(57)【要約】  （Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ｄ）のテトラペプチド構造を備え、アミノ酸残基ＡにあるＮ末端のＮＨ２の各水素は夫々独立的にＣ１〜５アルキル又はＣ１〜５アシルに置換されていてもよく、（Ａ）は芳香族アミノ酸残基であり、その芳香環は１つ以上のニトロ基による置換を受けても良く、（Ｂ）はジアミノ酸残基であり、その側鎖アミノ基はＣ１〜５アシル、Ｃ１〜５アルキル、−（Ｂ’）−Ｃ１〜５アシル、又は−（Ｂ’）−Ｃ１〜５アルキルによる置換を受けていてもよく、（Ｂ’）は１つ以上のニトロ基による置換を受けられていてもよいアミノ酸残基であり、（Ｃ）はＧｌｙであり、そのペプチドＮ−ＨはＮ−メチルに変えられていてもよく、（Ｄ）はＰｈｅであり、その芳香環は少なくとも１つのニトロ基による置換を受けており、更にニトロ、フルオロ、クロル、ブロモ、ヨード、ＣＦ３，又はＣＮより独立的に選択された一つ以上の基による置換を受けてもよく、前記ペプチドＮ−ＨはＮ−メチルに変えられていてもよく、アミノ酸残基（Ｄ）にあるＣ末端のＣ＝Ｏは、ＮＨ２、ＮＨＣ１〜５アルキル、ＮＨ−ＮＨ２、ＮＨ−ＮＨＣ１〜５アルキル若しくはＯ−Ｃ１〜５アルキルによる置換を受けており、又は前記Ｃ末端はＣＯＯＨ又はＣＨ２ＯＨである、ことを特徴とする化合物、又はその製薬学的に許容される塩。【選択図】【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ｄ）のテトラペプチド構造を備え、
アミノ酸残基ＡにあるＮ末端のＮＨ２の各水素は夫々独立的にＣ１〜５アルキル又はＣ１〜５アシルに置換されていてもよく、
（Ａ）は芳香族アミノ酸残基であり、その芳香環は１つ以上のニトロ基による置換を受けても良く、
（Ｂ）はジアミノ酸残基であり、その側鎖アミノ基はＣ１〜５アシル、Ｃ１〜５アルキル、−（Ｂ’）−Ｃ１〜５アシル、又は−（Ｂ’）−Ｃ１〜５アルキルによる置換を受けていてもよく、（Ｂ’）は１つ以上のニトロ基による置換を受けられていてもよいアミノ酸残基であり、
（Ｃ）はＧｌｙであり、そのペプチドＮ−ＨはＮ−メチルに変えられていてもよく、
（Ｄ）はＰｈｅであり、その芳香環は少なくとも１つのニトロ基による置換を受けており、更にニトロ、フルオロ、クロル、ブロモ、ヨード、ＣＦ３，又はＣＮより独立的に選択された一つ以上の基による置換を受けてもよく、そのペプチドＮ−ＨはＮ−メチルに変えられていてもよく、
アミノ酸残基（Ｄ）にあるＣ末端のＣ＝Ｏは、ＮＨ２、ＮＨＣ１〜５アルキル、ＮＨ−ＮＨ２、ＮＨ−ＮＨＣ１〜５アルキル若しくはＯ−Ｃ１〜５アルキルによる置換を受けていること、又は前記Ｃ末端はＣＯＯＨ又はＣＨ２ＯＨである
ことを特徴とする化合物、又はその製薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｎ末端のＮＨ２は置換を受けていないことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（Ａ）はＴｙｒ，サイロニン、Ｐｈｅ，Ｔｒｐから選択され、その芳香環は１つ以上のニトロ基による置換を受けてもよく、好ましくは（Ａ）は置換を受けていないＴｙｒであることを特徴とする請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
（Ｂ）は、Ｄａｐ，Ｄａｂ，Ｏｒｎ，Ｌｙｓ，４，５−デヒドロリシン、又は２，６−ジアミノ−４−ヘキシン酸であり、前記側鎖アミノ基はＣ１〜５アシル、Ｃ１〜５アルキル、−（Ｂ’）−Ｃ１〜５アシル、又は−（Ｂ’）−Ｃ１〜５アルキルによる置換を受けていることを特徴とする請求項１乃至３の何れかに記載の化合物。
【請求項５】
（Ｂ）はＤａｂ，Ｏｒｎ又はＬｙｓであり、前記側鎖アミノ基はＣ１〜５アシル、Ｃ１〜５アルキル、−（Ｂ’）−Ｃ１〜５アシル、又は−（Ｂ’）−Ｃ１〜５アルキルによって置換を受けており、好ましくは（Ｂ）はＣ１〜５アシルによる置換を受けたＯｒｎであることを特徴とする請求項１乃至４の何れかに記載の化合物。
【請求項６】
（Ｂ）の前記側鎖アミノ基はＣ１〜５アシル又は（Ｂ’）−Ｃ１〜５アシル、好ましくはＣ１〜５アシル、さらに好ましくはアセチルによる置換を受けていることを特徴とする請求項1乃至５の何れかに記載の化合物。
【請求項７】
（Ｂ）’はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｐｒｏ，Ｌｅｕ，Ａｓｎ又はＭｅｔであり、好ましくはＧｌｙ又はＡｓｎであることを特徴とする請求項１乃至６の何れかに記載の化合物。
【請求項８】
（Ｃ）は置換を受けていないＧｌｙであることを特徴とする請求項１乃至７の何れかに記載の化合物。
【請求項９】
（Ｄ）はパラ位置においてニトロ基による置換を受けたＰｈｅであり、芳香環においてニトロ、フルオロ、クロル、ブロモ、ヨード、ＣＦ３、又はＣＮから独立的に選択された1つ以上の基によって置換を更に受けていてもよく、ペプチドＮ−ＨはＮ−メチルに変えられていてもよく、好ましくは前記芳香環の唯一の置換基はパラ位置におけるニトロ基であることを特徴とする請求項１乃至８の何れかに記載の化合物。
【請求項１０】
アミノ酸残基（Ｄ）のＣ末端のＣ＝Ｏは、ＮＨ２による置換を受けていることを特徴とする請求項１乃至９の何れかに記載の化合物。
【請求項１１】
下記の構造を備える請求項1に記載の化合物。
Ｔｙｒ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ａｃ）−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ２）−ＮＨ２
【請求項１２】
請求項1乃至１１の何れかに記載の化合物と、製薬学的に許容される、希釈剤、担体又は賦形剤とを備える医薬組成物。
【請求項１３】
薬剤として使用される、請求項1乃至１１の何れかに記載の化合物又は請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
組織保護治療、好ましくは心臓保護治療のための薬剤の製造における請求項１乃至１１の何れかに記載の化合物の使用。
【請求項１５】
抗低酸素治療のための薬剤の製造における請求項１乃至１１の何れかに記載の化合物の使用。
【請求項１６】
鎮痛治療のための薬剤の製造における請求項１乃至１１の何れかに記載の化合物の使用。
【請求項１７】
抗虚血治療のための薬剤の製造における請求項１乃至１１の何れかに記載の化合物の使用。
【請求項１８】
組織保護治療、好ましくは心臓保護治療と、抗低酸素治療及び鎮痛治療の少なくとも何れかと、を組み合わせた治療のための薬剤の製造における請求項１乃至１１の何れかに記載の化合物の使用。
【請求項１９】
請求項１乃至１１の何れかに記載の化合物又は請求項１２に記載の医薬組成物のゆうこうてきな量を、必要津する対象に投与することを含む、請求項１４乃至１８の何れかに記載の治療を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば心臓保護化合物のような組織保護化合物として有用なペプチド又はペプチド系化合物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
メチオニン−エンケファリン及びロイシン−エンケファリンは、夫々Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ及びＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕの構造をもつペンタペプチドである（非特許文献１）。これら及び類似する化合物に関する多数の研究は、鎮痛作用に焦点を合わせるものであった。
【０００３】
対照的に、エンケファリン類似物の細胞保護作用及び組織保護作用に関する研究は比較的少数に止まっている。
【０００４】
類似物である［Ｄ−Ａｌａ２，ＭｅＰｈｅ４Ｍｅｔ（Ｏ）５‐ｏｌ］−エンケファリンは、胃損傷に対する保護作用を示した（非特許文献２、３）。
【０００５】
Ｄａｌａｒｇｉｎ［Ｄ−Ａｌａ２，Ｌｅｕ５，Ａｒｇ６］も胃損傷に対する保護作用を示した（非特許文献４）。
【０００６】
［Ｄ−Ａｌａ２−Ｄ−Ｌｅｕ５］エンケファリン（ＤＡＤＬＥ）は複数の臓器の生存時間の延長及び臓器移植前の組織保存に有効であることが証明されている（非特許文献５、６、７）。
【０００７】
