(57)【要約】【課題】本研究において、ブタ特異的リアルタイムＰＣＲアッセイを、ハラール認証のために開発する。【解決手段】３種の肉試料：ブタ、ウシ及びトリを用いた。マレーシアでは、これら３種の家禽肉が一般的に消費される肉であり、市場で容易に利用できる。各生肉試料からのＤＮＡを、ＤＮイージー（登録商標）ブラッド＆ティッシュキット（ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を使用して抽出することに成功した。抽出されたＤＮＡの濃度を、バイオフォトメーター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、ハンブルグ、ドイツ）を使用してＵＶ吸光光度分析により評価した後、リアルタイムＰＣＲ反応を行う。プライマーのアニーリング温度は、５８℃である。設計されたプライマーの特異性を検証するために、他の２種の肉試料に対してプライマーを試験するための反応を実施して、交差反応の可能性を検出した。この反応は、Ｃｔ±２２．８３においてブタのＤＮＡのみを増幅した。本明細書に記載のリアルタイムＰＣアッセイは、試料を試験した場合、非常に感度が高く、検出限界が低いことが証明されている。このアッセイを、１００ｎｇＤＮＡから出発した１０倍連続希釈を調製することによって実施し、この反応の感度を測定するために使用した。この感度の閾値はブタＤＮＡ０．００１ｎｇまでであった。従来のＰＣＲを使用した検出限界はブタＤＮＡ０．１ｎｇであることが報告されている。この状況から、本方法は食品中のブタＤＮＡの検出において有用であると思われる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試料のブタ肉からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を抽出するステップ、
（ｂ）ブタのミトコンドリアＮＤ５遺伝子に基づきフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計するステップ、並びに
（ｃ）フォワードプライマー及びリバースプライマーについてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するステップ
を含み、フォワードプライマーの配列がＳＵＳ−ＦＷＤ：５’−ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＣＣ−３’であり、リバースプライマーの配列がＳＵＳ−ＲＶＳ：５’−ＡＴＧ  ＣＧＴ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧ−３’であることを特徴とする、食品中のブタ肉含有を特定するための方法。
【請求項２】
フォワードプライマー及びリバースプライマーの濃度が０．３〜０．９μｍの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応温度が５０〜７０℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）ブタのミトコンドリアＮＤ５遺伝子に基づきフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計するステップ、並びに
（ｂ）フォワードプライマー及びリバースプライマーについてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験を実施するステップ
を含み、フォワードプライマーの配列がＳＵＳ−ＦＷＤ：５’−ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＣＣ−３’であり、リバースプライマーの配列がＳＵＳ−ＲＶＳ：５’−ＡＴＧ  ＣＧＴ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧ−３’であることを特徴とする、食品中のブタ肉含有を特定するための方法。
【請求項５】
フォワードプライマー及びリバースプライマーの濃度が０．３〜０．９μｍの間である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
反応温度が５０〜７０℃の間である、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品成分、特に肉加工食品の特定のためのプライマーを設計する方法に関する。特に、この方法は、ハラール認証のための加工食品中のブタ肉（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）の存在を特定するための方法である。
【背景技術】
【０００２】
粗悪食品は、世界共通の課題である。例えば、高価な肉の代用品として、安価な肉を使用する。最も頻繁には、ブタ肉が、食品中で他の種類の肉の代用として使用されている。したがって、食品中の動物種、特にブタの特定は、消費者にとって重要な課題になりつつある。食品の表示を誤った方向に導く暗示は、潜在的な非ハラール食品が存在する点で、さらに重要であり得る。この理由のために、いくつかの方法が、新鮮な肉及び食肉製品の起源の種を特定するために開発されている。ＤＮＡ分析に基づく多くの方法が、食品の粗悪品を監視するために、食品産業において用いられている。動物の種の特定のために確立された方法は、大部分が脂質、タンパク質及びＤＮＡに基づいている。しかし、ＤＮＡに基づく方法は、ＤＮＡが食品加工において使用される高温、高圧及び化学処理を伴う条件下で安定するため、特に信頼性がより高い。
