(57)【要約】  細胞増殖を阻害するための真核生物の開始因子ｅＩＦ４Ｅとの結合能を有する、ＶＰｇタンパク質、その断片又はその類似体の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物としての単離精製タンパク質であって、
（ｉ）真核生物の開始因子ｅＩＦ４Ｅ、好ましくは哺乳動物の開始因子ｅＩＦ４Ｅ、より好ましくはヒトの開始因子ｅＩＦ４Ｅとの結合能を有し、
（ｉｉ）アミノ酸モチーフ
【化１】
2010530743.tif 000012
（該モチーフ中、ｘは任意のアミノ酸であり、Ｙはチロシン（Ｔｙｒ）、Ｌはロイシン（Ｌｅｕ）であり、
【化２】
2010530743.tif 000013
はロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）である）を含まない、
ＶＰｇタンパク質若しくは少なくとも８つのアミノ酸を有するその断片若しくはその類似体を含むか又はこれらから成る、単離精製タンパク質。
【請求項２】
配列番号２のＶＰｇタンパク質から成ることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。 
【請求項３】
配列番号２の全長と少なくとも２０％の配列同一性又は少なくとも４５％の配列相同性を示すＶＰｇタンパク質類似体から成ることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質類似体が、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０から成る群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質の断片であって、前記ＶＰｇタンパク質の少なくとも８つの連続したアミノ酸を含むか又はこれらから成ることを特徴とする、タンパク質の断片。
【請求項６】
配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０又は配列番号２２から成る群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載のタンパク質の断片。
【請求項７】
配列番号１６の全長と少なくとも６０％の配列同一性又は少なくとも８０％の配列相同性を示す、配列番号１６で規定される断片の類似体から成ることを特徴とする、請求項６に記載のタンパク質の断片。
【請求項８】
配列番号１８の全長と少なくとも６０％の配列同一性又は少なくとも８０％の配列相同性を示す、配列番号１８で規定される断片の類似体から成ることを特徴とする、請求項６に記載のタンパク質の断片。
【請求項９】
配列番号１６の少なくとも８個、１０個、１５個、２０個、２５個又は２６個の連続したアミノ酸を含むか又はこれらから成ることを特徴とする、請求項５に記載のタンパク質の断片。
【請求項１０】
抗癌剤としての請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質、その断片又はその類似体。
【請求項１１】
その癌細胞が前記開始因子ｅＩＦ４Ｅを発現する癌、好ましくは神経膠腫、黒色腫又は結腸癌若しくは肺癌を治療するのに使用する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質、その断片又はその類似体。
【請求項１２】
前記開始因子ｅＩＦ４Ｅが発現される癌を治療する薬物の製造のための請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質、その断片又はその類似体の使用。
【請求項１３】
被験体の単離精製開始因子ｅＩＦ４Ｅとの結合特異性が、前記ＶＰｇタンパク質、好ましくは配列番号２のＶＰｇタンパク質と類似している化合物をスクリーニングする方法であって、ｉ）該ｅＩＦ４Ｅを候補化合物及び請求項１〜９に記載のタンパク質、その断片又はその類似体と接触させる工程と、ｉｉ）該候補化合物がｅＩＦ４Ｅと、該タンパク質、その断片又はその類似体との間の相互作用を阻害するか否かを検出する工程とを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１４】
癌を予防又は治療する薬物の調製のための請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質、その断片又はその類似体をコードする核酸を発現する組換えベクターの使用。
【請求項１５】
前記核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９又は配列番号２１から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質、その断片若しくはその類似体、又は請求項１４若しくは１５に記載の組換えベクターと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１７】
前記薬学的に許容される担体が陽イオン性脂質であることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記開始因子ｅＩＦ４Ｅが発現される癌を治療するのに使用する、請求項１６又は１７に記載の組成物。
【請求項１９】
トランスフェクトして、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質、その断片又はその類似体を発現する宿主細胞。
【請求項２０】
ｅＩＦ４Ｅとの結合特異性が配列番号２のＶＰｇタンパク質と類似している化合物をスクリーニングするための単離精製開始因子ｅＩＦ４Ｅの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖阻害タンパク質の分野に関する。より具体的には、本発明は、真核細胞に対して細胞傷害性であり、及び／又は細胞増殖を阻害する、ＶＰｇタンパク質、その断片若しくはその類似体を含むか又はこれらから成るタンパク質に関する。本発明は、かかるタンパク質、その断片又はその類似体の医学的使用にも関する。
【０００２】
真核生物の開始因子ｅＩＦ４Ｅは、ｍＲＮＡに付着すると共にｅＩＦ４Ｆ開始複合体のｅＩＦ４Ｇ成分と結合する、ｍＲＮＡ５’キャップ結合タンパク質である。かなりの割合のｅＩＦ４Ｅ（最大７０％近く）が核に局在している（Lejbkowicz et al., 1992）。核ｅＩＦ４Ｅが或る特定のメッセンジャーＲＮＡの核細胞質間輸送に関与していることが分かっている（Lejbkowicz et al., 1992、Rosenwald et al., 1995、Rousseau et al., 1996、Lai and Borden, 2000）。ｅＩＦ４Ｅの過剰発現が抑制できないと、細胞増殖及び悪性転換が起こるおそれがあるが、その一方でｅＩＦ４Ｅレベルの低減によって形質転換された表現型を反転させることができることが実証されている（Sonenberg and Gingras, 1998で概説）。さらにヒトでは、腫瘍の種類によって、高レベルのｅＩＦ４Ｅを示すものもある（Ruggero and Pandolfi, 2003）。高いｅＩＦ４Ｅレベルでは、適当なｍＲＮＡの細胞質へのｅＩＦ４Ｅ依存性輸送が増大するために、悪性転換に関与するタンパク質の細胞質レベルが増大すると考えられている（Shantz and Pegg, 1994、Rousseau et al., 1996、Lai and Borden, 2000）。
【０００３】
国際出願公開第００／７８８０３号パンフレットは、ｅＩＦ４Ｆ複合体の形成を破壊することによると思われる治療、特にプログラム細胞死の誘導に有用なｅＩＦ４Ｅ結合ペプチドを記載している。これらのペプチドは全て、ヒトｅＩＦ４Ｅ（２００７年４月１５日版のＧＥＮＢＡＮＫデータベースにおけるアクセッション番号ＮＰ＿００１９５９）との結合に必要なアミノ酸配列（モチーフ）
【０００４】
【化１】
2010530743.tif 000002
【０００５】
（モチーフ中、ｘは任意のアミノ酸であり、
【０００６】
【化２】
2010530743.tif 000003
【０００７】
はＬｅｕ、Ｍｅｔ又はＰｈｅである）を含む。
【０００８】
このため、抗癌治療に使用するのに適切なｅＩＦ４Ｅ結合剤の開発に関心が寄せられている。また例えば、薬剤耐性を克服するために、上記のものとは異なる作用機構を備えるｅＩＦ４Ｅ結合剤を発見することも必要とされている。
【０００９】
ジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）は、植物ウイルスの最も大きく、且つ経済的に最も重要な群であるポチウイルス科（Potyviridae family）に属するポチウイルス属の種類の成員である。ポチウイルスは、その線状核酸ゲノムの５’末端と共有結合するいわゆるゲノム連結ＶＰｇタンパク質（以下、ＶＰｇタンパク質又はＶＰｇと称される）を有している（Riechmann et al., 1989及びMurphy et al., 1991）。ポチウイルスのＶＰｇタンパク質は、ウイルスタンパク質合成、植物組織における長距離移動、及びウイルス複製に関与する（Lellis et al., 2002、Schaad et al., 2002、Fellers et al., 1998）。ポチウイルス感染の直後に、ゲノムＲＮＡは宿主細胞機構と相互作用し、タンパク質合成を開始させる。ゲノムＲＮＡ由来のプロテイナーゼＫによるＶＰｇタンパク質の除去によってＲＮＡ感染性が失われ、さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳効率が低減するために、ＶＰｇタンパク質はこの初期事象において重要な役割を果たすと考えられる（Leonard et al., 2000、Herbert et al., 1997）。ジャガイモＹウイルスゲノム連結ＶＰｇタンパク質のアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫデータベース（２００６年１１月１４日版）におけるアクセッション番号ＣＡＡ８２６４２で特定されるアミノ酸配列の３３６番目〜５２３番目のアミノ酸残基に対応する。これは、本明細書中で配列番号２として再現される。
【００１０】
近年の研究では、或る特定のポチウイルス（カブモザイクウイルス、レタスモザイクウイルス、タバコ葉脈斑紋（mottling）ウイルス、ジャガイモＹウイルス）のＶＰｇタンパク質と、植物の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅとの間の相互作用が報告されている（Wittmann et al., 1997、Duprat et al., 2002、Kang et al., 2005、Grzela et al., 2006）。カルシウイルス（Caliciviridae）科の或る特定の脊椎動物ウイルス（例えばネコカルシウイルス（ＦＣＶ）、ロードスダール（lordsdale）ウイルス（ＬＤＶ））又は近年発見されたマウスノロウイルス（ＭＮＶ−１））によってコードされるＶＰｇタンパク質がキャップ結合タンパク質ｅＩＦ４Ｅと相互作用することも分かっている（Goodfellow et al., 2005、Chaudhry et al., 2006）。
【００１１】
Grzela et al.（2006）は、ＰＶＹのＶＰｇタンパク質とｅＩＦ４Ｅとの間の相互作用が、酵母及び昆虫（ヨウトガ（S. frigiperda：スポドプテラ・フルギペルダ））のｅＩＦ４Ｅでも観察されたので、種特異性がかなり低いと考えられることを見出している。Grzela et al.は、ＶＰｇ／ｅＩＦ４Ｅ相互作用が、昆虫細胞において無細胞タンパク質合成の幾らかの阻害をもたらすが、昆虫細胞死を引き起こさないことも説明している。しかしながら、ＰＶＹのＶＰｇ一次アミノ酸配列は、上記のｅＩＦ４Ｅ結合モチーフ
【００１２】
【化３】
2010530743.tif 000004
【００１３】
を示さない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ここで、本発明者らは、ヒト細胞において、ジャガイモＹウイルスのＶＰｇタンパク質の存在下では、核プールのｅＩＦ４Ｅが劇的に失われたことを観察した。このため驚くべきことに、本発明者らは、細胞質においてＶＰｇタンパク質がヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅを固定し、これによりこれまでに昆虫細胞で観察されたものとは異なり、細胞増殖が阻害され、細胞死が引き起こされることを示した。
【００１５】
したがって、第１の態様では、本発明は、単離精製タンパク質であって、薬物として、好ましくは抗癌剤として、又は癌細胞が被験体において開始因子ｅＩＦ４Ｅを発現、好ましくは過剰発現する癌、好ましくは神経膠腫、黒色腫又は結腸癌若しくは肺癌を治療するのに使用するための
（ｉ）真核生物の開始因子ｅＩＦ４Ｅ、好ましくは哺乳動物の開始因子ｅＩＦ４Ｅ、より好ましくはヒトの開始因子ｅＩＦ４Ｅとの結合能を有し、
（ｉｉ）アミノ酸モチーフ
【００１６】
【化４】
2010530743.tif 000005
【００１７】
（モチーフ中、ｘは任意のアミノ酸であり、Ｙはチロシン（Ｔｙｒ）、Ｌはロイシン（Ｌｅｕ）であり、
【００１８】
【化５】
2010530743.tif 000006
【００１９】
はロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）である）を含まない、
ＶＰｇタンパク質若しくは少なくとも８つのアミノ酸を有するその断片若しくはその類似体を含むか又はこれらから成る、単離精製タンパク質に関する。
【００２０】
「被験体」は哺乳動物、好ましくはヒトを表す。
【００２１】
本発明によるタンパク質、その断片又はその類似体と真核生物（例えば昆虫）、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトのｅＩＦ４Ｅとの結合（又は相互作用）の特徴付けを、Grzela et al.（2006）に記載のようにＥＬＩＳＡベースの結合アッセイによって実施することができる。有利な点は、上記タンパク質、その断片又はその類似体と、上記ｅＩＦ４Ｅとの間の解離定数が約５ｎＭ〜約４５０ｎＭであることである。解離定数（又は親和性）の測定は、Grzela et al.（2006）に記載の方法を用いることを含む、当業者に既知の方法を用いて行うことができる。必要に応じて、この特徴付けは、真核生物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトの細胞において、本発明のタンパク質、その断片又はその類似体の存在下で、ｅＩＦ４Ｅの細胞局在（細胞質でのｅＩＦ４Ｅの固定）の変化のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの決定と組み合せることができる。例えば、本発明のタンパク質、その断片又はその類似体の存在下でのｅＩＦ４Ｅの細胞局在の変化のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの決定は昆虫細胞（例えば、ハイファイブ（イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni））細胞）で実施することができ、これはこれらの細胞がヒト細胞での該決定に対する良好な予測モデルであるためである。この決定は、以下の実施例３又は実施例４のように実施することができる。
【００２２】
「タンパク質」及び「ペプチド」という用語は、本明細書中で区別なく使用することができる。これらは、当該技術分野で既知であり、あらゆる長さの多量体形態のアミノ酸を表す。この用語は、化学的又は生化学的に修飾されたアミノ酸を含むタンパク質又はペプチド、及び修飾ペプチド骨格を有するタンパク質又はペプチド、例えばα−アミノ酸骨格又はＬ−アミノ酸側鎖（例えばＤ−アミノ酸）に対する１つ又は複数の修飾を含有するタンパク質又はペプチドも表す。
【００２３】
本発明によれば、ＶＰｇタンパク質は通常、上記ウイルスの線状核酸ゲノムの５’末端に共有結合したウイルスコード化タンパク質を表し（Riechmann et al., 1989及びMurphy et al., 1991）、また本発明によれば、
単離された植物ウイルスコード化ＶＰｇタンパク質、
植物ウイルスの組換えＶＰｇタンパク質、又は
植物ウイルスの合成ＶＰｇタンパク質を含む。
【００２４】
好ましくは、上記ＶＰｇタンパク質は、約１８８個〜１９３個のアミノ酸残基から成り、アミノ酸モチーフＫＧＫ及びＮＭＹＧ（配列番号２６）を含む。
【００２５】
好ましい実施の形態において、ＶＰｇタンパク質は、配列番号２のジャガイモＹウイルスコード化ＶＰｇタンパク質である。
【００２６】
「植物ウイルス」という用語は、植物で拡散する、特に少なくとも１種類の植物細胞に感染することが可能なウイルスを表す。
【００２７】
本発明の別の実施の形態において、ＶＰｇタンパク質類似体は、配列番号２のＰＶＹのＶＰｇタンパク質の全長と、少なくとも２０％、順に好ましくなるが、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性、又は少なくとも４５％、順に好ましくなるが、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列相同性を示す、配列番号２のＰＶＹのＶＰｇタンパク質の類似体であるが、但し該ＶＰｇタンパク質類似体は依然として、上記のように、真核生物（例えば昆虫）の開始因子ｅＩＦ４Ｅ、好ましくは哺乳動物の開始因子ｅＩＦ４Ｅ、より好ましくはヒトの開始因子ｅＩＦ４Ｅとの結合能を有する。
【００２８】
