(57)【要約】本発明は、ヒトＩｇＧに結合しないことを特徴とするカニクイザルＩｇＧに特異的に結合する抗体、および二重抗原架橋イムノアッセイを使用するサル種の試料中の薬物抗体（ＤＡ）および前記薬物抗体に対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）の免疫複合体（ＤＡ／ＡＤＡ複合体）の免疫学的測定のための方法を提供する。
2010500388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩｇＧに結合せず、そしてモノクローナルであることを特徴とする、カニクイザルＩｇＧに特異的に結合する抗体。
【請求項２】
細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２７９９、または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８００、または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０１、または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０２、または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０３によって産生される、モノクローナル抗体。
【請求項３】
捕獲抗体およびトレーサー抗体を含む二重抗原架橋イムノアッセイを使用するサル種の試料中の薬物抗体（ＤＡ）および前記薬物抗体に対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）の免疫複合体（ＤＡ／ＡＤＡ複合体）の免疫学的測定のための方法であって、前記抗体の一方がカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗体であり、そして他方の抗体がヒト免疫グロブリンに特異的に結合する抗体であることを特徴とする、方法。
【請求項４】
捕獲抗体がヒトＩｇＧに特異的に結合する抗体であり、そしてトレーサー抗体がカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒト免疫グロブリンに結合しない抗体であることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
捕獲抗体がカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒト免疫グロブリンに結合しない抗体であり、そしてトレーサー抗体がヒトＩｇＧに特異的に結合する抗体であることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項６】
カニクイザルＩｇＧに特異的に結合する抗体および／またはヒト免疫グロブリンに特異的に結合する抗体がモノクローナルであることを特徴とする、請求項３〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
形成された複合体の量がＤＡ／ＡＤＡ複合体、ＤＡ、および／またはＡＤＡの濃度に相関することを特徴とする、請求項３〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
試料が予め決定された量の前記薬物抗体とプレインキュベートされることを特徴とする、請求項３〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
捕獲抗体およびトレーサー抗体を含む二重抗原架橋イムノアッセイを使用するサル種の試料中の薬物抗体に対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）の免疫学的測定のための方法であって、捕獲抗体がカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗体であり、そしてトレーサー抗体が薬物抗体であることを特徴とする、方法。
【請求項１０】
捕獲抗体およびトレーサー抗体を含む二重抗原架橋イムノアッセイを使用するサル種の試料中の薬物抗体に対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）の免疫学的測定のための方法であって、トレーサー抗体がカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗体であり、そして捕獲抗体が薬物抗体であることを特徴とする、方法。
【請求項１１】
捕獲抗体が特異的結合対を介して固定化されることを特徴とする、請求項３〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
捕獲抗体がビオチンにコンジュゲートされ、そして固定化が固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して行われることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
トレーサー抗体が特異的結合対を介して検出可能な標識にコンジュゲートされることを特徴とする、請求項３〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
トレーサー抗体がジゴキシゲニンにコンジュゲートされ、そして検出可能な標識への結合がジゴキシゲニンに対する抗体を介して行われることを特徴とする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ハイブリドーマ細胞株３．２５．１２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２７９９）、３．２９．１５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８００）、４．３８．３０（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０１）、７．５７．４１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０２）、７．７２．３２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０３）。
【請求項１６】
請求項３〜１４のいずれか１項記載の方法において使用するための抗体組成物であって、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２７９９、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８００、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０１、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０２、および／または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０３によって産生される抗体の混合物を含むことを特徴とする、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗薬物抗体の測定のための方法およびそのようなアッセイの使用のためのキットを含む。
【０００２】
発明の背景
モノクローナル抗体を用いる標準的な固相イムノアッセイは、固相上に吸着された抗体（捕獲抗体）、抗原、および酵素または検出可能な標識とコンジュゲートされた抗原の別のエピトープに対する抗体（トレーサー抗体）の間の複合体の形成を含む。従って、以下のサンドイッチが形成される：固相−捕獲抗体−抗原−トレーサー抗体。このサンドイッチにおいて、抗体コンジュゲート酵素の活性（または検出可能な標識の量）は、インキュベーション媒質中の抗原濃度に比例する。１つのサンドイッチアッセイは、捕獲抗体およびトレーサー抗体が抗原の異なるエピトープに結合する、二重抗原架橋イムノアッセイである。Hoesel, W., et al., J. Immunol. Methods 294 (2004) 101-110は、アミノ基および炭水化物基に結合した固定化ｒｈＥＰＯの混合物が使用される、抗ＥＰＯ二重抗原架橋アッセイを報告している。二重抗原架橋ＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイは、抗体薬物に対する患者の免疫原性の答えの検討において一般的なアッセイの型である。Mire-Sluis, A.R., et al., J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16は、生物工学製品に対する宿主抗体の検出を使用するイムノアッセイの設計および最適化のための推奨をまとめている。Mire-Sluis et al.によれば、周知の抗薬物抗体アッセイフォーマットはかなりの不利益を示す。抗薬物抗体アッセイは、例えばＷＯ２００５／０４５０５８およびＷＯ９０／００６５１５において言及されている。抗イディオタイプ抗体アッセイは、例えばＵＳ５，２１９，７３０、ＷＯ８７／００２７７８、ＥＰ０１３９３８９、およびＥＰ０１７０３０２において言及されている。Wadhwa, M., et al., J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17は、治療生物学物質によって誘導される所望されない抗体の検出、測定および特徴付けのためのストラテジーを報告している。二重抗原架橋イムノアッセイを使用する試料中の薬物抗体に対する抗体の免疫学的測定のための免疫学的アッセイはＰＣＴ／ＥＰ２００７／００１９３５に記載されている。サルにおけるヒト抗体の測定のための免疫学的アッセイはＷＯ２００６／０６６９１２に記載されている。当該分野において（例えばＵＳ  ２００３／００６８６６４）、活性治療抗体の検出を可能にするアッセイシステムも知られている。そのようなシステムは、固相への抗原の結合、この結合した抗原への治療抗体の結合、および固相へ抗原を介して結合した治療抗体の検出を必要とする。
