(57)【要約】本発明は、アンジオポエチン／Ｔｉｅ２シグナル伝達経路における分子の発現を調節する核酸分子を提供する。前記核酸分子を使用する方法も提供する。本発明の１つの態様は、アンジオポエチン−１（Ａｎｇ−１）、アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）、または免疫グロブリンおよびＥＧＦ因子相同ドメインを有するチロシンキナーゼ（Ｔｉｅ２）遺伝子の発現を減少させる核酸分子を提供し、この核酸分子は、配列番号：１〜６４８のいずれか１つを含む、またはターゲットにする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンジオポエチン−１（Ａｎｇ−１）、アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）、または免疫グロブリンおよびＥＧＦ因子相同ドメインを有するチロシンキナーゼ（Ｔｉｅ２）遺伝子の発現を減少させる核酸分子であって、配列番号：１〜６４８のいずれか１つを含むかまたはターゲットにする核酸分子。
【請求項２】
Ａｎｇ−２遺伝子の発現を減少させる核酸分子であって、配列番号４８７、４８９、５２５、５２６、５５３、５５４、６３９、６４０、６４３および６４４のいずれか１つを含むかまたはターゲットにする核酸分子。
【請求項３】
短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
２５塩基対平滑末端ｓｉＲＮＡ分子である、請求項３に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分子を含む組成物。
【請求項６】
医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ナノ粒子をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
ヒスチジン−リシンコポリマーをさらに含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ターゲッティング部分をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
１つ以上の追加の治療薬をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
ＲＮＡ干渉を誘発し、対象となる遺伝子の発現を減少させる１つ以上の追加の核酸分子をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１２】
前記１つ以上の追加の核酸分子が、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、またはＴｉｅ−２の発現を減少させる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項４に記載のｓｉＲＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞におけるＡｎｇ−１、Ａｎｇ−２、またはＴｉｅ−２遺伝子のタンパク質レベル発現を減少させるための方法。
【請求項１４】
血管新生を減少させる必要がある被験者において血管新生を減少させる方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子；請求項４に記載のｓｉＲＮＡ分子；または請求項５〜１２のいずれか一項に記載の組成物を該被験者に投与することを含む方法。
【請求項１５】
癌を治療する必要がある被験者において癌を治療する方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子；請求項４に記載のｓｉＲＮＡ分子；または請求項５〜１２のいずれか一項に記載の組成物を該被験者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００７年７月６日に出願された米国仮特許出願第６０／９５８，５１９号、２００７年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／９６６，０８５号、および２００８年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／１３１，８７６号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、分子生物学の分野に存するものであり、アンジオポエチン／Ｔｉｅ２シグナル伝達経路における分子の発現を調節するための短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
アンジオポエチン／Ｔｉｅ２シグナル伝達経路は、幾つかのタイプの癌誘発血管新生に関係づけられている。Ａｎｇ−Ｔｉｅ経路内の幾つかの分子が同定されている（例えば、表１および１３参照）。それらの１つが受容体分子Ｔｉｅ２（ＴＩＥ−２、ＴＥＫまたは上皮特異的タンパク質受容体チロシンキナーゼ、ＴＥＫチロシンキナーゼとも呼ばれる、免疫グロブリンおよびＥＧＦ因子相同ドメインを有するチロシンキナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  ＥＧＦ  ｆａｃｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎｓ））であり、これは、ほぼ排他的に血管内皮細胞（ＥＣ）上で発現される（非特許文献１）。Ｔｉｅ２に結合するリガンドとしては、アンジオポエチン−１およびアンジオポエチン−２が挙げられる（非特許文献２）。
【０００４】
【表１】
2010532662.tif 000002
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓａｔｏら，１９９８，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１２１７−１２２７
【非特許文献２】Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓら，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：２４２−２４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、Ａｎｇ−Ｔｉｅ経路をターゲットにする治療薬が緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の１つの態様は、アンジオポエチン−１（Ａｎｇ−１）、アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）、または免疫グロブリンおよびＥＧＦ因子相同ドメインを有するチロシンキナーゼ（Ｔｉｅ２）遺伝子の発現を減少させる核酸分子を提供し、この核酸分子は、配列番号：１〜６４８のいずれか１つを含む、またはターゲットにする。本発明は、Ａｎｇ−２遺伝子の発現を減少させる核酸分子も提供し、この核酸分子は、配列番号４８７、４８９、５２５、５２６、５５３、５５４、６３９、６４０、６４３および６４４のいずれか１つを含む、またはターゲットにする。特定の実施形態において、本核酸分子は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。好ましい実施形態において、本発明は、平滑末端を有する２５塩基対のｓｉＲＮＡを提供する。
【０００８】
本発明は、配列番号：１〜６４８のいずれか１つを含むかまたはターゲットにする核酸分子と医薬的に許容される担体とを含む組成物も提供する。１つの実施形態において、本組成物は、ヒスチジン−リシンコポリマーをさらに含む。さらなる実施形態において、本組成物は、ターゲッティング部分をさらに含む。本組成物は、１つ以上の追加の治療薬も含む場合がある。
【０００９】
本発明は、多数の病原性遺伝子をターゲットにするまたは同じ遺伝子内の異なる配列をターゲットにする核酸分子の組み合わせも提供する。１つの態様において、本発明は、配列番号：１〜６４８のいずれか１つを含むかまたはターゲットにする核酸分子を含み、且つ、ＲＮＡ干渉を誘発し、対象となる遺伝子の発現を減少させる１つ以上の追加の核酸分子をさらに含む組成物を提供する。１つの実施形態において、前記１つ以上の追加の核酸分子は、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、またはＴｉｅ−２の発現を減少させる。
【００１０】
本発明は、細胞におけるＡｎｇ−１、Ａｎｇ−２またはＴｉｅ２遺伝子のタンパク質レベル発現を減少させるための方法をさらに提供し、この方法は、本発明の核酸分子またはｓｉＲＮＡ分子のいずれかをその細胞に導入することを含む。本発明は、その必要がある被験者において血管新生を減少させる方法も提供し、この方法は、本発明の核酸分子、ｓｉＲＮＡ分子または組成物のいずれかをその被験者に投与することを含む。加えて、本発明は、その必要がある被験者において癌を治療する方法も提供し、この方法は、本発明の核酸分子、ｓｉＲＮＡ分子または組成物のいずれかをその被験者に投与することを含む。
【００１１】