ＶＰｇタンパク質類似体の例は：
ＰＶＹ以外の、好ましくはポチウイルス科に、より好ましくはポチウイルス属に属する他の植物ウイルス、例えばタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）（配列番号４）、クローバー葉脈黄化ウイルス（ＣｌＹＶＶ）（ＧＥＮＢＡＮＫデータベース（２００６年３月３０日版）におけるアクセッション番号ＮＰ＿７３４１６９．１、配列番号６として本明細書中で再現）、タバコ葉脈斑紋ウイルス（ＴＶＭＶ）（ＧＥＮＢＡＮＫデータベース（２００６年３月３０日版）におけるアクセッション番号ＮＰ＿７３４３３３．１、配列番号８として本明細書中で再現）、カブモザイクウイルス（ＴｕＭＶ）（配列番号１０）、レタスモザイクウイルス（ＬＭＶ）（ＧＥＮＢＡＮＫデータベース（２００６年３月３０日版）におけるアクセッション番号ＮＰ＿７３４１５９．１、配列番号１２として本明細書中で再現）、又は
カルシウイルス科に、好ましくはノロウイルス属に属するウイルス、例えばネコカルシウイルス（ＦＣＶ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースにおけるアクセッション番号Ｑ６６９１４、配列番号２７として本明細書中で再現）、ヒトノロウイルス（ＨｕＮｏＶ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースにおけるアクセッション番号Ｐ５４６３４、及びＧＥＮＢＡＮＫデータベースにおけるアクセッション番号ＮＰ＿０５６８２０、それぞれ配列番号２８及び配列番号２９として本明細書中で再現）及びネズミノロウイルス（ＭＮＶ）（ＧＥＮＢＡＮＫデータベースにおけるアクセッション番号ＹＰ＿７２０００１、配列番号３０として本明細書中で再現）
でコードされるＶＰｇタンパク質である。
【００２９】
本発明の別の実施の形態によれば、上記で規定のタンパク質の断片は、本明細書中の上記で規定のＶＰｇタンパク質の断片又はＶＰｇタンパク質のタンパク質類似体の断片であって、該ＶＰｇタンパク質又はその類似体の少なくとも８個、順に好ましくなるが、少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、２６個又は４２個の連続した（contiguous）アミノ酸残基を含むか又はこれらから成るが、上記のように、真核生物（例えば昆虫）の開始因子ｅＩＦ４Ｅ、好ましくは哺乳動物の開始因子ｅＩＦ４Ｅ、より好ましくはヒトの開始因子ｅＩＦ４Ｅとの結合能を維持する、本明細書中の上記で規定のＶＰｇタンパク質の断片又はＶＰｇタンパク質のタンパク質類似体の断片である。
【００３０】
例えば、上記で規定の断片は、好ましくは配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の本明細書中の上記で規定のＶＰｇタンパク質のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも８個、順に好ましくなるが、少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、２６個又は４２個の連続したアミノ酸残基を含むか又はこれらから成る。
【００３１】
本発明の別の好ましい実施の形態によれば、ＰＶＹのＶＰｇ（配列番号２）の断片は：
配列番号２の４１位のアルギニン（Ａｒｇ）と、９４位のアルギニン（Ａｒｇ）との間に局在するアミノ酸配列（ＶＰｇ２とも呼ばれる、配列番号１４）、又は
配列番号２の４１位のアルギニン（Ａｒｇ）と、８２位のグリシン（Ｇｌｙ）との間に局在するアミノ酸配列（ＶＰｇ４とも呼ばれる、配列番号１６）、
配列番号２の４１位のアルギニン（Ａｒｇ）と、６６位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）との間に局在するアミノ酸配列（ＶＰｇ５とも呼ばれる、配列番号１８）、
配列番号２の４１位のアルギニン（Ａｒｇ）と、５９位のアルギニン（Ａｒｇ）との間に局在するアミノ酸配列（ＶＰｇ１とも呼ばれる、配列番号２０）、又は
配列番号２の６０位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）と、９４位のアルギニン（Ａｒｇ）との間に局在するアミノ酸配列（ＶＰｇ３とも呼ばれる、配列番号２２）
を含むか又はこれらから成る。
【００３２】
別の実施の形態において、断片は、配列番号１６のアミノ酸配列の少なくとも８個、順に好ましくなるが、少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個又は２６個の連続したアミノ酸残基を含むか又はこれらから成る。
【００３３】
別の実施の形態において、ＶＰｇタンパク質の断片は、配列番号１６のアミノ酸配列の全長と、少なくとも６０％、順に好ましくなるが、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性、又は少なくとも８０％、順に好ましくなるが、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列相同性を示す配列番号１６の類似体から成る。
【００３４】
別の実施の形態において、ＶＰｇタンパク質の断片は、配列番号１８のアミノ酸配列の全長と、少なくとも６０％、順に好ましくなるが、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性、又は少なくとも８０％、順に好ましくなるが、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列相同性を示す配列番号１８の類似体から成る。
【００３５】
「類似体(analog)」という用語は、本明細書中の上記で規定のように、アミノ酸配列内の１つ又は複数のアミノ酸が、代替的なアミノ酸、若しくは炭水化物、脂質若しくはケミカル（chemical）等の別の残基に置き換わっており、及び／又は１つ又は複数のアミノ酸が欠失しているか、又は１つ又は複数の付加的なアミノ酸、若しくは炭水化物、脂質若しくはケミカル等の別の残基が、ＰＶＹのＶＰｇタンパク質若しくはその断片のペプチド鎖若しくはアミノ酸配列に付加されている、任意の形態のＰＶＹのＶＰｇタンパク質（配列番号２）又はその断片（例えば配列番号１６又は配列番号１８）を包含するように意図されているが、但し上記類似体には依然として、上記のように、真核生物（例えば昆虫）の開始因子ｅＩＦ４Ｅ、好ましくは哺乳動物の開始因子ｅＩＦ４Ｅ、より好ましくはヒトの開始因子ｅＩＦ４Ｅとの結合能を有する。
【００３６】
スコアリングマトリクスＢＬＯＳＵＭ６２を選択するＢＬＡＳＴプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）のような２つのアミノ酸配列間の「同一性」を算出するのに好適なコンピュータプログラムの多くが当該技術分野で一般的に知られている。
【００３７】
「相同性(similarity)」という用語は、保存的なアミノ酸残基の置換が認められる２つのペプチドのアミノ酸残基の比較を表す。即ち同じ電荷と同じ極性とを共有するアミノ酸残基を相同(similar)であると見なす。保存的な変化は、得られるペプチドの結合特徴を有意には変えない。以下は、アミノ酸の様々な分類（groupings）の一例である：
非極性Ｒ基を有するアミノ酸
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン。
非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸
グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン。
荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電）
アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）
リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０で）
ＯＨ基を有するアミノ酸
セリン、スレオニン、チロシン
芳香族基を有するアミノ酸
フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン
別の分類は分子量（即ちＲ基の大きさ）に基づき行うことができる：
グリシン                    ７５
アラニン                    ８９
セリン                      １０５
プロリン                    １１５
バリン                      １１７
スレオニン                  １１９
システイン                  １２１