【０００３】
発明の概要
本発明は、カニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗体を提供する。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。
【０００４】
好ましい実施態様において、本発明による抗体は、細胞株３．２５．１２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２７９９）、３．２９．１５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８００）、４．３８．３０（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０１）、７．５７．４１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０２）、または７．７２．３２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０３）によって産生される。
【０００５】
本発明は、サンドイッチアッセイ、すなわち二重抗原架橋イムノアッセイを使用するサル種の試料中の薬物抗体（ＤＡ）および前記薬物抗体に対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）の免疫複合体の免疫学的測定のための方法を提供する。
【０００６】
免疫複合体はさらにＤＡ／ＡＤＡ複合体と略される。
【０００７】
本発明は、捕獲抗体およびトレーサー抗体を含むサンドイッチ型または二重抗原架橋イムノアッセイを使用する試料中のＤＡ／ＡＤＡ複合体の免疫学的測定のための方法であって、前記抗体の一方（すなわちトレーサー抗体または捕獲抗体）がカニクイザルＩｇＧに特異的に結合する抗体であり、そして他方の抗体がヒト免疫グロブリンに特異的に結合する抗体であることを特徴とする、方法を提供する。
【０００８】
本発明の好ましい実施態様において、捕獲抗体はヒト免疫グロブリンに特異的に結合する抗ヒトＩｇ抗体であり、そしてトレーサー抗体はカニクイザルＩｇＧに特異的に結合する抗カニクイザルＩｇＧ抗体である。本発明の好ましい実施態様において、捕獲抗体はカニクイザルＩｇＧに特異的に結合する抗カニクイザルＩｇＧ抗体であり、そしてトレーサー抗体はヒトＩｇに特異的に結合する抗ヒトＩｇ抗体である。
【０００９】
好ましくは、抗ヒトＩｇ抗体はヒトＩｇＧに特異的に結合する。好ましくは、抗カニクイザルＩｇＧ抗体および／または抗ヒトＩｇ抗体はモノクローナルである。好ましくは、ヒト免疫グロブリンに特異的に結合する前記抗体は、カニクイザルＩｇＧに結合しない。好ましくは、ヒト免疫グロブリンに結合する前記抗体は、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２７０８によって産生される。
【００１０】
好ましくは、カニクイザルＩｇＧに結合する前記抗体は、ヒトＩｇＧに結合しない。好ましくは、カニクイザルＩｇＧに結合する前記抗体は、細胞株３．２５．１２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２７９９）、３．２９．１５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８００）、４．３８．３０（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０１）、７．５７．４１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０２）、または７．７２．３２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０３）によって産生される。
【００１１】
前記測定の過程で、抗カニクイザルＩｇＧ抗体、ＤＡ／ＡＤＡ複合体、および抗ヒトＩｇ抗体の間で複合体が形成され、そして形成された複合体の量はＤＡ／ＡＤＡ複合体、ＤＡおよび／またはＡＤＡの濃度に相関する。
【００１２】
本発明によれば、形成されたＤＡ／ＡＤＡ複合体の検出のための直接的試料分析を行うことができる。そのようなアッセイにおいて、試料が薬物抗体と抗薬物抗体の両方を含有する場合にのみ陽性シグナルが見出される。
【００１３】
あるいは、本発明によれば、予め決定された量の薬物抗体とのプレプレインキュベーションの後に試料分析を行う（ことができる）。そのようなアッセイにおいて、試料中の薬物抗体の存在／非存在とは無関係に、試料が抗薬物抗体を含有する場合に陽性シグナルが見出される。
【００１４】
好ましくは、捕獲抗体は受動的吸着によって固相にコンジュゲートされ、それゆえ少なくとも２つの異なる抗体部位で固相にコンジュゲートされる。受動的吸着は、例えば、Butler, J.E., Solid Phases in Immunoassay, In: Immunoassays, Diamandis, E.P. and Christopoulos, T.K. (eds.) Academic Press San Diego (1996), pp. 205-225に記載されている。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様において、捕獲抗体は特異的結合対を介して固定化される。そのような結合対（第１成分／第２成分）は、例えば、ストレプトアビジンまたはアビジン／ビオチン、抗体／抗原（例えばHermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996参照）、レクチン／多糖、ステロイド／ステロイド結合タンパク質、ホルモン／ホルモン受容体、酵素／基質、ＩｇＧ／プロテインＡおよび／またはＧなどである。好ましくは、捕獲抗体はビオチンにコンジュゲートされ、そして固定化は固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して行われる。
【００１６】
好ましくは、抗体のそのコンジュゲーションパートナーへのコンジュゲーションは、抗体のアミノ酸骨格のＮ末端および／またはε−アミノ基（リジン）、異なるリジンのε−アミノ基、カルボキシ官能基、スルフヒドリル官能基、ヒドロキシル官能基および／またはフェノール官能基、および／または抗体の炭水化物構造の糖アルコール基を介する化学的結合によって行われる。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様において、トレーサー抗体は検出可能な標識にコンジュゲートされ、好ましくは特異的結合対を介してコンジュゲートされる。そのような結合対（第１成分／第２成分）は、例えば、ストレプトアビジンまたはアビジン／ビオチン、抗体／抗原、レクチン／多糖、ステロイド／ステロイド結合タンパク質、ホルモン／ホルモン受容体、酵素／基質、ＩｇＧ／プロテインＡおよび／またはＧなどである。好ましくは、トレーサー抗体は、ジゴキシゲニンおよびジゴキシゲニンに対する抗体を介して、検出可能な標識にコンジュゲートされる。あるいは、トレーサー抗体は、ルテニウムビスピリジル錯体のような電気化学発光標識にコンジュゲートされる。
【００１８】
さらなる実施態様において、本発明は、サンドイッチ型または二重抗原架橋イムノアッセイを使用するサル種の試料中の薬物抗体に対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）の免疫学的測定のための方法を提供する。
【００１９】
本発明は、捕獲抗体およびトレーサー抗体を含むサンドイッチ型または二重抗原架橋イムノアッセイを使用する試料中のＡＤＡの免疫学的測定のための方法であって、前記抗体の一方がカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗体であり、そして他方の抗体が薬物抗体であることを特徴とする、方法を提供する。
【００２０】
ＡＤＡの免疫学的測定の好ましい実施態様において、捕獲抗体は薬物抗体であり、そしてトレーサー抗体はカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗カニクイザルＩｇＧ抗体である。ＡＤＡの免疫学的測定のさらなる好ましい実施態様において、捕獲抗体はカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗カニクイザルＩｇＧ抗体であり、そしてトレーサー抗体は薬物抗体である。前記測定の過程で、薬物抗体、ＡＤＡ、および抗カニクイザルＩｇＧ抗体の間で複合体が形成され、そして形成された前記複合体の量はＡＤＡの濃度に相関する。ＡＤＡの免疫学的測定の好ましい実施態様において、抗カニクイザルＩｇＧ抗体は、モノクローナル抗体（抗カニクイザルｍＡｂ）である。
【００２１】
本発明の別の実施態様は、ハイブリドーマ細胞株３．２５．１２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２７９９）、３．２９．１５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８００）、４．３８．３０（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０１）、７．５７．４１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０２）、７．７２．３２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０３）である。
