(57)【要約】薬剤を必要とする患者、特に、脳卒中患者内の虚血組織または器官の再灌流を刺激するための薬剤の製造のためのトロンボモジュリンの使用。再灌流の改善に関する本発明の１つの実施態様によるトロンボモジュリンの血栓溶解効果は、驚くべきことに中大脳動脈（ＭＣＡ）の安定した閉塞を伴う動物モデルにおいて見出された。閉塞ＭＣＡを伴うマウスを可溶性トロンボモジュリンで治療し、そして驚くべきことに脳血流（ＣＢＦ）の増大により測定されるような実質的な再灌流を呈した。動物研究からのトロンボモジュリンに関する公知の抗凝固剤効果は、単に血流を回復させるよりもむしろ血液凝固を予防する能力を示唆したので、この知見は予想外であった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓溶解薬剤の製造のためのトロンボモジュリンの使用。
【請求項２】
虚血組織または器官の再灌流の刺激を必要とする患者、特に、脳卒中患者内の虚血組織または器官の再灌流を刺激するための薬剤の製造のためのトロンボモジュリンの使用。
【請求項３】
血栓塞栓イベントによる血管の閉塞を予防するための薬剤の製造のためのトロンボモジュリンの使用。
【請求項４】
前記患者が一過性神経発作、一過性虚血発作、軽微な脳卒中またはラクナ脳卒中を患う請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記患者がＡＢＣＤまたはＡＢＣＤ２スケールの少なくとも３好ましくは少なくとも４、最も好ましくは少なくとも５のスコアにより評価されるような血栓イベントに関して増大したリスクを有する請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記患者が狭窄、好ましくは頸動脈狭窄（ｃａｒｏｔｉｓ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）および／または微小塞栓を有する請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記血栓塞栓イベントの発症後４８時間内に、好ましくは２４時間内に前記患者が治療される、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記治療が前記血栓塞栓イベントの発症後最初の３時間内である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
トロンボモジュリンが０．０１から５ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０３から３ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは０．０３から１．５ｍｇ／ｋｇ体重または０．０５から１．０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与される、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
トロンボモジュリンが１から３０ｍｇの固定用量、好ましくは１、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍｇの固定用量で投与される、請求項１から８に記載の使用。
【請求項１１】
固定用量のトロンボモジュリンが使用準備済みの医薬組成物として提供される請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
トロンボモジュリンが前記患者の寿命、好ましくは長期的に１日１回より多く与えられる、請求項１〜１１のうちの１つに記載の使用。
【請求項１３】
トロンボモジュリンが１日間と８日間の間、さらに好ましくは２日間と７日間の間、そして最も好ましくは３日間と６日間の間の適用間隔で与えられる、請求項１〜１２のうちの１つに記載の使用。
【請求項１４】
トロンボモジュリンの単回用量適用がトロンボモジュリンの多回用量適用と組み合わされる、請求項１〜１３のうちの１つに記載の使用。
【請求項１５】
前記トロンボモジュリンが成熟可溶性トロンボモジュリンのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有し、そして次の修飾：
アミノ酸１−３の除去；
Ｍ３８８Ｌ；
Ｒ４５６Ｇ；
Ｈ４５７Ｑ；
Ｓ４７４ＡおよびＰ４９０で終止；
の１つ以上を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、閉塞された血管における再灌流を増大させるための新規なストラテジに関し、また欧州特許出願第０７  ０１３  ４８０．４号、欧州特許出願第０８  ００９  ０９６．２号および欧州特許出願第０８  ０１０  ３３３．６号（これらは、開示によって本明細書に完全に援用される）の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
細胞機能は血流による十分な酸素の供給を重大な要とする。故に血流供給の妨害はその程度に依存して下流組織の損傷または機能障害を招き得る。この不適切な血流または器官もしくは組織への血液供給の不足は虚血と称される。虚血イベントの根源となる最も顕著な理由の１つは血管における血栓形成である。
【０００３】
不十分な酸素の提供とは組織が低酸素になるか、または酸素が全く供給されない場合、あまりに長時間蔓延すると壊死（すなわち細胞死）を引き起こす症状である無酸素になることを意味する。
【０００４】
虚血はとりわけ特定の心臓疾患、一過性の虚血性発作、脳血管事故、動静脈奇形の破裂および／または末梢動脈閉塞性疾患の特色である。不適切な血液供給に対して特に感受性のある組織には心臓、腎臓および脳が含まれる。例えば脳卒中または頭部傷害による脳組織における虚血は、一連の継続し、平行し、そして相互作用するタンパク質分解酵素、反応性酸素種およびその他の活性化合物を伴う生化学的事象を意味する、いわゆる解放されるべき虚血カスケードを引き起こす。この一連の流れの最終的な転帰は脳組織の損傷および破壊である。
【０００５】
脳組織における虚血イベントに関する同義語である脳卒中は、心血管疾患および癌の後の死亡の第３の主要原因である。脳卒中は米国だけで毎年７５００００人の患者において診断され、そしてほぼ１６８０００人の死亡原因となる。脳卒中は疾患が引き起こす重度の障害のために高い人的および社会的影響力を有する。
【０００６】
血液供給を回復させるための閉塞動脈の再疎通は、現在のところヒトにおける脳卒中治療のための最も有効な療法である。かかる治療の成功率は脳内出血および再閉塞の可能性により低減される。出血は虚血カスケードにより引き起こされる損傷の一部であるが、また血栓溶解剤に関連するリスクでもある。再閉塞は同一部位で、または下流に運ばれた元来の凝血塊の断片により生じ得る。最近の研究（非特許文献１）では、継続性脳卒中患者１４２人のうち８４人（６１％）（部分的５３人、完全３１人）において再閉塞を生じた。これらのうち２１人（２５％）の患者が初期の改善の後に悪化した。
【０００７】
一般的に脈管の妨害または再妨害（再閉塞）の予防のための公知の方法は、抗凝固剤または抗血小板薬で血栓患者を治療することである。抗凝固剤は血液が凝血塊を形成する能力を低減させる物質である。種々の抗凝固剤、例えばヘパリンまたはワルファリンが当業者に公知である。
【０００８】
種々の物質の抗凝固または抗血栓効果は公知であるが、現在急性脳卒中患者を治療するための抗凝固療法は何ら承認されていない。数多くの抗血小板薬のうち低用量アスピリンのみが推奨される。しかしながら米国心臓協会（ＡＨＡ）および米国心臓協会脳卒中部門（ＡＳＡ）のガイドラインによれば、この推奨は急性虚血性脳卒中後最初の２４−４８時間に限定される（ガイドライン（２００７年５月）１６８１頁左欄参照）。
【０００９】
抗凝固療法に関してはガイドラインにより：
早期再発性脳卒中の予防、神経学的悪化の中止または急性脳卒中後の転帰の改善を目標とする緊急の抗凝固剤は急性虚血性脳卒中の患者の治療には推奨されない；
緊急の抗凝固剤は重症の頭蓋内出血性合併症のリスクの増大のために、中等度および重度の脳卒中を伴う患者には推奨されない；
静脈内投与されたｔＰＡでの治療の２４時間内の抗凝固剤療法の開始は推奨されない（ガイドライン１６８０頁左欄）；
ということが明確に述べられている。
【００１０】
抗凝固剤脳卒中療法についての科学者および監督機関の不本意は単に、抗凝固剤が脳卒中患者における出血性への転換のリスクを増大させることが示されており、それは治療的利益を全く消し去る可能性があるという事実による。承認された抗凝固剤療法は今までのところ心臓梗塞および肺塞栓症の分野に限定される。
【００１１】
しかしながら本発明によれば今ではトロンボモジュリンを使用して閉塞血管、とりわけ脳卒中患者の閉塞血管を改善するか、または再灌流さえももたらすことができることが見出されている。この改善は出血性への転換のリスクの実質的な増大につながる。この再灌流活性のために、トロンボモジュリンを血栓溶解剤として臨床的に使用することができる。
【００１２】
血栓溶解剤は直接的または間接的に閉塞を除去または低減し、そしてそれにより血管の再灌流に至る物質である。この血栓溶解（または線維素溶解促進）特性に加えて、トロンボモジュリンは既に公知のように抗凝固特性を呈する。
【００１３】
血栓溶解剤としてトロンボモジュリンで治療することができる血栓塞栓イベントには、限定するものではないが心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、門脈もしくは腎静脈血栓症、肝血栓症（バッド・キアリ症候群）、上肢の血栓症（パジェット・シュレッター病）または胸郭出口症候群および脳卒中イベントが含まれる。
