(57)【要約】  本発明は、核と、側鎖エステルの形態のＤ−フェニルグリシンおよびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンからなる群から選択される側鎖と、側鎖エステルと核の共役を触媒する酵素とから半合成β−ラクタム化合物を合成する方法において、その側鎖エステルを固体中間体として単離しないことを特徴とする方法を述べる。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
核と、側鎖エステルの形態のＤ−フェニルグリシンおよびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンからなる群から選択される側鎖と、前記側鎖エステルと前記核の共役を触媒する酵素とから半合成β−ラクタム化合物を合成するための方法であって、前記側鎖エステルを固体中間体として単離しないことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記側鎖の前記エステルを形成するステップを含み、前記側鎖エステルを固体中間体として単離しないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ．Ｄ−フェニルグリシンおよびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンからなる群から選択される遊離側鎖をアルコールで転化して、対応する側鎖エステルを含む混合物を形成するステップと、
ｂ．ステップａ）中で形成される前記側鎖エステルを固体中間体として単離しないという条件で、ステップａ）で得られる前記混合物を、核および前記半合成β−ラクタム化合物を形成するための酵素と混合することによって前記半合成β−ラクタム化合物を形成するステップと
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）で得られる前記混合物が、ステップｂ）において前記半合成β−ラクタム化合物を形成する前に精製される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核が、６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）、７−アミノ−デアセトキシ−セファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）、７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）、および７−アミノ−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボン酸（７−ＡＣＣＡ）からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記半合成β−ラクタム化合物が、アンピシリン、セファレキシン、セファラジン、およびセファクロールからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アルコールがメタノールまたはエタノール、好ましくはメタノールである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素がペニシリンＧアシラーゼ、好ましくは固定化形態のものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペニシリンＧアシラーゼが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のものである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
Ｄ−フェニルグリシンおよびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンからなる群から選択される側鎖のエステルを含む製剤であって、前記側鎖エステルが遊離塩基の形態であり、かつ９０％以上のｅ．ｅ．を有し、そして前記製剤が前記側鎖エステルに対して好ましくは２０モル％以下の塩含有量と、好ましくは≧８５％の「比」とを有する、製剤。
【請求項１１】
Ｄ−フェニルグリシン−メチルエステル、Ｄ−フェニルグリシン−エチルエステル、Ｄ−ジヒドロ−フェニルグリシン−メチルエステル、およびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシン−エチルエステルからなる群から選択されるエステルを含む、請求項８に記載の製剤。
【請求項１２】
・水性環境中で前記側鎖エステルの塩を塩基と混合し、それによって二相系を生成するステップと、
・遊離塩基の形態の前記側鎖エステルを水性相から、好ましくは遠心分離によって、最も好ましくは連続遠心分離によって分離するステップと
を含む、請求項１０または１１に記載の前記エステルの生成方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アシル化剤を用いた親アミノβ−ラクタムの酵素によるアシル化によって半合成β−ラクタム化合物を調製するための方法に関する。
【０００２】