ロイシン                    １３１
イソロイシン                １３１
アスパラギン                １３２
アスパラギン酸              １３３
グルタミン                  １４６
リシン                      １４６
グルタミン酸                １４７
メチオニン                  １４９
ヒスチジン（ｐＨ６．０で）  １５５
フェニルアラニン            １６５
アルギニン                  １７４
チロシン                    １８１
トリプトファン              ２０４
特に好ましい保存的な置換は：
正の電荷を維持し得るような、アルギニンのリシンへの置換、及びその逆の置換、
負の電荷を維持し得るような、アスパラギン酸のグルタミン酸への置換、及びその逆の置換、
遊離−ＯＨを維持し得るような、スレオニンのセリンへの置換、
残基の芳香族の特徴を維持し得るような、フェニルアラニンのチロシンへの置換、及び
遊離−ＮＨ２を維持し得るような、アスパラギンのグルタミンへの置換
である。
【００３８】
本明細書中で与えられる配列相同性の値は、配列同一性の算出を参照して上記のように決定する。
【００３９】
必要に応じて、本明細書中の上記で規定のタンパク質、その断片又はその類似体は、細胞取り込みを容易にするアミノ酸配列を含んでもよい。細胞透過性ペプチドとして知られるかかるアミノ酸配列は当該技術分野で既知である（CELL PENETRATING PEPTIDES: PROCESSES AND APPLICATIONS、Ulo Langel編（2002）又はAdvanced Drug Delivery Reviews, 2005, 57:489-660を参照されたい）。これらとしては、ヒト免疫不全（Immunodeficency）ウイルス１型（HIV−１）タンパク質Ｔａｔ又はその断片（Ruben et al., 1989）、ヘルペスウイルステグメントタンパク質ＶＰ２２（Elliott and O'Hare, 1997）、ペネトラチン（penetratin）（Derossi et al., 1996）、プロテグリン１抗菌ペプチドＳｙｎＢ（Kokryakov et al., 1993）及び塩基性線維芽細胞成長因子（Jans, 1994）が挙げられる。
【００４０】
本発明の第２の態様は、開始因子ｅＩＦ４Ｅが被験体で発現又は過剰発現される癌、好ましくは神経膠腫、黒色腫又は肺癌若しくは結腸癌を治療する薬物の製造のための、本明細書中の上記で規定のタンパク質、その断片又はその類似体の使用に関する。
【００４１】
第３の態様において、本発明は、上記で規定のように、タンパク質、その断片又はその類似体をコードする単離核酸配列を提供する。本発明の核酸配列を標準的な技法を用いて合成することができる。核酸操作法は当該技術分野で既知である（例えば、Sambrook J. et al. （2000） Molecular Cloning: A Laboratory Manualを参照されたい）。例えば、核酸配列は、配列番号１（ＰＶＹのＶＰｇタンパク質をコードする、ＧＥＮＢＡＮＫデータベース（２００６年１１月１４日版）におけるアクセッション番号Ｚ２９５２６下で特定されるヌクレオチド配列の１００７番目〜１５７０番目の残基）、又は配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９又は配列番号２１の核酸配列を含むか又はこれらから成る。
【００４２】
本発明は、上記で規定のタンパク質、その断片又はその類似体の発現のための組換えベクターも提供する。組換えベクターは、少なくとも１つの調節配列と操作可能に連結した、上記で規定のタンパク質、その断片又はその類似体をコードする少なくとも１つの核配配列を含む。
【００４３】
「ベクター」という用語は、別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を意味するように意図される。例えば、本発明で使用することができるベクターとしては、ウイルスベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルス）、プラスミド、ＲＮＡベクター、又は染色体、非染色体、半合成若しくは合成核酸から成り得る線状若しくは環状のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。多くの好適なベクターが当業者に知られており、市販されている。好ましいベクターは、自己複製可能なもの（エピソームベクター）及び／又は操作可能に連結した核酸を発現可能なもの（発現ベクター）である。
【００４４】
「操作可能に連結した(operably linked)」という用語は、ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列を発現させるように調節配列と連結することを意味すると意図される。
【００４５】
「調節配列」という用語は、プロモータ、エンハンサ及び転写制御因子又は翻訳制御因子を含む。またかかる調節配列は当該技術分野で知られている。
【００４６】
例えば、発現ベクターは、複製起点又は自己複製配列（ＡＲＳ）及び発現制御配列、プロモータ、エンハンサ及び必要なプロセシング情報部位（例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列及び翻訳終結配列、並びにｍＲＮＡ安定化配列）を含み得る。かかるベクターは、当該技術分野で周知であり、例えばSambrook et al., 2000で検討された標準的な組換え法によって調製することができる。
【００４７】
本発明は、癌を予防又は治療する薬物の製造のための、上記で規定のタンパク質、その断片又はその類似体をコードする核酸を発現する少なくとも１つの組換えベクターの使用にも関する。
【００４８】
また本発明による発現ベクターは、細胞をトランスフェクト又は（例えば電気穿刺によって）形質導入又は感染させることにより、上記で規定のタンパク質、その断片又はその類似体を導入又は産生するのに使用することができる。
【００４９】
本発明は、トランスフェクトされて、上記で規定のタンパク質、その断片又はその類似体を発現する宿主細胞にさらに関する。宿主細胞は、本発明の核酸又はベクターでトランスフェクトすることができる。宿主細胞は任意の原核細胞又は真核細胞であり得る。例えば、上記で規定のタンパク質、その断片又はその類似体は、大腸菌等の細菌細胞、昆虫細胞、酵母、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳動物細胞、又はＢ１６、ＬＧＬ２６、ＨｅＬａ若しくは２９３等の動物若しくはヒトの細胞、又は任意の形質転換細胞株で発現し得る。
【００５０】
別の態様において、本発明は、本明細書中の上記で規定のタンパク質、その断片又はその類似体又は組換えベクターと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。本発明による組成物は、開始因子ｅＩＦ４Ｅが被験体で発現又は過剰発現される癌、好ましくは神経膠腫、黒色腫又は結腸癌若しくは肺癌を治療するのに有用である。
【００５１】
本明細書中で使用されるように、「薬学的に許容される担体」には、製剤投与に適合する、任意の及び全ての溶媒、分散媒、リポソーム、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれるように意図される。好適な担体は、この分野の標準的な参考資料である最新版のRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。かかる担体又は希釈剤の好ましい例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。陽イオン性脂質、固定油等の非水性ビヒクル及び市販の形質導入株（transductants）も使用することができる。薬学的に活性のある物質へのかかる媒体及び作用物質の使用は当該技術分野で周知である。いかなる従来の媒体又は作用物質も上記で規定のタンパク質、その断片又はその類似体と不適合でない限りは、本発明の組成物でのそれらの使用が考慮される。
【００５２】
例えば、医薬組成物がタンパク質、その断片又はその類似体を含む場合、薬学的に許容される担体は、陽イオン性脂質、又は非陽イオン性脂質と陽イオン性脂質との混合物であるのが好ましい。
【００５３】
さらに別の態様において、本発明は、癌細胞増殖を阻害する方法であって、本明細書中の上記で規定のタンパク質、その断片又はその類似体を含む組成物で、それを必要とする被験体を治療する工程を含むことを特徴とする、方法を含む。
【００５４】
「阻害すること」という用語は、細胞増殖を緩徐、低減、遅延、阻止又は破壊することを表す。
