(57)【要約】本開示は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下または停止させる能力を持つ、部分二重鎖リボ核酸分子（ｍｄＲＮＡ）を提供する。本開示のｍｄＲＮＡは、組み合わさって、ニックまたはギャップによって離された少なくとも２つの非重複二本鎖領域を形成する少なくとも３本の鎖を含み、１本の鎖はＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である。さらに、部分二重鎖は、５−メチルウリジンで置換された少なくとも１つのウリジンを有し得、ヌクレオシドは、ロックされた核酸、または任意選択的に他の修飾、およびこれらの任意の組み合わせである。細胞において、または対象において、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させ、ＨＩＦ１Ａ関連疾患を治療する方法も、提供する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分二重鎖リボ核酸（ｍｄＲＮＡ）分子であって、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載される低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１Ａ）のｍＲＮＡに相補的である１５〜４０ヌクレオチド長の第１の鎖と、前記第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的である第２の鎖および第３の鎖と、を含み、前記第２の鎖および第３の鎖は、前記第１の鎖とアニーリングして最大１０ヌクレオチド離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、それによって前記第２の鎖と前記第３の鎖との間にギャップが形成される、部分二重鎖リボ核酸（ｍｄＲＮＡ）分子。
【請求項２】
前記第１の鎖は１５〜２５ヌクレオチド長または２６〜４０ヌクレオチド長である、請求項１に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記ギャップはニックであるか、または前記ギャップは、前記第１の鎖にアニーリングすると前記第２および第３の鎖によって形成される前記二本鎖領域の間に位置する前記第１の鎖内に、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記ｍｄＲＮＡ分子の少なくとも１つのウリジンは、５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、または２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンである、請求項１に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記ｍｄＲＮＡ分子は、少なくとも１つのロックされた核酸（ＬＮＡ）分子、デオキシヌクレオチド、Ｇクランプ、２’糖修飾、修飾されたヌクレオシド間結合、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記ｍｄＲＮＡは、前記ギャップの一部ではない１〜４個のヌクレオチドを含む少なくとも１つの３’オーバーハングを含有するか、または前記ｍｄＲＮＡは、前記ｍｄＲＮＡの一端もしくは両端に平滑末端を有する、請求項１に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記第３の鎖はヒドロキシルまたはリン酸塩を含む５’末端を有する、請求項１に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項８】
ｍｄＲＮＡ分子であって、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である１５〜４０ヌクレオチド長の第１の鎖と、前記第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的である第２の鎖および第３の鎖と、を含み、前記第２の鎖および第３の鎖は、前記第１の鎖とアニーリングして最大１０ヌクレオチド離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、それによって前記第２の鎖と前記第３の鎖との間にギャップが形成され、前記ｍｄＲＮＡの少なくとも１つのピリミジンは、式ＩまたはＩＩに従うピリジンヌクレオチドを含み、
2010519908.tif 000024
式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ハロゲン、置換もしくは未置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル、置換もしくは未置換の−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル、カルバモイル、カルバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換もしくは未置換のアリール、置換もしくは未置換のアラルキル、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−Ｃ≡Ｎ、またはヘテロシクロ基であり、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立してヒドロキシル、保護ヒドロキシル、リン酸塩、またはヌクレオシド間結合基であり、
Ｒ５およびＲ８は、それぞれ独立してＯまたはＳである、ｍｄＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記第１の鎖は１５〜２５ヌクレオチド長または２６〜４０ヌクレオチド長である、請求項８に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記ギャップはニックであるか、または前記ギャップは、前記第１の鎖にアニーリングすると前記第２および第３の鎖によって形成される前記二本鎖領域の間に位置する前記第１の鎖内に、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含む、請求項８に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１１】
少なくとも１つのヌクレオシドは式Ｉに従い、式中、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２は−ＯＨまたは−Ｏ−メチルである、請求項８に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１２】
少なくとも１つのＲ２は、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、２’−Ｏ−メチル、２’−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、および２’−フルオロから構成される群から選択される、請求項８に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記ｍｄＲＮＡ分子の少なくとも１つのウリジンは、５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、または２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンである、請求項８に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１４】
前記ｍｄＲＮＡ分子は、少なくとも１つのＬＮＡ、デオキシヌクレオチド、Ｇクランプ、２’糖修飾、修飾されたヌクレオシド間結合、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項８に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１５】
前記ｍｄＲＮＡは、前記ギャップの一部ではない１〜４個のヌクレオチドを含む、少なくとも１つの３’オーバーハングを含有するか、または前記ｍｄＲＮＡ分子は、前記ｍｄＲＮＡ分子の一端もしくは両端に平滑末端を有する、請求項８に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１６】
ｍｄＲＮＡ分子であって、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である第１の鎖と、前記第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的である第２の鎖および第３の鎖と、を含み、前記第２の鎖および第３の鎖は、前記第１の鎖とアニーリングして最大１０ヌクレオチド離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、それによって前記第２の鎖と前記第３の鎖との間にギャップが形成され、合わせた二本鎖領域は合計で約１５塩基対〜約４０塩基対である、ｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１７】
前記第１の鎖は１５〜２５ヌクレオチド長または２６〜４０ヌクレオチド長である、請求項１６に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記ギャップはニックであるか、または前記ギャップは、前記第１の鎖にアニーリングすると前記第２および第３の鎖によって形成される前記二本鎖領域の間に位置する前記第１の鎖内に、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含む、請求項１６に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記ｍｄＲＮＡ分子の少なくとも１つのウリジンは、５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、または２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンである、請求項１６に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記第１の鎖は、１９〜２３ヌクレオチド長であり、配列番号１１６０〜１６７１のうちのいずれか１つに記載されるヒトＨＩＦ１Ａ核酸配列に相補的である、請求項１に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項２１】
前記第１の鎖は、２５〜２９ヌクレオチド長であり、配列番号１１６０〜１６７１のうちのいずれか１つに記載されるヒトＨＩＦ１Ａ核酸配列に相補的である、請求項１に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項２２】
ヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させるための方法であって、請求項１〜２２のうちのいずれか１項に記載のｍｄＲＮＡ分子を、ＨＩＦ１Ａ遺伝子を発現する細胞に投与するステップを含み、前記ｍｄＲＮＡ分子は、前記細胞中のＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させる、方法。
【請求項２３】
前記細胞はヒトである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
過剰増殖性または炎症性疾患の治療において使用するための薬物を製造するための、先行する請求項のうちのいずれか１項に定義されるｍｄＲＮＡの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年３月２日に出願された米国特許出願第６０／９３４，９４０号、２００７年３月１６日に出願された第６０／９３４，９３０号、および２００７年８月１５日に出願された第６０／９５６，０９３号に対する優先権を主張するものであり、それらの各々は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本開示は、一般に、遺伝子サイレンシングを用いた疾病の治療において使用するための化合物に関し、また、より具体的には、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１Ａ）の遺伝子の発現を低下させる少なくとも３本の鎖を含む、ニックの入ったまたはギャップのある二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ならびに、心筋虚血、脳虚血、網膜虚血、肺高血圧症、妊娠疾患（例えば、子癇前症、子宮内発育遅延）および不適切なＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現に関連する癌を治療または予防するための、かかるｄｓＲＮＡの使用に関する。ＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させるｄｓＲＮＡは、５−メチルウリジンで置換される少なくとも１つのウリジンを任意選択的に有し得る。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、標的とするメッセンジャーＲＮＡの一部に相同である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）等の、低分子の抑制性核酸の分子によって媒介される、動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの細胞プロセスを意味する（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６，１９９８、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０，１９９９）。ＲＮＡｉは、哺乳類を含む様々な生命体において観察されてきた（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６，１９９８、Ｂａｈｒａｍｉａｎ  ａｎｄ  Ｚａｒｂｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．．Ｂｉｏｌ．１９：２７４，１９９９、Ｗｉａｎｎｙ  ａｎｄ  Ｇｏｅｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：７０，１９９９）。ＲＮＡｉは、外因性合成２１−ヌクレオチドのＲＮＡ二重鎖を、培養哺乳類細胞に導入することにより誘導することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４，２００１ａ）。
【０００４】
ｄｓＲＮＡが標的とする遺伝子サイレンシングを媒介する機構は、２つの段階を伴うと言える。第１のステップは、ダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素により、長いｄｓＲＮＡが、約１９塩基対と、通常は各３’末端でオーバーハングする２つのヌクレオチドとからなる二本鎖領域を持つ、２１〜２３ヌクレオチドを有する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと分解されることに関わる（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３，２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １５：１８８，２００１ｂ、およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：２２２，２００５）。ＲＮＡｉ遺伝子サイレンシングの第２のステップは、ｓｉＲＮＡからの１本の鎖（ガイド鎖またはアンチセンス鎖）およびアルゴノートタンパク質を有する、多成分ヌクレアーゼを活性化して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（「ＲＩＳＣ」）を形成することに関与する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８，２００１）。アルゴノートは、最初に二本鎖ｓｉＲＮＡと会合し、その後、組み込まれていない鎖（パッセンジャー鎖またはセンス鎖）をエンドヌクレアーゼとして切断し、結果として生じる切断された二重鎖の熱力学的不安定性によりその放出を促進する（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  ７：３１４，２００６）。ガイド鎖は相補的標的ｍＲＮＡに結合することができるようになり、活性化されたＲＩＳＣがｍＲＮＡを切断して遺伝子サイレンシングを促進する。標的ＲＮＡの切断は、ガイド鎖に相補的である標的領域の中心で起こる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ｂ）。
【０００５】
低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ１）は、エネルギー代謝、血管新生、およびアポトーシスに関与する遺伝子の調節を含む、低酸素症または虚血への細胞応答に重要な役割を果たす、哺乳類に認められる転写因子である。ＨＩＦ１は、αサブユニット（ＨＩＦ１Ａ）およびβサブユニット（ＨＩＦ１ＢまたはＡＲＮＴ）から構成されるヘテロ二量体である（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：５５１０，１９９５）。ＨＩＦ１の関与は、虚血性疾患、肺高血圧症、妊娠疾患、および癌を含む、ヒト疾病病態生理学に関連付けられている（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：１９８３，２０００）。例えば、最新のデータは、ＨＩＦ１の過剰発現が腫瘍抑制の重要な態様を促進し得ることを示唆している（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５：５５１，１９９９）。臨床治験における薬物は、現在、チラパザミン（ＤＮＡ鎖切断を生じる反応性ラジカルに還元される低酸素選択的な薬剤）であるが、それのみでは、臨床治験において有意な結果を達していない（Ｍａｒｃｕ  ａｎｄ  Ｏｌｖｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１：７１，２００６）。
【０００６】
ＨＩＦ１Ａ遺伝子発現の低下（遺伝子サイレンシング）が有益であるＨＩＦ１Ａ関連疾病または疾患を治療または予防するために有用な、代替となる有効な治療様式に対する必要性が依然として存在する。本開示は、かかる必要性を満足させ、他の関連する利点をさらに提供する。
【発明の概要】
【０００７】
簡潔に述べると、本開示は、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１Ａ）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現を修飾するための、ダイサーの基質として、またはＲＩＳＣ活性化因子として好適な、少なくとも３本の鎖を含む、ニックの入ったまたはギャップのある二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を提供する。
【０００８】
一態様において、本開示は、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である第１の鎖と、第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的である第２の鎖および第３の鎖と、を含む部分二重鎖（ｍｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）のｍｄＲＮＡ分子であって、第２の鎖および第３の鎖は、第１の鎖とアニーリングして最大１０ヌクレオチド離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、それによって、第２の鎖と第３の鎖との間にギャップが形成され、（ａ）ｍｄＲＮＡ分子は、５塩基対〜１３塩基対の少なくとも１つの二本鎖領域を任意選択的に含むか、または（ｂ）二本鎖領域は合わせて合計約１５塩基対〜約４０塩基対であり、ｍｄＲＮＡ分子は任意選択的に１つ以上の平滑末端を有する、部分二重鎖（ｍｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）のｍｄＲＮＡ分子を提供する。一部の実施形態において、第１の鎖は約１５〜約４０ヌクレオチド長であり、第２および第３の鎖はそれぞれが別個に約５〜約２０ヌクレオチドであり、第２の鎖と第３の鎖とを合わせた長さは、約１５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドである。他の実施形態において、第１の鎖は、約１５〜約４０ヌクレオチド長であり、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡの、少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の隣接するヌクレオチドに相補的である。またさらなる実施形態において、第１の鎖は約１５〜約４０ヌクレオチド長であり、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡの、少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の隣接するヌクレオチドに相補的である配列に、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【０００９】
他の実施形態において、ｍｄＲＮＡはＲＩＳＣ活性化因子（例えば、第１の鎖は約１５ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドを有する）であるか、またはダイサーの基質（例えば、第１の鎖は約２６ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドを有する）である。いくつかの実施形態において、ギャップは、第１の鎖にアニーリングした時に第２および第３の鎖によって形成される二本鎖領域の間に配置される第１の鎖の中に、少なくとも１〜１０個の不対ヌクレオチドを含むか、またはギャップはニックである。一部の実施形態において、ニックまたはギャップは、第１の（アンチセンス）鎖の５’末端から１０ヌクレオチドか、またはアルゴノート切断部位に位置する。別の実施形態において、部分二重鎖のニックまたはギャップは、第１および第２の鎖の二重鎖ならびに第１および第３の鎖の二重鎖に対する熱安定性が、異なる位置にニックまたはギャップを有するかかる部分二重鎖の熱安定性と比較して、最大化されるように配置される。
【００１０】
別の態様において、本開示は、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である第１の鎖と、第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的である第２の鎖および第３の鎖と、を有するｍｄＲＮＡ分子であって、第２の鎖および第３の鎖は、第１の鎖とアニーリングして最大１０ヌクレオチド離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、それによって、第２の鎖と第３の鎖との間にギャップが形成され、（ａ）ｍｄＲＮＡ分子は、５塩基対〜１３塩基対の少なくとも１つの二本鎖領域を任意選択的に含むか、または（ｂ）二本鎖領域は合わせて合計約１５塩基対〜約４０塩基対であり、ｍｄＲＮＡ分子は任意選択的に１つ以上の平滑末端を有し、ｍｄＲＮＡの少なくとも１つのピリミジンヌクレオシドは、式ＩまたはＩＩに従い、
2010519908.tif 000002
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ハロゲン、置換もしくは未置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル、置換もしくは未置換の−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル、カルバモイル、カルバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換もしくは未置換のアリール、置換もしくは未置換のアラルキル、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−Ｃ≡Ｎ、またはヘテロシクロ基であり、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立してヒドロキシル、保護ヒドロキシル、リン酸塩、またはヌクレオシド間の結合基であり、Ｒ５およびＲ８は、独立してＯまたはＳである、ｍｄＲＮＡ分子を提供する。一部の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオシドは式Ｉに従い、式中、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２は−ＯＨである。一部の関連する実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子の少なくとも１つのウリジンは式Ｉに従ったヌクレオシドであり、式中、Ｒ１はメチルでありかつＲ２は−ＯＨであるか、またはＲ１はメチルであり、Ｒ２は−ＯＨであり、Ｒ８はＳである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ１は、メチル等のＣ１−Ｃ５アルキルである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ２は、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、２’−Ｏ−メチル、２’−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、またはフルオロから選択される。いくつかの実施形態において、ｍｄＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つのピリミジンヌクレオシドは、二環式糖の形態にあるロックされた核酸（ＬＮＡ）であり、式中、Ｒ２は酸素であり、２’−Ｏおよび４’−Ｃは、同じリボース環上にオキシメチレン架橋（例えば、５−メチルウリジンＬＮＡ）を形成するか、またはＧクランプである。他の実施形態において、ヌクレオシドのうちの１つ以上は式Ｉに従い、式中、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２は２’−Ｏ−メチル等の２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ５）アルキルである。いくつかの実施形態において、ギャップは、第１の鎖にアニーリングしたときに第２および第３の鎖によって形成される二本鎖領域の間に配置される第１の鎖の中に、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含むか、またはギャップはニックである。一部の実施形態において、ニックまたはギャップは、第１の鎖の５’末端から１０ヌクレオチドに位置するか、またはアルゴノート切断部位に位置する。別の実施形態において、部分二重鎖のニックまたはギャップは、第１および第２の鎖の二重鎖ならびに第１および第３の鎖の二重鎖に対する熱安定性が、異なる位置にニックまたはギャップを有するかかる部分二重鎖の熱安定性と比較して、最大化されるように配置される。
【００１１】
さらに別の態様において、本開示は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子を発現する細胞にｍｄＲＮＡ分子を投与するステップを含む、細胞中のヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させるための方法であって、ｍｄＲＮＡ分子がＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに特異的に結合する能力を持ち、それによって、細胞における遺伝子の発現レベルが低下する、方法を提供する。関連する態様において、本開示のｍｄＲＮＡ分子を投与することにより、対象においてＨＩＦ１Ａの発現に関連する疾病を治療または予防する方法が提供される。一部の実施形態において、細胞または対象はヒトである。一部の実施形態において、該疾病は、心筋虚血、脳虚血、網膜虚血、肺高血圧症、妊娠疾患（例えば、子癇前症、子宮内発育遅延）、および癌である。
【００１２】
本開示のいずれの態様においても、いくつかの実施形態は、第１、第２、もしくは第３の鎖上の少なくとも１つのウリジンの代わりに、または第１、第２、もしくは第３の鎖上の１つ１つすべてのウリジンの代わりに、５−メチルウリジン（リボチミジン）、２−チオリボチミジン、または２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンを有するｍｄＲＮＡ分子を提供する。さらなる実施形態において、ｍｄＲＮＡは、デオキシウリジン、ロックされた核酸（ＬＮＡ）分子、または普遍的に結合するヌクレオチド（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、またはＧクランプ等の１つ以上の非標準ヌクレオチドをさらに含む。例示的な普遍的に結合するヌクレオチドには、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル、イノシン、アゾールカルボキサミド、１−β−Ｄ−リボフラノシル−４−ニトロインドール、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、１−β−Ｄ−リボフラノシル−６−ニトロインドール、または１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが含まれる。いくつかの実施形態において、ｍｄＲＮＡ分子は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−２−メトキシエチル、２’−Ｏ−アリル、またはハロゲン（例えば、２’−フルオロ）等の２’糖置換をさらに含む。特定の実施形態において、ｍｄＲＮＡ分子は、１つ以上の第１の鎖、第２の鎖、または第３の鎖の一端または両端に、独立してアルキル、脱塩基、デオキシ脱塩基、グリセリル、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、または反転したデオキシヌクレオチド部分等の末端キャップの置換基をさらに含む。他の実施形態において、ｍｄＲＮＡ分子は、独立して、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、メチルホスホン酸塩、アルキルホスホン酸塩、３’−アルキレンホスホン酸塩、５’−アルキレンホスホン酸塩、キラルホスホン酸塩、ホスホノ酢酸塩、チオホスホノ酢酸塩、ホスフィン酸塩、ホスホロアミド酸塩、３’−アミノ−ホスホロアミド酸塩、アミノアルキルホスホロアミド酸塩、チオノホスホロアミド酸塩、セレノリン酸塩、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルリン酸トリエステル、またはボランリン酸塩結合等の、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合をさらに含む。
【００１３】
本開示のいずれの態様においても、いくつかの実施形態は、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドまたは２つのデオキシヌクレオチド（例えばチミジン）等、ギャップの一部ではない少なくとも１つの３’末端上の１〜４ヌクレオチドのオーバーハングを含むｍｄＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態において、二本鎖領域内にある第２の鎖の少なくとも１つまたは２つの５’末端のリボヌクレオチドは、２’糖置換を含む。関連する実施形態において、二本鎖領域内にある第１の鎖の少なくとも１つまたは２つの５’末端のリボヌクレオチドは、２’糖置換を含む。他の関連する実施形態において、二本鎖領域内にある、第２の鎖の少なくとも１つまたは２つの５’末端のリボヌクレオチドおよび第１の鎖の少なくとも１つまたは２つの５’末端のリボヌクレオチドは、独立した２’糖置換を含む。他の実施形態において、ｍｄＲＮＡ分子は、少なくとも１つの二本鎖領域内に少なくとも３つの５−メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態において、ｍｄＲＮＡ分子は、一端または両端に平滑末端を有する。他の実施形態において、第３の鎖の５’末端は、ヒドロキシルまたはリン酸塩である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】１０の異なるＨＩＦ１Ａに特異的なニックの入ったギャップのあるｄｓＲＮＡダイサー基質の遺伝子サイレンシング活性を示す図。これは、表１に示すデータをグラフ表示したものである（ｘ軸上の複合体番号は、表１に示す１０の異なるＨＩＦ１Ａ  ｄｓＲＮＡのそれぞれに対するセット番号に相当する）。
【図２】ＲＩＳＣ活性化因子ｌａｃＺ  ｄｓＲＮＡ（２１ヌクレオチドのセンス鎖／２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖、２１／２１）、ダイサー基質ｌａｃＺ  ｄｓＲＮＡ（２５ヌクレオチドのセンス鎖／２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖、２５／２７）、および部分二重鎖ｌａｃＺ  ｍｄＲＮＡに対するノックダウン活性を示す図（１３ヌクレオチドのセンス鎖および１１ヌクレオチドのセンス鎖／２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖、１３，１１／２７―センス鎖にヌクレオチドが欠失しているため、２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖にアニーリングすると、１３ヌクレオチドセンス鎖と１１ヌクレオチドセンス鎖との間に単一のヌクレオチドギャップが残る。ノックダウン活性をＱｎｅｇ対照ｄｓＲＮＡに対して正規化し、Ｑｎｅｇの正規化値として表した（すなわち、Ｑｎｅｇが１００％または「正常な」遺伝子発現量を表す）。値がより小さいほどより大きなノックダウン効果を示す。
