(57)【要約】ｐｒｅＱ１リボスイッチは、抗生物質および他の小分子療法の標的である。ｐｒｅＱ１リボスイッチおよびその一部を使用して、ＲＮＡ分子ならびに他のエレメントおよび分子の発現または機能を調節することができる。ｐｒｅＱ１リボスイッチおよびその一部を、例えば、化合物を同定または検出するための種々の他の方法で使用することができる。化合物を使用して、ｐｒｅＱ１リボスイッチを刺激、活性化、阻害、および／または不活化することができる。ｐｒｅＱ１リボスイッチおよびその一部のみおよび他の核酸と組み合わせて、種々の構築物およびＲＮＡ分子で使用することができ、核酸によってコードすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コード領域に作動可能に連結されたｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含む調節可能な遺伝子発現構築物であって、該リボスイッチが該ＲＮＡの発現を調節し、該リボスイッチおよび該コード領域が非相同である、構築物。
【請求項２】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記リボスイッチが２つ以上のアプタマードメインおよび１つの発現プラットフォームドメインを含み、少なくとも１つの該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項１に記載の構築物。
【請求項４】
少なくとも２つの前記アプタマードメインが協同的結合を示す、請求項３に記載の構築物。
【請求項５】
天然に存在するｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの非天然誘導体である、リボスイッチ。
【請求項６】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項５に記載のリボスイッチ。
【請求項７】
前記リボスイッチが１つまたは複数のさらなるアプタマードメインをさらに含む、請求項６に記載のリボスイッチ。
【請求項８】
少なくとも２つの前記アプタマードメインが協同的結合を示す、請求項７に記載のリボスイッチ。
【請求項９】
前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化され、該トリガー分子によって活性化された場合に該リボスイッチがシグナルを生成する、請求項５に記載のリボスイッチ。
【請求項１０】
目的の化合物を検出する方法であって、サンプルをリボスイッチと接触させる工程を含み、該リボスイッチが該目的の化合物によって活性化され、該目的の化合物によって活性化された場合に該リボスイッチがシグナルを生成し、該サンプルが該目的の化合物を含む場合に該リボスイッチがシグナルを生成し、該リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法。
【請求項１１】
前記目的の化合物によって活性化された場合に前記リボスイッチが高次構造を変化させ、該高次構造の変化によって高次構造依存性標識を介してシグナルが生成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的の化合物によって活性化された場合に前記リボスイッチが高次構造を変化させ、該高次構造の変化によって該リボスイッチに連結したＲＮＡの発現が変化し、該発現の変化によってシグナルを生成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記シグナルが、前記リボスイッチに連結した前記ＲＮＡから発現したレポータータンパク質によって生成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験する工程であって、該阻害が該リボスイッチを介し、該リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、試験する工程、
（ｂ）工程（ａ）で遺伝子発現を阻害した化合物と細胞との接触によって遺伝子発現を阻害する工程であって、該細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、該化合物が該リボスイッチへの結合によって該遺伝子の発現を阻害する、阻害工程
を含む、方法。
【請求項１５】
ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを同定する方法であって、該方法が、
ｐｒｅＱ１の存在下および非存在下でのＲＮＡ分子のインライン自発切断（ｉｎ−ｌｉｎｅ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｌｅａｖａｇｅ）を評価する工程であって、該ＲＮＡ分子が該ｐｒｅＱ１によって調節される遺伝子によってコードされ、
該ＲＮＡ分子のインライン自発切断パターンの変化が該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを示す、工程
を含む、方法。
【請求項１６】
遺伝子発現を阻害する方法であって、
（ａ）化合物を細胞と接触させる工程を含み、
（ｂ）該化合物が式Ｉ：
【化１９】
2010521978.tif 000031
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体である）
の構造を有し、
該細胞がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、該化合物が、該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチへの結合によって該遺伝子の発現を阻害する、方法。
【請求項１７】
前記細胞が遺伝子発現の阻害が必要であると同定されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が細菌細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が前記細菌細胞を死滅させるか前記細菌細胞の増殖を阻害する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物および前記細胞が被験体への該化合物の投与によって接触する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が前記被験体中の細菌細胞であり、前記化合物が該細菌細胞を死滅させるか該細菌細胞の増殖を阻害する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体が細菌感染を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物がバイオフィルム中の細菌増殖を阻害する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
ｐｒｅＱ１の産生方法であって、該方法は、
（ａ）該ｐｒｅＱ１を産生することができる変異細菌細胞を培養する工程であって、該変異細菌細胞が前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの変異を含み、該変異を持たない細胞と比較して、該変異が、該変異細菌細胞による該ｐｒｅＱ１産生を増加させる、培養工程、
（ｂ）該細胞培養物から該ｐｒｅＱ１を単離し、それにより、該ｐｒｅＱ１を産生する工程、
を含む、方法。
【請求項２７】
前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの前記変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、前記ｐｒｅＱ１産生量が少なくとも１０％増加する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの前記変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、前記ｐｒｅＱ１産生量が少なくとも１０％増加する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの前記変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、前記ｐｒｅＱ１産生量が少なくとも２５％増加する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｐｒｅＱ１リボスイッチの前記変異がノックアウト変異である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
ｐｒｅＱ１リボスイッチの変異を含む細菌細胞であって、該変異を持たない細胞と比較した場合に、該変異が、該変異を含む細胞によるｐｒｅＱ１産生を測定可能な程度に増加させる、細菌細胞。
【請求項３２】
細菌細胞増殖を阻害する方法であって、該方法は、該細胞をｐｒｅＱ１応答性リボスイッチに結合する化合物と接触させる工程であって、該細胞がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、該化合物が該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチへの結合によって該細菌細胞増殖を阻害し、それにより、ｐｒｅＱ１産生が制限される、工程を含む方法。
【請求項３３】
前記化合物と接触しない細胞と比較して、細菌細胞増殖が少なくとも１０％減少する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
被験体への前記化合物の投与によって、該化合物および前記細胞を接触させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が前記被験体中の細菌細胞であり、前記化合物が該細菌細胞を死滅させるか該細菌細胞の増殖を阻害する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体が細菌感染を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
サンプル中のｐｒｅＱ１を検出する方法であって、該方法は、
ａ．ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを該サンプルと接触させる工程、および
ｂ．該ｐｒｅＱ１と該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチとの間の相互作用を検出する工程であって、該ｐｒｅＱ１と該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチとの間の相互作用が該ｐｒｅＱ１の存在を示す、検出工程、
を含む、方法。
【請求項３９】
前記ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを標識する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験することによって該遺伝子の該遺伝子発現を阻害する該化合物として同定された該化合物と細胞との接触によってリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現を阻害する工程を含む方法であって、該阻害が該リボスイッチを介し、該リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願の相互参照）
本出願は、２００７年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／９１９，４１０号の利益を主張する。２００７年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／９１９，４１０号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府の後援による研究に係る陳述）
本発明は、ＮＩＨによって授与された補助金番号Ｒ３３ＤＫ０７０２７およびＧＭ０６８８１９、ならびにＮＳＦによって授与された補助金番号ＥＩＡ０３２３５１０のもと、政府の支持を受けなされた。政府は本発明に対し確実な権利を保有する。
【０００３】
発明の分野
本開示の発明は、一般に、遺伝子発現分野、具体的には、遺伝子発現の調節領域に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
細胞が種々の遺伝子発現パターンの変化による複数の生化学シグナルおよび環境信号に応答しなければならないので、正確な遺伝子調節は生物系の本質的特徴である。最も公知の遺伝子調節機構は、化学的または物理的な刺激を感知し、その後に関連するＤＮＡまたは伝令ＲＮＡ配列との選択的相互作用によって遺伝子発現を調整するタンパク質因子の使用を含む。タンパク質は、複合体形状を採用することができ、生物系がその化学的および物理的環境を正確に感知することができる種々の機能を実行する。代謝産物に応答するタンパク質因子は、典型的には、ＤＮＡに結合することによって転写開始を調整するか（例えば、ｌａｃリプレッサータンパク質；非特許文献１）、ＲＮＡに結合することによって転写終結（例えば、ＰｙｒＲタンパク質；非特許文献２）または翻訳（例えば、ＴＲＡＰタンパク質；非特許文献３）のいずれかを調節するように作用する。タンパク質因子は、アロステリック調整または翻訳後改変などの種々の機構によって環境刺激に応答し、高応答性遺伝子スイッチとしての機能を果たすためにこれらの機能を活用するのに長けている（例えば、非特許文献４を参照のこと）。
【０００５】
遺伝子調節におけるタンパク質因子の広範な関与に加えて、ＲＮＡが遺伝子調節で積極的な役割を果たし得ることも公知である。最近の研究により、小さな非コードＲＮＡが破壊のためのｍＲＮＡの選択的ターゲティングで役割を果たし、それにより、遺伝子発現が下方制御されるという実質的役割が明らかにされ始めている（例えば、非特許文献５およびそのリファレンスを参照のこと）。このＲＮＡ干渉過程は、短いＲＮＡがワトソン−クリック塩基相補性を介して意図するｍＲＮＡ標的を選択的に認識する能力を活用し、その後に結合したｍＲＮＡをタンパク質作用によって破壊する。新規であるが特異性の高いＲＮＡ結合部位を使用してタンパク質因子を生成するよりも進化過程によって新規の標的特異的ＲＮＡ因子を生成することの方がはるかに容易であるので、ＲＮＡはこの系における理想的な分子認識のための作用因子である。
【０００６】
タンパク質が、酵素、受容体、および構造機能についての、生物学が有するほとんどの要件を満たすにもかかわらず、ＲＮＡはこれらの能力でも役立ち得る。例えば、ＲＮＡは、相当な酵素力および正確な分子認識を示す多数のリボザイムドメイン（非特許文献６；非特許文献７）および受容体ドメイン（非特許文献８；非特許文献９）を形成するのに十分な構造可塑性を有する。さらに、これらの活性を組み合わせて、エフェクター分子によって選択的に調整されるアロステリックリボザイム（非特許文献１０；非特許文献１１）を作製することができる。
【０００７】
細菌リボスイッチＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの主なコード領域の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）内に主に存在する遺伝子調節エレメントである。構造探索研究（以下でさらに考察）により、リボスイッチエレメントは一般に以下の２つのドメインから構成されることが明らかである：リガンド結合ドメインとしての機能を果たす天然のアプタマー（Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，８２０；Ｌ．Ｇｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，６４，７６３）および遺伝子発現に関与するＲＮＡエレメント（例えば、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）エレメント；転写終結ステム）に結びつく「発現プラットフォーム」。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｋ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｃ．，１９９８，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８，１２７−１６４
【非特許文献２】Ｓｗｉｔｚｅｒ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６２，３２９−３６７
【非特許文献３】Ｂａｂｉｔｚｋｅ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｇｏｌｌｎｉｃｋ，Ｐ．，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３，５７９５−５８０２
【非特許文献４】Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｇａｎｎ，Ａ．（２００２）．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
【非特許文献５】Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．２００２，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，２４４−２５１
【非特許文献６】Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ  Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，Ｔ．Ｒ．Ｃｅｃｈ，Ｊ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ，ｅｄｓ．，ｐｐ．３２１−３５０（１９９８）のＣｅｃｈ  ＆  Ｇｏｌｄｅｎ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｕｓｉｎｇ  ｏｎｌｙ  ＲＮＡ．
【非特許文献７】Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７，３７１−３９０（１９９７）
【非特許文献８】Ｏｓｂｏｒｎｅ  ＆  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７，３４９−３７０（１９９７）
【非特許文献９】Ｈｅｒｍａｎｎ  ＆  Ｐａｔｅｌ，Ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｐｔａｍｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，８２０−８２５（２０００）
【非特許文献１０】Ｓｏｕｋｕｐ  ＆  Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，３５８４−３５８９（１９９９）
【非特許文献１１】Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，３３６−３４１（２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ｐｒｅＱ１リボスイッチを調節するために使用することができる方法および組成物ならびに機能的ｐｒｅＱ１リボスイッチが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
コード領域に作動可能に連結されたｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含む調節可能な遺伝子発現構築物であって、リボスイッチがＲＮＡの発現を調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同である、構築物を本明細書中に開示する。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。リボスイッチは２つ以上のアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、少なくとも１つのアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。少なくとも２つのアプタマードメインは協同的結合を示すことができる。
【００１１】
天然に存在するｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの非天然誘導体であるリボスイッチも、本明細書中に開示する。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。リボスイッチは１つまたは複数のさらなるアプタマードメインをさらに含むことができる。少なくとも２つのアプタマードメインは協同的結合を示すことができる。リボスイッチをトリガー分子によって活性化することができ、トリガー分子によって活性化された場合にリボスイッチはシグナルを生成する。
【００１２】
目的の化合物を検出する方法であって、サンプルをリボスイッチと接触させる工程を含み、リボスイッチが目的の化合物によって活性化され、目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチがシグナルを生成し、サンプルが目的の化合物を含む場合にリボスイッチがシグナルを生成し、リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法をさらに開示する。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチは高次構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を変化させることができ、高次構造の変化によって高次構造依存性標識を介してシグナルが生成される。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチは高次構造を変化させることもでき、高次構造の変化によってリボスイッチに連結したＲＮＡの発現が変化し、発現の変化によってシグナルを生成する。シグナルを、リボスイッチに連結したＲＮＡから発現したレポータータンパク質によって生成することができる。
【００１３】
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現阻害について化合物を試験する工程であって、阻害がリボスイッチを介し、リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、試験工程、（ｂ）工程（ａ）で遺伝子発現を阻害した化合物と細胞との接触によって遺伝子発現を阻害する工程であって、細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって遺伝子発現を阻害する、阻害工程を含む方法も開示する。
【００１４】
ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを同定する方法であって、ｐｒｅＱ１の存在下および非存在下でのＲＮＡ分子のインライン自発切断（ｉｎ−ｌｉｎｅ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｌｅａｖａｇｅ）を評価する工程であって、ＲＮＡ分子がｐｒｅＱ１によって調節される遺伝子によってコードされ、ＲＮＡ分子のインライン自発切断パターンの変化がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを示す、評価工程を含む方法を開示する。
【００１５】
遺伝子発現を阻害する方法であって、化合物を細胞と接触させる工程を含み、前記化合物が式Ｉ：
【００１６】
【化１】
2010521978.tif 000002
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体である）
の構造を有し、細胞がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物が、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチへの結合によって遺伝子発現を阻害する、方法も開示する。
【００１７】
化合物は、式ＩＩ：
【００１８】
【化２】
2010521978.tif 000003
（式中、Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ−水素結合供与体、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり得、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであり、
Ｒ２は存在せず、
Ｒ３はＮＨ２であり、
Ｒ４は存在しない）の構造を有することができる。
【００１９】
化合物は、式ＩＩ：
【００２０】
【化３】
2010521978.tif 000004
（式中、Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体であり、
Ｒ２は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ３はＮＨ２であり、
Ｒ４は存在しない）の構造を有することができる。
【００２１】
化合物は、式ＩＩ：
【００２２】
【化４】
2010521978.tif 000005
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体であり、
Ｒ２は存在せず、
Ｒ３は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ４は存在しない）の構造を有することができる。
【００２３】
化合物は、式ＩＩ：
【００２４】
【化５】
2010521978.tif 000006
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体であり、
Ｒ２は存在せず、
Ｒ３はＮＨ２であり、
Ｒ４は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない）の構造を有することができる。
【００２５】
化合物は、式ＩＩ：
【００２６】
【化６】
2010521978.tif 000007
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体であり、
Ｒ２は存在せず、
Ｒ３は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ４は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない）の構造を有することができる。
【００２７】
化合物は、式ＩＩ：
【００２８】
【化７】
2010521978.tif 000008
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体であり、
Ｒ２は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ３はＮＨ２であり、
Ｒ４は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない）の構造を有することができる。
【００２９】
化合物は、式ＩＩ：
【００３０】
【化８】
2010521978.tif 000009
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体であり、
Ｒ２は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ３は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ４は存在しない）の構造を有することができる。
【００３１】
化合物は、式ＩＩ：
【００３２】
【化９】
2010521978.tif 000010
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体であり、
Ｒ２は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ３は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ４は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない）の構造を有することができる。
【００３３】
細胞を、遺伝子発現阻害に必要であると同定することができる。細胞は細菌細胞であり得る。化合物は、細菌細胞を死滅させるか細菌細胞の増殖を阻害することができる。化合物および細胞を、被験体への化合物の投与によって接触させることができる。細胞は被験体中の細菌細胞であり得、その中で化合物は細菌細胞を死滅させるか細菌細胞の増殖を阻害する。被験体は細菌感染を有し得る。細胞はｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むことができる。化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与することができる。化合物はバイオフィルム中の細菌増殖を阻害することができる。
【００３４】
ｐｒｅＱ１の産生方法であって、ｐｒｅＱ１を産生することができる変異細菌細胞を培養する工程であって、変異細菌細胞がｐｒｅＱ１リボスイッチの変異を含み、変異が変異を持たない細胞と比較して変異細菌細胞によってｐｒｅＱ１産生を増加させる、培養工程、および細胞培養物からｐｒｅＱ１を単離し、それにより、ｐｒｅＱ１を産生する工程を含む、方法も開示する。
本方法により、ｐｒｅＱ１リボスイッチの変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、ｐｒｅＱ１産生を少なくとも１０％増加させることができる。本方法により、ｐｒｅＱ１リボスイッチの変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、ｐｒｅＱ１産生を少なくとも１０％増加させることができる。本方法により、ｐｒｅＱ１リボスイッチの変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、ｐｒｅＱ１産生を少なくとも２５％増加させることができる。ｐｒｅＱ１リボスイッチの変異はノックアウト変異を含むことができる。
【００３５】
ｐｒｅＱ１リボスイッチの変異を含む細菌細胞であって、変異により、変異を持たない細胞と比較した場合にその細胞によるｐｒｅＱ１産生が測定可能な程度に増加する、細菌細胞をさらに開示する。
【００３６】
細菌細胞増殖を阻害する方法も開示するが該方法は、細胞をｐｒｅＱ１応答性リボスイッチに結合する化合物と接触させる工程であって、細胞がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチへの結合によって細菌細胞増殖を阻害し、それにより、ｐｒｅＱ１産生が制限される、接触工程を含む方法である。本方法により、化合物と接触しない細胞と比較して、細菌細胞増殖を少なくとも１０％減少させることができる。化合物および細胞を、被験体への化合物の投与によって接触させることができる。細胞が被験体中の細菌細胞であり得、その中で化合物が細菌細胞を死滅させるか細菌細胞の増殖を阻害する。被験体は細菌感染を有し得る。化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与することができる。
【００３７】
サンプル中のｐｒｅＱ１を検出する方法を開示するが該方法は、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチをサンプルと接触させる工程、およびｐｒｅＱ１とｐｒｅＱ１応答性リボスイッチとの間の相互作用を検出する工程を含み、該ｐｒｅＱ１とｐｒｅＱ１応答性リボスイッチとの間の相互作用がｐｒｅＱ１の存在を示す、方法である。ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを標識することができる。
【００３８】
化合物（遺伝子における遺伝子発現の阻害のための化合物を試験することにより、遺伝子における遺伝子発現を阻害する化合物として同定された）と細胞とを接触させることによって遺伝子（リボスイッチを含むＲＮＡをコードする）における遺伝子発現を阻害する工程を含む方法も開示するが、該方法は、該阻害がリボスイッチを介するものであって、該リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法である。
【００３９】
開示の方法および組成物のさらなる利点を以下の記載に一部示し、この記載から利点が一部理解される。あるいは、利点を、開示の方法および組成物の実施によって知ることができる。開示の方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘した要素および組み合わせによって理解および達成される。上記の一般的記載および以下の詳細な記載の両方は例示および説明のみであり、特許請求の範囲に記載の本発明を制限するものではないと理解すべきである。
【００４０】
本明細書中に組み込まれ、且つ本明細書の一部を構成する添付の図面は、開示の方法および組成物のいくつかの実施形態を例示し、記載と共に、開示の方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、ｐｒｅＱ１生合成に関与する真正細菌遺伝子の５’ＵＴＲ中に存在する保存配列を示す（配列番号５〜４２）。各型内で９５％超（上の例）および８０％超（下の例）保存されているヌクレオチドを、コンセンサス行（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｏｗ）中に示す（Ｒ＝Ａ、Ｇ；Ｙ＝Ｃ、Ｕ）。構造行中の角括弧で示した領域は、潜在的な二次構造エレメントＰ０（薄い影）およびＰ１（濃い影）に寄与する相補配列を示す。遺伝子を、元の配列ファイル由来の遺伝子座タグによって示す。生物の略称：（Ｂａｎ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ；（Ｂｃｅ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ；（Ｂｈａ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ；（Ｂｓｕ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；（Ｃａｃ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ；（Ｃｐｅ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ；（Ｃｔｅ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ；（Ｅｆａ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ；（Ｅｆｍ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ；（Ｅｘｉ）Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．；（Ｆｎｕ）Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ；（Ｇｋａ）Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ；（Ｈｉｎ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；（Ｌｉｎ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ；（Ｌｍｅ）Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ；（Ｌｐｌ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ；（Ｎｍｅ１）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ＭＣ５８；（Ｎｍｅ２）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｚ２４９１；（Ｏｉｈ）Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ；（Ｐｍｕ）Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ；（Ｓａｕ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ；（Ｓｅｐ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；（Ｓａｇ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ；（Ｔｔｅ）Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ；（Ｅｎｖ）Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＩＢＥＡ＿ＣＴＧ＿２１５７６０９。