デルタ・オピオイド受容体の活性化の役割については既に調査が行われている。新規のデルタ（２）−オピオイド・アゴニストであるデルトロフィン−Ｄ（［Ｄ−Ｐｅｎ（２，５）］エンケファリン（ＤＰＤＰＥ）；ｄｅｌｔｒｏｐｈｉｎ−Ｄ）を用いる前治療は梗塞面積を減少させるが［Ｄ−Ａｌａ（２）、Ｄ−Ｌｅｕ（５）］エンケファリン（ＤＡＤＬＥ）は効果がないことが証明されている（非特許文献８）。タカサキ等は、２つの天然エンケファリンは保護作用をもたらすが、βーエンドルフィンはそのような効果を示さないことを証明した（非特許文献９、兎の分離筋細胞を用いた実験）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｕｇｈｅｓ  Ｊ，Ｓｍｉｔｈ  ＴＷ，Ｋｏｓｔｅｒｌｉｔｚ  ＨＷ，Ｆｏｔｈｅｒｇｉｌｌ  Ｌａ，Ｍｏｒｇａｎ  ＢＡ，Ｍｏｒｒｉｓ  ＨＲ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，Ｌｏｎｄ．２５８，５７７−５７９（ヒューズ等筆、（１９７５年）ネイチャー、ロンドン、２５８，５７７〜５７９）
【非特許文献２】Ｆｅｒｒｉ，Ｓ．，Ｓｐｅｒｏｎｉ，Ｅ．，Ｃａｎｄｅｌｅｔｔｉ，Ｓ．，Ｃａｖｉｃｃｈｉｎｉ，Ｅ．，Ｒｏｍｕａｌｄｉ，Ｐ．，Ｇｏｖｏｎｉ，Ｐ−，＆Ｍａｒｃｈｉｎｉ，Ｍ．（１９８８）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３６，１４０−１４４（フェリー等筆（１９８８年）薬学、３６、１４０〜１４４）
【非特許文献３】Ｆｅｒｒｉ，  Ｓ．，Ａｒｒｉｇｏ−Ｒｅｉｎａ，Ｒ．，Ｃａｎｄｅｌｌｅｔｔｉ，Ｓ．，Ｃｏｓｔａ，  Ｓ．，Ｍｕｒａｒｉ，Ｇ．，Ｓｐｅｒｏｎｉ，Ｅ．，＆Ｓｃｏｔｏ，Ｇ（１９８３）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５，４０９−４１８（フェリー等筆（１９８３年）薬学研究通信、１５、４０９〜４１８）
【非特許文献４】Ｔｉｍｏｓｈｉｎ  ＳＳ，Ｓｈｖｅｔｓ  ＳＩ，Ｒａｄｉｖｏｚ  ＭＩ，Ａｌｅｋｓａｎｄｒｏｖｉｃｈ  ＡＧ，Ｍｅｌ’ｎｉｋ  Ｅｌ，Ｂｉｕｌｌ  Ｅｋｓｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ，１９９１  Ａｕｇ；１１２（８）：１３０−２）（チモシン等筆、実験的生物医学公報、１９９１年８月、１１２（８）、１３０〜１３２）
【非特許文献５】Ｃｈｉｅｎ，Ｓ．，Ｏｅｌｔｇｅｎ，Ｐ．Ｒ．，Ｄｉａｎａ，Ｊ．Ｎ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｎｉｌｅｋａｎｉ，Ｓ．Ｐ．，＆Ｓａｌｌｅｙ，Ｒ．（１９９１），Ｊ  Ｔｈｏｒａ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １０２，２２４−２３４（シエン等筆（１９９１年）胸部心臓血管手術誌、１０２，２２４〜２３４）
【非特許文献６】Ｃｈｉｅｎ，Ｓ．，Ｏｅｌｔｇｅｎ，Ｐ．Ｒ．，Ｄｉａｎａ，Ｊ．＆Ｓａｌｌｅｙ，Ｒ．Ｋ．（１９９４）Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １０７、９６４−９６７（シエン等筆（１９９４年）胸部心臓血管手術誌、１０７、９６４〜９６７）
【非特許文献７】Ｏｅｌｔｇｅｎ，Ｐ．Ｒ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｎ．Ｄ．，Ｂｏｌｌｉｎｇ，Ｓ．Ｆ．，＆Ｓｕ，Ｔ．ｐ．（１９９６）Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ６１，１４８８−１４９２（オルトゲン等筆（１９９６年）年刊胸部手術誌６１、１４８８〜１４９２）
【非特許文献８】Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００２  Ｊｕｎ；２８２（６）：Ｈ１１９５３−６０（米国生理学誌−心臓血管生理、２００２年６月、２８２（６）Ｈ１１９５３〜１１９６０）
【非特許文献９】Ｔａｋａｓａｋｉ  Ｙ．，Ｗｏｌｆｆ  Ｒ．Ａ．，Ｃｈｉｅｎ  Ｇ．Ｌ．，Ｖａｎ  Ｗｉｎｃｌｅ  Ｄ．Ｍ．，１９９９  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２７７，Ｈ２４４２−５０（タカサキ等筆、１９９９年米国生理学誌、２７７、Ｈ２４４２〜２４５０）
【非特許文献１０】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９８４），２１９，３４５−３７４（生物化学誌（１９８４年）２１９、３４５〜３７４）
【非特許文献１１】Ｕｅｄａ Ｈ．； Ａｍａｎｏ Ｈ．； Ｓｈｉｏｍｉ Ｈ．；Ｔａｋａｇｉ Ｈ．（１９７９）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５６，２６５―２６８（ウエダ等筆、（１９７９年）ヨーロッパ薬学誌、５６、２６５〜２６８）
【非特許文献１２】Ｇ．Ｗｏｏｌｆｅ ａｎｄ Ａ．Ｄ．Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，８０、３００（１９４４）） （ウルフ等筆、薬学及び実験的治療学誌、８０，３００（１９４４年））
【非特許文献１３】Ｃｉｃｅｒｏ  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，  １９７３（シセロ及びマイヤー、１９７３年）
【非特許文献１４】Ｐａｔｏｎ，  Ｗ．Ｄ．Ｍ．、Ｖｉｓｉ  Ｅ．Ｓ．（１９６９）Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３５，１０−２８（パトン等筆、１９６９年、薬学誌、３５，１０〜２８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在、様々な鎮痛剤が市販されており、そのため特定なシナリオにおいて適切なものを選択することができる。対照的に、心臓保護化合物のような、より効果的な組織保護化合物に関する強い要求があるともいえる。例えば、心筋梗塞は依然として医学的優先事項である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
我々は、有用な組織保護作用を示す新たな化合物を発見した。
【００１１】
第１態様において、本発明は（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ｄ）の構造を持つテトラペプチドを備える化合物、又はその製薬学的に許容される塩を提供する。
【００１２】
ここで言う（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ｄ）のテトラペプチド構造は、慣例にしたがって、Ｎ末端からＣ末端までに定義される。
【００１３】
該化合物のＮ末端はアミノ酸残基Ａにあり、置換を受けていなくてもよい（即ち、ただのＮＨ２基であり得る）。代わりに、このＮＨ２基の各水素は夫々独立的にＣ１〜５アルキル又はＣ１〜５アシルで置換されていてもよい。ここでのＣ１〜５は、１〜５個の炭素原子の直鎖又は分鎖であり、たとえばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、及びそれらの異性体であり得る。
【００１４】
（Ａ）はＤ体又はＬ体の芳香族アミノ酸残基であり、好ましくはＬ体である。本発明のある態様においては、この部分の芳香環は１つ以上のニトロ基を含んでもよい。しかし、そのようなニトロ基は必須ではなく、この位置にニトロ基を持たない場合も効果的な結果が得られている。（Ａ）に適切なアミノ酸は、Ｔｙｒ，サイロニン、Ｐｈｅ，又はＴｒｐを含む。本発明のある態様においては、該芳香環はヒドロキシル基の置換を含み、これは好ましくはパラ位に置換される。（Ａ）は好ましくはＴｙｒである。
（Ｂ）はＤ体又はＬ体のジアミノ酸残基であり、その側鎖アミノ基はＣ１〜５アシル、Ｃ１〜５アルキル、−（Ｂ’）−Ｃ１〜５アシル、又は−（Ｂ’）−Ｃ１〜５アルキルによる置換を受けており、（Ｂ’）はアミノ酸であり１つ以上のニトロ基による置換を受けてもよい。しかし、そのようなニトロ基は必須でなく、この位置にニトロ基を持たない場合も効果的な結果が得られている。したがって、好ましくは（Ｂ’）はニトロ基による置換を受けていない。
【００１５】
（Ｂ）は好ましくはＤ体である。
【００１６】
（Ｂ）はジアミノ酸残基であるため、１つのアミノ基は（Ａ）とのペプチド結合を形成し、もう１つのアミノ基は側鎖に位置しており、下記のように誘導体化される。適切なジアミノ酸残基はＤａｐ、Ｄａｂ，Ｏｒｎ，Ｌｙｓ，４，５−ジヒドロリシン、又は２，６−ジアミノ−４−ヘキシン酸を含み、好ましくはＤａｂ，Ｏｒｎ，又はＬｙｓであり、更に好ましくはＯｒｎである。本発明の異なる態様においては（Ｂ）はＬｙｓであり得る。本発明の更に異なる態様においては（Ｂ）はＤａｂであり得る。
【００１７】
（Ｂ）の側鎖アミノ基はＣ１〜５アシル基、又はＣ１〜５アルキル基による置換を受けており、その結果、この位置にアミド結合又は第２級アミンをもたらす。これは化合物の活性に好ましく影響する。Ｃ１〜５アシル基による置換が好ましい。この置換は電荷と両極性を変更させ、有効性に寄与する。Ｄ体又はＬ体（好ましくはＬ体）のアミノ酸残基（Ｂ’）は、（Ｂ）と、Ｃ１〜５アシル又はＣ１〜５アルキルの間に存在し得、その場合は（Ｂ）の側鎖アミノ基は（Ｂ’）のカルボニル基とペプチド結合を形成し、（Ｂ’）のアミノ基はＣ１〜５アルキル基又は（好ましくは）Ｃ１〜５アシル基による置換を受ける。
