(57)【要約】          （ａ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、それらの子孫またはそれらに由来するセルラインを細胞培養用培地中で培養する工程、および、（ｂ）胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーまたはその子孫を、非共培養で、ＦＧＦ２を含有する無血清培地中に播種して得た細胞を増殖させることにより前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が取得される前記細胞培養培地を任意に分離する工程、を含む細胞馴化培地を調製する方法を開示する。【選択図】          図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、それらの子孫またはそれらに由来するセルラインを細胞培養用培地中で培養する工程、
および、
（ｂ）胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーまたはその子孫を、非共培養で、ＦＧＦ２を含有する無血清培地中に播種して得た細胞を増殖させることにより前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が取得される前記細胞培養培地を任意に分離する工程
を含む細胞馴化培地を調製する方法。
【請求項２】
前記胚性幹細胞コロニーがヒト胚性幹細胞コロニー（ｈＥＳＣ）、好ましくは胚様体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記胚性幹細胞コロニーがトリプシンで分散される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法は、細胞を取り出す前に、コンフルエントプレートのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、好ましくは胚様体をトリプシンで分散させることを含む請求項１ないし３に記載の方法。
【請求項５】
前記非共培養は、フィーダー細胞層なしで前記細胞を培養することを含む請求項１ないし４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は、培養基材、好ましくはゼラチン化プレート上で増殖される請求項１ないし５いずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記無血清培地は、約５ｎｇ／ｍｌの濃度で繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を含有する請求項１ないし６いずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記無血清培地は、
（ｉ）血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ ＡＢ）、好ましくは約５ｎｇ／ｍｌの濃度での血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ ＡＢ）、
および、
（ｉｉ）上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、好ましくは約５〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度での上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）
の一方または両方をさらに含有する請求項１ないし７いずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記無血清培地は、血清代替培地を補充された請求項１ないし８いずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞は、コンフルエント時にトリプシン処理により１：４に分割される請求項１ないし９いずれかに記載の方法。
【請求項１１】
細胞表面マーカーの発現に基づいて、前記増殖させた細胞から間葉系幹細胞を選択する工程をさらに含む請求項１ないし１０いずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記間葉系幹細胞は、ANPEP (CD13;LAP1;PEPN;gp150: NM_001150.1); ENG (END;ORW;HHT1;ORW1;CD105: NM_000118.1); SCN9A (PN1;NE-NA: NM_002977.1); TRPV2 (VRL;VRL1;VRL-1;MGC12549: NM_016113.3); RAMP1 (: NM_005855.1); F2RL2 (PAR3: NM_004101.2); NTSR1 (NTR: NM_002531.1); GABRA2 (: NM_000807.1); SLC16A4 (MCT4: NM_004696.1); ITGA4 (CD49D: NM_000885.2); NCAM2 (NCAM21;MGC51008: NM_004540.2); IL1R1 (P80;IL1R;IL1RA;CD121A;D2S1473;IL-1R-alpha: NM_000877.2); PDGFRA (CD140A;PDGFR2: NM_006206.2); VCAM1 (INCAM-100: NM_080682.1); SSFA2 (CS1;CS-1;KRAP;SPAG13;KIAA1927: NM_006751.3); TRHDE (PAP-II: NM_013381.1); EDG2 (LPA1;edg-2;vzg-1;Gpcr26;Mrec1.3;rec.1.3: NM_001401.3); NT5E (eN;NT5;NTE;eNT;CD73;E5NT: NM_002526.1); and FLRT2 (KIAA0405: NM_013231.2); FAP (FAPA;DPPIV;SEPRASE: NM_004460.2) からなる群から選択される１または複数の表面マーカーの発現が上昇した細胞を選択することにより取得される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記表面マーカーは、CD105 (Accession Number NM_000118.1) を含む請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記表面マーカーは、CD73 (Accession Number NM_002526.1) を含む請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記間葉系幹細胞は、ITGB1BP3 (MIBP: NM_014446.1); PTPRZ1 (PTPZ;HPTPZ;PTP18;PTPRZ;RPTPB: NM_002851.1); CNTN1 (F3;GP135: NM_175038.1); PCDH1 (PC42;PCDH42;MGC45991: NM_002587.3); PODXL (PCLP;Gp200: NM_005397.2); GPR64 (HE6;TM7LN2: NM_005756.1); PROM1 (AC133;CD133;PROML1: NM_006017.1); GPRC5C (RAIG3;RAIG-3: NM_022036.2); CD24 (CD24A: NM_013230.1); CLDN3 (RVP1;HRVP1;CPE-R2;CPETR2: NM_001306.2); TACSTD1 (EGP;KSA;M4S1;MK-1;EGP40;MIC18;TROP1;Ep-CAM;hEGP-2;CO17-1A;GA733-2: NM_002354.1); HTR3A (HTR3: NM_000869.1); FGFR4 (TKF;JTK2: NM_022963.1); ADCY1 (: NM_021116.1); FGFR3 (ACH;CEK2;JTK4;HSFGFR3EX: NM_022965.1); IL17RB (CRL4;EVI27;IL17BR;IL17RH1;MGC5245: NM_018725.2); SORL1 (LR11;LRP9;SORLA;gp250;SorLA-1: NM_003105.3); GPM6B (M6B: NM_005278.2); KCNS3 (KV9.3;MGC9481: NM_002252.3); and FZD3 (Fz-3;hFz3: NM_017412.2) からなる群から選択される１または複数の表面マーカーの発現が減少した細胞を選択することにより取得される、請求項１１ないし１４いずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記表面マーカーは、CD24 (Accession Number NM_013230.1) を含む請求項１１ないし１５いずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記間葉系幹細胞は、ＣＤ１０５陽性ＣＤ２４陰性である細胞を選択することにより取得される請求項１１ないし１６いずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記間葉系幹細胞は、細胞を表面抗原に対する抗体で標識することにより選択され、好ましくは、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）または磁気細胞分類（ＭＡＣＳ）により選択される請求項１１ないし１６いずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞は、３５世代未満継代され、好ましくは前記細胞は約１４日間増殖され、好ましくは約７日間増殖される請求項１ないし１８いずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）コロニーは、ｈｕＥＳ９コロニーまたはＨ１ ＥＳＣコロニーを含む請求項１ないし１９いずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記取得された細胞培養物は、ｈｕＥＳ９．Ｅ１、ｈｕＥＳ９．Ｅ３またはＨ１．Ｅ２を含む請求項１ないし２０いずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記馴化培地は、いずれかの実施例、好ましくは実施例９、実施例１３、実施例１４または実施例１４Ａに記したポリペプチドの１または複数、好ましくは全てのポリペプチドを含む請求項１ないし２１いずれかに記載の方法。
【請求項２３】
請求項１ないし２２いずれかに記載の方法により得られる馴化培地。
【請求項２４】
医薬的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体（キャリア）とともに請求項２３記載の馴化培地を含む医薬組成物。
【請求項２５】
疾病の治療方法に使用する請求項２３に記載の馴化培地。
【請求項２６】
疾病治療の医薬組成物の調製のための請求項２３に記載の馴化培地の使用。
【請求項２７】
個体での疾病の治療方法における、請求項２３に記載の馴化培地の使用。
【請求項２８】
いずれかの実施例、好ましくは実施例９、実施例１３、実施例１４もしくは実施例１４Ａに記したポリペプチドの１もしくは複数、または、好ましくはほぼ全てのポリペプチドの組合せを含む組成物。
【請求項２９】
個体での疾病の治療方法における、請求項２８に記載の組成物の使用。
【請求項３０】
前記疾病は、心不全、骨髄疾患、皮膚病、火傷ならびに糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病および癌のような退行性の疾病からなる群から選択される請求項２５に記載の馴化培地、請求項２６に記載の馴化培地の使用、または、請求項２７もしくは２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記疾病は、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚疾患、皮膚病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、いぼ、血管腫、ケロイド、皮膚癌、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽種症、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、潰瘍、そして、線維化および機能の喪失、腎臓の虚血性傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎、鼻炎、または整形外科の疾病などの慢性的な組織修復に至る炎症および免疫調節異常を含めた初期損傷により特徴づけられる病態からなる群から選択される請求項２５に記載の馴化培地、請求項２６に記載の馴化培地の使用、または、請求項２７もしくは２９に記載の使用。
【請求項３２】
個体における創傷治癒、瘢痕の縮小、骨形成、骨移植また骨髄移植を補助するための、請求項２３または２８に記載の馴化培地の使用。
【請求項３３】
（ｉ）Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅによる細胞骨格調節、細胞周期、インテグリンシグナル伝達経路、ケモカイン＆サイトカインシグナル伝達経路を介する炎症、ＦＧＦシグナル伝達経路、ＥＧＦ受容体シグナル伝達経路、血管新生、プラスミノーゲン活性化カスケード、血液凝固、解糖、ユビキチンプロテアソーム経路、プリン塩基デノボ合成、クエン酸回路、フェニルアラニン生合成、ヘム生合成、のいずれか１または複数から選択される経路の調節における、
（ｉｉ）細胞構造と運動、細胞構造、細胞の情報伝達、細胞運動、細胞接着、エンドサイトーシス、有糸分裂、エキソサイトーシス、細胞質分裂、細胞周期、免疫防御、サイトカイン／ケモカイン介在性免疫、マクロファージ介在性免疫、顆粒球介在性免疫、リガンド介在性シグナル伝達、サイトカインおよびケモカイン介在性シグナル伝達経路、シグナル伝達、細胞外基質タンパク質介在性シグナル伝達、増殖因子ホメオスタシス、受容体タンパク質チロシンキナーゼシグナル伝達経路、細胞接着介在性シグナル伝達、細胞表面受容体介在性シグナル伝達、ＪＡＫ−ＳＴＡＴカスケード、抗酸化およびフリーラジカル除去、ホメオスタシス、ストレス応答、血液凝固、発生プロセス、中胚葉発生、骨格発生、血管新生、筋発生、筋収縮、タンパク質の代謝と修飾、タンパク質分解、タンパク質フォールディング、タンパク質複合体アセンブリ、アミノ酸活性化、細胞内タンパク質輸送、その他のタンパク質標的と局在、アミノ酸代謝、タンパク質生合成、プロテインジスルフィドイソメラーゼ反応、炭水化物代謝、ペントースリン酸シャント、その他の多糖類代謝、プリン代謝、リン代謝の調節、ビタミン代謝、アミノ酸生合成、ｍＲＮＡ前駆体プロセシング、翻訳調節、ｍＲＮＡスプライシング、のいずれか１または複数を含むプロセスの調節における、
または、
（ｉｉｉ）シグナル伝達分子、ケモカイン、増殖因子、サイトカイン、インターロイキン、その他のサイトカイン、細胞外基質、細胞外基質構造タンパク質、その他の細胞外基質、細胞外基質糖タンパク質、プロテアーゼ、その他のプロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、シャペロン、シャペロニン、Ｈｓｐ７０ファミリーシャペロン、その他のシャペロン、シンテターゼ、シンターゼおよびシンテターゼ、選択性カルシウム結合タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、その他のイソメラーゼ、ＡＴＰシンターゼ、ヒドラターゼ、トランスアミナーゼ、その他のリアーゼ、その他の酵素調節因子、選択性調節分子、アクチン結合細胞骨格タンパク質、細胞骨格タンパク質、非モーターアクチン結合タンパク質、アクチンおよびアクチン関連タンパク質、アネキシン、チューブリン、細胞接着分子、アクチン結合モータータンパク質、中間フィラメント、リボ核タンパク質、リボソームタンパク質、翻訳因子、その他のＲＮＡ結合タンパク質、ヒストン、カルモジュリン関連タンパク質、小胞コートタンパク質、のいずれか１または複数を含む機能の提供における、
請求項２３もしくは請求項２８に記載の馴化培地の使用。
【請求項３４】
馴化培地を標的に送達する操作が可能なディスペンサーとともに、請求項２３または２８に記載の馴化培地のソースを含む、馴化培地を送達する送達（デリバリー）システム。
【請求項３５】
馴化培地を標的に送達する方法における請求項３４に記載の送達（デリバリー）システムの使用。
【請求項３６】
前述したような、または、添付図面の図１から１１に示すような馴化培地を調製する方法。
【請求項３７】
前述したような、または、添付図面の図１から１１に示すような馴化培地。
【請求項３８】
前述したような、または、添付図面の図１から１１に示すような馴化培地の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発生学、細胞生物学、分子生物学、遺伝学に関する。特に本発明は、胚性幹細胞から間葉系幹細胞に派生させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、分化した細胞と異なり、分裂する能力と、自己複製または表現型的におよび機能的に異なる娘細胞へと分化する能力とを持つ (Keller, Genes Dev. 2005;19:1129-1155; Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005;85:635-678; Wiles, Methods in Enzymology. 1993;225:900-918; Choi et al, Methods Mol Med. 2005;105:359-368) 。
【０００３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は、筋骨格系障害の治療、循環器疾患の心臓機能の改善、および移植片体宿主病の重症度の改善における治療効果が示されている多能性幹細胞である (Le Blanc and Pittenger, 2005). 。系列制限されているので限定されるが、それらは間葉系の細胞種、例えば、脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞に分化する強固な能力を持っており、奇形腫形成の危険性はごくわずかである。移植したＭＳＣｓに対する宿主の免疫拒絶は、通常、自己移植または同種異系移植により回避される。ＭＳＣｓは、骨髄（ＢＭ）、脂肪組織（ａｄ）、および臍帯血から分離し、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で増殖ことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、組織の利用は、それらの分離に制限があり、危険な侵襲的手法が必要となる。また、ＭＳＣｓの生体外での増殖は顕著であるが、それでもなお限界がある。
【０００５】
広範囲の疾病［Ａ１，Ａ２］、例えば、筋骨格系障害の組織生体工学［Ａ３，Ａ４］におけるＧＶＨＤ［Ａ１］や心臓病［Ａ５，Ａ６］を治療する臨床や前臨床応用において、幅広い疾病を治療するＭＳＣｓの治療能力は、多くの様々な修復細胞種に分化する能力に起因する。
【０００６】
しかしながら、傷害組織または組織において、移植したＭＳＣｓが機能的な修復細胞に分化する効率、および、治療に関連する数字は、未だ十分に報告または開示がなされていない。
【０００７】
本発明は、本書に記載の方法により、これらおよびその他の問題を解決しようとするものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、幹細胞を用いる代わりに、ＭＳＣｓからの分泌物をＭＳＣｓそのものの代替またはＭＳＣｓに追加して適用することで内因性の組織修復を増強させることにより、傷害組織または欠損組織が再生または修復させることができる。
【０００９】
特に、本発明者らは、ヒト胚性幹細胞由来のＭＳＣｓが疾病の治療において培養される馴化培地の使用を提供する。このように、馴化培地はどのような疾病に対するＥＳ細胞、特に治療に最適であるＭＳＣｓに利用することができる。
【００１０】
本発明者らは、ＭＳＣｓにより分泌されるポリペプチドを同定し、馴化培地の成分を規定し、開示する。組成物が１または複数の特有の生理活性物質を、ＭＳＣｓの分泌物中に含んでいることは明らかである。特に、７９４ポリペプチドのうち１または複数がそのような治療における馴化培地の代替または馴化培地に追加して使用されてもよい。
【００１１】
本発明のアプローチにより、もし、自己移植の細胞調製物が用いられれば、細胞に基づく治療法に伴う免疫適合性、腫瘍原性、異種動物由来感染、費用および待機時間といった現在の交絡因子は排除されるであろう。
【００１２】
このようなアプローチは将来、低価格な費用、より良い品質管理および均質性のある「画一的な」ＭＳＣに基づく治療を提供できる可能性がある。
【００１３】
本発明の実施は、特に断りのない限り、通常の技術を有する当業者が、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を利用して行うことができる。そのような技術は、文献に説明されている。例えば、下記参照。J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855およびLab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3。これらの一般的なテキスト各々は、参考文献として組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
図１Ａ−１Ｇ  ｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物の特性解析。
【図１Ａ】位相差顕微鏡下における細胞形態。
【図１Ｂ】ｈＥＳＣ−ＭＳＣにおける多能性関連遺伝子の発現。転写レベルはＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定し、ｈＥＳＣの転写レベルで補正した。ｈＥＳＣの転写レベルは、ＨｕＥＳ９およびＨ１ｈＥＳＣ株の平均として算出した。
【図１Ｃ】ＨｕＥＳ９およびＨ１ ｈＥＳＣ株、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１.Ｅ２ ｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物ならびにＥ１４マウスＥＳＣ株における多能性関連遺伝子のウェスタンブロット解析。
【図１Ｄ】ＨｕＥＳ９およびＨｕＥＳ９．Ｅ１の腎被膜下移植。ＨｕＥＳ９．Ｅ１（上）またはＨｕＥＳ９（下）移植４ヶ月後のＨ＆Ｅ染色した腎臓切断面のパラフィン包埋。
【図１Ｅ】ヒトＨｕＥＳ９ ＥＳＣ株、マウスＥ１４ ＥＳＣ株、マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダーおよびＨｕＥＳ９．Ｅ１におけるアルカリフォスファターゼ活性。
【図１Ｆ】ヒトＡｌｕおよびマウスｃ−ｍｏｓ反復配列の存在を分析するためのＰＣＲによるゲノムＤＮＡ解析。
【図１Ｇ】Ｇバンド（上）および分光による染色体解析（ＳＫＹ）（中）による染色体分析。９番染色体の逆位（下）。
【００１５】
図２Ａ−２Ｂ  ＦＡＣＳ解析による細胞表面抗原プロファイリング。
【図２Ａ】ＨｕＥＳ９．Ｅ１ ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１.Ｅ２ ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ、ＨｕＥＳ９ ｈＥＳＣｓ、マウス胚性繊維芽フィーダー細胞を染色し、Ｃｙａｎ ＬＸ (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) 装置でＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いて解析した。非特異的蛍光は、アイソタイプマッチしたマウスモノクローナル抗体でアリコートした同様の細胞のインキュベーションにより決定した。
【図２Ｂ】ＨｕＥＳ９．Ｅ１およびＨｕＥＳ９．Ｅ３ ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓを、ＦＡＣＳによりＢＭ−ＭＳＣｓと同時に解析する前に、血清含有ＢＭ−ＭＳＣ培地で２回継代した。
【００１６】
図３Ａ−３Ｃ  ＨｕＥＳ９．Ｅ１ ＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞の分化は、標準的なプロトコールを用いて脂質形成、軟骨形成、骨形成に誘導される。
【図３Ａ】脂質形成 ｉ）脂質形成誘導１４日後、オイルレッドにより細胞の脂肪滴を染色した。ｉｉ）７日目および１４日目のＰＰＡＲγｍＲＮＡをＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。全数値はＨｕＥＳ９．Ｅ１の数値で補正した。ｉｉｉ）ＨｕＥＳ９およびＨ１ ｈＥＳＣｓ、それらから派生したＭＳＣ細胞培養物（ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２）ならびに成体組織由来ＭＳＣｓ（ＢＭ−ＭＳＣおよびａｄ−ＭＳＣ）における相対的ＰＰＡＲγｍＲＮＡレベルをＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。全数値はＨｕＥＳ９．Ｅ１の数値で補正した。
【図３Ｂ】軟骨形成 ｉ）骨形成誘導２１日後、アルシアンブルー（左）およびＨＲＰ可視化アッセイを用いたＩＩ型コラーゲンの免疫反応でプロテオグリカンを染色した。ｉｉ）７日目および１４日目のＡｇｇｒｅｃａｎおよびＰＰＡＲγｍＲＮＡをＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。全数値はＨｕＥＳ９．Ｅ１の数値で補正した。ｉｉｉ）ＨｕＥＳ９およびＨ１ ｈＥＳＣｓ、それらから派生したＭＳＣ細胞培養物（ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２）ならびに成体組織由来ＭＳＣｓ（ＢＭ−ＭＳＣおよびａｄ−ＭＳＣ）における相対的ＰＰＡＲγｍＲＮＡレベルをＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。全数値はＨｕＥＳ９．Ｅ１の数値で補正した。
【図３Ｃ】骨形成 ｉ）軟骨形成誘導２１日後、ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色により石灰化基質を染色した。ｉｉ ｉｉｉ）７日目および１４日目の骨特異的アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）および骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）ｍＲＮＡをＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。全数値はＨｕＥＳ９．Ｅ１の数値で補正した。
【００１７】
図４Ａ−４Ｄ  遺伝子発現解析
【図４Ａ】ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２からなる３つのｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物、３つのＢＭ−ＭＳＣサンプル、３つのａｄ−ＭＳＣサンプルならびにＨｕＥＳ９、Ｈ１およびＨｅｓ３からなる３つのｈＥＳＣ株における階層的クラスタ分析。
【図４Ｂ】ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとＢＭ−ＭＳＣｓとの間（左）、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとｈＥＳＣｓとの間（右）における遺伝子発現の一対比較
【図４Ｄ】ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとＢＭ−ＭＳＣｓにおいて共通に発現した遺伝子（＜２倍の差異）の解析。遺伝子は、Ｐａｎｔｈｅｒ分類システムを用いて、生物学的プロセスに分類した。各生物学的プロセスは、観察した遺伝子の頻度を、ＮＣＢＩの各生物学的プロセスに対する２３４８１遺伝子のホモサピエンス遺伝子データベースで予想された遺伝子頻度と比較することにより、顕著に過剰発現（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）または不十分な発現（ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）（ｐ＜０．０１）かどうかで決定した。顕著に過剰または不十分な発現であるプロセスをグループに分け、グラフで表した。
【図４Ｅ】ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとＢＭ−ＭＳＣｓにおいて異なる発現を示した遺伝子（＞２倍の差異）の解析。ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓまたはＢＭ−ＭＳＣｓにおいて高発現した遺伝子により顕著に過剰発現（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）または不十分な発現（ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）（ｐ＜０．０１）であった生物学的プロセスをグループに分け、グラフで表した。
【００１８】
図５Ａ−５Ｄ  ｈＥＳＣ−ＭＳＣの生成のための陽性および陰性ソーティング
【図５Ａ】ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２、ＨｕＥＳ９ ｈＥＳＣｓならびにマウス胚性繊維芽フィーダー細胞を染色し、ＣＤ２４の存在をＣｙａｎ ＬＸ (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) 装置でＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いて解析した。非特異的蛍光は、アイソタイプマッチしたマウスモノクローナル抗体でアリコートした同様の細胞のインキュベーションにより決定した。
【図５Ｂ】トリプシン処理し、ＰＤＧＦおよびＦＧＦ２を添加した培地でフィーダー細胞無しで１週間増殖させたＨｕＥＳ９細胞からのＣＤ１０５＋、ＣＤ２４−細胞のソーティング。Ｑ４に表されたＣＤ１０５＋、ＣＤ２４−細胞を培養のために選別した。
【図５Ｃ】Ｑ４．１と、その他の各Ｑ４の培養物（すなわち、Ｑ４．２〜Ｑ４．５）との間の遺伝子発現の一対比較。
【図５Ｄ】全Ｑ４培養物と、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２からなるｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとの間、ならびに、全Ｑ４培養物とＢＭ−ＭＳＣｓとの間の遺伝子発現の一対比較。
【図５Ｅ】Ｑ４．３のＳＫＹ解析
【図６】ＨｕＥＳ９．Ｅ１ ＭＳＣ培養物で馴化した培地のタンパク質解析。８０％コンフルエントなＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞培養物をＰＢＳで３回ウォッシュし、フェノールレッドを含まず、ＩＴＳ、５ｎｇ／ｍｌＦＧＦ２、５ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦ ＡＢ、グルタミン‐ペニシリン‐ストレプトマイシンおよびβ‐メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地からなる化学的に組成が明らかな培地で一晩培養した。それから、培養物をＰＢＳで３回リンスし、新しい化学的に組成が明らかな培地に置き換えた。培地のアリコートを０、２４、４８および７２時間に取り、５００×ｇで遠心し、その上清を０．２μフィルターで処理した。１０μｌの培地を４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、銀染色を行った。
【図７】抗体アレイ。１ｍｌの馴化培地（ＣＭ）または非馴化培地（ＮＣＭ）をＲａｙＢｉｏ（登録商標）サイトカイン抗体アレイ (RayBio Norcross, GA) で、操作手順書に従ってインキュベーションした。各アレイに対する抗体マップは実施例に記載した。特異的抗体に対するリガンドの結合は、ＨＲＰによる化学発光アッセイを用いて可視化した。各膜の様々な露光を解析した。シグナルがＣＭでハイブリダイズした膜上で存在し、ＮＣＭでハイブリダイズした膜上では存在しない時に、抗原が存在しているものとして記録した。ＣＭおよびＮＣＭの、４つの独立したバッチの解析データは実施例に要約した。
【図８】２０１遺伝子産物の生物学的プロセスへの分類。２０１遺伝子をＧＯ分類中の様々な生物学的プロセスに分類した。Ｕｎｉｇｅｎｅ、ＥｎｔｒｅｚおよびＧｅｎＢａｎｋ（ｐ値＜０．０５）と照合させたデータベースの遺伝子頻度と比較して、分泌プロテオーム中の遺伝子頻度により過剰発現していた５８生物学的プロセスを、３つの主要なグループ：代謝、防御応答および組織分化に分類した。
【図９】２０１遺伝子産物の経路への分類。２０１遺伝子をＧＯ分類中の様々な経路に分類した。Ｕｎｉｇｅｎｅ、ＥｎｔｒｅｚおよびＧｅｎＢａｎｋ（ｐ値＜０．０５）と照合させたデータベースの遺伝子頻度と比較して、分泌プロテオーム中の遺伝子頻度により過剰発現していた３０生物学的プロセスを、いくつかの主要なカテゴリ：受容体結合、シグナル伝達、細胞‐細胞間相互作用、細胞遊走、免疫応答および代謝に分類した。
【図１０】ＭＭＰゲラチナーゼ活性のＥＳ細胞馴化培地（ＣＭ）中の存在、非馴化培地中の非存在を示すＳＤＳゲル電気泳動。
【図１１Ａ】急性心筋梗塞（ＡＭＩ）モデルマウスにおける死亡率を示すグラフ。ＣＭ：ＥＳ細胞馴化培地を投与したマウス、ＮＣＭ：非馴化コントロール培地を投与したマウス
【図１１Ｂ】急性心筋梗塞（ＡＭＩ）モデルマウスにおける左心室駆出分画率を示すグラフ。ＣＭ：ＥＳ細胞馴化培地を投与したマウス、ＮＣＭ：非馴化コントロール培地を投与したマウス
【図１２】分泌タンパク質がドライブする予測経路。各経路における遺伝子頻度は、ＮＣＢＩホモサピエンスデータベースよりもセクレトームで顕著に高かった（ｐ＜０．０１）。
【図１３】分泌タンパク質がドライブする予測プロセス。各経路における遺伝子頻度は、ＮＣＢＩホモサピエンスデータベースよりもセクレトームで顕著に高かったまたは低かった（ｐ＜０．０１）。
【図１４】分泌タンパク質がドライブする予測分子。各経路における遺伝子頻度は、ＮＣＢＩホモサピエンスデータベースよりもセクレトームで顕著に高かった（ｐ＜０．０１）。
【図１５】１００μｇのＣＭタンパク質またはＮＣＭタンパク質またはＰＢＳに３０分間さらしたＴＨＰ−１細胞を示す。その後、細胞溶解液を調製し、抗リン酸化Ｓｍａｄ２抗体および化学発光による検出システムを用いた標準的なウェスタンブロットハイブリダイゼーションにより解析した。シグナルはデンシトメトリーにより定量し、シグナルの相対強度を算定した。
【図１６】孔径５μｍの膜であるＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）プレートの上チャンバーにセットされた１×１０５個のＨＵＶＥＣｓを示す。下チャンバーは、２５×濃縮したＣＭまたはＮＣＭのストック溶液を１０×、５０×、１００×希釈したＲＰＭＩ培地で満たしている。陽性および陰性のコントロールは、それぞれ１５％および０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）入りのＲＰＭＩで行った。ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃２４時間インキュベーション後、下チャンバーに遊走した細胞の数をカウントした。濃縮したＣＭの１０×希釈液で満たしたチャンバーにおける細胞数を１００に補正した。他のチャンバーで遊走した細胞数は、濃縮したＣＭの１０×希釈液における細胞数と相対的に表した。
【図１７】１×ＣＭまたは１０×ＣＭの存在下で、５０または５００μＭのＨ２Ｏ２でインキュベートした６ＣＥＭ細胞を示す。生存細胞の相対数は、トリパンブルー染色により１２および２４時間で決定した。
【図１８】ＣＭ、ＮＣＭまたは生理食塩水投与したブタにおける急性虚血再かん流後の相対的な梗塞サイズ。急性虚血は、７５分間ＬＣｘを結紮し、続いて結紮を開放し再かん流させることにより誘導した。再かん流開始５分前、ブタにＣＭ、ＮＣＭまたは生理食塩水を静脈内投与した。再かん流直後、ＣＭ、ＮＣＭまたは生理食塩水をＬＣｘ冠動脈の中に局所的に注入した。再かん流の４時間後、危険領域内の相対的な梗塞サイズを評価した。
【００１９】
図１９および図２０  心エコー検査
【図１９】収縮期壁厚。
【図２０】左心室内径短縮率。
【００２０】
心臓の測定は、虚血の前、虚血の間および虚血の４時間後に行った。虚血の４時間後、気絶心筋を挑発するβ１−アドレナリン受容体アンタゴニスト（遮断薬）ドブタミン（２．５および５．０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）の静脈内注入による薬理学的に誘導したストレス下で追加測定を行った。心外膜短軸の超音波画像 (Prosound SSD-5000, 5-MHz probe UST-5280-5, Aloka Holding Europe AG, Zug, Switzerland) を乳頭レベルで得た。梗塞サイズの壁厚（ＷＴ）および左心室内領域（Ｌ Ｖｉａ）を拡張末期（ＥＤ）および収縮末期（ＥＳ）に測定した。収縮期壁厚（ＳＷＴ）は［ＷＴ（ＥＳ）−ＷＴ（ＥＤ））／ＷＴ（ＥＤ）］×１００（％）で計算し、左心室内径短縮率は（ＦＡＳ）は、［（Ｌ Ｖｉａ（ＥＤ）−Ｌ Ｖｉａ（ＥＳ））／Ｌ Ｖｉａ（ＥＤ）］×１００（％）で計算した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
馴化培地（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉａ）
実施例に、ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオーム解析を記載する。
【００２２】
実施例７から１５に示すように、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓは成人骨髄由来のＭＳＣｓ（ＢＭ−ＭＳＣｓ）に類似した発現プロファイルを持つ。これらの結果は、本書に記載の方法により得られるＭＳＣｓは、骨髄由来のＭＳＣｓと、例えばパラクリン因子の分泌能力といった顕著な生物学的類似性を持つことを示す。従って、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓはＢＭ−ＭＳＣｓを適用できるどのような目的にでも使用することができる。
【００２３】
さらに、本発明者らは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓの培養により馴化される培地を提供する。そのような馴化培地は、特有の遺伝子産物を含めたｈＥＳＣ−ＭＳＣｓにより分泌される分子を含有する。そのような馴化培地および特有なタンパク質またはポリペプチドを含めたその中に含有する分子の組み合わせは、疾病の治療に使用することができる。それらは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓの活性の補完としてまたはその代替として、例えば疾病の治療または予防の目的で使用することができる。
【００２４】
馴化培地は、細胞培養液のような培地中で所定の時間ＭＳＣｓを培養することにより作製することができる。ＭＳＣｓは、特に、本書に記載のどのような方法により作製されるものも含まれる。馴化培地は、実施例に記載のように、ＭＳＣｓにより分泌されるポリペプチドを含有する。
【００２５】
馴化培地は、１または複数の処理工程の後、治療に用いることができる。例えば、馴化培地は、ＵＶ処理、ろ過滅菌等の処理をすることができる。また、１または複数の精製工程を行ってもよい。
【００２６】
特に、馴化培地は、例えば透析や限外ろ過により濃縮することができる。例えば３Ｋの分画分子量（ＮＭＷＬ）である限外ろ過膜を用いて濃縮することができる。
【００２７】
また、本発明者らは、そのような馴化培地の補完または代替として、実施例に記載したポリペプチドの１または複数、好ましくはすべてを含む組成物を提供する。
【００２８】
ＭＳＣ馴化培地により治療可能な疾病
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓのプロテオーム解析は、発現されるタンパク質が、代謝や防御応答、血管新生、造血、骨格の発達などの組織分化を含む多くの生物学的プロセスに関与するものであることを示している。それゆえ、本発明者らは概して、以下に記載するように、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓまたはｈＥＳＣ−ＭＳＣｓにより調製された培地の、これらのいかなる生物学的なプロセスを調節するものとしての使用を提供する。
【００２９】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓまたはｈＥＳＣ−ＭＳＣｓにより調製された培地は、次に示すものの１または複数の経路の調節に使用することができる：Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅを介する細胞骨格の調節、細胞周期、インテグリンシグナル伝達経路、ケモカイン＆サイトカインを介する炎症のシグナル伝達経路、ＦＧＦシグナル伝達経路、ＥＧＦ受容体シグナル伝達経路、血管新生、プラスミノーゲン活性化カスケード、血液凝固、解糖、ユビキチンプロテアソーム経路、プリン塩基デノボ生合成、クエン酸回路、フェニルアラニン生合成、ヘム生合成。
【００３０】
また、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓまたはｈＥＳＣ−ＭＳＣｓにより調製された培地は、次に示すものの１または複数のプロセスの調節に使用することができる：細胞の構造と運動、細胞構造、細胞の情報伝達、細胞運動、細胞接着、エンドサイトーシス、有糸分裂、エキソサイトーシス、細胞質分裂、細胞周期、免疫防御、サイトカイン／ケモカインを介する免疫、マクロファージを介する免疫、顆粒球を介する免疫、リガンドを介するシグナル伝達、サイトカインおよびケモカインを介するシグナル伝達経路、シグナル伝達、細胞外基質タンパク質を介するシグナル伝達、増殖因子のホメオスタシス、受容体タンパク質チロシンキナーゼシグナル伝達経路、細胞接着を介するシグナル伝達、細胞表面受容体を介するシグナル伝達、ＪＡＫ−ＳＴＡＴカスケード、抗酸化およびフリーラジカル除去、ホメオスタシス、ストレス応答、血液凝固、発生プロセス、中胚葉発生、骨格発生、血管新生、筋発生、筋収縮、タンパク質代謝とタンパク質修飾、タンパク質分解、タンパク質フォールディング、タンパク質複合体アセンブリ、アミノ酸活性化、細胞内タンパク質輸送、その他のタンパク質標的と局在、アミノ酸代謝、解糖、ペントースリン酸シャント、その他の多糖類代謝、プリン代謝、リン代謝の調節、ビタミン代謝、アミノ酸生合成、ｍＲＮＡ前駆体プロセシング、翻訳調節、ｍＲＮＡスプライシング
【００３１】
さらに、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓまたはｈＥＳＣ−ＭＳＣｓにより調製された培地は、次に示すものの１または複数の機能の補完品として使用することができる：シグナル伝達分子、ケモカイン、増殖因子、サイトカイン、インターロイキン、その他のサイトカイン、細胞外基質、細胞外基質の構造タンパク質、その他の細胞外基質、細胞外基質の糖タンパク質、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、その他のプロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、シャペロン、シャペロニン、Ｈｓｐ７０ファミリーシャペロン、その他のシャペロン、シンターゼ、シンターゼおよびシンテターゼ、選択したカルシウム結合タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、その他のイソメラーゼ、ＡＴＰシンターゼ、ヒドラターゼ、トランスアミナーゼ、その他のリアーゼ、その他の酵素調節因子、選択した調節分子、アクチン結合細胞骨格タンパク質、細胞骨格タンパク質、非モーターアクチン結合タンパク質、アクチンおよびアクチン関連タンパク質、アネキシン、チューブリン、細胞接着分子、アクチン結合モータータンパク質、中間体フィラメント、リボ核タンパク質、リボソームタンパク質、翻訳因子、その他のＲＮＡ結合タンパク質、ヒストン、カルモジュリン関連タンパク質、小胞コートタンパク質
【００３２】
さらに、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓは、これらの機能が関与するかもしれない疾病の治療、または、その修復もしくは治療にこれらの生物学的プロセスのいずれか１もしくは複数が関与するものに用いることができる。同様に、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓにより発現されるタンパク質は、単独または組合せで、好ましくは馴化培地のかたちで、例えばそのような疾病の治療もしくは予防の目的のために、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓの活性の補完または代替として用いてもよい。
【００３３】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓによる遺伝子産物は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＧＦ‐βシグナルおよびｍＴＯＲシグナル伝達経路のような、心臓血管生物学、骨発生、および造血における重要なシグナル伝達経路を活性化することを示唆している。従って、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓや、それらから発現されるタンパク質等は、これらのいずれかのシグナル経路が関与する、または、その原因がこれらシグナル伝達経路のいずれか１または複数において１または複数の欠陥である、疾病の予防もしくは治療に用いることができる。
【００３４】
従って、そのような馴化培地は、心不全、骨髄疾患、皮膚病、火傷ならびに糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病および癌のような退行性の疾病の治療に用いることができる。
【００３５】
そのような馴化培地は、また、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚疾患、皮膚病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、いぼ、血管腫、ケロイド、皮膚癌、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽種症、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、潰瘍、そして、線維化および機能の喪失、腎臓の虚血性傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎、鼻炎、または整形外科の疾病などの慢性的な組織修復に至る炎症および免疫調節異常を含めた初期損傷により特徴づけられる病態の治療に用いることもできる。
【００３６】
当該馴化培地は、個体における創傷治癒、瘢痕の縮小、骨形成、骨移植また骨髄移植に用いることができる。
【００３７】
特に、当該馴化培地は、血管新生、血液学（特に免疫プロセス）または筋骨格発生等に関与するプロセスの調節に用いることができる。
【００３８】
さらに、馴化培地のかたちを含めて本書に記載したＭＳＣｓから分泌されるタンパク質のいずれか１または複数は、本書に記載のＢＭ−ＭＳＣｓと同様の目的で使用することができる。それゆえ、本発明者らは、馴化培地中に存在するポリペプチドの１または複数、好ましくは実質的に全てを含有する組成物を提供する。特に、実施例９、１３、１４または１４Ａで設定されているポリペプチドの１または複数、好ましくは実質的に全てを含有する組成物を提供する。
【００３９】
そのような組成物は、馴化培地が用いられ得るいかなる目的にでも使用することができる。
【００４０】
特段の事情がない限り「馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）」という用語は、ＭＳＣｓにさらされた細胞培養培地だけではなく、馴化培地中に存在するポリペプチドの１または複数、好ましくは実質的に全てを含有する組成物も同様に含む。
【００４１】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓは、実施例１０から１４、特にその表に挙げられているようなもののような、分泌または発現されるいかなるタンパク質のソースとしても用いることができる。特に、当該ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓは馴化培地のソースとして使用することができる。それゆえ、本発明者らは、実施例１０から１４を含む実施例において示されているようなポリペプチドを産生する方法を提供する。当該方法は、記載されているような間葉系幹細胞の取得、当該間葉系幹細胞の培養、および、当該間葉系幹細胞好ましくは当該間葉系幹細胞が増殖した培地からのポリペプチドの分離、からなる方法である。
【００４２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の取得
馴化培地の作製に用いるのに適したＭＳＣｓは、当業者に公知の方法により作ることができる。特に、ＭＳＣｓは、胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーまたはその子孫を、ＦＧＦ２含有の無血清培地中、非共培養で播種して得た細胞を増殖させることにより作ることができる。この詳細は、以下のセクションに記載する。
【００４３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣｓ様の細胞をｈＥＳＣｓから取得する従来の方法としては、ヒトテロメアーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の遺伝子を分化しているｈＥＳＣｓにトランスフェクションする方法 (Xu et al., 2004) または、マウスＯＰ９細胞株と共培養する方法 (Barberi et al., 2005) がある。これらの誘導プロトコールでは、外来性の遺伝物質およびマウス細胞の使用が、腫瘍原性または異種動物の病原菌の感染といった許容できない危険性を導く。
【００４４】
対照的に、本発明者らによる方法は、分化しているｈＥＳＣｓから類似または同一（好ましくは同種の）ＭＳＣ集団を分離する臨床的意義があり再現可能なプロトコールである。概して、本発明者らによる方法は、胚性幹（ＥＳ）細胞のコロニーを細胞中に播種することからなる。当該細胞はそれから外に出し、増殖させる。当該細胞は、間葉系幹細胞を取得するために、ＦＧＦ２含有の無血清培地中で、非共培養で増殖させる。
【００４５】
このように、本発明者らの方法は、血清、マウス細胞の使用、または遺伝子操作を必要とせず、操作と時間をほとんど必要としないため、高い拡張性がある。実施例に、２つの異なるｈＥＳＣｓ株（ｈＨＳＣｓ ｌｉｎｅｓ）、ＨｕＥＳ９ならびにＨ−１および３代目であるＨｅｓ−３23からのＭＳＣｓの分離を記載し、本プロトコールのロバスト性を示す。本方法により得られるヒトＥＳ細胞由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）および本書に記載される組成物は、骨髄由来のＭＳＣｓ（ＢＭ−ＭＳＣｓ）と非常に類似している。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、胚性幹細胞培養は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）培養を含む。
【００４７】
本発明のある実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を作製する方法は、ＣＤ１０５陽性ＣＤ２４陰性細胞をソートする前に、ＦＧＦ２および任意でＰＤＧＦ ＡＢが補充された培地中で、フィーダー細胞の支持なしにトリプシン処理を行い増殖させることからなる。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態では、ＦＧＦ２および任意でＰＤＧＦ ＡＢが補充された培地中でフィーダー細胞無しで１週間増殖させた後、ＣＤ１０５陽性ＣＤ２４陰性細胞をトリプシン処理したｈＥＳＣｓ細胞からソートすることを含む本方法は、少なくともいくつかの、好ましくは実質的に全ての、より好ましくは全ての細胞が、お互いに類似または同一（好ましくはホモジニアスな）であるｈＥＳＣｓ−ＭＳＣ細胞株を作出する。
【００４９】
物理的に、生物的におよび機能的にＢＭ−ＭＳＣｓに類似した、臨床的に意義のあるｈＥＳＣＭＳＣ培養物を作出する本方法は、多くの臨床および前臨床動物研究における治療効果を示すＢＭ−ＭＳＣｓの分離のためのＢＭの制限供給を軽減させることができる可能性がある10,25。このことは、侵襲的なＢＭ吸引手法に伴う危険性をもまた排除し、ＢＭ−ＭＳＣｓを調製するための患者当たりの基本的な待機時間および費用を低減させ、バッチ間変動を低減させる。さらに、ｈＥＳＣｓのような明確な細胞タイプの健常者由来ＭＳＣｓは、現在の幅広い臨床および前臨床応用にもかかわらず謎が残っているＭＳＣの分化や生物の研究やよりよい理解に役立つモデルを提供する9。
【００５０】
さらに、当該プロセスにより作出された間葉系幹細胞の使用は、ヒトＥＳＣｓのような他の細胞種を増殖させるフィーダー細胞としての成人組織由来ＭＳＣｓの置換、臍帯血または骨髄幹細胞集団の増殖、および心疾患の治療のためのＭＳＣ−馴化培地の調製といった、臨床または治療への応用における成人組織由来ＭＳＣｓの置換を含む。
【００５１】
胚性幹細胞コロニーの分散
本発明者らによる間葉系幹細胞の作製方法は、胚性幹細胞のコロニーを分解し細胞中に分散させることを含む。
【００５２】
胚性幹細胞コロニーは、ｈｕＥＳ９コロニー (Cowan CA, Klimanskaya I, McMahon J, Atienza J, Witmyer J, et al. (2004) Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med 350: 1353-1356) またはＨ１ＥＳＣコロニー (Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, et al. (1998) Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 282: 1145-1147.) を含んでいても良い。
【００５３】
コロニー中の細胞は実質的な程度、すなわち少なくとも塊の程度にまで分解または分散されることが好ましい。また、コロニー中のすべての細胞が単一になる程度、すなわちコロニーが完全に分解される程度にまで分解または分散されることがより好ましい。
【００５４】
分解は、分散剤により行うことができる。
【００５５】
分散剤は、少なくともいくつかのコロニー中の胚性幹細胞において、お互いから引き離すことができるものであれば、どのようなものであっても良い。当該分散剤は、コロニー中の細胞間または細胞と基質間またはそれら両方の接着を壊す試薬を含むものであることが好ましい。また、当該分散剤はプロテアーゼを含有するものであることが好ましい。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態では、分散剤はトリプシンを含有する。トリプシンによる処理は、例えば約３７℃で３分間行えば十分である。それから、細胞を中和、遠心し、播種の前に培地中に再懸濁する。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法は、プレートにコンフルエントなヒト胚性幹細胞をトリプシンで分散させ、その細胞を播種することを含む。
【００５８】
当該分散とは、吸引（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）、洗浄（ｒｉｎｓｉｎｇ）、トリプシン処理（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）、インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）、取出し（ｄｉｓｌｏｄｇｉｎｇ）、クエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）、再播種（ｒｅ−ｓｅｅｄｉｎｇ）およびアリコーティング（ａｌｉｑｕｏｔｉｎｇ）の連続する工程の少なくともいくつかを含み得る。次のプロトコールは、the Hedrick Lab, UC San Diego (http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html)出典のものである。
【００５９】
吸引の工程では、フラスコのような容器から培地を吸引または除去する。洗浄の工程では、例えば５〜１０ｍｌの、好ましくはＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まない緩衝液で細胞を洗浄する。例えば、カルシウムとマグネシウムを含まないＰＢＳで細胞を洗浄する。トリプシン処理の工程では、緩衝液に入れた分散剤を容器に加え、細胞表面を分散剤溶液で覆うように、容器をまわす。例えば、Ｈａｎｋ’ｓＢＳＳに溶かした１ｍｌのトリプシンをフラスコに加えることができる。
【００６０】
インキュベーションの工程では、一定の温度で、ある時間、細胞を放置する。例えば、３７℃で数分間（例えば、２〜５分間）細胞を放置する。取出しの工程では、機械的作用により（例えば、かき取ること、または、手で容器の側面を打つことにより、細胞を取出すことができる。細胞はシートからはがれ、表面から滑り落ちる。
【００６１】
クエンチングの工程では、フラスコに培地を添加する。当該培地は、分散液の作用を止めるために中和剤を含んでいることが好ましい。例えば、もし分散液がトリプシンのようなプロテアーゼであれば、プロテアーゼの活性を完了させる血清タンパク質のようなタンパク質を培地に含んでいると良い。特殊な例としては、３ｍｌの血清含有細胞培養液を、総量が４ｍｌになるようにフラスコに添加する。細胞はピペットで取出し、分散させることができる。
【００６２】
再播種の工程では、細胞を未使用の培養容器に再播種し、新しい培地を添加する。再播種する数は、様々な分割比で作ることができる。例えば、１／１５希釈および１／５希釈で再播種することができる。特殊な例としては、２５ｃｍ２フラスコに１滴、他の容器に３滴の細胞を入れ、各々に、例えば７５ｃｍ２フラスコから１／１５希釈および１／５希釈になるように７〜８ｍｌの培地を加えても良い。アリコーティングの工程では、新しい培養皿に、望まれる全ての分割比に細胞をアリコートし、培地を添加することができる。
【００６３】
本発明の特殊な実施形態として、次のような工程を含む方法が挙げられる：最初に、胚様体（ＥＢｓ）を形成させるため非接着方法で浮遊させて成長させる。次に、ゼラチンコートされた組織培養プレート上に接着細胞として播種する前に、５〜１０日目のＥＢをトリプシン処理する。
【００６４】
細胞培養の維持
分解した細胞を播種し、培養細胞として維持する。
【００６５】
細胞は、培養容器またはゼラチン化されたプレートのような基質の上に播種することができる。重要なことに、細胞は、共培養せずに（例えば、フィーダー細胞の非存在下で）成長し増殖する。
【００６６】
細胞培養中の細胞は、繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）のような増殖因子を１または複数追加し、任意で、例えば５ｎｇ／ｍｌの血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ ＡＢ）を追加した非血清培地中で増殖する。細胞培養中の細胞は、トリプシン処理、洗浄、再播種を行うことにより、コンフルエント状態の時に分割比１：４で播種し継代することが好ましい。
【００６７】
非共培養
本発明の特に好ましい実施形態では、非共培養で細胞を培養することを含む方法が挙げられる。「共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）」という用語は、例えば間質のフィーダー細胞のように、２種またはそれより多い種類の細胞の混合物が共に増殖することを意味する。
【００６８】
このように、典型的なＥＳ細胞培養においては、培養皿の内側の表面は通常、分裂しないように処理されたマウス胚性皮膚細胞のフィーダー層で覆われている。フィーダー層はＥＳ細胞が接着し増殖するための接着表面を提供する。それに加えて、フィーダー細胞は、ＥＳ細胞が増殖するのに必要な栄養を培養液中に放出する。本書に記載の方法および組成物において、ＥＳおよびＭＳＣ細胞はそのような共培養を行わずに培養される。
【００６９】
好ましくは、当該細胞は、単層またはフィーダー細胞の非存在下で培養される。本書に記載の方法の好ましい実施形態では、胚性幹細胞はフィーダー細胞の非存在下で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を樹立する。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態では、解離または分散した胚性幹細胞を培養基材上に直接播種する。培養基材は、ペトリ皿のような組織培養容器であってもよい。容器は前処理されていてもよい。本発明の好ましい実施態様では、ゼラチン化された組織培養プレート上に細胞を播種し、増殖させる。
【００７１】
培養皿をゼラチンコートするためのプロトコール例は次のとおりである。蒸留水中に０．１％ゼラチン溶液を作成し、加圧滅菌する。これを室温で貯蔵してもよい。組織培養皿の底面をゼラチン溶液で覆い、１５分間インキュベーションする。ゼラチンを除去し、プレートは使用できる状態になる。低張性の溶解を防ぐため、培地は細胞を加える前に添加すべきである。
【００７２】
無血清培地
解離または分散した胚性幹細胞は、無血清培地中で培養することが好ましい。
【００７３】
「無血清培地（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ）」という用語は、血清タンパク質（例えば、ウシ胎仔血清）を含まない細胞培養用培地を含んでいてもよい。無血清培地は当業者に公知であり、例えば、米国特許５６３１１５９や５６６１０３４に記載されている。無血清培地は、例えばＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から市販されている。
【００７４】
無血清培地は、タンパク質、加水分解物および未知の組成の成分を欠乏しているという点で、タンパク質を含まないものであってもよい。無血清培地は、全ての成分の化学構造が公知である、既知組成培地であってもよい。既知組成の無血清培地は、バラツキを除外し、再現性やより一致した性能を可能にする完全に定義済みのシステムであり、外来の試薬によるコンタミネーションの可能性を減らすため、好都合である。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態では、無血清培地はＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ培地 (Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York) を含む。
【００７６】
当該無血清培地は、１または複数の血清代替培地のような成分を、例えば、５％、１０％、１５％等の濃度で追加したものであってもよい。当該非血清培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ (Grand Island, New York) から市販されている１０％の血清代替培地を追加したものであることが好ましい。
【００７７】
細胞増殖因子
解離または分散した胚性幹細胞が培養される無血清培地は、１または複数の細胞増殖因子を含むことが好ましい。ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、ＮＧＦ、エリスロポエチン、ＴＧＦ-β、ＩＧＦ-ＩおよびＩＧＦ-ＩＩを含む多くの細胞増殖因子が当業者に周知である。
【００７８】
細胞増殖因子は、繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を含んでいてもよい。また、当該培地は、血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ ＡＢ）のようなその他の細胞増殖因子を含んでいても良い。これらの細胞増殖因子は共に当業者に周知である。本発明の特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＦＧＦ２およびＰＤＧＦ ＡＢの両方を含有する培地中で細胞を培養する方法を含む。
【００７９】
代替的または追加的に、当該培地は上皮細胞増殖因子を含有するものであってもよい。ＥＧＦの使用は、ＭＳＣｓの成長を増長させ得る。ＥＧＦは、適当な濃度であればどのような濃度で使用してもよく（例えば５〜１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ）。ＥＧＦはＰＤＧＦの代わりに使用されてもよい。ＥＧＦは、当業者に良く知られたタンパク質であり、symbol EGF, Alt. Symbols URG, Entrez 1950, HUGO 3229, OMIM 131530, RefSeq NM_001963, UniProt P01133と称されている。
【００８０】
このように、本発明者らは、（ｉ）ＦＧＦ２、（ｉｉ）ＦＧＦ２およびＰＤＧＦ、（ｉｉｉ）ＦＧＦ２およびＰＤＧＦおよびその他の細胞増殖因子の組合せ、を含有する培地の使用を開示する。
【００８１】
ＦＧＦ２は、多くの組織、細胞種では低レベルで発現しており、脳および下垂体では高濃度に存在している、広帯域なマイトジェン因子、血管新生因子、神経栄養因子である。ＦＧＦ２は、四肢発生、血管新生、創傷治癒および腫瘍形成を含む多数の生理的および病理的なプロセスに関与している。ＦＧＦ２は、例えば、Invitrogen-Gibco (Grand Island, New York) から商業的に入手できる。
【００８２】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、繊維芽細胞、平滑筋、結合組織を含む幅広い細胞種に対して強力なマイトジェン作用を持つ。Ａ鎖およびＢ鎖と呼ばれる２本鎖の２量体からなるＰＤＧＦは、ＡＡもしくはＢＢホモ２量体またはＡＢヘテロ２量体として存在し得る。ヒトＰＤＧＦ-ＡＢは、１３．３ｋＤａのＡ鎖と１２．２ｋＤａのＢ鎖からなる２５．５ｋＤａのホモ２量体である。ＰＤＧＦは、例えば、Peprotech (Rocky Hill, New Jersey) から商業的に入手できる。
【００８３】
細胞増殖因子（好ましくはＦＧＦ２および任意でＰＤＧＦ ＡＢ）は、約１００ｐｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在することが好ましく、約５００ｐｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在することが好ましく、約１ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在することが好ましく、約２ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在することが好ましく、約３ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在することが好ましく、約４ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在することが好ましく、約５ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在することが最も好ましい。本発明の実施形態では、培地は約５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する。また、培地は約５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ ＡＢを含有することが好ましい。
【００８４】
細胞の分割
培養における細胞は通常、接触阻止（コンタクトインヒビション）により細胞分裂および細胞増殖が停止するコンフルエンス状態に達するまで増殖し続ける。その後、そのような細胞は、基材またはフラスコから解離し、組織培養培地に希釈し、再播種することにより継代培養「分割（ｓｐｌｉｔ）」する。
【００８５】
それゆえ、本書に記載される本発明の方法および構成は、培養のあいだの継代または分割を含む。細胞は、分割比１：２またはそれ以上で分割されることが好ましく、分割比１：３で分割されることが好ましく、分割比１：４、１：５またはそれ以上で分割されることがより好ましい。「継代（ｐａｓｓａｇｅ）」という用語は、セルライン（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）のコンフルエントな培養物のアリコートを取り、新しい培地に入れ、細胞がコンフルエンスまたは飽和状態に達するまで培養すること、からなるプロセスを指す。
【００８６】
選択（セレクション）、選抜（スクリーニング）または分類（ソーティング）の工程
本発明の特に好ましい実施形態によれば、本発明の方法はさらに間葉系幹細胞を分離または選択するための選択（セレクション）と分類（ソーティング）の工程を含む。
【００８７】
選択（セレクション）または分類（ソーティング）の工程は、１または複数の細胞表面抗原マーカーを用いることにより、細胞培養物から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を選別することを含んでいてもよい。選択（セレクション）または分類（ソーティング）の工程は、ＭＳＣｓに対する選別および分類（ソーティング）特異性の厳密さを増長させ、さらに、ｈＥＳＣｓやその他の出発物質由来のｈＥＳＣ誘導物のような胚性幹細胞による潜在的なコンタミネーションの可能性を減少させる。そしてこのことは、テラトーマ形成の危険性をさらに減少させ、本発明者らによるプロトコールの臨床的関連性をさらに増長させるものである。
【００８８】
抗原発現に基づく選択（セレクション）または分類（ソーティング）については多くの方法が知られており、本書で記載する選択（セレクション）または分類（ソーティング）の工程においてこれらのいかなる方法を用いてもよい。本発明における特に好ましい実施形態では、選択（セレクション）または分類（ソーティング）は、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）により行われる。ＦＡＣＳは、細胞に発現する抗原に結合して標識する標識抗体のようなレポーターに細胞をさらすことを伴うことは、当業者に周知である。レポーターを形成するための抗体作成とその標識方法は当業者に周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅに記載されている。それから、ＦＡＣＳ装置に細胞を通過させ、標識に基づいて各々の細胞を分類（ソート）する。代替的または追加的に、細胞を分類（ソート）するのに、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を使用してもよい。
【００８９】
本発明者らは、多くの細胞表面抗原候補（例えば、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＡＮＰＥＰ、ＩＴＧＡ４（ＣＤ４９ｄ）、ＰＤＧＦＲＡ）がＭＳＣｓと関連することが知られている一方で、いくつかのＭＳＣｓ関連細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２９およびＣＤ４９ｅ）はまた、ｈＥＳＣｓのようなＥＳ細胞でも高発現していることを発見し、それらの発現をＦＡＣＳ解析で検証した。細胞表面抗原とＭＳＣｓとの関連は、ＭＳＣｓをｈＥＳＣｓのようなＥＳ細胞から分離するための選択マーカーとしてその抗原が適格であるとみなすには十分ではない。つまり、選択（セレクション）または分類（ソーティング）の工程では、ＭＳＣｓとＥＳ細胞との間で発現の異なる抗原を使用することが好ましい。
【００９０】
本発明の方法の選択（セレクション）または分類（ソーティング）工程は、抗原の発現に基づいて間葉系幹細胞を陽性選択することができる。そのような抗原は、例えば、実施例に記載するように、ｈＥＳＣｓおよびｈＥＳＣＭＳＣｓの遺伝子発現プロファイルを比較することにより同定することができる。本発明の実施形態では、特に下記の表Ｅ１Ａおよび表Ｅ１Ｂに示される抗原を選択（セレクション）または分類（ソーティング）に使用することができる。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法の選択（セレクション）または分類（ソーティング）工程は、ＭＳＣｓ上で発現しておりｈＥＳＣｓのようなＥＳ細胞上で発現していないことが確認された抗原の発現に基づいて間葉系幹細胞を陽性選択することができる。
【００９２】
実施例に示されるように、本発明者らは、ＣＤ７３がＭＳＣｓ上に高発現しており3、その一方でｈＥＳＣｓ上では高発現していないことを実証した（図４Ａ）。さらに、実施例に示すように、ＣＤ７３およびＣＤ１０５はＭＳＣｓで高発現している細胞表面抗原であり、ｈＥＳＣと比べてｈＥＳＣ−ＭＳＣｓで高発現している細胞表面抗原の上位２０の中に入るため（図３、表）、ＣＤ７３またはＣＤ１０５（またはその両方）の推定ＭＳＣｓの選択マーカーとしての使用は、ｈＥＳＣｓの分化により生成した推定ＭＳＣｓを選別するのに効果的である。
【００９３】
代替的または追加的に、選択（セレクション）または分類（ソーティング）の工程は、ｈＥＳＣｓのような胚性幹細胞（ＥＳ細胞）上で高発現し、間葉系幹細胞（例えば、ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）では高発現していない細胞表面抗原に基づく抗原に対する陰性選択により行ってもよい。選択または選別は、従来から知られ同定されている、ＭＩＢＰ、ＩＴＧＢ１ＢＰ３およびＰＯＤＸＬ22、およびＣＤ２４のようなｈＥＳＣｓ特有の細胞表面抗原に基づいて行ってもよい。
【００９４】
実施例では、ＦＡＣＳ解析により、ＣＤ２４の発現がｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ上にはなく、ｈＥＳＣ上にあることを確認したことを示している。
それゆえ、ＣＤ２４は陰性選択（セレクション）または分類（ソーティング）マーカーとして、それ自身で、または、ｈＥＳＣ培養物から分化した推定ＭＳＣｓを分離する陽性選択マーカーとしてのＣＤ１０５と組み合わせて、使用することができる。
【００９５】
重要なことに、間葉系幹細胞は、形質転換せずに自己複製を維持することができる。したがって、例えば、腫瘍細胞や腫瘍細胞のセルラインのような不死化された細胞との融合、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＢＶまたはＨＴＬＶ−１のような形質転換ウイルスによるセルラインのウイルス感染、ラージＴ抗原の配列を含むＳＶ４０ベクターのような特別に適応させたベクターによるトランスフェクション (R. D. Berry et al., Br. J. Cancer, 57, 287-289, 1988)、テロメラーゼ (Bodnar-A-G. et.al., Science (1998) 279: p. 349-52) 、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡ配列を含むベクター（米国特許第５，３７６，５４２）、優性の癌遺伝子の導入、として知られている形質転換処理は、間葉系幹細胞を作製するための本発明の方法では必要ない。
【００９６】
