(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの寸法が変化しているゲルを可塑的圧縮することにより可変剛性を有する生体材料の製造に関する。この生体材料は、例えば、組織等価インプラント内の細胞の方向を制御または誘導するのに有用でありうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第２の領域よりも第１の領域において大きい寸法を有するゲルを提供するステップと、
前記第１及び第２の領域のゲルの寸法の差異が減少するようにゲルを可塑的に圧縮し、それにより生体材料を製造するステップと
を含み、前記生体材料が第２の領域と比較して第１の領域において増大した剛性を有する、可変剛性を有する生体材料を製造する方法。
【請求項２】
可塑的圧縮後に、ゲルの寸法が第１と第２の領域において同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体材料の剛性が第１の領域から第２の領域にかけて徐々に増大するように、ゲルの寸法が、ゲルの第１の領域から第２の領域にかけて徐々に増大する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
生体材料の剛性が第１の領域から第２の領域にかけて連続的に増大するように、ゲルの寸法が、ゲルの第１の領域から第２の領域にかけて連続的に増大する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生体材料の剛性が第１の領域から第２の領域にかけて直線的に増大するように、ゲルの寸法が、ゲルの第１の領域から第２の領域にかけて直線的に増大する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ゲルがコラーゲンゲルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ゲルが、カーボンナノチューブのコファイバー（co-fibres）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
可塑的圧縮前にゲルに生存細胞を播種する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
生存細胞が、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、心臓細胞、肺細胞、腸細胞、気管支細胞、眼細胞、生殖細胞、血管細胞、神経細胞、分泌細胞、幹細胞、線維芽細胞、シュワン細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、尿路上皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、および腱細胞からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ゲルの可塑的圧縮により、第２の領域に比較して第１の領域で細胞密度が高くなる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
可塑的圧縮前に、ゲルの第２の領域に向けて細胞を沈降させる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
可塑的圧縮により、第１の領域に比較して第２の領域で細胞密度が高くなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
一軸張力をゲルに負荷することによりゲルのフィブリルを整列させる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
一軸張力が可塑的圧縮前に負荷される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
損傷組織を修復または置換するために、ヒトまたは動物の体内に前記生体材料を埋め込むステップを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体材料をモールディングまたは成形して組織等価インプラントを製造するステップを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記生体材料を折りたたむか、または丸めて前記インプラントを製造するステップを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体材料を更に可塑的圧縮で処理することにより前記インプラントを製造する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法により製造される生体材料。
