(57)【要約】  本発明は、医薬組成物の製造におけるコレステリルアミンの使用に関する。これらの医薬組成物は、感染性疾患、特にウイルス又は細菌によって引き起こされる疾患の医学的介入において使用されるためのものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式１：
【化６】
2010511648.tif 000015
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の１つは、Ｘ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｘ（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、Ｘ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｃ１−４アルキル）２及びＸ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｃ１−４アルキル）３＋から選択されるアミン含有基であり；
Ｘは、直接結合であるか又はＯＰ（Ｏ）（ＯＣ１−４アルキル）Ｏ、ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）ＣＨ２Ｏ及びＯＰ（Ｏ）（ＯＣ１−４アルキル）ＣＨ２Ｏから選択されるリン含有基であり；
Ｘが直接結合である場合、ｎは０から２の整数であり；Ｘがリン含有基である場合、ｎは２から６の整数であり；
Ｒ５がアミン含有基である場合、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立してＨ又はＯＨであり；そして
Ｒ６はＨであるか、又は、Ｘが直接結合であり、かつｎが１又は２である場合、Ｒ６はＯＨであってもよく；
2010511648.tif 000016
は単結合又は二重結合であり、
2010511648.tif 000017
が二重結合である場合、Ｒ４は存在せず；
Ｒ１がアミン含有基である場合、
Ｒ２及びＲ６は、独立してＨ又はＯＨであり；
Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はＨであり；そして
2010511648.tif 000018
は単結合であり；
Ｒ２がアミン含有基である場合、
Ｒ３及びＲ６は、独立してＨ又はＯＨであり；
Ｒ１、Ｒ４及びＲ５はＨであり；そして
2010511648.tif 000019
は単結合であり；
Ｒ３がアミン含有基である場合、
Ｒ２及びＲ６は、独立してＨ又はＯＨであり；
Ｒ１、Ｒ４及びＲ５はＨであり；そして
2010511648.tif 000020
は単結合である）
の化合物、又はその医薬的に許容される塩、誘導体、溶媒和物若しくはプロドラッグの、感染性疾患／感染性障害の治療、予防及び／又は改善のための医薬組成物の製造のための使用。
【請求項２】
2010511648.tif 000021
が単結合である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｒ５がアミン含有基であり、Ｘが直接結合であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が独立してＨ又はＯＨであり；Ｒ６がＨである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ５がアミン含有基であり、Ｘがリン含有基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が独立してＨ又はＯＨであり；そしてＲ６がＨである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】
式１の化合物が、以下の式１ａから１ｌ：
【化７】
2010511648.tif 000022
のいずれか１つの化合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
以下の式２：
【化８】
2010511648.tif 000023
（式中、
Ｙは、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１−４アルキル）又はＮ（Ｃ１−４アルキル）２＋であり；
ｐは０から２の整数であり；
ｑは１又は２の整数であり；そして
2010511648.tif 000024
は単結合又は二重結合である）
の化合物、又はその医薬的に許容される塩、誘導体、溶媒和物若しくはプロドラッグの、感染性疾患／感染性障害の治療、予防及び／又は改善のための医薬組成物の製造のための使用。
【請求項７】
ＹがＮＨである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ｐが０であり、かつｑが２である、請求項６又は７に記載の使用。
【請求項９】
式２の化合物が、以下の式２ａ及び２ｂ：
【化９】
2010511648.tif 000025
のいずれか１つの化合物である、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
前記感染性疾患／感染性障害が、ウイルス又は細菌によって引き起こされる、請求項１から９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型）、ロタウイルス、ＲＳウイルス、ヘルペトウイルス科（例えば単純ヘルペスウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）、エコーウイルス１型、麻疹ウイルス、ピコルナウイルス科（例えばエンテロウイルス属、コクサッキーウイルス）、フィロウイルス科（例えばエボラウイルス、マールブルグウイルス）、パピローマウイルス科及びポリオーマウイルス科から成る群より選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記細菌が、グラム陽性杆菌、グラム陽性球菌、グラム陰性杆菌及びグラム陰性球菌から成る群より選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
グラム陽性杆菌が、クロストリジウム種、炭疽菌、豚丹毒菌、リステリア菌、ノカルジア種、ジフテリア菌及びざ瘡プロピオンバクテリウムから成る群より選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
グラム陽性球菌が、黄色ブドウ球菌及び連鎖球菌種から成る群より選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
グラム陰性杆菌が、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリ、ブルセラ種、アエロモナス・ハイドロフィラ、赤痢菌種、ビブリオ種、ペスト菌、サルモネラ種、肺炎杆菌、バークホルデリア・セパシア、エンテロバクター種、緑膿菌、カンピロバクター・ジェジュニ及びレジオネラ・ニューモフィラ菌から成る群より選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
グラム陰性球菌が、淋菌及びモラクセラ・カタラリスから成る群より選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１７】
細菌が、ボレリア種、バルトネラ・クインターナ、肺炎クラミジア、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、らい菌、マイコバクテリウム・ウルセランス、マイコバクテリウム・カンサシイ、トリ型結核菌、パラ結核菌、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、リケッチア種及びトレポネーマ種から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１８】
化合物が式１ａ、１ｂ、１ｇ、１ｈ、１ｉ、１ｋ、１ｊ又は２ａを有し、医薬組成物がインフルエンザ感染の治療、予防及び／又は改善のためのものである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１９】
化合物が式１ａ、１ｆ、１ｈ、１ｉ、２ａ又は２ｂを有し、医薬組成物がマイコバクテリア誘発性疾患の治療、予防及び／又は改善のためのものである、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
前記マイコバクテリア誘発性疾患が、結核、らい、熱帯皮膚潰瘍、膿瘍、肺疾患、並びに皮膚及び播種性疾患から成る群より選択される、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物の製造におけるコレステリルアミンの使用に関する。これらの医薬組成物は、感染性疾患、特にウイルス又は細菌によって引き起こされる疾患の医学的介入において使用されるためのものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜を形成する脂質二重層は、その機構が数十年間にわたって生化学者及び生物物理学者による集中的な研究の対象となってきた二次元液体である。二重層のバルクは均質な液体であると考えられているが、二重層脂質の構造と力学についての我々のモデルに側方不均質性、脂質ミクロドメインを導入することが繰り返し試みられてきた(Glaser, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993), 475-481 ; Jacobson, Comments Mol. Cell Biophys. 8 (1992), 1-144; Jain, Adv. Lipid Res. 15 (1977), 1-60; Winchil, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993), 482-488)。
【０００３】
上皮細胞がそれらの細胞表面を頂部と側底部ドメインに分極させ、これらのドメインの各々に異なるタンパク質及び脂質組成物が存在するという認識は、「脂質ラフト」の概念へと導く新しい開発を始動させた(Simons, Biochemistry 27 (1988), 6197-6202; Simons, Nature 387 (1997), 569-572)。膜タンパク質のためのプラットフォームとして機能するスフィンゴ脂質とコレステロールの集合体（assemblies）の概念は、これらの集合体が界面活性剤抽出で可溶化されず、界面活性剤不溶性膜（detergent resistant membranes）、ＤＲＭと称される所見によって促進された(Brown, Cell 68 (1992), 533-544)。これは、ラフト結合を４℃でのトリトン−Ｘ１００抽出に対する抵抗性と等価とみなす操作上の突破口であった。界面活性剤不溶性の喪失を導く、メチル−β−シクロデキストリンを用いたコレステロールの枯渇(Ilangumaran, Biochem. J. 335 (1998), 433- 440; Scheiffele, EMBO J. 16 (1997), 5501-5508)という２番目の判定基準の追加は、当分野のいくつかのグループを広範囲の生物学的反応における脂質ミクロドメインの役割の研究へと促した。現在、細胞極性、タンパク質の輸送とプロセシング、並びにシグナル伝達を含む数多くの細胞プロセスを調節する上での脂質集合体の役割に対する裏付けがますます増加しつつある。
【０００４】
脂質ラフトは、細胞膜内で膜成分を分離するように機能する特殊な化学的組成の脂質プラットフォームである（細胞膜の外葉ではスフィンゴミエリンとコレステロールに富む）。ラフトは相対的に小さい（直径３０から５０ｎｍ、大きさの評価は使用するプローブ及び分析する細胞型に依存してかなり変動がある）ことが理解されているが、それらはある種の条件下で融合し得る。脂質組成に関するそれらの特異性は、不均質モデル膜系における相分離挙動を想起させる。
【０００５】
病原体、細菌、プリオン、ウイルス及び寄生生物のいくつかのグループは、宿主細胞に感染するというそれらの目的のために脂質ラフトを乗っ取る(Van der Goot, Semin. Immunol. 13 (2001), 89-97)。例えばインフルエンザウイルス、ＨＩＶ−１、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス（Respiratory syncytial virus）、フィロウイルス科（Filoviridae）ウイルス、例えばエボラウイルス（Ebolavirus）及びマールブルグウイルス（Marburgvirus)、パピローマウイルス科（Papillomaviridae）及びポリオーマウイルス科（Polyomaviridae）ウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（Epstein-Barr virus)、Ｃ型肝炎ウイルス、及びエコーウイルス１型（Echovirus 1）によって引き起こされるウイルス感染は、ラフト及び／又はラフトタンパク質を標的とする疾患である。さらに、大腸菌（Escherichia coli）、ヒト型及びウシ型結核菌（Mycobacterium tuberculosis and bovis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、破傷風菌（Clostridium tetani）、連鎖球菌種（Streptococci species）、サルモネラ属（Salmonella）及び赤痢菌属（Shigella）によって生じる細菌感染は、ラフトに関連する病的過程を含む(Simons, J. Clin. Invest. 110 (2002), 597-603)。
【０００６】