本発明の好ましい実施形態では、間葉系幹細胞およびセルライン（またはそれらに由来する分化した細胞）は、胚性幹細胞の１または複数の特性を示さない。そのような特性は、ＯＣＴ４遺伝子の発現およびアルカリフォスファターゼ活性を含むことが好ましい。また、間葉系幹細胞は、１または複数の多能性マーカーの発現の低減を示すことが好ましい。多能性マーカーは、後に詳細に記載するが、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２ およびＵｔｆ１を含むものである。
【００９７】
本発明の方法により作製される間葉系幹細胞は、非腫瘍形成性のものであることが好ましい。親の胚性幹細胞の移植が腫瘍を形成することと比較して、間葉系幹細胞は、免疫不全の宿主動物に移植された時に、腫瘍にならないことが好ましい。免疫不全の宿主動物は、ＳＣＩＤマウスまたはＲａｇ１−／−マウスであることが好ましい。間葉系幹細胞は、移植の長期間後、好ましくは２週間以上、より好ましくは２ヶ月以上、もっとも好ましくは９ヶ月以上、腫瘍を形成しないことが好ましい。発癌性試験の詳細なプロトコールは実施例に記載する。
【００９８】
本発明の方法により作製される間葉系幹細胞はまた、１または複数の次の特性を示すことが好ましい。当該細胞は、染色体数により評価されるカリオタイプ（核型）が十分に安定であり、好ましくは、細胞培養で維持された場合に少なくとも１０代は安定であること。当該細胞はまた、好ましくは、何世代にもわたって十分に安定な遺伝子発現パターンを示すこと。このことは、１または複数の、好ましくは実質的に全部の、選択された一連の遺伝子発現レベルが、ある代とその次の代の間葉系幹細胞の間で著しくは変化しないことを意味する。
【００９９】
当該一連の遺伝子は、次の１または複数、一部または全てを含むことが好ましい。cerberus (GenBank Accession nos: NM_009887, AF031896, AF035579), FABP (GenBank Accession nos: NM_007980, M65034, AY523818, AY523819), Foxa2 (GenBank Accession nos: NM_010446, X74937, L10409), Gata-1 (GenBank Accession nos: NM_008089, X15763, BC052653), Gata-4 (GenBank Accession nos: NM_008092, AF179424, U85046, M98339, AB075549), Hesx1 (GenBank Accession nos: NM_010420, X80040, U40720, AK082831), HNF4a (GenBank Accession nos: NM_008261, D29015, BC039220), c-kit (GenBank Accession nos: NM_021099, Y00864, AY536430, BC075716, AK047010, BC026713, BC052457, AK046795), PDGFRα (NM_011058, M57683, M84607, BC053036), Oct4 (GenBank Accession nos: NM_013633, X52437, M34381, BC068268), Runx1 (GenBank Accession nos: NM_009821, D26532, BC069929, AK051758), Sox17 (GenBank Accession nos: NM_011441, D49474, L29085, AK004781), Sox2 (GenBank Accession nos: NM_011443, U31967, AB108673), Brachyury (NM_009309, X51683), TDGF1 (GenBank Accession nos: NM_011562, M87321) および Tie-2 (GenBank Accession nos: NM_013690, X67553, X71426, D13738, BC050824)。
【０１００】
本発明の方法により、間葉系幹細胞の作製と同様に、間葉系幹細胞のクローンの子孫を含む分化した細胞を作製することも可能である。「クローンの子孫（ｃｌｏｎａｌ ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）」という用語は、いかなる形質転換処理または遺伝的な改変をも受けていない細胞の子孫であることを意味する。そのような、実質的に遺伝的に変化していないクローンの子孫は、親細胞または祖先の細胞、好ましくは胚性幹細胞（低下した能力を保っている）と遺伝的に同一である。また、「間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」という用語は、間葉系幹細胞由来のセルライン、すなわち間葉系幹細胞セルラインおよびそれから派生したものを含めたものに用いられることが好ましい。
【０１０１】
前駆細胞の誘導
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法は、間葉系幹細胞を選別または選抜するためのさらなる工程を用いてもよい。
【０１０２】
前記さらなる工程とは、上記に記載した工程の前、工程の間、または工程の後に行うことができる。当該さらなる工程は、実際には独立して行われてもよく、具体的には、ＥＳ細胞から、１または複数の前駆細胞またはセルラインを誘導することを含んでいてもよい。
【０１０３】
それゆえ本発明者らは、間葉系幹細胞の誘導の別法を開示する。当該方法は、（ａ）胚性幹（ＥＳ）細胞を準備すること、（ｂ）胚性幹細胞から、その自己再生能力に基づいて選択される前駆細胞セルラインを樹立すること、の工程を含む。
【０１０４】
しかしながら、本方法は、一緒に行われることが好ましい。例えば、本発明者らの方法は、分散または増殖させる工程の前、あいだ、または後に、胚性幹細胞から前駆細胞または前駆細胞セルラインを誘導することを含んでいてもよい。本方法は、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーを分散させることにより得られる細胞またはそれらの子孫の細胞を準備することにより間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を取得すること、ＥＳ細胞から１または複数の前駆細胞または前駆細胞セルラインを誘導し、その細胞を共培養せずにＦＧＦ２含有無血清培地中で増殖させること、を含んでいてもよい。
【０１０５】
前駆細胞セルラインは、その自己複製能力に基づいて選択する方法、または、体細胞が自己複製できないことに基づいてその対照物を選択する方法、または、その両方を用いて選択することが好ましい。
【０１０６】
本発明の好ましい実施形態では、前駆細胞セルラインは、共培養せずに、好ましくはフィーダー細胞の非存在下で、誘導または樹立される。胚性幹細胞の対照物は、共培養せずに選択することが好ましい。
【０１０７】
本発明の好ましい実施形態では、前駆細胞セルラインは、形質転換なしに樹立される。前駆細胞セルラインは、胚性幹細胞またはその子孫細胞を、推定前駆細胞の自己複製を促進させる条件下にさらすことにより樹立してもよい。自己複製促進条件は、胚性幹細胞の増殖を抑えることが好ましい。
【０１０８】
自己複製促進条件は、富栄養培地（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉａ）中での増殖性を含んでいてもよい。自己複製促進条件は、ＬＩＦの非存在下で細胞を成長させることを含むことがより好ましい。自己複製促進条件は、連続継代を含むことが好ましい。自己複製促進条件は、少なくとも１２代の連続継代を含むことが好ましい。
【０１０９】
本発明の好ましい実施形態では、前駆細胞セルラインは、胚性幹細胞と比較して能力が低減している。前駆細胞セルラインは、系列制限され、多能性を持たないことが好ましい。前駆細胞セルラインは発癌性がないことが好ましい。
【０１１０】
前駆細胞セルラインを誘導する工程は、胚性幹細胞を特殊な系列への分化を促進させる条件にさらす工程を含むことが好ましい。分化を促進させる条件は、胚性幹細胞から胚様体を作出することを含むことが好ましい。当該細胞は、全能性を失った後、分化を促進させる条件下から除かれることが好ましい。
【０１１１】
当該細胞を系列制限促進の条件下から除くことは、胚様体を分散させることを含むことが好ましい。当該方法は、約３〜６日間成長した胚様体を分散させることを含むことが好ましい。
【０１１２】
本発明の好ましい実施形態では、前駆細胞セルラインは、ＯＣＴ４遺伝子およびアルカリフォスファターゼ活性のどちらかまたは両方の発現が低下するか、もしくはほぼ発現しない。
【０１１３】
前駆細胞セルラインは、それらが由来する胚性幹細胞と比較すると、全能性マーカーの発現が低下することが好ましい。全能性マーカーは、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２およびＵｔｆ１からなるグループから選択されることが好ましい。
【０１１４】
本発明の好ましい実施形態では、前駆細胞セルラインは、次に示す特性のうち、１または複数の特性を示すことが好ましい。（ａ）細胞培養において４０代以上維持できる、（ｂ）細胞培養において少なくとも１０代以上維持した時に、カリオタイプ（核型）または染色体数が十分に安定である、（ｃ）何世代にもわたって、十分に安定した遺伝子発現パターンを示す。
【０１１５】
前駆細胞セルラインは、動物（好ましくは免疫不全動物）に移植された時に、テラトーマをほとんど誘導しないことが好ましく、好ましくは３週間後、より好ましくは２〜９ヶ月後にテラトーマをほとんど誘導しないことが好ましい。
【０１１６】
胚性幹細胞または前駆細胞セルラインは哺乳動物であることが好ましく、マウスまたはヒトの胚性幹細胞または前駆細胞セルラインであることが好ましい。
【０１１７】
当該前駆細胞は、血管内皮前駆細胞セルライン（好ましくはＥ−ＲｏＳＨセルライン）であることが好ましい。代替的または追加的に、当該前駆細胞セルラインは、間葉系前駆細胞セルライン（好ましくはｈｕＥＳ９．Ｅ１セルライン）を含んでいてもよい。
【０１１８】
本発明のある実施形態では、本方法はさらに（ｄ）前駆細胞セルラインから分化した細胞を誘導すること、の工程を含む。
【０１１９】
前駆細胞セルラインは、分化の前に少なくとも５代の間、増殖させることが好ましい。
【０１２０】
本発明者らは、（ａ）胚性幹（ＥＳ）細胞から前駆細胞セルラインを誘導すること、（ｂ）前駆細胞セルラインを増殖させること、（ｃ）前駆細胞セルラインから分化した細胞を誘導すること、の方法を含む胚性幹（ＥＳ）細胞から分化した細胞を作出する方法を提供する。
【０１２１】
当該方法は、（ａ）胚性幹（ＥＳ）細胞を準備すること、（ｂ）胚性幹細胞から前駆細胞を誘導すること、（ｃ）前駆細胞からその自己複製能力に基づいて選択される前駆細胞セルラインを樹立すること、を含む方法である。
【０１２２】
当該方法は、特に、胚性幹（ＥＳ）細胞から分化した細胞を作出するのに用いられてもよい。分化した細胞は、血管内皮細胞または間葉系細胞であることが好ましい。また、分化した細胞は、脂肪細胞または骨細胞であることがより好ましい。
【０１２３】
本発明者らは、本発明のいかなる前記状況による方法で作製される前駆細胞セルラインをも提供する。
【０１２４】
本書で記載される当該方法および構成は、選択（セレクション）、選抜（スクリーニング）またはその両方のための、ＭＳＣｓのその他の要因または特性を利用したさらなる工程をさらに含んでいてもよい。
【０１２５】
分化の傾向
本発明の好ましい実施形態では、胚性幹細胞由来の特定系列の前駆細胞セルラインを作出する方法は、所望の特定系列または関心ある系列へと向かう胚性幹細胞の分化へと方向づける第１の工程をさらに含むことが好ましい。また、本発明者らの方法は、推定前駆細胞の自己複製を促し、胚性幹細胞の増殖を抑える、第２の工程を含んでいてもよい。
【０１２６】
第１の工程は、関心ある特定系列の成長または増殖を促進させることを含んでいてもよい。細胞を関心ある系列への分化を促進する条件下に置くことで、異なる前駆細胞セルラインを作ることができる。例えば、胚性幹細胞を、細胞増殖因子または分化を促進もしくは可能にするリガンドのような低分子にさらしてもよい。
【０１２７】
このように、胚性幹細胞由来の特定系列の細胞株を樹立するための本発明の方法は、特定系列へと向かう胚性幹細胞の分化を促す工程を含むものであることが好ましい。分化促進の工程は、所定の時間行われることが好ましい。胚性幹細胞またはその子孫細胞は、一過的に分化を促進させる環境にさらされることが好ましい。
【０１２８】
分化を促すまたは方向づける方法は、作製したい前駆細胞の特定の細胞系列によって選択する。当業者であれば、様々な細胞に用いられる様々な方法を認識している。
【０１２９】
内胚葉前駆細胞
内胚葉系の組織へと向かう胚性幹細胞の分化傾向が望まれるところでは、例えば、胚様体が形成および分散されてもよい（後述参照）。分散された胚様体は、内胚葉性への分化を誘導する細胞増殖因子、薬剤、またはそれらの組合せにさらされてもよい。前記増殖因子および薬剤の例には、アクチビンＡ、ＦＧＦ４、デキサメタゾンおよびレチノイン酸を含む。
【０１３０】
造血前駆細胞および血管内皮前駆細胞
一方、造血または血管内皮細胞系列へと向かう胚性幹細胞の分化傾向が望まれるところでは、分散した胚様体は、血管内皮細胞への分化を誘導する細胞増殖因子、薬剤、またはそれらの組合せにさらされてもよい。前記増殖因子および薬剤の例には、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−３、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ＴＮＦαおよびラパマイシンを含む。
【０１３１】
心臓中胚葉および骨格筋芽細胞の前駆細胞
一方、心臓中胚葉または骨格筋芽細胞系列へと向かう胚性幹細胞の分化傾向が望まれるところでは、分散した胚様体は、心臓中胚葉または骨格筋芽細胞への分化を誘導する細胞増殖因子、薬剤、またはそれらの組合せにさらされてもよい。前記増殖因子および薬剤の例には、デキサメタゾン、ＰＰＡＲγのインヒビター（阻害剤）およびテストステロンまたはそのアナログを含む。
【０１３２】
第２の工程は、富栄養培地（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉａ）中に分化した細胞を播種することを含んでもよい。そのような実施形態において、継続的増殖は、クローン化され得る前駆細胞を選択的に増やすであろう。
【０１３３】
胚様体の形成
本発明のある実施形態では、分化促進工程は、胚性幹細胞からの胚様体の形成を含む。胚様体およびその作製方法は当業者に周知である。「胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）」という用語は、懸濁液中での胚性幹細胞の成長により作られる培養で見られる、スフェロイドコロニーを意味する。胚様体は、混合細胞種であり、特殊な細胞種が現れる分配およびタイミングは、胚の中に観察されるものに相当する。胚様体は、胚性幹細胞を半固形培地上に播種することにより作出されることが好ましく、Lim et al, Blood. 1997;90:1291-1299 に記載されるようにメチルセルロース培地により作出されることが好ましい。また胚様体は、３〜６日間培養したものが好ましい。
【０１３４】
前記実施形態では、胚様体は分散される。すなわち、系列制限を促進する条件を解除するために、例えば、コラゲナーゼまたはトリプシン処理によって、構成細胞を互いに分離する。
【０１３５】
本発明の好ましい実施形態における方法は、所望の特定系列に向いている推定の前駆細胞を選択する工程を含む。当該選択は、細胞の形態またはマーカーの発現に基づいて行うことができる。遺伝子発現プロファイリングまたは抗原プロファイリングもまた、所望の系列である特定の前駆細胞を選択するのに用いることができる。選択された、所望の特定系列に向いている推定前駆細胞は、その後培養し、さらなる選択工程を行ってもよい。
【０１３６】
本発明の好ましい実施形態では、分化促進工程は、推定前駆細胞の自己複製を促進させる条件および胚性幹細胞の増殖を抑える条件下に分化した細胞をさらすことに続いて行われる。前記条件は、共培養またはフィーダー細胞の非存在下での培養（前述参照）を含むことが好ましい。
【０１３７】
富栄養培地（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉａ）
代替的または追加的に、前記の条件は、富栄養培地中に播種することを含む。本書で用いられているように、「富栄養培地（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉａ）」は、栄養の豊富な培地を意味しようとするものである。前記培地は、関連細胞の成長に必要な必須栄養素を含有していることが好ましい。当該富栄養培地は、血清を含むことが好ましい。また、成長に必要なほぼすべての栄養素を含むことがより好ましい。また、当該富栄養培地は、関連細胞の成長を促し、支持するものであることが最も好ましい。本発明のより好ましい実施形態では、当該関連細胞は、前駆細胞または関係する推定の前駆細胞である。富栄養培地の例としては、４５００ｍｇ／ｍｌ Ｄ−グルコースのＤＭＥＭに、２０％ウシ胎仔血清、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミンおよびβ‐メルカプトエタノールを補完したものが挙げられる。
【０１３８】
本発明の好ましい実施形態では、前記富栄養培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）のような胚性幹細胞の成長を促進させる付加的な増殖調節因子またはホルモンを含まない。
【０１３９】
前記実施形態によれば、継続的増殖は、クローン化され得る前駆細胞を選択的に増やすであろう。
【０１４０】
長期培養
本発明の方法は、胚性幹細胞またはその子孫細胞を一世代以上培養することを含むものであることが好ましい。当該細胞は５代以上、１０代以上、１５代以上、２０代以上、２５代以上、３０代以上、４０代以上、４５代以上、５０代以上、１００代以上、２００代上、５００代以上または８００代以上培養されることが好ましい。特に、当該細胞株は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、２００、５００、あたはそれ以上の世代にわたって維持されてもよい。
【０１４１】
培養における細胞は通常、接触阻止（コンタクトインヒビション）により細胞分裂および細胞増殖が停止するコンフルエンス状態に達するまで増殖し続ける。それから、そのような細胞は、基材またはフラスコから解離し、組織培養培地に希釈し、再播種することにより継代培養「分割（ｓｐｌｉｔ）」する。それゆえ、前駆細胞は、培養中に継代されてもよく、分割比１：２またはそれ以上で分割されることが好ましく、分割比１：３で分割されることが好ましく、分割比１：４、１：５またはそれ以上で分割されることがより好ましい。「継代（ｐａｓｓａｇｅ）」という用語は、セルライン（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）のコンフルエントな培養物のアリコートを取り、新しい培地に入れ、細胞がコンフルエンスまたは飽和状態に達するまで培養すること、からなるプロセスを指す。
【０１４２】
しかしながら、本発明の方法により誘導された前駆細胞は、その自己複製能力に基づいて、多くの世代にわたって維持されてもよい。一方で、組織から直接誘導された「普通の」細胞（すなわち、形質転換されていない体細胞）は不死ではないことが従来から確立されている。言い換えれば、前記体細胞は培養中の寿命に制限がある（死ぬ運命にある）。そのような体細胞は、無期限に増殖し続けることはできず、最終的に、ある数の世代の後に増殖または分裂する能力を失う。「危機的局面（ｃｒｉｓｉｓ ｐｈａｓｅ）」を境にして、そのような細胞は約５０世代後に死んでしまう。したがって、体細胞は制限された回数のみ継代されてもよい。
【０１４３】
重要なことに、当該前駆細胞は、形質転換せずに自己複製を維持することができる。したがって、例えば、腫瘍細胞や腫瘍細胞のセルラインのような不死化された細胞との融合、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＢＶまたはＨＴＬＶ−１のような形質転換ウイルスによるセルラインのウイルス感染、ラージＴ抗原の配列を含むＳＶ４０ベクターのような特別に適応させたベクターによるトランスフェクション (R. D. Berry et al., Br. J. Cancer, 57, 287-289, 1988)、テロメラーゼ (Bodnar-A-G. et.al., Science (1998) 279: p. 349-52) 、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡ配列を含むベクター（米国特許第5,376,542）、優性の癌遺伝子の導入、として知られている形質転換処理は、前駆細胞を作製するための本発明の方法では必要ない。
【０１４４】
本発明の方法の好ましい実施形態によれば、前駆細胞は、形質転換せずに５０代以上増殖されてもよい。本発明の好ましい実施形態では、当該前駆細胞は、前駆細胞セルラインとして形質転換せずに、無限に増殖されてもよい。当該前駆細胞および前駆細胞セルラインは、その親の胚性幹細胞と比較して系列制限されていることが好ましい。特に、当該前駆細胞および前駆細胞セルラインは、三胚葉すべてを発生させることはできない。本発明のより好ましい実施形態では、当該前駆細胞セルラインは非全能性であることが好ましい。
【０１４５】
前駆細胞の特性
本発明の好ましい実施形態では、当該前駆細胞およびセルライン（またはそれらに由来する分化した細胞））は、胚性幹細胞の１または複数の特性を示さない。前記特性は、ＯＣＴ４遺伝子の発現およびアルカリフォスファターゼ活性を含むことが好ましい。また、当該前駆細胞セルラインは、１または複数の多能性マーカーの発現の低減を示すことが好ましい。多能性マーカーは、後に詳細に記載するが、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２およびＵｔｆ１を含むものである。
【０１４６】
本発明の方法により作製される前駆細胞は、非腫瘍形成性のものであることが好ましい。親の胚性幹細胞の移植が腫瘍を形成することと比較して、間葉系幹細胞は、免疫不全の宿主動物に移植された時に、腫瘍にならないことが好ましい。免疫不全の宿主動物は、ＳＣＩＤマウスまたはＲａｇ１−／−マウスであることが好ましい。間葉系幹細胞は、移植の長期間後、好ましくは２週間以上、より好ましくは２ヶ月以上、もっとも好ましくは９ヶ月以上、腫瘍を形成しないことが好ましい。発癌性試験の詳細なプロトコールは実施例に記載する。
【０１４７】
本発明の方法により作製される前駆細胞はまた、１または複数の次の特性を示すことが好ましい。当該細胞は、染色体数により評価されるカリオタイプ（核型）が十分に安定であり、好ましくは、細胞培養で維持された場合に少なくとも１０代は安定であること。当該細胞はまた、好ましくは、何世代にもわたって十分に安定な遺伝子発現パターンを示すこと。このことは、１または複数の、好ましくは実質的に全部の、選択された一連の遺伝子発現レベルが、ある代とその次の代の前駆細胞の間で著しくは変化しないことを意味する。
【０１４８】
当該一連の遺伝子は、次の１または複数、一部または全てを含むことが好ましい：cerberus (GenBank Accession nos: NM_009887, AF031896, AF035579), FABP (GenBank Accession nos: NM_007980, M65034, AY523818, AY523819), Foxa2 (GenBank Accession nos: NM_010446, X74937, L10409), Gata-1 (GenBank Accession nos: NM_008089, X15763, BC052653), Gata-4 (GenBank Accession nos: NM_008092, AF179424, U85046, M98339, AB075549), Hesx1 (GenBank Accession nos: NM_010420, X80040, U40720, AK082831), HNF4a (GenBank Accession nos: NM_008261, D29015, BC039220), c-kit (GenBank Accession nos: NM_021099, Y00864, AY536430, BC075716, AK047010, BC026713, BC052457, AK046795), PDGFRα (NM_011058, M57683, M84607, BC053036), Oct4 (GenBank Accession nos: NM_013633, X52437, M34381, BC068268), Runx1 (GenBank Accession nos: NM_009821, D26532, BC069929, AK051758), Sox17 (GenBank Accession nos: NM_011441, D49474, L29085, AK004781), Sox2 (GenBank Accession nos: NM_011443, U31967, AB108673), Brachyury (NM_009309, X51683), TDGF1 (GenBank Accession nos: NM_011562, M87321) および Tie-2 (GenBank Accession nos: NM_013690, X67553, X71426, D13738, BC050824)。
【０１４９】
本発明の方法により、前駆細胞および前駆細胞セルラインの作製と同様に、前駆細胞のクローンの子孫を含む分化した細胞を作製することも可能である。「クローンの子孫（ｃｌｏｎａｌ ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）」という用語は、どのような形質転換処理または遺伝的な改変も受けていない細胞の子孫であることを意味する。そのような、実質的に遺伝的に変化していないクローンの子孫は、親細胞または祖先の細胞、好ましくは胚性幹細胞（低下した能力を保っている）と遺伝的に同一である。また、「前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）」という用語は、前駆細胞由来のセルライン、すなわち前駆細胞セルラインおよびそれから派生したものを含めたものに用いられることが好ましい。
【０１５０】
自己複製および分化の調節
本発明者らの方法は、自己複製または分化の推定調節因子を同定するのに使用されてもよい。本方法は、候補分子の存在下および非存在下で前駆細胞セルラインまたは分化した細胞を産出するための方法を実施すること、および、そのプロセスで当該分子がいかなる効果をもたらすかを同定すること、に関与する。例えば、前駆細胞または分化した細胞の産生を進展させる分子は分化の正の調節因子として（またはその代わりに自己複製の阻害因子として）用いることができる。反対に、そのプロセスを遅らせる分子は、分化の阻害因子または自己複製のプロモーターであると考えられる。
【０１５１】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明者らはまた、本発明の方法により得られる選択された系統の細胞（好ましくは前駆細胞）を提供する。これまで、前駆細胞の調製物は、選択したどの細胞が前駆細胞であるかの確実性という点で不純すぎるものであった。ほぼ１００％純粋な前駆細胞の調製物が可能な本発明の培養によれば、単一前駆細胞の単離が達成される。
【０１５２】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らはさらに、その大多数の細胞が選択された系列の前駆細胞である、多能性の細胞を含む組成物を提供する。当該細胞の少なくとも６０％が選択された系列の前駆細胞であることが好ましい。また、当該細胞の少なくとも６０％が前駆細胞であることがより好ましい。加えて、本発明は、単離された前駆細胞を提供する。セルライン（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）という用語は、培養中に維持されて増殖することができ、不死化または無限の寿命を示すものを意味することが好ましい。
【０１５３】
本発明は、ＵＳ ６０／６０９，２１６に記載されているように、分化を促進させるｍＴＯＲの活性を減少させることと組み合わせてもよい。
【０１５４】
前駆細胞の使用
本発明者らの方法は、様々な種類の前駆細胞およびセルラインを産生することができる。
【０１５５】
例えば、本発明者らは、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）、神経前駆細胞、造血前駆細胞、骨髄前駆細胞、血管内皮前駆細胞、骨髄間質細胞、骨格筋前駆細胞、膵島前駆細胞、間葉系前駆細胞、心臓中胚葉幹細胞、肺上皮前駆細胞、肝前駆細胞および内胚葉前駆細胞を作出する方法を開示する。
【０１５６】
本発明の方法により作製される前駆細胞は、様々な商業的に重要な研究、試薬および治療の目的で使用することができる。これらの使用は、通常、当業者に周知であるが、ここで簡単に記載する。
【０１５７】
例えば、幹細胞は、再生医療のための前駆細胞群を作出するのに用いてもよい。前駆細胞は、生体外での拡張、または、患者への直接投与によって作製されてもよい。当該細胞は、外傷による損傷組織を再構成するものとして用いることもできる。
【０１５８】
したがって、造血前駆細胞は骨髄置換として用いることができ、心臓の前駆細胞は、心不全の患者に用いることができる。皮膚の前駆細胞は、患者への植皮、および、ステントまたは人工心臓のような人工装具の内皮化のための血管内皮前駆細胞を成長させるために使用することができる。
【０１５９】
胚性幹細胞およびその組織幹細胞への誘導細胞は、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病等、退行性の疾病に向いた前駆細胞のソースとして用いてもよい。幹細胞は、例えば、癌の免疫治療に用いるナチュラルキラー細胞または樹状細胞の前駆体のソースとして用いることもできる。当該前駆体は、本発明の方法により作製することができる。
【０１６０】
本発明の方法および組成物により、前駆細胞を作製することができる。当該細胞は、当業者に周知の方法により分化させて作製したものであってもよい。したがって、分化した細胞のいかなる使用であっても、そのソースであるそれらの前駆細胞と同様である。
【０１６１】
本発明の方法および組成物により産生される前駆細胞は、医薬組成物の調製や疾病の治療のために用いてもよい。前記の疾病は、心不全、骨髄疾患、皮膚病、火傷ならびに糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病および癌のような退行性の疾病の治療を含む再生医療により治療できる疾病を含んでいてもよい。
【０１６２】
そのため、本発明者らは、（ａ）胚性幹（ＥＳ）細胞を提供すること、（ｂ）胚性幹細胞から、その自己複製能力に基づいて選択される前駆細胞セルラインを樹立すること、（ｄ）任意で、当該前駆細胞セルラインから分化した細胞を誘導すること、（ｅ）当該細胞株または分化した細胞を患者に投与すること、を含む疾病の治療方法を記載する。
【０１６３】
取得した間葉系幹細胞の特性
本発明の方法および組成物により取得したＭＳＣｓは、通常、ＭＳＣｓを同定するのに用いられるものとして当業者に周知であるような、形態学的、表現型および機能的な基準9を満たすことが好ましい。参照しやすいように、本発明の方法および組成物により取得した間葉系幹細胞（特に、ヒト胚性幹細胞を由来とするもの）は、「ｈＥＳＣ−ＭＳＣ」と呼ぶことができる。
【０１６４】
したがって、本発明の方法および組成物により取得されるＭＳＣは、間葉系幹細胞の１または複数の形態学的特性を示すことが好ましい。例えば、取得したＭＳＣｓは、繊維芽細胞様の表現型を伴った接着性の単層を形成してもよい。
【０１６５】
さらに、取得したＭＳＣｓは、間葉系幹細胞に類似または一致した細胞表面抗原プロファイルを示すことが好ましい。そのため、取得したＭＳＣｓの細胞表面抗原プロファイルは、ＣＤ２９陽性、ＣＤ４４陽性、ＣＤ４９ａおよびｅ陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１６６陽性、および、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性9-11、の１または複数、好ましくはすべてを含んでいてもよい。
【０１６６】
取得したＭＳＣｓは、当業者に周知および後述の方法を用いて、いかなる間葉系の系列に分化させてもよい。したがって、本発明の方法および組成物により取得したＭＳＣｓは、脂質形成、軟骨形成、骨形成を含む様々な可能性を示す9。
【０１６７】
記載されたように取得された間葉系幹細胞（例えば、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）は、インビトロにおいて十分な増殖能を持つことができる。ある実施形態では、取得した間葉系幹細胞は、通常の２倍体のカリオタイプ（核型）を維持している間、少なくとも１０回の細胞集団倍加を経ている。しかしながら、当該ＭＳＣｓは、通常の２倍体のカリオタイプ（核型）を維持している間、少なくとも２０〜３０の細胞集団倍加を経ることができる。本発明の好ましい実施形態では、この時間を通して、当該ＭＳＣｓは、安定な遺伝子発現および細胞表面抗原プロファイルを示す。
【０１６８】
取得したＭＳＣｓは、染色体異常および／または遺伝子発現の改変のような欠陥を示さないことが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、前記欠陥は、継代の１０代後、好ましくは１３代後、より好ましくは１５代後まで、明白にならない。
【０１６９】
均一性
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法により産生される間葉系幹細胞は、事実上、類似または同一（好ましくは均一）である。すなわち、本プロトコールにより単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）クローンは、表現型的またはその他の点において、お互いに高い類似性または同一性を示す。
【０１７０】
類似性または同一性は、多くの手法により評価され、１または複数の特性により測定することができる。本発明の好ましい実施形態では、当該クローンは、遺伝子発現において類似または同一である。本方法は、本方法により選択されるどれか２つまたは複数の間葉系幹細胞が、ほぼ同一または類似した遺伝子発現プロファイル（すなわち、遺伝子発現とその発現レベルの同一性の組合せ）を示すことが好ましい。単離された間葉系幹細胞のほぼすべてが、ほぼ同一または類似した遺伝子発現プロファイルを示すことが好ましい。
【０１７１】
遺伝子発現の均一性は、多くの手段により測定することができる。ゲノムワイドな遺伝子プロファイリングは、例えば、実施例で示すように、抽出したＲＮＡのアレイハイブリダイゼーションを用いて行う。全ＲＮＡを抽出し、関連ゲノムからの多能性の遺伝子配列を含むアレイチップにハイブリダイズするｃＤＮＡに変換してもよい。当該アレイは、遺伝子のバリデート、アノテート、キュレートがＮＣＢＩのスタッフおよびコラボレーターにより継続的に特徴付けられているＮＣＢＩ参照配列遺伝子を含むことが好ましい。
【０１７２】
それから、サンプル間の遺伝子発現は、解析ソフトを用いて比較する。本発明の好ましい実施形態では、遺伝子発現の類似性または同一性は、相関係数として現した。前記手法では、二つのサンプル間の高い相関係数は、二つのサンプル間の遺伝子発現パターンの類似性の高さを示している。逆に、二つのサンプル間の低い相関係数は、二つのサンプル間の遺伝子発現パターンの類似性の低さを示している。データ解析を行う前に、体系的な変化またはバイアス（強度的バイアス、空間的バイアス、プレートバイアスおよびバックグラウンドバイアスを含む）を除くために、補正（ノーマライゼーション）を行うとよい。
【０１７３】
相関試験は、当業者に周知であり、例えば、Hill, T. & Lewicki, P. (2006). Statistics: Methods and Applications. StatSoft, Tulsa, OK, ISBN: 1884233597 (also StatSoft, Inc. (2006). Electronic Statistics Textbook. Tulsa, OK: StatSoft. WEB: http://www.statsoft.com/textbook/stathome.html) に記載されているようなｔ−検定、Ｐｅａｒｓｏｎの検定を含む。参考文献として、Khojasteh et al., 2005, A stepwise framework for the normalization of array CGH data, BMC Bioinformatics 2005, 6:274 が挙げられる。クラス内相関係数は、Khojasteh et al, supra に記載されているように行ってもよい。
【０１７４】
本発明の好ましい実施形態では、Ｐｅａｒｓｏｎの検定は、Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数を生成するのに行う。相関係数１．０は、同一の遺伝子発現パターンであることを示す。
【０１７５】
本発明の好ましい実施形態では、ｃＤＮＡは、Ｓｅｎｔｒｉｘ ＨｕｍａｎＲｅｆ−８Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐにハイブリダイズし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＳｔａｔｉｏｎ ５００ｘを用いてスキャンを行う。データは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて抽出、補正（ノーマライズ）および解析されることが好ましい。しかしながら、遺伝子発現プロファイルの類似性をアッセイするのに、当該リーダーが、いかなる適したチップ、スキャニングハードウェアおよびソフトウェア（係数測定を出力する）を用いても良いことは明白である。
【０１７６】
好ましくは上記手段により測定される２つの単離物間の遺伝子発現相関係数は、０．６５以上であることが好ましく、０．７０以上であることが好ましく、０．８０以上であることが好ましく、０．８５以上であることが好ましく、０．９０以上であることがより好ましく、０．９５以上であることが最も好ましい。
【０１７７】
ある実施形態では、本発明の方法は、得られた間葉系幹細胞のどれか２つまたはそれ以上の単離物間での遺伝子発現相関係数が、１ヶ月のような期間を隔てて測定したときに、同等のＲＮＡサンプルの技術的複製物間での相関係数と同位またはわずかに小さい値である間葉系幹細胞を作出する。他の実施形態では、間葉系幹細胞のどれか２つまたはそれ以上の単離物間での遺伝子発現相関係数が、０．９０以上であり、好ましくは０．９５以上である。
【０１７８】
遺伝子発現相関係数は、上述した選択（セレクション）または分類（ソーティング）手段をうけた細胞間で前記範囲内にあることが好ましい。大多数の単離物間、好ましくはすべての単離物間の遺伝子発現係数が、前記範囲内にあることが好ましい。
【０１７９】
したがって、実施例で示されるように、相関係数は、取得した５つの間葉系幹細胞間で高い類似性を示し、４つの系列間の相関係数が０．９６で残りの１つが０．９０である。対照的に、１ヶ月を隔てて解析されるＲＮＡサンプルの技術的複製物間の相関係数は０．９７と０．９８の間にある。
【０１８０】
したがって、本発明者らは、互いにほぼ類似または同一（好ましくは均一）である間葉系幹細胞を作出する方法を提供する。当該単離物は、ほぼ同一の遺伝子発現プロファイルを示す。
【０１８１】
上述した「内部の」均一性（すなわち、本発明の方法によるＭＳＣｓの単離物間における均一性）と同様に、均一性は、前記単離物と、他の細胞または細胞種との間で評価されてもよい。特に、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣｓ）のような他の方法により誘導された間葉系幹細胞で比較してもよい。本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法および組成物により得られるＭＳＣｓは、ＢＭ−ＭＳＣに類似の、または均一の、または同一の遺伝子発現プロファイルを示す。したがって、当該取得したＭＳＣｓは、ＢＭ−ＭＳＣｓとの間で０．５以上、好ましくは０．６以上、好ましくは０．７以上の遺伝子発現相関係数を示してもよい。
【０１８２】
したがって、実施例で示すように、個別に誘導した３つのｈＥＳＣ−ＭＳＣ集団と、３つのＢＭ−ＭＳＣ集団のサンプル間における、遺伝子発現の一対比較は相関係数が０．７２に近いことがわかっている。
【０１８３】
間葉系幹細胞形成の調節因子
本発明者らの方法は、胚性幹細胞からの間葉系幹細胞形成の推定調節因子を同定するのに用いてもよい。
【０１８４】
当該方法は、候補分子の存在下および非存在下で間葉系幹細胞を産生するための本発明方法を実施すること、および、そのプロセスで当該分子がどのような効果をもたらすかを同定すること、を含むものである。例えば、間葉系幹細胞の産生を進展させる分子は分化の正の調節因子として用いることができる。反対に、そのプロセスを遅らせる分子は、間葉系幹細胞形成の阻害因子と考えられる。
【０１８５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らはまた、本発明の方法により得られる細胞（好ましくは間葉系幹細胞）を提供する。これまで、間葉系幹細胞の調製物は、不純すぎるもしくは実質的に、表現型的に、類似または同一ではない（例えば、遺伝子発現に関して）、または、共培養もしくは血清の存在下における方法により産生されるので臨床目的に適さないものであった。本発明の培養によれば、互いに類似または同一である（好ましくは均一である）ほぼ１００％純粋な間葉系幹細胞の調製物を生み出すことができる。
【０１８６】
加えて、本発明者らは、分化した細胞を産生するプロセス、ならびに、本書に記載される方法による間葉系幹細胞を取得することおよび当該間葉系幹細胞を分化させることを含む方法を記述する。例えば、脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞等に分化させる方法を提供する。さらに、そのような方法により得られる分化した細胞を提供する。前記間葉系幹細胞および分化した細胞から作製されるセルラインもまた提供する。セルライン（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）という用語は、培養中に維持および増殖し続けることができ、不死のまたは無期限の寿命を示すことが意味することが好ましい。
【０１８７】
本発明は、ＵＳ ６０／６０９，２１６に記載されているように、分化を促進させるｍＴＯＲの活性を減少させることと組み合わされてもよい。
【０１８８】
間葉系幹細胞馴化培地の使用
本発明の方法および組成物が、間葉系幹細胞からの馴化培地の産生を可能にすることは明白である。したがって、間葉系幹細胞のいかなる使用も、間葉系幹細胞からの馴化培地の産生と同様に伴うことになる。
【０１８９】
間葉系幹細胞ならびに、本発明の方法および本書に記載される組成物により作製される分化した細胞は、疾病の治療のための医薬組成物またはその調製に用いることができる。前記疾病は、心不全、骨髄疾患、皮膚病、火傷ならびに糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病および癌のような退行性の疾病を含む再生医療により治療できる疾病であってもよい。したがって、ＭＳＣｓ馴化培地は、前記疾病の治療に用いることができる。
【０１９０】
本発明の方法および組成物により作製されるような間葉系幹細胞馴化培地は、様々な商業的に重要な研究、試薬および治療の目的で使用することができる。
【０１９１】
当該間葉系幹細胞馴化培地は、特に、疾病の治療の医薬組成物の調製に用いることができる。前記疾病は、心不全、骨髄疾患、皮膚病、火傷ならびに糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病および癌のような退行性の疾病を含む再生医療により治療できる疾病であってもよい。
【０１９２】
実施例で示すように、本発明の方法および組成物により作製される間葉系幹細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣｓ）に類似または同一の性質を持つ。そのため、当該間葉系幹細胞およびこれらから作製されるいかなる分化した細胞も、それらに由来する馴化培地と同様に、いかなるＢＭ−ＭＳＣｓへの応用が知られているもの、または、応用が可能であるものに用いることができる。
【０１９３】
馴化培地の送達（デリバリー）
本書に記載される馴化培地は、いかなる適した手段によっても、ヒトまたは動物の体に送達（デリバリー）することができる。
【０１９４】
それゆえ、本発明者らは、本書に記載した馴化培地を、標的細胞、組織、臓器、動物体または人体に供給するための送達システム、および、馴化培地を標的に供給する送達システムの使用方法を記載する。
【０１９５】
当該送達システムは、馴化培地を含む容器のような、馴化培地のソースを含んでいてもよい。当該送達システムは、当該馴化培地を標的へと分配するディスペンサーを含んでもよい。
【０１９６】
したがって、本発明者らは、本書に記載する馴化培地のソースと共に、当該馴化培地を標的へと送達することが可能なディスペンサーを含む、馴化培地を送達するための送達システムを提供する。
【０１９７】
本発明者らはさらに、馴化培地を標的へと送達する方法における前記送達システムを使用するために提供する。
【０１９８】
流体を体内へと送達する送達システムは、当業者に周知であり、例えば、米国特許６，１３９，５２４に記載されているような注射、手術の点滴、カテーテル（かん流カテーテルを含む）、米国特許７，１２２，０１９に記載されているような薬物送達カテーテルを含むものである。
【０１９９】
肺または経鼻投与を含む鼻腔への送達は、例えば、鼻腔のスプレー、ｐｕｆｆｅｒ、吸入器等、当業者に周知の方法（例えば、米国意匠特許Ｄ５４４，９５７に示されるような）にてなされてもよい。
【０２００】
腎臓への送達は、米国特許７，２４１，２７３に記載されているような腎臓の大動脈内への送達カテーテルにてなされてもよい。
【０２０１】
最適な処置を行うために、必要量の馴化培地を、適切な間隔で送達する特殊な送達システムを設定すべきであることは、明白である。
【０２０２】
当該培地は、例えば、アテローム性動脈硬化症の治療または予防に用いることができる。ここで、当該馴化培地のかん流は、動脈硬化プラークを安定させるため、または、プラークの炎症を抑えるために、静脈内で行うことができる。当該馴化培地は、静脈内のかん流により、敗血性ショックの治療または予防に用いることもできる。
【０２０３】
当該馴化培地は、心疾患の治療または予防に用いることもできる。これは、リモデリングもしくは心疾患を遅らせるため、冠動脈内もしくは心筋内における馴化培地の常習的なかん流によりなされてもよい。当該馴化培地は、鼻腔内投与により、肺炎症の治療または予防に用いることもできる。
【０２０４】
当該馴化培地は、皮膚疾患（例えば、乾癬）の治療または予防に用いることもできる。馴化培地の長期の送達は、その状況が解決するまで、経皮的なマイクロインジェクション針を用いて行うことができる。
【０２０５】
当該送達方法が、当該馴化培地が送達される特定の組織によって決まり、当業者が、どの手段を用いるか決めることができるであろうことは、明白である。
【０２０６】
実施例で示すように、心臓の炎症の治療において、当該馴化培地は、胸壁を通した直接的な冠動脈内投与、または、心筋のような組織への直接注入もしくは体内の管腔に挿入されるステントもしくはカテーテルからの阻害剤の注入のための透視下での方法による標準的な経皮的カテーテルの使用により、例えば、心臓の組織（すなわち、心筋、心膜または心内膜）に送達することができる。
【０２０７】
冠動脈のカテーテルもしくはかん流のカテーテルのどのような種類であっても、化合物の投与に用いることができる。あるいは、当該馴化培地は、冠状血管に留置するステントに表覆もしくは浸透させることができる。
【０２０８】
組織再生
本発明の方法および組成物により作製される間葉系幹細胞および分化した細胞ならびにそれらに由来する馴化培地は、必要な患者に対して組織の再構成または再生のために用いることもできる。当該細胞は、所望の組織部位に移植でき、機能的に欠失した領域を再構成もしくは再生させる方法で投与される。
【０２０９】
例えば、本発明の方法および組成物は、幹細胞の分化を調節するのに用いることができる。間葉系幹細胞、分化した細胞、および、それらに由来する馴化培地は、植皮の増殖のためのような、組織工学に用いることができる。幹細胞の分化の調節は、人工臓器もしくは組織の生体工学またはステントのような人工装具に用いることができる。
【０２１０】
癌
本発明の方法および組成物により作製される間葉系幹細胞および分化した細胞ならびにそれらに由来する馴化培地は、癌の治療に用いることができる。
【０２１１】
「癌（ｃａｎｃｅｒ）」および「癌性の（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）」という用語は、無秩序な細胞増殖により典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的な状態を意味する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２１２】
前記癌のより特殊な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、グリア芽腫および神経線維腫のようなグリア細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰（部）癌、甲状腺癌、肝臓癌、様々な種類の頭頸部癌が含まれる。さらに、結腸癌、乳癌、肺癌および前立腺癌を含む固形癌、白血病を含む造血器悪性腫瘍、ホジキン病、再生不良性貧血および家族性大腸腺腫が挙げられる。さらに、脳新生物、結腸直腸新生物、乳房新生物、子宮頸部新生物、眼新生物、肝臓新生物、肺新生物、膵臓新生物、卵巣新生物、前立腺新生物、皮膚新生物、精巣新生物、骨新生物、絨毛性新生物、卵管新生物、腎臓新生物、結腸新生物、腎臓新生物、胃新生物および上皮小体新生物が挙げられる。乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、悪性黒色腫、白血病、卵巣癌、子宮頸癌および胆道癌もまた挙げられる。
【０２１３】
本発明の方法および組成物により作製される間葉系幹細胞および分化した細胞は、エンドスタチンおよびアンジオスタチンまたは細胞毒性薬または化学療法剤のような抗癌剤と組み合わせて用いてもよい。例えば、アドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチン、エトポシド、タキソール、タキソテールのような薬剤、ビンクリスチンのようなアルカロイド、および、メトトレキサートのような代謝拮抗剤が挙げられる。「細胞毒性薬（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）」という用語は、ここでは、細胞の機能を阻害または保護する物質および／または細胞の破壊を引き起こす物質を意味するものとして用いられる。当該用語は、放射線同位体（例えば、Ｉ、Ｙ、Ｐｒ）、化学療法剤、およびバクテリア、菌、植物もしくは動物起源、またはそれらの残留物の酵素的活性毒のような毒を含むものである。
【０２１４】
また、当該用語は、ＷＯ ９４／２２８６７に開示されている二環式アンサマイシン、ＥＰ６００８３２に開示されている１，２−ビス（アリルアミノ）安息香酸誘導体、ＥＰ６００８３１に開示されている６，７−ジアミノ−フタラジン−１、ＥＰ５１６５９８に開示されている４，５−ビス（アリルアミノ）−フタルイミド誘導体、または、チロシンキナーゼのＳＨ２を含む基質タンパク質への結合を阻害するペプチド、のような癌遺伝子産物／チロシンキナーゼ阻害物を含んでいる。「化学療法剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」とは、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ニコチンアミド、エスペラマイシン（米国特許４，６７５，１８７参照）、メルファランおよびその他の関連したナイトロジェンマスタード、および、内分泌療法（ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、タモキシフェン、ＬＨＲＨ拮抗薬、プロゲスチン、抗プロゲスチン等のような）が挙げられる。
【０２１５】
幹細胞
本書で用いるように、「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」という用語は、娘細胞が起源細胞と同一である（自己複製）またはその細胞がより特殊化した細胞種の前駆細胞である（分化）という２つ発生オプションの分裂局面にある細胞を意味する。それゆえ、幹細胞は、１または他の経路（各細胞種の１つが形成されるさらなる経路）を採用することができる。それゆえ、幹細胞は、最終分化しておらず、他の種の細胞を産生することができる細胞である。
【０２１６】
本書で意味する幹細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、多分化能幹細胞を含んでもよい。
【０２１７】
全能性幹細胞
「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、成体におけるいかなる細胞種、または、胚体外膜のいかなる細胞（例えば、胎盤）にもなることができる能力をもつ細胞を意味する。したがって、受精卵および卵割により作製される最初の４つの細胞が、唯一の全能細胞である。
【０２１８】
多能性幹細胞
「多能性（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」は、体内におけるいかなる分化した細胞をも作ることができる能力を持つ真の幹細胞である。しかしながら、それらの細胞は、栄養膜に由来する胚体外膜を作製することができない。これまでにいくつかの種類の多能性幹細胞が発見されている。
【０２１９】
胚性幹細胞
胚性幹（ＥＳ）細胞は、移植時に胚発生の段階にある胚盤胞の内細胞塊（ＩＣＭ）から単離することができる。
【０２２０】
胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、中絶された胎児における生殖腺への前駆体から単離することができる。
【０２２１】
胚性癌細胞
胚性癌（ＥＣ）細胞は、胎児の生殖腺で時折起こる奇形癌から単離することができる。はじめの２つと異なり、これらの細胞はたいてい異数性である。多能性幹細胞であるこれら３種の細胞種は全て、胚または胎児の組織から単離することができ、培養中に増殖することができる。これらの多能性細胞を分化しないようにする方法は当業者に周知である。
【０２２２】
成体幹細胞
成体幹細胞は、骨髄移植における活性成分である神経、皮膚および血液を形成する幹細胞を含む、幅広い種類の細胞を含むものである。これら後者の幹細胞種はまた、臍帯由来の幹細胞の主要な特性である。正確な数は選択された幹細胞の種類により制限されるが、成体幹細胞は、研究室および体内の両方で機能的により特殊化された細胞種へと成熟することができる。
【０２２３】
多能性幹細胞
多能性幹細胞は、限られた数の種類にのみ分化できる真の幹細胞である。例えば、骨髄は、血液の全ての細胞を生じさせることができるが、その他の種類の細胞は生じさせない多能性幹細胞を含んでいる。多能性幹細胞は、成体動物で見られる。体内の全ての臓器（脳や肝臓）がそれらの細胞を含み、その臓器で、死細胞または損傷を受けた細胞と置き換わることができると考えられている。
【０２２４】
幹細胞を特徴付ける方法は当業者に周知であり、クローナルアッセイ、フローサイトメトリー、長期培養および分子生物学的テクニック（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット）のような標準的なアッセイの手法の使用を含むものである。
【０２２５】
形態学的な差異に加えて、ヒトとマウスの多能性幹細胞は、多くの細胞表面抗原（幹細胞マーカー）の発現において異なっている。時期特異的胚抗原１および４（ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−４）ならびに、腫瘍拒絶抗原１−６０および１−８１（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）を含む幹細胞マーカーを同定する抗体は、例えば、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（Temecula, CA, USA）から市販されている。モノクローナル抗体を用いたこれらの抗原の免疫学的検出は、多能性幹細胞を特徴付けるために幅広く用いられている (Shamblott M.J. et. al. (1998) PNAS 95: 13726-13731; Schuldiner M. et. al. (2000). PNAS 97: 11307  11312; Thomson J.A. et. al. (1998). Science 282: 1145-1147; Reubinoff B.E. et. al. (2000). Nature Biotechnology 18: 399-404; Henderson J.K. et. al. (2002). Stem Cells 20: 329-337; Pera M. et. al. (2000). J. Cell Science 113: 5-10.)。
【０２２６】
幹細胞のソース
次の非限定的な例を含む様々な種類の幹細胞は、本発明の方法および組成物において、間葉系幹細胞および分化した細胞を作製するために用いることができる。
【０２２７】
米国特許５，８５１，８３２は、多分化能を持つ神経の幹細胞が脳組織から取得できることを報告している。米国特許５，７６６，９４８は、新生児の脳半球から神経芽細胞が作り出されることを報告している。米国特許５，６５４，１８３および５，８４９，５５３は、哺乳類の神経堤幹細胞の使用を報告している。米国特許６，０４０，１８０は、インビトロにおいて、哺乳類の多分化能ＣＮＳ幹細胞の培養物からの分化したニューロンの産出について報告している。ＷＯ ９８／５０５２６およびＷＯ ９９／０１１５９は、神経上皮性の幹細胞、オリゴデンドロサイト−アストロサイト前駆体および系列制限されたニューロンの前駆体の、産出および単離について報告している。米国特許５，９６８，８２９は、胚の前脳から取得し、グルコース、トランスフェリン、インシュリン、セレニウム、プロゲステロン、およびその他いくつかの増殖因子を含有する培地で培養した、神経幹細胞について報告している。
【０２２８】
初代肝細胞培養物は、ヒトの生検またはコラゲナーゼとヒアルロニダーゼの適切な組合せでのかん流により外科的に切り出された組織から取得することができる。あるいは、ＥＰ ０ ９５３ ６３３ Ａ１は、細分化したヒト肝臓組織を調製することによる肝細胞の単離、増殖培地中における濃縮した組織細胞の懸濁、当該細胞の培養での増殖について報告している。当該増殖培地は、グルコース、インシュリン、トランスフェリン、Ｔ３、ＦＣＳ、および、肝細胞を悪性形質転換なしに増殖させる様々な組織抽出物を含有する。肝臓中の当該細胞は、肝実質細胞、クッパー細胞、類洞内皮、胆管上皮、および、成熟した肝細胞もしくは胆管上皮細胞の両方に分化する能力を持つ前駆細胞（「肝芽細胞」もしくは「卵形細胞」と呼ばれる）を含む特殊化した細胞を含んでいると考えられる (L. E. Rogler, Am. J. Pathol. 150:591, 1997; M. Alison, Current Opin. Cell Biol. 10:710, 1998; Lazaro et al., Cancer Res. 58:514, 1998)。
【０２２９】
米国特許５，１９２，５５３は、ヒト新生児または胎児の造血幹細胞または造血前駆細胞を単離する方法を報告している。米国特許５，７１６，８２７は、Ｔｈｙ−１陽性の前駆体であるヒト造血細胞、および、インビトロにおいてそれら細胞を再生させる適切な増殖培地について報告している。米国特許５，６３５，３８７は、ヒト造血細胞およびそれらの前駆体を培養するための方法および装置について報告している。米国特許６，０１５，５５４は、ヒトリンパ系細胞および樹状細胞を再構築する方法を記載している。
【０２３０】
米国特許５，４８６，３５９は、１種類より多い結合組織の細胞（骨、軟骨、腱、靭帯および真皮のような）に分化することができるヒト間葉系幹細胞の均一な集団について報告している。それらの細胞は、骨髄または骨膜から取得されている。また、間葉系幹細胞の増殖に用いられる培養条件についても報告されている。ＷＯ ９９／０１１４５は、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦのような増殖因子で処理した個体の末梢血から単離したヒト間葉系幹細胞について報告している。ＷＯ ００／５３７９５は、脂肪由来の幹細胞、および、脂肪細胞と赤血球をほぼ含まない格子について報告している。報告によると、これらの細胞は、増殖することができ、ホルモンおよび馴化培地を産生するように培養できる。
【０２３１】
いかなる脊椎動物種の幹細胞であっても用いることができる。これには、ヒト、ヒト以外の霊長類、家畜、その他、げっ歯動物、マウス、ラット等のヒト以外の哺乳類の幹細胞を含む。
【０２３２】
本発明における使用に適した幹細胞は、妊娠後に形成された組織から誘導される胚盤胞のような霊長類の全能性幹（ｐＰＳ）細胞、または、妊娠の間のいかなる時期においてでも取得される胎児もしくは胚の組織である。例としては初代培養物や胚性幹細胞の樹立株が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２３３】
培地およびフィーダー細胞
全能性幹細胞を単離するおよび増殖させるための培地は、得られる当該細胞が所望の特性を持ち、さらに増殖できる限り、いくつかの異なる調製法により作ることができる。
【０２３４】
適したソースは次のようなものである：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７５２２；ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９。典型的な、血清含有胚性幹（ＥＳ）細胞用培地は、８０％ＤＭＥＭ（概してＫＯ ＤＭＥＭ）、２０％の加熱不活性化されていない定義された牛胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールで作製される。当該培地はフィルター処理して、４℃で２週間まで保存できる。無血清の胚性幹（ＥＳ）細胞用培地は、８０％ＫＯ ＤＭＥＭ、２０％血清代替物、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールで作製される。効果的な血清代替物は、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８−０２８である。当該培地はフィルター処理して、４℃で２週間まで保存できる。使用の直前に、最終濃度が４ｎｇ／ｍＬになるよう、ｂＦＧＦを添加する (Bodnar et al., Geron Corp, International Patent Publication WO 99/20741) 。
【０２３５】
本発明の好ましい実施形態では、当該培地は、１０％の血清代替培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）および５ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ ＡＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を添加したノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を含有する。
【０２３６】
フィーダー細胞（ここで用いられる）は、９０％ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２）、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃３００７１−０３）および２ｍＭ グルタミンを含むｍＥＦ培地中で増殖させる。ｍＥＦｓは、トリプシンを使って、一日おきに１：２に分割し、サブコンフルエントな状態を保ってＴ１５０フラスコ（Ｃｏｍｉｎｇ＃４３０８２５）中で増殖させる。フィーダー細胞層を調製するため、増殖を抑えて、ヒト胚性幹細胞を支持する重要な因子を合成できる量の放射線を細胞に照射する（約４０００ｒａｄｓγ線照射）。６穴培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３０４のような）では、１穴あたり１ｍＬの０．５％ゼラチンでコートし、３７℃で一晩インキュベーションし、１穴あたり３７５，０００の放射線を照射する。フィーダー細胞層は、通常、プレーティング後５時間から４日間使われる。当該培地は、ｐＰＳ細胞を播種する直前に、新しいヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞用培地に置き換える。
【０２３７】
その他の幹細胞を培養するための条件は周知であり、細胞の種類に応じて最適化することができる。前節の特殊な細胞種のための培地および培養技術は、引用文献に記載されている。
【０２３８】
胚性幹細胞
胚性幹細胞は、霊長類の胚盤胞から単離することができる (Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995) 。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、トムソンら（米国特許５，８４３，７８０; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998）により記載されている技術を用いてヒト胚盤胞から調製することができる。
【０２３９】
つまり、ヒト胚盤胞は、ヒト体内の着床前の胚から取得する。あるいは、インビトロで受精した（ＩＶＦ）胚を用いることができ、ヒト胚の１細胞を胚胞期まで成長させられるることができる (Bongso et al., Hum Reprod 4: 706, 1989) 。ヒト胚は、Ｇ１．２およびＧ２．２培地中で、胚胞期まで培養する (Gardner et al., Fertil. Steril. 69:84, 1998) 。発達した胚胞を、胚性幹細胞の単離のために選択する。透明帯は、短い間プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）にさらすことにより、胚盤胞から取り除く。内細胞塊は、胚盤胞を、１：５０希釈のウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に３０分間さらし、ＤＭＥＭで５分間、３回ウォッシュし、１：５希釈のモルモット補体（Ｇｉｂｃｏ）に３分間さらす、免疫的な処置によって単離する（参照 Solter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:5099, 1975）。さらにＤＭＥＭで２回ウォッシュした後、穏やかなピペッティングにより内細胞塊（ＩＣＭ）から溶解した栄養外胚葉細胞を取り除き、ＩＣＭをｍＥＦフィーダー細胞層上に播く。
【０２４０】
９〜１５日後、内細胞塊由来の生成物は、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むカルシウムおよびマグネシウムフリーのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）にさらすか、ディスパーゼもしくはトリプシンにさらすこと、または、マイクロピペットで機械的に解離させることにより、塊に解離させ、それから、新しい培地中でｍＥＦ上に再播種する。解離した細胞を、新しい胚性幹（ＥＳ）細胞用培地中で、ｍＥＦフィーダー細胞層上に再播種し、コロニー形成を観察する。未分化形態を示すコロニーを、マイクロピペットで個別に選択し、機械的に塊に解離し、再播種する。胚性幹細胞様の形態は、明らかに高い核細胞質比および顕著な核小体を伴うコンパクトなコロニーとして特徴付けられる。生じた胚性幹細胞は、それから１−２週間毎に、トリプシン処理、ダルベッコのＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムフリーで２ｍＭ ＥＤＴＡを含む）、および、タイプＩＶコラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）にさらすこと、マイクロピペットで個々のコロニーを選択することにより、規則的に分割する。塊の大きさは、約５０〜１００細胞が最適である。
【０２４１】
胚性生殖細胞
ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞は、最終月経期後８〜１１週後に得られるヒト胎児に存在する始原生殖細胞から調製することができる。適切な調製方法は、Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998 および 米国特許６，０９０，６２２に記載されている。
【０２４２】
つまり、生殖隆起を等張緩衝液でリンスし、０．１ｍＬの０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ ＳｏｄｉｕｍＥＤＴＡ溶液（ＢＲＬ）中に播いて、１ｍｍ３より小さい塊に切断する。それから、当該組織は、さらに細胞を解離するため、１００／μＬチップでピペッティングする。それから、３７℃で５分間インキュベーションし、３．５ｍＬのＥＧ増殖培地を添加する。ＥＧ増殖培地は、４５００ｍｇ／Ｌ Ｄ−グルコース、２２００ｍｇ／Ｌ ｍＭ重炭酸ナトリウム、１５％胚性幹細胞（ＥＳ）正規のウシ胎仔血清（ＢＲＬ）、２ｍＭグルタミン（ＢＲＬ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＢＲＬ）、１０００−２０００Ｕ／ｍＬヒト組換え白血病抑制因子（ＬＩＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）、１−２ｎｇ／ｍｌヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）、および、１０μＭホルスコリン（１０％ＤＭＳＯ中）を含むＤＭＥＭである。あるいは別のアプローチとして、ＥＧ細胞は、ヒアルロニダーゼ／コラゲナーゼ／ＤＮＡｓｅを用いて単する。腸間膜を伴う生殖腺原基または生殖隆起は、胎児から切り裂き、生殖隆起はＰＢＳでリンスして、その後、０．１ｍｌ ＨＣＤ切断溶液（０．０１％ヒアルロニダーゼ タイプＶ、０．００２％ＤＮＡｓｅＩ、０．１％コラゲナーゼ タイプＩＶ、全てＳｉｇｍａ社製で、ＥＧ増殖培地中で調製される）におく。組織を細分化して、１時間もしくは一晩、３７℃でインキュベーションして、１〜３ｍＬのＥＧ増殖培地中で懸濁し、フィーダー細胞層上に播く。
【０２４３】
ＬＩＦ、ｂＦＧＦもしくはホスコリンを含まない改変ＥＧ増殖培地中で３日間培養し、５０００ｒａｄの放射線で照射し不活性化したフィーダー細胞のサブコンフルエントな層を伴った９６穴組織培養プレートを調製する。ＳＴＯ細胞（ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＲＬ １５０３）が適したフィーダー細胞である。０．２ｍＬの初代生殖細胞（ＰＧＣ）懸濁液を各々の穴に入れる。最初の継代は、ＥＧ増殖培地中で７〜１０日後に行い、放射線を照射したＳＴＯマウス繊維芽細胞を調製する前に、各々の穴から２４穴培養プレートの穴へと移動する。当該細胞は、細胞の形態がＥＧ細胞で観察されるものと一致するまで（通常、７〜３０日後もしくは１〜４継代後）毎日培地交換を行って培養する。
【０２４４】
自己複製と分化
自己複製
自己複製している幹細胞は、当業者に周知の様々な手法（例えば、形態学的、免疫組織化学的、分子生物学的等）により同定することができる。
【０２４５】
前記幹細胞は、Ｏｃｔ４および／またはＳＳＥＡ−１の発現の増加を示すことが好ましい。また、Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−２およびｃ−ｋｉｔのいずれか１または複数の発現が減少していることが好ましい。自己複製している幹細胞は、自己複製していない幹細胞と比較して、細胞周期が短縮されていることが好ましい。
【０２４６】
例えば、２次元の標準的な顕微鏡画像において、ヒト胚性幹細胞は、高い核細胞質比、顕著な核小体、および、細胞間結合が弱くコンパクトなコロニー形成を示すことが好ましい。セルラインは、標準的なＧバンド法（Ｏａｋｌａｎｄ ＣａｌｉｆのＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌａｂのような染色体分析サービスを提供する、多くの臨床的診断研究室で用いられている）を用いて染色体分析を行うことができ、公開されたヒト染色体と比較することができる。
【０２４７】
ヒト胚性幹細胞およびヒト胚性生殖細胞は、発現している細胞マーカーにより特徴付けられてもよい。通常、本書で開示されている組織特異的マーカーは、膜結合マーカーに対するフローサイトメトリー、細胞内マーカーに対する免疫組織化学的手法、および、培地中に分泌されたマーカーに対する酵素結合免疫測定法のような、免疫学的技術を用いて検出することができる。タンパク質マーカーの発現は、マーカー特異的なプライマーを用いた逆転写ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルにより検出することもできる。詳細は、米国特許５，８４３，７８０を参照。
【０２４８】
時期特異的胎児性抗原（ＳＳＥＡ）は、いくつかの胚細胞種の特性である。ＳＳＥＡマーカーに対する抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．）から入手可能である。その他の有用なマーカーは、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１の抗体を用いて検出できる (Andrews et al., Cell Linesfrom Human Gern Cell Tumors, in E. J. Robertson, 1987, supra) 。ヒト胚性幹細胞は、通常、ＳＳＥＡ−１陰性およびＳＳＥＡ−４陽性である。ｈＥＧ細胞は、通常、ＳＳＥＡ−１陽性である。インビトロにおけるｐＰＳ細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１の発現を低下させ、ＳＳＥＡ−１の発現を増加させる。ｐＰＳ細胞はまた、アルカリフォスファターゼ活性により特徴付けることもできる。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、それから、製品（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆ．）に記載されているように、基質としてベクターレッドを用いる。
【０２４９】
また、胚性幹細胞は、通常、テロメラーゼ陽性およびＯＣＴ−４陽性である。テロメラーゼ活性は、市販で入手できるキット（ＴＲＡＰｅｚｅ．ＲＴＭ．ＸＫ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｃａｔ．ｓ７７０７；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏ．，Ｐｕｒｃｈａｓｅ Ｎ．Ｙ．もしくは、ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ＰＣＲ ＥＬＩＳ ｐｌｕｓ、Ｃａｔ．２，０１３，８９；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を用いたＴＲＡＰ活性アッセイ (Kim et al., Science 266:2011, 1997) により測定できる。ｈＴＥＲＴ発現はまた、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルにより評価することもできる。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．ｈＴＥＲＴ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃａｔ．３，０１２，３４４；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）は、研究目的で市販されており、入手できる。