【請求項２０】
請求項１９に記載の生体材料を含む組織等価インプラント。
【請求項２１】
個体内の損傷組織を治療する方法であって、
請求項２０に記載の組織等価インプラントを前記損傷組織に固定して、前記組織を修復および／または置換するステップ
を含む、方法。
【請求項２２】
個体内の損傷組織を治療する方法に用いるための、請求項２０に記載の組織等価インプラント。
【請求項２３】
損傷組織の治療に用いられる薬物の製造における、請求項２０に記載の組織等価インプラントの使用。
【請求項２４】
前記損傷組織が、関節炎疹、神経−筋損傷／変性、筋腱損傷、および加齢変性、外傷後の再生不良、組織壊死、または外科切除に起因する、請求項２１に記載の方法、請求項２２に記載のインプラント、または請求項２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、個体の損傷組織を修復および／もしくは置換するために、あるいは体外での試験、スクリーニング、または診断用の組織等価３次元モデルを製造するために用いられる組織等価インプラント（tissue equivalent implant）および組織スキャフォールド(tissue scaffolds)の剛性および密度の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体模倣材料は、細胞−組織の制御および系の模倣において、これまで以上に繊細かつ複雑な形態をとるように設計されているので、制御または指針の新しいモードが必要となる。さらに、特に常在細胞に害を及ぼさない手段によって組織構造のより繊細な特徴を作り出し、また、そのような構造を構築するための手段を同定する必要が生じている。
【０００３】
走触性（Durotaxis）は、細胞がより柔軟な基材からより硬い基材に選択的に移動する傾向があるという現象を表す生物学的用語である（Ｊｉａｎｇら、２００６  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．９０  １８０４〜１８０９頁；Ｌｏら、２０００  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．７９  １４４〜１５２頁）。剛性（走触性）勾配は、組織工学および修復生物学において１つまたは複数の所望の特定方向に細胞を制御し、または導くのに有用である可能性があり、生化学勾配または表面トポグラフィーなどの既知の細胞誘導技術に対して顕著な利便性をもたらす可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、特定形状を有するゲルの可塑的圧縮（plastic compaction）を通じて生体材料の密度を変化させることにより、組織等価インプラントの剛性を好都合に調節して所定の剛性（すなわち走触性）勾配を有するインプラントを製造することができるという知見に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の１つの態様は、
第２の領域よりも第１の領域において大きい寸法を有するゲルを提供するステップと、
前記第１及び第２の領域のゲルの寸法の差異が減少するようにゲルを可塑的に圧縮し、それにより生体材料を製造するステップと
を含み、前記生体材料が第２の領域と比較して第１の領域において増大した剛性を有する、可変剛性を有する生体材料を製造する方法を提供する。
【０００６】
生体材料を製造するために可塑的に圧縮されるゲルの寸法は、本明細書では厚さと称する。このゲルは任意の方向で圧縮することができ、第１および第２の領域におけるゲルの厚さは、ゲルのその他の２つ寸法の１つまたは両方（すなわち、ゲルの幅および高さ）よりも小さい、同じ、または大きくてもよい。したがって、本明細書に記載の用途で用いられるゲルは可変厚を有し、また可変剛性を有する生体材料に可塑的に圧縮される。
【０００７】