【００１８】
好ましくは該Ｃ１〜５アシル基はアセチルである。
【００１９】
好ましくは、（Ｂ’）が存在する場合は、（Ｂ’）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｐｒｏ，Ｌｅｕ，Ａｓｎ，又はＭｅｔであり、さらに好ましくはＧｌｙ又はＡｓｎである。
【００２０】
（Ｃ）はＧｌｙであり、そのペプチドＮ−ＨはＮ−メチルに変えられていてもよい（しかし、好ましくは変えられていない）。即ち、Ｇｌｙの骨格に含まれる窒素原子はメチル化されるように改造され得る。
【００２１】
（Ｄ）はＤ体又はＬ体のＰｈｅであり、好ましくはＬ−Ｐｈｅであり、その芳香環は少なくとも１つのニトロ基による置換を受けている。このニトロ基は化合物の活性を強化させる。該芳香環には更に、最大４つの置換を受けられ得、ニトロ、フルオロ、クロル、ブロモ、ヨード、トリフルオロメチル、又はシアンより独立的に選択される。しかし、１つのニトロ基のみが必須である。該ニトロ置換基は好ましくはパラ位にある。ペプチドＮ−ＨはＮ−メチルに変えられていてもよい（しかし、変えられていないものが好ましい）。即ち、Ｐｈｅの骨格に含まれる窒素原子はメチル化されるように改造され得る。
【００２２】
残基（Ｄ）にあるＣ末端は、ただの−ＣＯＯＨ、若しくはその代わりに−ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＣ１〜５アルキル、−ＣＯＮＨ−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ−ＮＨＣ１〜５アルキル、ＣＯＯ−Ｃ１〜５アルキル、又はＣＨ２ＯＨの形になれる。ある実施形態においては残基（Ｄ）のＣ末端は、ただのＣＯＯＨ又はＣＨ２ＯＨの形をとっておらず、−ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＣ１〜５アルキル、−ＣＯＮＨ−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ−ＮＨＣ１〜５アルキル、ＣＯＯ−Ｃ１〜５アルキルから選択される。好ましくはーＣＯＮＨ２である。この部分は、他の部分と共に、化合物のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の生物学的実験（ｂｉｏｔｅｓｔ）における高い活性をもたらす。
【００２３】
更なる態様において、本発明は、本発明の化合物と、薬剤として使用される化合物とを含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
更なる態様において、本発明は、組織保護治療又は心臓保護治療のための薬剤の製造におけるこれらの化合物の使用を提供する。
【００２５】
本発明の化合物は、虚血にさらされる心筋のような組織を保護する。我々は顕著な抗低酸素効果及び明確な鎮痛作用を更に観察した。これらの３つの効果の組合せは、心臓学や集中治療を含むいくつかの医学の分野において特別に有利である。いくつかの状態において、虚血症候群及び循環障害性低酸素症の抑制が重要である。
【００２６】
したがって、更なる態様において、本発明の化合物は、追加的に又は代わりに、抗低酸素治療及び鎮痛治療の少なくともいずれかに役に立つ。
【００２７】
ある態様において本発明は、心筋虚血（例えば、虚血性胸痛及び心筋梗塞）のため、又は虚血性脳障害（脳梗塞など）の特定の脳機能不全の影響を改善させるための、ペプチド及びペプチド系化合物に関する。我々の新たな化合物の抗低酸素効果は、肺、肝臓、眼の不全のような酸素依存性病態及び出産、ショック、出血、過労による病態において、安定性を向上させる。この新たな物質の鎮痛効果は、心筋梗塞などによる痛みを軽減させる。
【００２８】
ある態様では、この新たな物質は著しく有用な、心筋保護効果、抗低酸素効果、及び鎮痛効果を見せる。この顕著な鎮痛効果は、心筋梗塞による痛みを軽減させるために有用である。総合すれば、この組合せの効果は以前に知られていたものではないが、とても望ましい効果である。
【００２９】
本発明による好ましい化合物は、
Ｔｙｒ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ａｃ）−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ２）−ＮＨ２（１）である。
2010500991.tif 000002
【００３０】
本発明による４つの化合物（通例の化学式の（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ｄ）より（Ｂ）の位置を変形）は、
Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ２）−ＮＨ２、
Ｔｙｒ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ａｃ−Ａｓｎ）−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ２）−ＮＨ２、
Ｔｙｒ−Ｄ−Ｄａｂ（Ａｃ）−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ２）−ＮＨ２、及び
Ｔｙｒ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ａｃ−Ｇｌｙ）−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ２）−ＮＨ２である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】心筋梗塞におけるペプチド（１，２，３，４，５）の効果をラットモデルで調査する実験プロトコールを示す図である。ペプチドは閉塞５分前に投与される。梗塞面積は１２０分の再かん流期間後に分析される。
【図２】ペプチド（４）は、２５分間の閉塞及び１２０分間の再かん流を行う５分前に雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｙ（ＳＤ）ラットに静脈内投与すると、危険領域（ａｒｅａ−ａｔ−ｒｉｓｋ）の比率（ＩＳ／ＡＡＲ）で表しているように、梗塞面積を低減させた。
【図３】ペプチド（４）は、コントロール対照に比べ、２５分間の閉塞を除去した直後に雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｙ（ＳＤ）ラットに静脈内投与すると、危険領域（ａｒｅａ−ａｔ−ｒｉｓｋ）の比率（ＩＳ／ＡＡＲ）で表しているように、梗塞面積を低減させた。
【図４】エンケファリン類似物（１〜５）マウスに静脈内投与した際の鎮痛作用（“ホットプレート”方法）
【図５】曲線下の、５分の時点から９０分の時点までの面積として表現された、ジャンプまでの時間に対する効能
【図６】ペプチド（Ａ）及びモルヒネ（Ｂ）投与から15分後の投与量−反応図
【発明を実施するための形態】
【００３２】
＜＜例＞＞
［略記］
記号及び略記はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの生物化学術語に関する共同委員会による推薦（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、非特許文献１０）に順ずる。全ての光学活性アミノ酸は、別の指定がない限り、Ｌ体である。
使用される略記
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＵ：ジシクロヘキシル尿素
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＯＰｃｐ：ペンタクロロフェニル
ＯＰｆｐ：ペンタフルオロフェニル
ｐ−ＮＯ２：パラニトロ
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＭｅＯＨ：メタノール
ＭｅＣＮ：アセトニトリル
ｎＢｕＯＨ：ｎ−ブタノール
ｉＰｒＯＨ：イソプロパノール
ＮＨ４ＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトライアゾールのアンモニウム塩
ＤＰＰＡ：ジフェニルリン酸アジド
ｉ．ｃｉｓｔ：嚢内の（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ）
ｉ．ｖ．：静脈内投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）
