンプルを、無菌条件下、２４時間間隔で、１５ｍｌ目盛り付遠心チューブに回収した。各サンプルのうち、外来物増殖の評価のためのトリプシンダイズ寒天上への単離のために１０μｌを抜き取った（ｓｔｒｕｃｋ）。ペトリプレートを、３０℃で、２日間、インキュベートし、次いで、細菌または真菌の増殖の存在について評価した。外来物増殖を含有するサンプルを、以後のサンプル回収では、１，０００×の倍率で光学顕微鏡により確認した。外来物増殖を含有することが確認された発酵槽をオートクレーブし、そして培養物を適切に廃棄した。
【０１８５】
各発酵サンプルの残りの部分を、２，５００×ｇで１０分間、遠心分離して、細胞培養液から植物細胞を分離した。遠心分離後、チューブ内のパック細胞の容積（ｍｌ）の直接観察によって、ＰＣＶを決定した。最終容積測定値に１０を掛け、そして回収時点のＰＣＶとして記録した。チューブ由来の透明な上清相の約３〜４ｍｌを、３ｍｌシリンジに移し、そして透明な１．５ｍｌマイクロ遠心チューブにろ過（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＰＴＦＥ  ＃４３１２３１）した。チューブの内容物を、Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ  ３００Ａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｂｏｓｔｏｎ、マサチューセッツ州）を使用して、グルコース、ｐＨ、酢酸塩、オルト−リン酸、アンモニア、ナトリウム、カリウム、および乳酸塩について分析した。
【０１８６】
全可溶性タンパク質および組み換えタンパク質濃度について、上清およびパック細胞の残りのサンプルを、２〜３ｍｍのステンレス製ショット材を添加し、次いで、１５ｍｌのサンプルチューブをＧｅｎｏ  Ｇｒｉｎｄｅｒに、２分間、最大回転速度で配置することによって、処置した。１０，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離後、無細胞画分を回収し、そしてペレット画分を、ＰＢＳ、ｐＨ６．８よりなり、０．１％β−Ｄ−ドデシルマルトシドを伴う緩衝液に再懸濁した。再懸濁したペレットをＧｅｎｏ  Ｇｒｉｎｄｅｒに戻して配置し、そして２分間、撹拌した。１０，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離後、上清画分をプールし、そしてＢｒａｄｆｏｒｄ方法を使用して、全可溶性タンパク質を分析した。抽出物はまた、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットによって、ＷＮＶ  Ｅタンパク質についても分析した（実施例５を参照のこと）。
【０１８７】
２つの構築物、ｐＤＡＢ２４７５およびｐＤＡＢ２４８１由来の事象を、１０Ｌ撹拌タンクリアクタに調製した。発酵バッチの概要を表４に示す。
【０１８８】
発酵槽における組み換えタンパク質産生の時間に基づく測定は、事象１６２２−２０７では１８８時間に、および事象１７０２−５２５では１７２時間に最も高い容積力価を生じたことを示した。最適容積生産性に基づく回収基準を：（１）発酵槽における残留グルコース、（２）パック細胞容積、（３）呼吸気分析、（４）溶存酸素、および（５）ｐＨの変化に基づいて開発した（図３１〜３３）。容積生産性に基づく最適回収時間は、すべての事象で類似し、そしてグルコースの枯渇の４６時間後に生じた。炭素源の枯渇は、５．９０±０．１２−ｌｏｇＨ＋から６．５±０．２４−ｌｏｇＨ＋へのｐＨの増加、発酵ブロスの可視的暗化、および酸素取り込みによって認められる呼吸活性の＞８５％の減少、二酸化炭素放出、および溶存酸素に対応する。事象１６２２−２０７は、１．５７０±０．０７７（平均±標準偏差）ｍｇ「Ｅ」タンパク質／ｌ発酵槽稼動体積の容積力価、および０．２００±０．０１０（平均±標準偏差）ｍｇ「Ｅ」タンパク質／ｌ発酵槽稼動体積／日を示した（表４、バッチＷＮＶ−ＳＲＤ０５００６を指す）。
【０１８９】
タバコ（Ｎ．ｔｏｂａｃｕｍ）ＮＴ−１懸濁細胞におけるＭＥおよびｐｒＭＥ（−）産生の速度論を、組み換えウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス事象１６２２−２０７および１６２２−２１０について、９日間の期間に決定した（図３４）。組み換えタンパク質の有意な消失（５０％まで）が、８日間の期間を超えた発酵（グルコースの枯渇を＞７０時間超える）で観察された。経時した発酵サンプルのウエスタンブロットは、「Ｅ」タンパク質の有意なトランケーション、および細胞破壊後、８，０００×ｇ上清中のトランケート型および全長「Ｅ」タンパク質のより高いパーセンテージを示した（データ示さず）。図３４に示される容積生産性の下方傾向は、一次ＥＬＩＳＡ抗体とトランケート型「Ｅ」タンパク質との反応性の差異、および／またはタンパク質の分配特性の変化による「Ｅ」タンパク質の消失の増加の結果であり得る。この現象を調べるために、さらなる研究を実施するべきである。
【０１９０】
実施例７−植物細胞産生ＷＮＶ抗原のプロセシング
１０リットルのバイオリアクターにおいて増殖した細胞培養の下流のプロセシングは、並行して行われる６つの手順よりなった。すべての手順は、無菌条件下、０〜４℃で完了した。不活な三量体の形成を生じるＥタンパク質の四次構造への報告されたｐＨ誘導性変化（Modis et al., 2004）のため、すべての細胞培養およびプロセスサンプルのｐＨを、他で述べない限り、すべての条件について標準的な緩衝液として５０ｍＭ（ｐＨ７．５）３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ；ｐＫａ＝７．２）を使用することによって、７．０±０．２に維持した。
【０１９１】
プロセス方法１（ＰＭ１）：３０μｍのＳｐｅｃｔｒａｍｅｓｈの層および２５ｃｍ直径のブフナー漏斗を使用して、使用培地から植物懸濁細胞を回収した。湿潤ケーキを、等容積の溶解緩衝液（５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．５＋１ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、フィルター乾燥（２５インチ水カラムの減圧下で７０秒間）し、次いで、溶解緩衝液（５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．５＋１ｍＭのＥＤＴＡ）に、３３％（ｗ：ｖ）の最終濃度で再懸濁した。３ｃｍのローター−スターターヘッド部を具備し、そして１，５００ｒｐｍで操作されるＳｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｌ４Ｒ実験用ホモジナイザーを使用して、細胞懸濁液を、簡単に（３分間）均質化した。プレ−均質化細胞を、１６，０００ｐｓｉ（測定フローパス圧）で操作されるＭｉｃｒｏｆｌｕｄｉｃｓ１１０−Ｌ細胞破砕機への２回の通過により、破砕した。８，０００×Ｇ、１５分間の溶解物の遠心分離澄名化後、上清をペレット（廃棄されるペレット）からデカントし、そしてアッセイを実施するまで−２０℃で貯蔵した。
【０１９２】
プロセス方法２（ＰＭ２）：回収した細胞を、８，０００×Ｇで１５分間、遠心分離し、そして使用培地を、細胞ペレットからデカントした。細胞ペレットを１５０ｍＬの溶解緩衝液に再懸濁し、−２０℃で最短で１６時間凍結し、次いで、２５℃の水浴で融解した。融解した細胞を、３３％（ｗ：ｖ）の最終濃度で溶解緩衝液に再懸濁し、そして３ｃｍのローター−スターターヘッド部を具備し、１，５００ｒｐｍで操作されるＳｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｌ４Ｒ実験用ホモジナイザーを使用して、簡単に（３分間）均質化した。均質化した細胞スラリーを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｄｉｃｓ１１０−Ｌ細胞破砕機への２回の通過により１６，０００ｐｓｉで破砕し、そして溶解物を、ＰＭ１に記載のように透明化した。
【０１９３】
プロセス方法３（ＰＭ３）：Ａｇｒｉｍｕｌ  ＮＲＥ−１４０６（４６４ｇ／ｍｏｌ；Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、オハイオ州）およびＭＯＰＳ、ｐＨ７．５（最終濃度５０ｍＭ）を、５００ｍＬ三角（Ｅｒｌｅｎｍｙｅｒ）フラスコ中０．３％（ｗ：ｖ）の最終濃度の回収した細胞培養に直接添加した。フラスコを、５．０８ｃｍの撹拌子を使用して、３０分間、磁気撹拌プレート上で、１００ｒｐｍで撹拌した。３ｃｍのローター−スターターヘッド部を具備し、そして１，５００ｒｐｍで操作されるＳｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｌ４Ｒ実験用ホモジナイザーを使用して、細胞懸濁液を、簡単に（３分間）均質化した。プレ−均質化懸濁液を、１６，０００ｐｓｉで操作されるＭｉｃｒｏｆｌｕｄｉｃｓ１１０−Ｌ細胞破砕機への２回の通過により、破砕した。８，０００×ｇ、１５分間の溶解物の遠心分離澄名化後、上清をペレット（廃棄されるペレット）からデカントし、そしてアッセイを実施するまで−２０℃で貯蔵した。
【０１９４】
プロセス方法４（ＰＭ４）：実験用ホモジナイザーによる均質化の前に、０．３％（ｗ：ｖ）Ｄｅｒｉｐｈａｔ１６０（Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、オハイオ州）を融解した細胞ペレットに添加したことを除いて、プロセス方法４は、プロセス方法２に記載のプロセスに従った。他のすべての手順は、ＰＭ２と同一であった。
【０１９５】
プロセス方法５（ＰＭ５）：次の３つの分離分画工程を使用して、ＰＭ２透明化画分において、硫酸アンモニウム沈殿を行った：工程１：硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）の２０％飽和溶液（２５℃の温度に基づく）を、１１４ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４をＰＭ２透明化画分に直接添加することによって、調製した。溶液（測定温度＝１５℃）を、１００ｒｐｍで１０分間、撹拌し、次いで、１０，０００×ｇで２５分間、遠心分離して、沈殿したタンパク質を取り出した。ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスＥタンパク質を含有する上清を、ｓ０〜２０％画分と称し、回収して、工程２に移った。工程２：５９ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４をｓ０〜２０％画分に直接添加することによって、（ＮＨ４）２ＳＯ４の３０％飽和溶液を調製した。溶液（測定温度＝１５℃）を、１００ｒｐｍで１０分間、撹拌し、次いで、１０，０００×ｇで２５分間、遠心分離して、沈殿したタンパク質を取り出した。ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスＥタンパク質を含有する上清を、ｓ２０〜３０％画分と称し、回収して、工程３に移った。工程３：６２ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４をｓ２０〜３０％画分に直接添加することによって、（ＮＨ４）２ＳＯ４の４０％飽和溶液を調製した。溶液（測定温度＝８℃）を、１００ｒｐｍで１０分間、撹拌し、次いで、１０，０００×ｇで２５分間、遠心分離して、沈殿したタンパク質を取り出した。ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルスＥタンパク質を含有し、そしてｐ３０〜４０％沈殿物と称される、遠心分離工程から獲得されるペレットを、上清（廃棄される上清）からデカントし、そして、アッセイを実施するまで−２０℃で貯蔵した。