このゲルは、ゲルの第１の領域と第２の領域との間のゲルの厚さに差異が生じない、すなわち圧縮されたゲルの厚みが第１の領域と第２の領域とで同一となるように圧縮されることが好ましい。したがって、圧縮により製造される生体材料は、均一な厚さであるが可変材料密度を有することができる。生体材料の任意の点の密度は、本明細書において生体材料の剛性を反映させるために示される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ゲルの厚さは、ゲルの第１の領域から第２の領域に向けて徐々に増大し、このため、圧縮により製造された生体材料の剛性が第１の領域から第２の領域に向けて徐々に増大する。すなわち生体材料は、第１の領域と第２の領域の間で剛性勾配を示す。可変剛性を有する生体材料を製造する方法は、
第１の領域から第２の領域に向けて徐々に増大する寸法を有するゲルを提供するステップと、
前記第１及び第２の領域のゲルの寸法の差異が減少するようにゲルを可塑的に圧縮し、それにより生体材料を製造するステップと
を含むことができ、ここで、前記生体材料の剛性は第１の領域から第２の領域に向けて徐々に増大する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、製造された生体材料の剛性が第１の領域から第２の領域に向けて連続的に増大する（すなわち、連続的な剛性勾配を示す）ように、ゲルの寸法は、ゲルの第１の領域から第２の領域に向けて連続的に増大してもよい。ゲルの寸法を直線的に増大させることで直線的な剛性勾配を有する生体材料を製造するができ、あるいは非直線的な形で増加させることで非直線的な剛性勾配、例えば曲線的または段階的な剛性勾配を有する生体材料を製造することもできる。
【００１０】
その他の実施形態では、製造された生体材料の剛性が第１の領域と第２の領域との間で増大し、また減少するように、ゲルの寸法がゲルの第１の領域と第２の領域との間で増大し、また減少するものであってもよい。例えば、生体材料は低い剛性の領域に囲まれた高い剛性の島、またはその逆を含むことができる。
【００１１】
生体材料における剛性勾配の形状は、圧縮する前のゲルの形状で制御することができる。成形されたチャンバーで出発ゲルを鋳造することにより、複雑な形状（例、曲線プロフィール）を有するゲルを作り出すことができる。このようなゲルは、可塑的圧縮後、当初の複雑なゲルの形状を反映する複雑な剛性勾配を有する生体材料を生み出す（すなわち、特定の点における生体材料の剛性は、当該点における当初のゲルの厚さに直接関連する）。
【００１２】
ゲルは、ゲルの異なる領域において第２および／または第３の寸法（すなわち幅および高さ）が異なるものであってもよい。さらに、ゲルは、生体材料内の剛性にさらに差異が生じるように第２および／または第３の寸法において可塑的に圧縮されうる。これは、必要に応じて階層的な複雑性のレベルを増大させることを可能にする。
【００１３】
一般的に、生体材料の剛性の勾配またはパターンは、具体的な組織構造を模倣するように選択される。本明細書に記載の方法は、あらゆる所望の構造も模倣できるようにする、制御可能な製造プロセスを提供する。
【００１４】
ゲルはスキャフォールドファイバー（scaffold fibre）のマトリックスおよび間質液を含む。最初にモノマーを保持していた水性間質液の周囲に、フィブリルが連続的ネットワークを形成する、スキャフォールドフィブリル（scaffold fibril）の凝集（coalescence）および伸長（elongation）によりゲルが形成される。例えば、三重らせんコラーゲンモノマーは、最初希薄酸に溶解することができ、次に重合（凝集）を引き起してフィブリルにすることができる（例、３７度で中性のｐＨ）。フィブリルが重合すると、相転位が生じ、フィブリルの固体化したネットワークが残留する間質液をほぼ同じ体積および形状で「保持（support）」する。すなわち、ゲル化が起こる。可溶性のモノマーから固体ポリマーへの相転移はゲルの特徴であり、本明細書に記載の特徴をもたらす上で重要である。ゲルは、事前に重合したファイバー（pre-polymerized fibres）から形成可能な「スポンジ」とは異なる。
【００１５】
任意の水和ポリマー材料が本明細書に記載のゲルで使用するのに適している場合があり、これには天然のポリマー、例えば、絹、フィブリン、フィブロネクチン、エラスチンまたはコラーゲン（例、コラーゲンタイプＩ）などのタンパク質、フィブロネクチンなどの糖タンパク質、またはキチンもしくはセルロースなどの多糖類が含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、スキャフォールドファイバーはコラーゲンから作られる。天然のフィブリルを形成するコラーゲンタイプが好ましく、これに含まれるコラーゲンタイプとしてＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸおよびＸＩ、ならびにこれらを組み合わせたもの（例、Ｉ、ＩＩＩ、ＶまたはＩＩ、ＩＸ、ＸＩ）が挙げられる。例えば、コラーゲンタイプＩはスキャフォールドとして用いることができる。