【図３】ＲＩＳＣ活性化因子であるインフルエンザｄｓＲＮＡ  Ｇ１４９８（２１／２１）およびニックの入ったｄｓＲＮＡ（１０，１１／２１）の１００ｎＭにおけるノックダウン活性を示す図。「ｗｔ」という記号は、非置換のＲＮＡ分子を示し、「ｒＴ」は各ウリジンがリボチミジンで置換されたＲＮＡを示し、「ｐ」は、その鎖の５’−ヌクレオチドがリン酸化されたことを示す。Ｇ１４９８の２１ヌクレオチドの２１センス鎖およびアンチセンス鎖は、５’末端から測って１０個目と１１個目のヌクレオチドの間に別個にニックを入れ、それぞれ１１，１０／２１および２１／１０，１１，と称される。Ｇ１４９８の単一鎖の２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖（ＡＳのみ、表示）は対照であった。
【図４】センス鎖の（５’末端から数えて）８位から１４位のそれぞれ１つ１つにニックを有し、１３位にヌクレオチドギャップを１つ有するｌａｃＺダイサー基質（２５／２７）のノックダウン活性を示す図。１３位でニックの入ったまたはギャップのあるセンス配列の最も３’末端側の鎖の５’末端でジデオキシグアノシン（ｄｄＧ）を組み入れた。
【図５】ダイサー基質インフルエンザｄｓＲＮＡ  Ｇ１４９８ＤＳ（２５／２７）、およびセンス鎖の８位から１４位のそれぞれ１つ１つでニックの入ったその配列のノックダウン活性、ならびにリン酸化もされているかまたはロックされた核酸置換をも有するこれらのニックの入った分子の活性を示す図。
【図６】ダイサー基質インフルエンザｄｓＲＮＡ  Ｇ１４９８ＤＳ（２５／２７）、およびセンス鎖の１３位でニックの入ったその配列の用量反応ノックダウン活性を示す図。
【図７】センス鎖の８〜１２位のうちのいずれか１つで始まる１〜６ヌクレオチドのニックまたはギャップを有するダイサー基質インフルエンザｄｓＲＮＡ  Ｇ１４９８ＤＳのノックダウン活性を示す図。
【図８】センス鎖の８〜１４位のうちのいずれか１つで始まる１〜６ヌクレオチドのニックまたはギャップを有するＬａｃＺ  ＲＩＳＣ  ｄｓＲＮＡのノックダウン活性を示す図。
【図９】センス鎖の８〜１４位のうちのいずれか１つでニックを有し、１センス鎖当たり１つまたは２つのロックされた核酸（ＬＮＡ）をさらに有するインフルエンザＲＩＳＣ  ｄｓＲＮＡのノックダウン活性を示す図。グラフの右側に、ニック部位が異なる部分二重鎖構造の（明確にするため、それぞれ異なるニックの入ったセンス鎖をアンチセンス鎖の上に持つグループの下に、単一のアンチセンス鎖が示されている）図式表現を、センス鎖上におけるＬＮＡの相対位置づけとともに挿入した。
【図１０】センス鎖の８位から１４位のいずれか１つにニックを有するＬａｃＺダイサー基質ｄｓＲＮＡのノックダウン活性を、ロックされた核酸置換を有する以外は同じニックの入ったダイサー基質と比較して、示す図。
【図１１】インフルエンザ菌株ＷＳＮに対するインフルエンザ特異的ｍｄＲＮＡを用いたインフルエンザウイルス力価におけるノックダウンの割合（％）を示す図。
【図１２】ＴＣＩＤ５０で測定したインフルエンザ特異的ｍｄＲＮＡを用いたＰＲ８インフルエンザウイルス力価の生体内での低下を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、少なくとも３本の鎖を含む、ニックの入ったまたはギャップのある二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がダイサーまたはＲＩＳＣの好適な基質であり、従って、例えば、ＲＮＡ干渉経路を介して、遺伝子サイレンシングに有利に用いることができる、という予想外な発見に基づくものである。つまり、本明細書に記載される部分的に二重であるｄｓＲＮＡ分子（少なくとも１本の鎖にニックまたはギャップを有する部分二重鎖とも称される）は、ヒト低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１Ａ）のｍＲＮＡ等の標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現を変える（例えば低下させる）、ＲＮＡ干渉カスケードを開始する能力を持つということである。当業者は、熱力学的に不安定なニックの入ったまたはギャップのあるｄｓＲＮＡパッセンジャー鎖（インタクトなｄｓＲＮＡと比較して）は、遺伝子サイレンシングの効果が生じる前に崩壊すると予想するため、これは驚くべきことである（例えば、Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  ７：３１４，２００６を参照されたい）。
【００１６】
本明細書に記載される部分二重鎖リボ核酸（ｍｄＲＮＡ）分子は、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である第１の（アンチセンス）鎖および、それとともに、第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的である第２および第３の鎖（一緒になってギャップのあるセンス鎖を形成する）を含み、第２および第３の鎖は、第１の鎖とアニーリングして、ギャップによって離された少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、該少なくとも１つの二本鎖領域は、約５塩基対〜約１５塩基対であるか、または、合わせた二本鎖領域は合計で約１５塩基対〜約４０塩基対であり、ｍｄＲＮＡは平滑末端である。ギャップは、０ヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチド分子において、２つのヌクレオチド間にあるリン酸ジエステルの結合のみが壊れているニック）から最大約１０ヌクレオチドであり得る（すなわち、第１の鎖は、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを有する）。一部の実施形態において、ニックまたはギャップは、第１の（アンチセンス）鎖の５’末端から１０ヌクレオチドか、またはアルゴノート切断部位に位置する。別の実施形態において、部分二重鎖のニックまたはギャップは、第１および第２の鎖の二重鎖ならびに第１および第３の鎖の二重鎖に対する熱安定性が、異なる位置にニックまたはギャップを有するかかる部分二重鎖の熱安定性と比較して、最大化されるように配置される。また、本明細書では、細胞中のＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させるか、または心筋虚血、脳虚血、網膜虚血、肺高血圧症、妊娠疾患（例えば、子癇前症、子宮内発育遅延）、および癌を含む、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現に関連する疾病または疾患を治療または予防するための、かかるｄｓＲＮＡの使用方法が提供される。
【００１７】
本開示をさらに詳細に紹介する前に、本明細書において用いられる、ある用語の定義を提供することが、本開示を理解するうえで有用であるかもしれない。
【００１８】
本発明の記述において、任意の濃度の範囲、パーセンテージの範囲、比率の範囲、または整数の範囲は、特に記載のない限り、列挙された範囲内の任意の値を含むものとし、適切な場合には、その分数（ある整数の１０分の１および１００分の１等）を含むものと理解される。また、本明細書に列挙される、ポリマーのサブユニット、大きさまたは厚み等、物理的特性に関する任意の数値の範囲は、特に記載のない限り、列挙された範囲内の任意の整数を含むものと理解される。本明細書で用いられる「約」または「本質的に〜から構成される」は、特に記載のない限り、示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。本明細書で用いられる用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は非限定的であり、同義的に用いられる。本明細書において用いられる用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、列挙される構成要素の「１つ以上」を意味することを理解されたい。選択肢（例えば、「または」）の使用は、１つ、両方、またはその選択肢の任意の組み合わせのいずれかを意味することを理解されたい。
【００１９】
本明細書で用いられる場合、「単離された」という用語は、自然環境（例えば、自然環境は細胞であってもよい）において共存する物質の一部またはすべてから離される等、参照される物質（例えば、本開示の核酸分子）がその元の環境から除去されることを意味する。
【００２０】
本明細書で用いられる場合、「相補的」とは、別の核酸分子とともに、またはそれ自体と、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチドの間において従来のワトソン・クリック塩基対形成もしくは他の非従来型の対形成（例えば、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型水素結合）のいずれかにより、水素結合（複数を含む）を形成することができる核酸分子を意味する。本開示の核酸分子に関連して、核酸分子の、その相補的配列との結合自由エネルギーが、該核酸分子の関連機能（例えば、ＲＮＡｉ活性）を続行させるために十分であり、特異的結合が望ましい条件下、すなわち生体内アッセイもしくは治療の場合は生理学的条件下で、または生体外アッセイ（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ）の場合は、そのアッセイが行われる条件下で、核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）が非標的配列に非特異的に結合することを避けるために十分な程度の相補性が存在する。核酸分子に対する結合自由エネルギーの決定は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ＬＩＩ：１２３，  １９８７、Ｆｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：９３７３，  １９８６、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０９：３７８３，１９８７を参照されたい）。よって、「相補性」または「特異的にハイブリダイズ可能」または「特異的に結合する」という用語は、核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）とＤＮＡもしくはＲＮＡ標的との間で、安定かつ特異的な結合が起こるために十分な程度の相補性または正確な対形成を示す。特異的にハイブリダイズ可能であるまたは特異的に結合するために、核酸分子が標的核酸配列に１００％相補的である必要はないことが、当該技術分野において理解される。つまり、２つ以上の核酸分子は完全に相補的でなくてもよく、第２の核酸分子とともに水素結合を形成することができる核酸分子において、隣接する残基のパーセンテージによって示される。
【００２１】
例えば、第１の核酸分子が１０ヌクレオチドを有し得、第２の核酸分子が１０ヌクレオチドを有し得るならば、第１と第２の核酸分子の間の５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの対形成は（隣接する二本鎖領域を形成する場合も、しない場合もあるが）それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性を表す。一部の実施形態において、相補的な核酸分子が誤って対にされた塩基、つまり、従来のワトソン−クリック塩基対または他の非従来型の対（すなわち、「ミスマッチ」な塩基）を形成できない塩基を有する可能性がある。例えば、相補的核酸分子は、０、または約１、約２、約３、約４、または約５等の、特定数の「ミスマッチ」を有すると特定され得る。
【００２２】
「完璧に」または「完全に」相補的な核酸分子とは、第１の核酸分子の特定数のヌクレオチドが、第２の核酸分子中の同数の残基と水素結合（アニーリング）して、隣接する二本鎖領域を形成する核酸分子を意味する。例えば、２つ以上の完全に相補的な核酸分子鎖は、同数のヌクレオチドを有することができ（すなわち、オーバーハングを伴い、または伴わずに、同じ長さを有し、１つの二本鎖領域を形成する）、または異なる数のヌクレオチドを有することができる（例えば、１本の鎖は短いが、第２の鎖の中に十分に含まれているか、または一本の鎖が第２の鎖にオーバーハングすることができる）。
【００２３】
「リボ核酸」または「ＲＮＡ」は、少なくとも１つのリボヌクレオチド分子を含む核酸分子を意味する。本明細書で用いられる場合、「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２位にヒドロキシル基を持つヌクレオチドを指す。ＲＮＡという用語は、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ（部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えによって生成されたＲＮＡ等）、改変ＲＮＡ（１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換または改変により、自然発生型のＲＮＡとは異なる）、またはこれらの任意の組み合わせを含む。例えば、かかる改変ＲＮＡに、ＲＮＡ分子の一端または両端で、ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドの内部で、またはこれらの任意の組み合わせ等で、非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。本開示のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、自然発生型ヌクレオチド、非自然発生型ヌクレオチド、化学修飾されたヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはこれらの任意の組み合わせ等、非標準ヌクレオチドも含むことができる。これらの改変ＲＮＡは、標準的ヌクレオチド（すなわち、本明細書で用いられる、標準的ヌクレオチドは、アデニン、シチジン、グアニジン、チミジン、およびウリジンであると見なされる）を含有する類似体またはＲＮＡの類似体と称されてもよい。
【００２４】
本明細書で用いられる「ｄｓＲＮＡ」という用語は、「ｍｄＲＮＡ」と同義で使用され得、少なくとも１つのリボヌクレオチド分子を含み、例えば、配列特異的な様式においてＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）または遺伝子サイレンシングを促進することにより、遺伝子発現を抑制または下方制御する能力を持つ、任意の核酸分子を指す。本開示のｄｓＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）は、ＲＮＡｉによって遺伝子サイレンシングを媒介するための、ダイサーに、またはＲＩＳＣとの会合に、好適な基質となり得る。本開示のｄｓＲＮＡ分子の例は、本明細書に特定される配列表に提供される。ｄｓＲＮＡの１本または２本の鎖は、５’−リン酸塩または５’，３’−二リン酸塩等の末端リン酸基をさらに含み得る。本明細書で用いられるｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのリボヌクレオチドのほかに、置換、化学修飾されたヌクレオチド、および非ヌクレオチドをさらに含むことができる。一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、ヌクレオチド位の最大約１００％までリボヌクレオチドを含む。
【００２５】
また、本明細書で用いられる場合、ｄｓＲＮＡという用語は、配列特異的ＲＮＡｉを媒介する能力を持つ核酸分子を説明するために用いられる他の用語と同等であることが意図され、その用語には、例えば、部分二重鎖ＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）、ニックの入ったｄｓＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ）、ギャップのあるｄｓＲＮＡ（ｇｄｓＲＮＡ）、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、置換された短干渉オリゴヌクレオチド、修飾された短干渉オリゴヌクレオチド、化学修飾されたｄｓＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）等が含まれる。「大きな二本鎖ＲＮＡ」（「大きなｄｓＲＮＡ」）という用語は、約４０塩基対（ｂｐ）〜約１００ｂｐまたはそれよりも長い、特に最大約３００ｂｐ〜約５００ｂｐの長さの、任意の二本鎖ＲＮＡを意味する。大きなｄｓＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡのセグメントまたはｍＲＮＡ全体を表し得る。二本鎖構造は、自己相補的核酸分子によって、または２つ以上の異なる相補的核酸分子鎖のアニーリングによって形成され得る。
【００２６】
一態様において、ｄｓＲＮＡは、第１の鎖（アンチセンス）および第２の鎖（センス）を含む別々の２つのオリゴヌクレオチドを含み、アンチセンスとセンス鎖は自己相補的（すなわち、それぞれの鎖が、他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、別々の２本の鎖が、例えば、二本鎖領域は約１５〜約２４塩基対または約２６〜約４０塩基対である、二重鎖または二本鎖構造を形成する）であり、アンチセンス鎖は、標的核酸分子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み（例えば、配列番号１１５８もしくは１１５９のヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡ）、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部に対応する（すなわち相同である）ヌクレオチド配列を含む（例えば、標的核酸またはその一部に対応する約１５〜約２５ヌクレオチドまたは約２６〜約４０ヌクレオチドのセンス鎖）。
【００２７】
別の態様において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡの自己相補的なセンス鎖とアンチセンス鎖とが、核酸ベースリンカーまたは非核酸ベースのリンカーによって結合される、単一のオリゴヌクレオチドから構築される。一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子の第１（アンチセンス）および第２（センス）の鎖は、本明細書に記載されるように、かつ当該技術分野で既知であるように、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーによって共有結合される。他の実施形態において、第１のｄｓＲＮＡ分子は、当該技術分野で既知であるヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーによって、少なくとも１つの第２のｄｓＲＮＡ分子に共有結合され、第１のｄｓＲＮＡ分子は、同じもしくは異なっていてもよいか、またはこれらの任意の組み合わせである、複数の他のｄｓＲＮＡ分子に結合され得る。別の実施形態において、結合したｄｓＲＮＡは、結合されたｄｓＲＮＡと部分二重鎖を形成する第３の鎖を含み得る。
【００２８】
さらに別の態様において、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ分子は、例えば、「Ａ」（第１またはアンチセンス）鎖、「Ｓ１」（第２）鎖、および「Ｓ２」（第３）鎖等の３つ以上の鎖を有する部分二重鎖ＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）を形成し、「Ｓ１」および「Ｓ２」は、「Ａ」鎖の非重複領域と相補的であり、それとともに塩基対（ｂｐ）を形成する（例えば、ｍｄＲＮＡはＡ：Ｓ１Ｓ２の形態を取ることができる）。「Ｓ１」鎖と「Ａ」鎖とのアニーリングによって形成される二本鎖領域は、「Ｓ２」鎖と「Ａ」鎖とのアニーリングによって形成される二本鎖領域とは明確に異なり、非重複である。ｍｄＲＮＡ分子は「ギャップのある」分子であり、すなわち、０ヌクレオチド〜最大約１０ヌクレオチドの範囲の「ギャップ」（または、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５ヌクレオチドのギャップ）を含有する。一実施形態において、Ａ：Ｓ１二重鎖は、Ａ：Ｓ１二重鎖とＡ：Ｓ２二重鎖との間に配置され、「Ａ」、「Ｓ１」、または「Ｓ２」鎖のうちの１つ以上の３’末端にある１つ以上の不対ヌクレオチドのいずれともはっきりと異なる「Ａ」鎖における少なくとも１つの不対ヌクレオチド（最大約１０の不対ヌクレオチド）に起因するギャップによって、Ａ：Ｓ２二重鎖から離されている。別の実施形態において、Ａ：Ｓ１二重鎖は、Ａ：Ｓ１二重鎖とＡ：Ｓ２二重鎖との間の０ヌクレオチドのギャップ（すなわち、ポリヌクレオチド分子において、２つのヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合のみが壊れているまたは欠失しているニック）によって、Ａ：Ｓ２二重鎖と離されており、これはニックの入ったｄｓＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ）と称され得る。例えば、Ａ：Ｓ１Ｓ２は、合わせた合計が約１４塩基対〜約４０塩基対である少なくとも２つの二本鎖領域を有するｄｓＲＮＡを含み得、該二本鎖領域は、任意選択的に平滑末端を有する０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオチドのギャップによって離されているか、またはＡ：Ｓ１Ｓ２は、最大１０ヌクレオチド離間した少なくとも２つの二本鎖領域を有するｄｓＲＮＡを含み得、それによって第２の鎖と第３の鎖との間にギャップが形成され、二本鎖領域のうちの少なくとも１つは任意選択的に５塩基対〜１３塩基対を有する。
【００２９】
ｄｓＲＮＡまたは大きなｄｓＲＮＡは、置換または修飾を含むことができ、そこでは、該置換または修飾は、リン酸骨格結合、糖、塩基、またはヌクレオチドにおいてであり得る。かかるヌクレオシド置換は、天然の非標準ヌクレオシド（例えば５−メチルウリジンまたは５−メチルシチジンまたは２−チオリボチミジン）を含み得、かかる骨格、糖、またはヌクレオシド修飾は、メチル、アルコキシアルキル、ハロゲン、窒素もしくは硫黄、または当該技術分野で既知である他の修飾等の、アルキルまたはヘテロ原子の置換または付加を含むことができる。
【００３０】
また、本明細書で用いられる場合、「ＲＮＡｉ」という用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、またはエピジェネティクス等の配列特異的なＲＮＡ干渉を説明するために用いられるほかの用語と同等であることが意図される。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、転写後レベルもしくは転写前レベルで、またはこれらの任意の組み合わせで、後成的遺伝子をサイレンスするために用いることができる。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、「標的核酸」は、その発現または活性が改変されるべき、任意の核酸配列を指す（例えば、ＨＩＦ１Ａ）。標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその類似体であり得、一本鎖、二本鎖、および複数の鎖を持つ形態である。「標的部位」または「標的配列」は、ＲＮＡ分子内に存在する場合、ＲＮＡによって切断の「標的」とされ、標的部位または配列に相補的なアンチセンス鎖中に配列を含有する本開示のｄｓＲＮＡ構築物によって媒介される、標的核酸（例えばｍＲＮＡ）内の配列を意図する。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、「オフターゲット効果」または「オフターゲットプロファイル」とは、直接的にもまたは間接的にも、ｍｄＲＮＡまたはｄｓＲＮＡによる遺伝子サイレンシングの標的とされない、細胞または他の生体試料中の１つ以上の遺伝子に観察される発現パターンの改変である。例えば、オフターゲット効果は、ＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡ等の標的配列に特異的な候補ｍｄＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡ、またはその類似体の存在下において、いくつの非標的遺伝子が、２倍またはそれ以上改変された発現レベルを有するかを決定するために、ＤＮＡマイクロアレイを用いて定量化することができる。「最小限のオフターゲット効果」とは、ｍｄＲＮＡまたはｄｓＲＮＡが、検査される非標的遺伝子の約２５％〜約１％の発現に２倍以上の影響を及ぼすことを意味するか、または、置換もしくは修飾されたｍｄＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡ（例えば、５−メチルウリジンまたは２−チオリボチミジンで置換された少なくとも１つのウリジンを有し、任意選択的に少なくとも１つの２’位で修飾されたヌクレオチドを有する）のオフターゲット効果が、非置換または非修飾ｍｄＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの非標的遺伝子に対する効果と比較して、約１％〜約８０％以上低減されることを意味する。
【００３３】
「センス領域」または「センス鎖」とは、ｄｓＲＮＡ分子の１つ以上のアンチセンス領域に対して相補性を有するｄｓＲＮＡ分子の１つ以上のヌクレオチド配列を意味する。また、ｄｓＲＮＡ分子のセンス領域は、ＨＩＦ１Ａ等の標的配列に対して相同性または同一性を有する核酸配列を含む。「アンチセンス領域」または「アンチセンス鎖」とは、ＨＩＦ１Ａ等の標的核酸配列に対して相補性を有するｄｓＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス領域は、ｄｓＲＮＡ分子の１つ以上のセンス鎖に対して相補性を有する核酸配列領域を含み得る。
【００３４】
本明細書で用いられる「類似体」とは、構造的に親化合物（例えば、核酸分子）と類似するが、組成においてわずかに異なる化合物（例えば、１つの原子または官能基が異なる、加えられている、または除去された）を指す。類似体は、元の化合物とは異なる化学的または物理的特性を有する場合も、有さない場合もあり、向上した生物学的または化学的活性を有する場合も、有さない場合もある。例えば、類似体はより親水性であり得、または親化合物と比較して改変された活性を有し得る。類似体は、親化合物の化学的または生物学的活性を模倣し得（すなわち、類似するまたは同一の活性を有し得）、または、ある場合においては、増加または減少した活性を有し得る。類似体は、元の化合物の自然発生型または非自然発生型の（例えば、化学修飾されたまたは組み換えられた）変形であり得る。ＲＮＡ類似体の一例は、５−メチルウリジンまたは５−メチルシチジンまたは２−チオリボチミジン等の非標準ヌクレオチドを有するＲＮＡ分子であり、特定の所望される特性（例えば、安定性、バイオアベイラビリティを向上する、オフターゲット効果またはインターフェロン応答を最小限に留める等）に影響を与える可能性がある。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、「普遍的な塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）」とは、それぞれの標準的なＤＮＡ／ＲＮＡ塩基と、それらの塩基の間で、ほとんど差異なく塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体を指す。普遍的な塩基は、したがって、ヌクレオチド二重鎖の中に置換される場合、標準的なすべての塩基と交換され得る（例えば、Ｌｏａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２７０：４２６，１９９７を参照されたい）。例示的な普遍的な塩基には、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチルおよび他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、または３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、および６−ニトロインドール等のニトロアゾール誘導体が含まれる（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：２４３７，２００１を参照されたい）。
【００３６】
本明細書で用いられる「遺伝子」という用語は、特にＲＮＡｉの「標的遺伝子」または「遺伝子標的」という文脈において、ＲＮＡまたはかかる遺伝子の転写産物をコードする核酸分子を意味し、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ、またはポリペプチドをコードする構造的遺伝子とも称される）、かかる遺伝子のｍＲＮＡスプライス変異型、機能的ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）、または一過性の低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ））、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転位ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびその前駆体ＲＮＡ等の非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を含む。かかる非コードＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ媒介ＲＮＡｉの標的核酸分子としての役割を果たし、機能的または制御的な細胞プロセスに関与する標的ＲＮＡの活性を改変することができる。
【００３７】
本明細書で用いられる場合、「遺伝子サイレンシング」は、細胞における遺伝子発現の標的阻害を介した部分的または完全な機能喪失を指し、ＲＮＡｉの「ノックダウン」、「抑制」、「下方制御」、またはヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子等の標的遺伝子発現の「低下」と称すこともできる。取り組むべき状況や問題に応じて、遺伝子発現を部分的に低下させることが好ましい場合がある。あるいは、できる限り遺伝子発現を低下させることが望ましいかもしれない。サイレンシングの程度は、本明細書に記載される方法および当該技術分野で既知である方法（例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／３２６１９号、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７，２００１を参照されたい）によって決定することができる。アッセイに依存して、遺伝子発現の定量化が、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルもしくは活性の観点から、例えば、ベースライン（すなわち正常）または治療を標的とする特定の病態または他の状態と関連する可能性がある上昇した発現レベル含む他の対照レベルの１０％、３０％、５０％、７５％、９０％、９５％もしくは９９％と同じかそれを上回るレベルだけ、標的遺伝子の発現をノックダウンすることができる予防的および治療的な方法を含む、本開示の特定の実施形態において所望される可能性がある、様々な量の阻害の検出を可能にする。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、「治療的に有効な量」という用語は、それが投与される対象（例えば、ヒト）において、疾病症状の重症度の低減、寛解期の頻度もしくは持続時間の増加、または疾病による欠陥もしくは障害の予防をもたらすために十分な、ｄｓＲＮＡの量を意味する。例えば、ＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡ（例えば、配列番号１１５８もしくは１１５９）に対する治療的に有効な量のｄｓＲＮＡは、動脈壁におけるリポタンパク質の沈着を、治療を受けていない対象と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約８０％抑制することができる。治療的に有効な量の治療化合物は、対象において、例えば、アテローム症粥腫の大きさを縮小したり、あるいは症状を改善したりすることができる。当業者は、対象の体格、症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与経路等の要因に基づいて、かかる治療的に有効な量を決定することができるであろう。本開示の核酸分子は、単独で、または他の薬剤と組み合わせてもしくは併用して、本明細書で論じられる疾病または状態を治療するために用いることができる。例えば、特定の疾病、疾患、または状態を治療するために、ｄｓＲＮＡ分子は、治療に好適な条件下において、単独でまたは１つ以上の薬剤と組み合わせて、患者に投与され得、または、当業者には明白である他の適切な細胞に投与され得る。
【００３９】
また、１つ以上のｄｓＲＮＡが、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡ、または関連するｍＲＮＡスプライス変異型の発現をノックダウンするために用いられ得る。この点において、ＨＩＦ１Ａ遺伝子は、２つ以上のｍＲＮＡスプライス変異型に転写されてもよいことに留意すべきであり、従って、例えば、一部の実施形態において、他のｍＲＮＡスプライス変異型に影響を与えることなく１つのｍＲＮＡスプライス変異型をノックダウンすることが望ましく、またその逆も真であり、あるいはすべての転写産物のノックダウンが標的にされ得る。
【００４０】
また、本明細書に記載される構造および置換基の様々な組み合わせに由来する個々の化合物または化合物の群は、それぞれの化合物または化合物の群が別個に記載されるかのように、本出願によって開示されることを理解されたい。したがって、特定の構造または特定の置換基の選択は、本開示の範囲内に含まれる。本明細書に記載されるように、すべての値の範囲は、範囲で示される最初と最後の値を含む。よって、Ｃ１−Ｃ４の範囲は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４を含むように、１、２、３、および４の値を含むと理解される。
【００４１】
本明細書で用いられる「アルキル」という用語は、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜８個の炭素原子、そして最も好ましくは１〜４個の炭素原子を含有する、直鎖または分岐鎖飽和脂肪族基を指す。この定義は、アルコキシ、アルカノイルおよびアラルキル基のアルキル部分にも適用される。アルキル基は、置換または、非置換であり得る。一部の実施形態において、アルキルは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルまたはメチルである。
