(57)【要約】本発明は部分的には免疫学的経路をモジュレートするための方法及び組成物を提供する。本発明は部分的には細胞への分子の送達に関する。細胞はインビトロ又はインビボであってよい。本発明の一部の実施形態は補体経路、例えば古典的、レクチン、又は代替経路をモジュレートすることに関する。本発明は部分的には、補体経路のような経路をモジュレートするために使用できる方法、核酸、ベクター、蛋白及び結合分子を提供する。これらの方法及び組成物はとりわけ、補体経路に関連する種々の状態又は疾患の試験及び／又は治療のために利用できる。
2010520224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記成分：
（ｉ）補体活性を抑制又は低減する補体因子Ｂ類縁体；
（ｉｉ）補体因子Ｂ類縁体をコードするベクター；
（ｉｉｉ）補体活性を抑制又は低減する補体因子Ｄ類縁体；または、
（ｉｖ）補体因子Ｄ類縁体をコードするベクター；
を含む医薬組成物を治療の必要な患者に投与することを含む補体媒介疾患を治療する方法。
【請求項２】
前記ベクターがレトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、肝炎ウィルスベクター、ＳＶ４０ベクター又はＥＢＶベクターである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記レンチウィルスがＨＩＶ、ＥＩＡＶ、ＳＩＶ又はＦＩＶである請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記レンチウィルスがＢＩＶである請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターがアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）ベクターである請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記補体因子Ｂ類縁体がネイティブの補体因子Ｂと比較して増大したＣ３ｂ結合親和性；及び、
（ｉ）ネイティブの補体因子Ｂと比較して減衰したプロテアーゼ活性；又は
（ｉｉ）ネイティブの補体因子Ｂと比較して減衰した因子Ｄにより切断される能力；
を含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記補体因子Ｂ類縁体がネイティブの補体因子Ｂと比較して減衰したプロテアーゼ活性を有し、そしてネイティブの補体因子Ｂと比較してＣ３ｂに対して有意に増大した親和性を有さない請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記補体因子Ｂ類縁体がＣ３ｂ結合ドメインにおける改変を含む請求項１記載の方法。
【請求項９】
Ｃ３ｂ結合ドメインにおける前記改変が下記：
（ｉ）アスパラギン酸、アスパラギン又は両方の置換又は欠失；又は、
（ｉｉ）前記アスパラギン酸又は前記アスパラギンに隣接する挿入；
を含み、
ここで前記アスパラギン酸は配列番号２のアミノ酸２７９に相当し；そして、
ここで前記アスパラギンは配列番号２のアミノ酸２８５に相当する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記アスパラギン酸、前記アスパラギン又は両方が別のアミノ酸で置換されている請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記アスパラギン酸がグリシン、アラニン又はアスパラギンで置換されている請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記アスパラギンがグリシン、アラニン又はアスパラギン酸で置換されている請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記置換が前記アスパラギン酸をグリシンで、そして前記アスパラギンをアスパラギン酸で置き換えることを含む請求項９記載の方法。
【請求項１４】
前記補体因子Ｂ類縁体が因子Ｄ切断部位における改変を含む請求項６記載の方法。
【請求項１５】
因子Ｄ切断部位における前記改変が下記：
（ｉ）リジン少なくとも１つ又はアルギニン少なくとも１つの置換又は欠失；又は；
（ｉｉ）前記リジン少なくとも１つ又は前記アルギニン少なくとも１つに隣接する挿入；
を含み、
ここで前記リジン少なくとも１つは配列番号２のアミノ酸２５８又は２６０に相当し；そして、
ここで前記アスパラギン少なくとも１つは配列番号２のアミノ酸２５９に相当する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記改変がリジン少なくとも１つ、アルギニン少なくとも１つ又は両方の置換を含む請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記置換が前記リジン少なくとも１つをアラニンで、そして前記アルギニン少なくとも１つをアラニンで置き換えることを含む請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
配列番号２のアミノ酸２５８〜２６０に相当する前記アミノ酸が各々アラニンで置き換えられている請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
補体因子Ｂ類縁体が下記：
（ｉ）配列番号４又は配列番号４のアミノ酸２６〜７６４；
（ｉｉ）配列番号６又は配列番号６のアミノ酸２６〜７６４；又は、
（ｉｉｉ）配列番号８又は配列番号８のアミノ酸２６〜７６４；
を含む請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記補体因子Ｄ類縁体がネイティブの補体因子Ｄと比較して低減された因子Ｂを切断する能力を含む請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記補体因子Ｄ類縁体がネイティブの補体因子Ｄのセリンプロテアーゼ触媒ドメインにおいて改変を含む請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ネイティブの補体因子Ｄのセリンプロテアーゼ触媒ドメインにおける前記改変が下記：
（ｉ）配列番号２７のＨｉｓ６６、Ａｓｐ１１４、又はＳｅｒ２０８に相当するアミノ酸の置換又は欠失；又は、
（ｉｉ）配列番号２７のＨｉｓ６６、Ａｓｐ１１４、又はＳｅｒ２０８に相当するアミノ酸に隣接するアミノ酸少なくとも１つの挿入；
を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
（ｉ）Ｈｉｓ６６に相当するアミノ酸が中性、負荷電又は非極性であるアミノ酸少なくとも１つで置換されているか；
（ｉｉ）Ａｓｐ１１４に相当するアミノ酸が中性、正荷電又は非極性であるアミノ酸少なくとも１つで置換されているか；又は、
（ｉｉｉ）Ｓｅｒ２０８に相当するアミノ酸が荷電されているか非極性であるアミノ酸少なくとも１つで置換されている；
請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記補体因子Ｄ類縁体がネイティブの補体因子Ｄと比較してＮ末端において追加的アミノ酸１つ以上を含む請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
追加的アミノ酸１つ以上がグリシン及びアルギニンを含む請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
補体媒介疾患が眼の疾患である請求項１記載の方法。
【請求項２７】
医薬組成物が眼に送達される請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
医薬組成物が硝子体内注射、網膜下注射、前眼房内への注射、角膜への注射又は局所適用、結膜下注射、テノン下注射、又は点眼により送達される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
疾患が黄斑変性、加齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）、地図状委縮、湿性ＡＭＤ、心筋梗塞、乾性ＡＭＤ、結晶腔形成、卒中、虚血再灌流傷害、糖尿病性網膜症、硝子体網膜症、外傷性臓器傷害、角膜炎症、ブドウ膜炎、高眼圧症又は緑内障である請求項１記載の方法。
【請求項３０】
医薬組成物の投与の前、同時、又は後に補体抑制因子又は抗血管形成因子を患者に投与することを更に含む請求項１記載の方法。
【請求項３１】
前記補体抑制因子が因子Ｈ、因子Ｈ様１、ＭＣＰ、ＤＡＦ、又はMＣＰの可溶性形態よりなる群から選択される請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
医薬組成物の投与の前、同時、又は後に抗炎症剤を投与する請求項１記載の方法。
【請求項３３】
前記抗炎症剤が、下記：
（ｉ）医薬組成物と同時に投与されるか、又は、
（ｉｉ）医薬組成物が抗炎症剤を含む、
請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記抗炎症剤を眼に投与する請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記抗炎症剤がデキサメタゾン、デキサメタゾンナトリウムメタスルホベンゾエート、デキサメタゾンナトリウムホスフェート、フルオロメトロン、ブロムフェナク、プラノプロフェン、ＲＥＳＴＡＳＩＳＴＭ、シクロスポリン眼科用乳液、ナプロキセン、糖質コルチコイド、ケトロラック、イブプロフェン、トルメチン、非ステロイド抗炎症剤、ステロイド抗炎症剤、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、インドメタシン、及びスプロフェンよりなる群から選択される請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
前記ベクターがウィルスベクターであり、そして該ウィルスベクターが崩壊加速因子を含む請求項１記載の方法。
【請求項３７】
補体因子Ｂ類縁体をコードするウィルスベクターであって、ここで該補体因子Ｂ類縁体は補体活性を抑制又は低減する、ベクター。
【請求項３８】
前記補体因子Ｂ類縁体がネイティブの補体因子Ｂと比較して増大したＣ３ｂ結合親和性；及び
（ｉ）ネイティブの補体因子Ｂと比較して減衰したプロテアーゼ活性；または
（ｉｉ）ネイティブの補体因子Ｂと比較して減衰した因子Ｄにより切断される能力；
を含む、請求項３５記載のウィルスベクター。
【請求項３９】
請求項３８のウィルスベクターを生産する細胞。
【請求項４０】
補体因子Ｄ類縁体をコードするウィルスベクターであって、ここで該補体因子Ｄ類縁体は補体活性を抑制又は低減する、ベクター。
【請求項４１】
請求項４０のウィルスベクターを生産する細胞。
【請求項４２】
減衰したプロテアーゼ活性及び改変されたＣ３ｂ結合親和性を含む補体因子Ｂ類縁体を含む医薬組成物。
【請求項４３】
ネイティブの補体因子Ｄと比較して低減した補体因子Ｂを切断する能力を含む補体因子Ｄ類縁体。
【請求項４４】
補体因子Ｂ類縁体及び／又は補体因子Ｄ類縁体を含む組成物であって、ここで該因子Ｂ類縁体又は該因子Ｄ類縁体は少なくとも９５％〜９９％純粋である組成物。
【請求項４５】
請求項４３の補体因子Ｄ類縁体を含む医薬組成物。
【請求項４６】
ヒスチジン、ＭｇＣｌ２、トレハロース、ポリソルベート、ポリソルベート２０及びＮａＣｌよりなる群から選択される成分少なくとも１つを含む、請求項４２又は４５記載の医薬組成物。
【請求項４７】
下記成分：
（ｉ）補体活性を抑制又は低減する補体因子Ｂ類縁体；
（ｉｉ）補体因子Ｂ類縁体をコードするベクター；
（ｉｉｉ）補体活性を抑制又は低減する補体因子Ｄ類縁体；または、
（ｉｖ）補体因子Ｄ類縁体をコードするベクター；
を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願
本願は、２００７年３月１に出願された米国仮特許出願第６０／８９２，３９５号および２００７年１１月２日に出願された同第６０／９８５，０２４号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／８９２，３９５号および同第６０／９８５，０２４号は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
補体系は自然及び適応免疫系の重要な成分である（Ｖｏｌａｎａｋｉｓ，１９９８により考察されている）。補体は微生物の殺傷において重要な役割を果たしており、そして免疫複合体の輸送及びクリアランスのために必須である。補体系の活性化産物の多くはやはりプロ炎症性又は免疫調節の機能に関連している。補体系は血漿及び３つの酵素活性化カスケート、即ち古典的、レクチン、及び代替経路において組織化されている膜関連蛋白よりなる。全３経路とも、末端補体複合体（ＴＣＣ）及び生物学的に活性な産物のアレイの形成をもたらすことができる。
【０００３】
一部の場合においては、補体活性化は、種々の病原体及び外来性分子を認識して結合する特定の抗体によるか、及び／又は、外来性物質との補体蛋白の直接の相互作用によるかの何れかで、開始される。活性化されれば、これらの経路は不安定なプロテアーゼ複合体、Ｃ３−コンバターゼの形成をもたらす。古典的な経路のＣ３−コンバターゼであるＣ４ｂ２ａ、及び代替経路Ｃ３−コンバターゼであるＣ３ｂＢｂは両方ともＣ３のα鎖を切断してＣ３ｂを形成することができる。Ｃ３ｂは生物学的表面に共有結合する潜在能力を有する。Ｃ３ｂ結合は多形核細胞及びマクロファージによる貪食作用のためのオプソニン作用をもたらす。追加的Ｃ３ｂが使用できる場合、Ｃ３コンバターゼはＣ５−コンバターゼとして機能することができ、Ｃ５を切断してＴＣＣ又は膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の組み立てを開始し、これがターゲティングされた細胞膜内への細孔形成蛋白複合体の挿入により細胞溶解を媒介する。
【０００４】
補体系の厳密な機能は、補体カスケードの活性化が炎症に寄与する多くの蛋白の生産をもたらすため、堅固な調節に依存している。これは宿主の防御に寄与する場合は有益であるが、自己組織上で活性化されれば有害となる場合がある。典型的には、血液中のＣ３の活性化は低いレベルで維持され、そしてＣ３ｂの付着は病原体表面に限定される。
【０００５】
補体系を調節するためには、多くの補体調節蛋白が機能することにより補体の活性化を制限している。これらの蛋白はＣ３又はＣ４の誘導体と相互作用し、そしてヒト染色体ｌｑ３２上の補体活性化レギュレーター（ＲＣＡ）の遺伝子クラスターを含む緊密に関連した遺伝子によりコードされる（Ｄｉａｚ−Ｇｕｉｌｌｅｎ等、１９９９）。
【０００６】
補体因子Ｈ（ＣＦＨ又はｆＨ）、即ちＲＣＡ遺伝子の１つによりコードされている血漿蛋白は、代替補体経路の可溶性活性化抑制剤である（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ等、１９８０；Ｚｉｐｆｅｌ等、２００２；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｄｅ  Ｃｏｒｄｏｂａ等、２００４）。ＣＦＨはＣ３ｂへの因子Ｂの結合を防止し、Ｃ３ｂＢｂ複合体の解離に関する崩壊加速活性を示し、第Ｉ因子によるＣ３ｂの切断のためのコファクターとして機能し、そして、膜攻撃複合体（ＭＡＣ）としても知られているＣ５ｂ６−９の形成をブロックする（Ｗｈａｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｙ，１９７６；Ｗｅｉｌｅｒ等、１９７６；Ｐａｎｇｂｕｒｎ等、１９７７）。ＣＦＨはＣ３ｂ、ヘパリン、細菌表面蛋白、急性期蛋白、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、アドレノメジュリン及び細胞表面受容体を包含する多数のリガンドと結合し、相互作用する（Ｚｉｐｆｅｌ等、２００２）。
【０００７】
ヒトＣＦＨは７つの構造的及び免疫学的に関連する多ドメイン多機能性血清蛋白よりなる蛋白ファミリーの一員である。これらにはＣＦＨ及び因子Ｈ様蛋白１（ＦＨＬ−１）及び５つの因子Ｈ関連蛋白（ＦＨＲ−１〜ＦＨＲ−５）が包含される。これらの蛋白の各々は各々別個のエクソンによりコードされる短鎖コンセンサスリピート（ＳＣＲ）又は補体制御モジュールのみからなる。１５０ｋＤａのＣＦＨは２０ＳＣＲよりなる。４３ｋＤａであり７つのＳＣＲドメインよりなるＦＨＬ−１はオルタナティブスプライシングによりＣＦＨから誘導される（Ｅｓｔａｌｌｅｒ等、１９９１；Ｓｉｍ等、１９９３）。ＦＨＬ−１は、ＣＦＨと同様、補体調節物質として機能し、そしてコファクター及び崩壊加速活性を提示する（Ｚｉｐｆｅｌ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｋａ，１９９９）。更に又、ＦＨＬ−１は例えばＳＣＲ４における露出したＲＧＤドメインの存在のために接着蛋白として機能することを含む独特の機能を有する（Ｈｅｌｌｗａｇｅ等、１９９７）。ＣＦＨは５００μｇ／ｍｌでヒト血漿中に存在する。これとは対照的に、ＦＨＬ−１の血漿中濃度は１０〜５０μｇ／ｍｌである。５つのＦＨＲ蛋白は各々ＲＣＡ遺伝子クラスター中の別個の遺伝子から誘導される。このファミリーのメンバーはＳＣＲ数において異なっているが、個々のＳＣＲドメインは相互に高度な相同性を呈している。
【０００８】
ＣＦＨ及び関連の蛋白から多数の個々に折り畳まれた蛋白ドメインへの組織化は、構造的／機能的関連性を示唆している。ＣＦＨ及びＦＨＬ−１の補体調節ドメインは４つのアミノ末端ＳＣＲ内に位置している。３つのＣ３−結合ドメインはＣＦＨに位置している。Ｎ末端ドメイン（ＳＣＲ１〜４）は未損傷のＣ３ｂに結合し（Ｇｏｒｄｏｎ等、１９９５；Ｋｕｈｎ等、１９９５；１９９６）、中央のドメイン（ＳＣＲ１２−１４）はＣ３ｃフラグメントに結合し、そしてＣ末端ドメイン（ＳＣＲ  １９−２０）はＣ３ｄに結合する（Ｊｏｋｉｒａｎｔａ等、２０００）。Ｃ末端ドメイン（ＳＣＲ  １９−２０）も又、Ｃ５ｂ６−９  ＴＣＣの溶解機能をブロックする（Ｚｉｐｆｅｌ等、２００２）。この機能はＦＨＬ−１には存在しない。ＣＦＨ及びＦＨＬ−１はＳＣＲ７に位置するヘパリン、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）及びＭ蛋白に対する重複結合部位を含有する（Ｇｉａｎｎａｋｉｓ等、２００３）。
【０００９】
ファミリーにおける蛋白は主に肝臓において合成されるが、ＣＦＨは広範な種類の細胞型、例えば末梢血リンパ球、筋芽細胞、線維芽細胞、ニューロン、及び神経膠細胞において発現されることが明らかにされている（Ｆｒｉｅｓｅ等、１９９９）。より最近では、ＣＦＨ配列はヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞及び脈絡膜から誘導された発現配列タグライブラリにおいて発見されており（Ｗｉｓｔｏｗ等、２００２）、そして免疫組織化学的染色によれば脈絡膜血管及びＲＰＥとの境界をなしている領域においてＣＦＨが発見されている（Ｋｌｅｉｎ等、２００５）。
【００１０】
ＣＦＨ多形は加齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）の上昇した危険性と関連付けられている（Ｅｄｗａｒｄｓ等、２００５；Ｋｌｅｉｎ等、２００５；Ｈａｉｎｅｓ等、２００５）。この多形、即ちアミノ酸４０２におけるチロシンからヒスチジンへの変化（ｔｙｒ４０２ｈｉｓ又はＹ４０２Ｈ）はＡＭＤの起因となる危険の約５０％に相当する。最近の学術文献において発見されているＹ→Ｈの多形はＳＣＲ７に位置している（Ｅｄｗａｒｄｓ等、２００５；Ｋｌｅｉｎ等、２００５；Ｈａｉｎｅｓ等、２００５）。    
【００１１】
ＣＲＰは古典的な補体経路を活性化することが知られており、そしてＣＦＨの直接の結合を介してＣ５ｂ６−９の付着を抑制する（Ｍｏｌｄ等、１９９９）。ヘパリン及び／又はＣＲＰへのＣＦＨ結合は正荷電のヒスチジンによる中性のチロシンの置き換えにより潜在的に改変される（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｄｅ  Ｃｏｒｄｏｂａ等、２００４）。ＣＲＰの上昇した血清中レベルは臨床試験においてコントロールと比較した場合にＡＭＤ患者において観察されている（Ｓｅｄｄｏｎ等、２００４）。更に又、亜鉛を栄養補給するとＡＭＤの進行が緩徐化し、そして生化学的試験によればＣＦＨの機能は亜鉛濃度に対して感受性であることがわかった（ＡＲＥＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ，２００１；Ｂｌｏｍ等、２００３）。従って、ｔｙｒ４０２ｈｉｓ置換により誘発された網膜表面上のＣＲＰ又はヘパリンへのＣＦＨの改変された結合は外側の網膜における炎症のレベルに影響すると考えられる（Ｅｄｗａｒｄｓ等、２００５；Ｋｌｅｉｎ等、２００５；Ｈａｉｎｅｓ等、２００５）。
【００１２】
ＣＦＨ不全はヒト及び動物の両方において報告されている。それらはＣＦＨ機能を損なうトランケーション又はアミノ酸置換をもたらす突然変異により誘発される（Ａｕｌｔ等、１９９７；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｏｒｒａｌ等、２００２；Ｈｅｇａｓｙ等、２００３）。血漿中にＣＦＨが存在しないことはＣ３及び他の末端補体成分の消費による代替補体経路の制御不能な活性化をもたらす（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒｂｏｒｎ，１９８１；Ａｕｌｔ等、１９９７）。ヒトにおける機能不全ＣＦＨ分子は２つの異なる腎臓病、膜増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）及び非定型の溶血性尿毒症症候群に関連付けられている（Ｗｙａｔｔ等、１９８２；Ａｕｌｔ，２０００；Ｚｉｐｆｅｌ，２００１）。ＡＭＤにおいて観察されたものと同じ組成の結晶腔がＭＰＧＮＩＩ型の患者の眼において観察されている。この結晶腔は通常はＡＭＤよりもかなり早期の腎臓病の出現時において成人期の早期に出現する（Ｍｕｌｌｉｎｓ等、２００１；Ｃｏｌｖｉｌｌｅ等、２００３）。更に又、ＣＦＨ不全を有する動物はＭＰＧＮの特徴を有する腎臓病を発症する（Ｈｏｇａｓｅｎ等、１９９５；Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ等、２００２）。ブタにおいては、ＣＦＨ不全は、腎不全をもたらすヒトＭＰＧＮＩＩ型と同様、進行性の糸球体腎炎をもたらす（Ｈｏｇａｓｅｎ等、１９９５）。同様に、ＣＦＨノックアウトマウスはやはりヒトＭＰＧＮＩＩ型に類似している糸球体腎炎を自発的に発症する（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ等、２００２）。補体及び免疫グロブリンの付着よりなる結晶腔がＡＭＤの潜在的モデルであるＣｃｌ−２−欠損（ケモカインリガンド２）又はＣｃｒ−２−欠損（Ｃｃｌ−２受容体）マウスにおいて検出されており、げっ歯類が結晶腔を発症する場合があることを示している（Ａｍｂａｔｉ等、２００３）。
【００１３】
補体の活性化はアテローム性動脈硬化症及びアルツハイマー病を包含する数種の多様なヒトの疾患において関与を示唆されている。結晶腔の大量成分であるビトロネクチンもまたアテローム性動脈硬化症（Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ等、１９８９）、アミロイドーシス（Ｄａｈｌｂａｃｋ等、１９９３）、弾力線維症（Ｄａｈｌｂａｃｋ等、１９８８）、及びＭＰＧＮＩＩ型（Ｊａｎｓｅｎ等、１９９３）に関連する細胞外付着物の成分である。ビトロネクチンは細胞接着、止血の維持、及び補体誘導細胞溶解の抑制において機能する多機能性蛋白である（Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ，１９９１）。更に又、アテローム性動脈硬化症のプラークは結晶腔と多くの他の構成成分を共有しており、例えば補体成分及びアポリポ蛋白Ｅが挙げられる。進行ＡＭＤと頸動脈のアテローム性動脈硬化症の間の関連性が疫学的試験（Ｖｉｎｇｅｒｌｉｎｇ等、１９９５）において報告されており、そして別の試験ではＡＭＤ患者における非日光曝露皮膚炎の弾性症変性と脈絡膜血管新生との間の有意な相関が発見されている（Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｚ等、１９８６）。最後にアミロイドβペプチド、即ちアルツハイマー病におけるニューライトプラークの主要な構成成分もまた結晶腔において観察されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ等、２００２）。アミロイドβペプチドは補体の主要な活性化物質として関与を示唆されている（Ｂｒａｄｔ等、１９９８）。
【００１４】
補体系は炎症のこのような顕在化を媒介するが、多くの刺激物質が補体系の活性化をトリガーできる。例えばＴＧＦβ分子は特定の補体因子の発現を誘導するが、他の補体因子の発現は抑制する。
【００１５】
加齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）は先進国における６５歳超の人における低下した視力の最も一般的な原因である。乾式ＡＭＤは中央の視野の損失を誘発する黄斑の進行性の変性を特徴とする。６５〜７４歳の人の約２５％が何らかの程度の乾式ＡＤＭを有しており、７５〜８４歳では発生率は４０％まで上昇する（Ｈａｍｄｉ＆Ｋｅｎｎｅｙ，２００３）。合衆国においては、推定１０００万人がＡＭＤによる視力低下を有しており、そして集団の年齢が上昇するに従い、合衆国の２１００万人が危険を有している（Ｈａｍｄｉ＆Ｋｅｎｎｅｙ，２００３）。より急性の障害性のＡＭＤは湿性ＡＭＤとして知られる網膜における開花性の血管新生及び管外遊出を包含する。現在ＡＭＤに対する有効な治療法はない。
【００１６】
他の多くの慢性疾患と同様、ＡＭＤは遺伝子的及び環境による危険因子の組み合わせにより誘発される。これらの危険因子は年齢、喫煙、及び家族の病歴を包含する（ＡＲＥＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ，２０００）。遺伝性の成分は罹患した個体の有意な集団における常染色体の優性の形質として顕在化する（Ｇｏｒｉｎ等、１９９９）。
【００１７】
ＡＭＤの特徴は網膜色素上皮（ＲＰＥ）の基底層とブルーフ膜の内層の間に位置する結晶腔の蓄積である（Ｐａｕｌｅｉｋｈｏｆｆ等、１９９０；Ｂｒｅｓｓｌｅｒ等、１９９０）。結晶腔、並びにブルーフ膜の近位で生じる他の加齢関連変化は、虚血を誘導すること、並びに網膜と脈絡膜との間の栄養及び老廃物の交換の制限により、ＲＰＥ及び網膜の機能不全及び変性に寄与している（Ｂｉｒｄによる考察、１９９０）。いくつかの試験はＡＭＤの発症における免疫媒介過程を示している。重要な点は、免疫及び炎症媒介過程が結晶腔の発生及び／又は除去に関与しているという仮説により予測されていた通り、自己抗体がＡＭＤ患者の血清中で検出されている（Ｐｅｎｆｏｌｄ等、１９９０）。
【００１８】
ヒト結晶腔の分子組成並びに結晶腔に並行又は重複するＲＰＥ細胞の包括的な分析は免疫グロブリンに対する免疫反応性、及び、免疫複合体の付着に関連する補体系の成分を明らかにしている（Ｊｏｈｎｓｏｎ等、２０００）。結晶腔は又免疫系のモジュレーションにおいて役割を果たしているビトロネクチン（Ｈａｇｅｍｅｎ等、１９９９）及びアポリポ蛋白Ｅ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等、２００１）のような多機能性蛋白を含有する。更に又、炎症に対する急性期の応答に関与する分子、例えばアミロイドＰ成分及びα１−抗トリプシンは結晶腔（Ｍｕｌｌｉｎｓ等、２０００）、並びに凝固及びフィブリン溶解に関与する蛋白（Ｘ因子、トロンビン、及びフィブリノーゲン）において発見されている（Ｍｕｌｌｉｎｓ等、２０００）。結晶腔の形成及び関連するＲＰＥの病理は補体カスケードを活性化する慢性の炎症応答に寄与していると示唆されている（Ｈａｇｅｍａｎ等、２００１；Ｊｏｈｎｓｏｎ等、２００１）。
【００１９】
ＡＭＤに起因し、そして網膜の撹乱をもたらす視覚障害の１つの別の形態は地図状委縮であり、これは桿状細胞及び錐状体細胞並びにＲＰＥ細胞の斑の死滅をもたらす。
【００２０】
本明細書に記載する参考文献の引用及び考察は、それが本発明の先行技術であることの受け入れとはみなされない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は部分的には免疫学的経路をモジュレートするための方法及び組成物を提供する。本発明は部分的には細胞への分子の送達に関する。細胞はインビトロ又はインビボであってよい。本発明の一部の実施形態は補体経路、例えば古典的、レクチン、又は代替経路をモジュレートすることに関する。
【００２２】
本発明は部分的には補体経路及び／又は補体関連疾患をモジュレート（例えば抑制）する方法を提供する。とりわけ、本発明者等は補体経路をモジュレートするための組成物及び方法を本明細書に記載する。補体経路のモジュレーションは動物における疾患の状況をモジュレートするため、疾患の伏在機序を試験するため、補体に関連する試験の道具として、そして、補体経路における種々の成分及び／又は最終産物の製造のために使用できる。本発明の一部の実施形態は免疫学的経路を試験するため、関連する疾患の状況を試験するため、疾患の状況に対する治療法を開発するため、動物において疾患の状況を作るため（例えばマウス又はラットのような動物におけるモデルを開発するため）、又はインビトロで疾患の状況を生じさせるため、又は薬剤のスクリーニングのために使用できる。本発明の一部の実施形態は、古典的な補体経路；代替補体経路又はレクチン補体経路をモジュレートすることを包含する。
【００２３】
本明細書において提供されるものは補体経路のような免疫学的経路をモジュレートするための種々の組成物及び／又は方法である。
【００２４】
本発明者等は本明細書においてとりわけ、補体経路を抑制するための組成物／分子を提供する。例えば、本発明者等は、因子Ｂの特定の類縁体が因子ＤとのＣ３ｂＢの複合体を維持することにより補体活性を減衰させることを発見した。従って、本明細書において提供されるものは、補体活性を抑制することが示された因子Ｂの類縁体の例である。同様に提供されるものは補体活性を同様に減衰する因子Ｄの類縁体である。これらの類縁体は補体の活性化を減衰するが、完全にブロックするわけではないという利点を提供してよい。
【００２５】
一部の実施形態においては、分子はその作用の有無を調べるために、例えば眼の一部上に送達される。一部の実施形態においては、分子は例えばヒトにおいて有益又は治療上の作用を提供するために送達される。一部の実施形態においては、本発明の分子（例えば蛋白）は生物学的経路又は疾患の状況を試験するため、薬剤をスクリーニングするため、又は試験及び／又は検定における対照として使用される。一部の実施形態においては、分子は補体経路、例えば古典的経路、レクチン経路、又は代替経路をモジュレート、増強、媒介、又は抑制する。一部の実施形態においては、本発明の分子はペプチド、蛋白、補体抑制因子、又は核酸である。
【００２６】
更に又、本発明は例えば眼に対し、又は眼の特定の部分／領域に対し、本発明の分子を送達するための種々の方法を提供する。本発明の方法は又、例えば本明細書に記載する通り、１回又は多数回、分子を送達することを意図する。
【００２７】
本発明の一部の実施形態は疾患又は状態の病理、兆候又は症状を試験、抑制、安定化、悪化（例えば動物において疾患モデルを作成するため）、治癒、治療、防止、重症度の低下、経過の短縮化、改善、又は改変するための方法及び／又は組成物を提供する。一部の実施形態においては、疾患又は状態は補体媒介、補体関連、補体関係、又は補体依存性の疾患又は状態である。一部の実施形態においては、疾患又は状態は、失明性の眼の疾患、炎症から生じる疾患、早期の加齢関連黄斑変性、加齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）、湿性ＡＭＤ、緑内障、ブドウ膜炎、地図状委縮、糖尿病性増殖性網膜症、及び本明細書に記載した他のものである。
【００２８】
本発明は又、（ｉ）Ｃ３ｂ及び因子Ｂの関与する反応；（ｉｉ）Ｃ３ｂＢ及び因子Ｄの関連する反応；（ｉｉｉ）Ｃ３ｂ、因子Ｂ及び因子Ｄの関与する反応：（ｉｖ）因子Ｂの切断（例えば因子Ｄによる）；（ｖ）Ｃ３の切断（例えば因子Ｂによる）（ｖｉ）Ｃ３ｂＢＤからの因子Ｄの解離及び／又は（ｖｉｉ）補体経路、例えば代替補体経路、をブロック、抑制、増強及び／又はモジュレートするための方法及び組成物を提供する。
【００２９】
本発明の一部の実施形態は例えば因子Ｂの合成、切断又は活性を抑制することにより、対象における因子Ｂ媒介疾患を治療、改善、又は防止する方法を提供する。
【００３０】
本発明は又例えば本明細書に記載する通り因子Ｂのような補体経路の成分の突然変異体又は変異体を包含する蛋白を提供する。本発明の一部の実施形態は以下の特性、即ち：低下したＣ３切断能力、より堅固な因子Ｄへの結合、より堅固なＣ３ｂへの結合、又は低下した因子Ｄにより切断される能力、の１つ以上を有する因子Ｂ変異体を提供する。
【００３１】
本発明は（ｉ）因子Ｃ３ｂおよびＤの両方に結合する分子、例えばｆＢ３、二重特異性抗体等；（ｉｉ）因子Ｃ３ｂおよびＤの両方への増大した結合（そのネイティブの形態と比較して）を有する補体蛋白類縁体；（ｉｉｉ）因子Ｄに対する増大した結合（そのネイティブの形態と比較して）を有する補体蛋白類縁体；及び（ｉｖ）Ｃ３ｂＢ複合体への増大した結合（そのネイティブの形態と比較して）を有する補体蛋白類縁体を包含する。本発明は又、このパラグラフに記載したｉ〜ｉｖのもののような本発明の分子を用いた補体経路を抑制する方法を包含する。
【００３２】
本発明の一部の実施形態は補体活性を抑制する分子及び／又はその分子に対してコードしているトランスジーンを含むベクター及び／又はその分子を発現するベクターを含む細胞を含む医薬組成物を、補体媒介疾患の治療の必要な患者に投与することを含む、その治療方法を提供する。一部の実施形態においては、分子は補体因子類縁体である。
【００３３】
一部の実施形態においては、補体因子は改変された機能１つ以上を含む。一部の実施形態においては、改変された補体因子は減衰したプロテアーゼ活性を含む。一部の実施形態においては、補体因子は因子Ｂである。一部の実施形態においては、補体因子Ｂ類縁体は未改変の補体因子と比較して増大したＣ３ｂ結合親和性を含む。一部の場合において、これはアスパラギン酸、アスパラギン又は両方の置換のようなＣ３ｂ結合ドメインにおける改変により達成される。一部の実施形態においては、アスパラギン酸はグリシン、アラニン又はアスパラギンで置き換えられる。一部の実施形態においては、アスパラギンはグリシン、アラニン、又はアスパラギン酸で置き換えられる。一部の実施形態においては、このアスパラギン酸は配列番号２のアミノ酸２７９に相当し、そしてこのアスパラギンは配列番号２のアミノ酸２８５に相当する。
【００３４】
一部の実施形態においては、因子Ｂはセリンプロテアーゼドメインの活性部位における改変を含む。一部の実施形態においては、セリプロテアーゼドメインは配列番号２の７３９〜７４６に相当するアミノ酸を含むか、これよりなる。一部の場合においては、改変は例えばセリン、チロシン、グリシン、アラニン、グルタミン酸又はアスパラギンによるアスパラギン酸の置換を含む。一部の実施形態においては、置換されたアスパラギン酸は配列番号２のアミノ酸７４０に相当する。一部の実施形態においては、補体因子Ｂ類縁体は配列番号４を含むか、又は配列番号４のアミノ酸２６〜７６４を含む。
【００３５】
一部の実施形態においては、補体因子Ｂ類縁体はネイティブの因子Ｂと比較して因子Ｄにより切断される能力が減衰している。一部の実施形態においては、因子Ｂ類縁体は因子Ｄ切断部位が改変されている。一部の実施形態においては、改変は例えば各々アラニンによる少なくとも１つのリジン、アルギニン又は両方の置換を含む。一部の実施形態においては、リジン少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸２５８又は２６０に相当し、そして、前記アルギニンは配列番号２のアミノ酸２５９に相当する。
【００３６】
本発明は又、ネイティブの補体因子Ｄと比較して減衰した蛋白分解活性、及び／又は、ネイティブの補体因子Ｄと比較して増大したＣ３ｂＢｂ結合親和性を有する因子Ｄ類縁体を提供する。一部の実施形態においては、補体因子Ｄ類縁体はネイティブの補体因子Ｄと比較して因子Ｂを切断する能力が低下している。一部の実施形態においては、補体因子Ｄ類縁体はｆＤのセリンプロテアーゼ触媒ドメインにおける改変を含む。一部の実施形態においては、ｆＤのセリンプロテアーゼ触媒ドメインにおける改変は（ｉ）配列番号２７（ヒトｆＤ）のＨｉｓ６６、Ａｓｐ１１４、又はＳｅｒ２０８に相当するアミノ酸の置換又は欠失；又は（ｉｉ）配列番号２７のＨｉｓ６６、Ａｓｐ１１４、又はＳｅｒ２０８に相当するアミノ酸に隣接するアミノ酸少なくとも１つの挿入、を含む。一部の実施形態においては、Ｈｉｓ６６に相当するアミノ酸が少なくとも１つの中性アミノ酸、少なくとも１つの負荷電アミノ酸又は少なくとも１つの非極性アミノ酸で置換されている。一部の実施形態においては、Ａｓｐ１１４に相当するアミノ酸が少なくとも１つの正荷電又は少なくとも１つの非極性であるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態においては、Ｓｅｒ２０８に相当するアミノ酸が少なくとも１つの荷電、または少なくとも１つの非極性アミノ酸で置換されている。一部の実施形態においては、補体因子Ｄ類縁体は野生型因子Ｄと比較してＮ末端に追加的アミノ酸１つ以上を含む。一部の実施形態においては、追加的アミノ酸１つ以上はグリシン及びアルギニンを含む。
【００３７】
本発明の一部の実施形態は（ｉ）補体活性を抑制又は低減する補体因子Ｄ類縁体；（ｉｉ）補体因子Ｄ類縁体をコードするベクター；又は（ｉｉｉ）補体因子Ｄ類縁体をコードするベクターを含む細胞、を含む医薬組成物を、補体媒介疾患の治療が必要な患者に投与することを含むその治療方法を提供する
一部の実施形態においては、補体活性を抑制する分子は補体因子に結合する分子である。一部の実施形態においては、この分子は補体因子に結合する抗体の相補性決定領域少なくとも１つを含む。一部の実施形態においては、分子は補体因子に結合する抗体又はそのフラグメントである。一部の実施形態においては、抗体はヒト、ヒト化、キメラ、ネズミ、ニワトリ又はウサギ抗体である。一部の実施形態においては、結合分子は補体因子に結合するアプタマーである。一部の実施形態においては、本発明の結合分子は因子Ｂ、因子Ｃ３ｂ又は因子Ｄに結合する。
【００３８】
一部の実施形態においては、補体媒介疾患は眼の疾患である。一部の実施形態においては、本発明の医薬組成物は、例えば硝子体内注射、網膜下注射、前眼房内への注射、角膜への注射又は局所適用、結膜下注射、テノン下注射、又は点眼を介して、眼に送達／投与される。
【００３９】
本発明は又減衰したプロテアーゼ活性及び改変されたＣ３ｂ結合親和性を含む因子Ｂ類縁体を提供する。本発明の一部の実施形態は減衰したプロテアーゼ活性を含む補体因Ｄ類縁体を提供する。
【００４０】
本発明の一部の実施形態は補体活性を抑制又は低減する分子を含む医薬組成物を哺乳類に投与することを含む哺乳類における疾患を治療する方法を提供する。一部の例においては、分子は蛋白又は核酸である。一部の実施形態においては、医薬組成物は分子をコードするベクターを含む。一部の実施形態においては、蛋白は補体経路成分の類縁体、例えば因子Ｄ又は因子Ｂの類縁体である。一部の実施形態においては、類縁体はヒト因子Ｂ１、Ｂ２又はＢ３、又はマウス因子Ｂ１、Ｂ２又はＢ３である。
【００４１】
本発明の一部の方法は例えば補体媒介疾患又は障害の治療又は防止の方法に関し、ここで疾患は結晶腔形成、黄斑変性、ＡＭＤ、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、硝子体網膜症、角膜炎症、気道応答亢進症、免疫関連疾患、自己免疫関連疾患、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節炎、リューマチ様疾患、抗リン脂質抗体症候群、腸及び直腸のＩ／Ｒ傷害、喘息、非定型の溶血性尿毒症症候群、ＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎、非増殖性糸球体腎炎、胎児損失、緑内障、ブドウ膜炎、高眼圧症、脳傷害、卒中、外傷後臓器損傷、梗塞後臓器損傷、血管炎、虚血再灌流傷害、例えば心臓切開手術に用いられる場合のような心肺バイパス処置の外傷、脳血管偶発症、アルツハイマー病、移植片拒絶、感染症、敗血症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、重傷筋無力症、抗体媒介皮膚疾患、Ｉ型及びＩＩ型の真性糖尿病、甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病及び溶血性貧血、神経障害、多発性硬化症、心肺バイパス傷害、結節性多発性動脈炎、ヘノッホ−ホシェーンライン紫斑病、血清病、グッドパスチャー病、全身性壊死性血管炎、連鎖球菌感染後の糸球体腎炎、特発性肺線維症、膜性糸球体腎炎、心筋梗塞、急性ショック性肺症候群、成人呼吸窮迫症候群、再灌流、拒絶及び／又は補体媒介疾患である。
【００４２】
本発明の一部の方法は、１つ以上の因子Ｈ、因子Ｈ様１、ＭＣＰ、ＤＡＦ、ＣＤ５９又はＭＣＰの可溶性形態を、単独か、又は本発明の補体因子類縁体の前、後、又は同時に投与することを含む。
【００４３】
一部の実施形態においては、触媒抗体を使用して補体活性を抑制する。一部の実施形態においては、触媒抗体は例えば因子Ｂ、因子Ｄ、因子Ｂｂ、因子Ｃ３及び／又は因子Ｃ３ｂ補体蛋白を切断することによるなどして、プロテアーゼとして機能する。
【００４４】
一部の実施形態においては、補体蛋白の発現を抑制するＲＮＡを使用し、ここで例えば、ＲＮＡはリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ、そしてここで例えば補体蛋白はＣ３、ｆＢ、ｆＤ、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、又はＣ９である。一部の実施形態においては、医薬組成物は少なくとも２つの異なる補体蛋白の発現を抑制するＲＮＡを含む。
【００４５】
本発明の一部の実施形態は、因子Ｃ３ｂ及びＤの両方に結合する単離された分子を提供し、この場合、分子はネイティブの因子Ｂ、ｆＢ１、ｆＢ２又はｆＢ３ではない。本発明の一部の実施形態は、自身のネイティブの形態と比較して因子Ｃ３ｂ及びＤの両方への結合が増大した補体蛋白類縁体を提供し、この場合補体蛋白類縁体はｆＢ１、ｆＢ２又はｆＢ３ではない。本発明の一部の実施形態は自身のネイティブの形態と比較して因子Ｄへの結合が増大した補体蛋白類縁体を提供し、この場合補体蛋白類縁体はｆＢ１、ｆＢ２又はｆＢ３ではない。本発明の一部の実施形態は自身のネイティブの形態と比較してＣ３ｂＢ複合体への結合が増大した補体蛋白類縁体を提供し、この場合補体蛋白類縁体はｆＢ１、ｆＢ２又はｆＢ３ではない。一部の実施形態においては、補体蛋白類縁体は例えば免疫沈降により測定した場合少なくとも２倍結合が増大している。
【００４６】
一部の実施形態においては、ベクターはレトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、ＡＡＶベクター、ヘルペスウィルスベクター、肝炎ウィルスベクター、例えばＢ型肝炎又はＤ型肝炎ベクター、ＳＶ４０ベクター及びＥＢＶベクターである。一部の実施形態においては、レンチウィルスはＨＩＶ、ＥＩＡＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ又はＢＩＶである。一部の実施形態においては、ウィルスベクターは崩壊加速因子を含む。本発明は又本発明のウィルスベクターを生産する細胞を提供する。
【００４７】
一部の実施形態においては、抗炎症剤は本発明の医薬組成物の投与の前、これと同時、及び／又は後に投与される。一部の実施形態においては、抗炎症剤は医薬組成物と同じ溶液及び／又は同じシリンジ中で投与される。一部の実施形態においては、抗炎症剤は眼に投与される。抗炎症剤は限定しないがデキサメタゾン、デキサメタゾンナトリウムメタスルホベンゾエート、デキサメタゾンナトリウムホスフェート、ラパマイシン、ＦＫ５０６、フルオロメトロン、ブロムフェナク、プラノプロフェン、ＲＥＳＴＡＳＩＳＴＭ、シクロスポリン眼科用乳液、ナプロキセン、糖質コルチコイド、ケトロラック、イブプロフェン、トルメチン、非ステロイド抗炎症剤、ステロイド抗炎症剤、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、インドメタシン、及びスプロフェンを包含する。
【００４８】
一部の実施形態においては、補体活性は補体活性を抑制する第１の分子及び補体活性を抑制する第２の分子をコードするベクターを哺乳類に投与することにより抑制する。一部の場合においては、第１及び第２の分子は異なっている。一部の場合においては、第１の分子はベクターの投与の前、それと同時、及び／又は後に投与される。一部の場合においては、第１の分子及びベクターは同じ溶液及び／又は同じシリンジ中で投与される。場合により、第１の分子、ベクター又は両方は眼に投与してよい。
【００４９】
本発明の一部の実施形態はネイティブの補体因子Ｄと比較して減衰した蛋白分解活性を含む補体因子Ｄ類縁体を提供する。
【００５０】
一部の実施形態においては、本発明の分子又は該分子をコードするベクターは約、または少なくとも毎週、毎月、２か月、３か月、６か月、９か月、１年、１８か月、２年、３０か月、３年、５年、又は１０年に一回、個体に投与され、例えば眼に投与される。一部の実施形態においては、本発明の分子又は該分子をコードするベクターは１回投与され、そして１日以上、１か月以上、又は個体の生涯までの延長された期間、補体活性を抑制する。他の実施形態において、本発明の分子又は該分子をコードするベクターは毎週、毎月、２か月毎、３か月毎、６か月毎、９か月毎、１年毎、１８か月毎、２年毎、３０か月毎、３年毎、５年毎、又は１０年毎に一回を超えることなく、個体に投与され、例えば眼に投与される。
【００５１】
本発明の一部の実施形態は本発明の分子（例えば治療用分子）、例えば補体抑制因子、例えば崩壊加速因子（ＤＡＦ）又は野生型の分子と比較して生物学的機能を欠いているか低下している補体因子Ｂ類縁体、又は補体の機能、経路、又は活性に関与する分子に特異的に結合する結合分子（例えばアプタマー、抗体、抗体様又は抗体誘導分子）をコードする核酸を担持するベクターコンストラクト又はウィルスベクターを提供する。一部の実施形態においては、本発明のベクターコンストラクト又はウィルスベクターを利用する形質転換は例えば網膜において持続された細胞への送達及び／又はそれからの分子の発現をもたらす。
【００５２】
本発明は更に、細胞、特に細胞片、又は細胞集団を形質転換（インビボ又はインビトロ）するための方法を提供する。本発明の一部の方法は細胞、例えば限定しないが網膜細胞及び／又はＲＰＥ細胞を形質転換するために使用できる。本発明の一部の方法は強膜、角膜、虹彩、毛様体、脈絡膜、結膜、テノン嚢、網膜、網膜下組織、眼球外の脂肪、筋肉（例えば眼球外の筋肉）及び／又は筋膜組織の細胞を形質転換するために使用できる。しかしながら、本発明は特定の細胞片を形質転換することに限定されない。一部の実施形態においては、細胞は動物の特定の臓器又はコンパートメント、例えば脳、眼、脊髄、関節内、循環系内、及び／又は血中にある。一部の実施形態においては、分子を細胞に送達し、そしてその後、細胞を動物に導入する。
【００５３】
本発明の一部の実施形態は例えば本発明の組成物の投与後に補体活性及び／又は補体経路成分及び／又はその活性を検出及び／又は計測することを含む薬効を検出するため又は薬効を計測するための方法を提供する。一部の実施形態においては、これを連続的又は周期的に計測することにより、疾患の状態のモニタリング及び／又は今後の治療方法（本明細書に記載した物又は他の方法に関する）を決定するプロセスにおける使用が可能となる。
【００５４】
本明細書に記載する何れかの方法又は組成物を本明細書に記載する何れかの他の方法又は組成物に関して実施することができる。請求項及び／又は明細書における「含む」という用語に関連して使用する場合の「ある〜」という単語の使用は「１つの〜」という意味を有してよいが、「１つ以上の〜」、「少なくとも１つの〜」及び「１つ又は１つより多い〜」の意味にも合致するものである。「及び／又は」という用語／句は、列挙により使用する場合、列挙された項目の１つ以上を利用してよいこと、例えば要素の１つ又は全てに限定されないことを意味する。
【００５５】
追加的な特徴及び利点は以下の詳細な説明において記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
本発明を説明する目的のために、本発明の特定の実施形態を図面において説明する。しかしながら、本発明は図面に示す実施形態の厳密な配置及び手段に限定されない。
【図１】図１はＡＭＤの進行を説明する例を示す。早期のＡＭＤは網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞層の下の結晶腔の付着を特徴とする。結晶腔は中央のパネルにおいて淡色又は白色の斑点として可視化される。
【図２】図２はＢＩＶ（ウシ免疫不全ウィルス）系ベクターを作成するための４つのコンストラクトの例を示す。ＲＳＶはラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーターである。ＣＭＶは５’長末端リピート（ＬＴＲ）のＲ領域に並置されているサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーである。ＳＩＮは自己不活性化ベクターをもたらす３’ＬＴＲのＵ３領域からのエンハンサー及びプロモーターの欠失を示す。Φはウイルス粒子内へのベクターＲＮＡのパッケージングを指向するパッケージングシグナルである。非相同遺伝子とはプロモーター、及び分子、例えば治療用分子をコードするコーディング領域の両方を包含する発現カセットを指す。ｇｐ６４はバキュロウィルスｇｐ６４エンベロープ遺伝子である。
【図３】図３はＢＩＶベクター形質導入ラット網膜における緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）の発現を示す。３μＬ中３×１０５の形質導入単位（ｔｕ）を網膜下注射により投与した。１ヶ月後、ラットを屠殺し、網膜を採取し、スリットを網膜に切り込むことによりフラットな全マウントを調製した。図３Ａ：灰色の輪郭は網膜の端部を示す。より明るい領域は注射部位及びその近傍における形質導入及びＧＦＰの発現を示す。図３ＢはＧＦＰに関する免疫組織化学的染色が主にＲＰＥ層にあることを示している。
【図４】図４はＢＩＶベクター形質導入マウス網膜におけるＧＦＰの発現を示す。図４Ａは１μＬ中１×１０５ｔｕの網膜下注射の２週間後の成熟マウス網膜における形質導入及び発現を示す。図４Ｂは１μＬ中１×１０５ｔｕの硝子体内注射の２週間後の新生仔マウスにおける形質導入及び発現を示す。図４Ｃは図４Ｂの高倍率視界である。
【図５】図５はＲＰＥ細胞におけるＧＦＰの高レベル発現を示すＢＩＶＧＦＰベクターの眼内投与の１か月後のウサギ網膜のフラットマウントを示す。
【図６】図６はＧＦＰをコードするＢＩＶベクターの投与の１０週間後のサルＲＰＥ細胞におけるＧＦＰの発現を示す。
【図７】図７はＢＩＶベクターが一次ヒトＲＰＥ細胞を効率的に形質導入できることを示している。左側パネルはＲＰＥ６５、６５ＫＤのＲＰＥ特異的蛋白に関する染色を示す。中央及び右側のパネルはＧＦＰベクターで形質導入された細胞の明視野及び蛍光視界を示す。
【図８】図８はエンドスタチンをコードするＢＩＶベクターが開花性の血管新生の動物モデルにおいて血管形成を弱化させる能力を示すことを示している。上左側パネルは未投与の眼を示す。下の２つの左側のパネルは対照ベクターを投与した眼を示し、右側のものはＢＩＶエンドスタチンベクターを投与した目を示す。上側パネルはフルオレセインのアンジオグラフである。中央のパネルは網膜の組織学的断片である。底部のパネルは全眼の断面図である。
【図９】図９はセファクリルＳ５００−ＨＲカラム由来の溶出画分におけるベクター力価及びＢＳＡレベルの曲線を示す。この試験のために、ベクター精製の原料である培地には２％ＦＢＳを添加した。詳細は実施例３０に示す。
【図１０】図１０はレーザー傷害モデルにおいてＴ２−ＴｒｐＲＳを発現するＢＩＶベクターが血管新生を抑制したことを示す。図１０は２つのコホートにおける血管新生領域の平均の大きさを示す。血管新生の領域はＴ２−ＴｒｐＲＳ（トリプトファンｔＲＮＡ合成酵素のカルボキシル末端フラグメント）ベクター投与眼において有意に低値であった。
【図１１】図１１は古典的及びレクチン補体経路を示す。古典的経路はＣ１を介して開始されるが、レクチン経路はマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）を介して開始される。Ｃ４ｂＣ２ａはＣ３を切断してＣ３ａ及びＣ３ｂとするプロテアーゼであり、そしてＣ３コンバターゼと称される。同様に、Ｃ４ｂＣ２ａＣ３ｂはＣ５を切断してＣ５ａ及びＣ５ｂとするプロテアーゼであり、そしてＣ５コンバターゼと称される。Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、及びＣ５ａは炎症特性を有し、そして貪食細胞を誘因する。Ｃ５ｂ６〜９は膜攻撃複合体（ＭＡＣ）を形成し、これは、感染性物質を殺傷するが宿主細胞にも損傷を与える場合がある膜細孔を形成する。ＭＡＳＰはマンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼである。
【図１２】図１２は代替補体経路を示す。この経路はＣ３の自発的切断を介して低レベルで構成的に活性である。適切な表面の存在下においては、Ｃ３ｂは補体因子Ｂ（ｆＢ）に結合する。次にこの複合体が補体因子Ｄ（ｆＤ）により切断されてＣ３ｂＢｂが生じる。数分以内のこの複合体の自発的解離（「崩壊」）がその不活性化をもたらし、一方、プロペジンによる安定化によりＣ３を切断する複合体、即ちＣ３コンバターゼが形成される。補体経路を減衰させる因子の幾つかはＣ３及びＣ５コンバターゼの崩壊を加速させることによりそれを行う（後に示す表１参照）。注意すべきことは、Ｃ３ｂはＣ３コンバターゼに参加することにより追加的なＣ３ｂを形成し、これにより大型矢印で示す通り正のフィードバックループを生じさせる。Ｃ３ｂＢｂはＣ３コンバターゼである。Ｃ３ｂＢｂＣ３ｂはＣ５コンバターゼである。
【図１３】図１３はヒト網膜細胞におけるベクター誘導ｆＢの発現を示す。ＡＲＰＥ細胞（ＲＰＥ誘導細胞株）を実施例８に示す通りｆＢコンストラクトをコードするＢＩＶ系ベクターで形質導入した。形質導入された細胞集団の各々に由来する培地をウエスタン分析に付し、そしてｆＢに関してプローブした。レーン１、精製されたヒト血漿誘導ｆＢ１００ｎｇ；レーン２〜５、ヒト野生型ｆＢ、ｆＢ３、ｆＢ２及びｆＢ１をそれぞれコードするベクターで形質導入した細胞の由来する培地４０μＬ。全レーンとも同じゲルに由来する。
【図１４】図１４は例えば図２の転移ベクターコンストラクト中の非相同遺伝子としてサブクローニングできる、又は細胞から発現させることができる単鎖抗体の構造を示す。リーダーは選択を指向したリーダー配列であり；ＶＬ及びＶＨは例えば当該分野で知られたリンカーにより連結されたそれぞれ可変軽鎖及び重鎖、又はそのＣＤＲ含有部分である。一部の実施形態においては、重鎖配列は軽鎖配列の上流に位置することができる。
【図１５】図１５はベクター誘導ヒト野生型ｆＢ及びｆＢ優性阻害の溶血試験から得られた結果を示す。陽性対照は１００％溶血を起こすために蒸留水と混合したＥｒａｂ（ウサギ赤血球）とする。精製されたｆＢ蛋白は精製されたヒト血漿誘導ｆＢ５００ｎｇを添加したヒトｆＢ枯渇血清による溶血を示す。陰性対照はｆＢ枯渇ヒト血清単独による溶血を示す。５つの右側のバーはＧＦＰ、野生型ヒトｆＢ、ｆＢ１、ｆＢ２又はｆＢ３をコードするベクターで形質導入した細胞に由来する培地を添加した場合のｆＢ枯渇血清による溶血を示す。
【図１６】図１６はラット大動脈及びマウス脳へのレンチウィルスベクター遺伝子転移を示す。図１６ＡはＨＩＶ誘導レンチウィルスベクターによるラット大動脈の切片の形質導入を示す。図１６ＢはＢＩＶＧＦＰベクターを用いたマウス脳への遺伝子転移を示す。関連する方法は実施例１４に記載する。