【０２５０】
分化
間葉系幹細胞およびこれらから誘導された分化した細胞は、４Ｅ−ＢＰ１および／またはＳ６Ｋ１の脱リン酸化が促進されていることが好ましい。また、これらの細胞は、Ｏｃｔ−４および／またはＳＳＥＡ−１の発現が低下していることが好ましい。また、Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−２およびｃ−ｋｉｔのいずれか１または複数の発現が増加していることが好ましい。また、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＡＦＰ、ネスチン、およびｎｕｒｒ１のいずれか１または複数の発現が増加していることが好ましい。自己複製している幹細胞は、自己複製していない幹細胞と比較して長い細胞周期を示すことが好ましい。
【０２５１】
分化した幹細胞、すなわち、分化の経路に入り始めたもしくは分化の経路に入り込んでいる細胞は、特に転写の変化を含めた、多くの表現型の基準により特徴付けられる。当該基準には、形態学的特徴の特性化、発現した細胞マーカーおよび酵素活性の検出または定量、遺伝子発現、ならびに、体内における当該細胞の機能的な性質の測定が含まれるが、それらに制限されるものではない。通常、分化した幹細胞は、分化プロセスの最終産物である細胞種（すなわち分化した細胞）の１または複数の特徴を持つであろう。例えば、標的細胞種が筋細胞である場合、前記細胞へと分化の過程にある幹細胞は、例えば、ミオシンの発現という特徴を持つであろう。
【０２５２】
それゆえ、多くの点で、当該基準は分化した幹細胞の運命によって決まるものであり、様々な細胞種の概要は以下に示す。
【０２５３】
神経の細胞に分化した、もしくは、分化している細胞に関連するマーカーには、ニューロンの特性であるβ−チューブリンＥＩＩＩもしくはニューロフィラメント、アストロサイトに存在するグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、オリゴデンドロサイトの特性であるガラクトセレブロシド（ＧａＩＣ）もしくはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、未分化ヒト胚性幹細胞の特性であるＯＣＴ−４、神経前駆細胞およびその他の細胞の特性であるネスチンが含まれる。Ａ２Ｂ５およびＮＣＡＭは、各々グリア前駆細胞および神経前駆細胞の特性である。細胞に対して、特性のある生理活性物質の分泌の試験を行うこともできる。例えば、ＧＡＢＡを分泌するニューロンは、グルタミン酸脱炭酸酵素またはＧＡＢＡの産生により同定することができる。ドーパミン作動性ニューロンは、ドーパ脱炭酸酵素、ドーパミンまたはチロシン水酸化酵素の産生により同定することができる。
【０２５４】
肝臓の細胞に分化した、もしくは、分化している細胞に関連するマーカーには、α−フェトプロテイン（肝前駆細胞）；アルブミン、α１−抗トリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、シトクロムｐ４５０活性、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質受容体およびグリコーゲン貯蔵（肝細胞）；ＣＫ７、ＣＫ１９およびγ−グルタミルトランスフェラーゼ（胆管上皮細胞）が含まれる。肝細胞の分化には、転写因子ＢＮＦ−４αが必要であることが報告されている (Li et al., Genes Dev. 14:464, 2000) 。ＨＮＦ−４αの発現と無関連であるマーカーには、α１−抗トリプシン、α−フェトプロテイン、ａｐｏＥ、グルコキナーゼ、インシュリン増殖因子１および２、ＩＧＦ−１受容体、インシュリン受容体およびレプチンが含まれる。ＨＮＦ−４αの発現に依存するマーカーには、アルブミン、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＩ、ａｐｏＢ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＣＩＩ、アルドラーゼＢ、フェニルアラニン水酸化酵素、Ｌ型脂肪酸結合タンパク質、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）が含まれる。
【０２５５】
ｐＰＳ細胞から誘導された混合し細胞集団における細胞種は、特徴的な形態とそれらが発現するマーカーにより見分けることができる。骨格筋には、ｍｙｏＤ、ｍｙｏｇｅｎｉｎおよびｍｙｆ−５。内皮細胞には、ＰＥＣＡＭ（血小板細胞接着分子）、Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、血管内皮（ＶＥ）カドヘリン、ＭＥＣＡ−３２およびＭＥＣ−１４．７。平滑筋細胞には、特異的ミオシン重鎖。心筋細胞には、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、心筋トロポニン、α−ミオシン重鎖およびＡＮＦ。膵臓細胞には、ｐｄｘおよびインシュリン分泌。造血細胞および造血前駆細胞には、ＧＡＴＡ−１、ＣＤ３４、ＡＣ１３３、主なグロブリンおよびグロブリン様遺伝子ＰＨ１。
【０２５６】
本書で開示する、もしくは、当業者に周知である、特定の組織特異的マーカーは細胞表面マーカーに対する免疫細胞化学、細胞内もしくは細胞表面マーカーに対する免疫組織化学（例えば、固定した細胞もしくは組織切片）、細胞抽出物に対するウェスタンブロット解析、細胞抽出物もしくは培地中に分泌される産物に対する酵素結合免疫アッセイ、のような免疫学的な技術により検出することができる。組織特異的遺伝子の発現はまた、ノーザンブロット解析、ドットブロットハイブリダイゼーション解析、もしくは、標準的な増殖方法において配列特異的なプライマーを用いる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によるｍＲＮＡレベルで検出することもできる。本書で開示する特殊なマーカーの配列データは、ＧｅｎＢａｎｋ (URL www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez) のような公共のデータベースから取得できる。
【０２５７】
［実施例１］
方法
ｈＥＳＣ−ＭＳＣ（間葉系幹細胞）の誘導
【０２５８】
Ｈｕｅｓ９およびＨ１ ｈＥＳＣｓを以前に報告6,7されているように増殖させる。
【０２５９】
ｈＥＳＣｓを分化させるために、６ｃｍプレートにコンフルエントなｈＥＳＣｓを３７℃で３分間トリプシン処理し、中和、遠心をし、ゼラチン化した１０ｃｍプレート上で、１０％血清代替培地 (Invitrogen- Gibco, Grand Island, New York) 、５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２ (Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York) 、５ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ ＡＢ (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey) となるよう追加されたＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ培地に懸濁する。細胞は、コンフルエント時にトリプシン処理し、１：４の比で分割する。
【０２６０】
ＣＤ１０５陽性およびＣＤ２４陰性の分類（ソート）は、ｈＥＳＣｓをトリプシン処理した１週間後に行う。分化しているｈＥＳＣｓは、３分間トリプシン処理し、中和、遠心をし、培養液に懸濁した後、バクテリア培養プレートに播種する。ＣＯ２インキュベーターで３７℃２時間のインキュベーション後、細胞を回収し、ＰＢＳでウォッシュし、ＣＤ２４−ＰＥおよびＣＤ１０５−ＦＩＴＣ (PharMingen, San Diego, California) で９０分間、室温にてインキュベーションする。
【０２６１】
その後、細胞をＰＢＳでウォッシュし、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａｓｏｆｔｗａｒｅを用いたＦＡＣＳ Ａｒｉａ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) でソートする。ＢＭ ＭＳＣｓは、以前に報告26されているように調製する。細胞は、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、非必須アミノ酸、および１０％ウシ胎仔血清 (Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York) を添加したＤＭＥＭ中で培養する。
【０２６２】
脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞への分化は、以前に報告3されているように行う。オイルレッド、アルシアンブルーおよびｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色は、標準的な技術で行う。コラーゲンタイプＩＩに対する免疫活性は、ヤギ抗コラーゲンタイプＩＩ抗体およびＨＲＰ標識ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体 (Santa Cruz, Santa Cruz, California) を用いて、パラホルムアルデヒド固定切片およびパラフィン包埋切片上で行う。
【０２６３】
染色体分析
細胞をペトリディッシュで約８０％コンフルエントな状態にする。核分裂を停止させるため、細胞をコルセミドで処理し、標準的な低張処理およびメタノール：酢酸（３：１）固定により回収する。スライドは、標準的な空気乾燥法により準備し、ＳＫＹ ｐａｉｎｔプローブ（ＡＳＩ）でハイブリダイズさせる。製品プロトコールおよび本発明者らが確立した方法によれば、ハイブリダイゼーション後、ウォッシュを行う。培養あたり、２０〜３０の中期細胞が存在する。各々の培養の核型は、８０％以上が中期細胞であることが代表的である。
【０２６４】
移植研究
２×１０６個の細胞を３０μｌの生理食塩水に懸濁し、以前に報告27されているように、腎臓の被膜下の空間へと移す。４ヶ月後、マウスから腎臓を取出し、４％パラホルムアアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、４μｍの切片にし、Ｈ＆Ｅで染色する。
【０２６５】
ウェスタンブロット解析
標準的な手法28を用いる。つまり、細胞をＲＩＰＡバッファーに溶解し、４℃にて、１４，０００ｒｐｍを１５分間遠心する。上清２０μｇを変性させ、１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜に電気的に転写する。続いて、膜を一次抗体でインキュベーションし、次に、ＨＲＰ標識二次抗体もしくはビオチン化二次抗体とそれに続くニュートロアビジン−ＨＲＰでインキュベーションし、最後に、ＨＲＰ増強化学発光基質であるＥＣＳ(Pierce, Rockford, IL)でインキュベーションする。
【０２６６】
一次抗体には、１：２００希釈の抗ＯＣＴ４抗体、抗ＳＯＸ−２抗体および抗アクチン抗体(Santa Cruz Biotechnology, CA)を用いる。二次抗体には、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ抗体、ウサギ抗ヤギ抗体およびウサギ抗マウス抗体を用いる。
【０２６７】
ＰＣＲ
マウス、ヒト特異的な反復配列に対するゲノムＰＣＲを以前に報告8されているように行う。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ (Applied Biosystems, Foster City, CA) を用いて、１μｇの全ＲＮＡの逆転写を行い、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行う。ｃＤＮＡは、水で１０倍希釈し、Ｔａｑｍａｎプライマー (Applied Biosystems, Foster City, CA) で４０サイクルさせて増幅する。
【０２６８】
細胞表面抗原解析
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓおよびｈＥＳＣｓの細胞表面抗原は、ＦＡＣＳを用いて解析する。細胞を５分間トリプシン処理し、遠心し、培養液に懸濁し、バクテリアの培養ディッシュ中、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２〜３時間インキュベーションする。ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓおよびｈＥＳＣｓの細胞表面抗原は、ＦＡＣＳを用いて解析する。
【０２６９】
細胞を１分間トリプシン処理し、遠心し、ＰＢＳでウォッシュし、４％パラホルムアルデヒドで室温にて０．５時間固定し、２％ＦＣＳで室温にて０．５時間攪拌しながらウォッシュおよびブロッキングを行う。その後、１．５×１０５個の細胞を次の各々のモノクローナル抗体で室温にて９０分間インキュベーションする。
ＣＤ２４−ＰＥ、ＣＤ２９−ＰＥ、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ、ＣＤ４９ａ−ＰＥ、ＣＤ４９ｅ−ＰＥ、ＣＤ１０５−ＦＩＴＣ、ＣＤ１６６−ＰＥ、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ(PharMingen, San Diego, CA)。
【０２７０】
インキュベーション後、細胞をウォッシュし、ＰＢＳ中に懸濁する。非特異的な蛍光は、アイソタイプが合致したマウスモノクローナル抗体で同様の細胞アリコートをインキュベーションすることにより特定できる。データは、２０，０００個収集し、ＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いてＣｙａｎ ＬＸ(Dako North America, Inc., Carpinteria, CA)上で解析する。非特異的な蛍光は、アイソタイプが合致したマウスモノクローナル抗体または二次抗体のみで同様の細胞アリコートをインキュベーションすることにより特定できる。
【０２７１】
イルミナ遺伝子チップ解析
初代ＢＭおよび脂肪誘導ＭＳＣｓの各々３サンプル、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３の２つの生物学的複製物、および、Ｈ１、Ｈｅｓ３、ＨｕＥＳ９の３つの未分化ｈＥＳＣ株からの全ＲＮＡ（２μｇ）を、イルミナＲＮＡ増幅キットを用いて、製品説明書に従い、ビオチン化ｃＲＮＡへと変換する。
【０２７２】
サンプルはＲＮｅａｓｙキット(Qiagen, Valencia, CA)を用いて精製する。Ｓｅｎｔｒｉｘ ＨｕｍａｎＲｅｆ−８ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ(Illumina, Inc., San Diego, CA)へのハイブリダイゼーション、ウォッシュおよびスキャンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＳｔａｔｉｏｎ ５００ｘマニュアルに従って行う。メーカーから提供されているＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏを用いて、データを抽出、正規化し、解析する。９９％コンフィデンスで検出限界（ＬＯＤ）を下回る転写シグナルは、発現していない遺伝子として除外する。
【０２７３】
［実施例２］  ヒトＥＳ細胞株からのＭＳＣ培養物の作出
ｈＥＳＣコロニーをトリプシンで分散し、ゼラチン化した組織培養プレート上にフィーダー細胞の非存在下、および、無血清代替培地、ＦＧＦ２および任意でＰＤＧＦ ＡＢを添加した無血清培地中で継代すると、２週間以内に、互いに類似または同一の（好ましくは均一の）繊維芽細胞様細胞が作出する。
【０２７４】
培養物は、ＢＭ−ＭＳＣｓに似た繊維芽細胞様の形態を持つ（図１Ａ）。コラゲナーゼにより分散したｈＥＳＣコロニーは、このような繊維芽細胞様の細胞を作出する効率は良くない。
【０２７５】
その一方で、３番目のＨ１．Ｅ２がＨ１ ＥＳＣ株から作出される一方で、２つのポリクローナル培養物（ｈｕＥＳ９．Ｅ１およびｈｕＥＳ９．Ｅ３）は、ｈｕＥＳ９ ＥＳＣ株からの作出と関連がない。通常、いくつかの全能性に関連した遺伝子の発現が低下している。例えば、ＨＥＳＸ１、ＰＯＵＦＬ５、ＳＯＸ−２、ＵＴＦ−１およびＺＦＰ４２の転写レベルはｈＥＳＣｓの１０１−５倍以上下回る（図１Ｂ）。ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２のタンパク質レベルもまた低下する（図１Ｃ）。ｈｕＥＳ９．Ｅ１に代表されるように、これらの細胞では、アルカリフォスファターゼ活性は検出されなかった（図１Ｄ）。
【０２７６】
親のＨｕＥＳ９細胞と異なり、１×１０６個のＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞の免疫不全ＳＣＩＤマウスへの腎被膜下移植により、４ヶ月の観察期間中、テラトーマは誘導されなかった（図１Ｅ）。これらの細胞が、マウスフィーダー細胞で汚染または融合されている可能性を評価するため8、これらの細胞は試験を行い、マウス特異的ｃ−ｍｏｓ反復配列に対して陰性であり、ヒト特異的ａｌｕ反復配列に対して陽性であることを示した（図１Ｆ）。
【０２７７】
ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２の平均的な集団倍加時間は、それぞれ、７２、７２および１２０時間である。集団倍加時間は細胞密度に相当依存しており、最適な細胞密度は３０〜８０％コンフルエントな状態である。約８０回の集団倍加後、ＨｕＥＳ９．Ｅ１は、４６ＸＸｉｎｖ（９）を有する（ｐ１３ｑ１２核型。９番染色体の親のｈｕＥＳ９ ｈＥＳＣ株に由来する逆位）6。ＨｕＥＳ９．Ｅ３もまた、４６ＸＸｉｎｖ（９）を有する（ｐ１３ｑ１２核型。一方で、３６および３２集団倍加時間後、Ｈ１．Ｅ１は４６ＸＹ核型を有する）。本発明者らは、３５集団倍加後の細胞は、明らかに異常な、同一でない、染色体異常が、〜１０−３０％の細胞で生じ始めることを観察した（データは示さない）。細胞は、３５集団倍加後には使用しなかった。
【０２７８】
［実施例３］  細胞表面抗原プロファイル
ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２の細胞表面抗原プロファイルのＦＡＣＳによる解析により、これらの細胞表面抗原プロファイルは、ＢＭ−ＭＳＣｓで定義されたものと定性的に類似したものであることが示された。すなわち、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４９ａおよびｅ＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋およびＣＤ３４−、ＣＤ４５−であった9-11（図２Ａ）。
【０２７９】
これらの細胞の細胞表面抗原プロファイルをＢＭ−ＭＳＣｓのものと比較するため、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ１を、１０％ウシ胎仔血清を添加したＢＭ−ＭＳＣ培養用培地と同様の培地で２代の間、増殖させた。培養条件の変化にもかかわらず、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ１は、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４９ａ＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋およびＣＤ３４−、ＣＤ４５−であり、ＢＭ−ＭＳＣｓのものと大きく類似していた。ＣＤ４９ａは、ＢＭ−ＭＳＣｓにおいてより低い発現を示しており、例外である。これらのデータは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓが、安定したＢＭ−ＭＳＣ細胞表面抗原プロファイルの特性を示すこと、それは微小環境の変化によっては著しく影響されないこと、を示している。
【０２８０】
［実施例４］  ｈＥＳＣ−ＭＳＣの分化能：脂質形成、軟骨形成、骨形成
ＭＳＣｓに関連した細胞表面抗原の全ては、多くのその他の細胞種上でも発現しており、これら細胞表面抗原の発現は変化しやすいものであるため、推定ＭＳＣｓの同定は、伝統的に機能的なパラーメーターに依存している9。培養中のＭＳＣｓの初期の分化経路は、様々な程度の脂質形成および軟骨形成を伴った骨形成であることが報告されている9。
【０２８１】
そのため、公開されているプロトコールを用いた脂質形成、軟骨形成および骨形成のための標準的な分化条件を用いたＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞の分化能を試験した3。
【０２８２】
脂肪細胞への分化は、９９％以上の細胞に脂肪滴を伴い、効率的なものである（図３Ａ）。脂質形成における重要な転写因子の役割と一致して12、各々の親のＥＳＣ株より約１０〜１００倍高いｈＥＳＣ誘導ＭＳＣｓ中のＰＰＡＲγ ｍＲＮＡは、さらに２倍増加する（図３Ａ）。
【０２８３】
軟骨形成においてもまた、アルシアンブルー染色により検出されるように、９０％以上の細胞が細胞外基質中にプロテオグリカンを産生する細胞を効率的に形成し（図３Ｂ）、〜２０％の細胞がコラーゲンＩＩに対して免疫活性があった。アグリカン、軟骨特異的細胞外基質タンパク質の転写レベルもまた、増加した13（図３Ｂ）。しかしながら、コラーゲンＩＩ、その他の軟骨特異的細胞外基質タンパク質の転写レベルは、基質中でコラーゲンＩＩの免疫活性があるにもかかわらず、減少した。原因はわからないが、特にＡＵリッチなエレメントを有するいくつかのｍＲＮＡは、翻訳された時に不安定であることが知られている14,15。
【０２８４】
ＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞が、骨形成へと誘導される時、骨特異的アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の発現および骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）16の発現は２〜３倍増加した（図３Ｃ）。しかしながら、骨形成のより進展した段階である骨形成（ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色により特定されるような）17は弱かった（図３Ｃ）。分化した培養物中、染色が陽性であったのは１％以下であった。
【０２８５】
［実施例５］  遺伝子発現プロファイル
１）ｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物と成体組織由来のＭＳＣｓとの関連性を評価するために、３つの異なる個体および３つのヒトＥＳＣ株からのＢＭ−ＭＳＣｓおよび脂肪誘導（ａｄ）−ＭＳＣｓを用いて２）３つのｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物各々の間における関連性を評価するため３）ｈＥＳＣ由来ＭＳＣｓとＢＭ由来ＭＳＣｓ間における類似性および差異を比較するため、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓの遺伝子発現プロファイルを行った。
【０２８６】
全ＲＮＡより調製した標識したｃＤＮＡを、約２４，０００の独自の特徴を含むＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙにハイブリダイズさせた。３つのｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物（すなわち、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２）、３つのＢＭ−ＭＳＣサンプルならびに３つの脂肪誘導（ａｄ）−ＭＳＣｓサンプルにおける発現した遺伝子の階層的クラスタ分析により、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓの遺伝子発現プロファイルは、それらの親のｈＥＳＣｓよりも、成体組織由来ＭＳＣｓすなわちＢＭ−ＭＳＣおよびａｄ−ＭＳＣの遺伝子発現プロファイルと密接な関連があることがわかった（図４Ａ）。
【０２８７】
興味深いことに、ＭＳＣｓはそれらの組織の発生にしたがって集団となり、このことはｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとは異なるグループであるａｄ−ＭＳＣｓとＢＭ−ＭＳＣｓの集団により示唆されるように、成体組織と胚性組織の間にさらに一線を画した。
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとＢＭ−ＭＳＣｓ間の遺伝子発現の一対比較により、相関係数０．７２は、ｈＥＳｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとＢＭ−ＭＳＣｓの遺伝子発現がかなり保持されている一方、かなりの差異も存在することが明らかになった（図４Ｃ）。
【０２８８】
３つのｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物各々の間における関連性を評価するため、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２およびＨｕＥＳ９．Ｅ３は、各々、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２およびＨｕＥＳ９．Ｅ３で構成される同一の基準と比較を行った。同一の基準と、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２およびＨｕＥＳ９．Ｅ３間の相関係数は、実質的に同じであり（０．９３、０．９５および０．９３）、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２およびＨｕＥＳ９．Ｅ３は極めて類似性が高いことを示唆している（図４Ｃ）。
【０２８９】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣにおいて、９９％の信頼レベルで検出限界を上回る発現をした８６９９および８５０５の遺伝子のうち、各々、６３７６の遺伝子は、ｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣの両方において、２倍以下の差異で発現した。これらの遺伝子は、ＭＳＣｓの基礎生物学に見識を与える可能性があるので、本発明者らは、これらの遺伝子により促進される生物学的プロセスを調べた。共通に発現した６３７６遺伝子のうち、４０６４個がＰａｎｔｈｅｒ分類遺伝子リストで見られるものであった(March 2006; http://www.pantherdb.org/)。
【０２９０】
これらの遺伝子を異なる生物学的なプロセスに分類することにより、いくつかの生物学的プロセスにおける遺伝子の頻度は、ＮＣＢＩのＨ．ｓａｐｉｅｎｓ遺伝子データベースにおける２３，４８１遺伝子から構成される基準リストと比較すると、大幅に上下する（ｐ＜０．０１）ことが明らかになった。例えば、代謝プロセスにおいて高発現する（ｏｖｅｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｉｏｎ）遺伝子が存在し、それは、推定幹細胞の増殖および自己複製に重要である可能性がある。これらのプロセスは、異化作用活性、同化作用活性での基礎代謝プロセス、多くの転写後修飾（例えば、糖鎖付加）に必要な分泌産物の生合成、および細胞増殖を含むものである（図４Ｃ）。
【０２９１】
間葉性の分化と同様に、外胚葉への分化、特に神経の発生に関与する低発現（ｕｎｄｅｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の遺伝子もまた存在する。遺伝子発現解析はまた、ＭＡＰＫＫＫシグナルがＢＭ−ＭＳＣとｈＥＳＣ−ＭＳＣｓの両方で顕著であることを示唆している。少なくとも３つのサブファミリー、すなわち、古典的なＭＡＰＫ（ＥＲＫとしても知られる）、ストレス活性化プロテインキナーゼ／ｃ−ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）およびｐ３８キナーゼから構成されるＭＡＰＫＫＫシグナルは、増殖、分化、発生、細胞ストレス応答の調節、細胞周期、細胞死および細胞生存と関連している。
【０２９２】
さらなるｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣの遺伝子発現プロファイルの解析により、１１４２個および１１３４個の遺伝子が各々ｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣにおいて２倍以上発現していることがわかった。これらのうち、各々７３８個および８８０個の遺伝子が、Ｐａｎｔｈｅｒ分類遺伝子リスト(March 2006; http://www.pantherdb.org/)に存在し、生物学的プロセスに分類されていた？。ＮＣＢＩのＨ．ｓａｐｉｅｎｓ遺伝子データベースにおける２３，４８１遺伝子から構成される基準リストと比較すると、大幅に上下する（ｐ＜０．０１）生物学的プロセスを選択した。
【０２９３】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓにおいて選択的に発現している遺伝子が、増殖、分化、免疫およびシグナル伝達に関与するプロセスに集められる一方で、ＢＭ−ＭＳＣｓにおいて選択的に発現している遺伝子は、代謝プロセス、細胞構造、分化およびシグナル伝達に関与する生物学的プロセスに集められる（図３Ｃ）。増殖に関連する生物学的プロセスにおいて高発現している遺伝子は、ｈＥＳＣ−ＭＳＣがＢＭ−ＭＳＣを上回る高増殖能を有することと一致する。
【０２９４】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣまたはＢＭ−ＭＳＣのどちらかで高発現している遺伝子は、分化およびシグナル伝達の一般のカテゴリで高発現しているが、各々のカテゴリ内の特異的な生物学的プロセスはｈＥＳＣ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣにおいて異なる発現を示している。例えば、末期の胚発生（例えば、骨発生および筋発生）に関連した分化プロセスがＢＭ−ＭＳＣにおいて高発現している一方で、胚形成およびセグメンテーションのような初期の胚発生に関連した分化プロセスが、ｈＥＳＣ−ＭＳＣで高発現している。同様に、細胞外基質タンパク質を介したシグナル伝達およびＭＡＰＫＫＫカスケードがＢＭ−ＭＳＣにおいて高発現している。以上より、これらの結果は、ｈＥＳＣ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣにおける分化能およびシグナル経路利用は同一ではないであろうことを示唆している。
【０２９５】
［実施例５］  単一細胞由来のＭＳＣ集団を単離するための、ｈＥＳＣｓおよびｈＥＳＣ由来ＭＳＣｓの特徴的な細胞表面マーカー
分化しているｈＥＳＣｓからＭＳＣｓを単離するのを容易にする膜タンパク質をコードする、ｈＥＳＣｓ−ＭＳＣまたはｈＥＳＣのどちらかにおいて高発現している遺伝子を調べるため、ゲノムワイドな遺伝子発現を調べた。ｈＥＳＣｓ−ＭＳＣまたはｈＥＳＣのどちらかにおいて推定膜タンパク質をコードする高発現遺伝子の上位２０のリストから、それらの遺伝子産物に対する抗体が市販されている候補遺伝子が選択された（下記表Ｅ１Ａおよび表Ｅ１Ｂ）。ｈＥＳＣ由来において高発現しているこれら候補遺伝子の中で、
【０２９６】
［表Ｅ１Ａ］
ｈＥＳＣよりもｈＥＳＣ由来ＭＳＣにおいて高発現している膜タンパク質
2010500047.tif 000002
【０２９７】
2010500047.tif 000003
【０２９８】
［表Ｅ１Ｂ］
ｈＥＳＣ由来ＭＳＣよりもｈＥＳＣにおいて高発現している膜タンパク質
2010500047.tif 000004
【０２９９】
2010500047.tif 000005
【０３００】
上記表Ｅ１Ａおよび表Ｅ１Ｂは、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（表Ｅ１Ａ）またはそれらの親であるｈＥＳＣｓ（表Ｅ１Ｂ）における遺伝子がコードする高発現した細胞表面抗原を示す。ミクロアレイハイブリダイゼーションによる遺伝子発現解析に基づいた、ｈＥＳＣｓ（ＨｕＥＳ９、Ｈ１およびＨｅｓ３ ｈＥＳＣｓ）に対してｈＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２）において高発現している上位２０の遺伝子（表Ｅ１Ａ）、および、その逆の遺伝子（表Ｅ１Ｂ）である。
【０３０１】
ＭＳＣｓは、成体組織由来のＭＳＣｓの特徴的な細胞表面マーカー9-11であるＥＮＧ（ＣＤ１０５）、ＩＴＧＡ４（ＣＤ４９ｄ）、ＰＤＧＦＲＡ、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）および、ｈＥＳＣで高発現した候補遺伝子のうち、以前に高発現したｈＥＳＣ特異的遺伝子として同定されており、その発現がｈＥＳＣｓと関連していなかったＩＴＧＢ１ＢＰ３およびＰＯＤＸＬ22およびＣＤ２４である。本発明者らは、ＣＤ２４がｈＥＳＣ−ＭＳＣに対してｈＥＳＣにおいて高い発現であることを確認した（図５Ａ）。
【０３０２】
［実施例６］  均一なｈＥＳＣ−ＭＳＣ集団の誘導
次に、本発明者らは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣの均一性を促進させるためのこれらのマーカーの有用性を調べた。トリプシン処理および血清代替物、ＦＧＦ２、任意でＰＤＧＦ ＡＢを添加した培地中での培養の一週間後、細胞をＣＤ１０５陽性およびＣＤ２４陰性でＦＡＣＳにより分離した。
【０３０３】
ＣＤ１０５＋およびＣＤ２４−細胞は、培養物中〜５％であった（図５Ｂ）。分離した細胞は、１０×９６穴プレートに１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで、１×２４穴プレートに１００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで、３×６穴プレートに１０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種した。これらのうち、１０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの１８個中５個のみが、ＭＳＣ様培養物を形成し、これらの培養物が単一細胞から形成された可能性があることを示している。
【０３０４】
約２４，０００の独自の特徴を含むＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙを用いた、これら５つ（Ｑ４．１〜Ｑ４．５）の培養物のゲノムワイドな遺伝子発現プロファイリングにより、４つの株が相関係数０．９６であり、残りの１つが０．９０であるという、５つの培養物間で高い類似性があることが明らかになった（図５Ｃ）。本発明者らの実験では、少なくとも１ヶ月の期間をあけて、同様のＲＮＡサンプルを用いて行った再現実験との間の相関係数は、通常、０．９７〜０．９８の幅に収まるものであった。Ｑ４．１〜Ｑ４．５はまた、ｈｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２Ｅ１およびｈｕＥＳ９．Ｅ３から構成されるｈＥＳＣ−ＭＳＣｓならびにＢＭ−ＭＳＣｓは、各々相関係数０．８７および０．８１であり、非常に類似している（図５Ｄ）。
【０３０５】
対照的に、Ｑ４．１〜Ｑ４．５とその親であるＨｕＥＳ９．Ｅ１ ｈＥＳＣ株の相関係数は低く、０．５５であった（図５Ｄ）。ＧバンドおよびＳＫＹを用いた染色体解析を、ランダムに選択したＱ４．３培養物について行った。Ｑ４．３は、９番染色体の親のｈｕＥＳ９ ｈＥＳＣ株に由来する逆位を伴い、通常の核型を有するものであった（図５Ｅ）。これらの結果は、ｂＦＧＦ２および任意でＰＤＧＦ ＢＢを添加した培地で１週間増殖させた後にトリプシン処理したｈＥＳＣ培養物から、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２４−細胞を分離することにより、非常に均一なＭＳＣ培養物を形成することができることを示している。
【０３０６】
陽性および陰性の選択マーカーを誘導プロトコールに取り込むことにより、互いにほぼ同一であり、選別またはソート基準の特異性を確認したゲノムワイドな遺伝子発現プロファイルを伴う、５つのモノクローナル単離物の誘導が生じた。５つの単離物間の網羅的遺伝子発現比較は、同様のＲＮＡサンプルを用いて行った再現実験との結果とほぼ同じ遺伝子発現プロファイルを示した。
【０３０７】
実施例７〜１５は、ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオームを解析するための実験である。これらの実験では、ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）を臨床的に準拠したプロトコールを用いて解析することにより、化学的に定義された無血清培地を調製する。馴化培地は、多次元タンパク質同定技術（ＭｕＤＰＩＴ）およびサイトカイン抗体アレイで解析を行い、２０１個の特有の遺伝子産物の存在が明らかになった。
【０３０８】
これらの遺伝子産物の８６−８８％は、マイクロアレイまたはｑＲＴ−ＰＣＲアッセイにより転写レベルで検出することができた。コンピューター分析は、これらの遺伝子産物が、生物学的プロセスの３つの主要なグループ、代謝、防御応答ならびに血管新生、造血および骨発生を含む組織分化を有意に促進するであろうと予想している。また、コンピューター分析は、その２０１の遺伝子産物は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＧＦ−βシグナル伝達およびｍＴＯＲシグナル伝達経路のような、心臓血管生物学、骨発生および造血における重要なシグナル伝達経路を活性化すると予想している。
【０３０９】
［実施例７］  ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオームの解析：材料および方法
馴化培地の調製
ＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞は、上述のように培養した。８０％コンフルエントなＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞をＰＢＳで３回ウォッシュし、フェノールレッド無しのＤＭＥＭ培地(Catalog 31053; Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)に、ＩＴＳ(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)、５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)、５ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ ＡＢ(Peprotech, Rocky Hill, New Jersey)、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシンおよびメルカプトエタノールを添加した化学的に定義された培地中で一晩培養した。その後、培養物をＰＢＳで３回リンスし、新しい定義された培地に置き換えた。３日後、当該培地を回収し、５００×ｇで遠心し、その上清を０．２μのフィルターに通した。ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析のために、０．２μのフィルターでろ過する前に、馴化培地を分画分子量３５００の透析カセット(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)に入れ、１０倍量の０．９％ＮａＣｌで３回交換して透析を行い、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ濃縮溶液を用いて２０倍に濃縮し、１００倍量の０．９％ＮａＣｌで１０回交換して透析を行った。同量の非馴化培地も馴化培地と並行して透析および濃縮した。
【０３１０】
培地は、透析により濃縮する代わりに、３Ｋの分画分子量（ＮＭＷＬ）である限外ろ過膜を用いて濃縮してもよい。結果生じる濃縮液は、透析により濃縮された培地で観察される大抵のタンパク質および生理活性を保持している。
【０３１１】
サイトカイン抗体ブロットアッセイ
サイトカインおよびその他のタンパク質の存在を調べるため、製品説明書 (RayBio Norcross,GA) に従いＲａｙＢｉｏ（登録商標）サイトカイン抗体アレイを用いて１ｍｌの馴化培地または非馴化培地をアッセイした。
【０３１２】
ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析
２ｍｌの透析した馴化培地（ＣＭ）または非馴化培地（ＮＣＭ）中のタンパク質は、（Washburn, 2001 #2997）に記載されているように、還元、アルキル化およびトリプシンによる切断を行った。その後、切断された混合物を、調整したＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ−１８ ＳＰＥ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ (Waters, Milford, MA, USA) に通してサンプルを脱塩し、３％アセトニトリル（ＡＣＮ） (JT Baker, Phillipsburg, NJ) および０．１％ギ酸（ＦＡ）バッファーで２回ウォッシュし、７０％ＡＣＮおよび０．１％ＦＡバッファーで溶出した。その後、溶出したサンプルをスピードバックで最初のボリュームの約１０％にまで脱水し、０．１％ギ酸で５０μｌに調整した。当該サンプルは、ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析の前に４℃で保存した。
【０３１３】
脱塩したペプチド混合物は、ＬＣ ＭＳ／ＭＳシステム (LTQ, ThermoFinnign, San Jose, CA, USA) ＭｕｄＰＩＴにより解析した。サンプルは、強陽イオン交換体（ＳＣＸ）カラム (Biobasic SCX, 5um, Thermo Electron, San Jose, USA) にロードし、５０μｌのバッファー（０、２、５、１０、１００および１０００ｍＭの塩化アンモニウムを５％ＡＣＮおよび０．１％ＦＡに入れたもの）の６段階の塩溶液によって分画抽出した。ＳＣＸカラムから溶出したペプチドは、Ｚｏｒｂａｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｒａｐ (Agilent, Pola Alto, CA, USA) で濃縮し、脱塩した。二次元クロマトグラフィの分離は、ｈｏｍｅ−ｐａｃｋｅｄ ｎａｎｏｂｏｒｅｄ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ (75um i.d x 10cm, 5μｍ particles) を直接ｐｉｃｏ−ｆｒｉｔ ｎａｎｏｓｐｒａｙ ｔｉｐ (New Objective, Wubrun, MA, USA) に入れ、１２０分のグラジエント、流速２００ｎＬ／ｍｉｎで行った。
【０３１４】
ＬＴＱは、各ＭＳスキャンから最も強いピーク３つのＭＳ／ＭＳスキャンを行うことにより、データ依存的モードで行った。各実験のために、６段階の塩のｍｓ／ｍｓ（ｄｔａ）スペクトルを、自作のプログラムによりシングルｍａｓｃｏｔの一般的なファイルに組み込んだ。タンパク質の同定は、社内のＭａｃｏｔサーバーを介し、ＩＰＩヒトタンパク質データベースに対して合致したデータを調査することにより行った。サーチパラメーターは、トリプシンを用いた最大２のｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ；固定修飾がカルバミノメチレーションによるもの、ならびに、可変修飾がメチオニンの酸化およびタンパク質のＮ末アセチル化によるもの、である。ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅは、タンパク質前駆体および断片イオンにおいて各々２．０および０．８Ｄａに設定した。タンパク質の同定は２つの異なるペプチドがスコア５０以上で見られた時に真陽性として認められる。多くの増殖因子およびサイトカインは低分子／ペプチドであり、少量の分泌であるので、一致するＭＳ／ＭＳスペクトルは弱く、１タンパクあたり１ペプチドのみが同定されるであろう。Ｍａｓｃｏｔスコアが２０から５０の間にあるそれらのペプチドのため、ＭＳ／ＭＳスペクトルの手動のバリデーションを行った。
【０３１５】
バイオインフォマティクス
非馴化培地中で同定したバックグラウンドのタンパク質を除去することにより、バリデートされたタンパク質の照合を行った。その後、各々のタンパク質のＩＰＩ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒを、タンパク質相互参照表を用いることにより、遺伝子記号に変換した。遺伝子産物は、遺伝子オントロジー（ＧＯ）分類ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) ＧＯ分類系の異なる生物学的プロセスまたは経路に分類し、各プロセスまたは経路の遺伝子頻度をＧｅｎｂａｎｋヒトゲノムデータベースのものと比較し、顕著に高い遺伝子頻度（ｐ＜０．０５）を伴う経路のプロセスは、ＭＳＣの分泌物により顕著に修飾されていると考えられる。
【０３１６】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡは、製品プロトコールにしたがってＴｒｉｚｏｌ試薬 (Gibco-BRL) でＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞から抽出し、スピンカラム (Nucleospin RNA II System, Macherey-Nagel GmbH &Co., Duren, Germany) で精製した。１μｇの全ＲＮＡをHigh Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) を用いて５０μｌ反応液中でランダムプライマーでｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡは、蒸留水で１００μｌになるよう希釈した。１μｌは、製品プロトコールにしたがって、経路特異的ＲＴ2ＰｒｏｆｉｌｅｒＰＣＲＡｒｒａｙｓ (SuperArray, Frederick, USA) における各プライマーセットに用いた。解析には以下のプレートを用いた。Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ＆Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ (cat. no. APH-022) 、ＮＦｋＢ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ (cat. no. APH-025) 、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ＆Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ (cat. no. APH-011) 、Ｃｏｍｍｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ (cat. no. APH-021) 、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ (cat. no. APH-039) .
【０３１７】
［実施例８］  ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオームの解析：馴化培地（ＣＭ）および非馴化培地（ＮＣＭ）の調製
血清代替培地のような添加培地による馴化培地のコンタミネーションが最小限であることを保証するために、ＨｕＥＳ９．Ｅ１ ＭＳＣｓを約８０％コンフルエントになるまで増殖させ、ＰＢＳで３回ウォッシュし、ＤＭＥＭ培地に、ＩＴＳ（インシュリン、トランスフェリンおよびセレンタンパク質）、５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２、５ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ ＡＢ (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey) 、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシンおよびβ−メルカプトエタノールを添加した化学的に定義された培地中で一晩インキュベーションした。ＨｕＥＳ９．Ｅ１ ＭＳＣｓは、この最小培地で少なくとも一週間増殖させることができる。翌日、再度、細胞培養物をＰＢＳで３回ウォッシュし、新しい定義された培地でインキュベーションした。
【０３１８】
３日間馴化した後、培地を回収した。当該馴化培地（ＣＭ）は常に、等量の非馴化培地（ＮＣＭ）と並行して解析または処理を行った。ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析のため、材料および方法に記載のように、０．９％生理食塩水に対しての透析を行う前に、培地を〜１０×に濃縮した。濃縮したＣＭおよびＮＣＭの平均タンパク質濃度は、各々９８．０±１７．９μｇ／ｍｌおよび４１．６±１．２μｇ／ｍｌ（ｎ＝３）であった。ＭＳＣｓによる培地の馴化は、培地のアリコートをタンパク質ゲルに流すことにより評価する。
【０３１９】
培地のタンパク質組成は、時間と共に複雑さを増した（図６）。ＣＭはＮＣＭよりも複雑なタンパク質組成であった。
【０３２０】
［実施例９］  ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオームの解析：ＬＣ ＭＳ／ＭＳおよび抗体アレイによるＭＳＣ馴化培地の解析
ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析により、独立して調製した２つのＣＭのバッチ中に存在し、同様に処理したＮＣＭには存在しない、次の２５０のタンパク質を同定した：1. IPI00021428 α骨格筋のアクチン (Actin, alpha skeletal muscle)、2. IPI00414057 α１骨格筋タンパク質のアクチン (Actin alpha 1 skeletal muscle protein)、3. IPI00008603 大動脈平滑筋のアクチン (Actin, aortic smooth muscle)、4. IPI00021439 細胞質１のアクチン (Actin, cytoplasmic 1)、5. IPI00023006 α心筋のアクチン (Actin, alpha cardiac)、6. IPI00021440細胞質２のアクチン (Actin, cytoplasmic 2)、7. IPI00025416 γ腸平滑筋のアクチン (Actin, enteric smooth muscle)、8. IPI00479925 アグリン (agrin)、9. IPI00015102 ＣＤ１６６抗原前駆体 (CD166 antigen precursor)、10. IPI00007423 酸性のロイシンリッチ核内リン酸化タンパク質３２ファミリーメンバーＢ (Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member B)、11. IPI00413331 ３６ｋＤａのタンパク質 (36 kDa protein)、12. IPI00412577 ３４ｋＤａのタンパク質 (34 kDa protein)、13. IPI00413506 ３３ｋＤａのタンパク質 (33 kDa protein)、14. IPI00418169 仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｐ０３１５９ (Hypothetical protein DKFZp686P03159)、15. IPI00003815 Ｒｈｏ ＧＤＰ解離阻害剤１ (Rho GDP-dissociation inhibitor 1)、16. IPI00004656 β２ミクログロブリン前駆体 (Beta-2-microglobulin precursor)、17. IPI00218042 骨形成タンパク質１前駆体のスプライス・アイソフォームＢＭＰ１−５ (Splice Isoform BMP1-5 of Bone morphogenetic protein 1 precursor)、18. IPI00009054 骨形成タンパク質１前駆体のスプライス・アイソフォームＢＭＰ１−３ (Splice Isoform BMP1-3 of Bone morphogenetic protein 1 precursor)、19. IPI00014021 骨形成タンパク質１前駆体のスプライス・アイソフォームＢＭＰ１−１ (Splice Isoform BMP1-1 of Bone morphogenetic protein 1 precursor)、20. IPI00218040  骨形成タンパク質１前駆体のスプライス・アイソフォームＢＭＰ１−４ (Splice Isoform BMP1-4 of Bone morphogenetic protein 1 precursor)、21. IPI00006980 Ｃ１４ｏｒｆ１６６タンパク質 (Protein C14orf166)、22. IPI00296165補体Ｃ１ｒサブコンポーネント前駆体 (Complement C1r subcomponent precursor)、23. IPI00152540 ＯＴＴＨＵＭＰ００００００１６７４８ (OTTHUMP00000016748)、24. IPI00305064 ＣＤ４４抗原前駆体のスプライス・アイソフォームＣＤ４４ (Splice Isoform CD44 of CD44 antigen precursor)、25. IPI00297160仮タンパク質ＤＫＦＺｐ４５１Ｋ１９１８ (Hypothetical protein DKFZp451K1918)、26. IPI00293539 カドヘリン１１前駆体のスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Cadherin-11 precursor)、27. IPI00304227 カドヘリン１１前駆体のスプライス・アイソフォーム１ (Splice Isoform 1 of Cadherin-11 precursor)、28. IPI00386476 カドヘリン−１１タイプ２アイソフォーム１前駆タンパク質 (Cadherin 11, type 2, isoform 1 preproprotein)、29. IPI00024046 カドヘリン−１３前駆体 (Cadherin-13 precursor)、
【０３２１】
30. IPI00290085 神経のカドヘリン前駆体 (Neural-cadherin precursor)、31. IPI00029739 補体因子Ｈ前駆体のスプライス・アイソフォーム１ (Splice Isoform 1 of Complement factor H precursor)、32. IPI00012011 非筋型のコフィリン (Cofilin, non-muscle isoform)、33. IPI00007257 カルシンテニン１アイソフォーム２ (calsyntenin 1 isoform 2)、34. IPI00218539 コラーゲンα１（ＸＩ）鎖前駆体のスプライス・アイソフォームＢ (Splice Isoform B of Collagen alpha-1(XI) chain precursor)、35. IPI00477350 ＸＩ型、α１のコラーゲン (Collagen, type XI, alpha 1)、36. IPI00329573 コラーゲンα１（ＸＩＩ）長鎖前駆体のスプライス・アイソフォーム (Splice Isoform Long of Collagen alpha-1(XII) chain precursor)、37. IPI00221384 コラーゲンα１（ＸＩＩ）短鎖前駆体のスプライス・アイソフォーム (Splice Isoform Short of Collagen alpha-1(XII) chain precursor)、38. IPI00400935 コラーゲンα１（ＸＶＩ）鎖前駆体(Collagen alpha-1(XVI) chain precursor)、39. IPI00297646 コラーゲンα１（Ｉ）鎖前駆体 (Collagen alpha-1(I) chain precursor)、40. IPI00164755 前α２（Ｉ）コラーゲン前駆体 (Prepro-alpha2(I) collagen precursor)、41. IPI00304962 コラーゲンα２（Ｉ）鎖前駆体 (Collagen alpha-2(I) chain precursor)、42. IPI00021033 コラーゲンα１（ＩＩＩ）鎖前駆体(Collagen alpha-1(III) chain precursor)、43. IPI00167087 ＣＯＬ３Ａ１タンパク質 (COL3A1 protein)、44. IPI00021034 コラーゲンα１（ＩＶ）鎖前駆体(Collagen alpha-1(IV) chain precursor)、45. IPI00479324 α２ＩＶ型コラーゲン前タンパク質 (alpha 2 type IV collagen preproprotein)、46. IPI00306322 コラーゲンα２（ＩＶ）鎖前駆体(Collagen alpha-2(IV) chain precursor)、47. IPI00303313 コラーゲンα１（Ｖ）鎖前駆体 (Collagen alpha-1(V) chain precursor)、48. IPI00477611 １８４ｋＤａタンパク質 (184 kDa protein)、49. IPI00293881 ＣＯＬ５Ａ２タンパク質 (COL5A2 protein)、50. IPI00018279 コラーゲンα３（Ｖ）鎖前駆体 (Collagen alpha-3(V) chain precursor)、51. IPI00291136 コラーゲンα１（ＶＩ）鎖前駆体 (Collagen alpha-1(VI) chain precursor)、52. IPI00304840 コラーゲンα２（ＶＩ）鎖前駆体のスプライス・アイソフォーム２Ｃ２ (Splice Isoform 2C2 of Collagen alpha-2(VI) chain precursor)、53. IPI00220613 コラーゲンα２（ＶＩ）鎖前駆体のスプライス・アイソフォーム２Ｃ２Ａ (Splice Isoform 2C2A of Collagen alpha-2(VI) chain precursor)、54. IPI00022200 α３ＶＩ型コラーゲンアイソフォーム１前駆体 (alpha 3 type VI collagen isoform 1 precursor)、55. IPI00072918 α３ＶＩ型コラーゲンアイソフォーム４前駆体 (alpha 3 type VI collagen isoform 4 precursor)、56. IPI00220701 コラーゲンα３（ＶＩ）鎖前駆体のスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Collagen alpha-3(VI) chain precursor)、57. IPI00072917 α３ＶＩ型コラーゲンアイソフォーム３前駆体 (alpha 3 type VI collagen isoform 3 precursor)、58. IPI00021828シスタチンＢ (Cystatin B)、59. IPI00007778 (Di-N-acetylchitobiase precursor)、60. IPI00295741 カテプシンＢ前駆体 (Cathepsin B precursor)
【０３２２】
61. IPI00299219 ＣＹＲ６１タンパク質前駆体 (Protein CYR61 precursor)、62. IPI00514900 ４２ｋＤａタンパク質 (42 kDa protein)、63. IPI00333770 サイトキネシスタンパク質１０のデディケイター類似物 (Similar to Dedicator of cytokinesis protein 10)、64. IPI00478332 サイトキネシスタンパク質９のデディケイター類似物 (Similar to Dedicator of cytokinesis protein 9)、65. IPI00000875 伸長因子１−γ (Elongation factor 1-gamma)、66. IPI00465248 α−エノラーゼ (Alpha-enolase)、67. IPI00013769肺特異的α−エノラーゼ (Alpha-enolase, lung specific)、68. IPI00216171 γ‐エノラーゼ (Gamma-enolase)、69. IPI00218803 フィブリン‐１前駆体のスプライス・アイソフォームＢ (Splice Isoform B of Fibulin-1 precursor)、70. IPI00296537 フィブリン‐１前駆体のスプライス・アイソフォームＣ (Splice Isoform C of Fibulin-1 precursor)、71. IPI00328113 フィブリン‐１前駆体 (Fibrillin-1 precursor)、72. IPI00019439 フィブリン‐２前駆体 (fibrillin 2 precursor)、73. IPI00385645 線維芽細胞増殖因子１７前駆体のスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Fibroblast growth factor 17 precursor)、74. IPI00216602 線維芽細胞増殖因子受容体２前駆体のスプライス・アイソフォーム５ (Splice Isoform 5 of Fibroblast growth factor receptor 2 precursor)、75. IPI00216604 線維芽細胞増殖因子受容体２前駆体のスプライス・アイソフォーム８ (Splice Isoform 8 of Fibroblast growth factor receptor 2 precursor)、76. IPI00034099 仮タンパク質ＦＬＪ２１９１８ (Hypothetical protein FLJ21918)、77. IPI00333541 フィラミン‐Ａ (Filamin-A)、78. IPI00302592 フィラミン‐Ａ α (Filamin A, alpha)、79. IPI00339227 仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｏ１１６６ (Hypothetical protein DKFZp686O1166)、80. IPI00414283 フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）寒冷不溶性グロブリン（ＣＩＧ）スプライス・アイソフォーム３ (Fibronectin precursor (FN) (Cold-insoluble globulin) (CIG). Splice isoform 3)、81. IPI00339225 フィブロネクチン前駆体のスプライス・アイソフォーム５ (Splice Isoform 5 of Fibronectin precursor)、82. IPI00339319 フィブロネクチン前駆体のスプライス・アイソフォーム１１ (Splice Isoform 11 of Fibronectin precursor)、83. IPI00556632 フィブロネクチン前駆体のスプライス・アイソフォーム１２ (Splice Isoform 12 of Fibronectin precursor)、84. IPI00411462 仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｂ１８１５０ (Hypothetical protein DKFZp686B18150)、85. IPI00029723 ホリスタチン関連タンパク質１前駆体 (Follistatin-related protein 1 precursor)、86. IPI00005401 Ｎ‐アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ５ポリペプチド (Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 5)、87. IPI00219025 グルタレドキシン‐１ (Glutaredoxin-1)、88. IPI00171411 ゴルジリン酸化タンパク質２ (Golgi phosphoprotein 2)、89. IPI00026314 ゲルゾリン前駆体 (Gelsolin precursor)
【０３２３】
90. IPI00219757グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ (Glutathione S-transferase P)、91. IPI00027569 異種核リボ核タンパク質Ｃ様１ (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C-like 1)、92. IPI00003881 ＨＮＲＰＦタンパク質 (HNRPF protein)、93. IPI00442294 ニューロトリミン前駆体のスプライス・アイソフォーム１ (Splice Isoform 1 of Neurotrimin precursor)、94. IPI00003865 熱ショックコグネート７１ｋＤａタンパク質のスプライス・アイソフォーム１ (Splice Isoform 1 of Heat shock cognate 71 kDa protein)、95. IPI00037070 熱ショックコグネート７１ｋＤａタンパク質のスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Heat shock cognate 71 kDa protein)、96. IPI00220362 ミトコンドリアの１０ｋＤａ熱ショックタンパク質 (10 kDa heat shock protein, mitochondrial)、97. IPI00024284基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質前駆体 (Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein precursor)、98. IPI00297284 インスリン様成長因子結合タンパク質２前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 2 precursor)、99. IPI00297284 インスリン様成長因子結合タンパク質２前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 2 precursor)、100. IPI00029236 インスリン様成長因子結合タンパク質５前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 5 precursor)、101. IPI00029236 インスリン様成長因子結合タンパク質５前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 5 precursor)、102. IPI00029235 インスリン様成長因子結合タンパク質６前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 6 precursor)、103. IPI00029235 インスリン様成長因子結合タンパク質６前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 6 precursor)、104. IPI00016915 インスリン様成長因子結合タンパク質７前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 7 precursor)、105. IPI00016915 インスリン様成長因子結合タンパク質７前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 7 precursor)、106. IPI00328163 Ｋ‐α１タンパク質 (K-ALPHA-1 protein)、107. IPI00021396 血管内皮細胞増殖因子受容体２前駆体 (Vascular endothelial growth factor receptor 2 precursor)、108. IPI00298281ラミニンγ１鎖前駆体 (Laminin gamma-1 chain precursor)、109. IPI00219219 ガレクチン‐１ (Galectin-1)、110. IPI00023673 ガレクチン‐３結合タンパク質前駆体 (Galectin-3 binding protein precursor)、111. IPI00021405 ラミニンＡ／Ｃのスプライス・アイソフォームＡ (Splice Isoform A of Lamin-A/C)、112. IPI00216953 ラミニンＡ／Ｃのスプライス・アイソフォームＡδ１０ (Splice Isoform ADelta10 of Lamin-A/C)、113. IPI00180173 予測：トロポミオシン４類似物 (PREDICTED: similar to tropomyosin 4)、114. IPI00401614 予測：ＦＫＳＧ３０類似物 (PREDICTED: similar to FKSG30)、115. IPI00374397 予測：トロポミオシン４類似物 (PREDICTED: similar to tropomyosin 4)、116. IPI00374732 予測：ＰＰＩＡタンパク質類似物 (PREDICTED: similar to PPIA protein)、117. IPI00402104 予測：ペプチジルプロリル イソメラーゼＡアイソフォーム１、シクロフィリンＡ、プロペプチジルの類似物 (PREDICTED: similar to peptidylprolyl isomerase A isoform 1; cyclophilin A; peptidyl-pro)、118. IPI00455415 予測：異種核リボ核タンパク質Ｃ様ｄＪ８４５Ｏ２４．４の類似物 (PREDICTED: similar to Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C-like dJ845O24.4)、119. IPI00454722 予測：ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質の類似物 (PREDICTED: similar to Phosphatidylethanolamine-binding protein)、120. IPI00454852 予測：テラトカルシノーマ由来増殖因子１類似物 (PREDICTED: similar to Teratocarcinoma-derived growth factor 1)
【０３２４】
121. IPI00002802タンパク質‐リジン ６‐オキシダーゼ前駆体(Protein-lysine 6-oxidase precursor)、122. IPI00410152 (latent transforming growth factor beta binding protein 1 isoform LTBP-1L)、123. IPI00220249 潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質アイソフォーム１Ｌ前駆体 (Latent transforming growth factor beta-binding protein, isoform 1L precursor)、124. IPI00220249 潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質アイソフォーム１Ｌ前駆体 (Latent transforming growth factor beta-binding protein, isoform 1L precursor ")、125. IPI00410152 潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質アイソフォームＬＴＢＰ‐１Ｌ前駆体 (latent transforming growth factor beta binding protein 1 isoform LTBP-1L)、126. IPI00020986 ルミカン前駆体 (Lumican precursor)、127. IPI00291006 ミトコンドリアの前駆体のマレートデヒドロゲナーゼ (Malate dehydrogenase, mitochondrial precursor)、128. IPI00005707マクロファージマンノース受容体２前駆体 (Macrophage mannose receptor 2 precursor)、129. IPI00020501 ミオシン‐１１ (Myosin-11)、130. IPI00019502 ミオシン‐１１ (Myosin-9)、131. IPI00604620ヌクレオリン (Nucleolin)、132. IPI00220740 ヌクレオフォスミンのスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Nucleophosmin)、133. IPI00219446 ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質 (Phosphatidylethanolamine-binding protein)、134. IPI00299738プロコラーゲンＣ‐エンドペプチターゼエンハンサー１前駆体 (Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 precursor)、135. IPI00015902 β血小板由来増殖因子受容体前駆体 (Beta platelet-derived growth factor receptor precursor)、136. IPI00216691プロフィリン‐１ (Profilin-1)、137. IPI00169383 ホスホグリセリン酸キナーゼ１ (Phosphoglycerate kinase 1)、138. IPI00219568精巣特異的ホスホグリセリン酸キナーゼ (Phosphoglycerate kinase, testis specific)、139. IPI00296180ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター前駆体 (Urokinase-type plasminogen activator precursor)、140. IPI00215943プレクチン１のスプライス・アイソフォーム３(Splice Isoform 3 of Plectin 1)、141. IPI00215942 プレクチン１のスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Plectin 1)、142. IPI00014898 プレクチン１のスプライス・アイソフォーム１ (Splice Isoform 1 of Plectin 1)、143. IPI00398777 プレクチン１アイソフォーム８ (plectin 1 isoform 8)、144. IPI00398776 プレクチン１アイソフォーム７ (plectin 1 isoform 7)、145. IPI00186711 プレクチン１アイソフォーム６ (plectin 1 isoform 6)、146. IPI00420096 プレクチン１アイソフォーム３ (plectin 1 isoform 3)、147. IPI00398779 プレクチン１アイソフォーム１１ (plectin 1 isoform 11)、148. IPI00398778 プレクチン１アイソフォーム１０ (plectin 1 isoform 10)、149. IPI00398002 プレクチン１アイソフォーム１ (plectin 1 isoform 1)、150. IPI00419585ペプチジル‐プロリル シス‐トランス イソメラーゼＡ (Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A)