【０１９６】
プロセス方法７（ＰＭ７）：プロセス方法７は、細胞破砕および遠心分離後の上清画分を廃棄し、そして沈殿画分をさらに処理して、組み換えＷＮＶタンパク質を回収したことを除いて、プロセス方法１に記載のプロセスに従った。沈殿画分を、５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．５および１ｍＭのＥＤＴＡ中２０％（ｗ：ｖ）の最終濃度に希釈した。Ｄｅｒｉｐｈａｔ１６０（Ｎ−ラウリル−β−イミノジプロピオン酸モノナトリウム［Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、オハイオ州］の両性界面活性剤）を、希釈した懸濁液に直接添加して、１ｍｇの全可溶性タンパク質あたり１．３０±０．１４ｍｇのＤｅｒｉｐｈａｔ１６０の界面活性剤対全可溶性タンパク質比を達成した。主要なプロセシング工程を促進するために、線形方程式に基づく相関関係を、無細胞沈殿画分中の全可溶性タンパク質と発酵槽についての回収パック細胞容積との間で展開させた。Ｄｅｒｉｐｈａｔ１６０界面活性剤の要求量は、式１に基づく最終遠心分離パック細胞容積測定値を使用して、直ちに計算された：
式１：Ｄｅｒｉｐｈａｔ＿（ｇ）＝％最終＿ＰＣＶ＊サンプル＿容積（Ｌ）＊０．０３４１
［式中：Ｄｅｒｉｐｈａｔ＿（ｇ）は、再懸濁した沈殿画分に添加されたＤｅｒｉｐｈａｔ１６０の量である。
％最終＿ＰＣＶは、パーセントとしての細胞培養物由来の遠心分離ＰＣＶ測定値である。
サンプル＿容積（Ｌ）は、回収時の細胞培養物のリットルでの全容積である。
０．０３４１＝最終タンパク質濃度対回収ＰＣＶ勾配変換定数。
【０１９７】
懸濁液を、３ｃｍのローター−スターターヘッド部を具備し、そして１，５００ｒｐｍで１０分間操作されるＳｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｌ４Ｒ実験用ホモジナイザーを使用して均質化し、次いで、８，０００×ｇで２５分間、遠心分離した。上清を、ペレット（廃棄されるペレット）からデカントし、そしてアッセイを実施するまで−２０℃で貯蔵した。
【０１９８】
すべての調製（＞４０ｍｌ）サンプルは、３リットルステンレス製トレイにおける凍結乾燥によって、容積を減少させた。サンプルを、ステンレス製トレイに移し、そして−８０℃で１６時間、凍結融解し、次いで、−４４℃のコンデンサ温度および−１０℃の初期棚温度を伴うモデル４２２１１６Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｖｅｒｔｉｓ凍結乾燥機に移した。乾燥プログラムは、次の温度温度：−１０℃で２０分間、−５℃で２００分間、０℃で４００分間、５℃で２００分間、１０℃で２００分間、１５℃で２００分間、および２５℃で４０００分間における７つの時間設定された工程からなる。（２５℃の棚温度を使用する）最終的減圧が１００ｍＴｏｒｒ未満で維持され得る場合、生成物は乾燥状態であるとみなした。３Ｌトレイ由来の乾燥調製画分を、最小容積（＜４０ｍｌ）の滅菌蒸留水に再懸濁し、次いで、滅菌１００ｍＬ血清バイアルに移した。バイアルを、傾斜している（２５°）凍結ラック上の−８０℃凍結装置に、１６時間、移した。調整乾燥プログラムに従って、バイアルを乾燥させた。
【０１９９】
表５は、臨床治験（研究Ｉ）における評価のために調製された異なるサンプルを概要する。これらのサンプルは、ネガティブおよびポジティブコントロールと共に、２つの植物発現構築物、３つの事象および５つのプロセス方法を表す。
【０２００】
実施例８−植物細胞産生ＷＮＶ抗原の処方、研究Ｉ
２つの植物発現構築物、３つの事象および５つのプロセス方法を使用して、マウスにおける植物細胞産生ＷＮＶ抗原の臨床評価のためのワクチンおよびネガティブコントロールワクチンを作製した。すべてのワクチンを、第１の用量についてフロイント完全アジュバントと組み合わせ、そして第２の用量についてフロイント不完全アジュバントと組み合わせた。不活化ＷＮＶを、ポジティブコントロールとして使用するために処方した。
【０２０１】
植物細胞産生抗原の処方。ワクチン処方の初期では、１００または５０μｇ用量の調製が好適であった。従って、凍結乾燥した植物材料を、シリンジ針を通過させるのに必要な最小限の量の蒸留水に再水和させた。１用量あたり１００μｌ抗原容積の最大値については、結果的に、植物材料の溶解度によって、用量を決定した（表６）。処置グループ３について凍結乾燥した抗原は、不溶性であり、研究から取り除いた；グループ１について凍結乾燥した抗原は要求された１００μｌ容積中１００μｇ用量を達成するほど濃縮されず、研究から脱落させた。ネガティブコントロール調製物を、さらなる水で約１ｍｌにするのに必要な最小限の量の水で再水和した。
【０２０２】
再水和した抗原のアリコートを、２つの２ｍｌガラスシリンジおよび２  ７／８インチ２０ゲージの微小乳化針を使用して、等容積の完全フロイントアジュバント（ＩＣＮ  ６４２８５１）で乳化させた。全体を通して、ワクチンを氷上で保持し、そして、再水和したストック懸濁液を、使用直後に−８０℃で凍結した。第２の使用のために、予め再水和した植物材料を、室温で融解し、そして先と同じシリンジおよび針を使用して、等容積の不完全フロイントアジュバント（ＩＣＮ  ６４２８６１）で乳化させた。エマルジョンを、氷上で保持し、そして、すべてのワクチンの調製後直ちに注入した。
【０２０３】
参照抗原の処方。不活化ＷＮＶ参照標準（実施例５に記載されている）から、ワクチンとしての用途のための処方の前に、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ「Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ＯＵＴ」スピンカラムによってＴｒｉｔｏｎＸ−１００を取り出した。用量は、１ｍＬあたり２７．２μｇのＷＮＶ  Ｅタンパク質濃度に基づいた（表６）。
【０２０４】
実施例９−植物細胞産生抗原によるＷＮＶ中和血清の作製、研究Ｉ
マウスのワクチン接種。雌性ＣＤ−１異系交配ＳＰＦマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を獲得し、そしてワクチン接種接種前に研究施設に順応させた。マウスを、１ケージあたり５匹収容し、そして、耳パンチによってグループ番号を識別した。日齢０日目、５０日目に、すべてのマウスに、表６に記載の２００μＬ用量の多様な処置を施した（実施例８）。２７ゲージ針を伴う１ｍｌシリンジで、皮下投与により腹部領域の４つの部位にそれぞれ５０μＬをワクチン接種した。試薬のアベイラビリティーの遅延のため、グループ１２のマウスを、他のマウスより１箇月後にワクチン接種し、従って、日齢８０日にワクチン接種した。１７日目に、マウスに、表６に記載の２回目の２００μＬ用量の多様な処置を施した（実施例８）。皮下投与により腹部の領域の４つの部位にそれぞれ５０μＬをワクチン接種した。グループ１２は、１８日ではなく、１４日に再ワクチン接種した。グループ４の２匹のマウスは、２回目のワクチン接種後に疾患が認められ、そして１匹は３０時間後に死亡した。
【０２０５】
血清回収。３１日目、マウスを、ＣＯ２への短期の暴露により麻酔し、そして心穿刺により放血させた。血液を、ラベルを付したエッペンドルフチューブに回収し、凝固させ、そして遠心分離を行って、残留する細胞を沈降させた。血清を、アッセイの時間まで−８０℃で維持した。グループ１２のマウスを、３２ではなく２８日目に放血させた。
【０２０６】
ＷＮＶ血清中和アッセイ。すべての血清中和アッセイを、ＢＬ−３実験室で実施した。一定のウイルスにおいて、ＶＥＲＯ細胞に対する血清アッセイを変動して、中和力価を測定した。熱不活化血清（５６℃で３０分間）を、マイクロタイタープレート中、１希釈あたり２ウェルで、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を伴うＭｅｄｉｕｍ１９９において２倍工程で１：１０から１：１２８０へ希釈した。ストックＷＮＶウイルス、ワイオミング（Ｗｙｏｍｉｎｇ）キジオライチョウ単離体を、同じ培地において１：１０に希釈し、そして等容積を、各ウェル中の血清に添加して、１：２０〜１：２５６０の最終血清希釈物を得た。プレートを、３０分間インキュベートして、血清が、ウイルスを中和することを可能にし、次いで、等容積の同じ培地中の１２，０００個のＶＥＲＯ細胞をすべてのウェルに添加して、非中和ウイルスを検出した。コントロール（既知のポジティブ血清、非感染ウェル、ウイルス滴定）を、個別のプレートに含めた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２中１３日間、インキュベートし、そして細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在について、間隔的に顕微鏡下で観察した。
【０２０７】
最終アッセイの読み取りは１３日であった。非感染細胞コントロールは、ＣＰＥを有さなかった。試験サンプルの中和力価を、５０％エンドポイントで血清−ウイルス混合物に存在する血清の最終希釈の対応物として表した。ＷＮＶ逆的定は、１ウェルあたり＞１２８ＴＣＩＤ５０であった。ウサギ抗ＷＮＶポジティブコントロール血清は、＞２５６０の力価を有した。ワクチン接種したマウス由来の血清は、表７に示されるような中和力価を有した。＞２５６０の中和力価を２５６０（アッセイが測定し得る最大の力価）へ、そして＜２０の力価を２０（アッセイが測定し得る最小の力価）へ変更し、そして１グループあたりの幾何平均力価を計算することによって、図３５を作成した。図３５は、ＷＮＶ血清中和力価のグラフ図を提供する。
【０２０８】
スチューデントのｔ検定は、グループ２の力価が、グループ５を除く他のすべてのグループより有意に高く、そしてグループ４および５では、統計的差異が認められなかったことを示した。不活化ＷＮＶポジティブコントロール（グループ１２）は、より高いエンドポイント希釈を伴う個別のアッセイにおいて測定し、従って、他の結果とは、厳密に比較できなかった。
【０２０９】
結果として、存在するＥタンパク質の量またはプロセス方法、操作された中和抗体にかかわらず、植物細胞産生ＷＮＶ  Ｅタンパク質のすべての調製物がワクチン接種に使用される。ネガティブコントロール調製物は、中和抗体を生じさせなかった（グループ８、９、１１、および１３）。
【０２１０】
一般に、注入は、動物に良好に忍容された。グループ４の２回目の注入後の疾患および単一の死亡例が、物理的外傷または抗原、アジュバント、もしくはワクチンの他の成分の有害作用によるものであるかどうかは不明である。