キャラクタリゼーションされた最初の例はインフルエンザウイルスであった(Scheiffele, J. Biol. Chem. 274 (1999), 2038-2044; Scheiffele, EMBO J. 16 (1997), 5501-5508)。このウイルスは２つの内在性糖タンパク質、赤血球凝集素とノイラミニダーゼを含み、どちらもコレステロール依存性界面活性剤不溶性によって判定されるようにラフト結合している(Zhang, J. Virol. 74 (2000), 4634-4644)。コレステロールとラフトの完全性は、形質膜への赤血球凝集素の輸送に必須である(Keller, J. Cell Biol. 140 (1998), 1357-1367)。インフルエンザウイルスは、脂質ラフトに富む上皮細胞の頂膜から出芽する。インフルエンザウイルスのエンベロープは、出芽の間に融合したラフトから形成され、これは、Ｍタンパク質の集合体が、ラフトのクラスター化を駆動する新生ウイルスエンベロープの細胞質小葉で層を形成する過程である(Zhang, J. Virol. 74 (2000), 4634-4644)。最近のモデルによれば、表在性（peripheral）ラフトタンパク質であるウイルスＭ２タンパク質は、成熟インフルエンザウイルス粒子のピンチオフを促進する(Schroeder, Eur. Biophys. J. 34 (2005), 52-66)。
【０００７】
同様に宿主ラフト脂質とタンパク質をそのエンベロープに組み込むＨＩＶ−１は、その生活環における少なくとも４つの鍵となる事象：新しい宿主の粘膜の通過、免疫細胞へのウイルスの侵入、宿主細胞機能の変化のシグナル伝達並びに細胞からのウイルスの退出、及び宿主の血管系を通しての分散のためにラフトを使用する。
【０００８】
ウイルス、細菌及び寄生生物は、シグナル伝達の細胞状態を変化させることによって宿主細胞に侵入し得る又は宿主細胞と相互作用し得る。これはまた、ＨＩＶ感染においても当てはまる。初期ＨＩＶ遺伝子産物であるＮｅｆは、脂質ラフトを通してウイルスの感染性を促進し(Zheng, Curr. Biol. 11 (2001), 875-879)、Ｎｅｆを欠くＨＩＶ−１ビリオンによる感染はＡＩＤＳに進行しない(Kirchhoff, N. Engl. J. Med. 332 (1995), 228-232)。関連宿主細胞表面タンパク質を担持する脂質ラフトをクラスター化することにより、Ｎｅｆオリゴマー形成はＴ細胞シグナル伝達複合体及びＨＩＶ出芽部位を組織化するのに役立ち得る(Zheng, Curr. Biol. 11 (2001), 875-879; Wang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000), 394-399)。もう１つのラフト依存性工程である、細胞からのＨＩＶの退出は、ウイルスＧａｇタンパク質に決定的に依存する(Ono, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 13925-13930; Lindwasser, J. Virol. 75 (2001), 7913-7924):Ｇａｇタンパク質は、ラフトを共にクラスター化してウイルス構築を促進する、ＨＩＶスパイクタンパク質を含むラフトに特異的に結合する。ＨＩＶ−１タンパク質と脂質ラフトの相互作用は、エンベロープ構築のために必要なＧａｇの立体配座変化を生じさせ得る(Campbell, J. Clin. Virol. 22 (2001), 217-227)。
【０００９】
ラフトのクラスター化のもう１つの例は、数ある細菌の中でも特に、クロストリジウム、連鎖球菌及びアエロモナス種によって分泌される孔形成性毒素の病原性機構である(Lesieur, Mol. Membr. Biol. 14 (1997), 45-64)。これらの毒素は、軽度のセルライトからガス壊疽及び偽膜性腸炎までにわたる疾患を引き起こし得る。最もよく検討されているのは、海洋細菌、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）からの毒素、アエロリシン（Aerolysin）である。アエロリシンは分泌され、宿主細胞の表面のＧＰＩアンカー型ラフトタンパク質に結合する。毒素は、タンパク質分解後に膜に組み込まれ、ラフト依存的に七量体化して、ラフト結合チャネルを形成し、このチャネルを通して低分子とイオンが流れ、病的変化の引き金を引く。アエロリシンのオリゴマー形成は溶液中で開始され得るが、生細胞の表面では１０５倍以上低い毒素濃度で起こる。この膨大の効率上昇は、毒素のオリゴマー形成によって駆動される、ラフト結合及びラフトクラスターへの濃縮による活性化に起因する。やはり、小さな変化がラフトクラスター化の増幅によって膨大な作用へと導くことができる(Lesieur, Mol. Membr. Biol. 14 (1997), 45-64; Abrami, J. Cell Biol. 147 (1999), 175-184)。
【００１０】
細菌における膜の不均一性は先行技術において記述されているFishov, Mol. Microbiol. 32 (1999), 1166-1172; Mileykovskaya, J. Bacteriol. 182 (2000), 1172-1175参照。細菌膜内の種々のタンパク質は脂質流動性に対して様々な感受性を示し、多様な流動性と組成の物理的に分離された脂質ドメインの共存を示唆したが(Linden, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 (1973), 2271-2275; Morrisett, J. Biol. Chem. 250 (1975), 6969-6976)、同時に、細菌細胞質膜の、細胞質膜成分が差別的に局在することが認められる機能的ドメインへの組織化についての証拠も存在し(Myers, Curr. Microbiol. 19 (1989), 45-51) 、さらに、膜リン脂質は、組成、タンパク質−脂質相互作用及び秩序の程度（degree of order）が異なる別個のドメインへと分離する(Vanounou, Mol. Microbiol. 49 (2003), 1067-1079)。これに関して、細菌細胞膜ドメインは、機能的に及びある程度構造的に、哺乳動物脂質ラフトに類似する。ごく最近、抗菌ペプチドが、その膜内に高いホスホエタノールアミン含量を有する細菌に対して区別的に毒性であることが報告され、抗菌薬の選択毒性を決定する上で細胞表面の脂質組成の潜在的な重要性が強調された(Epand, Biochim Biophys Acta. 1758 (2006), 1343-1350)。
【００１１】
Wang, Biochemistry 43 (2004), 1010-1018は、ステロール／ステロイド構造と脂質ラフトへの関与の間の関係を検討している。これらの著者達は、ステロールが、細胞内のコレステロールに依存する生物学的過程を、何らかのラフト環境によって支持され得る過程と区別するために使用されることがあるので、この問題を興味深いと考えている。Ｗａｎｇと共同研究者達は、生体膜の秩序ドメインの形成を促進するステロイドを見出した。
【００１２】
国際公開公報第ＷＯ０１／２２９５７号は、スフィンゴ脂質／コレステロールミクロドメインの調節のためのガングリオシドの使用を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開公報第ＷＯ０１／２２９５７号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Glaser, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993), 475-481
【非特許文献２】Jacobson, Comments Mol. Cell Biophys. 8 (1992), 1-144
【非特許文献３】Jain, Adv. Lipid Res. 15 (1977), 1-60
【非特許文献４】Winchil, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993), 482-488
【非特許文献５】Simons, Biochemistry 27 (1988), 6197-6202
【非特許文献５】Simons, Nature 387 (1997), 569-572
【非特許文献６】Brown, Cell 68 (1992), 533-544
【非特許文献７】Ilangumaran, Biochem. J. 335 (1998), 433- 440
【非特許文献８】Scheiffele, EMBO J. 16 (1997), 5501-5508
【非特許文献９】Van der Goot, Semin. Immunol. 13 (2001), 89-97
【非特許文献１０】Simons, J. Clin. Invest. 110 (2002), 597-603
【非特許文献１１】Scheiffele, J. Biol. Chem. 274 (1999), 2038-2044
【非特許文献１２】Scheiffele, EMBO J. 16 (1997), 5501-5508
【非特許文献１３】Zhang, J. Virol. 74 (2000), 4634-4644
【非特許文献１４】Keller, J. Cell Biol. 140 (1998), 1357-1367
【非特許文献１５】Zhang, J. Virol. 74 (2000), 4634-4644
【非特許文献１６】Schroeder, Eur. Biophys. J. 34 (2005), 52-66
【非特許文献１７】Zheng, Curr. Biol. 11 (2001), 875-879)
【非特許文献１８】Kirchhoff, N. Engl. J. Med. 332 (1995), 228-232
【非特許文献１９】Zheng, Curr. Biol. 11 (2001), 875-879
【非特許文献２０】Wang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000), 394-399
【非特許文献２１】Ono, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 13925-13930
【非特許文献２２】Lindwasser, J. Virol. 75 (2001), 7913-7924
【非特許文献２３】Campbell, J. Clin. Virol. 22 (2001), 217-227
【非特許文献２４】Lesieur, Mol. Membr. Biol. 14 (1997), 45-64
【非特許文献２５】Lesieur, Mol. Membr. Biol. 14 (1997), 45-64
【非特許文献２６】Abrami, J. Cell Biol. 147 (1999), 175-184
【非特許文献２７】Fishov, Mol. Microbiol. 32 (1999), 1166-1172
【非特許文献２８】Mileykovskaya, J. Bacteriol. 182 (2000), 1172-1175
【非特許文献２９】Linden, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 (1973), 2271-2275
【非特許文献３０】Morrisett, J. Biol. Chem. 250 (1975), 6969-6976
【非特許文献３１】Myers, Curr. Microbiol. 19 (1989), 45-51
【非特許文献３２】Vanounou, Mol. Microbiol. 49 (2003), 1067-1079
【非特許文献３３】Epand, Biochim Biophys Acta. 1758 (2006), 1343-1350
【非特許文献３４】Wang, Biochemistry 43 (2004), 1010-1018
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の根底をなす課題は、感染性疾患／感染性障害、特に脂質ラフトによって調節される生物学的／生化学的プロセスに連鎖する及び／又は関連する感染性疾患／感染性障害における臨床的及び／又は医薬的介入のための手段と方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この技術的課題に対する解決法は、本明細書中の以下の記載並びに各請求項において特徴づけられる実施形態を提供することによって達成される。
【００１７】
本発明に関して、コレステリルアミンは、驚くべきことに、感染性疾患、特にウイルス病原因子及び細菌によって引き起こされる障害又は疾患の医学的管理において、他のコレステリル誘導体、特に硫酸コレステリルよりも優れていることが認められた。本発明に関して、「コレステリルアミン」という用語はまた、時として「アミノコレステリル誘導体」と称される化合物、及び、時として「アミノコレスタン及びアミノコレステン誘導体」と称される化合物を包含することが意図されている。さらに、本発明に関して、「コレステリルアミン」という用語はまた、以下の式２に示すようにＡ環が窒素含有複素環によって置換されたコレステロールの誘導体を包含することが意図されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
従って、１つの実施形態では、本発明は、感染性疾患／感染性障害の治療、予防及び／又は改善のための医薬組成物の製造のための、以下の式１：
【化１】
2010511648.tif 000002
の化合物、又はその医薬的に許容される塩、誘導体、溶媒和物若しくはプロドラッグの使用を提供する。前記障害又は疾患は、ウイルス又は細菌によって引き起こされ得る。
【００１９】
以下の炭素原子の番号及びステロイド骨格の環の記号は、本明細書全体を通じて順守される：
【化２】
2010511648.tif 000003
【００２０】
さらに、本発明において提供される一般式は、その式に表示される化合物のすべての可能な立体異性体及びジアステレオマーを包含することが意図されている。
【００２１】