アミドまたはエステルなどの側鎖酸誘導体を用いた親アミノβ−ラクタム部分のアシル化による半合成β−ラクタム抗体の酵素による生成については、特許文献、例えば欧州特許出願公開第Ａ−３３９７５１号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−４７３００８号明細書、国際公開第９２／０１０６１号パンフレット、国際公開第９３／１２２５０号パンフレット、国際公開第９６／０２６６３号パンフレット、国際公開第９６／０５３１８号パンフレット、国際公開第９６／２３７９６号パンフレット、国際公開第９７／０４０８６号パンフレット、国際公開第９８／５６９４６号パンフレット、国際公開第９９／２０７８６号パンフレット、国際公開第２００５／００３６７号パンフレット、国際公開第２００６／０６９９８４号パンフレット、米国特許第３，８１６，２５３号明細書、独国特許文書（Ｇｅｒｍａｎ  ｐａｔｅｎｔ  ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ）第２１６３７９２号および第２６２１６１８号中に広く記載されている。当該技術分野において使用される酵素は、ほとんどの場合、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から得られるペニシリンアシラーゼであり、水に不溶の様々な種類の材料上に固定化される（例えば、国際公開第９７／０４０８６号パンフレット）。
【０００３】
これら従来技術の方法の主な不利点は、その側鎖エステルを精製して、例えばエステル中の遊離側鎖の量を減らすために、側鎖エステルを固体の形態で単離しなければならないことである。特にＤ−フェニルグリシンおよびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンなどの疎水性側鎖がより多い場合、後続の酵素共役反応における遊離側鎖の存在は、その酵素共役反応の収率に強いマイナスの効果を及ぼすことが分っている。これは、酵素共役反応の条件下での遊離側鎖の低可溶性が原因であり、酵素共役反応中の遊離側鎖の濃度に上限が生ずるという事実によるものと考えられる。沈殿物は酵素共役反応のプロセス可能性に悪影響を与えるので、この限界値は、遊離側鎖が結晶化または沈殿してはならないという必要条件によって決まる。さらに半合成β−ラクタム化合物の下流での加工の最終ステップにおいて、この汚染性遊離側鎖は、例えば半合成β−ラクタム化合物の最終の結晶化のステップの母液により除去されなければならない。より高レベルの遊離側鎖では遊離側鎖を除去するためにより多量の母液が必要とされ、それは順に半合成β−ラクタム化合物のより高い損失の原因になる。固体の形態の側鎖エステルの単離をもたらす単位操作は、半合成抗生物質の生産工程を複雑にし、またその原価に著しく影響を与える。
【０００４】
したがって、エステル化反応の間に形成される側鎖エステルを、固体の形態で単離することなくその後の酵素共役反応において使用することができる生産工程に対する緊急性が存在する。
【０００５】
国際公開第９８／０４７３２号パンフレットは、実施例１、３、および４において、７−ＰＡＣＡ、７−ＡＤＣＡ、および６−ＡＰＡからの、Ｄ−４−ヒドロキシ−フェニルグリシンの２−ヒドロキシエチルエステルを含む、それぞれセフプロジル、セファドロキシル、およびアモキシシリンを合成し、その合成後のエステルを、その中で固体の形態に単離する後続の酵素共役反応に直接に加えることを開示している。Ｄ−４−ヒドロキシ−フェニルグリシンは、酵素共役反応の条件下できわめてすぐれた可溶性を有し、したがってＤ−フェニルグリシンおよびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンの場合に遭遇するような酵素共役反応の間の問題を生じない。これらの沈殿を避けるためには、それらの溶解度が低いことから、それらをきわめて低濃度でのみ存在させるとよい。
【０００６】
本発明の目的は、アンピシリン、セファレキシン、セファクロール、およびセファラジンなどの、Ｄ−フェニルグリシンおよびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンのβ−ラクタム誘導体の生産方法を提供することであり、この方法において側鎖エステルの合成は高収率を特徴とし、かつ得られる側鎖エステルは低濃度の遊離側鎖のみを含有し、またこの方法においてはその側鎖エステルを精製するための固体の形態の側鎖エステルの単離は省略される。
【０００７】
本明細書中では「核」は、半合成β−ラクタムのβ−ラクタム部分として定義され、任意のペネムまたはセフェム、例えば６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）、７−アミノデアセトキシ−セファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）、７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）、または７−アミノ−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボン酸（７−ＡＣＣＡ）であることができる。
【０００８】
本明細書中では「側鎖」は、半合成β−ラクタム化合物中で、本明細書中で定義される核中の６−アミノ位または７−アミノ位に付着している部分、例えばアンピシリン、セファレキシン、セファクロール中のＤ−フェニルグリシン、またはセファラジン中のＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンとして定義される。
【０００９】
「遊離側鎖」は、側鎖、例えばＤ−フェニルグリシンまたはＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンの誘導体化されていない形態である。
【００１０】
「側鎖エステル」は、その遊離側鎖のカルボキシル基がアルコールとエステル結合している遊離側鎖のエステル形態、例えばＤ−フェニルグリシンメチルエステルまたはＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンメチルエステルである。側鎖エステルは、遊離塩基の形態、または塩としての、例えばＨＣｌ塩としての形態であることができ、また側鎖エステルは、固体の形態であっても、また適切な溶媒中に溶解していてもよい。