【０２１１】
実施例１０−植物細胞産生抗原によるＷＮＶ中和血清の作製、研究ＩＩ
マウスモデルにおける植物細胞産生ＷＮＶ抗原の効力を確認、およびさらに理解するために、さらなるグループのマウスを獲得し、そして表８に列挙した異なる５つのアジュバントで処方した高、中、低用量の抗原で免疫した。形質転換事象および抗原回収のためのプロセス方法は確認しなかった。ＰＭ７によって回収した事象（ｐＤＡＢ  ２４７５）１６２２−２０７を、本研究において広範に使用した。
【０２１２】
ワクチンの処方。ワクチン処方は、凍結乾燥したＷＮＶ植物抽出物を再水和することによって、開始した。十分な水を５つのバイアルのそれぞれに添加して、１２５μｇ／ｍｌ抗原溶液を生成した。再水和は、滅菌水を使用し、そして水添加には、滅菌針およびシリンジを使用して行った。再水和させた溶液を、新たな滅菌ボトルにプールした。次いで、溶液を、２つの滅菌シリンジを使用する滅菌三方栓に５０回通過させることによって、均質化した。均質化した溶液を、新たな滅菌ボトルにプールした。
【０２１３】
各２５μｇ／用量ワクチンの６つのミリリットルバッチを、まず、３．０ｍｌの抗原溶液を、新たな滅菌１０ｍｌディスポーザブルシリンジに採取することによって調製した。次に、３．０ｍｌの滅菌したアジュバントを、第２の新たな滅菌ディスポーザブルシリンジに採取した。両方のシリンジを、新たな滅菌三方栓に固定した。次いで、栓を介して、植物抽出物を、アジュバントシリンジに移動させた。ワクチンを、２つのシリンジの間で、５０サイクル通過させることによって、ワクチンを乳化した。最後にサイクルの完了時に、ワクチンを含有するシリンジを栓から取り出した。ワクチンを、滅菌血清バイアルに移し、シールし、そしてラベルを付した。包装したワクチンを、４℃で貯蔵した。使用するまで、ワクチンを４℃で保持した。
【０２１４】
５μｇ／用量ワクチンを処方するために、本来の１２５μｇ／ｍｌ植物抽出物溶液の一部を、水で希釈して、２５μｇ／ｍｌ溶液を生成した。この希釈した抗原溶液を使用して、これらのワクチンを処方した。５つの試験ワクチンのそれぞれについて、新たな滅菌シリンジおよび各ワクチンの三方栓を使用して、上記で概略した手順を反復した。
【０２１５】
５μｇ／ｍｌに希釈した２５μｇ／ｍｌ抗原溶液の一部を使用して、０．５μｇ用量のワクチンを処方した。この希釈した抗原溶液を使用して、これらのワクチンを処方した。予め概略した同じ手順を使用して、この用量レベルで５つの治験用ワクチンを生成した。
【０２１６】
Ｔｉｔｅｒ−Ｍａｘアジュバントは、ネオプレンゴムとは適合しない。Ｔｉｔｅｒ−Ｍａｘアジュバントを含有するワクチンは、ネオプレンゴムと接触しないようにしなければならない。従って、すべてのプラスチックシリンジは、処方中に使用し、そしてテフロン（登録商標）表装した中隔を使用して、包装したワクチンのための血清バイアルをシールした。
【０２１７】
植物細胞コントロールの処方。凍結乾燥した非トランスジェニックＮＴ−１タバコ細胞抽出物の２つのバイアルを、滅菌水で再水和して、１２５μｇ／ｍｌ抗原溶液に類似の溶液を生成した。このブランクコントロール溶液を、抗原溶液と同じ様式で均質化した。２５μｇ／用量ワクチンと同じ手順を使用して、コントロールワクチンを処方した。上述のように、すべてのプラスチックシリンジおよびテフロン（登録商標）表装中隔を、このワクチンと共に使用した。
【０２１８】
マウスのワクチン接種。それぞれが４０匹のマウスの出荷容器における単一のコロニー由来の雌性ＣＤ−１異系交配ＳＰＦマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を受領した。マウスを、１ゲージあたり５匹収容し、研究施設に順応させ、そしてそれらのグループの番号を耳パンチで識別した。１０〜１１週齢に、すべてのマウスに、表８に記載の２００μＬ用量の多様な処置を施した。２７ゲージ針を伴う１ｍｌシリンジで、皮下投与により腹部領域の４つの部位にそれぞれ５０μＬをワクチン接種した。
【０２１９】
１回目のワクチン接種後４８時間以内に、グループ６〜８のマウスは、注入に対して局所的および全身的に反応していたことが明確に認められた。カルボポール処方されたワクチンを投与されたマウスは、飲食を停止し、共に群がり、そして体毛を逆立てていた。これらのマウスには、追加のワクチン接種はしなかった。
【０２２０】
１５日目、グループ１〜５および９〜１７のマウスに、表８に記載の２回目の２００μＬ用量の多様な処置を施した。皮下投与により腹部の領域の４つの部位にそれぞれ５０μＬをワクチン接種した。これらのグループでは、有害な作用は観察されなかった。
【０２２１】
血清回収。２２日目、グループ６〜８のマウスを、ＣＯ２への短期の暴露により麻酔し、そして心穿刺により放血させた。２８日目、他のすべてのグループのマウスも同様に麻酔し、そして放血させた。血液を、ラベルを付したエッペンドルフチューブに回収し、凝固させ、そして遠心分離を行って、残留する細胞を沈降させた。血清を、≦−８０℃で維持した。
【０２２２】
ＷＮＶ血清中和アッセイ。すべての血清中和アッセイを、ＢＳＬ−３実験室で実施した。一定のウイルスにおいて、ＶＥＲＯ細胞に対する血清アッセイを変動して、中和滴定を測定した。熱不活化血清（５６℃で３０分間）を、マイクロタイタープレート中、１希釈あたり５ウェルで、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を伴うＤＭＥＭにおいて、適切に希釈した。ストックＷＮＶウイルス、ワイオミング（Ｗｙｏｍｉｎｇ）キジオライチョウ単離体を希釈して、同じ希釈培地において１００〜３００ＴＣＩＤ５０／２５μｌの範囲を入手し、そして、等容積を各ウェルの血清に添加した。プレートを、６０分間インキュベートして、血清が、ウイルスを中和することを可能にし、次いで、１５０μｌの培地中の２０，０００〜３０，０００個のＶＥＲＯ細胞をすべてのウェルに添加して、非中和ウイルスを検出した。コントロール（既知のポジティブ血清、非感染ウェル、ウイルス滴定）を、個別のプレートに含めた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２中４〜７日間、インキュベートし、そして細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在について、間隔的に顕微鏡下で観察した。非感染細胞コントロールは、ＣＰＥを有さなかった。ＷＮＶ逆的定は、１ウェルあたり１９４ＴＣＩＤ５０であった。不明物の中和力価を、細胞が感染しなかった希釈における血清−ウイルス混合物に存在する血清の最終希釈の対応物として表した。
【０２２３】
多くのワクチン接種したマウスは、高レベルの中和抗体および抗原用量およびアジュバントにより変動した応答を発達した（図３６）。抗体は、アジュバントおよびＮＴ−１細胞単独を投与したマウス（グループ１、データ示さず）では生じなかった。植物細胞産生ＷＮＶ  Ｅタンパク質は、高度に免疫原性であり、そして中和抗体を発生させるのに必要な少なくとも１つのエピトープを所有することが明らかである。単回の注入が、カルボポール処方（グループ６〜８）を注入したマウスにおいて中和抗体を生じさせたという事実は、抗原が防御レベルのＩｇＭを誘導したことを示唆する。いくつかのグループの間の誤差は、ｐ＜０．０５で統計的に有意であったが、明白なパターンは、アッセイ内に固有の変動性のため、不明であった。
【０２２４】
実施例１１−ウマにおける植物細胞産生抗原の防御有効性の実証
ウマ種における植物細胞産生ＷＮＶ抗原の有効性を確認およびさらに理解するために、ウマを獲得し、そして表１７に列挙した２つの異なるアジュバントで処方した高および低用量の抗原をワクチン接種した。ＰＭ７によって回収した事象（ｐＤＡＢ  ２４７５）１６２２−２０７を、本研究において広範に使用した。
【０２２５】
ワクチンの処方。研究ＩＩ（実施例１０）と同じロットの抗原を使用して、凍結乾燥したＷＮＶ植物抽出物を再水和することによって、ワクチン処方を開始した。ワクチンの標的濃度は、１０および１μｇ／ｍｌであった。凍結乾燥した抗原を、滅菌水で再水和して、抽出物凍結乾燥前のＥＬＩＳＡによって決定されるＥタンパク質の濃度に基づき７０ｍｌ用量および２０μｇ／ｍｌ濃度とした。再水和後、抗原ストック溶液を均質化して、均質な溶液を提供した。三方栓に接続された２つの２０ｍｌシリンジを使用して、均質化を実施した。溶液を、シリンジ間の前後に５０サイクル通過させ、次いで、新たな滅菌１００ｍｌボトルに配置した。一旦均質化したら、ストックを、新たな滅菌プラスチックボトルに滅菌ろ過した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｔｅｒｉｖｅｘ−ＧＶ、０．２２μｍフィルターユニット（ロット番号Ｈ４ＮＮ９２４８８）を使用して、滅菌ろ過を実施した。この点において、ＥＬＩＳＡおよび滅菌性（Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）試験の両方の滅菌技術を使用して、材料をサンプル採取した。滅菌性（Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）試験は、完了するまで２週間を要し、そして溶液が、下記の試験の限界値内の滅菌状態であることが確認された。ＥＬＩＳＡアッセイにより、ストック溶液が約２０μｇ／ｍｌを含有したことが確認された。この濃度値は、この材料の先の値と一致した。
【０２２６】
Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９７４  Ｐ  ＮＦストック溶液。まず、１００ｍｌのＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｂｒａｎｄ  ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水１０×溶液（ロット番号０４４９２４−３６）をＤＩ水中１リットルに希釈することによって、１×ＰＢＳ滅菌緩衝液を調製した。５００ｍｌの１×ＰＢＳを、磁気撹拌子を具備する透明な６００ｍｌビーカーに移した。５．０グラムのＣａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐ  ＮＦ（Ｎｏｖｅｏｎ、ロット番号ＣＣ５２ＮＡＢ６３５）を、磁気スターラーを使用して、ＰＢＳ緩衝液に分散させた。混合物を３０分間撹拌して、粉体の分散を確実にした。撹拌したビーカーに、ｐＨプローブを適合し、そして水酸化ナトリウム溶液、５０％ｗ／ｗ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｒａｎｄ、ロット番号０４３０４５１−２４）を使用して、溶液のｐＨを６．８〜７．６のｐＨ範囲内にあるように調整した。一旦、ｐＨを調整したら、溶液をさらに３０分間撹拌させて、ｐＨが安定であることを確実にした。この手順により、中和されたＣａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐ  ＮＦの１０ｍｇ／ｍｌ（１０，０００μｇ／ｍｌ）ストック溶液を得た。最終溶液を、多様なサイズの透明なＰｙｒｅｘ  Ｍｅｄｉａ  Ｂｏｔｔｌｅに移し、そしてラベルを付した。次いで、ボトルを、４５分間、１２１℃、および１８ｐｓｉでオートクレーブして、滅菌性を確実にした。オートクレーブから取り出すとき、ボトルをシールし、そしてフード内で冷却した。ワクチン集成前に、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐ  ＮＦストック溶液の１つのボトルを選択し、そして下記のような滅菌性試験に供した。
