(57)【要約】  本発明は、例えば、アルツハイマー病及び関連状態の、診断、治療及び予防において使用され得る結合タンパク質及び特にヒト化抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）アミロイド−β（１−４２）球状凝集体に結合する抗原結合ドメイン（該抗原結合ドメインは、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む：
ＣＤＲ−Ｈ１。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号５）（式中、
Ｘ１はＳであり；
Ｘ２はＹであり；
Ｘ３はＧであり；
Ｘ４はＭであり；
Ｘ５はＳである。）、
ＣＤＲ−Ｈ２。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７（配列番号６）（式中、
Ｘ１はＳであり；
Ｘ２はＩであり；
Ｘ３はＮであり；
Ｘ４はＳであり；
Ｘ５はＮであり；
Ｘ６はＧであり；
Ｘ７はＧであり；
Ｘ８はＳであり；
Ｘ９はＴであり；
Ｘ１０はＹであり；
Ｘ１１はＹであり；
Ｘ１２はＰであり；
Ｘ１３はＤであり；
Ｘ１４はＳであり；
Ｘ１５はＶであり；
Ｘ１６はＫであり；
Ｘ１７はＧである。）
ＣＤＲ−Ｈ３。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４（配列番号７）（式中、
Ｘ１はＳであり；
Ｘ２はＧであり；
Ｘ３はＤであり；
Ｘ４はＹである。）、
ＣＤＲ−Ｌ１。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６（配列番号８）（式中、
Ｘ１はＲであり；
Ｘ２はＳであり；
Ｘ３はＳであり；
Ｘ４はＱであり；
Ｘ５はＳであり；
Ｘ６はＬであり；
Ｘ７はＶであり；
Ｘ８はＹであり；
Ｘ９はＳであり；
Ｘ１０はＮであり；
Ｘ１１はＧであり；
Ｘ１２はＤであり；
Ｘ１３はＴであり；
Ｘ１４はＹであり；
Ｘ１５はＬであり；
Ｘ１６はＨである。）、
ＣＤＲ−Ｌ２。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号９）（式中、
Ｘ１はＫであり；
Ｘ２はＶであり；
Ｘ３はＳであり；
Ｘ４はＮであり；
Ｘ５はＲであり；
Ｘ６はＦであり；
Ｘ７はＲである。）及び
ＣＤＲ−Ｌ３。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号１０）（式中、
Ｘ１はＳであり；
Ｘ２はＱであり；
Ｘ３はＳであり；
Ｘ４はＴであり；
Ｘ５はＨである；
Ｘ６はＶであり；
Ｘ７はＰであり；
Ｘ８はＷであり；
Ｘ９はＴである。））と、
２）配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４からなる群から選択される少なくとも１つのアクセプター配列を含むヒトアクセプターフレームワークと、
を含む、結合タンパク質。
【請求項２】
前記少なくとも１つのＣＤＲが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項３】
少なくとも３つのＣＤＲを含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項４】
少なくとも３つのＣＤＲが、次のものからなる可変ドメインＣＤＲセットから選択される、請求項３に記載の結合タンパク質。
【表１】
2010530739.tif 000017
2010530739.tif 000018
【請求項５】
２つの可変ドメインＣＤＲセットである、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
前記２つの可変ドメインＣＤＲセットがＶＨ  ８Ｆ５  ＣＤＲセット及びＶＬ  ８Ｆ５  ＣＤＲセットである、請求項５に記載の結合タンパク質。
【請求項７】
ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項９】
ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項５に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
前記結合タンパク質が、配列番号１及び配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変ドメインを含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
前記結合タンパク質が、２つの可変ドメインを含み、該可変ドメインが、配列番号１及び配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の結合タンパク質。
【請求項１７】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、キーとなる残基において少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、該キーとなる残基が、
ＣＤＲに隣接する残基；
グリコシル化部位残基；
希少残基；
Ａβ（１−４２）球状凝集体と相互作用することができる残基；
ＣＤＲと相互作用することができる残基；
カノニカル（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ）残基；
重鎖可変領域及と軽鎖可変領域との間の接触残基；
バーニアゾーン内の残基；及び
コチア定義の可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義の第一の重鎖フレームワークとの間で重複する領域における残基
からなる群から選択される、請求項に７記載の結合タンパク質。
【請求項１８】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、キーとなる残基において少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、該キーとなる残基が、
ＣＤＲに隣接する残基；
グリコシル化部位残基；
希少残基；
Ａβ（１−４２）球状凝集体と相互作用することができる残基；
ＣＤＲと相互作用することができる残基；
カノニカル残基；
重鎖可変領域及と軽鎖可変領域との間の接触残基；
バーニアゾーン内の残基；及び
コチア定義の可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義の第一の重鎖フレームワークとの間で重複する領域における残基
からなる群から選択される、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１９】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、キーとなる残基において少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、該キーとなる残基が、
ＣＤＲに隣接する残基；
グリコシル化部位残基；
希少残基；
Ａβ（１−４２）球状凝集体と相互作用することができる残基；
ＣＤＲと相互作用することができる残基；
カノニカル残基；
重鎖可変領域及と軽鎖可変領域との間の接触残基；
バーニアゾーン内の残基；及び
コチア定義の可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義の第一の重鎖フレームワークとの間で重複する領域における残基
からなる群から選択される、請求項１６に記載の結合タンパク質。
【請求項２０】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列が、該ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、該ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも５２個のアミノ酸残基を含む、請求項７に記載の結合タンパク質。
【請求項２１】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列が、該ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、該ヒトアクセプターフレームワークと同一である少なくとも５２個のアミノ酸残基を含む、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項２２】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列が該ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、該ヒトアクセプターフレームワークと同一である少なくとも５２個のアミノ酸残基を含む、請求項１６に記載の結合タンパク質。
【請求項２３】
前記結合タンパク質が、配列番号１及び配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変ドメインを含み、前記結合タンパク質が、原線維性の形態と比較した場合に、Ａβ（１−４２）球状凝集体の可溶型と選択的に結合する、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項２４】
２つの可変ドメイン（該２つの可変ドメインは、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列を有する。）を含む、請求項２３に記載の結合タンパク質。
【請求項２５】
前記結合タンパク質が、配列番号１及び配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変ドメインを含み、該結合タンパク質が、原線維性の形態と比較した場合に、Ａβ（１−４２）球状凝集体の可溶型に選択的に結合する、請求項２０に記載の結合タンパク質。
【請求項２６】
前記結合タンパク質が、配列番号１及び配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変ドメインを含む、請求項２１に記載の結合タンパク質。
【請求項２７】
前記結合タンパク質が、配列番号１及び配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変ドメインを含む、請求項２２に記載の結合タンパク質。
【請求項２８】
Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合し、原線維性の形態と比較した場合に、Ａβ（１−４２）球状凝集体の可溶型に選択的に結合する、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項２９】
Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合し、原線維性の形態と比較した場合に、Ａβ（１−４２）球状凝集体の可溶型に選択的に結合する、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項３０】
Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合し、原線維性の形態と比較した場合に、Ａβ（１−４２）球状凝集体の可溶型に選択的に結合する、請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項３１】
Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合し、原線維性の形態と比較した場合に、Ａβ（１−４２）球状凝集体の可溶型に選択的に結合する、請求項７に記載の結合タンパク質。
【請求項３２】
Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合し、原線維性の形態と比較した場合に、Ａβ（１−４２）球状凝集体の可溶型に選択的に結合する、請求項１１に記載の結合タンパク質。
【請求項３３】
Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合し、原線維性の形態と比較した場合に、Ａβ（１−４２）球状凝集体の可溶型に選択的に結合する、請求項１５に記載の結合タンパク質。
【請求項３４】
Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合し、原線維性の形態と比較した場合に、Ａβ（１−４２）球状凝集体の可溶型に選択的に結合する、請求項１７に記載の結合タンパク質。
【請求項３５】
Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合し、原線維性の形態と比較した場合に、Ａβ（１−４２）球状凝集体の可溶型に選択的に結合する、請求項２０に記載の結合タンパク質。
【請求項３６】
Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合し、原線維性の形態と比較した場合に、Ａβ（１−４２）球状凝集体の可溶型に選択的に結合する、請求項２３に記載の結合タンパク質。
【請求項３７】
Ａβ（１−４２）球状凝集体の生物学的機能を調節する、請求項２８に記載の結合タンパク質。
【請求項３８】
Ａβ（１−４２）球状凝集体の生物学的機能を調節する、請求項３３に記載の結合タンパク質。
【請求項３９】
Ａβ（１−４２）球状凝集体の生物学的機能を調節する、請求項３６に記載の結合タンパク質。
【請求項４０】
Ａβ（１−４２）球状凝集体を中和する、請求項２８に記載の結合タンパク質。
【請求項４１】
Ａβ（１−４２）球状凝集体を中和する、請求項３３に記載の結合タンパク質。
【請求項４２】
Ａβ（１−４２）球状凝集体を中和する、請求項３６に記載の結合タンパク質。
【請求項４３】
最大で約１０−７Ｍ、最大で約１０−８Ｍ、最大で約１０−９Ｍ、最大で約１０−１０Ｍ、最大で約１０−１１Ｍ、最大で約１０−１２Ｍ及び最大で約１０−１３Ｍからなる群から選択される前記標的への解離定数（ＫＤ）を有する、請求項２８に記載の結合タンパク質。
【請求項４４】
最大で約１０−７Ｍ、最大で約１０−８Ｍ、最大で約１０−９Ｍ、最大で約１０−１０Ｍ、最大で約１０−１１Ｍ、最大で約１０−１２Ｍ及び最大で約１０−１３Ｍからなる群から選択される前記標的への解離定数（ＫＤ）を有する、請求項３３に記載の結合タンパク質。
【請求項４５】
最大で約１０−７Ｍ、最大で約１０−８Ｍ、最大で約１０−９Ｍ、最大で約１０−１０Ｍ、最大で約１０−１１Ｍ、最大で約１０−１２Ｍ及び最大で約１０−１３Ｍからなる群から選択される前記標的への解離定数（ＫＤ）を有する、請求項３５に記載の結合タンパク質。
【請求項４６】
最大で約１０−７Ｍ、最大で約１０−８Ｍ、最大で約１０−９Ｍ、最大で約１０−１０Ｍ、最大で約１０−１１Ｍ、最大で約１０−１２Ｍ及び最大で約１０−１３Ｍからなる群から選択される前記標的への解離定数（ＫＤ）を有する、請求項３６に記載の結合タンパク質。
【請求項４７】
請求項１から４６の何れか１項に記載の１つの前記結合タンパク質を含む、抗体コンストラクト（該抗体コンストラクトは、リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む。）。
【請求項４８】
前記結合タンパク質が、
免疫グロブリン分子、
モノクローナル抗体、
キメラ抗体、
ＣＤＲグラフト抗体、
ヒト化抗体、
Ｆａｂ、
Ｆａｂ’、
Ｆ（ａｂ’）２、
Ｆｖ、
ジスルフィド結合Ｆｖ、
ｓｃＦｖ、
単一ドメイン抗体、
ダイアボディ、
多特異性抗体、
二重特異性抗体、
アイソタイプ抗体、
突然変異抗体、
二重可変ドメイン抗体及び
二特異的抗体
からなる群から選択される、請求項４７に記載の抗体コンストラクト。
【請求項４９】
前記結合タンパク質が、
ヒトＩｇＭ定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、
ドメイン、
ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、
ヒトＩｇＥ定常ドメイン及び
ヒトＩｇＡ定常ドメイン
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項４７に記載の抗体コンストラクト。
【請求項５０】
配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項４７に記載の抗体コンストラクト。
【請求項５１】
免疫接着分子、造影剤、治療薬及び細胞毒性薬からなる群から選択される物質をさらに含む、請求項４７から請求項５０の何れか１項に記載の抗体コンストラクトを含む抗体複合体。
【請求項５２】
前記物質が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁性標識及びビオチンからなる群から選択される造影剤である、請求項５１に記載の抗体複合体。
【請求項５３】
前記放射性標識が、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ及び１５３Ｓｍからなる群から選択される、請求項５２に記載の抗体複合体。
【請求項５４】
前記物質が、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、毒素及びアポトーシス剤からなる群から選択される治療薬又は細胞毒性薬である、請求項５１に記載の抗体複合体。
【請求項５５】
前記結合タンパク質がヒトグリコシル化パターンを有する、請求項４９に記載の抗体コンストラクト。
【請求項５６】
前記結合タンパク質がヒトグリコシル化パターンを有する、請求項５１に記載の抗体複合体。
【請求項５７】
結晶として存在する、請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項５８】
結晶として存在する、請求項４７に記載の抗体コンストラクト。
【請求項５９】
前記抗体コンストラクトが結晶として存在する、請求項５１に記載の抗体複合体。
【請求項６０】
前記結晶が担体不含医薬制御放出結晶である、請求項５７に記載の結合タンパク質。
【請求項６１】
前記結晶が担体不含医薬制御放出結晶である、請求項５８に記載の抗体コンストラクト。
【請求項６２】
前記結晶が担体不含医薬制御放出結晶である、請求項５９に記載の抗体複合体。
【請求項６３】
その結合タンパク質の可溶性形態よりもインビボで長い半減期を有する、請求項５７に記載の結合タンパク質。
【請求項６４】
その抗体コンストラクトの可溶性形態よりもインビボで長い半減期を有する、請求項５８に記載の抗体コンストラクト。
【請求項６５】
その抗体複合体の可溶性形態よりもインビボで長い半減期を有する、請求項５９に記載の抗体複合体。
【請求項６６】
生物学的活性を有する、請求項５７に記載の結合タンパク質。
【請求項６７】
生物学的活性を有する、請求項５８に記載の抗体コンストラクト。
【請求項６８】
生物学的活性を有する、請求項５９に記載の抗体複合体。
【請求項６９】
結合タンパク質（該結合タンパク質の前記可変重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有する。）をコードする単離核酸分子。
【請求項７０】
結合タンパク質（該結合タンパク質の前記可変軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有する。）をコードする単離核酸分子。
【請求項７１】
請求項１から請求項４６の何れか１項に記載の結合タンパク質アミノ酸配列をコードする単離核酸分子。
【請求項７２】
請求項４７から請求項５０の何れか１項に記載の抗体コンストラクトアミノ酸配列をコードする単離核酸分子。
【請求項７３】
請求項５１から請求項５３の何れか１項に記載の抗体複合体アミノ酸配列をコードする単離核酸分子。
【請求項７４】
請求項７１から請求項７３の何れか１項に記載の前記核酸分子を含むベクター。
【請求項７５】
請求項７４に記載の前記ベクターを含む宿主細胞。
【請求項７６】
原核細胞である、請求項７５に記載の宿主細胞。
【請求項７７】
Ｅ．コリ（大腸菌）である、請求項７６に記載の宿主細胞。
【請求項７８】
真核細胞である、請求項７５に記載の宿主細胞。
【請求項７９】
前記真核細胞が、原生細胞、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項７８に記載の宿主細胞。
【請求項８０】
前記動物細胞が、哺乳動物細胞、鳥類細胞及び昆虫細胞からなる群から選択される、請求項７９に記載の宿主細胞。
【請求項８１】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項８０に記載の宿主細胞。
【請求項８２】
ＣＯＳである、請求項８０に記載の宿主細胞。
【請求項８３】
前記真菌細胞が酵母細胞である、請求項８０に記載の宿主細胞。
【請求項８４】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロミセス・セレビシエ）である、請求項８３に記載の宿主細胞。
【請求項８５】
前記昆虫細胞がＳｆ９である、請求項８０に記載の宿主細胞。
【請求項８６】
Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合することができる結合タンパク質を生成させるのに十分な時間及び条件下で、請求項７５から請求項８５の何れか１項に記載の宿主細胞を培養することを含む、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合することができるタンパク質を生成させる方法。
【請求項８７】
請求項８６に記載の方法に従い産生される単離タンパク質。
【請求項８８】
（ａ）処方物（該処方物は、請求項５７から請求項８６のいずれか１項に記載の結晶化結合タンパク質及び成分を含む。）と、
（ｂ）少なくとも１つのポリマー性担体と、
を含む、結合タンパク質の放出のための組成物。
【請求項８９】
前記ポリマー性担体が、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）又はＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシブトリエート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（有機）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫酸化多糖類、それらの混合物及びコポリマーからなる群から選択される少なくとも１つのポリマーである、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記成分が、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項８７に記載の組成物。
【請求項９１】
治療を有効にするために十分な量で請求項８８に記載の前記組成物を哺乳動物に投与することを含む、アミロイドーシスを有する疑いのある哺乳動物を治療するための方法。
【請求項９２】
請求項１に記載の結合タンパク質と、医薬的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項９３】
前記医薬的に許容可能な担体が、前記結合タンパク質の吸収又は分散を向上させるのに有用なアジュバントとして機能する、請求項９１に記載の医薬組成物。
【請求項９４】
前記アジュバントがヒアルロニダーゼである、請求項９２に記載の医薬組成物。
【請求項９５】
Ａβ（１−４２）球状凝集体の存在が有害である疾患を治療するための少なくとも１つのさらなる治療薬をさらに含む、請求項９１に記載の医薬組成物。
【請求項９６】
前記少なくとも１つのさらなる治療薬が、コレステリナーゼ阻害剤、ＴＮＦアンタゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、部分的ＮＭＤＡ受容体ブロッカー、グリコサミノグリカン模倣物、γセクレターゼの阻害剤又はアロステリック調節物質、黄体形成ホルモン遮断ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体アンタゴニスト、キレート剤、神経選択的Ｌ型カルシウムチャネルブロッカー、免疫調節物質、アミロイド原線維形成阻害剤又はアミロイドタンパク質沈着阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ヒスタミンアゴニスト、糖化最終産物に対する受容体タンパク質、ＰＡＲＰ刺激物質、セロトニン６−受容体アンタゴニスト、５−ＨＴ４受容体アゴニスト、ヒトステロイド、神経代謝を促進するグルコース取り込み刺激剤、選択的ＣＢ１アンタゴニスト、ベンゾジアゼピン受容体における部分的アゴニスト、アミロイドβ産生アンタゴニスト又は阻害剤、アミロイドβ沈着阻害剤、ＮＮＲα−７部分アンタゴニスト、治療標的ＰＤＥ４、ＲＮＡ翻訳阻害剤、ムスカリン性アゴニスト、神経成長因子受容体アゴニスト、ＮＧＦ受容体アゴニスト及び遺伝子治療調節物質からなる群から選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
Ａβ（１−４２）球状凝集体活性が低下するように請求項１に記載の結合タンパク質とＡβ（１−４２）球状凝集体を接触させることを含む、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性を低下させるための方法。
【請求項９８】
ヒト対象におけるヒトＡβ（１−４２）球状凝集体活性が低下するように請求項１に記載の結合タンパク質をヒト対象に投与することを含む、Ａβ（１−４２）球状凝集体が有害である疾患に罹患しているヒト対象においてヒトＡβ（１−４２）球状凝集体活性を低下させるための方法。
【請求項９９】
治療を有効にするのに十分な量で請求項１に記載の結合タンパク質を対象に投与することを含む、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性が有害である疾病又は疾患に対して対象を治療するための方法。
【請求項１００】
前記疾病又は疾患が、α１−アンチトリプシン欠損症、Ｃ１−阻害剤欠損血管性浮腫、アンチトロンビン欠乏血栓塞栓症、クールー、クロイツフェルトヤコブ病／スクレイピー、牛海綿状脳症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、ハンチントン病、脊髄小脳失調、マカド−ジョセフ変性症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、前頭側頭型痴呆、鎌型血球病、不安定ヘモグロビン封入体溶血、薬物誘発性封入体溶血、パーキンソン病、全身性ＡＬアミロイドーシス、結節性ＡＬアミロイドーシス、全身性ＡＡアミロイドーシス、前立腺アミロイド、血液透析アミロイドーシス、遺伝性（アイスランド型）脳血管症、ハンチントン病、家族性臓器アミロイド、家族性臓器多発性神経炎、家族性臓器アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドニューロパシー、家族性心臓アミロイド、アルツハイマー病、ダウン症、甲状腺髄様癌及び２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）からなる群から選択される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
少なくとも１つの第二の物質の投与の前に、それと同時に、又はその後に請求項１に記載の結合タンパク質を投与する段階を含む、Ａβ（１−４２）球状凝集体が有害である疾患に罹患している患者を治療する方法（該少なくとも１つの第二の物質は、コレステリナーゼ阻害剤、部分的ＮＭＤＡ受容体ブロッカー、グリコサミノグリカン模倣物、ＴＮＦアンタゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、γセクレターゼの阻害剤又はアロステリック調節物質、黄体形成ホルモン遮断ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体アンタゴニスト、キレート剤、神経選択的Ｌ型カルシウムチャネルブロッカー、免疫調節物質、アミロイド原線維形成阻害剤又はアミロイドタンパク質沈着阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ヒスタミンアゴニスト、糖化最終産物に対する受容体タンパク質、ＰＡＲＰ刺激物質、セロトニン６−受容体アンタゴニスト、５−ＨＴ４受容体アゴニスト、ヒトステロイド、神経代謝を促進するグルコース取り込み刺激剤、選択的ＣＢ１アンタゴニスト、ベンゾジアゼピン受容体における部分的アゴニスト、アミロイドβ産生アンタゴニスト又は阻害剤、アミロイドβ沈着阻害剤、ＮＮＲα−７部分アンタゴニスト、治療標的ＰＤＥ４、ＲＮＡ翻訳阻害剤、ムスカリン性アゴニスト、神経成長因子受容体アゴニスト、ＮＧＦ受容体アゴニスト及び遺伝子治療調節物質からなる群から選択される。）。
【請求項１０２】
前記コレステリナーゼ阻害剤が、タクリン、ドネペジル、リバスチグミン及びガランタミンからなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記部分ＮＭＤＡ受容体ブロッカーがメマンチンである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
対象への前記投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心臓周囲内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口内、舌下、鼻内及び経皮からなる群選択される少なくとも１つの様式による、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０５】
ａ．患者から生体試料を単離し；
ｂ．球状凝集体／結合タンパク質複合体の形成に十分な時間及び条件下で請求項１に記載の前記結合タンパク質と該生体試料を接触させ；
ｃ．該試料中の該球状凝集体／結合タンパク質複合体の存在を検出する（該複合体の存在は、該患者におけるアルツハイマー病の診断を示す。）、
段階を含む、アルツハイマー病を有する疑いがある患者においてアルツハイマー病を診断する方法。
【請求項１０６】
ａ．患者から生体試料を単離し；
ｂ．球状凝集体／結合タンパク質複合体の形成に十分な時間及び条件下で請求項１に記載の前記結合タンパク質と該生体試料を接触させ；
ｃ．結合した結合タンパク質に複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が結合するのを可能にするために十分な時間及び条件下で、得られた球状凝集体／結合タンパク質複合体に複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を添加し（該複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、検出可能なシグナルを生成させることができるシグナル生成化合物に連結される抗結合タンパク質抗体を含む。）、
ｄ．該シグナル生成化合物により生成されるシグナルを検出することにより該生体試料において存在し得る該結合タンパク質の存在を検出する（該シグナルは、該患者におけるアルツハイマー病の診断を示す。）、段階を含む、アルツハイマー病を有する疑いがある患者においてアルツハイマー病を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
共同研究契約に対する参照
本願の内容は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ．とＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓとの間で２００６年８月３１日に締結された共同研究契約書に基づき、ヒト化アミロイドβ抗体に関する。
【０００２】
関連出願に対する相互参照
本願は、２００６年１１月３０日提出の国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１１５３０に関する。
【０００３】
発明の背景
技術分野
本発明は、例えば、アミロイドーシス（例えばアルツハイマー病）及び関連状態などの状態の、診断、治療及び予防において使用され得る抗体に関する。
【背景技術】
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性の認知能力喪失及び脳のいくつかの領域での、アミロイド沈着、神経原線維のもつれ及びニューロン欠損を含む特徴的な神経病理学的特性を特徴とする神経変性疾患である（Ｈａｒｄｙ及びＳｅｌｋｏｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７、３５３（２００２）；Ｍａｔｔｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ４３１、７００４（２００４）参照）。アミロイド沈着の主要な構成因子はアミロイドベータペプチド（Ａβ）であり、４２アミノ酸長型（Ａβ１−４２）が最も顕著である。
【０００５】
特に、アミロイドβ（１−４２）タンパク質は、タンパク質分解性プロセシングによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）由来の４２アミノ酸を有するポリペプチドである。これにはまた、ヒト変異型に加え、ヒト以外の生物（特にその他の哺乳動物、とりわけラット）に存在するアミロイドβ（１−４２）タンパク質のアイソフォームも含まれる。このタンパク質は、水性の環境で重合する傾向があり、非常に様々な分子形態で存在し得る。
【０００６】
例えばアルツハイマー病などの認知症の発症又は進行と不溶性タンパク質の沈着との単純な相互関係は疑わしいことが分かっている（Ｔｅｒｒｙら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３０．５７２−５８０（１９９１）；Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １６、２８５−２９８（１９９５））。一方、シナプス欠損及び知的知覚は、Ａβ（１−４２）の可溶型とより相関すると思われる（Ｌｕｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５、８５３−８６２（１９９９）；ＭｃＬｅａｎら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６、８６０−８６６（１９９９））。
【０００７】
過去にポリクローナル及びモノクローナル抗体がＡβ（１−４２）に対して作製されてきたが、動物及び／又はヒトにおいて重篤な副作用も起こさずに所望の治療効果をもたらすことが証明されているものはない。例えば、５ヵ月間、週に１回、Ｎ−末端特異的抗−Ａβ（１−４２）抗体の投与を受けた老齢ＡＰＰ２３マウスでの前臨床研究からの受動免疫付与の結果から、治療に関連のある副作用が示される。特に、これらのマウスは、食塩水処置マウスと比較して、微小出血の数及び重症度が上昇した（Ｐｆｅｉｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２  ２９８：１３７９）。同様の出血の増加は、最近、老齢（＞２４ヵ月）Ｔｇ２５７６及びＰＤＡＰＰマウスに対しても報告された（Ｗｉｌｃｏｃｋら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３、２３：３７４５−５１；Ｒａｃｋｅら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５、２５：６２９−６３６）。両系統において、抗−Ａβ（１−４２）の注射の結果、微小出血が顕著に増加した。このように、ヒトの身体において望ましくない潜在的な致死的影響を誘発することなく疾患の進行を予防又は遅らせる生物製剤の開発に対して非常に大きい治療ニーズがある。一般集団の寿命が長くなっており、この長寿化とともに、アルツハイマー病又は関連疾患と診断される年間患者数が上昇しているという観点において、このようなニーズは特に明白である。さらに、このような抗体により、アルツハイマー病の症状があった患者においてアルツハイマー病の適切な診断が可能となろう（この診断は現在、剖検でのみ確認することができる。）。さらに、このような抗体により、本タンパク質の生物学的特性及びこの衰弱性疾患に関与するその他の生物学的因子を解明することが可能となろう。
【０００８】
本明細書中で参照される全ての特許及び刊行物は、参照によりその全体において本明細書中に組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈａｒｄｙ及びＳｅｌｋｏｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７、３５３（２００２）
【非特許文献２】Ｍａｔｔｓｏｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ４３１、７００４（２００４）
【非特許文献３】Ｔｅｒｒｙら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３０．５７２−５８０（１９９１）
【非特許文献４】Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １６、２８５−２９８（１９９５）
【非特許文献５】Ｌｕｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５、８５３−８６２（１９９９）
【非特許文献６】ＭｃＬｅａｎら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６、８６０−８６６（１９９９）
【非特許文献７】Ｐｆｅｉｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２  ２９８：１３７９
