(57)【要約】  本発明は、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性とグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性とを有する遺伝的に改変された植物細胞および植物、ならびに前記遺伝的に改変された植物細胞および植物の作出のための方法に関するものである。この種類の植物は、増大した熱湯膨潤力を有するデンプンを合成する。本発明は同様に、増大した熱湯膨潤力を有するデンプン、および前記デンプンの製造のための方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的に改変されていない野生型の植物細胞と比較して、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性と、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性とを有する、遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項２】
遺伝的改変が、植物のゲノム中への少なくとも１つの外来核酸分子の導入からなる、請求項１に記載の遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項３】
遺伝的に改変されていない対応する野生型の植物細胞から単離されたデンプンと比較して、改変されたデンプンを合成する、請求項１及び２のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項４】
増大した熱湯膨潤力を有するデンプンを合成する、請求項１、２及び３のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された植物細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された植物細胞を含む植物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された植物を含む、請求項５に記載の植物の繁殖材料。
【請求項７】
ａ）植物細胞が、遺伝的に改変され、遺伝的改変が、以下の工程iおよびiiをいずれかの望ましい順序で個々にまたは同時に含み、
i）遺伝的に改変されていない対応する野生型の植物細胞と比較して、デンプン合成酵素IIの酵素活性を有するタンパク質の活性の増大に至る遺伝的改変の植物細胞中へ導入し、
ii）遺伝的に改変されていない対応する野生型の植物細胞と比較して、グルカン−水ジキナーゼの酵素活性を有するタンパク質の活性の増大に至る遺伝的改変の植物細胞中へ導入し、
ｂ）植物が、工程ａ）の植物細胞から再生され；
ｃ）場合により、工程ｂ）に従った植物を用いてさらなる植物が作出され、
植物細胞が場合により、工程ｂ）またはｃ）に従った植物から単離され、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性とグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性とを有する植物が作出されるまで、方法の工程ａ）〜ｃ）が、反復される、遺伝的に改変された植物の作出のための方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された植物細胞、請求項５に記載の植物、請求項６に記載の繁殖材料または請求項７に記載の方法によって得られることのできる植物からのデンプンの抽出の工程を含む、改変されたデンプンの製造のための方法。
【請求項９】
請求項５に記載の植物の、請求項６に記載の繁殖材料の、または請求項７に記載の方法によって得られることのできる植物の、デンプンの製造のための使用。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法によって得られることのできる改変されたデンプン。
【請求項１１】
少なくとも１１０g/gの熱湯膨潤力を有する、改変されたデンプン。
【請求項１２】
請求項１０または１１のいずれか一項に記載の改変されたデンプンがその後、誘導体化される、誘導体化されたデンプンの製造のための方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によって得られることのできる誘導体化されたデンプン。
【請求項１４】
誘導体化されたデンプンの製造のための、請求項１０または１１のいずれか一項に記載の改変されたデンプンの使用。
【請求項１５】
請求項８に記載の方法によって得られることのできる改変されたデンプンを含む、または請求項１０または１１のいずれか一項に記載の改変されたデンプンを含む、粉末。
【請求項１６】
請求項５に記載の植物の、請求項６に記載の繁殖材料の、または請求項７に記載の方法によって得られることのできる植物のすりつぶしの工程を含む、粉末の製造のための方法。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された植物細胞、請求項５に記載の植物、請求項６に記載の繁殖材料または請求項７に記載の方法によって得られることのできる植物の、粉末の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性とグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性とを有する遺伝的に改変された植物細胞および植物、ならびに前記遺伝的に改変された植物細胞および植物の作出のための方法に関するものである。この種類の植物は、増大した熱湯膨潤力を有するデンプンを合成する。本発明は同様に、増大した熱湯膨潤力を有するデンプン、および前記デンプンの調製のための方法にも関するものである。
【０００２】
油、脂肪およびタンパク質のほかに、多糖は、植物の主要な再生可能な原材料である。セルロースのほかに、より高次の植物における最も重要な貯蔵物質の１つであるデンプンは、多糖において中心的な役割を担う。
【０００３】
さらに、デンプンは、栄養生理学的観点において、ヒトおよび動物の栄養の必須構成体である。食物中に含有されるデンプンの構造的特徴は、食物の全種類の機能生理学特性（例えば、水結合力、膨潤力）、栄養生理学特性（例えば、消化性、血糖上昇率に及ぼす食物の影響）または構造に付与する（例えば、切断抵抗性、質感、粘着性、加工しやすさ）特性に影響することが可能である。食物組成はしたがって、問題の食物の所望の特性を決定する特定の構造的特徴を有するデンプンをしばしば含有する。デンプン貯蔵植物組織を含有する食物（例えば、子実、果実、粉末）の特性は、植物組織中に含有されるデンプンによっても影響され得る。
【０００４】
多糖デンプンは、化学的に均質な基本構造単位であるグルコース分子のポリマーである。しかしながら、本明細書に関与するものは、重合の程度、グルコース鎖の分枝の発生およびその鎖長に関して異なっており、およびさらには改変され、例えばリン酸化されることが可能である異なる分子形態の非常に複雑な混合物である。したがって、デンプンは、均質な原材料ではない。特に、α−１，４−グリコシド結合したグルコース分子の本質的に未分枝のポリマーであるアミロースは、異なって分枝したグルコース鎖の複雑な混合物であるアミロペクチンとは区別される。分枝は、本明細書において、さらなるα−１，６−グリコシド結合の発生の結果として生じる。産業的デンプン製造のために、または例えば、トウモロコシ、コメ、コムギまたはジャガイモ等の食物として使用される典型的な植物において、合成されたデンプンは、アミロース約２０〜２５％およびアミロペクチン約７０〜７５％からなる。
【０００５】
デンプンの機能的特性、栄養生理学特性または構造に付与する特性、例えば、デンプンの溶解度、老化挙動、水結合能、フィルム形成特性、粘性、ゼラチン化特性、凍結融解安定性、酸安定性、ゲル強度、膨潤力、消化性およびデンプン顆粒サイズなどはとりわけ、アミロース／アミロペクチン比、グルコースポリマーの分子量、側鎖の分布パターン、イオンの含有量、脂質およびタンパク質の含有量および／またはデンプン顆粒の形態など、デンプンの構造的特徴によって影響される。
【０００６】
育種に基づく方法によって、デンプンの選択された構造的特徴およびしたがって、植物細胞中のデンプンの機能的特性、栄養生理学特性または構造に付与する特性は、変化することが可能である。しかしながら、このことは、デンプンの選択された構造的特徴に関して今日唯一起こり得る（例えば、アミロペクチン／アミロース含有量、米国特許第５，３００，１４５号）。現時点で、例えば、育種方法単独によって植物デンプン中のリン酸の含有量に影響することは起こり得ない。
【０００７】
育種方法に対する代替例は、遺伝子工学方法によるデンプン産生植物の選択された改変からなる。しかしながら、このための必要条件は、トランスジェニック植物におけるデンプン合成および／またはデンプン改変ならびにそれらのその後の機能的分析に関与する酵素の同定および特徴付けである。
【０００８】
異なる反応を触媒する多様な酵素は、植物細胞におけるデンプン合成に関与する。デンプン合成酵素（EC.2.4.1.21、ＡＤＰ−グルコース、１，４−α−Ｄ−グルカン４−α−Ｄ−グルコシルトランスフェラーゼ）は、ＡＤＰ−グルコースのグリコシルラジカルをα−１，４−グルカンへ転移することによって重合反応を触媒し、転移されたグルコシルラジカルは、α−１，４−結合の生成によってα−１，４−グルカンへ連結される。これまで研究されたほぼすべての植物において、各場合においてデンプン合成酵素の多くのアイソフォームを示すことが可能であった。デンプン合成酵素は、２つの異なる群へと分割されることが可能であり、すなわち顆粒結合デンプン合成酵素（ＧＢＳＳ）および可溶性デンプン合成酵素（本発明との関係において「ＳＳ」とも略記）である。顆粒結合デンプン合成酵素は、アミロースの合成を触媒するのに対し、可溶性デンプン合成酵素は、アミロペクチンの合成に関与する（Ball and Morell, 2003, Annu. Rev, Plant Biol. 54, 207-233; Teltow et al., 2004, J. Expt. Bot. 55(406), 2131-2145）。可溶性デンプン合成酵素の群は、SSI、SSII、SSIII、SSIVとして技術文献中に指定される多くのアイソフォームを有する。個々の群（SSI、SSII、SSIII、SSIV）へのデンプン合成酵素の割り当ては、問題の個々の酵素のタンパク質配列の配列相同性によって実施される（Ball and Morell, 2003, Annu. Rev, Plant Biol. 54, 207-233）。可溶性デンプン合成酵素の各個々のアイソフォームは、最新の学説に従ったデンプン合成における特異的な機能を割り当てられる。双子葉植物においては、これまで、SSIIタンパク質の１つのアイソフォームを示すことが可能であったのに対し、多くの単子葉植物（例えば、トウモロコシ）においては、SSIIタンパク質の２つの異なるクラスが示されており、SSIIaまたはSSIIbによって指定される。単子葉植物において、SSIIaは、胚乳中で優先的に発現し、SSIIbは好ましくは、葉の組織中で発現する（Teltow et al., 2004, J. Expt. Bot. 55(406), 2131-2145）。特に、デンプン合成における個々の可溶性デンプン合成酵素の特異的機能は、現時点でなお、最終的に明確されていない（Ball and Morell, 2003, Annu. Rev, Plant Biol. 54, 207-233）。
【０００９】
デンプンの機能的特性、栄養生理学特性または構造に付与する特性は、デンプンの非炭素成分であるリン酸の含有量によっても影響される。（デンプンリン酸エステルとして指定される本発明に関連して）モノエステルの形態にあるデンプンのグルコース分子に共有結合するリン酸と、デンプンと結合したリン脂質の形態にあるリン酸との間の区別が、本発明においてなされるべきである。
【００１０】
デンプンリン酸エステルの含有量は、植物の種類に応じて変動する。例えば、あるトウモロコシ変異体は、デンプンリン酸エステルの増大した含有量を有するデンプンを合成する（蝋様トウモロコシ０．００２％および高アミローストウモロコシ０．０１３％）のに対し、トウモロコシの従来の種類は、デンプンリン酸エステルの痕跡量を含有するにすぎない。同様に、デンプンリン酸エステルの少量は、コムギにおいて見出される（０．００１％）のに対し、カラスムギおよびモロコシ属においては、デンプンリン酸エステルも検出することは不可能であった。同様に、デンプンリン酸エステルは、コメの従来の種類（０．０１３％）よりもコメ変異体（蝋様コメ０．００３％）において見出された。デンプンリン酸エステルの有意な量は、例えば、タピオカ（０．００８％）、サツマイモ（０．０１１％）、クズウコン（０．０２１％）またはジャガイモ（０．０８９％）など、塊茎または根で貯蔵するデンプンを合成する植物において見出された。各場合において上述に引用されるデンプンリン酸エステルの含有量に関する％値は、デンプンの乾燥重量と関連し、Janeら（1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832）によって測定されている。
【００１１】
デンプンリン酸エステルは、重合したグルコースモノマーのＣ２、Ｃ３またはＣ６位におけるモノエステルの形態で存在し得る（Takeda and Hizukuri, 1971, Starch/Starke 23, 267-272）。植物によって合成されたデンプン中のリン酸のリン酸分布は一般的に、グルコース分子のＣ３位におけるリン酸ラジカル約３０〜４０％およびＣ６位におけるリン酸ラジカル約６０〜７０％が共有結合している点で区別される（Blennow et al., 2000, Int. J. of Biological Macromolecules 27, 211-218）。Blennowら（2000, Carbohydrate Polymers 41, 163-174）は、例えば、ジャガイモデンプン（デンプン１mgあたり７．８〜３３．５nmol、栽培品種による）、様々なウコン属の種由来のデンプン（１mgあたり１．８〜６３nmol、栽培品種による）、タピオカデンプン（デンプン１mgあたり２．５nmol）、コメデンプン（デンプン１mgあたり１．０nmol）、リョクトウデンプン（デンプン１mgあたり３．５nmol）およびモロコシデンプン（デンプン１mgあたり０．９nmol）など、様々なデンプンの含有量を測定した。オオムギデンプンおよびトウモロコシの様々な蝋様変異体由来のデンプンにおいて、これらの著者は、Ｃ６位に結合したいずれのデンプンリン酸エステルも検出することはできなかった。これまで、植物の遺伝子型とデンプンリン酸エステル含有量との間を何ら関係付けることはできなかった（Jane et al., 1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832）。したがって、育種測定によって植物中のデンプンリン酸エステルの含有量に影響を及ぼすことは不可能である。
【００１２】
これまで、デンプンのグルコース分子中へのリン酸ラジカルの共有結合の導入を仲介する２つのタンパク質が記載されている。第一のタンパク質は、α−グルカン−水ジキナーゼ（ＧＷＤ、E.C.:2.7.9.4）（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171）の酵素活性を有し、特により古い科学文献においてしばしばＲ１と呼ばれ、ジャガイモ塊茎中の貯蔵デンプンのデンプン顆粒に結合している（Lorberth et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 473-477）。デンプン中へのデンプンリン酸エステルの導入を触媒する、文献中に記載される第二のタンパク質は、ホスホグルカン−水ジキナーゼ（ＰＷＤ、E.C.:2.7.9.5）の酵素活性を有する（Kotting et al., 2005, Plant Physiol. 137, 2424-252, Baunsgaard et al., 2005, Plant Journal 41, 595-605）。
【００１３】
ＧＷＤとＰＷＤとの間の有意差は、ＧＷＤが、リン酸化されていないデンプンを基質として使用することが可能であり、すなわち、リン酸化されていないデンプンのデノボ（de novo）リン酸化が、ＧＷＤによって触媒されることが可能であるのに対し、ＰＷＤは、既にリン酸化されたデンプンを基質として必要とし、すなわち、リン酸をすでにリン酸化されたデンプンへとさらに導入するという事実からなる（Kotting et al., 2005, Plant Physiol. 137, 2424-252, Baunsgaard et al., 2005, Plant Journal 41, 595-605）。ＧＷＤとＰＷＤの間のさらなる有意差は、ＧＷＤがもっぱら、デンプンのグルコース分子のＣ６位へとリン酸基を導入するのに対し、ＰＷＤがもっぱら、リン酸化されたデンプンのグルコース分子のＣ３位をリン酸化するという事実からなる（Ritte et al., 2006, FEBS Letters 580, 4872-4876）。
【００１４】
ＧＷＤまたはＰＷＤによって触媒される反応において、出発材料である（ＧＷＤのための）α−１，４−グルカンまたは（ＰＷＤのための）リン酸化されたα−１，４−グルカン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および水が反応し、生成物であるグルカンリン酸エステル（デンプンリン酸エステル）、モノリン酸およびアデノシン一リン酸を与える（Kotting et al., 2005, Plant Physiol. 137, 2424-252, Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171）。
【００１５】
ジャガイモからのＧＷＤコード遺伝子の発現により、ＧＷＤタンパク質の増大した活性を有するコムギ植物は、WO0234923に記載されている。デンプンリン酸エステルを検出することが不可能であった対応する野生型植物と比較して、これらの植物は、グルコース分子のＣ６位におけるデンプンリン酸エステルの有意な量を含有するデンプンを合成する。
【００１６】
ＷＯ０５２３５９は、トウモロコシ植物によって使用されるコドンに関して最適化されたトウモロコシ植物中でのジャガイモ由来のＧＷＤの過剰発現を記載する。３１Ｐ  ＮＭＲによって、グルコースの量に基づいた０．０７３６％のリン酸の問題のトウモロコシデンプンの（グルコース分子のＣ６、Ｃ３およびＣ２位において結合した）全体のリン酸含有量が測定された。９８の分子量がリン酸に関する基礎として採用される場合、デンプン１mgあたりのリン酸約７．５nmolの全リン酸含有量は、トランスジェニックトウモロコシ植物から単離されたデンプンに関してＷＯ０５２３５９において測定された０．０７３６％の全リン酸含有量の結果である。
【００１７】
シロイヌナズナ由来のＰＷＤコード遺伝子の過剰発現によりＰＷＤタンパク質の増大した活性を有する植物は、ＷＯ０５０９５６１７において記載されている。対応する形質転換していない野生型植物と比較して、これらの植物は、デンプンリン酸エステルの増大した含有量を有する。
【００１８】
例えば、食品産業でのデンプンの加工における重要な機能的特性は、膨潤力である。アミロース／アミロペクチン比、側鎖長、分子量、分枝数等のデンプンの多様な構造的特性は、問題のデンプンの膨潤力に影響を及ぼす（Narayana and Moorthy, 2002, Starch/Starke 54, 559-592）。
【００１９】
アミロース／アミロペクチン比、アミロペクチンの側鎖分布およびデンプンポリマーの分子量分布に加えて、デンプンリン酸エステルの量も、機能的特性、特にデンプンの膨潤力に影響するという忠告は、科学文献から得られ得る（Narayana and Moorthy, 2002, Starch/Starke 54, 559-592）。
【００２０】
デンプンの膨潤量に関して、冷水（例えば、室温）中の膨潤力と温水または熱水中の膨潤力との間の区別がなされるべきであることは強調されるべきである。未変性のデンプンは、たとえそうであるとしても冷水中でごくわずかな膨潤力を有するのに対し、物理的に改変された（α化した、乾燥した）デンプンはすでに、冷水中で膨潤することが可能である。冷水中で膨潤するデンプンに関する製品加工が、例えば米国特許第４，２８０，８５１号に記載されている。本発明と関連して、「膨潤力」という用語は、温かい／熱い水性懸濁液中でのデンプンの挙動に関する。膨潤力は、標準的に、水の過剰量の存在下でデンプン顆粒を加温し、懸濁液の遠心分離後に非結合水を除去し、得られた残渣の重量を秤量されたデンプン量の重量で除した商を形成することによって測定される。この方法を実施する場合、加温の際に、デンプン顆粒のデンプン懸濁結晶面積が溶解され、水分子が、デンプン顆粒中に挿入するが、デンプン顆粒自体の構造がここでは破壊されておらず、すなわち、水分子の吸収によって生じる個々のデンプン顆粒の膨潤のみが生じる。
【００２１】
子実デンプンと比較して、塊茎または塊茎組織から単離されたデンプンは、有意に高い熱湯膨潤力を有する。
【００２２】
