(57)【要約】  本発明は、一般的に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に、そして特に、患者においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法に、そしてこうした方法で使用するのに適した免疫原に関する。本発明はまた、診断試験キットおよび該キットを用いる方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において、免疫応答を誘導する方法であって、前記哺乳動物に、前記誘導を達成するのに十分な量で、伝染ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）配列サインを含む免疫原を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記伝染ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列サインがコンセンサスＥｎｖ中に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記コンセンサスＥｎｖがＭ群コンセンサスＥｎｖである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記伝染ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列サインが、ＨＩＶ  Ｅｎｖ切断速度に影響を及ぼすか、またはＶｐｕが仲介するＣＤ４下方調節をＨＩＶが達成する能力を改変する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記伝染ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列サインがＨＩＶ  Ｅｎｖのシグナル配列中にある、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記伝染ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列サインがＨＩＶ−ＥｎｖのＶ１領域中にある、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記伝染ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列サインが、伝染ＨＩＶビリオンの中和感受性またはＣＣＲＳ共受容体への結合のためのＨＩＶ  Ｖ３ループの曝露に影響を及ぼす、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記伝染ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列サインがＨＩＶ  ＥＮＶのＣ１領域中にある、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記伝染ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列サインが、ｇｐ４１−ｇｐ１２０相互作用の安定性に影響を及ぼす、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
伝染ＨＩＶ  Ｅｎｖ配列サインおよびキャリアーの混合物を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年３月２７日出願の米国仮出願第６０／９０７，２５９号から優先権を請求し、該出願の全内容は、本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、米国衛生研究所によって授与される助成金番号Ａ１０６７８５０１のもとに米国政府の援助を受けて作成された。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
技術分野
本発明は、一般的に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に、そして特に、患者においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法に、そしてこうした方法で使用するのに適した免疫原に関する。本発明はまた、診断試験キットおよび該キットを用いる方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＩＶワクチンを開発するために、ウイルス送達は最も困難な問題の１つであり続けている（Ｇａｓｃｈｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：２３５４（２００２））。