(57)【要約】  （ｉ）ポリエチレンイミンの濃度が、ポリエチレンイミンの数平均モル質量（Ｍｎ）に基づき１５μＭ又はそれ以下であり、糖濃度又は、２以上の糖が存在する場合は、総糖濃度が０．１Ｍより大きい、１又はそれ以上の糖類、ポリエチレンイミン及びウイルス粒子の水溶液を提供すること；及び（ｉｉ）溶液を乾燥して、前記ウイルス粒子を含む無定形固体マトリックスを形成すること、を含む、ウイルス粒子を保存するための方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ポリエチレンイミンの濃度が、ポリエチレンイミンの数平均モル質量（Ｍｎ）に基づき１５μＭ又はそれ以下であり、糖濃度又は、２以上の糖が存在する場合は、総糖濃度が０．１Ｍより大きい、１又はそれ以上の糖類、ポリエチレンイミン及びウイルス粒子の水溶液を提供すること；及び
（ｉｉ）溶液を乾燥して、前記ウイルス粒子を含む無定形固体マトリックスを形成すること
を含む、ウイルス粒子を保存するための方法。
【請求項２】
前記ポリエチレンイミンのＭｎが２０〜１０００ｋＤａであり、前記ポリエチレンイミンの濃度が、Ｍｎに基づき０．００１〜１００ｎＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリエチレンイミンのＭｎが１〜１００００Ｄａであり、前記ポリエチレンイミンの濃度が、Ｍｎに基づき０．０００１〜１０μＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記糖濃度又は総糖濃度が０．５〜２Ｍである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記糖が、スクロース、スタキオース、ラフィノース又は糖アルコールである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
２又はそれ以上の糖の溶液を使用する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
スクロースの濃度対その他の糖の濃度が３：７〜９：１の比率であり、工程（ｉ）におけるＭｎに基づくポリエチレンイミンの濃度が０．００２５ｎＭ〜５μＭである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物を凍結乾燥する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルス粒子が生ウイルス又は死滅ウイルスから成る、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生ウイルスが全ウイルス又は生弱毒化ウイルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ウイルス粒子、１又はそれ以上の糖類及びポリエチレンイミンを含み、無定形固体の形態である、保存された生成物。
【請求項１２】
ウイルスが誘発する毒性、ウイルス感染、ウイルス感染の続発症、癌又はアレルギーの予防又は治療におけるワクチンとして使用するための請求項１１に記載の生成物。
【請求項１３】
（ａ）スクロース、スタキオース若しくはラフィノース又はそれらの何らかの組合せ；及び
（ｂ）５μＭ又はそれ以下のＭｎに基づく濃度のポリエチレンイミン
を含む、ウイルス粒子の保存のための賦形剤。
【請求項１４】
凍結乾燥の間及び凍結乾燥後のウイルス粒子の保存のための、請求項１３に記載の賦形剤の使用。
【請求項１５】
請求項１３に記載の賦形剤を含むキット。
【請求項１６】
請求項１１で定義される保存された生成物及び場合によりアジュバントを含有するワクチン。
【請求項１７】
（ａ）ポリエチレンイミンの濃度が、ポリエチレンイミンの数平均モル質量（Ｍｎ）に基づき１５μＭ又はそれ以下であり、糖濃度又は、２以上の糖が存在する場合は、総糖濃度が０．１Ｍより大きい、１又はそれ以上の糖類、ポリエチレンイミン及びウイルス粒子の水溶液を提供すること；及び
（ｂ）場合によりアジュバント、緩衝剤、抗生物質及び／又は添加物を混合物に添加すること；及び
（ｃ）溶液を乾燥して、前記ウイルス粒子を含む無定形固体マトリックスを形成すること
を含む、ウイルス粒子を含有するワクチンを調製する方法。
【請求項１８】
ワクチンが多価ワクチンである、請求項１２に記載の生成物、請求項１６に記載のワクチン又は請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）１又はそれ以上の糖類、ポリエチレンイミン及びウイルス粒子の水溶液を提供すること；及び
（ｉｉ）溶液を乾燥して、前記ウイルス粒子を含む無定形固体マトリックスを形成すること
を含む、ウイルス粒子を保存するための方法。
【請求項２０】
請求項１から１０のいずれか一項において定義される方法によって得られる、保存されたウイルス粒子を含む乾燥粉末。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス粒子を熱分解及び乾燥から保護する方法に関する。本発明はまた、保存されたウイルス粒子を含む生成物に関する。
【０００２】
発明の背景
一部の生物学的分子は、それらを単離し、精製して、その後室温で溶液中に保存できるほど十分に安定である。しかし、これは多くの物質に関して可能ではなく、在庫の保存を確実にするために低温での貯蔵、安定剤の添加、凍結乾燥、真空形成及び空気乾燥を含む手法が試みられてきた。これらの手法が使用可能であるにもかかわらず、生物学的物質はまだ保存の間満足し得る安定性のレベルを示しておらず、また一部の手法は追加コストや不便さを導く。例えば、低温輸送及び貯蔵は費用がかかる。さらに、低温輸送はしばしば、開発途上の国々では医薬品、例えばワクチンの輸送には使用できない。
【０００３】
特に、凍結乾燥（freeze-drying or lyophilisation）のストレスは一部の生物学的物質を大きく損傷することがあり得る。生物医薬品の凍結乾燥は、熱感受性バイオマテリアルの溶液又は懸濁液を凍結し、続いて一次及び二次乾燥することを含む。その手法は、溶液の融解を伴わない真空下の氷点下温度での水の昇華に基づく。凍結乾燥は固体タンパク質及びワクチン医薬品を製造するための鍵となる工程である。凍結バイオマテリアルからの水蒸気拡散の割合は非常に低く、それ故この工程は時間がかかる。加えて、凍結と乾燥の両方の段階が、タンパク質をアンフォールディング又は変性することができるストレスを導入する。
【０００４】
国際公開公報第ＷＯ−Ａ−２００６／０８５００８２号は、糖、荷電物質、例えばヒストンタンパク質、及び乾燥感受性又は熱感受性の生物学的成分を含む乾燥又は保存された生成物を報告する。糖は無定形固体マトリックスを形成する。しかし、保存された生物学的成分がヒト又は動物に投与された場合、ヒストンは免疫学的影響を及ぼし得る。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者は、１、２又はそれ以上の糖類とポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む水溶液と混合したウイルス製剤が、乾燥したとき、例えば凍結乾燥したとき、保護されることを認めた。ウイルス製剤への１又はそれ以上の糖類の添加は、ウイルスの感染性及び／又は免疫原性のある程度の保存を導く。しかし、ＰＥＩを１又はそれ以上の糖類と共に添加すると、驚くべきことにウイルスの感染性及び／又は免疫原性の改善された保存を導く。感染性及び／又は免疫原性における特に好ましい改善は、比較的低濃度のＰＥＩと比較的高濃度の１又はそれ以上の糖類で認められる。
【０００６】
従って、本発明は、
（ｉ）ポリエチレンイミンの濃度が、ポリエチレンイミンの数平均モル質量（Ｍｎ）に基づき１５μＭ又はそれ以下であり、糖濃度又は、２以上の糖が存在する場合は、総糖濃度が０．１Ｍより大きい、１又はそれ以上の糖類、ポリエチレンイミン及びウイルス粒子の水溶液を提供すること；及び
（ｉｉ）溶液を乾燥して、前記ウイルス粒子を含む無定形固体マトリックスを形成すること
を含む、ウイルス粒子を保存するための方法を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、
−ウイルス粒子、１又はそれ以上の糖類及びポリエチレンイミンを含み、無定形固体の形態である、保存された生成物；
−（ａ）スクロース、スタキオース若しくはラフィノース又はそれらの何らかの組合せ；及び
（ｂ）５μＭ又はそれ以下のＭｎに基づく濃度のポリエチレンイミン
を含む、ウイルス粒子の保存のための賦形剤；
−凍結乾燥の間及び凍結乾燥後のウイルス粒子の保存のための賦形剤の使用；
−賦形剤を含むキット；
−保存された生成物及び場合によりアジュバントを含有するワクチン；
−（ａ）ポリエチレンイミンの濃度が、ポリエチレンイミンの数平均モル質量（Ｍｎ）に基づき１５μＭ又はそれ以下であり、糖濃度又は、２以上の糖が存在する場合は、総糖濃度が０．１Ｍより大きい、１又はそれ以上の糖類、ポリエチレンイミン及びウイルス粒子の水溶液を提供すること；及び
（ｂ）場合によりアジュバント、緩衝剤、抗生物質及び／又は添加物を混合物に添加すること；及び
（ｃ）溶液を乾燥して、前記ウイルス粒子を含む無定形固体マトリックスを形成すること
を含む、ウイルス粒子を含有するワクチンを調製する方法：及び
−本発明の方法によって得られる、保存されたウイルス粒子を含有する乾燥粉末
を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＰＥＩ、スクロース（Ｓｕｃ）及びラフィノース（Ｒａｆ）から成る賦形剤が、凍結乾燥及び室温（ＲＴ）で２４時間のインキュベーション又は３７℃（ＨＴ）で４８時間の熱処理のいずれかの後の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ−Ａ）の回復に及ぼす作用を示す。結果はまた、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が凍結乾燥（ＦＤ）の間の保護を与えないことを示す。示されている誤差バーは平均（ｎ＝２）の標準誤差である。