【００１４】
トロンボモジュリンは血管を裏打ちする内皮細胞上でトロンビン受容体として作用する膜タンパク質である。トロンビンは凝固カスケードにおける中心的酵素であり、それはフィブリノーゲンをフィブリンに変換し、マトリックス凝血塊はそれから作られる。最初に多くの傷害によりその不活性前駆体であるプロトロンビンから少量のトロンビンの作成を導く。今度はトロンビンが血小板および第二の特定の凝固因子（第Ｖおよび第ＶＩＩＩ因子を含む）を活性化する。後者の作用により、さらなるトロンビン分子の大量の活性化である、いわゆるトロンビンバーストを生じ、それは最終的に安定した凝血塊の形成を招く。
【００１５】
しかしながらトロンボモジュリンに結合した場合、トロンビンの活性は方向性において変化する：トロンビン−トロンボモジュリン複合体の主要な特色はプロテインＣを活性化するその能力であり、プロテインＣは次いで必須コファクターである第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子をタンパク質分解的に不活化することにより凝血カスケードを下方調節し（非特許文献２）、このように抗凝固活性を提供する。トロンビン−トロンボモジュリン複合体はまたトロンビン−活性化可能な線維素溶解阻害剤（ＴＡＦＩ）（それは次いで線維素溶解に拮抗する）を活性化することができる。
【００１６】
先の研究では陰性であったが、さらに最近の研究ではトロンボモジュリンが脳内皮細胞に存在する（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）のみならず、アストロサイトの表面でも発現され、ここでそれは脈管構造におけるように機能する、すなわちトロンビンとの複合体を形成した後、プロテインＣを活性化する（Ｐｉｎｄｏｎら、Ｇｌｉａ  （１９９７），１９：２５９−６８）ことが示されている。トロンボモジュリンはまたＣＮＳの反応性アストロサイトにおいて、機械的傷害に応答して上方調節される（Ｐｉｎｄｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２０００），２０：２５４３−５０）。関連する報告書により、組換えトロンボモジュリンは神経細胞において別の受容体、プロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ−１）のトロンビンの活性化を遮断することが可能であることが示唆される（Ｓａｒｋｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９９９），８２：１０７１−７７）。
【００１７】
活性型プロテインＣはまた種々のサイトカインまたは活性型白血球を伴う炎症応答の調節に強く結び付けられている（Ｅｓｍｏｎら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９９１），６６：１６０−１６５）。この仮説と一致して、活性型プロテインＣは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−アルファ）の生成を阻止することにより、強力な好中球のアクチベーターであるエンドトキシンＴＮＦ−アルファを投与されたラットにおける肺血管傷害を予防することが研究により示されている。（Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｂｌｏｏｄ  （１９９６），８７：６４２−６４７；Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６），２７２：Ｌ１９７−２）。これは組換えヒト可溶性トロンボモジュリンが、プロテインＣ活性化により媒介される作用において好中球の活性化を阻止することによるエンドトキシン誘発の肺血管傷害を予防する能力と一致する（Ｕｃｈｉｂａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６），２７１：Ｌ４７０−５；Ｕｃｈｉｂａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９７），２７３：Ｌ８８９−９４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｒｕｂｉｅｒａら、「Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｒｅｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｃａｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ」Ｓｔｒｏｋｅ（２００５）３６：１４５２−１４５６
【非特許文献２】Ｅｓｍｏｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．ＡｃＡｄ．Ｓｃｉ．（１９９１），６１４：３０−４３
【非特許文献３】Ｂｏｆｆａら、Ｎｏｕｖ．Ｒｅｖ．Ｆｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９１），３３：４２３−９
【非特許文献４】Ｗｏｎｇら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．（１９９１），５５６：１−５
【非特許文献５】Ｗａｎｇら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９７），１７：３１３９−４６
【非特許文献６】Ｔｒａｎら、Ｓｔｒｏｋｅ（１９９６），２７：２３０４−１０；考察２３１０−１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
再灌流の改善に関する本発明の１つの実施態様によるトロンボモジュリンの血栓溶解効果は、驚くべきことに中大脳動脈（ＭＣＡ）の安定した閉塞を伴う動物モデルにおいて見出された。閉塞ＭＣＡを伴うマウスを可溶性トロンボモジュリンで治療し、そして驚くべきことに脳血流（ＣＢＦ）の増大により測定されるような実質的な再灌流を呈した。動物研究からのトロンボモジュリンに関する公知の抗凝固剤効果は、単に血流を回復させるよりもむしろ血液凝固を予防する能力を示唆したので、この知見は予想外であった。
【００２０】
本発明の局面では、「再灌流」なる用語は閉塞の状態と比較して血流の任意の改善を指し、それは部分的または全体的な再灌流のいずれでもよい。このように再灌流なる用語は虚血イベントの前の元来の血流の完全な回復を招く効果に限定されない。本発明によれば、トロンボモジュリンの再灌流効果は、血栓形成に拮抗する、および／または凝血塊の自発的な溶解を支援する効果を含むと考えられる。
【００２１】
本発明の目的のために使用される際には「閉塞」なる用語は、健常または正常血管と比較してそれの遠位の組織の血流の低減を招く血管の任意の狭窄または狭小化として定義される。閉塞は部分的または完全のいずれでもよい。故に閉塞なる用語は狭窄症、すなわち遠位灌流を依然可能にする血管の異常な狭小化をも包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１である。
【図２】図２である。
【図３】図３である。
【図４】図４である。
【図５】図５である。
【図６】図６である。
【図７】図７である。
【図８】図８である。
【図９】図９である。
【図１０】図１０である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の別の態様ではトロンボモジュリンを使用して、血栓塞栓イベントによる、とりわけ二次的な血栓塞栓イベントによる血管の閉塞のリスクを予防するかたまは少なくとも低下させることができる。これらの二次的な血栓塞栓イベントは一次的な虚血イベントから誘導される脳凝血塊でよい。このように本発明のこの実施態様によれば、トロンボモジュリンを使用して二次的な脳血管閉塞（再閉塞）のリスクを被る脳卒中患者を治療することができる。
【００２４】
トロンボモジュリンＳｏｌｕｌｉｎを用いるトロンボモジュリン第Ｉ相臨床試験（「ＳＯＬＩＤ−Ｉ」）からの最初の結果により、安全で、そして高度に有効な抗凝固剤および血栓溶解剤としての可溶性トロンボモジュリンの使用が確認された。
【００２５】
ＳＯＬＩＤは健常ボランティアにおける単一施設無作為化単純盲検プラセボ対照第Ｉ相研究として設計された。定型的な安全性パラメータに加えてＳＯＬＩＤ−Ｉ研究は適用されたＳｏｌｕｌｉｎ用量の凝固系に及ぼす可能な悪影響を精査した。その研究では５群のボランティアに各々Ｓｏｌｕｌｉｎの単回用量を投与し、継続用量群では投薬量を漸増させる。各々の用量増加は研究安全性委員会により最初に承認された。参照として研究対象の幾人かは薬理学的に不活性な物質、すなわちプラセボが投与された。０．６から３０ｍｇの選択された用量範囲内で、Ｓｏｌｕｌｉｎは用量依存的な様式で９８％までトロンビン形成を阻止することが示された。既に最小用量群で影響を認めることができ、そして予想される治療用量を示す１ｍｇでトロンビン形成の５０％阻止が達成された。
【００２６】
Ｓｏｌｕｌｉｎの最低用量と最高用量の間のファクター５０により前臨床研究において既に認められた物質の良好な耐容性が確認される（表１および図８参照）。また前臨床研究の結果に従って出血傾向の増大を示唆している血液凝固パラメータに及ぼす影響は観察されなかった。
【００２７】
故に本発明によればトロンボモジュリンは１つの分子内で抗凝固剤および血栓溶解剤の多様な機能的特性を組み合わせる。すなわちトロンボモジュリンは抗凝固剤のように血栓イベントを予防することができ、そしてトロンボモジュリンは血栓溶解剤のように再灌流を誘発または引き起こすことができる。それ故に本発明に基づいてトロンボモジュリンは抗凝固および血栓溶解特性を呈する「二機能性」薬物の新しいクラスの第１の典型である。