【０３２５】
151. IPI00472718 ペプチジル‐プロリル イソメラーゼＡアイソフォーム２(peptidylprolyl isomerase A isoform 2)、152. IPI00000874 ペルオキシレドキシン‐１ (Peroxiredoxin-1)、153. IPI00024915 ミトコンドリアの前駆体のペルオキシレドキシン‐５ (Peroxiredoxin-5, mitochondrial precursor)、154. IPI00375306 ペルオキシレドキシン‐５ アイソフォームｂ (peroxiredoxin 5 precursor, isoform b)、155. IPI00012503プロアクチベーターポリペプチド前駆体のスプライス・アイソフォームＳａｐ−ｍｕ−０ (Splice Isoform Sap-mu-0 of Proactivator polypeptide precursor)、156. IPI00374179 プロテアソームアクチベーターサブユニット１アイソフォーム２ (proteasome activator subunit 1 isoform 2)、157. IPI00030154 プロテアソームアクチベーターコンプレックスサブユニット１ (Proteasome activator complex subunit 1)、158. IPI00168812 ＰＴＫ７タンパク質チロシンキナーゼ７アイソフォームｄ前駆体 (PTK7 protein tyrosine kinase 7 isoform d precursor)、159. IPI00419941 ＰＴＫ７タンパク質チロシンキナーゼ７アイソフォームａ前駆体 (PTK7 protein tyrosine kinase 7 isoform a precursor)、160. IPI00003590 Ｑｕｉｅｓｃｉｎ Ｑ６ アイソフォームａ(Quiescin Q6, isoform a)、161. IPI00015916 骨由来増殖因子（フラグメント）(Bone-derived growth factor (Fragment))、162. IPI00015916 骨由来増殖因子 (Bone-derived growth factor)、163. IPI00298289 レチキュロン‐４のスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Reticulon-4)、164. IPI00021766 レチキュロン‐４のスプライス・アイソフォーム１ (Splice Isoform 1 of Reticulon-4)、165. IPI00013895 Ｃａｌｇｉｚｚａｒｉｎ (Calgizzarin)、166. IPI00010402仮タンパク質 (Hypothetical protein)、167. IPI00218733 スーパーオキシドジスムターゼ (Superoxide dismutase)、168. IPI00014572 ＳＰＡＲＣ前駆体 (SPARC precursor)、169. IPI00005614脳１スペクトリンβ長鎖のスプライス・アイソフォーム (Splice Isoform Long of Spectrin beta chain, brain 1)、170. IPI00008780 スタニオカルシン‐２前駆体 (Stanniocalcin-2 precursor)、171. IPI00301288 ＳＥＬ‐ＯＢタンパク質 (SEL-OB protein)、172. IPI00216138トランスゲリン (Transgelin)、173. IPI00018219 ＴＧＦ‐β誘導タンパク質ｉｇ‐ｈ３前駆体 (Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 precursor)、174. IPI00304865 ＴＧＦ‐β受容体ＩＩＩ (transforming growth factor, beta receptor III ")、175. IPI00296099 トロンボスポンジン‐１前駆体 (Thrombospondin-1 precursor)、176. IPI00032292 メタロプロテイナーゼ阻害剤１前駆体 (Metalloproteinase inhibitor 1 precursor)、177. IPI00027166 メタロプロテイナーゼ阻害剤２前駆体 (Metalloproteinase inhibitor 2 precursor)、178. IPI00220828 サイモシンβ‐４ (Thymosin beta-4)、179. IPI00180240サイモシン様３ (thymosin-like 3)
【０３２６】
180. IPI00299633 ＯＴＴＨＵＭＰ００００００３１２７０（フラグメント） (OTTHUMP00000031270 (Fragment))、181. IPI00465028トリオースリン酸イソメラーゼ１変異体（フラグメント）(Triosephosphate isomerase 1 variant (Fragment))、182. IPI00451401 トリオースリン酸イソメラーゼのスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Triosephosphate isomerase)、183. IPI00010779トロンポミオシン４ (Tropomyosin 4)、184. IPI00216975トロンポミオシンα４鎖のスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Tropomyosin alpha-4 chain)、185. IPI00180675 チューブリンα３鎖 (Tubulin alpha-3 chain)、186. IPI00218343 チューブリンα６鎖 (Tubulin alpha-6 chain)、187. IPI00216298チオレドキシン (Thioredoxin)、188. IPI00472175チオレドキシン還元酵素に極めて類似したＣＤＮＡ ＦＬＪ４６６７２ ｆｉｓ、ｃｌｏｎｅ ＴＲＡＣＨ３００９００８ (CDNA FLJ46672 fis, clone TRACH3009008, highly similar to Thioredoxin reductase)、189. IPI00450472 ユビキチン結合酵素Ｅ２１ (Ubiquitin-conjugating enzyme E2I)、190. IPI00018352ユビキチンＣ末ヒドロラーゼアイソザイムＬ１ (Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1)、191. IPI00010207 ユビキチン様モディファイアー１前駆体 (Ubiquitin-fold modifier 1 precursor)、192. IPI00260630 ＵＲＢ (URB)、193. IPI00021263 １４‐３‐３タンパク質ｚｅｔａ／ｄｅｌｔａ (14-3-3 protein zeta/delta)、194. IPI00642991仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｆ１０１６４ 仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｆ１０１６４ (Hypothetical protein DKFZp686F10164)、195. IPI00470919仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｋ０８１６４ (Hypothetical protein DKFZp686K08164)、196. IPI00719088コラーゲンＶＩ型α１前駆体 (collagen, type VI, alpha 1 precursor)、197. IPI00654685 ＳＰＡＲＣ前駆体類似物 (Similar to SPARC precursor)、198. IPI00641961 コラーゲンＸＩＩ型α１ (Collagen, type XII, alpha 1)、199. IPI00645849 細胞外基質タンパク質１ (Extracellular matrix protein 1)、200. IPI00554786チオレドキシン還元酵素１ (Thioredoxin reductase 1)、201. IPI00645018 ウロキナーゼのプラスミノーゲンアクチベーター (Plasminogen activator, urokinase)、202. IPI00552339メタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤 (Tissue inhibitor of metalloproteinase 1)、203. IPI00642997細胞質２のアクチン (Actin, cytoplasmic 2)、204. IPI00719778アネキシンＡ２類似物 (Similar to Annexin A2)、205. IPI00647915トランスゲリン２ (Transgelin 2)、206. IPI00552815 コラーゲンＶ型α１ (Collagen, type V, alpha 1)、207. IPI00552981ホモサピエンスフィブリン１ＤｍＲＮＡに極めて類似したＣＤＮＡ ＰＳＥＣ０２６６ ｆｉｓ、ｃｌｏｎｅ ＮＴ２ＲＰ３００３６４９ (CDNA PSEC0266 fis, clone NT2RP3003649, highly similar to Homo sapiens fibulin-1D mRNA)、208. IPI00180776 ２９ｋＤａタンパク質 (29 kDa protein)、209. IPI00552416フィラミンＡα (Filamin A, alpha)
【０３２７】
210. IPI00640698 γ‐腸平滑筋のアクチン (Actin, gamma-enteric smooth muscle)、211. IPI00514530 α１骨格筋のアクチン (Actin, alpha 1, skeletal muscle)、212. IPI00556442インスリン様成長因子結合タンパク質２変異体（フラグメント）(Insulin-like growth factor binding protein 2 variant (Fragment))、213. IPI00513782ゲルゾリン (Gelsolin)、214. IPI00478731 ２９ｋＤａタンパク質 (29 kDa protein)、215. IPI00396479 ２４ｋＤａタンパク質 (24 kDa protein)、216. IPI00334627 ３９ｋＤａタンパク質 (39 kDa protein)、217. IPI00555762 ＰＴＫ７タンパク質チロシンキナーゼ７アイソフォーム変異体（フラグメント） (PTK7 protein tyrosine kinase 7 isoform a variant (Fragment))、218. IPI00658202 ９７ｋＤａタンパク質 (97 kDa protein)、219. IPI00006273 ＣＹＲ６１タンパク質 (CYR61 protein)、220. IPI00719405 ＴＭＳＬ６タンパク質 (TMSL6 protein)、221. IPI00658096サイモシンβ４ (Thymosin beta-4)、222. IPI00376163 ５ｋＤａタンパク質 (5 kDa protein)、223. IPI00556217フィブリリン１変異体（フラグメント） (Fibrillin 1 variant (Fragment))、224. IPI00514817 ＬａｍｉｎＡ／ｃの類似物 (Similar to Lamin A/C)、225. IPI00644087プロゲリン (Progerin)、226. IPI00655812 横紋筋肉腫抗原ＭＵ−ＲＭＳ−４０．１２ (Rhabdomyosarcoma antigen MU-RMS-40.12)、227. IPI00604517ヌクレオリン類似物 (Similar to Nucleolin)、228. IPI00444262ヌクレオリンに極めて類似したＣＤＮＡ ＦＬＪ４５７０６ ｆｉｓ、ｃｌｏｎｅ ＦＥＢＲＡ２０２８４５７ (CDNA FLJ45706 fis, clone FEBRA2028457, highly similar to Nucleolin)、229. IPI00412473タンパク質 (Protein)、230. IPI00414489タンパク質 (Protein)、231. IPI00411463 タンパク質 (Protein)、232. IPI00556415トランスゲリン変異体（フラグメント） (Transgelin variant (Fragment))、233. IPI00718825カルモジュリン (Calmodulin)、234. IPI00478156 １７ｋＤａタンパク質 (17 kDa protein)、235. IPI00386621 ＣＡＬＭ３タンパク質 (CALM3 protein)、236. IPI00647001 酸性の (Acidic)、237. IPI00642650スタニオカルシン２前駆体類似物 (Similar to Stanniocalcin 2 precursor)、238. IPI00641471コラーゲン様タンパク質 (Collagen-like protein)、239. IPI00514669 ＳＨ３ドメイン結合グルタミン酸リッチタンパク質様３ (SH3 domain binding glutamic acid-rich protein like 3)、240. IPI00719422 トリオースリン酸イソメラーゼ（フラグメント） (Triosephosphate isomerase (Fragment))、241. IPI00003734 推定のＳ１００カルシウム結合タンパク質Ｈ＿ＮＨ０４５６Ｎ１６．１ (Putative S100 calcium-binding protein H_NH0456N16.1)、242. IPI00029574 １１ｋＤａタンパク質 (11 kDa protein)、243. IPI00641047 ゲルゾリン (Gelsolin)、244. IPI00647556 ゲルゾリン (Gelsolin)、245. IPI00654821仮タンパク質ＬＯＣ５４８４５アイソフォーム１ (hypothetical protein LOC54845 isoform 1)、246. IPI00647572 Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質‐３前駆体 (Dickkopf related protein-3 precursor)、247. IPI00639879サイトキネシスタンパク質ｓｅｐＡ類似物 (Similar to Cytokinesis protein sepA)、248. IPI00657746 サイトキネシスタンパク質８のデディケイター類似物 (Similar to Dedicator of cytokinesis protein 8)、249. IPI00555993血管内皮細胞増殖因子受容体３変異体 (Vascular endothelial growth factor receptor 3 variant)、250. IPI00552545 サイトキネシスタンパク質８のデディケイター (Dedicator of cytokinesis protein 8) 。
【０３２８】
以上、これら２５０のタンパク質は、次の１３２の独自の公知の遺伝子によりコードされている：ＡＣＴＡ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＨＳＰＡ８、ＰＳＡＰ、ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ５Ａ３、ＨＳＰＥ１、ＰＳＭＥ１、ＡＣＴＢ、ＣＯＬ６Ａ１、ＨＳＰＧ２、ＰＴＫ７、ＡＣＴＣ、ＣＯＬ６Ａ２、ＩＧＦＢＰ２、ＱＳＣＮ６、ＡＣＴＧ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＩＧＦＢＰ５、ＲＴＮ４、ＡＣＴＧ２、ＣＳＴＢ、ＩＧＦＢＰ６、Ｓ１００Ａ１１、ＡＧＲＮ、ＣＴＢＳ、ＩＧＦＢＰ７、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＡＬＣＡＭ、ＣＴＳＢ、Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１、ＳＯＤ１、ＡＮＰ３２Ｂ、ＣＹＲ６１、ＫＤＲ、ＳＰＡＲＣ、ＡＮＸＡ２、ＤＯＣＫ１０、ＬＡＭＣ１、ＳＰＴＢＮ１、ＡＲＨＧＤＩＡ、ＤＯＣＫ８、ＬＧＡＬＳ１、ＳＴＣ２、Ｂ２Ｍ、ＥＣＭ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＳＶＥＰ１、ＢＭＰ１、ＥＥＦ１Ｇ、ＬＭＮＡ、ＴＡＧＬＮ、Ｃ１４ｏｒｆ１６６、ＥＮＯ１、ＬＯＸ、ＴＡＧＬＮ２、Ｃ１Ｒ、ＥＮＯ１Ｂ、ＬＴＢＰ１、ＴＧＦＢＩ、ＣＡＬＭ１、ＥＮＯ２、ＬＵＭ、ＴＧＦＢＲ３、ＣＤ１０９、ＦＢＬＮ１、ＭＤＨ２、ＴＨＢＳ１、ＣＤ４４、ＦＢＮ１、ＭＲＣ２、ＴＩＭＰ１、ＣＤＨ１１、ＦＢＮ２、ＭＹＨ１１、ＴＩＭＰ２、ＣＤＨ１３、ＦＧＦ１７、ＭＹＨ９、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＤＨ２、ＦＧＦＲ２、ＮＣＬ、ＴＭＳＬ３、ＣＦＨ／ＨＦ１、ＦＬＪ２１９１８、ＮＰＭ１、ＴＭＳＬ６、ＣＦＬ１、ＦＬＮＡ、ＰＢＰ、ＴＰＩ１、ＣＬＳＴＮ１、ＦＮ１、ＰＣＯＬＣＥ、ＴＰＭ４、ＣＯＬ１１Ａ１、ＦＳＴＬ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＴＵＢＡ３、ＣＯＬ１２Ａ１、ＧＡＬＮＴ５、ＰＦＮ１、ＴＵＢＡ６、ＣＯＬ１６Ａ１、ＧＬＲＸ、ＰＧＫ１、ＴＸＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＧＯＬＰＨ２、ＰＧＫ２、ＴＸＮＲＤ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＧＳＮ、ＰＬＡＵ、ＵＢＥ２Ｉ、ＣＯＬ３Ａ１、ＧＳＴＰ１、ＰＬＥＣ１、ＵＣＨＬ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＨＮＲＰＣＬ１、ＰＰＩＡ、ＵＦＭ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＨＮＲＰＦ、ＰＲＤＸ１、ＵＲＢ、ＣＯＬ５Ａ１、ＨＮＴ、ＰＲＤＸ５、ＹＷＨＡＺ。
【０３２９】
未知のタンパク質が３２個存在した：IPI00642991 仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｆ１０１６４ (Hypothetical protein DKFZp686F10164)、IPI00470919 仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｋ０８１６４ (Hypothetical protein DKFZp686K08164)、IPI00654685 ＳＰＡＲＣ前駆体の類似物 (Similar to SPARC precursor)、IPI00719778 アネキシンＡ２の類似物 (Similar to Annexin A2)、IPI00552981 ヒトフィブリン１Ｄ ｍＲＮＡに極めて類似したＣＤＮＡ ＰＳＥＣ０２６６ ｆｉｓ、ｃｌｏｎｅ ＮＴ２ＲＰ３００３６４９ (CDNA PSEC0266 fis, clone NT2RP3003649, highly similar to Homo sapiens fibulin-1D mRNA)、IPI00180776 ２９ｋＤａタンパク質 (29 kDa protein)、IPI00478731 ２９ｋＤａタンパク質 (29 kDa protein)、IPI00396479 ２４ｋＤａタンパク質 (24 kDa protein)、IPI00334627 ３９ｋＤａタンパク質 (39 kDa protein)、IPI00658202 ９７ｋＤａタンパク質 (97 kDa protein)、IPI00376163 ５ｋＤａタンパク質 (5 kDa protein; IPI00514817 ラミンＡ／Ｃ (Similar to Lamin A/C)、IPI00644087 プロゲリン (Progerin)、IPI00655812 横紋筋肉腫抗原ＭＵ−ＲＭＳ−４０．１２ (Rhabdomyosarcoma antigen MU-RMS-40.12)、IPI00604517 ヌクレオリンの類似物 (Similar to Nucleolin)、IPI00444262 ヌクレオリンに極めて類似したＣＤＮＡ ＦＬＪ４５７０６ ｆｉｓ、ｃｌｏｎｅ ＦＥＢＲＡ２０２８４５７ (CDNA FLJ45706 fis, clone FEBRA2028457, highly similar to Nucleolin)、IPI00412473 タンパク質 (Protein)、IPI00414489 タンパク質 (Protein)、IPI00411463 タンパク質 (Protein)、IPI00478156 １７ｋＤａタンパク質 (17 kDa protein)、IPI00386621 ＣＡＲＭ３タンパク質 (CALM3 protein)、IPI00647001 酸性の (Acidic)、IPI00642650 スタニオカルシン２前駆体の類似物 (Similar to Stanniocalcin 2 precursor)、IPI00641471 コラーゲン様タンパク質 (Collagen-like protein)、IPI00514669 ＳＨ３ドメイン結合グルタミン酸リッチタンパク質様３ (SH3 domain binding glutamic acid-rich protein like 3)、IPI00003734 推定のＳ１００カルシウム結合タンパク質Ｈ＿ＮＨ０４５６Ｎ１６．１ (Putative S100 calcium-binding protein H_NH0456N16.1)、IPI00029574 １１ｋＤａタンパク質 (11 kDa protein)、IPI00654821 仮タンパク質ＬＯＣ５４８４５アイソフォーム１ (hypothetical protein LOC54845 isoform 1)、IPI00647572 Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質‐３前駆体 (Dickkopf related protein-3 precursor)、IPI00639879 サイトキネシスタンパク質ＳｅｐＡの類似物 (Similar to Cytokinesis protein sepA)、IPI00657746サイトキネシスタンパク質８のデディケーターの類似物 (Similar to Dedicator of cytokinesis protein 8)、IPI00555993 血管内皮細胞増殖因子受容体３変異体 (Vascular endothelial growth factor receptor 3 variant) 。
【０３３０】
したがって、本書に記載されるＭＳＣｓは、これらのいずれかもしくは全てのタンパク質、または、それらにより分泌もしくは発現されたいずれかのタンパク質もしくはその他の分子のソースとして用いることができる。
【０３３１】
ＭＳＣｓは、それらの周辺の細胞に影響を与える広範囲のサイトカインおよび増殖因子を分泌することが知られている8。これらの因子の多くは、ショットガンＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析で容易に検出することができない低分子である。それゆえ、当該ＣＭおよびＮＣＭはまた、１０１のサイトカイン／増殖因子に対する抗体で行う、異なる５つの抗体アレイへのハイブリダイゼーションにより解析を行った。
【０３３２】
抗体アレイのレイアウト
RayBio（登録商標）血管新生アレイＩ（Angiogenesis array I）
2010500047.tif 000006
【０３３３】
RayBio（登録商標）ヒトケモカイン抗体アレイＩ（Human Chemokine Antibody Array I）
2010500047.tif 000007
【０３３４】
RayBio（登録商標）マトリクスメタロプロテイナーゼ抗体アレイＩ（Matrix Metalloproteinases Antibody Array I）
2010500047.tif 000008
【０３３５】
RayBio（登録商標）ヒトサイトカイン抗体アレイＩ（Human Cytokine Antibody Array I）
2010500047.tif 000009
【０３３６】
RayBio（登録商標）ヒトサイトカイン抗体アレイＶ（Human Cytokine Antibody Array V）
2010500047.tif 000010
【０３３７】
独立して調製した４つのＣＭのうち少なくとも３つで、ＨｕＥＳ９．Ｅ１により７２のサイトカイン／増殖因子が再現可能に分泌し、ＮＣＭでは分泌していないことがわかった。抗体アレイにより同定した７２のタンパク質は次の通りである（名前  遺伝子記号  遺伝子ＩＤ）：１．ＭＤＣ  ＡＤＡＭ１１  ＧＩ＿１１４９６９９７−Ａ、２．Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ  ＡＮＧ  ＧＩ＿４２７１６３１２−Ｓ、３．ＢＤＮＦ  ＢＤＮＦ  ＧＩ＿３４１０６７０９−Ａ、４．Ｉ−３０９  ＣＣＬ１  ＧＩ＿４５０６８３２−Ｓ、５．Ｅｏｔａｘｉｎ  ＣＣＬ１１  ＧＩ＿２２５３８３９９、６．ＭＩＰ−１δ  ＣＣＬ１５  ＧＩ＿３４３３５１８０−Ａ、７．ＨＣＣ−４  ＣＣＬ１６  ＧＩ＿２２５３８８００、８．ＭＣＰ−１  ＣＣＬ２  ＧＩ＿２２５３８８１２−Ｓ、９．Ｃｋβ８−１  ＣＣＬ２３  ＧＩ＿２２５３８８０７−Ａ、１０．Ｅｏｔａｘｉｎ−２  ＣＣＬ２４  ＧＩ＿２２１６５４２６−Ｓ、１１．Ｅｏｔａｘｉｎ−３  ＣＣＬ２６  ＧＩ＿２２５４７１５１−Ｓ、１２．ＲＡＮＴＥＳ  ＣＣＬ５  ＧＩ＿２２５３８８１３、１３．ＭＣＰ−３  ＣＣＬ７  ＧＩ＿１３４３５４０１−Ｓ、１４．ＭＣＰ−２  ＣＣＬ８  ＧＩ＿２２５３８８１５−Ｓ、１５．ＭＣＳＦ  ＣＳＦ１  ＧＩ＿２７２６２６６６−Ｉ、１６．ＧＭ−ＣＳＦ  ＣＳＦ２  ＧＩ＿２７４３７０２９−Ｓ、１７．ＧＣＳＦ  ＣＳＦ３  ＧＩ＿２７４３７０４８、１８．Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ  ＣＸ３ＣＬ１  ＧＩ＿４５０６８５６−Ｓ、１９．ＧＲＯ−ａ  ＣＸＣＬ１  ＧＩ＿４５０４１５２−Ｓ、２０．Ｉ−ＴＡＣ  ＣＸＣＬ１１  ＧＩ＿１４７９０１４５−Ｓ、２１．ＳＤＦ−１  ＣＸＣＬ１２  ＧＩ＿４０３１６９２３、２２．ＢＬＣ  ＣＸＣＬ１３  ＧＩ＿５４５３５７６−Ｓ、２３．ＥＮＡ−７８  ＣＸＣＬ５  ＧＩ＿４１８７２６１３−Ｓ、２４．ＩＰ−１０  ＣＸＣＲ３  ＧＩ＿４５０４０９８−Ｓ、２５．ＥＧＦ  ＥＧＦ  ＧＩ＿６０３１１６３−Ｓ、２６．ＦＧＦ−４  ＦＧＦ４  ＧＩ＿４５０３７００、２７．ＦＧＦ−６  ＦＧＦ６  ＧＩ＿１０３３７５８６、２８．ＦＧＦ−７  ＦＧＦ７  ＧＩ＿１５１４７３４４、２９．ＦＧＦ−９  ＦＧＦ９  ＧＩ＿４５０３７０６−Ｓ、３０．Ｆｉｔ  ３  Ｌｉｇａｎｄ  ＦＬＴ３ＬＧ  ＧＩ＿３８４５５４１５−Ｓ、３１．ＧＤＮＦ  ＧＤＮＦ  ＧＩ＿４０５４９４１０、３２．ＧＣＰ−２  ＧＯＬＧＡ４  ＧＩ＿４５３５９８５４−Ｓ、３３．ＨＧＦ  ＨＧＦ  ＧＩ＿３３８５９８３４−Ｓ、３４．ＩＦＮ−γ  ＩＦＮＧ  ＧＩ＿１０８３５１７０−Ｓ、３５．ＩＧＦ−Ｉ  ＩＧＦ１  ＧＩ＿１９９２３１１１−Ｓ、３６．ＩＧＦＢＰ−１  ＩＧＦＢＰ１  ＧＩ＿４５０４６１４−Ｓ、３７．ＩＧＦＢＰ−２  ＩＧＦＢＰ２  ＧＩ＿１０８３５１５６−Ｓ、３８．ＩＧＦＢＰ−４  ＩＧＦＢＰ４  ＧＩ＿１０８３５０２０−Ｓ、３９．ＩＬ−１０  ＩＬ１０  ＧＩ＿２４４３０２１６−Ｓ、４０．ＩＬ−１２ｐ４０ｐ７０  ＩＬ１２Ｂ  ＧＩ＿２４４９７４３７−Ｓ、４１．ＩＬ−１３  ＩＬ１３  ＧＩ＿２６７８７９７７−Ｓ、４２．ＩＬ−１６  ＩＬ１６  ＧＩ＿２７２６２６５４−Ａ、４３．ＩＬ−１ａ  ＩＬ１Ａ  ＧＩ＿２７８９４３２９−Ｓ、４４．ＩＬ−１β  ＩＬ１Ｂ  ＧＩ＿２７８９４３０５−Ｓ、４５．ＩＬ−２  ＩＬ２  ＧＩ＿２��１７８８６０−Ｓ、４６．ＩＬ−３  ＩＬ３  ＧＩ＿２８４１６９１４−Ｓ、４７．ＩＬ−６  ＩＬ６  ＧＩ＿１０８３４９８３−Ｓ、４８．ＩＬ−７  ＩＬ７  ＧＩ＿２８６１０１５２−Ｓ、４９．ＩＬ−８  ＩＬ８  ＧＩ＿２８６１０１５３−Ｓ、５０．ＳＣＦ  ＫＩＴＬＧ  ＧＩ＿４５８０４１９−Ａ、５１．ＬＥＰＴＩＮ  ＬＥＰ  ＧＩ＿４５５７７１４−Ｓ、５２．ＬＩＦ  ＬＩＦ  ＧＩ＿６００６０１８−Ｓ、５３．ＭＩＦ  ＭＩＦ  ＧＩ＿４５０５１８４−Ｓ、５４．ＭＭＰ−１  ＭＭＰ１  ＧＩ＿１３０２７７９８−Ｓ、５５．ＭＭＰ−１０  ＭＭＰ１０  ＧＩ＿４５０５２０４−Ｓ、５６．ＭＭＰ−１３  ＭＭＰ１３  ＧＩ＿１３０２７７９６−Ｓ、５７．ＭＭＰ  ３  ＭＭＰ３  ＧＩ＿１３０２７８０３−Ｓ、５８．ＭＭＰ−９  ＭＭＰ９  ＧＩ＿４８２６８３５−Ｓ、５９．ＰＡＲＣ  ＰＡＲＣ  ＧＩ＿２４３０７９９０、６０．ＰＤＧＦ−ＢＢ  ＰＤＧＦＢ  ＧＩ＿１５４５１７８５−Ａ、６１．ＰＩＧＦ  ＰＩＧＦ  ＧＩ＿２７８９４２８９−Ａ、６２．ＴＧＦ−β１  ＴＧＦＢ１  ＧＩ＿１０８６３８７２、６３．ＴＧＦ−β２  ＴＧＦＢ２  ＧＩ＿４５０７４６２−Ｓ、６４．Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ＴＨＰＯ  ＧＩ＿４０８０５８７１−Ｓ、６５．ＴＩＭＰ−１  ＴＩＭＰ１  ＧＩ＿４５０７５０８−Ｓ、６６．ＴＩＭＰ−２  ＴＩＭＰ２  ＧＩ＿９２５７２４７−Ｓ、６７．ＴＩＭＰ−３  ＴＩＭＰ３  ＧＩ＿２１５３６４３１−Ｓ、６８．ＴＩＭＰ−４  ＴＩＭＰ４  ＧＩ＿４５０７５１４−Ｓ、６９．ＴＮＦ−α  ＴＮＦ  ＧＩ＿２５９５２１１０、７０．Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ  ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ  ＧＩ＿２２５４７１２２−Ｓ、７１．ＶＥＧＦ  ＶＥＧＦ  ＧＩ＿３０１７２５６３−Ｓ、７２．  Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ  ＸＣＬ１  ＧＩ＿４５０６８５２−Ｓ。
【０３３８】
抗体アレイにより検出されなかった２９のタンパク質は次の通りである（名前  遺伝子記号  遺伝子ＩＤ）：ｂＦＧＦ  ＣＣＬ２３  ＧＩ＿２２５３８８０７−Ａ、ＭＣＰ−４  ＣＣＬ１３  ＧＩ＿２２５３８７９９−Ｓ、ＴＡＲＣ  ＣＣＬ１７  ＧＩ＿２２５３８８０１−Ｓ、ＭＩＰ−３ｂ  ＣＣＬ１９  ＧＩ＿２２１６５４２４−Ｓ、ＭＩＰ−３ａ  ＣＣＬ２０  ＧＩ＿４７５９０７５−Ｓ、ＭＰＩＦ−１  ＣＣＬ２３  ＧＩ＿２２５３８８０７−Ａ、ＴＥＣＫ  ＣＣＬ２５  ＧＩ＿２２５３８７９７−Ａ、ＣＴＡＣＫ  ＣＣＬ２７  ＧＩ＿２２１６５４２８−Ｓ、ＣＣＬ２８  ＣＣＬ２８  ＧＩ＿２２５３８８１０−Ａ、ＭＩＰ−１ｂ  ＣＣＬ４  ＧＩ＿４５０６８４４−Ｓ、ＳＤＦ−１ａ  ＣＸＣＬ１２  ＧＩ＿４０３１６９２３−Ｉ、ＳＤＦ−１ｂ  ＣＸＣＬ１２  ＧＩ＿４０３１６９２３−Ｉ、ＣＸＣＬ１６  ＣＸＣＬ１６  ＧＩ＿１１５４５７６４−Ｓ、ＭＩＧ  ＣＸＣＬ９  ＧＩ＿４５０５１８６−Ｓ、ＭＩＰ−１ａ  ＣＸＣＲ６  ＧＩ＿５７３０１０５−Ｓ、ＩＧＦＢＰ−３  ＩＧＦＢＰ３  ＧＩ＿１９９２３１１０−Ｓ、ＩＬ−１５  ＩＬ１５  ＧＩ＿２６７８７９７９−Ａ、ＩＬ−４  ＩＬ４  ＧＩ＿２７４７７０９１−Ａ、ＩＬ−５  ＩＬ５  ＧＩ＿２８５５９０３２−Ｓ、ＴＮＦ−ｂ  ＬＴＡ  ＧＩ＿６８０６８９２−Ｓ、ＭＭＰ−２  ＭＭＰ２  ＧＩ＿１１３４２６６５−Ｓ、ＭＭＰ−８  ＭＭＰ８  ＧＩ＿４５０５２２０−Ｓ、ＮＡＰ−２  ＮＡＰ１Ｌ４  ＧＩ＿２１３２７７１１−Ｓ、ＮＴ−３  ＮＴＦ３  ＧＩ＿４５３５９８６９−Ｓ、ＮＴ−４  ＮＴＦ５  ＧＩ＿３４３２８９３３−Ｓ、Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ  ＯＳＭ  ＧＩ＿２８１７８８６２−Ｓ、ＴＧＦ−ｂ１  ＴＧＦＢ１  ＧＩ＿１０８６３８７２−Ｓ、ＬＩＧＨＴ  ＴＮＦＳＦ１４  ＧＩ＿２５９５２１４６−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｄ  ＶＥＧＦＤ  ＧＩ＿１９９２４２９７−Ｓ。
【０３３９】
おそらく、多くのサイトカインおよび増殖因子は低分子であるために、慣習的なＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析では検出できないのが、ＩＧＦＢＰ２、ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２の３つの遺伝子産物のみ、ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析により検出することができた。
【０３４０】
各々ＬＣ ＭＳ／ＭＳおよび抗体アレイにより同定された１３２および７２の遺伝子産物リストには、３つの共通遺伝子、すなわちＩＧＦＢＰ２、ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２が存在する。それゆえ、最終的には全部で２０１の独自の遺伝子産物を同定した（下記表Ｅ２）。
【０３４１】
【表Ｅ２】
2010500047.tif 000011
【０３４２】
ＬＣ ＭＳ／ＭＳおよび抗体アレイにより同定した２０１の独自の遺伝子産物のアルファベット順のリスト。ＬＣ ＭＳ／ＭＳおよび抗体アレイにより同定したタンパク質を併せて、それらの遺伝子記号により表した。各々の遺伝子の転写レベルは、ハイスループットＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙを用いて評価した。
【０３４３】
これら遺伝子産物のうち２９の遺伝子産物、すなわち、ＥＮＡ−７８、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−９、ＧＣＰ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ−ａ、ＨＣＣ−４、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＬＩＦ、ＭＣＰ−１、ＭＣＳＦ、ＭＩＦ、Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ、ＰＡＲＣ、ＰＩＧＦ、ＳＣＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＶＥＧＦは、成体組織由来のＭＳＣｓにより分泌されることが報告されている（１３，１６，１９−２１）。成体組織由来のＭＳＣｓにより分泌されることが報告されているその他４つのタンパク質、すなわち、ＩＧＦＢＰ−３、ＭＩＰ−３α、オンコスタチンＭおよびＴＧＦ−３（上記参照）は、本発明者らの２０１遺伝子産物リストには存在しない。
【０３４４】
［実施例１０］  ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオームの解析：ゲノムワイドな遺伝子発現解析による検証
当該２０１遺伝子産物と、全ＲＮＡのＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙへのハイブリダイズにより生成したｈＥＳＣ−ＭＳＣｓのゲノムワイドな遺伝子発現プロファイルとの比較により、１３４または６７％の遺伝子産物が、９９％の信頼性を伴う上限値の遺伝子転写レベルで存在することが明らかとなった（表Ｅ２）。ＬＣ ＭＳ／ＭＳにより同定した１３２の遺伝子産物の１１５もしくは８８％が検出可能な遺伝子レベルである一方（表Ｅ２）、抗体アレイにより同定した７２遺伝子産物の２７もしくは３８％が検出可能な転写レベルであり、４５もしくは６２％が検出できない転写レベルであった（表Ｅ２）。２つの遺伝子産物（ＥＮＯ１ＢおよびＳＶＥＰ１）用のプローブは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙ上に存在しない。サイトカイン／ケモカインをコードするｍＲＮＡは、翻訳の間にｍＲＮＡの急速な分解を引き起こすＡＵリッチエレメントを含むことが知られているので、７２遺伝子のうちの大抵の遺伝子の転写レベルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙによる検出を行うには低すぎると考えられる（２２，２３）。
【０３４５】
そのため、より感度の良いｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを行った。７２個中４２の遺伝子産物をランダムに選択し、試験を行った。４２遺伝子産物中、３６もしくは８６％が、ノーマライズドＣｔ値＜３５で定義される検出可能な転写レベルを示した（下記表Ｅ３）。この頻度は、ＬＣ ＭＳ／ＭＳにより同定され、その遺伝子転写物がＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙで検出可能な遺伝子産物で観察される頻度と、８８％の類似性を示すものである。加えて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙで検出可能な転写レベルを持つ１５個全てが、ｑＲＴ−ＰＣＲで検出可能な転写レベルを持つ（表Ｅ３）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙで検出できなかった転写レベルである、２７個中２１個（７８％）の遺伝子産物が、ｑＲＴ−ＰＣＲで検出可能な転写レベルを持つ（表Ｅ３）。
【０３４６】
【表Ｅ３】
2010500047.tif 000012
【０３４７】
転写物の定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析のため、抗体アレイにより同定した遺伝子産物７２個のうち４２個をランダムに選択した。１２個の遺伝子産物が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙ、ハイスループットゲノムワイド遺伝子発現アッセイにおいて９９％の信頼性で、検出限界値（ＬＯＤ）よりも高い転写レベルを持っていた。各遺伝子のＣｔ値はアクチンで補正（ノーマライズ）した。
【０３４８】
［実施例１１］  ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオームの解析：分泌タンパク質により修飾される生物学的プロセス
分泌された産物が傷害組織や臓器を周福する能力を持つかどうかを調べるため、遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）に従って、遺伝子産物をその生物学的プロセスと経路により分類した。その後、各プロセスまたは経路に関連する分泌されたＭＳＣプロテオームにおける独自遺伝子の頻度を、Ｕｎｉｇｅｎｅ、ＥｎｔｒｅｚおよびＧｅｎＢａｎＫのデータベース中の各々の経路もしくはプロセスの遺伝子頻度と比較した。非常に高頻度の遺伝子（ｐ＜０．０５）は、５８の生物学的プロセスおよび３０の経路と関連していた。
【０３４９】
２０１の独自遺伝子産物により修飾されたＧＯ（遺伝子オントロジー）により分類された生物学的プロセス：
2010500047.tif 000013
【０３５０】
2010500047.tif 000014
【０３５１】
2010500047.tif 000015
【０３５２】
５８の生物学的プロセスは、代謝、防御応答および組織分化の３つの主要なグループに分けることができ、一方で３０の経路は、受容体結合、シグナル伝達、細胞‐細胞間相互作用、細胞遊走、免疫応答および代謝と、広範に分類することができる（図８、図９）。想定される生物学的プロセスおよび経路の両方は、エネルギー生産、高分子の分解、生合成および分泌、損傷組織の除去および新しい組織の再生に必要なプロセス、を調節する細胞内代謝に分泌タンパク質が強い影響を持つことを示唆している（図８、図９）。
【０３５３】
ＭＳＣ馴化培地中でサイトカインおよびケモカインが支配的に存在していることと一致して、本解析はまた、分泌因子が外的刺激（例えば、走化性、走性および多くの免疫応答）に依存する多くの細胞内応答を引き起こすことを予測した（図８）。特に、当該馴化培地はまた、組織の分化、特に脈管形成、造血および骨の発達を促進するプロセスにおいて重要である生物学的プロセスを誘導することができる（図８）。
【０３５４】
分泌されたプロテオームにより調節されると予測されるそれらの経路において、受容体を介したサイトカインおよびＥＣＭの結合の経路は、分泌されたプロテオーム中のサイトカインおよびＥＣＭ成分の支配と一致している（図９）分泌されたプロテオームにより活性化される主要なシグナル伝達経路は、Ｊａｋ‐ＳＴＡＴシグナル伝達経路、ＭＡＰＫシグナル伝達経路、トール様受容体シグナル伝達経路、ＴＧＦ‐βシグナル伝達経路、ｍＴＯＲシグナル伝達経路、ＦｃεＲＩシグナル伝達経路、および、ヘリコバクターピロリ感染における上皮細胞のシグナル伝達を含むものである。分泌されたプロテオームのコンピューター解析はまた、ＭＳＣ分泌物が細胞‐細胞間相互作用、遊走および免疫応答を強めることを示唆している。
【０３５５】
［実施例１２］  ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオームの解析：ディスカッション
ＭＳＣｓは、無数の疾病の前臨床試験および臨床試験に用いられている（３−５，２４−２７）。しかしながら、そのメカニズムは不明確なままである。ＭＳＣｓは多数の細胞タイプ（例えば、損傷組織を修複または再生できる可能性を持つ内皮細胞、心筋細胞、軟骨細胞）に分化する可能性を持っているが、ＭＳＣｓの治療効果は、ＭＳＣの分化が通常、組織修復または組織機能の回復を介在するにはあまりにも非効率すぎるので、単にＭＳＣ由来の修復細胞タイプの生成により介されるものではない。ＭＳＣｓのいくつかの治療効果は、ＭＳＣｓにより分泌されるパラクリン因子により介されるものであることが、次第に提案されてきている（８）。ここで本発明者らは、ＬＣ‐ＬＣ‐ＭＳおよび抗体アレイの２つの技術の組み合わせによりｈＥＳＣ−ＭＳＣｓの分泌されたプロテオームの組成を記載する。
【０３５６】
ＬＣ‐ＬＣ‐ＭＳによるショットガンプロテオミクス解析は、高感度な手法であり、ハイスループット能力を持っているが、ほとんどのサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子を含む低分子タンパク質／ペプチドを検出することは難しい。このことは、抗体アレイを用いることにより部分的に軽減される。この２つ技術を用いたＭＳＣ分泌物の定量的プロテオミクスプロファイルは、再現性が高い。ＬＣ ＭＳ／ＭＳにより同定されたタンパク質は、独立して調製した２つのＣＭのバッチに存在し、一方で、抗体アレイにより同定したタンパク質は、独立して調製した４つのＣＭのバッチ中少なくとも３つに存在する。
【０３５７】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓによる分泌物のプロテオミクスプロファイルの結果は、以前に報告されている、成体組織由来ＭＳＣｓ（１３、１６、１９−２１）により分泌されるほぼ全ての因子と、報告されていない多くの因子を含むものであった。さらに、ハイスループットマイクロアレイに基づいた遺伝子発現解析を用いてプロテオミクスプロファイル中の遺伝子産物の８６−８８％の転写物を検出することにより、プロテオミクスプロファイリングのロバスト性を実証した。
【０３５８】
ＭＳＣ分泌物の潜在的な機能を世界的規模で評価するために、本発明者らは、転写後修飾タンパク質よりむしろ遺伝子産物に基づいた遺伝子発現解析のために、より容易に利用できるコンピューターのツールを利用した。分泌物中のサイトカインおよびケモカインの支配と一致して、コンピューター解析は、多くのプロセスおよび経路は、走化性、走性、外的刺激に対する細胞内応答、高分子の分解、生合成および分泌、サイトカイン‐サイトカイン受容体間相互作用、細胞間連絡および基礎代謝（例えば、グルコースおよびアミノ酸代謝）のような、サイトカインおよびケモカインの機能と通常関連していると予測した。ここで記載されるＭＳＣｓは、これらの機能が関与する疾病の治療に用いることができる。
【０３５９】
これらのプロセスおよび経路は、どのような特定細胞もしくは組織タイプにおいても、損傷、修復および再生のプロセスに特異的であるわけではないが、免疫細胞の損傷部位への遊走、ＥＣＭリモデリング、細胞内代謝の増加の容易さは、大抵の損傷または病変組織に対する修復効果を持っている。
【０３６０】
コンピューター解析はまた、サイトカインおよびケモカインに関連した一般的経路だけでなく、分泌タンパク質は、血管新生、造血および骨格発生に関与する多くのプロセスを調節することを予測した。同時に、報告されている大抵のＭＳＣを介した組織修復または再生は、心臓血管、造血および筋骨格の組織に関連している（３−５、２４−２７）。さらに、経路解析は、いくつかのＭＳＣのパラクリン作用を介することに関与するかもしれない候補経路を明らかにした。実際、これらの候補経路の多くは、すでに造血および筋骨格の生物学に関係している。例えば、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達は、心臓保護（２８）、造血（２９、３０）ならびに骨格の修復およびリモデリング（３１、３２）に関連しており、ＭＡＰＫシグナル伝達は、心臓血管系応答（３３、３４）、骨格の修復およびリモデリング（３２、３５）および造血（３６）の多くの局面において、重要な役割を果たしており、トール様受容体シグナル伝達は、心臓血管病理の開始と進行（３７）および先天性免疫と適応免疫の調節（３８）に関係しており、ＴＧＦ−βシグナル伝達は、一般的な創傷治癒（４４）と同様に、正確な心臓の発達、心臓リモデリング、心疾患の進行および血管新生（３９−４１）造血（４２）、骨および軟骨の形成とリモデリング（２７、４３）に重要であり、そして、細胞増殖の重要な調節因子であるｍＴＯＲは、通常の生理および疾病において、重要であるが非特異的な役割を果たしている（４５−４７）。
【０３６１】
結果として、成体組織由来ＭＳＣｓにより分泌されることが報告されている多くのサイトカインを含む、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣｓの分泌タンパク質の本発明者らによる解析は、分泌プロテオームは、特に心臓血管、造血、筋骨格組織の組織修復や再生に、影響を及ぼす調節能力を持っており、そのため、ＭＳＣ移植研究における組織修復や再生に対するＭＳＣを介したパラクリン効果の分子サポートを提供することを示唆している。また、この分泌プロテオームは、高度に検証可能なＭＳＣを介した組織修復の分子メカニズム、および、組織修復や再生を調節するための薬の標的になる可能性のあるもの明らかにした。ｈＥＳＣ由来ＭＳＣｓと成体組織由来ＭＳＣｓの間の顕著な類似性は、ＭＳＣ培養物の馴化培地も同様の生物活性を持つ可能性が高いことを示唆している。
【０３６２】
したがって、このことは、本発明者らの方法により誘導されたＭＳＣｓは、骨髄由来の対応物と顕著な生物学的類似性を持つことを示している。これらの発見は、パラクリン因子を分泌する能力におけるｈＥＳＣ−ＭＳＣｓと成体ＢＭ由来ＭＳＣｓの類似性を示している。さらに、いずれか１または複数のここで記載されるＭＳＣｓから分泌されるタンパク質は、馴化培地のかたちも含めて、ここで記載されるＭＳＣｓと同様の目的のために用いることができる。
【０３６３】
しかし、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣｓには、成体組織由来ＭＳＣｓよりも有利な点がいくつかある。ＭＳＣの組織ソースとしてのｈＥＳＣ細胞株の使用は、無限に再生可能で増殖可能なソースを構成し、再現可能で一貫した臨床的に準拠したＣＭになるＭＳＣバッチの調製を高める。これはまた、ＣＭ調製の拡張性（スケーラビリティ）と低コストの既成の治療の発展の可能性を後押しするものである。加えて、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣ ＣＭの調製のための化学的に定義された無血清培地の開発は、血清や血清代替物のような複合培地添加物と関連する交絡変数であるコンタミネーションを減少させる。それゆえ、本発明者らのＣＭの解明は、臨床応用に向けたＭＳＣに基づく生物学の解釈に非常に関連性がある。
【０３６４】
［実施例１３］  ５８生物学的プロセスの各々における２０１遺伝子のリスト
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【０３６５】
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【０３６６】
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【０３６８】
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【０４２０】
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【０４２１】
［実施例１４］  ３０経路の各々における２０１遺伝子のリスト
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【０４２２】
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【０４２３】
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【０４５０】
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【０４５１】
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【０４５２】
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【０４５３】
［実施例１４Ａ］  追加の５９３タンパク質
さらなる馴化培地の解析により、当該培地は、全部で７９４の独自の遺伝子の産物である、以下に示すさらなる５９３のタンパク質を含むことが示唆された。
2010500047.tif 000105
【０４５４】
2010500047.tif 000106
【０４５５】
［実施例１４Ｂ］  追加の５９３タンパク質の解析
セクレトームにより調節される生物学的プロセスおよび経路は、さらに下記のようにして解析を行った。
【０４５６】
本発明者らは、ウェブ上の無料コンピュータープログラム(http://www.pantherdb.org/tools/genexAnalysis.jsp)を用いて解析を行った。各々の機能的なカテゴリにおける遺伝子の頻度を、７９４遺伝子全リストと、公共のデータベース（ＮＣＢＩ：ホモサピエンス）の遺伝子との間で比較した。
【０４５７】
本発明者らは、様々な（遺伝子オントロジー）経路ＧＯ、生物学的プロセスＧＯおよび分子機能ＧＯにおける遺伝子頻度を比較した。ＮＣＢＩホモサピエンスのデータベースの遺伝子頻度よりも顕著に高いまたは低い（ｐ＜０．０１）経路ＧＯ、生物学的プロセスＧＯおよび分子機能ＧＯのみが解析に用いられた。
【０４５８】
結果を図１２、図１３および図１４に示す。
【０４５９】
図１２は、分泌タンパク質により動かされる予測経路を示す。各経路における遺伝子頻度は、ＮＣＢＩホモサピエンスのデータベースよりも、当該セクレトームで顕著に高いものであった（ｐ＜０．０１）。
【０４６０】
図１３は、分泌タンパクにより動かされる予測プロセスを示す。各経路における遺伝子頻度は、ＮＣＢＩホモサピエンスのデータベースよりも、当該セクレトームで顕著に高いまたは低いものであった（ｐ＜０．０１）。
【０４６１】
図１４は、分泌タンパクにより動かされる予測分子を示す。各経路における遺伝子頻度は、ＮＣＢＩホモサピエンスのデータベースよりも、当該セクレトームで顕著に高いものであった（ｐ＜０．０１）。
【０４６２】
［実施例１５］  実施例７から１４に関する参考文献
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【０４６３】
［実施例１６］  ＥＳ細胞の馴化培地（ＣＭ）中の生物活性
主な検討事項は、ＭＳＣｓからの一致した、再現可能な生物活性のある因子の産生である。したがって、様々な分泌遺伝子産物は、報告されているＭＳＣｓの、多様な細胞内システムや疾病に対するパラクリン効果に対する分子的機序を与えなければならない（Ａ７−１８）。
【０４６４】
ＨｕＥＳ９．Ｅ１ ＭＳＣに馴化した化学的に定義された培地、および、化学的に定義された培養液のみからなるコントロール培地について、多次元タンパク質同定技術（ＭｕＤＰＩＴ）（Ａ２３）およびサイトカイン抗体アレイ解析を行うことにより、本発明者らは２０１の独自遺伝子産物を同定した（上述の実施例参照）。本発明者らは、馴化培地（ＣＭ）中の生物活性評価として、プロテオーム解析により予測されていたＭＭＰゲラチナーゼ活性を調べた。
【０４６５】
図１０は、ＥＳ細胞馴化培地におけるＭＭＰゲラチナーゼ活性を示す。
０．１μｇのタンパク質を用いたザイモグラフィにより、ＭＭＰゲラチナーゼ活性（おそらくＭＭＰ２またはＭＭＰ９）が、馴化培地（ＣＭ）中には存在するが、コントロールの非馴化培地（ＮＣＭ）には存在しないことが確認された（Ａ２４）。
【０４６６】
［実施例１６Ａ］  ＥＳ細胞の馴化培地（ＣＭ）中の生物活性
Ａ．本発明者らは、当該セクレトーム中に存在するＴＧＦ−βに生物活性があることを示した。ＴＨＰ−１細胞をセクレトームにさらすことにより、Ｓｍａｄ２のリン酸化、ＴＧＦ−βシグナル伝達の下流標的の増加が誘導された (Euler-Taimor, G., and J. Heger. 2006. The complex pattern of SMAD signaling in the cardiovascular system. Cardiovascular Research 69:15-25) 。このことは図１５に示す。
【０４６７】
図１５は、１００μｇのＣＭタンパク質またはＮＣＭタンパク質またはＰＢＳに３０分間さらしたＴＨＰ−１細胞を示す。その後、細胞溶解液を調製し、抗リン酸化Ｓｍａｄ２抗体および化学発光に基づいた検出システムを用いて、標準的なウェスタンブロットハイブリダイゼーションにより解析した。シグナルは、デンシトメトリーにより定量し、シグナルの相対強度を算定した。
【０４６８】
Ｂ．また、本発明者らは、馴化培地が、ＣＭにより影響を受けることがコンピューター解析で予測された細胞走化性を誘導できることを示した（実施例１１および実施例１３）。
【０４６９】
ＣＭは、孔径５μｍの膜を介したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）の遊走を誘導する。このことは図１６に示す。また、ＣＭは、ＴＨＰ１、単球細胞株および初代ヒトマクロファージにおいても同様の遊走を誘導した。
【０４７０】
図１６は、孔径５μｍの膜であるＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）プレートの上チャンバーにセットされた１×１０５個のＨＵＶＥＣｓを示す。下チャンバーは、２５×濃縮したＣＭまたはＮＣＭのストック溶液を１０×、５０×、１００×希釈したＲＰＭＩ培地で満たしている。陽性および陰性のコントロールは、それぞれ１５％および０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）入りのＲＰＭＩで行った。ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃２４時間インキュベーション後、下チャンバーに遊走した細胞の数をカウントした。
【０４７１】
Ｃ．ＣＭがアポトーシスに対する生物学的な効果を持つという予測（上述）は、ＣＭまたはＮＣＭの存在下で、酸化ストレスによるアポトーシスを誘導する過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）でＣＥＭ細胞をインキュベーションし、１２または２４時間後に残っている生存細胞の数を決定することにより、テストした。ＣＭは、酸化ストレスによるアポトーシスを顕著に減少させた。このことは図１７に示す。
【０４７２】
図１７は、１×ＣＭまたは１０×ＣＭの存在下で、５０または５００μＭのＨ２Ｏ２でインキュベートした６ＣＥＭ細胞を示す。生存細胞の相対数は、トリパンブルー染色により１２および２４時間で決定した。
【０４７３】
［実施例１７］  急性心筋梗塞（ＡＭＩ）モデルマウスにおける心臓保護効果
ＡＭＩは、前述のように、マウスの左（冠動脈）前下行枝の永続的な結紮により誘導した（Ａ５７）。
【０４７４】
その後、上述のように作成した１０×濃縮したＣＭまたはＮＣＭ（コントロール）１００μｌを、頸静脈に設置した浸透圧ポンプを介して７２時間、マウスに投与した。これらのマウスの心機能は、３週間後にＭＲＩにより評価した。ＣＭを与えたマウスは、死亡率が顕著に減少し（図１１Ａ）、左心室の駆出率を改善した（図１１Ｂ）。
【０４７５】
［実施例１８］  虚血再かん流モデルブタにおける心臓保護効果
馴化培地は、臨床的により関連のある虚血再かん流モデルブタの心臓における修復効果を持ち、心機能を回復させる。このモデルと時間は、梗塞後、病院に平均９０分で到着し、閉塞した動脈を開いてステントを設置した心筋梗塞患者と同程度のものである。
【０４７６】
麻酔
一晩の絶食後、挿管して酸素と空気の混合物（１：１ ｖ／ｖ）での間欠的陽圧換気のための人工呼吸器につなぐ前に、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）でブタを落ち着かせ、チオペンタール（４ｍｇ／ｋｇ、静脈内）で麻酔した。生理食塩水と麻酔薬の継続的な投与のため、静脈内カテーテルを耳静脈に設置した。麻酔は、ミダゾラムの継続的な投与（０．３ｍｇ／ｋｇ／ｈ、静脈内）により維持し、その一方で、クエン酸スフェンタニル（１μｇ／ｋｇ／ｈ、静脈内）の継続的な投与による鎮痛、臭化パンクロニウム（０．１ｍｇ／ｋｇ／ｈ、静脈内）の投与による筋弛緩を行った。手術の前に、心不整脈を防ぐため、１６０ｍｇのソタロールを静脈内に３０分投与した。
【０４７７】
心筋梗塞および手術手順
手術全体の間、心電図、動脈圧およびカプノグラムを継続的にモニターした。胸骨正中切開の後、一定の心拍数を測定するために、ペーシングリードを右心耳の小径穴を通して右心房に挿入した。左心室圧（ＬＶＰ）は、左心室の中に先端を通して挿入した圧センサ付きＭｉｌｌａｒカテーテルを用いて測定した。心拍出量を測定するため、遷音速流プローブ（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ、ＵＳＡ）を近位大動脈の周りに設置した。梗塞を誘導する前に、心エコー検査を行った。当該虚血再かん流モデルにおいては、最初に、再かん流を行うための除去前に、４５分間の閉塞を引き起こすため、左冠動脈回旋枝（ＬＣｘ）の周りをきつく縫合した。１０匹の動物の２つのグループが用いられた。試験グループは、パラクリン分泌物、すなわちｈＥＳＣ−ＭＳＣｓで馴化した培地を得ることができ、コントロールグループは、馴化していないコントロール培地を得ることができる。各々のブタにおいて、培地は３つの主要な冠動脈に直接運ばれる。はじめに、ＬＣＸの周りの縫合糸を除去した後、ＬＣＸ（左冠動脈回旋枝）に１ｍｌのボーラス投与がなされ、９０分後に、ＲＣＡ（右冠動脈）およびＬＡＤ（冠動脈の左前下行枝）に各々１ｍｌのボーラス投与がなされた。各々２ｍｌの培地が、胸およびカテーテルに流し込まれた３つの浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｃ）はポンプから各々の動脈（ＬＣＸ、ＲＣＡおよびＬＡＤ）に直接往復した。ポンプは、冠動脈に注入した後、培地（１０ｕｌ／ｈ）を７日間供給することができる。したがって、各ブタは局所的に９ｍｌの培地を受けることになる。ブタは３週間生存した。他の投与経路としては次のものがある。１）各ブタが、虚血再かん流の直後に、梗塞周囲の領域の心筋内にＣＭまたはＮＣＭ（３ｍｌ）のボーラスを受け、続く７２時間の間６ｍｌの静脈内投与を受ける。２）虚血再かん流の直後に、カテーテルによりＣＭまたはＮＣＭ（３ｍｌ）の冠動脈内投与を受け、続く７２時間の間６ｍｌの静脈内投与を受ける。心室細動が起こった時には、５０ジュールの体内除細動が用いられる。移植では、心筋梗塞の前後に、心拍出量、平均動脈圧、左心室圧および心エコーの測定が行われた。最後は、圧・容量曲線および梗塞面積の測定で延長された。血行動態および心拍リズムの安定後、胸部を閉じ、安定な状態に回復させた。
【０４７８】
評価
心筋梗塞の誘導３週間後、動物を再び麻酔し、胸骨を再開胸した。心臓の機能および形状を評価するため、圧・容積記録に基づいてコンダクタンスカテーテルおよび心エコーを測定した。機能測定後、実験室での分析のため、心臓を取出した。
【０４７９】
血行動態
心電図、動脈圧、心拍出量および左心室圧（ＬＶＰ）を３００Ｈｚの最小サンプリングレートでデジタル化し、オフライン解析 (Sonometrics Corporation, Ontario, Canada) のため保管した。
【０４８０】
心エコー検査
心外膜短軸の超音波(Prosound SSD-5000, 5 MHz probe UST-5280-5, Aloka Holding Europe AG, Zug, Switzerland)を乳頭レベルで得た。梗塞サイズの壁厚（ＷＴ）および左心室内領域（Ｌ Ｖｉａ）を拡張末期（ＥＤ）および収縮末期（ＥＳ）に測定した。収縮期壁厚（ＳＷＴ）は（ＷＴ（ＥＤ）−ＷＴ（ＥＳ））／ＷＴ（ＥＤ）×１００（％）で計算し、左心室内径短縮率は（ＦＡＳ）は、（Ｌ Ｖｉａ（ＥＤ）−Ｌ Ｖｉａ（ＥＳ））／Ｌ Ｖｉａ（ＥＤ）×１００（％）で計算した。
【０４８１】
コンダクタンスカテーテルプロトコール
コンダクタンスカテーテルの方法は、連続するＬＶ（左心室）容量およびＬＶ圧のオンライン測定を提供し、以前に報告されているように行った（Ａ５８、Ａ５９）。コンダクタンスカテーテルに由来する連続したＬＶ圧および容量のシグナルは、Ｌｅｙｃｏｍ ＣＦＬ−５１２ (CD Leycom, Zoetermeer, the Netherlands) を用いて２５０Ｈｚサンプリングレートで示された。データは、定常状態の間および一時的な大静脈閉塞の間に取得し、呼気の終わりには、全て人工呼吸器を停止させた。データ取得は、固定した心房ペーシングレートが８０拍／分で行った。圧・容量曲線の解析はカスタム・ソフトウェアを用いて行った。拡張末期は、左心室圧の急増の開始によって定義し、収縮末期は、左心室圧の最少レートの減少によって定義した（ｄＰ／ｄｔｍｉｎ）。
【０４８２】
梗塞面積
心臓を取出した後、ＬＶ（左心室）を分離し、頂点からベースまで５片に切り分けた。切片は、梗塞組織を生存心筋と区別するために、１％の塩化トリフェニルテトラゾリウム (TTC, Sigma-Aldrich Chemicals, Zwijndrecht, Netherlands) Sorensen バッファー (13.6 g/l KH2PO4 + 17.8 g/l Na2H PO4  2H2O, pH 7.4) ３７℃で１５分間インキュベーションした。全ての切片は、両サイドからスキャンし、デジタル面積測定ソフトウェアを用いて、全面積と各切片における梗塞サイズを比較した。切片の重量の補正後、梗塞サイズをＬＶのパーセンテージとして計算した。移植では、心筋梗塞の前後に、心拍出量、平均動脈圧、左心室圧および心エコーの測定が行われる。最後は、圧・容量曲線および梗塞面積の測定で延長される。
【０４８３】
［実施例１８Ｂ］  虚血再かん流モデルブタにおける心臓保護効果
実施例１８の簡略版が行われた。本実験は、終点が３週間後から４時間に短縮されるという大きな違いを除いて本質的に同じである。手順は、次の変更点を除いて一緒である。
【０４８４】
心筋梗塞および手術手順
手術全体の間、心電図、動脈圧およびカプノグラムを継続的にモニターした。胸骨正中切開の後、一定の心拍数を測定するために、ペーシングリードを右心耳の小径穴を通して右心房に挿入した。左心室圧（ＬＶＰ）は、左心室の中に先端を通して挿入した圧センサ付きＭｉｌｌａｒカテーテルを用いて測定した。心拍出量を測定するため、遷音速流プローブ（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ、ＵＳＡ）を近位大動脈の周りに設置した。梗塞を誘導する前に、心エコー検査を行った。当該虚血再かん流モデルにおいては、最初に、再かん流を行うための除去前に、７５分間の閉塞を引き起こすため、左冠動脈回旋枝（ＬＣｘ）の周りをきつく縫合した。３つのグループの動物が用いられた。試験グループにはＣＭすなわちｈＥＳＣ−ＭＳＣｓで馴化した培地を与え、コントロールグループには非馴化コントロール培地または生理食塩水を与えた。再かん流開始５分前に、ブタにＭＳＣ−ＣＭ（２．０ｍｇタンパク質、１ｍｌ）、ＮＣＭまたは生理食塩水を静脈内投与した。再かん流直後、ＭＳＣ−ＣＭ（４ｍｌ、８．０ｍｇタンパク質、Ｎ＝７）、ＮＣＭ（Ｎ＝５）または生理食塩水（Ｎ＝７）をＬＣｘ冠動脈の中に局所的に注入した。ブタは再かん流の４時間後に殺した。危険な領域における相対的な梗塞サイズは、エバンスブルーおよびＴＴＣ染色を用いて評価した。当該梗塞サイズは、ＣＭを投与したブタではＮＣＭ（ｐ＝０．０２４）および生理食塩水（ｐ＝０．００７）を投与したブタと比較して著しく減少していた（図７）。収縮期壁厚（ＳＷＴ）や左心室内径短縮率は（ＦＡＳ）のような心機能は心エコーで測定し（図８）、一方で、連続するＬＶ容量およびＬＶ圧のオンライン測定は、コンダクタンスカテーテル手法を用いて測定することができる。ベースラインおよび虚血の間、３つの実験グループのブタにおけるＳＷＴおよびＦＡＳは、顕著に異なるものではなかった。しかし、再かん流の４時間後、ＣＭを投与したブタのＳＷＴおよびＦＡＳは、ＮＣＭおよび生理食塩水を投与した動物よりも非常に良いものであった。ＣＭを投与したブタはまた、気絶心筋を挑発するβ１−アドレナリン受容体アンタゴニスト（遮断薬）ドブタミン（２．５および５．０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）の静脈内注入による薬理学的に誘導したストレス下で強い心機能を示した。
【０４８５】
結果
簡略化した実験の結果を図１８、１９および２０に示す。
【０４８６】
図１８：ＣＭ、ＮＣＭまたは生理食塩水投与したブタにおける急性虚血再かん流後の相対的な梗塞サイズ。急性虚血は、７５分間ＬＣｘを結紮し、続いて結紮を開放し再かん流させることにより誘導した。再かん流開始５分前、ブタにＣＭ、ＮＣＭまたは生理食塩水を静脈内投与した。再かん流直後、ＣＭ、ＮＣＭまたは生理食塩水をＬＣｘ冠動脈の中に局所的に注入した。再かん流の４時間後、危険領域内の相対的な梗塞サイズを評価した。
【０４８７】
図１９および２０  心エコー検査
図１９：収縮期壁厚  図２０：左心室内径短縮率
心臓の測定は、虚血の前、虚血の間および虚血の４時間後に行った。虚血の４時間後、気絶心筋を挑発するβ１−アドレナリン受容体アンタゴニスト（遮断薬）ドブタミン（２．５および５．０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）の静脈内注入による薬理学的に誘導したストレス下で追加測定を行った。
【０４８８】
心外膜短軸の超音波画像 (Prosound SSD-5000, 5-MHz probe UST-5280-5, Aloka Holding Europe AG, Zug, Switzerland) を乳頭レベルで得た。梗塞サイズの壁厚（ＷＴ）および左心室内領域（Ｌ Ｖｉａ）を拡張末期（ＥＤ）および収縮末期（ＥＳ）に測定した。収縮期壁厚（ＳＷＴ）は（ＷＴ（ＥＳ）−ＷＴ（ＥＤ））／ＷＴ（ＥＤ）×１００（％）で計算し、左心室内径短縮率は（ＦＡＳ）は、（Ｌ Ｖｉａ（ＥＤ）−Ｌ Ｖｉａ（ＥＳ））／Ｌ Ｖｉａ（ＥＤ）×１００（％）で計算した。
【０４８９】
圧・容量曲線を測定するためのコンダクタンスカテーテルプロトコール
コンダクタンスカテーテル手法は、連続するＬＶ容量およびＬＶ圧のオンライン測定を提供し、以前に報告されているように行った (Timmers, L., J. P. G. Sluijter, C. W. J. Verlaan, P. Steendijk, M. J. Cramer, M. Emons, C. Strijder, P. F. Grundeman, S. K. Sze, L. Hua, J. J. Piek, C. Borst, G. Pasterkamp, and D. P. V. de Kleijn. 2007. Cyclooxygenase-2 Inhibition Increases Mortality, Enhances Left Ventricular Remodeling, and Impairs Systolic Function After Myocardial Infarction in the Pig. Circulation 115:326-332) 。
【０４９０】
コンダクタンスカテーテルに由来する連続したＬＶ圧および容量のシグナルは、Ｌｅｙｃｏｍ ＣＦＬ−５１２ (CD Leycom, Zoetermeer, the Netherlands) を用いて２５０Ｈｚサンプリングレートで示した。データは、定常状態の間および一時的な大静脈閉塞の間に取得し、呼気の終わりには、全て人工呼吸器を停止させた。圧・容量曲線の解析はカスタム・ソフトウェアを用いて行った。
［実施例１９］
【０４９１】
皮膚科的疾患における馴化培地の治療効果
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓによるＣＭの分子成分およびＣＭの集団機能のコンピューター予測は、ＣＭが皮膚炎または乾癬のような皮膚創傷または皮膚病変疾患に対して回復効果を誘導することを示唆している。ＣＭにより動かされる分子成分および生物学的プロセスの多くは、皮膚創傷治療や皮膚科的疾患の治療に用いられるか、そのターゲットとされている。
【０４９２】
特に、インターフェロンγ、インターロイキン２およびインターロイキン１０のような分泌サイトカインは、コンジローマ、いぼ、血管腫、ケロイド、皮膚癌、アトピー性皮膚炎、乾癬、ベーチェット病、慢性肉芽腫症、創傷治癒および皮膚Ｔ細胞性リンパ腫［Ａ６０］の治療に用いられている。ＥＣＭタンパク質のような他の分泌タンパク質には、コラーゲン、ＥＣＭの調節因子（例えば、ＭＭＰやそれらの阻害剤）が含まれる。ＴＩＭＰｓ、血管新生因子（例えばＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ）、増殖因子（例えば、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ）もまた、創傷治癒痕の減少潰瘍に関与している［Ａ６１−６７］。ｈＥＳＣ−ＭＳＣのＣＭにより調節されうるいくつかのシグナル伝達経路は、多くの皮膚科的疾患に関与している。例えば、ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、乾癬中のＩＧＦおよびＩＧＦＢＰｓを介して乾癬調節のＩＧＦに関与しており［Ａ６８、６９］、トールシグナル伝達は皮膚科的疾病に関与している［Ａ７１］。
【０４９３】
従って、皮膚炎や乾癬のような皮膚創傷または皮膚科的疾患へのＣＭの局所使用は、治療を改善し、瘢痕を減少させる。恒常性も維持すべきである。ＣＭはリポソームに基づいたエマルジョン、ゲルまたはクリームの形状で供給されてもよく、標準的な創傷包帯の一部として供給されてもよい。また、ＣＭは、皮膚修復や治療を促進するスキンケア化粧品における添加物として用いられてもよい。
【０４９４】
皮膚疾患に対するＣＭの効果を試験するのに適したモデル動物は、皮膚炎モデルマウスである。皮膚感作は、以前に記載されているように［Ａ７２、７３］行った。簡潔には、ＰＢＳ１００μｌ中に５０μｇのＢｌｏ ｔ５を入れたものまたはＰＢＳのみを、１ｃｍ２のガーゼにアプライし、透明の包帯 (Smith Nephew) で皮膚にパッチした。この手順は、５０日の期間に渡って２度行った。その後、ＣＭおよびＮＣＭを１ｃｍ２のガーゼにアプライし、様々な期間に渡って、上述のように皮膚にパッチした。
【０４９５】
皮膚炎の組織学的試験のため、パッチした皮膚から検査サンプルを取得し、すぐに、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。
【０４９６】
［実施例２０］  ぜんそくおよびアレルギーにおける馴化培地の効果
ぜんそくは、特徴のあまりない遺伝子のセットおよび環境因子に複雑な病因が起因する、複雑な病気である。結果生じる病状は、平滑筋量の増加および細胞外基質タンパク質の堆積物の増加、それに続く肺機能の低下により特徴付けられる気道および上皮下の線維の慢性的な炎症を導く免疫調節異常である。
【０４９７】
現在の治療には、いくつかの因子またはシグナル経路（例えば、ＥＣＭ、インテグリン、および間葉系細胞機能［Ａ７４］、トール様受容体［Ａ７５］、ＴＧＦ−βやＥＧＦのような増殖因子［Ａ７６、Ａ７７］およびＩＬ６経路［Ａ７８］）を調節することが含まれている。ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓによるＣＭは、これらの標的領域にたいして生物学的効果を持つと予測されており、本発明者らは、ＣＭがぜんそくの肺において免疫調節の修復をし、組織修復を促進し、肺組織の瘢痕を最小化するのを助けると予測した。
【０４９８】
慢性気道炎症に対するＣＭおよびＮＣＭの効果を調べるため、上述のように［Ａ７２、Ａ７３］マウスの皮膚感作を行った。５０日後、パッチしたマウスを麻酔し、５０μｇのＢｌｏ ｔ５を３日間連続で経鼻投与した。最後の投薬から２４時間後、侵襲性ＢＵＸＣＯ［Ａ７９］を用いて気道過敏性を測定した。マウスを麻酔し、３日間連続でＣＭまたはＮＣＭを経鼻投与した。最後の投薬から２４時間後、気道過敏性を測定した。さらに２４時間後、気管支肺胞洗浄液を回収した。気管支肺胞洗浄液の回収に続き、肺を１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。
【０４９９】
急性気道炎症に対するＣＭおよびＮＣＭの効果を調べるため、アレルギーモデルマウスを樹立するために、高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３および検出できないレベルのＩＦＮ−γを分泌するＢｌｏ ｔ５特異的Ｔｈ２細胞株が用いられた。簡潔に言うと、各マウスの静脈内への２．５×１０６Ｂｌｏ ｔ５ 特異的Ｔｈ２細胞の有用なトランスファーにより、naiveマウスの感作を行った。これらのマウスを麻酔し、５０μｇのＢｌｏ ｔ５を３日間連続で経鼻投与した。最後の経鼻投与から２４時間後、侵襲性ＢＵＸＣＯ［Ａ７９］を用いて気道過敏性を測定した。その後、マウスを麻酔し、３日間連続でＣＭまたはＮＣＭを経鼻投与した。最後の経鼻投与から４８時間後、気管支肺胞洗浄液を回収した。気管支肺胞洗浄液の回収に続き、組織学的解析のために、肺を１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。
【０５００】
臨床診療においては、肺の病気を治療するためのＣＭの使用は、標準的なエアロゾル療法を用いて効果的に投与することができる［Ａ８０−８６］。
【０５０１】
［実施例２１］  他の疾病における馴化培地の治療効果
概して、本発明者らは、最初の損傷が炎症や免疫調節異常を誘導し、線維化や機能の喪失を含む慢性組織リモデリングを導く病態において、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓのＣＭが恒常性の復元および組織修復の促進に有用であると予測した。他の疾病には、虚血性傷害、嚢胞性線維症、静脈洞炎および鼻炎が含まれる。
【０５０２】
［実施例２２］  整形外科における馴化培地の治療効果
筋骨格組織の修復のための現在の治療戦略は、通常、物理的な支持を与えるだけでなく、細胞遊走、細胞接着、増殖および血管新生および最終的な骨新生を開始させる分化を促進させるスキャフォールドとしてのバイオマテリアル（セラミックまたはポリマー）の使用を含むものである［Ａ８７−９０］。ｈＥＳＣ−ＭＳＣによるＣＭのコンピューター解析によれば、スキャフォールド構造へのＣＭの組み込みは、細胞遊走、増殖、接着、骨格発達およびスキャフォールドの血管新生を促進するであろう。