【００２２】
本発明の別の態様は、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２７９９、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８００、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０１、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０２、および／または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０３によって産生される抗体の混合物を含む、本発明による方法において使用するための抗体組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＤＡ／ＡＤＡ複合体の検出のためのアッセイ  −  ＤＡ添加なし。ビオチン化抗ヒトＩｇ抗体をストレプトアビジンコートマイクロタイタープレート（ＳＡ−ＭＴＰ）に固定化する。薬物抗体／抗薬物抗体（ＤＡ／ＡＤＡ）複合体を固定化抗ヒトＩｇ抗体によって捕獲する（Ｂｉ；ビオチン化）。結合したＤＡ／ＡＤＡ複合体をジゴキシゲニン標識（Ｄｉｇ；ジゴキシゲニン化）抗カニクイザルＩｇＧ抗体および抗ジゴキシゲニン抗体西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）コンジュゲート（ＰＯＤにコンジュゲートされたポリクローナル抗ＤＩＧ抗体、ｐＡｂ＜Ｄｉｇ＞ＰＯＤ）によって検出する。カニクイザルＩｇＧに化学的にコンジュゲートされたヒトＩｇＧを標準として使用する。
【図２】ＤＡ／ＡＤＡ複合体の検出のためのアッセイ  −  ＤＡ添加あり。試料分析の前に、サル血清試料をＰＢＳベースの緩衝液で希釈し、そして薬物抗体をスパイクした。１５分間のプレインキュベーションの後、試料を上記のＥＬＩＳＡを用いて分析した（図１の説明参照）。
【図３】抗カニクイザル抗体を使用するＡＤＡの検出のためのアッセイ。ビオチン化薬物抗体をストレプトアビジンコートマイクロタイタープレート（ＳＡ−ＭＴＰ）に結合させる（Ｂｉ；ビオチン化）。抗薬物抗体（ＡＤＡ）は固定化薬物抗体に結合する。結合したＡＤＡをジゴキシゲニン標識（Ｄｉｇ；ジゴキシゲニン化）抗カニクイザルＩｇＧ抗体および抗ジゴキシゲニン抗体西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ｐＡｂ＜Ｄｉｇ＞ＰＯＤ）によって検出する。カニクイザルＩｇＧに化学的にコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ抗体を標準として使用する。
【図４】ＤＡ／ＡＤＡ複合体アッセイの標準曲線。１％（v／v）カニクイザル血清を含むＰＢＳベースの緩衝液で希釈したカニクイザルＩｇＧに化学的にコンジュゲートされたヒトＩｇＧの種々の濃度について光学密度（ＯＤ）を与える。
【図５】ＨｕＭａｂ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞（３mg／kg；ｉｖ）のカニクイザル単回用量ＰＫ研究の試料中のＤＡ／ＡＤＡ複合体の検出。薬物投与後０時間と１１７６時間との間の８つの時点で血清試料を採集し、そして薬物抗体の添加なしでＥＬＩＳＡ（図１に示す）を用いて分析した。ＤＡ／ＡＤＡ複合体の量（４０５nmのＯＤシグナル）を投与後の時間に対してプロットする。
【図６】ＨｕＭａｂ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞（３mg／kg；ｉｖ）のカニクイザル単回用量ＰＫ研究の試料中のＤＡ／ＡＤＡ複合体の検出。薬物投与後０時間と１１７６時間との間の８つの時点で血清試料を採集し、そして薬物抗体の添加ありでＥＬＩＳＡ（図２に示す）を用いて分析した。ＤＡ／ＡＤＡ複合体の量（４０５nmのＯＤシグナル）を投与後の時間に対してプロットする。
【図７】モノクローナル抗カニクイザルＩｇＧおよびポリクローナルカニクイザルＩｇＧによるカニクイザルＩｇＧの検出の比較。１％（v／v）カニクイザル血清を含むＰＢＳベースの緩衝液で希釈したカニクイザルＩｇＧに化学的にコンジュゲートされたヒトＩｇＧの種々の濃度について光学密度（シグナル（メジアン））を与える。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、カニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗体を提供する。
【００２５】
本発明による用語「薬物抗体」は、疾患の処置のために個体に投与されることができる抗体を示す。本発明に従って行われる１つのアッセイ内で、薬物抗体および捕獲抗体、または薬物抗体およびトレーサー抗体は、それぞれ「同じ」抗体分子（例えば、同じ発現ベクターを用いて組換え産生され、そして同じアミノ酸配列を含む）を含む。薬物抗体（治療モノクローナル抗体）は、腫瘍学的疾患（例えば、非ホジキンリンパ腫、乳癌および結腸直腸癌を含む血液および固形の悪性腫瘍）、免疫学的疾患、中枢神経疾患、血管疾患、または感染症のような種々の疾患の処置のために広く使用されている。そのような抗体は、例えばLevene, A.P., et al., Journal of the Royal Society of Medicine 98 (2005) 145-152に記載されている。そのような抗体は、例えばＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、Ｇ２５０、ＧＤ３、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ、ＣＤ５６、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ２、ＣＥＡ、ルイスＹ抗原、ＩＬ−６受容体、またはＩＧＦ−１受容体に対する抗体である。治療抗体は、Groner, B., et al., Curr. Mol. Meth. 4 (2004) 539-547；Harris, M., Lancet Oncol. 5 (2004) 292-302にも記載されている。
【００２６】
例示の（好ましくはモノクローナルの）治療／薬物抗体は、ＩＬ−６受容体に対する抗体（ｍＡｂ  ＩＬ−６Ｒ）である。そのような抗体は、例えばMihara, M., et al., Clin. Immunol. 98 (2001) 319-326；Nishimoto, N., et al., Blood 106 (2005) 2627-2632；臨床試験ＮＣＴ０００４６７７４；ＷＯ２００４／０９６２７４に記載されている。
【００２７】
例示の（好ましくはモノクローナルの）治療／薬物抗体は、ＩＧＦ−１受容体に対する抗体（ｍＡｂ  ＩＧＦ−１Ｒ）である。そのような抗体は、例えばＷＯ２００４／０８７７５６、ＷＯ２００５／００５６３５に記載されている。
【００２８】
「抗薬物抗体」は、例えば薬物抗体の可変ドメイン、定常ドメインまたは糖構造のような、薬物抗体の任意の領域に対するものでありうる抗体である。そのような抗薬物抗体は、抗体療法の間に患者の免疫原性反応として生じうる（Pan, Y., et al., FASEB J. 9 (1995) 43-49参照）。「抗薬物抗体」の大部分は薬物抗体の相補性決定領域の１つ以上に結合する。抗薬物抗体のその薬物抗体の抗原に対する親和性は、薬物抗体のその標的抗原に対する親和性と比較して一般に低い。
【００２９】
「抗カニクイザルＩｇＧ抗体」は、カニクイザルＩｇＧ（カニクイザル免疫グロブリンＧ）に特異的に結合する抗体（好ましくはモノクローナル（すなわちモノクローナル抗カニクイザル抗体、ｍＡｂ＜Ｃｙｎｏ  ＩｇＧ＞））である。そのような抗体は、カニクイザルＩｇＧに、少なくとも１０−９mol／Lの解離定数（＝ＫＤｉｓｓ．）で、より好ましくは少なくとも１０−１０mol／LのＫＤｉｓｓ．で結合する。同時に、ヒトＩｇＧに結合しない特性は、１０−８mol／Lまたはそれより悪い、例えば１０−５mol／LのＫＤｉｓｓ．によって保証される。また好ましくは、カニクイザルＩｇＧに結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗体は、それぞれカニクイザルＩｇＧおよびヒトＩｇＧに対するその反応性の間に少なくとも１００倍のＫＤｉｓｓ．のギャップを有する。
【００３０】
好ましくは、抗カニクイザルＩｇＧ抗体は、マーモセットＩｇＧ、アカゲザルＩｇＧおよびヒヒＩｇＧにも、少なくとも１０−８mol／l、好ましくは１０−９mol／Lの解離定数（＝ＫＤｉｓｓ．）で、より好ましくは少なくとも１０−１０mol／LのＫＤｉｓｓ．で結合する。
【００３１】