多様な品種から単離されたジャガイモデンプンに関し、７４．１５g/gの最大膨潤力（クフリ・ジョティ（Kufri Jyoti）品種）が、Leachらの方法（1959, Cereal Chemistry 36, 534-544）に従って、８５℃で測定された（Singh et al., 2002, Journal of the Science of Food and Agriculture 82, 1376-1383）。Takizawaら（2004, Brazilian Archives of Biology and Technology 47 (6), 921-931）は、ジャガイモデンプンに関して１００g/gの膨潤力を測定した（９０℃、Leachらの方法(1959, Cereal Chemistry 36, 534-544)による）。多様な栽培品種から単離されたコムギデンプンは、１６．６〜２６．０g/gの膨潤力（温度：沸騰中の０．１％ＡｇＮＯ３懸濁液）を有する（Yamamori and Quynh, 2000, Theor Appl Genet 100, 23-28）。外皮のないオオムギの多様な栽培品種から単離されたデンプンは、１６．５g/gまたは１９．３g/gの膨潤力を有し、該オオムギの多様な栽培品種の蝋様デンプンまたはアミロースを含有しないデンプンは、３６．０〜５５．７g/gの膨潤力を有する（温度：７０℃の０．１％ＡｇＮＯ３水溶液、Yasui et al., 2002, Starch/ Starke 54, 179-184）。トウモロコシデンプンに関して、２２．３g/gの膨潤力、および高アミローストウモロコシデンプンに関して、９．６g/g（Hylon V）、６．１g/g（Hylon VII）または３．９g/g（ＬＡＰＳ＝低アミロペクチンデンプン）の膨潤力を測定した（９０℃、Shi et al., 1998, J. Cereal Sci. 27, 289-299）。米国特許第６，２９０９，９０７号において、３５．４g/gの膨潤力が、蝋様デンプンに関して示された。多様なコメ栽培品種から単離されたデンプンに関して、２６．０〜３３．２g/gの膨潤力が、Leachらの方法（1959, Cereal Chemistry 36, 534-544）に従って測定された（Sodhi and Singh, 2003, Food Chemistry 80, 99-108）。Chenら（2003, Starch/Starke 55, 203-212）は、蝋様コメデンプンと高アミロースコメデンプンとの多様な混合物に関して、約２５〜約４９g/gの膨潤力を測定した。Yasuiら（2002, Starch/ Starke 54, 179-184）は、アミロースを含有しないコメデンプンに関して、５５．７g/gの膨潤力を測定した（０．１％硝酸銀水溶液中で沸騰水中で測定）。
【００２３】
未変性デンプンの誘導体の調製によって、デンプンの機能的特性は変化し得る。「架橋された」コムギデンプンは、架橋の程度に応じて、６．８〜８．９g/gの膨潤力を有し、アセチル化したコムギデンプンは、せいぜい１０．３g/gの膨潤力を有し、同時に、架橋されおよびアセチル化されたコムギデンプンは、９．４g/gの膨潤力を有するのに対し、対応する誘導体化されていないデンプンは、８．８g/gの膨潤力を有した（９０℃で測定；Van Hung and Morita, 2005, Starch/Starke 57, 413-420）。
【００２４】
アセチル化した蝋様コメデンプンに関して、約３０g/gの膨潤力が、架橋された蝋様コメデンプンに関して、約１５g/gの膨潤力が測定されたのに対し、対応する誘導体化されていない蝋様コメデンプンは、約４１g/gの膨潤力を有した。アセチル化したコメデンプンは、約２０g/gの膨潤力を有し、架橋されたコメデンプンは、約１３g/gの膨潤力を有するのに対し、対応する誘導体化されていないコメデンプンは、約１４g/gの膨潤力を有した（９０℃で測定、Liu et al., 1999, Starch/Starke 52, 249-252）。米国特許第６，２９９，９０７号は、架橋したデンプンを記載し、架橋反応は、水酸化ナトリウム／硫酸ナトリウム溶液中で問題のデンプンの前膨潤の後に実施される。架橋の程度に応じて、コムギデンプンに関しては、６．８〜７．３g/gの膨潤力（誘導体化されていないコムギデンプン１４．７g/gに相当）が、ヒドロキシプロピルコムギデンピンに関しては、９．７g/gの膨潤力（誘導体化されていない小麦デンプン２２．９g/gに相当）が、架橋されたトウモロコシデンプンに関しては、５．９g/gの膨潤力（誘導体化されていないトウモロコシデンプン１６．７g/gに相当）が、架橋された蝋様トウモロコシデンプンに関しては、８．３g/gの膨潤力（誘導体化されていない蝋様トウモロコシデンプン３５．４g/gに相当）が、および架橋されたジャガイモデンプンに関しては、６．７g/gの膨潤力（相当する誘導体化されていないジャガイモデンプンは、正確には特定されていなかった）が測定された（９５℃で測定）。このことから、デンプンの膨潤力が、たとえそうであったとしても、今日、誘導体化の通例の方法によって有意に増大することが不可能であることが結果として得られる。
【００２５】
本発明は、機能的特性の変化した利用可能な改変されたデンプンを製造する目的、機能的特性の変化したデンプンを合成する植物細胞および植物、ならびに該植物および／または植物細胞の作出のための方法および手段に基づいている。
【００２６】
本発明はしたがって、遺伝的に改変されていない対応する野生型の植物細胞または野生型植物と比較して、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性と、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性とを有する、遺伝的に改変された植物細胞および遺伝的に改変された植物に関する。
【００２７】
本発明の第一の局面は、遺伝的に改変された植物細胞または植物に関するものであり、遺伝的改変は、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物細胞または野生型植物と比較して、デンプン合成酵素IIの活性を有する少なくとも１つのタンパク質の活性における増大、および同時に、グルカン−水ジキナーゼの活性を有する少なくとも１つのタンパク質の活性における増大に至る。
【００２８】
遺伝的改変は、本発明において、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物細胞または野生型植物と比較して、遺伝的に改変された植物細胞または遺伝的に改変された植物におけるデンプン合成酵素IIの活性を有する少なくとも１つのタンパク質、および（同時に）グルカン−水ジキナーゼの活性を有する少なくとも１つのタンパク質の活性における増大に至る遺伝的改変であり得る。
【００２９】
「野生型植物細胞」という用語は、本発明と関連して、これらが、本発明に従った植物細胞の作出のための出発材料として機能する植物細胞であり、すなわち、前記植物細胞の遺伝情報が、導入される遺伝的改変は別として、本発明に従った植物細胞の遺伝情報に相当することを意味する。
【００３０】
本発明と関連して、「野生型植物」という用語は、これらが、本発明に従った植物細胞の作出のための出発材料として機能する植物であり、すなわち、前記植物の遺伝情報が、導入される遺伝的改変は別として、本発明に従った植物の遺伝情報に相当することを意味する。
【００３１】
「対応する」という用語は、本発明と関連して、多くの論文の比較の上で、互いに比較されている問題の論文が、同一条件下で維持されたことを意味する。本発明と関連して、野生型植物細胞または野生型植物と関連した「対応する」という用語は、互いに比較されている前記植物細胞または植物が、同一の栽培条件下で生育し、それらが同一の（栽培）齢を有することを意味する。
【００３２】
「デンプン合成酵素IIの活性を有する少なくとも１つのタンパク質の増大した活性」という用語は、本発明において、本発明と関連して、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする内在性遺伝子の発現の増大、および／または細胞におけるデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の量の増大、および／または細胞におけるデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の酵素活性の増大を意味する。
【００３３】
「グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性」という用語は、本発明において、本発明と関連して、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする内在性遺伝子の発現における増大、および／または細胞におけるグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の量における増大、および／または細胞におけるグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の酵素活性における増大を意味する。
【００３４】
発現の増大は、例えば、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードし、またはグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする転写産物の量の測定によって決定されることが可能である。このことは、例えば、ノザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって実施されることが可能である。本発明において、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする転写産物の量の増大は好ましくは、遺伝的に改変されていない対応する細胞と比較して、転写産物の量の、少なくとも１００％、特に少なくとも１２５％、好ましくは少なくとも１５０％および特に好ましくは少なくとも２００％ほどの増大を意味する。デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする転写産物の量の増大は、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする転写産物の検出可能な量を含有しない植物または植物細胞が、本発明に従った遺伝的改変後に、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする転写産物の検出可能な量を含有することも意味する。
【００３５】
本発明において、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする転写産物の量の増大は好ましくは、遺伝的に改変されていない対応する細胞と比較して、転写産物の量の、少なくとも５０％、特に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％および特に好ましくは少なくとも１００％の増大を意味する。
【００３６】
グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする転写産物の量の増大は、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする転写産物の検出可能な量を含有しない植物または植物細胞が、本発明に従った遺伝的改変後に、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする転写産物の検出可能な量を含有することも意味する。
【００３７】
結果として問題の植物細胞におけるデンプン合成酵素IIおよびグルカン−水ジキナーゼのタンパク質の増大した活性を有する、デンプン合成酵素IIの活性を有しまたはグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の量の増大は、例えば、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）またはＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）等の免疫学的方法によって測定されることが可能である。本発明において、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の量の増大は好ましくは、遺伝的に改変されていない対応する細胞と比較して、問題のタンパク質の量の、少なくとも１００％、特に少なくとも１２５％、好ましくは少なくとも１５０％および特に好ましくは少なくとも２００％の増大を意味する。デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の量の増大は、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の検出可能な量を含有しない植物または植物細胞が、本発明に従った遺伝的改変後に、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の検出可能な量を含有することも意味する。
【００３８】
本発明において、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の量の増大は好ましくは、遺伝的に改変されていない対応する細胞と比較して、問題のタンパク質の量の、少なくとも５０％、特に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％および特に好ましくは少なくとも１００％ほどの増大を意味する。
【００３９】
グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の量の増大は、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の検出可能な量を含有しない植物または植物細胞が、本発明に従った遺伝的改変後に、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の検出可能な量を含有することも意味する。
【００４０】
特定のタンパク質と特異的に反応する、すなわち、該タンパク質に特異的に結合する抗体の産生のための方法は、当業者に公知である（例えば、Lottspeich and Zorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik [Bioanalytics], Spektrum akad. Velag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4参照）。この種の抗体の産生は、いくつかの会社（例えば、Eurogentec, Belgium）によって役務契約として提供される。グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の量の増大を、免疫学的方法によって検出することを可能とする抗体は、Lorberthら（1998, Nature Biotechnology 16, 473-477）およびRitteら（2000, Plant Journal 21, 387-391）において記載されている。デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の量の増大を、免疫学的方法によって測定することを可能とする抗体は、Walter（"Untersuchungen der Expression und Funktion der Starkesynthase II (SS II) aus Weizen (Triticum aestivum)" [Investigations of the expression and function of starch synthase II (SS II) from wheat (Triticum aestivum)], the faculty of Biology of the University of Hamburgにおける学位論文, ISBN 3-8265-8212-8）において記載されている。
【００４１】
グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の活性の量は、例えば、文献（Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532; Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171）に記載されるように検出されることが可能である。
【００４２】
デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性の量は、例えば、文献（Nishi et al., 2001, Plant Physiology 127, 459-472）において記載されるように測定されることが可能である。デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性の量の測定のための好ましい方法は、一般的な方法の第９項に記載されている。
【００４３】
好ましくは、本発明に従った植物細胞または本発明に従った植物は、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物細胞または野生型植物と比較して、少なくとも６倍、好ましくは少なくとも７倍、特に好ましくは少なくとも８倍、特に好ましくは少なくとも９倍、および非常に特に好ましくは少なくとも１０倍増大するデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性を有する。
【００４４】
デンプン合成酵素II（ＡＤＰ−グルコース−１，４−α−Ｄ−グルカン−４−α−Ｄ−グルコシルトランスフェラーゼ；EC2.4.1.21）の活性を有するタンパク質は、前記タンパク質の構造中に特定のドメインの配列を有する。Ｎ末端に、前記タンパク質は、色素体における輸送のためのシグナルペプチドを有する。Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｎ末端領域および触媒ドメインが続く（Li et al., 2003, Funct Integr Genomics 3, 76-85）。デンプン合成酵素IIの活性を有する様々なタンパク質のアミノ酸配列比較（http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN）に基づいたさらなる分析は、これらのタンパク質が、３つの特異的ドメインを有することを示した。配列番号６に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸３２２〜３５１は、ドメイン１を表し、アミノ酸４２３〜４６２は、ドメイン２を表し、アミノ酸６４１〜７０５は、ドメイン３を表す。ドメイン１は、配列番号５で示される核酸配列のヌクレオチド１１９０〜１２７９によってコードされ、ドメイン２は、ヌクレオチド１４９３〜１６１２によってコードされ、ドメイン３は、ヌクレオチド２１４７〜２３５０によってコードされる。
【００４５】
本発明と関連して、「デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質」という用語は、基質ＡＤＰ−グルコースのグルコース分子が、α−１，４−連結の形成とともにα−１，４−連結されたグルカン鎖へ転移され（ＡＤＰ−グルコース＋｛（１，４）−α−Ｄ−グルコシル｝（Ｎ）⇔ＡＤＰ＋｛（１，４）−α−Ｄ−グルコシル｝（Ｎ＋１））、デンプン合成酵素IIのタンパク質の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号６で示されるアミノ酸配列のアミノ酸３２２〜３５１（ドメイン１）と少なくとも８６％、好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号６で示されるアミノ酸配列のアミノ酸４２３〜４６２（ドメイン２）と少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８６％、特に好ましくは少なくとも９５％の同一性を有し、配列番号６で示されるアミノ酸配列のアミノ酸６４１〜７０５（ドメイン３）と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは８６％、特に好ましくは９８％の同一性を有するグリコシル化反応を触媒するタンパク質を意味するものとして理解されるべきである。
【００４６】
ドメイン１、２および３との該同一性を有し、およびデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列およびそれに対応するアミノ酸配列は、当業者に公知であり、例えば、受託番号第AY133249号（オオムギ）、受託番号第AY133248号（タルホコムギ）、受託番号第XP467757号、第AAK64284号（イネ）、第AAK81729号（イネ）、受託番号第AAD13341号、第AAS77569号、第AAD13342号（トウモロコシ）、受託番号第AAＦ１3168号（キャッサバ）、受託番号第BAD18846号（インゲンマメ）、受託番号第CAA61241号（ジャガイモ）、受託番号第CAA61269号（エンドウマメ）、受託番号第AAC19119号（サツマイモ）、受託番号第AAF２6156号（シロイヌナズナ）、受託番号第AAP41030号（サトイモ）、受託番号第AAS88880号（オストレオコッカス・タウリ（Ostraeococcus tauri））または受託番号第AAC17970号（コナミドリムシ）で刊行されている。デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする記載された核酸配列およびアミノ酸配列は、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/）によってアクセス可能であり、参考文献の記載によって本願の明細書に明確に含まれる。
【００４７】
本発明の脈絡において、「グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質」という用語は、ＡＴＰからデンプンへβリン酸残基を転移させるタンパク質を意味するものとして理解されるべきである。シロイヌナズナｓｅｘ１−３変異体の葉から単離されたデンプンは、共有結合したリン酸ラジカルの検出可能な量を有さないが、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質によってリン酸化され、すなわち、例えばシロイヌナズナｓｅｘ１−３変異体の葉から単離されたリン酸化されていないデンプンが、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質によって触媒されるリン酸化反応において基質として使用される。
【００４８】