【００１６】
その他の適当な線維状のスキャフォールドとして、合成ポリマー、すなわちヒトまたは動物の体内に天然には存在しないポリマーが挙げられる。適当なポリマーには、ポリラクトン、ポリグリコン、およびポリカプリオラクトンなどの有機ポリマー、リン酸塩ガラスなどの無機ポリマー、および合成の、ゲル化するポリペプチドゲルが含まれる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、線維性のスキャフォールドは、２つ以上の異なるタイプのファイバーを含む複合材料であってもよい。例えば、スキャフォールドはフィブロネクチンとコラーゲン、コラーゲンとポリラクチド、フィブリンとコラーゲン、コラーゲンファイバーとカーボンナノチューブまたはフィブリン、コラーゲンとフィブロネクチンを含むことができる。
【００１８】
ゲル内の間質液は、一般的に可溶性のコラーゲンファイバーに対する溶媒として作用する水性液体である。例えば、この液体は塩やタンパク質などの溶質が溶け込んだ水であってもよい。いくつかの実施形態では、間質液は細胞が成長し、増殖するのに適した細胞培養液である。
【００１９】
生体材料として用いられるゲルを調合及び鋳造するための技術は当技術分野でよく知られている（例えば、ＷＯ２００６／００３４４２；ＷＯ２００７／０６０４５９；Ｍａｒｅｎｚａｎａら、２００６  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１２  ４２３〜４３３頁；Ｔｏｍａｓｅｋら（２００２）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３  ３４９〜３６３頁；Ｈａｒｒｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０（１９８１）２４９〜２５１頁；Ｅｌｓｄａｌｅら、１９７２  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５４  ６２６〜６３７頁；Ｋｏｌｏｄｎｅｙら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９２）１１７  ７３〜８２頁；Ｅａｓｔｗｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２０１（１９９４）１８６〜１９２頁を参照）。
【００２０】
好ましい実施形態では、ゲルは、このゲルの３つの寸法の少なくとも１つ（本明細書では「厚さ」と呼ぶ）が他の寸法の１つまたは両方に関連して変化する形状になるように鋳造することができる。例えば、鋳造ゲルの厚さは、このゲルの幅および／または長さにわたって変化することができる。
【００２１】
これは任意の簡便な技術により実現可能である。例えば、ゲルを流し込むときに、重力の影響によって楔形のゲルが作り出されるように鋳型を傾けることができる。また、成形された鋳型内でゲルを鋳造することができる。または、ゲルを複数の部品として鋳造し、次に圧縮する前に組み立てることができ、随意に、複数の異なる材料からなる部品と共に組み立てることができる。
【００２２】
鋳造後、ゲルは、本明細書に記載の通りに他の寸法の１つまたは両方に関連して変化する寸法で可塑的に圧縮されて、可変剛性を有する生体材料を生み出すように向きを定めることができる。
【００２３】
可塑的圧縮には、対象物が、圧縮の原因が取り除かれた後においてもその物の新しい体積を実質的に保持するように、ゲルなどの対象物を変形させてその体積を減少させることが含まれる。可塑的圧縮は迅速で細胞非依存性のプロセスであり、ゲルが、物理的処理を受けること、即ち、ゲルに外力または外圧などが負荷されて、間質液がゲルから排除され、負荷を解除しても間質液が元に戻らないことである。すなわち、これが、ゲルが可塑的圧縮を受けることである。未処理のゲルでは、スキャフォールドのマトリックスは一般的に膨んで水和した形態をとる。このスキャフォールド構造体は、可塑的圧縮を行っている最中に構造細部を損失することなく押しつぶされて、ゲル中のスキャフォールドから水を排除し、密度と強度が増大する。
【００２４】
可塑的圧縮は、ゲル中で増殖する細胞の本質的作用により生ずる、細胞によって駆動された収縮の遅いプロセスとは異なる。すなわち、可塑的圧縮は細胞が媒介するものではなく、またゲル内で培養される細胞の作用により生ずるものでもない。可塑的圧縮は、１つ、２つまたはこれよりも多い規定済みの方向にベクトルを有し、圧縮の方向、速さ、および範囲は制御可能である。
