(57)【要約】本願の開示は、表面結合細胞接着性ポリペプチドを提供することであり、同表面結合細胞接着性ポリペプチドは、金属及び／又は非金属無機表面に存在する一つ以上の材料との結合親和性を有する表面結合部分に付着される細胞接着性ポリペプチドを含む。表面結合細胞接着性ポリペプチドは、ステントのような移植可能な医療機器の表面の少なくとも一部への改善された接着性及び安定性を有する層を形成するために有用である。
2010521246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植可能な医療機器であって、
第１の表面を有する基質と、
前記第１の表面の少なくとも一部に配置される表面結合細胞接着性ポリペプチドと、からなり、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、前記第１の表面に結合される表面結合部分と、前記表面結合部分に付着される細胞接着性ポリペプチドと、からなる、移植可能な医療機器。
【請求項２】
前記第１の表面が内腔表面である、請求項１に記載の移植可能な医療機器。
【請求項３】
前記第１の表面が内腔面であり、かつ前記内腔面の少なくとも一部が１つ以上の金属材料を含む、請求項１に記載の移植可能な医療機器。
【請求項４】
前記第１の表面が内腔面であり、かつ前記内腔面の少なくとも一部が１つ以上の非金属無機材料を含む、請求項１に記載の移植可能な医療機器。
【請求項５】
前記移植可能な医療機器がステントである、請求項１に記載の移植可能な医療機器。
【請求項６】
前記細胞接着性ポリペプチドがリンカーを介して前記表面結合部分に付着される、請求項１に記載の移植可能な医療機器。
【請求項７】
前記表面結合部分がカテコール部分からなる、請求項６に記載の移植可能な医療機器。
【請求項８】
前記表面結合部分がＤＯＰＡ部分からなる、請求項７に記載の移植可能な医療機器。
【請求項９】
前記表面結合部分が（ＤＯＰＡ−Ｌｙｓ）２からなる、請求項８に記載の移植可能な医療機器。
【請求項１０】
前記表面結合部分がポリビスホスホネート部分からなる、請求項１に記載の移植可能な医療機器。
【請求項１１】
前記表面結合部分が付着性ポリペプチド部分からなる、請求項１に記載の移植可能な医療機器。
【請求項１２】
前記基質は付随的に第２の表面と、前記第２の表面の少なくとも一部に配置される薬剤溶出コーティング部と、からなり、前記薬剤溶出コーティング部は治療剤およびポリマーからなる、請求項１に記載の移植可能な医療機器。
【請求項１３】
その表面にコーティング部を有するステントであって、前記コーティング部は前記ステントの表面の少なくとも一部に表面結合細胞接着性ポリペプチドを結合する工程により提供され、前記表面結合細胞接着性ポリペプチドは表面結合部分と同表面結合部分にリンカーを介して付着される細胞接着性ポリペプチドとからなる、ステント。
【請求項１４】
前記コーティング部は前記ステントの少なくとも一部に内皮細胞を接着する更なる工程によって更に提供される、請求項１３に記載のステント。
【請求項１５】
前記表面結合細胞接着性ポリペプチドの表面結合部分はカテコール部分からなる、請求項１４に記載のステント。
【請求項１６】
前記細胞接着性ポリペプチドが、細胞外マトリックスのタンパク質、又はその結合ドメインフラグメントである、請求項１５に記載のステント。
【請求項１７】
前記細胞接着性ポリペプチドが、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ、ＷＱＰＰＲＡＲＩ、ＲＥＤＶ、又はＮＧＲからなる、請求項１６に記載のステント。
【請求項１８】
前記ステントの表面の一部が、同ステントの内腔面の一部からなる、請求項１６に記載のステント。
【請求項１９】
移植可能な医療機器を調製するための方法であって、
前記移植可能な医療機器の表面に表面結合細胞接着性ポリペプチドを接触させる工程と、
前記表面結合細胞接着性ポリペプチドを前記表面の少なくとも一部分であって、１つ以上の金属材料を含む部分に結合させる工程と、からなり、
前記表面結合細胞接着性ポリペプチドは少なくとも１つの細胞接着性ポリペプチドと少なくとも１つの表面結合部分とからなり、前記少なくとも１つの表面結合部分は１つ以上の金属材料との結合親和性を有する、方法。
【請求項２０】
前記移植可能な医療機器を表面結合細胞接着性ポリペプチドと接触させる工程は、前記移植可能な医療機器を、表面結合細胞接着性ポリペプチドを含む溶液中に浸漬させる工程からなる、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞接着性タンパク質及び細胞接着性ペプチドの安定性を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願はＰＣＴ国際特許出願として２００８年３月１４日に出願されたものであり、米国を除く全ての指定国に対しての出願人は米国の法人である、ボストン・サイエンティフィック・サイムド社（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｃｉｍｅｄ，Ｉｎｃ．）であり、米国のみを指定した出願人は、米国国民である、ジョン  エス．ベンコ（Ｊｏｈｎ  Ｓ．Ｂｅｎｃｏ）であり、本明細書において参照により援用されている２００７年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／８９４，９４４号からの優先権を主張するものである。
【０００３】
移植可能なステントのような医療機器は、生物学的に活性な物質でコーティングされ得る。しかしながら、生理学的に関連した条件下でそのような医療機器上においてコーティングの有効性及び／又は安定性と関連付けることは困難である。これらが困難であることは、いくつかの要因によるものである。生物学的に活性なコーティングは、伝統的には、医療機器の表面との付着に対して、疎水性相互作用及び／又は極性の相互作用（例えば、水素結合）のような非特異的な吸着現象に依存していた。残念ながら、これらの付着機構は熱力学的に弱く、ほぼ１０９の推定結合定数を有するものである。バドガマ（Ｖａｄｇａｍａ）により編集された非特許文献１を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】バドガマ編、「生体材料の表面及び界面（Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）」、Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＬＴＤ（英国、ケンブリッジ（２００５年））、第７７０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、医療機器の表面における生物学的に活性な分子及び／又はコーティングの付着を改善するための新たな方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願の開示は、移植可能な医療機器の基質表面の少なくとも一部に結合し（例えば、吸収する）かつ安定した状態とするのに有用な表面結合部分に付着される細胞接着性ポリペプチドを提供する。本願の開示はまた、ステント又は他の移植可能な医療機器であって、その基質表面の一部に分散される表面結合細胞接着性ポリペプチドの層を有するステント又は他の移植可能な医療機器を提供する。
【０００７】
本願の開示はまた、表面結合細胞接着性ポリペプチドの層を有する移植可能な医療機器を提供し、同細胞接着性ポリペプチドはカテコール含有表面結合部分に付着されている。
本願の開示はまた、表面結合細胞接着性ポリペプチドの層を有する移植可能な医療機器を提供し、同細胞接着性ポリペプチドはポリビスホスホネート表面結合部分に付着されている。
【０００８】
本願の開示はまた、細胞接着性ポリペプチドの層を有する移植可能な医療機器を提供し、同細胞接着性ポリペプチドは接着性ポリペプチドセグメントに結合されている。
本願の開示はまた、同医療機器上での内皮細胞接着を促進するために移植可能な医療機器に層を提供する方法を提供し、同方法は、移植可能な医療機器の少なくとも一部に表面結合細胞接着性ポリペプチドの層を接着する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】開示した表面結合細胞接着性ポリペプチドとともに使用するための例示的なステントの拡大図を示す概略図である。
【図２】表面結合細胞接着性ポリペプチドの層を含む医療機器の一例の概略図である。
【図３】表面結合細胞接着性ポリペプチドの別の例の概略図である。
【図４】表面結合細胞接着性ポリペプチドの層の更なる例の概略図である。
【図５】開示したペプチドでコーティングされたステンレス鋼ストリップと比較した、ステンレス鋼のストリップのみの場合における、ヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）移動を示すグラフである。
【図６】開示したポリペプチドのコーティング濃度について比較される、ＯＤにおける変化を示すグラフである。
【図７】開示したポリペプチドのステンレス鋼に対する経時的な親和性を示すグラフである。
【図８】ステンレス鋼に対する開示したポリペプチドの親和性を、ｐＨについて比較したグラフである。
【図９】ステンレス鋼基質上にコーティングされた場合の、開示したポリペプチドの適合性におけるＥｔＯ滅菌の影響を示すグラフである。アスタリスク（＊）は統計的な有意性を示す。
【図１０】開示したポリペプチドでコーティングされたＬｉｂｅｒｔｅ  ＷＨステントの画像である。
【図１１】ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）等温線を使用して測定されたステンレス鋼における、開示したポリペプチドの平衡結合定数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
同図面において、同一の符号は、全体を通して、同一の部材を示す。
以下に定義された用語に対して、これらの定義は、別の定義が特許請求の範囲又は本明細書のその他の箇所において与えられていない場合、適用される。
【００１１】
本明細書及び添付された特許請求の範囲において使用されているように、単数の形態である「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明確に記載されていない場合は、複数の指示対象を含む。本明細書及び添付された特許請求の範囲において使用されているように、用語「ｏｒ（又は）」は、内容が明確に記載されていない場合は、「ａｎｄ／ｏｒ（及び／又は）」を含む意味において一般的には使用される。
【００１２】
天然に存在するアミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸を、個々に、又はポリペプチド鎖内で連結される場合のいずれにおいても参照する場合、本明細書においては標準的な一文字及び三文字の略号が使用される。
【００１３】
本明細書において使用されているように、所定の材料の「層」は、その厚みがその全長及び幅の両者と比較して小さい当該材料の領域である。本明細書において使用されているように、層は平面である必要ははく、例えば、下側にある基質の輪郭とすることもできる。層は、下側にある基質の部分的な被覆のみを提供する、不連続なものとすることもできる。「フィルム」、「層」及び「コーティング」のような用語は、本明細書において相互に変換可能に使用され得る。
【００１４】
本願の開示は、表面を有する基質を含む移植可能な医療機器を提供し、表面結合細胞接着性ポリペプチドが基質表面の少なくとも一部に配置されている。本願の開示の表面結合細胞接着性ポリペプチドは少なくとも１つの表面結合部分に付着される少なくとも１つの細胞接着性ポリペプチドを含む。表面結合細胞接着性ポリペプチドは、少なくとも１つの表面結合部分に付着していない細胞接着性ポリペプチドよりも基質表面の部分によりよく接着するか、又は結合する。本願の開示はまた、基質表面の少なくとも一部で表面結合細胞接着性ポリペプチドの層を形成するための方法を提供する。
【００１５】
その基質表面の少なくとも一部に配置される表面結合細胞接着性ポリペプチドを有する移植可能な医療機器は、そのような機器を患者の血管系又は組織に移植した場合、同医療機器またはその一部上の上皮細胞の接着及び／又は成長を促進し得る。移植された医療機器への上皮細胞（例えば、内皮細胞）の動員（Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）は同移植された機器を患者の身体から効果的に「隠し」、それにより血栓症又は再狭窄並びに免疫反応及び拒絶のような負の影響が起こりうる可能性を低減する。例えば、管状の移植可能な機器（例えば、ステント）の内腔のような基質表面の表面結合細胞接着性ポリペプチドの層は、そのような機器が患者の血管に移植された場合、同ステントの内腔表面上を覆う内皮細胞の付着及び／又は増殖を促進する。表面結合細胞接着性ポリペプチドの内腔層への内皮細胞の付着及び／又は成長を促進することによって、ステントが、流れる血液から分離され、それによって、乱流及び／又は免疫応答の起こりうる可能性並びに血栓症及び／又は再狭窄の起こりうる可能性を低減する。
【００１６】
表面結合細胞接着性ポリペプチドは、基質の少なくとも１つの表面の少なくとも一部に優先的に結合するかもしれない。多くの場合、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、基質の１つ以上の表面の少なくとも一部に結合する。通常、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、移植可能な医療機器の基質の内部の（例えば、内腔の）表面に優先的に結合する。場合によっては、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、移植可能な医療機器の基質の少なくとも１つの内部の表面（例えば、内腔）及びそして少なくとも１つの外側の表面（例えば、反管腔側の（ａｂｌｕｍｉｎａｌ）の表面）に優先的に結合する。
【００１７】
表面結合細胞接着性ポリペプチドの表面結合部分は、結合が好ましい基質表面又はその一部における材料の選択に基づいて、表面結合部分が基質表面の少なくとも一部に見出される材料に対して表面結合細胞接着性ポリペプチドの結合を如何に支援するかに基づいて、表面結合細胞接着性ポリペプチドが基質表面に結合される環境に基づいて、選択される。多くの場合、表面結合細胞接着性ポリペプチドは基質表面の金属部分に優先的に結合する表面結合部分を含む。代替的に、又は付随的に、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、基質表面の非金属無機部分に優先的に結合する表面結合部分を含む。
