(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病の治療及び診断において使用され得るモノクローナル抗体に関する。特に、本発明は、１０Ｆ４及び３Ｃ５と表記されるモノクローナル抗体並びにこれらと類似の特性を有する他のモノクローナル抗体（例えば、マウス、ヒト又はヒト化）に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳脊髄液（ＣＳＦ）中に存在するＡβ（１−４２）ペプチド及びｂ）ＣＳＦ中に存在するＡβ（１−４０）ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのアミロイドβタンパク質よりＡβ（１−４２）グロブロマーに対してより高い親和性を有する単離された抗体。
【請求項２】
ａ）Ａβ（１−４２）単量体、ｂ）Ａβ（１−４０）単量体、ｃ）Ａβ（１−４２）原繊維及びｄ）可溶性アミロイド前駆体タンパク質α（ｓＡＰＰα）からなる群から選択される少なくとも１つのアミロイドβタンパク質に対する結合親和性より大きい、Ａβ（１−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有する単離された抗体。
【請求項３】
前記抗体が、非ＣＳＦ中に存在するアミロイドβタンパク質に対し、ＣＳＦ中に存在するアミロイドβタンパク質に対するよりも低い親和性で結合する、請求項２の単離された抗体。
【請求項４】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１又は請求項２の単離された抗体。
【請求項５】
抗体が組換え抗体である、請求項４の単離された抗体。
【請求項６】
抗体がヒト又はヒト化である、請求項１又は２の単離された抗体。
【請求項７】
前記抗体がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０８によって指定されるハイブリドーマから取得可能なモノクローナル抗体１０Ｆ４及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０６によって指定されるハイブリドーマから取得可能なモノクローナル抗体３Ｃ５からなる群から選択されるモノクローナル抗体として、少なくとも１つのエピトープに結合する、請求項１又は請求項２の単離された抗体。
【請求項８】
配列番号５を含む単離された抗体。
【請求項９】
配列番号６を含む単離された抗体。
【請求項１０】
配列番号５をさらに含む、請求項９の単離された抗体。
【請求項１１】
配列番号７を含む単離された抗体。
【請求項１２】
配列番号８を含む単離された抗体。
【請求項１３】
配列番号７をさらに含む、請求項１２の単離された抗体。
【請求項１４】
ａ）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０８によって指定されるハイブリドーマから取得可能なモノクローナル抗体（１０Ｆ４）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列及び軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列並びにｂ）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０６によって指定されるハイブリドーマから取得可能なモノクローナル抗体（３Ｃ５）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列及び軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項２の単離された抗体。
【請求項１５】
ａ）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０８によって指定されるハイブリドーマから取得可能なモノクローナル抗体（１０Ｆ４）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列及び軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列並びにｂ）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０６によって指定されるハイブリドーマから取得可能なモノクローナル抗体（３Ｃ５）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列及び軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項２の単離された抗体。
【請求項１６】
ａ）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０８によって指定されるハイブリドーマから取得可能なモノクローナル抗体（１０Ｆ４）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列及び軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列並びにｂ）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０６によって指定されるハイブリドーマから取得可能なモノクローナル抗体（３Ｃ５）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列及び軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項２の単離された抗体。
【請求項１７】
アミノ酸配列：ａ）ＳＨＹＡＷＮ；ｂ）ＹＩＤＹＳＧＳＴＲＹＬＰＳＬＫＳ；Ｃ）ＧＳＧＹＦＹＧＭＤＹ；ｄ）ＨＡＳＱＮＩＮＶＷＬＳ；ｅ）ＫＡＳＮＬＨＴ；ｆ）ＱＱＧＱＳＹＰＹＴ；ｇ）ＮＹＬＩＥ；ｈ）ＶＩＮＰＧＳＧＤＴＮＹＮＥＮＦＫＧ；ｉ）ＧＶＩＴＴＧＦＤＹ；ｊ）ＲＡＳＧＮＩＨＮＹＬＡ；ｋ）ＮＡＫＴＬＡＤ及びｌ）ＱＨＦＷＳＳＰＲＴからなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む単離された抗体。
【請求項１８】
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０８によって指定されるハイブリドーマ。
【請求項１９】
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０８によって指定されるハイブリドーマから取得可能なモノクローナル抗体（１０Ｆ４）。
【請求項２０】
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０６によって指定されるハイブリドーマ。
【請求項２１】
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０６によって指定されるハイブリドーマから取得可能なモノクローナル抗体（３Ｃ５）。
【請求項２２】
請求項１又は請求項２の抗体をコードする単離された核酸分子。
【請求項２３】
前記分子のヌクレオチド配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む、請求項２２の単離された核酸分子。
【請求項２４】
請求項２３の前記単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項２５】
請求項２４の前記ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
抗体を産生する方法であって、前記抗体の産生に適した時間及び条件下で、培地中において請求項２５の前記宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２７】
請求項２６の前記方法によって産生された単離された抗体。
【請求項２８】
請求項１の前記抗体、請求項２の前記抗体又はこれらの組み合わせを含む組成物。
【請求項２９】
組成物が医薬組成物であり、及び医薬として許容される担体をさらに含む、請求項２８の組成物。
【請求項３０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体。
【請求項３１】
前記抗体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０６によって指定されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０８によって指定されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項３０の単離された抗体。
【請求項３２】
配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項３０の単離された抗体。
【請求項３３】
アミロイドーシスの治療又は予防を必要としている患者において、アミロイドーシスを治療又は予防する方法であって、前記治療又は予防を実施するのに十分な量で、請求項１又は請求項２の前記抗体を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
前記アミロイドーシスがアルツハイマー病であり、又はダウン症候群のアミロイドーシスである、請求項３３の方法。
【請求項３５】
アミロイドーシスを有する患者の脳内のアミロイドβタンパク質の少なくとも１つのエピトープに結合する単離された抗体。
【請求項３６】
前記抗体がＰＴＡ−７４０６及びＰＴＡ−７８０８からなる群から選択されるＡＴＣＣ寄託番号を有するハイブリドーマによって産生される、請求項３５の単離された抗体。
【請求項３７】
アルツハイマー病を有すると疑われる患者においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
ａ．前記患者から生物学的試料を単離する工程；
ｂ．抗原／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で、請求項１又は請求項２の前記単離された抗体と、前記生物学的試料を接触させる工程；並びに
ｃ．前記試料中の前記抗原／抗体複合体の存在を検出する工程（前記複合体の存在は前記患者中のアルツハイマー病の診断を示す。）
を含む、方法。
【請求項３８】
前記抗原がグロブロマーである、請求項３７の方法。
【請求項３９】
アルツハイマー病を有すると疑われる患者においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
ａ．前記患者から生物学的試料を単離する工程；
ｂ．抗体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で、前記生物学的試料を抗原と接触させる工程；
ｃ．得られた抗体／抗原複合体に連結体を、結合された抗体へ前記連結体が結合するのに十分な時間及び条件下で添加する工程（前記連結体は、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に付着された請求項１又は請求項２の前記単離された抗体を含む。）；並びに
ｄ．前記シグナル生成化合物によって生成されたシグナルを検出することによって、前記生物学的試料中に存在し得る抗体の存在を検出する工程（前記シグナルは前記患者中のアルツハイマー病の診断を示す。）
を含む、方法。
【請求項４０】
前記抗原がグロブロマーである、請求項２８の方法。
【請求項４１】
アルツハイマー病を有すると疑われる患者においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
ａ．前記患者から生物学的試料を単離する工程；
ｂ．抗抗体／抗体複合体（前記複合体は前記生物学的試料中に存在する抗体を含有する。）の形成を可能とするのに十分な時間及び条件下で、前記生物学的試料中を抗抗体（前記抗抗体は請求項１又は請求項２の前記抗体に対して特異的である。）と接触させる工程；
ｃ．得られた抗抗体／抗体複合体に連結体を、結合された抗体へ前記連結体が結合するのに十分な時間及び条件下で添加する工程（前記連結体は、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合する抗原を含む。）；並びに
ｄ．前記シグナル生成化合物によって生成されたシグナルを検出する工程（前記シグナルは前記患者中のアルツハイマー病の診断を示す。）
を含む、方法。
【請求項４２】
ａ）請求項１の前記単離された抗体、請求項２の前記単離された抗体又はこれらの組み合わせと及びｂ）医薬として許容されるアジュバントとを含むワクチン。
【請求項４３】
アルツハイマー病を発症すると予測された患者の能動免疫に適した化合物を同定する方法であって、
ａ）目的とする１つ以上の化合物を、前記１つ又は以上の化合物が請求項１又は請求項２の前記単離された抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で、請求項１又は請求項２の前記単離された抗体に曝露する工程；及び
ｂ）請求項１又は請求項２の前記単離された抗体に結合する化合物を同定する工程（前記同定された化合物がアルツハイマー病を発症すると予測された患者中での能動免疫において使用される。）
を含む、方法。
【請求項４４】
ａ）請求項１又は請求項２の前記単離された抗体、及びｂ）シグナル生成化合物に付着された抗体を含む連結体を含み、前記連結体の前記抗体が前記単離された抗体とは異なる、キット。
【請求項４５】
ａ）請求項１又は請求項２の前記単離された抗体に対する抗抗体及びｂ）シグナル生成化合物に付着された抗原を含む連結体を含むキット。
【請求項４６】
前記抗原がグロブロマーである、請求項４６のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００６年１１月３０日に出願された米国仮出願第６０／８７２，１５６号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、アルツハイマー病の治療及び診断において使用され得るモノクローナル抗体に関する。特に、本発明は、１０Ｆ４及び３Ｃ５と称されるモノクローナル抗体及び該抗体と類似の特性を有する他のモノクローナル抗体（例えば、マウス、ヒト又はヒト化）に関する。
【背景技術】
【０００３】
１９０７年に、医師Ａｌｏｉｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒが、後にその名誉を称えてアルツハイマー病（ＡＤ）として彼の名が付けられた認知症の一形態の神経病理学的な特徴を最初に記載した（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ１９０７）。特に、ＡＤは、高齢者に最も頻繁に発生する認知症の原因であり、６５歳を超える集団の約１０％に発生する。年齢が上昇するとともに、疾病の確率も上昇する。全世界で、約１，５００万人がこの疾病に罹患しており、平均寿命のさらなる増加が、今後１０年にわたって、この病気の罹患者の数を約３倍まで増加させると予測されている。
【０００４】
分子的な観点から、アルツハイマー病（ＡＤ）は、異常に凝集されたタンパク質の沈着によって特徴付けられる。細胞外アミロイド斑の場合には、これらの沈着の多くはアミロイド−β−ペプチド繊維からなり、細胞内神経線維のもつれ（ＮＦＴ）の場合には、これらの沈着の多くはτタンパク質からなる。アミロイドβ（Ａβ）ペプチドは、タンパク質分解切断によって、β−アミロイド前駆体タンパク質から生じる。この切断は、α、β及びγ−セクレターゼと名付けられた幾つかのプロテアーゼの協働的活性によって行われる。切断は、異なる長さの多数の特異的断片をもたらす。アミロイド斑の多くは、４０又は４２アミノ酸長を有するペプチド（Ａβ４０、Ａβ４２）からなる。主要な切断産物はＡβ４０であるが、Ａβ４２は、ずっと強い毒性効果を有する。アルツハイマー病で観察されるものと極めて類似する脳アミロイド沈着及び認知障害は、８００の出生に約１件の頻度で発症するダウン症候群（トリソミー２１）の特徴でもある。
【０００５】
Ｈａｒｄｙ及びＨｉｇｇｉｎｓのアミロイドカスケード仮説は、Ａβ（１−４２）の増加した産生が、前原繊維及び原繊維（すなわち、Ａβ斑の主成分）の形成をもたらし、これらの原繊維がアルツハイマー病の症候の原因であると仮定した。認知症の重度及び沈着したＡβ斑の負荷との間に相関が乏しいにも関わらず、この仮説は、最近まで受け入れられてきた。斑の負荷より、ＡＤの症候との相関が優れている、ＡＤ脳内における可溶性Ａβ形態の発見は、修正されたアミロイドカスケード仮説をもたらした。
【０００６】
Ａβペプチドでの能動免疫は、形成の減少及び既存の斑の部分的な溶解を引き起こす。同時に、Ａβペプチドでの能動免疫は、ＡＰＰトランスジェニックマウスモデルでの認知障害の緩和をもたらす。Ａβペプチドに対して誘導された抗体を用いた受動免疫に関しては、Ａβ斑の負荷の減少も認められた。ＡＮ−１７９２（凝集の繊維性状態のＡβ（１−４２）ペプチド）での能動免疫の第ＩＩａ相試験の結果（ＥＬＡＮ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＰＩｃ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ  ａｎｄ  Ｄｕｂｌｉｎ，ＵＫ）は、Ａβペプチドに対して誘導された免疫療法が成功を収めたことを示唆する。３０人の患者の亜群において、疾病の進行は、ＭＭＳＥ及びＤＡＤ指標によって測定された陽性抗Ａβ抗体力価を有する患者で著しく減少していた。
【０００７】
しかしながら、髄膜脳炎の形態の重い副作用のために、この研究は停止された（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，２００５，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４，１０−１２）。特に、髄膜脳炎は、神経炎症及び脳内へのＴ細胞の浸潤によって特徴付けられた。おそらく、これは、抗原としてＡβ（１−４２）を注射することによって誘導されたＴ細胞免疫応答によるものであった。このような免疫応答は、受動免疫後には予想されない。現在まで、これに関して入手できる臨床データは存在しない。しかしながら、５ヶ月にわたって週に１回、Ａβ（１−４２）のＮ末端エピトープに対して誘導された抗体を与えた極めて高齢のＡＰＰ２３マウスでの前臨床研究のために、免疫化のためのこのような受動的アプローチに関して、副作用についての懸念が表明された。特に、これらのマウスは、生理的食塩水で処理された対照動物に比べて、微小出血の数及び重度の増大を示した（Ｐｆｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９８，１３７９）。極めて老齢の（＞２４月齢）Ｔｇ２５７６及びＰＤＡＰＰマウスにおいても、同様の微小出血の増加が記載された（Ｒａｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２５，６２９−６３６；Ｗｉｌｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，１（１）：２４；Ｄｅ  Ｍａｔｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ２５（Ｓ２）：５７７）。マウスの両系統において、抗体注射は、微小出血の著しい増加をもたらした。これに対して、Ａβ（１−４２）ペプチドの中央領域に対して誘導された抗体は、微小出血を誘導しなかった（ｄｅ  Ｍａｔｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。ＣＡＡの形態の凝集したＡβペプチドに結合しない抗体処理には、微小出血の誘導の欠如が伴った（Ｒａｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２５，６２９−６３６）。しかし、ＡＰＰが遺伝子導入されたマウス中に微小出血をもたらす正確な機序は、理解されていない。おそらく、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）は、脳出血を誘導し、又は少なくとも悪化させる。ＣＡＡは、ほぼ全てのアルツハイマー病の脳内に存在し、症例の約２０％は、「重度ＣＡＡ」と認められる。従って、受動免疫は、Ａβペプチドの中央又はカルボキシ末端領域を認識する抗体を選択することによって微小出血を回避することを目指すべきである。
【０００８】
国際特許出願公開ＷＯ２００４／０６７５６１は、安定なＡβ（１−４２）オリゴマー（Ａβ（１−４２）グロブロマー）及び該グロブロマーに対して特異的に誘導された抗体を記載している。非特異的なプロテアーゼによる消化は、Ａβグロブロマーは、状のコア構造から突出する親水性Ｎ末端から開始して消化され得ることを示す（Ｂａｒｇｈｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，９５，８３４−８４７）。このようなＮ末端切断されたＡβグロブロマー（Ａβ（１２−４２）及びＡβ（２０−４２）グロブロマー）は、このオリゴマーＡβの基本構造単位に相当し、ウサギ及びマウスの能動免疫化のための極めて強力な抗原であり、高い抗体力価をもたらす（ＷＯ２００４／０６７５６１）。Ｎ末端切断されたＡβ形態のインビボでの推定される病理的な役割が、ＡＤ脳内におけるそれらの存在についての幾つかの最近の報告によって示唆されている（Ｓｅｒｇｅａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，８５，１５８１−１５９１；Ｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ，５８，２１０−２１６）。インビボ消化の間に、脳内に見出されるある種のプロテアーゼ、例えば、ネプリリシン（ＮＥＰ２４．１１）又はインシュリン分解酵素（ＩＤＥ）が関与し得る（Ｓｅｌｋｏｅ，２００１，Ｎｅｕｒｏｎ，３２，１７７−１８０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際特許公開２００４／０６７５６１号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、６４、２００５年、ｐｐ．１０−１２
【非特許文献２】Ｐｆｅｉｆｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８、１３７９、２００２年、ｐｐ．１３７９
【非特許文献３】Ｒａｃｋｅ他、ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ、２５、２００５年、ｐｐ．６２９−６３６
【非特許文献４】Ｗｉｌｃｏｃｋ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，１（１）：２４、２００４年
【非特許文献５】Ｄｅ  Ｍａｔｔｏｓ他、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ２５（Ｓ２）：５７７、２００４年
【非特許文献６】Ｒａｃｋｅ他、ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ、２５、ｐｐ．６２９−６３６
【非特許文献７】Ｂａｒｇｈｏｍ他、ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ、９５、２００５年、ｐｐ．８３４−８４７
【非特許文献８】Ｓｅｒｇｅａｎｔ他、ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ、８５、２００３年、ｐｐ．１５８１−１５９１
【非特許文献９】Ｔｈａｌ他、ＪＮｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ、５８、１９９９年、ｐｐ．２１０−２１６
【非特許文献１０】Ｓｅｌｋｏｅ、Ｎｅｕｒｏｎ、３２、２００１年、ｐｐ．１７７−１８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記に照らせば、仮に存在しても、ほとんど副作用（例えば、微小出血）を有さない、アルツハイマー病のための治療に対する極めて大きな、差し迫った要求が存在する。このような治療を用いれば、罹患患者は、このような治療なしに可能な状態を超えて、長年にわたって、機能的で、活動的なライフスタイルを維持することが可能であり得る。従って、患者のみならず、介護者にとっても、このような治療に対する経済的な意義が存在するとともに、「生活の質」の意義も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、免疫療法における患者の認知能力を向上させ、同時に、脳内のＡβの全体量の僅かな一部のみと反応するＡβグロブロマーに対して誘導された抗体を包含する。このような特性は脳のＡβバランスの大幅な妨害を抑制し、より少ない副作用をもたらすと予想される（例えば、治療的に問題のある脳容積の低下が、凝集の繊維性状態にあるＡβペプチドでの能動免疫の研究（ＥＬＡＮ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＰＩｃ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ  ａｎｄ  Ｄｕｂｌｉｎ，ＵＫ）、ＡＮ−１７９２（凝集の繊維性状態にあるＡβ（１−４２）ペプチド）での能動免疫の研究において観察されている。さらに、この試験では、髄膜脳炎の形態の重い副作用が観察された。）。
【００１３】
特に、本発明は、Ａβグロブロマーに対して高い親和性を有するＡβグロブロマー抗体を提供することによって上記副作用の問題を解決する。これらの抗体は、Ａβペプチドの他の形態、特に単量体、原繊維及びｓＡＰＰαを識別することができる。さらに、本発明の抗体は、非ＣＳＦアミロイドβのみに結合することによって、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のアミロイドβに対しても識別する。さらに、本発明の抗体（例えば、１０Ｆ４及び３Ｃ５）は、公知の抗体（すなわち、６Ｅ１０）に比べて、Ａβ−斑及び血管Ａβへの結合がより少ない。
【００１４】
特に、本発明は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に存在するＡβ（１−４２）ペプチド及びｂ）ＣＳＦ中に存在するＡβ（１−４０）ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのアミロイドβタンパク質に対する親和性に比べて、Ａβ（１−４２）グロブロマーに対してより高い親和性を有する単離された抗体を包含する。
【００１５】
本発明は、ａ）Ａβ（１−４２）単量体、ｂ）Ａβ（１−４０）単量体、ｃ）Ａβ（１−４２）原繊維及びｄ）可溶性アミロイド前駆体タンパク質α（ｓＡＰＰα）からなる群から選択される少なくとも１つのアミロイドβタンパク質への結合親和性より高い、Ａβ（１−４２）グロブロマーへの結合親和性を有する単離された抗体も含む。
この抗体は、ＣＳＦ中に存在するアミロイドβタンパク質より、非ＣＳＦ中に存在するアミロイドβタンパク質へ、より大きな親和性で結合する。
【００１６】
上記抗体は、例えば、マウス、モノクローナル、組換え、ヒト及びヒト化であり得る。さらに、本発明の抗体の１つ又はそれ以上の何れもが、モノクローナル抗体１０Ｆ４（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０８によって指定されるハイブリドーマから取得可能）又はモノクローナル抗体３Ｃ５（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０６によって指定されるハイブリドーマから取得可能）が結合する同じ１つ又は複数のエピトープである少なくとも１つのエピトープに結合し得る。
【００１７】
さらに、本発明は、配列番号５を含む単離された抗体、配列番号６を含む単離された抗体並びに配列番号５及び配列番号６の両方を含む単離された抗体を含む。
【００１８】
さらに、本発明は、配列番号７を含む単離された抗体、配列番号８を含む単離された抗体並びに配列番号７及び配列番号８の両方を含む単離された抗体を含む。
【００１９】
本発明の上記抗体は、ａ）モノクローナル抗体（１０Ｆ４）（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０８によって指定されるハイブリドーマから取得可能）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列及び軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列並びにｂ）モノクローナル抗体（３Ｃ５）（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０６によって指定されるハイブリドーマから取得可能）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列及び軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００２０】
さらに、本発明の上記抗体は、ａ）モノクローナル抗体（１０Ｆ４）（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０８によって指定されるハイブリドーマから取得可能）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列及び軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列並びにｂ）モノクローナル抗体（３Ｃ５）（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０６によって指定されるハイブリドーマから取得可能）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列及び軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００２１】
また、本発明の上記抗体は、ａ）モノクローナル抗体（１０Ｆ４）（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０８によって指定されるハイブリドーマから取得可能）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列及び軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列並びにｂ）モノクローナル抗体（３Ｃ５）（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０６によって指定されるハイブリドーマから取得可能）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列及び軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００２２】
さらに、本発明は、アミノ酸配列：ａ）ＳＨＹＡＷＮ；ｂ）ＹＩＤＹＳＧＳＴＲＹＬＰＳＬＫＳ；ｃ）ＧＳＧＹＦＹＧＭＤＹ；ｄ）ＨＡＳＱＮＩＮＶＷＬＳ；ｅ）ＫＡＳＮＬＨＴ；ｆ）ＱＱＧＱＳＹＰＹＴ；ｇ）ＮＹＬＩＥ；ｈ）ＶＩＮＰＧＳＧＤＴＮＹＮＥＮＦＫＧ；ｉ）ＧＶＩＴＴＧＦＤＹ；ｊ）ＲＡＳＧＮＩＨＮＹＬＡ；ｋ）ＮＡＫＴＬＡＤ及びｌ）ＱＨＦＷＳＳＰＲＴからなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む単離された抗体も含む。
【００２３】
さらに、本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０８によって指定されるハイブリドーマ及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０８によって指定されるハイブリドーマから取得可能な又は該ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体（１０Ｆ４）を包含する。
【００２４】
本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０６によって指定されるハイブリドーマ及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０６によって指定されるハイブリドーマから取得可能な又は該ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体（３Ｃ５）も含む。
【００２５】
さらに、本発明は、上記抗体をコードする単離された核酸分子を含む。この分子のヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含み得る。また、本発明は、単離された核酸分子を含むベクター及び該ベクターを含む宿主細胞を含む。
【００２６】
さらに、本発明は、上記抗体の何れか１つの産生に適した時間及び条件下で、上記宿主細胞を培地中で培養することを含む、抗体を産生する方法を含む。この方法に従って産生された抗体も、本発明の範囲に含まれる。
【００２７】
また、本発明は、上記抗体の何れか１つ又はそれ以上を含む組成物を含む。さらに、この組成物は、医薬として許容される担体を含み得る。
【００２８】
さらに、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体を包含する。この抗体は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７４０６によって指定されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号ＰＴＡ−７８０８によって指定されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体からなる群から選択され得る。また、抗体は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み得る。
【００２９】
本発明は、アミロイドーシスの治療又は予防を必要としている患者中のアミロイドーシスを治療又は予防するための方法も含む。この方法は、治療又は予防を実施するのに十分な量で、患者に、（受動免疫化を介して）上記抗体の１つ又はそれ以上を投与することを含む。アミロイドーシスは、例えば、アルツハイマー病であり得、又はダウン症候群のアミロイドーシスであり得る。
【００３０】
また、本発明は、アミロイドーシスを有する患者の脳内のアミロイドβタンパク質の少なくとも１つのエピトープに結合する単離された抗体を包含する。この抗体は、例えば、ＰＴＡ−７４０６及びＰＴＡ−７８０８からなる群から選択されるＡＴＣＣ寄託番号を有するハイブリドーマによって産生され得る。
【００３１】
本発明は、アルツハイマー病を有すると疑われる患者中のアルツハイマー病を診断する方法も含む。この方法は、患者から生物学的試料（例えば、ＣＳＦ試料又は脳組織試料）を単離する工程と、抗原／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で、上記抗体の１つ又はそれ以上と生物学的試料を接触させる工程と、及び試料中の抗原／抗体複合体の存在を検出する工程とを含み、前記複合体の存在は、患者中のアルツハイマー病の診断を示唆する。複合体の抗原は、例えば、グロブロマーであり得る。
