(57)【要約】本発明の目的は、癌の治療用の医薬品の調製のための、ＣＸＣＲ４タンパク質に特異的に結合し、かくして腫瘍成長を阻害する能力をもつ少なくとも一つの抗体またはその機能的断片の使用にある。本発明は同様に、ＣＸＣＲ４タンパク質に結合しかつ／またはその血管形成および／もしくは増殖活性を阻害する能力をもつ少なくとも一つの抗ＣＸＣＲ４抗体またはその機能的断片を活性成分として含む、癌治療のための組成物をも目的とする。より詳細には、前記抗体は、ＭＡＢ１７３抗体からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療および／または予防用の医薬品の調製を目的とした、ＣＸＣＲ４タンパク質に特異的に結合しインビトロおよび／またはインビボで原発腫瘍の腫瘍成長を阻害する能力をもつモノクローナル抗体またはその機能的断片の使用方法であって、前記モノクローナル抗体またはその機能的断片がＭＡＢ１７０、ＭＡＢ１７１、ＭＡＢ１７２およびＭＡＢ１７３抗体から選択されることを特徴とする使用方法。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体またはその機能的断片が原発腫瘍における脈管化を阻害することを特徴とする、請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体またはその機能的断片が、原発腫瘍を構成する腫瘍細胞の増殖を阻害することを特徴とする、請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体またはその機能的断片が、原発腫瘍を構成する腫瘍細胞のアポトーシスも同様に誘発することを特徴とする、請求項２または３に記載の使用方法。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体がＭＡＢ１７３抗体からなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の使用。
【請求項６】
前記癌が、結腸、乳房、前立腺、肺（小細胞性および非小細胞性）、卵巣、膵臓、腎臓、脳の癌、ならびに一部のリンパ腫から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の使用。
【請求項７】
原発腫瘍の腫瘍成長をインビトロおよび／またはインビボで阻害する能力をもつ少なくとも一つの活性成分を含む組成物であって、前記少なくとも一つの活性成分が、ＭＡＢ１７０、ＭＡＢ１７１、ＭＡＢ１７２およびＭＡＢ１７３抗体から選択されるＣＸＣＲ４タンパク質に特異的に結合する能力をもつモノクローナル抗体またはその機能的断片からなることを特徴とする組成物。
【請求項８】
前記抗−ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体またはその機能的断片がＭＡＢ１７３抗体からなることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
薬学的に許容できる少なくとも一つの担体を含むことを特徴とする、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
同時に、個別に、または時間的に間隔をおいて使用するための組み合わせ製品として、少なくとも一つの細胞毒性剤／細胞増殖抑制剤および／または細胞毒素および／または放射性元素をさらに含むことを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項１１】
少なくとも一つの第二の抗腫瘍抗体をさらに含むことを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項１２】
癌の治療用の医薬品の調製を目的とした、請求項７〜１１のいずれか一つに記載の組成物の使用方法。
【請求項１３】
前記癌が、結腸、乳房、前立腺、肺（小細胞性および非小細胞性）、卵巣、膵臓、腎臓、脳の癌、ならびに一部のリンパ腫から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍成長を阻害する能力をもつ抗ＣＸＣＲ４抗体の新規の使用であって、前記抗体が特にマウス由来のモノクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である使用に関するものである。特定の態様によると、本発明の目的は、癌の予防的および／または治療的処置用の医薬品としてのこれらの抗体またはその機能的断片の使用にある。最後に本発明は、例えば抗体および／もしくは抗癌剤と組み合わせた、または毒素を抱合させた、かかる抗体を含む製品および／または組成物、そして一部の癌の予防および／または治療を目的としたその使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
ＣＸＣＲ４受容体は、ケモカイン受容体ファミリーのＧタンパク質に結合した膜受容体である。
【０００３】
ＣＸＣＲ４受容体には、それぞれ３５２個および３６０個のアミノ酸で構成された二つのアイソフォームが存在する。残基Ａｓｎ１１はグリコシル化され、残基Ｔｙｒ２１は硫酸基の付加により修飾され、受容体の細胞外部分においてＣｙｓ１０９と１８６の間にジスルフィド架橋が存在する。
【０００４】
この受容体は、内皮細胞、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、「ナチュラルキラー」を含めた健常な一定数の組織によって発現され、心臓、結腸、肝臓、腎臓および脳内でわずかに発現される。ＣＸＣＲ４受容体は、結腸、乳房、前立腺、肺（小細胞性および非小細胞性）、卵巣、膵臓、腎臓、脳の癌、ならびに一部のリンパ腫を含めた多数の癌において過剰発現する。ＣＸＣＲ４の発現は、原発腫瘍に由来する癌細胞に比べて、転移細胞上で増大している。
【０００５】
この受容体の唯一の公知のリガンドは、「ストローマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）」またはＣＸＣＬ１２である。ＣＸＣＬ１２は、リンパ節、骨髄、肝臓、肺の細胞によって大量に分泌され、腎臓、脳および皮膚内で微量に分泌される。
【０００６】
ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１軸は、細胞移動現象および転移の形成に直接関与することから、癌において重要な役割を果たす。実際、癌細胞は、ＣＸＣＲ４受容体を発現し、移動し、そして血液循環内に入る。これらの細胞は、大量のＳＤＦ−１を産生する臓器で停止し、そこで増殖し転移を形成する（Ｍｕｒｐｈｙ  ＰＭ．，２００１）。
【０００７】
ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１軸が血管形成において役割を果たすということも同様に示されている。より詳細には、ＣＸＣＲ４受容体およびそのリガンドであるＳＤＦ−１が、それ自体ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１の発現を増大させるＶＥＧＦ−Ａの発現を刺激して血管形成を促進させるということも、インビトロで明確に実証されている（Ｂａｃｈｅｌｄｅｒ  Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０００８】