【００２５】
また、圧縮のベクトル（複数可）を用いて密度／剛性勾配を制御することも可能である。
【００２６】
圧縮の量または範囲は、生体材料の使用目的に応じて変化しうる。例えば、コンプレッション（compression）によるゲルの圧縮は、ゲルの厚さを、５分の１以下、１０分の１以下、または２０分の１以下に低下させることができる。圧縮されたゲルの寸法を、２００分の１以下、１５０分の１以下、または１００分の１以下に減少させることができる。例えば、可塑的圧縮によりゲルの体積を、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または９９．９％以上減少させることができる。
【００２７】
ゲルの厚さの変化はゲルの異なる部分における圧縮量の相違をもたらす。ゲルのより厚い部分はより強い圧縮を受け、したがってゲルのより薄い部分よりも密度が高くなる。
【００２８】
圧縮に要する時間は、細胞により促進された収縮が生じるのに要する時間よりも短く、また採用する圧縮方法および条件に応じて変わる。例えば、圧縮は１２時間未満、６時間未満、３時間未満、１時間未満、３０分未満、または１０分未満で起こりうる。いくつかの好ましい実施形態では、ゲルは２分以内または１分以内に圧縮されうる。
【００２９】
ゲルの可塑的圧縮は、前記ゲルから間質液の一部またはすべての喪失または除去と連関する場合がある。例えば、可塑的圧縮によってゲルから失われ、または除去される液体の量は、ゲルの初期液体含有量の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％でありうる。
【００３０】
圧縮後に若干の、例えばゲルの初期液体含有量の少なくとも１０％、少なくとも１％、または少なくとも０．１％の間質液が残ることが好ましい。脱水は細胞を死滅させ、かつ生体材料の構造を損なうので、好ましい実施形態では、ゲルは可塑的圧縮後に乾燥（dryingまたはdesiccation）、例えば、加熱、凍結、気流または真空による乾燥を受けない。
【００３１】
可塑的圧縮は、間質液をゲルから排除する、または間質液をゲルの外側に抽出しうる。２つ以上の方法を、連続的または同時に使用してゲルを圧縮することができる。可塑的圧縮の方法と手段はＷＯ２００６／００３４４２に記述されている。
【００３２】
可塑的圧縮プロセスを最適化して、標準出発ゲル（standard starting gel）から、コラーゲン、細胞、およびチャンネル形成挿入物について、所望の最終比率を実現することができる。標準ゲルは、例えば、コラーゲン１〜４％、細胞０．２〜１０×１０６個／ｍｌ、およびチャネリングファイバーまたは顆粒０．２〜２％を含むことができる。
【００３３】
細胞をゲルのスキャフォールド内に播種する場合、ゲルの環境を、細胞が生存するための生理条件（例、温度、ｐＨ、水和状態、およびイオン強度）に維持することが好ましい。このような生物的な実施形態では、可塑的圧縮が、ゲル液のイオン特性を生理的条件から大きく変化させないことが好ましい。
【００３４】
ゲルに細胞が含まれない非生物的実施形態では、ゲルの環境は生理的である必要はなく、浸透圧法などのゲル液のイオン特性を変化させる方法を含め、任意の可塑的圧縮方法が適している。
【００３５】
好ましい実施形態では、ゲルには細胞、特にヒトまたはその他の哺乳動物の細胞が播種される。好ましい実施形態では、細胞は運動性細胞である。これらの細胞は、ゲルが生体材料に圧縮されても生存し続ける。ゲルは、組織が有する機能性を付与し、また体内組織を置換するか又はその修復を促進する構造を提供する細胞を含むことができる。例えば、ゲルは、収縮構造を提供するための筋肉細胞、導電的要素を提供するための血管細胞および／または神経細胞、分泌構造を提供するための代謝的に活性な分泌細胞、例えば、肝細胞、ホルモン合成細胞、脂腺細胞、膵島細胞または副腎皮質細胞など、神経インプラントのための骨髄由来幹細胞または胚性幹細胞などの幹細胞、皮膚線維芽細胞、皮膚ケラチン生成細胞、（および両者の複合した層）、シュワン細胞、血管構造のための平滑筋細胞および内皮細胞、膀胱／尿道構造のための尿路上皮細胞および平滑筋細胞、および骨および腱構造のための骨細胞、軟骨細胞、および腱細胞の１つまたは複数を含むことができる。いくつかの実施形態では、ゲルに播種される細胞には、線維芽細胞および神経細胞を含めることができる。
【００３６】