ＨＩＶ−１エンベロープに対する抗体は、感染前に前もって高レベルで存在した場合、そして抗体が曝露免疫不全ウイルス株に対して特異性を有する場合に、防御性であることが示されてきている（Ｍａｓｃｏｌａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：２０７−２１０（２０００）；  Ｍａｓｃｏｌａら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：４００９−４０１８（１９９９））。慢性ＨＩＶ感染被験体におけるウイルス多様性は非常に多様であるが、ＨＩＶ−１伝染後のウイルス多様性は減少する（Ｚｈａｎｇら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：３３４５６−３３５６（１９９３）；  Ｚｈｕら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１１７９−１１８１（１９９３）；  Ｒｉｔｏｌａら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１１２０８−１１２１８（２００４））。ドナーにおける稀な変異体がレシピエントに選択的に移動することもありうる（Ｗｏｌｉｎｓｋｙら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１１３４−１１３７（２０００））。
【０００４】
急性ＨＩＶ感染において、ｇａｇに比較して、ＨＩＶ−１エンベロープにおいては、不釣り合いにより大きい多様性の喪失があり、伝染事象中に、ｅｎｖが仲介するウイルス選択があることが示唆される（Ｚｈａｎｇら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：３３４５６−３３５６（１９９３）；  Ｚｈｕら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１１７９−１１８１（１９９３））。最近のデータによって、急性ＨＩＶ感染中に、短くされた可変ループを持つ中和感受性ｅｎｖが選択的に伝染することが示されてきている（Ｄｅｒｄｅｙｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：２０１９−２０２２（２００４））。ＳＩＶ急性感染中、Ｂ細胞が枯渇すると、ＳＩＶ感染の制御が防止されることもまた示されてきている（Ｍｉｌｌｅｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ｅ  ｐｕｂ  Ｆｅｂ．  ２８，  ２００７）。
【０００５】
本発明は、少なくとも部分的に、達成された場合、ＨＩＶに対する有効なワクチンを生じうる、ワクチン設計基準の同定から生じる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇａｓｃｈｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：２３５４（２００２）
【非特許文献２】Ｍａｓｃｏｌａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：２０７−２１０（２０００）
【非特許文献３】Ｍａｓｃｏｌａら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：４００９−４０１８（１９９９）
【非特許文献４】Ｚｈａｎｇら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：３３４５６−３３５６（１９９３）
【非特許文献５】Ｚｈｕら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１１７９−１１８１（１９９３）
【非特許文献６】Ｒｉｔｏｌａら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１１２０８−１１２１８（２００４）
【非特許文献７】Ｗｏｌｉｎｓｋｙら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１１３４−１１３７（２０００）
【非特許文献８】Ｄｅｒｄｅｙｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：２０１９−２０２２（２００４）
【非特許文献９】Ｍｉｌｌｅｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ｅ  ｐｕｂ  Ｆｅｂ．  ２８，  ２００７
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、一般的に、ＨＩＶに関する。本発明の特定の側面は、患者において、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法に、そしてこうした方法で使用するのに適した免疫原に関する。本発明のさらなる特定の側面は、診断試験キットに、そして該キットを用いる方法に関する。
【０００８】
本発明の目的および利点は、以下の説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】患者コンセンサス１００ブートストラップのＭＬツリー。