【図２】ＰＥＩが、スクロース（Ｓｕｃ）及びスタキオース（Ｓｔａｃ）に添加したときＦＭＤＶ−Ｏの回復を促進することを示す。ＰＥＩ、Ｓｕｃ及びＳｔａｃを含む賦形剤を使用して得られた結果を「Ｐｏｌｙ」で示す。ＰＥＩなしでＳｕｃ及びＳｔａｃを含む賦形剤を使用して得られた結果を「Ｓｕｇａｒ」で示す。作用は、２４時間（「２４ｈ  ＨＴ」）熱処理したＦＭＤＶ−Ｏと６日間（「６ｄａｙ  ＨＴ」）熱処理したＦＭＤＶ−Ｏの両方で認められる。示されている誤差バーは平均（ｎ＝２）の標準誤差である。
【図３】賦形剤中の初期糖濃度がＦＭＤＶ−Ｏの安定性を維持する上で重要であることを示す。スクロースとスタキオースの溶液（１２０Ｓｕｃ（３Ｍ）：８０Ｓｔａｃ（０．７５Ｍ））を容積比で１：１０に希釈すると、糖だけの賦形剤の保護作用の完全な喪失を生じさせる。示されている誤差バーは平均（ｎ＝３）の標準誤差である。
【図４−１】様々なＰＥＩ濃度でスクロース（Ｓｕｃ）：スタキオース（Ｓｔａｃ）の比率が凍結乾燥ＨＴ  ＦＭＤＶ−Ｏの回復に及ぼす影響を示す。結果は、Ｓｔａｃの添加が安定性を高めることを示す。各々のＰＥＩ濃度についての結果を順に並べた。一方向ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｒｋｅｙ検定を使用した統計解析は、すべてのＳｕｃを含む混合物が、容積比で１４０：６０のＳｕｃ：Ｓｔａｃ比を含むものよりも有意に低い回復を達成することを示した。誤差バーは平均（ｎ＝８）の標準誤差を示す。
【図４−２】国際公開公報第ＷＯ−Ａ−２００６／０８５００８２号に従って様々な濃度のヒストン（Ｈｉｓ）でＳｕｃ：Ｓｔａｃ比が凍結乾燥ＨＴ  ＦＭＤＶ−Ｏの回復に及ぼす影響を示す。ヒストンはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍより入手したヒストン２Ａであった。示されている誤差バーは平均（ｎ＝６）の標準誤差である。
【図５】Ｓｕｃ／Ｓｔａｃ／ＰＥＩの比率の最適化がアデノウイルスの回復に及ぼす影響を示す。１２時間の凍結乾燥及び２４時間の熱処理後にプラーク形成単位（ＰＦＵ）の形成を評価した。結果は、最高レベルのＳｔａｃを使用したとき、ウイルスＰＦＵが急速に低下したことを明らかにする。Ｓｔａｃが存在しない場合、ＰＦＵは劇的に低下した。ＰＢＳだけで凍結乾燥したとき、ＰＦＵは存在しなかった。ＰＥＩのより低い希釈はまたウイルスの回復を促進すると思われた。
【図６】ＰＥＩ及び糖中でのアデノウイルスの回復を示す。ＰＥＩ及び糖賦形剤を最適化し、３つの対照：糖類のみ、ＰＢＳ及びもとの力価（凍結乾燥前）と比較した。ＰＢＳだけでの凍結乾燥は熱保護を示さなかった。糖類だけでもある程度のウイルス活性を示したが、賦形剤中でＰＥＩを糖と共に使用するとより大きな活性が認められた。示されている誤差バーは平均（ｎ＝２）の標準誤差である。
【図７】０．０２ｎＭの濃度のＰＥＩとＳｕｃ（１．５Ｍ）／Ｓｔａｃ（０．１２５Ｍ）を含む賦形剤が最適であると思われ、Ｓｕｃ  Ｓｔａｃだけの溶液単独に比べてアデノウイルスの改善された回復を明らかにすることを示す。単独賦形剤としてのＰＥＩは、凍結乾燥の間の保護をほとんど又は全く示さなかった。
【図８】アデノウイルスの回復に関して２つの異なるＰＥＩを比較するために設計した実験の結果を示す。高分子量ＰＥＩは低分子量ＰＥＩよりもはるかに低い濃度で有効であった。ＰＢＳ単独ではウイルスの回復を示さなかった。やはり、最適ＰＥＩ／糖濃度は糖単独に比べて改善された回復を示す。
【図９】水へのＰＥＩの希釈（「ＰＥＩＷ」）とＰＢＳへのＰＥＩの希釈（「ＰＥＩＰ」）との比較を示す。結果は、ＰＥＩをＰＢＳに希釈したとき、水に比べてより高いアデノウイルス力価を示した。ＰＢＳ及び蒸留水自体を賦形剤として使用したとき、どちらも非常に低いレベルのアデノウイルスの回復を示した。
【０００９】
発明の詳細な説明
要旨
本発明は、ウイルス粒子を保存混合物を接触させることによる、ウイルス粒子の保存に関する。保存混合物は、ＰＥＩ及び１、２又はそれ以上の糖類の水溶液である。低濃度のＰＥＩと比較的高濃度の糖を使用する。ウイルス粒子がその中に存在する溶液を、その後、乾燥して、ウイルス粒子を含む無定形固体マトリックスを形成する。
【００１０】
それ故、本発明は、乾燥工程の間ウイルスの構造及び機能が保存されることを可能にする。それ故乾燥後もウイルス活性を保持することができる。保存されたウイルス粒子は、改善された熱及び乾燥耐性を示し、貯蔵寿命の延長、保存と輸送の容易さを可能にし、配給のための低温流通体系の必要性を取り除く。それ故、本発明は、凍結保護剤（凍結損傷に対する保護）、凍結乾燥保護剤（lyoprotectant）（乾燥に対する保護）及び／又は熱保護剤（４℃より高い又は低い温度に対する保護）としての保護を提供することができる。
【００１１】
ウイルス粒子
典型的には、全ウイルス又はビリオンは、保護タンパク質コート又はキャプシドによって取り囲まれた核酸から成る。ウイルス核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はそれらの何らかの組合せを含み得る。
【００１２】
キャプシドはサブユニットで構成される。多くのウイルスキャプシドは、正二十面体又はらせん対称性のいずれかを有し得るサブユニットから作られている。一部の型のウイルスはまた、ヌクレオキャプシドのようなウイルス構造、タンパク質尾部及び複雑な外壁のような追加構造、及びらせん尾部に結合した正二十面体頭部のような複雑な構造を含む。キャプシドはまた、エンベロープで取り囲まれていることもある。エンベロープはリポタンパク質二重層から成り、宿主細胞の膜からの物質並びにウイルス起源の物質を含み得る。例えば、エンベロープは細胞由来の脂質とウイルス由来のタンパク質を含み得る。ウイルスはまた、糖タンパク質スパイクを含み得る。
【００１３】
本発明において使用されるウイルス粒子は、全ウイルス、例えば生ウイルス、死滅ウイルス、生弱毒化ウイルス、不活化ウイルス、例えば化学的不活化ウイルス、又はビルレント若しくは非ビルレントウイルスであり得る。生ウイルスは、ウイルス宿主に感染することができ、ウイルス宿主によって繁殖され得る。死滅ウイルスは不活化されており、ウイルス宿主に感染することができない。粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）又はヌクレオキャプシドであり得る。
【００１４】
ウイルス粒子は、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、（＋）ｓｓＲＮＡウイルス、（−）ｓｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡ−ＲＴウイルス又はｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルスであり得るか又はそれに由来し得る。限定するわけではないが、一例として、ウイルス粒子は以下のファミリーのウイルスであり得るか又はそれに由来し得る。
−アデノウイルス科（adenoviridae）、例えばヒトＡｄ５、Ａｄ２、Ａｄ６、Ａｄ２４血清型を含むヒトアデノウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＦ；
−カリシウイルス科（caliciviridae）、例えばノーウォークウイルス；
−コロナウイルス科（coronaviridae）、例えばヒトコロナウイルス２９９Ｅ又はＯＣ４３及びＳＡＲＳ−コロナウイルス；
−フィロウイルス科（filoviridae）、例えばエボラウイルス；
−フラビウイルス科（flaviviridae）、例えば黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス；
−ヘパドナウイルス科（hepadnaviridae）、例えばＢ型肝炎ウイルス；
−ヘルペスウイルス科（herpesviridae）。例えば単純ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス１、３、４、５又は６；
−オルトミクソウイルス科（orthomyxoviridae）、例えば、これらに限定されないが、インフルエンザＡ型ウイルス血清型Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｈ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３及びＮ１０Ｎ７を含むインフルエンザウイルスＡ、Ｂ、Ｃ；
−パピローマウイルス科（papillomaviridae）、例えばヒトパピローマウイルス；
−パラミクソウイルス科（paramyxoviridae）、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１、麻疹ウイルス及び耳下腺炎ウイルス；
−パルボウイルス科（parvoviridae）、例えばアデノ関連ウイルス；
−ピコルナウイルス科（picornaviridae）、例えばヒトポリオウイルス、口蹄疫ウイルス（血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、ＳＡＴ−１、ＳＡＴ−２、ＳＡＴ−３及びＡｓｉａ−１を含む）；
−ポックスウイルス科（poxviridae）、例えばワクシニアウイルス、痘瘡ウイルス及びトリポックスウイルス（鶏頭ウイルス）；
−レオウイルス科（reoviridae）、例えばブルータングウイルス群；
−レトロウイルス科（retroviridae）、例えばヒト免疫不全ウイルス１及び２を含むレンチウイルス；及び
−トガウイルス科（togaviridae）、例えば風疹ウイルス 。
【００１５】
好ましい実施形態では、ウイルス粒子は、アデノウイルス科、オルトミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科又はポックスウイルス科ウイルスであり得るか又はそれに由来し得る。特に好ましい実施形態では、ウイルス粒子は、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス又は口蹄疫ウイルスであり得るか又はそれに由来し得る。