【００４２】
本明細書で用いられる「シクロアルキル」という用語は、任意に置換され得る３〜１２個の炭素原子を含有する飽和環状炭化水素の環系を意味する。例示的な実施形態には、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが含まれる。一部の実施形態において、シクロアルキル基はシクロプロピルである。別の実施形態において、（シクロアルキル）アルキル基は、環状部分に３〜１２個の炭素原子、およびアルキル部分に１〜６個の炭素原子を含む。一部の実施形態において、（シクロアルキル）アルキル基はシクロプロピルメチルである。アルキル基は、ハロゲン、ヒドロキシおよびアミノから構成される群から選択される１つから３つの置換基で任意に置換される。
【００４３】
本明細書で用いられる「アルカノイル」および「アルカノイルオキシ」という用語は、それぞれ任意選択的に２〜１０個の炭素原子を含有する、−Ｃ（Ｏ）−アルキル基および−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル基をそれぞれ意味する。アルカノイルおよびアルカノイルオキシ基の具体的な実施形態は、それぞれアセチルとアセトキシである。
【００４４】
「アルケニル」という用語は、２〜１５個の炭素原子を有し、親アルケンの単一の炭素原子から水素原子を１つ除去することにより得られる少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、不飽和の分岐鎖、直鎖、または環状アルキル基を指す。該基は、二重結合（複数を含む）の周りでシスまたはトランス構造のいずれかであり得る。一部の実施形態には、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−メチルエテニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、４−ペンテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、１−ヘプテニル、２−ヘプテニル、１−オクテニル、２−オクテニル、１，３−オクタジエニル、２−ノネニル、１，３−ノナジエニル、２−デセニル等が含まれる。アルケニル基は置換される場合もあり、非置換の場合もある。
【００４５】
本明細書で用いられる「アルキニル」という用語は、２〜１０個の炭素原子を有し、親アルキンの単一の炭素原子から水素原子を１つ除去することにより得られる少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する、不飽和の分岐鎖、直鎖、または環状アルキル基を指す。例示的なアルキニルには、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、４−ペンチニル、１−オクチニル、６−メチル−１−ヘプチニル、２−デシニル等が含まれる。アルキニル基は置換される場合もあり、非置換の場合もある。
【００４６】
「ヒドロキシアルキル」という用語は、単独でまたは組み合わせて、既に定義されたアルキル基であって、１つまたはいくつかの水素原子、好ましくは１つの水素原子がヒドロキシルによって置き換えられたものである。例にはヒドロキシメチル、ヒドロキシエチルおよび２−ヒドロキシエチルが含まれる。
【００４７】
本明細書で用いられる「アミノアルキル」という用語は−ＮＲＲ’基を指し、式中、ＲおよびＲ’は独立して水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり得る。
【００４８】
「アルキルアミノアルキル」という用語は、アルキル基を介して結合されたアルキルアミノ基を指す（すなわち、一般構造−アルキル−ＮＨ−アルキルまたは−アルキル−Ｎ（アルキル）（アルキル）を有する基）。かかる基には、これに限定されないが、モノ−およびジ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）アミノＣ１−Ｃ８アルキルが含まれ、各アルキルは同じであっても異なっていてもよい。
【００４９】
「ジアルキルアミノアルキル」という用語は、アルキル基に結合するアルキルアミノ基を指す。例には、これに限定されないが、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル等が含まれる。ジアルキルアミノアルキルという用語は、架橋するアルキル部分が任意に置換された基も含む。
【００５０】
「ハロアルキル」という用語は、例えば、クロロメチル、２−ブロモエチル、３−ヨードプロピル、トリフルオロメチル、パーフルオロプロピル、８−クロロノニル等の、１つ以上のハロ基で置換されたアルキルを指す。
【００５１】
本明細書で用いられる「カルボキシアルキル」という用語は、置換基−Ｒ１０−ＣＯＯＨを意味し、式中、Ｒ１０はアルキレンであり、「カルボアルコキシアルキル」は−Ｒ１０−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１１を意味し、式中、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれアルキレンおよびアルキルである。一部の実施形態において、アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、２−メチルペンチル、ｎ−ヘキシル等の、１〜６個の炭素原子の飽和直鎖または分岐鎖のヒドロカルビルラジカルを指す。アルキレンは、２価基であることを除いて、アルキルと同じである。
【００５２】
「アルコキシ」という用語は、酸素原子に共有結合的に結合する置換および非置換のアルキル、アルケニル、およびアルキニル基を含む。一実施形態において、アルコキシ基は、１〜約１０個の炭素原子を含有する。アルコキシ基の実施形態は、これに限定されないが、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびペントキシ基を含む。置換されたアルコキシ基の実施形態は、ハロゲン化アルコキシ基を含む。さらなる実施形態において、アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分等の基と置換され得る。例示的なハロゲン置換されたアルコキシ基は、これに限定されないが、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、およびトリクロロメトキシを含む。
【００５３】
「アルコキシアルキル」という用語は、アルコキシ基で置換されたアルキレンを指す。例えば、メトキシエチル（ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２−）およびエトキシメチル（ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２−）は、両方ともＣ３アルコキシアルキル基である。
【００５４】
本明細書で用いられる「アリール」という用語は、例えば、フェニル、ナフチル、ビフェニルおよびジフェニル基等の、環部分に６〜１２個の炭素原子を有する単環式または二環式の芳香族炭化水素基を指し、各々、例えば、１〜４個の置換基、例えば、アルキル、上で定義される置換されたアルキル、ハロゲン、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルキルオキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルバミル、カルバモイル、およびアリールオキシで置換され得る。本開示に従ったアリール基の具体的実施形態には、フェニル、置換されたフェニル、ナフチル、ビフェニル、およびジフェニルが含まれる。
【００５５】
「アロイル」という用語は、本明細書において単独でまたは組み合わせて用いられる場合、任意に置換された安息香酸またはナフトエ酸等の芳香族カルボン酸に由来するアリールラジカルを指す。
【００５６】
本明細書で用いられる「アラルキル」という用語は、アルキル基を介して２−ピリジニル環または４−ピリジニル環に結合されたアリール基を意味し、好ましくは１〜１０個の炭素原子を含有するものを指す。好ましいアルキル基はベンジルである。
【００５７】
本明細書で用いられる「カルボキシ」という用語は、式−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨまたは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−の基を表す。
【００５８】
本明細書で用いられる「カルボニル」という用語は、酸素原子が炭素原子と二重結合している−Ｃ＝Ｏ基を意味する。
【００５９】
本明細書で用いられる「トリフルオロメチル」という用語は、−ＣＦ３を意味する。
【００６０】
本明細書で用いられる「トリフルオロメトキシ」という用語は−ＯＣＦ３を意味する。
【００６１】
本明細書で用いられる「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨまたは−Ｏ−を意味する。
【００６２】
本明細書で用いられる「ニトリル」または「シアノ」という用語は、基−ＣＮを意味する。
【００６３】
「ニトロ」という用語は、本明細書において単独でまたは組み合わせて用いられる場合、−ＮＯ２基を意味する。
【００６４】
本明細書で用いられる「アミノ」という用語は−ＮＲ９Ｒ９基を意味し、式中、Ｒ９は独立して水素、アルキル、アリール、アルコキシ、またはヘテロアリールであり得る。本明細書で用いられる「アミノアルキル」という用語は、「アミノ」と比較してより詳細な選択肢を表し、−ＮＲ’Ｒ’基を意味し、式中、Ｒ’は独立して水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり得る。「ジアルキルアミノ」という用語は、同じであっても異なっていてもよい２つの結合するアルキル基を有するアミノ基を指す。
【００６５】
「アルカノイルアミノ」という用語は、例えば、アセチルアミノ、プロパノイルアミノ、およびブタノイルアミノ等、−Ｃ（＝Ｏ）−基の後に−Ｎ（Ｈ）−を含有するアルキル、アルケニルまたはアルキニル基を指す。
【００６６】
「カルボニルアミノ」という用語は、−ＮＲ’−ＣＯ−ＣＨ２−Ｒ’基を指し、式中、Ｒ’は独立して水素または（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから選択され得る。
【００６７】
本明細書で用いられる「カルバモイル」という用語は、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を意味する。
【００６８】
本明細書で用いられる「カルバミル」という用語は、窒素原子が、すなわち、−ＮＲ’’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’に見られる、直接カルボニルに結合する官能基を意味し、式中、Ｒ’’は独立して、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロ、またはヘテロアリールであり得る。
【００６９】
「アルキルスルホニルアミノ」という用語は、基−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ１２を意味し、式中、Ｒ１２はアルキルである。
【００７０】
本明細書で用いられる「ハロゲン」という用語は、臭素、塩素、フッ素またはヨウ素を指す。一実施形態において、ハロゲンはフッ素である。別の実施形態において、ハロゲンは塩素である。
【００７１】
「ヘテロシクロ」という用語は、少なくとも１つの炭素原子を含有する環に少なくとも１つのヘテロ原子を有する４〜７員環の単環式または７〜１１員環の二環系である、任意に置換された、不飽和の、部分的に飽和した、または完全に飽和した、芳香族または非芳香族の環状基を指す。ヘテロシクロ環上の置換基は、上でアリール基について挙げられたものから選択され得る。ヘテロ原子を含有するヘテロシクロ基の各環は、窒素、酸素または硫黄から選択される１、２、または３個のヘテロ原子を有し得る。所与のヘテロシクロ環中の複数のヘテロ原子は同じであってもまたは異なっていてもよい。
【００７２】
例示的な単環式へテロシクロ基には、ピロリジニル、ピロリル、インドリル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、フリル、テトラヒドロフリル、チエニル、ピペリジニル、ピペラジニル、アゼピニル、ピリミジニル、ピリダジニル、テトラヒドロピラニル、モルホリニル、ジオキサニル、トリアジニル、およびトリアゾリルが含まれる。好ましい二環式へテロシクロ基には、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフリル、インダゾリル、ベンゾイソチアゾリル、イソインドリニルおよびテトラヒドロキノリニルが含まれる。より詳細な実施形態において、ヘテロシクロ基は、インドリル、イミダゾリル、フリル、チエニル、チアゾリル、ピロリジル、ピリジルおよびピリミジルを含み得る。
【００７３】
「置換された」とは、１つ以上の水素原子がそれぞれ独立して、同じかまたは異なる置換基（複数を含む）で置き換えられた基を指す。代表的な置換基には、−Ｘ、−Ｒ６、−Ｏ−、＝Ｏ、−ＯＲ、−ＳＲ６、−Ｓ−、＝Ｓ、−ＮＲ６Ｒ６、＝ＮＲ６、−ＣＸ３、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−Ｓ（＝Ｏ）２２Ｏ−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ６、−ＯＳ（＝Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（＝Ｏ）２ＯＨ、−ＯＳ（＝Ｏ）２Ｒ６、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ−）、−ＯＰ（＝Ｏ）２（Ｏ−）、−Ｃ（−Ｏ）Ｒ６、−Ｃ（＝Ｓ）Ｒ６、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ６、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ６、−ＮＲ６−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ６）２、−ＮＲ６−Ｃ（＝Ｓ）−Ｎ（Ｒ６）２、および−Ｃ（＝ＮＲ６）ＮＲ６Ｒ６が含まれ、式中、各Ｘは独立してハロゲンであり、各Ｒ６は独立して水素、ハロゲン、アルキル、アリール、アリールアルキル、アリールアリール（ａｒｙｌａｒｙｌ）、アリールへテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ＮＲ７Ｒ７、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ７および−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ７であり、各Ｒ７は独立して水素、アルキル、アルカニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、アリールへテロアルキル（ａｒｙｌｈｅｔｅｒａｌｋｙｌ）、アリールアリール（ａｒｙｌａｒｙｌ）、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである。アリールを含む置換基は、１つ以上の置換を有してもまたは有さなくても、パラ（ｐ−）、メタ（ｍ−）もしくはオルト（ｏ−）構成で、またはこれらの任意の組み合わせで結合し得る。
【００７４】
低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１Ａ）および例示的なｄｓＲＮＡ分子
低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１Ａ、およびＨＩＦ１、ＨＩＦ−１α、ＨＩＦ１−Α、ＡＲＮＴ結合タンパク質、ＰＡＳスーパーファミリー１のメンバー、ＭＯＰ１、ＰＡＳＤ８、サイトカイン抑制抗炎症剤結合タンパク質、ＣＳＢＰ、ＣＳＡＩＤ結合タンパク質、ＣＳＢＰ１、ＣＳＢＰ２、ＣＳＰＢ１、ＭＡＸ結合タンパク質２、ＥＸＩＰ、ＲＫ、Ｍｘｉ２、ＰＲＫＭ１４、およびＰＲＫＭ１５としても知られる）は、低酸素症への細胞内および全身恒常性応答に関与する転写因子である。活性を増加させるＨＩＦ１Ａの変異または過剰発現は、心筋虚血、脳虚血、網膜虚血、肺高血圧症、妊娠疾患（例えば、子癇前症、子宮内発育遅延）および癌を含む、様々な疾病と関連している。
【００７５】
ＨＩＦ１Ａおよび関連疾患に関するより多くの詳細が、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ＯＭＩＭに記載され、ＭａｎデータベースのＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ（ＯＭＩＭ受入番号６０３３４８）にある。ヒトＨＩＦ１Ａの完全なｍＲＮＡは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１５３０．２（変異型１、配列番号１１５８）およびＮＭ＿１８１０５４．１（変異型２、配列番号１１５９）を有する。本明細書で用いられる場合、ＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡもしくはＲＮＡ配列またはセンス鎖への言及は、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるＨＩＦ１Ａアイソフォーム、ならびに配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒトＨＩＦ１Ａ配列と少なくとも８０％以上の相同性を有する変異型および相同体を意味する。
【００７６】
２つ以上の核酸配列の間の「相同性パーセント」は、ギャップの数、および２つ以上の配列のアライメントを最適化するために導入される必要のあるそれぞれのギャップの長さを考慮に入れた、該配列に共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝同一の位置の数／合計位置数×１００）。２つ以上の配列の間における、配列の比較および相同性パーセントの決定は、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラム等の数学的アルゴリズムを用いて達成することができる（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴを参照、またＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０も参照されたい）。
【００７７】
一態様において、本開示は、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である第１の鎖と、第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的である第２の鎖および第３の鎖と、を含むｍｄＲＮＡ分子であって、第２の鎖および第３の鎖は、第１の鎖とアニーリングして最大１０ヌクレオチド離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、それによって、第２の鎖と第３の鎖との間にギャップが形成され、（ａ）ｍｄＲＮＡ分子は、５塩基対〜１３塩基対の少なくとも１つの二本鎖領域を任意選択的に含むか、または（ｂ）合わせた二本鎖領域は合計で約１５塩基対〜約４０塩基対であり、ｍｄＲＮＡ分子は任意選択的に1つ以上の平滑末端を有し、ｍｄＲＮＡの少なくとも１つのピリミジンヌクレオシドは、式ＩまたはＩＩに従い、
2010519908.tif 000003
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ハロゲン、置換もしくは未置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル、置換もしくは未置換の−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル、カルバモイル、カルバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換もしくは未置換のアリール、置換もしくは未置換のアラルキル、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−Ｃ≡Ｎ、またはヘテロシクロ基であり、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立してヒドロキシル、保護ヒドロキシル、リン酸塩、またはヌクレオシド間の結合基であり、Ｒ５およびＲ８は、それぞれ独立してＯまたはＳである、ｍｄＲＮＡ分子を提供する。一部の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオシドは式Ｉに従い、式中、Ｒ１はメチルでありかつＲ２は−ＯＨであるか、またはＲ１はメチルであり、Ｒ２は−ＯＨであり、Ｒ８はＳである。他の実施形態において、ヌクレオシド間結合基は、約５〜約４０個のヌクレオシドを共有結合的に結合する。いくつかの実施形態において、ギャップは、第１の鎖にアニーリングしたときに第２および第３の鎖によって形成される二本鎖領域の間に配置される第１の鎖の中に、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含むか、またはギャップはニックである。一部の実施形態において、ニックまたはギャップは、第１の（アンチセンス）鎖の５’末端から１０ヌクレオチドか、またはアルゴノート切断部位に位置する。別の実施形態において、部分二重鎖のニックまたはギャップは、第１および第２の鎖の二重鎖ならびに第１および第３の鎖の二重鎖に対する熱安定性が、異なる位置にニックまたはギャップを有するかかる部分二重鎖の熱安定性と比較して、最大化されるように配置される。
【００７８】
さらに別の態様において、本開示は、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載される低酸素誘発因子１α（ＨＩＦ１Ａ）のｍＲＮＡに相補的である第１の鎖と、第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的である第２の鎖および第３の鎖と、を含み、第２の鎖および第３の鎖は、第１の鎖とアニーリングして最大１０ヌクレオチド離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、それによって第２の鎖と第３の鎖との間にギャップが形成され、ｍｄＲＮＡ分子は、５塩基対〜１３塩基対の少なくとも１つの二本鎖領域を任意選択的に含む、ｍｄＲＮＡ分子を提供する。さらなる態様において、本開示は、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である第１の鎖と、第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的である第２の鎖および第３の鎖と、を有し、第２の鎖および第３の鎖は、第１の鎖とアニーリングして最大１０ヌクレオチド離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、それによって第２の鎖と第３の鎖との間にギャップが形成され、合わせた二本鎖領域は合計で約１５塩基対〜約４０塩基対であり、ｍＲＮＡ分子は、１つ以上の平滑末端を任意選択的に有する、ｍｄＲＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態において、ギャップは、第１の鎖にアニーリングしたときに第２および第３の鎖によって形成される二本鎖領域の間に配置される第１の鎖の中に、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含むか、またはギャップはニックである。一部の実施形態において、ニックまたはギャップは、第１の（アンチセンス）鎖の５’末端から１０ヌクレオチドか、またはアルゴノート切断部位に位置する。別の実施形態において、部分二重鎖のニックまたはギャップは、第１および第２の鎖の二重鎖ならびに第１および第３の鎖の二重鎖に対する熱安定性が、異なる位置にニックまたはギャップを有するかかる部分二重鎖の熱安定性と比較して、最大化されるように配置される。
【００７９】
本明細書に提供される場合、本明細書に開示されるいずれの態様または実施形態も、心筋虚血、脳虚血、網膜虚血、肺高血圧症、妊娠疾患（例えば、子癇前症、子宮内発育遅延）、および癌を含む、ＨＩＦ１Ａ関連疾病または疾患の治療に有用である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、第１の鎖が約５ヌクレオチド〜約４０個のヌクレオチドを含み、第２および第３の鎖がそれぞれ別個に約５ヌクレオチド〜約２０個のヌクレオチドを含む、少なくとも３本の鎖を含み、第２の鎖と第３の鎖を合わせた長さは約１５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドである。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは少なくとも２本の鎖を含み、第１の鎖は約１５ヌクレオチド〜約２４ヌクレオチドであるか、または約２５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドである。さらに他の実施形態において、第１の鎖は、約１５〜約２４ヌクレオチド長または約２５〜約４０ヌクレオチド長を含み、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡの、少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の隣接するヌクレオチドに相補的である。代替的な実施形態において、第１の鎖は約１５〜約２４ヌクレオチド長または約２５〜約４０ヌクレオチド長を含み、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡの、少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の隣接するヌクレオチドに相補的である配列に、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【００８１】
さらなる実施形態において、第１の鎖は、第２の鎖に対して、または第２および第３の鎖に対して、または複数の鎖に対して、相補的である。第１の鎖およびその補体は、本開示のｄｓＲＮＡおよびｍｄＲＮＡ分子を形成することができるが、第１の鎖の約１９〜約２５のヌクレオチドのみが、ＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的な配列を含む。例えば、ダイサー基質ｄｓＲＮＡは、約２５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドを有し得るが、アンチセンス（第１の）鎖の１９ヌクレオチドのみがＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的となる。さらなる実施形態において、約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドにＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに対する相補性を有する第１の鎖は、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載される配列等のＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡか、または、例えば、ＲＩＳＣを活性化するかまたはＲＩＳＣにローディングする能力を持つ１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドからなる第１の鎖と、１つ、２つ、または３つのミスマッチを有し、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載される配列等のＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに見られる対応するヌクレオチドと少なくとも８０％の相同性を有する。
【００８２】
ｍｄＲＮＡ分子を設計するために用いることができ、かつ本明細書に記載される置換または修飾を任意選択的に含むことができる一部の具体的なｄｓＲＮＡ分子が、本明細書に添付される配列表（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ）において提供され、参照することにより本明細書に組み込まれる（名称「０７−Ｒ０３７ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ」のテキストファイル、２００８年２月１３日作成、サイズは３９３キロバイト）。さらに、米国仮特許出願番号第６０／９３４，９３０号（２００７年３月１６日出願）に開示される表Ｂの内容は、名称「Ｔａｂｌｅ＿Ｂ＿Ｈｕｍａｎ＿ＲｅｆＳｅｑ＿Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＿Ｎｕｍｂｅｒｓ．ｔｘｔ」の別個のテキストファイル（２００７年３月１６日作成、サイズは３，６０４キロバイト）として上記出願とともに提出されたが、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００８３】
ＨＩＦ１Ａ  ｄｓＲＮＡ分子の置換および修飾
置換および修飾されたヌクレオチドを、本開示のｍｄＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ分子に導入することで、体外から送達される天然のＲＮＡ分子（すなわち、標準的ヌクレオチドを有する）に本来存在する生体内安定性およびバイオアベイラビリティの潜在的な限界を克服する強力なツールが提供される。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ分子は血清中でより長い半減期を持つ傾向にあるため、本開示のｄｓＲＮＡ分子を使用することにより、特定の核酸分子が低用量で所与の治療効果を上げることができるようになる（例えば、ＨＩＦ１Ａの発現を低下または停止させる）。さらに、一部の置換および修飾は、特定の細胞もしくは組織を標的とすることにより、またはｄｓＲＮＡ分子の細胞摂取を向上させることにより、ｄｓＲＮＡのバイオアベイラビリティを改善することができる。したがって、たとえ天然のＲＮＡ分子と比較して本開示のｄｓＲＮＡ分子の活性が低い場合でも、該分子の安定性または送達が向上したことによって、置換または修飾されたｄｓＲＮＡ分子の全体的な活性は、天然のＲＮＡ分子の活性よりも優れている可能性がある。天然の非修飾ｄｓＲＮＡとは異なり、置換または修飾されたｄｓＲＮＡは、例えば、ヒトにおいて、インターフェロン応答を活性化する可能性を最小限に抑えることも可能である。
【００８４】
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、またはこれらの任意の組み合わせである第１の（アンチセンス）鎖の少なくとも１つのウリジン、少なくとも３つのウリジン、または１つ１つすべてのウリジン（すなわち、すべてのウリジン）を有する。関連する実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子またはその類似体は、５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、またはこれらの任意の組み合わせであるｄｓＲＮＡの第２の（センス）鎖の少なくとも１つのウリジン、少なくとも３つのウリジン、または１つ１つすべてのウリジンを有する。関連する実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、またはこれらの任意の組み合わせであるｄｓＲＮＡの第３の（センス）鎖の少なくとも１つのウリジン、少なくとも３つのウリジン、または１つ１つすべてのウリジンを有する。さらに別の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、またはこれらの任意の組み合わせである、第１（アンチセンス）および第２の（センス）鎖の両方、第１（アンチセンス）および第３の（センス）鎖の両方、第２（センス）および第３（センス）の鎖の両方、またはｄｓＲＮＡの第１（アンチセンス）、第２（センス）および第３（センス）鎖の少なくとも１つのウリジン、少なくとも３つのウリジン、または１つ１つすべてのウリジンを有する。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子の二本鎖領域は、少なくとも３つの５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、またはこれらの任意の組み合わせを有する。一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、１本の鎖、両方の鎖、またはこれらの任意の組み合わせにおけるヌクレオチドの位置の約５％〜約９５％で、リボヌクレオチドを含む。
【００８５】
さらなる実施形態において、本開示に従った、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させるｄｓＲＮＡ分子は、１つ以上の天然または合成の非標準ヌクレオチドをさらに含む。関連する実施形態において、非標準ヌクレオシドは、１つ以上のデオキシウリジン、ロックされた核酸（ＬＮＡ）分子、修飾された塩基（例えば５−メチルウリジン）、普遍的に結合するヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、修飾されたヌクレオシド間結合（例えばホスホロチオエート）、Ｇクランプ、またはこれらの任意の組み合わせである。一部の実施形態において、普遍的に結合するヌクレオチドは、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル、イノシン、アゾールカルボキサミド、１−β−Ｄ−リボフラノシル−４−ニトロインドール、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、１−β−Ｄ−リボフラノシル−６−ニトロインドール、または１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールであり得る。
【００８６】