【０２２７】
Ｐｏｌｙｇｅｎ３０％ストック溶液。Ｐｏｌｙｇｅｎは、市販のアジュバントである。Ｐｏｌｙｇｅｎの製造者は、処方前に製品を３０％溶液に希釈することを推奨している。また、アジュバントパッケージとして１５％ｖ／ｖＰｏｌｙｇｅｎを含有するようにワクチンを処方することが推奨されている。１４０ｍｌの滅菌水を滅菌２５０ｍｌポリカーボネートボトルに移すことによって、ＢＬ２  ＢｉｏｓａｆｅｔｙキャビネットにＰｏｌｙｇｅｎ３０％ストック溶液を調製した。６０ｍｌのＰｏｌｙｇｅｎ（ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  Ｒａｌｓｔｏｎ、ネブラスカ州、ロット１００１１）を、滅菌水に添加し、そして混合して、３０％Ｐｏｌｙｇｅｎ溶液を得た。次いで、この溶液を、２５０ｍｌ  Ｐｙｒｅｘ  Ｍｅｄｉａ  Ｂｏｔｔｌｅに移し、そしてオートクレーブした。オートクレーブから取り出すとき、ボトルをシールし、そしてＢＬ２フードに移して、そして室温まで冷却させた。ワクチン集成前に、この容器を、滅菌性について試験した。
【０２２８】
滅菌水。透明なＰｙｒｅｘ  Ｍｅｄｉａ  ＢｏｔｔｌｅｓにＤＩ水を部分的に充填することによって、滅菌水を調製した。次いで、ボトルを、４５分間、１２１℃および１８ｐｓｉでオートクレーブした。オートクレーブから取り出すとき、ボトルをシールする一方、なお加温し、そしてフード内で冷却した。ワクチン集成前に、滅菌水のボトルを選択し、そして下記のような滅菌性試験に供した。
【０２２９】
滅菌性試験。処方したワクチンの無菌性を確実にするために、処方において使用するすべての滅菌原材料、および処方したワクチン自体を、滅菌性について試験した。
【０２３０】
寒天およびペトリプレートの調製  ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）の寒天を、滅菌プレーティングのために使用した。ベネットの寒天は、以下の様式で調製した：
【０２３１】
【表１】
2010514698.tif 000002
【０２３２】
１００×１５ｍｍペトリディッシュにベネットの寒天を約３／４充填し、そして固化させた。試験の少なくとも４日前に、プレートを調製して、試験の使用前に、それらが滅菌状態であることを確実にする。
【０２３３】
原材料および処方したワクチンのプレーティング。滅菌１０μｌ播種ループを使用して、試験する生成分または処方したワクチンのサンプルを入手する。四分円画線方法、単一のコロニー単離体を得るための一般的な微生物学的技術を、サンプルのプレート化に使用した。試験の感受性を増加する努力において、２００μｌのサンプルを伴う第２のプレートを確立した。滅菌細胞スプレッダーにより、プレートに沿って、サンプルを均質に広げた。プレートを、３０℃インキュベーターにおいて、倒置してインキュベートした。混入増殖の何らかの兆候について、それらを毎日（週末を除く）確認した。一旦、２週間の間、プレートが清浄を保持したら、プレート化した原材料は、無菌的であり、そして使用の用意ができているとみなした。
【０２３４】
試験開始日の２〜３週間前に、ワクチンを集成した。表１８は、このバッチのワクチンについての計算および使用した各成分の容積を示す。まず、水および必要なアジュバント溶液を滅菌２５０ｍｌ滅菌プラスチックボトルにピペッティングすることによって、ワクチンを集成した。ボトルを閉じ、そして振盪して、２つの成分を混合した。次いで、ボトルを開け、そしてピペットにより抗原を添加した。ボトルを再度閉じ、そして振盪して、徹底的に成分を混合した。最終ワクチンを、１０または２５ｍｌのいずれかのワクチンを含有する滅菌バイアルに移す。ストッパーを取り扱うためのオートクレーブした１対の鉗子を使用して、中隔ストッパーを、バイアルに配置した。一旦、ストッパーがバイアルに着座したら、それらをアルミニウムクリンプシールでシールした。バイアルに、先に承認されたラベルを付し、そして冷蔵庫に貯蔵し、そして出荷前に２〜７℃に維持した。各ワクチンの１つのバイアルを、滅菌性試験（Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）セクションに記載のように、滅菌性について試験した。滅菌性試験が完了した後、ワクチンサンプルをｐＨ、密度、および重量オスモル濃度について評価した。物理的特性試験の結果を表１９に示す。
【０２３５】
ウマのワクチン接種。４６のＷＮＶ血清中性抗体ネガティブウマ（雄性および雌性；月齢６〜１２箇月；ＷＮＶ  ＳＮ力価≦１：２０）を、外部の供給者から購入した。ウマは、防蚊対策が施された施設において一緒に配置され、そしてインプラントされたマイクロチップによって個々に識別された。研究０日目、血液サンプルをすべてのウマから採取し、次いで、すべてのウマに、表１７に記載の１ｍＬの処方された処置を施した。ワクチン接種を、頚部の左側の筋肉内に投与した。血液を処理して血清にし、そしてさらなる分析のために−２０°Ｆで貯蔵した。ワクチン接種に対する有害作用の何らかの兆候について、ウマを毎日モニターした。有害作用は認められなかった。
【０２３６】
研究１４日目、血液サンプルをすべてのウマから採取し、次いで、すべてのウマに、表１７に記載の１ｍＬの処方された処置を施した。ワクチン接種を、頚部の右側の筋肉内に送達した。血液を処理して血清にし、そしてさらなる分析のために−２０°Ｆで貯蔵した。ワクチン接種に対する有害作用の何らかの兆候について、ウマを毎日モニターした。有害作用は認められなかった。
【０２３７】
研究０および１４日目に回収した血液サンプルに加えて、血液サンプルを、研究７、２１、２８、３５、４２および４９日目にすべてのウマから回収した。すべての血液サンプルを、頚静脈から回収し、そして約１２ｍＬの血液を、各サンプル採取日に回収した。すべての血液を処理して血清にし、そしてさらなる分析のために−２０°Ｆで貯蔵した。
【０２３８】
ＷＮＶ血清中和アッセイ。すべての血清中和アッセイを、ＢＳＬ−３実験室で実施した。一定のウイルスにおいて、ＶＥＲＯ細胞に対する血清アッセイを変動して、中和滴定を測定した。熱不活化血清（５６℃で３０分間）を、マイクロタイタープレート中、１希釈あたり５ウェルで、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を伴うＤＭＥＭにおいて、適切に希釈した。ストックＷＮＶウイルス、ワイオミング（Ｗｙｏｍｉｎｇ）キジオライチョウ単離体を希釈して、同じ希釈培地において１００〜３００ＴＣＩＤ５０／２５μｌの範囲を入手し、そして、等容積を各ウェルの血清に添加した。プレートを、６０分間インキュベートして、血清が、ウイルスを中和することを可能にし、次いで、１５０μｌの培地中の２０，０００〜３０，０００個のＶＥＲＯ細胞をすべてのウェルに添加して、非中和ウイルスを検出した。コントロール（既知のポジティブ血清、非感染ウェル、ウイルス滴定）を、個別のプレートに含めた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２中４〜７日間、インキュベートし、そして細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在について、間隔的に顕微鏡下で観察した。非感染細胞コントロールは、ＣＰＥを有さなかった。試験サンプルの中和力価を、５０％細胞が感染しなかった希釈における血清−ウイルス混合物に存在する血清の最終希釈の対応物として表した。ＷＮＶ逆滴定は、５０〜３００の範囲内である。ウマ抗ＷＮＶポジティブコントロール血清は、１５０〜４５０の力価範囲を有した。幾何平均力価（ＧＭＴ）を計算するために、力価≦２に２を割り当て、そして力価≧３５６に３５６を割り当てた。ワクチン接種したウマ由来の血清は、表２０に示されるような中和滴定を有した。アジュバントＮＴ−１細胞コントロールワクチンが投与されたウマ（グループ１および２）では、血清中和力価は生じなかった。アジュバント化ＷＮＶ  Ｅタンパク質を投与されたウマ（グループ３、４、５および６）は、ＷＮＶ中和抗体を生じた（表２０）。植物細胞産生ＷＮＶ  Ｅタンパク質は、高度に免疫原性であり、そして中和抗体を発生させるのに必要な少なくとも１つのエピトープを所有することが明らかである。
【０２３９】
研究１０１日目、グループ１および３由来のウマのすべて、ならびにグループ２由来の２頭のウマ（全体で１５頭のウマ）を、チャレンジのためにＢＳＬ−３施設に出荷した。研究１０５日目、すべてのウマを、１ｍＬのＰＢＳ中１０７，０００プラーク形成単位（ｐｆｕ）ＷＮＶ  ＮＹ９９の髄腔内播種によってチャレンジした。ウマを、１４日間、１日２回モニターし、そして血清への処理およびウイルス血症の評価のために、血液サンプルを、１〜６日目には１日２回、チャレンジ後０（チャレンジの日）、７、１０および１４日目には１日１回、採取した。チャレンジ後１４日間の観察期間中に重度の神経症状を実証するウマを、バルビツール酸の過剰投与により安楽死させた。残りのすべてのウマは、研究の終了時（１４〜１７日目）に安楽死させた。ウマは、チャレンジ後０〜７、１０および１４日目に採取した血液サンプルから２回連続ポジティブ培養物が認められた場合、ウマは、ＷＮＶに感染し、そして非防御であるものとみなした。さらに、疾患の防御について、温度測定を含む１日２回の臨床モニタリングによって評価した。組織病理学は、すべてのウマ由来の脳の切片において実施した。
【０２４０】
ウイルス血症のデータを表２１に示す。すべてのワクチン接種していないコントロールのウマ（グループ１および２）は、チャレンジ期間後少なくとも連続する２日間、ウイルス血症であった。チャレンジ後のモニタリング期間中にワクチン接種したいずれのウマにおいても、ウイルス血症は検出されなかった。
【０２４１】
温度データを表２２に示す。２連続温度測定値が、１０２．５°Ｆを超えるかまたは等しい場合、ウマは、発熱しているものとみなした。５頭のワクチン接種していないコントロールのウマ（グループ１および２）のうち４頭が、チャレンジ後期間中に発熱した。コントロールのウマのうち１頭は、≧１０２．５°Ｆの２連続温度測定値の基準に基づいて、発熱していないとみなされた；しかし、このウマは、いくらかの独立した発熱事象を有し、そしてチャレンジの観察期間の終了前に、重度の臨床徴候ため、安楽死させた。グループ３の１０頭のワクチン接種したウマのうち９頭は、チャレンジ後期間中に発熱が認められなかった。１０頭のワクチン接種したウマ（グループ３）のうちの１頭は、２連続温度測定値≧１０２．５°Ｆを有した。
【０２４２】