【図２】図２は、真正細菌におけるキューオシン（ｑｕｅｕｏｓｉｎｅ）生合成を示す。Ｑ産生に関与することが公知の酵素を、各段階で必要な補因子（括弧内）と共に示す。対応する特異的酵素が依然として同定されないままである転換物を疑問符で示す。
【図３】Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｑｕｅＣＤＥＦ  ｍＲＮＡの５’ＵＴＲは、ｐｒｅＱ１に応答して構造調整を受ける。（ａ）ｐｒｅＱ１生合成遺伝子に関連した各保存ドメイン型に対応する一次および二次構造のコンセンサスモデル（配列番号４３、４４、および４５）。灰色および黒色のヌクレオチドは、図１中に示す例的配列の間でそれぞれ９５％以上および８０％以上保存されている。ヌクレオチド数がわずかに変化し得る保存性のより低い領域を、円または太線で示す。保存性のより低い位置（ステムエレメントと推定）を灰色で示す。ＲはＡまたはＧを示し、ＹはＣまたはＵを示す。（ｂ）１０６  ｑｕｅＣ（予想されるアプタマーおよびターミネーター構造を含むＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｑｕｅＣ  ５’ＵＴＲの一部）の配列および二次構造モデル（配列番号４５）。ｐｒｅＱ１の存在に応答するかｐｒｅＱ１の存在と無関係の自発的ＲＮＡ切断部位をモデル上に重ねており、自発的ＲＮＡ切断部位は、ｃの構造探索分析に由来するものである。ヌクレオチド１０６とＡＵＧ開始コドンとの間に１０６個のヌクレオチドが存在する。矢じり形（ａｒｒｏｗｈｅａｄ）は、ｃで認められる最短の５’３２Ｐ標識フラグメントに対応する切断部位を示す。５’末端グアノシル残基は非天然であり、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写を容易にするために導入した。配列番号４５のヌクレオチド１６〜２７、３１〜３８、５７、５８、６７、７７〜８１、８３、および９３〜９５について一定の切断が認められた。配列番号４５のヌクレオチド５０〜５３、５９、６０、７０、７１、および７４〜７６について切断の減少が認められた。配列番号４５のヌクレオチド５５および５６に切断の増加が認められた。（ｃ）１０６  ｑｕｅＣ  ＲＮＡのインライン探索分析により、ｐｒｅＱ１の存在下で誘導される鎖切断の増加および減少部位が明らかとなる（矢じり形）。１μＭまたは１０μＭ  ｐｒｅＱ１の非存在下（−）または存在下でのインキュベーション由来の自発的ＲＮＡ切断産物を、変性１０％ＰＡＧＥによって分離した。（ＮＲ）反応なし；（Ｔ１）ＲＮアーゼＴ１での部分消化物；（−ＯＨ）アルカリ部分消化物；（Ｐｒｅ）前駆体ＲＮＡ。Ｔ１レーン中の選択されたバンドを、３’末端グアノシル残基の位置にしたがって示す。
【図４】図４は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｑｕｅＣ  ５’ＵＴＲ由来のｐｒｅＱ１結合ＲＮＡによる分子識別を示す。（ａ）１０６ｑｕｅＣと比較して系統発生的に保存された配列および構造エレメントのみを含むように短縮された５２  ｑｕｅＣ  ＲＮＡ構築物の二次構造モデル（配列番号４６）。２つの５’末端グアノシンヌクレオチドは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写を容易にするために導入された非天然残基である。（ｂ）ｐｒｅＱ１およびｐｒｅＱ０の化学構造ならびに５２ｑｕｅＣを使用して得たそれぞれの見かけのＫｄ値。影付きの領域は、ｐｒｅＱ１と比較した化学構造の相違するところを示す。ｐｒｅＱ１構造上の選択した環原子に番号を付けている。（ｃ）ｐｒｅＱ１関連化合物の化学構造。対応する見かけのＫｄ値は５２ｑｕｅＣを使用して得、２，６−ジアミノプリンおよびアデニンの場合はより長い構築物８０ｑｕｅＣを使用した（図６ａを参照のこと）。白抜きの円は、表示よりも高い可能性が高い見かけのＫｄを示す（３００μＭを超える濃度は、本分析において日常的に試験しなかった）。（ｄ）平衡透析実験で使用した装置は、５０００ダルトンの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する透過性膜によって分けられる２つのチャンバを含んでいた。３Ｈ−グアニンおよび１０６ｑｕｅＣ  ＲＮＡの各チャンバへの添加（上）により、ＲＮＡチャンバ中のその保持によって標識グアニン分布がシフトする（右下）。対照的に、リガンド結合ＲＮＡが存在しないか、非標識競合リガンドが過剰に存在する場合に、２つのチャンバ間の３Ｈ−グアニンの均一な分布（左下）が予想される。（ｅ）一定の関連するプリンは、モル過剰で添加した場合、１０６ｑｕｅＣ  ＲＮＡ結合に関し３Ｈ−グアニンと競合する。ＲＮＡチャンバ内における３Ｈ−グアニン隔離量を、この区画に分配する総添加トリチウムに対する割合として示す。したがって、１０６ｑｕｅＣ  ＲＮＡの非存在下または過剰な非標識競合物の存在下で起こるように、３Ｈ−グアニンが２チャンバ間に等しく分布している場合、０．５という値が予想される。逆に、非標識競合物の非存在下での平衡透析またはアッセイ条件下（１００ｎＭ  ３Ｈ−グアニン、２０μＭ  ＲＮＡ、６０μＭ非標識アナログ）で競合物として機能しない非標識プリンの存在下での平衡透析から得られるように、ＲＮＡチャンバ中で３Ｈ−グアニンが保持される場合、１．０に近ずく値が予想される。Ｇ、グアニン；ｐｒｅＱ１、７−アミノメチル−７−デアザグアニン；Ａ、アデニン；７ｄＧ、７−デアザグアニン。
【図５】図５は、ｐｒｅＱ１の結合に必要な最小のアプタマー配列の決定を示す。（ａ）Ｐ０ステム−ループが欠失した３６ｑｕｅＣ構築物の二次構造モデル（配列番号４７）。円で囲んだヌクレオチドは、３６ｑｕｅＣおよび長さが順次より短くなった２つの派生的欠失構築物の３’末端を示す。輪郭で示した残基は、その後のパネルで分析したリガンド誘導構造調整部位を示す。（ｂ）インライン探索分析により、３６ｑｕｅＣの３’末端付近の保存配列がｐｒｅＱ１誘導構造調整に必要であることが明らかとなる。構築物を、１０μＭ  ｐｒｅＱ１の非存在下（−）または存在下（＋）でインキュベートした。他の詳細および注釈を、図３ｃの説明文に記載する。（ｃ）漸増濃度のｐｒｅＱ１の存在下での３６ｑｕｅＣ  ＲＮＡのインキュベーションにより、部位１における自発的切断レベルが減少し、部位２における自発的切断レベルが増加する。（ｄ）ｐｒｅＱ１濃度との関係において部位１および部位２において切断されたＲＮＡ（ｃ中）の正規化した比を示すグラフ。
【図６】図６は、ｐｒｅＱ１とアプタマーの保存シチジル残基との間のワトソン−クリック対合相互作用の証明を示す。（ａ）８０ｑｕｅＣおよび２つの変異体Ｍ１およびＭ２  の二次構造モデル（配列番号４８）。２つの５’末端グアノシンヌクレオチドは非天然であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写を容易にするために導入した。（ｂ）８０ｑｕｅＣ  ＲＮＡ（ＷＴ）、Ｍ１およびＭ２のインライン探索分析。各構築物を、エフェクターの非存在下（−）およびそれぞれ１μＭ  ｐｒｅＱ１（Ｑ１）、２００μＭグアニン（Ｇ）、２００μＭ  ２，６−ジアミノプリン（Ｄ）、および２００μＭアデニン（Ａ）と共にインキュベートした。他の詳細および注釈を、図３ｃの説明文に記載する。（ｃ）８０ｑｕｅＣリガンド選択性の推定決定要因としてのｐｒｅＱ１のＣ３４とのワトソン−クリック塩基対合。野生型８０ｑｕｅＣのＣ３４とｐｒｅＱ１との間（影付きのバックグラウンド）またはＭ１構築物のＵ３４と各プリン化合物（ｂ中で試験した）との間の提示した塩基対合相互作用を示す。
【図７】図７は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子調節に及ぼす改変ｐｒｅＱ１リボスイッチの影響を示す。（ａ）レポーター遺伝子発現分アッセイで使用したｐｒｅＱ１リボスイッチ構築物に対応する配列（配列番号４９）。（ｂ）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｑｕｅＣ由来の野生型リボスイッチおよび変異誘導体Ｍ３〜Ｍ９によるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子発現の調節。エラーバーは、３つの独立した分析の標準偏差である。
【図８】図８は、ｐｒｅＱ１リボスイッチの位置および関連遺伝子を示す。ＧｅｎＢａｎｋのレコードアクセッション番号およびヌクレオチドの位置は配列アラインメント中の各リボスイッチエレメントとして示す（図１）。各リボスイッチエレメントの下流の予想される遺伝子またはオペロンを、遺伝子座タグによって示し、一般的タンパク質機能のＣＯＧデータベースの割り当ても示す。ｐｒｅＱ１レギュロン中のほとんどの遺伝子に対応する正確な分子機能は、現在知られていない。ｑｕｅＣＤＥＦオペロンの遺伝子は、Ｑ生合成に関与しているが（Ｒｅａｄｅｒ  ２００４；Ｇａｕｒ  ２００５；Ｖａｎ  Ｌａｎｅｎ  ２００５）、ＱｕｅＦによって触媒される特異的な化学的工程が実験的に決定されている（Ｖａｎ  Ｌａｎｅｎ  ２００５）。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
以下の特定の実施形態の詳細な記載およびそこに含まれる実施例、ならびに添付の図面および前および後の記載を参照して、開示の方法および組成物をより容易に理解することができる。
【００４３】
伝令ＲＮＡは、典型的には、タンパク質または小さなＲＮＡ調節因子によって、および翻訳過程の間のリボゾームによって作用する遺伝子情報の受動的キャリアと考えられている。一定のｍＲＮＡが天然のアプタマードメインを保有し、これらのＲＮＡドメインへの特異的代謝産物の直接結合によって遺伝子発現が調整されることが発見された。天然リボスイッチは、典型的には天然ＲＮＡと関連しない２つの驚くべき機能を示す。第１に、ｍＲＮＡエレメントは異なる構造状態を採用することができ、一方の構造は、その標的代謝産物の正確な結合ポケットとしての機能を果たす。第２に、構造状態間の代謝産物誘導性アロステリック相互交換により、いくつかの異なる機構のうちの１つによって遺伝子発現レベルが変化する。リボスイッチを、典型的には、以下の２つの個別のドメインに分けることができる：１つは標的に選択的に結合するドメイン（アプタマードメイン）および他方は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン（発現プラットフォーム）。これらの２ドメイン間の動的相互作用により遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節される。
【００４４】
異なるクラスのリボスイッチが同定されており、活性化化合物（本明細書中でトリガー分子と呼ぶ）を選択的に認識することが示されている。例えば、補酵素Ｂ１２、グリシン、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、およびフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）は、これらの化合物の代謝経路または輸送経路における重要な酵素をコードする遺伝子中に存在するリボスイッチを活性化する。各リボスイッチクラスのアプタマードメインは、高度に保存されたコンセンサス配列および構造に適合する。したがって、配列相同性検索を使用して、関連するリボスイッチドメインを同定することができる。リボスイッチドメインは、細菌、古細菌、および真核生物由来の種々の生物で発見されている。
【００４５】
Ａ．リボスイッチＲＮＡの一般的構成
細菌リボスイッチＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの主なコード領域の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）内に主に存在する遺伝子調節エレメントである。構造探索研究（以下でさらに考察）により、リボスイッチエレメントは一般に以下の２つのドメインから構成されることが明らかである：リガンド結合ドメインとしての機能を果たす天然のアプタマー（Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，８２０；Ｌ．Ｇｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，６４，７６３）および遺伝子発現に関与するＲＮＡエレメント（例えば、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）エレメント；転写終結ステム）を妨害する「発現プラットフォーム」である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したアプタマードメインが発現プラットフォームの非存在下で適切なリガンドに結合するという観察から、これらの結論を導いている（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２、３、および６を参照のこと）。さらに、構造探索調査により、ほとんどのリボスイッチのアプタマードメインが個別に試験した場合に特定の二次構造および三次構造の折り畳みを採用し、全５’リーダーＲＮＡの関係において試験した場合にアプタマー構造と本質的に同一であることが示唆される。これは、多くの場合、アプタマードメインが発現プラットフォームと無関係に折り畳まれるモジュラー単位であることを示す（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２、３、および６を参照のこと）。
【００４６】
最終的に、アプタマードメインのリガンド結合状態または非結合状態は発現プラットフォームを介して解釈され、それは遺伝子発現の際に影響を及ぼす。モジュラーエレメントとしてのリボスイッチの投影は、アプタマードメインが種々の生物の間（およびＴＰＰリボスイッチについて認められるように、界の間でさえも）で高度に保存されるのに対して（Ｎ．Ｓｕｄａｒｓａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  ２００３，９，６４４）、発現プラットフォームは、付加された読み取り枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｌａｍｅ）の発現が調節される配列、構造、および機構で変化するという事実によってさらに支持される。例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｔｅｎＡ  ｍＲＮＡのＴＰＰリボスイッチへのリガンド結合によって転写が終結する（Ａ．Ｓ．Ｍｉｒｏｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ２００２，１１１，７４７）。この発現プラットフォームは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｔｈｉＭ  ｍＲＮＡ中のＴＰＰリボスイッチの発現プラットフォームと比較して配列および構造が異なり、ＴＰＰ結合はＳＤ遮断機構によって翻訳を阻害する（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２を参照のこと）。ＴＰＰアプタマードメインは容易に認識可能であり、これらの２つの転写単位の間で機能的特徴がほぼ同一であるが、これらを実施する遺伝子調節機構および発現プラットフォームは非常に異なる。
【００４７】
リボスイッチＲＮＡのアプタマードメインは、典型的には、約７０〜１７０ｎｔ長の範囲である（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の図１１）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化実験でかなりより短く構造が複雑である多種多様な小分子結合アプタマーが同定されたことを考慮すると、この観察はいくらか予想外であった（Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，８２０；Ｌ．Ｇｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，６４，７６３；Ｍ．Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９，９，３２４）。人工アプタマーと比較した天然アプタマー配列の複雑さおよび情報量の実質的増加についての理由が依然として証明されていないにもかかわらず、この複雑さは、高い親和性および選択性で機能するＲＮＡ受容体を形成するのに必要であるとみられる。リガンド−リボスイッチ複合体の見かけ上のＫＤ値は、低ナノモル（ｎａｎｏｍｏｌａｒ）から低マイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）までの範囲である。いくつかのアプタマードメインは、追加発現プラットフォームから単離した場合、インタクトなリボスイッチよりも改良された標的リガンドに対する親和性を示す（約１０〜１００倍）ことも注目に値する（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２を参照のこと）。おそらく、完全にインタクトなリボスイッチＲＮＡによって必要とされる複数の異なるＲＮＡ高次構造のサンプリングにはエネルギーコストがかかり、リガンド親和性の喪失が反映される。アプタマードメインは分子スイッチとしての機能を果たさなければならないので、これは、天然のアプタマーに対する機能的要求を付加することもでき、この付加は、そのより精巧な構造を合理化するのに役立ち得る。
【００４８】
Ｂ．ｐｒｅＱ１リボスイッチ
リボスイッチについてのバイオインフォマティクスベースの研究により、真正細菌中のいくつかの候補モチーフが得られた。これらのモチーフのうちの１つは、一般に、キューオシン（Ｑ）（一定のｔＲＮＡのアンチコドンゆらぎ位置を占める高改変ヌクレオシド）の生合成に関与する遺伝子の５’非翻訳領域中に存在する。この構造化ＲＮＡが７−アミノメチル−７−デアザグアニン（ｐｒｅＱ１）（Ｑ生合成の中間体）に選択的なリボスイッチの一部であることを本明細書中に示す。他の天然代謝産物結合ＲＮＡと比較して、ｐｒｅＱ１アプタマーは、わずか３４ヌクレオチドから共に形成される１つのステム−ループおよび短いテール配列からなる簡単な構造を有するものとして現れる。その小さなサイズにもかかわらず、このアプタマーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでその同族リガンドに高い選択性を示し、低ナノモル（ｌｏｗ  ｎａｎｏｍｏｌａｒ）範囲でｐｒｅＱ１に親和性を示す。したがって、比較的小型のＲＮＡ構造は、遺伝子発現を調節するための代謝産物受容体として有効に機能を果たすことができる。
【００４９】
典型的には、特定のリボスイッチ候補の小分子標的の同一性を、その関連遺伝子の注釈付き機能から推測した。しかし、候補が未知の機能の遺伝子に関連する場合、推定リガンドの評価は容易ではない。この課題を例示する１つの候補（ｙｋｖＪ）を、９１種の微生物ゲノム由来の非コード領域のバイオインフォマティクス調査で同定した（Ｂａｒｒｉｃｋ  ２００４）。このエレメントはいくつかのＦｉｒｍｉｃｕｔｅ種で発見され、最も一般的には、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｙｋｖＪＫＬＭオペロンのホモログに関連し、そのタンパク質産物は特徴づけられなかった。さらに、ｙｋｖＪモチーフの保存された一次および二次構造の特徴はヌクレオチドの異常に短いスパンに制限される一方で、既知のリボスイッチはより広い配列保存およびより精巧な構造を示す。
【００５０】
その後、ｙｋｖＪＫＬＭオペロンに例される遺伝子ファミリーは、Ｑ（真核生物および細菌中で見出され、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、およびＴｙｒに特異的なｔＲＮＡのアンチコドンゆらぎ位置を占める高改変ヌクレオチド（Ｈａｒａｄａ  １９７２））の生合成に関与することが示された（Ｒｅａｄｅｒ  ２００４）。このオペロン中の一定の遺伝子（ｑｕｅＣ，−Ｄ，−Ｅ，および−Ｆと改名されている）は、Ｑ前駆体ｐｒｅＱ１の産生に特異的に関与する（Ｖａｎ  Ｌａｎｅｎ  ２００５；Ｇａｕｒ  ２００５）。次いで、細菌では、ｐｒｅＱ１はｔＲＮＡ−グアニントランスグリコシラーゼ（ＴＧＴ）（Ｏｋａｄａ  １９７９）によって適切なｔＲＮＡに輸送され、ｉｎ  ｓｉｔｕでさらに改変されて、Ｑ（Ｒｅｕｔｅｒ  １９９１）またはアミノアシル化誘導体（Ｓａｌａｚａｒ  ２００４；Ｂｌａｉｓｅ  ２００４）が得られる。ｑｕｅＣＤＥＦオペロンの機能を考慮すると、ｐｒｅＱ１または関連中間体は、ｙｋｖＪ（以後ｑｕｅＣと呼ぶ）リボスイッチ候補の潜在的リガンドと見なされた。
【００５１】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｑｕｅＣＤＥＦオペロンの５’ＵＴＲがｉｎ  ｖｉｔｒｏでｐｒｅＱ１に選択的に結合し、ｉｎ  ｖｉｖｏでレポーター遺伝子の発現を調節することを本明細書中（実施例１）で証明する。他の天然リボスイッチアプタマーと比較してのその異常に小さなサイズにもかかわらず、ｑｕｅＣリボスイッチのリガンド結合ドメインはナノモル範囲のｐｒｅＱ１に対する解離定数（Ｋｄ）を示す。また、微生物ゲノムデータベースの検索により、ｑｕｅＣモチーフの多数のさらなる例が見出され、これらの例は、この重要な改変核酸塩基の細胞内濃度に応答してその発現を調整することができる広範囲に及ぶレギュロンを定義する。
【００５２】
Ｃ．細菌における転写終結のリボスイッチ調節
細菌は、主に、２つの転写終結方法を使用する。一定の遺伝子は、Ｒｈｏタンパク質に依存する終結シグナルを組み込む一方で（Ｊ．Ｐ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ２００２，１５７７，２５１）、他の遺伝子は転写延長複合体を脱安定化するためのＲｈｏ非依存性ターミネーター（内因性ターミネーター）を使用する（Ｉ．Ｇｕｓａｒｏｖ，Ｅ．Ｎｕｄｌｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １９９９，３，４９５；Ｅ．Ｎｕｄｌｅｒ，Ｍ．Ｅ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  ２００２，７，７５５）。後者のＲＮＡエレメントは、ＧＣリッチなステム−ループ、その後の６〜９個のウリジル残基のストレッチから構成される。内因性ターミネーターは、細菌ゲノム全体に広く存在しており（Ｆ．Ｌｉｌｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，２００２，１８，９７１）、典型的には、遺伝子またはオペロンの３’末端に存在する。興味深いことに、５’−ＵＴＲ内に存在する内因性ターミネーターについて多数の例が認められている。
【００５３】
細菌によって使用される広範な種々の遺伝子調節ストラテジーのうち、ＲＮＡポリメラーゼが調節様式で５’−ＵＴＲ内の終結シグナルに応答するクラスの例が多数存在する（Ｔ．Ｍ．Ｈｅｎｋｉｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０００，３，１４９）。一定の条件中に、ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、外部シグナルによって終結シグナルを認識するか無視するように指示される。転写開始は調節なしで起こり得るにもかかわらず、ｍＲＮＡ合成に対する（および遺伝子発現の）調節は、内因性ターミネーターの調節によって最終的に指図される。推定上、少なくとも２つの相互に排他的なｍＲＮＡ高次構造の１つにより、転写終結をシグナル伝達するＲＮＡ構造が形成または破壊される。トランス活性化因子（いくつかの例ではＲＮＡであり（Ｆ．Ｊ．Ｇｒｕｎｄｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２００２，９９，１１１２１；Ｔ．Ｍ．Ｈｅｎｋｉｎ，Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２００２，２４，７００）、他の例ではタンパク質である（Ｊ．Ｓｔｕｌｋｅ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００２，１７７，４３３））は、一般に、特定の細胞内シグナルの受容およびその後のＲＮＡ高次構造の１つの安定化に必要である。リボスイッチは、ＲＮＡ構造の調整と代謝産物シグナル（遺伝子調節機構によって読みとられる）との間を直接結びつける。
【００５４】
ほとんどの臨床抗菌化合物は、たった４つの細胞過程の１つを標的とする（Ｗｏｌｆｓｏｎ  ２００６）。細菌は、これらの過程を保護するための十分に発達した耐性機構を有するので（Ｄ’Ｃｏｓｔａ  ２００６）、薬物介入に脆弱な新規の標的を発見することが有用である。脆弱な過程の１つの型は、リボスイッチによる遺伝子発現の調節である（Ｗｉｎｋｌｅｒ  ２００５）。一定の細菌ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ中に典型的に見出されるので、各公知のリボスイッチクラスのメンバーは、特異的な基本的代謝産物に結合するように進化した構造化された受容体（または「アプタマー」）（Ｍａｎｄａｌ  ２００４）を形成する。ほとんどの場合、リガンド結合は、結合した代謝産物の合成または輸送に関与する遺伝子または遺伝子群の発現を調節する。リボスイッチによって調節される生化学経路がしばしば細菌生存に不可欠であるので、リボスイッチターゲティングによるこれらの経路の抑制は致命的であり得る。
【００５５】
いくつかの抗菌代謝産物アナログは、リボスイッチのターゲティングによって機能する（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００３；Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００５；Ｗｏｏｌｌｅｙ  １９４３）。例えば、抗菌チアミンアナログであるピリチアミン（Ｗｏｏｌｌｅｙ  １９４３）は、チアミンピロリン酸結合リボスイッチのターゲティングによって機能する可能性が最も高い（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００５）。同様に、抗菌リジンアナログであるＬ−アミノエチルシステイン（Ｓｈｉｏｔａ  １９５８）（ＡＥＣ、図１ｂ）は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｌｙｓＣリボスイッチに結合し、ｌｙｓＣ調節レポーター遺伝子の発現を抑制する（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００６）。さらに、ｌｙｓＣリボスイッチは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株（Ｌｕ  １９９１）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｐａｔｔｅ  １９９８）株で変異しＡＥＣ耐性を示す。
【００５６】
他で特定しない限り、開示の方法および組成物は、特定の合成方法、特定の分析技術、または特定の試薬に制限されず、それ自体、変化することができると理解するべきである。本明細書中で使用した専門用語は特定の実施形態のみを記載することを目的とし、制限することを意図しないとも理解するべきである。
【００５７】
材料
開示の方法および組成物のために使用することができるか、これらと併せて使用することができるか、これらの調製で使用することができるか、または、これらの生成物である、材料、組成物、および成分を開示する。これらおよび他の材料を本明細書中に開示し、特にこれらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などを開示する場合、これらの化合物の種々の個々および集合的組み合わせおよび順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）のそれぞれに関する特別な言及は明確に開示できず、それぞれ、本明細書中で具体的に意図および記載されると理解される。例えば、リボスイッチまたはアプタマードメインを開示および考察し、多数の分子（リボスイッチまたはアプタマードメインが含まれる）に作製することができる多数の改変物を考察する場合、それとは反対であると具体的に示されない限り、リボスイッチまたはアプタマードメインおよび可能な改変物の各々および全ての組み合わせおよび順列を特に意図する。したがって、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスを開示し、ならびに分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラス、および組み合わせ分子の例（Ａ−Ｄ）も開示する場合、各々を個別に引用しない場合でさえも、各々を個別または集合的に意図する。したがって、この例では、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆの各組み合わせを特に意図し、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；ならびに組み合わせ例Ａ−Ｄの開示から開示されると見なすべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも特に意図および開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅの下位集団（ｓｕｂ−ｇｒｏｕｐ）を特に意図し、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；および組み合わせ例Ａ−Ｄの開示から開示されると見なすべきである。この概念を、本出願の全局面（開示の組成物を作製および使用する方法における工程が含まれるが、これらに限定されない）に適用する。したがって、実施することができる種々のさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる工程の各々を開示の方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを使用して実施することができ、それぞれのかかる組み合わせが特に意図され、開示されると見なすべきであると理解される。
【００５８】
Ａ．リボスイッチ
リボスイッチは、発現するＲＮＡ分子の一部であり、トリガー分子によって結合した場合に状態が変化する発現調節エレメントである。リボスイッチを、典型的には、以下の２つの個別のドメインに分けることができる：１つは標的に選択的に結合するドメイン（アプタマードメイン）および他は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン（発現プラットフォームドメイン）である。遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節されるこれらの２ドメイン間の動的相互作用がもたらされる。単離および組換えリボスイッチ、かかるリボスイッチを含む組換え構築物、かかるリボスイッチに作動可能に連結された非相同配列、かかるリボスイッチを保有する細胞およびトランスジェニック生物、リボスイッチ組換え構築物、ならびに非相同配列に作動可能に連結されたリボスイッチを開示する。非相同配列は、例えば、目的のタンパク質またはペプチド（レポータータンパク質またはペプチドが含まれる）をコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは、天然に存在するリボスイッチ（天然に存在するｐｒｅＱ１リボスイッチなど）であるか、天然に存在するリボスイッチに由来する。リボスイッチは、人工アプタマーを含むか、任意選択的に排除することができる。例えば、人工アプタマーには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択を介してデザインまたは選択されるアプタマーが含まれる。リボスイッチは、天然に存在するリボスイッチのコンセンサス配列（ｐｒｅＱ１リボスイッチのコンセンサス配列など）を含むことができる。ｐｒｅＱ１リボスイッチのコンセンサス配列を、図１および図３ａに示す。
【００５９】
天然に存在するｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの非天然誘導体であるリボスイッチを開示する。開示のリボスイッチ（その誘導体および組換え形態が含まれる）は、一般に、任意の供給源（天然に存在するリボスイッチおよびｄｅ  ｎｏｖｏでデザインしたリボスイッチが含まれる）に由来し得る。任意のかかるリボスイッチは、開示の方法で使用するか開示の方法と共に使用することができる。しかし、異なるリボスイッチ型を定義することができ、いくつかのかかるサブタイプは、特定の方法で有用であるか、特定の方法と共に有用であり得る（一般に、本明細書中の他所に記載）。リボスイッチ型には、例えば、天然に存在するリボスイッチ、天然に存在するリボスイッチの誘導体および改変形態、キメラリボスイッチ、および組換えリボスイッチが含まれる。天然に存在するリボスイッチは、天然で見出されるリボスイッチの配列を有するリボスイッチである。かかる天然に存在するリボスイッチは、天然で起こる天然に存在するリボスイッチの単離形態または組換え形態であり得る。すなわち、リボスイッチは、同一の一次構造を有するが、新規の遺伝子または核酸状況で単離または操作されている。キメラリボスイッチを、例えば、任意のリボスイッチのまたは特定のクラスもしくは型のリボスイッチのリボスイッチの一部および同一のリボスイッチのまたは任意の異なるクラスもしくは型のリボスイッチの異なるリボスイッチの一部；任意のリボスイッチのまたは特定のクラスもしくは型のリボスイッチのリボスイッチの一部および任意の非リボスイッチ配列または成分で構成することができる。組換えリボスイッチは、新規の遺伝子または核酸状況で単離または操作されているリボスイッチである。