【００２８】
これらの特性によりトロンボモジュリンは、血栓リスクおよび既存のまたは進展する血栓症の組み合わせを有する患者を治療するのにとりわけ適当なものになる。故に本発明の１つの実施態様によれば、軽微な脳卒中はトロンボモジュリンで治療可能である。
【００２９】
現在軽微な脳卒中は血栓溶解療法に関して好ましくないリスク・ベネフィット比のために臨床排除基準の一例である。これは一方では軽微な脳卒中を有する患者が有していた凝血塊がしばしば既に消散しており、そして他方では血栓溶解剤の固有の出血リスクがより重症の脳卒中症例に対する血栓溶解剤の使用を制限するということを考慮したためである。これらの患者は続く血栓イベントに関して高いリスクを有するので、それは「不安定脳卒中患者」としても記載される。
【００３０】
本発明のさらなる実施態様では、トロンボモジュリンを使用して軽微な脳卒中または臨床評価時までには既に改善している脳卒中を患う患者を治療することができるであろう。抗凝固剤としてそれを使用してさらなる血栓イベントを予防することができ、そしてトロンボモジュリン抗凝固に関わらず、それは血栓溶解剤としてとりわけ凝血塊が形成されている症例において「そのままで」凝血塊を消散させることができる。結果的にトロンボモジュリンを軽微な脳卒中と診断される患者に投与することができ、そして軽微な脳卒中を治療するための血栓溶解療法として適用することができる。
【００３１】
軽微な脳卒中を米国国立衛生研究所脳卒中スケール（ＮＩＨＳＳ）で脳卒中重症度６以下、好ましくは４以下により定義することができる。これに代えて米国国立神経疾患・脳卒中研究所ｒｔ−ＰＡ脳卒中研究グループにより提唱される５つの実用的定義（定義Ａ−Ｅ）にしたがって軽微な脳卒中を定義することができる（Ａｎｎ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ  （２００５）４６：２４３−２５１）。
【００３２】
定義Ａには０に違いない意識のレベル（項目１ａから１ｃ）を除いて、ベースラインＮＩＨＳＳスコアの各項目に関して０または１のスコアを有する全ての患者が含まれる。この定義では最大の可能なＮＩＨＳＳスコアは１１である。
【００３３】
定義Ｂには全ての推定される小血管閉塞患者が含まれる。この定義はラクナ様症候群に基づく。
【００３４】
定義Ｃには感覚の欠陥を伴うかまたは伴わない運動の欠陥を伴う全ての患者が含まれる（構音障害または運動失調を含み得る）。これらの患者は言語領域、意識のレベル、消去もしくは無視、水平方向の眼球運動または視野における欠陥を何ら伴わない運動、協調および感覚の欠陥のみを有し得て、欠陥は一般的により広い領域の限局的虚血によるものと見なされる。この定義は純粋運動性片麻痺のラクナ症候群または感覚運動脳卒中および失調性片麻痺の関連するラクナ症候群を伴うこれらの患者を捕捉しようと努めている。
【００３５】
定義Ｄには重篤度の最低の四分位（最小の重症度）に入るベースラインＮＩＨＳＳを有する全ての患者が含まれる（ＮＩＨＳＳスコア≦９）が、失語症、消去もしくは無視、または意識レベル質問に関して何らかの問題を有する全ての患者が排除される。重症度の最小の四分位の患者はこの定義に入り、そして一般的により小さな、さらに軽微な梗塞に関与しない選択された項目を伴うものはさらに排除される。
【００３６】
定義ＥにはベースラインＮＩＨＳＳスコアに基づく脳卒中重症度の最低の四分位に入る全ての患者が含まれる（最大ＮＩＨＳＳスコア９）。定義は伴われる神経学的欠陥の領域とは独立してＮＩＨＳＳスコアの最低の四分位の患者の群を分析する。
【００３７】
ＮＩＨＳＳは脳卒中関連の神経学的欠陥の定量的測定値を提供する系統的な評価手段である。ＮＩＨＳＳは元来、急性脳卒中臨床試験における患者に関するベースラインデータを測定するための調査手段として設計された。スケールは今や脳卒中患者の激しさをも評価し、適切な治療を決定し、そして患者の転帰を予測するための臨床評価手段としても広く使用される。ＮＩＨＳＳに従って意識のレベル、眼球運動、顔面麻痺または四肢の運動能力のようなパラメータを評価し、そして予め定義された数値スコア化に供する。日常的にＮＩＨＳＳスコア６からおよそ１５は中等度の脳卒中として査定される。１５以上のＮＩＨＳＳスケールのスコアはかなり重症の脳卒中を示す。頻繁に２０以上のＮＩＨＳＳスコアの脳卒中は治療不可能であると考えられる。しかしながら注目すべきことには、脳卒中の重症度の査定はまた医師による患者の個々の評価に依存し、それは患者の全体的な臨床成績の態様を含む。本発明によれば６以下のベースラインＮＩＨＳＳスコアが好ましい。
【００３８】
その他の血栓溶解剤と同様に、血管状態の可視化によりトロンボモジュリン療法のための治療的決定を行うことができる。本発明の１つの態様によれば、血液で充填された構造の内部開口の可視化に至り、そしてそれで動脈閉塞の同定を可能にする任意のイメージング手段を適用することができる。可能なイメージング様式にはＭＲＩまたはＣＴおよびそれをさらに発展させたものまたは修飾されたものが含まれる；しかしながらそれに限定されない。血管の可視化を血管造影と称することもできる。ＭＲＩまたはＣＴ画像をさらに評価するための種々の方法は当業者に周知である（例えばポストプロセシングマップとしてのＭＴＴ、ＴＴＰまたはＴｍａｘ）。
【００３９】
本発明のさらなる実施態様では、脳動脈、とりわけ全てのその分枝を含む中大脳動脈（ＭＣＡ）、前大脳動脈（ＡＣＡ）および／または後大脳動脈（ＰＣＡ）、とりわけＭ１および／またはＭ２に局在する閉塞を治療することができる。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様では、抗凝固剤または血栓溶解剤のいずれかとしてのトロンボモジュリンの使用は血管の状態の診断に基づくことができる。この目的のためにＴＩＭＩスケールを使用することができる。ＴＩＭＩスケール（心筋梗塞スケールにおける血栓溶解）は元来心筋梗塞における動脈閉塞の評価のために開発され、そして以下のとおりの４つのグレードを包含する：
グレード３：正常な血流；
グレード２：動脈は全体的に灌流しているが、血流は遅延している；
グレード１：造影剤により動脈は貫通しているが、遠位灌流はない；
グレード０：脈管の完全な閉塞。
【００４１】
ＴＩＭＩグレード０から２の患者は完全または部分的閉塞を被り、そしてその血栓溶解活性に基づいてトロンボモジュリンで（好ましくは急性的に）治療することができる。しかしながらＴＩＭＩグレード３でトロンボモジュリンは（再）閉塞を予防することができ、そして急性予防のために、または慢性的に、例えば数日から数週間の長期間、二次的な予防治療として与えられる。
【００４２】
本発明の別の実施態様では、トロンボモジュリンを使用して一過性神経発作を患う患者を治療することができる。一過性神経発作（ＴＮＡ）は一時的な（＜２４時間）神経学的病徴を伴う発作である。これらの病徴は限局性、非限局性または双方の混合型でよい。最近の出版物によれば、非限局性ＴＮＡを経験する患者、および特に混合型ＴＮＡを有するものはさらなる血栓イベントのリスクがさらに高く、そしてそれ故に特にトロンボモジュリンを使用する抗凝固療法に適している（Ｂｏｓら、「Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｔｔａｃｋｓ」ＪＡＭＡ  ２００７，２９８：２８７７−２８８５）。
【００４３】
ＴＮＡを患う患者におけるトロンボモジュリンを使用する抗凝固治療は約１日から約３か月が好ましいが、虚血イベントの急性相で最も高い血栓リスクが観察されたので、できるだけ早く予防的治療を開始することができる。
【００４４】
本発明のさらなる実施態様では、トロンボモジュリンを使用して一過性虚血発作（ＴＩＡ）を患う患者を治療することができる。これは主にさらなる閉塞の予防を可能にするその抗凝固特性に基づく。しかしながらこれらのＴＩＡ患者がさらなる血栓イベントに見舞われた場合、血漿中に依然存在するトロンボモジュリンが再灌流の誘発を助けることができる。この場合、補充的なトロンボモジュリンを適用するか、またはトロンボモジュリン用量を増加させることが必要であり得る。故に本発明によれば、トロンボモジュリンを抗凝固剤または血栓溶解剤のいずれかとして使用してＴＩＡ患者を治療することができる。
【００４５】
ＴＩＡは一過性の血栓性または塞栓性血管閉塞により引き起こされる、２４時間未満および通常１時間未満の持続時間の脳の限局性非痙攣性虚血性機能障害の短時間の非可逆的エピソードとして定義される。イベントを動脈分布、一時的パターンまたは病因学（例えば塞栓性対血栓性）により分類できる。最近提唱されたＴＩＡ定義には急性梗塞の不在もまた含まれる。
【００４６】
ＷＨＯのＩＣＤ−１０分類によれば、ＴＩＡは切迫した脳血管事故または間欠性脳虚血としても記載されることができ、そして以下の臨床症候を含む：椎骨脳底動脈症候群、頸動脈症候群（半球性）、多発性および両側性脳実質外動脈（ｐｒｅｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ）症候群、一過性黒内障、一過性健忘症（健忘症ＮＯＳを除く）、その他の一過性脳虚血性発作および関連する症候群ならびに不特定の一過性脳虚血性発作。
【００４７】
ＴＩＡ後の短期間の脳卒中リスクは大きな虚血性脳卒中後により高く、最近の研究によると４−２０％がＴＩＡ後９０日以内に、半分は２日以内に脳卒中になるであろうということが示されている。また急性脳虚血イベント（脳卒中またはＴＩＡ）を有する患者では、最初の２４時間に大きく回復したものは最も高い発生のリスクを有する。
【００４８】