【００１６】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルスの構造タンパク質に由来するウイルスタンパク質を含むが、ウイルス核酸を持たない。過剰発現されたとき、これらのウイルス構造タンパク質は自発的に粒子へと自己集合する。ＶＬＰは複製能力がない。一部の実施形態では、ＶＬＰは、脂質二重層に埋め込まれたウイルスタンパク質である。ＶＬＰの例としては、ファージ由来ＶＬＰ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１主要キャプシドタンパク質ＶＬＰ、ノーウォークウイルスキャプシドタンパク質ＶＬＰ及びインフルエンザウイルス構造タンパク質、例えばＭ１タンパク質、ＨＡ赤血球凝集素タンパク質及びＮ１ノイラミニダーゼタンパク質から集合したＶＬＰを含む。
【００１７】
ウイルス粒子は当業者に周知の標準的手法を用いて調整できる。例えば、ウイルスは、培養した宿主細胞を使用しようとするウイルス株に感染させ、ウイルスが培養細胞内で複製するように感染を進行させることによって調製でき、ウイルスを採取して精製するために当分野で公知の標準的方法によって放出させることができる。
【００１８】
保存混合物
本発明の保存混合物は、１又はそれ以上の糖類及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の水溶液を含む。いかなる適切な水溶液も使用し得る。溶液を緩衝してもよい。溶液は、ＨＥＰＥＳ溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は純水であり得る。
【００１９】
本発明における使用に適する糖類は、還元糖、例えばグルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ラクトース、アラビノース及びマルトース；及び非還元糖、例えばスクロースを含む。糖は、単糖類、二糖類、三糖類又は他のオリゴ糖類であり得る。「糖」という用語は糖アルコールを包含する。
【００２０】
単糖類、例えばガラクトース、ラフィノース及びマンノース；二糖類、例えばラクトース及びマルトース；及び三糖類、例えばスタキオースが考慮される。トレハロース、ウンベリフェロース、ベルバスコース、イソマルトース、セロビオース、マルツロース、ツラノース、メレジトース及びメリビオースも本発明における使用に適する。適切な糖アルコールはマンニトールである。
【００２１】
好ましくは、１、２又はそれ以上の糖類の水溶液は、スクロース、ラフィノース又はスタキオースの溶液である。特に、スクロースはグルコースとフルクトースの二糖類である；ラフィノースは、ガラクトース、フルクトース及びグルコースから成る三糖類である；そしてスタキオースは、連続的に結合した２個のＤα−ガラクトース単位、１個のＤα−グルコース単位及び１個のＤβ−フルクトース単位から成る四糖類である。スクロースとラフィノースの組合せ、又はスクロースとスタキオースの組合せを使用し得る。
【００２２】
ウイルスの感染性又は免疫原性の保存は、少なくとも２つの糖類を本発明の保存混合物において使用するとき特に有効である。それ故、１又はそれ以上の糖類の溶液は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４又は少なくとも５の糖類の溶液を含む。２、３、４、５、６、７、８、９、１０等の糖類の組合せが考慮される。好ましくは、２又はそれ以上の糖類は、スクロースとラフィノース、又はスクロースとスタキオースを含む。
【００２３】
ＰＥＩは、−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ）−と表される繰り返し化学単位によって特徴づけられる脂肪族ポリアミンである。本明細書におけるＰＥＩへの言及は、ポリエチレンイミンホモポリマー又はコポリマーを包含する。ポリエチレンイミンコポリマーは、ランダム又はブロックコポリマーであり得る。例えば、ＰＥＩは、ポリエチレンイミンのコポリマーともう１つ別のポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成され得る。ポリエチレンイミンは線状又は分枝のいずれでもよい。
【００２４】
ＰＥＩへの言及はまた、ポリエチレンイミンの誘導体化形態を包含する。ポリエチレンイミンは様々な位置に窒素原子を含む。窒素原子は、末端アミノ基、例えばＲ−ＮＨ２に、又は内部基、例えばポリマー構造内のアルキル基又はアルキレン基に割り込む（interrupting）基、例えばＲ−Ｎ（Ｈ）−Ｒ’に、及びポリマー分枝の交差部分、例えばＲ−Ｎ（−Ｒ’）−Ｒ”［式中、Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、例えばアルキレン基であり得る］に存在する。水素原子に加えて又は水素原子の代わりにアルキル基又はアリール基が窒素中心に結合していてもよい。そのようなアルキル基又はアリール基は置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい。アルキル基は、典型的にはＣ１〜Ｃ４アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチルである。アリール基は、典型的にはフェニルである。
【００２５】
ＰＥＩは、様々な他のポリマー、例えばポリエチレングリコールに共有結合したポリエチレンイミンであり得る。他の修飾型の様々なＰＥＩも生成されており、一部は市販されている。分枝ＰＥＩ  ２５ｋＤａ、ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）、ＬＭＷ−ＰＥＩ  ５．４ｋＤａ、プソイドデンドリマー（Pseudodendrimeric）ＰＥＩ、ＰＥＩ−ＳＳ−ＰＥＩ、ＰＥＩ−ＳＳ−ＰＥＧ、ＰＥＩ−ｇ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−コ−ＰＥＩ、ＰＥＧ−ｇ−ＰＥＩ、ＰＥＩ−コ−Ｌ−ラクトアミド−コ−スクシンアミド、ＰＥＩ−コ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル−エチレンイミン）、ＰＥＩ−コ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ＰＥＩ−ｇ−ＰＣＬ−ブロック−ＰＥＧ、ＰＥＩ−ＳＳ−ＰＨＭＰＡ、ＰＥＩ−ｇ−デキストラン１００００及びＰＥＩ−ｇ−トランスフェリン−ＰＥＧ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ８５（登録商標）／Ｐｌｕｒｏｎｉｃｌ２３（登録商標）−ｇ−ＰＥＩ。
【００２６】
ＰＥＩは、広範囲の数平均モル質量（Ｍｎ）で、例えば３００Ｄａ〜８０ＯｋＤａで入手可能である。好ましくは、数平均モル質量は、３００〜２０００Ｄａ、５００〜１５００Ｄａ、１０００〜１５００Ｄａ、１０〜１００ｋＤａ、２０〜１００ｋＤａ、３０〜１００ｋＤａ、４０〜１００ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、６０〜１００ｋＤａ、５０〜７０ｋＤａ又は５５〜６５ｋＤａである。約６０ｋＤａの比較的高いＭｎのＰＥＩ又は１２００Ｄａの比較的低いＭｎが適切である。
【００２７】
好ましくは、ＰＥＩの重量平均モル質量（Ｍｗ）は、５００Ｄａ〜１０００ｋＤａである。最も好ましくは、ＰＥＩのＭｗは５００Ｄａ〜２０００Ｄａ、１０００Ｄａ〜１５００Ｄａ又は１〜１０００ｋＤａ、１００〜１０００ｋＤａ、２５０〜１０００ｋＤａ、５００〜１０００ｋＤａ、６００〜１０００ｋＤａ、７５０〜１０００ｋＤａ、６００〜８００ｋＤａ、７００〜８００ｋＤａである。約７５０ｋＤａの比較的高いＭｗ又は１３００Ｄａの比較的低いＭｗが適切である。
【００２８】
ＰＥＩの重量平均モル質量（Ｍｗ）及び数平均モル質量（Ｍｎ）は、当業者に周知の方法によって決定することができる。例えば、Ｍｗは、光散乱、小角中性子散乱（ＳＡＮＳ）、Ｘ線散乱又は沈降速度によって決定し得る。Ｍｎは、例えばゲルパーミエーションクロマトグラフィー、粘度測定法（Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ式）及び束一法（colligative methods）、例えば蒸気圧浸透圧法又は末端基滴定によって決定し得る。
【００２９】
様々な形態のＰＥＩが市販されている（例えばＳｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）。例えば、約６０ｋＤａのＭｎと約７５０ｋＤａのＭｗを有する、本明細書において使用する分枝鎖の比較的高分子量形態のＰＥＩは市販されている（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３１４３）。このＰＥＩは以下の式によって表すことができる。
【化１】
2010521961.tif 000003
【００３０】
１３００ＤａのＭｗと１２００ＤａのＭｎを有する、本明細書において使用する比較的低分子量形態のＰＥＩも市販されている（例えばＡｌｄｒｉｃｈ  ４８２５９５）。
【００３１】
本発明において、ＰＥＩ及び１、２又はそれ以上の糖類の水溶液を含む保存混合物が提供される。典型的には、ウイルス粒子を保存混合物と混合して、乾燥用の水溶液を提供する。
【００３２】
乾燥用水溶液中の糖の濃度は０．１Ｍより大きい。好ましくは、乾燥用水溶液中の糖の濃度、又は２以上の糖が存在する場合は、乾燥用水溶液中の糖の総濃度は、少なくとも０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７５Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ又は２Ｍから飽和まで、例えば室温での飽和まで、又は３Ｍ、２．５Ｍ若しくは２Ｍまでである。２以上の糖が存在する場合の糖濃度又は総濃度は、０．５〜２Ｍであり得る。２以上の糖が存在する場合、各々の糖は、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７５Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ又は２Ｍから飽和まで、例えば室温での飽和まで、又は３Ｍ、２．５Ｍ若しくは２Ｍまでである。
【００３３】