【００６０】
リボスイッチは、１つまたは複数のアプタマードメインを有することができる。複数のアプタマードメインを有するリボスイッチ中のアプタマードメインは、トリガー分子の協同的結合を示すことができるか、トリガー分子の協同的結合を示すことができない（すなわち、アプタマーは協同的結合を示す必要がない）。後者の場合、アプタマードメインは、非依存性結合剤であるということができる。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、１つまたは複数の発現プラットフォームドメインを有することができる。例えば、トリガー分子の協同的結合を示す２つのアプタマードメインを有するリボスイッチを、両方のアプタマードメインによって調節される１つの発現プラットフォームドメインに連結することができる。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、リンカーを介して結合した１つまたは複数のアプタマーを有することができる。かかるアプタマーがトリガー分子の協同的結合を示す場合、リンカーは協同的リンカーであり得る。
【００６１】
ｘとｘ−１との間のヒル係数ｎを有する場合（ｘは、協同的結合について分析されるアプタマードメイン数（またはアプタマードメイン上の結合部位数）である）、アプタマードメインは協同的結合を示すということができる。したがって、例えば、リボスイッチが２と１との間のヒル係数を有する場合、２つのアプタマードメインを有するリボスイッチ（グリシン応答性リボスイッチなど）は協同的結合を示すということができる。使用した値ｘが協同的結合について分析したアプタマードメイン数（必ずしもリボスイッチ中のアプタマードメインの存在数ではない）に依存すると理解すべきである。一部のみしか協同的結合を示さない場合にリボスイッチが複数のアプタマードメインを有することができるので、これは理解される。
【００６２】
非相同アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むキメラリボスイッチを開示する。すなわち、キメラリボスイッチは、ある供給源由来のアプタマードメインおよび別の供給源由来の発現プラットフォームドメインから構成される。非相同供給源は、例えば、異なる特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。非相同アプタマーは、非リボスイッチアプタマーにも由来し得る。非相同発現プラットフォームドメインは、非リボスイッチ供給源にも由来し得る。
【００６３】
改変リボスイッチまたは誘導体リボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択および進化技術を使用して産生することができる。一般に、リボスイッチに適用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化技術は、リボスイッチ配列の一部が変化している一方で、リボスイッチの他の部分が一定に保持されている改変（ｖａｒｉａｎｔ）リボスイッチ組の産生を含む。次いで、改変リボスイッチ組の活性化、非活性化、または遮断（または他の機能的もしくは構造的基準）を評価することができ、目的の基準を満たす改変リボスイッチを使用またはさらなる進化ラウンドのために選択する。改変体生成に有用な基盤リボスイッチは、本明細書中に開示の特異的およびコンセンサスリボスイッチである。コンセンサスリボスイッチを使用して、どのリボスイッチ部分がｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択および進化のために変化するかについての情報を提供することができる。
【００６４】
調節が変化した改変リボスイッチも開示する。リボスイッチの調節を、リボスイッチ（キメラリボスイッチである）の発現プラットフォームドメインへのアプタマードメインの作動可能な連結によって変化させることができる。次いで、アプタマードメインは、例えば、アプタマードメインのためのトリガー分子の作用によってリボスイッチの調節を媒介することができる。アプタマードメインを、任意の適切な様式で（例えば、リボスイッチの通常または天然のアプタマードメインの新規のアプタマードメインとの置換によるものが含まれる）、リボスイッチの発現プラットフォームドメインに作動可能に連結することができる。一般に、アプタマードメインが由来するリボスイッチを活性化、誘導体化、または遮断することができる任意の化合物または条件を使用して、キメラリボスイッチを活性化、誘導体化、または遮断することができる。
【００６５】
不活化リボスイッチも開示する。リボスイッチの共有結合の変化（例えば、リボスイッチの一部の架橋または化合物のリボスイッチへのカップリング）によってリボスイッチを不活化することができる。この様式でのリボスイッチの不活化は、例えば、リボスイッチに対しトリガー分子の結合を防止するか、トリガー分子の結合の際にリボスイッチの状態の変化を防止するか、リボスイッチの発現プラットフォームドメインがトリガー分子の結合の際に発現に影響を及ぼすのを防止する変化に起因し得る。
【００６６】
バイオセンサーリボスイッチも開示する。バイオセンサーリボスイッチは、その同系のトリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを産生する操作リボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、閾値レベルまたは閾値レベルを超えるトリガー分子で誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかシグナル産生に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結されたバイオセンサーリボスイッチを、細胞または生物にリボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を保有させるように操作することによってｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むリボスイッチである。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチからの或いはそれに由来するアプタマードメインを使用する。バイオセンサーリボスイッチを、種々の状況およびプラットフォームで使用することができる。例えば、バイオセンサーリボスイッチを、固体支持体（プレート、チップ、ストリップ、およびウェルなど）と共に使用することができる。
【００６７】
新規のトリガー分子を認識する改変リボスイッチまたは誘導体リボスイッチも開示する。新規のトリガー分子を認識する新規のリボスイッチおよび／または新規のアプタマーを、公知のリボスイッチのために選択するか、公知のリボスイッチからデザインするか、公知のリボスイッチから誘導することができる。例えば、リボスイッチ中のアプタマー改変体組を産生する工程、目的の化合物の存在下での改変リボスイッチの活性化を評価する工程、活性化された改変リボスイッチ（または、例えば、最高にまたは最も選択的に活性化されたリボスイッチ）の選択、および所望の活性、特異性、活性と特異性との組み合わせ、または特性の他の組み合わせの改変リボスイッチが得られるまでこれらの工程を繰り返すことによってこれを行うことができる。
【００６８】
一般に、発現プラットフォームドメイン中の調節された鎖をアプタマードメインの調節鎖に相補的であるようにデザインまたは適合させることによって、任意のアプタマードメインを任意の発現プラットフォームドメインと共に使用するために適合させることができる。あるいは、調節鎖が発現プラットフォーム中の機能的に重要な配列に相補的であるように、アプタマーの配列およびアプタマードメインの調節鎖を適合させることができる。例えば、調節鎖とシャインーダルカルノ配列との間のステム構造の形成の際に、ＳＤ配列がリボソームに利用不可能になり、それにより、翻訳開始が減少または防止されるように、調節鎖をＲＮＡのＳＤ配列に相補的であるように適応させることができる。アプタマー鎖がアプタマードメイン中のＰ１ステムを形成可能なように配列内に対応する変化を有することに留意のこと。協同的結合を示す複数のアプタマーを有するリボスイッチの場合、活性化アプタマー（発現プラットフォームドメインと相互作用するアプタマー）のＰ１ステムの１つは、ＳＤ配列とステム構造を形成するようにデザインされる必要がある。
【００６９】
別の例として、転写ターミネーターを、ＲＮＡ分子（ＲＮＡの非翻訳領域が最も都合が良い）に付加することができる。ここで、転写ターミネーター配列の一部は、アプタマードメインの調節鎖に相補的である（その配列は調節された鎖である）。これにより、アプタマードメインの調節配列は、アプタマー鎖および調節された鎖と別のステム構造を形成することが可能であり、それにより、リボスイッチの活性化または非活性化の際に転写ターミネーターステムが形成されるか破壊される。任意の他の発現エレメントを、別のステム構造の類似のデザインによってリボスイッチの調節下におくことができる。
【００７０】
リボスイッチによって調節される転写ターミネーターについて、リボスイッチおよび発現プラットフォームエレメントの転写およびスペーシングの速度は、適切な調節に重要であり得る。転写速度を、例えば、ポリメラーゼ休止エレメント（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐａｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（例えば、一連のウリジン残基）を含めて転写を休止させ、リボスイッチがトリガー分子の形成および感知を可能とすることによって調整することができる。
【００７１】
コード領域に作動可能に連結されたｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含む調節可能な遺伝子発現構築物であって、リボスイッチがＲＮＡの発現を調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同である、構築物を開示する。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。リボスイッチは２つ以上のアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインの少なくとも１つは非相同である。少なくとも２つのアプタマードメインは協同的結合を示すことができる。
【００７２】
非相同リボスイッチおよびコード領域を含むＲＮＡ分子を開示する。すなわち、かかるＲＮＡ分子は、ある供給源由来のリボスイッチおよび別の供給源由来のコード領域から構成される。非相同供給源は、例えば、異なるＲＮＡ分子、異なる転写物、異なる遺伝子由来のＲＮＡまたは転写物、異なる細胞由来のＲＮＡまたは転写物、異なる生物由来のＲＮＡまたは転写物、異なる種由来のＲＮＡまたは転写物、天然の配列および人工または操作された配列、特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。
【００７３】
本明細書中に開示する場合、用語「コード領域」は、アミノ酸をコードする核酸の任意の領域をいう。これは、コドンまたはコドンのテンプレートを含む核酸鎖および二本鎖核酸分子の場合のかかる核酸鎖の相補物の両方を含むことができる。コード領域でない核酸領域を、非コード領域ということができる。転写される伝令ＲＮＡ分子は、典型的には、５’末端および３’末端の両方に非コード領域を含む。真核生物ｍＲＮＡ分子は、イントロンなどの内部非コード領域も含むことができる。いくつかのＲＮＡ分子型は、ｔＲＮＡ分子およびｒＲＮＡ分子などの機能的コード領域を含まない。非コードＲＮＡ分子と呼ぶことができる機能的コード領域を含まないＲＮＡ分子の発現を、開示のリボスイッチによって調節または影響を及ぼすこともできる。したがって、開示のリボスイッチを、コード領域へのリボスイッチの作動可能な連結について本明細書中に開示の任意の様式で非コードＲＮＡ分子に作動可能に連結することができる。コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡの調節について本明細書中に開示のように、リボスイッチはかかるＲＮＡの発現を調節することができる。任意の核酸分子の機能を、開示のリボスイッチによって調節または影響を及ぼすこともできる。例には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、人工核酸（ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。開示の方法では、リボスイッチは、例えば、コード領域の発現、コードされたタンパク質の発現、非コードＲＮＡ分子の発現、ＲＮＡまたはコード領域の転写、またはコードされたタンパク質の翻訳を調節することができる。
【００７４】
１．アプタマードメイン
アプタマーは、特定の化合物および化合物クラスに選択的に結合することができる核酸セグメントおよび構造である。リボスイッチは、トリガー分子の結合の際にリボスイッチの状態または構造が変化するアプタマードメインを有する。機能的リボスイッチでは、アプタマードメインに連結した発現プラットフォームドメインの状態または構造は、トリガー分子がアプタマードメインに結合した場合に変化する。リボスイッチのアプタマードメインは、任意の供給源（例えば、天然リボスイッチのアプタマードメイン、人工アプタマー、操作された、選択された、進化した、または誘導されたアプタマーまたはアプタマードメインが含まれる）に由来し得る。リボスイッチ中のアプタマーは、一般に、ステム構造の形成などによって連結した発現プラットフォームドメイン部分と相互作用することができる少なくとも１つの部分を有する。このステム構造は、トリガー分子の結合の際に形成されるか破壊されるかのいずれかである。
【００７５】
種々の天然リボスイッチのコンセンサスアプタマードメインを、米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の図１１および本明細書中の他所に示す。ｐｒｅＱ１リボスイッチのコンセンサス配列および構造を図３に見出すことができる。これらのアプタマードメイン（本明細書中に具体化された全てのダイレクト改変体（ｄｉｒｅｃｔ  ｖａｒｉａｎｔ）が含まれる）を、リボスイッチ中で使用することができる。コンセンサス配列および構造は、配列および構造の変形を示す。示した変形内のアプタマードメインを本明細書中でダイレクト改変体という。これらのアプタマードメインを、改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）または改変（ｖａｒｉａｎｔ）アプタマードメインが産生されるように改変することができる。保存的改変には、対の中のヌクレオチドが相補性を維持するような塩基対合ヌクレオチドの任意の変化が含まれる。中等度の改変には、示した長さ範囲の２０％以下のまたは等しい（長さまたは長さの範囲を示す）ステムまたはループの長さの変化が含まれる。コンセンサス構造が特定の長さのステムまたはループを示す場合、または、長さの範囲が列挙または表示される場合、ループおよびステムの長さを、「示す」と見なす。中等度の改変には、示した長さ範囲の４０％以下のまたは等しい（長さまたは長さの範囲を示さない）ステムまたはループの長さの変化が含まれる。中等度の改変には、アプタマードメインの非特定部分の機能的改変体も含まれる。
【００７６】
開示のリボスイッチのアプタマードメインを、任意の他の目的、および任意の他の状況のためにアプタマーとして使用することもできる。例えば、アプタマーを使用して、リボザイム、他の分子スイッチ、および構造の変化がＲＮＡの機能に影響を及ぼし得る任意のＲＮＡ分子を調節することができる。
【００７７】
２．発現プラットフォームドメイン
発現プラットフォームドメインは、リボスイッチを含むＲＮＡ分子の発現に影響を及ぼすリボスイッチの一部である。発現プラットフォームドメインは、一般に、ステム構造の形成などによって連結したアプタマードメインの一部と相互作用することができる少なくとも１つの部分を有する。このステム構想は、トリガー分子の結合の際に形成されるか破壊されるかのいずれかである。ステム構造は、一般に、発現調節構造を形成するか、これの形成を防止するかのいずれかである。発現調節構造は、構造を含むＲＮＡ分子の発現を許容するか、防止するか、増強するか、阻害する構造である。例には、シャイン−ダルガルノ配列、開始コドン、転写ターミネーター、安定性シグナル、ならびにプロセシングシグナル（ＲＮＡスプライシングジャンクションおよび調節エレメントなど）が含まれる。
【００７８】
Ｂ．トリガー分子
トリガー分子は、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物である。これには、リボスイッチの天然または通常のトリガー分子およびリボスイッチを活性化することができる他の化合物が含まれる。天然または通常のトリガー分子は、所与の天然のリボスイッチのためのトリガー分子であるかまたはいくつかの非天然リボスイッチの場合、リボスイッチがデザインされるためのトリガー分子か、それと共にリボスイッチが選択される（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択技術またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化技術など）トリガー分子である。
【００７９】
Ｃ．化合物
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物およびかかる化合物を含む組成物も開示する。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。化合物を使用して、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる。リボスイッチのトリガー分子（ならびに他の活性化化合物）を使用して、リボスイッチを活性化することができる。トリガー分子以外の化合物を使用して、一般に、リボスイッチを非活性化または遮断することができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチの存在からのトリガー分子の除去によって非活性化することもできる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチを活性化しないトリガー分子のアナログの結合によって遮断することができる。
【００８０】
ＲＮＡ分子がリボスイッチを含む、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変化させるための化合物も開示する。化合物のＲＮＡ分子との接触によってこれを行うことができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。したがって、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する条件に応じたリボスイッチを含む目的のＲＮＡ分子を供して、ＲＮＡの発現を変化させるために使用することができる。例えば、転写の終結またはＲＮＡへのリボゾーム結合遮断の結果として発現を変化させることができる。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質に応じて、ＲＮＡ分子の発現を減少または防止することができるか、ＲＮＡ分子の発現を促進または増加することができる。ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を調節するための化合物も開示する。リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってリボスイッチを含む天然に存在する遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための化合物も開示する。遺伝子がこの遺伝子を保有する細胞または生物の生存に不可欠である場合、リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断により、細胞または生物が死滅、静止、または衰弱し得る。
【００８１】
リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってリボスイッチを含む単離遺伝子、操作遺伝子、もしくは組換え遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための化合物も開示する。遺伝子が所望の発現産物をコードする場合、リボスイッチの活性化および非活性化を使用して、遺伝子発現を誘導し、それにより、発現産物を産生させることができる。遺伝子が遺伝子発現のインデューサーまたはリプレッサーあるいは別の細胞過程のインデューサーまたはリプレッサーをコードする場合、リボスイッチの活性化、非活性化、またはブロッキングにより、他の調節された遺伝子または細胞過程を誘導、抑制、または脱抑制することができる。多数のかかる二次調節効果は公知であり、リボスイッチと共に使用するために適応させることができる。かかる調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の一次調節（ｃｏｎｔｒｏｌ）としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチトリガー分子が小さな非抗原性分子であり得ることである。
【００８２】
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物を同定する方法も開示する。例えば、リボスイッチを活性化する化合物を、試験化合物とリボスイッチとの接触させる工程およびリボスイッチの活性化を評価する工程によって同定することができる。リボスイッチが活性化される場合、試験化合物を、リボスイッチを活性化する化合物と同定する。リボスイッチの活性化を、任意の適切な様式で評価することができる。例えば、リボスイッチをレポーターＲＮＡに連結することができ、レポーターＲＮＡの発現、発現レベル、または発現レベルの変化を、試験化合物の存在下および非存在下で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むことができる。かかるリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するか、これから誘導するアプタマードメインを使用する。認められるように、調節アッセイまたは測定を使用するか調節アッセイまたは測定を使用しないで、リボスイッチの活性化を評価することができる。リボスイッチを非活性化する化合物の同定方法を、類似の方法で行うことができる。リボスイッチを遮断する化合物の同定を、任意の適切な様式で行うことができる。例えば、リボスイッチを活性化または非活性化することが公知の化合物の存在下および試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を評価するためのアッセイを行うことができる。試験化合物の非存在下で観察されるように活性化または非活性化が認められない場合、試験化合物を、リボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定する。
【００８３】
ｐｒｅＱ１リボスイッチと相互作用するアナログを本明細書中に開示する。具体的には、これらの化合物のさらに改変されたバージョンは、ＲＮＡ構造中の他の官能基への新規の接触によってｐｒｅＱ１リボスイッチへの改良された結合を有することができる。さらに、リボスイッチの構造モデルがこれらの部位で可能な多数の改変を示すので、生物学的利用能、毒性、および合成の容易さ（他の特徴のうち）の調整を、これらの２つの足場領域における改変によって調節可能とすることができる。
【００８４】
ハイスループットスクリーニングを使用して、標準的または非標準的な分子認識様式のいずれかを使用してリボスイッチＲＮＡにも結合する全く新しい化学足場を完全に明らかにすることもできる。リボスイッチは、発見される天然代謝産物結合ＲＮＡの最初の主要な形態なので、ハイスループットスクリーニングのために適応させることができる結合アッセイを作製するための事前の努力はほとんど必要ない。複数の異なるアプローチを使用して、代謝産物結合ＲＮＡを検出することができ、このアプローチには、ゲルベースおよびチップベースの検出方法を使用したアロステリックリボザイムアッセイおよびインライン探索アッセイが含まれる。リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の同定および同定された化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物同定方法と同定された化合物の製造方法との組み合わせにより、これを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触、リボスイッチの活性化の評価、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造によって化合物を作製することができる。
【００８５】
化合物によるリボスイッチの活性化、非活性化、または遮断のチェックおよびチェックした化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物の活性化、非活性化、または遮断評価方法とチェックした化合物の製造方法との組み合わせによってこれを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触、リボスイッチの活性化の評価、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造によって化合物を作製することができる。化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する能力についての化合物のチェックは、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することを以前には知られていない化合物の同定および化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することが既に知られていた場合のリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の能力の評価の両方をいう。
【００８６】
本明細書中で使用する場合、用語「置換された」は、有機化合物の全ての許容される置換基を含むことが意図される。広範な態様では、許容される置換基には、非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環式および複素環式、ならびに芳香族および非芳香族の有機化合物の置換基が含まれる。例示的な置換基には、例えば、下記の置換基が含まれる。許容される置換基は、適切な有機化合物と１つまたは複数が同一または異なり得る。本開示の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、ヘテロ原子の原子価を満たす本明細書中に記載の有機化合物の水素置換基および／または任意の許容される置換基を有することができる。本開示は、いかなる様式においても有機化合物の許容される置換基によって制限されることを意図しない。また、用語「置換」または「〜と置換された」には、かかる置換が置換された原子および置換基の許容される原子価に従い、置換によって安定な化合物（例えば、転位、環化、脱離などによって自発的に変換されない化合物）が得られるという暗黙の条件が含まれる。
【００８７】
「Ａ１」、「Ａ２」、「Ａ３」、および「Ａ４」を、本明細書中で、種々の特異的置換基を示すための一般的記号として使用する。これらの記号は、本明細書中に開示の置換基に制限されない任意の置換基であってよく、置換基が一例にて一定の置換基であると定義される場合であっても、別の例にていくつかの他の置換基と定義することができる。
【００８８】
用語「アルキル」は、本明細書中で使用する場合、１〜２４個の炭素原子の分岐または非分岐の飽和炭化水素基（メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、およびテトラコシルなど）である。アルキル基は、置換または非置換であってもよい。アルキル基を１つまたは複数の基（下記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない）と置換することができる。用語「低級アルキル」は、６個以下の炭素原子を有するアルキル基である（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、およびヘキシルなど）。
【００８９】
本明細書を通して、「アルキル」を、一般に、非置換アルキル基および置換アルキル基の両方をいうために使用するが、置換アルキル基はまた、特に、本明細書中で、同定によるアルキル基上の特定の置換基をいう。例えば、用語「ハロゲン化アルキル」は、特に、１つまたは複数のハライド（例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素）と置換されたアルキル基をいう。用語「アルコキシアルキル」は、特に、１つまたは複数の下記のアルコキシ基と置換されたアルキル基をいう。用語「アルキルアミノ」は、特に、１つまたは複数の下記のアミノ基などと置換されたアルキル基をいう。ある例で「アルキル」を使用し、「ハロゲン化アルキル」などの特定の用語を別の例で使用する場合、用語「アルキル」には「ハロゲン化アルキル」などの特定の用語が含まれないことを意味するように意図するものではない。
【００９０】
このプラクティスを、本明細書中に記載の他の基にも使用する。すなわち、「シクロアルキル」などの用語が非置換および置換シクロアルキル部分の両方をいう一方で、置換部分を、さらに、本明細書中で特に同定することができる。例えば、特定の置換シクロアルキルは、例えば、「アルキルシクロアルキル」をいうことができる。同様に、置換アルコキシを、特に、例えば、「ハロゲン化アルコキシ」ということができ、特に置換されたアルケニルは、例えば、「アルケニルアルコール」などであり得る。さらに、「シクロアルキル」などの一般用語および「アルキルシクロアルキル」などの特定の用語を使用するプラクティスは、一般用語が特定の用語を含まないことを意味するように意図するものではない。
【００９１】
用語「アルコキシ」は、本明細書中で使用する場合、１つの末端エーテル結合によって結合したアルキル基である。すなわち、「アルコキシ」基を、−ＯＡ１（式中、Ａ２は上記定義のアルキルである）と定義することができる。
【００９２】
用語「アルケニル」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む構造式を有する２〜２４個の炭素原子の炭化水素基である。（Ａ１Ａ２）Ｃ＝Ｃ（Ａ３Ａ４）などの非対称構造は、Ｅ異性体およびＺ異性体の両方を含むことを意図する。これを非対称アルケンが存在する本明細書中の構造式中で推定することができるか、結合記号Ｃ＝Ｃによって明確に示すことができる。アルケニル基を、１つまたは複数の基（下記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない）と置換することができる。
【００９３】
用語「アルキニル」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む構造式を有する２〜２４個の炭素原子の炭化水素基である。アルキニル基を、１つまたは複数の基（下記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない）と置換することができる。
【００９４】
用語「アリール」は、本明細書中で使用する場合、任意の炭素ベースの芳香基を含む基（ベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、およびフェノキシベンゼン等が含まれるが、これらに限定されない）である。用語「アリール」には、芳香基の環内に組み込まれた少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香基を含む基と定義される「ヘテロアリール」も含まれる。ヘテロ原子の例には、窒素、酸素、硫黄、およびリンが含まれるが、これらに限定されない。同様に、用語「アリール」にも含まれる用語「非ヘテロアリール」は、ヘテロ原子を含まない芳香基を含む基を定義する。アリール基は、置換または非置換であり得る。アリール基を、１つまたは複数の基（本明細書中に記載のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない）と置換することができる。用語「ビアリール」は、アリール基の特定の型であり、アリールの定義に含まれる。ビアリールは、ナフタレンなどのように融合環構造を介して互いに結合しているか、ビフェニルなどのように１つまたは複数の炭素−炭素結合を介して結合している２つのアリール基をいう。
【００９５】
用語「シクロアルキル」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも３つの炭素原子から構成される非芳香族炭素ベースの環である。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれるが、これらに限定されない。用語「ヘテロシクロアルキル」は、環の少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子（窒素、酸素、硫黄、またはリンなどであるがこれらに限定されない）と置換される上記定義のシクロアルキル基である。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、置換または非置換であり得る。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基を、１つまたは複数の基（本明細書に記載のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない）と置換することができる。
【００９６】
用語「シクロアルケニル」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも３つの炭素原子から構成され、且つ少なくとも１つの二重結合（すなわち、Ｃ＝Ｃ）を含む非芳香族炭素ベースの環である。シクロアルケニル基の例には、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、およびシクロヘキサジエニルなどが含まれるが、これらに限定されない。用語「ヘテロシクロアルケニル」は、上記定義のシクロアルケニル基型であり、環の少なくとも１つの炭素原子が、ヘテロ原子（窒素、酸素、硫黄、またはリンなどであるがこれらに限定されない）と置換される用語「シクロアルケニル」の意味の範囲内に含まれる。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、置換または非置換であり得る。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基を、１つまたは複数の基（本明細書中に記載のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない）と置換することができる。
【００９７】