【００５５】
「細胞増殖」という用語は、細胞群が分裂する速度を表す。細胞増殖数は、当業者が容易に定量することができる。
【００５６】
「癌」という用語は、制御することができない異常な細胞増殖と、局所的に又は血流及びリンパ系を介して身体の他の部位に罹患細胞が広がる能力（即ち転移）と、任意の多くの特徴的な構造特性及び／又は分子特性とを特徴とする多くの疾患のいずれかを表す。癌の例は、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌（例えば小細胞、非小細胞）、気管支癌、前立腺癌、卵巣癌、脳腫瘍、膵臓癌、結腸癌、頭頸部癌、胃癌及び膀胱癌、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、白血病、神経芽細胞腫、神経膠腫、又は膠芽細胞腫である。
【００５７】
「癌細胞」は、分化能を欠き、且つ浸潤及び転移の可能性がある特定の構造特性を有する細胞と理解される。好ましくは、癌細胞は開始因子ｅＩＦ４Ｅを発現又は過剰発現する。ｅＩＦ４Ｅを発現する癌細胞は、当該技術分野で既知の方法、例えばＤＮＡシークエンシング、又はノーザンブロット法、又は抗ｅＩＦ４Ｅ抗体を使用する免疫化学法によって同定することができる。
【００５８】
「過剰発現」という用語は、ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする遺伝子が、正常な休止状態の真核生物、哺乳動物又はヒトの細胞（即ち非癌細胞）のレベルに比べてより高いレベルで発現することを意味し、これによりこの正常細胞で通常産生されるレベルを超えるｅＩＦ４Ｅレベルが癌細胞で生じる。発現又は産生の正常範囲は、ｅＩＦ４Ｅタンパク質、そのｍＲＮＡ、又はその遺伝子の解析等の常法によって決定することができる。
【００５９】
「治療すること」という用語は、疾患若しくは障害（例えば癌又は転移性癌）、疾患若しくは障害の症状、又は疾患若しくは障害の素因を有する患者に、これらの疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状、又は疾患若しくは障害の素因を、回復、治癒、軽減、緩和、変化、修復（remedy）、改善、好転させるため若しくはこれらに影響を与えるために、又は寿命を延ばすために、本明細書中の上記で規定のタンパク質、その断片又はその類似体、又は本発明の組成物を投与することを含む。
【００６０】
別の態様において、本発明は、ｅＩＦ４Ｅとの結合特異性がＶＰｇタンパク質、好ましくは配列番号２のＶＰｇタンパク質と類似している（mimic）化合物（例えば薬物）をスクリーニングするための、好ましくはヒト由来の単離精製開始因子ｅＩＦ４Ｅの使用に関する。
【００６１】
別の態様において、本発明は、開始因子ｅＩＦ４Ｅ（好ましくはヒトｅＩＦ４Ｅ）との結合特異性が好ましくは配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２、より好ましくは配列番号２のＶＰｇタンパク質と類似している化合物（例えば薬剤）をスクリーニングする方法であって、ｉ）単離精製ｅＩＦ４Ｅを候補化合物及び本発明によるタンパク質、その断片又はその類似体（例えば配列番号２）と接触させる工程と、ｉｉ）この候補化合物がｅＩＦ４Ｅと、該タンパク質、その断片又はその類似体との間の結合（又は相互作用）を阻害するか否かを検出する工程とを含む、方法に関する。競合結合アッセイを実施するには、当該技術分野において標準的な方法が利用可能である。さらに、ペプチド化合物とｅＩＦ４Ｅとの結合（又は相互作用）の検出は、Grzela et al.（2006）に記載のように実施することができる。
【００６２】
候補化合物としては、可溶性ペプチド等のペプチド、脂質、炭水化物、リポペプチド、糖ペプチド、及び有機小分子及び無機小分子が挙げられる。
【００６３】
以下の表１は、本明細書で使用される核酸及びペプチド配列の要約である。
【００６４】
【表１】
2010530743.tif 000007
【００６５】
上述の特徴に加えて、本発明は、以下の記載から明らかになる他の特徴をさらに含み、この記載は、本発明を示す実施例と添付の図面とを参照する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ヒトｅＩＦ４ＥとＰＶＹのＶＰｇタンパク質又はその断片（ＶＰｇ１〜ＶＰｇ４）との間の相互作用アッセイを示す図である。
【図２】昆虫細胞における天然ｅＩＦ４Ｅの局在化に対するＶＰｇタンパク質（配列番号２）発現の効果を示す図である。ＶＰｇは昆虫細胞で発現され、天然ｅＩＦ４Ｅ（左側の欄）及び組換えＶＰｇ（ＶＰｇ欄）の分布を、感染後の指定時点での共焦点顕微鏡によって解析した。幾つかの細胞の爆発的増殖は右の欄に示す。
【図３】ＶＰｇタンパク質（配列番号２）に特異的である天然ｅＩＦ４Ｅの細胞質保持を表す図である。昆虫細胞に、バクミド（bacmid）（ヌルバキュロウイルス、左側の欄）、ＨＣＶヘリカーゼのドメインＩＩ（中央の欄）及びＶＰｇ（右側の欄）を感染させた。昆虫細胞を感染後の指定時点での共焦点顕微鏡によって解析した。
【図４】分画昆虫細胞におけるｅＩＦ４Ｅ発現を表す図である。適切なバキュロウイルスをＭＯＩ  １０で感染させた昆虫細胞を感染後の指定時点で回収し、核を細胞質から分離し、細胞内抽出物をＳＤＳ／ＰＡＧＥとウェスタンブロット法とで解析した。組換えタンパク質の発現は、離れた右下のパネルに示している。
【図５】ヒトｅＩＦ４Ｅの局在化に対するＰＶＹのＶＰｇタンパク質の効果を示す図である。Ｐｒｏ−Ｊｅｃｔ（商標）（Pierceから購入）の存在下で、ＨｅＬａ細胞にＶＰｇを形質導入し、ＶＰｇ及びｅＩＦ４Ｅの存在に関して共焦点顕微鏡によって解析した（図１Ｂ）。図１Ａでは、ＨｅＬａ細胞を形質導入しなかった。
【図６】ヒト細胞の増殖に対するＰＶＹのＶＰｇタンパク質の効果を示す図である。タンパク質転移試薬としてＴｒａｎｓＰａｓｓ  Ｐ（Ozyme）を使用して、細胞にＶＰｇを形質導入し、指定期間インキュベートした。ＬＤＨ細胞傷害性検出アッセイ（Clontech）を使用して、細胞の損傷を推測した。結果は３つのウェルから得られた平均の結果を示す。
【図７】ＧＬ２６（マウス神経膠腫）腫瘍を保有するマウスにおけるＰＶＹのＶＰｇタンパク質の抗腫瘍効果を示す図である。０＝実験開始時に測定した腫瘍体積、処置なし。１＝３日後に測定した腫瘍体積。対照＝非処置のマウス。バッファ＝０．９％  ＮａＣｌで電気穿孔したマウス。ＶＰｇ＝２５μｇのＶＰｇが入った０．９％  ＮａＣｌで電気穿孔したマウス。０日目と３日後とで同じ符号は、同じマウスにおける腫瘍体積を示している。また図は、時点０と時点１との間での腫瘍の大きさの倍数増加も示している（１倍は腫瘍の大きさが増大していないことを意味する）。
【図８】Ｂ１６−ｏｖａ（マウス黒色腫）腫瘍を保有するマウスにおけるＰＶＹのＶＰｇタンパク質の抗腫瘍効力を示す図である。Ｂ１６−ｏｖａ黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿部に注射した（２群８匹の動物）。２週間後、触知可能な腫瘍が形成された。対照群では、Ｔｒａｎｓｐａｓｓ  Ｐと混合したバッファを腫瘍に注射した。第２の群では、６日間毎日、Ｔｒａｎｓｐａｓｓ  Ｐを形質導入したＶＰｇ  ５０μｇを注射した。６日の処置の間、毎日、腫瘍の直径を測定した。
【実施例】
【００６７】
実施例１：材料及び方法
細胞
懸濁液中で増殖させたハイファイブ昆虫（イラクサギンウワバ）細胞を、ゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）及びアンホテリシンＢ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）の入ったＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ  ＳＦＭ培地（Invitrogen）中で培養した。
【００６８】
ＨｅＬａ（ヒト頸癌）、Ｂ１６−ｏｖａ（マウス黒色腫）、ＧＬ２６（マウス神経膠腫）、ＩＭＲ９０（ヒト一次二倍体線維芽細胞）を、１０％  ＦＣＳを補ったＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ（Gibco）培地中で増殖させた。
抗体
抗ｈｉｓマウスモノクローナル抗体（ＭＭＳ−１５６Ｐ）をBabCO（Berkeley, CA, USA）から購入した。抗ｅＩＦ４Ｅマウスモノクローナル抗体（Ｐ−２、ｓｃ−９９７６）をSanta Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA, USA）から購入した。この抗体は、マウス、ラット、ヒト及びブタのｅＩＦ４Ｅを認識する。ヒトｅＩＦ４Ｅに対する抗ｅＩＦ４Ｅウサギポリクローナル抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratoriesから購入）は、Nahum Sonenbergの寄贈であった（McGill University, Montreal Canada）。
