(57)【要約】  本発明は、アミノ酸コポリマーの１つ以上の特性を評価する方法および組成物を提供する。2010530975.tif 000006
2010530975.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）サイトカインによって誘導されるタンパク質を発現できる少なくとも１つの細胞を提供するステップと、
（ｂ）サイトカインによって誘導される１つ以上のタンパク質を細胞が発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、少なくとも１つの細胞と、一定量のアミノ酸コポリマーおよびサイトカインとを接触させるステップと、
（ｃ）誘導タンパク質を検出して、アミノ酸コポリマーの特性を評価するステップと
を含む、アミノ酸コポリマーの特性を評価する方法。
【請求項２】
（ａ）サイトカインによって誘導されるタンパク質を発現できる少なくとも１つの細胞を提供するステップと、
（ｂ）誘導タンパク質を細胞が発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、少なくとも１つの細胞と、一定量のアミノ酸コポリマーおよびサイトカインとを接触させるステップと、
（ｃ）誘導タンパク質の発現、分泌、誘導、存在またはレベルを測定するステップと、
（ｄ）誘導タンパク質の、測定された発現、分泌、誘導、存在またはレベルと、酢酸グラチラマーの市販医薬品の基準値、サイトカイン誘導プロフィールまたは医薬品規格とを比較して、アミノ酸コポリマーの特性を評価するステップと
を含む、アミノ酸コポリマーを評価する方法。
【請求項３】
サイトカインが炎症性サイトカインである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サイトカインが、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、およびインターロイキン−８（ＩＬ−８）からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
サイトカインがＩＦＮγである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１つ以上のＩＦＮγ調節性タンパク質がＩＦＮγ調節性ケモカインである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
コポリマーが、アミノ酸であるアラニン、リジン、グルタミン酸、およびチロシンを含むコポリマーである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項８】
コポリマーが酢酸グラチラマーである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項９】
誘導タンパク質の生成、分泌、誘導、存在またはレベルの値と、酢酸グラチラマーの市販医薬品の基準値、サイトカイン誘導プロフィールまたは医薬品規格とを比較するステップである、ステップ（ｄ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
酢酸グラチラマーの市販医薬品の基準値、サイトカイン誘導プロフィールまたは医薬品規格特性が、効力、特異性、安定性、活性、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される特性に相当する値である、請求項２または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｄ）が、印刷またはコンピュータ可読媒体で値を記録するステップを含む、請求項２または請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの細胞が、骨髄性細胞系および初代骨髄性細胞からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの細胞がヒト骨髄性白血病細胞系である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト骨髄性白血病細胞系が、ヒト急性単球性白血病細胞系（ＴＨＰ−１）、ヒト白血病性単球リンパ腫細胞系（Ｕ９３７）、およびヒト前骨髄球性白血病細胞系（ＨＬ−６０）からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの細胞がヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および単球由来樹状細胞からなる群から選択される初代細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの細胞が、自己免疫性、炎症性、神経変性性、または脱髄性の、疾患、障害または機能不全を有する対象に由来する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、および炎症性腸疾患からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１つ以上の細胞が、無血清アッセイ培地に懸濁される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記サイトカインによって調節される１つ以上のタンパク質が、γ−インターフェロン−誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、インターフェロン−誘導性Ｔ細胞α−化学誘引物質（Ｉ−ＴＡＣ）、およびγ−インターフェロンによって誘導されるモノカイン（ＭＩＧ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
アミノ酸コポリマーの濃度が０．０５μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
アミノ酸コポリマーの濃度が０．１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
アミノ酸コポリマーの濃度が０．５μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｂ）のサイトカイン濃度が、(ｉ）サイトカイン不在下で細胞をアミノ酸コポリマーと接触させた場合のタンパク質発現、および(ｉｉ）アミノ酸コポリマー不在下で細胞をサイトカインと接触させた場合のタンパク質発現の合計よりも大きいレベルでタンパク質発現を誘導する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
サイトカインの濃度が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
サイトカインの濃度が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
サイトカインの前記濃度が約１０ｎｇ／ｍＬである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
期間が１時間〜４８時間である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項２８】
期間が６時間〜３６時間である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
期間が１２時間〜２４時間である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
アミノ酸コポリマーの濃度が０．５μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであり、サイトカインが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬで存在し、期間が１２時間〜２４時間であり、細胞がＴＨＰ−１細胞であり、コポリマーが酢酸グラチラマーであり、サイトカインがＩＦＮγである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｃ）における検出が抗体ベースの方法を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項３２】
抗体ベースの方法が免疫沈降法を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体ベースの方法が酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）サイトカインによって誘導されるタンパク質を発現できる型の少なくとも１つの細胞を提供するステップと、
（ｂ）前記細胞型の少なくとも１つの細胞を
（ｉ）サイトカインによって誘導されるタンパク質を細胞が発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、一定量のアミノ酸コポリマーの第１のサンプルと、
（ｉｉ）サイトカインによって誘導されるタンパク質を細胞が発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、一定量のアミノ酸コポリマーの第２のサンプルと
別々に接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）（ｉ）の少なくとも１つの細胞によって発現されるサイトカイン誘導タンパク質を検出して、アミノ酸コポリマーの第１のサンプルの特性を評価するステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）（ｉｉ）の少なくとも１つの細胞によって発現されるサイトカイン誘導タンパク質を検出して、アミノ酸コポリマーの第２のサンプルの特性を評価するステップと、
（ｅ）アミノ酸コポリマーの第１のサンプルの特性と、アミノ酸コポリマーの第２のサンプルの特性とを比較して、第１および第２のサンプル間の類似性を判定するステップと
を含む、アミノ酸コポリマーの少なくとも２つのサンプルを比較する方法。
【請求項３５】
アミノ酸コポリマーサンプルの少なくとも１つが参照標準である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
アミノ酸コポリマーサンプルの少なくとも１つが酢酸グラチラマーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの細胞が、骨髄性細胞系および初代骨髄性細胞からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
骨髄性細胞系がヒト骨髄性白血病細胞系を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ヒト骨髄性白血病細胞系がヒト急性単球性白血病細胞系（ＴＨＰ−１）、ヒト白血病性単球リンパ腫細胞系（Ｕ９３７）、およびヒト前骨髄球性白血病細胞系（ＨＬ−６０）からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
初代骨髄性細胞がヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および単球由来樹状細胞からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つの細胞が、自己免疫性、炎症性、神経変性性または脱髄性の疾患を有する対象に由来する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、および炎症性腸疾患からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
１つ以上の細胞がアッセイ培地に懸濁される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
アッセイ培地が無血清アッセイ培地である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記サイトカインによって調節される１つ以上のタンパク質が、γ−インターフェロン−誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、インターフェロン−誘導性Ｔ細胞α−化学誘引物質（Ｉ−ＴＡＣ）、およびγ−インターフェロンによって誘導されるモノカイン（ＭＩＧ）からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
アミノ酸コポリマーの第１のサンプルおよびアミノ酸コポリマーの第２のサンプルの濃度が０．０５μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
アミノ酸コポリマーの濃度が０．１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
アミノ酸コポリマーの濃度が０．５μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記サイトカインが炎症性サイトカインである、請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
サイトカインが、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、およびインターロイキン−８（ＩＬ−８）からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
サイトカインがインターフェロンγである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
サイトカインの濃度が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬである、請求項３４に記載の方法。
【請求項５３】
サイトカインの濃度が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
サイトカインの前記濃度が約１０ｎｇ／ｍＬである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
期間が１時間〜４８時間である、請求項３４に記載の方法。
【請求項５６】
期間が６時間〜３６時間である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