【０５０３】
ＣＭの欠陥部（そうでなければ、萎縮性の癒着不能を引き起こすであろう）における骨再生に対する効果を調べるため、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔに、半形１５ｍｍサイズの欠陥部を作り［Ａ９１］、ＣＭまたはＮＣＭでコートしたコラーゲンスポンジまたはハイドロゲルのような適当な基質でふさいだ。レントゲン写真を３週間毎に撮影した。６週間または１２週間後、動物を殺した。新骨はマイクロＣＴスキャンで測定し、血管は移植片内の血管内皮細胞の抗ＣＤ３１染色により測定した。少なくとも最初の段階では、血管が増加し、新骨形成も増加すべきである。
【０５０４】
軟骨修復に対するＣＭの効果を調べるため、骨軟骨損傷モデルウサギ［Ａ９２］を使用した。コラーゲンやハイドロゲルのような適当なスキャフォールドにＣＭをコートし、３ｍｍのひざの骨軟骨欠陥部位に埋め込んだ［Ａ９３］。臨床応用として、スキャフォールドや骨グラフトにＣＭを組み込むことにより、ＣＭを用いることができる［Ａ９４］。
【０５０５】
［実施例２３］  骨髄移植における馴化培地の治療効果
ＭＳＣｓは骨髄移植を促進し［Ａ９５］、移植片対宿主病を改善することが知られている。ＭＳＣｓの移植は、造血細胞移植の促進［Ａ９６］およびＧＶＨＤの制限［Ａ９７、９８］により、同種移植の結果を改善することが知られている。ＭＳＣｓを介したこれらの効果は、造血幹細胞ニッチの拡大ならびにＧＶＨＤの耐性および減少の誘導、同種組織移植の拒絶、炎症の調節［Ａ９８］を介した効果である、おそらく可溶性因子の分泌を介したものであると予想されている［Ａ１００］。
【０５０６】
ＭＳＣｓによるＣＭの臨床応用可能性：インビトロで培養液にＣＭを添加することによる、または、インビボで移植中に造血幹細胞と共にＣＭを入れることによる造血幹細胞数の拡大は、ＣＭの静脈内注入によるＧＶＨＤを改善する、または、移植細胞もしくは移植前後の治療の一部としてＣＭの静脈内注入による組織に対する免疫寛容を誘導する。
【０５０７】
［実施例２４］  実施例１６から実施例２２までの参考文献
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【０５０８】
各出願および特許の出願中（“出願引用文献”）ならびに各出願および特許および出願引用文献に引用もしくは記載されたいかなる製品のいかなる使用説明書もしくはカタログを含む本書に記載した各出願および特許ならびに各出願および特許における各引用文献または参考文献は、参照することにより、本書に含まれる。さらに、本書に引用された全ての文書ならびに本書に引用された全ての引用文献もしくは参考文献ならびに本書に記載または引用されたいかなる製品のいかなる使用説明書もしくはカタログは、参照することにより、本書に含まれる。
【０５０９】
本発明の精神と範囲から逸脱することなく、記載方法および発明のシステムの様々な変更および変動が当業者に容易であることは明らかである。本発明は、特殊な好ましい実施形態と関連して記載しているが、請求の範囲に記載する発明は、そのような特殊な形態に制限されるべきではなく、本発明の範囲内で、多くの変更および追加がなされてもよいことは当然のことである。実際、分子生物学または関連分野における当業者にとって明らかな本発明を実施するために記載した態様の様々な変更は、請求の範囲の範囲内で行われるであろう。さらに、独立項に続く特徴の様々な組み合わせは、本発明の範囲から逸脱することなく独立項の特徴とすることができる。
【図１Ｂ】
2010500047.tif 000107
2010500047.tif 000108
【図１Ｃ】
2010500047.tif 000109
【図１Ｄ】
2010500047.tif 000110
【図１Ｅ】
2010500047.tif 000111
【図１Ｆ】
2010500047.tif 000112
【図１Ｇ】
2010500047.tif 000113
【図２Ａ】
2010500047.tif 000114
【図２Ｂ】
2010500047.tif 000115
【図３Ａ】
2010500047.tif 000116
【図３Ａ（ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ）】
2010500047.tif 000117
【図３Ａ（ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ２）】
2010500047.tif 000118
2010500047.tif 000119
【図３Ｂ】
2010500047.tif 000120
【図３Ｂ（ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ）】
2010500047.tif 000121
2010500047.tif 000122
【図３Ｂ（ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ２）】
2010500047.tif 000123
【図３Ｃ】
2010500047.tif 000124
【図３Ｃ（ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ）】
2010500047.tif 000125
【図３Ｃ（ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ２）】
2010500047.tif 000126
【図４Ａ】
2010500047.tif 000127
【図４Ｂ】
2010500047.tif 000128
【図４Ｂ（ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ）】
2010500047.tif 000129
【図４Ｃ】
2010500047.tif 000130
【図４Ｄ】
2010500047.tif 000131
【図４Ｅ】
2010500047.tif 000132
【図５Ａ】
2010500047.tif 000133
【図５Ｂ】
2010500047.tif 000134
【図５Ｂ（ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ）】
2010500047.tif 000135
【図５Ｃ】
2010500047.tif 000136
【図５Ｄ】
2010500047.tif 000137
【図５Ｅ】
2010500047.tif 000138
【図６】
2010500047.tif 000139
【図７】
2010500047.tif 000140
【図８】
2010500047.tif 000141
【図８（ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ）】
2010500047.tif 000142
【図８（ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ２）】
2010500047.tif 000143
【図９】
2010500047.tif 000144
【図９（ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ）】
2010500047.tif 000145
【図１０】
2010500047.tif 000146
【図１１Ａ】
2010500047.tif 000147
【図１１Ｂ】
2010500047.tif 000148
【図１２】
2010500047.tif 000149
【図１３】
2010500047.tif 000150
【図１４】
2010500047.tif 000151
【図１５】
2010500047.tif 000152
【図１６】
2010500047.tif 000153
【図１７】
2010500047.tif 000154
【図１８】
2010500047.tif 000155
【図１９】
2010500047.tif 000156
【図２０】
2010500047.tif 000157
【図１Ａ】
2010500047.tif 000158
【誤訳訂正書】
【提出日】平成21年4月16日(2009.4.16)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発生学、細胞生物学、分子生物学、遺伝学に関する。特に本発明は、胚性幹細胞から間葉系幹細胞に派生させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、分化した細胞と異なり、分裂する能力と、自己複製または表現型的におよび機能的に異なる娘細胞へと分化する能力とを持つ (Keller, Genes Dev. 2005;19:1129-1155; Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005;85:635-678; Wiles, Methods in Enzymology. 1993;225:900-918; Choi et al, Methods Mol Med. 2005;105:359-368) 。
【０００３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は、筋骨格系障害の治療、循環器疾患の心臓機能の改善、および移植片体宿主病の重症度の改善における治療効果が示されている多能性幹細胞である (Le Blanc and Pittenger, 2005). 。系列制限されているので限定されるが、それらは間葉系の細胞種、例えば、脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞に分化する強固な能力を持っており、奇形腫形成の危険性はごくわずかである。移植したＭＳＣｓに対する宿主の免疫拒絶は、通常、自己移植または同種異系移植により回避される。ＭＳＣｓは、骨髄（ＢＭ）、脂肪組織（ａｄ）、および臍帯血から分離し、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で増殖ことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、組織の利用は、それらの分離に制限があり、危険な侵襲的手法が必要となる。また、ＭＳＣｓの生体外での増殖は顕著であるが、それでもなお限界がある。
【０００５】
広範囲の疾病［Ａ１，Ａ２］、例えば、筋骨格系障害の組織生体工学［Ａ３，Ａ４］におけるＧＶＨＤ［Ａ１］や心臓病［Ａ５，Ａ６］を治療する臨床や前臨床応用において、幅広い疾病を治療するＭＳＣｓの治療能力は、多くの様々な修復細胞種に分化する能力に起因する。
【０００６】
しかしながら、傷害組織または組織において、移植したＭＳＣｓが機能的な修復細胞に分化する効率、および、治療に関連する数字は、未だ十分に報告または開示がなされていない。
【０００７】
本発明は、本書に記載の方法により、これらおよびその他の問題を解決しようとするものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、幹細胞を用いる代わりに、ＭＳＣｓからの分泌物をＭＳＣｓそのものの代替またはＭＳＣｓに追加して適用することで内因性の組織修復を増強させることにより、傷害組織または欠損組織が再生または修復させることができる。
【０００９】
特に、本発明者らは、ヒト胚性幹細胞由来のＭＳＣｓが疾病の治療において培養される馴化培地の使用を提供する。このように、馴化培地はどのような疾病に対するＥＳ細胞、特に治療に最適であるＭＳＣｓに利用することができる。
【００１０】
本発明者らは、ＭＳＣｓにより分泌されるポリペプチドを同定し、馴化培地の成分を規定し、開示する。組成物が１または複数の特有の生理活性物質を、ＭＳＣｓの分泌物中に含んでいることは明らかである。特に、７９４ポリペプチドのうち１または複数がそのような治療における馴化培地の代替または馴化培地に追加して使用されてもよい。
【００１１】
本発明のアプローチにより、もし、自己移植の細胞調製物が用いられれば、細胞に基づく治療法に伴う免疫適合性、腫瘍原性、異種動物由来感染、費用および待機時間といった現在の交絡因子は排除されるであろう。
【００１２】
このようなアプローチは将来、低価格な費用、より良い品質管理および均質性のある「画一的な」ＭＳＣに基づく治療を提供できる可能性がある。
【００１３】
本発明の実施は、特に断りのない限り、通常の技術を有する当業者が、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を利用して行うことができる。そのような技術は、文献に説明されている。例えば、下記参照。J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855およびLab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3。これらの一般的なテキスト各々は、参考文献として組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
図１Ａ−１Ｇ  ｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物の特性解析。
【図１Ａ】位相差顕微鏡下における細胞形態。
【図１Ｂ】ｈＥＳＣ−ＭＳＣにおける多能性関連遺伝子の発現。転写レベルはＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定し、ｈＥＳＣの転写レベルで補正した。ｈＥＳＣの転写レベルは、ＨｕＥＳ９およびＨ１ｈＥＳＣ株の平均として算出した。
【図１Ｃ】ＨｕＥＳ９およびＨ１ ｈＥＳＣ株、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１.Ｅ２ ｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物ならびにＥ１４マウスＥＳＣ株における多能性関連遺伝子のウェスタンブロット解析。
【図１Ｄ】ＨｕＥＳ９およびＨｕＥＳ９．Ｅ１の腎被膜下移植。ＨｕＥＳ９．Ｅ１（上）またはＨｕＥＳ９（下）移植４ヶ月後のＨ＆Ｅ染色した腎臓切断面のパラフィン包埋。
【図１Ｅ】ヒトＨｕＥＳ９ ＥＳＣ株、マウスＥ１４ ＥＳＣ株、マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダーおよびＨｕＥＳ９．Ｅ１におけるアルカリフォスファターゼ活性。
【図１Ｆ】ヒトＡｌｕおよびマウスｃ−ｍｏｓ反復配列の存在を分析するためのＰＣＲによるゲノムＤＮＡ解析。
【図１Ｇ】Ｇバンド（上）および分光による染色体解析（ＳＫＹ）（中）による染色体分析。９番染色体の逆位（下）。
【００１５】
図２Ａ−２Ｂ  ＦＡＣＳ解析による細胞表面抗原プロファイリング。
【図２Ａ】ＨｕＥＳ９．Ｅ１ ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１.Ｅ２ ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ、ＨｕＥＳ９ ｈＥＳＣｓ、マウス胚性繊維芽フィーダー細胞を染色し、Ｃｙａｎ ＬＸ (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) 装置でＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いて解析した。非特異的蛍光は、アイソタイプマッチしたマウスモノクローナル抗体でアリコートした同様の細胞のインキュベーションにより決定した。
【図２Ｂ】ＨｕＥＳ９．Ｅ１およびＨｕＥＳ９．Ｅ３ ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓを、ＦＡＣＳによりＢＭ−ＭＳＣｓと同時に解析する前に、血清含有ＢＭ−ＭＳＣ培地で２回継代した。
【００１６】
図３Ａ−３Ｃ  ＨｕＥＳ９．Ｅ１ ＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞の分化は、標準的なプロトコールを用いて脂質形成、軟骨形成、骨形成に誘導される。
【図３Ａ】脂質形成 ｉ）脂質形成誘導１４日後、オイルレッドにより細胞の脂肪滴を染色した。ｉｉ）７日目および１４日目のＰＰＡＲγｍＲＮＡをＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。全数値はＨｕＥＳ９．Ｅ１の数値で補正した。ｉｉｉ）ＨｕＥＳ９およびＨ１ ｈＥＳＣｓ、それらから派生したＭＳＣ細胞培養物（ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２）ならびに成体組織由来ＭＳＣｓ（ＢＭ−ＭＳＣおよびａｄ−ＭＳＣ）における相対的ＰＰＡＲγｍＲＮＡレベルをＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。全数値はＨｕＥＳ９．Ｅ１の数値で補正した。
【図３Ｂ】軟骨形成 ｉ）骨形成誘導２１日後、アルシアンブルー（左）およびＨＲＰ可視化アッセイを用いたＩＩ型コラーゲンの免疫反応でプロテオグリカンを染色した。ｉｉ）７日目および１４日目のＡｇｇｒｅｃａｎおよびＰＰＡＲγｍＲＮＡをＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。全数値はＨｕＥＳ９．Ｅ１の数値で補正した。ｉｉｉ）ＨｕＥＳ９およびＨ１ ｈＥＳＣｓ、それらから派生したＭＳＣ細胞培養物（ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２）ならびに成体組織由来ＭＳＣｓ（ＢＭ−ＭＳＣおよびａｄ−ＭＳＣ）における相対的ＰＰＡＲγｍＲＮＡレベルをＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。全数値はＨｕＥＳ９．Ｅ１の数値で補正した。
【図３Ｃ】骨形成 ｉ）軟骨形成誘導２１日後、ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色により石灰化基質を染色した。ｉｉ ｉｉｉ）７日目および１４日目の骨特異的アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）および骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）ｍＲＮＡをＴａｑｍａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。全数値はＨｕＥＳ９．Ｅ１の数値で補正した。
【００１７】
図４Ａ−４Ｄ  遺伝子発現解析
【図４Ａ】ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２からなる３つのｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物、３つのＢＭ−ＭＳＣサンプル、３つのａｄ−ＭＳＣサンプルならびにＨｕＥＳ９、Ｈ１およびＨｅｓ３からなる３つのｈＥＳＣ株における階層的クラスタ分析。
【図４Ｂ】ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとＢＭ−ＭＳＣｓとの間（左）、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとｈＥＳＣｓとの間（右）における遺伝子発現の一対比較
【図４Ｄ】ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとＢＭ−ＭＳＣｓにおいて共通に発現した遺伝子（＜２倍の差異）の解析。遺伝子は、Ｐａｎｔｈｅｒ分類システムを用いて、生物学的プロセスに分類した。各生物学的プロセスは、観察した遺伝子の頻度を、ＮＣＢＩの各生物学的プロセスに対する２３４８１遺伝子のホモサピエンス遺伝子データベースで予想された遺伝子頻度と比較することにより、顕著に過剰発現（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）または不十分な発現（ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）（ｐ＜０．０１）かどうかで決定した。顕著に過剰または不十分な発現であるプロセスをグループに分け、グラフで表した。
【図４Ｅ】ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとＢＭ−ＭＳＣｓにおいて異なる発現を示した遺伝子（＞２倍の差異）の解析。ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓまたはＢＭ−ＭＳＣｓにおいて高発現した遺伝子により顕著に過剰発現（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）または不十分な発現（ｕｎｄｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）（ｐ＜０．０１）であった生物学的プロセスをグループに分け、グラフで表した。
【００１８】
図５Ａ−５Ｄ  ｈＥＳＣ−ＭＳＣの生成のための陽性および陰性ソーティング
【図５Ａ】ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２、ＨｕＥＳ９ ｈＥＳＣｓならびにマウス胚性繊維芽フィーダー細胞を染色し、ＣＤ２４の存在をＣｙａｎ ＬＸ (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) 装置でＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いて解析した。非特異的蛍光は、アイソタイプマッチしたマウスモノクローナル抗体でアリコートした同様の細胞のインキュベーションにより決定した。
【図５Ｂ】トリプシン処理し、ＰＤＧＦおよびＦＧＦ２を添加した培地でフィーダー細胞無しで１週間増殖させたＨｕＥＳ９細胞からのＣＤ１０５＋、ＣＤ２４−細胞のソーティング。Ｑ４に表されたＣＤ１０５＋、ＣＤ２４−細胞を培養のために選別した。
【図５Ｃ】Ｑ４．１と、その他の各Ｑ４の培養物（すなわち、Ｑ４．２〜Ｑ４．５）との間の遺伝子発現の一対比較。
【図５Ｄ】全Ｑ４培養物と、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２からなるｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとの間、ならびに、全Ｑ４培養物とＢＭ−ＭＳＣｓとの間の遺伝子発現の一対比較。
【図５Ｅ】Ｑ４．３のＳＫＹ解析
【図６】ＨｕＥＳ９．Ｅ１ ＭＳＣ培養物で馴化した培地のタンパク質解析。８０％コンフルエントなＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞培養物をＰＢＳで３回ウォッシュし、フェノールレッドを含まず、ＩＴＳ、５ｎｇ／ｍｌＦＧＦ２、５ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦ ＡＢ、グルタミン‐ペニシリン‐ストレプトマイシンおよびβ‐メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地からなる化学的に組成が明らかな培地で一晩培養した。それから、培養物をＰＢＳで３回リンスし、新しい化学的に組成が明らかな培地に置き換えた。培地のアリコートを０、２４、４８および７２時間に取り、５００×ｇで遠心し、その上清を０．２μフィルターで処理した。１０μｌの培地を４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、銀染色を行った。
【図７】抗体アレイ。１ｍｌの馴化培地（ＣＭ）または非馴化培地（ＮＣＭ）をＲａｙＢｉｏ（登録商標）サイトカイン抗体アレイ (RayBio Norcross, GA) で、操作手順書に従ってインキュベーションした。各アレイに対する抗体マップは実施例に記載した。特異的抗体に対するリガンドの結合は、ＨＲＰによる化学発光アッセイを用いて可視化した。各膜の様々な露光を解析した。シグナルがＣＭでハイブリダイズした膜上で存在し、ＮＣＭでハイブリダイズした膜上では存在しない時に、抗原が存在しているものとして記録した。ＣＭおよびＮＣＭの、４つの独立したバッチの解析データは実施例に要約した。
【図８】２０１遺伝子産物の生物学的プロセスへの分類。２０１遺伝子をＧＯ分類中の様々な生物学的プロセスに分類した。Ｕｎｉｇｅｎｅ、ＥｎｔｒｅｚおよびＧｅｎＢａｎｋ（ｐ値＜０．０５）と照合させたデータベースの遺伝子頻度と比較して、分泌プロテオーム中の遺伝子頻度により過剰発現していた５８生物学的プロセスを、３つの主要なグループ：代謝、防御応答および組織分化に分類した。
【図９】２０１遺伝子産物の経路への分類。２０１遺伝子をＧＯ分類中の様々な経路に分類した。Ｕｎｉｇｅｎｅ、ＥｎｔｒｅｚおよびＧｅｎＢａｎｋ（ｐ値＜０．０５）と照合させたデータベースの遺伝子頻度と比較して、分泌プロテオーム中の遺伝子頻度により過剰発現していた３０生物学的プロセスを、いくつかの主要なカテゴリ：受容体結合、シグナル伝達、細胞‐細胞間相互作用、細胞遊走、免疫応答および代謝に分類した。
【図１０】ＭＭＰゲラチナーゼ活性のＥＳ細胞馴化培地（ＣＭ）中の存在、非馴化培地中の非存在を示すＳＤＳゲル電気泳動。
【図１１Ａ】急性心筋梗塞（ＡＭＩ）モデルマウスにおける死亡率を示すグラフ。ＣＭ：ＥＳ細胞馴化培地を投与したマウス、ＮＣＭ：非馴化コントロール培地を投与したマウス
【図１１Ｂ】急性心筋梗塞（ＡＭＩ）モデルマウスにおける左心室駆出分画率を示すグラフ。ＣＭ：ＥＳ細胞馴化培地を投与したマウス、ＮＣＭ：非馴化コントロール培地を投与したマウス
【図１２】分泌タンパク質がドライブする予測経路。各経路における遺伝子頻度は、ＮＣＢＩホモサピエンスデータベースよりもセクレトームで顕著に高かった（ｐ＜０．０１）。
【図１３】分泌タンパク質がドライブする予測プロセス。各経路における遺伝子頻度は、ＮＣＢＩホモサピエンスデータベースよりもセクレトームで顕著に高かったまたは低かった（ｐ＜０．０１）。
【図１４】分泌タンパク質がドライブする予測分子。各経路における遺伝子頻度は、ＮＣＢＩホモサピエンスデータベースよりもセクレトームで顕著に高かった（ｐ＜０．０１）。
【図１５】１００μｇのＣＭタンパク質またはＮＣＭタンパク質またはＰＢＳに３０分間さらしたＴＨＰ−１細胞を示す。その後、細胞溶解液を調製し、抗リン酸化Ｓｍａｄ２抗体および化学発光による検出システムを用いた標準的なウェスタンブロットハイブリダイゼーションにより解析した。シグナルはデンシトメトリーにより定量し、シグナルの相対強度を算定した。
【図１６】孔径５μｍの膜であるＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）プレートの上チャンバーにセットされた１×１０５個のＨＵＶＥＣｓを示す。下チャンバーは、２５×濃縮したＣＭまたはＮＣＭのストック溶液を１０×、５０×、１００×希釈したＲＰＭＩ培地で満たしている。陽性および陰性のコントロールは、それぞれ１５％および０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）入りのＲＰＭＩで行った。ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃２４時間インキュベーション後、下チャンバーに遊走した細胞の数をカウントした。濃縮したＣＭの１０×希釈液で満たしたチャンバーにおける細胞数を１００に補正した。他のチャンバーで遊走した細胞数は、濃縮したＣＭの１０×希釈液における細胞数と相対的に表した。
【図１７】１×ＣＭまたは１０×ＣＭの存在下で、５０または５００μＭのＨ２Ｏ２でインキュベートした６ＣＥＭ細胞を示す。生存細胞の相対数は、トリパンブルー染色により１２および２４時間で決定した。
【図１８】ＣＭ、ＮＣＭまたは生理食塩水投与したブタにおける急性虚血再かん流後の相対的な梗塞サイズ。急性虚血は、７５分間ＬＣｘを結紮し、続いて結紮を開放し再かん流させることにより誘導した。再かん流開始５分前、ブタにＣＭ、ＮＣＭまたは生理食塩水を静脈内投与した。再かん流直後、ＣＭ、ＮＣＭまたは生理食塩水をＬＣｘ冠動脈の中に局所的に注入した。再かん流の４時間後、危険領域内の相対的な梗塞サイズを評価した。
【００１９】
図１９および図２０  心エコー検査
【図１９】収縮期壁厚。
【図２０】左心室内径短縮率。
【００２０】
心臓の測定は、虚血の前、虚血の間および虚血の４時間後に行った。虚血の４時間後、気絶心筋を挑発するβ１−アドレナリン受容体アンタゴニスト（遮断薬）ドブタミン（２．５および５．０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）の静脈内注入による薬理学的に誘導したストレス下で追加測定を行った。心外膜短軸の超音波画像 (Prosound SSD-5000, 5-MHz probe UST-5280-5, Aloka Holding Europe AG, Zug, Switzerland) を乳頭レベルで得た。梗塞サイズの壁厚（ＷＴ）および左心室内領域（Ｌ Ｖｉａ）を拡張末期（ＥＤ）および収縮末期（ＥＳ）に測定した。収縮期壁厚（ＳＷＴ）は［ＷＴ（ＥＳ）−ＷＴ（ＥＤ））／ＷＴ（ＥＤ）］×１００（％）で計算し、左心室内径短縮率は（ＦＡＳ）は、［（Ｌ Ｖｉａ（ＥＤ）−Ｌ Ｖｉａ（ＥＳ））／Ｌ Ｖｉａ（ＥＤ）］×１００（％）で計算した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
馴化培地（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉａ）
実施例に、ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオーム解析を記載する。
【００２２】
実施例７から１５に示すように、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓは成人骨髄由来のＭＳＣｓ（ＢＭ−ＭＳＣｓ）に類似した発現プロファイルを持つ。これらの結果は、本書に記載の方法により得られるＭＳＣｓは、骨髄由来のＭＳＣｓと、例えばパラクリン因子の分泌能力といった顕著な生物学的類似性を持つことを示す。従って、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓはＢＭ−ＭＳＣｓを適用できるどのような目的にでも使用することができる。
【００２３】
さらに、本発明者らは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓの培養により馴化される培地を提供する。そのような馴化培地は、特有の遺伝子産物を含めたｈＥＳＣ−ＭＳＣｓにより分泌される分子を含有する。そのような馴化培地および特有なタンパク質またはポリペプチドを含めたその中に含有する分子の組み合わせは、疾病の治療に使用することができる。それらは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓの活性の補完としてまたはその代替として、例えば疾病の治療または予防の目的で使用することができる。
【００２４】
馴化培地は、細胞培養液のような培地中で所定の時間ＭＳＣｓを培養することにより作製することができる。ＭＳＣｓは、特に、本書に記載のどのような方法により作製されるものも含まれる。馴化培地は、実施例に記載のように、ＭＳＣｓにより分泌されるポリペプチドを含有する。
【００２５】
馴化培地は、１または複数の処理工程の後、治療に用いることができる。例えば、馴化培地は、ＵＶ処理、ろ過滅菌等の処理をすることができる。また、１または複数の精製工程を行ってもよい。
【００２６】
特に、馴化培地は、例えば透析や限外ろ過により濃縮することができる。例えば３Ｋの分画分子量（ＮＭＷＬ）である限外ろ過膜を用いて濃縮することができる。
【００２７】
また、本発明者らは、そのような馴化培地の補完または代替として、実施例に記載したポリペプチドの１または複数、好ましくはすべてを含む組成物を提供する。
【００２８】
ＭＳＣ馴化培地により治療可能な疾病
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓのプロテオーム解析は、発現されるタンパク質が、代謝や防御応答、血管新生、造血、骨格の発達などの組織分化を含む多くの生物学的プロセスに関与するものであることを示している。それゆえ、本発明者らは概して、以下に記載するように、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓまたはｈＥＳＣ−ＭＳＣｓにより調製された培地の、これらのいかなる生物学的なプロセスを調節するものとしての使用を提供する。
【００２９】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓまたはｈＥＳＣ−ＭＳＣｓにより調製された培地は、次に示すものの１または複数の経路の調節に使用することができる：Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅを介する細胞骨格の調節、細胞周期、インテグリンシグナル伝達経路、ケモカイン＆サイトカインを介する炎症のシグナル伝達経路、ＦＧＦシグナル伝達経路、ＥＧＦ受容体シグナル伝達経路、血管新生、プラスミノーゲン活性化カスケード、血液凝固、解糖、ユビキチンプロテアソーム経路、プリン塩基デノボ生合成、クエン酸回路、フェニルアラニン生合成、ヘム生合成。
【００３０】
また、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓまたはｈＥＳＣ−ＭＳＣｓにより調製された培地は、次に示すものの１または複数のプロセスの調節に使用することができる：細胞の構造と運動、細胞構造、細胞の情報伝達、細胞運動、細胞接着、エンドサイトーシス、有糸分裂、エキソサイトーシス、細胞質分裂、細胞周期、免疫防御、サイトカイン／ケモカインを介する免疫、マクロファージを介する免疫、顆粒球を介する免疫、リガンドを介するシグナル伝達、サイトカインおよびケモカインを介するシグナル伝達経路、シグナル伝達、細胞外基質タンパク質を介するシグナル伝達、増殖因子のホメオスタシス、受容体タンパク質チロシンキナーゼシグナル伝達経路、細胞接着を介するシグナル伝達、細胞表面受容体を介するシグナル伝達、ＪＡＫ−ＳＴＡＴカスケード、抗酸化およびフリーラジカル除去、ホメオスタシス、ストレス応答、血液凝固、発生プロセス、中胚葉発生、骨格発生、血管新生、筋発生、筋収縮、タンパク質代謝とタンパク質修飾、タンパク質分解、タンパク質フォールディング、タンパク質複合体アセンブリ、アミノ酸活性化、細胞内タンパク質輸送、その他のタンパク質標的と局在、アミノ酸代謝、解糖、ペントースリン酸シャント、その他の多糖類代謝、プリン代謝、リン代謝の調節、ビタミン代謝、アミノ酸生合成、ｍＲＮＡ前駆体プロセシング、翻訳調節、ｍＲＮＡスプライシング
【００３１】
さらに、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓまたはｈＥＳＣ−ＭＳＣｓにより調製された培地は、次に示すものの１または複数の機能の補完品として使用することができる：シグナル伝達分子、ケモカイン、増殖因子、サイトカイン、インターロイキン、その他のサイトカイン、細胞外基質、細胞外基質の構造タンパク質、その他の細胞外基質、細胞外基質の糖タンパク質、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、その他のプロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、シャペロン、シャペロニン、Ｈｓｐ７０ファミリーシャペロン、その他のシャペロン、シンターゼ、シンターゼおよびシンテターゼ、選択したカルシウム結合タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、その他のイソメラーゼ、ＡＴＰシンターゼ、ヒドラターゼ、トランスアミナーゼ、その他のリアーゼ、その他の酵素調節因子、選択した調節分子、アクチン結合細胞骨格タンパク質、細胞骨格タンパク質、非モーターアクチン結合タンパク質、アクチンおよびアクチン関連タンパク質、アネキシン、チューブリン、細胞接着分子、アクチン結合モータータンパク質、中間体フィラメント、リボ核タンパク質、リボソームタンパク質、翻訳因子、その他のＲＮＡ結合タンパク質、ヒストン、カルモジュリン関連タンパク質、小胞コートタンパク質
【００３２】
さらに、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓは、これらの機能が関与するかもしれない疾病の治療、または、その修復もしくは治療にこれらの生物学的プロセスのいずれか１もしくは複数が関与するものに用いることができる。同様に、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓにより発現されるタンパク質は、単独または組合せで、好ましくは馴化培地のかたちで、例えばそのような疾病の治療もしくは予防の目的のために、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓの活性の補完または代替として用いてもよい。
【００３３】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓによる遺伝子産物は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＧＦ‐βシグナルおよびｍＴＯＲシグナル伝達経路のような、心臓血管生物学、骨発生、および造血における重要なシグナル伝達経路を活性化することを示唆している。従って、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓや、それらから発現されるタンパク質等は、これらのいずれかのシグナル経路が関与する、または、その原因がこれらシグナル伝達経路のいずれか１または複数において１または複数の欠陥である、疾病の予防もしくは治療に用いることができる。
【００３４】
従って、そのような馴化培地は、心不全、骨髄疾患、皮膚病、火傷ならびに糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病および癌のような退行性の疾病の治療に用いることができる。
【００３５】
そのような馴化培地は、また、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚疾患、皮膚病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、いぼ、血管腫、ケロイド、皮膚癌、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽種症、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、潰瘍、そして、線維化および機能の喪失、腎臓の虚血性傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎、鼻炎、または整形外科の疾病などの慢性的な組織修復に至る炎症および免疫調節異常を含めた初期損傷により特徴づけられる病態の治療に用いることもできる。
【００３６】
当該馴化培地は、個体における創傷治癒、瘢痕の縮小、骨形成、骨移植また骨髄移植に用いることができる。
【００３７】
特に、当該馴化培地は、血管新生、血液学（特に免疫プロセス）または筋骨格発生等に関与するプロセスの調節に用いることができる。
【００３８】
さらに、馴化培地のかたちを含めて本書に記載したＭＳＣｓから分泌されるタンパク質のいずれか１または複数は、本書に記載のＢＭ−ＭＳＣｓと同様の目的で使用することができる。それゆえ、本発明者らは、馴化培地中に存在するポリペプチドの１または複数、好ましくは実質的に全てを含有する組成物を提供する。特に、実施例９、１３、１４または１４Ａで設定されているポリペプチドの１または複数、好ましくは実質的に全てを含有する組成物を提供する。
【００３９】
そのような組成物は、馴化培地が用いられ得るいかなる目的にでも使用することができる。
【００４０】
特段の事情がない限り「馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）」という用語は、ＭＳＣｓにさらされた細胞培養培地だけではなく、馴化培地中に存在するポリペプチドの１または複数、好ましくは実質的に全てを含有する組成物も同様に含む。
【００４１】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓは、実施例１０から１４、特にその表に挙げられているようなもののような、分泌または発現されるいかなるタンパク質のソースとしても用いることができる。特に、当該ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓは馴化培地のソースとして使用することができる。それゆえ、本発明者らは、実施例１０から１４を含む実施例において示されているようなポリペプチドを産生する方法を提供する。当該方法は、記載されているような間葉系幹細胞の取得、当該間葉系幹細胞の培養、および、当該間葉系幹細胞好ましくは当該間葉系幹細胞が増殖した培地からのポリペプチドの分離、からなる方法である。
【００４２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の取得
馴化培地の作製に用いるのに適したＭＳＣｓは、当業者に公知の方法により作ることができる。特に、ＭＳＣｓは、胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーまたはその子孫を、ＦＧＦ２含有の無血清培地中、非共培養で播種して得た細胞を増殖させることにより作ることができる。この詳細は、以下のセクションに記載する。
【００４３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣｓ様の細胞をｈＥＳＣｓから取得する従来の方法としては、ヒトテロメアーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の遺伝子を分化しているｈＥＳＣｓにトランスフェクションする方法 (Xu et al., 2004) または、マウスＯＰ９細胞株と共培養する方法 (Barberi et al., 2005) がある。これらの誘導プロトコールでは、外来性の遺伝物質およびマウス細胞の使用が、腫瘍原性または異種動物の病原菌の感染といった許容できない危険性を導く。
【００４４】
対照的に、本発明者らによる方法は、分化しているｈＥＳＣｓから類似または同一（好ましくは同種の）ＭＳＣ集団を分離する臨床的意義があり再現可能なプロトコールである。概して、本発明者らによる方法は、胚性幹（ＥＳ）細胞のコロニーを細胞中に播種することからなる。当該細胞はそれから外に出し、増殖させる。当該細胞は、間葉系幹細胞を取得するために、ＦＧＦ２含有の無血清培地中で、非共培養で増殖させる。
【００４５】
このように、本発明者らの方法は、血清、マウス細胞の使用、または遺伝子操作を必要とせず、操作と時間をほとんど必要としないため、高い拡張性がある。実施例に、２つの異なるｈＥＳＣｓ株（ｈＨＳＣｓ ｌｉｎｅｓ）、ＨｕＥＳ９ならびにＨ−１および３代目であるＨｅｓ−３23からのＭＳＣｓの分離を記載し、本プロトコールのロバスト性を示す。本方法により得られるヒトＥＳ細胞由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）および本書に記載される組成物は、骨髄由来のＭＳＣｓ（ＢＭ−ＭＳＣｓ）と非常に類似している。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、胚性幹細胞培養は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）培養を含む。
【００４７】
本発明のある実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を作製する方法は、ＣＤ１０５陽性ＣＤ２４陰性細胞をソートする前に、ＦＧＦ２および任意でＰＤＧＦ ＡＢが補充された培地中で、フィーダー細胞の支持なしにトリプシン処理を行い増殖させることからなる。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態では、ＦＧＦ２および任意でＰＤＧＦ ＡＢが補充された培地中でフィーダー細胞無しで１週間増殖させた後、ＣＤ１０５陽性ＣＤ２４陰性細胞をトリプシン処理したｈＥＳＣｓ細胞からソートすることを含む本方法は、少なくともいくつかの、好ましくは実質的に全ての、より好ましくは全ての細胞が、お互いに類似または同一（好ましくはホモジニアスな）であるｈＥＳＣｓ−ＭＳＣ細胞株を作出する。
【００４９】
物理的に、生物的におよび機能的にＢＭ−ＭＳＣｓに類似した、臨床的に意義のあるｈＥＳＣＭＳＣ培養物を作出する本方法は、多くの臨床および前臨床動物研究における治療効果を示すＢＭ−ＭＳＣｓの分離のためのＢＭの制限供給を軽減させることができる可能性がある10,25。このことは、侵襲的なＢＭ吸引手法に伴う危険性をもまた排除し、ＢＭ−ＭＳＣｓを調製するための患者当たりの基本的な待機時間および費用を低減させ、バッチ間変動を低減させる。さらに、ｈＥＳＣｓのような明確な細胞タイプの健常者由来ＭＳＣｓは、現在の幅広い臨床および前臨床応用にもかかわらず謎が残っているＭＳＣの分化や生物の研究やよりよい理解に役立つモデルを提供する9。
【００５０】
さらに、当該プロセスにより作出された間葉系幹細胞の使用は、ヒトＥＳＣｓのような他の細胞種を増殖させるフィーダー細胞としての成人組織由来ＭＳＣｓの置換、臍帯血または骨髄幹細胞集団の増殖、および心疾患の治療のためのＭＳＣ−馴化培地の調製といった、臨床または治療への応用における成人組織由来ＭＳＣｓの置換を含む。
【００５１】
胚性幹細胞コロニーの分散
本発明者らによる間葉系幹細胞の作製方法は、胚性幹細胞のコロニーを分解し細胞中に分散させることを含む。
【００５２】
胚性幹細胞コロニーは、ｈｕＥＳ９コロニー (Cowan CA, Klimanskaya I, McMahon J, Atienza J, Witmyer J, et al. (2004) Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med 350: 1353-1356) またはＨ１ＥＳＣコロニー (Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, et al. (1998) Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 282: 1145-1147.) を含んでいても良い。
【００５３】
コロニー中の細胞は実質的な程度、すなわち少なくとも塊の程度にまで分解または分散されることが好ましい。また、コロニー中のすべての細胞が単一になる程度、すなわちコロニーが完全に分解される程度にまで分解または分散されることがより好ましい。
【００５４】
分解は、分散剤により行うことができる。
【００５５】
分散剤は、少なくともいくつかのコロニー中の胚性幹細胞において、お互いから引き離すことができるものであれば、どのようなものであっても良い。当該分散剤は、コロニー中の細胞間または細胞と基質間またはそれら両方の接着を壊す試薬を含むものであることが好ましい。また、当該分散剤はプロテアーゼを含有するものであることが好ましい。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態では、分散剤はトリプシンを含有する。トリプシンによる処理は、例えば約３７℃で３分間行えば十分である。それから、細胞を中和、遠心し、播種の前に培地中に再懸濁する。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法は、プレートにコンフルエントなヒト胚性幹細胞をトリプシンで分散させ、その細胞を播種することを含む。
【００５８】
当該分散とは、吸引（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）、洗浄（ｒｉｎｓｉｎｇ）、トリプシン処理（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）、インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）、取出し（ｄｉｓｌｏｄｇｉｎｇ）、クエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）、再播種（ｒｅ−ｓｅｅｄｉｎｇ）およびアリコーティング（ａｌｉｑｕｏｔｉｎｇ）の連続する工程の少なくともいくつかを含み得る。次のプロトコールは、the Hedrick Lab, UC San Diego (http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html)出典のものである。
【００５９】
吸引の工程では、フラスコのような容器から培地を吸引または除去する。洗浄の工程では、例えば５〜１０ｍｌの、好ましくはＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まない緩衝液で細胞を洗浄する。例えば、カルシウムとマグネシウムを含まないＰＢＳで細胞を洗浄する。トリプシン処理の工程では、緩衝液に入れた分散剤を容器に加え、細胞表面を分散剤溶液で覆うように、容器をまわす。例えば、Ｈａｎｋ’ｓＢＳＳに溶かした１ｍｌのトリプシンをフラスコに加えることができる。
【００６０】
インキュベーションの工程では、一定の温度で、ある時間、細胞を放置する。例えば、３７℃で数分間（例えば、２〜５分間）細胞を放置する。取出しの工程では、機械的作用により（例えば、かき取ること、または、手で容器の側面を打つことにより、細胞を取出すことができる。細胞はシートからはがれ、表面から滑り落ちる。
【００６１】
クエンチングの工程では、フラスコに培地を添加する。当該培地は、分散液の作用を止めるために中和剤を含んでいることが好ましい。例えば、もし分散液がトリプシンのようなプロテアーゼであれば、プロテアーゼの活性を完了させる血清タンパク質のようなタンパク質を培地に含んでいると良い。特殊な例としては、３ｍｌの血清含有細胞培養液を、総量が４ｍｌになるようにフラスコに添加する。細胞はピペットで取出し、分散させることができる。
【００６２】
再播種の工程では、細胞を未使用の培養容器に再播種し、新しい培地を添加する。再播種する数は、様々な分割比で作ることができる。例えば、１／１５希釈および１／５希釈で再播種することができる。特殊な例としては、２５ｃｍ２フラスコに１滴、他の容器に３滴の細胞を入れ、各々に、例えば７５ｃｍ２フラスコから１／１５希釈および１／５希釈になるように７〜８ｍｌの培地を加えても良い。アリコーティングの工程では、新しい培養皿に、望まれる全ての分割比に細胞をアリコートし、培地を添加することができる。
【００６３】
本発明の特殊な実施形態として、次のような工程を含む方法が挙げられる：最初に、胚様体（ＥＢｓ）を形成させるため非接着方法で浮遊させて成長させる。次に、ゼラチンコートされた組織培養プレート上に接着細胞として播種する前に、５〜１０日目のＥＢをトリプシン処理する。
【００６４】
細胞培養の維持
分解した細胞を播種し、培養細胞として維持する。
【００６５】
細胞は、培養容器またはゼラチン化されたプレートのような基質の上に播種することができる。重要なことに、細胞は、共培養せずに（例えば、フィーダー細胞の非存在下で）成長し増殖する。
【００６６】
細胞培養中の細胞は、繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）のような増殖因子を１または複数追加し、任意で、例えば５ｎｇ／ｍｌの血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ ＡＢ）を追加した非血清培地中で増殖する。細胞培養中の細胞は、トリプシン処理、洗浄、再播種を行うことにより、コンフルエント状態の時に分割比１：４で播種し継代することが好ましい。
【００６７】
非共培養
本発明の特に好ましい実施形態では、非共培養で細胞を培養することを含む方法が挙げられる。「共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）」という用語は、例えば間質のフィーダー細胞のように、２種またはそれより多い種類の細胞の混合物が共に増殖することを意味する。
【００６８】
このように、典型的なＥＳ細胞培養においては、培養皿の内側の表面は通常、分裂しないように処理されたマウス胚性皮膚細胞のフィーダー層で覆われている。フィーダー層はＥＳ細胞が接着し増殖するための接着表面を提供する。それに加えて、フィーダー細胞は、ＥＳ細胞が増殖するのに必要な栄養を培養液中に放出する。本書に記載の方法および組成物において、ＥＳおよびＭＳＣ細胞はそのような共培養を行わずに培養される。
【００６９】
好ましくは、当該細胞は、単層またはフィーダー細胞の非存在下で培養される。本書に記載の方法の好ましい実施形態では、胚性幹細胞はフィーダー細胞の非存在下で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を樹立する。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態では、解離または分散した胚性幹細胞を培養基材上に直接播種する。培養基材は、ペトリ皿のような組織培養容器であってもよい。容器は前処理されていてもよい。本発明の好ましい実施態様では、ゼラチン化された組織培養プレート上に細胞を播種し、増殖させる。
【００７１】
培養皿をゼラチンコートするためのプロトコール例は次のとおりである。蒸留水中に０．１％ゼラチン溶液を作成し、加圧滅菌する。これを室温で貯蔵してもよい。組織培養皿の底面をゼラチン溶液で覆い、１５分間インキュベーションする。ゼラチンを除去し、プレートは使用できる状態になる。低張性の溶解を防ぐため、培地は細胞を加える前に添加すべきである。
【００７２】
無血清培地
解離または分散した胚性幹細胞は、無血清培地中で培養することが好ましい。
【００７３】
「無血清培地（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ）」という用語は、血清タンパク質（例えば、ウシ胎仔血清）を含まない細胞培養用培地を含んでいてもよい。無血清培地は当業者に公知であり、例えば、米国特許５６３１１５９や５６６１０３４に記載されている。無血清培地は、例えばＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から市販されている。
【００７４】
無血清培地は、タンパク質、加水分解物および未知の組成の成分を欠乏しているという点で、タンパク質を含まないものであってもよい。無血清培地は、全ての成分の化学構造が公知である、既知組成培地であってもよい。既知組成の無血清培地は、バラツキを除外し、再現性やより一致した性能を可能にする完全に定義済みのシステムであり、外来の試薬によるコンタミネーションの可能性を減らすため、好都合である。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態では、無血清培地はＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ培地 (Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York) を含む。
【００７６】
当該無血清培地は、１または複数の血清代替培地のような成分を、例えば、５％、１０％、１５％等の濃度で追加したものであってもよい。当該非血清培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ (Grand Island, New York) から市販されている１０％の血清代替培地を追加したものであることが好ましい。
【００７７】
細胞増殖因子
解離または分散した胚性幹細胞が培養される無血清培地は、１または複数の細胞増殖因子を含むことが好ましい。ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、ＮＧＦ、エリスロポエチン、ＴＧＦ-β、ＩＧＦ-ＩおよびＩＧＦ-ＩＩを含む多くの細胞増殖因子が当業者に周知である。
【００７８】
細胞増殖因子は、繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を含んでいてもよい。また、当該培地は、血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ ＡＢ）のようなその他の細胞増殖因子を含んでいても良い。これらの細胞増殖因子は共に当業者に周知である。本発明の特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＦＧＦ２およびＰＤＧＦ ＡＢの両方を含有する培地中で細胞を培養する方法を含む。
【００７９】
代替的または追加的に、当該培地は上皮細胞増殖因子を含有するものであってもよい。ＥＧＦの使用は、ＭＳＣｓの成長を増長させ得る。ＥＧＦは、適当な濃度であればどのような濃度で使用してもよく（例えば５〜１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ）。ＥＧＦはＰＤＧＦの代わりに使用されてもよい。ＥＧＦは、当業者に良く知られたタンパク質であり、symbol EGF, Alt. Symbols URG, Entrez 1950, HUGO 3229, OMIM 131530, RefSeq NM_001963, UniProt P01133と称されている。
【００８０】
このように、本発明者らは、（ｉ）ＦＧＦ２、（ｉｉ）ＦＧＦ２およびＰＤＧＦ、（ｉｉｉ）ＦＧＦ２およびＰＤＧＦおよびその他の細胞増殖因子の組合せ、を含有する培地の使用を開示する。
【００８１】
ＦＧＦ２は、多くの組織、細胞種では低レベルで発現しており、脳および下垂体では高濃度に存在している、広帯域なマイトジェン因子、血管新生因子、神経栄養因子である。ＦＧＦ２は、四肢発生、血管新生、創傷治癒および腫瘍形成を含む多数の生理的および病理的なプロセスに関与している。ＦＧＦ２は、例えば、Invitrogen-Gibco (Grand Island, New York) から商業的に入手できる。
【００８２】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、繊維芽細胞、平滑筋、結合組織を含む幅広い細胞種に対して強力なマイトジェン作用を持つ。Ａ鎖およびＢ鎖と呼ばれる２本鎖の２量体からなるＰＤＧＦは、ＡＡもしくはＢＢホモ２量体またはＡＢヘテロ２量体として存在し得る。ヒトＰＤＧＦ-ＡＢは、１３．３ｋＤａのＡ鎖と１２．２ｋＤａのＢ鎖からなる２５．５ｋＤａのホモ２量体である。ＰＤＧＦは、例えば、Peprotech (Rocky Hill, New Jersey) から商業的に入手できる。
【００８３】
細胞増殖因子（好ましくはＦＧＦ２および任意でＰＤＧＦ ＡＢ）は、約１００ｐｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在することが好ましく、約５００ｐｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在することが好ましく、約１ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在することが好ましく、約２ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在することが好ましく、約３ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在することが好ましく、約４ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在することが好ましく、約５ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在することが最も好ましい。本発明の実施形態では、培地は約５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する。また、培地は約５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ ＡＢを含有することが好ましい。
【００８４】
細胞の分割
培養における細胞は通常、接触阻止（コンタクトインヒビション）により細胞分裂および細胞増殖が停止するコンフルエンス状態に達するまで増殖し続ける。その後、そのような細胞は、基材またはフラスコから解離し、組織培養培地に希釈し、再播種することにより継代培養「分割（ｓｐｌｉｔ）」する。
【００８５】
それゆえ、本書に記載される本発明の方法および構成は、培養のあいだの継代または分割を含む。細胞は、分割比１：２またはそれ以上で分割されることが好ましく、分割比１：３で分割されることが好ましく、分割比１：４、１：５またはそれ以上で分割されることがより好ましい。「継代（ｐａｓｓａｇｅ）」という用語は、セルライン（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）のコンフルエントな培養物のアリコートを取り、新しい培地に入れ、細胞がコンフルエンスまたは飽和状態に達するまで培養すること、からなるプロセスを指す。
【００８６】
選択（セレクション）、選抜（スクリーニング）または分類（ソーティング）の工程
本発明の特に好ましい実施形態によれば、本発明の方法はさらに間葉系幹細胞を分離または選択するための選択（セレクション）と分類（ソーティング）の工程を含む。
【００８７】
選択（セレクション）または分類（ソーティング）の工程は、１または複数の細胞表面抗原マーカーを用いることにより、細胞培養物から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を選別することを含んでいてもよい。選択（セレクション）または分類（ソーティング）の工程は、ＭＳＣｓに対する選別および分類（ソーティング）特異性の厳密さを増長させ、さらに、ｈＥＳＣｓやその他の出発物質由来のｈＥＳＣ誘導物のような胚性幹細胞による潜在的なコンタミネーションの可能性を減少させる。そしてこのことは、テラトーマ形成の危険性をさらに減少させ、本発明者らによるプロトコールの臨床的関連性をさらに増長させるものである。
【００８８】
抗原発現に基づく選択（セレクション）または分類（ソーティング）については多くの方法が知られており、本書で記載する選択（セレクション）または分類（ソーティング）の工程においてこれらのいかなる方法を用いてもよい。本発明における特に好ましい実施形態では、選択（セレクション）または分類（ソーティング）は、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）により行われる。ＦＡＣＳは、細胞に発現する抗原に結合して標識する標識抗体のようなレポーターに細胞をさらすことを伴うことは、当業者に周知である。レポーターを形成するための抗体作成とその標識方法は当業者に周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅに記載されている。それから、ＦＡＣＳ装置に細胞を通過させ、標識に基づいて各々の細胞を分類（ソート）する。代替的または追加的に、細胞を分類（ソート）するのに、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を使用してもよい。
【００８９】
本発明者らは、多くの細胞表面抗原候補（例えば、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＡＮＰＥＰ、ＩＴＧＡ４（ＣＤ４９ｄ）、ＰＤＧＦＲＡ）がＭＳＣｓと関連することが知られている一方で、いくつかのＭＳＣｓ関連細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２９およびＣＤ４９ｅ）はまた、ｈＥＳＣｓのようなＥＳ細胞でも高発現していることを発見し、それらの発現をＦＡＣＳ解析で検証した。細胞表面抗原とＭＳＣｓとの関連は、ＭＳＣｓをｈＥＳＣｓのようなＥＳ細胞から分離するための選択マーカーとしてその抗原が適格であるとみなすには十分ではない。つまり、選択（セレクション）または分類（ソーティング）の工程では、ＭＳＣｓとＥＳ細胞との間で発現の異なる抗原を使用することが好ましい。
【００９０】
本発明の方法の選択（セレクション）または分類（ソーティング）工程は、抗原の発現に基づいて間葉系幹細胞を陽性選択することができる。そのような抗原は、例えば、実施例に記載するように、ｈＥＳＣｓおよびｈＥＳＣＭＳＣｓの遺伝子発現プロファイルを比較することにより同定することができる。本発明の実施形態では、特に下記の表Ｅ１Ａおよび表Ｅ１Ｂに示される抗原を選択（セレクション）または分類（ソーティング）に使用することができる。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法の選択（セレクション）または分類（ソーティング）工程は、ＭＳＣｓ上で発現しておりｈＥＳＣｓのようなＥＳ細胞上で発現していないことが確認された抗原の発現に基づいて間葉系幹細胞を陽性選択することができる。
【００９２】
実施例に示されるように、本発明者らは、ＣＤ７３がＭＳＣｓ上に高発現しており3、その一方でｈＥＳＣｓ上では高発現していないことを実証した（図４Ａ）。さらに、実施例に示すように、ＣＤ７３およびＣＤ１０５はＭＳＣｓで高発現している細胞表面抗原であり、ｈＥＳＣと比べてｈＥＳＣ−ＭＳＣｓで高発現している細胞表面抗原の上位２０の中に入るため（図３、表）、ＣＤ７３またはＣＤ１０５（またはその両方）の推定ＭＳＣｓの選択マーカーとしての使用は、ｈＥＳＣｓの分化により生成した推定ＭＳＣｓを選別するのに効果的である。
【００９３】
代替的または追加的に、選択（セレクション）または分類（ソーティング）の工程は、ｈＥＳＣｓのような胚性幹細胞（ＥＳ細胞）上で高発現し、間葉系幹細胞（例えば、ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）では高発現していない細胞表面抗原に基づく抗原に対する陰性選択により行ってもよい。選択または選別は、従来から知られ同定されている、ＭＩＢＰ、ＩＴＧＢ１ＢＰ３およびＰＯＤＸＬ22、およびＣＤ２４のようなｈＥＳＣｓ特有の細胞表面抗原に基づいて行ってもよい。
【００９４】
実施例では、ＦＡＣＳ解析により、ＣＤ２４の発現がｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ上にはなく、ｈＥＳＣ上にあることを確認したことを示している。
それゆえ、ＣＤ２４は陰性選択（セレクション）または分類（ソーティング）マーカーとして、それ自身で、または、ｈＥＳＣ培養物から分化した推定ＭＳＣｓを分離する陽性選択マーカーとしてのＣＤ１０５と組み合わせて、使用することができる。
【００９５】
重要なことに、間葉系幹細胞は、形質転換せずに自己複製を維持することができる。したがって、例えば、腫瘍細胞や腫瘍細胞のセルラインのような不死化された細胞との融合、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＢＶまたはＨＴＬＶ−１のような形質転換ウイルスによるセルラインのウイルス感染、ラージＴ抗原の配列を含むＳＶ４０ベクターのような特別に適応させたベクターによるトランスフェクション (R. D. Berry et al., Br. J. Cancer, 57, 287-289, 1988)、テロメラーゼ (Bodnar-A-G. et.al., Science (1998) 279: p. 349-52) 、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡ配列を含むベクター（米国特許第５，３７６，５４２）、優性の癌遺伝子の導入、として知られている形質転換処理は、間葉系幹細胞を作製するための本発明の方法では必要ない。
【００９６】
本発明の好ましい実施形態では、間葉系幹細胞およびセルライン（またはそれらに由来する分化した細胞）は、胚性幹細胞の１または複数の特性を示さない。そのような特性は、ＯＣＴ４遺伝子の発現およびアルカリフォスファターゼ活性を含むことが好ましい。また、間葉系幹細胞は、１または複数の多能性マーカーの発現の低減を示すことが好ましい。多能性マーカーは、後に詳細に記載するが、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２ およびＵｔｆ１を含むものである。
【００９７】
本発明の方法により作製される間葉系幹細胞は、非腫瘍形成性のものであることが好ましい。親の胚性幹細胞の移植が腫瘍を形成することと比較して、間葉系幹細胞は、免疫不全の宿主動物に移植された時に、腫瘍にならないことが好ましい。免疫不全の宿主動物は、ＳＣＩＤマウスまたはＲａｇ１−／−マウスであることが好ましい。間葉系幹細胞は、移植の長期間後、好ましくは２週間以上、より好ましくは２ヶ月以上、もっとも好ましくは９ヶ月以上、腫瘍を形成しないことが好ましい。発癌性試験の詳細なプロトコールは実施例に記載する。
【００９８】
本発明の方法により作製される間葉系幹細胞はまた、１または複数の次の特性を示すことが好ましい。当該細胞は、染色体数により評価されるカリオタイプ（核型）が十分に安定であり、好ましくは、細胞培養で維持された場合に少なくとも１０代は安定であること。当該細胞はまた、好ましくは、何世代にもわたって十分に安定な遺伝子発現パターンを示すこと。このことは、１または複数の、好ましくは実質的に全部の、選択された一連の遺伝子発現レベルが、ある代とその次の代の間葉系幹細胞の間で著しくは変化しないことを意味する。
【００９９】
当該一連の遺伝子は、次の１または複数、一部または全てを含むことが好ましい。cerberus (GenBank Accession nos: NM_009887, AF031896, AF035579), FABP (GenBank Accession nos: NM_007980, M65034, AY523818, AY523819), Foxa2 (GenBank Accession nos: NM_010446, X74937, L10409), Gata-1 (GenBank Accession nos: NM_008089, X15763, BC052653), Gata-4 (GenBank Accession nos: NM_008092, AF179424, U85046, M98339, AB075549), Hesx1 (GenBank Accession nos: NM_010420, X80040, U40720, AK082831), HNF4a (GenBank Accession nos: NM_008261, D29015, BC039220), c-kit (GenBank Accession nos: NM_021099, Y00864, AY536430, BC075716, AK047010, BC026713, BC052457, AK046795), PDGFRα (NM_011058, M57683, M84607, BC053036), Oct4 (GenBank Accession nos: NM_013633, X52437, M34381, BC068268), Runx1 (GenBank Accession nos: NM_009821, D26532, BC069929, AK051758), Sox17 (GenBank Accession nos: NM_011441, D49474, L29085, AK004781), Sox2 (GenBank Accession nos: NM_011443, U31967, AB108673), Brachyury (NM_009309, X51683), TDGF1 (GenBank Accession nos: NM_011562, M87321) および Tie-2 (GenBank Accession nos: NM_013690, X67553, X71426, D13738, BC050824)。
【０１００】
本発明の方法により、間葉系幹細胞の作製と同様に、間葉系幹細胞のクローンの子孫を含む分化した細胞を作製することも可能である。「クローンの子孫（ｃｌｏｎａｌ ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）」という用語は、いかなる形質転換処理または遺伝的な改変をも受けていない細胞の子孫であることを意味する。そのような、実質的に遺伝的に変化していないクローンの子孫は、親細胞または祖先の細胞、好ましくは胚性幹細胞（低下した能力を保っている）と遺伝的に同一である。また、「間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」という用語は、間葉系幹細胞由来のセルライン、すなわち間葉系幹細胞セルラインおよびそれから派生したものを含めたものに用いられることが好ましい。
【０１０１】
前駆細胞の誘導
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法は、間葉系幹細胞を選別または選抜するためのさらなる工程を用いてもよい。
【０１０２】
前記さらなる工程とは、上記に記載した工程の前、工程の間、または工程の後に行うことができる。当該さらなる工程は、実際には独立して行われてもよく、具体的には、ＥＳ細胞から、１または複数の前駆細胞またはセルラインを誘導することを含んでいてもよい。
【０１０３】
それゆえ本発明者らは、間葉系幹細胞の誘導の別法を開示する。当該方法は、（ａ）胚性幹（ＥＳ）細胞を準備すること、（ｂ）胚性幹細胞から、その自己再生能力に基づいて選択される前駆細胞セルラインを樹立すること、の工程を含む。
【０１０４】
しかしながら、本方法は、一緒に行われることが好ましい。例えば、本発明者らの方法は、分散または増殖させる工程の前、あいだ、または後に、胚性幹細胞から前駆細胞または前駆細胞セルラインを誘導することを含んでいてもよい。本方法は、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーを分散させることにより得られる細胞またはそれらの子孫の細胞を準備することにより間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を取得すること、ＥＳ細胞から１または複数の前駆細胞または前駆細胞セルラインを誘導し、その細胞を共培養せずにＦＧＦ２含有無血清培地中で増殖させること、を含んでいてもよい。
【０１０５】
前駆細胞セルラインは、その自己複製能力に基づいて選択する方法、または、体細胞が自己複製できないことに基づいてその対照物を選択する方法、または、その両方を用いて選択することが好ましい。
【０１０６】
本発明の好ましい実施形態では、前駆細胞セルラインは、共培養せずに、好ましくはフィーダー細胞の非存在下で、誘導または樹立される。胚性幹細胞の対照物は、共培養せずに選択することが好ましい。
【０１０７】
本発明の好ましい実施形態では、前駆細胞セルラインは、形質転換なしに樹立される。前駆細胞セルラインは、胚性幹細胞またはその子孫細胞を、推定前駆細胞の自己複製を促進させる条件下にさらすことにより樹立してもよい。自己複製促進条件は、胚性幹細胞の増殖を抑えることが好ましい。
【０１０８】
自己複製促進条件は、富栄養培地（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉａ）中での増殖性を含んでいてもよい。自己複製促進条件は、ＬＩＦの非存在下で細胞を成長させることを含むことがより好ましい。自己複製促進条件は、連続継代を含むことが好ましい。自己複製促進条件は、少なくとも１２代の連続継代を含むことが好ましい。
【０１０９】
本発明の好ましい実施形態では、前駆細胞セルラインは、胚性幹細胞と比較して能力が低減している。前駆細胞セルラインは、系列制限され、多能性を持たないことが好ましい。前駆細胞セルラインは発癌性がないことが好ましい。
【０１１０】
前駆細胞セルラインを誘導する工程は、胚性幹細胞を特殊な系列への分化を促進させる条件にさらす工程を含むことが好ましい。分化を促進させる条件は、胚性幹細胞から胚様体を作出することを含むことが好ましい。当該細胞は、全能性を失った後、分化を促進させる条件下から除かれることが好ましい。
【０１１１】
当該細胞を系列制限促進の条件下から除くことは、胚様体を分散させることを含むことが好ましい。当該方法は、約３〜６日間成長した胚様体を分散させることを含むことが好ましい。
【０１１２】
本発明の好ましい実施形態では、前駆細胞セルラインは、ＯＣＴ４遺伝子およびアルカリフォスファターゼ活性のどちらかまたは両方の発現が低下するか、もしくはほぼ発現しない。
【０１１３】