【図１７】図１７は種々の因子Ｂ突然変異体を用いた代替補体経路の活性を評価するための溶血活性試験の結果を示す。Ｙ軸は赤血球の溶血後に上澄みに放出されたヘモグロビンレベルにより計測した相対的溶血活性を示す。Ｘ軸は左から右へ：１００％溶解を有する陽性対照、水中に溶解された赤血球（ＲＢＣ）；ＷＴ（野生型）ｈｆＢ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋５００ｎｇの精製血漿誘導ヒト因子Ｂ蛋白（カタログ番号Ａ４０８、Ｑｕｉｄｅｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；陰性対照、ＲＢＣは等張性食塩水中でインキュベートした（赤血球溶解無し）；野生型ｈｆＢベクター、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地；ＧＦＰベクター、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地；突然変異体ｈｆＢ１ベクター、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋突然変異体ｆＢ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地；突然変異体ｈｆＢ２ベクター、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋突然変異体ｆＢ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地；突然変異体ｈｆＢ３ベクター、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋突然変異体ｆＢ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地；ＧＦＰベクター＋ＷＴｆＢ１：１、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の１対１の比の混合物；突然変異体ｈｆＢ１＋ＷＴｆＢ１：１、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋突然変異体ｆＢ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の１対１の比の混合物；突然変異体ｈｆＢ２＋ＷＴｆＢ１：１、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋突然変異体ｆＢ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の１対１の比の混合物；突然変異体ｈｆＢ３＋ＷＴｆＢ１：１、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋突然変異体ｆＢ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の１対１の比の混合物；ＧＦＰベクター＋ＷＴｆＢ２：１、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型ヒト因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の２対１の比の混合物；突然変異体ｈｆＢ１＋ＷＴｆＢ２：１、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋突然変異体ｆＢ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の２対１の比の混合物；突然変異体ｈｆＢ２＋ＷＴｆＢ２：１、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋突然変異体ｆＢ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の２対１の比の混合物；突然変異体ｈｆＢ３＋ＷＴｆＢ２：１、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋突然変異体ｆＢ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の２対１の比の混合物である。
【図１８】図１８は代替補体経路活性を評価するための溶血活性試験の結果を示す。Ｙ軸は赤血球の溶血後に上澄みに放出されたヘモグロビンレベルにより計測した相対的溶血活性を示す。Ｘ軸は左から右へ：１００％溶解を有する陽性対照、水中に溶解されたＲＢＣ；ブランク、ＲＢＣを等張性食塩水中でインキュベートした（赤血球溶解無し）；４倍希釈マウス血清（５０ｕｌ）を以下の試料（各４０ｕｌ）、即ち：ＧＦＰベクター、ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を１対１の比で混合したもの；突然変異体ｍｆＢ１ベクター、マウス突然変異体ｆＢ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を１対１の比で混合したもの；突然変異体ｍｆＢ２ベクター、マウス突然変異体ｆＢ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を１対１の比で混合したもの；突然変異体ｍｆＢ３ベクター、マウス突然変異体ｆＢ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を１対１の比で混合したもの；ＧＦＰベクター、ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を２対１の比で混合したもの；突然変異体ｍｆＢ１ベクター、マウス突然変異体ｆＢ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を２対１の比で混合したもの；突然変異体ｍｆＢ２ベクター、マウス突然変異体ｆＢ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を２対１の比で混合したもの；突然変異体ｍｆＢ３ベクター、マウス突然変異体ｆＢ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を２対１の比で混合したもの；ＧＦＰベクター、ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を１対１の比で混合したもの；突然変異体ｈｆＢ１ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を１対１の比で混合したもの；突然変異体ｈｆＢ２ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を１対１の比で混合したもの；突然変異体ｈｆＢ３ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を１対１の比で混合したもの；ＧＦＰベクター、ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を２対１の比で混合したもの；突然変異体ｈｆＢ１ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を２対１の比で混合したもの；突然変異体ｈｆＢ２ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を２対１の比で混合したもの；突然変異体ｈｆＢ３ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型マウス因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地を２対１の比で混合したものに添加した。
【図１９】図１９は代替補体経路活性を評価するための溶血活性試験を示す。Ｙ軸は赤血球の溶血後に上澄みに放出されたヘモグロビンレベルにより計測した相対的溶血活性を示す。Ｘ軸は左から右へ：１００％溶解を有する陽性対照、水中に溶解されたＲＢＣ；ブランク、ＲＢＣを等張性緩衝液中でインキュベートした（赤血球溶解無し）；ＧＦＰ、ＢＩＶＧＦＰベクターで形質導入した細胞の培地；ＷＴｈｆＢベクター、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地；突然変異体ｈｆＢ１ベクター、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋突然変異体ｆＢ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地；突然変異体ｈｆＢ２ベクター、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋突然変異体ｆＢ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地；突然変異体ｈｆＢ３ベクター、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋突然変異体ｆＢ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地；ＧＦＰベクター＋１：１ｗＷＴｈｆＢ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型ヒト因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の１対１の比の混合物；突然変異体ｍｆＢ１＋１：１ｗＷＴｈｆＢ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋マウス突然変異体因子Ｂ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型ヒト因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の１対１の比の混合物；突然変異体ｍｆＢ２＋１：１ｗＷＴｈｆＢ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋マウス突然変異体因子Ｂ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地とヒト野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の１対１の比の混合物；突然変異体ｍｆＢ３＋１：１ｗＷＴｈｆＢ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋マウス突然変異体因子Ｂ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地とヒト野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の１対１の比の混合物；ＧＦＰベクター＋２：１ｗＷＴｈｆＢ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型ヒト因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の２対１の比の混合物；突然変異体ｍｆＢ１＋２：１ｗＷＴｈｆＢ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋マウス突然変異体因子Ｂ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型ヒト因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の２対１の比の混合物；突然変異体ｍｆＢ２＋２：１ｗＷＴｈｆＢ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋マウス突然変異体因子Ｂ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地とヒト野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の２対１の比の混合物；突然変異体ｍｆＢ３＋２：１ｗＷＴｈｆＢ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋マウス突然変異体因子Ｂ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地とヒト野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の２対１の比の混合物；ＧＦＰベクター＋４：１ｗＷＴｈｆＢ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型ヒト因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の４対１の比の混合物；突然変異体ｍｆＢ１＋４：１ｗＷＴｈｆＢ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋マウス突然変異体因子Ｂ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地と野生型ヒト因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の４対１の比の混合物；突然変異体ｍｆＢ２＋４：１ｗＷＴｈｆＢ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋マウス突然変異体因子Ｂ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地とヒト野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の４対１の比の混合物；突然変異体ｍｆＢ３＋４：１ｗＷＴｈｆＢ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋マウス突然変異体因子Ｂ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地とヒト野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地の４対１の比の混合物である。
【図２０】図２０は代替補体経路活性を評価するための溶血活性試験を示す。Ｙ軸は赤血球の溶血後に上澄みに放出されたヘモグロビンレベルにより計測した相対的溶血活性を示す。Ｘ軸は左から右へ：１００％溶解を有する陽性対照、水中に溶解されたＲＢＣ；陰性対照、ＲＢＣを等張性緩衝液中でインキュベート（赤血球溶解無し）；ＧＦＰベクター、ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を二倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したもの；野生型ｈｆＢベクター、野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を二倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したもの；突然変異体ｈｆＢ１ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を二倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したもの；突然変異体ｈｆＢ２ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を二倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したもの；突然変異体ｈｆＢ３ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を二倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したもの；ＧＦＰベクター、ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を四倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したもの；野生型ｈｆＢベクター、野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を四倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したもの；突然変異体ｈｆＢ１ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を四倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したもの；突然変異体ｈｆＢ２ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を四倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したもの；突然変異体ｈｆＢ３ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を四倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したもの；ＧＦＰベクター、ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を六倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したもの；野生型ｈｆＢベクター、野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を六倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したもの；突然変異体ｈｆＢ１ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を六倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したもの；突然変異体ｈｆＢ２ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を六倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したもの；突然変異体ｈｆＢ３ベクター、ヒト突然変異体ｆＢ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地（４０ｕｌ）を六倍希釈ブタ血清（５０ｕｌ）と混合したものである。
【図２１】図２１は因子ＤによるＣ３ｂ依存性ヒト因子Ｂ切断を示す。完全長因子Ｂ又は因子Ｂ切断産物、Ｂｂ及びＢａのウエスタンブロット検出。レーン１、陽性対照としての精製されたヒト因子Ｂ蛋白；レーン２、因子Ｄと共にインキュベートしたＧＦＰをコードするＢＩＶベクターにより形質導入された細胞の培地；レーン３、因子Ｄと共にインキュベートしたヒト野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターにより形質導入された細胞の培地；レーン４、因子Ｄと共にインキュベートしたヒト突然変異体因子Ｂ１をコードするＢＩＶベクターにより形質導入された細胞の培地；レーン５、因子Ｄと共にインキュベートしたヒト突然変異体因子Ｂ２をコードするＢＩＶベクターにより形質導入された細胞の培地；レーン６、因子Ｄと共にインキュベートしたヒト突然変異体因子Ｂ３をコードするＢＩＶベクターにより形質導入された細胞の培地；レーン７、分子量マーカー；レーン８、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたＧＦＰをコードするＢＩＶベクターにより形質導入された細胞の培地；レーン９、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたヒト野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターにより形質導入された細胞の培地；レーン１０、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたヒト突然変異体因子Ｂ１をコードするＢＩＶベクターにより形質導入された細胞の培地；レーン１１、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたヒト突然変異体因子Ｂ２をコードするＢＩＶベクターにより形質導入された細胞の培地；レーン１２、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたヒト突然変異体因子Ｂ３をコードするＢＩＶベクターにより形質導入された細胞の培地。各試料の反応混合物を表２に示す。
【図２２】図２２は因子Ｂ及びＣ３ｂ結合試験を示す。Ｃ３ｂ、因子Ｄ、及び因子Ｂ（ｗｔ又は突然変異体）を共に反応混合物中でインキュベートした。反応混合物をポリクローナル抗因子Ｂ抗血清で免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そして抗Ｃ３ｂポリクローナル抗血清を用いたウエスタンブロット分析により分析した。レーン１、陽性対照としての精製したＣ３ｂ蛋白（より低いバンドはＣ３ｂと同時精製したＣ３ベータ鎖である）；レーン２、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたＧＦＰをコードするＢＩＶベクターにより形質導入した細胞の培地；レーン３、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたヒト野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターにより形質導入した細胞の培地；レーン４、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたヒト突然変異体因子Ｂ３をコードするＢＩＶベクターにより形質導入した細胞の培地；レーン５、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたヒト突然変異体因子Ｂ２をコードするＢＩＶベクターにより形質導入した細胞の培地；及びレーン６、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたヒト突然変異体因子Ｂ１をコードするＢＩＶベクターにより形質導入した細胞の培地。
【図２３】図２３はヒト補体因子Ｂ及び因子Ｄの結合に関する試験を示す。実験の詳細は後述する実施例２１に記載する。レーン１、陰性対照、反応はＣ３ｂ、因子Ｄ及び因子Ｂの非存在下に実施；レーン２、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたＧＦＰをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地；レーン３、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたヒト野生型因子ＢをコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地；レーン４、分子量マーカー；レーン５、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたヒト突然変異体因子Ｂ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地；レーン６、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたヒト突然変異体因子Ｂ２をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地；レーン７、Ｃ３ｂ及び因子Ｄと共にインキュベートしたヒト突然変異体因子Ｂ１をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞の培地；及びレーン８、陽性対照としての精製されたヒト因子Ｂ。
【図２４】図２４は代替補体経路活性を評価するための溶血活性試験を用いた抗ヒト因子Ｂモノクローナル抗体によるヒト代替補体経路活性の抑制を示す。Ｙ軸は赤血球の溶血後に上澄みに放出されたヘモグロビンレベルにより計測した相対的溶血活性を示す。Ｘ軸は左から右へ：１００％溶解を有する陽性対照、水中に溶解されたＲＢＣ；精製されたｈｆＢ蛋白、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋５００ｎｇの精製されたヒト因子Ｂ蛋白；陰性対照、ＲＢＣは等張性食塩水中でインキュベートした（赤血球溶解無し）；抗ｈｆＢｍＡｂ、０．４μｇ；因子Ｂ枯渇ヒト血清＋抗ｈｆＢｍＡｂ（０．４μｇ）と５００ｎｇの精製されたヒト因子Ｂ蛋白との混合物；抗ｈｆＢｍＡｂ０．８μｇ；因子Ｂ枯渇ヒト血清＋抗ｈｆＢｍＡｂ（０．８μｇ）と５００ｎｇの精製されたヒト因子Ｂ蛋白との混合物；抗ｈｆＢｍＡｂ１．６μｇ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋抗ｈｆＢｍＡｂ（１．６μｇ）と５００ｎｇの精製されたヒト因子Ｂ蛋白との混合物；抗ｈｆＢｍＡｂ（２．４μｇ）；因子Ｂ枯渇ヒト血清＋抗ｈｆＢｍＡｂ（２．４μｇ）と５００ｎｇの精製されたヒト因子Ｂ蛋白との混合物；対照マウスＩｇＧ０．４μｇ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋対照マウスＩｇＧ（０．４μｇ）と５００ｎｇの精製されたヒト因子Ｂ蛋白との混合物；対照マウスＩｇＧ０．８μｇ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋対照マウスＩｇＧ（０．８μｇ）と５００ｎｇの精製されたヒト因子Ｂ蛋白との混合物；対照マウスＩｇＧ１．６μｇ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋対照マウスＩｇＧ（１．６μｇ）と５００ｎｇの精製されたヒト因子Ｂ蛋白との混合物；対照マウスＩｇＧ２．４μｇ、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋対照マウスＩｇＧ（２．４μｇ）と５００ｎｇの精製されたヒト因子Ｂ蛋白の混合物である。
【図２５】図２５はヒト因子Ｂ３蛋白の分析を示す。パネルＡはアフィニティー精製されたヒト因子Ｂ３蛋白の銀染色を示し：レーン１、分子量マーカー；レーン２、第１の画分に由来する溶出試料；レーン３、第２及び第３の画分の組み合わせに由来する溶出試料である。パネルＢはヒト因子Ｂ３蛋白のウエスタンブロット分析を示し、そしてレーンの割り付けはパネルＡと同様である。
【図２６】図２６は代替補体経路活性を評価するための溶血活性試験を示す。Ｙ軸は赤血球の溶血後に上澄みに放出されたヘモグロビンレベルにより計測した相対的溶血活性を示す。Ｘ軸は左から右へ：１００％溶解を有する陽性対照、水中に溶解されたＲＢＣ；ブランク、ＲＢＣを等張性食塩水中でインキュベートした（赤血球溶解無し）；野生型因子Ｂ蛋白（５０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、及び５００ｎｇ）、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋５０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、及び５００ｎｇの野生型ヒト因子Ｂ（Ｑｕｉｄｅｌ）；野生型因子Ｂ蛋白＋因子Ｂ３蛋白、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋４０μＬのアフィニティー精製突然変異体因子Ｂ３＋０ｎｇ、２００ｎｇ、又は５００ｎｇのＱｕｉｄｅｌより入手した野生型ヒト因子Ｂの混合物。
【図２７】図２７はマウス網膜におけるＧＦＰ発現及びＣ３染色を示す。図２７Ａ＆２７Ｂ：ＧＦＰベクターを実施例２７に記載の通り投与した。２週間後、フラットマウントを調製し、蛍光顕微鏡で検査した。図２７Ｃ＆２７Ｄ：ヌル及びｈｆＢ３ベクターを実施例２７に記載の通り投与した。２週間後、レーザー光凝固を網膜中心近傍で実施した。２０時間後、網膜を採取し、Ｃ３付着に関して染色し、そして蛍光顕微鏡で検査した。
【図２８】図２８はセファクリルＳ５００−ＨＲカラムからの溶出画分の各々におけるベクター力価を示す。この試験のために、ベクター精製の原料である培地にはＦＢＳを添加しなかった。詳細は実施例３２に示す。
【図２９Ａ】図２９は以下のプラスミドを示す。図２９ＡはｐＡＶＴｒＧＰ０３８（配列番号：１９）である。図２９ＢはｐＡＶＴｒＲＥＶ０３９（配列番号：２０）である。図２９ＣはｐＡＶＴｒＧＰ６４−０４０（配列番号：２１）である。図２９ＤはｐＡＶＴ００１（配列番号：２２）である。図２９ＥはｐＡＶＴＧＦＰ００６（配列番号：２３）である。
【図２９Ｂ】図２９は以下のプラスミドを示す。図２９ＡはｐＡＶＴｒＧＰ０３８（配列番号：１９）である。図２９ＢはｐＡＶＴｒＲＥＶ０３９（配列番号：２０）である。図２９ＣはｐＡＶＴｒＧＰ６４−０４０（配列番号：２１）である。図２９ＤはｐＡＶＴ００１（配列番号：２２）である。図２９ＥはｐＡＶＴＧＦＰ００６（配列番号：２３）である。
【図２９Ｃ】図２９は以下のプラスミドを示す。図２９ＡはｐＡＶＴｒＧＰ０３８（配列番号：１９）である。図２９ＢはｐＡＶＴｒＲＥＶ０３９（配列番号：２０）である。図２９ＣはｐＡＶＴｒＧＰ６４−０４０（配列番号：２１）である。図２９ＤはｐＡＶＴ００１（配列番号：２２）である。図２９ＥはｐＡＶＴＧＦＰ００６（配列番号：２３）である。
【図２９Ｄ】図２９は以下のプラスミドを示す。図２９ＡはｐＡＶＴｒＧＰ０３８（配列番号：１９）である。図２９ＢはｐＡＶＴｒＲＥＶ０３９（配列番号：２０）である。図２９ＣはｐＡＶＴｒＧＰ６４−０４０（配列番号：２１）である。図２９ＤはｐＡＶＴ００１（配列番号：２２）である。図２９ＥはｐＡＶＴＧＦＰ００６（配列番号：２３）である。
【図２９Ｅ】図２９は以下のプラスミドを示す。図２９ＡはｐＡＶＴｒＧＰ０３８（配列番号：１９）である。図２９ＢはｐＡＶＴｒＲＥＶ０３９（配列番号：２０）である。図２９ＣはｐＡＶＴｒＧＰ６４−０４０（配列番号：２１）である。図２９ＤはｐＡＶＴ００１（配列番号：２２）である。図２９ＥはｐＡＶＴＧＦＰ００６（配列番号：２３）である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、特段の記載が無い限り、当業者の技術範囲内である細胞生物学、分子生物学、細胞培養、ウイルス学等の従来の手法を使用することになる。これらの手法は現在の文献、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｄｓ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｅｌｉｓ  Ｊ．Ｅ．“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）及び  Ｂａｈｎｓｏｎ等、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５４：１３１−１４３（１９９５）に十分に記載されている。
【００５８】
「補体媒介」という用語は補体の関与する過程又は疾患を指す。典型的には、「補体媒介」疾患又は状態は、補体活性が疾患又は状態の伏在原因の１つとなっている、そして、補体活性の抑制又はブロッキングが疾患又は状態の範囲を低下させるものである。種々の補体媒介疾患又は状態の例を本明細書に記載する。
【００５９】
「補体蛋白」又は「補体経路成分」という用語は補体系の蛋白又はその受容体である。補体蛋白は全ての脊椎動物に存在する約３５の相互作用する蛋白及び糖蛋白の群である。補体蛋白は可溶性又は細胞表面上にあることができる（Ｓｉｍ  ａｎｄ  Ｔｓｉｆｔｓｏｇｌｏｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００４）３２（１）：２１−２７）。更に又、偶発的、又は望ましくない補体の攻撃から宿主細胞を保護する調節膜蛋白が存在する。補体蛋白は古典的経路において機能するもの、例えばＣ２、又は代替経路において機能するもの、例えば因子Ｂであることができる。少なくとも６補体蛋白はプロテアーゼである。例えば後述する例示的リストに包含される蛋白は補体蛋白：Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２−９、因子Ｂ、因子Ｄ、因子Ｈ、因子Ｉ、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、ＣＲ４、プロペルジン、Ｃ１（Ｉｎｈ）、Ｃ４ｂｐ、ＭＣＰ、ＤＡＦ、ＣＤ５９（ＭＩＲＬ）及びＨＲＦである。
【００６０】
野生型という用語は、ネイティブと互換的に使用され、本明細書においては哺乳類ゲノム、天然に存在する核酸、天然に存在する個体又は動物等によりコードされる天然に存在する蛋白に関する。
【００６１】
「補体蛋白変異体」、「補体蛋白突然変異体」又は「補体蛋白類縁体」は互換的に使用され、そしてネイティブ（天然に存在する）親蛋白の特性の全てを必ずしも保持していないか、又はネイティブ親蛋白と比較して少なくとも１つ改変された特性を有する、親蛋白の構造的誘導体をさす。類縁体又は変異体は、蛋白のネイティブアミノ酸配列に関して、アミノ酸を置き換え、置換、欠失、及び／又は付加することにより製造される。置換又は挿入は典型的には天然に存在するアミノ酸が関与するが、合成又は非従来のアミノ酸も同様に包含してよい。一部の実施形態においては、類縁体又は変異体は蛋白を突然変異させること、例えばそれをコードする核酸を突然変異させることにより製造する。類縁体は典型的にはネイティブ親蛋白のアミノ酸配列の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％を保持することになる（例えば全親蛋白の長さに渡り、又は、特定の実施形態においては、親蛋白の特定のドメイン又は部分に渡り測定した場合に天然に存在する親蛋白に関してそのようなパーセントアミノ酸配列同一性を有する）。類縁体は又アミノ酸配列の一部分を含む完全長類縁体のフラグメント（例えば少なくとも３０、５０、７０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００又は７００アミノ酸、又は類縁体のドメインの１つ又はサブセットを含む）を包含し、そして親蛋白又は完全長類縁体の生物学的活性１つ以上を保持しているか、又はこれらの生物学的活性の１つ以上を抑制する。
【００６２】
「相当する」という用語は特定の蛋白におけるアミノ酸に言及する場合、その特定の蛋白における特定のアミノ酸、及び蛋白に同様の機能を与える、関連する又は同様の蛋白におけるアミノ酸を指す。例えば、ヒト補体因子Ｂにおけるアミノ酸は、通常は２つのアミノ酸配列をアラインさせることにより求められる、ネズミ補体因子Ｂにおける、又は因子Ｂのヒト対立遺伝子変異体におけるアミノ酸に相当させて発見してよい。例えば当業者であれば２つの関連する配列、例えば配列番号２及び１６をアラインさせることにより例えば、ＢＬＡＳＴプログラムを用いながら、相当するアミノ酸を求めることができる。更に又、相当するアミノ酸は関連又は未関連の蛋白内のアライニグモチーフ（例えばプロテアーゼ切断モチーフ）により求めることができる。そのようなアライメントは又、標的蛋白のコンセンサス配列又はそのドメインを誘導するために使用してよい。
【００６３】
本明細書においては、「遺伝子」という用語は典型的には蛋白のコーディング領域を指す。しかしながら、一部の文脈においては、「遺伝子」という用語は又、プロモーター、エンハンサー、スプライシング部位（アクセプター及び／又はドナー）、ポリアデニル化シグナル、イントロン、５’未翻訳領域、３’未翻訳領域等のような、コーディング領域に作動可能に連結したエレメント（例えば調節エレメント）を指していることが明らかである。
【００６４】
本明細書においては、場合によりトランスジーンと称する「目的の遺伝子」とは、核酸ベクター又はベクターコンストラクトの原料と相対比較して非相同遺伝子又は外来性遺伝子である。即ち、例えば、ＢＩＶベクターの場合は、目的の遺伝子は一般的にＢＩＶ遺伝子ではない。一部の実施形態においては、目的の遺伝子は治療用遺伝子である。
【００６５】
「パッケージング配列」という用語はビリオン、ウィルス粒子又はウィルス様粒子内にウィルス核酸をパッケージングするために必要な配列である。例えばＢＩＶにおいては、パッケージング配列は一般的に５’主スプライスドナー及びｇａｇ遺伝子の上流領域の間の領域に位置する。本発明のベクターは他のウィルス、例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２又はＳＩＶのようなレンチウィルスに相当するパッケージング配列を包含してよい。パッケージング配列は１０００もの多くのヌクレオチド、又は僅か５０のヌクレオチドを包含してよい。パッケージング配列領域の大きさは当業者が容易に測定できる。
【００６６】
「製薬上許容しうる」という用語は連邦又は州政府の規制機関により認可されているか、又は米国薬局方又は人における使用に関する他の一般的に認知された薬局方に記載されていることを意味する。
【００６７】
「治療上の利益」とは必ずしも特定の疾患又は状態（本明細書に記載する何れかの疾患又は状態を包含する）の治癒ではなく、むしろ疾患又は状態の軽減を最も典型的には包含する結果、疾患又は状態の排除、疾患又は状態に関連する症状１つ以上の低減、一次的な疾患又は状態の発生に起因する二次的な疾患又は状態の予防又は軽減、状態又は疾患を発症する可能性の減衰、疾患又は状態の重症度の減衰、疾患又は状態の性質の変化、疾患又は状態の経過の短縮化、疾患又は状態の進行又は悪化の緩徐化又は防止、及び／又は疾患又は状態の防止を包含する。
【００６８】
「形質転換した」とは外因性、非相同又は外来性の核酸が細胞内に導入される何れかの手段を包含する意味を有する。それらは当該分野で知られる通り核酸自身、プラスミド（トランスフェクション）、ウィルス（感染又は形質導入）、合成担体分子等を用いて行うことができる。形質転換された細胞は目的の外来性核酸を運ぶ種々の方法の何れかで処理されるものである。そのような細胞は体細胞、胚性幹細胞ではない幹細胞、そして胚性幹細胞であることができる。
【００６９】
「ベクターコンストラクト」又は「ベクター配列」又は「転移ベクター」とはヌクレオチド配列、トランスジーン、蛋白又は治療用発現産物の発現を指向することができる組み立て物を指す。本発明の一部の実施形態においては、ベクターコンストラクトは転写を開始することができる５’配列（作動可能に連結したプロモーター領域を含む）；ウィルスゲノム由来のＤＮＡセグメント；及び／又はレンチウィルス又はレトロウィルスのようなウィルス由来のパッケージング配列を包含できる。１つの実施形態において、本発明はＢＩＶゲノム由来のＤＮＡセグメント、ビリオンにＲＮＡをパッケージングするためのパッケージング配列、ＤＮＡセグメントに作動可能に連結した第１のプロモーター、及び第２のプロモーターに作動可能に連結したトランスジーンを含むＢＩＶベクターコンストラクトを提供する。１つの実施形態において、ＢＩＶベクターコンストラクトのパッケージング配列はＢＩＶパッケージング配列である。
標的分子
「標的分子」とは経路に関与することができる、それ自体、又はその活性をモジュレートすることにより経路のモジュレーションをもたらすことができる分子である。標的分子は必ずしも経路に直接関わる必要はなく、例えばそれは、別の第２の分子に影響する能力を有してよく、そしてその分子が経路に直接関与する分子に影響してよい。本発明の一部の実施形態において、標的分子の分量及び／又は活性は増加、減少、または維持されてよい。これは限定しないが例えば、標的分子の発現をモジュレートすること、又は標的分子の少なくとも一部を脱安定化又は排除すること、分子を封鎖すること、及び／又は、標的分子の生物学的活性１つ以上を改変することにより、達成してよい。一部の実施形態においては、標的分子の発現をモジュレートすることは、標的分子が蛋白又は核酸である場合は、標的分子に関してコードしている核酸少なくとも１つで細胞（例えばインビトロ又はインビボ）を形質転換することにより達成される。一部の実施形態においては、標的蛋白は、標的蛋白を脱安定化するか、その活性を低減する結合分子を利用することにより、脱安定化することができるか、又はその活性を停止又は低減することができる。一部の実施形態においては、標的蛋白に結合することにより標的蛋白の脱安定化をもたらす結合分子を利用する。一部の実施形態においては、標的蛋白を切断するプロテアーゼを使用することにより標的分子の少なくとも一部分を脱安定化又は排除することができる。一部の実施形態においては、プロテアーゼは標的分子内の１２３４５６７８９１０又はそれより多い部位において標的分子を切断する。本発明の一部の実施形態は標的分子を抑制する。本発明の抑制剤は限定しないが例えば結合分子、例えば抗体分子（並びにその相同体、類縁体及び修飾又は誘導された形態）、例えば免疫グロブリンフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ、小分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ペプチドミメティック、及び有機化合物を包含する。
【００７０】
補体系は蛋白分解の連鎖反応、及び、例えば侵襲性の微生物の排除をもたらす蛋白複合体の組み立てを媒介することができる。３つの活性化経路（古典的、レクチン、及び代替経路）及び溶解経路がこれらの事象を調節する。
【００７１】
図１１に示すように古典的経路においては第１の成分（Ｃ１）のコラーゲン性のサブ成分であるＣ１ｑが免疫複合体内の免疫グロブリンに結合し、そしてその関連するセリンプロテアーゼであるＣ１ｒ及びＣ１ｓが活性化される。この補体カスケードはその後のＣ４及びＣ２の切断とその後のＣ３活性化により開始される。結果として生じるＣ３ｂフラグメントはオプソニンとして作用するのみならず、溶解経路における膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の形成ももたらす。自然免疫においては認識分子（レクチン）及びマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）−関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）と称されるセリンプロテアーゼよりなる複合体が、レクチン経路を介して、微生物の表面上の炭水化物に結合する際に、Ｃ４及びＣ２を活性化する。この結合は免疫グロブリンの非存在下に起こる。顎のある脊椎動物において観察されるレクチン経路の認識分子はＭＢＬ及びフィコリンであり、これらは両方ともＣ１ｑのようなコラーゲン様ドメイン及びＧｌｃＮＡｃに対する共通の結合特異性を有する炭水化物結合ドメインの存在を特徴とする。ＭＡＳＰ及びＣ１ｒ／Ｃ１ｓは同じドメイン組織を共有しており、そしてセリンプロテアーゼのサブファミリーを形成している。
【００７２】
自然免疫におけるレクチン補体経路は、適応免疫における古典的な補体経路と、例えばそれらの成分の構造及び機能に関して、緊密に関連している。両方の経路は典型的にはコラーゲン状の蛋白及びマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）／Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓファミリーよりなる複合体により開始される。古典的経路はレクチン経路の後に出現すると推定されている。
【００７３】
図１２に示す代替補体経路の活性化は、Ｃ３ｂ（又はＣ３ｉ）が細胞及び例えば微生物の他の表面成分に結合した場合に開始される。Ｃ３ｂは又ＩｇＧ抗体にも結合できる。次に代替経路の蛋白である因子ＢがＣ３ｂに結合してＣ３ｂＢを形成する。次に因子Ｄが結合因子Ｂを分裂させてＢｂ及びＢａとし、Ｃ３ｂＢｂを形成する。次にプロペルジンがＢｂに結合して典型的には数百のＣ３分子を酵素的に分裂してＣ３ａ及びＣ３ｂとすることができるＣ３コンバターゼとして機能するＣ３ｂＢｂＰを形成する。代替補体経路はこの時点で活性化される。Ｃ３ｂの一部はその後Ｃ３ｂＢｂの一部と結合してＣ５分子をＣ５ａ及びＣ５ｂに分裂することができるＣ５コンバターゼであるＣ３ｂＢｂＣ３ｂを形成する。
【００７４】
Ｃ３ｂは血漿中遊離であるため、それは宿主細胞又は病原体の表面の何れかに結合できる。宿主細胞に対して補体活性化が進行しないようにするためには、補体活性化の過程を途絶させる幾つかの異なる種類の調節蛋白がある。補体受容体１（ＣＲ１又はＣＤ３５）及びＤＡＦ（ＣＤ５５としても知られている）は細胞表面上のＣ３ｂとの結合において因子Ｂと競合し、そして既に形成されたＣ３ｂＢｂ複合体からＢｂを除去することもできる。Ｃ３コンバターゼの形成は又、第Ｉ因子と称される血漿プロテアーゼがＣ３ｂを切断してその不活性型であるｉＣ３ｂにする場合にも防止できる。第Ｉ因子はＣ３ｂ結合蛋白コファクター、例えばＣＲ１及び蛋白分解の膜コファクター（ＭＣＰ又はＣＤ４６）と共に作用する。他の補体調節蛋白は、因子Ｂと競合するか、コンバターゼからＢｂを排除するか、第Ｉ因子に対するコファクターとして機能するか、又は脊椎動物細胞に結合したＣ３ｂに優先的に結合する因子Ｈである。
【００７５】
標的分子は、限定しないが、免疫学的経路の成分又はその変異体、例えば古典的補体経路の成分；代替補体経路の成分又はレクチン補体経路の成分を包含する。一部の実施形態においては、１つより多い標的分子がモジュレート及び／又は作用されてよい。一部の実施形態においては、代替補体経路の成分はＣ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｂＢ、ｆＢ（因子Ｂ）、ｆＤ（因子Ｄ）、Ｃ３ｂＢｂ、Ｃ３ｂＢｂＣ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ５ｂ６−９、ＭＡＣ（膜攻撃複合体）及びそのフラグメント及びその成分よりなる群から選択される。一部の実施形態においては、古典的補体経路の成分はＣ１ｒ、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｓ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ４ａ、ＭＢＬ、ＭＡＳＰ、Ｃ２、Ｃ２ｂ、Ｃ４ｂＣ２ａ、Ｃ３、Ｃ３ｂ、Ｃ３ａ、Ｃ４ｂＣ２ａＣ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ５ｂ６−９及びＭＡＣよりなる群から選択される。
【００７６】
炎症を開始又は促進する標的分子は低減された発現及び／又は活性から利益を被り、そしてプロペジン、ＴＧＦβ、補体因子Ｂ（ヒト、アクセッション番号ＮＰ００１７０１、Ｋａｖａｎａｕｇｈ等、Ｍｏｌ．Ｉｍｍ．４３（７）８５６，２００６；マウス、アクセッション番号ＮＰ０３２２２４ｍ，Ｂｏｒａ等、Ｊ．Ｉｍｍ．１７７（３）１８７２、２００６）、補体因子Ｄ及び他の補体系因子、例えばＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９を包含する。即ち、目的の送達手段は、例えば、特異的抗原結合ポリペプチド、可溶性受容体、抑制性核酸、リボザイム、アプタマー、触媒抗体、受容体のドッキングを防止すること、又はそのような結合を不可逆とすること、酵素活性を除去すること等のような機能を妨害するアミノ酸置換を担持した分子を発現できる。或いは、受容体のような標的分子と競合できるが炎症を活性化又は促進する点においては無効である分子を炎症減衰のための競合的抑制剤として使用できる。更に又、何れかの１つの分子の特定の活性又は機能の１つ以上である改変された活性、又は無（欠落した）活性を有する補体因子を本発明の実施において使用できる。改変とは、より高活性で作動すること、活性のより高値のレベル又は活性のより低値のレベルで提示されることのような、通常の雰囲気における条件下に得られたものとは異なる活性又は機能を意味する。当該分野で知られた発現又は活性を弱める他の手段も実施できる。
【００７７】
補体因子は頻繁には多機能性である。即ち分子は複数のドメインを有すると考えられる。例えば補体因子は、認識及び結合の機能又は活性を担持したドメイン；別の分子により認識されるドメインであって、その部位又はそれに隣接する領域が反応、変化又は切断され得るもの；生物学的活性、例えば酵素活性、例えばプロテアーゼ活性を有するドメイン等を有してよい。補体因子の生物学的活性はドメイン機能の何れか１つ以上が改変された場合に減衰又は無効化されることができ、そしてあるドメインの改変は別のドメインの正常な機能発揮に対して影響してもしなくてもよい。蛋白のドメインを改変することは例えばドメインにおけるアミノ酸を置換、挿入及び／又は欠失させること、そして、所望の特性に関して試験することにより、達成することができる。ドメインの位置が未知である場合でも、系統的な方策を用いることにより改変された機能を有する変異体を位置決めして獲得することができる。
本発明の経路のモジュレーター及び分子
多くの分子を眼の疾患に関連するもののような補体媒介疾患の治療においてターゲティングすることができる。炎症を緩和又は緩解すること、又は炎症を継続させないことが目的である場合、本発明は部分的にはそのような結果を達成するための分子の局所的又は全身性の送達を有する方法に関する。即ち、本発明の一部の実施形態においては、分子は、炎症を開始、それに寄与、又はそれを促進する標的分子の発現又は活性を抑制するもの、又は炎症を弱化させる標的分子の発現又は活性を増強するものであることができる。
【００７８】
一部の実施形態においては、本発明は本明細書に記載した経路の成分の何れか１つ以上の活性のモジュレーションを介して経路をモジュレートすること、及び、本明細書に記載した経路の成分の活性をモジュレートするための方法の何れかを使用することを意図する。
【００７９】
免疫学的経路及び過程は動物における状態（例えば疾患）の進行、維持、及び／又は、抑制に寄与することができる。本発明は部分的には、例えばインビトロ又はインビボで免疫学的経路をモジュレート（例えば増強、増大、抑制、低下又は一般的には維持）する方法を提供する。本発明の一部の実施形態は免疫学的経路を試験するため、関連する疾患の状況を試験するため、疾患の状況のための治療法を開発するため、動物における疾患の状況を生じさせるため（例えばマウス又はラットのような動物における疾患モデルを開発するため）、又は薬剤をスクリーニングするために使用できる。
【００８０】
一部の実施形態においては、標的分子は例えば本明細書に記載した補体経路の成分である。本発明の一部の実施形態は古典的補体経路；代替補体経路又はレクチン補体経路をモジュレートすることを包含する。
【００８１】
本発明の一部の実施形態は炎症及び／又は補体活性を低減、増大又は防止する。本発明の一部の実施形態は補体の機能又は活性をモジュレートする。補体は同調して機能する多くの因子を含んでおり、そして、多くの分子及び因子が補体因子の存在及び活性を調節又は制御する補体として古典的には発見されていなかったため、そのような補体因子又は補体の調節分子の何れも、ベースラインと比較した場合に補体の活性を増強又は低減することのような、補体の活性及び機能に影響を与える手段としての本発明の入り口として、又は標的分子として機能することができる。
【００８２】
本発明による補体経路の抑制は、例えば補体経路における蛋白の発現（例えば転写及び／又は翻訳）又は生物学的活性に直接影響することにより、又は、補体経路における蛋白に結合するか、あるいは代替経路を介した補体の活性化に寄与する（正又は負）蛋白の能力に直接影響することにより、達成することができる。一部の実施形態においては、蛋白の発現は蛋白の転写又は蛋白の翻訳の何れかを指す。従って、本発明の一部の方法は蛋白を天然に発現する（例えば動物における）蛋白の転写及び／又は翻訳を抑制することができる（例えば蛋白の発現を抑制する剤を投与すること、及び／又は、低減した蛋白発現を有するように動物を遺伝子的に修飾することによる）。別の実施形態においては、補体経路の抑制は、経路の活性の何れかの計測可能な（検出可能な）低減（例えば低下、ダウンレギュレーション、又は抑制）として、例えば、代替補体経路内の蛋白の発現及び／又は生物学的活性の何れかの計測可能な低減等により、本明細書においては定義される。更に別の実施形態において、本発明は補体因子Ｈ、ＤＡＦ等のような補体活性を減衰する因子の発現及び／又は機能を増強させることに関する。
【００８３】
一部の実施形態においては、目的のベクターは補体の知られた抑制剤、例えばＣ１エステラーゼ阻害剤（Ｋｉｒｓｃｈｆｉｎｋ＆Ｍｏｌｉｎｅｓ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．２，１０７３，２００１）又はコンプスタチン（Ｎｉｌｓｓｏｎ等、Ｂｌｏｏｄ，９２，１６６１，１９９８）を発現できる。補体系をモジュレートし、そして目的の代替標的である他の標的分子はＨｔｒＡ１（Ｏｋａ等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１，１０４１，２００３；これはＣ３及び因子Ｂの発現の知られた刺激原であるＴＧＦβシグナリングを抑制する）及びＣＲＰを包含する。
【００８４】
一部の実施形態においては、標的分子の活性は減衰、低下、増大、増強又は維持される。これは種々の手法を用いて達成できる。一部の実施形態においては、結合分子（例えば蛋白、リガンド、受容体又は抗体）は標的分子に結合する。一部の実施形態においては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより大型の結合分子が標的分子に結合する。一部の実施形態においては、結合分子は標的蛋白に結合し、そして、例えば標的分子の活性に関与する標的分子上の部位の結合をブロックするか、部分的にブロックするか、又はそれに競合することにより；標的分子を封鎖することにより；リガンド（例えばネイティブリガンド）との標的分子の結合に対して競合することにより；標的分子が分解されるようにすることにより（例えばＦｃ部分のようなマクロファージ結合部分を含む結合蛋白を利用したマクロファージターゲティング分解等）により、標的蛋白を抑制する。
【００８５】
本発明の実施における１つの方策において本明細書で考察する通り、標的分子のコーディング配列（例えば炎症経路に関与するか、それを調節するもの）は、核酸又は蛋白に関わらず、低い作動可能性又は非作動可能性の発現産物を生じさせるため；優性阻害発現産物を生じさせるため；より作動可能であるか、又はより高値の活性を有する発現産物を生じさせるため；又は、自身の特定の機能が低減又は無効化された活性を有するように操作されている分子を生じさせるために、改変及び／又は操作することができる。結合又はドッキングの機能、酵素機能等を有する標的分子、例えば複数の機能を有するドメイン又は断片化部分を有するものが、活性の選択的減衰のための適当な標的である。例えば、標的分子は天然の受容体に結合したり、それに不可逆的に結合したりしないように改変できる。標的分子は酵素活性が消失又は減衰するように操作することができる。そのような変化は例えば部位指向性突然変異誘発による等、アミノ酸置換を導入するための当該分野で知られた物質及び方法を用いながら作成できる。本発明による治療に適する一部の障害は、当該分野で知られる通り炎症サイトカインの放出又は活性化、血管漏出、白血球浸潤、及び／又は組織損傷を特徴とする炎症を誘発されるか又は症状として有してよい。即ち、本発明の目的のためには、炎症を呈する疾患は、病因として炎症を有するもの、又は、疾患過程の間の症状又は顕在病状として、炎症の特徴を有するものである。
【００８６】
別の実施形態においては、結合能力を有する分子を用いて標的分子を捕獲して封鎖することにより、それらが相互作用してそれらの正常な生物学的機能を実行することを防止できる。即ち、例えば可溶性補体受容体又は炎症のインデューサーに結合する特定の分子を目的のベクターコンストラクトを用いながら送達又は局所発現させることにより、例えば、結合している分子がそれらのプロ炎症活性を発揮することを最小限とすることができる。
【００８７】
例えば、炎症を弱化させる標的分子は増強された発現及び／又は活性から利益を被り、そして例えば、補体受容体１（ＣＲ１、別名ＣＤ３５、Ｃ３ｂに結合、ＣＲ１の可溶性形態はＷｅｉｓｍａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９、１４６、１９９０に記載されている）；Ｃ４結合蛋白及びその結合部分；クラステリン、Ｓ蛋白及び相同制限因子（ＨＲＦ）、これらの３種全てがＭＡＣ形成を抑制；補体受容体１−関連蛋白／遺伝子ｙ（Ｃｒｒｙ）；補体因子Ｉ（Ｃ３ｂを分解）；補体因子Ｈ（因子Ｂの３ｂへの結合を抑制する）；ＤＡＦ（別名ＣＤ５５、Ｃ３コンバターゼを解離）；膜コファクター蛋白（ＭＣＰ，別名ＣＤ４６、補体因子Ｉのコファクター）；反応溶解の膜抑制剤（別名ＭＩＰ又はＣＤ５９）、膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の形成を防止；及びＦＨＬ−１を包含する。即ち、目的の送達手段は細胞（例えば眼の細胞）内に、上記したもののような蛋白を発現する核酸の追加的コピー又は発現されたコピーを導入することができるか；又は、例えば作動可能に連結したエンハンサー又は誘導プロモーターを挿入することにより内因性コーディング配列の発現を増強する手段を導入することができ、そして例えば米国特許５，２７２，０７１及び６，３０３，３７９を参照できる。発現を行うための他の手段及び方法は当該分野で知られる通り実施できる。本発明は又蛋白の送達を意図する。従って、蛋白又はペプチドを発現させることの如何なる考察も例えば局所的及び／又は全身性の蛋白そのものの直接の送達も意図している。
【００８８】