【００３２】
さらに、本発明は、アルツハイマー病を有することが疑われている患者において、アルツハイマー病を診断する別の方法を含む。この方法は、生物学的試料を患者から単離する工程；抗体／抗原複合体の形成のために十分な時間及び条件下で、生物学的試料を抗原と接触させる工程；結合された抗体に連結体を結合させるのに十分な時間及び条件下で、得られた抗体／抗原複合体に連結体を添加する工程（前記連結体は、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に付着された本発明の単離された抗体を含む。）、及びシグナル生成化合物によって生成されたシグナル（シグナルは、患者中のアルツハイマー病の診断を示唆する。）を検出することによって、生物学的試料中に存在し得る抗体の存在を検出する工程を含む。このアッセイにおいて使用される抗原は、例えば、グロブロマーであり得る。
【００３３】
さらに、本発明は、アルツハイマー病を有すると疑われる患者においてアルツハイマー病を診断するさらなる方法を含む。この方法は、生物学的試料を患者から単離する工程；抗抗体／抗体複合体（該複合体は、生物学的試料中に存在する抗体を含有する。）の形成のために十分な時間及び条件下で、生物学的試料を抗抗体（抗抗体は、本発明の抗体の１つ又はそれ以上に対して特異的である）と接触させる工程；結合された抗体に連結体を結合させるのに十分な時間及び条件下で、得られた抗抗体／抗原複合体に連結体を添加する工程（前記連結体は、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合する抗原を含む。）；並びにシグナル生成化合物によって生成されたシグナル（このシグナルは、前記患者中のアルツハイマー病の診断を示す。）を検出する工程を含む。
【００３４】
さらに、本発明は、本発明の抗体の１つ又はそれ以上及び医薬として許容されるアジュバントを含むワクチンも含む。
【００３５】
さらに、本発明は、アルツハイマー病を発症すると予測されている患者の能動免疫に適した化合物を同定する方法を包含する。この方法は、１つ又はそれ以上の化合物が１つ又はそれ以上の抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で、本発明の抗体の１つ又はそれ以上に、目的の１つ又はそれ以上の化合物を曝露する工程、次いで、前記１つ又は複数の抗体に結合する化合物を同定する工程を含み、同定された化合物は、アルツハイマー病を発症すると予測されている患者での能動免疫において使用される。
【００３６】
また、本発明には、本発明の抗体の１つ又はそれ以上、及びシグナル生成化合物に付着された抗体を含む連結体を含み、前記連結体の前記抗体がキット内の１つ又はそれ以上の抗体とは異なる、キットが含まれる。アッセイを実施する際に使用されるべき手順及びキットの成分を記載する同封物もキット中に含め得る。
【００３７】
本発明の抗体の１つ又はそれ以上の抗体に対する抗抗体と及びシグナル生成化合物に結合された抗原を含む連結体とを含む別のキットも、本発明に含まれる。抗原は、例えば、グロブロマーであり得る。同じく、アッセイを実施する際に使用されるべき工程及びキットの成分を記載する同封物を含め得る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１ａ】図１（ａ）は、異なる抗Ａβ抗体（−６Ｅ１０，−３Ｃ５，１０Ｆ４）の特異性のドットブロット分析を示す。ここで調べたモノクローナル抗体は、Ａβ（１２−４２）グロブロマー（実施例Ｉに記載されているように調製された。）でのマウスの能動免疫に続く、融合されたハイブリドーマ細胞の選択によって得られた（市販の６Ｅ１０、Ｓｉｇｎｅｔ、カタログ番号９３２０を除く。）。各Ａβ形態を系列希釈に適用し、免疫反応のために、各モノクローナル抗体とともに温置した。  １．Ａβ（１−４２）単量体、０．１％ＮＨ４ＯＨ  ２．Ａβ（１−４０）単量体、０．１％ＮＨ４ＯＨ  ３．Ａβ（１−４２）単量体、０．１％ＮａＯＨ  ４．Ａβ（１−４０）単量体、０．１％ＮａＯＨ  ５．Ａβ（１−４２）グロブロマー  ６．Ａβ（１２−４２）グロブロマー  ７．Ａβ（２０−４２）グロブロマー  ８．Ａβ（１−４２）原繊維調製物  ９．ｓＡＰＰα（Ｓｉｇｍａ）（ファーストドット：１ｐｍｏｌ）
【図１ｂ】図１（ｂ）は、強度の濃度測定分析を用いて行われた定量的評価を示している。Ａβ（１−４２）グロブロマーの光学的に明瞭に同定が為された最後のドットの相対密度の２０％を超える相対密度を有すると仮定して、各Ａβ形態に対して、最小抗原濃度に対応するドットのみを評価した（閾値）。この閾値は、全てのドットブロットに対して独立に測定した。値は、ある抗体に対するＡβ（１−４２）グロブロマーとそれぞれのＡβ形態の認識との間の関係を示す。
【図２ａ】図２は、アルツハイマー病の脳組織から免疫沈降されたＡβペプチドの結果を示している。  図２（ａ）は、分析のために使用された患者の材料の詳細な記述を表している。
【図２ｂ】図２（ｂ）は、抗体６Ｅ１０、３Ｃ５、１０Ｆ４及び対照抗体ＩｇＧ２ｂでの、異なる患者及び対照の脳試料に対するＳＥＬＤＩ−ＭＳ分析によって定量されたＡβ（１−４０）ペプチド及びＡβ（１−４２）ペプチドの免疫沈降された量を示している。
【図２ｃ】図２（ｃ）は、抗体３Ｃ５、１０Ｆ４及び対照抗体ＩｇＧ２ｂを用いて、異なる患者及び対照の脳試料に対するＳＥＬＤＩ−ＭＳ分析によって定量されたＡβ（１−４０）ペプチド及びＡβ（１−４２）ペプチドの、汎Ａβ抗体６Ｅ１０と比較したパーセントで表した免疫沈降された相対量を示している。抗体６Ｅ１０によって免疫沈降されたＡβペプチドの総量を１００％に設定した。
【図２ｄ】図２（ｄ）は、抗体６Ｅ１０、３Ｃ５、１０Ｆ４及び対照抗体ＩｇＧ２ｂでの、様々な患者及び対照脳試料に対するウェスタンブロット分析によって定量されたＡβペプチドの免疫沈降された量を示している。
【図２ｅ】図２（ｅ）は、抗体３Ｃ５、１０Ｆ４及び対照抗体ＩｇＧ２ｂを用いて、異なる患者及び対照の脳試料に対するウェスタンブロット分析によって定量されたＡβペプチドの、汎Ａβ抗体６Ｅ１０と比較したパーセントで表した免疫沈降された相対量を示している。抗体６Ｅ１０によって免疫沈降されたＡβペプチドの総量を１００％に設定した。
【図３ａ】図３（ａ）は、  １）標準タンパク質（分子マーカータンパク質）  ２）Ａβ（１−４２）原繊維調製物；対照  ３）Ａβ（１−４２）原繊維調製物＋ｍＡｂ６Ｅ１０、２０時間、３７℃、上清  ４）Ａβ（１−４２）原繊維調製物＋ｍＡｂ６Ｅ１０、２０時間、３７℃、沈降物  ５）Ａβ（１−４２）原繊維調製物＋ｍＡｂ３Ｃ５、２０時間、３７℃、上清  ６）Ａβ（１−４２）原繊維調製物＋ｍＡｂ３Ｃ５、２０時間、３７℃、沈降物  ７）Ａβ（１−４２）原繊維調製物＋ｍＡｂ１０Ｆ４、２０時間、３７℃、上清  ８）Ａβ（１−４２）原繊維調製物＋ｍＡｂ１０Ｆ４、２０時間、３７℃、沈降物のＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。
【図３ｂ】図３（ｂ）は、Ａβ原繊維へのインビトロでの抗体結合の濃度測定定量分析を示している。
【図４ａ】図４は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者又は老齢のＡＰＰトランスジェニックマウスの新皮質の横断切片への、異なる濃度の抗体の結合を示している。  図４（ａ）は、ＡＰＰトランスジェニックマウス系統Ｔｇ２５７６及びＡＤ患者（ＲＺ５５）において、脳組織中の斑として及び脳血管中の大脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）として、ＣｏｎｇｏＲｅｄ染色によって確認されたアミロイド沈着を表している。
【図４ｂ】図４（ｂ）は、ＡＤ患者（ＲＺ１６）中でのＡβの実質性沈着（アミロイド斑）の強い染色は６Ｇ１及び市販抗体６Ｅ１０を用いた場合にのみ起こり、これに対して、１０Ｆ４及び３Ｃ５はかなり弱い染色を示すことを示している。全ての抗体は、０．７μｇ／ｍＬの濃度で調べた。
【図４ｃ】図４（ｃ）は、ＴＧ２５７６マウス中でのＡβの実質性沈着（アミロイド斑）の強い染色が６Ｇ１及び市販抗体６Ｅ１０を用いた場合にのみ起こり、これに対して、１０Ｆ４及び３Ｃ５はより弱い染色を示すことを示している。全ての抗体は、０．７μｇ／ｍＬの濃度で調べた。
【図４ｄ】図４（ｄ）から４（ｇ）は、画像分析を用いた、組織学的画像中のＡβ斑染色の分析の定量を示している。光学密度の値（０％＝染色なし）は、バックグラウンド組織のグレイスケール値を差し引いた斑のグレイスケール値から計算した。図４（ｄ）は、Ｔｇ２５７６マウス中での０．７μｇ／ｍＬ抗体の結合を示している。
【図４ｅ】図４（ｄ）から４（ｇ）は、画像分析を用いた、組織学的画像中のＡβ斑染色の分析の定量を示している。光学密度の値（０％＝染色なし）は、バックグラウンド組織のグレイスケール値を差し引いた斑のグレイスケール値から計算した。図４（ｅ）は、APP/Lマウス中での０．０７から０．７μｇ／ｍＬ抗体の結合を示している。
【図４ｆ】図４（ｄ）から４（ｇ）は、画像分析を用いた、組織学的画像中のＡβ斑染色の分析の定量を示している。光学密度の値（０％＝染色なし）は、バックグラウンド組織のグレイスケール値を差し引いた斑のグレイスケール値から計算した。図４（ｆ）は、ＡＤ患者中での０．７μｇ／ｍＬ抗体（ＲＺ５５）の結合を示している。
【図４ｇ】図４（ｄ）から４（ｇ）は、画像分析を用いた、組織学的画像中のＡβ斑染色の分析の定量を示している。光学密度の値（０％＝染色なし）は、バックグラウンド組織のグレイスケール値を差し引いた斑のグレイスケール値から計算した。図４（ｇ）はＡＤ患者（ＲＺ１６）中での０．０７から０．７μｇ／ｍＬ抗体の結合を示している。市販の抗体６Ｅ１０（星）及び４Ｇ８（丸）と抗体６Ｇ１、１０Ｆ４及び３Ｃ５の染色の間の差を統計学的に評価した（１つのアスタリスク／丸：対照に対してｐ＜０．０５、２つのアスタリスク／丸：ｐ＜０．０１及び３つのアスタリスク／丸：ｐ＜０．００１；ｐ＜０．００１を有するＡＮＯＶＡ後の後知恵Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉのｔ検定。）（図４（ｄ）及び（ｅ））。図４（ｅ）及び４（ｇ）において、抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５は、市販抗体６Ｅ１０及び４Ｇ８より有意に弱い染色を常に示した（ＡＮＯＶＡでｐ＜０．００１の後、後知恵ｔ検定でｐ＜０．０５）。
【図４ｈ】図４（ｈ）は、Ａβの血管沈着（矢印）の強い染色が６Ｇ１及び市販抗体６Ｅ１０を用いた場合にのみ起こり、これに対して、８Ｆ５及び８Ｃ５での染色はずっと弱かったことを示している。全ての抗体は、０．７μｇ／ｍＬの濃度で調べた。Ｔｇ２５７６マウスにおいて、定性的に類似の状況が認められた（ここには図示せず。）。
【図５ａ】図５（ａ）、（ｃ）、（ｅ）及び（ｇ）は、モノクローナル抗体6E10、10F4、3C5及び8F5によって、アルツハイマー病患者の脳脊髄液から免疫沈降されたＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）ペプチドの量を示している。４つの各アルツハイマー病脳脊髄液試料に対する結果が示されている（（ａ）＝アルツハイマー病患者＃０５０４００９；（ｃ）＝アルツハイマー病患者＃３００２７；（ｅ）＝アルツハイマー病患者＃３００２６；（ｇ）＝アルツハイマー病患者＃２６７４８０１５）。
【図５ｂ】図５（ｂ）は、抗体６Ｅ１０によって免疫沈降されたＡβペプチドの量と比較した、抗体１０Ｆ４、３Ｃ５及び８Ｆ５によってアルツハイマー病患者の脳脊髄液から免疫沈降されたＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）ペプチドのパーセントで表した相対量を示している。ｍＡｂ６Ｅ１０抗体によって免疫沈降されたＡβペプチドの総量を１００％に設定した。４つの各アルツハイマー病脳脊髄液試料に対する結果が示されている（（ｂ）＝アルツハイマー病患者＃０５０４００９；（ｄ）＝アルツハイマー病患者＃３００２７；（ｆ）＝アルツハイマー病患者＃３００２６；（ｈ）＝アルツハイマー病患者＃２６７４８０１５）。
【図５ｃ】図５（ａ）、（ｃ）、（ｅ）及び（ｇ）は、モノクローナル抗体6E10、10F4、3C5及び8F5によって、アルツハイマー病患者の脳脊髄液から免疫沈降されたＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）ペプチドの量を示している。４つの各アルツハイマー病脳脊髄液試料に対する結果が示されている（（ａ）＝アルツハイマー病患者＃０５０４００９；（ｃ）＝アルツハイマー病患者＃３００２７；（ｅ）＝アルツハイマー病患者＃３００２６；（ｇ）＝アルツハイマー病患者＃２６７４８０１５）。
【図５ｄ】図５（ｂ）は、抗体６Ｅ１０によって免疫沈降されたＡβペプチドの量と比較した、抗体１０Ｆ４、３Ｃ５及び８Ｆ５によってアルツハイマー病患者の脳脊髄液から免疫沈降されたＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）ペプチドのパーセントで表した相対量を示している。ｍＡｂ６Ｅ１０抗体によって免疫沈降されたＡβペプチドの総量を１００％に設定した。４つの各アルツハイマー病脳脊髄液試料に対する結果が示されている（（ｂ）＝アルツハイマー病患者＃０５０４００９；（ｄ）＝アルツハイマー病患者＃３００２７；（ｆ）＝アルツハイマー病患者＃３００２６；（ｈ）＝アルツハイマー病患者＃２６７４８０１５）。
【図５ｅ】図５（ａ）、（ｃ）、（ｅ）及び（ｇ）は、モノクローナル抗体6E10、10F4、3C5及び8F5によって、アルツハイマー病患者の脳脊髄液から免疫沈降されたＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）ペプチドの量を示している。４つの各アルツハイマー病脳脊髄液試料に対する結果が示されている（（ａ）＝アルツハイマー病患者＃０５０４００９；（ｃ）＝アルツハイマー病患者＃３００２７；（ｅ）＝アルツハイマー病患者＃３００２６；（ｇ）＝アルツハイマー病患者＃２６７４８０１５）。
【図５ｆ】図５（ｂ）は、抗体６Ｅ１０によって免疫沈降されたＡβペプチドの量と比較した、抗体１０Ｆ４、３Ｃ５及び８Ｆ５によってアルツハイマー病患者の脳脊髄液から免疫沈降されたＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）ペプチドのパーセントで表した相対量を示している。ｍＡｂ６Ｅ１０抗体によって免疫沈降されたＡβペプチドの総量を１００％に設定した。４つの各アルツハイマー病脳脊髄液試料に対する結果が示されている（（ｂ）＝アルツハイマー病患者＃０５０４００９；（ｄ）＝アルツハイマー病患者＃３００２７；（ｆ）＝アルツハイマー病患者＃３００２６；（ｈ）＝アルツハイマー病患者＃２６７４８０１５）。
【図５ｇ】図５（ａ）、（ｃ）、（ｅ）及び（ｇ）は、モノクローナル抗体6E10、10F4、3C5及び8F5によって、アルツハイマー病患者の脳脊髄液から免疫沈降されたＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）ペプチドの量を示している。４つの各アルツハイマー病脳脊髄液試料に対する結果が示されている（（ａ）＝アルツハイマー病患者＃０５０４００９；（ｃ）＝アルツハイマー病患者＃３００２７；（ｅ）＝アルツハイマー病患者＃３００２６；（ｇ）＝アルツハイマー病患者＃２６７４８０１５）。
【図５ｈ】図５（ｂ）は、抗体６Ｅ１０によって免疫沈降されたＡβペプチドの量と比較した、抗体１０Ｆ４、３Ｃ５及び８Ｆ５によってアルツハイマー病患者の脳脊髄液から免疫沈降されたＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）ペプチドのパーセントで表した相対量を示している。ｍＡｂ６Ｅ１０抗体によって免疫沈降されたＡβペプチドの総量を１００％に設定した。４つの各アルツハイマー病脳脊髄液試料に対する結果が示されている（（ｂ）＝アルツハイマー病患者＃０５０４００９；（ｄ）＝アルツハイマー病患者＃３００２７；（ｆ）＝アルツハイマー病患者＃３００２６；（ｈ）＝アルツハイマー病患者＃２６７４８０１５）。
【図５ｉ】図５（ｉ）は、図５（ａ）から５（ｉ）での分析のために使用されたアルツハイマー病患者の脳脊髄液物質の詳細な記述を表している。
【図６ａ】図６（ａ）は、本明細書において「３Ｃ５」と称されるモノクローナル抗体をコードする可変重鎖のＤＮＡ配列（配列番号１）を示している。
【図６ｂ】図６（ｂ）は、本明細書において「３Ｃ５」と称されるモノクローナル抗体をコードする可変軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号２）を示している。
【図６ｃ】図６（ｃ）は、本明細書において「１０Ｆ４」と称されるモノクローナル抗体をコードする可変重鎖のＤＮＡ配列（配列番号３）を示している。
【図６ｄ】図６（ｄ）は、本明細書において「１０Ｆ４」と称されるモノクローナル抗体をコードする可変軽鎖のＤＮＡ配列（配列番号４）を示している。
【図７ａ】図７（ａ）は、本明細書において「３Ｃ５」と称されるモノクローナル抗体をコードする可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号５）を示している。
【図７ｂ】図７（ｂ）は、本明細書において「３Ｃ５」と称されるモノクローナル抗体をコードする可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号６）を示している。
【図７ｃ】図７（ｃ）は、本明細書において「１０Ｆ４」と称されるモノクローナル抗体をコードする可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号７）を示している。
【図７ｄ】図７（ｄ）は、本明細書において「１０Ｆ４」と称されるモノクローナル抗体をコードする可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号８）を示している。（記載されている各配列中の相補性決定領域（ＣＤＲ）には、下線が付されている。）
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の抗体は、実施例１に記載されているように、末端切断されたグロブロマーＡβ（１２−４２）を用いた免疫化から設計された。特に、モノクローナル抗体３Ｃ５及び１０Ｆ４は、（Ａβ（１−４２）グロブロマーに対して作製されたモノクローナル抗体８Ｆ５及び８Ｃ５とは異なり）、末端切断された（１２−４２）グロブロマーに対して作製された。この（１２−４２）グロブロマーは、限定的タンパク分解によって既存の１−４２グロブロマーから（１２−４２）グロブロマーが作製されるＢａｒｇｈｏｒｎ他（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，９５，８３４−８４７）及び実施例３、第６節に記載されている手順とは異なり、Ａβ１２−４２ペプチドから直接作製された。これら２つのＡβ（１２−４２）グロブロマー変形物の最終凝集パターンは異なる。Ａβ（１２−４２）ペプチドから作製されたものは、中間グロブロマー形態（ＷＯ２００４／０６７５６１に記載されているような「オリゴマーＡ」）のみを示し、既存のＡβ（１−４２）グロブロマーから作製されたものは、成熟したグロブロマーである（ＷＯ２００４／０６７５６１に記載されているような「オリゴマーＢ」）。
【００４０】
免疫療法における患者の認知能力を向上させ、同時に、脳内のＡβペプチドの全体量の僅かな一部のみと反応するＡβグロブロマーに対して誘導された抗体を提供することが本発明の目的である。これは、脳のＡβバランスの大幅な妨害を抑制し、より少ない副作用をもたらすと予想される（例えば、上述のように、治療的に問題のある脳容積の低下が、凝集の繊維性状態におけるＡβペプチドでの能動免疫の研究において観察されている（ＡＮ１７９２を用いたＥＬＡＮ試験）。さらに、この試験では、髄膜脳炎の形態の重い副作用が観察された。本発明は、Ａβグロブロマーに対して高い親和性を有するグロブロマー特異的抗体を提供することによってこの問題を解決する。これらの抗体は、Ａβペプチドの他の形態、特に単量体及び原繊維を識別することができる。さらに、これらの抗体は、脳脊髄液中のアミロイドβに結合しない（又は６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔカタログ番号９３２０）などの）市販の抗体と比べて、より低い親和性で結合する。その結果、本発明は、Ａβグロブロマーに対して結合親和性を有する抗体に関する。
【００４１】
本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）」という用語は、ヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙ（Ｘ及びＹの両方を含む。）のアミノ酸配列を指し、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡＴ（アミノ酸位置１から４３に対応する。）又はその天然に存在する変形物の何れかの、アミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙのアミノ酸配列を指し、特に、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオワ」）、Ａ４２Ｔ及びＡ４２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を有するもの（ここで、数字は、Ａβペプチドの開始位置に対するものであり、位置Ｘ及び位置Ｙの両方を含む。）又は最大３個のさらなるアミノ酸置換（これらの何れもがグロブロマー形成を妨害し得ない。）を有し、好ましくはアミノ酸１２又はＸ（大きい方の数）からアミノ酸４２又はＹ（小さい方の数）までの部分にさらなるアミノ酸置換を有さない、より好ましくはアミノ酸２０又はＸ（大きい方の数）からアミノ酸４２又はＹ（小さい方の数）までの部分にさらなるアミノ酸置換を有さない、最も好ましくはアミノ酸２０又はＸ（大きい方の数）からアミノ酸４０又はＹ（小さい方の数）までの部分にさらなるアミノ酸置換を有さない配列を指し、本明細書において「さらなる」アミノ酸置換とは、自然には見られない標準的な配列からの何らかの逸脱である。
【００４２】
本明細書において「Ａβ（１−４２）」という用語は、ヒトアミロイドβタンパク質の、アミノ酸位置１からアミノ酸位置４２（１及び４２の両方を含む。）のアミノ酸配列を指し、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡ又は天然に存在するその変形物の何れかを指し、特に、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオワ」）、Ａ４２Ｔ及びＡ４２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を有する変形物（ここで、数字は、Ａβペプチドの開始位置に対するものであり、１及び４２の両方を含む。）又は最大３個のさらなるアミノ酸置換（これらの何れもがグロブロマー形成を妨害し得ない。）を有し、好ましくはアミノ酸２０からアミノ酸４２までの部分にさらなるアミノ酸置換を有さない配列を指す。同様に、本明細書における「Ａβ（１−４０）」という用語は、ヒトアミロイドβタンパク質の、アミノ酸位置１からアミノ酸位置４０（１及び４０の両方を含む。）までのアミノ酸配列を指し、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ又は天然に存在するその変形物の何れかを指し、特に、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）及びＤ２３Ｎ（「アイオワ」）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を有する変形物（ここで、数字は、Ａβペプチドの開始位置に対するものであり、１及び４０の両方を含む。）又は最大３個のさらなるアミノ酸置換（これらの何れもがグロブロマー形成を妨害し得ない。）を有し、好ましくはアミノ酸２０からアミノ酸４０までの部分にさらなるアミノ酸置換を有さない配列を指す。
【００４３】
本明細書において「Ａβ（１２−４２）」という用語は、ヒトアミロイドβタンパク質の、アミノ酸位置１２からアミノ酸位置４２（１２及び４２の両方を含む。）のアミノ酸配列を指し、特に、アミノ酸配列ＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡ又は天然に存在するその変形物の何れかを指し、特に、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオワ」）、Ａ４２Ｔ及びＡ４２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を有する変形物（ここで、数字は、Ａβペプチドの開始位置に対するものであり、１２及び４２の両方を含む。）又は最大３個のさらなるアミノ酸置換（これらの何れもがグロブロマー形成を妨害し得ない。）を有し、好ましくはアミノ酸２０からアミノ酸４２までの部分にさらなるアミノ酸置換を有さない配列を指す。
【００４４】
本明細書において「Ａβ（２０−４２）」という用語は、ヒトアミロイドβタンパク質の、アミノ酸位置２０からアミノ酸位置４２（２０及び４２の両方を含む。）のアミノ酸配列を指し、特に、アミノ酸配列Ｆ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡ又は天然に存在するその変形物の何れかを指し、特に、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオワ」）、Ａ４２Ｔ及びＡ４２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を有する変形物（ここで、数字は、Ａβペプチドの開始位置に対するものであり、２０及び４２の両方を含む。）又は最大３個のさらなるアミノ酸置換（これらの何れもがグロブロマー形成を妨害し得ない。）を有し、好ましくはさらなるアミノ酸置換を一切有さない配列を指す。
【００４５】
本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー」（「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状オリゴマー」）という用語は、上で定義されるように、均一性及び独特の物理的特性を有する、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの可溶性の球状の非共有結合を指す。一態様によれば、Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーは、陰イオン性界面活性剤とともに温置することによって取得可能なＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの安定な非原線維性のオリゴマー集合体である。単量体及び原線維とは異なり、これらのグロブロマーは、サブユニットの定められた集合体数によって特徴付けられる（例えば、ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ０４／０６７５６１に記載のように、初期集合形態、ｎ＝４−６、「オリゴマーＡ」及び後期集合形態、ｎ＝１２−１４、「オリゴマーＢ」。）。グロブロマーは、３次元球状型構造を有する（「モルテングロビュール」、Ｂａｒｇｈｏｒｎら、２００５、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、９５、８３４−８４７参照）。これらは、以下の特性の１つ又はそれ以上によってさらに特徴付けられる。
【００４６】
−グロブロマーの末端切断された形態を与える広域プロテアーゼ（サーモリシン又はエンドプロテイナーゼＧｌｕＣなど）でＮ末端アミノ酸Ｘ−２３を切断できること；
−広域プロテアーゼ及び抗体がＣ末端アミノ酸２４−Ｙに接近できないこと；並びに
−これらのグロブロマーの末端切断された形態が、前記グロブロマーの３次元コア構造を維持しており、そのグロブロマー立体構造中のコアエピトープＡβ（２０−Ｙ）の接近性がより優れている。
【００４７】
本発明によると、及び、特に本発明の抗体の結合親和性を評価する目的のために、本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー」という用語は、特に、例えば以下に提示されている実施例Ｉに記載されているような方法によって得ることができる産物を指す。（ＷＯ０４／０６７５６１も参照）。このような方法は、Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１２−４２）グロブロマー及びＡβ（２０−４２）グロブロマーを得るために使用され得る。好ましくは、グロブロマーは、神経細胞に対して親和性を示す。好ましくは、グロブロマーは、神経調節効果も示す。本発明の別の態様によれば、グロブロマーは１１ないし１６、より好ましくは１２ないし１４のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドからなる。
【００４８】
本発明の別の態様によれば、本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー」という用語は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）サブユニットから実質的になるグロブロマーを表し、１２のサブユニットのうち、平均、少なくとも１１のサブユニットがＡβ（Ｘ−Ｙ）型であれば好ましく、グロブロマーの１０％未満が何れかの非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドを含めば、より好ましく、非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの含量が検出閾値を下回っていれば、最も好ましい。より具体的には、本明細書において「Ａβ（１−４２）グロブロマー」という用語は、上記定義のＡβ（１−４２）単位から実質的になるグロブロマーを表し、本明細書において「Ａβ（１２−４２）グロブロマー」という用語は、上記定義のＡβ（１２−４２）単位から実質的になるグロブロマーを表し、本明細書において「Ａβ（２０−４２）グロブロマー」という用語は、上記定義のＡβ（２０−４２）単位から実質的になるグロブロマーを表す。
【００４９】
本明細書において使用される「架橋されたＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー」という用語は、グロブロマーの構成単位の架橋によって、好ましくは化学的な架橋によって、より好ましくはアルデヒド架橋によって、最も好ましくは、グルタルジアルデヒド架橋によって、上述のようなＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーから取得可能な分子を表す。本発明の別の態様において、架橋されたグロブロマーは、実質的に、前記単位が非共有的相互作用のみによって互いに固定されるのではなく、少なくとも部分的に共有結合によって連結されているグロブロマーである。本発明において、架橋されたＡβ（１−４２）グロブロマーは、特に、架橋されたＡβ（１−４２）オリゴマーである。
【００５０】
本明細書において使用される「Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー誘導体」という用語は、特に、検出を容易にする基、好ましくは、蛍光色素分子、例えば、フルオレセイン・イソチオシアナート、フィコエリトリン、エコーレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）蛍光タンパク質、ディクチオソーマ（Ｄｉｃｔｙｏｓｏｍａ）蛍光タンパク質又はこれらのあらゆる組み合わせ若しくは蛍光活性誘導体；発色団；化学発色団、例えば、ルシフェラーゼ、好ましくは、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ルシフェラーゼ又はこれらのあらゆる組み合わせ若しくは化学発光活性誘導体；酵素的に活性な基、例えば、ペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又は酵素的に活性なこれらの何れかの誘導体；電子密度が高い基、例えば、重金属含有基、例えば、金含有基；ハプテン、例えば、フェノールに由来するハプテン；強く抗原性の構造、例えば、抗原性であると予測されるペプチド配列、例えば、Ｋｏｌａｓｋａｒ及びＴｏｎｇａｏｎｋａｒのアルゴリズムによって、抗原性であると予測されるペプチド配列；別の分子に対するアプタマー；キレート基、例えば、ヘキサヒスチジニル；更なる特定のタンパク質−タンパク質相互作用を媒介する天然の又は天然由来のタンパク質構造、例えば、ｆｏｓ／ｊｕｎ対の要素；磁性基、例えば、強磁性基；又は放射性基、例えば、１Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ若しくは１２５Ｉ又はこれらのあらゆる組み合わせを含む基；又は共有結合によって若しくは非共有結合高親和性相互作用によってフラッグ標識されているグロブロマー、好ましくは、不活化、隔離、分解及び／又は沈殿を促進する基に共有結合されているグロブロマー、好ましくはインビボでの分解を促進する基、より好ましくはユビキチンでフラッグ標識されているグロブロマー（この場合、このフラッグ標識されたオリゴマーがインビボで組み立てられるのであれば、特に好ましい。）、又は上記のあらゆる組み合わせによって修飾されたグロブロマーを表す。このような標識及びフラッグ基並びにタンパク質へこれらを付着させるための方法は本分野において公知である。標識化及び／又はフラッグ標識化は、グロブロマー化の前、間又は後に実施され得る。本発明の別の態様において、グロブロマー誘導体は、標識化及び／又はフラッグ化反応によって、グロブロマーから取得できる分子である。対応して、本明細書における「Ａβ（Ｘ−Ｙ）単量体誘導体」という用語は、特に、グロブロマーに対して記載されているように、標識化又はフラッグ化されたＡβ単量体を表す。
【００５１】
本明細書における「より大きな親和性」という用語は、一方で、結合していない及び結合していないグロブロマーと他方で抗体−グロブロマー複合体との間の平衡が抗体−グロブロマー複合体をさらに好む相互作用の程度を表す。同様に、本明細書中の「より小さな親和性」という用語は、一方で、結合していない及び結合していないグロブロマーと他方で抗体−グロブロマー複合体との間の平衡が、結合していない抗体と結合していないグロブロマーをさらに好む相互作用の程度を表す。「より大きな親和性」という用語は「より高い親和性」という用語と同義であり、「より小さな親和性」という用語は「より低い親和性」という用語と同義である。