ｄｓＲＮＡ分子中に存在する置換または修飾されたヌクレオチドは、好ましくはセンスまたはアンチセンス鎖にあるが、任意選択的にアンチセンスおよびセンス鎖の両方にあり、天然または標準的リボヌクレオチドと同様の特性または性質を有する、本開示に従う修飾または置換されたヌクレオチドを含む。例えば、本開示は、ノーザン構造（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（例えば、ノーザン擬似回転サイクル、例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  ｅｄ．，１９８４を参照されたい）を持つヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を特徴とする。したがって、好ましくはアンチセンス鎖にあるが、任意選択的にセンス鎖またはアンチセンスおよびセンス鎖の両方にある、本開示のｄｓＲＮＡ分子に存在する化学修飾ヌクレオチドは、ヌクレアーゼの分解に対して耐性を示すと同時に、その一方、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持する。ノーザン構造を有する例示的なヌクレオチドには、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’−メトキシエチル（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、５−メチルウリジン、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが含まれる。一部の実施形態において、ＬＮＡは５−メチルウリジンＬＮＡまたは２−チオ−５−メチルウリジンＬＮＡである。これらの実施形態のいずれにおいても、１つ以上の置換または修飾されたヌクレオチドは、Ｇクランプであり得る（例えば、９−（アミノエトキシ）フェノキサジン等のグアニンに対して追加の水素結合を形成するシトシン類似体、例えば、Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｕｃｃｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：８５３１，１９９８を参照されたい）。
【００８７】
本明細書に記載されるように、本開示によって提供されるｄｓＲＮＡ分子またはその類似体の第１の鎖と１つ以上の第２の鎖とは、ともにアニーリングまたはハイブリダイズして（すなわち、鎖間の相補性のため）、約４〜約１０塩基対、約５〜約１３塩基対、または約１５〜約４０塩基対の長さを持つ、少なくとも１つの二本鎖領域を形成することができる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約１５〜約２４塩基対または約１９〜約２３塩基対の範囲の長さの少なくとも１つの二本鎖領域を有する。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約２６〜約４０塩基対または約２７〜約３０塩基対または約３０〜約３５塩基対の範囲の長さの、少なくとも１つの二本鎖領域を有する。他の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子の２つ以上の鎖は、任意選択的に、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子によって、共有結合的にともに結合され得る。
【００８８】
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子またはその類似体は、デオキシリボヌクレオチドまたは２つのデオキシリボヌクレオチド（例えば、チミジン、アデニン）を含むオーバーハング等、ｄｓＲＮＡの３’末端の一端または両端に１〜４ヌクレオチドのオーバーハングを含む。一部の実施形態において、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む３’末端はｍｄＲＮＡ分子中にあり、それはギャップの中にあるか、ギャップの中にないか、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかである。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子またはその類似体は、ｄｓＲＮＡの一端または両端に平滑末端を有する。一部の実施形態において、第１または第２の鎖の５’末端はリン酸化されている。本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、核酸の糖、塩基、または骨格において化学的に修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上の普遍的な塩基リボヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上の非環式ヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、ｄｓＲＮＡは、５’リン酸塩（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．．１１０：５６３−５７４，２００２、およびＳｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ．１０：５３７−５６８，２００２を参照されたい）または５’，３’二リン酸塩等の末端リン酸基をさらに含むことができる。
【００８９】
本明細書に記載され場合、例えば、ＲＮＡｉによって、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させる本開示のｄｓＲＮＡの末端構造は、平滑末端か、または１つ以上のオーバーハングのいずれかを有することができる。一部の実施形態において、オーバーハングは３’末端または５’末端にあり得る。オーバーハングを有するｄｓＲＮＡの全長は、対になった二本鎖部分とオーバーハングするヌクレオチドとの長さの合計として表される。例えば、１９塩基対のｄｓＲＮＡが２つのヌクレオチドオーバーハングを両端に有する場合、全長は２１−ｍｅｒと表される。さらに、オーバーハングする配列は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子に対する特異性が低い可能性があるため、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の配列に対して必ずしも相補的（アンチセンス）または同一（センス）であるとは限らない。さらなる実施形態において、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させる本開示のｄｓＲＮＡは、例えば、ｄｓＲＮＡの１つ以上のオーバーハング部分に、低分子量構造（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡもしくはウイルスＲＮＡ等の天然のＲＮＡ分子、または人工のＲＮＡ分子）を、さらに含み得る。
【００９０】
さらなる実施形態において、本開示に従った、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させるｄｓＲＮＡ分子は、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−２−メトキシエチル、ハロゲン、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アリル、またはこれらの任意の組み合わせ等の２’糖置換をさらに含む。さらなる実施形態において、本開示に従った、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させるｄｓＲＮＡ分子は、第１の鎖または１つ以上の第２の鎖の一端または両端上に、アルキル、脱塩基、デオキシ脱塩基、グリセリル、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、反転したデオキシヌクレオチド部分、またはこれらの任意の組み合わせ等の末端キャップ置換基をさらに含む。一部の実施形態において、二本鎖領域内にあるセンス鎖の少なくとも１つまたは２つの５’末端リボヌクレオチドは、２’糖置換を有する。他の一部の実施形態において、二本鎖領域内にあるアンチセンス鎖の少なくとも１つまたは２つの５’末端リボヌクレオチドは、２’糖置換を有する。一部の実施形態において、二本鎖領域内にあるセンス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも１つまたは２つの５’末端リボヌクレオチドは、２’糖置換を有する。
【００９１】
他の実施形態において、本開示に従った、ＲＮＡｉにより１つ以上の標的遺伝子の発現を低下させるｄｓＲＮＡ分子は、糖骨格に、リボシル、２’−デオキシリボシル、テトロフラノシル（ｔｅｔｒｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）（例えば、Ｌ−α−トレオフラノシル）、ヘキソピラノシル（例えば、β−アロピラノシル、β−アルトロピラノシル、およびβ−グルコピラノシル）、ペントピラノシル（例えば、β−リボピラノシル、α−リキソピラノシル、β−キシロピラノシル、およびα−アラビノキシロピラノシル）、炭素環式（炭素のみの環）類似体、ピラノース、フラノース、モルホリノ、またはこれらの類似体もしくは誘導体の任意の組み合わせを含む、１つ以上の置換を含む。
【００９２】
さらに他の実施形態において、本開示に従った、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子（そのｍＲＮＡスプライス変異型を含む）の発現を低下させるｄｓＲＮＡ分子は、独立してホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、メチルホスホン酸塩、アルキルホスホン酸塩、３’−アルキレンホスホン酸塩、５’−アルキレンホスホン酸塩、キラルホスホネート、ホスホノ酢酸塩、チオホスホノ酢酸塩、ホスフィン酸塩、ホスホロアミド酸塩、３’−アミノホスホロアミド酸塩、アミノアルキルホスホロアミド酸塩、チオノホスホロアミド酸塩、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノリン酸塩、ボラノリン酸結合、またはこれらの任意の組み合わせ等の、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合をさらに含む。
【００９３】
修飾されたヌクレオチド間結合は、本明細書に記載されるように、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、両方の鎖、または複数の鎖（例えば、ｍｄＲＮＡ中）の中等、本開示のｄｓＲＮＡ分子の１つ以上の鎖に存在し得る。本開示のｄｓＲＮＡ分子は、第２のセンス鎖、第３のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはアンチセンス鎖と１つ以上のセンス鎖との任意の組み合わせの、３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に、１つ以上の修飾されたヌクレオチド間結合を含み得る。一実施形態において、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子（その特異的または選択されたｍＲＮＡスプライス変異型を含む）の発現を低下させる能力を持つｄｓＲＮＡ分子は、３’末端にホスホロチオエート結合等の１つの修飾されたヌクレオチド間結合を有する。例えば、本開示は、１つのｄｓＲＮＡ鎖に約１〜約８つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させる能力を持つｄｓＲＮＡ分子を提供する。さらに別の実施形態において、本開示は、複数のｄｓＲＮＡ鎖に約１〜約８つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、ＲＮＡｉにより、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させる能力を持つｄｓＲＮＡ分子を提供する。他の実施形態において、例示的な本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、両方の鎖、または複数の鎖の５’末端に、約１〜約５つ以上連続するホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。別の実施例において、例示的な本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、いずれかの鎖、または複数の鎖に、１つ以上のピリミジンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。さらに別の実施例において、例示的な本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、いずれかの鎖、または複数の鎖に、１つ以上のプリンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
【００９４】
本開示のｄｓＲＮＡにおいて有用な多くの例示的な修飾ヌクレオチド塩基またはその類似体には、５−メチルシトシン；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；６−メチル、２−プロピル、またはアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体；８−置換アデニンおよびグアニン（８−アザ、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル等）；７−メチル、７−デアザ、および３−デアザアデニンならびにグアニン；２−チオウラシル；２−チオチミン；２−チオシトシン；５−メチル、５−プロピニル、５−ハロ（５−ブロモまたは５−フルオロ等）、５−トリフルオロメチル、または他の５−置換ウラシルおよびシトシン；ならびに６−アゾウラシルが含まれる。さらなる有用なヌクレオチド塩基は、Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１６２８，２００３、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：２９７，２０００、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０、米国特許第３，６８７，８０８号、および同様の参考文献に見ることができる。
【００９５】
あるヌクレオチド塩基部分は、本開示のｄｓＲＮＡ分子の、相補的な標的に対する結合親和性を高めるために特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６、またはＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）が含まれる。例えば、５−メチルウリジンおよび５−メチルシトシンの置換は、核酸の二重鎖安定性を高めることが知られており、修飾または置換されたｄｓＲＮＡに対するヌクレアーゼ耐性を提供する２’糖修飾（２’−メトキシまたは２’−メトキシエチル等）またはヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わせることができる。
【００９６】
本開示の別の態様において、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である第１の鎖と、第１の鎖に相補的である第２の鎖と、を含む、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させるｄｓＲＮＡであって、第１および第２の鎖は約１５〜約４０塩基対の二本鎖領域を形成し、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つのピリミジンは式ＩまたはＩＩに従うピリミジンヌクレオシドであり、
2010519908.tif 000004
式中、Ｒ１およびＲ５は、それぞれ独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ハロゲン、置換もしくは未置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル、置換もしくは未置換の−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル、カルバモイル、カルバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換もしくは未置換のアリール、置換もしくは未置換のアラルキル、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−Ｃ≡Ｎ、またはヘテロシクロ基であり、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立してヒドロキシル、保護ヒドロキシル、またはヌクレオシド間の結合基であり、Ｒ５およびＲ８は、それぞれ独立してＯまたはＳである、ｄｓＲＮＡ分子が提供される。一部の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオシドは式Ｉに従い、式中、Ｒ１はメチルでありかつＲ２は−ＯＨであるか、またはＲ１はメチルであり、Ｒ２は−ＯＨであり、Ｒ８はＳである。他の実施形態において、ヌクレオシド間結合基は、約５〜約４０個のヌクレオシドを共有結合的に結合する。
【００９７】
一部の実施形態において、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させ、式ＩまたはＩＩに従うピリミジンヌクレオシドで置換された少なくとも１つのピリミジンを有するｄｓＲＮＡの第１の鎖と１つ以上の第２の鎖とは、ともにアニーリングまたはハイブリダイズして（すなわち、鎖間の相補性のため）、約１５〜約４０塩基対の長さまたは合わせた長さを有する、少なくとも１つの二本鎖領域を形成することができる。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約４塩基対〜約１０塩基対または約５〜約１３塩基対または約１５〜約２５塩基対または約１９〜約２３塩基対の範囲の長さの、少なくとも１つの二本鎖領域を有する。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約２６〜約４０塩基対または約２７〜約３０塩基対または約３０〜約３５塩基対の範囲の長さの、少なくとも１つの二本鎖領域を有する。一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子またはその類似体は、デオキシリボヌクレオチドまたは２つのデオキシリボヌクレオチド（例えば、チミジン）を含むオーバーハング等、３’末端の一端または両端に１〜４ヌクレオチドのオーバーハングを有する。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子またはその類似体は、ｄｓＲＮＡの一端または両端に平滑末端を有する。一部の実施形態において、第１または第２の鎖の５’末端はリン酸化されている。
【００９８】
一部の実施形態において、少なくとも１つのＲ１は、メチルまたはエチル等のＣ１−Ｃ５アルキルである。本開示の他の例示的な実施形態の中で、式Ｉの化合物は５−アルキルウリジンであるか（すなわち、Ｒ１はアルキルであり、Ｒ２は−ＯＨであり、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は本明細書に定義されるとおりである）、または式ＩＩの化合物は５−アルキルシチジンである（すなわち、Ｒ１はアルキルであり、Ｒ２は−ＯＨであり、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は本明細書に定義されるとおりである）。関連する実施形態において、５−アルキルウリジンは、５−メチルウリジン（リボチミジンまたはＴｒとも称される―すなわち、Ｒ１はメチルでありＲ２は−ＯＨである）であり、５−アルキルシチジンは５−メチルシチジンである。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡの第１の鎖の少なくとも１つ、少なくとも３つ、もしくはすべてのウリジンは、５−メチルウリジンであるか、またはｄｓＲＮＡの第２の鎖の少なくとも１つ、少なくとも３つ、もしくはすべてのウリジンは、５−メチルウリジンであるか、またはこれらの任意の組み合わせである（例えば、かかる変化は１つ以上の鎖上で起こる）。一部の実施形態において、式Ｉまたは式ＩＩの少なくとも１つのピリミジンヌクレオシドは、ＳであるＲ５またはＳであるＲ８を有する。
【００９９】
さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つのピリミジンヌクレオシドは、二環式糖の形態にあるロックされた核酸（ＬＮＡ）であり、Ｒ２は酸素であり、２’−Ｏおよび４’−Ｃは同じリボース環上にオキシメチレン架橋を形成する。関連する実施形態において、ＬＮＡは、５−メチルウリジンＬＮＡまたは２−チオ−５−メチルウリジンＬＮＡ等の塩基置換を含む。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡの第１の鎖の少なくとも１つ、少なくとも３つ、またはすべてのウリジンが、５−メチルウリジンもしくは２−チオリボチミジンもしくは５−メチルウリジンＬＮＡもしくは２−チオ−５−メチルウリジンＬＮＡであるか、またはｄｓＲＮＡの第２の鎖の少なくとも１つ、少なくとも３つ、もしくはすべてのウリジンが５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、５−メチルウリジンＬＮＡ、２−チオ−５−メチルウリジンＬＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせである（例えば、かかる変化は両方の鎖上でなされるか、またはいくつかの置換は、５−メチルウリジンのみ、２−チオリボチミジンのみ、５−メチルウリジンＬＮＡのみ、２−チオ−５−メチルウリジンＬＮＡのみ、または１つ以上の５−メチルウリジンＬＮＡもしくは２−チオ−５−メチルウリジンＬＮＡと１つ以上の５−メチルウリジンもしくは２−チオリボチミジンを含む）。
【０１００】
さらなる実施形態において、ピリミジンヌクレオシドまたはヌクレオシド間結合のリボースは、任意選択的に修飾され得る。例えば、式中、Ｒ２が２’−Ｏ−メチル置換等のアルコキシである式ＩまたはＩＩの化合物が提供される（例えば、それぞれ５−アルキルウリジンまたは５−アルキルシチジンに追加され得る）。一部の実施形態において、Ｒ２は、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、２’−Ｏ−メチル、２’−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、または２’−フルオロから選択される。さらなる実施形態において、１つ以上のピリミジンヌクレオシドが式Ｉに従い、式中、Ｒ１はメチルでありＲ２は２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）であるか、またはＲ１はメチルであり、Ｒ２は２’Ｏ−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル（例えば、２’Ｏ−メチル）であり、Ｒ２はＳであるか、またはこれらの任意の組み合わせである。他の実施形態において、式ＩまたはＩＩに従う１つ以上または少なくとも２つのピリミジンヌクレオシドは、−Ｈまたは−ＯＨではないＲ２を有し、３’末端または５’末端で組み込まれるが、ｄｓＲＮＡ分子の二本鎖領域にある１本以上の鎖のギャップ内には組み込まれない。
【０１０１】
さらなる実施形態において、式中、Ｒ２が−Ｈまたは−ＯＨおよびオーバーハングではない、式Ｉまたは式ＩＩに従ったピリミジンヌクレオシドを含むｄｓＲＮＡ分子またはその類似体は、ｄｓＲＮＡ分子の二本鎖領域内にある、１本の鎖または２本の鎖の３’末端または５’末端またはその両方のいずれかで組み込まれる少なくとも２つのピリミジンヌクレオシドをさらに含む。関連する実施形態において、Ｒ２が−Ｈまたは−ＯＨではない、少なくとも２つのピリミジンヌクレオシドのうちの少なくとも１つは、ｄｓＲＮＡ分子の少なくとも１本の鎖の二本鎖領域内の３’末端または５’末端に位置し、Ｒ２が−Ｈまたは−ＯＨではない、少なくとも２つのピリミジンヌクレオシドのうちの少なくとも１つは、ｄｓＲＮＡ分子の鎖の内部に位置する。またさらなる実施形態において、オーバーハングを有するｄｓＲＮＡ分子またはその類似体は、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖の二本鎖領域内の５’末端で組み込まれ、Ｒ２は−Ｈまたは−ＯＨではない、２つ以上のピリミジンヌクレオシドのうちの１つめを有し、２つ以上のピリミジンヌクレオシドの２つめはｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の二本鎖領域内の５’末端で組み込まれる。これらの実施形態のいずれにおいても、１つ以上の置換または修飾されたヌクレオチドは、Ｇクランプであり得る（例えば、９−（アミノエトキシ）フェノキサジン等のグアニンに対して追加の水素結合を形成するシトシン類似体、例えば、Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｕｃｃｉ，１９９８を参照されたい）。これらの実施形態のいずれにおいても、ギャップ内に存在しない１つ以上の修飾ピリミジンヌクレオシドが提供される。
【０１０２】
さらに別の実施形態において、４つ以上の独立したピリミジンヌクレオシド、またはＲ２は−Ｈまたは−ＯＨではない４つ以上の独立したピリミジンヌクレオシドを含むオーバーハングを有する、本開示に従った式ＩまたはＩＩのｄｓＲＮＡ分子またはその類似体は、（ａ）第１のピリミジンヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス（第２の）鎖の二本鎖領域内の３’末端に組み込まれ、（ｂ）第２のピリミジンヌクレオシドは、センス（第２の）鎖の二本鎖領域内の５’末端に組み込まれ、（ｃ）第３のピリミジンヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス（第１の）鎖の二本鎖領域内の３’末端に組み込まれ、（ｄ）第４のピリミジンヌクレオシドは、アンチセンス（第１の）鎖の二本鎖領域内の５’末端に組み込まれる。これらの実施形態のいずれにおいても、ギャップ内に存在しない１つ以上の修飾ピリミジンヌクレオシドが提供される。
【０１０３】
さらなる実施形態において、Ｒ２は−Ｈまたは−ＯＨではない、平滑末端である、式ＩまたはＩＩに従うピリミジンヌクレオシドを含む、ｄｓＲＮＡ分子またはその類似体は、ｄｓＲＮＡ分子の１本の鎖または２本の鎖の３’末端または５’末端またはその両方のいずれかで組み込まれる少なくとも２つのピリミジンヌクレオシドをさらに含む。関連する実施形態において、Ｒ２は−Ｈまたは−ＯＨではない、少なくとも２つのピリミジンヌクレオシドのうちの少なくとも１つは、ｄｓＲＮＡ分子の少なくとも１本の鎖の３’末端または５’末端に位置し、Ｒ２は−Ｈまたは−ＯＨではない、少なくとも２つのピリミジンヌクレオシドのうちの少なくとも１つは、ｄｓＲＮＡ分子の鎖の内部に位置する。またさらなる実施形態において、平滑末端であるｄｓＲＮＡ分子またはその類似体は、Ｒ２は−Ｈまたは−ＯＨではなく、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖の５’末端で組み込まれる、２つ以上のピリミジンヌクレオシドの１つめを有し、２つ以上のピリミジンヌクレオシドの２つめは、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の５’末端で組み込まれる。これらの実施形態のいずれにおいても、ギャップ内に存在しない１つ以上の修飾ピリミジンヌクレオシドが提供される。
【０１０４】
さらに別の実施形態において、式Ｉまたは式ＩＩに従ったピリミジンヌクレオシドを含み、平滑末端であるｄｓＲＮＡ分子は、４つ以上の独立したピリミジンヌクレオシド、またはＲ２は−Ｈまたは−ＯＨではない４つ以上の独立したピリミジンヌクレオシドを含み、（ａ）第１のピリミジンヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス（第２の）鎖の二本鎖領域内の３’末端に組み込まれ、（ｂ）第２のピリミジンヌクレオシドは、センス（第２の）鎖の二本鎖領域内の５’末端に組み込まれ、（ｃ）第３のピリミジンヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス（第１の）鎖の二本鎖領域内の３’末端に組み込まれ、（ｄ）第４のピリミジンヌクレオシドは、アンチセンス（第１の）鎖の二本鎖領域内の５’末端に組み込まれる。これらの実施形態のいずれにおいても、ギャップ内に存在しない１つ以上の修飾ピリミジンヌクレオシドが提供される。
【０１０５】
またさらなる実施形態において、本開示に従った式ＩまたはＩＩのｄｓＲＮＡ分子またはその類似体は、第１の鎖または第２の鎖の一端または両端に、アルキル、脱塩基、デオキシ脱塩基、グリセリル、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、反転したデオキシヌクレオチド部分、またはこれらの任意の組み合わせ等の末端キャップの置換基をさらに含む。さらなる実施形態において、１つ以上のヌクレオシド間結合は任意選択的に修飾され得る。例えば、本開示に従った式ＩまたはＩＩのｄｓＲＮＡ分子またはその類似体は、少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、メチルホスホン酸塩、アルキルホスホン酸塩、３’−アルキレンホスホン酸塩、５’−アルキレンホスホン酸塩、キラルホスホン酸塩、ホスホノ酢酸塩、チオホスホノ酢酸塩、ホスフィン酸塩、ホスホロアミド酸塩、３’−アミノホスホロアミド酸塩、アミノアルキルホスホロアミド酸塩、セレノリン酸塩、チオノホスホロアミド酸塩、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルリン酸トリエステル、ボラノリン酸結合、またはこれらの任意の組み合わせに修飾される。
【０１０６】
さらに別の実施形態において、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させるニックの入ったまたはギャップのあるｄｓＲＮＡ分子（それぞれ、ｎｄｓＲＮＡまたはｇｄｓＲＮＡ）は、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である第１の鎖と、第１の鎖に相補的である２つ以上の第２の鎖と、を含み、第１の鎖および第２の鎖の少なくとも１つは、約５〜１３塩基対の非重複二本鎖領域を形成する、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。本明細書に記載される置換または修飾のうちのいずれもが、本実施形態においても企図される。
【０１０７】
本開示の別の実施例において、ｄｓＲＮＡは、それぞれ独立して選択され得る少なくとも２つ以上の置換ピリミジンヌクレオシドを含み、Ｒ１は、例えば、アルキル（例えば、メチル）、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、アミノ、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アリール、アロイル、アラルキル、ニトリル、ジアルキルアミノ、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボニル、アルカノイルアミノ、カルバモイル、カルボニルアミノ、アルキルスルホニルアミノ、またはヘテロシクロ基等の、本明細書で企図される任意の化学修飾または置換を含む。２つ以上の修飾リボヌクレオチドが存在する場合は、各修飾リボヌクレオチドは、Ｒ１またはＲ２で同じまたは異なる修正または置換を有するように、独立して修飾され得る。
【０１０８】
他の詳細な実施形態において、式ＩまたはＩＩに従う１つ以上の置換ピリミジンヌクレオシドは、上述した１つ以上の複数の末端位置、または複数の末端ではない（「内側の」）位置のいずれか１つまたはその組み合わせを含む、本開示のｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれかまたはその両方の、任意のリボヌクレオチドの位置、またはリボヌクレオチドの位置の任意の組み合わせに位置し得る。これに関して、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、約１〜約６個以上の置換ピリミジンヌクレオシドを組み入れ得る。
【０１０９】
一部の実施形態において、２つ以上の置換ピリミジンヌクレオシドが本開示のｄｓＲＮＡに組み込まれる場合、少なくとも１つの置換ピリミジンヌクレオシドは、１本または両方の鎖の３’末端または５’末端に存在し、一部の実施形態において、少なくとも１つの置換ピリミジンヌクレオシドは、１本または両方の鎖の５’末端に存在する。他の実施形態において、置換ピリミジンヌクレオシドは、本明細書に記載されるように、同族のｍＲＮＡを標的とする相同配列として構築された非修飾ｄｓＲＮＡ中のピリミジンの位置に対応する位置に位置する。
【０１１０】
さらに、本開示のｄｓＲＮＡの末端構造は、ｄｓＲＮＡ分子の片側の末端が、例えば、リンカーＲＮＡ等のリンカー核酸によって接続されるステム−ループ構造を有し得る。二本鎖領域（ステム−ループ部分）の長さは、例えば、約１５〜約４９ｂｐ、約１５〜約３５ｂｐ、または約２１〜約３０ｂｐ長であり得る。あるいは、標的細胞内で発現されるべきｄｓＲＮＡの最終転写産物である二本鎖領域の長さは、例えば、約１５〜約４９ｂｐ、約１５〜約３５ｂｐ、または約２１〜約３０ｂｐ長であり得る。リンカーセグメントが用いられる場合は、ステム部分の対形成を妨げない限り、リンカーの長さに特定の制限はない。例えば、ステム部分の安定した対形成およびその部分に対してコード化するＤＮＡ間の組換えのために、リンカー部分はクローバーリーフ構造を有し得る。たとえリンカーがステム部分の対形成を妨げる長さであったとしても、例えば、成熟したＲＮＡ内にＲＮＡ前駆体をプロセスする間にイントロンが切り取られてステム部分の対形成ができるよう、イントロンを含むようにリンカー部分を構築することが可能である。ステム−ループｄｓＲＮＡの場合は、ループ構造を持たないＲＮＡのいずれの端（頭または尾）は低分子量ＲＮＡを有し得る。上述の通り、これらの低分子量ＲＮＡは、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡもしくはウイルスＲＮＡ等の天然のＲＮＡ分子、または人工ＲＮＡ分子を含み得る。
【０１１１】
ｄｓＲＮＡ分子は、環状核酸分子を含んでもよく、ここで、ｄｓＲＮＡは約１８〜約２３塩基対（例えば、約１９〜約２１ｂｐ）を有する約３８〜約７０ヌクレオチドの長さであり、環状オリゴヌクレオチドは、約１９塩基対および２つのループを有するダンベル型構造を形成する。一部の実施形態において、環状ｄｓＲＮＡ分子は２つのループモチーフを含有し、ｄｓＲＮＡ分子の１つまたは両方のループ部分は生分解性である。例えば、本開示の環状ｄｓＲＮＡ分子は、生体内でのｄｓＲＮＡ分子のループ部分の分解が、約１〜約４個の（不対）ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハング等の３’末端オーバーハングを有するｄｓＲＮＡ分子を生成できるように設計される。