ＡＴＰのβリン酸ラジカルは、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質からデンプンへ転移し、ＡＴＰのγリン酸ラジカルは、水へ転移する。ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）は、さらなる反応産物として結果的に生じる。グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質はしたがって、［α−１，４−グルカン］−水ジキナーゼとして、またはデンプン−水ジキナーゼ（EC: 2.7.9.4；Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171）としても指定される。グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質によって触媒されるデンプンのリン酸化において、さらなるリン酸モノエステル結合が、グルコース分子のＣ６位を独占的に生じる（Ritte et al., 2006, FEBS Letters 580, 4872-4876）。グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質によるデンプンのリン酸化反応の触媒において、ＡＴＰのβリン酸ラジカルが、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸へ共有結合するリン酸化したタンパク質は、中間体として結果的に生じる（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171）。グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の自己リン酸化によって結果的に中間体が生じ、すなわち、グルカン−水ジキナーゼ自体の活性を有するタンパク質は、中間体に至る反応を触媒する。グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列は、ホスホヒスチジンドメインを含有する。ホスホヒスチジンドメインは、例えば、Tien-Shin Yuら（2001, Plant Cell 13, 1907-1918）において記載されている。グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の自己リン酸化において、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列のホスホヒスチジンドメインにおけるヒスチジンラジカルは、リン酸化される（Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532）。配列番号２で示されるジャガイモ由来のグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質のタンパク質配列において、アミノ酸１０６４〜１０７５は、ホスホヒスチジンドメインである。ホスホヒスチジンドメインの（例えば配列番号２で示されるアミノ酸１０６９のタンパク質配列における）保存されたヒスチジンラジカルが、別のアミノ酸によって置換される場合、自己リン酸化およびしたがって変異誘発されたタンパク質によるグルカンのリン酸化も、もはや生じない（Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532）。さらに、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質は、例えば配列番号２で示されるアミノ酸１１２１〜１４６４のアミノ酸配列に含まれるＣ末端ヌクレオチド結合ドメインを前記タンパク質が有する点で区別される。ヌクレオチド結合ドメインの欠失は、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の不活性化を導く（Mikkelsen and Blennow, 2005, Biochemical Journal 385, 355-361）。Ｎ末端において、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸７８〜３６２のアミノ酸配列中に含まれる炭水化物結合ドメイン（ＣＢＭ）を含有する。炭水化物結合ドメインは、とりわけ、前記ドメインのアミノ酸配列が、保存されたトリプトファン残基を含有する点で区別される。これらの保存されたアミノ酸残基が、別のアミノ酸によって置換される場合、炭水化物結合ドメインは、グルカンに結合する前記ドメインの能力を損失する。例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸Ｗ１３９またはＷ１９４の置換は、炭水化物結合ドメインの機能の損失を導く。しかしながら、グルカン−水ジキナーゼの炭水化物結合ドメインが、欠失される場合（例えば、アミノ酸１〜３６２の欠失、ここで配列番号２で示されるアミノ酸配列中のアミノ酸１〜７７は、色素体シグナルペプチドである）、これは、酵素のリン酸化活性の不活性化を導かない（Mikkelsen et al., 2006, Biochemistry 45, 4674-4682）。
【００４９】
グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列およびこれらに対応するアミノ酸配列は、例えばジャガイモ（WO 97 11188、GenBank受託番号第AY027522号、第Y09533号）、コムギ（WO 00 77229、米国特許第6,462,256号、GenBank受託番号第AAN93923号、GenBank受託番号第AR236165号）、コメ（GenBank受託番号AAR61445号、GenBank受託番号第AR400814号）、トウモロコシ（GenBank受託番号AAR61444号、GenBank受託番号第AR400813号）、ダイズ（GenBank受託番号AAR61446号、GenBank受託番号第AR400815号）、ウコン（配列番号３）、柑橘類（GenBank受託番号第AY094062号）、アラビドプシス（GenBank受託番号第AＦ３12027号）および緑藻類オストレオコッカス・タウリ（Ostreococcus tauri）（GenBank受託番号第AY570720.1号）など、異なる種に関して記載されている。グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする記載された核酸配列およびアミノ酸配列は、とりわけ、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/）によって刊行されており、参考文献の記載によって本願の明細書に明確に含まれる。
【００５０】
本発明のさらなる実施態様は、本発明に従った遺伝的に改変された植物細胞または本発明に従った遺伝的に改変された植物に関するものであり、遺伝的改変は、植物細胞のゲノム中へのまたは植物のゲノム中への少なくとも１つの外来核酸分子の導入からなる。
【００５１】
この関係において、「遺伝的改変」という用語は、植物細胞のゲノム中へのまたは植物のゲノム中への同種（homologous）的および／または異種（heterologous）的外来核酸分子の導入を意味するものであり、これらの分子の該導入は、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の活性の増大およびデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性の増大に至る。
【００５２】
外来核酸分子の導入によって、本発明に従った植物細胞または本発明に従った植物は、前記植物細胞および前記植物の遺伝情報において変化する。少なくとも１つの外来核酸分子の存在または発現は、表現型の変化を導く。本発明において、「表現型の」変化とは、好ましくは細胞の１つ以上の機能の測定可能な変化を意味する。例えば、本発明に従った遺伝的に改変された植物細胞および本発明に従った遺伝的に改変された植物は、導入される外来核酸分子の存在の理由で、または前記核酸分子の発現の場合において、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の活性の増大およびデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性の増大を示す。
【００５３】
「外来核酸分子」という用語は、本発明と関連して、対応する野生型植物細胞において天然には生じない、または実際の空間的配置において野生型植物細胞において天然には生じない、または野生型植物細胞のゲノム中の天然には生じない部位中に局在する、いずれかの種類の分子を意味するものとして理解される。好ましくは、外来核酸分子とは、植物細胞中で組み合わせまたは特異的空間的配置が天然には生じない多様な要素からなる組換え分子である。
【００５４】
原理上、外来核酸分子は、植物細胞または植物におけるグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質のおよびデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性の増大を生じるいずれかの所望の核酸分子であり得る。
【００５５】
「組換え核酸分子」という用語は、本発明と関連して、組換え核酸分子に存在するようには一緒に天然には存在しない異なる核酸分子を含有する核酸分子を意味するものとして理解されるべきである。したがって、例えば、組換え核酸分子は、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をおよび／またはデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に加えて、組換え核酸分子は、記載される核酸分子と一緒には天然には存在しないさらなる核酸配列を含有することが可能である。グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をまたはデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子と一緒に、組換え核酸分子に存在すると記載されるさらなる核酸配列は、本発明におけるいずれかの所望の配列であり得る。例えば、前記核酸配列は、ゲノムおよび／または植物の核酸配列であり得る。好ましくは、記載されるさらなる核酸配列は、制御配列（プロモーター、終止シグナル、エンハンサー）であり、特に好ましくは、植物組織中で活性である制御配列であり、特に好ましくは植物組織中で活性である組織特異的制御配列である。組換え核酸分子の生成のための方法は、当業者に公知であり、例えば連結、ゲノム組換えまたは核酸分子のデノボ合成による核酸分子の接続等の遺伝子工学的方法を含む（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929参照）。
【００５６】
「ゲノム」という用語は、本発明と関連して、植物細胞中に存在する遺伝性材料の全体性を意味するものとして理解されるべきである。細胞核に加えて、他の区画（例えば、色素体、ミトコンドリア）も遺伝性材料を含有することは当業者に公知である。
【００５７】
さらなる実施態様において、本発明に従った植物細胞および本発明に従った植物は、少なくとも１つの外来核酸分子が、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする。好ましくは、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、多様な植物種から当業者に知られた既に記載された核酸分子であり、特に好ましくはジャガイモまたはウコン由来のグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子、特に好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有しまたは配列番号１に示される核酸配列によってコードされるグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子である。
【００５８】
配列番号３および配列番号４で示される配列は、従前刊行されていない。植物細胞または植物、特にウコン由来のグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を含有するコメ植物細胞またはコメ植物は、他の種（例えば、ジャガイモ）由来のグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を含有する植物細胞または植物よりも高いデンプンリン酸エステル含有量を有するデンプンを合成する点で区別される。
【００５９】
したがって、本発明は、
ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）アミノ酸配列が、配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、優先的には少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９６％および特に好ましくは少なくとも９９％含有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ）配列番号３で示される核酸配列または相補的な配列を含む核酸分子；
ｄ）配列番号３で示される核酸配列と少なくとも９０％、優先的には少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９６％および特に好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する核酸分子；
ｅ）ａ）またはｃ）で記載される核酸分子の少なくとも１本の鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；
ｆ）遺伝暗号の縮重の理由で、ヌクレオチド配列が、ａ）またはｃ）で記載される核酸分子の配列とは異なる核酸分子；
ｇ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）で記載される核酸分子の断片、対立遺伝子多型および／または誘導体である核酸分子；
ｈ）植物細胞において転写を開始する調節エレメント（プロモーター）へ連結される、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）またはｇ）に従った核酸分子または
ｉ）プロモーターが、組織特異的プロモーター、特に好ましくは、特に植物胚乳細胞における転写を開始するプロモーターである、ｈ）に従った核酸分子
からなる群より選択されるグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子にも関する。
【００６０】
さらに、本発明は、本発明に従った外来核酸分子を含有するプラスミド、ベクターおよび植物細胞または植物に関する。
【００６１】
さらなる実施態様において、本発明に従った植物細胞および本発明に従った植物は、少なくとも１つの外来核酸分子が、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする。好ましくは、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、多様な植物種から当業者に知られた既に記載された核酸分子であり、特に好ましくはコムギ由来のデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子、特に好ましくは、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有しまたは配列番号５に示される核酸配列によってコードされるデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子である。
【００６２】
さらなる実施態様において、本発明に従った植物細胞および本発明に従った植物は、第一の外来核酸分子が、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードし、第二の外来核酸分子が、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする。
【００６３】
植物細胞または植物における遺伝的改変に関して導入される外来核酸分子は、個々の核酸分子または多くの核酸分子であり得る。前記外来核酸分子はしたがって、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を含有する核酸分子と、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を含有する核酸分子の両者であり得、前記外来核酸分子は、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列およびデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列が、異なる核酸分子中に存在する核酸分子であり得る。グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列およびデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列は、例えば１つのベクター、プラスミドもしくは直鎖状で存在する核酸分子、または互いに別個に各場合における２つのベクター、プラスミドまたは直鎖状核酸分子のその他の構成体において同時に含有されることが可能である。
【００６４】
グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列およびデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列が、互いに別個である２つの核酸分子中に存在する場合、前記核酸配列は、植物細胞もしくは植物のゲノム中に同時に導入され（「コトランスフォーメーション」）、またはさもなくば連続して、すなわち、互いに経時的に追随してのいずれかで導入されることが可能である（「スーパートランスフォーメーション」）。互いに別個の核酸分子は、１つの種の異なる個々の植物細胞または植物へと導入されることも可能である。それにより、グルカン−水ジキナーゼの活性を有する少なくとも１つのタンパク質またはデンプン合成酵素IIの活性を有する少なくとも１つの他のタンパク質のいずれかの活性が増大した植物細胞または植物を作出することが可能である。本発明に従った植物は次に、植物のその後の交雑によって、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の活性が増大し、それとともに、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性が増大した植物を作出することが可能である。
【００６５】
さらに、外来核酸分子の導入に関して、野生型植物細胞または野生型植物の代わりにグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性またはデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性を既に有する点で区別される変異体細胞または変異体が使用される。変異体は、自発的に（天然に）発生する変異体と、突然変異原の選択的使用（例えば、化学物質、電離放射線など）または遺伝子工学方法（例えば、Ｔ−ＤＮＡ活性化タグ付け、トランスポゾン活性化タグ付け、インサイツ（in situ）活性化、インビボ（in vivo）変異誘発）によって作出された変異体との両者であり得る。
本発明に従った植物細胞または本発明に従った植物はしたがって、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性を既に有する変異体細胞または変異体におけるグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の活性の増大に至る外来核酸分子の導入によっても作出されることが可能である。本発明に従った植物細胞または本発明に従った植物は、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を既に有する変異体細胞または変異体への、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性の増大に至る外来核酸分子の導入によっても作出されることが可能である。
【００６６】
本発明に従った植物細胞または本発明に従った植物は、グルカンジキナーゼの活性を有するタンパク質の活性が増大する変異体を、外来核酸分子の導入の理由でデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性を有する植物と交雑させることによっても作出されることが可能である。同様に、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性が増大する変異体を、外来核酸分子の導入の理由で、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を有する植物と交雑させることによって、本発明に従った植物細胞または本発明に従った植物を作出することが可能である。
【００６７】
本発明に従った植物は、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性が増大する変異体を、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の活性が増大する変異体と交雑させることによっても作出されることが可能である。
【００６８】
ＤＮＡの宿主植物細胞への導入のために、多数の技術が利用可能である。これらの技術には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾジーンズ（Agrobacterium rhizogenes）を、トランスフォーメーション剤として使用するＴ−ＤＮＡによる植物細胞のトランスフォーメーション、ＤＮＡの電気穿孔法、微粒子銃アプローチによるＤＮＡの導入、およびさらなる可能性が含まれる。
【００６９】