細胞は、圧縮する前、例えばゲルを鋳造するときにゲルに播種することができる。細胞は、これを液体コラーゲンと混合し、次いで液体コラーゲンをゲル状に凝固させることによりマトリックス内に播種可能である。マトリックスへの播種は、ゲル形成前において生存能力を維持するのに適した、温度、ｐＨ、イオン強度および純度（sheer）の条件下で実施されることが好ましい。
【００３７】
好ましいいくつかの実施形態では、細胞は、可塑的圧縮を行う前にゲル全体にわたり均一に播種される。
【００３８】
細胞が均一に播種されたゲルを本明細書の記載に従い可塑的に圧縮すると、圧縮されたゲル内にコラーゲンの密度勾配に対応する細胞−密度勾配が生み出される。
【００３９】
ある状況下では、本明細書に記載の可塑的圧縮により生み出されたコラーゲン密度変化には対応しない細胞密度変化を必要とする場合がある。例えば、生体材料は、コラーゲン密度が低いゲル領域において高い細胞濃度、またコラーゲン密度が高いゲル領域において低い細胞濃度が求められる場合がある（すなわち、均一な細胞分布を有するゲルを可塑的に圧縮すると自然に生じる分布とは逆）。
【００４０】
細胞密度のそのような変化は、任意の好都合な技術で実現されうる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、細胞が均一に分布するように播種され、そしてゲル中の細胞が第１の領域から第２の領域に向けて沈降するように、例えば、ゲルを傾けることによってゲルの第２の領域に比較して第１の領域が挙上した未凝固のコラーゲンゲルを提供することができる。
【００４２】
未凝固のゲルは、このプロセスの最中、硬化するのを防ぐために４℃に保たれることが好ましい。
【００４３】
未凝固のゲルは、間質液中にコラーゲンファイバーの溶液を含むことができる。未凝固のゲルは、凝固後のゲルの形状を規定する鋳型、または鋳造物に保持可能である。
【００４４】
所望の細胞分布が実現したら（例、第２の領域で細胞密度が増大している）、例えば未凝固のゲルを、例えば３７℃まで加温することにより、このゲルを凝固させる。次に、凝固したゲルは本明細書に記載の方法で用いることができる。
【００４５】
その他の実施形態では、凝固前または凝固中に、細胞をゲルの一端に直接注入して細胞の密度に変化を生じさせることもできる。
【００４６】
圧縮された生体材料に含まれる細胞は乾燥しやすい。乾燥に関連した細胞の死および／または損傷を低減するために、ゲルを水性液体中で、例えば、ＤＭＥＭ、ＨａｍまたはＥａｇｌｅの培地などの培地、あるいはリンゲル液またはＰＢＳなどの生理的緩衝液中で圧縮することができる。非細胞性生体材料の場合、スキャフォールドマトリックスに適合性を有する任意の溶媒を使用することができる。
【００４７】
細胞は、圧縮された生体材料中の細胞密度が高くなることに起因して、低酸素による細胞の死および／または損傷も起こしやすい。細胞の死または損傷を低減および／あるいは防止するために、インプラントまたは生体材料は、使用時まで生存能力を維持するが細胞増殖は促進しない条件下で保存することができる。例えば、インプラントまたは生体材料を、０℃〜５℃、好ましくは４℃などの低温で保存することができる。
【００４８】
スキャフォールド、細胞および間質液に加えて、ゲルは追加の成分を含むことができる。特に、ゲルは固体成分、例えば、キャピラリーフィラメントまたは多孔性ビーズを含むことができる。
【００４９】
キャピラリーフィラメントは、硬質固体ポリマーからなる不溶性または可溶性のファイバーでありうる。適切なフィラメントとして、直径約１００μｍ未満が好ましい。
【００５０】
ゲル内に挿入された可溶性のフィラメントは、溶解してゲル内にキャピラリーチャンネルを形成することができる。ゲル内のこのキャピラリーチャンネルは、例えば、かん流、スキャフォールド内への薬剤および／または遺伝子および／または培地の送達、および移植者の循環系との吻合の１つまたは複数のために有用でありうる。
【００５１】
適切な可溶性のフィラメントは、可溶性のリン酸塩ガラス、ポリカプリオラクトン、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、絹、多糖類、または融解塩もしくは結晶塩から作成することができる。
【００５２】
不溶性フィラメントは、眼科治療（optical therapy）、視覚モニタリング（optical monitoring）、信号伝達（signal transmission）、および／またはひずみ検出（strain detection）に有用でありうる。適切な不溶性フィラメントはガラスから作製できる。