本発明のこれらのおよび他の態様は、後続の「発明を実施するための形態」を参照すことにより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ｓｉＲＮＡトランスフェクション後２４時間の時点でのヒト臍帯静脈内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞におけるｓｉＲＮＡ分子によるヒトＡｎｇ−２のインビトロ阻害を図示する棒グラフである。
【００１３】
表１１に挙げるヒトＡｎｇ−２−ｓｉＲＮＡ配列のヒトＡｎｇ−２遺伝子サイレンシング活性をＨＵＶＥＣ細胞において試験した。ｘ軸上の表示＃１〜＃４８は、表１１における１〜４８の番号のｓｉＲＮＡ配列に対応する。リバーストランスフェクションに基づくハイスループット（ＨＴＰ）法と１０ｎＭのｓｉＲＮＡデュプレックスを用いて、ＨＵＶＥＣ細胞をＡｎｇ−２−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ルシフェラーゼ特異的２５−ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡを陰性対照（Ｌｕｃ）として使用した。ヒトＡｎｇ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用して培地中のＡｎｇ−２タンパク質の濃度を測定することにより、ｓｉＲＮＡ媒介Ａｎｇ−２ノックダウン効果をモニターした。試験した４８のＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ候補の大多数でトランスフェクション後２４時間の時点でトランスフェクトＨＵＶＥＣ細胞においてＡｎｇ−２タンパク質レベル発現の有意な阻害が観察された。
【図２】ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の時点でのＨＵＶＥＣ細胞におけるｓｉＲＮＡ分子によるヒトＡｎｇ−２のインビトロ阻害を図示する棒グラフである。
【００１４】
表１１に挙げるヒトＡｎｇ−２−ｓｉＲＮＡ配列のヒトＡｎｇ−２遺伝子サイレンシング活性をＨＵＶＥＣ細胞において試験した。ｘ軸上の表示１〜４８は、表１１における１〜４８の番号のｓｉＲＮＡ配列に対応する。リバーストランスフェクションに基づくハイスループット（ＨＴＰ）法と１０ｎＭのｓｉＲＮＡデュプレックスを用いて、ＨＵＶＥＣ細胞をＡｎｇ−２−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ルシフェラーゼ特異的２５−ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡを陰性対照（Ｌｕｃ）として使用した。ヒトＡｎｇ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用して培地中のＡｎｇ−２タンパク質の濃度を測定することにより、ｓｉＲＮＡ媒介Ａｎｇ−２ノックダウン効果をモニターした。ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の時点で、トランスフェクトＨＵＶＥＣ細胞の５０％より多くが、ｍｏｃｋ対照と比較して２０％未満のＡｎｇ−２タンパク質を発現する。
【図３】ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の時点でのＨＵＶＥＣ細胞におけるｓｉＲＮＡ分子によるヒトＡｎｇ−２の阻害の百分率を図示する棒グラフである。
【００１５】
表１１に挙げるヒトＡｎｇ−２−ｓｉＲＮＡ配列のヒトＡｎｇ−２遺伝子サイレンシング活性をＨＵＶＥＣ細胞において試験した。ｘ軸上の表示１〜４８は、表１１における１〜４８の番号のｓｉＲＮＡ配列に対応する。リバーストランスフェクションに基づくハイスループット（ＨＴＰ）法と１０ｎＭのｓｉＲＮＡデュプレックスを用いて、ＨＵＶＥＣ細胞をＡｎｇ−２−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ルシフェラーゼ特異的２５−ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡを陰性対照として使用した。ヒトＡｎｇ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用して培地中のＡｎｇ−２タンパク質の濃度を測定することにより、ｓｉＲＮＡ媒介Ａｎｇ−２ノックダウン効果をモニターした。トランスフェクション後４８時間の時点で、Ａｎｇ−２発現に対するＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡの阻害効果は、より顕著であり、Ａｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ候補の５０％より多くが、対照Ｌｕｃ−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞と比較して８０％より多くのＡｎｇ−２発現ノックダウンを示した。
【図４】ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の時点での１０ｎＭヒトＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ分子でトランスフェクトしたＨＵＶＥＣ細胞の細胞生存度を図示する棒グラフである。
【００１６】
リバーストランスフェクションに基づくハイスループット（ＨＴＰ）法と１０ｎＭのｓｉＲＮＡデュプレックスを用いて、ＨＵＶＥＣ細胞をＡｎｇ−２−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ｘ軸上の表示２〜４８は、表１１における２〜４８の番号のｓｉＲＮＡ配列に対応する。ルシフェラーゼ特異的２５−ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡを陰性対照（Ｌｕｃ）として使用した。ＷＳＴ−１アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、トランスフェクト細胞の細胞生存度を測定した。Ａｎｇ−２発現のノックダウンに関連した、トランスフェクトＨＵＶＥＣ細胞における有意な細胞毒性は無かった。
【図５】ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の時点でのＨＵＶＥＣ細胞における２ｎＭのｓｉＲＮＡ分子によるヒトＡｎｇ−２のインビトロ阻害を図示する棒グラフである。
【００１７】
表１１に挙げるヒトＡｎｇ−２−ｓｉＲＮＡ配列のヒトＡｎｇ−２遺伝子サイレンシング活性をＨＵＶＥＣ細胞においてさらに確認した。ｘ軸上の表示は、表１１におけるｓｉＲＮＡ配列番号に対応する。リバーストランスフェクションに基づくハイスループット（ＨＴＰ）法と２ｎＭのｓｉＲＮＡデュプレックスを用いて、ＨＵＶＥＣ細胞をＡｎｇ−２−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ｄＴｄＴ  ３’−オーバーハングを両方の鎖上に有する１９−ｎｔ  ２本鎖領域を有し、且つ、任意の既知ヒト遺伝子を有する有意な相同配列を有さない、対照（Ｃｔｒｌ−）ｓｉＲＮＡを陰性対照として使用した。ヒトＡｎｇ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用して培地中のＡｎｇ−２タンパク質の濃度を測定することにより、ｓｉＲＮＡ媒介Ａｎｇ−２ノックダウン効果をモニターした。トランスフェクション後４８時間の時点で、トランスフェクトＨＵＶＥＣ細胞の大部分が、ｍｏｃｋ対照と比較して１６％未満のＡｎｇ−２タンパク質を発現する。
【図６】ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の時点でのＨＵＶＥＣ細胞における２ｎＭのｓｉＲＮＡ分子によるヒトＡｎｇ−２の阻害の百分率を図示する棒グラフである。
【００１８】
リバーストランスフェクションに基づくハイスループット（ＨＴＰ）法と２ｎＭのｓｉＲＮＡデュプレックスを用いて、ＨＵＶＥＣ細胞をＡｎｇ−２−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。対照（Ｃｔｒｌ−）ｓｉＲＮＡを陰性対照として使用した。ヒトＡｎｇ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用して培地中のＡｎｇ−２タンパク質の濃度を測定することにより、ｓｉＲＮＡ媒介Ａｎｇ−２ノックダウン効果をモニターした。トランスフェクション後４８時間の時点で、Ａｎｇ−２  ｓｉＲＮＡの大部分が、９０％より多いＡｎｇ−２発現ノックダウンを明示した。
【図７】ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の時点での２ｎＭのヒトＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ分子でトランスフェクトしたＨＵＶＥＣ細胞の細胞生存度を図示する棒グラフである。
【００１９】
