(57)【要約】  複合生体材料の製造方法であって：１つまたは複数のコラーゲン、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン、コラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチド、および任意に無機物質を含む第１実質的固形構成部分を用意し、前記構成部分は少なくとも多孔性の表面部分を有し；１つまたは複数のコラーゲン、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン、コラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチド、液体担体、および任意に無機物質を含む液体構成部分を用意し；前記液体構成部分を、前記第１構成部分の前記多孔性表面部分と接触させ；前記液体構成部分を、複数の固形結晶または粒子に液体担体が変わる温度まで冷却し；複数の固形結晶または粒子の少なくともいくつかを、昇華および／または気化により除くこと、を含む製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数のコラーゲン、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン、コラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチドおよび、任意に無機物質を含む第１実質的固形構成部分を用意し、前記構成部分は少なくとも多孔性の表面部分を有し；
１つまたは複数のコラーゲン、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン、コラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチド、液体担体および任意に無機物質を含む液体構成部分を用意し；
前記液体構成部分を、前記第１構成部分の前記多孔性表面部分と接触させ；
前記液体構成部分を、複数の固形結晶または粒子に液体担体が変わる温度に冷却し；
複数の固形結晶または粒子の少なくともいくつかを、昇華および／または気化により除くこと、を含む複合生体材料の製造方法。
【請求項２】
１つまたは複数のコラーゲン、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン、コラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチドおよび、任意に無機物質を含む第２実質的固形構成部分を用意し、前記構成部分は少なくとも多孔性の表面部分を有し；
前記液体構成部分を、前記第１構成部分および第２構成部分間に挟み、前記多孔性表面部分と接触させ；
前記第１構成部分および第２構成部分間の前記液体構成部分を、複数の固形結晶または粒子に液体担体が変わる温度に冷却し；
複数の固形結晶または粒子の少なくともいくつかを昇華および／または気化により除き、第１構成部分および第２構成部分間の中間層とすること、をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１構成部分および／または第２構成部分が無機物質を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
無機物質がリン酸カルシウム材を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
リン酸カルシウム材が、１つまたは複数のブラッシュ石、リン酸八カルシウムおよびアパタイトを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１構成部分および／または第２構成部分が、コラーゲンおよび任意にグリコサミノグリカンを含む、請求項１から５の何れか一つに記載の方法。
【請求項７】
第１構成部分および／または第２構成部分が、コラーゲンとリン酸カルシウム材の共沈物から形成される、請求項１から６の何れか一つに記載の方法。
【請求項８】
第１構成部分および／または第２構成部分が、コラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈物から形成される、請求項１から６の何れか一つに記載の方法。
【請求項９】
第１構成部分および／または第２構成部分が、コラーゲン、リン酸カルシウム材およびグリコサミノグリカンの３種類の共沈物から形成される、請求項１から６の何れか一つに記載の方法。
【請求項１０】
第１構成部分が、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンおよび任意にリン酸カルシウム材を含み、第２構成部分が、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびリン酸カルシウム材を含む、請求項２から９の何れか一つに記載の方法。
【請求項１１】
液体構成部分が無機物質を含む、請求項１から１０の何れか一つに記載の方法。
【請求項１２】
無機物質がリン酸カルシウム材を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リン酸カルシウム材が、１つまたは複数のブラッシュ石、リン酸八カルシウムおよびアパタイトを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
液体構成部分が、コラーゲンおよび任意にグリコサミノグリカンを含む、請求項１から１３の何れか一つに記載の方法。
【請求項１５】
液体担体が水を含む、請求項１から１４の何れか一つに記載の方法。
【請求項１６】
液体構成部分を懸濁液の形で用意する、請求項１から１５の何れか一つに記載の方法。
【請求項１７】
液体構成部分がコラーゲン懸濁液を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
液体構成部分をスラリーの形で用意する、請求項１から１５の何れか一つに記載の方法。
【請求項１９】
液体構成部分が、コラーゲンおよび任意にグリコサミノグリカンおよび任意にリン酸カルシウム材を含むスラリーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
液体構成部分が、コラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈物を含むスラリーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
液体構成部分が、コラーゲン、リン酸カルシウム材およびグリコサミノグリカンの３種類の共沈物を含むスラリーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
複合生体材料が多層スキャフォールドである、請求項１から２１の何れか一つに記載の方法。
【請求項２３】
第１構成部分の組成物が第２構成部分の組成物と同じでない、請求項２から２２の何れか一つに記載の方法。
【請求項２４】
液体構成部分の組成物が、第１構成部分の組成物または第２構成部分の組成物と同じでない、請求項２から２３の何れか一つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物医学的利用のための人工骨材料の分野に関し、特に組織工学用の、例えばコラーゲン、リン酸カルシウムおよび任意にグリコサミノグリカンを含む層状スキャフォールドに関する。
【背景技術】
【０００２】
自然骨は、コラーゲン、グリコサミノグリカン類を含む非コラーゲン性有機相および、リン酸カルシウムの生体複合材料である。その複雑な階層構造により、高い剛性、強度および破壊靱性を含む非常に優れた力学的な特性を示し、その結果骨は、日常生活でさらされている生理的ストレスに耐えることができる。本分野において研究者が取り組んでいる課題は、ヒトや動物体内にある人工材料の内部や周辺で自然骨が増殖することのできる組成や構造を有する人工材料を製造することである。
【０００３】
骨は、生体環境中で形成された骨様アパタイト層を介して、ヒト生体中でリン酸カルシウムと直接結合すること（生物活性と称される特性）が観察されている。他方では、コラーゲンおよび、コラーゲンやグリコサミノグリカン類などの他の生物有機化学物質を含む共重合体は、ヒト生体中の骨の生産や維持を担うものを含む、多くの細胞種の接着および増殖に最適な基質であることが知られている。
【０００４】
ヒドロキシアパタイトは、骨置換材料中の成分として最も一般的に用いられるリン酸カルシウムである。しかしこれは、ブラッシュ石、リン酸三カルシウムおよびリン酸八カルシウムなどの他の形態のリン酸カルシウム材料と比較すると、比較的不溶性の物質である。アパタイトの溶解度が相対的に低いことは、生体中でのこの材料の再吸収速度が特に遅いので、生体材料を製造する際に不利になる可能性がある。
【０００５】
ヒドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウムは力学的に堅い物質である。しかしこれらは、自然骨と比較すると比較的もろい。コラーゲンは力学的に強靭な物質であるが、自然骨と比較するとその剛性は比較的低い。コラーゲンとグリコサミノグリカン類の共重合体を含む物質はコラーゲン単独のものよりより強靭でより堅いが、自然骨と比較するとまだその剛性は比較的低い。
【０００６】
ヒドロキシアパタイトよりも力学的靭性を改良し、コラーゲンおよび、コラーゲンとグリコサミノグリカン類の共重合体よりも剛性を改良した人工骨置換材料を製造する先の試みには、コラーゲンとアパタイトを機械的混合により結合することが含まれる。このような機械的方法はEP-A-0164484中に記載されている。
【０００７】
より最近の開発では、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンおよびコンドロイチン−４−硫酸を機械的に混合したものを含む骨置換材料の製造がある。これはEP-A-0214070中に記載されている。この文献ではさらにコンドロイチン−４−硫酸のコラーゲンへの脱水熱架橋が記されている。アパタイト、コラーゲンおよびコンドロイチン−４−硫酸を含む材料は生体適合性が良いことが見出されている。アパタイトの、コラーゲンおよび任意にコンドロイチン−４−硫酸との機械的混合により、アパタイトをコラーゲン／コンドロイチン−４−硫酸でコーティングされた粒子が実質的に形成される。このような材料は生体適合性があるものの、ヒトや動物体内にあるとき自然骨の内部増殖に限界があり、人工材料のリン酸カルシウム相を再利用しないことが明らかとなっている。
【０００８】
先の研究で、凍結乾燥手順のパラメーターを制御して、コラーゲンと１つまたは複数のグリコサミノグリカン類（ＧＡＧｓ）の多孔性スキャフォールドを製造できる手段が開発されている。これらの方法により、パラメーターを、外傷や損傷部位における治癒反応に著しい効果があることが知られているものに制御し、細孔の大きさやアスペクト比などのスキャフォールドの特徴を変化させることができる。しかし、骨格および筋骨格の異常を含む損傷の治療には、無機質を含まないコラーゲン−ＧＡＧスキャフォールドではなく、骨の材料組成および力学的特性と厳密に一致する多孔性スキャフォールドを製造する技術を開発する必要がある。
【０００９】
出願者の先の国際特許出願、PCT/GB2006/000797、２００６年３月６日出願、は生物医学的利用のための材料に関し、特に例えば、コラーゲン、リン酸カルシウムおよび任意にグリコサミノグリカンを含む、多孔性一枚構造スキャフォールドおよび多孔性層状スキャフォールドに関する。PCT/GB2006/000797の内容を、ここに添付した書類中に、本発明のよりよい理解の助けとなるようにまた詳述する。
【００１０】
組織工学用改良型スキャフォールド材料を継続して使用および開発することにより、層状スキャフォールド材料の開発が必要であることが明らかとなった。生体において問題の多い生理学的部位には、１つまたは複数の組織型間の境界が含まれる。特定の組織型および細胞種には専用のスキャフォールド構造の開発が必要であることが指摘されており、多くの場合、生物学的に活性なスキャフォールド構造は組織間、細胞間、および用途間によって著しく変化しうる［１］。このような所見から、より複雑な組織における損傷部位や境界面の損傷を含む部位の治療には（すなわち、軟骨の損傷はその下の骨をも損傷やすく、腱や靱帯の損傷は骨や筋肉への付着部に近い）、スキャフォールド構造中のはっきりした境界面と同様にスキャフォールド構造中に段階的な変化があるスキャフォールドの開発が必要であることが示唆される。
【００１１】
特に、外傷、奇形または疾患により損傷を受けた骨格部位の修復には、一連の特定の課題がある。皮膚、神経および他のほとんどの組織中の異常とは異なり、骨格の異常は複数の異なった組織型（すなわち骨、軟骨、腱および靱帯）にわたり、通常の力学的負荷を受ける場所を含み、また石灰化組織と非石灰化組織間を横断する境界面（例えば靱帯付着部、骨／軟骨境界面の「石灰化線」）を含む。
【００１２】
現在のスキャフォールドを製造する技術には、物理的構造、力学的特性または化学的組成などのパラメーターに明確に段階的な変化があるスキャフォールドを製造するための適当な手順が含まれていない。軟骨だけ、または骨と軟骨の両方をふくむ関節の異常などの損傷を治療するために、多孔性層状スキャフォールドを用いる組織工学法を開発しようとしている近年の取り組みは、限られた数しかない。これらの構成体により、骨と軟骨の同時再生の誘導を試みているが、それはそれぞれに対して別のスキャフォールドを用いるものである［２〜９］。
【００１３】
この新しい取り組みは有望ではあるが、２つの重大な欠点により、今までに報告された層状スキャフォールドの有効性が制限される可能性がある。１つ目は、スキャフォールドの各層に用いられる材料に関するものである。再吸収可能な合成ポリマーは軟骨層に用いられる唯一の材料であり、また多くの場合、これらの多くのスキャフォールド中の骨性部位の構成部分でもある。合成ポリマーは加工しやすいが、コラーゲンなどの天然ポリマーと比べて細胞の付着および増殖をほとんど促進しないことが知られており、分解により、潜在的に細胞毒性のある酸を高濃度に放出する可能性がある。さらに、腱または靱帯の修復を必要とする用途に対して、再吸収可能な合成ポリマーは、架橋されているにもかかわらず、リハビリテーション運動中にかかる減弱された負荷に耐えることにさえ不十分な強度や剛性しか有していない。
【００１４】
現在の層状スキャフォールドの２つめの欠点は、各層間の境界面に関するものである。生体内でのコラーゲン繊維の連続性は、自然関節および腱／靱帯付着部などの多くの組織間の境界面にわたって観察される。円滑な変化（緩やかな境界面）による系により、本質的な力学的安定性がこれらの部位に与えられ、力学的な不具合が起こることなく生理学的負荷にこれらが耐えることができる。一方、大多数の既存の層状スキャフォールドははっきりした境界面を有し、２つの異種の材料間に明確な境界を形成する。縫合［７］、フィブリン接着［３］および他の方法［４、５］は、この境界面を強化するために行われるが、しかし境界面の剥離はまだ管理された動物モデルにおいてでさえ報告されている。また、これらの縫合および接着方法は高度の技術を要し再現可能性に乏しく、従って臨床環境には実用的ではないことに注意すべきである。
【００１５】
多くの適用に対して、範囲の限定された不均一性を有する層状スキャフォールド構造を、さらに広く製造することができる新規技術が必要とされていることが明らかである。最も重要なことは、適切な中間層結合を有する層状スキャフォールド構造を製造するために適した技術を開発することである。これは、有意な力学的負荷がかけられ、したがって中間層の層間剥離の機会が増える領域で使用されるスキャフォールドにとって特に重大な問題である。
【００１６】
層状多孔性コラーゲンスキャフォールドを製造する技術を開発することは、さらに不可欠な重要事項である。コラーゲンスキャフォールドは、天然の細胞外マトリックスの類似物として多くの異なった組織工学研究に成功裏に利用されており、コラーゲンスキャフォールドは従来から凍結乾燥により製造されている。コラーゲン、他の適切なタンパク質および液体担体の懸濁液を適当な温度条件下で凝固させ、コラーゲン繊維に囲まれた氷結晶の相互浸透網状組織とする。そして冷凍懸濁液を昇華し、凍った液体担体を除くと、後に多孔性スキャフォールド構造が残る。スキャフォールド孔のサイズはスラリーの凍結工程によって規定される。この製造技術の重要な利点は、コラーゲン繊維の連続性がスキャフォールドの全体にわたって観測されることである。しかし、細孔の大きさおよび形状の大きく異なる層状スキャフォールドを製造するには、極めて注意深く温度環境を調節する必要がある。さらに、化学組成、架橋密度および材料特性などの特性が著しく異なるスキャフォールドの製造は、すべての構造を同時に、単一凝固ステップ中に懸濁液の混合により形成しようとすれば、極めて困難になる。
【発明の概要】
【００１７】
本発明はPCT/GB2006/000797に記載された発明の延長であり、先行技術に関するいくつかの問題を処理することが目的である。
【００１８】
したがって、本発明は、
１つまたは複数のコラーゲン、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン、コラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチド類、および任意に無機物質を含む第１実質的固形構成部分を用意し、前記構成部分は少なくとも多孔性の表面部分を有し；
１つまたは複数のコラーゲン、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン、コラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチド類、液体担体、および任意に無機物質を含む液体構成部分を用意し；
前記液体構成部分を、前記第１構成部分の前記多孔性表面部分と接触させ；
前記液体構成部分を、複数の固形結晶または粒子に液体担体が変わる温度に冷却し；
複数の固形結晶または粒子の少なくともいくつかを、昇華および／または気化により除くこと、を含む複合生体材料の製造方法を提供する。
【００１９】
本方法はさらに：
１つまたは複数のコラーゲン、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン、コラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチド、および任意に無機物質を含む第２実質的固形構成部分を用意し、前記構成部分は少なくとも多孔性の表面部分を有し；
前記液体構成部分を、前記第１構成部分および第２構成部分間に挟み、前記多孔性表面部分と接触させ；
前記第１構成部分および第２構成部分間の前記液体構成部分を、複数の固形結晶または粒子に液体担体が変わる温度に冷却し；
複数の固形結晶または粒子の少なくともいくつかを昇華および／または気化により除き、第１構成部分および第２構成部分間の中間層とすること、を含んでもよい。
【００２０】
ここで用いられる用語「生体材料」は、ヒトまたは動物の生体に適合する材料を意味する。
【００２１】
ここで用いられる用語「スラリー」は、スラリー、溶液、懸濁液、コロイド溶液および分散液を含む。
【００２２】
ここで用いられる用語「コラーゲン」は、組み換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む。
【００２３】