ｉ．ｐ．：腹腔内の（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）
ＯＲ：オピオイド受容体
ＧＰＩ：モルモット回腸（ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｉｌｌｅｕｍ）
ＭＶＤ：マウス輸精管
Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ２）：４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン
Ｄａｂ：α、γージアミノ酪酸
Ｏｒｎ：オルニチン
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシ−カルボニル
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
ＭＢＨＡ樹脂：４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂
Ａｃ：アセチル
ＡｃＯＨ：酢酸。
【００３３】
［化学］
エンケファリン類似物（ペプチド１）の合成は従来のペプチド化学方法によって（溶液中で）行われた。
【００３４】
類似物（２，３，４，５）は、ＢＯＣ／Ｂｚｌケミストリーと、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドをカップリング剤として用いた固相法で合成された。
【００３５】
［実験プロトコール］
［例１］
＜エンケファリン類似物（１）の合成＞
エンケファリン類似物（１）の合成は活性エステルとアジド合成手法で行われた。Ｄ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ以外の全てのアミノ酸はＬ体である。
【００３６】
アミノ酸誘導体はＲｅａｎａｌ（ハンガリー）より入手した。蒸発は４０℃の真空中で行われた。融点（訂正されていない）はデジタル融点分析機である“Ｆｉｓｈｅｒ”の型番３５５を用いて測定された。１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルはＢｒｕｋｅｒＷＭ−３６０スペクトロメータで記録された。
【００３７】
合成された化合物の純度はＳｉｌｕｆｏｌ  ＵＶ  ２５４（チェコスロバキア）、又はＭｅｒｃｋのＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ６０Ｆ  ２５４、を用いるＴＬＣによって次のシステムにおいて実証された。Ａ：ＣＨＣｌ３−ＥｔＯＨ−ＡｃＯＨ  （８５：１０：５）、Ｂ：ｎＢｕＯＨ−ｐｙｒｉｄｉｎｅ−ＡｃＯＨ−Ｈ２Ｏ（１５：１０：３：６）、Ｃ：ｎＢｕＯＨーＡｃＯＨ−Ｈ２０（４：１：１），Ｄ：ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−ＡｃＯＨ−Ｈ２０，Ｅ：（６０：１８：２：３）。アミノ酸分析は、密閉されたアンプルにおけるペプチド加水分解後（１１０℃で２４時間）、Ｂｉｏｃａｌ  ＢＣ−２００アミノ酸分析器において行われた。
【００３８】
保護されたペプチドは“Ｍｅｒｃｋ”製のサイズＣ（４４０〜３７）クロマトグラフィー・カラムにおいて精製された。評価に使用された溶媒システムは、ＣＨＣｌ３−ＥｔＯＨ−酢酸エチル−ＡｃＯＨ−Ｈ２０、１８５：５：８：２：０．２５（ｃｈＩ）、８５：５：８：２：０．２５（ｃｈＩＩ）である。
【００３９】
分析用のＨＰＬＣはＤｕｐｏｎｔ８８００ＨＰＬＣシステムで、逆相吸着剤のＳｉｌａｓｏｒｂ  Ｃ１８（Ｌａｃｈｅｍａ）を詰めた４．６ｘ１１０ｍｍのカラム行われた。旋光度はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ１４１偏光計及び１０ｃｍのウォーター・ジャケット・セルを用いて、溶媒において下記の濃度で測定された。
【００４０】
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ２）（６）
４．２ｇ（２０ｍｍｏｌ）のＬ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ２）は２０ｍｌの１ＮのＮａＯＨに溶解され、１．６８ｇのＮａＨＣＯ３及び２０ｍｌのＤＭＦが加えられ、攪拌及び５℃までの冷却を行いながら１０ｍｌにＤＭＦに溶解されたＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＰｃｐが加えられた。数時間に渡って攪拌した後、化学反応が完了すると（クロマトグラフィによって確認される（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ））、混合物は酢酸エチル及び水で希釈され、５％のＫＨＳＯ４を用いてｐＨを３までに落とした。酢酸エチル層は分離され、水相は更に２度の酢酸抽出を経た。これらの３つの有機相を混合した後、水、ＮａＣｌ飽和溶液を用いて洗い（ｗａｓｈ）、無水Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥される。溶媒の蒸発後、結晶凝結物は、少量の石油エーテルが加えられた酢酸エチルより再結晶された。収穫されたのは４．６７ｇ（６３％）のジペプチド（６）であり、その性質はＭ．Ｐ．１６７〜１６８℃、［ａ］Ｄ２４＋４６．９°（ｃ１、ＥｔＯＨ）、Ｒｆ０．７９（Ａ）；０，７７（Ｂ）；０．８３（Ｅ）であった。
【００４１】
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ２）−ＮＨ２（７）
１．５２ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＮａ４ＯＢｔ及び２．０６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＤＣＣは、３．６７ｇ（１０ｍｍｏｌ）の化合物（６）が溶解されている２０ｍｌのＤＭＦ溶液に加えられた。反応混合物は一晩放置された。ＤＣＵはフィルタに通され、溶液の蒸発後に残る残留物はクロロホルムに溶解された。有機相は５％のＫＨＳＯ４溶液、水、５％のＫＨＳＯ４溶液、水、ＮａＣｌの飽和水溶液の順で洗い、最後に無水Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥された。溶液の蒸発後、産物は少量の酢酸エチルを含む純エタノールから結晶化された。。収穫されたのは２．７２ｇ（７４％）の保護ジペプチド・アミドであり、その性質はＭ．Ｐ．１６９〜１７１℃、［ａ］Ｄ２２−９．２°（ｃ１、ＤＭＦ）、Ｒｆ０．８４（Ａ）；０，８８（Ｂ）；０．６６（Ｅ）であった。
【００４２】
Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｚ）（９）
２．６６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＤ−Ｏｒｎ（Ｚ）は、１０ｍｌのＮａＯＨの１Ｎ溶液に溶解され、０．８４ｇのＮａＨＣＯ３及び２５ｍｌのＤＭＦを加え、攪拌及び−５℃まで冷却をしながら、１５ｍｌのＤＭＦに溶解された５．４７ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐを加えた。反応は数時間行われ、その後一晩放置された。反応が終わると、化合物（６）と同様に処理された。溶媒を除き、産物はジエチルエーテル及びヘキサンから結晶化された。固体の残留物は、同じ溶媒の混合物から再び結晶化され、真空において乾燥された。収穫されたのは３．２８ｇ（５２％）の保護ジペプチド（９）であり、その性質はＭ．Ｐ．１１２〜１１４℃、［ａ］Ｄ２２＋４．２°（ｃ０．５、ＥｔＯＨ）、Ｒｆ０．６６（Ａ）；０，５２（Ａ，”Ｍｅｒｃｋ”）；０．６６（Ｂ、”Ｍｅｒｃｋ”）であった。
【００４３】
Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｏｃ）−（Ｎδ-Ａｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（１１）
パラジウム・ブラックは、２．１ｇ（３．３ｍｍｏｌ）の保護ジペプチド（９）を含む１０ｍｌのメタノール、０．５ｍｌのＡｃＯＨ及び５ｍｌのＨ２Ｏに加えられ、数時間に渡って水素化された。反応が完了すると（クロマトグラフィによって確認される）、触媒をフィルターし、ろ過された液体を蒸発させた。残留物は、少量の酢酸エチルを含むエーテルに溶解された。この混合物は、結晶が形成されるまで冷蔵庫に置かれた。結晶化した生産物はフィルターされ、フィルター上で冷たいエーテルで洗われ、真空において乾燥された。収穫されたのは１．５４ｇ（８３％）の化合物（１０）であり、その性質はＲｆ０．１６（Ｃ“Ｍｅｒｃｋ”）、０．６６（Ｂ“Ｍｅｒｃｋ”）；０．６７（Ｄ）であった。