【０１１２】
本開示に従ったｄｓＲＮＡのヌクレオシドを置換または修飾することで、５’−エキソヌクレアーゼまたは３’−エキソヌクレアーゼ分解を含むエキソヌクレアーゼ分解等の酵素分解に対する耐性を高めることができる。したがって、ある実施形態において、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、標準的ヌクレオチドを有する対応するｄｓＲＮＡと比較して、酵素分解に対して有意な耐性を示し、よって、より高い安定性、長い半減期、および生理環境におけるより高いバイオアベイラビリティ（例えば、真核生物の標的細胞に導入される場合）を持つ。置換または修飾されたｄｓＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解に対する耐性が高まることに加えて、式ＩまたはＩＩに従う１つ以上のピリミジンヌクレオシドを組み込むことにより、他の酵素分解プロセスまたは化学分解プロセスに対するｄｓＲＮＡの耐性がより高いものなり、ひいては置換または修飾を含まない、それ以外は同一であるｄｓＲＮＡと比較して、より安定した生物学的に利用可能なものとなる。本開示の関連する態様において、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ置換または修飾は、研究、診断、および治療方法において使用される修飾ｄｓＲＮＡの安定性を向上することが多く、修飾されたｄｓＲＮＡは、例えば、哺乳類細胞、細胞内区画、血清もしくは他の細胞外体液、組織、または他の生体外もしくは生体内での生理学的な区画または環境等の生体試料と接触させられる。一実施形態において、診断は単離された生体試料上で行われる。別の実施形態において、診断方法は生体外で行われる。さらなる実施形態において、診断方法はヒトまたは動物の体に（直接的には）行われない。
【０１１３】
置換または修飾されたｄｓＲＮＡの安定性を高めることに加えて、遺伝子サイレンシングのために設計されたｄｓＲＮＡ中に式ＩまたはＩＩに従う１つ以上のピリミジンヌクレオシドを組み込むことで、対応する非修飾ｄｓＲＮＡと比較して、置換または修飾されたｄｓＲＮＡの融点を上昇させることを含む、付加的な望ましい機能的結果を提供することができる。本開示の別の態様において、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡの特定の置換または修飾は、生体試料に接触させると（例えば、潜在的な特異的および非特異的な標的として存在する特異的および非特異的なＲＮＡ種を有する標的となる真核生物細胞に導入される場合）、置換または修飾されたｄｓＲＮＡ分子の「オフターゲット効果」を低下することができる。本開示のさらに別の態様において、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡの置換または修飾は、ｄｓＲＮＡを生態試料と接触させると（例えば、真核生物細胞に導入される場合）、ｄｓＲＮＡ分子によるインターフェロンの活性化が低下する。
【０１１４】
さらなる実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、標的遺伝子（例えば、ＨＩＦ１Ａ）の配列に相同であるかまたは対応する１つ以上のセンス（第２の）鎖と、センス鎖および標的遺伝子（例えば、ＨＩＦ１Ａ）の配列に相補的であるアンチセンス（第１の）鎖とを含み得る。例示的な実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも１本の鎖は、式ＩまたはＩＩに従って置換された１つ以上のピリミジンを組み込む（例えば、ピリミジンは５−−メチルウリジン、２−−チオリボチミジン、または２−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンであり、リボースは、１つ以上の２’−Ｏ−メチル置換、またはこれらの任意の組み合わせを組み込むように修飾される）。式ＩまたはＩＩに従うこれらのおよび他の複数の置換または修飾は、ｄｓＲＮＡが非修飾ｄｓＲＮＡの活性と同様かそれより良好なＲＮＡｉ活性を有するかまたは保持する限り、本開示のｄｓＲＮＡの１本以上の鎖に存在する１つ以上のピリミジン、または任意の組み合わせ、および最も多くはすべてのピリミジンに導入され得る。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは１つ以上の２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンを含む。
【０１１５】
本明細書に記載されるいずれの実施形態においても、ｄｓＲＮＡは複数の修飾を含むことができる。例えば、少なくとも１つのリボチミジンまたは２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンを有するｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのＬＮＡ、２’−メトキシ、２’−フルオロ、２’−デオキシ、ホスホロチオエート結合、反転した塩基末端キャップ、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含むことができる。一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡは１つ〜すべてのリボチミジンを有し、最大７５％のＬＮＡを有する。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つ〜すべてのリボチミジンを有し、最大７５％の２’−メトキシ（例えば、アルゴノート切断部位に存在しない）を有する。さらに他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは１つ〜すべてのリボチミジンを有し、最大１００％の２’−フルオロを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは１つ〜すべてのリボチミジンを有し、最大７５％の２’−デオキシを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは最大７５％のＬＮＡを有し、最大７５％の２’−メトキシを有する。さらに他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは最大７５％のＬＮＡを有し、最大１００％の２’−フルオロを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは最大７５％のＬＮＡを有し、最大７５％の２’−デオキシを有する。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは最大７５％の２’−メトキシを有し、最大１００％の２’−フルオロを有する。より多くの実施形態において、ｄｓＲＮＡは最大７５％の２’−メトキシを有し、最大７５％の２’−デオキシを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは最大１００％の２’−フルオロを有し、最大７５％の２’−デオキシを有する。
【０１１６】
さらなる複数の変形実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つ〜すべてのリボチミジン、最大７５％のＬＮＡ、および最大７５％の２’−メトキシを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つ〜すべてのリボチミジン、最大７５％のＬＮＡ、および最大１００％の２’−フルオロを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つ〜すべてのリボチミジン、最大７５％のＬＮＡ、および最大約７５％の２’−デオキシを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つ〜すべてのリボチミジン、最大７５％の２’−メトキシ、および最大７５％の２’−フルオロを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つ〜すべてのリボチミジン、最大７５％の２’−メトキシ、および最大７５％の２’−デオキシを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１つ〜すべてのリボチミジン、最大１００％の２’−フルオロ、および最大７５％の２’−デオキシを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは１つ〜すべてのリボチミジン、最大７５％のＬＮＡ置換、最大７５％の２’−メトキシ、最大１００％の２’−フルオロ、および最大７５％の２’−デオキシを有する。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、最大７５％のＬＮＡ、最大７５％の２’−メトキシ、および最大１００％の２’−フルオロを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは、最大７５％のＬＮＡ、最大７５％の２’−メトキシ、および最大約７５％の２’−デオキシを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは最大７５％のＬＮＡ、最大１００％の２’−フルオロ、および最大７５％の２’−デオキシを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは最大７５％の２’−メトキシ、最大１００％の２’−フルオロ、および最大７５％の２’−デオキシを有する。
【０１１７】
多重に修飾されたｄｓＲＮＡを用いるためのこれらの例示的方法のいずれにおいても、ｄｓＲＮＡは、最大１００％のホスホロチオエートヌクレオシド間結合、１〜１０以上の反転した塩基の末端キャップ、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。さらに、これらのｄｓＲＮＡのいずれもが、ｄｓＲＮＡ分子内の１本の鎖、２本の鎖、３本の鎖、複数の鎖、もしくはすべての鎖、または同じかもしくは異なるヌクレオシド上に、これらの複数の修飾を有し得る。最後に、これらの複数の修飾ｄｓＲＮＡのいずれにおいても、ｄｓＲＮＡは遺伝子サイレンシング活性を持っていなければならない。
【０１１８】
一部の態様の中で、本開示は、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子（例えば、配列番号１１５８もしくは１１５９のＨＩＦ１Ａ）の発現を低下させるｄｓＲＮＡと、１つ以上のｄｓＲＮＡを含む組成物を提供し、少なくとも１つのｄｓＲＮＡは、該ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のアンチコドン内に第１、第２または第３の位置に１つ以上の普遍的に結合するヌクレオチド（複数を含む）を含み、該ｄｓＲＮＡは、標的細胞によって発現されるＲＮＡ等のＨＩＦ１Ａ配列に特異的に結合する能力を持つ。標的ＨＩＦ１Ａ  ＲＮＡの配列が１つ以上の単一ヌクレオチド置換を含む場合、普遍的に結合するヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡは、標的ＨＩＦ１Ａ  ＲＮＡに特異的に結合する能力を保持し、それによって遺伝子サイレンシングが媒介され、結果として、標的ＨＩＦ１ＡがｄｓＲＮＡ媒介による遺伝子サイレンシングから逃れることを防ぐ。本明細書に開示される組成物および方法に好適に利用することができる例示的な普遍的に結合するヌクレオチドには、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、または１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが含まれる。
【０１１９】
一部の態様において、本明細書に開示されるｄｓＲＮＡは、約１個から約１０個の普遍的に結合するヌクレオチドを含む。他の態様の中で、本開示のｄｓＲＮＡは、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の配列に相同であるセンス鎖と、該センス鎖に相補的なアンチセンス鎖とを含み得、ただし、それ以外は相補的なｄｓＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖またはセンス鎖の少なくとも１つのヌクレオチドは、１つ以上の普遍的に結合するヌクレオチドを有するものとする。
【０１２０】
核酸分子の合成
本開示の例示的分子は、組換えによって産生されるか、化学的に合成されるか、またはこれらの組み合わせである。オリゴヌクレオチド（例えば、特定の修飾オリゴヌクレオチドまたはリボヌクレオチドが欠失しているオリゴヌクレオチドの一部）は、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１１：３−１９，１９９２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４４５９号、Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２６７７−２６８４，１９９５、Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９，１９９７、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．６１：３３−４５，１９９８、およびＢｒｅｎｎａｎ，米国特許第６，００１，３１１号に記載される、当該技術分野において既知であるプロトコルを用いて合成される。本開示の特定のｄｓＲＮＡ分子およびその類似体を含むＲＮＡの合成は、Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５，１９８７、Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５４３３，１９９０、およびＷｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２６７７−２６８４，１９９５、Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９，１９９７に記載される手順を用いて行うことができる。
【０１２１】
一部の実施形態において、本開示の核酸分子は、別個に合成されても、また、例えば、ライゲーション（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：９９２３，１９９２、Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／２３５６９号、Ｓｈａｂａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４２４７，１９９１、Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １６：９５１，１９９７、Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８：２０４，１９９７）によって、または合成もしくは脱保護に続くハイブリダイゼーションによって、合成後に結合させることができる。
【０１２２】
さらなる実施形態において、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させる本開示のｄｓＲＮＡは、１つ以上のｄｓＲＮＡをコードして宿主細胞におけるそれらの発現を司るポリヌクレオチドベクターによって発現される、単一または複数の転写産物として作製することができる。これらの実施形態において、標的細胞内で発現されるべきｄｓＲＮＡの最終転写産物の二本鎖部分は、例えば、約５〜４０ｂｐ、約１５〜約２４ｂｐ、または約２５〜約４０ｂｐ長であり得る。例示的な実施形態の中で、２本以上の鎖が対をなすｄｓＲＮＡの二本鎖部分は、完全に対形成したヌクレオチドセグメントに限定されず、ミスマッチ（対応するヌクレオチドが相補的ではない）、バルジ（１本の鎖上に対応する相補的ヌクレオチドが欠失している）、オーバーハング等による非対形成部分を含み得る。非対形成部分は、ｄｓＲＮＡの形成および機能を妨げない程度まで含まれ得る。一部の実施形態において、「バルジ」は、１〜２個の非対形成ヌクレオチドを含み得、２本の鎖が対を形成するｄｓＲＮＡの二本鎖領域は、約１〜７個、または約１〜５個のバルジを含み得る。さらに、ｄｓＲＮＡの二本鎖領域に含まれる「ミスマッチ」部分は、約１〜７個、または約１〜５個のミスマッチを含み得る。他の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡの二本鎖領域は、バルジおよびミスマッチ部分の両方を、本明細書に特定されるおよその数値の範囲内で含み得る。
【０１２３】
本開示のｄｓＲＮＡまたはその類似体は、ｄｓＲＮＡのセンス領域を該ｄｓＲＮＡのアンチセンス領域に結合するヌクレオチド、非ヌクレオチド、または混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーをさらに含み得る。一実施形態において、ヌクレオチドリンカーは、約２ヌクレオチド長〜最大約１０ヌクレオチド長のリンカーであり得る。別の実施形態において、ヌクレオチドは核酸アプタマーであり得る。本明細書で用いられる「アプタマー」または「核酸アプタマー」とは、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、該核酸分子は、その自然環境において標的分子によって認識される配列を含む配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分子が自然には核酸に結合しない、該標的分子に結合する核酸分子であることができる。標的分子は、該当するいずれの分子であってもよい。例えば、アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合して、自然発生型リガンドとタンパク質との相互作用を防ぐために用いられ得る。これは非限定例であって、当業者は、当該技術分野で一般的に知られている技術を用いて、他の実施形態が容易に作製され得ることを理解するであろう（例えば、Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７６３，１９９５、Ｂｒｏｄｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：５，２０００、Ｓｕｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：１００，２０００、Ｋｕｓｓｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７，２０００、Ｈｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８２０，２０００、およびＪａｙａｓｅｎａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．４５：１６２８，１９９９を参照されたい）。
【０１２４】
非ヌクレオチドリンカーは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、または他のポリマー化合物（例えば、２〜１００のエチレングリコールユニットを有するようなポリエチレングリコール）から構成され得る。具体的な例には、Ｓｅｅｌａ  ａｎｄ  Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６３５３，１９９０、およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３１１３，１９８７、Ｃｌｏａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６３２４，１９９１、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：５１０９，１９９１、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２５８５，１９９３、およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１７５１，１９９３、Ｄｕｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６３５３，１９９０、ＭｃＣｕｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １０：２８７，１９９１、Ｊａｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３４：３０１，１９９３、Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：９９１４，１９９１、Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０２４３９号、Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０６７３１号、Ｄｕｄｙｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１１９１０号、ならびにＦｅｒｅｎｔｚ  ａｎｄ  Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：４０００，１９９１に記載されるものが含まれる。さらに修飾され得る本開示のｄｓＲＮＡ分子の合成は、（ａ）第１の（アンチセンス）鎖の合成ならびにそれぞれが第１の鎖の非重複領域に相補的である第２の（センス）鎖および第３の（センス）鎖の合成と、（ｂ）ｄｓＲＮＡ分子を得るために好適な条件下で、第１、第２および第３の鎖をともにアニーリングすることを含む。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子の第１、第２および第３の鎖の合成は、固相オリゴヌクレオチド合成を用いる。さらに別の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子の第１、第２および第３の鎖の合成は、固相タンデムオリゴヌクレオチド合成を用いる。
【０１２５】
置換または修飾（塩基、糖、リン酸塩、またはこれらの任意の組み合わせ）を持つ化学的に合成される核酸分子は、血清リボヌクレアーゼによる自らの分解を防ぐことが可能であり、それが作用強度の増加につながる可能性がある。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０７０６５号、Ｐｅｒｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：５６５，１９９０、Ｐｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４，１９９１、Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４，１９９２、Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３，１９９４、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５７０２，１９９５、Ｂｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４０９０，１９９６、Ｂｕｒｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５：１９９９，１９９７、Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３９：１１３１，１９９８、Ｅａｒｎｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｇａｉｔ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）４８：３９−５５，１９９８、Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９，１９９８、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  １０：２９７，２０００、Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１６２８，２００３、Ｄｏｒｓｅｔｔ  ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ３：３１８，２００４、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０３１６２号、第ＷＯ９３／１５１８７号、第ＷＯ９７／２６２７０号、第ＷＯ９８／１３５２６号、米国特許第５，３３４，７１１号、第５，６２７，０５３号、第５，７１６，８２４号、第５，７６７，２６４号、第６，３００，０７４号を参照されたい。上記の参考文献の各々は、塩基、リン酸塩、または核酸分子の糖部分に対する、様々な置換および化学修飾を開示しており、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡに用いることができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、糖部分で修飾し、ヌクレアーゼ耐性を増強することにより、安定性を向上するまたは生物学的活性を延長させることができる。代表的な糖修飾には、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、または２’−Ｈが含まれる。安定性を向上するまたは生物学的活性を延長する他の修飾は、ホスホロチオエート等のヌクレオシド間結合、ロックされた核酸等の塩基修飾（例えば米国特許第６，６７０，４６１号、第６，７９４，４９９号、第６，２６８，４９０号を参照されたい）、またはウリジンの代わりの５−メチルウリジンもしくは２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１４２２３０号を参照されたい）であり得る。よって、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、非修飾ｄｓＲＮＡと比較して実質的に向上したＲＮＡｉ活性を保持または有する一方で、ヌクレアーゼ耐性または二重鎖の安定性を増強するために修���され得る。
【０１２６】
一実施形態において、本開示は、１つ以上のホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，メチルホスフェート、リン酸トリエステル、モルホリノ、カルバミン酸アミド（ａｍｉｄａｔｅ  ｃａｒｂａｍａｔｅ）、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、チオホルムアセタール（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、またはアルキルシリル置換を含むリン酸骨格修飾等の、置換または修飾されたｄｓＲＮＡ分子を特徴とする。オリゴヌクレオチド骨格修飾のレビューについては、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７，１９９５、およびＭｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ，２４−３９，１９９４を参照されたい。
【０１２７】
別の実施形態において、共役分子を、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させるｄｓＲＮＡまたはその類似体に、任意選択的に結合させることができる。例えば、かかる共役分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、ポリアルギニン、Ｇｌｎ−Ａｓｎポリマー、または、例えば細胞の取り込みを媒介できる細胞受容体のリガンドであり得る（例えばＨＩＶ  ＴＡＴ、Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：２３，１９９９を参照、また米国特許出願公開第２００４／０１３２１６１号も参照されたい））。本開示のｄｓＲＮＡまたはその類似体に結合させることができる、本開示によって企図される共役分子の具体的な例は、Ｖａｒｇｅｅｓｅらの米国特許出願公開第２００３／０１３０１８６号、および米国特許出願公開第２００４／０１１０２９６号に記載される。別の実施形態において、共役分子は、生分解性リンカーを介して、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させるｄｓＲＮＡまたはその類似体に共有結合される。一部の実施形態において、共役分子は、本明細書に提供されるｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖のいずれかの３’末端に結合され得る。別の実施形態において、共役分子は、ｄｓＲＮＡ分子またはその類似体のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖のいずれかの５’末端に結合され得る。さらに別の実施形態において、共役分子は、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、もしくは両方の鎖、またはこれらの任意の組み合わせのいずれかの３末端および５鋳末端の双方に結合され得る。さらなる実施形態において、本開示の共役分子は、細胞等の生物系の中にｄｓＲＮＡまたはその類似体の送達を促進する分子を含む。当業者は、例えば、本明細書に記載されるまたは当該技術分野で一般的に知られる動物モデルにおいて、様々な共役体を有する本開示のｄｓＲＮＡをスクリーニングして、ｄｓＲＮＡ−共役体がＲＮＡｉを媒介する能力を維持する一方で、向上した特性（例えば、薬物動態プロファイル、バイオアベイラビリティ、安定性）を所有するかどうかを決定することができる。
【０１２８】
ＨＩＦ１Ａに特異的なｄｓＲＮＡ分子の選択方法
上に示すように、本開示は、非ＨＩＦ１Ａ遺伝子には特異的に結合する、またはごくわずかに結合する能力を持たない一方で、ＨＩＦ１Ａ遺伝子（そのｍＲＮＡスプライス変異型を含む）に特異的に結合する能力を持つｄｓＲＮＡおよびその類似体を選択するための方法も提供する。本明細書に開示される選択プロセスは、例えば、１つ以上の非ＨＩＦ１Ａ遺伝子に対して非特異的な結合および、そしてその後の非ＨＩＦ１Ａ遺伝子の分解のために細胞毒性であるｄｓＲＮＡ類似体を排除する際に有用である。
【０１２９】
本開示の方法は、ｄｓＲＮＡまたはその類似体に標的とされる、考えられるすべての変異型（ｍＲＮＡスプライス変異型を含む）のヌクレオチド配列に関する推測的知識を必要としない。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の保存領域またはコンセンサス配列から選択される。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＨＩＦ１Ａ遺伝子のｍＲＮＡスプライス変異型に含有される特定の配列を選択的または優先的に標的にすることができる。
【０１３０】
一部の実施形態において、諸方法は、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させる１つ以上のｄｓＲＮＡ分子であって、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である第１の鎖と、第１の鎖に相補的である第２の鎖とを含み、第１および第２の鎖は約１５〜約４０塩基対の二本鎖領域を形成し（例えば、本明細書に特定される配列表内のＨＩＦ１Ａ配列を参照されたい）、ｄｓＲＮＡ分子の少なくとも１つのウリジンは、５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、または２’−Ｏ−メチル−２−メチルウリジンである、１つ以上のｄｓＲＮＡ分子を選択するための方法が提供され、当該方法は、本明細書に提供される１つ以上のｄｓＲＮＡが生体内または生体外のいずれかの細胞と接触し、すべてのｍＲＮＡが、非ＨＩＦ１Ａ遺伝子（例えば、インターフェロン）を含む既知の遺伝子のパネルからの１つ以上のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、マイクロアレイのプロービングにおいて用いるために収集される、「オフターゲット」プロファイリングを利用する。関連する実施形態の中で、ＲＮＡｉによりＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させる１つ以上のｄｓＲＮＡ分子は、第１の鎖に相補的な第３の鎖をさらに含み得、第１および第３の鎖は二本鎖領域を形成し、第１および第３の鎖によって形成される該二本鎖領域は、第１および第２の鎖によって形成される二本鎖領域と重複しない。本明細書に提供されるｄｓＲＮＡの「オフターゲット」プロファイルは、候補ｄｓＲＮＡの存在下で低下した発現レベルを有する非ＨＩＦ１Ａ遺伝子の数を決定することにより、定量化される。「オフターゲット」結合の存在は、ｄｓＲＮＡが１つ以上の非ＨＩＦ１Ａ遺伝子メッセージに特異的に結合する能力を持つことを示す。一部の実施形態において、治療的使用に適用可能な本明細書に提供されるｄｓＲＮＡ（例えば、本明細書に特定される配列表内の配列を参照されたい）は、より高い安定性、最小限のインターフェロン応答、およびほとんどまたは皆無の「オフターゲット」結合を示す。
【０１３１】
さらなる実施形態は、本明細書に記載されるＨＩＦ１Ａ配列を含むｄｓＲＮＡ（約１５塩基対〜約４０塩基対または約５ヌクレオチド〜約２４ヌクレオチド、または約２５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドの長さを有するもの等）とインフレームで作用可能に融合する、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、またはβ−ガラクトシダーゼ等の１つ以上のレポーター遺伝子に作用可能に融合して発現を改変する能力を持つ、（そして、次いで、そのレポーター遺伝子は、本明細書に記載されるＨＩＦ１Ａ配列を含むｄｓＲＮＡ（約１５塩基対〜約４０塩基対または約５ヌクレオチド〜約２４ヌクレオチド、または約２５ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチドの長さを有するもの等）とインフレームで作用可能に融合する）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター等の構成的プロモーターを含む、１つ以上のレポーター遺伝子構築物を用いて、より効果的なｄｓＲＮＡを選択するための方法を提供する。
【０１３２】
