(57)【要約】  腫瘍関連マクロファージに対して免疫反応を誘発するのに有用なＤＮＡ組成物は、システインエンドペプチダーゼ（例えばレグマイン）又は腫瘍関連マクロファージなどの腫瘍関連細胞において過剰発現される少なくとも１つのその免疫原性断片又は免疫細胞で発現可能であるその免疫原性断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡコンストラクトを含み、これは、医薬的に許容可能な担体に組み込まれる。好ましい実施形態において、本組成物は、ＡｌａＡｌａＡｌａ又はＡｌａＡｌａＴｙｒなどのリンカーペプチドによって各断片が少なくとも１つの他の断片と連結されるように連続的に連結された腫瘍関連システインエンドペプチダーゼ（例えばレグマイン）の複数の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする。ある好ましい実施形態において、本組成物はまた、サイトカインなどの免疫エフェクタータンパク質をコードするＤＮＡコンストラクトも含む。本発明のＤＮＡ組成物は、腫瘍及び腫瘍転移などの疾患を治療するために、単独で又は化学療法剤と組み合わせて使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍関連細胞において発現されるシステインエンドペプチダーゼの複数の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡミニ遺伝子コンストラクト（前記複数の免疫原性断片は、前記ポリペプチド中で各連続断片間のリンカーペプチドにより連続的に連結されており、前記ポリペプチドは、腫瘍関連細胞に対する免疫反応を誘発することができ、免疫細胞で発現可能であり、医薬的に許容可能な担体に組み込まれる。）を含むＤＮＡ組成物。
【請求項２】
システインエンドペプチダーゼがレグマインである、請求項１のＤＮＡ組成物。
【請求項３】
ＤＮＡミニ遺伝子コンストラクトがヒトレグマイン（配列番号２）の免疫原性断片をコードする、請求項１及び請求項２の何れか一項のＤＮＡ組成物。
【請求項４】
各連続免疫原性断片間のリンカーペプチドが少なくとも３個のアミノ酸残基を含む、請求項１から請求項３の何れか一項のＤＮＡ組成物。
【請求項５】
ＤＮＡミニ遺伝子コンストラクトが裸のＤＮＡコンストラクトである、請求項１から請求項４の何れか一項のＤＮＡ組成物。
【請求項６】
裸のＤＮＡコンストラクトがプラスミドの形態である、請求項５のＤＮＡ組成物。
【請求項７】
ＤＮＡコンストラクトが弱毒化ウイルスベクターに組み込まれている、請求項１から請求項６の何れか一項のＤＮＡ組成物。
【請求項８】
ＤＮＡコンストラクトが弱毒化細菌ベクターに組み込まれている、請求項１から請求項６の何れか一項のＤＮＡ組成物。
【請求項９】
弱毒化細菌ベクターが弱毒化ＡｒｏＡ−、ｄａｍ−ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）である、請求項８のＤＮＡ組成物。
【請求項１０】
ＤＮＡミニ遺伝子コンストラクトが、ヒトレグマインの免疫原性断片をコードする配列番号１の一部を含む、請求項１から請求項９の何れか一項のＤＮＡ組成物。
【請求項１１】
免疫細胞において発現可能な免疫エフェクタータンパク質をコードするＤＮＡコンストラクトをさらに含む、請求項１から請求項１０の何れか一項のＤＮＡ組成物。
【請求項１２】
免疫エフェクタータンパク質がサイトカインである、請求項１１のＤＮＡ組成物。
【請求項１３】
サイトカインがＣＣＬ２１、ＩＬ−２又はＣＤ４０ＬＴである、請求項１２のＤＮＡ組成物。
【請求項１４】
ＤＮＡミニ遺伝子コンストラクトが、ポリペプチドのＮ末端に連結される小胞体リーダーペプチド配列をさらにコードする、請求項１から請求項１３の何れか一項のＤＮＡ組成物。
【請求項１５】
腫瘍関連細胞において発現されるシステインエンドペプチダーゼの複数の免疫原性断片をコードするＤＮＡミニ遺伝子コンストラクトを含む請求項１から請求項１４の何れか一項のＤＮＡ組成物を哺乳動物に投与することを含み、前記組成物が、腫瘍関連細胞に対する免疫反応を誘発するのに十分な量で投与される、哺乳動物において腫瘍成長又は腫瘍転移を阻害する方法。
【請求項１６】
腫瘍関連細胞が腫瘍関連マクロファージである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
哺乳動物がヒトである、請求項１５及び請求項１６の何れか一項の方法。
【請求項１８】
組成物が経口投与される、請求項１５から請求項１７の何れか一項の方法。
【請求項１９】
腫瘍関連細胞において発現されるシステインエンドペプチダーゼの複数の免疫原性断片をコードするＤＮＡミニ遺伝子コンストラクトを含む請求項１から請求項１４の何れか一項のＤＮＡ組成物を哺乳動物に投与し；続いて、抗腫瘍化学療法剤の抗腫瘍有効量を哺乳動物に投与する段階を含み；前記ＤＮＡ組成物が、システインエンドペプチダーゼを発現する哺乳動物において腫瘍関連マクロファージに対する免疫反応を誘発するのに十分な量で投与される、哺乳動物における腫瘍成長又は腫瘍転移を阻害する方法。
【請求項２０】
哺乳動物がヒトである、請求項１９の方法。
【請求項２１】
化学療法剤がドキソルビシンである、請求項１９及び請求項２０の何れか一項の方法。
【請求項２２】
組成物が経口投与される、請求項１９から請求項２１の何れか一項の方法。
【請求項２３】
腫瘍関連マクロファージにおいて発現されるシステインエンドペプチダーゼの複数の免疫原性断片をコードするＤＮＡミニ遺伝子コンストラクトを含む請求項１から請求項１４の何れか一項のＤＮＡ組成物の免疫反応誘発量を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍関連マクロファージ産生の阻害から利益を得る哺乳動物において腫瘍関連マクロファージ産生を阻害する方法。
【請求項２４】
哺乳動物がヒトである、請求項２３の方法。
【請求項２５】
組成物が経口投与される、請求項２３及び請求項２４の何れか一項の方法。
【請求項２６】
密封された滅菌容器中に納められた請求項１から請求項１４の何れか一項のＤＮＡ組成物を含み、その容器がそれに固定されたラベルを有し、前記ラベルが組成物を特定し、前記組成物を患者に投与する者に有用な情報を提供する印刷物を有する、製品。
【請求項２７】
ポリペプチド中の各連続断片間のリンカーペプチドにより連続的に連結されるレグマインの複数の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡミニ遺伝子コンストラクトを含み、免疫細胞で発現され得、レグマインを過剰発現する腫瘍関連細胞に対して免疫反応を誘発することができる、プラスミドベクター。
【請求項２８】
レグマインが、配列番号２からなるアミノ酸残基配列を有するヒトレグマイン又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質である、請求項２７のベクター。
【請求項２９】
免疫エフェクタータンパク質をコードするＤＮＡコンストラクトをさらに含む、請求項２７及び請求項２８の何れか一項のベクター。
【請求項３０】
免疫エフェクタータンパク質がサイトカインである、請求項２９のベクター。
【請求項３１】
サイトカインが、ＣＣＬ２１、ＩＬ−２又はＣＤ４０ＬＴである、請求項３０のベクター。
【請求項３２】
リンカーペプチドが少なくとも３個のアミノ酸残基を含む、請求項２７から請求項３１の何れか一項のベクター。
【請求項３３】
各リンカーペプチドが、アミノ酸残基配列ＡＡＡ又はＡＡＹを含む、請求項３２のベクター。
【請求項３４】
腫瘍関連細胞において発現されるシステインエンドペプチダーゼ又は腫瘍関連細胞に対する免疫反応を誘発することができる少なくとも１つの断片をコードするＤＮＡコンストラクトを含み、免疫細胞において発現可能であり、医薬的に許容可能な担体に組み込まれる、ＤＮＡ組成物。
【請求項３５】
システインエンドペプチダーゼがヒトレグマインである、請求項３４のＤＮＡ組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍関連マクロファージに対する免疫反応を誘発するのに有効な適切な分子をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）組成物に関する。とりわけ、本発明は、腫瘍関連細胞（腫瘍関連マクロファージなど）で発現される、レグマインなどのエンドペプチダーゼの少なくとも１つのエピトープをコードするＤＮＡ組成物に関する。本発明はまた、腫瘍成長及び腫瘍転移を阻害するためにＤＮＡ組成物を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、腫瘍成長及び転移に関与する。新規の抗腫瘍ストラテジーは、ＴＡＭにより過剰発現される分子に対して免疫付与し、それにより、これらのマクロファージを誘引してそれらの機能を媒介する腫瘍の微小環境を再構築することである（Ｏｏｓｔｅｒｌｉｎｇ他、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２０７、２００５年ｐ．１４７−１５５；Ｅｍｅｎｓ他、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  １２、２００５年、ｐ．１−１７参照）。ＴＡＭは、主に、一酸化窒素及び炎症性サイトカインの産生が限定的であるので腫瘍細胞に対してあまり細胞毒性がない、極性のあるＭ２（ＣＤ２０６＋、Ｆ４／８０＋）マクロファージ集団からなる（Ｍｉｌｌｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４、２０００年、ｐ．６１６６−６１７３参照）。
【０００３】
ＴＡＭはまた、抗原提示能が低く、Ｔ細胞活性を効果的に抑制する。実際、Ｍ２表現型のこれらのマクロファージは現に、幅広い範囲の増殖及びプロ血管形成因子ならびにメタロプロテイナーゼを分泌することにより、及び、腫瘍間質における繊維芽細胞の機能を調節するシグナル伝達回路でのそれらの関与により、細胞増殖及び転移を促進する（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ他、Ｎｏｖａｒｔｉｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．、２５６、２００４年、ｐ．１３７−１４５）。
【０００４】
現在、小分子阻害剤により誘導される抗−ＴＡＭ効果が腫瘍抑制に関与したことが報告されている（Ｌｅｗｉｓ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６７、２００５年、ｐ．６２７−６３５；及びＭａｎｔｏｖａｎｉ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１９８８；４０、２００４年、ｐ．１６６０−１６６７参照）。例えば、抗新生物剤であるヨンデリスは、ＴＡＭにおける選択的細胞毒性効果を有し、それにより、そのＩＬ６及びＣＣＬ２産生を顕著に減少させるが、これは炎症関連ヒト腫瘍の増殖抑制に関与する（Ａｌｌａｖｅｎａ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５、２００５年、ｐ．２９６４−２９７１参照）。このようなものの別の例は、ビホスホネート化合物、ゾレドロン酸であり、これは、ＴＡＭによるＭＭＰ９分泌を抑制し、それによって腫瘍メタロプロテイナーゼ活性を阻害し、増殖上皮細胞においてそのチロシンキナーゼ受容体とのＶＥＧＦの会合を減少させる（Ｇｉｒａｕｄｏ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４、２００４年、ｐ．６２３−６３３参照）。
【０００５】
異なる実験モデルにおいて、ケモカインＣＣＬ５がＴＡＭの動員において重要であることが示された。このケモカインのアンタゴニストによって腫瘍浸潤が低下し、腫瘍成長が遅くなった（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３、２００３年、ｐ．８３６０−８３６５）。それゆえに、ＴＡＭの治療標的化は比較的新しいアプローチではあるが、これらからＴＡＭ標的化が従来の癌治療法を補完し得ることが示唆されるので、初期臨床成績は有望である。
【０００６】
レグマインは、システインプロテアーゼのＣ１３ファミリーの全く新しい革新的な派生物であり（Ｉｓｈｉｉ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４、１９９４年、ｐ．６０４−６１５参照）、植物及びヒトを含む哺乳動物でよく保存されている。レグマインは、最初、種子発芽中の貯蔵タンパク質のプロセシング酵素として植物で同定され、その後寄生生物で、次いで哺乳動物で同定された。レグマインは強固な酸性システインエンドペプチダーゼであり、その基質配列のＰ１部位のアスパラギンを絶対に必要とする顕著に限定的な特異性を有する（Ｃｈｅｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、１９９７年、ｐ．８０９０−８０９８参照）。
【０００７】
本願において、腫瘍治療のための標的としてのレグマインの選択は、このエンドペプチダーゼをコードする遺伝子が多くのマウス及びヒト腫瘍組織において非常によく上方制御されるが、このような腫瘍が生じる全ての正常組織においては存在しないか又はごく低レベルでしか存在しないことが分かったという事実に基づくものである。重要なこととして、腫瘍低酸素状態などのストレス状態でレグマインの過剰発現が起こり、これにより、腫瘍進行、血管形成及び転移が促進される。
【０００８】
遺伝子発現プロファイリング及び免疫組織化学により確認した場合レグマインがマウス乳癌組織でＴＡＭにより非常に過剰発現されるという観察から、レグマインは、本発明の組成物及び方法に対して特に好ましい標的エンドペプチダーゼである。ＴＡＭは、腫瘍間質においてレグマインを特に大量に発現する。一方、Ｍ１表現型の従来からのマクロファージ（重要な免疫学的監視及び抗原提示機能を果たす。）はレグマインを発現しない。その結果、レグマインを過剰発現するＴＡＭの標的化によって、細胞毒性及び抗原提示を含め、（Ｍ１）マクロファージの生物学的機能は妨害されない。本発明は、レグマイン又はＴＡＭで過剰発現され、腫瘍及び腫瘍転移の治療に有用であるその他のエンドペプチダーゼを過剰発現するＴＡＭに対する免疫反応を誘導するためのＤＮＡ組成物を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｏｏｓｔｅｒｌｉｎｇ他、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２０７、２００５年ｐ．１４７−１５５
【非特許文献２】Ｅｍｅｎｓ他、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  １２、２００５年、ｐ．１−１７
【非特許文献３】Ｍｉｌｌｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４、２０００年、ｐ．６１６６−６１７３
【非特許文献４】Ｍａｎｔｏｖａｎｉ他、Ｎｏｖａｒｔｉｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．、２５６、２００４年、ｐ．１３７−１４５
【非特許文献５】Ｌｅｗｉｓ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６７、２００５年、ｐ．６２７−６３５
【非特許文献６】Ｍａｎｔｏｖａｎｉ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１９８８；４０、２００４年、ｐ．１６６０−１６６７
【非特許文献７】Ａｌｌａｖｅｎａ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５、２００５年、ｐ．２９６４−２９７１
【非特許文献８】Ｇｉｒａｕｄｏ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４、２００４年、ｐ．６２３−６３３
【非特許文献９】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３、２００３年、ｐ．８３６０−８３６５
【非特許文献１０】Ｉｓｈｉｉ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４、１９９４年、ｐ．６０４−６１５
【非特許文献１１】Ｃｈｅｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、１９９７年、ｐ．８０９０−８０９８
【発明の概要】
【００１０】