式１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の１つは、Ｘ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｘ（ＣＨ２）ｎＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、Ｘ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｃ１−４アルキル）２及びＸ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｃ１−４アルキル）３＋から選択されるアミン含有基である。好ましくは、Ｒ５はアミン含有基である。
【００２２】
Ｘは、直接結合であるか又はＯＰ（Ｏ）（ＯＣ１−４アルキル）Ｏ、ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）ＣＨ２Ｏ及びＯＰ（Ｏ）（ＯＣ１−４アルキル）ＣＨ２Ｏから選択されるリン含有基である。１つの好ましい実施形態では、Ｘは直接結合である。１つの実施形態では、ＸはＯＰ（Ｏ）（ＯＣ１−４アルキル）Ｏである。もう１つの実施形態では、ＸはＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）ＣＨ２Ｏである。さらにもう１つの実施形態では、ＸはＯＰ（Ｏ）（ＯＣ１−４アルキル）ＣＨ２Ｏである。
【００２３】
Ｘが直接結合である場合、ｎは０から２の整数である。１つの実施形態では、ｎは０である。もう１つの実施形態では、ｎは１である。さらにもう１つの実施形態では、ｎは２である。化合物の１つの好ましい群では、ｎは０又は１である。化合物のもう１つの好ましい群では、ｎは１又は２である。
【００２４】
Ｘがリン含有基である場合、ｎは２から６の整数であり、好ましくは２である。
【００２５】
ＸがＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）ＣＨ２Ｏである場合、式１の化合物は塩として存在してもよい。適切な対イオンは、「医薬的に許容される塩」として以下に列挙されている。対応する遊離塩基、すなわちＸがＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）ＣＨ２Ｏである遊離塩基も、本発明の範囲内である。
【００２６】
Ｒ５がアミン含有基である実施形態では、
2010511648.tif 000004
は単結合又は二重結合であり、好ましくは単結合である。
2010511648.tif 000005
が二重結合である場合、Ｒ４は存在しない。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立してＨ又はＯＨである。Ｒ６はＨである。Ｘが直接結合であり、かつｎが１又は２である場合、Ｒ６はＯＨであってもよい。好ましくは、Ｒ６はＨである。
【００２７】
Ｒ１がアミン含有基である実施形態では、Ｒ２及びＲ６は、独立してＨ又はＯＨである。Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はＨである。
2010511648.tif 000006
は単結合である。
【００２８】
Ｒ２がアミン含有基である実施形態では、Ｒ３及びＲ６は、独立してＨ又はＯＨである。Ｒ１、Ｒ４及びＲ５はＨである。
2010511648.tif 000007
は単結合である。
【００２９】
Ｒ３がアミン含有基である実施形態では、Ｒ２及びＲ６は、独立してＨ又はＯＨである。Ｒ１、Ｒ４及びＲ５はＨである。
2010511648.tif 000008
は単結合である。
【００３０】
Ｘが直接結合である場合、好ましい実施形態では、式１の化合物は１から４個のヒドロキシル基を含む。ヒドロキシル基は、両親媒性又は極性媒質中でのコレステリルアミンの溶解度を高め、これは医学適用において有利であり得る。
【００３１】
１つの実施形態では、式１の化合物は０又は１個のヒドロキシル基を含む。もう１つの実施形態では、式１の化合物はヒドロキシル基を含まない。
【００３２】
以下の式１ａから１ｌ：
【化３】
2010511648.tif 000009
の化合物は、式１の化合物の好ましい例である。
【００３３】
化合物１ｅ及び１ｌはカチオンを表し、ハロゲン化物、リン酸塩、硫酸塩及び酢酸塩等のあらゆる医薬的に許容されるアニオンと組み合わせて使用できる。
【００３４】
化合物１ａから１ｌの中で、化合物１ａ、１ｇ、１ｉ、１ｊ及び１ｋが好ましい。
【００３５】
もう１つの実施形態では、本発明は、感染性疾患／感染性障害の治療、予防及び／又は改善のための医薬組成物の製造のための、以下の式２：
【化４】
2010511648.tif 000010
の化合物、又はその医薬的に許容される塩、誘導体、溶媒和物若しくはプロドラッグの使用を提供する。前記障害又は疾患は、ウイルス又は細菌によって引き起こされ得る。
【００３６】
式２において、Ｙは、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１−４アルキル）又はＮ（Ｃ１−４アルキル）２＋であり、好ましくはＮＨである。
【００３７】
ｐは０から２の整数であり、ｑは１又は２の整数であるが、但し、ｐが２である場合、ｑが１であることを条件とする。好ましくは、ｐは０であり、ｑは２である。
【００３８】
2010511648.tif 000011
は単結合又は二重結合であり、好ましくは単結合である。
【００３９】
以下の式２ａ及び２ｂ：
【化５】
2010511648.tif 000012
の化合物は、式２の化合物の好ましい例である。
【００４０】
本発明に従って使用される化合物は、当分野で公知の標準的方法によって製造され得る。
【００４１】
Ｘが直接結合であり、３位に第一級アミノ官能基を有する一般式１の化合物は、市販の５−コレステン−３β−オール又は５α−コレスタン−３β−オールからアルコール−メシラート−アジド−アミンの合成シーケンスを使用して製造できる。最終産物であるアミンの立体化学は出発物質であるアルコールの立体化学に依存する：３β−アルコールは３α−アミンを提供し、逆もまた同様である。５−コレステン−３α−オール又は５α−コレスタン−３α−オールは、文献に記載のプロトコールに従って入手可能である(Boonyarattanakalin, J. Am. Chem. Soc. 126 (2004), 16379-16386)。あるいは、そのようなアミンは還元的アミノ化手段によって調製でき、例えばアルキルアミン又はジアルキルアミンを試薬として使用することにより置換アミンが得られ、又はヒドロキシルアミンを試薬として使用し、続いてラネーニッケルで処理することにより第一級アミンが得られる。アミンは、遊離塩基として得ることもでき、又はジエチルエーテル中でＨＣｌを溶液として用いた沈殿により対応する塩酸塩として得ることもできる。対応するヒドロキシ修飾誘導体は、どちらも市販されている４−コレステン−３−オン又は１，４−コレスタジエン−３−オンから、エポキシ化及びそれに続く水素化物を用いた開環又はオスミウムを介したビスヒドロキシル化手段によって調製できる。アミノメチル誘導体は、Oldenziel, J. Org. Chem. 42 (1977), 3114-3118に記載されているように、トシルメチルイソシアニド（ＴｏｓＭＩＣ）でのケトンの処理によって入手可能である。アミノエチル修飾コレステリル誘導体は、様々な文献に記載されるプロトコールに従って(Drefahl, Chem. Ber. 97 (1964), 2011-2013; Kargiozov, Synth. Commun. 34 (2004), 871-888; Shen, Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (2005), 4564-4569)、市販のシアノメチルホスホネートを試薬とするホーナー−ワズワース−エモンズ（Horner- Wadsworth-Emmons）（ＨＷＥ）アプローチを用いて、対応するケトンを出発物質として調製できる。形成された二重結合のその後の水素化及びそれに続く水素化物を介したニトリルの還元により、アミノエチル置換コレステリル誘導体が得られる。
【００４２】
アミン含有基がコレスタン骨格にＣ２位置で結合している場合、対応するケトンは合成前駆体として使用でき、これは、種々の文献 (Barillier, Tetrahedron 50 (1994), 5413-5424; Penz, Monatshefte fuer Chemie 112 (1981), 1045-1054; Lightner, Steroids 35 (1980), 189-207; Nakai, Tetrahedron Lett. (1979), 531-534) で公知の別の手順によって生産できる。その後のアミン含有基の導入は、３−コレスタノンについての上述した一般的戦略によって達成できる。同じ原理を基質としての４−コレスタノン（Nakai, Tetrahedron Lett. (1979), 531-534; Sondheimer, J. Org. Chem. 26 (1961), 630-631 ; Shoppee, J. Chem. Soc. (1959), 630-636に記載されているように入手可能)に使用するか又は１−コレスタノン（Shoppee, J. Chem. Soc. C (1968), 245-249に記載されているように入手可能)に応用することにより、それぞれコレステリル骨格のＣ４又はＣ１に結合したアミン含有官能基を有する対応誘導体を得ることができる。
【００４３】
Ｘが直接結合であり、１、２又は４位に第一級アミノ官能基を有する一般式１の化合物は、対応するアリルアミンから製造できる。あるいは、エポキシ化及びそれに続く二重結合の開裂又はビスヒドロキシル化は、前述したヒドロキシ修飾化合物を生じさせる。前記アリルアミンは、２α，３α−エポキシ−５α−コレスタンから、ベンジルアミンでのエポキシ部分の環開裂とそれに続く脱ベンジル化によって又は塩化メシルでの処理とそれに続くアジドでの処理及びその後の水素化アルミニウムリチウム還元によって製造できる。２α，３α−エポキシ−５α−コレスタンは、例えば、５α−コレスタン−２−エンのメタクロロ過安息香酸を介したエポキシ化によって入手可能である。５α−コレスタン−２−エン自体は、文献(Cruz Silva, Tetrahedron 61 (2005), 3065-3073)の記載に従って製造できる
【００４４】
ＸがＯ−アルキルホスフェートである一般式１の化合物は、文献で公知のホスホルアミダイト法 (Beaucage, S. L.; J. Org. Chem. 2007, 72(3), 805-815; Noyori, R.; J. Am Chem. Soc. 2001, 123(34), 8165-8176; Hayakawa, Y.; Bull. Chem. Soc. Jpn. 2001 , 74(9), 1547- 1565; Noyori, R.; Tetrahedron Lett. 1986, 27(35), 4191-4194; Reviews: Bannwarth W.; HeIv. Chim. Acta 1987, 70, 175-186 and Beaucage, S. L.; Tetrahedron 1993, 49(10), 1925-1963) を用いて、対応するコレステロール又はジヒドロコレステロール（上述したように入手可能）から製造できる。塩化ホスホリルを用いる古典的戦略と比較して、ホスホルアミダイトプロトコールはより強力であり、より信頼し得る結果を提供する。
【００４５】
Ｘがホスホネート又はＯ−アルキルホスホネートである一般式１の化合物は、文献に記載されている方法 (Rejman, D.; Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2001, 20, 1497-1522 and Holy, A.; J. Med. Chem. 2001 , 44, 4462-4467) を用いて 対応するコレステロール又はジヒドロコレステロール（上述と同様に入手可能）から製造できる。生じたホスホネートは、当業者に公知の標準的プロトコールにおいてＣ１−４ハロゲン化アルキルを使用してＯ−アルキル化できる。
【００４６】
一般式２の化合物は、文献で概説される方法で製造できる。例えばＳｈｏｐｐｅｅらは、同時に窒素の組込みを伴う環拡大のためのＢｅｃｋｍａｎｎ転位を用いて３−及び４−アザ−Ａ−コレステリル誘導体を製造するための合成方法を記載している(Shoppee, CW. ; J. Chem. Soc. 1962, 105)。あるいは、拡大した窒素含有Ａ環を示すコレステリル誘導体を、シュミット型転位を用いて生成することができる(Doorenbos, NJ. ; J. Org. Chem. 1961, 26, 2548-2549)。ステロイドＡ環を拡大せずに４−アザ−コレステリル誘導体を製造する合成方法は、対応するセコ−コレステリル誘導体を得るための酸化的Ａ環開裂(Boucza-Tomaszewski, Z.; Tetrahedron Lett. 1986, 27, 3767-3770)及びその後の窒素源の存在下での閉環(Doorenbos, N. J.; J. Org. Chem. 1961, 26, 2546-2548)とそれに続く生じたラクタム誘導体の対応するアミンへの還元(Shoppee, C.W.; J. Chem. Soc. 1962, 2275-2285 and Kim, J.C.; Bull. Korean Chem. Soc. 1993, 14(2), 176)という二段階戦略を用いる。Ａ−Ｎｏｒ−アザステロイドは、例えば対応する４−アザ−ステロイドのファヴォルスキー型環縮小によって(Edwards, O. E.; Can. J. Chem. 1997, 75(6), 857-872)又は上述したセコ−コレステリル誘導体を基質として用いるアミノ化−環化縮合連続反応によって(Chupina, L.N.; Khimiko-Farmatsevticheskii Zhurnal 1982, 16(5), 563-567 and Rulin, V.A.; Zhumal Organicheskoi Khimii 1975, 11(8), 1763-1766)入手できる。