このようにＴＩＡを有し、そして早期に部分的に回復した患者は脳卒中を有したことがあるものよりもさらに不安定であり、そしてそれ故に特に良好なリスク・ベネフィット比を有する組み合わせ血栓溶解および抗凝固剤としてのトロンボモジュリンでの療法に適している。ＴＩＡが血栓イベントに関する重要な警告徴候としてますます認識されているという事実のために、迅速で、有効でそして安全な予防的治療に関する緊急の要件が明白になってきている。医師および患者をＴＩＡの関連性に関して敏感にするために、頭字語ＴＩＡは「即時行動せよ（Ｔａｋｅ  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ａｃｔｉｏｎ）」を意味するはずであるということが提唱された。
【００４９】
ＴＩＡの初期管理に関する推奨において、多発性の、および漸増的に頻繁な病徴（漸増性ＴＩＡ」）、病徴の持続時間＞１時間、公知の凝固性亢進状態の場合、またはカリフォルニアスコア、ＡＢＣＤスコアもしくはＡＢＣＤ２スコア（ＴＩＡの管理のための米国脳卒中協会ガイドライン）の適切な組み合わせのようないくつかの臨床的な特色は好機な病院紹介を支援する。これらの臨床上の特色はさらなる血栓イベントに関するリスクの増大を示すので、それらをトロンボモジュリン療法のための組み入れ基準と考えてもよい。
【００５０】
ＴＩＡの一般的な医学的評価には、ＥＫＧ、全血球数、血清電解質およびクレアチナーゼならびに空腹時血糖および脂質が含まれる。この評価はイベントの性質の定義を助けるはずであり、そしてトロンボモジュリン療法を決定するために使用することができる。
【００５１】
コンピューター断層撮影法（ＣＴ）およびコンピューター断層撮影血管造影法（ＣＴＡ）または核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）および核磁気共鳴血管造影法（ＭＲＡ）のようないくつかの脳画像技術は梗塞および脈管閉塞を示すことができ、そしてＴＩＡを擬似し得るその他の病理との鑑別診断を確証することが推奨される。経頭蓋ドップラーは最近のＴＩＡを有する患者における補完的な検査研究である。それは脳血管の開存性、再疎通および側副路に関するさらなる情報を提供できる。前記された脳画像技術の各々は単独で、または組み合わせでトロンボモジュリン療法の決定を助けることができる。
【００５２】
静脈血栓症および光血栓脳卒中の動物モデルにおける出血傾向を有意に増大しない用量での可溶性トロンボモジュリンの有効性に基づいて、トロンボモジュリンを非心臓塞栓性または心臓塞栓性ＴＩＡ／脳卒中の治療のための血栓溶解剤または抗凝固剤として使用することができる。
【００５３】
心臓塞栓性ＴＩＡ／脳卒中の発生機序は心臓供給源からのデブリでの脳血管の閉塞である。塞栓は血小板凝集物、血栓、血小板血栓、コレステロール、カルシウムまたは細菌からなり得る。たいていの塞栓性デブリは血小板凝集物を含有する。しかしながら心臓塞栓の発達に寄与する単一のメカニズムはない。具体的な基礎心臓疾患が病態生理学および自然経過を決定し、そして故に各心臓塞栓供給源は別個に考慮されなければならない。毎年心臓塞栓性塞栓症は虚血性脳卒中のおよそ２０％を占める。一般的に心臓塞栓性脳卒中はその他の虚血性脳卒中サブタイプよりも予後が悪く、そしてより大きい、およびより障害を引き起こしやすい脳卒中を生じる。この一般的な観察は平均して大きなサイズ（例えば心耳、心室性血栓）である、心室を起源とする多血小板塞栓に由来する。心臓塞栓性ＴＩＡ／脳卒中に関して強力な血小板アクチベーターであり、そして血小板血栓の惹起ならびに後期血小板血栓成長および／または安定性において重要な役割を果たすトロンビンをトロンボモジュリンが直接的および間接的に（プロテインＣを介して）阻止するので、それは有望な治療選択肢を表し得る。
【００５４】
２０を超える具体的な障害が脳塞栓症に至ることと結び付けられている。塞栓の心臓供給源を大および小リスクカテゴリーに分けることは臨床的に有用である。大リスク供給源は初期および再発性脳卒中の相対的に高いリスクを担持する。大リスク心臓塞栓供給源が存在する場合、脳卒中の一次予防の努力が示され、それはまたトロンボモジュリン療法のための患者を査定する。
【００５５】
高リスク心臓供給源には、限定するものではないがリウマチ性僧帽弁狭窄症、人工弁、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性（衰弱性）心内膜炎、虚血性心臓疾患、急性心筋梗塞、左心室無動症もしくは動脈瘤、非虚血性心筋症（例えば特発性拡張、ウイルス性心筋炎随伴、エキノコックス、周産期、アミロイド随伴、過好酸球増加症候群随伴、リウマチ性心筋症随伴、サルコイドーシス関連、神経筋障害随伴、カテコラミン誘発、ドキソルビシン誘発、ミトキサントロン関連、クラックコカイン関連、心臓シュウ酸症随伴）、心房細動、心房粗動、心房粘液腫または洞機能不全症候群（いわゆる短速（ｂｒａｃｈｙ−ｔａｃｈｙ）症候群）が含まれる。
【００５６】
本発明の好ましい態様では、血栓イベントのリスクが増大した患者においてトロンボモジュリンを使用する。この高まったリスクは限定するものではないが、脳卒中、糖尿病、心筋梗塞、不安定狭心症、心房細動、腎損傷、肺塞栓症、深部静脈血栓症ならびに器官および補てつ移植片を含む基礎疾患の結果でよい。その他のリスク因子は低血圧、高コレステロール血症、高脂質血症、喫煙、アルコール摂取、肥満および低い身体活動性である。リスクは年齢、血圧、微小塞栓およびバイオマーカーのような臨床因子の結果であり得る。臨床因子を使用して診断スコアを確立することができる。ＴＮＡおよび限局的病徴（一過性虚血性発作：ＴＩＡのほうがよく知られている）を有する患者に関するさらなる血栓イベントのリスクを予測するために、ＡＢＣＤスコア（Ｒｏｔｈｗｅｌｌら、「Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｓｃｏｒｅ  （ＡＢＣＤ）  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｅａｒｌｙ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｓｔｒｏｋｅ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｉｓｃｈａｅｍｉｃ  ａｔｔａｃｋ」Ｌａｎｃｅｔ  ２００５  ３６６：２９−３６，）またはＡＢＣＤ２スコア（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、「Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｃｏｒｅｓ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｖｅｒｙ  ｅａｒｌｙ  ｓｔｒｏｋｅ  ｒｉｓｋ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｉｓｃｈａｅｍｉｃ  ａｔｔａｃｋ」Ｌａｎｃｅｔ  ２００７，３６９：２８３−９２）のような最近開発されたいくつかの診断手順がある。
【００５７】
ＡＢＣＤ２スコアは続発性血栓イベントの可能性を予測することができ、そして：
年齢≧６０歳＝１ポイント
診察時に血圧≧１４０／９０ｍｍＨｇ＝１ポイント
臨床徴候：
片側性の衰弱＝２ポイント
衰弱を伴わない言語障害＝１ポイント
発作の持続時間：
≧６０分＝２ポイント
１０−５９分＝１ポイント
糖尿病＝１ポイント
として計算される。
【００５８】
全スコアは０から７の範囲に入る。血栓イベントに関するリスクは、スコア０−３に関しては低く、スコア４−５に関しては中度であり、そしてスコア６−７に関しては高い。本発明によれば１つの実施態様においてＡＢＣＤ２が３以上、とりわけ少なくとも４、さらに好ましくは少なくとも６の患者をトロンボモジュリンで治療する。
【００５９】
加えて患者の遺伝的素因（例えば第Ｖ因子ライデン、以下の遺伝子における変異または多型：シスタチンＣ、４型コラーゲンアルファ−１、プロトロンビン、ホスホジエステラーゼ４Ｄ、ＡＣＥ、インターロイキン１−受容体アンタゴニスト、インターロイキン−６、５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＦＬＡＰ）、アラキドン酸５−リポキシゲナーゼ（Ａｌｏｘ−５）、ｔｏｌｌ様受容体−４、マンノース結合レクチン）、薬物療法（例えば避妊薬）の使用またはアテローム性動脈硬化、脈管炎および動脈瘤を含む脈管構造の病理学的変化に基づいて血栓リスクを評価できる。
【００６０】
さらなる実施態様では、トロンボモジュリンをいわゆるラクナ脳卒中の治療のために使用する。ラクナ脳卒中は深部貫通動脈（直径０．２−１５ｍｍ）の領域の領域における小型の皮質下梗塞（直径＞１５ｍｍｍ）として定義される。ラクナは大脳基底核および内包、視床、放射冠ならびに脳橋において最も頻繁に生じる。病徴はしばしば変動性（例えばカプセルワーニング症候群（ｃａｐｓｕｌａｒ  ｗａｒｎｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ））または進行性のいずれかの様式で生じる。疾患のこの経過を呈する患者はしばしば診断が遅すぎて、ｒ−ｔＰＡでの血栓溶解療法を受けることができない。今度はこれらの患者はトロンボモジュリンを使用する血栓溶解療法に関して査定される。加えてラクナ脳卒中を有する患者はしばしば早期の実質的な改善を示し、そして故にトロンボモジュリンを抗凝固剤として使用して続発性の血栓イベントを予防することができる。
【００６１】