ここで用いられる用語「構成部分」は、例えば特定の化学的、構造的および／または材料特性を有するスキャフォールドの異なる部分をいう。用語「スキャフォールド」は最終的な多構成部分スキャフォールド構造をいう。
【００２４】
用語「複合スキャフォールド」と「層状スキャフォールド」は同義語であり、各層の材料組成が隣接層の材料組成と一般に実質的に異なる２つ以上の層を含むスキャフォールドをいう。用語「単層スキャフォールド」または「一枚構造スキャフォールド」は同義語であり、各層の材料組成が全体にわたってほとんど均質である１層のみを含むスキャフォールドをいう。
【００２５】
ここで用いられる用語「多孔性」は、材料がマクロ孔および／またはミクロ孔を含んでもよいことを意味する。細孔は表面上にあってもよく、また大半の材料の中へ広がってもよい。マクロ孔性は一般に、約１０ミクロンより大きい細孔に関する特徴をいう。ミクロ孔性は一般に、約１０ミクロン未満の細孔に関する特徴をいう。当然のことながら、材料中に連続気泡と独立気泡が組み合わさっていてもよい。例えば、材料は通常マクロ孔とミクロ孔の両方を含むだろう。マクロ孔性は通常連続気泡構造であるが、独立気泡成分があってもよい。
【００２６】
本発明による方法は、一連の個々の構成部分を含む多孔性複合／層状スキャフォールドを製造するために何度でも繰り返すことができる一連のステップを含む。これらの個々の構成部分を互いに別々に製造後、共合成工程を何度でも繰り返すことによって一緒に接合して、異なった構造、力学的特性および／または組成特性（例えば細孔の大きさ、相対密度、細孔の形状、剛性、化学組成、架橋密度、分解速度）の範囲を有する一つの複合／層状スキャフォールドを形成することができる。
【００２７】
より大きな複合／層状スキャフォールド構造を組み立てた後、物理的架橋法（例えば脱水熱架橋、紫外線架橋）、化学的架橋法（例えばカルボジイミド架橋、グルタルアルデヒド架橋）または酵素混合物（例えばコラゲナーゼ、ディスパーゼ）を用いたスキャフォールドの部分分解を含む製造後工程ステップを何度も行うことができる。スキャフォールドの水和を含む何らかの処理を行った後、液体成分を、例えば凍結乾燥工程を用いて除くことができる。
【００２８】
本発明は好ましくは、例えば、生体内で見られるものとよく似た、スキャフォールド構成部分層間でコラーゲン繊維が連続した、連続（緩やかな）境界面の製造を可能にする。本発明者らは、製造後、これが異種相を互いに縫合または接着することに関する問題を解決することを見出した。
【００２９】
本発明による方法は、個々のスキャフォールド構成部分を、液体状態から実質的に同時に形成する必要がないという有利性を提供する。これは、すべてのスラリーを一緒に積層化し固化させる液相共合成（liquid-phase co-synthesis）と対照的である。
【００３０】
第１構成部分および第２構成部分（もしあれば）は、固形物または本質的に固形として提供される。
【００３１】
第１構成部分および／または第２構成部分は、コラーゲンおよび任意にグリコサミノグリカンを通常含むだろう。
【００３２】
第１構成部分および／または第２構成部分は、リン酸カルシウム材などの無機物質を通常含むだろう。例として１つまたは複数のブラッシュ石、リン酸八カルシウムおよびアパタイトが挙げられる。
【００３３】
アパタイトは、カルシウムおよびリン酸塩を含む無機物類であり、一般式：Ｃａ5（ＰＯ4）3（Ｘ）、ここでＸはイオン、すなわち通常ＯＨ-、Ｆ-およびＣｌ-であってよく、当業者に公知の他のイオンでもよい、を有する。用語「アパタイト」はまたケイ素置換アパタイトなどの置換アパタイトを含む。用語「アパタイト」はアパタイトの具体例であるヒドロキシアパタイトを含む。ヒドロキシアパタイトはまた例えばケイ素などの他の化学種で置換されてもよい。
【００３４】
本発明の１つの好ましい態様において、第１構成部分および／または第２構成部分を、コラーゲンとリン酸カルシウム材の共沈物から形成する。本発明の他の好ましい態様において、第１構成部分および／または第２構成部分を、コラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈物から形成する。
【００３５】
第１構成部分および／または第２構成部分を、コラーゲン、リン酸カルシウム材およびグリコサミノグリカンの３種類の共沈物から形成することが好都合である。
【００３６】
好ましい実施形態において、第１構成部分は、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよび任意にリン酸カルシウム材を含み、第２構成部分（もしあれば）は、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびリン酸カルシウム材を含む。
【００３７】
液体構成部分は、コラーゲンおよび任意にグリコサミノグリカンを通常含むだろう。
【００３８】
液体構成部分は、リン酸カルシウム材などの無機物質をさらに含んでもよい。例として１つまたは複数のブラッシュ石、リン酸八カルシウムおよびアパタイトが挙げられる。
【００３９】
液体担体は水を含むことが好ましい。
【００４０】
液体構成部分を懸濁液の形、例えばコラーゲンの懸濁液またはスラリーの形で準備することができる。懸濁液／スラリーは、グリコサミノグリカンおよび／またはリン酸カルシウム材のうちの１つまたは両方をさらに含んでもよい。
【００４１】
液体構成部分は、コラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈物および／またはコラーゲン、リン酸カルシウム材およびグリコサミノグリカンの３種類の共沈物を含む懸濁液／スラリーであることが好ましい。
【００４２】
あるいは、スラリーは、コラーゲンとリン酸カルシウム材および任意にグリコサミノグリカンの機械的な混合物を単に含んでもよい。これは、例えばEP-A-0164484およびEP-A-0214070に記載されているような従来技術によって製造することができる。
【００４３】
リン酸カルシウム材を、例えば１つまたは複数のブラッシュ石、リン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトから選択することができる。リン酸カルシウム材はブラッシュ石を含むことが好ましい。
【００４４】
懸濁液／スラリーのｐＨは、好ましくは２．５〜６．５、より好ましくは２．５〜５．５、さらに好ましくは３．０〜４．５、さらにより好ましくは３．８〜４．２である。
【００４５】
懸濁液／スラリー組成物は、１つまたは複数のグリコサミノグリカン類を含んでもよい。スラリー組成物は、１つまたは複数のリン酸カルシウム材を含んでもよい。
【００４６】
懸濁液／スラリー中に他の化学種（例えば銀、ケイ素、シリカ、食塩、糖など）が存在することは除外されない。
【００４７】
当然のことながら、他の成分が懸濁液／スラリー中に存在してもよい。例えば、増殖因子、遺伝子、薬物または他の生物学的に活性な物質を任意に、単独でまたは併用して、懸濁液／スラリーに加えてもよい。
【００４８】
複数の固形結晶または粒子のうち少なくともいくつかを昇華および／または気化により除き、第１構成部分および第２構成部分間の中間層とすることができる。好ましい方法は昇華である。
【００４９】
好ましい実施形態において、本発明による複合生体材料の製造方法は：
（ａ）１つまたは複数のコラーゲン（組み換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む）、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン、コラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチド、および任意に無機物質を含む第１実質的固形構成部分を用意し、前記構成部分は少なくとも多孔性の表面部分を有し；
（ｂ）１つまたは複数のコラーゲン（組み換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む）、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン、コラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチド、および任意に無機物質を含む第２実質的固形構成部分を用意し、前記構成部分は少なくとも多孔性の表面部分を有し；
（ｃ）１つまたは複数のコラーゲン（組み換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む）、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン、コラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチド、液体担体、および任意に無機物質を含む液体構成部分を用意し；
（ｄ）前記液体構成部分を、前記第１構成部分および第２構成部分間に挟み、前記多孔性表面部分と接触させ；
（ｅ）前記第１構成部分および第２構成部分間の前記液体構成部分を、複数の固形結晶または粒子に液体担体が変わる温度に冷却し；
（ｆ）複数の固形結晶または粒子の少なくともいくつかを昇華および／または気化により除き、第１構成部分および第２構成部分間の中間層とすること、を含む。
【００５０】
本発明において、例えばコラーゲン懸濁液の薄層を、第１構成部分と第２構成部分（例えばスキャフォールド）の間に配置し、各スキャフォールド中の最初の数層の細孔に吸着させることが都合がよい。そしてスキャフォールドを２回目の凍結乾燥に付すと、それぞれ異なったスキャフォールド構成部分間にコラーゲン繊維の相互浸透網状組織が得られる。必要であれば、この工程をもちろん複数回繰り返してもよい。
【００５１】
懸濁液／スラリーの化学的特性および物理的特性（例えば粘度）を、第１構成部分および第２構成部分の化学的性質および物理的性質に応じて選択することができる。例えば、もし第１構成部分および第２構成部分中の細孔が極めて小さければ、粘性の低い懸濁液／スラリーを選択して、細孔中への浸透を確実にすることができる。
【００５２】
複数の固形結晶または粒子に液体担体が変わる温度に液体構成部分を冷却するステップおよび、複数の固形結晶または粒子の少なくともいくつかを昇華および／または気化により除くステップは、凍結乾燥法により行うことができる。
【００５３】
もし液体担体が水であれば、昇華ステップは、型枠と冷凍懸濁液／スラリーの周囲の環境を水／氷／水蒸気系の三重点未満に減圧し、続いて達成された減圧で固相−気相転移温度より高い温度に昇温させることを含む。周囲の液体蒸気分圧が、その温度での冷凍液の分圧より低ければ、生成物中の氷は昇華により直接、水蒸気に変換される。温度を通常０℃以上に上昇させる。このステップを行い、氷の結晶を冷凍懸濁液／スラリーから昇華により除く。
【００５４】
凍結乾燥パラメーターを調節して、細孔の大きさおよびアスペクト比を要望通りに制御することができる。一般的に、冷却速度がより遅く最終凍結温度がより高ければ（例えば１分あたり約０．２５℃で約−１０℃の温度までの冷却）、より高いアスペクト比を有する大きな細孔が優位になり、一方冷却速度がより速く最終凍結温度がより低ければ（例えば１分あたり約２．５℃で約−４０℃の温度までの冷却）、小さな等軸の細孔の形成が優位になる。
【００５５】
本発明の方法を型枠中で行うことができる。この用語「型枠」には第１構成部分、第２構成部分および液体構成部分を成形、保持または支持することができる何らかの型枠、容器または担体を含む。従って、最も単純な形態における型枠には単に支持面を含むことができる。型枠は何らかの望ましい形状であってよく、ポリマー（ポリスルホン、ポリプロピレン、ポリエチレンなど）、金属（ステンレス鋼、チタン、コバルト・クロムなど）、セラミックス（アルミナ、ジルコニアなど）、ガラスセラミックス、およびガラス（ホウケイ酸ガラスなど）を含む何らかの適当な材料から型枠を製造することができる。
【００５６】
第１構成部分の組成物は第２構成部分の組成物とは通常同じではないだろう。
【００５７】
液体構成部分の組成物は、第１構成部分の組成物または第２構成部分の組成物（もしあれば）とは通常同じではないだろう。
【００５８】
本発明による方法によって製造された複合生体材料を、多層スキャフォールドの製造に用いてもよく、ここで少なくとも２つの層は多孔性である。すべての多層はコラーゲンを含むことが好ましく、またグリコサミノグリカンを含むことが好ましい。少なくとも１つの層はさらにリン酸カルシウム材を含むことが好ましい。
【００５９】
第１構成部分および／または第２構成部分を、出願者の先行国際出願、PCT/GB2006/000797、２００６年３月６日出願、に記載の方法によって調製してもよい。その内容をここに添付した書類中に詳述する。さらに、液体構成部分のスラリー組成物に関しては、PCT/GB2006/000797に記載のとおりであってもよい。
【００６０】
出願者の先行公開出願、PCT/GB04/004550、２００４年１０月２８日出願、にはコラーゲン、ブラッシュ石およびグリコサミノグリカンの３種類の共沈物およびその調製方法が記載されている。PCT/GB04/004550の内容を本願に引用して援用する。PCT/GB04/004550に記載の方法には：コラーゲン、カルシウム源、リン源およびグリコサミノグリカンを含む酸性水溶液を用意し；コラーゲン、ブラッシュ石およびグリコサミノグリカンを共に水溶液から沈殿させ、３種類の共沈物を形成することを含む。用語「共沈物」は２つまたは３つの化合物の沈殿物を意味し、ここで化合物は実質的に同時に、同じ溶液／分散液から沈殿する。これは、成分の機械的混合から生成した物質、特にこれらの成分が別々に、例えば異なった溶液中で沈殿したものとは区別される。共沈物の微細構造は、その成分の機械的混合から生成した物質とは、実質的に異なる。
【００６１】
共沈物の調製工程において、カルシウム源は、１つまたは複数の硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウムアルコキシド、水酸化カルシウム、ケイ酸カルシウム、硫酸カルシウム、グルコン酸カルシウムおよびヘパリンのカルシウム塩から選択されることが好ましい。ヘパリンのカルシウム塩は、ブタ腸粘膜由来であってもよい。適当なカルシウム塩は、例えばシグマアルドリッチ社から市販されている。リン源は、１つまたは複数のリン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸、オルトリン酸水素二ナトリウム二水和物（Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、時にＧＰＲソレンセン塩（GPR Sorensen's salt）といわれる）およびリン酸トリメチル、リン酸のアルカリ金属塩（例えばＮａやＫ）、リン酸のアルカリ土類塩（例えばＭｇやＣａ）から選択されることが好ましい。
【００６２】
グリコサミノグリカンは、繰返し二糖単位を含む長鎖非分岐多糖を含む高分子種である。好ましくは、グリコサミノグリカンは、１つまたは複数のコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸から選択される。コンドロイチン硫酸はコンドロイチン−４−硫酸またはコンドロイチン−６−硫酸であってよく、ともに例えばシグマアルドリッチ社から市販されている。コンドロイチン−６−硫酸はサメ軟骨由来であってもよい。ヒアルロン酸はヒト臍帯由来であってもよい。ヘパリンはブタ腸粘膜由来であってもよい。
【００６３】
コラーゲンは可溶性でも不溶性でもよく、いかなる動物中のいかなる組織由来であってよく、従来技術を何度も用いて抽出してもよい。
【００６４】
沈殿を、コラーゲン、カルシウム源、リン源およびグリコサミノグリカンを酸性水溶液中で混合し、沈殿ができるまで溶液を放置するか、溶液を撹拌するか、アンモニアなどの塩基性滴定剤を用いて滴定するか、作成済みのブラッシュ石などの核形成剤を添加するか、カルシウム源の添加速度を変化させるか、またはこれらのまたは従来知られている多くの他の方法を組み合わせることにより生じさせることができる。
【００６５】
本発明による複合生体材料を、筋骨格用および歯科用組織再生スキャフォールドとして用いることが好都合である。
【００６６】
本発明による複合生体材料を、代用骨または歯科材料として用いてもよい。したがって本発明は、ここに記載したような生体材料を含む、人工骨材料、骨インプラント、骨移植片、代用骨、骨スキャフォールド、充填剤、コーティング剤またはセメントを提供する。
【００６７】
複合生体材料を多層スキャフォールドの形で提供することが好都合である。特に本発明は、筋骨格用および歯科用組織再生スキャフォールドを提供する。本発明による多層（すなわち２つ以上の層の）スキャフォールドを、例えば骨／軟骨境界面（例えば関節）、骨／腱境界面（例えば腱付着部）、骨／靱帯境界面（例えば靱帯付着部）および歯／靱帯境界面（例えば歯／歯周靱帯接合部）に適用してもよい。
【００６８】
しかし本発明は主に組織工学用スキャフォールドに関し、本発明による材料を、生体中でかなり長期間存在するインプラントの製造に用いてもよい。例えば、半永久インプラントは腱および靱帯への適用に必要とされるだろう。
【００６９】
本発明を以下に、２つの好ましい合成実施形態：固相共合成および固液共合成に関連して詳述する。これらの方法は、本発明者らにより開発され、非常に異なった構成部分特性を有する多構成部分スキャフォールドの製造を可能にした。本発明者らは、生体内で見られるものとよく似た、スキャフォールド構成部分層間で連続したコラーゲン繊維を有する、連続（緩やかな）境界面の製造方法を提供する。本発明者らは、製造後に異種相を互いに縫合または接着することに関する問題を解決する。
【００７０】
本発明による固相共合成および固液共合成方法は、個々のスキャフォールド構成部分を実質的に同時に液体状態から形成する必要がないという有利性を提供する。これは、すべてのスラリーを一緒に積層化し固化させる液相共合成と対照的である。
【００７１】
本合成方法は、一連の個々の構成部分を含む多孔性スキャフォールドを製造するために、何回も繰り返すことができる一連のステップを含む。これらの個々の構成部分を互いに別々に製造し、その後共合成工程を何度も繰り返して接合し、異なった構造、力学的特性または組成特性（すなわち、細孔の大きさ、相対密度、細孔形状、剛性、化学組成、架橋密度、分解速度）の範囲を有する単一スキャフォールドを形成する。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
固相共合成方法および固液共合成方法を、実施例を用いて以下にさらに詳細に説明する。
【００７３】
「固相共合成」
固相共合成の場合、多構成部分スキャフォールドの各構成部分層を別々に製造する。そしてスキャフォールド構造の最終３次元マトリックスを別々の構成部分範囲から第２凍結乾燥方法を用いて組み立てる。例えば、コラーゲン懸濁液の薄層を各スキャフォールド間に配置し、各スキャフォールド中の最初の数層の細孔に吸着させる。そしてスキャフォールドを２回目の凍結乾燥に付し、それぞれ異なったスキャフォールド構成部分間にコラーゲン繊維の相互浸透網状組織を得る。必要であれば、この工程をもちろん複数回繰り返してもよい。
【００７４】
「固相共合成：ステップ１：スラリーの調製」
水性コラーゲンスラリーの何らかの組み合わせを製造することができる。タイプＩコラーゲン［１０、１１］、タイプＩＩコラーゲン［１２］または無機質を含んだタイプＩコラーゲン／ＧＡＧ／ブラッシュ石スラリーを製造する詳細な製造手順がある（例えばPCT/GB04/004550参照）。
【００７５】