植物細胞のアグロバクテリウム属により仲介されるトランスフォーメーションの使用は、とりわけ、欧州特許第１２０５１６号、Hoekema（In: The Binary Plant Vector System Offsetdruckkerij Kanters B.V. Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46）およびAnら（1985, EMBO J. 4, 277-287）において集中的に研究され記載されている。ジャガイモのトランスフォーメーションに関しては、例えば、Rocha-Sosaら（1989, EMBO J. 29-33）を参照されたい。
【００７０】
アグロバクテリウム属のトランスフォーメーションを基にしたベクターによる単子葉植物のトランスフォーメーションも記載されている（1993, Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, 491-506; Hiei et al., 1994, Plant J. 6, 271-282; Deng et al., 1990, Science in China 33, 28-34; Wilmink et al., 1992, Plant Cell Reports 11, 76-80; May et al., 1995, Bio/Technology 13, 486-492; Conner and Domisse, 1992, Int. J. Plant Sci. 153, 550-555; Ritchie et al., 1993, Transgenic Res. 2, 252-265）。単子葉植物のトランスフォーメーションのための代替的な方法は、微粒子銃アプローチ（Wan and Lemaux, 1994, Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil et al., 1993, Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer et al., 1990, Theor. Appl. Genet. 79, 625-631）、原形質体トランスフォーメーション、部分的に透過された細胞の電気穿孔法またはガラス繊維によるＤＮＡの組込みによるトランスフォーメーションである。特に、トウモロコシのトランスフォーメーションは、文献中に反復して記載されている（例えば、ＷＯ９５／０６１２８、欧州特許第０５１３８４９号、欧州特許第０４６５８７５号、欧州特許第０２９２４３５号、Fromm et al., 1990, Biotechnology 8, 833-844、Gordon-Kamm et al., 1990, Plant Cell 2, 603-618、Koziel et al., 1993, Biotechnology 11, 194-200、Moroc et al., 1990, Theor. Appl. Genet. 80, 721-726参照）。
【００７１】
他の穀類種の成功したトランスフォーメーションも、例えばオオムギ（Wan and Lemaux, 上述参照、Ritala et al., 上述参照、Krens et al., 1982, Nature 296, 72-74）およびコムギ（Nehra et al., 1994, Plant J. 5, 285-297; Becker et al., 1994, Plant Journal 5, 299-307）に関して既に記載されている。上述の方法はすべて、本発明の脈絡において適している。
【００７２】
グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の導入および／またはデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の導入によって遺伝的に改変された植物細胞および植物は、とりわけ、野生型植物細胞または野生型植物において天然には生じない少なくとも１つの外来核酸分子を有するという事実によって、またはこの種類の分子が、本発明に従った植物細胞のゲノム又は本発明に従った植物のゲノム中の１つの部位で統合されて存在し、野生型植物細胞または野生型植物においてすなわち別のゲノム環境で生じないという事実によって、野生型植物細胞または野生型植物とは区別されることが可能である。さらに、本発明に従ったこのような植物細胞および本発明に従った植物は、場合によりさらに、野生型植物細胞または野生型植物におけるこの種類の分子のコピーを自然発生させるために、ゲノム中へ安定して統合された外来核酸分子の少なくとも１つのコピーを含有するという事実によって、野生型植物細胞または野生型植物とは区別されることが可能である。本発明に従った植物細胞または本発明に従った植物へと導入された外来核酸分子が、野生型植物細胞または野生型植物において既に自然発生した分子へのさらなるコピーである場合、本発明に従った植物細胞および本発明に従った植物は、特に、この（これらの）さらなるコピーが、野生型植物細胞または野生型植物において生じないゲノム中の部位に局在するという事実によって、野生型植物細胞または野生型植物とは区別されることが可能である。このことは、例えば、サザンブロット分析を用いて実証されることが可能である。
【００７３】
さらに、本発明に従った植物細胞および本発明に従った植物は、好ましくは以下の特徴の少なくとも１つによって野生型植物細胞または野生型植物とは区別されることが可能である：導入される外来核酸分子が、植物細胞または植物に関して異種的である場合、本発明に従った植物細胞または本発明に従った植物は、導入される核酸分子の転写産物を含有する。これらは、例えば、ノザンブロット分析によって、またはＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）によって検出されることが可能である。好ましくは、本発明に従った植物細胞および本発明に従った植物は、導入される核酸分子によってコードされるタンパク質を含有する。このことは、例えば、免疫学的方法によって、特にウェスタンブロット分析によって検出されることが可能である。
【００７４】
導入された外来核酸分子が、植物細胞または植物に関して同種的である場合、本発明従った植物細胞および本発明に従った植物は、例えば、導入された外来核酸分子のさらなる発現の理由で、野生型植物細胞または野生型植物とは区別されることが可能である。本発明に従った植物細胞および本発明に従った植物は好ましくは、外来核酸分子の転写産物を含有する。このことは、例えば、ノザンブロット分析によって、または「定量的」ＲＴ−ＰＣＲを用いて検出されることが可能である。
【００７５】
本発明に従った植物は、原理上、いずれかの所望の植物種の植物、すなわち、単子葉植物および双子葉植物の両者であり得る。好ましくは、前記植物は、有用な植物、すなわち、栄養の目的または技術的な目的のために、特に産業目的のために、ヒトによって栽培される植物である。
【００７６】
さらなる実施態様において、本発明に従った植物は、デンプン貯蔵植物である。
【００７７】
本発明と関連して、「デンプン貯蔵植物」という用語は、例えば、トウモロコシ、コメ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、マニオク、ジャガイモ、サゴ、タロイモ、リョクトウ、エンドウマメ、ソルガム、サツマイモ等の貯蔵デンプンを含有する植物の部分を有するすべての植物を意味する。
【００７８】
好ましい実施態様において、本発明は、本発明に従ったデンプン貯蔵単子葉植物、特に好ましくは、（系統的な）イネ科の植物に関する。特に好ましくは、これらは、コメ、トウモロコシまたはコムギの植物である。
【００７９】
本発明と関連して、「コムギ植物」という用語は、コムギ属の植物種またはコムギ属の植物との交雑から作出される植物、特に農業において市販目的のために栽培されるコムギ属の植物種、またはコムギ属の植物との交雑から作出される植物を意味するものであり、特に、コムギ（Triticum aestivum）が好ましい。
【００８０】
本発明と関連して、「トウモロコシ植物」という用語は、トウモロコシ属の植物種、特に農業において市販目的のために栽培されるトウモロコシ属の植物種、特に好ましくはトウモロコシ（Zea mais）を意味する。
【００８１】
本発明と関連して、「コメ植物」という用語は、イネ属の植物種、特に農業において市販目的のために栽培されるイネ属の植物種、特に好ましくはイネ（Oryza sativa）を意味する。
【００８２】
さらなる実施態様において、本発明に従った植物細胞および本発明に従った植物は、トランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物である。
【００８３】
本発明に従った植物細胞および本発明に従った植物は、遺伝的に改変されていない野生型植物細胞または野生型植物から単離されたデンプンと比較して、改変されたデンプンを合成する。
【００８４】
したがって、本発明のさらなる対象は、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物細胞から単離された、または遺伝的に改変されていない対応する野生型植物から単離されたデンプンと比較して、改変されたデンプンを合成する本発明に従った植物細胞または本発明に従った植物に関する。
【００８５】
本発明はさらに、本発明に従った植物細胞を含有する遺伝的に改変された植物に関する。このような植物は、本発明に従った植物細胞から、再生によって作出されることが可能である。
【００８６】
本発明は、本発明に従った植物細胞を含む、本発明に従った植物の繁殖材料にも関する。
【００８７】
本発明において、「繁殖材料」という用語は、無性的または有性的な様式で子孫の作出に適した植物のいずれかの構成体を含む。無性繁殖に関しては、例えば、切断、カルス培養、根茎または塊茎が適している。他の繁殖材料は、例えば、果実、種子、実生、原形質体、細胞培養等を含む。特に好ましくは、繁殖材料は、胚乳含有種子（子実）である。
【００８８】
さらなる実施態様において、本発明は、果実、貯蔵根、根、花、蕾、苗条または茎、好ましくは種子、顆粒または塊茎等の本発明に従った植物の収穫可能な植物部分に関するものであり、これらの収穫可能な部分は、本発明に従った植物細胞を含有する。
【００８９】
本発明に従った植物細胞からまたは本発明に従った植物から合成されるデンプンは、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物細胞から単離されるデンプンと比較して、または遺伝的に改変されていない対応する野生型植物から単離されるデンプンと比較して区別され、特に、増大した熱湯膨潤力を有する点で区別される。
【００９０】
さらに、本発明は、遺伝的に改変された植物の作出のための方法にも関するものであり、
ａ）植物細胞が、遺伝的に改変され、遺伝的改変が、以下の工程iおよびiiをいずれかの望ましい順序で個々にまたは同時に含み、
i）遺伝的に改変されていない対応する野生型の植物細胞と比較して、デンプン合成酵素ＩＩの酵素活性を有するタンパク質の活性の増大に至る遺伝的改変の植物細胞中への導入、
ii）遺伝的に改変されていない対応する野生型の植物細胞と比較して、グルカン−水ジキナーゼの酵素活性を有するタンパク質の活性の増大に至る遺伝的改変の植物細胞中への導入、
ｂ）植物が、工程ａ）の植物細胞から再生され；
ｃ）場合により、工程ｂ）に従った植物を用いてさらなる植物が作出され、
ここで、植物細胞は場合により、工程ｂ）またはｃ）に従った植物から単離され、方法の工程ａ）〜ｃ）が、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子と、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子とを含有する植物が作出されるまで、反復される。
【００９１】
好ましい実施態様において、遺伝的に改変された植物の調製のための本発明に従った方法は、以下の工程を含む：
ａ）植物細胞が、遺伝的に改変され、遺伝的改変は、個々にまたは同時に実施されている以下の工程iおよびiiのいずれかの所望の順序またはいずれかの所望の組み合わせにおいて、以下の工程iおよびiiを含む
i）遺伝的に改変されていない対応する野生型の植物細胞と比較して、デンプン合成酵素ＩＩの酵素活性を有するタンパク質の活性の増大に至る遺伝的改変の植物細胞中への導入、
ii）遺伝的に改変されていない対応する野生型の植物細胞と比較して、グルカン−水ジキナーゼの酵素活性を有するタンパク質の活性の増大に至る遺伝的改変の植物細胞中への導入、
ｂ）植物が、工程
i）  ａ）i
ii）  ａ）ii
iii）  ａ）iおよびａ）ii
に従った遺伝的改変を含む植物細胞から再生され、
ｃ）工程に従った植物の植物細胞において、
i）  工程ａ）iiに従った遺伝的改変ｂ）i、
ii）  工程ａ）iに従った遺伝的改変ｂ）ii
が導入され、および植物が再生され、
ｄ）場合により、さらなる植物が、工程ｂ）iiiまたはｃ）iまたはｃ）iiの１つに従って得られる植物を用いて作出される。
【００９２】
植物細胞中へ導入される遺伝的改変が、原理上、デンプン合成酵素IIの酵素活性を有するタンパク質の活性の増大に至るおよび／またはグルカン−水ジキナーゼの酵素活性を有するタンパク質の活性の増大に至る改変のいずれかの種類である工程ａ）に従って、植物細胞中へ導入される遺伝的改変が求められる。
【００９３】
本発明に従った方法の工程ｂ）および場合により工程ｃ）に従った植物の再生は、当業者に公知の方法に従って実施されることが可能である（例えば、"Plant Cell Culture Protocols", 1999, edt. by R. D. Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2に記載）。
【００９４】
本発明に従った方法の（工程ｃ）または工程ｄ）に従った方法に応じた）さらなる植物の作出は、例えば、（例えば、実生、塊茎によるまたはカルス培養および植物全体の再生による）無性繁殖によって、または有性繁殖によって実施されることが可能である。有性繁殖は好ましくは、本発明において、調節された様式で生じ、すなわち、特定の特性を有する選択された植物が、互いに交雑され、繁殖する。選択は好ましくは、（工程ｃ）または工程ｄ）に従った方法に従って作出される）さらなる植物は、上述の工程において導入される改変を含む。
【００９５】
遺伝的に改変された植物の作出のための本発明に従った方法において、本発明にしたがって遺伝的に改変された植物細胞の作出のための遺伝的改変は、同時に又は互いに追随する工程において実施されることが可能である。本発明において、デンプン合成酵素IIの酵素活性を有するタンパク質の増大した活性に至る成功した遺伝的改変に関して、グルカン−水ジキナーゼの酵素活性を有するタンパク質の増大した活性に至る遺伝的改変に関するものと同一の方法が使用されるかどうかは重要ではない。
【００９６】
遺伝的に改変された植物の作出のための本発明に従った方法の好ましい実施態様において、方法の工程ｂ）−１は、植物が、工程ａ）iに従ったデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性を有する、および／または工程ａ）iiに従ったグルカン水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を有する植物が選択される工程ｂ）に追随する。選択された植物は次に、さらなる方法の工程のために使用される。
【００９７】
好ましくは、本発明において、工程ａ）iに従った遺伝的改変を含有し、対応する遺伝的に改変されていない野生型植物と比較して、少なくとも６倍、好ましくは少なくとも７倍、特に好ましくは少なくとも８倍、特に好ましくは少なくとも９倍および非常に特に好ましくは少なくとも１０倍増大するデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性の増大を有する植物が選択される。
【００９８】
好ましくは、本発明において、工程ａ）iiに従った遺伝的改変を含有し、遺伝的に改変されていない野生型植物と比較して、少なくとも４倍、特に好ましくは少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも６倍増大するデンプンリン酸エステル含有量を有するデンプンを合成する植物が選択される。
【００９９】
遺伝的に改変された植物の作出のための本発明に従った方法のさらなる実施態様において、遺伝的改変は、植物細胞のゲノムへの少なくとも１つの外来核酸分子の導入からなり、外来核酸分子／核酸分子の存在または発現は、デンプン合成酵素IIの酵素活性を有するタンパク質の増大した活性および／または細胞中でのグルカン−水ジキナーゼの酵素活性を有するタンパク質の増大した活性に至る。
【０１００】
遺伝的に改変された植物の作出のための本発明に従った方法のさらなる実施態様において、遺伝的改変は、植物細胞のゲノム中への少なくとも１つの外来核酸分子の導入からなり、外来核酸分子／核酸分子は、デンプン合成酵素IIの酵素活性を有するタンパク質および／またはグルカン−水ジキナーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする配列を含む。
【０１０１】
本発明に従った遺伝的に改変された植物の作出のための本発明に従った方法のさらなる実施態様において、少なくとも１つの外来核酸分子は、ジャガイモ、コムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、柑橘類、ウコンまたはシロイヌナズナ由来のグルカン−水ジキナーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする。好ましくは、少なくとも１つの外来核酸分子は、ウコンまたはジャガイモ由来の、特に好ましくはジャガイモ由来のグルカン−水ジキナーゼの酵素活性を有するタンパク質、特に好ましくは、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有しまたは配列番号５で示される核酸配列によってコードされるタンパク質をコードする。上述の植物由来の核酸配列をコードし、グルカン−水ジキナーゼの酵素活性を有するタンパク質に関する参照は、既に上述にさらに記載される。
【０１０２】
本発明に従った遺伝的に改変された植物の作出のための本発明に従った方法のさらなる実施態様において、少なくとも１つの外来核酸分子は、オオムギ、エギロプス（Aegilops）、コメ、トウモロコシ、マニオク、マメ、ジャガイモ、エンドウマメ、サツマイモ、シロイヌナズナ、タロイモ、オストレオコッカスまたはクラミドモナス由来のデンプン合成酵素IIの酵素活性を有するタンパク質をコードする。好ましくは、少なくとも１つの外来核酸分子は、コムギ由来のデンプン合成酵素IIの酵素活性を有するタンパク質をコードする。上述の植物由来のデンプン合成酵素IIの酵素活性を有する上述の核酸配列をコードするタンパク質に関する参照は、既に上述にさらに記載される。
【０１０３】
遺伝的改変のために植物細胞または植物中に組み込まれる外来核酸分子に関して既に上述のように、遺伝的に改変された植物の作出のための本発明に従った方法の工程ａ）は、個々の核酸分子または多くの核酸分子を包含し得る。したがって、デンプン合成酵素IIの酵素活性を有するタンパク質をコードしまたはグルカン−水ジキナーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、一緒に単一の核酸分子に存在し得るか、又は別個の核酸分子に存在し得る。デンプン合成酵素IIの酵素活性を有するタンパク質をコードしおよびグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が、別個の核酸分子に存在する場合、これらの核酸分子は、同時にまたは連続した工程において植物細胞中へと導入されることが可能である。
【０１０４】
さらに、本発明に従った方法の実施の間の外来核酸分子の導入に関して、野生型植物細胞または野生型植物の代わりに、デンプン合成酵素IIの酵素活性を有するタンパク質の増大した活性またはグルカン−水ジキナーゼの酵素活性を有するタンパク質の増大した活性を既に有する点で区別される変異体細胞または変異体が使用されることが可能である。本発明に従った植物細胞または植物の作出のための変異体の使用に関するさらに上述の記述は、本発明において対応して使用されるべきである。
【０１０５】
好ましい実施態様において、本発明は、遺伝的に改変された植物の作出のための本発明に従った方法に関するものであり、デンプン合成酵素IIの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子は、
ａ）配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）アミノ酸配列が、配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、優先的には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは少なくとも９８％を有するデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ）配列番号５で示される核酸配列または相補的な配列を含む核酸分子；
ｄ）ｃ）で記載される核酸配列と少なくとも７０％、優先的には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する核酸分子；
ｅ）ａ）またはｃ）で記載される核酸分子の少なくとも１本の鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；
ｆ）遺伝暗号の縮重の理由で、ヌクレオチド配列が、ａ）またはｃ）で記載される核酸分子の配列とは異なる核酸分子；
ｇ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）で記載される核酸分子の断片、対立遺伝子多型および／または誘導体である核酸分子；
ｈ）植物細胞において転写を開始する調節エレメント（プロモーター）へ、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列が連結される、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子または
ｉ）プロモーターが、組織特異的プロモーター、特に好ましくは、特に植物胚乳細胞における転写を開始するプロモーターである、ｈ）に従った核酸分子