【００１１】
本明細書中では「比」は、
【数１】
2010520752.tif 000002
（ただし量はモルの単位で表わされる）として定義される。
【００１２】
一態様において本発明は、核と、側鎖エステルの形態のＤ−フェニルグリシンおよびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンからなる群から選択される側鎖と、核と側鎖エステルの共役を触媒する酵素とから半合成β−ラクタム化合物を合成するための方法を提供し、この方法は側鎖エステルを固体中間体として単離しないことを特徴とする。この方法は、例えば、
ａ）Ｄ−フェニルグリシンおよびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンからなる群から選択される遊離側鎖をアルコールで転化して対応する側鎖エステルを含む混合物を形成するステップであって、このステップにおける側鎖エステルの形成が、好ましくはさきに定義した「比」によって表わされる転化率を有する混合物をもたらし、その比が好ましくは≧８５％、より好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％、より好ましくは≧９６％、より好ましくは≧９７％、より好ましくは≧９８％、最も好ましくは≧９９％であるステップと、
ｂ）ステップａ）において形成される側鎖エステルを固体中間体として単離しないという条件で、ステップａ）で得られた混合物を、核、および半合成β−ラクタム化合物を形成するための酵素と混合することによってその半合成β−ラクタム化合物を形成するステップと
を含むことができる。
【００１３】
本発明の方法において使用され、本明細書中でさきに定義した核は、６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）、７−アミノ−デアセトキシ−セファロ−スポラン酸（７−ＡＤＣＡ）、７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）、および７−アミノ−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボン酸（７−ＡＣＣＡ）からなる群から選択されて、それぞれ半合成ペニシリン類（６−ＡＰＡの誘導体）および半合成セファロスポリン類（７−ＡＤＣＡ、７−ＡＣＡ、および７−ＡＣＣＡの誘導体）を与えることができる。本発明の好ましい実施形態は、アンピシリン、セファレキシン、セファラジン、セファクロールからなる群から選択される半合成β−ラクタム化合物の調製方法である。
【００１４】
本発明の方法の転化のステップ（ステップ（ａ））では、Ｄ−フェニルグリシンおよびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンからなる群から選択される遊離側鎖は、アルコールで転化されて、対応する側鎖エステルを含む混合物を形成する。本発明の方法に使用されるアルコールはメタノールおよびエタノールからなる群から選択することができ、それによってその側鎖のそれぞれメチルエステルおよびエチルエステルを形成する。最も好ましいアルコールはメタノールである。ステップ（ａ）は、幾つかの方法で行うことができる。
【００１５】
転化のステップ（ａ）の一実施形態は、Ｄ−フェニルグリシンおよびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンからなる群から選択される遊離側鎖と、形成される所望のエステルに基づいて選択されるアルコール、例えばメチルエステルを得るためのメタノールまたはエチルエステルを得るためのエタノールと、硫酸などの強酸とを含む混合物を、２０から１２０℃の間、より好ましくは４０から１００℃の間の温度で還流下で加熱することを含む。アルコールとしてメタノールを使用する場合、温度は好ましくは６０から８０℃の間である。アルコールとしてエタノールを使用する場合、温度は好ましくは６５から１００℃の間である。適切な条件は、欧州特許出願公開第Ａ−０５４４２０５号明細書中に開示されている比較例１および２中に見出すことができる。
【００１６】
転化のステップ（ａ）の別の実施形態は以前の実施形態の改良点を含み、反応混合物に液体または気体としてアルコールを加える一方で、アルコールおよび反応由来の水を蒸留して取り除くことを含む（例えば、欧州特許出願公開第Ａ−０５４４２０５号明細書に記載されている）。
【００１７】
転化のステップ（ａ）の、側鎖のメチルエステルを含む混合物をもたらす高度に好ましい実施形態は、
１．Ｄ−フェニルグリシンおよびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンからなる群から選択される遊離側鎖と、メタノールと、硫酸などの強酸とを含む反応混合物を、例えば０．５から５時間の、好ましくは１時間から３時間の、より好ましくは１．５から２．５時間の或る一定時間のあいだ、２０から１２０℃の間、より好ましくは２０から１００℃の間、より好ましくは４０から１００℃の間、最も好ましくは６０から８０℃の間の温度で還流するステップ、続いて
２．この混合物を、４０から１００℃の間、好ましくは６０から９０℃の間、より好ましくは７０から８０℃の間の温度で濃縮するステップ。このステップの間の圧力は、最初は大気圧であることができ、濃縮のステップの間に、好ましくは５０ミリバール以下、より好ましくは４０ミリバール以下、好ましくは３０ミリバール以下、最も好ましくは２０ミリバール以下まで減圧することができる。濃縮のステップは、その濃縮のステップの前に存在した水の３０％超が除去される、好ましくは水の４０％超が除去される、好ましくは水の５０％超が除去される、好ましくは水の７０％超が除去される、好ましくは水の８０％超が除去される、最も好ましくは水の９０％超が除去されるまで続けられる。