【００６９】
抗原としてバキュロウイルスで発現したＰＶＹのｈｉｓＶＰｇを使用して、抗ＶＰｇウサギポリクローナル抗体をElevage Scientifique des Dombes（Chatillon, France）で調製し（以下に記載）、以下のようにＶＰｇに対してアフィニティ精製した。初めに、非感染昆虫細胞１ｇから得られたアセトン粉末を用い、血清から交差反応抗体を取り除いた。最終濃度が１％になるまで、細胞粉末を抗ＶＰｇウサギ血清に添加し、ゆっくり回転させながら一晩氷上で保存した。１００００ｇ、４℃で１０分間の遠心分離の後、製造業者の取扱説明書に従って固定されたＶＰｇタンパク質を含有するＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（Amersham Bioscienceから購入）に上清画分を適用した。１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２．４）によって、３Ｍのトリス（ｐＨ８．８）３０μｌと５ＭのＮａＣｌ  ２０μｌとが入った試験管に直接、結合抗体を溶出させた。
【００７０】
組換えタンパク質の発現及び精製
ジャガイモＹウイルス（Ｏ株、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースにおけるアクセッション番号Ｚ２９５２６）のＶＰｇ遺伝子を、フォワードプライマー５’ＧＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＡＡＡ−３’（配列番号 ２３）及びリバースプライマー５’ＣＣＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＴＴＡＴＴＣＡＴＧＣＴＣＣ−３’（配列番号２４）と共に、鋳型としてプラスミドｐＰＶＹ１５（ＧＥＮＢＡＮＫデータベース（２００６年１１月１４日版）におけるアクセッション番号Ｚ２９５２６で利用可能）を使用するＰＣＲによって合成し、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースにおけるアクセッション番号ＣＡＡ８２６４２を有するタンパク質を発現させた。ＡｃＭＮＰＶのポリヘドリンプロモータ（配列番号２５）の制御下で、ＶＰｇのｃＤＮＡをｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴｂ（Invitrogen（Carlsbad, CA, USA）から購入）に挿入し（O'Reilly et al., 1992）、バクミド技術（Gibco BRLから購入）を使用して、ｈｉｓタグ付けＶＰｇを発現する組換えバキュロウイルスを構築した。懸濁液中のハイファイブ（イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni））細胞に、５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで組換えバキュロウイルスを感染させた。組換えバキュロウイルスを感染させたＨＦ細胞の一部（１００ｍｌ）を感染後７２時間で回収し、３００ｍＭのＮａＣｌと、６ｍＭのβ−メルカプトエタノールと、５％グリセロールと、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０と、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Rocheから購入）とを含有する５０ｍＭのリン酸バッファ（ｐＨ７．０）１０ｍｌ中で懸濁して、５サイクルの液体窒素での凍結及び３７℃での解凍で溶解した。溶解（clearing）後、抽出物を重力で１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Qiagenから購入）に通し、５ｍｌの溶解バッファで平衡にした。３００ｍＭのＮａＣｌを含有する、２５０ｍＭのイミダゾールの入った５０ｍＭのリン酸バッファ（ｐＨ７．０）５００μｌで５回、結合タンパク質を溶出した。１０℃で４８時間のインキュベーションの間、ＴＥＶプロテアーゼを用いて、融合タグをＶＰｇから取り除いた。得られた産物を５ｍｌのＨｉ−Ｔｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎカラム（Amersham Pharmaciaから購入）上で精製した。タンパク質を１００ｍＭのＮａＣｌの入った５０ｍＭのリン酸バッファ（ｐＨ７．０）中のカラムに適用し、ＯＤ２８０が安定なレベルに達するまで同じバッファで洗浄した後、５０ｍＭのリン酸バッファ（ｐＨ７．０）中のＮａＣｌのグラジエント（１００ｍＭ〜１Ｍ）で溶出した。全長ｈｉｓＶＰｇを含有する画分を回収し、希釈して、Ｈｉ−Ｔｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎカラムで用いた条件下で５ｍｌの１５Ｓ−Ｓｏｕｒｃｅカラム（Amersham Pharmaciaから購入）上で分画化した。ＭＯＩ  ５で適当なバキュロウイルスを感染させた後、ＨＣＶヘリカーゼのＨｉｓタグ付けドメインＩＩをＨＦ細胞で発現させ、記載のように精製した（Boguszewska-Chachulska et al., 2004）。分子量標準として、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｕｒ（Bio-Radから購入）とＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（Invitrogenから購入）を用いて、ＣＢＢによる染色によって、１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で全ての工程を解析した。
【００７１】
細胞分画化
１ｍｌ当たり２×１０６個の細胞濃度のハイファイブ（T.ni）細胞に、ＭＯＩ  ５で、ＶＰｇタンパク質若しくはｈｉｓＶＰｇを発現するバキュロウイルス、又はＨＣＶヘリカーゼのドメインＩＩ又は空バクミドを感染させた。２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって、感染細胞を感染後指定時間で回収した。ペレットをＰＢＳ中で２回洗浄し、４倍の血中血球容積（packed cell volume）の低張バッファ（１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．７５ｍＭのスペルミジン、１５ｍＭのスペルミン）中で再懸濁した。細胞を氷上で３０分間膨張させ、完全に破壊されたのを位相差顕微鏡で確認した。それから、１／１０容量の回復（restoration）バッファ（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．９）、０．７５ｍＭのスペルミジン、０．１５ｍＭのスペルミン、１０ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、３ｍＭのＤＴＴ、６７．７％スクロース）を添加し、ホモジネートを１ｍｌのスクロースクッション（３０％スクロースの入った低張バッファ）上に積層し、３０００ｒｐｍで２０分間、冷蔵して遠心分離した。ペレット化した核を４倍の血中血球容積の核抽出バッファ（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、０．４２ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％スクロース、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０％グリセロール、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍｌ当たり３ｍｇのロイペプチン）中で再懸濁した。それから、４℃で３０分間ゆっくりと振動させることで核を溶解させた。細胞質画分と核画分とを１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動させた後、Ｘ線フィルムを備えたＥＣＬシステムを用いて、抗ｅＩＦ４Ｅ抗体でウェスタンブロット法を行った。Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアを備えたＧｅｌＤｏｃ２０００（BioRadから購入）を用いて、ｅＩＦ４Ｅバンドの濃度測定を実施した。
【００７２】
ＶＰｇタンパク質による細胞形質導入