からなる群より選択される。
【０１０６】
さらに好ましい実施態様において、本発明は、遺伝的に改変された植物の作出のための本発明に従った方法に関するものであり、グルカン−水ジキナーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子は、
ａ）配列番号２または配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）グルカン−水ジキナーゼの活性を有し、配列が、配列番号２または配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、優先的には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ）配列番号１または配列番号３で示される核酸配列または相補的な配列を含む核酸分子；
ｄ）ｃ）で記載される核酸配列と少なくとも７０％、優先的には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する核酸分子；
ｅ）ａ）またはｃ）で記載される核酸分子の少なくとも１本の鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；
ｆ）遺伝暗号の縮重の理由で、ヌクレオチド配列が、ａ）またはｃ）で記載される核酸分子の配列とは異なる核酸分子；
ｇ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）で記載される核酸分子の断片、対立遺伝子多型および／または誘導体である核酸分子；
ｈ）植物細胞において転写を開始する調節エレメント（プロモーター）へ、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列が連結される、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子または
ｉ）プロモーターが、組織特異的プロモーター、特に好ましくは、特に植物胚乳細胞における転写を開始するプロモーターである、ｈ）に従った核酸分子
からなる群より選択される。
【０１０７】
「同一性」という用語は、本発明と関連して、他のタンパク質／核酸と同一のアミノ酸／ヌクレオチド（同一性）の数を意味するもの、％で表現されるものとして理解されるべきである。好ましくは、コンピュータプログラムを利用して、他のタンパク質／核酸に対して、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号６で示されるアミノ酸配列の比較によって決定され、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号５で示される核酸配列の比較によって決定され、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号２または配列番号４で示されるアミノ酸配列の比較によって決定され、またはグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号１または配列番号３で示される核酸配列の比較によって決定される。互いに比較されている配列が、異なる長さを有する場合、同一性は、より短い配列がより長い配列と同様に有するアミノ酸／ヌクレオチドの数が、同一性の％比を決定するよう決定されるべきである。好ましくは、同一性は、公知であり公共に利用可能であるコンピュータプログラムClustalWによって決定される（Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680）。ClustalWは、Julie Thompson（Thompson@EMBL.Heidelberg.DE）およびToby Gibson（Gibson@EMBL.Heidelberg.DE）、European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Germanyによって公共に利用可能にされている。ClustalWは、同様に多様なインターネットサイト、とりわけIGBMC（Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, B. P. 163, 67404 Illkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/）およびEBI（ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/）およびEBIのすべてのインターネットミラーサイト（European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 10 1SD, UK）でダウンロードされることが可能である。
【０１０８】
好ましくは、バージョン1.8のClustalWコンピュータプログラムは、本発明の脈絡で記載されたタンパク質と、他のタンパク質との同一性を決定するために使用される。以下のパラメータが、本発明において設定されるべきである：KTUPLE=1、TOPDIAG=5、WINDOW=5、PAIRGAP=3、GAPOPEN=10、GAPEXTEND=0.05、GAPDIST=8、MAXDIV=40、MATRIX=GONNET、ENDGAPS(OFF)、NOPGAP、NOHGAP。
【０１０９】
好ましくは、バージョン1.8のClustalWコンピュータプログラムは、例えば、本発明の脈絡において記載される核酸分子のヌクレオチド配列と、他の核酸分子のヌクレオチド配列との間の同一性を決定するために使用される。以下のパラメータが、本発明において設定されるべきである：KTUPLE=2、TOPDIAGS=4、PAIRGAP=5、DNAMATRIX:IUB、GAPOPEN=10、GAPEXT=5、MAXDIV=40、TRANSITIONS：非加重（nnweight）。
【０１１０】
同一性はさらに、問題の核酸分子と前記核酸分子によってコードされるタンパク質との間に機能的および／または構造的同等性が存在することを意味する。上述の分子に相同的であり、これらの分子の誘導体である核酸分子は通常、同一の生物学的機能を発揮する改変であるこれらの分子のバリエーションである。前記核酸分子は、本発明において、天然に生じるバリエーションであり、例えば他の種の配列であり、または変異が天然に生じ得、もしくは選択的変異誘発によって導入されることが可能であるこれらの変異であるいずれかであり得る。さらに、バリエーションは、合成的に調製された配列であり得る。対立遺伝子多型の場合、前記バリエーションは、天然に生じる変異形と、合成的に調製されもしくは組換えＤＮＡ技術によって作製される変異形との両者であり得る。誘導体の特別な形態は、例えば、遺伝暗号の縮重の理由で本発明の脈絡において記載される核酸分子とは異なる核酸分子である。
【０１１１】
本発明の脈絡において「ハイブリダイゼーション」という用語は、従来のハイブリダイゼーション条件下での、優先的にはSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYにおいて記載されるストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを意味する。特に好ましくは、「ハイブリダイズすること」とは、以下の条件下でのハイブリダイゼーションを意味する：
ハイブリダイゼーション緩衝液：
２×ＳＳＣ；１０×Denhardt溶液（Ficoll 400+PEG+BSA；比１：１：１）；０．１％ＳＤＳ；５mM ＥＤＴＡ；５０mM Ｎａ２ＨＰＯ４；ニシン精子ＤＮＡ２５０μg/mL；ｔＲＮＡ５０μg/mL；または２５Mリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２；１mM ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳ
ハイブリダイゼーション温度：
Ｔ＝６５〜６８℃
洗浄緩衝液：０．１×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ
洗浄温度：Ｔ＝６５〜６８℃
【０１１２】
記載される分子とハイブリダイズする核酸分子は、例えば、ゲノムライブラリからまたはｃＤＮＡライブラリから単離されることが可能である。このような核酸分子の同定および単離は、本発明において、記載される核酸分子またはこれらの分子の部分またはこれらの分子の逆性相補体を使用して、例えば、標準的な方法に従ったハイブリダイゼーションによってまたはＰＣＲによる増幅によって実施されることが可能である。
【０１１３】
デンプン合成酵素IIの活性を有しまたはグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の単離のためのハイブリダイゼーションプローブとして、例えば、配列番号５（デンプン合成酵素II）でまたは配列番号１もしくは配列番号３（グルカン−水ジキナーゼ）またはこれらの配列の部分で示されるヌクレオチド配列を実際に含有しまたは本質的に含有する核酸分子を使用することが可能である。ハイブリダイゼーションプローブとして使用される断片は、通例の合成技術を用いて作製され、および本発明の脈絡において記載される核酸分子のものと配列が本質的に一致する合成断片またはオリゴヌクレオチドであり得る。本発明の脈絡において記載される核酸分子とハイブリダイズする遺伝子が同定および単離された場合、この配列によってコードされるタンパク質の配列の決定および特性の分析は、前記遺伝子が、デンプン合成酵素IIの活性またはグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質であるかどうかを決定するために、実施されるべきである。
【０１１４】
本発明の脈絡において記載される核酸分子とハイブリダイズする分子は特に、断片、誘導体および対立遺伝子多型を含む。本発明と関連して「誘導体」という用語は、これらの分子の配列が、１つ以上の位置で上述の核酸分子の配列とは異なり、およびこれらの配列との同一性の高い程度を有することを意味する。本発明において、上述の核酸分子に対する差異は、例えば欠失、付加、置換、挿入または組換えによる結果、生じ得る。
【０１１５】
デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質および／またはグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする本発明に従った核酸分子の発現のために、前記核酸分子は好ましくは、植物細胞における転写を保証する調節ＤＮＡ配列へ連結される。これらは、特にプロモーターを含む。一般的に、植物細胞中で活性のあるいずれかのプロモーターが、発現に適している。
【０１１６】
本発明において、プロモーターは、発現が、構成的に、または特定の組織中でのみ、植物の発達における特定の時間で、または外部の影響によって決定される時間で生じるよう選択されることが可能である。植物に関してプロモーターは、同種または異種であり、核酸分子に関してプロモーターは、相同的または非相同的であり得る。
【０１１７】
適切なプロモーターは、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ  ＲＮＡのプロモーターおよびトウモロコシ由来のユビキチンプロモーター、コメ由来のアクチン１遺伝子のプロモーター（McElroy et al., 1990, Plant Cell 2(2), 163-171）、構成的発現のためのトウモロコシ由来のヒストンプロモーター（WO 99 34005）、ジャガイモにおける塊茎特異的発現のためのパタティンゲン（Patatingen）プロモーターＢ３３（Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29）または光合成的に活性のある組織においてのみ発現を確実にするプロモーター、例えばＳＴ−ＬＳ１プロモーター（Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947、Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-2451）または胚乳特異的発現のためのコムギ由来のHMGプロモーター、ＵＳＰプロモーター、ファゼオリンプロモーター、トウモロコシ由来のゼイン遺伝子のプロモーター（Pedersen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026、Quatroccio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93）、グルテリンプロモーター（Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50、Zheng et al., Plant J. 4 (1993), 357-366、Yoshihara et al., FEBS Lett. 383 (1996), 213-218）、グロブリンプロモーター（Nakase et al., 1996, Gene 170(2), 223-226）、プロラミンプロモーター（Qu and Takaiwa, 2004, Plant Biotechnology Journal 2(2), 113-125）またはシュルンケン１プロモーター（Werr et al., EMBO J. 4 (1985), 1373-1380）である。しかしながら、外部の影響によって決定される時間でのみ活性化されるプロモーターも使用されることが可能である（例えば、ＷＯ９３０７２７９参照）。単純な誘導が可能である熱ショックタンパク質のプロモーターも関心対象であり得る。さらに、種子特異的プロモーター、例えば、ソラマメおよび他の植物における種子特異的発現を保証するソラマメ由来のUSPプロモーター等も使用されることが可能である（Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679、Baumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467）。
【０１１８】
さらに、転写産物へのポリＡテイルの付加のために機能する終止配列（ポリアデニル化シグナル）が存在し得る。ポリＡテイルは、転写産物の安定化に機能する。このようなエレメントは、文献（Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29参照）中に記載されており、適宜置換可能である。
【０１１９】
プロモーターとコード領域との間のイントロン配列も存在し得る。この種のイントロン配列は、植物における発現の安定性および増大した発現を導く（Callis et al., 1987 Genes Devel. 1, 1183-1200、Luehrsen and Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet. 225, 81-93、Rethmeier et al., 1997; Plant Journal. 12(4): 895-899、Rose and Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542、Vasil et al., 1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579、Xu et al., 2003, Science in China Series C Vol. 46 No. 6, 561-569）。適切なイントロン配列は、例えば、トウモロコシ由来のｓｈ１遺伝子の第一のイントロン、トウモロコシ由来のポリユビキチン遺伝子１の第一のイントロン、コメ由来のEPSPS遺伝子の第一のイントロン、コメ由来のアクチン１遺伝子の第一のイントロン（McElroy et al., 1990, Plant Cell 2(2), 163-171）またはシロイヌナズナ由来のＰＡＴ１遺伝子の２つの第一のイントロンの１つである。
【０１２０】
本発明のさらなる実施態様は、本発明に従った遺伝的に改変された植物の作出のための方法に関するものであり、
ａ）植物細胞は、遺伝的に改変され、遺伝的改変は、遺伝的に改変されていない対応する野生型の植物細胞と比較して、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性の増大を導き；
ｂ）植物が、工程ａ）の植物細胞から再生され；
ｃ）場合により、工程ｂ）に従った植物を用いてさらなる植物が作出されおよび
ｄ）工程ｂ）またはｃ）に従って得られた植物が、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物細胞と比較して、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の活性の増大を有する植物と交雑される。
【０１２１】
本発明のさらなる実施態様は、本発明に従った遺伝的に改変された植物の作出のための方法に関するものであり、
ａ）植物細胞は、遺伝的に改変され、遺伝的改変は、遺伝的に改変されていない対応する野生型の植物細胞と比較して、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の酵素活性の増大を導き；
ｂ）植物が、工程ａ）の植物細胞から再生され；
ｃ）場合により、工程ｂ）に従った植物を用いてさらなる植物が作出されおよび
ｄ）工程ｂ）またはｃ）に従って得られた植物が、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物細胞と比較して、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の酵素活性の増大を有する植物と交雑される。
【０１２２】
遺伝的に改変された植物の作出のための最後に記載された２つの方法において、工程ａ）は、既に上述のように遺伝的に改変されることが可能である。工程ｂ）に従った植物の再生および工程ｃ）に従ったさらなる植物の作出は同様に、さらに上述に既に示された。
【０１２３】
最後に記載された２つの実施態様の工程ｄ）に従って、工程ｂ）またはｃ）から得られた植物または植物の子孫と交雑する植物は、対応する野生型植物と比較して、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性またはグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を有するいずれかの植物であり得る。本発明において、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質のまたはグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の活性の増大は、対応する植物における問題のタンパク質の活性の増大に至るいずれかの改変によって生じることが可能である。これらの植物は、遺伝子工学方法によって改変された変異体または植物であり得る。変異体は、自発的に（天然に）発生する変異体と、突然変異原の選択的使用（例えば、化学薬品、電離放射線など）または遺伝子工学方法（例えば、トランスポゾン活性化タグ付け、Ｔ−ＤＮＡ活性化タグ付け、インビボ変異誘発）によって作出された変異体との両者であり得る。好ましくは、遺伝子工学方法によって作出された植物は、挿入変異誘発によって作製された変異体、特に好ましくは、外来核酸分子を発現する遺伝的に改変された植物、特に好ましくは、外来核酸分子が、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質またはグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする遺伝的に改変された植物である。
【０１２４】
好ましくは、本発明に従った最後に記載された２つの方法における交雑のために、対応する遺伝的に改変されていない野生型植物と比較して、少なくとも６倍、好ましくは少なくとも７倍、特に好ましくは少なくとも８倍、特に好ましくは少なくとも９倍および非常に特に好ましくは少なくとも１０倍ほど増大するデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性を有する植物が使用される。
【０１２５】
グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を有する植物に関して、本発明に従った最後に記載された２つの方法における交雑のために、対応する遺伝的に改変されていない野生型植物と比較して少なくとも４倍、特に好ましくは少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも６倍増大するデンプンリン酸エステル含有量を有するデンプンを合成する植物が好ましくは使用される。
【０１２６】
好ましい実施態様において、遺伝的に改変された植物の作出のための本発明に従った方法は、本発明に従った植物のまたは本発明に従った植物の特性を有する植物の作出のために使用される。
【０１２７】
本発明は、本発明に従った方法によって得られることのできる植物にも関する。
【０１２８】
デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性およびグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を有する、本発明に従った植物細胞および本発明に従った植物が、改変されたデンプンを合成することが驚くべきことに発見された。特に、本発明に従った植物細胞または本発明に従った植物によって合成されるデンプンが、増大した熱湯膨潤力を有するという事実は驚くべきことであった。本発明に従った植物細胞および本発明に従った植物から単離可能なデンプンの増大した熱湯膨潤力は、特定の適用について従来のデンプンよりも良好に適する特性をデンプンに付与する。デンプンが、例えば増粘剤として採用される場合、デンプンの増大した熱湯膨潤力は、同一の増粘力に到達するために使用されなければならないデンプンのはっきりとした減少を導く。このことは、例えば、デンプンで増粘された食物のカロリー含有量が低下する結果を有する。
【０１２９】