１つの実施態様において、本発明による抗体はモノクローナル抗体である。本出願内で使用する用語「モノクローナル」は、単一の細胞またはその子孫によって産生され、そしてまたその標的抗原の単一の抗原決定基に結合する抗体の集団を示す。本出願内で使用する用語「ヒトＩｇＧに結合しない」またはその文法的相当語句は、ヒトＩｇＧに対する特異的結合を示さない、すなわち１０−７mol／Lまたはそれより悪い、例えば１０−５mol／LのＫＤｉｓｓ．を有する抗体を示す。これは、ヒトＩｇＧに結合するカニクイザルＩｇＧを除去するためにヒト免疫グロブリンに対して交差吸着させられたカニクイザル抗体のポリクローナル集団を含まない。交差吸着は、このプロセスにおいて形成される結合平衡に起因して、ヒトＩｇＧに結合しないポリクローナル抗体（モノクローナル抗体どころか）の集団を与えない。この平衡に起因して、ヒトＩｇＧに結合するいくつかの抗体は交差吸着されず、そして溶液中に、従って得られた抗体調製物中に残存する。従って、一旦ヒトＩｇＧに交差吸着された免疫グロブリンは、全ての抗ヒトＩｇＧ結合を完全には枯渇しておらず、そしてヒトＩｇＧ結合をなお示す。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２７９９、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８００、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０１、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０２、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０３、ならびに細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２７９９、または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８００、または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０１、または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０２、または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０３によって産生されるモノクローナル抗体である。本発明の別の態様は、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２７９９、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８００、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０１、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０２、および／または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０３によって産生される抗体の混合物を含む抗体組成物である。本発明はさらに、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２７９９、または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８００、または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０１、または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０２、または細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０３によって産生される抗体を含む組成物を含む。
【００３３】
本発明による抗体を用いて、個々のヒト血清のバックグラウンド変動を最小化することができるか、または排除することさえできる。
【００３４】
本発明による用語「サル」は、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルおよびヒヒを意味する。好ましくは「サル」はカニクイザル、アカゲザル（Rhesus Macaque）およびヒヒを示す。
【００３５】
好ましくは、抗ヒトＩｇ抗体（Ｉｇは免疫グロブリンを示す）は、ＷＯ２００６／０６６９１２に記載されるようなカニクイザルの免疫グロブリン上に存在しないエピトープに特異的に結合する抗体である。このエピトープはＭＡＢ＜Ｈ−Ｆｃγｐａｎ＞Ｍ−Ｒ１０Ｚ８Ｅ９（ＭＡＢ＜ｈ−Ｆｃｇａｍｍａ＞Ｍ−Ｒ１０Ｚ８Ｅ９または簡潔にＭＡＢ  Ｍ−Ｒ１０Ｚ８Ｅ９とも示される）へのその結合によって特徴付けられる。本発明による好ましい実施態様において、抗ヒトＩｇ抗体は、ＭＡＢ  Ｍ−Ｒ１０Ｚ８Ｅ９と同じエピトープへの結合によってさらに特徴付けられる。ＭＡＢ  Ｍ−Ｒ１０Ｚ８Ｅ９は、ＤＳＭＺに２００４年１２月２２日にＤＳＭ  ＡＣＣ２７０８として寄託された細胞株によって産生される。好ましくは、抗ヒトＩｇ抗体は、ＭＡＢ  Ｍ−Ｒ１０Ｚ８Ｅ９の可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。より好ましくは、抗ヒトＩｇ抗体は、ＭＡＢ  Ｍ−Ｒ１０Ｚ８Ｅ９の可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインのＣＤＲ領域ならびに非ヒトフレームワークを含む。好ましくは、抗ヒトＩｇ抗体はモノクローナル抗体（抗ヒトＩｇＡｍｂ）である。
【００３６】
抗体の結合特性、特にＫＤｉｓｓ．は、好ましくはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）機器によって評価される。この方法において、結合特性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化によって評価される。検討中の抗体を固相（チップと呼ばれる）に結合させ、そしてこのコートされたチップへのモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはＩｇＧを含む血清さえ、の結合を評価するのが簡便である。
【００３７】
本発明によるイムノアッセイのための固体支持体は当該分野の技術水準で広く記載されている（例えばButler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23参照）。
【００３８】
様々なイムノアッセイの原理は、例えばHage, D.S., Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304Rに記載されている。Lu, B., et al., Analyst. 121 (1996) 29R-32Rは、イムノアッセイにおいて使用するための抗体の方向付けられた固定化を報告している。アビジン−ビオチン媒介イムノアッセイは、例えばWilchek, M. and Bayer, E.A., Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469に報告されている。
【００３９】
本出願内で使用する用語「二重抗原架橋イムノアッセイ」は、異なる、重複しないかまたは干渉しない抗原のエピトープに各々が結合する２つの異なる抗体によって抗原が結合される、サンドイッチ型イムノアッセイを示す。このアッセイにおいて、捕獲抗体、抗原、およびトレーサー抗体を含むサンドイッチが形成され、従って抗原がそれに結合する２つの抗体を架橋する。
【００４０】
モノクローナル抗体およびその定常ドメインは、タンパク質として、表面、タンパク質、ポリマー（例えばＰＥＧ）、セルロース、またはポリスチレン、酵素、または結合対のメンバーのような結合パートナーへの結合のためのいくつかの反応性側鎖を含む。抗体の化学的反応性基は、例えば、アミノ基（リジンのε−アミノ基、α−アミノ基）、チオール基（シスチン、システイン、メチオニン）、カルボン酸基（アスパラギン酸、グルタミン酸）、および糖アルコール基である。そのような方法は、例えばAslam, M. and Dent, A., Bioconjuation, MacMillan Ref. Ltd. (1999), pp. 50-100に記載されている。
【００４１】
用語「試料」は、サル由来の任意の量の物質を含む。そのような物質としては、限定するものではないが、そのような固体由来の全血、血清または血漿が挙げられ、これらは前臨床ルーチンにおいて最も広く使用される試料の供給源である。
【００４２】
用語「固相」は、非液体物質を意味し、そしてポリマー、金属（常磁性、強磁性粒子）、ガラス、およびセラミックスのような材料から作製される粒子（微粒子およびビーズを含む）；シリカ、アルミナ、およびポリマーゲルのようなゲル物質；ポリマー、金属、ガラスおよび／またはセラミックスから作製されうるキャピラリー；ゼオライトおよびその他の多孔性物質；電極；マイクロタイタープレート；固体ストリップ；キュベット、チューブまたはその他の分光計試料容器を含む。アッセイの固相成分は、アッセイが接触しうる不活性固体表面とは、「固相」が、捕獲抗体と相互作用することが意図される少なくとも１つの部分をその表面上に含むという点で区別される。固相は、チューブ、ストリップ、キュベットまたはマイクロタイタープレートのような定常性成分であってもよく、またはビーズおよび微粒子のような非定常性成分であってもよい。微粒子は均一アッセイフォーマットのための固相としても使用することができる。タンパク質およびその他の物質の非共有または共有いずれかの結合を可能にする種々の微粒子を使用しうる。そのような粒子は、ポリスチレンおよびポリ（メチルメタクリラート）のようなポリマー粒子；金ナノ粒子および金コロイドのような金粒子；およびシリカ、ガラスおよび金属酸化物粒子のようなセラミック粒子を含む。例えばMartin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features 70 (1998) 322A-327A（本明細書に参照により組み入れる）参照。
【００４３】
色素原（蛍光性または発光性の基および色素）、酵素、ＮＭＲ活性基または金属粒子、ハプテン、例えばジゴキシゲニンが、検出可能な標識の例である。検出可能な標識は、光活性化可能な架橋基、例えばアジドまたはアジリン基であることもできる。電気化学発光によって検出できる金属キレートも好ましいシグナル発生基であり、特に好ましくはルテニウムキレート、例えばルテニウム（ビスピリジル）３２＋キレートである。適切なルテニウム標識基は、例えばＥＰ０５８０９７９、ＷＯ９０／０５３０１、ＷＯ９０／１１５１１、およびＷＯ９２／１４１３８に記載されている。