期間が１２時間〜２４時間である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ステップ（ｄ）の前記検出するステップが抗体ベースの方法を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項５９】
抗体ベースの方法が免疫沈降法を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記免疫学的方法が酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
アミノ酸コポリマーの第１のサンプルおよびアミノ酸コポリマーの第２のサンプルの少なくとも１つが、自己免疫性、脱髄性、神経変性性または炎症性の疾患の治療を必要とする対象において、それを治療する既知の有効性を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項６２】
疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、および炎症性腸疾患からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
アミノ酸コポリマーの第１のサンプルの特性が、アミノ酸コポリマーの第２のサンプルの特性の８０％〜１２０％の範囲内である、請求項３４に記載の方法。
【請求項６４】
（ａ）酢酸グラチラマーのバッチを提供するステップと、
（ｂ）請求項１〜３１のいずれか一項に従ってバッチの特性を評価するステップと、
（ｃ）サイトカインによって調節される１つ以上のタンパク質のレベルが、酢酸グラチラマーの基準値に一致する場合、バッチが医薬用途のために許容可能であることを判定するステップと
を含む、酢酸グラチラマーの医薬組成物を調製する方法。
【請求項６５】
基準値が、酢酸グラチラマーの市販医薬品の効力、特異性、安定性、および／または生物学的活性に関する、サイトカイン誘導プロフィール、等価性範囲または医薬品規格である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
（ａ）骨髄性細胞を提供するステップと、
（ｂ）細胞がＩＦＮγ−誘導タンパク質を発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、細胞と、（ｉ）一定量のアミノ酸コポリマー、および（ｉｉ）ＩＦＮγとを接触させるステップと、
（ｃ）ＩＦＮγ−誘導タンパク質の存在、レベル、生成、分泌、誘導と、酢酸グラチラマーの基準値とを比較するステップと
を含む、アミノ酸コポリマー調製品の活性、効力、特異性または安定性を評価する方法。
【請求項６７】
基準値が、酢酸グラチラマーの市販医薬品の活性、効力、特異性または安定性に関するサイトカイン誘導プロフィール、等価性範囲または医薬品規格である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
比較するステップが、１つ以上の誘導タンパク質の測定された発現、分泌、誘導、存在またはレベルと、酢酸グラチラマーの市販医薬品の基準値、サイトカイン誘導プロフィールまたは医薬品規格との差が、所定の範囲内であるかどうかを判定するステップを含む、請求項２または請求項８に記載の方法。
【請求項６９】
差が所定の範囲内であれば、コポリマーを分類し、選択し、承認し、廃棄し、リリースし、または保留するステップと、コポリマーを製剤に加工し、コポリマーを含む製品を発送し、コポリマーを新しい場所に移動させるステップ、またはコポリマーを商業目的のために配合し、ラベルし、包装し、販売し、売りに出し、またはリリースするステップをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、ベンジル保護Ｌ−グルタミン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）保護Ｌ−リジン、およびＬ−チロシンを重合して、保護されるコポリマーを生成するステップと、保護されるコポリマーを処理して、保護されるコポリマーを部分的に解重合し、ベンジル保護基を脱保護し、ＴＦＡ保護リジンを脱保護して、酢酸グラチラマーを生成するステップと、酢酸グラチラマーを単離するステップとを含み、
サイトカインおよび単離された酢酸グラチラマーのサンプル存在下で、骨髄性細胞または初代骨髄性細胞系中のサイトカイン誘導タンパク質の発現を測定すること、および発現と基準値とを比較することを含む、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物を調製する方法。
【請求項７１】
サイトカインがＩＦＮγである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
測定される発現と基準値との差が所定の範囲内であれば、医薬組成物の調製で使用するための精製酢酸グラチラマーを選択するステップをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
選択された精製酢酸グラチラマーの少なくとも一部を含む医薬組成物を調製するステップをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ここで開示される主題は、一般に複合ペプチドまたはポリペプチド混合物を特性決定する方法に関する。より詳しくは、ここで開示される主題は、アミノ酸コポリマーの１つ以上の特性を評価するための細胞ベースの方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コポリマー１は、アミノ酸であるグルタミン酸、リジン、アラニン、およびチロシンの重合から調製されるポリペプチドの複合混合物である。コポリマー１はまた、酢酸グラチラマーとしても知られており、次の構造式を有する。
（Ｇｌｕ，Ａｌａ，Ｌｙｓ，Ｔｙｒ）ｘ  ＸＣＨ３ＣＯＯＨ
（Ｃ５Ｈ９ＮＯ４・Ｃ３Ｈ７ＮＯ２・Ｃ６Ｈ１４Ｎ２Ｏ２・Ｃ９Ｈ１１ＮＯ３）ｘ・ＸＣ２Ｈ４Ｏ２
【０００３】
酢酸グラチラマー（ＧＡ）はＴｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．，ＩｓｒａｅｌからのＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）の活性成分であり、報告された平均モル濃度画分がそれぞれ０．１４１、０．４２７、０．０９５、および０．３３８である、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、およびＬ−リジンの４つの天然アミノ酸を含有する合成ポリペプチドの酢酸塩を含む。
【０００４】
酢酸グラチラマーは、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）の治療において使用される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、候補薬剤（例えばコポリマー１などのアミノ酸コポリマー、例えば酢酸グラチラマー）の１つ以上の特性を評価する方法および組成物を提供する。一態様では、本発明は、例えば自己免疫性および／または炎症性の疾患、障害または機能不全の治療のための医薬品としての適合性について、効力、特異性、安定性、生物学的活性を含むが、これに限定されるものではない、生理学、薬力学、薬物動態学、または薬学的特性について、アミノ酸コポリマー調製品を評価する多様な実施態様を提供する。
【０００６】
一実施態様では、本明細書に記載の方法またはアッセイは、（ａ）細胞が調節性タンパク質を生成するのを誘導させるのに十分な濃度と時間で、（ｉ）炎症促進性分子によって調節される１つ以上のタンパク質を生成または分泌する少なくとも１つの細胞と、（ｉｉ）一定量のアミノ酸コポリマー、および（ｉｉｉ）炎症促進性分子とを接触させるステップを含む。１つ以上の調節性タンパク質の生成、分泌、誘導、存在またはレベル（または１つ以上の調節性タンパク質のレポーター遺伝子）が検出でき、アミノ酸コポリマーの特性と関連付けることができる。別の実施態様では、アミノ酸コポリマーを評価する方法は、（ａ）サイトカインによって誘導されるタンパク質を発現できる少なくとも１つの細胞を提供するステップと、（ｂ）誘導タンパク質を細胞が発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、少なくとも１つの細胞と、一定量のアミノ酸コポリマーおよびサイトカインとを接触させるステップと、（ｃ）誘導タンパク質の発現、分泌、誘導、存在またはレベルを測定するステップと、（ｄ）誘導タンパク質の測定された発現、分泌、誘導、存在またはレベルと、酢酸グラチラマーの市販医薬品の基準値、サイトカイン誘導プロフィールまたは医薬品規格とを比較してアミノ酸コポリマーの特性を評価するステップとを含む。サイトカインによって誘導されるタンパク質を発現できる細胞は、十分なレベルのサイトカインに曝された際に、サイトカイン不在下で細胞が発現するよりもタンパク質をより多く発現する細胞である。当然ながら、細胞は、サイトカイン不在下でタンパク質を発現してもよい。細胞は、サイトカインによって誘導される２つ以上のタンパク質を発現できる。タンパク質を生成または分泌する細胞は、タンパク質を発現する細胞である。
【０００７】
（ａ）サイトカインによって誘導されるタンパク質を発現できる少なくとも１つの細胞を提供するステップと、（ｂ）サイトカインによって誘導される１つ以上のタンパク質を細胞が発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、少なくとも１つの細胞と、一定量のアミノ酸コポリマーおよびサイトカインとを接触させるステップと、（ｃ）誘導されたタンパク質を検出して、アミノ酸コポリマーの特性を評価するステップとを含む、アミノ酸コポリマーの特性を評価する方法についてもまた、述べられている。
【０００８】
（ａ）サイトカインによって調節される１つ以上のタンパク質を分泌または生成できる少なくとも１つの細胞を提供するステップと、（ｂ）サイトカインによって調節される１つ以上のタンパク質を細胞が分泌または生成するのを誘導するのに十分な濃度および期間で、少なくとも１つの細胞と、一定量のアミノ酸コポリマーおよび前記サイトカインとを接触させるステップと、（ｃ）１つ以上の調節性タンパク質を検出して、アミノ酸コポリマーの特性を評価するステップとを含むアミノ酸コポリマーの特性を評価する方法についてもまた述べられている。
【０００９】
効力、特異性、安定性、および／または生物学的活性などのアミノ酸コポリマー調製品の（例えば試験アミノ酸コポリマー調製品の）１つ以上の特性は、アッセイの結果（例えば調節性タンパク質の誘導、生成、分泌、存在またはレベルに対応する定性的または定量的試験値）と、例えばコポリマーの特定レベルの効力、特異性、安定性、および／または生物学的活性に対応する所定の値など、例えば本明細書に記載の疾患、障害、または機能不全を治療するのに有用な医薬品に適したコポリマーの効力、特異性、安定性、および／または生物学的活性のレベルに対応する所定の値などである基準値とを比較することで、評価できる。一実施態様では、基準値は酢酸グラチラマーの市販医薬品の効力、特異性、安定性、および／または生物学的活性に関する、サイトカイン誘導プロフィール、等価性範囲または医薬品規格である。別の実施態様では、基準値は、例えば参照酢酸グラチラマー調製品などの基準化合物の特性の直接測定によって判定される値である。一実施態様では、基準値よりも２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％少ない範囲であれば、試験値は基準値に匹敵するとみなされる。
【００１０】
一実施態様では、アッセイで使用される細胞は白血球、例えば骨髄性細胞など、例えば骨髄性細胞系または初代細胞など、例えば血液単核細胞（例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージなど）、血液多形核細胞（例えば好酸球、好塩基球、好中球、巨核球など）、樹状細胞、および胸腺細胞である。細胞は、ＴＨＰ−１、Ｕ９３７、ＳｉＨａ、またはＨＬ−６０などの腫瘍形成性骨髄性細胞系であることができる。さらに哺乳類の末梢血単核細胞ならびに骨髄由来単球および単球を使用してもよい。
【００１１】
一実施態様では、炎症促進性分子は、例えば腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、およびインターロイキン−８（ＩＬ−８）からなる群から選択される、炎症促進性サイトカインである。別の実施態様では、炎症促進性分子はＬＰＳである。
【００１２】
一実施態様では、（その誘導、生成、分泌、存在またはレベルがアッセイ中で検出される）炎症促進性分子によって調節されるタンパク質は、例えばＩＦＮ−γ調節性ケモカインなどのケモカインである。一実施態様では、ケモカインは、γ−インターフェロン−誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、インターフェロン−誘導性Ｔ細胞α−化学誘引物質（Ｉ−ＴＡＣ）、γ−インターフェロンによって誘導されるモノカイン（ＭＩＧ）からなる群から選択される。ＩＦＮ−γによって誘導されるその他の可溶性タンパク質またはサイトカインとしては、表１に示されるものが挙げられる。調節性タンパク質の誘導、生成、分泌、存在またはレベルは、例えばＥＬＩＳＡなどの抗体ベースの方法によって直接検出でき、または例えばタンパク質の転写物を検出する技術分野で既知の技術によって、またはレポーター遺伝子アッセイの使用によって、間接的に検出できる。
【００１３】
いくつかの実施態様では、細胞のアミノ酸コポリマーおよび炎症性サイトカインへの曝露は、１つ以上のサイトカイン調節性タンパク質の相乗的誘導をもたらす。一例では、骨髄性細胞のアミノ酸コポリマー（例えば酢酸グラチラマー）およびＩＦＮγへの曝露は、１つ以上のＩＦＮγ調節性ケモカインまたはサイトカインの（例えばＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＭＩＧ、および／またはその他のＣＸＣＲ３リガンドの）相乗的誘導をもたらす。一実施態様では、調節性サイトカインの誘導は、（例えば炎症促進性分子なしおよび／またはコポリマーなしの負の対照と比べて）対照値よりも少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍以上高くあることができる。
【００１４】