【００４４】
８．３２（１５ｍｍｏｌ）のジペプチド・アセテート（１０）を５０ｍｌのＤＭＦに溶解し、攪拌及び冷却中に、１５ｍｌのＤＭＦに含まれた５．１ｍｌ（３０ｎｍｏｌ）のＤＩＥＡと、５ｍｌのＤＭＦに溶解された２．７ｇ（１５ｍｍｏｌ）のｐ−ニトロフェニルアセテートとを加えた。反応混合物は２〜３時間攪拌し、反応が完了すると（クロマトグラフィによって確認される）、化合物（６）同様に後処理した。溶媒を除いた後、残留物をエーテルに溶解し、ヘキサンで２回繰り返して沈殿させた。産物はフィルタに通され、真空において乾燥された。収穫されたのは６．５２ｇ（８１％）の保護ジペプチド（１１）であり、その性質はＲｆ０．３３（Ａ、”Ｍｅｒｃｋ”）；０，５５（Ｅ”Ｍｅｒｃｋ”）；０．６６（Ｂ、”Ｍｅｒｃｋ”）；Ｍ．Ｐ．９５℃、［ａ］Ｄ２２−９．６°（ｃ０．５、ＥｔＯＨ）であった。
【００４５】
Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｏｃ）−（Ｎδ-Ａｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ２）−ＮＨ２（１２）
４．７５ｇ（１３ｍｍｏｌ）のジペプチド（３）は、３０ｍｌの５０％ＴＦＡ及びＤＣＭに溶解され、３０分間保持された。溶媒を除いた後、残留物はエーテルでこすられ、フィルタされ、フィルタ上でエーテルで洗われ、真空の水酸化カリウムの上で乾燥された。収穫されたのは、４．５４ｇ（９２％）のジペプチド・トリフルオロ酢酸塩（８）であり、その性質はＲｆ０．３７（Ｄ）；０．５５（Ｅ）であった。
【００４６】
１．１４ｇ（３ｍｍｏｌ）のジペプチドアミド・トリフルオロ酢酸塩（８）、１．６ｇ（３ｍｍｏｌ）の保護ジペプチド（１１）は６０ｍｌのＤＭＦに溶解され、−０．５℃まで冷却され、攪拌及び冷却中に０．５１ｍｌのＤＩＥＡを加え、５ｍｌのＤＭＦに溶解された０，７５ｍｌ（３．６ｍｍｏｌ）のＤＰＰＡをゆっくり混合物に落とした。反応は数時間行われ、一晩放置された。反応が完了すると（クロマトグラフィによって確認される）、混合物は酢酸エチルと水で希釈され、０℃に冷却され、ＫＨＳＯ４の５％溶液を用いてｐＨを３までに落とした。酢酸エチル層は分離され、水相は追加的に１倍分の酢酸エチルで抽出された。有機相を併せ、ＮａＨＣＯ３の５％溶液、水、５％ＫＨＳＯ４、水、ＮａＣｌの飽和溶液で洗い、最後に無水２ＳＯ４の上で乾燥された。溶媒を除いた後、産物はシリカゲル・カラム（Ｃ）を用いて精製された（産物はシステムＣｈＩからでロードされ、ＣｈＩＩで溶離された）。夫々のフラクションは集められ、蒸発され、真空において乾燥された。収穫されたのは０．７３ｇ（３１％）の保護テトラペプチド・アミド（１２）であり、分析用のサンプルはＲＰ−ＨＰＬＣで精製され、その性質はＭ．Ｐ．１６９〜１７０℃、［ａ］Ｄ２２−４６．８°（ｃ０．２５、ＤＭＦ）、Ｒｆ０．５１（Ｅ、”Ｍｅｒｃｋ”）；０．６６（Ｂ”Ｍｅｒｃｋ”）であった。
【００４７】
Ｔｙｒ−（Ｎδ-Ａｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ２）−ＮＨ２（１）
０．２５ｇ（３１ｍｍｏｌ）のテトラペプチド・アミド（１２）は１０ｍｌの５０％ＴＦＡ及びＤＣＭに溶解され、化合物（８）と同様に仕上げられた。産物はセファデックスＧ−１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０）で生成された。溶離は０．０２ＭのＡｃＯＨ溶液で行った。収穫されたのは０．１８（９０％）の凍結乾燥されたテトラペプチド・アミド（１）であった。Ｍ．Ｐ．１３０〜１３１℃、［ａ］Ｄ２２＋８０°（ｃ０．１５、０．２Ｎ、ＡｃＯＨ）、Ｒｆ０．５２（Ｄ、”Ｍｅｒｃｋ”）；０．４９（Ｂ”Ｍｅｒｃｋ”）；アミノ酸分析：Ｇｌｙ  １．００；  Ｔｙｒ  ０．８６；  Ｏｒｎ  ０．８２；  Ｐｈｅ（ｐ−ＮＯ２）０．９１。分析的ＨＰＬＣによる分析は、Ｋ＝１．６のひとつのピークを示した（カラム４．６Ｘ１１０、シラソーブ（Ｓｉｌａｓｏｒｂ）ＳＰＨ、移動相：ＣＨ３ＣＮ及び０．２Ｍ酢酸アンモニアバッファー（２１：７９）、ｐＨ５、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎ、λ＝２２０ｎｍ。
【００４８】
［例２，３，４，５］
エンケファリン類似物（２，３，４，５）の合成
Ｎ−保護アミノ酸誘導体。サポート、及びペプチド合成のための試薬はシグマ（Ｓｉｇｍａ）、フィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、バケム（Ｂａｃｈｅｍ）、レアナル（Ｒｅａｎａｌ、Ｈｕｎｇａｒｙ）、サクソン・バイオケミカルＧＭＢＨ（Ｓａｘｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入され、４−メチルベンズヒドリルアミノポリマー（４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌａｍｉｎｏｐｏｌｙｍｅｒ）のみスイスのノババイオケム（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）から購入された。ＨＰＬＣグレードの溶媒のＤＣＭ，ＤＭＦ（４Åのモレキュラーシーブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｅｖｅ）に保存）ＭｅＣＮ及びＭｅＯＨは、合成及び精製に用いられた。他の試薬は試薬グレードのものであった。融点はボエティウスホットプレート（Ｂｏｅｔｉｕｓ  ｈｏｔ  ｐｌａｔｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分析された。
【００４９】
ペプチド（２，３，４，５）の合成はＮＰＳ−４０００セミオートマチック合成機（ネオシステム・ラボラトリズ（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）を用いる固相法で、ＭＢＨＡ樹脂において標準ＢＯＣ／Ｂｚｌ保護基戦略を使って行われた。
【００５０】
アミノ酸のα−アミノ機能はＢＯＣ保護基によって保護され、反応性側鎖官能基は次のように保護された。Ｄ−ｌｙｓのはＡｃ基、Ｄ−Ｄａｂ及びＤ−ＯｒｎはＦｍｏｃ、そしてＴｙｒアミノ酸残基には２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）で夫々保護された。Ａｓｎの側鎖は保護されなかった。全てのペプチドは４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（０．６ｍｍｏｌ／ｇの樹脂置換）において、アミド化されたＣ末端を持たせて作られた。カップリング反応には３倍過剰のＢｏｃ−アミノ酸が使われた。アミノ酸のカップリングは、６−Ｃｌ−ＨＯＢｔの存在下で、ジメチルホルムアミドに溶解されたＮ，Ｎ´−ジイソプロピルカルボジイミド用いて、伸長するペプチド残基にアミノ酸残基をカップリングした。カップリング時間である２時間後、各段階においてアシル化の完了度合いを標準ニンヒドリンテストで監視した。カップリングが不完全な場合、Ｂｏｃ保護基を取り除く前にそのカップリング過程を繰り返した。ＤＣＭに溶解されたトリフルオロ酢酸（６５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ））を用いて、Ｎ−保護基の選択的な切断を行い、次にＤＭＦに溶解されたトリエチルアミン（５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ））を用いて中性化した。ペプチドの側鎖アミノ基のアセチル化は、トリエチルアミンを含むＡｃ２Ｏの１０％ＤＣＭ溶液で処理されることによって達成される。
【００５１】
最終的脱保護及びペプチドの樹脂からの切断は、トリフルオロメタンスルホン酸の１ＭのＴＦＡ溶液による処理で行われ、チオアニソール及びエタンジチオールの存在下で行われる。
【００５２】
合成されたペプチドはゲルろ過によって塩が除かれ、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製され、質量分析及びアミノ酸分析によって分析される。
【００５３】
ゲルろ過はトヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）ＴＳＫ  ＨＷ−４０カラムをもちいて行われた。ペプチドの溶離には、ＮＨ４ＨＣＯ３の０．１ＭのｉＰｒＯＨ溶液を用いた。最終的な精製は、分析クロマトグラフィー用のルナＣ１８カラム（Ｌｕｎａ  Ｃ１８  Ｃｏｌｕｍｎ、４．６ｘ１５０ｍｍ）及び準備クロマトグラフィー用のヴィダックＣ１８カラム（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８  Ｃｏｌｕｍｎ、２２ｘ２５０ｍｍ）を備えた、システムゴールド・クロマトグラフ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）（ベックマン、米国）のＲＰ−ＨＰＬＣによって達成された。ペプチドは、分析カラムの場合０．１％Ｈ３ＰＯ４溶液に溶解されたアセトニトリルのグラディエントを流速１ｍｌ／ｍｉｎで溶離させ、準備カラムの場合１％ＴＦＡ溶液に溶かされたアセトにトリルのグラディエントを流速１０ｍｌ／ｍｉｎで溶離される。ＵＶ検出は２３０ｎｍで行われた。