【図２】ＳＧＡ由来エンベロープクローン。
【図３】ハミング距離頻度（ｈａｍｍｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ）のＺ２０ヒストグラム。
【図４】均質（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）患者１０１２。
【図５】均質患者７０００１００５８。
【図６】不均質（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）患者Ｚ１８。
【図７】不均質患者ＳＣ３３。
【図８】不均質患者。
【図９】７３人の不均質患者。
【図１０】２７人の患者は、複雑な多ピーク分布を有し、〜１５％が不均質感染を示唆するハミング距離を有する。
【図１１】ＳＧＡ由来機能性エンベロープクローン。
【図１２】相互情報サイン：各垂直線は、１人の人に相当し、得られた配列数を高さによって示す。各位におけるアミノ酸の破壊を色によって示す。１１位は慢性においてより可変であり、そしてＰおよびＮを許容する。
【図１３】シグナルペプチドにおける１１位。
【図１４】ＮＮＳＳＧ＿Ｅ＿ＫＭＥＫＧ。
【図１５Ａ】急性伝染サイン。
【図１５Ｂ】急性伝染サイン。
【図１５Ｃ】急性伝染サイン。
【図１５Ｄ】急性伝染サイン。
【図１５Ｅ】急性伝染サイン。
【図１５Ｆ】急性伝染サイン。
【図１５Ｇ】急性伝染サイン。
【図１５Ｈ】急性伝染サイン。
【図１５Ｉ】急性伝染サイン。
【図１５Ｊ】急性伝染サイン。
【図１５Ｋ】急性伝染サイン。
【図１５Ｌ】急性伝染サイン。
【図１５Ｍ】急性伝染サイン。
【図１５Ｎ】急性伝染サイン。
【図１５Ｏ】急性伝染サイン。
【図１５Ｐ】急性伝染サイン。
【図１５Ｑ】急性伝染サイン。
【図１５Ｒ】急性伝染サイン。
【図１５Ｓ】急性伝染サイン。
【図１５Ｔ】急性伝染サイン。
【図１５Ｕ】急性伝染サイン。
【図１５Ｖ】急性伝染サイン。
【図１５Ｗ】急性伝染サイン。
【図１５Ｘ】急性伝染サイン。
【図１５Ｙ】急性伝染サイン。
【図１５Ｚ】急性伝染サイン。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、本明細書記載（特に以下の実施例を参照されたい）の伝染サインを含有する伝染ウイルス由来のＨＩＶ  Ｅｎｖおよびワクチン免疫原として該サインを用いる方法に関する。本発明はさらに、診断試験において診断ターゲットとして用いるための、示す感染サインを含有する伝染ウイルス由来のＨＩＶ  Ｅｎｖに関する。さらに、本発明は、コンセンサスＥｎｖ内に取り込まれたＨＩＶ  Ｅｎｖ伝染サイン（すなわち伝染ウイルス配列サインのアミノ酸を、それ以外はＭ群コンセンサスであるかまたはサブタイプコンセンサスであるＥｎｖの配列内に取り込んでもよい）に関する。さらに、本発明は、ＨＩＶ伝染ウイルスコンセンサスＥｎｖ（伝染ウイルスサインを含む）に、そして免疫原として該Ｅｎｖを用いる方法に関する。さらに、本発明は、ＨＩＶ伝染ウイルスコンセンサスＥｎｖ（伝染ウイルスサインを含む）に、そして試験のための診断ターゲットとして該Ｅｎｖを用いる方法に関する。
【００１１】
本発明は、少なくとも部分的に、一連のＨＩＶ−１急性および初期伝染患者で行われた研究から生じる。これらの患者由来のエンベロープ配列を、慢性感染患者の対照群と比較した。伝染ウイルスにおいて、伝染の隘路が見出されてきており、患者の７５％では、１つのウイルス種が伝染した証拠が、そして患者の約１５％では、多数の株が伝染した証拠がある（Ｅｎｖにおける伝染サインが、どのウイルスが伝染するかに関与すると考えられる）。伝染ウイルスに特徴的であるが、慢性ＨＩＶ株では特徴的でない伝染株エンベロープ・サインの同定が始まっている。本明細書に記載するのは、２つの初期伝染Ｅｎｖサイン、ならびにこれらのサインおよび伝染ＨＩＶ−１株データベースを用いて、ＨＩＶ−１ワクチン開発のために有効なＨＩＶ−１エンベロープ免疫原を設計する方法である。
【００１２】
以下の基準を満たすワクチンは、ＨＩＶ伝染を効率的に阻害すると予期されうる：
１．保存される機能性伝染エンベロープ三量体エピトープに結合する抗体の産生を誘導し；
２．数時間から数日以内に感染に応答しうるＢ細胞集団による抗体産生を誘導し；
３．粘膜表面で抗体産生を誘導し；
４．伝染部位で局所的に高力価の抗体を誘導し；そして
５．大規模なアポトーシスまたはアポトーシス仲介性免疫抑制を予防するかまたは制限する。
【００１３】