本発明は、サイトカインによって調節される１つ以上のタンパク質の少なくとも所定のレベルが検出され、および／または調節性タンパク質が基準値の８０％〜１２５％（例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％）以内のレベルに誘導される場合に、酢酸グラチラマーのバッチを調製するステップと、本明細書に記載の方法によって、組成物の効力、特異性、生物学的活性および／または安定性を評価するステップと、酢酸グラチラマーが医薬用途のために許容可能であることを判定するステップを含む、酢酸グラチラマーの医薬組成物を調製する方法をさらに提供する。
【００１５】
Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、ベンジル保護Ｌ−グルタミン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）保護Ｌ−リジン、およびＬ−チロシンを重合して、保護されるコポリマーを生成するステップと、保護されるコポリマーを処理して、保護されるコポリマーを部分的に解重合し、ベンジル保護基を脱保護し、ＴＦＡ保護リジンを脱保護して、酢酸グラチラマーを生成するステップと、酢酸グラチラマーを単離するステップを含み、サイトカインおよび単離された酢酸グラチラマーのサンプル存在下で、骨髄性細胞または初代骨髄性細胞系中のサイトカイン誘導タンパク質の発現を測定して、発現と基準値とを比較するステップを含む、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物を調製する方法についてもまた述べられている。この調製法の様々な実施態様では、サイトカインはＩＦＮγであり、測定された発現と基準値との差が所定の範囲内であれば、医薬組成物の調製で使用するための精製酢酸グラチラマーを選択するステップをさらに含み、選択された精製酢酸グラチラマーの少なくとも一部を含む医薬組成物を調製するステップをさらに含む。
【００１６】
ここで開示される主題によって全部または一部が対処される、上述の開示される主題の特定の態様、その他の態様は、下で最も良く説明されている添付の実施例および図との関連で、説明の進行と共に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】一定のＩＦＮγ濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）での様々な血清含有または無血清培地中における、およそ２４時間にわたるＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、およびＭＩＧの分泌を例示する。１０％ＦＢＳ条件は、５０、１０、２、および０μｇ／ｍｌの酢酸グラチラマー（ＧＡ）で試験された。２％ＦＢＳ、０％ＦＢＳ、およびＸ−ＶＩＶＯ１５の条件は、５０および０μｇ／ｍｌ  ＧＡで分析された。Ｍは１００μｇ／ｍｌでアッセイされたマンニトール対照キャリアを表す。棒グラフ上の番号は、対照（０μｇ／ｍｌ）と比較した倍数的増加を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
ここで開示される主題のいくつかの、しかし全てではない実施態様が示される添付図を参照して、下文において、ここで開示される主題についてより詳細に述べる。ここで述べられる開示される主題の多数の修正とその他の実施態様は、前述の説明で提示される教示および関連図の利益を受ける、ここで開示される主題に関係する当業者であれば想到されるあろう。したがってここで開示される主題は開示される特定の実施態様に限定されず、修正およびその他の実施態様は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されると理解される。ここで特定の用語が用いられるが、それらはあくまで一般的な記述的意味で使用され限定は意図されない。
【００１９】
長年にわたる特許法の慣例に従って、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、特許請求の範囲を含めて本明細書での使用では「１つ以上」を指す。したがって例えば「サンプル（ａ  ｓａｍｐｌｅ）」への言及は、特に明白に断りのない限り、複数のサンプル（例えば複数のサンプル）などを含む。
【００２０】
全ての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、それぞれの個々の出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献を具体的かつ個別に参照によって援用したのと同程度に、参照によって本明細書に援用する。いくつかの特許出願、特許、およびその他の参考文献についてここで言及されるが、このような参考文献は、これらの文献のいずれかが当該技術分野の一般常識の一部をなすことを認めることものではないものと理解される。
【００２１】
概説
本発明は、例えば自己免疫性、神経変性性、脱髄性または炎症性の障害を治療する治療製剤として有用かもしれない、コポリマー調製品の１つ以上の特性を評価するための方法および組成物を提供する。ここで述べられるアッセイは、細胞培養アッセイ、臓器培養アッセイ、または生体外アッセイを含む、当該技術分野で知られている任意の形式であってもよい。
【００２２】
ここでの用法では、「コポリマー」、「アミノ酸コポリマー」または「アミノ酸コポリマー調製品」とは、規定の複数の異なるアミノ酸（例えば３〜６個など、典型的に２〜１０個の異なるアミノ酸）からなるポリペプチドの異種性混合物である。コポリマーは、個々のアミノ酸の重合から調製されてもよく、または組み換え的に生成されてもよい。「アミノ酸」という用語は天然アミノ酸に限定されないが、アミノ酸誘導体および／またはアミノ酸類似体を含むことができる。例えばチロシンアミノ酸を含むアミノ酸コポリマー中では、アミノ酸の１つ以上はホモチロシンであることができる。さらに２つの隣接する残基の間に、１つ以上の非ペプチドまたはペプチド模倣結合を有するアミノ酸コポリマーが、この定義に含まれる。コポリマーは、混合物内のポリペプチドの各化学種の分子量に関して不均一である。
【００２３】
本発明の一実施態様では、アミノ酸コポリマーは、アミノ酸Ｙ、Ｅ、Ａ、およびＫ；Ｙ、Ｆ、Ａ、およびＫ；Ｖ、Ｙ、Ａ、およびＫ；Ｖ、Ｗ、Ａ、およびＫ；Ｖ、Ｅ、Ａ、およびＫ；Ｙ、Ｆ、Ａ、およびＫ；Ｖ、Ｗ、Ａ、およびＫ；Ｗ、Ｅ、Ａ、およびＫまたはＦ、Ｅ、Ａ、およびＫを含むポリペプチドの混合物である。別の本発明の実施態様では、アミノ酸コポリマーは、それぞれが（ａ）リジンおよびアルギニン、（ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸、（ｃ）アラニンおよびグリシン、（ｄ）チロシンおよびトリプトファンの４群の異なる１群からのものである、４つの異なるアミノ酸を含有する。本発明のこの実施態様に従って特定のコポリマーは、アラニン、グルタミン酸、リジン、およびチロシンを含むポリペプチドの混合物を含む。一実施態様では、コポリマーは、コポリマー１（Ｃｏｐ  １）または酢酸グラチラマーとも称される、アミノ酸Ｙ、Ｅ、Ａ、およびＫからなるポリペプチドの混合物を含む。別の実施態様では、アミノ酸コポリマーは、それぞれが、例えばＹ、Ａ、およびＫ；Ｙ、Ｅ、およびＫ；Ｋ、Ｅ、およびＡ；またはＹ、Ｅ、およびＡなど、前述の（ａ）〜（ｄ）の内３群の異なる１群からのものである、３つの異なるアミノ酸を含有する。
【００２４】
別の実施態様では、アミノ酸コポリマーは、アラニン−グルタミン酸−リジン−チロシン−アラニン（Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｙ−Ａ）、アラニン−グルタミン酸−リジン−バリン−アラニン（Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｖ−Ａ）、アラニン−グルタミン酸−リジン−フェニルアラニン−アラニン（Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ａ）、アラニン−リジン−チロシン−アラニン−グルタミン酸（Ａ−Ｋ−Ｙ−Ａ−Ｅ）、グルタミン酸−アラニン−リジン−チロシン−アラニン（Ｅ−Ａ−Ｋ−Ｙ−Ａ）、アラニン−リジン−バリン−アラニン−グルタミン酸（Ａ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ）、およびグルタミン酸−アラニン−リジン−バリン−アラニン（Ｅ−Ａ−Ｋ−Ｖ−Ａ）、アラニン−リジン−フェニルアラニン−アラニン−グルタミン酸（Ａ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｅ）、およびグルタミン酸−アラニン−リジン−フェニルアラニン−アラニン（Ｅ−Ａ−Ｋ−Ｆ−Ａ）からなる群から選択されるアミノ酸を含む。
【００２５】
「炎症促進性分子」とは、炎症性免疫応答の増幅または伝播をもたらす、白血球、上皮細胞、または間質細胞の活性化を刺激する分子である。炎症促進性分子は、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好塩基球、好酸球、および肥満細胞などの免疫細胞からの活性化マーカー（例えばＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ５４、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８３、ＣＤ９５）の生成、および／またはその他の炎症促進性サイトカインおよび／またはケモカインの分泌を誘導できる。炎症性サイトカインは、例えばＩＦＮ−γなどの、本明細書に記載のような炎症促進性分子の特性を有する小型分泌タンパク質である。この定義は、文脈によっては、抗炎症活性もまた有してもよい分子を除外しない。
【００２６】
「ケモカイン」は、化学走性活性があるサイトカインである。ケモカインの例としては、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＴＡＲＣ、Ｉ−３０９が挙げられる。
【００２７】
ここで述べられる様々な方法を使用して、試験コポリマー調製品と、酢酸グラチラマーの効力、特異性、安定性、および生物学的活性などに関する医薬品規格値などの１つ以上の所定の基準値との比較によって、効力、特異性、安定性、純度、および生物学的活性などの試験コポリマー調製品の１つ以上の特性を評価できる。場合によっては、基準値は既知の薬剤との比較によって判定できる。この既知の薬剤は、ここでは「参照薬剤」または「基準化合物」と称される。本発明の好ましい参照薬剤は医薬品として使用するのに適したアミノ酸コポリマー（例えば酢酸グラチラマーの医薬品）であり、例えばそれは、１つ以上の自己免疫性、変性、脱髄性および／または炎症性の障害または病状において、治療効果を有することが示されている。「治療効果」とは、薬剤が障害または病状に付随する症状を予防、治療、または寛解できることが意図される。
【００２８】
一実施態様では、基準値は酢酸グラチラマーに関する所定の医薬品規格値である。一実施態様では、基準化合物は酢酸グラチラマーの医薬品である。一実施態様では、外来性に提供されるサイトカインおよびコポリマー１が同時投与された際の、様々な細胞型におけるサイトカイン調節性タンパク質の相乗的誘導が観察されている。ここでの用法では「相乗的」とは、各単一薬剤単独での個々の効果の合計よりも、併用においてより効果的である、２つ以上の薬剤（例えば酢酸グラチラマーおよびサイトカイン）を指す。このサイトカイン調節性タンパク質の相乗的誘導を使用して、酢酸グラチラマーに匹敵する生物学的活性を含む特性について、試験コポリマー調製品をスクリーンできる。
【００２９】
酢酸グラチラマーは、再発寛解型多発性硬化症がある患者における再発頻度の低下のために認可されている。多発性硬化症は自己免疫疾患に分類される。酢酸グラチラマーはその他の自己免疫疾患、炎症性非自己免疫疾患の治療で使用するために、神経再生を促進するためにおよび／または一次神経系傷害に続けて起きるかもしれない二次変性を予防または抑制するために開示されている。さらに酢酸グラチラマーは、免疫媒介疾患ならびに脱髄と関連付けられている疾患のための治療として開示されている。本明細書に記載の方法を使用して、これらのいずれかの障害のための医薬品としての適合性に関して、酢酸グラチラマー調製品の活性を評価できる。
【００３０】
生体外アッセイ
本発明の方法および組成物は、候補薬剤（例えばアミノ酸コポリマー）の１つ以上の特性を評価するのに有用なアッセイを含む。一実施態様では、炎症性サイトカインによって調節される１つ以上のタンパク質の生成および／または分泌に対するコポリマー調製品の効果を評価する生体外アッセイを使用して、試験コポリマー調製品がスクリーンされる。試験コポリマー調製品の存在下におけるタンパク質の炎症性サイトカイン調節性誘導のレベルは、同一細胞型中での参照薬剤存在下におけるタンパク質の炎症性サイトカイン調節性誘導のレベルと比較される。誘導のレベル（すなわち定性的または定量的なレベル）および性質（すなわちタンパク質種）は、ここで「サイトカイン誘導プロフィール」と称される。サイトカイン誘導プロフィールを使用して、効力、安定性、特異性、および生物学的活性などのアミノ酸コポリマーの１つ以上の特性を評価できる。一実施態様では、試験コポリマー調製品のサイトカイン誘導プロフィール（例えば誘導レベルまたは誘導された類似タンパク質の数、または双方）が、コポリマー医薬組成物（例えばＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）のロット）の基準値またはプロフィールの約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、約１２５％までを含む、約８０％〜約１２５％の間であれば、試験コポリマー調製品は医薬組成物として適切であると言われる。別の実施態様では、試験コポリマー調製品のサイトカイン誘導プロフィール（例えば誘導レベルまたは誘導された類似タンパク質の数、または双方）が、参照コポリマー調製品の約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、１２０％、約１２５％までを含む、約８０％〜約１２５％の間であれば、試験コポリマー調製品は参照コポリマー調製品（例えばＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標））と実質的に同じ特性を有すると言われる。
【００３１】
一実施態様では、参照は、１つ以上の自己免疫または炎症性の障害において既知の治療効果がある、アミノ酸コポリマーである。特定の実施態様では、参照薬剤は酢酸グラチラマーである。基準値は、酢酸グラチラマーの特定レベルの効力、純度、安定性またはその他の活性に対応する所定の値であることができる。