【００４７】
本明細書で提供する化合物は、ウイルス性疾患又は細菌感染のような、感染性疾患又は感染性障害の治療（並びに予防及び／又は改善）において有用である。本明細書で提供する化合物は、対応する細胞ベースの疾患／障害モデルにおいて評価された。
【００４８】
本発明に従って治療されるウイルス性疾患は、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型）、ロタウイルス（Rotavirus）、ＲＳウイルス（Respiratory syncytial virus）、ヘルペトウイルス科（Herpetoviridae）（例えば単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）、エコーウイルス１型、麻疹ウイルス、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）（例えばエンテロウイルス属（Enterovirus）、コクサッキーウイルス（Coxsackievirus)）、フィロウイルス科（例えばエボラウイルス、マールブルグウイルス）、パピローマウイルス科及びポリオーマウイルス科から成る群より選択されるウイルスによって誘発される疾患を含む。好ましい実施形態では、ウイルスはインフルエンザウイルスである。
【００４９】
本発明に従って治療される細菌感染は、中でも特に、グラム陽性杆菌、グラム陽性球菌、グラム陰性杆菌及びグラム陰性球菌によって誘発される感染を含む。グラム陽性杆菌は、例えばクロストリジウム種（Clostridium spp.）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、ノカルジア種（Nocardia spp.）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）及びざ瘡プロピオンバクテリウム（Propionibacterium acnes）である。グラム陽性球菌は、例えば黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）及び連鎖球菌種である。グラム陰性杆菌は、例えば大腸菌、ヘリコバクター・ピロリ（Heliobacter pylori）、ブルセラ種（Brucella spp.）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、赤痢菌種、ビブリオ種（Vibrio spp.）、ペスト菌（Yersinia pestis）、サルモネラ種（Salmonella spp.）、肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、バークホルデリア・セパシア（Burkhoideria cepacia）、エンテロバクター種（Enterobacter spp.）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、カンピロバクター・ジェジュニ及びレジオネラ・ニューモフィラ菌（Legionella pneumophila）である。グラム陰性球菌は、例えば淋菌（Neisseria gonorrhoeae）及びモラクセラ・カタラリス（Moraxella catarrhalis）である。
【００５０】
本発明に従って治療される細菌感染はまた、グラム染色が適用できない臨床細菌によって誘発される感染を含む。これらの細菌は、例えばボレリア種（Borrelia spp.）、バルトネラ・クインターナ（Bartonella Quintana）、肺炎クラミジア（Chlamydia pneumoniae）、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、らい菌（Mycobacterium leprae）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Mycobacterium ulcerans）、マイコバクテリウム・カンサシイ（Mycobacterium kanasasii）、トリ型結核菌（Mycobacterium avium）、パラ結核菌（Mycobacterium paratuberculosis）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Mycobacterium scrofulaceam）、リケッチア種（Rickettsia spp.）及びトレポネーマ種（Treponema spp.）である。
【００５１】
本発明に関して、「マイコバクテリア誘発性疾患」は、中でも特に、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、トリ型結核菌、アフリカ型結核菌（M. africanum）、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．イントラセルラーレ（M. intracellulare）、Ｍ．ウルセランス（M. ulcerans）、パラ結核菌、Ｍ．シミエ（M. simiae）、Ｍ．スクロフラセウム（M. scrofulaceam）、Ｍ．ツルガイ（M. szulgai）、Ｍ．ゼノピ（M. xenopi）、Ｍ．フォーチュイタム（M. fortuitum）、Ｍ．ケロネイ（M. chelonei）、らい菌及びＭ．マリヌム（M. marinum）による感染により説明される、及び／又は感染に関連する障害／疾患を含み得る。付属の実施例は、特に、本明細書で開示される化合物の、結核、すなわちヒト型結核菌による感染の治療及び／又は予防における創作的使用のデータを提供する。「治療及び／又は予防される感染」に関して上述したように、本発明は、病原因子（例えば細菌）自体によって引き起こされる障害の治療／予防に限定されず、前記病原体によって産生される生成物、例えば毒素によって引き起こされる障害の医学的改善も包含する。
【００５２】
本発明に従って治療されるマイコバクテリア誘発性疾患は、中でも特に、結核、らい、熱帯皮膚潰瘍、潰瘍形成、膿瘍、肺疾患、慢性（皮膚）肉芽腫症、非結核性マイコバクテリアによる日和見感染並びにトリ型結核菌のような異型マイコバクテリアによって惹起される疾患、例えば免疫減弱状態患者における肺疾患、リンパ節炎、皮膚及び播種性疾患を含む。前記使用は、ヒトにおけるマイコバクテリア誘発性疾患に限定されず、動物疾患、例えばウシ結核における本発明の使用も含む。好ましい実施形態では、マイコバクテリア誘発性疾患は、付属の実施例においても実証されるように結核である。
【００５３】
理論には拘束されないが、本明細書で記載する化合物は、脂質ラフト上で、脂質ラフトにおいて又は脂質ラフトの内部で起こる生化学的／生物物理学的な病理過程によって引き起こされる感染性疾患／感染性障害の治療、予防及び／又は改善において特に有用である。そのような疾患／障害並びにそのような生化学的／生物物理学的過程の対応する例をここに示す。脂質ラフト上で、脂質ラフトにおいて又は脂質ラフトの内部で起こる生化学的／生物物理学的病的過程という用語は、例えばウイルス又は細菌感染時に病原体が誘発する異常なラフトクラスター形成、病原体の感染による脂質ラフトにおける（細菌性）毒素のオリゴマー構造体の形成、又はウイルス若しくは細菌によって引き起こされる脂質ラフトでのシグナル伝達分子の活性上昇を意味する。また、脂質ラフト／脂質ラフト成分の通常よりも密なパッキングも、本発明における「生化学的／生物物理学的病的過程」として考慮される。
【００５４】
付属の実施例は、本明細書で定義され、説明されるコレステリルアミンを使用した場合、感染性疾患及び障害に伴う生物学的及び／又は生化学的過程が、脂質ラフトの集合を調節することによって影響され得ることを実証する。理論には拘束されないが、本明細書で開示する特定コレステリルアミンは、脂質ラフト内の調節分子の分配に干渉することができると考えられる。従って、脂質ラフトを含むタンパク質複合体の形成及び／又は脂質ラフトのクラスター形成が調節可能であり、疾患状態が遅延、さらには予防される。細胞、特に疾患細胞の脂質ラフトにおいて、脂質ラフト上で又は脂質ラフト内で起こる生物学的過程、特に病的過程を妨げることができると考えられる、上記で定義した特異的分子、すなわちコレステリルアミンが本明細書で提供される。これらの分子は、「ラフト調節剤」であると考えられる。
【００５５】
本発明において使用されるコレステリルアミンの疾患阻害活性に加えて、前記化合物をいくつかの毒性アッセイにおいても評価する。毒性アッセイは当分野において周知であり、中でも特に、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）又はアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）アッセイ又はアポトーシスアッセイを含み得る。しかし、これらの（細胞）毒性アッセイは、当業者に公知のように、上記のアッセイに限定されない。
【００５６】
本明細書で提供されるデータ及び情報に従って、本発明は、特に、ウイルス又は細菌感染によって引き起こされる障害及び疾患の治療のための、医療現場における、式１ａから１ｌ並びに２ａ及び２ｂに示す化合物の使用を提供する。しかしながら、特に対象となるのは、インフルエンザ感染及び結核である。
【００５７】
以下において、疾患及び障害に関するより詳細な情報を提供する。これらの疾患及び障害は、本明細書で提供されるコレステリルアミンを使用することによって予防、改善又は治療できる。特に、本明細書で提供される実験データは、１ａ、１ｂ、１ｆ、１ｇ、１ｈ、１ｉ、１ｊ、１ｋ、２ａ及び２ｂが個別の医学的介入又は予防において特に好ましい化合物であることを実証する。
【００５８】
本発明において記載されるコレステリルアミンは、１）ラフト形成を調節し、細胞表面への赤血球凝集素及びノイラミニダーゼの輸送を妨げる、２）Ｍタンパク質によって誘導されるスパイク糖タンパク質を含むラフトのクラスター化を予防し、それによってウイルス形成を阻害するため、又は３）脂質ラフトの大きさ／容積を上昇させるため、又は４）ラフト（ウイルス膜）と非ラフト（細胞膜）の相境界で起こる出芽孔（budding pore）の分体（切り取り）を妨げるために適用できる。
【００５９】
この点に関して特に好ましい化合物は、化合物１ａ、１ｂ、１ｇ、１ｈ、１ｉ、１ｊ、１ｋ、２ａ及び２ｂであり、化合物１ａ、１ｉ、１ｋ及び２ｂは、本発明との関連においてさらに一層好ましい実施形態である。対応する実験データを付属の実施例において提供する。
【００６０】
ウイルス感染において、ラフトのクラスター形成はウイルス形成過程に関与する。化合物１ａから１ｌ並びに２ａ及び２ｂは、ウイルス複製アッセイにおいて作用を及ぼす。理論には拘束されないが、この作用の基礎となる構造特徴は、ステロイドＡ環の内部でのアミン置換とコレステリル型側鎖を含むコレステリル型Ｂ、Ｃ、Ｄ環の存在の組合せに代表されるものと考えられる。Ａ環における３−アミノメチル置換又は３−アミノエチル置換の使用は、化合物１ｉ又は１ｋの効力上昇を生じさせ、それ故３−アミノメチル又は３−アミノエチル置換パターンがさらに一層好ましい実施形態であることが示される。Ａ環の内部でのヒドロキシ官能基による付加的な修飾は高い溶解度の化合物を提供し、それ故バイオアベイラビリティーを向上できる。実験部分で提供されるウイルス複製アッセイにおいて得られる結果が明らかにするように、これらの化合物は医薬的介入のために有用であろう。これに対し、トランス−２−アミノメチル−１−シクロヘキサノール、硫酸コレステリル及びコレステロールは、インフルエンザ感染のモデルアッセイにおいて有意な活性を示さない。
【００６１】
ＨＩＶ−１のウイルス放出の機構は、ラフトの関与に関して、インフルエンザウイルスのものと類似するので、上記化合物はまた、ＨＩＶ感染の治療において及びＨＩＶ関連疾患、特にＡＩＤＳの医学的管理においても使用できる。
【００６２】
上記化合物又はその誘導体で対処可能なさらなるウイルス疾患は（非限定的な例として）、ヘルペスウイルス、エボラウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ロタウイルス及びＲＳウイルスである。従って、特に好ましい化合物並びに特定の（ウイルス）アッセイ又は試験系に関して本明細書で提供される好ましい化合物は、他の感染性疾患、特にウイルス感染の医学的介入及び／又は予防においても有用であると考えられる。
【００６３】
上記で指摘したように、本明細書に記載する化合物は、細菌感染又は分泌される細菌性毒素によって誘発される中毒症の治療においても使用できる。
【００６４】
細菌毒素、例えばコレラ、アエロリシン、炭疽及びヘリコバクター毒素は、それらの機能に不可欠の、ラフトにおいてオリゴマー構造体を形成する。ラフトは、例えば、コレラではガングリオシドＧＭ１等のラフト脂質に結合することによって標的される。理論には拘束されないが、本発明に関して、オリゴマー化の予防はラフトクラスター化の予防と等価であると考えられ、それ故、ウイルス感染に使用される化合物と同じ又は類似の化合物は、細菌毒素の活性を阻害できるはずである。当業者、特に主治医は、細菌感染自体の治療及び／又はその細菌の毒素によって引き起こされる障害及び疾患の改善において、本明細書で定義されるコレステリルアミンを用いた治療レジームを採用することができる。
【００６５】
細菌感染、例えば結核、細菌性赤痢、並びにクラミジア及び尿路病原性細菌による感染において、微生物は、しばしばカベオラが関与するラフト依存性インターナリゼーション過程で細胞に取り込まれる。ラフト内での細菌受容体の局在化の防止又はインターナリゼーションのブロッキングにより感染が予防される。カベオリン（コレステロール結合タンパク質）に依存するカベオラの場合、ステロイド誘導体によるラフトからのコレステロールの排除は病原体の取込みを予防し得る。
【００６６】