ＣＸＣＲ４受容体に干渉することで転移を標的化することの利点が、特に、ＣＸＣＲ４に対するモノクローナル抗体を使用することにより、インビボで実証されている（Ｍｕｌｌｅｒ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。実際、ＳＣＩＤマウスにおける乳癌の同所性モデル（細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１）において、ＣＸＣＲ４に対するモノクローナル抗体は、神経節での転移数を有意な形で減少させる能力をもつ。補足的研究（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｒ．Ｊ  ｅｔ  ａｌ．２００３）は同様に、肺癌モデル（Ａ５４９）で転移の形成におけるＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４軸の役割を示している。
【０００９】
なお、腫瘍に関連するマクロファージは、腫瘍成長のための炎症性回路の主要な構成要素である。ＳＤＦ−１を含めたケモカインは、腫瘍でのマクロファージの動員に参与する。ＣＸＣＲ４受容体を認識する能力をもつモノクローナル抗体はまた、腫瘍におけるマクロファージの動員も削減でき、したがって腫瘍成長へのその影響も制限できると思われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
全般的態様によると、本発明は、癌治療のための、ＣＸＣＲ４タンパク質に特異的に結合する能力をもつ抗体またはその機能的断片の使用を目的とする。
【００１１】
本発明にしたがった抗体の機能的断片は、例えば、断片Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖の略）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、もしくは二重特異性抗体、または、ポリ（アルキレン）グリコール、例えばポリ（エチレン）グリコールなどの添加（「ＰＥＧ化」）（ＰＥＧ化断片は、Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）（「ＰＥＧ」はＰｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ）Ｇｌｙｃｏｌという英語の命名法に由来）といったような化学的修飾によってか、またはリポソーム、ミクロスフェア、もしくはＰＬＧＡ内への取込みによってその半減期が増大している可能性がある、あらゆる断片からなり、前記断片は一般に、それが由来する抗体の活性を、たとえ部分的であれ発揮させる能力をもつ。
【００１２】
好ましくは、前記機能的断片は、それらが由来する抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の部分配列で構成されているか、またはそれを含むものであり、前記部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性、および、それが由来する抗体の好ましくは少なくとも１／１００、より好ましくは少なくとも１／１０の、充分な親和性を保持するのに充分なものである。
【００１３】
かかる機能的断片は、それが由来する抗体の配列の連続するアミノ酸を少なくとも５個、好ましくは１０、１５、２５、５０および１００個有する。
【００１４】
好ましくは、これらの機能的断片は、それらが由来する抗体と同じ結合特異性を一般に有する、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃのタイプの断片、または二重特異性抗体である。本発明によると、本発明の抗体断片は、ペプシンもしくはパパインといった酵素による消化および／または化学的還元によるジスルフィド架橋の切断といった方法により、前述の抗体から得ることができる。あるいは、本発明に含まれた抗体の断片は、同様に当業者には周知である遺伝子組換え技術によってか、または、例えばＡｐｐｌｉｅｄ社から供給されるものといった自動ペプチド合成装置を用いたペプチド合成によって得ることができる。
【００１５】
本発明の一態様によると、使用される抗体は、マウスモノクローナル抗体からなる。
【００１６】
本発明にしたがった抗体はまた、キメラ抗体またはヒト化抗体でもある。
【００１７】
キメラ抗体とは、所与の種の抗体に由来する天然の可変領域（軽鎖および重鎖）と、前記所与の種とは異なる種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域とを組み合わせて含む抗体を意味する。
【００１８】
本発明にしたがって使用されるキメラタイプの抗体またはその断片は、遺伝子組換え技術を用いて調製可能である。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと、本発明にしたがった非ヒトモノクローナル抗体、とりわけマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列と、ヒト抗体の定常領域をコードする配列とを有する、組換えＤＮＡをクローニングすることによって得ることが可能である。かかる組換え遺伝子によりコードされる本発明のキメラ抗体は、例えばマウス−ヒトキメラであり、この抗体の特異性は、マウスＤＮＡ由来の可変領域によって決定され、そのアイソタイプはヒトＤＮＡ由来の定常領域により決定される。キメラ抗体の調製方法については、例えば文献Ｖｅｒｈｏｅｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，８：７４，１９８８）を参照することができる。
【００１９】
ヒト化抗体とは、非ヒト由来の抗体に由来するＣＤＲ領域を含み、抗体分子のその他の部分が一つ（または二つ以上）のヒト抗体に由来している抗体を意味する。その上、（ＦＲと呼ばれる）骨格セグメントの残基のいくつかは、結合親和力を保つために修飾され得る（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６，１９８８；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７，１９８８）。
【００２０】
ヒト化抗体またはその機能的断片は、当業者にとって公知の技術によって調製可能である（例えば文献Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４−２８５７，１９９２；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．，１０：１−１４２，１９９２；またはＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６９−１７５，１９９２において記載されている技術）。かかるヒト化抗体は、インビボでの予防的および／または治療的処置の方法におけるその使用に好ましいものである。例えば「ＣＤＲグラフティング」技術などのその他のヒト化技術も、同業者には公知であり、これについては、例えば欧州特許第０４５１２６１号明細書、欧州特許第０６８２０４０号明細書、欧州特許第０９３９１２７号明細書、欧州特許第０５６６６４７号明細書、またさらには米国特許第５５３０１０１号明細書、米国特許第６１８０３７０号明細書、米国特許第５５８５０８９号明細書および米国特許第５６９３７６１号明細書の対象となっているＰＤＬによって記述されている。同様に、米国特許第５６３９６４１号明細書、さらには米国特許第６０５４２９７号明細書、米国特許第５８８６１５２号明細書および米国特許第５８７７２９３号明細書を引用することもできる。