一般の当業者に周知の方法を用いて、本発明の免疫原を化学的に合成し、そして精製することも可能である。また、周知の組換えＤＮＡ技術によって免疫原を合成してもよい。本発明の免疫原をコードする核酸を、例えばＤＮＡワクチンの構成要素として用いてもよく、ここでコード配列は、裸のＤＮＡとして投与されるか、または例えば免疫原をコードするミニ遺伝子がウイルスベクター中に存在してもよい。コード配列は、例えば、複製または非複製アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、弱毒化結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ベクター、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）ベクター、ワクシニアまたは修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、別のポックスウイルスベクター、組換えポリオおよび他の腸管ウイルスベクター、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種細菌ベクター、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種細菌ベクター、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）ベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、またはタバコモザイクウイルスベクター中に存在してもよい。コード配列はまた、例えばＣＭＶプロモーターなどの活性プロモーターを含むＤＮＡプラスミドとして発現されてもよい。また、他の生存ベクターを用いて、本発明の配列を発現してもよい。好ましくはヒト細胞における発現を最適化するコドンおよびプロモーターを用いて、免疫原をコードする核酸の細胞内に導入することによって、患者自身の細胞において、本発明の免疫原の発現を誘導してもよい。ＤＮＡワクチンを作製し、そして用いる方法の例は、例えば、米国特許第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号、および第５，７０３，０５５号に開示される。
【００１４】
本発明には、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原、または該免疫原をコードする核酸配列を、薬学的に許容されうる送達系中に含む組成物が含まれる。免疫不全ウイルス感染の予防および／または治療のために、該組成物を用いてもよい。アジュバント（例えばミョウバン、ＡＳ０２１（ＧＳＫ由来）オリゴＣｐＧ、ＭＦ５９またはＥｍｕｌｓｉｇｅｎ）、乳化剤、薬学的に許容されうるキャリアーまたはワクチン組成物中でルーチンに提供される他の成分を用いて、本発明の組成物を配合してもよい。最適な配合物は、一般の当業者によって容易に設計可能であり、そしてこれには、即時放出および／または持続放出用の、そして全身免疫の誘導および／または局所粘膜免疫の誘導用の配合物が含まれてもよい（例えば配合物を鼻内投与用に設計してもよい）。皮下、鼻内、直腸内、膣内、経口、筋内、または他の非経口もしくは経腸経路、あるいはその組み合わせを含む、任意の好適な経路によって、本組成物を投与してもよい。免疫応答を誘導するのに十分な量で、例えば単一用量または多数用量として、免疫原を投与してもよい。最適免疫スケジュールは、一般の当業者によって容易に決定可能であり、そして患者、組成物および求める効果で多様でありうる。
【００１５】
本発明の組成物および投与措置の例には、例えば、抗体のためのＤＮＡプライム組換え水疱性口内炎（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ）ウイルス・ブーストおよび組換えエンベロープ・タンパク質ブースト、またはＤＮＡプライム組換えアデノウイルス・ブーストおよびエンベロープ・タンパク質ブーストとして発現される、コンセンサスもしくはモザイクｇａｇ遺伝子、およびコンセンサスもしくはモザイクｎｅｆ遺伝子、およびコンセンサスもしくはモザイクｐｏｌ遺伝子、および伝染サインを含むコンセンサスＥｎｖもしくは伝染サインを含むモザイクＥｎｖ、または伝染サインを含む野生型伝染ウイルスＥｎｖ、あるいは抗体誘導のみのため、アジュバント中のタンパク質として組換え体エンベロープのみが含まれる（米国出願第１０／５７２，６３８号およびＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３２９０７を参照されたい）。
【００１６】
本発明は、本発明の免疫原両方および／または該免疫原をコードする核酸および／または上述のベクター中のミニ遺伝子として発現される免疫原の直接の使用を意図する。例えば、免疫原をコードするミニ遺伝子を初回刺激および／またはブーストとして用いてもよい。
【００１７】
本開示を読むと、全エンベロープ遺伝子を用いてもよいし、またはその部分を（すなわちミニ遺伝子として）用いてもよいことが理解されるであろう。発現されたタンパク質の場合、タンパク質サブユニットを用いてもよい。
【００１８】
本発明にしたがって、ＨＩＶ−１に対する防御抗体の誘導を達成するため、ＨＩＶワクチン設計において、以下を用いてもよい：
１．以下の実施例に示す伝染サインを含有する野生型伝染ＨＩＶ−１株由来のＨＩＶ  ｅｎｖ構築物での免疫。
【００１９】