製造業者の取扱説明書に従って、Ｔｒａｎｓｐａｓｓ  Ｐ（Ozyme）を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）又はＰＢＳ中で精製ＶＰｇ（０．１μｇ／ウェル〜２μｇ／ウェル）と合わせた。最終容量が２５０μｌになるまで血清無含有培地をＶＰｇ／Ｔｒａｎｓｐａｓｓ  Ｐ混合物に添加した。血清無含有培地で予め洗浄したＨｅＬａ細胞（２４ウェル皿の１つのウェル当たり１０５個）をかかる部分の送達混合物で処理した。３７℃での指定期間のインキュベーション後、細胞をタンパク質局在化（共焦点顕微鏡）及び増殖（Clontech製のＬＤＨキット）による試験に使用した。
【００７３】
共焦点顕微鏡による昆虫細胞におけるｅＩＥ４Ｅ及びＶＰｇの局在化
懸濁液中のハイファイブ（T. ni）細胞（１ｍｌ当たり２×１０５個の細胞）に、１０  ＭＯＩでｈｉｓＶＰｇ、又はＨＣＶヘリカーゼのｈｉｓタグ付けドメインＩＩ、又は空バクミドのいずれかを発現するバキュロウイルスを感染させた。３０００ｒｐｍ、４℃で、５分間の遠心分離によって、感染後４８時間で細胞を回収した後、５００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。細胞を２％冷ＰＦＡで固定し、室温で１０分間置き、５００μｌのＰＢＳで２回洗浄して、３００μｌのＰＢＳで再懸濁した。１００μｌの固定細胞の一部を清潔な丸型カバーガラス上に塗布し、層流フード中で乾燥しながら付着させた。翌日、スライドガラスを２４ウェルプレートのウェルに乗せ、ＰＢＳ  ５００μｌによって室温で再水和した。ＰＢＳを取り除いた後、０．１％冷Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の入ったＰＢＳで１０分間、細胞を透過させ、ＰＢＳで２回洗い流し、室温で３０分間、５％血清の入ったＰＢＳで遮断した。ＰＢＳでの２回の洗浄後、室温で１時間、ＰＢＳ中で１００倍希釈した一次抗体（抗ｈｉｓ又は抗ヒトｅＩＦ４Ｅ）と細胞をインキュベートした後、洗浄し、ＰＢＳ中で１００倍希釈した二次抗体（抗ウサギＦＩＴＣ又は抗マウスＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ）（Jackson ImmunoResearch Laboratories）と１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で希釈したヨウ化プロピジウム（０．２μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）で核を染色した。３回、ＰＢＳで洗い流した後、スライドガラスは５０％グリセロールを備えていた。BioRadのＭＲＣ−６００／株式会社ニコンのＯｐｔｉｐｈｏｔレーザー走査型共焦点顕微鏡によって、画像を収集した。
【００７４】
共焦点顕微鏡によるヒト細胞でのｅＩＦ４Ｅ、ＶＰｇタンパク質及びＰＭＬの局在化
約６０％の密集度(confluency)でスライドガラス上に播種されたＨｅＬａ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２％冷ＰＦＡ中で固定した。１０  ＭＯＩで、細胞に、ｈｉｓＶＰｇ、又はＨＣＶヘリカーゼのｈｉｓタグ付けドメインＩＩ、又は空バクミドのいずれかを発現する、バキュロウイルスを感染させた。３０００ｒｐｍ、４℃で、５分間の遠心分離によって、感染後４８時間で細胞を回収した後、５００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。細胞を２％冷ＰＦＡで固定し、室温で１０分間置き、５００μｌのＰＢＳで２回洗浄して、３００μｌのＰＢＳで再懸濁した。１００μｌの固定細胞の一部を清潔な丸型カバーガラス上に塗布し、層流フード中で乾燥しながら付着させた。翌日、スライドガラスを２４ウェルプレートのウェルに乗せ、ＰＢＳ  ５００μｌによって室温で再水和した。ＰＢＳを取り除いた後、０．１％冷Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の入ったＰＢＳで１０分間、細胞を透過させ、ＰＢＳで２回洗い流し、室温で３０分間、５％血清の入ったＰＢＳで遮断した。ＰＢＳでの２回の洗浄後、室温で１時間、ＰＢＳ中で１００倍希釈した一次抗体（精製ポリクローナル抗ＶＰｇ抗体、抗ｅＩＦ４Ｅ（ＭＡｂ）抗体及び抗ＰＭＬ（ＭＡｂ）抗体）と細胞をインキュベートした後、洗浄し、ＰＢＳ中で１００倍希釈した二次抗体（抗ウサギＦＩＴＣ又は抗マウスＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ）（Jackson ImmunoResearch Laboratoriesから購入）と１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で希釈したヨウ化プロピジウム（０．２μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）で核を染色した。３回、ＰＢＳで洗い流した後、スライドガラスは５０％グリセロールを備えていた。BioRadのＭＲＣ−６００／株式会社ニコンのＯｐｔｉｐｈｏｔレーザー走査型共焦点顕微鏡によって、画像を収集した。
【００７５】
細胞増殖に対するＶＰｇタンパク質の効果
ＨｅＬａ細胞、Ｂ１６細胞、ＧＬ２６細胞及びＩＭＲ９０細胞を、１つのウェル当たり１×１０４個の細胞で９６ウェルプレートにおいて播種し、一晩培養した。ＶＰｇの一部（０．５μｇ／ウェル〜２μｇ／ウェル）を血清無含有培地に希釈し、総容量１０μｌを得て、室温で２０分間、０．２μｌのＴｒａｎｓＰａｓｓ  Ｐタンパク質トランスフェクション試薬（New England BioLabs）とインキュベートした。細胞を血清無含有培地で洗い流し、１００μｌ／ウェルの血清無含有培地と形質導入ミックスとを含有する混合物で覆った。３７℃での様々なインキュベーション時間後、１０００ｒｐｍで１０分間、プレートを遠心分離し、上清を新しいプレートに移した。４９０ｎｍで多重標識カウンターＶｉｃｔｏｒ１４１２（Wallac）を用いて、ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Clontech）によって、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの放出を測定した。ＬＤＨキットのマニュアルに従って、細胞傷害性のレベルを算出した。
【００７６】
実施例２：ヒトｅＩＦ４Ｅと、ＰＶＹのＶＰｇタンパク質及びその断片とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ相互作用アッセイ
ＧＳＴ融合タンパク質として、配列番号２（ＶＰｇ）、配列番号１４（ＶＰｇ２）、配列番号１６（ＶＰｇ４）、配列番号２０（ＶＰｇ１）、配列番号２２（ＶＰｇ３）及び配列番号１８（ＶＰｇ５）のペプチドを大腸菌での発現によって得た。ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Amersham Biosciencesから購入）でクローン化したｃＤＮＡ配列（ＶＰｇ、ＶＰｇ１、ＶＰｇ２、ＶＰｇ３、ＶＰｇ４又はＶＰｇ５をコードする）から標準的な方法でＧＳＴ融合タンパク質を産生した。
【００７７】
９６ウェル皿のウェルで固定化したｅＩＦ４Ｅとのペプチド相互作用を測定するのにＥＬＩＳＡ法を用いた。相互作用を抗ＧＳＴ抗体でモニタリングした。
【００７８】
１００ｎｇのヒトｅＩＦ４Ｅの入ったコーティングバッファ（０．１Ｍの炭酸バッファ（ｐＨ９．６））を４℃で一晩、９６ウェルマイクロタイタープレートに適用した。余分なｅＩＦ４Ｅを取り除き、３７℃で１時間、ウェルを５％ミルクの入ったＰＢＳＴバッファで遮断した。プレートをＰＢＳＴで３回洗い流し、室温で１時間、漸増量の様々なＧＳＴ融合ペプチドの入ったＰＢＳＴとインキュベートした。２回のＰＢＳＴ洗浄後、抗ＧＳＴ  ＨＲＰ結合抗体（５０００倍希釈）（Amersham Biosciencesから購入）とのインキュベーションを３７℃で３０分実施した。３回のＰＢＳＴ洗浄後、ペルオキシド基質によって、反応を起こし、４９０ｎｍでの吸光度を測定した。ＧＳＴタンパク質及び抗ＧＳＴ抗体と、ＧＳＴ融合ペプチドとの非特異的な相互作用を差し引いた。
【００７９】
結果を図１に示す。調べたペプチドの中で、配列番号２２（ＶＰｇ３）が弱い相互作用因子であると考えられる。配列番号２０（ＶＰｇ１）及び配列番号１４（ＶＰｇ２）はおおよそ同程度のレベルの相互作用を示し、これはＶＰｇ自体ともそれほど変わらない。最良のｅＩＦ４Ｅ相互作用ペプチドは、配列番号１６（ＶＰｇ４）及び配列番号１８（ＶＰｇ５）であると考えられ、これはより高い濃度で、ＰＶＹのＶＰｇタンパク質自体（配列番号２）よりも良好に機能する。
【００８０】
実施例３：昆虫細胞におけるｅＩＦ４Ｅ及びＰＶＹのＶＰｇタンパク質（配列番号２）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞局在化