本発明によれば、天然に存在する補体蛋白と比較して構造的に修飾されており、そしてこのため、蛋白分解活性；安定性；結合親和性；標的特異性；調節蛋白に対する感受性；蛋白分解に対する感受性；及びコファクターの必要性のような特性１つ以上において機能的修飾を有する補体蛋白類縁体が提供される。補体蛋白類縁体におけるこれらの性質の修飾はその補体媒介活性に直接又は間接的に影響する場合がある。これらの類縁体は補体系をモジュレートするために使用できる。補体蛋白の蛋白分解活性、安定性、標的に対する結合親和性、調節蛋白に対する感受性及び／又は蛋白分解に対する感受性を増大又は低下させてよい。基質特異性を広範化又は狭小化してよく、及び／又は、コファクターの必要性の厳密性を増減又は根絶してよい。一部の実施形態においては、修飾された補体蛋白は上記した特性を制御する領域における突然変異によりもたらされる。
【００８９】
一部の実施形態においては、本発明は例えばＣ１ｒ、Ｃ１ｓ、因子Ｂ、因子Ｄ、因子Ｉ、Ｃ３ｂ及び／又はＣ２の類縁体及び／又は抑制剤に関する。本発明は又、これらの類縁体を製造するための方法及びコードしているポリヌクレオチド、突然変異を包含するアミノ酸配列、補体関連障害の治療における治療薬としてのこれらの類縁体の医薬組成物、及び試薬として、例えば血清又は組織試料中の補体蛋白の競合的ＥＬＩＳＡのための標準物質として、これらの類縁体を使用する診断方法を提供する。
【００９０】
補体蛋白を修飾するための突然変異は、例えば短コンセンサスリピート（ＳＣＲ）、フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）ドメイン及び／又はプロテアーゼドメインにおけるか、又は基質、調節蛋白又はコファクターと結合又は会合する何れかの他の領域におけるもののような、１つ以上のアミノ酸の突然変異（例えば置換）を包含する。アミノ酸置換は少なくとも１つのアミノ酸から、全ドメイン又は１つより多いドメイン（例えばいくつかのＳＣＲ）を置換すること；或いは上記の組み合わせを含む。置換のほかに、１つ以上のアミノ酸残基又はドメインの付加及び欠失もおこなってよい。
【００９１】
一部の実施形態においては、多くの補体プロテアーゼファミリーのプロテアーゼドメインは（ａ）補体ファミリーの第２のメンバー、又は（ｂ）セリンプロテアーゼスーパーファミリーのメンバーの何れかのプロテアーゼドメインで置換される。（ａ）の例は因子Ｂのプロテアーゼドメインによる因子Ｉのプロテアーゼドメインの置換である。（ｂ）の例はキモトリプシン又はエラスターゼのプロテアーゼドメインによる置換である。そのような置換は補体プロテアーゼの基質特異性を改変することになる。例えば、Ｃ３コンバターゼの基質特異性は、Ｃ３コンバターゼがその通常の基質の代わりに毒素を切断することができるように改変してよい。一部の変形例においては、類縁体はかなりのプロテアーゼ活性を欠くか、又は低下したプロテアーゼ活性を有することになるが、しかし、例えば検出可能な結合親和性で補体成分に結合することになる。
【００９２】
本明細書に記載する通り、本発明は特に因子Ｂ類縁体のような補体蛋白類縁体を用いて補体活性を抑制する方法を提供する。後述する実施例の一部で説明する通り、一部の場合においては、１つの種に由来するネイティブの因子Ｂは別の種に由来する補体反応／経路における活性を有してよい。従って、本発明は又別の種における補体活性を抑制するための１つの種に由来する補体蛋白類縁体を包含する。
【００９３】
一部の実施形態においては、補体蛋白類縁体は天然に存在する補体成分に対するグリコシル化パターンとは区別可能なグリコシル化パターンを含んでよく、或いは、グリコシル化を全て欠いていてもよい。炭水化物は、例えばイヌ膵臓ミクロソーム系の場合（例えばＭｕｅｃｋｌｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｄｉｓｈ（１９８６）Ｃｅｌｌ４４：６２９及びＷａｌｔｅｒ，Ｐ．（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９６：８４参照）等のように、インビトロのＮ−及び／又はＯ−連結グリコシル化のためのグリコシル化部位配列を含むポリペプチド類縁体に付加、及び／又はそれより除去してよい。本発明の体補蛋白類縁体はグリコシル化部位に相当するアミノ酸配列の付加又は欠失／突然変異を含むように製造してよく、例えば蛋白のグリコシル化パターン／状態を変化させることは蛋白の機能的特性を変化させる場合がある。例えばｆｂ２及びｆｂ３（因子Ｂ類縁体）はＮグリコシル化部位を除去するＮ２８５Ｄ置換を含む。Ｎグリコシル化部位の消失は蛋白の特性を改変する。同じ作用は、改変されたグリコシル化パターンを有するか、又はこのＮ２８５をグリコシル化しない細胞において蛋白を生産することにより達成してよい。例えばｆＢ蛋白又は類縁体はＮ２８５をグリコシル化しないＥ・コリ細胞において生産してよい。一部の実施形態においては、ｆｂ２又はｆｂ３の何れかの配列を含む蛋白は、相当するアミノ酸２８５がアスパラギンである場合を除き、アミノ酸２８５をグリコシル化しない細胞（例えばＥ・コリ）において生産される。
【００９４】
一部の実施形態においては、本発明の組成物又は分子はＰＥＧ化され、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ等、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ５４（４）：４５９−４７６（２００２）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２２（５）：４０５−４１７（２００１）；Ｆｅｅ  ａｎｄ  ＡｌｓｔｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ６１（３）：９２４−９３９（２００６）；Ｋｏｄｅｒａ等、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ２３（７）：１２３３−１２７１（１９９８）；Ｍｏｒａｒ、Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ１９（４）：３４（２００６）；及びＶｅｒｏｎｅｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｓｕｔ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ１０（２１）：１４５１−１４５８（２００５）を参照できる。
【００９５】
特定の実施形態においては、カルボキシ末端又はアミノ末端、又は両方を化学修飾する。アシル化（例えばアセチル化）又はアルキル化（例えばメチル化）のようなアミノ末端修飾、及びアミド化のようなカルボキシ末端修飾、並びに他の末端修飾、例えば環化を本発明の種々の実施形態に組み込んでよい。特定のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端の修飾及び／又はペプチドの伸長（例えば非相同ポリペプチド、例えばアルブミン、免疫グロブリン又はその部分、例えば免疫グロブリンＦｃドメインへの融合）をコア配列に対して行うことにより、好都合な物理的、化学的、生化学的、及び薬理学的な特性；例えば増強された安定性、増大した力価及び／又は薬効、血清プロテアーゼに対する耐性、望ましい薬物動態特性、及びその他のものをもたらすことができる。
【００９６】
本発明は更に標的蛋白の少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、３００、５００、又は６００アミノ酸部分を含有する、及び／又は、蛋白の１、２又は３ドメインを含む、そして野生型補体蛋白又は類縁体の生物学的活性１つ以上を有し、及び／又は補体系（古典的経路、代替経路の何れか、又は両方）の特徴の抑制剤として機能する、補体蛋白のフラグメント（補体蛋白類縁体のフラグメントを包含する）である類縁体を提供する。
【００９７】
本発明の類縁体は種々の手法、限定しないが例えば化学合成により、又は組み換え類縁体の発現により製造できる。
【００９８】
例示を目的とするが、因子Ｂは自身の活性がモジュレート、例えば抑制される標的分子の例として提示される。更に例示を目的とするが、因子Ｂの特定の類縁体を本明細書に記載する。因子Ｂは例えば代替経路の活性化を抑制又は低減するために多くの方法において操作することができる。例えば、因子Ｂ結合分子、例えば抗体誘導分子又はアプタマーは、例えば分子がコンバターゼの形成に寄与できなくなるように、因子Ｂに結合及び／又はこれを封鎖することができる。抑制性の分子、例えばＲＮＡｉ分子、リボザイム又は触媒抗体を局所的に発現させることにより因子Ｂの発現を防止するか、これを破壊することができる。一部の実施形態においては、分子がもはや完全に適切には機能できなくなるように、因子Ｂの特定の部位を、例えば部位指向性突然変異誘発により改変することができる。一部の実施形態においては、分子の酵素部分又はドメイン（プロテアーゼ、これはセリンプロテアーゼである）を、分子がもはや酵素活性を有さないように、又は低減（例えば少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍又は１００倍低減）された酵素活性を有するように、例えばヒト因子Ｂ（配列番号２に示す）のアミノ酸７４０に相当する残基をＤから別のアミノ酸、例えばＮ、Ａ、Ｅ、Ｓ、Ｙ又はＧに改変することにより、改変することができる。本明細書に記載する特定の因子Ｂアミノ酸のナンバリングはシグナルペプチドを包含する全ポリペプチドに関連しており、そして配列番号２に反映されている。改変することができる因子Ｂの別の部位は、１）結合がより低い親和性（例えば、野生型因子Ｂと比較して２倍、５倍、１０倍、５０倍又は１００倍低減された親和性）で、又はより高い親和性（例えば、野生型因子Ｂと比較して２倍、５倍、１０倍、５０倍又は１００倍増大した親和性）で起こるようなプロペルジンに対する結合部位（プロペルジン結合ドメイン）；２）結合がより低い親和性（例えば、野生型因子Ｂと比較して２倍、５倍、１０倍、５０倍又は１００倍低減された親和性）で、又はより高い親和性（例えば、野生型因子Ｂと比較して２倍、５倍、１０倍、５０倍又は１００倍増大した親和性、これは配列番号２の２７９位及び／又は２８５位に相当するアミノ酸を他のアミノ酸で置換することにより達成してよく、この場合、例えば２７９位に相当する位置のアミノ酸をＧ、Ａ、又はＮで置換し、及び／又は２８５位に相当する位置のアミノ酸をＤ又はＡで置換する）で起こるようなＣ３ｂに対する結合部位（Ｃ３ｂ結合ドメイン）；３）因子Ｄが因子Ｂを切断してＢｂを形成する能力が低減しているか、もはや切断しないように因子Ｄにより作用される部位（例えば因子Ｄ切断部位において、例えば配列番号２の２５８、２５９又は２６０位に相当する位置におけるアミノ酸の少なくとも１つをＡに改変できる）、又は上記１、２、及び／又は３の組み合わせを包含する。因子Ｂは補体活性化において中枢的役割を有するため、因子Ｂは興味深い標的分子である。
「フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）」ドメイン（別名Ａ型ドメイン）は平均約２００アミノ酸である。これはｖＷＦにおいて３回、そして因子Ｂ、Ｃ２、ＣＲ３（Ｍａｃ−１）、ＣＲ４及び他の蛋白において１回観察される（検討文献はＣｏｌｕｍｂａｔｔｉ  ａｎｄ  Ｂｏｎａｌｄｏ（１９９１）Ｂｌｏｏｄ７７：２３０５）。ｖＷＦドメイン間の全体的配列同様性は典型的には、１８〜６４％の範囲である。
【００９９】
本発明は又、上昇した、低下した、又は検出不可能な補体媒介細胞溶解活性を示す修飾されたヒト因子Ｂを提供する。
【０１００】
本発明の一部の修飾された因子Ｂ類縁体は本明細書において考察するアミノ酸改変１つ以上を含み、そして更に、１つ以上の追加的なアミノ酸の置換、挿入又は改変（例えば少なくとも、または１、２、５、８、１０、１５、２０、５０、１００、又は２００を超えない改変）を有し、その類縁体は増大したＣ３ｂ及び／又は因子Ｄへの結合又は補体経路の抑制を媒介する本明細書において考察する因子Ｂ類縁体の他の生物学的活性を保持している。そのような類縁体は野生型因子Ｂ、例えば配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９９．９％、９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％又は７０％のアミノ酸配列同一性を有してよく、そして増大したＣ３ｂ及び／又は因子Ｄへの結合を保持している。
【０１０１】
本発明の一部の因子Ｂ類縁体はＣ３ｂ及び／又は因子Ｄへの野生型因子Ｂの結合と比較して、２倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍のファクターで上昇したＣ３ｂ及び／又は因子Ｄへの結合を有してよい。
【０１０２】
本発明の一部の実施形態は修飾された補体経路成分、例えばｆＢ３の生産において有用なポリヌクレオチド及び宿主細胞（又は宿主多細胞生物）に関する。これらの修飾された補体経路成分の補体媒介活性を単離及び試験する方法も提供される。本発明の一部の特徴はこれ等の修飾された補体経路成分が治療及び／又は予防の範囲内で活性成分となる医薬組成物に関する。本発明の一部の実施形態は修飾された補体蛋白の治療有効量を使用して補体媒介障害を治療する方法に関する。
【０１０３】
本発明の一部の実施形態は標的分子に結合する結合分子（例えば抗体又はそのフラグメント）を利用する。一部の実施形態においては、結合分子は例えば補体関係経路に関与するもののような標的分子の活性を抑制する。
【０１０４】
一部の実施形態においては、因子Ｂ及び／又は因子Ｄに結合する結合分子を利用し、例えば米国特許出願２００５０２６０１９８及びＰＣＴ公開ＷＯ００２１５５９を参照できる。一部の実施形態においては、結合分子は因子Ｂに結合し、そして第３の短コンセンサスリピートドメイン内で結合する。
【０１０５】
本発明の一部の実施形態は補体関係経路の成分に結合するペプチド、蛋白又は他の分子（例えば抗体又はアプタマー）を利用してよい。一部の実施形態においては、ペプチド又は他の分子は成分に結合し、そして別の成分による結合をブロック又はそれに競合する。一部の実施形態においては、ペプチド又は他の分子は成分に結合し、そして成分の活性をブロック又は抑制（例えば酵素触媒ドメインをブロック）及び／又は例えば他の成分により作用される部位をブロックする。これらの実施形態においては、作用される部位は切断部位又は酵素活性のための基質である別の部位（例えばホスホリル化部位又は脱ホスホリル化部位）であってよい。一部の実施形態においては、因子Ｂの結合特性を模倣しているがＣ３を活性化する能力は欠いているペプチドが利用され、例えばＰＣＴ公開ＷＯ００２１５５９を参照できる。一部の実施形態においては、本明細書に記載するペプチド又は蛋白を使用することができるか、又は核酸又はベクターを使用してそれらを発現することができる。一部の実施形態においては、多数の部位及び／又は成分に対して作用する多数のペプチドを利用する。
【０１０６】
本発明は（ｉ）因子Ｃ３ｂ及びＤの両方に結合する分子、例えばｆＢ３、二重特異性抗体等；（ｉｉ）因子Ｃ３ｂ及びＤの両方への増大した結合（そのネイティブ型と比較して）を有する補体蛋白類縁体；（ｉｉｉ）因子Ｄへの増大した結合（そのネイティブ型と比較して）を有する補体蛋白類縁体；及び（ｉｖ）Ｃ３ｂＢ複合体への増大した結合（そのネイティブ型と比較して）を有する補体蛋白類縁体を包含する。本発明は又上記ｉ〜ｉｖのような本発明の分子を使用しながら補体経路を抑制する方法を包含する。一部の実施形態においては、因子Ｃ３ｂ及びＤの両方に結合する分子は野生型ｆＢではない。一部の実施形態においては、因子Ｃ３ｂ及びＤの両方に結合する分子はｆＢ１、ｆＢ２又はｆＢ３ではない。
【０１０７】
一部の実施形態においては、増大した結合は、約１．５〜約１０，０００、約１０〜約１０，０００、約１００〜約１０，０００、約１，０００〜約１０，０００、約１．５〜約１，０００、約１．５〜約１００、約１．５〜約１０、約２〜約５、約２〜約１０、約５〜約１０、約５〜約２０、約１０〜約２０、約１０〜約３０、約２０〜約３０、約３０〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜約５００、約５００〜約１，０００、約１，０００〜約５，０００、又は約５，０００〜約１０，０００倍まで増大する。一部の実施形態においては、増大した結合は１．５、２、３、４、５、１０、５０、１００、５００、１０００、５０００又は１０，０００倍より高値に増大する。一部の実施形態においては、増大した結合は、例えば野生型蛋白と比較して免疫沈降により計測できる。上記（ｉ）の例として、結合はＣ３ｂに対する結合分子を用いた蛋白の免疫沈降、次に例えばＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイ又はウェスタンを用いた免疫沈降物中のＤの検出により計測でき、ここで増大した結合はウエスタンにおける増大した強度のバンドとして明らかになる。
【０１０８】
一部の実施形態においては、結合分子は、（ａ）配列番号２の概ね１６４位〜概ね２１０位、又は非ヒト因子Ｂ配列におけるそれに等価な位置を含む部分に相当するヒト因子Ｂの少なくとも一部分を包含する因子Ｂのエピトープ；（ｂ）配列番号２の概ね１６４位〜概ね１６６位、又は非ヒト因子Ｂ配列におけるそれに等価な位置に相当するアミノ酸配列を含むヒト因子Ｂの少なくとも一部分を包含する因子Ｂのエピトープ；（ｃ）配列番号２の概ね２０７位〜概ね２１０位、又は非ヒト因子Ｂ配列におけるそれに等価な位置を含むアミノ酸配列に相当するヒト因子Ｂの少なくとも一部分を包含する因子Ｂのエピトープ；又は、（ｄ）以下の位置、即ち：配列番号２の１６４、１６５、１６６、２０７、２０９，又は２１０又は非ヒト因子Ｂ配列におけるそれらの等価な位置の１つ以上に相当するアミノ酸を含むヒト因子Ｂの少なくとも一部分を包含する因子Ｂのエピトープ、から選択される因子Ｂの第３のＳＣＲドメインにおけるエピトープに結合する。更に別の態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下のアミノ酸位置、即ち：配列番号２の１６２、１６４、１６６、２０７、２１０、２１４、２１５、及び２１７又は非ヒト因子Ｂ配列におけるそれらの等価な位置の１つ以上に相当するアミノ酸を含む因子Ｂの第３のＳＣＲドメインにおけるエピトープに選択的に結合する。別の態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下のアミノ酸位置、即ち：配列番号２の１６２、１６４、１６６、２０７、２１０、２１４、２１５、及び２１７又は非ヒト因子Ｂ配列におけるそれらの等価な位置に相当するアミノ酸を含む因子Ｂの第３のＳＣＲドメインにおけるエピトープに選択的に結合する。更に別の態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下のアミノ酸位置、即ち：配列番号２の１６２、１６４、１６６、２０７、２１０、２１４、２１５、及び２１７又は非ヒト因子Ｂ配列におけるそれらの等価な位置に相当するアミノ酸よりなる因子Ｂの第３のＳＣＲドメインにおけるエピトープに選択的に結合する。抗体又は抗原結合フラグメントは因子Ｂの第３のＳＣＲドメインの一部分の三次元構造内の非線状エピトープに結合することができ、その場合、その部分は配列番号２の１６２〜２１７位又は非ヒト因子Ｂ配列の等価な位置に相当するアミノ酸位置により少なくとも定義される。
【０１０９】
一部の実施形態においては、結合分子は因子Ｂに結合し、そしてＣ３ｂＢｂ複合体の形成を抑制、防止、低減及び／又は排除する。一部の実施形態においては、結合分子は因子Ｂに結合し、そして因子Ｄによる因子Ｂの切断を抑制、防止、低減及び／又は排除する。一部の実施形態においては、結合分子はヒト因子Ｂへのモノクローナル抗体１３７９（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６２３０を担持するハイブリドーマにより生産される；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１０８）の結合を競合的に抑制する。一部の実施形態においては、結合分子はモノクローナル抗体１３７９（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６２３０）、モノクローナル抗体１３７９のヒト化又はキメラ形態、又は抗体１３７９又はそのヒト化形態の何れかの抗原結合フラグメント、例えば抗体１３７９の重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３及び／又は軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体（任意に結合親和性又は他の動態パラメーターを向上させる上記ＣＤＲにおける１、２、３、５、１０、１２、１５又は２０のアミノ酸の欠失、挿入及び／又は置換を有する）；又は例えばＥＬＩＳＡ又は他のイムノアッセイにより測定した場合にモノクローナル抗体１３７９との結合に関して競合する抗体、好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
【０１１０】
本発明の一部の実施形態においては、因子Ｄの活性をモジュレートする（例えば抑制する）。一部の実施形態においては、これは別の経路成分活性（例えば因子Ｂの、Ｃ３ｂの、及び／又はＣ３ｂＢの活性）のモジュレーションと組み合わせて行われる。因子Ｄの血清中濃度は比較的低値であると考えられている。一部の実施形態においては、因子Ｄは例えば抗体、アプタマー、経路成分の抑制性類縁体又は可溶性受容体の封鎖法のための標的分子であることができる。ＲＰＥ細胞とブルーフ膜の間の空間内への中和抗体又はそれに対するアプタマーのような因子Ｄ「抑制」分子の局所的発現は本発明の実施により得ることができる。一部の実施形態においては、蛋白のような因子Ｄ「抑制」分子を使用できる（例えば眼への注射による）。例えば米国特許６，９５６，１０７は因子Ｄ抑制剤に関するものである。一部の実施形態においては、抗体又はその因子Ｄ結合フラグメント、例えばモノクローナル抗体１６６−３２（アクセッション番号ＨＢ−１２４７６、ＡＴＣＣ）、モノクローナル抗体１６６−３２のヒト化又はキメラ形態、又は抗体１６６−３２の何れかの抗原結合フラグメント又はそのヒト化形態、例えば抗体１６６−３２の重鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３及び／又は軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体（任意に結合親和性又は他の動態パラメーターを向上させる上記ＣＤＲにおける１、２、３、５、１０、１２、１５又は２０のアミノ酸の欠失、挿入及び／又は置換を有する）；又は例えばＥＬＩＳＡ又は他のイムノアッセイにより測定した場合にモノクローナル抗体１６６−３２との結合に関して競合する抗体、好ましくはヒト化又はヒト抗体を利用する。
【０１１１】
代替経路の別の成分はＣＦＨである。本発明の一部の実施形態においては、ＣＦＨの活性をモジュレート（例えば抑制）する。一部の実施形態においては、これは別の経路成分活性（例えば因子Ｂの、因子Ｄの、Ｃ３ｂの、及び／又はＣ３ｂＢの活性）のモジュレーションと組み合わせて行われる。例えばＣＦＨの４０２位のチロシンはＡＭＤの低危険性と関連しているのに対し、その位置のヒスチジンは高危険性と関連している。ＣＦＨのＳＣＲ７に位置するＹ４０２Ｈ多形はまたＣＦＨスプライス変異体、ＦＨＬ−１にも観察されている（Ｅｓｔａｌｌｅｒ等、１９９１；Ｓｉｍ等、１９９３）。ＣＦＨ及びＦＨＬ−１は同様の補体調節機能を呈する（Ｚｉｐｆｅｌ＆Ｓｈｅｒｋａ，１９９９）。ＣＦＨは制御不能な補体の活性化を防止するための重要な抑制剤として機能する。発見されたｔｙｒ４０２ｈｉｓ多形は潜在的には眼の炎症に関連している。即ち、治療用のコーディング領域はＣＦＨ又はＦＨＬ−１分子の４０２位におけるチロシンをコードする核酸であることができる。分子を担持し、そして発現するように形質転換された細胞は、例えば炎症に関して、眼において有益な治療上及び／又は予防上の作用を有することになる。
【０１１２】
蛋白をコードする核酸の導入を考察する場合、本発明は又、蛋白そのものの導入も意図していると理解しなければならない。蛋白の導入を考察する場合、本発明は又、その蛋白をコードする核酸の導入も意図していると理解しなければならない。一部の実施形態においては、蛋白及びそれをコードする核酸の両方を導入する。
【０１１３】
更に又、本発明の核酸又は蛋白は例えば細胞療法として細胞を介して動物に送達又は投与することができる。例えば、特定の蛋白を投与又は送達する場合、これは蛋白を発現する細胞を投与又は送達することにより達成できる。一部の実施形態においては、蛋白は調節可能な、誘導可能な、及び／又はリプレッション可能なプロモーターを介して細胞から発現させる。一部の実施形態においては、目的の蛋白及び／又は核酸を発現するカプセル化された細胞を動物に送達し、例えばＰＣＴ公開ＷＯ０７０７８９２２を参照できる。動物に投与すべき細胞は自系、同種又は異種であることができる。一部の実施形態においては、自系の細胞をエクスビボで操作することによりそれらが本発明の分子を生産できるようにし、そして次に細胞を動物に導入し戻す。一部の実施形態においては、細胞を局所（例えば関節内に、硝子体内に、網膜内に、等）、又は全身（例えば静脈内）投与する。
【０１１４】
一部の実施形態においては、標的細胞は哺乳類細胞、例えば霊長類の細胞、及びヒトの細胞である。一部の実施形態においては、標的細胞は眼の細胞、例えばＲＰＥ細胞、網膜細胞、又は多能性細胞である。標的細胞はインビトロ、エクスビボ又はインビボであることができる。一部の実施形態においては、本発明において意図している遺伝子送達系は、宿主細胞ゲノム内の目的の遺伝子又はコーディング領域の安定な組み込みをもたらすことができる。一部の実施形態において、細胞は幹細胞である。幹細胞は限定しないが例えば多能性幹細胞、全能性幹細胞、造血幹細胞、癌幹細胞、及び胚性幹細胞を包含する。一部の実施形態においては、本発明において意図する多能性細胞は接合体又は分割球からの生存実体の増殖のためのものではない。本発明は又例えば眼の細胞を再生するための治療の必要な患者における眼内への移植のための部分的に未分化である細胞の使用を意図している。
【０１１５】
目的の遺伝子又は治療用遺伝子の限定しない例は、炎症誘導物質又は促進物質等の発現を低減する炎症抑制剤、例えばＤＡＦの発現を増強する発現産物をコードする核酸を包含する。
【０１１６】
一部の実施形態においては、本発明の分子はアプタマーである。アプタマーは抗体と同様、標的分子に結合する核酸配列である。所望の標的化合物又は分子に特異的に結合する特性を有するが、必ずしもある１本鎖の他方との相補塩基対形成によるものではなく、むしろ、リガンドのその受容体又は相手との、又は抗原の抗体との反応を模倣している、各々が独特の配列を有する核酸分子を得る技術がある。核酸分子はある標的化合物又は分子の特定のリガンドであることができる。核酸は種々の二次元及び三次元の構造を形成するために十分な能力を有し、そして単量体又は重合体にかかわらず実質的にいかなる化学物質に対してもリガンド又はバインダーとして作用する（特異的結合対を形成する）ために十分な化学的汎用性を有する。如何なる大きさの分子も標的として使用でき、例えば米国特許５，５６７，５８８；５，２７０，１６３；及び５，７５６，２９１を参照できる。アプタマーは本明細書に記載する抗体又は結合分子に関して説明した場合と同様に使用できる。一部の実施形態においては、本発明のアプタマーはチオアプタマーである（例えばＶｏｌｋ等、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１０８２（１），１１６-１１９（２００６）参照）。
【０１１７】
一部の実施形態においては、本発明の分子又は結合分子はＡＤＮＥＣＴＩＮＴＭのような抗体模倣体であり、やはり米国特許７，１１５，３９６を参照できる。ＡＤＮＥＣＴＩＮＴＭはフィブロネクチンから誘導されるターゲティングされる生物学的特徴を有するクラスである。
【０１１８】
一般的に、アプタマーを発見するためのインビトロの選択手法では無作為化された、又は突然変異誘発物質化された少なくとも一部分の領域を含有するＤＮＡ分子のプールを準備する。即ち、アプタマー選択のためのオリゴヌクレオチドプールは例えばＰＣＲプライマーの結合のために有用な所定の配列の約１５〜２５塩基の領域によりフランキングされた２０〜１００の無作為化ヌクレオチドの領域を含有する場合がある。オリゴヌクレオチドプールは標準的なＰＣＲ手法を用いて増幅することができるが、核酸配列の増幅を可能にする何れかの手段を使用することができる。次にプールをインビトロで転写することによりＲＮＡ転写物を作成できる。次にＲＮＡ転写物を選択スキームに付すことにより、もう１つの分子であるリガンド（例えば蛋白又は何れかの標的分子）に特異的に結合する核酸を単離してよい。次にリガンドに結合するＲＮＡ分子を逆転写して増幅することができる。選択された配列を別の選択工程に曝露できる。次にそのｃＤＮＡを増幅し、クローニングし、そして配列決定することにより標的リガンドに対する候補アプタマーを更に特性化できる。アプタマー配列が良好に発見されれば、アプタマーを追加的選択工程により更に最適化してよく、或いは、例えばより高い特異性を有する分子を得るために突然変異誘発により修飾することができる。アプタマーは、通常の生理学的状態を模倣した塩濃度及び温度の存在下におけるリガンド結合を目標に選択することが有益である場合がある。
【０１１９】
本発明で使用する核酸の多くの場合と同様、目的の核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであることができ、そして１本鎖分子であることができ、或いは、部分的又は完全に２本鎖であることができる。一部の実施形態においては、核酸は限定しないがＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡであってよい。一部の実施形態においては、核酸は蛋白をコードする。一部の実施形態においては、核酸は蛋白に対してコードしない。一部の実施形態においては、核酸は第２の核酸、例えばｍＲＮＡに由来する蛋白の発現を抑制する。
【０１２０】
アプタマーは、何れかの治療用核酸の場合と同様、標的蛋白に結合することができ、或いは、コーディング領域において、又は非コーディング領域、例えばイントロン又は上流／下流の調節配列において、標的核酸に結合することができる。
【０１２１】
有利な特性を備え持つように、その所望の核酸結合特性を減衰することなく、核酸を修飾する多くの方法が存在する。これらは当該分野で知られており、そしてＰＥＧ化、硫黄骨格修飾及びメチル化を包含する。
【０１２２】
「安定化された核酸分子」はインビボの分解（例えばエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによる）に対して相対的に耐性である核酸分子を意味する。安定化は長さ及び／又は二次構造の関数である場合がある。安定化は、例えば分子を安定化することができる二次構造を制御することにより行える。例えば核酸分子の３’末端が上流の領域に相補である場合は、その部分は折り戻し、そして分子を安定化させる「ステムループ」構造を形成することができる。
【０１２３】
「リボザイム」は特定の核酸配列を切断することができる核酸を指す。一部の実施形態内においては、リボザイムは特異的認識のためのアンチセンス配列、及び、ＲＮＡ切断酵素活性を含有するＲＮＡ分子を指すと理解され、例えば米国特許６，７７０，６３３を参照できる。
【０１２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般的にある遺伝子の発現に影響するその遺伝子の一部分に相補である小型オリゴヌクレオチドである。遺伝子発現は特定の遺伝子又はそのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを介して抑制することができる。一部の場合においては、治療の方策は炎症を開始又は加速すると考えられている１つ又は数種の遺伝子の発現を弱化することができ、例えば米国特許６，８２２，０８７及びＷＯ２００６／０６２７１６を参照できる。
【０１２５】
「小型干渉ＲＮＡ」又は「短鎖干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」又は「短鎖ヘアピンＲＮＡ」又は「ｓｈＲＮＡ」はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の形態である。干渉ＲＮＡは２本鎖ＲＮＡ又は部分２本鎖ＲＮＡ分子であることができ、それは標的核酸配列、例えばＶＥＧＦに対して相補である。マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）もまたこの範疇に属する。２本鎖ＲＮＡ分子は分子内の第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分との間の相補対形成により形成される。各部分の長さは一般的に３０ヌクレオチド長未満（例えば２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、又は１０ヌクレオチド）である。一部の実施形態においては、各部分の長さは１９〜２５ヌクレオチド長である。一部のｓｉＲＮＡ分子においては、ＲＮＡ分子の相補な第１及び第２の部分はヘアピン構造の「ステム」である。２つの部分は連結配列により連結されることができ、これはヘアピン構造における「ループ」を形成することができる。連結配列の長さは変動できる。一部の実施形態においては、連結配列は５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３ヌクレオチド長であることができる。連結配列は第１及び第２の部分を連結するために使用でき、そして当該分野で知られている。第１及び第２の部分は相補であるが、ヘアピン構造は３’又は５’オーバーハングヌクレオチド（例えば１、２、３、４、又は５ヌクレオチドオーバーハング）を含有していてよいため、完全に対称でなくてもよい。本発明のＲＮＡ分子はベクターから発現させるか、又は化学的又は合成的に製造できる。
【０１２６】
ｍｉＲＮＡは相同ｍＲＮＡとの相互作用を介して転写後に遺伝子発現を調節する小型ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは蛋白コーディング遺伝子由来の標的ｍＲＮＡにおける相補部位に結合することにより遺伝子の発現を制御することができる。ｍｉＲＮＡはより大きい２本鎖前駆体分子からプロセシングされる。前駆体分子は頻繁には約７０ヌクレオチド長のヘアピン構造であり、２５以上のヌクレオチドがヘアピン内で塩基対形成している。ＲＮＡｓｅＩＩＩ様酵素、Ｄｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒは前駆体を切断してｍｉＲＮＡを生成する。ｍｉＲＮＡは一般的に１本鎖であり、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称される蛋白複合体、又はｍｉＲＮＡに取り込まれる。ＲＮＡ−蛋白複合体は相補ｍＲＮＡをターゲティングする。ｍｉＲＮＡは翻訳を抑制するか、又は標的ｍＲＮＡを直接切断する（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ等、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：２２８（２００３）；Ｋｉｍ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ１９：１−１５（２００５））。
【０１２７】
核酸発現のＲＮＡｉ媒介抑制は相対的に特異性である。ＲＮＡｉ分子とターゲティングされた核酸との間の一部の塩基対のミスマッチはＲＮＡ干渉の作用を根絶することなく忍容され、例えばＷＯ２００６／０６２７１６を参照できる。本発明のＲＮＡｉは一般的に有意な抗ウィルス応答を示さない。
【０１２８】
ｓｉＲＮＡを設計するために当該分野で知られたスキームが存在する（例えばＥｌｂａｓｈｉｒｅ等、２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−８；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ等、２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３１６（４）：１０５０−８；及びＲｅｙｎｏｌｄｓ等、２００４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２（３）：３２６−３０参照）。ｓｉＲＮＡを作成するための詳細はＡｍｂｉｏｎ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅのような幾つかの市販元のウエブサイトに公開されている。何れかの潜在的なｓｉＲＮＡ候補の配列は一般的にＢＬＡＳＴアライメントプログラムを用いながら核酸配列の他の核酸配列との何れかの可能なマッチ又は多形があるかどうか確認することができる（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのインターネットウエブサイト参照）。典型的には、多くのｓｉＲＮＡを形成し、そしてスクリーニングすることにより有効な薬剤候補が得られ、例えば米国特許７，０７８，１９６を参照できる。本発明のｓｉＲＮＡはベクターから発現及び／又は化学的又は合成的に製造することができる。合成ＲＮＡｉは例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のような市販元から入手できる。ＲＮＡｉベクターも又例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅのような市販元から入手できる。
【０１２９】
トリプレックス分子はデュプレックスＤＮＡをターゲティングし、主溝に結合することにより共線状トリプレックスを形成し、これにより転写を防止又は改変する単ＤＮＡ鎖を指す（例えば米国特許５，１７６，９９６参照）。
【０１３０】
多くの標的結合分子が組み換え手段により発現できる。例えば単鎖抗体、ドメイン抗体、受容体等、及びこれらをコードする核酸を本発明の実施における治療用蛋白を製造するための治療遺伝子として使用できる。
【０１３１】
「抗体」とは未損傷の免疫グロブリン、又はその抗原結合部分を指し、これは特異的結合に関して未損傷の抗体と競合し、即ち、フラグメントは同族体抗原結合能力を保持している。一部の実施形態においては、抗原結合部分は組み換えＤＮＡ手法によるか、又は未損傷抗体の酵素的又は化学的切断により、製造してよい。抗原結合部分はとりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディー及びポリペプチドに特異的抗原結合を付与するために十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドを包含する。ＦａｂフラグメントはＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインよりなる一価のフラグメントであり；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントはヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントであり；ＦｄフラグメントはＶＨ及びＣＨ１ドメインより成り；Ｆｖフラグメントは抗体の単一のアーム部のＶＬ及びＶＨドメインよりなり；そして、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ等、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６，１９８９）はＶＨドメインよりなる。単鎖抗体（ｓｃＦｖ、又はｓｃＡｂ）は、ＶＬ及びＶＨ領域が対形成することによりＶ領域を単一の蛋白鎖として作成可能とする合成リンカーを介して一価の分子を形成する抗体誘導体である（Ｂｉｒｄ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６，１９８８及びＨｕｓｔｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８）。ダイアボディーは２価の、二重特異性の抗体であり、この場合ＶＨ及びＶＬドメインは単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、強制的にドメインを別の鎖の相補ドメインと対形成させ、そして２つの抗原結合部位を生じさせる（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８，１９９３，及びＰｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，等、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３，１９９４参照）。１つ以上のＣＤＲを共有結合的又は非共有結合的に分子内に取り込んでよい。当該分野で知られる通り、単一のＣＤＲは抗原結合能力及び特異性を、それを担持しているポリペプチドに与えることができる。特異的に結合する分子は、免疫学の分野で知られている特異性及び交差反応性を発見して評価するための基準を用いながら複数の他の分子から元の抗体が形成された対象であるエピトープ、即ち同族体抗原を認識して結合する必要な照準的反応性を担持しているものである。抗体又はその結合の少なくとも一部を保持しているフラグメントの何れかを本発明で利用できる。抗体を製造、精製、投与及び／又は利用するための種々の方法が当該分野で知られており、例えば米国特許６，８８４，８７９を参照できる。
【０１３２】
キメラ抗体はネズミｍＡｂ及びヒト免疫グロブリン定常領域から誘導された可変領域を有するもののような異なる動物種から誘導された異なる部分を含有する分子である。キメラ抗体は免疫原性を低減するために主に製造及び使用される。キメラ抗体及びその製造のための方法は当該分野で知られている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３  ６４６（１９８４）；Ｅｕｒｏｐｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １２５０２３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８−２７０（１９８５）；Ｅｕｒｏｐｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １７１４９６；Ｅｕｒｏｐｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １８４１８７；Ｓａｈａｇａｎ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６−１０７４（１９８６）；Ｌｉｕ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３（１９８７）；Ｓｕｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８（１９８７）；Ｂｅｔｔｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；及びＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。
【０１３３】
「ヒト化免疫グロブリン」という用語は本明細書においては、少なくとも一部分がヒト起源である、異なる起源の免疫グロブリンの部分を含む免疫グロブリンを指す。例えば、ヒト化抗体は、従来の手法（例えば合成）により連結された、又は遺伝子操作手法を用いて隣接ポリペプチドとして製造（例えばキメラ抗体の蛋白部分をコードするＤＮＡを発現させることにより隣接ポリペプチド鎖を製造できる）された、必要な特異性を有する非ヒト起源の免疫グロブリン（例えばマウス由来）から、そしてヒト起源の免疫グロブリン配列（例えばキメラ免疫グロブリン）から誘導された部分を含むことができる。本発明のヒト化免疫グロブリンの別の例は非ヒト起源の抗体から誘導されたＣＤＲ及びヒト起源の軽鎖及び／又は重鎖から誘導されたフレームワーク領域を含む免疫グロブリン鎖１つ以上を含有する免疫グロブリンである（例えば抗体の安定性及び／又は結合親和性を向上させるためのフレームワークの変化、そして任意に抗体の安定性及び／又は好ましくは結合親和性を向上させるためのＣＤＲ１つ以上における変化１つ以上を有するか有さないＣＤＲグラフト抗体）。キメラ又はＣＤＲグラフト単鎖抗体も又、ヒト化免疫グロブリンという用語に包含され、例えばＣａｂｉｌｌｙ等、米国特許４，８１６，５６７；Ｂｏｓｓ等、米国特許４，８１６，３９７；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等、ＷＯ  ８６／０１５３３；Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許５，２２５，５３９；Ｐａｄｌａｎ等、欧州特許出願０，５１９，５９６，Ｌａｄｎｅｒ等、米国特許４，９４６，７７８；Ｈｕｓｔｏｎ，米国特許５，４７６，７８６；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ等、米国特許５，７６６，８８６；Ｑｕｅｅｎ等、米国特許７，０２２，５００及びＢｉｒｄ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８）を参照できる。
【０１３４】
触媒抗体は結合抗原においてペプチド結合の切断のような化学反応又は変化を起こすことができるものである。触媒抗体は免疫原性とされた遷移状態の類縁体（ＴＳＡ）で動物を免疫化することにより誘導することができ（Ｐｏｌｌａｃｋ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８８）１１０：８７１３，Ｊａｃｋｓｏｎ等、ＰＮＡＳ（１９８８）８５：４９５３，Ｓｈｏｋａｔ等、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９８８）２７：１１７２）、そして、例えば化学反応の種々の異なる型を触媒することができ、例えば米国特許５，４０１，６４１；６，５９０，０８０；７，１０９，２９１及び７，２０５，１３６を参照できる。一部の実施形態においては、触媒抗体は標的蛋白の脱安定化を誘発する。一部の実施形態においては、触媒抗体は、例えば因子Ｂ、因子Ｄ、因子Ｂｂ、因子Ｃ３及び／又は因子Ｃ３ｂのような、標的分子を切断するプロテアーゼとして機能する。
【０１３５】
更に又、軽鎖を生来欠いているラクダ抗体も使用できる。ナノボディー及びドメイン抗体として知られている構造、例えば、抗原決定基又はエピトープ結合能力が保持されている限り、同族体抗原に結合することが分かっている抗体の単一のＣＤＲを含むポリペプチドを使用できる。
【０１３６】
単鎖抗体（ＳＣＡ）及び組み換え製造された結合分子の他の形態は、例えば遺伝子送達のために有用である。特定の抗体の該当するコーディング配列及びその抗原結合部分を単離し、所望の同族体抗原結合能力を有するポリペプチドの製造のためにクローニングすることができる。これらのフラグメントを作成する方法は当該分野で知られている（例えばＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８参照）。
【０１３７】
本発明の一部の実施形態においては、抗体配列はヒト化されるかヒト型であることにより、例えばそれに対する免疫応答の発生の危険性を低減できる。設計上の選択として決定される目的の特定の部位におけるアミノ酸を置換することにより抗原結合ポリペプチド又は目的の治療用蛋白のアミノ酸を修飾して結合活性を保持しつつ分子をより低抗原性とするための、当該分野で知られた種々の工程をとることができる。
【０１３８】
一部の実施形態においては、アミノ酸置換は限定しないが例えば（１）蛋白分解に対する感受性を低減し、（２）酸化に対する感受性を低減し、（３）蛋白複合体を形成する結合親和性を改変し、（４）結合親和性を改変（例えば上昇又は低下）させ、そして（５）免疫原性を低減するものを包含する。
【０１３９】
本発明は又類縁体の使用を包含する。類縁体は天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々のムテインを包含できる。例えば単一又は多数のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を天然に存在する配列において行ってよい（例えば分子間接点を形成するドメインの外部のポリペプチドの部分において）。保存的アミノ酸置換は親配列の構造的特徴を実質的に変化させてはならない（例えば置き換えのアミノ酸は親配列に存在するへリックスを壊す傾向を有してはならず、また親配列を特徴づける二次構造の他の型を途絶させてはならない）。当該分野で知られたポリペプチドの二次及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；及びＴｈｏｒｎｔｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載されている。一部の実施形態においては、非保存的置換を使用する。
【０１４０】
遺伝子療法の範囲において改変はコードしている核酸のレベルにおいて反映されることになる。即ち、修飾は又、発現を増強するために核酸に対して行うことができる。例えば特定のコドンが特定の宿主細胞により好まれる場合がある。即ち、再コーディングは、例えば哺乳類発現系及び細胞において特定のコドンが好まれる場合に起こりえる。核酸の再コーディングは当業者が使用できる設計選択である。
【０１４１】
転写及び／又は翻訳を制御するための方法を本発明の実施において使用できる。一部の実施形態においては、これらの方法は例えば眼に対する局所遺伝子送達に適している。例えば、ペプチド核酸オリゴマー（ＰＮＡ）（Ｅｇｌｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ３６５，５６６，１９９３）又は操作された亜鉛フィンガーの取り込みを介して何れかのゲノムＤＮＡ配列に結合するように設計できる核酸結合ポリペプチド、例えば転写因子を使用できる。そのような操作された転写因子は何れかの内因性の遺伝子をアップレギュレート又はダウンレギュレートするように設計できる。
【０１４２】
遺伝子療法及び遺伝子転移のための種々の方法は知られており、そして何れかを本発明の実施のために使用できる。遺伝子転移の方法の一般的考察はＧｏｌｄｓｐｉｅｌ等、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．１２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕ＆Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７  ９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；Ｍｏｒｇａｎ＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；及びＭａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を包含する。組み換えＤＮＡ技術の方法は知られており、そしてＡｕｓｕｂｅｌ等（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）を参照できる。
【０１４３】
１つの態様において、発現ベクター又はベクターコンストラクトは抗体誘導体、例えば単鎖抗体をコードする。一部の実施形態においては、目的の発現ベクターはヒトの眼の細胞において抗体誘導体を発現する。
【０１４４】
本発明の一部の実施形態は動物、例えばヒト内へのベクターコンストラクトの送達を包含する。ベクター又は更には蛋白のヒト内への送達は注射（例えば眼内に、例えば硝子体内又は網膜下に）によるなどベクター又は蛋白にヒトを直接曝露させる直接的なものであるか、又は細胞を先ずインビトロでベクターにより形質転換し、そして次に形質転換した細胞を患者内に移植する間接的なものであってよい。一部の実施形態においては、これらの形質転換された細胞は自系である。一部の実施形態においては、これらの形質転換された細胞は同種異系である。組織培養物中の細胞にコーディング領域を含む核酸を転移させることは、いずれかの方法、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、染色体媒介遺伝子転移、マイクロ細胞媒介遺伝子転移、スフェロプラスト融合、リポフェクション、微粒子衝突、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ウィルス感染等により行うことができる。任意に、選択可能なマーカーもまた細胞内に導入できる。選択可能なマーカーを使用する場合、細胞はその後、例えば発現を増強するため、及び／又は転移されたコーディング領域を発現する細胞を単離するための選択下に置くことができる（例えばＬｏｅｆｆｌｅｒ＆Ｂｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；及びＣｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２（１９８５）参照）。
【０１４５】
組み換え細胞（例えばインビトロで形質転換された自系又は同種異系の細胞）を当該分野で知られた種々の方法で患者に送達できる。例えば細胞は当該分野で知られているように、投与の前にカプセル化できる。一部の実施形態においては、カプセル化する場合、細胞は自系ではない。一部の実施形態においては、組み換え血球（例えば造血系幹細胞及び／又は前駆細胞）を静脈内投与する。一部の実施形態においては、眼細胞及び／又は多能細胞を目に直接注射できる。必要な細胞の量は所望の作用、動物の状態等に依存しており、そして当該分野で知られた方法を実施することにより当業者が決定できる。
【０１４６】
例えば失明性の眼疾患に関連する疾患、経路又は障害の治療、抑制及び防止において有効となる本発明の蛋白、核酸又はベクター粒子を含む組成物の量は、標準的な臨床手法により決定できる。更に又、インビトロの試験を任意に用いて最適用量範囲を発見してよい。製剤において使用すべき厳密な用量は又、投与経路及び疾患又は障害の重症度に依存している。一部の実施形態においては、これは医師の判断及び／又は患者の個々の状況に応じて決定する。有効用量はインビトロ又は動物モデル試験系から誘導された用量応答曲線から推定してよい。
【０１４７】
目的の一部の分子は遺伝子転移手段により送達する必要はなく、そして、注射、ドロップ等のような当該分野で知られた何れかの薬物送達手段により投与してよい。即ち、例えば補体因子又は補体調節分子を弱化、中和、発現を低減するようなアプタマー、スピーゲルマー、抗体型又は抗体誘導の分子、補体調節蛋白、優性阻害補体蛋白、相補結合ペプチド又は蛋白、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等は本発明に包含され、そして当該分野で知られる通り製剤できる。即ち、目的の分子は使用時に再建するために凍結乾燥してよく、又は、製薬上許容しうる希釈剤、例えば水、食塩水又は緩衝液を含有する液体の形態で提供してよく、そして任意の緩衝液、保存料、安定化剤等を含有できる。製剤は室温、低温又は冷蔵庫温度で安定であり、或いは凍結してよい。製剤は又他の形態を取ってよく、例えばカプセル又はデポ剤中に錠剤化又は貯蔵したものであることもできる。
補体経路及びヒトにおけるＡＭＤの病因に関する疾患モデル
本セクションは補体系に関する背景情報並びに本発明の理解を容易にするための新しい疾患モデルを示す。補体活性化には３つの経路、即ち古典的経路、代替経路、及びレクチン経路が存在する。実施例８及び９は本発明の蛋白の例を記載している、一部の実施形態においては、これらの蛋白は補体活性化の代替経路を減衰できる。しかしながら、全３補体経路が交差する態様に基づけば、これらの蛋白は３補体経路の何れかにより誘発される炎症を減衰することになり、そしてこれにより病因が少なくとも部分的に補体活性化を包含している何れかの病気のための治療法を提供する。これらには例えば限定しないが早期ＡＭＤ、湿性ＡＭＤ、及び地図状委縮が包含される。
【０１４８】
補体経路は、体液性及び細胞性に媒介された免疫系樹状系統の活性化の前に感染からの即時保護をもたらす自然免疫系として知られている免疫系の一部である。これらの経路は約３５因子よりなる。それらは高次の動態を示すが明確に十分調節されているカスケード反応を介して活性化及び不活性化される。代替補体経路は特に正のフィードバックループを介して急速にサイクルアップするように発展する。本発明者等は、おそらくは補体活性化の持続的な系の遮断又は抑制が患者を感染し易くしているため、慢性疾患の治療に関して有効性及び安全性の両方を有する如何なる開発された治療用補体抑制剤も無いと考える。
【０１４９】