【００１８】
表面結合細胞接着性ポリペプチドの更なる記述は、限定よりもむしろ例示のために、移植可能な医療機器との関係において示される。次に図面を参照すると、図１は移植可能な医療機器、ステント１００を示し、同ステント１００は、単一の部材１０２、または複数の相互に連結されたストラットおよびコネクタ（図示しない）から少なくとも部分的に構成されている。部材１０２は、近位開口部１１４と、遠位開口部１１６と、両者の間に流路１１８と、を定義する。部材１０２はまた、流路１１８と流体連通可能な細胞開口部１０４を定義する。部材１０２は流路１１８に対向する内腔面１２０、ならびに外側の、即ち反管腔側の表面１２２を有するように考慮される。
【００１９】
基質表面の少なくとも一部に結合される表面結合細胞接着性ポリペプチドの例は、図２においてステント１００の一部の拡大した概略図にて示される。上記したように、ステント１００は少なくとも１つの部材１０２から構成され、同部材１０２は、内腔面１２０の少なくとも一部に配置される表面結合細胞接着性ポリペプチド１０６に対する基質として提供される。図２に示されるように、表面結合細胞接着性ポリペプチド１０６は表面結合部分１１２にリンカー領域１１０を介して付着される細胞接着性ポリペプチド１０８を含み得る。
【００２０】
表面結合部分
本願の開示の表面結合細胞接着性ポリペプチドは、移植可能な医療機器の基質表面の少なくとも一部に見出される１つ以上の材料に結合する能力にて一部には少なくとも選択される表面結合部分を含む。表面結合部分の選択は、移植可能な医療機器の１つ以上の表面で見出される材料に基づいて、特定の表面結合部分が表面結合細胞接着性ポリペプチドの１つ以上の材料への接着をどれほど支援するかに基づいて、そして、移植可能な医療機器の基質表面の少なくとも一部に結合される環境が望まれるかに基づいている。
【００２１】
多くの場合、移植可能な医療機器の基質表面の部分に結合するべく使用するのに適した表面結合部分は、金属表面にて見出される１つ以上の材料に対して使用可能な結合親和性を有する。金属表面は、典型的には１つ以上の材料、例えば、ステンレス鋼、チタン合金、タンタル、コバルトクロム合金、又はその他のＦｅ−、Ｃｒ−、又はＴｉ−含有合金を含む。例えば、Ｃｒに対して使用可能な結合親和性を有する表面結合部分は、コバルトクロム合金、ステンレス鋼、又は他のＣｒ含有合金のようなＣｒを含有する移植可能な医療機器の基質表面の部分に結合することが期待される。
【００２２】
代替的又は付随的に、移植可能な医療機器の基質表面と結合するための使用に適した表面結合部分は、非金属無機表面にて見出される１つ以上の材料と使用可能な結合親和性を有する。非金属無機表面は１つ以上の材料、例えば、酸化アルミニウム及び遷移金属酸化物（チタン、ジルコニウム、ハフニウム、タンタル、モリブデン、タングステン、レニウム、鉄、ニオブ及びイリジウムの酸化物）；シリコン；窒化珪素、炭化ケイ素及び酸化ケイ素（時として、ガラス・セラミックスと称される）含むシリコンベースのセラミック；リン酸カルシウムセラミック（例えば、ハイドロキシアパタイト）；カーボン；及び窒化炭素のようなカーボンベースのセラミック様材料、を含む、金属酸化物セラミックを含む。
【００２３】
Ｋａのような平衡結合定数の決定は、使用可能な結合親和性を決定するために、あるいはそうでなければ、表面結合細胞接着性ポリペプチド（或いはより詳細にはその内部の表面結合部分）と、同表面結合細胞接着性ポリペプチドが配置される基質表面の部分との間の結合の相互作用を特徴付ける、一つの方法である。多くの場合、表面結合細胞接着性ポリペプチド（或いはより詳細にはその内部の表面結合部分）と移植可能な医療機器の基質表面との間のＫａは１０１０以上である。典型的には、表面結合細胞接着性ポリペプチド（或いはより詳細にはその内部の表面結合部分）と移植可能な医療機器の基質表面との間のＫａは１０１２より大きい。いくらかの例において、表面結合細胞接着性ポリペプチド（或いはより詳細にはその内部の表面結合部分）と移植可能な医療機器の基質表面との間のＫａは１０１５より大きい。Ｋａを決定するために使用できる方法は周知である。例えば、本明細書において参照により援用されているセーバー（Ｓｅｖｅｒ）他、Ｄｏｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓ．８１３−８２２頁を参照されたい。
【００２４】
使用可能な結合親和性を特徴付ける別の方法は、治療上の利点を提供するために、ステント又は他の移植可能な医療機器の表面の少なくとも一部への、十分な量のそして十分な期間にわたる、表面結合細胞接着性ポリペプチドの結合を評価することによるものである。治療上の利点は、疾病又は症状の治療（即ち、疾病又は症状に関連した徴候の減少又は排除、或いは同疾病又は症状の実質的な減少又は排除若しくは完全な減少又は排除）を参照する。治療上の利点を提供するために、典型的には金属表面に対する表面結合細胞接着性ポリペプチドの結合及び／又は接着部分の結合は、少なくとも生物学的に関連した条件下で評価される。生物学的に関連した条件とは、本願の開示の目的のために、ｐＨ  ７．０乃至７．６、かつ２５乃至４０℃の間である緩衝水溶液として定義される。特に、生物学的に関連した条件は、生きているほ乳動物の血流中において認められる条件である。多くの場合、生物学的に関連した条件は、生きているヒト患者の血流中において認められる条件である。例えば、生物学的に関連した条件は、生きているヒト患者の心臓の動脈血中において認められる条件である。
【００２５】
多くの場合、使用可能な結合親和性は、表面結合細胞接着性ポリペプチドの少なくとも１％が、移植可能な医療機器の基質表面の部分に配置された場合、少なくとも５分間、生物学的に関連した条件へ露出された後に、移植可能な医療機器の基質表面の部分に結合された状態である期待値を示す。典型的には、使用可能な結合親和性は、表面結合細胞接着性ポリペプチドの少なくとも１％が、移植可能な医療機器の基質表面の部分に配置された場合、少なくとも２時間、生物学的に関連した条件へ露出された後に、移植可能な医療機器の基質表面の部分に結合された状態である期待値を示す。場合によっては、使用可能な結合親和性は、表面結合細胞接着性ポリペプチドの少なくとも１％が、移植可能な医療機器の基質表面の部分に配置された場合、少なくとも２４時間、生物学的に関連した条件へ露出された後に、移植可能な医療機器の基質表面の部分に結合された状態である期待値を示す。一例において、使用可能な結合親和性は、表面結合細胞接着性ポリペプチドの少なくとも１％が、移植可能な医療機器の基質表面の部分に配置された場合、少なくとも９０日間、生物学的に関連した条件へ露出された後に、移植可能な医療機器の基質表面の部分に結合された状態である期待値を示す。
【００２６】
他の例において、使用可能な結合親和性は、表面結合細胞接着性ポリペプチドの少なくとも５０％が、移植可能な医療機器の基質表面の部分に配置された場合、少なくとも５分間、生物学的に関連した条件へ露出された後に、移植可能な医療機器の基質表面の部分に結合された状態である期待値を示す。時として、使用可能な結合親和性は、表面結合細胞接着性ポリペプチドの少なくとも５０％が、移植可能な医療機器の基質表面の部分に配置された場合、少なくとも２時間、生物学的に関連した条件へ露出された後に、移植可能な医療機器の基質表面の部分に結合された状態である期待値を示す。場合によっては、使用可能な結合親和性は、表面結合細胞接着性ポリペプチドの少なくとも５０％が、移植可能な医療機器の基質表面の部分に配置された場合、少なくとも２４時間、生物学的に関連した条件へ露出された後に、移植可能な医療機器の基質表面の部分に結合された状態である期待値を示す。一例において、使用可能な結合親和性は、表面結合細胞接着性ポリペプチドの少なくとも５０％が、移植可能な医療機器の基質表面の部分に配置された場合、少なくとも９０日間、生物学的に関連した条件へ露出された後に、移植可能な医療機器の基質表面の部分に結合された状態である期待値を示す。
【００２７】
場合によっては、使用可能な結合親和性についてＥＣ５０に関して考慮することが望ましいかもしれない。同ＥＣ５０は、基質表面の結合部位の半分が吸着質（表面結合細胞接着性ポリペプチド）によって占められる有効濃度である。場合によっては、使用可能な結合親和性は、非特異的な生物学的に活性なコーティングに対するＥＣ５０（それは通常１００μＭの範囲にＥＣ５０を有する）よりも実質的に小さいＥＣ５０（例えば、少なくとも２桁、或いは少なくとも３桁小さいことによって）を参照する。代替的に、使用可能な結合親和性は１０μＭ未満、１μＭ未満、０．５μＭ未満、若しくは０．３μＭ未満、或いは０．２μＭ乃至０．５μＭの間、０．２５μＭ乃至０．３５μＭの間のＥＤＣ５０を参照する。基質表面の表面結合細胞接着性ポリペプチドの使用可能な結合親和性はまた、生物学的に関連した一定期間にわたってＥＣ５０が実質的に一定の状態であるといった期待値を参照する。例えば、使用可能な結合親和性は、例えば、２４時間以内の間、１０時間以内の間、５時間以内の間、又は１時間以内の間といった関連した期間にわたって、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満において変化するＥＣ５０を参照するかもしれない。場合によっては、使用可能な結合親和性は２４時間にわたって１５％未満にて変化するＥＣ５０を参照するかもしれない。
【００２８】
他の例では、使用可能な結合親和性について、ｐＨの範囲にわたってＥＣ５０に関して考慮することが有用であるかもしれない。例えば、使用可能な結合親和性は、ｐＨがｐＨ４とｐＨ７との間で変化する場合、最初のＥＣ５０の５０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％又は１％の範囲内にとどまるといったように、実質的に一定にとどまるＥＣ５０を参照する。場合によっては、使用可能な結合親和性は、ｐＨがｐＨ４とｐＨ７との間で変化する場合、１μＭ、０．５μＭ、０．４μＭ、０．３μＭ、０．２μＭ、又は０．１μＭの範囲内にて実質的に一定の状態であるＥＣ５０を参照する。場合によっては、ｐＨ７におけるＥＣ５０は、１．５μＭ未満、１．０μＭ未満、０．５μＭ乃至１．５μＭの間、又は０．５μＭ乃至１．０μＭの間であり得る。
【００２９】
移植可能な医療機器のためのコーティングの使用可能な結合親和性を決定する際の別の重要な考察は、コーティングされた機器が滅菌される際に結合親和性がほぼ一定の状態であるかという点である。従って、場合によっては、使用可能な結合親和性は、例えば発色ラベルの光学濃度（ＯＤ）測定によって定められるように結合親和性を参照し、同結合親和性は、滅菌の後では、２５％、２０％、１５％、１０％、５％又は１％未満、１％乃至２５％の間、５％乃至２０％の間或いは１０％乃至２０％の間だけ低減する。
【００３０】
更に別の例において、使用可能な結合親和性は、基質表面の表面結合細胞接着性ポリペプチドの表面被覆率を示すかもしれない。表面被覆率（θ）は吸着質（この場合、表面結合細胞接着性ポリペプチド）によって占められる基質表面の吸着部位の関数として定義され得る。表面被覆率は実験的に測定することは困難な場合もある。しかしながら、表面被覆率は計算することができ、一般的にはθ＝Ｋｃ（Ｋ＝平衡結合定数；かつｃ＝濃度）からθ＝１の範囲に及ぶ。表面被覆率はまた、例えばラングミュアの等温線、即ち、吸着剤（又は基質表面）の吸着質（この場合、表面結合細胞接着性ポリペプチド）の量と、その濃度とを関係付ける関数、のようなアルゴリズムを使用して決定され得る。
【００３１】
ラングミュアの等温線：１／ｍ＝１／ｂ＋ｌ／（ｂＫｃ）、ここで、ｍは吸着された質量、ｂは定数、Ｋは平衡結合定数、ｃはペプチド濃度である。
場合によっては、使用可能な結合親和性はラングミュア等温線に適合する吸着パターンを示し、通常、表面被覆が単一層であることを提案する。
【００３２】
基質表面の一部に結合される表面結合細胞接着性ポリペプチドの相対量又は絶対量、或いは、基質表面に結合される表面結合細胞接着性ポリペプチドの結合の結合定数は、比色分析タイプのアッセイのような周知のアッセイにより測定され、表面結合細胞接着性ポリペプチドは容易に検出されるようにラベリングされる。表面結合細胞接着性ポリペプチドの結合量は、生物学的に関連した環境への露出の前に、露出の後に、及び／又は露出の間に評価されるかもしれない。例えば：ビオチンの標識が、各表面結合細胞接着性ポリペプチドに付着される。ビオチン−表面結合細胞接着性ポリペプチドは医療機器の代表である、又は以下に記載される医療機器である基質表面の少なくとも一部に配置される。過剰量のラベルされたストレプトアビジンが、ビオチンの標識と結合するために加えられる。コーティングされた基質表面は水溶液から除去され、いかなる未結合のラベルされたストレプトアビジンをも除去するために洗浄される。続いて、基質表面は基質表面に結合される表面結合細胞接着性ポリペプチドの最初の量を決定するために読み取られる。次に、結合された表面結合細胞接着性ポリペプチドを備えた基質表面は、例えば、上記された生物学的に関連した環境、例えば、２４時間の間、ｐＨ７．３、かつ３７℃にて、緩衝水溶液中に置かれる。基質が水溶液から除去され、いかなる未結合のラベルされたストレプトアビジン及びビオチン−表面結合細胞接着性ポリペプチドをも除去するために洗浄される。基質表面は続いて、基質表面に結合した状態にて残る表面結合細胞接着性ポリペプチドの量を測定するために読み取られる。ラベル、例えば蛍光分子、金ナノ粒子又はその他の部分は、周知の分光技術を使用して容易に検出かつ定量される。代替的に、又は付随的に、接着部分を欠く細胞接着性ポリペプチドコーティングとの比較が同様に行われる。本明細書に参照により援用されている、サイ（Ｔｓａｉ）他（２００５年）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４２７３−４２７５頁も同様に参照されたい。
【００３３】
上述されているような実験が表面結合細胞接着性ポリペプチドを基質表面に適用するための濃度範囲を決定するために使用され得る。場合によっては、少なくとも約０．０１μＭの濃度で表面結合細胞接着性ポリペプチドを提供することは望ましいかもしれない。他の例では、少なくとも約１μＭの濃度を提供することが望ましいかもしれない。更に典型的には、少なくとも１０μＭの、０．１μＭ及び１０００μＭ、１μＭ乃至１００μＭの間の、１μＭ乃至１０μＭの間の、又は１０μＭ乃至１００μＭの間の、濃度にて、基質に表面結合細胞接着性ポリペプチドを加えることによってコーティングが得られる。
【００３４】