乾燥用水溶液中のＰＥＩの濃度は、一般にＭｎに基づき１５μＭ又はそれ以下の範囲である。ＰＥＩ濃度は、Ｍｗに基づき１０μＭ又はそれ以下であり得る。そのような濃度のＰＥＩは、ウイルスの感染性又は免疫原性を保存するのに特に有効である。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、ＰＥＩは、５μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．０７５ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．０２５ｎＭ未満又は０．００２５ｎＭ未満のＭｎに基づく濃度で提供される。典型的には、Ｍｎに基づくＰＥＩ濃度は、０．００２５ｎＭ若しくはそれ以上、０．０２５ｎＭ若しくはそれ以上、又は０．１ｎＭ若しくはそれ以上である。Ｍｎに基づく適切なＰＥＩ濃度範囲は、０．００２５ｎＭ〜５μＭ、又は０．０２５〜２００ｎＭである。
【００３５】
好ましくは、Ｍｗに基づくＰＥＩ濃度は、５μＭ未満、１μＭ未満、０．１μＭ未満、０．０１μＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．０２ｎＭ未満、０．００２ｎＭ未満又は０．１ｎＭ未満である。典型的には、Ｍｗに基づくＰＥＩ濃度は、０．００００ｌｎＭ若しくはそれ以上、０．００ｌｎＭ若しくはそれ以上又は０．０１ｎＭ若しくはそれ以上である。Ｍｗに基づく適切なＰＥＩ濃度範囲は、０．００００１〜２０ｎＭ、０．０００１〜２０ｎＭ  又は０．０００１〜５ｎＭである。
【００３６】
典型的には、比較的高分子量のＰＥＩは、比較的低分子量のＰＥＩよりも低い濃度で有効であることが認められる。そこで、
−比較的高いＭｗ、例えば２０〜１０００ｋＤａの範囲内のＰＥＩを使用する場合は、Ｍｗに基づき０．００１〜５ｎＭのＰＥＩの濃度が好ましい。比較的低いＭｗ、例えば３００Ｄａ〜１０ｋＤａの範囲内のＰＥＩを使用する場合は、０．０００１〜１０μＭのＰＥＩの濃度が好ましい。
−比較的高いＭｎ、例えば２０〜１０００ｋＤａの範囲内のＰＥＩを使用する場合は、Ｍｎに基づくＰＥＩの濃度は、好ましくは０．００１〜１００ｎＭである。比較的低いＭｎ、例えば１Ｄａ〜１０ｋＤａの範囲内のＰＥＩを使用する場合は、０．０００１〜１０μＭのＰＥＩの濃度を使用する。
【００３７】
一実施形態では、ウイルス粒子と最初に接触させる保存混合物は、２μＭ未満のＭｎに基づく濃度のＰＥＩ、及び少なくとも０．１Ｍ、少なくとも０．２Ｍ、少なくとも０．３Ｍ、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．７５Ｍ、少なくとも０．９Ｍ、少なくとも１Ｍ又は少なくとも２Ｍの濃度の１又はそれ以上の糖類の溶液を含む。
【００３８】
１又はそれ以上の糖類の溶液が２又はそれ以上の糖類を含むとき、ＰＥＩの最も有効な濃度は、保存混合物中で使用される糖の特定のタイプに依存する。例えば、２又はそれ以上の糖類の一方がスクロースであり、他方がスタキオースであるとき、２μＭ未満のＭｎに基づく濃度、特に０．０２５ｎＭ〜２μＭの濃度のＰＥＩが保存に有効である。好ましい実施形態では、本発明の方法は、(ｉ) 糖類の一方がスクロースであり、他方がスタキオースである、１又はそれ以上の糖類、及び(ｉｉ) ２μＭ未満のＭｎに基づく濃度のＰＥＩの水溶液とウイルス粒子を混合することを含む。
【００３９】
２又はそれ以上の糖類の水溶液がスクロースとラフィノースの水溶液を含むとき、ＰＥＩの好ましい濃度は、２μＭ未満、又は０．００２５ｎＭ〜２μＭの範囲内であることが認められる。それ故さらなる実施形態では、本発明の方法は、(ｉ) スクロースとラフィノース、及び(ｉｉ) ０．００２５ｎＭ〜２μＭの濃度のＰＥＩ、の水溶液とウイルス粒子を混合することを含む。好ましくは、比較的高分子量、例えばＭｎに基づき１０〜１００ｋＤａのＰＥＩを使用するとき、Ｍｎに基づくＰＥＩの濃度は０．１〜１００ｎＭである。
【００４０】
保存混合物において２つの糖類の組合せを使用するが、本発明者らは、これらの糖類の異なるモル濃度比がウイルス粒子の保存に及ぼす影響を検討した。ある糖の別の糖に対する特定モル濃度比が特に有効であったが、正確な比率は使用する糖のタイプに依存した。それ故、２又はそれ以上の糖類の１つがスクロースを含む、本発明の一実施形態では、スクロースの濃度対その他の糖の濃度は、３：７〜９：１のモル濃度比、好ましくは少なくとも４：６、少なくとも５０：５０、少なくとも６：４、少なくとも７：３、少なくとも  ８：２又は少なくとも９：１の比率である。スクロースとスタキオースの場合は、少なくとも３：７、少なくとも４：６、少なくとも５０：５０、少なくとも６：４、少なくとも７：３、少なくとも３：１、少なくとも８：２又は少なくとも９：１のスクロース：スタキオースのモル濃度比は、特に有効な保存を示した。好ましくは、２又はそれ以上の糖類の溶液は、５０：５０〜８：２のモル濃度比のスクロース及びスタキオースの溶液を含む。
【００４１】
さらなる実施形態では、本発明の保存混合物は、(ｉ) 糖類の１つがスクロースであり、スクロースの濃度対その他の糖の濃度が３：７〜９：１のモル濃度比である２又はそれ以上の糖類、及び(ｉｉ)１００ｎＭ未満の濃度又は０．０２５〜１００ｎＭのＭｎに基づく濃度のＰＥＩ、の水溶液を含む。
【００４２】
保存
本発明の保存手法は、ウイルス粒子の乾燥及び凍結並びに熱的課題（thermal challenge）からの保存に特に適する。ウイルス粒子の保存は、本発明の保存混合物と混合したウイルス粒子を乾燥することによって達成される。乾燥したとき、無定形固体が結成される。「無定形」とは、構造化されておらず、観測し得る規則的又は反復的な組織を持たない分子の状態（すなわち非晶質）を意味する。
【００４３】
典型的には、乾燥は、凍結乾燥、スナップ凍結、真空乾燥又は噴霧乾燥によって達成される。凍結乾燥が好ましい。物質から水を除去し、バイアル中に物質を密閉することにより、物質を容易に貯蔵し、輸送し、後でそのもとの形態に再構成することができる。
【００４４】
凍結乾燥は、典型的には腐敗しやすい物質を保存するため又は物質をより輸送しやすくするために用いられる脱水工程である。凍結乾燥は、固体タンパク質及びワクチン医薬品を製造するための鍵となる工程である。しかし、生物学的物質は、その手順の間凍結と乾燥の両方のストレスを受け、それらのストレスはタンパク質をアンフォールディング又は変性し得る。さらに、凍結された生物学的物質からの水蒸気拡散の割合は非常に低いので、この工程は時間がかかる。本発明の保存手法は、生物学的物質が凍結乾燥手順の乾燥及び／又は熱ストレスから保護されることを可能にする。
【００４５】
この手法には３つの主要な段階、すなわち凍結、一次乾燥及び二次乾燥の段階がある。凍結は、典型的には凍結乾燥機を用いて実施される。この工程では、生物学的物質を、物質の固相と液相が共存することができる最低温度である、その共融点未満に冷却することが重要である。これにより、後に続く工程で融解ではなく昇華が確実に起こるようになる。あるいは、無定形物質は共融点を持たないが、臨界点を有しており、生成物は、一次及び二次乾燥の間の再融解又は崩壊を防ぐために臨界点未満に維持されねばならない。
【００４６】
一次乾燥の間は、圧を低下させ、水分を昇華させるために材料に十分な熱を供給する。必要な熱の量は、昇華する分子の昇華の潜熱を用いて算定することができる。物質中の水分の約９５％がこの段階で昇華する。過剰な熱は生物学的物質を分解する又はその構造を変化させることがあるので、一次乾燥は緩やかでよい。圧を制御するため、昇華を促進する部分的真空を適用する。低温コンデンサーチャンバー及び／又はコンデンサープレートは、水蒸気がその上で再凝固するための表面を提供する。
【００４７】
二次乾燥工程では、凍結工程の間に吸着した水分子が昇華する。水分子と凍結した生物学的物質の間で形成された何らかの物理化学的相互作用を破壊するために一次乾燥段階よりも高い温度にする。典型的には、昇華を促進するために圧も低下させる。凍結乾燥工程の完了後、通常は不活性ガス、例えば窒素で真空を破った後、物質を密封する。
【００４８】
一実施形態では、混合物を凍結する、例えばスナップ凍結することによって乾燥が達成される。「スナップ凍結」という用語は、例えば生成物を液体窒素中に浸漬することによって達成されるような実質的な瞬間凍結を意味する。一部の実施形態では、１〜２秒未満で完了する凍結工程を指す。
【００４９】
ある実施形態では、乾燥は、約１３００Ｐａでの真空乾燥を用いて実施される。しかし、真空乾燥は本発明にとって必須ではなく、他の実施形態では、ウイルス粒子と接触させる保存混合物を遠心する（すなわち回転乾燥）か又は凍結乾燥する（以下でさらに説明する）。有利には、本発明の方法は、ウイルス粒子を含む保存混合物を真空することを含む。好都合には、真空は２０，０００Ｐａ又はそれ以下、好ましくは１０，０００Ｐａ又はそれ以下の圧で適用される。有利には、真空は少なくとも１０時間、好ましくは１６時間又はそれ以上の期間適用される。当業者に公知のように、真空適用の期間は、試料の大きさ、使用する機械装置及び他のパラメータに依存する。
【００５０】
もう１つの実施形態では、乾燥は、本発明の保存混合物と混合したウイルス粒子を噴霧乾燥することによって達成される。この手法は当業者に周知であり、液体供給物を高温のガス、例えば空気、無酸素ガス又は窒素を通して乾燥する方法を含む。液体供給物を霧化して液滴のスプレーにする。次に液滴を乾燥チャンバーにおいて高温ガスと接触させることによって乾燥する。
【００５１】
保存混合物と混合すれば、冷蔵温度より高い、例えば約４℃〜約４５℃の範囲内の温度、又は冷蔵温度より低い、例えば約０℃〜−７０℃又はそれ以下の範囲内の温度での長期的な保存を提供するために試料を様々な残留含水量まで乾燥することができる。
【００５２】
本発明の方法を使用して、ウイルス粒子と保存混合物の混合物を乾燥して無定形固体マトリックスを形成する。本発明の一実施形態では、無定形固体は乾燥粉末形態で得られる。無定形固体は、自由流動性粒子の形態を取り得る。
【００５３】
しかし、本発明の方法のさらなる実施形態では、ウイルス粒子を含む混合物は固体支持体上に乾燥される。固体支持体は、ビーズ、試験管、マトリックス、プラスチック支持体、マイクロタイター皿、マイクロチップ（例えばシリコン、シリコンガラス又は金チップ）、又は膜を含み得る。もう１つの実施形態では、本発明の方法に従って保存されるウイルス粒子がその上に乾燥又は付着される固体支持体が提供される。
【００５４】
