(57)【要約】  養殖、特に、漁場システム内の動物用栄養組成物中にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ワクチンを含める工程、使用、方法、及び製剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階：
ａ．ＡＤＮ配列を増幅するベイトの合成
ｂ．図２の遺伝子配列クローンを含有するプラスミドｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘＴＯＰＯに基づく、プラスミド構築物ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２の形成
ｃ．微生物への組み換えプラスミドｐｃＤＮＡ−ＶＰ２のトランスフェクション。この場合、大腸菌ＪＭ−１０９株のトランスフェクションは、組み換え菌株である大腸菌ＪＭ−１０９（ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２）を構成する
ｄ．組み換え菌株である大腸菌ＪＭ−１０９（ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２）の培養槽内における培養
ｅ．プラスミド構築物ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２の精製
ｆ．Ｌｉｐｏｐｌｅｘと称する、プラスミドｐｃＤＮＡ−ＶＰ２とＤＯＴＡＰリポソームとの複合体の形成
ｇ．経口ワクチン又は調合ワクチンを構成する、飼料ベースと称する栄養組成物へのＬｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合
ｈ．ＤＮＡワクチンを含有する飼料の包装
を意図することを特徴とする、ＤＮＡワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項２】
ベイトを用いたＰＣＲ法の増幅段階において、ＩＰＮＶウイルスカプシドのタンパク質部分ＶＰ２をコードする遺伝子領域が増幅されることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項３】
ベイトを用いた増幅段階により、タンパク質ＶＰ２の一部である７２５ｂｐのヌクレオチド配列が生成されることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項４】
プラスミド形成段階において、プラスミド構築物にｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘＴＯＰＯを用い、ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２という名称によりブダペスト条約下で保護され、国際寄託番号がＬＭＢＰ  ５３３３である組み換えプラスミドを生成することを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項５】
トランスフェクション段階において、大腸菌ＪＭ−１０９菌株が宿主として用いられ、大腸菌ＪＭ−１０９（ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２）という名称によりブダペスト条約下で保護され、国際寄託番号がＬＭＢＰ  ５３３３である組み換え菌株を生成することを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項６】
組み換えプラスミドｐｃＤＮＡ−ＶＰ２の単離及び精製の段階が、アルカリ溶菌法並びに濾過及び限外濾過の連続する段階を介して実施されることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項７】
Ｌｉｐｏｐｌｅｘと称するプラスミドｐｃＤＮＡ−ＶＰ２−リポソーム複合体の形成段階において、ＤＯＴＡＰリポソームが特異的に用いられることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項８】
ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合段階において、飼料へのワクチンの組み込みが、乾燥供給経路及び液体供給経路を共に含む２つの工程選択肢により、バッチ稼働において展開されうることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項９】
飼料ベースへのｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合段階において、ワクチン添加の第１の選択肢に従い、乾燥供給経路でペレット形態における飼料ベースを真空状態下で油分混合機に投入することを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項１０】
飼料ベースへのｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合段階において、ワクチン添加の第１の選択肢に従い、液体経路が乾燥経路と並行し、２つの段階を介して稼働することを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。これらは、２つのデポジットに基づき、デポジットの１つではサイズに応じてあらかじめ投入されたＬｉｐｏｐｌｅｘを保持し、他のデポジットでは油分混合バッチにおいてあらかじめプログラムされた量の飼料ベースを保持する。
【請求項１１】
飼料ベースへのｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合段階において、ワクチン添加の第１の選択肢に従い、液体経路が乾燥経路と並行し、２つの段階を介して稼働することを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。第１段階では、真空状態下の微粒散布によりワクチンが添加され、第２段階では、通常の大気圧下において、第２のデポジット内であらかじめ秤量しておいた魚油が散布される。
【請求項１２】
飼料ベースへのｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合段階において、ワクチン添加の第２の選択肢に従い、組み込みが、乾燥経路及び液体経路を含む２つの供給経路を介するバッチ稼働において展開されうることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項１３】
飼料ベースへのｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合段階において、ワクチン添加の第２の選択肢に従い、角度及び速度の変化する回転ボイラー型混合機に組み込まれた、あらかじめ定められた量のペレット形態における飼料ベースを、乾燥経路において秤量装置により分類することを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項１４】
ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合段階において、ワクチン添加の第２の選択肢に従い、液体経路が混合機と並行して稼働し、飼料ベースのサイズ及び量に応じてあらかじめプログラムされた分注機と接続された散布システムからなることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチンを含む動物用飼料を生成する工程。
【請求項１５】
栄養製剤に含まれるＤＮＡワクチンがペレットの形態で生成され、その治療効果が水生生物におけるウイルス起源の病原体の感染を予防することであることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤組成物を生成する工程。
【請求項１６】
栄養製剤に含まれるＤＮＡワクチンが生成され、経口形態で提供され、特にＩＰＮウイルスにより引き起こされる感染が予防されることを特徴とする、請求項１及び１５に記載の薬剤組成物を生成する工程。
【請求項１７】
栄養製剤に含まれるＤＮＡワクチンが生成され、前記製剤が以下：
ｉ．有効成分：プラスミド構築物ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２、
ｊ．ＤＯＴＡＰリポソーム、
ｋ．個体の栄養特性を提示する賦形剤
であることを特徴とする、請求項１、１５及び１６に記載の薬剤組成物を生成する工程。
【請求項１８】
賦形剤がタンパク質、ミネラル脂質、炭水化物、塩分、及びビタミンである経口投与ＤＮＡワクチンであることを特徴とする、請求項１〜１７に記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
賦形剤が以下の平均組成（ｇ／ｋｇ）：
粗タンパク質  ５３０
脂質（酸の加水分解により解析）  ２００
灰分  １００
粗線維  ８
窒素以外の抽出物  ７７
を提示する経口投与ＤＮＡワクチンであることを特徴とする、請求項１〜１８に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
賦形剤が製剤中でより多く用いられる以下の成分：魚粉、魚油及び／又は植物油、小麦及びトウモロコシの副産物、ペプトン濃縮物、小麦及びトウモロコシのグルテン、オキアミ粉、ビタミン及び塩分のミネラルプレミックス、大豆タンパク質濃縮物、小麦、ベタイン、並びにヌクレオチドを提示する経口投与ＤＮＡワクチンであることを特徴とする、請求項１〜１９に記載の薬剤組成物。
【請求項２１】
図３で開示されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
ウイルスタンパク質配列をコードする７２５ｂｐのヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項１及び２１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
ウイルスタンパク質配列をコードする７２５ｂｐのヌクレオチド配列を有し、前記配列がＩＰＮウイルスカプシドのＶＰ２タンパク質の大型サブユニットに特異的であることを特徴とする、請求項１、２１、及び２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２が、図４に開示され国際寄託番号がＬＭＢＰ  ５３３３であるプラスミド構築物を有することを特徴とする、請求項１に記載の大腸菌ＪＭ−１０９の形質転換細胞。
【請求項２５】
ＣＨＳＥ−２１４細胞株に属し、プラスミドｐｃＤＮＡ４−ＶＰ２を含むＩＰＮウイルス由来の発現ベクターを含有することを特徴とする宿主細胞。
【請求項２６】
ＣＨＳＥ−２１４細胞株がＩＰＮウイルス由来の発現ベクターを含有し、プラスミドｐｃＤＮＡ−ＶＰ２がウイルスタンパク質ＶＰ２に関連するポリペプチド配列を合成できることを特徴とする、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
プラスミドｐｃＤＮＡ−ＶＰ２の機能的発現を可能とすることを特徴とする、請求項１に記載の細菌の使用。
【請求項２８】
配列が構造タンパク質ＶＰ２を含み、ＩＰＮウイルスに対する免疫をもたらすことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２９】
図２に開示される配列の発現に対応することを特徴とする、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３０】
大腸菌ＪＭ−１０９の形質転換菌内で増幅され、図３に開示された配列が水生生物、特に魚類、具体的にはサケ科魚類においてワクチンとして用いられることを特徴とする、請求項４に記載の発現ベクターｐｃＤＮＡ−ＶＰ２。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術の現状］
養殖中の魚類に影響を及ぼす感染性疾患のうちで、ウイルスは、経済的損失の大きな原因となっている。ＤＮＡワクチンは、主に、ラブドウイルス（ＶＨＳＶ及びＩＨＮＶ）及びビルナウイルス（ＩＰＮＶ）からなるウイルス群に対して実施されてきた。
【０００２】
ラブドウイルスは、サケ科ウイルス群の主要な病原体群を形成する。これらは、ヌクレオカプシドを取り囲む外延的な複合脂質による被覆により取り囲まれるリボ核酸ウイルス（ＡＲＮ）である。ウイルス粒子は杖の形態を有し（「ラブド（ｒｈａｂｄｏ）」とは「杖」を意味する）、約７０ｎｍの直径及び１７５ｎｍの長さを有する（Ｂｒｏｃｋ及びＭａｄｉｇａｎによる「微生物学」）。ラブドウイルスは、２つの重要な疾患：ウイルス性出血性敗血症（ＶＨＳＶ）及び感染性造血器壊死（ＩＨＮＶ）をもたらす。
【０００３】
現在までのところ、サケ科魚類におけるＤＮＡワクチン接種で最も成功した結果は、ラブドウイルス：魚類の養殖においてより大きな世界的影響を有する２つのウイルス性病理を広く構成する、ウイルス性出血性敗血症（ＶＨＳＶ）ウイルス及び感染性造血器壊死（ＩＨＮＶ）ウイルスに対して得られている。
【０００４】
これらのＤＮＡワクチンは、真核細胞内における一過性発現用に設計された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の単離されたプラスミドに主に基づく。すべての場合において、ウイルス糖タンパク質をコードするウイルス遺伝子は、挿入ｐＧである（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６年；Ｌｏｒｅｎｓｅｎら、１９９８年；Ｂｏｕｄｉｎｏｔら、１９９８年；Ｌｏｒｅｎｓｅｎら、２０００年；Ｌｏｒｅｎｚｅｎら、２００５年；Ｌｏｒｅｎｚｅｎら、２００２年；ＭｃＬａｕｃｈｌａｎら、２００３年；Ｐｕｒｃｅｌｌら、２００４年；Ｔａｋａｎｏら、２００４年；Ｖｅｓｅｌｙら、２００４年）。
【０００５】
また、ウイルス糖タンパク質（ｐＧ）を用いて、ヒラメラブドウイルスＨＩＲＲ（Ｔａｋａｎｏら、２００４年）及びスネークヘッドラブドウイルスＳＨＲＶ（Ｋｉｍら、２０００年）など、その地理的な分布の他、それらが影響を及ぼす種に関する限り、発症率が低くより限定された他のラブドウイルスに対して有効なＤＮＡワクチンが開発されてきた。
【０００６】
これらのワクチンが、多様な環境条件、サケ科魚類の種、魚類の生活周期の段階、及び異なるウイルスストック（ｖｉｒａｌ  ｓｔｏｃｋ）に対して高度に有効であることは、様々な研究が示している（Ｃｏｒｂｅｉｌら、２０００年；Ｇａｒｖｅｒら、２００５年；Ｋｕｒａｔｈら、２００１年；ＬａＰａｔｒａら、２０００年；Ｌｏｒｅｎｚｅｎら、１９９９年；Ｌｏｒｅｎｚｅｎら、２００１年；Ｔｒａｘｌｅｒら、１９９９年）。
【０００７】
用量−応答実験は、ナノグラム範囲のプラスミドＤＮＡによる簡略な筋肉内注射が、マス科のニシキベラ（ｒａｉｎｂｏｗ［ａｒｃｏｉｒｉｓ］ｆｉｓｈｅｓ）の幼魚におけるウイルス性出血性敗血症（ＶＨＳ）及び感染性造血器壊死（ＩＨＮ）に対して防御的な免疫反応を誘導するのに十分であることを示している（Ｃｏｒｂｅｉｌら、２０００年；Ｌｏｒｅｎｚｅｎら、２０００年）。
【０００８】
感染性膵臓壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）ＡＲＮのセグメントＡから発現されたＩＰＮＶの完全ポリタンパク質をコードする（ｃｏｄｉｆｙｉｎｇ）プラスミドワクチンを用いてアトランティックサーモンに対して実施された研究は、その投与後に高レベルの防御が得られることを示した（Ｍｉｋａｌｓｅｎら、２００４年）。ピスシリケッチア・サルモーニス（Ｐｉｓｃｉｒｉｃｋｅｔｓｉａ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）の抗原性配列を含有する高発現プラスミドによりギンザケに免疫感作したところ、比較的小規模の防御が観察された（Ｍｉｑｕｅｌら、２００３年）。２００５年に、シマスズキにおける防御を誘導した抗原Ａｇ８５Ａをコードするプラスミドに基づき、細菌マイコバクテリウム・マリーン（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｅ）に対するＤＮＡワクチンが評価された。
【０００９】
ワクチン投与法：
ＤＮＡワクチンの組み込み機構は、水産養殖（ａｑｕｉｃｕｌｔｕｒｅ）で用いうる大規模な免疫感作法を開発する必要性のために、探索の重要な対象を構成してきた。
【００１０】
より有効であったＤＮＡワクチンの投与経路は、筋肉内注射である。しかしながら、実際には、免疫感作する魚類のサイズにおける限界の他、ワクチン接種の追加費用も、現在までのところ答えの得られない問題である。
【００１１】
養殖場内の魚類に適する投与経路は、液浴又は浸漬である。この文脈では、ＤＮＡワクチン接種の実際的で大規模な適用法を改善し、それを幼魚にまで拡張する一連の手順の中で、浸漬に基づく投与経路が評価されてきた（Ｃｏｒｂｅｉｌら、２０００年；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｏｎｓｏら、１９９８年）。
【００１２】
溶解された裸のプラスミドを含有する水中に浸漬された魚類の側で直接的にＤＮＡを取り込むことはできないので、ＬＦ超音波法（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｏｎｓｏら、２００１年）及び高浸透圧ショック法（Ｈｕｉｓｉｎｇら、２００３年）の使用など、浸漬によるプラスミドワクチンの組み込みを最適化する物理又は化学的方法の評価は好結果をもたらした。
【００１３】
浸漬により、魚類によるＤＮＡの取り込みを誘導又は促進するため、当面は、以下に基づく方法を評価する：
ｉ）ＤＮＡ−リポソーム複合体
ｉｉ）浸漬又はマイクロカプセル封入されたＤＮＡからの経口摂取
【００１４】
陽イオンリポソームは、二層に構成されたリン脂質を含有する極微の脂質小胞であり、その正電荷により、負に荷電したＤＮＡと複合体が形成される。このため、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰ、又はＤＯＴＡＰ：コレステロール（Ｈｕａｎｇ及びＬｉ、１９９７年）など、合成脂質の混合物が、水産養殖においてプラスミドワクチンを送達する良好な代替物となっている（Ｒｕｍｏｒｅｎら、２００２年）。
【００１５】
この点では、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｏｎｓｏら（１９９９年）が、ＤＯＴＡＰリポソームとのプラスミドワクチン複合体を含有する水中にマス科のニシキベラの幼魚（０．２〜０．５ｇ）を浸漬するワクチン接種による組み換えタンパク質発現を生きたままモニターする最初のモデルを開発した。設計されたワクチンを効果的にモニターするために、ワクチンは、その配列中に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなるレポーター遺伝子を含有し、同著者らは、浸漬処置後に、大量の幼魚のヒレの中において蛍光発光を定量することができた。蛍光は、プラスミドワクチンへの曝露後２〜３日後から治療（ｃｕｒｅ）の１０日後まで検出された。
【００１６】