用語「環状基」は、本明細書中で、アリール基、非アリール基（すなわち、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニル基）のいずれか、またはその両方をいう。環状基は、置換または非置換であり得る１つまたは複数の環系を有する。環状基は、１つまたは複数のアリール基、１つまたは複数の非アリール基、または１つまたは複数のアリール基および１つまたは複数の非アリール基を含むことができる。
【００９８】
用語「アルデヒド」は、本明細書中で使用する場合、式−Ｃ（Ｏ）Ｈによって示される。本明細書を通して、「Ｃ（Ｏ）」は、Ｃ＝Ｏの略語である。
【００９９】
用語「アミン」または「アミノ」は、本明細書中で使用する場合、式ＮＡ１Ａ２Ａ３（式中、Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、独立して、上記の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る）によって示される。
【０１００】
用語「カルボン酸」は、本明細書中で使用する場合、式−Ｃ（Ｏ）ＯＨによって示される。「カルボキシラート」は、本明細書中で使用する場合、式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−によって示される。
【０１０１】
用語「エステル」は、本明細書中で使用する場合、式−ＯＣ（Ｏ）Ａ１または−Ｃ（Ｏ）ＯＡ１（式中、Ａ１は、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る）によって示される。
【０１０２】
用語「エーテル」は、本明細書中で使用する場合、式Ａ１ＯＡ２（式中、Ａ１およびＡ２は、独立して、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る）によって示される。
【０１０３】
用語「ケトン」は、本明細書中で使用する場合、式Ａ１Ｃ（Ｏ）Ａ２（式中、Ａ１およびＡ２は、独立して、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る）によって示される。
【０１０４】
用語「ハライド」は、本明細書中で使用する場合、ハロゲンであるフッ素、塩素、臭素、およびヨウ素をいう。
【０１０５】
用語「ヒドロキシル」は、本明細書中で使用する場合、式−ＯＨによって示される。
【０１０６】
用語「スルホ−オキソ」は、本明細書中で使用する場合、式−Ｓ（Ｏ）Ａ１（すなわち、「スルホニル」）、Ａ１Ｓ（Ｏ）Ａ２（すなわち、「スルホキシド」）、−Ｓ（Ｏ）２Ａ１、Ａ１ＳＯ２Ａ２（すなわち、「スルホン」）、−ＯＳ（Ｏ）２Ａ１、または−ＯＳ（Ｏ）２ＯＡ１（式中、Ａ１およびＡ２は、上記の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る）によって示される。本明細書を通して、「Ｓ（Ｏ）」は、Ｓ＝Ｏの略語である。
【０１０７】
用語「スルホニルアミノ」または「スルホンアミド」は、本明細書中で使用する場合、式−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−によって示される。
【０１０８】
用語「チオール」は、本明細書中で使用する場合、式−ＳＨによって示される。
【０１０９】
本明細書中で使用する場合、「Ｒｎ」（式中、ｎはいくつかの整数である）は、独立して、上記列挙の１つまたは複数の基を有することができる。選択される基に応じて、第１の基を第２の基内に組み込むことができるか、あるいは、第１の基は第２の基に対する懸垂物（すなわち、結合物）であり得る。例えば、句「アミノ基を含むアルキル基」では、アミノ基をアルキル基骨格内に組み込むことができる。あるいは、アミノ基を、アルキル基骨格に結合することができる。選択される基の性質は、第１の基が第２の基に埋め込まれるか結合するかどうかを決定する。
【０１１０】
逆に記述されない限り、実線のみで示され、楔形や破線として示されない化学結合を有する式は、それぞれ可能な異性体（例えば、それぞれの鏡像異性体およびジアステレオマー、ならびに異性体の混合物（ラセミ混合物またはスケールミック混合物（ｓｃａｌｅｍｉｃ  ｍｉｘｔｕｒｅ））を意図する。
【０１１１】
本明細書中に開示の一定の材料、化合物、組成物、および成分を購入することができるか、当業者に一般的に公知の技術を使用して容易に合成することができる。例えば、開示の化合物および組成物の調製で使用される出発材料および試薬を、供給業者（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ，Ｎ．Ｊ．）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ．）、またはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から入手可能であるか、Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第１−１７巻（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｒｏｄｄ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，第１−５巻およびＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８９）；Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，第１−４０巻（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；およびＬａｒｏｃｋ’ｓ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．，１９８９）などのリファレンスに記載の手順にしたがった当業者に公知の方法によって調製する。
【０１１２】
ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ（およびｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ由来のリボスイッチ）に有用な化合物には、式Ｉ：
【０１１３】
【化１０】
2010521978.tif 000011
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体である）によって示される化合物が含まれ、
細胞はｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物はｐｒｅＱ１応答性リボスイッチへの結合によって遺伝子発現を阻害する。
【０１１４】
化合物は、式ＩＩ：
【０１１５】
【化１１】
2010521978.tif 000012
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、Ｃ−水素結合供与体、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり得、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであり、
Ｒ２は存在せず、
Ｒ３はＮＨ２であり、
Ｒ４は存在しない）の構造を有することができる。
【０１１６】
化合物は、式ＩＩ：
【０１１７】
【化１２】
2010521978.tif 000013
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体であり、
Ｒ２は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ３はＮＨ２であり、
Ｒ４は存在しない）の構造を有することができる。
【０１１８】
化合物は、式ＩＩ：
【０１１９】
【化１３】
2010521978.tif 000014
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体であり、
Ｒ２は存在せず、
Ｒ３は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ４は存在しない）の構造を有することができる。
【０１２０】
化合物は、式ＩＩ：
【０１２１】
【化１４】
2010521978.tif 000015
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体であり、
Ｒ２は存在せず、
Ｒ３はＮＨ２であり、
Ｒ４は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない）の構造を有することができる。
【０１２２】
化合物は、式ＩＩ：
【０１２３】
【化１５】
2010521978.tif 000016
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体であり、
Ｒ２は存在せず、
Ｒ３は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ４は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない）の構造を有することができる。
【０１２４】
化合物は、式ＩＩ：
【０１２５】
【化１６】
2010521978.tif 000017
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体であり、
Ｒ２は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ３はＮＨ２であり、
Ｒ４は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない）の構造を有することができる。
【０１２６】
化合物は、式ＩＩ：
【０１２７】
【化１７】
2010521978.tif 000018
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体であり、
Ｒ２は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ３は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ４は存在しない）の構造を有することができる。
【０１２８】
化合物は、式ＩＩ：
【０１２９】
【化１８−１】
2010521978.tif 000019
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ、Ｎ、Ｃ−ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｃ−ＣＮ、Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ−ＣＨ＝ＮＨ、Ｃ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、またはＣ−水素結合供与体であり、
Ｒ２は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ３は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
Ｒ４は、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、Ｏ、ＯＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｃ−Ｒ５、ＣＨ−Ｒ５、Ｎ−Ｒ５、ＮＨ−Ｒ５、Ｏ−Ｒ５、またはＳ−Ｒ５であり、Ｒ５は、ＮＨ２＋、ＮＨ３＋、ＣＯ２Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＮＨ２）２、Ｃ（ＮＨ２）２＋、ＣＮＨ２ＮＨ３＋、Ｃ（ＮＨ３＋）３、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、１，２−ジヒドロキシエチル、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル、１−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシブチル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、１，４ジヒドロキシブチル、２，４−ジヒドロキシブチル、１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル、１−ヒドロキシメチル−１−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、１−チオールエチル、２−チオールエチル、１，２−ジチオールエチル、２−チオール−１−メチルエチル、１−チオールプロピル、２−チオールプロピル、３−チオールプロピル、１，３−ジチオールプロピル、２，３−ジチオールプロピル、１−チオールブチル、２−チオールブチル、３−チオールブチル、４−チオールブチル、１，４ジチオールブチル、２，４−ジチオールブチル、１−チオール−２−メチルプロピル、２−チオール−２−メチルプロピル、３−チオール−２−メチルプロピル、１−チオールメチル−１−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、１−アミノエチル、２−アミノエチル、１，２−ジアミノエチル、２−アミノ−１−メチルエチル、１−アミノプロピル、２−アミノプロピル、３−アミノプロピル、１，３−ジアミノプロピル、２，３−ジアミノプロピル、１−アミノブチル、２−アミノブチル、３−アミノブチル、４−アミノブチル、１，４ジアミノブチル、２，４−ジアミノブチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミノメチル−１−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない）の構造を有することができる。
【０１３０】
特定の部分または基を本明細書中で水素結合供与体または水素結合受容体ということができる一方、この用語を各言及について種々の置換基を分類するためだけに使用すると理解すべきである。かかる専門用語は、特定の部分がリボスイッチまたはいくつかの他の化合物との水素結合に実際に関与することを意味すると解釈すべきではない。例えば、本明細書中で水素結合受容体（または供与体）と呼ばれる部分が、リボスイッチまたは他の化合物との疎水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または他の型の相互作用に唯一または付加的に関与し得る可能性がある。
【０１３１】
本明細書中に開示の一定の基を本明細書中で水素結合受容体および水素結合供与体の両方としていうことができることもまた理解される。例えば、−ＯＨは水素原子の供与による水素結合供与体であり得る。−ＯＨは、酸素原子上の１つまたは複数の非結合電子対による水素結合受容体でもあり得る。したがって、本明細書を通して、種々の部分は水素結合供与体および水素結合受容体であり得、そのように言及することができる。
【０１３２】
上記定義内のあらゆる化合物は、本明細書中に具体的に開示されていることを意図するか、見なされるべきである。さらに、上記定義内で同定することができるあらゆる下位集団は、本明細書中に具体的に開示されていることを意図するか、見なされるべきである。結果として、任意の化合物または化合物の下位集団が特に使用のために含まれるか使用から排除されるか、化合物リスト中に含まれるか化合物リストから排除されることを特に意図する。例として、各化合物が上記定義の通りであり、且つｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを活性化することができる化合物群が意図される。
【０１３３】
リボスイッチと相互作用する化合物についての本明細書中に記載の特定の接触および相互作用（水素結合供与または水素結合受容など）が好ましいが、化合物のリボスイッチとの相互作用に不可欠ではないと理解すべきである。例えば、化合物は、開示の接触および相互作用を有する化合物よりも低い親和性および／または特異性でリボスイッチと相互作用することができる。さらに、化合物上の異なる官能基または追加の官能基が、リボスイッチとの、新規の接触、異なる接触、そして／または代償の接触をもたらすことができる。例えば、ｐｒｅＱ１リボスイッチについて、大きな官能基を使用することができる。かかる官能基は、リボスイッチの他の部分と接触または相互作用することができ、および接触または相互作用するようにデザインすることができる。かかる接触および相互作用は、トリガー分子およびコア構造の接触および相互作用を補うことができる。
【０１３４】
Ｄ．構築物、ベクター、および発現系
開示のｐｒｅＱ１リボスイッチを、任意の適当な発現系と共に使用することができる。組換え発現を、通常、プラスミドなどのベクターを使用して行う。ベクターは、リボスイッチコード配列および発現するＲＮＡ（例えば、タンパク質をコードするＲＮＡ）に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。ベクターはまた、転写および翻訳に必要な他のエレメントを含むことができる。本明細書中で使用する場合、ベクターは、外因性ＤＮＡを含む任意のキャリアをいう。したがって、ベクターは、分解することなく細胞に外因性核酸を輸送する作用物質（ａｇｅｎｔ）であり、送達された細胞中で核酸を発現させるプロモーターを含む。ベクターには、プラスミド、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。リボスイッチ調節構築物の輸送に適切な種々の原核生物および真核生物発現ベクターを産生することができる。かかる発現ベクターには、例えば、ｐＥＴ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＲ２．１、ｐＢＡＤ、ｐＵＣ、および酵母ベクターが含まれる。ベクターを、例えば、種々のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ状況で使用することができる。
【０１３５】
ウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経向性ウイルス（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルスおよび他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶバックボーンを有するこれらのウイルスが含まれる）が含まれる。ベクターとしての使用が適切となるこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーも有用である。Ｖｅｒｍａ（１９８５）に記載のレトロウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍａｌｏｎｅｙ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＬＶ）、およびベクターとしてＭＭＬＶの所望の性質を発現するレトロウイルスが含まれる。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を調節するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作する場合、ウイルスは、典型的には、１つまたは複数の初期遺伝子を除去し、除去したウイルスＤＮＡの代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットをウイルスゲノム中に挿入する。
【０１３６】
「プロモーター」は、一般に、転写開始部位に対して比較的固定した位置に存在する場合に機能するＤＮＡ配列である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。
【０１３７】
「エンハンサー」は、一般に、転写開始部位から固定していない距離で機能し、転写単位に対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，１９８１）または３’側（Ｌｕｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）であり得るＤＮＡ配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロン内に存在することができ（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）、コード配列自体の内部にも存在することができる（Ｏｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。これらは、通常、１０ｂｐ長と３００ｂｐ長との間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近接するプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、プロモーターと同様に、転写調節を媒介する応答エレメントをしばしば含む。エンハンサーは、しばしば、発現調節を決定する。
【０１３８】
真核生物宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写終結に必要な配列を含むことができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中でポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位がポリアデニル化領域も含むことが好ましい。この領域の利点の１つは、転写単位がｍＲＮＡのようにプロセシングおよび輸送される可能性が増加することである。発現構築物中でのポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを導入遺伝子構築物中で使用することが好ましい。
【０１３９】
ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含む。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達されたかどうか、および一旦送達されると発現するかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであり得る。かかる選択可能なマーカーが宿主細胞に首尾よく導入された場合、形質転換された宿主細胞は選択圧下においた場合に生存することができる。２つの広く使用されている異なるカテゴリーの選択レジメが存在する。第１のカテゴリーは、細胞の代謝および補充培地と無関係に増殖する能力を欠く変異細胞の使用に基づく。第２のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームをいい、変異細胞系統の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を使用する。新規の遺伝子を有するそれらの細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択を生き抜く。かかる優性選択の例は、薬物であるネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，１９８２）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，１９８０）、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）を使用する。
【０１４１】
遺伝子材料（プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体であるが、これらに限定されない）の直接移入の使用またはカチオニックリポソームなどの細胞またはキャリア中の遺伝子材料の移入を介して、遺伝子を移入することができる。かかる方法は当該分野で周知であり、本明細書中に記載の方法での使用に容易に適応することができる。移入ベクターは、細胞に遺伝子を送達させるために使用される任意のヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）または一般的な遺伝子送達ストラテジーの一部（例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部）（Ｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８，（１９９３））であり得る。適切なトランスフェクション手段（ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、または物理的機械的方法（エレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散など）が含まれる）は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；ａｎｄ  Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）に記載されている。
【０１４２】
１．ウイルスベクター
好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経向性ウイルス、シンドビスウイルスおよび他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶバックボーンを有するこれらのウイルスが含まれる）である。ベクターとしての使用が適切となるこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーも好ましい。好ましいレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、およびベクターとしてＭＭＬＶの所望の性質を発現するレトロウイルスが含まれる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより高い遺伝子負荷量（すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子）を輸送することができ、この理由のために、一般的に使用されるベクターである。しかし、これらは、非増殖細胞で有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、作業が容易であり、高力価を有し、エアゾール処方物中で送達させることができ、非分裂細胞にトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは、巨大であり、いくつかの遺伝子挿入部位を有し、熱安定性を示し、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって誘発される宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターである。この型の好ましいベクターは、インターロイキン８または１０のコード領域を保有する。
【０１４３】
ウイルスベクターは、細胞に遺伝子を導入するためのほとんどの化学的方法または物理的方法よりも高い処理能力（遺伝子導入能力）を有する。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を調節するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作する場合、ウイルスは、典型的には、１つまたは複数の初期遺伝子を除去し、除去したウイルスＤＮＡの代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットをウイルスゲノム中に挿入する。この構築物型は、約８ｋｂまでの外来遺伝子材料を保有することができる。除去された初期遺伝子の必要な機能を、典型的には、トランスで初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように操作された細胞系統によって供給される。
【０１４４】
ｉ．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、レトロウイルス科のウイルスファミリー（任意の型、亜科、属、向性が含まれる）に属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般に、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。遺伝子治療のためのレトロウイルスベクターの使用方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願国際公開第９０／０２８０６号および国際公開第８９／０７１３６号；およびＭｕｌｌｉｇａｎ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３））（その教示が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０１４５】
レトロウイルスは、本質的に、核酸カーゴ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃａｒｇｏ）に詰められたパッケージである。核酸カーゴは、パッケージングシグナルを保有し、これらのパッケージングシグナルは、複製された娘分子がパッケージコート内に効率的に詰められることを確実にする。パッケージシグナルに加えて、複製および複製されたウイルスのパッケージングのためにシスで必要な多数の分子が存在する。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含む。これは、典型的には標的細胞に移入される外来ＤＮＡと置換されるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的には、パッケージコートへの組み込みのためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写単位の開始をシグナル伝達する配列、逆転写に必要なエレメント（逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合するプライマー結合部位が含まれる）、ＤＮＡ合成中にＲＮＡ鎖のスイッチを導く末端反復配列、第２のＤＮＡ合成鎖の合成のためのプライミング部位としての機能を果たすプリンリッチ配列である５’→３’ＬＴＲ、および宿主ゲノムに挿入するためのレトロウイルスのＤＮＡ状態を挿入することができるＬＴＲの末端付近の特異的配列を含む。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の除去により、約８ｋｂの外来配列がウイルスゲノムに挿入され、逆転写するようになり、複製の際に新規のレトロウイルス粒子に詰められる。この核酸量は、各転写物のサイズに応じて、１つから多数の遺伝子の送達に十分である。挿入物中に他の遺伝子と共に正または負の選択マーカーのいずれかを含めることが好ましい。
【０１４６】
ほとんどのレトロウイルスベクター中の複製機構およびパッケージングタンパク質が除去されているので（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）、典型的には、パッケージング細胞系統へのこれらの配置によってベクターを生成する。パッケージング細胞系統は、複製およびパッケージング機構を含むが、いかなるパッケージングシグナルも欠くレトロウイルスを使用してトランスフェクションまたは形質転換した細胞系統である。選択のＤＮＡを保有するベクターをこれらの細胞系統にトランスフェクションする場合、目的の遺伝子を含むベクターを複製し、ヘルパー細胞によってシスで提供される機構によって新規のレトロウイルス粒子にパッケージングする。必要なシグナルを欠くので、この機構のゲノムはパッケージされない。
【０１４７】
ｉｉ．アデノウイルスベクター
複製欠損アデノウイルスの構築は記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ  ”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ”  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２（１９９３））。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利点は、これらのウイルスが最初の感染細胞内で複製することができるが新規の感染ウイルス粒子を形成できないので、他の細胞型に拡大することができる範囲が制限されていることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、および多数の他の組織部位への直接的なｉｎ  ｖｉｖｏ送達後に高効率の遺伝子移入を達成することが示されている（Ｍｏｒｓｙ，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，  Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１（１９９３）；ａｎｄ  Ｒａｇｏｔ，  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、特異的細胞表面受容体への結合によって遺伝子形質導入を達成し、その後、野生型または複製欠損アデノウイルスと同一の様式で、受容体媒介エンドサイトーシスによってウイルスを内在化する  （Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ  ａｎｄ  Ｄａｌｅｓ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７（１９７０）；Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：３８６−３９６（１９７３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｓｏｎ，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ��．Ｂｉｏｌ．  ４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９（１９９３））。
【０１４８】
好ましいウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスに基づいたウイルスベクターであり、これらのヴィロン（ｖｉｒｏｎ）をヒト２９３細胞系統などの細胞系統中で生成する。別の好ましい実施形態では、Ｅ１およびＥ３遺伝子の両方をアデノウイルスゲノムから除去する。
【０１４９】
別のウイルスベクター型は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠損パルボウイルスは、多数の細胞型に感染することができ、ヒトに非病原性を示すので、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは、約４〜５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは、第１９染色体に安定に挿入されることが公知である。この部位特異的組み込み特性を含むベクターが好ましい。このベクター型の特に好ましい実施形態は、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ製のＰ４．１  Ｃベクターである。これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、および／またはマーカー遺伝子（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子など）を含むことができる。