【００５２】
本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）単量体」という用語は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの単離された形態、好ましくは、他のＡβペプチドとの非共有結合的相互作用に実質的に関わっていないＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの一形態を指す。実際には、Ａβ（Ｘ−Ｙ）単量体は通常、水溶液の形態で提供される。本発明の特に好ましい実施形態では、水系単量体溶液は、０．０５％から０．２％、より好ましくは約０．１％のＮＨ４ＯＨを含有する。本発明の別の特に好ましい実施形態では、水系単量体溶液は、０．０５％から０．２％、より好ましくは約０．１％のＮａＯＨを含有する。（例えば、本発明の抗体の結合親和性を測定するために）使用される場合、前記溶液を適切な方法で希釈することが都合よい場合があり得る。さらに、通常、前記溶液は、その調製から２時間以内、特に１時間以内、特別には３０分以内に使用するのが都合よい。
【００５３】
本明細書において「原繊維」という用語は、電子顕微鏡中で原繊維性構造を示し、コンゴレッドを結合し、次いで、偏光下で複屈折を示し、そのＸ線回折パターンがクロス−β構造である非共有的に会合された各Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの集合物を含む分子構造を表す。本発明の別の態様において、原繊維は、界面活性剤の不存在下で、例えば、０．１ＭＨＣｌ中で、適切なＡβペプチドの自己誘導された重合体凝集を含む方法によって取得可能な分子構造であり、２４超、好ましくは１００単位超の凝集物が形成される。この方法は、本分野において周知である。都合よく、Ａβ（Ｘ−Ｙ）原繊維は、水溶液の形態で使用される。本発明の特に好ましい実施形態において、水性原繊維溶液は、０．１％ＮＨ４ＯＨ中にＡβペプチドを溶解し、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で１：４にこれを希釈した後に、ｐＨを７．４に再調整し、３７℃で２０時間溶液を温置した後、１００００ｇでの１０分間の遠心及び２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４注に再懸濁することによって作製される。
【００５４】
「Ａβ（Ｘ−Ｙ）原繊維」という用語は、本明細書において、Ａβ（Ｘ−Ｙ）サブユニットから実質的になる原繊維を表し、サブユニットの少なくとも９０％が、平均、Ａβ（Ｘ−Ｙ）型であれば好ましく、サブユニットの少なくとも９８％がＡβ（Ｘ−Ｙ）型であればより好ましく、非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの含量が検出閾値を下回っていれば、最も好ましい。
【００５５】
本発明は、前記モノクローナル抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５の何れか１つの結合特性と類似の結合特性を有する抗体にも関する。前記モノクローナル抗体の何れか１つの結合特性と類似の結合特性を有する抗体には、モノクローナル抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５と同じエピトープに結合する抗体が含まれる。
【００５６】
本発明は、１０Ｆ４及び３Ｃ５からなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは全ての抗体と競合することができる抗体にも関する。本明細書において、「競合する抗体」という用語は、同一の分子的実体又は安定的に、但し、非共有結合的に連結された超分子実体、好ましくは同一の分子を標的とする抗体のあらゆる数を表し、少なくとも１つは、好ましくは、その標的エピトープへの他の抗体のアクセスを立体的に妨害することによって、又は他の抗体に対する標的の親和性を低下させる標的実体中の立体構造を誘導及び／又は安定化させることによって、より好ましくは、標的実体の十分近くに近接するエピトープに結合し、標的実体と重複し、又は標的実体と一致し、最も好ましくは、重複又は一致し、特に一致することによって他の抗体の標的エピトープへの接近を直接的に遮断することによって、別の抗体の測定可能な結合を特異的に低下させることが可能である。２つのエピトープが、それらの化学構造、好ましくはそれらのアミノ酸配列の一部を共有すれば、２つのエピトープは、「重複する」と称され、それらの化学構造、好ましくはそれらのアミノ酸配列が同一であれば、「同一」であると称される。従って、本発明は、その標的エピトープが、１０Ｆ４及び３Ｃ５からなる群から選択される抗体の少なくとも１つの標的エピトープと重複し、好ましくは同一である抗体にも関する。従って、前記モノクローナル抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５の何れか１つの結合特性と類似の結合特性を有する抗体には、さらに、前記抗体の何れか１つの抗原結合部分の少なくとも一部を含む抗体が含まれる。好ましくは、前記部分は、前記モノクローナル抗体の何れか１つの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。従って、さらなる特定の実施形態によれば、本発明は、それぞれ、モノクローナル抗体１０Ｆ４又は３Ｃ５の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列及び／又は軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む抗体に関する。このような抗体の具体例には、それぞれ、モノクローナル抗体１０Ｆ４又は３Ｃ５の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列及び／又は軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列も含む抗体ものが含まれる。さらにより具体的には、このような抗体には、それぞれ、モノクローナル抗体１０Ｆ４又は３Ｃ５の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列及び／又は軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列も含む抗体が含まれる。一態様において、従って、本発明は、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ１ドメインがモノクローナル抗体１０Ｆ４又は３Ｃ５の重鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体に関する。従って、さらなる態様において、本発明は、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ１ドメインが、それぞれモノクローナル抗体１０Ｆ４又は３Ｃ５の軽鎖ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体に関する。
【００５７】
一実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲの組を含む。より好ましくは、２つの可変ドメインＣＤＲの組は、ＶＨ１０Ｆ４ＣＤＲセット及びＶＬ１０Ｆ４ＣＤＲセット；ＶＨ３Ｃ５ＣＤＲセット及びＶＬ３Ｃ５ＣＤＲセットからなる群から選択される（図７ａから７ｄ参照）。
【００５８】
別の実施形態において、上に開示されている抗体は、ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む。好ましい実施形態において、抗体はＣＤＲ移植された抗体である。好ましくは、ＣＤＲ移植された抗体は上に開示されているＣＤＲの１つ又はそれ以上を含む。好ましくは、ＣＤＲ移植された抗体はヒトアクセプターフレームワークを含む。
【００５９】
好ましい実施形態において、抗体はヒト化抗体である。好ましくは、ヒト化抗体は上に開示されているＣＤＲの１つ又はそれ以上を含む。より好ましくは、ヒト化抗体は、上に開示されているＣＤＲの３つ又はそれ以上を含む。最も好ましくは、ヒト化抗体は、上に開示されている６つのＣＤＲを含む。特定の実施形態において、ＣＤＲは、ヒトアクセプターフレームワークのヒト抗体可変ドメイン中に取り込まれる。好ましくは、ヒト抗体可変ドメインはコンセンサスヒト可変ドメインである。より好ましくは、ヒトアクセプターフレームワークは、ＣＤＲに隣接する残基、グリコシル化部位残基、まれな残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、標準的残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間の接触領域、Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン内の残基及びＣｈｏｔｈｉａ定義された可変重鎖ＣＤＲ１及びＫａｂａｔ定義された第一の重鎖フレームワークの間で重複する領域中の残基からなる群から選択される中心的残基に少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含む。好ましくは、ヒトアクセプターフレームワークは、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列は前記ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、及び前記ヒトアクセプターフレームワークと同一である少なくとも７０のアミノ酸を含む。さらなる態様において、本発明は、上に定義されている重鎖及び軽鎖の両方を含む抗体に関する。好ましくは、抗体は上に記載されている少なくとも１つの可変ドメインを含む。より好ましくは、抗体は上記２つの可変ドメインを含み、前記２つの可変ドメインは、図７に注記されているようにアミノ酸配列を有する。
【００６０】
別の態様において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びヒトＩｇＧ１Ａｌａ２３４Ａｌａ２３５変異体定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域を含む。特に、抗体はヒト定常領域を含む。ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体が好ましい。
【００６１】
別の実施形態において、抗体はグリコシル化されている。好ましくは、グリコシル化パターンは、ヒトグリコシル化パターンであり、又は本明細書に開示されている真核細胞の何れか１つ、特にＣＨＯ細胞によって産生されるグリコシル化パターンである。
【００６２】
本発明は、本発明の抗体の抗原結合部分にも関する。このような抗原結合部分には、抗体のＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片及び一本鎖Ｆｖ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらなる抗原結合部分は、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片及びジスルフィド結合されたＦｖ断片である。
【００６３】
本発明は、本明細書に開示されている抗体のあらゆる１つをコードする単離された核酸も提供する。さらなる実施形態は、本明細書に開示されている単離された核酸を含むベクターを提供する。ベクターは、特に、ｐｃＤＮＡ；ｐＴＴ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２，ＶｏＩ  ３０，Ｎｏ．２）；ｐＴＴ３（追加の多重クローニング部位を有するｐＴＴ）；ｐＥＦＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．，（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ＲｅｓｅａｒｃｈＶｏｌ１８，Ｎｏ．１７）；ｐＢＶ；ｐＪＶ；及びｐＢＪからなる群から選択され得る。
【００６４】
別の態様において、宿主細胞は、本明細書に開示されているベクターで形質転換される。好ましくは、宿主細胞は原核細胞である。より好ましくは、宿主細胞はイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。関連する実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。好ましくは、真核細胞は、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される。より好ましくは、宿主細胞は、ＣＨＯ及びＣＯＳを含む（但し、これらに限定されない。）哺乳動物細胞又はサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの真菌細胞又はＳｆ９などの昆虫細胞である。
【００６５】
本発明の別の態様は、抗体を生産するのに適した条件下で、本明細書に開示されている宿主細胞又はハイブリドーマの何れか１つを培地中において培養することを含む、本発明の抗体を生産する方法を提供する。別の実施形態は、本明細書に開示されている方法によって取得可能である抗体を提供する。本発明の抗体は、それ自体公知の様式で取得することが可能である。全体として、異なる抗体特異性の数千億から構成される抗体レパートリーを含有するＢリンパ球は、哺乳動物の免疫系の一部である。特定の抗原に対する正常な免疫応答とは、前記抗原に特異的に結合する前記レパートリーの１つ又はそれ以上の抗体を選択することを意味し、免疫応答の成功は、少なくとも部分的には、前記抗体が刺激抗原を特異的に認識し（最終的には、除去する）、前記抗体の環境中の他の分子を無視する能力に基づいている。１つの特定の標的抗原を特異的に認識する抗体の有用性は、モノクローナル抗体技術の開発をもたらした。現在では、標準化されたハイブリドーマ技術によって、目的の抗原に対して単一の特異性を有する抗体を産生することが可能である。より最近では、抗体ライブラリーのインビトロスクリーニングなどの組換え抗体技術が開発されている。これらの技術は、同様に、目的の抗原に対して単一の特異性を有する抗体の産生を可能とする。
【００６６】
本発明の方法において、インビボ又はインビトロの何れかで、抗体レパートリーに対して、目的の抗原を作用させ得る。一実施形態によれば、インビボにおいて動物を抗原で免疫化することによって、抗原をレパートリーに作用させる。このインビボアプローチは、さらに、動物のリンパ球から多数のハイブリドーマを確立すること、及び前記抗原へ特異的に結合する抗体を分泌する特定のハイブリドーマを選択することを含む。免疫化すべき動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物若しくはヒツジであり得、又は、抗原刺激後にヒト抗体を産生する、上に挙げられている動物の何れかのトランスジェニック様式、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスであり得る。免疫され得る動物の他の種類には、ヒト末梢血単核球で（キメラｈｕ−ＰＢＭＣＳＣＩＤマウス）又はリンパ球系細胞若しくはその前駆体で再構成されている重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を有するマウス、及び致死的な全身照射を施された後に、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を有するマウスから得られた骨髄細胞で照射に対して保護され、続いて、機能的ヒトリンパ球が移植されたマウス（「トリメラ」系）が含まれる。免疫化すべき動物の別の種類は、抗原での免疫化後に、前記動物が前記抗原を外来として認識するように、そのゲノム内において、目的の抗原をコードする内在性遺伝子のスイッチが、例えば、相同的組換えによって停止されている（ノックアウトされている）動物（例えば、マウス）である。この方法によって生産されたポリクローナル又はモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ及びドットブロット技術を含む（但し、これらに限定されない。）公知のスクリーニング方法を用いることによって性質決定及び選択される。
【００６７】
別の実施形態によれば、インビトロにおいて、抗原を用いて組換え抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって、抗原を抗体レパートリーに作用させる。組換え抗体ライブラリーは、例えば、バクテリオファージの表面上又は酵母細胞の表面上又は細菌細胞の表面上に発現され得る。様々な実施形態において、組換え抗体ライブラリーは、例えば、ｓｃＦｖライブラリー又はＦａｂライブラリーである。別の実施形態によれば、抗体ライブラリーは、ＲＮＡ−タンパク質融合物として発現される。
【００６８】
本発明の抗体を産生する別のアプローチは、インビボ及びインビトロアプローチの組み合わせを含む。例えば、インビボにおいて、動物を抗原で免疫化した後、前記動物のリンパ球系細胞から調製された組換え抗体ライブラリー又は（例えば、重鎖及び／又は軽鎖を含有する）単一ドメイン抗体ライブラリーを、前記抗原を用いてインビトロでスクリーニングすることによって、抗体レパートリーに対して抗原を作用させ得る。別のアプローチによれば、インビボにおいて、動物を抗原で免疫化した後、前記動物のリンパ球系細胞から作製された組換え抗体ライブラリー又は単一ドメインライブラリーをアフィニティー成熟に供することによって、抗体レパートリーに対して抗原を作用させる。別のアプローチによれば、インビボにおいて動物を抗原で免疫化した後、目的の抗体を分泌する各抗体産生細胞を選択し、（例えば、ＰＣＲを用いて）重鎖及び軽鎖の可変領域に対するｃＤＮＡを、前記選択された細胞から取得し、インビトロにおいて、哺乳動物宿主細胞中で重鎖及び軽鎖の前記可変領域を発現させることにより（これは、選択されたリンパ球抗体法又はＳＬＡＭと称される。）、選択された抗体遺伝子配列をさらに選択及び操作できるようにすることによって、抗原を抗体レパートリーに作用させる。さらに、モノクローナル抗体は、重鎖及び軽鎖に対する抗体遺伝子を哺乳動物細胞中で発現させ、所望の結合親和性を有する抗体を分泌する哺乳動物細胞を選択することによる発現クローニングによって選択され得る。
【００６９】
抗体を生産するための本発明の方法は、抗体の様々な種類を生産するために使用することが可能である。これらには、モノクローナル、特に組換え抗体、特に実質的にヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びＣＤＲ移植抗体並びにこれらの抗原結合部分が含まれる。
【００７０】
本発明は、さらに、本発明のモノクローナル抗体を産生（分泌）することができるハイブリドーマに関する。
本発明のハイブリドーマには、ＰＴＡ−７８０８及びＰＴＡ−７４０６からなる群から選択されるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託番号によって指定されるハイブリドーマ並びにモノクローナル抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５を産生するモノクローナル抗体が含まれる。
【００７１】
本発明の抗体は、本明細書に記載されているＡβグロブロマー以外のＡβ形態とも反応し得、すなわち結合し得ることが注目される。これらの抗原は、オリゴマー若しくはグロブロマーであってもよく、又はオリゴマー若しくはグロブロマーでなくてもよい。従って、本発明の抗体が結合する抗原には、本発明の抗体が反応性を有するグロブロマーエピトープを含むあらゆるＡβ形態が含まれる。このようなＡβ形態には、Ａβ（２０−４２）、Ａβ（２０−４０）、Ａβ（１２−４２）、Ａβ（１２−４０）、Ａβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）形態などの末端切断された及び末端切断されていないＡβ（Ｘ−Ｙ）形態（Ｘ及びＹは、上に定義されている。）が含まれるが、但し、前記形態はグロブロマーエピトープを含む。
【００７２】
本発明は、上に定義されているように、本発明の抗体又はその抗原結合部分を含む組成物にも関する。特定の実施形態によれば、前記組成物は、本発明の抗体又は抗原結合部分及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物である。上に定義されている本発明の抗体又は抗原結合部分は、インビトロ及びインビボの両方において、本発明の抗体又は抗原結合部分が結合するＡβグロブロマー又はその誘導体の活性を好ましくは中和することができる。従って、前記抗体又は抗原結合部分は、例えば、前記グロブロマー若しくはその誘導体を含有する調製物中で、又は前記グロブロマー若しくはその誘導体がその中に存在するヒト個体又は他の哺乳動物中で、前記グロブロマー又はその誘導体の活性を阻害するために使用され得る。
【００７３】
一実施形態によれば、本発明は、前記グロブロマー又はその誘導体の活性を阻害するために、本発明の抗体又はその抗原結合部分をグロブロマー又はその誘導体に対して作用させることを含む、前記グロブロマー又はその誘導体の活性を阻害する方法に関する。前記活性は、例えば、インビトロで阻害され得る。例えば、本発明の抗体又は抗原結合部分は、試料中で、グロブロマー又はその誘導体の活性を阻害するために、前記グロブロマー又はその誘導体を含有し、又は含有すると疑われている対象又は細胞培養から得られた試料などの調製物に添加され得る。あるいは、グロブロマー又はその誘導体の活性は、インビボで、個体中において阻害され得る。従って、本発明は、さらに、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病及びダウン症候群のアミロイドーシスからなる群から選択されるアミロイドーシスを治療又は予防するための医薬組成物を調製するための、上記抗体又は抗原結合部分の使用に関する。従って、本発明の前記使用の一態様は、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスの治療又は予防を必要としている対象において、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスの治療又は予防する方法であり、前記対象に上記抗体又は抗原結合部分を投与することを含む、前記方法である。アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを治療し、及び特に予防するために、前記抗体又は抗原結合部分を使用することは、特に、受動免疫のためである。従って、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを治療又は予防することを必要とする対象において、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを治療又は予防する方法において、前記対象へ抗体又は抗原結合部分を投与する１つの目的は、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスに対して前記対象を受動的に免疫することである。
【００７４】
好ましくは、上に定義されている本発明の抗体又は抗原結合部分は、インビトロ及びインビボの両方において、本発明の抗体又は抗原結合部分が結合するＡβグロブロマー又はその誘導体を検出することができる。従って、前記抗体又は抗原結合部分は、例えば、前記グロブロマー若しくはその誘導体を含有する調製物中で、又は前記グロブロマー若しくはその誘導体がその中に存在するヒト個体又は他の哺乳動物中で、前記グロブロマー又はその誘導体を検出するために使用され得る。
【００７５】
一実施形態によれば、グロブロマー又はその誘導体を結合するために、本発明の抗体又はその抗原結合部分をグロブロマー又はその誘導体に対して作用させること（これにより、好ましくは、抗体又はその抗原結合部分及びグロブロマー又はその誘導体を含む複合体を形成する。）を含む、前記グロブロマー又はその誘導体を検出する方法に関する。グロブロマーは、例えば、インビトロで検出され得る。例えば、本発明の抗体又は抗原結合部分は、調製物中でグロブロマー又はその誘導体を検出するために、調製物に、例えば、前記グロブロマー又はその誘導体を含有し、又は含有すると疑われている対象又は細胞培養から得られた試料に添加され得る。あるいは、グロブロマー又はその誘導体は、インビボで、個体中において検出され得る。従って、本発明は、さらに、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを診断するための組成物を調製するための、上記抗体又は抗原結合部分の使用に関する。本発明の前記使用の一態様は、抗体又は抗原結合部分を対象に投与すること、及び前記抗体又は抗原結合部分を抗原とともに含む複合体の形成を検出することを含み、前記複合体の存在が、前記対象におけるアミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスの存在を示唆する、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを有することが疑われている対象において、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを診断する方法である。本発明の前記使用の第二の態様は、対象から試料を準備すること、前記試料を上記定義の抗体又は抗原結合部分と接触させること、及び前記抗体又は抗原結合部分を抗原とともに含む複合体の形成を検出することを含み、前記複合体の存在が前記対象におけるアミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを示唆する、アミロイドーシス、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを有することが疑われている対象において、特に、アルツハイマー病又はダウン症候群のアミロイドーシスを診断する方法である。
【００７６】
本発明の抗体の結合親和性は、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット又はＢＩＡｃｏｒｅ分析（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）などの標準化されたインビトロイムノアッセイを使用することによって評価され得る。さらなる記載については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６;Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１１：６２０−６２７;Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１;及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７を参照されたい。特定の実施形態によれば、本明細書において定義されている親和性は、ドットブロットを実施し、これを濃度測定によって評価することによって得られる値を表す。本発明の特定の実施形態によれば、ドットブロットによって結合親和性を測定することは、以下のことを含む。抗原（例えば、上に定義されているような、Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー、Ａβ（Ｘ−Ｙ）単量体又はＡβ（Ｘ−Ｙ）原繊維）又は、都合よく、例えば、１００ｐｍｏｌ／μＬ、１０ｐｍｏｌ／μＬ、１ｐｍｏｌ／μＬ、０．１ｐｍｏｌ／μＬ及び０．０１ｐｍｏｌ／μＬの抗原濃度になるように、例えば、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．２ｍｇＢＳＡ中に希釈された抗原の適切な希釈物の一定量を、ニトロセルロース膜上にドット状に付与し、次いで、非特異的な結合を防止するために、膜をミルクでブロックし、洗浄し、次いで、目的の抗体と接触させた後、酵素連結された二次抗体及び呈色反応を用いて目的の抗体を検出し、所定の酵素濃度で、結合された抗体の量が親和性の測定を可能とする。従って、１つの標的への２つの異なる抗体の相対的親和性又は２つの異なる標的への１つの抗体の相対的親和性は、本明細書において、その他は同一のドットブロット条件下で、２つの抗体−標的組み合わせを用いて観察された標的結合された抗体のそれぞれの量の関係として定義される。ウェスタンブロッティングに基づく類似のアプローチとは異なり、ドットブロットアプローチは、天然の立体構造を採る所定の標的への抗体の親和性を測定する。ＥＬＩＳＡアプローチとは異なり、ドットブロットアプローチには、異なる標的とマトリックス間の親和性の差という問題がなく、これにより、異なる標的間でのより正確な比較が可能となる。
【００７７】
本明細書において使用される「Ｋｄ」という用語は、本分野において公知であるように、特定の抗体抗原相互作用の解離定数を表すものとする。
【００７８】
本発明の抗体は、好ましくは、単離された抗体である。「単離された抗体」とは、上述の結合親和性を有し、異なる結合親和性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する。本明細書において、「実質的に含まない」という用語は、抗体の少なくとも９５％、好ましくは抗体の少なくとも９８％、より好ましくは抗体の少なくとも９９％が所望の結合親和性を有する抗体調製物を表す。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないことができる。
【００７９】
本発明の単離された抗体には、モノクローナル抗体が含まれる。
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」は、異なるアミノ酸配列の抗体の混合物を含有する「ポリクローナル」抗体調製物とは異なり、共通の重鎖及び共通の軽鎖アミノ酸配列を共有する抗体分子、抗体の調製物を表すものとする。モノクローナル抗体は、ファージ、細菌、酵母又はリボソームディスプレイのような幾つかの新しい技術及びハイブリドーマから得られた抗体（例えば、標準的なＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎハイブリドーマ法（（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７などのハイブリドーマ技術によって調製されたハイブリドーマによって分泌された抗体）が例である古典的な方法によって作製することが可能である。従って、ハイブリドーマに由来しない均一な配列を有する抗体は、なお、本明細書においてモノクローナル抗体と称されるが、これは、非古典的な方法によって取得され得、「モノクローナル」という用語は、ハイブリドーマに由来する抗体に限定されず、１つの核酸クローンに由来する全ての抗体を表すために使用される。従って、本発明のモノクローナル抗体には、組換え抗体が含まれる。本明細書において使用される「組換え」という用語は、例えば、化学合成によって、又は遺伝子工学技術による核酸の単離されたセグメントの操作によって、組換えがなければ分離されていた配列の２つのセグメントが人工的に組み合わされていることを表す。特に、「組換え抗体」という用語は、宿主細胞中に形質移入された組換え発現ベクターを用いて発現された抗体；組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体；ヒト免疫具グロブリン遺伝子のためにトランスジュニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照されたい。）など、組換え手段によって産生され、発現され、作製され若しくは単離された抗体又は特定の免疫グロブリン遺伝子配列（ヒト免疫グロブリン遺伝子配列など）が他のＤＮＡ配列と組み合わされている、他の何れかの方法で産生され、発現され、作製され若しくは単離された抗体を表す。組換え抗体には、例えば、キメラ、ＣＤＲ移植及びヒト化抗体が含まれる。当業者は、異種の系内での、ハイブリドーマに由来する慣用のモノクローナル抗体の発現には、得られた抗体タンパク質のアミノ酸配列が変化されていない場合又は変化されることが意図される場合でさえ、組換え抗体の作製が必要であることを理解する。
【００８０】
本発明の特定の実施形態において、抗体は、ヒト化された抗体である。実施形態の複数によれば、抗体は、ヒト抗体又はマウス抗体など、専ら単一の種に由来するアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態によれば、抗体は、キメラ抗体又はＣＤＲ移植抗体又はヒト化された抗体の別の形態であり得る。
【００８１】
「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖）からなる免疫グロブリン分子を表すものとする。鎖は、通常、ジスルフィド結合を介して、互いに連結されている。各重鎖は、前記重鎖の可変領域（本明細書において、ＨＣＶＲ又はＶＨと略称される。）及び前記重鎖の定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、前記軽鎖の可変領域（本明細書において、ＬＣＶＲ又はＶＬと略称される。）及び前記軽鎖の定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、ＣＬドメインからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される保存された領域が散在された超可変領域へさらに分割され得る。従って、各ＶＨ及びＶＬ領域は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で、Ｎ末端からＣ末端に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。この構造は、当業者に周知である。
【００８２】
抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、本発明の抗体の断片の１つ又はそれ以上の断片を表し、前記断片は上記結合親和性をなお有する。完全な抗体の断片は、抗体の抗原結合機能を実施可能であることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に従えば、結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される一価断片）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（すなわち、蝶番領域において、ジスルフィド架橋を介して互いに連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから構成されるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＦＬ及びＶＨドメインから構成されるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメイン又はＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＤＨ３若しくはＶＨ、ＣＨ２、ＣＨ３からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６）及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。Ｆｖ断片の２つのドメイン、すなわちＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされているが、これらは、ＶＬ及びＶＨ領域が組み合わされて一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３）を形成している単一のタンパク質鎖として、これらの調製を可能とする合成リンカー（例えば、ポリ−Ｇ４Ｓアミノ酸配列）、及び組換え法を用いて互いにさらに連結され得る。抗体の「抗原結合部分」という用語は、このような一本鎖抗体も含むものとする。「ダイアボディ」などの一本鎖抗体の他の形態も、同様にここに包含される。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されているが、２つのドメインが同じ鎖上で組み合わされるには短すぎるリンカーを使用することにより、前記ドメインを異なる鎖の相補的ドメインと対合するように強制し、２つの抗原結合部位を形成する二価の二重特異的抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８；ＰｏｌｊａｋＲ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１−１１２３を参照）。免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖又は軽鎖定常ドメインを表す。ヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は、本分野において公知である。
【００８３】
さらに、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、前記抗体又は抗体部分の、１つ又はそれ以上のさらなるタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有的会合によって形成されたより大きな免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子に対して適しているのは、四量体ｓｃＦｖ分子を調製するためにストレプトアビジンコア領域を使用すること（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ６：９３−１０１）、並びに二価及びビオチン化されたｓｃＦｖ分子を作製するために、システイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジニル、例えば、ヘキサヒスチジニルタグを使用する（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１:１０４７−１０５８）ことである。
【００８４】
「ヒト抗体」という用語は、その可変及び定常領域が、例えば、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照。）によって記載されたように、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に対応し、又はヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する抗体を表す。しかしながら、本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ中、特にＣＤＲ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムな突然変異導入若しくは部位特異的突然変異導入によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含有し得る。本発明の組換えヒト抗体は可変領域を有し、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する定常領域も含有し得る（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照。）。しかしながら、特定の実施形態によれば、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖系列のＶＨ及びＶＬ配列に関連し、又はこれらの配列に由来するにも関わらず、インビボで、ヒト抗体生殖系列レパートリー内には、天然に存在しないように、組換えヒト抗体はインビトロ突然変異導入（又は、ヒトＩｇ配列のためにトランスジェニックである動物が使用される場合には、インビボ体細胞突然変異導入）に供される。特定の実施形態によれば、この種の組換え抗体は、選択的な突然変異導入又は逆突然変異又は両者の結果である。好ましくは、突然変異導入は、親抗体の親和性より大きい、標的に対する親和性をもたらし、及び／又は親抗体の親和性より小さい、非標的構造に対する親和性をもたらす。
【００８５】
「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種に由来する重鎖及び軽鎖の可変領域に対する配列並びに別の種に由来する定常領域配列を含有する抗体を表す。
【００８６】
「ＣＤＲ移植された抗体」という用語は、マウスＣＤＲの１つ又はそれ以上（例えば、ＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列で置換されているマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１つ又はそれ以上の配列が、別の種のＣＤＲ配列と置換されている抗体を表す。
【００８７】
「ヒト化された抗体」という用語は、ヒト以外の種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物、ヒツジ又はヤギ）由来の重鎖及び軽鎖の可変領域の配列を含有するが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部が、より「ヒト類似に」、すなわち、ヒト生殖系列の可変配列により類似するように改変された抗体を表す。ヒト化抗体の１つの種類は、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置換するために、ヒトＣＤＲ配列がヒト以外のＶＨ及びＶＬ配列中に挿入されているＣＤＲ移植抗体である。
【００８８】
「Ｋａｂａｔ番号」、「Ｋａｂａｔ定義」及び「Ｋａｂａｔ標識」という用語は、本明細書において互換的に使用される。本分野において認知されているこれらの用語は、抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基に比べて、より可変的な（すなわち、超可変的な）アミノ酸残基に付番するシステムを表す（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１及びＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  ＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮＯ．９１−３２４２）。
【００８９】
本明細書において使用される「アクセプター」及び「アクセプター抗体」という用語は、フレームワーク領域の１つ又はそれ以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％を提供又はコードする抗体又は核酸配列を表す。幾つかの実施形態において、「アクセプター」という用語は、定常領域を提供し、又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を表す。さらに別の実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域及び定常領域の１つ又はそれ以上を提供し、又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を表す。具体的な実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域の１つ又はそれ以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％を提供又はコードするヒト抗体アミノ酸又は核酸配列を表す。本実施形態によれば、アクセプターは、ヒト抗体の１つ又はそれ以上の特定の位置に存在しない少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ又は少なくとも１０のアミノ酸残基を含有し得る。アクセプターフレームワーク領域及び／又はアクセプター定常領域は、例えば、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、本分野で周知の抗体、開発中の抗体又は市販の抗体）に由来し、又はこれらから取得され得る。
【００９０】
本明細書で使用される「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を表す。重鎖及び軽鎖の各可変領域中には３つのＣＤＲが存在し、これらは、可変領域の各々に対して、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と表記される。本明細書において使用される「ＣＤＲセット」という用語は、抗原を結合することが可能な単一の可変領域中に存在する３つのＣＤＲの群を表す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従って、異なって定義されてきた。Ｋａｂａｔによって記載されたシステム（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）ａｎｄ  （１９９１））は、抗体の何れの可変領域に対しても適用可能な明瞭な残基付番系を提供するのみならず、３つのＣＤＲを画する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、ＫａｂａｔＣＤＲと称され得る。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）ａｎｄ  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７−８８３（１９８９））は、ＫａｂａｔＣＤＲ内のある種の亜部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにも関わらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体構造を採ることを見出した。これらの亜部分は、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３又はＨ１、Ｈ２及びＨ３（「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖及び重鎖領域を表記する。）と表記される。これらの領域は、ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲと称される場合があり、これは、ＫａｂａｔＣＤＲと重複する境界を有する。ＫａｂａｔＣＤＲと重複するＣＤＲを画する他の境界は、Ｐａｄｌａｎによって記載されている（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９（１９９５））及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  （Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２６２（５）：７３２−４５（１９９６））。さらに別のＣＤＲ境界定義は、上記系の１つに厳格に従わない場合があり得るが、それにも関わらず、ＫａｂａｔＣＤＲと重複するが、それらは、残基又は場合によってはＣＤＲ全体の特定の残基又は基が、抗原結合に著しい影響を与えないという予測又は実験的な発見に照らして、短縮又は延長され得る。本明細書に使用されている方法は、これらのシステムの何れかに従って定義されたＣＤＲを使用し得るが、好ましい実施形態は、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによって定義されたＣＤＲを使用する。
【００９１】
本明細書において使用される「標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」残基という用語は、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）;Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９（１９９２））によって定義される所定の標準的なＣＤＲ構造を規定するＣＤＲ又はフレームワーク中の残基を表す。Ｃｈｏｔｈｉａらによれば、多くの抗体のＣＤＲの重大な一部は、アミノ酸配列のレベルでの大きな多様性に関わらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体構造を有する。各標準的な構造は、ループを形成するアミノ酸残基の連続するセグメントに対して、ペプチド骨格ねじれ角度の群を主に指定する。
【００９２】
本明細書で使用される「ドナー」及び「ドナー抗体」という用語は、１つ又はそれ以上のＣＤＥを提供する抗体を表す。好ましい実施形態において、ドナー抗体は、フレームワーク領域が得られた又は由来する抗体とは異なる種に由来する抗体である。ヒト化抗体という文脈において、「ドナー抗体」という用語は、１つ又はそれ以上のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を表す。
【００９３】
本明細書で使用される「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」という用語は、ＣＤＲを差し引いた可変領域の残りの配列を表す。ＣＤＲ配列の正確な定義は、異なるシステムを用いて決定され得るので、フレームワーク配列の意義は、これに対応して、異なる解釈に供せられる。また、６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２及び−Ｌ３並びに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２及び−Ｈ３）は、軽鎖及び重鎖上のフレームワーク領域を各鎖上の４つの亜領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間に、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に位置する。他者によって表記されるように、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４として特定の亜領域を特定せずに、フレームワーク領域は、天然に存在する単一の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたＦＲを表す。本明細書において使用される、１つのＦＲは、４つの亜領域の１つを表し、複数のＦＲは、フレームワーク領域を構成する４つの亜領域の２つ又はそれ以上を表す。ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は、本分野において公知である。
【００９４】
本明細書において使用される「生殖系列抗体遺伝子」又は「遺伝子断片」という用語は、特定の免疫グロブリンの発現のための遺伝的再編成又は突然変異をもたらす変異プロセスを経ていない非リンパ系細胞によってコードされる免疫グロブリン配列を表す。（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１８３−２００（２００２）;Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．４８４：１３−３０（２００１）参照）。本発明の様々な実施形態によって提供される利点の１つは、生殖系列抗体遺伝子は、成熟した抗体遺伝子より、種内の個体に特徴的な必須のアミノ酸配列構造を保存する傾向がより大きく、このため、その種において使用された場合に、非自己と認識される可能性がより低いという知見から生じる。
【００９５】
本明細書において使用される「中心的な」残基という用語は、抗体、特に、ヒト化抗体の結合特異性及び／又は親和性に対してより大きな影響を有する可変領域内のある種の残基を表す。中心的な残基には、以下の１つ又はそれ以上、すなわちＣＤＲに隣接する残基、グリコシル化候補部位（Ｎ又はＯグリコシル化部位の何れかであり得る。）、稀な残基、抗原と相互作用することができる残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、標準的な残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間の接触残基、Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン内の残基並びに可変重鎖ＣＤＲ１のＣｈｏｔｈｉａ定義及び第一の重鎖フレームワークのＫａｂａｔ定義の間で重複する領域中の残基が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
本明細書において使用される「ヒト化抗体」という用語は、目的の抗原に免疫特異的に結合し、並びにヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域及び非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体又はその変形物、誘導体、類縁体若しくは断片を具体的に表す。ＣＤＲに関して、本明細書において使用される「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲを表す。ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の全てを実質的に含み、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全ては非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のものに対応し、及びフレームワーク領域の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。好ましくは、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの一部も含む。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有する。抗体は、重鎖のＣＨ１、蝶番、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４領域も含み得る。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含有する。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメイン及び／又はヒト化重鎖のみを含有する。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥなどの免疫グロブリンのあらゆるクラス、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４など（但し、これらに限定されない）のあらゆるサブクラスから選択することが可能である。ヒト化抗体のフレームワーク及びＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応する必要はない。例えば、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークは、当該部位のＣＤＲ又はフレームワーク残基が、ドナー抗体又はコンセンサスフレームワークの何れかに正確に対応しないように、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失によって変異され得る。好ましい実施形態において、このような変異は、しかしながら、大規模なものではない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９５％は、親ＦＲ及びＣＤＲ配列のものに対応する。本明細書で使用される「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を表す。本明細書において使用される「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連する免疫グロブリン配列のファミリー中の最も頻繁に存在するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を表す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ  （Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７を参照されたい。）。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列��の各位置は、ファミリー内で当該位置において最も頻繁に存在するアミノ酸によって占有される。２つのアミノ酸が等しい頻度で存在する場合には、何れも、コンセンサス配列中に含まれ得る。
【００９７】
本明細書において使用される「Ｖｅｒｎｉｅｒ」ゾーンとは、Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒ（１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９）によって記載されているように、ＣＤＲ構造を調整し、抗原への適合性を微調整し得るフレームワーク残基のサブセットを表す。Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン残基は、ＣＤＲの下に存在する層を形成し、ＣＤＲの構造及び抗体の親和性に対して影響を及ぼし得る。
【００９８】
「エピトープ」という用語には、免疫グロブリンに特異的な結合をすることができるあらゆるポリペプチド決定基が含まれる。ある種の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸又は糖側鎖、ホスホリル又はスルホリルなどの分子の化学的に活性な表面基を含み、ある種の実施形態において、特異的な三次元構造的特徴及び／又は特異的な電荷特徴を有し得る。エピトープとは、抗体によって結合される抗原の領域である。ある種の実施形態において、抗体が、タンパク質及び／又は高分子の複雑な混合物中で、その標的抗原を優先的に認識する場合に、抗体は抗原を特異的に結合すると称される。
【００９９】
本明細書において「ポリヌクレオチド」と称される用語は、２つ又はそれ以上のヌクレオチド（リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドの何れか又はヌクレオチドの何れかのタイプの修飾された形態）のポリマー形態を意味する。本用語は、ＤＮＡの一本鎖及び二本鎖形態を含むが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【０１００】
本明細書において使用される「単離されたポリペプチド」という用語は、（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ若しくは合成起源又はこれらの何れかの組み合わせの）ポリヌクレオチドを意味するものとし、その起源のために、「単離されたポリヌクレオチド」は、「単離されたポリヌクレオチド」が本来一緒に見出されるポリヌクレオチドの全部又は一部と会合しておらず、本来連結されていないポリヌクレオチドに作用可能に連結されており、又はより大きな配列の一部として本来存在しない。
【０１０１】
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、核酸分子に連結されている別の核酸を輸送することができる該核酸分子を表すものとする。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、その中にさらなるＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡを表す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、ここにおいて、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム中に連結され得る。ある種のベクターは、当該ベクターがその中に導入された宿主細胞中で自律的複製を行うことができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入時に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれることが可能であり、これにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作用可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することが可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（又は単に、「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。プラスミドは、最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に使用され得る。しかしながら、本発明は、均等な機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターのこのような他の形態を含むものとする。
【０１０２】
「作用可能に連結された」という用語は、記載された成分がそれらを所期の様式で機能させることができる関係にある併置を表す。例えば、コード配列に対して「作用可能に連結された」調節配列は、調節配列と適合的な条件下で、コード配列の発現が達成されるように接続されている。「作用可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と連続する発現調節配列及び目的の遺伝子を調節するように、トランスで又は離れて作用する発現調節配列の両方を含む。本明細書において使用される「発現調節配列」という用語は、それらが連結されているコード配列の発現及びプロセッシングに影響を与えるために必要なポリヌクレオチド配列を表す。発現調節配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；及び所望であれば、タンパク質分泌を増強させる配列が含まれる。このような調節配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物では、このような調節配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含む。真核生物では、このような調節配列は、一般に、プロモーター及び転写終結配列を含む。「調節配列」という用語は、その存在が発現及びプロセッシングに不可欠である成分を含むものとし、その存在が有利である追加の成分、例えば、リーダー配列及び融合対配列も含むことが可能である。
【０１０３】
本明細書で定義される「形質転換」とは、外来ＤＮＡが宿主細胞に入る全てのプロセスを表す。形質転換は、本分野で周知の様々な方法を用いて、自然の条件又は人工の条件下で起こり得る。形質転換は、原核又は真核宿主細胞中へ外来核酸配列を挿入するための何れかの公知の方法に依拠し得る。本方法は、形質転換されている宿主細胞に基づいて選択され、ウイルス感染、電気穿孔、リポフェション及び粒子照射を含み得るが、これらに限定されない。このような「形質転換された」細胞には、挿入されたＤＮＡが、自律的に複製するプラスミドとして、又は宿主染色体の一部として、その中で複製することできる安定に形質転換された細胞が含まれる。それらには、挿入されたＤＮＡ又はＲＮＡを、限られた時間にわたって一過性に発現する細胞も含まれる。
【０１０４】
本明細書において使用される「組換え宿主細胞」（又は単に、「宿主細胞」）という用語は、外来ＤＮＡがその中に導入されている細胞を表すものとする。このような用語は、当該細胞を表すのみならず、このような細胞の子孫も表すことを理解すべきである。突然変異又は環境的な影響のために、後続の世代中にある種の修飾が生じ得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一でないことがあり得るが、本明細書において使用される「宿主細胞」という用語の範囲になお含まれる。好ましくは、宿主細胞には、生物の何れかの界から選択される原核及び真核細胞が含まれる。好ましい真核細胞には、原生生物、真菌、植物及び動物細胞が含まれる。最も好ましくは、宿主細胞には、原核細胞株Ｅ．コリ；哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ；昆虫細胞株Ｓｆ９及び真菌細胞サッカロミセス・セレビシアエが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０５】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成及び組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に対しては標準的な技術が使用され得る。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、又は本分野で一般的に遂行されているように、又は本明細書に記載されているように実施され得る。一般に、先述の技術及び手順は、本分野で周知の慣用的な方法に従い、並びに本明細書を通じて引用及び論述されている様々な一般的参考文献及びより具体的な参考文献中に記載されているように実施され得る。例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）」を参照されたい。
【０１０６】
本分野において公知であり、本明細書において使用されている「トランスジェニック生物」は、導入遺伝子を含有する細胞を有する生物を表し、生物（又は生物の先祖）中に導入された導入遺伝子は、当該生物中で天然には発現されていないポリペプチドを発現する。「導入遺伝子」とは、トランスジェニック生物がそこから発達する細胞のゲノム中に安定に及び作用可能に組み込まれており、トランスジェニック生物の１つ又はそれ以上の細胞種又は組織中で、コードされた遺伝子産物の発現を誘導するＤＮＡ構築物である。
【０１０７】
本発明の抗体を作製する方法は、以下に記載されている。本明細書では、インビボアプローチ、インビトロアプローチ又は両方の組み合わせの間で、区別が為される。
【０１０８】
インビボアプローチ：
所望される抗体の種類に応じて、インビボ免疫化のために様々な宿主動物を使用し得る。目的の抗原の内在性様式そのものを発現している宿主が使用され得る。あるいは、目的の抗原の内在性様式を欠乏させた宿主を使用することが可能である。例えば、対応する内在遺伝子における相同的組換えを介して、特定の内在性タンパク質を欠乏させたマウス（すなわち、ノックアウトマウス）は、マウスを免疫化した当該タンパク質に対して液性応答を生成し、従って、該タンパク質に対する高親和性モノクローナル抗体の作製のために使用できることが示されている（例えば、Ｒｏｅｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８３：２３１−２３７;Ｌｕｎｎ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５：４０４−４１２参照）。
【０１０９】
本発明の非ヒト抗体を作製するために、ヒト以外の哺乳動物の複数が、抗体産生のための適切な宿主である。これらには、例えば、マウス、ラット、ニワトリ、ラクダ科の動物、ウサギ、ヒツジ及びヤギ（及びこれらのノックアウト様式）が含まれるが、ハイブリドーマの作製のためには、マウスが好ましい。さらに、ヒト抗体レパートリーを発現している非ヒト宿主動物は、二重特異性を有するヒト抗原に対する実質的にヒト抗体を作製するために使用され得る。この種の非ヒト動物には、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子を有するトランスジェニック動物（例えば、マウス）（キメラｈｕ−ＰＢＭＣＳＣＩＤマウス）及び、以下でより詳しく記載されているヒト／マウス照射キメラが含まれる。
【０１１０】
一実施形態によれば、免疫化された動物は、ヒト以外の哺乳動物が抗原刺激時にヒト抗体を作製するように、ヒト免疫グロブリン遺伝子のためにトランスジェニックとなっているヒト以外の哺乳動物、好ましくはマウスである。典型的には、それらの内在性重鎖及び軽鎖遺伝子坐が不活性であるように改変されたこのような動物中に、ヒト生殖系列配置を有する重鎖及び軽鎖のための免疫グロブリン導入遺伝子が導入される。このような動物が抗原で（例えば、ヒト抗原で）刺激されると、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体（ヒト抗体）が産生される。標準化されたハイブリドーマ技術を用いて、このような動物のリンパ球からヒトモノクローナル抗体を作製することが可能である。ヒト免疫グロブリンを有するトランスジェニックマウス及びヒト抗体の作製におけるそれらの使用のさらなる記載については、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号、ＷＯ９６／３３７３５、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３及びＷＯ９９／５３０４９（Ａｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．）及び米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，７７０，４２９号、米国特許第５，８１４，３１８号、米国特許第５，８７７，３９７号及びＷＯ９９／４５９６２（Ｇｅｎｐｈａｒｍ  Ｉｎｃ．）を参照されたい。「ＭａｃＱｕｉｔｔｙ，Ｊ．Ｊ．ａｎｄＫａｙ，Ｒ．Ｍ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：１１８８;Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ、Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ、Ｆ．Ａ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ、Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８４５−８５１；Ｍｅｎｄｅｚ、Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６−１５６;Ｇｒｅｅｎ、Ｌ．Ｌ．ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、Ａ．（１９９８）；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５；Ｇｒｅｅｎ、Ｌ．Ｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２３１:１１−２３；Ｙａｎｇ、Ｘ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：４０１−４１０;Ｇａｌｌｏ、Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：５３４−５４０も参照されたい。