前駆細胞セルラインは、それらが由来する胚性幹細胞と比較すると、全能性マーカーの発現が低下することが好ましい。全能性マーカーは、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２およびＵｔｆ１からなるグループから選択されることが好ましい。
【０１１４】
本発明の好ましい実施形態では、前駆細胞セルラインは、次に示す特性のうち、１または複数の特性を示すことが好ましい。（ａ）細胞培養において４０代以上維持できる、（ｂ）細胞培養において少なくとも１０代以上維持した時に、カリオタイプ（核型）または染色体数が十分に安定である、（ｃ）何世代にもわたって、十分に安定した遺伝子発現パターンを示す。
【０１１５】
前駆細胞セルラインは、動物（好ましくは免疫不全動物）に移植された時に、テラトーマをほとんど誘導しないことが好ましく、好ましくは３週間後、より好ましくは２〜９ヶ月後にテラトーマをほとんど誘導しないことが好ましい。
【０１１６】
胚性幹細胞または前駆細胞セルラインは哺乳動物であることが好ましく、マウスまたはヒトの胚性幹細胞または前駆細胞セルラインであることが好ましい。
【０１１７】
当該前駆細胞は、血管内皮前駆細胞セルライン（好ましくはＥ−ＲｏＳＨセルライン）であることが好ましい。代替的または追加的に、当該前駆細胞セルラインは、間葉系前駆細胞セルライン（好ましくはｈｕＥＳ９．Ｅ１セルライン）を含んでいてもよい。
【０１１８】
本発明のある実施形態では、本方法はさらに（ｄ）前駆細胞セルラインから分化した細胞を誘導すること、の工程を含む。
【０１１９】
前駆細胞セルラインは、分化の前に少なくとも５代の間、増殖させることが好ましい。
【０１２０】
本発明者らは、（ａ）胚性幹（ＥＳ）細胞から前駆細胞セルラインを誘導すること、（ｂ）前駆細胞セルラインを増殖させること、（ｃ）前駆細胞セルラインから分化した細胞を誘導すること、の方法を含む胚性幹（ＥＳ）細胞から分化した細胞を作出する方法を提供する。
【０１２１】
当該方法は、（ａ）胚性幹（ＥＳ）細胞を準備すること、（ｂ）胚性幹細胞から前駆細胞を誘導すること、（ｃ）前駆細胞からその自己複製能力に基づいて選択される前駆細胞セルラインを樹立すること、を含む方法である。
【０１２２】
当該方法は、特に、胚性幹（ＥＳ）細胞から分化した細胞を作出するのに用いられてもよい。分化した細胞は、血管内皮細胞または間葉系細胞であることが好ましい。また、分化した細胞は、脂肪細胞または骨細胞であることがより好ましい。
【０１２３】
本発明者らは、本発明のいかなる前記状況による方法で作製される前駆細胞セルラインをも提供する。
【０１２４】
本書で記載される当該方法および構成は、選択（セレクション）、選抜（スクリーニング）またはその両方のための、ＭＳＣｓのその他の要因または特性を利用したさらなる工程をさらに含んでいてもよい。
【０１２５】
分化の傾向
本発明の好ましい実施形態では、胚性幹細胞由来の特定系列の前駆細胞セルラインを作出する方法は、所望の特定系列または関心ある系列へと向かう胚性幹細胞の分化へと方向づける第１の工程をさらに含むことが好ましい。また、本発明者らの方法は、推定前駆細胞の自己複製を促し、胚性幹細胞の増殖を抑える、第２の工程を含んでいてもよい。
【０１２６】
第１の工程は、関心ある特定系列の成長または増殖を促進させることを含んでいてもよい。細胞を関心ある系列への分化を促進する条件下に置くことで、異なる前駆細胞セルラインを作ることができる。例えば、胚性幹細胞を、細胞増殖因子または分化を促進もしくは可能にするリガンドのような低分子にさらしてもよい。
【０１２７】
このように、胚性幹細胞由来の特定系列の細胞株を樹立するための本発明の方法は、特定系列へと向かう胚性幹細胞の分化を促す工程を含むものであることが好ましい。分化促進の工程は、所定の時間行われることが好ましい。胚性幹細胞またはその子孫細胞は、一過的に分化を促進させる環境にさらされることが好ましい。
【０１２８】
分化を促すまたは方向づける方法は、作製したい前駆細胞の特定の細胞系列によって選択する。当業者であれば、様々な細胞に用いられる様々な方法を認識している。
【０１２９】
内胚葉前駆細胞
内胚葉系の組織へと向かう胚性幹細胞の分化傾向が望まれるところでは、例えば、胚様体が形成および分散されてもよい（後述参照）。分散された胚様体は、内胚葉性への分化を誘導する細胞増殖因子、薬剤、またはそれらの組合せにさらされてもよい。前記増殖因子および薬剤の例には、アクチビンＡ、ＦＧＦ４、デキサメタゾンおよびレチノイン酸を含む。
【０１３０】
造血前駆細胞および血管内皮前駆細胞
一方、造血または血管内皮細胞系列へと向かう胚性幹細胞の分化傾向が望まれるところでは、分散した胚様体は、血管内皮細胞への分化を誘導する細胞増殖因子、薬剤、またはそれらの組合せにさらされてもよい。前記増殖因子および薬剤の例には、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−３、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ＴＮＦαおよびラパマイシンを含む。
【０１３１】
心臓中胚葉および骨格筋芽細胞の前駆細胞
一方、心臓中胚葉または骨格筋芽細胞系列へと向かう胚性幹細胞の分化傾向が望まれるところでは、分散した胚様体は、心臓中胚葉または骨格筋芽細胞への分化を誘導する細胞増殖因子、薬剤、またはそれらの組合せにさらされてもよい。前記増殖因子および薬剤の例には、デキサメタゾン、ＰＰＡＲγのインヒビター（阻害剤）およびテストステロンまたはそのアナログを含む。
【０１３２】
第２の工程は、富栄養培地（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉａ）中に分化した細胞を播種することを含んでもよい。そのような実施形態において、継続的増殖は、クローン化され得る前駆細胞を選択的に増やすであろう。
【０１３３】
胚様体の形成
本発明のある実施形態では、分化促進工程は、胚性幹細胞からの胚様体の形成を含む。胚様体およびその作製方法は当業者に周知である。「胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）」という用語は、懸濁液中での胚性幹細胞の成長により作られる培養で見られる、スフェロイドコロニーを意味する。胚様体は、混合細胞種であり、特殊な細胞種が現れる分配およびタイミングは、胚の中に観察されるものに相当する。胚様体は、胚性幹細胞を半固形培地上に播種することにより作出されることが好ましく、Lim et al, Blood. 1997;90:1291-1299 に記載されるようにメチルセルロース培地により作出されることが好ましい。また胚様体は、３〜６日間培養したものが好ましい。
【０１３４】
前記実施形態では、胚様体は分散される。すなわち、系列制限を促進する条件を解除するために、例えば、コラゲナーゼまたはトリプシン処理によって、構成細胞を互いに分離する。
【０１３５】
本発明の好ましい実施形態における方法は、所望の特定系列に向いている推定の前駆細胞を選択する工程を含む。当該選択は、細胞の形態またはマーカーの発現に基づいて行うことができる。遺伝子発現プロファイリングまたは抗原プロファイリングもまた、所望の系列である特定の前駆細胞を選択するのに用いることができる。選択された、所望の特定系列に向いている推定前駆細胞は、その後培養し、さらなる選択工程を行ってもよい。
【０１３６】
本発明の好ましい実施形態では、分化促進工程は、推定前駆細胞の自己複製を促進させる条件および胚性幹細胞の増殖を抑える条件下に分化した細胞をさらすことに続いて行われる。前記条件は、共培養またはフィーダー細胞の非存在下での培養（前述参照）を含むことが好ましい。
【０１３７】
富栄養培地（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉａ）
代替的または追加的に、前記の条件は、富栄養培地中に播種することを含む。本書で用いられているように、「富栄養培地（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉａ）」は、栄養の豊富な培地を意味しようとするものである。前記培地は、関連細胞の成長に必要な必須栄養素を含有していることが好ましい。当該富栄養培地は、血清を含むことが好ましい。また、成長に必要なほぼすべての栄養素を含むことがより好ましい。また、当該富栄養培地は、関連細胞の成長を促し、支持するものであることが最も好ましい。本発明のより好ましい実施形態では、当該関連細胞は、前駆細胞または関係する推定の前駆細胞である。富栄養培地の例としては、４５００ｍｇ／ｍｌ Ｄ−グルコースのＤＭＥＭに、２０％ウシ胎仔血清、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミンおよびβ‐メルカプトエタノールを補完したものが挙げられる。
【０１３８】
本発明の好ましい実施形態では、前記富栄養培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）のような胚性幹細胞の成長を促進させる付加的な増殖調節因子またはホルモンを含まない。
【０１３９】
前記実施形態によれば、継続的増殖は、クローン化され得る前駆細胞を選択的に増やすであろう。
【０１４０】
長期培養
本発明の方法は、胚性幹細胞またはその子孫細胞を一世代以上培養することを含むものであることが好ましい。当該細胞は５代以上、１０代以上、１５代以上、２０代以上、２５代以上、３０代以上、４０代以上、４５代以上、５０代以上、１００代以上、２００代上、５００代以上または８００代以上培養されることが好ましい。特に、当該細胞株は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、２００、５００、あたはそれ以上の世代にわたって維持されてもよい。
【０１４１】
培養における細胞は通常、接触阻止（コンタクトインヒビション）により細胞分裂および細胞増殖が停止するコンフルエンス状態に達するまで増殖し続ける。それから、そのような細胞は、基材またはフラスコから解離し、組織培養培地に希釈し、再播種することにより継代培養「分割（ｓｐｌｉｔ）」する。それゆえ、前駆細胞は、培養中に継代されてもよく、分割比１：２またはそれ以上で分割されることが好ましく、分割比１：３で分割されることが好ましく、分割比１：４、１：５またはそれ以上で分割されることがより好ましい。「継代（ｐａｓｓａｇｅ）」という用語は、セルライン（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）のコンフルエントな培養物のアリコートを取り、新しい培地に入れ、細胞がコンフルエンスまたは飽和状態に達するまで培養すること、からなるプロセスを指す。
【０１４２】
しかしながら、本発明の方法により誘導された前駆細胞は、その自己複製能力に基づいて、多くの世代にわたって維持されてもよい。一方で、組織から直接誘導された「普通の」細胞（すなわち、形質転換されていない体細胞）は不死ではないことが従来から確立されている。言い換えれば、前記体細胞は培養中の寿命に制限がある（死ぬ運命にある）。そのような体細胞は、無期限に増殖し続けることはできず、最終的に、ある数の世代の後に増殖または分裂する能力を失う。「危機的局面（ｃｒｉｓｉｓ ｐｈａｓｅ）」を境にして、そのような細胞は約５０世代後に死んでしまう。したがって、体細胞は制限された回数のみ継代されてもよい。
【０１４３】
重要なことに、当該前駆細胞は、形質転換せずに自己複製を維持することができる。したがって、例えば、腫瘍細胞や腫瘍細胞のセルラインのような不死化された細胞との融合、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＢＶまたはＨＴＬＶ−１のような形質転換ウイルスによるセルラインのウイルス感染、ラージＴ抗原の配列を含むＳＶ４０ベクターのような特別に適応させたベクターによるトランスフェクション (R. D. Berry et al., Br. J. Cancer, 57, 287-289, 1988)、テロメラーゼ (Bodnar-A-G. et.al., Science (1998) 279: p. 349-52) 、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡ配列を含むベクター（米国特許第5,376,542）、優性の癌遺伝子の導入、として知られている形質転換処理は、前駆細胞を作製するための本発明の方法では必要ない。
【０１４４】
本発明の方法の好ましい実施形態によれば、前駆細胞は、形質転換せずに５０代以上増殖されてもよい。本発明の好ましい実施形態では、当該前駆細胞は、前駆細胞セルラインとして形質転換せずに、無限に増殖されてもよい。当該前駆細胞および前駆細胞セルラインは、その親の胚性幹細胞と比較して系列制限されていることが好ましい。特に、当該前駆細胞および前駆細胞セルラインは、三胚葉すべてを発生させることはできない。本発明のより好ましい実施形態では、当該前駆細胞セルラインは非全能性であることが好ましい。
【０１４５】
前駆細胞の特性
本発明の好ましい実施形態では、当該前駆細胞およびセルライン（またはそれらに由来する分化した細胞））は、胚性幹細胞の１または複数の特性を示さない。前記特性は、ＯＣＴ４遺伝子の発現およびアルカリフォスファターゼ活性を含むことが好ましい。また、当該前駆細胞セルラインは、１または複数の多能性マーカーの発現の低減を示すことが好ましい。多能性マーカーは、後に詳細に記載するが、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２およびＵｔｆ１を含むものである。
【０１４６】
本発明の方法により作製される前駆細胞は、非腫瘍形成性のものであることが好ましい。親の胚性幹細胞の移植が腫瘍を形成することと比較して、間葉系幹細胞は、免疫不全の宿主動物に移植された時に、腫瘍にならないことが好ましい。免疫不全の宿主動物は、ＳＣＩＤマウスまたはＲａｇ１−／−マウスであることが好ましい。間葉系幹細胞は、移植の長期間後、好ましくは２週間以上、より好ましくは２ヶ月以上、もっとも好ましくは９ヶ月以上、腫瘍を形成しないことが好ましい。発癌性試験の詳細なプロトコールは実施例に記載する。
【０１４７】
本発明の方法により作製される前駆細胞はまた、１または複数の次の特性を示すことが好ましい。当該細胞は、染色体数により評価されるカリオタイプ（核型）が十分に安定であり、好ましくは、細胞培養で維持された場合に少なくとも１０代は安定であること。当該細胞はまた、好ましくは、何世代にもわたって十分に安定な遺伝子発現パターンを示すこと。このことは、１または複数の、好ましくは実質的に全部の、選択された一連の遺伝子発現レベルが、ある代とその次の代の前駆細胞の間で著しくは変化しないことを意味する。
【０１４８】
当該一連の遺伝子は、次の１または複数、一部または全てを含むことが好ましい：cerberus (GenBank Accession nos: NM_009887, AF031896, AF035579), FABP (GenBank Accession nos: NM_007980, M65034, AY523818, AY523819), Foxa2 (GenBank Accession nos: NM_010446, X74937, L10409), Gata-1 (GenBank Accession nos: NM_008089, X15763, BC052653), Gata-4 (GenBank Accession nos: NM_008092, AF179424, U85046, M98339, AB075549), Hesx1 (GenBank Accession nos: NM_010420, X80040, U40720, AK082831), HNF4a (GenBank Accession nos: NM_008261, D29015, BC039220), c-kit (GenBank Accession nos: NM_021099, Y00864, AY536430, BC075716, AK047010, BC026713, BC052457, AK046795), PDGFRα (NM_011058, M57683, M84607, BC053036), Oct4 (GenBank Accession nos: NM_013633, X52437, M34381, BC068268), Runx1 (GenBank Accession nos: NM_009821, D26532, BC069929, AK051758), Sox17 (GenBank Accession nos: NM_011441, D49474, L29085, AK004781), Sox2 (GenBank Accession nos: NM_011443, U31967, AB108673), Brachyury (NM_009309, X51683), TDGF1 (GenBank Accession nos: NM_011562, M87321) および Tie-2 (GenBank Accession nos: NM_013690, X67553, X71426, D13738, BC050824)。
【０１４９】
本発明の方法により、前駆細胞および前駆細胞セルラインの作製と同様に、前駆細胞のクローンの子孫を含む分化した細胞を作製することも可能である。「クローンの子孫（ｃｌｏｎａｌ ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）」という用語は、どのような形質転換処理または遺伝的な改変も受けていない細胞の子孫であることを意味する。そのような、実質的に遺伝的に変化していないクローンの子孫は、親細胞または祖先の細胞、好ましくは胚性幹細胞（低下した能力を保っている）と遺伝的に同一である。また、「前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）」という用語は、前駆細胞由来のセルライン、すなわち前駆細胞セルラインおよびそれから派生したものを含めたものに用いられることが好ましい。
【０１５０】
自己複製および分化の調節
本発明者らの方法は、自己複製または分化の推定調節因子を同定するのに使用されてもよい。本方法は、候補分子の存在下および非存在下で前駆細胞セルラインまたは分化した細胞を産出するための方法を実施すること、および、そのプロセスで当該分子がいかなる効果をもたらすかを同定すること、に関与する。例えば、前駆細胞または分化した細胞の産生を進展させる分子は分化の正の調節因子として（またはその代わりに自己複製の阻害因子として）用いることができる。反対に、そのプロセスを遅らせる分子は、分化の阻害因子または自己複製のプロモーターであると考えられる。
【０１５１】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明者らはまた、本発明の方法により得られる選択された系統の細胞（好ましくは前駆細胞）を提供する。これまで、前駆細胞の調製物は、選択したどの細胞が前駆細胞であるかの確実性という点で不純すぎるものであった。ほぼ１００％純粋な前駆細胞の調製物が可能な本発明の培養によれば、単一前駆細胞の単離が達成される。
【０１５２】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らはさらに、その大多数の細胞が選択された系列の前駆細胞である、多能性の細胞を含む組成物を提供する。当該細胞の少なくとも６０％が選択された系列の前駆細胞であることが好ましい。また、当該細胞の少なくとも６０％が前駆細胞であることがより好ましい。加えて、本発明は、単離された前駆細胞を提供する。セルライン（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）という用語は、培養中に維持されて増殖することができ、不死化または無限の寿命を示すものを意味することが好ましい。
【０１５３】
本発明は、ＵＳ ６０／６０９，２１６に記載されているように、分化を促進させるｍＴＯＲの活性を減少させることと組み合わせてもよい。
【０１５４】
前駆細胞の使用
本発明者らの方法は、様々な種類の前駆細胞およびセルラインを産生することができる。
【０１５５】
例えば、本発明者らは、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）、神経前駆細胞、造血前駆細胞、骨髄前駆細胞、血管内皮前駆細胞、骨髄間質細胞、骨格筋前駆細胞、膵島前駆細胞、間葉系前駆細胞、心臓中胚葉幹細胞、肺上皮前駆細胞、肝前駆細胞および内胚葉前駆細胞を作出する方法を開示する。
【０１５６】
本発明の方法により作製される前駆細胞は、様々な商業的に重要な研究、試薬および治療の目的で使用することができる。これらの使用は、通常、当業者に周知であるが、ここで簡単に記載する。
【０１５７】
例えば、幹細胞は、再生医療のための前駆細胞群を作出するのに用いてもよい。前駆細胞は、生体外での拡張、または、患者への直接投与によって作製されてもよい。当該細胞は、外傷による損傷組織を再構成するものとして用いることもできる。
【０１５８】
したがって、造血前駆細胞は骨髄置換として用いることができ、心臓の前駆細胞は、心不全の患者に用いることができる。皮膚の前駆細胞は、患者への植皮、および、ステントまたは人工心臓のような人工装具の内皮化のための血管内皮前駆細胞を成長させるために使用することができる。
【０１５９】
胚性幹細胞およびその組織幹細胞への誘導細胞は、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病等、退行性の疾病に向いた前駆細胞のソースとして用いてもよい。幹細胞は、例えば、癌の免疫治療に用いるナチュラルキラー細胞または樹状細胞の前駆体のソースとして用いることもできる。当該前駆体は、本発明の方法により作製することができる。
【０１６０】
本発明の方法および組成物により、前駆細胞を作製することができる。当該細胞は、当業者に周知の方法により分化させて作製したものであってもよい。したがって、分化した細胞のいかなる使用であっても、そのソースであるそれらの前駆細胞と同様である。
【０１６１】
本発明の方法および組成物により産生される前駆細胞は、医薬組成物の調製や疾病の治療のために用いてもよい。前記の疾病は、心不全、骨髄疾患、皮膚病、火傷ならびに糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病および癌のような退行性の疾病の治療を含む再生医療により治療できる疾病を含んでいてもよい。
【０１６２】
そのため、本発明者らは、（ａ）胚性幹（ＥＳ）細胞を提供すること、（ｂ）胚性幹細胞から、その自己複製能力に基づいて選択される前駆細胞セルラインを樹立すること、（ｄ）任意で、当該前駆細胞セルラインから分化した細胞を誘導すること、（ｅ）当該細胞株または分化した細胞を患者に投与すること、を含む疾病の治療方法を記載する。
【０１６３】
取得した間葉系幹細胞の特性
本発明の方法および組成物により取得したＭＳＣｓは、通常、ＭＳＣｓを同定するのに用いられるものとして当業者に周知であるような、形態学的、表現型および機能的な基準9を満たすことが好ましい。参照しやすいように、本発明の方法および組成物により取得した間葉系幹細胞（特に、ヒト胚性幹細胞を由来とするもの）は、「ｈＥＳＣ−ＭＳＣ」と呼ぶことができる。
【０１６４】
したがって、本発明の方法および組成物により取得されるＭＳＣは、間葉系幹細胞の１または複数の形態学的特性を示すことが好ましい。例えば、取得したＭＳＣｓは、繊維芽細胞様の表現型を伴った接着性の単層を形成してもよい。
【０１６５】
さらに、取得したＭＳＣｓは、間葉系幹細胞に類似または一致した細胞表面抗原プロファイルを示すことが好ましい。そのため、取得したＭＳＣｓの細胞表面抗原プロファイルは、ＣＤ２９陽性、ＣＤ４４陽性、ＣＤ４９ａおよびｅ陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１６６陽性、および、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性9-11、の１または複数、好ましくはすべてを含んでいてもよい。
【０１６６】
取得したＭＳＣｓは、当業者に周知および後述の方法を用いて、いかなる間葉系の系列に分化させてもよい。したがって、本発明の方法および組成物により取得したＭＳＣｓは、脂質形成、軟骨形成、骨形成を含む様々な可能性を示す9。
【０１６７】
記載されたように取得された間葉系幹細胞（例えば、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）は、インビトロにおいて十分な増殖能を持つことができる。ある実施形態では、取得した間葉系幹細胞は、通常の２倍体のカリオタイプ（核型）を維持している間、少なくとも１０回の細胞集団倍加を経ている。しかしながら、当該ＭＳＣｓは、通常の２倍体のカリオタイプ（核型）を維持している間、少なくとも２０〜３０の細胞集団倍加を経ることができる。本発明の好ましい実施形態では、この時間を通して、当該ＭＳＣｓは、安定な遺伝子発現および細胞表面抗原プロファイルを示す。
【０１６８】
取得したＭＳＣｓは、染色体異常および／または遺伝子発現の改変のような欠陥を示さないことが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、前記欠陥は、継代の１０代後、好ましくは１３代後、より好ましくは１５代後まで、明白にならない。
【０１６９】
均一性
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法により産生される間葉系幹細胞は、事実上、類似または同一（好ましくは均一）である。すなわち、本プロトコールにより単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）クローンは、表現型的またはその他の点において、お互いに高い類似性または同一性を示す。
【０１７０】
類似性または同一性は、多くの手法により評価され、１または複数の特性により測定することができる。本発明の好ましい実施形態では、当該クローンは、遺伝子発現において類似または同一である。本方法は、本方法により選択されるどれか２つまたは複数の間葉系幹細胞が、ほぼ同一または類似した遺伝子発現プロファイル（すなわち、遺伝子発現とその発現レベルの同一性の組合せ）を示すことが好ましい。単離された間葉系幹細胞のほぼすべてが、ほぼ同一または類似した遺伝子発現プロファイルを示すことが好ましい。
【０１７１】
遺伝子発現の均一性は、多くの手段により測定することができる。ゲノムワイドな遺伝子プロファイリングは、例えば、実施例で示すように、抽出したＲＮＡのアレイハイブリダイゼーションを用いて行う。全ＲＮＡを抽出し、関連ゲノムからの多能性の遺伝子配列を含むアレイチップにハイブリダイズするｃＤＮＡに変換してもよい。当該アレイは、遺伝子のバリデート、アノテート、キュレートがＮＣＢＩのスタッフおよびコラボレーターにより継続的に特徴付けられているＮＣＢＩ参照配列遺伝子を含むことが好ましい。
【０１７２】
それから、サンプル間の遺伝子発現は、解析ソフトを用いて比較する。本発明の好ましい実施形態では、遺伝子発現の類似性または同一性は、相関係数として現した。前記手法では、二つのサンプル間の高い相関係数は、二つのサンプル間の遺伝子発現パターンの類似性の高さを示している。逆に、二つのサンプル間の低い相関係数は、二つのサンプル間の遺伝子発現パターンの類似性の低さを示している。データ解析を行う前に、体系的な変化またはバイアス（強度的バイアス、空間的バイアス、プレートバイアスおよびバックグラウンドバイアスを含む）を除くために、補正（ノーマライゼーション）を行うとよい。
【０１７３】
相関試験は、当業者に周知であり、例えば、Hill, T. & Lewicki, P. (2006). Statistics: Methods and Applications. StatSoft, Tulsa, OK, ISBN: 1884233597 (also StatSoft, Inc. (2006). Electronic Statistics Textbook. Tulsa, OK: StatSoft. WEB: http://www.statsoft.com/textbook/stathome.html) に記載されているようなｔ−検定、Ｐｅａｒｓｏｎの検定を含む。参考文献として、Khojasteh et al., 2005, A stepwise framework for the normalization of array CGH data, BMC Bioinformatics 2005, 6:274 が挙げられる。クラス内相関係数は、Khojasteh et al, supra に記載されているように行ってもよい。
【０１７４】
本発明の好ましい実施形態では、Ｐｅａｒｓｏｎの検定は、Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数を生成するのに行う。相関係数１．０は、同一の遺伝子発現パターンであることを示す。
【０１７５】
本発明の好ましい実施形態では、ｃＤＮＡは、Ｓｅｎｔｒｉｘ ＨｕｍａｎＲｅｆ−８Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐにハイブリダイズし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＳｔａｔｉｏｎ ５００ｘを用いてスキャンを行う。データは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて抽出、補正（ノーマライズ）および解析されることが好ましい。しかしながら、遺伝子発現プロファイルの類似性をアッセイするのに、当該リーダーが、いかなる適したチップ、スキャニングハードウェアおよびソフトウェア（係数測定を出力する）を用いても良いことは明白である。
【０１７６】
好ましくは上記手段により測定される２つの単離物間の遺伝子発現相関係数は、０．６５以上であることが好ましく、０．７０以上であることが好ましく、０．８０以上であることが好ましく、０．８５以上であることが好ましく、０．９０以上であることがより好ましく、０．９５以上であることが最も好ましい。
【０１７７】
ある実施形態では、本発明の方法は、得られた間葉系幹細胞のどれか２つまたはそれ以上の単離物間での遺伝子発現相関係数が、１ヶ月のような期間を隔てて測定したときに、同等のＲＮＡサンプルの技術的複製物間での相関係数と同位またはわずかに小さい値である間葉系幹細胞を作出する。他の実施形態では、間葉系幹細胞のどれか２つまたはそれ以上の単離物間での遺伝子発現相関係数が、０．９０以上であり、好ましくは０．９５以上である。
【０１７８】
遺伝子発現相関係数は、上述した選択（セレクション）または分類（ソーティング）手段をうけた細胞間で前記範囲内にあることが好ましい。大多数の単離物間、好ましくはすべての単離物間の遺伝子発現係数が、前記範囲内にあることが好ましい。
【０１７９】
したがって、実施例で示されるように、相関係数は、取得した５つの間葉系幹細胞間で高い類似性を示し、４つの系列間の相関係数が０．９６で残りの１つが０．９０である。対照的に、１ヶ月を隔てて解析されるＲＮＡサンプルの技術的複製物間の相関係数は０．９７と０．９８の間にある。
【０１８０】
したがって、本発明者らは、互いにほぼ類似または同一（好ましくは均一）である間葉系幹細胞を作出する方法を提供する。当該単離物は、ほぼ同一の遺伝子発現プロファイルを示す。
【０１８１】
上述した「内部の」均一性（すなわち、本発明の方法によるＭＳＣｓの単離物間における均一性）と同様に、均一性は、前記単離物と、他の細胞または細胞種との間で評価されてもよい。特に、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣｓ）のような他の方法により誘導された間葉系幹細胞で比較してもよい。本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法および組成物により得られるＭＳＣｓは、ＢＭ−ＭＳＣに類似の、または均一の、または同一の遺伝子発現プロファイルを示す。したがって、当該取得したＭＳＣｓは、ＢＭ−ＭＳＣｓとの間で０．５以上、好ましくは０．６以上、好ましくは０．７以上の遺伝子発現相関係数を示してもよい。
【０１８２】
したがって、実施例で示すように、個別に誘導した３つのｈＥＳＣ−ＭＳＣ集団と、３つのＢＭ−ＭＳＣ集団のサンプル間における、遺伝子発現の一対比較は相関係数が０．７２に近いことがわかっている。
【０１８３】
間葉系幹細胞形成の調節因子
本発明者らの方法は、胚性幹細胞からの間葉系幹細胞形成の推定調節因子を同定するのに用いてもよい。
【０１８４】
当該方法は、候補分子の存在下および非存在下で間葉系幹細胞を産生するための本発明方法を実施すること、および、そのプロセスで当該分子がどのような効果をもたらすかを同定すること、を含むものである。例えば、間葉系幹細胞の産生を進展させる分子は分化の正の調節因子として用いることができる。反対に、そのプロセスを遅らせる分子は、間葉系幹細胞形成の阻害因子と考えられる。
【０１８５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らはまた、本発明の方法により得られる細胞（好ましくは間葉系幹細胞）を提供する。これまで、間葉系幹細胞の調製物は、不純すぎるもしくは実質的に、表現型的に、類似または同一ではない（例えば、遺伝子発現に関して）、または、共培養もしくは血清の存在下における方法により産生されるので臨床目的に適さないものであった。本発明の培養によれば、互いに類似または同一である（好ましくは均一である）ほぼ１００％純粋な間葉系幹細胞の調製物を生み出すことができる。
【０１８６】
加えて、本発明者らは、分化した細胞を産生するプロセス、ならびに、本書に記載される方法による間葉系幹細胞を取得することおよび当該間葉系幹細胞を分化させることを含む方法を記述する。例えば、脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞等に分化させる方法を提供する。さらに、そのような方法により得られる分化した細胞を提供する。前記間葉系幹細胞および分化した細胞から作製されるセルラインもまた提供する。セルライン（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）という用語は、培養中に維持および増殖し続けることができ、不死のまたは無期限の寿命を示すことが意味することが好ましい。
【０１８７】
本発明は、ＵＳ ６０／６０９，２１６に記載されているように、分化を促進させるｍＴＯＲの活性を減少させることと組み合わされてもよい。
【０１８８】
間葉系幹細胞馴化培地の使用
本発明の方法および組成物が、間葉系幹細胞からの馴化培地の産生を可能にすることは明白である。したがって、間葉系幹細胞のいかなる使用も、間葉系幹細胞からの馴化培地の産生と同様に伴うことになる。
【０１８９】
間葉系幹細胞ならびに、本発明の方法および本書に記載される組成物により作製される分化した細胞は、疾病の治療のための医薬組成物またはその調製に用いることができる。前記疾病は、心不全、骨髄疾患、皮膚病、火傷ならびに糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病および癌のような退行性の疾病を含む再生医療により治療できる疾病であってもよい。したがって、ＭＳＣｓ馴化培地は、前記疾病の治療に用いることができる。
【０１９０】
本発明の方法および組成物により作製されるような間葉系幹細胞馴化培地は、様々な商業的に重要な研究、試薬および治療の目的で使用することができる。
【０１９１】
当該間葉系幹細胞馴化培地は、特に、疾病の治療の医薬組成物の調製に用いることができる。前記疾病は、心不全、骨髄疾患、皮膚病、火傷ならびに糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病および癌のような退行性の疾病を含む再生医療により治療できる疾病であってもよい。
【０１９２】
実施例で示すように、本発明の方法および組成物により作製される間葉系幹細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣｓ）に類似または同一の性質を持つ。そのため、当該間葉系幹細胞およびこれらから作製されるいかなる分化した細胞も、それらに由来する馴化培地と同様に、いかなるＢＭ−ＭＳＣｓへの応用が知られているもの、または、応用が可能であるものに用いることができる。
【０１９３】
馴化培地の送達（デリバリー）
本書に記載される馴化培地は、いかなる適した手段によっても、ヒトまたは動物の体に送達（デリバリー）することができる。
【０１９４】
それゆえ、本発明者らは、本書に記載した馴化培地を、標的細胞、組織、臓器、動物体または人体に供給するための送達システム、および、馴化培地を標的に供給する送達システムの使用方法を記載する。
【０１９５】
当該送達システムは、馴化培地を含む容器のような、馴化培地のソースを含んでいてもよい。当該送達システムは、当該馴化培地を標的へと分配するディスペンサーを含んでもよい。
【０１９６】
したがって、本発明者らは、本書に記載する馴化培地のソースと共に、当該馴化培地を標的へと送達することが可能なディスペンサーを含む、馴化培地を送達するための送達システムを提供する。
【０１９７】
本発明者らはさらに、馴化培地を標的へと送達する方法における前記送達システムを使用するために提供する。
【０１９８】
流体を体内へと送達する送達システムは、当業者に周知であり、例えば、米国特許６，１３９，５２４に記載されているような注射、手術の点滴、カテーテル（かん流カテーテルを含む）、米国特許７，１２２，０１９に記載されているような薬物送達カテーテルを含むものである。
【０１９９】
肺または経鼻投与を含む鼻腔への送達は、例えば、鼻腔のスプレー、ｐｕｆｆｅｒ、吸入器等、当業者に周知の方法（例えば、米国意匠特許Ｄ５４４，９５７に示されるような）にてなされてもよい。
【０２００】
腎臓への送達は、米国特許７，２４１，２７３に記載されているような腎臓の大動脈内への送達カテーテルにてなされてもよい。
【０２０１】
最適な処置を行うために、必要量の馴化培地を、適切な間隔で送達する特殊な送達システムを設定すべきであることは、明白である。
【０２０２】
当該培地は、例えば、アテローム性動脈硬化症の治療または予防に用いることができる。ここで、当該馴化培地のかん流は、動脈硬化プラークを安定させるため、または、プラークの炎症を抑えるために、静脈内で行うことができる。当該馴化培地は、静脈内のかん流により、敗血性ショックの治療または予防に用いることもできる。
【０２０３】
当該馴化培地は、心疾患の治療または予防に用いることもできる。これは、リモデリングもしくは心疾患を遅らせるため、冠動脈内もしくは心筋内における馴化培地の常習的なかん流によりなされてもよい。当該馴化培地は、鼻腔内投与により、肺炎症の治療または予防に用いることもできる。
【０２０４】
当該馴化培地は、皮膚疾患（例えば、乾癬）の治療または予防に用いることもできる。馴化培地の長期の送達は、その状況が解決するまで、経皮的なマイクロインジェクション針を用いて行うことができる。
【０２０５】
当該送達方法が、当該馴化培地が送達される特定の組織によって決まり、当業者が、どの手段を用いるか決めることができるであろうことは、明白である。
【０２０６】
実施例で示すように、心臓の炎症の治療において、当該馴化培地は、胸壁を通した直接的な冠動脈内投与、または、心筋のような組織への直接注入もしくは体内の管腔に挿入されるステントもしくはカテーテルからの阻害剤の注入のための透視下での方法による標準的な経皮的カテーテルの使用により、例えば、心臓の組織（すなわち、心筋、心膜または心内膜）に送達することができる。
【０２０７】
冠動脈のカテーテルもしくはかん流のカテーテルのどのような種類であっても、化合物の投与に用いることができる。あるいは、当該馴化培地は、冠状血管に留置するステントに表覆もしくは浸透させることができる。
【０２０８】
組織再生
本発明の方法および組成物により作製される間葉系幹細胞および分化した細胞ならびにそれらに由来する馴化培地は、必要な患者に対して組織の再構成または再生のために用いることもできる。当該細胞は、所望の組織部位に移植でき、機能的に欠失した領域を再構成もしくは再生させる方法で投与される。
【０２０９】
例えば、本発明の方法および組成物は、幹細胞の分化を調節するのに用いることができる。間葉系幹細胞、分化した細胞、および、それらに由来する馴化培地は、植皮の増殖のためのような、組織工学に用いることができる。幹細胞の分化の調節は、人工臓器もしくは組織の生体工学またはステントのような人工装具に用いることができる。
【０２１０】
癌
本発明の方法および組成物により作製される間葉系幹細胞および分化した細胞ならびにそれらに由来する馴化培地は、癌の治療に用いることができる。
【０２１１】
「癌（ｃａｎｃｅｒ）」および「癌性の（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）」という用語は、無秩序な細胞増殖により典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的な状態を意味する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２１２】
前記癌のより特殊な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、グリア芽腫および神経線維腫のようなグリア細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰（部）癌、甲状腺癌、肝臓癌、様々な種類の頭頸部癌が含まれる。さらに、結腸癌、乳癌、肺癌および前立腺癌を含む固形癌、白血病を含む造血器悪性腫瘍、ホジキン病、再生不良性貧血および家族性大腸腺腫が挙げられる。さらに、脳新生物、結腸直腸新生物、乳房新生物、子宮頸部新生物、眼新生物、肝臓新生物、肺新生物、膵臓新生物、卵巣新生物、前立腺新生物、皮膚新生物、精巣新生物、骨新生物、絨毛性新生物、卵管新生物、腎臓新生物、結腸新生物、腎臓新生物、胃新生物および上皮小体新生物が挙げられる。乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、悪性黒色腫、白血病、卵巣癌、子宮頸癌および胆道癌もまた挙げられる。
【０２１３】
本発明の方法および組成物により作製される間葉系幹細胞および分化した細胞は、エンドスタチンおよびアンジオスタチンまたは細胞毒性薬または化学療法剤のような抗癌剤と組み合わせて用いてもよい。例えば、アドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチン、エトポシド、タキソール、タキソテールのような薬剤、ビンクリスチンのようなアルカロイド、および、メトトレキサートのような代謝拮抗剤が挙げられる。「細胞毒性薬（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）」という用語は、ここでは、細胞の機能を阻害または保護する物質および／または細胞の破壊を引き起こす物質を意味するものとして用いられる。当該用語は、放射線同位体（例えば、Ｉ、Ｙ、Ｐｒ）、化学療法剤、およびバクテリア、菌、植物もしくは動物起源、またはそれらの残留物の酵素的活性毒のような毒を含むものである。
【０２１４】
また、当該用語は、ＷＯ ９４／２２８６７に開示されている二環式アンサマイシン、ＥＰ６００８３２に開示されている１，２−ビス（アリルアミノ）安息香酸誘導体、ＥＰ６００８３１に開示されている６，７−ジアミノ−フタラジン−１、ＥＰ５１６５９８に開示されている４，５−ビス（アリルアミノ）−フタルイミド誘導体、または、チロシンキナーゼのＳＨ２を含む基質タンパク質への結合を阻害するペプチド、のような癌遺伝子産物／チロシンキナーゼ阻害物を含んでいる。「化学療法剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」とは、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ニコチンアミド、エスペラマイシン（米国特許４，６７５，１８７参照）、メルファランおよびその他の関連したナイトロジェンマスタード、および、内分泌療法（ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、タモキシフェン、ＬＨＲＨ拮抗薬、プロゲスチン、抗プロゲスチン等のような）が挙げられる。
【０２１５】
幹細胞
本書で用いるように、「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」という用語は、娘細胞が起源細胞と同一である（自己複製）またはその細胞がより特殊化した細胞種の前駆細胞である（分化）という２つ発生オプションの分裂局面にある細胞を意味する。それゆえ、幹細胞は、１または他の経路（各細胞種の１つが形成されるさらなる経路）を採用することができる。それゆえ、幹細胞は、最終分化しておらず、他の種の細胞を産生することができる細胞である。
【０２１６】
本書で意味する幹細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、多分化能幹細胞を含んでもよい。
【０２１７】
全能性幹細胞
「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、成体におけるいかなる細胞種、または、胚体外膜のいかなる細胞（例えば、胎盤）にもなることができる能力をもつ細胞を意味する。したがって、受精卵および卵割により作製される最初の４つの細胞が、唯一の全能細胞である。
【０２１８】
多能性幹細胞
「多能性（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」は、体内におけるいかなる分化した細胞をも作ることができる能力を持つ真の幹細胞である。しかしながら、それらの細胞は、栄養膜に由来する胚体外膜を作製することができない。これまでにいくつかの種類の多能性幹細胞が発見されている。
【０２１９】
胚性幹細胞
胚性幹（ＥＳ）細胞は、移植時に胚発生の段階にある胚盤胞の内細胞塊（ＩＣＭ）から単離することができる。
【０２２０】
胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、中絶された胎児における生殖腺への前駆体から単離することができる。
【０２２１】
胚性癌細胞
胚性癌（ＥＣ）細胞は、胎児の生殖腺で時折起こる奇形癌から単離することができる。はじめの２つと異なり、これらの細胞はたいてい異数性である。多能性幹細胞であるこれら３種の細胞種は全て、胚または胎児の組織から単離することができ、培養中に増殖することができる。これらの多能性細胞を分化しないようにする方法は当業者に周知である。
【０２２２】
成体幹細胞
成体幹細胞は、骨髄移植における活性成分である神経、皮膚および血液を形成する幹細胞を含む、幅広い種類の細胞を含むものである。これら後者の幹細胞種はまた、臍帯由来の幹細胞の主要な特性である。正確な数は選択された幹細胞の種類により制限されるが、成体幹細胞は、研究室および体内の両方で機能的により特殊化された細胞種へと成熟することができる。
【０２２３】
多能性幹細胞
多能性幹細胞は、限られた数の種類にのみ分化できる真の幹細胞である。例えば、骨髄は、血液の全ての細胞を生じさせることができるが、その他の種類の細胞は生じさせない多能性幹細胞を含んでいる。多能性幹細胞は、成体動物で見られる。体内の全ての臓器（脳や肝臓）がそれらの細胞を含み、その臓器で、死細胞または損傷を受けた細胞と置き換わることができると考えられている。
【０２２４】
幹細胞を特徴付ける方法は当業者に周知であり、クローナルアッセイ、フローサイトメトリー、長期培養および分子生物学的テクニック（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット）のような標準的なアッセイの手法の使用を含むものである。
【０２２５】
形態学的な差異に加えて、ヒトとマウスの多能性幹細胞は、多くの細胞表面抗原（幹細胞マーカー）の発現において異なっている。時期特異的胚抗原１および４（ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−４）ならびに、腫瘍拒絶抗原１−６０および１−８１（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）を含む幹細胞マーカーを同定する抗体は、例えば、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（Temecula, CA, USA）から市販されている。モノクローナル抗体を用いたこれらの抗原の免疫学的検出は、多能性幹細胞を特徴付けるために幅広く用いられている (Shamblott M.J. et. al. (1998) PNAS 95: 13726-13731; Schuldiner M. et. al. (2000). PNAS 97: 11307  11312; Thomson J.A. et. al. (1998). Science 282: 1145-1147; Reubinoff B.E. et. al. (2000). Nature Biotechnology 18: 399-404; Henderson J.K. et. al. (2002). Stem Cells 20: 329-337; Pera M. et. al. (2000). J. Cell Science 113: 5-10.)。
【０２２６】
幹細胞のソース
次の非限定的な例を含む様々な種類の幹細胞は、本発明の方法および組成物において、間葉系幹細胞および分化した細胞を作製するために用いることができる。
【０２２７】
米国特許５，８５１，８３２は、多分化能を持つ神経の幹細胞が脳組織から取得できることを報告している。米国特許５，７６６，９４８は、新生児の脳半球から神経芽細胞が作り出されることを報告している。米国特許５，６５４，１８３および５，８４９，５５３は、哺乳類の神経堤幹細胞の使用を報告している。米国特許６，０４０，１８０は、インビトロにおいて、哺乳類の多分化能ＣＮＳ幹細胞の培養物からの分化したニューロンの産出について報告している。ＷＯ ９８／５０５２６およびＷＯ ９９／０１１５９は、神経上皮性の幹細胞、オリゴデンドロサイト−アストロサイト前駆体および系列制限されたニューロンの前駆体の、産出および単離について報告している。米国特許５，９６８，８２９は、胚の前脳から取得し、グルコース、トランスフェリン、インシュリン、セレニウム、プロゲステロン、およびその他いくつかの増殖因子を含有する培地で培養した、神経幹細胞について報告している。
【０２２８】
初代肝細胞培養物は、ヒトの生検またはコラゲナーゼとヒアルロニダーゼの適切な組合せでのかん流により外科的に切り出された組織から取得することができる。あるいは、ＥＰ ０ ９５３ ６３３ Ａ１は、細分化したヒト肝臓組織を調製することによる肝細胞の単離、増殖培地中における濃縮した組織細胞の懸濁、当該細胞の培養での増殖について報告している。当該増殖培地は、グルコース、インシュリン、トランスフェリン、Ｔ３、ＦＣＳ、および、肝細胞を悪性形質転換なしに増殖させる様々な組織抽出物を含有する。肝臓中の当該細胞は、肝実質細胞、クッパー細胞、類洞内皮、胆管上皮、および、成熟した肝細胞もしくは胆管上皮細胞の両方に分化する能力を持つ前駆細胞（「肝芽細胞」もしくは「卵形細胞」と呼ばれる）を含む特殊化した細胞を含んでいると考えられる (L. E. Rogler, Am. J. Pathol. 150:591, 1997; M. Alison, Current Opin. Cell Biol. 10:710, 1998; Lazaro et al., Cancer Res. 58:514, 1998)。
【０２２９】
米国特許５，１９２，５５３は、ヒト新生児または胎児の造血幹細胞または造血前駆細胞を単離する方法を報告している。米国特許５，７１６，８２７は、Ｔｈｙ−１陽性の前駆体であるヒト造血細胞、および、インビトロにおいてそれら細胞を再生させる適切な増殖培地について報告している。米国特許５，６３５，３８７は、ヒト造血細胞およびそれらの前駆体を培養するための方法および装置について報告している。米国特許６，０１５，５５４は、ヒトリンパ系細胞および樹状細胞を再構築する方法を記載している。
【０２３０】
米国特許５，４８６，３５９は、１種類より多い結合組織の細胞（骨、軟骨、腱、靭帯および真皮のような）に分化することができるヒト間葉系幹細胞の均一な集団について報告している。それらの細胞は、骨髄または骨膜から取得されている。また、間葉系幹細胞の増殖に用いられる培養条件についても報告されている。ＷＯ ９９／０１１４５は、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦのような増殖因子で処理した個体の末梢血から単離したヒト間葉系幹細胞について報告している。ＷＯ ００／５３７９５は、脂肪由来の幹細胞、および、脂肪細胞と赤血球をほぼ含まない格子について報告している。報告によると、これらの細胞は、増殖することができ、ホルモンおよび馴化培地を産生するように培養できる。
【０２３１】
いかなる脊椎動物種の幹細胞であっても用いることができる。これには、ヒト、ヒト以外の霊長類、家畜、その他、げっ歯動物、マウス、ラット等のヒト以外の哺乳類の幹細胞を含む。
【０２３２】
本発明における使用に適した幹細胞は、妊娠後に形成された組織から誘導される胚盤胞のような霊長類の全能性幹（ｐＰＳ）細胞、または、妊娠の間のいかなる時期においてでも取得される胎児もしくは胚の組織である。例としては初代培養物や胚性幹細胞の樹立株が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２３３】
培地およびフィーダー細胞
全能性幹細胞を単離するおよび増殖させるための培地は、得られる当該細胞が所望の特性を持ち、さらに増殖できる限り、いくつかの異なる調製法により作ることができる。
【０２３４】
適したソースは次のようなものである：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７５２２；ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９。典型的な、血清含有胚性幹（ＥＳ）細胞用培地は、８０％ＤＭＥＭ（概してＫＯ ＤＭＥＭ）、２０％の加熱不活性化されていない定義された牛胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールで作製される。当該培地はフィルター処理して、４℃で２週間まで保存できる。無血清の胚性幹（ＥＳ）細胞用培地は、８０％ＫＯ ＤＭＥＭ、２０％血清代替物、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールで作製される。効果的な血清代替物は、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８−０２８である。当該培地はフィルター処理して、４℃で２週間まで保存できる。使用の直前に、最終濃度が４ｎｇ／ｍＬになるよう、ｂＦＧＦを添加する (Bodnar et al., Geron Corp, International Patent Publication WO 99/20741) 。
【０２３５】
本発明の好ましい実施形態では、当該培地は、１０％の血清代替培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）および５ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ ＡＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を添加したノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を含有する。
【０２３６】
フィーダー細胞（ここで用いられる）は、９０％ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２）、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃３００７１−０３）および２ｍＭ グルタミンを含むｍＥＦ培地中で増殖させる。ｍＥＦｓは、トリプシンを使って、一日おきに１：２に分割し、サブコンフルエントな状態を保ってＴ１５０フラスコ（Ｃｏｍｉｎｇ＃４３０８２５）中で増殖させる。フィーダー細胞層を調製するため、増殖を抑えて、ヒト胚性幹細胞を支持する重要な因子を合成できる量の放射線を細胞に照射する（約４０００ｒａｄｓγ線照射）。６穴培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３０４のような）では、１穴あたり１ｍＬの０．５％ゼラチンでコートし、３７℃で一晩インキュベーションし、１穴あたり３７５，０００の放射線を照射する。フィーダー細胞層は、通常、プレーティング後５時間から４日間使われる。当該培地は、ｐＰＳ細胞を播種する直前に、新しいヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞用培地に置き換える。
【０２３７】
その他の幹細胞を培養するための条件は周知であり、細胞の種類に応じて最適化することができる。前節の特殊な細胞種のための培地および培養技術は、引用文献に記載されている。
【０２３８】
胚性幹細胞
胚性幹細胞は、霊長類の胚盤胞から単離することができる (Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995) 。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、トムソンら（米国特許５，８４３，７８０; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998）により記載されている技術を用いてヒト胚盤胞から調製することができる。
【０２３９】
つまり、ヒト胚盤胞は、ヒト体内の着床前の胚から取得する。あるいは、インビトロで受精した（ＩＶＦ）胚を用いることができ、ヒト胚の１細胞を胚胞期まで成長させられるることができる (Bongso et al., Hum Reprod 4: 706, 1989) 。ヒト胚は、Ｇ１．２およびＧ２．２培地中で、胚胞期まで培養する (Gardner et al., Fertil. Steril. 69:84, 1998) 。発達した胚胞を、胚性幹細胞の単離のために選択する。透明帯は、短い間プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）にさらすことにより、胚盤胞から取り除く。内細胞塊は、胚盤胞を、１：５０希釈のウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に３０分間さらし、ＤＭＥＭで５分間、３回ウォッシュし、１：５希釈のモルモット補体（Ｇｉｂｃｏ）に３分間さらす、免疫的な処置によって単離する（参照 Solter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:5099, 1975）。さらにＤＭＥＭで２回ウォッシュした後、穏やかなピペッティングにより内細胞塊（ＩＣＭ）から溶解した栄養外胚葉細胞を取り除き、ＩＣＭをｍＥＦフィーダー細胞層上に播く。
【０２４０】
９〜１５日後、内細胞塊由来の生成物は、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むカルシウムおよびマグネシウムフリーのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）にさらすか、ディスパーゼもしくはトリプシンにさらすこと、または、マイクロピペットで機械的に解離させることにより、塊に解離させ、それから、新しい培地中でｍＥＦ上に再播種する。解離した細胞を、新しい胚性幹（ＥＳ）細胞用培地中で、ｍＥＦフィーダー細胞層上に再播種し、コロニー形成を観察する。未分化形態を示すコロニーを、マイクロピペットで個別に選択し、機械的に塊に解離し、再播種する。胚性幹細胞様の形態は、明らかに高い核細胞質比および顕著な核小体を伴うコンパクトなコロニーとして特徴付けられる。生じた胚性幹細胞は、それから１−２週間毎に、トリプシン処理、ダルベッコのＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムフリーで２ｍＭ ＥＤＴＡを含む）、および、タイプＩＶコラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）にさらすこと、マイクロピペットで個々のコロニーを選択することにより、規則的に分割する。塊の大きさは、約５０〜１００細胞が最適である。
【０２４１】
胚性生殖細胞
ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞は、最終月経期後８〜１１週後に得られるヒト胎児に存在する始原生殖細胞から調製することができる。適切な調製方法は、Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998 および 米国特許６，０９０，６２２に記載されている。
【０２４２】
つまり、生殖隆起を等張緩衝液でリンスし、０．１ｍＬの０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ ＳｏｄｉｕｍＥＤＴＡ溶液（ＢＲＬ）中に播いて、１ｍｍ３より小さい塊に切断する。それから、当該組織は、さらに細胞を解離するため、１００／μＬチップでピペッティングする。それから、３７℃で５分間インキュベーションし、３．５ｍＬのＥＧ増殖培地を添加する。ＥＧ増殖培地は、４５００ｍｇ／Ｌ Ｄ−グルコース、２２００ｍｇ／Ｌ ｍＭ重炭酸ナトリウム、１５％胚性幹細胞（ＥＳ）正規のウシ胎仔血清（ＢＲＬ）、２ｍＭグルタミン（ＢＲＬ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＢＲＬ）、１０００−２０００Ｕ／ｍＬヒト組換え白血病抑制因子（ＬＩＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）、１−２ｎｇ／ｍｌヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）、および、１０μＭホルスコリン（１０％ＤＭＳＯ中）を含むＤＭＥＭである。あるいは別のアプローチとして、ＥＧ細胞は、ヒアルロニダーゼ／コラゲナーゼ／ＤＮＡｓｅを用いて単する。腸間膜を伴う生殖腺原基または生殖隆起は、胎児から切り裂き、生殖隆起はＰＢＳでリンスして、その後、０．１ｍｌ ＨＣＤ切断溶液（０．０１％ヒアルロニダーゼ タイプＶ、０．００２％ＤＮＡｓｅＩ、０．１％コラゲナーゼ タイプＩＶ、全てＳｉｇｍａ社製で、ＥＧ増殖培地中で調製される）におく。組織を細分化して、１時間もしくは一晩、３７℃でインキュベーションして、１〜３ｍＬのＥＧ増殖培地中で懸濁し、フィーダー細胞層上に播く。
【０２４３】
ＬＩＦ、ｂＦＧＦもしくはホスコリンを含まない改変ＥＧ増殖培地中で３日間培養し、５０００ｒａｄの放射線で照射し不活性化したフィーダー細胞のサブコンフルエントな層を伴った９６穴組織培養プレートを調製する。ＳＴＯ細胞（ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＲＬ １５０３）が適したフィーダー細胞である。０．２ｍＬの初代生殖細胞（ＰＧＣ）懸濁液を各々の穴に入れる。最初の継代は、ＥＧ増殖培地中で７〜１０日後に行い、放射線を照射したＳＴＯマウス繊維芽細胞を調製する前に、各々の穴から２４穴培養プレートの穴へと移動する。当該細胞は、細胞の形態がＥＧ細胞で観察されるものと一致するまで（通常、７〜３０日後もしくは１〜４継代後）毎日培地交換を行って培養する。
【０２４４】
自己複製と分化
自己複製
自己複製している幹細胞は、当業者に周知の様々な手法（例えば、形態学的、免疫組織化学的、分子生物学的等）により同定することができる。
【０２４５】
前記幹細胞は、Ｏｃｔ４および／またはＳＳＥＡ−１の発現の増加を示すことが好ましい。また、Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−２およびｃ−ｋｉｔのいずれか１または複数の発現が減少していることが好ましい。自己複製している幹細胞は、自己複製していない幹細胞と比較して、細胞周期が短縮されていることが好ましい。
【０２４６】
例えば、２次元の標準的な顕微鏡画像において、ヒト胚性幹細胞は、高い核細胞質比、顕著な核小体、および、細胞間結合が弱くコンパクトなコロニー形成を示すことが好ましい。セルラインは、標準的なＧバンド法（Ｏａｋｌａｎｄ ＣａｌｉｆのＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌａｂのような染色体分析サービスを提供する、多くの臨床的診断研究室で用いられている）を用いて染色体分析を行うことができ、公開されたヒト染色体と比較することができる。
【０２４７】
ヒト胚性幹細胞およびヒト胚性生殖細胞は、発現している細胞マーカーにより特徴付けられてもよい。通常、本書で開示されている組織特異的マーカーは、膜結合マーカーに対するフローサイトメトリー、細胞内マーカーに対する免疫組織化学的手法、および、培地中に分泌されたマーカーに対する酵素結合免疫測定法のような、免疫学的技術を用いて検出することができる。タンパク質マーカーの発現は、マーカー特異的なプライマーを用いた逆転写ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルにより検出することもできる。詳細は、米国特許５，８４３，７８０を参照。
【０２４８】
時期特異的胎児性抗原（ＳＳＥＡ）は、いくつかの胚細胞種の特性である。ＳＳＥＡマーカーに対する抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．）から入手可能である。その他の有用なマーカーは、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１の抗体を用いて検出できる (Andrews et al., Cell Linesfrom Human Gern Cell Tumors, in E. J. Robertson, 1987, supra) 。ヒト胚性幹細胞は、通常、ＳＳＥＡ−１陰性およびＳＳＥＡ−４陽性である。ｈＥＧ細胞は、通常、ＳＳＥＡ−１陽性である。インビトロにおけるｐＰＳ細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１の発現を低下させ、ＳＳＥＡ−１の発現を増加させる。ｐＰＳ細胞はまた、アルカリフォスファターゼ活性により特徴付けることもできる。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、それから、製品（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆ．）に記載されているように、基質としてベクターレッドを用いる。
【０２４９】
また、胚性幹細胞は、通常、テロメラーゼ陽性およびＯＣＴ−４陽性である。テロメラーゼ活性は、市販で入手できるキット（ＴＲＡＰｅｚｅ．ＲＴＭ．ＸＫ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｃａｔ．ｓ７７０７；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏ．，Ｐｕｒｃｈａｓｅ Ｎ．Ｙ．もしくは、ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ＰＣＲ ＥＬＩＳ ｐｌｕｓ、Ｃａｔ．２，０１３，８９；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を用いたＴＲＡＰ活性アッセイ (Kim et al., Science 266:2011, 1997) により測定できる。ｈＴＥＲＴ発現はまた、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルにより評価することもできる。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．ｈＴＥＲＴ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃａｔ．３，０１２，３４４；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）は、研究目的で市販されており、入手できる。
【０２５０】
分化
間葉系幹細胞およびこれらから誘導された分化した細胞は、４Ｅ−ＢＰ１および／またはＳ６Ｋ１の脱リン酸化が促進されていることが好ましい。また、これらの細胞は、Ｏｃｔ−４および／またはＳＳＥＡ−１の発現が低下していることが好ましい。また、Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−２およびｃ−ｋｉｔのいずれか１または複数の発現が増加していることが好ましい。また、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＡＦＰ、ネスチン、およびｎｕｒｒ１のいずれか１または複数の発現が増加していることが好ましい。自己複製している幹細胞は、自己複製していない幹細胞と比較して長い細胞周期を示すことが好ましい。
【０２５１】
分化した幹細胞、すなわち、分化の経路に入り始めたもしくは分化の経路に入り込んでいる細胞は、特に転写の変化を含めた、多くの表現型の基準により特徴付けられる。当該基準には、形態学的特徴の特性化、発現した細胞マーカーおよび酵素活性の検出または定量、遺伝子発現、ならびに、体内における当該細胞の機能的な性質の測定が含まれるが、それらに制限されるものではない。通常、分化した幹細胞は、分化プロセスの最終産物である細胞種（すなわち分化した細胞）の１または複数の特徴を持つであろう。例えば、標的細胞種が筋細胞である場合、前記細胞へと分化の過程にある幹細胞は、例えば、ミオシンの発現という特徴を持つであろう。
【０２５２】
それゆえ、多くの点で、当該基準は分化した幹細胞の運命によって決まるものであり、様々な細胞種の概要は以下に示す。
【０２５３】
神経の細胞に分化した、もしくは、分化している細胞に関連するマーカーには、ニューロンの特性であるβ−チューブリンＥＩＩＩもしくはニューロフィラメント、アストロサイトに存在するグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、オリゴデンドロサイトの特性であるガラクトセレブロシド（ＧａＩＣ）もしくはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、未分化ヒト胚性幹細胞の特性であるＯＣＴ−４、神経前駆細胞およびその他の細胞の特性であるネスチンが含まれる。Ａ２Ｂ５およびＮＣＡＭは、各々グリア前駆細胞および神経前駆細胞の特性である。細胞に対して、特性のある生理活性物質の分泌の試験を行うこともできる。例えば、ＧＡＢＡを分泌するニューロンは、グルタミン酸脱炭酸酵素またはＧＡＢＡの産生により同定することができる。ドーパミン作動性ニューロンは、ドーパ脱炭酸酵素、ドーパミンまたはチロシン水酸化酵素の産生により同定することができる。
【０２５４】
肝臓の細胞に分化した、もしくは、分化している細胞に関連するマーカーには、α−フェトプロテイン（肝前駆細胞）；アルブミン、α１−抗トリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、シトクロムｐ４５０活性、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質受容体およびグリコーゲン貯蔵（肝細胞）；ＣＫ７、ＣＫ１９およびγ−グルタミルトランスフェラーゼ（胆管上皮細胞）が含まれる。肝細胞の分化には、転写因子ＢＮＦ−４αが必要であることが報告されている (Li et al., Genes Dev. 14:464, 2000) 。ＨＮＦ−４αの発現と無関連であるマーカーには、α１−抗トリプシン、α−フェトプロテイン、ａｐｏＥ、グルコキナーゼ、インシュリン増殖因子１および２、ＩＧＦ−１受容体、インシュリン受容体およびレプチンが含まれる。ＨＮＦ−４αの発現に依存するマーカーには、アルブミン、ａｐｏＡＩ、ａｐｏＡＩＩ、ａｐｏＢ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＣＩＩ、アルドラーゼＢ、フェニルアラニン水酸化酵素、Ｌ型脂肪酸結合タンパク質、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）が含まれる。
【０２５５】
ｐＰＳ細胞から誘導された混合し細胞集団における細胞種は、特徴的な形態とそれらが発現するマーカーにより見分けることができる。骨格筋には、ｍｙｏＤ、ｍｙｏｇｅｎｉｎおよびｍｙｆ−５。内皮細胞には、ＰＥＣＡＭ（血小板細胞接着分子）、Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、血管内皮（ＶＥ）カドヘリン、ＭＥＣＡ−３２およびＭＥＣ−１４．７。平滑筋細胞には、特異的ミオシン重鎖。心筋細胞には、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、心筋トロポニン、α−ミオシン重鎖およびＡＮＦ。膵臓細胞には、ｐｄｘおよびインシュリン分泌。造血細胞および造血前駆細胞には、ＧＡＴＡ−１、ＣＤ３４、ＡＣ１３３、主なグロブリンおよびグロブリン様遺伝子ＰＨ１。
【０２５６】
本書で開示する、もしくは、当業者に周知である、特定の組織特異的マーカーは細胞表面マーカーに対する免疫細胞化学、細胞内もしくは細胞表面マーカーに対する免疫組織化学（例えば、固定した細胞もしくは組織切片）、細胞抽出物に対するウェスタンブロット解析、細胞抽出物もしくは培地中に分泌される産物に対する酵素結合免疫アッセイ、のような免疫学的な技術により検出することができる。組織特異的遺伝子の発現はまた、ノーザンブロット解析、ドットブロットハイブリダイゼーション解析、もしくは、標準的な増殖方法において配列特異的なプライマーを用いる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によるｍＲＮＡレベルで検出することもできる。本書で開示する特殊なマーカーの配列データは、ＧｅｎＢａｎｋ (URL www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez) のような公共のデータベースから取得できる。
【０２５７】
［実施例１］  方法
ｈＥＳＣ−ＭＳＣ（間葉系幹細胞）の誘導
【０２５８】
Ｈｕｅｓ９およびＨ１ ｈＥＳＣｓを以前に報告6,7されているように増殖させる。
【０２５９】
ｈＥＳＣｓを分化させるために、６ｃｍプレートにコンフルエントなｈＥＳＣｓを３７℃で３分間トリプシン処理し、中和、遠心をし、ゼラチン化した１０ｃｍプレート上で、１０％血清代替培地 (Invitrogen- Gibco, Grand Island, New York) 、５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２ (Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York) 、５ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ ＡＢ (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey) となるよう追加されたＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ培地に懸濁する。細胞は、コンフルエント時にトリプシン処理し、１：４の比で分割する。
【０２６０】
ＣＤ１０５陽性およびＣＤ２４陰性の分類（ソート）は、ｈＥＳＣｓをトリプシン処理した１週間後に行う。分化しているｈＥＳＣｓは、３分間トリプシン処理し、中和、遠心をし、培養液に懸濁した後、バクテリア培養プレートに播種する。ＣＯ２インキュベーターで３７℃２時間のインキュベーション後、細胞を回収し、ＰＢＳでウォッシュし、ＣＤ２４−ＰＥおよびＣＤ１０５−ＦＩＴＣ (PharMingen, San Diego, California) で９０分間、室温にてインキュベーションする。
【０２６１】
その後、細胞をＰＢＳでウォッシュし、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａｓｏｆｔｗａｒｅを用いたＦＡＣＳ Ａｒｉａ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) でソートする。ＢＭ ＭＳＣｓは、以前に報告26されているように調製する。細胞は、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、非必須アミノ酸、および１０％ウシ胎仔血清 (Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York) を添加したＤＭＥＭ中で培養する。