使用可能な結合親和性を特徴付ける更に別の方法は、その上に配置される表面結合細胞接着性ポリペプチドを有するステント又は他の移植可能な医療機器の表面の一部での上皮細胞（例えば、内皮細胞）の接着及び／又は成長を評価することである。表面の一部に上皮細胞を接着させる及び／又は成長させる能力は、同表面に配置される細胞接着性ポリペプチドの使用可能な結合親和性を示すと予測される。表面への細胞接着は、本明細書中に参照により援用されるラザトス（Ｒａｚａｔｏｓ）ら（１９９８）、ＰＮＡＳ  ９５：１１０５９−１１０６４、に記載されているＡＦＭ（原子力間顕微鏡）技術によって測定され得る。上皮細胞の成長はまた、細胞移動、例えば、以下の実施例１に記載されているように、ヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）の移動活性を試験することにより測定され得る。場合によっては、表面結合細胞接着性ポリペプチドでコーティングされた基質表面の上皮細胞の移動活性は、未コーティングの基質の、１．２倍、１．５倍、１．７倍、２倍、３倍、又は５倍より大きい。場合によっては、上皮細胞の移動活性は、未コーティングの基質の、１．２乃至３倍、又は１．５乃至２倍大きい。
【００３５】
接着部分は、表面結合細胞接着性ポリペプチドを形成するために、周知のペプチド化学によって細胞接着性ポリペプチドに容易に付着される。本願の開示の表面結合細胞接着性ポリペプチドの接着部分の例は、カテコール部分、ポリビスホスホネート部分及び接着性ポリペプチドセグメントを含む。
【００３６】
カテコール部分
本願の開示の表面結合部分はカテコール部分を含むかもしれない。カテコール部分は細胞接着性ポリペプチドに付着される。１つ以上のカテコール部分は１つ以上の細胞接着性ポリペプチドに付着されるかもしれない。付着は、細胞接着性ポリペプチドに直接されるか、又は例えばリンカーを介して間接的にされる。例えば、表面結合部分は、１つ以上の付随的なカテコール部分、またはその他の表面結合部分、及び１つ以上の細胞接着性ポリペプチドに、一つ以上のリンカーを介して結合されるカテコール部分を含み得る。
【００３７】
１つ以上のカテコール部分を含む表面結合部分は使用可能な親和性を備えた金属表面に結合することが予測される。典型的には、カテコール部分は１０１６またはそれ以上のオーダーの結合定数を備えた第１列遷移金属と結合する。参照によって本明細書において援用されるシーバー（Ｓｅｖｅｒ）ら（２００６）のＤａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓ．８１３−８２２を参照されたい。カテコール部分の熱力学結合は、水素結合のような非特異的吸着現象に寄与する強度よりも数桁大きいので、カテコール部分を含む細胞接着性ポリペプチドは、生理学的な条件の下で基質表面の一部に配置されるよりも大きい安定性を示すことが期待される。
【００３８】
多くの場合、カテコール部分は以下の式Ｉにて示され
【００３９】
【化１】
2010521246.tif 000003
ここで、Ｒ１及びＲ２は細胞接着性ポリペプチド、リンカー、付随的な表面結合部分、Ｈ又はそれらの組み合わせからそれぞれ選択され、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方は、少なくとも一つの細胞接着性ポリペプチドに直接的又は間接的に付着される。ある例において、Ｒ１は細胞接着性ポリペプチド又はリンカーであり、同リンカーは少なくとも一つの細胞接着性ポリペプチドに付着されており、かつＲ２はＨである。例えば、Ｒ１はリンカーであり、同リンカーは少なくとも一つの細胞接着性ポリペプチドに付着されており、かつＲ２はＨである。
【００４０】
例えば、表面結合部分に有用なカテコール部分は、ＤＯＰＡとも称される、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンである。  ＤＯＰＡは１０１６のオーダーにて結合定数を備えた第１列遷移金属と結合親和性を示し、かつ本明細書に記述されている表面結合部分及び表面結合細胞接着性ポリペプチドに対して使用可能な結合親和性を提供すると期待される。前述のシーバーらを参照されたい。ＤＯＰＡ部分はまた、生物学的に関連した条件下で金属表面上にて数ヶ月間の長期にわたる安定性を示した。参照によって本明細書において援用されるスタッツ（Ｓｔａｔｚ）ら（２００５）、ＪＡＣＳ、１２７：７９７２−７９７３を参照されたい。ＤＯＰＡ及びその誘導体は、以下の式ＩＩにて示される。
【００４１】
【化２】
2010521246.tif 000004
ここで、Ｒ３及びＲ４が細胞接着性ポリペプチド、リンカー、付随的な表面結合部分、Ｈ又はそれらの組み合わせからそれぞれ選択され、Ｒ３及びＲ４の少なくとも一方は、少なくとも一つの細胞接着性ポリペプチドに直接的又は間接的に付着される。ある例において、Ｒ３は細胞接着性ポリペプチド又はリンカーであり、同リンカーは少なくとも一つの細胞接着性ポリペプチドに付着されており、かつＲ４はＨである。例えば、Ｒ３はリンカーであり、同リンカーは少なくとも一つの細胞接着性ポリペプチドに付着されており、かつＲ４はＨである。代替的に、Ｒ４は細胞接着性ポリペプチド又はリンカーであり、同リンカーは少なくとも一つの細胞接着性ポリペプチドに付着されており、かつＲ３はＯＨである。例えば、Ｒ４はリンカーであり、同リンカーは少なくとも一つの細胞接着性ポリペプチドに付着されており、かつＲ３はＯＨである。
【００４２】
ある特定の例では、表面結合部分は式ＩＩＩで示されるカテコール部分を含む。式ＩＩＩのカテコール部分はまた、本明細書に記述されている表面結合部分及び表面結合細胞接着性ポリペプチドに使用可能な結合親和性を提供すると期待される。例えば、式ＩＩＩで示される部分に構造的に類似したカテコール部分は、ヒト血漿の条件に類似した条件下で、少なくとも２日間、ＴｉＯ２表面への安定した結合を示した。参照によって本明細書において援用されるチェルシェ（Ｚｕｒｃｈｅｒ）ら（２００５）、ＪＡＣＳ  １２８：１０６４−１０６５、を参照されたい。
【００４３】
下記のように示されている式ＩＩＩでは：
【００４４】
【化３】
2010521246.tif 000005
ここで、Ｒ９が細胞接着性ポリペプチド、リンカー、付随的な表面結合部分、Ｈ又はそれらの組み合わせであり、かつＲ９は、少なくとも一つの細胞接着性ポリペプチドに直接的又は間接的に付着される。例えば、Ｒ９はリンカーであり、同リンカーは少なくとも一つの細胞接着性ポリペプチドに付着されている。
【００４５】
カテコール部分は標準的なペプチド合成技術によってポリペプチドに容易に付着され、同ポリペプチドは細胞接着性ポリペプチド、ペプチドリンカー及び／又は付随的なカテコール部分を含む。参照によって本明細書において援用される、フー（Ｈｕ）ら（２０００）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４１：５７９５−５７９８、を参照されたい。細胞接着性ポリペプチド、ペプチドリンカー、及び／又は付随的なカテコール部分の一部である、又は付着される付随的なアミノ酸に付着された式ＩＩのカテコール部分の１例を、式ＩＶとして以下に示す：
【００４６】
【化４】
2010521246.tif 000006
ここで、Ｒ６及びＲ７は天然由来のアミノ酸側鎖又は非天然由来のアミノ酸側鎖であり；Ｒ５はＨ、リンカー、カテコール部分、細胞接着性ポリペプチド又はそれらの組合せであり；そしてＲ８はＯＨ、リンカー、カテコール部分、細胞接着性ポリペプチド又はそれらの組合せであり；かつＲ５及びＲ８の少なくとも１つが少なくとも１つの細胞接着性ポリペプチドに付着されている。更なる例は、Ｒ５及びＲ８の少なくとも１つがリンカーである場合を含み、１つ以上のリンカーが少なくとも１つ細胞接着性ポリペプチドに付着されている。
【００４７】
ある特定の例では、表面結合部分は１つ以上のアミノ酸によって結合される少なくとも２つの式ＩＩのＤＯＰＡ部分を含む。特定の例は以下の式Ｖで示され、カテコール表面結合部分がＤＯＰＡ−Ｌｙｓ−ＤＯＰＡ−Ｌｙｓ−であるか、又は（ＤＯＰＡ−Ｌｙｓ）２である。式Ｖはまた、細胞接着性ポリペプチドの例であるＹＩＧＳＲに付着される（ＤＯＰＡ−Ｌｙｓ）２表面結合部分を示す。式Ｖでは、細胞接着性ポリペプチドはペプチドリンカー，（Ａｌａ−Ａｉｂ）３に付着されている。
【００４８】
【化５】
2010521246.tif 000007
一般に、カテコール部分を含むがそれに限定されない接着性部分は互いに結合され得、そしてリンカーによって細胞接着性ポリペプチドに結合される。リンカーは、金属表面からの間隔を、可撓性を、二次若しくは高レベル構造（例えば、α螺旋形）を、そして表面結合細胞接着性ポリペプチドの成分又は一部に付着されるための反応部位を、提供する。カテコール接着部分及び細胞接着性ポリペプチドの間のリンカーは、内皮細胞のような上皮細胞への結合に対し、基質表面からの細胞接着部分の間隙を提供するのに十分な長さであることが好ましい。リンカーを介する金属表面からの間隙はまた、例えば医療機器の表面に対する血液タンパク質又はその他の成分の非特異的な会合により細胞接着部分が遮断される（例えば、生物付着）のを回避するのに十分な長さである。カテコール接着部分及び細胞接着性ポリペプチド間のリンカーは、多くの場合、少なくとも２０Åの長さである。典型的には、カテコール接着部分及び付着された細胞接着性ポリペプチド間のリンカーは、少なくとも２０Å乃至７０Åの範囲内であるが、代替的な長さも可能である。
【００４９】
本明細書に記載されているように、使用に適した例示的なリンカーは、任意のアルカン、アルケン又は芳香族分子から選択され、それらの任意のものは、付着が可能なＮ、Ｓ、又はＯ及びそれらの組合せとのヘテロ置換型である。多くの場合、リンカーは、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、並びに天然由来の及び非天然由来のアミノ酸のポリペプチドから選択される。典型的には、カテコール接着部分及び細胞接着性ポリペプチド間のリンカーは、少なくとも２つの天然由来の及び／又は非天然由来のアミノ酸から形成されたポリペプチドであることが好ましい。場合によっては、カテコール接着部分及び細胞接着性ポリペプチド間のリンカーは、２乃至６個のアミノ酸から形成されたポリペプチドであることが好ましいが、代替的なものも可能である。例えば、個々のカテコール部分のような接着性部分間のリンカーは、より短い、例えば少なくとも１つの天然由来の及び／又は非天然由来のアミノ酸であり得る。
【００５０】
ポリビスホスホネート
表面結合細胞接着性ポリペプチド１０６の別の例を図３に示す。表面結合細胞接着性ポリペプチド１０６において、細胞接着性ポリペプチド１０８がポリビスホスホネート接着部分１１２に付着されている。図３に示されるように、１つ以上のポリビスホスホネート接着部分１１２はリンカー１１０によって細胞接着性ポリペプチド１０８に付着されるかもしれない。ポリビスホスホネートはリンカーによって互いに結合され、そして細胞接着性ポリペプチドに結合される。適切なリンカーは、任意のアルカン、アルケン又は芳香族分子から選択され、それらの任意のものは、Ｎ、Ｓ、又はＯ及びそれらの組合せとのヘテロ置換型である。場合によっては、リンカーは、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、並びに天然由来の及び非天然由来のアミノ酸のポリペプチドから選択される。
【００５１】
加えて、リンカー１１０は、基質表面からの間隔を、可撓性を、二次若しくは高レベル構造（例えば、α螺旋形）を、自己凝集単一層を、そして付着のための反応部位を、提供する。ポリビスホスホネート接着部分１１２と細胞接着性ポリペプチド１０８との間のリンカー１１０は、内皮細胞のような上皮細胞への結合に対し、基質表面からの細胞接着部分の間隙を提供するのに十分な長さであることが好ましい。リンカーを介する金属表面からの間隙はまた、例えば医療機器の表面に対する血液タンパク質又はその他の成分の非特異的な会合により細胞接着部分が遮断される（例えば、生物付着）のを回避するのに十分な長さである。ポリビスホスホネート接着部分及び細胞接着性ポリペプチド間のリンカーは、多くの場合、少なくとも２０Åの長さである。典型的には、ポリビスホスホネート接着部分及び付着された細胞接着性ポリペプチド間のリンカーは、少なくとも２０Å乃至７０Åの範囲内であるが、代替的な長さも可能である。
【００５２】
ポリアリルアミンビスホスホネートのようないくらかのポリビスホスホネートは、標準的なペプチドカップリング化学を使用してペプチドリンカー及び／又は細胞接着性ポリペプチドに結合され得るアミノ官能基を有する。更なるポリビスホスホネートは、参照によって本明細書において援用されるフィッシュベイン（Ｆｉｓｈｂｅｉｎ）ら（２００６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０３（１）：１５９−１６４に記載されている。
【００５３】
接着性ポリペプチド部分
表面結合細胞接着性ポリペプチド１０６の別の例を図４に示し、細胞接着性ポリペプチドが接着性ポリペプチドセグメントに付着されるか、又は同セグメントとともに合成されている。接着性ポリペプチド部分は、複数の疎水性アミノ酸又は帯電されたアミノ酸を含有するペプチドを含む。多くの場合、接着性ポリペプチド部分は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はそれらの組合せである正荷電のアミノ酸を含む。例えば、図４に示されるように、細胞接着性ポリペプチド１０８は、ポリリジンアミノ酸の配列を含む接着性ポリペプチドセグメント１１２に付着されており、当該アミノ酸の各々はｐＨ１０未満の正の電荷を保持する。更なる例はまた、参照によって本明細書において援用される、ウィレット（Ｗｉｌｌｅｔ）ら（２００５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０２（２２）：７８１７−７８２２、トサッティ（Ｔｏｓａｔｔｉ）ら（２００３）、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２４：４９４９−４９５８、及びエリス−ベンケ（Ｅｌｌｉｓ−Ｂｅｈｎｋｅ）（２００６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０３：５０５４−５０５９を参照されたい。ある特定の例において、各接着性ポリペプチド部分は少なくとも５つの連結された疎水性又は帯電されたアミノ酸を含む。ある特定の例において、各接着性ポリペプチド部分は少なくとも１０個の連結された疎水性又は帯電されたアミノ酸を含む。
【００５４】