近年では、Ｒｕｍｏｒら、（２００４年）が、リポソームにより調合されたプラスミドワクチンからの異なる臓器中での発現を調べた。ルシフェラーゼからなるマーカー遺伝子を含むプラスミドを異なる経路（腹腔内、筋肉内、静脈内、浸漬、又は経肛門）を介して投与すると、ワクチン−リポソーム複合体の使用により、他の投与機構と比べてルシフェラーゼのより高度の発現がもたらされる。
【００１７】
［参考文献］
・  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｅ．Ｄ．，  Ｍｏｕｒｉｃｈ  Ｄ．Ｖ．，  Ｆａｈｒｅｎｋｒｕｇ  Ｓ．Ｃ．，  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．，  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｌｅｏｎｇ  Ｊ．Ａ．  （１９９６）．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  （Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｓｅａ．  Ｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５  （２）：  １１４−１２２．
・  Ｌｏｒｅｎｓｅｎ  Ｎ．  ＆  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｅ．，  Ｅｉｎｅｒ−ｊｅｎｓｅｎ  Ｋ．，  Ｈｅｐｐｅｌｌ  Ｊ．，  Ｗｕ  Ｔ．  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ  Ｈ．Ｌ．  （１９９８）．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ＶＨＳ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  （Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ，  Ｗａｌｂａｕｍ）  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｎｍｕｎｏｌ．，  ８：２６１  −  ２７０．
・  Ｂｏｕｄｉｎｏｔ  Ｐ．，  Ｔａｒｇｅｔ  Ｍ．  ｏｆ  Ｋｉｎｋｅｌｉｎ  Ｐ．  ａｎｄ  Ｂｅｎｍａｎｓｏｕｒ  Ａ．  （１９９８）．  Ｖｉｒａｌ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ２４９  （２）：  ２９７−３０６
・  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｅ．，  Ｅｉｎｅｒ．Ｊｅｎｓｅｎ  Ｋ．，  Ｍａｒｔｉｎｕｓｓｅｎ  Ｔ．，  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．Ｅ  ａｎｄ  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｎ．  （２０００）．  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ：  ｔｏ  ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  Ｔｉｍｅ−ｃｏｕｒｓｅ  ｓｔｕｄｙ．  Ｊ．  ａｑｕａｔ．  Ａｎｉｍ．  Ｈｌｔｈ．，  １２  （３）：  １６７−１８０
・  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｅ．，  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｎ．  Ｅｉｎｅｒ．Ｊｅｎｓｅｎ  Ｋ．，  Ｂｒｕｄｅｓｅｔｈ  Ｂ．  ａｎｄ  Ｅｖｅｎｓｅｎ  Ｏｒ．  （２００５）．  Ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＶＨＳ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  （Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ，  Ｗａｌｂａｕｍ）  ｆｒｙ．  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９  （１）：  ２７−４１．
・  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｅ．，  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｎ．  Ｅｉｎｅｒ．Ｊｅｎｓｅｎ  Ｋ．  ａｎｄ  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．Ｅ．  （２００２）．  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ａｃｅ  ｔｏ  ｔｏｏｌ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ．  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２：４３９  −  ４５３．
・  ＭｃＬａｕｃｈｌａｎ  ＥＰ．，  Ｃｏｌｌｅｔ  Ｂ．，  Ｉｎｇｅｒｓｌｅｖ  Ｅ．，  Ｓｅｃｏｍｂｅｓ  Ｃ．Ｊ．，  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｎ．  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｓ  Ａ．Ｅ．  （２００３）  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ  （ＶＨＳ）  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ：  ｓｉｚｅ，  ｄｏｓｅ，  ｒｏｕｔｅ  ｏｆ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  −  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｙｏｕ  ｃｏｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ＭＸ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｆｉｓｈ．  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５  （１）：  ３９−５０．
・  Ｐｕｒｃｅｌｌ  Ｍ．Ｋ．，  Ｋｕｒａｔｈ  Ｇ．  ｔｏ  ｇｒａｖｅｒ  Ｋ．Ａ．，  Ｈｅｒｗｉｎ  Ｒ．Ｐ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｏｎ  Ｊ．Ｒ．  （２００４）．  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  （ＩＨＮＶ）  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｆｉｓｈ．  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７  （５）：  ４４７−４６２．
・  Ｖｅｓｅｌｙ  Ｔ．，  Ｐｏｋｏｒｏｖａ  Ｄ．，  Ｅｉｎｅｒ−Ｊｅｎｓｅｎ  Ｋ．  ａｎｄ  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｎ．  （２００４）．  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃａｒｐ  （Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）  ａｇａｉｎｓｔ  ＳＶＣＶ：  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．  Ｉｎ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｂｓｔｒａｃｔ，  ６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２６−２７  Ｍａｙ，  Ｔｕｒｋｕ，  Ｆｉｎｌａｎｄ，  ４３．
・  Ｔａｋａｎｏ  Ｔ．，  Ｉｗａｈｏｒｉ  Ａ．，  Ｈｉｒｈｏｎｏ  Ｉ．  ａｎｄ  Ａｏｋｉ  Ｔ．  （２００４）．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｉｒａｍｅ  ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｍｉｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ａｆｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｆｉｓｈ．  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７  （４）：  ３６７−３７４．
・  Ｋｉｍ  Ｃ．Ｈ．，  ｔｈｅ  Ｊｏｈｎｓｏｎｓ  Ｍ．Ｃ．，  Ｄｒａｉｎ  Ｂ．Ｅ．，  Ｓｉｍｏｎ  Ｅ．，  Ｔｈｏｍａｎｎ  Ｅ．  ＆  Ｌｅｏｎｇ  Ｊ．Ａ．Ｃ．  （２０００）  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６：２３  −  ２７．
・  Ｃｏｒｂｅｉｌ  Ｓ．，  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．Ｅ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｅ．Ｄ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｔｈ  Ｇ．  （２０００）．  Ｎａｎｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  ｆｒｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ，  １８  （２５）：  ２８１７．２８２４．
・  Ｇａｒｖｅｒ  Ｋ．Ａ．，  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．Ｅ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｔｈ  Ｇ．  （２００５）．  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎａｃｒｏｓｉｓ  （ＩＨＮ）  ｖｉｒｓ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｏｏｋ  （Ｏｎｃｏｒｙｎｃｈｕｓ  ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）  ａｎｄ  ｓｏｃｋｅｙｅ  （Ｏｎｃｏｒｙｎｃｈｕｓ  ｎｅｒｋａ）  ｓａｌｍｏｎ．  Ｄｉｓ  ａｑｕａｔ．  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，  ６４  （１）：  １３−２２．
・  Ｋｕｒａｔｈ  Ｇ．，  Ｃｏｒｂｅｉｌ  Ｓ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｅ．Ｄ  ａｎｄ  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．  （２００１）．  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ．  Ｂｕｌｌ．  Ｎａｔｌ．  Ｈｅａｄ  ｏｆ  ｃａｔｔｌｅ．  Ｉｎｓｔ．  Ａｑｕａｃｕｌｔ．，  ５：２７  −  ３３．
・  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．Ｅ．，  Ｃｏｒｂｅｉｌ  Ｓ．，  Ｊｏｎｅｓ  Ｇ．Ｒ．，  Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ  Ｗ．Ｄ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｔｈ  Ｇ．  （２０００）．  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｔｈｅ  ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｔｏ  （ＩＨＮ）  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｓｕｂｙｅａｒｌｉｎｇ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ．  Ｊ．  Ａｑｕａｔ．  Ａｎｉｍ．  Ｈｌｔｈ．，  １２  （３）：  １８１−１８８．
・  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｎ．，  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｅ．，  Ｅｉｎｅｒ−Ｊｅｎｓｅｎ  Ｋ．，  Ｈｅｐｐｅｌｌ  Ｊ．  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ  Ｈ．Ｌ．  （１９９９）．  Ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ：  ｓｍａｌｌ  ａｍｏｕｎｔｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｏ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ．  Ｖｉｒｕｓ  Ｈｅａｄ  ｏｆ  ｃａｔｔｌｅ．，  ６３  （１−２）：  １９−２５．
・  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｎ．，  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｅ．  ａｎｄ  Ｅｉｎｅｒ−Ｊｅｎｓｅｎ  Ｋ．  （２００１）．  Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｏｆ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ  （ＶＨＳ）  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  ＡＴ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｌｉｋｅ−ｓｔａｇｅ．  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １１  （７）：  ５８５−５９１．
・  Ｔｒａｘｌｅｒ  Ｇ．Ｓ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｅ．，  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．Ｅ．，  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．，  Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ  Ｂ．  ａｎｄ  Ｋｕｒａｔｈ  Ｇ．  （１９９９）．  Ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ｓａｌｍｏｎ  Ｐｓａｌｍ  ｔｏ  ｓａｌａｒ  ａｇａｉｎｓｔ  ＩＨＮＶ．  Ｄｉｓ．  Ａｑｕａｔ．  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，  ３８  （３）：  １８３−１９０．
・  Ｃｏｒｂｅｉｌ  Ｓ．，  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．Ｅ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｅ．Ｄ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｔｈ  Ｇ．  （２０００）．  Ｎａｎｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  ｆｒｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ，  １８  （２５）：  ２８１７．２８２４．
・  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｅ．，  Ｅｉｎｅｒ．Ｊｅｎｓｅｎ  Ｋ．，  Ｍａｒｔｉｎｕｓｓｅｎ  Ｔ．，  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．Ｅ  ａｎｄ  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｎ．  （２０００）．  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ：  ｔｏ  ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  Ｔｉｍｅ−ｃｏｕｒｓｅ  ｓｔｕｄｙ．  Ｊ．  Ａｑｕａｔ．  Ａｎｉｍ．  Ｈｌｔｈ．，  １２  （３）：  １６７−１８０
・  Ｍｉｋａｌｓｅｎ  Ａ．Ｂ．，  Ｔｏｒｇｅｎｓｅｎ  Ｊ．，  Ａｌｅｓｔｒｏｍ  Ｐ．，  Ｈｅｌｌｅｍａｎｎ  Ａ．，  Ｋｏｐｐａｎｇ  Ｅ．  ａｎｄ  Ｒｉｍｓｔａｄ  Ｅ．  （２００４）．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｔｌａｎｔｉｃ  ｓａｌｍｏｎ  Ｐｓａｌｍ  ｔｏ  ｓａｌａｒ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｔｏ  ａｆｔｅｒ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｄｉｓ．  Ａｑｕａｔ．  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，  ６０  （１）：  １１−２０．