本発明のＤＮＡ組成物は、腫瘍関連細胞（例えば腫瘍関連マクロファージ）において過剰発現される少なくともシステインエンドペプチダーゼの免疫原性断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡコンストラクトを含む。このＤＮＡコンストラクトは、ＤＮＡコンストラクトが投与されている対象の免疫細胞においてそのポリペプチドの発現を促進する構造エレメントを含む。好ましくは、本エンドペプチダーゼは、レグマイン又は少なくとも１つのその免疫原性断片（例えばエピトープ）を含む。本ＤＮＡコンストラクトは、患者に投与できるように医薬的に許容可能な担体に組み込まれる。本組成物は、エンドペプチダーゼの１個の免疫原性断片（例えばレグマインのエピトープ）、エンドペプチダーゼの２以上の免疫原性断片を含むポリペプチド（例えば免疫原性ポリペプチド）、エンドペプチダーゼタンパク質全体又は対象において免疫反応を誘発するその何れかの部分をコードし得る。好ましくは、本ＤＮＡコンストラクトは、配列番号２からなるアミノ酸残基配列、配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質（例えばヒトレグマイン、ブタレグマイン又はマウスレグマイン）又はその免疫原性断片を有するヒトレグマインをコードし、これは、本ＤＮＡコンストラクトが投与される対象の免疫細胞において発現可能である。本発明のＤＮＡコンストラクトは腫瘍成長及び腫瘍転移を阻害するのに有用である。
【００１１】
本ＤＮＡコンストラクトは裸のＤＮＡコンストラクト、好ましくはプラスミドの形態であり得る。リポソーム送達ビヒクル、ポリマー性送達ビヒクルにこのような裸のＤＮＡコンストラクトを組み込むことができるか又は必要に応じてエレクトロポレーション、遺伝子銃などにより投与することができる。ある好ましい実施形態において、弱毒化ウイルスベクター又は弱毒化細菌ベクターに本ＤＮＡコンストラクトを組み込む。
【００１２】
好ましい実施形態において、本ＤＮＡコンストラクトは、弱毒化ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）など、例えばネズミチフス菌の二重弱毒化（ＡｒｏＡ−、ｄａｍ−）株などの弱毒化細菌ベクターに組み込まれる。
【００１３】
本ＤＮＡ組成物はまた任意選択で、サイトカインなどの免疫エフェクタータンパク質をコードするＤＮＡコンストラクトも含み得る。好ましいサイトカインには、ＣＣＬ２１、ＩＬ−２及びＣＤ４０ＬＴが含まれる。
【００１４】
特に好ましい実施形態において、本発明のＤＮＡ組成物は、腫瘍関連細胞において高発現されるシステインエンドペプチダーゼ（例えばレグマイン）の免疫原性断片（例えばエピトープ）の複数を含む免疫原性ポリペプチドをコードするＤＮＡミニ遺伝子コンストラクトを含む。免疫原性ポリペプチドは、腫瘍関連細胞に対する免疫反応を誘発することができ、免疫細胞において発現可能であり、医薬的に許容可能な担体中で組み込まれる。ポリペプチドにおいて各連続断片間のリンカーペプチドにより免疫原性断片が連続的に連結される。このリンカーペプチドは通常、少なくとも３個のアミノ酸残基長であり、好ましくは、アミノ酸配列ＡＡＡ又はＡＡＹを含む。本明細書中で使用する場合、「リンカーペプチド」という用語は、少なくとも２個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも３個のアミノ酸残基の配列を指し、エンドペプチダーゼの免疫原性断片と一緒に連結される場合、天然のエンドペプチダーゼとは異なるアミノ酸残基配列を形成する。通常、リンカーペプチド及びエンドペプチダーゼの免疫原性断片の組み合わせは、約１００アミノ酸残基長未満、より好ましくは約１９から約６２アミノ酸長（例えば、各３個のアミノ酸の１から４個のリンカーペプチドにより連結される、各８から１０アミノ酸の２から約５個の免疫原性断片）のポリペプチドを含む。好ましくは、このＤＮＡミニ遺伝子コンストラクトはヒトレグマインの免疫原性断片（配列番号２）をコードする。
【００１５】
本発明のＤＮＡ組成物は、Ｔ細胞が介在する癌免疫治療に対する非常に選択性の高い標的を与えるレグマインなどのシステインエンドペプチダーゼを発現する腫瘍関連マクロファージを標的とするワクチンとして働き得る。腫瘍関連マクロファージにより発現されるレグマインなどのエンドペプチダーゼを標的化するアプローチには、腫瘍細胞そのものにより単独で発現される抗原に対する治療を上回るいくつかの長所がある。例えば、レグマインは、ＴＡＭにおいて非常によく過剰発現され、このように、腫瘍細胞においてよくあるケースのように、下方制御されたＭＨＣ抗原発現によって妨害されない。さらに、腫瘍細胞は、アポトーシスシグナル伝達経路における欠陥、抗アポトーシスタンパク質の上方制御又は細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）における免疫抑制効果のために、Ｔ細胞介在性の細胞死滅に対して次第に耐性となることが多い。レグマインを発現するＴＡＭを標的化することによって、特異的腫瘍型により単独で発現される抗原を含む治療と対照的に、治療組成物により多くの様々な悪性腫瘍を治療できるようになる。
【００１６】
ある好ましい実施形態において、弱毒化細菌送達ベクター（例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の弱毒化株）を伴う経口ＤＮＡ組成物のように、本発明のＤＮＡ組成物は、１以上のその免疫原性断片をコードするＤＮＡのそのｃＤＮＡを送達することにより、レグマイン自己抗原に対する末梢Ｔ細胞耐性を打ち破る。このような実施形態において、二次リンパ系器官（即ち小腸のパイエル板）における抗原提示細胞（ＡＰＣ）に本ＤＮＡ組成物を接触させる。予防的アプローチにおいて、本発明のＤＮＡ組成物によるワクチン接種によって誘発されるＴ細胞介在性抗腫瘍免疫反応によって、複数のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍成長が阻害された。本ＤＮＡ組成物はまた、ＣＴ２６結腸癌の治療モデルにおける確立された肺転移播種も顕著に抑制する。
【００１７】
好ましいＤＮＡ組成物は、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の二重弱毒化株（例えば、ＲＥ８８と呼ばれる株）などの弱毒化サルモネラ担体を含み、これには、ｄａｍ−及びＡｒｏＡ−突然変異が含まれ、Ｒｅｍｅｄｙｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｏｌｅｔａ、ＣＡ）から入手可能である。本発明において、エンドペプチダーゼ（例えばレグマイン）をコードするＤＮＡコンストラクト又はその免疫原性断片をコードするポリペプチドを含むように弱毒化サルモネラ担体に遺伝子移入する。それが投与される哺乳動物の免疫細胞において、このエンドペプチダーゼ又はポリペプチドは発現可能である。細菌そのものはレグマイン又はポリペプチドを発現しないが、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）などの免疫細胞にＤＮＡを送達し、次に、これがエンドペプチダーゼ又はその免疫原性断片を含むポリペプチドを発現する。このような組成物によって、マウスモデルにおいて抗腫瘍効果を延長させることができる。さらに、Ｔ細胞のインビボ枯渇実験から、レグマインをコードする、及び、レグマインの免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする組成物と関連する免疫原性反応におけるＣＤ８＋であるがＣＤ４＋ではないＴ細胞の関与が示唆される。インビトロで、ＣＤ８＋Ｔ細胞が介在する、観察される細胞毒性効果が、レグマイン抗原を過剰発現する標的ＴＡＭに対して特異的に向けられた。
【００１８】
本発明のＤＮＡ組成物はまた、組成物に対するアジュバントとして免疫エフェクター分子をコードするＤＮＡコンストラクトも組み込み得る。このような免疫エフェクター分子には、例えば、ＩＬ−２、Ｔ細胞増殖の誘導因子、ＣＣＬ２１、成熟樹状細胞を化学的に誘引するケモカイン及びナイーブＴ細胞ならびにＣＤ４０ＬＴ、樹状細胞成熟の既知の誘導因子が含まれる。免疫エフェクタータンパク質をコードする核酸は、好ましくは、プラスミドに組み込まれる。レグマイン及び免疫エフェクタータンパク質ＤＮＡコンストラクトを同じプラスミド又は２個の別個のプラスミドに組み込むことができる。ＴＡＭに対して誘導されるＣＴＬ−反応は、様々な腫瘍の成長を阻害し得、特定の腫瘍型に対して特異的ではない。
【００１９】
本発明はまた、レグマインを発現するＴＡＭに対する免疫反応を誘発するのに十分な量で本発明のＤＮＡ組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において腫瘍成長及び腫瘍転移を阻害する方法も提供する。
【００２０】
本発明の別の態様は、化学療法及び本発明のＤＮＡ組成物での治療を組み合わせる有効な併用療法レジメである。本発明のこの方法実施形態において、ポリペプチド中の各連続免疫原性断片間のリンカーペプチドにより連続的に連結されるエンドペプチダーゼの少なくとも２個の免疫原性断片を含むミニ遺伝子コンストラクトを好ましくは含む、レグマイン又はその免疫原性部分をコードするポリペプチドなどのＴＡＭで発現されるエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡコンストラクトを含む本発明のＤＮＡ組成物と組み合わせて、ドキソルビシン、パクリタキセル及び／又はシクロホスファミドなどの様々な化学療法剤（これは、最大耐性用量（ＭＴＤ）で投与された場合に骨髄抑制を引き起こさない。）が患者に投与される。
【００２１】
別の好ましい方法実施形態は、哺乳動物において、レグマインなどのエンドペプチダーゼを過剰発現するＴＡＭに対して免疫反応を誘発するのに十分な量で本発明のＤＮＡ組成物を哺乳動物に投与し、続いて抗腫瘍化学療法剤の抗腫瘍有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物（例えばヒト）において腫瘍成長又は腫瘍転移を阻害する方法である。
【００２２】
好ましくは、本発明の方法により治療される哺乳動物はヒトである。
【００２３】
本発明の方法実施形態において、腸投与（経口投与によるものなど）により、又は非経口投与（注射もしくは静脈点滴よるものなど）により、ＤＮＡ組成物を投与することができる。好ましくは、本組成物を経口投与する。密封容器中に本組成物を納め、本組成物を効果的に投与するための臨床家に対する有用な情報を有するラベルを付することができる。
【００２４】
本発明のＤＮＡ組成物は、多くの疾患状態の治療及び予防に有用である。例えば、結腸直腸癌、乳癌、肺癌などに罹患している患者は、本発明の組成物による免疫付与から利益を得ることができる。本発明の組成物はまた、癌の様々な形態におけるレグマインの役割を調べるためにも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】腫瘍間質の腫瘍関連マクロファージにおいてレグマインが高発現される。（Ａ）ＴＡＭにおけるレグマイン発現は、パネルＡで示されるように明らかであった。矢印で示されるように、Ｈ／Ｅ染色により腫瘍浸潤マクロファージを可視化した。抗ＣＤ６８Ａｂと組み合わせた抗レグマインＡｂでの二重染色によりレグマイン発現が示される。（倍率ｘ３５）（Ｂ）新鮮な腫瘍組織から単離されたＣＤ２０６＋／Ｆ４／８０＋Ｍ２マクロファージの二重陽性集団でのフローサイトメトリー分析によりＴＡＭにおける高レグマイン発現が確認された。（Ｃ）多色フローサイトメトリーにより、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３（１０ｎｇ／ｍＬ）とともに培養した後、ＲＡＷ細胞におけるＭ２マクロファージマーカーＣＤ２０６の上方制御が明らかになった。下の写真で示される野生型ＲＡＷ細胞と比較した場合、上の写真において示されるように、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３と培養したＦ４／８０＋／ＣＤ２０６＋陽性ＲＡＷ細胞においてレグマインが高発現されることが分かった。（Ｄ）ＩＬ−４、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０による単独又は組み合わせ刺激後のウエスタンブロッティングによるＲＡＷ細胞におけるレグマイン発現の確認。
【図２】レグマイン発現細胞の標的化の結果、腫瘍進行が抑制される。（Ａ）レグマイン遺伝子が突然変異ポリユビキチンのＣ末端に融合されたｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏベクター骨格を用いて構築された本発明のＤＮＡ組成物の略図。断片全体を挿入し、ウエスタンブロッティングによりタンパク質発現を明らかにした。（Ｂ）予防モデル：１週間間隔での３回の免疫付与とそれに続く、約２ｘ１０５  Ｄ１２１非小細胞肺癌細胞、約５ｘ１０４個のＣＴ２６結腸癌細胞のｉ．ｖ．での接種及び約７ｘ１０３個の４Ｔ１乳癌細胞の乳房脂肪体注入による接種に対してワクチン接種スケジュールを設定した。腫瘍細胞接種から２４日後（Ｄ１２１又はＣＴ−２６）又は３０日後（４Ｔ１）、肺重量を調べ、各群で分析した。２つの対照群（ＰＢＳ及び／又は空のベクター）と治療群との間の差は統計学的に有意であった＊＊Ｐ＜０．００５。正常肺重量＝０．２ｇ。（Ｃ）治療モデル：ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）の群の乳房脂肪体に約７ｘ１０３個の４Ｔ１乳癌細胞を最初に注入し、その後、第３、７及び１１日に３回、それぞれＰＢＳ、空のベクター又はｐＬｅｇｍａｉｎ  ＤＮＡ組成物でワクチン接種し、原発腫瘍を第１２日に切除した。生存プロットは、各治療及び対照群における８匹のマウスに対する結果を表す。空ベクター対照群と治療群との間の差は統計学的に有意であった＊＊Ｐ＜０．００５。
【図３】レグマインに基づくＤＮＡ組成物により誘導されるＣＤ８＋特異的ＣＴＬによって、腫瘍間質におけるＴＡＭ集団が減少する。（Ａ）ＲＡＷマクロファージ細胞は、１０ｎｇ／ｍＬ  ＢＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３とともに培養した後、レグマインを高発現し、４時間の５１Ｃｒ−放出アッセイにおいて標的細胞となる。ｐＬｅｇｍａｉｎ組成物で免疫付与したマウスから単離した脾臓細胞は、様々なエフェクター対標的細胞比でインビトロでこれらのサイトカインにより処理したＲＡＷ細胞を効果的に死滅させたが、レグマイン発現を欠く未刺激ＲＡＷ細胞の細胞毒性死滅は誘導できなかった。＊＊対照群と比較してＰ＜０．００５。（Ｂ）フローサイトメトリーは、ワクチン接種後の腫瘍組織において特異的マクロファージマーカー（ＣＤ２０６及びＦ４／８０）を有するＴＡＭ集団の％を検出する。本発明のＤＮＡ組成物で処置したマウスから単離された腫瘍組織細胞中のＴＡＭ集団の％が低下することが分かった。ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇後、空のベクター又はｐＬｅｇｍａｉｎの何れかで処置したマウスから単離されたＴＡＭ集団は減少しなかった（＊＊Ｐ＜０．００５）。（Ｃ）共焦点顕微鏡により評価する免疫組織化学染色によって、フローサイトメトリーの結果を確認した。腫瘍間質におけるＴＡＭ集団はワクチン接種後、劇的に減少した。倍率ｘ５（Ｈ／Ｅ）、ｘ３５（対照、空のベクター及びｐＬｅｇｍａｉｎ）。
【図４】ＭＨＣ−クラスＩ抗原は、レグマイン発現細胞に対する特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を制限した。（Ａ）ＦＡＣＳプロットから、ＤＮＡ治療によって、ＤＣによる同時刺激分子の発現が促進されることが示される。ＰＥ結合抗ＣＤ８０Ａｂ、抗ＭＨＣクラスＩ又は抗ＣＤ４０Ａｂと組み合わせたＦＴＴＣ標識抗ＣＤ１  ＩｃＡｂで、ワクチン接種から３日後に得られたパイエル板からのリンパ球を染色した。（＊対照群に対してＰ＜０．０５）。（Ｂ）ＦＡＣＳ分析によりＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞質内ＩＮＦ−γ放出を測定した。＊＊対照群に対してＰ＜０．００５。（Ｃ）ＥＬＩＳＰＯＴにより１細胞レベルで特異的ＩＮＦ−γの産生を確認した。これは、ウェルあたり形成される免疫スポットの数により示されるように、レグマイン＋４Ｔ１腫瘍組織細胞又はレグマイン−４Ｔ１細胞の何れかで再刺激した免疫付与マウスからのリンパ球に対して適用される。＊＊刺激なしの治療群に対してＰ＜０．００５。＃＃対照群に対してＰ＜０．００５。（Ｄ）５１Ｃｒ放出アッセイを用いることによって、処置マウスから単離された脾臓細胞はＴＡＭの死滅に有効であった（＊対照群に対してＰ＜０．０１）。Ｈ２Ｋｄ／Ｈ−２Ｄｄ  ＭＨＣクラスＩ抗原に対するＡｂを用いた阻害実験から、Ｔ細胞介在性腫瘍細胞溶解がＭＨＣクラスＩ  Ａｇ限定的であったことが分かった。ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞のインビボでの枯渇から、ワクチン接種マウスから単離されたリンパ球（その後、ＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇した。）が標的細胞の細胞毒性死滅を誘導できなかったことが示された。ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇は、これらの同じ標的細胞の細胞毒性死滅を無効にしなかった。＊ＰＢＳ又は空のベクター群に対してＰ＜０．０１。