結核は、ラフトが関与する細菌感染性疾患の一例である。第一に、補体受容体３型（ＣＲ３）は、ザイモサン及びＣ３ｂｉ被覆粒子をインターナライズすることができる受容体であり、ヒト好中球におけるマイコバクテリウム・カンサシイの非オプソニン性食作用に関与する。これらの細胞においてＣＲ３は、細胞膜の脂質ラフトに局在する複数種類のＧＰＩアンカー型タンパク質に結合していることが認められた。コレステロール枯渇は、ザイモサン又は血清オプソニン化Ｍ．カンサシイの食作用には影響を及ぼさずに、Ｍ．カンサシイの食作用を顕著に阻害する。ＣＲ３は、ＧＰＩタンパク質と結合した場合、Ｍ．カンサシイがインターナライズされるコレステロールリッチなドメインに再度局在化する。ＣＲ３がＧＰＩタンパク質と結合していない場合、ＣＲ３はこれらのドメインの外側にとどまり、ザイモサン及びオプソニン化粒子の食作用を媒介するが、Ｖγ９Ｖδ２型Ｔ細胞を特異的に刺激するマイコバクテリア抗原であるＭ．カンサシイイソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）の食作用は媒介しない。従って、本発明はまた、マイコバクテリア感染、好ましくはヒト型結核菌感染の治療及び／又は改善における、本明細書で開示される化合物の使用を提供する。
【００６７】
本明細書で記載する化合物は、ファーマコフォア若しくは医薬組成物としてのそれらの使用において化合物それ自体として投与してもよく、又は薬剤として製剤してもよい。式１又は２の化合物、特に上記で定義した式１ａから１ｌ並びに２ａ及び２ｂの１つを有効成分として含む医薬組成物は本発明の範囲内である。医薬組成物は、場合により、医薬的に許容される賦形剤、例えば担体、希釈剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、結合剤、着色剤、色素、安定剤、防腐剤又は抗酸化剤を含んでいてもよい。
【００６８】
医薬組成物は、当業者に公知の手法、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 20th Editionに公開されている手法によって製剤できる。医薬組成物は、経口、非経口、例えば筋肉内、静脈内、皮下、皮内、動脈内、経直腸、経鼻、局所、エアロゾル又は経膣投与用の剤型として製剤できる。経口投与のための剤型は、被覆及び非被覆錠剤、軟ゼラチンカプセル、硬ゼラチンカプセル、ロゼンジ、トローチ、溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリシキシル、再溶解用の粉末及び顆粒、分散性粉末及び顆粒、薬用ガム、チュアブル錠剤及び発泡錠剤を含む。非経口投与用の剤型は、溶液、エマルジョン、懸濁液、分散液並びに再溶解用の粉末及び顆粒を含む。エマルジョンは非経口投与のための好ましい剤型である。経直腸及び経膣投与用の剤型は、座剤及び膣坐剤を含む。経鼻投与用の剤型は、吸入及びガス注入（insufflation）によって、例えば定量吸入器によって投与され得る。局所投与のための剤型は、クリーム、ゲル、軟膏（ointments, salves）、パッチ及び経皮送達システムを含む。
【００６９】
本発明において使用できる化合物の医薬的に許容される塩は、様々な有機酸及び無機酸並びに有機塩基及び無機塩基で形成され得る。例示的な塩基付加塩は、例えば、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩又はカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩又はマグネシウム塩；アンモニウム塩；脂肪族アミン塩、例えば、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、プロカイン塩、メグルミン塩、ジエタノールアミン塩又はエチレンジアミン塩；アラルキルアミン塩、例えばＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン塩；複素環式芳香族アミン塩、例えばピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩又はイソキノリン塩；第四級アンモニウム塩、例えばテトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩又はテトラブチルアンモニウム塩；及び塩基性アミノ酸塩、例えばアルギニン塩又はリシン塩を含む。例示的な酸付加塩は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、塩化物、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルスルホン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、例えばトシラート、ウンデカン酸塩等、並びにアミノ酸との塩を含む。
【００７０】
本発明において使用できる化合物の医薬的に許容される溶媒和物は、水との溶媒和物、例えば水和物の形態で、又は有機溶媒、例えばメタノール、エタノール又はアセトニトリルとの溶媒和物の形態で、すなわちそれぞれメタノレート、エタノレート又はアセトニトリレートとして存在し得る。
【００７１】
本発明において使用できる化合物の医薬的に許容されるプロドラッグは、化学反応又は代謝反応によって開裂可能な基を有し、インビボでの加溶媒分解によって又は生理的条件下で、医薬的に活性な本発明の化合物になる誘導体である。本発明において使用できる化合物のプロドラッグは、アミノ基又はヒドロキシ基のような化合物の官能基を用いて従来の方法にて、例えばカルバメート又はエステルとして、形成され得る。プロドラッグ誘導体形態は、しばしば哺乳類生物における溶解度、組織適合性又は遅延放出の利点を提供する（Bundgaard, H., Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985参照)。
【００７２】
本明細書で記載する医薬組成物は、適切な用量で被験者に投与され得る。投薬レジメンは主治医及び臨床的因子によって決定され得る。医学分野において周知のように、任意の患者についての用量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定化合物、性別、投与の時間及び経路、全般的健康状態、及び同時投与される他の薬剤を含む、多くの因子に依存する。一般に、医薬組成物の通常の投与としてのレジメンは、１日当たり０．１μｇから１５０００ｍｇ単位の範囲内であるべきである。レジメンが持続的注入である場合は、それぞれ０．１ｎｇから１０μｇ単位／ｋｇ体重／分の範囲内となるであろう。定期的な評価によって進行をモニタリングできる。
【００７３】
本明細書で記載する使用、すなわち感染性疾患の治療、改善及び／又は予防のためのコレステリルアミンの使用は、医学的及び薬学的に有益である。
【００７４】
従って、本発明はまた、そのような医学的治療を必要とする被験者を治療する方法に関し、前記方法は、医薬的作用を明らかにする、すなわち前記被験者が罹患している医学的状態を改善する又は治癒するため、特に感染性疾患に対抗するために十分な量の、本明細書で定義されるコレステリルアミンの投与を含む。好ましい実施形態では、治療される被験者はヒトである。
【００７５】
本発明に関して記載されるコレステリルアミンの医学的重要性の故に、本発明はまた、１又はそれ以上の医薬的に許容される賦形剤と本明細書で定義される化合物の混合物を含有する医薬組成物の製造方法を提供する。対応する賦形剤は上記で言及されており、リポソーム形成に使用される脂質誘導体を含むが、これらに限定されない。上記で指摘したように、本発明の医薬組成物が注射又は注入によって投与される場合、医薬組成物はエマルジョンであることが好ましい。
【００７６】
例えばエマルジョンは、６７重量％のリポイドＳ１００（リポイドカタログ番号７９０）、エタノール（２５重量％）及びグリセロール（８．３３重量％）を３７℃で６０分間又は均質になるまで撹拌することによって調製できる。試験化合物、例えば化合物１ｉの場合は１４．１ｍｇを、サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）においてＡｇｉｌｅｎｔガラス管（容積１．７ｍＬ）中にて３７℃で９０分間混合することにより、製剤１８５．９ｍｇに溶解する。この脂質エマルジョンは、試験化合物のプロリポソーム濃縮物である。その後、脂質エマルジョン２００ｍｇを０．５３６％ＮａＣｌ溶液１．０４ｇに希釈して、等張溶液を調製し、２０秒間ボルテックス撹拌する。このリポソーム懸濁液（１１．３５ｍｇ／ｍＬの試験化合物）を、所望濃度を達成するために０．９％ＮａＣｌ溶液でさらに希釈する。
【００７７】
以下の実施例は本発明を例示する。
【実施例】
【００７８】
以下の化学反応はすべて、不活性ガス雰囲気（アルゴン又は窒素）下に乾燥溶媒中で行った。ＴＨＦ及びジエチルエーテルを、溶媒精製システム（ＭＢｒａｕｎ−ＳＰＳ）を用いて乾燥した。化学物質及び溶媒は、市販の製品を購入したままの状態で使用した。ＴＬＣ：Ｍｅｒｃｋ  ＴＬＣアルミニウムシートシリカゲル６０Ｆ２５４。フラッシュクロマトグラフィー：Ｍｅｒｃｋシリカゲル（０．０４０から０．０６３ｍｍ）。質量分析器：Ｂｒｕｋｅｒ  ＨＰ−Ｅｓｑｕｉｒｅ  ＬＣ。ＮＭＲ分析器：Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ  ５００又はＤＲＸ  ３００；δはｐｐｍで表示、ＪはＨｚで表示。
【００７９】
実施例１、２及び３：３β−アミノ−５α−コレスタン（１ａ）、３α−アミノ−５α−コレスタン（１ｂ）及び３β−アミノコレスト−５−エン（１ｆ）の製造
化合物１ａの合成は、Boonyarattanakalin, J. Am. Chem. Soc. 126 (2004), 16379-16386によって記載されているＬ−セレクトリドプロトコールを使用して市販の３−コレスタノンから調製した、ジヒドロエピコレステロールを出発物質とした。ジヒドロエピコレステロールを、次に、対応するメシラートに変換し、続いてアジドで置換して(Davis, Tetrahedron Lett. 38 (1997), 4305-4308)、その後水素化アルミニウムリチウム処理によってアジドをアミンに還元した。
【００８０】
化合物１ｂの合成は、市販のジヒドロコレステロールを出発物質とし、それを対応するメシラートに変換して、続いてアジドで置換し(Davis, Tetrahedron Lett. 38 (1997), 4305-4308)、その後水素化アルミニウムリチウム処理によってアジドをアミンに還元した。
【００８１】
化合物１ｆの合成は、文献の手順(Boonyarattanakalin, J. Am. Chem. Soc. 126 (2004), 16379-16386)に従って市販のコレステロールから２段階で調製したエピコレステロールを出発物質とした。エピコレステロールを対応するメシラートに変換し、続いてアジドで置換して(Davis, Tetrahedron Lett. 38 (1997), 4305-4308)、その後水素化アルミニウムリチウム処理によってアジドをアミンに還元した。
【００８２】
以下では、化合物１ａ、１ｂ及び１ｆの合成において使用した、典型的な手順を説明する。
【００８３】
アルコールからメシラートを調製するための典型的手順：コレスト−５−エン−３β−オールメタンスルホネート
エピコレステロール（１．３２ｇ、３．４２ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（４２ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で無水ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（４８６ｍｇ、３．７６ｍｍｏｌ）及び塩化メタンスルホニル（４３１ｍｇ、３．７６ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。１００分後、石油エーテル／ジクロロメタン（１：１）＋１％エタノール中でのＴＬＣ分析は完全な変換を示した。混合物をジクロロメタンと水（各々１００ｍＬ）に分離した。有機層を希釈ＮａＨＳＯ４、水、飽和ＮａＨＣＯ３、水及びブラインで連続的に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して、ろ過し、蒸発乾固して、減圧下で一晩乾燥した。
【００８４】
収量：オフホワイト色固体としてコレスト−５−エン−３β−オールメタンスルホネート１．５４ｇ（９６％）。この物質はさらなる精製なしに次の段階で用いられた。さらなる精製は、石油エーテル／酢酸エチル（４：１）を用いたフラッシュクロマトグラフィーによって達成できる。
ＭＳ（ＥＳＩ）：４８２．３（Ｍ＋ＮＨ４）＋。
【００８５】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６７（ｓ，３Ｈ），０．８１−２．０７（ｍ，３８Ｈ），２．３６（ｄ，Ｊ＝１５．６，１Ｈ），２．５６（ｄ，Ｊ＝１５．６，１Ｈ），２．９８（ｓ，３Ｈ），４．５５（ｍ，１Ｈ），５．３５（ｄ，Ｊ＝５．１，１Ｈ）。
【００８６】
メシラートからアジドを調製するための典型的手順：３β−アジド−５α−コレスタン
コレスタン−３β−オールメタンスルホネート（１７．２ｇ、３７．０ｍｍｏｌ）及び粉末無水アジ化ナトリウム（１２．０３ｇ、１８５ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下に置き、無水Ｎ，Ｎ'−ジメチルプロピレン尿素（２４０ｍＬ）に懸濁した。混合物を、効率良く撹拌しながら４６℃に２４時間加熱した。粗生成物を水（１Ｌ）とジエチルエーテル／石油エーテルの１：１混合物（５００ｍＬ）に分離した。水層を同じ混合物でもう一度洗浄した。混合有機層を水（４×１Ｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、蒸発乾固して、減圧下で乾燥した。シリカでのフラッシュクロマトグラフィー（０、５、１０、１５及び２０％ ジクロロメタンを含む石油エーテルによる段階溶出）により、３β−アジド−５α−コレスタン１４．９ｇ（９７％）を無色の固体として得た。
【００８７】