・  Ｍｉｑｕｅｌ  Ａ．，  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｉ．，  Ｆｅｒｒｅｒ  Ｐ．，  Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  Ｐ．Ｄ  ａｎｄ  Ｂｕｒｚｉｏ  Ｌ．Ｏ．  （２００３）．  Ｉｎｍｕｎｏｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｈｏ  ｓａｌｍｏｎ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｏ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｆｒｏｍ  Ｐｉｓｃｉｒｉｃｋｅｔｓｉａ  ｓａｌｍｏｎｉｓ．  Ｂｉｏｌ．  Ｈｅａｄ  ｏｆ  ｃａｔｔｌｅ．，  ３６  （３−４）：  ３１３−３２３．
・  Ｐａｓｎｉｋ  Ｄ．Ｊ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｓ．Ａ．  （２００５）．  Ｉｎｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ．  Ｆｉｓｈ．  Ｖｅｔ．  Ｉｎｍｕｎｏｌ．  Ｉｎｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，  １０３  （３−４）：  １９５−２０６．
・  Ｃｏｒｂｅｉｌ  Ｓ．，  Ｋｕｒａｔｈ  Ｇ．  ａｎｄ  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．Ｅ．  （２０００）．  Ｆｉｓｈ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ：  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｒｏｕｔｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １０  （８）：  ７１１−７２３．
・  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｏｎｓｏ  Ｍ．，  Ａｌｖａｒｅｚ  Ｆ．，  Ｓｔｅｐｐｅ  Ａ．，  Ｂｌａｃｏ  Ｒ．  ａｎｄ  Ｃｏｌｌ  Ｊ．Ｍ．  （１９９９）．  Ｔｏ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｆｉｓｈ  ＤＮＡ  ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ．  Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓ．，  ２２  （３）：  ２３７−２４１．
・  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｏｎｓｏ  Ｍ．，  Ｒｏｃｈａ  Ａ．  ａｎｄ  Ｃｏｌｌ  Ｊ．Ｍ．  （２００１）．  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｔｏ  ｔｒｏｕｔ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ，  １９  （２３−２４）：  ３０６７−３０７５．
・  Ｒｏｍｏｒｅｎ  Ｋ．，  Ｔｈｕ  Ｂ．Ｊ．，  Ｓｍｉｓｔａｄ  Ｇ．  ＆  Ｅｖｅｎｓｅｎ  Ｏｒ．  （２００２）  Ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｒｓ  Ｉ．  Ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  ｔｏ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  （Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓ）  ｆｒｙ．  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓ．  ８５  （１−３）：  ２０３−２１３．
・  Ｒｏｍｏｒｅｎ  Ｋ．，  Ｔｈｕ  Ｂ．Ｊ．，  Ｓｍｉｓｔａｄ  Ｇ．  ＆  Ｅｖｅｎｓｅｎ  Ｏｒ．  （２００２）．  Ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｒｓ  ＩＩ．  Ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  ｔｏ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  （Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓ）  ｆｒｙ．  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ８５  （１−３）：  ２１５−２２５．
・  Ｈｕｉｓｉｎｇ  Ｍ．Ｏ．，  Ｇｕｉｃｈｅｌａａｒ  Ｔ．，  Ｈｏｅｋ  Ｃ．，  Ｖｅｒｂｕｒｇ−ｇｏ  Ｋｅｍｅｎａｄｅ  Ｂ．Ｍ．Ｌ，  Ｆｌｉｋ  Ｇ．，  Ｓａｖｅｌｋｏｕｌ  Ｈ．Ｆ．Ｊ  ａｎｄ  Ｒｏｍｂｏｕｔ  Ｊ．Ｈ．Ｗ．Ｍ．  （２００３）．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｉｓｈ  ｗｉｔｈ  ｈｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｔｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２１：４１７８  −  ４１９３．
・  Ｔｕｃｋｅｒ  Ｃ．Ｍ．，  Ｅｎｄｏ  Ｍ．，  Ｈｉｒｏｎｏ  Ｉ．  ａｎｄ  Ａｕｋｉ  Ｔ．  （２０００）．  Ａｓｓｅｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｔｏ  ｆｌｏｕｎｄｅｒ  Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓ，  ｔｈｒｏｕｔ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  Ｖａｃｃｉｎｅ，  １９  （７−８）：  ８０１−８０９．
・  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｏｎｓｏ  Ｍ．，  Ａｌｖａｒｅｚ  Ｆ．，  Ｓｔｅｐｐｅ  Ａ．，  Ｂｌａｃｏ  Ｒ．  ａｎｄ  Ｃｏｌｌ  Ｊ．Ｍ．  （１９９８）．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ＤＮＡ  ｉｎ  ａｑｕｉｃｕｌｔｕｒｅ．  ＡｑｕａＴＩＣ  ４，  ｈｔｔｐ：／／ａｑｕａｔｉｃ．ｕｎｉｚａｒ．ｅｓ／Ｎ  ｏ／ａｒｔ４０１／ＤＮＡ＿ｖａｃ．ｈｔｍ
・  Ｋｕｒａｔｈ  Ｇ．，  Ｃｏｒｂｅｉｌ  Ｓ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｅ．Ｄ  ａｎｄ  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．  （２００１）．  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ．  Ｂｕｌｌ．  Ｎａｔｌ．  Ｈｅａｄ  ｏｆ  ｃａｔｔｌｅ．  Ｉｎｓｔ．  Ａｑｕａｃｕｌｔ．  ５：２７  −  ３３．
・  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｅ．，  Ｅｉｎｅｒ．Ｊｅｎｓｅｎ  Ｋ．，  Ｍａｒｔｉｎｕｓｓｅｎ  Ｔ．，  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．Ｅ  ａｎｄ  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｎ．  （２０００）．  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ：  ｔｏ  ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  Ｔｉｍｅ−ｃｏｕｒｓｅ  ｓｔｕｄｙ．  Ｊ．  Ａｑｕａｔ．  Ａｎｉｍ．  Ｈｌｔｈ．，  １２  （３）：  １６７−１８０
・  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．Ｅ．，  Ｃｏｒｂｅｉｌ  Ｓ．，  Ｊｏｎｅｓ  Ｇ．Ｒ．，  Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ  Ｗ．Ｄ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｔｈ  Ｇ．  （２０００）．  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｔｈｅ  ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｔｏ  （ＩＨＮ）  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｓｕｂｙｅａｒｌｉｎｇ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ．  Ｊ．  Ａｑｕａｔ．  Ａｎｉｍ．  Ｈｌｔｈ．  １２  （３）：  １８１−１８８．
・  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｎ．，  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｅ．  ａｎｄ  Ｅｉｎｅｒ−Ｊｅｎｓｅｎ  Ｋ．  （２００１）．  Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｏｆ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ  （ＶＨＳ）  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  ＡＴ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｌｉｋｅ−ｓｔａｇｅ．  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１  （７）：  ５８５−５９１．
・  Ｓｏｍｍｅｒｓｅｔ  Ｉ．，  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｅ．，  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｈ．，  Ｂｌｅｉｅ  Ｈ．  ａｎｄ  Ｎｅｒｌａｎｄ  Ａ．Ｈ．  （２００３）．  Ｔｏ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｏ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｕｓ  ｙｏｕ  ｉｎｄｕｃｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｏ  ｎｏｄａｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｉｎ  ｔｕｒｂｏｔ．  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２１  （３２）：  ４６６１−４６６７．
・  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｎ．Ｅ．，  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｋ．，  Ｅｉｎｅｒ−Ｊｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．Ｅ．  （２００２ｂ）．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｈｏｒｔｌｙ  ｔｏ  ａｆｔｅｒ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．  Ｄｅｖｅｌ．  Ｃｏｍｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２６  （２）：  １７３−１７９．
・  Ｃｈｉｌｌｅｒ  Ｊ．Ｍ．，  Ｈｏｆｋｉｎｓ  Ｈ．Ｏ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｅｒ  Ｒ．Ｓ．  （１９６９）．  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  （Ｐｓａｌｍ  ｇａｉｒｄｎｅｎ）．  ＩＩ．  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １０２：１２０２  −  １２０７．
・  Ｂｏｕｄｉｎｏｔ  Ｐ．，  Ｔａｒｇｅｔ  Ｍ．  ｏｆ  Ｋｉｎｋｅｌｉｎ  Ｐ．  ａｎｄ  Ｂｅｎｍａｎｓｏｕｒ  Ａ．  （１９９８）．  Ｖｉｒａｌ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ２４９  （２）：  ２９７−３０６
・  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｅ．，  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｎ．  Ｅｉｎｅｒ．Ｊｅｎｓｅｎ  Ｋ．  ａｎｄ  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．Ｅ．  （２００２ａ）．  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ａｃｅ  ｔｏ  ｔｏｏｌ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ．  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｎｍｕｎｏｌ．，  １２：４３９  −  ４５３．
・  Ｐｕｒｃｅｌｌ  Ｍ．Ｋ．，  Ｋｕｒａｔｈ  Ｇ．，  Ｇａｒｖｅｒ  Ｋ．Ａ．，  Ｈｅｒｗｉｇ  Ｒ．Ｐ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｏｎ  Ｊ．Ｒ．  （２００４）．  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  （ＩＨＮＶ）  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７  （５）：  ４４７−４６２．
・  Ｔａｋａｎｏ  Ｔ．，  Ｉｗａｈｏｒｉ  Ａ．，  Ｈｉｒｈｏｎｏ  Ｉ．  ａｎｄ  Ａｏｋｉ  Ｔ．  （２００４）．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｉｒａｍｅ  ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ａｆｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｆｉｓｈ．  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７  （４）：  ３６７−３７４．
・  Ｔｒａｘｌｅｒ  Ｇ．Ｓ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｅ．，  ＬａＰａｔｒａ  Ｓ．Ｅ．，  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．，  Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ  Ｂ．  ａｎｄ  Ｋｕｒａｔｈ  Ｇ．  （１９９９）．  Ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ｓａｌｍｏｎ  Ｐｓａｌｍ  ｔｏ  ｓａｌａｒ  ａｇａｉｎｓｔ  ＩＨＮＶ．  Ｄｉｓ．  Ａｑｕａｔ．  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，  ３８  （３）：  １８３−１９０．
・  Ｋａｎｅｌｌｏｓ  Ｔ．，  Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ．  Ｉ．Ｄ．，  Ａｍｂａｌｉ  Ａ．Ｇ．，  Ｈｏｗａｒｄ  Ｃ．Ｒ  ａｎｄ  Ｒｕｓｅｌｌ  Ｐ．Ｈ  （１９９９ａ）．  Ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｆｉｓｈ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ９６  （２）：  ３０７−３１３．
・  ＭｃＬａｕｃｈｌａｎ  ＥＰ．，  Ｃｏｌｌｅｔ  Ｂ．，  Ｉｎｇｅｒｓｌｅｖ  Ｅ．，  Ｓｅｃｏｍｂｅｓ  Ｃ．Ｊ．，  Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  Ｎ．  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｓ  Ａ．Ｅ．  （２００３）．  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ  （ＶＨＳ）  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ：  ｓｉｚｅ，  ｄｏｓｅ，  ｒｏｕｔｅ  ｏｆ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  −  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｙｏｕ  ｃｏｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ＭＸ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｆｉｓｈ．  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５  （１）：  ３９−５０．
・  Ｂｏｕｄｉｎｏｔ  Ｐ．，  Ｔａｒｇｅｔ  Ｍ．  ｏｆ  Ｋｉｎｋｅｌｉｎ  Ｐ．  ａｎｄ  Ｂｅｎｍａｎｓｏｕｒ  Ａ．  （１９９８）．  Ｖｉｒａｌ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  ２４９  （２）：  ２９７−３０６
・  Ｇｒａｃｅ  Ｍ．Ｆ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｍ．Ｊ．  （１９８９）．  Ｈｉｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｏｒｇａｎｓ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ，  ｐｓａｌｍ  ｇａｉｒｄｎｅｒｉ．  Ｄｅｖ．  Ｃｏｍｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ４：２５５  −  ２６４．