「固相共合成：ステップ２：多孔性コラーゲン構成部分の製造」
各構成部分を、異なったコラーゲンスラリーから凍結乾燥によって製造することができる。異なった平均細孔径、形状、および方向を有するスキャフォールドを製造できる様々な凍結乾燥手順が公開されており［１０、１１、１３〜１５］、いかなるこれらの手順を、各スキャフォールド構成部分の形成に用いてもよい。簡単にいえば、各コラーゲン懸濁液を型枠中に入れ；型枠は、何らかの望ましい形状であることができ、いくつの材料（すなわち、ポリマー、金属、セラミックス、ガラス、またはガラスセラミックス）からでも製造することができる。そして、型枠を冷凍環境に置くことにより、懸濁液を型枠中で凝固させ；凝固は速やかにまたはゆっくり、支配的な方向または均一に起こることができ、また凝固環境の温度を何らかの方法で制御して、懸濁液を完全に凝固させ、コラーゲン繊維に囲まれた氷結晶の相互浸透網状組織とすることができる。そして凝固懸濁液を昇華させて氷結晶を除き、それ自体が均質のスキャフォールド構造を構成する多孔性構成部分とする。
【００７６】
個々の構成部分をいくつでも、異なった凍結手順を用いて、異なった型枠中で、異なった懸濁液から製造してもよい。
【００７７】
「固相共合成：ステップ３：製造後工程」
製造後工程ステップを何度も各構成部分について、凍結乾燥後行ってもよい。このような製造後工程には、物理的架橋法（すなわち、脱水熱架橋、紫外線架橋）［１１、１３、１６〜１８］、化学的架橋法（すなわち、カルボジイミド架橋、グルタルアルデヒド架橋）［１１、１６］または酵素混合物（すなわち、コラゲナーゼ、ディスパーゼ）を用いるスキャフォールドの部分分解が含まれる。スキャフォールドの水和を含む何らかの処理を行った後、液体成分を、第２凍結乾燥工程を用いて除くことができる。再度、容器の成形、凍結手順および昇華手順を何度でも行い、液体成分をスキャフォールドから除いてもよい。
【００７８】
「固相共合成：ステップ４：固相共合成」
各構成部分を完全に処理した後、個々の構成部分を、固相共合成を用いて接合することができる。コラーゲン懸濁液の薄層を、個々のスキャフォールド構成部分間に配置する。この工程を繰り返してすべての個々のスキャフォールド構成部分を接合し、異なる領域を有するより大きなスキャフォールドとする。コラーゲン懸濁液は各スキャフォールド間の境界と局所的に水和し、一時的にスキャフォールドに貼り付く。そして組み立てられたスキャフォールドを、何度もの凝固および昇華手順の１回により凍結乾燥し；凍結乾燥後、スキャフォールド構成部分は、スキャフォールド構成部分間の各境界面にわたって広がるコラーゲン繊維の相互連結網状組織によって互いに保持される。
【００７９】
「固相共合成：ステップ５：製造後工程」
より大きなスキャフォールド構造を組み立てた後、製造後工程ステップを何度も行うことができる。このような工程についてはすでにステップ３に列挙した。このような工程後、スキャフォールドを再び凍結乾燥し、多様な異種の構造および組成特性を有する多孔性のコラーゲンスキャフォールドを製造することができる。
【００８０】
「固液共合成」
固液共合成の場合、最終スキャフォールドの、１つまたは複数の構成部分層を別々に製造する。そしてスキャフォールド構造の最終３次元マトリックスを、１回または複数回のさらなる凍結乾燥方法を用いて組み立てる。コラーゲン懸濁液を、例えば、すでに製造された構成部分と配置し、構成部分スキャフォールド中に吸着させる。そして懸濁液−スキャフォールド系を２回目の凍結乾燥に付し、それぞれ異なったスキャフォールド構成部分間にコラーゲン繊維の相互浸透網状組織を得る。この工程をもちろん、もし必要であれば別の懸濁液／スラリーと共に、最終スキャフォールド構造を形成するように、複数回繰り返してもよい。
【００８１】
固液共合成方法は固相共合成方法と類似しており、何回も繰り返すことができる一連のステップを含み、一連の個々の多孔性構成部分を含む多孔性スキャフォールドを製造する。また固相共合成方法と同様に、それ自体は均質な多孔性スキャフォールドを含む１つまたは複数の多孔性構成部分を、凍結乾燥法によって結合する。しかし固液共合成方法は、少なくとも１つの構成部分を、凍結乾燥によって、１つまたは複数のすでに製造された構成部分と完全に接触するように配置されたスラリーから形成するという点において、固相共合成方法とは異なる。
【００８２】
「固液共合成：ステップ１：スラリーの調製」
水性コラーゲンスラリーの何らかの組み合わせを製造することができる。タイプＩコラーゲン［１０、１１］、タイプＩＩコラーゲン［１２］または無機質を含んだタイプＩコラーゲン／ＧＡＧ／ブラッシュ石スラリーを製造する詳細な製造手順がある（例えばPCT/GB04/004550参照）。
【００８３】
「固液共合成：ステップ２：多孔性構成部分の製造」
１つまたは複数の構成部分スキャフォールドを、異なったコラーゲンスラリーから、固相共合成に関して上に記載した１つまたは複数の凍結乾燥法を用いて製造する。
【００８４】
「固液共合成：ステップ３：すでに製造した多孔性構成部分の製造後工程」
製造後工程ステップを何度も、固相共合成に関して上に記載した凍結乾燥の後に、各スキャフォールド構成部分に対して行ってもよい。
【００８５】
「固液共合成：ステップ４：固液共合成」
各スキャフォールド構成部分の処理を完全に行った後、１つまたは複数のスラリーを、１つまたは複数のすでに製造した多孔性構成部分と完全に接触するように配置し；スラリーを、隣接したすでに製造した構成部分の細孔中に一定時間拡散させた後に、前記１つまたは複数のスラリーを凝固させ、凍結乾燥によって昇華させ、すでに製造した構成部分と完全に結合した新しいスキャフォールド構成部分の多相スキャフォールドを形成する。このステップを何回でも繰り返して、構成部分をいくつでも含む多相スキャフォールドを製造してもよい。
【００８６】
「固液共合成：ステップ５：製造後工程」
完全なスキャフォールド構造を組み立てた後、製造後工程ステップを何度も行うことができる。このような工程についてはすでにステップ３に列挙した。工程後、スキャフォールドを再び凍結乾燥し、多様な異種の構造および組成特性を有する多孔性のコラーゲンスキャフォールドを製造することができる。
【００８７】
本発明に記載の方法は、多構成部分スキャフォールドの製造に複数の利点を提供する。特に：
−スキャフォールドの異なる領域中に、個々に制御された物理的特性（すなわち、細孔の大きさ、細孔の形状、架橋密度、分解速度）、力学的特性（すなわち係数）、および化学的特性（すなわち、無機物含量、コラーゲン含量、グリコサミノグリカン含量）を有すること
−主成分であるコラーゲンの抱合を介した細胞付着の改善
−異なった構成部分間の境界にわたって相互に連結されたコラーゲン繊維構造による強い境界面強度
−固相共合成による、スキャフォールド中の化学組成の異なった隣接層間に限定された化学物質の拡散
【００８８】
本発明を以下に、さらに下記の実施例および図面を用いて説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】２層スキャフォールドを形成する実施例１Ｃによる固相共合成によって製造された２構成部分スキャフォールドを示した図であり、上部領域は、無機質を含まないタイプＩＩコラーゲンスキャフォールドから成り、一方下部領域は、無機質を含んだタイプＩコラーゲンスキャフォールドから成る。
【図２】実施例１Ｃによる固相共合成により製造された層状スキャフォールド中の無機物（ＣａおよびＰ）の元素分析を示した図であり、無機物は主に、無機質を含んだ領域（下の一組の緑の線の間）にもっぱら認められる。
【図３】実施例１Ｃによる、無機質を含んだタイプＩコラーゲンスキャフォールド構成部分および無機質を含まないタイプＩＩコラーゲンスキャフォールド構成部分から形成された層状スキャフォールド中の無機物の相対濃度を示した図である。
【実施例】
【００９０】
〔実施例１：固相共合成〕
Ａ．無機質（ブラッシュ石）を含んだタイプＩコラーゲン−グリコサミノグリカンスキャフォールドの製造
「懸濁液の調製」
PCT/GB04/004550にすでに記載されているように、無機質（ブラッシュ石）を含んだコラーゲン−グリコサミノグリカン懸濁液を、タイプＩコラーゲン（インテグラライフサイエンス社、Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、ＮＪ、米国）、コンドロイチン６−硫酸（シグマアルドリッチ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）、オルトリン酸（Ｈ3ＰＯ4、ＢＤＨラボラトリーサプライズ（BDH Laboratory Supplies）、Ｐｏｏｌｅ、英国）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）2、シグマアルドリッチ社）および硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ、シグマアルドリッチ社）から調製した。
【００９１】
「凍結乾燥」
１０ｍｍ層の無機質（ブラッシュ石）を含んだタイプＩコラーゲン−グリコサミノグリカン懸濁液を、底厚８ｍｍの長方形の（２５ｍｍ×５０ｍｍ）ポリスルホン型枠中に入れた。すでに記載した温度傾斜法（temperature ramping technique）［１０、１５］を用いて、無機質（ブラッシュ石）を含んだタイプＩコラーゲン−グリコサミノグリカン懸濁液を凝固させた：凍結乾燥器の温度を、室温から−２０℃まで、あらかじめ規定された速度（３℃／分）で変化させた後、−２０℃で６００分間保持し、完全に凝固させた［１５］；完全に凝固させた後、冷凍懸濁液を２５℃の温度で２４時間２００ｍＴｏｒｒの圧力で昇華させ、２５０μｍより大きい平均細孔径を有するコラーゲン−グリコサミノグリカンスキャフォールドとした。
【００９２】
「製造後工程」
スキャフォールドをその型枠から外し、あらかじめ規定されたカルボジイミド（液体化合物として）架橋処理により架橋させた［１６］。架橋後、スキャフォールドを繰り返しリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、シグマアルドリッチ社）と脱イオン水中で洗浄した。水和したスキャフォールドを、−４０℃の一定温度の凍結乾燥器に６０分間戻し、続いて昇華（０℃、１７時間、２００ｍＴｏｒｒ）させ、液体成分をスキャフォールドから除いた。
【００９３】
Ｂ．無機質を含まないタイプＩＩコラーゲン−グリコサミノグリカンスキャフォールドの製造
「懸濁液の調製」
作成済みのタイプＩＩコラーゲン−グリコサミノグリカン懸濁液（ガイストリッヒバイオマテリアルズ（Geistlich Biomaterials）、Ｗｏｌｈｕｓｅｎ、スイス）［１２］を冷蔵庫から出し、室温に戻した。
【００９４】
「凍結乾燥」
３ｍｍ層のタイプＩＩコラーゲン−グリコサミノグリカン懸濁液を、底厚８ｍｍの長方形の（２５ｍｍ×５０ｍｍ）ポリスルホン型枠中に入れた。すでに記載した温度傾斜法［１０、１５］を用いて、タイプＩＩコラーゲン−グリコサミノグリカン懸濁液を凝固した。凍結乾燥器の温度を、室温から−４０℃まで、あらかじめ規定された速度（１．４℃／分）で変化させた後、−４０℃で６０分間保持し完全に凝固させた［１５］；完全に凝固させた後、冷凍懸濁液を０℃の温度で１７時間２００ｍＴｏｒｒの圧力で昇華させ、約１００μｍの平均細孔径を有するコラーゲン−グリコサミノグリカンスキャフォールドを製造した。
【００９５】
「製造後工程」
スキャフォールドをそのポリスルホン型枠から外し、スキャフォールド剛性を強化しスキャフォールド分解速度を遅くするために、既述の脱水熱架橋処理により架橋した［１１、１３］；簡単にいえば、脱水熱架橋を１０５℃の温度で２４時間５０ｍＴｏｒｒの圧力で行った。
【００９６】
Ｃ．２層スキャフォールドを形成する固相共合成
「懸濁液の調製」
少量の既述の無機質を含まないタイプＩコラーゲン−グリコサミノグリカン懸濁液を、タイプＩコラーゲン（インテグラライフサイエンス社）、酢酸（シグマアルドリッチ社）、およびコンドロイチン６−硫酸（シグマアルドリッチ社）から調製した［１０、１１、１５］。
【００９７】
「固相共合成」
無機質（ブラッシュ石）を含んだタイプＩコラーゲン−グリコサミノグリカンスキャフォールドを、最初のスキャフォールド製造中に用いた長方形のポリスルホン型枠中に入れた。無機質を含まないタイプＩコラーゲン−グリコサミノグリカン懸濁液の薄層を、無機質（ブラッシュ石）を含んだスキャフォールドの上面全体に広げた。タイプＩＩコラーゲン−グリコサミノグリカンスキャフォールドを、懸濁液層の上部に配置した。両スキャフォールドを、コラーゲン−グリコサミノグリカン懸濁液で境界面に沿って水和した。
【００９８】
すでに記載した温度傾斜法［１０、１５］を用いて、２つのすでに形成されたスキャフォールド間の境界面に沿ったタイプＩコラーゲン−グリコサミノグリカン懸濁液を凝固した。凍結乾燥器の温度を、室温から−４０℃まで、あらかじめ規定された速度（１．４℃／分）で変化させた後、−４０℃で６０分間保持し、完全に凝固させた［１５］；完全に凝固させた後、冷凍懸濁液を、０℃の温度で１７時間２００ｍＴｏｒｒの圧力で昇華させた。
【００９９】
この方法により、２つの異なる領域（無機質を含んだタイプＩコラーゲン−グリコサミノグリカンと無機質を含まないタイプＩＩコラーゲン−グリコサミノグリカンスキャフォールド）を有する層状スキャフォールドが製造される。２つのスキャフォールド層は、２つの元のスキャフォールド間の境界面に広がる薄いタイプＩコラーゲン−グリコサミノグリカンスキャフォールド構造によって、ともに保持される（図１〜３参照）。
【０１００】
〔実施例２：固液共合成〕
Ａ．無機質（ブラッシュ石）を含んだタイプＩコラーゲン−グリコサミノグリカンスキャフォールドの製造
「懸濁液の調製」
既述の（PCT/GB04/004550参照）無機質（ブラッシュ石）を含んだコラーゲン−グリコサミノグリカン懸濁液を、タイプＩコラーゲン（インテグラライフサイエンス社、Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、ＮＪ、米国）、コンドロイチン６−硫酸（シグマアルドリッチ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）、オルトリン酸（Ｈ3ＰＯ4、ＢＤＨラボラトリーサプライズ（BDH Laboratory Supplies）、Ｐｏｏｌｅ、英国）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）2、シグマアルドリッチ社）および硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ、シグマアルドリッチ社）から調製した。
【０１０１】
「凍結乾燥」
無機質（ブラッシュ石）を含んだタイプＩコラーゲン−グリコサミノグリカン懸濁液の１０ｍｍ層を、底厚８ｍｍの長方形の（２５ｍｍ×５０ｍｍ）ポリスルホン型枠中に入れた。すでに記載した温度傾斜法［１０、１５］を用いて、無機質（ブラッシュ石）を含んだタイプＩコラーゲン−グリコサミノグリカン懸濁液を凝固させた。凍結乾燥器の温度を、室温から−２０℃まで、あらかじめ規定された速度（３℃／分）で変化させた後、−２０℃で６００分間保持し、完全に凝固させた［１５］；完全に凝固させた後、冷凍懸濁液を２５℃の温度で２４時間２００ｍＴｏｒｒの圧力で昇華させ、２５０μｍより大きい平均細孔径を有するコラーゲン−グリコサミノグリカンスキャフォールドとした。
【０１０２】
「製造後工程」
スキャフォールドをその型枠から外し、あらかじめ規定されたカルボジイミド（液体化学品に基づく）架橋処理により架橋した［１６］。架橋後、スキャフォールドを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、シグマアルドリッチ社）と脱イオン水中で繰り返し洗浄した。水和したスキャフォールドを、−４０℃の一定温度の凍結乾燥器に６０分間戻し、続いて昇華（０℃、１７時間、２００ｍＴｏｒｒ）させ、液体成分をスキャフォールドから除いた。
【０１０３】
Ｂ．２層スキャフォールドを形成する固液共合成
「懸濁液の調製」
タイプＩウシアキレス腱コラーゲンの０．０５Ｍリン酸懸濁液（デブロケーシングス（Devro Casings）、Ｍｏｏｄｉｅｓｂｕｒｎ、Ｃｈｙｓｔｏｎ、スコットランド）を含む冷凍高粘性スラリーを室温に戻した。
【０１０４】
「固液共合成」
無機質（ブラッシュ石）を含んだタイプＩコラーゲン−グリコサミノグリカン多孔性構成部分を、最初のスキャフォールド製造中に用いた長方形のポリスルホン型枠中に入れた。そして２ｍｍ層の高粘性タイプＩコラーゲン懸濁液を、無機質を含んだ多孔性構成部分の上面全体に広げ、多孔性構成部分／スラリー構造物を１５分間置いておくことにより、細孔構造の表面に近い範囲に浸透させた。
【０１０５】
すでに記載した温度傾斜法［１０、１５］を用いて、高粘性タイプＩコラーゲン懸濁液を凝固した。凍結乾燥器の温度を、室温から−４０℃まで、あらかじめ規定された速度（１．４℃／分）で変化させた後、−４０℃で６０分間保持し、完全に凝固させた［１５］；凝固後、冷凍懸濁液を０℃の温度で１７時間２００ｍＴｏｒｒの圧力で昇華させた。
【０１０６】
「製造後工程」
スキャフォールドをそのポリスルホン型枠から外し、既述のカルボジイミド架橋処理により架橋し［１９］、スキャフォールド剛性を強化し、スキャフォールド分解速度を遅くした。
【０１０７】
この方法により、２つの異なる領域（無機質を含んだタイプＩコラーゲン−グリコサミノグリカンおよび無機質を含まないタイプＩコラーゲン層）を有する層状スキャフォールドが製造される。
【０１０８】
本発明は、異なった構造特性、組成特性および機械的特性の範囲を有する大きな多孔性スキャフォールドを製造する新規方法を記載する。第１工程は固相共合成を含む。第２工程は固液共合成を含む。
【０１０９】
固相共合成により、より大きなスキャフォールド構造の異なった構成部分を別々に製造し、そして例えば、凍結乾燥により相互浸透コラーゲン繊維網状組織を形成するコラーゲンスラリーの薄層を介して、一緒に付着させることができる。この方法により、制御された物理的特性（すなわち、細孔の大きさ、細孔形状、架橋密度、分解速度）、力学的特性（すなわち係数）、および化学的特性（すなわち、無機物含量、コラーゲン含量、グリコサミノグリカン含量）を、異なる領域中に有する専用のスキャフォールドを製造できる。
【０１１０】
固液共合成により、異種のスキャフォールド構成部分を別々に製造し、そして他のスラリーと共に、凍結乾燥によって、より大きなスキャフォールド構造に組み立てることができる。この方法により、制御された物理的特性（すなわち、細孔の大きさ、細孔形状、架橋密度、分解速度）、力学的特性（すなわち係数）、および化学的特性（すなわち、無機物含量、コラーゲン含量、グリコサミノグリカン含量）を、異なる領域中に有する専用のスキャフォールドを製造できる。特に重要なことは、固相共合成方法と固液共合成方法を用いて達成された、異なったスキャフォールド領域間の境界面強度が強いことと、スキャフォールド成分間の化学物質の拡散が有益でない場合に、隣接したスキャフォールド領域間の化学物質の拡散を制御できることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１１１】
【特許文献１】EP-A-0164484
【特許文献２】EP-A-0164484
【特許文献３】EP-A-0214070
【非特許文献】
【０１１２】
【非特許文献１】Yannas IV. Tissue and Organ Regeneration in Adults. New York: Springer; 2001.