【図５】ＴＡＭの無効化の結果、成長因子放出、腫瘍細胞移動及び転移が低下する。（Ａ）本発明のＤＮＡ組成物は、ＴＡＭによる成長因子の放出を低下させた。ワクチン接種及び腫瘍細胞接種から１２日後に、４Ｔ１乳癌組織及びマウス血清を回収した。２４時間又は４８時間培養後、腫瘍組織細胞の上清を回収し、血清又は上清中のＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α及びＶＥＧＦの濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。治療群と対照群との間で有意差があった。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００５。（Ｂ）腫瘍の微小環境でのこれらの成長因子の発現を調べるために、免疫組織化学染色を行った。ワクチン治療群は、空のベクター群と比較して、ＴＡＭの減少後、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β及びＭＭＰ−９放出が低下したことが分かった。（Ｃ）ワクチン接種後の腫瘍細胞移動を調べるために、トランスウェル移動アッセイを行った。ワクチン接種後、移動細胞の数が顕著に減少した。＊＊＊空のベクター群と比較してＰ＜０．００１。（Ｄ）マウスの腫瘍転形成能を調べるために、インビボ実験を行った。上述のような治療設定内でワクチンによりマウスを処置した。原発腫瘍切除から２５日後、腫瘍転移スコア及び肺重量を調べた。転移スコアは、融合した転移巣に覆われた％肺表面として表す：０＝なし；１＝＜５％、２＝５％から５０％及び３＝＞５０％。ワクチン治療マウス群と全対照群との間の肺重量の差は統計学的に有意であった（＊＊Ｐ＜０．００５）。
【図６】ＴＡＭの排除の結果、腫瘍血管形成が減少する。ＶＥＧＦ誘導性血管形成の抑制：空のベクター、ｐＬｅｇｍａｉｎを遺伝子移入したか又は、それぞれインビボでのＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞何れかの枯渇後にｐＬｅｇｍａｉｎを遺伝子移入した、何れかのネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスにワクチン接種を行った。最後のワクチン接種から１週間後、マウス腹部正中線にマトリゲルをｓ．ｃ．（皮下注射）で移植した。ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦにより血管形成が誘導された。（Ａ）マトリゲルプラグ移植から６日後、デジタルカメラによって画像撮影した。さらに、Ｍａｓｓｉｏｎトリクロムで染色したマトリゲルプラグの切片から、矢印で強調されるようにマトリゲルプラグ中の血管成長が示される（倍率ｘ５）。（Ｂ）ＦＩＴＣ標識イソレクチンＢ４による内皮のインビボ染色及び蛍光定量による評価後、血管成長の定量を行った。レグマインをコードするベクターによるワクチン接種後のみ、ＶＥＧＦ誘導性の血管新生が減少したが、空のベクター又はＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇後のｐＬｅｇｍａｉｎでのワクチン接種後では低下しなかった。レグマイン治療群に対して＊＊Ｐ＜０．００５、＊Ｐ＜０．０１。（Ｃ）免疫組織化学染色を行い、共焦点顕微鏡により評価した。これらのプラグ中で増殖したか又はこれらのプラグ中に移動した細胞タイプを調べるために、マトリゲルプラグの横断面を染色した。画像から、ＣＤ３１マーカーを有する内皮細胞又はＣＤ６８マーカーを有するマクロファージが、矢印で示されるように、マトリゲルプラグ中で増殖するか又はマトリゲルプラグ中に移動したことが示される（倍率ｘ３５）。Ｈ／Ｅ染色を対照とした（倍率ｘ５）。
【図７】レグマインプラスミドを有するレトロウイルスによって、４Ｔ１細胞株に安定的に遺伝子移入し、次いで、免疫付与マウスからの脾臓細胞に対する標的細胞として使用し（パネルＡ、左の写真は５ｘ倍率；右の写真は３５ｘ倍率）、遺伝子移入から２日後に画像撮影し、陽性細胞を矢印で示す。５１Ｃｒ放出アッセイデータをパネルＢで示す。ｐＬｅｇｍａｉｎＤＮＡ組成物で免疫付与したマウスから単離した脾臓細胞は、レグマインを遺伝子移入した４Ｔ１細胞死滅において有効であった（空のベクター対照群に対して、＊Ｐ＜０．０１）。レグマイン発現がない正常な４Ｔ１細胞は溶解されなかったので、腫瘍特異的Ｔ細胞介在死滅はレグマインに対して特異的であった。
【図８】図８は、ヒトレグマインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図９】図９は、ヒトレグマインのアミノ酸残基配列（配列番号２）を示す。
【図１０】図１０は、マウスレグマインをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図１１】図１１は、マウスレグマインのアミノ酸残基配列（配列番号４）を示す。
【図１２】図１２は、ヒトＩＬ−２をコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図１３】図１３は、ヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸残基配列を示す。
【図１４】図１４は、ヒトＣＣＬ２１をコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図１５】図１５は、ヒトＣＣＬ２１のアミノ酸残基配列（配列番号８）を示す。
【図１６】図１６は、ヒトＣＤ４０Ｌをコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図１７】図１７は、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号１０）のアミノ酸残基配列を示す。
【図１８】図１８は、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｎａｔｅｄ）マウスレグマインのヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図１９】図１９は、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｎａｔｅｄ）マウスレグマインのアミノ酸残基配列（配列番号１２）を示す。
【図２０】図２０は、マウスレグマインエピトープ配列のアミノ酸残基配列を示す。
【図２１】図２１は、レグマインの免疫原性断片を含むレグマインミニ遺伝子をコードするプラスミドの概略図を示す。
【図２２】図２２は、ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄミニ遺伝子組成物がＤ２Ｆ２乳癌細胞の接種からマウスを保護することを示す。指示されたベクターを有する二重弱毒化ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＲＥ−８８を用いて、１週間間隔で３回、ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝８）に免疫付与を行った。最後の免疫付与から１週間後、２ｘ１０５  Ｄ２Ｆ２乳癌細胞のｉ．ｖ．注射により、マウスに腫瘍細胞接種を行った。Ａ．実験プロトコールの概略。Ｂ．腫瘍細胞接種から５−２５日後のマウスの平均腫瘍体積。Ｃ．細胞接種から２５日後のマウスの腫瘍重量、＊空のベクター対照群に対してＰ＜０．０５。
【図２３】図２３は、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてｐＫｄミニ遺伝子ワクチンがＤ２Ｆ２乳癌転移を防ぐことを示す。指示されたベクターを有する弱毒化ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＲＥ−８８を胃管注入することにより、１週間間隔で３回、マウス群（ｎ＝８）に免疫付与を行った。１ｘ１０５個のＤ２Ｆ２乳癌細胞のｉ．ｖ．注入によって最後の免疫付与から２週間後、マウスに腫瘍細胞を接種した。Ａ．実験プロトコールの概略。Ｂ．腫瘍細胞接種から２５日後の各実験群からのマウスの平均肺転移スコア。次のように、融合転移により覆われた表面領域の％を見積もることによって、肺における腫瘍転移スコアを定めた：０、転移なし；１、＜２０％；２、２０％から５０％及び３、＞５０％  各治療群に対する個々のシンボルにより表される。＊空のベクター対照群に対してＰ＜０．０５。
【図２４】図２４は、ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄミニ遺伝子組成物により誘導されたレグマイン特異的Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ放出を示す。Ａ．刺激細胞として、腫瘍組織から新たに回収した４Ｔ１細胞によるレグマインの発現を使用した。これらの細胞におけるレグマイン発現の程度を示すために、フローサイトメトリーを行った。Ｂ．腫瘍組織から新たに回収されたレグマイン＋４Ｔ１腫瘍細胞又はレグマイン−４Ｔ１組織培養細胞の何れかで、免疫付与マウスからのリンパ球が再刺激された場合、ＥＬＩＳＰＯＴにより、１細胞レベルでＩＦＮ−γの産生が立証された。ウェルあたり形成される免疫スポット数によりＩＦＮ−γ放出が示される。  ＊レグマイン＋腫瘍細胞によりリンパ球が刺激されなかったマウスの群に対してＰ＜０．０５。＃対照群に対してＰ＜０．０５。
【図２５】図２５は、ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄミニ遺伝子組成物により誘導されるレグマイン陽性マクロファージ細胞の特異的ＣＴＬ死滅を示す。Ａ．ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３との培養後の、マクロファージ細胞株ＲＡＷによるレグマインの発現を示す。これらの細胞におけるレグマイン発現を示すために、ウエスタンブロット分析を行った。Ｂ．最後の免疫付与から２週間後、免疫付与ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝４）を屠殺し、それらから単離した脾臓細胞を５日間、照射済み４Ｔ１レグマイン＋細胞で刺激した。その後、標的細胞として野生型ＲＡＷレグマイン−細胞（下のパネル）又はＲＡＷレグマイン＋細胞（上のパネル）の何れかを用いて、細胞毒性アッセイを行った。＊標的細胞としてＲＡＷレグマイン＋細胞を用いた空のベクター対照群に対して、Ｐ＜０．０５。
【図２６】図２６は、ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄミニ遺伝子組成物により誘導された同系ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血管形成の抑制を示す。Ａ．マトリゲルアッセイの結果。空のベクター、ｐＣＭＶ−Ｄｂ／Ｄｄ又はｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄワクチンの何れかでワクチン接種したマウスにマトリゲルを移植した。血管成長の定量のために、マトリゲルプラグ中のヘモグロビン（Ｈｂ）濃度の測定を行った。マウスの各群からのマトリゲルプラグの平均Ｈｂ濃度を棒グラフにより示す（ｎ＝４；平均＋ＳＤ）。＊、空のベクター対照群に対してＰ＜０．０５。Ｂ．マトリゲルプラグ移植から７日後に調製したマトリゲル切片のＭａｓｓｏｎのトリクロム染色。矢印はマトリゲルプラグ中の血管を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）などの腫瘍関連細胞を標的とするＤＮＡ組成物を提供する。本ＤＮＡ組成物は、腫瘍関連細胞において過剰発現されるシステインエンドペプチダーゼ又は腫瘍関連細胞に対する免疫反応を誘導することができる少なくとも１つのその免疫原性断片をコードするＤＮＡコンストラクトを含み、医薬的に許容可能な担体に組み込まれる。好ましくは、ＤＮＡ組成物は、腫瘍関連細胞において高発現されるシステインエンドペプチダーゼ（例えばレグマイン）の複数の免疫原性断片を含む免疫原性ポリペプチドをコードするＤＮＡミニ遺伝子コンストラクトを含み、この場合、このポリペプチドは、腫瘍関連細胞に対する免疫反応を誘発することができ、免疫細胞において発現可能である。ミニ遺伝子実施形態、ポリペプチド中の各連続断片間のリンカーペプチドによってエンドペプチダーゼの複数の免疫原性断片が連続的に連結される。
【００２７】
好ましくは、システインエンドペプチダーゼはレグマイン（例えばヒトレグマイン；配列番号２）である。このＤＮＡコンストラクトは、システインエンドペプチダーゼの１個の免疫原性断片（例えばエピトープ）をコードすることができるが、好ましくは、エンドペプチダーゼの２以上の免疫原性断片を含むポリペプチダーゼをコードする。
【００２８】
「ＤＮＡコンストラクト」という用語は、本明細書中及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、レグマイン又は免疫原性レグマイン断片（エピトープ）などの関心のあるタンパク質又はポリペプチド（まとめて「レグマインＤＮＡ」と呼ばれる。）、ならびにＩＬ−２、ＣＣＬ２１、ＣＤ４０Ｌなどのタンパク質をコードするＤＮＡ構造を指す。好ましくは、各免疫原性断片は約８から１０アミノ酸残基長を含む。ＤＮＡコンストラクトは、線状ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡならびに、細胞又はウイルスの遺伝物質に組み込まれているＤＮＡを含む、標的細胞において転写され得る何らかのＤＮＡを含む。好ましくは、ＤＮＡコンストラクトは、ウイルス又は細菌送達ベクター、例えば非病原性である弱毒化ウイルス又は細菌ベクターに組み込まれているＤＮＡである。対象が本発明の組成物で治療される場合、免疫細胞（例えばマクロファージ及び樹状細胞）にレグマインＤＮＡが送達され、次いでこの免疫細胞がその免疫原性断片を含むタンパク質又はポリペプチドを発現する。レグマインＤＮＡのウイルス及び細菌担体そのものはレグマインを発現しない。
【００２９】
ある好ましい実施形態において、本ＤＮＡコンストラクトは、ＴＡＭにおいて高発現されるエンドペプチダーゼ（例えばレグマイン）の複数の免疫原性断片（例えば２から５）を含む免疫原性ポリペプチドをコードするミニ遺伝子コンストラクトである。本明細書中で使用する場合、「ミニ遺伝子」という用語は、好ましくは少なくとも３個のアミノ酸の小ペプチドによって一緒に連結される、関心のあるタンパク質の複数部分（断片）をコードするＤＮＡコンストラクトを指す。このようにして、ミニ遺伝子は、関心のあるタンパク質の免疫原性部分を含むポリペプチドをコードするが、関心のあるタンパク質全体をコードしない。好ましくは、約２から５の免疫原性断片（即ち、タンパク質のエピトープ領域からのペプチド配列）を含むポリペプチダーゼをコードするミニ遺伝子コンストラクトは、好ましくは連結ペプチドにより連結される。このミニ遺伝子はまた、リーダー配列及び／又はポリペプチドの発現もしくは輸送を促進するのに有用なその他の配列をコードする配列も含み得る。
【００３０】
上記のように、ポリペプチド中の免疫原性断片は、好ましくは各断片間のリンカー又はスペーサーペプチドにより連結される。このリンカーペプチドは、好ましくは、少なくとも３個のアミノ酸残基（例えばＡＡＡ又はＡＡＹ）を含む。好ましくは、レグマインの免疫原性断片をコードするＤＮＡコンストラクトはまた、リンカーペプチドによってＤＮＡコンストラクトによりコードされるポリペプチドのＮ末端に連結される、小胞体（ＥＲ）リーダー配列などのリーダー配列もコードする。ＤＮＡコンストラクトが２以上の免疫原性レグマイン断片を含むポリペプチダーゼをコードする場合、リーダー配列は、好ましくは、そのＮ末端からの第一の免疫原性断片に連結される。好ましくは、エンドペプチダーゼの免疫原性断片は、その１以上のエピトープ領域からの約８から１０個の連続アミノ酸残基からなる。
【００３１】