【０１１１】
別の実施形態によれば、免疫されている動物は、ヒト末梢血単核球若しくはリンパ球系細胞又はこれらの前駆体で再構築された重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を有するマウスであり得る。キメラｈｕ−ＰＢＭＣＳＣＩＤマウスと称されるこのようなマウスは、証明されているように、抗原刺激をすると、ヒト免疫グロブリン応答を産生する。これらのマウス及び抗体を作製するためのそれらの使用のさらなる記述については、例えば、Ｌｅａｄｅｒ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７６：２２９−２３４；Ｂｏｍｂｉｌ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．１９５：３６０−３７５；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２３３−２４１；Ｈｅｒｚ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．ＡｌｌｅｒｇｙＩｍｍｕｎｏｌ．１１３：１５０−１５２；Ａｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１３９３−１４０３；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１:９０１−９０７；Ａｒａｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２１７：７９−８５；Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ，Ｋ．ａｎｄ  Ａｒａｉ，Ｋ．（１９９８）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１７：４１−４５；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ，Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１８：１２１−１２９；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９０：２２−２７；Ｓｍｉｔｈｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１１３−１２４；Ｃｈａｍａｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ１８０：２６８−２７７；及びＨｅａｒｄ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．５：３５−４５を参照されたい。
【０１１２】
別の実施形態によれば、免疫されている動物は、全身照射の致死線量で処理された後、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を有するマウスから得られた骨髄細胞で照射から保護され、続いて、機能的ヒトリンパ球で移植されたマウスである。目的の抗原で前記マウスを免疫化し、次いで、標準化されたハイブリドーマ技術を使用することによってモノクローナル抗体を作製することによって、ヒトモノクローナル抗体を作製するために、Ｔｒｉｍｅｒａ系と称されるキメラのこの種類が使用される。これらのマウス及び抗体を作製するためのそれらの使用のさらなる記述については、例えば、Ｅｒｅｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９３：１５４−１６１;Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ｙ  ａｎｄ  Ｄａｇａｎ，Ｓ．（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２４２−２４６;Ｉｌａｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２９：５５３−５６２;及びＢｏｃｈｅｒ，Ｗ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９６：６３４−６４１を参照されたい。
【０１１３】
インビボ生成された抗体産生細胞から開始して、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に記載されたハイブリドーマ技術などの標準化された技術を用いて、モノクローナル抗体を作製し得る（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１２７：５３９−４６;Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）ＰＮＡＳ７６：２９２７−３１；及びＹｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２９：２６９−７５も参照されたい。）。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製する技術は、十分に公知である（一般的には、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）;Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２;Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．，３：２３１−３６を参照されたい。）。要約すれば、不死化された細胞株（典型的には、骨髄腫）は、本発明のＡβグロブロマー又はその誘導体で免疫された哺乳動物のリンパ球（典型的には、脾細胞又はリンパ節細胞又は末梢血リンパ球）と融合され、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するために、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングする。この目的のために、リンパ球及び不死化された細胞株を融合するための多くの周知のプロトコールのうち何れをも使用することが可能である（Ｇ．Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ２６６：５５０−５２;Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ（上で引用）;Ｌｅｒｎｅｒ，ＹａＩｅＪ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（上で引用）;Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（上で引用）も参照されたい。）。さらに、当業者は、同様に有用であるこのような方法の多様な変形が存在することを理解する。典型的には、不死化された細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳動物種から得られる。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫されたマウスから得られたリンパ球を、不死化されたマウス細胞株と融合することによって確立され得る。好ましい不死化された細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含有する培地に対して感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。骨髄腫細胞株の多数の何れも、例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３又はＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫細胞株を、融合対として、当初からby default使用し得る。これらの骨髄腫細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手することができる。典型的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、マウス脾細胞に融合される。次いで、Ｈ���Ｔ培地を使用し、これにより、融合されていない骨髄腫細胞及び非生産的に融合された骨髄腫細胞を死滅させることによって（融合されていない脾細胞は形質転換されていないので、数日後に死亡する。）、融合から得られたハイブリドーマ細胞株を選択する。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、上に定義されているように結合親和性を有する抗体を選択するために、ドットブロットアッセイを用いることによって、このような抗体に対してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって同定される。モノクローナル抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５の全ては、上記インビボアプローチを用いて作製され、本明細書に定義されているハイブリドーマから取得することができる。
【０１１４】
同様に、前記ハイブリドーマは、以下でさらに詳しく記載されているように、本発明の抗体を組換え的に産生するために、軽鎖及び／又は重鎖をコードする核酸の源として使用することができる。
【０１１５】
インビトロアプローチ：
免疫化及び選択によって本発明の抗体を生産する別の方法として、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングし、これにより、必要とされる結合親和性を有する免疫グロブリンライブラリーの要素を単離することによって、本発明の抗体を同定及び単離し得る。ディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（Ｒ）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。多くの実施形態において、ディスプレイライブラリーはｓｃＦｖライブラリー又はＦａｂライブラリーである。組換え抗体ライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ技術は、十分に記載されている。抗体ディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングするために特に有利に使用することができる方法及び化合物の例は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらＷＯ９２／０１０４７、米国特許第５，９６９，１０８号及び欧州特許第５８９８７７号（特に、ｓｃＦｖ  ｄｉｓｐｌａｙを記載する。）、Ｌａｄｎｅｒら米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６９８号、米国特許第５，８３７，５００号及び欧州特許第４３６５９７号（例えば、ｐＩＩＩ融合を記載する。）；ＤｏｗｅｒらＷＯ  ９１／１７２７１、米国特許第５，４２７，９０８号、米国特許第５，５８０，７１７号及び欧州特許第５２７８３９号（特に、Ｆａｂディスプレイを記載する。）；ＷｉｎｔｅｒらＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＷＯ９２／２０７９１号及び欧州特許３６８，６８４号（特に、可変免疫グロブリンドメインに対する配列のクローニングを記載する。）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓらの米国特許第５，８８５，７９３号及び欧州特許第５８９８７７号（特に、組換えライブラリーを使用することによる、ヒト抗原に対するヒト抗体の単離を記載する。）；ＧａｒｒａｒｄらＷＯ９２／０９６９０（特に、ファージ発現技術を記載する。）;ＫｎａｐｐｉｋらＷＯ９７／０８３２０（ヒト組換え抗体ライブラリーＨｕＣａｌを記載する。）;ＳａｌｆｅｌｄらＷＯ９７／２９１３１（ヒト抗原（ヒト腫瘍壊死因子α）に対する組換えヒト抗体の作製及び組換え抗体のインビトロ親和性成熟も記載する。）及びＳａｌｆｅｌｄらの米国仮特許出願第６０／１２６，６０３号及びこれらに基づく特許出願（同様に、ヒト抗原（ヒトインターロイキン−１２に対する組換えヒト抗体の作製及び組換え抗体のインビトロ親和性成熟も記載する。）に見出すことができる。
【０１１６】
組換え抗体ライブラリーのスクリーニングのさらなる記述は、Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７０−１３７２;Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ３：８１−８５;Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１;Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）ＥＭＢＯＪ１２：７２５−７３４;Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）ＪＭｏｌＢｉｏｌ２２６：８８９−８９６;Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８;Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）ＰＮＡＳ８９：３５７６−３５８０;Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７３−１３７７;Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ１９：４１３３−４１３７;Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ＰＮＡＳ８８：７９７８−７９８２;ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４；及びＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６などの科学的な刊行物中に見出すことができる。
【０１１７】
バクテリオファージディスプレイ系の使用に代えて、組換え抗体ライブラリーは、酵母細胞又は細菌細胞の表面上に発現され得る。ＷＯ９９／３６５６９は、酵母細胞の表面上に発現されたライブラリーを調製し、スクリーニングする方法について記載する。ＷＯ９８／４９２８６は、細菌細胞の表面上に発現されたライブラリーを調製し、スクリーニングする方法についてさらに詳しく記載する。全てのインビトロアプローチにおいて、所望の特性を有する組換え抗体を濃縮するための選択方法は、該方法の不可欠な部分を形成し、これは、一般的に、「パニング」と呼ばれ、しばしば、そのマトリックスに標的構造が付着されたカラム上のアフィニティークロマトグラフィーの形態を採る。次いで、好ましくは標準化されたドットブロットアッセイを用いて、有望な候補分子を、それらの絶対的及び／又は相対的親和性の個別的測定に供する。
【０１１８】
コンビナトリアルライブラリーの目的の抗体が一旦同定され、十分に性質決定されたら、前記抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ配列は、標準化された分子生物学的技術を用いて、例えば、ライブラリースクリーニングの間に単離されたディスプレイパッケージ（例えば、ファージ）からのＤＮＡのＰＣＲ増幅を用いて単離される。ＰＣＲプライマーを調製するために使用し得る軽及び重抗体鎖に対する遺伝子のヌクレオチド配列は、当業者に公知である。このような配列の複数が、例えば、「Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２」及びヒト生殖系列ＶＢＡＳＥの配列のデータベースに記載されている。
【０１１９】
本発明の抗体又は抗体部分は、宿主細胞中で、軽及び重免疫グロブリン鎖に対する遺伝子を組換え的に発現することによって作製され得る。抗体を組換え的に発現させるために、前記抗体の軽及び重免疫グロブリン鎖をコードすることにより、宿主細胞中の軽鎖及び重鎖を発現し、好ましくは前記宿主細胞がその中で培養されている培地中にそれらを分泌するＤＮＡ断片を担持する１つ又はそれ以上の組換え発現ベクターで、宿主細胞が形質移入される。抗体は、この培地から単離することが可能である。重及び軽抗体鎖に対する遺伝子を取得し、前記遺伝子を組換え発現ベクター中に挿入し、前記ベクターを宿主細胞中に導入するために、標準化された組換えＤＮＡ法が使用される。この種の方法は、例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ;Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９），Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）及びＢｏｓｓらの米国特許第４，８１６，３９７号に記載されている。
【０１２０】
目的の抗体のＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が取得されたら、該ＤＮＡ断片は、例えば、可変領域に対する遺伝子を完全長抗体鎖に対する遺伝子に、Ｆａｂ断片に対する遺伝子に、又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準化された組換えＤＮＡ技術を用いてさらに操作され得る。これらの操作は、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片を、別のタンパク質、例えば、定常抗体領域又は柔軟なリンカーをコードする別のＤＮＡ断片に作用可能に連結することを含む。本明細書において「作用可能に連結された」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってコードされたアミノ酸配列が翻訳領域内部に保たれるように、２つのＤＮＡ断片が連結されることを意味することと理解すべきである。ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）と作用可能に連結することによって、完全長重鎖に対する遺伝子へと変換し得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、周知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  ＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１−３２４２を参照）、前記領域を包含するＤＮＡ断片は、標準化されたＰＣＲ増幅を用いて取得し得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＤから得られる定常領域であり得、ＩｇＧ、特に、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４由来の定常領域が好ましい。重鎖Ｆａｂ断片に対する遺伝子を得るために、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖定常領域ＣＨ１のみをコードする別のＤＮＡ分子へ作用可能に連結され得る。ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作用可能に連結することによって、完全長軽鎖に対する遺伝子（及びＦａｂ軽鎖に対する遺伝子）へと変換され得る。ヒト軽鎖の定常領域の遺伝子の配列は、周知であり（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  ＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１−３２４２を参照）、前記領域を包含するＤＮＡ断片は、標準化されたＰＣＲ増幅を用いて取得し得る。軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域であり得るが、κ定常領域が好ましい。
【０１２１】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨ及びＶＬ配列が連続する一本鎖タンパク質として発現され、ＶＬ及びＶＨ領域が柔軟なリンカーによって互いに連結されるように、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片は、柔軟なリンカーをコードする別の断片（例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３）へ、作用可能に連結され得る（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６;Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３;ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  （１９９０）３４８：５５２−５５４参照）。
【０１２２】
上記結合親和性を有する単一のドメインＶＨ及びＶＬは、上記方法によって、単一ドメインライブラリーから単離され得る。所望の結合親和性を有する２つのＶＨ単一ドメイン鎖（ＣＨ１あり又はなし）又は２つのＶＬ鎖又は１つのＶＨ鎖及び１つのＶＬ鎖の対は、本発明の抗体に対して本明細書に記載されているように有用であり得る。
【０１２３】
本発明の組換え抗体又は抗体部分を発現させるために、遺伝子を適切な転写調節配列及び翻訳調節配列へ作用可能に連結するように、部分又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは発現ベクター中に挿入され得る。この文脈において、「作用可能に連結された」という用語は、ベクター内の転写調節配列及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御するという所期の機能を充足するように、抗体遺伝子がベクター中に連結されていることを意味するものと理解すべきである。都合よく、発現ベクター及び発現調節配列は、使用される発現宿主細胞と適合的であるように選択される。抗体軽鎖に対する遺伝子及び抗体重鎖に対する遺伝子は、別個のベクター中に挿入され得、又は両遺伝子は同一の発現ベクター中に挿入され、これが通常の事例である。抗体遺伝子は、標準化された方法を（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補的制限切断部位の連結によって、又は制限切断部位が存在しなければ、平滑末端連結によって）用いて発現ベクター中に挿入される。発現ベクターは、軽鎖及び重鎖に対する配列の挿入の前に、抗体定常領域に対する配列を既に担持し得る。例えば、１つのアプローチは、ＶＨ及びＶＬ配列を、それぞれ、重鎖及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクター中に挿入し、これにより、ベクター内において、ＶＨセグメントをＣＨセグメントに作用可能に連結し、また、ベクター内において、ＶＬセグメントをＣＬセグメントへ作用可能に連結することによって、ＶＨ及びＶＬ配列を完全長抗体遺伝子へ変換することである。
【０１２４】
これに加えて又はこれに代えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。前記抗体鎖に対する遺伝子をベクター中にクローニングし、これにより、抗体鎖に対する遺伝子のＮ末端へ、翻訳領域内にシグナルペプチドを連結し得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種のシグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。抗体鎖に対する遺伝子に加えて、本発明の発現ベクターは、宿主細胞中の抗体鎖に対する遺伝子の発現を調節する制御配列を有し得る。
【０１２５】
「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖に対する遺伝子の転写又は翻訳を調節するさらなる発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。この種の制御配列は、例えば、「Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）」に記載されている。当業者は、制御配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現強度などの要因に依存し得ることを理解する。哺乳動物宿主細胞中での発現のための好ましい制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなど、哺乳動物細胞中に強い恒常的タンパク質発現をもたらすウイルス要素が含まれる。ウイルス制御要素及びその配列のさらなる記述については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉに対する米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらに対する米国特許４，５１０，２４５号及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらに対する米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。
【０１２６】
抗体鎖に対する遺伝子及び制御配列以外に、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）及び選択可能なマーカー遺伝子など、さらなる配列を有し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、その中にベクターが導入される宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌに対する米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，６３４，６６５号及び米国特許第５，１７９，０１７を参照されたい。）。例えば、選択可能なマーカー遺伝子は、その中にベクターが挿入される宿主細胞に対して、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの細胞毒性薬に対する耐性を付与するのが一般的である。好ましい選択可能なマーカー遺伝子には、（メトトレキサート選択／増幅とともに、ｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するための）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）に対する遺伝子及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が含まれる。
【０１２７】
軽鎖及び重鎖を発現させるために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準化された技術を用いて、宿主細胞中に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、原核又は真核宿主細胞中に外来ＤＮＡを導入するために一般に使用される技術の複数、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入などを包含するものとする。原核又は真核宿主細胞の何れの中でも、本発明の抗体を発現することは理論的に可能であるが、真核細胞、特に、哺乳動物細胞中では、原核細胞中に比べて、適切に折りたたまれ、免疫学的に活性な抗体を組み立て、及び分泌する確率がより高いので、真核細胞、特に哺乳動物宿主細胞中で抗体を発現させることが好ましい。抗体遺伝子の原核発現は、活性な抗体の高い収率の産生には有効でないことが報告されている（Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ６：１２−１３）。
【０１２８】
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されており、例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようにＤＨＦＲ−選択可能マーカーとともに使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞中に導入すると、抗体が前記宿主細胞中で発現されるまで、又は、好ましくは、宿主細胞がその中で増殖している培地中に抗体が分泌されるまで、宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。次いで、抗体は、標準化されたタンパク質精製方法を用いることによって、培地から単離され得る。同様に、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子など、完全な状態の抗体の部分を作製するために、宿主細胞を使用することが可能である。上記操作の変形は、もちろん、本発明に含まれる。例えば、本発明の抗体の軽鎖又は重鎖の何れか（但し、両鎖ではない。）をコードするＤＮＡで宿主細胞を形質移入することが望ましい場合があり得る。目的の抗原の結合のために必要とされない軽鎖又は重鎖が存在する場合には、このような軽鎖又はこのような重鎖又は両鎖をコードするＤＮＡは、組換えＤＮＡ技術を用いて、部分的に又は完全に除去され得る。このような末端切断されたＤＮＡ分子によって発現された分子は、同様に、本発明の抗体に含まれる。さらに、標準化された化学的方法を用いて本発明の抗体を第二の抗体に架橋することによって、１つの重鎖及び１つの軽鎖が本発明の抗体であり、他の重鎖及び他の軽鎖が、目的の抗原とは異なる抗原に対して特異性を有する二機能性抗体を作製することが可能である。
【０１２９】
本発明の抗体又はその抗原結合部分の組換え発現用の好ましい系では、リン酸カルシウムによって媒介された形質移入を用いて、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖及び軽鎖に対する遺伝子は、各事例において、前記遺伝子の強い転写を実施するために、制御ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＰＬプロモーター要素へ作用可能に連結されている。組換え発現ベクターは、メトトレキサート選択／増幅を使用することによって、ベクターで形質移入されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を選択するために使用可能なＤＨＦＲ遺伝子も担持する。選択された被形質転換宿主細胞は、重及び軽抗体鎖が発現され、完全な状態の抗体が培地から単離されるように培養される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞を形質移入し、形質転換体を選択し、前記宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収するために、標準化された分子生物学的技術が使用される。従って、本発明は、本発明の組換え抗体が合成されるまで、適切な培地中で、本発明の宿主細胞を培養することによって、本発明の組換え抗体を合成する方法に関する。この方法は、前記培地から前記組換え抗体を単離することをさらに含み得る。
【０１３０】
ファージディスプレイによって、組換え抗体ライブラリーをスクリーニングする代わりに、巨大なコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして本発明の抗体を同定するために、当業者に公知の他の方法を使用し得る。基本的には、核酸と該核酸によってコードされる抗体との間の密接な物理的連結が確立され、及び核酸配列がコードする抗体の特性によって適切な核酸配列を選択するために使用され得る全ての発現系を使用し得る。別の発現系の１つの種類において、組換え抗体ライブラリーは、Ｓｚｏｓｔａｋ及びＲｏｂｅｒｔｓに対するＷＯ９８／３１７００並びに「Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１２２９７−１２３０２」に記載されているように、ＲＮＡ−タンパク質融合物の形態で発現される。この系では、３’末端上にピューロマイシン（ペプチジルアクセプター抗生物質）を担持する合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳は、ｍＲＮＡ及びこれによってコードされるペプチド又はタンパク質の共有的融合をもたらす。従って、ｍＲＮＡの複雑な混合物（例えば、コンビナトリアルライブラリー）の特定のｍＲＮＡは、Ａβ（１２−４２）グロブロマー又はその誘導体への前記抗体又は前記抗体の前記部分の結合など、コードされるペプチド又はタンパク質の（例えば、抗体又はその部分の）特性に基づいて濃縮され得る。抗体又はその部分をコードし、このようなライブラリーのスクリーニングによって得られる核酸配列は、上述のように（例えば、哺乳動物宿主細胞中で）組換え手段によって発現され得、さらに、ｍＲＮＡ−ペプチド融合物をさらなるラウンドにおいてスクリーニングし、最初に選択された配列中に変異を導入することによって、又は上述のように組換え抗体のインビトロアフィニティー成熟の他の方法を用いることによって、さらなる親和性成熟に供され得る。
【０１３１】
インビボとインビトロアプローチの組み合わせ