・  Ｔａｔｎｅｒ  Ｍ．Ｆ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｍ．Ｊ．  （１９８３）．  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｏｒｇａｎｓ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ，  ｐｓａｌｍ  ｇａｉｒｄｎｅｒｉ，  ｆｒｏｍ  ｏｎｅ  ｔｏ  １５  ｍｏｎｔｈｓ  ｏｆ  ａｇｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｚｏｏｌｏｇｙ  Ｌｏｎｄｏｎ．  １９９：５０３  −  ５２０．
・  Ｃａｓｔｌｅ  Ａ．，  Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｃ．，  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  Ｊ．，  Ｋａａｔａｒｉ  ＬＩＭＩＴＥＤ  ＬＩＡＢＩＬＩＴＹ  ＣＯＭＰＡＮＹ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌｅｎａ  Ａ．Ｊ．  （１９９３）．  Ｏｎｔｏｇｅｎｙ  ｏｆ  ＩｇＭ  ａｎｄ  ＩｇＭ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ．  Ｄｅｖ．  Ｃｏｍｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７：４１９  −  ４２４．
・  Ｔａｔｎｅｒ  Ｍ．Ｆ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｍ．Ｊ．  （１９８５）．  Ｔｈｅ  ｏｎｔｏｇｅｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ，  ｐｓａｌｍ  ｇａｉｒｄｎｅｒｉ，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ．  Ｊ．  Ｆｉｓｈ．  Ｄｉｓ．，  ８：３５  −  ４１．
・  Ｅｌｌｉｓ  Ａ．Ｅ．  （１９８８）．  Ｏｎｔｏｇｅｎｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｔｅｌｅｏｓｔ  ｆｉｓｈ．  Ｆｉｓｈ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｅｄ．Ａ．Ｅ．Ｅｌｌｉｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０−３１．
・  Ｚａｐａｔａ  Ａ．Ｇ．  （１９９６）．  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｆｉｓｈ．  Ｔｈｅ  ｆｉｓｈ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：  ｏｒｇａｎｉｓｍ，  ｐａｔｈｏｇｅｎ，  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．  Ｅｄ  Ａｋｉｒａ  Ｋｉｄ．  Ａｌｂｅｒｔｏ  Ｖａｒａｓ，  ２７８．
・  Ｔａｔｎｅｒ  Ｍ．Ｆ．  （１９８５）．  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｔｈｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｏｒｇａｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ，  ｐｓａｌｍ  ｇａｉｒｄｎｅｒｉ，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ．  Ｄｅｖ．  Ｃｏｍｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ９：８５  −  ９１．
・  Ｊｏｈｎｓｏｍ  Ｋ．Ａ．，  Ｆｌｙｎｎ  Ｊ．Ｋ  ａｎｄ  Ａｍｅｎｄ  Ｄ．Ｆ．  （１９８２）．  Ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｓａｌｍｏｎｉｄ  ｆｒｙ  ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｒｕｃｋｅｒｉ  ａｎｄ  Ｖｉｂｒｉｏ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ  ｂａｃｔｅｒｉｎｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ５：１９７  −  ２０５．
・  Ｊｏｈｎｓｏｍ  Ｋ．Ａ．，  Ｆｌｙｎｎ  Ｊ．Ｋ  ａｎｄ  Ａｍｅｎｄ  Ｄ．Ｆ．  （１９８２）．  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｓａｌｍｏｎｉｄｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｒｕｃｋｅｒｉ  ａｎｄ  Ｖｉｂｒｉｏ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ  ｂａｃｔｅｒｉｎｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ５：２０７  −  ２１２．
・  Ｐｅｒｒｉｅ，  ａｎｄ．  Ｏｂｒｅｎｏｖｉｃ，  Ｍ，  ＭｃＣａｒｔｈｙ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，  Ｇ．  （２００２）．  Ｏｒａｌ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｒｏｕｔｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，  １８５−１９７
・  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｏｎｓｏ  Ｍ．，  Ａｌｖａｒｅｚ  Ｆ．，  Ｓｔｅｐｐｅ  Ａ．，  Ｂｌａｃｏ  Ｒ．  ａｎｄ  Ｃｏｌｌ  Ｊ．Ｍ．  （１９９９）．  Ｔｏ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｆｉｓｈ  ＤＮＡ  ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ．  Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓ．，  ２２  （３）：  ２３７−２４１．
・  Ｋ．，  Ｔｈｕ  Ｂ．Ｊ．，  Ｅｖｅｎｓｅｎ  ｒｕｍｏｒ  Ｏｒ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｏｒｇａｎｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎａｋｅｄ  ａｎｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｏ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｔｒｏｕｔ  （Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓ）  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓ  ｒｏｕｔｓ  ｏｆ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １６：２５１  −  ２６４．
【００１８】
［産業財産権の現状］
世界の特許庁の主要なデータベースにおいて探索を行った。この探索は、各場合において用いられた基準が何であったかを含む、６つの基本的部分に分類される。最初の４つの探索が本発明の明確なエレメントに関したのに対し、最後の２つの探索はワクチン製造工程及び栄養製剤への封入に関する。
１．用いられるベイト、
２．用いられるプラスミド、
３．大腸菌ＪＭ−１０９株、
４．ＤＯＴＡＰリポソーム構築物、
５．魚用ＤＮＡワクチン、
６．ＤＮＡ又は他の対象エレメントを用いた製剤の工程
【００１９】
１．ベイトに関する探索：
本発明で用いられるベイトは、２２及び２６ｐｂの新規の２つの配列：
・  Ｓ１  ５’３ＴＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＴＣＡＡＣＣＧＧＧＡＧＡ’センス（２６）
・  Ｓ２  ５’３ＣＣＣＣＴＴＧＧＣＴＣＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣＴ’アンチセンス（２２）
に対応する。
魚類において免疫を誘導するのに用いられる配列に関連する探索は、きわめて限られている。同様の優先権を保護した出願は少ない。
チリに優先権のある米国特許出願第２００３１４７９０９号明細書は、免疫原性を示しピスシリケッチア・サルモーニス菌に感染したギンザケから単離されたタンパク質ＣＨＡＰを精製する手順を開示する。チリではＣＬ２０８６−０１の出願番号により出願されたこの出願は、いくつかの理由により本発明には関連しない。
ａ）本発明は異なる病原体に対する防御を期待する、
ｂ）異なるエピトープに由来するので、関与する配列が異なる、
ｃ）用いられる免疫原性タンパク質が異なり、したがって、ベイトが異なる、
ｄ）この出願は、分子的な基本有効成分の封入装置としてのリポソームの使用に向かって前進するものでもない。これが、この出願により分子的性格の薬剤放出装置を含有する栄養製剤が得られない理由である。
【００２０】
上述より、また、他の出願は存在しないので、免疫原性を有するコード配列又はペプチドを生成するベイトの使用及び意図は新規である。
【００２１】
２．用いられるプラスミドに関する探索：
挿入配列をクローニングする市販のプラスミドは、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ  ＴＯＰＯ（米国、カリフォルニア州、カールスバード、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）である。この点では、このクローニングベクターの使用を開示するいくつかの先行特許が認められ、その最良の例は、国際公開第２００６００３１００号パンフレットによる発明特許出願である。この出願は、グルタミン酸受容体をコードするベクターの発現を保護し、このために発現ベクター、特に、受容体グループＩのメンバーであるヒト受容体ｍＧｌｕＲＩａをコードするｍＧｌｕＲの核酸配列を付加するｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（米国、カリフォルニア州、カールスバード、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）が用いられた。参照される該発明特許出願において、発明者は、テトラサイクリンにより誘導されるヒト代謝調節型グルタミン酸受容体グループＩをコードするベクターの発現を保護することを目論んでいる。この出願はまた、宿主細胞株（Ｔ−Ｒｅｘ−２９３）、アゴニスト及び同じ受容体の活性を調節する能力を有する他の化合物を認識する方法の他、トランスジェニック細胞の使用も保護する。
【００２２】
国際公開第２００６００３１００号パンフレットによる出願は本発明と大きく異なっており、同じクローニングベクターを用いることのみが共通するが、それも異なる形態において用いられる。該国際公開出願により、グルタミン酸受容体及びこれらを調節する物質をクローニングするプラスミドベクターの使用が保護される。しかし、該出願では、魚類において哺乳動物のクローニング系を用いることを目論んでいる。他方、多くの場合、クローニング配列は、哺乳動物に由来する受容体と関連を有さないが、魚類の病原体であるウイルスタンパク質とは関連を有する。
【００２３】
３．大腸菌ＪＭ−１０９株に関する探索
大腸菌Ｋ−１２に由来する大腸菌ＪＭ−１０９株（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）は、宿主として広く用いられている。次に、このベクターを用い、本出願に何らかの形で関連する主な発明について考察する。
【００２４】
ＲＵ２２０８６３７によるロシアの発明特許出願は、糖尿病に罹患する患者を治療する構築物の調製を開示している。この構築物用に、新規の菌株を生成する細菌ベクターに遺伝子が導入され、これが大腸菌ＪＭ  １０９／ｐＰＩＮＳ０７と命名された。保護される方法は、封入体中に含有される組み換えタンパク質の広範な単離プロトコールを含む。この手順の利点は、とりわけ、既存の技法と比べた試料調製時間の短縮である。加えて、ヒトインスリン生成のための遺伝子の調製に関連する遺伝子組み換え法は複雑である。ロシアの出願では、ハイブリッドタンパク質生成の増大が示されている。
【００２５】
参照される出願の他、本出願で提示される発明においても、大腸菌ＪＭ  １０９株が、大腸菌株の使用に対して当技術分野で広く認知されたプラスミドを増幅させる宿主として用いられていることを言及すべきである。本発明特許出願の新規の態様は、ヒトではなく魚類のゲストである微生物に関連するウイルスペプチド配列を増幅する菌株の使用である。
【００２６】
他方、関連しうる出願は、例外なく、薬剤組成物を生成する必要なしにこの菌株の生成物からの抽出物の権利を主張する。特徴的な製剤を保護する他の先行特許が存在する。これらの製剤は、保護することが望ましい手順と同様の技法により、即ち、クローニング法を介して得られる有効成分を含有する。しかしながら、これらの発明の大半はヒト又は魚類と関連するが、一般に、本発明特許出願において用いられるエピトープとは異なるエピトープを用いる、異なる病原体からなるワクチンである。本出願は、プラスミド、タンパク質、又はハイブリッドポリペプチドからの抽出物の域を超えた。クローニング生成物を単離したが、後にこの生成物を処置して、その有効成分がクローニングポリペプチド配列である組成物を生成した。該薬剤、組成物、及び投与経路により、既存のワクチンに対する予想外で新規の利点が示される。該配列は、当技術分野でかつて開示されたことも認知されたこともなく、その上、大腸菌ＪＭ  １０９株内におけるクローニングは、リポソーム媒体内に含有され、病原性生物に対する免疫原性の置換をもたらすＤＮＡワクチンの生成により終結する多岐にわたる手順の１段階にすぎない。リポソームは、有効成分の保護及び組み込みを容易にする製剤を担持する媒体として用いられる。将来のＬｉｐｏｐｌｅｘであるプラスミド−リポソーム複合体は、飼料製造過程において魚用栄養製剤に添加される。投与されると、該飼料は摂取され、非免疫生体（ｗｈｉｔｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）の腸管腔領域内で吸収される有効成分は、該領域及び他の組織内で速やかに発現され、防御的な免疫応答をもたらした。これらの態様は、当技術分野における新規性を享受するだけでなく、本発明に大きな主導権（ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）を賦与する。
【００２７】
ＪＰ２０００２９５９９４による日本の発明特許出願は、分子的技法を介して、キシリトール精製の問題を解決する。日本の出願は、プラスミドベクター中に含有される酵素であるキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子により大腸菌を形質転換する段階を含む方法を開示する。後に、形質転換された微生物は、Ｄ−キシルロースからキシリトールを生成する能力を獲得する。ＪＰ２０００２９５９９４による日本の発明特許出願は、本発明特許出願との顕著な違いを示す。それらの違いのうちで、本発明者らは、日本の出願が、具体的な大腸菌細胞株を大腸菌ＪＭ−１０９細胞株として主張せず、一般的な形態のみにおいて主張していることを強調しうる。これまでのところ、特許下にある生成物はヒト用である。最後に、該配列、使用、生成物、方法、経路は、本発明特許出願において主張することが望ましい配列、使用、生成物、方法、経路とはきわめて異なる。
【００２８】
プラーク形成を阻害する変異菌株の生成は、日本の発明ＪＰ２００００８３６６５により解決された問題である。日本の出願で開示された工程は、ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｏｗｎｅｉ）のグルコシルトランスフェラーゼＩ遺伝子を得る目的を有する。該遺伝子は、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子に基づく３０ｂｐのベイトを用いるＰＣＲ法を介して増幅される。生成された増幅物は、大腸菌ＪＭ−１０９を速やかに形質転換する発現ベクターに連結される。その後、組み換え菌株を培養し、該酵素を単離し、上清からグルコシルトランスフェラーゼを抽出する。両発明における発明単位がまったく異なるため、日本の発明の出願は、本明細書で保護することが望ましい発明特許出願とは関連を有さない。両出願において主張される工程は、異なる技術の現状に対する解決を提供する。遺伝子の大量の生成及びその単離は、分子生物学における類似の手順であるが、その生物学的概念は異なる。結果として、用いられるベイトが異なり、培養プロトコールは大きな違いを提供する。これらの発明特許出願は、同一の大腸菌ＪＭ−１０９株の使用など全般的な態様を共有するのみであり、得られる組み換え菌株が異なる他、配列又はこの配列の最終的な使用に関する限り、単離された遺伝子は報告されていない。日本の出願において、発明単位は、生物活性を有する酵素の生成である。本発明特許出願において、発明単位は、飼育される動物用の飼料製造工程の開発である。該工程は、薬剤として有効な物質の添加を可能としなければならない。すべての物質は、組み換えＤＮＡ法を介して生成される。
【００２９】
発明特許出願ＪＰ２００００５０８６９は、大腸菌、特に、大腸菌ＪＭ−１０９における自立的な複製能を有する新規のプラスミドを得る段階を開示している。このプラスミドは、グルコバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属種に特異的なベクターとして用いるのに有用である。該ベクターは、グルコバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＩＦＯ  ３１７１菌株から単離された。日本の特許は、説明的覚書において大腸菌ＪＭ−１０９株の使用を開示するが、日本の提起では、プラスミド構築物の宿主となる具体的な菌株なしに、該細菌種及びその使用が広範で一般的な形のみにおいて主張されているので、本発明特許出願とは関連を有さない。本発明者らの先行特許における大腸菌ＪＭ−１０９株という、プラスミドの大量生成段階で用いられるが、主張することが望まれる全般的な工程段階の内部で用いられる菌株の使用は、特定のレベルにある。ヌクレオチド配列の他、コンセプト、使用、及び工程は、日本の発明特許出願と関連を有さない。