本明細書中に参照により組み込まれるＮＩＨｗｗｗウェブサイトのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）のＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）により提供されるＨＬＡ結合予測プログラムなどの当技術分野で周知の方法によって、ヒトレグマインを含むレグマインなどのエンドペプチダーゼの免疫原性断片を同定することができる。
【００３２】
本発明のＤＮＡ組成物は、エンドペプチダーゼを発現する腫瘍関連マクロファージに対して活性があるＣＴＬの形成を刺激する。このような腫瘍関連マクロファージは、本発明のＤＮＡ組成物による免疫付与に反応して産生されるＣＴＬにより選択的に標的化される。ＴＡＭの除去又は排除により、腫瘍微小環境が変化し、その結果、腫瘍成長及び腫瘍転移が抑制される。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、「免疫」という用語は、感染物質の病原型又は腫瘍抗原に対する、長期免疫学的保護を指す。「免疫付与」という用語は、非毒性源由来の病原体の抗原への曝露を指し、その結果、処置した対象において病原体に対する免疫が生じる。
【００３４】
本発明のＤＮＡ組成物において有用なＤＮＡコンストラクトは、好ましくは、レグマイン（例えばヒトレグマイン）又はレグマインの免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸を含み、免疫細胞での遺伝子発現に必要とされる調節エレメントに操作可能に連結される。好ましい実施形態において、ＤＮＡコンストラクトは、全長ヒトレグマインタンパク質（配列番号２）又はこれと少なくとも約８０％の高い相同性を有するポリペプチド（例えばブタレグマイン、マウスレグマインなど）又はその免疫原性断片をコードし、レグマインを過剰発現する細胞に対する免疫反応を誘発することができる。
【００３５】
特に好ましい実施形態において、ＤＮＡコンストラクトは、各免疫原性断片間に１つのリンカーペプチドがある、３−アミノ酸リンカーペプチド（例えばＡＡＡ又はＡＡＹ）により連結される２から５個のレグマイン（例えばヒトレグマイン）の免疫原性断片をコードするミニ遺伝子を含む。
【００３６】
ミニ遺伝子コンストラクトを含む有用なＤＮＡコンストラクトは、好ましくは、ヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。このような因子には、例えば、プロモーター、開始コドン、停止コドン及びポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、免疫原性標的タンパク質をコードする配列の発現のためにエンハンサーが必要とされることが多い。当技術分野で公知のように、これらのエレメントは、好ましくは、所望のタンパク質をコードする配列に操作可能に連結される。調節エレメントは、好ましくは、それらが投与されるべき種において操作可能なものが選択される。好ましくは、ＤＮＡコンストラクトは、プラスミドの形態であるか又はウイルスもしくは細菌ベクターに組み込まれる。当技術分野で周知の方法を用いて、遺伝子移入により、レグマインをコードするＤＮＡコンストラクトを最初に細菌ベクターに組み込み得る。続いて、細菌の遺伝物質中にレグマインＤＮＡを含む、細菌の準備済みストック（ｒｅａｄｙ  ｓｔｏｃｋ）を提供するために、形質転換された細菌を培養することができる。このような形質転換細菌の培養物は、本発明のＤＮＡ組成物に対する準備済みソース（ｒｅａｄｙ  ｓｏｕｒｃｅ）を提供する。
【００３７】
開始コドン及び停止コドンは、好ましくは、本発明のＤＮＡ組成物中にエンドペプチダーゼ又は免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部として含まれる。開始及び停止コドンは、コード配列とインフレームでなければならない。
【００３８】
本発明の組成物中に含まれるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、好ましくは、免疫付与しようとする対象の細胞内で機能的であるように選択される。
【００３９】
特にヒトに対する遺伝子ワクチンＤＮＡ組成物の産生で、本発明の組成物において有用なプロモーターの例には、以下に限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（ＨＩＶ末端反復配列（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ、ＬＴＲ）プロモーターなど）、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶ前初期プロモーターなど）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ならびにヒト遺伝子由来プロモーター（ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びヒトメタロチオネインなど）が含まれる。
【００４０】
特にヒトに対するＤＮＡ組成物の産生で、本発明のＤＮＡ組成物において有用なポリアデニル化シグナルの例には、以下に限定されないが、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれる。
【００４１】
ＤＮＡ発現に必要とされる調節エレメントに加えて、その他のエレメントもＤＮＡ分子に含まれ得る。このようなさらなるエレメントにはエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びウイルスエンハンサー（ＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶ由来のものなど）であり得る。
【００４２】
調節配列及びコドンは、一般に、種依存性であり、つまりタンパク質産生を最大化するために、調節配列及びコドンは、好ましくは、免疫付与しようとする種において有効であるように選択される。当技術分野で通常の技術を有する者は、ある一定の対象種において機能的であるＤＮＡコンストラクトを作製することができる。
【００４３】
本発明の組成物において有用なＤＮＡコンストラクトは、Ｒｅｓｔｉｆｏ他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７、２０００年、ｐ．８９−９２（その関連する開示は参照により組み込まれる。）において定義されるような「裸の」ＤＮＡであり得る。好ましくは、本ＤＮＡコンストラクトは、弱毒化ウイルス又は弱毒化細菌の遺伝物質に組み込まれるプラスミド又はＤＮＡの形態である。有用な送達ビヒクル又は担体には、生体分解性マイクロカプセル、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）及び裸のＤＮＡコンストラクトに対するリポソーム及び遺伝子操作された弱毒化生ウイルス又は細菌のための様々な生理的に許容可能な緩衝液が含まれる。
【００４４】
ＦＡＰ  ＤＮＡコンストラクトを組み込むために形質転換することができる適切な弱毒化生細菌ベクターの例には、当技術分野で公知であるように、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、バチルス・カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ））、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）又はあらゆるその他の適切な細菌ベクターが含まれる。好ましくは、特に、組成物が経口投与に対して意図される場合、ベクターは弱毒化生ネズミチフス菌ベクターである。好ましい弱毒化生ネズミチフス菌には、ＡｒｏＡ−株（ＳＬ７２０７など）又は二重弱毒化ＡｒｏＡ−、ｄａｍ−株（ＲＥ８８など）が含まれる。
【００４５】
外来ＤＮＡコンストラクトを有する生細菌ベクターを形質転換する方法は、当技術分野で詳述されている。例えば、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＤａｖｉｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ）を参照のこと。形質転換後、細菌が再生するように外来ＤＮＡがその生物のネイティブＤＮＡとともに複製されるように、細菌の遺伝物質に外来遺伝物質を組み込む。このようにして、細菌が形質転換されると、その生物の正常な再生プロセスによって、外来ＤＮＡが即時供給される。
【００４６】
好ましいウイルスベクターには、バクテリオファージ、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、シンドビスウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアウイルス及びアビポックスが含まれる。外来ＤＮＡコンストラクトでウイルスベクターを形質転換する方法もまた、当技術分野で詳述されている。上記、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ参照のこと。
【００４７】
有用なリポソーム担体ビヒクルは、脂溶性物質から形成される膜部分及び内部水性部分を有する、単層又は多重膜小胞である。標的細胞に送達しようとするポリヌクレオチド物質を含有するために、本発明において水性部分が使用される。リポソーム形成物質が四級アンモニウム基などの陽イオン基及び約６から約３０個の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和アルキル基などの１以上の脂溶性基を有することは、一般に好ましい。適切な物質の１つの基が、欧州特許公開０１８７７０２において記載され、さらに、Ｗｏｌｆｆらに対する米国特許第６，２２８，８４４号において考察されている（その関連する開示は参照により組み込まれる。）。多くのその他の適切なリポソーム形成陽イオン性脂質化合物が文献に記載されている。例えば、Ｌ．Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７、１９８８年、ｐ．３９１７−３９２５；及びＨ．Ｅｉｂｌ他、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０、１９７９年、ｐ．２６１−２７１を参照のこと。あるいは、ポリラクチド−コグリコリド生体分解性ミクロスフェアなどのミクロスフェアを使用することができる。核酸コンストラクトはカプセル封入されるか又は、あるいは、当技術分野で公知のような、組織への核酸の送達のためのリポソームもしくはミクロスフェアと複合体化される。
【００４８】
その他の有用な担体ビヒクルには、Ｗａｎｇ他、Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．３（３）、２００４年２月１５日、ｐ．１９０−６．Ｅｐｕｂ（その関連する開示は参照により本明細書中に組み込まれる。）により記載されるような、生体分解性ポリ（オルトエステル）物質を含むポリマー性ミクロスフェアが含まれる。
【００４９】
好ましくは、本発明を具体化する組成物は、ヒトレグマインの免疫原性断片又はその機能的ホモローグをコードするＤＮＡコンストラクトを含む。レグマインの機能的ホモローグは、好ましくは、ヒトレグマインと、少なくとも約８０％のアミノ酸残基配列同一性、より好ましくは、ヒトレグマインと、少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を有する。
【００５０】
ＧｅｎＢａｎｋは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）の遺伝子配列データベースであり、これは、全公開ＤＮＡ配列の注釈付きコレクションである。ＧｅｎＢａｎｋは、ＤＮＡ  ＤａｔａＢａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎＢａｎｋの協力による、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎの一部である。
【００５１】
ヒトレグマインをコードする核酸の核酸配列、配列番号１（図８）は、ＧｅｎＢａｎｋ識別番号ＢＣ０２６２５０で公開されている（その開示は参照により本明細書中に組み込まれる。）。ヒトレグマインの対応するアミノ酸残基配列は配列番号２（図９）である。
【００５２】
マウスレグマインをコードするＤＮＡの核酸配列、配列番号３を図１０で示す。マウスレグマインの対応するアミノ酸残基配列は配列番号４（図１１）である。
【００５３】
Ｃｈｅｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．２７２（１２）、１９９７年、ｐ．８０９０−８０９８（これは、参照により本明細書中に組み込まれる。）は、ヒトレグマインと約８３％の配列同一性を有するブタレグマインの構造及び性質を報告した。
【００５４】
遺伝子コードの固有の縮重のため、本発明の実施において、ヒトレグマインに対するアミノ酸配列をコードするその他のＤＮＡ配列を使用することができる。このようなＤＮＡ配列には、ヒトレグマインとハイブリッド形成できるものが同じく含まれる。
【００５５】
本発明に従い使用することができるヒトレグマインをコードするＤＮＡ配列には、配列番号１におけるものに対して様々なヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を有し、結果としてその配列が同じレグマイン遺伝子産物をコードする、核酸が含まれる。ヒトレグマインの機能的に同等なホモローグをコードするＤＮＡ分子もまた本発明のＤＮＡ組成物において使用することができる。
【００５６】
核酸によりコードされる遺伝子産物もまた、レグマインアミノ酸残基配列中で、結果としてサイレントな変化となり、従って、機能的に同等なレグマインを産生する、アミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含有し得る。このようなアミノ酸置換は、含まれる残基の、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の類似性に基づき行われ得る。例えば、負の電荷を持つアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ；正の電荷を持つアミノ酸には、リシン及びアルギニンが含まれ；同様の親水性値を持つ非荷電極性頭部基を有するアミノ酸には次のもの：ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニン、チロシンが含まれる。本明細書中で使用する場合、機能的に同等なレグマインとは、１以上のエピトープを含み、それが、Ｔ細胞により認識される場合、これらの同じＴ細胞がレグマイン発現細胞上に提示されるレグマインエピトープを認識できるようにするタンパク質を指す。好ましい実施形態において、機能的に同等なレグマインは、ヒトレグマインのアミノ酸残基配列（配列番号２）と少なくとも約８０％の配列同一性、例えば少なくとも約９０％の配列同一性又は少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸残基配列を有する。
【００５７】
以下に限定されないがレグマイン遺伝子産物のプロセシング及び発現を変化させる変更を含む様々な末端に対して、レグマインコード配列を変更（ネイティブレグマインＤＮＡ、配列番号１に対して。）するために、レグマインをコードするＤＮＡコンストラクトを操作することができる。例えば、新しい制限部位を挿入するために、グリコシル化パターン、リン酸化などを変更するために、当技術分野で周知の技術（例えば部位特異的突然変異誘発）を用いて、ＤＮＡに突然変異を導入し得る。
【００５８】
ある好ましい実施形態において、本発明のＤＮＡ組成物は、ヒトレグマインの複数の免疫原性断片を含む免疫原性ポリペプチドをコードするＤＮＡコンストラクト及び少なくとも１つの免疫エフェクタータンパク質を操作可能にコードするＤＮＡコンストラクト（これらは両者とも免疫細胞において発現可能である。）を含む。本明細書中及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、「免疫エフェクタータンパク質」という句は、免疫系経路の調節に関与するタンパク質を意味する。好ましくは、免疫エフェクタータンパク質はサイトカインである。
【００５９】