個々のレポーター遺伝子発現構築物は、１つ以上のｄｓＲＮＡまたはその類似体と同時にトランスフェクションされ得る。所与のｄｓＲＮＡがＨＩＦ１Ａの発現レベルを低下させる能力は、該当するｄｓＲＮＡ分子をトランスフェクトされた、またはされていない細胞において測定したレポーター遺伝子の活性を比較することによって決定することができる。
【０１３３】
本明細書に開示される一部の実施形態は、ｄｓＲＮＡ二重鎖の安定性を予測するステップを用いた、１つ以上の修飾ｄｓＲＮＡ分子（複数を含む）を選択するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、かかる予測は、理論上の融解曲線を用いることにより達成され、より高い理論上の融解曲線がｄｓＲＮＡ二重鎖の安定性の増加、および、同時に、細胞毒性効果の低下を示唆する。あるいは、ｄｓＲＮＡ二重鎖の安定性は、本明細書に記載される、単一のＲＮＡ類似体鎖と、例えばポリヌクレオチドアレイ内の、相補的標的遺伝子とのハイブリダイゼーションを測定することにより経験的に決定され得る。アレイに固定化されたそれぞれの修飾ＲＮＡおよび相補的ＲＮＡの融解温度（すなわちＴｍ値）を決定することができ、またこのＴｍ値から、相補的ＲＮＡ分子と対形成する修飾ＲＮＡの相対的な安定性が決定される。
【０１３４】
例えば、Ｋａｗａｓｅら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：７７２７，１９８６）は、Ｄｉ（イノシン）の、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴへのヌクレオチド対形成の特性の分析について記述しており、該分析は、様々な位置にＤｉを含むオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）を、アレイとして作られたＯＤＮの相補的なセットにハイブリダイゼーションして測定することにより達成された。ヌクレオチド対形成の相対強度はＩ−Ｃ＞Ｉ−Ａ＞Ｉ−Ｇ≒Ｉ−Ｔである。一般的に、Ｄｉ含有二重鎖は、対応する野生型（ＷＴ）ヌクレオチド対と比較すると、より低いＴｍ値を示した。対形成によるＤｉの安定化は、Ｄｃ＞Ｄａ＞Ｄｇ＞Ｄｔ＞Ｄｕの順序であった。当業者は理解するように、本明細書において、二重鎖の安定性（すなわちＴｍ値）を決定する例として普遍的に結合するヌクレオチドが用いられているが、他のヌクレオチド置換（例えば、ウリジンに対して５−メチルウリジン）またはさらなる修飾（例えば、２’位でのリボース修飾）も、これらの方法または同様の方法を用いて評価することができる。
【０１３５】
本開示の方法のさらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子またはその類似体のアンチセンス鎖内にある１つ以上のアンチコドンは、アンチセンス鎖のアンチコドンの２位または３位にある普遍的に結合するヌクレオチドで置換される。普遍的に結合するヌクレオチドを１位または２位と置換することにより、その１つ以上の１位または２位のヌクレオチド対の置換が、１位または２位のヌクレオチド対の置換が起こった置換されたｄｓＲＮＡ分子がｍＲＮＡに特異的に結合することを可能にし、１つ以上のヌクレオチド対の置換が対応する遺伝子産物におけるアミノ酸変化を引き起こす。
【０１３６】
該当するｄｓＲＮＡを同定するこれらの方法のいずれもが、ＲＮＡ干渉によりＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させるｄｓＲＮＡを調べるために用いることができ、そのｄｓＲＮＡは、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせに相補的である第１の鎖と、第１の鎖に相補的である非重複領域を有する第２および第３の鎖と、を含み、第１の鎖および第２または第３の鎖の内の少なくとも１本が任意選択的に約５〜約１３塩基対の二本鎖領域を形成し、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つのピリミジンは、式ＩまたはＩＩに従うピリミジンヌクレオシドを含み、
2010519908.tif 000005
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ハロゲン、置換もしくは未置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル、置換もしくは未置換の−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル、カルバモイル、カルバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換もしくは未置換のアリール、置換もしくは未置換のアラルキル、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−Ｃ≡Ｎ、またはヘテロシクロ基であり、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立してヒドロキシル、保護ヒドロキシル、またはヌクレオシド間の結合基であり、Ｒ５およびＲ８は独立してＯまたはＳである。一部の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオシドは式Ｉに従い、式中、Ｒ１はメチルでありかつＲ２は−ＯＨであるか、またはＲ１はメチルであり、Ｒ２は−ＯＨであり、Ｒ８はＳである。一部の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオシドは式Ｉに従い、式中、Ｒ１はメチルでありかつＲ２は−Ｏ−メチルであるか、またはＲ１はメチルであり、Ｒ２は−Ｏ−メチルであり、Ｒ８はＯである。他の実施形態において、ヌクレオシド間結合基は、約５〜約４０個のヌクレオシドを共有結合的に結合する。
【０１３７】
組成物および使用方法
本明細書に記載されるように、本開示のｄｓＲＮＡは、上昇したレベルで発現されるか、またはそうされるべきでない場合にも発現し続ける、例えば、心筋虚血、脳虚血、網膜虚血、肺高血圧症、妊娠疾患（例えば、子癇前症、子宮内発育遅延）、および癌と関連する原因因子または要因であるＨＩＦ１Ａ遺伝子（その１つ以上のｍＲＮＡスプライス変異型を含む）を標的にするように設計される。これに関連して、本開示のｄｓＲＮＡまたはその類似体は、１つ以上の関連する疾病症状の重症度または発症を予防、緩和、または低下させるレベルまで、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を効果的に下方制御する。あるいは、疾病または他の有害な状態の影響または結果のために、必ずしもＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現量が上昇していない様々な異なる疾病モデルにおいてさえも、遺伝子発現を低下させる（すなわち、選択されたｍＲＮＡまたはＨＩＦ１Ａ遺伝子のタンパク質生成物のレベルを低下させる）ことにより、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の下方制御は治療結果をもたらす。さらに、本開示のｄｓＲＮＡは、ＨＩＦ１Ａの発現を低下させるために標的にされ得、発現がＨＩＦ１Ａタンパク質によって、直接的または間接的に負に制御される「下流」遺伝子の上方制御をもたらすことができる。本開示のｄｓＲＮＡ分子は有用な試薬を含み、様々な治療、診断、標的のバリデーション、ゲノムの発見、遺伝子工学、および薬理ゲノミクスへの応用のための方法において用いることができる。
【０１３８】
一部の実施形態において、水性懸濁液は、本開示のｄｓＲＮＡを懸濁化剤または分散剤または湿潤剤等の好適な賦形剤と混合して含有する。例示的な懸濁化剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムが含まれる。代表的な分散剤または湿潤剤としては、自然発生のリン脂質（例えば、レシチン）、脂肪酸と酸化アルキレンとの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンステアリン酸）、長鎖脂肪族アルコールとエチレンオキシドとの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、または脂肪酸およびヘキシトールの無水物に由来する部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられる。一部の実施形態において、水性懸濁液は、１つ以上の保存剤（例えば、エチルまたはｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアート）、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味剤、または１つ以上の甘味剤（例えば、スクロース、サッカリン）を任意選択的に含有し得る。追加の実施形態において、水を添加することにより水性懸濁剤の調製に好適となる分散性粉末および顆粒は、本開示のｄｓＲＮＡを分散剤または湿潤剤、懸濁化剤、および任意選択的に１つ以上の保存剤、着色剤、香味剤、または甘味剤と混合して提供する。
【０１３９】
本開示は、薬学的に許容される担体または希釈剤の中に薬学的な有効量の望ましい化合物を含む保存または投与のために調製されるｄｓＲＮＡ組成物を含む。治療的使用のために許容される担体または希釈剤は医薬分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．，１９８５に記載されており、参照することにより本明細書に組み込まれる。一部の実施形態において、本開示の医薬組成物は、保存剤、抗酸化剤、安定化剤、色素、香味剤、またはこれらの任意の組み合わせを任意選択的に含むことができる。例示的な保存剤には、安息香酸エステルナトリウム、ソルビン酸、クロロブタノール、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。
【０１４０】
本開示のｄｓＲＮＡ組成物は、薬学的に許容される製剤として効果的に用いることができる。薬学的に許容される製剤は、対象における病状または他の有害な状態を予防するか、その発症もしくは重症度を変化させるか、または治療する（１つ以上の症状（複数を含む）を検出可能または測定可能な程度まで軽減する）。薬学的に許容される製剤には、例えば、塩酸、臭化水素酸、酢酸、またはベンゼンスルホン酸の塩等の酸付加塩等、上記化合物の塩が含まれる。医薬組成物または製剤は、細胞、またはヒト（例えば、全身投与）等の対象への投与に好適な形態の組成物または製剤を指す。ＨＩＦ１Ａ遺伝子発現に関連する疾患を治療または予防するために十分な量のｄｓＲＮＡを有する本開示の製剤は、例えば、局所（例えば、クリーム、軟膏、皮膚添付剤、点眼剤、点耳剤）適用または投与に好適である。他の投与経路には、経口、非経口、舌下、膀胱洗浄、膣内、直腸内、腸内、座剤、経鼻、および吸入が挙げられる。本明細書で用いられる非経口という用語には、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、関節内、眼球内または眼球後方、耳内、髄腔内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、脊髄内、肺内または経肺、滑液嚢内、および尿道内の注射または注入手法が含まれる。本開示の医薬組成物は、その中に含有されるｄｓＲＮＡが対象に投与されると生物学的に利用可能になるように処方される。
【０１４１】
さらなる実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを、例えば、植物油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、またはヤシ油）または無機質油（例えば、液体パラフィン）に懸濁することにより、油性懸濁液または乳濁液（例えば、油中水）として処方され得る。好適な乳化剤は、自然発生のゴム（例えば、アカシアゴムまたはトラガカントゴム）、自然発生のリン脂質（例えば、大豆、レシチン、脂肪酸およびヘキシトールに由来するエステルまたは部分エステル）、無水物（例えば、ソルビタンモノオレエート）、エチレンオキシドと部分エステルとの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）であることができる。一部の実施形態において、油性懸濁液または乳濁液は、任意選択的に、ミツロウ、固形パラフィン、またはセチルアルコール等の増粘剤を含有し得る。関連する実施形態において、美味な経口剤を提供するために、甘味剤および香味剤が任意選択的に加えられ得る。さらに他の実施形態において、これらの組成物は、アスコルビン酸等の抗酸化剤を任意選択的に加えることにより保存され得る。
【０１４２】
さらなる実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、甘味剤（例えば、グリセロール、プロピレン、グリコール、ソルビトール、グルコースまたはスクロース）を用いたシロップ剤およびエリキシル剤として処方され得る。かかる製剤は、粘滑剤、保存剤、香味剤、着色剤、またはこれらの任意の組み合わせを含有し得る。他の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、無菌の、注射用の水性または油性の懸濁液の形態であり得る。無菌注射剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の、無菌の注射用溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として）であり得る。本開示の組成物において有用である例示的な許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル溶液、または等張性の塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、無菌の固定油が本開示のｄｓＲＮＡのための溶媒または懸濁培地として用いられ得る。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無視激性の固定油が用いられ得る。さらに、オレイン酸等の脂肪酸が、非経口製剤の調製において役立つ。
【０１４３】
本開示の一部の実施形態の中で、本開示の１つ以上のｄｓＲＮＡまたはその類似体の存在または投与を特徴とする医薬組成物および方法は、ポリペプチドと組み合わせて、複合させて、または共役させて、任意選択的に希釈剤、安定化剤、緩衝剤等の薬学的に許容される担体を用いて処方される。負の電荷を持つ本開示のｄｓＲＮＡ分子は、治療に好適である組成物を形成するために、安定化剤、緩衝剤等を用いて、または用いずに、いずれの標準手段を用いて患者に投与することができる。リポソーム送達機構を用いることが望ましい場合は、リポソームの処方のための標準プロトコルに従うことができる。本開示の組成物はまた、当該技術分野で既知である他の化合物とともに、またはそれを伴わずに、経口投与のための錠剤、カプセル、またはエリキシル剤として、直腸内投与のための座剤として、無菌溶液として、または注射用の懸濁液として、処方および使用され得る。よって、本開示のｄｓＲＮＡは、経鼻的、経皮的、非経口的、または局所注射等の任意の形態において投与され得る。
【０１４４】
本開示に従って、（任意に置換された、または修飾された、または共役された）ｄｓＲＮＡ分子、その組成物、および細胞または有機体においてＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を抑制するための方法が提供される。一部の実施形態において、本開示は、またはＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現に起因するもしくは関連する疾病に罹患する、または疾病を発症する危険性のある、ヒト細胞、組織、または個体を含む対象を治療するための方法およびｄｓＲＮＡ組成物を提供する。一実施形態において、当該方法は、標的遺伝子の発現が停止されるように、本開示のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物を、細胞または哺乳類等の有機体に投与することを含む。（任意に置換された、または修飾された、または共役された）ｄｓＲＮＡ分子を用いた治療、その組成物、および本開示の方法で改善可能な対象（例えば、哺乳類、ヒト）は、心筋虚血、脳虚血、網膜虚血、肺高血圧症、妊娠疾患（例えば、子癇前症、子宮内発育遅延）、および癌を含む、少なくとも部分的に、ＨＩＦ１Ａ遺伝子の過剰発現または不適切な発現により媒介される１つ以上の疾病または状態に罹患する者、またはＨＩＦ１Ａタンパク質の発現の低下による治療の影響を受けやすい者が挙げられる。例示的な実施形態の中で、本開示の組成物および方法は、例えば、上に列記される状態の症状を治療または予防するために、ＨＩＦ１Ａの発現を調節するための治療ツールとしても有用である。
【０１４５】
明細書に開示される方法のいずれにおいても、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載される低酸素誘発因子１α（ＨＩＦ１Ａ）のｍＲＮＡに相補的である第１の鎖と、第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的である第２の鎖および第３の鎖と、を含み、明細書に記載される、１つ以上のｄｓＲＮＡ、または置換もしくは修飾されたｄｓＲＮＡに使用され得、第２の鎖および第３の鎖は、第１の鎖とアニーリングして最大１０ヌクレオチド離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、それによって第２の鎖と第３の鎖との間にギャップが形成され、ｍｄＲＮＡ分子は、５塩基対〜１３塩基対の少なくとも１つの二本鎖領域を任意選択的に含む。他の実施形態において、１つ以上のｄｓＲＮＡを有効量投与することにより、予防的または治療的に、対象を効果的に治療することができ、そのｄｓＲＮＡは、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒト低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１Ａ）のｍＲＮＡに相補的である第１の鎖と、第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的な第２の鎖および第３の鎖とを有し、第２の鎖および第３の鎖は、第１の鎖とアニーリングして最大１０ヌクレオチド離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、それによって、第２の鎖と第３の鎖との間にギャップが形成され、ｍｄＲＮＡ分子は、５塩基対〜１３塩基対からなる少なくとも１つの二本鎖領域を任意選択的に含み、ｍｄＲＮＡの少なくとも１つのピリミジンヌクレオシドは、式ＩまたはＩＩに従い、
2010519908.tif 000006
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ハロゲン、置換もしくは未置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル、置換もしくは未置換の−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル、カルバモイル、カルバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換もしくは未置換のアリール、置換もしくは未置換のアラルキル、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−Ｃ≡Ｎ、またはヘテロシクロ基であり、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立してヒドロキシル、保護ヒドロキシル、またはヌクレオシド間の結合基であり、Ｒ５およびＲ８は独立してＯまたはＳである。一部の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオシドは式Ｉに従い、式中、Ｒ１はメチルでありかつＲ２は−ＯＨであるか、またはＲ１はメチルであり、Ｒ２は−ＯＨであり、Ｒ８はＳである。一部の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオシドは式Ｉに従い、式中、Ｒ１はメチルでありかつＲ２は−Ｏ−メチルであるか、またはＲ１はメチルであり、Ｒ２は−Ｏ−メチルであり、Ｒ８はＯである。他の実施形態において、ヌクレオシド間結合基は、約５〜約４０個のヌクレオシドを共有結合的に結合する。
【０１４６】
本明細書に記載されるいずれの方法においても、使用されるｄｓＲＮＡは複数の修飾を含むことができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、ＬＮＡ、２’−メトキシ、２’−フルオロ、２’−デオキシ、ホスホロチオエート結合、反転した塩基の末端キャップ、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。一部の例示的方法において、ｄｓＲＮＡは１個〜すべての５−メチルウリジンおよび最大約７５％のＬＮＡを有する。他の例示的方法において、ｄｓＲＮＡは１個〜すべての５−メチルウリジンを有し、また２’−メトキシがアルゴノート切断部位に存在しない場合は、最大約７５％の２’−メトキシを有する。さらに他の例示的方法において、ｄｓＲＮＡは１個〜すべての５−メチルウリジンを有し、また最大約１００％の２’−フルオロ置換を有する。さらなる例示的方法において、ｄｓＲＮＡは１個〜すべての５−エチルウリジンを有し、また最大約７５％の２’−デオキシを有する。さらなる例示的方法において、ｄｓＲＮＡは最大約７５％のＬＮＡを有し、また最大約７５％の２’−メトキシを有する。さらに他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは最大約７５％のＬＮＡを有し、また最大約１００％の２’−フルオロを有する。さらなる例示的方法において、ｄｓＲＮＡは最大約７５％のＬＮＡを有し、また最大約７５％の２’−デオキシを有する。さらなる例示的方法において、ｄｓＲＮＡは最大約７５％の２’−メトキシを有し、また最大約１００％の２’−フルオロを有する。さらなる例示的方法において、ｄｓＲＮＡは最大約７５％の２’−メトキシを有し、また最大約７５％の２’−デオキシを有する。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは最大約１００％の２’−フルオロを有し、また最大約７５％の２’−デオキシを有する。
【０１４７】
多重に修飾されたｄｓＲＮＡを用いるための他の例示的方法において、ｄｓＲＮＡは、５−メチルウリジンと置換された１つ〜すべてのウリジン、最大約７５％のＬＮＡ、および最大約７５％の２’−メトキシを有する。さらなる例示的方法において、ｄｓＲＮＡは、１つ〜すべての５−メチルウリジン、最大約７５％のＬＮＡ、および最大約１００％の２’−フルオロを有する。さらなる例示的方法において、ｄｓＲＮＡは、１つ〜すべての５−メチルウリジン、最大約７５％のＬＮＡ、および最大約７５％の２’−デオキシを有する。さらなる例示的方法において、ｄｓＲＮＡは、１つ〜すべての５−メチルウリジン、最大約７５％の２’−メトキシ、および最大約７５％の２’−フルオロを有する。さらなる例示的方法において、ｄｓＲＮＡは、１つ〜すべての５−メチルウリジン、最大約７５％の２’−メトキシ、および最大約７５％の２’−デオキシを有する。より多くの例示的方法において、ｄｓＲＮＡは、１つ〜すべての５−メチルウリジン、最大約１００％の２’−フルオロ、および最大約７５％の２’−デオキシを有する。さらに他の例示的方法において、ｄｓＲＮＡは、１つ〜すべての５−メチルウリジン、最大約７５％のＬＮＡ、最大約７５％の２’−メトキシ、最大約１００％の２’−フルオロ、および最大約７５％の２’−デオキシを有する。他の例示的方法において、ｄｓＲＮＡは、最大約７５％のＬＮＡ、最大約７５％の２’−メトキシ、および最大約１００％の２’−フルオロを有する。さらなる例示的方法において、ｄｓＲＮＡは、最大約７５％のＬＮＡ、最大約７５％の２’−メトキシ、および最大約７５％の２’−デオキシを有する。より多くの例示的方法において、ｄｓＲＮＡは、最大約７５％のＬＮＡ、最大約１００％の２’−フルオロ、および最大約７５％の２’−デオキシを有する。さらなる例示的方法において、ｄｓＲＮＡは、最大約７５％の２’−メトキシ、最大約１００％の２’−フルオロ、および最大約７５％の２’−デオキシを有する。
【０１４８】
多重に修飾されたｄｓＲＮＡを用いるためのこれらの例示的方法のいずれにおいても、ｄｓＲＮＡは、最大１００％のホスホロチオエートヌクレオシド間結合、１〜１０以上の反転した塩基の末端キャップ、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。さらに、これらのｄｓＲＮＡのいずれもが、ｄｓＲＮＡ分子内の１本の鎖、２本の鎖、３本の鎖、複数の鎖、もしくはすべての鎖、または同じかもしくは異なるヌクレオシド上に、これらの複数の修飾を有し得る。最後に、これらの複数の修飾ｄｓＲＮＡのいずれにおいても、ｄｓＲＮＡは遺伝子サイレンシング活性を持っていなければならない。
【０１４９】
さらなる実施形態において、本明細書に記載されるように、１つ以上のｄｓＲＮＡ、または置換もしくは修飾されたｄｓＲＮＡを有効量投与することにより、予防的または治療的に対象を効果的に治療することができ、そのｄｓＲＮＡは、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である第１の鎖と、第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的な第２の鎖および第３の鎖とを有し、第２の鎖および第３の鎖は、第１の鎖とアニーリングして最大１０ヌクレオチド離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、それによって、第２の鎖と第３の鎖との間にギャップが形成され、合わせた二本鎖領域は合計で約１５塩基対〜約４０塩基対であり、該ｍｄＲＮＡ分子は任意選択的に1つ以上の平滑末端を有する。さらなる実施形態において、本明細書に開示される方法は、１つ以上のｄｓＲＮＡとともに用いることができ、該ｄｓＲＮＡは、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である第１の鎖と、第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的な第２の鎖および第３の鎖とを含み、第２の鎖および第３の鎖は、第１の鎖とアニーリングして、最大１０ヌクレオチド離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、それによって、第２の鎖と第３の鎖との間にギャップが形成され、ｍｄＲＮＡは、合計で約１５塩基対〜約４０塩基対である合わせた二本鎖領域を有し、５塩基対〜１３塩基対の少なくとも１つの二本鎖領域を任意選択的に有し、１つ以上の平滑末端、またはこれらの任意の組み合わせを任意選択的に有し、ｍｄＲＮＡのうちの少なくとも１つのピリミジンは式ＩまたはＩＩに従うピリミジンヌクレオシドであり、
2010519908.tif 000007
式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ハロゲン、置換もしくは未置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル、置換もしくは未置換の−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル、カルバモイル、カルバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換もしくは未置換のアリール、置換もしくは未置換のアラルキル、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−Ｃ≡Ｎ、またはヘテロシクロ基であり、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立してヒドロキシル、保護ヒドロキシル、またはヌクレオシド間の結合基であり、Ｒ５およびＲ８は独立してＯまたはＳである。一部の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオシドは式Ｉに従い、式中、Ｒ１はメチルでありかつＲ２は−ＯＨであるか、またはＲ１はメチルであり、Ｒ２は−ＯＨであり、Ｒ８はＳである。一部の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオシドは式Ｉに従い、式中、Ｒ１はメチルでありかつＲ２は−Ｏ−メチルであるか、またはＲ１はメチルであり、Ｒ２は−Ｏ−メチルであり、Ｒ８はＯである。他の実施形態において、ヌクレオシド間結合基は、約５〜約４０個のヌクレオシドを共有結合的に結合する。
【０１５０】
本開示の付加的な態様の中で、有効量の１つ以上の本開示のｄｓＲＮＡと、本明細書に記載されるＨＩＦ１Ａに関連する疾病または状態を制御する本開示のｄｓＲＮＡとともに調製されるまたは協調的に投与される１つ以上の二次的または補助的な活性薬剤を併用する、併用処方および方法が提供される。これらの組み合わせの処方および協調的治療方法における有用な補助治療剤には、例えば、酵素核酸分子、アロステリック核酸分子、アンチセンス、デコイ、またはアプタマー核酸分子、モノクローナル抗体等の抗体、小分子、金属、塩およびイオンを含む他の有機もしくは無機化合物、ならびに癌を治療するための化学療法剤、ステロイド、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、チロシンキナーゼ阻害剤等を含む、ＨＩＦ１Ａに関連する疾病または状態の治療に適応される他の薬剤および活性薬剤、が含まれる。
【０１５１】
例示的な化学療法剤には、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ブスルファン、ニトロソ尿素、窒素マスタード、ウラムスチン、テモゾロマイド）、代謝拮抗薬（例えば、アミノプテリン、メトトレキサート、メルカプトプリン、フルオロウラシル、シタラビン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン）、ブレオマイシン、マイトマイシン、アクチノマイシン、ヒドロキシウレア、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド）、モノクローナル抗体（例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ロイコボリン、オキサリプラチンが含まれる。
【０１５２】
いくつかの補助的療法は、ＨＩＦ１Ａと相互作用もしくは会合する標的、または特異的なＨＩＦ１Ａの生物学的活性に影響を与える標的を対象とし得る。例えば、ＨＩＦ１Ａは、ヘテロ二量体および転写因子であるため、ＨＩＦ１Ａの二量化または生物学的活性の阻害剤は、マイトマイシンＣ、チラパザミン、ＡＱ４Ｎ（ミトキサントロンのジ−Ｎ−オキシド類似体）等の本開示のｄｓＲＮＡとともに用いる良好な補助的療法であろう。
【０１５３】
本開示の協調的投与方法を実施するために、ｄｓＲＮＡは、本明細書で企図される１つ以上の二次的または補助的な薬剤を用いた協調的なプロトコルにおいて、同時または経時的に投与される。協調的な投与はいずれの順序でも行われ得、１つのみまたは両方の（もしくはすべての）活性治療剤が、個別にまたは全体として、生物学的活性を発揮する期間があり得る。かかる協調的な治療の特徴的な態様は、組成物中に存在するｄｓＲＮＡがある有益な臨床応答を引き出すことであり、二次的な治療剤によって提供される二次的な臨床応答が併せて見られるかもしれないしまたは見られないかもしれない。例えば、本明細書で企図される二次的な治療剤を用いたｄｓＲＮＡの協調的投与は、精製したｄｓＲＮＡまたは二次的治療剤単独のいずれかまたは両方によって引き出される治療応答を超えた、増強された（相乗的）治療応答をもたらすことが可能である。
【０１５４】
別の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡの１つ以上の末端ヌクレオチド上に共役体の構成要素を含み得る。共役体の構成要素は、例えば、親油性物質、テルペン、タンパク質結合剤、ビタミン、炭水化物、またはペプチドであり得る。例えば、共役体の構成要素は、ナプロキセン、ニトロインドール（もしくは、スタッキング相互作用に貢献する別の共役体）、葉酸、イブプロフェン、またはＣ５ピリミジンリンカーであり得る。他の実施形態において、共役体の構成要素は、グリセリド脂質共役体（例えば、ジアルキルグリセリド誘導体）、ビタミンＥ共役体、またはチオ−コレステロールである。さらなる共役体の構成要素は、修飾された本開示のｄｓＲＮＡと共役した時に、ｄｓＲＮＡの標的細胞内への送達を促進するか、あるいは、生体試料（例えば、ＨＩＦ１Ａを発現する標的細胞）と接触したときに、ｄｓＲＮＡの送達、安定性、もしくは活性を向上させる機能を果たすペプチドが含まれる。本開示のこれらの態様において用いられる例示的なペプチド共役体の構成要素には、例えば、米国特許出願公開第２００６／００４０８８２号および第２００６／００１４２８９号、ならびに米国仮特許出願第６０／８２２，８９６号および第６０／９３９，５７８号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７５７４４号（参照することによってすべて本明細書に組み込まれる）に記載されるペプチドＰＮ２７、ＰＮ２８、ＰＮ２９、ＰＮ５８、ＰＮ６１、ＰＮ７３、ＰＮ１５８、ＰＮ１５９、ＰＮ１７３、ＰＮ１８２、ＰＮ１８３、ＰＮ２０２、ＰＮ２０４、ＰＮ２５０、ＰＮ３６１、ＰＮ３６５、ＰＮ４０４、ＰＮ４５３、ＰＮ５０９、およびＰＮ９６３が含まれる。一部の実施形態において、ペプチド共役体のパートナーが開示のｄｓＲＮＡの送達を向上させるために用いられる場合、結果として生じるｄｓＲＮＡ製剤および方法は、脂質送達ビヒクル（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標））等の代替の送達ビヒクルとともに送達されるｄｓＲＮＡと比較して、標的細胞におけるインターフェロン応答をさらに低下させることが多い。
【０１５５】
さらに別の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡまたはその類似体は、ポリペプチドと共役、また１つ以上の非カチオン性脂質または非カチオン性脂質とカチオン性脂質との組み合わせと混合することができ、標的細胞をネイキッドｄｓＲＮＡと接触させることによる送達と比較してｄｓＲＮＡの細胞内送達を向上する組成物を形成する。本開示のより詳細な態様において、ｄｓＲＮＡとポリペプチドとを含む混合物、複合体または共役体は、任意選択的にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）等のカチオン性脂質と併用（例えば、混合または複合）され得る。ポリペプチド、ｄｓＲＮＡおよびカチオン性脂質を含むこれらの組成物を生成するために、ｄｓＲＮＡとペプチドとを細胞培養培地等の好適な培地においてはじめに混合し、その後でカチオン性脂質を混合物に加えることにより、ｄｓＲＮＡ／送達ペプチド／カチオン性脂質組成物を形成することができる。任意選択的に、ペプチドとカチオン性脂質とを細胞培養培地等の好適な培地においてはじめに混合し、続いてｄｓＲＮＡを加えることにより、ｄｓＲＮＡ／送達ペプチド／カチオン性脂質組成物を形成することができる。