【００３０】
ＲＵ２１４３４９２によるロシアの発明特許出願は、ヒトレベルでクローニングされるシステムである、プロインスリン「Ａ」のＩｇＧドメイン（ｄｏｍｉｎｉｏｎ）に結合するリーダーペプチドを発現する新規の組み換えプラスミドの開発を開示し、ロシアの発明で生成されるプラスミドがｐＲＲｐｒｏｉｎｓである。該プロインスリンは、大腸菌ＪＭ−１０９株−ｐＲＲｐｒｏｉｎｓ（組み換え菌株）の培養を伴う工程により調製される。その後、封入体の単離、可溶化、イオン交換クロマトグラフィー、トリプシン及び他の酵素によるタンパク質分解を用いて、インスリンを確実に単離しなければならない。既に考察したすべての発明の場合と同様、ＲＵ２１４３４９２によるロシアの発明特許出願が本発明と共有する独自の特徴は、生成物を生成する大腸菌株及びプラスミドによる形質転換の使用である。即ち、該出願は該菌株をベクターとして用い、これは、当技術分野で広く構想されている態様である。しかしながら、該使用は、常にヒト遺伝子に関し、動物で発現されるタンパク質をクローニングするのに用いることを目論む本発明の場合とは異なる。加えて、関与する配列、ベイト、及び使用がきわめて異なる。解析されたすべての出願において、発明単位は、異なるプロトコール下における、プラスミド又は別のベクターにより形質転換された菌株の培養及び生成物の単離のみに寄与する。工程の段階は細菌株によるクローニングであるが、プラスミドが魚類を攻撃する病原体のウイルスタンパク質（ＶＰ２）に関する検討を含むため、本発明特許出願における発明単位ははるかにより広範である。その後、クローニングされた配列を含むプラスミドが単離され、陽イオンリポソーム内に封入される。この複合体（リポソーム−プラスミド）が、養殖される動物への有効成分のトランスフェクション媒体及び投与用製剤として用いられる。加えて、ワクチンが飼料中に含まれているので、飼料供給の形でワクチンを与える段階を含むまったく新規の発明技術が産業的工程を介して開発されている。これらの態様は、単独又は全体のいずれであれ、当技術分野のいずれの文献においても考慮されていない。
【００３１】
ＲＵ２１３００７１によるロシアの出願は、ヒルジンＨＶ１を調製する方法を開示している。該工程は、分泌ベクターｐＭＴＳ  ＨＶ１又はｐＭＫＳ  ＨＶ１による大腸菌ＪＭ−１０９の組み換え菌株（ＢＰ−３２２６６）の形質転換により実施される。該菌株は、形質転換された後で培養され、すぐに培地又は細胞膜周辺腔から最終的なアイテムが単離された。構築されたプラスミドは、３つの主要なエレメント：アルカリホスファターゼをコードするＤＮＡフラグメント、Ａｃｃｌ部位と結合したヒルジンのＨＶ１フラグメント、及び遺伝子マーカーとしてのアンピシリンに対する耐性を決定する遺伝子を含有する。該システムは、この使用による出血の低減を改善として示す。ロシアの発明特許出願は、クローニングされる遺伝子が、細菌内で増幅することが望ましい遺伝子との類似性を示さないので、本発明特許出願とはいくつかの重要な違いを示す。本発明特許出願において、細菌株は同一であり、それがクローニングベクターであるという意図も定義上は同一であるが、プラスミドも遺伝子も類似性を示さない。本発明者らは、クローニングが、多数の段階からなる工程を主張することが望ましいと考えるならば小さくはない、保護することが望ましい工程内部の段階にすぎないことを考慮しなければならない。既出のすべての出願と同様、ＲＵ２１３００７１によるロシアの出願は、別の生物学的機能を有し、プラスミドの宿主としての大腸菌ＪＭ−１０９株から形質転換される細菌株、及び関連する単離工程を主張するにすぎない。使用及びコンセプトのいずれも、本発明特許出願で用いられる使用及びコンセプトとは異なる。
【００３２】
ＪＰ２０８４１９５の日本の出願は、大量のタンパク質生成過程を開示する。工程は、肝臓タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントからなるプラスミドを内蔵する特殊性を有するベクターによる宿主微生物の形質転換に基づく。該工程を開始するため、肝臓を浸軟させ、酵素で直接処理する。ヒトポリタンパク質（ＨＡＰＥ）又はＨＡＰＥと類似のポリタンパク質をコードするセグメントは、従来の技法により単離される。次いで、大腸菌のＤＮＡを制限酵素で処理して、両方のＤＮＡのシグナルの配列又はコドンを得る。コドンが得られると、発現ベクターすべてを伴うタンデム形態の構造が生成される。ベクターは、ＴＡＣプロモーションベクター及びリボソームへの結合ドメインからなる特異性を示す。これらの構成要素の組み込みにより、細菌株から構築物ｐＯＦＡａｐｏＥが得られる。例えば、大腸菌ＪＭ−１０９株は、形質転換状態下でヒトＥポリタンパク質を生成する。該タンパク質は、微生物が培養される培地中で分泌される。日本の発明特許出願は、本発明特許出願とはいくつかの違いを示す。例えば、細菌株は同一であるが、本発明特許出願における細菌ベクターはヒト用ではなく、同じクローニングベクターを用いようとする生物学的観点から見る限りプラスミドも遺伝子も類似性を示さず、異なる遺伝子がクローニングされるので、クローニングされる遺伝子が、本発明特許出願における細菌ベクター内でクローニングすることが望ましい遺伝子との類似性を示さず、クローニングベクターの使用というこの段階における意図は同じであるが、完全な違いを表す。したがって、プラスミドのヌクレオチド使用及びその配列の違いが残る。
【００３３】
日本の先行特許では大腸菌ＪＭ−１０９株がベクターとして用いられるが、主張することが望まれる本発明特許出願で用いられる配列はヒト配列でなく、したがって、解析されたすべての出願とは異なる。加えて、クローニングはすべての出願に共通する段階であり、これは、細菌株のベクターとしての使用が当技術分野で広く知られる態様であることを意味するが、該使用は常に動物ではなくヒトの遺伝子に関する。加えて、解析されたすべての発明では、発明単位が、異なるプロトコール下におけるプラスミド又は別のＤＮＡベクターにより形質転換された菌株の培養、及び、その後の生成物の単離のみに寄与する限りにおいて、関与する配列、ベイト、及び使用が著しく異なる。主張することが望ましい工程の段階が、宿主細菌を介するウイルスエピトープ（ｅｐｉｔｏｎｉｃ）のクローニングであるため、本発明特許出願における発明単位は、はるかに多岐にわたる。クローニングすることが望ましいペプチド配列は、魚類を攻撃するＩＰＮＶウイルスであるウイルス性病原体のタンパク質ＶＰ２の一部である、７２５ｂｐのポリペプチドである。該細菌は、クローニングされる配列を含有するプラスミドにより形質転換され、次いで、培養され、最後にプラスミドを抽出するように処理され、これが、精製後に陽イオンリポソーム内に封入される。これは、既に考察されたいずれの発明においても用いられていない。このＬｉｐｏｐｌｅｘ複合体（リポソーム−プラスミド）は、魚類において免疫反応を引き起こす能力を有するＡＤＮ配列からなる媒体として用いられる。この技法を用いて魚類に免疫感作することは、該技法の１つの適用にすぎない。新規でまったく独創的な本発明の重要な態様は、これによって飼料供給の形で魚類及び他の生物に薬剤を与えることが可能となり、これは、当技術分野におけるいずれの文献も、単独又は全体として考慮していない態様である。
【００３４】
４．ＤＯＴＡＰリポソームの使用に関連する探索
本発明特許出願では、ＤＯＴＡＰリポソームが、トランスフェクション媒体として、並びに、加えて、複合体及び安定化エレメントとして用いられた。次に、最も重要な発明（ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）について考察する。
【００３５】
国際公開第９８０７４０８号パンフレットによる発明特許出願は、生物学的に活性な試薬の送達又はトランスフェクションのシステムとして開発された陽イオンリポソームの使用を保護する。リポソームの構造は、リポソーム二重層間に挿入された１つ又は複数の物質又は有効作用物質を想定する。この構造は、その内側にある作用物質を保護する。該システムは、「生きたままでの」トランスフェクションにおいて高度の有効性を示す。ポリペプチドの最高度の発現は胃内で得られたが、いくつかの臓器及び組織内での発現も上昇した。参照された出願は、熱、及びその後のコレステロール分子の添加、超音波処理、空隙率の低いフィルターを介する脂質成分の連鎖的な形態への押し出し成形によるリポソームの生成を主張する。参照された発明特許出願は、分子媒体としてのリポソームの使用を主張するが、それは一般的な形態においてである。加えて、この先行特許においてリポソームに認められた使用は、相乗作用的であるコレステロール分子と関連する。提起される発明特許出願において、複合体製剤はその製剤又は相乗作用においてコレステロールを用いず、配列は新規であり使用は特徴的である。複合体の生成が全般的な工程の挿間的段階であることは、本発明者らの優先権（ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）にある。製剤はｌｉｐｏｐｌｅｘと称し、コレステロールを含有せず、その配列はウイルスタンパク質のエピトープをコードする。本発明は、第４項で考察されるすべての先行特許のように、生体活性それ自体として考案されるのではない。リポソームは、魚類の免疫系内において応答を引き起こす配列の発現を目的とする媒体であり、次に本発明者らが検討するすべての出願などの、ヒトにおける美容及び／又は医薬的なタイプの適用ではないので、発明された製剤は、この項に群別されるすべての発明特許出願の製剤とは異なる。
【００３６】
国際公開第９８１０７４８号パンフレットによる発明特許出願は、陽イオンリポソームの使用法及び製造手順を保護する。該使用法は、その脱水及び水和技法に基づく。このため、第１に、細胞は無傷で（ｍｏｒｎｉｎｇ）採取しなければならず、これを培養し、後でそれらが治療作用を有することが望まれる生体の体外でトランスフェクトされる。次いで、「生きた」作用を及ぼすように、細胞が該生体に導入される。参照される発明特許出願は、リポソームの内容物がポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであると主張する。リポソームに導入された情報は、その機能が、それらが投与された個体内に免疫反応を引き起こすことである、２本鎖ＤＮＡ線維又はｍＡＲＮである。該国際公開出願がポリヌクレオチド、特にその遺伝子構造を主張しており、したがって、場合によっては、これにより、プロモーション配列及びリボソームに対する結合配列が提示されなければならない。加えて、リポソームの陽イオン成分はグリセリドである。リポソームの製造手順は、以下の通りにまとめられる一連の段階を含む工程として主張される：脱水段階、次いで、マイクロ流及び押し出し成形をもたらす水和段階が続く。最後に、国際公開第９８１０７４８号パンフレットによる発明特許出願は、「薬剤として許容される」賦形剤を伴う筋肉内経路、皮下経路、静脈内経路、又は腹腔内経路によることが可能である、リポソーム−ポリヌクレオチド複合体の投与経路を主張する。
【００３７】
国際公開第９８１０７４８号パンフレットには、リポソーム−ヌクレオチド複合体の製造手順を含む本発明特許出願との大きな違いの他、リポソームの使用及び適用に実質的な違いが存在するが、リポソームの使用における全般的なコンセプトが同一であり、結果として、本発明特許の出願は新規性を欠くことになる。にもかかわらず、該手順は、いくつかの違いを示す。個体の細胞を抽出する必要なしに「生きたままの」免疫反応を引き起こすリポソームの使用が強調されることはこれらの違いであり、これは、類似の先行特許（ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）では主張も開示もされておらず、その優先権が、培養され、速やかにトランスフェクトされなければならない細胞の抽出物を示唆する手順を明らかに主張する国際公開第９８１０７４８号パンフレットにおいても示されていない。次いで、ある洗練された方法により細胞は個体に再び組み込まれ、そこで、治療作用をもたらす。本製剤において保護することが望ましい手順は相乗作用を用いず、投与経路が国際公開発明特許出願において主張される投与経路とは異なり、本発明特許出願の新規性及び独創性を強調する違いとなるので、本出願に関連するさらなる独創性が存在する。
【００３８】
米国特許出願公開第２００５２４９７９４号明細書による発明特許出願において主張される組成物は、ＤＯＴＡＰリポソームがその１つである、複数種類のリポソームを保護している。米国の発明特許出願は、オリゴヌクレオチドを封入するリポソームの使用を主張する。これらの物質は、サイトカインの分泌を刺激する機能を有する。該オリゴヌクレオチドは、治療された哺乳動物における免疫反応を改善しない。しかしながら、米国の出願では、非免疫生体中においていずれかの免疫反応を引き起こす特異的な配列である、用いられたオリゴヌクレオチドの性格を確立していない。脂質粒子と連結された抗原分子の投与がこの応答に寄与するため、米国の特許出願は、その中で主張される抗原に対する特異的な免疫反応の生成を保護する。主張された組成物が、オリゴヌクレオチド内では指定されない配列を含有するため、米国の発明特許出願の重要な態様は、主張された配列に関する。米国の出願は、オリゴヌクレオチドの核酸が、陽イオン脂質を含有しうることを示す。しかしながら、これは、ホスホジエステル又はホスホチオレートでなければならない。これは、ＣｐＧなどの領域（ｒｅａｓｏｎ）を含有するヒトゲノムに相補的な配列であってもなくてもよく、機能性により一般化されるパリンドローム配列を含有してもよい。
【００３９】
米国の出願は、その残基がホスホジエステル及び相乗作用的な脂質に結合したＣｐＧ領域を有するオリゴヌクレオチドを含有する製剤を主張する。該脂質は、ＰＥＧ若しくはＰＡＯ又はガングリオシド型の構造を示す。この組成物は、リポソーム内に含有される。米国特許出願公開第２００５２４９７９４号明細書による米国の発明特許出願は、ＤＯＴＡＰがその１つである、製剤を産出するのに用いうる一連のリポソームを主張する。本発明者らの優先権の場合、ＤＯＴＡＰリポソーム及びヌクレオチドのみを用いたが、このヌクレオチドは、サケ科魚類のゲストでありその発現が腸内細胞において生じるウイルスペプチドをコードする。本発明者らが検討したすべての先行特許において、リポソームは、非免疫生体に直接に導入される。しかしながら、本発明の大きな違いは、リポソームが、明確に定められたプロトコールにより、魚用飼料をもたらす製剤に組み込まれることである。ＤＯＴＡＰリポソームがすべての哺乳動物における使用ではなくヒトでの使用に向けて考案されているため、同様の出願は、リポソームが魚類において用いられることに言及しない。高等哺乳動物系におけるその使用を主張する先行特許は存在するが、それでも、飼料製造―ヒト以外の生体に腸内放出を介して吸収されうる物質の導入をもたらす一般的な形態における―に関する先行特許は存在しない。
【００４０】
米国特許出願公開第２００３２２０２８４号明細書による米国の発明特許出願において保護される方法は、ＤＯＴＡＰリポソーム、コレステロール、及びウイルスヌクレオチド分子を用いる組成物に関する。該ヌクレオチドは、組み換えアデノウイルスの環状ＤＮＡである。この製剤は、ヒト胃癌に対する免疫反応を中和化する治療担体である。製剤、方法、手順、及び使用が、本発明特許出願において主張することが望ましい製剤、方法、手順、及び使用と異なるので、米国の出願は、保護することが望ましい本発明特許出願とは大きな違いを示す。これらの違いは大きく、本先行特許の発明単位に影響を及ぼさないため、これらの全体については考察しない。
【００４１】
ＥＳ２２２４８３６によるスペインの発明特許出願が、腫瘍様細胞への非ウイルスベクターのトランスフェクション、及び、その後の放射線照射に関する手順を主張している。用いられるリポソームはＤＯＴＡＰであり、このベクターの使用に放射線照射段階が後続する。トランスフェクトされた細胞の発現により、顆粒球コロニー増殖因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が生成される。遺伝子治療の領域におけるトランスフェクトされた細胞の使用、及びその抗腫瘍薬としての使用。
【００４２】
スペインの出願は、本発明者らの先行特許と異なるコンセプトを示す。例えば、調合工程の他、発明された技法の使用においても、それらは高分子レベルでの違いを示す。いずれの先行特許にも共通するのは、トランスフェクションベクターとしてのリポソームの使用のみであり、用いられるプラスミドの他、情報及び方法は、使用及び意図の大きな違いを示す。
【００４３】
米国特許出願公開第２００２１６８６６２号明細書によるアメリカの発明特許出願が、患者における癌の退縮又は進行を決定する方法を開示している。該手順は、試験抗原としてのＳｐ１７分子の検出及び同定に基づく。このため、既に癌と診断された患者の試料が採取（ｐｒａｃｔｉｃｅ）される。試料中では、Ｓｐ１７タンパク質をコードする核酸分子の発現レベルが決定される。次いで、正常な発現レベルが、患者におけるＳｐ１７分子の発現レベルと比較される。それらの間の違いにより、癌の進行又は退縮が示される。
【００４４】
該発明の手順並びにコンセプトは、本発明との重大な違いを示す。それらは、本発明の分野とかけ離れており、まったく異なる発明単位であるため考察しない。
【００４５】
国際公開第９５２７５０８号パンフレットによる国際公開発明特許出願は、哺乳動物において、ある抗原に対する免疫反応をもたらす組成物を開示する。該組成物は、リポソーム（ＤＯＴＡＰ）内に取り込まれ、相乗作用物質（ＩＳＣＯＭ）により統合される抗原を含む。組成物は、経鼻、気管内、経口、皮内、直腸を含むいくつかの経路、及び注水により投与することができる。抗原は、皮膚、気道、尿生殖路、又は別の粘膜表面の感染に関与する生物に由来する。加えて、該微生物は、ウイルス、細菌、マイコプラズマ、又は真菌でありうる。国際公開第９５２７５０８号パンフレットによる発明出願は、それが攻撃しうる病原体又は用いられる配列を定義せずに、発明の分野を拡張している。該出願は、投与経路も製剤も定義していない。該出願は、ＤＯＴＡＰリポソームを媒体として用いる想定された組成物の最終的な機能のみを定義している。しかしながら、国際公開第９５２７５０８号パンフレットによる出願は、同一の抗原を有効成分として定義しているが、該抗原をおそらく生成する配列は定義していない。加えて、国際公開第９５２７５０８号パンフレットによる国際公開特許出願が開示する組成物は、相乗作用物質としてのＩＳＣＯＭの使用を組み込まなければならない。本発明者らの出願は、有効成分が製剤中に含まれる同一の抗原ではなく、異なる組織内で発現され病原体に対する免疫反応もまた生成する分子の一部を生成する配列であり、生物学的関係における根本的な違いが生じることを示唆するため、まず組成物の違いが重要である。
【００４６】