３．メタノール、好ましくは濃縮のステップの前の反応混合物の初期体積を得るための量、または反応混合物の初期体積未満の量、例えば、反応混合物の初期体積の≦９０％、または≦８０％、または≦７０％、または≦６０％、または≦５０％、または≦４０％、または≦３０％、または≦２０％の量を加えるステップ。この加えられるメタノールの量はまた、反応混合物の初期体積を超えてもよい。
４．任意選択でステップ１〜３を１回または複数回、好ましくは少なくとも１回、好ましくは２回、より好ましくは３回、より好ましくは４回、より好ましくは５回、より好ましくは６回、より好ましくは７回、より好ましくは８回、より好ましくは９回、より好ましくは１０回繰り返すステップ。これらのステップを繰り返すことによって、本明細書中でさきに定義したメチルエステルの形成の「比」が著しく増加することが分かった。例えば、ステップ（ａ）〜（ｃ）を１回だけしか行わなかった後では７５〜８５％の間の「比」を得ることができ、ステップ（ａ）〜（ｃ）を１回繰り返した後には８５〜９５％の間の「比」を得ることができ、ステップ（ａ）〜（ｃ）を２回繰り返した後には９５〜９７％の間の「比」を得ることができ、ステップ（ａ）〜（ｃ）を３回繰り返した後には９７〜９８％の間の「比」を得ることができ、ステップ（ａ）〜（ｃ）を４回繰り返した後には９８〜９９％の間の「比」を得ることができ、ステップ（ａ）〜（ｃ）を５回繰り返した後には９９〜９９．５％の間の「比」を得ることができ、ステップ（ａ）〜（ｃ）を６回以上繰り返した後には９９．５％を超える「比」を得ることができる。
【００１８】
転化のステップ（ａ）の、側鎖のエチルエステルを含む混合物をもたらす別の高度に好ましい実施形態は、
１．Ｄ−フェニルグリシンおよびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシンからなる群から選択される遊離側鎖と、エタノールと、硫酸などの強酸とを含む反応混合物を、例えば０．５から５時間の、好ましくは１時間から３時間の、より好ましくは１．５から２．５時間の或る一定時間のあいだ、２０から１２０℃の間、より好ましくは２０から１００℃の間、より好ましくは４０から１００℃の間、最も好ましくは６５から１００℃の間の温度で還流するステップ、続いて
２．この混合物を、４０から１００℃の間、好ましくは６０から９０℃の間、より好ましくは７０から８０℃の間の温度で濃縮するステップ。このステップの間の圧力は、最初は大気圧であることができ、濃縮のステップの間に、好ましくは５０ミリバール以下、より好ましくは４０ミリバール以下、好ましくは３０ミリバール以下、最も好ましくは２０ミリバール以下まで減圧することができる。濃縮のステップは、その濃縮のステップの前に存在した水の３０％超が除去される、好ましくは水の４０％超が除去される、好ましくは水の５０％超が除去される、好ましくは水の７０％超が除去される、好ましくは水の８０％超が除去される、最も好ましくは水の９０％超が除去されるまで続けられる。
３．エタノール、好ましくは濃縮のステップの前の反応混合物の初期体積を得るための量、または反応混合物の初期体積未満の量、例えば反応混合物の初期体積の≦９０％、または≦８０％、または≦７０％、または≦６０％、または≦５０％、または≦４０％、または≦３０％、または≦２０％の量を加えるステップ。この加えられるエタノールの量はまた、反応混合物の初期体積を超えてもよい。
４．任意選択で、ステップ１〜３を１回または複数回、好ましくは少なくとも１回、好ましくは２回、より好ましくは３回、より好ましくは４回、より好ましくは５回、より好ましくは６回、より好ましくは７回、より好ましくは８回、より好ましくは９回、より好ましくは１０回繰り返すステップ。これらのステップを繰り返すことによって、本明細書中でさきに定義したエチルエステルの形成の「比」が著しく増加することが分かった。例えば、ステップ（ａ）〜（ｃ）を１回だけしか行わなかった後では７５〜８５％の間の「比」を得ることができ、ステップ（ａ）〜（ｃ）を１回繰り返した後には８５〜９５％の間の「比」を得ることができ、ステップ（ａ）〜（ｃ）を２回繰り返した後には９５〜９７％の間の「比」を得ることができ、ステップ（ａ）〜（ｃ）を３回繰り返した後には９７〜９８％の間の「比」を得ることができ、ステップ（ａ）〜（ｃ）を４回繰り返した後には９８〜９９％の間の「比」を得ることができ、ステップ（ａ）〜（ｃ）を５回繰り返した後には９９〜９９．５％の間の「比」を得ることができ、ステップ（ａ）〜（ｃ）を６回以上繰り返した後には９９．５％を超える「比」を得ることができる。
【００１９】
ステップ（ａ）のすべての実施形態において、好ましくは３から２５の間、より好ましくは５から２５の間、最も好ましくは６から１０の間のアルコール対遊離側鎖のモル比が用いられる。また、ステップ（ａ）のすべての実施形態において、好ましくは０．９から１０の間、より好ましくは１から５の間、最も好ましくは２から３の間の強酸（単位は当量、例えば塩酸の１モルは１当量であり、硫酸の１モルは２当量である）対遊離側鎖のモル比が用いられる。当業者は、選択される側鎖およびアルコールに応じて必要以上の実験なしに反応条件を最適化することが可能なはずである。
【００２０】
ステップ（ｂ）において半合成β−ラクタム化合物の形成に先立って、ステップ（ａ）で得られた混合物を精製して、本明細書中でさきに定義した高い「比」を有する混合物を得ることができる。本発明の方法のステップ（ｂ）で使用されることになる混合物の比は、好ましくは≧８５％、より好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％、より好ましくは≧９６％、より好ましくは≧９７％、より好ましくは≧９８％、最も好ましくは≧９９％である。