同様に、Ａβ（１２−４２）グロブロマー又はその誘導体を、まず、インビボで、宿主動物中の抗体レパートリーに対して作用させて、Ａβ（１２−４２）グロブロマー又は誘導体結合抗体の産生を刺激した後、１つ又はそれ以上のインビトロ技術の補助を得て、さらなる抗体選択及び／又は抗体成熟（すなわち、最適化）が達成される方法など、インビボとインビトロアプローチの組み合わせを使用することによって、本発明の抗体を作製し得る。一実施形態によれば、この種の組み合わされた方法は、まず、抗原に対する抗体応答を刺激するために、前記Ａβ（１２−４２）グロブロマー又はその誘導体でヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物、ヒツジ若しくはヤギ又はこれらのトランスジェニック様式又はキメラマウス）を免疫化し、次いで、前記Ａβ（１２−４２）グロブロマー又は誘導体の作用によってインビボで刺激されたリンパ球の免疫グロブリン配列を使用することによって、ファージディスプレイ抗体ライブラリーを調製及びスクリーニングすることを含み得る。この組み合わせ操作の第一の工程は、インビボアプローチと組み合わせて上記の様式で実施され得るが、この操作の第二の工程は、インビトロアプローチと組み合わせて上記の様式で実施され得る。前記刺激されたリンパ球から調製されたファージディスプレイライブラリーのその後のインビトロスクリーニングによって非ヒト動物を過免疫化する好ましい方法には、ＢｉｏＳｉｔｅＩｎｃによって記載される方法に含まれ、例えば、ＷＯ９８／４７３４３、ＷＯ９１／１７２７１、米国特許第５，４２７，９０８号及び米国特許第５，５８０，７１７号を参照されたい。
【０１３２】
別の実施形態によれば、組み合わされた方法は、まず、Ａβ（１２−４２）グロブロマー又はその誘導体に対する抗体応答を刺激するために、本発明のＡβ（１２−４２）グロブロマー又はその誘導体でヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物、ヒツジ若しくはヤギ又はこれらのノックアウト及び／又はトランスジェニック様式又はキメラマウス）を免疫化し、（例えば、免疫化された動物から調製された）ハイブリドーマをスクリーニングすることによって、所望の特異性を有する抗体を作製するリンパ球を選択することを含む。抗体又は単一ドメイン抗体に対する遺伝子は、（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応などの標準化されたクローニング方法を用いて）選択されたクローンから単離され、選択された１つ又は複数の抗体の結合特性を改善するために、インビトロアフィニティー成熟に供される。この操作の第一の工程は、インビボアプローチに関連する上記様式で実施され得るのに対して、この操作の第二の工程は、特に、ＷＯ９７／２９１３１及びＷＯ００／５６７７２に記載されているものなど、インビトロアフィニティー成熟の方法を用いることによって、インビトロアプローチに関連して上述されている様式で実施され得る。
【０１３３】
さらなる組み合わされた方法において、組換え抗体は、選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ；ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｔｈｏｄ）として当業者に公知であり、米国特許第５，６２７，０５２号、ＷＯ９２／０２５５１及びＢａｂｃｏｃｋ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：７８４３−７８４８に記載されている操作を使用することによって、個別の単離されたリンパ球から作製される。この方法では、まず、オリゴマー又は誘導体への免疫応答を刺激するために、Ａβ（１２−４２）グロブロマー又はその誘導体で、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物、ヒツジ、ヤギ若しくはこれらのトランスジェニック様式、又はキメラマウス）をインビボで免疫化し、次いで、抗原特異的溶血斑アッセイを用いることによって、目的の抗体を分泌する個別の細胞を選択する。＜０｝この目的のために、グロブロマー又はその誘導体又は構造的に関連する目的の分子は、ビオチンなどのリンカーを用いて、ヒツジ赤血球に結合し、これにより、溶血斑アッセイを使用することによって、適切な特異性を有する抗体を分泌する個別の細胞を同定することを可能とし得る。目的の抗体を分泌する細胞の同定に続き、逆転写酵素ＰＣＲによって、軽鎖及び重鎖の可変領域に対するｃＤＮＡを細胞から取得し、次いで、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞中で、適切な免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト定常領域）に付随して、前記可変領域を発現し得る。インビトロで選択されたリンパ球に由来する増幅された免疫グロブリン配列で形質移入された宿主細胞は、次いで、例えば、結合親和性を有する抗体を発現する細胞を単離するために、形質移入された細胞を伝播させることによって、さらなるインビトロ分析及びインビボ選択に供され得る。増幅された免疫グロブリン配列は、さらに、インビトロで操作され得る。
【０１３４】
本明細書に定義されている必要とされる親和性を有する抗体は、実質的に上述されているドットブロットを実施することによって選択することができる。簡潔に述べると、系列希釈して、抗原を固体マトリックスに付着させ、好ましくはニトロセルロース膜上に点状に付着させる。次いで、固定化された抗原を目的の抗体と接触させた後、酵素連結された二次抗体及び比色反応を用いた抗体の検出を行う。所定の抗体及び抗原濃度で、結合された抗体の量が、アフィニティー測定を可能とする。従って、１つの標的への２つの異なる抗体の相対的親和性又は２つの異なる標的への１つの抗体の相対的親和性は、本明細書において、その他は同一のドットブロット条件下で、２つの抗体−標的組み合わせを用いて観察された標的結合された抗体のそれぞれの量の関係として定義される。モノクローナル抗体１０Ｆ４又は３Ｃ５と同一のエピトープに結合する抗体は、それ自体公知の様式で取得することが可能である。
【０１３５】
上記抗体が競合され得るのと同様に、これらの構造の少なくとも１つは、好ましくは重複するエピトープ又は同一のエピトープ、より好ましくは同一のエピトープを提供することによって、別の構造の測定可能な結合を特異的に低下させることができれば、本明細書において、異なる標的構造は、特定の抗体に対して「競合する」と称される。標的実体との競合は、このような標的構造に対するそれらの相対的親和性によって抗体を直接的に選択するのに有用である。従って、競合実体、例えば、異なって標識された競合構造の区別可能な形態を目的の抗体と接触させ、抗体によって結合されるこれらの実体の相対量から、これらの実体の各々に対する抗体の相対的親和性を推定する競合アッセイを使用することによって、相対的親和性を直接測定し得る。より大きな親和性が望まれる実体を固体マトリックス支持体に付着させ、培地に対してより小さな親和性が望まれる競合実体の適切な量、好ましくは、モル過剰を添加することによって、標的実体に対する所望の相対的親和性を有する抗体を直接濃縮するために、このような競合を使用し得る。従って、所望の相対的親和性を示す抗体は、他の抗体より強くマトリックスに結合する傾向があり、例えば、低い塩濃度で洗浄した後、高い塩濃度を使用することにより、結合した抗体をその標的から可逆的に剥離させることによって結合した抗体を採集することによって、より望ましくない形態を洗浄除去した後に取得され得る。所望であれば、濃縮を数回繰り返して実施し得る。例えば、ハイブリドーマ又は抗原をディスプレイするファージ又は酵母細胞のプール中で、抗体の基礎を成す遺伝子型がこの抗体に物理的に関連付けられている本発明の特定の実施形態では、対応する表現型が救出され得る。
【０１３６】
本発明の別の実施形態において、抗体の相対的親和性が固定化された抗原に結合されたパーセントから推測できるように、抗体結合に関して、固定化された抗原が溶解された実体と競合する修飾されたドットブロットが使用される。パパイン又はペプシンでの消化など慣用技術を使用することによって、完全な抗体から、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分を作製し得る。さらに、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は、標準化された組換えＤＮＡ技術を使用することによって取得し得る。
【０１３７】
本発明は、本発明の抗体を含み、医薬として適切な担体を場合によって含む薬剤（組成物）にも関する。
本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、その緩和のために本発明の抗体が有用である疾病の治療のための１つ又はそれ以上のさらなる治療剤をさらに含有し得る。例えば、本発明の抗体が本発明のグロブロマーに結合すれば、医薬組成物は、さらに、前記グロブロマーの活性が重要である疾患の治療に有用である１つ又はそれ以上の追加の治療剤を含有し得る。医薬として適切な担体には、生理的に適合性がある限り、全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。医薬として許容される担体には、例えば、水、生理的食塩水、リン酸緩衝化された生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの及びこれらの組み合わせが含まれる。多くの事例で、等張剤、例えば、糖、マニトール若しくはソルビトールなどの多価アルコール又は塩化ナトリウムをさらに使用することが好ましい。医薬として適切な担体は、抗体の半減期又は効力を増強する、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝剤などの補助物質の比較的少量をさらに含有し得る。医薬組成物は、例えば、非経口投与に適切であり得る。ここで、抗体は、好ましくは、０．１から２５０ｍｇ／ｍＬの抗体含量を有する注射可能溶液として調製される。注射可能溶液は、液体又は凍結乾燥された形態で調製され得、剤形は、フリントガラス又はバイアル、アンプル又は予め充填された注射器である。緩衝液は、Ｌ−ヒスチジン（１から５０ｍＭ、好ましくは、５から１０ｍＭ）を含有し得、５．０から７．０、好ましくは６．０のｐＨを有する。さらに、適切な緩衝液には、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。０から３００ｍＭの濃度に（好ましくは、液体剤形に対して１５０ｍＭ）の溶液の浸透圧を調整するために、塩化ナトリウムを使用し得る。凍結乾燥された剤形に対して、凍結保護剤、例えば、スクロース（例えば、０から１０％、好ましくは、０．５から１．０％）も含め得る。他の適切な凍結保護剤は、トレハロース及びラクトースである。凍結乾燥された剤形に対して、充填剤、例えば、マニトール（例えば、１０％、好ましくは、２から４％）も含め得る。液体及び凍結乾燥された剤形の両方に、安定化剤、例えば、Ｌ−メチオニン（例えば、５１から５０ｍＭ、好ましくは５から１０ｍＭ）を使用し得る。さらなる適切な充填剤は、グリシン及びアルギニンである。界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０（例えば、０．０５％、好ましくは、０．００５から０．０１％）も使用し得る。さらなる界面活性剤は、ポリソルベート２０及びＢＲＩＪ界面活性剤である。
【０１３８】
本発明の組成物は、多様な形態を有し得る。これらには、液体溶液（例えば、注射可能及び注入可能な溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、リポソーム及び坐剤などの液体、半固体及び固体剤形が含まれる。好ましい形態は、予定される投与の種類及び治療用途に依存する。典型的には、注射可能溶液又は注入可能溶液の形態の組成物、例えば、ヒトの受動免疫のための他の抗体と類似する組成物が好ましい。投与の好ましい経路は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態によれば、抗体は、静脈内注入又は注射によって投与される。別の好ましい実施形態によれば、抗体は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。治療組成物は、典型的には、調製及び保存条件下で、無菌及び安定でなければならない。組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、分散液、リポソーム又は活性物質の高濃度に適したその他の秩序化された構造として製剤化され得る。無菌注射可能溶液は、適宜、必要であれば、上記成分の１つ又は組み合わせとともに、必要な量で活性化合物（すなわち、抗体）を適切な溶媒中に導入し、次いで、前記溶液を滅菌ろ過することによって調製され得る。通常、分散液は、塩基性分散媒、及び、適宜、その他の必要とされる成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を導入することによって調製される。無菌注射可能溶液を調製するための凍結乾燥された無菌粉末の場合には、予め滅菌ろ過された溶液から、活性成分の粉末、及び、適宜、さらなる所望の成分の粉末を産生する真空乾燥及び粉末乾燥が好ましい調製方法である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合には、必要な粒径を維持することによって、又は界面活性剤を使用することによって維持し得る。注射可能組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中にさらに導入することによって実現され得る。
【０１３９】
本発明の抗体は、当業者に公知の方法の複数によって投与され得るが、多くの治療用途に対して好ましい投与の種類は、皮下注射、静脈内注射又は注入である。当業者は、投与の経路及び／又は種類が所望される結果に依存することを理解する。特定の実施形態によれば、活性化合物は、例えば、インプラント、経皮膏薬及び微小封入された放出系を含む持続的な放出又は調節された放出を有する製剤など、急速な放出に対して化合物を保護する担体とともに調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生物分解可能な生体適合性ポリマーを使用し得る。このような製剤を調製する方法は、当業者に周知であり、例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８」を参照されたい。
【０１４０】
特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、例えば、不活性希釈剤又は代謝可能な食用担体中に入れて、経口投与され得る。また、抗体（及び、所望であれば、さらなる成分）を硬若しくは軟ゼラチンカプセル中に封入し、錠剤へと圧縮し、又は食物に直接添加し得る。経口治療的投与の場合、抗体は、賦形剤と混合され、経口錠剤、口腔錠、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップなどの形態で使用され得る。非経口経路以外の経路を介して本発明の抗体を投与することが予定される場合には、その不活化を妨げる材料からコーティングを選択することが必要であり得る。
【０１４１】
本発明は、アミロイドβタンパク質が関与しており、及び、特に、本発明の前記グロブロマーの活性が重要である疾患に罹患している個体中の本発明のグロブロマーの活性を阻害する方法にも関する。抗体が結合するグロブロマーの活性を阻害する目的で、前記方法は、本発明の少なくとも１つの抗体を個体に投与することを含む。前記個体は、好ましくは、ヒトである。本発明の抗体は、治療目的のために、ヒト個体に投与され得る。さらに、本発明の抗体は、獣医目的のためにヒト以外の哺乳動物に投与され得、又は、特定の疾患に対する動物モデルの枠組み内に投与され得る。このような動物モデルは、（例えば、投与の用量及び時間を検査するために）本発明の抗体の治療的効力を評価するのに有用であり得る。
【０１４２】
本発明のグロブロマーが役割を果たしている疾患には、特に、その発達及び進行に、本発明のグロブロマーが関与している疾患が含まれる。これらは、特に、本発明のグロブロマーが、明らかに又はおそらく、疾患の病態生理の原因であり、又は前記疾患の発達及び／又は進行に寄与している因子である疾患である。従って、本発明のグロブロマーの活性の阻害が疾患の症候及び／又は進行を緩和させることができるこれらの疾患が本明細書に含まれる。このような疾患は、例えば、特定の疾患に罹患している個体の生物学的液体中の本発明のグロブロマーの増加された濃度（例えば、血清、血漿、ＣＳＦ、尿中などの増加された濃度）によって確認することができる。これは、例えば、本発明の抗体を使用することによって検出され得る。本発明のグロブロマーは、神経変性要素、認知不全、神経毒性要素及び炎症性要素が関与する疾患の複数と関連する病理において重要な役割を果たしている。
【０１４３】
本発明の別の態様において、治療又は予防可能な疾患には、アミロイドーシスを伴う疾患が含まれる。本明細書において「アミロイドーシス」という用語は、身体の様々な組織中の特定のタンパク質（アミロイド、繊維性タンパク質及びこれらの前駆体）の異常な折り畳み、凝集塊形成、凝集及び／又は蓄積を特徴とする多数の疾患を表す。アルツハイマー病及びダウン症候群では神経組織が冒され、脳アミロイド血管症では血管が冒される。本発明の医薬組成物は、本発明の抗体又は抗体部分の「治療的有効量」又は「予防的有効量」を含み得る。「治療的有効量」は、所望の治療的結果を達成するために必要な投薬量で、及び所望の治療的結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を表す。抗体又は抗体部分の治療的有効量は、当業者によって決定され得、病状、年齢、性別及び個体の体重並びに抗体又は抗体部分が個体内で所望の応答を惹起する能力などの因子に従って変動し得る。治療的有効量は、抗体又は抗体部分のあらゆる毒性効果又は有害な効果が、治療的に有益な効果によって凌駕される量でもある。「予防的有効量」は、所望の予防的結果を達成するために必要な投薬量で、及び所望の予防的結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を表す。疾病のより初期段階の前に又は疾病のより初期段階において、予防的投薬が対象中で使用されるので、通例、予防的有効量は、治療的有効量を下回る。
【０１４４】
さらに、本発明は、アルツハイマー病の予防又は治療を必要としている患者において、アルツハイマー病を予防又は治療するさらなる方法をさらに含む。この方法は、予防又は治療を実施するのに十分な量で、上記ワクチンを患者に投与する工程を含む。
【０１４５】
さらに、本発明は、アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病を発症すると予測されている患者の能動免疫に適した化合物を同定する方法を包含する。この方法は、１）１つ又はそれ以上の化合物が１つ又は複数の抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で、上記抗体の１つ又はそれ以上に目的の１つ又はそれ以上の化合物を曝露すること、２）前記１つ又は複数の抗体に結合する化合物を同定することを含み、同定された化合物は、アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病を発症すると予測されている患者での能動免疫において使用される。
【０１４６】
抗体の診断的使用の枠内において、定性又は定量特異的グロブロマー測定は、特に、疾病に関連するアミロイドβ形態を診断する役割を果たす。この文脈において、特異性とは、あるグロブロマー又はその誘導体又はこれらの混合物を十分な感度で検出できる可能性を意味する。本発明の抗体は、試料の１０ｎｇ／ｍＬ未満、好ましくは試料の１ｎｇ／ｍＬ未満、及び特に好ましくは試料の１００ｐｇ／ｍＬ未満の検出閾値濃度を有利に有し、少なくとも各事例に示されているｍＬ試料当りのグロブロマーの濃度、有利には、より低い濃度が、本発明の抗体によって検出可能であることを意味する。検出は、免疫学的に実施される。これは、原則として、凝集及び沈殿技術、イムノアッセイ、免疫組織学的方法並びにイムノブロット技術、例えば、ウェスタンブロッティング又は、好ましくは、ドットブロット法など、抗体が使用されるあらゆる分析又は診断アッセイ方法によって実施され得る。インビボ法では、例えば、画像化法も本発明に含まれる。
【０１４７】
イムノアッセイにおける使用が有利である。競合的イムノアッセイ（すなわち、抗原及び標識された抗原（追跡物質）が抗体結合を競合するアッセイ）及びサンドイッチアッセイ（すなわち、抗原への特異的抗体の結合が、第二の、通常は標識された抗体によって検出されるアッセイ）が、ともに適切である。これらのアッセイは、均一（すなわち、固相及び液相への分離がない。）又は不均一（すなわち、結合された標識が、例えば、固相に結合された抗体を介して、結合されていない抗体から分離されている。）の何れかであり得る。標識化及び測定の方法に応じて、様々な不均一及び均一イムノアッセイフォーマットは、特定のクラスに、例えば、ＲＩＡｓ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＦＩＡ（蛍光イムノアッセイ）、ＬＩＡ（発光イムノアッセイ）、ＴＲＦＩＡ（時間分解ＦＩＡ）、ＩＭＡＣ（免疫活性化（ｉｍｍｕｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ））、ＥＭＩＴ（酵素増倍免疫検査）、ＴＩＡ（免疫比濁法）、Ｉ−ＰＣＲ（イムノＰＣＲ）に分類することができる。
【０１４８】
発明のグロブロマー定量の場合、追跡物質としての役割を果たす標識されたグロブロマー誘導体の所定量が、使用されている抗体への結合について定量されるべき試料（標識されていないグロブロマーの未知の量を含有する。）のグロブロマーと競合する競合的イムノアッセイが好ましい。試料中の抗原の量、すなわち、グロブロマーの量は、標準曲線の補助を得て、置換された追跡物質の量から測定することが可能である。
【０１４９】
これらの目的のために利用可能な標識のうち、酵素が有利であることが判明している。ペルオキシダーゼ、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びβ−Ｄガラクトシダーゼに基づく系が、例えば使用され得る。例えば、その転化を分光学的にモニターすることができる特異的な基質をこれらの酵素に対して利用することが可能である。適切な基質系は、アルカリホスファターゼに対しては、ｐ−ニトロフェニルホスファート（ｐ−ＮＰＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＰＴ）、ファーストレッド／ナフトールーＡＳ−ＴＳホスファート；ペルオキシダーゼに対しては、２，２−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンー６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＴ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、３−ジメチルアミノ安息香酸（ＤＭＡＢ）及び３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）；β−ガラクトシダーゼに対しては、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ｏ−ＮＰＧ）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド及び４−メチルウンベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＧ）に基づく。多くの事例で、これらの基質系は、即時使用形態で、例えば、適切な緩衝液などのさらなる試薬も含有し得る錠剤の形態で市販されている。使用される追跡物質は、標識されたグロブロマーであり得る。この意味で、特定のグロブロマーは、測定されるべきグロブロマーを標識し、これを追跡物質として使用することによって測定することが可能である。追跡物質を調製するための、グロブロマーへの標識の結合は、それ自体公知の様式で実施され得る。本発明のグロブロマーの誘導体化に関する上記コメントは、類推によって表記されている。さらに、タンパク質への連結のために適切に修飾された多数の標識、例えば、ビオチン、アビジン、エクストラビジン又はストレプトアビジン連結された酵素、マレイミドで活性化された酵素などが利用可能である。これらの標識は、オリゴマーと直接、又は、必要であれば、追跡物質を与えるために適切に誘導体化されたグロブロマーと反応され得る。例えば、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ連結体が使用される場合には、次いで、これは、まず、グロブロマーのビオチン化を必要とする。これは、逆の順序に対しても準用される。この目的のための適切な方法は、当業者にも公知である。
【０１５０】
異種のイムノアッセイフォーマットが選択されるのであれば、例えば、支持体に結合された抗イディオタイプ抗体、例えば、ウサギＩｇＧに対して誘導された抗体を介して、抗原抗体複合体を支持体に結合することによって抗原抗体複合体を分離し得る。適切な支持体、特に、適切な抗体で被覆されたミクロタイタープレートが公知であり、一部は市販されている。
【０１５１】
さらに、本発明は、少なくとも１つの上記抗体及びさらなる成分を有するイムノアッセイセットに関する。前記セットは、通常、本発明のグロブロマー測定を実施するための手段の組み合わせであるパッケージング単位の形態である。取り扱いを可能な限り容易にするために、前記手段は、好ましくは、実質的に即時使用形態で提供される。有利な配置は、キットの形態のイムノアッセイを与える。キットは、通常、成分を分離して配置するための複数の容器を含む。全ての成分は、即時使用希釈液中に、希釈するための濃縮物として、又は溶解若しくは懸濁するための乾燥物質若しくは凍結乾燥物として与えることができ、個々の又は全ての成分は、凍結され、又は使用まで室温で保存され得る。これらの事例において、イムノアッセイは、好ましくは、使用前に凍結温度以下の温度に保たなければならないので、血清は、好ましくは、例えば−２０℃で、瞬間凍結される。イムノアッセイとともに供給されるさらなる成分は、前記イムノアッセイの種類に依存する。通常、標準的なタンパク質、必要とされ得る又は必要とされ得ない追跡物質及び対照血清が、抗血清とともに供給される。さらに、マイクロタイタープレート（好ましくは、抗体で被覆されている。）、例えば、検査用、洗浄用又は基質の転化用緩衝液及び酵素基質自体も含まれ得る。
【０１５２】
イムノアッセイの一般的な原理並びに研究室及び病院での補助具としての抗体の作製及び使用は、例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）中に見出すことができる。
【０１５３】
本発明は、アミロイドーシスを有することが疑われている患者において、アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病を診断する方法も含む。この方法は、１）患者から生物学的試料を単離する工程；２）抗原／抗体複合体の形成のために十分な時間及び条件下で、上記抗体の少なくとも１つと生物学的試料を接触させる工程；及び３）前記試料中の抗原／抗体複合体の存在を検出する工程を含み、複合体の存在が、患者中のアミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病の診断を示唆する。抗原は、グロブロマーであり得、又は、例えば完全なグロブロマーと同じ機能的特性（例えば、結合活性）を有するその一部若しくは断片であり得る。
【０１５４】
さらに、本発明は、アミロイドーシスを有することが疑われている患者において、アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病を診断する別の方法を含む。この方法は、１）生物学的試料を患者から単離する工程；２）抗体／抗原複合体の形成のために十分な時間及び条件下で、生物学的試料を抗原と接触させる工程；３）結合された抗体に連結体を結合させるのに十分な時間及び条件下で、得られた抗体／抗原複合体に連結体を添加する工程（前記連結体は、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に付着された、上記抗体の１つを含む。）、及び４）前記シグナル生成化合物によって生成されたシグナルを検出することによって、前記生物学的試料中に存在し得る抗体の存在を検出する工程（前記シグナルは前記患者中のアミロイドーシス、例えばアルツハイマー病の診断を示す。）を含む。抗原はグロブロマーであり得、又は完全なグロブロマーと同じ機能的特性（例えば、結合活性）を有するその一部若しくは断片であり得る。
【０１５５】
本発明は、アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病を有することが疑われている患者において、アミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病を診断するさらなる方法を含む。この方法は、１）生物学的試料を前記患者から単離する工程；２）抗抗体／抗体複合体（該複合体は、生物学的試料中に存在する抗体を含有する。）の形成を可能とする十分な時間及び条件下で、生物学的試料を抗抗体（抗抗体は、上記抗体の１つに対して特異的である）と接触させる工程；２）結合された抗体に連結体を結合させるのに十分な時間及び条件下で、得られた抗抗体／抗体複合体に連結体を添加する工程（前記連結体は、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合する抗原を含む。）；並びに３）シグナル生成化合物によって生成されたシグナルを検出する工程を含み、シグナルは、前記患者中のアミロイドーシス、例えば、アルツハイマー病の診断を示す。
【０１５６】
また、本発明には、ａ）上記抗体の少なくとも１つ、及びｂ）シグナル生成化合物に付着された抗体を含む連結体を含み、前記連結体の前記抗体が単離された抗体とは異なる、キットが含まれる。
【０１５７】
本発明は、ａ）上記抗体の１つに対する抗抗体及びｂ）シグナル生成化合物に付着された抗原を含む連結体を含むキットも包含する。抗原はグロブロマーであり得、又はグロブロマーと同じ機能的な特徴（例えば、結合活性）を有するその断片若しくは一部であり得る。
【０１５８】
本発明の１つの診断的実施形態において、本発明の抗体又はその一部は、固相上にコートされている（又は液相中に存在する。）。次いで、検査又は生物試料（例えば、全血、脳脊髄液、血清など）を固相と接触させる。抗原（例えば、グロブロマー）が試料中に存在する場合には、このような抗原は、固相上の抗体に結合し、次いで、直接法又は間接法の何れかによって検出される。直接法は、単に、複合体そのものの存在を検出し、従って抗原の存在を検出することを含む。間接法では、連結体が、結合された抗原に添加される。連結体は、シグナル生成化合物又は標識に付着された第二の抗体を含み、第二の抗体は、結合された抗原を結合する。第二の抗体が結合された抗原に結合すると、シグナル生成化合物は、測定可能なシグナルを生成する。次いで、このようなシグナルは、検査試料中の抗原の存在を示す。診断用イムノアッセイにおいて使用される固相の例は、多孔性及び非多孔性材料、ラテックス粒子、磁気粒子、微粒子（米国特許第５，７０５，３３０号を参照。）、ビーズ、膜、マイクロタイターウェル及びプラスチックチューブである。固相材料の選択及び連結体中に存在する抗原又は抗体を標識する方法は、所望であれば、所望のアッセイフォーマット性能特性に基づいて決定される。
【０１５９】
上述のように、連結体（又は指標試薬）は、シグナル生成化合物又は標識に付着された抗体（又は、おそらく、アッセイによっては、抗抗体）を含む。このシグナル生成化合物又は「標識」は、それ自体検出可能であり、又は検出可能な生成物を生成させるための１つ又はそれ以上の追加の化合物と反応させ得る。シグナル生成化合物の例には、色素原、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ及び１４Ｃ）、化学発光化合物（例えば、アクリジニウム）、粒子（可視又は蛍光）、核酸、錯化剤又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びリボヌクレアーゼ）などの触媒が含まれる。酵素（例えば、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ）を使用する場合には、色素産生性、蛍光性又は発光性基質の添加が、検出可能なシグナルの生成をもたらす。時間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）及びラマン分光法などの他の検出系も有用である。上記イムノアッセイによって検査され得る生物学的液体の例には、血漿、全血、乾燥された全血、血清、脳脊髄液又は組織及び細胞の水性又は有機水性抽出物が含まれる。
【０１６０】
本発明は、検査試料中の抗体の存在を検出するための方法も包含する。この方法は、（ａ）抗抗体／抗体複合体の形成を可能とするのに十分な時間及び条件下で、患者試料中の抗体に対して特異的な抗抗体（抗抗体は、患者試料中の抗体に結合する本発明の抗体である。）と、抗体を含有することが疑われる検査試料を接触させる工程、（ｂ）得られた抗抗体／抗体複合体に連結体を添加する工程（前記連結体は、検出可能なシグナルを検出することができるシグナル生成化合物に付着された抗原（抗抗体に結合する。）を含む。）、及び（ｄ）シグナル生成化合物によって生成されたシグナルを検出することによって、検査試料中に存在し得る抗体の存在を検出する工程を含む。抗抗体に対する抗体を含む対照又は標準物質を使用し得る。
【０１６１】
キットも、本発明の範囲に含まれる。より具体的には、本発明は、アルツハイマー病又は認知障害を特徴とする別の症状を有すると疑われる患者中の抗原（例えば、グロブロマー）の存在を測定するためのキットを含む。特に、検査試料中の抗原の存在を測定するためのキットは、ａ）本明細書に記載されている抗体又はその部分、及びｂ）検出可能なシグナルを検出することができるシグナル生成化合物に付着された第二の抗体（抗原に対する特異性を有する。）を含む連結体を含む。キットは、抗原に結合する試薬を含む対照又は標準物質及びアッセイを実施する際に使用されるべき操作を記載する同封物も含有し得る。
【０１６２】
本発明は、検査試料中の抗体を検出するためのキットも含む。キットは、ａ）目的の抗体に対して特異的な抗抗体（例えば、本発明の１つ）、及びｂ）上記抗原又はその一部を含み得る。抗原に結合する試薬を含む対照又は標準物質も含まれ得る。より具体的には、前記キットは、ａ）抗体に対して特異的な抗抗体（本発明の１つなど）及びｂ）検出可能なシグナルを生成することが可能なシグナル生成化合物に付着された抗原（例えば、グロブロマー）を含む連結体を含み得る。この場合にも、キットは、抗原に結合する試薬を含む対照又は標準物質並びにキットの成分及びその使用法を記載する同封物も含み得る。キットは、バイアル、瓶又は細片などの１つの容器も含み得、各容器は予め設置された固相を有し、他の容器はそれぞれの連結体を含有する。これらのキットは、洗浄、加工及び指示試薬など、アッセイを実施するために必要とされる他の試薬のバイアル又は容器も含有し得る。
【０１６３】