【０１５６】
本開示は、例えば、ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ修飾、または長期循環リポソームもしくはステルスリポソーム）（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５：２６０１，１９９５、Ｉｓｈｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４３：１００５，１９９５、Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１２７５，１９９５、Ｏｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２３８：８６，１９９５、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４２：２４８６４，１９９５、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９１号、Ａｎｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９０号、Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９２号）を含有する、表面修飾リポソームを含むｄｓＲＮＡ組成物の使用も特徴とする。
【０１５７】
別の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子が肝細胞等の特異的な細胞型を標的にするために、組成物が提供される。例えば、ｄｓＲＮＡは、例えば、肝臓を標的とした送達のための、複合または共役された糖タンパク質または合成の複合糖質糖タンパク質または分岐ガラクトース（例えば、アシアロオロソムコイド）、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、またはマンノースを有する合成の複合糖質であり得る（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９，１９８７、Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｔｅ，Ｃｅｌｌ．２２：６１１，１９８０、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：９３９，１９８２、Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．４：３１７，１９８７、Ｐｏｎｐｉｐｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：１３８８，１９８１を参照されたい）。
【０１５８】
薬学的に有効な量とは、ある病態を予防し、その発症を阻害し、また治療する（症状をある程度まで、好ましくはすべての症状を緩和する）ために必要とされる量である。薬学的に有効な量は、疾病の種類、使用される組成物、投与経路、治療される対象の種類、治療が検討される特定の対象の物理的特性、併用する薬物、および当業者が認識するであろう他の要因に依存する。例えば、本開示のｄｓＲＮＡの作用強度に応じて、０．１ｍｇ／体重ｋｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／日の量の活性成分が投与され得る。
【０１５９】
任意の特定の患者に対する具体的な投与量レベルは、用いられる特異的化合物の活性、年齢、体重、総体的な健康状態、性別、食生活、投与期間、投与経路、排泄率、薬剤の組み合わせ、および治療を受ける特定の疾病の重症度を含む様々な要因に依存する。本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ組成物の投与に続いて、被験者は、プラセボで治療した患者または他の好適な対照患者と比較して、治療される疾病または疾患に関連する１つ以上の症状において約１０％〜約９９％の低減を示す。
【０１６０】
１日に体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇ台の投与量レベルが、上記の状態の治療において有用である得る（患者１人当たり約０．５ｍｇ〜約７ｇ／１日）。単一剤形を生成するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される宿主および特定の投与様式に依存して異なる。一般に、投与単位剤形は約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含有する。
【０１６１】
本開示のｄｓＲＮＡおよびその組成物の剤形は、液体、乳濁液、もしくはミセル、またはエアロゾルもしくは液滴の形態であり得る。本開示のｄｓＲＮＡおよびその組成物の剤形は、投与前に液体中で元に戻すことができる固体であり得る。固体は粉末として投与することができる。固体はカプセル、錠剤、またはゲルの形態であり得る。当業者は、生体内での遺伝子の抑制のほかに、本開示のｄｓＲＮＡおよびその類似体が、化学的および商業的な研究（例えば、生理学的経路の解明、創薬および開発）、ならびに医学的および獣医学的診断等の様々な生体外での応用に有用であることを理解するであろう。
【０１６２】
核酸分子およびポリペプチドは、ｄｓＲＮＡのみ、ｄｓＲＮＡとポリペプチドとの複合体／共役体のみを含む製剤、または薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、補助剤、乳化剤、安定化剤、保存剤等の１つ以上の追加構成成分をさらに含む製剤中における投与を含む、当業者に既知である様々な方法を用いて細胞に投与することができる。生理的状態に近づくために用いられる他の例示的な物質には、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、およびこれらの混合物を含む、ｐＨ調整および緩衝剤、浸透圧調整剤、ならびに湿潤剤が含まれる。固体組成物には、従来の無毒性の薬学的に許容される担体を用いることができ、それには、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム炭酸塩等が含まれる。
【０１６３】
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡおよびその組成物は、リポソームに封入され得、イオン注入によって投与されてもよく、またはハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性なのカプセル、生体接着性微粒子、もしくはタンパク質性ベクター（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／５３７２２号を参照されたい）等の他のビヒクルに組み込むことができる。本開示の一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、例えば、徐放性ポリマーを含む組成物等の持効性製剤中で投与され得る。ｄｓＲＮＡは、急速な放出から保護する担体、例えば、ポリマー、マイクロカプセル化送達システム、または生体接着性ゲル等の、制御放出性ビヒクルを用いて調製することができる。本開示の様々な組成物において、ｄｓＲＮＡの長期送達は、例えば、ステアリン酸アルミニウムヒドロゲルおよびゼラチン等の吸収を遅らせる組成の薬剤に含ませることにより実現できる。
【０１６４】
あるいは、本開示のｄｓＲＮＡ組成物は、直接注射によって、または、例えば、輸液ポンプの使用によって、局所的に送達することができる。本開示のｄｓＲＮＡの直接注射は、皮下、筋肉内、または皮内のいずれであっても、標準的な針と注射器を用いた手順によって、またはＣｏｎｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５：２３３０，１９９９）、およびＰＣＴ公開第ＷＯ９９／３１２６２号に記載されるもの等の針を使用しない技術を用いて、行われ得る。
【０１６５】
本開示のｄｓＲＮＡおよびその組成物は、経口直腸内、膣内、鼻腔内、肺内、もしくは経皮的送達を含む様々な粘膜投与様式によって、または眼、耳、皮膚、または他の粘膜面への局所的送達によって、対象に投与され得る。一実施形態において、粘膜組織層には上皮細胞層が含まれ、それは肺、気管、気管枝、肺胞、鼻、頬側、上皮、または消化管であり得る。本開示の組成物は、機械式の噴霧装置、および加圧式、電気作動式、または他の種類のアクチュエータ等、従来のアクチュエータを用いて投与され得る。またｄｓＲＮＡは、例えば、直腸内投与のために、座剤の形態においても投与され得る。例えば、これらの組成物は、室温では固体であるが、直腸内の温度では液体となるためｄｓＲＮＡが放出される、賦形剤と混合することもできる。かかる物質には、例えば、カカオバターおよびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１６６】
本開示のｄｓＲＮＡ等の核酸分子を送達するためのさらなる方法は、例えば、Ｂｏａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ８７：１３０８，  １９９８、  Ｔｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２１：２８０，１９９９、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：５５９２，１９９５、Ｂｏａｄｏ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１５：７３，１９９５、Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：４９１０，１９９８、Ｔｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７０５３−７０５８，１９９９、Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２：１３９，１９９２、「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，」ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５，Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６：１２９，１９９９、Ｈｏｆｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３７：１６５，１９９９、およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７５２：１８４，２０００、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０２５９５号に記載される。
【０１６７】
本明細書において参照されるすべての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国の特許、外国の特許出願、特許以外の出版物、図、表、およびウェブサイトは、参照することにより、それらの全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１６８】
実施例１
ＭＤＲＮＡによる遺伝子発現のノックダウン
二重蛍光アッセイを用いて、ニックの入ったまたはギャップのある同じｄｓＲＮＡと比較して、ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性を調べた。合計２２個の異なる遺伝子を、それぞれ異なる１０の部位で標的にした（表１を参照）。
【０１６９】
２５ヌクレオチドのセンス鎖と、２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、アンチセンス鎖（２５／２７ｄｓＲＮＡと称される）の３’末端に２デオキシヌクレオチドのオーバーハングと、を有するダイサー基質ｄｓＲＮＡ分子を使用した。ニックの入った各ｄｓＲＮＡダイサー基質は、センス鎖の５’末端から測って、該センス鎖の９〜１６位のうちの１つにニックを有する。例えば、１１位にニックを有するｎｄｓＲＮＡは、１１ヌクレオチドの５’センス鎖、１４ヌクレオチドの３’センス鎖、および２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖（Ｎ１１−１４／２７ｍｄＲＮＡとも称される）の、３本の鎖を有する。さらに、ｎｄｓＲＮＡの各センス鎖は、各センス断片に沿って均等に分布されたロックされた核酸（ＬＮＡ）を３つ有する。ニックが９位にある場合は、ＬＮＡは、５’センス鎖断片の２、６、および９位ならびに３’センス鎖断片の１１、１８、および２３位に見ることができる。ニックが１０位にある場合は、ＬＮＡは、５’センス鎖断片の２、６、および１０位ならびに３’センス鎖断片の１２、１８、および２３位に見ることができる。ニックが１１位にある場合は、ＬＮＡは、５’センス鎖断片の２、６、および１１位ならびに３’センス鎖断片の１３、１８、および２３位に見ることができる。ニックが１２位にある場合は、ＬＮＡは、５’センス鎖断片の２、６、および１２位ならびに３’センス鎖断片の１４、１８、および２３位に見ることができる。ニックが１３位にある場合は、ＬＮＡは、５’センス鎖断片の２、７、および１３位ならびに３’センス鎖断片の１５、１８、および２３位に見ることができる。ニックが１４位にある場合は、ＬＮＡは、５’センス鎖断片の２、７、および１４位ならびに３’センス鎖断片の１６、１８、および２３位に見ることができる。ニックが１５位にある場合は、ＬＮＡは、５’センス鎖断片の２、８、および１５位ならびに３’センス鎖断片の１７、１９、および２３位に見ることができる。ニックが１６位にある場合は、ＬＮＡは、５’センス鎖断片の２、８、および１６位ならびに３’センス鎖断片の１８、１９、および２３位に見ることができる。同様に、ギャップのある各ｄｓＲＮＡダイサーの基質は、センス鎖の５’末端から測って、該センス鎖の１０〜１７位のうちの１つで単一のヌクレオチドが欠失している。例えば、１１位でギャップを有するｇｄｓＲＮＡは、１１ヌクレオチドの５’センス鎖、１３ヌクレオチドの３’センス鎖、２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖の、３本の鎖を有する（Ｇ１１−（１）−１３／２７ｍｄＲＮＡとも称される）。さらに、ｇｄｓＲＮＡの各センス鎖は、各センス断片に沿って均等に分布された、３つのロックされた核酸（ＬＮＡ）を有する（ニックの入ったｄｓＲＮＡについて記載されるように）。
【０１７０】
つまり、非修飾ｄｓＲＮＡ、センス鎖断片当たり３つのＬＮＡを持つニックの入ったｍｄＲＮＡ、およびセンス鎖断片当たり３つのＬＮＡを持つ単一ヌクレオチドのギャップのあるｍｄＲＮＡの３つのｄｓＲＮＡについて、遺伝子ごとにそれぞれ異なる１０の部位で検査した。換言すると、異なる６６０個のｄｓＲＮＡを検査した。
【０１７１】
簡潔に述べると、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中に、約７〜８×１０５ＨｅＬａ細胞／ウェルずつマルチウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩培養した。トランスフェクションの直前に、ＨｅＬａ細胞培地を無血清ＤＭＥＭに変更した。無血清ＤＭＥＭ中で希釈した標的遺伝子の約１，０００塩基対の挿入断片を含有するｐｓｉＣＨＥＣＫ（登録商標）−２ベクターを、希釈したＧｅｎＪｅｔ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＳｉｇｎａｌＤＴ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と製造者の指示に従って混合し、室温で１０分間培養した。ＧｅｎＪｅｔ／ｐｓｉＣＨＥＣＫ（登録商標）−２−［標的遺伝子挿入断片］溶液をＨｅＬａ細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２で４．５時間培養した。ベクタートランスフェクションの後、細胞をトリプシン処理して、１０％ＦＢＳを含有する、抗生物質を含まないＤＭＥＭに１０５細胞／ｍＬの濃度で懸濁させた。
【０１７２】
ｄｓＲＮＡをトランスフェクトするために、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ血清使用量低減培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中でｄｓＲＮＡを調製して、マルチウェルプレートに移した。その後、製造者の仕様に沿ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＯＰＴＩ−ＭＥＭと混合してｄｓＲＮＡを含有する各ウェルに加え、手で混合して、室温で１０〜２０分間培養した。その後、ベクターでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞３０μＬ（１０５細胞／ｍＬ）を各ウェルに加え（ｄｓＲＮＡ最終濃度２５ｎＭ）、プレートを１，０００ｒｐｍで３０秒回転させてから、３７℃／５％ＣＯ２で２日間培養した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ（ＣＴＢ）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｏｎ）を用いて細胞の生存および増殖について検定したところ、ｄｓＲＮＡはいずれも実質的な毒性を示さなかった。
【０１７３】
トランスフェクションの後、培地およびＣＴＢ試薬を除去して、１００ＰＢＳでウェルを１回洗浄した。最初に、１０分間振盪させながらＤｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を加え、それからＶＩＣＴＯＲ３（登録商標）１４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で発光シグナルを定量化して、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼレポーターの活性について細胞を検定した。ホタルの発光を測定後、１０分間振盪させながらＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を加えて、ホタルルシフェラーゼ反応の停止と、ウミシイタケルシフェラーゼ反応の開始を同時に行い、ＶＩＣＴＯＲ３（登録商標）１４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で定量化した。その結果を表１に示す。
【０１７４】
【表１−１】
2010519908.tif 000008
【表１−２】
2010519908.tif 000009
【表１−３】
2010519908.tif 000010
【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【０１７５】
実施例２
ギャップのあるＤＳＲＮＡダイサー基質を用いたβ−ガラクトシダーゼ活性のノックダウン
通常のダイサー基質ｄｓＲＮＡ（すなわちギャップのない）と比較して、ＬａｃＺ  Ｍｒｎａのサイレンシングにおける二本鎖構造にギャップを有するダイサー基質ｄｓＲＮＡの活性を調べた。
【０１７６】
ＬａｃＺ  ｍＲＮＡを標的とするｄｓＲＮＡおよびｍｄＲＮＡのヌクレオチド配列
下に示す１つ以上のセンス鎖の核酸配列、ならびにｄｓＲＮＡおよびギャップのあるｄｓＲＮＡ（本明細書において部分二重鎖またはｍｄＲＮＡとも称される）のアンチセンス鎖を、標準的な技術を用いて合成した。ＲＩＳＣ活性化因子ＬａｃＺ  ｄｓＲＮＡは、アニーリングして、各鎖上に２デオキシチミジンのオーバーハングを持つ１９塩基対の二本鎖領域を形成することができる、２１ヌクレオチドのセンス鎖および２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む（２１／２１  ｄｓＲＮＡと称される）。
ＬａｃＺ  ｄｓＲＮＡ（２１／２１）−ＲＩＳＣ活性化因子
センス ５’−ＣＵＡＣＡＣＡＡＡＵＣＡＧＣＧＡＵＵＵｄＴｄＴ−３’ （配列番号１）
アンチセンス ３’−ｄＴｄＴＧＡＵＧＵＧＵＵＵＡＧＵＣＧＣＵＡＡＡ−５’ （配列番号２）
【０１７７】
ダイサーの基質ＬａｃＺ  ｄｓＲＮＡは、２５ヌクレオチドのセンス鎖および２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、アニーリングして、１つの平滑末端ならびに他方の端にシチジンおよびシチジンのオーバーハングを持つ２５塩基対の二本鎖領域を形成することができる（２５／２７  ｄｓＲＮＡと称される）。
ＬａｃＺ  ｄｓＲＮＡ（２５／２７）−ダイサー基質
センス ５’−ＣＵＡＣＡＣＡＡＡＵＣＡＧＣＧＡＵＵＵＣＣＡＵｄＧｄＴ−３’ （配列番号３）
アンチセンス ３’−ＣＵＧＡＵＧＵＧＵＵＵＡＧＵＣＧＣＵＡＡＡＧＧＵＡＣＡ−５’ （配列番号４）
ＬａｃＺ  ｍｄＲＮＡは、１３ヌクレオチド（５部分）および１１ヌクレオチド（３鋳部分）の２本のセンス鎖、ならびに２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、３本の鎖がアニーリングして、単一のヌクレオチドギャップによって離された１３および１１塩基対の２つの二本鎖領域を形成することができる（１３，１１／２７  ｍｄＲＮＡと称される）。１１ヌクレオチドのセンス鎖の断片の５’末端は、任意選択的にリン酸化され得る。「＊」はギャップ（この場合は単一のヌクレオチドギャップ）を示す（すなわち、シチジンが欠失している）。
ＬａｃＺ  ｍｄＲＮＡ（１３，１１／２７）−ダイサー基質
センス ５’−ＣＵＡＣＡＣＡＡＡＵＣＡＧ＊ＧＡＵＵＵＣＣＡＵｄＧｄＴ−３’ （配列番号５、６）
アンチセンス ３’−ＣＵＧＡＵＧＵＧＵＵＵＡＧＵＣＧＣＵＡＡＡＧＧＵＡＣＡ−５’ （配列番号４）
ＬａｃＺ  ｄｓＲＮＡまたはｍｄＲＮＡのそれぞれを、９ｌａｃＺ／Ｒ細胞をトランスフェクトするために用いた。
【０１７８】
トランスフェクション
コラーゲンでコーティングした６ウェルプレートに、ウェル当たり２ｍｌの体積を５×１０５  ９ｌａｃＺ／Ｒ細胞／ウェルで播種し、ＤＭＥＭ／高グルコース培地を用いて３７℃／５％ＣＯ２で一晩培養した。トランスフェクションの準備：２５０μｌの無血清ＯＰＴＩＭＥＭ培地を２０ｐｍｏｌ／μｌのｄｓＲＮＡ  ５μｌと混合し、ＨＩＰＥＲＦＥＣＴトランスフェクション溶液（Ｑｉａｇｅｎ）５μｌを別の２５０μｌのＯＰＴＩＭＥＭ培地と混合した。両方の混合物を５分間平衡化してから、ＲＮＡとトランスフェクション溶液とを合わせ、室温で２０分間放置してトランスフェクション複合体を形成した。ＨＩＰＥＲＦＥＣＴの最終濃度は５０μＭであり、ｄｓＲＮＡを０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、および１０ｎＭで検査し、一方ｍｄＲＮＡは０．２ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、および５０ｎＭで検査した。完全培地を除去して、細胞を不完全ＯＰＴＩＭＥＭで洗浄し、５００μｌのトランスフェクション混合物を細胞に適用して、穏やかに振とうさせながら３７℃で４時間培養した。トランスフェクション後、トランスフェクション培地を除去して、完全ＤＭＥＭ／高グルコース培地で細胞を一度洗浄してから新鮮培地を加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。
【０１７９】
β−ガラクトシダーゼアッセイ
トランスフェクトした細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．５ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡを用いて剥離した。剥離した細胞を完全ＤＭＥＭ／高グルコース１ｍｌに懸濁させて、清潔なチューブに移した。２５０ｘｇで５分間遠心分離することにより細胞を収集し、１×溶解緩衝液５０μｌに４℃で再懸濁させた。溶解した細胞を、ドライアイスおよび３７℃の水浴で２回の凍結融解サイクルに供した。溶解した試料を４℃で５分間遠心分離して、上清を回収した。各試料につき、１．５μｌおよび１０μｌのライセートを清潔なチューブに移し、無菌水を加えて最終容積３０μｌにし、続いてｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノース（ＯＮＰＧ）７０μｌ、およびβ−メルカプトエタノールを含む１×切断緩衝剤２００μｌを添加した。試料を短時間混合して、３０分間３７℃で培養した後、停止緩衝剤５００μｌを加えた（最終容積８００μｌ）。各試料について、β−ガラクトシダーゼ活性をディスポーザブルキュベット内で４２０ｎｍで測定した。ＢＣＡ（ビシンコニン酸）法によりタンパク質濃度を決定した。本実施例の目的のために、測定したＬａｃＺ活性のレベルを、９Ｌ／ＬａｃＺ細胞内のＬａｃＺ転写物の量に相関させた。従って、細胞生存率に悪影響をおよぼすことのない、ｄｓＲＮＡトランスフェクション後のβ−ガラクトシダーゼ活性の低下は、ＬａｃＺ  ｄｓＲＮＡによって媒介された標的分解に起因するＬａｃＺ転写物の量の低下によるものであった。
【０１８０】
結果
トランスフェクトした細胞およびトランスフェクトしていない細胞におけるノックダウン活性をＱｎｅｇ対照ｄｓＲＮＡに対して正規化し、Ｑｎｅｇ対照の正規化値として表した（すなわち、Ｑｎｅｇが１００％または「正常な」遺伝子発現量を表した）。ｌａｃＺ  ＲＩＳＣ活性化因子およびダイサー基質ｄｓＲＮＡ分子の両方が、０．１ｎＭ（図２）の低濃度でβ−ガラクトシダーゼ活性の良好なノックダウンを示した一方で、ダイサー基質のアンチセンス鎖のみ（一本鎖２７ｍｅｒ）はサイレンシング効果を持たなかった。驚くべきことに、ギャップのあるｍｄＲＮＡが、インタクトなＲＩＳＣ活性化因子およびダイサー基質ｄｓＲＮＡよりはやや低いものの、良好なノックダウンを示した（図２）。様々な濃度（０．１μＭ〜５０μＭ）でのギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）シチジン（すなわち、ヌクレオチドの欠失）の存在は、ｍｄＲＮＡの活性に影響を与えなかった（データは非表示）。ｄｓＲＮＡまたはｍｄＲＮＡ溶液のいずれも、トランスフェクトした９Ｌ／ＬａｃＺ細胞において検出可能な毒性をまったく示さなかった。ｌａｃＺ  ｍｄＲＮＡのＩＣ５０は、以前にｌａｃＺ  ｄｓＲＮＡ  ２１／２１（データ非表示）について測定されたものに比べて１０倍低い、３．７４ｎＭとして算出された。これらの結果は、部分二重鎖（ギャップのあるｄｓＲＮＡ）が、遺伝子サイレンシングを誘導する能力を持つことを示すものである。
【０１８１】
実施例３
ニックの入ったＤＳＲＮＡを用いたインフルエンザ遺伝子発現のノックダウン
通常のｄｓＲＮＡ（すなわち、ニックを持たない）と比較して、インフルエンザ遺伝子の発現のサイレンシングにおける、ニックの入ったｄｓＲＮＡ（２１／２１）の活性を調べた。
【０１８２】
インフルエンザｍＲＮＡを標的とするｄｓＲＮＡおよびｍｄＲＮＡのヌクレオチド配列
下に示すｄｓＲＮＡおよびニックの入ったｄｓＲＮＡ（部分二重鎖の別の形態、本明細書においてはｎｄｓＲＮＡと称される）を、標準的な技術を用いて合成した。ＲＩＳＣ活性化因子インフルエンザＧ１４９８  ｄｓＲＮＡは、アニーリングして、各鎖上に２デオキシチミジンのオーバーハングを持つ１９塩基対の二本鎖領域を形成することができる、２１ヌクレオチドのセンス鎖と２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。
Ｇ１４９８−ｗｔ  ｄｓＲＮＡ（２１／２１）
センス ５’−ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧｄＴｄＴ−３’ （配列番号７）
アンチセンス ３’−ｄＴｄＴＣＣＵＡＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＣ−５’ （配列番号８）
【０１８３】
ＲＩＳＣ活性化因子インフルエンザＧ１４９８  ｄｓＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド１１の後にニックを入れ、１１ヌクレオチド（５’部分、イタリック体）および１０ヌクレオチド（３’部分）の２本のセンス鎖ならびに２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖を有するｎｄｓＲＮＡを生成し、その３本の鎖がアニーリングして、１つのヌクレオチドギャップによって離された１１（イタリック体で表示）および１０塩基対の２つの二本鎖領域を形成することができるようにした（Ｇ１４９８  １１，１０／２１  ｎｄｓＲＮＡ−ｗｔと称することができる）。１０ヌクレオチドのセンス鎖の断片の５’末端は、ヌクレオチド（例えば、ｐＣ）の前にある「ｐ」で示されるように、任意選択的にリン酸化され得る。
Ｇ１４９８  ｎｄｓＲＮＡ−ｗｔ（１１，１０／２１）
センス ５’−ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧｄＴｄＴ−３’ （配列番号９、１０）
アンチセンス ３’−ｄＴｄＴＣＣＵＡＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＣ−５’ （配列番号８）
Ｇ１４９８  ｎｄｓＲＮＡ−ｗｔ（１１，１０／２１）
センス ５’−ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵｐＣＵＵＣＧＧＡＧｄＴｄＴ−３’  （配列番号Ｓ：９，  １０）
アンチセンス ３’−ｄＴｄＴＣＣＵＡＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＧＣＣＵＣ−５’ （配列番号８）
さらに、これらのＧ１４９８  ｄｓＲＮＡの各々は、５−メチルウリジン（リボチミジン）でそれぞれＵ置換されて作製され、Ｇ１４９８  ｄｓＲＮＡ−ｒＴと称される。５−メチルウリジン置換を有するか、または有さない、Ｇ１４９８  ｄｓＲＮＡまたはｎｄｓＲＮＡ（部分二重鎖）の各々が、ルシフェラーゼ遺伝子と関連するインフルエンザ標的配列を有するＨｅＬａ  Ｓ３をトランスフェクトするために用いられた。また、Ｇ１４９８アンチセンス鎖のみ、または１１ヌクレオチドのセンス鎖部分にアニーリングされたアンチセンス鎖のみ、または１０ヌクレオチドのセンス鎖部分のみを、活性について調べた。
【０１８４】
トランスフェクションおよびデュアルルシフェラーゼアッセイ
ホタルｌｕｃ２（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）およびウミシイタケ（ラテン名Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、シーパンジーとしても知られる）ルシフェラーゼの両方を構成的に発現するレポータープラスミドｐｓｉＣＨＥＣＫ（登録商標）−２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、ウミシイタケ−インフルエンザＮＰ融合ｍＲＮＡをもたらすウミシイタケ翻訳停止コドンの下流にあるインフルエンザＮＰ遺伝子の一部をクローン化するために用いられた。ｐｓｉＣＨＥＣＫ（登録商標）−２ベクター中のホタルルシフェラーゼを、ウミシイタケルシフェラーゼの発現を正規化するのに使用し、これは、トランスフェクション効率の対照としての機能を果たす。
【０１８５】
マルチウェルプレートに、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞／ウェルでＨａｍのＦ１２倍地１００μｌおよび１０％ウシ胎仔血清中に播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩培養した。ＨｅＬａ  Ｓ３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００およびＯＰＴＩＭＥＭ低減血清培地中で調製されたｐｓｉＣＨＥＣＫ（登録商標）−インフルエンザプラスミド（７５ｎｇ）およびＧ１４９８  ｄｓＲＮＡまたはｎｄｓＲＮＡ（最終濃度１０ｎＭまたは１００ｎＭ）でトランスフェクトした。トランスフェクション混合物をＨｅＬａ  Ｓ３細胞とともに穏やかに振とうさせながら、３７℃で１８〜２０時間培養した。
【０１８６】
トランスフェクション後、はじめにＤｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を１０分間振とうさせながら加え、次にＶＩＣＴＯＲ３（登録商標）１４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて発光シグナルを定量化することにより、ホタルルシフェラーゼレポーターの活性を測定した。ホタルの発光を測定した後、Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を１０分間振とうさせながら加え、ホタルの反応の停止とウミシイタケルシフェラーゼ反応の開始を同時に行い、ウミシイタケルシフェラーゼの発光シグナルをＶＩＣＴＯＲ３（登録商標）１４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて定量化した。
【０１８７】
結果
トランスフェクトした細胞およびトランスフェクトしていない細胞におけるノックダウン活性をＱｎｅｇ対照ｄｓＲＮＡに対して正規化し、Ｑｎｅｇ対照の正規化値として表した（すなわち、Ｑｎｅｇが１００％または「正常な」遺伝子発現量を表した）。よって、値が小さいほど、ノックダウン効果が大きいことが示唆される。Ｇ１４９８  ｄｓＲＮＡ−ｗｔおよびｄｓＲＮＡ−ｒＴは、１００ｎＭの濃度で同様の良好なノックダウンを示した（図３）。驚くべきことに、Ｇ１４９８  ｎｄｓＲＮＡ−ｒＴが、リン酸化されていようといまいと、Ｇ１４９８  ｄｓＲＮＡ−ｗｔよりはやや低いものの、良好なノックダウンを示した（図３）。ｄｓＲＮＡまたはｎｄｓＲＮＡでも、１０ｎＭで同様の結果が得られた（データは非表示）。Ｇ１４９８  ｄｓＲＮＡまたはｎｄｓＲＮＡ溶液のいずれも、１０ｎＭまたは１００ｎＭで、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞において検出可能な毒性を全く示さなかった。Ｇ１４９８アンチセンス鎖とともに半分のみニックが入ったセンス鎖（１１ヌクレオチドまたは１０ヌクレオチド鎖単独で）が存在するだけでも、何らかの検出可能な活性を示した。これらの結果は、ニックの入った種類の部分二重鎖のｄｓＲＮＡ分子は予想外に遺伝子サイレンシングを促進する能力を持っていることを示す。