【００２１】
精製のステップの一実施形態は、側鎖エステルからの遊離側鎖の沈殿および除去を伴う。これは、ステップ（ａ）で得られた混合物のｐＨをＮａＯＨ、アンモニア、ＫＯＨなどの適切な塩基を加えることによって２から６．５の間、好ましくは２．５から５の間、最も好ましくは３から４の間の値に調整することによって達成することができる。別の実施形態ではステップ（ａ）で得られた反応混合物を、適切な量の水に、またはアルコールに、または水とアルコールの混合物に加え、続いてｐＨをＮａＯＨ、アンモニア、ＫＯＨなどの適切な塩基を加えることによって２から６．５の間、好ましくは２．５から５の間、最も好ましくは３から４の間の値に調整することができる。ｐＨを所望の値に調整した後に、適切な塩基を加えることによってｐＨをその所望の値に保つことができる。これらの条件下で遊離側鎖を含む沈殿物を形成することができる。適切な時間の後、既知の手法を用いて沈殿物を濾過して取り除くことができる。その濾液は側鎖エステルを含む。本発明の方法のステップ（ｂ）に直接に使用するために濾液のｐＨを、１から６の間、好ましくは１から４の間、最も好ましくは１．５から３の間のｐＨにした後に、既知の手法を用いて蒸発によりアルコールを除去する。
【００２２】
精製のステップの別の実施形態は、側鎖エステル誘導体および少量の遊離側鎖を含有する有機相と、遊離側鎖を含有する水相と、場合によっては塩とを含む二相または多相系の形成を伴う。これは、ステップ（ａ）で得られた混合物のｐＨをＮａＯＨ、アンモニア、ＫＯＨなどの適切な塩基を加えることにより７．５から１０の間、好ましくは８．５から９．５の間、最も好ましくは８．８から９．２の間の値に調整することによって達成することができる。別の実施形態ではステップ（ａ）で得られた反応混合物を、適切な量の水、またはアルコール、または水とアルコールの混合物に加え、続いてｐＨをＮａＯＨ、アンモニア、ＫＯＨなどの適切な塩基を加えることにより７．５から１０の間、好ましくは８．５から９．５の間、最も好ましくは８．８から９．２の間の値に調整することができる。ｐＨを所望の値に調整した後に、適切な塩基を加えることによってｐＨをその所望の値に保つことができる。任意選択で水は、塩（例えばＮａＣｌ）の水溶液の形態であることもできる。遊離側鎖もまた、沈殿物を形成することができる。多相系中の様々な相は、既知の手法を用いて分離することができる。任意選択で有機相は、水または塩水溶液で洗浄することができる。収率の減損を避けるために、洗液の水相を適切なプロセスの流れに再利用することができる。このプロセスの流れは、ステップ（ａ）後または上記ｐＨ調整後に得られる反応混合物であることができる。
【００２３】
精製のステップの高度に好ましい実施形態は、さきの２つの実施形態を組み合わせる、すなわち先ずステップ（ａ）で得られた混合物のｐＨを２から６．５の間、好ましくは２．５から５の間、最も好ましくは３から４の間の値に調整し、形成される沈殿物を濾過して除き、次いで得られた濾液のｐＨを７．５から１０の間、好ましくは８．５から９．５の間、最も好ましくは８．８から９．２の間の値に調整し、得られた多相系中の様々な相を既知の手法を用いて分離する。
【００２４】
意外にも、多相系がｐＨ７．５から１０の間、好ましくは８．５から９．５の間、最も好ましくは８．８から９．２の間で形成されるさきの２つの実施形態は、遊離塩基の形態の好ましくはＤ−フェニルグリシン−メチルエステル、Ｄ−フェニルグリシン−エチルエステル、Ｄ−ジヒドロ−フェニルグリシン−メチルエステル、およびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシン−エチルエステルからなる群から選択されるエステルであって、下記の特性、すなわち
・好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、好ましくは９６％以上、好ましくは９７％以上、好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上のｅ．ｅ．（鏡像異性体過剰率）と、
・エステルのモル数に対する塩のモル数として表わされる、好ましくは２０モル％以下、より好ましくは１０モル％以下、より好ましくは５モル％以下、より好ましくは２モル％以下、最も好ましくは１モル％以下の塩含有量と、
・好ましくは≧８５％、より好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％、より好ましくは≧９６％、より好ましくは≧９７％、より好ましくは≧９８％、最も好ましくは≧９９％の、本明細書中でさきに定義した「比」と
を有するエステルを得られることが分かった。
【００２５】
本発明の方法のステップ（ｂ）では、ステップａ）で形成され、任意選択で精製される側鎖エステルを固体中間体として単離しないという条件で、半合成β−ラクタム化合物は、ステップ（ａ）で得られ、任意選択で本明細書中で上述したように精製した混合物を、核および適切な酵素、好ましくは固定化酵素と混合して、対応する半合成β−ラクタム化合物を形成することによって形成される。ステップ（ｂ）は、当業界で知られている、本明細書中でさきに引用した方法のいずれかに従って行うことができる。例えばアンピシリンの合成は、欧州特許出願公開第Ａ−３３９７５１号明細書または国際公開第９８／５６９４６号パンフレットに記載のように行うことができる。同様にセファレキシンの合成は、国際公開第９６／２３７９６号パンフレットに記載のように行うことができる。セファラジンの合成は、国際公開第２００５／００３３６７号パンフレットに記載のように行うことができ、またセファクロールの合成は、国際公開第２００６／０６９９８４号パンフレットに記載のように行うことができる。