本発明の別の実施態様では、トロンボモジュリンを抗凝固剤または血栓溶解剤として使用して癌誘発または関連の血栓症のリスクを有するかまたはそれを被る癌患者における再閉塞を予防するかまたは再灌流を誘発することができる。それ故にトロンボモジュリンをトルソー症候群の予防および／または治療のために使用することができる。トロンボモジュリンのこの使用はとりわけ血栓リスクが増大した癌患者、例えば肺、乳房、結腸直腸および前立腺癌ならびに悪性脳腫瘍および卵巣、膵臓、結腸、胃、肺および腎臓を含む腺癌に適用される。癌患者における血栓イベントに関するリスク因子には非移動性、中心静脈アクセス装置の使用、ホルモン療法、化学療法および外科的手術が含まれる。
【００６２】
計り知れない脳内出血のリスクがあり、それは血栓溶解剤の投与後に強調すらされるので、現在抗凝固剤で再閉塞を予防するための抗凝固剤療法は承認されていないことは当業者には公知である。本発明の１つの実施態様による新規の教示はこのように虚血患者（とりわけ脳卒中患者）にトロンボモジュリンを投与できることであり、トロンボモジュリンで未治療の患者に比較して有害な影響、とりわけ出血の実質的なリスクが少ないかまたはない。故にたとえ患者が以前に脳卒中を被っており、そして／または血栓溶解療法を受けていたとしても、本発明の１つの実施態様にしたがって患者を可溶性トロンボモジュリンでの抗凝固療法に供することができる。研究により可溶性トロンボモジュリンのレベルの増大と脳卒中を有する患者における死亡のリスクの増大との間の関連性が報告されたので、以前の血栓もしくは虚血イベントの可能性または血栓溶解療法に関わらないトロンボモジュリンの有利な影響は当業者に予想外であった（Ｏｌｉｖｏｔ  ＪＭら、「Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」Ｓｔｒｏｋｅ  ２００４，３５：１９４６−１９５１）。
【００６３】
本発明のなお別の態様では、虚血イベントの急性または早期相内にトロンボモジュリンを患者に投与する。特定の実施態様では、血栓溶解物質、例えばｔＰＡまたは任意のその他のプラスミノーゲン活性化因子の投与後最初の２４時間の時間窓で投与を適用する。この場合、トロンボモジュリンを好ましくは抗凝固剤として投与する。
【００６４】
本発明のさらなる実施態様では、虚血イベントの発症後３時間以内に抗凝固のためにトロンボモジュリンを投与する。
【００６５】
本発明のなお別の態様によれば、例えば当業者に公知のＡＰＴＴまたはＰＴＴアッセイにより測定されるような血液凝固パラメータを実質的に増大しない投薬量でトロンボモジュリンを患者に投与する。ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）またはＰＴＴ（部分トロンボプラスチン時間）は各々の固有の、および共通の凝固経路の有効性の指標であるアッセイである。凝血における異常の検出は別として、それをまた抗凝固剤の治療効果をモニタリングするためにも使用する。
【００６６】
本発明の別の実施態様によれば、凝固時間の延長に関連しないトロンボモジュリンの投薬量を患者に投与する。健常ヒトのＡＰＴＴ値は正常にはほぼ２５秒と３９秒の間にある。この範囲外の値は一般的には異常と考えられる。本発明のこの態様によれば、適用された投薬量は実質的にはＡＰＴＴを延長しないが、例えばマウスの中大脳動脈の光血栓閉塞のアッセイにおいて測定されるように、脈管閉塞を効果的に予防する。
【００６７】
本発明によるトロンボモジュリンの好ましい投薬量はおよそ０．０１から５ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０３から３ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは０．０３から１．５ｍｇ／ｋｇ体重または０．０５から１．０ｍｇ／ｋｇ体重である。このように本発明によれば、バイアルまたはアンプルのような可能な投薬単位形態はほぼ０．８から４００ｍｇ、好ましくは２．４から２４０ｍｇ、最も好ましくは０．８から１２００ｍｇまたは４から８０ｍｇ（ほぼ６５ｋｇ体重の患者と仮定）を含有すると示唆される。
【００６８】
本発明の別の実施態様では、脳卒中を治療し、凝固および再閉塞を予防するか、または血栓溶解療法のためのトロンボモジュリン、とりわけＳｏｌｕｌｉｎの用量範囲は患者あたりおよそ０．５（とりわけ０．６）からおよそ３０ｍｇであり、そして最も好ましい用量範囲は患者あたり１から１０ｍｇ、最も好ましくは３から１０ｍｇである。このように本発明によればトロンボモジュリンの固定用量を伴う使用準備済みの医薬組成物が提供される。
【００６９】
トロンボモジュリン、とりわけＳｏｌｕｌｉｎは好ましくは非経口的に、例えば静脈内適用により与えられる。静脈内ボーラス適用が可能である。このように本発明によればトロンボモジュリン、とりわけＳｏｌｕｌｉｎを１−３０ｍｇまたはそれより多い範囲の用量で、好ましくは１、２、２．５、３、４、５、６、７、７．５、８、９または１０ｍｇの固定用量のトロンボモジュリン、とりわけＳｏｌｕｌｉｎを含有する医薬組成物が提供される。
【００７０】
本発明によれば、単回用量もしくは多回用量またはその組み合わせのいずれかでトロンボモジュリンを投与することができる。体重調整された、または固定用量のいずれかの前記のような用量を使用することができる。
【００７１】
単回用量群および多回用量群により、トロンボモジュリン（とりわけＳｏｌｕｌｉｎ）の投与はボランティア内でトロンボモジュリンに対する抗体生成を招かなかったことが示された。故にトロンボモジュリン、とりわけＳｏｌｕｌｉｎの多回用量でさえ長期間続く、すなわち数週間、数か月または数年にわたる投与が可能である。このように本発明によればトロンボモジュリン長期療法が可能である。加えて、この免疫原性の欠如により、患者は寿命トロンボモジュリン（とりわけＳｏｌｕｌｉｎ）での療法以上のものを受けることが可能になる。
【００７２】
本発明のこれらの実施態様は前記されたＳＯＬＩＤ−Ｉ研究の結果に基づく。この研究ではトロンボモジュリン（Ｓｏｌｕｌｉｎ）０．６、１．０、３．０、１０．０および３０ｍｇの漸増単回用量をボーラスとしてボランティア５群に投与した。この単回用量パートでは、ａＰＴＴ、プロトロンビン比、プロトロンビン時間測定値およびＰＦＡ１００出血アッセイから明白であるように、Ｓｏｌｕｌｉｎは出血傾向の増大を引き起こさなかった。有害事象はわずかだけで、そして軽微であったという観察を伴うこの事実により、Ｓｏｌｕｌｉｎは非常に安全な薬物であることが確認された。単回用量パートでの最低用量と最高用量の間のファクター５０により、前臨床研究において既に認められた物質の良好な耐容性が確認される（表１および図８参照）。
【００７３】
研究のこのパートでは、Ｓｏｌｕｌｉｎは用量依存的な様式で９８％までトロンビン形成を阻止し、それにより１ｍｇ／ボランティアの用量が５０％阻止に至った（図１１）。
【００７４】
研究の多回用量パートでは、Ｓｏｌｕｌｉｎを１日１回５日にわたって投与した。このように本発明によればトロンボモジュリンの多回用量を可能にするのに適当である医薬組成物が提供される。多回用量パートでは、ａＰＴＴ、プロトロンビン比、プロトロンビン時間測定値およびＰＦＡ１００出血アッセイから明白であるように、Ｓｏｌｕｌｉｎは出血傾向の増大を引き起こさなかった。この知見によりＳｏｌｕｌｉｎが安全な抗血栓薬であることがさらに確認される。
【００７５】
さらにＳｏｌｕｌｉｎは用量依存的な様式で９３％までトロンビン形成を阻止することが示された（図１２）。このトロンビン作成阻止の範囲は単回用量適用の結果に相関する。このようにこれらの２つの投薬計画を組み合わせて、例えば単回用量で開始し、そしてその後、好ましくはより短期の間隔での多回用量計画で終えるか、またはその逆を行うことができる。
【００７６】
加えて、将来の療法適用において毎日治療よりも長い間隔を可能にする長い血漿排出半減期（１５から３０時間）が観察された。長い血漿排出半減期を伴う多回用量群の結果により１日間と８日間の間、さらに好ましくは２日間と７日間の間、そして最も好ましくは３日間と６日間の間の適用間隔が教示される。
【００７７】
全ての用量群の分析により、Ｓｏｌｕｌｉｎは線形薬物動態を呈することが示され、それはＳｏｌｕｌｉｎの代謝において個体相互の差異が少ないことを実証した。線形薬物動態および広い治療濃度域に基づいて、固定用量の適用が体重用量適用よりもさらに好ましく、それは医師および患者にとってより都合がよく、そして過剰または過少投薬のリスクを有意に低減する。このように本発明によればトロンボモジュリンの固定用量を伴う使用準備済みの医薬組成物が提供される。
【００７８】
トロンビン阻止の阻止に関して観察されたＳｏｌｕｌｉｎ効果の優れた用量依存性により、診断結果（例えば凝固パラメータ）またはその他の臨床観察に基づいて患者の用量が容易に調整される可能性が教示される。
【００７９】
任意の可溶性トロンボモジュリンで本発明による方法を実施することができる。本発明の局面ではトロンボモジュリンは、トロンビンとの機能的複合体を形成する能力に関して天然のトロンボモジュリンの生物学的活性を実質的に示すトロンボモジュリン修飾体、その類似体、変異体、フラグメントおよび誘導体を含む任意のタンパク質（本明細書では全て一般的にトロンボモジュリンと称する）として定義される。本発明によればトロンビンとの「機能的複合体」はプロテインＣ／タンパク質Ｓ経路を活性化する任意の複合体である。
【００８０】
可溶性トロンボモジュリンの種々の形態、例えばＡｓａｈｉ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（東京、日本）により開発されたいわゆるＡＲＴ−１２３またはＰＡＩＯＮ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，Ａａｃｈｅｎ（ドイツ）により現在開発中の組換え可溶性ヒトトロンボモジュリンＳｏｌｕｌｉｎは当業者に公知である。組換え可溶性トロンボモジュリン、すなわちアミノ酸配列の修飾を伴わない可溶性トロンボモジュリンはＡｓａｈｉの特許、欧州特許第０３１２５９８号の対象である。
