(57)【要約】  本発明は、物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクを予測する方法に関し、物質をアニオン性界面活性剤に添加して、物質と界面活性剤との混合物を提供するステップと、混合物の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を測定して、物質がアニオン性界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に与える影響を調べるステップと、を含む。ここで、物質を添加する前の界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と比較して、物質の添加により臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が低下した場合に、物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクがあることを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質をアニオン性界面活性剤に添加して、物質と界面活性剤との混合物を提供するステップと、
前記混合物の臨界ミセル濃度を測定して、前記物質がアニオン性界面活性剤の臨界ミセル濃度に与える影響を調べるステップと、
を含み、
前記物質を添加する前の前記界面活性剤の臨界ミセル濃度と比較して、前記物質の添加により臨界ミセル濃度が低下した場合に、前記物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクがあることを示す、物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクを予測する方法。
【請求項２】
前記物質と界面活性剤との混合物の臨界ミセル濃度と、純界面活性剤の臨界ミセル濃度とを比較するステップを含み、
純界面活性剤の臨界ミセル濃度と比較して、前記物質の添加により臨界ミセル濃度が低下した場合に、前記物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクがあることを示す、
又は、
前記混合物の臨界ミセル濃度と、異なる濃度の物質と界面活性剤との第２の混合物の臨界ミセル濃度とを比較するステップを含み、
前記界面活性剤中の前記物質濃度の増加により臨界ミセル濃度が低下した場合に、前記物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクがあることを示す、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物質の前記界面活性剤の溶液の、空気−水界面における表面張力を測定するステップと、
前記界面活性剤中の前記物質の少なくとも２種の異なる濃度についての、又は前記界面活性剤中の前記物質の少なくとも１種の濃度について及び純界面活性剤についての、表面張力と界面活性剤濃度との関数から、臨界ミセル濃度を決定するステップと、
を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
「物質：界面活性剤比」を増加させて得られる最大変化量の５０％だけ臨界ミセル濃度を低下させる際の「物質：界面活性剤比Ｒ１／２」を求めるステップと、
得られた「物質：界面活性剤比Ｒ１／２」と、Ｒ１／２についての所定の閾値とを比較するステップ、及び／又は界面活性剤中の前記物質についての最小臨界ミセル濃度を決定してこれを最小臨界ミセル濃度についての所定の閾値と比較するステップと、
前記比較に基づいて、前記薬剤を、例えば前記物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクを示し又は分類する、少なくとも２つのリスクグループのうち１つに分類するステップと、
を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｒ１／２は、純脂質において得られる臨界ミセル濃度をｐ、界面活性剤中の前記物質について得られる最小臨界ミセル濃度をｍとした場合に、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が
ＣＭＣ＝１／２（ｐ＋ｍ）
となる場合の「物質：界面活性剤比」に相当する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記関数は、プロット曲線である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記界面活性剤は、リン脂質である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記リン脂質は、フォスファチジルセリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール又はフォスファチジルイノシトールリン酸、又はこれらのリゾ脂質、過酸化脂質、酸化物、プラスマローゲン又はジエーテル脂質（ジアルキル脂質）誘導体、或いは、リン脂質類似体、又はリン脂質様アニオン性界面活性剤であり、
前記リン脂質は全鎖を合わせて計２８個未満の炭素原子を有する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記物質は、ＤＭＳＯ等の水溶性溶媒に溶解される請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記物質は、両親媒性及び／又はカチオン性の物質である請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記物質は、医薬品である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記物質が前記リン脂質症誘導特性を呈するリスクを示すのに、４つのリスクグループを用いる請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記４つのグループは、リン脂質症の可能性のないグループ１、リン脂質症の原因となる可能性の低いグループ２、動物においてリン脂質症の原因となることが知られるグループ３、ヒトにおいて実際にリン脂質症の原因となったことが知られるグループ４、として定義される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