リバーストランスフェクションに基づくハイスループット（ＨＴＰ）法と２ｎＭのｓｉＲＮＡデュプレックスを用いて、ＨＵＶＥＣ細胞をＡｎｇ−２−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ｘ軸上の表示は、表１１におけるｓｉＲＮＡ配列番号に対応する。ｄＴｄＴ  ３’−オーバーハングを両方の鎖上に有する１９−ｎｔ  ２本鎖領域を有し、且つ、任意の既知ヒト遺伝子を有する有意な相同配列を有さない、対照（Ｃｔｒｌ−）ｓｉＲＮＡを陰性対照として使用した。ＷＳＴ−１アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、トランスフェクト細胞の細胞生存度を測定した。Ａｎｇ−２発現のノックダウンに関連した、トランスフェクトＨＵＶＥＣ細胞における有意な細胞毒性はなかった。
【図８】ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の時点でのＨＵＶＥＣ細胞における０．２ｎＭのｓｉＲＮＡ分子によるヒトＡｎｇ−２のインビトロ阻害を図示する棒グラフである。
【００２０】
表１１に挙げるヒトＡｎｇ−２−ｓｉＲＮＡ配列のヒトＡｎｇ−２遺伝子サイレンシング活性をＨＵＶＥＣ細胞においてさらに確認した。ｘ軸上の番号表示は、表１１におけるｓｉＲＮＡ配列番号に対応する。リバーストランスフェクションに基づくハイスループット（ＨＴＰ）法と０．２ｎＭのｓｉＲＮＡデュプレックスを用いて、ＨＵＶＥＣ細胞をＡｎｇ−２−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。対照（Ｃｔｒｌ−）ｓｉＲＮＡを陰性対照として使用した。ヒトＡｎｇ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用して培地中のＡｎｇ−２タンパク質の濃度を測定することにより、ｓｉＲＮＡ媒介Ａｎｇ−２ノックダウン効果をモニターした。トランスフェクション後４８時間の時点で、トランスフェクトＨＵＶＥＣ細胞の一部が、ｍｏｃｋ対照と比較して６０％未満のＡｎｇ−２タンパク質を発現する。丸を付けたｓｉＲＮＡ配列番号をさらなる実験に使用した。それらの結果を図９および１０に示す。
【図９】ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の時点でのＨＵＶＥＣ細胞における選択したＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡのＩＣ５０値の決定を図示する３つの折れ線グラフを示す。
【００２１】
それぞれのｓｉＲＮＡデュプレックス（表１１における＃１０（図９Ａ）、＃１４（図９Ｂ）、および＃３１（図９Ｃ））の１０の希釈物でＨＵＶＥＣ細胞をトランスフェクトした。前記希釈物は、０．０７６ｐＭ、０．３１ｐＭ、１．２ｐＭ、４．９ｐＭ、１９．５ｐＭ、７８．１ｐＭ、３１２．５ｐＭ、１．２５ｎＭ、５ｎＭ、および２０ｎＭであった。ヒトＡｎｇ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用して培地中のＡｎｇ−２タンパク質の濃度を測定することにより、ｓｉＲＮＡ媒介Ａｎｇ−２ノックダウン効果をモニターした。Ａｎｇ−２濃度の正規化のためにＷＳＴ−１アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、トランスフェクト細胞の細胞生存度を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の時点でのＨＵＶＥＣ細胞におけるそれぞれのｓｉＲＮＡデュプレックスのＩＣ５０値を得た。Ａｎｇ−２−２５−１０のＩＣ５０は、０．３６３ｎＭであり、Ａｎｇ−２−２５−１４のＩＣ５０は、０．４９４ｎＭであり、およびＡｎｇ−２−１５−３１のＩＣ５０は、０．３９８ｎＭであった。
【図１０】ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の時点でのＨＵＶＥＣ細胞における選択したヒト／マウスＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡのＩＣ５０値の決定を図示する２つの折れ線グラフを示す。
【００２２】
それぞれのｓｉＲＮＡデュプレックス（表１１における＃２５（図１０Ａ）および＃４５（図１０Ｂ））の１０の希釈物でＨＵＶＥＣ細胞をトランスフェクトした。前記希釈物は、０．０７６ｐＭ、０．３１ｐＭ、１．２ｐＭ、４．９ｐＭ、１９．５ｐＭ、７８．１ｐＭ、３１２．５ｐＭ、１．２５ｎＭ、５ｎＭ、および２０ｎＭであった。ヒトＡｎｇ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用して培地中のＡｎｇ−２タンパク質の濃度を測定することにより、ｓｉＲＮＡ媒介Ａｎｇ−２ノックダウン効果をモニターした。Ａｎｇ−２濃度の正規化のためにＷＳＴ−１アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、トランスフェクト細胞の細胞生存度を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の時点でのＨＵＶＥＣ細胞におけるそれぞれのｓｉＲＮＡデュプレックスのＩＣ５０値を得た。Ａｎｇ−２−２５−２５のＩＣ５０は、１．６３４ｎＭであり、およびＡｎｇ−２−２５−４５のＩＣ５０は、０．９０ｎＭであった。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、望ましくない血管新生（多くの場合、血管の異常なまたは過剰な増殖および成長）を伴う疾患を治療するための組成物および方法を提供する。血管新生は、正常な生体プロセスである場合もあるので、好ましくは病的組織に対する選択性をもって望ましくない血管新生の阻害を遂行し、好ましくは、これは、ターゲッティングされたナノ粒子を使用するその病的組織への治療用分子の選択的送達を必要とする。本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘発する核酸分子による、Ａｎｇ−Ｔｉｅ生化学経路の選択的阻害（Ａｎｇ−Ｔｉｅ経路遺伝子発現の阻害、および病的血管形成性組織に局限された阻害を含む）によって血管新生を制御する組成物および方法を提供する。本発明は、ポリマーコンジュゲートを含み、且つ、ＲＮＡｉを誘発する核酸分子をさらに含む、組織ターゲッティング型ナノ粒子組成物を使用する組成物および方法も提供する。
【００２４】
本発明をここで詳細に説明するが、当業者には本発明の完全な範囲が正しく認識されるであろう。
【００２５】
Ａｎｇ／Ｔｉｅ２経路遺伝子阻害のための核酸分子
本発明は、ＲＮＡｉによるＡｎｇ／Ｔｉｅ２経路における遺伝子のターゲッティングおよびサイレンシングのための、様々な物理化学的構造を有する核酸分子を提供する。１つの実施形態において、本発明は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５、９６、９７、９８、９９または１００％のＡｎｇ−１、Ａｎｇ−２またはＴｉｅ２  ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの低下を生じさせる結果となる核酸分子を提供する。この減少は、本核酸分子の投与後２４時間までに、３６時間までに、４８時間までに、６０時間までに、または７２時間までに生じ得る。この減少を生じさせる核酸分子を１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡ、５ｎＭ  ｓｉＲＮＡ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、または０．２ｎＭ当量で投与することができる。１つの実施形態において、本核酸分子は、０．７５ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、または０．４ｎＭ以下の、Ａｎｇ−２タンパク質レベルを減少させるためのＩＣ５０を有することができる。
【００２６】
本発明の核酸分子は、ｄｓＲＮＡである場合もあり、またはｓｓＲＮＡである場合もある。本発明の１つの実施形態において、本核酸分子は、ｓｉＲＮＡである。本核酸分子は、１５〜５０、１５〜３０、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５の塩基対を含むことがある。本核酸分子は、５’−または３’−１本鎖オーバーハングを含むことがある。一定の実施形態において、本核酸分子は、平滑末端を有する。好ましい実施形態において、本核酸分子は、平滑末端を有する２５塩基対の２本鎖ｓｉＲＮＡである。Ａｎｇ／Ｔｉｅ２経路遺伝子をターゲットにする本発明の具体例としてのｓｉＲＮＡ配列を表２〜１０に示す。（表２〜１０に挙げるすべての配列については、ＡＴＧコドンの「Ａ」を位置１であるとみなするように位置を表示する）。平滑末端を有する２５塩基対２本鎖ＲＮＡを有するｓｉＲＮＡが、最も大きな阻害期間を有する最も強力な阻害剤の幾つかであることが以前に判明した（ＷＯ  ０６／１１０８１３）。加えて、非自然発生化学的類似体の組込みが、本発明の一部の実施形態では有用であり得る。そのような類似体としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＬＮＡおよびＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドの２’−Ｏ−メチルリボース類似体、ならびに核酸オリゴヌクレオチドの他の化学的類似体が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、ヒトｍＲＮＡと、他の非ヒト哺乳動物種、例えば霊長類、マウスまたはラット、における相同または相似ｍＲＮＡの両方をターゲットにする。