【００５４】
アミノ酸誘導体の純度は、予めコーティングされたメルク（Ｍｅｒｃｋ）Ｆ２５４プレート（ドイツ）におけるＴＬＣで、次に述べるクロマトグラフィーシステムにおいて調整された。１：３の１％アンモニア‐ｓｅｃ−ブタノール、９：２  クロロホルム‐メタノール、及び９０：７：３  クロロホルム‐メタノール‐酢酸。合成されたペプチドの純度は、ｎＢｕＯＨ‐ＡｃＯＨ‐Ｈ２Ｏ（４：１：１）のシステム、及びＣＨＣｌ３‐ＭｅＯＨ‐ＡｃＯＨ‐Ｈ２Ｏ（３０：２０：４：６）（６０：１８：２：３）のシステムにおいて分析された。クロマトグラムはニンヒドリン溶液をスプレー又は塩素／ベンジジンの試薬を使い、２５４ｎｍのＵＶ放射を用いて可視化された。アミノ酸分析は、密閉されたアンプルにおけるペプチド加水分解後（１１０℃で２４時間）、マイクロテクナ（Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈｎａ）Ｔ３３９Ｍ分析器（チェコ共和国）を用いて行われた。質量スペクトルはＭＸ−５３０３飛行時間形質量分析計（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）に、エレクトロスプレーイオン化（ＦＩＮＥＰＫｈＦ）及び反射モードにおいて記録された。
【００５５】
＜＜生物学＞＞
［生物作用の例］
＜エンケファリン類似物（１）の心臓保護作用＞
本発明によるエンケファリン類似物（１）の心臓保護作用は、体重２００〜２５０ｇの白の雄ラット１４５匹にテストされた。左冠状動脈を縛って急な心筋虚血を引き起こした。調査される化合物は、冠動脈閉塞の３０分後、０．０５ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇの濃度で動物に腹腔内に注入された。心筋梗塞に使われてきた従来の薬との比較のため、ニトログリセリン及びアナプリリヌム（Ａｎａｐｒｉｌｉｎｕｍ）がテストされた。コントロール実験においては、急な心筋虚血が引き起こされたラットに生理溶液を注入した。
【００５６】
動物は、冠動脈閉塞の６時間及び２４時間後に殺され、その血液及び心臓組織を採取し調査を行った。心臓は、血液を洗い落とし、左心室と右心室を分離し、４〜５つの均等な横断片に切断された。全ての断片ニトロブルーテトラゾルの１％リン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）に１５分間３７℃でインキュベートされた。心筋の壊死領域の面積は、重力法で測定された。虚血性障害の速度は、血液中のクレアチン・ホスホキナーゼ（ＣＰＫ）のレベル及びその心臓の分（ＨＦ−ＣＰＫ）に従って推定された。２つのキナーゼ（ＣＰＫ＋ＨＦ−ＣＰＫ）の両方の活性をテスト及び計算するために標準キット（ボーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、ドイツ）を使用した。得られた結果はステューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）の基準を使用して統計的に処理された。
【００５７】
冠状動脈の閉塞は、６時間後には検出できる程度の壊死領域の出現を導き、その領域は次の２４時間徐々に広がる。血液からは、特徴的な代謝性変化が見られた。閉塞及び循環低酸素症の程度を表す乳酸の量が増えた。ＣＰＫ及びＨＦ−ＣＰＫの活性が増えており、これは心筋細胞の損傷を反映している（表２）。
【００５８】
冠動脈閉塞症から６時間が経過した時点の前後の壊死領域の面積に関しては、エンケファリン類似物（１）を腹腔内に注入したラットと、コントロールのラットとの間で統計的に有意な差は見られなかった。
【００５９】
しかし、２４時間の実験の終了時点においては、エンケファリン類似物（１）が腹腔内に注入されたラットの心筋壊死領域は、コントロールグループのラットの心筋壊死領域より統計的に小さかった（表１）。
【００６０】
表１：エンケファリン類似物（１）の、冠状動脈が縛られたラットの心筋壊死の面積への影響。
2010500991.tif 000003
【００６１】
血液中の乳酸の量は心筋梗塞の進行に関する、最も信頼できる指数である。新たなエンケファリン類似物（１）の０．０５ｍｇ／ｋｇの投与量は、高乳酸血の進行及び血液中のＣＰＫとＨＦ−ＣＰＫの過剰活性を低下させることが分かった。又、心臓や肝臓のグリコーゲンのレベルが増加する（表２）。この結果は、病的過程において化合物（１）がもたらす有益な影響を示している。実験動物の軽減された死亡率はまさにその証拠である（表３）。
【００６２】
更に、この結果は、新たなエンケファリン類似物（１）は酸素依存性の病的過程（例えば、ショック、虚血、出血等）において生物の安定性を高めることを意味する。
【００６３】
表２：生理溶液、エンケファリン類似物（１）又はニトログリセリンが与えられた動物に急な心筋虚血を引き起こした際の、血液と組織のテストより得られた代謝結果。
2010500991.tif 000004
【００６４】
表３：生理溶液又はエンケファリン類似物（１）が与えられたラットが急な心筋虚血を起こした際の死亡率。
2010500991.tif 000005
【００６５】
これらの結果は、本発明による新たなエンケファリン類似物（１）は実験的心筋梗塞の過程に有益な影響をもたらすことを示している。
【００６６】
血液の形態学的検査及び酵素レベルの検査は、心臓保護作用及び心筋壊死領域の拡大を制限する能力を示した。
【００６７】
比較のために、最大の治療用量のニトログリセリン及びアナプリリヌムを、心筋梗塞に使用される従来の薬とともに使用した。ハイパーファーメンテミア（ｈｙｐｅｒｆｅｒｍｅｎｔｅｍｉａ）の減少率及び心筋壊死領域の減少（表１及び２）は、ニトログリセリン及びアナプリリヌムを投与したラットの方が、新たなエンケファリン類似物（１）を投与したラットよりはるかに小さかった。従って、心筋の虚血性障害の程度を減少させるには、従来のニトリグリセリン及びアナプリリヌムより、新たなエンケファリン類似物（１）の方が効果的であると結論付けた。
【００６８】
新たなエンケファリン類似物（１）は抗虚血作用を持っており、低酸素症において生物の安定性を高める。又、実験的心筋梗塞を引き起こされた動物の心筋壊死領域の拡大を制限し、実験動物の死亡率を減少させる。
【００６９】
［エンケファリン類似物（４）の心臓保護作用のインビボ検定］
この検定に使われたラットは実験動物飼育センタ（Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ）から使用され、ロシア科学アカデミー（Ｒｕｓｓｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ＩＢＣＲＡＳ）の生物有機化学機関（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｂｒａｎｃｈ）の実験動物の扱いと使用の委員会の姿勢による方針及びガイドラインに従って維持された。テスト施設は、実験室の標準作用手順（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、ＳＯＰｓ）に規定された要件に従っている。
【００７０】
＜心虚血のラットモデル＞
＜動物の準備＞
＜手術と左冠状動脈の閉鎖（Ｌｅｆｔ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ、ＬＣＡＯ）＞
本実験に使用されたラットは全て、体重が２８０〜３８０ｇである雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットである。ラットは、ウレタンの腹腔内投与（１〜１．５ｇ／ｋｇ）によって麻酔された。気管切開術を行った後、動物の気管を、齧歯動物酸素吸入器（ｒｏｄｅｎｔ  ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ）（モデルＵＧＯ  ＢＡＳＩＬＥ  ７０２５）に繋がっている排管（ｃａｎｎｕｌａ）に挿管した。体温は、あんかを用いて３７℃に保たれ、ディジタル体温計に接続された温度プローブを肛門に挿入し監視された（体温は３７±１℃になるように監視及び維持された）。
【００７１】