本発明の蛋白及び／又はそれらを発現するベクターは哺乳類への全身投与のため、及び／又は、慢性疾患を治療するために好都合に使用してよい。例えば、補体蛋白類縁体、本発明の因子Ｂ又は因子Ｄ類縁体はネイティブの蛋白の結合と競合することにより補体経路を抑制する。これは経路の完全な遮断とは逆に、補体活性の減衰を可能にする。従って、補体活性を完全にブロックすることなく治療性のある（例えば一部の症状又はその重症度を軽減する）レベルにまで補体活性をダウンレギュレートすることが可能である場合がある。即ち、感染の危険性の増大のような補体活性の遮断に伴う危険性を回避又は低下する。従って、本発明は本発明の蛋白又は組成物の全身投与（例えば静脈内、腹腔内又は経口）により補体関連疾患（例えば慢性疾患）を治療するための方法を提供する。
【０１５０】
感染性物質に対抗することを特に指向していない補体媒介活性は正常細胞に対して顕著な同時多発損傷をもたらす場合がある。この同時多発損傷から自身を保護するために、補体系の幾つかの成分は補体活性を鎮静化させ、そして近傍の正常細胞を保護するように特に設計される。これらの補体抑制剤は通常は流体（血漿）相にあるか、又は正常細胞上の内在性膜蛋白として存在する。１つの補体因子、特にＣＦＨは血漿中には高レベルで通常は循環しているが細胞膜、細胞間マトリックス成分、及び一部の血漿蛋白に結合する能力を有する代替経路の主要な抑制剤である。
【０１５１】
図１１及び１２は補体経路の概要であり、それらがＣ３ｂで交差することに留意する。
【０１５２】
表１は補体活性化の調節物質の一部の概要である。
【０１５３】
【表１】
2010520224.tif 000003
各抑制剤の分布はその機能に関連している。例えばＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＤ５９及びその他は宿主細胞上の内在性膜蛋白である。一方ＣＦＨは流体相にあるが、特定の固体構造に結合できる。
ＡＭＤの１病因を説明するモデル
本発明は特定の機序のモデルにより制約されることを意図しないが、本発明者等は以下のモデルがＡＭＤの大部分の症例に関する主要な病因を説明すると考える。多くの要因が個体におけるＡＭＤの発症及び経過に寄与している。以下のモデルは例えば患者の大部分において病気の経過を加速することができる因子の１つのセットを示す。更に又、これらの因子は種々の理由のためにこの病因に対して遺伝子型的に罹患し易い個体における特に早期又は急速な経過をもたらす場合がある。
【０１５４】
早期ＡＭＤはＲＰＥ細胞と伏在する膜、即ちブルーフ膜との間の結晶腔の蓄積を特徴としている（図１）。結晶腔は一部の補体因子並びに一般的に炎症のマーカーとみなされているＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）と称される血漿蛋白を包含する多くの成分を含有する。ＣＲＰは種々の脂質及び核成分に結合する５量体蛋白である。ＣＲＰは又、１）貪食細胞上のＦｃ受容体に結合し；２）古典的補体経路の早期の工程を活性化し；３）膜結合補体抑制剤因子ＤＡＦ、ＭＣＰ、及びＣＤ５９をアップレギュレートし；そして４）ＣＦＨに結合するという働きを有する（例えばＪｏｈｎｓｏｎ等、２００６，Ｂｌａｃｋ等、２００４，Ｍｏｌｄ等、１９９９，及びＬｉ等、２００４参照）。
【０１５５】
理論に制約されないが、本発明者等は早期のＡＭＤにおいては結晶腔が蓄積するに従ってＣＲＰが結晶腔に結合し、そしてそこに固定されると考える。次に固定されたＣＲＰが貪食細胞の誘因に寄与し、それらが結晶腔を包囲して除去するように刺激する。ＣＲＰはこのことを、Ｆｃ受容体に結合するその能力を介して、そして、生物学的に活性なフラグメントＣ４ａ及びＣ３ａの生成を介して行う。しかしながら、これらのフラグメントをもたらす古典的経路の活性化は又、Ｃ３ｂをもたらし、次にこれが代替経路に入ることができ、そして正のフィードバックループを介してサイクルアップされる。即ち、代替経路が制御されない場合、結晶腔は増大する炎症のための貯蔵庫となる。ＣＲＰはＤＡＦ、ＭＣＰ、及びＣＤ５９を確かにアップレギュレートするが、これらは細胞表面蛋白であり、そして結晶腔内部の代替経路を効果的に制御することはできないと考えられる。本発明者等は、代替経路の暴走的活性化及び多大な炎症を防止するためには、ＣＲＰは結晶腔内部のＣＦＨに結合してこれを固定化すると考える。この非限定的なモデルに従えば、ＣＦＨがＣＲＰに効果的に結合することができない場合、又は、それが単に代替経路の減衰においては有効ではない場合、網膜下には多大な炎症が生じることになる。これはＣＲＰの増大した結合を伴った増大した組織損傷をもたらす。即ち、全過程がサイクルアップし、最終的には両方とも末期の経過である湿性ＡＭＤ及び地図状萎縮（ＧＡ）を包含する進行性のＡＭＤをもたらす。患者が湿性ＡＭＤ又は地図状萎縮を発症するか否かは、追加的な後天的及び遺伝的な因子、例えば前及び抗血管形成因子のバランス、並びに、例えばマトリックスプロテアーゼ及びＴＧＦ−β調節物質ＨｔｒＡ１の発現レベルにより決定される（例えばＯｋａ等、２００４，Ｙａｎｇ等、２００６及びＤｅＷａｎ等、２００６参照）。
【０１５６】
このモデルにおいては、ＣＲＰは眼の後部の破砕物に関する自然な浄化過程の部分である。しかしながら、この役割を果たす場合、ＣＲＰは代替補体経路の活性化に由来する組織傷害を潜在的に誘発する場合がある。数年間に渡る代替経路の効果的でない制御は進行性のＡＭＤをもたらす場合がある。本発明は代替経路を抑制する種々の実施形態を提供する。
補体活性化を減衰できる蛋白の設計
本発明は、補体活性化の代替経路を減衰させるために、蛋白として、及び／又は遺伝子転移を介して（例えばベクターが遺伝子及び／又は蛋白に関してコードしているコーディング領域を含む）送達できる蛋白を包含する。これらの蛋白は補体抑制剤（例えば眼の疾患に関する）の発生を妨害するハードルを克服すると考えられ、例えば１）長期の全身免疫抑制を回避すること；２）血中の補体因子のあるいは回避すべき高いレベルに直面して薬効を達成すること；３）薬効のために網膜及びブルーフ膜の近傍における治療用蛋白の十分なレベル及び分布を達成すること；４）結晶腔内部の治療用蛋白の活性を達成すること；５）慢性疾患を治療するための治療薬送達の十分な継続期間を達成すること；６）眼の後部における古典的補体経路の活性を妨害することなく薬効を達成すること；及び７）治療薬に対する免疫応答（例えば局所的免疫反応）を回避又は減衰させること、が挙げられる。
【０１５７】
本発明者等は代替経路における正のフィードバックループを減衰させることは経路全体をダウンレギュレートすることを意味すると判断した。そのような減衰はｆＢ、ｆＤ、又はプロペルジンの機能及び／又はレベルを妨害することにより達成される。一部の実施形態においては、経路の減衰はＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＲ１、又はＣＦＨのような天然の調節物質の機能をアップレギュレート又は正常化することにより達成される。一部の実施形態においては、その細胞外ドメインを発現させることで結晶腔内への貫通を可能にしてよい。
【０１５８】
本発明者等は代替経路のフィードバックループを減衰させる適当な手段は補体因子Ｂ（ｆＢ）の機能又はレベルを妨害することであると判断した。本発明の一部の実施形態はｆＢ機能を減衰するための優性阻害の方策を使用する。以下は各々が独特の属性を有する３つの特異的な優性阻害ｆＢ部分を例として説明している。
【０１５９】
補体因子Ｂは不活性のプロテアーゼとして循環し、そして２工程の過程を介して機能する。第１にこれは因子Ｃ３ｂと結合して一過性の複合体を形成する。第２に、これはｆＤにより切断されてＢｂを生じ、そしてｆＢセリンプロテアーゼを活性化する。次いでＣ３ｂＢｂ複合体がプロペルジンにより安定化される。
【０１６０】
ヒト因子Ｂ及び他の補体蛋白をコードする遺伝子及びコーディング領域のヌクレオチド配列、並びにそのような蛋白のアミノ酸配列は当該分野で知られている。例えばヒト因子Ｂ及び他の補体蛋白をコードする遺伝子はＮＣＢＩデータベースアクセッション番号ＮＧ＿００００１３に記載されている。因子Ｂのコーディング配列はＮＣＢＩデータベースアクセッション番号ＮＭ＿００１７１０に記載されており、そして因子Ｂのプレプロ蛋白のアミノ酸配列はＮＣＢＩデータベースアクセッション番号ＮＰ＿００１７０１又はＰ００７５１に記載されている。ＮＣＢＩデータベースアクセッション番号Ｐ００７５１はヒトプレプロ蛋白因子Ｂ配列である。他の動物種由来の配列も当該分野で知られている。比較のために、マウス因子Ｂ配列（例えばＮＣＢＩデータベースアクセッション番号Ｐ０４１８６参照）において、第３のＳＣＲドメインはこの７６１アミノ酸のプレ蛋白の１６０〜２１７位に位置し、そして成熟ネズミ因子Ｂ蛋白は２３〜７６１位に渡っている。マウス因子Ｂの最初の２２アミノ酸はシグナル配列（配列番号１６）である。
【０１６１】
ヒト因子Ｂプレ蛋白はアミノ酸位１〜２５に渡るシグナルペプチドを有する７６４アミノ酸の蛋白（配列番号２）である。因子Ｂの成熟鎖は２６〜７６４位に相当する。ヒト因子Ｂの３つのＳＣＲ領域は、概ね３５位から概ね１００位に渡るＳｕｓｈｉ１とも称されるＳＣＲ１、概ね１０１位から概ね１６０位に渡るＳｕｓｈｉ２とも称されるＳＣＲ２、及び概ね１６３位から概ね２２０位に渡るＳｕｓｈｉ３とも称されるＳＣＲ３である。
【０１６２】
３つの優性阻害の第１のものはｆＢ１と称され、ｆＢプロテアーゼ部位の１つのアミノ酸を改変する。このｆＢ部分は通常の親和性及び動態においてＣ３ｂに結合するが、しかしｆＤによる作用を受け、プロペルジンで安定化されれば、プロテアーゼとして機能せず、配列番号２の７４０位に相当するアミノ酸におけるＮによる置換（例えばＤ７４０Ｎ）のようなＣ３コンバターゼの形成を行わない。
【０１６３】
第２の優性阻害はｆＢ２と称され、ｆＢ１と同じアミノ酸を改変するが、更にＣ３ｂ結合ドメインにおける２つの別のアミノ酸も改変（配列番号２の２７９及び２８５位に相当するアミノ酸の置換）することによりＣ３ｂへのｆＢ２の結合親和性を増大させ、例えばＤ２７９Ｇ、Ｎ２８５Ｄ及びＤ７４０Ｎの変化が挙げられる。Ｎ２８５Ｄの置換は推定Ｎグリコシル化部位を除去する。
【０１６４】
第３の優性阻害はｆＢ３と称され、ｆＢ２からのＣ３ｂ結合を増大する突然変異を、因子Ｄによる切断のための結合部位をノックアウトする突然変異に、特に配列番号２の残基２５８、２５９及び２６０に相当する位置における置換並びに２７９及び２８５における置換、例えばＫ２５８Ａ、Ｒ２５９Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｄ２７９Ｇ及びＮ２８５Ｄの変化に、組み合わせている。野生型ｆＢの因子Ｄによる切断はｆＢプロテアーゼを活性化する。即ちｆＢ３はその５アミノ酸変化によりＣ３ｂに効率的に結合するが、最小限のプロテアーゼ活性を有する。
【０１６５】
ＦＢ１、ｆＢ２及びｆＢ３は本発明を実施する場合に使用できるｆＢ類縁体の例であるが、本発明はこれらの特定の類縁体に限定されない。本発明の一部の実施形態は補体経路を抑制する何れのｆＢ類縁体も包含する。一部の実施形態においては、ｆＢ類縁体はｆＢ１ではない。一部の実施形態においては、ｆＢ類縁体はｆＢ２ではない。一部の実施形態においては、ｆＢ類縁体はｆＢ３ではない。一部の実施形態においては、ｆＢ類縁体は配列番号２における以下のアミノ酸、即ち２５８、２５９、２６０、２７９、２８５、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５及び７４６の１つ以上に相当するアミノ酸の突然変異１つ以上を含む。これらの１つ以上の突然変異はアミノ酸の置換又は欠失、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸に隣接する、又はその内部における少なくとも１つのアミノ酸の付加であることができる。一部の実施形態においては、この付加は列挙したアミノ酸の機能を途絶、変化、増強、又は抑制し、例えば（ｉ）別の蛋白の切断における（例えば７４０）、（ｉｉ）別の蛋白による切断の部位としてのその役割（例えば２５８、２５９及び／又は２６０）、又は（ｉｉｉ）他の蛋白への結合におけるその役割（例えば２７９又は２８５）を途絶させる。
【０１６６】
本発明の一部の実施形態はアラニン、グリシン、バリン、ロイシン及びイソロイシンよりなる群から選択されるアミノ酸による２５８、２５９及び／又は２６０アミノ酸の１つ以上に相当するアミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態は以下のアミノ酸、即ち：２５８、２５９及び／又は２６０の１、２又は３つに相当するアミノ酸の欠失を含む。本発明の一部の実施形態は２５８、２５９及び／又は２６０アミノ酸に相当するアミノに直接隣接する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多いアミノ酸の付加少なくとも１つを含む。
【０１６７】
本発明の一部の実施形態はアラニンによる配列番号２の７３９位に相当するアミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態はアラニン、グリシン、バリン、ロイシン及びイソロイシンよりなる群から選択されるアミノ酸による配列番号２の７３９位に相当するアミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態は７３９アミノ酸に相当するアミノ酸の欠失を含む。
【０１６８】
本発明の一部の実施形態はグルタミン酸、アスパラギン、アラニン、セリン、グリシン及びチロシンよりなる群から選択されるアミノ酸による配列番号２の７４０位に相当するアミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態はバリン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、グルタミン酸、アスパラギン、アラニン、セリン、グリシン及びチロシンよりなる群から選択されるアミノ酸による７４０位に相当するアミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態は７４０アミノ酸に相当するアミノ酸の欠失を含む。
【０１６９】
本発明の一部の実施形態はトリプトファン及びアラニンよりなる群から選択されるアミノ酸による配列番号２の７４１位に相当するアミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態はアラニン、グリシン、バリン、ロイシン及びイソロイシンよりなる群から選択されるアミノ酸による７４１アミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態はトリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンよりなる群から選択されるアミノ酸による７４１アミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態は７４１アミノ酸の欠失を含む。
【０１７０】
本発明の一部の実施形態はグルタミンによる配列番号２の７４２位に相当するアミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態はグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、及びアスパラギン酸よりなる群から選択されるアミノ酸による７４２アミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態は７４２アミノ酸の欠失を含む。
【０１７１】
本発明の一部の実施形態はフェニルアラニンによる配列番号２の７４３及び／又は７４５位に相当するアミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態はフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンよりなる群から選択されるアミノ酸による７４３及び／又は７４５アミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態は７４３、７４４及び／又は７４５アミノ酸の１つ以上の欠失を含む。
【０１７２】
本発明の一部の実施形態はトリプトファン及びアラニンよりなる群から選択されるアミノ酸による配列番号２の７４６位に相当するアミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態はアラニン、グリシン、バリン、ロイシン及びイソロイシンよりなる群から選択されるアミノ酸による７４６アミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態はトリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンよりなる群から選択されるアミノ酸による７４６アミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態は７４６アミノ酸の欠失を含む。
【０１７３】
本発明の一部の実施形態は７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５及び／又は７４６アミノ酸の位置に直ぐ隣接するか、又はその位置における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多いアミノ酸の挿入又は置換を含む。
【０１７４】
本発明の一部の実施形態はグリシン、アラニン及びアスパラギンよりなる群から選択されるアミノ酸による配列番号２の２７９位に相当するアミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンよりなる群から選択されるアミノ酸による２７９アミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態はアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸及びグルタミンよりなる群から選択されるアミノ酸による２７９アミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態は２７９アミノ酸の欠失を含む。本発明の一部の実施形態は２７９に直ぐ隣接するか、又はその位置における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多いアミノ酸の挿入又は置換を含む。
【０１７５】
本発明の一部の実施形態はアラニン及びアスパラギン酸よりなる群から選択されるアミノ酸による配列番号２の２８５位に相当するアミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンよりなる群から選択されるアミノ酸による２８５アミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態はアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸及びグルタミンよりなる群から選択されるアミノ酸による２８５アミノ酸の置換を含む。本発明の一部の実施形態はＮ２８５アミノ酸の欠失を含む。本発明の一部の実施形態は２８５に直ぐ隣接するか、又はその位置における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多いアミノ酸の挿入又は置換を含む。
【０１７６】
本発明の一部の実施形態は配列番号２の２７９、２８２、２８３、２８４及び２８５位に相当するアミノ酸１つ以上の置換を含む。一部の実施形態においては、これらのアミノ酸はグリシン、イソロイシン、プロリン、ヒスチジン及びアスパラギン酸によりそれぞれ置き換えられる。
【０１７７】
本発明の一部の実施形態は本明細書に記載する通り、２５８、２５９、２６０、２７９及び２８５に相当するアミノ酸の突然変異を含む。
【０１７８】
特定の実施形態においては、因子Ｂ類縁体は配列番号４、６又は８の１つのアミノ酸配列を含む本発明の方法において使用できる（任意に如何なるシグナル配列も内部に保有しないもの）。
【０１７９】
本発明の類縁体は本明細書において考察した置換の組み合わせを含み、そしてｆＢ１、ｆＢ２及び／又はｆＢ３類縁体又は本明細書で考察した何れかの他のｆＢ類縁体の属性１つ以上を保持している因子Ｂ類縁体を包含する。本発明は更に上記考察した類縁体の属性１つ以上を有する類縁体のフラグメント（例えば本明細書に記載したアミノ酸改変１つ以上を有する因子Ｂ蛋白のドメイン１つ以上を含む）である類縁体を提供する。更に又、類縁体は類縁体が少なくとも９９．５％、９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％又は７５％同一であるように追加的なアミノ酸置換、欠失又は挿入（例えば保存的アミノ酸の置換、Ｎ末端又はＣ末端のトランケーション等）を含んでよい。
【０１８０】
一部の実施形態においては、優性阻害ｆＢ部分は例えば網膜において局所的に観察されるネイティブのｆＢ及びＣ３ｂのレベルと近似又はそれを超過するレベルにおいて生産又は送達される。この点に関し、留意すべきことは、それぞれ２００及び１，０００μｇ／ｍｌである血漿中のｆＢ及びＣ３の高レベルは網膜のような他の領域のｆＢ及びＣ３ｂの局所的レベルを反映していないということである。一部の実施形態においては、優性阻害ｆＢ部分は例えばヒトのような動物の網膜中で局所的に観察されるネイティブのｆＢ及びＣ３ｂのレベルの約１％〜約１００，０００％；約１％〜約１０％；約１％〜約２０％；約１％〜約３０％；約１％〜約４０％；約１％〜約５０％；約１％〜約６０％；約１％〜約７０％；約１％〜約８０％；約１％〜約９０％；約１％〜約１００％；９０％〜約１００％；８０％〜約１００％；７０％〜約１００％；６０％〜約１００％；５０％〜約１００％；４０％〜約１００％；３０％〜約１００％；２０％〜約１００％；１０％〜約１００％；１０％〜約２０％；約２０％〜約３０％；約３０％〜約４０％；約４０％〜約５０％；約５０％〜約６０％；約６０％〜約７０％；約７０％〜約８０％；８０％〜約９０％；約１００％〜約１２５％；約１００％〜約１５０％；約１００％〜約１７５％；約１００％〜約２００％；約１００％〜約２５０％；約１００％〜約３００％；約１００％〜約４００％；約１００％〜約５００％；約１００％〜約７００％；約１００％〜約８５０％；約１００％〜約１０００％；約２００％〜約３００％；約３００％〜約４００％；約４００％〜約５００％；約５００％〜約６００％；約６００％〜約７００％；約７００％〜約８００％；約８００％〜約９００％；約９００％〜約１０００％；約２５０％〜約５００％；約５００％〜約７５０％；約７５０％〜約１０００％；約１０００％〜約２０００％；約２０００％〜約３０００％；約３０００％〜約４０００％；約４０００％〜約５０００％；約５０００％〜約６０００％；約６０００％〜約７０００％；約７０００％〜約８０００％；約８０００％〜約９０００％；約９０００％〜約１０，０００％；約１０，０００％〜約２０，００％；約１０，０００％〜約５０，０００％；又は約５０，０００％〜約１００，０００％であるレベルにおいて生産又は送達される。
【０１８１】
げっ歯類の実験を実施するためには、ｆＢ１、ｆＢ２、及びｆＢ３の類縁突然変異をマウスｆＢに導入することによりｍｆＢ１、ｍｆＢ２、及びｍｆＢ３を得る。アミノ酸レベルにおいては、ヒト及びマウスのｆＢは８３％の配列同一性を有する。ヒトｆＢにおいて修飾されたアミノ酸はマウスｆＢにおいて完全に保存されている。この配列同一性にもかかわらず、補体因子は一般的に種特異的態様において機能する。全てのインビトロの試験はヒト及びマウスの両方に特異的な試験法において実施し、そしてインビボのげっ歯類の試験は、最初はヒト及びマウスのｆＢ突然変異体を用いて実施した。
【０１８２】
８つのｃＤＮＡ（ヒト野生型ｆＢ及び３優性阻害並びに４類縁体ネズミ配列）を形成すること及びそのベクターへの取り込みのための例示される操作法は後述の実施例８において詳述する。
【０１８３】
本発明者等は代替経路のフィードバックループを減衰する別の適当な手段は補体因子Ｄ（ｆＤ）の機能又はレベルを妨害することであると結論している。本発明の一部の実施形態はｆＤ機能を減衰するために優性阻害の方策を使用する。以下に記載するものは代替補体経路活性を抑制するための因子Ｄ類縁体の例である。
【０１８４】
補体因子Ｄ（ｆＤ）はＣ３ｂＢ複合体においてｆＢを切断して活性化するプロテアーゼである（図１２）。因子Ｄは典型的には約２μｇ／ｍｌの低レベルにおいて血漿中に存在し、そして代替経路において触媒として作用する。即ち、単一のｆＤ部分がＣ３ｂＢに結合してｆＢを切断することにより複合体Ｃ３ｂＢｂを形成し、複合体から解離し、そして次にこれらの工程を反復し続ける。蛋白分解活性を有さないｆＤの優性阻害型は代替経路を抑制すると期待されない。野生型ｆＤの存在下において、優性阻害体は単に結合して遊離し、Ｃ３ｂＢ複合体を野生型ｆＤにより切断されるように残存させる。しかしながら実施例２１に概説した発見はｆＢ切断の非存在下においてｆＤは複合体から遊離しないか、又は少なくともより低値の頻度／速度において遊離することを示している。従って、一部の実施形態においては、優性阻害ｆＤは実際には代替経路の抑制剤として機能することが可能である。一部の実施形態においては、優性阻害ｆＤはＣ３ｂＢに結合し、そして解離しないか、又は野生型ｆＤより緩徐な速度で解離する。複合体は野生型ｆＤによるｆＢ切断に関して使用不能であり続け、そして補体活性化の過程を通して継続することはない。
【０１８５】
野生型ヒト因子Ｄを配列番号２７に示す。これはアミノ酸位１〜２０に渡るシグナルペプチドを有するｆＤプレ蛋白である。
【０１８６】
一部の実施形態においては、ｆＤ類縁体はＣ３ｂＢ複合体に結合するが、ｆＢを切断しないか、低減したｆＢを切断する能力を有している。一部の実施形態においては、本発明のｆＤ類縁体は野生型ｆＤと比較してＮ末端に追加的なアミノ酸を含む。例えば、野生型ｄＦのレベルの１％未満で血漿中を循環しているＮ末端に２つの追加的アミノ酸、Ｇｌｙ−Ａｒｇを有するｆＤの変異体が存在することが分かっている。この変異体はプロテアーゼ活性を有さず、トリプシンの極めて高い濃度によって活性化できるのみである（Ｙａｍａｕｃｈｉ等、１９９４  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（７）：３６４５−５３）。この優性阻害変異体はＣ３ｂＢに結合し、それが機能的Ｃ３ｂＢｂ、Ｃ３コンバターゼになることを防止することにより、野生型ｆＤと競合するはずである。従って本発明はｆＤ類縁体が低減又は排除されたｆＢ切断の能力又は速度を有する、野生型ｆＤと比較した場合にＮ末端に追加的アミノ酸１つ以上を含むｆＤ類縁体を提供する。一部の実施形態においては、このｆＤ類縁体は２つより多い追加的Ｎ末端アミノ酸を含む。一部の実施形態においては、このｆＤ類縁体は２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の追加的Ｎ末端アミノ酸を含む。一部の実施形態においては、追加的Ｎ末端アミノ酸はグリシン及びアルギニンを含む。
【０１８７】
一部の実施形態においては、因子Ｄ類縁体は野生型因子Ｄの触媒ドメインにおいて突然変異を有する。ｆＤの３アミノ酸がｆＤのセリンプロテアーゼ触媒ドメインのための重要な成分であると考えられている。これらの３アミノ酸は配列番号２７のアミノ酸６６，１１４及び２０８に相当し、これらは又Ｖｏｌａｎａｋｉｓ＆Ｎａｒａｙａｎａ等、（１９９６  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ５：５５３−５６４）に記載されている通りアミノ酸５７，１０２及び１９５に相当する。一部の実施形態においては、これらの３アミノ酸の１つ、２つ又は全てにおける置換がセリンプロテアーゼ活性を減衰又は排除できるが、なおＣ３Ｂに結合できる。一部の実施形態においては、配列番号２７の６６位におけるアミノ酸に相当するアミノ酸は少なくとも１つの中性のアミノ酸、少なくとも１つの負荷電のアミノ酸、又は少なくとも１つの非極性アミノ酸により置換される。一部の実施形態においては、配列番号２７の１１４位のアミノ酸に相当するアミノ酸は少なくとも１つの荷電したアミノ酸又は少なくとも１つの非極性アミノ酸で置換される。一部の実施形態においては、２０８位のアミノ酸に相当するアミノ酸は少なくとも１つの荷電したアミノ酸又は少なくとも１つの非極性アミノ酸により置換される。一部の実施形態においては、配列番号２７の６６、１１４、又は２０８位のアミノ酸に相当するアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンよりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸により置換される。
【０１８８】
これらのｆＤ類縁体はＣ３ｂＢに結合することにより野生型ｆＤと競合することになり、そしてそれが機能的Ｃ３コンバターゼとなる速度を抑制するか緩徐化する。従って、本発明の一部の実施形態は、配列番号２７のアミノ酸Ｈｉｓ６６、Ａｓｐ１１４、及びＳｅｒ２０８に相当するアミノ酸の突然変異１つ以上を含むｆＤ類縁体を包含する。これらの３アミノ酸は又、Ｖｏｌａｎａｋｉｓ＆Ｎａｒａｙａｎａ等、（１９９６  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ５：５５３−５６４）において使用されている通りのナンバリングを用いればＨｉｓ５７、Ａｓｐ１０２、及びＳｅｒ１９５アミノ酸に相当する。これらの１つ以上の突然変異はアミノ酸の置換又は欠失、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸に隣接する、又はその内部における少なくとも１つのアミノ酸の付加であることができる。本発明の一部の実施形態は、ｆＤセリンプロテアーゼ触媒ドメインに対する変化をもたらす突然変異を有するｆＤ類縁体を包含し、その場合、ｆＤ類縁体はＣ３Ｂに結合する能力をなお有しているが、ｆＤ類縁体は低下したｆＢを切断する能力を有している。本発明の類縁体は上記において考察した置換の組み合わせを含み、そして
上記において考察したｆＤ類縁体の属性１つ以上（例えば低下したｆＢを切断する能力）を保持している因子Ｄ類縁体を包含する。本発明は更に本明細書において考察した類縁体の属性１つ以上を有するこれらの類縁体のフラグメント（例えば本明細書に記載したアミノ酸改変１つ以上を有する因子Ｄ蛋白のドメイン１つ以上を含む）である類縁体を提供する。更に又、類縁体は、類縁体が少なくとも９９．５％、９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％又は７５％同一であるように追加的なアミノ酸の置換、欠失又は挿入（例えば保存的なアミノ酸の置換、Ｎ末端又はＣ末端のトランケーション等）を含んでよい。
【０１８９】
本明細書に記載する通りｆＤ類縁体は代替経路の活性化をブロックするための単独の治療薬として、又は代替補体経路の他の抑制剤、例えば本明細書に記載するｆＤ類縁体と組み合わせて使用できる。本明細書に記載するｆＤ類縁体は本明細書に記載するｆＢに関して記載した通り、又はその使用の代わりに使用できる。
【０１９０】
因子Ｈ、因子Ｈ様１、ＭＣＰ、ＤＡＦ及びＣＤ５９は典型的には補体活性を抑制することにより作用する。本発明の一部の実施形態は補体活性を調節するために因子Ｈ、因子Ｈ様１、ＣＲ１、ＭＣＰ、ＤＡＦ及び／又はＣＤ５９（単独又は組み合わせ）を使用することを包含する。これらの蛋白はそれらの蛋白型において使用するか、又は例えばベクターを使用しながら蛋白をコードする核酸を介して送達することができる。一部の実施形態においては、ＭＣＰ、ＤＡＦ又はＣＤ５９は補体活性をモジュレート（例えば抑制）することができる可溶性形態又は可溶性フラグメント（例えば膜貫通領域が消失しているか置き換えられているもの）である。
種々の補体関連状態に関係する補体関係経路又は蛋白のモジュレーション
一部の実施形態においては、本発明は補体に関係する、補体に関連する経路をモジュレート、調節、抑制及び／又は増強するための組成物及び方法を提供する。補体関係経路は、例えば限定しないが、古典的及びレクチン補体経路及び代替補体経路を包含する。一部の場合においては、補体関係経路は特定の状態又は疾患において役割を果たす場合がある。従って、本発明の一部の実施形態は補体関係経路１つ以上により媒介される疾患の状況を調節、改質、治癒、抑制、防止、改善、進行緩徐化、及び／又は治療する方法を提供する。そのような疾患の状況又は状態は、限定しないが、結晶腔形成、黄斑変性、ＡＭＤ、乾燥眼、角膜潰瘍、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、硝子体網膜症（Ｇｒｉｓａｎｔｉ等、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３２：２７１１−２７１７）、角膜炎症、気道応答性亢進、免疫関連疾患、自己免疫関連疾患、ループス腎炎、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節炎（例えば慢性関節リューマチ）、リューマチ性疾患、抗リン脂質抗体症候群、腸及び腎臓のＩ／Ｒ傷害、喘息、非定型溶血性尿毒性症候群、ＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎、非増殖性糸球体腎炎、胎児損失（例えば自発的胎児損失）、緑内障、ブドウ膜炎、高眼圧症、脳傷害（例えば外傷性脳傷害）、卒中（例えばＡｒｕｍｕｇａｍ等、ＰＮＡＳ  ９３（１２）：５８７２−６（１９９６）参照）、外傷後臓器損傷、梗塞後臓器損傷（例えば心臓、神経系）、血管炎、虚血再灌流傷害、脳血管偶発症、アルツハイマー病、移植片拒絶（例えば異種移植片及び自家移植片）、感染症、敗血症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、重症筋無力症、抗体媒介皮膚疾患、全ての抗体媒介臓器特異的疾患（例えばＩ型及びＩＩ型真性糖尿病、甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病及び溶血性貧血、及び神経障害）、多発性硬化症、心肺バイパス傷害、結節性多発性動脈炎、ヘノッホ−ホシェーンライン紫斑病、血清病、グッドパスチャー病、全身性壊死性血管炎、連鎖球菌感染後の糸球体腎炎、特発性肺線維症（通常の間質性肺炎）、膜性糸球体腎炎、心筋炎（例えば自己免疫性心筋炎）（Ｋａｙａ等、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；２（８）：７３９−４５）、心筋梗塞、筋ジストロフィー（例えばジストロフィン欠損に関連）、急性ショック性肺症候群、成人呼吸窮迫症候群、再灌流、拒絶及び／又は補体媒介疾患を包含する。
【０１９１】
眼における結晶腔の形成は黄斑変性のような種々の疾患に関連する場合がある。一部の場合においては、結晶腔の形成及び／又はその疾患との関連性は補体活性に関係していることが示唆されている（例えば図１参照）。本発明の一部の実施形態は、ヒトのような動物における結晶腔の形成又は成長をモジュレート、調節、抑制、低減、遅延及び／又は退行させるための組成物及び方法を提供する。例えば、本発明の組成物又は分子は結晶腔に送達してよい（例えば結晶腔内への直接の注射（結晶腔内注射）又は硝子体内注射による）。本発明の一部の実施形態は例えば結晶腔形成を抑制することを介して黄斑変性の進行を緩徐化するために利用できる。
【０１９２】
アテローム性動脈硬化症は補体に関係する経路に典型的に関与していることがわかっており、例えばＮｉｃｕｌｅｓｃｕ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０（１）：７３−８０（８）（２００４）及びＮｉｃｕｌｅｓｃｕ  ａｎｄ  Ｈｏｒｅａ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ３０（１）：７３−８０（２００４）を参照できる。補体活性化及びＣ５ｂ−９付着は典型的にはヒト及び実験的アテローム性動脈硬化症の両方において生じる。Ｃ５ｂ−９は細胞溶解を担っている場合があり、そしてＣ５ｂ−９の溶解下の組み立ては平滑筋（ＳＭＣ）及び内皮細胞（ＥＣ）の活性化及び増殖を誘導する。補体Ｃ６不全は食餌誘導アテローム性動脈硬化症に対する保護的作用を有し、Ｃ５ｂ−９組み立てがアテローム性動脈硬化症幹部の悪化において必要であるか、又は少なくとも意味のある役割を果たしていることを示唆しており、例えばＮｉｃｕｌｅｓｃｕ  ａｎｄ  Ｈｏｒｅａ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０（１）：７３−８０（２００４）を参照できる。本発明の一部の実施形態はＣ５ｂ−９の形成及び／又はアテローム性動脈硬化症の抑制のために使用してよい。これは形成を直接抑制すること、又は結果的にＣ５ｂ−９の形成及び／又は活性化を抑制することになる経路内のある工程の抑制により行うことができる。一部の実施形態においては、本明細書に記載する通り因子Ｂ変異体をアテローム性動脈硬化症の部位又は潜在的部位に投与する。この因子Ｂ変異体はある経路（例えば古典的及び／又は代替補体経路）を抑制し、次にこれが、Ｃ５ｂ−９又はアテローム性動脈硬化症に関与する他の補体経路関連化合物の形成又は活性化を抑制する。形成及び／又は活性化が同様の態様において抑制又はブロックされるアテローム性動脈硬化症に関与する他の補体に関係する蛋白が存在すると考えられる。
【０１９３】
気道応答亢進症（ＡＨＲ）は種々の疾患、例えば限定しないが喘息（例えばアレルギー性喘息）の特徴である。ＡＨＲは補体に関係する経路に典型的に関与していることが分かっており、例えばＴａｕｂｅ等、２００６  ＰＮＡＳ  １０３（２１）：８０８４−８０８９；Ｐａｒｋ等、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６９：７２６−７３２，（２００４）；Ｔｈｕｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｈｏｌｅｒｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７６：１３０５−１３１０（２００６）及び米国特許公開２００５０２６０１９８を参照できる。Ｐａｒｋ等は腹腔内注射により投与されたＣｒｒｙ−ＩｇがＡＨＲに対して作用を有していることを示している。本発明の一部の実施形態はヒトのような動物においてＡＨＲをモジュレート、調節、抑制、低減、活性化及び／又は増大させるための組成物及び方法を提供する。治療、軽減、抑制及び／又は改善してよい特定のＡＨＲに関係する疾患は、限定しないが例えば、ぜんそく、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、肺気腫、気管支炎、アレルギー性気管支炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、結核、過敏性肺臓炎、職業性喘息、サルコイド、反応性気道疾患症候群、間質性肺疾患、好酸球増多症候群、鼻炎、副鼻腔炎、運動誘導喘息、汚染誘導喘息、咳喘息、寄生虫肺疾患、呼吸器シンシチウムウィルス（ＲＳＶ）感染症、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）感染症、ライノウィルス（ＲＶ）感染症、ハンターンウィルス（例えばフォーコーナーズ菌株）及びアデノウィルス感染症を包含する。
【０１９４】
免疫に関係する疾患、例えば自己免疫関連疾患、ＨＬＡ−Ｂ２７関連炎症性疾患、ループス腎炎及び全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）は補体が関係する経路に典型的に関与していることが示されており、例えばＴｈｕｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｈｏｌｅｒｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７６：１３０５−１３１０（２００６）を参照できる。ループス腎炎はＳＬＥの１つの合併症である。これは狼瘡の自己免疫過程に関係しており、この場合、免疫系が身体成分に対して抗体を生成する（抗核抗体及び他のもの）。これらの抗体及び補体の複合体は典型的には腎臓に蓄積し、そして炎症性応答をもたらす。本発明の一部の実施形態は例えばＳＬＥのような補体経路に関与する、又は関係する免疫に関係する疾患を調節、改質、治癒、抑制、防止、改善及び／又は治療するための方法及び組成物を提供する。
【０１９５】
関節炎は補体に関係する経路が典型的には関与していることが示されており、例えばＴｈｕｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｈｏｌｅｒｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１７６：１３０５−１３１０（２００６）及びＢａｎｄａ等、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７（３）：１９０４−１２（２００６）を参照できる。代替補体経路は関節炎の誘導において重要な役割を果たしており、そして代替補体経路はむしろ必要とされる場合がある。本発明の一部の実施形態は、関節炎、例えば慢性関節リューマチ又は炎症性関節炎を調節、改質、治癒、抑制、防止、改善及び／又は治療するための方法及び組成物を提供する。
【０１９６】
緑内障は視神経障害の特徴的パターンにおける網膜神経節細胞の損失が関与する視神経の疾患群である。網膜神経節細胞の損失を伴った緑内障患者の約２５％が正常な眼圧を有している。高眼圧症（ＯＨＴ）は緑内障の発症の重要な危険因子であり、医薬品又は手術を用いてそれを低下させることは緑内障治療の現在の主流である。高眼圧症及び緑内障は典型的には補体が関係する経路が関与することが示されており、例えばＫｈａｌｙｆａ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ，１３：２９３−３０８（２００７）；Ｓｔａｓｉ等、ＩＯＶＳ  ４７（３）：１０２４−１０２９（２００７）；及びＫｕｅｈｎ等、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８３：６２０−６２８（２００６）を参照できる。Ｃ１ｑ及びＣ３の発現及び／又は存在はＯＨＴに付されている網膜において高値となることが分かっている。本発明の一部の実施形態は緑内障を調節、改質、治癒、抑制、防止、改善及び／又は治療するための方法及び組成物を提供する。
【０１９７】
ブドウ膜炎は典型的には補体経路に関連することが示されており、例えばＭｏｎｄｉｎｏ  ａｎｄ  Ｒａｏ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ２４：３８０−３８４（１９８３）及びＪｈａ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４４：３９０１−３９０８（２００７）を参照できる。Ｍｏｎｄｉｎｏ及びＲａｏは房水から血清の計測までの全ての試験した補体成分の平均値が過去の眼の手術の病歴を有する患者において上昇しており、そして前部ブドウ膜炎を有する患者において最高値であったことを観察している。本発明の一部の実施形態は、ブドウ膜炎を調節、改質、治癒、抑制、防止、改善及び／又は治療するための方法及び組成物を提供する。
【０１９８】
糖尿病性網膜症は中年個体における視覚の損失の主要原因の１つである。補体系の活性化は糖尿病性網膜症の発症において重要な役割を果たしていると考えられている（例えばＪｈａ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４４：３９０１−３９０８（２００７）参照）。本発明の一部の実施形態は糖尿病性網膜症を調節、改質、治癒、抑制、防止、改善及び／又は治療するための方法及び組成物を提供する。
【０１９９】
増殖性硝子体網膜症（ＰＶ）は網膜剥離の最も一般的な合併症の１つである。ＰＶは補体活性に関連付けられており、例えばＧｒｉｓａｎｔｅ等、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．１９９１；３２（１０）：２７１１−７  ａｎｄ  Ｇｒｉｓａｎｔｅ等、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｅ．１９９２；８９（１）：５０−４を参照できる。本発明の一部の実施形態は、ＰＶを調節、改質、治癒、抑制、防止、改善及び／又は治療するための方法及び組成物を提供する。
【０２００】
抗リン脂質抗体症候群、腸及び腎虚血再灌流Ｉ／Ｒ傷害、非定型溶血性尿毒症、ＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎、及び胎児損失（例えば自発的胎児損失）には典型的には補体に関係する経路が関与していることが明らかにされており、例えばＴｈｕｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｈｏｌｅｒｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１７６：１３０５−１３１０（２００６）を参照できる。
【０２０１】
脳傷害（例えば外傷性脳傷害）には典型的には補体に関係する経路が関与していることが明らかにされており、例えばＬｅｉｎｈａｓｅ等、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ４：１３（２００７）  ａｎｄ  ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：５５（２００６）を参照できる。Ｌｅｉｎｈａｓｅ２００６は野生型（ｆＢ＋／＋）マウスにおける実験的外傷性脳傷害の後、時間依存性の全身性の補体活性化が観察された。これとは対照的に、全身性補体活性化の程度はｆＢ−／−マウスにおいては有意に減衰されていた。本発明の一部の実施形態はニューロン細胞死、外傷性神経傷害（例えば脳）、補体媒介神経炎症及び／又は神経障害を調節、改質、治癒、抑制、防止、改善及び／又は治療するための方法及び組成物を提供する。
【０２０２】
虚血再灌流傷害は細胞及び組織により生産される種々の潜在的に有害な化合物の生産量又は酸化の増大を誘発する場合があり、これは細胞及び組織の酸化性の損傷又は死滅をもたらす場合がある。例えば、腎虚血再灌流傷害は急性尿細管壊死に特徴的な腎尿細管損傷及び変化を包含する腎臓の組織学的損傷をもたらす場合がある。結果として生じる腎機能不全は腎臓から通常排出される窒素性の老廃物、例えば血清中尿素態窒素（ＳＵＮ）の蓄積を可能にする。虚血再灌流は又遠隔の臓器、例えば肺にも傷害をもたらす場合がある。本発明の一部の実施形態は、例えば虚血再灌流を経験又は発症しているか、その危険性がある動物に投与された場合に、補体経路のモジュレーター、例えば抑制剤（例えば因子Ｂ活性の抑制剤）を利用する。一部の実施形態においては、これらのモジュレーターは虚血再灌流に起因する傷害の症状少なくとも１つを防止、低減又は抑制する。本発明の方法及び組成物を用いて防止又は低減できる虚血再灌流傷害の別の型は、限定しないが例えば心臓虚血再灌流傷害、例えば心筋梗塞又は冠動脈バイパス手術、中枢神経系虚血再灌流傷害、四肢又は指の虚血再灌流傷害、肺、肝臓又は腸のような内臓の虚血再灌流、又はいずれかの移植された臓器又は組織の虚血再灌流傷害を包含する。例えば心筋梗塞及び補体経路を考察しているＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６１７６５を参照できる。
【０２０３】
炎症は心筋梗塞の主要な病因決定因子である（Ｒｉｄｋｅｒ，２００７  Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．６５（１２  Ｐｔ  ２）：Ｓ２５３−９）。骨髄（幹）細胞の送達（例えば冠動脈内）は急性心筋梗塞後の収縮期機能における改善をもたらすことが示されている（Ｗｏｌｌｅｒｔ，２００８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊａｎ  ３１  ［Ｅｐｕｂ］）。更に又、骨髄幹細胞は梗塞した心筋を再生できる（Ｏｒｌｉｃ等、２００３  Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｌｐａｎｔ．７  Ｓｕｐｐｌ  ３：８６−８８）。間葉性幹細胞は虚血性心疾患において心臓保護作用を与えることが示されている（Ｇｕｏ等、２００７  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ３０（３−４）：９７−１０４）。本発明においては幹細胞の送達はいずれかの手段により、例えば冠動脈内注射、心筋への直接の注射（例えば疾患を有する及び／又は健常な心筋内（例えば障害領域の隣接部））に行える。一部の実施形態においては、哺乳類をサイトカインで治療することにより循環系中にその骨髄幹細胞を移動させ、幹細胞を心筋梗塞まで運搬することができる。
【０２０４】
種々の幹細胞が種々の用途のためにインビボで使用されている。インビボで幹細胞を使用することに関わる１つの問題は、例えば目的領域における幹細胞の生存及び／又は播種が所望に満たないことである。本発明者等は幹細胞の低値の播種性及び生存性の１つの重大な理由はその部位における炎症である可能性があると考える。従って、本発明は治療法及び／又は幹細胞の生存性及び／又は播種性を向上させる方法を提供し、方法は幹細胞の投与又は移動の前、その間、及び／又はその後に本発明の組成物を投与することを含む。一部の実施形態においては、本発明の補体抑制剤は所望の播種領域（例えば損傷を有する心臓）への回帰と生存のため、そして結果として損傷組織の修復又は置き換えのために幹細胞にとって好ましい環境を創生する抗炎症剤として機能する。幹細胞はｆＢ類縁体又はｆＤ類縁体のような本発明の分子をやはり含有する溶液中で投与してよい。幹細胞は限定しないが例えば造血幹細胞、胚性幹細胞、間葉性幹細胞、神経幹細胞、乳腺幹細胞、嗅幹細胞、膵臓島幹細胞、全能性幹細胞、多重能力性幹細胞又は多能性幹細胞を包含する。幹細胞は自系、同種異系、又は同系であってよい。
【０２０５】
補体活性は筋ジストロフィーに関与していると考えられる（例えばジストロフィン欠損に関連）。例えばＰＣＴ公開ＷＯ２００７１３００３１，Ｓｐｕｌｅｒ＆Ｅｎｇｅｌ１９９８Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５０：４１−４６，及びＳｅｌｃｅｎ等、２００１Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５６：１４７２−１４８１を参照できる。従って本発明の一部の実施形態は筋ジストロフィーを調節、改質、治癒、抑制、防止、改善及び／又は治療するための方法及び組成物を提供する。
【０２０６】
補体活性は又角膜炎症にも寄与する場合がある。従って本発明の一部の実施形態は例えば手術後の角膜炎症を調節、改質、治癒、抑制、防止、改善及び／又は治療するための方法及び組成物を提供する。一部の実施形態においては、本発明の分子は点眼薬により、あるいは本明細書に記載する通り投与する。
【０２０７】
本発明の一部の実施形態は冠動脈又は末梢動脈のバイパス移植又は血管形成術の後の薬効を増強するための方法を提供する。一部の実施形態においては、本発明の蛋白（例えばｆＢ１及び／又はｆＢ３）をコードする本発明のベクターを使用して血管の細胞（例えば内皮細胞）を形質導入する。一部の実施形態においては、血管の細胞は動物への移植の前に形質導入する。一部の実施形態においては、血管の細胞はインビボである。
【０２０８】
術後の患者の疼痛及び苦痛及び炎症を軽減することは、特に毎年実施されている外来患者の手術の件数の増大により、臨床医学において特に着目されている分野である。本発明の組成物は例えば補体活性を抑制することにより、炎症を抑制するために利用できる。従って、本発明の組成物は例えば術後患者において炎症を低減するために使用できる。一部の実施形態においては、本発明の組成物は炎症を抑制すべき手術部位に局所的に（例えば手術付随的に）送達し、それは一部の場合においては、疼痛及び苦痛を低減することになる。一部の実施形態においては、本発明の組成物は例えば生理学的電解質担持流体中において、溶液中で投与される。一部の実施形態においては、組成物は組成物を含有する灌注溶液の手術部位への手術付随的直接送達を介して送達される。一部の実施形態においては、本発明の局所的手術付随的送達法のために、所望の治療作用は、他の送達方法、例えば静脈内、筋肉内、皮下及び経口で使用する場合に必要なものよりも低用量の薬剤で達成される場合がある。一部の実施形態においては、手術付随的に使用する場合、溶液は手術部位の疼痛及び／又は炎症の臨床的に意味のある低下をもたらすことになり、これにより患者の術後の鎮痛剤（例えばアヘン）の必要性の低下をもたらし、そして適宜、手術部位の早期の患者の運動性を可能にする。一部の実施形態においては、従来の灌注液と比較して本発明の溶液を使用する場合、外科医及び手術室の担当者の役割に過剰な負担がかからない。一部の実施形態においては、本発明の組成物は、関節鏡検査、心臓血管及び一般的な血管の治療及び診断の操作法、泌尿器科の操作法、一般的な外科的創傷及び一般的な創傷に対して使用（例えば灌注液として）される。本発明の組成物は、限定しないが例えば注射（例えばシリンジを介して）、灌注液により、創傷に被覆する包帯の一部として、又は局所適用において、例えば溶液、クリーム、ゲル等として、送達してよい。
【０２０９】
別の実施形態においては、本発明の組成物又は分子はＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）又はＶＥＧＦに結合するか血管形成を抑制する分子と組み合わせて投与する。ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）は湿性ＡＭＤを治療するために使用される。本発明の一部の実施形態は又湿性ＡＭＤを治療するために使用できる。従って、本発明はＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）及び本発明の組成物を投与することを含む湿性ＡＭＤを治療するための方法及び組成物を提供し、ここでそれらは別個に、又は共に投与できる。更に又、眼内炎症はＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）の投与後に報告されている最も一般的な有害反応の１つであり、例えばＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）に関する「Ｆｕｌｌ  Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」を参照できる。従って本発明はＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）の投与の前、それと同時、及び／又はその後に本発明の分子又は組成物を投与することを含む、眼内炎症（例えばＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）の投与に起因する）を抑制又は低減するための方法を提供する。
【０２１０】
疾患に寄与、及び／又は誘発する補体経路は、本発明の一部である種々の方法及び／又は組成物を用いてモジュレート、調節、抑制、及び／又は活性化することができる。本発明の一部の実施形態は、経路をモジュレートするために蛋白を利用する。
動物及び／又は細胞への投与
補体に関係する経路を調節することに関する化合物及び方法を本明細書に記載する。これはインビトロ、エクスビボ、又はインビボで行うことができる。動物への投与（例えば目的部位への）は多くの方法、例えば本明細書に記載するか又は当該分野で知られている方法で達成できる。一部の実施形態においては、蛋白は蛋白をコードする核酸の投与を介して「間接的に」投与する。一部の実施形態においては、蛋白そのものを動物に投与する。動物の所望の部位に本発明の組成物を送達することに適合する送達方法は当業者の知る通りである。
【０２１１】
一部の実施形態においては、組成物（例えば類縁体を含むもの）は局所的又は全身に投与できる。投与の有用な経路は本明細書に記載する通りであり、そして当該分野で知られている。導入又は投与の方法は、限定しないが例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、気管内、局所、吸入、経皮、直腸、非経口経路、硬膜外、頭蓋内、脳内、脳室内、硬膜下、動脈内、髄腔内、心臓内、冠動脈内、硝子体内、網膜下、前眼房内、特に角膜上に局所的に、結膜下、テノン下注射、点眼薬適用、経口経路、バルーンカテーテル使用、ステント使用、又はこれらの何れかの組み合わせを包含する。一部の実施形態においては、本発明の組成物又は分子は例えば結晶腔への直接の注射により、結晶腔に投与される。全身投与は、限定しないが、注射によるか、又は経粘膜及び／又は経皮の送達により行ってよい。一部の実施形態においては、本発明の組成物は例えば疾患の部位ではない部位に最初は指向させてよい。例えば、動物の肺において生じるＡＨＲに関しては、本発明の蛋白又は核酸の腹腔内注射は肺におけるＡＨＲの変化をもたらす場合があり、例えばＰａｒｋ等、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１６９：７２６−７３２，（２００４）を参照できる。一部の実施形態においては、組成物の用量レベル及び／又は投与様式は組成物の性質、治療すべき状態の性質、及び／又は患者個体の病歴に応じたものとなる。一部の実施形態においては、本発明の蛋白を発現する細胞を投与する。それらの細胞は細胞株、異種、同種、又は自系であることができる。