昆虫細胞に、ＰＶＹのＶＰｇ遺伝子（配列番号１）を含有するバキュロウイルスを感染させた。共焦点顕微鏡解析によって、核と細胞質との両方のコンパートメントでの感染開始時に局在していた（図２、１２ｈｐｉ）開始因子ｅＩＦ４Ｅが６０ｈｐｉ時点では細胞周辺で観察されたことが示された（図２、左側の欄）。ＶＰｇは、感染を通して細胞質でしか観察されなかった（図２、ＶＰｇ欄）。融合（Merged）画像は、感染開始時には核でかなりの割合のｅＩＦ４Ｅを示していたが、感染の経過中に消失していき、２４ｈｐｉでは、ｅＩＦ４Ｅは細胞質とちょうど核周辺部とに見ることができ、６０ｈｐｉでは細胞質でしか観察されず、このことはＶＰｇとのかなりの重複を示していた。
【００８１】
ｅＩＦ４Ｅ局在化において観察される変動が特にＶＰｇの存在によるものであるか否かを解明するために、ウイルス由来のバキュロウイルスヌル（バクミド）による昆虫細胞感染時、外来遺伝子の挿入前、また非関連タンパク質、ＨＣＶヘリカーゼのドメインＩＩ又はＶＰｇを発現するバキュロウイルスの感染時のｅＩＦ４Ｅの局在化を調べた（図３）。非感染昆虫細胞では、ｅＩＦ４Ｅが両方の細胞コンパートメントで観察された（最上部のパネル）。１２ｈｐｉでは、３種類全てのウイルスを感染させた細胞が同様の挙動を示す一方で、６０ｈｐｉでは、ＶＰｇを発現する細胞だけが細胞質中でのｅＩＦ４Ｅ保持を示した（図３、最下部のパネル）。より定量的なデータを得るために、細胞核を細胞質と分けて、両方のコンパートメントにおけるｅＩＦ４Ｅ量をウェスタンブロット法（図４）、その後の濃度測定（以下の表２）で評価した。
【００８２】
【表２】
2010530743.tif 000008
【００８３】
ｈｉｓタグ付形態のＶＰｇを発現するバキュロウイルスを感染させた細胞が、本実験に含まれていた。非感染細胞、及び１２時間感染させた細胞の両方において、同程度のレベルのｅＩＦ４Ｅが細胞質及び核に存在していた。核プールの開始因子は、バクミド及びヘリカーゼ発現ウイルスの感染経過中に幾らか低減した。しかしながら、両方のＶＰｇ形態が発現されると、核プールのｅＩＦ４Ｅが大幅に失われ、３６ｈｐｉでは、核プールのｅＩＦ４Ｅは、総細胞因子の１３％しか占めていなかった（５１％〜５３％から下がって）。
【００８４】
これらの実験によって、（１）バキュロウイルス系単独で発現したＶＰｇが細胞質に残り、（２）ＶＰｇの存在下で、ｅＩＦ４Ｅが細胞質中に保持され、これにより核プールの開始因子が失われるが、昆虫細胞が幾らかのｅＩＦ４Ｅアイソフォームを含有していると思われるので、細胞増殖又は細胞死は阻害されないことが実証された。
実施例４：ＨｅＬａ細胞におけるｅＩＦ４Ｅ及びＰＶＹのＶＰｇタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞局在化
植物ウイルスのＶＰｇタンパク質がヒトｅＩＦ４Ｅと相互作用し、核プールの開始因子を失わせることができるか否かを確認するために、様々な条件下で、幾つかのトランスフェクション実験を実施した。しかしながら、ＶＰｇを発現する細胞を回収することができず、このことはヒト細胞に対するＶＰｇの毒性効果を示唆していた。したがって、ＰＶＹのＶＰｇ（配列番号２）は、タンパク質を細胞内送達させる陽イオン性脂質混合物であるＰｒｏ−Ｊｅｃｔ（商標）（Pierceから購入）で、ＨｅＬａ細胞に直接転座させた（図５Ｂを参照されたい）。ＶＰｇは細胞質に局在し、天然ｅＩＦ４Ｅの局在化に強い影響を与えた。対照ＨｅＬａ細胞では、開始因子は細胞質と核とで観察された。ＶＰｇの存在下では、ｅＩＦ４Ｅのレベルは核で大幅に低減し、細胞質に局在したＶＰｇにかなり重複していた。
【００８５】
実施例５：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖に対するＰＶＹのＶＰｇタンパク質の効果
形質転換細胞、ＨｅＬａ細胞及びＢ１６細胞、並びに一次非形質転換ヒト細胞ＩＭＲ９０細胞へのＶＰｇ送達後に、細胞損傷の評価を可能にするＬＤＨアッセイを適用した。ＶＰｇ細胞内送達の１時間後には既に、ＨｅＬａ細胞及びＢ１６細胞の両方が有意な細胞損傷を示した。重要なことに、一次ＩＭＲ９０（ヒト胎児肺線維芽細胞）に導入されたＶＰｇはこれらの増殖に影響を与えなかった（図６、ＩＭＲ９０）。
【００８６】
ＶＰｇと、真核生物の開始因子ｅＩＦ４Ｅとの相互作用によって、細胞質において開始因子の固定化が起こり、これにより細胞増殖が阻害された後、細胞死が起こる。ＶＰｇとの相互作用によって引き起こされる核プールのｅＩＦ４Ｅの低減は、増殖誘発（pro-proliferative）タンパク質のメッセンジャーＲＮＡの細胞質輸送の阻害によって達成されると考えられ、これによりその後に細胞死を伴う細胞増殖の阻害が起こる。
【００８７】
実施例６：ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞増殖に対するＰＶＹのＶＰｇタンパク質の効力
ＰＶＹのＶＰｇタンパク質（配列番号２）の抗癌効果を調べるために、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を実施した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、マウス神経膠腫腫瘍を誘導するＧＬ２６細胞又はＢ１６−ｏｖａ黒色腫細胞で接種した。
【００８８】
ＧＬ２６腫瘍は、成体のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの右大腿四頭筋に、０．５×１０６個のＧＬ２６細胞の入った１００μｌのウシ胎児血清の一部を注射することで樹立した。約２週間後、神経膠腫腫瘍増殖の対数増殖期中に、ＶＰｇ（０．９％  ＮａＣｌ中、２５μｇ）又は０．９％  ＮａＣｌ（５０μｌ）（バッファ）を２群５匹のマウスに電気穿孔で投与し、対照群のマウスは未処理のままにした。ＶＰｇ及びバッファで処理したマウスは、４００μｌのＩｍａｌｇｅｎ１０００と、２％Ｒｏｍｐｕｎ（両方ともCentravet（Lapalisse, France）製）と、０．９％ＮａＣｌとを含有する溶液２５０μｌを腹腔内注射することで麻酔した。電気穿孔条件は以下の通りであった：１Ｈｚの周波数で細胞融合遺伝子導入装置（electro square porator）Ｔ８２０（BTX, San Diego, CA, U.S.A）から８００ボルトの５×１００μ秒パルス。パルス間の遅延は１秒であった。動物は、麻酔から回復するまで保温した（３７℃）。腫瘍の容量は、２日又は３日ごとにノギス（slide calliper）で測定し（ｍｍ３）、未処理の対照群マウスの正常に増殖した神経膠腫腫瘍と比較した。
【００８９】
Ｂ１６−ｏｖａ黒色腫腫瘍は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２群８匹）の左大腿部にＰＢＳで懸濁した５×１０５個の細胞を注射することで樹立した。１２日後、触知可能な腫瘍が形成されたら、対照群の腫瘍に、バッファと混合したＴｒａｎｓｐａｓｓ  Ｐを注射した。第２の群には、６日間毎日、Ｔｒａｎｓｐａｓｓ  Ｐを形質導入したＶＰｇ  ５０μｇを注射した。腫瘍の直径を毎日測定することで、腫瘍増殖速度を求めた。
【００９０】
結果を図７及び図８に示す。ＶＰｇの投与が、対照群に比べて、腫瘍の増殖の速度をゆっくりにするか、又は阻害した。このことは、実際にＶＰｇが腫瘍増殖に対する阻害効果を有することを示している。
【００９１】
【表３】
2010530743.tif 000009
【００９２】
【表４】
2010530743.tif 000010
【００９３】
【表５】
2010530743.tif 000011
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
配列番号２３：ＶＰｇ遺伝子ＰＣＲプライマー
配列番号２４：ＶＰｇ遺伝子ＰＣＲプライマー
配列番号２６：ＶＰｇモチーフ
【図１】
2010530743.tif 000014
【図２】
2010530743.tif 000015
【図３】
2010530743.tif 000016
【図４】
2010530743.tif 000017
【図５】
2010530743.tif 000018
【図６】
2010530743.tif 000019
【図７】
2010530743.tif 000020
【図８】
2010530743.tif 000021
【配列表】
2010530743000001.app
【国際調査報告】
2010530743.tif 000022
2010530743.tif 000023
2010530743.tif 000024
2010530743.tif 000025
2010530743.tif 000026
2010530743.tif 000027
2010530743.tif 000028