【００４４】
イムノアッセイは当業者に周知である。そのようなアッセイを実施するための方法ならびに実際の適用および手順は関連するテキストにまとめられている。関連するテキストの例は、Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, In: Practice and theory of enzyme immunoassays, Burdon, R.H. and v. Knippenberg, P.H. (eds.), Elsevier, Amsterdam (1990) pp. 221-278および免疫学的検出方法を取り扱うColowick, S.P. and Caplan, N.O. (eds.), "Methods in Enzymology", Academic Pressの種々の巻、特に第７０、７３、７４、８４、９２および１２１巻である。
【００４５】
本発明による抗体は、ハイブリドーマ細胞株３．２５．１２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２７９９）、３．２９．１５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８００）、４．３８．３０（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０１）、７．５７．４１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０２）、７．７２．３２（ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０３）（これら自体もまた本発明の態様である）によって産生されることができる。本発明による（すなわちカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない）さらなる抗体を、例えば実施例３に概要を記載する方法を使用して見出すことができる。
【００４６】
あるいは、例えば、第１工程において、同じ標的抗原に結合する２つの抗体のエピトープ重複を、競合試験系の助けで決定する方法を使用することができる。この目的のために、例えば酵素イムノアッセイの助けで、固定化標的抗原への結合について既知の抗体（例えば、本発明による細胞株によって産生された抗体）と問題の抗体が競合する程度を試験する。この目的のために、適切に固定化された標的抗原を、標識形態の既知の抗体および過剰量の問題の抗体とともにインキュベートする。問題の抗体の存在下および非存在下で結合した標識形態の抗体の量を測定することによって、問題の抗体が既知の抗体の結合を置換できる程度を評価することができる。既知の抗体を参照して、同じ濃度で２０％より多い、好ましくは３０％より多い置換、またはより高い濃度で（好ましくは問題の抗体が１０３〜１０５倍過剰の場合に）７０％より多い、好ましくは８０％より多い置換が存在する場合、エピトープ重複が生じており、そして両方の抗体が同じエピトープの同じかまたは重複する部分に結合する。そのような同定された抗体を方法の第２工程において使用する。ここで、ヒトＩｇＧへの第１工程で同定された抗体の結合を決定する。そのような決定を、例えばＥＬＩＳＡ、イムノアッセイまたは表面プラズモン共鳴を用いて行うことができる。ヒトＩｇＧへの結合のないことを決定することができる場合、そのような抗体はカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗体として定義される。あるいは、本発明による抗体を、カニクイザルＩｇＧおよびヒトＩｇＧに対するＫＤｉｓｓ．を別々に測定し、そしてそれらの値を比較することによって同定することができる。
【００４７】
本発明は、薬物抗体および抗薬物抗体の複合体（これを以下でＤＡ／ＡＤＡ複合体として示す）の測定のための免疫学的測定方法を報告する。より詳細には、本発明は、捕獲抗体およびトレーサー抗体を含むサンドイッチ型イムノアッセイを使用するサル種の試料中の薬物抗体（ＤＡ）および前記薬物抗体に対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）の免疫複合体（ＤＡ／ＡＤＡ複合体）の免疫学的測定のための方法であって、前記抗体の一方がカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しそして好ましくはヒトＩｇＧに結合しない抗体であり、そして前記抗体の他方がヒトＩｇＧに特異的に結合しそして好ましくはカニクイザルＩｇＧに結合しない抗体であることを特徴とする、方法を含む。１つの実施態様において、捕獲抗体はヒトＩｇＧに特異的に結合しかつカニクイザルＩｇＧに結合しない抗体であり、そしてトレーサー抗体はカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗体である。異なる実施態様において、捕獲抗体はカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗体であり、そしてトレーサー抗体はヒトＩｇＧに特異的に結合しかつカニクイザルＩｇＧに結合しない抗体である。本発明の別の実施態様は、カニクイザルＩｇＧに特異的に結合する抗体および／またはヒトＩｇＧに特異的に結合する抗体がモノクローナルであるということである。
【００４８】
本発明の方法の好ましい実施態様において、試料は予め決定された量の薬物抗体とプレインキュベートされる。本発明の方法はＤＡ／ＡＤＡ複合体の検出のためのものであるので、これにより、試料中の薬物抗体の存在とは無関係に抗薬物抗体の検出が可能になる（例えば図５および６参照）。
【００４９】
ヒトまたはヒト化薬物抗体とカニクイザルＩｇＧとの間の高い同一性により、薬物抗体の主な抗原決定基はその相補性決定領域である。これらの抗原決定基は好適に抗薬物抗体によって認識される。従って、抗薬物抗体の大部分は対応する薬物抗体の相補性決定領域を認識し、それゆえそれに結合する。抗薬物抗体−薬物抗体複合体の形成は、抗原性エピトープを遮蔽し、従ってサンドイッチアッセイにおける前記複合体の測定と競合する。
【００５０】
抗ヒトＩｇＧ抗体は、例えばＷＯ２００６／０６６９１２に記載されるような、カニクイザルから得られた免疫グロブリン上に存在しないエピトープに特異的に結合する抗体である。好ましい実施態様において、抗ヒトＩｇＧ抗体は、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２７０８によって産生される抗体と同じエピトープへの結合によってさらに特徴付けられ、これは、クラスＧのヒト免疫グロブリンの全てのサブクラス上に存在し、そしてチンパンジーのＩｇＧ以外の大部分の実験動物の免疫グロブリン上には存在しないようであるエピトープへの結合である。さらなる好ましい実施態様において、抗ヒトＩｇＧ抗体は細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２７０８によって産生される抗体である。
【００５１】
驚くべきことに、本発明による方法を用いて、抗薬物抗体の不完全な検出が防止されることが見出された。例えば捕獲分子が抗薬物抗体と同じ抗原決定基（すなわち、薬物抗体のＣＤＲ）に結合する場合、捕獲分子への薬物抗体の結合はこれらのエピトープをブロックし、すなわちそれらを抗薬物抗体について遮蔽し、従って抗薬物抗体が結合しそして検出されることを妨げる。この結果、試料中の抗薬物抗体の不完全な検出がもたらされる。抗薬物抗体は通常薬物抗体に対して低い結合親和性を有し、それゆえ薬物抗体の結合のために抗薬物抗体の両方の抗原結合領域の協同を必要とする。従って、捕獲分子への結合がない可能性があり、これもまた抗薬物抗体の低い検出を導く。それゆえ、抗薬物抗体のＣＤＲを介する捕獲はアッセイに適切ではない。
【００５２】
従って、本発明の１つの態様は、捕獲抗体およびトレーサー抗体を含むサンドイッチイムノアッセイを使用するサル種の試料中の薬物抗体（ＤＡ）および前記薬物抗体に対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）の免疫複合体（ＤＡ／ＡＤＡ複合体）の免疫学的測定のための方法であって、前記抗体の一方がカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗体であり、そして他方の抗体がヒトＩｇＧに特異的に結合しかつカニクイザルＩｇＧに結合しない抗体であることを特徴とする、方法である。この態様の１つの実施態様において、カニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗体は、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２７９９またはＤＳＭ  ＡＣＣ２８００またはＤＳＭ  ＡＣＣ２８０１またはＤＳＭ  ＡＣＣ２８０２またはＤＳＭ  ＡＣＣ２８０３によって産生される。この態様の別の実施態様において、ヒトＩｇＧに特異的に結合しかつカニクイザルＩｇＧに結合しない抗体は、細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２７０８によって産生される。
【００５３】
本発明の方法の１つの実施態様において、形成された複合体の量はＤＡ／ＡＤＡ複合体、ＤＡ、および／またはＡＤＡの濃度に相関する。
【００５４】
別の実施態様において、抗薬物抗体またはＤＡ／ＡＤＡ複合体に結合する捕獲抗体は、抗薬物抗体のＣＤＲまたはＣＤＲに連続的または幾何的に近接したフレームワーク領域に結合しない。
【００５５】