【００８１】
Ｓｏｌｕｌｉｎはヒトトロンボモジュリンの可溶性の、ならびにプロテアーゼおよび酸化抵抗性の類似体であり、そして故にインビボで長時間有効である。Ｓｏｌｕｌｉｎはトロンビンを独占的に阻止するのではないので、その主要な特色はその広い作用のメカニズムにある。それはまた自然のプロテインＣ／プロテインＳ経路を活性化し、そしてそれ故にトロンビンのさらなる作成を停止させる。さらにＳｏｌｕｌｉｎのトロンビンに対する結合は後者をそのプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）の活性化から予防するので、Ｓｏｌｕｌｉｎは神経保護効果を奏する（例えば欧州特許第１３６５７８８号参照）。ＰＡＲ受容体の阻止は今度はアポトーシス細胞死を遮断する。
【００８２】
Ｓｏｌｕｌｉｎはとりわけ欧州特許第０６４１２１５（Ｂ１）号、欧州特許第０５４４８２６（Ｂ１）号および欧州特許第０５２７８２１（Ｂ１）号の対象である。本発明の１つの実施態様に従ってＳｏｌｕｌｉｎを患者に投与する。Ｓｏｌｕｌｉｎは天然のヒトトロンボモジュリン（配列番号：１）と比較して、以下の位置で修飾を含有する：Ｇ−３Ｖ、アミノ酸１−３の除去、Ｍ３８８Ｌ、Ｒ４５６Ｇ、Ｈ４５７Ｑ、Ｓ４７４ＡおよびＰ４９０で終止。このナンバリングシステムは配列番号：１の天然のトロンボモジュリンに従う。本発明の好ましい実施態様としてのＳｏｌｕｌｉｎの配列を配列番号：２に示す。
【００８３】
しかしながら注目すべきことには、本発明に従って前記された特性または前記された欧州特許文書、欧州特許第０５４４８２６（Ｂ１）号、欧州特許第０６４１２１５（Ｂ１）号および欧州特許第０５２７８２１（Ｂ１）号にて概要を記された特性の１つのみ、またはそれより多くを含んでなるトロンボモジュリン類似体もまた利用することができる。
【００８４】
本発明に従って適用可能な特に好ましいトロンボモジュリン変異体は１つ以上の次の特徴を有するものである：
（ｉ）それらは酸化抵抗性である；
（ｉｉ）それらはプロテアーゼ抵抗性を呈する；
（ｉｉｉ）それらは同種のＮ−またはＣ−末端を有する；
（ｉｖ）それらは例えば天然のトロンボモジュリン（配列番号：１）のグリコシル化部位の少なくともいくつかのグリコシル化により翻訳後修飾されている；
（ｖ）それらは線形二重逆数トロンビン結合特性を有する；
（ｖｉ）それらは相対的に少量の界面活性剤中で水溶液に可溶性であり、そして典型的には膜貫通配列を欠如する；
（ｖｉｉ）それらはグリコサミノグリカン鎖を欠如する。
【００８５】
本発明において使用されるためのこれらの類似体の製造は前記された欧州特許文献にて開示される。
【００８６】
最も好ましいのは、例えばＳｏｌｕｌｉｎにより示されるようなこれらの修飾の全てを含んでなる分子である。
【００８７】
本発明のさらなる実施態様では、第ＷＯ０１／９８３５２（Ａ２）号または米国特許第６６３２７９１号から公知のトロンボモジュリン類似体を使用することができる。本発明の別の実施態様ではウサギから誘導されたトロンボモジュリンを使用することができる。Ｓｏｌｕｌｉｎの６ＥＧＦフラグメントは、ヒトプロテインＣを活性化する能力を伴うトロンビンとの複合体の形成に関して本質的に同じ生物学的活性を伴うトロンボモジュリンフラグメントの実例である。このフラグメントは本質的には天然のトロンボモジュリンの６つの上皮成長因子ドメインからなる。
【実施例】
【００８８】
実施例１
虚血性脳卒中の光血栓モデル：動脈閉塞の前にトロンボモジュリンを添加
中大脳動脈の光血栓閉塞のモデルを使用して可溶性トロンボモジュリン（Ｓｏｌｕｌｉｎ）が血栓症を妨害する能力を試験した。中大脳動脈の閉塞の前に薬物を添加した。
【００８９】
１．試験系
雄マウスＣ５７ＢＬ／６系統で研究を行った。割り付け時の動物の平均体重は２６ｇであった。動物の年齢はおよそ１０週齢であった。
【００９０】
２．実験手順
脳卒中モデル
抱水クロラール（Ｍｏｒｔｏｎ  Ｇｒｏｖｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、モートングローブ、イリノイ州）９０ｍｇ／ｋｇ腹腔内でマウスを麻酔し、そして次に解剖顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＳＭＺ−２Ｔ、Ｍａｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）下に確実に配置した。左中大脳動脈（ＭＣＡ）を暴露した後、ＭＣＡの二分枝から１．５ｍｍ背側正中に位置する大脳皮質を覆う暴露された頭蓋の表面にレーザードップラーフロープローブ（Ｎ型（１８ゲージ）、Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を取り付けた。プローブをフローメータ（トランソニックモデルＢＬＦ２１）に連結し、そして連続データ収集プログラムを使用して記録を行った（Ｗｉｎｄａｑ、ＤＡＴＡＱ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。１．５ｍＷ緑色光レーザー（５４０ｎｍ、Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ）を６ｃｍの距離からＭＣＡに向け、そして次にＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌに希釈したローズベンガル（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を最終用量５０ｍｇ／ｋｇで尾静脈に注射した。次いで閉塞後レーザーを１０分間続けた。大脳皮質の組織灌流率をレーザードップラーフローメータで連続的にモニタリングし、そしておよそ２−３時間記録した。組織灌流率がその元来の値の７０％以上まで低減された場合、安定した閉塞が達成された。
【００９１】
研究処置および観察
レーザー照射による血栓形成の誘発の３０分前に、ラットにＳｏｌｕｌｉｎ（１または３ｍｇ／ｋｇ）または等容量のビヒクル（１００μｌ／ｋｇ）のボーラス注射を投与した。血栓形成までの時間をレーザードップラー測定により評価した。レーザー測定をＳｏｌｕｌｉｎまたはビヒクルの注射後少なくとも１５０分間続けた。Ｓｏｌｕｌｉｎまたはビヒクル投与のおよそ２時間後、生存動物を屠殺することにより実験を終止した。
【００９２】
データ分析
ＤＡＴＡＱ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｗｉｎ  ＤＡＱ  Ｓｅｒｉａｌ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎを使用して組織灌流単位（ＴＰＵ）を記録した。
【００９３】
閉塞時間
閉塞に必要とされた時間をベンガルレッドの注射と安定した閉塞の間の時間として計算した。７０％またはそれより高い血流の低減が５分間蔓延した場合、後者と見なされた。波形から時間を直接読み取り、そして数値形式に変換した。
【００９４】
血流の決定
血流データを圧縮し（秒あたり約２０ポイント）、そしてＣＳＶファイルとして保存した。生データをグラフ化し、そして異常点を削除した。流れのデータをローズベンガル注射の１０分前から注射までの平均ＴＰＵ値を用いるパーセンテージに正規化した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してローズベンガル注射から１２０分までの正規化された流れから曲線下面積を計算した。血流データが技術的な理由または動物の死亡のために利用不可能になった場合、その時点からゼロの値を取った。
【００９５】
統計
両側ｔ検定を使用して有意性を決定した。各試験測定に関して、ｐ＜０．０５の確立値を統計的に有意であると考えた。
【００９６】
３．結果
安全性
全部で３５匹のマウスを使用した。ベンガルレッドはそれだけで動物へのかなりのストレスを保有し、３匹の動物に致死を引き起こし、中大脳動脈閉塞が得られる前に死亡した（対照で２／１４、低Ｓｏｌｕｌｉｎ用量群で０／１０および高Ｓｏｌｕｌｉｎ用量群で１／１１）。これらのマウスは評価に考慮されなかった。
【００９７】
Ｓｏｌｕｌｉｎは一般的にいずれの用量レベルでも耐容性が良好であった。対照ならびに低および高用量Ｓｏｌｕｌｉｎ群における動脈閉塞後の致死率は各々０／１２、０／１０および１／１０動物であった。
【００９８】
中大脳動脈における血流の時間経過
中大脳動脈における血流の時間経過を図１−３に示す。ローズベンガル注射の１０分前から注射までの平均ＴＰＵ値に基づくパーセンテージに正規化した後の波形を示す。血流の低下により示されるような閉塞までの時間は対照マウスと比較してＳｏｌｕｌｉｎ処置動物において延長された。さらに目覚ましいのは、閉塞は対照実験において安定なままであったが（１つの技術的な混乱を除いて、図１に対する凡例を参照）、たいていのＳｏｌｕｌｉｎ処置動物では一過性であった（１および３ｍｇ／ｋｇ  Ｓｏｌｕｌｉｎで各々４／１０および６／１０動物）。
【００９９】
閉塞までの時間
図４は閉塞に必要とされる時間を要約する。いずれかの用量のＳｏｌｕｌｉｎは対照と比較して閉塞までの時間を有意に延長した。（１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ対対照のＰ値は各々０．０１および０．００５である。群あたり１０−１２匹の動物の平均±ＳＥＭを示す）。
【０１００】
血流（再灌流）