【００２１】
より詳細には、出願人は、いかなる理論による束縛も望むことなく、癌治療の枠内での抗ＣＸＣＲ４抗体の使用が、先行技術から考えられるようなＣＸＣＲ４の転移促進活性の阻害のみならず、特に原発腫瘍での直接的作用のために、利点を有すると考えられることを提唱している。
【００２２】
実際、前述の通り、抗体によるＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１軸の遮断によって神経節での転移の数を有意な形で減少させることができるということは、当業者にとって公知である（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。その上、この軸のインビボでの遮断は、転移を有意な形で減少させることにせよ、原発腫瘍のサイズも腫瘍における血管形成活性も変化させることはないということも同様に記載されている（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００２３】
その結果、先行技術からは、抗ＣＸＣＲ４抗体、すなわちＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１軸に干渉する能力をもつ抗体の使用が、転移のレベルでのみ利点を呈するということが明らかである。
【００２４】
本発明は、当業者の先入観に反し、転移のレベルでのみ作用するのではなく特に原発腫瘍の腫瘍成長のレベルで直接作用する能力をもつ抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体の使用を初めて記載し、特許請求の範囲に記載しているという意味において、革新的である。
【００２５】
より詳細には、本発明の目的は、ＣＸＣＲ４タンパク質に特異的に結合してインビトロおよび／またはインビボで原発腫瘍の腫瘍成長を阻害する能力をもつ、モノクローナル抗体またはその機能的断片の使用にある。
【００２６】
腫瘍細胞の形質転換は、特に、細胞周期の制御喪失、アポトーシスに対するＤＮＡ修復異常の不感受性という形で現れる。したがって癌は、最初の形質転換（リンパ腫、癌腫、肉腫）が生じた細胞のタイプに応じて分類され、この最初の悪性細胞はその後分裂して、原発腫瘍を形成する。一部の原発腫瘍は、この原発腫瘍に由来する腫瘍細胞の漏出により、生体のより包括的な浸潤に向かって進行する可能性がある。これが転移である。
【００２７】
したがって、本発明の枠内では「原発腫瘍」という表現は「転移」と対比させるべきものであるということを充分に理解しなくてはならない。原発腫瘍は癌の最初の成長段階であるのに対し、転移は、原発腫瘍が成長して向かう可能性のある、その後の異なる段階である。
【００２８】
実際、「転移」とは、最初の病巣つまり原発腫瘍から血液またはリンパ液を介して癌細胞が播種することにより形成される、二次的感染病巣であると理解すべきである。
【００２９】
したがって、本発明は、転移する前に原発腫瘍を早期に治療するという意味で、既存の治療に対する代替案を提案する。
【００３０】
原発腫瘍の「腫瘍成長」とは、様々な機序、つまり脈管化、アポトーシス、またはさらには細胞増殖から生じる、前記原発腫瘍の体積の増加と理解すべきである。
【００３１】
「脈管化」とは、血管形成および／または脈管形成による、原発腫瘍での脈管化の増大と理解すべきである。
【００３２】
血管形成は、特に瘢痕化または癌性腫瘍の成長の途中である内皮細胞の増殖および移動による、既存の毛細血管網から生じる新たな血管の形成（新脈管化）からなる。
【００３３】
脈管形成は、内皮細胞および初期の神経叢が内皮細胞前駆体（アンジオブラストおよびヘマンジオブラスト）の分化によって生成されるプロセスからなる。
【００３４】
「アポトーシス」とは、細胞がシグナルに応えてその自己破壊を開始するプロセスであると理解すべきである。これは遺伝的にプログラミングされた細胞死である。
【００３５】
「細胞増殖」とは、細胞数の増加に関与するあらゆるプロセスと理解すべきである。このプロセスは、さらに、細胞周期の一部を成す細胞分裂に関連する。より詳細には、細胞増殖は、腫瘍を生じさせる、細胞の無制御で過剰な分裂からなる。
【００３６】
したがって、本発明は、原発腫瘍における脈管化、つまり血管形成および／または脈管形成を阻害する能力をもつ、前述したモノクローナル抗体またはその機能的断片の使用について記載するものである。
【００３７】
第二の態様によると、本発明は、原発腫瘍を構成する腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する能力をもつ、前述した抗体またはその機能的断片の使用について記載している。
【００３８】
第三の態様によると、本発明は、原発腫瘍における脈管化、および前記原発腫瘍を構成する腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する能力をもつ、前述した抗体またはその機能的断片の使用について記載するものである。
【００３９】
最後に、さらに別の態様によると、本発明は、原発腫瘍を構成する腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する能力をさらに有する、前述した抗体またはその機能的断片の使用について記載するものである。
【００４０】
好ましくは、本発明は、主として、モノクローナル抗体からなる少なくとも一つの抗ＣＸＣＲ４抗体またはその機能的断片の使用からなる。
【００４１】
「モノクローナル抗体」とは、ほぼ均一な抗体集団に由来する抗体を意味する。より詳細には、一つの集団の個々の抗体は、わずかな割合で発見されることのある、天然に発生しうるいくつかの偶発的な突然変異を除いて同一である。換言すると、モノクローナル抗体は均一な抗体からなるのであって、該均一な抗体は、単一の細胞クローン（例えばハイブリドーマ、均一な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた真核宿主細胞、均一な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた原核宿主細胞など）の増殖の結果として得られ、一般に同一のクラスおよびサブクラスの重鎖ならびに単一のタイプの軽鎖を特徴とする。モノクローナル抗体は、きわめて特異的であり、単一の抗原に対するものである。さらに、異なる決定基またはエピトープに対する異なる抗体を通常含んでいるポリクローナル抗体の調製物とは異なり、各々のモノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対するものである。