リンカー１１０は、基質表面からの間隔を、可撓性を、二次若しくは高レベル構造を、自己凝集単一層を、提供する。多くの場合、リンカーは、例えば、医療機器の表面に対する血液タンパク質又はその他の成分の非特異的な会合により細胞接着部分が遮断される（例えば、生物付着）のを回避するのに十分な長さである金属表面からの間隙を提供する。典型的には、接着性ポリペプチドセグメント１１２及び細胞接着性ポリペプチド１０８間のリンカー１１０は、同細胞接着性ポリペプチドを移植可能な医療機器の表面から分離するために少なくとも２０Åの長さである。典型的には、接着性ポリペプチドセグメント及び付着された細胞接着性ポリペプチド間のリンカーは、２０Å乃至７０Åの範囲内であるが、代替的なものも可能である。場合によっては、リンカーは、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、並びに天然由来の及び非天然由来のアミノ酸のポリペプチドから選択される。
【００５５】
細胞接着性ポリペプチド
本明細書において使用されるように、用語「細胞接着性ポリペプチド」は、上皮細胞の表面に表示されるインテグリンのような細胞表面分子を介して上皮細胞（例えば、内皮細胞）に結合することができる化合物であって、分子ごとに少なくとも２つのアミノ酸を有する、化合物を指す。
【００５６】
典型的には、細胞接着性ポリペプチドは、細胞接着の役割を担うことが知られている細胞外マトリックスのタンパク質の任意のものであり、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、フィブリノゲン並びにＩ型、ＩＩ型及びＶ型等のコラーゲンを含む。付随的に、細胞接着性ポリペプチドは上記分子の結合ドメインを含む誘導体又はフラグメントを含む前述のタンパク質の任意のものから得られる任意のペプチドであるかもしれない。例示的なペプチドは、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩）のモチーフ、ＹＩＧＳＲ（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）のモチーフ及び機能的等価物である関連したペプチドのようなインテグリン−結合モチーフを有するものを含む。例えば、ＲＧＤ配列（例えば、ＧＲＧＤＳ）及びＷＱＰＰＲＡＲＩ配列を含むポリペプチドは、内皮細胞の拡散及び遊走特性を指示することが知られている。ブイ．ゴウロー（Ｖ．Ｇａｕｖｒｅａｕ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．、（２００５）９月−１０月、１６（５），１０８８−９７を参照されたい。ＲＥＤＶのテトラペプチドは、内皮細胞の接着を支持するが、平滑筋細胞、繊維芽細胞、又は血小板の接着を支持することは示されず、ＹＩＧＳＲのペンタペプチドは上皮細胞の付着は促進するが、血小板の付着は促進しないことが示されていた。ＲＥＤＶ及びＹＩＧＳＲペプチドの更なる情報は、米国特許第６，１５６，５７２号明細書及び米国特許出願第２００３／００８７１１１号で見つけることができる。また、本明細書中において参照により援用されている、ボーテン（Ｂｏａｔｅｎｇ）らの「ＲＧＤ及びＹＩＧＳＲ合成ペプチドはラミニン及びフィブロネクチンと同一の細胞接着を促進するが新生児の心筋細胞の生理機能を変更する（ＲＧＤ  ａｎｄ  ＹＩＧＳＲ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｔｏ  Ｔｈａｔ  ｏｆ  Ｌａｍｉｎｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ｂｕｔ  Ａｌｔｅｒ  ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｍｙｏｃｙｔｅｓ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．−Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８８：３０−３８（２００５）を参照されたい。細胞接着配列の更なる例は内皮細胞のＣＤ１３に結合するＮＧＲトリペプチドである。例えば、エル．ホール（Ｌ．Ｈｏｌｌｅ）ら「ヒト結晶とα（１−３）ガラクトースエピトープを担持するヒトアルブミンタンパク質に結合されたＮＧＲペプチドとの共培養によるヒト内皮細胞のインビトロ標的化による死滅（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ＮＧＲ  ｐｅｐｕｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｅａｒｉｎｇ  ａｌｐｈａ（１−３）  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）」、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．（２００４年３月）；１１（３）：６１３−６を参照されたい。細胞接着性ポリペプチドはまた、本明細書中において参照により援用されている、米国特許出願公開第２００６００６７９０９号（ウェスト（Ｗｅｓｔ）ら）に記述されているペプチドの任意のものであり得る。代替的に、細胞付着性ポリペプチドは特定の細胞タイプ（例えば内皮細胞）への付着及び選択性のためにライブラリーをスクリーニングすることによって得られるか、或いは、バクテリオファージディスプレイ技術によって経験的に開発され得る。
【００５７】
表面結合細胞接着性ポリペプチドでコーティングされる移植可能な医療機器
移植可能な医療機器は、第１の表面及び第２の表面を有する基質を含むものとして提供され、第１の基質表面の少なくとも一部が表面結合細胞接着性ポリペプチドに結合するかもしれない。典型的に、移植可能な医療機器は、第１の表面及び第２の表面を有する基質と、第１の基質表面の少なくとも一部に配置される表面結合細胞接着性ポリペプチドの層と、を含む。表面結合細胞接着性ポリペプチドはまた、第１の表面に結合する前に、後に、又は同結合する間に、上皮細胞（例えば、内皮細胞）に結合するかもしれない。
【００５８】
移植可能な医療機器の例は、例えば、ステント（冠状血管用ステント、末梢血管用ステント、大脳用、尿道用、尿管用、胆管用、気管用、消化管用及び食道用のステント）、ステントカバー、ステント移植片、血管移植片、腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）装置（例えば、ＡＡＡのステント、ＡＡＡ移植片）、血管アクセスポート、透析用ポート、カテーテル（バルーンカテーテル及び種々の中心静脈カテーテルのような泌尿器科用カテーテルまたは血管カテーテル）、バルーン、フィルタ（例えば、大静脈フィルタ及び蒸留保護装置のためのメッシュフィルタ）、脳動脈瘤フィラーコイル、中隔欠損閉鎖装置、心筋プラグ、パッチ、ペースメーカー、ペースメーカーリードを含むリードコーティング、除細動リード及びコイルを含む塞栓装置、左心室補助用ヒア及びポンプ、完全人工心臓、バイパスを含む左心室補助装置、心臓弁及び血管弁を含む弁、吻合用クリップ及びリング、蝸牛インプラント、組織バルク装置、軟骨、骨、皮膚及びインビボの組織再生におけるその他のもののための組織工学用足場、縫合、縫合アンカー、組織ステープル及び手術部位における結紮クリップ、カニューレ、金属ワイヤ結紮糸、尿道用スリング、ヘルニア「メッシュ」、人工結紮糸、骨移植片のような整形外科用プロテーゼ、骨プレート、フィン、及び融合装置、関節プロテーゼ、くるぶし、膝及び手の領域における干渉スクリュ、結紮糸取り付け及び半月板修復のための鋲のような整形外科用固定装置、歯科用インプラント、或いは内皮と接触した状態にて身体に移植される装置を含む。
【００５９】
表面結合細胞接着性ポリペプチドの層が配置された医療機器は、例えば、全身処置のために、同様に、任意の組織又は器官の局所用処置のために、使用される移植可能な医療機器を含む。非限定的な例は、腫瘍、心臓、冠状血管系及び末梢血管系（全体として「血管系」として参照される）を含む器官、腎臓、膀胱、尿道、尿管、前立腺、子宮及び卵巣を含む尿生殖器系、目、耳、脊柱、神経系、肺、気管、食道、腸、胃、脳、肝臓及び膵臓、骨格筋、平滑筋、胸、皮膚組織、軟骨組織、歯及び骨である。本明細書において使用されるように、「治療」とは、病気又は症状と関連付けられる徴候の低減又は除去、或いは病気又は症状の実質的な、若しくは完全な除去を示す。被験者は脊椎動物被験者、より典型的には、ヒト被験者、ペット及び家畜を含む哺乳動物の被験者、である。
【００６０】
上記されるように、移植可能な医療機器は、第１の表面を有する基質と、同第１の基質表面の少なくとも一部に配置される表面結合細胞接着性ポリペプチドの層と、を含む。多くの場合、移植可能な医療機器は第１の表面及び第２の表面を有し、表面結合細胞接着性ポリペプチドの層が上皮細胞（例えば、内皮細胞）の付着及び／又は増殖を促進するために第１の基質表面の少なくとも一部に配置される。表面結合細胞接着性ポリペプチドの層はまた、第２の基質表面の少なくとも一部に配置され得る、及び／又は、薬物溶出コーティングが第２の基質表面の少なくとも一部に配置され得る。場合によっては、第１の表面及び第２の表面はそれぞれ、内腔面及び反管腔側の面である。例えば、医療機器は、内腔面及び反管腔側の面を有する血管に移植可能な医学機器であり、内腔面の少なくとも一部は、その上に配置される表面結合細胞接着性ポリペプチドを有する。
【００６１】
場合によっては、移植可能な医療機器は第１の表面及び第２の表面が内腔面及び反管腔側の面であり、かつ表面結合細胞接着性ポリペプチドの層が第１の基質表面の少なくとも一部に配置される、ステントである。典型的に、ステントは、開口した格子状の側壁構造を含む血管内ステントであり、患者の血管に永久的に移植されるように設計されている。例としては、自己拡張可能なステント又はバルーンで拡張可能なステントを含む拡張可能なステントを含み、開口した端部と、その内部に開口部を有する側壁構造と、同側壁構造の表面の少なくとも一部に配置される表面結合細胞接着性ポリペプチドの層と、を含む管状の金属体を有する。
【００６２】
多くの場合、上記した表面結合細胞接着性ポリペプチドは、細胞接着性ポリペプチド上に付着された表面結合接着性部分を介してステント表面の金属部分に優先的に結合する。表面結合細胞接着性ポリペプチドの層は金属部分に付着するので、それは、ステントが拡張する場合のような、開口部を保持した様式にて同構造体と生来的に適合する。
【００６３】
代替的に、又は付随的に、上記した表面結合細胞接着性ポリペプチドは、細胞接着性ポリペプチド上に付着された表面結合接着性部分を介してステント表面の非金属無機部分に優先的に結合する。同層は非金属無機部分に付着するので、それは、ステントが拡張する場合のような、開口部を保持した様式にて同構造体と生来的に適合する。
【００６４】
本願の開示に従って、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、同表面結合細胞接着性ポリペプチドが使用可能な結合親和性を有するステント又は他の移植可能な医療機器の表面の少なくとも一部に結合される。典型的には、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、ステント又は他の移植可能な医療機器の内腔面の一部に結合される。多くの場合、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、ステント又は他の移植可能な医療機器の内面の一部又は複数の部分（例えば、内腔面）、あるいは、同ステント又は他の移植可能な医療機器の外面（例えば、反管腔側の面）の一部又は複数の部分に結合される。いくらかの例において、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、ステント又は他の移植可能な医療機器の複数の部分及び／又は複数の表面に結合される。それらの例において、表面結合細胞接着性ポリペプチド。
【００６５】
本願の開示の移植可能な医療機器は、本願の開示の表面結合細胞接着性ポリペプチドが使用可能な結合親和性を有するべく選択される金属材料又は無機非金属材料の少なくとも１つの基質表面を含む。移植可能な医療機器の残りの部分は、組成において広く変更可能であり、任意の特定材料に制限されない。
【００６６】
本明細書に開示されている、移植可能な医療機器の医療機器のための基質材料は、一定の範囲の生体安定性の材料及び生体分解可能な材料（即ち、患者の体内に配置された場合、溶解されるか、分解されるか、再吸収されるか、及び／又はそうでなければ配置された部位から除去される材料）から選択され、当該材料としては、（ａ）重合体材料（即ち、ポリマー、典型的には５０ｗｔ％以上のポリマー、例えば、５０ｗｔ％から、７５ｗｔ％までの、９０ｗｔ％までの、９５ｗｔ％までの、９７．５ｗｔ％までの、９９ｗｔ％又はそれ以上までの、ポリマーを含有する材料）及び生物製剤のような有機材料（即ち、有機種を含む材料であって、典型的には、５０ｗｔ％以上の有機種、例えば、５０ｗｔ％から、７５ｗｔ％までの、９０ｗｔ％までの、９５ｗｔ％までの、９７．５ｗｔ％までの、９９ｗｔ％又はそれ以上までの、有機種を含有する材料）、（ｂ）金属材料（即ち、金属、典型的には５０ｗｔ％以上の金属、例えば、５０ｗｔ％から、７５ｗｔ％までの、９０ｗｔ％までの、９５ｗｔ％までの、９７．５ｗｔ％までの、９９ｗｔ％又はそれ以上までの、金属を含有する材料）及び非金属無機材料（即ち、非金属無機材料、典型的には、５０ｗｔ％以上の非金属無機材料、例えば、５０ｗｔ％から、７５ｗｔ％までの、９０ｗｔ％までの、９５ｗｔ％までの、９７．５ｗｔ％までの、９９ｗｔ％又はそれ以上までの、非金属無機材料を含有する材料））のような無機材料（即ち、無機種を含む材料であって、典型的には、５０ｗｔ％以上の無機種、例えば、５０ｗｔ％から、７５ｗｔ％までの、９０ｗｔ％までの、９５ｗｔ％までの、９７．５ｗｔ％までの、９９ｗｔ％又はそれ以上までの、無機種を含有する材料）（例えば、種々の金属及び非金属酸化物、種々の金属及び非金属窒化物、種々の金属及び非金属カーバイド、種々の金属及び非金属ホウ化物、種々の金属及び非金属リン酸塩、及び種々の金属及び非金属硫化物等を含む、炭素、半導体、ガラス及びセラミックを含む）、及び（ｃ）ハイブリッド材料（例えば、ハイブリッド化した有機／無機材料、例えばポリマー／金属−無機ハイブリッド及びポリマー／非金属−無機ハイブリッド）、を含む。
【００６７】
無機非金属材料の特殊な例は、例えば、以下の一つ以上：酸化アルミニウムおよび遷移金属酸化物（例えば、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、タンタル、モリブデン、タングステン、レニウム、鉄、ニオブ及びイリジウムの酸化物）を含む金属酸化物セラミック；シリコン；チッ化シリコン、シリコーンカーバイド及び酸化ケイ素を含むシリコンベースのセラミック（時として、ガラスセラミックと称される）；リン酸カルシウムセラミック（例えば、ヒドロキシアパタイト）；炭素及びチッ化炭素のような炭素ベースの、セラミック様材料、を含む材料から選択される。