【０２６２】
脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞への分化は、以前に報告3されているように行う。オイルレッド、アルシアンブルーおよびｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色は、標準的な技術で行う。コラーゲンタイプＩＩに対する免疫活性は、ヤギ抗コラーゲンタイプＩＩ抗体およびＨＲＰ標識ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体 (Santa Cruz, Santa Cruz, California) を用いて、パラホルムアルデヒド固定切片およびパラフィン包埋切片上で行う。
【０２６３】
染色体分析
細胞をペトリディッシュで約８０％コンフルエントな状態にする。核分裂を停止させるため、細胞をコルセミドで処理し、標準的な低張処理およびメタノール：酢酸（３：１）固定により回収する。スライドは、標準的な空気乾燥法により準備し、ＳＫＹ ｐａｉｎｔプローブ（ＡＳＩ）でハイブリダイズさせる。製品プロトコールおよび本発明者らが確立した方法によれば、ハイブリダイゼーション後、ウォッシュを行う。培養あたり、２０〜３０の中期細胞が存在する。各々の培養の核型は、８０％以上が中期細胞であることが代表的である。
【０２６４】
移植研究
２×１０６個の細胞を３０μｌの生理食塩水に懸濁し、以前に報告27されているように、腎臓の被膜下の空間へと移す。４ヶ月後、マウスから腎臓を取出し、４％パラホルムアアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、４μｍの切片にし、Ｈ＆Ｅで染色する。
【０２６５】
ウェスタンブロット解析
標準的な手法28を用いる。つまり、細胞をＲＩＰＡバッファーに溶解し、４℃にて、１４，０００ｒｐｍを１５分間遠心する。上清２０μｇを変性させ、１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜に電気的に転写する。続いて、膜を一次抗体でインキュベーションし、次に、ＨＲＰ標識二次抗体もしくはビオチン化二次抗体とそれに続くニュートロアビジン−ＨＲＰでインキュベーションし、最後に、ＨＲＰ増強化学発光基質であるＥＣＳ(Pierce, Rockford, IL)でインキュベーションする。
【０２６６】
一次抗体には、１：２００希釈の抗ＯＣＴ４抗体、抗ＳＯＸ−２抗体および抗アクチン抗体(Santa Cruz Biotechnology, CA)を用いる。二次抗体には、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ抗体、ウサギ抗ヤギ抗体およびウサギ抗マウス抗体を用いる。
【０２６７】
ＰＣＲ
マウス、ヒト特異的な反復配列に対するゲノムＰＣＲを以前に報告8されているように行う。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ (Applied Biosystems, Foster City, CA) を用いて、１μｇの全ＲＮＡの逆転写を行い、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行う。ｃＤＮＡは、水で１０倍希釈し、Ｔａｑｍａｎプライマー (Applied Biosystems, Foster City, CA) で４０サイクルさせて増幅する。
【０２６８】
細胞表面抗原解析
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓおよびｈＥＳＣｓの細胞表面抗原は、ＦＡＣＳを用いて解析する。細胞を５分間トリプシン処理し、遠心し、培養液に懸濁し、バクテリアの培養ディッシュ中、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２〜３時間インキュベーションする。ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓおよびｈＥＳＣｓの細胞表面抗原は、ＦＡＣＳを用いて解析する。
【０２６９】
細胞を１分間トリプシン処理し、遠心し、ＰＢＳでウォッシュし、４％パラホルムアルデヒドで室温にて０．５時間固定し、２％ＦＣＳで室温にて０．５時間攪拌しながらウォッシュおよびブロッキングを行う。その後、１．５×１０５個の細胞を次の各々のモノクローナル抗体で室温にて９０分間インキュベーションする。
ＣＤ２４−ＰＥ、ＣＤ２９−ＰＥ、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ、ＣＤ４９ａ−ＰＥ、ＣＤ４９ｅ−ＰＥ、ＣＤ１０５−ＦＩＴＣ、ＣＤ１６６−ＰＥ、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ(PharMingen, San Diego, CA)。
【０２７０】
インキュベーション後、細胞をウォッシュし、ＰＢＳ中に懸濁する。非特異的な蛍光は、アイソタイプが合致したマウスモノクローナル抗体で同様の細胞アリコートをインキュベーションすることにより特定できる。データは、２０，０００個収集し、ＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いてＣｙａｎ ＬＸ(Dako North America, Inc., Carpinteria, CA)上で解析する。非特異的な蛍光は、アイソタイプが合致したマウスモノクローナル抗体または二次抗体のみで同様の細胞アリコートをインキュベーションすることにより特定できる。
【０２７１】
イルミナ遺伝子チップ解析
初代ＢＭおよび脂肪誘導ＭＳＣｓの各々３サンプル、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３の２つの生物学的複製物、および、Ｈ１、Ｈｅｓ３、ＨｕＥＳ９の３つの未分化ｈＥＳＣ株からの全ＲＮＡ（２μｇ）を、イルミナＲＮＡ増幅キットを用いて、製品説明書に従い、ビオチン化ｃＲＮＡへと変換する。
【０２７２】
サンプルはＲＮｅａｓｙキット(Qiagen, Valencia, CA)を用いて精製する。Ｓｅｎｔｒｉｘ ＨｕｍａｎＲｅｆ−８ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ(Illumina, Inc., San Diego, CA)へのハイブリダイゼーション、ウォッシュおよびスキャンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＳｔａｔｉｏｎ ５００ｘマニュアルに従って行う。メーカーから提供されているＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏを用いて、データを抽出、正規化し、解析する。９９％コンフィデンスで検出限界（ＬＯＤ）を下回る転写シグナルは、発現していない遺伝子として除外する。
【０２７３】
［実施例２］  ヒトＥＳ細胞株からのＭＳＣ培養物の作出
ｈＥＳＣコロニーをトリプシンで分散し、ゼラチン化した組織培養プレート上にフィーダー細胞の非存在下、および、無血清代替培地、ＦＧＦ２および任意でＰＤＧＦ ＡＢを添加した無血清培地中で継代すると、２週間以内に、互いに類似または同一の（好ましくは均一の）繊維芽細胞様細胞が作出する。
【０２７４】
培養物は、ＢＭ−ＭＳＣｓに似た繊維芽細胞様の形態を持つ（図１Ａ）。コラゲナーゼにより分散したｈＥＳＣコロニーは、このような繊維芽細胞様の細胞を作出する効率は良くない。
【０２７５】
その一方で、３番目のＨ１．Ｅ２がＨ１ ＥＳＣ株から作出される一方で、２つのポリクローナル培養物（ｈｕＥＳ９．Ｅ１およびｈｕＥＳ９．Ｅ３）は、ｈｕＥＳ９ ＥＳＣ株からの作出と関連がない。通常、いくつかの全能性に関連した遺伝子の発現が低下している。例えば、ＨＥＳＸ１、ＰＯＵＦＬ５、ＳＯＸ−２、ＵＴＦ−１およびＺＦＰ４２の転写レベルはｈＥＳＣｓの１０１−５倍以上下回る（図１Ｂ）。ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２のタンパク質レベルもまた低下する（図１Ｃ）。ｈｕＥＳ９．Ｅ１に代表されるように、これらの細胞では、アルカリフォスファターゼ活性は検出されなかった（図１Ｄ）。
【０２７６】
親のＨｕＥＳ９細胞と異なり、１×１０６個のＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞の免疫不全ＳＣＩＤマウスへの腎被膜下移植により、４ヶ月の観察期間中、テラトーマは誘導されなかった（図１Ｅ）。これらの細胞が、マウスフィーダー細胞で汚染または融合されている可能性を評価するため8、これらの細胞は試験を行い、マウス特異的ｃ−ｍｏｓ反復配列に対して陰性であり、ヒト特異的ａｌｕ反復配列に対して陽性であることを示した（図１Ｆ）。
【０２７７】
ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２の平均的な集団倍加時間は、それぞれ、７２、７２および１２０時間である。集団倍加時間は細胞密度に相当依存しており、最適な細胞密度は３０〜８０％コンフルエントな状態である。約８０回の集団倍加後、ＨｕＥＳ９．Ｅ１は、４６ＸＸｉｎｖ（９）を有する（ｐ１３ｑ１２核型。９番染色体の親のｈｕＥＳ９ ｈＥＳＣ株に由来する逆位）6。ＨｕＥＳ９．Ｅ３もまた、４６ＸＸｉｎｖ（９）を有する（ｐ１３ｑ１２核型。一方で、３６および３２集団倍加時間後、Ｈ１．Ｅ１は４６ＸＹ核型を有する）。本発明者らは、３５集団倍加後の細胞は、明らかに異常な、同一でない、染色体異常が、〜１０−３０％の細胞で生じ始めることを観察した（データは示さない）。細胞は、３５集団倍加後には使用しなかった。
【０２７８】
［実施例３］  細胞表面抗原プロファイル
ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２の細胞表面抗原プロファイルのＦＡＣＳによる解析により、これらの細胞表面抗原プロファイルは、ＢＭ−ＭＳＣｓで定義されたものと定性的に類似したものであることが示された。すなわち、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４９ａおよびｅ＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋およびＣＤ３４−、ＣＤ４５−であった9-11（図２Ａ）。
【０２７９】
これらの細胞の細胞表面抗原プロファイルをＢＭ−ＭＳＣｓのものと比較するため、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ１を、１０％ウシ胎仔血清を添加したＢＭ−ＭＳＣ培養用培地と同様の培地で２代の間、増殖させた。培養条件の変化にもかかわらず、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ１は、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４９ａ＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋およびＣＤ３４−、ＣＤ４５−であり、ＢＭ−ＭＳＣｓのものと大きく類似していた。ＣＤ４９ａは、ＢＭ−ＭＳＣｓにおいてより低い発現を示しており、例外である。これらのデータは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓが、安定したＢＭ−ＭＳＣ細胞表面抗原プロファイルの特性を示すこと、それは微小環境の変化によっては著しく影響されないこと、を示している。
【０２８０】
［実施例４］  ｈＥＳＣ−ＭＳＣの分化能：脂質形成、軟骨形成、骨形成
ＭＳＣｓに関連した細胞表面抗原の全ては、多くのその他の細胞種上でも発現しており、これら細胞表面抗原の発現は変化しやすいものであるため、推定ＭＳＣｓの同定は、伝統的に機能的なパラーメーターに依存している9。培養中のＭＳＣｓの初期の分化経路は、様々な程度の脂質形成および軟骨形成を伴った骨形成であることが報告されている9。
【０２８１】
そのため、公開されているプロトコールを用いた脂質形成、軟骨形成および骨形成のための標準的な分化条件を用いたＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞の分化能を試験した3。
【０２８２】
脂肪細胞への分化は、９９％以上の細胞に脂肪滴を伴い、効率的なものである（図３Ａ）。脂質形成における重要な転写因子の役割と一致して12、各々の親のＥＳＣ株より約１０〜１００倍高いｈＥＳＣ誘導ＭＳＣｓ中のＰＰＡＲγ ｍＲＮＡは、さらに２倍増加する（図３Ａ）。
【０２８３】
軟骨形成においてもまた、アルシアンブルー染色により検出されるように、９０％以上の細胞が細胞外基質中にプロテオグリカンを産生する細胞を効率的に形成し（図３Ｂ）、〜２０％の細胞がコラーゲンＩＩに対して免疫活性があった。アグリカン、軟骨特異的細胞外基質タンパク質の転写レベルもまた、増加した13（図３Ｂ）。しかしながら、コラーゲンＩＩ、その他の軟骨特異的細胞外基質タンパク質の転写レベルは、基質中でコラーゲンＩＩの免疫活性があるにもかかわらず、減少した。原因はわからないが、特にＡＵリッチなエレメントを有するいくつかのｍＲＮＡは、翻訳された時に不安定であることが知られている14,15。
【０２８４】
ＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞が、骨形成へと誘導される時、骨特異的アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の発現および骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）16の発現は２〜３倍増加した（図３Ｃ）。しかしながら、骨形成のより進展した段階である骨形成（ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色により特定されるような）17は弱かった（図３Ｃ）。分化した培養物中、染色が陽性であったのは１％以下であった。
【０２８５】
［実施例５］  遺伝子発現プロファイル
１）ｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物と成体組織由来のＭＳＣｓとの関連性を評価するために、３つの異なる個体および３つのヒトＥＳＣ株からのＢＭ−ＭＳＣｓおよび脂肪誘導（ａｄ）−ＭＳＣｓを用いて２）３つのｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物各々の間における関連性を評価するため３）ｈＥＳＣ由来ＭＳＣｓとＢＭ由来ＭＳＣｓ間における類似性および差異を比較するため、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓの遺伝子発現プロファイルを行った。
【０２８６】
全ＲＮＡより調製した標識したｃＤＮＡを、約２４，０００の独自の特徴を含むＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙにハイブリダイズさせた。３つのｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物（すなわち、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２）、３つのＢＭ−ＭＳＣサンプルならびに３つの脂肪誘導（ａｄ）−ＭＳＣｓサンプルにおける発現した遺伝子の階層的クラスタ分析により、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓの遺伝子発現プロファイルは、それらの親のｈＥＳＣｓよりも、成体組織由来ＭＳＣｓすなわちＢＭ−ＭＳＣおよびａｄ−ＭＳＣの遺伝子発現プロファイルと密接な関連があることがわかった（図４Ａ）。
【０２８７】
興味深いことに、ＭＳＣｓはそれらの組織の発生にしたがって集団となり、このことはｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとは異なるグループであるａｄ−ＭＳＣｓとＢＭ−ＭＳＣｓの集団により示唆されるように、成体組織と胚性組織の間にさらに一線を画した。
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとＢＭ−ＭＳＣｓ間の遺伝子発現の一対比較により、相関係数０．７２は、ｈＥＳｈＥＳＣ−ＭＳＣｓとＢＭ−ＭＳＣｓの遺伝子発現がかなり保持されている一方、かなりの差異も存在することが明らかになった（図４Ｃ）。
【０２８８】
３つのｈＥＳＣ−ＭＳＣ培養物各々の間における関連性を評価するため、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２およびＨｕＥＳ９．Ｅ３は、各々、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２およびＨｕＥＳ９．Ｅ３で構成される同一の基準と比較を行った。同一の基準と、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２およびＨｕＥＳ９．Ｅ３間の相関係数は、実質的に同じであり（０．９３、０．９５および０．９３）、ＨｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２およびＨｕＥＳ９．Ｅ３は極めて類似性が高いことを示唆している（図４Ｃ）。
【０２８９】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣにおいて、９９％の信頼レベルで検出限界を上回る発現をした８６９９および８５０５の遺伝子のうち、各々、６３７６の遺伝子は、ｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣの両方において、２倍以下の差異で発現した。これらの遺伝子は、ＭＳＣｓの基礎生物学に見識を与える可能性があるので、本発明者らは、これらの遺伝子により促進される生物学的プロセスを調べた。共通に発現した６３７６遺伝子のうち、４０６４個がＰａｎｔｈｅｒ分類遺伝子リストで見られるものであった(March 2006; http://www.pantherdb.org/)。
【０２９０】
これらの遺伝子を異なる生物学的なプロセスに分類することにより、いくつかの生物学的プロセスにおける遺伝子の頻度は、ＮＣＢＩのＨ．ｓａｐｉｅｎｓ遺伝子データベースにおける２３，４８１遺伝子から構成される基準リストと比較すると、大幅に上下する（ｐ＜０．０１）ことが明らかになった。例えば、代謝プロセスにおいて高発現する（ｏｖｅｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｉｏｎ）遺伝子が存在し、それは、推定幹細胞の増殖および自己複製に重要である可能性がある。これらのプロセスは、異化作用活性、同化作用活性での基礎代謝プロセス、多くの転写後修飾（例えば、糖鎖付加）に必要な分泌産物の生合成、および細胞増殖を含むものである（図４Ｃ）。
【０２９１】
間葉性の分化と同様に、外胚葉への分化、特に神経の発生に関与する低発現（ｕｎｄｅｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の遺伝子もまた存在する。遺伝子発現解析はまた、ＭＡＰＫＫＫシグナルがＢＭ−ＭＳＣとｈＥＳＣ−ＭＳＣｓの両方で顕著であることを示唆している。少なくとも３つのサブファミリー、すなわち、古典的なＭＡＰＫ（ＥＲＫとしても知られる）、ストレス活性化プロテインキナーゼ／ｃ−ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）およびｐ３８キナーゼから構成されるＭＡＰＫＫＫシグナルは、増殖、分化、発生、細胞ストレス応答の調節、細胞周期、細胞死および細胞生存と関連している。
【０２９２】
さらなるｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣの遺伝子発現プロファイルの解析により、１１４２個および１１３４個の遺伝子が各々ｈＥＳＣ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣにおいて２倍以上発現していることがわかった。これらのうち、各々７３８個および８８０個の遺伝子が、Ｐａｎｔｈｅｒ分類遺伝子リスト(March 2006; http://www.pantherdb.org/)に存在し、生物学的プロセスに分類されていた。ＮＣＢＩのＨ．ｓａｐｉｅｎｓ遺伝子データベースにおける２３，４８１遺伝子から構成される基準リストと比較すると、大幅に上下する（ｐ＜０．０１）生物学的プロセスを選択した。
【０２９３】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓにおいて選択的に発現している遺伝子が、増殖、分化、免疫およびシグナル伝達に関与するプロセスに集められる一方で、ＢＭ−ＭＳＣｓにおいて選択的に発現している遺伝子は、代謝プロセス、細胞構造、分化およびシグナル伝達に関与する生物学的プロセスに集められる（図３Ｃ）。増殖に関連する生物学的プロセスにおいて高発現している遺伝子は、ｈＥＳＣ−ＭＳＣがＢＭ−ＭＳＣを上回る高増殖能を有することと一致する。
【０２９４】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣまたはＢＭ−ＭＳＣのどちらかで高発現している遺伝子は、分化およびシグナル伝達の一般のカテゴリで高発現しているが、各々のカテゴリ内の特異的な生物学的プロセスはｈＥＳＣ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣにおいて異なる発現を示している。例えば、末期の胚発生（例えば、骨発生および筋発生）に関連した分化プロセスがＢＭ−ＭＳＣにおいて高発現している一方で、胚形成およびセグメンテーションのような初期の胚発生に関連した分化プロセスが、ｈＥＳＣ−ＭＳＣで高発現している。同様に、細胞外基質タンパク質を介したシグナル伝達およびＭＡＰＫＫＫカスケードがＢＭ−ＭＳＣにおいて高発現している。以上より、これらの結果は、ｈＥＳＣ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣにおける分化能およびシグナル経路利用は同一ではないであろうことを示唆している。
【０２９５】
［実施例５］  単一細胞由来のＭＳＣ集団を単離するための、ｈＥＳＣｓおよびｈＥＳＣ由来ＭＳＣｓの特徴的な細胞表面マーカー
分化しているｈＥＳＣｓからＭＳＣｓを単離するのを容易にする膜タンパク質をコードする、ｈＥＳＣｓ−ＭＳＣまたはｈＥＳＣのどちらかにおいて高発現している遺伝子を調べるため、ゲノムワイドな遺伝子発現を調べた。ｈＥＳＣｓ−ＭＳＣまたはｈＥＳＣのどちらかにおいて推定膜タンパク質をコードする高発現遺伝子の上位２０のリストから、それらの遺伝子産物に対する抗体が市販されている候補遺伝子が選択された（下記表Ｅ１Ａおよび表Ｅ１Ｂ）。ｈＥＳＣ由来において高発現しているこれら候補遺伝子の中で、
【０２９６】
［表Ｅ１Ａ］
ｈＥＳＣよりもｈＥＳＣ由来ＭＳＣにおいて高発現している膜タンパク質
2010500047.tif 000159
【０２９７】
2010500047.tif 000160
【０２９８】
［表Ｅ１Ｂ］
ｈＥＳＣ由来ＭＳＣよりもｈＥＳＣにおいて高発現している膜タンパク質
2010500047.tif 000161
【０２９９】
2010500047.tif 000162
【０３００】
上記表Ｅ１Ａおよび表Ｅ１Ｂは、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（表Ｅ１Ａ）またはそれらの親であるｈＥＳＣｓ（表Ｅ１Ｂ）における遺伝子がコードする高発現した細胞表面抗原を示す。ミクロアレイハイブリダイゼーションによる遺伝子発現解析に基づいた、ｈＥＳＣｓ（ＨｕＥＳ９、Ｈ１およびＨｅｓ３ ｈＥＳＣｓ）に対してｈＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ＨｕＥＳ９．Ｅ１、ＨｕＥＳ９．Ｅ３およびＨ１．Ｅ２）において高発現している上位２０の遺伝子（表Ｅ１Ａ）、および、その逆の遺伝子（表Ｅ１Ｂ）である。
【０３０１】
ＭＳＣｓは、成体組織由来のＭＳＣｓの特徴的な細胞表面マーカー9-11であるＥＮＧ（ＣＤ１０５）、ＩＴＧＡ４（ＣＤ４９ｄ）、ＰＤＧＦＲＡ、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）および、ｈＥＳＣで高発現した候補遺伝子のうち、以前に高発現したｈＥＳＣ特異的遺伝子として同定されており、その発現がｈＥＳＣｓと関連していなかったＩＴＧＢ１ＢＰ３およびＰＯＤＸＬ22およびＣＤ２４である。本発明者らは、ＣＤ２４がｈＥＳＣ−ＭＳＣに対してｈＥＳＣにおいて高い発現であることを確認した（図５Ａ）。
【０３０２】
［実施例６］  均一なｈＥＳＣ−ＭＳＣ集団の誘導
次に、本発明者らは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣの均一性を促進させるためのこれらのマーカーの有用性を調べた。トリプシン処理および血清代替物、ＦＧＦ２、任意でＰＤＧＦ ＡＢを添加した培地中での培養の一週間後、細胞をＣＤ１０５陽性およびＣＤ２４陰性でＦＡＣＳにより分離した。
【０３０３】
ＣＤ１０５＋およびＣＤ２４−細胞は、培養物中〜５％であった（図５Ｂ）。分離した細胞は、１０×９６穴プレートに１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで、１×２４穴プレートに１００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで、３×６穴プレートに１０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種した。これらのうち、１０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの１８個中５個のみが、ＭＳＣ様培養物を形成し、これらの培養物が単一細胞から形成された可能性があることを示している。
【０３０４】
約２４，０００の独自の特徴を含むＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙを用いた、これら５つ（Ｑ４．１〜Ｑ４．５）の培養物のゲノムワイドな遺伝子発現プロファイリングにより、４つの株が相関係数０．９６であり、残りの１つが０．９０であるという、５つの培養物間で高い類似性があることが明らかになった（図５Ｃ）。本発明者らの実験では、少なくとも１ヶ月の期間をあけて、同様のＲＮＡサンプルを用いて行った再現実験との間の相関係数は、通常、０．９７〜０．９８の幅に収まるものであった。Ｑ４．１〜Ｑ４．５はまた、ｈｕＥＳ９．Ｅ１、Ｈ１．Ｅ２Ｅ１およびｈｕＥＳ９．Ｅ３から構成されるｈＥＳＣ−ＭＳＣｓならびにＢＭ−ＭＳＣｓは、各々相関係数０．８７および０．８１であり、非常に類似している（図５Ｄ）。
【０３０５】
対照的に、Ｑ４．１〜Ｑ４．５とその親であるＨｕＥＳ９．Ｅ１ ｈＥＳＣ株の相関係数は低く、０．５５であった（図５Ｄ）。ＧバンドおよびＳＫＹを用いた染色体解析を、ランダムに選択したＱ４．３培養物について行った。Ｑ４．３は、９番染色体の親のｈｕＥＳ９ ｈＥＳＣ株に由来する逆位を伴い、通常の核型を有するものであった（図５Ｅ）。これらの結果は、ｂＦＧＦ２および任意でＰＤＧＦ ＢＢを添加した培地で１週間増殖させた後にトリプシン処理したｈＥＳＣ培養物から、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２４−細胞を分離することにより、非常に均一なＭＳＣ培養物を形成することができることを示している。
【０３０６】
陽性および陰性の選択マーカーを誘導プロトコールに取り込むことにより、互いにほぼ同一であり、選別またはソート基準の特異性を確認したゲノムワイドな遺伝子発現プロファイルを伴う、５つのモノクローナル単離物の誘導が生じた。５つの単離物間の網羅的遺伝子発現比較は、同様のＲＮＡサンプルを用いて行った再現実験との結果とほぼ同じ遺伝子発現プロファイルを示した。
【０３０７】
実施例７〜１５は、ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオームを解析するための実験である。これらの実験では、ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）を臨床的に準拠したプロトコールを用いて解析することにより、化学的に定義された無血清培地を調製する。馴化培地は、多次元タンパク質同定技術（ＭｕＤＰＩＴ）およびサイトカイン抗体アレイで解析を行い、２０１個の特有の遺伝子産物の存在が明らかになった。
【０３０８】
これらの遺伝子産物の８６−８８％は、マイクロアレイまたはｑＲＴ−ＰＣＲアッセイにより転写レベルで検出することができた。コンピューター分析は、これらの遺伝子産物が、生物学的プロセスの３つの主要なグループ、代謝、防御応答ならびに血管新生、造血および骨発生を含む組織分化を有意に促進するであろうと予想している。また、コンピューター分析は、その２０１の遺伝子産物は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＧＦ−βシグナル伝達およびｍＴＯＲシグナル伝達経路のような、心臓血管生物学、骨発生および造血における重要なシグナル伝達経路を活性化すると予想している。
【０３０９】
［実施例７］  ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオームの解析：材料および方法
馴化培地の調製
ＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞は、上述のように培養した。８０％コンフルエントなＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞をＰＢＳで３回ウォッシュし、フェノールレッド無しのＤＭＥＭ培地(Catalog 31053; Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)に、ＩＴＳ(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)、５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)、５ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ ＡＢ(Peprotech, Rocky Hill, New Jersey)、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシンおよびメルカプトエタノールを添加した化学的に定義された培地中で一晩培養した。その後、培養物をＰＢＳで３回リンスし、新しい定義された培地に置き換えた。３日後、当該培地を回収し、５００×ｇで遠心し、その上清を０．２μのフィルターに通した。ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析のために、０．２μのフィルターでろ過する前に、馴化培地を分画分子量３５００の透析カセット(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)に入れ、１０倍量の０．９％ＮａＣｌで３回交換して透析を行い、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ濃縮溶液を用いて２０倍に濃縮し、１００倍量の０．９％ＮａＣｌで１０回交換して透析を行った。同量の非馴化培地も馴化培地と並行して透析および濃縮した。
【０３１０】
培地は、透析により濃縮する代わりに、３Ｋの分画分子量（ＮＭＷＬ）である限外ろ過膜を用いて濃縮してもよい。結果生じる濃縮液は、透析により濃縮された培地で観察される大抵のタンパク質および生理活性を保持している。
【０３１１】
サイトカイン抗体ブロットアッセイ
サイトカインおよびその他のタンパク質の存在を調べるため、製品説明書 (RayBio Norcross,GA) に従いＲａｙＢｉｏ（登録商標）サイトカイン抗体アレイを用いて１ｍｌの馴化培地または非馴化培地をアッセイした。
【０３１２】
ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析
２ｍｌの透析した馴化培地（ＣＭ）または非馴化培地（ＮＣＭ）中のタンパク質は、（Washburn, 2001 #2997）に記載されているように、還元、アルキル化およびトリプシンによる切断を行った。その後、切断された混合物を、調整したＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ−１８ ＳＰＥ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ (Waters, Milford, MA, USA) に通してサンプルを脱塩し、３％アセトニトリル（ＡＣＮ） (JT Baker, Phillipsburg, NJ) および０．１％ギ酸（ＦＡ）バッファーで２回ウォッシュし、７０％ＡＣＮおよび０．１％ＦＡバッファーで溶出した。その後、溶出したサンプルをスピードバックで最初のボリュームの約１０％にまで脱水し、０．１％ギ酸で５０μｌに調整した。当該サンプルは、ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析の前に４℃で保存した。
【０３１３】
脱塩したペプチド混合物は、ＬＣ ＭＳ／ＭＳシステム (LTQ, ThermoFinnign, San Jose, CA, USA) ＭｕｄＰＩＴにより解析した。サンプルは、強陽イオン交換体（ＳＣＸ）カラム (Biobasic SCX, 5um, Thermo Electron, San Jose, USA) にロードし、５０μｌのバッファー（０、２、５、１０、１００および１０００ｍＭの塩化アンモニウムを５％ＡＣＮおよび０．１％ＦＡに入れたもの）の６段階の塩溶液によって分画抽出した。ＳＣＸカラムから溶出したペプチドは、Ｚｏｒｂａｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｒａｐ (Agilent, Pola Alto, CA, USA) で濃縮し、脱塩した。二次元クロマトグラフィの分離は、ｈｏｍｅ−ｐａｃｋｅｄ ｎａｎｏｂｏｒｅｄ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ (75um i.d x 10cm, 5μｍ particles) を直接ｐｉｃｏ−ｆｒｉｔ ｎａｎｏｓｐｒａｙ ｔｉｐ (New Objective, Wubrun, MA, USA) に入れ、１２０分のグラジエント、流速２００ｎＬ／ｍｉｎで行った。
【０３１４】
ＬＴＱは、各ＭＳスキャンから最も強いピーク３つのＭＳ／ＭＳスキャンを行うことにより、データ依存的モードで行った。各実験のために、６段階の塩のｍｓ／ｍｓ（ｄｔａ）スペクトルを、自作のプログラムによりシングルｍａｓｃｏｔの一般的なファイルに組み込んだ。タンパク質の同定は、社内のＭａｃｏｔサーバーを介し、ＩＰＩヒトタンパク質データベースに対して合致したデータを調査することにより行った。サーチパラメーターは、トリプシンを用いた最大２のｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ；固定修飾がカルバミノメチレーションによるもの、ならびに、可変修飾がメチオニンの酸化およびタンパク質のＮ末アセチル化によるもの、である。ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅは、タンパク質前駆体および断片イオンにおいて各々２．０および０．８Ｄａに設定した。タンパク質の同定は２つの異なるペプチドがスコア５０以上で見られた時に真陽性として認められる。多くの増殖因子およびサイトカインは低分子／ペプチドであり、少量の分泌であるので、一致するＭＳ／ＭＳスペクトルは弱く、１タンパクあたり１ペプチドのみが同定されるであろう。Ｍａｓｃｏｔスコアが２０から５０の間にあるそれらのペプチドのため、ＭＳ／ＭＳスペクトルの手動のバリデーションを行った。
【０３１５】
バイオインフォマティクス
非馴化培地中で同定したバックグラウンドのタンパク質を除去することにより、バリデートされたタンパク質の照合を行った。その後、各々のタンパク質のＩＰＩ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒを、タンパク質相互参照表を用いることにより、遺伝子記号に変換した。遺伝子産物は、遺伝子オントロジー（ＧＯ）分類ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) ＧＯ分類系の異なる生物学的プロセスまたは経路に分類し、各プロセスまたは経路の遺伝子頻度をＧｅｎｂａｎｋヒトゲノムデータベースのものと比較し、顕著に高い遺伝子頻度（ｐ＜０．０５）を伴う経路のプロセスは、ＭＳＣの分泌物により顕著に修飾されていると考えられる。
【０３１６】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡは、製品プロトコールにしたがってＴｒｉｚｏｌ試薬 (Gibco-BRL) でＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞から抽出し、スピンカラム (Nucleospin RNA II System, Macherey-Nagel GmbH &Co., Duren, Germany) で精製した。１μｇの全ＲＮＡをHigh Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) を用いて５０μｌ反応液中でランダムプライマーでｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡは、蒸留水で１００μｌになるよう希釈した。１μｌは、製品プロトコールにしたがって、経路特異的ＲＴ2ＰｒｏｆｉｌｅｒＰＣＲＡｒｒａｙｓ (SuperArray, Frederick, USA) における各プライマーセットに用いた。解析には以下のプレートを用いた。Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ＆Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ (cat. no. APH-022) 、ＮＦｋＢ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ (cat. no. APH-025) 、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ＆Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ (cat. no. APH-011) 、Ｃｏｍｍｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ (cat. no. APH-021) 、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ (cat. no. APH-039) .
【０３１７】
［実施例８］  ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオームの解析：馴化培地（ＣＭ）および非馴化培地（ＮＣＭ）の調製
血清代替培地のような添加培地による馴化培地のコンタミネーションが最小限であることを保証するために、ＨｕＥＳ９．Ｅ１ ＭＳＣｓを約８０％コンフルエントになるまで増殖させ、ＰＢＳで３回ウォッシュし、ＤＭＥＭ培地に、ＩＴＳ（インシュリン、トランスフェリンおよびセレンタンパク質）、５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２、５ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ ＡＢ (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey) 、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシンおよびβ−メルカプトエタノールを添加した化学的に定義された培地中で一晩インキュベーションした。ＨｕＥＳ９．Ｅ１ ＭＳＣｓは、この最小培地で少なくとも一週間増殖させることができる。翌日、再度、細胞培養物をＰＢＳで３回ウォッシュし、新しい定義された培地でインキュベーションした。
【０３１８】
３日間馴化した後、培地を回収した。当該馴化培地（ＣＭ）は常に、等量の非馴化培地（ＮＣＭ）と並行して解析または処理を行った。ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析のため、材料および方法に記載のように、０．９％生理食塩水に対しての透析を行う前に、培地を〜１０×に濃縮した。濃縮したＣＭおよびＮＣＭの平均タンパク質濃度は、各々９８．０±１７．９μｇ／ｍｌおよび４１．６±１．２μｇ／ｍｌ（ｎ＝３）であった。ＭＳＣｓによる培地の馴化は、培地のアリコートをタンパク質ゲルに流すことにより評価する。
【０３１９】
培地のタンパク質組成は、時間と共に複雑さを増した（図６）。ＣＭはＮＣＭよりも複雑なタンパク質組成であった。
【０３２０】
［実施例９］  ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオームの解析：ＬＣ ＭＳ／ＭＳおよび抗体アレイによるＭＳＣ馴化培地の解析
ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析により、独立して調製した２つのＣＭのバッチ中に存在し、同様に処理したＮＣＭには存在しない、次の２５０のタンパク質を同定した：1. IPI00021428 α骨格筋のアクチン (Actin, alpha skeletal muscle)、2. IPI00414057 α１骨格筋タンパク質のアクチン (Actin alpha 1 skeletal muscle protein)、3. IPI00008603 大動脈平滑筋のアクチン (Actin, aortic smooth muscle)、4. IPI00021439 細胞質１のアクチン (Actin, cytoplasmic 1)、5. IPI00023006 α心筋のアクチン (Actin, alpha cardiac)、6. IPI00021440細胞質２のアクチン (Actin, cytoplasmic 2)、7. IPI00025416 γ腸平滑筋のアクチン (Actin, enteric smooth muscle)、8. IPI00479925 アグリン (agrin)、9. IPI00015102 ＣＤ１６６抗原前駆体 (CD166 antigen precursor)、10. IPI00007423 酸性のロイシンリッチ核内リン酸化タンパク質３２ファミリーメンバーＢ (Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member B)、11. IPI00413331 ３６ｋＤａのタンパク質 (36 kDa protein)、12. IPI00412577 ３４ｋＤａのタンパク質 (34 kDa protein)、13. IPI00413506 ３３ｋＤａのタンパク質 (33 kDa protein)、14. IPI00418169 仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｐ０３１５９ (Hypothetical protein DKFZp686P03159)、15. IPI00003815 Ｒｈｏ ＧＤＰ解離阻害剤１ (Rho GDP-dissociation inhibitor 1)、16. IPI00004656 β２ミクログロブリン前駆体 (Beta-2-microglobulin precursor)、17. IPI00218042 骨形成タンパク質１前駆体のスプライス・アイソフォームＢＭＰ１−５ (Splice Isoform BMP1-5 of Bone morphogenetic protein 1 precursor)、18. IPI00009054 骨形成タンパク質１前駆体のスプライス・アイソフォームＢＭＰ１−３ (Splice Isoform BMP1-3 of Bone morphogenetic protein 1 precursor)、19. IPI00014021 骨形成タンパク質１前駆体のスプライス・アイソフォームＢＭＰ１−１ (Splice Isoform BMP1-1 of Bone morphogenetic protein 1 precursor)、20. IPI00218040  骨形成タンパク質１前駆体のスプライス・アイソフォームＢＭＰ１−４ (Splice Isoform BMP1-4 of Bone morphogenetic protein 1 precursor)、21. IPI00006980 Ｃ１４ｏｒｆ１６６タンパク質 (Protein C14orf166)、22. IPI00296165補体Ｃ１ｒサブコンポーネント前駆体 (Complement C1r subcomponent precursor)、23. IPI00152540 ＯＴＴＨＵＭＰ００００００１６７４８ (OTTHUMP00000016748)、24. IPI00305064 ＣＤ４４抗原前駆体のスプライス・アイソフォームＣＤ４４ (Splice Isoform CD44 of CD44 antigen precursor)、25. IPI00297160仮タンパク質ＤＫＦＺｐ４５１Ｋ１９１８ (Hypothetical protein DKFZp451K1918)、26. IPI00293539 カドヘリン１１前駆体のスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Cadherin-11 precursor)、27. IPI00304227 カドヘリン１１前駆体のスプライス・アイソフォーム１ (Splice Isoform 1 of Cadherin-11 precursor)、28. IPI00386476 カドヘリン−１１タイプ２アイソフォーム１前駆タンパク質 (Cadherin 11, type 2, isoform 1 preproprotein)、29. IPI00024046 カドヘリン−１３前駆体 (Cadherin-13 precursor)、
【０３２１】
30. IPI00290085 神経のカドヘリン前駆体 (Neural-cadherin precursor)、31. IPI00029739 補体因子Ｈ前駆体のスプライス・アイソフォーム１ (Splice Isoform 1 of Complement factor H precursor)、32. IPI00012011 非筋型のコフィリン (Cofilin, non-muscle isoform)、33. IPI00007257 カルシンテニン１アイソフォーム２ (calsyntenin 1 isoform 2)、34. IPI00218539 コラーゲンα１（ＸＩ）鎖前駆体のスプライス・アイソフォームＢ (Splice Isoform B of Collagen alpha-1(XI) chain precursor)、35. IPI00477350 ＸＩ型、α１のコラーゲン (Collagen, type XI, alpha 1)、36. IPI00329573 コラーゲンα１（ＸＩＩ）長鎖前駆体のスプライス・アイソフォーム (Splice Isoform Long of Collagen alpha-1(XII) chain precursor)、37. IPI00221384 コラーゲンα１（ＸＩＩ）短鎖前駆体のスプライス・アイソフォーム (Splice Isoform Short of Collagen alpha-1(XII) chain precursor)、38. IPI00400935 コラーゲンα１（ＸＶＩ）鎖前駆体(Collagen alpha-1(XVI) chain precursor)、39. IPI00297646 コラーゲンα１（Ｉ）鎖前駆体 (Collagen alpha-1(I) chain precursor)、40. IPI00164755 前α２（Ｉ）コラーゲン前駆体 (Prepro-alpha2(I) collagen precursor)、41. IPI00304962 コラーゲンα２（Ｉ）鎖前駆体 (Collagen alpha-2(I) chain precursor)、42. IPI00021033 コラーゲンα１（ＩＩＩ）鎖前駆体(Collagen alpha-1(III) chain precursor)、43. IPI00167087 ＣＯＬ３Ａ１タンパク質 (COL3A1 protein)、44. IPI00021034 コラーゲンα１（ＩＶ）鎖前駆体(Collagen alpha-1(IV) chain precursor)、45. IPI00479324 α２ＩＶ型コラーゲン前タンパク質 (alpha 2 type IV collagen preproprotein)、46. IPI00306322 コラーゲンα２（ＩＶ）鎖前駆体(Collagen alpha-2(IV) chain precursor)、47. IPI00303313 コラーゲンα１（Ｖ）鎖前駆体 (Collagen alpha-1(V) chain precursor)、48. IPI00477611 １８４ｋＤａタンパク質 (184 kDa protein)、49. IPI00293881 ＣＯＬ５Ａ２タンパク質 (COL5A2 protein)、50. IPI00018279 コラーゲンα３（Ｖ）鎖前駆体 (Collagen alpha-3(V) chain precursor)、51. IPI00291136 コラーゲンα１（ＶＩ）鎖前駆体 (Collagen alpha-1(VI) chain precursor)、52. IPI00304840 コラーゲンα２（ＶＩ）鎖前駆体のスプライス・アイソフォーム２Ｃ２ (Splice Isoform 2C2 of Collagen alpha-2(VI) chain precursor)、53. IPI00220613 コラーゲンα２（ＶＩ）鎖前駆体のスプライス・アイソフォーム２Ｃ２Ａ (Splice Isoform 2C2A of Collagen alpha-2(VI) chain precursor)、54. IPI00022200 α３ＶＩ型コラーゲンアイソフォーム１前駆体 (alpha 3 type VI collagen isoform 1 precursor)、55. IPI00072918 α３ＶＩ型コラーゲンアイソフォーム４前駆体 (alpha 3 type VI collagen isoform 4 precursor)、56. IPI00220701 コラーゲンα３（ＶＩ）鎖前駆体のスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Collagen alpha-3(VI) chain precursor)、57. IPI00072917 α３ＶＩ型コラーゲンアイソフォーム３前駆体 (alpha 3 type VI collagen isoform 3 precursor)、58. IPI00021828シスタチンＢ (Cystatin B)、59. IPI00007778 (Di-N-acetylchitobiase precursor)、60. IPI00295741 カテプシンＢ前駆体 (Cathepsin B precursor)
【０３２２】
61. IPI00299219 ＣＹＲ６１タンパク質前駆体 (Protein CYR61 precursor)、62. IPI00514900 ４２ｋＤａタンパク質 (42 kDa protein)、63. IPI00333770 サイトキネシスタンパク質１０のデディケイター類似物 (Similar to Dedicator of cytokinesis protein 10)、64. IPI00478332 サイトキネシスタンパク質９のデディケイター類似物 (Similar to Dedicator of cytokinesis protein 9)、65. IPI00000875 伸長因子１−γ (Elongation factor 1-gamma)、66. IPI00465248 α−エノラーゼ (Alpha-enolase)、67. IPI00013769肺特異的α−エノラーゼ (Alpha-enolase, lung specific)、68. IPI00216171 γ‐エノラーゼ (Gamma-enolase)、69. IPI00218803 フィブリン‐１前駆体のスプライス・アイソフォームＢ (Splice Isoform B of Fibulin-1 precursor)、70. IPI00296537 フィブリン‐１前駆体のスプライス・アイソフォームＣ (Splice Isoform C of Fibulin-1 precursor)、71. IPI00328113 フィブリン‐１前駆体 (Fibrillin-1 precursor)、72. IPI00019439 フィブリン‐２前駆体 (fibrillin 2 precursor)、73. IPI00385645 線維芽細胞増殖因子１７前駆体のスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Fibroblast growth factor 17 precursor)、74. IPI00216602 線維芽細胞増殖因子受容体２前駆体のスプライス・アイソフォーム５ (Splice Isoform 5 of Fibroblast growth factor receptor 2 precursor)、75. IPI00216604 線維芽細胞増殖因子受容体２前駆体のスプライス・アイソフォーム８ (Splice Isoform 8 of Fibroblast growth factor receptor 2 precursor)、76. IPI00034099 仮タンパク質ＦＬＪ２１９１８ (Hypothetical protein FLJ21918)、77. IPI00333541 フィラミン‐Ａ (Filamin-A)、78. IPI00302592 フィラミン‐Ａ α (Filamin A, alpha)、79. IPI00339227 仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｏ１１６６ (Hypothetical protein DKFZp686O1166)、80. IPI00414283 フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）寒冷不溶性グロブリン（ＣＩＧ）スプライス・アイソフォーム３ (Fibronectin precursor (FN) (Cold-insoluble globulin) (CIG). Splice isoform 3)、81. IPI00339225 フィブロネクチン前駆体のスプライス・アイソフォーム５ (Splice Isoform 5 of Fibronectin precursor)、82. IPI00339319 フィブロネクチン前駆体のスプライス・アイソフォーム１１ (Splice Isoform 11 of Fibronectin precursor)、83. IPI00556632 フィブロネクチン前駆体のスプライス・アイソフォーム１２ (Splice Isoform 12 of Fibronectin precursor)、84. IPI00411462 仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｂ１８１５０ (Hypothetical protein DKFZp686B18150)、85. IPI00029723 ホリスタチン関連タンパク質１前駆体 (Follistatin-related protein 1 precursor)、86. IPI00005401 Ｎ‐アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ５ポリペプチド (Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 5)、87. IPI00219025 グルタレドキシン‐１ (Glutaredoxin-1)、88. IPI00171411 ゴルジリン酸化タンパク質２ (Golgi phosphoprotein 2)、89. IPI00026314 ゲルゾリン前駆体 (Gelsolin precursor)
【０３２３】
90. IPI00219757グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ (Glutathione S-transferase P)、91. IPI00027569 異種核リボ核タンパク質Ｃ様１ (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C-like 1)、92. IPI00003881 ＨＮＲＰＦタンパク質 (HNRPF protein)、93. IPI00442294 ニューロトリミン前駆体のスプライス・アイソフォーム１ (Splice Isoform 1 of Neurotrimin precursor)、94. IPI00003865 熱ショックコグネート７１ｋＤａタンパク質のスプライス・アイソフォーム１ (Splice Isoform 1 of Heat shock cognate 71 kDa protein)、95. IPI00037070 熱ショックコグネート７１ｋＤａタンパク質のスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Heat shock cognate 71 kDa protein)、96. IPI00220362 ミトコンドリアの１０ｋＤａ熱ショックタンパク質 (10 kDa heat shock protein, mitochondrial)、97. IPI00024284基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質前駆体 (Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein precursor)、98. IPI00297284 インスリン様成長因子結合タンパク質２前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 2 precursor)、99. IPI00297284 インスリン様成長因子結合タンパク質２前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 2 precursor)、100. IPI00029236 インスリン様成長因子結合タンパク質５前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 5 precursor)、101. IPI00029236 インスリン様成長因子結合タンパク質５前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 5 precursor)、102. IPI00029235 インスリン様成長因子結合タンパク質６前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 6 precursor)、103. IPI00029235 インスリン様成長因子結合タンパク質６前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 6 precursor)、104. IPI00016915 インスリン様成長因子結合タンパク質７前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 7 precursor)、105. IPI00016915 インスリン様成長因子結合タンパク質７前駆体 (Insulin-like growth factor binding protein 7 precursor)、106. IPI00328163 Ｋ‐α１タンパク質 (K-ALPHA-1 protein)、107. IPI00021396 血管内皮細胞増殖因子受容体２前駆体 (Vascular endothelial growth factor receptor 2 precursor)、108. IPI00298281ラミニンγ１鎖前駆体 (Laminin gamma-1 chain precursor)、109. IPI00219219 ガレクチン‐１ (Galectin-1)、110. IPI00023673 ガレクチン‐３結合タンパク質前駆体 (Galectin-3 binding protein precursor)、111. IPI00021405 ラミニンＡ／Ｃのスプライス・アイソフォームＡ (Splice Isoform A of Lamin-A/C)、112. IPI00216953 ラミニンＡ／Ｃのスプライス・アイソフォームＡδ１０ (Splice Isoform ADelta10 of Lamin-A/C)、113. IPI00180173 予測：トロポミオシン４類似物 (PREDICTED: similar to tropomyosin 4)、114. IPI00401614 予測：ＦＫＳＧ３０類似物 (PREDICTED: similar to FKSG30)、115. IPI00374397 予測：トロポミオシン４類似物 (PREDICTED: similar to tropomyosin 4)、116. IPI00374732 予測：ＰＰＩＡタンパク質類似物 (PREDICTED: similar to PPIA protein)、117. IPI00402104 予測：ペプチジルプロリル イソメラーゼＡアイソフォーム１、シクロフィリンＡ、プロペプチジルの類似物 (PREDICTED: similar to peptidylprolyl isomerase A isoform 1; cyclophilin A; peptidyl-pro)、118. IPI00455415 予測：異種核リボ核タンパク質Ｃ様ｄＪ８４５Ｏ２４．４の類似物 (PREDICTED: similar to Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C-like dJ845O24.4)、119. IPI00454722 予測：ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質の類似物 (PREDICTED: similar to Phosphatidylethanolamine-binding protein)、120. IPI00454852 予測：テラトカルシノーマ由来増殖因子１類似物 (PREDICTED: similar to Teratocarcinoma-derived growth factor 1)
【０３２４】
121. IPI00002802タンパク質‐リジン ６‐オキシダーゼ前駆体(Protein-lysine 6-oxidase precursor)、122. IPI00410152 (latent transforming growth factor beta binding protein 1 isoform LTBP-1L)、123. IPI00220249 潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質アイソフォーム１Ｌ前駆体 (Latent transforming growth factor beta-binding protein, isoform 1L precursor)、124. IPI00220249 潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質アイソフォーム１Ｌ前駆体 (Latent transforming growth factor beta-binding protein, isoform 1L precursor ")、125. IPI00410152 潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質アイソフォームＬＴＢＰ‐１Ｌ前駆体 (latent transforming growth factor beta binding protein 1 isoform LTBP-1L)、126. IPI00020986 ルミカン前駆体 (Lumican precursor)、127. IPI00291006 ミトコンドリアの前駆体のマレートデヒドロゲナーゼ (Malate dehydrogenase, mitochondrial precursor)、128. IPI00005707マクロファージマンノース受容体２前駆体 (Macrophage mannose receptor 2 precursor)、129. IPI00020501 ミオシン‐１１ (Myosin-11)、130. IPI00019502 ミオシン‐１１ (Myosin-9)、131. IPI00604620ヌクレオリン (Nucleolin)、132. IPI00220740 ヌクレオフォスミンのスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Nucleophosmin)、133. IPI00219446 ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質 (Phosphatidylethanolamine-binding protein)、134. IPI00299738プロコラーゲンＣ‐エンドペプチターゼエンハンサー１前駆体 (Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 precursor)、135. IPI00015902 β血小板由来増殖因子受容体前駆体 (Beta platelet-derived growth factor receptor precursor)、136. IPI00216691プロフィリン‐１ (Profilin-1)、137. IPI00169383 ホスホグリセリン酸キナーゼ１ (Phosphoglycerate kinase 1)、138. IPI00219568精巣特異的ホスホグリセリン酸キナーゼ (Phosphoglycerate kinase, testis specific)、139. IPI00296180ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター前駆体 (Urokinase-type plasminogen activator precursor)、140. IPI00215943プレクチン１のスプライス・アイソフォーム３(Splice Isoform 3 of Plectin 1)、141. IPI00215942 プレクチン１のスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Plectin 1)、142. IPI00014898 プレクチン１のスプライス・アイソフォーム１ (Splice Isoform 1 of Plectin 1)、143. IPI00398777 プレクチン１アイソフォーム８ (plectin 1 isoform 8)、144. IPI00398776 プレクチン１アイソフォーム７ (plectin 1 isoform 7)、145. IPI00186711 プレクチン１アイソフォーム６ (plectin 1 isoform 6)、146. IPI00420096 プレクチン１アイソフォーム３ (plectin 1 isoform 3)、147. IPI00398779 プレクチン１アイソフォーム１１ (plectin 1 isoform 11)、148. IPI00398778 プレクチン１アイソフォーム１０ (plectin 1 isoform 10)、149. IPI00398002 プレクチン１アイソフォーム１ (plectin 1 isoform 1)、150. IPI00419585ペプチジル‐プロリル シス‐トランス イソメラーゼＡ (Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A)
【０３２５】
151. IPI00472718 ペプチジル‐プロリル イソメラーゼＡアイソフォーム２(peptidylprolyl isomerase A isoform 2)、152. IPI00000874 ペルオキシレドキシン‐１ (Peroxiredoxin-1)、153. IPI00024915 ミトコンドリアの前駆体のペルオキシレドキシン‐５ (Peroxiredoxin-5, mitochondrial precursor)、154. IPI00375306 ペルオキシレドキシン‐５ アイソフォームｂ (peroxiredoxin 5 precursor, isoform b)、155. IPI00012503プロアクチベーターポリペプチド前駆体のスプライス・アイソフォームＳａｐ−ｍｕ−０ (Splice Isoform Sap-mu-0 of Proactivator polypeptide precursor)、156. IPI00374179 プロテアソームアクチベーターサブユニット１アイソフォーム２ (proteasome activator subunit 1 isoform 2)、157. IPI00030154 プロテアソームアクチベーターコンプレックスサブユニット１ (Proteasome activator complex subunit 1)、158. IPI00168812 ＰＴＫ７タンパク質チロシンキナーゼ７アイソフォームｄ前駆体 (PTK7 protein tyrosine kinase 7 isoform d precursor)、159. IPI00419941 ＰＴＫ７タンパク質チロシンキナーゼ７アイソフォームａ前駆体 (PTK7 protein tyrosine kinase 7 isoform a precursor)、160. IPI00003590 Ｑｕｉｅｓｃｉｎ Ｑ６ アイソフォームａ(Quiescin Q6, isoform a)、161. IPI00015916 骨由来増殖因子（フラグメント）(Bone-derived growth factor (Fragment))、162. IPI00015916 骨由来増殖因子 (Bone-derived growth factor)、163. IPI00298289 レチキュロン‐４のスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Reticulon-4)、164. IPI00021766 レチキュロン‐４のスプライス・アイソフォーム１ (Splice Isoform 1 of Reticulon-4)、165. IPI00013895 Ｃａｌｇｉｚｚａｒｉｎ (Calgizzarin)、166. IPI00010402仮タンパク質 (Hypothetical protein)、167. IPI00218733 スーパーオキシドジスムターゼ (Superoxide dismutase)、168. IPI00014572 ＳＰＡＲＣ前駆体 (SPARC precursor)、169. IPI00005614脳１スペクトリンβ長鎖のスプライス・アイソフォーム (Splice Isoform Long of Spectrin beta chain, brain 1)、170. IPI00008780 スタニオカルシン‐２前駆体 (Stanniocalcin-2 precursor)、171. IPI00301288 ＳＥＬ‐ＯＢタンパク質 (SEL-OB protein)、172. IPI00216138トランスゲリン (Transgelin)、173. IPI00018219 ＴＧＦ‐β誘導タンパク質ｉｇ‐ｈ３前駆体 (Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 precursor)、174. IPI00304865 ＴＧＦ‐β受容体ＩＩＩ (transforming growth factor, beta receptor III ")、175. IPI00296099 トロンボスポンジン‐１前駆体 (Thrombospondin-1 precursor)、176. IPI00032292 メタロプロテイナーゼ阻害剤１前駆体 (Metalloproteinase inhibitor 1 precursor)、177. IPI00027166 メタロプロテイナーゼ阻害剤２前駆体 (Metalloproteinase inhibitor 2 precursor)、178. IPI00220828 サイモシンβ‐４ (Thymosin beta-4)、179. IPI00180240サイモシン様３ (thymosin-like 3)
【０３２６】
180. IPI00299633 ＯＴＴＨＵＭＰ００００００３１２７０（フラグメント） (OTTHUMP00000031270 (Fragment))、181. IPI00465028トリオースリン酸イソメラーゼ１変異体（フラグメント）(Triosephosphate isomerase 1 variant (Fragment))、182. IPI00451401 トリオースリン酸イソメラーゼのスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Triosephosphate isomerase)、183. IPI00010779トロンポミオシン４ (Tropomyosin 4)、184. IPI00216975トロンポミオシンα４鎖のスプライス・アイソフォーム２ (Splice Isoform 2 of Tropomyosin alpha-4 chain)、185. IPI00180675 チューブリンα３鎖 (Tubulin alpha-3 chain)、186. IPI00218343 チューブリンα６鎖 (Tubulin alpha-6 chain)、187. IPI00216298チオレドキシン (Thioredoxin)、188. IPI00472175チオレドキシン還元酵素に極めて類似したＣＤＮＡ ＦＬＪ４６６７２ ｆｉｓ、ｃｌｏｎｅ ＴＲＡＣＨ３００９００８ (CDNA FLJ46672 fis, clone TRACH3009008, highly similar to Thioredoxin reductase)、189. IPI00450472 ユビキチン結合酵素Ｅ２１ (Ubiquitin-conjugating enzyme E2I)、190. IPI00018352ユビキチンＣ末ヒドロラーゼアイソザイムＬ１ (Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1)、191. IPI00010207 ユビキチン様モディファイアー１前駆体 (Ubiquitin-fold modifier 1 precursor)、192. IPI00260630 ＵＲＢ (URB)、193. IPI00021263 １４‐３‐３タンパク質ｚｅｔａ／ｄｅｌｔａ (14-3-3 protein zeta/delta)、194. IPI00642991仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｆ１０１６４ 仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｆ１０１６４ (Hypothetical protein DKFZp686F10164)、195. IPI00470919仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｋ０８１６４ (Hypothetical protein DKFZp686K08164)、196. IPI00719088コラーゲンＶＩ型α１前駆体 (collagen, type VI, alpha 1 precursor)、197. IPI00654685 ＳＰＡＲＣ前駆体類似物 (Similar to SPARC precursor)、198. IPI00641961 コラーゲンＸＩＩ型α１ (Collagen, type XII, alpha 1)、199. IPI00645849 細胞外基質タンパク質１ (Extracellular matrix protein 1)、200. IPI00554786チオレドキシン還元酵素１ (Thioredoxin reductase 1)、201. IPI00645018 ウロキナーゼのプラスミノーゲンアクチベーター (Plasminogen activator, urokinase)、202. IPI00552339メタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤 (Tissue inhibitor of metalloproteinase 1)、203. IPI00642997細胞質２のアクチン (Actin, cytoplasmic 2)、204. IPI00719778アネキシンＡ２類似物 (Similar to Annexin A2)、205. IPI00647915トランスゲリン２ (Transgelin 2)、206. IPI00552815 コラーゲンＶ型α１ (Collagen, type V, alpha 1)、207. IPI00552981ホモサピエンスフィブリン１ＤｍＲＮＡに極めて類似したＣＤＮＡ ＰＳＥＣ０２６６ ｆｉｓ、ｃｌｏｎｅ ＮＴ２ＲＰ３００３６４９ (CDNA PSEC0266 fis, clone NT2RP3003649, highly similar to Homo sapiens fibulin-1D mRNA)、208. IPI00180776 ２９ｋＤａタンパク質 (29 kDa protein)、209. IPI00552416フィラミンＡα (Filamin A, alpha)