【０１５０】
ウイルスおよびレトロウイルス中の挿入遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の調節を補助するためのプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定した位置に存在する場合に機能する配列またはＤＮＡ配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。
【０１５１】
２．ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を調節する好ましいプロモーターを、種々の供給源（例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスゲノム）、または非相同哺乳動物プロモーター（例えば、βアクチンプロモーター）から得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターを、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして得ることが都合が良い（Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：  １１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして得ることが都合が良い（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８：  ３５５−３６０（１９８２））。勿論、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本明細書中で有用である。
【０１５２】
エンハンサーは、一般に、転写開始部位から固定していない距離で機能し、転写単位に対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：  ９９３（１９８１））または３’側（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：  １１０８（１９８３））のいずれかであり得るＤＮＡ配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロン内に存在することができ（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３３：  ７２９（１９８３））、ならびにコード配列自体の内部にも存在することができる（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：  １２９３（１９８４））。これらは、通常、１０ｂｐ長と３００ｂｐ長との間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近接するプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、転写調節を媒介する応答エレメントをしばしば含む。プロモーターはまた、転写調節を媒介する応答エレメントを含む。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現調節を決定する。哺乳動物遺伝子由来の多数のエンハンサー配列が現在知られているが（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【０１５３】
プロモーターおよび／またはエンハンサーを、その機能を誘発する軽度または特異的な化学事象のいずれかによって特異的に活性化することができる。系を、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節することができる。ガンマ線照射などの照射への曝露またはアルキル化化学療法薬によってウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法も存在する。
【０１５４】
プロモーターおよび／またはエンハンサー領域が全ての真核細胞型で活性であることが好ましい。この型の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
【０１５５】
全ての特異的調節エレメントをクローン化し、これを使用して、黒色腫細胞などの特定の細胞型で選択的に発現する発現ベクターを構築することができることが示されている。グリア線維酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＡＰ）プロモーターを使用して、神経膠起源の細胞中の遺伝子が選択的に発現されている。
【０１５６】
真核生物宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写終結に必要な配列を含むことができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中でポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位がポリアデニル化領域も含むことが好ましい。この領域の利点の１つは、転写単位がｍＲＮＡのようにプロセシングおよび輸送される可能性が増加することである。発現構築物中でのポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを導入遺伝子構築物中で使用することが好ましい。転写単位の好ましい実施形態では、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。転写された単位は、他の標準的な配列のみを含むか、上記配列と組み合わせて構築物からの発現または構築物の安定性を改善することも好ましい。
【０１５７】
３．マーカー
ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達され、一旦送達されると発現するかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子である。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであり得る。哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ヒドロマイシン（ｈｙｄｒｏｍｙｃｉｎ）、およびピューロマイシンである。かかる選択可能なマーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移入された場合、形質転換された哺乳動物宿主細胞は選択圧下においた場合に生存することができる。２つの広く使用されている異なるカテゴリーの選択レジメが存在する。第１のカテゴリーは、細胞の代謝および補充培地と無関係に増殖する能力を欠く変異細胞系統の使用に基づく。２つの例は以下である：ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素を添加せずに増殖する能力を欠く。これらの細胞が完全なヌクレオチド合成経路に必要な一定の遺伝子を欠くので、これらの細胞は、補充培地中に欠けているヌクレオチドを供給しない限り生存できない。培地の補充の代替は、インタクトなＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子を各遺伝子を欠く細胞に導入し、それによってその増殖要件を変化させることである。ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子で形質転換しなかった各細胞は、非補充培地で生存できない。
【０１５９】
第２のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームをいい、変異細胞系統の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を使用する。薬物耐性を伝達するタンパク質を発現する細胞は、選択を生き抜く。かかる優性選択の例は、薬物であるネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：  ３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：  １４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：  ４１０−４１３（１９８５））を使用する。３つの例は、真核生物調節下で細菌遺伝子を使用して、適切な薬物Ｇ４１８もしくはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を伝達する。他には、ネオマイシンアナログＧ４１８およびピューラマイシン（ｐｕｒａｍｙｃｉｎ）が含まれる。
【０１６０】
Ｅ．バイオセンサーリボスイッチ
バイオセンサーリボスイッチも開示する。バイオセンサーリボスイッチは、その同族トリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを生成する操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、トリガー分子の閾値レベルまたは閾値レベル超で誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかシグナル生成に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結されたｐｒｅＱ１バイオセンサーリボスイッチを、細胞または生物がｐｒｅＱ１リボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を保有するように操作することによってｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むリボスイッチである。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するか起源とするアプタマードメイン（ｐｒｅＱ１など）を使用する。
【０１６１】
Ｆ．レポータータンパク質およびペプチド
リボスイッチの活性化の評価またはバイオセンサーリボスイッチの評価のために、レポータータンパク質またはペプチドを使用することができる。レポータータンパク質またはペプチドをＲＮＡによってコードすることができ、その発現はリボスイッチによって調節される。実施例は、いくつかの特異的レポータータンパク質の使用を記載している。レポータータンパク質およびペプチドの使用は周知であり、リボスイッチとの使用のために容易に適応することができる。レポータータンパク質は、検出することができるか検出可能なシグナルを産生する任意のタンパク質またはペプチドであり得る。好ましくは、タンパク質またはペプチドの存在を、標準的な技術（例えば、放射免疫アッセイ、放射性標識、免疫アッセイ、酵素活性のためのアッセイ、吸光度、蛍光、発光、およびウェスタンブロット）を使用して検出することができる。より好ましくは、レポータータンパク質レベルを、低レベルでさえも、標準的な技術を使用して容易に定量可能である。有用なレポータータンパク質には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、およびそれらの誘導体（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）およびＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）など）が含まれる。
【０１６２】
Ｇ．高次構造依存性標識
高次構造依存性標識は、標識が会合した分子または化合物（リボスイッチなど）の形態または高次構造の変化に基づいて蛍光強度または波長が変化する全ての標識をいう。プローブおよびプライマーとの関係において使用される高次構造依存性標識の例には、分子ビーコン、アンプリフォー（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）、ＦＲＥＴプローブ、切断性ＦＲＥＴプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、スコーピオンプライマー、蛍光三重鎖オリゴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｔｒｉｐｌｅｘ  ｏｌｉｇｏ）（三重鎖分子ビーコンまたは三重鎖ＦＲＥＴプローブが含まれるが、これらに限定されない）、蛍光水溶性複合ポリマー、ＰＮＡプローブ、およびＱＰＮＡプローブが含まれる。かかる標識を、特に、その機能の原理を、リボスイッチと共に使用するために適応させることができる。いくつかの高次構造依存性標識型は、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２１−２７（２００１）中に概説されている。
【０１６３】
ステム消光標識（ｓｔｅｍ  ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｌａｂｅｌ）（高次構造依存性標識の一形態）は、ステム構造を形成する場合に標識からの蛍光が消光されるように消光部分が近接するような核酸上に配置された蛍光標識である。ステムが破壊される場合（標識を含むリボスイッチが活性化する場合など）、消光部分はもはや蛍光標識に近接せず、蛍光が増加する。この効果の例を、分子ビーコン、蛍光三重鎖オリゴ、三重鎖分子ビーコン、三重鎖ＦＲＥＴプローブ、およびＱＰＮＡプローブで見出すことができ、その操作原理をリボスイッチと共に使用するために適応させることができる。
【０１６４】
ステム活性化標識（高次構造依存性標識の一形態）は、ステム構造の形成によって蛍光が増加するか変化する標識または標識対である。ステム活性化標識には、受容体および供与体が近接する場合（標識を含む核酸鎖がステム構造を形成する場合）に供与体から受容体への蛍光共鳴エネルギー転移によって受容体が蛍光を発するような受容体蛍光標識および供与体部分が含まれ得る。ステム活性化標識は、典型的には、核酸分子中でステム構造を形成する場合に受容体および供与体が近接するような核酸分子（リボスイッチなど）上に配置された標識対である。ステム活性化標識の供与体部分自体が蛍光標識である場合、この標識は、受容体に近接しない場合（すなわち、ステム構造を形成しない場合）に蛍光（典型的には、受容体の蛍光よりも異なる波長で）としてエネルギーを放出することができる。ステム構造を形成する場合、全体的な効果としては、供与体蛍光が減少し、受容体蛍光が増加する。ＦＲＥＴプローブはステム活性化標識の使用例であり、その操作上の原理をリボスイッチと共に使用するために適応することができる。
【０１６５】
Ｈ．検出標識
リボスイッチの活性化、非活性化、もしくは遮断、またはリボスイッチの活性化、非活性化、もしくは遮断の際に産生された核酸またはタンパク質の発現の検出および定量を補助するために、検出標識を、検出プローブまたは検出分子に組み込むか、発現した核酸またはタンパク質に直接組み込むことができる。本明細書中で使用する場合、検出標識は、核酸またはタンパク質と直接または間接的に会合することができ、それにより、測定可能な検出シグナルが直接的または間接的のいずれかで得られる任意の分子である。多数のかかる標識は、当業者に公知である。開示の方法での使用に適切な検出標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体、およびリガンドである。
【０１６６】
適切な蛍光標識の例には、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、カスケードブルー（登録商標）、オレゴングリーン（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、クォンタムダイＴＭ（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｙｅＴＭ）などのランタニドイオンの大環状キレート、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体などの蛍光エネルギー転移染料、ならびにシアニン染料Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が含まれる。他の特定の蛍光標識の例には、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸性フクシン、アリザリンコンプレクソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、ステアリン酸アントロイル（ａｎｔｈｒｏｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン、オーロホスフィンＧ、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、硫酸ベルベリン、ビスベンズアミド、ブランコホルＦＦＧ溶液、ブランコホルＳＶ、ボディピー  Ｆ１（Ｂｏｄｉｐｙ  Ｆ１）、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、カルカインブルー（ｃａｌｃｉｅｎ  ｂｌｕｅ）、カルシウムグリーン、カルコフロールＲＷ溶液、カルコフロールホワイト、カルコホールホワイトＡＢＴ溶液、カルコホールスタンダード溶液、カルボスチリル、カスケードイエロー、カテコールアミン、キナクリン（ｃｈｉｎａｃｒｉｎｅ）、コリホスフィンＯ、クマリン−ファロイジン、ＣＹ３．１  ８、ＣＹ５．１  ８、ＣＹ７、ダンス（１−ジメチルアミノナファリン５スルホン酸）、ダンサ（ジアミノナフチルスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、ジピロメテンホウ素二フッ化物（ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅｂｏｒｏｎ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ジフェニルブリリアントフラビン７ＧＦＦ、ドーパミン、エリスロシンＩＴＣ、オイクリシン、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）、フラゾオレンジ、フルオ３、フルオレスカミン、フラ−２、ゲナクリルブリリアントレッドＢ、ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲナクリルピンク３Ｇ、ゲナクリルイエロー５ＧＦ、ｇｌｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ、グラニュラーブルー、ヘマトポルフィリン、インド−１、イントラホワイトＣｆ液、リューコフォーＰＡＦ（Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＰＡＦ）、リューコフォーＳＦ、リューコフォーＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシフェルイエローＣＨ、ルシフェルイエローＶＳ、マグダラレッド、マリーナブルー、マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ミトラマイシン、ＮＢＤ���ミン、ニトロベンゾキサジドール、ノルアドレナリン、ヌクレアーファストレッド、ヌクレアーイエロー、ナイロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ、オキサジアゾール、パシフィックブルー、パラローザニリン（ホイルゲン）、ホルウィットＡＲ溶液、ホルウィットＢＫＬ、ホルウィットＲｅｖ、ホルウィットＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、ポリアザインダセンポントクロームブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオンイエロー、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエキストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、セブロンブリリアントレッド２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）、スチルベン、スナーフ１、スルホローダミンＢ  Ｃａｎ  Ｃ、スルホローダミンＧエキストラ、テトラサイクリン、チアジンレッドＲ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、チオライト、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンＢ、ユビテックスＳＦＣ、キシレンオレンジ、およびＸＲＩＴＣが含まれる。
【０１６７】
有用な蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）、ならびにシアニン染料Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７である。これらの蛍光体の吸収および発光の極大は、ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、したがって、同時検出が可能である。フルオレセイン染料の他の例には、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−融合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）および２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）が含まれる。蛍光標識は、種々の商業供給者（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏが含まれる）から得ることができる。
【０１６８】
目的とするさらなる標識には、それらが関連するプローブが標的分子に特異的に結合する場合にのみシグナルを提供するものが含まれ、かかる標識には、Ｔｙａｇｉ  ＆  Ｋｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６）１４：３０３および欧州特許第００７０６８５  Ｂ１号に記載の「分子ビーコン」が含まれる。目的とする他の標識には、米国特許第５，５６３，０３７号、国際公開第９７／１７４７１号、および国際公開第９７／１７０７６号に記載されているものが含まれる。
【０１６９】
標識ヌクレオチドは、合成の間に発現核酸へ直接組み込むための検出標識の有用な形態である。核酸に組み込むことができる検出標識の例には、ＢｒｄＵｒｄ（５−ブロモデオキシウリジン、Ｈｏｙ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９０：２１７−２３０（１９９３））、アミノアリルデオキシウリジン（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３４５−３４８（２０００））、５−メチルシトシン（Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９５１：１５７−１６５（１９８８））、ブロモウリジン（Ｗａｎｓｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２２：２８３−２９３（１９９３））などのヌクレオチドアナログ、およびビオチン（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６６３３（１９８１））またはジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）（Ｋｅｒｋｈｏｆ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３５９−３６４（１９９２））などの適切なハプテンで改変したヌクレオチドが含まれる。適切な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネートｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰである（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：３２２６−３２３２（１９９４））。ＤＮＡに好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ブロモデオキシウリジン、ＢｒｄＵｒｄ、ＢｒｄＵ、ＢＵｄＲ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ）である。検出標識のＤＮＡへの組み込みに有用な他のヌクレオチドアナログは、ＡＡ−ｄＵＴＰ（アミノアリル−デオキシウリジントリホスフェート、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）および５−メチル−ｄＣＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。検出標識のＲＮＡへの組み込みに有用なヌクレオチドアナログは、ビオチン−１６−ＵＴＰ（ビオチン−１６−ウリジン−５’−トリホスフェート、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。フルオレセイン、Ｃｙ３およびＣｙ５は、直接標識のためにｄＵＴＰに結合することができる。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチン−またはジゴキシゲニン標識プローブの二次検出用のアビジンまたは抗ジゴキシゲニン結合体として利用可能である。
【０１７０】
ビオチンなどの核酸に組み込まれる検出標識を、その後に当該技術で周知の感度のよい方法を使用して検出することができる。例えば、ビオチンは、ビオチンに結合しているストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を使用して検出することができ、その後に適切な基質（例えば、化学発光基質ＣＳＰＤ：３−（４−メトキシスピロ−〔１，２，−ジオキセタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ〔３．３．１．１３，７〕デカン〕−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム；Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）の化学発光により検出することができる。標識はまたは、例えば、化学シグナル増幅により、または発光シグナルを生じる酵素（例えば、化学発光１，２−ジオキセタン基質）もしくは蛍光シグナルを生じる酵素への基質を使用することにより検出することができる、アルカリホスファターゼ、ダイズペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびポリメラーゼなどの酵素であり得る。
【０１７１】
２個以上のこれらの検出標識を組み合わせる分子も検出標識と見なされる。既知の検出標識のいずれかを、開示されているプローブ、タグ、分子、および方法と共に使用して、開示の方法で産生された活性化または非活性化リボスイッチ、または核酸、またはタンパク質を標識および検出することができる。検出標識により生成されたシグナルを検出および測定する方法も、当業者に公知である。例えば、放射性同位体を、シンチレーションカウンティングまたは直接可視化により検出することができ、蛍光分子を、蛍光分光光度計を使用して検出することができ、リン光分子を、分光光度計またはカメラによる直接可視化により検出することができ、酵素を、酵素により触媒された反応の産物の検出または可視化により検出することができ、抗体を、抗体に結合した二次検出標識を検出することによって検出することができる。本明細書で使用する場合、検出分子は、検出する化合物または組成物と相互作用し、１つまたは複数の検出標識をカップリングする分子である。
【０１７２】
Ｉ．配列類似性
本明細書中で考察するように、用語相同性および同一性の使用は類似性と同一であることを意味すると理解される。したがって、例えば、用語相同性を２配列間（例えば、非天然配列）で使用する場合、これは必ずしもこれら２配列間の進化的関係を示しているわけではなく、むしろ、それらの核酸配列間の類似性または関連性に注目していると理解される。２つの進化的に関連した分子間の相同性の多数の決定方法を、これらが進化的に関連するかどうかと無関係に、配列類似性を測定するために任意の２つ以上の核酸またはタンパク質に日常的に適用する。
【０１７３】
一般に、本明細書中に開示のリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子、およびタンパク質の任意の公知の改変体および誘導体または生じ得るものを定義する１つの方法は、公知の特異的配列に対する相同性に関する改変体および誘導体の定義によると理解される。本明細書中に開示の特定の配列のこの同一性も、本明細書中の他所で考察する。一般に、本明細書中に開示のリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子、およびタンパク質の改変体は、典型的には、定められた配列または天然配列に対して少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の相同性を有する。当業者は、２つのタンパク質または核酸（遺伝子など）の相同性の決定方法を容易に理解する。例えば、相同性がその最高レベルとなるような２つの配列のアラインメント後に相同性を計算することができる。
【０１７４】
相同性の別の計算方法を、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための最適な配列アラインメントを、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または調査によって行うことができる。
【０１７５】
例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９（少なくとも核酸アラインメントに関する材料について本明細書中で参考として援用される）に開示のアルゴリズムによって、核酸についての同型の相同性を得ることができる。典型的には任意の方法を使用することができると理解され、場合によってはこれらの種々の方法の結果が異なり得ると理解されるが、当業者は、これらの方法の少なくとも１つを使用して同一性を見出す場合、配列は定められた同一性を有するといわれると理解する。
【０１７６】
例えば、本明細書中で使用する場合、別の配列に対して特定の相同率を有するものとして列挙される配列は、１つまたは複数の上記の計算方法のいずれかによって計算した列挙した相同性を有する配列をいう。例えば、本明細書中で定義するように、Ｚｕｋｅｒ計算法を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、任意の他の計算法によって計算した場合に第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を持たない場合でさえ、第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する。別の例として、本明細書中で定義するように、Ｚｕｋｅｒ計算法およびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ計算法の両方を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの計算法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈの計算法、Ｊａｅｇｅｒの計算法、または任意の他の計算法によって計算した場合に第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を持たない場合でさえ、第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する。さらに別の例として、本明細書中で定義するように、各計算法を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する（しかし、実際には、異なる計算法により、しばしば、異なる相同率の計算値が得られる）。
【０１７７】
Ｊ．ハイブリッド形成および選択的ハイブリッド形成
用語「ハイブリッド形成」は、典型的には、少なくとも２つの核酸分子（プライマーまたはプローブとリボスイッチまたは遺伝子など）の間の配列駆動相互作用を意味する。配列駆動相互作用は、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体の間でヌクレオチド特異的様式にて起こる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧまたはＴと相互作用するＡは、配列駆動相互作用である。典型的には、配列駆動相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面またはフーグスティーン面上で起こる。２つの核酸のハイブリッド形成は、当業者に公知の多数の条件およびパラメータに影響を受ける。例えば、塩濃度、ｐＨ、および反応温度の全てが２つの核酸分子がハイブリッド形成するかどうかに影響を及ぼす。
【０１７８】
２つの核酸分子間の選択的ハイブリッド形成のパラメータは、当業者に周知である。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件を、ストリンジェントなハイブリッド形成条件と定義することができる。例えば、ハイブリッド形成のストリンジェンシーを、ハイブリッド形成工程および洗浄工程のいずれかまたは両方の温度および塩濃度の両方によって調節する。例えば、選択的ハイブリッド形成を達成するためのハイブリッド形成条件は、高イオン強度溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）中でＴｍ（分子の半分がそのハイブリッド形成パートナーから解離する融点）より約１２〜２５℃低い温度でのハイブリッド形成およびそれに続く洗浄温度がＴｍより約５℃〜２０℃低いように選択された温度と塩濃度との組み合わせによる洗浄を含むことができる。温度および塩条件は、フィルター上に固定した参照ＤＮＡサンプルを目的の標識核酸とハイブリッド形成させ、次いで、異なるストリンジェンシー条件下で洗浄する予備実験において実験的に容易に決定される。ハイブリッド形成温度は、典型的には、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成についてはより高い。上記の条件または当該分野で公知の条件を使用して、ストリンジェンシーを達成することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７（少なくとも核酸のハイブリッド形成に関連する材料について本明細書中で参考として援用される））。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド形成のための好ましいストリンジェントなハイブリッド形成条件は、約６８°Ｃ（水溶液中）の６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥおよびそれに続く６８℃での洗浄であり得る。ハイブリッド形成および洗浄のストリンジェンシーを、必要に応じて、所望の相補度が減少するのに合わせて、さらに、変動性が検索される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに応じて減少させることができる。同様に、ハイブリッド形成および洗浄のストリンジェンシーを、必要に応じて、所望の相同性が増加するのに合わせて、さらに、高相同性が望まれる任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに応じて増加させることができ、これらは全て当該分野で公知である。