ＭＳ（ＥＳＩ）：４１４．５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８８】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６４（ｓ＋ｍ，４Ｈ），０．７９（ｓ，３Ｈ），０．８１−１．６１（ｍ，３４Ｈ），１．６２−１．７０（ｍ，１Ｈ），１．７２−１．８６（ｍ，３Ｈ），１．９６（ｄｍ，Ｊ＝１２．６，１Ｈ），３．２４（ｍ，１Ｈ）。
【００８９】
アジドからアミンを調製するための典型的手順：３β−アミノ−５α−コレスタン（１ａ）
アルゴンの不活性雰囲気中、無水ジエチルエーテル（２５０ｍＬ）中の水素化アルミニウムリチウム（５．０ｇ、１３１．６ｍｍｏｌ）の懸濁液を撹拌しながら加熱還流した。無水ジエチルエーテル（１１０ｍＬ）中の３β−アジド−５α−コレスタン（１４．９ｇ、３６．０４ｍｍｏｌ）の溶液を、反応が穏やかな還流で維持される速度で滴下した。添加の完了後、混合物を１時間還流し、その後、石油エーテル／ジクロロメタン（８５：１５）中でのＴＬＣ分析により出発物質の完全な消費が示された。混合物を氷浴中で冷却し、メタノール４０ｍＬ、次いで２Ｍ ＮａＯＨ  ２００ｍＬを滴下した。混合物を水（約５００ｍＬ）で希釈し、有機層を分離して、混濁した水相をジクロロメタンとジエチルエーテルで複数回抽出した。混合有機層を水及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して、ろ過し、蒸発乾固して、減圧下で一晩乾燥した。収量：白色固体として３β−アミノ−５α−コレスタン（１ａ）１２．１ｇ（８７％）。
【００９０】
ＭＳ（ＥＳＩ）：３８８．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６３（ｓ＋ｍ，４Ｈ），０．７６（ｓ，３Ｈ），０．７０−１．８７（ｍ，４０Ｈ），１．９４（ｄｍ，Ｊ＝１２．２，１Ｈ），２．６２（ｍ，１Ｈ）。
【００９１】
３α−アミノ−５α−コレスタン（１ｂ）の調製
化合物１ｂを、上記と同様に、また典型的手順で概説したように製造した。
【００９２】
ＭＳ（ＥＳＩ）：３８８．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９３】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６４（ｓ，３Ｈ），０．６６−１．９０（ｍ，４４Ｈ），１．９５（ｄｍ，Ｊ＝１２．１，１Ｈ），３．１６（ｍ，１Ｈ）。
【００９４】
３β−アミノコレスト−５−エン（１ｆ）の製造
化合物１ｆを、上述したように、また典型的手順で概説したように製造した。
【００９５】
ＭＳ（ＥＳＩ）：３８６．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９６】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６６（ｓ，３Ｈ），０．７７−２．２１（ｍ，４２Ｈ），２．５９（ｍ，１Ｈ），５．３１（ｄ，Ｊ＝５．２，１Ｈ）。
【００９７】
実施例４及び５：３β−メチルアミノ−５α−コレスタン（１ｃ）及び３β−ジメチルアミノ−５α−コレスタン（１ｄ）の調製
化合物１ｃ及び１ｄを、市販の５α−コレスタン−３−オンから、以下の一般的プロトコールに従ってメチルアミン又はジメチルアミンをＴＨＦ中の２Ｍ溶液として使用する還元的アミノ化手段によって１段階で調製した。好都合なことに、アミン類は、それらの対応する塩酸塩として純粋な形態で入手した。
【００９８】
無水１，２−ジクロロエタン中の５α−コレスタン−３−オン（１．０当量）及びアミン（１．０当量、市販されているＴＨＦ中の２Ｍ溶液として使用した）の溶液をトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１．４当量）及び氷酢酸（１．０当量）で処理した。混合物を、アルゴン雰囲気下に室温で１８時間撹拌した後にＴＬＣ分析によって測定したところ、反応物は消費され尽していた。水を添加して反応混合物をクエンチングし、生成物をジエチルエーテルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させて粗生成物（すなわち遊離アミン）を得た。ジエチルエーテル中のＨＣｌの１Ｍ溶液をジエチルエーテル中のアミン溶液に添加し、その後ジエチルエーテルで洗浄することによって塩酸塩を調製した。このプロトコールにより、それぞれ６０から７０％の収率で化合物１ｃ及び１ｄの塩酸塩の白色結晶を得た。
【００９９】
３β−メチルアミノ−５α−コレスタン（１ｃ）：
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝４０２．５（Ｍ＋）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６２（ｓ，３Ｈ），０．７９（ｓ，３Ｈ），０．８４−０．８８（ｍ，１２Ｈ），０．９６−１．３２（ｍ，１８Ｈ），１．４５−１．８０（ｍ，１２Ｈ），１．９０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），１．９７（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，１Ｈ），２．６４（ｂｒ ｓ，３Ｈ），３．２０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），９．３０（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
【０１００】
３β−ジメチルアミノ−５α−コレスタン（１ｄ）：
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝４１６．４（Ｍ＋）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６１（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，３Ｈ），０．８１（ｍ，１０Ｈ），０．９７−１．３１（ｍ，１８Ｈ），１．４２−２．０２（ｍ，１５Ｈ），２．７３（ｂｒ ｓ，３Ｈ），２．８２（ｂｒ ｓ，３Ｈ），３．０３（ｂｒ ｍ，１Ｈ），１１．３３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
【０１０１】
実施例６：３β−トリメチルアンモニウム−５α―コレスタンクロリド（１ｅ）の調製
無水ジクロロメタン中の３β−メチルアミノ−５α−コレスタン（１ｃ）（１．０当量）及び水素化ナトリウム（鉱物油中の６０％懸濁液として８．０当量）の懸濁液を３０分間加熱還流した。純粋なヨウ化メチル（２０当量）を添加し、反応混合物を４５℃でさらに２日間加熱した。反応混合物を冷却し、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈して、ブラインで繰り返し洗浄し、ジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出した。混合有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物をジエチルエーテルで洗浄すると、対応する塩化物としての３β−トリメチルアンモニウム−５α―コレスタンクロリド（１ｅ）が白色結晶として得られた。
【０１０２】
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝４３０．５（Ｍ＋）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６７（ｍ，３Ｈ），０．８８（ｍ，１２Ｈ），１．１３−２．０１（ｍ，３１Ｈ），３．１７（ｂｒ ｓ，６Ｈ），３．３６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．７２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．４８（ｂｒ ｓ，２Ｈ）。
【０１０３】
実施例７：２β−アミノ−３α−ヒドロキシ−５α―コレスタンクロリド（１ｇ）の調製
化合物１ｇを、ジヒドロコレステロールの２−コレステンへの脱水とそれに続くエポキシ化を含む公知の手順(Cruz Silva, Tetrahedron 61 (2005), 3065-3073)によって入手可能である、２α，３α−エポキシコレスタンから調製した。
【０１０４】
以下で概説するように、ベンジルアミンでのエポキシド開裂及び水素と活性炭担持パラジウムでの脱ベンジル化によってアミノアルコール（１ｇ）を得た。
【０１０５】
２β−（Ｎ−ベンジルアミノ）−３α−ヒドロキシ−５α―コレスタンの調製
アルゴン雰囲気中、２α，３α−エポキシコレスタン(２１７ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）をベンジルアミン（３ｍＬ）に懸濁した。混合物を１２０℃で３日間撹拌した。その後、石油エーテル／酢酸エチル（１０：１）中でのＴＬＣにより出発物質の約９０％の消費が示された。ベンジルアミンの大部分を減圧下で除去した。残渣をＴＨＦ／イソプロパノール（２：１）中に溶解し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性化して、分取ＨＰＬＣによる精製に供した。（カラム：Ｖｙｄａｃ  ２０８ＴＰ１０５０（ＲＰ−Ｃ８）、検出器：ＵＶ（２１５ｎｍ）、流速：５０ｍＬ／分、溶離液Ａ：水／アセトニトリル（８５：１５）＋０．１％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：ＴＨＦ＋０．１％ＴＦＡ、２１分間以上かけて３８％から５９％のＢの勾配、ＲＴ＝１９．３分間）。生成物を含む分画を回収した。ＴＨＦの大部分を減圧下で除去した。残りの溶液を飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液で塩基性化し、ジクロロメタンで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過して、蒸発乾固し、減圧下で乾燥した。生成物を、Ａｌｏｘ−Ｎ（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ４）での石油エーテル／酢酸エチル（４：１）＋２％エタノールでのクロマトグラフィーによってさらに精製した。収量：無色のオイルとして２β−（Ｎ−ベンジルアミノ）−３α−ヒドロキシ−５α―コレスタン２７ｍｇ（１０％）。
【０１０６】
ＭＳ（ＥＳＩ）：４９４．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１０７】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６３（ｓ，１Ｈ），０．６５−０．７５（ｍ，１Ｈ），０．８０−１．４０（ｍ，３２Ｈ）１．４５−１．７０（ｍ，８Ｈ），１．７１−１．９１（ｍ，３Ｈ），１．９５（ｄｍ，Ｊ＝１２．６，１Ｈ），２．８４（ｄｍ，Ｊ＝４．６，１Ｈ），３．７５（ｄ，Ｊ＝１３．２，１Ｈ），３．８３（ｄｍ，Ｊ＝４．２，１Ｈ），３．８７（ｄ，Ｊ＝１３．４，１Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），７．３２（ｍ，４Ｈ）。
【０１０８】
塩酸塩としての２β−アミノ−３α−ヒドロキシ−５α―コレスタン（１ｇ）の調製
２β−（Ｎ−ベンジルアミノ）−３α−ヒドロキシ−５α―コレスタン（２５ｍｇ、５０．６μｍｏｌ）をジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解し、炭素担持パラジウム（１０％）２０ｍｇの存在下に常圧で一晩かけて水素化した。粗混合物の質量分析では変換は示されなかった。別途の触媒５０ｍｇとジクロロメタン／メタノール（４：１）３ｍＬを添加し、さらに２４時間水素化を続けた。その後、石油エーテル／酢酸エチル（４：１）＋１０％ジクロロメタン＋３％メタノールを用いたＴＬＣ分析では、完全な変換が示された。セライト５７７の短いパッドを用いたろ過によって触媒を除去した。ジクロロメタン／メタノール（７０：３０）（３００ｍＬ）での洗浄を用いて物質を確実に完全に回収した。減圧下で溶媒を除去し、減圧下で乾燥すると、無色の固体１８．４ｍｇ（９０％）が得られ、この固体をジエチルエーテル（４．５ｍＬ）及びイソプロパノール数滴中に溶解した。ジチルエーテル（６０μＬ）中の１Ｍ ＨＣｌの溶液を添加して、ジエチルエーテル（４ｍＬ）で希釈し、冷却することで塩酸塩を沈殿させ、この沈殿物を膜ろ過によって回収して、ジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥した。収量：無色固体として２β−アミノ−３α−ヒドロキシ−５α―コレスタンヒドロクロリド１７ｍｇ（７７％）。
【０１０９】
ＭＳ（ＥＳＩ）：４０４．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１１０】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝０．６２（ｓ，３Ｈ），０．６２−０．６９（ｍ，１Ｈ），０．７６−１．８０（ｍ，３９Ｈ），１．９２（ｄｍ，Ｊ＝１２．３，１Ｈ），３．１４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２），３．７２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），５．１７（ｄ，Ｊ＝３．７，１Ｈ，ＯＨ），８．０４（ｂｒ ｓ，３Ｈ，ＮＨ３＋）。
【０１１１】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ８：２）：δ＝０．５３（ｓ，３Ｈ），０．６４（ｍ，１Ｈ），０．６９−１．６０（ｍ，４０Ｈ），１．６５−１．７８（ｍ，３Ｈ），１．８５（ｄｍ，Ｊ＝１２．６，１Ｈ），３．１５（ｄｍ，Ｊ＝６．１，１Ｈ），３．８４（ｂｒ ｓ，ＯＨ，ＮＨ２，Ｈ−３）。
【０１１２】
実施例８及び９：３β−アミノメチル−５α−コレスタン（１ｈ）及び３α−アミノメチル−５α−コレスタン（１ｉ）の調製