本明細書で本発明特許出願により主張される製剤のＤＯＴＡＰ−ヌクレオチド複合体は、工程の１段階であるだけでなく、むしろ、新規の栄養製剤の封入媒体であることに注目されたい。それは、ＤＯＴＡＰの使用に関する発明でありそのすべてが薬剤複合体の直接的な使用を主張する過去のすべての出願と異なる。これは、複合体が相乗作用と共に異なる方法下で応答を生成し、生体活性が直接的である場合に、リポソーム−有効成分の複合体が用いられることを意味する。既に考察された発明特許出願において、リポソーム−分子複合体及び相乗作用（すべての出願が相乗作用を主張する）は、同一の生物学的機能を有し、さらに重要なことだが、同一の生体活性を有する。一部の先行特許が、非免疫生体中における免疫反応、一般には癌に対する免疫反応の生成を主張するにすぎない。しかしながら、各製剤に由来する手順及び使用は異なり、結果として、それらは、方法の一部として、及び、手順中において主張されている。用いられるコンセプトのために本発明特許出願は他のすべての出願と異なり、放出ベクターの使用に関し類似のエレメントが用いられるが、本発明は直接的な生体活性及びそれに適用されたプロトコールを示さず、例えば、本発明において用いられる配列は、過去に出願されたすべての出願と異なりヒト用ではないため、手順及び／又は使用のいずれの場合においても、違いが残る。言い換えれば、製剤の有効成分が異なる。加えて、動物用の栄養製剤中に放出媒体（リポソーム−ＤＮＡ）を含有する場合、主張することが望ましい工程が異なる。したがって、本出願は、解析されたすべての出願と異なる。第１の違いは、用いられる配列の性格に存在する。第２は、プラスミドの使用意図である。第３に、細菌株を用いて、この菌株における形質転換及びクローニングに関して当技術分野では以前に開示されていないプラスミドによりこれを形質転換し、次いで、該プラスミドをある媒体に導入する、即ち、当技術分野では、ヒトにおける遺伝子治療用の媒体としてのプラスミドの使用における場合と同様に媒体が広く考案されているが、本出願は、新規の使用である、動物への免疫感作用のワクチンとしての媒体及びＡＤＮ配列の使用を開示している。既出において明示した５つの生成物とは異なり、リポソームの使用による工程は回収可能であるがこの工程下での魚類における使用が新規であるので、発明単位は拡張されている。このリポソーム−プラスミド複合体は、その内部にＤＮＡワクチンを含有する媒体として用いられ、加えて、新規でまったく予想外の技法に基づき、飼料供給の形で魚類に提供され、これは、当技術分野における文献が単独又は全体として考慮しない態様である。
【００４７】
本発明は、従来のワクチン接種システムに対して多大の利点を提供する。本発明は、弱毒化微生物からなるワクチンなどのように毒力復帰問題が存在しないので、安全なワクチンを開示する。該ワクチンは、何らかの相乗作用物質を伴う場合に生じる有毒な副作用を及ぼさない。投与形態及び放出媒体として大きな安定性を有することの他、毒性の病原性菌株の攻撃に対する有効な防御が示されている。本発明は、長期的な防御を提示するために考案されている。
【００４８】
５．魚用ワクチン製剤に関する出願の探索
ＧＢ２３０８３６７による発明特許出願は、免疫抑制活性を示すタンパク質の使用を開示する。該タンパク質は、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属種から単離された。それは、非溶血的な性格であり、３０ＫＤａの分子量を特徴とし、酵素活性を示さない。該タンパク質は、細胞の免疫反応を抑制する特徴を示し、特に、フルンケル（ｆｕｒｕｎｃｕｌｏｕｓ）に対する免疫感作を魚類、特に、サケ科魚類に行うワクチン製剤において用いることができる。用いられるコンセプトに関する限り本発明との違いは基本的であり、製造工程に関する違いは多岐にわたる。何にもまして、英国の出願は、ワクチンの投与形態にも最終的な組成にも言及しない。それは、目的及び「ワクチン製剤において又は魚用に用いうる」ことのみに言及する。英国の出願は、魚類へのワクチン接種の方法又は形態にも、そのための具体的な製剤にも一切言及せず、英国の出願では投与形態がまったく看過されている。発明単位が工程保護の目的を具体的に指向し、新規段階の保護を意図し、それらにおける予想外の利点を示す本発明特許出願の場合はまったく異なる。加えて、既存の工程に関する限り、本発明は新規である。加えて、各段階は、例外的な生成物を特に提示する。最終生成物の１つは、その製剤、放出機構、経路、及び製剤が、英国の出願による発明単位とは明確に分離され、本発明特許出願では明確に定義される魚用ワクチンである。
【００４９】
米国特許第５９３９０７３号明細書による米国の発明特許出願は、魚類において膵臓疾患をもたらすウイルス株の単離を開示する。該ワクチンは、有効成分として不活化ウイルスを提示する。加えて、診断補助キットが保護される。診断は、評価される魚類試料に特異的なウイルス形態を検出する抗体を見出す段階に基づく。該抗体は、検出可能なマーカーを有する。該方法は、魚類試料を採取する段階、試薬による反応、及びその後の試料中におけるウイルス量の検出を含む。該出願は、特異的な組織からのウイルスの検出に関する他の手順も主張する。違いは大きい。第１に、米国の発明特許出願は、弱毒化ウイルスを用い、核酸配列を用いない。ワクチンは同じウイルス（ＩＰＮＶ）に対して効果を及ぼさない。本発明特許出願は、それに対して防御すべき病原体に特異的な製剤を主張する。米国の出願は、プラスミド、菌株、又はリポソームの使用又はこれに対する言及を行わず、その放出は、それに対して防御することを所望するウイルス用の栄養製剤と結合されない。
【００５０】
米国特許出願第５９１４２６０号明細書による発明は、魚類、特に、アトランティックサーモンにおける膵臓疾患を引き起こす新規のウイルスについて説明する。ウイルスの単離法が開示され、また、ウイルス株又はワクチンなど該ウイルスに由来するタンパク質及び／若しくはポリペプチドの使用も開示される。診断キットは開示されるが保護されない。ウイルス株のみが主張されている。本発明特許出願との違いは大きい。該方法、使用、配列、手順、及び、本発明と異なる特徴については考察しない。
【００５１】
サケ感染性貧血症（ＩＳＡ）ウイルスに対するワクチンは、ノルウェーの優先権及び国際公開第００７２８７８号パンフレットによる国際公開発明特許の提示の下で開示されている。該発明は、ウイルスカプシドからの単離体である免疫原性タンパク質をコードするウイルスＡＤＮ配列として開発された、ＩＳＡウイルスに対するワクチンの開発に関する。ウイルス核酸配列検出用の診断キットもまた開示される。ワクチンは、ウイルスタンパク質をコードするＡＤＮ配列を含むことを特徴とする。本発明特許出願との違いは大きい。国際公開第００７２８７８号パンフレットによる発明特許出願は、同じ配列又は類似の機能性を示さない。加えて、配列をクローニングするのに用いられるプラスミドは、本発明で用いられる配列と関連を示さない。最後に、国際公開特許の発明は、リポソームも用いず、何らかの製剤についての説明も行わない。工程は、国際公開発明特許出願において言及されていないので、該発明分野の外にある。
【００５２】
ＥＰ１０９４０６９による欧州の発明特許出願は、その主要なエレメントがウイルスの構造タンパク質をコードする核酸配列である製剤を保護する。検討された微生物は、サケ感染性貧血症ウイルスであった。欧州の発明出願では、タンパク質（ＳＰ１）の単離、診断又はワクチン用の使用の意図及び試薬が主張されている。ワクチン組成は単純であり、核酸配列又はタンパク質及び「許容される」担体を含む。キットは診断用に主張されている。主成分は、従来の免疫学的側面に基づき、このタンパク質（ＳＰ１）を認知する抗体により、試料中における核酸又はタンパク質（ＳＰ１）が検出される。本発明特許出願との違いは、配列、クローニングベクター、媒体又は担体、製剤中におけるプラスミド及びリポソームの存在に由来して大きい。製造工程内におけるワクチンの完全性は、新規性又は独創的レベルにおいて既に考察した出願による影響を受けない。
【００５３】
米国特許出願公開第２００５１６４１７６号明細書及び米国特許出願公開第２００５５２６１２２７号明細書による米国の発明特許出願は、ＩＳＡウイルスに対するワクチン製剤及び魚類への免疫感作のための異なる核酸配列又はペプチド配列の使用を開示する。該ワクチンは、合成された配列がウイルスに由来するか又は類似形態にあり、該配列がペプチドに翻訳されるという事実に基づく。米国の出願では、該タンパク質がウイルス抗原性応答を引き起こす表面であるという基準が適用されているので、該ペプチドはワクチンの一部である。したがって、いずれの場合も、ＩＳＡＶに対するワクチンの使用が開示され、特異的なペプチド配列のワクチン内への組み込みが、いずれの先行特許によっても保護されている。加えて、ワクチンは薬剤形態の他、診断キット及び組成物を含有する細胞（形質転換細胞）としても保護されている。本出願との違いは、用いられた配列、ベクター、プラスミド、及び微生物に由来して大きい。共通する態様は、ＤＮＡワクチンのコンセプト又は含まれるポリヌクレオチドに関連することに限り、形質転換媒体若しくは放出媒体又はこれらと同じ製剤が大きく異なっているため、なお、重要な違いが残る。これに劣らず重要な別の異なる態様は、本発明の特許出願において構想される意図とは異なる意図である。ワクチンは、本発明特許出願において主張される新規な発明工程の生成物であるので、本発明者らが工程について語っていないことに注目されたい。
【００５４】
米国特許出願公開第２００５２２６８９５号明細書による米国の出願が開示する魚用ワクチンは、配列の保存を除き同じ発明単位を開示する米国特許出願公開第２００５１６４１７６号明細書及び米国特許出願公開第２００５５２６１２２７号明細書による出願の場合と同様に、有効成分としてのヌクレオチド配列又はペプチド配列及び担体を意図する製剤により、サケ科魚類においてピスシリケッチア・サルモーニスに対する免疫の生成を保護する。本発明は、配列、放出及び製剤に関する違い以外に、微生物、クローニングベクター、動物ではなく主にヒトのＤＮＡをクローニングし、陽イオンＤＯＴＡＰリポソームなどのトランスフェクション担体中に製剤を導入するのに用いられてきたプラスミドの使用において違いを示す。プラスミドワクチンを含有する飼料の製造工程に関する違いが残る。
【００５５】
米国特許出願公開第２００４２３５８０号による発明は、ＩＳＡＶに対するワクチンを開示する。抗原性ポリペプチド分子又は抗原性核酸分子が、それらをコードする媒体に封入され、その有効成分が核酸分子であり、加えて担体により構成されるワクチンをもたらす。米国の発明特許出願は、製剤中において相乗作用分子も役割を果たすことを開示し、診断用キットも主張される。本発明は、配列、トランスフェクション、及び製剤の違い以外に、工程及び投与経路に関する違いも示す。
【００５６】
米国特許出願公開第２００４１４６８６０号明細書、国際公開第０３／０３５６８０号パンフレット、ＣＡ２３２１４３７、国際公開第０１１６６５６９号パンフレット、国際公開第０１４９７１２号パンフレット、及び米国特許第６９１１９０８３号明細書による出願は、ＩＳＡＶウイルスに対するワクチンである。すべての出願は、製剤の有効成分としてのペプチド又はヌクレオチド配列の保護である同じ意図を示す。すべての製剤は、ＩＳＡＶに感染した動物から得られた抗体に結合するポリペプチドをコードする配列に基づく。診断キットもまた、発明特許出願の一部で主張されている。本発明は、大きな違いを示す。組み換えプラスミドにおいて現れる配列及び陽イオンリポソームにより実施される放出の違い、新規の薬剤組成物を定義する違い以外に、配列がＩＰＮＶウイルスなどの異なるウイルスの配列であるため異なり特徴的であることから、第１の大きな違いは有効成分である。栄養製剤における経口経路を含む放出過程によっても大きな違いが残る。
【００５７】
ＫＲ２００３０７８８０７、ＣＡ２４０７３０１、及びＣＡ２３８１７０８による出願は、ピスシリケッチア・サルモーニスに対するワクチンを提示する。前出の一連の特許と同様に、本節にまとめられた出願はすべて、その活性物質がハイブリッド的又は分子的な性格を有する魚用ワクチンであり、魚類へのワクチン接種後にヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の放出により免疫反応をもたらす製剤であるために本発明と関連するにすぎない。本発明特許出願との違いは大きく、組成も異なる。クローニング段階において役割を果たすベクターが異なり、放出は他の経路によってなされ、他の作用物質が役割を果たす。まとめると、本発明特許出願において主張されることが望ましい組成物に類似する、ＩＰＮＶウイルスに対するＤＮＡワクチン製剤は見出されない。
【００５８】
国際公開第２００３／１０１４８２Ａ３号パンフレットによる出願は、リポソームと結合した１つ又は複数の魚類病原体に由来する抗原性物質を含む魚用ワクチン製剤を開示し、場合によって他の治療化合物を含む。ワクチンは、これらの魚類病原体に対する免疫感作又は治療的処置に用いることができる。該発明はまた、リポソームによるワクチンの調製法、投与法、及び保存法も主張する。
【００５９】
該国際公開出願は、ＩＰＮＶに対するワクチンを生成するのに用いられるリポソームを主張するが、記載された配列は、ベイト配列も発現されたペプチド配列も報告されていない。組成物は、その成分によって主張されなければならないが、該国際公開出願では、組成物に由来するどの部分が具体的にＤＯＴＡＰ陽イオンリポソームであるのかを確立していない。加えて、主張された組成物は、決定された魚種用の特異的な使用を有し、本発明特許出願において保護することが望ましい使用と異なる。該国際公開出願の薬剤組成物は、ＩＰＮＶウイルスのヌクレオチド配列でありうる有効成分である「リポソーム」により構成される。しかし、既存のいずれのリポソームであるかが説明されていないため、１つ又は複数の脂質クラスが、１つ又は複数の生体活性物質、１つ又は複数のアジュバント作用物質、生体活性作用物質、及び「薬剤として許容される」担体であることが曖昧に示されるにとどまる。即ち、ほとんど無関係とは考えられるが、国際公開発明特許出願は、主張されることが望ましい組成物を報告していない。加えて、製造工程が明らかに異なっており、国際公開出願は、有効成分が魚類にどのように与えられるかについても説明していない。国際公開出願が確立するのは、生成物がリポソームによる製剤から生じるということである。しかしながら、本発明特許出願において、生成物は、特に感染性膵臓壊死ウイルス用のワクチンを含有する栄養製剤である。同じ技法を他の病原体にも用いることができる。
【００６０】
チリには、魚用ＤＮＡワクチン製剤に関連する発明特許出願がただ１つだけ存在する。「抗原及びアジュバント、溶媒又は薬剤として許容される媒体、並びにＡＤＮ配列及び抗原タンパク質を含む、魚類中のカイアシ類（ｃａｌｉｇｉｄ  ｃｏｐｅｐｏｄ）による感染に対するＤＮＡワクチン及びペプチド」と称する発明特許出願である。本出願との違いは、用いられた配列、プラスミド、宿主細菌、及び生体に由来して大きい。共通する態様は、ＤＮＡワクチンのコンセプト又は含まれるポリヌクレオチドに関連することに限り、例えば、形質転換媒体又は放出媒体及び製剤が大きく異なっているため、なお、重要な違いが残る。別の重要な態様は、本発明の特許において構想される意図とは異なる意図である。ワクチンは、本発明特許出願において主張される新規な発明工程の最終生成物であるので、本発明者らが、工程について語っていないことに注目されたい。
【００６１】
６．ＤＮＡワクチンを含有する魚用栄養製剤の調製に関する出願の探索：
この探索基準の下で一致する文献は見出されず、このため、主張することが望ましい工程は新規であり、大きな独創性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】用いられるベイトは、図１で見ることができる。
【図２】図２は、以下のベイト：  センス      ：Ｓ１、Ｓ１ｐ  ６０８ｂｐのフラグメント（ベイトＳ１ｐ及びＳ２ｐ）  アンチセンス：Ｓ２、Ｓ２ｐ  ７２５ｂｐのフラグメント（ベイトＳ１及びＳ２）   組合せ              増幅のサイズ（ｂｐ）  Ｓ１ｐ及びＳ２ｐ    ６０８  Ｓ１及びＳ２        ７２５   により増幅されたウイルスＡＲＮに由来する免疫原性配列の増幅スキームを示す。
【図３】図３は、本先行特許のために生成されたＩＰＮＶのＶＰ２タンパク質の免疫原性ウイルスペプチドをコードする７２５ｂｐの遺伝子領域の配列を示す（その配列決定は、チリ大学理学部バイオテクノロジーセンターにおいて実施された）。
【図４】図４では、ベクターｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘＴＯＰＯの多重クローニング領域が詳細に検討される。
【図５】図５は、トランスフェクトされた細胞培養物から単離されたｐｃＤＮＡ−ＶＰ２プラスミドからの挿入配列の増幅を示す。
【図６】図６は、プラスミドワクチンの構造的安定性の評価結果を示す。
【図７】ワクチンが飼料中に組み込まれ、油分で被覆されると、油分混合機が１８０°回転して、秤量包装用（ｐｒｅ−ｅｎｃａｓａｄｏ）ホッパーの投入口に位置合わせする。油分混合機が投入位置に置かれると、該装置のバタフライ弁が開放され、秤量包装装置へと直接に供給するホッパーにすべてのバッチ製剤が自由落下する。該工程のさらなる詳細は、図７及び８に付属のフローチャートに見ることができる。
【図８】ワクチンが飼料中に組み込まれ、油分で被覆されると、油分混合機が１８０°回転して、秤量包装用（ｐｒｅ−ｅｎｃａｓａｄｏ）ホッパーの投入口に位置合わせする。油分混合機が投入位置に置かれると、該装置のバタフライ弁が開放され、秤量包装装置へと直接に供給するホッパーにすべてのバッチ製剤が自由落下する。該工程のさらなる詳細は、図７及び８に付属のフローチャートに見ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
［発明の説明］
本発明は、工程及び生成物を保護する意図を有する。該工程により、養殖システムにおける生体の飼料中に含まれる病原性ウイルスに対するある種類のＤＮＡワクチンからなり、分子生物学の技法を介して開発された動物用薬剤組成物の調合が可能となる。保護される生成物は、上述の薬剤組成物であり、その主要な特性は、大量生産システム内にある動物に対して、経口形態で―各個体を操作することなく―投与しうることである。
【００６４】
本出願において達成された成果は、より具体的には漁場システムにおけるものであり、魚類病原体に対するものであった。本発明は、ウイルス病原体に対するＤＮＡワクチンの製造工程を主張することを目論む。このワクチンは、魚類、特に、サケ科魚類に適用され、漁場施設向けに考案されている。本発明は、ウイルスポリペプチド成分をコードする遺伝子配列の単離から産業的規模での工程までに及ぶいくつかの段階からなる。該工程は、個体がワクチンを含有する飼料を貪欲に摂取し、これが魚類によって腸溶性の形態で吸収され、魚類の異なる組織において薬理学的作用を及ぼすように、美味の賦形剤を伴う本製剤の作製において存在する。
【００６５】
保護される製剤は、その有効成分をリポソームとも組み合わせてプラスミド中に含有される対象の遺伝子配列であり、飼料の一部である製剤として、経口形態で投与されるように考案される。
【００６６】
本発明は、任意の種類の生体に免疫感作するワクチンを含有する飼料の製造に適用しうる工程を主張することを目論む。本事例では漁業に適用されるが、本工程は、とりわけ、鳥類、ブタ、ウマ、ヤギの肥育業に適用可能な工程でありうる。
【００６７】
ウイルス、タンパク質、及びベイトの生成