【００３２】
サイトカイン調節性タンパク質の誘導に十分な濃度と時間で、サイトカイン調節性タンパク質を生成または分泌できる１つ以上の細胞と、候補薬剤または参照薬剤とを接触させる。アッセイは、初代細胞、細胞系、またはそれらの組み合わせであってもよい、２つ以上の細胞型を含んでなってもよい。サイトカイン調節性タンパク質の誘導に十分な濃度と時間は、（例えばサイトカインによって調節されるタンパク質のベースラインレベルを超える）候補または参照薬剤の不在下におけるタンパク質レベルを超える、サイトカイン調節性タンパク質の検出可能な生成または分泌をもたらすものである。濃度が細胞毒性である濃度に達しさえしなければ、少なくとも約０．０５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１μｇ／ｍＬ、少なくとも約２μｇ／ｍＬ、少なくとも約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ以上の濃度で、一定濃度の候補薬剤がアッセイ培地中に存在してもよい。
【００３３】
候補薬剤または参照薬剤は、少なくとも約１時間、少なくとも約１．５時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、約５時間、約６時間、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約４０、約４５、約４８以上時間にわたり、サイトカイン調節性タンパク質を分泌または生成できる細胞と共にインキュベート（すなわち「接触」）されてもよい。
【００３４】
一実施態様では、上述のタンパク質の発現を調節する量の炎症性サイトカインが、アッセイ培地に外来性に添加されてもよい。サイトカインは、試験または参照コポリマー調製品の添加前、同時、または後に添加できる。一実施態様では、サイトカインは試験または参照コポリマー調製品と同時に添加される。サイトカインは、濃度が細胞毒性である濃度に達しさえしなければ、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度でアッセイ培地中に存在できる。いくつかの実施態様では、サイトカインは、アッセイ宿主細胞中で異種性に発現させることができる。異種性遺伝子は、構成的または誘導性プロモーターの制御下にあることができる。
【００３５】
本発明の様々な態様では、本明細書に記載の１つ以上のタンパク質の生成および分泌を調節するサイトカインは、炎症性サイトカインである。炎症性サイトカインは、典型的にＴｈ１  Ｔ細胞応答と関連付けられている。一実施態様では、炎症性サイトカインは、ＴＮＦα、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−１（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）、およびリンホトキシン−αを含む群から選択されるが、これに限定されるものではない。本明細書に記載のアッセイでは、サイトカインは、サイトカインによって調節される１つ以上のタンパク質の生成または分泌を誘導するのに十分な濃度で存在する。一実施態様では、サイトカイン調節性タンパク質は、γ−インターフェロン−誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、インターフェロン−誘導性Ｔ細胞α−化学誘引物質（Ｉ−ＴＡＣ）、およびγ−インターフェロンによって誘導されるモノカイン（ＭＩＧ）を含む、インターフェロンγによって調節されるタンパク質（例えばケモカイン）を含む。ＩＰ−１０、ＭＩＧ、およびＩ−ＴＡＣは、実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）および多発性硬化症（ＭＳ）の双方においてＣＮＳ病変内で発現され、症状悪化の際に、これらのリガンドに結合する受容体、ＣＸＣＲ３は、ＥＡＥおよびＭＳ病変に浸潤するＴ細胞上、ならびにＭＳ患者の脳脊髄液および末梢中のＴ細胞上に発現される（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：５５０−５５９で概説されている）。
【００３６】
細胞
ここで述べられるサイトカインによって調節される１つ以上のタンパク質を生成できさえすれば、多数の細胞型が本発明の方法において有用である。例えば骨髄性細胞系または初代細胞など、例えば血液単核細胞（例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージなど）、血液多形核細胞（例えば好酸球、好塩基球、好中球、巨核球など）、および樹状細胞などの炎症反応に関与する細胞と、胸腺上皮細胞とが挙げられるがこれらに限定されるものではない。ＴＨＰ−１、Ｕ９３７、ＳｉＨａ、およびＨＬ−６０などの腫瘍形成性細胞系もまた挙げられる。その他の有用な細胞としては、上皮細胞、間質細胞、および例えば初代の微小血管系、ＨＵＶＥＣ、大動脈内皮細胞などの内皮細胞も挙げられる。さらに哺乳類の末梢血単核細胞ならびに骨髄由来単球および水簸または負磁気ビーズ単離によって単離された単球もまた使用してもよい。
【００３７】
細胞培養条件
細胞培地の調合物については文献でよく知られており、数多く市販されている。一実施態様では、アッセイ中の細胞は、無血清培地内で培養される。無血清培地を調製する方法については、当該技術分野でよく知られている。成分は、グルタミン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、シスチン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン、およびそれらの誘導体などのアミノ酸（Ｄおよび／またはＬ−アミノ酸の双方）と、チアミン、アスコルビン酸、第二鉄化合物、第一鉄化合物、プリン、グルタチオンおよびリン酸二水素ナトリウムなどの酸可溶性下位群とを含んでもよい。
【００３８】
追加的成分としては、糖、デオキシリボース、リボース、ヌクレオシド、水溶性ビタミン、リボフラビン、塩、微量金属、脂質、酢酸塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッド、ピルビン酸塩、および緩衝液が挙げられる。
【００３９】
培地調合物中で使用されることが多いその他の成分としては、（ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫを含む）脂溶性ビタミン、ステロイドおよびそれらの誘導体、コレステロール、脂肪酸および脂質、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、２−メルカプトエタノールピリミジン、ならびに血清（胎児の、ウマ、ウシなど）を含む多様な栄養補給剤、タンパク質（インシュリン、トランスフェリン、成長因子、ホルモンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢなど）、全卵限界濾液、および付着因子（フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、ラミニン、テネイシンなど）が挙げられる。本発明の方法で有用な細胞を増殖させる適切な条件を判定することは、十分に当業者の能力範囲内である。
【００４０】
細胞は、懸濁状態、単層内、ビーズ上または三次元を含む当該技術分野で知られている任意の様式で培養されてもよい。細胞および組織を培養する方法については当該技術分野でよく知られており、例えばＣｅｌｌ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７），Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓで述べられている。
【００４１】
本発明の実施では、特に断りのない限り、技術分野の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組み換え生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を用いる。このような技術については、文献で詳細に説明されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｄ  Ｌａｂ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５；Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶを参照されたい。
【００４２】
タンパク質誘導の測定
本明細書に記載のようなサイトカイン調節性タンパク質の誘導は、当業者にそれぞれ知られている多様な異なる方法で評価できる。測定がサンプル中で、目的とするサイトカイン調節性タンパク質のレベルが、基準値であり、基準値を超え、または基準値未満であるかどうかを指示できさえすれば、測定は定量的または定性的のどちらであってもよい。サイトカイン調節性タンパク質の１つ以上の誘導のレベル、ならびに誘導される特定タンパク質（ここで「サイトカイン誘導プロフィール」と称される）は、参照サイトカイン誘導プロフィール（例えば特定の活性または活性レベルに相当するように予め定められたプロフィール）と、または参照薬剤および負の対照薬剤の１つ以上のサイトカイン誘導プロフィールと比較できる。負の対照薬剤は、例えばアッセイで利用される細胞型中において、効力または活性を有さないもの、またはサイトカイン調節性タンパク質生成を誘導しないもの、または双方であることができる。
【００４３】
サイトカイン誘導プロフィールは、生物学的特性または活性の指標として使用できる。効力、特異性、および安定性などの特性は、サイトカイン誘導プロフィールを使用して評価できる。本発明の目的では、効力および生物学的活性は、１つ以上のサイトカイン調節性タンパク質の誘導レベルを評価することで評価される。「特異性」は、例えば結果に基づいて試験された調製品を酢酸グラチラマーである、または酢酸グラチラマーでないと同定または識別することで評価される。安定性は、候補薬剤のサイトカイン誘導プロフィールを参照薬剤と経時的に比較することで、評価できる。いくつかの実施態様では、サイトカイン誘導プロフィールは参照薬剤との等価性の指標として使用できる。
【００４４】
一実施態様では、サイトカイン調節性タンパク質の誘導は、免疫学的方法を使用して検出される。サイトカイン調節性タンパク質の誘導を検出するのに使用できる免疫学的方法としては、ウエスタンブロットなどの免疫ベースの技術を使用した競合的および非競合的アッセイシステム、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、マルチプレックスＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。このようなアッセイは、日常的であり当該技術分野で知られている（例えばここでその全体を参照によって援用するＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。例示的な免疫測定法については、下で簡単に述べられている（しかし限定は意図されない）。
【００４５】
免疫沈降法プロトコルは、一般に（任意に例えばエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、フェニルメタンスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）、アプロチニン、バナジン酸ナトリウムなどのタンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤が添加された）アッセイ培地から上清を得るステップと、目的とする結合分子（すなわち目的とするサイトカイン調節性タンパク質と特異的に結合する抗体などの分子）を上清に添加して、約４℃で一定期間（例えば１〜４時間）インキュベートするステップと、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解産物に添加して、約４℃で約１時間以上インキュベートして、ビーズを緩衝液で洗浄して、ビーズをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）／サンプル緩衝液に再懸濁するステップを含む。目的とする結合分子が特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えばウエスタンブロット分析によって評価できる。当業者は、結合分子のサイトカイン調節性タンパク質への結合を増大させ、バックグラウンドを低下させるために修正できるパラメーター（例えばセファロースビーズを用いた上清の事前クリーニング）についての知識があるであろう。免疫沈降法プロトコルに関するさらなる考察については、例えばここでその全体を参照によって本明細書に援用するＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １０．１６．１を参照されたい。
【００４６】
ウエスタンブロット分析は、一般にタンパク質サンプルをアッセイ上清から調製するステップと、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル（例えば抗原の分子量に応じて８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で電気泳動するステップと、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンなどの膜に転移して、膜をブロッキング溶液（例えば３％のＢＳＡまたは脱脂乳添加ＰＢＳ）中でブロックして、膜を洗浄緩衝（例えばＰＢＳ−ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０）液で洗浄するステップと、膜を緩衝液で希釈された目的とする分子（例えば目的とするサイトカイン調節性タンパク質に対して特異的な抗体）によってブロックして、膜を洗浄緩衝液で洗浄するステップと、膜をブロッキング緩衝液で希釈された酵素基質（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合する抗体（結合分子を認識する、例えば二次抗体など）によってブロックして、膜を洗浄緩衝液で洗浄するステップと、サイトカイン調節性タンパク質の存在を検出するステップを含む。当業者は、検出シグナルを増大させ、バックグラウンドノイズを低下させるために修正できるパラメーターについての知識があるであろう。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えばここでその全体を参照によって本明細書に援用するＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １０．８．１を参照されたい。