本発明の別の態様は、捕獲抗体およびトレーサー抗体を含むサンドイッチイムノアッセイを使用するサル種の試料中の薬物抗体に対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）の免疫学的測定のための方法であって、捕獲抗体がカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗体であり、そしてトレーサー抗体が薬物抗体であることを特徴とする、方法である。捕獲抗体およびトレーサー抗体を含むサンドイッチイムノアッセイを使用するサル種の試料中の薬物抗体に対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）の免疫学的測定のための方法であって、トレーサー抗体がカニクイザルＩｇＧに特異的に結合しかつヒトＩｇＧに結合しない抗体であり、そして捕獲抗体が薬物抗体であることを特徴とする、方法もまたは態様である。
【００５６】
本発明による好ましいハイブリドーマ細胞株３．２５．１２、３．２９．１５、４．３８．３０、７．５７．４１および７．７２．３２は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germanyに寄託された。
【００５７】
【表１】
2010500388.tif 000003
【００５８】
前記細胞株から得られうる抗体は本発明の実施態様である。
【００５９】
以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために与えられ、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神を逸脱することなく記載の手順に改変がなされうることが理解される。
【００６０】
実施例
実施例１
カニクイザルＩｇＧおよびカニクイザルＦｃフラグメントの調製
ａ）カニクイザルＩｇＧの調製
カニクイザル血清をＡｅｒｏｓｉｌ（登録商標）３８０を用いて脱脂し、そして硫酸アンモニウムを用いて沈殿させた（２．０Mまで）。ペレットをリン酸緩衝液中でホモジナイズし、そしてリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。混合物をｐＨ７．０のＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーによって分離し、そして素通り中のＩｇＧをゲルろ過によって濃縮および精製した。
【００６１】
ｂ）カニクイザルＦｃの調製
ａ）の精製ＩｇＧを１５mMシステインの存在下３７℃、ｐＨ７．０でパパイン（４mUパパイン／mg ＩｇＧ）を用いてフラグメント化した。８０分後、混合物を２５℃でヨードアセトアミド（３０mMまで）とともにインキュベートし、そしてその後３０mM ＮａＣｌを含む１０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。混合物をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換クロマトグラフィーによって分離した。Ｆａｂ画分は素通り中に存在し、そしてＦｃ画分を１Mまでの塩化ナトリウムの塩勾配を使用することによって溶出した。最後に、Ｆｃ画分をリン酸緩衝液に対して透析し、そしてゲルろ過によって精製した。
【００６２】
実施例２
モノクローナル抗カニクイザルＩｇＧ抗体の生成
ａ）マウスの免疫
雌性Ｂａｌｂ／ｃまたはＮＭＲＩマウス（それぞれ８〜１２週齢）をＣＦＡ（フロイント完全アジュバント）と混合した１００μgのカニクイザルＩｇＧ（カニクイザル免疫グロブリンＧ）またはカニクイザルＦｃを用いて腹腔内に一次免疫した。３回のさらなる腹腔内免疫工程を、４、７および１０週後に、ＩＦＡ（フロイント不完全アジュバント）と混合したマウス当たり１００μgのカニクイザルＩｇＧを適用して続けた。次に、融合の３日前に、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水；抗ヒスタミン剤およびアドレナリン添加）中の１００μgのカニクイザルＩｇＧを各々用いて静脈内追加免疫を行った。
【００６３】
ｂ）融合およびクローニング
ａ）に従って免疫したマウスの脾臓細胞のミエローマ細胞との融合をGalfre, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. 73 (1981) 3-46に従って行った。約１×１０８個の脾細胞を約２×１０７個のミエローマ細胞（Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）と混合し、そして遠心分離した（１０分間、３００×ｇおよび４℃）。その後細胞をＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含まないＲＰＭＩ  １６４０培地で１回洗浄し、そして尖った５０mLバイアル中４００×ｇで再度遠心分離した。その後、１mLのＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量４，０００g／mol）を添加し、混合をピペッティングによって実施した。３７℃の水浴中での１分間の後に、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０  ５mLを滴下し、懸濁液を混合し、１０％（v／v）ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０で５０mLにフィルアップし、次いで遠心分離した。沈降した細胞を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０に再懸濁し、そして増殖因子インターロイキン６（ＩＬ−６、１００U／mL）を含有するヒポキサンチン−アザセリン選択培地（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０中１００mmol／Lヒポキサンチン、１μg／mLアザセリン）中でプレーティングした。約１０日後、初代培養物を特異的抗体合成についてアッセイした（実施例３参照）。カニクイザルＩｇＧへの結合を示し、かつヒト正常ＩｇＧとの交差反応を示さない初代培養物をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＡｒｉａ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する９６ウェル細胞培養プレート中への単一細胞沈着によって個別化し、培地は増殖因子インターロイキン６を含んでいた（１００U／mL）。このプロトコルに従うことによって、寄託したクローン（表１）が生成された。本発明に有用な細胞株をDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germanyに寄託した（表１）。
【００６４】
【表２】
2010500388.tif 000004
【００６５】
ｃ）細胞培養上清からの免疫グロブリンの産生
生成されたハイブリドーマ細胞株を、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中に１．０×１０５〜２．２×１０５細胞／mL（個々の細胞株によって）の開始細胞密度（生細胞）で接種し、そして９〜１６日の期間（個々の細胞株によって）スピナー技術で拡大した。回収された培養上清において、３６〜６１μgモノクローナル抗体／mLの濃度が達成された。培養上清からの抗体の精製を標準的なタンパク質化学方法に従って、例えばBruck, C., et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 587- 596に従って行った。
【００６６】
実施例３
抗カニクイザルＩｇＧ抗体の検出のためのスクリーニングアッセイ
ａ）カニクイザルＩｇＧに優先的に結合する抗体についての一次スクリーニング
ハイブリドーマ細胞の培養上清中の抗体の特異性の測定のために、組換えストレプトアビジンで予めコートしたＭＴＰ（マイクロタイタープレート）（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ、Ｂｅｒｎｒｉｅｄ、ロットＭＣ  １０９８）を、１．０％（w／v）ＢＳＡ  ＩＩを補充したＰＢＳ中のそれぞれビオチン化カニクイザルＩｇＧ  ２５０ng／mLまたはビオチン化ヒトＩｇＧ  ２５０ng／mLでコートし（１ウェル当たり１００μL、６０分間周囲温度で振とうしながらのインキュベーション）、次に０．９％（w／v）ＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した。次の工程において、１ウェル当たり、アッセイしようとする抗体溶液（培養上清）１００μLを添加し、そして６０分間周囲温度で振とうしながらインキュベートした。０．９％（w／v）ＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０での３回の洗浄工程の後、１ウェル当たり、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したポリクローナルヒツジ抗マウスＦｃγ抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメント１００μLを、結合した試料抗体の検出のために添加し、そして６０分間周囲温度で振とうしながらインキュベートした。次に、上記のように洗浄を行った。最後に、１ウェル当たり１００μLのＡＢＴＳ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、カタログ番号１６８４３０２）を添加した。３０分間周囲温度でのインキュベーションの後、吸光度（ＯＤ）を４０５および４９２nm［４０５／４９２］で市販のマイクロタイタープレートＥＬＩＳＡリーダー中で測定した。このスクリーニングにより、カニクイザルＩｇＧに十分に結合し、かつヒトＩｇＧに対する交差反応性を示さない／低く示す抗体が選択された。この抗体の選択をさらにアッセイｂ）に供した。