【００２７】
【表２−１】
2010532662.tif 000003
【００２８】
【表２−２】
2010532662.tif 000004
【００２９】
【表２−３】
2010532662.tif 000005
【００３０】
【表２−４】
2010532662.tif 000006
【００３１】
【表２−５】
2010532662.tif 000007
【００３２】
【表２−６】
2010532662.tif 000008
【００３３】
【表３−１】
2010532662.tif 000009
【００３４】
【表３−２】
2010532662.tif 000010
【００３５】
【表３−３】
2010532662.tif 000011
【００３６】
【表３−４】
2010532662.tif 000012
【００３７】
【表４】
2010532662.tif 000013
【００３８】
【表５−１】
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【００３９】
【表５−２】
2010532662.tif 000015
【００４０】
【表５−３】
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【００４１】
【表５−４】
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【００４２】
【表５−５】
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【００４３】
【表６−１】
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【００４４】
【表６−２】
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【００４５】
【表７】
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【００４６】
【表８−１】
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【００４７】
【表８−２】
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【００４８】
【表８−３】
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【００４９】
【表８−４】
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【００５０】
【表８−５】
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【００５１】
【表８−６】
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【００５２】
【表９−１】
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【００５３】
【表９−２】
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【００５４】
【表１０】
2010532662.tif 000030
本発明は、Ａｎｇ−Ｔｉｅ経路において活性な個々の遺伝子または遺伝子の組み合わせを阻害するための方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、望ましくない血管新生を随伴する組織における血管新生を阻害または減少させる方法を提供し、この方法は、Ｔｉｅ２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子をその組織に投与して、Ｔｉｅ２の発現を減少させることを含む。一部の実施形態において、本発明は、望ましくない血管新生を随伴する組織における血管新生を阻害または減少させる方法を提供し、この方法は、Ａｎｇ−１をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子をその組織に投与して、Ａｎｇ−１を減少させることを含む。さらなる実施形態において、本発明は、望ましくない血管新生を随伴する組織における血管新生を阻害または減少させる方法を提供し、この方法は、Ａｎｇ−２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子をその組織に投与して、Ａｎｇ−２を減少させることを含む。１つの実施形態において、前記組織は腫瘍である。
【００５５】
複合Ａｎｇ／Ｔｉｅ２経路遺伝子阻害
血管新生を阻害するための本発明の組成物および方法は、幾つかの基本態様に基づく。第一に、病的血管新生は複合プロセスであり、また、罹病組織において異常発現または過発現される多数のタンパク質の相互作用に起因する。第二に、ＲＮＡｉを活性化する核酸物質は、配列特異的様式で高選択的である。第三に、タンパク質活性の調節による血管新生の阻害は、タンパク質機能の阻害（アンタゴニスト）、タンパク質機能の刺激（アゴニスト）、タンパク質発現レベルの低下およびタンパク質の翻訳後修飾をはじめとする（しかし、これらに限定されない）多くの方法によって効果を生じ得る。重要なこととして、疾患を治療する際、リガンドおよびそれらの受容体の機能を同時に遮断することにより、受容体活性と下流のシグナル伝達タンパク質の活性を同時に遮断することにより、ならびに／またはある経路の重複要素を同時に遮断することにより、疾患の進行に重要である特定の生体経路を有効に閉鎖することが望ましいことがある。そのような方法をＡｎｇ／Ｔｉｅ２経路を含むものをはじめとする血管新生関連疾患の治療に用いることができる。
【００５６】
臨床研究によって顕著な治療効力が実証されたが、成分の異なる起源、異なる製造プロセスおよび異なる化学的性質のため、より高い投薬量の毒性および長期安全性が大きな懸念である。
【００５７】
これらの問題を克服するために、本発明の態様は、同じ治療の際に多数の病原性遺伝子をターゲットにするまたは同じ遺伝子内の異なる配列をターゲットにする核酸分子（ｓｉＲＮＡを含む）の併用で独特な利点をもたらすための、すなわちコンビナトリアル効果を達成するための、核酸分子（ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む）の組成物および使用方法を提供する。本発明の組成物および方法の１つの利点は、すべてのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドが、化学的に、薬理学的に、非常に類似しており、ならびに同じ源からおよび同じ製造プロセスを用いて生産することができる点である。本発明が提供するもう１つの利点は、多数のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをナノ粒子製剤などの単一製剤に調合できる点である。
【００５８】
従って、本発明の１つの態様は、ｓｉＲＮＡをはじめとする核酸分子を併用して、Ａｎｇ／Ｔｉｅ２経路における多数の遺伝子の特異的で選択的なサイレンシングを達成すること、および結果として、血管新生関連疾患の抑制を達成することおよびより良好な臨床恩恵を獲得することである。本発明は、Ｔｉｅ２、Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２から選択される２つ以上のターゲットの組み合わせをはじめとする、ｓｉＲＮＡターゲットの組み合わせに備えている。本発明は、Ａｎｇ／Ｔｉｅ２経路における同じ遺伝子内の１つ以上の配列をターゲットにするｓｉＲＮＡの併用にも備えている。これらのｍＲＮＡをサイレンシングする具体例としてのｓｉＲＮＡ配列を表２〜１０に挙げる。そのようなｓｉＲＮＡ組成物を、他の血管新生経路、例えばＶＥＧＦ経路、ＰＤＧＦおよびＥＧＦならびにそれらの受容体、下流シグナル伝達因子（ＲＡＦおよびＡＫＴを含む）、ならびに転写因子（ＮＦκＢを含む）、をターゲットにするｓｉＲＮＡと併用することもできる。そのようなｓｉＲＮＡ組成物を、Ｔｉｅ２、Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２の下流の遺伝子をターゲットにするｓｉＲＮＡと併用することもできる。
【００５９】