【００４７】
ＥＬＩＳＡは、サイトカイン調節性タンパク質を調製するステップと、目的とするサイトカイン調節性タンパク質、または目的とするサイトカイン調節性タンパク質を含むアッセイ上清で、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを被覆するステップと、酵素基質（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物と結合する、目的とする結合分子をウェルに添加して、一定期間インキュベートするステップと、サイトカイン調節性タンパク質の存在を検出するステップを含む。ＥＬＩＳＡでは、目的とする結合分子は検出可能な化合物と結合していなくてもよく、代わりに検出可能な化合物と結合する（目的とする結合分子を認識する）抗体をウェルに添加してもよい。さらに目的とするサイトカイン調節性タンパク質、または目的とするサイトカイン調節性タンパク質を含むアッセイ上清でウェルを被覆する代わりに、結合分子でウェルを被覆してもよい。この場合、目的とするサイトカイン調節性タンパク質、または目的とするサイトカイン調節性タンパク質を含むアッセイ上清を被覆されたウェルに添加するのに続いて、検出可能な化合物に結合する抗体を添加してもよい。当業者は、検出シグナルを増大させるために修正できるパラメーター、ならびに当該技術分野で知られているＥＬＩＳＡのその他の変法についての知識があるであろう。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えばここでその全体を参照によって本明細書に援用するＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １１．２．１を参照されたい。様々なＥＬＩＳＡキットは、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、およびＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＩＬ）などの商業的供給元から得てもよい。
【００４８】
測定されるサイトカイン調節性タンパク質と特異的に結合する分子（抗体またはアプタマーなどの「親和性試薬」）を利用した親和性ベースの測定もまた使用してもよく、ならびに分光法ベースの技術（例えばマトリックス支援レーザー脱離イオン化法−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分光法）などのその他の技術についても同様である。
【００４９】
親和性ベースの技術としては、抗体ベースのアッセイ（上述のような免疫測定法）およびＥＬＯＮＡなどのアプタマー（その他の分子と特異的に結合する核酸分子）を用いたアッセイが挙げられる。さらに抗体およびアプタマーの双方を用いたアッセイ（例えば捕捉のための抗体および検出のためのアプタマーを用いたサンドイッチ形式アッセイ）もまた考えられる。一般にアプタマーは、ほぼ全ての免疫測定形式で抗体に置き換えてもよいが、アプタマーは追加的なアッセイ形式（ＰＣＲなどの核酸増幅技術を使用した結合アプタマーの増幅（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）など）または複合材プライマーによる等温増幅（米国特許第６，２５１，６３９号明細書および同第６，６９２，９１８号明細書）を可能にする。
【００５０】
親和性ベースのアッセイは、サンドイッチ型の形式を利用した競合または直接反応形式であってもよく、さらに異種性（例えば固体担体を利用する）または均質（例えば単一相内で起きる）であってもおよび／または免疫沈降法を利用してもよい。ほとんどのアッセイは標識された親和性試薬（例えば抗体、ポリペプチド、またはアプタマー）の使用を伴い、標識は、例えば酵素的、蛍光性、化学発光性、放射性、または染料分子であってもよい。プローブからのシグナルを増幅するアッセイについてもまた知られており、その例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、およびＥＬＩＳＡおよびＥＬＯＮＡアッセイなどの酵素標識および酵素媒介免疫測定法である。
【００５１】
異種性形式では、アッセイは２相（典型的に水性液および固体）を利用する。典型的にサイトカイン調節性タンパク質に特異的な親和性試薬は固体担体に結合して、サンプルの大半からのサイトカイン調節性タンパク質の分離を促進する。親和性試薬／サイトカイン調節性タンパク質複合体の形成に十分な時間の反応後、典型的に、結合ポリペプチドの検出に先だって、抗体を含有する固体担体または表面を洗浄する。サイトカイン調節性タンパク質を測定するアッセイでは、親和性試薬を担体（例えば固体または半固体）上に提供してもよく、あるいはサンプル中のポリペプチドを担体または表面上に固定化できる。使用できる担体の例は、ニトロセルロース（例えば膜またはマイクロタイターウェル形態）、ポリ塩化ビニル（例えばシートまたはマイクロタイターウェル形態）、ポリスチレンラテックス（例えばビーズまたはマイクロタイタープレート形態）、フッ化ポリビニリデン、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、ガラス、およびプロテインＡビーズである。これらのアッセイについては、標準および競合形態の双方が当該技術分野で知られている。
【００５２】
複数のサイトカイン調節性タンパク質を用いて本発明の方法を実施する場合には、アレイ型異種性アッセイがサイトカイン調節性タンパク質のレベルを測定するのに適する。本発明の方法の実施において使用されるアレイ型アッセイは、基材に所定のパターン（例えば格子）で結合する、異なるサイトカイン調節性タンパク質に対して特異的な２つ以上の捕捉試薬がある固体基材を一般に利用する。サンプル（例えばアッセイ上清）は基材に塗布され、サンプル中のサイトカイン調節性タンパク質が捕捉試薬によって捕捉される。サンプルの除去（および適切な洗浄）後、様々なサイトカイン調節性タンパク質に特異的に結合する適切な検出試薬の混合物を使用して、結合サイトカイン調節性タンパク質を検出する。検出試薬の結合は、一般に蛍光染料ベースのシステムなどの視覚的システムを使用して達成される。捕捉試薬は基材上に所定のパターンで配列されるので、アレイ型アッセイは、多重検出システムの必要なしに複数のサイトカイン調節性タンパク質を検出する利点を提供する。
【００５３】
均質形式では、アッセイは単一相（例えば水性液相）内で行われる。典型的にサンプルは、溶液中のサイトカイン調節性タンパク質に対して特異的な親和性試薬と共にインキュベートされる。例えばそれは、形成する任意の親和性試薬／抗体複合体を沈殿させる条件下であってもよい。これらのアッセイについては、標準および競合的形式の双方が当該技術分野で知られている。
【００５４】
標準（直接反応）形式では、サイトカイン調節性タンパク質／親和性試薬複合体のレベルは、直接モニターされる。これは例えば結合中でサイトカイン調節性タンパク質／親和性試薬複合体を形成する、標識された検出試薬の量を判定することで達成されてもよい。競合的形式では、サンプル中のサイトカイン調節性タンパク質の量は、複合体中における、既知量の標識されたサイトカイン調節性タンパク質（またはその他の競合リガンド）の結合に対する競合効果をモニターすることによって、推定される。結合または複合体形成の量は、定性的にまたは定量的に判定できる。
【００５５】
免疫測定法に加えて、サイトカイン調節性タンパク質をコードする遺伝子の、またはレポーター遺伝子の発現パターンを評価することにより誘導が測定できる。例えば発現パターンは、ノーザン分析、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎ分析、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ＦＲＥＴ検出、１つ以上の分子ビーコンのモニタリング、オリゴヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーション、ポリヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション、液体マイクロアレイとのハイブリダイゼーション、微小電気アレイとのハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡ配列決定、クローンハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡ断片フィンガープリント法などによって評価できる。選ばれる特定の方法は、回収されたＲＮＡの量、当業者の好み、入手できる試薬、および機材、検出器などの要因に左右されるであろう。
【００５６】
当業者によって理解されるであろうように、シグナルの検出様式は、アッセイで利用される正確な検出システムに依存する。例えば放射標識された検出試薬が利用される場合、シグナルは、シンチレーション測定、（典型的にスキャニングデンシトメトリーと併用される）オートラジオグラフィーなど、サンプルからのシグナルを定量でき、またはサンプルからのシグナルと参照サンプルからのシグナルとを比較できる技術を使用して測定される。化学発光検出システムが使用される場合、信号は典型的に照度計を使用して検出される。検出システムからシグナルを検出する方法は当該技術分野でよく知られており、ここでさらに詳しく述べる必要はない。
【００５７】
２つ以上のサイトカイン調節性タンパク質を測定する場合、サンプルをいくつかのアリコートに分割し、別々のアリコートを使用して異なるサイトカイン調節性タンパク質を測定してもよい（特定のサンプル中のサイトカイン調節性タンパク質レベルの多重判定を可能にする、サンプルの複数のアリコートへの分割もまた考察される）。あるいは、アレイ型アッセイまたは多重検出技術を用いるアッセイ（例えば異なる蛍光染料マーカーで標識された検出試薬を用いるアッセイ）など、単一アッセイ中で異なるサイトカイン調節性タンパク質の個々のレベルを測定できるアッセイを使用して、サンプル（またはそれからのアリコート）を試験し、単一反応中の複数のサイトカイン調節性タンパク質のレベルを判定してもよい。
【００５８】
当該技術分野では、「反復」測定を実施することが一般的である。反復測定は、通常、サンプルを複数のアリコートに分割し、同一アッセイシステムの別々の反応中でバイオマーカーを別々に測定して得られる。反復測定値は本発明の方法にとって必ずしも必要でないが、本発明の多くの実施態様は、反復試験、特に二連および三連試験を利用する。いくつかの実施態様では、参照薬剤および候補薬剤は、同一細胞培養から得られた細胞の別々のアリコートを使用してアッセイされる。別の実施態様では、参照薬剤（および／または負の対照）および候補薬剤は、同一バッチの細胞を使用してアッセイされる。この実施態様では、各薬剤を異なる時点でアッセイし、アッセイ培地を測定ごとに入れ替えて、各測定に続いて細胞が適切な細胞濃度を回復できるようにする。
【００５９】
ここで述べられる方法を実行でき、および／または結果を記録できる任意の装置を使用して、方法を実行し、および／または結果を記録してもよい。使用してもよい装置の例としては、任意のタイプのコンピュータを含む電子的計算装置が挙げられるが、これに限定されるものではない。ここで述べられる方法をコンピュータ内で実行し、および／または記録する場合、コンピュータが方法のステップを遂行するよう設定するのに使用してもよいコンピュータプログラムは、コンピュータプログラムを含有できる任意のコンピュータ可読媒体に含有されてもよい。使用してもよいコンピュータ可読媒体の例としては、ディスケット、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、およびその他のメモリー、およびコンピュータの記憶装置が挙げられるが、これに限定されるものではない。コンピュータが方法のステップを遂行し、および／または結果を記録するよう設定するのに使用してもよいコンピュータプログラムは、例えばインターネット、イントラネット、またはその他のネットワーク経由など、電子ネットワーク経由で提供されてもよい。
【００６０】
測定される値と基準値とを比較する過程は、測定される値と件のサイトカイン調節性タンパク質基準値とのタイプに適した任意の都合のよい様式で実施できる。上で考察したように、「測定」は定量的または定性的測定技術を使用して実施でき、測定される値と基準値との比較様式は用いられる測定技術に応じて変動できる。例えば定性的比色分析アッセイを使用してサイトカイン調節性タンパク質レベルを測定する場合、着色反応生成物の強度を視覚的に比較することで、または着色反応生成物の濃度測定または分光測定からのデータを比較することで（例えば測定装置に由来する数値データまたは棒グラフなどのグラフデータを比較することで）、レベルを比較してもよい。しかし本発明の方法で使用される測定される値は、最も一般的には、定量値であることが予期される（例えばサンプル１ミリリットル当たりのサイトカイン調節性タンパク質のナノグラムなどの濃度、または絶対量の定量的測定）。その他の例では、測定される値は定性的である。定性的測定と同様に、数値データを調べることで、またはデータの表示を調べる（例えば棒グラフまたは折れ線グラフなどのグラフ表示を調べる）ことで比較ができる。
【００６１】
測定される値は、それが基準値の約８０％〜約１２５％であれば、一般に基準値と実質的に類似していると見なされる。
【００６２】
比較過程は、手動（方法実行者による外観検査など）であってもよく、またはそれは自動化されてもよい。例えばアッセイ装置（化学発光シグナルを測定する照度計など）は、測定される値とサイトカイン調節性タンパク質の基準値とを比較できるようにする回路網およびソフトウェアを含んでもよい。あるいは、別個の装置（例えばデジタルコンピュータ）を使用して、測定される値と基準値とを比較してもよい。比較のための自動化装置は、測定されるサイトカイン調節性タンパク質に関する記憶された基準値を含んでもよく、またはそれらは測定される値と、同時に測定される参照サンプル（例えば酢酸グラチラマーサンプル）に由来する基準値とを比較してもよい。
【００６３】
当業者には明らかであるように、試験されるバイオマーカーについて反復測定値を採用する場合、基準値と比較される測定される値は、反復測定値を考慮に入れた値である。反復測定値は、測定される値の平均値または中央値のどちらかを「測定される値」として使用することで、考慮に入れてもよい。
【００６４】