【非特許文献８】Ｗｉｌｃｏｃｋら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３、２３：３７４５−５１
【非特許文献９】Ｒａｃｋｅら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５、２５：６２９−６３６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、結合タンパク質、特に、可溶性オリゴマー、特にアルツハイマー病の患者の脳に存在するＡβ（１−４２）球状凝集体、に結合することができる抗体（本明細書中で、マウスモノクローナル抗体に対して「８Ｆ５」という用語で、ヒト化８Ｆ５に対して「８Ｆ５ｈｕｍ８」という用語で呼ばれるもの）に関する。本明細書中での目的のために、これらの結合タンパク質及び特に抗体は、「球状凝集体−エピトープ特異的抗体」と呼ばれる。これは、本抗体が、アルツハイマー病の原因であると考えられる球状凝集体の１以上のエピトープ（例えば、Ａβ（１−４２）ペプチドの（１−４２）アミノ酸領域）又は抗原に結合することを意味する。さらに、本発明はまた、これらの結合タンパク質又はそれらの一部を産生し使用する方法も提供する。
【００１１】
本発明のある態様は、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合することができる抗原結合ドメインを含む結合タンパク質（例えば抗体）に関する。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む：
ＣＤＲ−ＶＨ１。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号５）（式中、
Ｘ１はＳであり；
Ｘ２はＹであり；
Ｘ３はＧであり；
Ｘ４はＭであり；
Ｘ５はＳである。）
ＣＤＲ−ＶＨ２。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７（配列番号６）（式中、
Ｘ１はＳであり；
Ｘ２はＩであり；
Ｘ３はＮであり；
Ｘ４はＳであり；
Ｘ５はＮであり；
Ｘ６はＧであり；
Ｘ７はＧであり；
Ｘ８はＳであり；
Ｘ９はＴであり；
Ｘ１０はＹであり；
Ｘ１１はＹであり；
Ｘ１２はＰであり；
Ｘ１３はＤであり；
Ｘ１４はＳであり；
Ｘ１５はＶであり；
Ｘ１６はＫであり；
Ｘ１７はＧである。）、
ＣＤＲ−ＶＨ３。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４（配列番号７）（式中、
Ｘ１はＳであり；
Ｘ２はＧであり；
Ｘ３はＤであり；
Ｘ４はＹである。）、
ＣＤＲ−ＶＬ１。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６（配列番号８）（式中、
Ｘ１はＲであり；
Ｘ２はＳであり；
Ｘ３はＳであり；
Ｘ４はＱであり；
Ｘ５はＳであり；
Ｘ６はＬであり；
Ｘ７はＶであり；
Ｘ８はＹであり；
Ｘ９はＳであり；
Ｘ１０はＮであり；
Ｘ１１はＧであり；
Ｘ１２はＤであり；
Ｘ１３はＴであり；
Ｘ１４はＹであり；
Ｘ１５はＬであり；
Ｘ１６はＨである。）、
ＣＤＲ−ＶＬ２。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号９）（式中、
Ｘ１はＫであり；
Ｘ２はＶであり；
Ｘ３はＳであり；
Ｘ４はＮであり；
Ｘ５はＲであり；
Ｘ６はＦであり；
Ｘ７はＳである。）及び
ＣＤＲ−ＶＬ３。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号１０）（式中、
Ｘ１はＳであり；
Ｘ２はＱであり；
Ｘ３はＳであり；
Ｘ４はＴであり；
Ｘ５はＨであり；
Ｘ６はＶであり；
Ｘ７はＰであり；
Ｘ８はＷであり；
Ｘ９はＴである。）。
【００１２】
好ましくは、抗原結合ドメインは、配列番号１の残基３１−３５（即ち、ＳＹＧＭＳ（配列番号１１）；８Ｆ５  ＶＨ  ＣＤＲ１）；配列番号１の残基５０−６６（即ち、ＳＩＮＳＮＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号１２）；８Ｆ５  ＶＨ  ＣＤＲ２）；配列番号１の残基９８−１０８（即ち、ＳＧＤＹ（配列番号１３）；８Ｆ５  ＶＨ  ＣＤＲ３）；配列番号２の残基２４−３９（即ち、ＲＳＳＱＳＬＶＹＳＮＧＤＴＹＬＨ（配列番号１４）；８Ｆ５  ＶＬ  ＣＤＲ１）；配列番号２の残基５５−６１（即ち、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１５）；８Ｆ５  ＶＬ  ＣＤＲ２）；及び配列番号２の残基９４−１０２（即ち、ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号１６）；８Ｆ５  ＶＬ  ＣＤＲ３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む。好ましい実施形態において、結合タンパク質は、上記で開示される配列からなる群から選択される少なくとも３つのＣＤＲを含む。より好ましくは、選択される３つのＣＤＲは、以下からなる群から選択される可変ドメインＣＤＲのセットからのものである：
【００１３】
【表１】
2010530739.tif 000002
【００１４】
ある実施形態において、本発明の結合タンパク質は、少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲセットを含む。より好ましくは、２つの可変ドメインＣＤＲセットは、ＶＨ  ８Ｆ５  ＣＤＲセット及びＶＬ  ８Ｆ５  ＣＤＲセットである。別の実施形態において、上記で開示される結合タンパク質は、ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む。好ましくは、ヒトアクセプターフレームワークは、ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１７）；ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（配列番号１８）；ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（配列番号１９）；ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２０）；ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣ（配列番号２１）；ＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹ（配列番号２２）；ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣ（配列番号２３）；及びＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
好ましい実施形態において、結合タンパク質は、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合することができる、ＣＤＲグラフト抗体又はその抗原結合部分である。好ましくは、ＣＤＲグラフト抗体又はその抗原結合部分は、上記で開示される１以上のＣＤＲを含む。より好ましくは、ＣＤＲグラフト抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変ドメインを含む。最も好ましくは、ＣＤＲグラフト抗体又はその抗原結合部分は、上記で開示される群から選択される２つの可変ドメインを含む。好ましくは、ＣＤＲグラフト抗体又はその抗原結合部分は、ヒトアクセプターフレームワークを含む。より好ましくは、ヒトアクセプターフレームワークは、上記で開示されるヒトアクセプターフレームワークの何れか１つである。
【００１６】
好ましい実施形態において、結合タンパク質は、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合することができる、ヒト化抗体又はその抗原結合部分である。好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、ヒトアクセプターフレームワークのヒト抗体可変ドメインに組み込まれる上記で開示される１以上のＣＤＲを含む。好ましくは、ヒト抗体可変ドメインは、コンセンサスヒト可変ドメインである。より好ましくは、ヒトアクセプターフレームワークは、キーとなる残基における少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含む（このキーとなる残基は、ＣＤＲに隣接する残基；グリコシル化部位残基；希少残基；Ａβ（１−４２）球状凝集体と相互作用することができる残基；ＣＤＲと相互作用することができる残基；カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）残基；重鎖可変領域及と軽鎖可変領域との間の接触残基；バーニアゾーン内の残基；及びコチア定義の可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義の第一の重鎖フレームワークとの間で重複する領域における残基からなる群から選択される。好ましくは、ヒトアクセプターフレームワークは、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、このフレームワークのアミノ酸配列は、前記ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、前記ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも５２個のアミノ酸残基を含む。
【００１７】
好ましい実施形態において、結合タンパク質は、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合することができる、ヒト化抗体又はその抗原結合部分である。好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、上記で開示される１以上のＣＤＲを含む。より好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、上記で開示される３以上のＣＤＲを含む。最も好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、上記で開示される６つのＣＤＲを含む。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１及び配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変ドメインを含む。配列番号１（８Ｆ５ｈｕｍ８  ＶＬ）に関して、Ｋａｂａｔの付番に基づき、アミノ酸位置１９はＫであり得、位置４０はＴであり得；位置４２はＤであり得；位置４４はＲであり得；位置８２ＡはＳであり得；位置８３はＫであり得；位置８４はＳであり得；位置８９はＭであり得、Ｊセグメント１０７−１０９「ＴＬＶ」は「ＳＴＬ」であり得る。配列番号２（８Ｆ５ｈｕｍ  ７ＶＨ）に関して、Ｋａｂａｔの付番に基づき、アミノ酸位置７はＴであり得；位置１４はＳであり得； 位置１５はＬであり得；位置１７はＤであり得；位置１８はＱであり得；位置８３はＬであり得；位置８７はＦであり得る。より好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、上記で開示される群から選択される２つの可変ドメインを含む。最も好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、２つの可変ドメインを含み、この２つの可変ドメインは、配列番号１１、１２及び１３及び配列番号１４、１５及び１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
好ましい実施形態において、上記で開示される結合タンパク質は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン及びヒトＩｇＡ定常ドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。より好ましくは、結合タンパク質は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８を含む。
【００２０】
本発明の結合タンパク質は、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合することができる。好ましくは、結合タンパク質は、Ａβ（１−４２）球状凝集体の生物学的機能を調節することができるヒト化抗体（例えば８Ｆ５）である。より好ましくは、結合タンパク質は、Ａβ（１−４２）球状凝集体を中和することができる。さらに、ヒト化抗体は、アミロイドβタンパク質単量体よりもアミロイドβ（Ａβ）タンパク質球状凝集体に特異的に結合する。従って選択的結合が観察される。単量体に対する球状凝集体への結合特異性の比は少なくとも１．４である。特に、この比は、好ましくは少なくとも約１．４から少なくとも約１６．９である。（１．０−１７．５（両端を含む。）の比もまた、本発明の範囲内であるとみなされる（同時にその小数％範囲内）。例えば、１．１、１．２、１．３、．．．、２．０、２．１、２．２．．．、１７．１、１７．２、１７．３、１７．４、１７．５ならびにそれらの間及び％の全ての整数は、本発明の範囲内に入るとみなされる。）。アミロイドベータタンパク質単量体は、例えば、Ａβ（１−４２）単量体又はＡβ（１−４０）単量体であり得る。
【００２１】
別の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、１ｘ１０−６Ｍから１ｘ１０−１２の、Ａβ（１−４２）球状凝集体に対する解離定数（ＫＤ）を有する。好ましくは、本抗体は、高い親和性で、例えば、１ｘ１０−７ＭのＫＤ以上の親和性で（例えば３ｘ１０−８ＭのＫＤ以上の親和性で）、１ｘ１０−９ＭのＫＤ以上の親和性で（例えば３ｘ１０−１０ＭのＫＤ以上の親和性で）、１ｘ１０−１０ＭのＫＤ以上の親和性で（例えば３ｘ１０−１１ＭのＫＤ以上の親和性で）又は１ｘ１０−１１ＭのＫＤ以上の親和性で、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合する。
【００２２】
本発明のある実施形態は、上記で開示される結合タンパク質の何れか１つ及びリンカーポリペプチド又は免疫グロブリンを含む抗体コンストラクトを提供する。好ましい実施形態において、抗体コンストラクトは、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多特異性抗体、二重特異性抗体、アイソタイプ抗体、突然変異抗体、二重可変ドメイン抗体及び二特異的抗体からなる群から選択される。好ましい実施形態において、抗体コンストラクトは、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン及びヒトＩｇＡ定常ドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。より好ましくは、抗体コンストラクトは、（配列番号２５及び配列番号２６）又は（配列番号２７及び配列番号２８）を含む。別の実施形態において、本発明は、上記で開示される抗体コンストラクト及び、免疫接着分子、造影剤、治療薬及び細胞毒性薬からなる群から選択される物質を含む抗体複合体を提供する。好ましい実施形態において、造影剤は、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁性標識及びビオチンからなる群から選択される。より好ましくは、造影剤は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ及び１５３Ｓｍからなる群から選択される放射性標識である。好ましい実施形態において、治療薬又は細胞毒性薬は、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、毒素及びアポトーシス剤からなる群から選択される。
【００２３】
別の実施形態において、抗体コンストラクトはグリコシル化されている。好ましくはグリコシル化はヒトグリコシル化パターンである。
【００２４】
さらなる実施形態において、上記で開示される結合タンパク質、抗体コンストラクト又は抗体複合体は結晶として存在する。好ましくは、結晶は担体不含医薬制御放出結晶である。好ましい実施形態において、結晶化結合タンパク質、結晶化抗体コンストラクト又は結晶化抗体複合体は、その可溶性形態よりもインビボで長い半減期を有する。別の好ましい実施形態において、結晶化結合タンパク質、結晶化抗体コンストラクト又は結晶化抗体複合体は、結晶化後、生物学的活性を保持する。
【００２５】
本発明のある態様は、上記で開示される、結合タンパク質、抗体コンストラクト又は抗体複合体をコードする単離核酸に関する。さらなる実施形態は、上記で開示される単離核酸を含むベクターを提供する（該ベクターは、ｐｃＤＮＡ；ｐＴＴ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２、Ｖｏｌ．３０、Ｎｏ．２）；ｐＴＴ３（さらなる多重クローニング部位を有するｐＴＴ；ｐＥＦＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ、Ｓ．及びＮａｇａｔａ、Ｓ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．１８、Ｎｏ．１７）；ｐＢＶ；ｐＪＶ；及びｐＢＪからなる群から選択される。）。
【００２６】
本発明はまた、上記で開示されるベクターで形質転換される宿主細胞も包含する。好ましくは、宿主細胞は原核細胞である。より好ましくは、宿主細胞はＥ．コリである。関連する実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。好ましくは、真核細胞は、原生細胞、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される。より好ましくは、宿主細胞は、以下に限定されないが、ＣＨＯ及びＣＯＳを含む哺乳動物細胞；又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロミセス・セレビシエ）などの真菌細胞；又はＳｆ９などの昆虫細胞である。
【００２７】
さらに、本発明は、Ａβ（１−４２）に結合する結合タンパク質を産生させるのに十分な条件下及び時間で、培地中で上記で開示される宿主細胞の何れか１つを培養することを含む、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合する結合タンパク質を生成させる方法を含む。別の実施形態は、上記で開示される方法に従い生成される結合タンパク質を提供する。
【００２８】
ある実施形態は、本明細書中で定義されるような結合タンパク質の放出のための組成物を提供する（この組成物は、順に上記で開示されるような結晶化結合タンパク質、結晶化抗体コンストラクト又は結晶化抗体複合体及び成分と；少なくとも１つのポリマー性担体と、を含む製剤を含む。好ましくは、ポリマー性担体は、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）又はＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシブトリエート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（有機）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫酸化多糖類、それらの混合物及びコポリマーからなる群の１以上から選択されるポリマーである。好ましくは、成分は、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールからなる群から選択される。別の実施形態は、上記で開示される組成物の有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物を治療するための方法を提供する。
【００２９】
本発明はまた、上記で開示されるような、結合タンパク質、抗体コンストラクト又は抗体複合体と、医薬的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物も包含する。さらなる実施形態において、医薬組成物は、活性が有害である疾患を治療するための少なくとも１つのさらなる治療薬を含む。好ましくは、さらなる治療薬は、コレステリナーゼ阻害剤、部分的ＮＭＤＡ受容体ブロッカー、グリコサミノグリカン模倣物、γセクレターゼの阻害剤又はアロステリック調節物質、黄体形成ホルモン遮断ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体アンタゴニスト、キレート剤、神経選択的Ｌ型カルシウムチャネルブロッカー、免疫調節物質、アミロイド原線維形成阻害剤又はアミロイドタンパク質沈着阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ヒスタミンアゴニスト、糖化最終産物に対する受容体タンパク質、ＰＡＲＰ刺激物質、セロトニン６−受容体アンタゴニスト、５−ＨＴ４受容体アゴニスト、ヒトステロイド、神経代謝を促進するグルコース取り込み刺激剤、選択的ＣＢ１アンタゴニスト、ベンゾジアゼピン受容体における部分的アゴニスト、アミロイドβ産生アンタゴニスト又は阻害剤、アミロイドβ沈着阻害剤、ＮＮＲα−７部分アンタゴニスト、治療標的ＰＤＥ４、ＲＮＡ翻訳阻害剤、ムスカリン性アゴニスト、神経成長因子受容体アゴニスト、ＮＧＦ受容体アゴニスト及び遺伝子治療調節物質からなる群から選択される。
【００３０】
別の態様において、本発明は、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性が阻害されるように、上記で開示される結合タンパク質とＡβ（１−４２）球状凝集体を接触させることを含む、Ａβ（１−４２）球状凝集体の活性を阻害するための方法を提供する。関連態様において、本発明は、ヒト対象におけるＡβ（１−４２）球状凝集体活性が阻害され治療が達成されるように、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性が有害である疾患に罹患しているヒト対象に上記で開示される結合タンパク質を投与することを含む、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性が有害である疾患に罹患しているヒト対象においてヒトＡβ（１−４２）球状凝集体活性を阻害するための方法を提供する。この方法を用いて治療され得る状態又は疾病の例には、以下に限定されないが、α１−アンチトリプシン欠損症、Ｃ１−阻害剤欠損血管性浮腫、アンチトロンビン欠乏血栓塞栓症、クールー、クロイツフェルトヤコブ病／スクレイピー、牛海綿状脳症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、ハンチントン病、脊髄小脳失調、マカド−ジョセフ変性症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、前頭側頭型痴呆、鎌型血球病、不安定ヘモグロビン封入体溶血、薬物誘発性封入体溶血、パーキンソン病、全身性ＡＬアミロイドーシス、結節性ＡＬアミロイドーシス、全身性ＡＡアミロイドーシス、前立腺アミロイド、血液透析アミロイドーシス、遺伝性（アイスランド型）脳血管症、ハンチントン病、家族性臓器アミロイド、家族性臓器多発性神経炎、家族性臓器アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドニューロパシー、家族性心臓アミロイド、アルツハイマー病、ダウン症、甲状腺髄様癌及び２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）が含まれる。好ましくは、疾病は、例えば、アルツハイマー病又はダウン症などのアミロイドーシスから選択される。
【００３１】
別の態様において、本発明は、上記で考察されるように、第二の薬剤の投与の前に、それと同時に、又はその後に、上記で開示される結合タンパク質の何れか１つを投与する段階を含む、Ａβ（１−４２）球状凝集体が有害である疾患に罹患している患者を治療する方法を提供する。好ましい実施形態において、第二の薬剤は、低分子又は生物学的分子からなる群から選択される（即ち、上記で与えられるさらなる治療薬のリストを参照（例えば、さらなる抗体、コリンエステラーゼ阻害剤、部分的ＮＭＤＡ受容体ブロッカーなど））。
【００３２】
好ましい実施形態において、上記で開示される医薬組成物は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心臓周囲内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口内、舌下、鼻内及び経皮から選択される少なくとも１つの方式により、対象に投与される。
【００３３】
本発明のある態様は、本発明の少なくとも１つのＡβ（１−４２）球状凝集体結合タンパク質に対する少なくとも１つのＡβ（１−４２）球状凝集体抗イディオタイプ抗体を提供する。抗イディオタイプ抗体は、以下に限定されないが、本発明の結合タンパク質に組み込まれ得る、重鎖もしくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）又はそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域又はその何らかの一部などの、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む分子を含有する何らかのタンパク質又はペプチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１（Ａ）は、ヒト化抗体８Ｆ５の可変重鎖のヌクレオチド配列（配列番号３）を示し、図１（Ｂ）は、このヌクレオチド配列によりコードされる可変重鎖（配列番号１）のアミノ酸配列を示す。図１（Ｃ）は、ヒト化抗体８Ｆ５の可変軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号４）を示し、図１（Ｄ）は、このヌクレオチド配列によりコードされる可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。（全てのＣＤＲ領域に下線を付す。）
【図２】図２（Ａ）は、標準的タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ（分子マーカータンパク質、レーン１）；Ａβ（１−４２）原線維調製物；対照（レーン２）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ８Ｆ５  ｈｕｍ８、２０時間、３７℃、上清（レーン３）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ８Ｆ５  ｈｕｍ８、２０時間、３７℃、ペレット（レーン４）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ６Ｅ１０、２０時間、３７℃、上清（レーン５）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ６Ｅ１０、２０時間、３７℃、ペレット（レーン６）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ＩｇＧ２ａ、２０時間、３７℃、上清（レーン７）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ＩｇＧ２ａ、２０時間、３７℃、ペレット（レーン８）を示し、図２（Ｂ）は、総抗体の％でのＡβ−原線維に結合するｍＡｂの定量分析の結果を示す。
【図３】図３は、Ａβ（１−４２）球状凝集体へのビオチン化マウス８Ｆ５抗体の結合を示す。特に、非標識マウス抗体（ＨＹＢ）又はヒト化抗体（ＨＵＭ８）の量を増加させることにより、ビオチン化マウス８Ｆ５抗体の結合が阻害される。
【図４】図４は、８Ｆ５ＶＨ領域アミノ酸配列のアラインメントを示す。８Ｆ５ＶＨ（配列番号１００）、Ｈｕ８Ｆ５ＶＨｖ１（配列番号１０１）、Ｈｕ８Ｆ５ＶＨｖ２（配列番号１０２）及びヒトＹＳＥ’ＣＬ（配列番号１０３）及びＪＨ４セグメントのアミノ酸配列を一文字表記で示す。マウス８Ｆ５ＶＨ配列において、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）の定義に基づくＣＤＲ配列に下線を付す。アクセプターヒトＶＨセグメントにおけるＣＤＲ配列は図面では省略する。Ｈｕ８Ｆ５ＶＨｖ１及びＨｕ８Ｆ５ＶＨｖ２配列で一重線を付したアミノ酸は、ＣＤＲ配列と接触することが予想され、従って、これは、対応するマウス残基で置換されている。Ｈｕ８Ｆ５ＶＨｖ１及びＨｕ８Ｆ５ＶＨｖ２配列での二重線を付したアミノ酸は、免疫原性の可能性を排除するために、同じヒトＶＨサブグループのコンセンサスアミノ酸に変更されている。
【図５】図５は、８Ｆ５ＶＬ領域アミノ酸配列のアラインメントを示す。８Ｆ５ＶＬ（配列番号１０４）、Ｈｕ８Ｆ５ＶＬ（配列番号１０５）及びヒトＴＲ１．３７’ＣＬ（配列番号１０６）及びＪＫ４セグメントのアミノ酸配列を一文字表記で示す。マウス８Ｆ５ＶＬ配列において、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）の定義に基づくＣＤＲ配列に下線を付す。アクセプターヒトＶＬセグメントにおけるＣＤＲ配列は図面では省略する。Ｈｕ８Ｆ５ＶＬ配列で一重線を付したアミノ酸は、ＣＤＲ配列に接触することが予想され、従って、対応するマウス残基で置換されている。Ｈｕ８Ｆ５ＶＬ配列で二重線を付したアミノ酸は、免疫原性の可能性を排除するために、同じヒトＶＬサブグループのコンセンサスアミノ酸に変更されている。
【図６】図６は、ミニエクソンにおけるＨｕ８Ｆ５ＶＨｖ１の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１０７）及び推定アミノ酸配列（配列番号１０８）を示す。シグナルペプチド配列を斜字体で示す。成熟重鎖はグルタミン酸残基（太字で示す。）で始まる。Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）の定義に基づくＣＤＲに下線を付す。この配列は、ユニークなＭｌｕＩ（ＡＣＧＣＧＴ）及びＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位に隣接する。
【図７】図７は、ミニエクソンにおけるＨｕ８Ｆ５ＶＨｖ２の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１０９）及び推定アミノ酸配列（配列番号１１０）を示す。シグナルペプチド配列を斜字体で示す。成熟重鎖はグルタミン酸残基（太字で示す。）で始まる。Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）の定義に基づくＣＤＲに下線を付す。この配列は、ユニークなＭｌｕＩ（ＡＣＧＣＧＴ）及びＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位に隣接する。
【図８】図８は、ミニエクソンにおけるＨｕ８Ｆ５ＶＬの軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１１１）及び推定アミノ酸配列（配列番号１１２）を示す。シグナルペプチド配列を斜字体で示す。成熟軽鎖はアスパラギン酸残基（太字で示す。）で始まる。Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）の定義に基づくＣＤＲに下線を付す。この配列は、ユニークなＭｌｕＩ（ＡＣＧＣＧＴ）及びＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位に隣接する。
【図９】図９は、発現プラスミド、ｐＨｕ  ８Ｆ５ＶＨｖ１−Ｃｇ１及びｐＶｋ−Ｈｕ８Ｆ５ＶＬの制限マップを示す。
【図１０】図１０は、ヒトＡ−βオリゴマー抗原（１−４２）に対する様々な８Ｆ５抗体の相対的結合親和性を比較するための競合ＥＬＩＳＡを示す。実施例１に記載のように、Ｍｕ８Ｆ５及びＨｕ８Ｆ５競合物抗体の様々な量の存在下で、固定化ヒトＡ−βオリゴマー抗原（１−４２）に対するビオチン化Ｍｕ８Ｆ５の結合を分析した。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本明細書中で別段の定義がない限り、本発明に関して使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有する。これらの用語の意味及び範囲は明確であるが、しかし、何らかの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書中で提供される定義が、あらゆる辞書又は付帯的な定義よりも優先される。さらに、内容により必要とされない限り、単数形である語は、複数性を含み、複数形の語は単数性を含む。本願において、「又は」の使用は、別段の断りがない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などのその他の形態の使用は限定ではない。また、別段の断りがない限り、「要素」又は「成分」などの用語は、１単位を含む要素及び成分及び複数のサブユニットを含む要素及び成分の両方を包含する。
【００３６】
一般に、本明細書中に記載の、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質及び核酸化学及びハイブリッド形成と関連して使用される命名法及びそれらの技術は当技術分野で周知であり一般に使用されるものである。本発明の方法及び技術は、一般に、別段の指示がない限り、当技術分野で周知の従来法に従い、本願を通じて引用され考察される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載のように、行われる。酵素反応及び精製技術は、当技術分野で一般に完遂されるように又は本明細書中に記載のように、製造者の仕様書に従い行われる。本明細書中に記載の、分析化学、合成有機化学及び医学及び製薬化学と関連して使用される命名法及びそれらの検査法及び技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用される。化学合成、化学分析、医薬調製、処方及び送達ならびに患者の治療に対して標準的技術が使用される。
【００３７】
本発明がより容易に理解され得るように、選択した用語を下記で定義する。
【００３８】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、何らかのアミノ酸のポリマー鎖を指す。「ペプチド」及び「タンパク質」という用語はポリペプチドという用語と交換可能に使用され、また、アミノ酸のポリマー鎖も指す。「ポリペプチド」という用語は、ネイティブ又は人工タンパク質、タンパク質断片及びタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは単量体性又はポリマー性であり得る。
【００３９】
「単離タンパク質」又は「単離ポリペプチド」という用語は、派生物のその起源又は源に基づいて、そのネイティブの状態においてそれに付随する天然に結合される成分と会合していないタンパク質又はポリペプチドであるか；同じ種由来のその他のタンパク質を実質的に含まないか；異なる種由来の細胞により発現されるか；又は天然では生じないものである。このようにして、化学的に合成されるか又はそれが天然に由来する細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、天然で会合する成分から「単離」されている。タンパク質はまた、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって、天然で会合する成分を実質的に含まないようにされているものであり得る。
【００４０】
「回収する」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えば当技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって、ポリペプチドなどの化学種が、天然に会合する成分を実質的に含まないようにされるプロセスを指す。
【００４１】
「Ａβ（Ｘ−Ｙ）」という用語は、本明細書中で、ヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙ（Ｘ及びＹの両方を含む。）のアミノ酸配列を指し、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡ（配列番号２９）又はその天然の変異体の何れかの、アミノ酸位置１からアミノ酸位置４２のアミノ酸配列を指し、特に、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「Ｆｌｅｍｉｓｈ」）、Ｅ２２Ｇ（「Ａｒｃｔｉｃ」）、Ｅ２２Ｑ（「Ｄｕｔｃｈ」）、Ｅ２２Ｋ（「Ｉｔａｌｉａｎ」）、Ｄ２３Ｎ（「Ｉｏｗａ」）、Ａ４２Ｔ及びＡ４２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異があるもの（ここで、数字は、Ａβペプチドの開始位置に対応し、位置Ｘ及び位置Ｙの両方を含む。）又は３個以下のさらなるアミノ酸置換（これらの中に球状凝集体形成を妨害し得るものはない。）を有する配列を指す。「さらなる」アミノ酸置換とは、本明細書中で、自然には見られない規範的（カノニカル）な配列からの何らかの逸脱として定義される。
【００４２】