【０１７９】
別の選択的ハイブリッド形成を定義する方法は、他の核酸に結合した核酸の１つの量（比率）の検索による。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の制限核酸が非制限核酸に結合する場合である。典型的には、非制限核酸は、例えば、１０、または１００、または１０００倍過剰である。このアッセイ型を、制限核酸および非制限核酸の両方が、例えば、それらのｋｄよりも１０倍、または１００倍、または１０００倍を下回る条件下、または核酸分子の一方のみが１０倍、または１００倍、または１０００倍である条件下、または核酸分子の一方または両方がそれらのｋｄを超える条件下で行うことができる。
【０１８０】
別の選択的ハイブリッド形成を定義する方法は、所望の酵素操作を促進するためにハイブリッド形成が必要な条件下で酵素的に操作される核酸の比率の検索による。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の核酸が、酵素操作を促進する条件下で酵素的に操作される場合である。例えば、酵素操作がＤＮＡ伸長である場合、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の核酸分子が伸長される場合である。好ましい条件には、製造者によって示唆される条件または当該分野で操作を実行する酵素に適切であることが示された条件も含まれる。
【０１８１】
相同性と同様に、２つの核酸分子の間のハイブリッド形成レベルを決定するための本明細書中に開示の種々の方法が多数存在すると理解される。これらの方法および条件により、２つの核酸分子間で異なる比率でハイブリッド形成を提供し得るが、他で示さない限り、任意の方法のパラメータを満たすことで十分であると理解される。例えば、８０％ハイブリッド形成が必要である場合、およびこれらの方法のいずれか１つにおける必要なパラメータ内でハイブリッド形成が起こる限り、本明細書中に開示されると見なされる。
【０１８２】
当業者は、組成物または方法が集合的または単独にハイブリッド形成の決定のためのこれらの基準のうちのいずれか１つを満たす場合、この組成物または方法は本明細書中に開示される組成物または方法であると理解すると理解される。
【０１８３】
Ｋ．核酸
核酸ベースである種々の分子（例えば、リボスイッチ、アプタマー、ならびにリボスイッチおよびアプタマーをコードする核酸が含まれる）を本明細書中に開示する。開示の核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換物から構成され得る。これらの分子および他の分子の制限されない例は、本明細書中に述べられている。例えば、ベクターを細胞中で発現する場合、発現したｍＲＮＡは、典型的には、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵから構成されると理解される。同様に、例えば、外因性送達によって核酸分子を細胞または細胞環境に導入する場合、細胞環境下で核酸分子の分解を減少させるヌクレオチドアナログから核酸分子が構成されることが有利であると理解される。
【０１８４】
それらの関連する機能が維持される限り、リボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、および任意の他のオリゴヌクレオチドおよび核酸は、改変ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログ）から構成され得るかまたはそれを含むことができる。多くの改変ヌクレオチドが知られており、オリゴヌクレオチドおよび核酸で使用することができる。ヌクレオチドアナログは、いくつかの改変型（塩基部分、糖部分またはリン酸部分のいずれかに対応する）を含むヌクレオチドである。塩基部分に対する改変には、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ／Ｕ、ならびに異なるプリンまたはピリミジン塩基の天然および合成改変が含まれる（ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）および２−アミノアデニン−９−イルなど）。改変塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニジンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニジンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換のアデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換のウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれるが、これらに限定されない。さらなる塩基改変を、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３で見出すことができる。特定のヌクレオチドアナログ（５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンなど）には、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含まれる。５−メチルシトシンは、二重鎖形成の安定性を増加することができる。他の改変塩基は、ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）として機能するものである。ユニバーサル塩基には、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールが含まれる。ユニバーサル塩基は、通常の塩基の代わりになるが、塩基対合に対して偏りがない。すなわち、ユニバーサル塩基は、任意の他の塩基と塩基対合することができる。塩基改変は、しばしば、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルなどの糖改変と組み合わせて、二重鎖の安定性の増加などの特有の特性を得ることができる。塩基改変の範囲を詳述し、記載する、多数の米国特許（第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号および第５，６８１，９４１号など）が存在する。これらの特許は、それぞれその全体が、特に、塩基改変、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのオリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについて本明細書中で参照として援用される。
【０１８５】
ヌクレオチドアナログは、糖部分の改変を含むこともできる。糖部分の改変には、リボースおよびデオキシリボースの天然改変、ならびに合成改変が含まれる。糖改変には、２’位での以下の改変が含まれるが、これらに限定されない：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０置換または非置換のアルキルまたはＣ２〜Ｃ１０置換または非置換のアルケニルおよびアルキニルであり得る）。２’糖改変には、−Ｏ〔（ＣＨ２）ｎＯ〕ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（ここで、ｎおよびｍは、１〜約１０である）も含まれるが、これらに限定されない。
【０１８６】
２’位での他の改変には、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および同様な特性を有する他の置換基が含まれるが、これらに限定されない。類似の改変を、糖の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合オリゴヌクレオチド内の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。改変糖には、架橋環酸素での改変（ＣＨ２およびＳなど）を含むものも含まれる。ヌクレオチド糖アナログは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣物を有することもできる。かかる改変糖構造の調製を教示する多数の米国特許（第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号および第５，７００，９２０号など）が存在し、それぞれその全体が、特に、改変糖構造、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される。
【０１８７】
ヌクレオチドアナログは、リン酸部分を改変することもできる。改変リン酸部分には、２つのヌクレオチド間の架橋が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートが含まれる）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートが含まれる）、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートを含むように改変できるものが含まれるが、これらに限定されない。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸または改変リン酸架橋は、３’−５’架橋または２’−５’架橋を介することができ、および架橋は、３’−５’から５’−３’までまたは２’−５’から５’−２’までなどの逆の極性を含むことができることが理解される。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。多数の米国特許が改変リン酸を含むヌクレオチドをどのように作製し、使用するかを教示しており、第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号および第５，６２５，０５０号が含まれるが、これらに限定されない（それぞれその全体が、特に、改変リン酸、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される）。
【０１８８】
ヌクレオチドアナログは単一の改変しか含む必要がないが、１つの部分の中にまたは異なる部分の間に、複数の改変を含むこともできることが理解される。
【０１８９】
ヌクレオチド置換物は、ヌクレオチドと同様の機能的性質を有するが、リン酸部分を含まない分子である（ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）。ヌクレオチド置換物は、ワトソン・クリックまたはフーグスティーン様式で相補核酸を認識し、それにハイブリダイズする（塩基対合する）分子であるが、リン酸部分以外の部分を介して一緒に結合する分子である。ヌクレオチド置換物は、適切な標的核酸と相互作用する場合、二重らせん型構造に調和することもできる。
【０１９０】
ヌクレオチド置換物は、リン酸部分および／または糖部分が置換されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ヌクレオチド置換物は、標準的なリン原子を含まない。リン酸の置換物は、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間架橋、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間架橋、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間架橋であり得る。これらには、モルホリノ架橋（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成されている）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの、ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他のものが含まれる。多数の米国特許がこれらの種類のリン酸置換体をどのように作製し、使用するかを開示しており、第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が含まれるが、これらに限定されない（それぞれその全体が、特に、リン酸置換体、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される）。
【０１９１】
また、ヌクレオチドの糖とリン酸の両方の部分を、例えばアミド型架橋（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）で置換することができることが、核酸置換物において理解される。米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号および同第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子をどのように作製し、使用するかを教示しており、それぞれ本明細書中で参考として援用される。（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００（１９９１）も参照すること）。
【０１９２】
オリゴヌクレオチドおよび核酸をヌクレオチドから構成することができ、異なるヌクレオチド型または同一のヌクレオチド型から構成することができる。例えば、オリゴヌクレオチドにおける１つまたは複数のヌクレオチドが、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、ヌクレオチドの約１０％〜約５０％が、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、ヌクレオチドの約５０％以上が、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、あるいは全てのヌクレオチドが、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得る。かかるオリゴヌクレオチドおよび核酸を、キメラオリゴヌクレオチドおよびキメラ核酸と呼ぶことができる。
【０１９３】
Ｌ．固体支持体
固体支持体は、分子（トリガー分子など）およびリボスイッチ（または開示の方法で使用されるか開示の方法によって産生された他の成分）を会合することができる固体状態の基質または支持体である。リボスイッチおよび他の分子を、固体支持体と直接または間接的に会合することができる。例えば、分析物（例えば、トリガー分子、試験化合物）を、固体支持体表面に結合することができるか、固体支持体上に固定した捕捉剤（例えば、分析物に結合する化合物または分子）と会合することができる。別の例として、リボスイッチを、固体支持体表面に結合することができるか、固体支持体上に固定したプローブと会合することができる。アレイは、複数のリボスイッチ、プローブ、または他の分子がアレイ、グリッド、または他の組織化されたパターンに会合された固体支持体である。
【０１９４】
固体支持体で使用する固体状態の基質には、成分を直接または間接的に会合することができる任意の固体材料が含まれ得る。これには、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンラバー、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルソエステル、官能性シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸などの材料が含まれる。固体状態の基質は、任意の有用な形態（薄膜、膜、ボトル、皿、ファイバー、織り繊維、成形ポリマー、粒子、ビーズ、微粒子、またはこれらの組み合わせが含まれる）を有することができる。固体状態の基質および固体支持体は、多孔質または非多孔質であり得る。チップは、矩形または四角の材料小片である。固体状態の基質の好ましい形態は、薄膜、ビーズ、またはチップである。有用な固体状態の基質の形態はマイクロタイターディッシュである。いくつかの実施形態では、マルチウェルガラススライドを使用することができる。
【０１９５】
アレイは、固体支持体上の規定または所定の位置に固定した複数のリボスイッチ、トリガー分子、他の分子、化合物、またはプローブを含むことができる。固体支持体上のそれぞれの所定の位置は、一般に、１種の成分型を有する（すなわち、その位置の全成分は同一である）を有する。あるいは、固体支持体上の同一の所定の位置に複数の成分型を固定することができる。各位置は、所与の成分の複数のコピーを有する。固体支持体上の異なる成分の空間的分離により、個別に検出および同定が可能である。
【０１９６】
有用であるにもかかわらず、固体支持体は単一の単位または構造である必要はない。リボスイッチ、トリガー分子、他の分子、化合物、および／またはプローブの組を、多数の固体支持体の一面に分布させることができる。例えば、ある極端な場合では、各成分を個別の反応管または反応容器中、または個別のビーズまたは微粒子上に固定することができる。
【０１９７】
オリゴヌクレオチドの固体状態の基質への固定方法は十分に確立されている。オリゴヌクレオチド（アドレスプローブおよび検出プローブが含まれる）を、確立されたカップリング法を使用して基質にカップリングすることができる。例えば、適切な付着方法は、Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）およびＫｈｒａｐｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８−７３０（１９９１）に記載されている。カゼイン被覆スライド上の３’−アミンオリゴヌクレオチドの固定方法は、Ｓｔｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６３７９−６３８３（１９９５）に記載されている。オリゴヌクレオチドの固体状態の基質への有用な付着方法は、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）に記載されている。
【０１９８】
固体支持体上に固定した各成分（例えば、リボスイッチ、トリガー分子、または他の分子）を、固体支持体の異なる所定の領域に配置することができる。異なる位置は、異なる反応チャンバーであり得る。異なる所定の領域それぞれを、相互の異なる領域から物理的に分離することができる。固体支持体の異なる所定の領域の間の距離は、固定されていても変化しても良い。例えば、アレイでは、各成分を、相互に固定した距離に配置することができる一方で、ビーズに会合した成分は固定した空間的関係にない。特に、複数の固体支持体単位（例えば、複数のビーズ）の使用により、距離が変化する。
【０１９９】
成分を、任意の密度で固体支持体上に会合または固定することができる。成分を、立方センチメートルあたり４００種を超える異なる成分を含む密度で固体支持体に固定することができる。成分アレイは、多数の成分を有することができる。例えば、アレイは、固体支持体上に固定した少なくとも１，０００種の異なる成分、固体支持体上に固定した少なくとも１０，０００種の異なる成分、固体支持体上に固定した少なくとも１００，０００種の異なる成分、または固体支持体上に固定した少なくとも１，０００，０００種の異なる成分を有することができる。
【０２００】
Ｍ．キット
上記の材料および他の材料を、開示の方法の実施または実施の補助に有用なキットとして任意の適切な組み合わせで一緒に包装することができる。所与のキット中のキット構成成分を、開示の方法で一緒に使用するためにデザインおよび適合することが有用である。例えば、化合物検出のためのキット、１つまたは複数のバイオセンサーリボスイッチを含むキットを開示する。キットはまた、リボスイッチの活性化の検出のための試薬および標識を含むことができる。
【０２０１】
Ｎ．混合物
開示の方法の実施または実施のための調製によって形成された混合物を開示する。例えば、リボスイッチおよびトリガー分子を含む混合物を開示する。
【０２０２】
方法が組成物、または成分、または試薬の混合または接触を含むときはいつでも、方法の実施により、多数の異なる混合物が作製される。例えば、方法が３つの混合工程を含む場合、工程を個別に実施する場合にこれらの各工程後に固有の混合物が形成される。さらに、工程の実施方法と無関係に、全工程の完了時点に混合物が形成される。本開示は、開示の方法の実施によって得られたこれらの混合物および任意の開示の試薬、組成物、または成分（例えば、本明細書中に開示）を含む混合物を意図する。
【０２０３】
Ｏ．系
開示の方法の実施または実施における補助に有用な系を開示する。系は、一般に、構造、機械、およびデバイスなどならびに組成物、化合物、材料などの製品の組み合わせを含む。開示または開示から明らかなかかる組み合わせを意図する。例えば、バイオセンサーリボスイッチ、固体支持体、および信号読み取りデバイスを含む系を開示および意図する。
【０２０４】
Ｐ．データ構造およびコンピュータ制御
開示の方法で使用されるか、開示の方法によって生成されるか、開示の方法から生成されるデータ構造を開示する。データ構造は、一般に、組成物または媒体中に回収され、組織化され、保存され、そして／または統合された任意の形態のデータ、情報、および／またはオブジェクトである。電子的形態（ＲＡＭ中または保存ディスク上など）で保存されたリボスイッチ構造および活性化の測定値は、１つのデータ構造型である。
【０２０５】
開示の方法、その任意の一部、またはその調製を、コンピュータ制御によって調節、管理、または支援することができる。かかるコンピュータ制御を、コンピュータ制御されたプロセスまたは方法によって実施することができ、データ構造を使用および／または生成することができ、コンピュータプログラムを使用することができる。かかるコンピュータ制御、コンピュータ制御されたプロセス、データ構造、およびコンピュータプログラムが意図され、本明細書中に開示されると理解すべきである。
【０２０６】
方法
ＲＮＡのスプライシングを調節するリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する方法を開示する。かかる方法は、例えば、リボスイッチと、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物またはトリガー分子とを接触させる工程を含むことができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。化合物を使用して、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチの存在からのトリガー分子の除去によって非活性化することもできる。したがって、開示のリボスイッチの非活性化方法は、例えば、リボスイッチの存在または接触からトリガー分子（または他の活性化化合物）を除去する工程を含むことができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチを活性化しないトリガー分子のアナログの結合によって遮断することができる。
【０２０７】
化合物のＲＮＡ分子との接触によってスプライシングを調節するリボスイッチをＲＮＡ分子が含む、ＲＮＡ分子の発現またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変化させる方法も開示する。リボスイッチは、例えば、ＲＮＡ分子のオルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｉｃｉｎｇ）を調節することができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。したがって、リボスイッチを含む目的のＲＮＡ分子を、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する条件に供して、ＲＮＡの発現を変化させるために用いることができる。例えば、転写の終結またはＲＮＡへのリボゾーム結合の遮断の結果として発現を変化させることができる。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質および生じるオルタナティブスプライシングの型に応じて、ＲＮＡ分子の発現を減少または防止することができるか、またはＲＮＡ分子の発現を促進または増加することができる。
【０２０８】
リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってスプライシングを調節するリボスイッチを含む天然に存在する遺伝子またはＲＮＡの発現を調節する方法も開示する。リボスイッチは、例えば、ＲＮＡのオルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｉｃｉｎｇ）を調節することができる。遺伝子がこの遺伝子を保有する細胞または生物の生存に不可欠である場合、リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断により、細胞または生物が死滅、静止、または衰弱し得る。例えば、微生物の生存に不可欠な天然に存在する遺伝子中の天然に存在するリボスイッチの活性化により、微生物を死滅させることができる（リボスイッチの活性化が発現を停止するか発現を抑制する場合）。これは、抗菌効果および抗生物質効果のための本開示の化合物および方法の使用についての１つの基礎である。これらの抗菌効果を有する化合物は、静菌性であるかまたは殺菌性であると見なされる。
【０２０９】
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物を選択および同定する方法も開示する。リボスイッチの活性化は、トリガー分子の結合の際のリボスイッチの状態の変化をいう。リボスイッチを、トリガー分子以外の化合物およびトリガー分子の結合以外の方法で活性化することができる。用語トリガー分子を、本明細書中で、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物をいうために使用する。これには、リボスイッチおよびリボスイッチを活性化することができる他の化合物のための天然または通常のトリガー分子が含まれる。天然または通常のトリガー分子は、所与の天然のリボスイッチのトリガー分子またはいくつかの非天然リボスイッチの場合、リボスイッチがデザインされるか、リボスイッチが選択される（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択技術またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化技術など）トリガー分子である。非天然トリガー分子を、非天然トリガー分子ということができる。
【０２１０】
本明細書中に開示されているか本明細書中に開示の方法によって同定された化合物と細菌を接触させる工程を含む、細菌を死滅させるかまたは阻害する方法も開示する。
【０２１１】
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物を同定する方法も開示する。例えば、リボスイッチを活性化する化合物を、試験化合物とリボスイッチとを接触させる工程、およびリボスイッチ活性化を評価する工程によって同定することができる。リボスイッチが活性化される場合、試験化合物を、リボスイッチを活性化する化合物と同定する。リボスイッチの活性化を、任意の適切な様式で評価することができる。例えば、リボスイッチをレポーターＲＮＡに連結することができ、レポーターＲＮＡの発現、発現レベル、または発現レベルの変化を、試験化合物の存在下および非存在下で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むことができる。かかるリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するか、これから誘導したアプタマードメインを使用する。認められるように、調節アッセイまたは測定を使用するかあるいは調節アッセイまたは測定を使用しないで、リボスイッチ活性化の評価を実施することができる。リボスイッチを非活性化する化合物の同定方法を、類似の方法で行うことができる。
【０２１２】
本明細書中の他所に開示の方法に加えて、リボスイッチを遮断する化合物の同定を、任意の適切な様式で行うことができる。例えば、リボスイッチを活性化または非活性化することが公知の化合物の存在下および試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を評価するためのアッセイを行うことができる。試験化合物の非存在下において認められないのと同様に活性化または非活性化が認められない場合、試験化合物を、リボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定する。
【０２１３】
バイオセンサーリボスイッチを使用した化合物の検出方法も開示する。本方法は、試験サンプルとバイオセンサーリボスイッチとを接触させる工程およびバイオセンサーリボスイッチの活性化を評価する工程を含むことができる。バイオセンサーリボスイッチの活性化は、試験サンプル中のバイオセンサーリボスイッチのためのトリガー分子の存在を示す。バイオセンサーリボスイッチは、その同系トリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを産生する操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、トリガー分子の閾値レベルまたは閾値レベルを超えて誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかシグナル生成に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結されたｐｒｅＱ１バイオセンサーリボスイッチを、細胞または生物がリボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を保有するように操作することによってｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むｐｒｅＱ１リボスイッチである。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するｐｒｅＱ１リボスイッチに由来するか起源とするアプタマードメインを使用する。
【０２１４】
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の同定および同定された化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物同定方法と同定された化合物の製造方法との組み合わせにより、これを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触工程、リボスイッチの活性化の評価工程、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造工程によって化合物を作製することができる。
【０２１５】
化合物によるリボスイッチの活性化、非活性化、または遮断のチェック工程およびチェックした化合物の製造工程によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示したように化合物の活性化、非活性化、または遮断の評価方法とチェックした化合物の製造方法との組み合わせによってこれを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触工程、リボスイッチ活性化の評価工程、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造工程によって化合物を作製することができる。化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する能力についての化合物のチェックは、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することを以前に知られていない化合物の同定および化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することが既に知られていた場合のリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の能力の評価の両方をいう。
【０２１６】
目的の化合物を検出する方法をさらに開示するが、該方法は、サンプルをリボスイッチと接触させる工程を含み、リボスイッチが目的の化合物によって活性化され、目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチがシグナルを生成し、サンプルが目的の化合物を含む場合にリボスイッチがシグナルを生成し、リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法である。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチは高次構造を変化させることができ、高次構造の変化によって高次構造依存性標識を介してシグナルが生成される。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチは高次構造を変化させることもでき、高次構造の変化によってリボスイッチに連結したＲＮＡの発現が変化し、発現の変化によってシグナルを生成する。シグナルを、リボスイッチに連結したＲＮＡから発現したレポータータンパク質によって生成することができる。
【０２１７】
具体的には、サンプル中のｐｒｅＱ１を検出する方法であって、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチをサンプルと接触させる工程、およびｐｒｅＱ１とｐｒｅＱ１応答性リボスイッチとの間の相互作用を検出する工程を含み、ｐｒｅＱ１と該ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチとの間の相互作用がｐｒｅＱ１の存在を示す、方法を開示する。ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを標識することができる。
【０２１８】
下記の工程を含む方法を開示する：（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子における遺伝子発現の阻害のための化合物を試験する工程であって、阻害がリボスイッチを介し、リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、試験工程、（ｂ）工程（ａ）で遺伝子発現を阻害した化合物と細胞との接触によって遺伝子発現を阻害する工程であって、細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって遺伝子の発現を阻害する、阻害工程。
【０２１９】
遺伝子における遺伝子発現阻害について化合物を試験することによって遺伝子における遺伝子発現を阻害する化合物として同定された化合物と細胞とを接触させることによってリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子における遺伝子発現を阻害する工程であって、阻害がリボスイッチを介するものであり、リボスイッチがｐｒｅＱ１応答性リボスイッチまたはｐｒｅＱ１応答性リボスイッチの誘導体を含む、阻害工程を含む方法も開示する。