酢酸グラチラマーを調製する方法
本発明の方法および組成物は、酢酸グラチラマーのバッチの１つ以上の特性を評価するのに有用である。方法は、酢酸グラチラマーのバッチを調製するステップと、本明細書に記載のアッセイを使用して、安定性、特異性、効力、および生物学的活性の１つ以上を評価するステップと、酢酸グラチラマーのバッチの特性と、基準化合物（例えば酢酸グラチラマーの標準化バッチ、例えば治療用途のために認可されたもの）の特性、または基準化合物の基準値（例えば酢酸グラチラマーに関する医薬品規格）とを比較するステップを含む。少なくとも所定のレベルの１つ以上のサイトカイン調節性タンパク質が検出されれば、酢酸グラチラマーのバッチは医薬用途のために許容可能であると言われる。「所定のレベル」とは、基準化合物を使用して検出できるもの、または酢酸グラチラマーに関する医薬品規格で規定されたものである。
【００６５】
以下の実施例は、ここで開示される主題の代表的な実施態様を実施するための指針を当業者に提供するために含まれる。本開示および当該技術分野の一般技術レベルに照らして、当業者は、以下の実施例があくまで例示を意図し、ここで開示される主題の範囲を逸脱することなく、多数の変形、修正、および変更が用いられることを理解できるであろう。したがって以下の実施例は、限定のための手段ではなく、例示のための手段として提供される。
【実施例】
【００６６】
実施例１：コポリマーアッセイ
方法
ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−２０２）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手された。ＴＨＰ−１細胞は、指標細胞−ＤＮＡ蛍光色素染色アッセイ（ｃａｔ．＃Ｍ−２５０，Ｂｉｏｎｉｑｕｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｒａｎａｃ  Ｌａｋｅ，ＮＹ）と組み合わさった複数培地直接培養アッセイを使用して、マイコプラズマ汚染を含まないことが示された。細胞を完全な増殖培地内で成育させ、３７℃、５％ＣＯ２の恒温器内でインキュベートした。
【００６７】
アッセイ培地をアッセイ当日に新鮮に調製した。アッセイ培地は、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５無血清培地（Ｃａｍｂｒｅｘ，０４−４１８Ｑ）中の２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ  Ｉ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，３５０５０−７９）を含有した。これらの試薬は、０．２ミクロンの酢酸セルロースフィルターユニット（Ｎａｌｇｅｎｅ，１５６−４０２０）内で濾過された。濾過後、瓶をホイルで覆って培地を光から保護した。
【００６８】
ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）（酢酸グラチラマー；Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、４℃で製造業者のシリンジ内に保存した。サンプルを無菌シリコン処理微量遠心管内で、２×ＩＦＮ−γアッセイ培地中に２×濃度で調製した。アッセイでは、０μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌの最終濃度を試験した。
【００６９】
ヒトＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２８５−ＩＦ−１００）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の無菌０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、３２２５−８０）で戻した。
【００７０】
アッセイの１日前に、ＴＨＰ−１細胞を２×１０５細胞／ｍｌ（２０ｍｌ最終体積）で播種した。これらの細胞を１８℃において４００×ｇで５分間の遠心分離によって収集した。細胞をアッセイ培地（ＩＦＮ−γなし）で１回洗浄し、アッセイ培地（ＩＦＮ−γなし）に再懸濁して計数した。ＴＨＰ−１細胞をアッセイ培地（最終濃度０、１、１０、および１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ）中に５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。マルチチャネルピペッターを用いて、細胞をウェル当たり５０μｌで、低濃度から高濃度の酢酸グラチラマー（５０、１０、２、および０ｎｇ／ｍｌ）に播種した。アッセイプレートを３７℃で５％ＣＯ２の恒温器内で０〜２３時間インキュベートした。
【００７１】
馴化培地を非無菌シリコン処理管内に採取した。管を４００×ｇで５分間４℃で遠心分離した。上清を新しいシリコン処理管に移し、液体窒素内で急速冷凍した。Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔ多重サイトカイン分析（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）に供されるまで、冷凍順化培地を−８０℃で保存した。
【００７２】
結果
タンパク質の広範なパネルに対するＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）の効果：
ＴＨＰ−１細胞からのサイトカイン、ケモカイン、可溶性受容体、およびプロテアーゼの幅広いパネルの分泌に対する、ＩＦＮ−γと組み合わさったＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）の効果を調べた。ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）の添加は、ケモカインＩＰ−１０の分泌に著しい増大を誘導した（表１）。ＩＰ−１０はＣＸＣＲ３受容体に結合するＩＦＮ−γ−調節性ケモカインである。ＩＦＮ−γは実験開始時に外来性に添加されたにも関わらず、ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）処理はまた、興味深いことに、２４時間目に培地中で観察された、より高レベルのＩＦＮ−γをもたらした。ＩＦＮ−γ生成に対するＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）の効果が、ある程度、ＩＰ−１０分泌に対するその相乗作用の原因であるかもしれない。それぞれＣＣＲ２およびＣＣＲ４受容体に結合するＭＣＰ−１およびＭＤＣなどのその他のケモカインもまたＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）に対する強い分泌応答を示したが、誘導の規模は、ＩＰ−１０（表１）によって観察されたものほど高くなかった。同様に、ＩＬ６などのその他のサイトカインは、ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）およびＩＦＮ−γに対する相乗的応答を示した。ＲＡＮＴＥＳおよびＴＡＲＣなどのいくつかのケモカイン、およびＩＬ−１０、ＩＬ１２、ｐ７０、ＴＮＦアルファ、ＴＩＭＰ１、およびＭＭＰ９などのサイトカインは、ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）処置による小さな増加を示した。
【００７３】
（表１）THP-1からのケモカインおよびサイトカイン分泌に対するＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）処置の効果
2010530975.tif 000003
【００７４】
相乗効果：
アッセイのいくつかの実施態様は、相乗効果を示す。図１は、ＩＰ−１０およびその他のケモカインの分泌に対するＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）およびＩＦＮ−γの相乗効果を例示する。ＩＦＮ−γ単独で処理されたＴＨＰ−１細胞は、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、およびＭＩＧ（全てＣＸＣＲ３リガンド）のわずかな生成のみを示した。ＩＦＮ−γと併用されたＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）の添加は、３つの全ケモカインの分泌に対する著しい濃度依存効果を誘導した。５０μｇ／ｍｌのＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）および１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γの存在下で分泌されたＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、およびＭＩＧのレベルは、ＩＦＮ−γを単独で含有するベースラインよりもそれぞれ３２９−、４１２−、および５７３倍高かった。２４時間目に測定されたＩＦＮ−γレベルは、ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）処理による濃度依存性増大もまた示した。ＴＨＰ−１細胞は、様々な濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の存在下で、またはＸ−ＶＩＶＯ１５無血清培地で培養された。ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）は全ての条件において、３つのケモカイン、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、およびＩ−ＴＡＣ全ての強い分泌、ならびにＩＦＮ−γの分泌を誘導したが、Ｘ−ＶＩＶＯ１５無血清合成培地中で培養された細胞が、ベースラインからの最も高い倍数的増加を示した。同様の応答は、その他の２つのヒト骨髄性細胞系Ｕ−９３７およびＨＬ−６０、および初代ヒト樹状細胞についても見られた。
【００７５】
表２は、２３時間目のＩＦＮ−γ単独と比べたＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）およびＩＦＮ−γ処理によるＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、およびＭＩＧの倍数的増加を示す。ベースラインからの倍数的増加は、１〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γで最大である。重要なことにＴＨＰ−１細胞は、ＩＦＮ−γ不在下においてＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）で処理されるといかなる顕著な量のＩＰ−１０も生成せず、ＩＦＮ−γ単独（ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）不在下で）は、少量のケモカイン分泌のみを誘導する。ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）およびＩＦＮ−γの相乗効果は、表２で明らかに例示される。より低レベルのＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、およびＭＩＧは、ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）とより高いＩＦＮ−γ濃度を用いた、３〜６時間程度の処理のアッセイで検出できる。しかしダイナミックレンジは１８〜２４時間目により良くなり、より低いＩＦＮ−γ濃度が使用できる。
【００７６】
（表２）２３時間目のケモカイン誘導（対照（０）の倍数的増加で表される）
2010530975.tif 000004
【００７７】
用量依存性：
表３は、アッセイの濃度依存性を示す。酢酸グラチラマー（ＧＡ）の各濃度における、ＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）が媒介するＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、およびＭＩＧの誘導について、ｐｇ／ｍｌ値を標準偏差と共に示す。各値は、それぞれ２２〜２４時間のインキュベーションで測定された、二連の点がある６つの独立したＴＨＰ−１アッセイからの１２個のサンプルを表す。この場合、読み取りはＥｎｄｏｇｅｎ  Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔ多重ＥＬＩＳＡアッセイであった。絶対ｐｇ／ｍｌ数は検出法に応じて異なる。例えばＥｎｄｏｇｅｎ  Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔ多重ＥＬＩＳＡアッセイと標準ＥＬＩＳＡとの間で、５〜１０倍の差が見られるかもしれない。絶対数は、インキュベーション時間とＩＦＮ−γの濃度に応じて異なる。それにもかかわらず同一アッセイ形式および方法内では、試験調製品を用いて得られた値を比較するために、アッセイを使用して、２つ以上のコポリマー調製品を比較し、および／または基準値（例えば等価性範囲）を判定できる。
【００７８】
（表３）酢酸グラチラマー（ＧＡ）の用量依存性
2010530975.tif 000005
【００７９】
概要
この実施例は、炎症促進性サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）からの刺激に応えた、酢酸グラチラマーが媒介する例えばケモカインＩＰ−１０、ＭＩＧ、およびＩ−ＴＡＣ、などのサイトカイン誘導が、酢酸グラチラマーの活性（例えば効力、純度、経時的安定性、生物学的活性または参照標準との等価性の１つ以上）を評価するのに使用できることを示す。一般に比較アッセイ中により大きな増強を有するサンプルは、より大きな効力または安定性と関連付けられる。
【００８０】
ＩＦＮ−γの存在下における、酢酸グラチラマーが媒介するＩＰ−１０、ＭＩＧ、およびＩ−ＴＡＣの分泌の増強は意外な結果である。これらの４つの可溶性因子は、典型的にＴｈ１炎症促進性サイトカイン応答と関連付けられており、酢酸グラチラマーは、Ｔｈ１応答を抑制しＴｈ２応答を促進することで、ある程度作用すると考えられている。
【００８１】