サイトカインは、細胞増殖、細胞分化、免疫反応の調節、造血及び炎症性反応など、その他の細胞の挙動に影響を及ぼし得る細胞により産生されるタンパク質及びポリペプチドである。サイトカインは、ケモカイン、ヘマトポエチン、免疫グロブリン、腫瘍壊死因子及び様々な無所属の分子を含む多くのファミリーに分類されてきた。一般的には、「Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」改訂版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年；及びＣ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ、Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｍ．Ｗａｌｐｏｒｔ及びＭ．Ｓｃｈｌｏｍｃｈｉｋ、「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」第５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００１年（本明細書中で以後、「Ｊａｎｅｗａｙ及びＴｒａｖｅｒｓ」と呼ぶ。）を参照のこと。サイトカインの簡潔な分類は、Ｊａｎｅｗａｙ及びＴｒａｖｅｒｓ、付録ＩＩＩ、ｐ．６７７−６７９で示される（その関連する開示は参照により本明細書中に組み込まれる。）。
【００６０】
ヘマトポエチンには、例えばエリスロポエチン、インターロイキン−２（ＩＬ−２、Ｔ細胞により産生され、Ｔ細胞増殖に関与する１３３アミノ酸タンパク質）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５（１１４アミノ酸ＩＬ−２様タンパク質、これは、腸上皮、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を刺激する。）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）が含まれる。
【００６１】
インターフェロンには、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γ（Ｔ細胞及びＮＫ細胞により産生される１４３アミノ酸ホモ２量体タンパク質、これはマクロファージ活性化、ＭＨＣ分子の発現向上及び抗原プロセシング成分、ＩＧクラススイッチング及びＴＨ２の抑制に関与する。）が含まれる。
【００６２】
免疫グロブリンには、例えば、Ｂ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）（この両者とも、Ｔ細胞反応を共刺激する。）が含まれる。
【００６３】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーには、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン）、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ｔｒａｉｌ及びＯＰＧリガンドが含まれる。
【００６４】
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の生物学的役割（特に、Ｔ細胞活性化の共刺激中に抗原提示細胞上で発現されるＣＤ４０とのその相互作用）は、当技術分野で周知である。ＣＤ４０は、全成熟Ｂ細胞、殆どのＢ細胞悪性腫瘍及び一部の初期Ｂ細胞急性リンパ性白血病の表面上で発現される４８ｋＤａの糖タンパク質であるが、これは、形質細胞では発現されない（Ｃｌａｒｋ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ３５、１９９０年、ｐ．３３−３６）。約３５ｋＤａのＩＩ型膜タンパク質であるＣＤ４０Ｌは、抗原認識においてＴ細胞表面上で発現される。ＴＮＦファミリーのメンバーは、ホモ３量体として発現される場合に生物学的に最も活性が高い。ＣＤ４０Ｌはこの点において例外ではなく、このリガンドの細胞外ドメイン全体のＮ末端に融合した３３アミノ酸ロイシンジッパーモチーフの修飾により、ホモ３量体（ＣＤ４０ＬＴ）として発現され得る。Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１、１９９８年、ｐ．４５６３により、免疫原性が高いモデル抗原β−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡをマウスにワクチン接種した場合、ＣＤ４０ＬＴ  ＤＮＡが、ＩＦＮ−γ及び細胞溶解性Ｔ細胞活性の誘導などの細胞性免疫反応を促進することが報告されている。
【００６５】
ＣＤ４０ＬＴは、腫瘍自己抗原に対する効果的な防御免疫を誘導するのに必要なＴ細胞の活性化において重要な因子である。ＭＨＣクラスＩ抗原：ペプチド複合体が樹状細胞（ＤＣ）により取り込まれ、ナイーブＴ細胞に対して提示されると、第一の抗原シグナルがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して送達され、続いて、ＣＤ４０ＬＴが上方制御される。Ｔ細胞表面上で、次に、ＣＤ４０−ＣＤ４０ＬＴ相互作用を介してＤＣにおいてＣＤ４０ＬＴが共刺激活性を誘導する。このようにして、刺激を受けると、これらの抗原提示細胞は共刺激分子Ｂ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）を発現することができ、これは、ＣＤ２８との相互作用を介してＴ細胞に対する第二の共刺激シグナルを送る（この事象は、炎症性サイトカイン、ＩＮＦ−γ及びＩＬ１２を同時に産生するため及びエフェクター機能を実行するためのＴ細胞の完全な活性化に必要である。）。
【００６６】
特定のファミリーに割り当てられない様々なサイトカインには、例えば、腫瘍成長因子−β（ＴＧＦ−β）、ＩＬ−Ｉα、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ナチュラルキラー細胞刺激因子；ＮＫ細胞活性化及びＴＨ１様細胞へのＴ細胞分化の誘導に関与する、１９７アミノ酸鎖及び３０６アミノ酸鎖を有するヘテロ二量体）、マクロファージ阻害因子（ＭＩＦ）、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７（サイトカイン産生誘導因子、これは、上皮、内皮及び繊維芽細胞においてサイトカイン産生を誘導する。）及びＩＬ−１８が含まれる。
【００６７】
ケモカインは、比較的小さい走化性タンパク質及びポリペプチドである化学誘因性サイトカインのファミリーであり、これは、白血球移動（例えば食細胞及びリンパ球）などの様々な細胞の移動及び活性化を刺激する。ケモカインは、炎症及びその他の免疫反応に関与する。ケモカインは、Ｃケモカイン、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン及びＣＸ３Ｃケモカインを含む多くのファミリーに分類されている。これらの名称は、分子中のシステイン（ｃ）残基の数及び間隔を指し；Ｃケモカインは１個のシステインを有し、ＣＣケモカインは２個の連続システインを有し、ＣＸＣは２個のシステインが１個のアミノ酸残基で隔てられており、ＣＸ３Ｃケモカインは２個のシステインが３個のアミノ酸残基で隔てられている。ケモカインは、細胞表面上に存在する多くのケモカイン受容体と相互作用する。Ｊａｎｅｗａｙ及びＴｒａｖｅｒｓ、付録ＩＶ、６８０頁（これは、参照により本明細書中に組み込まれる。）。
【００６８】
さらに、ケモカインは、免疫修飾活性を有し得、癌に対する免疫反応に関与している。例えば、マウス６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ（ヒト二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）のマウス類似体）は現在、一般にＣＣＬ２１と呼ばれ、Ｃ−２６結腸癌腫瘍細胞株において抗腫瘍反応を誘導することが報告されている。Ｖｉｃａｒｉ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（４）、２０００年、ｐ．１９９２−２０００を参照のこと。ヒトＣＣＬ２１及びそのマウス対応物である６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣはＣＣケモカインとして分類され、これは、ＣＣＲ７ケモカイン受容体と相互作用する。マウス６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ（ｍｕＣＣＬ２１）はまた、Ｖｉｃａｒｉらによって、ＣＸＣＲ３ケモカイン受容体に対するリガンドであることも報告されている。ヒトＣＣＬ２１、マウスｍｕＣＣＬ２１及び様々なその他のケモカインは、樹状細胞、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの様々な免疫系細胞の調節に関与する。
【００６９】
Ｍｉｇ及びＩＰ−１０は、活性化Ｔ細胞に関連するＣＸＣＲ３受容体と相互作用するＣＸＣケモカインである。リンホタクチンは、Ｃケモカインであり、これは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞と関連するＸＣＲ１受容体と相互作用する。フラクタルカインは、ＣＸ３Ｃケモカインであり、これは、Ｔ細胞、単球及び好中球と関連するＣＸ３ＣＲ１受容体と相互作用する。
【００７０】
本発明のＤＮＡ組成物にコードされるべき特に好ましい免疫エフェクタータンパク質には、サイトカイン、ＩＬ−２（ヘマトポエチン）、ＣＣＬ２１（ケモカイン）ならびにＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０リガンド三量体（ＣＤ４０ＬＴ）など）、ＴＮＦファミリーサイトカインが含まれる。
【００７１】
ヒトＩＬ−２に対するＤＮＡ及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、識別番号ＢＣ０７０３３８で公開されている（この開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。）。マウスＩＬ−２のＤＮＡ及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、識別番号ＮＭ００８３６６で公開されている（この開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。）。
【００７２】
ヒトＩＬ−２をコードする核酸配列を図１２（配列番号５）で示し、対応するそのアミノ酸残基配列（配列番号６）を図１３で提供する。
【００７３】
ヒトＣＣＬ２１に対するＤＮＡ及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、識別番号ＡＢ００２４０９で公開されている（この開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。）。
【００７４】
ヒトＣＣＬ２１をコードする核酸配列は図１４（配列番号７）で示し、対応するそのアミノ酸残基配列（配列番号８）を図１５で提供する。
【００７５】
ヒトＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、２６１アミノ酸タンパク質であり、これは、その最も活性のある形態で三量体（ＣＤ４０ＬＴ）として存在する。ヒトＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４としても知られる。）をコードするＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、識別番号ＮＭ００００７４で公開されている（この開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。）。（図１６、配列番号９）。ＣＤ４０Ｌの対応するタンパク質配列は図１７（配列番号１０）で示す。
【００７６】
本発明の方法態様は、哺乳動物の免疫細胞において発現可能である、レグマインをコードするＤＮＡコンストラクトを含むＤＮＡ組成物の哺乳動物への投与を含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。組成物が調製される特定の剤形に依存して、この組成物を経口、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、皮内又は局所投与し得る。好ましくは、溶液、懸濁液、乳剤、カプセル、錠剤などの経口投与可能な剤形でこの組成物を調製する。
【００７７】
本組成物で治療される患者において腫瘍成長及び／又は腫瘍転移の長期阻害をもたらすために、本発明のＤＮＡ組成物を利用することができる。好ましい実施形態において、抗腫瘍化学療法剤と組み合わせて、本ＤＮＡ組成物を投与する。併用剤形で化学療法剤とともに本ＤＮＡ組成物を投与することができるか、又は、投与される化学療法剤の薬理学に合わせた別個の剤形及び別個の投与間隔で、本組成物及び化学療法剤を投与することができる。
【００７８】
本発明のＤＮＡ組成物との組み合わせにおいて有用な化学療法剤には、ドキソルビシン、パクリタキソール（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、シクロホスファミド、エトポシド、５−フルオロウラシル、メトトレキセートなどの抗癌剤が含まれる。
【００７９】
組成物の処方及び投与を促進するために、本発明のＤＮＡ組成物は、好ましくは、医薬的に許容可能な担体又は賦形剤（水、食塩水、デキストロース、グリセロールなど及びその組み合わせ）とともに処方される。本組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤などの補助物質及び医薬の技術分野で周知のその他の補助物質も含有し得る。
【００８０】
本発明の組成物は、好ましくは、レグマインをコードするＤＮＡの重量に基づき、約１から約１０μｇ／ｍＬの範囲のＤＮＡ濃度で、医薬的に許容可能な担体中の溶液又は懸濁液として、ヒトなどの哺乳動物に経口投与される。本発明のＤＮＡ組成物に対する特定の好ましい剤形は、適切な緩衝溶液中の弱毒化レグマイン−遺伝子移入細菌の懸濁液であり、これは、経口投与用に処方することができる。本組成物の適切な投与量は、ワクチン接種しようとする対象、組成物の活性及び、ある部分、本組成物の投与を行うか又は投与を要求する医師の判断に依存する。
【００８１】
哺乳動物に投与しようとする投与量及び複数の投与が使用されるべき場合、投与のスケジュールは、哺乳動物により様々であり、剤形による。当技術分野で周知のように、臨床用量反応研究を通じて、有効投与量及び投与スケジュールを経験的に決定することができる。レグマインを発現する腫瘍関連マクロファージに対する哺乳動物での免疫反応を誘発するための免疫細胞でのレグマイン発現の十分量を提供するために、投与量及び投与スケジュールを選択する。好ましくは、対象哺乳動物に投与される本組成物の投与量は、少なくとも１ヵ月、例えば少なくとも６ヵ月又は少なくとも約１年という期間にわたり継続する、レグマイン提示腫瘍関連マクロファージに対する免疫反応を維持するために、哺乳動物の免疫細胞においてレグマイン抗原の十分量の発現を誘発する。ある好ましい実施形態において、患者に投与されるレグマイン形質転換細胞の投与量は、レグマインＤＮＡの約０．３から約０．８μｇを遺伝子移入した、約１ｘ１０８個の細胞である。
【００８２】
本発明の組成物は、複数回投与又は単位剤形の何れかで、アンプル、瓶又はバイアルなどの適切に滅菌された容器に封入され得る。この容器は、好ましくは、本発明のＤＮＡ組成物を充填後、密封して封入される。好ましくは、それに固定されたラベル（これは、組成物を示し、適切な法律下で組成物の承認を反映するＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎなどの政府機関により規則として定められた形態での通告、投与情報などを有する。）を有する容器に本組成物を封入する。このラベルは、好ましくは、本組成物を患者に投与するヘルスケア専門家に有用な組成物に関する情報を含有する。このパッケージはまた、好ましくは、組成物の投与、説明、指示及び何らかの必要な警告に関する印刷された情報資料も含有する。
【００８３】
本発明の特性及び実施形態をさらに説明するために次の実施例を提供するが、これに限定されないものとする。
【００８４】
材料及び方法
動物、菌種及び細胞株。Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから、雌ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウス、６−８週齢を購入した。Ｒｅｍｅｄｙｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｏｌｅｔａ、ＣＡから、二重弱毒化したＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＲＥ８８（ａｒｏＡ−、ｄａｍ−）を得た。マウスＣＴ−２６結腸癌細胞株は、Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ博士（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）の好意により提供され、マウスＤ１２１非小細胞肺癌細胞は、Ｌ．Ｅｉｓｅｎｂａｃｈ（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）から寄贈された。マウス４Ｔ１乳癌細胞は、Ｓｕｚａｎｎｅ  Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ）の好意により提供された。