【００４２】
本発明の特定の一実施形態によると、使用されるモノクローナル抗体は、ＭＡＢ１７０抗体（クローン１２Ｇ５由来）、ＭＡＢ１７１抗体（クローン４４７０８由来）、ＭＡＢ１７２抗体（クローン４４７１６由来）、およびＭＡＢ１７３抗体（クローン４４７１７由来）から選択される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）。本明細書では、各々の抗体は、その名称またはそれが由来するハイブリドーマの名称で呼ばれ得る。例えば、ＭＡＢ１７３抗体は、特に実施例において、４４７１７またはＭＡＢ１７３さらにはＭａｂ１７３と無差別に呼ばれ得る。
【００４３】
以下の表１は、各クローンについて非網羅的に、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから当業者が入手できる抗体をまとめている。
【００４４】
【表１】
2010526044.tif 000002
【００４５】
より詳細には、本発明にしたがったモノクローナル抗体は、ＭＡＢ１７３抗体からなる。
【００４６】
したがって本発明は、ＭＡＢ１７３抗体からなる抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体またはその機能的断片の使用について記載するものである。
【００４７】
ＭＡＢ１７３モノクローナル抗体は、ｈＣＸＣＲ４タンパク質でトランスフェクトされたマウス３Ｔ３細胞で免疫付与されたマウスから単離したＢ細胞と、マウスの骨髄腫との融合の結果得られる、ハイブリドーマから産生された。ＩｇＧをその後、Ｇタンパク質アフィニティークロマトグラフィーにより腹水から精製した（ＭＡＢ１７３抗体に関するＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓのデータシート）。
【００４８】
この抗体は、ヒトタンパク質ＣＸＣＲ４を特異的に認識し、ラットの同等のタンパク質を認識しないものとして記載されている。この抗体はまた、ケモカインに対するその他の受容体も認識しない（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓのデータシート）。
【００４９】
本発明の一実施形態によると、癌の治療および／または予防用の医薬品の調製のための前述の抗体の使用が想定される。
【００５０】
好ましくは、癌の治療および／または予防の枠内での抗ＣＸＣＲ４抗体の使用は、この同じＣＸＣＲ４受容体を過剰発現する癌においてとりわけ適している。
【００５１】
このような癌は、結腸、乳房、前立腺、肺（小細胞性および非小細胞性）、卵巣、膵臓、腎臓、脳の癌、ならびに一部のリンパ腫からなる。
【００５２】
したがって、本発明は、結腸、乳房、前立腺、肺（小細胞性および非小細胞性）、卵巣、膵臓、腎臓、脳の癌、ならびに一部のリンパ腫から選択された癌の治療のための上述の抗体の使用を、特許請求の範囲に記載するものである。
【００５３】
本発明は、同様に、抗体またはその誘導化合物もしくはその機能的断片の一つからなり、好ましくは賦形剤および／または薬学的に許容できる担体が添加されている化合物を活性成分として含む、薬学組成物にも関するものである。
【００５４】
より詳細には、本発明は、さらに少なくとも一つの薬学的に許容できる担体を含む薬学組成物の調製のための、本発明にしたがった抗体の使用を目的とする。
【００５５】
本明細書において、薬学的に許容できる担体とは、副反応を誘発せず、かつ例えば一つ以上の活性化合物の投与を容易にし、生体内でのその寿命および／またはその有効性を増大させ、その溶液溶解度を増加し、さらにはその保存性を改善することのできる、薬学組成物の中に入れられる化合物、または化合物の組み合わせを指すものとする。これらの薬学的に許容できる担体は当業者にとっては周知であり、一つまたは複数の選択された活性化合物の性質および投与形態に応じて当業者が適合させるものである。
【００５６】
好ましくは、これらの化合物は、全身的経路、特に静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、もしくは皮下経路、または経口で投与される。より好ましくは、本発明にしたがった抗体を含む組成物は、時間的に間隔をおいて複数回にわたって投与される。
【００５７】
最適な投与形態、薬量および剤形は、患者の年令または体重、患者の全身状態の深刻度、治療の忍容性および確認された副作用などといった、患者に適合させた治療の確立において一般に考慮される基準にしたがって決定され得る。
【００５８】
本発明によると、癌の治療用の、ＣＸＣＲ４タンパク質に結合する能力をもつ少なくとも一つの抗ＣＸＣＲ４抗体またはその機能的断片を活性成分として含むことを特徴とする組成物が記載される。
【００５９】
本発明の別の態様によると、抗体ＭＡＢ１７０、ＭＡＢ１７１、ＭＡＢ１７２、またはＭＡＢ１７３の中から選択された、好ましくは抗体ＭＡＢ１７３であるモノクローナル抗体である少なくとも一つの抗ＣＸＣＲ４抗体またはその機能的断片を含む、組成物が記載される。
【００６０】
本発明のさらなる一態様によると、以上で言及した抗体またはそれらの機能的断片の組み合わせを含む組成物が特許請求の範囲に記載される。
【００６１】
以上で見てきたように、本発明はまた、結腸、乳房、前立腺、肺（小細胞性および非小細胞性）、卵巣、膵臓、腎臓、脳の癌、ならびに一部のリンパ腫の治療のための、上述の少なくとも一つの抗体を含む組成物の使用をも目的としている。
【００６２】
当然のことながら、上述のリストは一例として示されたものにすぎず、全ての癌を、ＣＸＣＲ４タンパク質を過剰発現するものとして、ひいては本発明にしたがって治療することができるものとして含み入れるべきである。本発明の別の補足的実施形態は、同時に、個別に、または時間的に間隔をおいて使用するための組み合わせ製品として、少なくとも一つの細胞毒性剤／細胞増殖抑制剤および／または細胞毒素および／または放射性元素をさらに含むことを特徴とする上述の組成物からなる。
【００６３】
「同時使用」とは、同一の薬学形態の中に含まれる、本発明にしたがった組成物の二つの化合物の投与を意味する。
【００６４】
「個別使用」とは、異なる薬学形態の中に含まれる、本発明にしたがった組成物の二つの化合物の、同時の投与を意味する。
【００６５】
「時間的に間隔をおいた使用」とは、各々が異なる薬学形態の中に含まれる、本発明にしたがった組成物の二つの化合物の連続的な投与を意味する。
【００６６】
全般的に、本発明にしたがった組成物は、癌治療の有効性を著しく増大させる。換言すると、本発明にしたがった抗体の治療的効果は、細胞毒性剤の投与によって想像以上に高められる。本発明にしたがった組成物により得られる、それに続く別の主要な利点は、用いる活性成分の有効用量を少なくすることができるという点にあり、これにより副作用、特に細胞毒性剤の効果が現れる危険性を回避または削減することができる。その上、本発明にしたがったこの組成物は、期待された治療的効果の達成をより早く可能にすると考えられる。
【００６７】