感染性膵臓壊死ウイルス（ＩＰＮｖ）は、ビルナウイルス科のウイルスであり、ＡＲＮ二重鎖からなるそのゲノムは２分され、小型のサブゲノムセグメント（セグメントＢ）が酵素であるＡＲＮ依存性ＡＲＮポリメラーゼ（ＶＰ１）をコードするのに対し、大型のセグメント（セグメントＡ）は、ポリタンパク質ＮＨ２−ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３−ＣＯＯ−をコードする（ここで、ＶＰ２及びＶＰ３は構造タンパク質であり、ＶＰ４は、これにより前駆体である中間体が逐次生成され、次いで、機能的な成熟成分が生じる、タンパク質分解による自己分解過程を担うウイルスプロテアーゼである）。これらは、全面的に曝露されるか又はウイルスカプシドの最外層において部分的に曝露されるＶＰ２、ＶＰ１と相互作用する（このためにカプシドの内側に存在すると本発明者らは考える）タンパク質であるＶＰ３、及び自己分解過程の一因をなすプロテアーゼであるＶＰ４である（Ｄｕｎｃａｎ及びＤｏｂｏｓ、１９８６年；Ｄｕｎｃａｎら、１９９１年）。
【００６８】
第１段階は、病原体の遺伝物質、本例ではＡＲＮ又はＤＮＡを得る段階である。ＡＲＮは、明らかな免疫原性を有するタンパク質セグメントをコードする配列の増幅に必要である。サケ科魚類を攻撃するＩＰＮＶウイルスの場合、ＶＰ２タンパク質のサブユニット「Ａ」領域をコードする相補的ＤＮＡが増幅された。この目的で、サケ胚細胞のコンフルエントの単層であるキングサーモンＣＨＳＥ−２１４細胞（ＡＴＣＣ  １６８１）にＩＰＮウイルスを感染させた。感染後期間の経過後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｇｅｎ社製）を用いて全ＡＲＮを抽出した。細胞からウイルスＡＲＮを単離するため、ＱＩＡａｍｐ（Ｑｉａｇｅｎ社製）キットを適用し、純粋形態におけるウイルスＡＲＮを得た。
【００６９】
第２段階は、増幅したヌクレオチド配列を得る段階である。この目的で、対象の抗原領域を含有するウイルスタンパク質をコードする遺伝子配列を定義した後で、まずＡＲＮによるベイト、その後、相補的ＤＮＡ（ＡＤＮｃ）を、すべてインバースポリメラーゼ連鎖反応及びポリメラーゼ連鎖反応を介して構築した。用いられるベイトは、図１で見ることができる。これらにより、特に、ＩＰＮウイルスのカプシドタンパク質サブユニット２によるエピトープをコードする情報を選択的な形で増幅及びクローニングすることが可能となる。ＩＰＮウイルスの具体例において、増幅されたヌクレオチド配列は、その起点がアミノ末端から約２５０ｂｐに存在するＩＰＮＶのセグメント「Ａ」の配列であった。これを検討するため、このウイルスについて記載された６つの遺伝子群に対応する、以下の血清型：Ｖｒ２９９、Ｊａ−ＡＴＣＣ、Ｃ２、Ａｂ、ＡＳＶ、Ｓｐ、及びＨｅの配列に対するバイオインフォーマティックス解析を考慮した。Ｖｒ２９９血清型は、チリ国内におけるその遍在性を踏まえ、基準血清型として採用した。アライメント解析及び相同性解析は、ジーンバンクのデータベース及びヌクレオチド配列のアライメントプログラム（ＢＬＡＳＴ又はＤＮＡｍａｎ）により実施した。解析により、ウイルスゲノムの増幅された配列は、残りのＩＰＮＶ血清型に対して８５％を超える相同性を有することが示された。
【００７０】
ウイルスの全ＡＲＮに由来する逆増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）法の実施にプロトコールを適合させた。対象ウイルスゲノム領域のＡＤＮｃは、後のＰＣＲ法による増幅の鋳型として用いられる。２つのアンチセンスベイトであるＳ２及びＳ２ｐを評価し、これらをＩＰＮウイルスのサブユニットＡに特異的な配列とハイブリダイズさせ、相補的なＤＮＡ線維を生成するよう設計した。
ＡＤＮｃが得られたところで、ベイトの異なる組合せを有する配列を増幅した：図２は、以下のベイト：
センス      ：Ｓ１、Ｓ１ｐ  ６０８ｂｐのフラグメント（ベイトＳ１ｐ及びＳ２ｐ）
アンチセンス：Ｓ２、Ｓ２ｐ  ７２５ｂｐのフラグメント（ベイトＳ１及びＳ２）
組合せ              増幅のサイズ（ｂｐ）
Ｓ１ｐ及びＳ２ｐ    ６０８
Ｓ１及びＳ２        ７２５
により増幅されたウイルスＡＲＮに由来する免疫原性配列の増幅スキームを示す。
【００７１】
ＰＣＲ法により得られるフラグメントは、アガロースゲル中で可視化され、分光光度法により定量された。その後、エタノールを用いる沈殿反応により、６０８ｂｐ及び７２５ｂｐの単位複製配列を精製する手順が実施された。
【００７２】
図３は、本先行特許のために生成されたＩＰＮＶのＶＰ２タンパク質の免疫原性ウイルスペプチドをコードする７２５ｂｐの遺伝子領域の配列を示す（その配列決定は、チリ大学理学部バイオテクノロジーセンターにおいて実施された）。
工程の第３段階は、プラスミド構築物の形成及び発現ベクターへの挿入である。哺乳動物の発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘＴＯＰＯにより、効率の高い増幅産物の挿入が可能となる。用いられるウイルスプロモーターは、翻訳ポテンシャルを有するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）であり、これを用いて高レベルの発現を得た。ＰＣＲ産物から生成されたポリペプチドを検出及び精製する目的で、このポリペプチドは、エクスプレス（Ｘｐｒｅｓｓ）（登録商標）のＮ末端及び残りのヒスチジン（インビトロジェンライフテクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（登録商標）社製）に隣接する形で発現させる。
【００７３】
プラスミド構築物は、プラスミドｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘＴＯＰＯを宿主とする所望のポリペプチドをコードする配列を含む。このプラスミド構築物を、ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２と命名する。このベクターを増幅するためには、既知量の対象挿入配列により形質転換された大腸菌ＪＭ−１０９株を用いた。選択圧力（カナマイシン及びアンピシリン）を加える液体培地中での組み換え菌株の増殖後に、プラスミドを有する細菌クローンを単離した。挿入を含む及び含まない状態で制限酵素ＰｖｕＩＩにより切断された配列を比較した後に、また、多重クローニング領域をプラスミドｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘＴＯＰＯに特異的なベイトで伸長させたときに、遺伝子の挿入及びその正しい方向を確認した。図４では、ベクターｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘＴＯＰＯの多重クローニング領域が詳細に検討される。
【００７４】
選択圧力を有する培地中における大腸菌ＪＭ−１０９の細菌コロニーの存在により、遺伝物質を受容する菌株の存在が示される。形質転換菌を確実に維持するために、これらを培養槽中のルリア−ベルターニ培地中で４時間にわたり培養し、速やかに−８０℃のグリセロール中で保存した。
【００７５】
プラスミドの精製は、細菌の培養後に実施した。実験室での解析には、Ｂｉｏｒａｄ社製の「Ｑｕａｎｔｕｍ  ｐｒｅｐ．Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ」キットを用いた。拡大培養の場合は、５００ｍｌを上回る容量の細菌培養物からのプラスミドの精製を可能とする、「ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍａｄ  Ｍｅｇａ」キットを用いた。
【００７６】
魚類細胞がクローニングプラスミドｐｃＤＮＡ−ＶＰ２を取り込む能力を有するかどうか、しかも、ＩＰＮＶウイルスのＶＰ２ウイルスタンパク質の一部の挿入配列を発現する条件においてそうであるかどうかを判定するため、サブコンフルエントの単層ＣＨＳＥ−２１４細胞にトランスフェクトし、その後、トランスフェクション後の異なる時点で、プラスミドの全ＤＮＡ及びＡＲＮのＴｒｉｚｏｌによる抽出を実施した。
【００７７】
単離されたプラスミドＤＮＡによりＰＣＲ法を実施し、選択されたベイト対により定義された増幅産物を得た。１％のアガロースゲル中における７２５ｂｐの単位増幅配列の存在により、該細胞株が、挿入配列を伴うプラスミドを取り込む能力を有することが示された。全細胞培養物から抽出されたＡＲＮに対して、ＲＴ−ＰＣＲ法による何らかの解析を実施して、試料中に存在するメッセンジャーＡＲＮからＩＰＮＶのＶＰ２配列を増幅すると、これは、図５に示す通り、トランスフェクトされた細胞培養物に由来するｐｃＤＮＡ−ＶＰ２プラスミドからのウイルス挿入配列の増幅を検証するアガロースゲルを示す。図５は、トランスフェクトされた細胞培養物から単離されたｐｃＤＮＡ−ＶＰ２プラスミドからの挿入配列の増幅を示す。プラスミドＤＮＡ及びメッセンジャーＡＲＮは、ＣＨＳＥ−２１４細胞から抽出された（トラック４及び５）。７２５ｂｐのフラグメントは、ＰＣＲ法によりプラスミドベクターから増幅されて得られた（トラック１、２、及び３）。「０」は分子量マーカーに対応し、「Ａ」は試料中の全ＲＮＡの泳動点であり、「Ｂ」はプラスミドの泳動点である。制限酵素による消化後に、予測される長さと同様の長さのヌクレオチドフラグメントが得られることを検証することができる。また、プラスミドを得る段階により、細胞株内へのプラスミドの取り込みが示される。
【００７８】
媒体の選択
本発明は、遺伝子構築されたプラスミドにより恒常的に誘導される発現からなるベクターを含有する新規の細菌細胞株を開示する。この細胞株は、大腸菌ＪＭ−１０９株に対応し、図３に示される挿入配列を伴い、図４に示されるプラスミドにより形質転換され、組み換え菌株である大腸菌ＪＭ−１０９（ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２）を構成する。得られた組み換えプラスミドは、ＩＰＮＶウイルスのカプシドタンパク質サブユニット２の一部である対象ポリペプチドを合成するのに必要な情報を含有する。形質転換後、細菌はベクターを組み込み、この遺伝子成分を増幅する能力を有する。決定された製剤により、経口経路を介してこのプラスミド構築物（ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２）を投与すると、特に魚類の非免疫生体中で免疫反応が生じる。プラスミドはまた、アンピシリンからなるマーカー遺伝子も提示する。組み換え菌株である大腸菌ＪＭ−１０９（ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２）は、ＢＣＣＭ（ベルギー微生物保存機関）に寄託され、その寄託番号はＬＭＢＰ  ５３３３である。
【００７９】
本発明の重要な態様は、プラスミドが、クローニングされた後で単離され、陽イオンリポソーム（ＤＯＴＡＰ）と複合され、「Ｌｉｐｏｐｌｅｘ」と称する複合体を生成することである。本発明の１段階ではあるが、Ｌｉｐｏｐｌｅｘは、それ自体で免疫グロブリンの合成を誘導する。
【００８０】
ＤＯＴＡＰリポソームの使用により本先行特許が解決する問題は、無傷細胞（ｍｏｒｎｉｎｇ  ｃｅｌｌ）が高いトランスフェクション率でプラスミドによりコードされるポリペプチドを発現する、間接的な形質転換手順を確保することである。
【００８１】
「ｌｉｐｏｐｌｅｘ」複合体中に含有されるＤＮＡの定量化に関しては、報告におけるＤＮＡ：ＤＯＴＡＰが１：４のｌｉｐｏｐｌｅｘ試料を遠心分離にかけ、その後水中で再懸濁させ、次いで、アガロースゲル中に投入したことが指摘できる。ＤＮＡ含有量の推定は、比重計解析により実施した。左側には分子量マーカーが示される。
トラック１：ＭＥＭ培地中４２ｎｇのプラスミドＤＮＡ。
トラック２：ＭＥＭ培地による処理及び遠心分離後におけるプラスミド抽出物の再懸濁。
トラック３：ＭＥＭ培地中４２ｎｇのＬｉｐｏｐｌｅｘプラスミド。
トラック４：Ｌｉｐｏｐｌｅｘの遠心分離後におけるＭＥＭ培地中での再懸濁。
トラック５：ＭＥＭ培地中１７０ｎｇまでのＤＯＴＡＰ
トラック６：ＭＥＭ培地のみ
【００８２】
Ｌｉｐｏｐｌｅｘは、陽イオンリポソーム（ＤＯＴＡＰ）に複合又は封入されたＤＮＡベクターとして、それ自体で免疫反応を誘導することができる。該ワクチンは飼料に導入され、これは、ＩＰＮウイルスのヌクレオチド配列がプラスミドにより発現され、魚類の飼料ベースと調合されることを意味する。試料は消化管内で消化され、ワクチンは、個体の腸内で放出される。薬剤組成物（リポソーム−ＤＮＡ）は、必要とされる治療的応答をもたらす。この応答は、ウイルス遺伝子配列の細胞による取り込みの結果であり、これによりウイルスペプチドの発現が生じる。ゲストにより未知のポリペプチド配列が示される時、細胞は免疫反応を誘導し、これにより、該配列を自らの表面又はウイルスカプシド中に含有する作用体による感染に対する防御を誘導する。
【００８３】
図６は、プラスミドワクチンの構造的安定性の評価結果を示す。実験的に最適化された条件によるＣＨＳＥ−２１４の細胞培養物にトランスフェクトし、６、１２、２４時間後にプラスミド及びメッセンジャーＡＲＮ（ａ）を発現し、プラスミド及びメッセンジャーＡＲＮ（ａ）を得た。ＲＴ−ＰＣＲ法により、メッセンジャーＡＲＮから７２５ｂｐのＩＰＮＶ挿入配列（ｂ）を増幅した。
【００８４】
このワクチンの、特に魚類への、飼料の形態における投与はまた、ワクチン接種の過程を容易にし、養殖中の魚類の種に応じた最適のワクチン接種段階を選択する可能性を増大させることも仮定する。魚類が病原体に対してより感受性である段階を決定することもでき、特定の養殖種における挙動の動態及び各影響に基づき応答及び有効な抵抗性を誘導することもできる。
【００８５】
導入された病原体を根絶する有効な代替法を我が国に適用することは、微小動物相環境に対する明らかな有害作用を伴う抗生剤の無差別的使用を緩和することに寄与するので、本発明は、加えて、生態学的有益性も提示する。
【００８６】
飼料ベース製造工程の説明
１）製剤、用量、及び混合物：
実験結果により、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ取り込みの条件は、具体的には、水溶液の重量に対して０〜５０％の範囲内、より具体的には、飼料重量に対して０〜２５％の範囲内になければならないことが決定された。飼料粒子の均一な広がりの範囲に加え、散布要素としての噴霧器の使用が定義された。
【００８７】
一連の工程は、動物生産施設用の飼料を生成する任意の種類の生産工程向けであることを意図する。しかしながら、本出願では、その投与形態がペレットである飼料製造に関する工程のみが開示され、そのために一般的となる。
【００８８】
第１段階では、飼料ベースを調合するための原料がすりつぶされる。選別する段階は、環境基準及び国際基準に基づいて既に決定されている。
【００８９】
完成品が生成される工程は、粉末成分混合バッチ及び油分混合バッチの稼働により動物の特定の食餌を構成する１つずつの成分が投入される食餌の調合により始まる。液体生成物と共に投入しなければならないペレット量の他、特定のワクチンなど、非免疫生体に応じて液体成分により投入しうる特定の成分も、バッチ内でプログラムされる。
【００９０】
投入及び混合の段階では、成分及び添加物が秤量及び混合され、食餌乾燥粉末成分に適した比率及び均質化が得られる。
【００９１】
２）押し出し成形
この段階では、水、油、及び／又は添加剤と混合された成分が、油分及び圧力を介して既に調製されている。押し出し成形機バレル内のエンドレススクリューにより圧力が加えられる。バレルの端部には穴のあいた層又はマトリックスが配置され、これによって２つの球面部分を伴う円筒形の形態が与えられる。この段階により、マイクロカプセルのエッジと同様の丸型エッジを有するマイクロペレットに最終的な形態が与えられる。湿潤式の押し出し成形により、各種の生成物に必要な形態及び物理的外観を有し一定の形に凝集したペレットベースを得るための、食餌の異なる成分に由来するタンパク質テクスチャーの他、炭水化物の部分的なゼラチン化も可能となる。
【００９２】
３）飼料ベースへのＬｉｐｏｐｌｅｘの添加法の説明
既に示した通り、飼料ベースは、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体に添加される媒体であり、その添加工程は、２つの機構：１．真空散布、及び２．単純散布を介して実施することができる。
【００９３】
１．真空散布：
ワクチンの飼料への組み込み工程は、乾燥経路（ａ）及び液体経路（ｂ）の２つの供給経路を有するバッチ工程において展開される。
ａ）乾燥経路は、重量であらかじめ定められた量のペレット形態における飼料ベースを投入する段階からなり、該飼料ベースは、真空式油分混合機に投入される。真空をかけると、油分混合機内に大気圧よりも低い圧力が生成され、減圧時には、油分混合機の自由空間の他、飼料中に既に存在する油分のうちより低い融点のオレイン酸部分により、ペレット内部からも空気が抜かれる。
ｂ）液体経路は、乾燥経路と並行して、また、２つのデポジット（ｄｅｐｏｓｉｔ）を有し、その１つではサイズに応じてあらかじめ投入されたＬｉｐｏｐｌｅｘを保持し、他のデポジットでは油分混合バッチにおいてプログラムされた量の飼料ベースを保持する、２つの段階を介して稼働する。第１段階では、真空状態下の微粒散布及び混合によりワクチンが添加され、すべてのペレットに適する含浸が確保される。次に、ゆっくりと真空が解除されて空気が流入し、大気圧に復帰することが可能となり、当初は自由油分の一部と共に表面にあるワクチンが、空気によりペレット内部に押し込まれることを促進する。第２に、通常の大気圧下において、第２のデポジット内であらかじめ秤量しておいた魚油もまた混合状態下での散布により微粒状で添加され、配管内に余剰のワクチンがあれば魚油に引き込まれる。この工程は、トップコーティングと呼ばれ、ペレット１粒ずつのすべての表面を被覆し、飼料表面における有効成分の直接的な曝露を最小化する。
【００９４】
ワクチンが飼料中に組み込まれ、油分で被覆されると、油分混合機が１８０°回転して、秤量包装用（ｐｒｅ−ｅｎｃａｓａｄｏ）ホッパーの投入口に位置合わせする。油分混合機が投入位置に置かれると、該装置のバタフライ弁が開放され、秤量包装装置へと直接に供給するホッパーにすべてのバッチ製剤が自由落下する。該工程のさらなる詳細は、図７及び８に付属のフローチャートに見ることができる。
【００９５】
２．単純散布
飼料へのワクチン組み込みのこの第２の選択肢は、第１の場合と同様、乾燥経路（ａ）及び液体経路（ｂ）の２つの供給経路により展開される。
ａ）乾燥経路は、角度及び速度の変化する回転ボイラー型混合機に組み込まれた、あらかじめ定められた量のペレット形態における飼料ベースを秤量装置により分類する段階からなる。このシステムにより、回転に基づき、ペレット飼料の均等な混合が得られる。回転数は５〜５０ｒｐｍ、定位角度は水平位置に対して１０°〜３５°で段階的に変化させ、均等な混合サイクルを得なければならない。次いで、液体経路が実施される。
ｂ）液体経路は、混合機と共に稼働し、飼料ベースのサイズ及び量に応じてあらかじめプログラムされた分注機と接続されたスプリンクラーのみからなる。球形の飼料は高度に吸湿性であり、このため、スプリンクラーにより散布される液体を効率的に吸収するので、実施される含浸段階は瞬間的である。
【００９６】
スプリンクラーによりワクチンが飼料ベースに組み込まれると、混合機が１８０°回転して、秤量包装用ホッパーの投入口に位置合わせする。投入弁により、秤量包装装置へと直接にフィードするホッパーにすべてのバッチ製剤が自由落下する。
【００９７】
４）乾燥及び冷却