【００２６】
酵素による共役の後、半合成ベータ−ラクタム抗生物質は、既知の方法を用いて回収することができる。例えば酵素リアクターは、上向き撹拌（ｕｐｗａｒｄｓ  ｓｔｉｒｒｉｎｇ）を用いた底部ふるい（ｂｏｔｔｏｍ  ｓｉｅｖｅ）を通して放出することができる。次いでこの得られた半合成ベータ−ラクタム抗生物質懸濁液を、ガラスフィルターを通して濾過することができる。
【００２７】
酵素共役反応後に存在する少量の遊離側鎖のせいで、最終の半合成ベータ−ラクタム抗生物質の結晶化は、高収率をもたらす高濃度のベータ−ラクタム抗生物質で行うことができる。
【００２８】
第二の態様において本発明は、遊離塩基の形態の、好ましくはＤ−フェニルグリシン−メチルエステル、Ｄ−フェニルグリシン−エチルエステル、Ｄ−ジヒドロ−フェニルグリシン−メチルエステル、およびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシン−エチルエステルからなる群から選択されるエステルであって、下記の特性、すなわち
・好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、好ましくは９６％以上、好ましくは９７％以上、好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上のｅ．ｅ．（鏡像異性体過剰率）と、
・エステルのモル数に対する塩のモル数として表わされる、好ましくは２０モル％以下、より好ましくは１０モル％以下、より好ましくは５モル％以下、より好ましくは２モル％以下、最も好ましくは１モル％以下の塩含有量と、
・好ましくは≧８５％、より好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％、より好ましくは≧９６％、より好ましくは≧９７％、より好ましくは≧９８％、最も好ましくは≧９９％の本明細書中でさきに定義した「比」と
を有するエステルを提供する。
【００２９】
列挙したｅ．ｅ．の任意の値を、列挙した塩含有量の任意の値と合せ有する、また「比」の任意の値と合せ有する遊離塩基の形態のエステルが提供されることは当業者には明らかであろう。
【００３０】
第三の態様において本発明は、上記で規定した特性を有する本発明の遊離塩基の形態のエステルの生成方法を提供する。この方法は、水性環境中で側鎖エステルの塩を塩基と混合し、それによって二相系を生成すること、およびその水性相から遊離塩基の形態の側鎖エステルを分離することを含むことができる。
【００３１】
側鎖エステルの塩は、ＨＣｌ塩などの任意の適切な塩であることができる。塩は、固体の形態でも、また液体の形態、すなわち水または別の適切な溶媒に溶かした、場合によっては塩などの他の成分を含有する溶液でもよい。側鎖エステルの塩と混合される塩基は、任意の塩基、好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、またはアンモニアなどの強塩基であることができる。
【００３２】
形成される二相系において、遊離塩基の形態の側鎖エステルを含む有機相は、好ましくは遊離側鎖を全く含有しないか、または非常に低レベルの遊離側鎖しか含有しない、すなわち本明細書中でさきに定義した「比」が好ましくは≧８５％、より好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％、より好ましくは≧９６％、より好ましくは≧９７％、より好ましくは≧９８％、最も好ましくは≧９９％であり、一方、遊離側鎖、および場合によっては塩を含有する水性相は、好ましくは側鎖エステルを全く含有せず、または非常に低レベルの側鎖エステルのみを含有する。
【００３３】
二相系は、多相系がｐＨ７．５から１０の間、好ましくは８．５から９．５の間、最も好ましくは８．８から９．２の間で形成される精製のステップの下で本明細書中で上述したように形成することができる。
【００３４】
多相系中の様々な相は、既知の手法を用いて分離することができる。適切な方法は、それら様々な相間の密度差を利用するものである。その規模に応じて分離は、バッチ方式または、より好ましくは連続方式のいずれかで、正規重力を用いてまたは好ましくは遠心力を用いて得ることができる。好ましい連続遠心分離法は、ＰＧＭについて図１および実施例５に詳細に記載する。この方法は、遊離塩基の形態の好ましくはＤ−フェニルグリシン−メチルエステル、Ｄ−フェニルグリシン−エチルエステル、Ｄ−ジヒドロ−フェニルグリシン−メチルエステル、およびＤ−ジヒドロ−フェニルグリシン−エチルエステルからなる群から選択される任意のエステルに適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】好ましい連続遠心分離法の加工ラインを示す。
【００３６】
［図１］
Ａは、実施例４の記述のように得ることができるＰＧＭ溶液を入れる容器である。
Ｂは、水（溶液１ｋｇ当たり７２４ｇ）に溶かしたＮａＯＨ（溶液１ｋｇ当たり６５ｇ）およびＮａＣｌ（溶液１ｋｇ当たり２１１ｇ）の溶液を入れた容器であり、容器の内容物は３から５℃に保たれる。
Ｃは、撹拌機、バッフル、温度計、ｐＨメーター、ＰＧＭ溶液の注入口、ＮａＯＨ／ＮａＣｌ溶液の注入口、および反応混合物の流出口を備えた１０Ｌガラス容器であり、容器は冷却槽中に置かれる。
Ｄは、反応混合物の温度を遠心器中に導入する前に３０℃まで加熱するための熱交換器（内容積１Ｌ）である。
Ｅは、Ｎａ２ＳＯ４の２５％（ｗ／ｗ）溶液を入れた容器であり、容器の内容物は３０℃まで加温された。