本発明のさらなる対象は、増大した熱湯膨潤力を有する改変されたデンプンに関する。特に好ましくは、本発明に従った改変されたデンプンの熱湯膨潤力は、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物細胞から単離されたまたは遺伝的に改変されていない対応する野生型植物から単離されたデンプンと比較して、少なくとも係数２ほど、特に少なくとも係数３ほどおよび非常に特に好ましくは少なくとも係数４ほど増大する。
【０１３０】
熱湯膨潤力の測定のための方法は、当業者に公知であり、文献（例えば、Leach et al., 1959, Cereal Chemistry 36, 534-544）中に記載される。好ましくは本発明と関連して、熱湯膨潤力の測定のために使用される方法は、一般的な方法の第１項に記載される。
【０１３１】
好ましくは、本発明は、少なくとも１１０g/g、好ましくは少なくとも１１５g/g、特に好ましくは少なくとも１２０g/gおよび特に好ましくは少なくとも１２５g/gの熱湯膨潤力を有する改変されたデンプンに関する。好ましくは、改変されたデンプンは、せいぜい３５０g/g、特に好ましくはせいぜい３００g/g、特に好ましくはせいぜい２５０g/gおよび特に好ましくはせいぜい２００g/gの熱湯膨潤力を有する。
【０１３２】
本発明のさらなる対象は、単子葉植物細胞からまたは単子葉植物から単離される改変されたデンプンに関するものであり、少なくとも６０g/g、好ましくは少なくとも７５g/g、特に好ましくは少なくとも９０g/g、特に好ましくは少なくとも１０５g/gおよび特に好ましくは少なくとも１２０g/gの熱湯膨潤力を有する。好ましくは、単子葉植物細胞または単子葉植物から単離される改変されたデンプンは、せいぜい２５０g/g、特に好ましくはせいぜい２００g/g、特に好ましくはせいぜい１７５g/gおよび特に好ましくはせいぜい１５０g/gの熱湯膨潤力を有する。
【０１３３】
本発明のさらなる対象は、コメ植物細胞またはコメ植物から単離される改変されたデンプンに関するものであり、少なくとも６５g/g、好ましくは少なくとも８０g/g、特に好ましくは少なくとも１００g/g、特に好ましくは少なくとも１１５g/gおよび特に好ましくは少なくとも１２５g/gの熱湯膨潤力を有する。好ましくは、コメ植物細胞またはコメ植物から単離される改変されたデンプンは、せいぜい２５０g/g、特に好ましくはせいぜい２００g/g、特に好ましくはせいぜい１７５g/gおよび特に好ましくはせいぜい１５０g/gの熱湯膨潤力を有する。
【０１３４】
本発明のさらなる好ましい対象は、トウモロコシ植物細胞またはトウモロコシ植物から単離される改変されたデンプンに関するものであり、少なくとも４０g/g、好ましくは少なくとも４２g/g、より好ましくは少なくとも４５g/gおよび最も好ましくは少なくとも５５g/gの熱湯膨潤力を有する。
【０１３５】
本発明のさらに好ましい対象は、コムギ植物細胞またはコムギ植物から単離される改変されたデンプンに関するものであり、少なくとも３５g/g、好ましくは少なくとも５０g/gの熱湯膨潤力を有する。
【０１３６】
本発明に従った遺伝的に改変された植物細胞または本発明に従った遺伝的に改変された植物から合成されるデンプンは好ましくは、増大したデンプンリン酸エステル含有量を有する。本発明に従った植物細胞または本発明に従った植物から単離されるデンプンのデンプンリン酸エステル含有量は、本発明において、問題の親植物のリン酸含有量の合計から、交雑後に期待されるであろうデンプンリン酸エステル含有量よりもはっきりと高い。
【０１３７】
したがって、本発明の好ましい対象は、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物細胞または遺伝的に改変されていない対応する野生型植物から単離されるデンプンと比較して、増大したデンプンリン酸エステル含有量を有する本発明に従った改変されたデンプンに関する。好ましくは、本発明に従ったデンプンのデンプンリン酸エステル含有量は、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物細胞から単離されたまたは遺伝的に改変されていない対応する野生型植物から単離されたデンプンと比較して、少なくとも１０倍、特に好ましくは少なくとも１５倍、特に好ましくは少なくとも２０倍および非常に特に好ましくは少なくとも２５倍増大する。
【０１３８】
好ましくは、本発明に従った改変されたデンプンは、対応する野生型植物細胞から単離されたまたは対応する野生型植物から単離されたデンプンよりもデンプンのグルコース分子のＣ６位において少なくとも１０倍以上、特に好ましくは少なくとも１５倍以上、特に好ましくは少なくとも２０倍以上および非常に特に好ましくは少なくとも２５倍以上のデンプンリン酸エステルを有する。
【０１３９】
グルコース分子のＣ６位において結合したデンプンリン酸エステルの量は、例えば、結合した酵素的検査による分光法で、またはKasemusuwan and Jane（1996, Cereal Chemistry 73, 702-707）において記載される方法に従った３１Ｐ−ＮＭＲによってなど、当業者に公知の方法を使用して測定されることが可能である。好ましくは、本発明と関連して、グルコース分子のＣ６位において結合したデンプンリン酸エステルの量は、一般的な方法の第２項に記載される方法を使用して測定される。
【０１４０】
本発明のさらに好ましい対象は、本発明に従って改変されたデンプンに関するものであり、単子葉植物細胞からまたは単子葉植物から単離され、デンプン１mgあたり少なくとも１１nmolの、特に好ましくはデンプン１mgあたり少なくとも１２nmolの、デンプンのグルコース分子のＣ６位において結合したデンプンリン酸エステル含有量を有する。特に、本発明に従ったこの改変されたデンプンは、好ましくはトウモロコシ、コメまたはコムギのデンプンである。
【０１４１】
本発明のさらなる実施態様において、本発明に従って改変されたデンプンは、未変性デンプンである。
【０１４２】
本発明と関連して、「未変性デンプン」という用語は、デンプンが、本発明に従った植物、本発明に従った収穫可能な植物の部分、本発明に従ったデンプン保存部分または本発明に従った植物の繁殖材料から、当業者に公知の方法に従って単離されることを意味する。
【０１４３】
本発明は、本発明に従った植物細胞または本発明に従った植物から、本発明に従った繁殖材料からまたは本発明に従った収穫可能な植物の部分から得られることの可能な、または遺伝的に改変された植物の作出のために本発明に従った方法を使用して作出された植物から得られることの可能な本発明に従った改変されたデンプンにも関する。
【０１４４】
本発明は、本発明に従った改変されたデンプンを合成する植物細胞または植物にも関する。
【０１４５】
本発明はさらに、本発明に従った植物細胞または本発明に従った植物から、このタイプの植物の本発明に従った繁殖材料からおよび／または本発明に従ったこのような植物の収穫可能な植物の部分から、好ましくは本発明に従ったこのような植物のデンプン貯蔵部分からデンプンを抽出する工程を含む、改変されたデンプンの製造のための方法に関する。好ましくは、このタイプの方法は、デンプンの抽出前に栽培された植物または植物の部分のおよび／またはこれらの植物の繁殖材料の収穫の工程も含み、特に好ましくは、収穫前に本発明に従った植物の栽培の工程をさらに含む。
【０１４６】
植物からのまたは植物のデンプン貯蔵部分からのデンプンの抽出のための方法は、当業者に公知である。さらに、多様なデンプン貯蔵植物からデンプンを抽出するための方法が、例えば、Starch: Chemistry and Technology（ed.: Whistler, BeMiller and Paschall (1994), 2nd edition, Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; 例えば、chapter XII, page 412-468: Corn and Sorghum Starches: Production; by Watson; chapter XIII, page 469-479: Tapioca, Arrowroot and Sago Starches: Production; by Corbishley and Miller; chapter XIV, page 479-490; Potato Starch: Production and Uses; by Mitch; chapter XV, page 491 to 506; Wheat Starch: Production, Modification and Uses; by Knight and Oson; and chapter XVI, page 507 to 528: Rice Starch: Production and Uses; by Rohmer and Klem; Corn Starch: Eckhoff et al., Cereal Chem. 73 (1996), 54-57参照。産業規模のトウモロコシデンプンの抽出は、「湿式粉砕」によって通常達成される）に記載されている。植物材料からデンプンを抽出するための方法において通常使用される装置は、分離装置、デカンター、ハイドロサイクロン、スプレー乾燥機、流動層乾燥機である。
【０１４７】
「デンプン貯蔵部分」という用語は、本発明と関連して、デンプンが、一過性の葉のデンプンとは異なり、より長期の多年生育のための貯蔵所として貯蔵される植物のデンプン貯蔵部分を意味するものとして理解されるべきである。好ましいデンプン貯蔵植物部分は例えば、塊茎、貯蔵根および子実であり、胚乳を含む子実は、特に好ましく、トウモロコシ、コメまたはコムギの植物由来の胚乳を含む子実は、特に好ましい。
【０１４８】
好ましい実施態様において、改変されたデンプンの製造のための本発明に従った方法は、本発明に従ったデンプンの製造のために使用される。
【０１４９】
同様に、本発明は、改変されたデンプンの製造のための本発明に従った方法によって得られることの可能な改変されたデンプンに関する。
【０１５０】
本発明はさらに、改変されたデンプンの製造のための本発明に従った植物細胞または本発明に従った植物の使用に関する。
【０１５１】
デンプンの特性が、例えば温熱性の、化学的、酵素的または機械的誘導体化によって変化することが可能であることは、当業者に公知である。誘導体化されたデンプンは、食品および／または非食品領域における多様な応用に特に適している。本発明に従ったデンプンは、例えばデンプンリン酸エステルのより高い含有量により、反応性機能基のより高い含有量を有するので、誘導体化されたデンプンの製造のための出発物質として、従来のデンプンよりも良好に適している。さらに、誘導体化は、本発明に従ったデンプンの増大した熱湯膨潤力の理由で、この最中にデンプン顆粒構造を有意に破壊することなく、より高温で実施されることが可能である。
【０１５２】
したがって、本発明は、本発明に従った改変されたデンプンが、その後誘導体化される、誘導体化されたデンプンの製造のための方法にも関する。
【０１５３】
「誘導体化されたデンプン」という用語は、本発明と関連して、植物細胞からの単離後の特性が、化学的、酵素的、温熱性のまたは機械的方法を用いて変化した、本発明に従った改変されたデンプンを意味するものとして理解されるべきである。
【０１５４】
本発明のさらなる実施態様において、本発明に従った誘導体化されたデンプンとは、熱および／または酸で処理されたデンプンである。
【０１５５】
さらなる実施態様において、誘導体化されたデンプンとは、デンプンエーテルであり、特にデンプンアルキルエーテル、Ｏ−アリルエーテル、ヒドロキシアルキルエーテル、Ｏ−カルボキシメチルエーテル、窒素含有デンプンエーテル、リン酸含有デンプンエーテルまたは硫黄含有デンプンエーテルである。
【０１５６】
さらなる実施態様において、誘導体化されたデンプンとは、架橋されたデンプンである。
【０１５７】
さらなる実施態様において、誘導体化されたデンプンとは、デンプングラフトポリマーである。
【０１５８】
さらなる実施態様において、誘導体化されたデンプンとは、酸化されたデンプンである。
【０１５９】
さらなる実施態様において、誘導体化されたデンプンとは、デンプンエステルであり、特に、有機酸を使用してデンプンへと導入されたデンプンエステルである。誘導体化されたデンプンとは、特に好ましくは「リン酸エステル」、「硝酸エステル」、「硫酸エステル」、「キサントゲン酸エステル」、「酢酸エステル」または「クエン酸エステル」デンプンである。
【０１６０】
本発明に従った誘導体化されたデンプンは、医薬産業においてならびに食品および／または非食品分野において多様な用途に適している。本発明に従った誘導体化されたデンプンの製造のための方法は、当業者に公知であり、一般的な文献において適切に記載されている。誘導体化されたデンプンの製造の要約は、例えば、Orthoefer（Corn, Chemistry and Technology, 1987, eds. Watson and Ramstad, chapter 16, 479-499）において見出される。
【０１６１】
同様に、本発明は、誘導体化されたデンプンの製造のための本発明に従った方法によって得られることの可能な誘導体化されたデンプンに関する。
【０１６２】
本発明はさらに、誘導体化されたデンプンの製造のための本発明に従った改変されたデンプンの使用に関する。
【０１６３】
植物のデンプン貯蔵部分はしばしば、粉末を生じるために加工される。粉末が製造されることの可能な植物の部分の例は、例えば、ジャガイモ植物由来の塊茎および子実植物由来の子実である。子実植物由来の粉末の製造のために、これらの植物の胚乳含有子実が、すりつぶされおよび篩過される。デンプンは、胚乳の主要構成体である。しかし、胚乳を含有しないが、例えば塊茎または根等の他のデンプン貯蔵部分を含有する他の植物において、粉末はしばしば、問題の貯蔵器官の粉砕、乾燥およびその後のすりつぶしによって製造される。胚乳のデンプンまたは植物のデンプン貯蔵部分中に含有されるデンプンは、問題の植物の部分から製造される粉末の本質的な部分である。したがって、粉末の特性は、問題の粉末中に存在するデンプンによっても影響される。本発明に従った植物細胞および本発明に従った植物は、対応する遺伝的に改変されていない野生型植物細胞または遺伝的に改変されていない野生型植物と比較して、変化したデンプンを合成する。それゆえ、本発明に従った植物細胞、本発明に従った植物、本発明に従った繁殖材料または本発明に従った収穫可能な部分は、変化した特性を有する。粉末の特性は、デンプンを粉末と混合することによってまたは異なる特性を有する粉末を混合することによっても影響され得る。
【０１６４】
したがって、本発明のさらなる対象は、本発明に従ったデンプンを含む粉末に関する。
【０１６５】
本発明のさらなる対象は、本発明に従った植物細胞、本発明に従った植物、本発明に従った植物のデンプン貯蔵部分から、本発明に従った繁殖材料からまたは本発明に従った収穫可能な植物の部分から製造されることが可能である粉末に関する。粉末の製造のための本発明に従った植物の好ましいデンプン貯蔵部分は、塊茎、貯蔵根および胚乳を含有する子実である。本発明と関連して、（系統的な）イネ科の植物由来の子実は、特に好ましく、トウモロコシ、コメまたはコムギの植物由来の子実は、特に好ましい。
【０１６６】
「粉末」という用語は、本発明と関連して、植物の部分をすりつぶすことによって得られる粉末を意味するものとして理解されるべきである。場合により、植物の部分は、すりつぶす前に乾燥され、すりつぶした後に粉砕されおよび／または篩過される。
【０１６７】
本発明に従った粉末は、前記粉末中に存在する本発明に従ったデンプンをベースとして、前記粉末が、変化したリン酸含有量および／または増大した熱湯膨潤力を有するという事実によって区別される。このことは、例えば、多くの応用のための食品産業における粉末の加工において、特に焼き上げられた製品の製造において望まれる。
【０１６８】
本発明の好ましい対象は、単子葉植物の子実から製造される粉末に関するものであり、少なくとも２８g/g、好ましくは少なくとも３３g/g、特に好ましくは少なくとも３８g/gおよび特に好ましくは少なくとも４３g/gの熱湯膨潤力を有する。
【０１６９】
粉末の熱湯膨潤力の測定は、本発明において、デンプンの熱湯膨潤力の測定に関して既に記載されている方法と同様に実施され、本発明において穀粉がデンプンの代わりに使用されるという違いを伴う。粉末の熱湯膨潤力の測定についての好ましい方法は、一般的な方法の第１項に記載される。
【０１７０】
本発明のさらなる対象は、本発明に従った植物細胞、本発明に従った植物、本発明に従った植物の部分、本発明に従った植物のデンプン貯蔵部分、本発明に従った繁殖材料または本発明に従った収穫可能な材料のすりつぶしの工程を含む、粉末の製造のための方法である。
【０１７１】
粉末は、本発明に従った植物のデンプン貯蔵部分をすりつぶすことによって製造されることが可能である。粉末を製造する方法は、当業者に公知である。好ましくは、粉末の製造のための方法は、すりつぶす前に、栽培された植物または植物の部分および／または繁殖材料またはこれらの植物のデンプン貯蔵部分を収穫する工程も含み、特に好ましくは、収穫前の本発明に従った植物の栽培の工程をさらに含む。
【０１７２】
本発明のさらなる実施態様において、粉末の製造のための方法は、本発明に従った植物の、本発明に従った植物のデンプン貯蔵部分の、本発明に従った繁殖材料のまたは本発明に従った収穫可能な材料のすりつぶす前の加工を含む。
【０１７３】
本発明において、前記加工は例えば、熱処理および／または乾燥であり得る。熱処理後の熱処理された材料の乾燥は、例えば、すりつぶしが実施される前の例えばジャガイモ塊茎等の貯蔵根または塊茎からの粉末の製造において使用される。本発明に従った植物の、本発明に従った植物のデンプン貯蔵部分の、本発明に従った繁殖材料の、または本発明に従った収穫可能な材料のすりつぶし前の粉砕は同様に、本発明の意図内での加工であり得る。すりつぶし前の植物組織の除去、例えば子実からの籾殻などの除去も、本発明の意図内でのすりつぶし前の加工である。
【０１７４】
本発明のさらなる実施態様において、粉末の製造のための加工は、すりつぶし後の製粉用穀物の加工を含む。
【０１７５】
本発明において、製粉用穀物は、例えば粉末の多様な種類を製造するために、例えばすりつぶし後に篩過されることが可能である。
【０１７６】
本発明のさらなる対象は、本発明に従った遺伝的に改変された植物の部分、本発明に従った植物、本発明に従った植物の部分、本発明に従った植物のデンプン貯蔵部分、本発明に従った繁殖材料または本発明に従った収穫可能な材料の、粉末の製造のための使用である。
【０１７７】
配列の記載
配列番号１：ジャガイモ（Solanum tuberosum）由来のグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号２：ジャガイモ由来のグルカン−水ジキナーゼの活性を有する配列番号１によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号３：ウコン（Curcuma longa）由来のグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号４：ウコン由来のグルカン−水ジキナーゼの活性を有する配列番号３によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号５：コムギ（Triticum aestivum）由来のデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号６：コムギ由来のデンプン合成酵素IIの活性を有する配列番号３によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１は、野生型と比較したデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性の測定のための酵素電気泳動像を示す。野生型植物（ＷＴ）の未成熟な（開花開始15日後）子実のタンパク質全体の抽出物および発現ベクターAH32-191を使用するトランスフォーメーションから互いに独立して生じる遺伝的に改変された３つの植物（oe-SSII-O.s.-5、oe-SSII-O.s.-12、oe-SSII-O.s.-19）のタンパク質全体の抽出物を使用した。ＷＴおよびpur（非希釈）のトラックにおいて、個々の抽出物のタンパク質の等量を各場合において適用する。遺伝的に改変された植物のタンパク質抽出物を連続希釈し（１：２、１：４、１：６、１：８、１：１０、１：２０または１：１００）、これらの希釈物を同様に、電気泳動で互いに分離した。野生型植物由来のタンパク質抽出物のルゴール溶液による染色後の酵素電気泳動像中に存在するデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質によって合成される特異的産物の強度（矢印によって標識）を、問題の遺伝的に変化した植物由来のタンパク質抽出物のバンドの強度と比較することによって、野生型植物と比較したデンプン合成酵素IIの活性の増大が測定されることが可能である。等価の強度は、本発明において、等価の活性を意味する。
【図２】図２は、遺伝的に改変されていない野生型植物（ＷＴ）と比較して、コメ系oe-SSII-O.s.-19、oe-SSII-O.s.-20、oe-SSII-O.s.-21、oe-SSII-O.s.-22、oe-SSII-O.s.-23の未成熟のＴ１種子のノザンブロット分析のオートラジオグラムを示す。このために、発現ベクターAH32-191を使用するトランスフォーメーションとは独立して生じた系の各場合において３個の種子からＲＮＡを抽出し、一般的な方法の第８項に記載される方法に従って分析した。コムギ由来のデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする標識された核酸プローブを使用してハイブリダイズしたバンドをSSIIによって印付ける。