本発明は、上記完全長抗体を含むのみならず、その部分又は断片、例えば、そのＦａｂ部分も含むことに留意すべきである。さらに、本発明は、例えば、結合特異性、構造などの点で、本発明の抗体と同一の特性を有するあらゆる抗体を包含する。
【０１６４】
発明の利点
（実施例Ｉに記載されているように）Ａβ（１２−４２）グロブロマーでの免疫化によって、上述されている比較ドットブロッティングによって測定されるように、異なるＡβ（１−４２）オリゴマー及びＡβ（Ｘ−４２）オリゴマーの寛容性又は認識が異なる、異なったモノクローナル抗体が取得され得る。これによって、認知増強効果の間の最適な関係、他のＡβ形態に比べて望ましい特異性及び最小の副作用特性を有するＡβオリゴマーに対して誘導された抗体の開発が可能となる。同じことが、受動免疫において使用するためのモノクローナル抗体に対しても当てはまる。（能動及び受動）免疫化のためのこのような特定の戦略の利点は、Ａβ単量体に対する免疫応答、凝集の繊維性状態にあるＡβペプチド又はｓＡＰＰαを誘導しないことである。これは、幾つかの点で有利である。
【０１６５】
１）不溶性Ａβ斑の形態において、凝集の繊維性状態中のＡβペプチドは、ＡＤ脳内の全体のＡβペプチドプールの主要な部分を占める。これらの斑との抗Ａβ抗体の反応によって誘導されたＡβ斑の溶解によるＡβの大規模な放出は、有害であると認められる。Ａβのこの大規模な放出は、次いで、血液脳関門を横切り、血流に入り、微小出血のリスクを増大させ得る。さらに、上記ＥＬＡＮ試験において、繊維性Ａβペプチド形態を用いた免疫化のこの戦略は、髄膜脳炎を発症する症例の６％のために、試験を止める必要があった。
【０１６６】
２）単量体Ａβペプチド形態は認知増強効果を発揮し得ることが示され得るので、単量体Ａβペプチド形態に対して誘導された免疫応答は望ましくない。
【０１６７】
３）反応に対して誘導された免疫応答。
さらに、ｓＡＰＰαも認知増強効果を発揮することが示された。
【０１６８】
４）微小出血の望ましくない副作用を回避するために、ＣＡＡの形態の血管Ａβペプチドに対して誘導された応答は避けるべきである（すなわち、Ａβの中央部分に対する抗体、及び、さらに、ＣＡＡの形態で凝集されたＡβペプチドに結合しない抗体は、Ｎ末端に対するこのような抗体と比べて、より少ない微小結果を誘導する。上記参照。）。
【０１６９】
５）Ａβオリゴマーと特異的に反応する抗体は、例えば、繊維性Ａβ又は単量体Ａβに結合されず、従って、治療的効果のために利用不能なので、病態生理学的に関連するＡβ種に関してより高い生物学的利用性を有する。
【０１７０】
この場合にも、本発明の抗体、特に１０Ｆ４及び３Ｃ５は、６Ｅ１０のような市販の抗体（Ｓｉｇｎｅｔカタログ番号９３２０）と比べて、脳脊髄液中のアミロイドβを検出しない（又はより低い結合親和性で検出する。）ことに注目すべきである。従って、ＣＳＦ中のアミロイドβの高い代謝回転速度のために、ＣＳＦ中のアミロイドβに抗体が結合しないことにより、抗体の浪費が抑制されるとともに、体内（例えば、脳及びＣＳＦ）に見出される全てのアミロイドβに結合する抗体と比べて、より効果的で選択的な系を作出される。さらに、本発明の抗体のこの特性のために、（受動免疫に関連して）投与されるべき抗体の量が低減され、投薬量がより少なくなることによって、抗体が標的へ限局されるので副作用のリスクが低減され、効力が増大し、治療指数も増大する。さらに、微小出血のリスクも低減される。さらに、抗体はアミロイドβの原繊維形態を検出しないので、このような複合体系性に伴うリスクも低減される。
【０１７１】
寄託情報：
モノクローナル抗体３Ｃ５を産生するハイブリドーマ（ＭＬ４５−３Ｃ５．５Ｃ１０）は、ブダペスト条約の規定に基づいて、２００６年２月２８日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０に寄託され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７４０６が割り当てられた。モノクローナル抗体１０Ｆ４を産生するハイブリドーマ（ＭＬ４３−１０Ｆ４．３Ｈ８）は、ブダペスト条約の規定に基づいて、２００６年８月１６日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０に寄託され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７８０８が割り当てられた。
【０１７２】
本発明は、以下の非限定的な実施例の使用によって例示され得る。
【実施例】
【０１７３】
（実施例Ｉ）
免疫化のためのＡβ（１２−４２）グロブロマーの調製
１００％（ｖ／ｖ）１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）中に、４０ｍｇ／ｍＬ（ＨＦＩＰ１２５μＬ中５ｍｇ）で、Ａβ（１２−４２）合成ペプチド（ＡｎａＳｐｅｃＩｎｃ．；Ｌｏｔ＃４０４４３）を懸濁し、完全に可溶化するために、３７℃で１時間、振盪下で温置した。ＨＦＩＰは水素結合切断物質として作用し、Ａβペプチド中の既存の構造的な不均一性を除去するために使用される。１０，０００ｇで１０分間遠心した後、ＨＦＩＰ溶解されたＡβ（１２−４２）の上清を、リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４，１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）６．１ｍＬで希釈し、（Ｈ２Ｏ中の）２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）６２５μＬを添加し（０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの最終濃度）、３７℃で３時間温置した。もう一度、（Ｈ２Ｏ中の）２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）６２５μＬを添加し（０．４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの最終濃度）を添加し、３７℃で３時間、さらに温置した。Ｈ２Ｏ７ｍＬで溶液を希釈し、３７℃で１６時間温置した。３０００ｇで１０分間遠心した後、ＰＢＳ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）１５ｍＬで上清をさらに希釈し、０．６５ｍＬまで限外ろ過（５ｋＤａカットオフ）によって濃縮し、室温で１６時間、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、ｐＨ７．４に対して透析し、１００００ｇで１０分間遠心し、Ａβ（１２−４２）グロブロマーを含む上清を採取した。試料を分取し、さらなる使用まで、−８０℃で保存した。
【０１７４】
（実施例ＩＩ）
モノクローナル抗体３Ｃ５及び１０Ｆ４の作製
ＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ）中の、実施例Ｉに記載されているＡβ（１２−４２）グロブロマー５０μｇで、Ｂａｌｂ／ｃマウスを皮下に免疫化し、１ヶ月の間隔を置いて、２回強化免疫を行った。脾臓を集め、ＰＥＧ操作によって、５：１の比で、脾臓細胞をマウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞と融合した。２×１０５細胞／ｍＬ、２００ｍＬ／ウェルで、アザセリン／ヒポキサンチン選択培地中、９６ウェルの皿の中に融合細胞を播種した。目に見えるコロニーを形成させるために、細胞を増殖させ、直接的ＥＬＩＳＡアッセイにより、Ａβオリゴマー反応性に関して上清をアッセイした。抗体発現が安定であるように見受けられるまで、限界希釈によって、Ａβオリゴマーに対する抗体を分泌するハイブリドーマをサブクローニングした。
【０１７５】
（実施例ＩＩＩ）
抗Ａβグロブロマー抗体の選択性のドットブロット特性
モノクローナル抗Ａβグロブロマー抗体の選択性を性質決定するために、異なるＡβ形態での認識に関して、モノクローナル抗Ａβグロブロマー抗体を探索した。この目的のために、０．２ｍｇ／ｍＬＢＳＡが補充されたＰＢＳ中の、１００ｐｍｏｌ／μＬから０．０１ｐｍｏｌ／μＬの範囲の各Ａβ形態の系列希釈を作製した。各試料１μＬをニトロセルロース膜上に吸収転移させた。検出のために、対応する抗体を使用した（０．２μｇ／ｍＬ）。ペルオキシダーゼ連結された抗マウスＩｇＧ及び染色試薬ＢＭＢｌｕｅＰＯＤＳｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、免疫染色を行った。
【０１７６】
ドットブロットのためのＡβ標準：
１．Ａβ（１−４２）単量体、０．１％ＮＨ４ＯＨ
（調製直後の）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮＨ４ＯＨ０．５ｍＬ中にＡβ（１−４２）１ｍｇ（ＢａｃｈｅｍＩｎｃ．，カタログ番号Ｈ−１３６８）を溶解し（＝２ｍｇ／ｍＬ）、室温で３０秒間、直ちに振盪して透明な溶液を得た。さらなる使用のために、試料を−２０℃で保存した。
【０１７７】
２．Ａβ（１−４０）単量体、０．１％ＮＨ４ＯＨ
（調製直後の）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮＨ４ＯＨ０．５ｍＬ中にＡβ（１−４０）１ｍｇ（ＢａｃｈｅｍＩｎｃ．，カタログ番号Ｈ−１３６８）を溶解し（＝２ｍｇ／ｍＬ）、室温で３０秒間、直ちに振盪して透明な溶液を得た。さらなる使用のために、試料を−２０℃で保存した。
【０１７８】
３．Ａβ（１−４２）単量体、０．１％ＮａＯＨ
（調製直後の）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮａＯＨ０．５ｍＬ中にＡβ（１−４２）２．５ｍｇ（ＢａｃｈｅｍＩｎｃ．，カタログ番号Ｈ−１３６８）を溶解し（＝５ｍｇ／ｍＬ）、室温で３０秒間、直ちに振盪して透明な溶液を得た。さらなる使用のために、試料を−２０℃で保存した。
【０１７９】
４．Ａβ（１−４０）単量体、０．１％ＮａＯＨ
（調製直後の）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮａＯＨ０．５ｍＬ中にＡβ（１−４０）２．５ｍｇ（ＢａｃｈｅｍＩｎｃ．，カタログ番号Ｈ−１３６８）を溶解し（＝５ｍｇ／ｍＬ）、室温で３０秒間、直ちに振盪して透明な溶液を得た。さらなる使用のために、試料を−２０℃で保存した。
【０１８０】
５．Ａβ（１−４２）グロブロマー
６ｍｇ／ｍＬで１００％１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）中に、Ａβ（１−４２）合成ペプチド（Ｈ−１３６８，Ｂａｃｈｅｍ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を懸濁し、完全に可溶化するために、振盪しながら、３７℃で１．５時間温置した。ＨＦＩＰは水素結合切断物質として作用し、Ａβペプチド中の既存の構造的な不均一性を除去するために使用される。ＳｐｅｅｄＶａｃ中での蒸発によってＨＦＩＰを除去し、ジメチルスルホキシド中、５ｍＭの濃度でＡβ（１−４２）を再懸濁し、２０秒間音波処理した。リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４，１４０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）中に、予めＨＦＩＰ処理されたＡβ（１−４２）を４００μＭになるように希釈し、（Ｈ２Ｏ中の）２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１／１０容量を添加した（０．２％ＳＤＳの最終濃度）。３７℃で６時間の温置によって、１６／２０ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマー（球状オリゴマーに対する短縮形態）中間体が得られた。Ｈ２Ｏの３倍容量でさらに希釈し、３７℃で１８時間温置することによって、３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーを作製した。３０００ｇで２０分間の遠心後、限外ろ過（３０ｋＤａカットオフ）によって試料を濃縮し、５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して透析し、１００００ｇで１０分間遠心し、３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーを含む上清を採取した。透析に対する代替法として、４℃で１時間、氷冷されたメタノール／酢酸溶液（３３％メタノール、４％酢酸）の９倍過剰（ｖ／ｖ）によって、３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーを沈殿させることもできる。次いで、３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーを沈降させ（１６２００ｇで１０分）、５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に再懸濁し、ｐＨを７．４になるように調整した。
【０１８１】
６．Ａβ（１２−４２）グロブロマー
実施例３．５（上記参照）に従って調製されたＡβ（１−４２）グロブロマー調製物２ｍＬを、緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム３５ｍＭ、ｐＨ７．４）３８ｍＬ及びＨ２Ｏ中のＧｌｕＣエンドプロテイナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）１ｍｇ／ｍＬの１５０μＬと混合した。反応混合物を室温で６時間撹拌し、Ｈ２Ｏ中のＧｌｕＣエンドプロテイナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）１ｍｇ／ｍＬのさらなる１５０μＬを続いて添加する。反応混合物を室温でさらに１６時間撹拌した後、５ＭＤＩＦＰ（ジイソプロピルフルオロリン酸）溶液８μＬを添加する。１５ｍＬの３０ｋＤａＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐチューブを介して、反応混合物を約１ｍＬまで濃縮する。濃縮物を緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）９ｍＬと混合し、再び、１ｍＬまで濃縮する。透析チューブ中で１６時間、緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭ塩化ナトリウム）１Ｌに対して、濃縮物を６℃で透析する。Ｈ２Ｏ中の１％強度ＳＤＳ溶液を用いて、０．１％のＳＤＳ含量になるように、透析液を調整する。１００００ｇで１０分間の遠心によって試料を除去し、上清を除去する。
【０１８２】
７．Ａβ（２０−４２）グロブロマー
実施例２．５（上記参照）に従って調製されたＡβ（１−４２）グロブロマー調製物１．５９ｍＬを、緩衝液（５０ｍＭＭＥＳＮａＯＨ、ｐＨ７．４）３８ｍＬ及びＨ２Ｏ中のサーモリシン溶液（Ｒｏｃｈｅ）１ｍｇ／ｍＬの２００μＬと混合する。反応混合物を室温で２０時間撹拌する。次いで、Ｈ２Ｏ中の１００ｍＭＥＤＴＡ溶液、ｐＨ７．４の８０μＬを添加し、１％強度のＳＤＳ溶液４００μＬを用いて、０．０１％のＳＤＳ含量になるように、混合物をさらに調整する。１５ｍＬの３０ｋＤａＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐチューブを介して、反応混合物を約１ｍＬまで濃縮する。濃縮物を緩衝液（５０ｍＭＭＥＳ／ＮａＯＨ、０．０２％ＳＤＳ、ｐＨ７．４）９ｍＬと混合し、再び、１ｍＬまで濃縮する。透析チューブ中で１６時間、緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭ塩化ナトリウム）１Ｌに対して、濃縮物を６℃で透析する。Ｈ２Ｏ中の２％強度ＳＤＳ溶液で、０．１％のＳＤＳ含量になるように透析液を調整する。１００００ｇでの１０分間の遠心によって試料を除去し、上清を除去する。
【０１８３】
８．Ａβ（１−４２）原繊維
０．１％ＮＨ４ＯＨ水溶液５００μＬ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆチューブ）中に、Ａβ（１−４２）（ＢａｃｈｅｍＩｎｃ．カタログ番号：Ｈ−１３６８）１ｍｇを溶解し、室温で１分間、試料を撹拌した。調製された直後のこのＡβ（１−４２）溶液１００μＬを、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４の３００μＬで中和した。１％ＨＣｌで、ｐＨ７．４になるようにｐＨを調整した。３７℃で２４時間、試料を温置し、遠心した（１００００ｇで１０分）。上清を廃棄し、１分間渦巻き撹拌することによって、原繊維沈降物を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の４００μＬで再懸濁した。
【０１８４】
９．ｓＡＰＰα
Ｓｉｇｍａによって供給された（カタログ番号Ｓ９５６４；２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．４中２５μｇ）。２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．２ｍｇ／ｍＬＢＳＡを用いて、０．１ｍｇ／ｍＬ（＝１ｐｍｏｌ／μＬ）になるようにｓＡＰＰαを希釈した。
【０１８５】
ドットブロットのための材料：
Ａβ標準：
２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４＋０．２ｍｇ／ｍＬＢＳＡ中のＡβ抗原の系列希釈
１）１００ｐｍｏｌ／μＬ
２）１０ｐｍｏｌ／μＬ
３）１ｐｍｏｌ／μＬ
４）０．１ｐｍｏｌ／μＬ
５）０．０１ｐｍｏｌ／μＬ
ニトロセルロース：
Ｔｒａｎｓ−ＢｌｏｔＴｒａｎｓｆｅｒ溶媒、ＰｕｒｅＮｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅＭｅｍｂｒａｎｅ（０．４５μｍ）；ＢＩＯ−ＲＡＤ
抗マウスＰＯＤ：カタログ番号：７１５−０３５−１５０（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
検出試薬：
ＢＭＢｌｕｅＰＯＤ基質、沈殿（Ｒｏｃｈｅ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：
カタログ番号：Ａ−７８８８（ＳＩＧＭＡ）
ブロッキング試薬：
ＴＢＳ中の５％低脂肪乳
緩衝液溶液：
ＴＢＳ
２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５＋１５０ｍＭＮａＣｌ
ＴＴＢＳ  ２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ−緩衝液ｐＨ７．５＋１５０ｍＭＮａＣｌ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
ＰＢＳ＋０．２ｍｇ／ｍＬＢＳＡ
２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４緩衝液ｐＨ７．４＋１４０ｍＭＮａＣｌ＋０．２ｍｇ／ｍＬＢＳＡ
抗体溶液Ｉ：
ＴＢＳ中の１％低脂肪乳２０ｍＬ中に希釈された０．２μｇ／ｍＬ抗体
抗体溶液ＩＩ：
１：５０００希釈
ＴＢＳ中の１％低脂肪乳中の抗マウスＰＯＤ
【０１８６】
ドットブロット操作：
１）互いに約１ｃｍの距離で、（５つの系列希釈中の）異なるＡβ標準の各１μＬをニトロセルロース膜上へドット状に付与した。
２）室温（ＲＴ）で、少なくとも１０分間、Ａβ標準ドットをニトロセルロース膜上において風乾させた（＝ドットブロット）。
３）ブロッキング：
ＴＢＳ中の５％低脂肪乳３０ｍＬとともに、室温で１．５時間、ドットブロットを温置した。
４）洗浄：
ブロッキング溶液を廃棄し、室温で、１０分間、ＴＴＢＳ２０ｍＬとともに、振盪しながらドットブロットを温置した。
５）抗体溶液Ｉ：
洗浄緩衝液を廃棄し、室温で２時間、抗体溶液とともにドットブロットを温置した。
６）洗浄：
抗体溶液Ｉを廃棄し、室温で１０分間、ＴＴＢＳ２０ｍＬとともに、振盪しながらドットブロットを温置した。洗浄溶液を廃棄し、室温で１０分間、ＴＴＢＳ２０ｍＬとともに、振盪しながらドットブロットを温置した。洗浄溶液を廃棄し、室温で１０分間、ＴＢＳ２０ｍＬとともに、振盪しながらドットブロットを温置した。
７）抗体溶液ＩＩ：
洗浄緩衝液を廃棄し、室温で一晩、抗体溶液ＩＩとともにドットブロットを温置した。
８）洗浄：
抗体溶液ＩＩを廃棄し、室温で１０分間、ＴＴＢＳ２０ｍＬとともに、振盪しながらドットブロットを温置した。洗浄溶液を廃棄し、室温で１０分間、ＴＴＢＳ２０ｍＬとともに、振盪しながらドットブロットを温置した。洗浄溶液を廃棄し、室温で１０分間、ＴＢＳ２０ｍＬとともに、振盪しながらドットブロットを温置した。
９）展開：
洗浄溶液を廃棄した。ＢＭＢｌｕｅＰＯＤ基質１０ｍＬを用いて１０分間、ドットブロットを展開した。Ｈ２Ｏでドットブロットを激しく洗浄することによって、展開を停止させた。ドット強度の濃度測定分析（ＧＳ８００濃度計（ＢｉｏＲａｄ）及びソフトウェアパッケージＱｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ、バージョン４．５．０（ＢｉｏＲａｄ））を用いて、定量的評価を行った。Ａβ（２０−４２）グロブロマーの光学的に明確に同定された最後のドットの相対密度の２０％を超える相対密度を有するドットのみを評価した。この閾値は、全てのドットブロットに対して独立に決定した。計算された値は、Ａβ（１−４２）グロブロマーの認識と所定の抗体に対するそれぞれのＡβ形態の間の関係を示す。
【０１８７】
（実施例Ｉに記載されているように調製された）Ａβ（１２−４２）グロブロマーでのマウスの能動免疫化の後、融合されたハイブリドーマ細胞を選択することによって、検査したモノクローナル抗体（６Ｅ１０を除く。）を得た。各Ａβ形態を系列希釈に適用し、免疫反応のために各抗体とともに温置した。
【０１８８】
１．Ａβ（１−４２）単量体、０．１％ＮＨ４ＯＨ
２．Ａβ（１−４０）単量体、０．１％ＮＨ４ＯＨ
３．Ａβ（１−４２）単量体、０．１％ＮａＯＨ
４．Ａβ（１−４０）単量体、０．１％ＮａＯＨ
５．Ａβ（１−４２）グロブロマー
６．Ａβ（１２−４２）グロブロマー
７．Ａβ（２０−４２）グロブロマー
８．Ａβ（１−４２）原繊維調製物
９．ｓＡＰＰα（Ｓｉｇｍａ）；（第一のドット：１ｐｍｏｌ）
結果は、図１に示されている。
【０１８９】
ドットブロット結果の分析に基づいて、抗ＡβグロブロマーｍＡｂ１０Ｆ４及び３Ｃ５は、Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１２−４２）グロブロマー及びＡβ（２０−４２）グロブロマーなどのＡβグロブロマー形態に対して高い親和性を有する。抗ＡβグロブロマーｍＡｂ１０Ｆ４及び３Ｃ５は、Ａβ単量体などの他のＡβ形態をある程度識別し、Ａβ（１−４２）フィブリル又はｓＡＰＰαを有意に認識しない。従って、抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５は、創出された「抗Ａβグロブロマー抗体」であり得る。
【０１９０】
（実施例ＩＶ）
１０Ｆ４及び３Ｃ５によるアルツハイマー病脳中のＡβグロブロマーエピトープの検出
Ａ：抽出操作
試薬リスト：
３％ＳＤＳ緩衝液：
−５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１ｍＭＥＧＴＡ、３％ＳＤＳ、１％デオキシコール酸ナトリウム、ｐＨ７．４
完全プロテアーゼ阻害剤カクテル：
−Ｈ２Ｏ１ｍＬ中に１錠の完全阻害剤カクテル（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ；カタログ番号１６９７４９８）を溶解；新たに調製
ＰＭＳＦ溶液：
−メタノール中５００ｍＭＰＭＳＦ
３％ＳＤＳ抽出緩衝液：
−３％ＳＤＳ緩衝液に１／１００の完全阻害剤カクテル溶液を添加
−３％ＳＤＳ緩衝液に１／５００ＰＭＳＦ溶液を添加
−使用直前に、室温で、抽出緩衝液を調製
抗体：
−ｍＡｂ１０Ｆ４
−ｍＡｂ３Ｃ５
−ｍＡ６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ；カタログ番号：９３２０）
−ｍＡｂＩｇＧ２ｂ（対照抗体、合成ハプテンに対して作製、Ｄｉａｎｏｖａ、クローンＮＣＧ２Ｂ．０１、カタログ番号：ＤＬＮ−０５８１２）
操作：
新たに調製された室温の３％ＳＤＳ抽出緩衝液１．８ｍＬに、−８０℃で凍結された死後のヒトＡＤ脳組織試料及び年齢を合致させた対照脳組織試料０．２ｇを添加した。ガラスポッターによって、氷上で、試料を直ちに均質化した。均質化された試料を反応容器に移し、１０，０００ｇで５分間遠心した。上清（＝３％ＳＤＳ脳抽出物）を慎重に集め、さらなる使用のために、−８０℃で、反応容器中に保存した。
【０１９１】
Ｂ：モノクローナルマウス抗体でのＤｙｎａｂｅａｄｓの活性化
−発泡を防ぐために、ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−２８０ヒツジ抗マウスＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１１２．０２）の原懸濁物を慎重に振盪した。
−１ｍＬを無菌的に取り出し、１．５ｍＬの反応容器に移した。
−免疫沈降（ＩＰ）洗浄緩衝液１ｍＬ（ＩＰ−洗浄緩衝液：ＰＢＳ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ）で３回５分間、ｄｙｎａｂｅａｄｓを洗浄した。磁気分離装置スタンド（ＭＳＳ）を用いて、反応容器の側面にｄｙｎａｂｅａｄｓを固定化しながら、洗浄操作の間に、上清を慎重に除去した。
−ＰＢＳ１ｍＬ、０．１％ＢＳＡ中のＡβ抗体４０μｇとともに、洗浄されたｄｙｎａｂｅａｄｓを温置した。
−４℃で撹拌しながら、一晩温置することによって、活性化を行った。
−（再びＭＳＳを用いて）ＩＰ洗浄緩衝液（ＰＢＳ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ）１ｍＬで、活性化されたｄｙｎａｂｅａｄｓを４回、３０分間洗浄した。
−ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウム１ｍＬを用いて、活性化されたｄｙｎａｂｅａｄｓを再懸濁し、渦巻き撹拌し、短時間遠心した。
−抗体活性化されたｄｙｎａｂｅａｄｓは、さらなる使用まで、４℃で保存した。
【０１９２】
Ｃ：免疫沈降（ＩＰ）
−３％ＳＤＳ脳抽出物２５μＬを、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．５の９７５μＬで希釈した（＝１：４０希釈）。
−以下のリストの抗体活性化された各ｄｙｎａｂｅａｄｓ２５μＬを、１：４０希釈された３％ＳＤＳ脳抽出物１ｍＬとともに温置した。
・６Ｅ１０−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ
・３Ｃ５−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ
・１０Ｆ４−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ
・ＩｇＧ２ｂ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ
−免疫沈降は、６℃で、振盪しながら一晩温置（約２０時間）することによって実施した。
−ＭＰＳを用いて、ｄｙｎａｂｅａｄｓを固定化した。
−上清を慎重に取り除き、廃棄した。
−以下のようにして、ｄｙｎａｂｅａｄｓを洗浄した。
・２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５＋０．１％ＢＳＡ５００μＬで、２回、５分
・２ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５の５００μＬで、１回、３分
・重要：洗浄緩衝液を最後に除去した後、反応容器を遠心し、ＭＳＳ中に戻し、液体の残りの滴を慎重に除去した。
・Ｈ２Ｏ中の５０％ＣＨ３ＣＮ、０．５％ＴＦＡ１０μＬを反応容器に添加し、渦巻き撹拌した
・振盪しながら、室温で１０分間、反応容器を温置した
・ＭＳＳを用いて、ｄｙｎａｂｅａｄｓを固定化した。
・免疫沈降され、溶出されたＡβ種を含む上清を慎重に採取した（＝ＩＰ溶出液）
【０１９３】
Ｄ：表面増強レーザー脱離イオン化質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＭＳ）：
−Ｈ４ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＡｒｒａｙ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ；カタログ番号Ｃ５７３−００２８）上へ、ＩＰ溶出液１μＬをスポット状に付与した。
−暖かい温置装置プレート上でスポットを乾燥させた
−ＣＨＣＡ溶液：
・アセトニトリル１５０μＬ＋１％ＴＦＡ１５０μＬ中にＣＨＣＡ５ｍｇを溶解した＝原溶液；−２０℃で保存した
・原溶液のうち１０μＬを、アセトニトリル２０μＬ及び１％ＴＦＡ２０μＬで希釈した＝作業ＣＨＣＡ溶液
・作業ＣＨＣＡ溶液２μＬをスポット上に適用した。
−暖かい温置装置プレート上でスポットを乾燥させ、ＳＥＬＤＩ−ＭＳ（表面増強レーザー脱離イオン化質量分析法）によって分析した
・条件：レーザー強度２００；感度６；質量範囲８００Ｄａから１００００Ｄａ；位置２０から８０；コレクト５
・分析：各Ａβ質量ピークのＭＺ面積を定量した
【０１９４】
Ｅ．免疫沈降されたＡＤ脳抽出物のウェスタンブロット分析：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：
ＳＤＳ−試料緩衝液：
−ＳＤＳ０．３ｇ
−１ＭＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ６．８  ４ｍＬ、
−グリセロール８ｍＬ
−エタノール中の１％ブロモフェノールブルー７０μＬ
−５０ｍＬになるようにＨ２Ｏを添加
−走行緩衝液：
−Ｔｒｉｓ７．５ｇ
−グリシン３６ｇ
−ＳＤＳ２．５ｇ
−２．５ＬになるようにＨ２Ｏを添加
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルシステム：
１８％Ｔｒｉｓ／グリシンゲル：（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩｎｃ．，カタログ番号ＥＣ６５０５５ＢＯＸ）
試料緩衝液（ＳＤＳ試料緩衝液３００μＬ＋Ｈ２Ｏ中の１ＭＴｒｉｓ溶液１０μＬ＋８５％グリセロール２０μＬ）１３μＬに、ＩＰ溶出液５μＬを添加した。得られた１８μＬの試料を１８％Ｔｒｉｓ／グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．カタログ番号：ＥＣ６５０５５ＢＯＸ）上に搭載する。２０ｍＡの定常電流で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施する。
ウェスタンブロット操作：
電気泳動に続いて、半乾燥ブロッティングチャンバー（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、ニトロセルロース膜（７．５ｃｍ×９ｃｍ、０．２μｍ、ＢｉｏＲａｄ）上に、７５ｍＡで４５分間、ゲルを吸収転移させた。
ブロット緩衝液：
−Ｔｒｉｓ６ｇ
−グリシン２８．１ｇ
−メタノール５００ｍＬ
−２．５ＬになるようにＨ２Ｏを添加する
ウェスタンブロット免疫染色：
材料：
−抗Ａβ抗体６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ；カタログ番号９３２０）
−抗マウスＰＯＤ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号：７１５−０３５−１５０）
−検出試薬：
・ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＰｉｃｏＳｕｂｓｔｒａｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３４０７７）
−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｅｒｖａ、カタログ番号：１１９２６）
−低脂肪乳粉末（Ｌａｓａｎａ）
−ブロッキング試薬：
・ＰＢＳＴ中の２％ＢＳＡ
−ＴＢＳ：
・２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ
・１５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５
−ＴＴＢＳ：
・２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ
・１５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液
・０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５
−ＰＢＳ：
・２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４緩衝液
・１４０ｍＭＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５
−ＰＢＳＴ：
・２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４緩衝液
・１４０ｍＭＮａＣｌ緩衝液
・０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５
−抗体溶液Ｉ：
・１μｇ／ｍＬ６Ｅ１０＝ＴＢＳ中の３％低脂肪乳２０ｍＬ中１：１０００
−抗体溶液ＩＩ：
・ＴＢＳ中の３％低脂肪乳２０ｍＬ中の１：１００００希釈された抗マウスＰＯＤ
操作：
１）ＰＢＳ中で１０分間、ウェスタンブロットを沸騰させた。
２）ブロッキング：
ブロッキング試薬５０ｍＬとともに、６℃で１６時間、ウェスタンブロットを温置した。
３）洗浄：
−ブロッキング溶液を廃棄し、室温で１０分間、ＴＴＢＳ５０ｍＬでウェスタンブロットを洗浄した。
−ブロッキング溶液を廃棄し、室温で１０分間、ＴＢＳ５０ｍＬでウェスタンブロットを洗浄した。
４）抗体溶液Ｉ：
−洗浄溶液を廃棄し、室温で４時間、抗体溶液Ｉとともにウェスタンブロットを温置した。
５）洗浄：
−ブロッキング溶液を廃棄し、室温で１０分間、ＴＴＢＳ５０ｍＬでウェスタンブロットを洗浄した。
−ブロッキング溶液を廃棄し、室温で１０分間、ＴＴＢＳ５０ｍＬでウェスタンブロットを洗浄した。
−ブロッキング溶液を廃棄し、室温で１０分間、ＴＢＳ５０ｍＬでウェスタンブロットを洗浄した。
６）抗体溶液ＩＩ：洗浄溶液を廃棄し、室温で１時間、抗体溶液ＩＩとともにウェスタンブロットを温置した。
７）洗浄：
−ブロッキング溶液を廃棄し、室温で１０分間、ＴＴＢＳ５０ｍＬでウェスタンブロットを洗浄した。
−ブロッキング溶液を廃棄し、室温で１０分間、ＴＴＢＳ５０ｍＬでウェスタンブロットを洗浄した。