【０２１２】
例えば眼への投与を含む一部の実施形態においては、本発明の分子又はベクターは概ね毎週、毎月、２か月、３か月、６か月、９か月、１年、１８か月、２年、３０か月、３年、５年、１０年に１回、又は必要に応じて投与する。例えば眼への投与を含む一部の実施形態においては、本発明の分子又はベクターは概ね約１〜４週毎、約４〜８週毎、約１〜４月毎、約３〜６月毎、約４〜８月毎、約６〜１２月毎、約９〜１５月毎、約１２〜１８月毎、約１５〜２１月毎、約１８〜２４月毎、約１〜２年毎、約１．５〜３年毎、約２〜４年毎、約３〜５年毎、約５〜７年毎、約７〜１０年毎、又は約１０〜２０年毎に投与する。
【０２１３】
例えば眼への投与を含む一部の実施形態においては、本発明の分子又はベクターは患者に対し、その生涯において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い回数投与される。例えば眼への投与を含む一部の実施形態においては、本発明のレンチウィルスベクターは患者に対し、その生涯において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い回数投与される。
【０２１４】
一部の実施形態においては、抗炎症剤は本発明の分子又はベクター（例えばｆＢ３）と組み合わせて送達してよい。抗炎症剤は本発明の分子又はベクターの投与の前、同時、及び／又は後に送達してよい。一部の実施形態においては、抗炎症剤は本発明の分子又はベクターと同じ溶液及び／又は同じシリンジ中で投与される。一部の実施形態においては、本発明の分子又はベクター及び抗炎症剤は例えば本明細書に記載する通り眼に同時投与される。
【０２１５】
多くの抗炎症剤が当該分野で知られており、そして限定しないが例えばデキサメタゾン、デキサメタゾンナトリウムメタスルホベンゾエート、デキサメタゾンナトリウムホスフェート、フルオロメトロン、ブロムフェナク、プラノプロフェン、ＲＥＳＴＡＳＩＳＴＭ、シクロスポリン眼科用乳液、ナプロキセン、糖質コルチコイド、ケトロラック、イブプロフェン、トルメチン、非ステロイド抗炎症剤、ステロイド抗炎症剤、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、インドメタシン、及びスプロフェンを包含する。
【０２１６】
本発明の一部の実施形態は、補体活性を抑制する蛋白及び／又は補体活性を抑制する蛋白に関してコードするベクターを包含する。本発明の一部の実施形態は蛋白及びそれをコードするか、本発明の別の蛋白をコードするベクターの両方の投与を包含する。本発明の蛋白は本発明のベクターの投与の前、同時、及び／又は後に送達してよい。一部の実施形態においては、本発明の蛋白は本発明のベクターと同じ溶液及び／又は同じシリンジ中で投与される。一部の実施形態においては、本発明の蛋白及び本発明のベクターは例えば本明細書に記載する通り眼に同時投与される。
核酸
目的の核酸の局所的及び長期の発現を確保するために、本発明の一部の実施形態は核酸又はベクターを用いた細胞の形質転換を意図する。本発明は何れかの１つの特定の核酸送達方法に限定されると解釈してはならず、そしてインビボ又はインビトロの何れかの核酸送達方策とともに用いる何れかの使用可能な核酸送達ベヒクル、又は操作された細胞（例えばＮｅｕｒｏｔｅｃｈ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＲＩの技術、例えば米国特許６，２３１，８７９；６，２６２，０３４；６，２６４，９４１；６，３０３，１３６；６，３２２，８０４；６，４３６，４２７；６，８７８，５４４参照）並びに治療用蛋白自体をコードする核酸（例えば「ネイキッドＤＮＡ」）の使用も本発明の実施において使用できる。種々の送達ベヒクル、例えばベクターを本発明と共に使用できる。例えば、レンチウィルス、アデノウィルスベクター（例えば米国特許７，０４５，３４４参照）、ＡＡＶベクター（例えば米国特許７，１０５，３４５参照）、プラスミド（例えば米国特許６，９３６，４６５参照）、他のウィルスベクター（例えば、ヘルペス、米国特許５，８３０，７２７及び６，０４０，１７２；Ｄ型肝炎、米国特許５，２２５，３４７；及びＥＢＶ、米国特許６，５２１，４４９）、アンフィトリピック脂質、カチオン性重合体、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びポリリジン、デンドリマー、例えばｃｏｍｂｂｕｒｓｔ分子及びｓｔａｒｂｕｒｓｔ分子、ノニオン性脂質、アニオン性脂質、小胞、リポソーム及び他の遺伝子送達の合成核酸手段（例えば、米国特許６，９５８，３２５及び７，０９８，０３０；及びＬａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔ等、“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”、“Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ”；及びＬｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ＆Ｆｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．３１７−３２７及び３５３−３６５（１９８９）参照）；“ネイキッド”核酸等を本発明の実施において使用できる。例示目的のみにおいて、本明細書の考察の一部は、一部の特定のベクター型、例えばレンチウィルス、例えばＨＩＶと遠い関係にあるウシ免疫不全ウィルス（ＢＩＶ）から発現し、獲得されるものに着目することになる。
【０２１７】
ベクターは目的の核酸（例えば治療用蛋白をコードする治療用核酸）を目的の標的細胞に導入するための手段である。ベクターは典型的には出発原料、例えば外来性の遺伝子又はトランスジーンを担持することができ、そして標的細胞内に侵入してそこで発現されることができる核酸から構築又は獲得される。ベクターを獲得できる適当な出発原料は当該分野で知られる通り、トランスポゾン、プラスミド、ウィルス、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等を包含する。目的のベクターを獲得又は構築するための方法は、限定しないが例えば、当該分野で知られる通り、標準的な遺伝子操作手法、配列決定反応、制限酵素、ポリメラーゼ、ＰＣＲ、ＰＣＲソーイング、ライゲーション、リコンビナーゼ反応（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術）、核酸に対して作用する他の酵素、細菌及びウィルスの増殖物質及び方法、化学薬品及び試薬、部位指向性突然変異誘発プロトコル等を包含し、例えばＭａｎｉａｔｉｓ等の文献である「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」を参照できる。
【０２１８】
トランスジーンと一般的に称されているヌクレオチド配列の広範な種類のものを、例えば選択手段として、又は発現を増強するために使用してよい任意のマーカー遺伝子に加えて、本発明のベクターにより担持させてよい。一部の実施形態においては、外来性ヌクレオチド配列は生存ウィルス粒子の生産を可能にするための十分な大きさのものでなければならない。例えば、特定のウィルス粒子は特定の大きさの範囲の核酸のみをパッケージすることになる。これらのトランスジーン（非相同遺伝子）の一部の例は、例えば単鎖抗体、抗体及びその種々の抗原結合型、リボザイム、抑制性ＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ、触媒抗体、並びに例えばアンチセンス配列のような蛋白をコードする配列を包含する。
【０２１９】
蛋白は治療用蛋白又は治療用蛋白に影響する蛋白であってよい。更に、蛋白は完全な蛋白又はその機能的に活性なフラグメントであってよい。蛋白は例えば炎症に関与するか、それを調節するものであってよく、例えばその場合、蛋白は治療用蛋白であるか、補体因子に対して作用すること、又は例えば補体因子又はその調節物質を発現する遺伝子に対して作用すること、又は炎症を担っているエレメントを調節することができる別の遺伝子に対して作用することにより炎症を調節する蛋白であってよい。
【０２２０】
一部の実施形態においては、発現された配列はプロモーターに作動可能に連結することになる。一部の実施形態においては、トランスジーンインサートは第２のプロモーターに作動可能に連結することになる。
【０２２１】
本明細書に開示するコンストラクトに関しては、プロモーターの選択は当該分野で良く知られており、そして、本発明に従って、第１のプロモーター（例えばプロデューサー細胞において機能性）を用いたコンストラクト又は第２のプロモーター（例えば最終的な標的細胞において機能性）を用いたコンストラクトで形質転換された標的又は宿主細胞における遺伝子転写を指向することのできる何れかの真核生物、原核生物又はウィルスのプロモーターにまで範囲が及ぶ。プロモーターは組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、誘導プロモーター、リプレッションプロモーター、合成プロモーター又はハイブリッドプロモーター等であってよい。１つより多いプロモーターを本発明のコンストラクト内に入れてよい。本発明のコンストラクトにおいて有用なプロモーターの例は、限定しないが例えば、ファージラムダ（ＰＬ）プロモーター；ＳＶ４０初期プロモーター；単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）プロモーター；サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばヒトＣＭＶ前初期プロモーター；テトラサイクリン制御トランス活性化物質応答性プロモーター（ｔｅｔ）系；長末端リピート（ＬＴＲ）プロモーター、例えばＭｏＭＬＶＬＴＲ、ＢＩＶＬＴＲ又はＨＩＶＬＴＲ；モロニーネズミ肉腫ウィルスのＵ３領域プロモーター；グランザイムＡプロモーター；メタロチオネイン遺伝子の調節配列；ＣＤ３４プロモーター；ＣＤ８プロモーター；チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター；Ｂ１９パルボウィルスプロモーター；ＰＧＫプロモーター；糖質コルチコイドプロモーター；熱ショック蛋白（ＨＳＰ）プロモーター、例えばＨＳＰ６５及びＨＳＰ７０プロモーター；免疫グロブリンプロモーター；ＭＭＴＶプロモーター；ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター；ｌａｃプロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；及びノパリン合成酵素プロモーターを包含する。多くのプロモーターが市販元、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手可能である。
【０２２２】
一部の実施形態においては、プロモーターはＨＩＶ又はＢＩＶの５’ＬＴＲプロモーターのようなＬＴＲのプロモーター領域を包含する。一部の実施形態においては、プロモーターはＣＭＶプロモーター及びＰＧＫプロモーターを包含する。一部の実施形態においては、プロモーターはＭＮＤプロモーター（Ｒｏｂｂｉｎｓ等、１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９４６６−９４７４）であるか、又はＬＴＲエンハンサーが最小限のＣＭＶプロモーターと組み合わせられているＭＮＤプロモーターの誘導体であるＭＮＣプロモーターである（Ｈａｂｅｒｍａｎ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１８）：８７３２−８７３９，２０００）。
【０２２３】
非相同イントロンは知られており、そして非限定的な例はヒトβ−グロビン遺伝子イントロンを包含する。一部の実施形態においては、本発明のベクターは例えば目的の蛋白又はトランスジーンに関してコードしている遺伝子の部分としてイントロンを含む。一部の実施形態においては、本発明の一部のコンストラクトにおいて使用されるイントロンはＳＶ４０ウィルス又はヒトインスリン遺伝子から得てよい。一部の実施形態においては、レトロウィルスコンストラクトにおいて、イントロンはｇａｇ及び／又はｐｏｌコーディング領域の上流に位置する。
【０２２４】
シグナル配列又はリーダー配列は知られており、そして例えばｆＢ類縁体又はｆＤ類縁体のような本発明の蛋白を発現するために発現コンストラクト中で使用できる。シグナル配列は選択されたポリペプチドのアミノ末端に結合したペプチドとしてインフレームに翻訳され、分泌シグナル配列は宿主細胞の機序と相互作用することによりポリペプチドの分泌を誘発することになる。分泌過程の部分として、この分泌シグナル配列は切断除去されることになる。ヒト胎盤アルカリンホスファターゼ分泌シグナル配列はシグナル配列の例である。本発明は特定の分泌シグナル配列に限定されず、そして他のものは当業者の知る通りである。「シグナル配列」という用語は分泌ペプチドをコードする核酸配列を指す。シグナル配列が包含される場合、それはネイティブの配列、相同配列、又は非相同配列のいずれかであることができる。
【０２２５】
ウィルス遺伝子又はトランスジーンの発現では、典型的には、十分なプロモーターがコーディング核酸配列に作動可能に連結している。「作動可能に連結」又は「作動性に連結」という用語は互換的に使用され、そして成分がそれらの通常の期待される又は記載された機能を実施できるように立体配置されているコンストラクト内のエレメントの配置を指す。プロモーター又は他の制御エレメントはコーディング配列に隣接している必要はない。例えばそれらは、機能的関係が維持される限り、プロモーター又は制御エレメントとコーディング領域の間の介在残基が存在してよい。
【０２２６】
本明細書に開示する通り、本発明によるコンストラクト１つ以上は更にコーディング配列の３’に位置するポリアデニル化シグナル（ポリＡ）を包含してよい。ポリＡ尾部は、例えば細胞質において、安定性を促進するために十分な任意のサイズであってよい。ポリＡシグナルはＢＩＶ、ＨＩＶ及びＳＩＶのようなレンチウィルスから誘導してよい。しかしながら、ポリＡ配列はＳＶ４０のような他の細胞又はウィルスからも誘導してよい。多くのポリＡ部位が知られており、設計選択として使用でき、又は合成のポリＡを当該分野で知られる通り使用できる。
【０２２７】
一部の実施形態においては、治療用遺伝子は補体因子又はその調節物質を発現するか、或いはリボザイム、酵素抗体、抑制性ＲＮＡ、アンチセンス分子等のような炎症に寄与するエレメントの生産又は機能に拮抗するものであってよい。
ウィルスベクター
本発明は特定のウィルスベクターに限定されない。ウィルスベクターは限定しないが例えば、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター（例えば米国特許７，０４５，３４４参照）、ＡＡＶベクター（例えば米国特許７，１０５，３４５参照）、ヘルペスウィルスベクター（例えば米国特許５，８３０，７２７及び６，０４０，１７２）、Ｄ型肝炎ウイルスベクター（例えば米国特許５，２２５，３４７）、ＳＶ４０ベクター及びＥＢＶベクター（例えば米国特許６，５２１，４４９）。
【０２２８】
本発明のビリオン（例えばＢＩＶ系ベクター）はインビボ又はインビトロで細胞（例えば哺乳類細胞）に投与してよい。ベクター（ウィルス性及び非ウィルス性）を使用して細胞、限定しないが例えば未分化細胞、分化細胞、体細胞、原始細胞及び／又は幹細胞を形質導入又は形質転換することができる。一部の実施形態においては、幹細胞はヒトへの投与のために意図され、そして小児への分化及び発達のための適当な擬似妊娠女性への移植を意図しない。
【０２２９】
一部の実施形態においては、ビリオンは非相同（ウィルスと、及び／又は標的細胞と比較して）コーディング領域又はトランスジーンをコードする。一部の実施形態においては、非相同コーディング領域は治療用生成物をコードする。本発明により生成された一部のビリオンは、限定しないが例えば組み換え粒子、組み換えウィルス粒子、組み換えＢＩＶ粒子、組み換えベクター粒子又はビリオンである。「組み換え粒子又はビリオン」とはウィルス系のベクター核酸を含有するウィルス粒子を指す。一部の場合においては、ベクターコンストラクトはウィルス（例えばＢＩＶ以外）、例えばレトロウィルス又はレンチウィルス、例えばＦＩＶ、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＢＩＶ、及びＥＩＡＶから誘導された粒子に含有されることができ、これらの型の系統は目的のベクターを得ることができる出発原料として公的に入手可能である。
【０２３０】
一般的に本発明の一部のウィルス粒子の濃度は先ず遠心分離（例えばウィルス含有培地の）を介してウィルス粒子を収集し、そして次に上澄みを除去することにより上昇できる。一部の実施形態においては、殆ど、又は本質的に全ての上澄みを除去し、そしてウィルス粒子をより小容量中に懸濁する。一部の実施形態は遠心分離前の元の容量よりも１０倍少ない液体の容量中に収集したウィルスを懸濁させることによりウィルスを１０倍濃縮することを含む。一部の場合においては、これは形質導入効率の３倍〜１０倍の上昇をもたらす場合がある。当業者の知る通り、更にウィルスを濃縮すれば形質導入効率は更に上昇する場合がある。単独で、又は本明細書に記載した他のものとの組み合わせにおいて使用できる濃縮の他の形態は、限定しないが例えば、接線流精製、透析濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヘパリンセファロースアフィニティークロマトグラフィー及び分離及び濃縮の他の知られた形態を包含する。一部の実施形態においては、ウィルス粒子は約１．５〜約１０００倍；約２〜約９０倍；約２〜約８０倍；約２〜約７０倍；約２〜約６０倍；約２〜約５０倍；約２〜約４０倍；約２〜約３０倍；約２〜約２０倍；約２〜約１５倍；約２〜約１０倍；約２〜約７倍；約２〜約５倍；約５〜約５００倍；約１０〜約５００倍；約５０〜約５００倍；約１００〜約５００倍；約２００〜約５００倍；約３００〜約５００倍；約４００〜約５００倍；約４５０〜約５００倍；約５００〜約１０００倍；約６００〜約１０００倍；約７００〜約１０００倍；約８００〜約１０００倍；約９００〜約１０００倍；約１０〜約２００倍；約５０〜約３００倍；約５０〜約１５０倍；約５０〜約１００倍；約１００〜約２００倍；約１００〜約３００倍；又は約３００〜約５００倍濃縮される。
【０２３１】
ＢＩＶベクターは例示されるベクター型として、そして核酸送達方法／組成物の例として、そしてレトロウィルス又はレンチウィルスベクターの例として本発明で利用できるものを本明細書に提示している。しかしながら本発明はＢＩＶベクターに、或いは更にはレンチウィルス又はレトロウィルスベクターに限定されない。ＢＩＶベクター及びそれらを生産する系は、しかしながら、本発明に従って使用できるベクターの一部の例でもある。他のベクターを本発明と共に使用できる。ＢＩＶベクターに関して本明細書に記載する特徴に関しては、相当する特徴を他のベクター、例えば他のレンチウィルス及びＨＩＶウィルス、そして一部の場合においては、他のレトロウィルス内に設計することができる。従ってＢＩＶは例示される実施形態として提示されたものである。
【０２３２】
ＢＩＶはヒト疾患を誘発することは分かっていない。しかしなお、ＢＩＶベクターは種々のヒトの細胞、例えば眼の細胞、例えばＲＰＥ細胞を確かに形質導入できる。本発明の一部の実施形態においては、ベクターは治療用遺伝子の転移のために必要なＢＩＶエレメントの最少量のみ含有する（Ｍｏｌｉｎａ等、２００４）。ＢＩＶゲノムの９０％超に相当するウィルス遺伝子の本質的に全てがそのようなベクター中で除去され得る。一部のＢＩＶベクター系の特徴は、限定しないが例えば、高い力価、例えば少なくとも１０６〜３×１０９以上の形質導入単位／ｍｌ；広範なスペクトルのヒト細胞におけるインビトロの効率的な遺伝子転移；インビボによる網膜細胞への効率的な遺伝子転移；一部の実施形態においては他のレンチウィルスベクター系と等しいかそれより向上した広範な安全性の特徴；及びスケールアップ及び製造のための技術を包含する。ＢＩＶ系の例は、例えばＭａｔｕｋｏｎｉｓ等、２００２；Ｍｏｌｉｎａ等、２００２；２００４；米国特許６，８６４，０８５、７，１２５，７１２及び７，１５３，５１２に記載されている。
【０２３３】
ＤＮＡコンストラクトの多くの種類の異なる組み合わせを使用することにより目的の治療用遺伝子を格納しているウィルス系ゲノムを担持したＢＩＶ粒子を得ることができる。１つの系においては、４つのＤＮＡ成分をＢＩＶベクター生産のために使用する。これらにはＢＩＶベクター配列をコードする発現コンストラクト；ＢＩＶｒｅｖ配列をコードする発現コンストラクト；ＢＩＶｇａｇ／ｐｏｌ配列をコードする発現コンストラクト；及びエンベロープをコードする発現コンストラクトを包含する。一部の実施形態においては、エンベロープのコーディング領域はＢＩＶから誘導されない。ベクター配列をコードする発現コンストラクトはベクター／ウィルス粒子内にパッケージングされた所望のトランスジーンを担持するＲＮＡを形成してよい。ｇａｇ／ｐｏｌ及びエンベロープに関する発現コンストラクトはベクター粒子を形成するＢＩＶキャプシド蛋白を生産する。ｒｅｖに関する発現コンストラクトはとりわけ細胞核外へのベクターＲＮＡの輸送を支援する蛋白を生産する。Ｒｅｖはｇａｇ／ｐｏｌ又はｅｎｖコンストラクト上に位置することができる。一部の実施形態においては、ｒｅｖはｇａｇ、ｐｏｌ、又はｅｎｖ発現コンストラクトの部分ではない。一部の実施形態においては、宿主細胞株のゲノム内に組み込まれたＢＩＶ遺伝子１つ以上を担持する細胞株を、例えばＢＩＶベクター導入時の形質転換事象数を最小限にするために使用できる。一部の実施形態においては、ベクターを形成するために必要な成分全てを取り込んだ細胞株を用いることによりベクター製造時の形質転換の必要性を排除できる。ベクター粒子を形成するための本発明の一部の方法では、組織培養中の細胞内への発現コンストラクトの同時形質転換を行う。ベクターＲＮＡのパッケージング及び細胞質内の粒子の組み立ての後、ベクター粒子は細胞膜を経由して発芽し、脂質２層被膜を獲得し、そして組織培養培地中に蓄積し、そこからそれらを任意に精製及び／又は任意に濃縮してよい。形質転換細胞により製造されたビリオンを収集する方法は例えばＲｉｇｇ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２１８：２９０−２９５（１９９６）に記載されている。
【０２３４】
例えばレンチウィルス又はレトロウィルスベクターに関する一部の実施形態においては、ｇａｇ遺伝子の一部分をウィルスゲノムのＤＮＡセグメント内に組み込む。ＢＩＶｇａｇコーディング配列の例は典型的には約１４３１ヌクレオチドである。一部の実施形態においては、目的のベクター内で使用されるｇａｇコーディング領域の一部分はｇａｇコーディング領域の約１０２ヌクレオチド以下を包含することになる。一部の実施形態においては、目的のベクター内で使用されるｇａｇコーディング領域の一部分はｇａｇコーディング領域の約７６〜約５００、約７６〜約２００、約７６〜約１０２、約７６〜約１００、約７６〜約９５、約７６〜約９０、約７６〜約８５、約７６〜約８０、約８０〜約９０、又は約９０〜約１００ヌクレオチドを包含することになる。一部の実施形態においては、このＲＮＡ配列はベクター粒子内へのベクターＲＮＡのパッケージングを増強できる。一部の実施形態においては、ＤＮＡセグメントはｖｉｆ、ｖｐｗ、ｖｐｙ、ｔａｔ、ｖｐｕ、ｖｐｒ、ｎｅｆ、ｔｍｘ、又はｒｅｖ、例えばＢＩＶ、ＨＩＶ由来のものよりなる群から選択される蛋白に対する遺伝子又はコーディング領域を含んでよく、或いは別のレンチウィルスを使用して遺伝子転移を増強してよい。
【０２３５】
ＢＩＶベクターコンストラクトは更に、１つ以上の調節エレメント、例えばＲＮＡ輸送エレメント（例えばｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）），構成輸送エレメント（ＣＴＥ）、例えばＭａｓｏｎ−ＰｆｉｚｅｒサルウィルスＣＴＥ又はトリ白血病ウィルスＣＴＥ、翻訳を増強する配列、シグナル配列、コピー数制御エレメント、組み込み適合配列、終止配列、ｍＲＮＡリーダー配列、例えばヒト起源のスカホールド結合領域（ＳＡＲ）、ポリプリン管、一般的に３’ＬＴＲの上流、転写後調節エレメント、例えばｗｏｏｄｃｈｕｃｋ肝炎ウィルスのもの（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ等、Ｖｉｒｏｌ．７３（４）：２８８６−９２（１９９９））、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、エンハンサー及び当業者の知る他の調節配列を含んでよい。一部の実施形態においては、トランスジーン（例えば第２のプロモーターに作動可能に連結している）を推定ＢＩＶＲＲＥの下流に位置させる。ＲＲＥはＢＩＶ以外のレンチウィルス由来であってよい。目的のコンストラクトに包含される殆どの遺伝子エレメントの場合と同様、上記エレメントは作動可能な発現産物が生じるような態様において立体配置及び結合しており、即ちエレメントは作動可能に連結している。エレメントは合成、購入、及び／又は他の核酸から、又は天然原料からサブクローニングすることができる。
【０２３６】
一部の実施形態においては、本発明のレトロウィルス又はレンチウィルスベクターコンストラクトは自己不活性化ベクターである。例えばＬＴＲが存在する場合、ＢＩＶベクターコンストラクトの３’ＬＴＲのＵ３領域の一部分は欠失するか、又は非相同配列により置き換えられてよい。そのような状況においてトランスジーンは内部プロモーターに作動可能に連結してよい。一部の実施形態においては、Ｕ３エレメントは更にポリアデニル化を増強する配列を含有してよい。例えば３’ＬＴＲのＵ３領域の一部分はＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルエンハンサーエレメントで置き換えられることができる（例えばＳｅｈｅｔ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２：５３８６−５３９３（１９９２）参照）。
【０２３７】
場合によりヘルパーコンストラクトとも称される「パッケージングコンストラクト」は少なくともｇａｇ及び／又はｐｏｌコーディング領域及びそれに作動可能に連結したプロモーター、そして任意にｇａｇ及び／又はｐｏｌをコードするヌクレオチド配列の下流に位置するポリアデニル化配列の発現を指向できる組み立て物をさす。ポリアデニル化配列は例えばサルウィルス４０（ＳＶ４０）又は牛成長ホルモン遺伝子から誘導できる。多くのポリアデニル化シグナルが当該分野で知られている。
【０２３８】
パッケージングコンストラクトは上記した特定の遺伝子に加えて他のコーディング領域も包含してよい。他の遺伝子はｖｉｆ、ｖｐｗ、ｖｐｙ、ｔａｔ及びｒｅｖ遺伝子を包含する。一部の実施形態においては、ｒｅｖ遺伝子はＢＩＶから、又は異なるレンチウィルスから、例えばＨＩＶから得ることができる。コンストラクトは又機能的ｔａｔ遺伝子に相当するヌクレオチドの十分な数量を包含できる。
【０２３９】
一部の実施形態においては、スプライシング部位、例えば主要スプライシングドナー部位を不活性化又は排除することにより異常なスプライシングを低減又は排除してよい。配列の変化、例えばパッケージング配列及び／又はスプライシングドナー部位に対するものは、当該分野で知られた標準的な手法により達成してよい。
【０２４０】
本発明の一部の実施形態は又、最少レトロウィルス又はレンチウィルスパッケージングコンストラクトを提供する。一部の実施形態においては、コンストラクトはｇａｇ／ｐｏｌコーディング配列に作動可能に連結したプロモーター及びｇａｇ／ｐｏｌコーディング配列の３’末端におけるポリアデニル化シグナルを含む。一部の実施形態においては、パッケージングコンストラクトはｇａｇ／ｐｏｌコーディング配列の上流（即ち５’）に非相同イントロンを含む。更に又、パッケージングコンストラクトはＲＮＡ輸送エレメントを含有してよい。一部の実施形態においては、このエレメントはレンチウィルスＲＲＥ、ＢＩＶＲＲＥであってよく、或いはそれは本明細書に記載する通りＣＴＥであってよい。一部の実施形態においては、パッケージングコンストラクトは又Ｒｅｖコーディング配列を含有してよい。一部の実施形態においては、ｇａｇ／ｐｏｌコーディング領域はアミノ酸配列を変えることなく改変する事が出来るが、例えば最適化コドンの場合と同様、ｇａｇ／ｐｏｌコーディング領域を再コーディングすることにより、ＲＲＥの必要性を排除する。
【０２４１】
一部の実施形態においては、本発明のウィルス細胞表面蛋白発現コンストラクト、即ち、エンベロープコーディング配列を担持する発現コンストラクトはＶＳＶ−Ｇｅｎｖコーディング領域を包含する。一部の実施形態においては、ＶＳＶ−Ｇ蛋白は、ＶＳＶ−Ｇが組み換えウィルスに対して広範な宿主範囲を与えることから、望ましいｅｎｖ遺伝子である。しかしながら、一部の場合においては、ＶＳＶ−Ｇｅｎｖは宿主細胞に対して有害な作用を有することができる。即ち、一部の実施形態においては、ＶＳＶ−Ｇｅｎｖに対する者のようなコーディング領域を使用する場合、ＶＳＶ−Ｇの発現が必要ではない場合に宿主細胞毒性を最小限となるようにＶＳＶ−Ｇ発現を調節することができるように、誘導プロモーター系のような制御された遺伝子発現機序を使用する。例えばＧｏｓｓｅｎ＆Ｂｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）８９：５５４７−５５５１）のテトラサイクリン調節可能な遺伝子発現系を使用することによりＶＳＶ−Ｇの誘導発現を実現できる。一部の実施形態においては、ｔｅｔ／ＶＰ１６トランスアクチベーターを第１のベクター上に存在させてよく、そしてＶＳＶ−Ｇコーディング配列を別のベクター上のｔｅｔオペレーター配列により制御されるプロモーターから下流にクローニングしてよい。調節可能な発現系の他の非限定的な例はＰＣＴ公開ＷＯ０１／３０８４３及びＷＯ０２／０６４６３に記載されている。
【０２４２】
一部の実施形態においては、本発明のエンベロープコードコンストラクトはＬＣＭＶ突然変異体ｅｎｖコーディング領域（Ｂｅｙｅｒ，等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：１４８８  １４９５，２００２）、Ｔｈｏｇｏｔｏエンベロープ（例えばＰＣＴ公開ＷＯ０３０６６８１０参照）及び／又はバキュロウィルスｇｐ６４ｅｎｖコーディング領域（Ｍｏｎｓｍａ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（７）：４６０７−４６１６，１９９６）を包含する。１つの実施形態において、ＬＣＭＶ突然変異体ｅｎｖ及び／又はｇｐ６４ｅｎｖコーディング領域は構成的に発現される。別の実施形態においては、ＬＣＭＶ突然変異体ｅｎｖ及び／又はｇｐ６４ｅｎｖコーディング領域は誘導プロモーターから発現される。誘導プロモーター系及び構成プロモーター系は当該分野で知られており（例えばＷＯ０３０６６８１０参照）、そして一部は本明細書に記載している。他のエンベロープを本発明の実施において使用でき、そして限定しないが例えば４０７０Ａｅｎｖ、ネズミ白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）ｅｎｖ、Ｍｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウィルスｅｎｖ、両栄養性ｅｎｖ、異種栄養性ｅｎｖ、外栄養性ｅｎｖ、多栄養性ｅｎｖ、ＨＩＶ由来のＧＰ１２０ｅｎｖ、ＨＴＬＶ  Ｉｅｎｖ、ＨＴＬＶ  ＩＩｅｎｖ、Ｂ型肝炎Ｂウィルス（ＨＢＶ）ｅｎｖ、インフルエンザｅｎｖ、例えばＨＡ、リッサウィルス糖蛋白（ＧＰ）、アルファウィルスＧＰ、ロスリバーウィルスＧＰ、セミリキフォレストウィルスＧＰ、シンドビスＧＰ、フィロウィルスＧＰ、エボラウィルス（例えばＺａｉｒｅ系統）ｅｎｖ、Ｍａｒｂｕｒｇウィルスｅｎｖ、ガンモレトロウィルスＧＰ、及びＥＢＶｅｎｖを包含し、同様に例えばＲｅｉｓｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ７：９１０−９１３（２０００）及びＣｒｏｎｉｎ等、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ５（４）：３８７−３９８（２００５）を参照できる。これらのエンベロープはＢＩＶ又はレンチウィルスベクターにおける使用に限定されず、何れかの適切又は適合性のあるエンベロープを有するウィルス又はエンベロープを有するベクターと共に使用できる。
【０２４３】
一部の実施形態においては、本発明のウィルスベクターは崩壊加速因子（ＤＡＦ）を含む。例えばエンベロープを有するウィルスベクターはウィルス膜上にＤＡＦを包含する。一部の実施形態においては、ＤＡＦは野生型ＤＡＦである。一部の実施形態においては、ＤＡＦはエンベロープ蛋白との融合蛋白の一部であり、例えばＧｕｉｂｉｎｇａ等、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５、１１（４）：６４５−５１を参照できる。本発明は又、ＤＡＦを発現するＢＩＶプロデューサー細胞を包含する。
【０２４４】
本発明の一部のベクターコンストラクト（例えばＢＩＶコンストラクト）はパッケージング細胞又はプロデューサー細胞として機能することになる実質的に如何なる細胞株又は宿主細胞を形質転換するためにも使用してよい。そのような細胞は原核生物又は真核生物の宿主細胞であることができる。細胞は細菌、コウボ、昆虫等であることができる。形質転換は一般的にトランスフェクション又は形質導入により行う。トランスフェクションはプラスミドのような単離されたＤＮＡゲノムによる標的又は宿主細胞を形質転換であり、例えばＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｍａｎ＆ＣｏｍｐａｎｙＮＹ（１９９０）を参照できる。市販のキット、例えばＣａｌＰｈｏｓキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）及びＰｒｏｆｅｃｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を参照できる。スピノキュレーションの方法の例に関してはＫｏｔａｎｉ等、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：１９−２８（１９９４）及びＦｏｒｓｔｅｌｌ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６０：１７１−１７８（１９９６）を参照できる。一部の実施形態においては、細胞は哺乳類細胞、例えば霊長類細胞、又はヒト細胞である。例は限定しないが例えば、ヒト胚性腎細胞（例えば２９３又は２９３Ｔ）、ＥＲＥｐウサギ細胞、Ｃｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１４３０）、ＣＨＯ、ＳＷ４８０、ＣＶ−１、ヒトＴ細胞株ＣＥＭ−ＳＳ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＤＣＫ及びＤ１７イヌ細胞株、ＨＴ１０９０、ＬＩＮＡ、ＷＥＳ及びネズミ細胞株、例えばＮＩＨ３Ｔ３を包含する。細胞株又は細胞培養物はインビトロで生育又は維持された真核生物の細胞を意味する。ある細胞の子孫は親細胞とは完全に同一ではない（例えば形態学的に、遺伝子型的に、又は表現型的に）と理解される。
【０２４５】
パッケージング細胞及び／又はプロデューサー細胞はヒト型であってよく、そして標的細胞はヒト型である場合があるため、目的のベクターコンストラクトの種々のエレメントは、例えばヒト誘導プロモーター、ヒト至適化コドンを用いたコーディング領域の再コーディング等、特定の宿主及び標的細胞における最適な発現を与えるために選択してよい。
【０２４６】
パッケージング細胞及び／又はプロデューサー細胞を本発明のベクターコンストラクトを用いてトランスフェクト又は形質導入した後、遺伝子は発現され、そして新しいビリオンが細胞により形成されることになる。結果的に、ビリオンを収集して標的細胞を感染又は形質導入するために使用してよく、これにより標的細胞にベクター中の目的の遺伝子を転移させる。ウィルスを用いた形質導入の方法は細胞の直接の同時培養（Ｂｒｅｇｎｉ等、Ｂｌｏｏｄ８０：１４１８−１４２２（１９９２））又はウィルス上澄み単独と共に、又は適切な成長因子も用いながら培養すること（Ｘｕ等、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．，２２：２２３−２３０（１９９４））を包含する。一部の実施形態においては、ウィルスビリオンを精製（部分的又はほぼ完全に）及び／又は濃縮する。
【０２４７】
本発明の一部の実施形態は又、ウィルスを作成するための安定なパッケージング細胞株及びプロデューサー細胞株を樹立することに関する。それぞれのレンチウィルスプロテアーゼの活性部位における突然変異はレンチウィルスベクターの生産のための安定なパッケージング細胞株を樹立するために有用であるレンチウィルスパッケージングベクターの構築を可能にすることができ、例えば米国特許７，０７０，９９３を参照できる。慨すれば、ＨＩＶプロテアーゼの触媒中心は３アミノ酸モチーフＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙを包含する（例えばＫｏｎｖａｌｉｎｋａ，Ｊ．等Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７１８０−７１８６，１９９５参照）。これらの３アミノ酸は典型的にはこれまで報告されているＨＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ及びＳＩＶの単離株の間で保存されている（Ｋｏｒｂｅｒ  Ｂ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８０：５３７１）。Ｔｈｒ残基（ＨＩＶ単離株ＨＸＢ２におけるプロテアーゼ遺伝子の起点からアミノ酸番号２６に相当する）を例えばＳｅｒに改変する突然変異は、宿主細胞において持続性の構成的な発現を可能にできる機能的プロテアーゼをもたらす。
【０２４８】
従って、１つの実施形態において、本発明はプロテアーゼ、例えばＢＩＶ又はＨＩＶのプロテアーゼのＡｓｐ−Ｔｈｒ−ＧｌｙモチーフにおけるＴｈｒからＳｅｒへの突然変異を可能にする。本発明の一部の実施形態は、プロテアーゼコーディング領域におけるこの点突然変異を有するＢＩＶｇａｇ／ｐｏｌを発現するＢＩＶ系レンチウィルスベクター生産のためのＢＩＶ系の安定なパッケージング細胞株を使用する。そのような安定なパッケージング細胞株はウィルス粒子を高力価で形成するＢＩＶレンチウィルスベクター生産細胞株の製造を可能にする。
【０２４９】
コードされたレンチウィルスプロテアーゼにおけるＴ→Ｓ置換に「相当する」突然変異はＴ→Ｓ置換そのもの又は等価な生物学的作用をプロテアーゼの同じか類似のモチーフにおいて有する置換の何れかであってよい。他の置換が等価な生物学的作用をもたらすかどうかを調べるためにそれらを評価することは当業者には容易である。「等価な生物学的作用」とはＴ→Ｓ置換又は野生型のプロテアーゼと同様のレベルのウィルスプロテアーゼ活性を保持しながら、宿主細胞中で構成的及び持続性の発現をもたらす置換を意味し、Ｋｏｎｖａｌｉｎｋａ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７１８０−７１８６，１９９５を参照できる。「ウィルスプロテアーゼ活性」はＫｏｎｖａｌｉｎｋａ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７１８０−７１８６，１９９５に記載されている通り計測してよい。活性及び細胞毒性は、Ｔ→Ｓ置換に関して計測したものと、本質的に同じ実験条件下にその部位における他のアミノ酸によるものとの間の差が２倍未満、１．５倍未満、又、更には１．２倍未満である場合に、本発明の意味内で「同様」となる。一部の実施形態においては、プロテアーゼにおける同じ又は類似のモチーフにおける置換は、ある生産系において使用された場合、例えば一過性トランスフェクション系における相当する野生型のプロテアーゼを用いた生産系と比較して、同様のウィルス粒子収率、例えば約３倍以内、約４倍以内、約５倍以内、約２倍以内、約１．５倍以内又は約１．２倍以内の差をもたらすことになる。倍差は相当する野生型プロテアーゼを用いた場合の収率より低値及び／又は高値であってよい。
【０２５０】
本発明の一部の実施形態においては、安全性の特徴はＨＩＶ又はＢＩＶのようなレンチウィルスベクター系内に導入操作されている。ウィルス系のベクター系を開発する場合の主要な指示の１つは、ベクターを生産する細胞が「生」ウィルス、例えばプロデューサー細胞外部で増殖できるか、又は標的細胞中で増殖できるものを形成することができる可能性を排除又は最小限とすることである。この目的のために、本発明の一部のベクター系（例えばＢＩＶ）は他の現在使用されているベクター系、例えば他のレンチウィルスベクターの安全性の特徴と同等以上のものを組み込んでいる。本発明のＢＩＶ、レトロウィルス又はレンチウィルスの生産系内に組み込むことができる一部の特徴は、限定しないが例えばベクター内のｇａｇ及び／又はＲＲＥ配列が最小限とされること；ベクター内のｇａｇＡＴＧが突然変異されること；ベクター骨格が自己不活性化（ＳＩＮ）できること；ｔａｔ遺伝子が系から排除できること；及び／又は全て又は一部のアクセサリー遺伝子が排除できること、を包含する。一部の実施形態においては、ウィルスベクターが標的細胞中で増殖又は複製する機会を最小限化、低減又は排除するように設計されたウィルス系ベクター系を使用する。一部の実施形態においては、ウィルスベクターが標的細胞中で増殖、拡張及び／又は複製可能となるように設計されたウィルス系ベクター系を使用する。これは、初回形質転換はウィルスベクター粒子を生産する形質転換された細胞をもたし、これが次に「放出」され、そして細胞の第２の集団を形質転換する場合のような、例えば標的細胞中の複製が１回に限定された、ウィルスの拡張を制限する制御された複製を包含する。一部の実施形態においては、細胞のこの第２の集団はウィルスベクター粒子を生産しない。複製コンピテントなウィルスベクター又は限定された複製コンピテントなウィルスベクターは増大された量の形質転換された細胞をもたらすことができる。
【０２５１】
ＢＩＶベクター系及び核酸送達（例えば眼送達）のためのその使用は優れた安全性の特徴に寄与することができる。例えば、ＢＩＶはヒトの疾患は誘発せず；典型的にはＢＩＶベクターはヒトの病原体、ＨＩＶとは有意な配列同一性を共有しておらず；ＢＩＶはレンチウィルス系統発生樹状図においてＨＩＶとは最も遠隔なウィルスであり；そしてＨＩＶはウィルス粒子内にＢＩＶベクターをパッケージしない。即ち、ＨＩＶによる感染は移動性とならず、そして治療用ＢＩＶベクターを発散させる。
本発明の蛋白
本発明は本明細書に記載した抗体又は蛋白類縁体のような本発明の蛋白を発現させ、そして製造する方法を提供する。本発明は又本発明の蛋白をコードする単離された核酸、核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び蛋白の製造のための組み換え技術を提供する。
【０２５２】
蛋白の組み換え製造のためにはそれをコードする核酸をベクター（例えば複製可能）に挿入し、その後のクローニング（例えばＤＮＡ増幅）又は発現に付してよい。一部の実施形態においては、本発明の蛋白に関してコードしている配列はそれが発現される細胞に対して最適化されたコドンを含有するコーディング配列であってよい。別の実施形態においては、蛋白は例えば米国特許５，２０４，２４４に記載されている通り、相同組み換えにより生産してよい。
【０２５３】
多くのベクターが使用できる。例えば米国特許５，５３４，６１５に記載の通り、ベクター成分は一般的に、限定しないが例えば以下のもの、即ち：シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子１つ以上、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終止配列の１つ以上を包含する。
【０２５４】
ベクター中のコーディング領域のクローニング又は発現のための適当な宿主細胞は原核生物、酵母、又はより高等な真核細胞である。この目的のために適当である原核生物は、限定しないが例えば真正細菌目、例えばグラム陰性又はグラム陽性の生物、例えば腸内細菌科、例えばエシェリシア、例えばＥ・コリ、エンテロバクター、エルウイニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばサルモネラ・チフィムリウム、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス、及びシゲラ、並びに桿菌類、例えばＢ・サブチルス及びＢ・リチェニフォルミス（例えばＢ・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス類、例えばＰ・アエルギノーサ、及びストレプトマイセス類を包含する。一部の実施形態においては、Ｅ・コリクローニング宿主はＥ．ｃｏｌｉ２９４（例えばＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の菌株、例えばＥ．ｃｏｌｉＢ，Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（例えばＡＴＣＣ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０（例えばＡＴＣＣ２７，３２５）も適している場合がある。これらの例は限定的ではなく例示にすぎない。
【０２５５】
原核生物に加えて、真核生物の微生物、例えば糸状カビ類又はコウボは適当なクローニング又は発現の宿主である。サッカロマイセス・セレビシアエ、即ち一般的なパン酵母がより低い等級の真核生物宿主微生物の中では一般的に使用されている。しかしながら本発明においては多くの他の属、種、及び系統が一般的に入手可能であり使用することができ、例えばスキゾサッカロマイセス・ポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ・ラクチス、Ｋ・フラジリス（例えばＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ・ブルガリクス（例えばＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ・ウイケラミ（例えばＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ・ワルチ（例えばＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ・ドロソフィラルム（例えばＡＴＣＣ３６，９０６）、サーモトレランス、及びＫ・マルキシアミス；ヤロウイア（例えばＥＰ４０２，２２６）；ピチア・パストリス（例えばＥＰ１８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア（例えばＥＰ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス；及び糸状カビ類、例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム、及びアスペルギルス宿主、例えばＡ．ニヅランス及びＡ．ナイジャーが挙げられる。
グリコシル化された蛋白の発現のための適当な宿主細胞は多細胞生物から誘導できる。無脊椎動物細胞の例は植物及び昆虫細胞を包含する。多くのバキュロウイルス系統及び変異体及びスポドプテラ・フルギペルダ（イモムシ）、アエデス・アエギプチ（カ）、アエデス・アルボピクタス（カ）、ドロソフィリア・メラノガスター（ミバエ）、及びボンビックス・モリのような宿主に由来する相当する許容性昆虫宿主細胞が発見されており、そして蛋白を発現するために使用できる。トランスフェクションのための種々のウィルス系統、例えばオートグラファ・カリホルニカＮＰＶのＬ−１変異体及びボンビックス・モリＮＰＶのＢｍ−５系統を蛋白発現のために使用でき、そして公的に入手することができ、そしてそのようなウィルスは例えばスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために本発明に従って本明細書におけるウィルスとして使用してよい。メンカ、トウモロコシ、バレイショ、ダイズ、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養物も又宿主として利用できる。
本発明の一部の実施形態は脊椎動物の細胞を利用し、そして培養物（組織培養物）中の脊椎動物細胞の増殖は定型的な操作法である。有用な哺乳類宿主細胞株の例はＳＶ４０で形質転換されたサル腎ＣＶＩ系統（例えばＣＯＳ−７，ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎系統（例えば２９３又は２９３Ｔ細胞、例えば懸濁培養物中の生育のためにサブクローニングされた何れかの細胞株、Ｇｒａｈａｍ等、Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）、例えば２９３フリースタイル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））又は２９３ＦＴ；ベビーハムスター腎細胞（例えばＢＨＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（例えばＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞（例えばＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（例えばＣＶＩＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（例えばＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（例えばＨＥＬＡ，ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（例えばＭＯＣＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；ＣＦ２ＴＨ細胞；バッファローラット肝細胞（例えばＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（例えばＷ１３８，ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（例えばＨｅｐＧ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（例えばＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ等、ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８３））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトヘパトーマ系統（ＨｅｐＧ２）である。
【０２５６】
宿主細胞は典型的には蛋白生産のための発現又はクローニングベクターを用いて形質転換され、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択、所望の配列をコードする遺伝子の増幅のため、又は後続の精製及び／又は濃縮の操作法のために適宜変性された従来の栄養培地中で培養される。
【０２５７】
一部の場合においては、宿主細胞は内因性蛋白の発現を低下又は排除するために改質してよい。例えば因子Ｂ類縁体を特定の宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）中で生産したい場合は、宿主細胞のネイティブの因子Ｂ（例えばハムスター因子Ｂ）の発現が低減又は排除されるように宿主細胞を改質する。従って本発明は宿主細胞における相当するネイティブの補体蛋白の発現を低減又は排除することを含む補体蛋白類縁体を製造する方法を提供する。宿主細胞蛋白の発現を低減、排除又はノックアウトするための方法は当該分野で知られている。例えば、蛋白の発現レベルは、蛋白に対してコードしているＲＮＡに対して特異的な抑制性ＲＮＡ（例えばＲＮＡｉ）を発現するように宿主細胞を操作することにより、低減又は排除してよい。例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）は種々のベクター及びキット、例えば宿主細胞における蛋白の発現をノックダウンするためのＫＮＯＣＫＯＵＴＴＭＲＮＡｉシステムの部分として呼称されているものを販売している。他の方法は何れかのクローニングされた遺伝子内への特異的突然変異の導入を可能にする相同組み換えによる遺伝子ターゲティングを包含し、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４−１９９８、セクション９．１６及び９．１７を参照できる。これは宿主細胞蛋白を発現している遺伝子をノックアウトするために使用できる。
【０２５８】
内因性蛋白の発現を低減するために使用してよい別の方法は、内因性蛋白の発現をリプレッションするターゲティングされた転写因子を使用することを包含する。例えば転写因子に由来するリプレッサードメインを亜鉛フィンガーポリペプチドのようなＤＮＡ結合ドメインに結合又は融合してよい。当業者であれば特定のＤＮＡ配列に結合する亜鉛フィンガーポリペプチドを設計することができ、例えば米国特許６，１４０，０８１；及び７，０６７，６１７；及び米国特許出願２００６００７８８８０；２００４０２２４３８５；及び２００７０２１３２６９を参照できる。当業者であれば設計された亜鉛フィンガーポリペプチドを転写リプレッサードメイン（例えばＫＲＡＢ（Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス）に関連付けることができる。そのような分子及び手法の例はＢｅｅｒｌｉ等、（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０００、９７（４）：１４９５-１５００）及び米国特許出願２００７００２０６２７に記載されている。本発明の一部の実施形態においては、宿主細胞は転写リプレッサーを発現するベクターで形質導入される。この手順は、大部分の例において、宿主細胞は二倍体となり、そして両方の遺伝子コピーをノックアウトすることが望ましいため、相同組み換えを用いて目的の遺伝子をノックアウトすることよりも有利である。即ち、転写リプレッサーの発現は両方の遺伝子コピーの発現をリプレッションしなければならない。
【０２５９】
特定の内因性蛋白の発現は又、その特定の内因性蛋白の発現を直接又は間接的に低減することになる化合物を用いて低減してもよい。ｆＢを例とすれば、種々の化合物を用いて内因性ｆＢ発現の発現を低減できる。例えばｆＢ発現はヒスタミン（Ｆａｌｕｓ＆Ｍｅｒｅｔｅｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９８７  ６０：５４７−５５１及びＦａｌｕｓ＆Ｍｅｒｅｔｅｙ、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１９８８、２５（１１）：１０９３−９７）、酪酸ナトリウム（Ａｎｄｏｈ等、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏ１９９９、１１８：２３−２９）、糖質コルチコイド、例えばデキサメタゾン（Ｄａｕｃｈｅｌ等、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９０、２０（８）：１６６９−７５）、血小板誘導成長因子（Ｃｉｒｃｏｌｏ等、１９９０、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２６５（９）：５０６６−５０７１）、表皮成長因子（Ｃｉｒｃｏｌｏ等、１９９０）、及び線維芽細胞成長因子（Ｃｉｒｃｏｌｏ等、１９９０）により抑制されることが分かっている。本発明の宿主細胞はｆＢ及び場合によってはｆＤの内因性発現を低減するためにこれらの分子の何れか１つ又は組み合わせの存在下に培養してよい。これはｆＢ類縁体又はｆＤ類縁体の宿主細胞内での生産のために有用である。従って、本発明の一部の実施形態においては、ｆＢ類縁体又はｆＤ類縁体を発現する宿主細胞をヒスタミン、酪酸ナトリウム、糖質コルチコイド（例えばデキサメタゾン）、血小板誘導成長因子、表皮成長因子、又は線維芽細胞成長因子よりなる群から選択される化合物の何れか１つ以上の存在下で培養する。
【０２６０】