【０２２０】
Ａ．抗菌化合物の同定
リボスイッチは、有機小分子の結合の目的のために考案された新規の構造化ＲＮＡクラスである。リボスイッチの天然の結合ポケットを、代謝産物アナログまたは天然代謝産物の形状−空間を模倣する化合物によって標的とすることができる。リボスイッチの小分子リガンドにより、薬物候補を生成するための有用な誘導体化部位が得られる。いくつかのリボスイッチの分布は、米国特許出願公開第２００５／００５３９５１号の表１に示されている。一旦リボスイッチクラスが同定されおよび薬物標的としての可能性が評価されると（ｐｒｅＱ１リボスイッチなど）、候補分子を同定することができる。
【０２２１】
薬物耐性の細菌株の出現により、新規の抗生物質クラスを同定する必要性が高まっている。抗リボスイッチ薬は、抗菌作用様式を示し、以下の理由のために非常に興味深い。リボスイッチは、基本的代謝過程に重要な遺伝子発現を調節する。したがって、薬物でこれらの遺伝子調節エレメントを操作することにより、新規の抗生物質が得られる。これらの抗菌薬を、静菌性であるまたは殺菌性であると見なすことができる。リボスイッチはまた、代謝産物に選択的に結合するように進化したＲＮＡ構造を保有する。したがって、これらのＲＮＡ受容体により、タンパク質酵素および受容体のような良好な薬物標的物が作製される。さらに、２つの抗菌化合物（上記で考察）が抗生物質耐性（ＲＮＡ標的の変異を介して出現）の非活性化によって細菌を死滅させることが示されている。
【０２２２】
化合物の非存在下での同一のリボスイッチアッセイと比較して（すなわち、コントロールアッセイと比較して）、化合物の存在下のリボスイッチアッセイにおけるシグナルが少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、または５００％増加する場合に、化合物がリボスイッチを活性化すると同定することができるか、リボスイッチ活性化活性を有すると決定することができる。リボスイッチアッセイを、任意の適切なリボスイッチ構築物を使用して行うことができる。リボスイッチ活性化アッセイに特に有用なリボスイッチ構築物を、本明細書中の他所に記載している。１つまたは複数の特定のリボスイッチ、リボスイッチ構築物、またはリボスイッチクラスに関して、化合物を、リボスイッチを活性化するかリボスイッチ活性化活性を有すると同定することができる。便宜上、ｐｒｅＱ１リボスイッチを活性化するとして同定されたかまたはｐｒｅＱ１リボスイッチのためのリボスイッチ活性化活性を有するとして同定された化合物を、特定のｐｒｅＱ１リボスイッチ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓで見出されるｐｒｅＱ１リボスイッチなど）のためのものとして同定されたとすることができる。
【０２２３】
Ｂ．抗菌化合物の使用方法
ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌方法が本明細書中に開示する。「抗菌」は、細菌増殖の阻害もしくは防止、細菌の死滅、または細菌数の減少を意味する。したがって、有効量の本明細書中に開示の化合物の１つまたは複数と細菌とを接触させる工程を含む、細菌増殖を阻害または防止する方法を開示する。本開示の化合物についてのさらなる構造を、本明細書中に提供する。
【０２２４】
細菌細胞増殖を阻害する方法を開示するが、該方法は、細胞をｐｒｅＱ１応答性リボスイッチに結合する化合物と接触させる工程を含んでおり、そこでは、細胞がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物がｐｒｅＱ１応答性リボスイッチに結合することによって細菌細胞増殖を阻害し、それにより、ｐｒｅＱ１産生が制限される、方法である。本方法により、化合物と接触しない細胞と比較して、細菌細胞増殖を少なくとも１０％減少させることができる。化合物および細胞を、被験体への化合物の投与によって接触させることができる。細胞が被験体中の細菌細胞であり得、化合物が細菌細胞を死滅させるか細菌細胞の増殖を阻害する。被験体は細菌感染を有し得る。化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与することができる。
【０２２５】
細菌は、任意の細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｍｏｏｒｅｌｌａ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属、およびＶｉｂｒｉｏ属由来の細菌など）であり得る。細菌は、例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｆｎｉｅｎｓｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｏｌ��ｂａｃｔｅｒ  ｕｓｉｔａｔｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、またはＶｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓであり得る。細菌増殖を、細菌が見出される任意の状況で阻害することもできる。例えば、流体中、バイオフィルム中、および他の表面上の細菌増殖を阻害することができる。本明細書中に開示の化合物を、任意の他の化合物または組成物と組み合わせて投与または使用することができる。例えば、本開示の化合物を、別の抗菌化合物と組み合わせて投与または使用することができる。
【０２２６】
「細菌増殖の阻害」を、１つの細菌の娘細胞への分裂能力の減少または細菌集団の娘細胞の形成能力の減少と定義する。細菌の再生能力を、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または１００％またはそれを超えて減少させることができる。
【０２２７】
本明細書中に開示および記載された１つまたは複数の化合物と細菌を接触させる工程を含む、細菌または細菌集団の増殖を阻害し、そして／または死滅させる方法も提供する。
【０２２８】
「細菌の死滅」を、１つの細菌の死滅または複数の細菌（コロニー中の細菌など）の数の減少と定義する。複数の形態の細菌について言及する場合、「細菌の死滅」を、集団の１０％、集団の２０％、集団の３０％、集団の４０％、集団の５０％、集団の６０％、集団の７０％、集団の８０％、集団の９０％、または集団の１００％以下の比率での所与の細菌集団の細胞死と定義する。
【０２２９】
本明細書中に開示の化合物および組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで抗菌活性を有し、殺菌性も示し得る他の化合物または組成物と併せて使用することができる。
【０２３０】
本明細書中に提供される化合物の、用語「治療有効量」は、非毒性であるが、１つまたは複数の症状を望ましく減少させるのに十分な化合物の量を意味する。以下に指摘するように、化合物の正確な必要量は、被験体の種、年齢、および一般的な健康状態、処置を受ける疾患の重症度、使用された特定の化合物、ならびにその投与様式などに応じて被験体によって変化する。したがって、正確な「有効量」を特定することは可能でない。しかし、当業者は、適切な有効量を、日常的な実験のみを使用して決定することができる。
【０２３１】
本明細書中に開示の組成物および化合物を、薬学的に許容可能なキャリア中にてｉｎ  ｖｉｖｏで投与することができる。「薬学的に許容可能な」は、生物学的でないか、そうでなければ望ましくないことはない材料を意味する。すなわち、材料を、いかなる望ましくない生物学的影響を引き起こすことなくまたは含有するいかなる薬学的組成物の他の成分との有害様式での相互作用も引き起こすことなく被験体に投与することができる。当業者に周知のように、キャリアを、当然のことながら、有効成分の任意の分解を最小にし、被験体における任意の有害な副作用を最小にするように選択する。
【０２３２】
本明細書中に開示の組成物または化合物を、経口、非経口（例えば、静脈内）、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮、体外、局所など（局所的鼻腔内投与または吸入剤による投与が含まれる）で投与することができる。本明細書中で使用する場合、「局所鼻腔内投与」は、外鼻孔の一方または両方を介した鼻および鼻道への組成物の送達を意味し、噴霧機構もしくは液滴機構、または核酸もしくはベクターのエアゾール化による送達を含むことができる。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達によって鼻または口を介して行うことができる。挿管によって呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接送達させることもできる。組成物の正確な必要量は、被験体の種、年齢、体重、および一般的な健康状態、処置を受けるアレルギー障害の重症度、使用された特定の核酸またはベクター、ならびにその投与様式などに応じて被験体によって変化する。したがって、全ての組成物について正確な量を特定することは可能でない。しかし、当業者は、適切な量を、本明細書中に教示された日常的な実験のみを使用して決定することができる。
【０２３３】
組成物または化合物の非経口投与は、使用する場合、一般に、注射によって特徴づけられる。注射剤を、従来の形成で、液体溶液または懸濁液、注射前に液体中に懸濁する溶液に適切な固体形態、または乳濁液として調製することができる。より最近に修正された非経口投与アプローチは、一定の投薬量を維持するような遅延放出系または徐放系の使用を含む。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０２３４】
本明細書中に開示の組成物および化合物を、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて治療的に使用することができる。適切なキャリアおよびその処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。典型的には、処方物を等張にするのに適切な量の薬学的に許容可能な塩を処方物中で使用する。薬学的に許容可能なキャリアの例には、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなるキャリアには、マトリックスが成形製品の形態である（例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子）抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性調製物が含まれる。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じて、一定のキャリアがより好ましいことが当業者に明らかである。
【０２３５】
薬学的キャリアは、当業者に公知である。これらは、最も典型的には、ヒトへの薬物投与のための標準的なキャリアである（滅菌水、生理食塩水、生理学的ｐＨの緩衝化溶液などの溶液が含まれる）。組成物を、筋肉内または皮下に投与することができる。他の化合物を、当業者によって使用される標準的な手順にしたがって投与する。
【０２３６】
薬学的組成物は、選択の分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、および界面活性剤などを含むことができる。薬学的組成物はまた、１つまたは複数の有効成分（抗菌薬、抗炎症薬、および麻酔薬など）を含むことができる。
【０２３７】
薬学的組成物を、局所処置または全身処置のいずれが望ましいかおよび処置する領域に応じて多数の方法で投与することができる。投与は、局所（眼科、膣、直腸、鼻腔内が含まれる）、経口、吸入、または非経口（例えば、点滴、皮下、腹腔内、または筋肉内注射）であり得る。開示の抗体を、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮に投与することができる。
【０２３８】
非経口投与のための調製物には、滅菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）、および注射可能な有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。水性キャリアには、水、アルコール溶液／水溶液、乳濁液または懸濁液（生理食塩水および緩衝化溶媒が含まれる）が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補給液（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、および電解質補給液（リンゲルデキストロースにもとづくものなど）などが含まれる。防腐剤および他の添加物も存在し得る（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなど）。
【０２３９】
局所投与のための処方物には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の薬学的キャリア、水性、粉末、または油性ベース、および増粘剤などが必要であるか望ましくあり得る。
【０２４０】
経口投与のための組成物には、粉末または顆粒、水性媒体または非水性媒体での懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味物質、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましくあり得る。
【０２４１】
いくつかの組成物を、無機酸（塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸など）および有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸など）との反応によりまたは無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど）および有機塩基（モノ、ジ、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンなど）との反応によって形成された薬学的に許容可能な酸付加塩または塩基付加塩として潜在的に投与することができる。
【０２４２】
本明細書中に開示の治療組成物を、化合物分子をカップリングする個別のキャリアとしてのモノクローナル抗体の使用によって送達させることもできる。本開示の治療組成物を、標的化が可能な（ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ）薬物キャリアとしての可溶性ポリマーとカップリングすることもできる。かかるポリマーには、ポリビニル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドフェノール（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌ−ａｍｉｄｅｐｈｅｎｏｌ）、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル残基と置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが含まれ得るが、これらに限定されない。さらに、本開示の治療組成物を、薬物の制御放出の実施に有用な生分解性ポリマークラス（例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルソエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマー）とカップリングすることができる。
好ましくは少なくとも約３％、より好ましくは約１０％、より好ましくは約２０％、より好ましくは約３０％、より好ましくは約５０％、より好ましくは７５％、さらにより好ましくは約１００％の細菌感染が、化合物の投与によって減少する。感染の減少を、白血球数の減少、熱の低下、炎症の減少、細菌数の減少、または細菌感染の他の指標の減少などのパラメーターによって決定する。細菌感染の減少率を増加させるために、被験体に対して非毒性を保持する最も有効なレベルに投薬量を増加させることができる。
【０２４３】
全体を通して使用する場合、「被験体」は、個体をいう。好ましくは、被験体は、哺乳動物（非ヒト哺乳動物または霊長類、およびより好ましくはヒトなど）である。「被験体」には、飼い慣らされた動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ  ａｎｉｍａｌ）（ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）、および魚類が含まれ得る。
【０２４４】
「細菌感染」を、被験体またはサンプル中の細菌の存在と定義する。かかる細菌は、被験体またはサンプル中またはその上での天然に存在する細菌の増殖であり得るか、外来生物の侵入に起因し得る。
【０２４５】
本明細書中に開示の化合物を、抗生物質と同一の様式で使用することができる。抗生物質の使用は、当該分野で十分に確立されている。１つのその使用例には、動物の処置が含まれる。必要に応じて、本開示の化合物を、通常、獣医または栄養士の指導の下で注射によるか飼料または水によって動物に投与することができる。本開示の化合物を、疾患の重症度および動物種などの環境に応じて、個別または群のいずれかで動物に送達させる。全動物が類似の免疫状態にある場合および全動物が同一の病原微生物に曝露している場合に、全ての獣群（ｈｅｒｄ）または全ての鳥獣群（ｆｌｏｃｋ）の処置およびケアが必要であり得る。
【０２４６】
化合物の別の使用例には、微生物感染した水生動物を選択する工程、開示の化合物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ＴＲＩＥＮＥを含む抗菌溶液を準備する工程、溶液にｐＨ緩衝剤を添加してそのｐＨを約７．０と約９．０の間の値に調整する工程、水生動物を溶液中に浸漬し、水生動物の微生物負荷（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂｕｒｄｅｎ）を減少させるのに有効な期間水生動物を放置する工程、溶液から水生動物を取り出し、溶液を含まない水に該動物を戻す工程を含む、水生動物の微生物感染の減少が含まれる。ＥＤＴＡ、開示の化合物、ＴＲＩＥＮＥ、およびｐＨ緩衝剤を含む溶液中への水生動物の浸漬を、動物の微生物負荷が消失するまで繰り返すことができる（米国特許第６，５１８，２５２号）。
【０２４７】
本明細書中に開示の化合物の他の使用には、歯科処置および水の精製（これには、例えば、都市用水、下水処理システム、携帯および非携帯の給水、および孵化場が含まれ得る）が含まれるが、これらに限定されない。
Ｃ．ｐｒｅＱ１の産生方法
ｐｒｅＱ１の産生方法を開示するが、該方法は、ｐｒｅＱ１を産生することができる変異細菌細胞を培養する工程であって、変異細菌細胞がｐｒｅＱ１リボスイッチの変異を含み、変異が変異を持たない細胞と比較して変異細菌細胞によってｐｒｅＱ１産生を増加させる、工程、ならびに細胞培養物からｐｒｅＱ１を単離し、それにより、ｐｒｅＱ１が産生する工程を含む、方法である。
【０２４８】
変異細菌細胞はノックアウト変異体であり得、この細胞はｐｒｅＱ１リボスイッチを産生できない。細胞は、完全に除去されたｐｒｅＱ１リボスイッチのコード領域を有し得る。ｐｒｅＱ１の産生を、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％、またはそれ以上増加させることができる。これは、インタクトなｐｒｅＱ１リボスイッチを有する細胞によって産生されたｐｒｅＱ１と比較したｐｒｅＱ１の全体量によって測定することができる。
【０２４９】
変異を持たない細胞と比較した場合、変異によって、変異細胞によるｐｒｅＱ１産生が測定可能に増加する、ｐｒｅＱ１リボスイッチの変異を含む細菌細胞をさらに開示する。「測定可能に増加する」は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％、またはそれを超えたｐｒｅＱ１産生の増加を意味する。
【実施例】
【０２５０】
実施例１：キューオシン前駆体ｐｒｅＱ１に選択性を示すリボスイッチは、通常、小アプタマードメインを含む
ｉ．結果
ａ．ｑｕｅＣモチーフの広範な系統発生的保存
最初に報告されたｑｕｅＣモチーフの例は、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ目およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ目のいくつかの細菌種のみに限られていた。これらの例の間の配列保存の大部分は、４０ｎｔ未満の範囲（ｓｐａｎ）内に生じた。このモチーフの見かけ上制限された分布およびその比較的小さなサイズは公知のリボスイッチと異なり、系統発生学的により広範囲に及び、保存された配列エレメントおよびより多数のヌクレオチドを必要とする構造の特徴を含む傾向がある。
【０２５１】
ｑｕｅＣエレメントがより広範に分布し得るかどうかを決定するために、修正二次構造モデル（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｍｏｄｅｌ）に基づいた検索アルゴリズムを使用した。最初に同定された少数のｑｕｅＣＲＮＡの例は、相補的であるが、配列中に絶対的に保存されている領域を含んでいた。ステム構造内の広範な配列保存はリボスイッチ間で前例がないにもかかわらず、ステムの完全性が保存されている限り、配列多様性はより典型的である。したがって、その塩基対合可能性にもかかわらず、これらの絶対的に保存された領域は、二次構造エレメントとして以前に示されていなかった。
【０２５２】
これらの領域中の検索制約が緩和され、その結果主な要件がもはや一次構造ではなく二次構造であったときに、さらなる多数のｑｕｅＣモチーフ例はＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ，Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ間で表れた（ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ）（図１および図８）。これらの配列のアラインメントにより、２つの近接した間隔にあるステム−ループ構造（その一方のみが常に存在する）および第２のステム−ループのすぐ３’側に存在する高度に保存された配列が明らかとなった。その散発的発生により、５’側のほとんどのステムをＰ０と呼ぶ一方で、下流の絶対的に保存されたヘリックスエレメントをＰ１と呼ぶ。Ｐ０が存在する場合、対応するループ配列（Ｌ０）は、配列が保存されていない。この知見により、多数の例におけるＰ０の見かけの非存在と併せて、この推定構造エレメントがｑｕｅＣモチーフの機能に不可欠ではないと示唆される。１つの例で（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ；図１）さらなる推定ステム−ループの挿入がＰ１のすぐ３’側で認められるにも関わらず、Ｐ０エレメントとＰ１エレメントとの間およびＰ１と３’保存セグメントの間の介在ヌクレオチド数は、これらのエレメント間の距離が強く制限されていることを示す。
【０２５３】
保存配列の大部分は、Ｌ１内およびアデノシンリッチ３’テーリングセグメント中に存在する。このモチーフ例を、そのＬ１配列の相違に基づいて、１０〜１５ｎｔの長さの範囲で２つの型に分類することができる（図１）。Ｐ１下部構造（ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のいくつかの特徴が全ての例で保存されているにもかかわらず、ｑｕｅＣモチーフの２つのサブタイプの存在は、対応するループ内の明らかな特徴的配列（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）から明らかである。興味深いことに、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ由来のｑｕｅＣモチーフは、両サブタイプの特徴を示すＬ１配列を保有し、異なる特徴的配列をいくらかの範囲でブレンドすることができることが示唆される。
【０２５４】
ｂ．ｑｕｅＣモチーフはＱ生合成遺伝子に関連する
拡大されたｑｕｅＣモチーフのセットを含む例は、その配列および構造の保存が著しい。これは、それらが多様な細菌集団由来の相同遺伝子に一貫して関連することが見出されたからである（図８）。見かけのレギュロン中の遺伝子の特徴づけを欠くことによってさらなる分析が妨げられたが、これらの特性はこのＲＮＡモチーフについての調節上の役割を強く示した。通常はＲＮＡに属する遺伝子ファミリー（図８）がＱ生合成に関与し（Ｒｅａｄｅｒ  ２００４）、可能なリボスイッチリガンドの検索をこの生合成経路の代謝産物に集中したことが報告された時に、この問題は解決した。
【０２５５】
Ｑおよびその誘導体は、真核生物および真正細菌の間で広く見出されるグアノシンの高改変バージョンであり、Ｑは広範な生理学的過程に関与している（Ｉｗａｔａ−Ｒｅｕｙｌ  ２００３）。真正細菌のうち、Ｑ改変は病原体Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉの病原性（Ｄｕｒａｎｄ  １９９４）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの静止期中の生存能（Ｎｏｇｕｃｈｉ  １９８２；Ｆｒｅｙ  １９８９）などの現象に必要であることが証明されている。Ｑ欠損に起因する異種表現型集団は、一般に、翻訳忠実度に及ぼす有害作用に起因し（Ｍｅｉｅｒ  １９８５；Ｂｉｅｎｚ  １９８１；Ｕｒｂｏｎａｖｉｃｉｕｓ  ２００１）、いくつかのｔＲＮＡのアンチコドンループ中のＱの出現と一致すると解釈される。
【０２５６】
真正細菌では、ｄｅ  ｎｏｖｏでのＱ生合成は、遊離核酸塩基（グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）は出発材料としての役割を果たす）の合成を必要とする（図２）（Ｋｕｃｈｉｎｏ）。生合成経路における第１の公知の中間体は、７−シアノ−７−デアザグアニン（ｐｒｅＱ０）であり（Ｏｋａｄａ  １９７８）、これはその後にＱｕｅＦによって触媒されるＮＡＤＰＨ依存性還元においてｐｒｅＱ１に変換される（Ｖａｎ  Ｌａｎｅｎ  １９７２）。ＴＧＴ酵素によって媒介されるグアニン交換反応では、ｐｒｅＱ１を関連するｔＲＮＡのアンチコドン中の適切な位置に挿入する（Ｏｋａｄａ  １９７９；Ｒｅｕｔｅｒ  １９９１）。ｔＲＮＡへのｐｒｅＱ１の組み込み後、Ｑ産生はｉｎ  ｓｉｔｕで継続する。これは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）のリボシル部分由来のエポキシシクロペンタンジオール環の付加がおこり（Ｓｌａｎｙ  １９９４；Ｆｒｅｙ  １９８８）、その後にエポキシドが還元されＱを生じる見かけの補酵素Ｂ１２依存工程が続く（Ｆｒｅｙ  １９８８）。興味深いことに、最近の研究により、Ｑはいくつかの真正細菌においてシクロペンテンジオール部分のグルタミル化によるなおさらなる改変に供されることが示されている（Ｓａｌａｚａｒ  ２００４；Ｂｌａｉｓｅ  ２００４）。小分子中間体であるｐｒｅＱ０およびｐｒｅＱ１は、ＲＮＡモチーフの候補リガンドと見なされた。この可能性を支持して、最近の研究によってｑｕｅＣ、−Ｄ、−Ｅ、および−Ｆ遺伝子ファミリーを関連ずけた（その例は、ｐｒｅＱ１上流の生化学的ステップにおいて共通してｑｕｅＣモチーフと関連する。）（Ｒｅａｄｅｒ  ２００４；Ｖａｎ  Ｌａｎｅｎ  ２００５；Ｇａｕｒ  ２００５）。
【０２５７】
ｃ．Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｑｕｅＣモチーフはｐｒｅＱ１に結合する
ｑｕｅＣエレメントの例を、保存ループ内の明らかな特徴的配列に基づいて２つの型のうちの１つに分類することができる（図１および３ａ）。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｑｕｅＣモチーフを含む１０６ｎｔＲＮＡ（１０６ｑｕｅＣと呼ぶ；図３ｂ）を試験した。そのヌクレオチド配列はＩＩ型コンセンサスに合致する。このＲＮＡ構築物は、ｑｕｅＣモチーフの保存配列および構造エレメントならびに内因性転写ターミネーターの特徴を有するステム−ループを含んでいた（Ｇｕｓａｒｏｖ  １９９９；Ｙａｒｎｅｌｌ  １９９９）（図３ｂ）。
【０２５８】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｑｕｅＣモチーフとｐｒｅＱ１との間のタンパク質非依存性相互作用の可能性を試験するために、５’３２Ｐ標識１０６ｑｕｅＣ  ＲＮＡをインライン探索分析に供した。この分析は、リガンド結合によって誘導される三次構造の変化を活用する（Ｓｏｕｋｕｐ  １９９９）。構造が不均一な部位はより高い自発的切断レベルを示し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による切断産物の分離によって同定することができる。放射性標識１０６ｑｕｅＣを１μＭ  ｐｒｅＱ１または１０μＭ  ｐｒｅＱ１のいずれかの存在下で分析する場合、得られた自発的切断産物のパターンは、リガンドの非存在下で得られる切断産物プロフィールと比較して顕著に変化する（図３ｃ）。多数のリボスイッチと同様に、構造調整を受けたｑｕｅＣモチーフ領域は、一般に、系統発生学的に保存された配列と相関する。１μＭおよび１０μＭのｐｒｅＱ１濃度を使用して認められたＲＮＡ構造調整の程度の類似性により、この相互作用の解離定数（Ｋｄ）が１μＭ未満であることが示唆される。
【０２５９】
自発的切断のｐｒｅＱ１依存性変化は、推定ループまたは他の非ヘリックスエレメントで起こり、その三次構造形成の関与を支持する。逆に、構造調整は予測される内因性ターミネーターのごく近傍に認められず、このステムが発現プラットフォーム成分であり、リガンドと直接接触しないという概念を確証する。系統発生における３６個ｑｕｅＣモチーフ（図１）のうち、２２個は翻訳レベルで調節され、１４個は転写レベルで調節されるように現れる。ターミネーターを含むリボスイッチのうち、強力なアンチターミネーターを、１０個の中に同定することができる。このリボスイッチのｐｒｅＱ１同化に関与する遺伝子との関連ずけにより、それがリガンド結合に応答して遺伝子発現を下方制御する働きをすることが示唆される。
【０２６０】
ｄ．ｑｕｅＣモチーフによる選択的ｐｒｅＱ１認識
ＲＮＡ構築物である５２ｑｕｅＣ（図４ａ）を使用して、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｑｕｅＣエレメントのリガンド選択性の程度を試験した。種々のプリン化合物に対する親和性を、５’３２Ｐ標識５２ｑｕｅＣを、一定範囲のリガンド濃度を使用したインライン探索分析に供することによっておよびその後のリガンド依存性構造調整レベルの定量分析によって決定した。ｐｒｅＱ１および生合成中間体であるｐｒｅＱ０は、それぞれ約２０ｎＭおよび１００ｎＭのＫｄ値で５２ｑｕｅＣによって認識される（図４ｂ）。これらの値により、ｐｒｅＱ１はｑｕｅＣ  ＲＮＡエレメントの主な標的であることが示唆され、遊離核酸塩基として存在する最終Ｑ生合成中間体がレギュレーターとしての役割をはたすことが遺伝子調節の視点から妥当なようである。しかし、親和性のわずかな相違のみに基づいて、ｐｒｅＱ０のような構造的に関連した前駆体をこのＲＮＡモチーフの生理学的に関連する候補リガンドとして排除することはできない。
【０２６１】
２つのモチーフ型（図１および３ａ）のメンバーにおいて、異なるが依然として関連する代謝産物に対し選択性を示し得る可能性を試験した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＩＩ型ｑｕｅＣエレメントが優先的にｐｒｅＱ１に結合することが確立されているので（図４ｂ）、Ｉ型の例の標的選択性を次に試験した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓで同定された２つのＩ型ｑｕｅＣモチーフに対応する配列を使用したインライン探索アッセイにより、ＩＩ型の例と同一のリガンド特異性が明らかとなる。これらの結果は、ｐｒｅＱ０よりもむしろｐｒｅＱ１が両方のｑｕｅＣモチーフ型の主な標的である可能性が高いことを示す。これらの結果を考慮して、これらの型を定義する異なるＬ１特徴的配列は、同一代謝産物の認識についての微妙に異なる構造上の解釈を提供することができる。
【０２６２】
５２ｑｕｅＣによるリガンド認識に関与する分子接触は、一連のプリンアナログに対する見かけのＫｄ値の決定によってより詳細に理解された（図４ｃ）。予想通り、ｐｒｅＱ１をグアニンと区別する化学的特徴−７位でのアミノメチル基および炭素原子の置換−は、ＲＮＡアプタマーの分子認識決定要因である。アミノメチル部分［７−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノメチル）−７−デアザグアニン］の窒素における２つのメチル基の配置により、実質的に結合親和性が減少し、アミノメチル基の除去（７−デアザグアニン）でも同様である。前者の場合、ｐｒｅＱ１と比較してより弱い結合相互作用は、立体干渉（ｓｔｅｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）または水素結合ポテンシャルの不在のいずれかに起因し得る。炭素原子置換を欠く７−メチルグアニンを使用して認められた結合親和性の減少はさらにより顕著であるが、これは、Ｎ９位の水素結合供与体の喪失に一部起因し得る。興味深いことに、ｐｒｅＱ１のアミドアナログ（７−カルボキサミド−７−デアザグアニン）の見かけのＫｄはｐｒｅＱ１と類似し、適切なメチレン基での立体許容度（ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｓｔｅｒｉｃ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を示す。推定上、カルボキサミド誘導体が生物学的に関連しそうにないので、この化合物に対する分子識別のための選択圧は存在しない。
【０２６３】
５２ｑｕｅＣを使用していくつかの構造調整度を誘導するｐｒｅＱ１アナログのうち、グアニンのみが生理学的条件下で蓄積すると予想される。ｐｒｅＱ１に対する５２ｑｕｅＣの親和性はグアニンよりも約２５倍しか高くなく、このリガンド親和性の相違はｉｎ  ｖｉｖｏで推定上起こる選択的結合を十分に説明しているのかどうか疑問がある。ｉｎ  ｖｉｖｏでのｐｒｅＱ１に対するより高い選択性に寄与し得る１つの要因は、グアニンの最大細胞濃度に限度のあることである。また、いくつかの研究により、転写中のリガンド会合の動態学はリボスイッチ機能に重要であり、リボスイッチがｉｎ  ｖｉｖｏで反応するＫｄ値とリガンド濃度とは必ずしも同等ではないことが示された（Ｗｉｃｋｉｓｉｅｒ  ２００５ａ；Ｗｉｃｋｉｓｉｅｒ  ２００５ｂ；Ｌｅｍａｙ  ２００６）。したがって、ｑｕｅＣ  ＲＮＡのｐｒｅＱ１特異的応答をｐｒｅＱ１とグアニンとの間のリガンド会合の動態学的相違によって補助することができる可能性がある。
【０２６４】