−ブロッキング溶液を廃棄し、室温で１０分間、ＴＢＳ５０ｍＬでウェスタンブロットを洗浄した。
８）展開及び定量分析：
−洗浄溶液を廃棄した。
ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＰｉｃｏＳｕｂｓｔｒａｔｅＥｎｈａｎｃｅｒ２ｍＬ及びＰｅｒｏｘｉｄｅＳｏｌｕｔｉｏｎ２ｍＬを混合した。
−得られた４ｍＬの溶液をウェスタンブロットに添加し、ブロットを暗所で５分間温置した。
−化学発光画像化システム（ＶｅｒｓａＤｏｃ，ＢｉｏＲａｄ）を用いて、ブロットを分析した。３０、９７．５、１６５、２３２．５及び３００秒の獲得時間に、５つの写真を撮影した。
−ソフトウェアパッケージＱｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ４．５．０（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、Ａβタンパク質バンドの痕跡（強度×ｍＭ）の飽和が起こらなかった写真を定量的に分析した。
【０１９５】
結果は、図２に示されている。緩衝液組成は凝集された原繊維形態中のＡβペプチドを可溶化するのに十分でないので、本実施例で使用した３％（ｗ／ｖ）を用いた抽出操作は脳内の全Ａβペプチドプールの可溶性形態を抽出すると考えられる。従って、モノクローナル抗体３Ｃ５及び１０Ｆ４によってアルツハイマー病脳抽出物中で結合されるＡβペプチドは、可溶性Ａβペプチドである。これらの可溶性Ａβ種は、ＡＤ脳中に見出されるＡβ斑の形態の原繊維Ａβより、疾病の重症度とよく相関しているので（Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，４０７７−４０８１；Ｌｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５，８５３−８６２）、アルツハイマー病関連種であると考えられる。従って、抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５は疾病関連Ａβ種を標的とする。さらに、汎Ａβ抗体６Ｅ１０と比べて、モノクローナル抗体３Ｃ５及び１０Ｆ４はアルツハイマー病脳抽出物中の全可溶性Ａβプールの亜画分のみに結合する。残りのＡβ形態は、３Ｃ５及び１０Ｆ４によって認識されるＡβグロブロマーエピトープを明らかに有しない。これらのＡβ形態は神経病原性であると考えられないという事実により、副作用を低減するために、及び中枢神経系中の循環する抗体の有効濃度を低下させないために、これらのＡβ形態を治療抗体によって攻撃しないことが有利である。従って、治療抗体の投薬を低下させることができ、よりよい治療指数がもたらされる。
【０１９６】
（実施例Ｖ）
Ａβ（１−４２）原繊維に対する抗Ａβグロブロマー抗体の識別のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化された半定量的分析
Ａβ（１−４２）原繊維の調製：
Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮＨ４ＯＨ５００μＬ中に、Ａβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ，カタログ番号：Ｈ−１３６８）１ｍｇを溶解し、室温で１分間撹拌した。１００００ｇで５分間、試料を遠心した。上清を集めた。上清中のＡβ（１−４２）濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｉｎｃ．アッセイ操作）に従って測定した。
【０１９７】
０．１％ＮＨ４ＯＨ中のＡβ（１−４２）１００μＬを、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の３００μＬと混合し、ｐＨ７．４になるように２％ＨＣｌで調整した。次いで、３７℃で２０時間、試料を温置した。この後、１０，０００ｇで、１０分間、試料を遠心した。上清を廃棄し、残留物を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の４００μＬと混合し、１分間激しく撹拌（「渦巻き撹拌」）することによって再懸濁し、１００００ｇで１０分間遠心した。さらにもう一度、上清を廃棄し、残留物を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の４００μＬと混合し、１分間激しく撹拌（「渦巻き撹拌」）することによって再懸濁し、１００００ｇで１０分間遠心した。上清を廃棄した。２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の３８０μＬ中に残留物を再懸濁し、激しい撹拌（「渦巻き撹拌」）によって促進した。
【０１９８】
Ａβ（１−４２）原繊維への抗Ａβ抗体の結合：
２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４の１６０μＬで、Ａβ（１−４２）原繊維調製物４０μＬを希釈し、室温で５分間撹拌し、次いで、１００００ｇで１０分間試料を遠心した。上清を廃棄し、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４の９５μＬ中に残留物を再懸濁した。激しい撹拌（「渦巻き撹拌」）によって、再懸濁を促進した。原繊維調製物１０μＬの分取試料を、それぞれ、以下のものと混合した。
【０１９９】
ａ）２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の１０μＬ
ｂ）２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の３Ｃ５の０．５μｇ／μＬの１０μＬ
ｃ）２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の１０Ｆ４の０．５μｇ／μＬの１０μＬ
ｄ）２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔカタログ番号９３２０）の０．５μｇ／μＬの１０μＬ
【０２００】
３７℃で２０時間、試料を温置し、次いで、１００００ｇで１０分間遠心した。上清を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液２０μＬと混合した。２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４の５０μＬと残留物を混合し、「渦巻き撹拌」によって再懸濁した。次いで、１０，０００ｇで１０分間、試料を遠心した。上清を廃棄し、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４の２０μＬと残留物を混合し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液２０μＬと混合した。電気泳動のために、試料を４から２０％Ｔｒｉｓ／グリシンゲルにかけた。
【０２０１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに対するパラメータ：
ＳＤＳ試料緩衝液：０．３ｇＳＤＳ
１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８の４ｍＬ
グリセリン８ｍＬ
エタノール中の１％ブロモフェノールブルー１ｍＬ
５０ｍＬになるようにＨ２Ｏで満たす
４から２０％Ｔｒｉｓ／グリｓンゲル：（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＥＣ６０２５ＢＯＸ）
電気泳動緩衝液：Ｔｒｉｓ７．５ｇ
グリシン３６ｇ
ＳＤＳ２．５ｇ
２．５ＬになるようにＨ２Ｏで満たす
２０ｍＡの定常電流でゲルを走行させる。
ゲルの染色：ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅＲ２５０
結果は、図３に示されている。
【０２０２】
異なる抗Ａβ抗体及びそれらのＡβ（１−４２）原繊維の識別の半定量的分析：
抗体、Ａβ（１−４２）原繊維抗体重鎖、抗体軽鎖及びＡβ（１−４２）単量体の位置が、ゲルの端にマークされている。そのサイズのために、Ａβ（１−４２）原繊維はＳＤＳ−ＰＡＧＥの中に入ることができず、ゲルスロット中に見ることができる。
【０２０３】
１．マーカー
２．Ａβ（１−４２）原繊維調製物：対照
３．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂ６Ｅ１０；２０時間３７℃；上清
４．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂ６Ｅ１０；２０時間３７℃；沈降物
５．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂ６３Ｃ５；２０時間３７℃；上清
６．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂ３Ｃ５；２０時間３７℃；沈降物
７．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂ１０Ｆ４；２０時間３７℃；上清
８．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂ１０Ｆ４；２０時間３７℃；沈降物
【０２０４】
遠心後の結合した原繊維（沈降粒画分）及び上清画分中の抗体の重鎖から光学密度（ＯＤ）値を測定することによって、原繊維型Ａβへの相対的結合をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から評価した。Ａβ原繊維に結合した抗体はＡβ原繊維と一緒に沈降するはずであり、従って、沈降物画分中に見出されるのに対して、非Ａβ原繊維結合（遊離）抗体は上清中に見出される。Ａβ原繊維に結合された抗体のパーセントは、以下の式に従って計算した。
【０２０５】
Ａβ原繊維に結合された％抗体＝ＯＤ原繊維画分×１００％／（ＯＤ原繊維画分＋ＯＤ上清画分）
【０２０６】
結果は、図３に示されている。ＡＡ１から１７の間の直鎖Ａβエピトープを認識及び結合する市販の抗体６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔカタログ番号９３２０）とは異なり、共沈降実験において、Ａβグロブロマー抗体３Ｃ５及び１０Ｆ４はＡβ（１−４２）原繊維に、より低い親和性で結合する。これは、Ａβ（１−４２）原繊維とともに温置した後、Ａβ（１−４２）原繊維に結合されているために、３Ｃ５及び１０Ｆ４抗体が沈降工程後に主として上清中に残存し、共沈降しないという事実によって証明される。
【０２０７】
アルツハイマー病の脳では、Ａβ原繊維は全Ａβペプチドプールの主成分である。抗Ａβ抗体によってこれらの原繊維を攻撃することによって、その後微小出血のリスクを増大させ得るＡβの大量の解離のために、負の副作用のリスクが増大する。微小出血に対する増大したリスクは、Ａβペプチドの原繊維凝集物を用いた能動免疫アプローチにおいて観察された（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，２００５，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４，１０−１２；Ｏｒｇｏｇｏｚｏ  Ｊ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００３，６１，４６−５４；Ｓｃｈｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６，５９９−６０６）。
【０２０８】
（実施例ＶＩ）
アミロイド斑の形態の原繊維Ａβペプチド並びに老齢ＡＰＰトランスジェニックマウス及びアルツハイマー病患者中の髄膜血管中のアミロイドへの抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５の特異的反応の原位置分析
抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５は原繊維Ａβペプチド沈着への低下した染色を示し、これらの治療効果がＡβペプチドの原繊維性の沈着された形態ではなく、可溶性グロブロマー形態への結合によって媒介されることを示唆する。原繊維性Ａβペプチドへの抗体結合は凝集物の迅速な溶解及び可溶性Ａβ濃度のその後の増加（可溶性Ａβ濃度のその後の増加は神経毒性であると考えられており、微小出血をもたらし得る。）をもたらすことができるので、単量体ではなく可溶性グロブロマーに影響を与える抗体治療が好ましい。
【０２０９】
方法：
これらの実験のために、２人のＡＤ患者（ＲＺ１６及びＲＺ５５）から得た皮質組織及び１９月齢のＴｇ２５７６マウス（ＡＰＰＳＷＥ＃００１３４９，Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）又は１２月齢のＡＰＰ／Ｌマウス（ＲｅＭＹＮＤ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から得た皮質組織という幾つかの脳材料試料を使用した。マウスは、家族性アルツハイマー病突然変異を有するヒトＡＰＰを過剰発現し、約１１月齢で脳実質中にβアミロイド沈着を形成し、約１８月齢でより大きな脳血管中にβアミロイド沈着を形成する。動物に深く麻酔をかけ、０．１Ｍリン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で経心的に灌流して、血液を洗い流した。次いで、頭蓋から脳を取り出し、縦方向に分割した。脳の一方の半球を瞬間凍結し、４％パラホルムアルデヒド中に浸漬することによって他方の半球を固定した。ＰＢＳ中の３０％スクロース中に浸すことによって、浸漬固定された半球を凍結保護し、凍結ミクロトーム上に戴置した。前脳全体を４０μｍの横断切片へ切断し、これをＰＢＳ中に集めて、その後の染色操作のために使用した。アルツハイマー病患者由来の新皮質試料は、Ｂｒａｉｎ−Ｎｅｔ、ミュンヘン、ドイツから、凍結された組織として取得し、融解の間に４％パラホルムアルデヒド中に浸漬固定し、続いて、マウス組織と同様に処理した。
【０２１０】
以下のプロトコールを用いて、各切片をＣｏｎｇｏＲｅｄで染色した。
【０２１１】
材料：
−アルコール性ＮａＣｌ溶液、ＮａＯＨ溶液及びＣｏｎｇｏＲｅｄ溶液からなるアミロイド染料ＣｏｎｇｏＲｅｄキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；ＨＴ−６０）
−染色キュベット
−顕微鏡スライドＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＰｌｕｓ及びカバーガラス
−エタノール、キシロール、包埋溶媒
【０２１２】
試薬：
−ＮａＣｌ溶液で１：１００希釈されたＮａＯＨは、アルカリ生理的食塩水を与える
−ＣｏｎｇｏＲｅｄ溶液で１：１００希釈されたアルカリ生理的食塩水はアルカリＣｏｎｇｏＲｅｄ溶液を与える（使用の１５分以内に調製し、ろ過する）
−切片をスライド上に戴置し、切片を乾燥させる
−まず、アルカリ生理的食塩水中で３０から４０分間、次いで、アルカリＣｏｎｇｏＲｅｄ溶液中で３０から４０分間、スライドを染色キュベット中で温置する
−新鮮なエタノールで３回濯ぎ、キシロールの上に包埋する
まず、ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて染色の写真を撮影し、定性的に評価した。赤い色は、アミロイドが斑の形態で及びより大きな髄膜血管中に沈着することを示唆した。その後、抗体染色の評価は、これらの構造に集中した。
【０２１３】
以下のプロトコールに従って、各抗体の０．０７から０．７μｇ／ｍＬを含有する溶液とともに切片を温置することによって染色を行った。
【０２１４】
材料：
−ＴＢＳＴ洗浄溶液（Ｔｗｅｅｎ２０を加えたＴｒｉｓ緩衝化生理的食塩水；１０×濃縮物；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎＳ３３０６，ＤＡＫＯ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）Ａｑｕａｂｉｄｅｓｔ．中に１：１０）
−メタノール中の０．３％Ｈ２Ｏ２
−ロバ血清（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＴＢＳＴ中５％、ブロッキング血清として
−ＴＢＳＴ中に所定の濃度で希釈されたモノクローナルマウス抗グロブロマー抗体
−二次抗体：ビオチン化されたロバ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ／Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；７１５−０６５−１５０；ＴＢＳＴ中に１：５００希釈）
−ＳｔｒｅｐｔＡＢＣｏｍｐｌｅｘ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎＫ０３７７，ＤＡＫＯ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
−ペルオキシダーゼ基質キットジアミノベンジジン（＝ＤＡＢ；ＳＫ−４１００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）
−ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔＰｌｕｓ顕微鏡スライド及びカバーガラス
−無キシロール包埋溶媒（Ｍｅｄｉｔｅ，Ｂｕｒｇｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｘ−ｔｒａＫｉｔｔ）
【０２１５】
操作：
−浮遊している切片を氷冷された０．３％Ｈ２Ｏ２中に移し、３０分間温置する
−ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄する
−ロバ血清／ＴＢＳＴとともに２０分間温置する
−室温で２４時間、一次抗体とともに温置する
−ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄する
−ブロッキング血清とともに２０分間温置する
−ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄する
−室温で６０分間、二次抗体とともに温置する
−ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄する
−室温で６０分間、ＳｔｒｅｐｔＡＢＣｏｍｐｌｅｘとともに温置する
−ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄する
−ＤＡＢとともに２０分間温置する
−切片をスライド上に戴置し、スライドを風乾し、アルコールでスライドを脱水し、スライドを包埋する
【０２１６】
顕微鏡下で切片を視覚的に検査するとともに、ＩｍａｇｅＰｒｏ５．０画像分析システムを用いて組織学的画像から無作為に選択された１０個の斑を光学的に切除し、それらの平均グレイスケール値を求めることによって、アミロイド染色をさらに定量した。アミロイド斑の密度から染色された物質の平均バックグラウンド密度を差し引くことによって、グレイスケール値から、光学密度の値を計算した（０％−周囲のバックグラウンドを上回る斑の染色なし、１００％透過なし／最大染色）。ＡＮＯＶＡを用いて、統計学的有意性に関して、それぞれ、抗体６Ｅ１０／４Ｇ８と６Ｇ１の間、１０Ｆ４と３Ｃ５の間の差を検定した。
【０２１７】
結果：
以下に記載されている全ての抗体染色された物質は、ｃｏｎｇｏ親和性アミロイド沈着であることが判明した（図４（ａ））。グロブロマーを好む抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５は、０．７μｇ／ｍＬの同じ濃度で、Ａβペプチドの実質及び硬膜のｃｏｎｇｏ親和性沈着を、抗体６Ｇ１及び６Ｅ１０より有意に弱く染色した（図４（ｂ，ｃ，ｈ））。実質アミロイド斑染色の定量分析によって、全ての抗体が斑に結合するが（対照を上回る統計的に有意な密度）、抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５の結合は（ＡβのＮ末端配列に対して産生された）参照抗体６Ｅ１０の結合より有意に低く、（ＡβのＮ末端配列に対して産生された）参照抗体４Ｇ８と等しく、又は低いことが明らかとなった（図４（ｄ−ｇ））。抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５はＡβ単量体又はＡβ配列の一部を認識する抗体より、アミロイド沈着により少なく結合する。原繊維Ａβペプチドに結合する抗体での処理によって、脳組織中のアミロイド斑の素早い溶解及びその後の可溶性Ａβ濃度の増大（可溶性Ａβ濃度の増大は、次いで、神経毒性であると考えられ、微小出血を引き起こし得る。）、及び／又は血管アミロイドの素早い溶解（これも、微小出血を引き起こし得る。）をもたらし得る。従って、単量体ではなく可溶性グロブロマーに対して影響を与える抗体治療が好ましい。
【０２１８】
（実施例ＶＩＩ）
抗Ａβグロブロマー抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５での免疫沈降後のＡＤ患者の脳脊髄液中の内在性Ａβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）レベル
ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−２８０ヒツジ抗マウスＩｇＧでの、ＡＤ脳の脳脊髄液由来のＡβ種の免疫沈降（ＩＰ）
以下のｍＡｂをＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−２８０ヒツジ抗マウスＩｇＧに固定した。
−ｍＡｂ６Ｅ１０（ＳｉｇｎｅｔＩｎｃ．；カタログ番号９３２０）
−ｍＡｂ３Ｃ５
−ｍＡｂ１０Ｆ４
−ｍＡｂ８Ｆ５
Ｄｙｎａｂｅａｄｓｍ−２８０ヒツジ抗マウスＩｇＧ：
ヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩｎｃ．，カタログ番号１１２．０２）を磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）に共有結合させる。
モノクローナルマウス抗体でのＤｙｎａｂｅａｄｓの活性化
−発泡を防ぐために、ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−２８０ヒツジ抗マウスＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；製品番号１１２．０２）の原懸濁物を慎重に振盪した。
−１ｍＬを無菌的に取り出し、１．５ｍＬの反応容器に移した。
−免疫沈降（ＩＰ）洗浄緩衝液１ｍＬ（ＩＰ洗浄緩衝液：ＰＢＳ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）で、ｄｙｎａｂｅａｄｓを３回、５分間洗浄した。磁気分離装置スタンド（ＭＳＳ）を用いて、反応容器の側面にｄｙｎａｂｅａｄｓを固定化しながら、洗浄操作の間に、上清を慎重に除去した。
−ＰＢＳ１ｍＬ、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中のＡβ抗体４０μｇとともに、洗浄されたｄｙｎａｂｅａｄｓを温置した。
−４℃で振盪しながら、一晩温置することによって、活性化を行った。
−（再びＭＳＳを用いて）ＩＰ洗浄緩衝液１ｍＬ（ＰＢＳ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ）で、活性化されたｄｙｎａｂｅａｄｓを４回、３０分間洗浄した。
−ＰＢＳ、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウム１ｍＬを用いて、活性化されたｄｙｎａｂｅａｄｓを再懸濁し、渦巻き撹拌し、短時間遠心した。
−抗体活性化されたｄｙｎａｂｅａｄｓは、さらなる使用まで、４℃で保存した。
【０２１９】
ＣＳＦ試料の調製
アルツハイマー病患者から得たＣＳＦ４００μＬを完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＲｏｃｈｅＩｎｃ．カタログ番号１６９７４９８、水１ｍＬ中に１錠溶解）４μＬに添加し、５００ｍＭＰＭＳＢ０．８μＬをメタノール中に溶解した。１０分後、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４（ＰＢＳＴ）１．６ｍＬを添加した。
【０２２０】
ヒトＡＤ−ＣＳＦからのＡβ種の免疫沈降：
調製されたＣＳＦ試料の分取試料２５０μＬを抗Ａβ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ懸濁物２５μＬに添加した。
−撹拌しながら、６℃で１６時間、免疫沈降を行った。続いて、ＰＢＳ／０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで５分間３回、最後に、１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５の１ｍＬで３分間１回、ビーズの洗浄を行った。磁気分離装置スタンド（ＭＳＳ）を用いて、反応容器の側面にｄｙｎａｂｅａｄｓを固定化しながら、洗浄操作の間に、上清を慎重に除去した。
【０２２１】
最終洗浄工程後、残存する上清を完全に除去した。β−メルカプトエタノールなしの試料緩衝液（０．３６ＭＢｉｓｔｒｉｓ、０．１６Ｍビシン、１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．００４％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー）２５μＬをＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆチューブに添加し、加熱ブロック中において、９５℃で５分間加熱することによって、Ａβペプチド及び対応する抗体をＤｙｎａｂｅａｄｓから除去した。室温まで冷却した後、磁気分離装置スタンド（ＭＳＳ）を用いて、反応容器の側面にｄｙｎａｂｅａｄｓを固定化し、上清を別のＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆチューブ（ＩＰ溶出液）に移した。
【０２２２】
尿素−ＰＡＧＥに続くウェスタンブロット操作によるＡβ免疫沈降物の分析：
「Ｈ．Ｗ．Ｋｌａｆｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２３７．，２４−２９（１９９６）」によって最初に記載され、「Ｊ．Ｗｉｌｔｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ８１，４８１−４９６，２００２」によっても後に使用された操作に従い、８Ｍ尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動系及びその後のウェスタンブロット分析によって、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２種の定量を行った。実験操作に施された２つの僅かな変更のみが存在した。
【０２２３】
１）スタッキングゲル中のＳＤＳ濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）の代わりに０．２５％（ｗ／ｖ）に調整した。
２）ウェスタンブロットのために、抗体１Ｅ８（ＳｅｎｅｔｅｋＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）は抗ヒトアミロイドβ（Ｎ）（８２Ｅ１）マウスＩｇＧｍＡｂ（ＩＢＬカタログ番号１０３２３）に置き換えられた。
【０２２４】
免疫沈降された試料のＩＰ溶出液分取試料１５μＬを８Ｍ尿素ＰＡＧＥにかけた。電気泳動は１００Ｖ（１５分）で行い、６０Ｖで継続した。青い試料搭載色素の走行する先頭がゲルの末端からなお０．５ｃｍ離れている時点で、電気泳動を停止した。
【０２２５】
ウェスタンブロットの操作：
ウェスタンブロット分析は、７．５ｃｍ×９ｃｍニトロセルロース０．４５μｍ（ＢｉｏＲａｄＩｎｃ．）上への、ＳｅｍｉＤｒｙＢｌｏｔｔｉｎｇチャンバー（ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．，７５ｍＡで４５分）中で行った。
ブロッティング緩衝液：Ｔｒｉｓ６ｇ；グリシン２８．１ｇ；メタノール５００ｍＬ；２．５Ｌになるように水で調整。
【０２２６】
ＰＢＳ中において、１００℃で１０分間、ニトロセルロースブロットを沸騰させた。室温で１時間、ＰＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ５０ｍＬでの処理によって、ブロットを飽和させた。液体相を除去した後、室温で１０分間、ＴＴＢＳ（２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ；１５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．５）５０ｍＬで２回、室温で１０分間、続いてＴＢＳ（２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ；１５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液；ｐＨ７．５）５０ｍＬで以下の洗浄工程を実施した。
【０２２７】
さらなる展開のために、ブロットから最終洗浄緩衝液を廃棄し、抗体Ｉ溶液１５ｍＬ（３％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末（ＬａｓａｎａＩｎｃ．）中の（０．２μｇ／ｍＬ８２Ｅ１＝１：５００、ＴＢＳ１５ｍＬ中）を６℃で２０時間添加した。緩衝液の除去後、上述されているように３つの洗浄工程を行った。抗体溶液ＩＩ（ＴＢＳ１５ｍＬ中の３％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末１５ｍＬ中の抗マウスＰＯＤの１：１００００希釈）とともに、室温で１時間、ブロットを温置した。緩衝液の除去後、上述されているように３つの洗浄工程を行った。
【０２２８】
最後の洗浄緩衝液を除去した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＦｅｍｔｏＭａｘｉｍｕｍＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＳｕｂｓｔｒａｔＥｎｈａｎｃｅｒ２ｍＬ及びＰｅｒｏｘｉｄｅＳｏｌｕｔｉｏｎ２ｍＬを混合した。調製した直後の溶液を、暗所で５分間、事前温置されたブロット上に注いだ。ＶｅｒｓａＤｏｃＩｍａｇｉｎｇシステム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、化学発光を記録した。
【０２２９】
画像化パラメータ：
露出時間１８０秒。
３０秒、６０秒、１２０秒及び１８０秒後に、写真を記録。
１８０秒の露出時間での写真から、結果を得た。
【０２３０】
本発明の抗グロブロマー抗体１０Ｆ４及び３Ｃ５は、（文献において、Ａβの立体構造に関わらず、全てのＡβ形態を認識すると認められている）市販の抗体６Ｅ１０と比べて、アルツハイマー病患者の脳脊髄液中のＡβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）ペプチドに対して、より低い親和性を有する。ＣＳＦＡβペプチド形態は高い代謝回転速度に供せられ（Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００６，１２（７）：８５６−６１）、従って、疾病の関連種である可能性は低い。従って、ＣＳＦＡβ形態は、望ましくない副作用のリスクを低減するために、アルツハイマー病の受動免疫化治療戦略における標的とすべきではない。より初期の研究において（Ｂａｒｇｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００５；９５（３）：８３４−８４７）、抗Ａβグロブロマー抗体８Ｆ５はアルツハイマー病患者のＣＳＦ中のＡβペプチドを認識及び結合しないことが注目される。この初期の研究は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて行われた。これに対して、上記免疫沈降及び尿素ＰＡＧＥ法を使用する場合、同じ抗体８Ｆ５はアルツハイマー病患者の脳脊髄液中のＡβペプチドを認識する（図５参照）。従って、サンドイッチＥＬＩＳＡ法は偽陰性結果を与えた。従って、ＣＳＦ中のＡβペプチドの検出のために、本明細書に記載されている免疫沈降及び尿素ＰＡＧＥ法を使用すべきである。
【図１ａ】
2010511386.tif 000002
【図１ｂ】
2010511386.tif 000003
【図２ａ】
2010511386.tif 000004
【図２ｂ】
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【図２ｃ】
2010511386.tif 000006
【図２ｄ】
2010511386.tif 000007
【図２ｅ】
2010511386.tif 000008
【図３ａ】
2010511386.tif 000009
【図３ｂ】
2010511386.tif 000010
【図４ａ】
2010511386.tif 000011
【図４ｂ】
2010511386.tif 000012
【図４ｃ】
2010511386.tif 000013
【図４ｄ】
2010511386.tif 000014
【図４ｅ】
2010511386.tif 000015
【図４ｆ】
2010511386.tif 000016
【図４ｇ】
2010511386.tif 000017
【図４ｈ】
2010511386.tif 000018
【図５ａ】
2010511386.tif 000019
【図５ｂ】
2010511386.tif 000020
【図５ｃ】
2010511386.tif 000021
【図５ｄ】
2010511386.tif 000022
【図５ｅ】
2010511386.tif 000023
【図５ｆ】
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【図５ｇ】
2010511386.tif 000025
【図５ｈ】
2010511386.tif 000026
【図５ｉ】
2010511386.tif 000027
【図６ａ】
2010511386.tif 000028
【図６ｂ】
2010511386.tif 000029
【図６ｃ】
2010511386.tif 000030
【図６ｄ】
2010511386.tif 000031
【図７ａ】
2010511386.tif 000032
【図７ｂ】
2010511386.tif 000033
【図７ｃ】
2010511386.tif 000034
【図７ｄ】
2010511386.tif 000035
【配列表】
2010511386000001.app
【国際調査報告】
2010511386.tif 000036
2010511386.tif 000037
2010511386.tif 000038