最大２．０、好ましくは最大１．０までの範囲にある「物質：界面活性剤モル比」について、臨界ミセル濃度を測定するステップを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
臨界ミセル濃度を測定するのに用いる試料の体積は、最大５０μＬであり、前記界面活性剤の濃度は、最大５ｍＭである請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
「物質：界面活性剤比」の少なくとも１つの値について、純界面活性剤の臨界ミセル濃度と、前記物質を含む界面活性剤の臨界ミセル濃度とを測定するステップを含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、薬剤、或いは医薬品添加物又は食品添加物（以下、本明細書において「薬剤」と総称する。ただし、これに限定する訳ではない）等の物質の、吸収・分布・代謝・排泄に関する毒性（ＡＤＭＥ−ｔｏｘ）の測定に関する。具体的には、本発明が対象とするのは、薬剤のリン脂質症誘導特性又はリン脂質形成（phospholipidogenic）特性（細胞内でのリン脂質の蓄積）、すなわち薬剤によって誘導されるリン脂質症を予測する方法である。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質症を最も引き起こしやすい化合物は、カチオン性かつ両親媒性であり、しばしばＣＡＤ（カチオン性両親媒性薬剤）と称される。現在の見解では、これらの薬剤がリン脂質と複合体を形成してリン脂質分解酵素の機能を阻害し、分解が阻害されると共に合成が強化されることによりリソソーム内でリン脂質が蓄積する、というのがリン脂質症の根底にあるメカニズムであるとされている。このような理由から、潜在的に有用な化合物の脂質への結合を評価する方法が必要とされている。本発明は、添加される物質が界面活性剤の表面活性特性、特に臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）、に与える影響を調べることで、物質（典型的には薬剤）のアニオン性界面活性剤（有利なことにはリン脂質）との相互作用を評価することを目的とする。
【０００３】
臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を調べる方法は幾つかあり、例えば蛍光分析、光散乱、超音波吸収、伝導率、接触角、及び表面張力又は表面圧力測定がある。化合物の疎水性は、一般にオクタノール／水の二相系における分配係数（ｌｏｇＰ）を測定することにより決定される。両親媒性及び洗浄特性は一般に、物質が水の表面張力に与える影響を測定することにより決定される。
【０００４】
リン脂質症（ＰＬＤ）は、ある種の医薬品及び薬剤により誘起される副作用として知られている。リン脂質は、例えば肺、腎臓及び肝臓の細胞内に蓄積する。組織内でリン脂質が大量に蓄積すると、組織の通常の生理的機能に障害が生じる。特に薬剤が長期に亘って服用される場合には、より大量のリン脂質が細胞内に蓄積し得るため、問題となり易い。その結果、更に慢性的で不可逆のリン脂質症や臓器不全に至る可能性がある。特にこれが薬剤の発売後に明らかになった場合には、市場から薬剤を回収する必要が生じるため、医薬産業にとっては深刻かつ費用のかかる問題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
薬剤がリン脂質症（ＰＬＤ）の原因となるか否かを調べるのに、現在では２種の方法が一般的である。その１つが、細胞培養を行い、薬剤によって誘導される細胞中の変化を検出する方法である。この方法は、多大な労力を必要とするのみならず、分析の再現性、特に異なる研究所間での再現性が低くなりがちであるという点で不利である。更に細胞培養は、常に手入れが必要であり、感染を受けやすく、生育条件に応じて多様に変化しやすく、継代培養における遺伝子選択によって細胞株が不安定となりやすい。
【０００６】
もう１つの方法は、動物試験を用いるものである。これらの方法はいずれも、費用がかかり、従って薬剤開発の終盤でしか使用することができず、例えばリード化合物最適化において実施されるような、新規な薬剤化合物の大規模なスクリーニングには適していない。新薬の開発費は、製品開発過程の終端に向かって指数関数的に上昇するため、潜在的なリン脂質症（ＰＬＤ）誘導特性を薬剤開発の初期段階で明らかにする試験が必要とされている。このような試験があれば、潜在的なリン脂質症（ＰＬＤ）原因化合物を区別して排除することが可能であるため、薬剤開発の費用と時間との双方を節約し得る。さらに、この試験の情報を用いて、化合物の物理化学的性質を適切に調節してリン脂質症（ＰＬＤ）誘導能を低減するように、化合物の化学的性質を向上させることもできる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、物質をアニオン性界面活性剤に添加して、物質と界面活性剤との混合物を提供するステップと、前記混合物の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を測定して、前記物質がアニオン性界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に与える影響を調べるステップと、を含み、前記物質を添加する前の前記界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と比較して、前記物質の添加により臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が低下した場合に、前記物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクがあることを示す、物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクを予測する方法を対象としている。
【０００８】