【００８５】
免疫組織化学分析。４Ｔ１腫瘍組織及びマトリゲルプラグ切片において免疫組織化学分析を行った。ビオチン化ラット抗マウスＣＤ６８ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で、二次レポーター試薬であるＧＦＰ結合ストレプトアビジンを用いて、４Ｔ１腫瘍組織切片においてマクロファージのレグマイン発現を同定した。Ｅ．コリにおいて産生された精製ヒトレグマインでの免疫付与により、ウサギ抗レグマイン抗血清を調製した。（Ｉｓｈｉｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４、１９９４年、ｐ．６０４−６１５）。テキサスレッド結合ストレプトアビジンでこの反応を視覚化した。さらに、４Ｔ１腫瘍組織切片及びマトリゲルプラグ切片を固定し、４Ｔ１腫瘍組織切片はＭＭＰ−９、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β及びＦ４／８０抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色し、一方、マトリゲルプラグ切片ではＣＤ６８及びＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用した。テキサスレッド又は二次レポーター試薬としてＧＦＰ結合ストレプトアビジンで全ての組織切片を視覚化し、共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によりレーザー走査でスライドを分析した。画像は全て、ＳＰＯＴＴＭ  ｃｏｏｌｅｄ  ｃｏｌｏｒ  デジタルカメラシステム（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．）により取り込んだ。
【００８６】
免疫付与及び腫瘍細胞接種。予防モデル：ＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６マウスをそれぞれ３つの実験群（ｎ＝８）に分け、ＰＢＳ、空のベクター又はｐＵｂ−レグマイン遺伝子移入ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）で免疫付与した。実験的又は自然発生的肺転移の何れかを誘発するために、最後の免疫付与から１週間後、約５ｘ１０４個のＣＴ−２６細胞（ＢＡＬＢ／ｃ）、約２ｘ１０５個のＤ１２１細胞（Ｃ５７ＢＬ／６）を静脈内（ｉ．ｖ．）注入により、又は約７ｘ１０３個の４Ｔ１細胞（ＢＡＬＢ／ｃ）を乳腺脂肪体注入により、全マウスに接種した。腫瘍細胞接種から２４日後、実験及び対照群の肺重量を調べた。治療モデル：ＢＡＬＢ／ｃマウスを３つの実験群（ｎ＝８）に分け、約７ｘ１０３個の４Ｔ１細胞を脂肪体に最初に第０日に接種し、次いで、第３、７及び１１日に開始して本発明のＤＮＡ組成物を用いて３回免疫付与した。２４日後、マウス肺重量及び転移スコア又はマウス生存率を調べるために、原発腫瘍を切り出した。
【００８７】
ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞のインビボ枯渇、細胞毒性及びＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。既に記載のようにインビボでのＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇を行った（Ｃｅｒｅｄｉｇ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４、１９８５年、ｐ．９８−１００）。細胞毒性を測定し、既に報告されているように、標準的５１Ｃｒ−放出アッセイにより計算した（Ｚｈｏｕ他、Ｂｌｏｏｄ  １０６、２００５年、ｐ．２０２６−２０３２）。製造者により提供された説明書に従い、ＥＬＩＳＰＯＴキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。
【００８８】
インビボマトリゲル血管形成アッセイ。ワクチン接種後の血管形成の抑制を評価するために、マトリゲルを使用した。簡潔に述べると、最後のワクチン接種から２週間後に、ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ−２（約２００ｎｇ／プラグ）を含有する成長因子−低下マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び前もってγ線１０００グレイ（約１００，０００ｒａｄ）を照射した４Ｔ１腫瘍細胞（約５ｘl０３／プラグ）をＢＡＬＢ／ｃマウスの胸骨領域に皮下注入（ｓ．ｃ．）した。フルオレセインを結合させたバンデイエラ・シンプロフィカ（Ｂａｎｄｉｅｒａ  ｓｉｍｐｌｏｆｉｃａ）レクチンＩ（イソレクチンＢ４）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のｉ．ｖ．注入により、マトリゲル移植から６日後、内皮を染色した。対照動物の内皮の染色とともにこれを行った。約３０分後、マウスを屠殺し、マトリゲルプラグを抽出し、蛍光定量により蛍光を評価した。さらに、マトリゲル移植から６日後にマトリゲルプラグを取り出し、ブアン溶液で２４時間固定し、次いでパラフィン中に包埋した。全組織を切片化し、スライド上に載せ、Ｍａｓｓｏｎのトリクロムで染色した。上述のように画像全てをＳＰＯＴＴＭ  ｃｏｏｌｅｄ  ｃｏｌｏｒ  デジタルカメラシステムにより取り込んだ。
【００８９】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳ  ＣＡＬＩＢＵＲ（Ｒ）分析装置による２色フローサイトメトリー分析により、Ｔ細胞の活性化マーカーを測定した。ワクチン接種に成功したマウス及び対照マウスから新たに単離したリンパ球を、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＭＨＣ−クラスＩＩ  Ａｇに対するＡｂと組み合わせて抗ＣＤ１１ｃ  Ａｂで染色することにより、ＤＣ細胞マーカーを調べた。２色フロー分析によりＣＤ２０６及びＦ４／８０が高レベルであるマクロファージを定量した。ワクチン接種に成功したＢＡＬＢ／ｃマウスから腫瘍細胞を単離し、次いでＰＥ結合抗ＣＤ２０６Ａｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．）、ＡＰＣ結合抗Ｆ４／８０Ａｂ及びＦＴＴＣ結合抗レグマインＡｂで染色し、次いでＦＡＣＳ分析を行った。抗体は全て、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから購入した。１回の免疫付与から３日後に得たパイエル板のリンパ球において、細胞内レベルでのＩＦＮ−γ放出を調べ、ＡＰＣタグ付加抗ＣＤ８Ａｂで染色した。細胞を固定し、透化処理し、次に、ＩＦＮ−γの細胞内発現を検出するために、ＰＥ標識抗ＩＦＮ−γＡｂで染色した。
【００９０】
移動アッセイ。改変ボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバー（トランスウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を用いることにより、細胞移動アッセイを行った。トランス−ウェル移動アッセイを行うために、マウスの治療群又は対照群の何れかの腫瘍組織から、腫瘍細胞を回収した。４時間培養した後、ウェルの下面の細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定し、１％クリスタルバイオレットで染色し、数えた（Ｓｈｉ他、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２、２００４年、ｐ．３９５−４０２）。
【００９１】
統計学的解析。スチューデントのｔ検定により、実験群と対照との間の差異の統計学的有意性を調べた。両側Ｐ値が＜０．０５である場合、結果を有意であるとみなした。マウスの生存を評価するために、カプラン−マイヤー分析を使用した。
【実施例１】
【００９２】
ベクター構築、タンパク質発現及びＤＮＡプラスミドによるネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の形質転換。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから市販されているｐＣＭＶベクターに基づき、２つのコンストラクトを調製した。ｐＵｂ−レグマインコンストラクトには、ポリユビキチン化、全長マウスレグマインが含まれた。全長レグマインマウスレグマインＤＮＡは、図１０、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有する（マウスレグマインのアミノ酸残基配列は図１１、配列番号４で示す。）。空のベクターコンストラクトを対照とした。鋳型としてトータルＲＮＡを用いて、ＰＣＲにより、４Ｔ１乳癌細胞からマウスレグマインを回収した。レグマイン配列の前にクローニングされたポリユビキチン配列を含有するｐＣＭＶ−ｃｙｔｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づき、発現ベクターを確立した。ポリユビキチン化（ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｎａｔｅｄ）マウスレグマインの核酸配列を図１８（配列番号１１）で示す。ユビキチン化（ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｎａｔｅｄ）マウスレグマインのアミノ酸残基配列は図１９（配列番号１２）で示す。ポリクローナルウサギ抗マウスレグマインＡｂならびにローディング対照として抗マウスβ−アクチンＡｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ）を用いてウエスタンブロッティングによって、レグマインのタンパク質発現を明らかにした。ヤギ抗ウサギ−ＨＲＰ結合ＩｇＧ  Ａｂ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で特異的タンパク質を検出した。Ｌｕｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００、２００３年、ｐ．８８５０−８８５５及びＸｉａｎｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７、２０００年、ｐ．５４９２−５４９７に記載のようにエレクトロポレーションによって、弱毒化ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）にＤＮＡワクチンプラスミドを形質導入した。
【実施例２】
【００９３】
免疫原性マウスレグマイン断片。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから市販されているｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ＥＲ  ＭＣＳプラスミドにレグマインミニ遺伝子を挿入することにより、各断片間の３−アミノ酸スペーサー（ＡＡＹ）により連結される３個の免疫原性レグマイン断片をコードするレグマインミニ遺伝子をそれぞれ含む２種類のプラスミドを調製した（図２０及び２１参照）。このベクターは、ＥＲシグナルペプチド、ｍｙｃエピトープ及びＥＲ保留シグナルをコードするセグメントを含む（図２１参照）。図２１で示されるように、ＥＲシグナルペプチドセグメントのＢｓｓＨ  ＩＩ部位とＸｈｏＩ部位との間にこのミニ遺伝子を挿入した。第一のレグマインミニ遺伝子プラスミド（ｐＣＭＶ−Ｄｂ／Ｄｄ；図面においてｐＨ−２Ｄｄとも呼ぶ。）は、ＡＡＹスペーサー、免疫原性レグマイン断片ｌｅｇｕ１３７、ＡＡＹスペーサー、免疫原性レグマイン断片ｌｅｇｕ２３８、ＡＡＹスペーサー及び免疫原性レグマイン断片ｌｅｇｕ２２３を含む。第二のレグマインミニ遺伝子プラスミド（ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄ；図面においてｐＨ−２Ｋｄとも呼ぶ。）は、ＡＡＹスペーサー、免疫原性レグマイン断片ｌｅｇｕ４０５、ＡＡＹスペーサー、免疫原性レグマイン断片ｌｅｇｕ１８０、ＡＡＹスペーサー及び免疫原性レグマイン断片ｌｅｇｕ２２９を含む。図２０は、免疫原性レグマイン断片に対するアミノ酸残基配列、ならびにＭＨＣクラスＩ結合スコア及び各断片に対する配列識別番号（配列番号）を示す。モノクローナル抗ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、遺伝子移入したＣＯＳ−７細胞のウエスタンブロッティングによって、ペプチド発現を確認した。ペプチド発現を確認した後、ベクターのｍｙｃエピトープ配列のすぐ前に停止コドンを導入した。得られたミニ遺伝子プラスミドベクター（ｐＣＭＶ−Ｄｂ／Ｄｄ及びｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄ）をヌクレオチド配列決定によりそれぞれ確認し、次いで、レグマインミニ遺伝子をコードする本発明のＤＮＡ組成物を提供するために、エレクトロポレーションによって弱毒化ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＲＥ８８細菌に遺伝子移入した。下記で詳述するように、これらの組成物は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの４Ｔ１及びＤ２Ｆ２乳癌を攻撃するために有効であった。観察された腫瘍予防反応には、ＣＤ８Ｔ細胞が介在し、これは、レグマイン＋腫瘍関連マクロファージ細胞を特異的に死滅させ、結果として腫瘍血管形成が顕著に抑制された。
【００９４】
経口免疫付与及び腫瘍細胞接種。空のベクター、ｐＣＭＶ−Ｄｂ／Ｄｄプラスミド又はｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄプラスミドの何れかを有する二重弱毒化ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のおよそ５ｘ１０８ＣＦＵを含有する１００μＬ  ＰＢＳの強制経口投与により、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）の群を１週間間隔で３回処置した。最後の処置から２週間後に、ｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．でＤ２Ｆ２癌細胞株をマウスに接種した。
【００９５】
細胞毒性アッセイ。既に記載のとおり、標準的な５１Ｃｒ−放出アッセイにより、細胞毒性を測定した。式［Ｅ−Ｓ）／（Ｔ−Ｓ）］ｘ１００（式中、Ｅは、平均実験放出であり、Ｓは、平均自然発生放出であり、Ｔは平均トータル放出である。）により、特異的標的細胞溶解の％を計算した。
【００９６】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。Ｄ２Ｆ２腫瘍細胞接種から２週間後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの全ての実験群から脾臓細胞を回収し、照射済み（１０００Ｇｙ）４Ｔ１細胞又は新たに回収した４Ｔ１乳癌組織から得た４Ｔ１細胞の何れかとともに２４時間培養した。製造者（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により提供される説明書に従い、アッセイを行った。
【００９７】