【非特許文献２】Hunziker EB, Driesang IMK. Functional Barrier Principle for Growth-Factor-Based Articular Cartilage Repair. Osteoarthritis and Cartilage 2003; 11 (5): 320-327.
【非特許文献３】Gao J, Dennis JE, Solchaga LA, Awadallah AS, Goldberg VM, Caplan AI. Tissue-Engineered Fabrication of an Osteochondral Composite Graft Using Rat Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering 2001; 7 (4): 363-371.
【非特許文献４】Gao J, Dennis JE, Solchaga LA, Goldberg VM, Caplan AI. Repair of Osteochondral Defect with Tissue-Engineered Two-Phase Composite Material of Injectable Calcium Phosphate and Hyaluronan Sponge. Tissue Engineering 2002; 8 (5): 827-837.
【非特許文献５】Hung CT, Lima EG, Mauck RL, Taki E, LeRoux MA, Lu HH, et al. Anatomically Shaped Osteochondral Constructs for Articular Cartilage Repair. Journal of Biomechanics 2003; 36: 1853-1864.
【非特許文献６】Niederauer GG, Slivka MA, Leatherbury NC, Korvick DL, H.H. HJ, Ehler WC, et al. Evaluation of Multiphase Implants for Repair of Focal Osteochondral Defects in Goats. Biomaterials 2000; 21: 2561-2574.
【非特許文献７】Schaefer D, Martin I, Shastri P, Padera RF, Langer R, Freed LE, et al. In Vitro Generation of Osteochondral Composites. Biomaterials 2000; 21 (24): 2599-2606.
【非特許文献８】Schaefer D, Martin I, Jundt G, Seidel J, Heberer M, Grodzinsky A, et al. Tissue-Engineered Composites for the Repair of Large Osteochondral Defects. Arthritis and Rheumatism 2002; 46(9): 2524-2534.
【非特許文献９】Sherwood JK, Riley SL, Palazzolo R, Brown SC, Monkhouse DC, Coates M, et al. A Three-Dimensional Osteochondral Composite Scaffold for Articular Cartilage Repair. Biomaterials 2002; 23: 4739-4751.
【非特許文献１０】O'Brien FJ, Harley BA, Yannas IV, Gibson LJ. Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds. Biomaterials 2004; 25 (6): 1077-1086.
【非特許文献１１】Yannas IV, Lee E, Orgill DP, Skrabut EM, Murphy GF. Synthesis and characterization of a model extracellular matrix that induces partial regeneration of adult mammalian skin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 86 (3): 933-937.
【非特許文献１２】Gordon TD, Schloesser L, Humphries DE, Spector M. Effects of the degradation rate of collagen matrices on articular chondrocyte proliferation and biosynthesis in vitro. Tissue Eng. 2004; 10 (7-8): 1287-1295.
【非特許文献１３】Harley BA, Spilker MH, Wu JW, Asano K, Hsu H-P, Spector M, et al. Optimal degradation rate for collagen chambers used for regeneration of peripheral nerves over long gaps. Cells Tissues Organs 2004; 176 (1-3): 153-165.
【非特許文献１４】Loree HM, Yannas IV, Mikic B, Chang AS, Perutz SM, Norregaard TV, et al. A freeze-drying process for fabrication of polymeric bridges for peripheral nerve regeneration. In: Proc. 15th Annual Northeast Bioeng. Conf.; 1989; 1989. p. 53-54.
【非特許文献１５】O'Brien FJ, Harley BA, Yannas IV, Gibson LJ. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials 2005; 26 (4): 433-441.
【非特許文献１６】Lee CR, Grodzinsky AJ, Spector M. The effects of crosslinking of collagen-glycosaminoglycan scaffolds on compressive stiffness, chondrocyte-mediated contraction, proliferation, and biosynthesis. Biomaterials 2001; 22: 3145-3154.
【非特許文献１７】Yannas IV, Burke JF, Huang C, Gordon PL. Correlation of in vivo collagen degradation rate with in vitro measurements. J Biomed Mater Res 1975; 9 (6): 623-628.
【非特許文献１８】Yannas IV, Tobolsky AV. Cross linking of gelatine by dehydration. Nature 1967; 215 (100): 509-510.
【非特許文献１９】Olde Damink LHH, Dijkstra PJ, van Luyn MJA, Van Wachem PB, Nieuwenhuis P, Feijen J. Cross-linking of dermal sheep collagen using a water soluble carbodiimide. Biomaterials 1996; 17:765-773.
【添付書類】
【０１１３】
出願者の先行国際特許出願、PCT/GB2006/000797、２００６年３月６日出願、の内容を以下に詳述する。
【０１１４】
本発明は生物医学的利用のための人工骨材料の分野に関し、特に組織工学用の、コラーゲン、リン酸カルシウムおよび任意にグリコサミノグリカンを含む多孔性一枚構造スキャフォールドおよび多孔性層状スキャフォールドに関する。
【０１１５】
自然骨は、コラーゲン、グリコサミノグリカン類を含む非コラーゲン性有機相および、リン酸カルシウムの生体複合材料である。その複雑な階層構造により、高い剛性、強度および破壊靱性を含む非常に優れた力学的な特性を示し、それによって骨は、日常生活でさらされている生理的ストレスに耐えることができる。本分野において研究者が取り組んでいる課題は、ヒトや動物体内の人工材料の内部や周辺で自然骨が増殖することのできる組成や構造を有する人工材料を製造することである。
【０１１６】
骨は、生体環境中で形成された骨様アパタイト層を介して、ヒト生体中でリン酸カルシウムと直接結合すること（生物活性と称される特性）が観察されている。他方では、コラーゲンおよび、コラーゲンやグリコサミノグリカン類などの他の生物有機化学物質を含む共重合体は、ヒト生体中の骨の生産や維持を担うものを含む、多くの細胞種の付着および増殖に最適な基質であることが知られている。
【０１１７】
ヒドロキシアパタイトは、骨置換材料中の成分として最も一般的に用いられるリン酸カルシウムである。しかしこれは、ブラッシュ石、リン酸三カルシウムおよびリン酸八カルシウムなどの他の形態のリン酸カルシウム材料と比較すると、比較的不溶性の物質である。アパタイトの溶解度が相対的に低いことは、生体中でのこの材料の再吸収速度が特に遅いので、生体材料を製造する際に不利になる可能性がある。
【０１１８】
ヒドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウムは力学的に堅い物質である。しかしこれらは、自然骨と比較すると比較的もろい。コラーゲンは力学的に強靭な物質であるが、自然骨と比較するとその剛性は比較的低い。コラーゲンとグリコサミノグリカン類の共重合体を含む物質は、コラーゲンのみのものよりより強靭でより堅いが、自然骨と比較するとまだその剛性は比較的低い。
【０１１９】
ヒドロキシアパタイトよりも力学的靭性を改良し、コラーゲンおよび、コラーゲンとグリコサミノグリカンの共重合体よりも剛性を改良した人工骨置換材料を製造する先の試みには、コラーゲンとアパタイトを機械的混合により結合することが含まれる。このような機械的方法はEP-A-0164484中に記載されている。
【０１２０】
より最近の開発では、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンおよびコンドロイチン−４−硫酸を機械的に混合したものを含む骨置換材料の製造がある。これはEP-A-0214070中に記載されている。この文献ではさらにコンドロイチン−４−硫酸のコラーゲンへの脱水熱架橋が記されている。アパタイト、コラーゲンおよびコンドロイチン−４−硫酸を含む材料は生体適合性が良いことが見出されている。アパタイトの、コラーゲンおよび任意にコンドロイチン−４−硫酸との機械的混合により、アパタイトをコラーゲン／コンドロイチン−４−硫酸でコーティングした粒子が実質的に形成される。このような材料は生体適合性があるものの、ヒトや動物の体内にあるとき自然骨の内部増殖に限度があり、人工材料のリン酸カルシウム相を再利用しないことが明らかとなっている。
【０１２１】
外傷、奇形または疾患により損なわれた骨格部位の修復には、整形外科医にとって特別な課題があり、その中には、皮膚、神経および他のほとんどの組織中の異常とは異なり、骨格の異常は複数の異なった組織型（すなわち骨、軟骨、腱および靱帯）にわたり、通常の力学的負荷を受ける場所を含み、また石灰化組織と非石灰化組織間を横切る境界面（例えば靱帯付着部、骨／軟骨境界面の「石灰化線」）を含む。
【０１２２】
既存の臨床的アプローチは、再吸収できない補綴インプラント、自家または同種組織移植、化学薬品、細胞移植またはこれらの方法の組み合わせによる骨格異常の修復を目指している。これらのアプローチは、単一組織型の治療にいくらかの成功を収めているが、例えば関節の異常などの、石灰化組織と非石灰化組織間の境界面が含まれる場合、よくても回復中、すなわち、不完全となる。さらに、既存の治療が最もうまくいっても、ドナー側からの組織の摘出および／または骨、軟骨、靱帯または腱の縫合が必要である。前者の方法にはドナー側の不足およびドナー側の罹患の問題があり、一方後者は施術が困難で、縫合穴の形での別の異常を引き起こしてしまう。
【０１２３】
用語「複合スキャフォールド」と「層状スキャフォールド」は同義語であり、各層の材料組成がその隣接層の材料組成と実質的に異なる２つ以上の層を含むスキャフォールドをいう。用語「単一層スキャフォールド」または「一枚構造スキャフォールド」は同義語であり、各層の材料組成が全体にわたってほとんど均質である１層のみを含むスキャフォールドをいう。
【０１２４】
軟骨だけまたは骨と軟骨の両方をふくむ関節の異常を治療するために、多孔性層状スキャフォールドを用いる組織工学法を開発しようとしている近年の取り組みは、限られた数しかない。これらの構成体により、骨と軟骨の同時再生を試みているが、それはそれぞれに対して別のスキャフォールドを用いるものである（Ｎｉｅｄｅｒａｕｅｒら、２０００年；Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２０００年；Ｇａｏら、２００１年；Ｇａｏら、２００２年；Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２００２年；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、２００２年；Ｈｕｎｇら、２００３年；ＨｕｎｚｉｋｅｒおよびＤｒｉｅｓａｎｇ、２００３年）。
【０１２５】
層状スキャフォールドの別の特徴は、骨層を軟骨下骨板と直接接着することにより、縫合せずに固定できる可能性があることである。もし軟骨性部位が骨性部分としっかりと接着されたままであるなら、さらなる固定は必要ない。縫合しない固定により、腱や靱帯の骨への付着部を含む異常をまた治療できるかもしれない。
【０１２６】
この新しい取り組みは有望ではあるが、２つの欠点により、今までに報告された層状スキャフォールドの有効性が制限される可能性がある。１つ目は、スキャフォールドの各層に用いられる材料に関するものである。再吸収可能な合成ポリマーは軟骨層に用いられる唯一の材料であり、また多くの場合、これらの多くのスキャフォールド中の骨性部位の構成成分でもある。合成ポリマーは加工しやすいが、コラーゲンなどの天然ポリマーと比べて細胞の付着および増殖をほとんど促進しないことが知られており、さらに分解により高濃度の酸を放出する可能性がある。さらに、腱または靱帯の修復を必要とする用途に対して、再吸収可能な合成ポリマーは、架橋されているにもかかわらず、リハビリテーション運動中にかかる減弱された負荷に耐えることにさえ不十分な強度や剛性しか有していない。
【０１２７】
通常の層状スキャフォールドの第２の欠点は、各層間の境界面に関するものである。自然関節および腱／靱帯付着部は、石灰化領域と非石灰化領域間でコラーゲン繊維が連続性を持っていることにより特徴づけられる。円滑な変化（緩やかな境界面）による系により、本質的な力学的安定性がこれらの部位に与えられ、力学的な不具合が起こることなく生理学的負荷にこれらが耐えることができる。一方、大多数の既存の層状スキャフォールドははっきりした境界面を有し、２つの異種の材料間に明確な境界を形成する。縫合（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２０００年）、フィブリン接着（Ｇａｏら、２００１年）および他の方法（Ｇａｏら、２００２年；Ｈｕｎｇら、２００３年）は、この境界面を強化するために行われている。しかし、境界面の剥離はまだ管理された動物モデルにおいてでさえ報告されている。これらの縫合および接着方法はまた高度の技術を要し、再現性に乏しい。
【０１２８】
先の研究で、凍結乾燥手順のパラメーターを制御して、コラーゲンと１つまたは複数のグリコサミノグリカン類（ＧＡＧｓ）の多孔性スキャフォールドを製造できる手段が開発されている（Ｙａｎｎａｓら、１９８９年；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、２００４年；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、２００５年；Ｌｏｒｅｅら、１９８９年）。これらの方法により、パラメーターを、外傷や損傷部位における治癒反応に著しい効果があることが知られているものに制御し、細孔の大きさやアスペクト比などのスキャフォールドの特徴を変化させることができる。しかし、骨格および筋骨格の異常を含む損傷の治療には、無機質を含まないコラーゲン−ＧＡＧスキャフォールドではなく、骨の材料組成および力学的特性と厳密に一致する多孔性スキャフォールドを製造する技術を開発する必要がある。
【０１２９】
本発明は先行技術に関連する、少なくともいくつかの問題を解決しようとするものである。
【０１３０】
無機物質および有機物質を含む複合生体材料の製造方法であって、本方法は：
（ａ）液体担体、無機物質および有機物質を含む第１スラリー組成物を用意し；
（ｂ）スラリーの型枠を用意し；
（ｃ）スラリーを型枠中に入れ；
（ｄ）型枠中に入れたスラリーを、複数の固形結晶または粒子に液体担体が変わる温度に冷却し；
（ｅ）複数の固形結晶または粒子のうち少なくともいくつかを、好ましくは昇華および／または気化により除き、無機物質および有機物質を含む多孔性複合材料を残し；
（ｆ）材料を型枠から外すこと、を含む。
【０１３１】
ここで用いられる用語「生体材料」は、ヒトまたは動物の生体に適合する材料を意味する。
【０１３２】
ここで用いられる用語「スラリー」は、スラリー、溶液、懸濁液、コロイド溶液および分散液を含む。
【０１３３】
無機物質はリン酸カルシウム材を通常含むだろう。
【０１３４】
有機物質は生物有機種、例えば水性媒体中に溶解または懸濁してスラリーを形成することができるものを通常含むだろう。例としては、１つまたは複数のアルブミン、グリコサミノグリカン類、ヒアルロナン、キトサン、およびコラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチドが挙げられる。コラーゲンは好ましい材料であり、任意にグリコサミノグリカンと共に用いられる。