【００６７】
ｂ）ヒトＩｇＧに対する検出可能な交差反応性を有しない抗体の選択
一次スクリーニングａ）の抗体の選択から、ヒトＩｇＧに対する検出可能な交差反応性を示さないものを同定するために、下記のアッセイを行った。組換えストレプトアビジンで予めコートしたＭＴＰ（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ、Ｂｅｒｎｒｉｅｄ、ロットＭＣ  １０９８）を、１．０％ＢＳＡ  ＩＩを含むＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中のビオチン化カニクイザルＩｇＧ  ２５０ng／mLでコートし（１ウェル当たり１００μL、６０分間周囲温度で振とうしながらのインキュベーション）、次に０．９％（w／v）ＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した。次の工程において、それぞれ１ウェル当たり、アッセイしようとする抗体溶液（培養上清）１００μL、およびＰＢＳ（参照シグナル）５０μL、またはヒトＩｇＧの溶液（８０mg／mL；アッセイ中の最終濃度：２７mg／mL；アッセイシグナル）５０μLを添加し、そして６０分間周囲温度で振とうしながらインキュベートした。０．９％（w／v）ＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０での３回の洗浄工程の後、１ウェル当たり、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したポリクローナルヒツジ抗マウスＦｃγ抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメント１００μLを、結合した試料抗体の検出のために添加し、そして６０分間周囲温度で振とうしながらインキュベートした。次に、上記のように洗浄を行った。最後に、１ウェル当たり１００μLのＡＢＴＳ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、カタログ番号１６８４３０２）を添加した。３０分間周囲温度でのインキュベーションの後、吸光度を［４０５／４９２］nmで市販のマイクロタイタープレートＥＬＩＳＡリーダー中で測定した。関連する参照シグナルと有意に異ならないアッセイシグナルを示す抗体をさらなる使用のために選択した。定量的には、これは＜０．００１％のヒトＩｇＧへの交差反応性の評価に相当する。（「有意に異ならない」の定義：アッセイシグナル＝参照シグナルの９０〜１１０％。）
【００６８】
実施例４
カニクイザルＩｇＧ（Ｃｙｎｏ−ＩｇＧ）のヒトＩｇＧ（Ｈ−ＩｇＧ）とのコンジュゲートの調製
ａ）Ｃｙｎｏ−ＩｇＧ−ＳＡＴＰの調製
イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過によってカニクイザル血清から精製したカニクイザルＩｇＧを３０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．１）に対して透析し、そして得られたタンパク質溶液を約１０mg／mlのタンパク質濃度に調整した。Ｎ−スクシンイミジル−３−アセチルチオプロピオナート（ＳＡＴＰ）をＤＭＳＯ中に溶解し、そして抗体溶液に１：５（ＩｇＧ：ＳＡＴＰ）のモル比で添加した。混合物を６０分間２５℃、ｐＨ７．１でインキュベートした。最終濃度１０mMでＬ−リジンを添加することによって反応を停止し、ｐＨをｐＨ６．１に調整し、そして余剰のＳＡＴＰを２００mM  ＮａＣｌおよび１mM  ＥＤＴＡを含む１０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．１）に対する透析によって除去した。
【００６９】
ｂ）Ｈ−ＩｇＧ−ＭＨの調製
イオン交換クロマトグラフィーによってヒト血清から精製したヒトＩｇＧを３０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．１）に対して透析し、そして得られたタンパク質溶液を約２０mg／mlのタンパク質濃度に調整した。マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＨＳ）をＤＭＳＯ中に溶解し、そして抗体溶液に１：６（ＩｇＧ：ＭＨＳ）のモル比で添加した。混合物を６０分間２５℃、ｐＨ７．１でインキュベートした。最終濃度１０mMにＬ−リジンを添加することによって反応を停止し、ｐＨを６．１に調整し、そして余剰のＭＨＳを２００mM  ＮａＣｌおよび１mM  ＥＤＴＡを含む１０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．１）に対する透析によって除去した。
【００７０】
ｃ）Ｃｙｎｏ−ＩｇＧ−ＳＡＴＰのＨ−ＩｇＧ−ＭＨとのコンジュゲーション
２．５％（v／v）１M  ヒドロキシルアミン溶液（ｐＨ７．５）を添加し、そして６０分間２５℃でインキュベートすることによって、Ｃｙｎｏ−ＩｇＧ−ＳＡＴＰをＣｙｎｏ−ＩｇＧ−ＳＨに脱アセチル化した。脱アセチル化した抗体を、Ｈ−ＩｇＧ−ＭＨと、総ＩｇＧ約７mg／mlの最終濃度に混合した（Ｃｙｎｏ−ＩｇＧ−ＳＨ：Ｈ−ＩｇＧ−ＭＨのモル比＝１：１）。ｐＨを７．１に調整し、そして混合物を２５℃でインキュベートした。コンジュゲーションプロセスを分析用ゲルろ過カラム（例えばＴＳＫ３０００）を用いて分析した。一般に、システインを最終濃度２mMに添加することによって、４０分後にコンジュゲーションプロセスを停止した。３０分のインキュベーション時間の後、Ｎ−メチルマレイミド（ＮＭＭ）を５mMの最終濃度に添加し、そしてｐＨを７．５に調整した。６０分間の２５℃でのインキュベーションの後、コンジュゲートをＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００を用いるゲルろ過クロマトグラフィーによって分離して、非コンジュゲート抗体を除去した。
【００７１】
実施例５
ジゴキシゲニン化モノクローナル抗カニクイザルＦｃ抗体の調製
ａ）モノクローナル抗カニクイザルＦｃ抗体の調製
モノクローナル抗カニクイザルＦｃ抗体の発酵上清を約１０倍濃縮し、２０mM  ＴＲＩＳ、１M硫酸アンモニウムを含む緩衝液（ｐＨ９．０）に移し、そしてＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅにアプライした。０．２Mクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）での溶出物をリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。ウシＩｇＧの混入物（発酵ブロス中のＦＣＳに由来する）を、固定化されたウシＩｇＧに対する抗体を用いる免疫吸着によって分離した。
【００７２】
ｂ）モノクローナル抗カニクイザルＦｃ抗体のジゴキシゲニン化
リン酸緩衝液中のモノクローナル抗カニクイザルＦｃ抗体の溶液をｐＨ８．１および約２mg／mlの濃度に調整した。ジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをＤＭＳＯに溶解し、そして抗体溶液に１：５のモル比で添加した。Ｌ−リジンを添加することによって反応を６０分後に停止し、そして余剰の標識試薬を１５０mM  ＮａＣｌを含む５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に対する透析によって除去した。
【００７３】
実施例６
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システムによる抗体結合／特異性の評価
全ての測定を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器を用いＣＭ５チップを使用して行った。抗体でのこのチップのコーティングを、標準的なアミンカップリングによって達成した。別段示さない限り、全てのインキュベーションをＨＢＳ緩衝液（ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中２５℃で行った。飽和量の異なるモノクローナル抗カニクイザルＩｇＧ抗体、ＭＡＢ  Ｍ−Ｒ１０Ｚ８Ｅ９、およびポリクローナル抗ヒトＦｃγ抗体（Ｄｉａｎｏｖａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をそれぞれ同じＣＭ５チップの異なるチャネル上にアミンカップリングによって固定化した。全ての動物血清を１mg／ml  ＣＭ−デキストランを含有するＨＢＳ緩衝液中で最終濃度１％に希釈した。１／１００希釈した血清の注入および６０秒間のインキュベーションによって結合を分析した。チップ表面をＨＢＳ緩衝液で１８０秒間洗浄することによって解離を測定した。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）からのＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、解離定数値（＝ＫＤｉｓｓ．）を、１：１ラングミュアフィッティングモデル（Langmuir fitting model）を用いて算出した。全ての動物血清について、この算出は、ＩｇＧレベルが１５mg／mlであるという仮定に基づいた。試験抗体の注入開始の８０秒後のシグナル値を、結合したＩｇＧの量の比較のために選択した（表２中ＲＵ）。
【００７４】
【表３】
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【００７５】
表２は、モノクローナル抗カニクイザルＩｇＧ抗体がヒト血清と交差反応しないことを示す。カニクイザル、アカゲザルおよびヒヒ血清中に含まれるＩｇＧのみが検出される。モノクローナル抗カニクイザルＩｇＧ抗体とは対照的に、ポリクローナル抗ヒトＦｃ抗体は、ヒト、イヌおよび全ての試験したサル種の血清との高い反応性を示す。