本発明は、（ｉ）１又はそれ以上の糖類及び（ｉｉ）ＰＥＩ、の水溶液を含有する賦形剤を含むキットを提供する。好ましくは、キットは、獣医学又は薬学的目的に適するさらなる賦形剤、担体又は希釈剤を含む。投与のための指示書も提供され得る。キットはまた、本発明の保存されたウイルス粒子の患者又は標的細胞への送達に適する補助物質、例えばアジュバント、硬化剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化剤、増粘添加物又は着色剤を含み得る。
【００５５】
ウイルス粒子に関する保存とは、乾燥、凍結、０℃未満、−５℃未満、−１０℃未満、−１５℃未満、−２０℃未満又は−２５℃未満の温度、凍結乾燥、室温、−１０℃を超える、−５℃を超える、０℃を超える、５℃を超える、１０℃を超える、１５℃を超える、２０℃を超える、２５℃を超える又は３０℃を超える温度の条件への暴露下での、物理的分解及び／又は生物活性の損失、例えば核酸又はタンパク質の分解、形質導入効率の損失、ウイルス感染性の損失、免疫原性の損失、ウイルス力価の損失又はワクチン効力の損失に対するウイルス粒子の抵抗性を指す。好ましくは、本発明による保存は、凍結保護（凍結損傷に対する保護）、凍結乾燥保護（lyoprotectant）（乾燥に対する保護）及び／又は熱保護（４℃より高い又は低い温度に対する保護）を含む。
【００５６】
ウイルス粒子の保存の測定
本発明に従ったウイルス粒子の保存は、パラメータ、例えばウイルス感染性、免疫原性、トランスフェクション率、ウイルス力価及び宿主細胞応答の評価によって測定できる。そのような手法は当業者に周知である。
【００５７】
ウイルス感染性及び／又は免疫原性を検定する方法は当業者に周知であり、細胞培養におけるウイルスの増殖、血液中のウイルス特異的抗体の検出、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞応答を惹起する能力、ウイルス抗原の検出、ウイルスをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡの検出、又は顕微鏡を用いたウイルス粒子の観察を含むが、これらに限定されない。
【００５８】
さらに、ウイルスの存在は宿主細胞に形態学的変化を生じさせ、これを測定してウイルス活性の指標を示すことができる。検出可能な変化、例えばウイルス感染に起因する宿主細胞における変化は細胞変性効果として知られる。細胞変性効果は、細胞の円形化、方向感覚喪失（disorientation）、膨張又は収縮、死滅及び表面からの剥離から成り得る。多くのウイルスは、ＴＵＮＥＬ（ターミナルウリジンデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識）(Terminal uridine deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling)アッセイなどの手法及び当業者に周知の他の手法によって測定可能な、感染細胞におけるアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導する。
【００５９】
ウイルスはまた、宿主細胞遺伝子の発現の調節にも影響を及ぼすことがあり、これらの遺伝子を分析してウイルス活性が存在するか否かの指標を示すことができる。そのような手法は、ウイルス発現産物との酵素反応又は化学反応を完了させるための細胞培養への試薬の添加を含み得る。さらに、ウイルス感染性の検出を高めるためにウイルスゲノムを修飾し得る。例えば、位相差顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査又は放射線イメージングによって容易に検出できるマーカーを発現するようにウイルスゲノムを遺伝的に修飾し得る。マーカーは、比色反応又は放射標識反応に関与し得る、発現される蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）又は発現される酵素であり得る。マーカーはまた、試験する細胞の特定機能を妨げる又は阻害する遺伝子産物であり得る。
【００６０】
ウイルス感染性を測定するため及びウイルス力価を示すためにプラーク形成単位についてのアッセイが使用できる。このアッセイでは、適切な宿主細胞を、それらがプラスチック底又は皿を覆う細胞の単層を形成するまで、平らな表面で増殖させる。特定宿主細胞の選択はウイルスのタイプに依存する。適切な宿主細胞の例は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、１０Ｔ１／２、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ、ＢＳＣ  １、ＢＳＣ  ４０、ＢＭＴ  １０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、２９３、Ｂ−５０、３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ−２、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ細胞を含むが、これらに限定されない。次に、宿主細胞の単層をウイルス粒子に感染させる。感染の結果として生成されたウイルス粒子がそれらの産生部位から遠くに移動できないように、液体培地を半固体培地と交換する。ウイルス粒子が細胞に感染し、複製して、その後その細胞を死滅させたとき、プラークが形成される。プラークは、細胞変性効果を示す、例えば顕微鏡下で他の細胞よりも丸く、濃く見える、又は肉眼で目視したとき白色の点として見える単層内の細胞の領域を指す；プラークの中心には、ウイルスが誘導する溶解のための細胞が存在しないことがある。新たに複製したウイルスは周囲の細胞に感染し、それらをも死滅させる。この過程が数回反復され得る。細胞を、その後、生細胞だけを染める染料、例えばメチレンブルーで染色する。プラーク内の死細胞は染まらず、着色した背景上の非染色領域として見える。
【００６１】
各々のプラークは、１個のウイルスによる１個の細胞の感染及びそれに続くそのウイルスの複製と拡大の結果である。しかし、細胞を死滅させないウイルスはプラークを形成しないことがある。プラークは、細胞変性効果を示す、例えば顕微鏡下で他の細胞よりも丸く、濃く見える、又は肉眼で目視したとき白色の点として見える単層内の細胞の領域を指す；プラークの中心には、ウイルスが誘導する溶解のための細胞が存在しないことがある。ウイルス力価の指標は、「プラーク形成単位」（ＰＦＵ）を測定することによって示される。ＰＦＵとは、プラークを生じさせる１個のウイルス又はウイルスの群を指す。例えば、ウイルス保存溶液が１０００ｐｆｕ／ｍｌを有する場合、それは、この保存溶液のｍｌ当たりに、プラークを形成することができる１０００個のウイルス粒子が存在することを意味する。本発明に従って保存された生物学的物質の試料においてウイルス感染性のレベルを測定し、対照試料、例えば新たに採取されたウイルス又は本発明の保存混合物を添加せずに乾燥及び／又は熱変化に供された試料と比較することができる。
【００６２】
典型的には、本発明に従って保存し、生じた生成物を３７℃で５日間インキュベートした後のウイルス力価は、そのようなインキュベーションの前又は、実際には本発明に従った保存とそのようなインキュベーションの前のウイルスの力価の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％である。
【００６３】
本発明のウイルス粒子の一部のタイプ、例えばウイルスタンパク質、ＶＬＰ又は一部の不活化ウイルスは、プラークアッセイにおいてプラークを形成する能力を持たない。この場合は、他の方法、例えば当業者に周知である免疫原性を測定するための方法によって保存を測定できる。例えば、抗体又は細胞媒介性宿主免疫応答を測定するためのｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは当分野で公知であり、本発明における使用に適する。例えば、抗体に基づく免疫応答は、本発明の保存されたウイルス粒子を用いた免疫の前後に、動物モデルにおける血清抗体の量、アビディティ及びアイソタイプ分布を比較することによって測定し得る。
【００６４】
本発明の保存されたウイルス粒子の用途
ワクチン
本発明の保存されたウイルス粒子はワクチンとして使用し得る。例えば、保存されたウイルス粒子、例えば全死滅ウイルス、生弱毒化ウイルス、化学的不活化ウイルス、ＶＬＰ又は生ウイルスベクターは、ワクチンとしての使用に適する。ワクチンとして、本発明の保存されたウイルス粒子は、多くの状態、例えばウイルス感染、ウイルス誘発の毒性を含むがこれに限定されないウイルス感染の続発症、癌及びアレルギーを含むがこれらに限定されない状態の治療又は予防のために抗原として又はウイルスタンパク質などの抗原をコードするために使用し得る。そのような抗原は、宿主の免疫系を刺激して体液性及び／又は細胞性抗原特異的応答を生じさせる１又はそれ以上のエピトープを含む。
【００６５】
本発明の保存されたワクチンは、ウイルス、例えばヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＨＩＶ、ＨＳＶ２／ＨＳＶ１、インフルエンザウイルス（Ａ、Ｂ及びＣ型）、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ＲＳＶウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、エンテロウイルス、アストロウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、ｅｐｓｔｅｉｎ−ｂａｒｒウイルス、アデノウイルス、風疹ウイルス、ヒトＴ細胞リンパ腫Ｉ型ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、ポックスウイルス及びワクシニアウイルスによる感染を治療するために使用し得る。ワクチンはさらに、数多くの獣医学的疾患、例えば口蹄疫（血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、ＳＡＴ−Ｉ、ＳＡＴ−２、ＳＡＴ−３及びＡｓｉａ−１を含む）、コロナウイルス、ブルータングウイルス、ネコ白血病ウイルス、鳥インフルエンザ、ヘンドラ及びニパーウイルス、ペスチウイルス、イヌパルボウイルス及びウシウイルス性下痢ウイルスに対する適切な免疫応答を与えるために使用し得る。一実施形態では、ワクチンは、サブユニット、結合型又は多価ワクチンである。例えば、本発明の保存されたワクチンは、２又はそれ以上の異なる型のウイルス、例えば麻疹、耳下腺炎及び風疹ウイルスによる感染を治療するために使用し得る（例えばＭＭＲワクチン）。