ローズベンガル注射から１２０分までの経時的な血流対時間チャートのＡＵＣの決定により血流（再灌流）を定量化した（図５）。２つのＳｏｌｕｌｉｎ濃度で得られたＡＵＣはビヒクル処置マウスよりも有意に大きく；また３ｍｇ／ｋｇでのＡＵＣは１ｍｇ／ｋｇでのものを有意に超えた。Ｓｏｌｕｌｉｎ高用量群では動物のうちの１匹は極めて高レベルの再灌流を発達させ、その後低下した。しかしながらその動物を伴う、および伴わないＡＵＣは各々相対単位４５６２３および３８４７４になり、それは対照群および１ｍｇ／ｋｇの用量での値から依然有意に異なったので、この動物を評価から排除し、データおよび結果は影響力を受けなかった。
【０１０１】
凡例
図１
対照における中大脳動脈の下流の組織灌流
ビヒクルの注射後３０分にローズベンガルを尾静脈に注射して（ダイアグラムでは０時）、レーザー照射部位で血栓形成および続発性閉塞を誘発した。動物５および６はローズベンガル注射後直ぐに死亡し、そしてこのデータ分析に含めなかった。１匹の動物の波形における一時的な増大は不十分な麻酔に関係して、レーザーフロープローブに相対して動物の動きを招いたかもしれない。しかしながらこの一時的な増大はその原因に関わらず、それでも分析には含めた。
【０１０２】
図２
１ｍｇ／ｋｇの用量でのＳｏｌｕｌｉｎの注射後のマウス中大脳動脈の下流の組織灌流
Ｓｏｌｕｌｉｎの注射後３０分にローズベンガルを尾静脈に注射して（ダイアグラムでは０時）、レーザー照射部位で血栓形成および続発性閉塞を誘発した。
【０１０３】
図３
Ｓｏｌｕｌｉｎ  ３ｍｇ／ｋｇの注射後のマウス中大脳動脈の下流の組織灌流
Ｓｏｌｕｌｉｎの注射後３０分にローズベンガルを尾静脈に注射して（ダイアグラムでは０時）、レーザー照射部位で血栓形成および続発性閉塞を誘発した。動物３はローズベンガル注射後直ぐに死亡し、そして分析に含めなかった。１００％を超えて血流の増大を表した動物６はローズベンガル注射後８５分に死亡した。
【０１０４】
図４
ビヒクルまたはＳｏｌｕｌｉｎの存在下での閉塞に必要とされる時間
単一のアステリスクにより指定されたいずれかの濃度で対照とＳｏｌｕｌｉｎとの間の差異は有意であった。１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ対対照のＰ値は各々０．０１０および０．００５である。群あたり１０−１２匹の動物の平均±ＳＥＭを示す。
【０１０５】
図５
ローズベンガル注射からその後１２０分までの血流時間チャートの曲線下面積
いずれかのＳｏｌｕｌｉｎ濃度でＳｏｌｕｌｉｎと対照との間の差異は有意であり、そしてＳｏｌｕｌｉｎ用量１ｍｇ／ｋｇと３ｍｇ／ｋｇの間の差異も有意であった。１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ対対照のＰ値は各々０．０４３および０．００１であった。１ｍｇ／ｋｇ対３ｍｇ／ｋｇのＰ値は０．０４０であった。１２０分の観察間隔あたりの血流時間チャートの曲線下面積を表す相対単位でデータを表す。群あたり９−１２匹の動物の平均±ＳＥＭを示す。
【０１０６】
実施例２
虚血性脳卒中の光血栓モデル：動脈閉塞後にトロンボモジュリンを添加
中大脳動脈の光血栓閉塞のモデルを使用して可溶性トロンボモジュリン（Ｓｏｌｕｌｉｎ）が血栓症を妨害する能力を試験した。中大脳動脈の閉塞後に薬物を添加した。
【０１０７】
１．試験系
マウスＣ５７ＢＬ／６系統で研究を行った。動物の年齢は試験の開始時におよそ１２週齢であった。
【０１０８】
２．実験手順
脳卒中モデル
抱水クロラール（Ｍｏｒｔｏｎ  Ｇｒｏｖｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、モートングローブ、イリノイ州）９０ｍｇ／ｋｇ腹腔内でマウスを麻酔し、そして次に解剖顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＳＭＺ−２Ｔ、Ｍａｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）下に確実に配置した。左中大脳動脈（ＭＣＡ）を暴露した後、ＭＣＡの二分枝から１．５ｍｍ背側正中に位置する大脳皮質を覆う暴露された頭蓋の表面にレーザードップラーフロープローブ（Ｎ型（１８ゲージ）、Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を取り付けた。プローブをフローメータ（トランソニックモデルＢＬＦ２１）に連結し、そして連続データ収集プログラムで記録をした（Ｗｉｎｄａｑ、ＤＡＴＡＱ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。１．５ｍＷ緑色光レーザー（５４０ｎｍ、Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ）を６ｃｍの距離からＭＣＡに向け、そして次にＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬに希釈したローズベンガル（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を最終用量５０ｍｇ／ｋｇで尾静脈に注射した。次いで閉塞後レーザーを１０分間続けた。大脳皮質の組織灌流率をレーザードップラーフローメータで連続的にモニタリングし、そしておよそ２−３時間記録した。組織灌流率がその元来の値の７０％までまたはそれを超えて低減された場合、安定した閉塞が達成された。３０分間のＭＣＡの安定した閉塞が得られた後、被験物質での処置を開始し、そして脳血流（ＣＢＦ）を２時間まで連続的に測定した。脳卒中誘発後７２時間に再閉塞に関する最終ＣＢＦ評価を実施した後に動物を屠殺した。
【０１０９】
被験および対照物質の投与
安定したＭＣＡ閉塞を検証した（虚血性脳卒中）後３０分に尾静脈を介してＳｏｌｕｌｉｎ（１００μｌ）のボーラス注射を投与した。脳卒中後、さらなるＳｏｌｕｌｉｎ注射を２４時間間隔で全部で３回まで実施した。脳卒中後７２時間に動物を安楽死させた。
【０１１０】
梗塞領域においてレーザードップラーフロープローブセットにより凝血塊の溶解の成功を検証した。対照およびＳｏｌｕｌｉｎ動物において血流を決定した。
【０１１１】
実験群および用量レベル
以下の表は実験群および投薬量を要約する：
【０１１２】
【化１】
2010532776.tif 000002
以下は前記されたＳｏｌｕｌｉｎおよび対照群の適用スケジュールをチャート化する：
【０１１３】
【化２】
2010532776.tif 000003
結果の統計分析
データの評価において使用した統計手順は以下のとおりである：
全てのデータを処置群間のＡＮＯＶＡ（平均の分散分析）により分析した。ｐ＜０．０５は統計的に有意と考えられた。
【０１１４】
図６
脳血流（ＣＢＦ；ローズベンガル注射前の１０分間の参照期間の％）のＡＵＣを示し、２時間追跡した（安定した閉塞の時間＝０；血流を２時間追跡；Ｓｏｌｕｌｉｎ  １ｍｇ／ｋｇ）。
【０１１５】
図７
脳卒中後７２時間でのＣＢＦを示す。（Ｓｏｌｕｌｉｎ  １ｍｇ／ｋｇ；２日目および３日目にさらなる用量）。
【０１１６】
実施例３
ラットのうっ滞モデルにおける静脈血栓症の阻止
Ｓｏｌｕｌｉｎ用量の急性抗血栓効果をトロンボプラスチン誘発の静脈うっ滞のラットモデルにおいて２つの比較物質：活性型プロテインＣ（ＡＰＣ）（市販の薬物Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標）（Ｄｒｏｔｒｅｃｏｇｉｎアルファ活性型）を使用）および低分子量ヘパリン、Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ；と共に研究した。
【０１１７】
１．試験系および実験手順
麻酔した雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて大静脈を準備し、そして左腎および腸骨静脈の間で大静脈に２つの緩い結紮を作成した。Ｓｏｌｕｌｉｎ、Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎまたはビヒクル（０．９％  ＮａＣｌ）の静脈内投与の３０分後に２５０μｇ／ｋｇトロンボプラスチンを静脈内注射した。ＡＰＣの静脈内適用の５分後にトロンボプラスチンを適用した。各々の場合で注射容量は５ｍｌ／ｋｇであった。
【０１１８】
トロンボプラスチン注射終了後３０秒に縫合をきつく締めることによりうっ滞を確立した。３０分の期間の後、形成された血栓をその区域から除去し、１−４のスケール（０＝流動性血液、１＝１個または数個の小型凝血塊、２＝脈管区域の５０％を充填する非閉塞性血栓、３＝脈管区域の７５％を充填する非閉塞性血栓、４＝閉塞区域を意味するＷｅｓｓｌｅｒ技術による）でスコア化し、ろ紙にブロットし、そして即座に（湿重量）、および３７℃で２４時間乾燥後（乾燥重量）重量測定した。平均血栓重量における３０％もしくはそれを超える低下またはビヒクル処置群に相対するＷｅｓｓｌｅｒスコアは抗血栓活性の指標と考えられた。
【０１１９】
２．結果
表１および図８から明白であるように（凝血塊形成の拮抗作用（インビボで結紮されたラット大静脈、トロンンボプラスチン誘発））、Ｓｏｌｕｌｉｎは血栓サイズおよび重量を用量依存的に低減し、３ｍｇ／ｋｇの高用量でいかなる血栓形成をも抑止した。効果は０．１ｍｇ／ｋｇから有意に始まっていた。対照的にＡＰＣは試験された高用量（２ｍｇ／ｋｇ）においてのみ有意な抗血栓活性（血栓重量における約５０％低減およびＷｅｓｓｌｅｒスコア）を示し、大きさはＳｏｌｕｌｉｎ  ０．３ｍｇ／ｋｇのものに匹敵した。安全性の考察において要約されるように、ＡＰＣのみがこの有効性レベルでＡＰＴＴおよび出血時間のかなりの延長に関連した。Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎは試験された双方の投薬量で血栓形成を抑制した。これらの効果はまたＡＰＴＴおよび出血時間の実質的な延長に関連した。