１つの実施形態では、Ｔｉｅ２とそのリガンドのうちの２つ、Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２、とを阻害するｓｉＲＮＡの併用を用いる。一部の実施形態では、Ｔｉｅ２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子とＡｎｇ−１をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子の併用を用いて、Ｔｉｅ２とＡｎｇ−１の両方の発現を減少させる。一部の実施形態では、Ｔｉｅ２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子とＡｎｇ−２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子の併用を用いて、Ｔｉｅ２とＡｎｇ−２の両方の発現を減少させる。一部の実施形態では、Ａｎｇ−１をターゲットするｓｉＲＮＡ分子とＡｎｇ−２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子の併用を用いて、Ａｎｇ−１とＡｎｇ−２の両方の発現を減少させる。
【００６０】
一部の実施形態において、本発明は、望ましくない血管新生を随伴する組織における血管新生を阻害または減少させる方法を提供し、この方法は、Ｔｉｅ２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子およびＡｎｇ−１をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子をその組織に投与して、Ｔｉｅ２およびＡｎｇ−１の発現を減少させることを含む。一部の実施形態において、本発明は、望ましくない血管新生を随伴する組織における血管新生を阻害または減少させる方法を提供し、この方法は、Ｔｉｅ２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子およびＡｎｇ−２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子をその組織に投与して、Ｔｉｅ２およびＡｎｇ−２の発現を減少させることを含む。一部の実施形態において、本発明は、望ましくない血管新生を随伴する組織における血管新生を阻害または減少させる方法を提供し、この方法は、Ａｎｇ−１をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子およびＡｎｇ−２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子をその組織に投与して、Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２の発現を減少させることを含む。さらなる実施形態において、本発明は、望ましくない血管新生を随伴する組織における血管新生を阻害または減少させる方法を提供し、この方法は、Ｔｉｅ２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子、Ａｎｇ−１をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子およびＡｎｇ−２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子をその組織に投与して、Ｔｉｅ２、Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２の発現を減少させることを含む。１つの実施形態において、前記組織は腫瘍である。
【００６１】
本発明のもう１つの実施形態は、Ｔｉｅ２、Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２、ＰＤＧＦおよびその受容体、ならびにＥＧＦおよびその受容体を阻害するｓｉＲＮＡの併用である。さらにもう１つの実施形態は、Ｔｉｅ２、Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２遺伝子ならびにそれらの下流シグナル伝達遺伝子を阻害するｓｉＲＮＡの併用である。
【００６２】
それらのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、血管新生関連疾患の治療のための治療薬として併用することができる。本発明の１つの実施形態では、それらをカクテルとして混合することができ、もう１つの実施形態では、それらを同じ経路によってまたは異なる経路および調合物によって逐次的に投与することができ、ならびにさらにもう１つの実施形態では、一部をカクテルとして投与し、一部を逐次的に投与することができる。血管新生関連疾患の治療を達成するためのｓｉＲＮＡの他の組み合わせおよびそれらの併用方法は、当業者には理解されるであろう。
【００６３】
治療的使用方法
本発明は、被験者における血管新生関連疾患および状態を治療するための方法も提供する。一部の実施形態において、本発明は、望ましくない血管新生を随伴する疾患または状態に罹患している被験者を治療する方法を提供し、この方法は、Ｔｉｅ２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子をその被験者に投与して、Ｔｉｅ２の発現を減少させることを含む。一部の実施形態において、本発明は、望ましくない血管新生を随伴する疾患または状態に罹患している被験者を治療する方法を提供し、この方法は、Ａｎｇ−１をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子をその被験者に投与して、Ａｎｇ−１の発現を減少させることを含む。さらなる実施形態において、本発明は、望ましくない血管新生を随伴する疾患または状態に罹患している被験者を治療する方法を提供し、この方法は、Ａｎｇ−２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子をその被験者に投与して、Ａｎｇ−２の発現を減少させることを含む。
【００６４】
一部の実施形態において、本発明は、望ましくない血管新生を随伴する疾患または状態に罹患している被験者を治療する方法を提供し、この方法は、Ｔｉｅ２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子およびＡｎｇ−１をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子をその被験者に投与して、Ｔｉｅ２およびＡｎｇ−１の発現を減少させることを含む。一部の実施形態において、本発明は、望ましくない血管新生を随伴する疾患または状態に罹患している被験者を治療する方法を提供し、この方法は、Ｔｉｅ２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子およびＡｎｇ−２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子をその被験者に投与して、Ｔｉｅ２およびＡｎｇ−２の発現を減少させることを含む。一部の実施形態において、本発明は、望ましくない血管新生を随伴する疾患または状態に罹患している被験者を治療する方法を提供し、この方法は、Ａｎｇ−１をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子およびＡｎｇ−２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子をその被験者に投与して、Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２の発現を減少させることを含む。さらなる実施形態において、本発明は、望ましくない血管新生を随伴する疾患または状態に罹患している被験者を治療する方法を提供し、この方法は、Ｔｉｅ２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子、Ａｎｇ−１をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子およびＡｎｇ−２をターゲットにするｓｉＲＮＡ分子をその被験者に投与して、Ｔｉｅ２、Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２の発現を減少させることを含む。
【００６５】
本発明は、被験者における、癌、眼病、関節炎および炎症性疾患をはじめとする血管新生関連疾患を治療するための方法も提供する。前記血管新生関連疾患としては、癌腫、例えば乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌および膀胱癌、ならびに他の腫瘍性疾患、例えば黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、肉腫、頭頚部癌、中皮腫、胆管（胆管癌）、小腸腺癌、小児悪性病変および膠芽腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