【０００３】
食肉製品中の動物組織の種の特定は、経済的、宗教的及び健康的理由のための、違法又は望ましくない粗悪品から消費者を保護するという重要な課題である。この目的のために、数多くの分析法が、タンパク質及びＤＮＡの分析に基づいて開発されている。ＤＮＡに基づく方法の中で、種の特定のために高度に開発されたものは、種特異的な従来のＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲである。ブタの種特異的ＰＣＲのために開発された標的遺伝子断片は、１２Ｓ  ｒＲＮＡ、ＮＤ５、ミトコンドリア置換ループ（Ｄ−Ｌｏｏｐ）及び核メラノコルチン受容体１（ＭＣＩＲ）に由来するものである。
【０００４】
従来のＰＣＲを利用する方法が良好であることは証明されているが、ＰＣＲ後の操作が必要であり、該後操作は分析時間を延長させ、また実験室汚染の原因となり得る有害化学物質の取扱いを必要とする。他方、リアルタイムＰＣＲ法は、従来のＰＣＲに置き換わる大きな可能性を保有している。このことは主に、リアルタイムＰＣＲ法が迅速で、感度が高く、特異的で、自動化及び標的の定量化の程度が高いためである。（Ｈｅｉｄら、１９９６）。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は食品中のブタ肉含有を特定する方法に関し、該方法は試料のブタからデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を抽出するステップ、並びにブタのミトコンドリアＮＤ５遺伝子に基づきフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計するステップを含み、フォワードプライマー及びリバースプライマーについてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験を実施することによって実現し、フォワードプライマーの配列がＳＵＳ−ＦＷＤ：５’−ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＣＣ−３’であり、リバースプライマーの配列がＳＵＳ−ＲＶＳ：５’−ＡＴＧ  ＣＧＴ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧ−３’であることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】設計されたブタプライマーが他の肉の種（ウシ及びトリ）に対する特異性試験を示した図である。
【図２】１０倍連続希釈によるブタプライマーの感度試験を示した図である。
【図３】プライマー濃度の最適化を示した図である。
【図４】プライマーのアニーリング温度の最適化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、ハラール認証のためのブタ特異的リアルタイムＰＣＲアッセイの開発及び適用を記載する。プライマーを、ブタのミトコンドリアＮＤ５（ＮＤ５）遺伝子の８９ｂｐのアンプリコンを増幅するために設計し、市販のトリ及びウシの種には適合しない。このアッセイは高感度であり、水に希釈したＤＮＡを使用して評価した場合、０．００１ｎｇのブタ鋳型ＤＮＡの存在も検出した。ハラール製品の立証のために開発されたプライマーのセットは、ブタのミトコンドリアＮＤ５遺伝子に基づき、プライマーの配列は以下のとおりである：
フォワードプライマー：（ＳＵＳ−ＦＷＤ：５’−ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＣＣ−３’）
リバースプライマー：（ＳＵＳ−ＲＶＳ：５’−ＡＴＧ  ＣＧＴ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧ−３’）
【実施例】
【０００８】
ブタのＤＮＡ検出に関するＰＣＲの条件は、マスターサイクラー（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）ｅｐ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、ハンブルグ、ドイツ）における増幅によって実施した。各反応チューブは、１０μｌの２×クワンティテクトＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）、１μｌのフォワードプライマー、１μｌのリバースプライマー、３μｌのｄＨ２０及び５μｌのＤＮＡ試料（２０ｎｇ／μｌ）からなる、２０μｌの反応混合物を含む。３ステップの増幅サイクルプログラムは以下のとおりである：初期活性化９５℃で１５分間、変性９４℃で１５秒間、アニーリング５８℃で３０秒間、７２℃で３０秒間。初期活性化のステップは、反応混合物中に存在するホットスタータックＤＮＡポリメラーゼ（ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を活性化するためである。サイクルは４０回繰り返し、融解曲線分析を実施し、増幅されたＤＮＡの特異性及び同一性を検証した。