本発明によると、本方法は一方で、前記物質と界面活性剤との混合物の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と、純界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）とを比較するステップ（ここで、純界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と比較して、前記物質の添加により臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が低下した場合に、前記物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクがあることを示す）を含み得る。一実施形態によると、本発明はまた前記物質と界面活性剤との混合物の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と、異なる濃度の物質と界面活性剤との第２の混合物の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）とを比較するステップ（ここで、前記界面活性剤中の前記物質濃度の増加により臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が低下した場合に、前記物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクがあることを示す）を含み得る。従って、第２の混合物における物質濃度が前記混合物における物質濃度より低下したときに、第２の混合物の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と比較して前記混合物の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が低下した場合、前記物質がリン脂質誘導特性を呈するリスクがあることを示す。
【０００９】
後者の場合は当然、物質と界面活性剤との混合物中の物質濃度が低下したときに、混合物の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が増加した場合、前記物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクがあることを示す、ということを表す。
【００１０】
従って、本発明による方法は、概して、アニオン性界面活性剤中の物質の濃度を上昇させるステップと、物質と界面活性剤との混合物の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を測定して、前記物質がアニオン性界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に与える影響を調べるステップと、を含む。ここで、前記界面活性剤中の前記物質の濃度の増加前の界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と比較して、前記物質の添加により臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が低下した場合に、前記物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクがあることを示す。
【００１１】
物質濃度の増加には、界面活性剤中の物質の濃度を増加させることを目的として、純界面活性剤（物質を含まない界面活性剤）に物質を添加すること、及び、物質と界面活性剤との混合物に物質を添加すること、が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】測定した表面圧力πと、無単位の（ｍｏｌ／Ｌで割った）濃度の自然対数ｌｎ（ｃ／Ｍ）との関係を示すプロットの２例である。純ＤＣ８ＰＳ（１，２ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスフォ−Ｌ−セリン］）（□：白四角）と、ゲンタマイシン：ＤＣ８ＰＳ＝１：１０（●：黒丸）と、が示されている。鎖線と矢印とは、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を得る原理を概略的に示す。
【図２】臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と薬剤：脂質比との関係を示す曲線である。関連線は目視を補助するためだけのものである。符号は以下の通りである。クロザピン（■：黒四角）、ハロペリドール（Ｏ：アルファベットの「オー」）、１−フェニルピペラジン（▼：黒三角）、クロルプロマジン（■：薄い黒四角）、プロマジン（○：実線の丸）、プロプラノロール（▼：薄い黒三角）、アミオダロン（□：灰色四角）、ゲンタマイシン（○：破線の丸）、ペルヘキシリン（▽：灰色三角）。
【図３】臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に対する最大作用の半分の作用を与える薬剤：脂質比Ｒ１／２と、最大１：２までの薬剤：脂質比について得られる臨界ミセル濃度の最小値（最小臨界ミセル濃度）と、の関係を示す。符号は、４グループのうちいずれに分類されるかを示す。グループ１（■：黒四角）＝リン脂質症の可能性なし、グループ２（○：丸）＝培養細胞においてリン脂質症の原因となるが、動物におけるリン脂質症の原因となる能力が低い、グループ３（△：上向き三角）＝動物においてリン脂質症の原因となることが知られている、グループ４（▽：下向き三角）＝その物質がヒトにおいて実際にリン脂質症の原因となったことが知られている（Ploeman, J.-P.H.T.M., J.Kelder, T.Hafmans, H.van de Sandt, J. A.van Burgsteden, P.J.M.Salemink, and E.van Esch (2004) Use of physicochemical calculation of pKa and CLogP to predict phospholipidosis-inducing potential. A case study with structurally related piperazines. Eur.Toxic.Pathol.; Morelli, J.K., M.Buehrle, F.Pognan, L.R.Barone, W.Fieles, and P.J.Ciaccio (2006) Validation of an in vitro screen for phospholipidosisusing a high-content biology platform. Cell Biol.Toxicol）。略称は以下の通りである。ama＝アマンタジン、amio＝アミオダロン、amit＝アミトリプチリン、bus＝ブスピロン、clomi＝クロミプラミン、cloz＝クロザピン、clq＝クロロキン、cpz＝クロルプロマジン、desi＝デシプラミン、doxo＝ドキソルビシン、gmcn＝ゲンタマイシン、hp＝ハロペリドール、hyz＝ヒドロキシジン、imi＝イミプラミン、kcz＝ケトコナゾール、map＝マプロチリン、mia＝ミアンセリン、nort＝ノルトリプチリン、１-php＝１−フェニルピペラジン、phx＝ペルヘキシリン、prom＝プロマジン、prop＝プロプラノロール、tcyc＝テトラサイクリン、thio＝チオリダジン。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