【０１２０】
表１：ラットの静脈うっ滞モデルにおけるＳｏｌｕｌｉｎ、ＡＰＣ、Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎまたはビヒクル投与後の血栓重量およびＷｅｓｓｌｅｒスコア
【０１２１】
【表１】
2010532776.tif 000004
＊一方向ＡＮＯＶＡ、続くダネット検定によりｐ＜０．０５；低減％は値をビヒクル群と比較する；データは群あたり１０匹の動物の平均値±ＳＥＭを表す。
【０１２２】
実施例４
ラットにおける尾切断出血時間に及ぼす影響
活性型プロテインＣ（ＡＰＣ；市販の薬物Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標）（Ｄｒｏｔｒｅｃｏｇｉｎアルファ活性型）を使用）およびＥｎｏｘａｐａｒｉｎと比較した尾切断出血時間に及ぼすＳｏｌｕｌｉｎの影響をラットにおいて分析した。
【０１２３】
１．試験系および実験手順
用量および適用計画は有効性研究（静脈血栓のラットうっ滞モデル、実施例３参照）と同一であった。
【０１２４】
Ｓｏｌｕｌｉｎ、Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎまたはビヒクルを麻酔した雄および雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに静脈内注射し、３０分後に、尾の先端（３ｍｍ）を統一して切断した。尾先端の切断の５分前にＡＰＣを静脈内投与した。観察期間の間、全てのラットを麻酔したままにした。３７℃で予め加温した生理食塩水中で、試験管への垂直方向の尾の浸漬と少なくとも１５秒間の出血停止との間の時間の長さにより水中出血時間を決定した。何らかの再出血の発生をその後２０分まで注目した。動物のビヒクル対照群に相対して５０％以上の出血時間の延長は有意と考えられた。
【０１２５】
２．結果
結果を表２に要約し、そして図９に示す（ラットにおける出血時間）。Ｓｏｌｕｌｉｎは双方の性別において３ｍｇ／ｋｇの高用量でのみ出血時間を有意に延長した。この効果は雄よりも雌においてさらに顕著であった。Ｓｏｌｕｌｉｎ処置された雄における再出血の発生は対照に類似して２０％と４０％の間の範囲であった。Ｓｏｌｕｌｉｎ群の雌では、再出血の率はわずかに上昇した（６０％まで）が、用量依存性は全く欠如した。
【０１２６】
ＡＰＣは雄において０．５ｍｇ／ｋｇで、および双方の性において２ｍｇ／ｋｇで出血時間を有意に延ばした。０．５ｍｇ／ｋｇ用量の投与後、再出血は対照に匹敵したままであった（２０−４０％）が、２ｍｇ／ｋｇ群では雄において６０％まで、および雌において８０％まで増大した。
【０１２７】
Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎは雌において３ｍｇ／ｋｇで、そして最大には、すなわち観察期間の最後まで雄および雌において３０ｍｇ／ｋｇで出血時間を有意に延長した。３ｍｇ／ｋｇ  Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ群の雄では、再出血の発生は対照と均等であった。しかしながら再出血は同じ用量を投与されている雌の８０％で明白であった。出血時間は双方の性別で３０ｍｇ／ｋｇ  Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎにより最大に延長されたので、再出血の率は評価できなかった。
【０１２８】
表２：ＡＰＣおよびＥｎｏｘａｐａｒｉｎと比較したラットにおける尾切断出血時間に及ぼす種々用量のＳｏｌｕｌｉｎの影響
【０１２９】
【表２】
2010532776.tif 000005
＊一方向ＡＮＯＶＡ、続くダネット検定によりｐ＜０．０５；低減％は値を各々のビヒクル群と比較する；データは各々雄５匹および雌５匹の平均値±ＳＥＭを表す。
【０１３０】
これらの結果および前記で報告された薬力学的研究から、Ｓｏｌｕｌｉｎはとりわけラットおよびマウスにおいて有効である投薬量で出血の大きなリスクを保有しないと結論付けることができる。
【０１３１】
ＡＰＣが、静脈血栓症のラットうっ滞モデルにおいてかろうじて（０．５ｍｇ／ｋｇ）または中程度に有効（２ｍｇ／ｋｇ）のいずれかであった用量でさえ出血時間に有意に影響したことは、この薬物の臨床プロフィールと合致し、そしてより一般的なトロンビン作成の阻止により説明され得る。
【０１３２】
低用量のＥｎｏｘａｐａｒｉｎの投与後の出血率は容認されたが、この研究により、Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎは３０ｍｇ／ｋｇの用量で凝固に実質的に影響し、そして故に耐容性の上限であったようであることも確認される。ＡＰＣおよびＥｎｏｘａｐａｒｉｎの高用量群の各々の雌１匹が実験の２４時間以内に死亡したが、Ｓｏｌｕｌｉｎ処置で致死性は観察されなかった。
【０１３３】
実施例５
インビボで凝固パラメータに及ぼす影響
静脈うっ滞モデルにおいて用いられた用量でＳｏｌｕｌｉｎ、ＡＰＣ（Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標）（Ｄｒｏｔｒｅｃｏｇｉｎアルファ活性型）およびＥｎｏｘａｐａｒｉｎの薬力学のさらに完全な像を得るために、凝固パラメータに及ぼすこれらの薬物の影響をインビボで評価した。
【０１３４】
１．試験系および実験手順
Ｓｏｌｕｌｉｎ、Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎまたはビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を雄および雌ラットに静脈内投与し、３０分後に下大静脈から血液を収集した。ＡＰＣを静脈内適用し、５分後に同一部位から血液を収集した。クエン酸乏血小板血漿を調製し、そして活性型部分トロンンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）およびトロンビン時間（ＴＴ）に関して試験した。
【０１３５】
２．結果
３つ全ての薬物は高用量でＰＴに有意に影響し、影響を示さなかったＥｎｏｘａｐａｒｉｎ処置された雌を除いて軽度の１．１倍の延長に至った（表３）。
【０１３６】
表３：ＡＰＣおよびＥｎｏｘａｐａｒｉｎと比較した種々の用量のＳｏｌｕｌｉｎのインビボ凝固に及ぼす影響
【０１３７】
【表３】
2010532776.tif 000006
＊一方向ＡＮＯＶＡ、続くダネット検定によりｐ＜０．０５；データは各々雄５匹および雌５匹の平均値±ＳＥＭを表す。
【０１３８】
ＳｏｌｕｌｉｎおよびＥｎｏｘａｐａｒｉｎは用量依存的にＴＴに影響を及ぼし、各々高用量で最大延長に至った。効果は０．３−３ｍｇ／ｋｇ  Ｓｏｌｕｌｉｎおよび双方の用量のＥｎｏｘａｐａｒｉｎで有意であり、各々１．５−１４．４倍および６．１−１４．４倍の延長に相当した。対照的にＡＰＣは雄でＴＴを延長せず、そしてかろうじて雌でそれに影響した（表３）。
【０１３９】
Ｓｏｌｕｌｉｎは雌において１ｍｇ／ｋｇで、および３ｍｇ／ｋｇ用量で処置された双方の性においてａＰＴＴを有意に延長し、１．４−１．７倍のａＰＴＴ延長を引き起こした。ＡＰＣ（２ｍｇ／ｋｇ）は匹敵する程度までａＰＴＴを有意に増大した（１．６倍）。双方の用量のＥｎｏｘａｐａｒｉｎもまたａＰＴＴに有意に影響を及ぼした。しかしながら３ｍｇ／ｋｇ用量による増大はその他の２つの薬物で認められたものと同じ範囲に入った（１．８倍）が、３０ｍｇ／ｋｇ  Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎはビヒクル処置と比較してａＰＴＴの過度な延長（３７倍を超える）を引き起こした（表３、図１０（ラットにおけるａＰＴＴの延長））。
【０１４０】
１．５から２．５倍のａＰＴＴ延長は、以前は未分画ヘパリンが用量設定される有効なレベルとして用いられたことに注目すべきである。さらに最近では、異なる実験室で用いられるａＰＴＴ試薬とコアグロメータ間の変動性が不十分なヘパリン暴露を招いていたので、ヘパリン用量をプロタミン滴定または抗第Ｘａ因子アッセイにより較正できない場合、２．０から３．５倍の延長さえ推奨されている。Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎはヘパリンの低分子変異体であるが、３０ｍｇ／ｋｇ用量のａＰＴＴに及ぼす強烈な影響はほぼ確実に不耐容であり、それは出血時間研究において決定された高リスクにより立証される。それにも関わらず、全てのＳｏｌｕｌｉｎまたはＡＰＣ投薬量の影響は容認できるａＰＴＴ範囲に対応する。
【図１】
2010532776.tif 000007
【図２】
2010532776.tif 000008
【図３】
2010532776.tif 000009
【図４】
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【図５】
2010532776.tif 000011
【図６】
2010532776.tif 000012
【図７】
2010532776.tif 000013
【図８】
2010532776.tif 000014
【図９】
2010532776.tif 000015
【図１０】
2010532776.tif 000016
【配列表】
2010532776000001.app
【国際調査報告】
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2010532776.tif 000018
2010532776.tif 000019
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