臨床評価データを表２３に示す。ウマを、嗜眠、抑うつ、振戦、食欲低下、過敏、運動制限、瀕死状態を含む疾患の臨床徴候について、１日２回モニターした。臨床疾患の徴候が認められず、そしてウマが臨床的に正常であった場合、それらを、快活および応答性（ＢＡＲ）であると評価した。疾患の臨床徴候が認められる２連続評価が存在する場合、ウマは、ＷＮＶの臨床徴候を有するものとみなした。５頭のワクチン接種していないコントロールのウマ（グループ１および２）のうちの３頭は、疾患の臨床徴候を実証した。これらの臨床徴候の重症度は有意に進行し、そしてこれらの３頭のウマを、チャレンジ後期間中、安楽死させた。５頭のコントロールのウマのうち２頭は、疾患の臨床徴候を実証しなかった。グループ３の１０頭のワクチン接種したウマのうち９頭は、チャレンジ後期間中無症状であった。１０頭のワクチン接種したウマ（グループ３）のうち１頭は、疾患の軽度の臨床徴候が明確に認められる２連続評価を示した。これらの臨床徴候は、進行せず、そしてウマはＢＡＲに回復した。
【０２４３】
（橋および髄中部（ｍｉｄ−ｍｅｄｕｌｌａ）を介する）脳の２切片の組織学的検査を、各ウマにおいて実施した。これらの組織学的検査の結果を、表２４に示す。両方の切片が軽度、中度、重度の変化の徴候を示した場合、組織学は、異常であるものとみなした。５頭のワクチン接種していないコントロールのウマ（グループ１および２）のうち５頭は、組織学的に異常であり、検査した両切片は、脳炎に関連する中度〜重度組織学的変化を有した。グループ３の１０頭のワクチン接種したウマのうちの３頭は、検査した２脳切片が異常な組織学を呈した。これらのウマのうちの２頭では、これらの異常所見は、検査した両切片において軽度であった。ウマの１頭は、中度の脳炎を示した。重度の明確な病巣は認められなかった。１０頭のワクチン接種したウマのうち７頭は、正常な組織学または試験した切片の１つのみにおいてごく軽度の組織学的変化を有した。これらの軽度の片側性の変化は、ＷＮＶ感染とは一致しないと思われた。
【０２４４】
本明細書に記載の実施例および具体例は、単に例示目的であり、それに照らして行われる多様な修飾および変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲に含まれることが理解されるべきである。さらに、本明細書において開示した任意の発明またはその具体例の任意の要素もしくは限定は、本明細書において開示した任意のおよび／または他のすべての要素または限定（個々にもしくは任意の組み合わせで）あるいは他の任意の発明またはその具体例と組み合わせることができ、そのようなすべての組み合わせは、それらに限定されることなく、本発明の範囲にあるとみなされる。
【０２４５】
【表２】
2010514698.tif 000003
【０２４６】
【表３】
2010514698.tif 000004
【０２４７】
【表４】
2010514698.tif 000005
【０２４８】
【表５】
2010514698.tif 000006
【０２４９】
【表６】
2010514698.tif 000007
【０２５０】
【表７】
2010514698.tif 000008
【０２５１】
【表８】
2010514698.tif 000009
【０２５２】
【表９】
2010514698.tif 000010
【０２５３】
【表１０】
2010514698.tif 000011
【０２５４】
【表１１】
2010514698.tif 000012
【０２５５】
【表１２】
2010514698.tif 000013
【０２５６】
【表１３】
2010514698.tif 000014
【０２５７】
【表１４】
2010514698.tif 000015
【０２５８】
【表１５】
2010514698.tif 000016
【０２５９】
【表１６】
2010514698.tif 000017
【０２６０】
【表１７】
2010514698.tif 000018
【０２６１】
【表１８】
2010514698.tif 000019
【０２６２】
【表１９】
2010514698.tif 000020
【表２０】
2010514698.tif 000021
【表２１】
2010514698.tif 000022
【０２６３】
【表２２】
2010514698.tif 000023
【０２６４】
【表２３】
2010514698.tif 000024
【０２６５】
【表２４】
2010514698.tif 000025
【０２６６】
【表２５】
2010514698.tif 000026
【０２６７】
【表２６】
2010514698.tif 000027
【０２６８】
【表２７】
2010514698.tif 000028
【０２６９】
【表２８】
2010514698.tif 000029
【０２７０】
【表２９】
2010514698.tif 000030
【０２７１】
【表３０】
2010514698.tif 000031
【０２７２】
【表３１】
2010514698.tif 000032
【０２７３】
【表３２】
2010514698.tif 000033
【０２７４】
【表３３】
2010514698.tif 000034
【０２７５】
【表３４】
2010514698.tif 000035
【０２７６】
【表３５】
2010514698.tif 000036
【０２７７】
【表３６】
2010514698.tif 000037
【０２７８】
【表３７】
2010514698.tif 000038
【０２７９】
【表３８】
2010514698.tif 000039
【０２８０】
【表３９】
2010514698.tif 000040
【０２８１】
【表４０】
2010514698.tif 000041
【０２８２】
【表４１】
2010514698.tif 000042
【０２８３】
【表４２】
2010514698.tif 000043
【０２８４】
【表４３】
2010514698.tif 000044
【０２８５】
【表４４】
2010514698.tif 000045
【０２８６】
【表４５】
2010514698.tif 000046
【０２８７】
【表４６】
2010514698.tif 000047
【０２８８】
【表４７】
2010514698.tif 000048
【０２８９】
【表４８】
2010514698.tif 000049
【０２９０】
【表４９】
2010514698.tif 000050
【０２９１】
【表５０】
2010514698.tif 000051
【０２９２】
【表５１】
2010514698.tif 000052
【０２９３】
【表５２】
2010514698.tif 000053
【０２９４】
【表５３】
2010514698.tif 000054
【０２９５】
【表５４】
2010514698.tif 000055
【０２９６】
【表５５】
2010514698.tif 000056
【０２９７】
【表５６】
2010514698.tif 000057
【０２９８】
【表５７】
2010514698.tif 000058
【０２９９】
【表５８】
2010514698.tif 000059
【０３００】
【表５９】
2010514698.tif 000060
【０３０１】
【表６０】
2010514698.tif 000061
【０３０２】
【表６１】
2010514698.tif 000062
【０３０３】
【表６２】
2010514698.tif 000063
【０３０４】
【表６３】
2010514698.tif 000064
【０３０５】
【表６４】
2010514698.tif 000065
【０３０６】
【表６５】
2010514698.tif 000066
【０３０７】
【表６６】
2010514698.tif 000067
【０３０８】
【表６７】
2010514698.tif 000068
【０３０９】
【表６８】
2010514698.tif 000069
【０３１０】
【表６９】
2010514698.tif 000070
【０３１１】
【表７０】
2010514698.tif 000071
【０３１２】
【表７１】
2010514698.tif 000072
【０３１３】
【表７２】
2010514698.tif 000073
【０３１４】
【表７３】
2010514698.tif 000074
【０３１５】
【表７４】
2010514698.tif 000075
【０３１６】
【表７５】
2010514698.tif 000076
【０３１７】
【表７６】
2010514698.tif 000077
【０３１８】
【表７７】
2010514698.tif 000078
【０３１９】
【表７８】
2010514698.tif 000079
【０３２０】
【表７９】
2010514698.tif 000080
【０３２１】
【表８０】
2010514698.tif 000081
【０３２２】
【表８１】
2010514698.tif 000082
【０３２３】
【表８２】
2010514698.tif 000083
【０３２４】
【表８３】
2010514698.tif 000084
【０３２５】
【表８４】
2010514698.tif 000085
【０３２６】
【表８５】
2010514698.tif 000086
【０３２７】
【表８６】
2010514698.tif 000087
【０３２８】
【表８７】
2010514698.tif 000088
【０３２９】
【表８８】
2010514698.tif 000089
【０３３０】
【表８９】
2010514698.tif 000090
【０３３１】
【表９０】
2010514698.tif 000091
【０３３２】
【表９１】
2010514698.tif 000092
【０３３３】
【表９２】
2010514698.tif 000093
【０３３４】
【表９３】
2010514698.tif 000094
【０３３５】
【表９４】
2010514698.tif 000095
【０３３６】
参考文献
U.S. Patent No. 5,773,689
U.S. Patent No. 5,773,695
U.S. Patent No. 6,239,328
U.S. Patent No. 5,879,903
U.S. Patent No. 5,637,489
U.S. Patent No. 5,276,268
U.S. Patent No. 5,273,894
U.S. Patent No. 5,478,925
U.S. Patent No. 5,073,627
U.S. Patent No. 6,121,424
U.S. Patent No. 5,843,464
U.S. Patent No. 5,750,352
U.S. Patent No. 5,990,275
U.S. Patent No. 6,342,362
U.S. Patent No. 6,524,825
U.S. Patent No. 6,419,931
U.S. Patent No. 5,712,170
U.S. Patent No. 5,183,740
U.S. Patent No. 4,816,567
U.S. Patent No. 5,380,831
U.S. Patent No. 5,436,391
U.S. Patent No. 6,319,691
U.S. Patent No. 6,277,375
U.S. Patent No. 5,643,570
U.S. Patent No. 5,565,335