【００６８】
金属材料の特殊な例は、例えば、金、鉄、ニオブ、プラチナ、パラジウム、イリジウム、オスミウム、ロジウム、チタン、タンタル、タングステン、ルテニウム及びマグネシウム等のような金属；鉄及びクロムを含むもの（例えば、プラチナに富んだ放射線不透過性のステンレス鋼を含むステンレス鋼）、ニオブ合金、チタン合金、ニッケル及びチタンからなる合金（例えば、ニチノール（登録商標））、コバルト及びクロムからなる合金、コバルト、クロム及び鉄からなる合金（例えば、エルジロイ（登録商標）合金）、ニッケル、コバルト及びクロムからなる合金（例えば、ＭＰ３５Ｎ）、コバルト、クロム、タングステン及びニッケルからなる合金（例えば、Ｌ６０５）、ニッケル及びクロムからなる合金（例えば、インコネル合金）及びマグネシウム及び／又は鉄の合金を含む生体分解性の合金（及びその、Ｃｅ，Ｃａ，Ｚｎ，Ｚｒ及びＬｉと組み合わせられた合金）等を含む合金、から選択され得る。
【００６９】
有機材料の特殊の例はポリマー（生体安定性の、及び生体分解可能な）及び他の高分子量有機材料が含まれ、例えば以下の１つ以上を含む適切な材料から選択され得る：ポリアクリル酸を含むポリカルボン酸ポリマー及びコポリマー；アセタールポリマー及びコポリマー；アクリル酸塩及びメタクリル酸塩のポリマー及びコポリマー（例えば、ｎ−ブチルメタクリル酸塩）；酢酸セルロース、硝酸セルロース、プロピオン酸セルロース、セルロースアセテートブチレート、セロハン、レーヨン、レーヨントリアセテートを含むセルロースポリマー及びコポリマー及びカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロースのようなセルロースエーテル；ポリオキシメチレンのポリマー及びコポリマー；ポリエーテルブロックイミド、ポリアミジミド、ポリエステルイミド及びポリエーテルイミドのようなポリイミドのポリマー及びコポリマー；ポリアリールスルホン及びポリエーテルスルホンを含むポリスルホンのポリマー及びコポリマー；ナイロン６，６、ナイロン１２、ポリエーテル・ブロックコポリアミドポリマー（例えば、Ｐｅｂａｘ（登録商標）樹脂）、ポリカプロラクタム及びポリアクリルアミドを含むポリアミドのポリマー及びコポリマー；アルキド樹脂、フェノール樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、アリル樹脂及びエポキシドの樹脂を含む樹脂；ポリカーボネート；ポリアクリロニトリル；ポリビニルピロリドン（架橋されたもの及びそうではないもの）；ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニルのようなポリビニルハライド、エチレン−ビニルアセテートコポリマー（ＥＶＡ）、ポリ塩化ビニリデン、ポリビニルメチルエーテルのようなポリビニルエーテル、ポリスチレン、スチレン−マレイン酸無水物コポリマーのようなビニル芳香族のポリマー及びコポリマー、スチレンブタジエンコポリマーを含むビニル芳香族炭化水素コポリマー、スチレン−エチレンーブチレンコポリマー（例えば、Ｋｒａｔｏｎ（登録商標）Ｇシリーズのポリマーとして入手可能な、ポリスチレンポリエチレン／ブチレンポリスチレン（ＳＥＢＳ）コポリマー）、スチレンイソプレンのコポリマー（例えば、ポリスチレン−ポリイソプレン−ポリスチレン）、アクリロニトリル−スチレンコポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレンコポリマー、スチレン−ブタジエンコポリマー及びスチレン−イソブチレンコポリマー（例えば、ＳＩＢＳのようなポリイソブチレン−ポリスチレンのブロックコポリマー）、ポリ酢酸ビニルのようなポリビニルケトン、ポリビニルカルバゾール及びポリビニルのエステルを含むビニルモノマーのポリマー及びコポリマー；ポリベンズイミダゾール；イオノマー；ポリエチレン酸化物（ＰＥＯ）を含むポリアルキル酸化物のポリマー及びコポリマー；ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート及びラクチド（乳酸並びに、ｄ−，ｌ−及びメソラクチドを含む）、ε−カプロラクトン、グリコリド（グリコール酸を含む）、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、パラ−ジオキサノン、トリメチレンカーボネート（及びそのアルキル誘導体）、１，４−ジオキセパン−２−オン、１，５−ジオキセパン−２−オンおよび６，６−ジメチル−１，４���ジオキサン−２−オン（ポリ乳酸とポリカプロラクトンのコポリマーが１つの特殊な例である）のような脂肪族ポリエステルを含むポリエステル；ポリフェニレンエーテルのようなポリアリールエーテル、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトンのようなポリエーテルのポリマー及びコポリマー、ポリフェニレンスルフィド；ポリイソシアネート；ポリプロピレン、ポリエチレン（低密度及び高密度、低分子量及び高分子量）、ポリブチレン（ポリブト−１−エン及びポリイソブチレンのような）を含むポリアルキレン、ポリオレフィンエラストマー（例えば、サントプレン）、エチレンプロピレンジエンモノマー（ＥＰＤＭ）ゴム、ポリ−４−メチル−ペン−１−エン、エチレン−α−オレフィンコポリマー、エチレン−メチルメタクリレートコポリマー及びエチレン−酢酸ビニルコポリマーを含むポリオレフィンのポリマー及びコポリマー；ポリテトラフルオルエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリ（テトラフルオロエチレン−コ−ヘキサフルオロプロピレン）（ＦＥＰ）、修飾したエチレンテトラフルオロエチレンコポリマー（ＥＴＦＥ）及びポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を含むフッ素化されたポリマー及びコポリマー；シリコンのポリマー及びコポリマー；ポリウレタン；ｐ−キシリレンポリマー；ポリイミノカーボネート；ポリエチレンオキシド−ポリ乳酸コポリマーのようなコポリ（エーテル−エステル）；ポリホスファジン；ポリアルキレンオキザレート；ポリオキザアミド及びポリオキザエステル（アミン基及び／又はアミド基を含むものを含む）；ポリオルトエステル；フィブリン、フィブリノゲン、コラーゲン、エラスチン、キトサン、ゼラチン、澱粉及びヒアルロンサンのようなグリコサミノグリカンを含む、ポリペプチド、タンパク質、多糖類及び脂肪酸（及びそのエステル）のようなバイオポリマー；並びに上記したものの混合物及び更なるコポリマーを含む。
【００７０】
典型的には、表面結合細胞接着性ポリペプチドとのコーティングに適したステント又は他の移植可能な医療機器は１つ以上の金属表面を備えている。多くの場合、金属表面は、ステンレス鋼、チタン合金、タンタル及びコバルトクロム合金からなる群より選択される。場合によっては、ステント又は移植可能な医療機器の金属表面は、表面結合細胞接着性ポリペプチドでコーティングされる前に少なくとも部分的に酸化される。例えば、クロムを含有するステンレス鋼のようなある種の合金は、標準的な環境条件下で酸化し、結果として、予め酸化されることが考慮される。場合によっては、医療機器の表面は、例えば酸化物を除去することによって、金属表面の化学的環境を変えるべく処理される。
【００７１】
ステントの金属表面は、テキスチャ化されていない（ｕｎｔｅｘｔｕｒｅｄ）か、又はテキスチャ化されている（ｔｅｘｔｕｒｅｄ）。時として、移植可能な医療機器の金属表面は、本明細書において参照により援用される米国特許出願公開第２００５／０２６６０４０号（ガーベディング（Ｇｅｒｂｅｒｄｉｎｇ））に記載されているような多孔ステント表面のような多孔性である。ある場合において、移植可能な医療機器の表面は、例えば、表面に地形的な特徴（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ）を提供することにより、テキスチャを与えるべく改質される。例えば、表面のテキスチャは、内皮細胞が表面を提供され、被覆されるべき増殖（例えば、コンフルエンス）が迅速に生ずるように最適化され得る（例えば、テキスチャの特徴が適切にサイズ化され、かつ間隔をあけられる）。例えば、テキスチャ表面にて培養された内皮細胞は迅速に広がり、生来の動脈においてより細胞のように見えることが文献に示されている。例えば、本細書において参照により援用される、アール．ジー．フレミング（Ｒ．Ｇ．Ｆｌｅｍｍｉｎｇ）ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０（１９９９年）、５７３−５８８頁及び等エヌ．フジサワ（Ｎ．Ｆｕｊｉｓａｗａ）ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０（１９９９年）、９５５−９６２頁を参照されたい。加えて、地形的な特徴備えた表面は表面積が増大している。典型的には、移植可能な医療機器がテキスチャ化された表面を有する場合、当該テキスチャは、同表面を表面結合細胞接着性ポリペプチドでコーティングされる前に与えられる。
【００７２】
血管系へ送達するための分岐したステント及びシステムの例は、それらに限定されるものではないが、いずれも発明の名称が回転するバルーン拡張可能なシース分岐部送達（Ｒｏｔａｔｉｎｇ  Ｂａｌｌｏｏｎ  Ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ  Ｓｈｅａｔｈ  Ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）である、２００３年２月２７日に出願された、米国特許出願第１０／６５７，４７２号及び２００３年９月８日に出願された、米国特許出願第１０／６５７，４７２号に示されるとともに記載されており、かつ、発明の名称が回転するバルーン拡張可能なシース分岐部送達システム（Ｒｏｔａｔｉｎｇ  Ｂａｌｌｏｏｎ  Ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ  Ｓｈｅａｔｈ  Ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）である、２００３年１２月２９日に出願された米国特許出願第１０／７４７，５４６号及び発明の名称が、分岐したステント送達システム（Ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ  Ｓｔｅｎｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）である２００４年１月１３日に出願された米国特許出願第１０／７５７，６４６号に記載されており、これらの各々の全体の内容は、本明細書において参照により援用される。ステント１００は、既に記載されたような標準的な「単一の容器」型のステントであるが、ステント１００はまた、トランク又はステム部を有するとともに、同トランク又はステム部に隣接する一つ以上の脚部及び／又は分岐開口部を備えた、分岐したステント、であり得ることを、更に明記すべきである。そのような分岐したステント及びステントアセンブリは、当該技術分野において周知である。
【００７３】
加えて、１つの表面基質の少なくとも一部に配置される表面結合細胞接着性ポリペプチドを有する移植可能な医療機器は、血管内、又は同血管に隣接する一つ以上の領域のような送達部位に、１つ以上の治療剤を送達するように構成され得る。例えば、図１において、ステント１００は内腔面１２０の少なくとも一部に配置される表面結合細胞接着性ポリペプチドの層を含み、薬剤溶出用のコーティング層は反管腔側の面１２２の少なくとも一部に配置され得る。薬剤溶出用コーティングは少なくとも１つの治療剤及び少なくとも１つのポリマーを含む。
【００７４】
「治療剤」、「生物学的な活性剤」、「薬物」、「製薬的な活性剤」、「製薬的に活性を有する材料」、及び他の関連した用語は、本明細書においては相互に変換可能に使用され、遺伝的な治療剤、非遺伝的な治療剤及び細胞を含むかもしれない。多種にわたる治療剤は、多種にわたる疾病及び症状（即ち、疾病又は症状の関連した徴候の低減又は除去、或いは、疾病又は症状の実質的な、又は完全な除去）の治療のために使用されるものを含み、本明細書において開示された移植可能な医療機器と組み合わせて使用され得る。種々の治療剤は以下に列挙されている。
【００７５】
本明細書に開示されている移植可能な医療機器と関連して使用するのに適切な非遺伝的治療剤は、例えば以下のうちの１つ以上から選択され得る：（ａ）ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、クロピドグレル及びＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニンプロリンアルギニンクロロメチルケトン）のような抗血栓剤、（ｂ）デキサメタゾン、プレドニゾロン、コルチコステロン、ブデソニド、エストロゲン、スルファサラジン及びメサラミンのような抗炎症剤；（ｃ）パクリタキセル、５−フルオロウラシル、シスプラチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エポシロン、エンドスタチン、アンジオスタチン、アンジオペプチン、平滑筋細胞増殖をすることが可能なモノクロナール抗体及びチミジンキナーゼ阻害剤のような抗腫瘍性／抗増殖性／抗縮瞳剤；（ｄ）リドカイン、ブピバカイン及びロピバカインのような麻酔剤；（ｅ）Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ＲＧＤペプチド含有化合物、ヘパリン、ヒルジン、抗トロンビン化合物、血小板受容体拮抗剤、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、プロスタグランジン阻害剤、血小板阻害剤及びダニ抗血小板ペプチドのような抗凝血剤；（ｆ）成長因子、転写活性化因子及び翻訳プロモータのような血管細胞成長プロモータ；（ｇ）成長因子阻害剤、成長因子受容体のアンタゴニスト、転写リプレッサ、翻訳リプレッサ、複製阻害剤、阻害的な抗体、成長因子に指向する抗体、成長因子及び細胞毒素から構成される２機能分子、抗体及び細胞毒素から構成される２機能分子を含む血管細胞成長阻害剤；（ｈ）タンパク質キナーゼ及びチロシンキナーゼの阻害剤（例えば、チルホスチン、ゲニステイン、キノキサリン）；（ｉ）プロスタサイクリンの類似体；（ｊ）コレステロール低下剤；（ｋ）アンジオポイエチン；（ｌ）トリクロサン、セファロスポリンのような抗菌剤、マガイニン、アミノグリコシド及びニトロフラントインのような抗菌ペプチド；（ｍ）細胞毒素剤、細胞増殖抑制剤及び細胞増殖影響因子；（ｎ）血管拡張剤；（ｏ）内因性血管作動機構に影響を与える薬剤、（ｐ）モノクロナール抗体のような白血球動員の阻害剤、；（ｑ）サイトカイン；（ｒ）ホルモン；（ｓ）ゲルダマイシンを含むＨＳＰ９０プロテインの阻害剤（即ち、分子シャペロン又はハウスキーピングタンパク質であり、かつ細胞の成長及び生存に寄与するその他のクライアントタンパク質／シグナル伝達タンパク質の安定性及び機能のために必要である、ヒートショックタンパク質）、（ｔ）β−ブロッカー（ｕ）ｂＡＲＫｃｔ阻害剤、（ｖ）ホスホランバン阻害剤、（ｗ）Ｓｅｒｃａ２遺伝子／タンパク質、（ｘ）アミノキノリン、例えば、レシキモド及びイミキモドのようなイミダゾキノリンを含む免疫反応調整剤、（ｙ）ヒトアポリポタンパク質（ａｐｏｌｉｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）（例えば、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＩＩ、ＡＮ、ＡＶ等）。