これらの分子に対する拮抗は、病態生理学的プロセスを阻害する、およびその結果、様々な血管新生依存性疾患のための強力な治療法として作用すると予想される。充実性腫瘍およびそれらの転移に加えて、血液学的悪性病変、例えば、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫も血管新生依存性である。過剰な血管成長は、非常に多くの非腫瘍性障害の一因となる。これらの非腫瘍性血管新生依存性疾患としては、アテローム性動脈硬化症、血管腫、血管内皮腫、血管線維腫、血管奇形（例えば、遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＨＨＴ）、またはオスラー・ウェーバー症候群）、いぼ、化膿性肉芽腫、多毛症、カポジ肉腫、瘢痕ケロイド、アレルギー性浮腫、乾癬、失調性子宮出血、卵胞嚢胞、卵巣過剰刺激、子宮内膜症、呼吸困難、腹水、透析患者における腹膜硬化症、腹部手術に起因する癒着形成、肥満、関節リウマチ、滑膜炎、骨髄炎、パンヌス成長、骨増殖体、血友病関節症、炎症性および感染性プロセス（例えば、肝炎、肺炎、糸球体腎炎）、喘息、鼻ポリープ、肝臓再生、肺高血圧症、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、白質軟化症、血管新生緑内障、角膜移植新生血管形成、トラコーマ、甲状腺炎、甲状腺肥大、ならびにリンパ球増殖性障害が挙げられる。
【００６７】
本発明の１つの実施形態において、治療される被験者は、ヒトである。
【００６８】
組成物および投与方法
もう１つの態様において、本発明は、本発明の、ｓｉＲＮＡをはじめとする、核酸分子を含む組成物を提供する。本組成物のｓｉＲＮＡをＡｎｇ−Ｔｉｅ経路からのｍＲＮＡにターゲッティングすることができる。本組成物は、核酸分子および医薬的に許容される担体、例えば食塩溶液または緩衝食塩溶液、を含む場合がある。
【００６９】
一定の実施形態において、本発明は、「裸の」核酸分子、あるいは自然発生もしくは合成ベクター、例えばウイルスベクター、リポソーム、ポリリシンまたはカチオンポリマーであり得るビヒクル中の核酸分子を提供する。１つの実施形態において、本組成物は、本発明のｓｉＲＮＡと複合体形成剤、例えばカチオン性ポリマー、とを含む場合がある。前記カチオン性ポリマーは、ヒスチジン−リシン（ＨＫ）コポリマーまたはポリエチレンイミンであり得る。
【００７０】
一定の実施形態において、前記カチオン性ポリマーは、ＨＫコポリマーである。このＨＫコポリマーは、ヒスチジンとリシンのコポリマーである。一定の実施形態において、前記ＨＫコポリマーは、ポリヒスチジン、ポリリシン、ヒスチジンおよび／またはリシンの任意の適切な組み合わせから合成される。一定の実施形態において、前記ＨＫコポリマーは、線状である。一定の好ましい実施形態において、前記ＨＫコポリマーは、分岐している。
【００７１】
一定の好ましい実施形態において、前記分岐ＨＫコポリマーは、ポリペプチド骨格を含む。好ましくは、前記ポリペプチド骨格は、１〜１０個のアミノ酸残基、およびさらに好ましくは２〜５個のアミノ酸残基を含む。
【００７２】
一定の好ましい実施形態において、前記ポリペプチド骨格は、リシンアミノ酸残基から成る。
【００７３】
一定の好ましい実施形態において、前記分岐ＨＫコポリマー上の分岐数は、骨格アミノ酸残基数より１多い。一定の好ましい実施形態において、前記分岐ＨＫコポリマーは、１〜１１個の分岐を含有する。一定の好ましい実施形態において、前記ＨＫコポリマーは、２〜５個の分岐を含有する。一定のさらにいっそう好ましい実施形態において、前記分岐ＨＫコポリマーは、４個の分岐を含有する。
【００７４】
一定の実施形態において、前記分岐ＨＫコポリマーの分岐は、１０〜１００個のアミノ酸残基を含む。一定の好ましい実施形態において、前記分岐は、１０〜５０個のアミノ酸残基を含む。一定のさらに好ましい実施形態において、前記分岐は、１５〜２５個のアミノ酸残基を含む。一定の実施形態において、前記分岐ＨＫコポリマーの分岐は、アミノ酸残基数５のサブセグメントごとに少なくとも３個のヒスチジンアミノ酸残基を含む。一定の他の実施形態において、前記分岐は、アミノ酸残基数４のサブセグメントごとに少なくとも３個のヒスチジンアミノ酸残基を含む。一定の他の実施形態において、前記分岐は、アミノ酸残基数３のサブセグメントごとに少なくとも２個のヒスチジンアミノ酸残基を含む。一定の他の実施形態において、前記分岐は、アミノ酸残基数２のサブセグメントごとに少なくとも１個のヒスチジンアミノ酸残基を含む。
【００７５】
一定の実施形態において、前記ＨＫコポリマーの分岐の少なくとも５０％は、配列ＫＨＨＨの単位を含む。一定の好ましい実施形態において、前記分岐の少なくとも７５％は、配列ＫＨＨＨの単位を含む。
【００７６】
一定の実施形態において、前記ＨＫコポリマーの分岐は、ヒスチジンまたはリシン以外のアミノ酸残基を含む。一定の好ましい実施形態において、前記分岐は、システインアミノ酸残基を含み、この場合のシステインは、Ｎ末端アミノ酸残基である。
【００７７】
一定の実施形態において、前記ＨＫコポリマーは、構造（ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ）４−ＫＫＫを有する。一定の他の実施形態において、前記ＨＫコポリマーは、構造（ＣＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ）４−ＫＫＫを有する。
【００７８】
ＨＫコポリマーの幾つかの適する例は、例えば、米国特許第６，６９２，９１１号および同第７，１６３，６９５号において見つけることができ、前記特許は両方とも参照により本明細書に援用されている。
【００７９】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、本発明のｓｉＲＮＡと、ナノ粒子を作るために使用される複合体形成剤とを含む場合がある。前記ナノ粒子は、立体ポリマーおよび／またはターゲッティング部分を場合によっては含むことがある。前記ターゲッティング部分は、ペプチド、抗体、または抗原結合部であり得る。前記ターゲッティング部分、例えば、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含むペプチドは、血管内皮細胞にターゲッティングするための手段としての役割を果たすことができる。そのようなペプチドは、環状である場合もあり、または線状である場合もある。１つの実施形態において、このペプチドは、ＲＧＤＦＫである。一定の実施形態において、このペプチドは、シクロ（ＲＧＤ−Ｄ−ＦＫ）である。
【００８０】
本発明の核酸分子、組成物および治療方法は、単独で用いることができ、または他の治療薬およびモダリティー（ターゲッティングされた治療薬を含み、且つ、Ａｎｇ−Ｔｉｅ経路アンタゴニスト、例えばモノクローナル抗体および小分子阻害剤を含むもの）、ならびにＥＧＦおよびその受容体、ＰＤＧＦおよびその受容体、またはＭＥＫもしくはＢｃｒ−Ａｂｌを阻害するターゲッティングされた治療薬、ならびに他の免疫療法および化学療法薬、例えば、ＥＧＦＲ阻害剤ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）（パニツムマブ）およびＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブ）、Ｈｅｒ−２をターゲットにする療法ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）、または抗血管新生薬、例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）およびＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（リンゴ酸スニチニブ）と併用することができる。本核酸分子、組成物および方法は、治療上、放射線、レーザー療法、外科手術などをはじめとする他の治療モダリティーと併用することもできる。
【００８１】
本発明の核酸および組成物のための投与方法は、通常の当業者に公知である。投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、皮膚、または経皮的であり得る。１つの実施形態において、投与は、全身性であり得る。さらなる実施形態において、投与は、局所性であり得る。例えば、本発明の核酸分子を、腫瘍組織に直接注射により送達することができ、ならびに血管形成性組織または望ましくない新生血管形成を有する組織に直接または該組織の付近に送達することができる。一定の用途については、電場を印加して本核酸分子および組成物を投与することがある。一定の実施形態において、本発明は、「裸の」ｓｉＲＮＡの投与に備えている。
【００８２】
Ａｎｇ／Ｔｉｅ２経路遺伝子の発現を調節する核酸分子を含有するナノ粒子の作製
本発明の１つの実施形態は、ｓｉＲＮＡをはじめとする、抗Ａｎｇ／Ｔｉｅ２経路核酸分子のナノ粒子作製のための組成物および方法を提供する。本ナノ粒子は、ヒスチジン−リシンコポリマー、ポリエチレングリコール、またはポリエチレンイミンのうちの１つ以上を含むことができる。本発明の１つの実施形態では、ＲＧＤ媒介リガンド指向型ナノ粒子を作製することができる。ｓｉＲＮＡを含有するＲＧＤ媒介組織ターゲッティング型ナノ粒子を製造するための１つの方法では、ターゲッティングリガンド、ＲＧＤ含有ペプチド、をポリエチレングリコールなどの立体ポリマー、または同様の特性を有する他のポリマーにコンジュゲートさせる。このリガンド−立体ポリマーコンジュゲートを、ポリエチレンイミンなどのポリカチオン、またはヒスチジン−リシンコポリマーなどの他の材料にさらにコンジュゲートさせる。このコンジュゲーションは、共有結合による場合もあり、または非共有結合による場合もあり、および前記共有結合は、非開裂性である場合もあり、または加水分解によりもしくは還元剤により開裂可能である場合もある。前記ポリマーコンジュゲートを含む溶液、またはポリマーコンジュゲートと他のポリマー、脂質もしくはミセル、例えばリガンドもしくは立体ポリマーもしくは膜融合因子（ｆｕｓｏｇｅｎ）を含む材料との混合物を含む溶液を、核酸、１つの実施形態では対象となる特定のｍＲＮＡにターゲッティングされたｓｉＲＮＡ、を含む溶液と望ましい比率で混合して、ｓｉＲＮＡを含有するナノ粒子を得る。そのような比率が、所望のサイズ、安定性、または他の特性のナノ粒子を生じさせ得る。