２．  ＣＯＮＳ（Ｌｉａｏら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５３：２６８−８２（２００６））、あるいはより新しいｍ群コンセンサス、２００３年ＣＯＮＴ、またはＣＯＮＡ  ２００３、ＣＯＮＢ  ２００３、またはＣＯＮＣ  ２００３などのサブタイプコンセンサスＥｎｖなどの慢性ＨＩＶ−１配列から発展している、コンセンサスＨＩＶ−１  Ｅｎｖ内へのこれらの伝染サインの取り込み。ロスアラモスＨＩＶ配列データベース由来の２００３年より後の配列から得られる、これらのコンセンサス配列のより後の型を用いてもよい。他のサブタイプ・コンセンサス遺伝子、例えばクレードＡＥ＿０１、ＡＧ組換え体、Ｇ、Ｆ等由来のものもまた用いてもよい。
【００２０】
３．個々の患者由来のコンセンサス配列のみに基づく伝染単離体ｅｎｖコンセンサスの発展。これは伝染ＨＩＶデータベースに非Ｂ配列を付加することを必要とする−これらの配列は、ＨＩＶ  ＡＩＤＳワクチン免疫学センターによって生成されている。
【００２１】
４．実施例に記載する任意のＥｎｖの発現は、これらが最も天然のコンホメーションにあることを必要としうる。したがって、ウイルス様粒子中のｇｐ１４０Ｃ（切断突然変異体）Ｆ（融合ドメイン欠失）型として、ｇｐ１４０Ｃ型として、ｇｐ１６０型として（Ｓａｉｌａｊａら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｆｅｂ  ２，  ２００７  ｅ  ｐｕｂ．）、またはｇｐ１４０のＣ末端でＧＣＮ４三量体化モチーフを用いた安定化三量体として（Ｐａｎｃｅｒａ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：９９５４−９９６９（２００５））、Ｅｎｖを発現してもよい。
【００２２】
５．あるいは、伝染サインがＥｎｖ安定化中和エピトープ上で与えられるならば、安定化エピトープを含有するＥｎｖ部分をサブユニットとして発現し、そして免疫に用いてもよい。
【００２３】
６．免疫系のＴ細胞アームによるＥｎｖ認識は、ＨＩＶワクチン設計に重要である（Ｗｅａｖｅｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：６７４５−５６（２００６））。したがって、これらのサインまたはこれらのサインを含有するコンセンサスＥｎｖを含む野生型伝染Ｅｎｖは、特定のＴ細胞エピトープのＴ細胞認識を安定化し、そしてＴ細胞ワクチン設計に好適でありうる。
【００２４】
７．  Ｔ細胞は、ＨＩＶゲノム全体の免疫原性エピトープを認識し（Ｌｅｔｖｉｎら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９：８６１−８６６（２００３））、そしてしたがって、伝染ウイルスの全ゲノム配列を伝染ＨＩＶデータベース内に包含すると、ＨＩＶゲノム全体に由来するＴ細胞エピトープを含む完全ＨＩＶワクチンの設計が促進されそして可能になりうる。
【００２５】
上記に示すように、本発明はまた、診断ターゲットおよび診断試験にも関する。例えば、伝染ウイルスサインを含有するエンベロープを、哺乳動物細胞の一過性または安定トランスフェクションによって発現してもよい（または例えば組換えワクシニアウイルスタンパク質として発現してもよい）。該タンパク質を、ＥＬＩＳＡ、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ試験、または他の診断試験において用いて、ＨＩＶ感染の最初期段階での患者由来の生物学的試料において、伝染ウイルスに対する抗体を検出してもよい。
【００２６】
本発明の特定の側面は、以下の限定されない実施例により詳細に記載されうる。（２００６年１２月２２日出願の米国出願第１０／５７２，６３８号、および２００６年８月２３日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３２９０７号もまた参照されたい。）
【実施例】
【００２７】
ＨＩＶ−１伝染ウイルスのエンベロープの性質決定は、エンベロープに基づく有効なワクチンの設計に非常に重要である。１９２人の個体由来の４２６０のＢクレードｅｎｖ配列をコドン並列させ、過剰突然変異（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ）配列または１００塩基より大きいギャップを含む配列を削除した。これらの配列を試験、検証および初期セットに分けた。頑強なサブタイプ内Ｂクレードを探すため、セットの患者コンセンサス配列に基づいて、尤度ツリー（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｔｒｅｅ）を生成した：特定の試料、特に米国およびトリニダード由来のＣＨＡＶＩ試料は、ツリー中で、別個の地理的系譜を有した（図１）。
【００２８】