より具体的には、本明細書中で「Ａβ（１−４２）」という用語は、ヒトアミロイドβタンパク質の、アミノ酸位置１からアミノ酸位置４２（１及び４２の両方を含む。）のアミノ酸配列を指し、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡ（即ち、アミノ酸位置１から４２に対応する全配列；配列番号２９）又はその天然の変異体の何れかの、アミノ酸位置１からアミノ酸位置４２のアミノ酸配列を指す。このような変異体は、例えば、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「Ｆｌｅｍｉｓｈ」）、Ｅ２２Ｇ（「Ａｒｃｔｉｃ」）、Ｅ２２Ｑ（「Ｄｕｔｃｈ」）、Ｅ２２Ｋ（「Ｉｔａｌｉａｎ」）、Ｄ２３Ｎ（「Ｉｏｗａ」）、Ａ４２Ｔ及びＡ４２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を有するもの（数字は、Ａβペプチドの開始位置に対するものであり、位置１及び位置４２の両方を含む。）又は３個以下のさらなるアミノ酸置換（これらの中に球状凝集体形成を妨害し得るものはない。）を有する配列であり得る。同様に、「Ａβ（１−４０）」という用語は、本明細書中で、ヒトアミロイドβタンパク質の、アミノ酸位置１からアミノ酸位置４０（１及び４０の両方を含む。）のアミノ酸配列を指し、特に、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号３０）又はその天然の変異体の何れかの、アミノ酸位置１からアミノ酸位置４０のアミノ酸配列を指す。このような変異体は、例えば、Ａ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「Ｆｌｅｍｉｓｈ」）、Ｅ２２Ｇ（「Ａｒｃｔｉｃ」）、Ｅ２２Ｑ（「Ｄｕｔｃｈ」）、Ｅ２２Ｋ（「Ｉｔａｌｉａｎ」）及びＤ２３Ｎ（「Ｉｏｗａ」）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を有するもの（数字は、Ａβペプチドの開始位置に対するものであり、位置１及び位置４０の両方を含む。）又は３個以下のさらなるアミノ酸置換（これらの中に球状凝集体形成を妨害し得るものはない。）を有する配列を含む。
【００４３】
「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体」（「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状オリゴマー」としても知られる。）という用語は、本明細書中で、上記で定義されるように、均一性及び別個の物理的特性を有する、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの可溶性の球状の非共有結合体を指す。Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体は、陰イオン性界面活性剤と温置することにより得られるＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの安定な非原線維性のオリゴマー集合体である。単量体及び原線維とは異なり、これらの球状凝集体は、サブユニットの定められた集合体数を特徴とする（例えば、参照により本明細書中に組み込まれる国際出願公開ＷＯ０４／０６７５６１に記載のように、初期集合形態、ｎ＝３−６、「オリゴマーＡ」及び後期集合形態、ｎ＝１２−１４、「オリゴマーＢ」。）。球状凝集体は、３次元球状型構造を有する（「モルテングロビュール」、Ｂａｒｇｈｏｒｎら、２００５、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、９５、８３４−８４７参照）。これらはさらに、次の特性の１以上をさらに特徴とし得る：
−短縮型Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体を生じさせる広域プロテアーゼ（サーモリシン又はエンドプロテイナーゼＧｌｕＣなど）でのＮ−末端アミノ酸Ｘ−２３の切断可能性；
−広域プロテアーゼ及び抗体とのＣ末端アミノ酸２４−Ｙの非近接性；及び
−これらのＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体の短縮型は、その球状凝集体配座におけるコアエピトープＡβ（２０−Ｙ）の近接性がより良好である球状凝集体の３次元コア構造を維持する。
【００４４】
本発明によると、及び、特に、本発明の抗体の結合親和性を評価する目的のために、「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、国際出願公開ＷＯ０４／０６７５６１（その全体において本明細書中に参照により組み込まれる。）に記載のようなプロセスにより得られる生成物を指す。このプロセスは、天然、組み換えもしくは合成Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチド又はその誘導体を変性（アンフォールディング）させること；変性（アンフォールディング）させたＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチド又はその誘導体を界面活性剤に少なくとも部分的に曝露し、その界面活性剤作用を低下させ、温置を続けることを含む。
【００４５】
ペプチドの変性（アンフォールディング）のために、例えばヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）などの水素結合破壊剤をタンパク質に対して作用させ得る。作用温度が約２０から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、数分、例えば１０から６０分の作用時間で十分である。蒸発乾固した残渣を、好ましくは濃縮形態で、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの水性緩衝剤と混ざり合う適切な有機溶媒中で続いて溶解することにより、結果として、その後に使用され得る、少なくとも部分的に変性（アンフォールディング）したペプチド又はその誘導体の懸濁液が得られる。必要に応じて、保存用懸濁液を低温、例えば約−２０℃でしばらくの間保存し得る。
【００４６】
あるいは、弱酸性の、好ましくは水性の、溶液、例えば約１０ｍＭ  ＨＣｌ水溶液中で、ペプチド又はその誘導体を溶解させ得る。およそ数分間温置した後、不溶性成分を遠心により除去する。１０，０００ｇで数分が好都合である。好ましくはこれらの方法の段階を室温、即ち２０から３０℃の範囲の温度で行う。遠心後に得られる上清は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチド又はその誘導体を含有し、低温、例えば約−２０℃でしばらくの間保存し得る。
【００４７】
界面活性剤への続く曝露は、ペプチド又はその誘導体のオリゴマー化に関連し、オリゴマーの中間型（国際出願公開ＷＯ０４／０６７５６１、オリゴマーＡと呼ばれる。）が得られる。このために、十分な中間体オリゴマーが生じるまで、場合によっては少なくとも部分的に変性（アンフォールディング）したペプチド又はその誘導体に対して界面活性剤を作用させる。イオン性界面活性剤、特に陰イオン性界面活性剤を用いることが好ましい。
【００４８】
特定の実施形態によると、式（Ｉ）：
Ｒ−Ｘ
の界面活性剤が使用される（式中、基「Ｒ」は、６から２０、好ましくは１０から１４個の炭素原子を有する非分枝もしくは分枝アルキル又は６から２０、好ましくは１０から１４個の炭素原子を有する非分枝もしくは分枝アルケニルであり、基「Ｘ」は酸性基又はその塩であり、Ｘは好ましくは−ＣＯＯ−Ｍ＋、−ＳＯ３−Ｍ＋の中から選択され、最も好ましくは−ＯＳＯ３−Ｍ＋であり、Ｍ＋は、水素陽イオン又は無機もしくは有機陽イオンであり、好ましくは、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類金属陽イオン及びアンモニウム陽イオンから選択される。）。最も有利であるのは、特に、Ｒが非分枝アルキルである（そのアルキル（ａｌｋ−ｌ−ｙｌ）基に言及しなければならない。）、式（Ｉ）の界面活性剤である。特に好ましいのは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。ラウリン酸及びオレイン酸も有利に使用できる。界面活性剤ラウロイルサルコシンのナトリウム塩（サルコシルＮＬ−３０又はＧａｒｄｏｌ（Ｒ）としても知られている。）もまた特に有利である。
【００４９】
界面活性剤作用時間は、特に、変性（アンフォールディング）しているならば、オリゴマー化に供されるペプチド又はその誘導体がどの程度まで変性（アンフォールディング）しているかに依存する。変性（アンフォールディング）段階に従い、ペプチド又はその誘導体が水素結合破壊剤で（即ち、特にヘキサフルオロイソプロパノールで）既に処理されているならば、作用温度が約２０から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、数時間の範囲の作用時間、有利には約１から２０、特に約２から１０時間で十分である。変性（アンフォールディング）の程度が小さいか又は基本的に変性（アンフォールディング）されていないペプチド又はその誘導体が出発点である場合、相応して、作用時間が長い方が好都合である。例えばＨＦＩＰ処理に代わる手段として上記手順に従いペプチドもしくはその誘導体が前処理されているか、又は該ペプチドもしくはその誘導体がオリゴマー化に直接供されるならば、作用温度が約２０から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、約５から３０時間、特に約１０から２０時間の作用時間で十分である。温置後、有利に不溶性成分を遠心により除去する。１０，０００ｇで数分間が好都合である。
【００５０】
選択すべき界面活性剤濃度は使用される界面活性剤に依存する。ＳＤＳを使用する場合、０．０１から１重量％、好ましくは、０．０５から０．５重量％の範囲、例えば、約０．２重量％の濃度が好都合と分かる。ラウリン酸又はオレイン酸が使用される場合、例えば、０．０５から２重量％、好ましくは０．１から０．５重量％の範囲、例えば約０．５重量％の、幾分高い濃度が好都合である。
【００５１】
界面活性剤作用は、生理的範囲前後の塩濃度となるはずである。従って、特に５０から５００ｍＭ、好ましくは１００から２００ｍＭの範囲、より具体的には約１４０ｍＭのＮａＣｌ濃度が好都合である。
【００５２】
続く界面活性剤作用の低下及び温置の継続は、さらなるオリゴマー化に関連し、本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体（国際出願公開ＷＯ０４／０６７５６１において、オリゴマーＢと呼ばれる。）が得られる。前段階から得られる組成物は通常、界面活性剤及び生理的範囲の塩濃度を含有するので、界面活性剤作用を低下させ、好ましくは塩濃度も低下させることが好都合である。例えば、水又は低塩濃度の緩衝液（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．３）で好都合に希釈することにより界面活性剤及び塩の濃度を低下させることによって、これを行い得る。約２から１０の範囲、有利には、約３から８の範囲、特に約４の、希釈係数が適切であることが分かっている。この界面活性剤作用を中和することができる物質を添加することによっても、界面活性剤作用の低下を達成し得る。これらの例には、一連の精製及び抽出方法において細胞を安定化させることができる物質のような界面活性剤を錯化させることができる物質（例えば、特定のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー、特に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（Ｒ）Ｆ６８の商標名のブロックコポリマー）が含まれる。特定の臨界ミセル濃度前後又はそれ以上の濃度範囲の、アルコキシル化及び、特に、エトキシル化アルキルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ（Ｒ）Ｘシリーズのエトキシル化ｔ−オクチルフェノール、特にＴｒｉｔｏｎ（Ｒ）Ｘ１００、３−（３−コラミドプロピルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ（Ｒ））など）又はアルコキシル化及び特にエトキシル化ソルビタン脂肪エステル（Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）シリーズのものなど、特にＴｗｅｅｎ（Ｒ）２０）も同様に使用され得る。
【００５３】
続いて、十分なＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体が生成されるまでこの溶液を温置する。作用温度が約２０から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、数時間の範囲、好ましくは約１０から３０時間、特に約１５から２５時間の範囲の作用時間で十分である。次にこの溶液を濃縮し得、得られるであろう残渣を遠心により除去し得る。繰り返すが、１０，０００ｇで数分間が好都合であることが分かっている。遠心後に得られる上清は、本明細書中に記載のようなＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体を含有する。
【００５４】
例えば超遠心、透析、沈殿又は遠心により、Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体を最終的に回収することができる。変性条件下でのＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体の電気泳動による（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）分離によって２重のバンドが得られれば（例えば、Ａβ（１−４２）に対して３８／４８ｋＤａの見かけの分子量を有する。）さらに好ましく、分離前にオリゴマーのグルタールアルデヒド処理においてこれらの２本のバンドが１本にまとまれば特に好ましい。球状凝集体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果、１本のピークになることも好ましい（例えば、Ａβ（１−４２）に対するおよそ６０ｋＤａの分子量に対応する。）。Ａβ（１−４２）ペプチドから開始する場合、本プロセスは、特にＡβ（１−４２）球状凝集体を得るために適切である。好ましくは、この球状凝集体は、神経細胞に対して親和性を示し、また、神経調節作用も示す。「神経調節作用」は、神経可塑性に関してニューロンの機能不全を導く、ニューロンの長期にわたる阻害作用として定義される。
【００５５】
本発明の別の態様によると、「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、基本的にＡβ（Ｘ−Ｙ）サブユニットからなる球状凝集体を指し、これは、平均で１２サブユニットのうち少なくとも１１がＡβ（Ｘ−Ｙ）型であれば好ましく、より好ましくはこの球状凝集体の１０％未満が何らかの非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドであり、最も好ましくは、この調製物の非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの含量は検出閾値以下である。より具体的には、「Ａβ（１−４２）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、上記で定義されるような、Ａβ（１−４２）単位を含む球状凝集体を指し；「Ａβ（１２−４２）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、上記で定義されるような、Ａβ（１２−４２）単位を含む球状凝集体を指し；「Ａβ（２０−４２）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、上記で定義されるような、Ａβ（２０−４２）単位を含む球状凝集体を指す。
【００５６】
「架橋Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、球状凝集体の構成単位の架橋により、好ましくは化学的架橋により、より好ましくはアルデヒド架橋により、最も好ましくはグルタールジアルデヒド架橋により、上述のようなＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体から得ることができる分子を指す。本発明の別の態様において、架橋球状凝集体は基本的に、その単位が、非共有結合相互作用のみによって一緒になっているのではなく、少なくとも一部が共有結合により連結されている球状凝集体である。
【００５７】
「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体誘導体」という用語は、本明細書中で、特に、検出を容易にする基に共有結合されることにより標識される球状凝集体（好ましくは、フルオロフォア、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリスリン、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）蛍光タンパク質、Ｄｉｃｔｙｏｓｏｍａ蛍光タンパク質又はそれらの何らかの組み合わせもしくはそれらの蛍光活性誘導体；発色団；化学発光団、例えば、ルシフェラーゼ、好ましくはＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（ホタル）ルシフェラーゼ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ（発光細菌）ルシフェラーゼ又はそれらの何らかの組み合わせもしくはそれらの化学発光活性誘導体；酵素活性基、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ又はその酵素活性誘導体；高電子密度基、例えば、金含有基などの重金属含有基；ハプテン、例えば、フェノール誘導化ハプテン；強い抗原性のある構造、例えば、Ｋｏｌａｓｋａｒ及びＴｏｎｇａｏｎｋａｒのアルゴリズムなどにより抗原性があると予想されるペプチド配列；別の分子に対するアプタマー；キレート基、例えば、ヘキサヒスチジニル；さらに特異的なタンパク質−タンパク質相互作用に介在する天然もしくは天然由来タンパク質構造、例えば、ｆｏｓ／ｊｕｎペアのメンバー；磁気基、例えば、強磁性体基；又は１Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉ又はそれらの何らかの組み合わせを含む基などの放射活性基）；又は共有結合により、もしくは高親和性相互作用による非共有結合によりフラグ付加されている、好ましくは、不活性化、金属イオン封鎖、分解及び／又は沈降を促進する基に共有結合されている、好ましくは、インビボでの分解を促進する基（より好ましくは、ユビキチン）でフラグ付加されている球状凝集体（このフラグ付加オリゴマーがインビボで構築される場合、特に好ましい。）；又は何らかの上記の組み合わせにより修飾されている球状凝集体を指す。このような標識及びフラグ付加された基及びこれらをタンパク質に結合させるための方法は当技術分野で公知である。球状化の前、最中又は後に、標識及び／又はフラグ付加を行い得る。本発明の別の態様において、球状凝集体誘導体は、標識及び／又はフラグ付加反応により球状凝集体から得ることができる分子である。従って、「Ａβ（Ｘ−Ｙ）単量体誘導体」という用語は、本明細書中で、特に、球状凝集体に対して述べられるように標識又はフラグ付加されるＡβ単量体を指す。
【００５８】
「より高い親和性」という用語は、本明細書中で、一方の非結合抗体及び非結合球状凝集体と、他方の抗体−球状凝集体複合体との間の平衡が、抗体−球状凝集体複合体にさらに偏っている、相互作用の程度を指す。同様に、「より小さい親和性」という用語は、本明細書中で、一方の非結合抗体及び非結合球状凝集体と、他方の抗体−球状凝集体複合体との間の平衡が、非結合抗体及び非結合球状凝集体にさらに偏っている相互作用の程度を指す。
【００５９】
「Ａβ（Ｘ−Ｙ）単量体」という用語は、本明細書中で、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの単離形態、好ましくは、その他のＡβペプチドとの基本的に非共有相互作用に関与していないＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの形態を指す。実際に、Ａβ（Ｘ−Ｙ）単量体は通常、水溶液の形態で与えられる。好ましくは、水性単量体溶液は、例えば本発明の抗体の結合親和性を調べるために使用される場合、０．０５％から０．２％、より好ましくは、約０．１％ＮａＯＨを含有する。別の好ましい状況において、水性単量体溶液は、０．０５％から０．２％、より好ましくは約０．１％ＮａＯＨを含有する。使用される場合、適切な形式で溶液を希釈することは好都合であり得る。さらに、通常、溶液調製後、２時間以内、特に１時間以内、とりわけ３０分以内に溶液を使用することが好都合である。
【００６０】
「原線維」という用語は、本明細書中で、電子顕微鏡下で原線維性構造を示す非共有結合した個々のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの集合体を含む分子構造を指し、これはコンゴレッドに結合し、偏光下で複屈性を示し、そのＸ−線回折パターンはクロス−β構造である。原線維はまた、２４単位を超える、好ましくは、１００単位を超える凝集体の形成をもたらす、界面活性剤非存在下での、例えば０．１Ｍ  ＨＣｌ中での、適切なＡβペプチドの自己誘導重合体凝集を含むプロセスにより得ることができる分子構造としても定義され得る。このプロセスは当技術分野で周知である。好都合に、Ａβ（Ｘ−Ｙ）原線維は、水溶液の形態で使用される。本発明の特に好ましい実施形態において、０．１％ＮＨ４ＯＨ中でＡβペプチドを溶解し、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４でそれを１：４に希釈し、次いで７．４にｐＨを再調整し、３７℃にて２０時間溶液を温置し、次いで１００００ｇで１０分間遠心し、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で再懸濁することにより、水性原線維溶液が調製される。
【００６１】
「Ａβ（Ｘ−Ｙ）原線維」という用語は、本明細書中で、Ａβ（Ｘ−Ｙ）サブユニットを含む原線維を指し、この場合、平均でサブユニットの少なくとも９０％がＡβ（Ｘ−Ｙ）型のものであれば好ましく、サブユニットの少なくとも９８％がＡβ（Ｘ−Ｙ）型のものであればより好ましく、非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの含量が検出閾値以下であれば最も好ましい。
【００６２】
抗体８Ｆ５に戻って、このＡβ（１−４２）球状凝集体−特異的抗体は、例えば、ｍ２６６及び３Ｄ６などの競合物抗体とは異なり、主にＡβ（１−４２）球状凝集体形態を認識し、Ａβ（１-４０）単量体、Ａβ（１−４２）単量体、Ａβ−原線維又はｓＡＰＰ（即ちＡβ前駆体）の標準的調製物を認識しない。例えば８Ｆ５などの球状凝集体選択的抗体によってＡβの球状凝集体型を特異的に標的とすることにより、１）不溶性アミロイド沈着を標的とすることが回避され（これに結合することは、不溶性Ａβで免疫付与する際に観察される炎症性の副作用の原因となり得る。）；２）予知的な生理的機能を有することが報告されているＡβ単量体及びＡＰＰを使用せず（Ｐｌａｎら、Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２３：５５３１−５５３５（２００３）；及び３）不溶性沈着への大量の結合により隠蔽されたり又は接近不可能とならないため、抗体のバイオアベイラビリティーが向上するので、球状凝集体に対するこのような特異性は重要である。
【００６３】
本発明はまた、抗体８Ｆ５の可変軽鎖及び重鎖をコードする単離ヌクレオチド配列（又はその断片）ならびに、これらのコードヌクレオチド配列と少なくとも約７０％（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％又は７９％）、好ましくは少なくとも約８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％又は８９％）及びより好ましくは少なくとも約９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一であるものを、含むか、これらに対応するか、これらと同一であるか、これらとハイブリッド形成するか、又はこれらと相補的である、配列を有するヌクレオチド配列（又はその断片）も含む。（７０％と１００％との間及びこれらを含む全ての整数（及びその一部）は、％同一性に関して本発明の範囲内であるとみなされる。）。このような配列は、あらゆる源由来であり得る（例えば、天然源から単離されるか、半合成経路を介して産生されるか、又はデノボ合成される。）。特に、実施例に記載のもの以外の源からこのような配列を単離し得るか、又は、このような配列は実施例に記載のもの以外の源由来であり得る（例えば、細菌、真菌、藻類、マウス又はヒト）。
【００６４】
上述のヌクレオチド配列に加えて、本発明はまた、抗体８Ｆ５の可変軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列（又はこれらのアミノ酸配列の断片）も含む。さらに、本発明はまた、本発明のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約７０％（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％又は７９％）、好ましくは少なくとも約８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％又は８９％）及びより好ましくは少なくとも約９０％同一（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）であるものを含むか、これらに相当するか、これらと、同一であるか又は相補的である、アミノ酸配列（又はその断片）も含む。（繰り返すが、７０％と１００％との間及びこれらを含む全ての整数（及びその一部）も（上記のヌクレオチド配列同一性に関連して引用される場合）、％同一性に関して本発明の範囲内であるとみなされる。）。
【００６５】
本発明の目的に対して、ヌクレオチド配列の「断片」は、特定のヌクレオチド配列の領域に相当する、およそ少なくとも６、好ましくは少なくとも約８、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドの連続する配列として定義される。
【００６６】
「同一性」という用語は、特定の比較枠又はセグメントにわたる、ヌクレオチドごとの２つの配列の関連性を指す。従って、同一性は、２つのＤＮＡセグメント（又は２つのアミノ酸配列）の同じ鎖（センス又はアンチセンスの何れか）間の、同一である程度、対応性の程度又は同等性の程度として定義される。「配列同一性の％」は、特定の領域にわたり２つの最適に並べられた（アラインされた）配列を比較し、一致する位置の数を得るために両配列において同一の塩基又はアミノ酸がある位置の数を調べ、このような位置の数を比較セグメント中の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けることにより計算される。Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の方法により、及び、関連するアルゴリズムを実行するコンピュータプログラムにより（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｍａｃａｗ  Ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／１１Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５１−１５３（１９８９））、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：３３８９−３４０２（１９９７））、ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）又はＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、配列の最適アラインメントを行い得る。（米国特許第５，９１２，１２０号参照）。
【００６７】
本発明の目的に対して、「相補性」は、２つのＤＮＡセグメント間の関連性の程度として定義される。これは、二重らせんを形成させるために、適切な条件下で、一方のＤＮＡセグメントのセンス鎖が他方のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリッド形成する能力を測定することにより決定される。「相補的」とは、規範的（カノニカル）な塩基対形成規則に基づきある一定の配列に対して対形成する配列として定義される。例えば、あるヌクレオチド鎖中の配列Ａ−Ｇ−Ｔは、他方の鎖のＴ−Ｃ−Ａに対して「相補的」である。
【００６８】
二重らせんにおいて、アデニンが一方の鎖に現れ、チミンが他方の鎖に現れる。同様に、グアニンが一方の鎖で見られる場合は常に、他方でシトシンが見られる。２つのＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連性が大きいほど、２つのＤＮＡセグメントの鎖間でのハイブリッド二本鎖形成能が大きくなる。
【００６９】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、一連の同一ならびに保存的アミノ酸残基が両配列において存在することとして定義される。２つのアミノ酸配列間の類似性の程度が高いほど、２つの配列の、対応性、同一性又は同等性が高くなる。（２つのアミノ酸配列の間の「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、一連の正確に等しい又は不変のアミノ酸残基が両配列において存在することとして定義される。）。「相補性」、「同一性」及び「類似性」の定義は、当業者にとって周知である。
【００７０】
「によりコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、このポリペプチド配列又はその一部は、その核酸配列によりコードされるポリペプチド由来の、少なくとも３アミノ酸、より好ましくは少なくとも８アミノ酸及びさらにより好ましくは少なくとも１５アミノ酸のアミノ酸配列を含有する。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、「生物活性」とは、球状凝集体のＡβ（１−４２）領域の全ての固有の生物学的特性を指す。このような特性には、例えば、本明細書中に記載の８Ｆ５及び機能的に関連のある抗体に結合する能力が含まれる。
【００７２】
「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、本明細書中で使用される場合、第二の化学種との、抗体、タンパク質又はペプチドの相互作用に関連して、相互作用が、化学種における特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味し；例えば、抗体は、全般的にタンパク質へというよりも、特異的タンパク質構造を認識し、これに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識された「Ａ」及び抗体を含有する反応中にエピトープＡ（又は遊離の、非標識Ａ）を含有する分子が存在すると、抗体に結合する標識されたＡの量が減少する。
【００７３】
「抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、広く、４本のペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖からなる何らかの免疫グロブリン（Ｉｇ）分子又は、それらの何らかの機能的断片、突然変異体、変異体又は誘導体を指し、これは、Ｉｇ分子の基本的なエピトープ結合特性を保持する。このような突然変異体、変異体又は誘導体抗体型は、当技術分野で公知である。この非限定実施形態は下記で考察する。
【００７４】
全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中で略してＨＣＶＲ又はＶＨと呼ぶ。）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中で略してＬＣＶＲ又はＶＬと呼ぶ。）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに区分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端で次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で構築される、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。免疫グロブリン分子は、何らかのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであり得る。
【００７５】
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えばＡβ（１−４２）球状凝集体）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の１以上の断片によって発揮され得ることが示されている。このような抗体実施形態はまた、２以上の様々な抗原に特異的に結合する、二特異性、二重特異性又は多特異性形態でもあり得る。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む２価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の１本のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ｄＡｂ断片（参照により本明細書中に組み込まれる、Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６、Ｗｉｎｔｅｒら、国際出願公開ＷＯ９０／０５１４４Ａ１）（これは１つの可変ドメインを含有する。）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。
【００７６】
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によりコードされるが、これらは、組み換え法を使用して、それらをＶＬ及びＶＨ領域が対になって１価の分子を形成する単一のタンパク質鎖にすることができる合成リンカーにより連結することができる（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照。）。このような１本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される。１本鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディーなどもこの範囲内に包含される。ダイアボディーは、２価で、二特異性の抗体であり、ＶＨ及びＶＬのドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、使用されるリンカーが短すぎるため、同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成できず、それによりドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成せざるを得ず、２つの抗原結合性部位が生じる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。このような抗体結合部分は当技術分野で公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０ｐｐ．（ＩＳＢＮ３−５４０−４１３５４−５）。
【００７７】
「抗体コンストラクト」という用語は、本明細書中で使用される場合、リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインに連結される本発明の１以上の抗原結合部分を含むポリペプチドを指す。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合により連結される２以上のアミノ酸残基を含み、１以上の抗原結合部分を連結するために使用される。このようなリンカーポリペプチドは当技術分野で周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖又は軽鎖定常ドメインを指す。ヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は当技術分野で公知であり、表１で示される。
【００７８】
【表２】
2010530739.tif 000003
2010530739.tif 000004
【００７９】