【００５３】
キャピラリーフィラメントは、ゲルの層間に挿入してもよく、鋳造前のゲルに添加してもよく、または鋳造後のゲルに挿入てもよい。２つ以上の鋳造ゲルを含む実施形態では、フィラメントを、例えば、ゲルの間に挟みこむことができる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ゲルは多孔性のビーズを含むことができる。ゲルマトリックスの可塑的圧縮により、スキャフォールドファイバーが多孔性のビーズの孔隙に押し込まれ、強固に結合した構造体が生じる。これは例えば、人工の骨または石灰化軟骨に代わる組織として、骨芽細胞または軟骨細胞が播種された場合に有用であろう。適切な多孔性のビーズは、直径が約１００〜５００ミクロンでありえ、また、任意の固体材料、例えば、多孔性のセラミック、ガラス、リン酸塩ガラス、ヒドロキシアパタイト、または骨塩調製物（bone mineral preparations）（天然骨から有機相を除去したもの）でありうる。
【００５５】
顆粒：ゲル：細胞の比率は、必要とされる粒子の大きさおよび組織の特性（例、高密度または低密度でパックされた硬組織）に依存する。
【００５６】
コラーゲンマトリックスの特性は、どのようにして組織を細胞で修復または再生するか、またどのようにして初期のスキャフォールド構造で効果的にその後の下流３Ｄ構造の大部分を決定するかを判断するにおいて、重要である。したがって、コラーゲンマトリックスの特性は、多くの用途において、組織等価インプラント内の細胞およびファイバーを整列させるのに有用である。
【００５７】
スキャフォールドマトリックスの細胞および／またはファイバーは、例えばゲル全体に張力を与えることにより整列させることができる。張力は、可塑的圧縮の前、最中、および／または後に加えることができる。
【００５８】
張力は一軸方向が好ましく、またゲルは５〜５０％の一軸張力、好ましくは１０〜３０％の一軸張力を受けることができる。ぶおよび、存在する場合には播種された細胞は、主たる張力方向に対して並行の向きで整列する。
【００５９】
例えば、コラーゲンゲルの場合、５〜３０％、好ましくは２０〜２５％の張力を用いることができる。いくつかの実施形態では、ＷＯ２００７／０６０４５９の記述に従い、ゲルの機械特性を改善するために、圧縮されたゲルに一軸張力を反復負荷することができる。反復負荷は、圧縮されたコラーゲンゲル内のコラーゲンフィブリルの融合を増大させて、材料強度が改善した（すなわち、破壊応力、破壊張力、および／または弾性率が増強した）生体材料を生み出す。
【００６０】
本方法により製造される生体材料は、損傷を受けた組織を修復または置換するための組織等価インプラントの製造において、追加の処理を行うことなく使用可能である。
【００６１】
組織等価インプラントは、例えば、損傷を受けた、あるいは疾患状態にある可能性のある体内組織を修復または置換するための個体内移植用デバイスである。組織等価インプラントにより修復され、または置換されうる疾患組織の例として、神経、腱、軟骨、皮膚、骨、尿生殖系組織、肝臓、心肺組織、腎臓、眼組織、血管、腸、および腺が挙げられる。
【００６２】
本明細書に記載の剛性（走触性）勾配は、整形外科用インプラントの軸部、皮膚創傷被覆材の中央部および端部、神経修復ガイドまたは脊髄再生インプラント、誘導増殖血管キャピラリー（guided vascular capillary in-growth）、抗接着剤（anti-adhesion）、術後フィルムおよび／または血管壁インプラントにおいて特に有用でありうる。
【００６３】
損傷を受けた組織の修復用または置換用の組織等価インプラントを製造するために、生体材料に追加の処理を行うことができる。生体材料を、例えば、モールディングおよび／または成形して組織等価インプラントを製造することもできる。生体材料は、所定の形状に成型され、および／または対称的もしくは非対称的な追加の可塑的圧縮または張力により処理してもよい。生体材料は、任意の都合のよいインプラント形態、例えば、パッチ、ブロック、チューブ、テープ、ストリップ、リング、トロイド、キャピラリー、ロール、シートまたは糸状に成形、切断または成型されうる。組織等価インプラントの最終形状は、これが用いられる具体的状況に依存する。いくつかの実施形態では、組織等価インプラントは更なる成形に適した柔軟な形態を有することができる。
【００６４】