「抗癌治療薬」または「細胞毒性剤」という用語は、患者に投与されるとその患者における癌の成長を治療または予防する物質であると理解すべきである。かかる作用物質の限定的でない例としては、「アルキル化」剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害物質、クロマチン機能阻害物質、抗血管形成剤、抗エストロゲン剤、抗アンドロゲン剤、または免疫調節剤に言及することができる。
【００６８】
かかる作用物質は、例えばＶＩＤＡＬにおいて「細胞毒性物質」の欄の癌腫学および血液学に関連する化合物についての頁で言及されており、参照としてこの文献から引用されるこれらの細胞毒性化合物は、ここで好ましい細胞毒性剤として挙げられる。
【００６９】
「アルキル化剤」とは、細胞内であらゆる分子、好ましくは核酸（例えばＤＮＡ）を共有結合により結合し得るか、またはそれをアルキル化し得る、あらゆる物質を意味する。かかるアルキル化剤の例としては、窒素マスタード、例えばメクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、塩酸塩、ピポブロマン、プレドニムスチン、リン酸ナトリウム、またはエストラムスチン；オキサザホスホリン、例えばシクロホスファミド、アルトレタミン、トロホスファミド、スルホホスファミド、またはイホスファミド；アジリジンまたはエチレンイミン、例えばチオテパ、トリエチレンアミン、またはアルテトラミン；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、ストレプトゾシン、ホテムスチン、またはロムスチン；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、トレオスルファン、またはインプロスルファン；トリアゼン、例えばダカルバジン；さらには白金錯体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン、またはカルボプラチンを挙げることができる。
【００７０】
「代謝拮抗物質」とは、ある種の活性、一般的にはＤＮＡ合成に干渉することで細胞の成長および／または代謝を遮断する物質を意味する。代謝拮抗物質の例としては、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、クロロデオキシアデノシン、５−アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシン、およびペントスタチンに言及できる。
【００７１】
「抗腫瘍抗生物質」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の合成を予防または阻害できる化合物を意味する。かかる抗腫瘍抗生物質の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、ミトマイシンＣ、ブレオマイシン、およびプロカルバジンが含まれる。
【００７２】
「有糸分裂阻害物質」は、細胞周期および有糸分裂の正常な進行を妨害する。一般に、微小管阻害物質つまり「タキソイド」、例えばパクリタキセルおよびドセタキセルは、有糸分裂を阻害する能力を有する。ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンも同様に、有糸分裂を阻害する能力を有する。
【００７３】
「クロマチン機能阻害物質」または「トポイソメラーゼ阻害物質」とは、トポイソメラーゼＩおよびＩＩなどのクロマチンリモデリングタンパク質の正常な機能を阻害する物質を意味する。かかる阻害物質の例としては、トポイソメラーゼＩについてはカンポトテシンおよびその誘導体、例えばイリノテカンまたはトポテカン、そしてトポイソメラーゼＩＩについてはエトポシド、リン酸エチポシド、およびテニポシドが含まれる。
【００７４】
「抗血管形成剤」とは、血管の成長を阻害する全ての薬物、化合物、物質または作用物質を意味する。抗血管形成剤の例としては、全く限定することなく、ラゾキシン、マリマスタット、バチマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、イロマスタット、ＣＧＳ−２７０２３Ａ、ハロフギノン、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、ＣＤＣ５０１、ＤＭＸＡＡ、Ｌ−６５１５８２、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−アルファ、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチン、およびビタキシンが含まれる。
【００７５】
「抗エストロゲン物質」または「抗エストロゲン剤」とは、エストロゲンの作用を低減させるか、拮抗するか、または阻害する、全ての物質を意味する。かかる作用物質の例としてはタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、アナストロゾール、レトロゾール、およびエクセメスタンがある。
【００７６】
「抗アンドロゲン物質」または「抗アンドロゲン剤」とは、アンドロゲンの作用を削減するか、拮抗するか、または阻害する、あらゆる物質を意味する。抗アンドロゲン物質の例としてはフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、スピロノラクトン、酢酸シプロテロン、フィナステリド、およびシミチジンがある。
【００７７】
免疫調節剤は、免疫系を刺激する物質である。かかる免役調節剤の例としては、インターフェロン、例えばアルデスロイキン、ＯＣＴ−４３、デニロイキンジフチトクス、またはインターロイキン−２などのインターロイキン、例えばタソネルミンなどの腫瘍壊死因子、または、例えばレンチナン、シゾフィラン、ロキニメックス、ピドチモド、ペガデマーゼ、チモペンチン、ポリＩ：Ｃ、もしくは５−フルオロウラシルと組み合わせたレバミソールなどの、その他のタイプの免役調節剤が含まれる。
【００７８】
さらに詳しい情報を得るためには、当業者は、ｌ’Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  ｄｅｓ  Ｅｎｓｅｉｇｎａｎｔｓ  ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｑｕｅにより編纂された 「ｔｒａｉｔｅ  ｄｅ  ｃｈｉｍｉｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｑｕｅ，Ｖｏｌ．６，Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｕｘ  ｅｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｄａｎｓ  ｌｅ  ｔｒａｉｔｅｍｅｎｔ  ｄｅｓ  ｃａｎｃｅｒｓ，ｅｄｉｔｉｏｎ  ＴＥＣ＆ＤＯＣ，２００３」なる標題の手引書を参照することができる。
【００７９】
特に好ましい一実施形態においては、本発明にしたがった組み合わせ製品としての前記組成物は、前記細胞毒性剤が同時使用のために前記抗体に化学的に結合していることを特徴とする。