またさらに、抗体又はその抗原結合部分は、１以上のその他のタンパク質又はペプチドと抗体又は抗体部分の共有又は非共有結合により形成されているより大きな免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）及び二価及びビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するための、システイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が含まれる。全抗体の、それぞれパパイン又はペプシン消化などの従来技術を用いて、全抗体から、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体の一部を調製することができる。さらに本明細書中に記載のように、標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて、抗体、抗体部分及び免疫接着分子を得ることができる。
【００８０】
さらに、本明細書中に記載のように、標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて、抗体、抗体部分及び免疫接着分子を得ることができる。
【００８１】
「単離抗体」は、本明細書中で使用される場合、異なる抗原特性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指すものとする（例えば、Ａβ（１−４２）球状凝集体に特異的に結合する単離抗体は、Ａβ（１−４２）球状凝集体以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。）。しかし、Ａβ（１−４２）球状凝集体に特異的に結合する単離抗体は、その他の種からのＡβ（１−４２）球状凝集体分子などのその他の抗原に対して交差反応性を有する。さらに、単離抗体は、その他の細胞性物質及び／又は化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００８２】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでの無作為又は部位特異的突然変異誘発により、又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、別の哺乳動物種（例えばマウスなど）の生殖細胞系列由来であるＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含まないものとする。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、「組み換えヒト抗体」という用語は、組み換え手段によって調製、発現、作製又は単離される全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞中に遺伝子移入される組み換え発現ベクターを使用して発現される抗体（下記）、組み換え体から単離される抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．、（１９９７）ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．１５：６２−７０；Ａｚｚａｚｙ  Ｈ．及びＨｉｇｈｓｍｉｔｈ  Ｗ．Ｅ．、（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５−４４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ．Ｖ．及びＬａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８−１４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．及びＣｈａｍｅｓ  Ｐ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７８）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離される抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ、Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０、６２８７−６２９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｓ−Ａ．及びＧｒｅｅｎ  Ｌ．Ｌ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５９３−５９７；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０参照）又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む何らかのその他の手段によって調製、発現、作製又は単離される抗体を含むものとする。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する。しかし、ある実施形態において、このような組み換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックである動物を使用する場合は、インビボ体細胞突然変異誘発）が起こりやすく、従って組み換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ及びＶＬ配列由来であり、これらと関連している一方で、天然ではインビボのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に存在し得ない配列である。
【００８４】
「キメラ抗体」という用語は、ある種からの重鎖及び軽鎖可変領域配列及び別の種からの定常領域配列を含む抗体、例えば、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、を指す。
【００８５】
「ＣＤＲグラフト抗体」という用語は、ある種からの重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、この中でＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１以上の配列が、別の種のＣＤＲ配列で置換された抗体、例えば、マウスＣＤＲの１以上（例えばＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列で置換されているマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、を指す。
【００８６】
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えばマウス）由来の重及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部がより「ヒト様」となるように改変されている、即ちヒト生殖細胞系列可変配列により類似している抗体を指す。ヒト化抗体のあるタイプはＣＤＲグラフト抗体であり、この場合、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置換するために、ヒトＣＤＲ配列が非ヒトＶＨ及びＶＬ配列に導入されている。
【００８７】
「Ｋａｂａｔ付番」、「Ｋａｂａｔ定義」及び「Ｋａｂａｔラベリング」という用語は本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、当技術分野で認識されており、抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域における他のアミノ酸残基よりもより可変性がある（即ち超可変性）アミノ酸残基を付番する系を指す（Ｋａｂａｔら（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１及びＫａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ９１−３２４２）。重鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対してアミノ酸位置３１から３５の範囲であり、ＣＤＲ２に対してアミノ酸位置５０から６５であり、ＣＤＲ３に対してアミノ酸位置９５から１０２の範囲である。軽鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対してアミノ酸位置２４から３４であり、ＣＤＲ２に対してアミノ酸位置５０から５６であり、ＣＤＲ３に対してアミノ酸位置８９から９７である。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、「アクセプター」及び「アクセプター抗体」という用語は、フレームワーク領域の１以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％をもたらすか又はコードする抗体又は核酸配列を指す。ある実施形態において、「アクセプター」という用語は、定常領域をもたらすか又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。さらに別の実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域及び定常領域の１以上をもたらすか又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。具体的な実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域の１以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％をもたらすか又はコードするヒト抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。この実施形態によると、アクセプターは、ヒト抗体の１以上の特異的位置で生じない、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５又は少なくとも１０個のアミノ酸残基を含有し得る。アクセプターフレームワーク領域及び／又はアクセプター定常領域は、例えば、生殖細胞系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、当技術分野で周知の抗体、開発中の抗体又は市販の抗体）由来であり得るか又はそれらから得ることができる。
【００８９】
本明細書中で使用される場合、「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれに３個のＣＤＲがあり、これらは、可変領域のそれぞれに対して、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれる。「ＣＤＲセット」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原に結合することができる１つの可変領域で生じる３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正しい境界は、システムが異なると異なって定義される。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９８７）及び（１９９１））により記載されるシステムは、抗体のあらゆる可変領域に適用可能である明確な残基付番システムを提供するだけでなく、３個のＣＤＲを定義する明確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと呼ばれる得る。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者ら（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）及びＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３（１９８９））は、アミノ酸配列のレベルで非常に多様であるにもかかわらず、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ内のある一定のサブポーション（ｓｕｂｐｏｒｔｉｏｎ）がほぼ同一のペプチド骨格構造をとることを見出した。これらのサブポーションは、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３又はＨ１、Ｈ２及びＨ３と名付けられた（ここで、「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ軽鎖及び重鎖領域とする。）。これらの領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲと呼ばれ得、これらは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する境界を有する。ＫａｂａｔＣＤＲと重複するＣＤＲを定義するその他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９（１９９５））及びＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−４５（１９９６））により記載されている。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記のシステムの１つに正確には従わない可能性があるが、特定の残基又は残基群又はＣＤＲ全体でさえも抗原結合に重大な影響を与えないという予想又は実験的知見を考慮すると、それらが短くされ得るか又は長くされ得るかにかかわらず、それでもなお、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する。本明細書中で使用される方法は、これらのシステムの何れかに従い定義されるＣＤＲを使用し得るが、好ましい実施形態は、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａで定義されるＣＤＲを使用する。
【００９０】
本明細書中で使用される場合、「カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」残基という用語は、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９０７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９（１９９２）、両者とも参照により本明細書中に組み込まれる。）により定義されるような、特定の標準的なＣＤＲ構造を定義する、ＣＤＲ又はフレームワークにおける残基を指す。Ｃｈｏｔｈｉａらによると、多くの抗体のＣＤＲの重要な部分は、アミノ酸配列のレベルでは非常に多様であるにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格構造を有する。規範的（カノニカル）な各構造は、主に、ループを形成するアミノ酸残基の隣接セグメントに対するペプチド骨格ねじれ角のセットを指す。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、「ドナー」及び「ドナー抗体」という用語は、１以上のＣＤＲを提供する抗体を指す。好ましい実施形態において、ドナー抗体は、フレームワーク領域が得られるか又はそれが由来する抗体とは異なる種由来の抗体である。ヒト化抗体に関して、「ドナー抗体」という用語は、１以上のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を指す。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」という用語は、ＣＤＲを差し引いた可変領域の残存配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は異なるシステムにより決定され得るので、フレームワーク配列の意味は、相応して異なる解釈に従う。６個のＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２及び−Ｌ３及び重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２及び−Ｈ３）もまた、軽鎖及び重鎖においてフレームワーク領域を各鎖で４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分け、ここで、ＣＤＲ１は、ＦＲ１とＦＲ２との間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３との間に位置し、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４との間に位置する。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４として特定のサブ領域を指定することなく、フレームワーク領域は、その他により指定される場合、１本の天然の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わせられたＦＲ’を表す。本明細書中で使用される場合、ＦＲ（単数形）は４つのサブ領域の１つを表し、ＦＲ（複数形）は、フレームワーク領域を構成する４つのサブ領域の２以上を表す。
【００９３】
ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は当技術分野で公知である。本発明のある実施形態において、ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は、下記に記載の配列から選択される。
【００９４】
【表３】
2010530739.tif 000005
【００９５】
【表４】
2010530739.tif 000006
【００９６】
本明細書中で使用される場合、「生殖細胞系列抗体遺伝子」又は「遺伝子断片」という用語は、特定の免疫グロブリンの発現に対して遺伝子再配列及び突然変異をもたらす成熟プロセスが行われていない非リンパ系細胞によりコードされる免疫グロブリン配列を指す（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１８３−２００（２００２）；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．４８４：１３−３０（２００１）参照）。本発明の様々な実施形態により提供される長所の１つは、生殖細胞系列抗体遺伝子が、成熟抗体遺伝子よりも、種における個体の必須のアミノ酸配列構造の特徴を保存する可能性が高いが、その種において治療用に使用される場合、外来源由来のものとして認識される可能性が低いという認識によるものである。本明細書中で使用される場合、「キーとなる」残基という用語は、抗体の、特にヒト化抗体の、結合特異性及び／又は親和性においてより影響がある可変領域内のある一定の残基を指す。キーとなる残基には、以下に限定されないが、次のものの１以上が含まれる：ＣＤＲに隣接する残基、潜在的グリコシル化部位（Ｎ−又はＯ−グリコシル化部位の何れかであり得る。）、希少残基、抗原と相互作用することができる残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、カノニカル残基、重鎖可変領域及と軽鎖可変領域との間の接触残基、バーニアゾーン内の残基及び可変重鎖ＣＤＲ１のコチア定義と第一の重鎖フレームワークのＫａｂａｔ定義との間で重複する領域における残基。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、関心のある抗原に免疫特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域及び非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体又は、それらの変異体、誘導体、類似体もしくは断片である。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、ＣＤＲに関して、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％及び最も好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的に全てを含み、ここでＣＤＲ領域の全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリン（即ちドナー抗体）のものに相当し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。好ましくは、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン（通常はヒト免疫グロブリンの）定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。ある実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖ならびに、少なくとも重鎖の可変ドメインの両方を含有する。本抗体はまた、重鎖の、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４領域も含み得る。その他の実施形態において、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含有する。ある実施形態において、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメイン及び／又はヒト化重鎖のみを含有する。
【００９９】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥ及び何らかのアイソタイプ（以下に限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。）を含む、免疫グロブリンの何らかのクラスから選択することができる。ヒト化抗体は、複数のクラス又はアイソタイプからの配列を含み得、当技術分野で周知である技術を用いて、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択し得る。
【０１００】
ヒト化抗体の、フレームワーク及びＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応する必要はなく、例えば、その部位でＣＤＲ又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークの何れかに相当しないように、少なくとも１つのアミノ酸残基の、置換、挿入及び／又は欠失により、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークに対して突然変異誘発を行い得る。しかし、好ましい実施形態において、このような突然変異は大規模ではない。通常、ヒト化抗体残基の、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が親ＦＲ及びＣＤＲ配列のものに相当する。本明細書中で使用される場合、「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列のフレームワーク領域を指す。本明細書中で使用される場合、「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連免疫グロブリン配列のファミリーにおいて最も高頻度に現れるアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７参照）。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列の各位置には、そのファミリーのその位置で最も高頻度に現れるアミノ酸がある。２種類のアミノ酸が同等の頻度で現れる場合、何れかをコンセンサス配列に含めることができる。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、「ベルニア」ゾーンは、Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒ（１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９、参照により本明細書中に組み込まれる。）により記載されるように、ＣＤＲ構造を調整し得、抗原への合致を細かく調整し得るフレームワーク残基のサブセットを指す。バーニアゾーン残基は、ＣＤＲの基礎をなす層を形成し、ＣＤＲの構造及び抗体の親和性に影響を及ぼし得る。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、「中和する」という用語は、結合タンパク質が球状凝集体に特異的に結合する場合、球状凝集体の生物学的活性の中和を指す。好ましくは、結合タンパク質を中和することは、球状凝集体のＡβ（１−４２）アミノ酸領域への結合の結果、球状凝集体の生物学的活性の阻害が起こる抗体を中和することである。好ましくは、中和結合タンパク質は、球状凝集体のＡβ（１−４２）領域に結合し、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％以上、球状凝集体の活性を生物学的に低下させる。中和結合タンパク質による球状凝集体の生物学的活性の阻害は、当技術分野で周知の球状凝集体の生物学的活性の１以上の指標を測定することにより評価され得る。
【０１０３】
「活性」という用語は、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性（例えばＡβ（１−４２）球状凝集体に結合する抗Ａβ（１−４２）抗体）及び／又は抗体の中和能（例えば、Ａβ（１−４２）へのその結合により球状凝集体の生物学的活性が阻害される、抗Ａβ（１−４２）抗体）などの活性を含む。
【０１０４】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体と特異的に結合することができる何らかのポリペプチド決定基を含む。ある実施形態においては、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面配置を含み、ある実施形態においては、特定の３次元構造的特徴及び／又は特定の電荷的特徴を有し得る。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。ある実施形態において、抗体は、タンパク質及び／又は巨大分子の複雑な混合物中でその標的抗原を選択的に認識した際に抗原に特異的に結合すると言われる。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、「表面プラズモン共鳴」という用語は、（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化の検出による、リアルタイムの生体特異性相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。さらなる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ  Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、Ｂ．ら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ、Ｂ．ら（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８、２６８−２７７を参照のこと。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、「Ｋｏｎ」という用語は、当技術分野で公知のように、抗体／抗原複合体を形成するための抗原への抗体の会合に対する会合速度定数を指すものとする。
【０１０７】
本明細書中で使用される場合、「Ｋｏｆｆ」という用語は、当技術分野で公知のように、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に対する解離速度定数を指すものとする。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、「Ｋｄ」又は「ＫＤ」という用語は、当技術分野で公知のように、特定の抗体−抗原相互作用の「解離定数」を指すものとする。
【０１０９】
「標識結合タンパク質」という用語は、本明細書中で使用される場合、結合タンパク質の同定を可能にする標識が組み込まれたタンパク質を指す。好ましくは、この標識は、例えば、放射性標識アミノ酸の組み込み又は標識化アビジンにより検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの結合など、検出可能マーカーである（例えば、光学的方法又は比色法により検出することができる蛍光マーカー又は酵素活性を含有するストレプトアビジン）。ポリペプチドに対する標識の例には、以下に限定されないが、次のものが含まれる：放射性同位元素又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ又は１５３Ｓｍ）；蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ又はアルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチニル基；第二のレポーターにより認識される予め定められたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）；及びガドリニウムキレートなどの磁性物質。
【０１１０】
「抗体複合体」という用語は、治療薬又は細胞毒性薬などの第二の化学部分に化学的に連結された抗体などの、結合タンパク質を指す。「薬剤（ａｇｅｎｔ）」という用語は、本明細書中で、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的巨大分子又は生体物質から調製された抽出物を指すために使用される。好ましくは、治療薬又は細胞毒性薬には、以下に限定されないが、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びプロマイシン、ならびにそれらの類似物又はホモローグが含まれる。
【０１１１】
「結晶」及び「結晶化」という用語は、本明細書中で使用される場合、結晶の形態で存在する、抗体又はその抗原結合部分を指す。結晶は物質の固体状態の一形態であり、非晶質固体状態又は液晶状態などのその他の形態とは異なる。結晶は、原子、イオン、分子（例えば抗体などのタンパク質）又は分子集合体（例えば抗原／抗体複合体）の、規則的な繰り返しの３次元配列から構成される。これらの３次元配列は、その分野でよく理解されている具体的な数学的関係に従い配置される。結晶において繰り返される基本単位又は構成要素は、非対称ユニットと呼ばれる。ある一定の明確な結晶学的対称性に従う配置における非対称ユニットの繰り返しによって、結晶の「単位格子」がもたらされる。全ての３つの次元での規則正しい並進による単位格子の繰り返しによって結晶がもたらされる。Ｇｉｅｇｅ、Ｒ．及び及びＤｕｃｒｕｌｘ、Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、ｐｐ．２０１−１６、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）」を参照のこと。
【０１１２】
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で述べられる場合、２以上のヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドの何れか）又は何れかのタイプのヌクレオチドの修飾型のポリマー形態を意味する。この用語には、ＤＮＡの１本鎖及び２本鎖形態が含まれるが、好ましくは、２本鎖ＤＮＡである。
【０１１３】
「単離ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、その起源ゆえに、「単離ポリヌクレオチド」が天然で一緒に見出されるポリヌクレオチドの全て又は一部と会合していないか；天然ではそれが連結されないポリヌクレオチドに操作可能に連結されているか；又はより大きな配列の一部として天然では生じない、ポリヌクレオチド（例えば、ゲノムの、ｃＤＮＡの、又は合成起源の又はそれらのある組み合わせの）を意味する。
【０１１４】
「ベクター」という用語は、本明細書中で使用される場合、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すものとする。ベクターのあるタイプは「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の２本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、この場合、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み入れられ得、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが操作可能に連結される遺伝子の発現を支配することができる。このようなベクターは、本明細書中で「組み換え発現ベクター」（又は単純に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用である発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本願において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）などの発現ベクターのこのようなその他の形態を含むものとする。
【０１１５】
「操作可能に連結される」という用語は、記載の成分が、それらの所望の様式でそれらを機能させる関係にある並置状態を指す。コード配列に「操作可能に連結される」制御配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように連結される。「操作可能に連結される」配列には、関心のある遺伝子と隣接する発現制御配列と、関心のある遺伝子を制御するためにトランスで又は離れた位置で作用する発現制御配列と、の両方が含まれる。「発現制御配列」という用語は、本明細書中で使用される場合、それらが連結されるコード配列の発現及びプロセシングをもたらすのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；有効なＲＮＡプロセシングシグナル（スプライシング及びポリアデニル化シグナルなど）；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を促進する配列（即ちコザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を促進する配列；及び必要に応じて、タンパク質分泌を促進する配列が含まれる。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なり；原核生物では、このような制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含み；真核生物では、一般に、このような制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現及びプロセシングに必須である成分を含むものとし、これにはまた、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列などの、存在すると有利であるさらなる成分も含まれ得る。
【０１１６】
本明細書中で定義される場合、「形質転換」は、外来ＤＮＡが宿主細胞に入る何らかのプロセスを指す。形質転換は、当技術分野で周知の様々な方法を用いて、天然又は人工的条件下で起こり得る。形質転換は、原核又は真核宿主細胞への外来核酸配列の挿入のための何らかの公知の方法に依存し得る。その方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、この方法には、以下に限定されないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション及び微粒子銃が含まれる。このような「形質転換された」細胞には、挿入ＤＮＡが自己複製プラスミドとして又は宿主染色体の一部としての何れかで複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。これらにはまた、限られた時間、挿入ＤＮＡ又はＲＮＡを一時的に発現する細胞も含まれる。
【０１１７】
「組み換え宿主細胞」（又は単純に「宿主細胞」）という用語は、本明細書中で使用される場合、外来ＤＮＡが導入されている細胞を指すものとする。このような用語が、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も指すものであることを理解されたい。突然変異又は環境的影響の何れかにより後世においてある種の修飾が起こり得るので、このような子孫は、実際に、その親細胞と非同一であり得るが、本明細書中で使用される場合の「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。好ましくは、宿主細胞には、生物界の何れかから選択される原核及び真核細胞が含まれる。好ましい真核細胞には、原生細胞、真菌細胞、植物細胞及び動物細胞が含まれる。最も好ましくは、宿主細胞には、以下に限定されないが、原核細胞株Ｅ．コリ（大腸菌）；哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ；昆虫細胞株Ｓｆ９；及び真菌細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロミセス・セレビシエ）が含まれる。
【０１１８】