Ｆは、２個のＲｏｂａｔｅｌ  ＢＸＰ１３０抽出遠心器（液体／液体抽出装置、ボウルの直径１２５ｍｍ、ボウルの容積１．４Ｌ、軽相堰の直径６１ｍｍ、重相堰の直径６６ｍｍ）であり、遠心器の注入口および流出口は下記のように連結された。すなわち
・１０Ｌ容器からの反応混合物は遠心器１の軽相注入口中に導入された。
・Ｎａ２ＳＯ４の２５％（ｗ／ｗ）溶液は遠心器２の重相注入口中に導入された。
・遠心器１の重相流出口は受け容器（Ｇ）に連結された。実験後、この内容物は廃棄された。
・遠心器１の軽相流出口は遠心器２の軽相注入口に連結された。
・遠心器２の重相流出口は遠心器１の重相注入口に連結された。
・遠心器２の軽相流出口は、蠕動ポンプにより、このプロセスの流れを３〜５℃まで冷却するための熱交換器を通って汲み上げられた。
Ｇは、遠心器１から水性相を回収するための受け容器である。
Ｈは、プロセスの流れを３〜５℃まで冷却するための熱交換器である。
Ｉは、ＰＧＭ遊離塩基を回収するために３〜５℃の冷えた状態に保たれた容器である。
【００３７】
図１に示されないが、蠕動ポンプは、
・ＰＧＭ溶液を１０Ｌ容器に汲み上げるための蠕動ポンプ。
・ＮａＯＨ／ＮａＣｌ溶液を１０Ｌ容器に汲み上げるための蠕動ポンプ。このポンプの流れはｐＨメーターによって制御された。
・熱交換器を通る反応混合物を遠心器に汲み上げるための蠕動ポンプ。
・Ｎａ２ＳＯ４の２５％（ｗ／ｗ）溶液を遠心器に汲み上げるための蠕動ポンプ
である。
【００３８】
［実施例］
［実施例１］
［ａ）フェニルグリシン−メチルエステル（ＰＧＭ）溶液の合成］
Ｄ−フェニルグリシン９０ｇをメタノール１７０ｍＬ中に懸濁させ、濃硫酸７３．２ｇを加えた。この混合物を還流状態で約７３℃に２時間保ち、真空ポンプを用いて減圧下で濃縮した。圧力は大気圧から２０ミリバールに降下し、同時に反応混合物の温度は４０から８０℃まで上昇した。
【００３９】
メタノール１７０ｍＬを加え、その混合物を再び還流状態で２時間保ち、減圧下で濃縮した。さらに、メタノール１７０ｍＬを加え、その混合物を還流状態で２時間保ち、減圧下で濃縮した。最後にメタノール１２５ｍＬを加えた。本明細書中でさきに定義した「比」は、この段階で９５％であった。
【００４０】
この溶液を、メタノール２０ｍＬを予め装入した第二リアクター中へ２０℃で１時間のうちに投入した。ｐＨをアンモニアで３．５に保った。固形物が形成され、それを濾過により取り除いた。得られた母液を水２５ｍＬで希釈し、減圧下で濃縮した（ｐ＝２０ｍｍＨｇ、Ｔ＝４０〜４５℃）。最後にＤ−フェニルグリシン−メチルエステル（ＰＧＭ）溶液２０７．５ｇが得られた。得られた溶液の「比」は９９％であった。
【００４１】
［ｂ）セファレキシンの酵素による合成］
１７５μｍのふるい底を有するリアクターに、１５ｇの固定化大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＰｅｎＧアシラーゼ変異体Ｐｈｅ−Ｂ２４−Ａｌａを満たした。続いて２５℃において２１．４ｇの７−ＡＤＣＡおよび９５ｇの水を加え、２５％アンモニアでｐＨを７．０に調整した。
【００４２】
ステップａ）（上記）で得られたＰＧＭ溶液３８ｇを、一定速度で１２０分のうちにリアクター中へ投入した。ｐＨをアンモニアでｐＨを７．０に保った。温度は２５℃に保たれた。３０分後、固体セファレキシン（シード）０．２５ｇを加えた。４５分でセファレキシンの結晶化が始まった。１２０分から１５０分までｐＨを２５％硫酸により７．０に保った。続いてｐＨを２５％硫酸により５．７まで下げた。
【００４３】
［ｃ）セファレキシンの回収］
リアクターは、上向き撹拌を用いた底部ふるいを通して放出された。得られたセファレキシン懸濁液はガラスフィルターを通して濾過した。得られた母液をリアクター中に戻した。この一連のステップを５回繰り返した。その後、酵素を水２×１０ｍＬで洗浄した。この方法でセファレキシンの≧９８％が固形生体触媒から分離された。
【００４４】
セファレキシンウェットケーキ、母液、および洗浄水を一緒にし、温度を２℃に保った。この一緒にしたウェットケーキと母液のｐＨを濃硫酸で１．５まで下げ、得られた溶液を０．４５μｍフィルターを通して濾過した。
【００４５】
結晶化リアクターを、水２０ｇおよびセファレキシン（シード）１．０ｇで満たした。上記酸性セファレキシン溶液を、結晶化リアクター中へ３０℃で８０分間のうちに投入した。このｐＨをアンモニアで５．０に保った。続いてこの懸濁液を２０℃でさらに３０分間撹拌した。懸濁液を、ガラスフィルターを通して濾過し、そのウェットケーキを水２×１５ｍＬおよびアセトン２×１５ｍＬで洗浄した。乾燥後、一水素化セファレキシン３２．６ｇが得られた（純度＞９９．８％）。
【００４６】
［実施例２］
［ａ）Ｄ−ジヒドロフェニルグリシン−メチルエステル（ＤＨＰＧＭ）溶液の合成］
Ｄ−ジヒドロ−フェニルグリシン（ＤＨＰＧ）９０ｇをメタノール２００ｍＬ中に懸濁させ、濃硫酸７３．２ｇを加えた。この混合物を還流状態で約７３℃に２時間保ち、真空ポンプを用いて減圧下で濃縮した。圧力は大気圧から２０ミリバールに降下し、同時に反応混合物の温度は４０から８０℃に上昇した。
【００４７】
メタノール１７０ｍＬを加え、その混合物を再び還流状態で２時間保ち、減圧下で濃縮した。さらに、メタノール１７０ｍＬを加え、その混合物を還流状態で２時間保ち、減圧下で濃縮した。最後にメタノール１２５ｍＬを加えた。本明細書中でさきに定義した「比」は、この段階で９４．８％であった。
【００４８】
この溶液を、メタノール２０ｍＬを予め装入した第二リアクター中へ２０℃で１時間のうちに投入した。ｐＨをアンモニアで３．５に保った。固形物が形成され、それを濾過により取り除いた。得られた母液を水２５ｍＬで希釈し、木炭（活性炭）３ｇで脱色し、減圧下で濃縮した（ｐ＝２０ｍｍＨｇ、Ｔ＝４０〜４５℃）。最後にＤＨＰＧＭ溶液２１７．６ｇが得られた。得られた溶液の「比」は９９．２％であった。