【０１３５】
ここで用いられる用語「コラーゲン」は、組み換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む。
【０１３６】
好ましい実施形態において、無機物質はリン酸カルシウム材を含み、有機物質はコラーゲンおよび任意にグリコサミノグリカンを含む。これにより、リン酸カルシウム材およびコラーゲンおよび任意にグリコサミノグリカンを含む多孔性複合材料となる。第１スラリーは、コラーゲンおよびリン酸カルシウム材の共沈物を含むことが好ましい。第１スラリーは、コラーゲン、リン酸カルシウム材およびグリコサミノグリカンの３種類の共沈物を含むことがより好ましい。
【０１３７】
あるいは、第１スラリーは、コラーゲンとリン酸カルシウム材および任意にグリコサミノグリカンの機械的な混合物を単に含んでもよい。これを、例えばEP-A-0164484およびEP-A-0214070に記載されているような従来技術によって製造してもよい。機械的混合物をスラリーの形成に用いてもよいが、コラーゲンおよびリン酸カルシウム材の共沈物またはコラーゲン、リン酸カルシウム材およびグリコサミノグリカンの３種類の共沈物が好ましい。
【０１３８】
リン酸カルシウム材を、例えば１つまたは複数のブラッシュ石、リン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトから選択することができる。リン酸カルシウム材はブラッシュ石を含むことが好ましい。
【０１３９】
スラリーのｐＨは、好ましくは２．５〜６．５、より好ましくは２．５〜５．５、さらに好ましくは３．０〜４．５、さらにより好ましくは３．８〜４．２である。
【０１４０】
スラリー組成物は、１つまたは複数のグリコサミノグリカン類を含んでもよい。スラリー組成物は、１つまたは複数のリン酸カルシウム材を含んでもよい。
【０１４１】
前駆スラリー中に他の化学種（例えば銀、ケイ素、シリカ、食塩、糖など）が存在することは除外されない。
【０１４２】
複数の固形結晶または粒子のうち少なくともいくらかを昇華および／または気化により除き、コラーゲン、リン酸カルシウム材および任意にグリコサミノグリカンを含む多孔性複合材料を残す。好ましい方法は昇華である。
【０１４３】
ステップ（ｄ）および（ｅ）を凍結乾燥法により行うことができる。もし液体担体が水であれば、昇華ステップは、型枠と冷凍スラリーの周囲の環境を水／氷／水蒸気系の三重点未満に減圧し、続いて達成された減圧で固相−気相転移温度より高い温度に昇温させることを含む。周囲の液体蒸気分圧が、その温度で冷凍液の分圧より低ければ、生成物中の氷は昇華により直接、水蒸気に変換される。温度を通常０℃以上に上昇させる。このステップを行い、氷の結晶を冷凍スラリーから昇華により除く。
【０１４４】
凍結乾燥パラメーターを調節して、細孔の大きさとアスペクト比を要望通りに制御することができる。一般的に、冷却速度がより遅く最終凍結温度がより高ければ（例えば１分あたり約０．２５℃で約−１０℃の温度までの冷却）、より高いアスペクト比を有する大きな細孔が優位になり、一方冷却速度がより速く最終凍結温度がより低ければ（例えば１分あたり約２．５℃で約−４０℃の温度までの冷却）、小さな等軸の細孔の形成が優位になる。
【０１４５】
ここで用いられる用語「型枠」は、スラリー組成物を、成形、保持または支持することのできる何らかの型枠、容器または担体を含むことを意図する。従って、最も単純な形態における型枠には単に支持面を含むことができる。型枠は何らかの望ましい形状であってよく、ポリマー（ポリスルホン、ポリプロピレン、ポリエチレンなど）、金属（ステンレス鋼、チタン、コバルト・クロムなど）、セラミックス（アルミナ、ジルコニアなど）、ガラスセラミックス、およびガラス（ホウケイ酸ガラスなど）を含む何らかの適当な材料から型枠を製造することができる。
【０１４６】
出願者の先行出願、PCT/GB04/004550、２００４年１０月２８日出願、には、コラーゲン、ブラッシュ石およびグリコサミノグリカンの３種類の共沈物およびその調製方法が記載されている。PCT/GB04/004550の内容を本願に引用して援用する。
【０１４７】
PCT/GB04/004550に記載の方法には：コラーゲン、カルシウム源、リン源およびグリコサミノグリカンを含む酸性水溶液を用意し；コラーゲン、ブラッシュ石およびグリコサミノグリカンを共に水溶液から沈殿させ、３種類の共沈物を形成することを含む。
【０１４８】
用語「共沈物」は２つまたは３つの化合物の沈殿物を意味し、ここで化合物は実質的に同時に、同じ溶液／分散液から沈殿する。これは、成分の機械的混合から生成した物質、特にこれらの成分が別々に、例えば異なった溶液中で沈殿したものとは区別される。共沈物の微細構造は、その成分の機械的混合から生成した物質とは、実質的に異なる。
【０１４９】
共沈物の調製工程において、カルシウム源は、１つまたは複数の硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウムアルコキシド、水酸化カルシウム、ケイ酸カルシウム、硫酸カルシウム、グルコン酸カルシウムおよびヘパリンのカルシウム塩から選択されることが好ましい。ヘパリンのカルシウム塩は、ブタ腸粘膜由来であってもよい。適当なカルシウム塩は、例えばシグマアルドリッチ社から市販されている。リン源は、１つまたは複数のリン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸、オルトリン酸水素二ナトリウム二水和物（Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、時にＧＰＲソレンセン塩といわれる）およびリン酸トリメチル、リン酸のアルカリ金属塩（例えばＮａやＫ）、リン酸のアルカリ土類塩（例えばＭｇやＣａ）から選択されることが好ましい。
【０１５０】
グリコサミノグリカンは、繰返し二糖単位を含む長鎖非分岐多糖を含む高分子種である。好ましくは、グリコサミノグリカンは、１つまたは複数のコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸から選択される。コンドロイチン硫酸はコンドロイチン−４−硫酸またはコンドロイチン−６−硫酸であってもよく、ともに例えばシグマアルドリッチ社から市販されている。コンドロイチン−６−硫酸はサメ軟骨由来であってもよい。ヒアルロン酸はヒト臍帯由来であってもよい。ヘパリンはブタ腸粘膜由来であってもよい。
【０１５１】
コラーゲンは可溶性でも不溶性でもよく、いかなる動物中のいかなる組織由来であってもよく、従来技術を何度も用いて抽出してもよい。
【０１５２】
沈殿を、コラーゲン、カルシウム源、リン源およびグリコサミノグリカンを酸性水溶液中で混合し、沈殿ができるまで溶液を放置するか、溶液を撹拌するか、アンモニアなどの塩基性滴定剤を用いて滴定するか、作成済みのブラッシュ石などの核形成剤を添加するか、カルシウム源の添加速度を変化させるか、またはこれらのまたは従来知られている多くの他の技術を組み合わせることにより生じさせることができる。
【０１５３】
当然のことながら他の成分がスラリー中に存在してもよい。例えば、増殖因子、遺伝子、薬物または他の生物学的に活性な物質を、単独でまたは組み合わせてスラリーに任意に加えてもよい。
【０１５４】
好ましい実施形態において、本発明による方法はさらに：液体担体、有機物質および任意に無機物質を含む第２スラリー組成物を用意し；前記冷却ステップより前、前記第１スラリー組成物を入れる前または後に前記第２スラリー組成物を型枠中に入れることを含むことが好都合である。
【０１５５】
既述のとおり、有機物質は、１つまたは複数のコラーゲン（組み換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む）、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン、およびコラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチドを通常含むだろう。
【０１５６】
第２スラリー組成物は、例えばリン酸カルシウム材などの無機物質を含んでもよい。
【０１５７】
第２スラリー組成物は、液体担体、コラーゲン、任意にリン酸カルシウム材および任意にグリコサミノグリカンを含むことが好ましい。この実施形態においては、第２スラリー組成物は、コラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈物、またはコラーゲンとリン酸カルシウム材の共沈物、またはコラーゲン、グリコサミノグリカンおよびリン酸カルシウム材の３種類の共沈物を含むことが好ましい。共沈物についてはすでに第１スラリーの調製に関して論じている。
【０１５８】
あるいは、第２スラリーは、コラーゲンおよび、任意にリン酸カルシウム材とグリコサミノグリカンのうちの１つまたは両方の機械的混合物を単に含んでもよい。機械的混合物についてはすでに第１スラリーの調製に関して論じている。
【０１５９】
もしあれば、第２スラリー中のリン酸カルシウム材を、１つまたは複数のブラッシュ石、リン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトから選択してもよい。
【０１６０】
第１スラリー組成物および第２スラリー組成物を、第１層および第２層として型枠中に通常入れるだろう。例えば、第１スラリーを型枠中に入れ、続いて第２スラリーを入れる。そして型枠内容物をステップ（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）に付すことができる。したがって、本方法を多層化材料の形成に用いてもよく、そのうち少なくとも１層はコラーゲン、リン酸カルシウム材および任意にグリコサミノグリカンを含む多孔性複合材料を含むことが好ましい。第２スラリー組成物から生成する層は、多孔性層または非多孔性層であることができる。もし多孔性層が望ましければ、細孔を、第２スラリー中に生成した複数の固形結晶または粒子の昇華および／または気化により作り出すことができる。この方法はすでに第１スラリーに関して論じており、凍結乾燥法を含むことが好ましい。
【０１６１】
本工程は液相中で行われ、これは第１スラリー層および第２スラリー層間に拡散をもたらす。
【０１６２】
層を、いかなる層の順序または配置方法で堆積させてもよい。層を例えば、垂直に（すなわち層の上に重ねて）、水平に（すなわち層の横に）および／または放射状に（下層の上に球状の層があるように）位置させることができる。
【０１６３】
本発明による成型方法によれば、組織工学用の多孔性一枚構造スキャフォールドおよび多孔性層状スキャフォールドを製造することができる。
【０１６４】
第１スラリー組成物と第２スラリー組成物を型枠中に入れた後、型枠の内容物を冷却ステップの前に最大２４時間まで、寝かせることが好ましい。
【０１６５】
これにより種々のスラリー成分が隣接層間で内部拡散するので好都合である。これにより層間結合強度が強化されることになる。
【０１６６】
第１スラリー中の液体担体は水を含むことが好ましい。第２スラリー中の液体担体もまた水を含むことが好ましい。
【０１６７】
当然のことながら、前記冷却ステップより前、前記第１スラリー組成物および／または第２スラリー組成物を加える前または後に、さらにスラリー層を型枠中に入れることができる。
【０１６８】
冷却ステップより前に型枠中に入れたスラリーの温度は通常、スラリーの粘度に影響を及ぼすだろう。温度が高すぎると、スラリーの粘度が極端に低くなり、第２スラリーを加えたとたんに、第１層と第２層が完全に（従って好ましくなく）混合してしまうかもしれない。温度が高すぎると、コラーゲンが変性するかもしれないことにもまた留意されたい。他方では、温度が低すぎると、効率的に拡散、平滑化または成形させるにはスラリーの粘度が高くなりすぎ、氷の結晶が速くできてしまう危険性がある。したがって、本発明者らは、冷却ステップより前に型枠中に入れた第１スラリーの温度は、好ましくは２〜４０℃の範囲、より好ましくは４〜３７℃、さらにより好ましくは２０〜３７℃であることを見出した。もし多層スラリー組成物を用いるなら、これらの範囲はまた別のスラリーにも適用できる。
【０１６９】
型枠中に入れた第１スラリーを冷却するステップは、≦０℃の温度で行うことが好ましい。より好ましくは、本冷却ステップは−１００〜０℃の範囲の温度で行われ、好ましくは−８０〜−１０℃、より好ましくは−４０〜−２０℃である。もし多層スラリー組成物を用いるなら、これらの範囲はまた別のスラリーにも適用できる。
【０１７０】
型枠中に入れた第１スラリーの冷却ステップは、好ましくは０．０２〜１０℃／分の冷却速度、より好ましくは０．０２〜６．０℃／分の冷却速度、さらにより好ましくは０．２〜２．７℃／分の冷却速度で行われる。もし多層スラリー組成物を用いるなら、これらの範囲はまた別のスラリーにも適用できる。
【０１７１】
一般的に、冷却速度がより遅く最終凍結温度がより高ければ（例えば１分あたり０．２５℃で−１０℃の温度までの冷却）、より高いアスペクト比を有する大きな細孔が優位になり、一方冷却速度がより速く最終凍結温度がより低ければ（例えば１分あたり２．５℃で−４０℃の温度までの冷却）、小さな等軸の細孔の形成が優位になる。
【０１７２】
型枠中に入れたスラリーの冷却ステップは、好ましくは１〜２００ｋＰａの圧力で、より好ましくは５０〜１５０ｋＰａの圧力で、さらにより好ましくは５０〜１０１．３ｋＰａの圧力で行われる。もし多層スラリー組成物を用いるなら、これらの範囲はまた別のスラリーにも適用できる。本発明者らは、圧力が５０ｋＰａ未満であればスラリー中に気泡が生成する可能性があり、一方圧力が２００ｋＰａより大きい隣接層との過度の混合が起こるかもしれないことを見出した。
【０１７３】
型枠中に入れた第１スラリーの厚さは、好ましくは０．１〜５００ｍｍ、より好ましくは０．５〜２０ｍｍ、さらにより好ましくは１．０〜１０ｍｍである。もし多層スラリー組成物を用いるなら、これらの範囲はまた別のスラリーにも適用できる。層の厚さが５００ｍｍを超えると完全には凝固しにくくなり、一方層の厚さが０．１ｍｍ未満だとほとんど瞬間的に凍結していまい、氷の結晶核形成および成長の進行を正確に制御することが困難になる。
【０１７４】
型枠中に入れる前の第１スラリーの粘度は、好ましくは０．１〜５０Ｐａ・ｓ、より好ましくは０．１〜１０Ｐａ・ｓ、さらにより好ましくは０．５〜５Ｐａ・ｓである。もし多層スラリー組成物を用いるなら、これらの範囲はまた別のスラリーにも適用できる。スラリーの粘度が非常に高いと、拡散、平滑化および成形が難しくなる可能性があり、一方粘度が極端に低いと、第２スラリーを加えたとたんに、第１層と第２層が完全に（従って好ましくなく）混合してしまうかもしれない。
【０１７５】
第１スラリー中の、少なくともいくらかの固形結晶または粒子を昇華により除くステップは、好ましくは０〜０．０８ｋＰａの圧力で、より好ましくは０．００２５〜０．０８ｋＰａの圧力で、さらにより好ましくは０．００２５〜０．０４ｋＰａの圧力で行われる。もし多層スラリー組成物を用いるなら、これらの範囲はまた別のスラリーにも適用できる。圧力が水の三重点（約０．０８ｋＰａ）より高いと、昇華の代わりに融解が起こる危険性があり、一方圧力を極端に低くすることは困難で、昇華の促進には必要ない。
【０１７６】
第１スラリー中の、少なくともいくらかの固形結晶または粒子を昇華により除くステップに関しては、昇華の継続時間が短かすぎると、残った水や溶媒がスキャフォールド壁の再溶解を引き起こし、したがって細孔構造を危ういものにする可能性がある。したがって、本発明者らは、このステップは好ましくは９６時間以下、より好ましくは１２〜７２時間、さらにより好ましくは２４〜３６時間行われることを見出した。もし多層スラリー組成物を用いるなら、これらの範囲はまた別のスラリーにも適用できる。
【０１７７】
第１スラリー中の、少なくともいくらかの固形結晶または粒子を昇華により除くステップは、好ましくは−１０〜６０℃の温度で、より好ましくは０〜４０℃の温度で、さらに好ましくは２０〜３７℃の温度で、さらにより好ましくは２５〜３７℃の温度で行われる。もし多層スラリー組成物を用いるなら、これらの範囲はまた別のスラリーにも適用できる。もし昇華中の温度が低すぎると、完全に昇華するまでに必要な時間が極端に長くなる可能性があり、一方極端に高い温度だと（すなわち４０℃を超える）、コラーゲンが変性する危険性がある。
【０１７８】
もし材料がコラーゲンおよびグリコサミノグリカンを含むなら、本発明による方法は、多孔性複合生体材料中のコラーゲンおよびグリコサミノグリカンを架橋するステップをさらに含んでもよい。架橋は通常、昇華後に材料を型枠から外した後、行われるだろう。架橋は、共沈物を、１つまたは複数のガンマ線放射、紫外線放射、脱水熱処理、グルコース、マンノース、リボースおよびショ糖などの簡単な糖による非酵素的糖化に付すこと、３種類の共沈物を、１つまたは複数のグルタルアルデヒド、カルボジイミド（例えばエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド）および／またはノルジヒドログアヤレチック酸と接触させること、またはこれらの方法のなんらかの組み合わせにより行うことができる。これらの方法は技術的に通常のものである。
【０１７９】
もし材料がリン酸カルシウムを含むなら、本発明による方法は、多孔性複合生体材料中の少なくともいくらかのリン酸カルシウム材を他のリン酸カルシウム相に変換させるステップをさらに含むことができる。例えば本方法は、多孔性複合生体材料中の少なくともいくらかのブラッシュ石をリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトに変換するステップを含んでもよい。ブラッシュ石のリン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトへの変換を加水分解により行うことが好ましい。相変換は通常、材料を型枠から外した後（および任意に架橋後）に行われるだろう。
【０１８０】
アパタイトはカルシウムおよびリン酸塩を含む無機物類であり、一般式：Ｃａ5（ＰＯ4）3（Ｘ）、ここでＸはイオン、すなわち通常ＯＨ-、Ｆ-およびＣｌ-であってよく、当業者に公知の他のイオンでもよい、を有する。用語「アパタイト」は、ケイ素置換アパタイトなどの置換アパタイトをまた含む。用語「アパタイト」は、アパタイトの具体例であるヒドロキシアパタイトを含む。ヒドロキシアパタイトは、例えばケイ素などの他の化学種でまた置換されてもよい。
【０１８１】