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成及び組織培養及び形質転換に対して標準的技術を使用し得る（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）。製造者の説明書に従い、又は当技術分野で一般に遂行されるように、又は本明細書中に記載のように、酵素反応及び精製技術を行い得る。当技術分野で周知の従来法に従い、及び本願を通じて引用され考察される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載のように、先述の技術及び手段を一般的に行い得る。例えば、あらゆる目的に対して参照により本明細書中に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。
【０１１９】
当技術分野で公知のように、及び本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック生物」は、トランス遺伝子を含有する細胞を有する生物を指し、この場合、生物（又はその生物の祖先）に導入されるトランス遺伝子は、その生物において天然では発現されないポリペプチドを発現する。「トランス遺伝子」は、ＤＮＡコンストラクトであり、トランスジェニック生物が発生する細胞のゲノムに安定的に操作可能に組み入れられ、１以上の細胞タイプ又はトランスジェニック生物の組織においてコードされる遺伝子産物の発現を支配する。
【０１２０】
「制御する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）」及び「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は交換可能に使用され、本明細書中で使用される場合、関心のある分子の活性における変化又は変更を指す（例えばＡβ（１−４２）球状凝集体の生物学的活性）。調節は、関心のある分子のある種の活性又は機能の大きさの向上又は低下であり得る。分子の代表的な活性及び機能には、以下に限定されないが、結合特性、酵素活性、細胞受容体活性化及びシグナル伝達が含まれる。
【０１２１】
相応して、「調節物質」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある分子の活性又は機能を変化又は変更させることができる化合物である（例えばＡβ（１−４２）球状凝集体の生物学的活性）。例えば、調節物質は、その調節物質の非存在下で観察される活性又は機能の大きさと比較して、分子のある種の活性又は機能の大きさを向上又は低下をさせ得る。ある種の実施形態において、調節物質は阻害剤であり、これは、分子の少なくとも１つの活性又は機能の大きさを低下させる。代表的な阻害剤には、以下に限定されないが、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、炭水化物又は小さな有機分子が含まれる。ペプチボディは例えば国際出願公開ＷＯ０１／８３５２５に記載されている。
【０１２２】
「アゴニスト」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある分子と接触した場合に、アゴニストの非存在下で観察される活性又は機能の大きさと比較して、分子のある種の活性又は機能の大きさを向上させる調節物質を指す。関心のある特定のアゴニストには、以下に限定されないが、Ａβ（１−４２）球状凝集体ポリペプチド又は、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合する、ポリペプチド、核酸、炭化水素又は何らかのその他の分子が含まれ得る。
【０１２３】
「アンタゴニスト」又は「阻害剤」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある分子と接触した場合に、アンタゴニストの非存在下で観察される活性又は機能の大きさと比較して、分子のある種の活性又は機能の大きさを低下させる調節物質を指す。関心のある特定のアンタゴニストには、Ａβ（１−４２）球状凝集体の生物学的又は免疫学的活性を阻止又は調節するものが含まれる。Ａβ（１−４２）球状凝集体のアンタゴニスト及び阻害剤には、以下に限定されないが、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合する、タンパク質、核酸、炭化水素又は何らかのその他の分子が含まれ得る。
【０１２４】
本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、疾患又はその１以上の症候の、重症度及び／又は持続時間を低下させるか又は改善する、疾患の進行を予防するか、疾患の軽減を引き起こすか、疾患に付随する１以上の症候の再発、発現、発症もしくは進行を予防するか、疾患を検出するか、又は別の治療薬（例えば、予防薬又は治療薬）の予防的もしくは治療的効果を促進もしくは向上させるのに十分である治療薬の量を指す。
【０１２５】
「試料」という用語は、本明細書中で使用される場合、その最も広い意味で使用される。「生体試料」とは、本明細書中で使用される場合、以下に限定されないが、生物由来の又は死亡した生物由来の物質の何らかの量が含まれる。このような生物には、以下に限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギ及びその他の哺乳動物又は非哺乳動物が含まれる。このような物質には、以下に限定されないが、血液、血清、尿、滑液、細胞、臓器、組織（例えば脳）、骨髄、リンパ節、脳脊髄液及び脾臓が含まれる。
【０１２６】
Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合する抗体
本発明のある態様は、高い親和性で、遅い解離速度で、高い中和能を有してＡβ（１−４２）球状凝集体と結合する、単離マウスモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【０１２７】
本発明の第二の態様は、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合するキメラ抗体を提供する。本発明の第三の態様は、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合するＣＤＲグラフト抗体又はその抗原結合部分を提供する。本発明の第四の態様は、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合するヒト化抗体又はその抗原結合部分を提供する。好ましくは、この抗体又はその一部は単離抗体である。好ましくは、本発明の抗体は、中和ヒト抗Ａβ（１−４２）球状凝集体抗体である。
【０１２８】
Ａ．抗Ａβ（１−４２）球状凝集体抗体を作製する方法
本発明の抗体は、当技術分野で公知の多くの技術の何れかにより調製され得る。これらの方法のうちいくつかを下記で詳述する。
【０１２９】
１．ハイブリドーマ技術を用いた抗Ａβ（１−４２）球状凝集体モノクローナル抗体
ハイブリドーマ、組み換え及びファージディスプレイ技術又はそれらの組み合わせの使用を含む当技術分野で公知の多岐にわたる技術を用いて、モノクローナル抗体を調製することができる。例えば、当技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．１９８１）（これらの参考文献は、それらの全体において参照により組み込まれる。）で教示されるものを含むハイブリドーマ技術を用いて、モノクローナル抗体を作製することができる。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、ハイブリドーマ技術を通じて作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、何らかの真核、原核又はファージクローンを含む単一クローン由来の抗体を指し、それが作製される方法ではない。
【０１３０】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を作製し、これについてスクリーニングするための方法は通常のものであり当技術分野で周知である。ある実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体を作製する方法ならびに、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む方法により産生される抗体を提供するが、この場合、好ましくはハイブリドーマは、本発明の抗原を免疫付与されたマウスから単離される脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させ、次いで本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンに対する融合の結果得られるハイブリドーマをスクリーニングすることにより作製される。簡潔に述べると、Ａβ（１−４２）球状凝集体抗原によりマウスに免疫付与することができる。好ましい実施形態において、免疫反応を刺激するためにアジュバントとともに抗原が投与される。このようなアジュバントには、フロインドの完全又は不完全アジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）又はＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）が含まれる。このようなアジュバントは、局所沈着においてそれを封鎖することにより急速にポリペプチドが分散しないようにし得るか又はこれらは、マクロファージ及び免疫系のその他の成分に対して化学走性がある因子を分泌するように宿主を刺激する物質を含有し得る。好ましくは、ポリペプチドが投与されている場合、免疫付与スケジュールには、数週間にわたる２回以上のポリペプチドの投与が含まれる。
【０１３１】
Ａβ（１−４２）球状凝集体抗原での動物の免疫付与後、抗体及び／又は抗体産生細胞をその動物から得ることができる。動物から採血するか又は屠殺することにより、動物から抗Ａβ（１−４２）球状凝集体抗体含有血清を得る。この血清を動物から得られるままに使用し得るか、免疫グロブリン画分を血清から得ることができるか又は抗Ａβ（１−４２）球状凝集体抗体を血清から精製し得る。このようにして得られる血清又は免疫グロブリンはポリクローナルであり、従って、異なる一連の特性を有する。
【０１３２】
免疫反応が検出されたら、例えば、マウス血清中で抗原Ａβ（１−４２）球状凝集体に対して特異的な抗体を検出し、マウス脾臓を摘出し、脾臓細胞を単離する。次に、脾臓細胞を周知の技術により何らかの適切な骨髄腫細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によりクローニングする。次に、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合することができる抗体を分泌する細胞について、当技術分野で公知の方法によりハイブリドーマクローンをアッセイする。陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスに免疫付与することによって、通常高レベルの抗体を含有する腹水を産生させることができる。
【０１３３】
別の実施形態において、免疫付与動物から、抗体産生不死化ハイブリドーマを調製し得る。免疫付与後、動物を屠殺し、当技術分野で周知であるように脾臓Ｂ細胞を不死化骨髄腫細胞に融合させる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、上出参照。好ましい実施形態において、骨髄腫細胞は免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌細胞株）。融合及び抗生物質選択後、Ａβ（１−４２）球状凝集体もしくはその一部又はＡβ（１−４２）球状凝集体を発現する細胞を用いてハイブリドーマをスクリーニングする。好ましい実施形態において、最初のスクリーニングは、酵素連結免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）を用いて行う（好ましくはＥＬＩＳＡ）。ＥＬＩＳＡスクリーニングの例は、国際出願公開ＷＯ００／３７５０４で提供される（これは参照により本明細書中に組み込まれる。）。
【０１３４】
下記でさらに考察するように、抗Ａβ（１−４２）球状凝集体抗体産生ハイブリドーマを選択し、クローニングし、さらに、ロバストなハイブリドーマ増殖、高抗体産生及び所望の抗体特性を含む所望の特性についてスクリーニングする。ハイブリドーマを培養し、インビボで同系動物において、免疫系を欠損している動物（例えばヌードマウス）において、又はインビトロで細胞培養において、増殖させ得る。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、増殖させる方法は当業者にとって周知である。
【０１３５】
好ましい実施形態において、上述のように、ハイブリドーマはマウスハイブリドーマである。別の好ましい実施形態において、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ又はウマなどの、非ヒト、非マウス種で産生される。別の実施形態において、ハイブリドーマは、ヒト非分泌骨髄腫が抗Ａβ（１−４２）球状凝集体抗体を発現するヒト細胞と融合させられているヒトハイブリドーマである。
【０１３６】
特異的エピトープを認識する抗体断片を公知の技術により作製することができる。例えば、（Ｆａｂ断片を作製するための）パパイン又は（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するための）ペプシンなどの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって、本発明のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を作製することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨＩドメインを含有する。
【０１３７】
２．ＳＬＡＭを用いた抗Ａβ（１−４２）球状凝集体モノクローナル抗体
本発明の別の態様において、米国特許第５，６２７，０５２号、国際出願公開ＷＯ９２／０２５５１及びＢａｂｃｏｃｋ、Ｊ．Ｓ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−７８４８に記載のような、当技術分野で選択的リンパ球抗体法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｔｈｏｄ、（ＳＬＡＭ））と呼ばれる手順を用いて、単一の単離リンパ球から組み換え抗体を作製する。この方法において、抗原特異的溶血プラークアッセイを用いて、関心のある抗体を分泌する単一細胞（例えば、セクション１に記載の免疫付与動物の何れか１つ由来のリンパ球）をスクリーニンするが、ここで、抗原Ａβ（１−４２）球状凝集体、Ａβ（１−４２）球状凝集体のサブユニット又はその断片は、ビオチンなどのリンカーを用いてヒツジ赤血球細胞にカップリングされており、Ａβ（１−４２）球状凝集体に対する特異性を有する抗体を分泌する単一の細胞を同定するために使用される。関心のある抗体分泌細胞の同定後、逆転写酵素−ＰＣＲにより重鎖及び軽鎖可変領域ｃＤＮＡを細胞からレスキューし、次いで、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞において、適切な免疫グロブリン定常領域（例えばヒト定常領域）の下で、これらの可変領域を発現させることができる。次に、例えばＡβ（１−４２）球状凝集体に対する抗体を発現する細胞を単離するために遺伝子移入された細胞を掬いだすことにより、インビボ選択リンパ球由来の増幅免疫グロブリン配列を遺伝子移入された宿主細胞をインビトロでさらに分析及び選択することができる。国際出願公開ＷＯ９７／２９１３１及び国際出願公開ＷＯ００／５６７７２に記載のものなどのインビトロ親和性成熟法などによって、増幅免疫グロブリン配列をインビトロでさらに操作することができる。
【０１３８】
３．トランスジェニック動物を用いた抗Ａβ（１−４２）球状凝集体モノクローナル抗体
本発明の別の実施形態において、Ａβ（１−４２）球状凝集体抗原でヒト免疫グロブリン遺伝子座のいくつか又は全てを含む非ヒト動物に免疫付与することによって抗体を作製する。好ましい実施形態において、非ヒト動物は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウス、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きな断片を含み、マウス抗体産生欠損である、改変マウス系列である。例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）及び米国特許第５，９１６，７７１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，９８５，６１５号、同第５，９９８，２０９号、同第６，０７５，１８１号、同第６，０９１，００１号、同第６，１１４，５９８号及び同第６，１３０，３６４号を参照のこと。また、国際特許公開ＷＯ９１／１０７４１（１９９１年７月２５日公開）、ＷＯ９４／０２６０２（１９９４年２月３日公開）、ＷＯ９６／３４０９６及びＷＯ９６／３３７３５（両方とも１９９６年１０月３１日公開）、ＷＯ９８／１６６５４（１９９８年４月２３日公開）、ＷＯ９８／２４８９３（１９９８年６月１１日公開）、ＷＯ９８／５０４３３（１９９８年１１月１２日公開）、ＷＯ９９／４５０３１（１９９９年９月１０日公開）、ＷＯ９９／５３０４９（１９９９年１０月２１日公開）、ＷＯ００／０９５６０（２０００年２月２４日公開）及びＷＯ００／０３７５０４（２０００年６月２９日公開）も参照のこと。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原−特異的ヒトＭａｂを産生する。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座及びｘ軽鎖遺伝子座の、メガベースの大きさの生殖細胞系列構造ＹＡＣ断片の導入を通じて、ヒト抗体レパートリーのおよそ８０％を含有する。Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）、Ｇｒｅｅｎｅ及びＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）を参照のこと（これらの開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。）。
【０１３９】
４．組み換え抗体ライブラリを用いた抗Ａβ（１−４２）球状凝集体モノクローナル抗体
本発明の抗体を作製するために、インビトロ法を使用することもでき、この場合、所望の結合特異性を有する抗体を同定するために、抗体ライブラリをスクリーニングする。組み換え抗体ライブラリのこのようなスクリーニングのための方法は、当技術分野で周知であり、これには、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、国際出願公開ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、国際出願公開ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒら、国際出願公開ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら、国際出願公開ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、国際出願公開ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、国際出願公開ＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；及びＢａｒｂａｓら（１９９１）、ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２、米国出願公開第２００３０１８６３７４及び国際出願公開ＷＯ９７／２９１３１（これらのそれぞれの内容は参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載の方法が含まれる。
【０１４０】
組み換え抗体ライブラリは、Ａβ（１−４２）球状凝集体又はＡβ（１−４２）球状凝集体の一部で免疫付与された対象由来であり得る。あるいは、組み換え抗体ライブラリは、ナイーブの対象、即ちＡβ（１−４２）球状凝集体で免疫付与されていない対象由来であり得、例えば、ヒトＡβ（１−４２）球状凝集体で免疫付与されていないヒト対象からのヒト抗体ライブラリなどである。ヒトＡβ（１−４２）球状凝集体を含むペプチドを用いて組み換え抗体ライブラリをスクリーニングし、それによりＡβ（１−４２）球状凝集体を認識する抗体を選択することにより、本発明の抗体を選択する。このようなスクリーニング及び選択を行うための方法は、先行する段落における参考文献に記載のものなど、当技術分野で周知である。特定のｋＯｆｆ速度定数でヒトＡβ（１−４２）球状凝集体から解離するものなど、Ａβ（１−４２）球状凝集体に対する特定の結合親和性を有する本発明の抗体を選択するために、当技術分野で公知の表面プラズモン共鳴の方法を使用して、所望のｋＯｆｆ速度定数を有する抗体を選択することができる。特定のＩＣ５０を有するものなど、Ａβ（１−４２）球状凝集体に対する特定の中和活性を有する本発明の抗体を選択するために、ヒトＡβ（１−４２）球状凝集体活性の阻害を評価するための当技術分野で公知の標準的方法を使用し得る。
【０１４１】
ある態様において、本発明は、ヒトＡβ（１−４２）球状凝集体に結合する、単離抗体又はその抗原結合部分に関する。好ましくは、本抗体は中和抗体である。様々な実施形態において、本抗体は組み換え抗体又はモノクローナル抗体である。
【０１４２】
例えば、本発明の抗体はまた、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を担うファージ粒子の表面上で機能的抗体ドメインを提示する。特に、このようなファージは、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えばヒト又はマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために使用することができる。抗原により、例えば標識抗原又は固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉される抗原を用いて、関心のある抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを選択するか又は同定することができる。これらの方法において使用されるファージは、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質の何れかに組み換え融合される、Ｆａｂ、Ｆｖ又はジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインとともにファージから発現されるｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む線状ファージである。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；国際出願公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；及び米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３及び同第５，９６９，１０８号（これらはそれぞれ、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）で開示されるのものが含まれる。
【０１４３】
上記参考文献に記載のように、例えば下記で詳述するように、ヒト抗体又は何らかのその他の所望の抗原結合断片を含み、何らかの所望の宿主（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む。）において発現される全抗体を生成させるために、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離し、使用することができる。例えば、国際出願公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；及びＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；及びＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（これらの参考文献は、それらの全体において参照により組み込まれる。）で開示されているものなどの当技術分野で公知の方法を用いて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片を組み換え作製するための技術を使用することもできる。１本鎖Ｆｖ及び抗体を作製するために使用することができる技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；及びＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載のものが含まれる。
【０１４４】
ファージディスプレイによる組み換え抗体ライブラリのスクリーニングの代わりに、大型のコンビナトリアルライブラリをスクリーニングするための当技術分野で公知のその他の方法を、本発明の２重特異性抗体の同定に適用することができる。あるタイプの代替的な発現系は、Ｓｚｏｓｔａｋ及びＲｏｂｅｒｔｓによる国際出願公開ＷＯ９８／３１７００及びＲｏｂｅｒｔｓ、Ｒ．Ｗ．及びＳｚｏｓｔａｋ、Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２に記載のような、組み換え抗体ライブラリがＲＮＡ−タンパク質融合物として発現されているものである。この系において、その３’末端にプロマイシン、ペプチジルアクセプター抗生物質を有する合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳により、ｍＲＮＡとそれがコードするペプチド又はタンパク質との間で、共有結合融合が生じる。このようにして、コードされるペプチド又はタンパク質、例えば抗体又はその一部の特性（二重特異性抗原への、抗体又はその一部の結合など）に基づき、ｍＲＮＡの複合体混合物（例えばコンビナトリアルライブラリ）から、特異的ｍＲＮＡを濃縮することができる。上記のような組み換え手順によって、このようなライブラリのスクリーニングから回収される抗体又はその一部をコードする核酸配列を発現させることができ（例えば哺乳動物宿主細胞において）、さらに、上述のような、元来選択された配列へと突然変異が導入されているｍＲＮＡ−ペプチド融合物のスクリーニングのさらなるラウンドによるか又は組み換え抗体のインビトロでの親和性成熟のためのその他の方法によるかの何れかで、さらなる親和性成熟に供することができる。
【０１４５】
別のアプローチにおいて、本発明の抗体はまた、当技術分野で公知の酵母ディスプレイ法を用いて作製することもできる。酵母ディスプレイ法において、酵母細胞壁に抗体ドメインをつなぎとめ、酵母の表面上にそれらを提示するために遺伝学的方法を使用する。特に、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えばヒト又はマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために、このような酵母を使用することができる。本発明の抗体を作製するために使用することができる酵母ディスプレイ法の例には、参照により本明細書中に組み込まれる、Ｗｉｔｔｒｕｐら、米国特許第６，６９９，６５８号で開示されるものが含まれる。
【０１４６】
Ｂ．組み換えＡβ（１−４２）球状凝集体抗体の作製
上記のように、本発明の抗体は、当技術分野で公知の技術の多くの何れかにより作製され得る。例えば、宿主細胞からの発現（重及び軽鎖をコードする発現ベクターは標準的技術により宿主細胞に遺伝子移入される。）。「遺伝子移入（トランスフェクション）」という用語の様々な形態は、原核又は真核宿主細胞への外来ＤＮＡの導入のために一般に使用される多岐にわたる技術を包含するものとする（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン遺伝子移入など）。原核又は真核宿主細胞の何れかにおいて本発明の抗体を発現することが可能であるが、真核細胞（及び特に哺乳動物細胞）は、原核細胞よりも、正しく折り畳まれた免疫学的活性のある抗体を構築して分泌する可能性が高いので、真核細胞での抗体の発現が好ましく、哺乳動物宿主細胞中での発現が最も好ましい。
【０１４７】
本発明の組み換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ及びＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載のような、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用されるＵｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１：４２１６−４２２０に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、宿主細胞での抗体の発現を可能にするか又はより好ましくは、宿主細胞が増殖させられる培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間にわたり宿主細胞を培養することによって、抗体が産生される。標準的タンパク質精製法を用いて培地から抗体を回収することができる。
【０１４８】
Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子などの機能的抗体断片を生成させるために宿主細胞を使用することもできる。上記手順における変化が本発明の範囲内であることを理解されたい。例えば、本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖の何れかの機能的断片をコードするＤＮＡを宿主細胞に遺伝子移入することが望ましいものであり得る。関心のある抗原への結合に必要ではない軽鎖及び重鎖の何れか又は両方をコードするＤＮＡのいくつか又は全てを除去するために、組み換えＤＮＡ技術を使用することもできる。このような短縮ＤＮＡ分子から発現される分子もまた本発明の抗体により包含される。さらに、標準的化学架橋法により第二の抗体へ本発明の抗体を架橋することによって、１つの重鎖及び１つの軽鎖が本発明の抗体であり、その他の重鎖及び軽鎖が、関心のある抗原以外の抗原に特異的である２機能性抗体を作製し得る。
【０１４９】
本発明の抗体又はその抗原結合部分の組み換え発現のための好ましい系において、リン酸カルシウムが介在する遺伝子移入によって、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組み換え発現ベクターをｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組み換え発現ベクター内で、抗体重及び軽鎖遺伝子は、遺伝子の高レベル転写を推進するために、それぞれＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントに操作可能に連結される。組み換え発現ベクターはまた、ＤＨＦＲ遺伝子も有し、これにより、メトトレキセート選択／増幅を用いてベクターが遺伝子移入されているＣＨＯ細胞の選択が可能になる。抗体重鎖及び軽鎖の発現を可能にするために、選択された形質転換宿主細胞を培養し、インタクトな抗体を培地から回収する。組み換え発現ベクターを調製し、宿主細胞に遺伝子移入し、形質転換体について選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収するために、標準的分子生物学技術を使用する。またさらに、本発明は、本発明の組み換え抗体が合成されるまで、適切な培地中で本発明の宿主細胞を培養することにより、本発明の組み換え抗体を合成する方法を提供する。この方法はさらに、培地から組み換え抗体を単離することを含む。
【０１５０】
１．抗Ａβ（１−４２）球状凝集体抗体
本明細書中に記載の単離抗Ａβ（１−４２）球状凝集体抗体ＣＤＲ配列（表４参照）は、本発明に従い単離され、上記で列挙されるＣＤＲ配列を含むポリペプチドを含む、Ａβ（１−４２）球状凝集体結合タンパク質の新規ファミリーを確立する。好ましいＡβ（１−４２）球状凝集体結合を有し及び／又はＡβ（１−４２）球状凝集体に関する活性を中和する本発明のＣＤＲを作製し、選択するために、以下に限定されないが、本明細書中に具体的に記載されるものを含む、本発明の結合タンパク質を作製し、Ａβ（１−４２）球状凝集体結合を評価し、及び／又はこれらの結合タンパク質の特性を中和するための、当技術分野で公知の標準的方法を使用することができる。
【０１５１】
２．抗Ａβ（１−４２）球状凝集体キメラ抗体
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体など、抗体の異なる部分が異なる動物種由来である分子である。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知であり、実施例２．１で詳細に考察される。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；及び４，８１６，３９７号（これらはそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）を参照のこと。さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに適切な抗原特異性のマウス抗体分子から遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（これらはそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）を使用することができる。
【０１５２】
ある実施形態において、本発明のキメラ抗体は、上述のマウスモノクローナル抗ヒトＡβ（１−４２）球状凝集体抗体の重鎖定常領域をヒトＩｇＧ１定常領域で置換することにより、作製される。具体的な実施形態において、本発明のキメラ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１５３】
３．抗Ａβ（１−４２）球状凝集体ＣＤＲグラフト抗体
本発明のＣＤＲグラフト抗体は、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１以上が本発明のマウス抗体のＣＤＲ配列で置換されるヒト抗体からの重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む。何らかのヒト抗体からのフレームワーク配列は、ＣＤＲグラフトのための鋳型となり得る。しかし、このようなフレームワーク上への直鎖置換により、抗原に対する結合親和性がある程度喪失されることが多い。オリジナルのマウス抗体に対してヒト抗体が相同であるほど、マウスＣＤＲをヒトフレームワークと組み合わせることにより、親和性を低下させ得るＣＤＲでゆがみが導入される可能性は低くなる。従って、ＣＤＲ抜きのマウス可変フレームワークを置換するために選択されるヒト可変フレームワークは、マウス抗体可変領域フレームワークと少なくとも６５％配列同一性があることが好ましい。より好ましくは、ＣＤＲ抜きのヒト及びマウス可変領域は少なくとも７０％の配列同一性を有する。さらにより好ましくは、ＣＤＲ抜きのヒト及びマウス可変領域は少なくとも７５％の配列同一性を有する。最も好ましくは、ＣＤＲ抜きのヒト及びマウス可変領域は少なくとも８０％の配列同一性を有する。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知であり、実施例２．２で詳細に考察される（ＥＰ２３９，４００；国際出願公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；及び同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）又はリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））及び鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３５２号）。
【０１５４】
４．抗Ａβ（１−４２）球状凝集体ヒト化抗体
下記の表４は、本発明の好ましい抗Ａβ（１−４２）ヒト化球状凝集体抗体のＶＨ及びＶＬ領域ならびにそれに含有されるＣＤＲのアミノ酸配列のリストを含む。
【０１５５】
【表５】
2010530739.tif 000007
2010530739.tif 000008
【０１５６】
ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。既知のヒトＩｇ配列は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ−／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｅｇｎ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ−０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｍ−ｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．−ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｌ／；ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ−；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃｊｐ／．ａｂｏｕｔ．ｙａｓｕｈｉｔｏ−／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎｋｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；Ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／．ａｂｏｕｔ．ｒｅｋ／ＡＥＰ−Ｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／．ａｂｏｕｔ．ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；Ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／．ａｂｏｕｔ．ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍ−ｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｕｂｃｇ０７ｓ／；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｈ−ｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ−ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒ  ｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ．Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）、それぞれ全体的に参照により本明細書中に組み込まれる。免疫原性を低下させるか又は、当技術分野で公知ののような、結合、親和性、会合速度、解離速度、結合力、特異性、半減期又は何らかのその他の適切な特性を低下、促進又は変化させるために、このようなインポート（取り込まれる）配列を使用することができる。
【０１５７】
ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変化させる、好ましくは向上させるために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換され得る。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用のモデリング及び抗原結合及び特定の位置での通常はないフレームワーク残基を同定するための配列比較によって、同定される。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）（これらは、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）参照）。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を示し、提示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの提示の検討により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンのその抗原への結合能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性向上などの所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基を選択し、コンセンサス及びインポート配列から組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、直接的に、及び最も実質的に、抗原結合に影響を与えることに関与する。抗体は、以下に限定されないが、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４）；国際出願公開ＷＯ９１／０９９６７、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５；ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９２４６、ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６、ＥＰ２３９，４００、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，９７６，８６２号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１７，４８３号、同第５，８１４，４７６号、同第５，７６３，１９２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５２号、同第６，２０４，０２３号、同第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５，５３９号；��第４，８１６，５６７号、（それぞれ、全体的に、そこで引用される参考文献を含め、参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載のものなど、当技術分野で公知の様々な技術を用いて、ヒト化され得る。
【０１５８】
Ｃ．抗体の作製及び抗体産生細胞株
上記のように、好ましくは、本発明の抗Ａβ（１−４２）球状凝集体抗体は、例えば、当技術分野で公知のいくつかのインビトロ及びインビボアッセイの何れか１つにより評価したとき、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性を低下させるか又は中和する高い能力を示す（例えば、下記の実施例参照）。
【０１５９】
ある種の実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域を含む。好ましくは、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域である。さらに、本抗体は、軽鎖定常領域、κ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域の何れか、を含み得る。好ましくは、本抗体はκ軽鎖定常領域を含む。あるいは、抗体部分は、例えば、Ｆａｂ断片又は１本鎖Ｆｖ断片であり得る。
【０１６０】
抗体エフェクター機能を変化させるためのＦｃ部分におけるアミノ酸残基の置換は当技術分野で公知である（Ｗｉｎｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２６０号及び同第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃ部分は、例えば、抗体及び抗原−抗体複合体の、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び半減期／クリアランス速度などのいくつかの重要なエフェクター機能を媒介する。いくつかの場合において、これらのエフェクター機能は、治療用抗体に対して好ましいが、その他の場合においては、治療目的によっては、不要であり得るか又は有害であり得る。ある種のヒトＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、それぞれＦｃγＲ及び補体Ｃ１ｑへの結合を介してＡＤＣＣ及びＣＤＣを媒介する。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する重要な成分である。さらに別の実施形態において、抗体のエフェクター機能が変更されるように、抗体の定常領域、例えば抗体のＦｃ領域において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換される。
【０１６１】
ある実施形態は、本発明の抗体又は抗体部分が誘導体化されるか又は別の機能分子（例えば別のペプチド又はタンパク質）に連結される、標識された結合タンパク質を提供する。例えば、本発明の抗体又は抗体部分を機能的に連結することにより（化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合又はその他により）、１以上のその他の分子部分へ、例えば、別の分子（ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど）との抗体又は抗体部分の会合を媒介することができる、別の抗体（例えば、二特異的抗体又はダイアボディ）、検出可能な試薬、細胞毒性薬、医薬品及び／又はタンパク質又はペプチドへ、本発明の標識された結合タンパク質を誘導体化することができる。
【０１６２】
本発明の抗体又は抗体部分が誘導体化され得る有用な検出可能な試薬には、蛍光化合物が含まれる。代表的な蛍光性の検出可能試薬には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリンなどが含まれる。抗体はまた、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素で誘導体化され得る。抗体が検出可能な酵素で誘導体化される場合、検出可能な反応産物を生成させるために酵素が使用するさらなる試薬を添加することによりこれが検出される。例えば、検出可能な試薬ホースラディッシュペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素及びジアミノベンジジンの添加により、検出可能である有色の反応産物がもたらされる。ビオチンで抗体を誘導体化し、アビジン又はストレプトアビジン結合の間接的測定を通じて検出し得る。
【０１６３】
本発明の別の実施形態は、結晶化結合タンパク質を提供する。好ましくは、本発明は、本明細書中で開示されるような抗Ａβ（１−４２）球状凝集体全抗体及びその断片の結晶及び、このような結晶を含む製剤及び組成物に関する。ある実施形態において、結晶化結合タンパク質は、結合タンパク質の可溶性形態よりもインビボでの半減期が長い。別の実施形態において、本結合タンパク質は、結晶化後、生物学的活性を保持する。
【０１６４】
本発明の結晶化結合タンパク質は、当技術分野で公知の方法に従い、及び参照により本明細書中に組み込まれる国際出願公開ＷＯ０２／０７２６３６で開示されるように、調製され得る。
【０１６５】
本発明の別の実施形態は、抗体又はその抗原結合部分が１以上の炭水化物残基を含むグリコシル化結合タンパク質を提供する。新生インビボタンパク質産生は、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセシングを受け得る。特に、糖（グリコシル）残基を酵素により添加し得るが、これは、グリコシル化として知られるプロセスである。結果として得られる、共有結合されるオリゴ糖側鎖を有するタンパク質は、グリコシル化タンパク質又は糖タンパク質として知られる。抗体は、Ｆｃドメインならびに可変ドメインにおいて１以上の炭水化物残基を有する糖タンパク質である。Ｆｃドメインにおける炭水化物残基は、抗体の抗原結合又は半減期における影響が最小限であるＦｃドメインのエフェクター機能に重要な影響を及ぼす（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１（２００５）、ｐｐ．１１−１６）。一方、可変ドメインのグリコシル化は、抗体の抗原結合活性に影響を及ぼし得る。可変ドメインにおけるグリコシル化は、おそらく立体障害のために、抗体結合親和性に負の影響を及ぼし得るか（Ｃｏ、Ｍ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）３０：１３６１−１３６７）、又は結果として、抗原に対する親和性を向上させ得る（Ｗａｌｌｉｃｋ、Ｓ．Ｃ．ら、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８）１６８：１０９９−１１０９；Ｗｒｉｇｈｔ、Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９１）１０：２７１７−２７２３）。
【０１６６】
本発明のある態様は、結合タンパク質のＯ−又はＮ−結合グリコシル化部位が突然変異させられているグリコシル化部位突然変異体を生じさせることに関する。当業者は、標準的な周知の技術を用いて、このような突然変異体を生じさせることができる。生物学的活性を保持するが結合活性が向上しているか又は低下しているグリコシル化部位突然変異体の作製は、本発明の別の目的である。
【０１６７】
さらに別の実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合部分のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（即ちこの抗体はグリコシル化を欠く。）。例えば抗原に対する抗体の親和性を向上させるために、グリコシル化を変化させることができる。例えば抗体配列内のグリコシル化の１以上の部位を変化させることにより、このような糖修飾を行うことができる。例えば、結果として１以上の可変領域グリコシル化部位が除去され、それによりその部位のグリコシル化が除去される、１以上のアミノ酸置換を行うことができる。このような非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性を向上させ得る。このようなアプローチは、国際出願公開ＷＯ０３／０１６４６６Ａ２及び米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号（これらのそれぞれが、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）でさらに詳しく記載されている。
【０１６８】
さらに又はあるいは、フコシル残基の量が少なくなった低フコシル化抗体又は分岐ＧｌｃＮＡｃ構造が増加した抗体など、グリコシル化のタイプが変化した本発明の修飾抗体を作製することができる。このような改変グリコシル化パターンにより、抗体のＡＤＣＣ能が向上することが明らかになっている。例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞において抗体を発現させることにより、このような糖修飾を行うことができる。グリコシル化機構が変化した細胞は、当技術分野で記載されており、本発明の組み換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が改変された抗体を産生させるために、宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１ならびに欧州特許第ＥＰ１，１７６，１９５号；国際出願公開ＷＯ０３／０３５８３５号及びＷＯ９９／５４３４２８０号（これらのそれぞれは、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）を参照のこと。
【０１６９】
タンパク質グリコシル化は、関心のあるタンパク質のアミノ酸配列ならびにそのタンパク質が発現される宿主細胞に依存する。生物によってグリコシル化酵素が異なり得（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ）、利用可能な基質が異なり得る（ヌクレオチド糖）。このような因子のために、タンパク質グリコシル化パターン及びグリコシル残基の組成は、特定のタンパク質が発現される宿主系に依存して異なり得る。本発明において有用なグリコシル残基には、以下に限定されないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミン及びシアル酸が含まれ得る。好ましくはグリコシル化結合タンパク質は、グリコシル化パターンがヒトであるようにグリコシル残基を含む。
【０１７０】
様々なタンパク質グリコシル化の結果、タンパク質の特徴が異なり得ることは当業者にとって公知である。例えば、酵母などの微生物宿主で産生され、酵母内在性経路を使用してグリコシル化される治療用タンパク質の効率は、ＣＨＯ細胞株などの哺乳動物細胞中で発現される同じタンパク質の効率と比較して低下している可能性がある。このような糖タンパク質はまた、ヒトにおいて免疫原性があり得、投与後のインビボでの半減期が短い可能性がある。ヒト及びその他の動物における特異的受容体は、特異的グリコシル残基を認識し、血流からのタンパク質の急速なクリアランスを促進し得る。その他の有害事象には、タンパク質折り畳み、溶解性、プロテアーゼに対する感受性、トラフィッキング、輸送、区画化、分泌、その他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性又はアレルギー誘発性の変化が含まれ得る。従って、実施者は、特異的組成及びグリコシル化パターン、例えば、ヒト細胞又は意図される対象動物の種特異的細胞において産生されるものと同一であるか又は少なくとも類似のグリコシル化組成及びパターンを有する治療用タンパク質を好み得る。宿主細胞のものとは異なるグリコシル化タンパク質の発現は、異種グリコシル化酵素を発現させるために宿主細胞を遺伝子操作することにより達成され得る。当技術分野で公知の技術を用いて、実施者は、ヒトタンパク質グリコシル化を示す抗体又はその抗原結合部分を生成させ得る。例えば、酵母株は、これらの酵母株において産生されるグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）が動物細胞、特にヒト細胞のものと同一のタンパク質グリコシル化を示すように非天然のグリコシル化酵素を発現させるために遺伝子操作されている（米国特許出願公開２００４００１８５９０及び２００２０１３７１３４及び国際出願公開ＷＯ０５／１００５８４Ａ２）。
【０１７１】
「多価結合タンパク質」という用語は、２以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を示すために本願で使用される。多価結合タンパク質は、好ましくは３以上の抗原結合部位を有するように改変され、通常は天然抗体ではない。「多特異的結合タンパク質」という用語は、２以上の関連又は非関連標的に結合することができる結合タンパク質を指す。二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質は、本明細書中で使用される場合、２以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質であり、３価又は多価結合タンパク質である。このようなＤＶＤは単一特異的、即ち１つの抗原に結合することができるか、又は多特異的、即ち２以上の抗原に結合することができる。２つの重鎖ＤＶＤポリペプチド及び２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合タンパク質は、ＤＶＤＩｇを指す。ＤＶＤＩｇの各半分は、重鎖ＤＶＤポリペプチド及び軽鎖ＤＶＤポリペプチド及び２つの抗原結合部位を含む。各結合部位は、抗原結合部位ごとに抗原結合に関与する全部で６つのＣＤＲを有する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。ＤＶＤ結合タンパク質及びＤＶＤ結合タンパク質を作製する方法は、米国特許出願１１／５０７，０５０で開示されており、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１７２】
本発明のある態様は、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合することができる結合タンパク質を含むＤＶＤ結合タンパク質に関する。好ましくは、ＤＶＤ結合タンパク質は、Ａβ（１−４２）球状凝集体及び第二の標識に結合することができる。
【０１７３】
結合タンパク質に加えて、本発明はまた、本発明のこのような結合タンパク質に対して特異的な抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体にも関する。
【０１７４】
抗Ｉｄ抗体は、通常は別の抗体の抗原結合領域と会合するユニークな決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄは、結合タンパク質又はそのＣＤＲ含有領域で動物に免疫付与することにより調製することができる。免疫付与された動物は、免疫付与抗体のイディオタイプ決定基を認識し、それに対して反応し、抗Ｉｄ抗体を産生する。抗Ｉｄ抗体はまた、また別の動物において免疫反応を誘導するために、「免疫原」としても使用され得、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生する。
【０１７５】
さらに、当業者にとって当然のことながら、ライブラリのメンバー宿主細胞が変異グリコシル化パターンを有する関心のあるタンパク質を産生するように、様々なグリコシル化酵素を発現するよう遺伝子操作された宿主細胞のライブラリを用いて関心のあるタンパク質を発現させ得る。次いで、実施者は、特定の新規グリコシル化パターンを有する関心のあるタンパク質を選択し、単離し得る。好ましくは、特に選択された新規グリコシル化パターンを有するタンパク質は、生物学的特性が向上するか又は変化する。
【０１７６】
Ｄ．抗Ａβ（１−４２）抗体の使用
Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合するそれらの能力を考えると、酵素免疫測定吸着法アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）又は組織免疫組織化学などの従来の免疫アッセイを用いて、Ａβ（１−４２）球状凝集体を（例えば、血清、全血、ＣＳＦ、脳組織又は血漿などの生体試料中で）検出するために、本発明の抗Ａβ（１−４２）球状凝集体抗体又はその一部を使用することができる。従って、本発明は、本発明の抗体又は抗体部分と生体試料を接触させ、Ａβ（１−４２）球状凝集体に結合する抗体（又は抗体部分）又は非結合抗体（又は抗体部分）の何れかを検出し、それにより生体試料中のＡβ（１−４２）球状凝集体を検出することを含む、生体試料中のＡβ（１−４２）球状凝集体を検出するための方法を提供する。本抗体は、結合又は非結合抗体の検出を促進するための検出可能な物質で直接又は間接的に標識される。適切な検出可能物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質及び放射性物質が含まれる。適切な酵素の例にはホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリスリンが含まれ；発光物質の例にはルミノールが含まれ；適切な放射性物質の例には、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ又は１５３Ｓｍが含まれる。
【０１７７】
抗体を標識する代わりに、検出可能な物質で標識された組み換えＡβ（１−４２）球状凝集体標準物質及び非標識抗Ａβ（１−４２）球状凝集体抗体を用いる競合免疫アッセイにより、体液中のＡβ（１−４２）球状凝集体をアッセイすることができる。このアッセイにおいて、生体試料、標識した組み換えＡβ（１−４２）球状凝集体標準物質及び抗Ａβ（１−４２）球状凝集体抗体を組み合わせ、非標識抗体に結合した標識組み換えＡβ（１−４２）球状凝集体標準物質の量を調べる。生体試料中のＡβ（１−４２）球状凝集体の量は、抗Ａβ（１−４２）球状凝集体抗体に結合したｒＡβ（１−４２）球状凝集体標準物質の量と反比例する。
【０１７８】
本発明の抗体及び抗体部分は、好ましくは、インビトロ及びインビボの両方で、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性を中和することができる。従って、本発明のこのような抗体及び抗体部分は、例えば、Ａβ（１−４２）球状凝集体を含有する細胞培養において、ヒト対象において、又は本発明の抗体が交差反応するＡβ（１−４２）球状凝集体を有するその他の哺乳動物対象において、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性を阻害するために使用することができる。ある実施形態において、本発明は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体活性が阻害されるように、Ａβ（１−４２）球状凝集体を本発明の抗体又は抗体部分と接触させることを含む、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性を阻害するための方法を提供する。例えば、Ａβ（１−４２）球状凝集体を含有するか又は含有する疑いのある細胞培養において、培養中でＡβ（１−４２）球状凝集体活性を阻害するために、本発明の抗体又は抗体部分を培地に添加することができる。
【０１７９】
別の実施形態において、本発明は、対象において、有利に、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性が有害である疾病又は疾患（例えばアルツハイマー病などのアミロイドーシス）に罹患している患者から、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性を低下させるための方法を提供する。従って、本発明は、このような疾病又は疾患に罹患している対象においてＡβ（１−４２）球状凝集体活性を低下させるための方法を提供し、この方法は、対象におけるＡβ（１−４２）球状凝集体活性が低下させられるように、本発明の抗体又は抗体部分を対象に投与することを含む。好ましくは、Ａβ（１−４２）球状凝集体はヒトＡβ（１−４２）球状凝集体であり、対象はヒト対象である。あるいは、対象は、本発明の抗体が結合することができるＡβ（１−４２）球状凝集体を発現する哺乳動物であり得る。またさらに、対象は、（例えば、Ａβ（１−４２）球状凝集体の投与によって又はＡβ（１−４２）球状凝集体トランス遺伝子の発現によって）Ａβ（１−４２）球状凝集体が導入されている哺乳動物であり得る。本発明の抗体は治療目的のためにヒト対象に投与され得る。さらに、本発明の抗体は、獣医学の目的のための、又はヒト疾患の動物モデルとしての、本抗体が結合することができるＡβ（１−４２）球状凝集体を発現する非ヒト哺乳動物に投与され得る。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性を評価するために有用であり得る（例えば、投与量及び投与の時間的経過の試験）。
【０１８０】
本明細書中で使用される場合、「Ａβ（１−４２）球状凝集体活性が有害である疾患」という用語は、その疾患に罹患している対象におけるＡβ（１−４２）球状凝集体の存在が、その疾患の病態生理学又はその疾患の悪化に関与する因子の何れかに関与することが示されているか又はその疑いがある、疾病及びその他の疾患を含むものとする。従って、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性が有害である疾患は、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性の低下により、その疾患の症候及び／又は進行の一部又は全てが緩和されることが予想される疾患である。このような疾患は例えばその疾患に罹患している対象の体液中のＡβ（１−４２）球状凝集体の濃度の上昇（例えば、対象の、血清、脳組織、血漿、脳脊髄液中などのＡβ（１−４２）球状凝集体の濃度の上昇）によって明らかとなり得、これらは、例えば、上述のような抗Ａβ（１−４２）球状凝集体抗体を使用して検出することができる。本発明の抗体で治療することができる疾患の非限定例には、本発明の抗体の医薬組成物に関連する下記セクションで考察される疾患が含まれる。
【０１８１】
Ｄ．医薬組成物
本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合部分及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物も提供する。本発明の抗体を含む医薬組成物は、以下に限定されないが、疾患の診断、検出又は監視における、疾患又はその１以上の症候の予防、治療、管理又は改善における、及び／又は研究における、使用のためのものである。具体的な実施形態において、組成物は１以上の本発明の抗体を含む。別の実施形態において、本医薬組成物は、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性が有害である疾患を治療するための本発明の抗体以外の１以上の本発明の抗体及び１以上の予防薬又は治療薬を含む。好ましくは、疾患又はその１以上の症候の予防、治療、管理又は改善に有用であることが知られているか又はそれにおいて使用されてきたか又は現在使用されている予防薬又は治療薬である。これらの実施形態によると、組成物は、担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含み得る。
【０１８２】
本発明の抗体及び抗体部分は、対象への投与に適切な医薬組成物に組み込まれ得る。通常、医薬組成物は、本発明の抗体又は抗体部分及び医薬的に許容可能な担体を含む。本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能な担体」には、生理学的に適合性である、あらゆる及び全ての、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。医薬的に許容可能な担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにこれらの組合せの１以上が含まれる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど又は塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。医薬的に許容可能な担体には、抗体又は抗体部分の貯蔵期間又は有効性を高める、湿潤剤又は乳化剤、保存料又は緩衝剤などの、湿潤化物質又は少量の補助物質などもさらに含まれ得る。
【０１８３】
１以上の本発明の抗体又は１以上の本発明の抗体の組み合わせ及び、疾患又はその１以上の症候の予防、管理、治療又は改善に有用な予防薬又は治療薬を投与するために、様々な送達系が知られており、使用することができる（例えば、リポソーム中での封入、微粒子、マイクロカプセル、抗体又は抗体断片を発現させることができる組み換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ及びＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）参照）、レトロウイルス又はその他のベクターなどの一部としての核酸の構築物。）。本発明の予防薬又は治療薬を投与する方法には、以下に限定されないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与及び粘膜投与（例えば、鼻内及び口腔経路）が含まれる。さらに、例えば、吸入器又はネブライザーの使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺内投与を使用し得る。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号及び同第４，８８０，０７８号；及び国際出願公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６及びＷＯ９９／６６９０３（これらのそれぞれは、それらの全体において、参照により本明細書中に組み込まれる。）を参照のこと。ある実施形態において、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（Ｒ）肺内薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて、本発明の抗体、併用療法又は本発明の組成物を投与する。具体的な実施形態において、筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、鼻内、肺内又は皮下により本発明の予防薬又は治療薬を投与する。何らかの従来経路により、例えば、点滴又はボーラス注射により、上皮又は皮膚粘膜内層を通じた吸収（例えば、経口粘膜、直腸及び小腸粘膜など）により、予防薬又は治療薬を投与し得、その他の生物学的活性のある薬物とともに投与し得る。投与は全身性又は局所性であり得る。
【０１８４】
具体的な実施形態において、治療の必要がある領域に局所的に本発明の予防薬又は治療薬を投与することは望ましいものであり得；これは、例えば、限定するものではないが、局所点滴により、注射により、又は移植手段により（該移植片は、膜及びマトリクスを含む多孔性又無孔性材料、例えば、サイラスティック膜、ポリマー、繊維状マトリクス（例えばＴｉｓｓｕｅｌ（Ｒ））又はコラーゲンマトリクスなど、である。）、達成され得る。ある実施形態において、本発明の１以上の抗体の有効量アンタゴニストは、疾患又はその症候を予防、治療、管理及び／又は改善するために、対象の病変部に局所的に投与される。別の実施形態において、１以上の本発明の抗体の有効量は、疾患又は１以上のその症候を予防、治療、管理及び／又は改善するために、本発明の抗体以外の１以上の治療薬（例えば１以上の予防薬又は治療薬）の有効量と組み合わせて、病変部に局所的に投与される。
【０１８５】
別の実施形態において、制御放出又は持続放出系で予防薬又は治療薬を送達させることができる。ある実施形態において、制御放出又は持続放出を行うためにポンプを使用し得る（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４）。別の実施形態において、本発明の治療薬の制御放出又は持続放出を行うためにポリマー性材料を使用することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ及びＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｓｍｏｌｅｎ及びＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ及びＰｅｐｐａｓ、１９８３、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１参照；また、Ｌｅｖｙら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５）；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；国際出願公開ＷＯ９９／１５１５４；及び国際出願公開ＷＯ９９／２０２５３も参照）。持続放出製剤で使用されるポリマーの例には、以下に限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステルが含まれる。好ましい実施形態において、持続放出製剤で使用されるポリマーは、不活性で、滲出不純物不含であり、保管時に安定であり、滅菌されており、生体分解性である。さらに別の実施形態において、制御又は持続放出系は、予防又は治療標的の隣接して置かれ得、従って、必要とされるのは全身的用量のうちわずかである（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、前出、ｖｏｌ．２、ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）参照）。
【０１８６】
制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）により概説で考察されている。本発明の１以上の治療薬を含む持続放出製剤を調製するために、当業者にとって公知の何らかの技術を使用することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、国際出願公開ＷＯ９１／０５５４８、国際出願公開ＷＯ９６／２０６９８、Ｎｉｎｇら、１９９６、「Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ」、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３９：１７９−１８９、Ｓｏｎｇら、１９９５、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」、ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０：３７２−３９７、Ｃｌｅｅｋら、１９９７、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３−８５４及びＬａｍら、１９９７、「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９−７６０（これらのそれぞれは、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）参照。
【０１８７】