試験セットは、検出可能なＨＩＶ特異的免疫を含まない２６人のＦｅｉｂｉｇ  ＩＩ、急性試料（Ｆｅｉｂｉｇら，  ＡＩＤＳ  １７：１８７１−１８７５（２００３））、抗体＋であった１４人のＦｅｉｂｉｇ  ＩＩＩ、急性ＨＩＶ感染（ＡＨＩ）試料、および４０人のマッチする慢性患者からなる。試料の第二のセットを検証セット用に用いた：再び、ＨＩＶ特異的免疫前の２６人のＦｉｅｂｉｇ  Ｉ−ＩＩ  ＡＨＩ試料、抗体陽性であった１４人のＦｅｉｂｉｇ  ＩＩＩ−ＩＶ  ＡＨＩ、およびロスアラモス・データベース由来の３８人のＢクレード慢性患者（Ｂａｉｌｅｙら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：４７５８−６２（２００６））。
【００２９】
図２は、２人のＡＨＩ患者由来の単一ゲノム増幅エンベロープクローンを示す。患者あたりおよそ４０のクローンを生成し、そしてこれらは非常に近い相同性を示し、クローン中に数アミノ酸の相違しかなかった。
【００３０】
初期感染におけるウイルス進化をモデリングするために、所定の世代数に関して予期される最大距離を計算するため、そして進化のシミュレーションを算出するため、以下の仮定を用いた：
・各世代で、各細胞は６つの細胞を感染させる
・突然変異率はμ＝３．４ｘ１０−５
・世代時間は２日間
・ハミング距離（ＨＤ）頻度はポワソン分布にしたがい、λ＝ＮＢｘμであり、式中、ＮＢは配列の長さ（塩基数）である
図３〜９は、これらの分析の結果を示す。
【００３１】
「均質患者」に関しては、７３／１００試料がコンピューターシミュレーションに基づくモデルとよく適合可能であり、そして単一ウイルスが感染を達成するのと一致する：
−ハミング距離分布において観察される単一ピーク
−比較的均質である
−Ｆｉｅｂｉｇ病期に基づいた、感染からの概算日数以内のＭＲＡからの概算日数
しかし、急性感染においては「選択的スイープ」の徴候が見出された：
−多くの試料が、感染からの概算時間より新しい、概算される最も新しい共通祖先（ＭＲＡ）を有する
・１９／２１の病期ＩＶ〜ＶＩ試料が、３週間前より新しい、最も新しい共通祖先（ＭＲＡ）を有する。
【００３２】
・６／１１の病期ＩＩＩ試料が、２週間前より新しいＭＲＡを有する。
【００３３】
−いくつかの試料は、残りの多様性を考慮すると予期されない、大量の同一配列を有する。
【００３４】
ここで提示される問題は、ＭＲＡまでの概算日数がしばしば、Ｆｉｅｂｉｇ病期を考慮して感染から予期される日数未満であるのはなぜかである。２つの説明があると考えられる。モデルとなる仮定が、ＭＲＡからの日数の一貫した過小評価を生じるバイアスを生じさせるか、または選択的スイープが実在しうる；すなわち、急性感染中は、ウイルスターゲット細胞特異性、新規組織の浸潤、またはＨＩＶ特異的免疫応答前の生得的免疫のような圧から生じる、異なる系譜の連続増殖が一般的でありうる。
【００３５】
試料中で観察される最大ハミング距離を考慮して、このレベルの多様性を得るために共有祖先から進化するのに何日が必要であるかに関する概算を行った：
世代段階あたり、１０％の極端な選択および９０％の中性ドリフトを仮定し（恣意的）、そして
２，５００〜３，５００の範囲のＮＢに関して世代あたりに予期されるドリフトを算出する。
【００３６】
各患者に関して、観察される多様性を達成するのに必要な最小日数の概算を行う。この概算がＦｉｅｂｉｇ病期と適合しない場合、この症例は、１つより多い変異体が伝染している不均質感染の優れた候補である：〜１５／１００症例。図１０は、これらの方法を用いた不均質感染を示す。
【００３７】
図１１は、ワクチン開発で使用可能な初期急性ＨＩＶ感染患者に由来する、単一ゲノム増幅機能性エンベロープクローンを示す。
【００３８】
伝染ウイルスサインに関するこの伝染ウイルスデータセットの分析
陽性関連は、試験セットにおけるｑ＜０．５０、および検証セットにおけるｐ＜０．０５を必要とする。初期分析のため、２つの分析法を用いた：
−アミノ酸位、ならびに急性（または急性＋初期）配列および慢性配列状態間の相互情報、ならびに
−急性または慢性伝染状態と関連する患者コンセンサス・ツリー内の変化パターン。
【００３９】
相互情報分析（Ｋｏｒｂｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：７１７６−７１８０（１９９３）；  Ｋｏｒｂｅｒら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．  ８：１５４９−１５６０（１９９２））のため、各位のアミノ酸および急性または慢性の分類間の相互情報の計算を行った。モンテカルロ統計を用いた：
−開始前に患者あたり等しい数の配列を有するように置換を用いて、各患者をリサンプリングし、
−１０，０００ランダム化で患者分類をシャッフルして、各場合にランダム化データの相互情報を再計算して、そして
−クレード内の分類をシャッフルして関連性（非独立）試料を少なくとも部分的に計上する。
【００４０】
最後に、ｑ値の決定を行って、多数の試験に取り組む。図１２、１３は、ＨＩＶ−１  ｖｐｕ遺伝子ともまた重複する、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖのシグナル配列において、これらの方法を用いて伝染Ｅｎｖを示す。図１３に示すように、この伝染サインは、ＨＩＶ  Ｅｎｖ切断速度に影響を及ぼし、そしてしたがって、伝染ウイルスの表面上により多くのＥｎｖを提供しうると仮定される。あるいは、この突然変異は、Ｖｐｕが仲介するＣＤ４下方調節をＨＩＶ−１が達成する能力を改変しうる（Ｂｕｔｔｉｃａｚら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １５０２−１５０５（２００７））。