U.S. Patent No. 5,561,071
U.S. Patent No. 5,753,439
U.S. Patent No. 6,214,545
U.S. Patent No. 5,384,253
U.S. Patent No. 5,428,147
U.S. Patent Publication No. 2004/0268442 A1
EP 404,097
WO 93/11161
WO 94/10308
WO 94/07902
WO 97/27207
WO 98/49305
WO 91/09957
Altendorf et al. (1999-WWW, 2000) “Structure and Function of the Fo Complex of the ATP Synthase from Escherichia Coli”J. of Experimental Biology 203:19-28.
Altschul, S. F. et al. (1990) “Basic Local Alignment Search Tool”J. Mol. Biol. 215(3):403-410.
Alwine, J. C.  et al. (1977) “Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes”Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5350-5354.
An, G. (1985) “High Efficiency Transformation of Cultured Tobacco Cells”Plant Physiol., 79:568-570.
Ausubel, M. et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY.
Ausubel, M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.
Baneyx, F. (1999) “Recombinant Protein Expression in Escherichia coli”Biotechnology 10:411-21.
Barker, R. F. et al. (1983) “Nucleotide sequence of the T-DNA region from the Agrobacterium tumefaciens octopine Ti plasmid pTi15955”Plant Molecular Biology 2:335-350.
Beasley, D. W., and A. D. Barrett (2002) “Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein”J Virol 76:13097-13100.
Beltz, G. et al. (1983) “Isolation of multigene families and determination of homologies by filter hybridization methods”Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman and K. Moldave [eds.] Academic Press, New York 100:266-285.
Benoist, C., Chambon, P. (1981) “In vivo sequence requirements of the SV40 early promoter region”Nature 290:304-310.
Berchtold, M. W. (1989) “A simple method for direct cloning and sequencing cDNA by the use of a single specific oligonucleotide and oligo(dT) in a polymerase chain reaction (PCR)”Nuc. Acids. Res. 17:453.
Bianchi, N. et al. (1997) “Biosensor technology and surface plasmon resonance for real-time detection of HIV-1 genomic sequences amplified by polymerase chain reaction”Clin. Diagn. Virol. 8(3):199-208.
Blitvich, B. J. et al. (2003) “Epitope-blocking enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of serum antibodies to West Nile virus in multiple avian species”J. Clin. Microbiol. 41(3):1041-1047.
Bray, M., B. T. Zhao, L. Markoff, K. H. Eckels, R. M. Chanock, and C. J. Lai (1989) “Mice immunized with recombinant vaccinia virus expressing dengue 4 virus structural proteins with or without nonstructural protein NS1 are protected against fatal dengue virus encephalitis”J Virol 63:2853-2856.
Bressanelli, S., K. Stiasny, S. L. Allison, E. A. Stura, S. Duquerroy, J. Lescar, F. X. Heinz, and F. A. Rey (2004) “Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation”Embo J 23:728-738.
Brinster, R. L. et al. (1982) “Regulation of metallothionein-thymidine kinase fusion plasmids injected into mouse eggs”Nature 296:39-42.
Callis, J. et al. (1995) “Structure and Evolution of Genes Encoding Polyubiquitin and Ubiquitin-Like Proteins in Arabidopsis thaliana Ecotype Columbia”Genetics 139(2):921-939.
Cammack, N., and E. A. Gould (1986) “Topographical analysis of epitope relationships on the envelope glycoprotein of yellow fever 17D vaccine and the wild type Asibi parent virus”Virology 150:333-341.
Capecchi, M. R. (1980) “High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells”Cell 22(2):479-488.
Cecilia, D., and E. A. Gould (1991) “Nucleotide changes responsible for loss of neuroinvasiveness in Japanese encephalitis virus neutralization-resistant mutants”Virology 181:70-77.
Clackson, T. et al. (1991) “Making Antibody Fragments Using Phage Display Libraries”Nature 352:624 628.
Clapp, J. F. (1993) “Somatic gene therapy into hematopoietic cells.  Current status and future implications”Clin. Perinatol. 20(1):155-168.
Curiel, D. T. et al. (1991) “Adenovirus Enhancement of Transferrin-Polylysine-Mediated Gene Delivery”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(19):8850-8854.
Curiel, D. T. et al. (1992) “High-efficiency gene transfer mediated by adenovirus coupled to DNA-polylysine complexes”Hum. Gen. Ther. 3(2):147-154.
deBoer, H. A. et al. (1983) “The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters”Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80(1):21-25.
Doran, P. M. (2000) “Foreign protein production in plant tissue cultures”Current Opinions in Biotechnology, 11:199-204.
Eglitis, M. A. et al. (1988) “Retroviral-mediated gene transfer into hemopoietic cells”Avd. Exp. Med. Biol. 241:19-27.
Eglitis, M. A., Anderson, W. F. (1988) “Retroviral Vectors for Introduction of Genes into Mammalian Cells”Biotechniques 6(7):608-614.
Eihauer, A. et al. (2001) “The FLAG（商標） Peptide, a Versatile Fusion Tag for the Purification of Recombinant Proteins”J. Biochem Biophys Methods 49:455-65.
Fischer, R. et al. (1999) “Towards molecular farming in the future:  Pichia pastoris-based production of single-chain antibody fragments”Biotechnol. Appl. Biochem. 30:109-112.