【００７６】
好ましい非遺伝的治療剤は、パクリタキセル（その粒子形態のもの、例えば、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）のようなアルブミン結合パクリタキセルナノ粒子のようなタンパク質と結合されたパクリタキセル粒子を含む）、シロリムス、エベロリムス、タクロリムス、ＥｐｏＤ、デキサメタゾン、エストラジオール、ハロフィギノン（ｈａｌｏｆｉｒｇｉｎｏｎｅ）、シロスタゾール、ゲルダマイシン、ＡＢＴ−５７８（アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社）、トラピジル、リプロスチン、アクチノマイシンＤ、ＲｅｓｔｅｎＮＧ、Ａｐ−１７、アブシキシマブ、クロピドグレル、リドグレル、β−ブロッカー、ｂＡＲＫｃｔ阻害剤、ホスホランバン阻害剤、Ｓｅｒｃａ２遺伝子／タンパク質、イミキモド、ヒトアポリオプロテイン（例えば、ＡＩ−ＡＶ）、成長因子（例えば、ＶＥＧＦ−２）並びに上記の誘導体等を含む。
【００７７】
本明細書に開示されている移植可能な医療機器に関連して使用するための例示的な遺伝的治療剤は、アンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡ並びに、（ａ）アンチセンスＲＮＡ、（ｂ）不完全又は不十分な内因性分子と置き換えるためのｔＲＮＡ又はｒＲＮＡ、（ｃ）酸性及び塩基性の繊維芽細胞成長因子、血管内皮成長因子、表皮成長因子、形質転換成長因子α及びβ、血小板由来の内皮成長因子、血小板由来の成長因子、腫瘍壊死要因α、肝細胞増殖成長因子及びインシュリン様成長因子のような成長因子を含む血管新生因子、（ｄ）ＣＤ阻害剤を含む細胞周期阻害剤、及び（ｅ）チミジンのキナーゼ（「ＴＫ」）及びその他の細胞増殖を干渉するのに有用な薬剤、に対してコードするＤＮＡ、を含む。また、興味深いものは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６（Ｖｇｒ−１）、ＢＭＰ−７（（ＯＰ−Ｉ）、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−１６を含む、骨形態形成タンパク質（ＢＰＭ）のファミリーをコードするＤＮＡである。現在のところ好ましいＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７のうちの任意のものである。これらの二量体タンパク質は、ホモ二量体、ヘテロ二量体、若しくはその組み合わせを単独で、又は他の分子と組み合わせて提供され得る。代替的に、又は付随的に、ＢＭＰの上流側又は下流側の効果を誘導することが可能な分子が提供され得る。そのような分子は、「ヘッジホッグ」タンパク質、又はそれをコードするＤＮＡの任意のものを含む。
【００７８】
遺伝的治療剤を送達するためのベクタは、アデノウィルス、ｇｕｔｔｅｄアデノウィルス、アデノ関連ウイルス、レトロウィルス、アルファウイルス（セムリキフォレスト及びシンドビス等）、レンチウィルス、単純ヘルペスウイルス、複製型ウィルス（例えば、ＯＮＹＸ−０１５）のようなウィルスベクタ、及びハイブリッドベクタ；人工染色体及びミニ染色体、プラスミドＤＮＡベクタ（例えば、ｐＣＯＲ）、カチオンポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、グラフトコポリマー（例えば、ポリエーテル−ＰＥＩ及びポリエチレン酸化物−ＰＥＩ）、中性ポリマー  ＰＶＰ、ＳＰ１０１７（ＳＵＰＲＡＴＥＫ社）、カチオン脂質、リポソーム、リポプレックスのような脂質、ナノ粒子又はマイクロ粒子のような非ウィルスベクタであって、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）のような標的配列を伴う及び伴わないもの、を含む。
【００７９】
本明細書において開示されている移植可能な医療機器に関連して使用するための細胞は、ヒト器官（自己移植の、または同種異系の）の細胞を含み、全骨髄細胞、骨髄細胞に由来する単核細胞、前駆細胞（例えば、内皮前駆細胞）、幹細胞（例えば、間葉細胞、造血細胞、神経細胞）、多能性幹細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、衛星細胞、周皮細胞、心筋細胞、骨格筋細胞若しくはマクロファージ、を含み、或いは、動物由来のもの、細菌由来のもの若しくは真菌由来のもの（異種）を含み、それらは、関心のあるタンパク質を送達するために所望に応じて遺伝的に設計することができる。
【００８０】
上記に列挙されたものに必ずしも制限されるものではないが、種々の治療剤は、例えば、再狭窄を標的とする薬剤として、血管治療及びその他の治療の投薬計画のための候補として特定された。そのような薬剤は、本明細書に開示されている移植可能な医療機器の実施において有用であり、適切な例は以下のうちの一つ以上から選択され得る：（ａ）ジルチアゼム及びクレンチアゼムのようなベンゾチアゼピン、ニフェジピン、アムロジピン及びニカルダピンのようなジヒドロピリジン及びベラパミルのようなフェニルアルキルアミンを含むＣａ−チャネルブロッカー、（ｂ）ケタンセリン及びナフチドロフリルのような５ＨＴアンタゴニスト並びにフロキセチンのような５ＨＴ−取り込み阻害剤を含むセロトニン経路調整剤、（ｃ）シロスタゾール及びジピリダモールのようなホスホジエステラーゼ阻害剤、フォルスコリンのようなアデニレート／グアニレートシクラーゼ刺激剤、並びにアデノシン類似体を含む環状ヌクレオチド経路作用剤、（ｄ）プラゾシン及びブナゾシンを含むα−アンタゴニスト、プロプラノロールのようなβ−アンタゴニスト、ラベタロール及びカルベジロールのようなα／β−アンタゴニストを含むカテコールアミン調整剤、（ｅ）エンドセリン受容体アンタゴニスト、（ｆ）ニトログリセリン、２硝酸イソソルバイド、及び亜硝酸アミルのような有機硝酸塩／亜硝酸塩、ニトロプルシドナトリウムのような無機ニトロソ化合物、モルジドミン及びリンシドミンのようなシドノンイミン、ジアゼニウムジオレート（ｄｉａｚｅｎｉｕｍ  ｄｉｏｌａｔｅｓ）のようなノノエート、アルカンジアミンのＮＯ添加物、低分子量化合物（例えば、カプトプリルのＳニトロソ誘導体、グルタチオン及びＮ−アセチルペニシラミン）及び高分子量化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、オリゴ糖類、多糖類、合成ポリマー／オリゴマー及び天然ポリマー／オリゴマーのＳ−ニトロ誘導体）を含むＳ−ニトロソ化合物並びにＣニトロソ化合物、Ｏ−ニトロソ化合物、Ｎ−ニトロソ化合物及びＬ−アルギニン、（ｇ）シラザプリル、ホシノプリル及びエナラプリルのようなアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、（ｈ）サララシン及びロサルチンのようなＡＴＩＩ−受容体アンタゴニスト、（ｉ）アルブミン及びポリエチレン酸化物のような血小板接着阻害剤、（ｊ）シロスタゾール、アスピリン及びチエノピリジン（チクロピジン、クロピドグレル）を含む血小板凝集阻害剤及びアブシキシマブ、エプチフィバチド及びチロフィバンを含むＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、（ｋ）ヘパリン、低分子量ヘパリン、硫酸デキストラン及びβ−シクロデキストリンテトラデカスルフェートのようなヘパリノイドを含む凝血経路調整剤、ヒルジン、ヒルログ、ＰＰＡＣＫ（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−プロピルーＬ−ａｒｇ−クロロメチルケトン）及びアルガトロバンのようなトロンビン阻害剤、アンチスタチン及びＴＡＰ（ダニ抗凝固ペプチド）のようなＦＸａ阻害剤、ワルファリンのようなビタミンＫ阻害剤並びに活性化タンパク質Ｃ、（ｌ）アスピリン、イブプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン及びスルフィンピラゾンのようなシクロオキシゲネーゼ経路阻害剤、（ｍ）デキサメタゾン、プレドニゾロン、メタ���レドニゾソン及びヒドロコルチゾンのような天然の及び合成のコルチコステロイド類、（ｎ）ノルジヒドログアヤレチック酸及びカフェイン酸のようなリポオキシゲネーゼ経路阻害剤、（ｏ）ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、（ｐ）Ｅ−及びＰ−セクレチンのアンタゴニスト、（ｑ）ＶＣＡＭ−Ｉ及びＩＣＡＭ−Ｉの相互作用の阻害剤、（ｒ）ＰＧＥｌ及びＰＧＩ２のようなプロスタグランジン、シプロステン、エポプロステノール、カルバサイクリン、イロプロスト及びベラプロストのようなプロスタサイクリン類似体を含むプロスタグランジン及びその類似体、（ｓ）ビスホスホネートを含むマクロファージ活性化遮断剤、（ｔ）ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、シムバスタチン及びセリバスタチンのようなＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤、（ｕ）魚油及びオメガ３−脂肪酸、（ｖ）プロブコール、ビタミンＣ及びＥ、エブセリン、トランス−レチノイン酸及びＳＯＤ模倣体のようなフリーラジカルスカベンジャー／抗酸化剤、（ｗ）ｂＦＧＦ抗体及びキメラ融合タンパク質のようなＦＧＦ経路作用剤、トラピジルのようなＰＤＧＦ受容体アンタゴニスト、アンジオペプチン及びオクレオチドのようなソマトスタチン類似体を含むＩＧＦ経路作用剤、ポリアニオン系作用剤（ヘパリン、フコイジン）、デコリン及びＴＧＦ−β抗体を含むＴＧＦ−β経路作用剤、ＥＧＦの抗体、受容体アンタゴニスト、キメラ融合タンパク質のようなＥＧＦ経路作用剤、サリドマイド及びその類似体のようなＴＮＦ−α経路作用剤、スロトロバン、バピプロスト、ダゾキシベン及びリドグレルのようなトロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）経路調整剤並びにチロホスチン、ゲニステイン及びキノキサリン誘導体のようなタンパク質チロシンのキナーゼ阻害剤を含む種々の成長因子に影響を与える薬剤、（ｘ）マリマスタット、イロマスタット及びメタスタットのようなＭＭＰ経路阻害剤、（ｙ）サイトカラシンＢのような細胞運動阻害剤、（ｚ）プリン類似体（例えば、塩素化されたプリンヌクレオシド類似体である６−メルカプトプリン又はクラドリビン）、ピリミジン類似体（例えば、シタラビン及び５−フルオロウラシル）及びメトトレキセートのような代謝拮抗物質、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルフォン酸塩、エチレンイミン、抗生物質（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン）、ニトロソウレア、シスプラチン、微小管動態に影響を与える薬剤（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、コルヒチン、ＥｐｏＤ、パクリタキセル及びエポチロン）、カスパーゼ活性化剤、プロテアソーム阻害剤、血管新生阻害剤（例えば、エンドスタチン、アンジオスタチン及びスクアラミン）、ラパマイシン、セリバスタチン、フラボピリドール及びスラミンを含む抗増殖剤／抗新生物剤、（ａａ）ハロフィギノン又はその他のキナゾリノン誘導体及びトラニラストのようなマトリックス沈殿／形成経路阻害剤、（ｂｂ）ＶＥＧＦ及びＲＧＤのペプチドのような内皮化促進剤及び（ｃｃ）ペントキシフィリンのような血液レオロジー調整剤。
【００８１】
本明細書に開示されている移植可能な医療機器の実施のために有用な種々の更なる治療剤はまたクンツ（Ｋｕｎｚ）らに付与された米国特許第５，７３３，９２５号明細書にも開示されている。
【００８２】
治療剤溶出ポリマー層は、典型的には、例えば、層内に、１ｗｔ％から、２ｗｔ％未満まで、５ｗｔ％未満まで、１０ｗｔ％未満まで、２５ｗｔ％未満まで、５０ｗｔ％未満まで、又はそれ以上の単一の治療剤若しくは複数の治療剤の混合物を含むであろう。治療剤はまた、例えば以下に列挙されたものから選択され得る。
【００８３】
薬剤溶出コーティングはまた、典型的には、例えば、層内に、５０ｗｔ％から、７５ｗｔ％未満まで、９０ｗｔ％未満まで、９５ｗｔ％未満まで、９７．５ｗｔ％未満まで、９９ｗｔ％未満まで、又はそれ以上の単一のポリマー若しくは複数のポリマーの混合物を含むであろう。ポリマーはまた生体分解性ポリマー又は生体安定性ポリマーであり、かつ例えば、基質において使用するために上記に列挙されたもの、及びテキスチャ化ポリマー層と組み合わせて以下に記載されたものから、選択され得る。
【００８４】
薬剤溶出コーティングの厚みは広く変更可能であり、典型的には、１０ｎｍから、２５ｎｍまで、５０ｎｍまで、１００ｎｍまで、２５０ｎｍまで、５００ｎｍまで、１μｍまで、２．５μｍまで、５μｍまで、１０μｍまで、２０μｍまで、の範囲の厚みであり得る。
【００８５】
薬剤溶出コーティングは、当該技術分野において周知の任意の適切な方法を使用して、基質上に配置され得る。例えば、層が熱可塑性の特徴を有する１つ以上のポリマーを含む場合、層は、例えば、（ａ）ポリマー、治療剤及び所望とされる任意のその他の選択的な種を含有する溶融物を提供する工程と、（ｂ）引き続いて同溶融物を冷却する工程と、により形成され得る。別の例として、層は、例えば、（ａ）１つ以上の溶媒種、ポリマー、治療剤及び所望とされる任意のその他の選択的な種を含有する溶液又は分散体を提供する工程と、（ｂ）引き続いて溶媒種を除去する工程と、により形成され得る。溶融物、溶液及び分散体は例えば、基質への押出成形によって、基質とともに共押出成形によって、基質へのロール塗布によって、ブラシ、ローラ、スタンプ若しくはインクジェットプリンタのような適切な塗布装置を使用して基質に塗布することによって、基質に浸漬することによって、超音波スプレーコーティングのような噴霧技術を使用して基質に噴霧コーティングすることによって、電気流体力学的なコーティングによって、その他の方法によって、基質表面の少なくとも一部に配置され得る。ある例において、基質の別の表面が、薬剤溶出ポリマー層が当該表面に塗布されることを回避するために、マスクされる。