【図３】図３は、ルゴール溶液で染色した後の、遺伝的に改変されていない野生型植物（ＷＴ）の種子と比較したコメ系oe-SSII-O.s.-8、oe-SSII-O.s.-19、oe-SSII-O.s.-23の未成熟なＴ１種子のタンパク質抽出物の酵素電気泳動像を示す。系あたり２つ（oe-SSII-O.s.-8）または３つ（oe-SSII-O.s.-19、oe-SSII-O.s.-23）の異なる子実のタンパク質抽出物を分析した。本発明において、一般的な方法の第９項に記載される方法に従って、酵素電気泳動像による分析を実施した。デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質に特異的な酵素電気泳動像におけるバンドをSSIIにより印付ける。
【図４】図４は、プラスミドpJH77のマップを示す。
【図５】図５は、野生型植物（ＷＴ）の未成熟なトウモロコシカーネル由来のおよびデンプン合成酵素II（SS2）の活性を有するタンパク質の増大した活性を有するトランスジェニック系（TG）由来のタンパク質抽出物の酵素電気泳動像を示す。示されているのは、提供されたタンパク質量である。
【図６】図６は、プラスミドpHN3のマップを示す。
【０１７９】
一般的な方法
本発明に従った方法を実施するために使用されることが可能である方法が、以下に記載されている。これらの方法は、本発明の実際の実施態様であるが、これらの方法に本発明を制限するわけではない。記載されている方法の改変によって、および／または方法の個々の部分を方法の代替的な部分によって置換することによって、同一の様式で本発明を実施することが可能であることは、当業者に公知である。引用されるすべての刊行物の内容は、参照により本願の明細書中にさらに含まれる。
【０１８０】
１．熱湯膨潤力（ＳＰ）の測定
試料（デンプンまたは粉末）１００mgを水６mL中に懸濁した後、９２．５℃で２０分間膨潤させる。９２．５℃での試料のインキュベーション中に試料の容器を３６０°注意深く回転させることによって、（最初の２分間連続して、３、４、５、１０、１５または２５分後に）懸濁液を繰り返し混合する。９２．５℃での合計３０分間のインキュベーションの後、懸濁液を氷水中で約１分間冷却した後、２５℃で５分間のインキュベーションを実施する。遠心分離（室温、１０００×ｇ、１５分間）後、得られた上清をゼラチン状沈降物から注意深く引き抜き、沈降物の重量を測定する。熱湯膨潤力を、次式に従って算出する：
ＳＰ＝（ゼラチン状沈降物の重量）／（（粉末またはデンプン）中で秤量された試料の重量）
【０１８１】
２．デンプンリン酸エステルの含有量の測定
ａ）グルコース分子のＣ６位におけるリン酸含有量の測定
デンプン中で、グルコース単位のＣ２、Ｃ３およびＣ６の位置が、リン酸化可能である。（Nielsen et al., 1994, Plant Physiol. 105: 111-117に従った改変された）デンプンのまたは粉末のＣ６ Ｐ含有量の測定のために、コメ／トウモロコシ粉末またはコメ／トウモロコシデンプン５０mgを０．７M ＨＣｌ ５００μL中で９５℃で４時間、連続振盪しながら加水分解した。その後、バッチを１５，５００rpmで１０分間遠心分離し、懸濁された物質および濁度から、フィルターメンブレン（０．４５μM）によって上清を精製した。透明な加水分解産物２０μLをイミダゾール緩衝液１８０μL（３００mM イミダゾール、ｐＨ７．４；７．５mM ＭｇＣｌ２、１mM ＥＤＴＡおよび０．４mM ＮＡＤＰ）と混合し、光度計で試料を３４０nmで測定した。基礎吸収測定後、グルコース６リン酸脱水素酵素（ロイコノストク・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由来、Boehringer Mannheim）各２単位を添加することによって、酵素反応を開始した。測定された変化（ＯＤ）は、６−ホスホグルコナートおよびＮＡＤＰＨを生じるためのグルコース６リン酸およびＮＡＤＰの等モル反応をベースとしており、ＮＡＤＰＨの形成は、上述の波長で測定される。終点に到達するまで、反応をモニターした。加水分解産物中のグルコース６リン酸の含有量は、この測定の結果から算出されることが可能である：
【０１８２】
【数１】
2010500012.tif 000002
【０１８３】
秤量された材料（粉末またはデンプン）中のデンプンの不完全な加水分解による誤った結果を得ないために、その後、加水分解の程度を測定した。このために、グルコース６リン酸に関して測定された個々の加水分解産物から加水分解産物１０μLを採取し、０．７M ＮａＯＨ１０μLで中和し、水で２mLの最終容積にし、水で１：１００に希釈した。この希釈液４μLを測定緩衝液（１００mMイミダゾールｐＨ６．９；５mM ＭｇＣｌ２、１mM ＡＴＰ、０．４mM ＮＡＤＰ）１９６μLで処理し、グルコース含有量の光度計による測定のために使用した。３４０nmでの基礎吸収の測定後、酵素混合物（測定緩衝液中のヘキソキナーゼ１：１０；酵母由来のグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ１：１０）２μLの添加によって、終点に到達するまで光度計（３４０nm）で反応をモニターした。測定原理は、第一の反応に相当する。得られた測定結果から、グルコースの量を個々の試料について算出することが可能である：
【０１８４】
【数２】
2010500012.tif 000003
【０１８５】
検出された個々の試料のグルコースの量は、本発明において、Ｃ６リン酸測定のために利用可能なデンプンの比に対応する。簡素化のため、グルコース含有量は、さらなる計算においてデンプン含有量に変換される。
【０１８６】
【数３】
2010500012.tif 000004
【０１８７】
その後、加水分解されたデンプン１mgあたりのグルコース６リン酸の含有量を表すために、グルコース６リン酸の測定結果を、対応する試料のデンプン含有量と関連付ける：
【０１８８】
【数４】
2010500012.tif 000005
【０１８９】
この計算様式によって、試料（粉末またはデンプン）の秤量された重量におけるグルコース６リン酸の量に関する以外に、グルコース６リン酸の量を、グルコースへ完全に加水分解されたデンプンの部分と関連付けるのみである。
【０１９０】
ｂ）リン酸全体の含有量に関する測定
Ames（Methods in Enzymology VIII, (1966), 115-118）の方法に従って、リン酸全体の含有量の測定を実施した。
【０１９１】
デンプン約５０mgを硝酸マグネシウム-エタノール溶液３０μLで処理し、マッフル炉中で混合物を５００℃で３時間焼却処分する。残留物を０．５Ｍ ＨＣｌ３００μLで処理し、６０℃で３０分間インキュベートする。その後、一定分量を０．５Ｍ ＨＣｌで３００μLにし、２Ｍ硫酸中の１０％強度のアスコルビン酸１００μLと０．４２％モリブデン酸アンモニウム６００μLとの混合物へ添加し、４５℃で２０分間インキュベートする。
【０１９２】
３．コメ植物のトランスフォーメーション
Hiei et al.（1994, Plant Journal 6(2), 271-282）によって記載された方法に従って、コメ植物をトランスフォームした。
【０１９３】
４．コムギ植物のトランスフォーメーション
Becker et al.（1994, Plant Journal 5, 299-307）によって記載された方法に従って、コムギ植物をトランスフォームした。
【０１９４】
５．トウモロコシ植物のトランスフォーメーション
A188系のトウモロコシ植物の未成熟な胚を、Ishida et al.（1996, Nature Biotechnology 14, 745-750）によって記載された方法に従ってトランスフォームした。
【０１９５】
６．コメ子実の加工およびコメ粉末の製造
研究材料の適切な量の製造のために、温室中でコメ植物を栽培し、完全な成熟度に到達した後、収穫した。さらなる乾燥のために、成熟したコメ子実を３７℃で３〜７日間貯蔵した。その後、デハスカー（Laboratory Paddy sheller, Grainman, Miami, Florida, USA）によって外皮から子実を取り出し、得られた褐色のコメを１分間研磨することによって加工し（Pearlest Rice Polisher, Kett, Villa Park, CA, USA）、白色のコメを付与した。子実の組成およびデンプンの特性の研究のために、実験用ミル（Cyclotec, Sample mill, Foss, Denmark）によって白色子実をすりつぶして「コメ粉末」を付与した。
【０１９６】
７．コメ粉末からのコメデンプンの抽出
コメ粉末からのコメデンプンの抽出を、Wang and Wang（2004; Journal of Cereal Science 39: 291-296）において記載される方法に従って実施した。
【０１９７】
コメ粉末約１０ｇを０．０５％(w/v)ＮａＯＨ４０ｍＬとともに、振盪器上で室温で１６〜１８時間インキュベートした。その後、消化を完全にするために懸濁液をWaringブレンダーへと移し、低速で１５秒間の後高速で４５秒間完全に混合した。より大きな構成体（例えば、細胞壁）の分離のために、１２５μmおよび６３μmのメッシュ幅を有する篩に懸濁液を連続して通過させた。１５００rpmで１５分間遠心分離後（Microfuge 3.OR; Heraeus）、上清を捨て、沈殿物の表面上にあるタンパク質層を、スパチュラを使用して除去した。得られた沈殿物を０．０５％(w/v)ＮａＯＨ中に再度懸濁し、上述の方法を反復した。その後、沈殿物を水中で再懸濁し、ＨＣｌを使用して懸濁液のｐＨを６．５〜７に調整した。得られたコメデンプンを水で合計３回洗浄し、各洗浄工程は、沈降（１５００rpm、１５分、室温で遠心分離）、上清の廃棄および新鮮な水中での沈殿物の再懸濁を含んだ。最後の洗浄工程の前にｐＨを再度チェックし、場合によりＨＣｌを使用してｐＨ７に調整した。最後の洗浄工程の沈殿物をアセトン中に再懸濁し、沈降させ、上清を廃棄した。沈殿物をアセトン中で再懸濁した後、懸濁液をペトリ皿中に注ぎ、フード下で室温で少なくとも１８時間乾燥させた。
【０１９８】
最後の工程において、このように得られたコメデンプンを、乳鉢中ですりつぶすことによって細かな粉末へと変換し、それをさらなる研究のために直接使用することが可能である。
【０１９９】
８．ノザンブロットによるタンパク質の発現レベルの分析
タンパク質をコードする核酸の発現をノザンブロット分析によって研究した。このために、トランスフォーメーションによって得られた各独立した植物について、３つの未成熟なコメ子実を収穫し（開花約１５日後）、液体窒素中で凍結した。ホモジナイゼーションのために、９６穴マイクロタイタープレート中の凍結したコメ子実を、Retschミル（MM300モデル）中の４．５mmスチール球を使用して、３０Hzの周波数で３０秒間粉砕した。その後、製造元の説明書に従ったPromega ＲＮＡ抽出キット（SV 96 Total ＲＮＡ Isolation System、注文番号Z3505、Promega, Mannheim）によって、ＲＮＡを単離した。個々の試料中のＲＮＡ濃度を、２６０nmでの吸収の光度計による測定によって測定した。
【０２００】
１試料につき、各場合にＲＮＡ２μgを均一の容積にし、ＲＮＡ試料緩衝液（６５％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、８％ホルムアルデヒド、１３％（ｖ／ｖ）ゲル緩衝液（上述参照）、５０μg／mL臭化エチジウム）の同一容積で処理した。加熱（６５℃、１０分間）および氷上での即時冷却の後、ＲＮＡ溶出緩衝液（２０mM  ＭＯＰＳ  ｐＨ８．０、５mM酢酸ナトリウム、１mM  ＥＤＴＡ）を使用して、５０〜８０mAの定常電流強度で約２時間、１．２％(w/v)アガロースゲル（２０mM  ＭＯＰＳ  ｐＨ８．０、５mM酢酸ナトリウム、１mM  ＥＤＴＡ、６％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド）上でＲＮＡを分離した。その後、１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、１５０mMクエン酸ナトリウムｐＨ７．０）を使用する拡散ブロットによってＲＮＡをHybond-Nメンブレンへと転移させ、紫外線照射によってメンブレン上にＲＮＡを固定した。
【０２０１】
デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の発現の検出のためのノザンブロットのハイブリダイゼーションのために、コムギ由来のデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡの５’領域を含むプラスミドAH32-191（４５６８〜５６８６塩基対）の約１kbのSpeI/BsｐＨI断片を使用した。製造元の説明書に従って、３２Ｐ−α−ｄＣＴＰを使用するRocheのRandom primed ＤＮＡ標識キット（注文番号1004 760）によって、ＤＮＡ断片の放射性標識を実施した。
【０２０２】
ハイブリダイゼーション緩衝液（２５０mMリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、１mM ＥＤＴＡ、６％(w/v)ＳＤＳ、１％(w/v)ＢＳＡ）を含有する水槽中で穏やかに振盪しながら、転移したＲＮＡを含むナイロンメンブレンを６０℃で４時間インキュベートした後、放射性標識したＤＮＡをハイブリダイゼーション緩衝液に添加した。１６時間のインキュベーション後、ハイブリダイゼーション緩衝液を除去し、非特異的に結合したＤＮＡ分子の除去のために、水槽中で穏やかに振盪しながら、６０℃で、メンブレンを３×ＳＳＣで１回、２×ＳＳＣ（上述参照）で１回、連続して洗浄した。
【０２０３】
標識されたＲＮＡの検出のために、ナイロンメンブレンのオートラジオグラフィーをＸ線フィルム上で、−７０℃で１〜３日間実施した。
【０２０４】
９．活性ゲル（酵素電気泳動像）によるデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性の測定
未変性条件下でポリアクリルアミドゲル中でタンパク質抽出物を分離した後、適切な基質と共にインキュベートする活性ゲル（酵素電気泳動像）によって、未成熟なコメ子実におけるデンプン合成酵素の活性を有するタンパク質の活性の検出を実施した。得られた反応産物（αグルカン）をルゴール溶液によってゲル中で染色した。
【０２０５】
個々の未成熟なコメ子実（開花約１５日後）を液体窒素中で凍結し、冷却抽出緩衝液（５０mMトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．６、２．５mM  ＥＤＴＡ、２mM  ＤＴＴ、４mM  ＰＭＳＦ、０．１％(w/v)グリコーゲン、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）１５０〜２００μＬ中でホモジナイズした。遠心分離（４℃、１３，０００ｇ、１５分間）後、透明な上清を清潔な反応容器へ移し、抽出物の一定分量を使用して、Bradford（1976, Anal Biochem 72: 248-254）に従ったタンパク質含有量を測定した。
【０２０６】
単一濃度の溶出緩衝液（２５mMトリス／ＨＣｌ、１９２mMグリシン）を使用する連続的７．５％ポリアクリルアミドゲル（７．５％アクリルアミド：ビスアクリルアミド３７．５：１、２５mMトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１９２mMグリシン、０．１％(w/v)ＡＰＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＥＭＥＤ）によって、タンパク質抽出物の分離を実施した。各試料について、タンパク質１５μｇに相当する量を使用し、電気泳動を４℃で２〜２．５時間実施した。その後、連続振盪しながら、インキュベーション緩衝液（０．５mMクエン酸ナトリウムｐＨ７．０、２５mM酢酸カリウム、２mM  ＥＤＴＡ、２mM  ＤＴＴ、０．１％(w/v)アミロペクチン、５０mMトリシン／ＮａＯＨ  ｐＨ８．５、１mM  ＡＤＰ−グルコース）１５mL中で室温で一晩ゲルをインキュベートした。ルゴール溶液によって、形成されたデンプンの染色を実施した。
【０２０７】
デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性が、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物との比較で何倍ほど増大するかを決定するために、遺伝的に改変された系のタンパク質抽出物を各場合において連続希釈し、上述の方法に従って電気泳動で分離した。既に上述に記載されるとおり、さらなる工程を実施した。ルゴール溶液による酵素電気泳動像を染色した後、遺伝的に改変された植物のタンパク質抽出物の多様な希釈についてのデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質によって生じる染色された産物（図１における矢印によって標識）の強度の、希釈されていない問題の野生型タンパク質の産物との視覚的な比較を実施した。産物の染色強度が、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性と直接相関するため、等強度を有する産物のバンドは、同一の活性を有する。希釈されたタンパク質抽出物におけるデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の産物のバンドが、問題の野生型植物由来の対応する希釈されていないタンパク質抽出物の産物のバンドと同一の強度を有する場合、希釈係数は、問題の遺伝的に改変された植物における活性の増大の程度に相当する（これについては図１を比較）。
【０２０８】
１０．コメ胚（胚救出）による植物の作出
種子を穂から分離し、籾殻を除去する。小刀を使用して胚から胚乳を分離し、適切な分析のために使用する。湿潤可能性を改良するために、胚を７０％エタノールで簡潔に処理した後、１０％ＮａＯＣｌおよび滅菌用の市販の洗剤１滴を含む溶液中に２０分間インキュベートする。
【０２０９】
その後、滅菌溶液をできるだけ完全に除去し、各場合において胚を滅菌脱塩水で１分間１回洗浄した後、１０分間２回洗浄する。ＭＳ培地（Murashige-Skoog培地）の塩濃度の１／４および４％ショ糖種子を含むアガーを使用して凝固させた培地上でペトリ皿中に種子を置く。その後、ペトリ皿をパラフィルムで密封し、暗所で２３℃でインキュベートする。発芽後（胚を置いた約５〜７日後）、ペトリ皿を明所へ転移する。実生の胚軸が、約２ｃｍの長さに到達した場合、２％ショ糖を含有するアガーを使用して凝固させたＭＳ培地を含むガラスポットへ、植物を転移する。適切な根の形成後、植物を土壌中に植えることが可能である。
【０２１０】
１１．トウモロコシカーネルの加工
十分な材料の作出のため、トウモロコシ植物を温室条件下で生育させた。完全に熟したトウモロコシの穂を収穫し、３７℃で３〜７日間貯蔵してさらに乾燥させた後、カーネル（Kernel）を穂から摘出した。
【０２１１】
１２．トウモロコシデンプンの抽出
「Corn Refiners Association」（http://www.corn.org）によって記載される湿式製粉方法に従って、トウモロコシデンプンを抽出した。１０〜５０ｇのトウモロコシカーネルを、硫酸の過剰量中で５０℃で３日間インキュベートして、タンパク質マトリックスを放置した。その後、カーネルを水で洗浄し、簡単に乾燥した。２mmのメッシュ幅を有する篩を備えた超遠心製粉機（retsch, Germany, ZM100）中でカーネルの製粉を実施した。製粉した材料をガラスビーカーに移し、２０％ＮａＣｌ溶液中で少なくとも３０分間インキュベートし、デンプン顆粒の沈降および上部相中での脂質体の浮遊を生じさせた。胚を含む上部相をデカントし、沈降物を残余溶液中で再度懸濁した。以下において、多様な篩い分け工程によって、デンプン顆粒のさらなる精製を達成した。５００μmの篩（DIN 4188）、その後、２００μmの篩（DIN 4188）および１２５μmの篩（ISO 3310-1）を使用し、それにより、篩の下の滴が、デンプン顆粒をこれ以上含有しなくなるまで、噴霧器の使用によって篩を２０％ＮａＣｌ（２〜３Ｌ）で洗浄した。回収したデンプンを室温で一晩沈降させ、沈降したデンプン上の上清約５mmが留まる方法で、上清をデカントした。その後、デンプンを遠心チューブに移し、再度、Heraeus Variofuge中で３５００rpmで１０分間沈降させた。遠心分離後、（異なる色を有することによってしばしば認識される）沈降の上部のデンプン-タンパク質層をスパチュラで除去し、廃棄した。得られたデンプンを再度、０．２M酢酸ナトリウムで数回懸濁し、遠心分離し（５分間、残りのパラメータは上述参照）、各回に、沈降物の上部のデンプン-タンパク質層を上述のとおり除去した。以下において、得られたデンプンを、０．２M酢酸ナトリウム、ｐＨ４．６、１％ブロメラインおよび１％ペシン（pesin）を含む溶液中で、定常回転の下で１時間消化した後、遠心分離した（３０００rpm、他のパラメータは上述参照）。沈降物の上部にあるデンプン−タンパク質層を上述のとおり再度除去し、得られた沈降物を水中で懸濁し、再度遠心分離した後、沈降物の上部にあるタンパク質層を上述のとおり除去した。この洗浄工程を合計５回反復した後、得られたデンプンを８０％エタノール中に懸濁し、遠心分離した（３０００rpm、他のパラメータは上述参照）。この工程を４回反復した。最後に、得られたデンプンをアセトン中で１回洗浄し、脂質を除去した。その後、デンプンを室温で乾燥させた。
【０２１２】
１３．トウモロコシ植物の栽培
植物材料  トウモロコシ（Zea mays）、品種Ａ１８８
温室中での栽培条件：
土壌：８０％白色ピート
２０％褐色ピート
１００kg／ｍ３ガラス砂
４０kg／ｍ３粘土
構造：細かい
ｐＨ５．３〜６．１
基礎肥料：２kg／ｍ３  12-12-17(+2)および１００ｇ／ｍ３  Radigen（Therafor GmbH, Isrlohn, Germany）
植木鉢：１０Ｌ容器
密度：最大６苗／ｍ２
施肥：四葉段階において１ＴＡＢ  Plantosan  ４ｇ(20-10-15+6)
さらに３週間後、１ＴＡＢ  Plantosan（上述）
温度：昼２２〜２５℃／夜１６℃
照明：１８時間、３５０〜４００μアインシュタイン／秒／ｍ
湿度：５０％相対値
【０２１３】
実施例
１．デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質のためのコード配列を含む植物発現ベクターAH32-191の調製