【００６６】
本発明のワクチン組成物は、１又はそれ以上の糖類とＰＥＩを含む保存混合物と混合したウイルス粒子を含有する。ワクチン組成物は、適切な緩衝剤及び添加物、例えば抗生物質、アジュバント又は免疫系の特定細胞に対するワクチン抗原の提示を促進する他の分子をさらに含み得る。
【００６７】
当分野で周知の様々なアジュバントが、ワクチンの効力を高めるため及び／又は体液性及び細胞性免疫応答を調節するために使用できる。適切なアジュバントは、水中油型エマルジョンを含有するアジュバント又は油中水型アジュバント、例えば鉱物油、アルミニウムベースのアジュバント、スクアレン／リン酸ベースのアジュバント、フロイント完全／不完全アジュバント、サイトカイン及びワクチンの有効性を高めるための免疫刺激剤として働く何らかの他の物質を含むが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明のワクチン組成物は、適切な保存を提供し、製剤の貯蔵寿命を最大化するために凍結乾燥形態であり得る。これは、長期間にわたるワクチンの備蓄を可能にし、免疫原性、効力及び効果を維持するのを助ける。本発明の保存混合物は、凍結乾燥プロトコールの間に起こる乾燥及び熱ストレスに対してウイルス物質を保護するのに特に適する。それ故、保存混合物は、試料を採取した直後及び凍結乾燥手順に供する前にウイルス又はウイルス粒子に添加するのに適する。
【００６９】
本発明に従って調製したワクチンの保存を測定するために、当業者に周知の手法を用いてワクチンの効力を測定することができる。例えば、細胞性又は体液性免疫応答の生成を、抗体の産生又はワクチンに対する免疫細胞応答を観測することにより、適切な動物モデルにおいて試験することができる。本発明の方法に従って調製したワクチン試料が免疫応答を惹起する能力を、同じ保存手法に供していないワクチンと比較してもよい。
【００７０】
ウイルスベクター
本発明の方法に従って保存されたウイルス又はウイルスベクターは、異種遺伝子又は他の拡散配列を標的細胞に導入するために使用できる。適切には、異種配列（すなわち導入遺伝子）は、標的細胞において発現され得るタンパク質又は遺伝子産物をコードする。適切な導入遺伝子は、所望レポーター遺伝子、治療用遺伝子及び免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子（ワクチンとして使用するため）を含む。遺伝子発現不全に関連する疾患の治療又は予防のためのアプローチである遺伝子治療は、細胞内への治療用遺伝子の挿入、それに続く必要なタンパク質の発現と生産を含む。このアプローチは、損傷した遺伝子の置換又は望ましくない遺伝子の発現の阻害を可能にする。特に、保存されたウイルス又はウイルスベクターは、治療用導入遺伝子又は免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を患者に導入するために遺伝子治療において使用し得る。
【００７１】
好ましい実施形態では、保存されたウイルス粒子は生ウイルスベクターである。「生ウイルスベクター」とは、標的種に対して非病原性又は低病原性であり、他のウイルス又は微生物に対する保護免疫応答を刺激する抗原をコードする１又はそれ以上の遺伝子、レポーター遺伝子及び治療用タンパク質が挿入されている生ウイルスベクターを意味する。特に、核酸は、まだ複製することができ、それにより挿入核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現するように、及びワクチンの場合には、感染宿主動物において免疫応答を惹起するように、ウイルスベクターに導入される。一実施形態では、生ウイルスベクターは、弱毒化生ウイルスベクターである、すなわち野生型ウイルスよりもビルレントでない（疾患を引き起こさない）ように改変されている。
【００７２】
組換えウイルスを潜在的ワクチンとして使用することの根拠には、病原性生物からの特定遺伝子の、非病原性又は弱毒化ウイルスのゲノムへの組込みが含まれる。組換えウイルスは、その後、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで特定真核細胞に感染して、それらに組換えタンパク質を発現させることができる。
【００７３】
疾患生物からの配列をコードする遺伝子の挿入によって誘導される生ウイルスベクターワクチンは、生弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、サブユニット又はＤＮＡアプローチに比べて好ましいと考えられる。生ウイルスベクターの最も重要な安全性特徴の１つは、受容者が、疾患の病原因子自体には暴露されることなく病原性生物からの特異的抗原に対して免疫され得ることである。安全性は、宿主に対して弱毒化されているウイスルベクターか又は対象とする異種抗原をまだ発現することができるが宿主内で複製することができないウイルスベクターのいずれかを選択することによってさらに調節される。標的種において安全性の歴史を有するワクチン株はさらなる安全性特徴を提供する。ベクターが必須遺伝子を欠失しているいくつかの系が開発されており、欠けている機能を提供する細胞系においてワクチンが調製される。
【００７４】
様々なベクター、例えばレトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスベクターが、標的細胞への異種遺伝子の送達のために使用できる。対象とする異種遺伝子をウイルスベクターに挿入し得る。本発明のウイルスベクターは、例えば、複製起点、場合により異種遺伝子の発現のためのプロモーター及び場合によりプロモーターの調節因子を備えたウイルスベクターを含み得る。例えば、本発明の実施において有用なアデノウイルスは、Ｅ１及び／又はＥ３及び／又はＥ４領域に欠失を有し得るか、又はさもなければ異種ＤＮＡを受け入れるために最大化され得る。
【００７５】
ウイルスベクターは、対象とする異種遺伝子に作動可能に連結された他のウイルス核酸配列と共に、構成的プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、アデノウイルスプロモーター、例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、ＨＳＶプロモーター（例えばＨＳＶ  ＩＥプロモーター）、ＨＰＶプロモーター、例えばＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）又はラウス肉腫ウイルスプロモーターを含み得る。組織特異的又は誘導的プロモーターも、対象異種遺伝子の発現を制御するために使用できる。プロモーターはまた、そのために発現が設計される宿主細胞と適合性であるように選択され得る。
【００７６】
ウイルスベクターはまた、他の転写調節エレメント、例えばエンハンサーを含み得る。エンハンサーは、広くは、プロモーター／遺伝子配列に作動可能に連結されたとき、その遺伝子配列の転写を高める、シス作用性因子と定義される。エンハンサーは、他の発現制御エレメント（例えばプロモーター）に比べて対象配列からはるかに離れた位置から機能することができ、対象配列に対していずれの方向に位置するときでも作動し得る。エンハンサーは、多くのウイルスソースから、例えばポリオーマウイルス、ＢＫウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、モロニー肉腫ウイルス、ウシパピローマウイルス及びラウス肉腫ウイルスから同定されている。適切なエンハンサーの例は、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター、及びヒト又はマウスＣＭＶに由来するエレメント、例えばＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメントを含む。
【００７７】
対象異種遺伝子を含むウイルスベクターは、その後、貯蔵、凍結乾燥などのさらなる保存手法に供すること、又は患者若しくは宿主細胞への投与の前に、本発明の方法に従って保存され得る。
【００７８】
抗ウイルス活性を示すことが公知のポリペプチドをコードする核酸、免疫調節分子、例えばサイトカイン（例えばＴＮＦ−α、インターフェロン類、例えばＩＬ−６及びＩＬ−２、インターフェロン類、コロニー刺激因子、例えばＧＭ−ＣＳＦ）、アジュバント、共刺激分子及び補助分子も本発明のウイルスベクターに含まれ得る。あるいは、そのようなポリペプチドは、別途に、例えば本発明の保存混合物中で提供され得るか又は本発明のウイルスベクターと同時に、連続的に又は別々に投与され得る。
【００７９】
好ましくは、本発明の保存されたウイルスベクターは、当分野で公知の様々なウイルス手法を用いて、例えば、組換えウイルスベクター、例えばレトロウイルス、単純ヘルペスウイルス及びアデノウイルスによる感染を用いて適切な宿主細胞に導入され得る。好ましくは、対象遺伝子を含む本発明の保存されたウイルスベクターの投与は、標的細胞のウイルス感染によって媒介される。
【００８０】
数多くのウイルスに基づく系が、哺乳動物細胞をトランスフェクトするために開発されている。
【００８１】
例えば、当分野で公知の手法を用いて選択した組換え核酸分子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子としてパッケージングすることができる。次に組換えウイルスを単離し、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで被験者の細胞に送達することができる。レトロウイルスベクターはモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）に基づき得る。レトロウイルスベクターでは、ウイルス遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）の１又はそれ以上が一般に対象遺伝子で置換される。
【００８２】
多くのアデノウイルスベクターが公知である。アデノウイルスサブグループＣ血清型２及び５がベクターとして一般的に使用される。野生型アデノウイルスゲノムは約３５ｋｂであり、そのうち３０ｋｂまでが外来性ＤＮＡで置換できる。