【００８３】
１つの実施形態では、ポリマーコンジュゲートと過剰なポリカチオンおよび核酸を混合することを含む積層ナノ粒子自己組織化によって、ナノ粒子を形成する。負電荷を有する核酸と、ポリマーコンジュゲートの正電荷を有するセグメントとの非共有結合性静電相互作用が、ナノ粒子の形成につながる自己組織化を誘導する。このプロセスは、核酸を含有するそれらの溶液の１つを、ポリマーコンジュゲートおよび過剰なポリカチオンを含有するもう１つの溶液に添加し、その後、または同時に攪拌する、溶液の単純な混合を含む。
１つの実施形態において、前記混合物中の正電荷を有する成分と負電荷を有する成分との比率は、それぞれの溶液の濃度を適切に調整することによって、または添加する溶液の容量を調整することによって決定される。もう１つの実施形態では、スタティックミキサーなどの混合装置を使用して、不断流条件下で前記２つの溶液を混合する。この実施形態では、２つ以上の溶液を、ある溶液比を生じさせる速度および圧力でスタティックミキサーに導入し、この場合、それらの溶液流は、そのスタティックミキサーの中で混合される。配置するミキサーについての配置は、並列であってもよいし、または直列であってもよい。
【００８４】
このように一般に説明した本発明は、以下の実施例（これらは、実例として提供するものであり、本発明を限定するためのものでない）を参照することによって、より容易に理解されるであろう。以下の実施例によって本発明を例証するが、本発明が限定されないことは当業者には理解されるであろう。
【実施例】
【００８５】
実施例１：効力スクリーニングのための４８のヒトＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ候補の選択
効力あるヒトＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡを選択するために、４８のｓｉＲＮＡ候補を表８および表１０から選択した（表１１）。これらのｓｉＲＮＡをプレート形式で２０ｎｍｏｌスケールで合成し、インビトロ効力スクリーニングのために使用した。
【００８６】
【表１１−１】
2010532662.tif 000031
【００８７】
【表１１−２】
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【００８８】
【表１１−３】
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【００８９】
【表１１−４】
2010532662.tif 000034
実施例２：ヒトＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡの、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＡｎｇ−２発現の阻害に関するそれらの効力についての、ハイスループットスクリーニング
リバーストランスフェクションに基づくハイスルプーット（ＨＴＰ）法を用いて、４８のヒトＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ（表１１）をＨＵＶＥＣ細胞におけるＡｎｇ−２発現の阻害に関するそれらの効力についてスクリーニングした。簡単に言うと、１０ｎＭのｓｉＲＮＡデュプレックスを９６ウエルプレートの底に配置し、その後、０．２５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。ルシフェラーゼ特異的２５−ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡを陰性対照として使用した。そのプレートを室温で１０〜２０分間インキュベートし、１００ｕＬの成長培地中の７，５００のＨＵＶＥＣ細胞をそれぞれのウエルに添加した。プレートを前後に揺り動かすことによってそのプレートを穏かに混合し、その後、ＣＯ２インキュベーターの中で２４〜４８時間、３７℃でインキュベートした。ヒトＡｎｇ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用してその倍地中のＡｎｇ−２タンパク質の濃度を測定することにより、ｓｉＲＮＡ媒介Ａｎｇ−２ノックダウン効果をモニターした。Ａｎｇ−２濃度の正規化のためにＷＳＴ−１アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用してそれらのトランスフェクト細胞の細胞生存度を測定した。
【００９０】
トランスフェクトＨＵＶＥＣ細胞においてＡｎｇ−２タンパク質レベル発現の有意な阻害が、試験した４８のＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ候補の大部分でトランスフェクション後２４時間の時点で観察された（図１）。トランスフェクション後４８時間の時点で、阻害効果はさらに大きく（図２）、Ａｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ候補の約５０％が、対照Ｌｕｃ−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞と比較して８０％より大きいＡｎｇ−２発現阻害を示した（図３）。Ａｎｇ−２発現のノックダウンに関連した、トランスフェクトＨＵＶＥＣ細胞における細胞毒性は無かった（図４）。
【００９１】
実施例３：２ｎＭのＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＵＶＥＣ細胞におけるＡｎｇ−２遺伝子発現ノックダウンの確認
別の実験で、前のＨＴＰスクリーニングにおいて高いＡｎｇ−２ノックダウン百分率を明示した３８のＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ候補（図１〜３）を、リバーストランスフェクション法を用いてＨＵＶＥＣ細胞におけるＡｎｇ−２発現の阻害に関するそれらの効力にういてさらに検査した。簡単に言うと、２ｎＭのｓｉＲＮＡデュプレックスを９６ウエルプレートの底に配置し、その後、０．２５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。ｄＴｄＴ  ３’−オーバーハングを両方の鎖上に有する１９−ｎｔ  ２本鎖領域を有し、且つ、任意の既知ヒト遺伝子を有する有意な相同配列を有さない、陰性対照（Ｃｔｒｌ−）ｓｉＲＮＡを陰性対照として使用した。そのプレートを室温で１０〜２０分間インキュベートし、１００μＬの成長培地中の７，５００のＨＵＶＥＣ細胞をそれぞれのウエルに添加した。プレートを前後に揺り動かすことによってそのプレートを穏かに混合し、その後、ＣＯ２インキュベーターの中で４８時間、３７℃でインキュベートした。ヒトＡｎｇ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用してその倍地中のＡｎｇ−２タンパク質の濃度を測定することにより、ｓｉＲＮＡ媒介Ａｎｇ−２ノックダウン効果をモニターした。Ａｎｇ−２濃度の正規化のためにＷＳＴ−１アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用してそれらのトランスフェクト細胞の細胞生存度を測定した。
【００９２】
トランスフェクトＨＵＶＥＣ細胞において、Ａｎｇ−２タンパク質レベル発現の有意な阻害（＞９０％）が、Ａｎｇ−２タンパク質レベル発現の９０％より大きいノックダウンを有する多くのｓｉＲＮＡ候補（図６）を含めて、試験した３８のＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ候補の大部分でトランスフェクション後４８時間の時点で観察された（図５）。加えて、ヒトとマウス両方のＡｎｇ−２をターゲットにする３つのｓｉＲＮＡは、下流のヒトＡｎｇ−２発現のノックダウンに関しても高い効力を明示した（図５および６）。最後に、Ａｎｇ−２発現のノックダウンに関連した、トランスフェクトＨＵＶＥＣ細胞における細胞毒性は無かった（図７）。
【００９３】
実施例４：０．２ｎＭでトランスフェクトしたＨＵＶＥＣ細胞におけるＡｎｇ−２遺伝子発現ノックダウンに基づくＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡの最終選択