これは、最終生成物に必要な水分量を調節することを可能とする物理的過程である。そこで、生成物は冷却され、高温による微生物分解と関連する危険性を回避する。工程は、工業規格により生成物を包装することを目的とする、包装する段階により終了する。
【００９８】
５）包装
工程は、一連の規格により生成物を包装することを目的とする、包装する段階により終了する。
【００９９】
経口ワクチンを送達すると考えられる異なる生物用の飼料ベースは、生物の必要及び治療を行う時点において生物が置かれる増殖サイクルの段階に応じて、いくつかのサイズ及び栄養組成で実現される。
【０１００】
本出願は、個体の大規模なワクチン接種など、複数の技術的問題を解決する。ワクチンの操作を回避する今回の幼魚の場合、本発明により、経口ワクチンの容易な投与に関連する操作的な有益性の他、高度の安定性及び簡便な保存法も示唆されることが強調される。
【０１０１】
［適用の実施例］
Ａ．遺伝子挿入配列ＶＰ２の「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」発現能力の評価
単層ＣＨＳＥ−２１４細胞を８０％のサブコンフルエントに培養した。１２ウェルプレート中のＭＥＭ培地、２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、及び２．５％のウシワクチン血清（ＳＢＦ）において、２０℃の温度で４〜１４日間にわたり細胞を培養した。ＤＯＴＡＰリポソームとの複合体であるプラスミド構築物（ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２）を取り込むため、調製されたＰＢＳにより速やかに細胞を洗浄した。
【０１０２】
説明的な覚書で述べた通り、ＤＮＡのアリコート及びＤＯＴＡＰをＭＥＭ培地中に添加した。次いで、それらを混合し、３０分間にわたりインキュベートした。トランスフェクションは、各混合物を、細胞単層を伴う総容量０．５ｍｌのＭＥＭ培地に添加することにより実施した。トランスフェクションに対して定められたインキュベーション（５％ＳＦＢを伴うＭＥＭ培地中）時間が経過してから、プラスミドの抽出が実施された。
【０１０３】
ＣＨＳＥ−２１４細胞株からのプラスミド抽出は、ＭＥＭ培地の５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）による置換、ＰＢＳによる細胞の洗浄、ある量の試薬の添加、室温で５分間のインキュベーション、クロロホルムの添加、及び、その後、１２０００ｇで１５分間にわたる遠心分離を想定する、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）用に説明されたプロトコールに従い実施された。形成された２相のうち、水様の上相がＡＲＮ及びプラスミドを含有し、下相がゲノムＤＮＡを含有する。
【０１０４】
抽出されたプラスミドは、イソプロピルアルコールにより沈殿させ、遠心分離し、７０％エタノールで洗浄した。最後に、溶媒を蒸発させ、無菌の脱イオン化水中に試料を再懸濁させた。１％のアガロースゲル中にプラスミドＤＮＡ試料を投入し、臭化エチジウム（０．５ｕｇ／ｍｌ）で染色し、２６０ｎｍのトランスライター（ｔｒａｎｓｌｉｇｈｔｅｒ）で可視化した。ゲル中の泳動プロファイルにより、プラスミド全体の完全性が示された。密度計解析により、異なる試験時点に対し、それぞれ、１１．６５、１３．６５、及び４６１ｎｇのプラスミドワクチンが示された。さらなる試験では、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＡＲＮｍから７２５ｂｐのフラグメントが増幅され、３回の評価において所望の増幅産物（７２５ｂｐ）自体を得た。
【０１０５】
工程の例及び飼料製剤
淡水中における養殖サケ用のペレット飼料を調合したが、その結果を以下に示す。これらの飼料ベースの組成の詳細の他、その使用に関する推奨事項を表１に示す。使用に関する推奨事項は表２に示す。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
【表２】
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【０１０８】
治療用量
治療用量は魚類摂食率（ＳＦＲ）に基づくが、治療される生物量の重量％としても表わされる。飼料中のプラスミド濃度は、ワクチンがサイズに応じた飼料中の固有の用量により均等に投与されるように、あらかじめ確立されたＳＦＲに基づき決定されている。こうして、ＳＦＲが低度である条件下におけるプラスミドに関する最小限の要件を満たす送達用量が確認される。ワクチンを伴う飼料投与時に、魚類があらかじめ確立されたＳＦＲよりも高度のＳＦＲを示す場合は、ワクチンを伴う飼料及び伴わない飼料を供給して飼料の量を調整する。異なる飼料サイズに対するワクチン用量及びＳＦＲを、表３に詳しく示す。
【０１０９】
【表３】
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【０１１０】
表４は球形マイクロペレットに対するサイズ規格を含み、表５は円筒形ペレットに対する同様の規格を含む。
【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
ワクチンの免疫原性ポテンシャルの評価例
実験を実施して、飼料ベース中に調合されたワクチンの有効性を決定した。経口ワクチンの投与は、調べた魚類において免疫反応を引き起こすのに十分であり、病原性菌株に対するその抵抗性は、曝露生体試験で検証された。
【０１１４】
経口ワクチン摂取により、アトランティックサーモン（Ｓａｌｍｏｎ  ｓａｌａｒ）の５ｇの幼魚５０００匹に免疫感作した。投与スキームは、飼料により異なる所望のレベルに達するよう希釈される、マスター飼料の加工を含んだ。
【０１１５】
投与及び対照に応じた別個のプール内の幼魚に対して、生解析を実施した。幼魚には７日間にわたりワクチン投与を行った。次いで、ワクチン投与の０．１５、４５、６０日後の時点で試料を得た。Ａｌｌｐｈａｒｍａ社製のワクチンＡｌｐｈａｊｅｔ  １０００を陽性対照として選択し、実験を開始してから４５日間を経過した後の幼魚群に腹腔内経路を介して投与した。
【０１１６】
実験解析を開始して０、１５、及び４５日後の血液試料を得ることにより、レポート遺伝子の発現動態を調べた。ＥＬＩＳＡ解析により免疫反応推定値の決定が可能となり、ここで、プラスミドワクチンにより免疫感作された魚類の血漿試料中における抗ＩＰＮＶ抗体を見出すため、抗原性異種タンパク質に対する免疫反応の推定値を決定した。
【０１１７】
解析により、Ｈ２Ｏ２及びペルオキシドの存在下におけるＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）反応により生成される生成物の４５０ｎｍにおける吸光度のリーディングにより総抗体レベルを検出する間接的ＥＬＩＳＡ法の成果を考察した。９６ウェルを血漿の希釈系列（１、１：２、１：４、１：１６）でコートし、１５℃で４時間にわたりインキュベートした後、０．０５％ＰＢＳ／Ｔｗｅｎｎ  ２０で洗浄した。０．０５％ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０及び５％スキムミルクにより、室温で１時間にわたりブロックした。再び洗浄し、０．０５％ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０中における抗サケ抗体の希釈系列（１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００）と共に、室温で２時間にわたりインキュベートした。
【０１１８】
その後、０．０５％ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０中に１：３０００の、ペルオキシド（ｐｅｒｏｘｉｄｅ）と結合した抗マウスＩｇＧヤギ抗体の希釈液を添加して、室温で１時間静置した。
【０１１９】
最後に、０．０５％ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０中に１：３０００の、ペルオキシダーゼと抱合させた抗マウスＩＩｇＧヤギ抗体の希釈液を添加して、室温で２時間静置した。洗浄後、ＴＭＢを添加し、室温で２０分間待機して着色を観察した。１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４により反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度の読み取りにより得られた生成物を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで定量した。
【０１２０】
特定の抗体の検出には、マルチウェルプレートを１＊１０５ＵＦＰ／ｍｌのＩＰＮウイルスと共にインキュベートし、次いで、あらかじめ確立された希釈率（１：１６）で血漿を添加し、説明した段階を１つずつ実施し、この分子クラスを間接的に決定した。１ｍｇ／ＫｇのＰＶ用量に対して得られた結果により、プラスミドワクチンを含有する栄養製剤を介して４５日間にわたり投与されたプラスミドワクチンを摂取した魚類と対照との間において、信頼区間９０％による統計学的な有意差が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月12日(2008.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚用飼料に含まれ、その処方が以下：
ａ．配列番号３の７２５ｂｐのフラグメントを有するプラスミド構築物ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２、
ｂ．ＤＯＴＡＰリポソーム、
ｃ．免疫感作された個体の栄養特性を提示する受容者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）
を含むことを特徴とする、魚用ＤＮＡワクチン。
【請求項２】
賦形剤が以下の平均組成（ｇ／Ｋｇ）：
ａ．粗タンパク質  ４５０〜６００
ｂ．脂質  １５０〜２５０
ｃ．灰分  ８０〜１２０
ｄ．粗線維  ６〜１０
ｅ．窒素以外の抽出物  ７０〜８０
を提示するＤＮＡワクチンであることを特徴とする、請求項１に記載の魚用ＤＮＡワクチン。
【請求項３】
賦形剤が以下の成分：
ａ．魚粉、
ｂ．魚油及び／又は植物油、
ｃ．小麦及びトウモロコシの副産物、
ｄ．ペプトン濃縮物、
ｅ．小麦及びトウモロコシのグルテン、
ｆ．オキアミ粉、
ｇ．ビタミン及びミネラル塩分のプレミックス、
ｈ．大豆ミネラル塩分、
ｉ．小麦、
ｊ．ベタイン、並びに
ｋ．ヌクレオチド
を含む経口投与ＤＮＡワクチンであることを特徴とする、請求項１に記載の魚用ＤＮＡワクチン。
【請求項４】
以下の段階：
ａ．図１のベイトによる構築物の合成
ｂ．配列番号３を含むプラスミド構築物ｐｃＤＮＡの形成、
ｃ．ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２のトランスフェクション、クローニング、及び精製、
ｄ．ｌｉｐｏｐｌｅｘと称するｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘＴＯＰＯ分子複合体を生成する、ＩＰＮＶウイルスの配列番号３のフラグメントを有するプラスミドと、ＤＯＴＡＰリポソームとを含有する複合体の形成、
ｅ．経口ワクチン又は調合ワクチンを構成する、飼料ベースと称する栄養組成物へのｌｉｐｏｐｌｅｘの散布及び混合及び統合
ｆ．ＤＮＡワクチンを含有する飼料の包装
を含むことを特徴とする、魚用ＤＮＡワクチンを得る手順。
【請求項５】
トランスフェクション、クローニング、及び精製の段階において、ＬＭＢＰ  ５３３３セパ（ｃｅｐａ）菌株を用いることを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡワクチンを得る手順。
【請求項６】
組み換えプラスミドｐｃＤＮＡ−ＶＰ２の単離及び精製の段階において、アルカリ溶菌法並びに濾過及び限外濾過の連続する段階を介して実施されることを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡワクチンを得る手順。
【請求項７】
飼料ベースへのｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合段階において、飼料へのワクチンの組み込みが、乾燥供給経路及び液体経路を共に含む２つの好ましい工程形態により、バッチで稼働しうることを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡワクチンを得る手順。
【請求項８】
飼料ベースへのｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合段階において、ワクチン添加の第１の選択肢に従い、乾燥供給を介してペレット形態における飼料ベースを真空状態下で油分混合機に投入することを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡワクチンを得る手順。
【請求項９】
ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合段階において、ワクチン添加の第１の選択肢に従い、液体供給が乾燥供給と並行し、２つの段階を介して稼働することを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡワクチンを得る手順。これらは、２つのデポジットに基づき、デポジットの１つでは、サイズに応じてあらかじめ投入されたｌｉｐｏｐｌｅｘを保持し、他のデポジットでは油分混合バッチにおいてあらかじめプログラムされた量の飼料ベースを保持する。
【請求項１０】
ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合段階において、ワクチン添加の第１の選択肢に従い、液体供給が乾燥供給と並行し、２つの段階を介して稼働することを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡワクチンを得る手順。第１段階では、真空状態下の微粒散布によりワクチンが添加され、第２段階では、通常の大気圧下において、第２のデポジット内で再び秤量された魚油が散布される。
【請求項１１】
ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合段階において、ワクチン添加の第２の選択肢に従い、組み込みが、乾燥経路及び液体経路を含む２つの供給経路を介するバッチ稼働において展開されうることを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡワクチンを得る手順。
【請求項１２】
ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合段階において、ワクチン添加の第２の選択肢に従い、角度及び速度の変化する回転ブロイラー（ｂｒｏｉｌｅｒ）型混合機に組み込まれた、あらかじめ定められた量のペレット形態における飼料ベースを、乾燥経路で秤量装置により分類することを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡワクチンを得る手順。
【請求項１３】
ｌｉｐｏｐｌｅｘ複合体の散布／混合及び統合段階において、ワクチン添加の第２の選択肢に従い、液体経路が混合機と並行して稼働し、飼料ベースのサイズ及び量に応じてあらかじめプログラムされた分注機と接続された散布システムからなることを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡワクチンを得る手順。
【請求項１４】
ＤＮＡワクチンでありその組成が：
ａ．図１のブート（ｂｏｏｔ）の使用に由来し、配列が配列番号３である有効成分、
ｂ．媒体である陽イオンリポソームＤＯＴＡＰ、
ｃ．栄養があり無害で薬学的に許容される、魚類に摂取可能な栄養のある賦形剤
を含むことを特徴とする、魚ワクチンを含有する活性な免疫学的組成物。
【請求項１５】
経口投与ＤＮＡワクチンであることを特徴とする、請求項１４に記載の魚ワクチンを含有する薬剤組成物。
【請求項１６】
魚類感染性膵臓壊死ウイルスに対する免疫感作を可能とし、加えて、個体の栄養摂取も可能とすることを特徴とする、請求項１４に記載の魚ワクチンを含有する薬剤組成物。
【請求項１７】
薬剤投与形態がペレット形態であることを特徴とする、請求項１４に記載の魚ワクチンを含有する薬剤組成物。
【請求項１８】
製剤が魚類の免疫に有用であることを特徴とする、請求項１４に記載の魚ワクチンを含有する薬剤組成物。
【請求項１９】
以下の段階：
ａ．配列番号１のプライマーブートを用いた構築物の合成
ｂ．配列番号３を含有するプラスミド構築物ｐｃＤＮＡの形成、
ｃ．ｐｃＤＮＡ−ＶＰ２のトランスフェクション、クローニング、及び精製、
ｄ．ｌｉｐｏｐｌｅｘと称する分子複合体を生成する、ＩＰＮＶウイルスの配列番号３のフラグメントを有するプラスミドと、ＤＯＴＡＰリポソームとを含有する複合体の形成、
ｅ．経口ワクチン又は調合ワクチンを構成する栄養組成物へのｌｉｐｏｐｌｅｘの散布、混合、及び統合
ｆ．ＤＮＡワクチンを含有する飼料の包装
を含むことを特徴とする、ＤＮＡ魚ワクチンを含有する製剤を得る工程。
【請求項２０】
以下の段階：
ａ．対象プライマーによる構築物の合成
ｂ．対象配列を含有するプラスミド構築物の形成、
ｃ．対象配列のトランスフェクション、クローニング、及び精製、
ｄ．安定な分子複合体を生成する、対象フラグメントを有するプラスミドとリポソームとを含有する複合体の形成、
ｅ．経口ワクチン又は調合ワクチンを構成する栄養組成物への複合体の散布、混合、及び統合
ｆ．ＤＮＡワクチンを含有する飼料の包装
を含むことを特徴とする、ＤＮＡワクチンを含有する動物用飼料を得る工程。
【請求項２１】
請求項２０に記載の工程により生成されることを特徴とする、請求項１９に記載の栄養組成物。
【請求項２２】
水生生物、特に魚類に免疫を賦与するのに有用であることを特徴とする、請求項１９に記載の栄養組成物。
【請求項２３】
以下の平均組成（ｇ／Ｋｇ）：
ａ．粗タンパク質  ４５０〜６００
ｂ．脂質  １５０〜２５０
ｃ．灰分  ８０〜１２０
ｄ．粗線維  ６〜１０
ｅ．窒素以外の抽出物  ７０〜８０
を含有することを特徴とする栄養組成物。
【請求項２４】
配列番号３を有し、その国際寄託番号がＬＭＢＰ  ５３３３であり、プラスミドｐｃＤＮＡ−ＶＰ２の増幅に有用であることを特徴とする、大腸菌ＪＭ−１０９の形質転換細胞。
【請求項２５】
ＣＨＳＥ−２１４細胞株に属し、魚類に免疫を賦与するのに有用である配列番号３を含有することを特徴とする宿主細胞。
【請求項２６】
配列番号３の転写及び翻訳に由来することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２７】
魚類感染性膵臓壊死ウイルスに対するワクチン合成に有用な菌株ＬＭＢＰ  ５３３３に対応することを特徴とする発現ベクター。 
【国際調査報告】
2010514412.tif 000016
2010514412.tif 000017
2010514412.tif 000018
2010514412.tif 000019
2010514412.tif 000020
2010514412.tif 000021
2010514412.tif 000022
2010514412.tif 000023