【０１８８】
実施例４
ニックの入ったＭＤＲＮＡのノックダウン活性
本実施例において、様々な位置にニックを持つセンス鎖を有する、実施例１に記載されるダイサー基質ＬａｃＺ  ｄｓＲＮＡの活性を調べた。さらに、ニックまたは単一のヌクレオチドを有するセンス配列の最も３末端側の鎖の５鋳末端でジデオキシヌクレオチド（すなわち、ｄｄＧ）を取り込み、ニックの入ったセンス鎖の生体内ライゲーションが、「レスキュー」活性であるかどうかを決定した。ｄｄＧはライゲーションの基質ではない。８〜１４位のうちの１つにニックを持つセンス鎖を有する、実施例７のインフルエンザのダイサー基質ｄｓＲＮＡについても調べた。記号「ｐ」は、ニックの入ったセンスインフルエンザ配列の最も３’末端側の鎖の５’末端がリン酸化されていることを示す。記号「Ｌ」は、ニックの入ったセンスインフルエンザ配列の最も５’末端側の２位にあるＧが、ロックされた核酸Ｇに置換されたことを示す。Ｑｎｅｇは陰性対照ｄｓＲＮＡである。
【０１８９】
実施例３の二重蛍光アッセイを用いて、５ｎＭでのＬａｃＺ配列、および０．５ｎＭでのインフルエンザ配列のノックダウン活性を測定した。ｌａｃＺダイサー基質（２５／２７，ＬａｃＺ−ＤＳ）およびｌａｃＺ  ＲＩＳＣ活性化因子（２１／２１，ＬａｃＺ）は同等の活性を示し、活性に影響を与えることなく、ＬａｃＺ−ＤＳの８〜１４位の間の任意の位置にニックを入れることが可能である（図３）。さらに、ニックを有するＬａｃＺセンス配列の最も３末端側の５鋳末端（ＬａｃＺ：ＤＳＮｋｄ１３−３ｄｄ）または１つのヌクレオチドギャップ（ＬａｃＺ：ＤＳＮｋｄ１３Ｄ１−３ｄｄ）にｄｄＧを取り込むと、実質的には未置換の配列（図４）と同程度の活性を示した。’８〜１４位のうちの任意の位置でニックが入ったインフルエンザのダイサー基質（Ｇ１４９８ＤＳ）も、非常に活性に富んでいた（図５）。ニックの入ったセンスインフルエンザ配列の最も３’末端側の５’末端のリン酸化は、実質的に、活性に何の影響も与えなかったが、ロックされた核酸の添加が活性を向上させると思われる。
【０１９０】
実施例５
ＭＤＲＮＡの平均阻害濃度
本実施例では、用量反応アッセイを行って、ロックされた核酸を含むまたは含まない、１２、１３、または１４位にニックを持つセンス鎖を有する、実施例８のインフルエンザのダイサー基質ｄｓＲＮＡの平均阻害濃度（ＩＣ５０）を測定した。実施例２の二重蛍光アッセイが用いられた。インフルエンザのダイサー基質ｄｓＲＮＡ（Ｇ１４９８ＤＳ）を０．０００４ｎＭ、０．００２ｎＭ、０．００５ｎＭ、０．０１９ｎＭ、０．０６７ｎＭ、０．２３３ｎＭ、０．８１６ｎＭ、２．８ｎＭ、および１０ｎＭで検査し、１３位にニックを持つｍｄＲＮＡ（Ｇ１４９８ＤＳ：Ｎｋｄ１３）を、０．００１ｎＭ、０．０４８ｎＭ、０．１６７ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、７ｎＭ、および２５ｎＭで検査した（図６を参照）。様々な位置にニックを持つまたは持たないＲＩＳＣ活性化因子分子（２１／２１）（Ｇ１４９８ＤＳ：Ｎｋｄ１１、Ｇ１４９８ＤＳ：Ｎｋｄ１２、およびＧ１４９８ＤＳ：Ｎｋｄ１４を含む）も検査し、上述の通り、ニックの入ったものはそれぞれロックされた核酸を含むものであった（データ非表示）。Ｑｎｅｇは陰性対照ｄｓＲＮＡであった。
【０１９１】
ＲＩＳＣ活性化因子Ｇ１４９８のＩＣ５０は約２２ｐＭとして算出され、一方、ダイサー基質Ｇ１４９８ＤＳのＩＣ５０は約６ｐＭとして算出された。ＲＩＳＣおよびダイサーｍｄＲＮＡのＩＣ５０は約２００ｐＭ〜約１５ｎＭの範囲であった。単一のロックされた核酸を包含することにより、ダイサーｍｄＲＮＡのＩＣ５０が４倍まで低減された（データ非表示）。これらの結果は、任意の位置にニックまたはギャップを有する部分二重鎖ｄｓＲＮＡは、遺伝子サイレンシングを誘導する能力を持つことを示すものである。
【０１９２】
実施例６
ギャップのあるＭＤＲＮＡのノックダウン活性
異なる大きさ、および位置にギャップを持つセンス鎖を有する、インフルエンザのダイサー基質ｄｓＲＮＡの活性を調べた。８位に０〜６ヌクレオチドのギャップ、９位に４ヌクレオチドのギャップ、１０位に３ヌクレオチドのギャップ、１１位に２ヌクレオチドのギャップ、および１２位に１ヌクレオチドのギャップを有するセンス鎖を持つ、実施例８のインフルエンザのダイサー基質ｄｓＲＮＡを産生した。（表２参照）。Ｑｎｅｇは陰性対照ｄｓＲＮＡであった。それぞれのｍｄＲＮＡを５ｎＭ（データ非表示）および１０ｎＭの濃度で検査した。ｍｄＲＮＡは、アンチセンス鎖５’−ＣＡＵＵＧＵＣＵＣＣＧＡＡＧＡＡＡＵＡＡＧＡＵＣＣＵＵ（配列番号１１）、および、表２に示すニックの入ったまたはギャップのあるセンス鎖を有する。
【０１９３】
【表２】
2010519908.tif 000019
【０１９４】
実施例２の二重蛍光アッセイを用いて、ノックダウン活性を測定した。５ｎＭおよび１０ｎＭの両方の濃度で同様の結果が得られた。これらのデータは、最大６ヌクレオチドのギャップを有するｍｄＲＮＡでも活性を有することを示したが、４以下のヌクレオチド欠失を有するものが最高の活性を示した（図７も参照）。よって、様々な大きさのギャップを様々な異なる位置に有するｍｄＲＮＡは、ノックダウン活性を有する。
【０１９５】
異なる大きさおよび位置にギャップを持つセンス鎖を有する配列の一般的な適用性を調べるために、様々なｄｓＲＮＡ配列を検査した。８位に０〜６ヌクレオチドのギャップ、９位に５ヌクレオチドのギャップ、１０位に４ヌクレオチドのギャップ、１１位に３ヌクレオチドのギャップ、１２位に２ヌクレオチドのギャップ、１２位に１ヌクレオチドのギャップ、および１４位にニック（０のギャップ）を有するセンス鎖を持つ、実施例１のｌａｃＺ  ＲＩＳＣ  ｄｓＲＮＡを産生した（表３を参照）。Ｑｎｅｇは陰性対照ｄｓＲＮＡであった。それぞれのｍｄＲＮＡを５ｎＭ（データ非表示）および２５ｎＭの濃度で検査した。ｌａｃＺ  ｍｄＲＮＡは、アンチセンス鎖５’−ＡＡＡＵＣＧＣＵＧＡＵＵＵＧＵＧＵＡＧｄＴｄＴＵＡＡＡ（配列番号２）表３に示すニックの入ったまたはギャップのあるセンス鎖を有していた。
【０１９６】
【表３】
2010519908.tif 000020
【０１９７】
実施例３の二重蛍光アッセイを用いて、ノックダウン活性を測定した。図８は、ｍｄＲＮＡは、最大６つのヌクレオチドを有するものまで、相当の活性を有し、ギャップの位置がノックダウンの強度に影響を与える可能性を示している。よって、様々な位置および様々なｍｄＲＮＡ配列にある様々な大きさのギャップを有するｍｄＲＮＡが、ノックダウン活性を有する。
【０１９８】
実施例７
置換されたＭＤＲＮＡのノックダウン活性
ニックの入ったセンス鎖と、ロックされた核酸置換を有するセンス鎖と、を有するインフルエンザｄｓＲＮＡ  ＲＩＳＣ配列の活性を調べた。５’末端から数えて８〜１４位にニックを有するセンス鎖を用いて、実施例３のインフルエンザＲＩＳＣ配列Ｇ１４９８を産生した。’表４に示すように、各センス鎖を、１つまたは２つのロックされた核酸で置換した。Ｑｎｅｇおよびプラスミドが陰性対照であった。各ｍｄＲＮＡを５ｎＭの濃度で検査した。使用したアンチセンス鎖は５’−ＣＵＣＣＧＡＡＧＡＡＡＵＡＡＧＡＵＣＣｄＴｄＴ（配列番号８）であった。
【０１９９】
【表４】
2010519908.tif 000021
【０２００】
実施例３の二重蛍光アッセイを用いて、ノックダウン活性を測定した。これらのデータは、ロックされた核酸置換の数を増やすことで、任意の数の位置にニックを有するｍｄＲＮＡの活性を増加させる傾向が見られることを示している。ニックが１１位にある場合、センス鎖当たり単一のロックされた核酸が最も活性が高いと思われる（図９を参照）。しかし、各センス鎖上に複数のロックされた核酸があると、任意の位置にニックを有するｍｄＲＮＡを、単一置換を持つ最適なニックの位置（すなわち、１１位）と同じだけ活性化する（図９）。よって、二重鎖安定化修飾を有するｍｄＲＮＡは、ニックの位置に関わらず、実質的にｍｄＲＮＡを活性化する。
【０２０１】
実施例２のＬａｃＺダイサー基質ｍｄＲＮＡ（配列番号３および４）においてロックされた核酸の置換が行われたときも、同様の結果が得られた。８〜１４位でｌａｃＺダイサーにニックを入れ、ロックされた核酸Ａ（ＬＮＡ−Ａ）を５’センス鎖の３位（５’末端から）にあるＡで置換したことを除いて、ニックの入ったＬａｃＺダイサー分子の複製セットを作製した。図１０から明白であるように、ＬＮＡ−Ａを含有するニックの入ったｌａｃＺダイサー分子のほとんどが、非置換ｌａｃＺ  ｄｉｃｅｒと同じ位のノックダウン活性の強度であった。
【０２０２】
実施例７
インフルエンザウイルス力価のＭＤＲＮＡノックダウン
野生型ｄｓＲＮＡ（すなわちニックのない）と比較して、インフルエンザウイルスの力価の減少における、ダイサー基質でニックを入れたｄｓＲＮＡの活性を調べた。インフルエンザのダイサー基質配列は（２５／２７）以下の通りである。
センス ５’−ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧＡＣＡＡｄＴｄＧ（配列番号６２）
アンチセンス ５’−ＣＡＵＵＧＵＣＵＣＣＧＡＡＧＡＡＡＵＡＡＧＡＵＣＣＵＵ（配列番号１１）
ｍｄＲＮＡ配列は、５’末端から数えて１２、１３、および１４位の後にそれぞれニックの入ったセンス鎖を有し、２位のＧはロックされた核酸Ｇで置換される。
【０２０３】
ウイルス感染価アッセイのために、トランスフェクションの前日に、ベロ細胞を、６．５×１０４細胞／ウェルで、ウェル当たり５００μｌの１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地に播種した。各ｄｓＲＮＡの１００、１０、１、０．１、および０．０１ｎＭストックの試料を、１．０μｌ（１ｍｇ／ｍｌストック）のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と複合させ、ＯＰＴＩＭＥＭ１５０μｌ（総容積）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で室温で２０分間培養した。ＯＰＴＩＭＥＭでベロ細胞を洗浄し、ＯＰＴＩＭＥＭ中のトランスフェクション複合体１５０μｌを、１５０μｌのＯＰＴＩＭＥＭ培地を含む各ウェルに加えた。３つの同様のウェルを各条件について検査した。トランスフェクション条件を用いない追加の対照ウェルを調製した。トランスフェクションから３時間後、培地を除去した。各ウェルを０．３％ＢＳＡおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＰＳを含有するＰＢＳ２００μｌで１回洗浄した。０．３％ＢＳＡ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＰＳおよび４μｇ／ｍｌのトリプシンを含有する感染培地２００μｌ中で、各ウェル内の細胞を、感染多重度０．０１でインフルエンザウイルスのＷＳＮ菌株に感染させた、プレートを３７℃で１時間培養した。吸着しなかったウイルスを、２００μｌの感染培地で洗い流して廃棄し、０．３％ＢＳＡ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＰＳおよび４μｇ／ｍｌのトリプシンを含有する４００μｌのＤＭＥＭを各ウェルに加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時培養してから、各ウェルからの上清５０μｌを、ＭＤＣＫ細胞内でＴＣＩＤ５０アッセイ（５０％組織培養感染量、ＷＨＯのプロトコル）を用いて二重検査を行い、スピアマン−カーバー法（Ｓｐｅａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｋａｒｂｅｒ）の式を用いて力価を推定した。結果は、これらのｍｄＲＮＡが、１０ｐＭという低濃度においてでさえも、約５０％〜６０％のウイルス力価ノックダウンを示したことを表している（図１１）。
【０２０４】
野生型ｄｓＲＮＡ（すなわち、ニックのない）と比較して、インフルエンザウイルス力価減少における、ダイサー基質でニックを入れたｄｓＲＮＡの活性を調べるために生体内インフルエンザ感染マウスモデルも用いた。メスＢＡＬＢ／ｃマウス（グループ当たり５〜１０匹のマウス、８〜１０週齢）に、１２０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日のｄｓＲＮＡ（Ｃ１２−ｎｏｒＡｒｇ（ＮＨ３＋Ｃｌ−）−Ｃ１２／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＤＳＰＣ／コレステロール中で３０：１：２０：４９の比率で処方）を３日間連続で鼻腔内投与した後、インフルエンザ菌株ＰＲ８（２０ＰＦＵ／マウス）を鼻腔内暴露した。感染の２日後、各マウスから全肺を採取して、抗菌剤を含むＰＢＳ／０．３％ＢＳＡ溶液に入れ、均質化してウイルスの力価を測定した（ＴＣＩＤ５０）。マウスは用量に十分な耐容性を示し、いずれの用量群においても体重の減少は２％未満であった。検査したｍｄＲＮＡは、非修飾およびニックの入っていないＧ１４９８ダイサー基質と比較して、やや高めではないにしても、生体内で同様のウイルス減少を示した（図１２を参照）。よって、ｍｄＲＮＡは、生体内で活性である。
【０２０５】
実施例８
ＭＤＲＮＡがサイトカイン誘導に与える影響
ｍｄＲＮＡ構造がサイトカインの生体内誘導に与える影響を調べた。メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（７〜９週齢）に、ｄｓＲＮＡ約５０μＭ（Ｃ１２−ｎｏｒＡｒｇ（ＮＨ３＋Ｃｌ−）−Ｃ１２／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＤＳＰＣ／コレステロール中で処方、比率３０：１：２０：４９）または６０５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日のネイキッドｄｓＲＮＡを３日間連続で鼻腔内投与した。最終用量が投与されてから約４時間後、マウスを屠殺して気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を収集し、採血した血液をサイトカイン応答の評価のために血清にした。氷冷した血清中０．３％ＢＳＡ（０．５ｍＬ）を用いて２回、全体で１ｍＬで気管支洗浄を行った。ＢＡＬＦを回転させて、上清を収集し、サイトカイン分析まで冷凍した。安楽死の直後に、大動脈から血液を採取し、血清分離管に入れて、室温で少なくとも２０分間凝固させた。試料を処理して血清にし、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ  ０．２２μｍ濾過管に分注して、１２，０００ｒｐｍで回転させてドライアイス上で冷凍し、分析まで−７０℃で保管した。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ（登録商標）アレイリーダー上でＰｒｏｃａｒｔａ（登録商標）マウス１０−Ｐｌｅｘ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いて、ＢＡＬＦおよび血漿のサイトカイン分析を行った。０日目の１回目の投薬前および３日目（安楽死の直前）に、体重を含む毒性パラメータも測定した。脾臓を採取して重さを計測した（最終体重に正規化した）。結果を表５に提供する。
【０２０６】
【表５】
2010519908.tif 000022
【０２０７】
ｍｄＲＮＡ（ＲＩＳＣまたはサイジングされたダイサー）は、完全な（すなわち、ニックの入っていない）親分子よりも少ないサイトカインを誘導した。サイトカイン誘導における低下はＩＬ−１２（ｐ４０）を見ると最も著しく、これは１０のサイトカイン多重アッセイで一貫して最高の誘導レベルを保ったサイトカインである。ｍｄＲＮＡについては、ＩＬ−１２（ｐ４０）における低下は２５倍〜５６倍の範囲である一方で、ＩＬ−６またはＴＮＦαにおける誘導のいずれも、より程度の低いものであった（これらの２つのサイトカインにおける低下は２倍〜１０倍の範囲）。したがって、非修飾ｄｓＲＮＡと比較してサイトカインの誘導が最小限に抑えられるという点において、ｍｄＲＮＡ構造が生体内で有利に働くと思われる。
【０２０８】
誘導における低減は顕著ではないものの、調製したｍｄＲＮＡでも同様の結果が得られた。また、ロックされた核酸の存在または不在は、サイトカインの誘導に影響を与えなかった。これらの結果を表６に示す。
【０２０９】
【表６】
2010519908.tif 000023
【０２１０】
本明細書に挙げられる、特許、特許出願、雑誌の記事、ウェブページ、表、および優先権書類を含むすべての参考文献の教示は、参照することにより、それらの全体が本明細書に組み込まれる。上述の開示が、明白な理解の目的のために例として詳細に記載されているが、当業者には、制限するためではなく実例として示される添付の特許請求の範囲内で、特定の変更および修正が実行され得ることは明白である。このような文脈で、様々な出版物および他の参考文献が、前述の開示の中で説明を省くために列挙された。しかしながら、本明細書において考察される様々な出版物は、本出願の出願日よりも前のそれらの開示についてのみ組み込まれるのであって、発明者は従来の発明に基づくかかる開示に先行する権利を保持することに留意されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年10月8日(2008.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１Ａ）のｍＲＮＡの発現を下方制御する部分二重鎖リボ核酸（ｍｄＲＮＡ）分子であって、前記ｍｄＲＮＡ分子は、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である１５〜４０ヌクレオチド長の第１の鎖と、前記第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的である第２の鎖および第３の鎖と、を含み、前記第２の鎖および第３の鎖は、前記第１の鎖とアニーリングしてニックまたはギャップにより離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができる、ｍｄＲＮＡ分子。
【請求項２】
前記第１の鎖は１５〜２５ヌクレオチド長または２６〜４０ヌクレオチド長である、請求項１に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記ギャップは、１〜１０個の不対ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記ｍｄＲＮＡ分子は、少なくとも１つの５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、または２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンを含む、請求項１に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記ｍｄＲＮＡ分子は、少なくとも１つのロックされた核酸（ＬＮＡ）分子、デオキシヌクレオチド、Ｇクランプ、２’糖修飾、修飾されたヌクレオシド間結合、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記ｍｄＲＮＡは、前記ギャップの一部ではないか、または前記ｍｄＲＮＡの一端または両端に平滑末端を有する、少なくとも１つの３’末端上の１〜４ヌクレオチドのオーバーハングを含む、請求項１に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項７】
ヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡの発現を下方制御するｍｄＲＮＡ分子であって、前記ｍｄＲＮＡ分子は、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である１５〜４０ヌクレオチド長の第１の鎖と、前記第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的である第２の鎖および第３の鎖と、を含み、前記第２の鎖および第３の鎖は、前記第１の鎖とアニーリングしてニックまたはギャップにより離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、前記ｍｄＲＮＡ分子の少なくとも１つのピリミジンは、式ＩまたはＩＩに従うピリミジンヌクレオシドであり、
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式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ハロゲン、置換もしくは未置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル、置換もしくは未置換の−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル、カルバモイル、カルバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換もしくは未置換のアリール、置換もしくは未置換のアラルキル、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−Ｃ≡、またはヘテロシクロ基であり、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立してヒドロキシル、保護ヒドロキシル、リン酸塩、またはヌクレオシド間結合基であり、
Ｒ５およびＲ８は、それぞれ独立してＯまたはＳである、ｍｄＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記第１の鎖は１５〜２５ヌクレオチド長または２６〜４０ヌクレオチド長である、請求項７に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記ギャップは、１〜１０個の不対ヌクレオチドを含む、請求項７に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１０】
少なくとも１つのヌクレオシドは式Ｉに従い、式中、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２は−ＯＨまたは−Ｏ−メチルである、請求項７に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１１】
少なくとも１つのＲ２は、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、２’−Ｏ−メチル、２’−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、およびフルオロから構成される群から選択される、請求項７に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１２】
前記ｍｄＲＮＡ分子は、少なくとも１つの５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、または２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンを含む、請求項７に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記ｍｄＲＮＡ分子は、少なくとも１つのロックされた核酸（ＬＮＡ）分子、デオキシヌクレオチド、Ｇクランプ、２’糖修飾、修飾されたヌクレオシド間結合、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項７に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１４】
前記ｍｄＲＮＡ分子は、前記ギャップの一部ではない少なくとも１つの３’末端上の１〜４ヌクレオチドのオーバーハングを含むか、または前記ｄｓＲＮＡ分子は、前記ｍｄＲＮＡ分子の一端もしくは両端に平滑末端を有する、請求項７に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１５】
ヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡの発現を下方制御するｍｄＲＮＡ分子であって、前記ｍｄＲＮＡ分子は、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である１５〜４０ヌクレオチド長の第１の鎖と、前記第１の鎖の非重複領域にそれぞれが相補的である第２の鎖および第３の鎖と、を含み、前記第２の鎖および第３の鎖は、前記第１の鎖とアニーリングしてニックまたはギャップにより離間した少なくとも２つの二本鎖領域を形成することができ、前記二本鎖領域は、約１５塩基対〜約４０塩基対の合わせた長さを有する、ｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記第１の鎖は１５〜２５ヌクレオチド長または２６〜４０ヌクレオチド長である、請求項１５に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１７】
前記ギャップは、１〜１０個の不対ヌクレオチドを含む、請求項１５に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記ｍｄＲＮＡ分子は、少なくとも１つの５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、または２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンを含む、請求項１５に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記第１の鎖は、１９〜２３ヌクレオチド長であり、配列番号１１６０〜１６７１のうちのいずれか１つに記載されるヒトＨＩＦ１Ａ核酸配列に相補的である、請求項１５に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記第１の鎖は、２５〜２９ヌクレオチド長であり、配列番号１１６０〜１６７１のうちのいずれか１つに記載されるヒトＨＩＦ１Ａ核酸配列に相補的である、請求項１５に記載のｍｄＲＮＡ分子。
【請求項２１】
ヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させるための方法であって、請求項１〜２０のうちのいずれか１項に記載のｍｄＲＮＡ分子を、ヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子を発現する細胞に投与するステップを含み、前記ｍｄＲＮＡ分子は、前記細胞中のヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させる、方法。
【請求項２２】
前記細胞はヒト細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
過剰増殖性または炎症性疾患の治療において使用するための薬物を製造するための、先行する請求項のうちのいずれか１項に定義されるｍｄＲＮＡの使用。
【請求項２４】
ヒト低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１Ａ）のｍＲＮＡの発現を下方制御する部分二重鎖リボ核酸（ｍｄＲＮＡ）分子であって、前記ｄｓＲＮＡ分子は、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である２６〜４０ヌクレオチド長の第１の鎖と、前記第１の鎖に相補的である第２の鎖と、を含み、前記第１の鎖および前記第２の鎖がアニーリングすると、前記ｄｓＲＮＡは３’オーバーハングおよび平滑末端を有する、ｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２５】
前記第１の鎖は２７〜３５ヌクレオチド長である、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２６】
前記ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つの５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、または２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンを含む、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２７】
前記ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのロックされた核酸（ＬＮＡ）分子、デオキシヌクレオチド、Ｇクランプ、２’糖修飾、修飾されたヌクレオシド間結合、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２８】
前記３’オーバーハングは、１〜４個のヌクレオチドを有し、前記第１の鎖上にある、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２９】
前記ｄｓＲＮＡ分子は、ヒドロキシルまたはリン酸塩を含む５’末端を有する、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３０】
ヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡの発現を下方制御するｄｓＲＮＡ分子であって、前記ｄｓＲＮＡ分子は、配列番号１１５８もしくは１１５９に記載されるヒトＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡに相補的である２６〜４０ヌクレオチド長の第１の鎖と、前記第１の鎖に相補的である第２の鎖と、を含み、前記第１の鎖および前記第２の鎖がアニーリングすると、前記ｄｓＲＮＡは３’オーバーハングおよび平滑末端を有し、前記ｄｓＲＮＡ分子の少なくとも１つのピリミジンは、式ＩまたはＩＩに従うピリミジンヌクレオシドを含み、
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式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ハロゲン、置換もしくは未置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルキルスルホニルアミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、トリフルオロメチル、シクロアルキル、（シクロアルキル）アルキル、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル、置換もしくは未置換の−Ｏ−アリル、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、置換もしくは未置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル、カルバモイル、カルバミル、カルボキシ、カルボニルアミノ、置換もしくは未置換のアリール、置換もしくは未置換のアラルキル、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−Ｃ≡Ｎ、またはヘテロシクロ基であり、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立してヒドロキシル、保護ヒドロキシル、リン酸塩、またはヌクレオシド間結合基であり、
Ｒ５およびＲ８は、それぞれ独立してＯまたはＳである、ｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３１】
前記第１の鎖は２７〜３５ヌクレオチド長である、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３２】
少なくとも１つのヌクレオシドは式Ｉに従い、式中、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２は−ＯＨまたは−Ｏ−メチルである、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３３】
少なくとも１つのＲ２は、２’‐Ｏ‐（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、２’‐Ｏ‐メチル、２’‐ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、２’‐ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’‐Ｏ‐アリル、および２’‐フルオロから構成される群から選択される、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３４】
前記ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つの５−メチルウリジン、２−チオリボチミジン、または２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンを含む、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３５】
前記ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのＬＮＡ、デオキシヌクレオチド、Ｇクランプ、２’糖修飾、修飾されたヌクレオシド間結合、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３６】
前記３’オーバーハングは、１〜４個のヌクレオチドを有し、前記第１の鎖上にある、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３７】
ヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させるための方法であって、請求項２４〜３６のうちのいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ分子を、ヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子を発現する細胞に投与するステップを含み、前記ｄｓＲＮＡ分子は、前記細胞中のヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子の発現を低下させる、方法。
【請求項３８】
前記細胞はヒト細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
過剰増殖性または炎症性疾患の治療において使用するための薬物を製造するための、請求項２４〜３８のうちのいずれか１項に定義されるｄｓＲＮＡ分子の使用。
【国際調査報告】
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