酢酸グラチラマーの正確な作用機序は複雑であり、依然として完全に理解されていないが、本方法は試験または候補コポリマー調製品の（例えばＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）の等価性または医薬品規格範囲の等価性などの）活性、効力、安定性、特異性について、サンプルコポリマー調製品を測定する方法を提供する。
【図１】
2010530975.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成22年3月15日(2010.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの骨髄性細胞を提供するステップと、
（ｂ）ＩＦＮ−γによって誘導される１つ以上のタンパク質を細胞が発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、少なくとも１つの細胞と、一定量のコポリマー１およびＩＦＮ−γとを接触させるステップと、
（ｃ）ＩＦＮ−γによって誘導されるタンパク質を検出して、コポリマー１の活性を評価するステップと
を含むコポリマー１の活性を評価する方法。
【請求項２】
（ａ）少なくとも１つの骨髄性細胞を提供するステップと、
（ｂ）ＩＦＮ−γによって誘導される１つ以上のタンパク質を細胞が発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、少なくとも１つの骨髄性細胞と、一定量のコポリマー１およびＩＦＮ−γとを接触させるステップと、
（ｃ）誘導タンパク質の発現、分泌、誘導、存在またはレベルを測定するステップと、
（ｄ）誘導タンパク質の、測定された発現、分泌、誘導、存在またはレベルと、酢酸グラチラマーの市販医薬品の基準値、サイトカイン誘導プロフィールまたは医薬品規格とを比較して、コポリマー１の特性を評価するステップと、
を含む、コポリマー１の活性を評価する方法。
【請求項３】
誘導タンパク質がＩＦＮ−γ−調節性ケモカインである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
誘導タンパク質の生成、分泌、誘導、存在またはレベルの値と、酢酸グラチラマーの市販医薬品の基準値、サイトカイン誘導プロフィールまたは医薬品規格とを比較するステップである、ステップ（ｄ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
酢酸グラチラマーの市販医薬品の基準値、サイトカイン誘導プロフィールまたは医薬品規格特性が、効力、特異性、安定性、活性、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される特性に相当する値である、請求項２または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｄ）が、印刷またはコンピュータ可読媒体で値を記録するステップを含む、請求項２または請求項４に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの骨髄性細胞が、骨髄性細胞系および初代骨髄性細胞からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項８】
ＩＦＮ−γによって誘導される１つ以上のタンパク質が、γ−インターフェロン−誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、インターフェロン−誘導性Ｔ細胞α−化学誘引物質（Ｉ−ＴＡＣ）、およびγ−インターフェロンによって誘導されるモノカイン（ＭＩＧ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
コポリマー１の濃度が、０．０５μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、または０．５μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）のＩＦＮ−γ濃度が、(ｉ）ＩＦＮ−γ不在下で細胞をコポリマー１と接触させた場合のタンパク質発現、および(ｉｉ）コポリマー１不在下で細胞をＩＦＮ−γと接触させた場合のタンパク質発現の合計よりも大きいレベルでタンパク質発現を誘導する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
ＩＦＮ−γの濃度が、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
期間が、１時間〜４８時間、６時間〜３６時間または１２時間〜２４時間である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
コポリマー１の濃度が０．５μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであり、ＩＦＮ−γが１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬで存在し、期間が１２時間〜２４時間であり、細胞がＴＨＰ−１細胞である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）少なくとも１つの骨髄性細胞を提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの骨髄性細胞を
（ｉ）ＩＦＮ−γによって誘導されるタンパク質を細胞が発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、一定量のコポリマー１の第１のサンプルおよびＩＦＮ−γと、
（ｉｉ）ＩＦＮ−γによって誘導されるタンパク質を細胞が発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、一定量のコポリマー１の第２のサンプルおよびＩＦＮ−γと
別々に接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）（ｉ）の少なくとも１つの骨髄性細胞によって発現されるＩＦＮ−γ−誘導タンパク質を検出して、コポリマー１の第１のサンプルの活性を評価するステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）（ｉｉ）の少なくとも１つの骨髄性細胞によって発現されるＩＦＮ−γ−誘導タンパク質を検出して、コポリマー１の第２のサンプルの活性を評価するステップと、
（ｅ）コポリマー１の第１のサンプルの活性と、コポリマー１の第２のサンプルの活性とを比較するステップと
を含む、コポリマー１の少なくとも２つのサンプルを比較する方法。
【請求項１５】
コポリマー１のサンプルの少なくとも１つが参照標準である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
コポリマー１のサンプルの少なくとも１つが酢酸グラチラマーである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの骨髄性細胞が、骨髄性細胞系および初代骨髄性細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ＩＦＮ−γによって誘導される１つ以上のタンパク質が、γ−インターフェロン−誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、インターフェロン−誘導性Ｔ細胞α−化学誘引物質（Ｉ−ＴＡＣ）、およびγ−インターフェロンによって誘導されるモノカイン（ＭＩＧ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
コポリマー１の第１のサンプルの濃度およびコポリマー１の第２のサンプルの濃度が０．０５μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
コポリマー１の濃度が０．１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
コポリマー１の濃度が０．５μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＩＦＮ−γの濃度が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
ＩＦＮ−γの濃度が１ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
コポリマー１の濃度が約１０ｎｇ／ｍＬである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
期間が１時間〜４８時間、６時間〜３６時間、１２時間〜２４時間である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
コポリマー１の第１のサンプルの活性が、コポリマー１の第２のサンプルの活性の８０％〜１２０％の範囲内である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）酢酸グラチラマーのバッチを提供するステップと、
（ｂ）請求項１または請求項２のいずれか一項に従ってバッチの特性を評価するステップと、
（ｃ）サイトカインによって調節される１つ以上のタンパク質のレベルが、酢酸グラチラマーの基準値に一致する場合、バッチが医薬用途のために許容可能であることを判定するステップと
を含む、酢酸グラチラマーの医薬組成物を調製する方法。
【請求項２８】
基準値が、酢酸グラチラマーの市販医薬品の効力、特異性、安定性、および／または生物学的活性に関する、サイトカイン誘導プロフィール、等価性範囲または医薬品規格である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）骨髄性細胞を提供するステップと、
（ｂ）細胞がＩＦＮγ−誘導タンパク質を発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、細胞と、（ｉ）一定量のコポリマー１および（ｉｉ）ＩＦＮ−γとを接触させるステップと、
（ｃ）ＩＦＮ−γ−誘導タンパク質の存在、レベル、生成、分泌、誘導と、酢酸グラチラマーの基準値とを比較するステップと
を含む、コポリマー１調製品の活性、効力、特異性または安定性を評価する方法。
【請求項３０】
基準値が、酢酸グラチラマーの市販医薬品の活性、効力、特異性または安定性に関するサイトカイン誘導プロフィール、等価性範囲または医薬品規格である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
比較するステップが、１つ以上の誘導タンパク質の測定された発現、分泌、誘導、存在またはレベルと、酢酸グラチラマーの市販医薬品の基準値、サイトカイン誘導プロフィールまたは医薬品規格との差が、所定の範囲内であるかどうかを判定するステップを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
差が所定の範囲内であれば、コポリマーを分類し、選択し、承認し、廃棄し、リリースし、または保留するステップと、コポリマーを製剤に加工し、コポリマーを含む製品を発送し、コポリマーを新しい場所に移動させるステップ、またはコポリマーを商業目的のために配合し、ラベルし、包装し、販売し、売りに出し、またはリリースするステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、ベンジル保護Ｌ−グルタミン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）保護Ｌ−リジン、およびＬ−チロシンを重合して、保護されるコポリマーを生成するステップと、保護されるコポリマーを処理して、保護されるコポリマーを部分的に解重合し、ベンジル保護基を脱保護し、ＴＦＡ保護リジンを脱保護して、酢酸グラチラマーを生成するステップと、酢酸グラチラマーを単離するステップとを含み、
ＩＦＮ−γおよび単離された酢酸グラチラマーのサンプル存在下で、骨髄性細胞または初代骨髄性細胞系中のサイトカイン誘導タンパク質の発現を測定すること、および発現と基準値とを比較することを含む、
酢酸グラチラマーを含む医薬組成物を調製する方法。
【請求項３４】
測定される発現と基準値との差が所定の範囲内であれば、医薬組成物の調製で使用するための精製酢酸グラチラマーを選択するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
選択された精製酢酸グラチラマーの少なくとも一部を含む医薬組成物を調製するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
ここで開示される主題によって全部または一部が対処される、上述の開示される主題の特定の態様、その他の態様は、下で最も良く説明されている添付の実施例および図との関連で、説明の進行と共に明らかになるであろう。
[請求項101]
(a)サイトカインによって誘導されるタンパク質を発現できる少なくとも1つの細胞を提供するステップと、
(b)サイトカインによって誘導される1つ以上のタンパク質を細胞が発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、少なくとも1つの細胞と、一定量のアミノ酸コポリマーおよびサイトカインとを接触させるステップと、
(c)誘導タンパク質を検出して、アミノ酸コポリマーの特性を評価するステップと
を含む、アミノ酸コポリマーの特性を評価する方法。
[請求項102]
(a)サイトカインによって誘導されるタンパク質を発現できる少なくとも1つの細胞を提供するステップと、
(b)誘導タンパク質を細胞が発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、少なくとも1つの細胞と、一定量のアミノ酸コポリマーおよびサイトカインとを接触させるステップと、
(c)誘導タンパク質の発現、分泌、誘導、存在またはレベルを測定するステップと、
(d)誘導タンパク質の、測定された発現、分泌、誘導、存在またはレベルと、酢酸グラチラマーの市販医薬品の基準値、サイトカイン誘導プロフィールまたは医薬品規格とを比較して、アミノ酸コポリマーの特性を評価するステップと
を含む、アミノ酸コポリマーを評価する方法。
[請求項103]
サイトカインが炎症性サイトカインである、請求項101または請求項102に記載の方法。
[請求項104]
サイトカインが、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)、インターフェロンγ(IFNγ)、インターロイキン-1ベータ(IL-1β)、インターロイキン-6(IL-6)、およびインターロイキン-8(IL-8)からなる群から選択される、請求項103に記載の方法。