【００７６】
実施例７
ＤＡ／ＡＤＡ複合体についてのアッセイ  −  ＤＡ添加なし
第１工程において、ビオチン化ＭＡＢ  Ｍ−Ｒ１０Ｚ８Ｅ９を、ストレプトアビジンコートマイクロタイタープレート（ＳＡ−ＭＴＰ）のウェルに結合させた。過剰の非結合抗体を洗浄によって除去した。その後、サル血清試料および参照標準（１％カニクイザル血清中にスパイクしたカニクイザルＩｇＧと化学的にコンジュゲートされたヒトＩｇＧ）をウェル中でインキュベートした。非結合物質を洗浄した後、結合したＤＡ／ＡＤＡ複合体をジゴキシゲニン化抗カニクイザル抗体、および続く西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体とのインキュベーションにより検出した。抗体−酵素コンジュゲートは、ＡＢＴＳ（登録商標）基質の呈色反応を触媒する。シグナルを４０５nmの波長でＥＬＩＳＡリーダーによって測定した（参照波長：４９０nm（［４０５／４９０］nm））。各血清試料の吸光度値を二連で測定した。この試験系の模式図を図１に示す。
【００７７】
実施例８
ＤＡ／ＡＤＡ複合体についてのアッセイ  −  ＤＡ添加あり
試料分析の前に、サル血清試料をＰＢＳベースの緩衝液で希釈し、そして薬物抗体をスパイクした。１５分間のプレインキュベーションの後、試料を上記のＥＬＩＳＡを用いて分析した。この試験系の模式図を図２に示す。
【００７８】
実施例９
カニクイザルＰＫ研究の試料中のＤＡ／ＡＤＡ複合体の検出
ＩＧＦ−１Ｒに対するヒト抗体（ＷＯ２００５／００５６３５；３mg／kg；ｉｖ）を用いるカニクイザル単回用量ＰＫ研究（ＰＫ＝薬物動態）の血清試料を上記のＥＬＩＳＡを用いて分析した：ｉ）薬物抗体添加なしのＤＡ／ＡＤＡ複合体の検出（図５）、およびｉｉ）薬物抗体添加ありのＤＡ／ＡＤＡ複合体の検出（図６）。投与後０時間と１１７６時間との間の８つの時点で血清試料を採集しそして分析した。図中、ＤＡ／ＡＤＡ複合体の量（４０５nmのＯＤシグナル）を投与後の時間に対してプロットした。図５に示すように、薬物抗体のインビトロでの添加なしの陽性シグナルは、ＡＤ／ＡＤＡ複合体がインビボで形成された場合、３３６時間と６７２時間との間の血清試料においてのみ検出された（ピーク形状）。抗薬物抗体の非存在下では、免疫複合体は形成されず、そして陽性シグナルは検出されなかった（３３６時間の前の時点）。試料中の薬物の非存在に起因して、投与の６７２時間以降は、複合体は検出可能でなかった。プレインキュベーション工程として血清試料に薬物抗体を添加すると、インビボ形成およびインビトロ形成両方のＤＡ／ＡＤＡ複合体が検出されたかまたは検出可能であった。図６において実証されるように陽性シグナルはＡＤＡの生成のみに依存する。両方の図（図５および６）は薬物−時間曲線とよく相関する。
【００７９】
実施例１０
抗カニクイザル抗体を使用するＡＤＡ検出のためのアッセイ
第１工程において、ビオチン化薬物抗体（ＩＧＦ−１Ｒに対するヒト抗体）を、ストレプトアビジンコートマイクロタイタープレート（ＳＡ−ＭＴＰ）のウェルに結合させた。過剰の非結合抗体を洗浄によって除去した。その後、サル血清試料（ＰＢＳベースの緩衝液で２０倍希釈）および参照標準をインキュベートした。非結合基質を洗浄した後、結合した抗薬物抗体（ＡＤＡ）をジゴキシゲニン化抗カニクイザル抗体、および続く西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体とのインキュベーションにより検出した。抗体−酵素コンジュゲートは、ＡＢＴＳ（登録商標）基質の呈色反応を触媒する。シグナルを４０５nmの波長でＥＬＩＳＡリーダーによって測定した（参照波長：４９０nm）。各血清試料の吸光度値を三連で測定した。この試験系の模式図を図３に示す。
【００８０】
実施例１１
カニクイザルＩｇＧに対するポリクローナル抗体の調製
ａ）ウサギ血清からのポリクローナル抗体の精製
ウサギを標準的な方法に従ってカニクイザルＦｃで免疫した。カニクイザルＦｃで免疫した５羽のウサギの生血清において、脂質成分をＡｅｒｏｓｉｌ（１．５％（w／v））を用いる脱脂によって除去し、そして免疫グロブリンを硫酸アンモニウム（１．７M）を用いて沈殿させた。酸処理（３０分間、ｐＨ５．５）および５０mM  ＮａＣｌを補充した１５mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対する透析の後、混合物をｐＨ７．０のＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーによって分離し、そして素通り中のＩｇＧ画分（＝ウサギポリクローナル抗カニクイザルＩｇＧ抗体）を約２５mg／mlに濃縮した。
【００８１】
ｂ）ヒトＩｇＧに対する交差反応性を有しないアフィニティ精製ポリクローナルウサギ抗カニクイザルＩｇＧ抗体（ｐＡｂ＜Ｃｙｎｏ−ＩｇＧ＞）の調製
工程ａ）の濃縮ＩｇＧ画分を１５０mM  ＮａＣｌを補充した５０mMリン酸カリウム（ｐＨ７．５）（ＰＢＳ）を用いる緩衝液系に移した。固定化カニクイザルＩｇＧ（当該分野の技術水準によるカニクイザルＩｇＧのＮＨＳ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅへのコンジュゲーションによって調製）を含む免疫吸着剤をカラムに充填し、そして１５０mM  ＮａＣｌを補充した５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した。
【００８２】
１０mg  ＩｇＧ／ml免疫吸着剤を、ＰＢＳで平衡化したカラムにアプライした。カラムを、ＰＢＳ、０．０５％（w／v）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を補充した０．５M  ＮａＣｌ、および３０mM  ＮａＣｌで連続的に洗浄した。アフィニティマトリックスに特異的に結合したＩｇＧを３mM  ＨＣｌおよび１Mプロピオン酸を用いて溶出し、そしてＰＢＳに対して透析した。
【００８３】
ヒトＩｇＧに対する交差反応性を有する抗体を除去するために、アフィニティ精製した抗体を、固定化ヒトＩｇＧ（当該分野の技術水準による非特異的ヒトＩｇＧのＮＨＳ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅへのコンジュゲーションによって調製）を含むアフィニティカラムにアプライした。カラムをＰＢＳで平衡化した。約６mg  ＩｇＧ／ml免疫吸着剤をカラムにアプライした。特異的ポリクローナルＩｇＧ画分は素通り中に存在する。０．０５％（w／v）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を補充した０．５M  ＮａＣｌでのカラムの再生の後、３０mM  ＮａＣｌ、１Mプロピオン酸、およびＰＢＳ。非特異的に結合しているＩｇＧの免疫吸着を２回反復して、ヒトＩｇＧに対する交差反応性を有する抗体を完全に除去した。
【００８４】
得られた、ヒトＩｇＧに対する交差反応性を有しない精製ポリクローナル抗カニクイザルＩｇＧ抗体を、約４mg／mlに濃縮し、そして−８０℃で貯蔵した。
【００８５】
実施例１２
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システムによるポリクローナルウサギ抗カニクイザルＦｃ抗体（ｐＡｂ＜Ｃｙｎｏ−Ｆｃ＞）の抗体結合／特異性の評価
全ての測定を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器を用いＣＭ５チップを使用して行った。抗体でのこのチップのコーティングを、標準的なアミンカップリングによって達成した。別段示さない限り、全てのインキュベーションをＨＢＳ緩衝液（ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中２５℃で行った。飽和量のポリクローナル抗カニクイザルＩｇＧ抗体をＣＭ５チップ上にアミンカップリングによって固定化した。全ての動物血清を１mg／ml  ＣＭ−デキストランを含有するＨＢＳ緩衝液中で最終濃度１％に希釈した。１／１００希釈した血清の注入および６０秒間のインキュベーションによって結合を分析した。チップ表面をＨＢＳ緩衝液で１８０秒間洗浄することによって解離を測定した。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）からのＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、解離定数値（＝ＫＤｉｓｓ．）を、１：１ラングミュアフィッティングモデルを用いて算出した。全ての動物血清について、この算出は、ＩｇＧレベルが１５mg／mlであるという仮定に基づいた。試験抗体の注入開始の８０秒後のシグナル値を、結合したＩｇＧの量の比較のために選択した（表３中ＲＵ）。
【００８６】
【表４】
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【００８７】
表３は、ポリクローナル抗カニクイザルＩｇＧ抗体がヒト血清と交差反応しないことを示す。マーモセット、カニクイザル、アカゲザルおよびヒヒ血清中に含まれるサルＩｇＧのみが検出される。モノクローナル抗カニクイザルＩｇＧ抗体とは対照的に、ポリクローナル抗カニクイザルＩｇＧ抗体は、ＮＭＲＩ−マウスの血清との反応性を示す。また、ポリクローナル抗カニクイザルＩｇＧ抗体は、ヒトＩｇＧに結合せず、そしてサルＩｇＧおよびマウスＩｇＧに対する反応性の間に少なくとも１００倍の反応性の差異を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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