種々の化合物及び蛋白がｆＢの発現をアップレギュレート又は維持することが分かっている。例えば、ｆＢ発現はＴＮＦ（Ａｎｄｏｈ等、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏ  １９９９  １１８：２３−２９）、エストロゲン（Ｓｈｅｎｇ−Ｈｓｉａｎｇ等、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ２００２  ６６：３２２−３３２）、インターロイキン−１（Ｄａｕｃｈｅｌ等、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１９９０、２０（８）：１６６９−７５）、デキサメタゾン（Ｌａｐｐｉｎ＆Ｗｈａｌｅｙ，ＢｉｏｃｈｅｍＪ、１９９１、２８０：１１７−１２３）、プレドニソロン（Ｌａｐｐｉｎ  ＆  Ｗｈａｌｅｙ  １９９１）、コルチカール（Ｌａｐｐｉｎ＆Ｗｈａｌｅｙ、１９９１）、及びインターフェロン−ガンマ（Ｈｕａｎｇ等、２００１、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１：３６７６−３６８６）によりアップレギュレート又は維持されることが分かっている。本発明の宿主細胞をこれらの分子の何れか１つ以上又は組み合わせの非存在下で培養することによりｆＢ及び場合によってはｆＤの内因性発現を低減してよい。更に又、宿主細胞はこれらの化合物の何れか１つ以上の抑制剤の存在下に培養してよい。これは宿主細胞におけるｆＢ類縁体又はｆＤ類縁体の生産のために有用である。従って、本発明の一部の実施形態においては、ｆＢ類縁体又はｆＤ類縁体を発現する宿主細胞をＴＮＦ、エストロゲン、インターロイキン−１、デキサメタゾン、プレドニソロン、コルチカール、及びインターフェロン−ガンマよりなる群から選択される化合物を抑制する化合物の何れか１つ以上の存在下で培養する。一部の実施形態においては、これらの化合物の１つ以上の宿主細胞による発現は例えば本明細書に記載した方法を用いながら低減される。エストロゲンの抑制剤の例は限定しないが例えばタモキシフェンである。抑制剤は又化合物に結合し、そしてその活性を低減する抗体を包含する。例えばＴＮＦに結合して不活性化する種々の抗体が当該分野で知られている。
【０２６１】
本発明の蛋白を生産するために使用される宿主細胞は種々の培地中で培養してよい。市販の培地、例えばハムＦ１０（例えば、Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（（ＭＥＭ）、例えば、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭ１−１６４０（例えば、Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ変性イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、例えばＳｉｇｍａ）が宿主細胞を培養するために適している場合がある。更に又、Ｈａｍ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；４，５６０，６５５；又は５，１２２，４６９；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；又は米国特許Ｒｅ３０，９８５に記載の培地の何れかを宿主細胞のための培地として使用してよい。一部の実施形態においては、培地は完全合成（例えばＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））血清非含有又は血清含有のものであることができる。これらの培地の何れにも、必要に応じてホルモン類及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝物質（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM剤）、微量元素（マイクロモル範囲の終濃度において通常存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース又は他の等価なエネルギー源を補給添加してよい。何れかの他の必要な補給物もまた当該分野で知られる通り適切な濃度において包含してよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は発現のために選択された宿主細胞において以前に使用されたものであるか、又は開発の当業者の知る通りである。
【０２６２】
組み換え手法を使用する場合、蛋白は細胞内で、ペリプラズム空間内で生産することができ、及び／又は培地中に直接分泌させることができる。一部の実施形態においては、蛋白が細胞内で生産される場合、第１工程として、粒子状の破砕片、即ち宿主細胞又は溶解フラグメントを、例えば遠心分離又は限外濾過により除去する。Ｃａｒｔｅｒ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３−１６７（１９９２）はＥ・コリのペリプラズム空間内に分泌される蛋白（抗体）を単離するための操作法を記載している。一部の実施形態においては、蛋白は培地中に分泌される。一部の実施形態においては、そのような発現系由来の上澄みを一般的には先ず例えば市販の蛋白濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて濃縮する。一部の実施形態においては、プロテアーゼ阻害剤、例えばＰＭＳＦ、を上記工程の何れかで使用することにより蛋白分解を抑制するか、及び／又は抗生物質を含有させることにより有害夾雑物の生育を防止してよい。
【０２６３】
細胞から製造した蛋白組成物は例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、接線流精製、透析濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヘパリンセファロースアフィニティークロマトグラフィー及び分離及び濃縮の他の知られた形態を用いて精製できる。
【０２６４】
蛋白が抗体である場合、プロテインＡを精製のために利用できる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適性は抗体中に存在する何れかの免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する場合がある。プロテインＡはヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１２（１９８３））。プロテインＧはすべてのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ等、ＥＭＢＯＪ．５：１５６７−１５７５（１９８６））。一部の実施形態においては、アフィニティーリガンドが結合するマトリックスはアガロースであるが、他のマトリックスも使用できる。機械的に安定なマトリックス、例えば制御された細孔を有するガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンはアガロースで達成されるよりも高速の流量を及び短い処理時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ  ＡＢＸTM樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。蛋白精製のための他の手法、例えばイオン交換カラム上の分画、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）上のクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈澱も又回収すべき蛋白又は抗体に応じて使用される。
【０２６５】
何れかの予備的精製工程の後、目的の蛋白及び夾雑物が存在する場合はそれを含む混合物を、例えば、一部の場合においては、低塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍ塩）で実施される約２．５〜４．５のｐＨで溶離緩衝液を用いる低ｐＨ疎水的相互作用クロマトグラフィー、又は追加的精製のための他の操作法に付してよい。
眼送達又は治療
眼の遺伝子療法の使用の選択は療法の安全性にかかわってくる。持続性の発現を達成するベクターは一般的に、それらのトランスジーン負荷物を標的細胞ゲノムＤＮＡに組み込むことによりそれを行う。組み込み事象は「挿入突然変異誘発」として知られる標的細胞ＤＮＡにおける局所的途絶をもたらす。一部の実施形態においては、ＢＩＶベクターはある細胞型、例えばＲＰＥ細胞を特異的にターゲティングできる。ＲＰＥ細胞は一般的に分裂を起こさず；ＲＰＥ細胞は腫瘍を生じさせることは極めて稀であり；一部の場合においては、限定数のＲＰＥ細胞のみ形質導入する必要があり；そして形質導入されたＲＰＥ細胞は注射部位に局在して残存し、これは一部の場合においては、非侵襲的方法、例えば検眼鏡検査により反復して可視化できる。一部の実施形態においては、可視化のための非侵襲性の方法は検眼鏡検査であり、そしてＲＰＥ細胞（例えば形質導入されたＲＰＥ細胞）はレーザー治療により除去できる。即ち、生成物（例えば治療用生成物、例えば蛋白又はｓｉＲＮＡ）を生産するための標的細胞としてのＲＰＥ細胞は遺伝子改質に特に良好に適している。最終的に、部位指向性組み込みを達成するためにベクターを操作できる。そのような指向された組み込みを得るための１つの手段は、例えばインテグラーゼと会合した亜鉛フィンガーモチーフを含有する分子のような特定の核酸結合分子の使用を介したものである。これを目的とした別の方法は大部分においてエピソーム性のままであるＡＡＶのようなベクターを使用することである。
【０２６６】
図１はＡＭＤの進行の一例である。早期のＡＭＤは典型的には結晶腔、網膜色素上皮（ＲＰＥ）層及びブルーフ膜の間の小さな沈着を特徴とする。結晶腔は網膜と伏在する脈絡膜毛細管床との間の栄養、酸素、及び／又は老廃物の流動をブロックする機能を有する場合がある。重要な点として、結晶腔は多くの炎症因子及び補体因子を含有する。ＡＭＤの経過は主に２つの方向の一方に進行する。湿性ＡＭＤにおいては、血管新生として知られる過程により新しい血管が脈絡膜外に派生する。新しい血管は不全である。それらは漏出及び出血を起こし、これが急速に盲目をもたらす。第２の疾患の経過は地図状委縮である。この場合、網膜、ＲＰＥ層、及び脈絡膜は全て死滅し、網膜を有さない眼の後方において拡張性の領域をもたらす。拡張性の領域は盲斑を伴っており、これは最終的には中心視力をノックアウトし、盲目をもたらす場合がある。重要な点として、本発明の一部の実施形態はＡＭＤの全病期；即ち早期のＡＭＤ及び後期のＡＭＤの両方を治療することになる。本発明はＡＭＤの一般的治療法として使用できる。
組成物、製剤及び調製品
本発明の一部の実施形態は治療上の使用のため等の組成物、例えば医薬組成物を提供する。一部の実施形態においては、組成物は本明細書に記載した補体類縁体を含む。一部の実施形態においては、「治療有効量」又は適切な用量は、天然に存在する蛋白のインビトロの活性を類縁体と比較すること、及び／又は、天然に存在する蛋白のインビトロの活性を天然に存在する蛋白のインビボの活性と比較すること（例えば動物モデルにおいて）、次に類縁体の予測される及び／又は所望のインビボの活性を計算又は外挿すること、一部の場合においては、半減期における何れかの相違を調節することにより、求める。
【０２６７】
製剤（例えば注射用）は一般的に、ただし必須ではなく、例えばＨａｎｋ溶液又はＲｉｎｇｅｒ溶液を含む活性成分の生体適合性溶液である。経皮又は経粘膜の投与のための製剤は一般的に、限定しないが例えば浸透剤、例えばフシジン酸又は胆汁酸塩を洗剤又は界面活性剤と組み合わせて包含する。一部の実施形態においては、製剤はエアロゾル、座薬、又はパッチとして製造できる。一部の実施形態においては、経口投与は蛋白又はペプチドの活性成分に対しては好ましくない場合があり；しかしながらこの型の組成物は、経口投与も又使用できるように消化酵素から保護されるべく、例えば腸溶性コーティング形態において、蓄積剤において、カプセルにおいて等、適宜製剤してよい。本発明の一部の製剤はバランス塩溶液（Ａｌｃｏｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，Ｔｅｘａｓ）又はバランス塩溶液プラス（Ａｌｃｏｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含む。一部の実施形態においては、製剤は以下のもの、即ち：クエン酸塩、ＮａＣｌ（例えば０．６４％）、塩化カリウム（ＫＣｌ）（例えば０．０７５％）、塩化カルシウム２水和物（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）（例えば０．０４８％）、塩化マグネシウム６水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）（例えば０．０３％）、酢酸ナトリウム３水和物（ＣＨ３ＣＯ２Ｎａ・３Ｈ２Ｏ）（例えば０．３９％）、クエン酸ナトリウム２水和物（Ｃ６Ｈ５Ｏ７Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ）（例えば０．１７％）、及び水酸化ナトリウム及び／又は塩酸（ｐＨ調節用）及び水の１つ以上を含む。上記列挙には特定の水和物、例えば２水和物、３水和物、６水和物等として列挙した一部分子が包含される。これらの化合物の種々の水和物が本発明において使用することができ、そして本発明は列挙した分子のこれらの特定の水和物形態に限定されないと理解しなければならない。一部の実施形態においては、製剤は以下のもの、即ち：ＮａＣｌ、１塩基性リン酸塩１水和物、２塩基性リン酸ナトリウム７水和物及びｐＨ調節用の塩酸及び／又は水酸化ナトリウム及び水の１つ以上を含む。一部の実施形態においては、製剤は以下のもの、即ち：ヒスチジン（例えば約１０ｍＭ）、α，α−トレハロース脱水物（例えば１０％又は約５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（例えば約１０ｍＭ）、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０（例えば約０．０１％）及びＮａＣｌ２（例えば約０．１％）の１つ以上を含む。一部の実施形態においては、製剤は本発明の分子、１０ｍＭヒスチジン、１０ｍＭＭｇＣｌ２、５０ｍＭトレハロース及び０．０１％ポリソルベート２０を含むかこれよりなる。一部の実施形態においては、製剤は本発明の分子、０．１％ＮａＣｌ及び１０ｍＭＭｇＣｌ２を含むかこれよりなる。一部の実施形態においては、製剤又は組成物は約５．５のｐＨである。一部の実施形態においては、製剤又は組成物は、活性成分の生物活性及び安定性を保持するために適当である限り、約５．０〜９．０、約５．０〜５．５、約５．３〜５．７、約５．５〜６．０、約５．８〜６．２、約６．０〜６．５、約６．３〜６．７、約６．５〜７．０、約６．８〜７．２、約７．０〜７．５、約７．３〜７．７、約７．５〜８．０、約７．８〜８．２、約８．０〜８．５、約８．３〜８．７及び約８．５〜９．０のｐＨである。
【０２６８】
適当な製剤及び所望の投与様式のための製剤方法の例は、最新版のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ及び米国特許７，２０８，５７７に記載されている。用量レベル及び厳密な製剤は当該分野で知られる通り定型的な最適化の操作法により決定してよい。
【０２６９】
本発明の一部の実施形態は補体類縁体（例えば因子Ｂ類縁体）の医薬組成物を提供する。一部の実施形態においては、治療有効量又は適切な用量は、例えば、天然に存在する蛋白のインビトロの活性を類縁体と比較すること、天然に存在する蛋白のインビトロの活性を天然に存在する蛋白のインビボの活性と比較すること、次に類縁体の予測されるインビボの活性を計算すること、半減期における何れかの計測された相違を調節することにより、決定する。一部の実施形態においては、治療有効量は以前の試験、例えば臨床治験に基づいて決定される。一部の実施形態においては、それは例えば所望の作用が達成されるか治療上の利益が達成されるまで患者において用量を変更することにより求められる。特定の用量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており；例えば米国特許４，６５７，７６０；５，２０６，３４４；又は５，２２５，２１２を参照できる。
【０２７０】
一部の実施形態においては、インビボの使用のための組成物は「担体」又は「製薬上許容しうる担体」を含有する。「担体」という用語は希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はベヒクルをさし、これと共に目的のベクターを投与する。「担体」という用語は限定しないが例えば固体又は液体の物質を包含し、これは無機又は有機又は合成又は天然起源のものであってよく、これに組成物の活性成分を混合するか製剤することにより対象への投与を容易にする。医薬品を製剤する場合に慣用的に使用される何れかの他の物質も適している場合がある。固体担体は限定しないが例えば、天然又は合成のクロワゾネ珪酸塩、例えば天然の珪酸塩、例えばケイソウ土；マグネシウム珪酸塩、例えばタルク；マグネシウムアルミニウム珪酸塩、例えばアタプルガイト及びバーミキュライト；アルミニウム珪酸塩、例えばカオリナイト、モンモリロナイト、及び雲母；炭酸カルシウム；硫酸カルシウム；合成の水和したシリコーンオキシド及び合成のカルシウム又はアルミニウムの珪酸塩；元素、例えば炭素又はイオウ；天然又は合成の樹脂、例えばポリビニルアルコール；及びワックス類、例えばパラフィン及び蜜蝋を包含する。適当な液体担体の例は水；酸素を有する有機化合物を含有する水性の溶液、例えばエタノール及び油脂類、例えば石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えばピーナツ油（例えば低アレルギー性）、大豆油、鉱物由、胡麻油等を包含する。一部の実施形態においては、水、生理食塩水、デキストロース及びグリセロール溶液又は緩衝液が担体となり得る。一部の実施形態においては、組成物は１つ以上の製薬上許容しうる担体、例えば食塩水、リン酸塩緩衝食塩水、及び／又は制御放出製剤を含む。緩衝物質及び通常薬学的調製品中に存在する他の物質、例えばフレーバー、着香剤、着色剤及び懸濁剤も又存在できる。医薬品担体は、組成物の投与対象である宿主にとって有害となるかもしれない物質の量及び利用性を排除及び／又は最小限にするためにインビボの使用のためにそれらが特に製造されるという点において典型的な溶液及び懸濁液とは異なる場合がある（例えば細菌毒素の除去）。
【０２７１】
一般的に、水、適当な油脂、食塩水、水性デキストロース（グルコース）、及び関連する糖溶液及びグリコール類、例えばプロピレングリコール又はポリエチレングリコールが非経口溶液のための典型的に適している担体である。一部の実施形態においては、非経口投与のための溶液は活性成分の水溶性の塩、適当な安定化剤、及び所望又は必要に応じて緩衝物質を含有する。抗酸化剤、例えば重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、又はアスコルビン酸の単独又は組み合わせが適当な安定化剤である。同様に使用されるものはクエン酸及びその塩及びナトリウムＥＤＴＡである。更に又、非経口溶液は保存料、例えば塩化ベンザルコニウム、メチル−又はプロピル−パラベン、及びクロロブタノールを含有できる。
【０２７２】
適当な薬学的賦形剤は、限定しないが例えば、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、抗生物質、保存料、麦芽、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を包含する。所望により組成物は水和剤及び／又は乳化剤及び／又はｐＨ緩衝剤も含有できる。必要に応じて、組成物は又、可溶化剤及び／又は局所麻酔剤、例えばリグノカインを含有することにより注射部位の疼痛を緩和してよい。
【０２７３】
適当な薬学的担体はこの分野における標準的な参考文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．に記載されている。本発明の一部の実施形態は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の担体及び／又は賦形剤の使用を包含する。
【０２７４】
活性成分は又、例えばコアセルベーション手法によるか、又は界面重合により製造されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンのマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョン中に捕獲してよい。そのような手法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．に記載されている。
【０２７５】
安定化剤を本発明において使用できる。安定化剤は、増量剤から剤を可溶化させるか変性又は容器壁面への付着の防止を支援する添加剤までの、機能における範囲であることができる賦形剤の広範な分類を指す。典型的な安定化剤は多価の糖アルコール；アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン等、有機の糖類又は糖アルコール、例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、アラビトール、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロール等、例えばサイクリトール、例えばイノシトール；ポリエチレングリコール；アミノ酸重合体；イオウ含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（例えば＜１０残基）；蛋白、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン、糖類、単糖類、例えばキシロース、マンノース、フラクトース、グルコース；２糖類、例えばラクトース、マルトース及びスクロース；３糖類、例えばラフィノース；多糖類、例えばデキストラン等であることができる。安定化剤は典型的には活性成分（例えばｆＢ類縁体、例えばｆｂ３又はｆＢに結合する抗体又はそのフラグメント）の０．１〜１０，０００ｗ／ｗ部の範囲において存在する。
【０２７６】
錠剤崩壊剤は固体剤型とされる治療薬の製剤中に包含してよい。錠剤崩壊剤として使用される物質は限定しないが例えば澱粉、例えば市販の澱粉系の錠剤崩壊剤、エクスプロタブ（Ｅｘｐｌｏｔａｂ）を包含する。ナトリウム澱粉グリコレート、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラアミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジ果皮、カルボキシメチルセルロース、天然海綿及びベントナイトを全て使用してよい。錠剤崩壊剤の別の型は不溶性のカチオン交換樹脂を包含する。粉末ガム類を錠剤崩壊剤として、そして結合剤として使用してよく、そしてこれらは粉末ガム類、例えば寒天、カラヤ又はトラガカントを包含できる。アルギン酸及びそのナトリウム塩も又錠剤崩壊剤として使用される。
【０２７７】
結合剤は剤を一体保持し錠剤を形成するために使用してよく、そして天然産物、例えばアカシア、トラガカント、澱粉及びゼラチン由来の物質を包含する。他のものとしてはメチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及び他のセルロースが包含される。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は両方とも治療薬を顆粒化するためのアルコール性溶液中で使用できる。
【０２７８】
抗摩擦剤を治療薬の製剤中に包含させることにより製剤過程中の粘着を防止してよい。潤滑剤は、治療薬とダイ壁面との間の層として使用してよく、及び／又は製剤に添加することができ、そしてこれらは限定しないが例えばステアリン酸、例えばそのマグネシウム及びカルシウム塩、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油及びワックスを包含する。可溶性潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、例えばＣａｒｂｏｗａｘ４０００及び６０００等も使用してよい。
【０２７９】
製剤中の剤の流動特性を向上させ、圧縮の間の再配列に寄与する滑剤を添加してよい。滑剤は澱粉、タルク、火成シリカ及び水和シリコアルミネートを包含してよい。
【０２８０】
水性の環境中への剤の溶解を容易にするために、界面活性剤を水和剤として添加してよい。界面活性剤はアニオン系洗剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルナトリウムスルホスクシネート及びジオクチルナトリウムスルホネートを包含してよい。カチオン系洗剤を使用してよく、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムを包含する。界面活性剤として製剤に包含させることができるノニオン系洗剤は限定しないが例えば、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン水添ヒマシ油１０、５０及び６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート２０、４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びプルロニック洗剤の何れか、例えばプルロニックＦ６８及び／又はプルロニックＦ１２７（例えばＳｔｒａｐｐｅ等、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ６１：１２６−１３３（２００５）参照）。界面活性剤は蛋白又は誘導体の製剤中に、単独で、又は種々の比における混合物として存在する。
【０２８１】
蛋白（又は誘導体）の取り込みを潜在的に増強する添加剤は限定しないが例えば脂肪酸、オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸を包含する。
【０２８２】
一部の実施形態においては、制御放出製剤が望ましい場合がある。剤（例えば蛋白）は、拡散、膨潤又は浸出の機序の何れかによる放出を可能にする不活性マトリックス、例えばガム類及びセルロース系化合物中に配合される。緩徐に変質するマトリックスも又製剤中に配合してよい。別の形態の制御放出はＯｒｏｓ治療系（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づく方法によるものであり、例えば、浸透圧作用により単一の小型の開口部を経由して水を進入させ、そして薬剤を押し出す半透過性の膜中に薬剤を封入する。腸溶性コーティングは遅延した放出作用を有するが、持続放出作用も有する場合がある。
【０２８３】
他のコーティングを製剤のために使用してよい。これらはコーティングパン中で適用できる種々の糖類を包含する。剤は又フィルムコーティング錠剤中で与えることもでき、そしてこの場合に使用される物質は２つの群に分割できる。第１のものは非腸溶性物質であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドン及びポリエチレングリコールを包含する。第２の群は一般的にはフタル酸エステルである腸溶性物質よりなる。
【０２８４】
物質の混合物を使用して最適なフィルムコーティングを形成してよい。フィルムコーティングはパンコーター中で、又は流動床中で、又は圧縮コーティングにより行ってよい。
【０２８５】
一部の実施形態においては、本発明の核酸及び粒子は中性又は塩の形態に製剤できる。製薬上許容しうる塩は限定しないが例えば、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸及び／又は酒石酸等から誘導したもののようなアニオンとともに形成されたもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導されたもののようなカチオンと共に形成されたものを包含する。他の安定化剤は蛋白、例えばアルブミン、乳化剤、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ、Ｔｗｅｅｎ等を包含する。更に又、アミノ酸、糖類、例えばトレハロース、マンノース、スクロース及び安定化特性を備えた他の化合物を当該分野で知られる通り包含させることができる。
【０２８６】
本発明において同様に意図されるものは本発明の剤又は蛋白（又はその誘導体）の肺送達である。蛋白（誘導体）は哺乳類の肺に、吸入しながら、そして一部の実施形態においては、肺の上皮内層を横断して血流に到るように送達される（例えばＡｄｊｅｉ等、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：５６５−５６９（１９９０）；Ａｄｊｅｉ等、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ６３：１３５−１４４（１９９０）；Ｂｒａｑｕｅｔ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ１３（補遺５）：ｓ．１４３−１４６（１９８９）；Ｈｕｂｂａｒｄ等、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：２０６−２１２（１９８９）；Ｓｍｉｔｈ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−１１４６（１９８９）；Ｏｓｗｅｉｎ等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏ．，Ｍａｒｃｈ，１９９０；Ｄｅｂｓ等、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４０：３４８２−３４８８（１９８８）及びＰｌａｔｚ等、米国特許５，２８４，６５６参照）。
【０２８７】
本発明の実施における使用を意図されるものは治療用製品の肺送達のために設計された広範な種類の機械装置、限定しないが例えばネブライザー、計量用量吸入器、及び粉末吸入器を包含する。
【０２８８】
本発明の一部の実施形態の実施のために適する市販の装置の一部の特定の例はＵｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー、製造元Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；ＡｃｏｒｎＩＩネブライザー、製造元Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏ．；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ計量用量吸入器、製造元Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｃ．；及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器、製造元Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓである。
【０２８９】
一部の実施形態においては、これらの装置は蛋白の分注に適する製剤を使用する。典型的には、各製剤は使用する装置の型に対して特異的であり、そして治療において有用である希釈剤、アジュバント及び／又は担体に加えて適切な高圧ガスを使用する。
【０２９０】
一部の実施形態においては、蛋白は粒状形態に製造する。一部の実施形態においては、この粒状形態は遠位の肺への送達のために１０μｍ（又はミクロン）未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの平均粒径を有する。
【０２９１】
担体は炭水化物、例えばトレハロース、マンニトール、グルタチオン、キシリトール、スクロース、ラクトース、及びソルビトールを包含することができる。製剤中に使用する他の成分は、例えばＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ及びＤＯＰＣを包含してよい。天然又は合成の界面活性剤を使用してよい。ポリエチレングリコールを使用してよい（蛋白を送達する場合のその使用とは別個に）。デキストラン、例えばシクロデキストランを使用してよい。一部の実施形態においては、シクロデキストリン、第３アミン及び／又はベータシクロデキストリンを使用してよい。胆汁酸塩及び他の関連するエンハンサーを使用してよい。セルロース及びセルロース誘導体を使用してよい。緩衝物質製剤における使用のようにアミノ酸を使用してよい。更に又、リポソーム、マイクロカプセル又は微小球、封入複合体、又は他の型の担体の使用も意図される。
【０２９２】
ネブライザー（ジェット、又は超音波）と共に使用する場合に適する製剤は典型的には、水中に溶解した蛋白を、一部の実施形態においては、溶液ｍＬ当たり生物活性蛋白約０．１〜約２５ｍｇの濃度において含む。製剤は又、緩衝液及び／又は単純糖（ｓｉｍｐｌｅ  ｓｕｇａｒ）（例えば蛋白の安定化及び浸透圧の調節のため）を包含してよい。ネブライザー製剤は又、エアロゾルを形成する場合に溶液の霧状化により誘発される蛋白の表面誘発凝集を低減又は防止するために界面活性剤も含有してよい。
【０２９３】
計量用量吸入装置と共に使用するための製剤は一般的に、例えば補助的な界面活性剤と共に高圧ガス中に懸濁した本発明の蛋白又は剤を含有する微細分割粉末を含む。高圧ガスはこの目的のために使用されている何れかの従来の物質、例えばクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、又は炭化水素、例えばトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン、又はこれらの組み合わせであってよい。適当な界面活性剤はソルビタントリオレエート及び大豆レシチンを包含する。オレイン酸は又界面活性剤としても有用である場合がある。
【０２９４】
一部の実施形態においては、粉末吸入装置から分注するための製剤は本発明の剤又は蛋白を含有する微細分割乾燥粉末を含むことになり、そして又、増量剤、例えばラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース、又はキシリトールを、装置からの粉末の分散を容易にする量、例えば製剤の５０〜９０重量％において、包含してよい。
【０２９５】
蛋白の鼻内送達も意図される。一部の実施形態においては、鼻内送達は例えば鼻への剤の投与の直後に、血流中への蛋白の通過を可能にする。一部の実施形態においては、これは肺内への剤の付着を必要とすることなく、又は最小限の付着において達成される。鼻内送達のための製剤はデキストラン又はシクロデキストランを包含する。他の粘膜経由の輸送による送達も又意図される。
【０２９６】
一部の実施形態においては、蛋白のような剤の製剤は約０．１０μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日が所望の（例えば治療的な）作用をもたらすようなものとする。投与の方法及び経路は本明細書に記載する通りである。本発明の組成物及び製剤は例えば注入（例えば緩徐注入）又は瞬時注射により動物に投与してよい。目的の分子又はベクターは注入（例えば緩徐注入）又は瞬時注射により、上皮又は粘膜皮膚内層を経由する吸収により投与してよく、そして他の生物活性剤と共に投与してもよい。投与は全身性（例えばＩ．Ｖ．）であっても、局所的であってもよい。
【０２９７】
一部の実施形態においては、投与は眼内注射による。種々の型の眼内注射を本明細書に記載する。一部の実施形態においては、本発明の蛋白の眼内注射は注射当たり蛋白約０．０５ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約５ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．０５ｍｇ〜約５ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約３ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１ｍｇ、約０．０５ｍｇ〜約０．５ｍｇ、約０．０５ｍｇ〜約０．１ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約５ｍｇ、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、約１ｍｇ〜約３ｍｇ、及び０．５〜約２ｍｇである。一部の実施形態においては、約５ｕｌ〜約１５０ｕｌ、約２５ｕｌ〜約１５０ｕｌ、約５０ｕｌ〜約１５０ｕｌ、約１００ｕｌ〜約１５０ｕｌ、約５ｕｌ〜約１００ｕｌ、約５０ｕｌ〜約１５０ｕｌ、約２５ｕｌ〜約１５０ｕｌ、約２５ｕｌ〜約１００ｕｌ、又は約３５ｕｌ〜約７０ｕｌの眼内注射を行う。一部の実施形態においては、約５０ｕｌの眼内注射を行う。
【０２９８】
本発明の一部の製剤は次にエアロゾル、座薬、点眼薬又はパッチとして製造できる。
【０２９９】
一部の実施形態においては、成分は、典型的には活性剤の量を明示している密封容器、例えばアンプル及びシャシェ中にある、例えば凍結乾燥粉末又は水非含有濃縮物として、単位剤型において、別個に、又は混合して供給される。医薬組成物が注射により投与される場合は、例えば成分が投与前に混合されるように、滅菌された注射用水又は食塩水のアンプルを提供してよい。成分は又、凍結された形態又は液体形態において供給できる。活性成分を安定化、及び／又はシェルフライフを延長するための種々の成分（例えば不活性成分）を、例えば当該分野で知られる通り包含させることができる。
【０３００】
本発明の一部の組成物（例えばｆｂ３又は抗体）のインビボの血清中循環を延長するためには、種々の手法を使用できる。例えば、不活性の重合体分子、例えば高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、多官能性リンカーを使用するか使用することなく、ＰＥＧの部位特異的コンジュゲーション（例えば抗体のＮ末端への、又はＣ末端への）を介するか、又はリジン残基上に存在するイプシロンアミノ基を介して結合（例えば抗体に）させることができる。一部の実施形態においては、生物学的活性の最小限の損失をもたらす線状又は分枝鎖の重合体誘導体化を用いることができる。コンジュゲーションの程度は組成物（例えば蛋白、例えば抗体又はｆＢ類縁体）へのＰＥＧ分子の適切なコンジュゲーションを確保するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量スペクトル分析により緊密にモニタリングできる。一部の実施形態においては、未反応のＰＥＧは、サイズエクスクルージョンにより、及び／又はイオン交換クロマトグラフィーにより、ＰＥＧコンジュゲートから分離できる。ＰＥＧ誘導組成物は当該分野で知られた方法を用いて活性並びにインビボの薬効に関して試験できる。
製造物品
一部の実施形態においては、製造物品は例えば本明細書に記載した障害又は疾患の治療のために有用な物質を含有する。一部の実施形態においては、製造物品は容器及びラベルを含む。適当な容器は例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管を包含する。容器は種々の物質、例えばガラス又はプラスチックから形成してよい。容器は例えば状態を治療するために有効な本発明の組成物を保持してよい。容器は出入り口（例えば滅菌口）を有してよく、例えば容器は皮下注射針で穿刺可能な栓を有する静脈内投与溶液のバッグ又はバイアルであってよい。一部の実施形態においては、容器は、例えば、穿刺可能及び／又は屈曲可能な材料のような、内容物の除去を可能にできるように横断通過することができる密封手段を有する出入り口を有してよい。組成物中の活性剤は本明細書に記載したものの何れかであることができる。一部の実施形態においては、容器上又はそれに付随されたラベルは選択された状態を治療するために組成物が使用されることを示す。一部の実施形態においては、製造物品は製薬上許容しうる緩衝液、例えばリン酸塩緩衝食塩水、リンゲル溶液及び／又はデキストロース溶液を含む第２の容器を含んでよい。一部の実施形態においては、製造物品は水の容器を含む。それは更に、商業的及び使用者の見地から望ましい他の物質、例えば他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用法の説明を記載した添付文書を包含してよい。
トランスジェニック動物
本発明の一部の実施形態は、本明細書に記載した補体経路成分少なくとも１つの変異体又は突然変異体を発現するトランスジェニック動物（例えば非ヒト）を提供する。トランスジェニック動物を作成するための方法は当該分野で知られている。本発明の一部の実施形態は本発明の核酸及び／又は蛋白、例えば因子Ｂ類縁体、例えばｆＢ３を発現するトランスジェニック動物を提供する。一部の実施形態においては、トランスジェニック動物（例えばマウス）は又、Ｆａｓ遺伝子における突然変異、欠失又は途絶を含むことになり、例えばＭａｃｍｉｃｋｉｎｇ等、Ｃｅｌｌ．８１：６４１−６５０（１９９５）を参照できる。
【０３０１】
本発明をこれより以下の非限定的な実施例により例示する。
【実施例】
【０３０２】
本発明を以下の実施例を参照しながらこれより説明する。これらの実施例は説明を目的とするのみであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものとみなしてはならず、むしろ本明細書に記載した教示内容の結果として明らかになる全ての変更例を包含するとみなさねばならない。
【０３０３】
本発明者等はとりわけ、遺伝子送達は眼への治療薬の持続的及び継続的な送達を達成する有効な手段を提供すると判断した。本発明の実施形態は十分な遺伝子転移、十分な遺伝子発現、発現及び発現された蛋白治療薬の適切な時期及び分布、発現された治療用蛋白の無視できる程度の全身分布、発現された蛋白治療薬の適切な生物学的活性、及び／又は、減衰した免疫応答の非存在を達成することになる。実施例はウシレンチウィルスから誘導したＢＩＶ系ベクターによる、そして一部の実施形態においては補体活性化（例えば代替経路補体活性化）を減衰させる蛋白と組み合わせた場合の、ベクター送達を概説する。１つの目的は加齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）並びに終末期のＡＭＤである地図状委縮及び湿性ＡＭＤの両方の型を治療及び／又は試験することである。これらの疾患は先進国における失明の主要原因であり、そして６５歳超の人口の２５％超が罹患している。本発明者等は、補体活性化の代替経路が全ての形態のＡＭＤの重要で一般的な伏在原因であるという本発明者等の結論に基づいて治療標的としてこの経路を選択した。この結論は全ての形態のＡＭＤの発症の増大した危険性を有する補体因子Ｈ、即ち補体抑制蛋白をコードする遺伝子における特定の多形の統計学的関連性と合致している（Ｋｌｅｉｎ等、２００５，Ｈａｉｎｅｓ等、２００５，Ｅｄｗａｒｄｓ等、２００５，Ｈａｇｅｍａｎ等、２００５，Ｌｉ等、２００６，Ｍａｌｌｅｒ等、２００６，Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ等、２００６，Ｓｅｐｐ等、２００６，及びＰｏｓｔｅｌ等、２００６）。
【０３０４】
実施例１は全てではなくとも大部分のレンチウィルスベクターに対して利用できるプロセスによるＢＩＶベクターの一部の製造方法を概説している。実施例２〜７はＢＩＶベクターがインビボの動物の網膜細胞及びインビトロの一次ヒト網膜細胞を遺伝子的に改質する場合の効率を示している。これらの実施例は又、ヒト眼疾患の治療に該当するマウスモデルにおける薬効の２つの試験を包含している。実施例８は正のフィードバックループを妨害することにより補体経路の活性化を減衰させる新しい治療用蛋白を説明している。これらにはｆＢ１、ｆＢ２、及びｆＢ３と標記される補体因子Ｂの３つの優性阻害変異体が包含される。実施例９は補体経路を抑制する抗体の形成を説明している。実施例１０及び１１は補体抑制蛋白のインビトロの評価を考察している。実施例１２は補体媒介ＡＭＤに該当するマウスモデルにおけるベクターのインビボの評価のための方策を概説している。実施例１３は蛋白を送達するためにレンチウィルス系ではないベクター系利用している。実施例１４は眼以外の疾患又は状態に対しても本発明が用途を有することを示すために記載した。実施例１５〜１８は優性阻害因子Ｂ部分がヒト及び他の非ヒト補体経路を抑制することを示すための追加的詳細及びデータを示す。実施例１９は因子Ｄによる優性阻害因子Ｂ部分の切断に関するデータを示す。実施例２０は優性阻害因子Ｂ変異体が補体因子Ｃ３ｂと複合体を形成するときの親和性を試験したものである。実施例２１は優性阻害変異体ｆＢ３が補体因子Ｄと安定な複合体を形成することを示している。実施例２２〜２４は補体因子Ｂ及びＤに対する抗体が補体経路を抑制できることを示している。実施例２５及び２６は精製されたヒトｆＢ３蛋白の生物学的活性を確認するためのデータを示しており、そしてヒトｆＢ３の製造のための細胞株の作成を説明している。実施例２７及び２８は補体活性化のマウスレーザー傷害モデルにおけるヒトｆＢ３をコードするＢＩＶベクターの評価並びに同じ動物モデルにおけるヒトｆＢ３蛋白注射の評価を説明している。実施例２９はＢＩＶベクターの濃縮及び精製のための詳細で数値化可能なプロトコルを示す。実施例３０〜３２はベクター製造のための実施例２９のプロトコルの変更を示す。
実施例１：ＢＩＶベクターの製造
ＢＩＶベクターの一部の一般的製造方法は文献に記載されており、例えばＭａｔｕｋｏｎｉｓ等、２００２；Ｍｏｌｉｎａ等、２００４並びに米国特許６，８６４，０８５及びＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６６８１０に記載されている。一部の方法においては４つの成分を使用してベクターを製造する。これらの成分は、例えば図２に示すとおりであり、１）ＢＩＶ転移ベクターコンストラクト；２）ＢＩＶｇａｇ／ｐｏｌポリ蛋白をコードする発現コンストラクト；３）ＶＳＶ−Ｇ蛋白又はバキュロウィルスｇｐ６４エンベロープ蛋白のようなエンベロープ蛋白をコードする発現コンストラクト；及び４）ＢＩＶｒｅｖ蛋白をコードする発現コンストラクトを包含する。転移ベクターコンストラクトは非相同（治療用）遺伝子を含有し、そしてベクター粒子内にパッケージされるＲＮＡ転写物を形成する。ｇａｇ／ｐｏｌ及びエンベロープコンストラクトはベクター粒子を形成するキャプシド蛋白を生産する。ｒｅｖコンストラクトは細胞核外にベクターＲＮＡを輸送するために必要な蛋白を生産する。
【０３０５】
ベクターを産生するために、リン酸カルシウム同時沈降法を用いながら培地中の細胞を４発現コンストラクトで同時トランスフェクトする。１〜３日後、細胞質中の粒子の組み立て、及びベクターＲＮＡのパッケージングの後、ベクター粒子は細胞膜を通過して発芽し、脂質二層被覆を獲得し、そして蓄積した組織培養液からこれらを精製及び／又は濃縮することができる。
【０３０６】
特記すれば、１ｘ１０７２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）又は２９３ＦＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の１５０ｍｍ皿内に播種し、そして５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃でインキュベートする。細胞はプレートが概ね８５〜９０％コンフルエントとなる翌日にトランスフェクトする。典型的には４５μｇの転移ベクターコンストラクト、４５μｇのｇａｇ／ｐｏｌコンストラクト、１５μｇのエンベロープコンストラクト（これは本実施例においてはバキュロウィルスｇｐ６４エンベロープ蛋白をコードする）、及び３０μｇのｒｅｖ発現コンストラクトを各皿につき使用する。リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法は当該分野で良く知られており、そしてリン酸カルシウムトランスフェクションのためのキットは市販されている（例えばＰｒｏｍｅｇａ）。２４時間後、培地を吸引し、新しい培地＋５ｍＭ酪酸ナトリウムと交換する。ウィルスベクター上澄みを２４時間後に採取し、０．４５μｍフィルターで濾過し、そして−８０℃において小分量ずつ凍結保存し、インビトロの使用に備える。細胞上澄み中のベクターの力価は一般的にｍｌ当たり２〜６×１０６形質導入単位（ｔｕ／ｍｌ）である。
インビボの使用のためには、ウィルスベクターは当該分野で良く知られている超遠心分離操作法により、又は以下のクロマトグラフィー法により容易に精製し、１００倍濃縮することができる。ベクター上澄みを５０単位／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅと共に３７℃で３０分間インキュベートし、そして次に０．２μｍのＰＥＳフィルターで濾過する。３００ｍｌのベクター上澄みをローディング緩衝液（２Ｘ合計で１ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ）で１：１に希釈し、そして次にＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ７５膜吸着ユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）上に５ｍｌ／ｍｉｎの速度でペリスタポンプを使用しながらロードする。Ｑ７５膜吸着ユニットを次に５０−７５ｍｌの洗浄緩衝液（１Ｘ合計５００ｍＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ）で５ｍｌ／ｍｉｎで洗浄する。洗浄工程の後、ベクターを以下の通り溶出する。Ｑ７５ユニットをペリスタポンプから外し、そして溶離緩衝液（１Ｘ合計１．３ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ）の入った５ｍｌシリンジに慎重に接続する。約５滴／分の速度で、３つの１ｍｌ画分を、各画分の間１５分インキュベートしながら収集する。濃縮したベクターは画分２及び３中に溶出する。更に２倍濃縮と並行して保存緩衝液への緩衝液交換を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（１００万ダルトンｍｗｃｏ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）遠心分離装置を用いた透析濾過により達成する。濃縮したベクターをＶｉｖａｓｐｉｎ２０ユニットに入れ、透析カップを挿入し、そして１２ｍｌの適切な保存緩衝液を添加する。ユニットを８００ｇで約４０分、又は濃縮ベクター容量が０．７５〜１．０ｍｌに低減するまで遠心分離する。濃縮されたベクターを０．２μｍＰＥＳシリンジフィルターで濾過滅菌し、そして次に小分にし、そして−８０℃で保存する。保存緩衝液が蛋白、例えばＢＳＡを含有する場合は、ＢＳＡは透析濾過工程の後であって滅菌濾過の前に添加する。この操作法は典型的にはベクター力価の約１００倍増大を典型的には約３０％収率でもたらす。特段の記載が無い限り、保存緩衝液は２．５ｍＭＫＣｌ及び１．０ｍＭＭｇＣｌ２を添加したＰＢＳとした。
【０３０７】
以下の実施例においては、レンチウィルスベクターを使用することにより培養物中の細胞を形質導入する場合は、８μｇ／ｍｌのポリブレン又は１又は５μｇ／ｍｌのプロタミンを組織培養培地に添加した。これらのポリカチオンの添加は典型的には互換的に使用できる。特段の記載が無い限り、ポリカチオンは、それらが動物内に直接注射される場合はレンチウィルスベクターと同時投与しなかった。
実施例２：インビボのげっ歯類網膜細胞の形質導入
ＢＩＶベクターはラット及びマウスの両方においてインビボで眼の細胞を効率的に形質導入した。図３及び４Ａに示したラット及びマウスの試験に関して、ＧＦＰベクターを超遠心分離により濃縮し、そして２％ＢＳＡ添加ＰＢＳ中に調製した。８μｇ／ｍｌのポリブレンは注射時にベクターに添加した。図４Ｂ及び４Ｃに示すマウス試験に関しては、ベクターは実施例１のクロマトグラフィー方法により濃縮し、そしてＰＢＳ中に調製した。ポリブレンをベクターと共に同時投与しなかった。約１×１０８ｔｕ（形質導入単位）／ｍｌの力価の緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）をコードするベクター１〜３マイクロリットルを網膜下に注射し、そして網膜をＧＦＰ発現に関して後に検査した。ラットは９か月までフォローし、そしてマウスは５か月までフォローした。両方の動物モデルにおいて、高レベルのＧＦＰ発現が注射部位の網膜細胞において観察された。更に又、各試験の期間中、発現の検知可能な損失は観察されなかった。ラット網膜におけるＧＦＰ発現の例を図３に示し、そしてマウス網膜におけるＧＦＰ発現の例を図４に示す。網膜切片の免疫細胞化学的分析によれば、光受容体層に伏在する網膜細胞型である網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞において主にベクターが発現されていた。
実施例３：インビボのウサギ網膜細胞の形質導入
ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターを実施例１のクロマトグラフィー法により調製し、そして５０ｍＭトレハロース及び０．１％ＢＳＡを添加した実施例１のＰＢＳ／ＫＣｌ／ＭｇＣｌ２緩衝液中に調製した。体重各約３ｋｇのニュージーランド白ウサギを麻酔し、トラピカミド１％及びＡＫ−ジレート１％を用いて瞳孔を弛緩させた。アルカイン０．５％１滴を各眼に点眼した。眼瞼検査鏡を設置し、眼瞼及び結膜の盲嚢をポビドンイオジンで拭き取った。Ｚｅｉｓｓ手術用顕微鏡下に、眼圧を低減するために３０ｇ針を用いて穿刺を行った。角膜上にコンタクトレンズを置くことにより網膜の観察を容易にした。２５ｇ針（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ）を鋭角で上側四分円内の縁の後方３〜４ｍｍに結膜及び強膜を通して押し込むことによりレンズを回避した。３９ｇのカニューラを網膜表面にわずかに接触するまで２５ｇ針を通過させながらガイドした。１×１０８ｔｕ／ｍｌの力価を有するＧＦＰベクター溶液１００μｌのパルスを注射することにより網膜切開を行った。網膜下のブレブは明瞭に形成された。次に針及びカニューラを眼から緩徐に引き出すことにより、自己密封性の強膜切開を行った。手術の後、動物に０．５ｍｌのＫｅｎａｌｏｇ−Ｇの結膜下注射及びネオマイシン、ポリミキシンＢ、及びデキサメタゾンを含有する軟膏（Ａｌｃｏｎ）の角膜投与を行った。
【０３０８】
４週間後、ウサギを屠殺し、網膜を採取し、そして網膜ホールマウントを調製した。図５に示す通り、ウサギ網膜のＲＰＥ細胞中のＧＦＰの頑健な発現が観察された。発現は又種々の細胞型における神経網膜においても明らかにされた（データ示さず）。
実施例４：インビボのサル網膜細胞の形質導入
ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターを実施例１のクロマトグラフィー法により調製し、そしてＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４，１３０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ２，５０ｍＭトレハロース，０．１％  ＢＳＡ）中に製剤した。ベクター力価は１．５×１０８ｔｕ／ｍｌであった。２匹のカニクイザルの各々に、ウサギに関して記載したもの（実施例３）と同様の外科的操作法を用いて網膜下注射により片眼にＢＩＶ  ＧＦＰ７５μＬを投与した。１匹のサルを１０週間後に屠殺し、網膜のフラットマウントを作成した。図６は網膜のＲＰＥ層におけるＧＦＰの発現を示す。
実施例５：一次ヒトＲＰＥ細胞におけるＧＦＰの発現
７５歳女性、７３歳男性、及び４３歳男性に由来するヒト眼をＯｒｅｇｏｎのＬｉｏｎｓ  Ｅｙｅ  Ｂａｎｋから入手した。前区、硝子体、及び神経感覚網膜を除去することにより眼を切開した。アイカップをＰＢＳで洗浄し、ＲＰＥ層の状態に応じて１０〜２０分間０．０５％トリプシンＥＤＴＡ２ｍｌ中でインキュベートした。ＲＰＥ細胞を、スパチュラを用いて穏やかに掻き取り、１５ｍｌ容の三角試験管中に収集した。細胞を５分間１００ｒｐｍで遠心分離し、ＰＢＳで洗浄した。最後に各眼に由来するＲＰＥ細胞をＤＭＥＭ＋１５％ＦＢＳ１ｍｌに再懸濁した後、１２ウェルの培養プレートに播種した。
【０３０９】
ＲＰＥ細胞を緩徐に生育させ、２〜３週間かけてウェル中コンフルエントとした。色素を有する細胞がＲＰＥであることを確認するために、それらをＲＰＥ特異的蛋白、即ちＲＰＥ６５の発現に関して、免疫蛍光染色により試験した。図７に示す通り、細胞はＲＰＥ６５に対するモノクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）による強力な染色を示した。これとは対照的に、一次抗体が存在しない対照においてはバックグラウンド染色のみが観察された（データ示さず）。