コムギ由来のデンプン合成酵素II（T.a.-SSII）の活性を有するタンパク質の完全なコード配列を、制限エンドヌクレアーゼEclI136AおよびXhoIによって（名称pTaSS1の下でＷＯ９７４５５４５に記載される）プラスミドpCF31から切り出し、制限エンドヌクレアーゼEcoRVおよびXhoIを使用して開裂したプラスミドIR103-123にクローニングした。得られた発現ベクターは、AH32-191と名づけられた。植物発現ベクターIR103-123は、コメ由来のグロブリンプロモーターの調節下で標的遺伝子の胚乳特異的発現のために機能した。植物発現ベクターIR103-123はさらに、植物のトランスフォーメーションのための選択マーカーとして使用されたCaMV35Sプロモーターの調節下でbar遺伝子を含有する。
【０２１４】
２．デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性を有するコメ植物の作出
Hiei et al.（1994, Plant Journal 6(2), 271-282）に記載される方法を使用して、プラスミドAH32-191を含むアグロバクテリウムによって、コメ植物（M202種）をトランスフォームした。得られた植物に、名称oe-SSII-O.s.-Xを付与し、Xは、トランスフォーメーションから作出される独立した植物を指定する。
【０２１５】
３．グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を有するコメ植物の作出
Hiei et al.（1994, Plant Journal 6(2), 271-282）に記載される方法を使用して、（WO05095619において記載される）プラスミドpML82を含むアグロバクテリウムによって、コメ植物（M202種）をトランスフォームした。得られた植物に、名称oe-GWD-O.s.-Xを付与し、Xは、トランスフォーメーションから作出される独立した植物を指定する。
【０２１６】
４．発現ベクターAH32-191を使用してトランスフォームされたコメ植物の分析
名称oe-SSII-O.s.-Xを有する系の発現ベクターAH32-191によるトランスフォーメーションから作出されたコメ植物（Ｔ０植物）を、温室中の土壌中で栽培した。名称oe-SSII-O.s.-Xを有する多様な系の未成熟な子実（Ｔ１種子）からＲＮＡを単離し、一般的な方法の第８項に記載される方法に従って、ノザンブロット分析を実施した。対応する遺伝的に改変されていない野生型植物と比較して、コムギ由来のデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した発現を有する多くの系を同定することは可能であった（図２の典型的な表示参照）。
【０２１７】
多様な系oe-SSII-O.s.-Xの未成熟なＴ１種子におけるデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性を、酵素電気泳動によってさらに検出した（図１および図２の典型的な表示参照）。酵素電気泳動による分析を、一般的な方法の第９項に記載される方法に従って実施した。
【０２１８】
５．発現ベクターpML82を使用してトランスフォームされたコメ植物の分析
名称oe-GWD-O.s.-Xを有する系の発現ベクターpML82によるトランスフォーメーションから作出されたコメ植物（Ｔ０植物）を、温室中の土壌中で栽培した。名称oe-GWD-O.s.-Xを有する多様な系の個々の成熟した子実（Ｔ１種子）から粉末を製造した。このために、個々の子実を細かく微粉砕し、すりつぶした材料をその後ボールミル（Retsch, model MM300）中で３０Hzの周波数で３０秒間粉末状にした。その後、粉末のグルコース分子のＣ６位におけるデンプンリン酸エステル含有量の測定を、一般的な方法の第２項に記載される方法に従って実施した。
【０２１９】
選択された植物について、以下の結果を得た：
【０２２０】
【表１】
2010500012.tif 000006
【０２２１】
表１：遺伝的に改変されていない品種M202の対応する野生型植物（ＷＴ）の種子から製造された粉末と比較した、名称oe-GWD-O.s.-Xを有する異なる系の個々のＴ１種子から製造された粉末におけるグルコース分子のＣ６位において結合したリン酸の含有量。
【０２２２】
表１から明らかなように、遺伝的に改変されていない対応する野生型植物と比較して、粉末におけるグルコース分子のＣ６位において結合したリン酸の増大した含有量を有したトランスフォーメーションから、発現ベクターpML82を使用して作製された独立した系を同定することは可能であった。グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した発現を有する植物細胞が、対応する遺伝的に改変されていない野生型植物と比較してより高いデンプンリン酸エステル含有量を有するデンプンを合成することが公知であるため、名称oe-GWD-O.s.-Xを有する系におけるリン酸含有量の増大は、グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性に起因すると考えられるべきである。
【０２２３】
６．デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性およびグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を有する植物の作出
名称Oe-SSII-O.s.-Xを有する多様な系のまたはOe-GWD-O.s.-X系の植物の各場合における３０個のＴ１種子を温室中で再度栽培し、問題の植物に０．５％Basta（登録商標）（Bayer CropSciencｅ）を含む溶液を噴霧した。oe-SSII-O.s.-19、oe-GWD-O.s.-2、oe-GWD-O.s.-4およびoe-GWD-O.s.-9の系の処理された植物の約１／４は、Basta（登録商標）による処理に対して感度よく反応し、そのことによって、前記植物が、Basta（登録商標）に対するbar遺伝子仲介性抵抗性を含有せず、発現ベクターのＴ−ＤＮＡが、ゲノムの一部位でまたは互いに密接に位置することにより分離しないゲノムにおける部位で組み込まれたと結論付けられた。Basta（登録商標）による処理に対して抵抗性のあるこれらの系のＴ１植物のＴ２種子を、温室中に再度置き、Basta（登録商標）による処理をちょうど記載されたように実施した。その後、Basta（登録商標）による同一の処理を、これらの系のＴ３植物で実施した。すべての植物がBasta（登録商標）に対して抵抗性のあるoe-GWD-O.s.-19、oe-GWD-O.s.-2、oe-GWD-O.s.-4およびoe-GWD-O.s.-9の系の多様なＴ３植物を同定することが可能であった。このことによって、問題のＴ３種子が生じるＴ２植物が、組み込まれたＴ−ＤＮＡについてホモ接合性であると結論付けられた。oe-SSII-O.s.-19、oe-GWD-O.s.-2、oe-GWD-O.s.-4およびoe-GWD-O.s.-9の系のホモ接合性の植物のＴ２種子を再度置き、各場合において、oe-SSII-O.s.-19系の多様な植物に、oe-GWD-O.s.-2、oe-GWD-O.s.-4およびoe-GWD-O.s.-9の系の花粉をまぶした。そこから得られる交雑する子孫を、oe-SSII/GWD-O.s.-1（oe-SSII-O.s.-19×oe-GWD-O.s.-2）、oe-SSII/GWD-O.s.-2（oe-SSII-O.s.-19×oe-GWD-O.s.-4）およびoe-SSII/GWD-O.s.-3（oe-SSII-O.s.-19×oe-GWD-O.s.-9）と命名した。
【０２２４】
７．デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性およびグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を有する植物の分析
交雑から生じたoe-SSII/GWD-O.s.-1、oe-SSII/GWD-O.s.-2、oe-SSII/GWD-O.s.-3の系およびホモ接合性の親植物（oe-SSII-O.s.-19、oe-GWD-O.s.-2、oe-GWD-O.s.-4およびoe-GWD-O.s.-9）の個々のＦ１種子を各場合において収穫し、胚を分離し、室温で貯蔵した。一般的な方法の第６項に記載される方法を使用して、各個々のＦ１種子の残りの胚乳から得られる粉末を、グルコース分子のＣ６位において結合したリン酸の含有量について研究した。以下の結果が得られた。
【０２２５】
【表２】
2010500012.tif 000007
【０２２６】
表２：遺伝的に改変されていない品種M202の対応する野生型植物（ＷＴ）の種子から製造された粉末と比較した、名称oe-SSII/GWD-O.s.-Xを有する系の個々のＦ１種子から製造された粉末におけるグルコース分子のＣ６位において結合したリン酸の含有量。親の系の個々のホモ接合性種子から製造された粉末におけるグルコース分子のＣ６位において結合したリン酸の含有量を同様に示す。
【０２２７】
粉末が、デンプン1mgあたり少なくとも６．０nmolのＣ６リン酸であるグルコース分子のＣ６位に結合したリン酸含有量を有するoe-SSII/GWD-O.s.-Xの系の種子の胚を、一般的な方法の第１０項に記載された方法によって出芽させた後、Ｆ２種子の産生のために温室中で栽培した。デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性を仲介しまたはグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を仲介する２つの組み込まれたＴ  ＤＮＡに関してホモ接合性である子孫の同定のために、Ｆ１種子についてちょうど記載された方法を、Ｆ２種子で反復した。その後、順に、粉末が、種子の新鮮重量1mgあたり少なくとも６．０nmolのＣ６リン酸であるグルコース分子のＣ６位の結合したリン酸含有量を有する種子の胚を出芽させ、Ｆ３種子の産生のために温室中で栽培した。各場合においてＦ２植物から生じる個々のＦ３種子について、以下の結果が得られた：
【０２２８】
【表３】
2010500012.tif 000008
2010500012.tif 000009
【０２２９】
表３：遺伝的に改変されていないM202品種の対応する野生型植物（ＷＴ）の個々の種子から製造される粉末と比較した、oe-SSII-O.s.-19の親系（母）をoe-GWD-O.s.-Xの系（父）と交雑することによって調製された名称oe-SSII/GWD-O.s.-Xを有する系の個々のＦ３種子から製造された粉末におけるグルコース分子のＣ６位において結合したリン酸の含有量。個々の親の系の個々のホモ接合性種子から製造された粉末におけるグルコース分子のＣ６位において結合したリン酸の含有量を同様に示す。
【０２３０】
問題の系のＦ２植物から各場合において生じた個々のＦ３種子から製造された粉末におけるグルコース分子のＣ６位において結合したリン酸の含有量が、ほぼ同一であったという事実は、問題のＦ２植物が、組み込まれた２つのＴ−ＤＮＡについてホモ接合性であるという事実を示した。
【０２３１】
デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性を仲介しまたはグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を仲介する組み込まれた２つのT ＤＮＡについてホモ接合性であるoe-SSII/GWD-O.s.-1、oe-SSII/GWD-O.s.-2、oe-SSII/GWD-O.s.-3の系のＦ２植物のＦ３種子を加工して、一般的な方法の第６項に記載される方法に従って粉末にした。一般的な方法の第７項に記載される方法に従って、この粉末の一部からデンプンを単離した。その後、グルコース分子のＣ６位において結合したリン酸の含有量を、粉末およびデンプンにおいて測定した。以下の結果が得られた：
【０２３２】
【表４】
2010500012.tif 000010
【０２３３】
表４：oe-SSII-O.s.-19（母）およびoe-GWD-O.s.-X（父）の親の系またはM202品種の野生型植物（ＷＴ）の種子から製造された粉末またはデンプンと比較した、交雑によって生じた名称oe-SSII/GWD-O.s.-Xを有する系のホモ接合性植物の種子から製造された粉末またはデンプンにおけるグルコース分子のＣ６位において結合したリン酸の含有量。
【０２３４】
Oe-SSII-O.s.-19およびoe-GWD-O.s.-Xの系のホモ接合性植物のおよび野生型植物のＴ−ＤＮＡ組込みに関してoe-SSII/GWD-O.s.-Xの系のＦ３種子から製造された粉末またはデンプンの熱湯膨潤力の測定を、一般的な方法の第１項に記載された方法に従って実施した。これらの系とともに一般的な方法の第１項に記載された水の量を使用する場合、膨潤した物質の水性上清からの分離が認識できないため、oe-SSII/GWD-O.s.-Xの系については、一般的な方法の第１項に記載された方法とは異なって、粉末またはデンプンの量に基づいた水の量の２倍を使用した。以下の結果が得られた：
【０２３５】
【表５】
2010500012.tif 000011
【０２３６】
表５：oe-SSII-O.s.-19（母）およびoe-GWD-O.s.-X（父）の親の系またはM202品種の野生型植物（ＷＴ）の種子から製造された粉末またはデンプンと比較した、交雑によって生じた名称oe-SSII/GWD-O.s.-Xを有する系のホモ接合性植物の種子から製造された粉末またはデンプンの熱湯膨潤力。
【０２３７】
８．デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質のためのコード配列を含む植物発現ベクターpJH77の調製
【０２３８】
コムギ由来のデンプン合成酵素II（T.a.-SSII）の活性を有するタンパク質の完全なコード配列をサブクローニングした。得られたプラスミドは、pJH77と命名され（図４参照）、以下の機能的要素を含む：
【０２３９】
【表６】
2010500012.tif 000012
【０２４０】
表６：プラスミドpJH77の遺伝的要素。
【０２４１】
【表７】
2010500012.tif 000013
【０２４２】
表７：表６において引用される参考文献。
【０２４３】
９．デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性を有するトウモロコシ植物の作出および同定
一般的な方法の第５項に記載の方法に従って、トウモロコシ植物（品種A188）をプラスミドpJH77でトランスフォームした。名称JH77-Xを、得られた植物に付与した。Xが、トランスフォーメーションから作出された独立した植物を指定する。プラスミドJH77によるトランスフォーメーションから生じた植物（Ｔ０植物）を温室中で生育させ、野生型植物（品種A188）由来の花粉を受粉させた。
【０２４４】
プラスミドpJH77によるトランスフォーメーションおよび野生型による他家受粉後に得られた独立した植物由来の単一の未成熟な（受粉約１５日後）カーネル（Ｔ１カーネル）から、トランスフォームされていない野生型植物（A188）由来と同様に、タンパク質を抽出した。一般的な方法の第９項に記載される方法に従って、多様な植物の個々のタンパク質抽出物を酵素電気泳動において分析した。SSIIの活性を有するタンパク質の活性の増大の定量化のために、トランスジェニック系由来のタンパク質抽出物を連続希釈した。このような分析の結果を図５によって具現化する。いくつもの植物は、野生型植物（A188）との比較で、３〜５の係数のデンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性の増大を示した。
【０２４５】
１０．グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質のためのコード配列を含む植物発現ベクターpHN3の調製
ベクターpHN3（図７）は、pRPA-BL150-Aα2（欧州特許第0337899号）由来である。ベクター主鎖は、以下の遺伝的要素を含有する：
【０２４６】
【表８】
2010500012.tif 000014
【０２４７】
表８：プラスミドpHN3の遺伝的要素。
【０２４８】
【表９】
2010500012.tif 000015
【０２４９】
表９：表８において引用される参考文献。
【０２５０】
１１．グルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を有するトウモロコシ植物の作出および同定
一般的な方法の第５項に記載の方法に従って、トウモロコシ植物（品種A188）をプラスミドpHN3でトランスフォームした。名称HN3-Xを、得られた植物に付与した。Xが、トランスフォーメーションから作出された独立した植物を指定する。
【０２５１】
プラスミドpHN3によるトランスフォーメーションから生じた植物（Ｔ０植物）を温室中で生育させ、野生型植物（品種A188）由来の花粉を受粉させた。結果として生じたＴ１世代の植物を温室中で生育させ、三つ葉状態において、０．５％Basta（登録商標）を含有する溶液を噴霧した。プラスミドpHN3の関連Ｔ−ＤＮＡの組込みが、ゲノム中の単一座に存在するものであるため、Basta（登録商標）溶液による噴霧後に各場合において３０苗の栽培された植物の約２５％が死滅したＴ１植物の群のみをさらに追随した。Basta（登録商標）溶液による噴霧を生き残った植物の約７５％由来の葉材料からゲノムＤＮＡを単離し、Invader（登録商標）技術によって存在するコピー数について各場合において研究した（Pielberg et al. 2003, Genome Res.;13, 2171-2177）。Invader(登録商標）技術による分析において同一のＴ０植物の残りの子孫の約2倍強いシグナルを示したＴ０植物の子孫の一群内でのＴ１植物は、プラスミドＴ−ＤＮＡが組み込まれる座に関してホモ接合性である。Basta（登録商標）溶液による処理を生き残ったＴ０植物の子孫の約３０％が、Invader技術による分析において、同一のＴ０植物の子孫の残り約７０％と比較して約２倍強いシグナルを示す場合、このことは、Ｔ−ＤＮＡの組込みが単一座にあるというさらなる表れである。
【０２５２】
ちょうど記載されるように選択された植物から収穫されたカーネルから単離されたデンプンにおいて、一般的な方法の第２ａ）項に記載される方法に従って、デンプンリン酸エステル含有量を測定した。HN3-101系から単離されたデンプンは、デンプン１mgあたり４．６nmolのＣ６位におけるデンプンリン酸エステル含有量を有した。
【０２５３】
１２．デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性およびグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を有するトウモロコシ植物の作出および同定
デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の活性の増大において異なる程度を示すいくつもの独立した系（JH77-X）を、プラスミドpHN3由来のＴ−ＤＮＡの組込みに関してホモ接合性であるHN3-101系由来の植物との交雑のために使用した。HN3-101と命名された植物を花粉ドナー（雄性の交雑パートナー）として使用し、JH77-Xの系の植物を雌性の交雑パートナーとして使用した。これらの交雑から生じるＦ１植物を温室中で生育させ、ＤＮＡを葉から抽出した。両者のトランス遺伝子を有する多様なＦ１植物は、PCRを用いて選択されることが可能であった。これらの各植物由来の多様なＦ２植物を温室中で生育させ、ゲノムＤＮＡを葉材料から単離し、Invader（登録商標）技術によって両トランス遺伝子に関して存在するコピー数について各場合において研究した（Pielberg et al. 2003, Genome Res.;13, 2171-2177）。Invader（登録商標）技術による分析において同一のＦ１植物の残りの子孫の約2倍強いシグナルを示したＦ１植物の子孫の一群内でのＦ２植物は、両プラスミドのＴ−ＤＮＡが組み込まれる個々の座に関してホモ接合性であることが理解されるべきである。
【０２５４】
以下の表は、ちょうど記載されたように選択された植物の由来を示す：
【０２５５】
【表１０】
2010500012.tif 000016
【０２５６】
表１０：HN3-101およびJH77-Xの系由来の植物を交雑させた後に得られた植物の由来。
【０２５７】
１３．デンプン合成酵素IIおよびαグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を有する植物由来のデンプンの分析
Cross-13およびCross-49と命名された植物由来の成熟した穂を収穫し、さらに、一般的な方法の第１１項に記載されるように乾燥させた。一般的な方法の第１２項に記載されるようにカーネルからデンプンを抽出した。これらのデンプン中のデンプンリン酸エステル含有量を、一般的な方法の第２ａ）項に記載された方法に従って分析し、一般的な方法の第１項に記載されるとおり、熱湯膨潤力を分析した。以下の結果が得られた：
【０２５８】
【表１１】
2010500012.tif 000017
【０２５９】
表１１：野生型植物（A188-105、A188-114）と比較した、デンプン合成酵素IIの活性を有するタンパク質の増大した活性を有する植物（JH77-01903、JH77-02101）、αグルカン−水ジキナーゼの活性を有するタンパク質の増大した活性を有する植物（HN3-101）または両タンパク質の増大した活性を有する植物（Cross-13、Cross-49）から単離されたデンプンのデンプンリン酸エステル含有量および膨潤力。
【図１】
2010500012.tif 000018
【図２】
2010500012.tif 000019
【図３】
2010500012.tif 000020
【図４】
2010500012.tif 000021
【図５】
2010500012.tif 000022
【図６】
2010500012.tif 000023
【配列表】
2010500012000001.app
【国際調査報告】
2010500012.tif 000024
2010500012.tif 000025
2010500012.tif 000026