ｐｒｅＱ１の２位の環外の（ｅｘｏｃｙｌｉｃ）アミンがｑｕｅＣ  ＲＮＡによるリガンド認識の重要な決定要因であることが結合親和性データの比較から明らかである。試験した化合物のうち、約１ｍＭの濃度で存在する場合でさえ、この官能基を欠く化合物はｑｕｅＣ  ＲＮＡ構築物における構造調整を誘導しない。リガンド結合に対する２−アミノ基の寄与を、ｐｒｅＱ１および７−アミノメチル−７−デアザヒポキサンチン（ｐｒｅＱ１に対するその唯一の構造の相違はこの官能基が存在しないことである）の親和性の比較による単離で試験することができる。５２ｑｕｅＣのｐｒｅＱ１との強い相互作用と比較して、７−アミノメチル−７−デアザヒポキサンチンに対する親和性は少なくとも４桁減少し、２−アミノ基が主な特異性決定要因であることが証明された。ｐｒｅＱ１の他の官能基のホストの置換または除去に起因するリガンド結合に及ぼす有害作用と組み合わせて、この知見は、ｑｕｅＣ  ＲＮＡがこの改変塩基に対する高度な選択的アプタマーとしての機能を果たすことを示す。
【０２６５】
ｅ．平衡透析によるｐｒｅＱ１認識の評価
ｐｒｅＱ１とｑｕｅＣ  ＲＮＡモチーフとの間の特異的な物理的相互作用についてのさらなる支持を得るために、５０００ダルトンの分子量カットオフを有する透過性膜によって分けられた２つのチャンバを含む平衡透析装置を使用して競合結合実験を行った（図４ｄ）。グアニンはナノモルの親和性でｑｕｅＣモチーフによって認識されるので（図４ｃ）、最初に３Ｈ−グアニンおよびモル過剰の１０６ｑｕｅＣ  ＲＮＡを各チャンバに個別に添加した。予想通り、１０〜１５時間の平衡期間後のＲＮＡ含有チャンバへのトリチウムの再分配（図４ｅ）が認められた。３Ｈ−グアニンのこの隔離を、標識していないグアニン、ｐｒｅＱ１、または７−デアザグアニンをＲＮＡ濃度を超える濃度で添加した場合に、その添加によって競合的に回復することができる一方で、アデニンはこれらの条件下で競合物としての機能を果たさなかった（図４ｅ）。これらの結果は、ｑｕｅＣ  ＲＮＡがｐｒｅＱ１および密接に関連するプリンと選択的に相互作用するという結論を支持する。
【０２６６】
ｆ．ｐｒｅＱ１アプタマーの最小長
Ｐ０ステム−ループ下部構造の不十分な系統発生学的保存（図１）は、アプタマー機能におけるその役割が不可欠ではないことを示す。この可能性を試験するために、Ｐ０を消失させるために５’末端を短縮した３６ｑｕｅＣを調製した（図５ａ）。５’３２Ｐ標識３６ｑｕｅＣを使用したインライン探索分析によって１０μＭ  ｐｒｅＱ１の存在下でループおよび３’テール内の領域で構造調整が起こることが明らかとなり、Ｐ０の非存在によってアプタマー機能が壊滅的に喪失しないことを示す（図５ｂ）。
【０２６７】
ｑｕｅＣモチーフの３’末端付近の保存配列がリガンド結合に必要であるかどうかを調査するために、Ａ３２およびＡ２５に対応する３’末端を有する２つの派生的欠失構築物を形成した。これらの短縮ＲＮＡはいずれもｐｒｅＱ１依存性構造変化を示さず、リガンド認識におけるテールセグメントの関与を支持する（図５ｂ）。これらのデータにより、ｑｕｅＣモチーフを定義する一次構造および二次構造保存の比較的小さな領域がｐｒｅＱ１の選択的認識に必要な配列の全てを含むことが確認される。特に、合成ＲＮＡを使用した結合実験により、３６ｑｕｅＣの２つの５’グアノシル残基がリガンド結合に必ずしも必要ではないという証拠が得られ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるｐｒｅＱ１アプタマーの最小長はわずか３４ｎｔであることを示す。
【０２６８】
Ｐ０の喪失がリガンド結合の結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）を損なうかどうかを試験するために、ｐｒｅＱ１のＫｄを、漸増濃度のｐｒｅＱ１の存在下で３６ｑｕｅＣをインライン探索分析に供することによって決定した（図５ｃ）。２つの選択された部位での構造調整の定量分析により、約５０ｎＭのＫｄが明らかとなる（図５ｄ）。Ｐ０を含む構築物のＫｄ値はわずかにより低く（２０ｎＭ；図４ｂ）、このステム−ループがリガンド結合に少ししか寄与していないことが示唆される。Ｐ０の存在がリボスイッチ機能の動態学的態様に影響を及ぼし得る可能性もある。それにも関わらず、Ｐ０に寄与し得る結合親和性の任意の増強が実質的でなく、この結論はこの下部構造の制限された系統発生学的分布と一致することがこれらのデータから明らかである。
【０２６９】
ｇ．ｐｒｅＱ１認識における標準的塩基対の証明
グアニンリボスイッチの選択性は、一部、そのリガンドとのワトソン−クリック塩基対の形成に依存する（Ｇｉｌｂｅｒｔ  ２００６；Ｍａｎｄａｌ  ２００４；Ｂａｔｅｙ  ２００４）。リガンドと塩基対合するシチジル残基をウリジル残基に変異させて、グアニンからアデニンへのアプタマー特異性を変化させることができる（Ｇｉｌｂｅｒｔ  ２００６；Ｍａｎｄａｌ  ２００４）。この単一点変異により、他所での分子間接触を混乱させることなくアデニンリガンドとの標準的塩基対合相互作用が可能である。構造的に類似する代謝産物であるグアニンおよびｐｒｅＱ１が同一のシチジンとの標準的塩基対形成能力を有するので、ｐｒｅＱ１アプタマーとの類似のリガンド−シチジン対合相互作用の検索を行った。グアニンリボスイッチとの類似性により、この仮説上の役割を果たすｑｕｅＣＲＮＡの任意のシチジル残基が絶対的に保存され、この位置でのウリジンへの変異がアデニンにより密接に関連する化合物を優先するようにリガンド特異性を切り替えるのに十分であると判断された。
【０２７０】
この可能性を、野生型ｑｕｅＣ構築物（８０ｑｕｅＣ）のリガンド結合特性と絶対的に保存されたシチジン残基が個別にウリジンと置換された２つの変異ＲＮＡのリガンド結合特性との比較によって試験した（図６ａ）。２−アミノ基がｐｒｅＱ１アプタマーによるリガンド認識に重要であることが以前に確立されていたので、２，６−ジアミノプリンを試験化合物のパネルに含めた（図４ｃ）。したがって、この部分を欠く化合物（アデニンまたは７−アミノメチル−７−デアザアデニンなど）が、ウリジル識別残基と塩基対合する可能性があるにもかからず、検出可能に結合し得ないと予想された。
【０２７１】
野生型８０ｑｕｅＣを使用したインライン探索分析により、予想通り、１μＭ  ｐｒｅＱ１または２００μＭグアニンの存在下で構造調整が起こることが証明される（図６ｂ）。この構築物の構造の変化は２００μＭ  ２，６−ジアミノプリンによっても誘導され、このことは以前の知見と一致する。８０ｑｕｅＣとの相互作用のＫｄが３００μＭを超えるように現れるにも関わらず（図４ｃ）、２，６−ジアミノプリンによって誘導される構造の変化は、１０μＭほどの低濃度で検出される。アデニンでは、２００μＭの濃度で存在しても野生型８０ｑｕｅＣの構造調整は起こらない。
【０２７２】
シチジン３４がウリジンに置換された８０ｑｕｅＣの変異バージョン（Ｍ１）である（Ｍ１）は、野生型構築物と顕著に異なる選択性プロフィールを示す（図６ｂ）。ｐｒｅＱ１またはグアニンとのインキュベーションではＭ１の構造調整は認められない。さらに、アデニンはいかなる高次構造応答を誘導することもできないにもかかわらず、２，６−ジアミノプリンとのインキュベーションの際にＭ１で重要な変化が認められる。重要なことには、これらの構造の変化は野生型構築物中のｐｒｅＱ１によって誘発される変化と類似し、これらの変化のうちで最も顕著に反映するＣ２９のすぐ３’側のヌクレオチド間結合の鎖切断レベルの増加である（図６ｂ）。対照的に、試験化合物は、Ｍ２（他の絶対的に保存されたシチジン（Ｃ３５）がウリジンに置換された構築物）の構造調整を誘導しない。
【０２７３】
これらのデータは、野生型８０ｑｕｅＣにおいて、グアニンリボスイッチの識別子（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒ）であるシチジンと同様に、Ｃ３４がｐｒｅＱ１リガンドとワトソン−クリック塩基対を形成することができることを示す（図６ｃ）。Ｍ１によるアデニン結合の非存在は、２−アミノ基の除去がリガンド認識に深刻な負の影響を及ぼすという以前の知見と完全に一致する（図４ｃ）。実際、１ｍＭもの高濃度の７−アミノメチル−７−デアザアデニンも類似のＣ３４Ｕ変異を含むｑｕｅＣ  ＲＮＡ構築物の構造を調整できず、この部分の非存在の影響が強調される。
【０２７４】
ウリジン３４とグアニンまたはｐｒｅＱ１のいずれかとの間の非標準的ゆらぎ対が形成される可能性があるにも関わらず、Ｍ１  ＲＮＡへのこれらの核酸塩基リガンドの結合は認められなかった。ウリジン３４が実際に２，６−ジアミノプリンと塩基対合相互作用に関与する場合、ｐｒｅＱ１およびグアニンの排除は、おそらく、結合ポケットによって課された空間的制約に起因する。リガンドのフーグスティーンおよび糖端とのアプタマーの接触は、ゆらぎ対形成に必要であり得る約２Åのシフトと適合しない（図６ｃ）。
【０２７５】
Ｍ１  ＲＮＡの構造に及ぼす２，６−ジアミノプリンの定量的影響が明らかであるにも関わらず、この調整の大きさはｐｒｅＱ１またはグアニンに応答する野生型ＲＮＡを用いて認められるものほど顕著ではないことは明らかである（図６ｂ）。構造調整度のこの見かけの減少は、おそらく、変異体が２，６−ジアミノプリンに結合する能力の低下を反映する。これと一致して、インライン探索法により、この相互作用のＫｄが３００μＭを超えることが明らかとなった（データ示さず）。相対的に、野生型ｑｕｅＣ  ＲＮＡとグアニンとの間の相互作用のＫｄは約５００ｎＭであり（図４ｃ）、適切な塩基対合リガンドを使用した場合でさえ、Ｃ３４Ｕ変異は６００倍を超える結合親和性の相対的喪失を経験することを示す。２，６−ジアミノプリンと同様に，グアニンは７−デアザ−７−アミノメチル改変を欠き、それにより、リガンドおよび識別子の塩基（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒ  ｂａｓｅ）のワトソン−クリック端のみに起因する影響を直接比較することが可能である。
【０２７６】
この差異の可能な理由には、重要な官能基の置換に起因する可能性が高い球状アプタマー構造に及ぼす有害作用が含まれる。例えば、Ｃ３４Ｕ変異に起因する主な化学的相違は、４位での環外のアミンのケト基との有効な置換である（図６ｃ）。この官能基の交換によって２，６−ジアミノプリンと塩基対合が可能となるにもかかわらず、それがアプタマー内の重要な分子内接触を破壊し、それにより、全ての折り畳みの安定性を損ない得る。同様に、ｐｒｅＱ１の６−ケト酸素が、Ｃ３４の４−アミノ基に加えて、他の分子決定基と接触することができる可能性がある。
【０２７７】
ｈ．ｐｒｅＱ１リボスイッチは遺伝子調節エレメントである
ｐｒｅＱ１生合成に関与する遺伝子とこのエレメントとの頻繁な会合と組み合わせて、ｑｕｅＣモチーフによる高い親和性および選択性でのｐｒｅＱ１の認識により、このモチーフの例はｐｒｅＱ１レベルに応答して遺伝子発現を調節するリボスイッチのリガンド結合成分としての機能を果たすことが強く示唆される。ｑｕｅＣエレメントがこの能力で機能するかどうかを試験するために、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｑｕｅＣＤＥＦオペロン由来の５’ＵＴＲ配列の野生型または操作されたバージョンを、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子と連結した（図７ａ）。次いで、この一連の転写融合構築物を使用してＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ染色体形質転換体を生成し、各株を富栄養培地中での増殖後にβ−ガラクトシダーゼ活性レベルについてアッセイした。
【０２７８】
野生型５’ＵＴＲ配列にカップリングしたｌａｃＺ遺伝子を含む形質転換体は、ｐｒｅＱ１補充せずに増殖させた場合に比較的低レベルのβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。この結果は、ｑｕｅＣエレメントが遺伝子発現を抑制する作用を示し、ｑｕｅＣＤＥＦオペロンから発現したタンパク質によって天然に産生されたｐｒｅＱ１に対する応答による可能性が最も高い（図７ｂ）。対照的に、重要なアプタマー残基が変異した構築物（Ｍ３およびＭ４）を保有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株は抑制解除される。Ｍ３およびＭ４において、ｐｒｅＱ１の認識に重要であると証明された位置での変異が起こるので（図６ａ、ｂ）、この結果により、アプタマー機能と遺伝子調節との間の直接的な相互作用が得られる。
【０２７９】
ステム完全性を修復するようにデザインされた代償性変異を含んでいた別の改変体（Ｍ６）を使用した実験で同様の程度の抑制解除を誘発したにもかかわらず、Ｐ１ステム内の２ｂｐが破壊された構築物（Ｍ５）を使用したアッセイにより、ｌａｃＺ抑制も喪失された。野生型配列と同様、Ｍ６がｌａｃＺ発現を抑制できないのは、おそらく、これらの位置でのヌクレオチド同一性の強い偏り（ｂｉａｓ）に起因し、このことは、ｑｕｅＣモチーフ例のアラインメントによって明らかとなる（図１）。隣接するＡ：Ｕ塩基対でかかる偏りは認められないので、これら２つのｎｔのみのより集中的な変異分析を行った。使用した変異体のサブセットにより、Ｐ１構造の破壊がｌａｃＺの抑制解除と相関する一方で（Ｍ７およびＭ９）、Ｐ１の完全性を修復する代償性変異（Ｍ８）によって、野生型に生じるのと同様のβ−ガラクトシダーゼ抑制レベルが得られることが明らかとなった。まとめると、これらのデータは、系統発生的に保存された配列または構造の変異に起因するアプタマー機能の任意の妨害が遺伝子調節の障害と相関することを示す。これらの知見は、ｑｕｅＣモチーフがｐｒｅＱ１感知リボスイッチのアプタマー成分であるという結論を支持する。
【０２８０】
ｉｉ．考察
保存された核酸モチーフを検索するためのバイオインフォマティクスアプローチの使用により、いくつかのリボスイッチおよび多数のリボスイッチ候補が明らかになった（Ｂａｒｒｉｃｋ  ２００４；Ｃｏｒｂｉｎｏ  ２００８；Ｆｕｃｈｓ  ２００６）。多数のこれらの候補モチーフの特異的役割は不明のままであるが、これは、その関連する遺伝子機能の理解が不十分なためにさらなる分析の障壁となっていることに一部起因する。未知の機能の遺伝子と併せて最初に同定されたｑｕｅＣモチーフ（Ｂａｒｒｉｃｋ  ２００４）は、かかる困難（ｑｕａｎｄａｒｙ）を象徴していた。しかし、ｑｕｅＣＤＥＦオペロンの遺伝子がＱ生合成に関与するという発見（Ｒｅａｄｅｒ  ２００４）により、ｐｒｅＱ１リボスイッチとしてのこの保存モチーフの機能を明確にすることにおいて重要な情報が得られた。
【０２８１】
相互様式で、ｑｕｅＣエレメントの標的代謝産物としてのｐｒｅＱ１の同定は、特徴づけられていないままであるこの新規に見出されたレギュロン中の他の遺伝子の役割を明らかにするのに役立ち得る。例えば、予想される膜タンパク質をコードする遺伝子とのｐｒｅＱ１リボスイッチの繰返しの近位（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）（ＣＯＧ４７０８；図８）は、Ｑまたは関連する代謝産物の輸送におけるこのタンパク質の役割を意味する。さらに、ｐｒｅＱ１リボスイッチは、いくつかの場合、未知の機能の２つの遺伝子を含む相同オペロンに関連する（図８）。ＣＯＧデータベースアサインメント（Ｔａｔｕｓｏｖ  ２００１）に基づいて、これらの遺伝子のうちの１つは、イノシン−ウリジンヌクレオシドＮ−リボヒドロラーゼと類似したタンパク質をコードすると予想される。このクラスの酵素がヌクレオシドのＮ−リボース結合（Ｎ−ｒｉｂｏｓｉｄｉｃ  ｂｏｎｄ）の加水分解による核酸塩基サルベージに関与するので（Ｄｅｗｅｙ  １９７３；Ｍｉｌｌｅｒ  １９８４）、ｐｒｅＱ１リボスイッチに関連する相同遺伝子の産物がＱまたは関連基質との類似の反応を触媒すると推測することが妥当である。この推定バイシストロン性オペロン（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｏｐｅｒｏｎ）中の他の遺伝子は、輸送体として機能することができる保存膜タンパク質をコードすると予想される。その発現がｐｒｅＱ１レベルによって調節されるようであるならば、これらの遺伝子は、Ｑまたはその誘導体の輸送および再利用に関与するサルベージオペロンを含む可能性が高い。この仮説を支持して、キューオシン５’−ホスフェートに作用してｔＲＮＡ代謝回転後にキューイン塩基（ｑｕｅｕｉｎｅ  ｂａｓｅ）を回収する特異的酵素系が哺乳動物で同定されている（Ｇｕｎｄｕｚ  １９８２；Ｇｕｎｄｕｚ  １９８４）。
【０２８２】
リボスイッチのｐｒｅＱ１クラスの最も顕著な特性の１つは、その小さなアプタマーのサイズである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択的な高親和性標的認識に必要な全ての決定要因は、たった３４ｎｔのスパン内に含めることができる。この小さな保存ＲＮＡエレメントの特徴は、簡潔に、ステム−ループおよびいくつかの連続アデノシン残基を保有する短い３’テールからなる。このアデノシンリッチセグメントとＰ１副溝（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）との間のＡ−マイナー相互作用（Ａ−ｍｉｎｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）（Ｎｉｓｓｅｎ  ２００１）がそのリガンド結合状態でのアプタマーの三次構造に寄与し得ると想像される。
【０２８３】
その顕著に小さなサイズにもかかわらず、ｐｒｅＱ１モチーフは種々の真正細菌における遺伝子調節の有効な作用因子としての役割を果たすことができるように現れる。これにより、大きなサイズおよび構造の複雑さは代謝産物結合ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの機能に必要な要素ではないことが明確に証明される。さらに、比較的小さなＲＮＡモチーフは一般に自動化検索法を使用した検出にあまり影響を受けないと推測されるので、ｐｒｅＱ１アプタマーと類似のサイズのモチーフは、まだ発見されていない代謝産物結合ドメインの実質的部分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含むことができる。
【０２８４】
多くの点で、天然の小型ＲＮＡの能力を高度な機能について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択を使用して単離した多数の小型のアプタマードメインによって予測した。天然の例と比較して異常に小さいにもかかわらず、ｐｒｅＱ１アプタマーのサイズは研究所で進化させたそのサイズを測定した場合に例外的でない。しかし、同族リガンドとのその相互作用の親和性および選択性に関して、ｐｒｅＱ１結合モチーフは特徴的である。その長さが由来するプールによって制限される人工的に生成したアプタマーは、一般に、天然に存在するモチーフよりも低い親和性および選択性でその標的と結合することが認められる（Ｂｒｅａｋｅｒ  ２００６）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択されたアプタマーの制限は、要因（あまり厳しくない選択圧および固定法に起因するリガンドへのアクセスの遮断が含まれる）の組み合わせに寄与し得る。しかし、小さなサイズのみではＲＮＡは小分子標的の特異的な高親和性認識から除外されないことが明らかである。
【０２８５】
ｉｉｉ．方法
オリゴヌクレオチドおよび化学物質。合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＨＨＭＩ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ／Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによる標準的な固相法を使用して調製した。変性（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による精製後、オリゴヌクレオチドを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２３℃でｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でゲル断片から溶離し、その後にエタノール沈殿によって濃縮した。７−デアザヒポキサンチンおよび７−デアザアデニンを、Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから入手した。他のプリン化合物を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０２８６】
ｐｒｅＱ１を記載のように合成し（Ａｋｉｍｏｔｏ  １９８８）、２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．０）の定組成移動相を使用した流速５ｍＬ／分での逆相ＨＰＬＣ（Ｌｕｎａ  Ｃ１８、２５０×１０ｍｍ、５μｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ））によって精製した。ｐｒｅＱ１は１７分で溶離された。ｐｒｅＱ１を含む画分を回収し、凍結し、凍結乾燥させて、白色粉末として生成物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ  ６．８８（ｓ，１Ｈ，Ｃ−Ｈ），４．１３（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），１．９５（ｓ，３Ｈ，酢酸塩）。
【０２８７】
７−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノメチル）−７−デアザグアニン（ｐｒｅＱ１のジメチルアナログ）を記載のように合成し（Ａｋｉｍｏｔｏ  １９８８）、ＥｔＯＨから再結晶して、白色固体として生成物を得た。
【０２８８】
【化１８−２】
2010521978.tif 000020
７−シアノ−７−デアザグアニン（すなわち、ｐｒｅＱ０）を記載のように合成し（Ｍｉｇａｗａ  １９９６）、４％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．０）の定組成移動相を使用した流速５ｍＬ／分での逆相ＨＰＬＣ（ＬｕｎａＣ１８、２５０×１０ｍｍ、５μｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ））によって精製した。ｐｒｅＱ０は１５分で溶離され、関連画分の凍結乾燥によって純白ではない固体としてｐｒｅＱ０を得た。
【０２８９】
【化１８−３】
2010521978.tif 000021
７−カルボキサミド−７−デアザグアニン（ｐｒｅＱ１のアミドアナログ）を記載のように合成し（Ｍｉｇａｗａ  １９９６）、ＥｔＯＨから再結晶して、黄色粉末として生成物を得た。
【０２９０】
【化１８−４】
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７−アミノメチル−７−デアザヒポキサンチンを、以前に報告されたプロトコールの修正バージョンを使用して調製した（Ａｋｉｍｏｔｏ  １９８６）。中間体７−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノメチル）−７−デアザヒポキサンチンを以前に公開された手順にしたがって合成した５０。
【０２９１】
【化１８−５】
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７−アミノメチル−７−デアザアデニンを、以前に報告されたプロトコール（Ａｋｉｍｏｔｏ  １９８６）の修正バージョンを使用して調製した。中間体７−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノメチル）−７−デアザアデニンを、以前に公開された手順にしたがって合成した（英国特許第９８１４５８号（１９６５））。
【０２９２】
【化１８−６】
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バイオインフォマティクス。ｐｒｅＱ１アプタマー配列アラインメントを、以前に公開されたｙｋｖＪ  ＲＮＡモチーフ（Ｂａｒｒｉｃｋ  ２００４）のアラインメント由来のこの報告中に存在する二次構造モデルに手作業で適合させた。この最初のアラインメントで訓練した共分散モデル（Ｅｄｄｙ  １９９４）を使用して、ＩＮＦＥＲＮＡＬソフトウェアパッケージ（Ｅｄｄｙ  ２００３）に対するＲＡＶＥＮＮＡ拡張（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ２００６）（配列ベースのヒューリスティックフィルターを使用した共分散モデル検索を迅速化する）によってさらなる適合について微生物ゲノムおよび環境配列を検索した。ＰｒｅＱ１リボスイッチ候補を、そのゲノムコンテクストの試験（推定オペロン中の遺伝子機能を予測するためのＣＯＧデータベース（Ｔａｔｕｓｏｖ  ２００３）の使用を含む）によって検証した。最終アラインメント中の配列をＧＳＣアルゴリズム（Ｇｅｒｓｔｅｉｎ  １９９４）を使用して加重して、報告したコンセンサス配列の計算前に類似の配列由来の偏りを軽減した。
【０２９３】
ＲＮＡ構築物の調製。ｑｕｅＣ上流の遺伝子間領域の一部を、プライマー５’−ＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＧＧＣＧＣＴＴＴＧＣ（配列番号１）および５’−ＴＴＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＣ−ＴＣＣ（配列番号２）を使用したＰＣＲを使用して、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ（１Ａ４０株）から増幅した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでの消化後、増幅産物をｐＤＧ１６６１（リファレンス５７）にクローン化し、得られたプラスミドの完全性を配列決定によって確認した。このプラスミドは、１０６ｑｕｅＣ構築物をコードするＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのテンプレートとしての機能を果たした。残りのＲＮＡ構築物に対応するＤＮＡテンプレートを、製造者の説明書にしたがってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した適切な部分的に相補的な合成オリゴヌクレオチドの伸長によって調製した。転写テンプレートの産生で使用した各オリゴヌクレオチド対のために、センス方向のプライマーはＴ７プロモーター配列を含んでいた。ＲＮＡ分子を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写によって調製し、以前に記載のようにゲル精製した（Ｒｏｔｈ  ２００６）。
【０２９４】
インライン探索分析。酵素的に合成したＲＮＡ分子を、アルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して脱リン酸化し、製造者の説明書にしたがってγ−３２Ｐ  ［ＡＴＰ］およびＴ４  ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で放射性標識した。ゲル精製した５’末端標識ＲＮＡを使用した自発的エステル交換反応を、以前に記載のように構築した（Ｍａｎｄａｌ  ２００３）。インキュベーションは、各実験について、記載の試験化合物の存在下または非存在下で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２３℃でｐＨ８．３）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、および約５ｎＭ前駆体ＲＮＡを含む１０μＬの体積を２５℃にて約４０時間であった。ｐｒｅＱ１および関連化合物を、典型的には、１０ｎＭ〜２００μＭの範囲の濃度で試験したが、結合親和性がより弱い一定の化合物をこの範囲を超える濃度でアッセイした。自発的エステル交換反応に起因するＲＮＡフラグメントを変性１０％ＰＡＧＥによって分離し、これらのデータの画像化および定量を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒおよびＩｍａｇｅＱｕａＮＴソフトウェアを使用して行った。Ｋｄ値を、以前に記載のように決定した（Ｍａｎｄａｌ  ２００３）。
【０２９５】
平衡透析。それぞれインライン探索のために使用したのと同じ緩衝液中で調製した１００ｎＭ  ３Ｈ−グアニンまたは２０μＭ  １０６ｑｕｅＣ  ＲＮＡのいずれかを含むサンプルを、体積３０μＬでＤｉｓｐｏＥｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｄｉａｌｙｚｅｒ（ＥＤ−１，Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の反対側のチャンバに添加した。２５℃で１０〜１５時間の平衡後、５μＬのアリコートを採取し、液体シンチレーションカウンターで定量した。競合結合実験のために、その後に１ｍＭの非標識試験化合物を含む３μＬの緩衝液をＲＮＡ含有チャンバに送達させた一方で、同体積の緩衝液を反対側のチャンバに添加した。さらなる平衡期間後、５μＬアリコートを再度回収して、３Ｈ−グアニン分布を評価した。
【０２９６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｐｒｅＱ１リボスイッチ機能の分析。ｐｒｅＱ１リボスイッチのｉｎ  ｖｉｖｏでの機能を、以前に記載の方法に類似の方法を使用して、このエレメントを含む配列のｌａｃＺレポーター遺伝子との融合によってアッセイした６０。プライマー５’−ＣＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＴＧＡＡＡＣＧＡＡＣＣＧＴＣＡＣＴＡＴＡＧ（配列番号３）および５’−ＧＴＡＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＴＴＡＡＣＡＧＣＣＴＡＧＧＴＧＣ（配列番号４）を使用したＰＣＲを使用して、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ（１Ａ４０株）からｑｕｅＣの上流の遺伝子間領域部分を増幅した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでの消化後、増幅産物をｌａｃＺのすぐ上流のｐＤＧ１６６１にクローン化し、得られたプラスミドの完全性を配列決定によって確認した。配列改変体Ｍ３〜Ｍ９を生成するために、所望の変異を有するプライマーと共にＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、野生型構築物の部位特異的変異誘発を行った。構築物を１Ａ４０株中のａｍｙＥ遺伝子座に組み込み、記載のように確認した（Ｍａｎｄａｌ  ２００３）。震盪しながら３７°ＣでＡ６００が０．６になるまで２ＸＹＴブロス中で増殖させた後、これらの株をβ−ガラクトシダーゼアッセイで使用した。
【０２９７】
開示の方法および組成物が記載の特定の方法、プロトコール、および試薬に制限されず、これらは変化し得ると理解される。本明細書中で使用した専門用語が特定の実施形態の記載のみを目的とし、本発明の範囲を制限することを意図せず、本発明は添付の特許請求の範囲のみに制限されるとも理解すべきである。
【０２９８】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用する場合、他で明確に示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「ａ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ」は複数のかかるリボスイッチが含まれ、「ｔｈｅ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ」は１つまたは複数のリボスイッチおよび当業者に公知のその等価物などをいう。
【０２９９】
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、その後に記載する事象、環境、または材料が出現または存在してもしなくてもよいことを意味し、ならびに記載には、事象、環境、または材料が出現または存在する例およびそれが出現しないかまたは存在しない例が含まれることを意味する。
【０３００】
範囲を、本明細書中で、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までと示すことができる。かかる範囲を示す場合、他で具体的に示さない限り、一方の特定の値からおよび／または他方の特定の値までの範囲も具体的に意図され、開示されると見なされる。同様に、値を先行詞「約」の使用によって近似値で示す場合、特定の値が別の具体的に意図される実施形態を形成し、他で具体的に示されない限り、開示されたと見なすべきであると理解される。他で具体的に示されない限り、各範囲の終点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）が他の終点に関して有意であり、且つ他の終点に依存しないとさらに理解される。最終的に、例示的に開示された範囲内の全ての各値および値の部分的範囲も具体的に意図され、他で具体的に示さない限り、開示されると見なすべきであると理解すべきである。特定の場合にこれらの実施形態のいくつかまたは全てが例示的に開示されるかどうかと無関係に、上記を適用する。
【０３０１】
他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、開示の方法および組成物が属する分野の当業者に一般的に理解される意味を有する。本明細書中に記載のものに類似するか等価な任意の方法および材料を本発明の方法および組成物の実施または試験で使用することができるにもかかわらず、特に有用な方法、デバイス、および材料は記載の通りである。本明細書中で引用した刊行物および刊行物が引用した材料は、特に本明細書中で参考として援用される。本発明は、先行発明によるかかる開示に先行する権利がないと承認していると解釈されない。いかなるリファレンスも先行技術を構成していると承認していない。リファレンスの考察はその著者の主張を記載し、出願人が引用した書類の正確性および適切性に挑む権利を留保する。多数の刊行物が本明細書で参照されているにもかかわらず、かかるリファレンスは任意のこれらの書類が当該分野の一般的知識の一部を形成することを承認しないことが明確に理解される。
【０３０２】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの用語の変形形態（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」など）は、「含むが、これらに限定されない」を意味し、例えば、他の添加物、成分、整数、または工程を排除することを意図しない。
【０３０３】
当業者は、日常的な実験しか使用せずに、本明細書中に記載の方法および組成物の特定の実施形態に対する多数の等価物を認識するか、確認することができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０３０４】
参考文献
【０３０５】
【数１】
2010521978.tif 000025
【０３０６】
【数２】
2010521978.tif 000026
【０３０７】
【数３】
2010521978.tif 000027
【０３０８】
【数４】
2010521978.tif 000028
【０３０９】
【数５】
2010521978.tif 000029
【０３１０】
【数６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2010521978000001.app
【国際調査報告】
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2010521978.tif 000041