【０３１０】
細胞を２μｇ／ｍｌのプロタミンの存在下５μｌのＢＩＶ  ＧＦＰベクターで形質導入した。ベクターをＰＢＳ中に製剤し、そして１×１０８ｔｕ／ｍｌの力価を有していた。図７に示す通り、細胞は形質導入後４８時間に顕著なＧＦＰ発現を示していた。
実施例６：誘導ＶＥＧＦモデル
上記実施例に示した通り、ＢＩＶベクターは非ヒト霊長類を包含する小型及び大型の両方の動物モデルにおいてインビボで網膜細胞を形質導入することができる。更に又、ＢＩＶベクターは一次ヒト網膜細胞をインビトロで効率的に形質導入できる。ベクターを硝子体内、テノン下及び眼周囲の注射、並びに、角膜への直接のベクターの適用により投与したマウス及びラットにおける追加的試験は、ベクターが他の眼細胞型、例えば角膜細胞、結膜細胞、及び強膜線維芽細胞を形質導入できることを示していた（データ示さず）。これらのデータは例えばヒト眼障害を改善又は安定化するための眼の細胞に対する遺伝子導入の方策を裏付けている。
【０３１１】
ＢＩＶベクターがヒト眼疾患の治療に関連する疾患モデルにおいて薬効を達成できることを確認するために数種の試験を実施した。以下の２つの例においては、ベクターは、網膜血管新生のマウスモデルにおける新しい血管の生育と漏出をブロック又は抑制する抗血管形成因子に関する遺伝子をコードしていた。マウス眼への注射の後、ベクターは網膜細胞を遺伝子的に改質した。次に改質された細胞は抗血管形成因子を分泌し、これは全眼に渡って拡散し、そして血管新生をブロック及び／又は抑制した。
【０３１２】
抗血管形成蛋白エンドスタチン（エンドスタチンｃＤＮＡはＩｎｖｉｖｏＧｅｎより購入、カタログ番号ｐｂｌａ−ｈｅｎｄｏ１８）をコードするＢＩＶベクターを眼血管新生の極めて攻撃的なマウスモデルにおいて評価した（例えばＯｋａｍｏｔｏ等、１９９７参照）。マウスは、それらにドキシサイクリンを投与すればそれらの光受容体がＶＥＧＦを分泌し始めるように操作した。３日以内に、ＶＥＧＦは有意な血管漏出及び新しい血管の形成をもたらした。１週間以内に、病的状態はかなり重度となったため、網膜は眼の後方から剥離した。
【０３１３】
各動物において、片方の眼をＢＩＶエンドスタチンベクターの網膜下注射により処置し、もう一方の眼を、治療用蛋白をコードしない対照ベクターで処理した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００３年３月２８日オンライン発表）。３週間後、ドキシサイクリンを投与した。５日後、フルオレセイン血管造影法により生存動物において血管の漏出を評価した。
【０３１４】
この評価においては、フルオレセインは静脈内注射により投与し、そして網膜の血管漏出は眼の後部における拡散蛍光パターンにより可視化する。
【０３１５】
マウス１０匹の別のコホートをドキシサイクリン投与の７日後に屠殺した。網膜の組織学的切片を血管漏出に起因する肥厚化に関して検査し、そして全眼の断面を網膜剥離の重度の帰結に関して検査した。
【０３１６】
結果は図８に示す通りであり、そしてＴａｋａｈａｓｈｉ等（２００３）が記載するとおりである。フルオレセイン血管造影は対照眼における広範な血管漏出を明らかにしていたが、エンドスタチンベクター投与眼においては正常又はほぼ正常な血管パターンを示していた。これらの結果は組織学的評価により確認された。対照眼由来の網膜は血管漏出に起因する重度の肥厚化を示していたのに対し、エンドスタチンベクター処置眼由来の網膜は正常又は最小限の肥厚化のみ示していた。最終的に、対照眼は部分的又は完全な網膜剥離に罹患していたのに対し、エンドスタチンベクター処置眼ははるかに低値の、一部の場合においては皆無の剥離を示していた。全体としてＢＩＶエンドスタチンベクターはマウスの８０％において処置眼を保護していた。更に又、治療上の利益は各網膜全体に渡っており、そして注射部位に限定されなかった。
【０３１７】
これらのデータはＢＩＶベクターが眼の血管新生及び漏出を防止する潜在能力を有することを示している。
実施例７：レーザー傷害モデル
２つの異なるトランスジーンを有するＢＩＶベクターを眼血管新生のレーザー傷害モデルにおいて評価した。このモデルは眼の治療薬の開発のために十分受け入れられており、そして血管新生を刺激するために網膜へのレーザー熱傷を使用する（例えばＧｅｈｌｂａｃｈ等、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００３  １４（２）：１２９−４１；Ｍｏｒｉ等、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２００２、４３（６）：１９９４−２０００；及びＭｏｒｉ等、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００１、１８８（２）：２５３−６３参照）。慨すれば、熱傷は網膜に孔部を形成し、これにより新しい毛細管が伏在する脈絡膜毛細管床から網膜内に成長する。血管は通常は欠損性であり、漏出しやすい。  
【０３１８】
第１の試験において、抗血管形成蛋白色素上皮誘導因子（ＰＥＤＦ）（ＰＥＤＦのｃＤＮＡはＩｎｖｉｖｏＧｅｎより購入、カタログ番号ｐｂｌａ−ｈｐｅｄｆ）をコードするＢＩＶベクターをラット眼内に網膜下注射により投与した。各ラットにつき、片方の眼にＰＥＤＦベクターを投与し、もう片方に治療用トランスジーンをコードしない対照ＢＩＶベクターを投与した。２週間後、レーザー傷害により血管新生を誘導した。更に２週間後、ラットに新血管の輪郭を示すＦＩＴＣ−デキストランを投与した。網膜を回収し、血管構造に関して検査した。結果を図９に示す。予測された通り、対照ベクターを投与した眼は病理学的な血管新生を示していた。これとは対照的に、ＰＥＤＦベクターを投与した眼における新しい毛細血管は血管新生緩解に特徴的な外観を有していた。
【０３１９】
第２の試験において、抗血管形成蛋白Ｔ２−ＴｒｐＲＳ（Ｔ２−ＴｒｐＲＳのｃＤＮＡはＩｎｖｉｖｏＧｅｎより購入、カタログ番号ｐｂｌａ−ｈｔｒｐｒｓ）をコードするＢＩＶベクターを、レーザー傷害モデルを用いてマウスにおいて評価した。各マウスの片方の眼にＴ２−ＴｒｐＲＳベクターを投与し、そしてもう一方に対照ベクターを投与した。同日、レーザー傷害により血管新生を誘導した。２週間後、血管新生領域の大きさをＦＩＴＣ−デキストラン及び連続切片作成により評価した。図１０のデータは、平均血管新生面積はＴ２−ＴｒｐＲＳベクター投与眼において有意に小さく、このベクターが血管新生の抑制において高度に有効であることを示していた。
【０３２０】
これらのＰＥＤＦ及びＴ２−ＴｒｐＲＳ動物実験の結果は、とりわけ、眼疾患の改善及び／又は安定化のための遺伝子転移の使用を裏付けるものであった。
実施例８：補体活性化を減衰できる治療用蛋白の設計
５’及び３’末端の両方においてそのネイティブのフランキング配列を有する野生型のヒトｆＢｃＤＮＡをヒト肝ｃＤＮＡライブラリ（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，カタログ番号ＣＨ１００５）からＰＣＲにより得た。ＰＣＲに使用した２つのプライマーは５’ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＣ−３’（フォワードプライマー）（配列番号１７）及び５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＣＣＡＣＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣ−３’（リバースプライマー）（配列番号１８）とした。両方のプライマーはＮｈｅＩ部位を含有していた。増幅されたＰＣＲ産物をＮｈｅＩで消化し、そして予めＮｈｅＩで消化しておいたＢＩＶ転移ベクタープラスミドにライゲーションした（実施例１５参照）。このコンストラクトにおいて、ＭＮＣプロモーターを用いてｆＢ転写を駆動させた。ベクター及びｆＢの配列を確認した。野生型ヒトｆＢに関するＤＮＡ配列は配列番号１に示す通りであり、そして相当するアミノ酸配列は配列番号２に示す通りである。ｆＢをコードするレンチウィルス転移ベクターコンストラクトの模式図は図２に示す通りである。この場合、コンストラクト標識非相同遺伝子の区分はｆＢ配列である。配列表の核酸配列はフランキング配列を包含することに留意する。
【０３２１】
その後、ヒト優性阻害ｆＢ突然変異体／類縁体（ｆＢ１、ｆＢ２、及びｆＢ３）をコードする３つのＤＮＡ配列を直接合成した（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｉｎｃ．）。これら３つのＤＮＡ配列はｆＢコーディング領域における特定の突然変異を除き、配列番号１と同一であった。アミノ酸レベルにおいては、ｆＢ１は変化Ｄ７４０Ｎを含有している。ｆＢ１のＤＮＡ及びアミノ酸の配列は配列番号３及び４にそれぞれ示す。アミノ酸レベルにおいてｆＢ２は変化Ｄ２７９Ｇ、Ｎ２８５Ｄ、及びＤ７４０Ｎを含む。ｆＢ２のＤＮＡ及びアミノ酸の配列を配列番号５及び６にそれぞれ示す。アミノ酸レベルにおいてｆＢ３は変化Ｋ２５８Ａ、Ｒ２５９Ａ、Ｋ２６０Ａ、Ｄ２７９Ｇ、及びＮ２８５Ｄを含有する。ｆＢ３のＤＮＡ及びアミノ酸配列を配列番号７及び８にそれぞれ示す。各優性阻害ヒトｆＢコンストラクトをＮｈｅＩフラグメントとしてＢＩＶ転移ベクタープラスミド内にサブクローニングした。全てのコンストラクトを配列決定することによりそれらの一貫性を確認した。
【０３２２】
３つの類似のマウス優性阻害ｆＢ突然変異体／類縁体も又直接合成（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｉｎｃ．）し、そしてＮｈｅＩフラグメントとしてＢＩＶ転移ベクタープラスミドにサブクローニングした。マウスｆＢ１はＤ７３７Ｎの変化を含有している。配列はそれぞれ配列番号９及び１９に示す。マウスｆＢ２はＤ２７６Ｇ、Ｎ２８２Ｄ、及びＤ７３７Ｎの変化を含有している。配列はそれぞれ配列番号１１及び１２に示す。マウスｆＢ３はＫ２５５Ａ、Ｒ２５６Ａ、Ｋ２５７Ａ、Ｄ２７６Ｇ、及びＮ２８２Ｄの変化を含有している。配列はそれぞれ配列番号１３及び１４に示す。マウス野生型ｆＢはｍｆＢ１を逆操作することにより得た。特記すれば７３７位のＮを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．）を用いた部位指向性突然変異誘発によりＤに変換した。マウス野生型ｆＢに関する配列をそれぞれ配列番号１５及び１６に示す。全てのコンストラクトを配列決定することによりそれらの一貫性を確認した。
【０３２３】
ここではヒト因子Ｂ野生型及び突然変異体／類縁体は文字ｈを付してそのまま（例えばｈｆＢ１）標記し、そしてマウス類縁体はｍを付して（例えばｍｆＢ１）標記する。
【０３２４】
レンチウィルスベクタープリパレーションを実施例１に概説した通り作成し、そしてベクターを発現に関してインビトロで評価した。ベクター上澄みを使用してＡＲＰＥ細胞、即ちヒト網膜色素上皮細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２３０２）を形質導入した。ＢＩＶベクターによる細胞の形質導入は以前に報告された通りである（例えばＭａｔｕｋｏｎｉｓ等、２００２；Ｍｏｌｉｎａ等、２００４）。概すれば、ＡＲＰＥ細胞をウェル当たり１×１０５個の細胞密度で６穴プレート中にプレーティングした。翌日、５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃において５μｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ）の存在下にベクター上澄み３ｍｌで形質導入した。５時間後、培地を新しい細胞培養用の培地（１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ）に交換した。形質導入された細胞を７２時間培養した時点で、培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析に付し、ｆＢの発現を調べた。
【０３２５】
４０μｌの細胞培養物を１０μｌの５×ＳＤＳ試料緩衝液と混合し、９５℃に３分間加熱した。次に試料を７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離した。分離された蛋白をニトロセルロース膜に移し、これをヤギ抗ヒトｆＢ血清（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＧＡＨｕ／ＰＦＢ）でプローブした。次に膜をビオチニル化ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ−５０００）次いでアビジン−ビオチニル化アルカリホスファターゼ複合体と共にインキュベートした。最後に膜をアルカリンホスファターゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートし、バンドを可視化した。ヒト野生型ｆＢ、ｆＢ１、ｆＢ２、及びｆＢ３に関する代表的データを図１３に示す。正しい分子量を有していたｆＢ蛋白は２．５μｇ／ｍｌのレベルでベクター形質導入細胞から分泌されていた。マウス野生型及び優性阻害ｆＢ蛋白をコードしているベクターでも同様のデータが得られた（データ示さず）。これらのデータはＢＩＶレンチウィルスベクターが網膜細胞におけるｆＢ蛋白の効率的な発現を媒介することを示しており、そして臨床用途への潜在性を裏付けている。
実施例９：補体ｆＢ活性を抑制するための結合分子の方策
代替補体経路を抑制するための第２の方策はｆＢ活性を中和又は抑制する抗体（例えばモノクローナル）又はそのフラグメントを形成することを包含する。モノクローナル抗体はマウス、ウサギ、及びニワトリにおいて定型的に形成される。本実施例のためには、本発明者等はウサギを使用した。ウサギの使用はげっ歯類の試験のためのマウスｆＢと交差反応するモノクローナル抗体を得る可能性を最適化する。明らかにこれはげっ歯類における試験を簡素化するが、ヒトｆＢを抑制するための要件とはならない。例示される方策は更に、例えば組み換え単鎖抗体を形成するためのＲＴ−ＰＣＲを介したハイブリドーマ由来の抗体配列をクローニングすることを包含する。単鎖抗体を調製するための手法は当該分野で良く知られている（Ｃａｒｏｌｉｎａ等、１９９４）。必要に応じて、やはり当該分野で良く知られている操作法によりフレームワーク配列をヒト化することにより治療用途のために抗体を更に最適化できる（Ａｄａｍｓ等、２００５）。更に又、抗体又は抗体フラグメントの結合特性を改変することができ、例えば米国特許７，１７５，９９６及び６，６５６，４６７を参照できる。最後にｆＢを中和する抗体（例えば単鎖抗体）をベクター内でコードさせ、そして遺伝子転移により送達することができる。一部の実施形態においては、抗体又はそのフラグメントを送達できる。
【０３２６】
ヒトｆＢに対抗するウサギモノクローナル抗体を作成する過程は以下の通りである。精製された（＞９５％）血漿由来ヒトｆＢをＱｕｉｄｅｌ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より入手する。各ウサギを合計２．５ｍｇのヒトｆＢで３回まで免疫化する。免疫化プロトコルの開始後６週間〜３か月において、ウサギより得た血清試料をｆＢに対する抗体力価に関してＥＬＩＳＡにより確認する。血清試料は又溶血試験において中和力価を試験する（実施例１１参照）。ヒト特異的及びマウス特異的な溶血試験の両方を実施することによりヒト及びマウスｆＢに交差反応する抗体を明らかにする。高力価の血清を有するウサギをモノクローナル抗体作成のために使用する。細胞融合のために脾臓を摘出する。ハイブリドーマを単離し、そして各々に由来するモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡにより、そしてヒト及びマウスのｆＢ中和力価に関してスクリーニングする。最も高値の中和力価を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを１〜３回サブクローニングすることにより抗体生産の安定性を確保する。各サブクローニングにおいて、クローンを中和力価に関してスクリーニングする。次に最良のクローンを抗体配列のＲＴ−ＰＣＲ増幅のために選択することにより組み換え単鎖抗体を生産する。慨すれば、抗原結合特異性を付与する抗体可変領域にフランキングするプライマーを設計する。次に可変領域をＰＣＲ増幅し、そして得られたＤＮＡ配列を用いて図１４に示す一般的構造を有する単鎖抗体を構築する。組み換え単鎖抗体は、それらがなおｆＢ結合及び中和活性を呈することを確認するために再評価する。次に単鎖抗体を図２の転移ベクターコンストラクト内にサブクローニングすることによりインビトロ及びインビボの評価のためのＢＩＶベクターを形成する。ヒトにおける臨床用途のために選択された単鎖抗体は、フレームワーク領域をヒト化するために更に修飾することができる。最後に、必要に応じて指向進化の手法を用いてｆＢに対する抗体の親和性を更に増大させ、そしてｆＢ中和の効能を更に向上させる（例えばＢｒｏｄｅｒ等、２０００参照）。これらの手法は限定しないが例えばＣＤＲグラフティング、フレームワークシャッフリング、及びリサーフィシング技術を包含する。
【０３２７】
一部の実施形態において、個々のＣＤＲをハイブリドーマからＰＣＲ増幅し、そして抗原結合能力を有するポリペプチドをコードするＤＮＡコンストラクト内に組み入れる。そのようなポリペプチドは単鎖抗体の構造を有していないが、それらは効率的にｆＢを中和し、そしてＢＩＶベクターを介して送達されるべき、又は蛋白として送達されるべき、蛋白（例えば治療薬）として作用できる。
【０３２８】
本実施例の抗体は血漿誘導ヒトｆＢに対して作成されるが、等しく有効な抗体を組み換えｆＢから、又は更には製造されたｆＢポリペプチド（例えば２０アミノ酸エピトープ）から作成することもできる。最後に、同一又は同様の方策を用いて補体経路の何れかの成分を中和する抗体を作成することができる。補体因子Ｄ（ｆＤ）は、ｆＤが血漿中に、そして眼中に極めて低濃度（約１〜２μｇ／ｍｌ）で存在し、そして代替経路の律速工程を媒介することから、代替補体経路を減衰するための抗体方策に関する優秀な標的となる（Ｖｏｌａｎａｋｉｓ＆Ｎａｒａｙａｎａ等、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ５：５５３−５６４）。更に又、ｆＤを中和する組み換え単鎖抗体はｆＢ活性を減衰する上記した技術と組み合わせて使用できる。
【０３２９】
ウサギ免疫化、ハイブリドーマ作成、サブクローニング、及び抗体収集の工程は、台湾のＧｅｎｅｓｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．のような商業的実体により実施されることができる。更に又、多くの企業がマウスモノクローナル抗体を提供する業務を行っている（例えばＣｏｖａｎｃｅ又はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
実施例１０：ｆＢ優性阻害の例を評価するための溶血試験
ヒト野生型ｆＢ及び３つの優性阻害をコードするＢＩＶベクターを用いてＡＲＰＥ細胞を形質導入し、そして分泌されたｆＢ蛋白の機能的活性を代替補体経路の溶血試験により評価した。この試験はウサギ赤血球を利用しており、これは自発的にヒト及びマウスの代替経路を活性化する（Ｓｏｈｎ等、２０００）。第１に未感作のウサギ赤血球（Ｅｒａｂ）の細胞懸濁液を２×１０８個／ｍｌでゼラチン／ベロナール緩衝食塩水＋Ｍｇ＋＋及びＥＧＴＡ、ｐＨ７．３５（ＧＶＢ−ＥＧＴＡ）中に調製した。第２に、２０μｌのｆＢ枯渇ヒト血清（Ｑｕｉｄｅｌ）を（１）無添加；（２）血漿誘導ヒトｆＢ（Ｑｕｉｄｅｌ）５００ｎｇ；または（３）ＧＦＰ，野生型ヒトｆＢ、ｆＢ１、ｆＢ２又はｆＢ３のいずれかをコードするベクターで形質導入されているＡＲＰＥ細胞に由来する培地４０μｌを含有するＧＶＢ−ＥＧＴＡで１：５に希釈した。培地は、Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ８０３００８）を用いて１０倍に濃縮した。次に、各血清混合物１００μｌをＥｒａｂ１００μｌに添加し、そして振とう器ウォーターバス中３７℃において６０分間インキュベートした。氷冷ＮａＣｌ（０．１５Ｍ）を使用して反応を停止した。試験管を４℃で１０分間１２５０ｇで遠心分離することにより細胞を沈殿させ、そして各上澄みのＯＤ４０５を測定した。陽性対照として蒸留水をＥｒａｂ懸濁液に添加したところ、これは細胞の１００％の浸透圧溶解をもたらした。
【０３３０】
データを図１５に示す。ｆＢ枯渇血清に添加した場合、精製された血漿誘導ヒトｆＢ５００ｎｇは８０％溶血をもたらした（これに対し浸透圧溶解によれば１００％）。何れのｆＢも添加しなかったｆＢ枯渇血清は溶血をもたらさなかった。ＧＦＰベクターで形質導入された細胞に由来する組織培養培地は血清の溶血能力を回復させなかった。これとは対照的に、野生型ヒトｆＢベクターで形質導入した細胞に由来する組織培養培地は４０％の溶血をもたらした。予測された通り、３つのヒト優性阻害ｆＢ部分の各々をコードするベクターで形質導入された細胞に由来する組織培養培地は血清の溶血能力を回復させなかった。これらのデータはベクター誘導ヒト野生型ｆＢが生物学的に活性であること、そして優性阻害が代替補体経路を活性化させないことを確認するものである。
実施例１１：補体経路を抑制する蛋白を評価するための溶血試験の使用
競合試験を用いることにより優性阻害ｆＢ部分をコードするベクターの能力を評価できる。ｆＢ優性阻害蛋白はＡＲＰＥ細胞のベクター形質導入により組織培養物中に調製する。ｆＢ蛋白を組織培養培地中に分泌させ、そして実施例８に示す通りウエスタン分析により定量する。種々の比の優性阻害ｆＢ及び野生型ｆＢを溶血試験に加える競合試験を実施する。各優性阻害ｆＢの能力は、野生型ｆＢ蛋白と競合して野生型の蛋白能力を減衰することによりｆＢ枯渇血清の溶血活性を再建するその能力により測定する。蛋白をコードするベクターは又、動物モデルにおいて評価でき、そして一部の場合においては、所望の能力を有する（例えば最も強力な）ものを、例えば補体経路を試験するため、及び／又は動物（例えばヒト）における適用のために、更に開発する。
【０３３１】
本明細書に記載したとおり、ｆＢ１は通常の親和性及び動態でＣ３ｂに結合すると考えられているが、ｆＤによる作用を受け、そしてプロペルジンで安定化されれば、ｆＢはプロテアーゼとして機能しなくなり、そしてＣ３コンバターゼを形成しない。ｆＢ２はＣ３ｂに対し増大した結合親和性を有するが、プロテアーゼ機能は不活性化する。ｆＢ３はＣ３ｂに対して増大した結合親和性を有するが、因子Ｄによって切断されず、そしてこのため最小限のプロテアーゼ活性を示すのみである。ｆＢ１、ｆＢ２、及びｆＢ３は野生型ｆＢとの競合試験において試験される。
【０３３２】
抗ｆＢ抗体の能力はｆＢ枯渇血清を用いて実施例１０に記載するものと同様の溶血試験において評価される。特記すれば、試験は溶血活性を再建する精製されたｆＢの能力を各抗体の希釈／濃縮がブロック又は抑制する能力を計測する。溶血試験における抗ｆＢ抗体の初期のインビトロの評価を抗体生産のためのベクターを用いることなく抗体蛋白を用いて実施する。即ち精製された抗体を試験に加えることにより各抗体が溶血を減衰する能力を評価する。その後の溶血試験を用いたインビトロの評価は、抗体、例えば最も強力な抗体の単鎖型をコードするベクターで形質導入したＡＲＰＥ細胞由来の組織培養培地を用いて実施する。
実施例１２：ｆＢ優性阻害及びｆＢ中和抗体をコードするベクターのインビボ分析
マウスｆＢ優性阻害を用いながら、そしてマウスｆＢを中和する抗体を用いながら先ずマウスにおけるインビボの評価を実施する。ヒトｆＢ優性阻害体も又、種特異性がこれらの評価の信頼性を損なうかもしれないが、マウスにおいてインビボで評価する。
【０３３３】
潜在的に治療用の蛋白をコードするベクターを評価するために使用するマウスモデルはレーザー傷害モデルである（Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ  ａｎｄ  Ｈａｃｋｅｔｔ  ２００３）。実施例７に記載した通り、レーザーパルスを用いることによりブルーフ膜に孔部をあけ、それを通過させて脈絡膜毛細管床から新しい血管を生育させる。血管の生育の程度はレーザー処置後１〜２週間にＦＩＴＣデキストラン注入により定量する。興味深いことに、新しい血管の生育は代替補体経路の活性化に依存している。最近のデータによれば、代替経路がマウスにおいて抑制又はブロックされた場合、レーザー誘導血管新生は実質的に減衰することが明らかにされている（Ｂｏｒａ，Ｎ．等、２００６，Ｂｏｒａ，Ｐ．等、２００６，及びＢｏｒａ，Ｎ．等、２００７）。従って本モデルはインビボにおける補体活性化を本発明の遺伝子転移ベクターが抑制するときの有効性を評価するための容易な方法を提供する。モデルは補体抑制を試験するため、全ての型のＡＭＤ（早期乾性ＡＭＤ、湿性ＡＭＤ、及び地図状萎縮）を包含する補体活性化が自身の病因に関与しているヒト疾患を治療するための治療薬の開発のための予測的価値を有している。最後に、ヒト結晶腔中に観察される補体成分Ｃ３ａ及びＣ５ａはインビトロでＶＥＧＦ発現を誘導することがわかっており、マウスにおける血管新生の機序がヒトにおけるものと極めて同様であることを示唆している（Ｎｏｚａｋｉ等、２００６）。
【０３３４】
慨すれば、ｆＢ優性阻害をコードするベクター又は非関連の蛋白をコードする（例えば治療用蛋白をコードしない）対照ベクターをマウス、例えば新生仔（ｐ５）又は若年期（約６週齢）のＣ５７Ｂｌ／６マウスに、網膜下及び／又は硝子体内注射により注射する。動物が約８週齢になった時点で、レーザー傷害を実施して網膜当たり３斑点を形成する。多くの異なるレーザー傷害の操作法が当該分野で知られている。本発明者等は典型的には、赤色ダイオードを含有し、そして８１０ｎｍの波長で光を発するＩｒｉｓ  Ｏｃｕｌｉｇｈｔ  ＳＬＸレーザーを使用する。レーザーパラメーターは典型的には光線直径７５μｍ、エネルギーレベル１００ｍワット、及びパルス持続時間１００ｍｓｅｃに設定する。レーザー傷害の７日後、動物をＦＩＴＣ−デキストランで灌流し、網膜を採取し、そして血管新生の程度を共焦点顕微鏡により調べる。
【０３３５】
抗体の方策を試験するために、レーザー傷害を若年期のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて実施する。同日、動物にモノクローナル抗ｆＢ抗体の硝子体内注射を行う。各場合において、陰性対照のコホートを非関連の抗体で処置する。
【０３３６】
インビトロの分析の場合と同様、典型的ではあるが必ずしも常時ではなく、最も強力な抗体を発現しているハイブリドーマを用いて組み換え単鎖抗体を作成する。次にこれらの単鎖抗体を遺伝子転移ベクターにコードさせ、そしてｆＢ優性阻害に関して記載したものと同一の態様においてマウスで試験する。ヒトへの適用のためには、組み換え単鎖抗ｆＢ抗体は任意に、フレームワーク領域をヒト化するためにさらに修飾することができる。
【０３３７】
任意に、指向進化の手法を用いてｆＢに対する抗体の親和性を更に増大させ、そしてｆＢ中和の効能を更に向上させる（例えばＢｒｏｄｅｒ等、２０００参照）。
実施例１３：レンチウィルス系ではないベクター系を用いたｆＢ優性阻害及び抗ｆＢ抗体の送達
前述の実施例はレンチウィルスベクター遺伝子転移系、そして特にＢＩＶ系ベクター系に着目してきたが、他のベクター系を用いて蛋白又は治療薬を目に送達することもできる。例えば、上記した優性阻害ｆＢ部分及び単鎖抗体はＡＡＶベクター中に容易にコードされる。ＡＡＶベクターの使用は極めて容易であり、そして当該分野で良く知られている（例えばＬｕ２００４；米国特許７，０３７，７１３；６，９５３，５７５；６，８９７，０６３；６，７６４，８４５；６，７５９，０５０；６，７１０，０３６；６，６１０，２９０；６，５９３，１２３；６，５８２，６９２；６，５３１，４５６；６，４１６，９９２；６，２０７，４５７；及び６，１５６，３０３を参照できる）。インビボの遺伝子転移効率が異なる、そして発現の開始が異なる少なくとも８種のＡＡＶ血清型が存在する。ＡＡＶベクターの大部分の血清型は眼内で機能する（例えばＡｕｒｒｉｃｃｈｉｏ等、２００１及びＹａｎｇ等、２００２参照）。ＡＡＶベクター系は詳細な使用説明書とともにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から市販されている。ベクター内に治療用蛋白をサブクローニングすること、一過性のトランスフェクションによりベクター好ましくはパレーションを作成すること、及び密度勾配超遠心分離又はカラムクロマトグラフィーによりベクターを精製することの工程は、容易であり、当該分野で良く知られている。例えば前述の実施例において記載した蛋白をコードするＡＶＶベクターはＢＩＶベクターに関して記載した操作法と同じか同様の操作法により、インビトロで評価し、そして動物モデルに注射する。
実施例１４：アテローム性動脈硬化性心臓血管疾患のようなヒトの疾患の治療への本発明の適用
前述の実施例は眼疾患に着目してきたが、ヒトにおける多くの異なる疾患が病因として補体活性化を有することに留意しなければならない。それらには、とりわけ、リューマチ学的、神経学的、及び心臓血管学的な疾患が包含される（例えばＮｉｃｕｌｅｓｃｕ及びＲｕｓ２００４、Ｋａｒｄｙｓ等、２００６、及びＲｕｓ等、２００６参照）。従って、本発明の一部のベクターは例えば疾患臓器内への本発明のベクター又は蛋白の直接の注射を介した眼疾患以外の疾患の抑制、安定化及び／又は治療に直接適用できる。特にアテローム性動脈硬化症プラークは少なくとも部分的には、本明細書に提示したＡＭＤのモデルにおける結晶腔に関して記載したものと同じ病因を介して、成長する場合がある。補体抑制剤の局所発現及び／又は送達はプラークの成長を緩徐化し、そして疾患の進行を緩徐化することになる。冠動脈又は抹消動脈の疾患を治療する一部の実施形態においては、ベクターは血管に投与される。治療において血管形成を行う場合、ベクター及び／又は蛋白は例えば血管形成の部位に対し、カテーテルを介して投与できる。治療において血管グラフトを行う場合は、ベクター及び／又は蛋白はグラフトの前に血管を介して注入できる。一部の実施形態においては、ベクター及び／又は蛋白は局所炎症を減衰させ、そしてアテローム性動脈硬化プラークの回帰又は進行を緩徐化させる。図１６は血管及び脳にレンチウィルスベクターが遺伝子を転移させる場合の効率を示すことにより眼以外への適用の根拠を与えている。
【０３３８】
図１６はラット大動脈及びマウス脳へのレンチウィルスベクター遺伝子転移を示す。図１６Ａはラット大動脈の切片の形質導入を示す。この場合、血管にβ−ガラクトシダーゼをコードするＨＩＶから誘導したレンチウィルスベクターを注入した。β−ガラクトシダーゼレポーター蛋白は細胞の核内に局在化するように操作した。その後血管を切開し、青色を呈するβ−ガラクトシダーゼに関する染色を行った。図１６Ａに示す青色の核は管腔表面に沿った内皮細胞及び平滑筋細胞への、そしてある程度までは血管壁全体に渡る効率的な遺伝子転移を示している。ＨＩＶベクターの作成及び使用は当該分野で良く知られており、そしてＨＩＶベクター系はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から市販されている。図１６ＢはＢＩＶ  ＧＦＰベクターを用いたマウス脳への遺伝子転移を示す。ベクター１μＬを黒質への定位注射により投与した。１７日後、マウスを屠殺し、脳を切開した。ＧＦＰ発現はニューロン及び神経膠細胞の両方に観察される。興味深いことにＧＦＰ発現は、注射が片側のみであったにも関わらず、脳の両側に観察されている。脳は赤色を呈するＮｅｕＮでニューロンに関して染色した。差し込み図は高倍率における緑色及び赤色染色の黄色同時発生を示しており、ニューロンの形質導入が確認されている。
【０３３９】
上記したインビトロ及びインビボの分析を組み合わせれば、特に、抗炎症性治療用蛋白をコードする遺伝子転移ベクターを用いたヒトの眼の疾患の治療のための遺伝子転移の方策の根拠となりえる。本実施例の試験は又、心臓血管及び神経学的疾患のような他のヒトの疾患を治療するための本発明の潜在性も明らかにしている。
実施例１５：ヒト因子Ｂ突然変異体によるヒト代替補体経路活性の抑制
材料、方法及び装置
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｌｌｅｇｒａ６ＫＲ遠心分離機、Ｃ７６ウォーターバス振とう器（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｌａｓｓｉｃ  Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｖｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ１９０マイクロプレートリーダー、Ｃｏｒｎｉｎｇ９６穴プレート白色、１４ｍｌ容のポリスチレン丸底試験管（Ｆｉｓｈｅｒ）、Ａｍｉｃｏ  Ｕｌｔｒａフィルター装置、分子量カットオフ３０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
試薬及び緩衝液
ＧＶＢ＋＋（Ｓｉｇｍａ）は５ｍＭバルビタール緩衝液、０．１５ｍＭＣａＣｌ２、１４１ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＭｇＣｌ２を含有していた。Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液は使用毎に新しく製造し、そして１００ｍＭＥＧＴＡ、１００ｍＭＭｇＣｌ２、ＧＶＢ＋＋及び５％グルコースを含有していた。ウサギ赤血球はＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈより購入した。ヒト因子Ｂ枯渇血清はＱｕｉｄｅｌ（カタログ番号Ａ５０６）より購入した。
ＢＩＶベクターによりコードされたヒト因子Ｂ野生型蛋白及び３つの優性阻害ヒト突然変異体蛋白ｆＢ１、ｆＢ２、及びｆＢ３の製造
プラスミドをＢＩＶ系ベクターの製造のために構築した。ｐＡＶＴｒＧＰ０３８（配列番号１９；図２９Ａ）はＢＩＶｇａｇ／ｐｏｌコーディング領域（プロテアーゼのＤＴＧＡＤモチーフにおけるスレオニンからセリンへの突然変異に関してコードしている）に作動可能に連結したＲＳＶプロモーターとその後の合成ポリＡシグナルを有しており、例えば米国特許７，０７０，９９３を参照できる。ｇａｇ／ｐｏｌコーディング配列のコドンは又、発現のために最適化されており、例えば、Ｍｏｌｉｎａ等、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００４、１５（９）：８６５−７７を参照できる。ｐＡＶＴｒＲＥＶ０３９（配列番号２０；図２９Ｂ）はＢＩＶｒｅｖコーディング領域（最適なコドンとともに再コードされている）に作動可能に連結したＲＳＶプロモーターとその後の合成ポリＡシグナルを含有する。ｐＡＶＴｒＧＰ６４−０４０（配列番号２１；図２９Ｃ）はＧＰ６４エンベロープに対してコードしている。ヒト野生型因子Ｂ、ｆＢ１、ｆＢ２及びｆＢ３（それぞれ配列番号２、４、６及び８）に関してコードしているＢＩＶ系の転移ベクターは全て、これらの対応するコーディング領域（それぞれ配列番号１、３、５及び７のコーディング領域及び実施例８を参照）をｐＡＶＴ００１（配列番号２２；図２９Ｄ）のＮｈｅＩ部位内にクローニングすることにより製造した。
【０３４０】
野生型ヒト因子Ｂ及び３つの優性阻害ヒト因子Ｂ突然変異体をコードするＢＩＶベクター粒子を作成するために、２９３ＦＴ細胞を１．１×１０７個／ディッシュの細胞密度で１５０ｍｍのディッシュにプレーティングした。翌日、細胞を４５μｇのＢＩＶ系ｐａｃｋａｇｉｎｇコンストラクトｐＡＶＴｒＧＰ０３８、４５μｇの野生型ヒト因子Ｂ蛋白ｆＢ１、ｆＢ２、又はｆＢ３をコードするＢＩＶ系ｔｒａｎｓｆｅｒベクターコンストラクト、３０μｇのＲｅｖ発現コンストラクトｐＡＶＴｒＲＥＶ０３９及び１５μｇのＧＰ６４エンベロープ発現コンストラクｐＡＶＴｒＧＰ６４−０４０で実施例１に記載の通りトランスフェクトした。ｅＧＦＰをコードする対照ＢＩＶベクターも同様にｐＡＶＴＧＦＰ００６（配列番号２３；図２９Ｅ）を使用しながら製造した。トランスフェクション後３６時間、ベクター上澄みを採取し、２０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離することにより細胞破砕物を除去した。
【０３４１】
野生型ヒト因子Ｂ及び３つの優性阻害ヒト因子Ｂ突然変異体蛋白を形成するために、２×１０５個のＡＲＰＥ細胞又はＣｆ２Ｔｈ細胞を適切なベクターを含有する組織培養培地３ｍｌで形質導入した。対照として、細胞をｅＧＦＰをコードするベクター３ｍｌで形質導入した。形質導入を増強させるために８μｇ／ｍｌの終濃度でウェルに硫酸プロタミンを添加した。６時間後、ベクター上澄みを吸引し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含有する新しい細胞ＤＭＥＭ培養培地３ｍｌと交換した。細胞がコンフルエントに達した後、培地を２％熱不活性化ウシ胎児血清を含有するフェノールレッドを含有しない培地１．５ｍｌと交換した。９６時間後、細胞培養培地を収集し、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより細胞破砕物を除去し、そして次に０．２μｍフィルターで濾過した。回収した細胞培養培地は、次に、分子量カットオフ３０ＫのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏ  Ｕｌｔｒａフィルター装置で５倍濃縮した。野生型ヒト因子Ｂ及び３つの優性阻害ヒト因子Ｂ突然変異体の蛋白発現レベルをウエスタンブロットで評価したところ、本質的に同等であることがわかり、例えば目視によれば２倍以内であった。野生型及び優性阻害突然変異体のヒト因子Ｂ蛋白を含有する濃縮培地を濾過滅菌し、小分けにしてマイナス８０℃で使用時まで保存した。
代替補体経路溶血活性試験のための操作法
以下の試験は因子Ｂの枯渇したヒト血清を利用する競合試験である。この因子Ｂ枯渇血清は、それ自体、検出可能な補体媒介溶血活性を欠いている。試験へのヒト野生型因子Ｂの添加は血清溶血活性を再建する。優性阻害因子Ｂ蛋白（ｆＢ１、ｆＢ２、及びｆＢ３）を含有する培養上澄みの同時添加を行うことにより、優性阻害体が野生型因子Ｂに競合して溶血活性の再建を減衰するかどうか明らかにする。
【０３４２】
ウサギ赤血球懸濁液（Ｅｒａｂ）１ｍｌを５０ｍｌ容量の三角遠沈管に移し、そして新しく作成した冷Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液３０ｍｌで洗浄した。Ｅｒａｂを冷Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液中、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｌｌｅｇｒａ６ＫＲ遠心分離機で、１２００ｒｐｍ４℃で５分間、ブレーキをオフにして遠心分離した。Ｅｒａｂを更に２回洗浄し、氷冷Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液２ｍｌ中に再懸濁した。細胞数はヘモサイトメーターを用いて計数した。ＥＧＴＡは代替補体経路に影響することなく古典的補体経路を抑制する機能を有することに留意しなければならない。
【０３４３】
試験の最初の部門はｆＢ１、ｆＢ２、及びｆＢ３がそれら自体では溶血活性を再建しないことを明らかにするために設計した。試験の第２の部門は溶血活性を再建する野生型ｆＢの能力をｆＢ１、ｆＢ２、及びｆＢ３がブロックすることを示すように設計した。溶血反応混合物は１４ｍｌ容量のポリスチレン丸底試験管中氷上に設定した。試験の第１の部門については、上記した通り製造した野生型ｆＢ、ｆＢ１、ｆＢ２、及びｆＢ３を含有する培地４０μｌを各試験管に添加した。試験の第２の部門については、記載した比において野生型因子Ｂ及びｆＢ１、ｆＢ２、又はｆＢ３のいずれかを含有する培地の混合物４０μｌを各試験管に添加した。次に２５倍希釈ヒト因子Ｂ枯渇ヒト血清５０μｌを各試験管に添加した。因子Ｂ枯渇ヒト血清は新しく作成した氷冷Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液中に希釈した。試験管をＦｉｓｈｅｒ  Ｖｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ２装置で十分な旋回渦流混合を行った。次に５×１０７赤血球を含有するＭｇ２＋−ＥＧＴＡ洗浄Ｅｒａｂ１０μＬを各試験管に添加し、その後旋回渦流させることなく穏やかに混合した。試験管は４０分間、分当たり１１０ｒｐｍにおいて、軌道振とうにより３７℃のウォーターバス中でインキュベートした。次に、各試験管を氷上に置き、そして氷冷０．９％食塩水１５０μＬを添加することにより反応を停止した。試験管を穏やかに混合し、そして４℃で５分間Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機で２０００ｒｐｍにおいてブレーキをオフにしながら遠心分離した。ペレットを攪乱することなく、上澄み１８０μｌを平底の９６穴プレートに移し、そしてＯＤ４０５を９６穴マイクロプレートリーダー中で測定した。
【０３４４】
更に又、２つの対照試験管を作成して１００％及び０％のＥｒａｂ溶解に対するＯＤ読み取り値を確定した。１００％溶解については、試験管にはＧＦＰベクターで形質導入した細胞に由来する培地４０μｌ及び５×１０７赤血球を含有するＭｇ２＋−ＥＧＴＡ洗浄Ｅｒａｂ１０μＬを入れた。軌道振とう器中で３７℃でインキュベートした後、氷冷水２００μｌを添加することにより赤血球を浸透圧的に溶解させた。０％溶解（ブランク）については試験管にはＧＦＰベクターで形質導入した細胞に由来する培地９０μＬ及び５×１０７赤血球を含有するＭｇ２＋−ＥＧＴＡ洗浄Ｅｒａｂ１０μＬを入れた。軌道振とう器中で３７℃でインキュベートした後、氷冷０．９％食塩水１５０μｌを添加することにより赤血球の溶解を防止した。
結果
上記した通り、ヒト野生型ｆＢ及び３つの優性阻害ヒトｆＢ部分をＢＩＶベクター形質導入細胞由来の組織培養培地中に作成した。代替補体経路溶血活性を抑制する場合にｆＢ１、ｆＢ２、及びｆＢ３含有培養上澄みが野生型ｆＢと競合する能力を図１７に示す。データは特に、（１）ベクターによりコードされたヒト野生型ｆＢは内因性ヒト補体因子Ｂを機能的に置換することができ、そして因子Ｂ枯渇ヒト血清中で代替経路の溶血活性を再建しており；（２）ヒトｆＢ１、ｆＢ２、及びｆＢ３はそれら自体、野生型ｆＢのようには機能せず、そして因子Ｂ枯渇ヒト血清中で代替経路の溶血活性を再建しておらず；（３）ｆＢ１は、示した比において、代替補体経路活性をブロックすることにおいて有意な抑制活性を示しておらず（１：６の高値のｆＢ１対野生型ｆＢの比においては、ｆＢ１は抑制活性を確かに示している（データ示さず））；（４）ｆＢ２はある程度の抑制活性を示しており；そして（５）ｆＢ３は約９０％の代替補体経路活性の強力な抑制を示したことを示している。野生型ｆＢと１：１の比で混合した場合、ｆＢ３は約９０％溶血活性を抑制した。２対１の比においては、ｆＢ３は代替経路補体活性を完全に抑制した（図１７）。
実施例１６：マウス因子Ｂ突然変異体及びヒト因子Ｂ突然変異体によるマウス代替補体経路活性の抑制
材料及び方法
機材、試薬及び緩衝液は、新しい正常マウス血清をＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入するか、又はマウスから新しく採取した以外は、実施例１５に記載したものと本質的に同じである。
【０３４５】
ヒト野生型因子Ｂ及び３つのヒト因子Ｂ突然変異体をコードするＢＩＶベクターに加えて、野生型のマウス因子Ｂ及び３つのマウス因子Ｂ突然変異体をコードするＢＩＶベクターも実施例１５に記載の通り製造した。ヒト因子Ｂ突然変異体はｈｆＢ１、ｈｆＢ２、及びｈｆＢ３と標記し、そしてマウスの因子Ｂ突然変異体はｍｆＢ１、ｍｆＢ２、及びｍｆＢ３と標記する。次にベクターを用いてＡＲＰＥ細胞又はＣｆ２Ｔｈ細胞を形質導入することによりマウス野生型因子Ｂ蛋白及びマウス突然変異体因子Ｂ蛋白を実施例１５に記載の通り作成した。野生型のマウス因子Ｂ及び３つのマウス因子Ｂ突然変異体の発現レベルをウエスタンブロット分析により試験したところ、本質的に同等であることがわかり、例えば目視によれば２倍以内であった。
代替補体経路溶血活性試験
補体因子Ｂ枯渇マウス血清は市販されていない。本発明者等は、マウス血清における代替補体経路の活性化のためには、因子Ｂが律速因子であることを発見した。従って、血清を適切に希釈することにより、これは本試験では４倍としたが、試験を実施例１５における試験と同様に行うことができた。競合試験は、容量でそれぞれ１対１又は１対２となるように、ＧＦＰ又はｍｆＢ１、ｍｆＢ２、又はｍｆＢ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した細胞に由来する培地と希釈全マウス血清を混合することにより設定した。並行して、３つのヒト因子Ｂ突然変異体もこの試験で使用することにより、ヒト優性因子Ｂ突然変異体が内因性野生型マウス因子Ｂと競合できるかどうか調べ；即ち、ヒト因子Ｂ突然変異体が適切なマウスモデルにおいて評価できるかを調べた。（この点に関し、補体因子は頻繁には種特異的な態様において機能し（例えばＨｏｒｓｔｍａｎｎ等、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８５）１３４：１１４０１−４参照）、そして異なる種に由来する血清中の補体活性化を支援しないことに留意しなければならない。）
溶血活性反応は氷上の１４ｍｌ容量のポリスチレン丸底試験管中に設定した。上記した混合物４０μｌを新しく作成した氷冷Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液５０μｌと共に各試験管に添加した。試験管をＦｉｓｈｅｒ  Ｖｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ２装置で十分な旋回渦流混合を行った。次に５×１０７赤血球を含有するＭｇ２＋−ＥＧＴＡ洗浄Ｅｒａｂ１０μＬを各試験管に添加し、その後旋回渦流させることなく穏やかに混合した。次に試験管を１時間１１０ｒｐｍにおいて、軌道振とうにより３９℃のウォーターバス中でインキュベートした。これらのインキュベーション条件はマウス血清による試験のために最適化されており、ヒト血清による試験で用いたものとは異なっていることに留意しなければならない。次に、各試験管を氷上に戻し、そして氷冷０．９％食塩水１５０μＬを添加することにより反応を停止した。穏やかに混合した後、試験管を４℃で５分間Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機で２０００ｒｐｍにおいてブレーキをオフにしながら遠心分離した。ペレットを攪乱することなく、各上澄み１８０μｌを平底の９６穴プレートに移し、そしてＯＤ４０５をマイクロプレートリーダー中で測定した。１００％溶解及び陰性対照（ブランク）試料は実施例１５に記載の通り設定した。
結果
マウス血清中で代替補体経路溶血活性を抑制する場合にマウス及びヒト因子Ｂ突然変異体が内因性マウス因子Ｂと競合する能力を図１８に示す。データは特に、（１）ｍｆＢ３はマウス代替補体経路を抑制したが、ｍｆＢ１及びｍｆＢ２はこの試験では低値の抑制活性を示しており；（２）意外にも、ｈｆＢ２及びｈｆＢ３はマウス代替補体経路を抑制したのに対し、ｈｆＢ１はこの試験ではマウス代替補体経路を抑制しなかったことを示している。この結果は、補体因子の予測された種特異性のために予測されていなかったが、マウスモデルにおけるインビボのｈｆＢ３の試験を可能にする。
実施例１７：マウス因子Ｂ突然変異体によるヒト代替補体経路活性の抑制
材料及び方法
機材、試薬及び緩衝液は、実施例１５及び１６に記載したものと本質的に同じであった。
【０３４６】
マウス野生型因子Ｂ及び３つの優性阻害因子Ｂ突然変異体をコードするＢＩＶベクターの形成は実施例１５及び１６に記載したものと本質的に同じであった。ＢＩＶベクター形質導入細胞からの野生型のマウス因子Ｂ及び優性阻害因子Ｂ突然変異体の製造は実施例１５及び１６に記載したものと本質的に同じであった。溶血試験は実施例１５の操作法に従ってヒト因子Ｂ枯渇血清を用いて実施した。
結果
実施例１５及び１６はとりわけ、ヒト優性阻害突然変異体因子Ｂ２及びＢ３がヒトとマウスの両方の代替補体経路を抑制できること、及びマウス優性阻害突然変異体因子Ｂ３がマウス代替補体経路を抑制できることを明らかにしている。この実施例はマウス因子Ｂ突然変異体がヒト代替補体経路を抑制できるかを調べるために設計されている。図１９に示す通り、データは（１）ｍｆＢ３はヒト代替補体経路を抑止しており、そして（２）ｍｆＢ１及びｍｆＢ２は本試験においては実質的な抑制活性を示さなかったことを示している。野生型ヒト因子Ｂ及びヒト因子Ｂ突然変異体を試験対照として同様に包含させた。
実施例１８：ヒト因子Ｂ突然変異体によるブタ代替補体経路活性の抑制
材料及び方法
機材、試薬及び緩衝液は、新しいブタ血清をユカタンミニブタから採取した以外は実施例１５に記載したものと本質的に同じであった。
【０３４７】
ヒト野生型因子Ｂ及びヒト優性阻害因子Ｂ突然変異体をコードするＢＩＶベクターの形成は実施例１５に記載したものと本質的に同じであった。ＢＩＶベクター形質導入細胞からの野生型ヒト因子Ｂ及びヒト因子Ｂ突然変異体の製造は実施例１５及に記載したものと本質的に同じであった。
【０３４８】
ブタ代替補体経路溶血活性試験は希釈した新しいブタ血清をマウス血清の代わりに使用した以外は実施例１６に記載したものと本質的に同じであった。血清の希釈は本試験においては１：２、１：４、及び１：６とした。
結果
ブタは、ブタの眼の大きさ及び脈管形成状態がヒトの眼のものと同様であることから、大型動物眼モデルとして有用である。本発明者等はヒト優性阻害因子Ｂ突然変異体がブタ代替補体経路を抑制し、これによりブタにおける将来のインビボのモデリングを潜在的に可能とするかどうか調べた。図２０に示す通り、結果はｈｆＢ３がブタの代替補体経路を効率的に抑制したことを示している。ｈｆＢ２も又抑制活性も示したが、ｈｆＢ２はｈｆＢ３ほど強力ではなかった。
【０３４９】
図２０において明らかにされるとおり、野生型ヒト因子Ｂはブタ代替補体経路において機能すると考えられる。特記すれば、ブタ血清を希釈すると、溶血活性の全体的能力が低下している。しかしながら、各希釈において、ヒト野生型補体因子Ｂの添加は溶血活性を惹起している。ヒト野生型因子Ｂがブタ血清において生物学的活性を有するという観察結果に加えて、この所見は又、少なくともこれらの実験条件下においては、因子Ｂがブタ及び恐らくはヒトの補体媒介溶血活性に対する限定的な化合物であるという試験の想定を裏付けている。結果は更に、とりわけ因子Ｂ機能をブロック又は低下させることが代替補体経路を強力に抑制することになるという、本発明の方策を強化するものである。
実施例１９：Ｃ３ｂ依存性因子Ｂ切断
試薬及び緩衝液及び材料及び方法
精製されたヒト補体因子Ｄ蛋白及び精製されたヒト補体因子Ｃ３ｂ蛋白はＱｕｉｄｅｌから購入した（カタログ番号は、それぞれＡ４０９及びＡ４１３）。抗ヒト補体因子Ｂポリクローナル抗体はＱｕｉｄｅｌから購入した（カタログ番号Ａ３１１）。
【０３５０】
ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ−ＡｍｐウエスタンブロッティングイムノデテクションキットをＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した（カタログ番号ＡＫ−６０００）。リン酸塩緩衝液（ＰＢ）は８ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ７．４を含有していた。
【０３５１】
ヒト因子Ｂ野生型蛋白及び３つのヒト優性阻害突然変異体蛋白をコードするＢＩＶベクターの作成は、ＢＩＶ形質導入細胞から採取した因子Ｂ蛋白を更に濃縮する工程に付すことなく使用した以外は本質的に実施例１５記載の通りとした。
Ｃ３ｂ依存性因子Ｂ切断試験
終濃度約５００ｎｇ／ｍＬの形質導入上澄み由来の野生型ヒト因子Ｂ蛋白及び３つのヒト因子Ｂ突然変異体蛋白を３７℃で３０分間、ＰＢ＋２５ｍＭＮａＣｌ及び１０ｍＭＭｇＣｌ２（ＰＢ＋）中、終濃度２００ｎｇ／ｍＬのヒト因子Ｄ及び終濃度２０００ｎｇ／ｍＬのヒト因子Ｃ３ｂと共にインキュベートした。反応混合物中の各成分の量を以下の表２に示す。対照として１セットの反応をＣ３ｂを使用することなく実施した。
【０３５２】
野生型因子Ｂの因子Ｄによる切断はＣ３ｂ依存性である。因子ＢのＣ３ｂへの結合により、因子Ｂはコンホーメーション変化を起こし、因子Ｄ切断部位を露出し、因子Ｄが因子Ｂ（９３Ｋｄａ）を切断してＢｂ（６３Ｋｄａ）及びＢａ（３０Ｋｄａ）とすることができるようにし、これによりＣ３コンバターゼであるＣ３ｂＢｂを活性化する。因子Ｄによる因子Ｂの切断はＣ３ｂの非存在下では起こりえないか、又は極めて低レベルにおいて起こるのみである。留意すべき点は形質導入された細胞の上澄みに由来する各ＢＩＶコードヒト因子Ｂ蛋白の濃度はウエスタンブロット分析に基づけば約１０μｇ／ｍｌと推定されていたことである。
【０３５３】
反応の後、反応混合物２５μｌを還元性蛋白試料緩衝液と混合し、３０分間９０℃でインキュベートし、冷却し、そして７．５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に付した。半ゲル転移系を用いながらゲルをニトロセルロース膜上にブロットした。次に膜をヤギ抗ヒト因子Ｂポリクローナル抗体（Ｑｕｉｄｅｌ、カタログ番号８０００）の１：８０００希釈物、次いでウサギ抗ヤギビオチニル化ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ−５０００）の１：５０００希釈物でプローブした。検出はＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ−Ａｍｐウエスタンブロッティングイムノデテクションキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で実施した。
【０３５４】
【表２】
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結果
野生型ヒト補体因子Ｂ及び３つの因子Ｂ突然変異体を因子Ｄによる切断に関して検査した。図２１に示す通り、Ｃ３ｂ非存在下においては、野生型因子Ｂ又は３つの因子Ｂ突然変異体の何れの効率的な切断も観察されなかった。Ｃ３ｂ存在下では、因子Ｄは効率的に野生型因子Ｂを切断した。ｆＢ１及びｆＢ２も種々の程度にまで切断した。しかしながら、ｆＢ３の切断は殆ど或いは全く観察されず、ｆＢ３の因子Ｄ切断部位内に導入された突然変異が因子Ｄ切断を効果的にブロックしたことが確認された。この所見の意味は、この蛋白分解性の切断の非存在下においてはＣ３コンバターゼであるＣ３ｂＢｂは形成されず、そして代替補体経路の活性化はブロック又は抑制されることになるということである。留意すべき点は、図２１において、ｆＢ２に由来するＢｂは、ｆＢ２内に操作された突然変異によりＮ−グリコシル化部位が除去されているため、野生型因子Ｂ又はｆＢ１に由来するＢｂよりも分子の質量において小さい。
実施例２０：因子ＢのＣ３ｂへの結合
試薬及び緩衝液及び材料及び方法
精製されたヒト補体因子Ｄ蛋白及び精製されたヒト補体因子Ｃ３ｂ蛋白はＱｕｉｄｅｌから購入した（カタログ番号は、それぞれＡ４０９及びＡ４１３）。抗ヒト補体因子Ｂ及びＣ３ポリクローナル抗体はＱｕｉｄｅｌから購入した（カタログ番号はそれぞれＡ３１１及びＡ４１３）。ビオチニル化ウサギ抗ヤギＩｇＧＦｃフラグメント抗体はＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（カタログ番号３０５−０６５−０４６）より購入した。
【０３５５】
リン酸塩緩衝液（ＰＢ）は８ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ７．４を含有していた。洗浄緩衝液は２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８．０、０．１５ＭＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、２ｍＭＥＤＴＡを含有していた。フェニルメタンスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）はＳｉｇｍａ（カタログ番号Ｐ７６２６）から購入した。プロテイナーゼ阻害剤カクテルはＲｏｃｈｅ（カタログ番号１１８３６１７０００１）から購入した。プロテインＡアガロースビーズはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号１５９１８−０１４）から購入した。正常ウサギＩｇＧはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＡＢ−１０５−Ｃ）から購入した。ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ−ＡｍｐウエスタンブロッティングイムノデテクションキットはＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ヒト因子Ｂ野生型蛋白及び３つのヒト優性阻害突然変異体蛋白をコードするＢＩＶベクターはＢＩＶ形質導入細胞から採取した因子Ｂ蛋白は更に濃縮工程に付すことなく使用したことを除き、本質的には実施例１５に記載する通りである