【００８０】
特に好ましい一実施形態においては、本発明にしたがった前記組成物は、前記細胞毒性剤／細胞増殖抑制剤が、紡錘体の阻害剤または安定剤、好ましくはビノレルビンおよび／またはビンフルニンおよび／またはビンクリスチンから選択されることを特徴とする。
【００８１】
本発明にしたがった前記細胞毒性剤と前記抗体との間の結合を容易にするため、特に、例えばポリエチレングリコールなどのポリ（アルキレン）グリコール、さらにはアミノ酸といったスペーサ分子を、結合すべき二つの化合物の間に導入することができ、または別の実施形態においては、本発明にしたがった前記抗体と反応する能力を有する官能基が導入された前記細胞毒性剤の活性誘導体を使用することができる。これらの結合技術は、当業者にとっては周知であり、本明細書中でこれについて詳述することはしない。
【００８２】
本発明は、別の態様においては、前記抗体のうちの少なくとも一つ、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的断片の一つが、細胞毒素および／または放射性元素に抱合されていることを特徴とする組成物に関する。
【００８３】
好ましくは、前記毒素または前記放射性元素は、腫瘍細胞の成長または増殖を妨げる能力、特に前記腫瘍細胞を完全に不活性化する能力を有する。
【００８４】
さらに好ましくは、前記毒素は、腸内細菌毒素、特にシュードモナスの外毒素Ａである。
【００８５】
治療において用いられる、好ましくは抗体に抱合された放射性元素（または放射性同位体）は、ガンマ線を発出する放射性同位体、好ましくはヨウ素１３１、イットリウム９０、金１９９、パラジウム１００、銅６７、ビスマス２１７、およびアンチモン２１１である。ベータおよびアルファ線を放射する放射性同位体もまた、治療において使用可能である。
【００８６】
本発明にしたがった、少なくとも一つの抗体またはその機能的断片に抱合された毒素または放射性元素とは、結合分子の導入を伴ってまたは伴わずに、特に二つの化合物の間の共有結合により、前記少なくとも一つの抗体に対して前記毒素または前記放射性元素を結合させることのできる全ての手段を指す。
【００８７】
抱合体の元素の全てまたは一部の化学的（共有）結合、静電結合、または非共有結合を可能にする作用物質としては、特にベンゾキノン、カルボジイミド、そしてより詳細には、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］−カルボジイミド塩酸塩）、ジマレイミド、ジチオビスニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、一つ以上のフェニルアジド基を有する一つ以上の基を有し紫外線（Ｕ．Ｖ．）と反応する、「架橋」剤と呼ばれる作用物質、そしてきわめて好ましくはＮ−［４−（アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、および６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）に言及することができる。
【００８８】
特に放射性元素についての別の結合形態は、二官能性イオンキレート剤を使用することで構成されていてよい。
【００８９】
これらのキレート剤としては、金属、詳細には放射性金属、および免疫グロブリンを結合させるために開発されたＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）から誘導されたキレート剤に言及することができる。かくして、ＤＴＰＡおよびその誘導体は、リガンド−金属錯体の安定性および剛性を増大させるような形で、炭素鎖上で異なる基により置換され得る（Ｋｒｅｊｃａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）；Ｂｒｅｃｈｂｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）；Ｇａｎｓｏｗ（１９９１）；米国特許第４８３１１７５号明細書）。
【００９０】
例えば、医療および生物学において長い間その遊離形態または金属イオンとの錯体の形態で極めて広範に使用されてきたＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）およびその誘導体は、金属イオンと安定したキレートを形成し、癌の治療における放射性免疫抱合体の開発のための抗体などの治療または診断に有利なタンパク質に結合されるという特筆すべき特性を呈する（Ｍｅａｓｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）；Ｇａｎｓｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０））。
【００９１】
さらに別の態様によると、本発明にしたがった組成物は、その抗腫瘍活性が公知である少なくとも一つの第二の抗体をさらに含んでいる。限定的意味のない一例として、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（ヘルセプチン）、抗−ＥＧＦＲ抗体（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、さらには抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（７Ｃ１０またはｈ７Ｃ１０）を引用することができる。当然のことながら、全ての抗腫瘍抗体を、本発明にしたがった組成物の中に入れることができる。
【００９２】
本発明はさらに、医薬品の調製のための本発明にしたがった組成物の使用を含む。
【００９３】
したがって、本発明は、さらに詳細には、癌の治療用の医薬品の調製のための上述の組成物の使用を目的としている。予防および／または治療され得る癌の中でも、結腸、乳房、前立腺、肺（小細胞性および非小細胞性）、卵巣、膵臓、腎臓、脳の癌、ならびに一部のリンパ腫が選好される。
【００９４】
本発明は、同様に、ＣＸＣＲ４受容体を発現または過剰発現する細胞への、生物学的に活性な化合物の特異的な標的化を目的とした、医薬品の調製のための本発明にしたがった抗体の使用をも目的とする。
【００９５】
ここで、生物学的に活性な化合物とは、細胞活性、特にその成長、その増殖、遺伝子の転写または翻訳を変調させる、特に阻害する能力をもつあらゆる化合物を指す。
【００９６】
本発明のその他の特徴および利点は、実施例を伴う以下の記述および以下にその簡単な説明を示す図面の中で明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ヒトＣＸＣＲ４受容体を構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞膜上への〔１２５Ｉ〕ＳＤＦ１の結合の、ＳＤＦ１および４４７１７抗体による阻害の研究を示す図である。
【図２】ヒトＣＸＣＲ４受容体を構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞膜上への〔３５Ｓ〕ＧＴＰγＳの結合の研究、すなわちＳＤＦ１および４４７１７抗体の影響を示す図である。