溶液中の界面活性剤の濃度が増加すると、その化学ポテンシャルが増加する。溶液中の化合物又は物質の化学ポテンシャル（Atkins,P.W.、Physical Chemistry、第５版、Oxford University Press、1997）は、溶液に化合物を少量添加した際に起きる系の自由エネルギーの増加についての係数とみなすことができる。その系は、ある濃度において、化学ポテンシャルが界面活性剤凝集体（一般にはミセル）の形成に十分となる点に達する。この濃度を超えるモノマーは凝集体又はミセルを形成するが、一方この濃度未満では凝集体は見られない。従って、このときの濃度は臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と呼ばれる。この濃度を超えると、濃度がさらに増加しても溶液中のモノマー濃度は顕著には増加せず、ミセル数が増加するだけである。界面活性剤とその他の化合物（これも界面活性剤であってもよい）との混合物において、混合物の臨界ミセル濃度は２種の化合物間の相互作用の自由エネルギーに依存している。界面活性剤とその他の化合物との相互作用が有利に作用する場合、界面活性剤のみの場合と比較して、又は化合物の濃度が低い混合物と比較して、その混合物は低い臨界ミセル濃度を有する。
【００１４】
従って、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に薬剤が与える影響は、薬剤と界面活性剤との間の相互作用の自由エネルギーを反映している。リン脂質等の界面活性剤と堅固な複合体を形成する薬剤の性質が、リン脂質症を引き起こすと考えられているため、上記事実は興味深い。薬剤と界面活性剤との相互作用の自由エネルギーは、複合体の形成しやすさの説明にもなっている。上記した試験は、薬剤が界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に与える影響を測定することで、薬剤のリン脂質症誘導能を予測する良好な方法が提供されることを実証している。しかし、生体膜及び細胞内で通常見られるリン脂質は、数個（通常、１４個以上）の炭素原子を含む長いアルキル鎖又はアシル鎖を一般に備えている。このような長鎖リン脂質の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、通常、ナノモルの範囲内又はそれ未満であり、従ってハイスループットスクリーニング研究は言うまでもなく、ここで用いる種類の実用的な測定を行うには小さ過ぎる。従って本発明は二つの形態を有する。すなわち、薬剤の、界面活性剤（生細胞中のリン脂質）と複合体を形成してリン脂質症を引き起こす傾向について報告することを目的とした、薬剤が界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に与える影響の利用と、実験的な上記測定を可能とすることを目的とした、界面活性剤（有利なことには短鎖リン脂質）の利用と、である。
【００１５】
本発明の一実施形態において、物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクを評価する方法は、前記物質の、界面活性剤溶液の空気−水界面における表面張力を測定するステップと、前記界面活性剤中の前記物質の少なくとも２種の異なる濃度についての、又は前記界面活性剤中の前記物質の少なくとも１種の濃度について及び純界面活性剤についての、表面張力と界面活性剤濃度（例えばその自然対数）との関数から、前記臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を決定するステップと、を更に含む。
【００１６】
本発明による方法はまた、物質：界面活性剤比を増加させて得られる最大変化量の５０％だけ臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を低下させる際の物質：界面活性剤比Ｒ１／２を求めるステップと、得られた物質：界面活性剤比Ｒ１／２と、Ｒ１／２についての所定の閾値（boundary-limit）とを比較するステップ、及び／又は界面活性剤中の前記物質についての臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の最小値（これを最小臨界ミセル濃度（最小ＣＭＣ）とする）を求めてこれを最小臨界ミセル濃度（最小ＣＭＣ）についての所定の閾値と比較するステップと、前記比較に基づいて、前記薬剤を少なくとも２つのリスクグループのうちの１つに分類するステップと、を含む。このようなグループは、例えば前記物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクを示し、或いはこれを分類するものである。
【００１７】
本発明によると、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に与える影響を調べるのに用いられる物質：界面活性剤比（モル比）は、０．０〜２．０、好ましくは０．０〜１．０又は０．０〜０．５の範囲であり、すなわち、純界面活性剤（物質を含まない状態の界面活性剤）に始まり、界面活性剤１モルあたり物質が最大２モル、典型的には最大０．５モルの範囲である。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を測定するのに用いる試料の体積は、最大５０μＬとすることができ、界面活性剤の濃度は、最大５ｍＭとすることができる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態によると、物質が臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に与える影響は、物質：界面活性剤比の少なくとも１個の値について、純界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）と、前記物質を含む界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）とをそれぞれ測定することによって決定される。