【００８６】
適用方法
表面結合細胞接着性ポリペプチドはステント又は他の移植可能な医療機器の表面の少なくとも一部に結合される。ある特定の例では、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、ステント又は他の移植可能な医療機器の表面の全ての表面に結合される。場合によっては、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、ステント又は他の移植可能な医療機器の表面の内面及び外面に結合される。多くの場合、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、ステント又は他の移植可能な医療機器の内面に結合される。一例では、移植可能な医療機器の内面は内腔面であり、移植可能な医療機器の外面は反管腔側の面である。
【００８７】
表面結合細胞接着性ポリペプチドは、ステント又は他の移植可能な医療機器の表面の少なくとも一部に結合され、また上皮性細胞（例えば、内皮細胞）に結合され得るが、結合の相互作用が起こる順序に関しては制限されるものではない。表面結合細胞接着性ポリペプチドは、基質表面の一部への結合の前に、後に、又は結合時に上皮細胞（例えば、内皮細胞）に結合し得る。典型的には、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、上皮細胞へ結合される前に、ステント又は他の移植可能な医療機器の表面の少なくとも一部に配置される。多くの場合、表面の結合の細胞接着性ポリペプチドは、患者にステント又は他の移植可能な医療機器を使用する前に、即ち、移植前に、同ステント又は他の移植可能な医療機器の少なくとも一部に配置され得る。代替的に、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、ステント又は他の移植可能な医療機器の表面の少なくとも一部と、同表面結合細胞接着性ポリペプチドを結合する前に、上皮細胞に結合され得る。そのような例では、患者への機器の移植は、ステント又は他の移植可能な医療機器の表面に表面結合細胞接着性ポリペプチドを結合する前、又は後に実施され得る。
【００８８】
細胞接着性ポリペプチドは、当該技術分野において周囲のコーティング法を使用することを含む、種々の様式にて、医療機器の表面に適用され得る。一般に、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、ステント又は他の移植可能な医療機器と接触される溶媒を含む混合物中に供給される。コーティングは、ステントを完全に拡張した状態にて適用され得る。また、コーティングはステントを回転した状態にて適用され得る。例えば、参照によって本明細書において援用される米国特許出願公開第２００５／０１５８４０５０号を参照されたい。混合物との接触時間は、表面結合細胞接着性ポリペプチドがステント又は他の移植可能な医療機器との結合によってコーティングを形成すること可能とするように選択される。次に溶媒は、典型的には蒸発によって、取除かれる。ステントは、コーティングを形成するために、表面結合細胞接着性ポリペプチドと１回以上接触され得る。
【００８９】
混合物中の表面結合細胞接着性ポリペプチドの濃度は、典型的には約０．１乃至約１００μＭである。適切な溶媒は、蒸発を促進するための添加物を含むかもしれない水溶液を含む。溶媒は典型的には、本明細書に記載されている表面結合細胞接着性ポリペプチドを少なくとも１μＭの濃度で溶媒和するのに適した、ｐＨ４．０乃至９．０の緩衝液である。
【００９０】
表面結合細胞接着性ポリペプチドは、溶媒中に同表面結合細胞接着性ポリペプチドを含む混合物中に、ステント又は他の移植可能な医療機器を浸すことによって適用され得る。この方法はステントの全表面をコーティングするのに使用され得る。代替的に、コーティングは溶媒中に同表面結合細胞接着性ポリペプチドを含む混合物を含むコーティング組成物を噴霧することによってステントに適用され得る。ステントの選択された領域の全ての表面が噴霧コーティングされ得る。
【００９１】
例えば、表面結合細胞接着性ポリペプチドは、医療機器に堆積される荷電したペプチドを含有する液滴を生ずる従来からの静電気噴霧プロセスによって、医療機器に噴霧され得る。コーティング流体が乾燥すると、ポリペプチドは、同ポリペプチドの側鎖基との分子間結合によって医療機器に接着した状態になる。ある特定の例では、堆積されたポリペプチドは、ヴァン  アルステン（Ｖａｎ  Ａｌｓｔｅｎ）の「加工金属における自己アセンブリされた単層：構造、派生及び実用性（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ｏｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｍｅｔａｌｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ、ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｔｙ）」、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １５：７６０５−１４（１９９９年）、に記載されているように、ラングミュアの単層又は自己アセンブリした単層のような単層を医療機器の表面に形成するかもしれない。
【実施例】
【００９２】
実施例１：ＨＣＡＥＣ移動
生体材料上の内皮細胞の移動及び増殖は、移植可能な医療機器の開発及び成功時に重要である場合もある再内皮化（ｒｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉｚａｔｉｏｎ）及び血管新生の速度に影響を与える。この実験では、ステンレス鋼の基質上にあるヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）の運動性に対する表面結合細胞接着性ポリペプチドの効果をインビトロで試験した。この実施例で使用された表面結合細胞接着性ポリペプチドは、表面結合部分としてのＤＯＰＡ、（ＡＬＡ−Ａｉｂ）３リンカー及び細胞接着性ポリペプチドとしてラミニン受容体（ＹＩＧＳＲ）のため認識配列を含んでいた、即ち、［（ＤＯＰＡ）２―（ＡＬＡ−Ａｉｂ）３−ＹＩＧＳＲ−ＯＨ、以下においてＰＥＰＴＩＤＥ−１と記載］（マサチューセッツ州ボストンに所在の、ハーバード医学校のＭＧＨペプチド／プロテイン・コア施設にて合成した）である。
【００９３】
ヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ，カリフォルニア州サンディエゴに所在の、セル・アプリケーションズ（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）社より入手できる）をこの試験で使用した。基質は滅菌したステンレス鋼ストリップ［３．５”ｘ０．３０８”ｘ０．０３１”］、又はＰＥＰＴＩＤＥ−１でコーティングした滅菌したステンレス鋼ストリップであった。
【００９４】
コラーゲンゲルを以下のプロトコルを使用して調製した：高濃度（ＨＣ）Ｉ型コラーゲン（カリフォルニア州サンノゼ所在のＢＤ  Ｍｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社より入手、ラット尾）の１０ｍｇのバイアル１つを蒸留した滅菌水にて希釈し、最終濃度を３８ｍｌとし、（ピペットを上下に操作させることにより）気泡を入れることなく完全に混合した。次に、コラーゲン溶液を６つの正方形のペトリ皿（６ｍｌ／ペトリ皿）に移した。粘性コラーゲン溶液の容積損失を最小限にするために、同一のピペットを使用して、溶液の全てを移した。緩やかな傾斜と軽い振とうによってコラーゲン溶液をペトリ皿の底にコーティングした。大きな気泡は潰して除去した。小さな泡はピペットの先端を使用して皿の側部に押し出した。
【００９５】
折ったペーパータオルを水酸化アンモニウムで飽和し、同ペーパータオルを少なくとも１つのペトリ皿を保持するのに十分な大きさのタッパーウェア（Ｔｕｐｐｅｒｗａｒｅ（登録商標））の容器内に置くことにより、水酸化アンモニウムチャンバを準備した。覆われていないペトリ皿を水酸化アンモニウムチャンバの水平面に置いて、ふたを密閉した。ペトリ皿はチャンバ内のアンモニア蒸気に５分間さらし、次に除去した。コラーゲンゲルの頂部に蒸留した滅菌水（ＤＳ  Ｈ２Ｏ）の１５のｍｌを加え、１５分間室温に静置した。次に、ゲルを更なる１５ｍｌのＤＳ  Ｈ２Ｏを用いて緩やかに２回洗浄し、次にＤＳ  Ｈ２Ｏ中にて、フード内にて一晩静置した。代替的に、ペトリ皿は覆われて、４℃にて２週間まで保存された。
【００９６】
実験を行う朝に、ゲルを１０ｍｌのＨＣＡＥＣの成長培地（カリフォルニア州サンディエゴに所在のセル・アプリケーションズ社）で緩やかに３回洗浄し、洗浄と洗浄の間は、室温（ＲＴ）にて５分間放置した。ＨＣＡＥＣ成長培地中にて成長したコンフルエントに達したＨＣＡＥＣを含む１個のＴ−７５細胞培養フラスコ（ビーディ・ファルコン（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ））は、アッセイにて使用すべく、ペトリ皿ごとにトリプシン処理により採集した。ペトリ皿上にプレート化される全細胞は、ＨＣＡＥＣ成長培地中のマスター細胞懸濁液と合わせた。マスター細胞懸濁液は各ペトリ皿について少なくとも１０ｍｌの懸濁液を含んでいた。次に１０ｍｌの細胞懸濁液を各ペトリ皿に配置し、３７℃にて約４乃至５時間培養した。
【００９７】
細胞の単一層が形成された後、適切な分配及び拡散についてプレートをチェックした。次にプレートを吸引し、１５ｍｌのＨＣＡＥＣ成長培地を再びプレートに戻した。
滅菌したステンレス鋼ストリップは以下のプロトコルを使用してＰＥＰＴＩＤＥ−１でコーティングした：カルシウム及びマグネシウム（カリフォルニア州カールズバッド所在のインビトロージェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）並びに１０μＭのＰＥＰＴＩＤＥ−１を備えたダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）リン酸緩衝生理食塩水を含有する１．５ｍｌのコーティング溶液を、各ステンレス鋼ストリップをコーティングするために調製した。ピンセットを使用して各ストリップの一方の側の頂部付近に、ストリップの裏側であることを示すべく印「Ｘ」を刻み込んだ。ステンレス鋼ストリップをポリスチレン管に置いて、少なくとも１．５ｍｌのコーティング溶液を各管に加えた。次に、ステンレス鋼のストリップの「Ｘ」側を上向きにした状態にて、振とう機の一方の側に管をおいた。管は４℃にて約１００ＲＰＭにて一晩振とうした。
【００９８】
３連のステンレス鋼ストリップを各ペトリ皿のゲルに押しつけた。完全に垂直になっている場合、ストリップがペトリ皿に適合しなかったので、同ストリップを皿に対してわずかな角度にてゲルに押し込んだ。ストリップが完全にぬれなかった場合、培地がストリップを覆うまで皿を揺らした。ストリップ及び皿を、３７℃のインキュベータに、２日間（４８時間）戻した。
【００９９】
ＨＣＡＥＣの移動活性は以下のプロトコルを使用して定量した：
カルセインＡＭ染料は、所望とされる１２．５ｍｌの染色液（ハンクス平衡液（Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）−ＨＢＳＳ）の各々に対して１つの５０μｇバイアルの染料を得ることによって調製した（約９−１２．５ｍｌの染色液は典型的には正方形のペトリ皿の６個のステンレス鋼ストリップを染色する）。２０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び１５０μｌの温ＨＢＳＳ染色液を、カルセインＡＭの５０μｇバイアルの各々に加え、緩やかに混合した。次にこの溶液を、１２．５ｍｌのＨＢＳＳとともに、正方形のペトリ皿（１００×１５ｍｍ、ファルコン製）に移した。バイアルはＨＢＳＳを用いて洗浄した。ＨＢＳＳを染料と完全に混合し、同染料の約７乃至１０ｍｌが正方形のペトリ皿の各々に移され、その後、同ペトリ皿はホイルにて覆われ、別にしておいた。
【０１００】
ステンレス鋼ストリップをゲルから取り除き、ＨＢＳＳで２回洗浄し、次に染色液に沈めた。ストリップを３７℃にて６０分間培養した後、ＨＢＳＳで３回洗浄し、軽く叩いて乾燥し、以下の設定条件を用いたＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５にて読み取った：最上部蛍光読み取り（ｔｏｐ  ｒｅａｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）；自動カットオフを備えたＥＸ／ＥＭ＝４８５／５３０ｎｍ；及び９位置の十分なスキャン。ペプチドでコーティングされたステンレス鋼ストリップに対して得られた蛍光の読取値は、コーティングされていないステンレス鋼ストリップ（対照）から得られた読取値によって正規化された。
【０１０１】
結果は、ステンレス鋼対照に対するパーセントにて図５において示されており、コーティングされていないステンレス鋼は１に正規化されている。ＨＣＡＥＣの移動は、ステンレス鋼単独のものと比較して、ＰＥＰＴＩＤＥ−１で予めコーティングされたステンレス鋼ストリップは１．７倍大きかった。この差異は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０１）。
【０１０２】
実施例２．濃度範囲試験
濃度範囲試験はステンレス鋼基質上における開示されたポリペプチドに対する有効濃度を決定するために行われた。
【０１０３】
この実施例において、表面結合ポリペプチドは、表面結合部分としてのＤＯＰＡ、（ＡＬＡ−Ａｉｂ）３リンカー、ペプチドフラグメント（ＲＩＧＳＹ）、及びビオチン含んでいた［（ＤＯＰＡ）２−（ＡＬＡ−Ａｉｂ）３−ＲＩＧＳＹ−（ビオチン）−ＯＨ、以下ＰＥＰＴＩＤＥ−２と記載］。ＰＥＰＴＩＤＥ−２は、８ｍｍのＬｉｂｅｒｔｅ  ＷＨステントに上に、１００ＲＰＭの緩やかな撹拌下で、室温にて１時間培養することにより０．０００１μＭ乃至１０００μＭの間の複数の濃度でコーティングした。
【０１０４】