【００４９】
［ｂ）セファラジンの酵素による合成］
このステップは、国際公開第２００５／００３３６７号パンフレットに記載のように行った。
【００５０】
［実施例３］
［ａ）Ｄ−フェニルグリシン−メチルエステル（ＰＧＭ）溶液の合成］
Ｄ−フェニルグリシン９０ｇをメタノール１７０ｍＬ中に懸濁させ、濃硫酸７３．２ｇを加えた。この混合物を還流状態で約７３℃に２時間保ち、真空ポンプを用いて減圧下で濃縮した。圧力は大気圧から２０ミリバールに降下し、同時に反応混合物の温度は４０から８０℃に上昇した。
【００５１】
メタノール１７０ｍＬを加え、その混合物を再び還流状態で２時間保ち、減圧下で濃縮した。さらに、メタノール１７０ｍＬを加え、その混合物を還流状態で２時間保ち、減圧下で濃縮した。最後にメタノール１２５ｍＬを加えた。この混合物をエステル化混合物と呼ぶ。
【００５２】
このエステル化混合物の大部分（約９５％）を、水４０ｍＬを予め装入した第二リアクター中へ２５〜３０℃で１時間のうちに投入した。ｐＨを８Ｍ  ＮａＯＨで３．５に保った（消費量３４ｇ）。固形物が形成され、それを濾過により取り除いた。得られた母液をエステル化混合物（約５％）と混合して、濾液のｐＨをｐＨ＝２に下げた。この混合物を減圧下で濃縮した（ｐ＝２０ｍｍＨｇ、Ｔ＝４０〜４５℃）。最後に粘性混合物１９０ｇが得られた。
【００５３】
［ｂ）５Ｍ  ＮａＣｌに溶かした２Ｍ  ＮａＯＨの調製］
８０ｇのＮａＯＨを１４９ｍＬの水に溶解した。この溶液を５Ｍ  ＮａＣｌの添加によって１０００ｍＬに希釈した。体積を１０００ｍＬに調整するには約８４０ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌが必要とされる。
【００５４】
［ｃ）遊離塩基としてのＰＧＭの合成］
ａ）で得られた粘性混合物を、４０℃において１２０ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌと混合した。この混合物を、５Ｍ  ＮａＣｌに溶かした２Ｍ  ＮａＯＨの添加によってｐＨをｐＨ＝９に保ちながら、５０ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌに２０分の間に加えた。混合物の温度は２０℃に保った。混合物を分離漏斗に移し、混合物を２０分間放置して沈降させた。続いて層を分離した。上層を、室温で１２０ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌと混合した。混合物を分離漏斗に移し、混合物を２０分間放置して沈降させた。層が分離した。上層を５０００ｒｐｍで遠心分離した。少ない方の最下層が形成され、これを油状生成物から取り除いた。９５ｇのＰＧＭ遊離塩基が得られた。含有量は８５％、ｅ．ｅ．＝９７％、ステップ（ａ）におけるＰＧ投入量を基準にした収率は８２％。ＰＧＭ中のＰＧ遊離塩基の含有量は０．２％（すなわち９９．８％の「比」）。
【００５５】
［ｄ）アンピシリンの合成］
このステップは、６−ＡＰＡおよびＰＧＡ、すなわちメチルエステルの代わりにＰＧのアミド誘導体からのアンピシリンの合成についての国際公開第９８／５６９４６号パンフレット中の記載のように行った。
【００５６】
［実施例４］
［Ｄ−フェニルグリシン−メチルエステル（ＰＧＭ）溶液の合成］
Ｄ−フェニルグリシン１３５ｇをメタノール２５２ｍＬ中に懸濁させ、濃硫酸（９８％）１０７ｇを加えた。この混合物を、還流状態で約７３℃に２時間保ち、真空ポンプを用いて減圧下で濃縮した。圧力は大気圧から２０ミリバールに降下し、同時に反応混合物の温度は４０から８０℃に上昇した。メタノール１２６ｍＬ（１００ｇ）を加え、その混合物を還流状態で約８１℃に１時間保ち、上述のように濃縮した。
【００５７】
この手順をさらに４回繰り返した（メタノールの添加、還流、および濃縮）。最後にメタノール１２６ｍＬを加え、その溶液をさらに１時間還流させ、周囲温度まで冷却した。
【００５８】
アンモニア１５ｍＬを、３５分間のうちにｐＨ２．３〜２．４まで一定速度で投入した。水７５ｍＬを加えた。メタノールを減圧下において５０℃未満の温度で蒸留して除いた。最終ＰＧＭ溶液のｐＨは２．０であり、また「比」は９９．０％であった。
【００５９】
［実施例５］
［向流抽出遠心分離器の使用によるＰＧＭ遊離塩基の生成］
図１に示した加工ラインを下記のように作動させた。すなわち
・遠心器を始動し、２４００ｒｐｍで作動させた。
・Ｎａ２ＳＯ４の２５％（ｗ／ｗ）溶液を、流量７．５ｋｇ／時で遠心器１中に導入した。遠心器１の重相流出口からの流れが起こった後に、この反応混合物（下記参照）を遠心器１中に導入した。
・１０００ｍＬの５．３Ｍ  ＮａＣｌを１０Ｌ容器に加えた。
・この１０Ｌ容器の内容物を８〜１０℃まで冷却した。
・ＰＧＭ溶液を、流量１５ｋｇ／時で１０Ｌ容器に導入した。
・この１０Ｌ容器中のｐＨを、ＮａＯＨ／ＮａＣｌ溶液の添加によりｐＨ＝９．７に保った。
・この１０Ｌ容器中の体積を、その容器からの反応混合物の流れを調整することによって５Ｌに保った。
・この１０Ｌ容器中の温度を８〜１０℃に保った。
・この１０Ｌ容器の反応混合物を、熱交換器を経て汲み上げ、それによって３０℃まで加温した。続いて反応混合物を遠心器１中に導入した。
・遠心器２からの軽相を、熱交換器を通して３〜５℃まで冷却して容器中に３〜５℃で保管した。
・軽相の生成後、軽相を４時間未満のうちにアンピシリンへの転化に使用した。
【図１】
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【国際調査報告】
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