【０３２７】
210. IPI00640698 γ‐腸平滑筋のアクチン (Actin, gamma-enteric smooth muscle)、211. IPI00514530 α１骨格筋のアクチン (Actin, alpha 1, skeletal muscle)、212. IPI00556442インスリン様成長因子結合タンパク質２変異体（フラグメント）(Insulin-like growth factor binding protein 2 variant (Fragment))、213. IPI00513782ゲルゾリン (Gelsolin)、214. IPI00478731 ２９ｋＤａタンパク質 (29 kDa protein)、215. IPI00396479 ２４ｋＤａタンパク質 (24 kDa protein)、216. IPI00334627 ３９ｋＤａタンパク質 (39 kDa protein)、217. IPI00555762 ＰＴＫ７タンパク質チロシンキナーゼ７アイソフォーム変異体（フラグメント） (PTK7 protein tyrosine kinase 7 isoform a variant (Fragment))、218. IPI00658202 ９７ｋＤａタンパク質 (97 kDa protein)、219. IPI00006273 ＣＹＲ６１タンパク質 (CYR61 protein)、220. IPI00719405 ＴＭＳＬ６タンパク質 (TMSL6 protein)、221. IPI00658096サイモシンβ４ (Thymosin beta-4)、222. IPI00376163 ５ｋＤａタンパク質 (5 kDa protein)、223. IPI00556217フィブリリン１変異体（フラグメント） (Fibrillin 1 variant (Fragment))、224. IPI00514817 ＬａｍｉｎＡ／ｃの類似物 (Similar to Lamin A/C)、225. IPI00644087プロゲリン (Progerin)、226. IPI00655812 横紋筋肉腫抗原ＭＵ−ＲＭＳ−４０．１２ (Rhabdomyosarcoma antigen MU-RMS-40.12)、227. IPI00604517ヌクレオリン類似物 (Similar to Nucleolin)、228. IPI00444262ヌクレオリンに極めて類似したＣＤＮＡ ＦＬＪ４５７０６ ｆｉｓ、ｃｌｏｎｅ ＦＥＢＲＡ２０２８４５７ (CDNA FLJ45706 fis, clone FEBRA2028457, highly similar to Nucleolin)、229. IPI00412473タンパク質 (Protein)、230. IPI00414489タンパク質 (Protein)、231. IPI00411463 タンパク質 (Protein)、232. IPI00556415トランスゲリン変異体（フラグメント） (Transgelin variant (Fragment))、233. IPI00718825カルモジュリン (Calmodulin)、234. IPI00478156 １７ｋＤａタンパク質 (17 kDa protein)、235. IPI00386621 ＣＡＬＭ３タンパク質 (CALM3 protein)、236. IPI00647001 酸性の (Acidic)、237. IPI00642650スタニオカルシン２前駆体類似物 (Similar to Stanniocalcin 2 precursor)、238. IPI00641471コラーゲン様タンパク質 (Collagen-like protein)、239. IPI00514669 ＳＨ３ドメイン結合グルタミン酸リッチタンパク質様３ (SH3 domain binding glutamic acid-rich protein like 3)、240. IPI00719422 トリオースリン酸イソメラーゼ（フラグメント） (Triosephosphate isomerase (Fragment))、241. IPI00003734 推定のＳ１００カルシウム結合タンパク質Ｈ＿ＮＨ０４５６Ｎ１６．１ (Putative S100 calcium-binding protein H_NH0456N16.1)、242. IPI00029574 １１ｋＤａタンパク質 (11 kDa protein)、243. IPI00641047 ゲルゾリン (Gelsolin)、244. IPI00647556 ゲルゾリン (Gelsolin)、245. IPI00654821仮タンパク質ＬＯＣ５４８４５アイソフォーム１ (hypothetical protein LOC54845 isoform 1)、246. IPI00647572 Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質‐３前駆体 (Dickkopf related protein-3 precursor)、247. IPI00639879サイトキネシスタンパク質ｓｅｐＡ類似物 (Similar to Cytokinesis protein sepA)、248. IPI00657746 サイトキネシスタンパク質８のデディケイター類似物 (Similar to Dedicator of cytokinesis protein 8)、249. IPI00555993血管内皮細胞増殖因子受容体３変異体 (Vascular endothelial growth factor receptor 3 variant)、250. IPI00552545 サイトキネシスタンパク質８のデディケイター (Dedicator of cytokinesis protein 8) 。
【０３２８】
以上、これら２５０のタンパク質は、次の１３２の独自の公知の遺伝子によりコードされている：ＡＣＴＡ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＨＳＰＡ８、ＰＳＡＰ、ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ５Ａ３、ＨＳＰＥ１、ＰＳＭＥ１、ＡＣＴＢ、ＣＯＬ６Ａ１、ＨＳＰＧ２、ＰＴＫ７、ＡＣＴＣ、ＣＯＬ６Ａ２、ＩＧＦＢＰ２、ＱＳＣＮ６、ＡＣＴＧ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＩＧＦＢＰ５、ＲＴＮ４、ＡＣＴＧ２、ＣＳＴＢ、ＩＧＦＢＰ６、Ｓ１００Ａ１１、ＡＧＲＮ、ＣＴＢＳ、ＩＧＦＢＰ７、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＡＬＣＡＭ、ＣＴＳＢ、Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１、ＳＯＤ１、ＡＮＰ３２Ｂ、ＣＹＲ６１、ＫＤＲ、ＳＰＡＲＣ、ＡＮＸＡ２、ＤＯＣＫ１０、ＬＡＭＣ１、ＳＰＴＢＮ１、ＡＲＨＧＤＩＡ、ＤＯＣＫ８、ＬＧＡＬＳ１、ＳＴＣ２、Ｂ２Ｍ、ＥＣＭ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＳＶＥＰ１、ＢＭＰ１、ＥＥＦ１Ｇ、ＬＭＮＡ、ＴＡＧＬＮ、Ｃ１４ｏｒｆ１６６、ＥＮＯ１、ＬＯＸ、ＴＡＧＬＮ２、Ｃ１Ｒ、ＥＮＯ１Ｂ、ＬＴＢＰ１、ＴＧＦＢＩ、ＣＡＬＭ１、ＥＮＯ２、ＬＵＭ、ＴＧＦＢＲ３、ＣＤ１０９、ＦＢＬＮ１、ＭＤＨ２、ＴＨＢＳ１、ＣＤ４４、ＦＢＮ１、ＭＲＣ２、ＴＩＭＰ１、ＣＤＨ１１、ＦＢＮ２、ＭＹＨ１１、ＴＩＭＰ２、ＣＤＨ１３、ＦＧＦ１７、ＭＹＨ９、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＤＨ２、ＦＧＦＲ２、ＮＣＬ、ＴＭＳＬ３、ＣＦＨ／ＨＦ１、ＦＬＪ２１９１８、ＮＰＭ１、ＴＭＳＬ６、ＣＦＬ１、ＦＬＮＡ、ＰＢＰ、ＴＰＩ１、ＣＬＳＴＮ１、ＦＮ１、ＰＣＯＬＣＥ、ＴＰＭ４、ＣＯＬ１１Ａ１、ＦＳＴＬ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＴＵＢＡ３、ＣＯＬ１２Ａ１、ＧＡＬＮＴ５、ＰＦＮ１、ＴＵＢＡ６、ＣＯＬ１６Ａ１、ＧＬＲＸ、ＰＧＫ１、ＴＸＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＧＯＬＰＨ２、ＰＧＫ２、ＴＸＮＲＤ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＧＳＮ、ＰＬＡＵ、ＵＢＥ２Ｉ、ＣＯＬ３Ａ１、ＧＳＴＰ１、ＰＬＥＣ１、ＵＣＨＬ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＨＮＲＰＣＬ１、ＰＰＩＡ、ＵＦＭ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＨＮＲＰＦ、ＰＲＤＸ１、ＵＲＢ、ＣＯＬ５Ａ１、ＨＮＴ、ＰＲＤＸ５、ＹＷＨＡＺ。
【０３２９】
未知のタンパク質が３２個存在した：IPI00642991 仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｆ１０１６４ (Hypothetical protein DKFZp686F10164)、IPI00470919 仮タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｋ０８１６４ (Hypothetical protein DKFZp686K08164)、IPI00654685 ＳＰＡＲＣ前駆体の類似物 (Similar to SPARC precursor)、IPI00719778 アネキシンＡ２の類似物 (Similar to Annexin A2)、IPI00552981 ヒトフィブリン１Ｄ ｍＲＮＡに極めて類似したＣＤＮＡ ＰＳＥＣ０２６６ ｆｉｓ、ｃｌｏｎｅ ＮＴ２ＲＰ３００３６４９ (CDNA PSEC0266 fis, clone NT2RP3003649, highly similar to Homo sapiens fibulin-1D mRNA)、IPI00180776 ２９ｋＤａタンパク質 (29 kDa protein)、IPI00478731 ２９ｋＤａタンパク質 (29 kDa protein)、IPI00396479 ２４ｋＤａタンパク質 (24 kDa protein)、IPI00334627 ３９ｋＤａタンパク質 (39 kDa protein)、IPI00658202 ９７ｋＤａタンパク質 (97 kDa protein)、IPI00376163 ５ｋＤａタンパク質 (5 kDa protein; IPI00514817 ラミンＡ／Ｃ (Similar to Lamin A/C)、IPI00644087 プロゲリン (Progerin)、IPI00655812 横紋筋肉腫抗原ＭＵ−ＲＭＳ−４０．１２ (Rhabdomyosarcoma antigen MU-RMS-40.12)、IPI00604517 ヌクレオリンの類似物 (Similar to Nucleolin)、IPI00444262 ヌクレオリンに極めて類似したＣＤＮＡ ＦＬＪ４５７０６ ｆｉｓ、ｃｌｏｎｅ ＦＥＢＲＡ２０２８４５７ (CDNA FLJ45706 fis, clone FEBRA2028457, highly similar to Nucleolin)、IPI00412473 タンパク質 (Protein)、IPI00414489 タンパク質 (Protein)、IPI00411463 タンパク質 (Protein)、IPI00478156 １７ｋＤａタンパク質 (17 kDa protein)、IPI00386621 ＣＡＲＭ３タンパク質 (CALM3 protein)、IPI00647001 酸性の (Acidic)、IPI00642650 スタニオカルシン２前駆体の類似物 (Similar to Stanniocalcin 2 precursor)、IPI00641471 コラーゲン様タンパク質 (Collagen-like protein)、IPI00514669 ＳＨ３ドメイン結合グルタミン酸リッチタンパク質様３ (SH3 domain binding glutamic acid-rich protein like 3)、IPI00003734 推定のＳ１００カルシウム結合タンパク質Ｈ＿ＮＨ０４５６Ｎ１６．１ (Putative S100 calcium-binding protein H_NH0456N16.1)、IPI00029574 １１ｋＤａタンパク質 (11 kDa protein)、IPI00654821 仮タンパク質ＬＯＣ５４８４５アイソフォーム１ (hypothetical protein LOC54845 isoform 1)、IPI00647572 Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質‐３前駆体 (Dickkopf related protein-3 precursor)、IPI00639879 サイトキネシスタンパク質ＳｅｐＡの類似物 (Similar to Cytokinesis protein sepA)、IPI00657746サイトキネシスタンパク質８のデディケーターの類似物 (Similar to Dedicator of cytokinesis protein 8)、IPI00555993 血管内皮細胞増殖因子受容体３変異体 (Vascular endothelial growth factor receptor 3 variant) 。
【０３３０】
したがって、本書に記載されるＭＳＣｓは、これらのいずれかもしくは全てのタンパク質、または、それらにより分泌もしくは発現されたいずれかのタンパク質もしくはその他の分子のソースとして用いることができる。
【０３３１】
ＭＳＣｓは、それらの周辺の細胞に影響を与える広範囲のサイトカインおよび増殖因子を分泌することが知られている8。これらの因子の多くは、ショットガンＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析で容易に検出することができない低分子である。それゆえ、当該ＣＭおよびＮＣＭはまた、１０１のサイトカイン／増殖因子に対する抗体で行う、異なる５つの抗体アレイへのハイブリダイゼーションにより解析を行った。
【０３３２】
抗体アレイのレイアウト
RayBio（登録商標）血管新生アレイＩ（Angiogenesis array I）
2010500047.tif 000163
【０３３３】
RayBio（登録商標）ヒトケモカイン抗体アレイＩ（Human Chemokine Antibody Array I）
2010500047.tif 000164
【０３３４】
RayBio（登録商標）マトリクスメタロプロテイナーゼ抗体アレイＩ（Matrix Metalloproteinases Antibody Array I）
2010500047.tif 000165
【０３３５】
RayBio（登録商標）ヒトサイトカイン抗体アレイＩ（Human Cytokine Antibody Array I）
2010500047.tif 000166
【０３３６】
RayBio（登録商標）ヒトサイトカイン抗体アレイＶ（Human Cytokine Antibody Array V）
2010500047.tif 000167
【０３３７】
独立して調製した４つのＣＭのうち少なくとも３つで、ＨｕＥＳ９．Ｅ１により７２のサイトカイン／増殖因子が再現可能に分泌し、ＮＣＭでは分泌していないことがわかった。抗体アレイにより同定した７２のタンパク質は次の通りである（名前  遺伝子記号  遺伝子ＩＤ）：１．ＭＤＣ  ＡＤＡＭ１１  ＧＩ＿１１４９６９９７−Ａ、２．Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ  ＡＮＧ  ＧＩ＿４２７１６３１２−Ｓ、３．ＢＤＮＦ  ＢＤＮＦ  ＧＩ＿３４１０６７０９−Ａ、４．Ｉ−３０９  ＣＣＬ１  ＧＩ＿４５０６８３２−Ｓ、５．Ｅｏｔａｘｉｎ  ＣＣＬ１１  ＧＩ＿２２５３８３９９、６．ＭＩＰ−１δ  ＣＣＬ１５  ＧＩ＿３４３３５１８０−Ａ、７．ＨＣＣ−４  ＣＣＬ１６  ＧＩ＿２２５３８８００、８．ＭＣＰ−１  ＣＣＬ２  ＧＩ＿２２５３８８１２−Ｓ、９．Ｃｋβ８−１  ＣＣＬ２３  ＧＩ＿２２５３８８０７−Ａ、１０．Ｅｏｔａｘｉｎ−２  ＣＣＬ２４  ＧＩ＿２２１６５４２６−Ｓ、１１．Ｅｏｔａｘｉｎ−３  ＣＣＬ２６  ＧＩ＿２２５４７１５１−Ｓ、１２．ＲＡＮＴＥＳ  ＣＣＬ５  ＧＩ＿２２５３８８１３、１３．ＭＣＰ−３  ＣＣＬ７  ＧＩ＿１３４３５４０１−Ｓ、１４．ＭＣＰ−２  ＣＣＬ８  ＧＩ＿２２５３８８１５−Ｓ、１５．ＭＣＳＦ  ＣＳＦ１  ＧＩ＿２７２６２６６６−Ｉ、１６．ＧＭ−ＣＳＦ  ＣＳＦ２  ＧＩ＿２７４３７０２９−Ｓ、１７．ＧＣＳＦ  ＣＳＦ３  ＧＩ＿２７４３７０４８、１８．Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ  ＣＸ３ＣＬ１  ＧＩ＿４５０６８５６−Ｓ、１９．ＧＲＯ−ａ  ＣＸＣＬ１  ＧＩ＿４５０４１５２−Ｓ、２０．Ｉ−ＴＡＣ  ＣＸＣＬ１１  ＧＩ＿１４７９０１４５−Ｓ、２１．ＳＤＦ−１  ＣＸＣＬ１２  ＧＩ＿４０３１６９２３、２２．ＢＬＣ  ＣＸＣＬ１３  ＧＩ＿５４５３５７６−Ｓ、２３．ＥＮＡ−７８  ＣＸＣＬ５  ＧＩ＿４１８７２６１３−Ｓ、２４．ＩＰ−１０  ＣＸＣＲ３  ＧＩ＿４５０４０９８−Ｓ、２５．ＥＧＦ  ＥＧＦ  ＧＩ＿６０３１１６３−Ｓ、２６．ＦＧＦ−４  ＦＧＦ４  ＧＩ＿４５０３７００、２７．ＦＧＦ−６  ＦＧＦ６  ＧＩ＿１０３３７５８６、２８．ＦＧＦ−７  ＦＧＦ７  ＧＩ＿１５１４７３４４、２９．ＦＧＦ−９  ＦＧＦ９  ＧＩ＿４５０３７０６−Ｓ、３０．Ｆｉｔ  ３  Ｌｉｇａｎｄ  ＦＬＴ３ＬＧ  ＧＩ＿３８４５５４１５−Ｓ、３１．ＧＤＮＦ  ＧＤＮＦ  ＧＩ＿４０５４９４１０、３２．ＧＣＰ−２  ＧＯＬＧＡ４  ＧＩ＿４５３５９８５４−Ｓ、３３．ＨＧＦ  ＨＧＦ  ＧＩ＿３３８５９８３４−Ｓ、３４．ＩＦＮ−γ  ＩＦＮＧ  ＧＩ＿１０８３５１７０−Ｓ、３５．ＩＧＦ−Ｉ  ＩＧＦ１  ＧＩ＿１９９２３１１１−Ｓ、３６．ＩＧＦＢＰ−１  ＩＧＦＢＰ１  ＧＩ＿４５０４６１４−Ｓ、３７．ＩＧＦＢＰ−２  ＩＧＦＢＰ２  ＧＩ＿１０８３５１５６−Ｓ、３８．ＩＧＦＢＰ−４  ＩＧＦＢＰ４  ＧＩ＿１０８３５０２０−Ｓ、３９．ＩＬ−１０  ＩＬ１０  ＧＩ＿２４４３０２１６−Ｓ、４０．ＩＬ−１２ｐ４０ｐ７０  ＩＬ１２Ｂ  ＧＩ＿２４４９７４３７−Ｓ、４１．ＩＬ−１３  ＩＬ１３  ＧＩ＿２６７８７９７７−Ｓ、４２．ＩＬ−１６  ＩＬ１６  ＧＩ＿２７２６２６５４−Ａ、４３．ＩＬ−１ａ  ＩＬ１Ａ  ＧＩ＿２７８９４３２９−Ｓ、４４．ＩＬ−１β  ＩＬ１Ｂ  ＧＩ＿２７８９４３０５−Ｓ、４５．ＩＬ−２  ＩＬ２  ＧＩ＿２��１７８８６０−Ｓ、４６．ＩＬ−３  ＩＬ３  ＧＩ＿２８４１６９１４−Ｓ、４７．ＩＬ−６  ＩＬ６  ＧＩ＿１０８３４９８３−Ｓ、４８．ＩＬ−７  ＩＬ７  ＧＩ＿２８６１０１５２−Ｓ、４９．ＩＬ−８  ＩＬ８  ＧＩ＿２８６１０１５３−Ｓ、５０．ＳＣＦ  ＫＩＴＬＧ  ＧＩ＿４５８０４１９−Ａ、５１．ＬＥＰＴＩＮ  ＬＥＰ  ＧＩ＿４５５７７１４−Ｓ、５２．ＬＩＦ  ＬＩＦ  ＧＩ＿６００６０１８−Ｓ、５３．ＭＩＦ  ＭＩＦ  ＧＩ＿４５０５１８４−Ｓ、５４．ＭＭＰ−１  ＭＭＰ１  ＧＩ＿１３０２７７９８−Ｓ、５５．ＭＭＰ−１０  ＭＭＰ１０  ＧＩ＿４５０５２０４−Ｓ、５６．ＭＭＰ−１３  ＭＭＰ１３  ＧＩ＿１３０２７７９６−Ｓ、５７．ＭＭＰ  ３  ＭＭＰ３  ＧＩ＿１３０２７８０３−Ｓ、５８．ＭＭＰ−９  ＭＭＰ９  ＧＩ＿４８２６８３５−Ｓ、５９．ＰＡＲＣ  ＰＡＲＣ  ＧＩ＿２４３０７９９０、６０．ＰＤＧＦ−ＢＢ  ＰＤＧＦＢ  ＧＩ＿１５４５１７８５−Ａ、６１．ＰＩＧＦ  ＰＩＧＦ  ＧＩ＿２７８９４２８９−Ａ、６２．ＴＧＦ−β１  ＴＧＦＢ１  ＧＩ＿１０８６３８７２、６３．ＴＧＦ−β２  ＴＧＦＢ２  ＧＩ＿４５０７４６２−Ｓ、６４．Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ＴＨＰＯ  ＧＩ＿４０８０５８７１−Ｓ、６５．ＴＩＭＰ−１  ＴＩＭＰ１  ＧＩ＿４５０７５０８−Ｓ、６６．ＴＩＭＰ−２  ＴＩＭＰ２  ＧＩ＿９２５７２４７−Ｓ、６７．ＴＩＭＰ−３  ＴＩＭＰ３  ＧＩ＿２１５３６４３１−Ｓ、６８．ＴＩＭＰ−４  ＴＩＭＰ４  ＧＩ＿４５０７５１４−Ｓ、６９．ＴＮＦ−α  ＴＮＦ  ＧＩ＿２５９５２１１０、７０．Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ  ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ  ＧＩ＿２２５４７１２２−Ｓ、７１．ＶＥＧＦ  ＶＥＧＦ  ＧＩ＿３０１７２５６３−Ｓ、７２．  Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ  ＸＣＬ１  ＧＩ＿４５０６８５２−Ｓ。
【０３３８】
抗体アレイにより検出されなかった２９のタンパク質は次の通りである（名前  遺伝子記号  遺伝子ＩＤ）：ｂＦＧＦ  ＣＣＬ２３  ＧＩ＿２２５３８８０７−Ａ、ＭＣＰ−４  ＣＣＬ１３  ＧＩ＿２２５３８７９９−Ｓ、ＴＡＲＣ  ＣＣＬ１７  ＧＩ＿２２５３８８０１−Ｓ、ＭＩＰ−３ｂ  ＣＣＬ１９  ＧＩ＿２２１６５４２４−Ｓ、ＭＩＰ−３ａ  ＣＣＬ２０  ＧＩ＿４７５９０７５−Ｓ、ＭＰＩＦ−１  ＣＣＬ２３  ＧＩ＿２２５３８８０７−Ａ、ＴＥＣＫ  ＣＣＬ２５  ＧＩ＿２２５３８７９７−Ａ、ＣＴＡＣＫ  ＣＣＬ２７  ＧＩ＿２２１６５４２８−Ｓ、ＣＣＬ２８  ＣＣＬ２８  ＧＩ＿２２５３８８１０−Ａ、ＭＩＰ−１ｂ  ＣＣＬ４  ＧＩ＿４５０６８４４−Ｓ、ＳＤＦ−１ａ  ＣＸＣＬ１２  ＧＩ＿４０３１６９２３−Ｉ、ＳＤＦ−１ｂ  ＣＸＣＬ１２  ＧＩ＿４０３１６９２３−Ｉ、ＣＸＣＬ１６  ＣＸＣＬ１６  ＧＩ＿１１５４５７６４−Ｓ、ＭＩＧ  ＣＸＣＬ９  ＧＩ＿４５０５１８６−Ｓ、ＭＩＰ−１ａ  ＣＸＣＲ６  ＧＩ＿５７３０１０５−Ｓ、ＩＧＦＢＰ−３  ＩＧＦＢＰ３  ＧＩ＿１９９２３１１０−Ｓ、ＩＬ−１５  ＩＬ１５  ＧＩ＿２６７８７９７９−Ａ、ＩＬ−４  ＩＬ４  ＧＩ＿２７４７７０９１−Ａ、ＩＬ−５  ＩＬ５  ＧＩ＿２８５５９０３２−Ｓ、ＴＮＦ−ｂ  ＬＴＡ  ＧＩ＿６８０６８９２−Ｓ、ＭＭＰ−２  ＭＭＰ２  ＧＩ＿１１３４２６６５−Ｓ、ＭＭＰ−８  ＭＭＰ８  ＧＩ＿４５０５２２０−Ｓ、ＮＡＰ−２  ＮＡＰ１Ｌ４  ＧＩ＿２１３２７７１１−Ｓ、ＮＴ−３  ＮＴＦ３  ＧＩ＿４５３５９８６９−Ｓ、ＮＴ−４  ＮＴＦ５  ＧＩ＿３４３２８９３３−Ｓ、Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ  ＯＳＭ  ＧＩ＿２８１７８８６２−Ｓ、ＴＧＦ−ｂ１  ＴＧＦＢ１  ＧＩ＿１０８６３８７２−Ｓ、ＬＩＧＨＴ  ＴＮＦＳＦ１４  ＧＩ＿２５９５２１４６−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｄ  ＶＥＧＦＤ  ＧＩ＿１９９２４２９７−Ｓ。
【０３３９】
おそらく、多くのサイトカインおよび増殖因子は低分子であるために、慣習的なＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析では検出できないのが、ＩＧＦＢＰ２、ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２の３つの遺伝子産物のみ、ＬＣ ＭＳ／ＭＳ解析により検出することができた。
【０３４０】
各々ＬＣ ＭＳ／ＭＳおよび抗体アレイにより同定された１３２および７２の遺伝子産物リストには、３つの共通遺伝子、すなわちＩＧＦＢＰ２、ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２が存在する。それゆえ、最終的には全部で２０１の独自の遺伝子産物を同定した（下記表Ｅ２）。
【０３４１】
【表Ｅ２】
2010500047.tif 000168
【０３４２】
ＬＣ ＭＳ／ＭＳおよび抗体アレイにより同定した２０１の独自の遺伝子産物のアルファベット順のリスト。ＬＣ ＭＳ／ＭＳおよび抗体アレイにより同定したタンパク質を併せて、それらの遺伝子記号により表した。各々の遺伝子の転写レベルは、ハイスループットＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙを用いて評価した。
【０３４３】
これら遺伝子産物のうち２９の遺伝子産物、すなわち、ＥＮＡ−７８、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−９、ＧＣＰ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ−ａ、ＨＣＣ−４、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＬＩＦ、ＭＣＰ−１、ＭＣＳＦ、ＭＩＦ、Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ、ＰＡＲＣ、ＰＩＧＦ、ＳＣＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＶＥＧＦは、成体組織由来のＭＳＣｓにより分泌されることが報告されている（１３，１６，１９−２１）。成体組織由来のＭＳＣｓにより分泌されることが報告されているその他４つのタンパク質、すなわち、ＩＧＦＢＰ−３、ＭＩＰ−３α、オンコスタチンＭおよびＴＧＦ−３（上記参照）は、本発明者らの２０１遺伝子産物リストには存在しない。
【０３４４】
［実施例１０］  ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオームの解析：ゲノムワイドな遺伝子発現解析による検証
当該２０１遺伝子産物と、全ＲＮＡのＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙへのハイブリダイズにより生成したｈＥＳＣ−ＭＳＣｓのゲノムワイドな遺伝子発現プロファイルとの比較により、１３４または６７％の遺伝子産物が、９９％の信頼性を伴う上限値の遺伝子転写レベルで存在することが明らかとなった（表Ｅ２）。ＬＣ ＭＳ／ＭＳにより同定した１３２の遺伝子産物の１１５もしくは８８％が検出可能な遺伝子レベルである一方（表Ｅ２）、抗体アレイにより同定した７２遺伝子産物の２７もしくは３８％が検出可能な転写レベルであり、４５もしくは６２％が検出できない転写レベルであった（表Ｅ２）。２つの遺伝子産物（ＥＮＯ１ＢおよびＳＶＥＰ１）用のプローブは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙ上に存在しない。サイトカイン／ケモカインをコードするｍＲＮＡは、翻訳の間にｍＲＮＡの急速な分解を引き起こすＡＵリッチエレメントを含むことが知られているので、７２遺伝子のうちの大抵の遺伝子の転写レベルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙによる検出を行うには低すぎると考えられる（２２，２３）。
【０３４５】
そのため、より感度の良いｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを行った。７２個中４２の遺伝子産物をランダムに選択し、試験を行った。４２遺伝子産物中、３６もしくは８６％が、ノーマライズドＣｔ値＜３５で定義される検出可能な転写レベルを示した（下記表Ｅ３）。この頻度は、ＬＣ ＭＳ／ＭＳにより同定され、その遺伝子転写物がＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙで検出可能な遺伝子産物で観察される頻度と、８８％の類似性を示すものである。加えて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙで検出可能な転写レベルを持つ１５個全てが、ｑＲＴ−ＰＣＲで検出可能な転写レベルを持つ（表Ｅ３）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙで検出できなかった転写レベルである、２７個中２１個（７８％）の遺伝子産物が、ｑＲＴ−ＰＣＲで検出可能な転写レベルを持つ（表Ｅ３）。
【０３４６】
【表Ｅ３】
2010500047.tif 000169
【０３４７】
2010500047.tif 000170
【０３４８】
2010500047.tif 000171
【０３４９】
転写物の定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析のため、抗体アレイにより同定した遺伝子産物７２個のうち４２個をランダムに選択した。１２個の遺伝子産物が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙ、ハイスループットゲノムワイド遺伝子発現アッセイにおいて９９％の信頼性で、検出限界値（ＬＯＤ）よりも高い転写レベルを持っていた。各遺伝子のＣｔ値はアクチンで補正（ノーマライズ）した。
【０３５０】
［実施例１１］  ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオームの解析：分泌タンパク質により修飾される生物学的プロセス
分泌された産物が傷害組織や臓器を周福する能力を持つかどうかを調べるため、遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）に従って、遺伝子産物をその生物学的プロセスと経路により分類した。その後、各プロセスまたは経路に関連する分泌されたＭＳＣプロテオームにおける独自遺伝子の頻度を、Ｕｎｉｇｅｎｅ、ＥｎｔｒｅｚおよびＧｅｎＢａｎＫのデータベース中の各々の経路もしくはプロセスの遺伝子頻度と比較した。非常に高頻度の遺伝子（ｐ＜０．０５）は、５８の生物学的プロセスおよび３０の経路と関連していた。
【０３５１】
２０１の独自遺伝子産物により修飾されたＧＯ（遺伝子オントロジー）により分類された生物学的プロセス：
2010500047.tif 000172
【０３５２】
2010500047.tif 000173
【０３５３】
2010500047.tif 000174
【０３５４】
2010500047.tif 000175
【０３５５】
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【０３５６】
2010500047.tif 000177
【０３５７】
５８の生物学的プロセスは、代謝、防御応答および組織分化の３つの主要なグループに分けることができ、一方で３０の経路は、受容体結合、シグナル伝達、細胞‐細胞間相互作用、細胞遊走、免疫応答および代謝と、広範に分類することができる（図８、図９）。想定される生物学的プロセスおよび経路の両方は、エネルギー生産、高分子の分解、生合成および分泌、損傷組織の除去および新しい組織の再生に必要なプロセス、を調節する細胞内代謝に分泌タンパク質が強い影響を持つことを示唆している（図８、図９）。
【０３５８】
ＭＳＣ馴化培地中でサイトカインおよびケモカインが支配的に存在していることと一致して、本解析はまた、分泌因子が外的刺激（例えば、走化性、走性および多くの免疫応答）に依存する多くの細胞内応答を引き起こすことを予測した（図８）。特に、当該馴化培地はまた、組織の分化、特に脈管形成、造血および骨の発達を促進するプロセスにおいて重要である生物学的プロセスを誘導することができる（図８）。
【０３５９】
分泌されたプロテオームにより調節されると予測されるそれらの経路において、受容体を介したサイトカインおよびＥＣＭの結合の経路は、分泌されたプロテオーム中のサイトカインおよびＥＣＭ成分の支配と一致している（図９）分泌されたプロテオームにより活性化される主要なシグナル伝達経路は、Ｊａｋ‐ＳＴＡＴシグナル伝達経路、ＭＡＰＫシグナル伝達経路、トール様受容体シグナル伝達経路、ＴＧＦ‐βシグナル伝達経路、ｍＴＯＲシグナル伝達経路、ＦｃεＲＩシグナル伝達経路、および、ヘリコバクターピロリ感染における上皮細胞のシグナル伝達を含むものである。分泌されたプロテオームのコンピューター解析はまた、ＭＳＣ分泌物が細胞‐細胞間相互作用、遊走および免疫応答を強めることを示唆している。
【０３６０】
［実施例１２］  ヒトＥＳＣ由来ＭＳＣｓ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓ）のプロテオームの解析：ディスカッション
ＭＳＣｓは、無数の疾病の前臨床試験および臨床試験に用いられている（３−５，２４−２７）。しかしながら、そのメカニズムは不明確なままである。ＭＳＣｓは多数の細胞タイプ（例えば、損傷組織を修複または再生できる可能性を持つ内皮細胞、心筋細胞、軟骨細胞）に分化する可能性を持っているが、ＭＳＣｓの治療効果は、ＭＳＣの分化が通常、組織修復または組織機能の回復を介在するにはあまりにも非効率すぎるので、単にＭＳＣ由来の修復細胞タイプの生成により介されるものではない。ＭＳＣｓのいくつかの治療効果は、ＭＳＣｓにより分泌されるパラクリン因子により介されるものであることが、次第に提案されてきている（８）。ここで本発明者らは、ＬＣ‐ＬＣ‐ＭＳおよび抗体アレイの２つの技術の組み合わせによりｈＥＳＣ−ＭＳＣｓの分泌されたプロテオームの組成を記載する。
【０３６１】
ＬＣ‐ＬＣ‐ＭＳによるショットガンプロテオミクス解析は、高感度な手法であり、ハイスループット能力を持っているが、ほとんどのサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子を含む低分子タンパク質／ペプチドを検出することは難しい。このことは、抗体アレイを用いることにより部分的に軽減される。この２つ技術を用いたＭＳＣ分泌物の定量的プロテオミクスプロファイルは、再現性が高い。ＬＣ ＭＳ／ＭＳにより同定されたタンパク質は、独立して調製した２つのＣＭのバッチに存在し、一方で、抗体アレイにより同定したタンパク質は、独立して調製した４つのＣＭのバッチ中少なくとも３つに存在する。
【０３６２】
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓによる分泌物のプロテオミクスプロファイルの結果は、以前に報告されている、成体組織由来ＭＳＣｓ（１３、１６、１９−２１）により分泌されるほぼ全ての因子と、報告されていない多くの因子を含むものであった。さらに、ハイスループットマイクロアレイに基づいた遺伝子発現解析を用いてプロテオミクスプロファイル中の遺伝子産物の８６−８８％の転写物を検出することにより、プロテオミクスプロファイリングのロバスト性を実証した。
【０３６３】
ＭＳＣ分泌物の潜在的な機能を世界的規模で評価するために、本発明者らは、転写後修飾タンパク質よりむしろ遺伝子産物に基づいた遺伝子発現解析のために、より容易に利用できるコンピューターのツールを利用した。分泌物中のサイトカインおよびケモカインの支配と一致して、コンピューター解析は、多くのプロセスおよび経路は、走化性、走性、外的刺激に対する細胞内応答、高分子の分解、生合成および分泌、サイトカイン‐サイトカイン受容体間相互作用、細胞間連絡および基礎代謝（例えば、グルコースおよびアミノ酸代謝）のような、サイトカインおよびケモカインの機能と通常関連していると予測した。ここで記載されるＭＳＣｓは、これらの機能が関与する疾病の治療に用いることができる。
【０３６４】
これらのプロセスおよび経路は、どのような特定細胞もしくは組織タイプにおいても、損傷、修復および再生のプロセスに特異的であるわけではないが、免疫細胞の損傷部位への遊走、ＥＣＭリモデリング、細胞内代謝の増加の容易さは、大抵の損傷または病変組織に対する修復効果を持っている。
【０３６５】
コンピューター解析はまた、サイトカインおよびケモカインに関連した一般的経路だけでなく、分泌タンパク質は、血管新生、造血および骨格発生に関与する多くのプロセスを調節することを予測した。同時に、報告されている大抵のＭＳＣを介した組織修復または再生は、心臓血管、造血および筋骨格の組織に関連している（３−５、２４−２７）。さらに、経路解析は、いくつかのＭＳＣのパラクリン作用を介することに関与するかもしれない候補経路を明らかにした。実際、これらの候補経路の多くは、すでに造血および筋骨格の生物学に関係している。例えば、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達は、心臓保護（２８）、造血（２９、３０）ならびに骨格の修復およびリモデリング（３１、３２）に関連しており、ＭＡＰＫシグナル伝達は、心臓血管系応答（３３、３４）、骨格の修復およびリモデリング（３２、３５）および造血（３６）の多くの局面において、重要な役割を果たしており、トール様受容体シグナル伝達は、心臓血管病理の開始と進行（３７）および先天性免疫と適応免疫の調節（３８）に関係しており、ＴＧＦ−βシグナル伝達は、一般的な創傷治癒（４４）と同様に、正確な心臓の発達、心臓リモデリング、心疾患の進行および血管新生（３９−４１）造血（４２）、骨および軟骨の形成とリモデリング（２７、４３）に重要であり、そして、細胞増殖の重要な調節因子であるｍＴＯＲは、通常の生理および疾病において、重要であるが非特異的な役割を果たしている（４５−４７）。
【０３６６】
結果として、成体組織由来ＭＳＣｓにより分泌されることが報告されている多くのサイトカインを含む、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣｓの分泌タンパク質の本発明者らによる解析は、分泌プロテオームは、特に心臓血管、造血、筋骨格組織の組織修復や再生に、影響を及ぼす調節能力を持っており、そのため、ＭＳＣ移植研究における組織修復や再生に対するＭＳＣを介したパラクリン効果の分子サポートを提供することを示唆している。また、この分泌プロテオームは、高度に検証可能なＭＳＣを介した組織修復の分子メカニズム、および、組織修復や再生を調節するための薬の標的になる可能性のあるもの明らかにした。ｈＥＳＣ由来ＭＳＣｓと成体組織由来ＭＳＣｓの間の顕著な類似性は、ＭＳＣ培養物の馴化培地も同様の生物活性を持つ可能性が高いことを示唆している。
【０３６７】
したがって、このことは、本発明者らの方法により誘導されたＭＳＣｓは、骨髄由来の対応物と顕著な生物学的類似性を持つことを示している。これらの発見は、パラクリン因子を分泌する能力におけるｈＥＳＣ−ＭＳＣｓと成体ＢＭ由来ＭＳＣｓの類似性を示している。さらに、いずれか１または複数のここで記載されるＭＳＣｓから分泌されるタンパク質は、馴化培地のかたちも含めて、ここで記載されるＭＳＣｓと同様の目的のために用いることができる。
【０３６８】
しかし、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣｓには、成体組織由来ＭＳＣｓよりも有利な点がいくつかある。ＭＳＣの組織ソースとしてのｈＥＳＣ細胞株の使用は、無限に再生可能で増殖可能なソースを構成し、再現可能で一貫した臨床的に準拠したＣＭになるＭＳＣバッチの調製を高める。これはまた、ＣＭ調製の拡張性（スケーラビリティ）と低コストの既成の治療の発展の可能性を後押しするものである。加えて、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣ ＣＭの調製のための化学的に定義された無血清培地の開発は、血清や血清代替物のような複合培地添加物と関連する交絡変数であるコンタミネーションを減少させる。それゆえ、本発明者らのＣＭの解明は、臨床応用に向けたＭＳＣに基づく生物学の解釈に非常に関連性がある。
【０３６９】
［実施例１３］  ５８生物学的プロセスの各々における２０１遺伝子のリスト
2010500047.tif 000178
【０３７０】
2010500047.tif 000179
【０３７１】
2010500047.tif 000180
【０３７２】
2010500047.tif 000181
【０３７３】
2010500047.tif 000182
【０３７４】
2010500047.tif 000183
【０３７５】
2010500047.tif 000184
【０３７６】
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【０３７７】
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【０３７８】
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【０３７９】
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【０３８０】
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【０３８１】
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【０３８２】
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【０３８３】
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【０３８４】
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【０３８５】
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【０３８６】
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【０３８７】
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【０３８８】
2010500047.tif 000197
【０３８９】
2010500047.tif 000198
【０３９０】
2010500047.tif 000199
【０３９１】
2010500047.tif 000200
【０３９２】
2010500047.tif 000201
【０３９３】
2010500047.tif 000202
【０３９４】
2010500047.tif 000203
【０３９５】
2010500047.tif 000204
【０３９６】
2010500047.tif 000205
【０３９７】
2010500047.tif 000206
【０３９８】
2010500047.tif 000207
【０３９９】
2010500047.tif 000208
【０４００】
2010500047.tif 000209
【０４０１】
2010500047.tif 000210
【０４０２】
2010500047.tif 000211
【０４０３】
2010500047.tif 000212
【０４０４】
2010500047.tif 000213
【０４０５】
2010500047.tif 000214
【０４０６】
2010500047.tif 000215
【０４０７】
2010500047.tif 000216
【０４０８】
2010500047.tif 000217
【０４０９】
2010500047.tif 000218
【０４１０】
2010500047.tif 000219
【０４１１】
2010500047.tif 000220
【０４１２】
2010500047.tif 000221
【０４１３】
2010500047.tif 000222
【０４１４】
2010500047.tif 000223
【０４１５】
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【０４１６】
2010500047.tif 000225
【０４１７】
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【０４１８】
2010500047.tif 000227
【０４１９】
2010500047.tif 000228
【０４２０】
2010500047.tif 000229
【０４２１】
2010500047.tif 000230
【０４２２】
2010500047.tif 000231
【０４２３】
2010500047.tif 000232
【０４２４】
2010500047.tif 000233
【０４２５】
2010500047.tif 000234
【０４２６】
2010500047.tif 000235
【０４２７】
2010500047.tif 000236
【０４２８】
2010500047.tif 000237
【０４２９】
2010500047.tif 000238
【０４３０】
2010500047.tif 000239
【０４３１】
2010500047.tif 000240
【０４３２】
2010500047.tif 000241
【０４３３】
［実施例１４］  ３０経路の各々における２０１遺伝子のリスト
2010500047.tif 000242
【０４３４】
2010500047.tif 000243
【０４３５】
2010500047.tif 000244
【０４３６】
2010500047.tif 000245
【０４３７】
2010500047.tif 000246
【０４３８】
2010500047.tif 000247
【０４３９】
2010500047.tif 000248
【０４４０】
2010500047.tif 000249
【０４４１】
2010500047.tif 000250
【０４４２】
2010500047.tif 000251
【０４４３】
2010500047.tif 000252
【０４４４】
2010500047.tif 000253
【０４４５】
2010500047.tif 000254
【０４４６】
2010500047.tif 000255
【０４４７】
2010500047.tif 000256
【０４４８】
2010500047.tif 000257
【０４４９】
2010500047.tif 000258
【０４５０】
2010500047.tif 000259
【０４５１】
2010500047.tif 000260
【０４５２】
2010500047.tif 000261
【０４５３】
2010500047.tif 000262
【０４５４】
2010500047.tif 000263
【０４５５】
2010500047.tif 000264
【０４５６】
2010500047.tif 000265
【０４５７】
2010500047.tif 000266
【０４５８】
2010500047.tif 000267
【０４５９】
2010500047.tif 000268
【０４６０】
2010500047.tif 000269
【０４６１】
2010500047.tif 000270
【０４６２】
2010500047.tif 000271
【０４６３】
2010500047.tif 000272
【０４６４】
2010500047.tif 000273
【０４６５】
2010500047.tif 000274
【０４６６】
2010500047.tif 000275
【０４６７】
2010500047.tif 000276
【０４６８】
2010500047.tif 000277
【０４６９】
2010500047.tif 000278
【０４７０】
［実施例１４Ａ］  追加の５９３タンパク質
さらなる馴化培地の解析により、当該培地は、全部で７９４の独自の遺伝子の産物である、以下に示すさらなる５９３のタンパク質を含むことが示唆された。
2010500047.tif 000279
【０４７１】
2010500047.tif 000280
【０４７２】
2010500047.tif 000281
【０４７３】
［実施例１４Ｂ］  追加の５９３タンパク質の解析
セクレトームにより調節される生物学的プロセスおよび経路は、さらに下記のようにして解析を行った。
【０４７４】
本発明者らは、ウェブ上の無料コンピュータープログラム(http://www.pantherdb.org/tools/genexAnalysis.jsp)を用いて解析を行った。各々の機能的なカテゴリにおける遺伝子の頻度を、７９４遺伝子全リストと、公共のデータベース（ＮＣＢＩ：ホモサピエンス）の遺伝子との間で比較した。
【０４７５】
本発明者らは、様々な（遺伝子オントロジー）経路ＧＯ、生物学的プロセスＧＯおよび分子機能ＧＯにおける遺伝子頻度を比較した。ＮＣＢＩホモサピエンスのデータベースの遺伝子頻度よりも顕著に高いまたは低い（ｐ＜０．０１）経路ＧＯ、生物学的プロセスＧＯおよび分子機能ＧＯのみが解析に用いられた。
【０４７６】
結果を図１２、図１３および図１４に示す。
【０４７７】
図１２は、分泌タンパク質により動かされる予測経路を示す。各経路における遺伝子頻度は、ＮＣＢＩホモサピエンスのデータベースよりも、当該セクレトームで顕著に高いものであった（ｐ＜０．０１）。
【０４７８】
図１３は、分泌タンパクにより動かされる予測プロセスを示す。各経路における遺伝子頻度は、ＮＣＢＩホモサピエンスのデータベースよりも、当該セクレトームで顕著に高いまたは低いものであった（ｐ＜０．０１）。
【０４７９】
図１４は、分泌タンパクにより動かされる予測分子を示す。各経路における遺伝子頻度は、ＮＣＢＩホモサピエンスのデータベースよりも、当該セクレトームで顕著に高いものであった（ｐ＜０．０１）。
【０４８０】
［実施例１５］  実施例７から１４に関する参考文献
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【０４８１】
［実施例１６］  ＥＳ細胞の馴化培地（ＣＭ）中の生物活性
主な検討事項は、ＭＳＣｓからの一致した、再現可能な生物活性のある因子の産生である。したがって、様々な分泌遺伝子産物は、報告されているＭＳＣｓの、多様な細胞内システムや疾病に対するパラクリン効果に対する分子的機序を与えなければならない（Ａ７−１８）。
【０４８２】
ＨｕＥＳ９．Ｅ１ ＭＳＣに馴化した化学的に定義された培地、および、化学的に定義された培養液のみからなるコントロール培地について、多次元タンパク質同定技術（ＭｕＤＰＩＴ）（Ａ２３）およびサイトカイン抗体アレイ解析を行うことにより、本発明者らは２０１の独自遺伝子産物を同定した（上述の実施例参照）。本発明者らは、馴化培地（ＣＭ）中の生物活性評価として、プロテオーム解析により予測されていたＭＭＰゲラチナーゼ活性を調べた。
【０４８３】
図１０は、ＥＳ細胞馴化培地におけるＭＭＰゲラチナーゼ活性を示す。
０．１μｇのタンパク質を用いたザイモグラフィにより、ＭＭＰゲラチナーゼ活性（おそらくＭＭＰ２またはＭＭＰ９）が、馴化培地（ＣＭ）中には存在するが、コントロールの非馴化培地（ＮＣＭ）には存在しないことが確認された（Ａ２４）。
【０４８４】
［実施例１６Ａ］  ＥＳ細胞の馴化培地（ＣＭ）中の生物活性
Ａ．本発明者らは、当該セクレトーム中に存在するＴＧＦ−βに生物活性があることを示した。ＴＨＰ−１細胞をセクレトームにさらすことにより、Ｓｍａｄ２のリン酸化、ＴＧＦ−βシグナル伝達の下流標的の増加が誘導された (Euler-Taimor, G., and J. Heger. 2006. The complex pattern of SMAD signaling in the cardiovascular system. Cardiovascular Research 69:15-25) 。このことは図１５に示す。
【０４８５】
図１５は、１００μｇのＣＭタンパク質またはＮＣＭタンパク質またはＰＢＳに３０分間さらしたＴＨＰ−１細胞を示す。その後、細胞溶解液を調製し、抗リン酸化Ｓｍａｄ２抗体および化学発光に基づいた検出システムを用いて、標準的なウェスタンブロットハイブリダイゼーションにより解析した。シグナルは、デンシトメトリーにより定量し、シグナルの相対強度を算定した。
【０４８６】
Ｂ．また、本発明者らは、馴化培地が、ＣＭにより影響を受けることがコンピューター解析で予測された細胞走化性を誘導できることを示した（実施例１１および実施例１３）。
【０４８７】
ＣＭは、孔径５μｍの膜を介したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）の遊走を誘導する。このことは図１６に示す。また、ＣＭは、ＴＨＰ１、単球細胞株および初代ヒトマクロファージにおいても同様の遊走を誘導した。
【０４８８】
図１６は、孔径５μｍの膜であるＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）プレートの上チャンバーにセットされた１×１０５個のＨＵＶＥＣｓを示す。下チャンバーは、２５×濃縮したＣＭまたはＮＣＭのストック溶液を１０×、５０×、１００×希釈したＲＰＭＩ培地で満たしている。陽性および陰性のコントロールは、それぞれ１５％および０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）入りのＲＰＭＩで行った。ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃２４時間インキュベーション後、下チャンバーに遊走した細胞の数をカウントした。
【０４８９】
Ｃ．ＣＭがアポトーシスに対する生物学的な効果を持つという予測（上述）は、ＣＭまたはＮＣＭの存在下で、酸化ストレスによるアポトーシスを誘導する過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）でＣＥＭ細胞をインキュベーションし、１２または２４時間後に残っている生存細胞の数を決定することにより、テストした。ＣＭは、酸化ストレスによるアポトーシスを顕著に減少させた。このことは図１７に示す。
【０４９０】
図１７は、１×ＣＭまたは１０×ＣＭの存在下で、５０または５００μＭのＨ２Ｏ２でインキュベートした６ＣＥＭ細胞を示す。生存細胞の相対数は、トリパンブルー染色により１２および２４時間で決定した。
【０４９１】
［実施例１７］  急性心筋梗塞（ＡＭＩ）モデルマウスにおける心臓保護効果
ＡＭＩは、前述のように、マウスの左（冠動脈）前下行枝の永続的な結紮により誘導した（Ａ５７）。
【０４９２】
その後、上述のように作成した１０×濃縮したＣＭまたはＮＣＭ（コントロール）１００μｌを、頸静脈に設置した浸透圧ポンプを介して７２時間、マウスに投与した。これらのマウスの心機能は、３週間後にＭＲＩにより評価した。ＣＭを与えたマウスは、死亡率が顕著に減少し（図１１Ａ）、左心室の駆出率を改善した（図１１Ｂ）。
【０４９３】
［実施例１８］  虚血再かん流モデルブタにおける心臓保護効果
馴化培地は、臨床的により関連のある虚血再かん流モデルブタの心臓における修復効果を持ち、心機能を回復させる。このモデルと時間は、梗塞後、病院に平均９０分で到着し、閉塞した動脈を開いてステントを設置した心筋梗塞患者と同程度のものである。
【０４９４】
麻酔
一晩の絶食後、挿管して酸素と空気の混合物（１：１ ｖ／ｖ）での間欠的陽圧換気のための人工呼吸器につなぐ前に、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）でブタを落ち着かせ、チオペンタール（４ｍｇ／ｋｇ、静脈内）で麻酔した。生理食塩水と麻酔薬の継続的な投与のため、静脈内カテーテルを耳静脈に設置した。麻酔は、ミダゾラムの継続的な投与（０．３ｍｇ／ｋｇ／ｈ、静脈内）により維持し、その一方で、クエン酸スフェンタニル（１μｇ／ｋｇ／ｈ、静脈内）の継続的な投与による鎮痛、臭化パンクロニウム（０．１ｍｇ／ｋｇ／ｈ、静脈内）の投与による筋弛緩を行った。手術の前に、心不整脈を防ぐため、１６０ｍｇのソタロールを静脈内に３０分投与した。
【０４９５】
心筋梗塞および手術手順
手術全体の間、心電図、動脈圧およびカプノグラムを継続的にモニターした。胸骨正中切開の後、一定の心拍数を測定するために、ペーシングリードを右心耳の小径穴を通して右心房に挿入した。左心室圧（ＬＶＰ）は、左心室の中に先端を通して挿入した圧センサ付きＭｉｌｌａｒカテーテルを用いて測定した。心拍出量を測定するため、遷音速流プローブ（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ、ＵＳＡ）を近位大動脈の周りに設置した。梗塞を誘導する前に、心エコー検査を行った。当該虚血再かん流モデルにおいては、最初に、再かん流を行うための除去前に、４５分間の閉塞を引き起こすため、左冠動脈回旋枝（ＬＣｘ）の周りをきつく縫合した。１０匹の動物の２つのグループが用いられた。試験グループは、パラクリン分泌物、すなわちｈＥＳＣ−ＭＳＣｓで馴化した培地を得ることができ、コントロールグループは、馴化していないコントロール培地を得ることができる。各々のブタにおいて、培地は３つの主要な冠動脈に直接運ばれる。はじめに、ＬＣＸの周りの縫合糸を除去した後、ＬＣＸ（左冠動脈回旋枝）に１ｍｌのボーラス投与がなされ、９０分後に、ＲＣＡ（右冠動脈）およびＬＡＤ（冠動脈の左前下行枝）に各々１ｍｌのボーラス投与がなされた。各々２ｍｌの培地が、胸およびカテーテルに流し込まれた３つの浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｃ）はポンプから各々の動脈（ＬＣＸ、ＲＣＡおよびＬＡＤ）に直接往復した。ポンプは、冠動脈に注入した後、培地（１０ｕｌ／ｈ）を７日間供給することができる。したがって、各ブタは局所的に９ｍｌの培地を受けることになる。ブタは３週間生存した。他の投与経路としては次のものがある。１）各ブタが、虚血再かん流の直後に、梗塞周囲の領域の心筋内にＣＭまたはＮＣＭ（３ｍｌ）のボーラスを受け、続く７２時間の間６ｍｌの静脈内投与を受ける。２）虚血再かん流の直後に、カテーテルによりＣＭまたはＮＣＭ（３ｍｌ）の冠動脈内投与を受け、続く７２時間の間６ｍｌの静脈内投与を受ける。心室細動が起こった時には、５０ジュールの体内除細動が用いられる。移植では、心筋梗塞の前後に、心拍出量、平均動脈圧、左心室圧および心エコーの測定が行われた。最後は、圧・容量曲線および梗塞面積の測定で延長された。血行動態および心拍リズムの安定後、胸部を閉じ、安定な状態に回復させた。
【０４９６】
評価
心筋梗塞の誘導３週間後、動物を再び麻酔し、胸骨を再開胸した。心臓の機能および形状を評価するため、圧・容積記録に基づいてコンダクタンスカテーテルおよび心エコーを測定した。機能測定後、実験室での分析のため、心臓を取出した。
【０４９７】
血行動態
心電図、動脈圧、心拍出量および左心室圧（ＬＶＰ）を３００Ｈｚの最小サンプリングレートでデジタル化し、オフライン解析 (Sonometrics Corporation, Ontario, Canada) のため保管した。
【０４９８】
心エコー検査
心外膜短軸の超音波(Prosound SSD-5000, 5 MHz probe UST-5280-5, Aloka Holding Europe AG, Zug, Switzerland)を乳頭レベルで得た。梗塞サイズの壁厚（ＷＴ）および左心室内領域（Ｌ Ｖｉａ）を拡張末期（ＥＤ）および収縮末期（ＥＳ）に測定した。収縮期壁厚（ＳＷＴ）は（ＷＴ（ＥＤ）−ＷＴ（ＥＳ））／ＷＴ（ＥＤ）×１００（％）で計算し、左心室内径短縮率は（ＦＡＳ）は、（Ｌ Ｖｉａ（ＥＤ）−Ｌ Ｖｉａ（ＥＳ））／Ｌ Ｖｉａ（ＥＤ）×１００（％）で計算した。
【０４９９】
コンダクタンスカテーテルプロトコール
コンダクタンスカテーテルの方法は、連続するＬＶ（左心室）容量およびＬＶ圧のオンライン測定を提供し、以前に報告されているように行った（Ａ５８、Ａ５９）。コンダクタンスカテーテルに由来する連続したＬＶ圧および容量のシグナルは、Ｌｅｙｃｏｍ ＣＦＬ−５１２ (CD Leycom, Zoetermeer, the Netherlands) を用いて２５０Ｈｚサンプリングレートで示された。データは、定常状態の間および一時的な大静脈閉塞の間に取得し、呼気の終わりには、全て人工呼吸器を停止させた。データ取得は、固定した心房ペーシングレートが８０拍／分で行った。圧・容量曲線の解析はカスタム・ソフトウェアを用いて行った。拡張末期は、左心室圧の急増の開始によって定義し、収縮末期は、左心室圧の最少レートの減少によって定義した（ｄＰ／ｄｔｍｉｎ）。
【０５００】
梗塞面積
心臓を取出した後、ＬＶ（左心室）を分離し、頂点からベースまで５片に切り分けた。切片は、梗塞組織を生存心筋と区別するために、１％の塩化トリフェニルテトラゾリウム (TTC, Sigma-Aldrich Chemicals, Zwijndrecht, Netherlands) Sorensen バッファー (13.6 g/l KH2PO4 + 17.8 g/l Na2H PO4  2H2O, pH 7.4) ３７℃で１５分間インキュベーションした。全ての切片は、両サイドからスキャンし、デジタル面積測定ソフトウェアを用いて、全面積と各切片における梗塞サイズを比較した。切片の重量の補正後、梗塞サイズをＬＶのパーセンテージとして計算した。移植では、心筋梗塞の前後に、心拍出量、平均動脈圧、左心室圧および心エコーの測定が行われる。最後は、圧・容量曲線および梗塞面積の測定で延長される。
【０５０１】
［実施例１８Ｂ］  虚血再かん流モデルブタにおける心臓保護効果
実施例１８の簡略版が行われた。本実験は、終点が３週間後から４時間に短縮されるという大きな違いを除いて本質的に同じである。手順は、次の変更点を除いて一緒である。
【０５０２】
心筋梗塞および手術手順
手術全体の間、心電図、動脈圧およびカプノグラムを継続的にモニターした。胸骨正中切開の後、一定の心拍数を測定するために、ペーシングリードを右心耳の小径穴を通して右心房に挿入した。左心室圧（ＬＶＰ）は、左心室の中に先端を通して挿入した圧センサ付きＭｉｌｌａｒカテーテルを用いて測定した。心拍出量を測定するため、遷音速流プローブ（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ、ＵＳＡ）を近位大動脈の周りに設置した。梗塞を誘導する前に、心エコー検査を行った。当該虚血再かん流モデルにおいては、最初に、再かん流を行うための除去前に、７５分間の閉塞を引き起こすため、左冠動脈回旋枝（ＬＣｘ）の周りをきつく縫合した。３つのグループの動物が用いられた。試験グループにはＣＭすなわちｈＥＳＣ−ＭＳＣｓで馴化した培地を与え、コントロールグループには非馴化コントロール培地または生理食塩水を与えた。再かん流開始５分前に、ブタにＭＳＣ−ＣＭ（２．０ｍｇタンパク質、１ｍｌ）、ＮＣＭまたは生理食塩水を静脈内投与した。再かん流直後、ＭＳＣ−ＣＭ（４ｍｌ、８．０ｍｇタンパク質、Ｎ＝７）、ＮＣＭ（Ｎ＝５）または生理食塩水（Ｎ＝７）をＬＣｘ冠動脈の中に局所的に注入した。ブタは再かん流の４時間後に殺した。危険な領域における相対的な梗塞サイズは、エバンスブルーおよびＴＴＣ染色を用いて評価した。当該梗塞サイズは、ＣＭを投与したブタではＮＣＭ（ｐ＝０．０２４）および生理食塩水（ｐ＝０．００７）を投与したブタと比較して著しく減少していた（図７）。収縮期壁厚（ＳＷＴ）や左心室内径短縮率は（ＦＡＳ）のような心機能は心エコーで測定し（図８）、一方で、連続するＬＶ容量およびＬＶ圧のオンライン測定は、コンダクタンスカテーテル手法を用いて測定することができる。ベースラインおよび虚血の間、３つの実験グループのブタにおけるＳＷＴおよびＦＡＳは、顕著に異なるものではなかった。しかし、再かん流の４時間後、ＣＭを投与したブタのＳＷＴおよびＦＡＳは、ＮＣＭおよび生理食塩水を投与した動物よりも非常に良いものであった。ＣＭを投与したブタはまた、気絶心筋を挑発するβ１−アドレナリン受容体アンタゴニスト（遮断薬）ドブタミン（２．５および５．０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）の静脈内注入による薬理学的に誘導したストレス下で強い心機能を示した。
【０５０３】
結果
簡略化した実験の結果を図１８、１９および２０に示す。
【０５０４】
図１８：ＣＭ、ＮＣＭまたは生理食塩水投与したブタにおける急性虚血再かん流後の相対的な梗塞サイズ。急性虚血は、７５分間ＬＣｘを結紮し、続いて結紮を開放し再かん流させることにより誘導した。再かん流開始５分前、ブタにＣＭ、ＮＣＭまたは生理食塩水を静脈内投与した。再かん流直後、ＣＭ、ＮＣＭまたは生理食塩水をＬＣｘ冠動脈の中に局所的に注入した。再かん流の４時間後、危険領域内の相対的な梗塞サイズを評価した。
【０５０５】
図１９および２０  心エコー検査
図１９：収縮期壁厚  図２０：左心室内径短縮率
心臓の測定は、虚血の前、虚血の間および虚血の４時間後に行った。虚血の４時間後、気絶心筋を挑発するβ１−アドレナリン受容体アンタゴニスト（遮断薬）ドブタミン（２．５および５．０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）の静脈内注入による薬理学的に誘導したストレス下で追加測定を行った。
【０５０６】
心外膜短軸の超音波画像 (Prosound SSD-5000, 5-MHz probe UST-5280-5, Aloka Holding Europe AG, Zug, Switzerland) を乳頭レベルで得た。梗塞サイズの壁厚（ＷＴ）および左心室内領域（Ｌ Ｖｉａ）を拡張末期（ＥＤ）および収縮末期（ＥＳ）に測定した。収縮期壁厚（ＳＷＴ）は（ＷＴ（ＥＳ）−ＷＴ（ＥＤ））／ＷＴ（ＥＤ）×１００（％）で計算し、左心室内径短縮率は（ＦＡＳ）は、（Ｌ Ｖｉａ（ＥＤ）−Ｌ Ｖｉａ（ＥＳ））／Ｌ Ｖｉａ（ＥＤ）×１００（％）で計算した。
【０５０７】
圧・容量曲線を測定するためのコンダクタンスカテーテルプロトコール
コンダクタンスカテーテル手法は、連続するＬＶ容量およびＬＶ圧のオンライン測定を提供し、以前に報告されているように行った (Timmers, L., J. P. G. Sluijter, C. W. J. Verlaan, P. Steendijk, M. J. Cramer, M. Emons, C. Strijder, P. F. Grundeman, S. K. Sze, L. Hua, J. J. Piek, C. Borst, G. Pasterkamp, and D. P. V. de Kleijn. 2007. Cyclooxygenase-2 Inhibition Increases Mortality, Enhances Left Ventricular Remodeling, and Impairs Systolic Function After Myocardial Infarction in the Pig. Circulation 115:326-332) 。
【０５０８】
コンダクタンスカテーテルに由来する連続したＬＶ圧および容量のシグナルは、Ｌｅｙｃｏｍ ＣＦＬ−５１２ (CD Leycom, Zoetermeer, the Netherlands) を用いて２５０Ｈｚサンプリングレートで示した。データは、定常状態の間および一時的な大静脈閉塞の間に取得し、呼気の終わりには、全て人工呼吸器を停止させた。圧・容量曲線の解析はカスタム・ソフトウェアを用いて行った。
［実施例１９］
【０５０９】
皮膚科的疾患における馴化培地の治療効果
ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓによるＣＭの分子成分およびＣＭの集団機能のコンピューター予測は、ＣＭが皮膚炎または乾癬のような皮膚創傷または皮膚病変疾患に対して回復効果を誘導することを示唆している。ＣＭにより動かされる分子成分および生物学的プロセスの多くは、皮膚創傷治療や皮膚科的疾患の治療に用いられるか、そのターゲットとされている。
【０５１０】
特に、インターフェロンγ、インターロイキン２およびインターロイキン１０のような分泌サイトカインは、コンジローマ、いぼ、血管腫、ケロイド、皮膚癌、アトピー性皮膚炎、乾癬、ベーチェット病、慢性肉芽腫症、創傷治癒および皮膚Ｔ細胞性リンパ腫［Ａ６０］の治療に用いられている。ＥＣＭタンパク質のような他の分泌タンパク質には、コラーゲン、ＥＣＭの調節因子（例えば、ＭＭＰやそれらの阻害剤）が含まれる。ＴＩＭＰｓ、血管新生因子（例えばＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ）、増殖因子（例えば、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ）もまた、創傷治癒痕の減少潰瘍に関与している［Ａ６１−６７］。ｈＥＳＣ−ＭＳＣのＣＭにより調節されうるいくつかのシグナル伝達経路は、多くの皮膚科的疾患に関与している。例えば、ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、乾癬中のＩＧＦおよびＩＧＦＢＰｓを介して乾癬調節のＩＧＦに関与しており［Ａ６８、６９］、トールシグナル伝達は皮膚科的疾病に関与している［Ａ７１］。
【０５１１】
従って、皮膚炎や乾癬のような皮膚創傷または皮膚科的疾患へのＣＭの局所使用は、治療を改善し、瘢痕を減少させる。恒常性も維持すべきである。ＣＭはリポソームに基づいたエマルジョン、ゲルまたはクリームの形状で供給されてもよく、標準的な創傷包帯の一部として供給されてもよい。また、ＣＭは、皮膚修復や治療を促進するスキンケア化粧品における添加物として用いられてもよい。
【０５１２】
皮膚疾患に対するＣＭの効果を試験するのに適したモデル動物は、皮膚炎モデルマウスである。皮膚感作は、以前に記載されているように［Ａ７２、７３］行った。簡潔には、ＰＢＳ１００μｌ中に５０μｇのＢｌｏ ｔ５を入れたものまたはＰＢＳのみを、１ｃｍ２のガーゼにアプライし、透明の包帯 (Smith Nephew) で皮膚にパッチした。この手順は、５０日の期間に渡って２度行った。その後、ＣＭおよびＮＣＭを１ｃｍ２のガーゼにアプライし、様々な期間に渡って、上述のように皮膚にパッチした。
【０５１３】
皮膚炎の組織学的試験のため、パッチした皮膚から検査サンプルを取得し、すぐに、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。
【０５１４】
［実施例２０］  ぜんそくおよびアレルギーにおける馴化培地の効果
ぜんそくは、特徴のあまりない遺伝子のセットおよび環境因子に複雑な病因が起因する、複雑な病気である。結果生じる病状は、平滑筋量の増加および細胞外基質タンパク質の堆積物の増加、それに続く肺機能の低下により特徴付けられる気道および上皮下の線維の慢性的な炎症を導く免疫調節異常である。
【０５１５】
現在の治療には、いくつかの因子またはシグナル経路（例えば、ＥＣＭ、インテグリン、および間葉系細胞機能［Ａ７４］、トール様受容体［Ａ７５］、ＴＧＦ−βやＥＧＦのような増殖因子［Ａ７６、Ａ７７］およびＩＬ６経路［Ａ７８］）を調節することが含まれている。ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓによるＣＭは、これらの標的領域にたいして生物学的効果を持つと予測されており、本発明者らは、ＣＭがぜんそくの肺において免疫調節の修復をし、組織修復を促進し、肺組織の瘢痕を最小化するのを助けると予測した。
【０５１６】
慢性気道炎症に対するＣＭおよびＮＣＭの効果を調べるため、上述のように［Ａ７２、Ａ７３］マウスの皮膚感作を行った。５０日後、パッチしたマウスを麻酔し、５０μｇのＢｌｏ ｔ５を３日間連続で経鼻投与した。最後の投薬から２４時間後、侵襲性ＢＵＸＣＯ［Ａ７９］を用いて気道過敏性を測定した。マウスを麻酔し、３日間連続でＣＭまたはＮＣＭを経鼻投与した。最後の投薬から２４時間後、気道過敏性を測定した。さらに２４時間後、気管支肺胞洗浄液を回収した。気管支肺胞洗浄液の回収に続き、肺を１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。
【０５１７】
急性気道炎症に対するＣＭおよびＮＣＭの効果を調べるため、アレルギーモデルマウスを樹立するために、高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３および検出できないレベルのＩＦＮ−γを分泌するＢｌｏ ｔ５特異的Ｔｈ２細胞株が用いられた。簡潔に言うと、各マウスの静脈内への２．５×１０６Ｂｌｏ ｔ５ 特異的Ｔｈ２細胞の有用なトランスファーにより、naiveマウスの感作を行った。これらのマウスを麻酔し、５０μｇのＢｌｏ ｔ５を３日間連続で経鼻投与した。最後の経鼻投与から２４時間後、侵襲性ＢＵＸＣＯ［Ａ７９］を用いて気道過敏性を測定した。その後、マウスを麻酔し、３日間連続でＣＭまたはＮＣＭを経鼻投与した。最後の経鼻投与から４８時間後、気管支肺胞洗浄液を回収した。気管支肺胞洗浄液の回収に続き、組織学的解析のために、肺を１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。
【０５１８】
臨床診療においては、肺の病気を治療するためのＣＭの使用は、標準的なエアロゾル療法を用いて効果的に投与することができる［Ａ８０−８６］。
【０５１９】
［実施例２１］  他の疾病における馴化培地の治療効果
概して、本発明者らは、最初の損傷が炎症や免疫調節異常を誘導し、線維化や機能の喪失を含む慢性組織リモデリングを導く病態において、ｈＥＳＣ−ＭＳＣｓのＣＭが恒常性の復元および組織修復の促進に有用であると予測した。他の疾病には、虚血性傷害、嚢胞性線維症、静脈洞炎および鼻炎が含まれる。
【０５２０】
［実施例２２］  整形外科における馴化培地の治療効果
筋骨格組織の修復のための現在の治療戦略は、通常、物理的な支持を与えるだけでなく、細胞遊走、細胞接着、増殖および血管新生および最終的な骨新生を開始させる分化を促進させるスキャフォールドとしてのバイオマテリアル（セラミックまたはポリマー）の使用を含むものである［Ａ８７−９０］。ｈＥＳＣ−ＭＳＣによるＣＭのコンピューター解析によれば、スキャフォールド構造へのＣＭの組み込みは、細胞遊走、増殖、接着、骨格発達およびスキャフォールドの血管新生を促進するであろう。
【０５２１】
ＣＭの欠陥部（そうでなければ、萎縮性の癒着不能を引き起こすであろう）における骨再生に対する効果を調べるため、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔに、半形１５ｍｍサイズの欠陥部を作り［Ａ９１］、ＣＭまたはＮＣＭでコートしたコラーゲンスポンジまたはハイドロゲルのような適当な基質でふさいだ。レントゲン写真を３週間毎に撮影した。６週間または１２週間後、動物を殺した。新骨はマイクロＣＴスキャンで測定し、血管は移植片内の血管内皮細胞の抗ＣＤ３１染色により測定した。少なくとも最初の段階では、血管が増加し、新骨形成も増加すべきである。
【０５２２】
軟骨修復に対するＣＭの効果を調べるため、骨軟骨損傷モデルウサギ［Ａ９２］を使用した。コラーゲンやハイドロゲルのような適当なスキャフォールドにＣＭをコートし、３ｍｍのひざの骨軟骨欠陥部位に埋め込んだ［Ａ９３］。臨床応用として、スキャフォールドや骨グラフトにＣＭを組み込むことにより、ＣＭを用いることができる［Ａ９４］。
【０５２３】
［実施例２３］  骨髄移植における馴化培地の治療効果
ＭＳＣｓは骨髄移植を促進し［Ａ９５］、移植片対宿主病を改善することが知られている。ＭＳＣｓの移植は、造血細胞移植の促進［Ａ９６］およびＧＶＨＤの制限［Ａ９７、９８］により、同種移植の結果を改善することが知られている。ＭＳＣｓを介したこれらの効果は、造血幹細胞ニッチの拡大ならびにＧＶＨＤの耐性および減少の誘導、同種組織移植の拒絶、炎症の調節［Ａ９８］を介した効果である、おそらく可溶性因子の分泌を介したものであると予想されている［Ａ１００］。
【０５２４】
ＭＳＣｓによるＣＭの臨床応用可能性：インビトロで培養液にＣＭを添加することによる、または、インビボで移植中に造血幹細胞と共にＣＭを入れることによる造血幹細胞数の拡大は、ＣＭの静脈内注入によるＧＶＨＤを改善する、または、移植細胞もしくは移植前後の治療の一部としてＣＭの静脈内注入による組織に対する免疫寛容を誘導する。
【０５２５】
［実施例２４］  実施例１６から実施例２２までの参考文献
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【０５２７】
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【国際調査報告】
2010500047.tif 000282
2010500047.tif 000283
2010500047.tif 000284