化合物１ｈ及び１ｉを、文献の手順に従った(Oldenziel, J. Org. Chem. 42 (1977), 3114-3118)市販のトシルメチルイソシアニド（ＴｏｓＭＩＣ）での処理により、市販の５α−コレスタン−３−オンをエピマーニトリルの混合物、すなわち３α−及び３β−シアノコレスタンに変換することによって調製した。その後、エピマーのクロマトグラフィーによる分離と単離したニトリルの水素化アルミニウムリチウム還元により、化合物１ｈ及び１ｉを得た。
【０１１３】
３α−及び３β−シアノコレスタンの分離は、石油エーテル／酢酸エチル（１０：１）又は石油エーテル／ジクロロメタン（２：１）のいずれかを溶離液として使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって、又は水を溶離液Ａとし、ＴＨＦを溶離液Ｂとして、４０分間以上かけて４０から７０％のＢの勾配を用いた逆相Ｃ８カラムでの分取ＨＰＬＣによって達成された。
【０１１４】
３α−アミノメチル−５α−コレスタン（１ｉ）の調製
不活性雰囲気中、水素化アルミニウムリチウム（１．６８ｇ、４４．３ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）に懸濁し、混合物を撹拌しながら加熱還流した。無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）中の３α−シアノ−５α−コレスタン（７．２８ｇ、１８．３ｍｍｏｌ）の溶液を１５分間以上かけて滴下した。混合物をさらに９０分間還流で撹拌し、その後、石油エーテル／ジクロロメタン（１：１）中でのＴＬＣ分析により、出発物質は完全に消費されたことが示された。水を滴下して反応を停止させた。混合物を水とジエチルエーテルに分離し、水層をジエチルエーテルと酢酸エチルで複数回抽出した。混合有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過して、蒸発乾固した。残渣をジクロロメタン／メタノール（９：１）中に溶解し、セライト５７７の短いプラグを通じてろ過して、無機物質を除去した。溶媒を除去し、減圧下で乾燥して、化合物１ｉ  ６．６０ｇ（９０％）を無色の固体として得た。
【０１１５】
ＭＳ（ＥＳＩ）：４０２．５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１１６】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ８：２）：δ＝０．６７（ｓ，３Ｈ），０．７０−０．７３（ｍ，１Ｈ），０．８０−１．７２（ｍ，４１Ｈ），１．７５−１．８７（ｍ，２Ｈ），１．９９（ｄｍ，Ｊ＝１２．５，１Ｈ），２．０８（ｍ，１Ｈ），３．００（ｍ，２Ｈ）。
【０１１７】
塩酸塩としての３β−アミノメチル−５α−コレスタン（１ｈ）の調製
化合物１ｈを、化合物１ｉに関する記載と同様のプロトコールを用いて調製した。粗生成物をジエチルエーテル（１０ｍＬ）に溶解し、ジエチルエーテル（３５ｍＬ）中の１Ｍ ＨＣｌの添加によって１ｈの対応する塩酸塩を沈殿させた。形成された固体をろ取し、ジエチルエーテルで洗浄して、高真空で乾燥して、塩酸塩としての１ｈを無色の固体（０．３６ｇ、６８％）として得た。
【０１１８】
ＭＳ（ＥＳＩ）：４０２．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１１９】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ８：２）：δ＝０．６７（ｓ，３Ｈ），０．７０（ｍ，１Ｈ），０．７９（ｓ，３Ｈ），０．８６−１．３８（ｍ，３１Ｈ），１．４９−１．５８（ｍ，３Ｈ），１．６７（ｍ，３Ｈ），１．７７−１．８５（ｍ，２Ｈ），１．９９（ｄｍ，Ｊ＝１２．６，１Ｈ），２．７７（ｄ，Ｊ＝５．２，１Ｈ）。ＮＨ３＋は明瞭には視認できない。
【０１２０】
実施例１０：塩酸塩としての３α−アミノメチル−３β−ヒドロキシ−５α−コレスタン（１ｊ）の調製
化合物１ｊを、市販の５α−コレスタン−３−オンから、対応するＯ−トリメチルシリル保護されたシアンヒドリン誘導体(Evans, J. Org. Chem. 39 (1974), 914-917)及びその後の水素化アルミニウムリチウムでの処理とそれに続くＨＣｌ沈殿により、その塩酸塩として調製した。シアンヒドリン中間体は精製せず、粗物質のまま水素化還元に供した。
【０１２１】
水素化アルミニウムリチウムでのシアンヒドリン誘導体の還元による化合物１ｊの調製は、化合物１ｉに関する先の記載と同様に達成され、対応する塩酸塩の形成は、化合物１ｈに関する先の記載と同様に達成された。
【０１２２】
ＭＳ（ＥＳＩ）：４１８．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２３】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．４８（ｓ，３Ｈ），０．５９−１．５２（ｍ，４２Ｈ），１．５８−１．７１（ｍ，１Ｈ），１．７６−１．８４（ｍ，１Ｈ），２．８４（ｂｒ ｓ，２Ｈ）。ＮＨ３＋は明瞭には視認できない。
【０１２４】
実施例１１：塩酸塩としての３β−アミノエチル−５α−コレスタン（１ｋ）の調製
化合物１ｋを、文献に記載されているように(Karagiozov, S. K.; Synth. Commun. 2004, 34(5), 871-888)、Ｈｏｒｎｅｒ−Ｗａｓｗｏｒｔｈ−Ｅｍｍｏｎｓプロトコールを使用して、市販の３−コレスタノン及びジエチルシアノメチルホスホネートから出発して調製した。生じたα，β−不飽和ニトリルを、活性炭担持パラジウムを触媒とする標準的水素化によって対応するニトリルに変換した。その後のニトリルの対応するアミンへの還元は、ジエチルエーテル中の水素化アルミニウムリチウムを用いて達成された。最後に、ジエチルエーテル中の塩酸の市販溶液を用いた沈殿により、化合物１ｋをその塩酸塩として非常に純粋な形態で得た。
【０１２５】
ＭＳ（ＥＳＩ）：４１６．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２６】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６７（ｓ，３Ｈ），０．７１−１．６９（ｍ，４４Ｈ），１．７８−１．８５（ｍ，１Ｈ），２．６１（ｍ，２Ｈ）。ＮＨ３＋は明瞭には視認できない。
【０１２７】
実施例１２：トリフルオロ酢酸塩としての（５α−コレスタン−３β−オール）メチル［２−（トリメチルアンモニオ）−エチル］ホスフェート（１ｌ）の調製
化合物１ｌを、上記の一般的合成の記述において述べたように、市販の試薬、メチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト、テトラゾール、コリントシラート、Ｎ−フェニルイミダゾリウムトリフルオロメタンスルホネート及びｔｅｒｔ−ブチルペルオキシドを使用したホスホロアミダイト法を用いて、市販のジヒドロコレステロールからワンポット手順で調製した。粗生成物を、次に、分取ＨＰＬＣによって精製し、対応するトリフルオロ酢酸塩を単離した。
【０１２８】
ＭＳ（ＥＳＩ）：５６８．４Ｍ＋。
【０１２９】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６３（ｓ，３Ｈ），０．６３（ｍ，１Ｈ），０．７０−２．００（ｍ，４２Ｈ），３．２２（ｓ，９Ｈ），３．７１（ｄ，Ｊ＝１１．３，３Ｈ），３．７６（ｍ，２Ｈ），４．２３（ｍ，１Ｈ），４．３９（ｍ，２Ｈ）。
【０１３０】
実施例１３：塩酸塩としての３−アザ−Ａ−ホモ−５α−コレスタン（２ａ）の調製
化合物２ａを、Ｄｏｏｒｅｎｂｏｓら(Doorenbos, NJ. ; J. Org. Chem. 1961, 26, 2548-2549)によって記載されているように、市販のコレスタン−３−オンからＢｅｃｋｍａｎｎ型転位反応において対応するオキシムを介して調製した。
【０１３１】
得られた物質の融点及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは公表データ(Takahashi, T.T.; J. Chem. Soc. Perkin I 1980, 1916-1919) と一致した。
【０１３２】
実施例１４：塩酸塩としての４−アザ−５α−コレスタン（２ｂ）の調製
化合物２ｂを、市販のコレスト−４，５−エン−３−オンから、４，５−ビスヒドロキシル化、３−ケトの３−ヒドロキシへの還元、メタノール中の四酢酸鉛又は過塩素酸のいずれかを用いた３，４，５−トリオールの酸化的開裂、生じたメチルエステルのけん化、加圧下でのアンモニア処理による４−アザコレスト−４，５−エン−３−オンへの縮合、５，６−二重結合の水素化、及び生じたラクタムの、水素化アルミニウムリチウムを用いた還元の連続反応によって調製した(Boucza-Tomaszewski, Z.; Tetrahedron Lett. 1986, 27, 3767-3770; Doorenbos, N.J. ; J. Org. Chem. 1961, 26, 2546-2548; Shoppee, C.W. ; J. Chem. Soc. 1962, 2275-2285)。２ｂの別の調製方法が McKenna and Tulleyによって記載されている(McKenna, J.; J. Chem. Soc. 1960, 945)。得られた物質の融点及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは公表データ(Pradhan, S. K.; Heterocycles 1989, 28(2), 813-839)と一致した。
【０１３３】
実施例１５：ウイルスの複製及び感染性アッセイ（フォーカス減少アッセイ(Focus Reduction Assay)）
以下では、上記で同定した化合物を、ウイルス複製を阻害する及び／又はウイルス感染性を低下させる上でのそれらの効力に関して評価した。対応するウイルス病原因子として、インフルエンザを使用した。抗ウイルス作用を、伝統的なプラーク減少アッセイと等価のウイルス力価測定によって評価した。本アッセイは、マイクロタイタープレートで実施し、細胞ＥＬＩＳＡとして展開した。細胞（メイディン・ダービーイヌ腎臓細胞、ＭＤＣＫ）を試験化合物の連続希釈液と共に５分間プレインキュベートし、その後、連続希釈したウイルスに感染させた。ウイルス複製及び感染性アッセイの有効性（ＩＣ５０及びＩＣ９０値、すなわちウイルス複製の５０％又は９０％が阻害される濃度によって特徴づけられる）を以下で記載するように評価し、同じく有効性の判定に使用される細胞モデルでの毒性と比較した。化合物を、一定の濃度範囲内でウイルス複製及び感染性の阻害に関して試験する。この濃度範囲において、毒性は認められなかった。ウイルス複製の５０％又は９０％が阻害される濃度を算定することによって定量化を行った。対応する値をそれぞれ「ＩＣ５０」又は「ＩＣ９０」と表す。これに関して、「阻害なし」（すなわちゼロ）は、溶媒ビヒクル単独、すなわち試験化合物を含まない溶媒において生じる阻害と定義される。「完全な阻害」又は１００％阻害は、フォーカスの不存在によって定義される。
【０１３４】
以下の物質をフォーカス減少アッセイに使用する：低保持力チューブ（low retention tubes）及びガラス製希釈プレート（７０％エタノールから、フード下で乾燥）；２つのサーモミキサー、１．５ｍＬエッペンドルフ及び９６穴ブロック；試験化合物希釈液を調製するための９６穴ガラスプレート又はガラス被覆プレート（Ｚｉｎｓｓｅｒ又はＬａｂ  Ｈｕｔ）；１から２日齢のＭＤＣＫ細胞を含むＣｏｓｔａｒ  ９６穴プレート（黒色）又はガラス被覆Ｌａｂ  Ｈｕｔプレート；公知の力価を有するウイルスアリコート；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｃｅｌｌｉａｎｃｅから市販、カタログ番号８２−０４６−４）を添加したＩＭ（感染培地）；−８０℃でアリコートとして保存した、トリプシンの２ｍｇ／ｍＬ保存溶液；１プレート当たり２５０ｍＬの量で使用時毎に新たに調製したＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、１：５００希釈）中のグルタルアルデヒドの０．０５％溶液（水中２５％、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ  ５８８２、−２０℃で保持）；細胞Ｅｌｉｓａ展開のための抗体；Ｐｉｅｒｃｅ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ）基質。ＭＤＣＫ細胞及びヒトインフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／ＰＲ８／３４株（Ｈ１Ｎ１））はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）より入手した。
【０１３５】
以下の作業常用手順を用いてフォーカス減少アッセイを実施する：
【０１３６】
工程１：試験化合物溶液の調製
ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ、５ｍＭ又は３ｍＭ 保存溶液として−２０℃で保存した試験化合物を３７℃で解凍し、透明な溶液を得るため、必要に応じて超音波処理する。ＩＭをサーモミキサーにて３７℃で低保持力チューブ中で予備加熱し、試験化合物保存溶液を以下方法で添加する（１０ｍＭ試験化合物保存溶液について算定した例）：１００μＭ試験化合物溶液に関して：ＩＭ  １０７８μＬ＋試験化合物保存溶液２２μＬ；５０μＭ試験化合物溶液に関して：ＩＭ  １０８９μＬ＋試験化合物保存溶液１１μＬ；２５μＭ試験化合物溶液に関して：ＩＭ  １０９４μＬ＋試験化合物保存溶液５．５μＬ；１０μＭ試験化合物溶液に関して：ＩＭ  １０９８μＬ＋試験化合物保存溶液２．２μＬ。生じた試験化合物溶液を３０から６０分間振とうし、サーモミキサーマイクロプレートブロックにおいて３７℃で予備加熱しておいた９６穴ガラスプレートに移す。２つの力価測定プレートについて１つのガラスプレートを使用し、左半分にはプレート１用の試験媒質を入れ、右半分にはプレート２用の試験培地を入れる。各々の穴に試験化合物溶液又はコントロール培地２５０μＬを入れる（以下のテンプレート参照）。最後に、試験化合物希釈液（各々１００μＬ）を、マルチチャネルピペットを用いてガラス製希釈プレートからＭＤＣＫ細胞培養プレートに移す。