【００８３】
調節機能を有する４つの初期転写単位（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４）、及び構造タンパク質をコードする１つの転写産物が存在する。アデノウイルスベクターは、Ｅ１及び／又はＥ３遺伝子を不活性化し得る。次に、欠けている遺伝子をヘルパーウイルス、プラスミドによってイントランスで供給し得るか又はヘルパー細胞ゲノムに組み込み得る。アデノウイルスベクターは、Ｅ２ａ温度感受性突然変異体又はＥ４欠失を利用し得る。最小アデノウイルスベクターは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）及び導入遺伝子の周囲のパッケージング配列だけを含み得るが、必要なウイルス遺伝子はすべて、ヘルパーウイルスによってイントランスで提供される。それ故、適切なアデノウイルスベクターは、Ａｄ５ベクター及びサルアデノウイルスベクターを含む。
【００８４】
ウイルスベクターはまた、ワクシニアウイルス及び鳥ポックスウイルス、例えば鶏痘ウイルスワクチンを含む、ポックスファミリーのウイルスに由来し得る。例えば、修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）は、正常ヒト組織を含む大部分の細胞型において複製しないワクチンウイルスの株である。それ故、組換えＭＶＡベクターは、本発明のポリペプチドを送達するために使用し得る。
【００８５】
付加的な種類のウイルス、例えばアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）も、適切なベクター系を開発するために使用し得る。
【００８６】
賦形剤
本発明では、ウイルス粒子の保存のための賦形剤も提供される。賦形剤は、（ａ）スクロース、スタキオース、トレハロース、糖アルコール若しくはラフィノース又はそれらの何らかの組合せ；及び（ｂ）５Ｍ又はそれ以下のＭｎに基づく濃度のＰＥＩを含む。「賦形剤」とは、本発明のウイルス粒子のための担体として使用される（例えばウイルス粒子をワクチンとして使用するとき）不活性物質を意味する。典型的には、ウイルス粒子（例えばワクチンとしての使用のため）は、ウイルス粒子の防腐剤として働く及び／又は一部の状況では身体への投与と吸収を助ける、賦形剤に溶解されるか又は賦形剤と混合される。本発明の保存混合物だけでなく、賦形剤はまた、他の防腐剤、例えば当分野で周知の抗酸化剤、潤滑剤及び結合剤を、それらの成分が本発明の保存混合物の有効性を有意に低下させない限り、含有してもよい。
【００８７】
固体支持体上での検定
固体支持体上で貯蔵される保存されたウイルス粒子は、診断のため又はワクチン接種レジームを観測するために使用し得る。例えば、患者試料、例えば体液（血液、尿、唾液、粘液、胃液等）を、患者試料と本発明の保存混合物を含む混合物を固体支持体上に乾燥することにより、本明細書で述べる方法に従って保存し得る。保存された患者試料は、その後、抗ウイルス抗体を使用して試料中のウイルス抗原／エピトープの存在に関して試験し得る（例えばＥＬＩＳＡを用いて）。あるいは、対象とするウイルス粒子を、ウイルス粒子と本発明の保存混合物を含む混合物を固体支持体上に乾燥することにより、本明細書で述べる方法に従って保存し得る。対象とするウイルス粒子が付着している固体支持体と患者試料を接触させることにより、患者試料を抗ウイルス抗体の存在に関して試験し得る。抗原−抗体複合体の形成は、測定可能なシグナルを惹起することができる。試料中のウイルス粒子抗原−抗体複合体の存在及び／又は量を使用して、患者におけるウイルス感染の存在又はワクチン接種レジームの進行を指示し得る。
【００８８】
投与
本発明における保存されたワクチン又はウイルス粒子は、一部の場合には凍結乾燥製品の再構成後に、様々な公知の経路及び手法を用いてｉｎ ｖｉｖｏで被験者に投与し得る。例えば、保存されたワクチンは、注射用溶液、懸濁液又はエマルジョンとして提供でき、従来の針と注射器を用いた非経口的、皮下、経口、表皮、皮内、筋肉内、動脈内、腹腔内静脈内注射によって、又は液体噴流注入システム（liquid jet injection system）を用いて投与できる。保存されたワクチンは、皮膚又は粘膜組織に局所的に、例えば経鼻、髄腔内、経腸、舌下、経直腸又は経膣的に投与され得るか、又は呼吸器又は肺投与に適する微細に分割されたスプレーとして提供され得る。
【００８９】
一実施形態では、本発明の方法は、混合物を、液体注射剤としての投与に適した製剤に加工する工程をさらに含む。好ましくは、本発明の方法は、混合物を、経口摂取による又は肺経路による投与に適した製剤に加工する工程をさらに含む。
【００９０】
保存された製品は、投与製剤と適合性であり、且つ予防的及び／又は治療的に有効である量で被験者に投与される。本発明の保存された製品又はワクチンは、「予防」又は「治療」を目的とし得る。本明細書において使用される、「治療的（therapeutic）」又は「治療（treatment）」という用語は以下のいずれかを含む。感染又は再感染の予防；症状の軽減又は排除；及び病原体の低減又は完全な排除。治療は、予防的に（感染前）又は治療的に（感染後）実施され得る。
【００９１】
以下の実施例は本発明を説明する。実施例１、２、３、４、５、６、７、８及び１０で使用したＰＥＩは、７５００００のＭｗ及び６００００のＭｎを有していた（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３１４３）。実施例９で使用した「高分子量」ＰＥＩは、７５００００のＭｗ及び６００００のＭｎを有していた（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３１４３）。実施例９の「低分子量」ＰＥＩは、１３００のＭｗ及び１２００のＭｎを有していた（Ａｌｄｒｉｃｈ  ４８２５９５）。実施例で使用したヒストンは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍより入手したヒストン２Ａであった。
【００９２】
以下の一般的実験手法を用いた。
【００９３】
凍結乾燥
ボルテックス撹拌後、水３０ｍｌの入った、ゴム栓がその中に部分的に浸されている状態の凍結乾燥機トレイで、バイアルを−８０℃で凍結した。凍結したバイアルを、あらかじめ冷却しておいた凍結乾燥機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）の凍結乾燥機ストッパリングシェルフ（freeze dryer stoppering shelf）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に移し、１６時間乾燥させた。凍結乾燥機から取り出す前に真空下でゴム栓をバイアル内に十分押し下げた。
【００９４】
ＦＭＤＶアッセイ
ウイルスと細胞を、１０％ウシ胎仔血清、２０ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。イーグルオーバーレイ７５ｍｌ、リン酸トリプトンブロス５ｍｌ、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１ｍｌ並びにペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）１ｍｌに、水に溶解したｉｎｄｕｂｉｏｓｅ（２４ｍｇ／ｍｌ）２５ｍｌを添加することによってイーグルオーバーレイ培地を調製した。
【００９５】
ＢＨＫ−２１細胞を６穴組織培養プレートで調製し、約８０〜９０％の集密度まで３７℃で一晩増殖させた。凍結乾燥した試料をＤＭＥＭに再懸濁した。細胞単層をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＦＭＤＶ試料１００μｌと共に３７℃で１５分間インキュベートした。細胞単層をイーグルオーバーレイ２ｍｌに重ね、それを室温（ＲＴ）で固着させた後、３７℃でさらに４０〜４８時間インキュベートした。
【００９６】
感染細胞単層をメチレンブルー（ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒド）２ｍｌによりＲＴで２４時間染色し、目に見えたプラークを記録した。
【００９７】
アデノウイルスアッセイ
９６穴平底細胞培養皿（Ｊｅｎｃｏｎｓ，ＵＫ）にＨＥＫ  ２９３細胞を１０５細胞／ｍｌ（１００μｌ／穴）で接種し、３７℃、５％ＣＯ２を維持した。９０％の集密度に達した後、アデノウイルスと賦形剤を含むバイアルをＤＭＥＭ及び５％ＦＢＳ  １ｍｌ中で再構成した。次に、再構成したバイアルから１００ｍｌを取り、ＤＭＥＭ  ９００ｍｌに添加することによって１：１０の希釈工程を実施した。次に、生じた希釈ウイルス１００ｍｌをプレートの最初の列に添加し、プレートの下の列で１：２希釈を実施した。その後この工程を次の賦形剤で反復した。さらに４８時間後、蛍光顕微鏡を用いてウエル当たりのＧＦＰ細胞数を数えた。
【００９８】
統計解析
ＰＲＩＳＭ  Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウエアバージョン４．００を用いて異なる賦形剤の間の有意性を解析するためにスチューデントＴ検定を実施した。あるいは、ペアの複数比較が必要である場合は、Ｔｕｒｋｅｙ  ｐｏｓｔ比較検定と共に一方向ＡＮＯＶＡを実施した。Ｐ値の要約は、＊ｐ＜０．１０；＊＊ｐ＜０．０５；及び＊＊＊ｐ＜０．００５である。
【実施例１】
【００９９】
４．１×１０７ｐｆｕ／ｍｌ（組織培養培地１ｍｌ当たり）の力価で高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現する組換えアデノウイルスを、スクロース（飽和溶液、約６４％ｗ／ｖ）、スタキオース（飽和溶液、約６４％ｗ／ｖ）及びＰＥＩ（３３μｇ／ｍｌ）をそれぞれ３：１：１ｖ／ｖの比率で含む賦形剤と混合した（１：５ｖ／ｖ）。混合物を以下のように凍結乾燥した。試料を液体窒素中で凍結し、真空下に室温で１６時間乾燥した。この時間後、試料を使用時まで−２０℃で保存するか又は直ちに使用した。２９３Ａ細胞におけるプラークアッセイを用いてアデノウイルスを検定した。結果を以下の表に示す。
【表１】
2010521961.tif 000004
【実施例２】
【０１００】