【図３】ＣＸＣＲ４受容体を発現する無傷のＣＨＯ−Ｋ１細胞上の細胞内カルシウムの遊離の研究、すなわちＳＤＦ１および４４７１７抗体の影響を示す図である。
【図４】異種移植モデルＵ−９３７における、４４７１７モノクローナル抗体のインビボでの抗腫瘍活性を表す図である。
【図５】４４７１７モノクローナル抗体による、異種移植モデルＭＤＡ−ＭＢ−２３１における腫瘍成長の阻害を表す図である。
【実施例１】
【００９８】
実施例１：４４７１７（ＭＡＢ１７３とも呼ばれる）抗体による〔１２５Ｉ〕ＳＤＦ−１の結合の阻害についての試験
方法：
ヒトＣＸＣＲ４受容体を構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ヒトＣＸＣＲ４のコード配列全体を含む発現ベクターでの安定したトランスフェクションによって得る。これらの細胞を、５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）および５００μｇ／ｍｌのゲネチシンを含むＤＭＥＭ−Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２完全培地の中で培養する。緩衝液〔２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ〕中への細胞の機械的擦過で得た細胞膜上で、結合試験を実施し、１５分間、１００００ｇで遠心分離することにより回収する。９６ウェルプレート内で、ＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ビーズを用いて、均一な培地の中で〔１２５Ｉ〕ＳＤＦ１（比活性１５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の結合を測定する。簡潔に言うと、膜（３０μｇ／ウェル）を結合緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＢＳＡ）中で、研究対象の化合物（ＳＤＦ１または４４７１７抗体）、放射性リガンド（１ｎＭ）、そして次にＳＰＡ−ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（７．３ｍｇ／ウェル）と共にインキュベートし、２５℃で１時間インキュベートする。遠心分離〔１０００ｇで１０分間〕の後、シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において放射能を読み取る。〔１２５Ｉ〕ＳＤＦ１の非特異的結合を１０μＭの非標識ＳＤＦ１の存在下で判定する。
【００９９】
結果：
ＳＤＦ１は、〔１２５Ｉ〕ＳＤＦ１の結合を、２５．２±６．４ｎＭ（ｎ＝６）というＩＣ５０（〔１２５Ｉ〕ＳＤＦ１の特異的結合の５０％阻害）値で用量依存的に阻害する（図１）。これらの実験条件下で、４４７１７抗体は、１μＭの用量で７５％という〔１２５Ｉ〕ＳＤＦ１結合の最大の阻害、そして４４．８±５．６ｎＭ（ｎ＝３）というＩＣ５０値を示す（図１）。
【実施例２】
【０１００】
実施例２：４４７１７抗体による〔３５Ｓ〕ＧＴＰγＳの結合の変調についての試験
この試験により、ＣＸＣＲ４およびそれに結合されるリガンドに仲介されるヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化の変調を研究することができる。
方法：
ヒトＣＸＣＲ４受容体を構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、実施例１で記述したものと同じ要領で得る。緩衝液〔２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ〕への細胞の機械的擦過で得た細胞膜上で、結合試験を実施し、１５分間、１００００ｇでの遠心分離により回収する。９６ウェルプレート内で、ＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ビーズを用いて、均一な培地の中で〔３５Ｓ〕ＧＴＰγＳ（比活性１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の結合を測定する。簡潔に言うと、膜（１０μｇ／ウェル）を結合緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３μＭのＧＤＰ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．４）中で、研究対象の化合物（ＳＤＦ１および／または４４７１７抗体）、〔３５Ｓ〕ＧＴＰγＳ（０．２〜０．４ｎＭ）、そして次にＳＰＡ−ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（７．３ｍｇ／ウェル）と共にインキュベートし、２５℃で１時間インキュベートする。遠心分離〔１０００ｇで１０分間〕の後、シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において放射能を読み取る。
【０１０１】
結果：
ＳＤＦ１は、ＣＸＣＲ４受容体の活性化を反映する〔３５Ｓ〕ＧＴＰγＳの結合を用量依存的に刺激する。得られる最大刺激は、〔３５Ｓ〕ＧＴＰγＳの基底の結合に対して１４３％であり、その強さは３０．８±９．７ｎＭ（ｎ＝１６）である（図２）。これらの実験条件下で、４４７１７抗体は、３００ｎＭの用量で５８％という、ＳＤＦ１（１０ｎＭ）により誘発される〔３５Ｓ〕ＧＴＰγＳ結合の刺激の最大の阻害、および２０．７±５．９ｎＭというＩＣ５０値（ｎ＝４）を示す（図２）。
【実施例３】
【０１０２】
実施例３：ＣＸＣＲ４に仲介される細胞内カルシウムの動員についての試験
この試験により、細胞内カルシウムの遊離を誘発する、ホスホリパーゼＣを介したＣＸＣＲ４受容体のシグナル伝達を評価することができる。この動態試験により、系の経時的な推移を追跡することができる。
【０１０３】
方法：
ヒトＣＸＣＲ４受容体を構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、実施例１で記述したものと同じ要領で得る。細胞を黒色の９６ウェルプレート内に播種し（ＤＭＥＭ−Ｆ１２−ＦＣＳ５％／ウェルの培地内に１０万個の細胞）、一晩分離させる。３７℃で３０分間、次に２５℃で３０分間、緩衝液〔１×ＨＢＳＳ、２０ｍＭのＨＥＰＳ、２５ｍＭのプロベネシド酸〕中において蛍光カルシウムプローブ（Ｆｌｕｏ−４、無洗浄）を細胞にロードする。拮抗作用を測定するために、１０μｌの４４７１７抗体の溶液を細胞に添加する。周囲温度で１０分間インキュベートした後、４８５ｎｍでの励起、５３５ｎｍでの発光、およびエネルギー１００００でのランプというパラメータを用いて、蛍光モードにてＭｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０リーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）測定を実施する。各々のウェルを２０秒間にわたり１秒に１回、０．１秒間読み取り（基底シグナル）、その後２０μｌのＳＤＦ−１を注入し、ウェルの読み取りを２分間再開する。各々の実験条件を二回ずつ試験する。細胞を有さないウェルの値を細胞を有するウェルの値から差引くことで、結果を補正する。その後、値を、基底シグナルに対する％で表し、ＳＤＦ−１の添加後の最初の値が１００％となるように補正する。これにより、リガンドの注入によって誘発される蛍光の偶発的な急変を補償することができる。