ＢＰトランスデューザ（モデルＰＮ：１８９１−Ｅ４５，ＤＴＸＴＭ、シンガポール）を用いて血圧（ＢＰ）を測るために、大腿動脈を分離し、カニューレを挿入した。動脈の平均血圧及び心拍数は、特別なソフトウェアを用いて計算された。ペプチド又は塩水と、メチレンブルー染料とを投与するために右大腿静脈にカニューレを挿入した。
【００７２】
心臓を第５肋間間隙で露出させるために、左開胸を行った。心膜を取り除き、肺流出路と左心室の間にある溝にある左冠状動脈の下に縫い目を配置した。テュービングを心筋表面に置いてあり、縫い目は左冠状動脈を縛るように締め、クランプするることができ、簡単に元に戻せる血流の閉鎖を提供する。この過程中には血行力学及び体温の監視が行われた。
【００７３】
ウレタンによって麻酔され、開胸され、局部的な心筋虚血‐再かん流にさらされたラットに行われた実験のプロトコールは図１に示されている（付録を参照）。
【００７４】
全ての動物は、２５分の閉鎖及び２時間の再かん流にさらされた。閉鎖の５分前に、いくつかの量（０．１μｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇ）のペプチド（４）が与えられた。全てのラットの冠状動脈は、縫い目の糸を引き、プラスチックチューブでクランプすることによって閉鎖された。２５分後、クランプは放され、冠状動脈の再かん流を行った。すると左心室の色はピンクになる。１２０分の再かん流後、縫い目を縛って再び閉鎖を起こし、２％のメチレンブルー染料を注射した。損傷された場所以外の心臓が染料によって染色され、総危険領域（Ｔｏｔａｌ  Ａｒｅａ  Ａｔ  Ｒｉｓｋ，  ＡＡＲ）が明確に定められると、心臓は動物の体から素早く取り出され、水に洗われ、左心室だけ残るように心房、弁部位、及び右心室壁を取り除いた。左心室は横に（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅｌｙ）切断された２ｍｍの薄片に処理された。（青に染まる）正常な組織と決定された領域はＡＡＲ（青に染まっていない）から分離され、薄片は塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムの１％のｐＨ７．４バッファー溶液で、１５分間３７℃でインキュベートされた。塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムによる染色後、梗塞された領域は白っぽくなり、梗塞されていない（又は生きている）領域は赤っぽく表れる。その後、薄片は５分間１０％のホルマリンに浸けられ、固定された。
【００７５】
＜ＡＡＲ及び梗塞面積の測定＞
薄片は写真撮影された。薄片ごとに、梗塞の面積（塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムによって染まらない）及び危険領域（塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムによって染まる）が、コンピュータによる面積測定技術をもちいて追跡、そしてディジタル化された。各領域の面積はコンピュータによって測定（“ＩｍａｇｅＴｏｏｌ”というプログラム）された。
【００７６】
梗塞領域をＡＡＲで割り、梗塞領域／ＡＡＲの比率（ＩＳ／ＡＡＲ）を計算した。心臓保護効果（減少された％ＩＳ／ＡＡＲ）の統計的な分析のため、データは、梗塞面積（Ｉｎｆａｒｃｔ  Ｓｉｚｅ、ＩＳ）をＡＡＲの百分率として示される（例えば、％ＩＳ／ＡＡＲ）。インビボ梗塞の減少の統計的な比較は、賦形剤のコントロールに対して行われた。
【００７７】
＜実験プロトコール＞
賦形剤（Ｎ＝１２）に対するペプチド（４）の心臓保護効果の投与量−反応の関係を示す曲線（用量反応曲線）は、ＬＣＡＯの５分前に、１ｍｌ／ｋｇのボーラスとして、０．０１μｇ／ｋｇ（ｎ＝６）、０．１μｇ／ｋｇ（ｎ＝１２）、１．０μｇ／ｋｇ（ｎ＝１２）及び０．００５ｍｇ／ｋｇの静脈注射（ｉ．ｖ．）投与量のペプチド（４）を投与して作成された。
【００７８】
梗塞後の再かん流傷害に対するペプチド（４）の影響は、ＬＣＡＯの解除の直後に１μｇ／ｋｇのペプチド（４）（１ｍｌ／ｋｇのボーラスとして）の投与によって評価された。
【００７９】
＜結果＞
＜心臓保護効果のモデリング：用量反応曲線＞
コントロールの動物は４２．９±２．７の平均梗塞面積を示した。ペプチド（４）は、虚血の５分前に投与されると、ＡＡＲの百分率（ＩＳ／ＡＡＲ）として示される梗塞面積を有意に減少させ（Ｐ＜０．０５、表４）、０．２μｇ／ｋｇ〜３．２μｇ／ｋｇの投与量では３０％以下まで減少する。ペプチド（４）の効果は１．０μｇ／ｋｇの投与量で最大であった（２６．０±３．５％）。０．０１μｇ／ｋｇの低い投与量では、ペプチド（４）の静脈注射は梗塞面積に何の効果ももたらさなかった（４５±４．６％）（表４及び付録の図２）。
【００８０】
＜ペプチド（４）の再かん流傷害に対する効果＞
ＬＣＡＯの解除直後に投与されると（即ち、１２０分の再かん流期間の開始時点で）、ペプチド（４）は、コントロールに比べ、虚血性障害の程度を有意に減少させた（３２．５±４％、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ、図３、付録を参照）。
【００８１】
我々は、２５分の閉鎖及び１２０分の再かん流期間の前にペプチド（４）を雄ＳＤラットに静脈注射で投与すると、ペプチド（４）はインビボにおいて虚血性障害を制限すると結論付ける。ペプチド（４）（１．０μｇ／ｋｇ）は、コントロールに比べ、梗塞面積を約３９％減少させた。梗塞面積に対する有益な効果は、手術によって引き起こされる虚血及び緊急な状況において、臨床的に利用できる可能性を示した。
【００８２】
表４：ペプチド（４）で治療されたラット心臓の梗塞面積のデータ。梗塞面積はＡＡＲの百分率（ＩＳ／ＡＡＲ）として表示。
2010500991.tif 000006
【００８３】
＜抗低酸素作用＞
新たなエンケファリン類似物（１）の抗低酸素作用は大気圧低酸素性低酸素症条件（ｎｏｒｍｏｂａｒｉｃ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｈｙｐｏｘｉａ）におけるマウスの寿命を計測して測定された。
【００８４】
実験は、体重２０〜２２ｇのＢＡＬＢ繁殖マウスを対象に行われた。大気圧低酸素性低酸素症条件は、過剰な二酸化炭素を吸収するＣａ（ＯＨ）２を含む密封カメラ（ｈｅｒｍｅｔｉｃ  ｃａｍｅｒａ）の中に動物を置くことでモデリングされた。検査された物質は、動物を密封カメラ内に入れる１分前に腹腔内に注射された。ペプチドは１．０ｍｇ／ｋｇの投与量で使用された。この投与量は、ペプチドの抗低酸素作用を調べるために最適な量であることが分かっていた。治療用の最大投与量のオキシブチラート・ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）を、比較化合物として用いた。寿命は、動物が呼吸の動作を行わなくなるまでの時間とし定義した。結果は表５に示してある。
【００８５】
表５：低酸素環境におけるマウスの寿命に対する、エンケファリン類似物及びオキシブチラート・ナトリウムの影響。
2010500991.tif 000007
【００８６】
新たなエンケファリン類似物（１）が注射された動物の寿命は、コントロール動物より５７％長かった。オキシブチラート・ナトリウムが注射された動物の寿命は、コントロール動物に比べ２４％長かった。
【００８７】
＜エンケファリン類似物（１）のインビボ鎮痛作用検定：尻尾をつねる方法＞
エンケファリン類似物の鎮痛作用は、尻尾をつねる方法（“ｔａｉｌ  ｐｉｎｃｈ”  ｍｅｔｈｏｄ）で測定された（非特許文献１１）。鎮痛効果は、体重１８〜２２ｇの異系交配された雄マウスに、モルヒネ、［Ｌｅｕ５］のエンケファリン及び［Ｍｅｔ５］のエンケファリンを嚢内投与及び静脈投与して得られた。１０匹のマウスが各実験に使われた。
【００８８】
検査された物質は無菌の生理溶液に溶解され、その１０μｌを意識のあるマウスの脳内に、Ｊの形をした針を用いて注射した。コントロール動物は１０μｌの無菌生理溶液を与えた。静脈投与は尻尾静脈に行われた。鎮痛作用は、２００ｇの圧力を持つ動脈クリップ（ａｒｔｅｒｉａｌ  ｃｌｉｐ）を用いて尻尾をつねることでテストされた。クリップを適用してから１秒以内にクリップを噛んだマウスを検定のために選択した。鎮痛作用は、クリップを噛む反応までの時間が６秒以上ある場合と定義した。鎮痛テストは、投与から５，１５，３０，６０、および９０分後に行われ、鎮痛反応が止まるまで３０分ごとに行われた。ペプチドの鎮痛作用はクリップを噛む反応を見せないマウスの百分率として示された。結果は表６及び７に要約されている。鎮痛作用はモルヒネと相対的に示されている（モルヒネ＝１）。
【００８９】
表６：エンケファリン類似物の嚢内投与による鎮痛作用（尻尾をつねる方法）。
2010500991.tif 000008
【００９０】
表７：エンケファリン類似物の静脈投与による鎮痛作用（尻尾をつねる方法）。