Fraley, R. T.  et al. (1985) “The SEV system:  A new disarmed Ti plasmid vector system for plant transformation”Biotechnology 3:629-635.
Fromm, M. et al. (1985) “Expression of Genes Transferred into Monocot and Dicot Plant Cells by Electroporation”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(17):5824-5828.
Fynan, E. F. et al. (1993) “DNA Vaccines:  Protective Immunizations by Parenteral, Mucosal, and Gene-Gun Inoculations”Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(24):11478-11482.
Gao, G. F., M. H. Hussain, H. W. Reid, and E. A. Gould (1994) “Identification of naturally occurring monoclonal antibody escape variants of louping ill virus”J Gen Virol 75 (Pt 3):609-614.
Gardner, R. C. et al. (1981) “The complete nucleotide sequence of an infectious clone of cauliflower mosaic virus by M13mp7 shotgun sequencing”Nucl. Acids Res. 9(12):2871-2888.
Graham, F. L., van der Eb, A. J. (1973) “Transformation of rat cells by DNA of human adenovirus 5”Virology 54(02):536-539.
Gish, W. et al. (1993) “Identification of protein coding regions by database similarity search”Nature Genetics 3:266-272.
Guirakhoo, F., F. X. Heinz, and C. Kunz (1989) “Epitope model of tick-borne encephalitis virus envelope glycoprotein E: analysis of structural properties, role of carbohydrate side chain, and conformational changes occurring at acidic pH”Virology 169:90-99.
Hanna, Sheri L, Theodore C. Pierson, Melissa D. Sanchez, Asim A. Ahmed, Mariam M. Murtadha, and Robert W. Doms  (2005) “N-Linked Glycosylation of West Nile Virus Envelope Proteins Influences Particle Assembly and Infectivity”J Virol. 79:13262-13274.
Hasegawa, H., M. Yoshida, T. Shiosaka, S. Fujita, and Y. Kobayashi (1992) “Mutations in the envelope protein of Japanese encephalitis virus affect entry into cultured cells and virulence in mice”Virology 191:158-165.
Heinz, F., and C. Kunz (1977) “Characterization of tick-borne encephalitis virus and immunogenicity of its surface components in mice”Acta Virol 21:308-316.
Heinz, F. X. (1986) “Epitope mapping of flavivirus glycoproteins”Adv Virus Res 31:103-168.
Heinz, F. X., R. Berger, W. Tuma, and C. Kunz (1983) “A topological and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick-borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies”Virology 126:525-537.
Heinz, F. X., and C. Kunz (1982) “Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus: peptide mapping of large non-structural proteins of European isolates and comparison with other flaviviruses”J Gen Virol 62 (Pt 2):271-285.
Heinz, F. X., C. W. Mandl, H. Holzmann, C. Kunz, B. A. Harris, F. Rey, and S. C. Harrison (1991) “The flavivirus envelope protein E: isolation of a soluble form from tick-borne encephalitis virus and its crystallization”J Virol 65:5579-5583.
Heinz, F. X., and J. T. Roehrig (1990) Flaviviruses, p. 289-305, Immunochemistry of viruses, vol. II. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford.
Herrera-Estrella, L. et al. (1983) “Expression of chimaeric genes transferred into plant cells using a Ti-plasmid-derived vector”Nature 303:209-213.
Herrera-Estrella, L. et al. (1984) “Light-inducible and chloroplast-associated expression of a chimaeric gene introduced into Nicotiana tabacum using a Ti plasmid vector”Nature 310:115-120.
Higgins, D. G. et al. (1996) “Using CLUSTAL for multiple sequence alignments”Methods Enzymol. 266:383-402.
Holliger, P. et al. (1993) “‘Diabodies’: small bivalent and bispecific antibody fragments”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
Holzmann, H., K. Stiasny, M. Ecker, C. Kunz, and F. X. Heinz (1997) “Characterization of monoclonal antibody-escape mutants of tick-borne encephalitis virus with reduced neuroinvasiveness in mice”J Gen Virol 78 (Pt 1):31-37.
Holzmann, H., G. Utter, E. Norrby, C. W. Mandl, C. Kunz, and F. X. Heinz (1993) “Assessment of the antigenic structure of tick-borne encephalitis virus by the use of synthetic peptides”J Gen Virol 74 (Pt 9):2031-2035.
Jan, L. R., C. S. Yang, L. S. Henchal, H. Sumiyoshi, P. L. Summers, D. R. Dubois, and C. J. Lai (1993) “Increased immunogenicity and protective efficacy in outbred and inbred mice by strategic carboxyl-terminal truncation of Japanese encephalitis virus envelope glycoprotein”Am J Trop Med Hyg 48:412-423.
Jefferson, R.A. (1987) “Assaying chimeric genes in plants:  the GUS fusion system”Plant Mol Biol Rep 5:387-405.
Jiang, W. R., A. Lowe, S. Higgs, H. Reid, and E. A. Gould (1993) “Single amino acid codon changes detected in louping ill virus antibody-resistant mutants with reduced neurovirulence”J Gen Virol 74 (Pt 5):931-935.
Johnston, S. A., Tang, D. C. (1994) “Gene gun transfection of animal cells and genetic immunization”Methods Cell. Biol. 43(A):353-365.
Jones, C. et al. (1995) “Current Trends in Molecular Recognition and Bioseparation”J. of Chromatography A. 707:3-22.
Jorgensen, R. A. et al. (1987) T-DNA is organized predominantly in inverted repeat structures in plants transformed with Agrobacterium tumefaciens C58 derivatives”Mol. Gen. Genet. 207:471-477.
Kanai R, Kar K, Anthony K, Gould LH, Ledizet M, Fikrig E, Koski RA, Modis Y. (2006) “Crystal structure of West Nile virus envelope glycoprotein reveals viral surface epitopes”J Virol. Aug 30; [Epub ahead of print]
Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, NY., pp. 169-170.
Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity”Nature 256(5517):495-497.
Kolaskar, A. S., and U. Kulkarni-Kale (1999) “Prediction of three-dimensional structure and mapping of conformational epitopes of envelope glycoprotein of Japanese encephalitis virus”Virology 261:31-42.
Konishi, E., S. Pincus, E. Paoletti, R. E. Shope, T. Burrage, and P. W. Mason (1992) “Mice immunized with a subviral particle containing the Japanese encephalitis virus prM/M and E proteins are protected from lethal JEV infection”Virology 188:714-720.
Kuhn, R. J., W. Zhang, M. G. Rossmann, S. V. Pletnev, J. Corver, E. Lenches, C. T. Jones, S. Mukhopadhyay, P. R. Chipman, E. G. Strauss, T. S. Baker, and J. H. Strauss (2002) “Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion”Cell 108:717-725.
Kusterbeck, A. W. et al. (1990a) “A Continuous Flow Immunoassay for Rapid and Sensitive Detection of Small Molecules”Journal of Immunological Methods 135(1-2):191-197.
Kusterbeck, A. W. et al. (1990) “Antibody-Based Biosensor for Continuous Monitoring”In Biosensor Technology, R. P. Buck et al., eds., Marcel Dekker, N.Y. pp. 345-350.
Lee, E., and M. Lobigs (2000) “Substitutions at the putative receptor-binding site of an encephalitic flavivirus alter virulence and host cell tropism and reveal a role for glycosaminoglycans in entry”J Virol 74:8867-8875.
Letchworth, G. J. and J. A. Appleton (1984) Methods for Production of Monoclonal Antibodies.  USDA Handbook #630.
Ligler, F. S. et al. (1992) “Drug Detection Using the Flow Immunosensor”In Biosensor Design and Application, J. Findley et al., eds., American Chemical Society Press, pp. 73-80.
Lin, B., C. R. Parrish, J. M. Murray, and P. J. Wright (1994) “Localization of a neutralizing epitope on the envelope protein of dengue virus type 2”Virology 202:885-890.
Lu, L. et al. (1993) “High efficiency retroviral mediated gene transduction into single isolated immature and replatable CD34 (3+) hematopoietic stem/progenitor cells from human umbilical cord blood”J. Exp. Med. 178(6):2089-2096.
Mandl, C. W., F. Guirakhoo, H. Holzmann, F. X. Heinz, and C. Kunz (1989) “Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model”J Virol 63:564-571.
Maniatis, J.-M. et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
Marcotte, W. R. et al. (1988) “Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts”Nature 335:454-457.
Margolin, W. (2000) “Green Fluorescent Protein as a Reporter for Macromolecular Localization in Bacterial Cells”Methods 20:62-72.
Marks, J. D. et al. (1991) “By-Passing Immunization:  Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage”J. Mol. Biol. 222(3):581-597.
Mason, P. W., J. M. Dalrymple, M. K. Gentry, J. M. McCown, C. H. Hoke, D. S. Burke, M. J. Fournier, and T. L. Mason (1989) “Molecular characterization of a neutralizing domain of the Japanese encephalitis virus structural glycoprotein”J Gen Virol 70 (Pt 8):2037-2049.
Mason, P. W., S. Pincus, M. J. Fournier, T. L. Mason, R. E. Shope, and E. Paoletti (1991) “Japanese encephalitis virus-vaccinia recombinants produce particulate forms of the structural membrane proteins and induce high levels of protection against lethal JEV infection”Virology 180:294-305.
Melton, D. A. et al. (1984) “Efficient In Vitro Synthesis of Biologically Active RNA and RNA Hybridization Probes From Plasmids Containing a Bacteriophage SP6 Promoter”Nuc. Acids Res. 12:7035-7036.
Men, R. H., M. Bray, and C. J. Lai (1991) “Carboxy-terminally truncated dengue virus envelope glycoproteins expressed on the cell surface and secreted extracellularly exhibit increased immunogenicity in mice”J Virol 65:1400-1407.
Modis, Y., Ogata, S., Clements, D., Harrison, S. C. (2004) “Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusion”Nature 427:313-319.