抗血管形成活性の評価。既に記載のようにマトリゲルアッセイによって血管形成の抑制を調べた。ドラブキン（Ｄｒａｂｋｉｎ）試薬（１ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、０．０５ｇ／Ｌ  ＫＣＮ及び０．２ｇ／Ｌ  Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６を含有する水溶液）を用いてヘモグロビンの濃度を測定することにより、マトリゲル中の血管成長を調べた。マトリゲル移植から６日後にマトリゲルプラグを取り出し、ブアン溶液（１５部  ｗ／ｗ飽和ピクリン酸水溶液、３７％ホルマリン水溶液５部  ｗ／ｗ及び氷酢酸１部  ｗ／ｗ）中で２４時間固定し、パラフィン包埋した。全組織を切片化し、スライド上に載せ、Ｍａｓｓｏｎのトリクロムで染色した。画像全てをＳＰＯＴＴＭ  Ｃｏｏｌｅｄ  Ｃｏｌｏｒ  デジタルカメラシステムにより取り込んだ。本発明のミニ遺伝子アプローチを用いて、同系ＢＡＬＢ／ｃマウス、抗ＴＡＭミニ遺伝子ＤＮＡ組成物は腫瘍成長及び血管形成の両方を抑制した。ＮＩＨウェブサイトのＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）により提供されるＨＬＡペプチド結合予想プログラムによるこれらのＭＨＣクラスＩ抗原分子の結合予想に基づき、Ｈ−２Ｄｄ−１，２，３又はＨ−２Ｋｄ−１，２，３−制限ミニ遺伝子として、６個のレグマイン免疫原性ペプチドを評価した。これらのペプチドのアミノ酸配列及びＤＮＡＳＴＡＲ（Ｒ）ソフトウェア（ＤＮＡＳｔａｒ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で予想されるようなそれらの結合活性を図２０で列挙する。
【００９８】
ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄミニ遺伝子ワクチンは、Ｄ２Ｆ２乳癌細胞接種からマウスを保護し、肺転移を防ぐ。最初に、予防的乳癌モデルにおいてミニ遺伝子ＤＮＡ組成物を試験した（この場合、マウスに最初にミニ遺伝子組成物を接種し、次いでマウスＤ２Ｆ２乳癌細胞をｓ．ｃ．で接種した。）（図２２）。ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄでワクチン接種した同系ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、腫瘍成長の顕著な阻害が観察されたが、ｐＣＭＶ−Ｄｂ／Ｄｄでは観察されなかった。一方、空のベクター対照ベクターのみでワクチン接種した全マウスで急速なｓ．ｃ．腫瘍成長が明らかになった。
【００９９】
３回目のワクチン接種から２週間後、Ｄ２Ｆ２乳癌細胞をｉ．ｖ．注入により接種したＢＡＬＢ／ｃマウスで観察される実験的転移の顕著な阻害により示されるように、ＴＡＭを攻撃することによって、ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄレグマインミニ遺伝子ワクチンは、肺Ｄ２Ｆ２転移を抑制した。一方、ｐＣＭＶ−Ｄｂ／Ｄｄは、このモデルにおいて転移を防御しなかった。空のベクター対照のみでワクチン接種したマウスから、均一で急速な転移性の肺腫瘍成長が明らかになった（図２３）。
【０１００】
ミニ遺伝子ワクチンは、レグマイン＋細胞を死滅させることができるＣＴＬ反応を誘導した。ミニ遺伝子ワクチン接種後に達成された特異的Ｔ細胞反応を示すために、活性化Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの特異的放出によって、Ｔ細胞活性化を明らかにした（図２４、パネルＢ）。フローサイトメトリー分析により示されるように、レグマインを高発現した新鮮な４Ｔ１腫瘍組織から回収した細胞でこれらの細胞を刺激した（図２４、パネルＡ）。重要なこととして、細胞毒性アッセイは、免疫付与マウスでのみ、明らかに、顕著なＣＴＬ活性を示した。標的細胞は、マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷの細胞であり、これは、レグマインの発現を誘導するために、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３サイトカインとともに培養したものであった。これもまた、ウエスタンブロット分析により確認したが（図２５、パネルＡ）、ここで、野生型ＲＡＷ細胞がレグマイン陰性であることが分かった。空のベクターで処置した対照マウスから単離された脾臓細胞は、レグマイン発現に対して陽性又は陰性何れかのＲＡＷ細胞の同様のバックグラウンド細胞死滅を示した（図２５、パネルＢ）。しかし、ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄ処置マウスからの脾臓細胞は、ｐＣＭＶ−Ｄｂ／Ｄｄ又は空のベクターで処置したマウスから回収したこのような細胞に対するものよりも、レグマイン＋標的細胞に対して有意に強い殺細胞を誘導した（図２５、パネルＢ）。これらのデータから、ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄミニ遺伝子誘導性ＣＴＬ活性の特異性及びそのレグマイン＋マクロファージ特異的死滅能が明らかになる。
【０１０１】
ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄミニ遺伝子ワクチンは、抗血管形成効果を誘導する。抗血管形成がｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄ−ワクチン誘導性腫瘍防御において重要な役割を果たす度合いを評価するために、組み換えｂＦＧＦによりマトリゲル中で血管形成が誘発されるマトリゲルアッセイを行った。免疫付与又は対照マウスの何れかから得たマトリゲルプラグ抽出物におけるヘモグロビン（Ｈｂ）の相対濃度を測定することにより、様々な治療群間の血管形成の差異を定量した。このようにして、ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄワクチンで処置したマウスでは、Ｈｂの平均相対濃度の明らかな低下が示された（図２６、パネルＡ）。さらに、免疫付与及び対照マウスからのマトリゲル切片をＭａｓｓｏｎのトリクロム染色により分析した場合、空のベクター対照群のマウスから得たものでは、十分な複数の血管が明らかになった。一方、ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄ処置マウスからのマトリゲル切片において、血管が顕著に減少した（図２６、パネルＢ）。これらのデータから、ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄワクチンでの免疫付与の結果、腫瘍血管系が減少したことが分かる。まとめると、これらの所見から、ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄミニ遺伝子組成物は、顕著な抗血管形成効果を誘導し、これが、予防的設定においてＤ２Ｆ２乳癌細胞の接種からのＢＡＬＢ／ｃマウスの保護を促進したことが示された。
【０１０２】
別個の実験において、同系Ｃ５７／ＢＬマウスでＤ１２１非小細胞癌細胞を用いて、ｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄ及びｐＣＭＶ−Ｄｂ／Ｄｄ組成物の両方が、有効な抗ＴＡＭ免疫反応を与えた。
【０１０３】
考察
レグマインは、腫瘍進行中に過剰発現されるＴＡＭを死滅させるための標的として働く。腫瘍進行及び転移においてＴＡＭが重要な役割を果たすことは周知である。従って、これらのＭ２マクロファージの標的化は、新規抗腫瘍ストラテジーを表す。腫瘍微小環境及び間質でのこれらの細胞でのその高レベル発現のために、ＴＡＭの重要なマーカー分子としてレグマインが最初に同定された。マウス４Ｔ１乳癌組織からＴＡＭを単離した。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）から、特に脾臓において正常Ｍ１マクロファージと比較した場合、ＣＤ２０６及びＦ４／８０二重陽性Ｍ２マクロファージにおいてレグマインが顕著に過剰発現されたことが分かった（図１、パネルＢ）。この結果はまた免疫組織化学分析により確認し、これにより、Ｈ／Ｅ染色によりＴＡＭを視覚化することができたことが示され、抗ＣＤ６８Ａｂ（赤色）と組み合わせた抗レグマイン抗体（Ａｂ）（緑色）での二重染色により、レグマイン過剰発現がさらに示された（図１、パネルＡ）。これらのデータから、４Ｔ１腫瘍組織において浸潤ＴＡＭが不均衡に大きな細胞サブ集団であり、レグマインがＴＡＭを死滅させるための潜在的な有効な標的であることが分かる。
【０１０４】
Ｔｈ２サイトカインによるＴＡＭにおけるレグマイン発現の誘導。ＴＡＭにおけるレグマイン発現がＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３などのＴｈ２サイトカインにより誘導された度合いを評価するために、これらのサイトカインと同時培養したマウスマクロファージ細胞株、ＲＡＷを使用した。レグマインの上方制御と同時に、これらのＲＡＷ細胞におけるＣＤ２０６＋、Ｆ４／８０＋発現の顕著な上昇が観察された。（図１、パネルＣ）。ウエスタンブロッティングによりこれらの結果を確認した（図１、パネルＤ）。これらの同じサイトカインとともに培養した場合、腫瘍細胞株によるレグマイン発現に対する証拠が見られなかった。これらの所見から、ＩＬ−４、ＢＬ−１０及びＩＬ−１３などのＴｈ２サイトカインが腫瘍及びその他の腫瘍間質細胞により放出され、腫瘍微小環境で蓄積されることが示される。この環境において、サイトカインは、増殖及びＭ１マクロファージからレグマインを過剰発現するＭ２表現型を有する集団への形質転換を誘導することができる可能性がある。
【０１０５】
ＴＡＭの標的化により、腫瘍進行が抑制される。腫瘍の成長及び転移は、ＴＡＭの存在とよく連携しており、従って、このマクロファージサブ集団の標的化により、腫瘍成長及び転移の抑制が導かれる。これらのＴＡＭに対して免疫反応を誘導するために、レグマインをコードするＤＮＡ組成物に対する発現ベクターを調製した。
【０１０６】
免疫細胞にレグマインＤＮＡに対する送達ビヒクルを提供するために、レグマインをコードするプラスミドベクターを弱毒化ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＲＥ８８株）に遺伝子移入した。弱毒化細菌の同じ株に空のプラスミドベクターを組み込むことにより、対照組成物を調製した。図２、パネルＡは、レグマインをコードするＤＮＡを組み込む、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏベクター骨格に基づくベクターコンストラクトマップを図式的に示す。プロテアソームにおいて抗原プロセシングを向上させるために、突然変異ポリユビキチン（ｐＬｅｇｍａｉｎ）のＣ末端にレグマインをコードする遺伝子を融合させた。次に、プラスミドのＰｓｔＩとＮｏｔＩ制限部位との間に断片全体を挿入した。ウエスタンブロッティングによってレグマイン発現を明らかにした。予防的及び治療的設定の両方において、レグマインに基づく本発明のＤＮＡ組成物を用いてＴＡＭの数を減少させることによって、マウスモデルにおける、自然発生的４Ｔ１乳癌転移及びＤ１２１非小細胞肺癌及びＣＴ２６結腸癌の転移が効果的に阻害された。
【０１０７】
予防的設定において、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；対照群１）、空のベクター（対照群２）を組み込む弱毒化ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）又は本発明のＤＮＡ組成物（ｐＬｅｇｍａｉｎ−遺伝子移入弱毒化ネズミチフス菌；治療群）の何れかで、３回、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに免疫付与した。最後の免疫付与から１週間後、これらのマウスに約２ｘ１０５個のＤ１２１非小肺癌細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）接種した。約２４日後、肺転移を測定し、分析した。２つの対照群において、平均肺重量は、治療群よりも有意に重かった（図２、パネルＢ）。同系ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６結腸癌モデル及び４Ｔ１乳癌モデルにおいて同様の結果が得られた（図２、パネルＢ）。
【０１０８】
より厳しい治療設定において、ＢＡＬＢ／ｃマウスに最初に４Ｔ１乳癌細胞を接種し、次いで、上述のように、ｐＬｅｇｍａｉｎに基づくＤＮＡ組成物（治療群）、ＰＢＳ（対照）又は空のベクター組成物（対照）で３回免疫付与した。４Ｔ１腫瘍細胞での接種から１２日後、原発腫瘍を外科的に切除した。対照及び治療群に対する寿命曲線から、ｐＬｅｇｍａｉｎで免疫付与したマウスの７５％（６／８）が３ヶ月生存したことが示された。一方、対照群におけるマウスは全て１ヵ月以内に死亡した（図２、パネルＣ）。これらのデータから、４Ｔ１乳癌、Ｄ１２１非小細胞肺癌及びＣＴ−２６結腸癌のマウスモデルにおいて、本発明のレグマインに基づくＤＮＡ組成物が効果的に腫瘍細胞成長及び転移を抑制することが示される。手術と合わせて、これらの非常に厳しい治療的マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍細胞転移を阻害することによって、この処置は、実際に、マウスの寿命を有意に延長させ得た。
【０１０９】
レグマインを標的化することによって、腫瘍間質においてＴＡＭ集団を減少させる特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ反応が誘導される。レグマインに対する免疫付与によって、このアスパラギニルエンドペプチダーゼを高発現するＴＡＭに対する特異的Ｔ細胞反応が誘導された。５１Ｃｒ放出アッセイによって特異的Ｔ細胞反応が明らかになったが、この場合、本発明のＤＮＡ組成物での免疫付与に成功したマウスから単離される脾臓細胞がＲＡＷマクロファージを死滅させることにおいて有効であったが、このＲＡＷマクロファージは、サイトカイン、ＩＬ−４、ＢＬ−１０及びＩＬ−１３との培養後、レグマインを高レベルで発現した。これらの同じ脾臓細胞は、レグマインを発現しなかった細胞の細胞毒性細胞死滅を誘導することができず（図３、パネルＡ）、このことから、レグマインに対するこのＴ細胞反応に対する高い特異性が示唆される。さらに、５１Ｃｒ放出アッセイにおいて標的としてレグマイン遺伝子移入細胞を用いることにより、同じ結果が得られた（図７）。さらに、図３、パネルＢで示された結果により、レグマインに基づく本発明のＤＮＡ組成物での治療後、Ｆ４／８０＋／ＣＤ２０６＋マクロファージ集団の劇的な減少が明らかとなる。これらのデータもまた、図３、パネルＣで示されるように、免疫組織化学染色により確認した。
【０１１０】
ＭＨＣ−クラスＩ制限ＣＤ８＋ＣＴＬは、ＴＡＭに対して特異的に活性がある。理論に縛られることは望まないが、遺伝子移入された細菌は消化器官のパイエル板により取り込まれ、ここで、次に、レグマインＤＮＡがマクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）などの免疫細胞に組み込まれ、次にこれがレグマインＤＮＡを発現する、と考えられている。上方制御されたＤＣ活性化マーカー、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＭＨＣ−１により示されるように、免疫付与に成功したマウスのパイエル板のＤＣは、ｐＬｅｇｍａｉｎでのワクチン接種から３日後に活性化されることが分かった。（図４、パネルＡ）。ワクチン接種に成功したマウスから得られた脾臓細胞におけるＩＮＦ−γ及びＣＤ８に対する二重染色により（図４、パネルＢ）及びレグマイン陽性細胞で刺激された活性化Ｔ細胞によるＩＮＦ−γの特異的放出により（図４、パネルＣ）示されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化もまた、レグマインに対して特異的であることも分かった。さらに、インビボでのＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫枯渇から、それらの枯渇のみが完全にこの細胞死滅効果を無効にしたので、ＴＡＭの特異的な細胞毒性細胞死滅においてＣＤ８＋Ｔ細胞のみが主要な役割を果たすことが明らかになった。抗Ｈ−２Ｄｄ／Ｈ−２Ｋｄ抗体により細胞死滅が特異的に阻害されたので、この特異的細胞毒性は、ＭＨＣ−クラスＩ抗原限定であった（図４、パネルＤ）。まとめると、これらの結果から、本発明のレグマインに基づくＤＮＡ組成物が最初にパイエル板でＤＣを活性化し、その後、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）へのＭＨＣ−クラスＩ抗原経路を通じてこれらの細胞がレグマインペプチドを提示し、その結果、特異的細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞反応がＴＡＭを排除したことが示唆される。
【０１１１】