ビオチンアッセイのために、以下の手順を使用した：ＰＥＰＴＩＤＥ−２をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって順次希釈して調製することにより、０．０００１μＭ乃至１０００μＭの濃度を有するサンプルを生成した。ＰＢＳのみの対照溶液も調製した。
【０１０５】
８ｍｍのＬｉｂｅｒｔｅ  ＷＨのステントを、４８ウェルのポリスチレンプレートのウェル内に置いて、各ペプチド濃度（対照を含む）の２４０μｌを各ウェルに加えた。次にプレートを室温（ＲＴ）にて少なくとも１時間、緩やかに振とう（１００ｒｐｍ）しながら培養して結合させた。過剰のペプチド溶液は、マイクロピペットを使用して除去及び廃棄した。
【０１０６】
次にステントを１．５ｍｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄し、洗浄と洗浄の間は１５０ｒｐｍにて約３０秒振とうした。次に、ＰＢＳ中に１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む溶液１．５ｍｌ（ブロッキング溶液）を各ステントに加え、ＲＴにて１時間、緩やかに振とう（１００ｒｐｍ）しながら培養してブロッキングさせた。１時間後、過剰のブロッキング溶液は、マイクロピペットを使用して除去及び廃棄した。次に、ステントは、上記した洗浄方法を用いて１．５ｍｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄した。
【０１０７】
３００μｌのストレプトアビジン−ＡＰ（アルカリホスファターゼ）溶液を各ステントに、ＴＢＳ＋１％ＢＳＡ中に１／１０００にて加え、室温にて緩やかに振とう（１００ｒｐｍ）しながら３０分間培養した。次に、過剰のストレプトアビジン溶液を除去及び廃棄した。次に、ステントを１．５ｍｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて２回洗浄し、次に、ピンセットを用いて同じプレート上の一組の新たなウェルに移した。ステントが移動されると、次にそれらをもう一度１．５ｍｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄した。３００μｌの色原体ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を４８ウェルプレートの各ステントに加えた。次にプレートを振とう機のプラットホーム上に置いて、１００ｒｐｍにて５分間培養し、発色させた。次に、１０μｌの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を、９６ウェル組織培養プレートのウェルに加えた。発色を止めるために、ステントを含有する各ウェル中の溶液の１００μｌを、９６ウェルプレートのＮａＯＨを含有するウェルに移した。
【０１０８】
光学濃度（ＯＤ）は、終点モードの４０５ｎｍにおいてプレートリーダ（モレキュラー・デバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社のＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ）中の９６ウェルプレートを読み取ることにより決定した。対照に対する測定したＯＤ値を、全てのその他の溶液に対するＯＤから引いた。得られたＯＤを濃度（μＭ）（ｌｏｇｘ−軸）に対してプロットした（ｙ軸）。
【０１０９】
結果を図６に示す。二つのラインは、同一のアッセイの二つの別々のランを示す。以下の実験にて使用するのに適したコーティング濃度は１０μＭであると決定された。最大値の半分の濃度（ＥＣ５０）は、約０．３７μＭであると決定された。
【０１１０】
実施例３．培養時間試験
培養時間試験は、ステンレス鋼の、時間の経過におけるペプチド親和性を調査することによって実施した。
【０１１１】
実施例２の表面結合ポリペプチド（ＰＥＰＴＩＤＥ−２）は、実施例２に記載した方法を用いて、０．０００１μＭ乃至１００μＭの間の複数の濃度で、ステンレス鋼の基質（８ｍｍ−ＬｉｂｅｒｔｅＷＨステント、ボストンサイエンティフィック（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社）に適用した。５分におけるＯＤ（４０５ｎｍ）を、上記したように、１時間、４時間及び２４時間に測定した。
【０１１２】
結果を図７に示す。ＥＣ５０のデータ（２４時間＝０．２７μＭ；４時間＝０．３０μＭ；１時間＝０．３１μＭ）は、時間の経過におけるステンレス鋼基質へのＰＥＰＴＩＤＥ−２の親和性はわずかに変化することのみを示している。
【０１１３】
実施例４．ｐＨ試験
ステンレス鋼基質（８ｍｍ−ＬｉｂｅｒｔｅＷＨステント、ボストンサイエンティフィック社）へのＰＥＰＴＩＤＥ−２の親和性におけるｐＨの影響を調査することによってｐＨ試験を実施した。
【０１１４】
実施例２のＰＥＰＴＩＤＥ−２ポリペプチドは、実施例２に記載した方法を用いて、０．０００１μＭ乃至１００μＭの間の濃度範囲にわたり、ｐＨ８、７、６及び４にて、ステンレス鋼基質にコーティングした。５分におけるＯＤ（４０５ｎｍ）を、上記したように測定し、ＥＣ５０を決定した。
【０１１５】
結果を図８に示す。ＥＣ５０は、１つの傾向はあるもののｐＨを７から４に低減しても接着は大きくは変化しなかったことを示す。
実施例５．滅菌試験
滅菌試験は、ステンレス鋼ストリップにコーティングされたＰＥＰＴＩＤＥ−２のＥｔＯ滅菌の影響を調べるために実施した。合計９個のステンレス鋼ストリップを、実施例２にて記載したように、１００μＭ濃度のＰＥＰＴＩＤＥ−２でコーティングした。９個のステンレス鋼ストリップを３つのカテゴリに分類した：（Ａ）３つのコーティングされたストリップを、ＯＤを測定するまで２週間４℃にて保存した（「保存（ｓｈｅｌｆ）」と参照）；（Ｂ）３つのストリップを、ＯＤを測定する前にＥｔＯを用いて滅菌した（滅菌済み（ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ）と参照）；及び（Ｃ）３つのストリップは「未処理」（“ｆｒｅｓｈ”）であった（即ち、ストリップは試験直前にコーティングされ、ペプチド構造における乾燥の影響を評価するために乾燥しなかった）。１０分間での光学濃度（ＯＤ）（４０５ｎｍ）は、上記したように、９個の全てのストリップについて測定した。
【０１１６】
滅菌工程の条件は以下のとおりである：
プロセス温度：１２０±５°Ｆ（４６．１〜５１．７℃）
初期の真空圧力：１．０±０．５ｐｓｉａ（６８９１．２±３４４５．６Ｐａ）
初期の調節圧力：１．２５±０．２５ｐｓｉａ（８６１３．９±１７２２．８Ｐａ）
相対湿度（調節）：３０−１００％
ガス放出圧力：５．４±０．３ｐｓｉａ（３７２１２．２±２０６７．３Ｐａ）
初期のガス放出圧力：１．２＋０．３／−０．２ｐｓｉａ（８２６９．４＋２０６７．３／−１３７８．２Ｐａ）
【０１１７】
ガス露出圧力：１４．０ｐｓｉａ（９６４７６．２Ｐａ）
ＥｔＯガス濃度：５８５ｍｇ／ｌ
真空後シリーズ＃１圧力：１．０±０．５ｐｓｉａ（６８９１．２±３４４５．６Ｐａ）
【０１１８】
真空後シリーズ＃２圧力：１．０±０．５ｐｓｉａ（６８９１．２±３４４５．６Ｐａ）
総プロセス時間：２２時間
ＰＥＰＴＩＤＥ−２ペプチドの親和性は、以下に記載されているビオチンアッセイを使用して試験した。ビオチンアッセイはビオチン基の存在を示すが、ペプチド活性を調査しないことに注意することは重要である。
【０１１９】
ピンセットを使用して、ステンレス鋼ストリップの１つの側に印「Ｘ」を刻んだ。ストリップのこの側は、コーティングされていない状態であると推定された。ストリップをポリスチレンファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）において、１．５ｍｌのペプチドコーティング溶液を、ストリップを含有する各バイアルに加えた。次に同バイアルをインキュベータ内において、ストリップの刻印された側が上向きになるように配向した。コーティング溶液と接触しているストリップの底部側（刻印されていない側）をストリップのコーティングされた側と考えた。バイアルを室温にて少なくとも１時間、緩やかに振とう（１００ｒｐｍ）しながら培養して結合させた。過剰のペプチド溶液は、ピンセットを用いてバイアルからストリップを持ち上げて、同溶液を注ぎだすことによって除去及び廃棄した。ペプチド溶液を除去した後、ステンレス鋼ストリップをバイアル内に戻した。次にストリップをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）−Ｔｗｅｅｎの５ｍｌを用いて１５０ｒｐｍにて３０秒振とうさせることによる洗浄を３回実施した。洗浄液は上記した注ぎだす方法を用いて廃棄した。
【０１２０】
同じバイアル中にて、各ストリップを５ｍｌのＢＳＡブロッキング溶液でブロックした。次にバイアルを刻印した側を上向きにしてインキュベータ内において、室温で１００ｒｐｍにて１時間培養した。１時間後、ブロッキング溶液を除去及び廃棄し、上記した洗浄の手順を繰り返した。
【０１２１】
次に、３．６ｍｌのストレプトアビジン−ＡＰ溶液を、ストリップを含有する各バイアルに加えた。バイアルは、ストリップの刻印された側を上にして、室温で１００ｒｐｍにて３０分間培養した。次に、ストレプトアビジン−ＡＰ溶液を除去及び廃棄した。洗浄手順を繰り返した。
【０１２２】
次にストリップをマニホルドに装填し、マニホルドの各ウェルに３００μｌのｐＮＰＰを加えた。マニホルドを、振とう機のプラットホーム上に置いて、１０分間、緩やかに撹拌（１００ｒｐｍ）しながら、発色させた。
【０１２３】
１０μｌのＮａＯＨを、９６ウェル組織培養プレートのウェルに加えた。発色を止めるために、各ウェル内の溶液の１００μｌを、９６ウェルプレートのＮａＯＨを含有する対応するウェルに移した。光学濃度（ＯＤ）は、終点モードの４０５ｎｍにおいてプレートリーダ中の溶液を含有する９６ウェルプレートを読み取ることにより決定した。
【０１２４】
各ストリップに対して６回の測定を行った。結果を図９に示す。未処理のストリップでの結果は、保存ストリップ及び滅菌ストリップでの結果と統計学的に異なっている。保存ストリップ及び滅菌ストリップは、互いに統計学的に異なってはいなかった。ビオチンアッセイのデータは、保存及び滅菌がステンレス鋼表面に存在するペプチドの量に負の影響を与えないことを示す。このアッセイは表面のペプチド親和性を評価するようには設計されていない。
【０１２５】
実施例６．蛍光及び金標識画像化
蛍光及び金標識画像化を使用して、表面結合ポリペプチドのＬｉｂｅｒｔｅ  ＷＨステント（マサチューセッツ州ネイティックに所在のボストンサイエンティフィック社）に対する結合を視認化した。Ｌｉｂｅｒｔｅ  ＷＨステントは、上記実施例２に記載されたプロトコルを用いて１００μＭのＰＥＰＴＩＤＥ−２にてコーティングした。次にコーティングされたステントは、Ａｌｅｘａ−４８８（カリフォルニア州、カールズバッドに所在のインビトロージェン社）に結合されたストレプトアビジン又は２０ｎｍの免疫金ナノ粒子（コロラド州サリダ（Ｓａｌｉｄａ）に所在のビービーアイ・インターナショナル（ＢＢＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社）を用いて標識化した。
【０１２６】
蛍光は、オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）社のＦｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶｌ０００共焦点顕微鏡を使用して画像化した。４００倍での蛍光画像を図１０Ａに示す。免疫金ナノ粒子で標識化したＰＥＰＴＩＤＥ−２を検出するために使用した走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）はＪＥＯＬ  ７４０１Ｆであった。画像は、１２．０ｋＶ、ＷＤ８．０ｍｍで撮影された。５００００でのＳＥＭ画像を図１０Ｂに示す。
【０１２７】
実施例７．ラングミュアの等温線
本実施例において、本開示のポリペプチド（ＰＥＰＴＩＤＥ−３［（ＤＯＰＡ）２（Ａｌａ−Ａｉｂ）３−ＲＩＧＳＹ−ＯＨ］）の表面の被覆を、散逸型水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ−Ｄ）技術を用いて、非特異的タンパク質（ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）の表面被覆と比較した。
【０１２８】
表面の調製：ステンレス鋼の水晶振動子（Ｑ−Ｓｅｎｓｅ，ＱＳＸ３０４）を、ＵＶ／オゾン処理（Ｂｉｏｆｏｒｃｅ，ＵＶ  Ｔｉｐｃｌｅａｎｅｒ，モデル番号ＵＶ．ＴＣ．１１０）を用いて１０分間洗浄した。次に、水晶を、ｄＨ２Ｏ溶液中の２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（ＭＰＩ、製品番号８１１０３６）に５分間浸漬し、ｄＨ２Ｏを用いて完全に洗浄し、Ｎ２にて乾燥させ、更に１０分間ＵＶ／オゾンにて処理した。
【０１２９】
表面の特徴化：ＱＣＭ−Ｄ測定（Ｑ−Ｓｅｎｓｅ  Ｅ４）は、１分当り１００μＬの流速の溶液を用いて行った。実験は、２５℃に温度制御されていた。
実験では、４つのサンプルを、ＱＣＭ−Ｄを用いて一度に試験した。安定したベースラインを確立するために、各実験は約１０分間の間ＰＢＳを流すことを含んでいた。次に、周波数の変化が３０分以下につき２Ｈｚとなるまで、種々の濃度にてペプチド溶液を加えた。最後の工程は、３０分間、又は周波数の変化が３０分以下につき２Ｈｚとなるまで、ＰＢＳで洗浄することである。分析のために（Ｓａｕｅｒｂｒｅｙモデル，Ｑ−Ｔｏｏｌｓ）、通常、各サンプルから、３番目の倍音を使用した。
【０１３０】
Ｋｄ及びＥＣ５０を決定し、結果を図１１に示す。０．２６μＭのＫｄ値又は０．２８μＭのＥＣ５０が認められた。吸着機構が、単層が形成されていることを示唆するラングミュアの等温線に従っていることを理論的な適合が示している。１００μＭ以上のＥＣ５０を有することが決定されている非特異的タンパク質，ＢＳＡと比較して、ＰＥＰＴＩＤＥ−２は、ステンレス鋼に対する親和性が３桁分大きいことが示される。
【０１３１】
上記した種々の実施例は例示のみの目的にて提供されたものであり、本願の開示を制限するものであると解釈されるべきではない。本明細書に例示されるとともに記載されている実施例及び適用に従うことなく、そして、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、本願の開示に対して種々の修正及び変更がなされることを当業者は容易に理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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