Morrison, S. L. et al. (1984) “Chimeric Human Antibody Molecules:  Mouse Antigen-Binding Domains with Human Constant Region Domains”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855.
Mukhopadhyay, S., B. S. Kim, P. R. Chipman, M. G. Rossmann, and R. J. Kuhn (2003) “Structure of West Nile virus”Science 302:248.
Murai et al. (1982) “T-DNA of pTi-15955 from Agrobacterium tumefaciens is transcribed into a minimum of seven polyadenylated RNAs in a sunflower crown gall tumor”Nucleic Acids Res. 10(5):1679-1689.
Murray, E. E. et al. (1989) “Codon usage in plant genes”Nucleic Acids Res. 17(2):477-498.
Norris, S. R. et al. (1993) “The intron of Arabidopsis thaliana polyubiquitin genes is conserved in location and is a quantitative determinant of chimeric gene expression”Plant Mol. Biol. 21(5):895-906.
Nowak, T., and G. Wengler (1987) “Analysis of disulfides present in the membrane proteins of the West Nile flavivirus”Virology 156:127-137.
Ogert, R. A. et al. (1992) “Detection of Cocaine Using the Flow Immunosensor”Analytical Letters 25:1999-2019.
Pearson, W. R. et al. (1988) “Improved Tools for Biological Sequence Comparison”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448.
Pietu, G. et al. (1996) “Novel gene transcripts preferentially expressed in human muscles revealed by quantitative hybridization of a high density cDNA array”Genome Research 6(6):492-503.
Pincus, S., P. W. Mason, E. Konishi, B. A. Fonseca, R. E. Shope, C. M. Rice, and E. Paoletti (1992) “Recombinant vaccinia virus producing the prM and E proteins of yellow fever virus protects mice from lethal yellow fever encephalitis”Virology 187:290-297.
Pluckthun, A. (1994) In The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113:269-315, Rosenburg and Moore eds. Springer Verlag, New York.
Potrykus, I. et al. (1985) “Direct gene transfer to cells of a graminaceous monocot”Mol. Gen. Genet. 199:183-188.
Puig, O. et al. (2001) “The Tandem Affinity Purification (TAP) Method:  A General Procedure of Protein Complex Purification”Methods 24:218-29. 
Rey, F. A., F. X. Heinz, C. Mandl, C. Kunz, and S. C. Harrison (1995) “The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution”Nature 375:291-298.
Roehrig, J. T., J. H. Mathews, and D. W. Trent (1983) “Identification of epitopes on the E glycoprotein of Saint Louis encephalitis virus using monoclonal antibodies”Virology 128:118-126.
Roehrig, J. T. (1986) The use of monoclonal antibodies in studies of the structural proteins of togaviruses and flaviviruses, p. 251-278. In S. Schlesinger and M. J. Schlesinger (ed.), The Togaviridae and Flaviviridae. Plenum Press, New York.
Roehrig, J. T., A. R. Hunt, A. J. Johnson, and R. A. Hawkes (1989) “Synthetic peptides derived from the deduced amino acid sequence of the E-glycoprotein of Murray Valley encephalitis virus elicit antiviral antibody”Virology 171:49-60.
Rogers, S. G. et al. (1987) “Improved Vector for plant transformation:  expression cassette vectors and new selectable markers”Meth. in Enzymol. 153:253-277.
Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., pp. 9.47-9.57.
Sanchez, M. D., T. C. Pierson, D. McAllister, S. L. Hanna, B. A. Puffer, L. E. Valentine, M. M. Murtadha, J. A. Hoxie, and R. W. Doms (2005) “Characterization of neutralizing antibodies to West Nile virus”Virology 336:70-82.
Sassenfeld, H. M. (1990) “Engineering Proteins for Purification”TibTech 8:88-93.
Schena, M. et al. (1995) “Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns With a Complementary DNA Microarray”Science 270:467-470.
Schena, M. et al. (1996a) “Parallel human genome analysis: microarray-based expression monitoring of 1000 genes”Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(20):10614-10619.
Schena, M. (1996b) “Genome analysis with gene expression microarrays”BioEssays 18(5):427-431.
Schlesinger, J. J., J. R. Putnak, and K. H. Eckels (1992) “New approaches to flavivirus vaccine development”Biotechnology 20:289-307.
Sheibani, N. (1999) “Prokaryotic Gene Fusion Expression Systems and Their Use in Structural and Functional Studies of Proteins”Prep. Biochem. & Biotechnol. 29(1):77-90.
Skerra, A. et al. (1999) “Applications of a Peptide Ligand for Streptavidin:  the Strep-tag”Biomolecular Engineering 16:79-86.
Smith, C. (1998) “Cookbook for Eukaryotic Protein Expression:  Yeast, Insect, and Plant Expression Systems”The Scientist 12(22):20.
Smith, G. L. and B. Moss (1984) “Vaccinia Virus expression Vectors:  Construction, Properties, and applications”Bio Techniques Nov/Dec:306-312.
Smyth, G. K. et al. (2000) “Eukaryotic Expression and Purification of Recombinant Extracellular Matrix Proteins Carrying the Strep II Tag”Methods in Molecular Biology 139:49-57.
Spielmann, A. et al. (1986) “T-DNA structure in transgenic tobacco plants with multiple independent integration sites”Mol. Gen. Genet. 205:34-41.
Stiasny, K., S. L. Allison, A. Marchler-Bauer, C. Kunz, and F. X. Heinz (1996) “Structural requirements for low-pH-induced rearrangements in the envelope glycoprotein of tick-borne encephalitis virus”J Virol 70:8142-8147.
Suggs, S. V. et al. (1981) ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes, D.D. Brown [ed.], Academic Press, New York, 23:683-693.
Sun C.-W. et al. (1997) “Independent modulation of Iarabidopsis thaliana polyubiquitin mRNAs in different organs and in response to environmental changes”Plant J. 11(5):1017-1027.
Sutter, G. et al. (1994) “A recombinant vector derived from the host range-restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulates protective immunity in mice to influenza virus”Vaccine 12(11):1032-1040.
Sutter, G., Moss, B. (1992) “Nonreplicating Vaccinia Vector Efficiently Expresses Recombinant Genes”Proc. Nat'l. Acad. Sci U.S.A. 89:10847-10851.
Thompson, J. et al. (1994) “Clustal-W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice”Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680.
Unger, T. F. (1997) “Show Me the Money:  Prokaryotic Expression Vectors and Purification Systems”The Scientist 11(17):20.
Villa-Kamaroff, L. et al. (1978) “A bacterial clone synthesizing proinsulin”Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75(8):3727-3731.
Wagner, M. J. et al. (1981) “Nucleotide sequence of the thymidine kinase gene of herpes simplex virus type 1”Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78(3):1441-1445.
Wagner, E. et al. (1992) “Coupling of Adenovirus to Transferrin-Polylysine/DNA Complexes Greatly Enhances Receptor-Mediated Gene Delivery and Expression of Transfected Genes”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(13):6099-6103.
Wei, C. F. et al. (1983) “Isolation and comparison of two molecular species of the BAL 31 nuclease from Alteromonas espejiana with distinct kinetic properties”J. Biol. Chem. 258:13506-13512.
Wengler, G., and G. Wengler (1989) “An analysis of the antibody response against West Nile virus E protein purified by SDS-PAGE indicates that this protein does not contain sequential epitopes for efficient induction of neutralizing antibodies”J Gen Virol 70 (Pt 4):987-992.
Winkler, G., F. X. Heinz, and C. Kunz (1987) “Characterization of a disulphide bridge-stabilized antigenic domain of tick-borne encephalitis virus structural glycoprotein”J Gen Virol 68 (Pt 8):2239-2244.
Wong, T. K., Neumann, E. (1982) Electric field mediated gene transfer”Biochim. Biophys. Res. Commun., 107(2):584-587.
Yamamoto, T. et al. (1980) “Identification of a functional promoter in the long terminal repeat of Rous sarcoma virus”Cell 22(3):787-797.
Zapata, G. et al. (1995) “Engineering linear F(ab')2 fragments for efficient production in Escherichia coli and enhanced antiproliferative activity”Protein Eng. 8(10):1057-1062.
Zatloukal, K. et al. (1992) “Transferrinfection:  a highly efficient way to express gene constructs in eukaryotic cells”Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:136-153.
【図１】
2010514698.tif 000096
【図２】
2010514698.tif 000097
【図３】
2010514698.tif 000098
【図４】
2010514698.tif 000099
【図５】
2010514698.tif 000100
【図６】
2010514698.tif 000101
【図７】
2010514698.tif 000102
【図８】
2010514698.tif 000103
【図９】
2010514698.tif 000104
【図１０】
2010514698.tif 000105
【図１１】
2010514698.tif 000106
【図１２】
2010514698.tif 000107
【図１３】
2010514698.tif 000108
【図１４】
2010514698.tif 000109
【図１５】
2010514698.tif 000110
【図１６】
2010514698.tif 000111
【図１７】
2010514698.tif 000112
【図１８】
2010514698.tif 000113
【図１９】
2010514698.tif 000114
【図２０】
2010514698.tif 000115
【図２１】
2010514698.tif 000116
【図２２】
2010514698.tif 000117
【図２３】
2010514698.tif 000118
【図２４】
2010514698.tif 000119
【図２５】
2010514698.tif 000120
【図２６】
2010514698.tif 000121
【図２７】
2010514698.tif 000122
【図２８】
2010514698.tif 000123
【図２９】
2010514698.tif 000124
【図３０】
2010514698.tif 000125
【図３１】
2010514698.tif 000126
【図３２】
2010514698.tif 000127
【図３３】
2010514698.tif 000128
【図３４】
2010514698.tif 000129
【図３５】
2010514698.tif 000130
【図３６】
2010514698.tif 000131
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月24日(2009.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010514698000001.app
【国際調査報告】
2010514698.tif 000132
2010514698.tif 000133
2010514698.tif 000134