2010500991.tif 000009
【００９１】
表６に示されているように、新たなエンケファリン類似物（１）は明確な鎮痛効果を持っている。新たなエンケファリン類似物（１）は天然のエンケファリン（化合物ａ）及びｂ））よりはるかに強く、標準オピオイドであるモルヒネの嚢内投与より６０倍の効能を持つ。
【００９２】
天然のエンケファリンとは違って、新たなエンケファリン類似物（１）は静脈投与でも活性を見せる。又、静脈投与されたモルヒネより２倍の効能を見せた（表７）。
【００９３】
＜エンケファリン類似物（１，２，３，４，５）のインビボ鎮痛作用検定：ホットプレート方法＞
この検査は、現在の米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．ＦＤＡ）の非臨床的研究の良心的な研究実践（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧＬＰ）規則（２１ＣＦＲ，パート５８）に従って行われた。テスト施設は、実験室の標準活動手順（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、ＳＯＰｓ）に規定された要件に従っている。
【００９４】
ペプチド（１〜５）の鎮痛作用は、ＣＤ−１雄マウスを静脈注射によって投与し、ホットプレートテスト（非特許文献１２）を用いて検定された。比較の化合物としてモルヒネを用いた。
【００９５】
体重２０〜２２ｇのスイスアルビノ雄マウス（ＣＤ１）を、検定の全ての過程において用いた。動物は標準実験食が置かれた、隙間のないポリカーボネートケージで飼育され、任意に水道水を備える。そして管理される環境において飼育された（温度：１８〜２６℃、午前８時〜午後８時の明暗サイクル）。マウスは１回のみテストされた。
【００９６】
ホットプレート−メータは、透明な壁（長さ：２５ｃｍ、幅：２５ｃｍ、高さ：２５ｃｍ）によって制限された、サーモスタット制御可能な電子的に加熱された表面を意味する。この装置の前面にあるパネルは、時間及び温度モードを調整するためのボタンを備えている（コロンバス  インストゥルメント）。
【００９７】
全てのペプチド及びモルヒネは、静脈投与のために塩水に溶解された。静脈投与は尻尾の静脈にボーラス注射として行われた。全ての動物への投与量は個体毎の最終的体重に基づいて計算された。
【００９８】
塩水又はペプチドを静脈注射した後、動物は予熱されたホットプレート（５５±０．５℃）に置かれ、初めて脚を舐めるまでの時間及び初めてジャンプするまでの時間を計った。他の行動反応は無視した。動物は、初めてジャンプ後ホットプレートから取り出された。組織の損傷を避けるために、中断時間の１８０秒までに実験を続けた。
【００９９】
ホットプレートテストの反応を評価するために、塩水及びペプチドを注射した後、夫々コントロールからの時間（ｔ０）とテストでの時間（ｔ１）を測定した。可能な最大効果の百分率（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｍａｘｉｍａｌ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｅｆｆｅｃｔ、％ＭＰＥ）は、％ＭＰＥ＝（ｔ１−ｔ０）／（ｔ２−ｔ０）Ｘ１００として計算され、ここでｔ０とは中断時間の１８０秒である。
【０１００】
初めてのジャンプまでの時間は、ホットプレートテストにおいて最も指標となるものと考えられている。ジャンプまでの時間として示されたペプチド（１〜５）（投与量８μｍｏｌ／ｋｇ）の鎮痛効果は図４に示されている（付録を参照）。時間−反応曲線（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｕｒｖｅ）下の面積は、非特許文献１３に記載の方法を用いて痛覚抑制の程度を検定するために計算された（図５、付録を参照）。
【０１０１】
モルヒネにと比較した結果は図６に示されている（付録）。
【０１０２】
このパラメータに関して、鎮痛投与量の中央値（ＥＤ５０）も計算された。静脈投与から１５分後の時点でのペプチド（１，２，３，５）の鎮痛作用の結果は表８に示されている。
【０１０３】
図４に示されているように（付録を参照）、エンケファリン類似物（１〜５）はマウスに静脈投与されてから９０〜３００分間、明確な鎮痛効果を持つ（ホットプレート方法）。ペプチド（１）及び（５）は類似した性質のプロフィールを示し、ペプチド（３）は効果が現れるまで１５分の待ち時間があり、その後はペプチド（１）及び（５）と同様なプロフィールを見せる。ペプチド（４）は投与後３０分の時点で最大値の著しい鎮痛効果を見せる。しかしその鎮痛効果は、他の４つのペプチドより弱い。
【０１０４】
表８：ホットプレートテストによる静脈投与から１５後におけるペプチド’（１，２，３，５）の鎮痛作用。
2010500991.tif 000010
【０１０５】
ホットプレートテストにおいて、新たな合成エンケファリン類似物であるペプチド（１〜５）は明確な鎮痛作用を持っていることを示した。ペプチド（３）及び（５）は、実質的にモルヒネと同様な鎮痛効能を示した。
【０１０６】
最も活発な作用を見せるのはペプチド（１）（ＥＤ５０＝１．２７ｍｇ／ｋｇ）及び（２）（ＥＤ５０＝１．７ｍｇ／ｋｇ）であることが分かった。ペプチド（１）及び（２）は夫々、モルヒネの２倍及び１．５倍の作用を見せた（表８）。
【０１０７】
＜インビトロ鎮痛作用検定＞
＜モルモット回腸（ＧＰＩ）及びマウス輸精管（ＭＶＤ）を用いる生物学的検定（ｂｉｏａｓｓａｙ）＞
ペプチドの末梢オピオイド受容体に対する効果は、電気刺激によるモルモット（Ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ）の腸間膜神経叢（ｍｅｓｅｎｔｅｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｐｌｅｘｕｓ）を持つ回腸の縦走筋の部分収縮を抑制する能力、及び電気刺激によるマウス輸精管の縦走筋の部分収縮を抑制する能力で測定された（非特許文献１４）。何れの性別の（体重３５０〜５００ｇ）モルモットの回腸縦走筋を、その下にある輪走筋カラ慎重に分離し、３６℃のクレブズ溶液（Ｋｒｅｂ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）がある小槽に入れた。
【０１０８】
溶液は常に酸素供給された。０．２ｇの定荷重が組織に与えられた。組織は、輪状白金電極を用いて０．１Ｈｚの頻度の１μｓの刺激を与えた。同じ大きさの伸縮がニホンコウデンポリグラフに接続されたＴＢ−６１１Ｔレコーダで読み取れた。マウス（体重２７〜３０ｇ）の輪精管は、修正された３１℃のクレブズ溶液（硫酸マグネシウムを含まない）の槽に入れられた。検査される物質は蒸留水に溶解された。化合物の抑制作用は、化合物を洗い流さずに足して行き、投与量を増していくことで測定された。調合された化合物の作用はｎｍｏｌ／ｌ単位のＩＣ５０で表現される。８〜１０回のテストカラ得られた結果はスチューデント基準に従って統計的に処理された。表９はＰ０．０５の信頼できる間隔のＩＣ５０を示している。
【０１０９】
表９：モルモット回腸（Ｇｕｉｎｅａ  Ｐｉｇ  Ｉｌｅｕｍ，  ＧＰＩ）及びマウス輸精管（Ｍｏｕｓｅ  Ｖａｓ  Ｄｅｆｅｒｅｎｓ、ＭＶＤ）におけるエンケファリン類似物のオピオイド作用。
2010500991.tif 000011
【０１１０】
ＧＰＩ検定において（主にμタイプのオピオイド受容体）、エンケファリン類似物（１）は高いレベルの効能を見せた。エンケファリン類似物（１）のμ−親和性は、［Ｌｅｕ５］−エンケファリンの親和性より２３倍高かった。エンケファリン類似物（１）は更にモルヒネより一桁高い作用を見せた。
【０１１１】
＜結論＞
従って我々は、新たなペプチドの心臓保護作用（梗塞面積の２４〜３９％減少）、ニトログリセリン及びβ−アドレナリン遮断薬であるアナプリリヌムのような周知の心臓保護薬より優れた虚血性障害に対する保護、オキシブチラート・ナトリウムのような周知の薬物より明確な抗低酸素作用、並びに静脈投与のモルヒネより明確及び長期的な鎮痛作用を明らかにした。
【図１】
2010500991.tif 000012
【図２】
2010500991.tif 000013
【図３】
2010500991.tif 000014
2010500991.tif 000015
【図４】
2010500991.tif 000016
【図５】
2010500991.tif 000017
【図６】
2010500991.tif 000018
【国際調査報告】
2010500991.tif 000019
2010500991.tif 000020
2010500991.tif 000021
2010500991.tif 000022
2010500991.tif 000023