もう１つの実験では、前に実験において９４％より高いＡｎｇ−２発現ノックダウンを明示した１８のＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ候補（図６）、および３つのヒト／マウスＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡを、より低いｓｉＲＮＡ用量でリバーストランスフェクション法を用いてＨＵＶＥＣ細胞におけるＡｎｇ−２発現の阻害に関するそれらの効力についてさらに検査した。簡単に言うと、０．２ｎＭのｓｉＲＮＡデュプレックスを９６ウエルプレートの底に配置し、その後、０．２５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。ｄＴｄＴ  ３’−オーバーハングを両方の鎖上に有する１９−ｎｔ  ２本鎖領域を有し、且つ、任意の既知ヒト遺伝子を有する有意な相同配列を有さない、陰性対照（Ｃｔｒｌ−）ｓｉＲＮＡを陰性対照として使用した。そのプレートを室温で１０〜２０分間インキュベートし、１００μＬの成長培地中の７，５００のＨＵＶＥＣ細胞をそれぞれのウエルに添加した。プレートを前後に揺り動かすことによってそのプレートを穏かに混合し、その後、ＣＯ２インキュベーターの中で４８時間、３７℃でインキュベートした。ヒトＡｎｇ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用してその倍地中のＡｎｇ−２タンパク質の濃度を測定することにより、ｓｉＲＮＡ媒介Ａｎｇ−２ノックダウン効果をモニターした。Ａｎｇ−２濃度の正規化のためにＷＳＴ−１アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用してそれらのトランスフェクト細胞の細胞生存度を測定した。
【００９４】
０．２ｎＭのｓｉＲＮＡのみでトランスフェクトしたとき、トランスフェクトＨＵＶＥＣ細胞においてＡｎｇ−２タンパク質レベル発現の有意な阻害（３０〜５０％）が、ヒトとマウス両方のＡｎｇ−２をターゲットにする１つのｓｉＲＮＡを含めて、試験した３８のＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ候補の大部分でトランスフェクション後４８時間の時点で観察された（図８）。
【００９５】
３つのＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ、＃１０（Ａｎｇ−２−２５−１０）、＃１４（Ａｎｇ−２−２５−１４）および＃３１（Ａｎｇ−２−２５−３１）をさらなる実験のためにＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡとして選択した。加えて、＃２５（Ａｎｇ−２−２５−２５）および＃４５（Ａｎｇ−２−２５−４５）をさらなる実験のためにヒト／マウスＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡとして選択した。
【００９６】
実施例５：Ａｎｇ−２  ｓｉＲＮＡのＩＣ５０値の決定
Ａｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ候補が確定し次第、ＨＵＶＥＣ細胞においてＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ（Ａｎｇ−２−２５−１０、Ａｎｇ−２−２５−１４およびＡｎｇ−２−２５−３１）のＩＣ５０値を決定するための実験を行った。簡単に言うと、それぞれのｓｉＲＮＡデュプレックスの１０の希釈物を９６ウエルプレートの底に配置し、その後、０．２５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。それらのｓｉＲＮＡ希釈物は、０．０７６ｐＭ、０．３１ｐＭ、１．２ｐＭ、４．９ｐＭ、１９．５ｐＭ、７８．１ｐＭ、３１２．５ｐＭ、１．２５ｎＭ、５ｎＭ、および２０ｎＭであった。そのプレートを室温で１０〜２０分間インキュベートし、１００μＬの成長培地中の７，５００のＨＵＶＥＣ細胞をそれぞれのウエルに添加した。プレートを前後に揺り動かすことによってそのプレートを穏かに混合し、その後、ＣＯ２インキュベーターの中で４８時間、３７℃でインキュベートした。ヒトＡｎｇ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用してその倍地中のＡｎｇ−２タンパク質の濃度を測定することにより、ｓｉＲＮＡ媒介Ａｎｇ−２ノックダウン効果をモニターした。Ａｎｇ−２濃度の正規化のためにＷＳＴ−１アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用してそれらのトランスフェクト細胞の細胞生存度を測定した。
【００９７】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の時点でのＨＵＶＥＣ細胞におけるそれぞれのｓｉＲＮＡデュプレックスのＩＣ５０値を得た（図９）。Ａｎｇ−２−２５−１０のＩＣ５０は、０．３６３ｎＭであり、Ａｎｇ−２−２５−１４のＩＣ５０は、０．４９４ｎＭであり、およびＡｎｇ−２−２５−３１のＩＣ５０は、０．３９８ｎＭであった（図９および表１２）。
【００９８】
実施例６：ヒト／マウスＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡのＩＣ５０値の決定
ヒトとマウス両方のＡｎｇ−２  ｍＲＮＡをターゲットにするヒト／マウスＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ候補が確定し次第、ＨＵＶＥＣ細胞においてヒト／マウスＡｎｇ−２  ｓｉＲＮＡ（Ａｎｇ−２−２５−２５およびＡｎｇ−２−２５−４５）のＩＣ５０値を決定するための実験を行った。簡単に言うと、それぞれのｓｉＲＮＡデュプレックスの１０の希釈物を９６ウエルプレートの底に配置し、その後、０．２５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。それらのｓｉＲＮＡ希釈物は、０．０７６ｐＭ、０．３１ｐＭ、１．２ｐＭ、４．９ｐＭ、１９．５ｐＭ、７８．１ｐＭ、３１２．５ｐＭ、１．２５ｎＭ、５ｎＭ、および２０ｎＭであった。そのプレートを室温で１０〜２０分間インキュベートし、１００μＬの成長培地中の７，５００のＨＵＶＥＣ細胞をそれぞれのウエルに添加した。プレートを前後に揺り動かすことによってそのプレートを穏かに混合し、その後、ＣＯ２インキュベーターの中で４８時間、３７℃でインキュベートした。ヒトＡｎｇ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）を使用してその倍地中のＡｎｇ−２タンパク質の濃度を測定することにより、ｓｉＲＮＡ媒介Ａｎｇ−２ノックダウン効果をモニターした。Ａｎｇ−２濃度の正規化のためにＷＳＴ−１アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用してそれらのトランスフェクト細胞の細胞生存度を測定した。
【００９９】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の時点でのＨＵＶＥＣ細胞におけるそれぞれのｓｉＲＮＡデュプレックスのＩＣ５０値を得た（図１０）。Ａｎｇ−２−２５−２５のＩＣ５０は、１．６３４ｎＭであり、およびＡｎｇ−２−２５−４５のＩＣ５０は、０．９０ｎＭであった（図１０および表１２）。
【０１００】
【表１２】
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【０１０１】
【表１３−１】
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【０１０２】
【表１３−２】
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【０１０３】
【表１３−３】
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【０１０４】
【表１３−４】
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【０１０５】
【表１３−５】
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【０１０６】
【表１３−６】
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【０１０７】
【表１３−７】
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【０１０８】
【表１３−８】
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【０１０９】
【表１３−９】
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【０１１０】
【表１３−１０】
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【０１１１】
【表１３−１１】
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【０１１２】
【表１３−１２】
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【０１１３】
【表１３−１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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