上述のように、前記冷却ステップより前、前記第１スラリー組成物および／または第２スラリー組成物を加える前または後に、さらにスラリー層を型枠中に入れることができる。さらなるスラリー層は、例えば液体担体、コラーゲン、任意にリン酸カルシウム材、および任意にグリコサミノグリカンをまた通常含むだろう。種々のスラリー成分が隣接層に内部拡散するように、型枠の内容物を、冷却ステップの前に最大２４時間まで、寝かせることが好ましい。
【０１８２】
したがって本発明は、１層、２層またはそれ以上の層を含む複合生体材料の製造方法を提供する。少なくとも１つの層は、コラーゲン、リン酸カルシウム材、およびまた好ましくはグリコサミノグリカンの多孔性生体複合材料を含むことが好ましい。すべての層は、コラーゲンを含むことが好ましい。
【０１８３】
本発明による複合生体材料を、例えば多孔性一枚構造スキャフォールド、または少なくとも１つの層が多孔性である多層スキャフォールドの製造に用いてもよい。本発明による複合生体材料を、筋骨格用および歯科用組織再生スキャフォールドとして用いることが好都合である。
【０１８４】
本発明による方法は、第１層および第２層中の有機成分としてコラーゲンを包含することを含むことが好ましい（コラーゲンは、第１層および第２層中の主有機成分であることが好ましい）。もし別の層が存在するなら、本方法は、１つまたは複数の、これらのさらなる層中の有機成分としてコラーゲンを包含することを含むことが好ましい（コラーゲンは、１つまたは複数のさらなる層中の主有機成分であることがまた好ましい）。本方法はすべての層、従って同時に液相中のそれらの境界面を製造することを含む。これにより、内部拡散を介して層間の強い境界面を作ることになる。用語「内部拡散」は、異なる組成の２つのスラリーが完全に接触するように配置されるとき、分子拡散またはブラウン運動の結果として起こる混合をいう。
【０１８５】
第２の態様において、本発明は合成複合生体材料を提供し、ここで少なくとも一部の生体材料は、リン酸カルシウム材および、１つまたは複数のコラーゲン（組み換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む）、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサンまたはコラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチドを含む多孔性共沈物から形成され、ここでマクロ孔の大きさの範囲（孔径）は好ましくは１〜１０００ミクロン、より好ましくは２００〜６００ミクロンである。材料はコラーゲンを含むことが好ましい。リン酸カルシウム材は、１つまたは複数のブラッシュ石、リン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトから選択されることが好ましい。多孔性材料は、コラーゲンとリン酸カルシウム材の共沈物を含むことが好ましい。これについてはすでに本発明の第１態様に関して論じている。
【０１８６】
ここで用いられる用語「多孔性」は、材料がマクロ孔および／またはミクロ孔を含んでもよいことを意味する。マクロ孔性は一般に、約１０ミクロンより大きい細孔に関する特徴をいう。ミクロ孔性は一般に、約１０ミクロン未満の細孔に関する特徴をいう。当然のことながら、材料中に連続気泡と独立気泡のいかなる組み合わせがあってもよい。例えば材料は、マクロ孔とミクロ孔の両方を通常含むだろう。マクロ孔性は通常連続気泡構造であるが、独立気泡成分があってもよい。
【０１８７】
本発明の第２態様による多孔性材料中のマクロ孔の大きさの範囲（孔径）は、通常１〜１２００ミクロン、好ましくは１０〜１０００ミクロン、より好ましくは１００〜８００ミクロン、さらにより好ましくは２００〜６００ミクロンである。
【０１８８】
本発明の第２態様による多孔性材料中の平均アスペクト比の範囲は、好ましくは１〜５０、より好ましくは１〜１０、最も好ましくは約１である。
【０１８９】
本発明の第２態様による多孔性材料中の細孔の大きさの分布（平均孔径の標準偏差）は、好ましくは１〜８００ミクロン、より好ましくは１０〜４００ミクロン、さらにより好ましくは２０〜２００ミクロンである。
【０１９０】
本発明の第２態様による多孔性材料中の有孔率は、好ましくは５０〜９９．９９ｖｏｌ％、より好ましくは７０〜９８ｖｏｌ％である。
【０１９１】
本発明の第２態様による多孔性材料中の連続気泡有孔率の割合（連続気泡および独立気泡の両細孔の全数の割合として測定）は、好ましくは１〜１００％、より好ましくは２０〜１００％、さらにより好ましくは９０〜１００％である。
【０１９２】
第３の態様において、本発明は合成複合生体材料を提供し、ここで少なくとも一部の生体材料は、リン酸カルシウム材および、２つ以上のコラーゲン（組み換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む）、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサンおよびコラーゲンのポリペプチド配列の一部を含む合成ポリペプチドを含む多孔性材料から形成される。本材料は、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンを含むことが好ましい。リン酸カルシウム材は、１つまたは複数のブラッシュ石、リン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトから選択されることが好ましい。多孔性材料は、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびリン酸カルシウム材の３種類の共沈物を含むことが好ましい。これについてはすでに本発明の第１態様に関して論じている。本発明の第２態様による多孔性材料中のマクロ孔の大きさの範囲（孔径）はまた第３態様にも適用できる。平均アスペクト比範囲、細孔の大きさの分布、有孔率および連続気泡有孔率の割合も同じである。
【０１９３】
第４態様において、本発明は：
本発明の第２態様または第３態様に記載の複合生体材料の形成された第１層；および
第１層に結合し、コラーゲン、またはコラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈物、またはコラーゲンとリン酸カルシウム材の共沈物、またはコラーゲン、グリコサミノグリカンおよびリン酸カルシウム材の３種類の共沈物を含む材料の形成された第２層、を含む合成複合生体材料を提供する。リン酸カルシウム材は、１つまたは複数のブラッシュ石、リン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトから選択されることが好ましい。
【０１９４】
第１層と第２層を一体化して形成することが好ましい。これを、液相共合成を含む方法により好都合に行うことができる。これには、前駆物質を含むスラリーの配置により、多層を含む材料の、高密度または多孔性の隣接層を形成し、液体担体を前記スラリーから除く前に各層と互いに完全に接触させる工程と、前記液体担体をすべての層から除くことを好ましくは実質的に同時に行う工程を含む。前駆物質スラリーが完全に接触するように、液体担体を除く前に（すなわちまだ液相中にある間に）配置することにより、隣接スラリー間に相互拡散がおこる。これにより、生成する材料の隣接層間の境界に相互拡散帯ができ、その内部の材料組成は、隣接層の材料組成の中間物となる。相互拡散帯が存在することで、力学的強度および安定性が隣接層間の境界面に与えられる。したがって、第１層および第２層を、内部拡散層を介して互いに結合することが好ましい。
【０１９５】
あるいは、第１層と第２層を、中間層を介して互いに結合してもよい。用語「中間層」は、中間層結合強度を改善する目的、または生成するスキャフォールドの隣接層間を、細胞、分子または体液が通過することを阻止する目的で、２つの他の層の間に独立して置かれた何らかの層をいい、例えばコラーゲン、グリコサミノグリカン、フィブリン、抗血管新生薬（例えばスラミン）、増殖因子、遺伝子または何らかの他の成分を含んでもよい。中間層は、その組成物が隣接層の組成物とは異なるスラリーとして別に置かれ、一方内部拡散層は、隣接層間の内部拡散の結果としてのみ形成されることから、中間層は内部拡散層とは区別される。
【０１９６】
第１層は多孔性である。第２層もまた多孔性であることが好ましいが、もし必要であれば、非多孔性層または実質的に非多孔性層であることができる。
【０１９７】
本発明の第２態様による多孔性材料中のマクロ孔の大きさの範囲（孔径）をまた、第４態様による実施形態中の第１層および／または第２層に適用できる。平均アスペクト比の範囲、細孔の大きさの分布、有孔率および連続気泡有孔率の割合も同じである。
【０１９８】
第２、第３および第４態様のいずれにおいても、生体材料は、第１層および／または第２層に結合した１つまたは複数のさらなる層を含んでもよく、各前記のさらなる層を、コラーゲン、またはコラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈物、またはコラーゲンとリン酸カルシウム材の共沈物、またはコラーゲン、グリコサミノグリカンおよびリン酸カルシウム材の３種類の共沈物を含む材料から形成することが好ましい。リン酸カルシウム材は、１つまたは複数のブラッシュ石、リン酸八カルシウムおよび／またはアパタイトから選択されることが好ましい。第１層、第２層および前記１つまたは複数のさらなる層を一体化して形成することが好ましく、隣接層を、液相共合成によって通常形成される内部拡散層を介して互いに結合することが好ましい。通常、少なくとも１つの前記さらなる層は多孔性であるだろう。再度、本発明の第２態様による多孔性材料中のマクロ孔の大きさの範囲（孔径）を、１つまたは複数のこれらのさらなる層にまた適用することができる。平均アスペクト比範囲、細孔の大きさの分布、有孔率および連続気泡有孔率の割合も同じである。
【０１９９】
隣接層間の細孔の大きさの相違は、ほとんど無視できる程度から＋／−１０００ミクロン程度の変動であってよい。
【０２００】
特に明記しない限り、以下の記述を、本発明のいずれの態様にも適用できる。
【０２０１】
もし材料がコラーゲンとグリコサミノグリカンを含むなら、コラーゲンとグリコサミノグリカンは架橋されてもよい。
【０２０２】
コラーゲンは材料中に、好ましくは１〜９９ｗｔ％の量、より好ましくは５〜９０ｗｔ％、さらにより好ましくは１５〜６０ｗｔ％存在する。
【０２０３】
グリコサミノグリカンは材料中に、好ましくは０．０１〜２０ｗｔ％の量、より好ましくは１〜１２ｗｔ％、さらにより好ましくは１〜５．５ｗｔ％存在する。
【０２０４】
もし材料がブラッシュ石を含むなら、コラーゲンとブラッシュ石の重量比は、好ましくは１０：１〜１：１００、より好ましくは５：１〜１：２０である。
【０２０５】
もし材料がリン酸八カルシウムを含むなら、コラーゲンとリン酸八カルシウムの重量比は、好ましくは１０：１〜１：１００、より好ましくは５：１〜１：２０である。
【０２０６】
コラーゲンとグリコサミノグリカンの重量比は８：１〜３０：１であることが好ましい。
【０２０７】
本発明による生体材料を、代用骨または歯科材料として用いてもよい。したがって本発明は、ここに記載したような生体材料を含む人工骨材料、骨インプラント、骨移植片、代用骨、骨スキャフォールド、充填剤、コーティング剤またはセメントを提供する。
【０２０８】
生体材料を、多層スキャフォールドの形で提供することが好都合である。特に本発明は、筋骨格用および歯科用組織再生スキャフォールドを提供する。本発明による多層（すなわち２つ以上の層の）スキャフォールドを、例えば骨／軟骨境界面（例えば関節）、骨／腱境界面（例えば腱付着部）、骨／靱帯境界面（例えば靱帯付着部）および歯／靱帯境界面（例えば歯／歯周靱帯接合部）に適用してもよい。
【０２０９】
しかし本発明は主に組織工学用スキャフォールドに関し、本発明による材料を、生体中でかなり長期間存在するインプラントの製造に用いてもよい。例えば、半永久インプラントは、腱および靱帯への適用に必要とされるだろう。
【０２１０】
本発明は、ここに記載したような方法によって得られた多孔性複合生体材料をさらに提供する。
【０２１１】
「合成方法」
本発明を、実施例を用いて以下にさらに詳細に説明する。好ましい合成方法は一連のステップを含み、これを全てまたは一部に適用して、１つまたは複数の層を有する多孔性スキャフォールドを製造することができ、ここで少なくとも１つの層は、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびリン酸カルシウム材の３種類の共沈物を含むことが好ましい。
【０２１２】
「ステップ０：スラリーの調製」
無機質を含むコラーゲン／ＧＡＧ／ブラッシュ石スラリーの調製は、出願者の先行特許出願、PCT/GB04/004550、2004年10月28日出願、に概説された方法を用いて行うことができる。PCT/GB04/004550の内容を本願に引用して援用する。
【０２１３】
無機質を含まないコラーゲン／ＧＡＧスラリーの調製は、Ｙａｎｎａｓら、１９８９年；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、２００４年；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、２００５年；Ｌｏｒｅｅら、１９８９年に概説された方法を用いて行うことができる。
【０２１４】
増殖因子、遺伝子、薬物または他の生物学的に活性な物質を、単独でまたは組み合わせてスラリーに任意に加えて、機械的に混合し、この段階でスキャフォールド中へのこれらの混和を促進してもよい。１層より大きいスキャフォールドの場合、１層中に混和される生物学的に活性な物質は、次の層に混和される物質と同じである必要はない。
【０２１５】
「ステップＩ：成型」
ステップＩ−ａ：第１層の成型
ステップＩ−ｂ：第２層の成型
ステップＩ−ｃ：第３層の成型
ステップＩ−ｎ：第ｎ層の成型
【０２１６】
成型ステップは、水が主希釈剤である、溶液、懸濁液、コロイド溶液または分散液の形でのスラリーを型枠中に次々と加えることを含み、ここで少なくとも１つのスラリーは、コラーゲン、１つまたは複数のグリコサミノグリカンおよびリン酸カルシウムであるブラッシュ石の３種類の共沈物を含み、すべてのスラリーはコラーゲンを含む。
【０２１７】
型枠はいかなる望ましい形状であってよく、ポリマー（ポリスルホン、ポリプロピレン、ポリエチレンなど）、金属（ステンレス鋼、チタン、コバルト・クロムなど）、セラミックス（アルミナ、ジルコニアなど）、ガラスセラミックス、およびガラス（ホウケイ酸ガラスなど）を含むいかなる複数の材料から製造されてもよい。
【０２１８】
型枠を、層化を促進するように具体的に構成してもよい。
【０２１９】
層を例えば、垂直に（すなわち層の上に重ねて）、水平に（すなわち層の横に）および／または放射状に（下層の上に球状の層があるように）位置させることができる。
【０２２０】
スキャフォールドが１層を含む場合には、成型される単一層は、コラーゲン、ブラッシュ石であることが好ましいリン酸カルシウム材および、任意にグリコサミノグリカンを含む共沈物のスラリーを含む。好ましくは、スラリーは、コラーゲン、ブラッシュ石およびグリコサミノグリカンを含む３種類の共沈物を含む。本層の好ましい厚さは、表１のしかるべき部分に規定されている。
【０２２１】
スキャフォールドが２つの層を含む場合には、成型される少なくとも１つの層は、コラーゲン、ブラッシュ石であることが好ましいリン酸カルシウム材および、任意にグリコサミノグリカンを含む共沈物のスラリーを含む。好ましくは、スラリーは、コラーゲン、ブラッシュ石およびグリコサミノグリカンを含む３種類の共沈物を含む。この層の好ましい厚さは、表１のしかるべき部分に規定されている。他の層は、コラーゲン、任意にリン酸カルシウム材および、任意にグリコサミノグリカンを含むスラリーを含む。このスラリー組成物は、コラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈物、コラーゲンと、ブラッシュ石などのリン酸カルシウム材の共沈物または、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよび、ブラッシュ石であることが好ましいリン酸カルシウム材の３種類の共沈物を含むことが好ましい。
【０２２２】
さらなる層が要望通りに含まれてもよく、これらのさらなる層は、コラーゲン、任意にリン酸カルシウム材および、任意にグリコサミノグリカンを含むスラリーから形成されることが好ましい。さらにスラリー組成物は、コラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈物、コラーゲンと、ブラッシュ石などのリン酸カルシウム材の共沈物または、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよび、ブラッシュ石であることが好ましいリン酸カルシウム材の３種類の共沈物を含むことが好ましい。
【０２２３】
コラーゲンおよび好ましくはまたグリコサミノグリカンが各層中に存在するならば、そして少なくとも１つの層がまた、例えばブラッシュ石などのリン酸カルシウム材を含むならば、各次の層中のスラリーの組成物は同一であっても、わずかに異なっていても、または著しく異なっていてもよい。
【０２２４】
「ステップＩＩ：内部拡散」
共拡散ステップは、成型された層状スラリーの各層を内部拡散させることを含む。このステップを、隣接層間でスラリー成分を内部拡散させ、したがって凝固および昇華後の層間結合強度を強化する目的で行う。内部拡散ステップに好ましい状態を、表２のしかるべき部分に列挙する。
【０２２５】
「ステップＩＩＩ：制御された冷却」
制御された冷却ステップは、スラリーを含む型枠を、制御された速度で０℃未満の最終温度まで冷却する環境中に配置することを含む。このステップを開始し、スラリー中での氷結晶核形成および増殖の速度を制御する。その後、氷結晶を昇華により除き、多孔性スキャフォールドを残す。氷結晶網の構造は、スキャフォールドの最終細孔構造を決定するだろう。冷却に好ましいパラメーターを表３に列挙する。
【０２２６】
「ステップＩＶ：アニーリング」
アニーリングステップは、スラリーを、制御された冷却ステップの最終温度で一定時間放置することを含む。このステップを行い、スラリーの完全なまたは実質的に完全な凍結を確実にする。アニーリングに好ましいパラメーターを表４に列挙する。
【０２２７】
「ステップＶ：昇華」