【００４１】
第二に、各人由来のコンセンサス配列のみを用いて、最大尤度ツリー分析を使用し、これは、慢性または急性配列まで伸長したツリー中の枝に沿って特徴的なアミノ酸変化があるかどうかを尋ねた（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５：１５８３−１５８６（２００７）を参照されたい）。図１４は、ＨＩＶ−１  ＥｎｖのＶ１領域における伝染サインを示す。このサインは、伝染ＨＩＶビリオンの中和感度に影響を及ぼすことも可能であり、そしてまた、ＣＣＲ５共受容体への結合に関して、ＨＩＶ  Ｖ３ループの曝露に影響を及ぼし、したがって伝染ＨＩＶ株を伝染により「適合」させうると仮定される。
【００４２】
ｇｐ４１がｇｐ１２０と会合すると考えられる部位に近いＣ１領域で、別のサインが見出された：  ＥＮＶＴＥ＿Ｎ＿ＦＮＭＷＫアミノ酸Ｎ＠Ｅｎｖ  ｇｐ１６０中の１０８位。この配列は、急性伝染ＨＩＶにおいてＮになる。この突然変異は、ｇｐ４１−ｇｐ１２０相互作用の安定化に影響を及ぼしうる。
【００４３】
これらの分析の有用性
伝染単離体データセットを用いて行うことが可能なさらなる分析には：
コンセンサスだけでなく、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）配列セットに関する完全ＭＬツリー補正関連分析（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５：１５８３−１５８６（２００７）の適応）；
重要なタンパク質−タンパク質相互作用：
ＣＣＲ５結合、
ｇｐ１２０／ｇｐ４１相互作用、および
交差反応性中和抗体結合部位
に関与することが知られる非連続アミノ酸の組み合わせの分析；
タンパク質表面上で近接するアミノ酸の組み合わせの分析；
リスク要因、地理的位置、サンプリングの年などの、潜在的な交絡要因に関して統計的に調節する共変数分析；および
選択の役割、多様化速度、および不均質対均質急性感染試料、隘路の性質、ならびに感染初期の組換えの影響を定義する患者内研究
が含まれる。
【００４４】
上記に引用するすべての文書および他の情報供給源は、その全体が本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１５Ｉ】
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【図１５Ｊ】
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【図１５Ｋ】
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【図１５Ｌ】
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【図１５Ｏ】
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【図１５Ｐ】
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【図１５Ｑ】
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【図１５Ｒ】
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【図１５Ｓ】
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【図１５Ｔ】
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【図１５Ｕ】
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【図１５Ｖ】
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【図１５Ｗ】
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【図１５Ｘ】
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【図１５Ｙ】
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【図１５Ｚ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１５Ｍ】
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【図１５Ｎ】
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