具体的な実施形態において、本発明の組成物が、予防薬又は治療薬をコードする核酸である場合、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、細胞内に入るようにそれを投与することによって、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）又は直接注入によって又は微粒子銃の使用によって（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）、又は脂質もしくは細胞表面受容体もしくは遺伝子移入剤でのコーティングによって又は核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結してそれを投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８参照）、そのコードされる予防薬又は治療薬の発現を促進するためにインビボで核酸を投与することができる。あるいは、核酸を細胞内にを導入し、相同組み換えによる発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０１８８】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように処方される。投与経路の例には、以下に限定されないが、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口、鼻内（例えば吸入）、経皮（例えば局所）、経粘膜及び直腸投与が含まれる。具体的な実施形態において、本組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻内又は局所投与に適している医薬組成物としての通常の手順に従い処方される。通常、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤及び局所麻酔薬（例えば、注射部位の疼痛を緩和するためのリドカインなど）も含み得る。
【０１８９】
本発明の組成物が局所投与されるべき場合、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョン又はその他の当業者にとって周知の形態で本組成物を処方することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９５）参照。噴霧用ではない局所投与形態の場合、局所塗布に適合し、好ましくは水よりも動的粘性が高い担体又は１以上の賦形剤を含む粘着性から半固体状又は固体形態が通常は使用される。適切な製剤には、以下に限定されないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、塗布薬、軟膏（ｓａｌｖｅ）などが含まれ、必要に応じて、それらは滅菌されているか又は例えば浸透圧などの様々な特性に影響を与えるための助剤（例えば、保存料、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤又は塩）と混合される。その他の適切な局所投与形態には、好ましくは、固体又は液体不活性担体と組み合わせられた活性成分が加圧揮発剤（ｐｒｅｓｓｕｒｉｚｅｄ  ｖｏｌａｔｉｌｅ）（例えばフレオンなどのガス噴射剤）との混合物中又は搾り出しボトル中に封入される、噴霧用エアロゾル製剤が含まれる。モイスチャライザー又は保湿剤も必要に応じて医薬組成物及び投与形態に添加され得る。このようなさらなる成分の例は当技術分野で周知である。
【０１９０】
本発明の方法が、組成物の鼻内投与を含む場合、エアロゾル形態、スプレー、ミスト又はドロップの形態で組成物を処方することができる。特に、本発明に従う使用のための予防薬又は治療薬は、都合よく、適切な推進薬（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の適切な気体）の使用とともに、加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達させることができる。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、定量を送達するための値を与えることにより決定され得る。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ又はｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）での使用のためのカプセル及びカートリッジ（例えばゼラチンからなる。）は、本化合物と、ラクトース又はデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末混合物を含有して処方され得る。
【０１９１】
本発明の方法が経口投与を含む場合、錠剤、カプセル、カプセル（ｃａｃｈｅｔｓ）、ジェルキャップ、溶液、懸濁液などの形態で組成物を経口用に処方することができる。結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬的に許容可能な賦形剤とともに従来の手法により錠剤又はカプセルを調製することができる。当技術分野で周知の方法により錠剤を被覆し得る。経口投与用の液体製剤は、以下に限定されないが、溶液、シロップ又は懸濁液の形態をとり得るか、又はそれらは、使用前に水又はその他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として与えられ得る。懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化された食用脂）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分別された植物油）；及び保存料（例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）などの医薬的に許容可能な添加物とともに、従来の手順により、このような液体製剤を調製し得る。本製剤はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味料、色素及び甘味料も含有し得る。経口投与のための製剤は、予防薬又は治療薬の、徐放、制御放出又は持続放出のために適切に処方され得る。
【０１９２】
本発明の方法は、例えば、エアロゾル化剤とともに処方される組成物の吸入器又はネブライザーの使用による、複数の投与を含み得る。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号及び同第４，８８０，０７８号；及び国際出願公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６及びＷＯ９９／６６９０３（これらのそれぞれは、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）参照。具体的な実施形態において、本発明の抗体、併用療法及び／又は本発明の組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（Ｒ）肺内薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて投与される。
【０１９３】
本発明の方法は、注射による（例えば、ボーラス注射又は連続的点滴による）非経口投与のために処方される組成物の投与を含み得る。注射用の製剤は、保存料を添加された単位投与形態（例えば、アンプル又は複数回使用容器中）で与えられ得る。本組成物は、懸濁液、溶液又は油中エマルジョン又は水性ビヒクルなどの形態をとり得、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調剤に必要な薬剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）も含有し得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば滅菌発熱物質不含水）での構成のための粉末形態であり得る。本発明の方法は、さらに、デポー製剤として処方される組成物の投与を含み得る。このような長時間作用製剤は、移植（例えば、皮下又は筋肉内）により又は筋肉内注射により投与され得る。従って、例えば、本組成物は、適切なポリマー性又は疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂とともに、又は難溶性誘導体として（例えば難溶性の塩として）、処方され得る。
【０１９４】
本発明の方法は、中性又は塩形態として処方される組成物の投与を包含する。医薬的に許容可能な塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸由来のものなどの陰イオンとともに形成されるものなど、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど由来のものなどの陽イオンとともに形成されるものが含まれる。
【０１９５】
一般に、組成物の成分は、個別に又は単位投与形態で一緒に混合されて、例えば、活性物質の量を表示するアンプル又はサシェなどの密封容器中の凍結乾燥粉末又は水不含濃縮物として、供給される。投与方式が点滴である場合、滅菌された医薬グレードの水又は塩水を含有する点滴瓶とともに組成物を調剤することができる。投与方式が注射によるものである場合、注射のための滅菌水又は塩水のアンプルは、投与前に成分が混合され得るように提供され得る。
【０１９６】
特に、本発明はまた、予防薬又は治療薬又は本発明の医薬組成物の１以上が、薬物の量を表示するアンプル又はサシェなどの密封容器中に封入されることも提供する。ある実施形態において、予防薬又は治療薬の１以上又は本発明の医薬組成物は、密封容器中で乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は水不含の濃縮物として供給され、対象への投与のために、（例えば水又は塩水で）適切な濃度に再構成され得る。好ましくは、予防薬又は治療薬又は本発明の医薬組成物の１以上は、少なくとも５ｍｇ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ又は少なくとも１００ｍｇの単位投与量で、密封容器中で乾燥した滅菌凍結乾燥粉末として供給される。凍結乾燥された予防薬又は治療薬又は本発明の医薬組成物は、その元の容器中で２℃から８℃の間で保管すべきであり、予防薬又は治療薬又は本発明の医薬組成物は、再構成後、１週間以内、好ましくは５日間以内、７２時間以内、４８時間以内、２４時間以内、１２時間以内、６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与すべきである。代替的な実施形態において、予防薬又は治療薬又は本発明の医薬組成物の１以上は、薬物の量及び濃度を表示する密封容器中で液体形態で供給される。好ましくは、投与される組成物の液体形態は、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ又は少なくとも１００ｍｇ／ｍＬで密封容器中で供給される。液体形態はその元の容器中で２℃から８℃の間で保管すべきである。
【０１９７】
本発明の抗体及び抗体部分は、非経口投与に適切な医薬組成物に組み込まれ得る。好ましくは、この抗体又は抗体部分は、０．１−２５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射用の溶液として調製される。注射用の溶液は、フリントガラス又はアンバーバイアル、アンプル又はプレフィルドシリンジ中で、液体又は凍結乾燥製剤の形態の何れかから構成され得る。緩衝液は、ｐＨ５．０から７．０（最適にはｐＨ６．０）のＬ−ヒスチジン（１−５０ｍＭ、最適には５−１０ｍＭ）であり得る。その他の適切な緩衝液には、以下に限定されないが、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムが含まれる。０−３００ｍＭの濃度（液体投与形態の場合、最適には１５０ｍＭ）で溶液の毒性を変化させるために、塩化ナトリウムを使用することができる。凍結乾燥製剤の場合、凍結保護剤、基本的には０−１０％スクロース（最適には０．５−１．０％）を含み得る。その他の適切な凍結保護剤には、トレハロース及びラクトースが含まれる。凍結乾燥投与形態の場合、充填剤、基本的には１−１０％マンニトール（最適には２−４％）を含み得る。安定化剤は、基本的には１−５０ｍＭ  Ｌ−メチオニン（最適には５−１０ｍＭ）を液体及び凍結乾燥投与形態の両方で使用することができる。その他の適切な充填剤には、グリシン及びアルギニンが含まれ、０−０．０５％ポリソルベート−８０（最適には０．００５−０．０１％）として含まれ得る。さらなる界面活性剤には、以下に限定されないが、ポリソルベート２０及びＢＲＩＪ界面活性剤が含まれる。非経口投与のための注射用の溶液として調製される本発明の抗体及び抗体部分を含む医薬組成物は、治療用タンパク質（例えば抗体）の吸収又は分散を促進するために使用されるものなどのアジュバントとして有用な物質をさらに含み得る。特に有用なアジュバントは、Ｈｙｌｅｎｅｘ（Ｒ）（組み換えヒトヒアルロニダーゼ）などのヒアルロニダーゼである。注射用溶液におけるヒアルロニダーゼの添加により、非経口投与、特に皮下投与後のヒトのバイオアベイラビリティーが向上する。これによりまた、疼痛及び不快感を軽減し、注入部位の反応の発生を最小限にしながら、注射部位の体積を大きくする（即ち１ｍＬ超）ことも可能になる（国際出願公開ＷＯ０４／０７８１４０及び米国特許出願公開ＵＳ２００６１０４９６８（参照により本明細書中に組み込まれる。）参照。）。
【０１９８】
本発明の組成物は様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体、半固体及び固体投与形態、例えば溶液（例えば、注射用及び点滴用溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム及び坐薬などが含まれる。好ましい形態は、意図する投与方法及び治療用途に依存する。通常の好ましい組成物は、注射用又は点滴用溶液の形態、例えば他の抗体によるヒトの受動免疫法のために使用されるものと類似の組成物など、である。好ましい投与方法は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態において、本抗体は静脈内点滴又は注射によって投与される。別の好ましい実施形態において、本抗体は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。
【０１９９】
治療用組成物は、通常、製造及び保管の条件下で無菌かつ安定でなければならない。本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム又はその他の高い薬物濃度に適した秩序構造として処方され得る。滅菌注射用溶液は、活性合物（即ち抗体又は抗体部分）を、必要な量で、適切な溶媒中に、必要に応じて上記で列挙した成分の１以上の組合せと共に配合し、続いてろ過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒及び上記で列挙したものからの必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を配合することにより調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌凍結乾燥粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に何らかのさらなる所望の成分を加えた粉末を、予めろ過滅菌したこれらの溶液から得る、真空乾燥及び噴霧乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、及び、界面活性剤を使用することにより、維持し得る。組成物中に吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に含むことにより、注射用組成物を持続的に吸収させるようにすることができる。
【０２００】
本発明の抗体及び抗体部分は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができるが、多くの治療用途に対して、好ましい投与の経路／方法は、皮下注射、静脈内注射又は点滴である。当業者にとって当然のことながら、投与の経路及び／又は方法は、所望の結果に依存して変化する。ある実施形態において、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル型送達系を含む制御放出製剤など、化合物を急速な放出から保護する担体を用いて活性化合物を調製し得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生体分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製のための多くの方法が特許取得されているか、又は当業者にとって一般に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８参照。
【０２０１】
ある実施形態において、例えば不活性希釈剤又は同化可能な可食担体と共に、本発明の抗体又は抗体部分を経口投与し得る。この化合物（及び必要に応じてその他の成分）を、硬殻又は軟殻のゼラチンカプセルに封入するか、錠剤に圧縮するか又は対象の食餌に直接混合することもできる。治療剤の経口投与の場合、賦形剤とともにこの化合物を配合し、経口摂取錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハースなどの形態で使用し得る。本発明の化合物を非経口投与以外によって投与するために、この化合物をその不活性化を阻止する物質で被覆するか、又はこの化合物をこれらと一緒に投与することが必要であり得る。
【０２０２】
補助的な活性物質を組成物中に配合することもできる。ある実施形態において、Ａβ（１−４２）活性が有害である疾患を治療するのに有用な１以上のさらなる治療薬と一緒に、本発明の抗体又は抗体部分を処方、及び／又は一緒に投与する。例えば、本発明の抗Ａβ（１−４２）抗体の１つ又はその抗体部分を、その他の標的に結合する１以上のさらなる抗体とともに共処方（ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）及び／又は同時投与し得る（例えばその他のサイトカインに結合するか又は細胞表面分子に結合する抗体）。さらに、１以上の本発明の抗体は、先行する治療薬の２以上と組み合わせて使用され得る。このような併用療法は、有利に、投与される治療薬のより低い投与量を使用し得、従って、様々な単剤療法に付随する毒性又は合併症の可能性を回避する。
【０２０３】
ある実施形態において、Ａβ（１−４２）に対する抗体又はその断片は、当技術分野で公知の半減期延長ビヒクルに連結される。このようなビヒクルには、以下に限定されないが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール及びデキストランが含まれる。このようなビヒクルは、例えば、米国特許出願第０９／４２８，０８２号及び公開国際特許出願ＷＯ９９／２５０４４（これらは、あらゆる目的に対して参照により本明細書により組み込まれる。）に記載されている。
【０２０４】
具体的な実施形態において、遺伝子治療により、疾患又はその１以上の症候を治療、予防、管理又は改善するために、本発明の抗体又は本発明の別の予防薬又は治療薬をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列が投与される。遺伝子治療は、発現されるか又は発現可能な核酸の対象への投与により行われる治療を指す。本発明のこの実施形態において、この核酸は、それらのコードされる抗体又は予防もしくは治療効果を媒介する本発明の予防薬もしくは治療薬を生成させる。
【０２０５】
本発明に従い、当技術分野で利用可能な遺伝子治療のための何らかの方法を使用することができる。遺伝子治療の方法の一般的な概説に関しては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；Ｗｕ及びＷｕ、１９９１、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；及びＭｏｒｇａｎ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；１９９３年５月、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５を参照のこと。使用することができる組み換えＤＮＡ技術の技術分野で一般に公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；及びＫｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）に記載されている。遺伝子治療の様々な方法の詳細な記述は、米国特許出願公開ＵＳ２００５００４２６６４  Ａ１（参照により本明細書中に組み込まれる。）で開示されている。
【０２０６】
α１−アンチトリプシン欠損症、Ｃ１−阻害剤欠損血管性浮腫、アンチトロンビン欠乏血栓塞栓症、クールー、クロイツフェルトヤコブ病／スクレイピー、牛海綿状脳症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、ハンチントン病、脊髄小脳失調、マカド−ジョセフ変性症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、前頭側頭型痴呆、鎌型血球病、不安定ヘモグロビン封入体溶血、薬物誘発性封入体溶血、パーキンソン病、全身性ＡＬアミロイドーシス、結節性ＡＬアミロイドーシス、全身性ＡＡアミロイドーシス、前立腺アミロイド、血液透析アミロイドーシス、遺伝性（アイスランド型）脳血管症、ハンチントン病、家族性臓器アミロイド、家族性臓器多発性神経炎、家族性臓器アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドニューロパシー、家族性心臓アミロイド、アルツハイマー病、ダウン症、甲状腺髄様癌及び２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）などの疾患を治療するために、本発明の抗体又はその抗原結合部分を単独で又は組み合わせて使用することができる。好ましくは、アミロイドーシス、例えばアルツハイマー病及びダウン症を治療するために、本発明の抗体が使用され得る。
【０２０７】
本発明の抗体又はその抗原結合部分を単独で又は１以上のさらなる薬剤、例えば、治療薬（例えば低分子分子又は生物学的）と組み合わせて使用することができ、このさらなる薬剤は、その意図される目的のために当業者により選択されることを理解されたい。例えば、さらなる薬剤は、コレステリナーゼ阻害剤（例えばタクトリン、ドネペジル、リバスチグミン又はガランタミン）、部分的ＮＭＤＡ受容体ブロッカー（例えばメマンチン）、グリコサミノグリカン模倣物（例えばアルツェメド（ａｌｚｈｅｍｅｄ））、γセクレターゼの阻害剤又はアロステリック調節物質（例えばＲ−フルルビプロフェン）、黄体形成ホルモン遮断ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（例えばリュープロレリン）、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体アンタゴニスト、キレート剤、神経選択的Ｌ型カルシウムチャネルブロッカー、免疫調節物質、アミロイド原線維形成阻害剤又はアミロイドタンパク質沈着阻害剤（例えばＭ２６６）、別の抗体（例えばバピニューズマブ）、５−ＨＴ１ａ受容体アンタゴニスト、ＰＤＥ４阻害剤、ヒスタミンアゴニスト、糖化最終産物に対する受容体タンパク質、ＰＡＲＰ刺激物質、セロトニン６受容体アンタゴニスト、５−ＨＴ４受容体アゴニスト、ヒトステロイド、神経代謝を促進するグルコース取り込み刺激剤、選択的ＣＢ１アンタゴニスト、ベンゾジアゼピン受容体における部分的アゴニスト、アミロイドβ産生アンタゴニスト又は阻害剤、アミロイドβ沈着阻害剤、ＮＭＲα−７部分アンタゴニスト、サイトカイン阻害剤、ＴＮＦアンタゴニスト（例えばヒュミラ及びレミケード）、ＴＮＦ受容体融合タンパク質（例えばエンブレル）、治療標的ＰＤＥ４、ＲＮＡ翻訳阻害剤、ムスカリン性アゴニスト、神経成長因子受容体アゴニスト、ＮＧＦ受容体アゴニスト及び遺伝子治療調節物質（即ち、本発明の抗体により治療されている疾病又は状態を治療するのに有用であるものと現在認識されているか又は将来認識される薬剤）などの治療薬であり得る。さらなる薬剤はまた、治療組成物に有利な属性を与える薬剤、例えば、組成物の粘性をもたらす薬剤、でもあり得る。
【０２０８】
本発明内に含まれるべき組み合わせは、それらの用途に有用な組み合わせであることをさらに理解されたい。下記で述べられる物質は、説明のためのものであり、限定を意図するものではない。本発明の一部である組み合わせは、本発明の抗体及び下記リストから選択される少なくとも１つのさらなる薬剤であり得る。この組み合わせには、また、この組み合わせが、形成される組成物がその所望の機能を果たし得るようなものである場合、複数のさらなる薬剤、例えば２又は３のさらなる薬剤も含まれ得る。
【０２０９】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体又は抗体部分の「治療的有効量」又は「予防的有効量」を含み得る。「治療的有効量」とは、必要な投与量で、必要な期間、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。抗体又は抗体部分の治療的有効量は、当業者により決定され得、個体の、疾病のステ―ジ、年齢、性別及び体重、その個体において所望の反応を誘発するための抗体又は抗体部分の能力などの因子に従い変化し得る。治療的有効量はまた、治療上の有益な効果が抗体又は抗体部分の何らかの毒性又は有害な影響を上回るものでもある。「予防的有効量」とは、必要な投与量で、必要な期間、所望の予防結果を達成するのに有効な量を指す。通常、予防的用量は、対象において、疾患の前又は初期段階に使用されるので、予防的有効量は治療的有効量より少量となろう。
【０２１０】
最適の所望の反応（例えば、治療又は予防的反応）をもたらすために投薬計画を調整し得る。例えば、単回ボーラスを投与し得、何回かの分割用量をある時間にわたり投与し得るか、又は、治療状況の要件により指示されるように、用量を均等に減少させ得るか又は増加させ得る。投与を容易にするために及び投与を均一にするために、投与単位形態で非経口組成物を処方することは特に有利である。投与単位形態は、本明細書中で使用される場合、治療されるべき哺乳動物対象に対する単一の投与量として適切な物理的に分離された単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体を伴って所望の治療効果を発揮するために計算される活性化合物の所定の量を含有する。本発明の投与単位形態は、（ａ）活性化合物のユニークな特徴及び達成されるべき特定の治療又は予防効果及び（ｂ）個体における感受性の治療に対するこのような活性化合物を化合する技術分野に固有の制限により決定され、これらに直接依存する。
【０２１１】
本発明の抗体又は抗体部分の治療的又は予防的有効量の代表的な非限定範囲は、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１−１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は、緩和すべき状態のタイプ及び重症度により変化し得ることに注意されたい。あらゆる特定の対象に対して、個々のニーズ及び本組成物の投与を行うか又は投与を監督する者の専門的判断に従い、時間経過によって具体的投薬計画を調整すべきであり、本明細書中で述べられる投与範囲は単なる例示であり、主張される組成物の範囲又は実施を限定するものではないことをさらに理解されたい。
【０２１２】
当業者にとって当然のことながら、本明細書中に記載される本発明の方法のその他の適切な変更及び適合は明らかであり、本発明の範囲及び本明細書中で開示される実施形態から逸脱することなく、適切な同等物を用いて為し得る。
【０２１３】
本発明を詳細に説明してきたが、次の実施例（単なる説明のために含まれるものであり、本発明を限定するものではない。）を参照することにより本発明がより明確に理解されよう。
【実施例１】
【０２１４】
ヒト化抗Ａβ（１−４２）球状凝集体モノクローナル抗体の作製及び単離
この実施例は、抗Ａβ抗体のヒト化について述べる。基本的にＱｕｅｅｎ、Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）の手順に従い、マウスモノクローナル抗体８Ｆ５（Ｍｕ８Ｆ５）のヒト化を行った。最初に、Ｍｕ８Ｆ５  ＶＨ又はＶＬアミノ酸配列と高いホモロジーを有するヒトＶセグメントを同定した。次に、ＣＤＲの構造を維持するために重要なフレームワークアミノ酸と一緒に相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を選択ヒトフレームワーク配列に移植した。さらに、免疫原性の可能性を低下させるために、対応するＶ領域サブグループで稀であることが分かったヒトフレームワークアミノ酸をコンセンサスアミノ酸で置換した。ヒト腎臓細胞株２９３Ｔ／１７において、得られたヒト化モノクローナル抗体（Ｈｕ８Ｆ５）を発現させた。精製８Ｆ５抗体との競合結合アッセイを用いて、ヒトＡβへのＨｕ８Ｆ５の親和性がＭｕ８Ｆ５の親和性と同等であることが分かった。.
材料及び方法
ヒト化：
Ｑｕｅｅｎ、Ｃ．ら（同節）により概説されるように、抗体Ｖ領域のヒト化を行った。配列ホモロジーに基づき、Ｍｕ８Ｆ５のＣＤＲに対してアクセプターとして使用されるヒトＶ領域フレームワークを選択した。可変領域の分子モデルを構築するために、コンピュータプログラムＡＢＭＯＤ及びＥＮＣＡＤ（Ｌｅｖｉｔｔ、Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５−６２０（１９８３））を使用した。ＣＤＲと接触することが予想されるヒト化Ｖ領域におけるアミノ酸をＭｕ８Ｆ５の対応する残基で置換した。免疫原性の可能性を除くために、同じＶ領域サブグループにおいて稀であることが分かったヒト化Ｖ領域におけるアミノ酸をコンセンサスアミノ酸に変化させた。
【０２１５】
公開されている方法に従い、およそ２０から４０塩基長の範囲のおよそ３０の重複合成オリゴヌクレオチドを用いて、重及び軽鎖可変領域遺伝子を設計した（Ｒｏｕｉｌｌａｒｄ、Ｊ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：Ｗ１７６−Ｗ１８０（２００４））。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて構築し、全長産物を得た。ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、得られた産物をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＰＣＲ増幅断片をゲルで精製し、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングした。配列確認後、Ｈｕ８Ｆ５  ＶＨ及びＨｕ８Ｆ５  ＶＬをＭｌｕＩ及びＸｂａＩで消化し、ゲルで精製し、ｐＶｇ１．Ｄ．Ｔｔ（Ｃｏｌｅ、Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３−３６２１（１９９７）；及び下記参照）及びｐＶｋ（Ｃｏ、Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９−１１５４（１９９２））の修飾形態にそれぞれサブクローニングした。制限マッピングにより最終的プラスミドを確認した。ヌクレオチド配列決定により、重及び軽鎖の可変領域の配列を確認した。
【０２１６】
部位特異的突然変異誘発
製造者の推奨に従い、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、合成Ｖ遺伝子の部位特異的突然変異誘発を行った。Ｈｕ８Ｆ５ＶＨ遺伝子配列においてＷ４７Ｌ突然変異を生成させるために、両方とも所望の突然変異を含有する合成オリゴヌクレオチドプライマーのペアを設計した。突然変異誘発プライマー５’Ｗ４７Ｌ（５’−ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＡＧＧ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＡＣ−３’）（配列番号３１）及び３’Ｗ４７Ｌ（５’−ＧＴＴ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＡＧ−３’）（配列番号３２）を使用した。９５℃で３０秒間で温置し、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で１分間及び６８℃で１分間を１８サイクル行い、続いて６８℃で７分間温置することにより、製造者の推奨に従い、ＰＣＲ段階を行った。プライマー置換なしで、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により、それぞれベクターの逆の鎖に相補的である、オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させた。得られたＰＣＲ反応により、互い違いのニック（切れ目）を含有する変異プラスミドが生じ、親ＤＮＡ鋳型を消化し、突然変異含有合成ＤＮＡに対して選択するために、メチル化及びヘミメチル化ＤＮＡに特異的なＤｐｎＩエンドヌクレアーゼでこれを処理した。次に、所望の突然変異を組み込む、ニックのあるベクターＤＮＡをＥ．コリ株ＴＯＰ１０Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。配列確認されたミニプレップＤＮＡをＭｌｕＩ及びＸｂａＩで消化し、変異Ｈｕ８Ｆ５ＶＨ遺伝子を含有する得られた制限断片を下記の修飾ｐＶｇ１．Ｄ．Ｔｔ発現ベクターにサブクローニングした。
【０２１７】
発現ベクターの修飾
Ｇ１ｍ（ｚ，ａ）からｚ、非アロタイプへと、発現プラスミドｐＶｇ１．Ｄ．Ｔｔにおけるヒトγ−１定常領域遺伝子のアロタイプを修飾した。突然変異誘発プライマー３５６Ｅ３５８Ｍ−Ａ（５’−ＣＣＡ  ＴＣＣ  ＣＧＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＡＡＣ−３’）（配列番号３３）及び３５６Ｅ３５８Ｍ−Ｂ（５’−ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  −３’）（配列番号３４）を用いて、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍ（Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）のＥＵインデックスに従い付番）を生成させるために、重複伸長ＰＣＲ法（Ｈｉｇｕｃｈｉ、Ｒ．「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、ｐｐ．６１−７０）を使用した。ＰＣＲの第一ラウンドでは、左側断片に対して外側のプライマーｇ１−５（５’−ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＣＣＧ−３’）（配列番号３５）及び３５６Ｅ３５８Ｍ−Ｂを使用し、右側断片に対して外側のプライマーｍｃ−１２４（５’−ＡＧＧ  ＧＣＡ  ＧＣＧ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＧＣ−３’）（配列番号３６）及び３５６Ｅ３５８Ｍ−Ａを使用した。Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、９５℃で５分間温置し、続いて９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１分間を３５サイクル行い、続いて７２℃で１０分間温置することにより、ＰＣＲ反応を行った。外側のプライマーｇ１−５及びｍｃ−１２４を用いて、９５℃で５分間温置し、続いて９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で９０秒間を３５サイクル行い、続いて７２℃で７分間温置することにより、左側と右側の断片を組み合わせるためのＰＣＲの第二ラウンドを上述のように行った。ＳｆｉＩ及びＥａｇＩでの消化後、ヒンジとＣＨ２エクソンとの間のイントロンにおいてＮｈｅＩ制限部位を含有するｐＶｇ１．Ｄ．Ｔｔ発現ベクターの修飾型に、得られた制限断片をサブクローニングした。
【０２１８】
鋳型として上記のプラスミドを用いて、部位特異的突然変異誘発によって、γ−１定常領域遺伝子の下位のヒンジ領域に対する突然変異も生成させた。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、同節のＥＵインデックスに従い付番）を生成させるために、突然変異誘発プライマー５’Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ（５’−ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＣＧＣ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＡＣＣ  ＧＴＣ  ＡＧＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ−３’）（配列番号３７）及び３’Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ（５’−ＡＧＧ  ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＡＴＧ−３’）（配列番号３８）を使用した。９５℃で３０秒間温置し、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で１分間及び６８℃で１分間を１８サイクル行い、続いて６８℃で７分間温置することにより、上記のように、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＰＣＲ段階を行った。ＤｐｎＩでの消化後、少量のＰＣＲ産物を用いて、Ｅ．コリ株ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。ＮｈｅＩ及びＥａｇＩでプラスミドを消化し、ヒンジとＣＨ２エクソンとの間のイントロンにおいてＮｈｅＩ部位を含有する上述の修飾ｐＶｇ１．Ｄ．Ｔｔ発現ベクターに、得られた制限断片をサブクローニングした。ヌクレオチド配列決定によって突然変異を確認した。