昇華ステップは、冷凍スラリーを、制御された冷却ステップおよびアニーリングステップのおおよその最終温度で保ちながら、型枠と冷凍スラリーの周囲環境の圧力を、水／氷／水蒸気系の三重点未満に減圧し、続いて達成された減圧で固相−気相転移温度より高い温度に昇温させること（通常≧０℃）を含む。このステップを行い、冷凍スラリーから氷結晶を昇華により除く。水の除去手段として気化より昇華が有利な点は、氷結晶の既存の網状組織構造を正確に模倣した間隙の網状組織（すなわち細孔）が残ることである。もし氷が溶融するなら、氷結晶網はその形状を失い、生成する細孔網の構造は損なわれる。昇華ステップに好ましいパラメーターを表５に列挙する。
【０２２８】
「ステップＶ＋Ｉ：架橋」
必要であれば、本方法はまた架橋ステップを含み、コラーゲンとグリコサミノグリカンを架橋してもよい。これは出願者の先行特許出願、PCT/GB04/00455O、２００４年１０月２８日出願、に記載されている。PCT/GB04/004550の内容を本願に引用して援用する。
【０２２９】
〔実施例〕
「実施例Ｉ：コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰの単一層スキャフォールド」」
「材料」
コラーゲン：ウシ腱由来タイプＩ微細繊維コラーゲン（microfibrillar collagen）、インテグラライフサイエンス社、Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、ＮＪ、米国
ＧＡＧ：サメ軟骨由来コンドロイチン−６−硫酸、ナトリウム塩、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）2）、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）；（ｉｉ）硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ）、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
リン源：オルトリン酸（Ｈ3ＰＯ4）、ＢＤＨラボラトリーサプライズ（BDH Laboratory Supplies）（Ｐｏｏｌｅ、英国）
架橋剤：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（＝ＥＤＡＣ）、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（＝ＮＨＳ）、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
【０２３０】
「手順」
「ステップ０：スラリーの調製」
３．８６４４ｇのコラーゲンを、氷浴中で冷却した１７１．４ｍＬの０．１３８３Ｍ  Ｈ3ＰＯ4中に、１９ｍｍ直径のステータを装備したホモジナイザーを用いて９０分間１５０００ｒｐｍで混合することにより分散し、高粘性のコラーゲン分散液を得た。平行して、０．３４３６ｇのコンドロイチン−６−硫酸（ＧＡＧ）を１４．３ｍＬの０．１３８３Ｍ  Ｈ3ＰＯ4中に室温で、周期的な振動により溶解させ、ＧＡＧ溶液を生成するためにＧＡＧを分散溶解した。９０分後、１４．３ｍＬのＧＡＧ溶液を、混合コラーゲン分散液に約０．５ｍＬ／分の速度で、１５０００ｒｐｍで連続的にホモジナイズしながら加え、生成した高粘性コラーゲン／ＧＡＧ分散液をさらに９０分間混合した。９０分の混合後、１．８０４ｇのＣａ（ＯＨ）2と０．７８０ｇのＣａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏを高粘性コラーゲン／ＧＡＧ分散液に３０分かけて、１５０００ｒｐｍの一定混合速度で加え、ｐＨが約４．０のコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーを得た。コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーを２５℃で４８時間、スターラー（stir plate）上で混合しながら放置し、その後４０℃でさらに１２時間置いておく。そして冷却したスラリーを、真空フラスコ中で２５時間にわたって２５Ｐａの圧力で脱ガスした。
【０２３１】
「ステップＩ：成型」
１５ｍＬの無機質を含むコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーを、長さ５０ｍｍ、幅３０ｍｍ、深さ１０ｍｍのポリスルホン型枠中に、自動分注器を用いて加えた。すべての大きな気泡を、手動式分注器を用いてスラリーから除いた。
【０２３２】
「ステップＩＩ：内部拡散」
実施例１のスキャフォールドは１層だけを含むので、内部拡散ステップは不要である。
【０２３３】
「ステップＩＩＩ：制御された冷却」
型枠およびスラリーをバーチス（VirTis）、ジェネシス（Genesis）凍結乾燥機（温度制御されたステンレス鋼棚を装備）中に配置し、凍結乾燥機の棚温度を４℃から−２０℃まで、１分あたり約２．４℃の速度で下げた。
【０２３４】
「ステップＩＶ：アニーリング」
凍結乾燥機の棚温度を−２０℃で１０時間保った。
【０２３５】
「ステップＶ：昇華」
−２０℃の棚温度のまま、型枠と（いまや凍結している）スラリーを含む庫内を２５Ｐａ（約２００ｍＴｏｒｒ）未満に減圧した。そして庫内の温度を３７℃に上げ、昇華を３６時間続けた。そして減圧を除き、温度を室温に戻し、５０ｍｍ×３０ｍｍ×１０ｍｍの大きさのコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰの単一層スキャフォールドを得た。
【０２３６】
「ステップＶ＋Ｉ：架橋」
スキャフォールドを４０ｍＬの脱イオン水中で２０分間水和した。２０ｍＬの０．０３５Ｍ  ＥＤＡＣ溶液と０．０１４Ｍ  ＮＨＳを、スキャフォールドと脱イオン水を含む容器に加え、スキャフォールドを室温で２時間、穏やか撹拌しながら架橋させた。ＥＤＡＣ溶液を除き、スキャフォールドをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄後、３７℃で２時間、新たなＰＢＳ中で軽く攪拌しながら温めた。ＰＢＳ中で２時間後、スキャフォールドを脱イオン水中で、１０分間隔で２回、３７℃で軽く攪拌しながら温めることにより洗浄した。そしてスキャフォールドを、室温から−２０℃への１分あたり約２．４℃の速度での制御された冷却、続く−２０℃で約５時間のアニーリング、そして２５Ｐａ未満３７℃での昇華により凍結乾燥して残留した水を除き、およそ５０ｍｍ×３０ｍｍ×１０ｍｍの大きさの架橋コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスキャフォールドとした。
【０２３７】
生成した１層スキャフォールドのＸ線マイクロトモグラフィー像、走査電子顕微鏡像、イオン分布図および圧縮機構挙動（compressive mechanical behaviour）を検討した。Ｘ線マイクロトモグラフィー（X-ray microtomographic image）に関して注目すべきは、スキャフォールド全体にわたって材料組成および有孔率ともに実質的に均質であることである。同一スキャフォールドの連続断面図から、スキャフォールド孔構造が均質であることが明らかとなり；また細孔の相互連続性が高度であり、細孔の形態が等軸で、マクロ孔の大きさが大きい（５００ミクロンの平均直径）ことが明らである。ＳＥＭにおいても同様のマクロ孔形態を示し、一方またいくつかのマクロ孔壁中に明らかな、わずかなミクロ孔性が存在することが認められる。スキャフォールド壁部分の高倍率（４０００×）二次（すなわち物質表面に感度が高い）および後方散乱（すなわち組成物に感度が高い）電子像により、約１〜２ミクロンの大きさの突起小節の形でわずかな位相偏差が存在するが、スキャフォールド壁の組成均質性が示される。カルシウム分布図およびリン分布図から、スキャフォールド全体にわたって実質的に組成が均質であることが、スキャフォールド全体にわたって両元素が均等に分布することともに確認される。乾燥状態における単一層スキャフォールドを、崩壊、亀裂またはその全体性を失うことなく、外科用メス、安全かみそりの刃および穿孔刃（角膜移植時に用られる円形の切断器具）などの一般の手術器具を用いて、何らかの望ましい形状に切断することができる。乾燥状態における単一層スキャフォールドの性質は、多孔性固形物に特徴的な３段階の変形を示し、７６２＋／−１８８ｋＰａの弾性係数および８５．２＋／−１１．７ｋＰａの圧縮降伏応力を有する。乾燥スキャフォールドの降伏強さにより、しっかりした指の圧力（例えば異常部位への挿入時）に、恒久的に変形することなく耐えることができ、さらに強い指の圧力がかかるとき（例えば、外科医がインプラントの形状を修正することによる）でもまだ形作られていることは注目に値する。水和状態における単一層スキャフォールドの圧縮変形は、圧縮荷重下で３段階の機構挙動を示すが、しかし乾燥スキャフォールドの対応する特性よりおよそ１ケタ低い弾性係数（４．１２＋／−０．７６ｋＰａ）および降伏応力（０．２９＋／−０．１１ｋＰａ）を有する。さらに、粘弾性のひずみ回復の事実は、続く崩壊並行領域（collapse plateau region）における圧縮応力の解放として観測された。
【０２３８】
〔実施例ＩＩ：無機質を含む−無機質を含まない２層スキャフォールド〕
「材料」
コラーゲン（無機質を含むスラリー用）：ウシ腱由来のタイプＩ微小繊維系コラーゲン、インテグラライフサイエンス社、Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、ＮＪ、米国
ＧＡＧ（無機質を含むスラリー用）：サメ軟骨由来のコンドロイチン−６−硫酸、ナトリウム塩、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
タイプＩＩコラーゲン
＋ＧＡＧ（無機質を含まないスラリー用）：タイプＩＩコラーゲンおよび
ブタ軟骨由来の可溶化ＧＡＧ（コラーゲン／ＧＡＧ）スラリー、ガイストリッヒバイオマテリアルズ（Geistlich Biomaterials）（Ｗｏｌｈｕｓｅｎ、スイス）。
カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）2）シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）；（ｉｉ）硝酸カルシウム、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
リン源：オルトリン酸（Ｈ3ＰＯ4）、ＢＤＨラボラトリーサプライズ（BDH Laboratory Supplies）（Ｐｏｏｌｅ、英国）
架橋剤：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（＝ＥＤＡＣ）、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（＝ＮＨＳ）、シグマアルドリッチ社  （Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
【０２３９】
「ステップ０：スラリーの調製」
「無機質を含むスラリーの調製」
３．８６４４ｇのコラーゲンを、氷浴中で冷却した１７１．４ｍＬの０．１３８３Ｍ  Ｈ3ＰＯ4中に、１９ｍｍ直径のステータを装備したホモジナイザーを用いて９０分間１５０００ｒｐｍで混合することにより分散し、高粘性のコラーゲン分散液を得た。平行して、０．３４３６ｇのコンドロイチン−６−硫酸（ＧＡＧ）を、１４．３ｍＬの０．１３８３Ｍ  Ｈ3ＰＯ4中に室温で、周期的な振動により溶解させ、ＧＡＧ溶液を生成するためにＧＡＧを分散溶解した。９０分後、１４．３ｍＬのＧＡＧ溶液を混合コラーゲン分散液に、約０．５ｍＬ／分の速度で、１５０００ｒｐｍで連続的にホモジナイズしながら加え、生成した高粘性コラーゲン／ＧＡＧ分散液をさらに９０分間混合した。９０分の混合後、１．８０４ｇのＣａ（ＯＨ）2と０．７８０ｇのＣａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏを、高粘性コラーゲン／ＧＡＧ分散液に３０分かけて、１５０００ｒｐｍの一定混合速度で加え、ｐＨが約４．０のコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーを得た。そして冷却したスラリーを真空フラスコ中で２５時間にわたって２５Ｐａの圧力で脱ガスし、ホモジナイザーを用いて３０分かけて再混合後、再度４８時間脱ガスした。
【０２４０】
「無機質を含まないスラリーの調製」
タイプＩＩコラーゲン／ＧＡＧスラリーを冷蔵庫から出し、室温に戻した。
【０２４１】
「ステップＩ：成型」
２．５ｍＬの無機質を含まないタイプＩＩコラーゲン／ＧＡＧスラリーをポリスルホン配合型枠（combination polysulphone mould）の底部に配置した。その基部は、長さ５０ｍｍ、幅３０ｍｍ、深さ２ｍｍであった。スラリーを、安全かみそりの刃を用いて平面に均した。長さ５０ｍｍ、幅３０ｍｍ、深さ６ｍｍの、同じくポリスルホン製の上部カラーを、平滑化した無機質を含まないスラリーを含む型枠の底部に取り付けた。９ｍＬの無機質を含むコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーを、平滑化した無機質を含まない層の上部および前の空の上部カラーの中に、均等に分散するよう配置した。すべての大きな気泡を、手動式分注器を用いてスラリーから除いた。
【０２４２】
「ステップＩＩ：内部拡散」
層状スラリーを、凍結乾燥機に配置する前に、室温、常圧で全４時間放置した。
【０２４３】
「ステップＩＩＩ：制御された冷却」
型枠および層状スラリーを、バーチス（VirTis）、ジェネシス（Genesis）凍結乾燥機（温度制御されたステンレス鋼棚を装備）中に配置し、凍結乾燥機の棚温度を４℃から−４０℃まで、１分あたり約−２．４℃の速度で下げた。
【０２４４】
「ステップＩＶ：アニーリング」
凍結乾燥機の棚温度を−４０℃で１０時間保った。
【０２４５】
「ステップＶ：昇華」
−４０℃の棚温度のまま、型枠と（いまや凍結している）層状スラリーを含む庫内を２５Ｐａ（約２００ｍＴｏｒｒ）未満に減圧した。そして庫内の温度を３７℃に上げ、昇華を３６時間続けた。そして減圧を除き、温度を室温に戻し、２ｍｍ厚さの無機質を含まない層と６ｍｍ厚さの無機質を含む層を含む５０ｍｍ×３０ｍｍ×８ｍｍの大きさのコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰの２層スキャフォールドを得た。
【０２４６】
「ステップＶ＋Ｉ：架橋」
スキャフォールドを３２ｍＬの脱イオン水中で２０分間水和した。１８ｍＬの０．０３５Ｍ  ＥＤＡＣ溶液と０．０１４Ｍ  ＮＨＳを、スキャフォールドと脱イオン水を含む容器に加え、スキャフォールドを室温で２時間、穏やか撹拌しながら架橋させた。ＥＤＡＣ溶液を除いた後、スキャフォールドをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、３７℃で２時間、新たなＰＢＳ中で軽く攪拌しながら温めた。ＰＢＳ中で２時間後、スキャフォールドを脱イオン水中で、１０分間隔で２回、３７℃で軽く攪拌しながら温めることにより洗浄した。そしてスキャフォールドを、室温から−２０℃への１分あたり約−２．４℃の速度での制御された冷却、続く−２０℃で５時間のアニーリング、最後に２５Ｐａ未満３７℃で２４時間の昇華により凍結乾燥して残留した水を除き、２ｍｍ厚さの無機質を含まない層と６ｍｍ厚さの無機質を含む層を含むおよそ５０ｍｍ×３０ｍｍ×８ｍｍの大きさの架橋層状コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスキャフォールドを得た。
【０２４７】
得られた２層スキャフォールドのＸ線マイクロトモグラフィー像、走査電子顕微鏡像およびイオン分布図を検討した。上記の方法によって製造した２層スキャフォールドの９．５ｍｍ×９．５ｍｍ円筒断面のＸ線マイクロトモグラフィー像には、無機質を含む層を示す不透明な下部領域と、一方無機質を含まない層を示すより半透明な領域が含まれる。両層は、有孔率および組成物に関して共に概して均一である。無機質を含む層中のマクロ孔の大きさの平均は約４００ミクロンであり、一方無機質を含まない層中のそれはほぼ７００ミクロンであり；無機質を含む層および無機質を含まない層中の細孔はともに等軸形態である。ＳＥＭ画像から、無機質を含まない層の平面図にはミクロ孔性がほとんどないことが示され、一方境界面範囲の画像から、無機質を含む層と無機質を含まない層を隔てる大きな空隙や他の不連続性はないことが分かる。圧縮荷重下の２層スキャフォールドの性質を調べた。圧縮荷重を負荷すると、無機質を含まない柔軟な層は圧縮しはじめ、無機質を含むスキャフォールド中にいくらかの有意な変形を誘導するには不十分な応力において、ほぼ完全に軟骨性部分は圧縮される。負荷が解放された後、無機質を含まないコラーゲン／ＧＡＧ層はほとんど瞬間的にその本来の形状に戻る。水和状態における２層スキャフォールドの力学的性質を調べた。一旦水和されると、無機質を含まないコラーゲン／ＧＡＧ層は低度の負荷で圧縮されうる。乾燥状態とは異なり、水和された無機質を含まない部分は１回目の圧縮荷重負荷後、完全にはその本来の厚さには戻らないが、代わりに無機質を含む部分の断面を覆う。しかしこの最初の圧縮の後は、無機質を含まない層は各次の圧縮荷重負荷の後、その圧縮された厚さに戻る。２層スキャフォールドの無機質を含まない層が、関節中の骨と軟骨の境界面にわたる外科的に異常な壁に接着する能力を調べた。スライドガラスは骨軟骨欠損壁に類似しており、無機質を含まない層がこの表面に接着する能力は、これらのスキャフォールドが、スキャフォールドの無機質を含まない層と隣接した関節軟骨間の隙間を残すことなく、このような欠損部分とその周囲に充填できる能力を示す。
【０２４８】
〔実施例ＩＩＩ：無機質を含む−無機質を含まない−無機質を含む３層スキャフォールド〕
「材料」
コラーゲン（無機質を含むスラリー用）：ウシ腱由来のタイプＩ微小繊維系コラーゲン、インテグラライフサイエンス社（Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、ＮＪ、米国）
ＧＡＧ（無機質を含むスラリー用）：サメ軟骨由来のコンドロイチン−６−硫酸、ナトリウム塩、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）2）、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）；（ｉｉ）硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ）、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