【０００９】
試料
ブタ、ウシ及びトリの３種をこの実験に使用した。肉試料は、地元の生鮮市場、Ｓｅｌａｎｇｏｒ  Ｗｈｏｌｅｓａｌｅ  Ｍａｒｋｅｔから購入した。それらを、ＤＮＡの抽出に使用するまで、−２０℃で保存した。
【００１０】
ＤＮＡの抽出
肉試料からのＤＮＡを、ＤＮイージー（ＤＮｅａｓｙ）（登録商標）ブラッドアンドティッシュキット（Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を使用して抽出した。２５ｍｇの試料を、１．５ｍｌの微小遠心管に秤量した。１８０μｌのバッファーＡＴＬ（Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＴＬ）及び２０μｌのプロテイナーゼＫを加えた。混合物をボルテックスにかけ、その後、溶解のため、５６℃のウォーターバスにおいて一晩インキュベートした。試料が完全に溶解したら、４μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｍｇ／ｍｌ）を加え、混合し、室温で２分間インキュベートした。混合物をボルテックスにかけた後で２００μｌのバッファーＡＬ（Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＬ）を加え、その後、再度ボルテックスにかけ、十分に混合した。次いで、２００μｌのエタノール（９６〜１００％）を加え、ボルテックスにかけることによって混合し、均一な溶液を作製した。混合物を、ＤＮイージーミニスピンカラムセット（ＤＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ  ｓｅｔ）にピペットで入れ、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離機にかけた。流動液及びコレクションチューブに溜まった液を廃棄する。その後、ＤＮイージーミニスピンカラムを新しい２ｍｌのコレクションチューブに配置した。５００μｌのバッファーＡＷ２（Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＷ２）を加え、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心分離機にかけ、カラムを乾燥させ、エタノールのキャリーオーバーがないことを確実にする。次いで、ＤＮイージーミニスピンカラムを、新しい１．５ｍｌの微小遠心管に配置し、溶出のために１００μｌのバッファーＡＦ（Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＦ）を加えた。チューブを室温で１分間インキュベートし、その後、８，０００ｒｐｍで１分間遠心分離機にかけた。抽出されたＤＮＡを含む上清を、さらなる使用の前に４℃で保存する。
【００１１】
プライマーの設計
Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を、リアルタイムＰＣＲに使用するプライマーセットの設計に利用した。ブタ（ＮＣ＿０００８４５）、ウシ（ＮＣ＿００６８５３）及びトリ（ＮＣ＿００１３２３）に由来するＮＤ５遺伝子の配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋのデータベース（ｈｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手し、アラインメントし、比較した。１つのプライマーセット（ＳＵＳ−ＦＷＤ：５’−ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＣＣ−３’及びＳＵＳ−ＲＶＳ：５’−ＡＴＧ  ＣＧＴ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＧ−３’）を合成し、ブタのＮＤ５遺伝子の８９ｂｐの断片を、特異的に増幅した。
【００１２】
リアルタイムＰＣＲ分析
ブタＤＮＡの検出を、マスターサイクラーｅｐ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、ハンブルグ、ドイツ）における増幅によって実施する。各反応チューブは、１０μｌの２×クワンティテクトＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）、１μｌのフォワードプライマー、１μｌのリバースプライマー、３μｌのｄＨ２Ｏ及び５μｌのＤＮＡ試料からなる、２０μｌの反応混合物を含む。３ステップの増幅サイクルプログラムは、以下のとおりである：初期活性化９５℃で１５分間、変性９４℃で１５秒間、アニーリング５８℃で３０秒間、伸長７２℃で３０秒間。初期活性化のステップは、反応混合物中に存在するホットスタータック  ＤＮＡポリメラーゼを活性化するためである。サイクルは４０回繰り返し、融解曲線分析を実施し、増幅されたＤＮＡの特異性及び同一性を検証した。特に明記しない限り、すべての反応を３重に実施した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2010530763.tif 000008
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