【０１０４】
結果：
ＳＤＦ１（３００ｎＭ）は、ＣＨＯ／ＣＸＣＲ４細胞におけるカルシウムの塩析効果を誘発するのに対して、ＣＨＯ−Ｋ１ナイーブ細胞上では全く応答が見られない。最大シグナルは、約３０秒後に得られ、ＳＤＦ−１の最大効率は基底シグナルの１８０％である（図３）。４４７１７抗体（１３３ｎＭ）は、ＳＤＦ１誘発性のカルシウムの塩析を強く阻害し、これはＳＤＦ１の注入から１分後に最大となり、基底シグナルの１３０％に達する（図３）。
【実施例４】
【０１０５】
実施例４：ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスのＵ９３７異種移植モデルにおける４４７１７抗体の抗腫瘍活性
方法
Ｕ−９３７細胞を、フェノールレッドおよび４．５ｇ／ｌのグルコースを有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ  Ｇ８７６９）において、１０％ＦＣＳ（Ｆ７５２４、Ｓｉｇｍａ）および２ｍＭのＬ−グルタミン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  ｒｅｆ  ＢＥ１７−６０５Ｅ）を補充して培養した。グラフティングの２日前に細胞を播種し、動物への移植時には、これらの細胞は指数成長期にあった。１０００万個のＵ−９３７Ｐ（（２）＋４）細胞を、腹腔内注入により、メスの８週齢のＮｏｄ／Ｓｃｉｄマウスにグラフトした（株：ＳＯＰＦ／ＮＯＤ．ＣＢ１７ＰＲＫＤＣ  ／Ｊ  ＦＥ  ６  Ｓ、ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ  ｓｃｉｄ／Ｊ、ｒｅｆ  ＮＳＣＳＳＦＥ０６Ｓ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【０１０６】
グラフティングから２日後に、マウスを以下の概要で処理した（背面皮下注入）：
−対照群：ＰＢＳ、一週間に２回
−ＩｇＧ２ｂ群：ＩｇＧ２ｂ、（Ｓｉｇｍａ  ｒｅｆ  Ｍ２６９５、Ｓｉｇｍａ  ｌｏｔ  ０４６Ｋ４８４３、ｌｏｔ  ２２０６０３０７、３ｍｇ／ｍｌ）、マウス一頭当たり１ｍｇ／投与、２回／週）
−４４７１７群：抗ｈＣＸＣＲ４モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｒｅｆ  ＭＡＢ１７３、ｌｏｔ  ＡＵＺ０４５１２Ａ、３．４３ｍｇ／ｍｌ）、マウス一頭当たり１ｍｇ／投与、２回／週。
【０１０７】
最初の用量は、対照ＩｇＧ２ｂ抗体および４４７１７抗体ではマウス一頭当たり２ｍｇであった。処理に皮下経路を選択したのは、腹腔内での腫瘍細胞と抗体との間のあらゆる直接的接触を回避するためであった。
【０１０８】
各群におけるマウスの生存を毎日追跡調査した。
【０１０９】
結果：
ＩｇＧ２ｂ群において最初にマウスが死亡したのは１５日後であった。一頭を除く全てのマウスがその後７日以内に死亡した（図４）。生き延びたマウスは、グラフティング後８２日目に安楽死させ検査したが、その腹腔内に腫瘍細胞は存在しなかった。
【０１１０】
ＰＢＳグループ内では、一匹を除く全てのマウスが、グラフティング後１７日目から２１日目の間に死亡した（図４）。最後のマウスが死亡したのはグラフティング後８２日目であった。
【０１１１】
４４７１７群では、マウスは、他の２つの対照群に比べて４〜６日遅れで死亡し始めた。２２日目から２７日目の間に８頭のマウスが死亡した。２頭のマウスが１０９日目まで、つまりその安楽死の日まで生き延びた（図４）。生存の結果の統計分析（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）を、ログランク検定を用いて行った（図４）。ここで記載した実験は、ＣＸＣＲ４受容体に対する４４７１７モノクローナル抗体が、Ｕ９３７異種移植モデルにおいてマウスの生存を増大させる能力を有するということを示している。
【実施例５】
【０１１２】
実施例５：胸腺欠損ヌードマウスのＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルにおける４４７１７抗体による腫瘍成長の阻害
方法
１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）内でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＥＣＡＣＣ）を培養した。グラフティングの６０時間前に細胞を播種した。細胞は、移植時には指数成長期にあった。７週齢の胸腺欠損ヌードマウス（ＨＡＲＬＡＮ）に、ＰＢＳ中の１０００万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｐ３５＋１８）細胞をグラフティングした。移植後５日目に、腫瘍は測定可能であり（３７ｍｍ３＜Ｖ３／４４ｍｍ３）、動物を無作為に、同程度のサイズの腫瘍を有する１２頭のマウスからなる群に分けた。マウス一頭当たり２ｍｇのチャレンジ用量の４４７１７モノクローナル抗体（ｌｏｔ  ＡＵＺ０５６０７ＡおよびＡＵＺ０４５１２Ａ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、腹腔内経由でマウスを処理した。その後、マウスに、１頭当たり１ｍｇの用量の４４７１７モノクローナル抗体を一週間に２回投与した。この実験において、対照マウス群には、等量のＰＢＳを投与した。
【０１１３】
腫瘍の体積を一週間に２回測定し、以下の式を用いて計算した：π／６×長さ×幅×高さ。
【０１１４】
各測定について、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験を用いて統計分析を実施した。
【０１１５】
結果：
０１ＭＤＡＭＢ２３１０１４０６プロトコルにおいては、処理の間に死亡は全く観察されなかった。対照ＰＢＳ群に比べて、一用量当たり１ｍｇ投与した４４７１７モノクローナル抗体については、６日目から３５日目の間に腫瘍成長の有意な阻害が存在した（ｐ≦０．０５）。
【０１１６】
処理の５週間後の平均腫瘍体積は、ＰＢＳに比べて４４７１７抗体については５６％削減された。
【０１１７】
ここで記述されている実験は、ＣＸＣＲ４受容体に対する４４７１７モノクローナル抗体が、胸腺欠損ヌードマウスのＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルにおける腫瘍成長を阻害する能力をもつことを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１１８】
【特許文献１】米国特許第４８３１１７５号明細書
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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