[請求項105]
サイトカインがIFNγである、請求項104に記載の方法。
[請求項106]
1つ以上のIFNγ調節性タンパク質がIFNγ調節性ケモカインである、請求項105に記載の方法。
[請求項107]
コポリマーが、アミノ酸であるアラニン、リジン、グルタミン酸、およびチロシンを含むコポリマーである、請求項101または請求項102に記載の方法。
[請求項108]
コポリマーが酢酸グラチラマーである、請求項101または請求項102に記載の方法。
[請求項109]
誘導タンパク質の生成、分泌、誘導、存在またはレベルの値と、酢酸グラチラマーの市販医薬品の基準値、サイトカイン誘導プロフィールまたは医薬品規格とを比較するステップである、ステップ(d)をさらに含む、請求項101に記載の方法。
[請求項110]
酢酸グラチラマーの市販医薬品の基準値、サイトカイン誘導プロフィールまたは医薬品規格特性が、効力、特異性、安定性、活性、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される特性に相当する値である、請求項102または請求項109に記載の方法。
[請求項111]
ステップ(d)が、印刷またはコンピュータ可読媒体で値を記録するステップを含む、請求項102または請求項109に記載の方法。
[請求項112]
少なくとも1つの細胞が、骨髄性細胞系および初代骨髄性細胞からなる群から選択される、請求項101または請求項102に記載の方法。
[請求項113]
少なくとも1つの細胞がヒト骨髄性白血病細胞系である、請求項112に記載の方法。
[請求項114]
ヒト骨髄性白血病細胞系が、ヒト急性単球性白血病細胞系(THP-1)、ヒト白血病性単球リンパ腫細胞系(U937)、およびヒト前骨髄球性白血病細胞系(HL-60)からなる群から選択される、請求項113に記載の方法。
[請求項115]
少なくとも1つの細胞がヒト末梢血単核細胞(PBMC)および単球由来樹状細胞からなる群から選択される初代細胞である、請求項112に記載の方法。
[請求項116]
少なくとも1つの細胞が、自己免疫性、炎症性、神経変性性、または脱髄性の、疾患、障害または機能不全を有する対象に由来する、請求項101または請求項102に記載の方法。
[請求項117]
疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、および炎症性腸疾患からなる群から選択される、請求項116に記載の方法。
[請求項118]
1つ以上の細胞が、無血清アッセイ培地に懸濁される、請求項101または請求項102に記載の方法。
[請求項119]
前記サイトカインによって調節される1つ以上のタンパク質が、γ-インターフェロン-誘導性タンパク質10(IP-10)、インターフェロン-誘導性T細胞α-化学誘引物質(I-TAC)、およびγ-インターフェロンによって誘導されるモノカイン(MIG)からなる群から選択される、請求項101に記載の方法。
[請求項120]
アミノ酸コポリマーの濃度が0.05μg/mL〜1mg/mLである、請求項101または請求項102に記載の方法。
[請求項121]
アミノ酸コポリマーの濃度が0.1μg/mL〜500μg/mLである、請求項120に記載の方法。
[請求項122]
アミノ酸コポリマーの濃度が0.5μg/mL〜100μg/mLである、請求項121に記載の方法。
[請求項123]
ステップ(b)のサイトカイン濃度が、(i)サイトカイン不在下で細胞をアミノ酸コポリマーと接触させた場合のタンパク質発現、および(ii)アミノ酸コポリマー不在下で細胞をサイトカインと接触させた場合のタンパク質発現の合計よりも大きいレベルでタンパク質発現を誘導する、請求項101または請求項102に記載の方法。
[請求項124]
サイトカインの濃度が0.01ng/mL〜100ng/mLである、請求項123に記載の方法。
[請求項125]
サイトカインの濃度が1ng/mL〜50ng/mLである、請求項124に記載の方法。
[請求項126]
サイトカインの前記濃度が約10ng/mLである、請求項125に記載の方法。
[請求項127]
期間が1時間〜48時間である、請求項101または請求項102に記載の方法。
[請求項128]
期間が6時間〜36時間である、請求項127に記載の方法。
[請求項129]
期間が12時間〜24時間である、請求項127に記載の方法。
[請求項130]
アミノ酸コポリマーの濃度が0.5μg/mL〜100μg/mLであり、サイトカインが1ng/mL〜50ng/mLで存在し、期間が12時間〜24時間であり、細胞がTHP-1細胞であり、コポリマーが酢酸グラチラマーであり、サイトカインがIFNγである、請求項101または請求項102に記載の方法。
[請求項131]
ステップ(c)における検出が抗体ベースの方法を含む、請求項101または請求項102に記載の方法。
[請求項132]
抗体ベースの方法が免疫沈降法を含む、請求項131に記載の方法。
[請求項133]
前記抗体ベースの方法が酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を含む、請求項131に記載の方法。
[請求項134]
(a)サイトカインによって誘導されるタンパク質を発現できる型の少なくとも1つの細胞を提供するステップと、
(b)前記細胞型の少なくとも1つの細胞を
(i)サイトカインによって誘導されるタンパク質を細胞が発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、一定量のアミノ酸コポリマーの第1のサンプルと、
(ii)サイトカインによって誘導されるタンパク質を細胞が発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、一定量のアミノ酸コポリマーの第2のサンプルと
別々に接触させるステップと、
(c)ステップ(b)(i)の少なくとも1つの細胞によって発現されるサイトカイン誘導タンパク質を検出して、アミノ酸コポリマーの第1のサンプルの特性を評価するステップと、
(d)ステップ(b)(ii)の少なくとも1つの細胞によって発現されるサイトカイン誘導タンパク質を検出して、アミノ酸コポリマーの第2のサンプルの特性を評価するステップと、
(e)アミノ酸コポリマーの第1のサンプルの特性と、アミノ酸コポリマーの第2のサンプルの特性とを比較して、第1および第2のサンプル間の類似性を判定するステップと
を含む、アミノ酸コポリマーの少なくとも2つのサンプルを比較する方法。
[請求項135]
アミノ酸コポリマーサンプルの少なくとも1つが参照標準である、請求項134に記載の方法。
[請求項136]
アミノ酸コポリマーサンプルの少なくとも1つが酢酸グラチラマーである、請求項134に記載の方法。
[請求項137]
少なくとも1つの細胞が、骨髄性細胞系および初代骨髄性細胞からなる群から選択される、請求項134に記載の方法。
[請求項138]
骨髄性細胞系がヒト骨髄性白血病細胞系を含む、請求項137に記載の方法。
[請求項139]
ヒト骨髄性白血病細胞系がヒト急性単球性白血病細胞系(THP-1)、ヒト白血病性単球リンパ腫細胞系(U937)、およびヒト前骨髄球性白血病細胞系(HL-60)からなる群から選択される、請求項137に記載の方法。
[請求項140]
初代骨髄性細胞がヒト末梢血単核細胞(PBMC)および単球由来樹状細胞からなる群から選択される、請求項137に記載の方法。
[請求項141]
少なくとも1つの細胞が、自己免疫性、炎症性、神経変性性または脱髄性の疾患を有する対象に由来する、請求項134に記載の方法。
[請求項142]
疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、および炎症性腸疾患からなる群から選択される、請求項141に記載の方法。
[請求項143]
1つ以上の細胞がアッセイ培地に懸濁される、請求項134に記載の方法。
[請求項144]
アッセイ培地が無血清アッセイ培地である、請求項142に記載の方法。
[請求項145]
前記サイトカインによって調節される1つ以上のタンパク質が、γ-インターフェロン-誘導性タンパク質10(IP-10)、インターフェロン-誘導性T細胞α-化学誘引物質(I-TAC)、およびγ-インターフェロンによって誘導されるモノカイン(MIG)からなる群から選択される、請求項135に記載の方法。
[請求項146]
アミノ酸コポリマーの第1のサンプルおよびアミノ酸コポリマーの第2のサンプルの濃度が0.05μg/mL〜1mg/mLである、請求項135に記載の方法。
[請求項147]
アミノ酸コポリマーの濃度が0.1μg/mL〜500μg/mLである、請求項146に記載の方法。
[請求項148]
アミノ酸コポリマーの濃度が0.5μg/mL〜100μg/mLである、請求項147に記載の方法。
[請求項149]
前記サイトカインが炎症性サイトカインである、請求項135に記載の方法。
[請求項150]
サイトカインが、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)、インターフェロンγ(IFNγ)、インターロイキン-1ベータ(IL-1β)、インターロイキン-6(IL-6)、およびインターロイキン-8(IL-8)からなる群から選択される、請求項149に記載の方法。
[請求項151]
サイトカインがインターフェロンγである、請求項150に記載の方法。
[請求項152]
サイトカインの濃度が0.01ng/mL〜100ng/mLである、請求項134に記載の方法。
[請求項153]
サイトカインの濃度が1ng/mL〜50ng/mLである、請求項152に記載の方法。
[請求項154]
サイトカインの前記濃度が約10ng/mLである、請求項153に記載の方法。
[請求項155]
期間が1時間〜48時間である、請求項134に記載の方法。
[請求項156]
期間が6時間〜36時間である、請求項155に記載の方法。
[請求項157]
期間が12時間〜24時間である、請求項156に記載の方法。
[請求項158]
ステップ(d)の前記検出するステップが抗体ベースの方法を含む、請求項134に記載の方法。
[請求項159]
抗体ベースの方法が免疫沈降法を含む、請求項158に記載の方法。
[請求項160]
前記免疫学的方法が酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を含む、請求項158に記載の方法。
[請求項161]
アミノ酸コポリマーの第1のサンプルおよびアミノ酸コポリマーの第2のサンプルの少なくとも1つが、自己免疫性、脱髄性、神経変性性または炎症性の疾患の治療を必要とする対象において、それを治療する既知の有効性を有する、請求項134に記載の方法。
[請求項162]
疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、および炎症性腸疾患からなる群から選択される、請求項161に記載の方法。
[請求項163]
アミノ酸コポリマーの第1のサンプルの特性が、アミノ酸コポリマーの第2のサンプルの特性の80%〜120%の範囲内である、請求項134に記載の方法。
[請求項164]
(a)酢酸グラチラマーのバッチを提供するステップと、
(b)請求項101〜131のいずれか一項に従ってバッチの特性を評価するステップと、
(c)サイトカインによって調節される1つ以上のタンパク質のレベルが、酢酸グラチラマーの基準値に一致する場合、バッチが医薬用途のために許容可能であることを判定するステップと
を含む、酢酸グラチラマーの医薬組成物を調製する方法。
[請求項165]
基準値が、酢酸グラチラマーの市販医薬品の効力、特異性、安定性、および/または生物学的活性に関する、サイトカイン誘導プロフィール、等価性範囲または医薬品規格である、請求項164に記載の方法。
[請求項166]
(a)骨髄性細胞を提供するステップと、
(b)細胞がIFNγ-誘導タンパク質を発現するのを誘導させるのに十分な濃度と期間で、細胞と、(i)一定量のアミノ酸コポリマー、および(ii)IFNγとを接触させるステップと、
(c)IFNγ-誘導タンパク質の存在、レベル、生成、分泌、誘導と、酢酸グラチラマーの基準値とを比較するステップと
を含む、アミノ酸コポリマー調製品の活性、効力、特異性または安定性を評価する方法。
[請求項167]
基準値が、酢酸グラチラマーの市販医薬品の活性、効力、特異性または安定性に関するサイトカイン誘導プロフィール、等価性範囲または医薬品規格である、請求項166に記載の方法。
[請求項168]
比較するステップが、1つ以上の誘導タンパク質の測定された発現、分泌、誘導、存在またはレベルと、酢酸グラチラマーの市販医薬品の基準値、サイトカイン誘導プロフィールまたは医薬品規格との差が、所定の範囲内であるかどうかを判定するステップを含む、請求項102または請求項108に記載の方法。
[請求項169]
差が所定の範囲内であれば、コポリマーを分類し、選択し、承認し、廃棄し、リリースし、または保留するステップと、コポリマーを製剤に加工し、コポリマーを含む製品を発送し、コポリマーを新しい場所に移動させるステップ、またはコポリマーを商業目的のために配合し、ラベルし、包装し、販売し、売りに出し、またはリリースするステップをさらに含む、請求項167に記載の方法。
[請求項170]
L-アラニンのN-カルボキシ無水物、ベンジル保護L-グルタミン酸、トリフルオロ酢酸(TFA)保護L-リジン、およびL-チロシンを重合して、保護されるコポリマーを生成するステップと、保護されるコポリマーを処理して、保護されるコポリマーを部分的に解重合し、ベンジル保護基を脱保護し、TFA保護リジンを脱保護して、酢酸グラチラマーを生成するステップと、酢酸グラチラマーを単離するステップとを含み、
サイトカインおよび単離された酢酸グラチラマーのサンプル存在下で、骨髄性細胞または初代骨髄性細胞系中のサイトカイン誘導タンパク質の発現を測定すること、および発現と基準値とを比較することを含む、酢酸グラチラマーを含む医薬組成物を調製する方法。
[請求項171]
サイトカインがIFNγである、請求項169に記載の方法。
[請求項172]
測定される発現と基準値との差が所定の範囲内であれば、医薬組成物の調製で使用するための精製酢酸グラチラマーを選択するステップをさらに含む、請求項169に記載の方法。
[請求項173]
選択された精製酢酸グラチラマーの少なくとも一部を含む医薬組成物を調製するステップをさらに含む、請求項171に記載の方法。
【国際調査報告】
2010530975.tif 000008
2010530975.tif 000009
2010530975.tif 000010
2010530975.tif 000011
2010530975.tif 000012