因子ＢのＣ３ｂへの結合に関する試験
終濃度約５００ｎｇ／ｍＬの形質導入上澄み由来の野生型ヒト因子Ｂ蛋白及び３つのヒト因子Ｂ突然変異体蛋白を３７℃で３０分間、ＰＢ＋２５ｍＭＮａＣｌ及び１０ｍＭＭｇＣｌ２（ＰＢ＋）中、終濃度２００ｎｇ／ｍＬのヒト因子Ｄ及び終濃度２０００ｎｇ／ｍＬのヒト因子Ｃ３ｂと共にインキュベートした。反応混合物中の各成分の量を以下の表３に示す。対照として１セットの反応をＣ３ｂを使用することなく実施した。
【０３５６】
【表３】
2010520224.tif 000005
切断試験の後、試験管を氷上に置き、そして試料を免疫沈降に付した。各試料（５００μｌ）をＰＭＳＦ及びプロテイナーゼ阻害剤カクテル錠剤を含有する氷冷洗浄緩衝液１ｍｌと混合した。次に正常ウサギＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）２μＬを添加し、試験管を４℃で１時間振とうし、そして１００μＬのプロテインＡビーズを添加した。混合の後、試験管を再度４℃で１時間振とうし、そして５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。各上澄みを新しい試験管に移し、抗ヒト補体因子Ｂポリクローナル抗体２μＬを添加し、そして試験管を４℃で一夜振とうした。次に、各試験菅に氷冷洗浄緩衝液中の蛋白Ａビーズ１００μＬを添加し、試験管を４℃で１時間振とうした。次に試験管を１分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、ペレットを攪乱することなく上澄みを棄て、ビーズを氷冷洗浄緩衝液＋ＰＭＳＦ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤で３回洗浄した。次にビーズを再懸濁し、１分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。最後に、ビーズを５００ｍＭＭｇＣｌ２緩衝液１ｍｌで洗浄することにより、非特異的に結合していた如何なる蛋白も除去した。更に１分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄みを棄て、還元性蛋白試料緩衝液１００μｌを添加し、ビーズを旋回渦流により十分混合した。次にビーズを９５℃に３分間加熱し、蛋白を遊離させた。ビーズは２分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離することにより除去し、そして上澄み９０μｌを新しい試験管に移した。
【０３５７】
各試料４０μＬを７．５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上にロードし、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでウエスタンブロット分析に付した。半ゲル転移系を用いながらゲルをニトロセルロース膜上にブロットした。膜をヤギ抗ヒト因子Ｃ３ポリクローナル抗体の１：５０００希釈物、次いでウサギ抗ヤギビオチニル化ＩｇＧ  Ｆｃフラグメント抗体の１：２０，０００希釈物でプローブした。蛋白バンドはＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ−Ａｍｐウエスタンブロッティングイムノデテクションキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて可視化した。
結果
この実験はヒト因子Ｂ突然変異体の野生型因子Ｂと比較した場合のＣ３ｂ結合特性を調べるものであった。図２２に示す通り、インビトロ結合試験をＣ３ｂ、因子Ｂ及び因子Ｄを用いて実施した。次に反応複合体をポリクローナル抗因子Ｂ抗血清を用いて免疫沈降させ、そして複合体を変性条件下、Ｃ３ｂポリクローナル抗体プローブを用いながら、ウエスタン分析により評価した。Ｃ３ｂ免疫沈降の程度はｆＢ３で最高であった（図２２、レーン４）。有意に低値の量のＣ３ｂがｆＢ２で免疫沈降され、更に低値の量のＣ３ｂが野生型因子Ｂ及びｆＢ１で免疫沈降された（図２２、レーン３、５及び６）。注目に値することは、本試験においては、野生型因子Ｂとの複合体が既知半減期２分未満の短命であることから、免疫沈降されたＣ３ｂの量は低値であると予測された点である。Ｃ３ｂのｆＢ３への結合がＣ３ｂのｆＢ２への結合よりも有意に高値であったという観察結果は、Ｃ３ｂ結合を向上させるように設計されたアミノ酸変化がｆＢ２及びｆＢ３の両方で同一だったため、極めて意外である。ｆＢ３における突然変異の特定の組み合わせがＣ３ｂへのより堅固な結合をもたらすためにこのように有効である理由はなお不明である。もっとも重要な点は、Ｃ３ｂへのｆＢ３の強力な結合は、代替補体経路を抑制する場合においては、ｆＢ３が因子Ｂ優性阻害体の最も強力なものであるという所見の１つの説明であるかもしれない。特記すれば、ｆＢ３のＣ３ｂへの持続的結合は、非機能性Ｃ３コンバターゼにおけるＣ３ｂの持続性の封鎖をもたらすと考えられる。
実施例２１：因子ＤのＣ３ｂＢ複合体への結合
材料及び方法
試薬及び緩衝液は、ポリクローナルヤギ抗ヒト因子Ｄ抗血清をＱｕｉｄｅｌ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ−１８２４）から購入した以外は本質的に実施例２０に記載のものと同様とした。
【０３５８】
ヒト野生型因子Ｂ蛋白及び３つの優性阻害ヒト因子Ｂ蛋白をコードするＢＩＶベクターの形成は本質的に実施例１５に記載のものと同様とした。
【０３５９】
因子ＤのＣ３ｂＢ複合体への結合に関する試験は、反応複合体を抗因子Ｄ抗血清を用いて免疫沈降し、そしてウエスタンブロットはポリクローナルヤギ抗ヒト因子Ｂ抗血清を用いてプローブした以外は、実施例２０に記載のＣ３ｂへのｆＢの結合に関する試験と本質的に同様とした。
結果
実施例１９及び２０はヒトｆＢ３が因子Ｄによる切断に対して耐性であること、及び、それが野生型因子Ｂ、ｆＢ１、又はｆＢ２の何れかよりも堅固にＣ３ｂに結合することを示している。この実施例は、異なるＣ３ｂＢ複合体への因子Ｄの結合特性を評価するために設計されており、各々の異なるＣ３ｂＢ複合体は異なるヒト優性阻害因子Ｂ類縁体を有する。因子Ｄは通常は極めて低レベルで存在し、そしてＣ３ｂＢ複合体中の因子Ｂを切断してＢａ及びＢｂとするための触媒として機能する。従って、極めて少量の因子Ｄが何れの時点においてもＣ３ｂＢ複合体に結合していると予測される。予測通り、そして図２３に示す通り、少量のみの因子Ｂが野生型因子Ｂ、ｆＢ１、及びｆＢ２について因子Ｄを用いた場合に同時沈澱した。興味深いことに、そして非常に意外なことに、ｆＢ３を用いた場合は、遙かにより多くが因子Ｄで同時沈降した（図２３、レーン５）。即ちＣ３ｂがｆＢ３と複合体形成する場合、因子Ｄは遙かにより堅固に複合体に結合すると考えられる。この持続的結合が起こる機序はなお不明である。もっとも重要な点は、持続的な因子Ｄの結合は、代替補体経路の抑制においてｆＢ１又はｆＢ２よりもｆＢ３がより強力である理由を更に示していることである。特に、Ｃ３ｂとの複合体形成の後、ｆＢ３は因子Ｄの持続的結合を達成し、そしてこれにより因子Ｄを封鎖することができる。因子Ｄは少量使用可能であるのみであり、そして因子Ｄ蛋白は多くの蛋白分解性切断を媒介する役割を有するため、代替補体経路からの因子Ｄの除去はその経路のブロッキングにおいて強力な作用を有するはずである。
【０３６０】
本実施例及び前述のものにおけるデータは、３つすべての優性阻害因子Ｂ部分が代替補体経路を減衰するために機能するが、ｆＢ３は意外にも最も強力であったことを示している。更に又、機序に関する試験によれば、ｆＢ３の独特の効力は２つの属性、即ち１）Ｃ３ｂへのその堅固な結合、及び２）因子Ｄへのその堅固な結合によるものと考えられる。即ち代替補体経路に進入すると、ｆＢ３はＣ３ｂ及び因子Ｄの両方に持続的結合を達成し、これらの成分の両方を、機能的Ｃ３コンバターゼ（又はＣ５コンバターゼ）を形成することなく経路から除去する。最終結果は代替補体経路の正のフィードバックの増幅ループの遮断及び強力な経路抑制である。
【０３６１】
理論に制約されないが、因子ＤがＣ３ｂの複合体及びｆＢ３に強力に結合するという所見はそれがｆＢ３を切断する能力を有さないことに関連すると考えられる。このことは、代替補体経路を効率的に抑制する追加的手段としての、弱化されたプロテアーゼ活性を有するように設計された優性阻害因子Ｄ（例えば本明細書に記載したもの）の使用の根拠となる。因子Ｂを切断する能力を有さないため、そのような優性阻害因子Ｄは野生型の因子Ｄよりも堅固にＣ３ｂＢ複合体に結合することが予測される。結合した優性阻害因子Ｄは野生型因子Ｄが複合体に進入すること、因子Ｂを切断すること、及びＣ３コンバターゼを活性化することを防止することになる。因子Ｄの構造は特性化されており（Ｖｏｌａｎａｋｉｓ  ＪＥ  ａｎｄ  Ｎａｒａｙａｎａ  ＳＶＬ，１９９６，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ５：５５３-５６４）、弱化されたプロテアーゼ活性を有する優性阻害体の設計が可能である。最後に、優性阻害因子Ｄ部分は単独又は優性阻害因子Ｂ部分と組み合わせて使用してよい。
実施例２２：抗ヒト因子Ｂモノクローナル抗体によるヒト代替補体経路の抑制
材料及び方法
機材、試薬及び緩衝液は、ヒト因子Ｂに対するマウスモノクローナル抗体をＱｕｉｄｅｌ（カタログ番号Ａ２２７）から購入し、そしてアイソタイプマッチ対照マウスＩｇＧをｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（カタログ番号１４−４７１４）から購入した以外は、実施例１５に記載したものと本質的に同じである。
代替補体経路溶血活性試験
ウサギ赤血球は実施例１５記載と同様に取り扱った。溶血反応の前に、精製された組み換えヒト因子Ｂ蛋白１２．５ｎｇ／μＬを、４℃で３０分間、総容量４０μＬを有する各試験管中、Ｍｇ−ＥＧＴＡ緩衝液中１：０．５、１：１、１：２、及び１：３のモル比において抗ヒト因子Ｂモノクローナル抗体とともに予備インキュベートした。次に新しく調製した氷冷Ｍｇ−ＥＧＴＡ緩衝液中２５倍に希釈したヒト因子Ｂ枯渇血清５０μｌを各試験管に添加した。陽性対照試験管用に、精製されたヒト補体因子Ｂ蛋白５００ｎｇを２５倍希釈ヒト因子Ｂ枯渇血清５０μｌ中に調製し、そして容量をＭｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液で９０μＬにまで増大させた。次に５×１０７赤血球を含有するＭｇ２＋−ＥＧＴＡ洗浄Ｅｒａｂ１０μＬを各試験管に添加した。反応混合物は旋回渦流させることなく穏やかに混合した。試験管は４０分間１１０ｒｐｍにおいて、軌道振とうにより３７℃のウォーターバス中に入れた。４０分後、試験管を氷上に戻し、そして氷冷０．９％食塩水１５０μＬを添加することにより反応を停止した。各試験管を穏やかに混合し、そして４℃で５分間Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機で２０００ｒｐｍにおいてブレーキをオフにしながら遠心分離した。ペレットを攪乱することなく、各上澄み１８０μｌを平底の９６穴プレートにそっと移し、そしてＯＤ４０５をマイクロプレートリーダー中で測定した。
結果
代替補体経路を抑制するための本発明の別の態様は、経路の成分、限定しないが例えば因子Ｂ、因子Ｄ、Ｃ３ｂ、Ｃ３コンバターゼ等に対する結合分子、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその結合フラグメントを使用することである。結合分子は直接送達（例えば網膜へ）するか、又は遺伝子転移ベクター（例えばレンチウィルスベクター）により発現させることができる。モノクローナル抗体はフラグメント、例えばＦａｂフラグメント又は単鎖抗体として送達できる。本実験は結合分子、例えばモノクローナル抗体が代替経路を効果的に抑制できるかを調べるものであった。図２４に示す通り、抗ヒト因子ＢｍＡｂは試験した４段階全ての用量において代替補体経路活性を本質的にシャットダウンしている。抑制は、対照マウスＩｇＧが同様の用量において経路活性を抑制又はブロックしなかったことから、特異的であった。
実施例２３：抗ヒト補体因子Ｄによるヒト代替補体経路活性の抑制
材料及び方法
機材、試薬及び緩衝液は、モノクローナル抗ヒト因子Ｄ抗体をＡｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ，カタログ番号ＧＡＵ００８−０１−０２）から購入し、そしてアイソタイプマッチマウス対照ＩｇＧをｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（カタログ番号１４−４７３２）から得た以外は、実施例１５に記載したものと本質的に同じである。代替補体経路活性溶血試験は抗因子ＤｍＡｂを抗因子ＢｍＡｂの代わりに使用した以外は実施例２２に記載したものと本質的に同じである。
結果
因子Ｄは代替補体経路の重要な成分であり、そしてそのため、経路を抑制するための理想的な標的である。本実験はヒト因子Ｄに対するｍＡｂのような結合蛋白は経路を抑制できることを示すように設計されている。表４に示す通り、抗因子ＤｍＡｂは用量依存的な態様において代替補体経路溶血活性を抑制している。抑制は、アイソタイプマッチの対照マウスＩｇＧが如何なる抑制も示さなかったことから、因子Ｄ特異的である。
【０３６２】
【表４】
2010520224.tif 000006
代替補体経路の活性は溶血試験を用いて評価した。相対的溶血活性はウサギ赤血球の溶解後に上澄み内に放出されたヘモグロビンの量により計測する。１００％溶解を有する陽性対照、ＲＢＣを水中で溶解；精製ｈｆＢ蛋白、因子Ｂ枯渇ヒト血清＋５００ｎｇの精製ヒト因子Ｂ蛋白；陰性対照、赤血球を等張性の食塩水中でインキュベートした（赤血球溶解無し）；因子Ｂ枯渇ヒト血清＋５００ｎｇの精製ヒト因子Ｂ蛋白と抗ヒト因子ＤｍＡｂ（５ｎｇ〜２４００ｎｇ）又は対照マウスＩｇＧ（５ｎｇ〜２４００ｎｇ）との混合物。
実施例２４：ウサギ抗因子Ｂモノクローナル抗体によるヒト及びマウス代替補体経路の抑制
材料及び方法
代替補体経路溶血試験は、マウス抗因子ＢｍＡｂの代わりに本実施例に記載したウサギ抗因子ＢｍＡｂを使用した以外は実施例２２に記載したものと本質的に同じである。
【０３６３】
本発明者等はヒト因子Ｂに対して作成した抗体がマウス因子Ｂと交差反応する可能性を増大させることによりマウスにおける動物モデリングが可能となるようにウサギ中にｍＡｂを形成した。精製されたヒト因子ＢはＱｕｉｄｅｌ（カタログ番号Ａ４０８）から購入し、ウサギを免疫化するための抗原として使用した。抗体はＧｅｎｅｓｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ（Ｔａｉｗａｎ）がその標準的な操作法に従って作成した。ウサギ２匹を免疫化し、脾細胞を融合相手と融合させ、ハイブリドーマを識別し、そしてｍＡｂの分泌をＥＬＩＳＡでスクリーニングした。２０ハイブリドーマ上澄みを更に、実施例２２に記載した溶血試験を用いて代替補体経路をブロックするそれらの能力について分析した。凍結乾燥したハイブリドーマ培地（ハイブリドーマ培地１ｍｌ由来）をバイアル当たり１×ＰＢＳ合計２５０μｌに溶解した。ＰＢＳ再懸濁ハイブリドーマ溶液は−８０℃で小分けにして保存した。
【０３６４】
溶血反応の前に、各ハイブリドーマ培地２０μｌを４℃で３０分間、総容量４０μＬ中のＭｇ−ＥＧＴＡ緩衝液中で精製ヒト因子Ｂ蛋白５００ｎｇと共に予備インキュベートした。抗体陽性対照については、精製ヒト因子Ｂ蛋白５００ｎｇを４℃で３０分間、Ｍｇ−ＥＧＴＡ緩衝液中の抗ヒト因子Ｂモノクローナル抗体（Ｑｕｉｄｅｌ）４００又は８００ｎｇとともに予備インキュベートした。次に新しく調製した氷冷Ｍｇ−ＥＧＴＡ緩衝液中２５倍に希釈したヒト因子Ｂ枯渇血清５０μｌを各試験管に添加した。陽性対照試験管用に、精製されたヒト補体因子Ｂ蛋白５００ｎｇを２５倍希釈ヒト因子Ｂ枯渇血清５０μｌ中に調製し、そして容量をＭｇ２＋−ＥＧＴＡ緩衝液で９０μＬにまで増大させた。次に５×１０７赤血球を含有するＭｇ２＋−ＥＧＴＡ洗浄Ｅｒａｂ１０μＬを各試験管に添加した。反応混合物は旋回渦流させることなく穏やかに混合した。試験管は４０分間１１０ｒｐｍにおいて、軌道振とうにより３７℃のウォーターバス中に入れた。４０分後、試験管を氷上に戻し、そして氷冷０．９％食塩水１５０μＬを添加することにより反応を停止した。各試験管を穏やかに混合し、そして次に４℃で５分間、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機で２０００ｒｐｍにおいてブレーキをオフにしながら遠心分離した。ペレットを攪乱することなく、各上澄み１８０μｌを平底の９６穴プレートにそっと移し、そしてＯＤ４０５をマイクロプレートリーダー中で測定した。
【０３６５】
マウス代替補体経路活性に対する２０ウサギｍＡｂの抑制を調べるために、因子Ｂ枯渇ヒト血清の代わりに４倍希釈全マウス血清を用いて行った以外は同じ実験を実施した。
結果
ヒト及びマウスの因子Ｂはアミノ酸レベルにおいて約８３％相同である。げっ歯類における動物モデリング及びヒトにおける治療の両方のために使用できるｍＡｂを作成することが望ましい。表５及び６に示す通り、２０の陽性ウサギハイブリドーマを作成した。これらのクローンの一部により生産されたモノクローナル抗体はヒト（表５）及びマウス（表６）の両方の代替補体経路を抑制した。これらの陽性ハイブリドーマを原料として使用することにより単鎖抗体を作成し、これを次に例えばヒト治療のためにヒト化することができる。そのような単鎖抗体は蛋白の注射によるか、又は単鎖抗体をコードするベクターを用いながら、送達することができる。或いは、ウサギｍＡｂをヒト化し、そしてＦａｂフラグメントとして、又は全蛋白として、例えば治療用途のために送達することができる。この例における方策は他の代替補体経路の重要な要素、例えば因子Ｄ、Ｃ３ｂ、又はＣ３コンバターゼに対する治療用途を有するウサギモノクローナル抗体を作成するために使用できる。
【０３６６】
【表５】
2010520224.tif 000007
【０３６７】
【表６】
2010520224.tif 000008
実施例２５：精製されたヒトｆＢ３蛋白は代替補体経路を抑制する。
【０３６８】
本発明の一部の実施形態は代替補体経路のような経路を抑制又はブロックする蛋白を送達することを包含する。例示を目的として、本実施例では例えば代替補体経路を抑制するためのｆＢ３蛋白の使用を記載する。
【０３６９】
ｆＢ３蛋白は、本明細書に記載した通り、哺乳類細胞中、細菌中、コウボ中、昆虫中、又は他の生存生物中で作成できる。本試験は、本発明者等がｆＢ３蛋白を細胞培養培地から精製することができ、そしてその生物学的活性をなお温存できるかどうかを調べるように設計されている。Ｃｆ２Ｔｈ細胞をヒトｆＢ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した（実施例１５参照）。形質導入された細胞を２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中に維持した。形質導入後７２時間に、細胞培養培地を回収し、０．２μｍの滅菌フィルターを通して濾過することにより細胞破砕物を浄化した。浄化した細胞培養培地をヒト因子Ｂに対するモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＭＡＢ２７３９）にコンジュゲートしたアフィニティーカラム（ＰＩＥＲＣＥ、カタログ番号４４８９４）上にロードした。カラムを洗浄し、試料を製造元の説明書に従って溶離させた。溶離画分を銀染色を使用しながらＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。画分は又、蛋白を同定するためにウエスタンブロット分析でも検査した。図２５Ａ及び２５Ｂに示す通り、アフィニティーカラムは予測された大きさの比較的純粋なｆＢ３を与えた。図２５Ａはアフィニティー精製されたヒト因子Ｂ３蛋白の銀染色を示し：レーン１、分子量マーカー；レーン２、第１の画分に由来する溶出試料；レーン３、第２及び第３画分の組み合わせに由来する溶出試料である。図２５Ｂはヒト因子Ｂ３蛋白に関するウエスタンブロットの分析を示し、レーンの割り付けはパネルＡと同様である。
【０３７０】
更に又、顕著な分解生成物は観察されず、精製過程が突然変異体因子Ｂ３により十分忍容されたことを示唆していた。約６５ｋＤａにおいてＢＳＡに等価な分子サイズにおいて追加的なバンドが観察されている（図２５、パネルＡ、レーン２及び３）。
【０３７１】
精製された突然変異体因子Ｂ３が生物学的に活性であるか調べるために、代替補体経路溶血試験を実施例１５に記載の通り実施した。図２６に示す通り、アフィニティー精製されたヒトｆＢ３蛋白はヒト代替補体経路を効率的に抑制し、精製過程が蛋白の生物学的機能に如何なる著明な損傷ももたらさなかったことを示している。ｆＢ３蛋白は又他の手段により、或いは他の手段と組み合わせて精製することもでき、例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈降、ＨＰＬＣ等が挙げられる。
実施例２６：構成的にヒトｆＢ３を発現する細胞株
ｆＢ３をより容易に製造及び精製するために、本発明者等は血清非含有懸濁培養物中においてｆＢ３を構成的に発現する細胞株を作成した。特記すれば２９３フリースタイル細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をｆＢ３をコードするＢＩＶベクターで形質導入した（例えば実施例１５参照）。細胞を懸濁細胞培養において２９３フリースタイル血清非含有培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で生育させた。組織培養培地を実施例２５に記載の通りＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析に付した。ｆＢ３蛋白は組織培養培地中に発現され分泌されたことがわかった（データ示さず）。ｆＢ３の生物学的活性を実施例２５に記載した溶血試験により評価したところ、ｆＢ３は生物学的に活性であることがわかった（データ示さず）。ｆＢ３蛋白は又ＣＨＯ細胞及びＣｆ２Ｔｈ細胞からも発現されている。
【０３７２】
ｆＢ３蛋白又は本明細書に記載した他の蛋白は例えば治療目的のために薬効を高めるために更に修飾することができる。例えば、蛋白はそのインビボの半減期を増大するためにポリエチレングリコールにコンジュゲート（ＰＥＧ化）することができ；装置をインビボで移植する場合は蛋白を放出する装置により送達することができ；インビボにおけるその効力又は半減期を増大させるために融合蛋白として作成でき；インビボのその分布を増大させるために担体と混合することができ；上記蛋白を発現する細胞を介して送達でき；その薬物動態プロファイルを向上させるためにさらに修飾することができ；及び／又はなおその生物学的機能を温存している変異体を作成するためにトランケーションすることができる。
実施例２７：ヒトｆＢ３をコードするＢＩＶベクターはインビボで網膜炎症を抑制する。
【０３７３】
本実施例は網膜に対するレーザー傷害のマウスモデルにおいてヒトｆＢ３をコードするＢＩＶベクターを評価している。この攻撃的炎症モデルにおいて、レーザーは網膜を熱傷させることにより数時間以内に代替補体経路の急速な活性化をもたらす。
【０３７４】
試験において、各マウスにはｆＢ３をコードするかトランスジーンを有さないベクターを網膜の周辺部に網膜下注射した。２週間後、３か所のレーザー熱傷を網膜の中央部近傍に作成した。２０時間後、網膜を採取し、補体活性化のマーカーである補体因子Ｃ３又は膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の付着に関して染色した。
【０３７５】
ベクター注射の大きさ及び位置を明らかにするために、マウスの別個のコホートにＧＦＰをコードするベクターを注射した。このコホートはレーザー傷害に付さなかった。
方法
ＧＦＰ、ヒトｆＢ３をコードする、又はトランスジーンを有さない（ヌル）ベクターを作成し、実施例１５に記載の通りアニオン交換クロマトグラフィーにより濃縮した。保存緩衝液はＰＢＳ＋１ｍＭＭｇＣｌ２、２．５ｍＭＫＣｌ、及び０．１％ＢＳＡとした。ベクターは使用時まで−８０ｏＣで保存した。
【０３７６】
ＧＦＰベクターは以下の通り力価測定した。即ち、第１日において２×１０５のＣｆ２ＴＨ細胞を２ｍＭグルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及び１０％ＦＢＳ（完全ＤＭＥＭ）を添加したＤＭＥＭ３ｍｌ中で６穴プレート中ウェル当たり播種した。細胞は３７ｏＣにおいて８．５％ＣＯ２下に一夜インキュベートした。翌日、培地を１．５ｍｌの完全ＤＭＥＭ＋８ｕｇ／ｍｌポリブレンに交換した。ベクター（０．２又は１ｕｌ）を各ウェルに添加し、プレートを１５〜１８時間インキュベートした。次に培地を３ｍｌの新しい完全ＤＭＥＭに交換した。更に４９〜５２時間の後、細胞をフローサイトメトリーに付し、そして蛍光性である（即ち未形質導入細胞より蛍光性である）細胞のパーセンテージを評価した。力価はベクターの投入容量、ウェル内の細胞数、及び蛍光性の細胞のパーセンテージから数学的に求めた。
【０３７７】
ｈｆＢ３及びヌルベクターの力価を測定するためにこれら３ベクター全てを用いて上記した通り細胞を形質導入した。しかしながら、フローサイトメトリーの代わりに、形質導入した細胞はリアルタイムＰＣＲに付すことによりベクターＤＮＡコピー数を求めた。ＤＮＡは定型的な操作法により細胞から調製した。ＰＣＲプライマーはＢＩＶベクターのＲＲＥ領域を増幅するために以下の通り設計した。
プローブ：５’−ＦＡＭ−ＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣＴＣＣＧＣＡＴＣＣＧＡ−ＢＨＱ−１−３’（配列番号２４）
センスプライマー：５’−ＴＧＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＡＡＡＴＧＡＣＡＣ−３’（配列番号２５）
アンチセンスプライマー：５’−ＴＧＧＴＴＣＡＣＧＡＧＣＧＴＴＧＴＡＧＣ−３’（配列番号２６）
ＰＣＲ増幅はＩＱ５マルチカラーリアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）により以下の条件、即ち：１００ｎＭプローブ、６００ｎＭセンスプライマー、６００ｎＭアンチセンスプライマー、及び１ＸＳｕｐｅｒＭｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）において実施した。反応混合物は９５℃で３分間インキュベートし、その後、９５℃１０秒及び５５℃３０秒を４０サイクル行った。形質導入単位（ｔｕ）／ｍｌにおけるｈｆＢ３及びヌルベクターの力価はそのベクターＤＮＡコピー数をＧＦＰベクターのものと比較することにより求めた。
【０３７８】
この試験のためには、ｔｕ／ｍｌにおける力価は以下の通り、即ち：ＧＦＰベクター、９×１０７；ｈｆＢ３ベクター、３．２×１０７；及びヌルベクター、７．３×１０７であった。
【０３７９】
網膜下注射の操作は以下の通り実施した。各マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）にケタミン（１００ｕｇ／ｇｍ）を筋肉内注射により投与した。用量は深麻酔が維持されるように調節した。眼には操作直前に局所用０．５５プラパラカインを投与した。麻酔下において、手作業により眼をそっと突出させた。３０ゲージの針の端部を使用しながら縁部のすぐ後方において強膜を通して小型の切開部を形成した。３３ゲージの平板先端の針を眼球後極に向けて接線方向に挿入し、そして網膜と網膜色素上皮層の間に入れた。０．５〜１．０ｕｌのベクター懸濁液を注射し、そして、注射部位において表面から網膜が隆起していることを観察することにより、注射が良好に行えたことを確認した。（着目に値する点は、注射した流体が吸収され、そして網膜は一日以内に再度結着することである。）針を引き出し、そして圧力を維持することにより逆漏出を防止した。動物は覚醒及び歩行するまで観察し、その後ケージに戻した。
【０３８０】
ベクター注射の２日後、ＧＦＰベクターを投与された動物の網膜を採取し；網膜のフラットマウントを作成し；そしてＧＦＰの発現を観察した（図２７Ａ及び２７Ｂ）。
【０３８１】
ベクターの注射後２週間において、ｈｆＢ３及びヌルベクターを投与した眼を以下の通りレーザー傷害に付した。レーザー光凝固はダイオードレーザー（８１０ｎｍ、ＯｃｕＬｉｇｈｔ  Ｓｉｘ、ＩＲＩＳ  Ｍｅｄｉｃａｌより入手）及びＺｅｉｓｓスリットランプシステムを用いながら、コンタクトレンズとしてのハンドヘルドのカバーガラスを使用しながら実施した。レーザーのパラメーターは１００ｍＷ強度、７５ミクロンスポットサイズ、０．１秒持続、及び単パルスとした。３か所の熱傷部（３、１２及び９時の位置）を各眼に作成し、各スポットは視神経から２〜３円板直径とした。熱傷操作の良好な終了；即ちブルーフ膜の破壊は熱傷部位における気泡形成の発見により確認した。これらのレーザーパラメーターは過剰な損傷、即ち熱傷部位における出血を誘発することなく良好な熱傷が一貫して得られるように予め最適化されている。
【０３８２】
レーザー傷害の２０時間後、網膜を採取し、熱傷部位において補体因子Ｃ３又はＭＡＣの付着に関して染色した。動物はケタミン及びキシラジンの過剰投与により屠殺し、眼を即座に摘出した。４℃で４％パラホルムアルデヒド中一夜固定した後、前区及び硝子体を除去しながら、各眼をＮｉｋｏｎ解離用顕微鏡下に慎重に解離させた。神経感覚網膜をＲＰＥ層から慎重に分離し、残存するＲＰＥ−脈絡膜−強膜の複合体を放射状に切り出し、フラットマウントを形成した。複合体を免疫組織化学的染色に付した。
【０３８３】
Ｃ３付着に関する免疫組織学的染色操作は以下の通り実施した。（ＭＡＣ染色操作は同様に行った。）各ＲＰＥ−脈絡膜−強膜複合体フラットマウントを５分間ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水：Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２５ｍＭ、ＮａＣｌ０．１３Ｍ、ＫＣｌ０．００２７Ｍ、ｐＨ７．４±０．１３；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号ＢＰ２４７１−１００）で洗浄しパラホルムアルデヒドを除去した。次に各複合体をＴＢＳ中２％ＢＳＡ及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００で１時間ブロックした。その後複合体を３回ＴＢＳ中５分間洗浄した。次に複合体を室温で２時間ＴＢＳ中１０％正常ウサギ血清（ＮＲＳ）及び１％Ｔｒｉｔｏｎでブロックし、その後ＴＢＳ中で３回の５分間洗浄を行った。次に複合体をＴＢＳ＋１０％ＮＲＳ及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ中に１：１００希釈した一次抗体（ポリクローナルヤギ抗ヒトＣ３、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍより入手、カタログ番号２０４８６９）中４℃で一夜インキュベートした。翌朝、複合体をＴＢＳ＋０．２％Ｔｗｅｅｎ２０で各々１０分間３回、その後ＴＢＳで１０分間１回洗浄した。次に複合体をＴＢＳ中に１：３００希釈した二次抗体（Ａｌｅｘａフルオロ５９４コンジュゲートウサギ抗ヤギＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手、カタログ番号Ａ−１１０８０）とともに室温で２時間インキュベートした。複合体をＴＢＳ＋０．２％Ｔｗｅｅｎ２０で各々１０分間３回、次いでＴＢＳで５分間１回洗浄した。複合体をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウント用培地を用いながらカバーガラス下にスライド上にマウントした。次に複合体を蛍光顕微鏡で観察した。対照染色用には一次抗体を無添加とした。着目に値する点は一次抗体がヒトＣ３に対して形成されたにもかかわらず、それは又マウスＣ３も染色したことである。
結果
図２７Ａ及び２７Ｂは２つの代表的な網膜フラットマウントのＧＦＰ染色を示す。各々の場合において、注射は周辺網膜の領域を形質導入していた。図２７Ｃ及び２７Ｄはヌルベクターを投与した眼及びｈｆＢ３コードベクターを投与した眼の代表的なレーザー熱傷のＣ３染色を示す。Ｃ３染色の面積及び強度はｈｆＢ３ベクター投与眼よりもヌルベクター投与眼において実質的に高値であった。ＭＡＣ染色の結果はＣ３染色のものと同様であった（データ示さず）。
結論
ｈｆＢ３をコードするベクターは本レーザー傷害モデルで補体活性化を抑制することにおいて有効であった。結果は少なくとも２つの理由に関して特に印象的であった。第１に、これは補体活性化の非常に攻撃的なモデルであり、補体活性化は急性の熱傷に起因している。第２に、薬効はレーザー傷害部位から遠隔に位置する形質導入細胞の極めて少数で達成された。眼炎症の本該当動物モデルにおける薬効はヒト疾患の治療における薬効を予測するものである。
実施例２８：インビボで補体活性化をブロックする手段としてのヒトｆＢ３蛋白送達の評価
本実験はｈｆＢ３蛋白が、直接の眼内注注射により送達された場合に、補体活性化を抑制できることを明らかにするように設計されている。試験は上記試料の１つと同様に実施する。この場合、ヒトｆＢ３蛋白、例えば実施例２５又は２６における操作法により製造されたものを、硝子体内及び／又は網膜下の注射により投与する。硝子体内注射の操作法が網膜下注射の操作法と異なる点は、針を網膜下ではなく硝子体内に入れることのみである。各々の場合において、注射容量は１ｎｇ／μｌ〜２０μｇ／μｌの範囲のｆＢ３の濃度において約１μｌである。対照眼にはｈｆＢ３蛋白を含有しない製剤を注射する。レーザー熱傷は注射直前に実施する。レーザー傷害の２０時間後、網膜を回収し、Ｃ３又はＭＡＣに関して染色し、製剤のみの注射と比較する。
実施例２９：ベクター濃縮及び精製の操作法：Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳｉｎｇｌｅＳｅｐＭｉｎｉＱ膜吸着カプセルを用いたスケールアップ
以下に記載するものはＢＩＶ系レンチウィルスベクターに関する精製プロセスをスケールアップするための詳細な操作法である。
【０３８４】
試薬及び材料
ａ．ベンゾナーゼ、超純粋、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｅ８２６３又は同等品
ｂ．１ＸＰＢＳｐＨ７．４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１００１０−０２３又は同等品
ｃ．１０ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号７００１１−０４４又は同等品
ｄ．蒸留水、滅菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ非含有、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０９７７０１５又は同等品
ｅ．５ＭＮａＣｌ、Ｃａｍｂｒｅｘカタログ番号５１２０２又は同等品
ｆ．Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳｉｎｇｌｅＳｅｐ  ＭｉｎｉＱ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓカタログ番号９２ＩＥＸＱ４２Ｄ４−ＯＯ
ｇ．Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、１００万ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓカタログ番号ＶＳ２０６１
ｈ．透析濾過カップ、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０用、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓカタログ番号ＶＳＡ００５
ｉ．Ｎａｌｇｅｎｅ管、１８０ＰＶＣ、ＦＤＡ／ＵＳＰＶＩ、１／８”ＩＤｘ１／４”ＯＤｓ１／１６”ｗａｌｌ又は同等品
ｊ．ＥＧＴＡ、ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ  Ｕｌｔｒａ＞９９％、Ｓｉｇｍａカタログ番号０３７７８又は同等品
ｋ．保存瓶、使い捨て、種々のサイズ、Ｃｏｒｎｉｎｇ又は同等品
ｌ．遠沈管、２５０ｍｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ
ｍ．遠沈管、５０ｍｌ、Ｆａｌｃｏｎ
ｎ．ＭＦ７５ａＰＥＳ０．２μｍフィルターユニット、１リットル、Ｎａｌｇｅｎｅ商品番号５６７−００２０又は同等品
ｏ．０．２μｍＰＥＳ、２６ｍｍ、滅菌シリンジフィルター、Ｃｏｒｎｉｎｇ商品番号４３１２２９又は同等品
ｐ．シリンジ、３ｍｌ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＢＤ商品番号３０９５８５又は同等品
ｑ．シリンジ、６０ｍｌ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＢＤ商品番号３０１６２７又は同等品
ｒ．血清学的ピペット、種々の大きさ、滅菌、個別包装
ｓ．リングスタンド及びクランプ
ｔ．ペリスタポンプ及びポンプヘッド、ＭａｓｔｅｒｆｌｅｘＬ／Ｓ又は同等品
ｕ．遠心分離機、ＧＨ３．８ローター付きＢｅｃｋｍａｎ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６ＫＲ又は同等品
試料製造
ａ．出発物質として１２５０ｍｌの実施例１に記載の通りリン酸カルシウムプラスミドトランスフェクションにより製造したベクター（未濃縮ベクター）を含有する細胞培養培地。
ｂ．未濃縮ベクターを２５０ｍｌ遠沈管に分配。
ｃ．Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６ＫＲ遠心分離機＋付属品のＧＨ３．８ロータにおいて２８００ｒｐｍで約１０分間遠心分離することにより細胞破砕片を除去する。
ｄ．６００ｍｌの未濃縮ベクターを２本のＣｏｒｎｉｎｇの１リットルビンに入れる。
ｅ．各ボトルに１２ｍｌの５００ｍＭＥＧＴＡ（１０ｍＭ終濃度）、ｐＨ８．０及び３０，０００単位のベンゾナーゼ（５０単位／ｍｌ終濃度）を添加する。３０〜４０分間３７℃でインキュベートする。
ｆ．各々６００ｍｌの未濃縮ベクターをＮａｌｇｅｎｅ０．２μｍＰＥＳフィルターユニットを通して濾過する。
ローディング
ａ．１，２００ｍｌのベクターを冷却ローディング緩衝液で１：１に希釈する。氷上に置く。
ローディング緩衝液（２ＸＰＢＳ、１．０ＭＮａＣｌ）：＊
２４０．０ｍｌの１０ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４
１６５．６ｍｌの５ＭＮａＣｌ
７９４．４ｍｌの滅菌ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ非含有水（冷却）１，２００ｍｌ
ｂ．製造元の説明書に従ってペリスタポンプのヘッドに管を入れる。
ｃ．管の端部を１ＸＰＢＳの入った容器に入れる。ＳｉｎｇｌｅＳｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｑに連結し、約２５０ｍｌの１ＸＰＢＳを用いながら管及びカプセルユニットから空気をパージする。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｍｉｎｉ  Ｑカプセルから全ての空気を除去したことを確認する。
ｄ．未濃縮ベクター溶液にフィード管端部を慎重に入れる。
ｅ．約１２ｍｌ／分の速度でユニットに試料溶液を通過させる。フィード容器中に最少量の試料が残存するまで継続する。管内に空気を引きこまない。
洗浄
ａ．フィード管を試料容器から慎重にはずし、冷却した洗浄緩衝液中に入れる。ＳｉｎｇｌｅＳｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｑユニットに空気が入らないようにする。
ｂ．ＳｉｎｇｌｅＳｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｑを約２００ｍｌの洗浄緩衝液で１２ｍｌ／分の速度で洗浄する。
洗浄緩衝液（１ＸＰＢＳ、５００ｍＭＮａＣｌ）：
４０．０ｍｌの１０ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４
２７．６ｍｌの５ＭＮａＣｌ
３３２．４ｍｌの滅菌、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ非含有水（冷却）
４００ｍｌの合計量
溶離
ａ．６０ｍｌシリンジに４０ｍｌの冷却溶離緩衝液を充填する。
溶離緩衝液（１ＸＰＢＳ、１．３ＭＮａＣｌ）：
２０．０ｍｌの１０ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４
４５．８ｍｌの５ＭＮａＣｌ
１３４．２ｍｌの滅菌、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ非含有水（冷却）
２００ｍｌの合計量
ｂ．ＳｉｎｇｌｅＳｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｑを連結し、空気が入らなかったことを確認する。
ｃ．ユニットを垂直に保持し、９ｍｌの溶離緩衝液を極めて緩徐に一滴ごとに押し込む。廃棄する。
ｄ．１０〜１５分間放置する。
ｅＳｉｎｇｌｅＳｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｑ下に新しい５０ｍｌの遠沈管を入れ、約２０ｍｌを収集する。
その後の濃縮及び透析濾過
ａ．ＧＨ３．８ローター付きＢｅｃｋｍａｎ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６ＫＲを１０℃に予備冷却する。
ｂ．溶出したベクターを２つのＶｉｖａｓｐｉｎ２０ユニット（１００万ＭＷＣＯ）に慎重に入れる。ＧＨ３．８ローター付きＢｅｃｋｍａｎ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６ＫＲ中２２００ＲＰＭで２０分間遠心分離し、容量を確認し、約２ｍｌが残存するまで再度遠心分離する（液体は装置のＶ内に十分含有される）。
ｃ．透析濾過カップをユニット内に入れ、カップを一番下まで押し下げる。
ｄ．１２ｍｌの透析濾過緩衝液（１ＸＰＢＳ＋１ｍＭＭｇＣｌ２及び２．５ｍＭＫＣｌ）を透析濾過カップに添加する。
ｅ．Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０をＧＨ３．８ローター付きＢｅｃｋｍａｎ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６ＫＲ中で２２００ＲＰＭにおいて１５分間１０℃遠心分離する。
ｆ．残存容量を確認し、ベクターの容量が２つのＶｉｖａｓｐｉｎ２０透析濾過装置の各々において約７５０μｌとなるまで必要に応じて再回転する。
ｇ．透析濾過カップを取り外す。ピペットで吸入排出を数回繰り返す（約１０回）ことによりベクターを収集する。
ｈ．２つの透析濾過物を合わせ、最終容量１．５ｍｌの濃縮ベクターを得る。
ｉ．０．２μＭのＰＥＳシリンジフィルターを通して滅菌濾過する・
ｊ．−８０℃で保存する。
【０３８５】
本操作法は定型的には低〜中間の１０８ｔｕ／ｍｌの範囲の力価を有するベクター調製品２ｍｌを与えており、５０ｐｇ／ｍｌ未満のプラスミドＤＮＡ夾雑物混在、４ｐｇ／ｍｌ未満の宿主細胞ＤＮＡ夾雑物混在、及び検出不能（０．１ｎｇ／ｍｌ未満）のベンゾナーゼ夾雑物混在を伴っていた。操作法はＢＳＡを完全に除去しなかった。未濃縮のベクター出発物質が１０％ＦＢＳを含有していた場合、濃縮ベクター中のＢＳＡレベルは７〜２１μｇ／ｍｌの範囲となった（ＢＳＡ  ＥＬＩＳＡ、入手元Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，カタログ番号Ｆ０３０）。この操作法は更に製造条件に合致するようにスケールアップされる。
実施例３０：実施例２９のベクター濃縮及び精製の操作法へのサイズエクスクルージョンクロマトグラフィー研磨工程の追加
以下に記載するものは実施例２９のベクターを更に精製し、そしてＢＳＡレベルを減衰するための操作法である。実施例２９の透析濾過工程の後であるが滅菌濾過の前に、濃縮したベクターをＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ５００−ＨＲカラム（Ｓｉｇｍａ）に適用する。
【０３８６】
空の２０ｍｌ容量のＥｃｏｎｏ−Ｐａｃクロマトグラフィーカラム（ＢｉｏＲａｄ）にＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ５００−ＨＲを重力下に床容量２０ｍｌとなるまで充てんする。
ａ．保存緩衝液（ＰＢＳ＋２．５ｍＭＫＣｌ及び１．０ｍＭＭｇＣｌ２）５倍容量で平衡化する。
ｂ．Ｓｅｐｈａｃｒｙｌの上端に濃縮ベクター約１．５ｍｌを慎重に適用し、そしてベクターが重力下にＳｅｐｈｒａｃｒｙｌに進入するようにする。
ｃ．カラム上端に更に保存緩衝液を添加し、カラムを重力で廃液し、そして０．５〜１．０ｍｌ画分を収集する。ベクターは６．５〜９．５ｍｌの溶出容量分に存在する。
ｄ．ベクターを含有する画分を合わせ、滅菌濾過し、そして−８０℃で保存する。
【０３８７】
カラムに適用した透析濾過と比較した場合、溶出液中のベクターの力価は２倍希釈され、そして収率は約９０％であった。図２８に示す試験においては、未濃縮ベクター出発物質は２％ＦＢＳ含有組織培養培地中とした（後述する実施例３１参照）。カラムに適用した透析濾過のＢＳＡ含有量は３１１ｎｇ／ｍｌであった。図９に示す通り、このサイズエクスクルージョンクロマトグラフィー工程の追加によりベクターからＢＳＡが効率的に分離された。この操作法は更に製造条件に合致するようにスケールアップされる。
実施例３１：低血清又は血清非含有完全合成培地中のベクターの収集
実施例１に記載した上流の過程では２９３、２９３Ｔ、又は２９３ＦＴ細胞内への４つのプラスミドのリン酸カルシウム媒介トランスフェクションを行い、その後ブチレートを添加しながら培地を交換し、次にベクター含有培地を収集していた。上記した実施例においては、大部分において、１０％ＦＢＳを含有する組織培養培地を使用した。本発明者等は低ＦＢＳの培地中のベクターを収集すること、又は完全合成培地を使用して力価を全く損失することなくＦＢＳを全て除去することが可能であることを発見した。本実施例においては全ての細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中にプレーティングした。翌日、培地をＤＭＥＭ＋１０％又は２％ＦＢＳに交換した。３時間後、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後１８時間に、培地を各５ｍＭの酪酸ナトリウムを含有するＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ又は２％ＦＢＳに交換するか、又は培地をＦＢＳを含有しないが５ｍＭ酪酸ナトリウムは含有するＣＤ  ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に交換した。２４時間後、培地を収集し、ベクターの力価を測定した。表７に示す結果は、リン酸カルシウムトランスフェクションは２％ＦＢＳ中で実施することができ、そして高力価のベクターを血清非含有完全合成培地中に得ることができることを示している。本発明者等は又、トランスフェクションの上流の過程及びベクターの収集をＮｕｎｃ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓにおいてスケールアップすることができ、その収率は組織培養皿中で達成されたものに近似している（力価は２倍以内である）と判断した。
【０３８８】
【表７】
2010520224.tif 000009
実施例３２：実施例１及び２９〜３１のベクター濃縮及び精製技術の複合化
２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を実施例１に記載の通りＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中にプレーティングした。翌日各プレート上において、培地をＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳに交換した。４つのベクター形成プラスミドのリン酸カルシウムトランスフェクションを実施例１に記載の通り実施した。１８時間後、培地をＦＢＳを含有しないが５ｍＭ酪酸ナトリウムを含有するＣＤＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に交換した。２４時間後、培地を収集し、実施例３０のサイズエクスクルージョンクロマトグラフィー操作と組み合わせた実施例２９の濃縮及び精製の操作法に付した。図２８はＳｅｐｈａｃｒｙｌカラムからの画分の各々におけるベクター力価を示す。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌカラムからの画分の何れにおいても検出可能なＢＳＡは観察されなかった。ＢＳＡ  ＥＬＩＳＡ（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，カタログ番号Ｆ０３０）に関する検出限界は５００  ｐｇ／ｍｌであった。このスケールアップ可能な操作法は高度に精製された高力価のベクターを与える。
実施例３３：ＡＫＴＡ精製装置によるヒトｆＢ３の精製
細胞（例えばＣＨＯ又は２９３細胞）の培養上澄みに由来する可溶性分泌ｆＢ３の精製を、捕獲、中間体精製及び研磨工程のためのアニオン交換（ＩＥＸＱ）、疎水相互作用（ＨＩＣ）及びサイズエクスクルージョンクロマトグラフィー（ＳＥＣ）の組み合わせにより実施する。ｆＢ３含有細胞培養上澄みを３０  ｋＤａカットオフの限外濾過膜上で４０〜５０倍まで濃縮し、そして５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ９．０に調節した後にプレパックアニオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｑ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にローディングする。カラムはあらかじめ６０ｍｌ／ｈの直線的流量で５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ９．０（緩衝液Ａ、導電性５ｍＳ／ｃｍ）を含有する緩衝液で平衡化しておき、そして流出液は２８０ｎｍにおけるＵＶ検出によりモニタリングする。未結合の物質が溶出したのち、保持された物質を、移動相の導電性を段階的に１６ｍＳ／ｃｍ（１０％緩衝液Ｂ、１０  ＣＶ）、３４ｍＳ／ｃｍ（２７％緩衝液Ｂ、１０  ＣＶ）、５４ｍＳ／ｃｍ（５０％緩衝液Ｂ、５  ＣＶ）そして次に１０１ｍＳ／ｃｍ（１００％緩衝液Ｂ、１０  ＣＶ）に上昇させる非直線勾配を用いながら緩衝液Ｂ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ９．０）と混合することにより溶出させる。アニオン交換カラムの画分を還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＬＩＳＡにより分析する。ｆＢ３の大部分は１８〜３０ｍＳ／ｃｍの導電性で第２工程（２７％緩衝液Ｂ）において溶出する物質中に検出され、それは総投入量のｆＢ３の約８０％を含有する。これらの画分は典型的には、完全に還元されたｆＢ３に相当する約９３ｋＤａにおいて主分子種（総ローディング物質の５０〜７０％）を含有している。しかしながら、他の蛋白夾雑物も又、これらの画分内に存在する場合がある。任意に、溶血試験を機能試験として適用することによりこの条件下で精製されたｆＢ３がその優性阻害活性を保持しているか否かを決定できる。陽性結果はこの精製行程におけるｆＢ３の用量を増大させることは代替補体活性化経路媒介溶血を抑制することができることを示すことになり、アニオン交換精製されたｆＢ３は野生型ｆＢを超えたその優性阻害活性を維持していることを示している。
【０３８９】
蛋白夾雑物の除去を容易にするために、中間工程を利用してよい。この中間工程は蛋白を主にそれらの表面疎水性の相違に基づいて精製し分離する疎水相互作用クロマトグラフィーを使用できる。アニオン交換クロマトグラフィーに由来する主要なｆＢ３含有画分を合わせ、２Ｍ硫酸アンモニウム及び５０ｍＭリン酸塩緩衝液を添加することにより終濃度１．５  Ｍ硫酸アンモニウム及び５０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０（導電性２１６ｍＳ／ｃｍ）に調節する。次に試料を６０  ｍｌ／ｈの流量の１．５Ｍ硫酸アンモニウム及び５０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０で予め平衡化しておいた疎水相互作用カラム（例えばＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用する。試料ローディングの後、保持された物質を直線的に硫酸アンモニウム濃度を低下させることにより溶出させる（１．５Ｍから０Ｍまで、３５ＣＶ）。画分中のｆＢ３の存在は例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット及び／又はＥＬＩＳＡにより測定できる。
【０３９０】
次にｆＢ３含有ピークを１ｍｌの終容量まで濃縮し、そしてそれぞれＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００  １６／２６  ＨＲカラム上、及びＰＢＳ緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で平衡化されたゲル濾過に付す。ｆＢ３の溶出は３０ｃｍ／ｈの一定の直線的流量において実施し、２８０ｎｍにおけるＵＶ検出で溶出をモニタリングする。画分の純度は、例えば銀染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認できる。活性試験は野生型ｆＢの存在下の溶血試験を用いて実施できる。
【０３９１】
更に又、ＰＤ−１０脱塩カラムを用いてＨＩＣ精製されたｆＢ３の画分又はプールされた画分をＧＶＢ緩衝液に交換することができる。溶血試験は抑制活性を試験するためにＨＩＣ精製ｆＢ３の漸増用量を添加することにより実施できる。
【０３９２】
参考文献
【０３９３】
【数１】
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【０３９４】
【数２】
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【０３９５】
【数３】
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【０３９６】
【数４】
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【０３９７】
【数５】
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【０３９８】
【数６】
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【０３９９】
【数７】
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【０４００】
【数８】
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【０４０１】
【数９】
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【０４０２】
【数１０】
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本明細書中に記載される種々の変化および改変は、当業者にとって明白であることが理解されるべきである。そのような変化および改変は、本願の主題の精神および範囲から、はずれることなく、そして意図された利点を減少させることなく、なされ得る。
【０４０３】
本明細書中で挙げられた全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、および特許出願が特異的かつ個々に本明細書中に参考として援用されるように、本明細書中に同じ程度までその全体が、本明細書中に参考として援用される。
【図３Ａ−３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図２９Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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