【０２１９】
一時的遺伝子移入
７．５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）（本明細書中で以後、２９３培地と呼ぶ。）中で、ヒト腎臓細胞株２９３Ｔ／１７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓｕｓ、ＶＡ）を維持した。一時的遺伝子移入後のモノクローナル抗体の発現及び精製のために、２％低ＩｇＧ  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ（本明細書中で以後、低ＩｇＧ−２９３培地と呼ぶ。）中で２９３Ｔ／１７細胞を温置した。
【０２２０】
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の推奨に従い、２９３Ｔ／１７細胞の一時的遺伝子移入を行った。２９３培地５０ｍＬ中でＴ−１７５フラスコにおいて、遺伝子移入あたりおよそ２ｘ１０７個の細胞を播種し、コンフルエントになるまで一晩増殖させた。翌日、軽鎖プラスミド３５μg及び重鎖プラスミド３５μgをハイブリドーマ−ＳＦＭ（ＨＳＦＭ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）３．７５ｍＬと混合した。個別のチューブ中で、リポフェクタミン２０００試薬１７５μＬ及びＨＳＦＭ３．７５ｍＬを合わせ、室温で５分間温置した。３．７５ｍＬリポフェクタミン２０００−ＨＳＦＭ混合物を３．７５ｍＬ  ＤＮＡ−ＨＳＦＭ混合物と穏やかに混合し、室温で２０分間温置した。２９３Ｔ／１７細胞を覆う培地を吸引除去し、低ＩｇＧ２９３培地で置き換え、次いでリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体を細胞に滴下添加し、旋回させて穏やかに混合し、７．５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で７日間、細胞を温置し、その後上清を回収した。
【０２２１】
ＥＬＩＳＡによる抗体発現の測定
サンドイッチＥＬＩＳＡによってＨｕ８Ｆ５抗体の発現を測定した。０．２Ｍ炭酸−重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．４中の、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ鎖特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）の１：１０００希釈  １００μＬ／ウェルで、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｎａｌｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を４℃にて一晩被覆し、洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、ＴＢＳ中のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）３００μＬ／ウェルで室温で１時間ブロッキング処理した。洗浄緩衝液で洗浄した後、ＥＬＩＳＡ緩衝液（１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）中でＨｕ８Ｆ５を含有する試料を適切に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００μＬ／ウェルを添加した。標準物質として、ヒト化ＩｇＧ１／κ抗体ダクリズマブ（ＰＤＬ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ｉｎｃ．）を使用した。室温で１時間プレートを温置し、洗浄緩衝液で洗浄した後、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトκ軽鎖特異的ポリクローナル抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）の１：１０００希釈液１００μＬ／ウェルを用いて、結合した抗体を検出した。室温で１時間温置し、洗浄緩衝液で洗浄した後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質／ペルオキシダーゼ溶液Ｂ（ＫＰＬ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）１００μＬ／ウェルを添加することにより、発色させた。室温で７分間温置した後、２％シュウ酸５０μＬ／ウェルを添加することにより発色を停止させた。ＶｅｒｓａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて４１５ｎｍで吸収の読み取りを行った。
【０２２２】
８Ｆ５抗体の精製
遠心により一時的遺伝子移入物からの培養上清を回収し、ろ過滅菌した。１Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０の１／５０体積を添加することにより、ろ過した上清のｐＨを調整した。２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で前もって平衡化した１ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に上清を流した。同じ緩衝液でこのカラムを洗浄し、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０で結合した抗体を溶出した。１．５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５の１／５０体積を添加して中和した後、１５ｍＬ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心ろ過器（３０，０００ダルトンＭＷＣＯ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて、プール抗体分画を〜０．５−１．０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。次に、ＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ膜付きの０．２μｍ  Ａｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）を用いて、試料をろ過滅菌した。２８０ｎｍ（１ｍｇ／ｍＬ＝１．４Ａ２８０）での吸収を測定することによりＵＶ分光学によって精製抗体の濃度を調べた。
【０２２３】
競合ＥＬＩＳＡ
４℃で一晩、ＰＢＳ中の５．０μｇ／ｍＬヒトＡβオリゴマー抗原（１−４２）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）１００μＬ／ウェルで、ＭａｘｉＳｏｒｐＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を被覆し、洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）３４０μＬ／ウェルで室温にて１時間ブロッキング処理した。洗浄緩衝液で洗浄した後、ＰＢＳ中の５％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液１００μＬ／ウェル中のビオチン化Ｍｕ８Ｆ５（１．０μｇ／ｍＬ最終濃度）及び競合物抗体（２７μｇ／ｍＬ最終濃度で始まる３倍連続希釈のＭｕ８Ｆ５又はＨｕ８Ｆ５）の混合物を添加した（各３回測定）。非競合物対照として、ＰＢＳ中の５％ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液１００μＬ／ウェルを使用した。室温で２時間プレートを温置し、洗浄緩衝液で洗浄した後、ＰＢＳ中５％ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液中の１μｇ／ｍＬ  ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）１００μＬ／ウェルを使用して、結合した抗体を検出した。室温で３０分間プレートを温置し、洗浄緩衝液で洗浄した後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質／ペルオキシダーゼ溶液Ｂ（ＫＰＬ）１００μＬ／ウェルを添加することにより、発色を行った。室温で５分間温置した後、２％シュウ酸５０μＬ／ウェルを添加することにより発色を停止させた。４１５ｎｍで吸収を読み取った。
【０２２４】
結果：
ヒト化
Ｍｕ８Ｆ５可変領域のヒト化に対して、本発明において提供される一般的アプローチに従った。第一に、コンピュータプログラムＡＢＭＯＤ及びＥＮＣＡＤを用いて、Ｍｕ８Ｆ５可変領域の分子モデルを構築した（Ｌｅｖｉｔｔ、Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５−６２０（１９８３））。次に、ヒトＶ及びＪセグメント配列に対するホモロジー検索に基づき、Ｈｕ８Ｆ５重鎖可変領域に対するフレームワークを提供するために、ＶＨセグメント  ＹＳＥ’ＣＬ（Ｍａｒｉｅｔｔｅ、Ｘ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：８４６−８５１（１９９３））及びＪセグメントＪＨ４（Ｒａｖｅｔｃｈ、Ｊ．Ｖ．ら、Ｃｅｌｌ  ２７：５８３−５９１（１９８１））を選択した。Ｈｕ８Ｆ５軽鎖可変領域に対して、ＶＬセグメントＴＲ１．３７’ＣＬ（Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２８３９−２８５１（１９９３））及びＪセグメントＪＨ４（Ｈｉｅｔｅｒ、Ｐ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１５１６−１５２２（１９８２））を使用した。Ｍｕ８Ｆ５  ＶＨ及びアクセプターヒトＹＳＥ’ＣＬ及びＪＨ４セグメントの間のフレームワークアミノ酸の同一性は８０％であり、一方、Ｍｕ８Ｆ５  ＶＬ及びアクセプターヒトＴＲ１．３７’ＣＬ及びＪＫ４セグメントの間の同一性は、８６％であった。
【０２２５】
コンピュータモデルからＣＤＲとの顕著な接触が示唆されるフレームワーク位置において、元のヒトフレームワークアミノ酸に対してマウスＶ領域からのアミノ酸で置換した。重鎖のバージョン１及び２に対して残基４９及び９８においてこれを行い、重鎖のバージョン２に対して残基４７においてさらにこれを行った（図７）。軽鎖に対して、残基５０で置換を行った（図８）。対応するヒトＶ領域サブグループのそれらの個々の位置で稀にしか現れなかったフレームワーク残基をそれらの位置においてヒトコンセンサスアミノ酸で置換した。重鎖の残基１３及び７８（図４）で、及び軽鎖の残基１及び２で（図５）、これを行った。
【０２２６】
Ｈｕ８Ｆ５抗体の発現
ミニエクソンとして、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル及び哺乳動物発現ベクターへの続くクローニングのための適切な制限酵素部位を含む、ヒト化ＶＨ又はＶＬをコードする遺伝子を設計した。ＶＨ及びＶＬミニエクソンにおけるスプライスドナーシグナルは、それぞれ対応するヒト生殖細胞系列ＪＨ及びＪＫ配列由来である。Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒにより、ヒト化ＶＨ及びＶＬミニエクソン中のシグナルペプチド配列が提供された。重複合成オリゴヌクレオチドの構築及びＰＣＲにより、Ｈｕ８Ｆ５  ＶＨ及びＶＬ遺伝子を構築した。ヒト化重鎖可変領域の合成のためのプライマー１−２８は表Ａで与える。ヒト化軽鎖可変領域の合成のためのプライマー１−２９は表Ｂで与える。
【０２２７】
ヒト化ＶＨｖ１、ＶＨｖ２及びＶＬミニエクソンのＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列をそれぞれ図６、７及び８で示す。得られたＶ遺伝子断片をそれぞれｐＶｇ１．Ｄ．Ｔｔ及びｐＶｋの修飾型にクローニングした（図９）。
【０２２８】
材料及び方法に記載のように、Ｈｕ８Ｆ５を産生する一時的遺伝子移入物を作製した。Ｈｕ８Ｆ５の産生について、ＥＬＩＳＡによって、一時的に遺伝子移入された２９３Ｔ／１７細胞の培養上清を分析した。典型的にはおよそ３０−５０μｇ／ｍＬの発現レベルが観察された。材料及び方法に記載のように、プロテインＡセファロースカラムを用いて、消耗培養上清から、Ｈｕ８Ｆ５  ＩｇＧ１／κモノクローナル抗体を精製した。非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、Ｈｕ８Ｆ５抗体の分子量が約１５０−１６０ｋＤａであることが示された。還元条件下での分析から、Ｈｕ８Ｆ５抗体が、約５０ｋＤａの分子量の重鎖及び約２５ｋＤａの分子量の軽鎖からなることが示された。抗体の純度は９５％を超えると思われた。
【０２２９】
Ｈｕ８Ｆ５抗体の結合特性
材料及び方法に記載のように、競合ＥＬＩＳＡにより、ヒトＡβオリゴマー抗原（１−４２）に対するＨｕ８Ｆ５の親和性を分析した。代表的な結果を図１０で示す。Ｍｕ８Ｆ５及びＨｕ８Ｆ５の両方が、濃度依存的にビオチン化Ｍｕ８Ｆ５と競合した。表Ｃで示されるように、コンピュータソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて得られたＭｕ８Ｆ５、Ｈｕ８Ｆ５ｖ１及びＨｕ８Ｆ５ｖ２の平均ＩＣ５０値は、それぞれ５．０８、６．３６及び６．９９μｇ／ｍＬであった。ヒトＡβオリゴマー抗原（１−４２）へのＨｕ８Ｆ５ｖ１及びＨｕ８Ｆ５ｖ２の結合は、Ｍｕ８Ｆ５の場合と同等であった。これらの結果から、マウス抗Ａβモノクローナル抗体８Ｆ５のヒト化に成功し：Ｈｕ８Ｆ５が、ヒトＡβオリゴマー抗原（１−４２）に対して完全な結合親和性を保持していたことが明らかに示された。
【０２３０】
【表６】
2010530739.tif 000009
2010530739.tif 000010
【０２３１】
【表７】
2010530739.tif 000011
2010530739.tif 000012
2010530739.tif 000013
【０２３２】
【表８】
2010530739.tif 000014
【０２３３】
ヒト化抗体ＶＨ及びＶＬ断片の構築
配列全体に及ぶ重複するオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、ヒト化設計のためのＶＨ及びＶＬ遺伝子断片を構築した。簡潔に述べると、ＶＨ又はＶＬ断片のコード鎖全体を一連の６０個のヌクレオチドオリゴに分割し、２つの対応するボトム鎖オリゴと３０個のヌクレオチド重複があるようにそれぞれを設計した。ボトム鎖オリゴの合計はまた配列全体に及んだ。統合すると、このオリゴヌクレオチドは完全な２本鎖ＤＮＡセグメントを満たした。
【０２３４】
手順の第一段階において、３７℃で３０分間、１００μＬの反応液中、各３ｎＭ濃度で７本のトップ鎖と７本のボトム鎖オリゴとを一緒に組み合わせることによって、オリゴヌクレオチドをキナーゼ処理（ｋｉｎａｓｅｄ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  カタログ番号２０１Ｓ）した。次に、キナーゼ処理した（ｋｉｎａｓｅｄ）オリゴをフェノール／クロロホルム抽出し、沈殿させ、ＮＥＢリガーゼ緩衝液１００μＬ中で再懸濁した。
【０２３５】
手順の第二段階において、９５℃に加熱し、次いでＰＣＲ機器の制御冷却ランプにより９０分間にわたりゆっくりと２０℃に冷却することによって、オリゴヌクレオチドをアニーリング処理した。
【０２３６】
手順の第三段階において、アニーリング処理したオリゴを一緒に結合させてＶＨ及びＶＬセグメントの鎖を形成させるために、アニーリング処理したオリゴにリガーゼ（ＮＥＢカタログ番号２０２Ｓ）１μＬを添加した。１０分間、６５℃に加熱することによってリガーゼを不活性化した。
【０２３７】
第四段階において、構築された断片の末端をＫｌｅｎｏｗ酵素（ＮＥＢカタログ番号２１２Ｓ）で埋め、ＤＮＡをゲルで精製した後、ヒト重及び軽鎖カセットベクターにクローニングした。
【実施例２】
【０２３８】
競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡアッセイを行うために、次のプロトコールを使用した。
【０２３９】
最初に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５μｇ／ｍＬの濃度のＡβ抗原（１−４２）でプレート（１実験あたり１プレート）を一晩被覆した。翌日、上清を捨て、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）３４０ｍＬで４５分間、プレートをブロッキング処理した。次に、プレートを空にして、ビオチン化７Ｃ６又は５Ｆ７マウス抗体を１μｇ／ｍＬ（体積＝１００μＬ）の濃度で添加した。２７μｇ／ｍＬから０．１１μｇ／ｍＬの範囲の濃度で、その他の抗体（マウス又はヒト化）を添加した。（体積＝５０μＬ）。次に、プレートを２時間温置し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄した。２次試薬としてニュートラアビジンＨＲＰを添加した（希釈１：２０，０００；体積＝１００μＬ）。次に、プレートを３０分間温置し、５回洗浄した。次に、ＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加した（体積＝１００μＬ）。続いて、プレートを４分間温置した。次に、２Ｎ硫酸（体積−１００μＬ）で反応を停止させた。分光光度法で４５０ｎｍの波長でプレートの読み取りを行った。結果を図３で示す。
【０２４０】
特に、図３は、ビオチン化マウス抗体とのヒト化抗体の競合能（及びビオチン化マウス抗体の結合シグナルの阻害能）に関して、ヒト化抗体（即ち、８Ｆ５ｈｕｍ８、ＨＵＭ８）がマウス親抗体と同等であることを示す。従って、ヒト化抗体は、その結合能を保持している。
【実施例３】
【０２４１】
Ａβ（１−４２）原線維への８Ｆ５ｈｕｍ８の結合
８Ｆ５ｈｕｍ８抗体は可溶性球状凝集体に対して作製されたので、８Ｆ５ｈｕｍ８は沈着斑又は原線維物質に結合しないはずであるという仮説が立てられた。従って、次の実施例に記載のように重合化Ａβ原線維懸濁物に対する８Ｆ５ｈｕｍ８の結合を調べた。
【０２４２】
Ａβ（１−４２）原線維の調製：
５００μＬの０．１％ＮＨ４ＯＨ水（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ）中で１ｍｇ  Ａβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、カタログ番号：Ｈ−１３６８）を溶解させ、試料を室温で１分間撹拌した後、１００００ｇで５分間遠心した。上清をピペットで採取して新しいエッペンドルフチューブに入れ、ブラッドフォードタンパク質濃度アッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｉｎｃ．アッセイ手順）に従い、Ａβ（１−４２）濃度を測定した。
【０２４３】
３００μＬの２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４でこの新鮮調製Ａβ（１−４２）溶液１００μＬを中和し、次いで、２％ＨＣｌでｐＨ７．４に調整した。３７℃でさらに２０時間試料を温置し、遠心した（１０分間、１００００ｇ）。上清を捨て、Ｖｏｒｔｅｘミキサー上で１分間撹拌しながら、４００μＬ  ２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４で原線維ペレットを再懸濁した後、遠心した（１０分間、１００００ｇ）。上清を捨てた後、この再懸濁手順を繰り返し、最終原線維懸濁液をさらなる遠心により沈降させた（１０分間、１００００ｇ）。上清をもう一度捨て、Ｖｏｒｔｅｘミキサー上で１分間撹拌しながら、３８０μＬの２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４中で最終ペレットを再懸濁した。試料の分注液を冷凍庫で−２０℃にて保管した。
【０２４４】
８０μＬ原線維懸濁液を３２０μＬの２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４緩衝液と混合し、室温で５分間撹拌した後、超音波処理（２０秒間）した。遠心後（１０分間、１００００ｇ）、Ｖｏｒｔｅｘミキサー上で撹拌しながら、１９０μＬの２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４でペレットを再懸濁した。
【０２４５】
Ａβ（１−４２）原線維への抗体の結合
ａ）１０μＬ  ２０ｍＭ  ＮａＰｉ；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４
ｂ）１０μＬ  ０．１μｇ／μＬ  ｍＭＡｂ  ６Ｅ１０  Ｓｉｇｎｅｔ  Ｉｎｃ．カタログ番号９３２０（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４中）
ｃ）１０μＬ  ０．１μｇ／μＬ  ｍＭＡｂ  ８Ｆ５ｈｕｍ８（２０ｍＭ  ＮａＰｉ；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４中）
ｄ）１０μＬ  ０．１μｇ／μＬ  ｍＭＡｂ  ＩｇＧ２（２０ｍＭ  ＮａＰｉ；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４中）
とともに、この原線維懸濁液の１０μＬの分注液を温置した。
【０２４６】
３７℃で２０時間、試料を温置した。最終的に、試料を遠心した（１００００ｇで１０分間）。非結合抗体分画を含有する上清を回収し、２０μＬ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と混合した。Ｖｏｒｔｅｘミキサーで１分間撹拌しながら、５０μＬ  ２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４緩衝液でペレット分画を洗浄し、次いで遠心した（１０分間、１００００ｇ）。２０μＬの２０ｍＭ  ＮａＰｉ；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４緩衝液中で最終ペレットを再懸濁し、２０μＬ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中で溶解させた。
【０２４７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
上清及び再懸濁ペレット試料を９８℃で５分間加熱し、次の条件下で１８％Ｔｒｉｓ／グリシンゲルに載せた：
ＳＤＳ試料緩衝液：０．３ｇ  ＳＤＳ；０．７７ｇ  ＤＴＴ；４ｍＬ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ６．８；８ｍＬグリセロール；１ｍＬ  １％ブロモフェノールブルー（エタノール中）；５０ｍＬ  １８％Ｔｒｉｓ／グリシンゲルに水を添加：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．番号：ＥＣ６５０５ＢＯＸランニング緩衝液：７．５ｇ  Ｔｒｉｓ；３６ｇグリシン；２．５ｇ  ＳＤＳ；２．５  １に水を添加。
【０２４８】
２０ｍＡでＰＡＧＥを行った。クーマシーブルーＲ２５０でゲルを染色した。
【０２４９】
結果：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシー染色から、抗体８Ｆ５ｈｕｍ８の場合、主に原線維縣濁液の上清中で抗体の重鎖及び軽鎖の存在が示され（レーン３、図２ａ）、ペレットの残りの原線維縣濁液からごくわずかな抗体物質が示され、一方で、部分的に脱重合化したＡβも４．５ｋＤａで示された。８Ｆ５ｈｕｍ８と対照的に、その他の抗Ａβ抗体は、原線維結合分画（レーン６、図２ａ）と比較すると、可溶性分画中（６Ｅ１０、レーン５、図２ａ）には現れなかった。非特異的結合及びこの方法の固有のバックグラウンドに対する参照として、内部対照として非特異的抗体ＩｇＧ２ａを使用した。何らかの形態のＡβペプチドに対するものではないＩｇＧ２ａ抗体は、Ａβ原線維に対してある一定の非特異的結合を示す。
【０２５０】
原線維結合及び上清分画中の抗体の重鎖からの反射密度値を測定することにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、原線維型のＡβへの相対的結合を評価し、次の式に従い計算した：
原線維結合Ａｂ分画＝ＲＤ原線維分画ｘ１００％／（ＲＤ原線維分画＋ＲＤ上清分画）。
【０２５１】
次の値を得た。
【０２５２】
【表９】
2010530739.tif 000015
【０２５３】
これらのデータから、標準的抗体６Ｅ１０と比較して、結合した８Ｆ５ｈｕｍ８が有意に少ないことが示される。
【実施例４】
【０２５４】
ドットブロットにより調べられる、Ａβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）の単量体調製物と比較した、８Ｆ５ｈｕｍ８選択的球状凝集体結合
８Ｆ５ｈｕｍ８の選択性を調べるために、Ａβ（１−４２）単量体ならびに新鮮調製Ａβ（１−４０）を単量体に対する代替物として使用した。ドットブロット免疫アッセイにより、Ａβ（１−４２）単量体及びＡβ（１−４０）単量体に対するオリゴマー選択性を調べた。この実験において、Ａβ（１−４２）単量体と比較した場合ならびにＡβ（１−４０）単量体と比較した場合、８Ｆ５ｈｕｍ８は、Ａβ（１−４２）球状凝集体に対して選択的結合性を示した（８Ｆ５ｈｕｍ８との類似領域にあるが、線状ペプチドＡβ（１７-２４）（Ａｂｃａｍ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ））での免疫付与由来である、既知抗体４Ｇ８と比較して）。
【０２５５】
ドットブロット法の説明
１）Ａβ抗原の調製：
ａ）Ａβ（１−４２）球状凝集体の調製：
１．５ｍＬ  ＨＦＩＰ（１．１．１．３．３．３  ヘキサフルオロ−２−プロパノール）中で９ｍｇ  Ａβ（１−４２）Ｆａ．Ｂａｃｈｅｍを溶解し、３７℃で１．５時間温置した。スピードバック中で溶液を蒸発させ、３９６μＬ  ＤＭＳＯ中で縣濁した（５ｍＭ  Ａβ保存溶液）。２０秒間、超音波水浴中で試料を超音波処理し、１０分間振盪し、−２０℃で一晩保存した。
【０２５６】
４．５ｍＬ  ＰＢＳ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）で試料を希釈し、０．５ｍＬ  ２％ＳＤＳ水溶液を添加した（０．２％ＳＤＳ含量）。３７℃で７時間、混合物を温置し、１６ｍＬ  Ｈ２Ｏで希釈し、３７℃で１６時間さらに温置した。その後、Ａβ（１−４２）球状凝集体溶液を３０００ｇで２０分間遠心した。３０ｋＤａセントリプレップにより上清を０．５ｍＬに濃縮した。５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；３５ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４に対して、６℃で一晩、濃縮物を透析した。続いて、１００００ｇで１０分間、Ａβ（１−４２）球状凝集体濃縮物を遠心した。次いで、上清を分注し、−２０℃で保存した。
【０２５７】
ｂ）ＨＦＩＰ前処理した単量体Ａβ（１−４２）の調製：
１．７ｍＬエッペンドルフチューブ中の０．５ｍＬ  ＨＦＩＰ（６ｍｇ／ｍＬ縣濁液）中で３ｍｇヒトＡβ（１−４２）、（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ）カタログ番号Ｈ−１３６８を溶解し、透明な溶液が得られるまで３７℃で１．５時間、振盪した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ  サーモミキサー、１４００ｒｐｍ）。スピードバック濃縮装置中で試料を乾燥させ（１．５時間）、１３．２μＬ  ＤＭＳＯ中で再懸濁し、１０秒間振盪し、次いで超音波浴で超音波処理し（２０秒間）、１０分間振盪した（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ  サーモミキサー中で、１４００ｒｐｍ）。
【０２５８】
６ｍＬ  ２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．１％プルロニックＦ６８；ｐＨ７．４を添加し、室温で１時間撹拌した。３０００ｇで２０分間、試料を遠心した。上清を捨て、沈殿を０．６ｍＬの２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；１％プルロニックＦ６８；ｐＨ７．４中で溶解した。３．４ｍＬの水を添加し、室温で１時間撹拌した後、３０００ｇで２０分間遠心した。上清の８ｘ０．５ｍＬ分注物を−２０℃で保存した。
【０２５９】
ｃ）単量体Ａβ（１−４０）の調製：
エッペンドルフチューブ中の０．２５ｍＬ  ＨＦＩＰ（４ｍｇ／ｍＬ懸濁液）中で、１ｍｇヒトＡβ（１-４０）、（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ）カタログ番号Ｈ−１１９４を縣濁した。３７℃で１．５時間、このチューブを振盪し（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆサーモミキサー中で、１４００ｒｐｍ）、透明な溶液を得て、後にスピードバック濃縮装置で乾燥させた（１．５時間）。４６μＬ  ＤＭＳＯ中で試料を再溶解させ（２１．７ｍｇ／ｍＬ溶液）、１０分間振盪し、次いで２０秒間、超音波浴中で超音波処理した。振盪１０分後（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆサーモミキサー中で、１４００ｒｐｍ）、さらなる使用のために−２０℃で試料を保存した。
【０２６０】
２）ドットブロット：材料及び手順：
ドットブロットのための材料：
Ａβ標準物質
２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ中のＡβ抗原の連続希釈液
１）１００ｐｍｏｌ／μＬ
２）１０ｐｍｏｌ／μＬ
３）１ｐｍｏｌ／μＬ
４）０．１ｐｍｏｌ／μＬ
５）０．０１ｐｍｏｌ／μＬ
ニトロセルロース：
Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔトランスファー液、Ｐｕｒｅニトロセルロース膜（０．４５μｍ）；ＢＩＯ−ＲＡＤ
抗マウス−ＡＰ：カタログ番号ＡＰ３２６Ａ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）
抗ヒト−ＡＰ：カタログ番号：Ａ３３１３（Ｓｉｇｍａ）
検出試薬：
ＮＢＴ／ＢＣＩＰ；カタログ番号：１１６９７４７１００１；Ｒｏｃｈｅ）
ウシ血清アルブミン、（ＢＳＡ）：カタログ番号：Ａ−７８８８（Ｓｉｇｍａ）
ブロッキング試薬：
ＴＢＳ中の５％低脂肪乳
緩衝溶液：
ＴＢＳ
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ７．５＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
ＴＴＢＳ
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ７．５＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
ＰＢＳ＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ  ２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液ｐＨ７．４＋１４０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
抗体溶液Ｉ：
ＴＢＳ中の２０ｍＬ  １％低脂肪乳中で希釈した０．２μｇ／ｍＬ抗体
抗体溶液ＩＩ：
１：５０００希釈
マウス抗体４Ｇ８の場合、ＴＢＳ中１％低脂肪乳中の抗マウス−ＡＰ又はヒト化抗Ａβ球状凝集体抗体８Ｆ５ｈｕｍ８の場合、ＴＢＳ中１％低脂肪乳中の抗ヒト−ＡＰ
ドットブロット手順：
１）互いにおよそ１ｃｍの間隔で１μＬの異なる各Ａβ−標準物質（それらの５種類の連続希釈液において）それぞれをニトロセルロース膜上にドット状になるように添加した。
【０２６１】
２）Ａβ−標準物質のドットをニトロセルロース膜上で室温（ＲＴ）にて少なくとも１０分間、風乾させた（＝ドットブロット）
３）ブロッキング：
ＴＢＳ中の３０ｍＬ  ５％低脂肪乳とともに、ＲＴで１６時間ドットブロットを温置した。
【０２６２】
４）洗浄：ブロッキング溶液を捨て、２０ｍＬ  ＴＴＢＳとともに振盪下でＲＴにて１０分間、ドットブロットを温置した。
【０２６３】
５）抗体溶液Ｉ：
洗浄緩衝液を捨て、ＲＴにて２時間、抗体溶液とともにドットブロットを温置した。
【０２６４】
６）洗浄：
抗体溶液Ｉを捨て、２０ｍＬ  ＴＴＢＳとともに振盪下でＲＴにて１０分間、ドットブロットを温置した。洗浄溶液を捨て、２０ｍＬ  ＴＴＢＳとともに振盪下でＲＴにて１０分間、ドットブロットを温置した。洗浄溶液を捨て、２０ｍＬ  ＴＢＳとともに振盪下でＲＴにて１０分間、ドットブロットを温置した。
【０２６５】
７）抗体溶液ＩＩ：
洗浄緩衝液を捨て、ＲＴで１時間、抗体溶液ＩＩとともにドットブロットを温置した。
【０２６６】
８）洗浄：
抗体溶液ＩＩを捨て、ＲＴで１０分間、２０ｍＬ  ＴＴＢＳとともに振盪下でドットブロットを温置した。洗浄溶液を捨て、ＲＴにて１０分間、２０ｍＬ  ＴＴＢＳとともに振盪下でドットブロットを温置した。洗浄溶液を捨て、ＲＴにて１０分間、２０ｍＬ  ＴＢＳとともに振盪下でドットブロットを温置した。
【０２６７】
９）現像：
洗浄溶液を捨てた。２０ｍＬ  Ｈ２Ｏ中で溶解されたＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｒｏｃｈｅ）１錠から調製した現像溶液を用いて、ドットブロットを５分間現像した。Ｈ２Ｏでドットブロットを激しく洗浄することによって、現像を停止させた。ドット強度のデンシトメトリー分析（ＧＳ８００デンシトメーター（ＢｉｏＲａｄ）及びソフトウェアパッケージＱｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ、バージョン４．５．０（ＢｉｏＲａｄ））を用いて、量的評価を行った。１０ｐｍｏｌ  Ａβ抗原に対するドットのみを評価した。
【０２６８】
ドットブロット法によるＡβ球状凝集体に対するＡβ単量体の識別性に関する結果：４Ｇ８に対する８Ｆ５ｈｕｍ８の比較。
【０２６９】
ＰＢＳ中の１００ｐｍｏｌ／μＬから０．０１ｐｍｏｌ／μＬの範囲で、Ａβ（１−４２）球状凝集体、Ａβ１−４２単量体及びＡβ１−４０単量体の連続希釈物を調製した。各試料の１μＬをニトロセルロース膜上にドット状になるように添加した。アルカリホスファターゼにカップリングされた抗マウスＩｇＧ（二次抗体として）及び染色試薬ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｈｅｉｍ）による検出に対して、マウスモノクローナル抗体４Ｇ８（０．２μｇ／ｍＬ）を使用した。アルカリホスファターゼにカップリングされた抗ヒトＩｇＧ（二次抗体として）及び染色試薬ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｈｅｉｍ）による検出に対して、ヒト化モノクローナル抗体８Ｆ５ｈｕｍ８（０．２μｇ／ｍＬ）を使用した。１０ｐｍｏｌの抗原濃度で、デンシトメーター（ＧＳ８００、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を介して、その強度について検出シグナルを分析した（反射密度＝ＲＤ）。全てのＡβ形態に対して、この濃度において、測定反射密度は、デンシトメーター検出の線形範囲中にあった。結果を下記表で示す。
【０２７０】
【表１０】
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【０２７１】
抗Ａβ−抗体の、Ａβ１−４０単量体及びＡβ１−４２単量体の識別。Ａβ１−４２球状凝集体及びＡβ１−４２単量体、それぞれＡβ１−４０単量体の検出シグナルの比として、識別性を計算した。
【０２７２】
特に、上記結果から、４Ｇ８（これは、Ａβ（１７−２４）（即ち線状配列）に位置する。）に対する市販の抗Ａβ（１−４２）抗体と比較して、８Ｆ５ｈｕｍ８が異なる結合プロファイルを示すことが示唆される。より具体的には、８Ｆ５ｈｕｍ８は、Ａβ４２単量体と比較して球状凝集体結合に対して選択性があり（表のカラム４を参照、４Ｇ８の場合、Ａβ（１−４２）球状凝集体／Ａβ（１−４２）単量体の比が０．４２であるのに対して、８Ｆ５ｈｕｍ８の場合、この比が１．６であることが示されている。）ならびにＡβ４０と比較して球状凝集体結合に対して選択性がある（表のカラム５を参照、４Ｇ８の場合、Ａβ（１−４２）球状凝集体／Ａβ（１−４０）単量体の比が１０．０であるのに対して、８Ｆ５ｈｕｍ８の場合、この比が５９．０であることが示されている。）ことを示す。標準的４Ｇ８を凌ぐこれらの２つの結合選択性の改善の結果、上述のように、８Ｆ５ｈｕｍ８の使用時の副作用が減少するはずである。（例えば斑結合）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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