腫瘍間質におけるＴＡＭの排除により、腫瘍成長因子及びプロ血管形成因子の放出が低下し、同時に、腫瘍細胞移動及び転移が阻害される。ＴＡＭは腫瘍血管形成ならびに腫瘍成長及び転移を刺激する広範囲の腫瘍成長因子、プロ血管形成因子及び腫瘍関連酵素を分泌するので、ＴＡＭは、いくつかの方法で、腫瘍転移に影響を与え得る。ＴＡＭの排出がこれらの因子の一部の放出を実際に低下させた度合いを評価するために、ワクチン接種マウスから及び適切な対照動物から血清及び腫瘍組織細胞を回収した。新たに単離した腫瘍細胞を培養し、それらの上清をそれぞれ２４及び４８時間で回収した。ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−βを定量するために行われるＥＬＩＳＡから、腫瘍細胞上清及び血清の両方においてＴＮＦ−α及びＶＥＧＦの有意な低下が示された。細胞上清においてのみＴＧＦ−βが低下し、血清中では低下しなかった。（図５、パネルＡ）。
【０１１２】
免疫組織学的染色により、腫瘍組織におけるこれらの因子の発現の低下が確認された（図５、パネルＢ）。さらに、移動及び浸潤アッセイにおいて、治療及び対照群を比較した場合、腫瘍細胞移動の有意な低下が観察された（図５、パネルＣ）。この結果から、ＴＡＭの低下により引き起こされる腫瘍微小環境のワクチン誘導性の再構築後に腫瘍細胞の特性が変化したことが示される。治療的設定における原発腫瘍切除から２４日後、転移スコア及び肺重量を調べることにより、インビボアッセイにおいて、腫瘍転移を形成する能力を確認した。２つの対照群と比較した場合、治療マウスに対する転移スコア及び肺重量が有意に低下した（図５、パネルＤ）。
【０１１３】
腫瘍間質におけるＴＡＭの排除の結果、腫瘍血管形成が減少する。腫瘍間質においてＴＡＭを排除した後、顕著な抗血管形成効果が観察されたが、これは、一部、これらのＭ２マクロファージが多岐にわたるプロ血管形成因子を産生するという事実によるものであり得る。マトリゲルアッセイによってインビボで新しい血管成長が検出され、ＦＴＴＣ標識イソレクチンＢ４で内皮を染色することによりこれを定量した。これらの結果から、明らかに、本発明のＤＮＡ組成物でのワクチン接種後、血管成長が有意に低下したことが分かる（図６、パネルＢ）。デジタル画像及びＭａｓｓｏｎトリクロムでの染色により調べたとき、レグマインＤＮＡ組成物で処置したマウスと比較して、非常に多くの血管が、空のベクターで免疫付与された対照マウスにおいてマトリゲルプラグで成長していることが観察された（図６、パネルＡ）。さらに、マトリゲルプラグに実際に移動した細胞のタイプを評価するために、免疫化学組織学的アッセイを行った。共焦点顕微鏡画像から、ＣＤ３１を発現する内皮細胞又はＣＤ６８を発現するマクロファージが成長したか又は空のベクター対照群においてマトリゲルプラグに相当な程度移動したが治療群では相当少なかったことが示された（図６、パネルＣ）。
【０１１４】
本発明のＤＮＡ組成物で免疫付与したマウスからの脾臓細胞により、トランスジェニックレグマイン発現腫瘍細胞が標的化される。モデル実験において、レグマインプラスミドを有するレトロウイルスにより、４Ｔ１細胞株に安定的に遺伝子移入し、次いで標的細胞として使用した（図７、パネルＡ、左写真は、５ｘ倍率であり；右写真は３５ｘ倍率である。）。遺伝子移入から２日後に顕微鏡写真を撮影した。図７、パネルＡで陽性細胞を矢印により示す。５１Ｃｒ放出アッセイを行った；図７、パネルＢでデータを示す。ｐＬｅｇｍａｉｎ  ＤＮＡ組成物で免疫付与されたマウスから単離した脾臓細胞は、レグマインを遺伝子移入した４Ｔ１細胞を死滅させることにおいて有効であった（＊空のベクター対照群と比較してＰ＜０．０１）。レグマイン発現がない４Ｔ１細胞は細胞溶解されなかったので、腫瘍特異的Ｔ細胞が介在する細胞死滅はレグマインに特異的であった。
【０１１５】
本発明は、腫瘍治療に対する新しい範例を提供し、即ち、腫瘍間質のＴＡＭの密度低下により、腫瘍成長及び血管形成を増強する因子の放出を低下させるが、これは、腫瘍微小環境を再構築し、腫瘍細胞増殖、血管形成及び転移を顕著に抑制する。腫瘍間質のＴＡＭを標的化することによって、これらの細胞の排除が、固有の免疫系のこれらの重要な成分の正常な免疫学的機能を妨害し得る懸念が増加し得る。しかし、この場合はそうではない。
【０１１６】
循環単球は、特殊化したマクロファージの様々な形態に分化することができる多面的な前駆体である。実際、サイトカイン環境は、組織マクロファージの分化及び機能に深く影響を与える。細菌産物及びＴｈ１サイトカインにより活性化されるマクロファージは、Ｍ１表現型であるとみなされ、即ち、高い殺菌活性及び腫瘍細胞に対する細胞毒性機能を有する古典的に活性化されたマクロファージである。一方、ＩＬ−４及びＩＬ−１３などのＴｈ２サイトカイン又はビタミンＤ３及びＩＬ−１０などの免疫抑制因子により活性化されるマクロファージは、Ｍ２表現型を有するものとして分類され、これは、細胞毒性機能が低いが組織再構築活性が高いことを特徴とする。
【０１１７】
Ｍ１細胞は、免疫刺激特性を有し、病原性感染から宿主を保護し、一方で、Ｍ２細胞は、急性炎症反応を減弱させ、強く細胞の破片を取り除き、傷ついた組織の修復に必須の様々なプロ成長因子及び血管形成因子を分泌する。さらに、健康な組織又は炎症組織由来のマクロファージは腫瘍細胞を溶解させ、免疫刺激サイトカインを発現し、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖及び抗腫瘍機能を刺激するために、腫瘍関連抗原を提示することができる。ＴＡＭなどのＭ２マクロファージは、これらの活性のレベル低下を示す。これは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β及びプロスタグランジンＥ２などの腫瘍由来抗炎症分子へのそれらの曝露の結果であり得る。実際に、Ｍａｎｔｏｖａｎｉ及び共同研究者は、ＩＬ−４及びＩＬ−１０への曝露により、腫瘍における単球が極性化したタイプＩＩ又はＭ２マクロファージに進むように誘導し得ることを示唆している（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３、２００２年、ｐ．５４９−５５５）。
【０１１８】
それらが既に調べられている限り、分化した成熟ＴＡＭは、タイプＩＩマクロファージと同様の表現型及び機能を有する（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４０、２００４年、ｐ．１６６０−１６６７）。従って、腫瘍微小環境に存在するサイトカインは、動員された単核食細胞の分化を促進し、その向きを定める可能性を有する。実際に、腫瘍微小環境においてＴＡＭがＭ２マクロファージに偏向させられ、様々なプロ腫瘍成長及び血管形成因子ならびに免疫抑制分子を産生することを示唆する証拠が増えている。このようにして、腫瘍部位におけるＴＡＭの存在及びそれらの産物の連続的発現及び放出は、腫瘍進行及び転移に拮抗するというよりむしろ、それに好都合であり得る。
【０１１９】
ＴＡＭは、ＩＬ−４及びＩＬ−１３への曝露後、大量のＣＤ２０６、Ｍ２マクロファージにおいて上方制御されるマンノース受容体を発現する（Ｐｏｒｃｈｅｒａｙ他、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２、２００５年、ｐ．４８１−４８９）。本明細書中で明らかにされるように、マクロファージのこの集団は、レグマインを高レベル発現する。重要なこととして、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３は、マクロファージ細胞株ＲＡＷにおいてＣＤ２０６及びレグマインの発現を上方制御する。この所見は、末梢血由来であり、これらが、腫瘍細胞及び腫瘍間質細胞によりＩＬ−４、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０が放出される腫瘍部位に動員されるとＭ２マクロファージに分化することを考えると、最もよく理解することができる（Ｓｔｅｉｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６、１９９２年、ｐ．２８７−２９２）。このようにして、レグマインを発現するＭ２マクロファージの標的化は、腫瘍成長及び転移の抑制に利益があるだけでなく、Ｍ１表現型を有するマクロファージの正常機能も維持する。
【０１２０】
ＴＡＭによる浸潤と腫瘍患者における予後診断との間の関係もまたいくつかの研究により示されており、これらの研究から、マクロファージ浸潤が大きくなるほど、予後が悪くなることが結論付けられた（例えば、Ｗｙｃｋｏｆｆ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４、２００４年、ｐ．７０２２−７０２９）。いくつかの証拠から、癌細胞とＴＡＭとの間で腫瘍間質において共生関係が存在し、これにより、癌細胞がＴＡＭを誘引し、その生存を維持し、一方で重要な成長因子及び細胞外マトリクス酵素を産生することによりＴＡＭが腫瘍由来分子に反応することが示唆される。同様に、これは、腫瘍増殖、血管形成及び周囲組織の浸潤を刺激する（例えばＷｙｃｋｏｆｆら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：７０２２−７０２９参照）。このようにして、腫瘍環境におけるＴＡＭの減弱は、腫瘍間質を再構築し、微小環境において腫瘍を変化させるための有効なストラテジーを提供する。
【０１２１】
本発明のＤＮＡ組成物は、ストレスタンパク質として機能し、ＴＡＭにより高度に過剰発現されるアスパラギニルエンドペプチダーゼである、このレグマインに対するロブストなＣＴＬ反応を引き起こした。抗レグマイン免疫反応は、ＭＨＣ−ＩクラスＩ抗原限定及びＣＤ８＋Ｔ細胞特異的であることが分かった。重要なこととして、本発明は、レグマインに基づく本発明のＤＮＡ組成物での免疫付与後、二重陽性ＣＤ２０６＋及びＦ４／８０＋マクロファージ、即ちＴＡＭ、の密度が劇的に低下したことを明らかにする。さらに、ＴＡＭにより放出されるＶＥＧＦ、ＭＭＰ−９及びＴＧＦ−βなどの様々な因子が、培養腫瘍細胞の上清及びマウス血清の両方において低レベルで存在することが分かった。ＶＥＧＦ及びメタロプロテイナーゼＭＭＰ−９が腫瘍血管系の形成及び腫瘍血管形成の開始中に重要な役割を果たすことは周知である。ＴＡＭはこの点で意義深いが、これは、ＴＡＭがＶＥＧＦ及びＭＭＰ−９の両方を産生するからである。徐々に血管形成を増強することは、ＶＥＧＦ及び細胞外プロテアーゼ（ＭＭＰ−９など）の上方制御発現に関連する（ここで、ＴＧＦ−βは、血管への腫瘍細胞の移動に関与する重要な成長因子であることが知られる。）。実際、ＴＧＦ−βは、腫瘍細胞に対する増殖及び抗アポトーシスシグナルを提供し、ならびに、血管浸潤が起こるのに必要とされる細胞外マトリクス分解に関与し得るウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）を活性化することができる。
【０１２２】
明確に、本発明は、特異的なＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によりＴＡＭが腫瘍組織において排除されると、悪性度が低くなり浸潤化が低下することにより腫瘍細胞がその特徴を変化させたことを明らかにする。腫瘍組織における新生血管系の形成もまた、本発明のＤＮＡ組成物での処置により劇的に減少した。さらに、ＴＡＭは、報告によると、腫瘍微小環境における免疫抑制及び耐性に関与し、ＮＯ、ＰＧ、ＴＮＦ−α放出及びアルギナーゼ活性の上方制御を介して活性化されたＴ細胞のアポトーシスを誘導することによってＴ細胞反応を阻害し得る（例えばＳａｉｏ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７、２００１年、ｐ．５５８３−５５９３参照）。ＴＡＭの排除後、特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞活性が顕著に上方制御され、さらに、これにより、本発明の抗ＴＡＭアプローチが、腫瘍に対する免疫耐性を打ち破るための有効なストラテジーを提供することが示唆される。
【０１２３】
４Ｔ１自然発生マウス乳癌転移モデルにおいて、驚くべき有意な寿命の延長が起こり、原発腫瘍を外科的に切除した後にレグマインに基づく本発明のＤＮＡ組成物で処置すると、７５％（８例中６例）のマウスが、乳腺への４Ｔ１腫瘍細胞接種後、最長で３ヶ月生存した。さらに予想外に、６２％（８例中５例）のマウスで、肺転移が全く見られなかった。その他の２種類の腫瘍モデル、即ちＤ１２１−非小細胞肺癌及びＣＴ−２６結腸癌における予防的設定において同様の結果が得られた。これらのさらなる確証的データから、腫瘍微小環境を再構築するためのＴＡＭの標的化は、普遍的な抗腫瘍ストラテジーとなる可能性があり、これが、腫瘍成長及び及び転移を促進するＴＡＭにより放出される因子の濃度を低下させることによって、腫瘍細胞浸潤及び転移を抑制することが明らかとなる。
【０１２４】
実施例２において、本発明のミニ遺伝子ＤＮＡ組成物の構築のために、ＥＲシグナルを有する哺乳動物発現ベクター（ｐＣＭＶ／Ｍｙｃ／ＥＲ）を利用した。ＥＲシグナルペプチドは、タンパク質を分泌区画に向けさせる。このベクターにはまた、小胞体（ＥＲ）にタンパク質を維持するＣ末端ペプチドも含まれた。このＤＮＡ組成物によりコードされるペプチドは、消化管の免疫細胞のＥＲでプロセシングされ、次いで、ＭＨＣクラスＩ抗原結合部位に結合して、最終的にＴ細胞受容体に対して提示され、これにより、レグマインを発現するマウスにおけるＴＡＭに対するレグマイン特異的Ｔ細胞反応が誘導された。これらのコンストラクトは、マウス腫瘍モデルにおいて様々な臓器の腫瘍に対する有効なＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘導できる有効なミニ遺伝子ワクチンを作り出す。
【０１２５】
同系Ｃ５７／ＢＬマウスでのＤ１２１非小細胞癌細胞によるさらなる実験から、ｐＣＭＶ−Ｄｂ／Ｄｄ及びｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄミニ遺伝子コンストラクトの両方が有効な抗ＴＡＭ免疫反応を与えたことが分かった。一方、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＤ２Ｆ２細胞での結果から、ｐＣＭＶ−Ｋｂ／ＫｄコンストラクトがｐＣＭＶ−Ｄｂ／Ｄｄ又はｐＣＭＶ−Ｋｂ／Ｋｄコンストラクトの何れよりも非常に有効であったことが示される。この所見に対する説明としては、Ｈ−２Ｄｄ／Ｋｂ分子に結合するものよりも高い親和性でＨ−２Ｄｄ／Ｋｄに結合すると予想される非常に多くのレグマインペプチドがある、と考えることができる。ＮＩＨのＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）によると、Ｈ−２Ｄｄ及びＨ−２Ｋｄに結合するレグマインペプチドの予想スコアは、Ｈ−２Ｄｂ及びＨ−２Ｋｂに対する対応するスコアよりもかなり高く、Ｈ−２Ｋｄの結合スコアが最大である（図２０）。
【０１２６】
Ｔ細胞受容体のレパートリーが殆ど無制限であることを考慮すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＣＴＬにより認識され得る非常に多数のペプチド−Ｈ−２Ｄｄ／Ｋｄ複合体があり得る。さらに、Ｈ−２Ｄペプチドは、３つのＨ−２Ｋペプチドのうち２つよりも非常に高い抗原性指標を有していた（図２０）。これらのデータを基にすると、抗原性は、抗ＴＡＭ免疫反応に関して、ＭＨＣ結合スコアよりも予測的ではない。本発明のレグマインに基づくミニ遺伝子組成物は、乳癌モデルにおいてＴＡＭを攻撃することによって、腫瘍に対する有効な保護を誘導した。Ｋｄに基づくミニ遺伝子ワクチンにより誘導される腫瘍防御によって、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスでのＤ２Ｆ２乳癌微小環境でのＴＡＭにおける攻撃が導かれた。この防御免疫反応には、レグマイン＋ＴＡＭを特異的に死滅させるＣＤ８＋Ｔ細胞が介在し、またその結果、腫瘍血管形成を顕著に抑制することが分かった。重要なこととして、本発明のミニ遺伝子ＤＮＡコンストラクトは、レグマイン遺伝子全体をコードするワクチンと同様の効率であることが証明された。同様に、Ｄｄ及びＫｄに基づくコンストラクトの両方が、Ｃ５７／ＢＬマウスにおけるＤ１２１癌モデルにおいて抗ＴＡＭ反応を与えた。まとめると、これらのデータは、ＴＡＭに対して有効な第一の抗レグマインミニ遺伝子組成物を表し、このストラテジーが、様々な遺伝学的背景を有する個体に対して特に有用であり得、それにより、乳癌治療における遺伝子全体のワクチンストラテジーに対して、単純でより安全で柔軟性のある代替法を与えることを表す。
【０１２７】
本発明の新規特性の精神及び範囲から逸脱することなく、上述の実施形態の多くの変法及び変形が成立し得る。本明細書中で例示される具体的な実施形態に関して限定されるものではなく、又はそのように推定されるべきものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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