【０１３７】
工程２：感染
ＭＤＣＫ細胞単層を含む９６穴プレートのエッジカラムを試験化合物溶液で処理し、偽感染させる；それらをデンシトメトリー評価（以下の「アッセイ結果の定量化」参照）のためのバックグラウンドコントロールとして用いる（ウエルａ）。さらに３つのウエルｂ、ｃ及びｄに、２×１０−６フォーカス形成単位希釈が５０から１００フォーカスを生成するように、ウイルス希釈液、例えば２×１０−６フォーカス形成単位、１×１０−６フォーカス形成単位又は５×１０−７フォーカス形成単位を添加する。適切な希釈はウイルス力価測定によって決定した。すべてのウイルス希釈液をＩＭ中で調製する。ウイルスをＩＭ中で１：６４に事前希釈する（すなわちＩＭ  ６３０μＬ＋ウイルス溶液１０μＬ）。１：６４ウイルス希釈液を冷却ＩＭ中で１：２０００（＝１）に希釈し、続いてさらに２回の２倍希釈を行う。１つの９６穴プレートについて、そのような溶液３ｍＬ、１．５ｍＬ及び１．５ｍＬを調製し、２つのプレートについて６ｍＬ、３ｍＬ及び３ｍＬを調製して、これらの溶液を４℃に維持する。トリプシンの２０μｇ／ｍＬ溶液を調製し、０．２μｍ滅菌シリンジフィルターに通して、その後ＩＭ中で４μｇ／ｍＬに希釈する。感染の１０分前に、等容量、即ち、３ｍＬ又は６ｍＬのトリプシン希釈液（４μｇ／ｍＬ）をウイルス希釈液又はＩＭ（偽感染用）に添加し、感染まで４℃に維持する。細胞単層をＩＭ  ２×２００μＬで洗浄する。ＩＭ中の試験化合物又は溶媒コントロールの１００μＬをマルチチャネルピペットで添加し、各々のカラム（２から１１）が単一の試験化合物溶液を含むようにする。カラム１と１２にはＩＭを添加し、エッジ効果が極微であれば溶媒不含コントロールとして使用する。ＩＭ  １００μＬ及びトリプシン２μｇ／ｍＬをマルチチャネルピペットで列ＡとＨ（偽感染）に添加する。その他の列には、ピペットチップを毎回交換して、ウイルス希釈液を添加する。各々の添加後、ウエルの内容物をピペッティングで撹拌する。プレートを３７℃で１６時間インキュベートする。偽感染ウエルにおける毒性／細胞形態／沈殿を顕微鏡検査によって評価する。プレート全体を、ＰＢＳ中の０．０５％グルタルアルデヒド溶液２５０ｍＬで少なくとも２０分間かけて、室温にて固定及び液浸／充填することによって感染を終了させる。
【０１３８】
工程３：検出
グルタルアルデヒド溶液を振とう除去し、プレートをＰＢＳでリンスして、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ５０μＬで３０分間透過化させ、再びＰＢＳでリンスする。ウエルを、揺動器上にて室温で１時間又は４℃で一晩かけて、ＰＢＳ＋１０％熱不活化ウシ胎仔血清の混合物（ブロッキング液）２００μＬ／穴でブロッキングし、続いてブロッキング液中で１：１０００希釈した抗ウイルス核タンパク質抗体(ＭＡｂ ｐｏｏｌ ５, ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉ７６５０−０４Ａ)５０μＬ／穴で１時間処理する。抗体を、ＴＢＳ（トリス緩衝食塩水）＋０．１％Ｔｗｅｅｎで５分間ずつ３回洗浄することによって除去する。その後、ブロック液中で１：２０００希釈した、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウス二次抗体５０μＬ／穴と共に１時間インキュベートする。プレートを室温で１時間揺動器上に置き、ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで３回及びＴＢＳで１回洗浄する。
【０１３９】
工程４：画像化
最後の洗浄液の除去後、マイクロタイターウエルに、使用の直前に等容量の２つの成分を混合することによって調製した基質溶液（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ，Ｐｉｅｒｃｅ  ３４０７６）５０μＬを満たす。次にプレートをＣＣＤカメラＬＡＳ  ３０００（Ｆｕｊｉ／Ｒａｙｔｅｓｔ）のフレネル（Fresnel）レンズラックに入れ、高解像度で１０分間露出する。
【０１４０】
工程５：アッセイ結果の定量化
画像をデンシトメトリーで評価する。最初にバックグラウンドを減算する（ウエルａ、上記参照）。デンシトメトリー強度は、以下に従って算定する：
Ｉ＝［０．２５×ｉ（ウエルｂ）＋０．５×ｉ（ウエルｃ）＋ｉ（ウエルｄ）］／１．７５
（式中、ｉは関連ウエルｂ、ｃ又はｄについて測定された面積当たりの強度の１００００倍と定義される）。この計算は標準的なプラークアッセイに対応する。係数は個々の値の重み付けを示す。
【０１４１】
結果は、以下のように定義される阻害率％として表す：
阻害率％＝１００−コントロール％
（式中、コントロール％は、試験化合物の任意のＩに１００を乗じ、適切な溶媒コントロールのＩで除することによって算定される。Ｉがコントロール又は溶媒コントロールである場合、その値は１００％と設定される）。
【０１４２】
アッセイ結果を定量化するためのこの評価を、一連の異なる濃度の試験化合物、例えば１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、２．５μＭ、０．２５μＭ、０．１μＭについて実施し、それにより、ＩＣ５０／ＩＣ９０評価の前にＭＤＣＫ  ＩＩ細胞を用いた毒性アッセイで評価した場合、このシリーズで使用される最高濃度が非毒性であることが保証される。各濃度についての数値は３つの重複する系での実験の平均値である。得られた用量−応答結果を、４パラメータロジスティック関数に基づくＳｉｇｍａｐｌｏｔ  ９．０ソフトウエア（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いて処理することによりＩＣ５０及びＩＣ９０値が得られる。
【０１４３】
様々なコレステリルアミンは、ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）ウイルス複製アッセイ（インフルエンザ感染の細胞モデルとして）において強い阻害作用を示した。特に、化合物１ａから１ｌ、２ａ及び２ｂは良好な結果を示した（表１）。理論に拘束されるわけではないが、コレスタン骨格とステロイドＡ環に結合したアミノ官能基との組み合わせ（コレステリルアミン及びその誘導体）又はその部分であるアミノ官能基との組み合わせ（アザコレスタン、アザホモコレスタン又はその誘導体）は、ウイルス複製の阻害を導く構造モチーフであると考えられる。これに対し、硫酸コレステリルは、１０、２０及び５０μＭの濃度で試験した場合、ウイルス複製の阻害を示さず、５０μＭ以上の濃度で毒性が認められた。また、アッセイ条件下で負に荷電した官能基を有するコレステリル−３β−グリコール酸、及びコレステリルコア構造のＡ管に結合した窒素原子を有する３−オキシモコレスタンは、本明細書で記載するアッセイ条件下で阻害を示さなかった。さらに、３−ケト−４α，５α−コレスタンジオール（ＩＣ５０  １６．０μＭ）及び３β，４α，５α−コレスタントリオール（ＩＣ５０  １６．１μＭ）は、インフルエンザ感染の疾患モデルとして使用したウイルス複製アッセイにおいて弱い効力を示した。ステロイドＡ環に局在する強い極性は、抗ウイルス活性を提供するには十分でないと考えられる。さらに、アミノ官能基の存在が、化合物の特に高い活性を得るために必要であると考えられる。しかし、トランス−２−アミノメチル−１−シクロヘキサノールは全く阻害作用を示さない。これは、環状炭化水素モチーフに結合したアミノ部分又はアミノアルコール部分が抗インフルエンザ活性の唯一の理由ではないことを明らかにする。
【表１】
2010511648.tif 000013
【０１４４】
本明細書で提示するデータによって明らかにされるように、化合物１ａから１ｌ、２ａ及び２ｂはインフルエンザ感染における医薬的介入のための好ましい化合物である。これらの化合物のうち８つ、すなわち化合物１ａ、１ｂ、１ｇ、１ｈ、１ｉ、１ｊ、１ｋ及び２ａは、インフルエンザウイルス複製アッセイにおいて特に良好な成績を示した。
【０１４５】
さらに、これらの化合物は、溶解度試験及び治療指数において良好な成績を示した。極性媒質中でのコレステリルアミンの溶解度は、ステロイドＡ環に結合した水素原子のヒドロキシ官能基による置換を増加させると共に上昇し、それ故、効力のわずかな低下は、高いバイオアベイラビリティーを達成し得る溶解度の増大によって相殺される。これに関して、化合物１ｇ及び１ｉは、ウイルス感染、特にインフルエンザ感染の治療に好ましい分子である。
【０１４６】
実施例１６：抗菌活性アッセイ
このアッセイの目的は、抗結核作用を有する化合物の同定であり、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖを結核の疾患モデルとして使用した。抗菌アッセイにおける効力（ＭＩＣ９０）を以下で記載されるように評価し、哺乳動物Ｖｅｒｏ細胞における毒性と比較した。 
【０１４７】
好気的複製アッセイとして使用したマイクロプレートＡｌａｍｅｒ  Ｂｌｕｅアッセイ（Microplate Alamar Blue Assay）（ＭＡＢＡ）
試験化合物によるヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖの増殖阻害の測定を文献の記載に沿って行った(Collins, Antimicrob. Agents Chemother. 41 (1997) 1004-1009; Franzblau, J. Clin. Microbiol. 36 (1998), 362-366; Pauli, Life Sci. 78 (2005), 485)。阻害率は、１−（試験ウエル蛍光単位／細菌のみを含有する３つのウエルの平均蛍光単位）×１００と定義した。≧９０％の阻害を生じさせる最も低い薬剤濃度をＭＩＣ９０として考慮した。ここで提示する数値は３つの重複する系での実験の平均値である。
【０１４８】
非複製性持続アッセイ（non-replicating persistence）として使用した低酸素回収アッセイ（Low Oxygen Recovery Assay）（ＬＯＲＡ）
非複製性持続（ＮＲＰ）の生理的状態は、多くの細菌感染における抗菌薬耐性の原因である。結核においては、６か月レジメンを短縮するために、このＮＲＰサブポピュレーションを標的することが不可欠である。文献に記載されているように(Cho, S. H.; Antimicrob. Agents Chemother. 2007, 57(4), 1380-1385)ＮＲＰ又は定常期のヒト型結核菌に対して試験化合物をスクリーニングするために高スループットのルミネセンスに基づく酸素回収アッセイ（ＬＯＲＡ）を使用した。細菌ルシフェラーゼ遺伝子を駆動するアセトアミダーゼプロモーターを有するプラスミドを含むヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖを、発酵槽での長時間培養によって低酸素条件に適応させ、好気的条件下に１０日間維持したマイクロプレート培養物においてＭＩＣ９０を測定した。阻害率をＭＡＢＡと同様にして測定した。
【０１４９】
細胞傷害活性の決定
Ｖｅｒｏ細胞を用いた試験化合物の細胞毒性活性の評価を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６水性非放射性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ）を使用して先に記載されているように(Cantrell, J. Nat. Prod. 59 (1996), 1131-1136)実施した。化合物が活性を示した濃度範囲内では毒性は認められなかった。
【０１５０】
結果
様々なコレスタン及びコレステン誘導体の阻害作用の評価に、上記のＭＡＢＡをヒト型結核菌による感染のモデルとして使用した際、本発明に従って使用されるコレステリルアミン誘導体も細菌増殖を阻害することが認められた。例えば化合物１ａ、１ｆ、１ｈ、１ｉ、２ａ及び２ｂは良好な成績を示した（表２）。ステロイドＡ環に結合したアミノ官能基とコレスタン骨格の組合せは、マイコバクテリア増殖、特にヒト型結核菌増殖の阻害における好ましい構造モチーフである。これに対し、硫酸コレステリル又はトランス−２−アミノメチル−１−シクロヘキサノールは、１００μＭまでの濃度で試験した場合、マイコバクテリアに対する阻害作用を示さなかった。
【０１５１】
また、ステロイドＡ環へのアミノ部分の組込みは、ＭＡＢＡアッセイによって例示されるように（表２）細菌増殖を効率的に阻害するアザコレステリル誘導体を提供する。それ故、ステロイドＡ環に組み込まれた窒素とコレスタン骨格の組合せあるいは拡大又は縮小Ａ環を有する類似誘導体は、化合物２ａ及び２ｂによって例示されるように、マイコバクテリア増殖、特にヒト型結核菌増殖の阻害のための好ましい構造モチーフである。
【表２】
2010511648.tif 000014
【０１５２】
化合物１ａ、１ｆ、１ｈ、１ｉ、２ａ及び２ｂは、マイコバクテリア性疾患、特に結核の医薬的介入のための好ましい化合物である。これらの化合物のうちの２つ、すなわち化合物１ｆと１ｈは、著明に低いＭＩＣ９０値によって実証されたように、マイコバクテリアアッセイにおいて特に良好な成績を示した。それ故、化合物１ｆ及び１ｈは、結核等のマイコバクテリア性疾患の治療用の医薬組成物に使用される化合物としてさらに一層好ましい。
【０１５３】
持続性細菌サブポピュレーションを標的とする試験化合物の性能を評価した際、化合物１ａ及び２ａは、ＬＯＲＡモデルにおいて特に良好な成績を示した。それ故、化合物１ａ及び２ａは、持続性ヒト型結核菌表現型の治療用の医薬組成物における使用に特に好ましい化合物である。
【国際調査報告】
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