この実験は、凍結乾燥（ＦＤ）し、室温（ＲＴ）で２４時間放置するか又は３７℃で４８時間熱処理した（ＨＴ）とき賦形剤成分がＦＭＤＶ−Ａの回復に及ぼす作用を検討するために設計した。すべての賦形剤をガラスバイアル中で調製した。すべてのバイアルを二組ずつ用意した。
【０１０１】
Ｓｕｃ（１ｇ／ｍｌ）の水溶液１７０μｌとＲａｆ（１ｇ／ｍｌ）の水溶液３０μｌを互いに添加して、合計２００μｌ容量の糖混合物にした。次に、ＰＥＩ（０．０３ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを添加して賦形剤を完成させた。最後に、ＦＭＤＶ−Ａ  ５０μｌを添加し、混合物をボルテックス撹拌した。賦形剤混合物中の各々の糖とＰＥＩの最終濃度を以下の表に示す。
【表２】
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【０１０２】
ＦＭＤＶ−Ａ  ５０μｌをＰＢＳ  ２５０μに添加して対照混合物を調製した。バイアルを凍結乾燥し、その後ＲＴで２４時間又は３７℃で４８時間放置した。次にＦＭＤＶアッセイを実施した。結果を図１に示す。結果は、賦形剤がＰＢＳ単独であるときにはウイルスの回復がほとんど存在しないことを明らかにする。Ｓｕｃ、Ｒａｆ及びＰＥＩを含む賦形剤はＲＴ又はＨＴで同様のＦＭＤＶの回復を示した。スチューデントＴ検定は、事実上、室温（ＲＴ）でのインキュベーションと３７℃で４８時間の熱処理（ＨＴ）の間で有意差を示さなかった。
【実施例３】
【０１０３】
この実験は、熱処理したＦＭＤＶ−ＯウイルスへのＰＥＩの有用性を検討するために設計した。Ｓｕｃ（３Ｍ）１２０μｌ、Ｓｔａｃ（０．７５Ｍ）８０μｌ及びＰＥＩ（１０−２ｍｇ／ｍｌ）又は蒸留水のいずれか５０μｌでガラスバイアルを二組調製した。ＦＭＤＶ−Ｏ  ５０μｌを各々の賦形剤バイアルに添加した。賦形剤混合物中の各々の糖及び、存在するときは、ＰＥＩの最終濃度を以下の表に示す。
【表３】
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【０１０４】
使用したウイルスの５０μｌ容量も、対照（もとの力価）として再凍結した。凍結乾燥後、試料を３７℃で２４時間又は６日間インキュベートした。試料をＤＭＥＭ  １ｍｌ（及び１０％ＦＢＳ）に再懸濁し、ウイルスの回復をプラークアッセイで測定した。結果を図２に示す。
【０１０５】
実施例３は、単に糖賦形剤単独である場合に比べて糖賦形剤にＰＥＩを含むことの追加的な利益を評価するために設計した。３７℃で２４時間の熱処理後、ＰＥＩを含む賦形剤を使用したときウイルスの回復の顕著な低下は存在しなかったが、糖賦形剤をＰＥＩなしで用いたときにはウイルスの回復が有意に低下した。熱処理の６日後、ＰＥＩを含む賦形剤を使用したときウイルスの損失が生じた。しかし、やはりこの損失は糖単独を含む賦形剤を用いたときの損失よりも有意に低かった。
【実施例４】
【０１０６】
ＦＭＤＶ−Ｏの回復における賦形剤等成分を最適化するために、初期糖濃度を検討した。１２０：８０のＳｕｃ（３Ｍ）対Ｓｔａｃ（０．７５Ｍ）比を有する糖溶液を調製し（「糖類」）、１：１０、１：１００、１：１０００の連続希釈を実施した。各々の糖濃度又はＰＢＳ  ２００μｌを含む三組のガラスバイアルを調製し、ＦＭＤＶ−Ｏ  ５０μｌを糖溶液又はＰＢＳに添加した。
【０１０７】
各々の糖の最終濃度を以下の表に示す。
【表４】
2010521961.tif 000007
【０１０８】
５０μｌ容量のウイルスも、対照（もとの力価）として再凍結した。試料を凍結乾燥し、３７℃で７日間インキュベートした後、ＤＭＥＭ  １ｍｌ（及び１０％ＦＢＳ）に再懸濁して、ウイルスの回復をプラークアッセイで測定した。結果を図３に示す。
【０１０９】
実施例４の目的は、糖濃度を希釈することの影響を調べることであった。凍結乾燥後、ウイルスの回復は、糖溶液を含む賦形剤ではもとの力価の約１０分の１に低下する。糖濃度を１：１０に希釈したとき、有意の回復は認められない。
【実施例５】
【０１１０】
実施例５は、ＦＭＤＶ−Ｏの回復のためのスクロース及びスタキオース濃度の最適な組合せの影響を検討するために設計した。Ｓｕｃ（３Ｍ）８０μｌとＳｔａｃ（０．７５Ｍ）１２０μｌからＳｕｃ  ２００μｌとＳｔａｃ  ０μｌまでの一連の糖比を調製した。ＰＥＩは、１：１００から１：３２０００まで１ｍｇ／ｍｌの一連の希釈で調製した。Ｈｉｓは、１ｍｇ／ｍｌから０．６２５ｍｇ／ｍｌまでの一連の希釈で調製した。ＦＭＤＶ−Ｏ  ５０μ、各々の糖比２００μｌ及び各々のＰＥＩ希釈５０μｌで試料のマトリックスを調製した。
【０１１１】
各々の糖とＰＥＩの最終濃度を以下の表に示す。
【表５】
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【０１１２】
試料を凍結乾燥し、３７℃で３日間（ＰＥＩ試料）又は２４時間（Ｈｉｓ試料）インキュベートした後、ＤＭＥＭ  １ｍｌ（及び１０％ＦＢＳ）に再懸濁し、ＦＭＤＶの回復をプラークアッセイで測定した。結果を図４−１及び４−２に示す。
【０１１３】
各々のＰＥＩ濃度についての結果を順に並べた。図４−１に示す結果は、１４０：６０比のＳｕｃ:Ｓｔａｃを含む賦形剤と比較して、スクロースだけの賦形剤を使用したとき有意に低い回復が見られたことを明らかにする。純粋なＳｕｃ賦形剤を別にして、Ｓｕｃ:Ｓｔａｃの種々の比率の間で有意差はなかった。
【０１１４】
図４−２は、賦形剤中のＨｉｓをＰＥＩに置き換えた同じ実験の結果を示す。結果は、最適Ｓｕｃ:Ｓｔａｃ比への影響を明らかにし、はるかに高い比率のＳｕｃが好ましく、Ｓｕｃ単独賦形剤の著明な悪影響は認められなかった。
【実施例６】
【０１１５】
この実施例では、ＧＦＰタグを有するアデノウイルスを使用して、種々の糖／ＰＥＩ濃度でのウイルスの回復を比較した。２００μｌの最終容量で一連の異なるＳｕｃ:Ｓｔａｃ比を調製した。０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．０１μｇ／ｍｌの濃度範囲のＰＥＩ  ５０μｌも、各バイアルに添加した。種々のＳｕｃ:Ｓｔａｃ：ＰＥＩ比へのアデノウイルスの添加後、バイアルを凍結及び凍結乾燥した。
【０１１６】
各々の糖とＰＥＩの最終濃度を以下の表に示す。
【表６】
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【０１１７】
３７℃で２４時間の熱処理後、賦形剤とウイルスをＤＭＥＭ  １ｍｌ（及び１０％ＦＢＳ）中で再構成した。２９３細胞の９０％集密単層を含む９６穴プレート中の２倍連続希釈を用いてウイルス力価を検定した。結果を図５に示す。
【０１１８】
初期最適化は、種々の濃度のマトリックスを用いて３つの変数：Ｓｕｃ濃度、Ｓｔａｃ濃度及びＰＥＩ濃度を検討した。マトリックスの結果は、糖濃度とＰＥＩ濃度の両方が著明にウイルスの回復を生じさせ得ることを明らかにする。Ｓｕｃに対して高濃度のＳｔａｃ又は高濃度のＰＥＩは、どちらも低レベルの回復を示した。ウイルスの最適の回復にはＳｕｃの存在が必要であった。Ｓｕｃを含まない試料は回復を示さなかった。
【実施例７】
【０１１９】
この実験の目的は、Ｓｕｃ:Ｓｔａｃ糖賦形剤中のＰＥＩ濃度を検討することであった。最適ＰＥＩ濃度を評価するためにＰＥＩの一連の１：１０希釈を調製した。糖濃度を最適化する作業から、１２０：８０のＳｕｃ:Ｓｔａｃ比を選択した。
【０１２０】
各々の糖とＰＥＩの最終濃度を以下の表に示す。
【表７】
2010521961.tif 000010
【０１２１】
凍結乾燥後、試料を３７℃で２４時間加熱処理し、その後アデノウイルスアッセイを実施した。結果を図６に示す。
【０１２２】
結果は、ＰＥＩをより高濃度で使用したとき低いウイルス回復が認められることを明らかにする。ＰＥＩをさらに希釈すると共にウイルスの回復が改善し、約０．０１μｇ／ｍｌが最適濃度である。この濃度での回復は、糖賦形剤だけを使用したウイルス回復よりも有意に高かった。ＰＢＳを含む賦形剤はウイルスの回復を示さなかった。
【実施例８】
【０１２３】
この実験は、凍結乾燥の間のウイルスの安定性に関して種々の賦形剤成分のより一層の理解を得るために設計した。
【０１２４】
各々の糖とＰＥＩの最終濃度を以下の表に示す。
【表８】
2010521961.tif 000011
【０１２５】
賦形剤とウイルスを含むバイアルを一晩凍結乾燥した。凍結乾燥後、バイアルを３７℃で５日間インキュベートした後、ＤＭＥＭ  １ｍｌ（１０％ＦＢＳ）に再懸濁した。次に、生じた溶液を１：１０００に希釈し、続いて一連の１：２希釈を実施した後、２９３アッセイに進んだ。結果を図７に示す。
【実施例９】
【０１２６】
実施例９は、高分子量ＰＥＩと低分子量ＰＥＩの間の差を調べるために設計した。高分子量ＰＥＩ（「ＨＰＥＩ」）は７５００００のＭｗを有し、低分子量ＰＥＩ（「ＬＰＥＩ」）は１３００のＭｗを有する。
【０１２７】
各々の糖とＰＥＩの最終濃度を以下の表に示す。
【表９】
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【０１２８】
賦形剤とアデノウイルスを含むバイアルを一晩凍結乾燥した。凍結乾燥後、バイアルを３７℃で５日間インキュベートした後、ＤＭＥＭ  １ｍｌ（１０％ＦＢＳ）に再懸濁した。次に、生じた溶液を１：１０００に希釈し、続いて一連の１：２希釈を実施した後、２９３アッセイに進んだ。結果を図８に示す。
【実施例１０】
【０１２９】
実施例１０は、ＰＥＩ（高分子量；Ｍｗ  ７５００００）をＰＢＳ（「ＰＥＩＰ」）又は水（「ＰＥＩＷ」）に希釈したときのアデノウイルスの回復の差を検討するために設計した。
【０１３０】
各々の糖とＰＥＩの最終濃度を以下の表に示す。
【表１０】
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【０１３１】
賦形剤とウイルスを含むバイアルを一晩凍結乾燥した。凍結乾燥後、バイアルを３７℃で５日間インキュベートした後、ＤＭＥＭ  １ｍｌ（１０％ＦＢＳ）に再懸濁した。次に、生じた溶液を１：１０００に希釈し、続いて一連の１：２希釈を実施した後、２９３アッセイに進んだ。結果を図９に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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