組織等価インプラントは組織損傷部位で固定できることが好ましい。例えば、インプラントは、侵入側（entry end）が損傷組織の近位端（proximal stump）近傍に位置し、出口側（exit end）が損傷組織の遠位端（distal stump）近傍に位置するように固定できる。組織等価インプラントは、任意の好都合な技法により固定されうる。例えば、これは所定の位置で縫合または接着されうる。
【００６５】
本発明の別の態様は、
本明細書に記載の方法を用いて組織等価インプラントを製造するステップと、
前記インプラントを前記損傷組織に固定して該組織を修復および／または置換するステップと
を含む、個体内の前記損傷組織の治療方法を提供する。
【００６６】
本発明の様々なさらなる態様および実施形態は、本開示に照らせば当業者には自明であろう。
【００６７】
本明細書で使用する「および／または」は２つの具体的な特徴または要素のそれぞれの、もう一方を伴うまたは伴わない具体的な開示として捉えるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」とは、本明細書では、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、および（ｉｉｉ）ＡおよびＢ、のそれぞれの具体的な開示として、ちょうどそれぞれが個別に記述されたように捉えられるべきである。
【００６８】
文脈中に別途指示がないかぎり、上記特徴の記述内容および定義は、本発明のいかなる具体的な態様または実施形態に限定されることもなく、記述されるすべての態様および実施形態に対して同等に適用される。
【００６９】
例を挙げ、添付の図面および表を参照しながら、本発明の特定の態様および実施形態について説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】楔形をしたコラーゲンゲルの鋳造（上図）、及び勾配を有するように圧縮されるゲル（下図）の図である。
【図２】１ｇ／５ｍｌのセファロースビーズ、０．１５ｍｌを播種し、０．７ｍｍまで可塑的圧縮を行ったコラーゲンゲルであり、直線的な密度／剛性勾配を有するゲル７ｍｌ中のセファロースビーズの濃度を表す図である（ｎ＝３）。
【図３】１ｇ／５ｍｌのセファロースビーズを０．１５ｍｌを播種し、可塑的圧縮を行ったコラーゲンゲルであり、連続的な剛性勾配を有するゲルの動的機械分析（ＤＭＡ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＤＭＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を表す図である。
【図４】図３と同じ
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７１】
実験
細胞は、先の文献の記載に沿って投入及び播種した（ＷＯ２００６／００３４４２；ＷＯ２００７／０６０４５９；Ｅａｓｔｗｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２０１（１９９４）１８６〜１９２頁）。
【００７２】
細胞の播種と同様にして、標準ブルーセファロースビーズを、鋳造する際にゲル内に均一に播種することにより、圧縮されたゲル内の密度の変化を評価した。可塑的圧縮後に、ゲルを顕微鏡により観察し、「硬い」側、中央部、および「柔らかい」側におけるビーズ数（区域毎の平均ビーズ数）をカウントした。区域毎のセファロースビーズ数の増加は、圧縮後のゲル内の密度勾配を表している（図２）。重いビーズはゲル化期間中（約５分）にわずかに沈降する傾向があり、このことにより、楔の形状に起因して厚い（最終的により密度が高い）側に向かってビーズの濃度がわずかに高まる傾向がもたらされる。
【００７３】
図３に示すように、圧縮されたゲルの「硬い」側、中央部、および「柔らかい」側に由来するサンプルを用いて、ＤＭＡ分析を行った。この分析では、ビーズに見られる沈降効果は、測定された剛性において認められなかった。これは、コラーゲンフィブリルは、直径がｎｍであるため、ビーズと同じようには沈降できないからである。また、測定された剛性は、ほぼ直線的であることが明らかとなった。図４から、圧縮されたゲルの実際の材料剛性は、予想通りに材料に沿って増大し、セファロースビーズ密度による測定において、ゲルの縦方向に渡って、密度と比較して２倍超増大していることが明らかである。ただし本実験においては、合成の増大はほぼ直線的なものであった（図４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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