リン源：オルトリン酸（Ｈ3ＰＯ4）、ＢＤＨラボラトリーサプライズ（BDH Laboratory Supplies）（Ｐｏｏｌｅ、英国）
コラーゲン（無機質を含まないコラーゲン−ＧＡＧスラリー用）：ブタ真皮由来のペプシン可溶化８５％タイプＩ、１５％タイプＩＩＩ、日本ハム（大阪、日本）
ＧＡＧ（無機質を含まないスラリー用）：サメ軟骨由来のコンドロイチン−６−硫酸、ナトリウム塩、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
無機質を含まないコラーゲンおよびＧＡＧ用希釈剤：氷酢酸（ＣＨ3ＣＯＯＨ）、フィッシャーサイエンティフィック（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、英国）
架橋剤：ノルジヒドログアヤレチック酸（ＮＤＧＡ）、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）；
リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）、ＢＤＨラボラトリーサプライズ（BDH Laboratory Supplies）（Ｐｏｏｌｅ、英国）
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
【０２４９】
「ステップ０：スラリーの調製」
「無機質を含むスラリーの調製」
３．８６４４ｇのコラーゲンを、氷浴中で冷却した１７１．４ｍＬの０．１３８３Ｍ  Ｈ3ＰＯ4中に、１９ｍｍ直径のステータを装備したホモジナイザーを用いて９０分間１５０００ｒｐｍで混合することにより分散させ、高粘性のコラーゲン分散液を得た。平行して、０．３４３６ｇのコンドロイチン−６−硫酸（ＧＡＧ）を１４．３ｍＬの０．１３８３Ｍ  Ｈ3ＰＯ4中に室温で、周期的な振動により溶解させ、ＧＡＧ溶液を生成するためにＧＡＧを分散溶解した。９０分後、１４．３ｍＬのＧＡＧ溶液を混合コラーゲン分散液に、約０．５ｍＬ／分の速度で、１５０００ｒｐｍで連続的にホモジナイズしながら加え、生成した高粘性コラーゲン／ＧＡＧ分散液をさらに９０分間混合した。９０分の混合後、１．８０４ｇのＣａ（ＯＨ）2と０．７８０ｇのＣａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏを高粘性コラーゲン／ＧＡＧ分散液に３０分かけて、１５０００ｒｐｍの一定混合速度で加え、ｐＨが約４．０のコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーを得た。そして冷却したスラリーを真空フラスコ中で２５時間にわたって２５Ｐａの圧力で脱ガスし、ホモジナイザーを用いて３０分かけて再混合後、再度４８時間脱ガスした。
【０２５０】
「無機質を含まないスラリーの調製」
１．９３２２ｇのタイプＩ／ＩＩＩコラーゲンを、氷浴中で冷却した１７１．４ｍＬの０．０５Ｍ酢酸中に、１９ｍｍ直径のステータを装備したホモジナイザーを用いて９０分間１５０００ｒｐｍで混合することにより分散させ、高粘性のコラーゲン分散液を得た。平行して、０．１７１８ｇのコンドロイチン−６−硫酸（ＧＡＧ）を２８．６ｍＬの０．０５Ｍ酢酸中に室温で、周期的な振動により溶解させ、ＧＡＧ溶液を生成するためにＧＡＧを分散溶解した。９０分後、１４．３ｍＬのＧＡＧ溶液を混合コラーゲン分散液に、約０．５ｍＬ／分の速度で、１５０００ｒｐｍで連続的にホモジナイズしながら加え、生成した高粘性コラーゲン／ＧＡＧ分散液をさらに９０分間混合した。
【０２５１】
「ステップＩ：成型」
３．５ｍＬの無機質を含むコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーをポリスルホン配合型枠の底部に配置した。その底部は、長さ５０ｍｍ、幅３０ｍｍ、深さ３ｍｍであった。スラリーを、安全かみそりの刃を用いて平面に均した。長さ５０ｍｍ、幅３０ｍｍ、深さ５ｍｍの、同じくポリスルホン製の中間カラーを、平滑化した無機質を含むスラリーを含む型枠の基部に取り付けた。７．５ｍＬの無機質を含まないコラーゲン／ＧＡＧスラリーを、平滑化した無機質を含まない層の上部および前の空の中間カラーの中に、均等に分散するよう配置した。長さ５０ｍｍ、幅３０ｍｍ、深さ３ｍｍの、同じくポリスルホン製の上部カラーを、平滑化した無機質を含まないスラリーの上の型枠の中間部に取り付けた。３．５ｍＬの無機質を含むコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーを、平滑化した無機質を含まない層の上部および前の空の上部カラーの中に、均等に分散するよう配置した。すべての大きな気泡を、手動式分注器を用いてスラリーから除いた。
【０２５２】
「ステップＩＩ：内部拡散」
３層スラリーを、凍結乾燥機に配置する前に、室温、常圧で２０分間放置した。
【０２５３】
「ステップＩＩＩ：制御された冷却」
型枠および３層スラリーを、バーチス（VirTis）、アドバンテージ（Advantage）凍結乾燥機（温度制御されたステンレス鋼棚を装備）中に配置し、凍結乾燥機の棚温度を４℃から−４０℃まで、１分あたり約−２．４℃の速度で下げた。
【０２５４】
「ステップＩＶ：アニーリング」
凍結乾燥機の棚温度を−４０℃で１０時間保った。
【０２５５】
「ステップＶ：昇華」
−４０℃の棚温度のまま、型枠と（いまや凍結している）３層スラリーを含む庫内を２５Ｐａ（約２００ｍＴｏｒｒ）未満に減圧した。そして庫内の温度を３７℃に上げ、昇華を３６時間続けた。そして減圧を除き、温度を室温に戻し、３ｍｍ厚さの２つの無機質を含む層に挟まれた５ｍｍ厚さの無機質を含まない中間層を含む５０ｍｍ×３０ｍｍ×１１ｍｍの大きさの３層スキャフォールドを得た。
【０２５６】
「ステップＶＩ：架橋」
３層スキャフォールドを、リン酸緩衝生理食塩水中の０．１Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4および０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ＰＢＳ；ｐＨ７．０）中で３０分間水和した。ＮＤＧＡを１Ｎ  ＮａＯＨ中に懸濁し、ＰＢＳを加えてＮＤＧＡの３ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液とした；そしてスキャフォールドをこの溶液中で、２４時間かき混ぜながら水和した。３層スキャフォールドをＮＤＧＡ−ＰＢＳ溶液から除き、脱イオン水で洗浄した。そしてスキャフォールドを、室温から−２０℃まで、１分あたり約２．４℃の速度での制御された冷却、続く−２０℃で５時間のアニーリング、最後に２５Ｐａ未満３７℃で２４時間の昇華により凍結乾燥して残留した水を除き、乾燥架橋スキャフォールドとした。そして次の処理を０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のＮＤＧＡで行った。そしてスキャフォールドを７０％エタノール中で６時間洗浄し、その後室温で２４時間ＰＢＳ中で洗浄した。そしてスキャフォールドを、室温から−２０℃まで、１分あたり約２．４℃の速度での制御された冷却、続く−２０℃で５時間のアニーリング、最後に２５Ｐａ未満３７℃で２４時間の昇華により２回目の凍結乾燥を行い、残留した水を除いた。
【０２５７】
下記の表中のパラメーターは、特に明記しない限り、本発明のいずれの態様にも適切な値または組み合わせである。
【０２５８】
【表１】
2010500070.tif 000003
【０２５９】
【表２】
2010500070.tif 000004
【０２６０】
【表３】
2010500070.tif 000005
【０２６１】
【表４】
2010500070.tif 000006
【０２６２】
【表５】
2010500070.tif 000007
【０２６３】
〔参考文献〕
・Gao J, Dennis JE, Solchaga LA, Awadallah AS, Goldberg VM, Caplan AI. 2001. Tissue-Engineered Fabrication of an Osteochondral Composite Graft Using Rat Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering 7: 363-371.
・Gao J, Dennis JE, Solchaga LA, Goldberg VM, Caplan AI. 2002. Repair of Osteochondral Defect with Tissue-Engineered Two-Phase Composite Material of Injectable Calcium Phosphate and Hyaluronan Sponge. Tissue Engineering 8: 827-837.
・Hung CT, Lima EG, Mauck RL, Taki E, LeRoux MA, Lu HH, Stark RG, Guo XE, Ateshian GA. 2003. Anatomically Shaped Osteochondral Constructs for Articular Cartilage Repair. Journal of Biomechanics 36: 1853-1864.
・Hunziker EB, Driesang IMK. 2003. Functional Barrier Principle for Growth-Factor-Based Articular Cartilage Repair. Osteoarthritis and Cartilage 11: 320-327.
・Niederauer GG, Slivka MA, Leatherbury NC, Korvick DL, H.H. HJ, Ehler WC, Dunn CJ, Kieswetter K. 2000. Evaluation of Multiphase Implants for Repair of Focal Osteochondral Defects in Goats. Biomaterials 21: 2561-2574.
・O'Brien FJ, Harley BA, Yannas IV, Gibson L. 2004. Influence of Freezing Rate on Pore Structure in Freeze-Dried Collagen-GAG Scaffolds. Biomaterials 25: 1077-1086.
・O'Brien FJ, Harley BA, Yannas IV, Gibson LJ. 2005. The Effect of Pore Size and Structure on Cell Adhesion in Collagen-GAG Scaffolds. Biomaterials 26: 433-441.
・HM Loree, IV Yannas, B Mikic, AS Chang, SM Perutz, TV Norregaard, and C Kararup, 'A freeze-drying process for fabrication of polymeric bridges for peripheral nerve regeneration' Proc. 15th Annual Northeast Bioeng. Conf. P. 53-54, 1989.
・Schaefer D, Martin I, Jundt G, Seidel J, Heberer M, Grodzinsky A, Bergin I, Vunjak-Novakovic G, Freed LE. 2002. Tissue-Engineered Composites for the Repair of Large Osteochondral Defects. Arthritis and Rheumatism 46: 2524-2534.
・Schaefer D, Martin I, Shastri P, Padera RF, Langer R, Freed LE, Vunjak-Novakovic G. 2000. In Vitro Generation of Osteochondral Composites. Biomaterials 21: 2599-2606.
・Sherwood JK, Riley SL, Palazzolo R, Brown SC, Monkhouse DC, Coates M, Griffith LG, Landeen LK, Ratcliffe A. 2002. A Three-Dimensional Osteochondral Composite Scaffold for Articular Cartilage Repair. Biomaterials 23: 4739-4751.
・Yannas IV, Lee E, Orgill DP, Skrabut EM, Murphy GF. 1989. Synthesis and Characterization of a Model Extracellular Matrix that Induces Partial Regeneration of Adult Mammalian Skin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 933-937.
【０２６４】
本発明は複数の範囲に適応でき、例えば下記を提供する。
【０２６５】
「関節軟骨修復製品：２層スキャフォールド」
２層スキャフォールドには、骨髄由来幹細胞を関節軟骨の損傷部位に補充する、従来の最も重要な外科的方法の効果を高める可能性がある。例えば、発泡スチロールに似た、乾燥した、２ｃｍ×２ｃｍ×１ｃｍ角の乾燥、真空パックの、ガンマ線滅菌された材料を用意し、これらのスキャフォールドを外科用メスまたは他の器具を用いて切断し、指やとがっていない器具の圧力だけにより欠損部に容易に挿入し、縫合または接着をせずに直接部位に結合することができる。
【０２６６】
「膝蓋骨靱帯ドナー側修復製品：３層スキャフォールド」
３層スキャフォールドは、膝前部の痛みを軽減し、膝蓋骨靱帯破裂および膝蓋骨骨折の危険性を減らしながら、前十字靱帯（ＡＣＬ）再建中の膝蓋骨靱帯（膝蓋腱）ドナー側の再生を促進する可能性がある。
【０２６７】
「腱修復製品：２層スキャフォールド」
広範囲に無機質を含まない構成部分を有する２層スキャフォールドは、回旋腱板治療中の腱修復効果を改善する可能性、および現在効果的な治療法が存在しない小さい腱への適用に対処する可能性がある。
【０２６８】
本発明を、大型動物試験に基づいてさらに検討した。要約を以下に示す。
【０２６９】
「試験１：ヒツジの骨異常モデル」
本発明により、その構造および組成が片方は骨に、もう片方は非石灰化組織（例えば軟骨、靱帯、腱）によく似ており、その境界面は滑らかで安定な、層状組織再生用スキャフォールドの生産が可能になる。本発明によりさらに、このようなインプラントの骨部分の無機相の化学組成を計画的に変更することができる。
【０２７０】
動物：骨格的に十分成長したテクセルコンチネンタルシープ（Texcel Continental sheep）（雌）。
【０２７１】
欠損：外側大腿顆上の直径９ｍｍ×深さ９ｍｍの海綿骨欠損。
【０２７２】
移植期間：６週間。
【０２７３】
実験群：実験群ごとに６つのインプラントを、同じ動物の各側に、同じインプラントタイプと対側性に移植した。
【０２７４】
「対照群」
正対照：４か所を脛骨粗面から採取した海綿状自家移植片で充填した。
負対照：４か所を、無機相を全く含まないインプラントを含む対照インプラント（すなわちコンドロミメティック（ChondroMimetic）の骨側の有機成分のみを含む）で充填した。
【０２７５】
研究目的：化学組成の異なる４つの実験インプラント群の性能の相違を確認し、これらのうちでコンドロミメティック（ChondroMimetic）の骨部分の最終組成として最も望ましいものを確認する。
【０２７６】
重要な結果：３つの実験群はいずれも、何ら有害な免疫反応を引き起こさなかった；３実験群すべてに加えて無機質を含まない負対照群は、細胞を介した直接の置換機構を介して骨の内部成長を助けた；３インプラント群間に、統計的に有意な相違は認められなかった；すべての３実験群において観測された骨形成は、統計的に有意な水準で、負の対照群における骨形成より高かった。
【０２７７】
移植設計に対する影響：この研究によって推定された直接の置換機構により、骨形成メカニズムは、従来の骨−グラフト置換において観察された特徴的な付加成長メカニズムよりも、胎児および新生児動物（ヒトを含む）中の増殖プレートにおいて起こる鋳型骨形成（templated bone formation）により類似していることが示唆される。無機質を含まない対照におけるこの置換機構の存在は、この特徴を与えるものはインプラントの有機成分であることを示している。
【０２７８】
インプラントの骨部分の平均細孔径を小さくすることによってこの置換機構を説明するために、インプラントの細孔の大きさを変更するだろう。
【０２７９】
３つの実験群の骨形成挙動において統計的に有意な相違がないことは、処理パラメーターを用いてインプラントの最も適当な無機物組成を確認してもよいことを示している。
【０２８０】
「試験２：ヤギの骨軟骨異常モデル」
この研究の目的は、コンドロミメティック（ChondroMimetic）の性能を、骨髄刺激法（marrow stimulation technique）（骨軟骨病変ドリリング（subchondral drilling））の成績を改善する手段として評価することである。
【０２８１】
動物：骨格的に十分成長したピレネーヤギ（Spanish goat）（雌）。
【０２８２】
欠損：直径４ｍｍ×深さ６ｍｍの骨軟骨の欠損（滑車溝中に１つ；外側顆上に１つ）。
【０２８３】
移植期間：１６週間。
【０２８４】
実験群：コンドロミメティック（ChondroMimetic）実用試作品の６つのインプラント。
【０２８５】
対照群：従来の骨軟骨病変ドリリングをシミュレートした６つの欠損（すなわちインプラントを含まない）。
【０２８６】
研究目的：骨髄刺激の補助としてのコンドロミメティック（ChondroMimetic）の性能評価
【０２８７】
結果：コンドロミメティック（ChondroMimetic）の取扱い性に関する外科医からの意見は、例外なく圧倒的に良好であった。
（添付書類終了）
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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