【００２０】
本発明によると、同一の濃度の条件下では、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を低下させる効果がより大きい物質では、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を低下させる効果がより小さい物質と比較して、物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクがより高くなる。或いは、所定量の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の低下を引き起こすのにより低い濃度で十分である物質では、同じ量の低下を引き起こすのにより高い濃度が必要な物質と比較して、物質がリン脂質症誘導特性を呈するリスクがより高くなる。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態によると、アニオン性界面活性剤は、全鎖を合わせて最大２８個の炭素原子、好ましくは１０〜２８個の炭素原子を含み、一本の炭素鎖中に通常４〜１２個の炭素原子を含むリン脂質である。本発明で用いる典型的なリン脂質としては、約１μＭを超える臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を得るのに十分な疎水性を有する短い炭素鎖を備えた、フォスファチジルセリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール及びフォスファチジルイノシトールリン酸、これらそれぞれのリゾ脂質、過酸化脂質、酸化脂質、プラスマローゲン及びジアルキル脂質変異体、並びに、アニオン性リン脂質類似体や、アルキル及びアシルリン酸又はモノメチルリン酸等のアニオン性界面活性剤が挙げられる。
【００２２】
本発明によると、界面活性剤の混合物を用いることも可能である。
【００２３】
表面張力又は表面圧力（純表面の表面張力−物質の存在下における表面張力）は、薬剤：界面活性剤比（モル比）が０〜１である物質と界面活性剤との混合物を用いて測定することが有利である。通常、少なくとも４〜５点が、信頼性のあるＲ１／２の値を求めるのに必要である。
【００２４】
本発明によると、薬剤を、ＤＭＳＯやアルコール等の好適な溶媒に溶解することができる。
【００２５】
表面活性（表面張力又は表面圧力）の測定は、例えばウェルプレートの行と列に薬剤の種類と薬剤の濃度を変えて入れたウェルプレートを用いて、容易かつ効率的に実施することができる。このような表面活性測定に使用可能な装置の一つとして、MultiPi装置（Kibron社）が挙げられる。
【００２６】
図１は、表面圧力測定を用いて臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を調べる一例を示す。一旦バルク濃度が臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に達すると、濃度がさらに増加しても、バルク中のモノマー濃度と化学ポテンシャルとが増加しなくなるので、表面圧力は顕著に増加することがなくなる。求めた臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の値に基づいて、薬剤：脂質比に対する臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）のプロット曲線を、図２に示すように構築することができる。
【００２７】
本発明の一実施形態によると、三次補間関数を用いて、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を５０％低下させる、すなわち、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を
ＣＭＣ＝１／２（ｐ＋ｍ）
とする薬剤：界面活性剤比であるＲ１／２を得ることができる。ここで、ｐは純界面活性剤において得られる臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）であり、ｍは界面活性剤中の薬剤について得られる臨界ミセル濃度の最小値（最小臨界ミセル濃度、最小ＣＭＣ）である。
【００２８】
本発明の一実施形態によると、図３を参照して、ある薬剤についての薬剤：脂質比Ｒ１／２を、薬剤により誘導されるリン脂質症の様々なリスクを定義する４個の所定のグループのＲ１／２についての所定の閾値と比較する。さらに薬剤についての最小臨界ミセル濃度（最小ＣＭＣ）を測定して、対応する最小臨界ミセル濃度（最小ＣＭＣ）についての閾値と比較することができる。前記４個のリスクグループは、リン脂質症の可能性のないグループ１、リン脂質症の原因となる可能性の低いグループ２、動物においてリン脂質症の原因となることが知られるグループ３、ヒトにおいて実際にリン脂質症の原因となったことが知られるグループ４、として定義される。上記の閾値は、物質がリン脂質症を引き起こすか否かについて、従来法による試験を行った結果に基づくものである。
【００２９】
調査結果を評価する方法においては、公知の一連の化合物のリン脂質形成能に関するいくつかの参照データを必要とする。このようなデータは、例えば細胞実験又は動物実験から得ることができる。このような参照データから得た値を用いることで、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の減少量の最大値とＲ１／２とについての試験パラメータの値に関連させて、リン脂質症のリスクレベルを割り当てることができる（図３を参照）。リン脂質形成の可能性があることが知られている化合物に基づいてこれらのリスクレベルを割り当てることで、未知の化合物のリン脂質形成の可能性を評価することが可能になる。
【００３０】
本発明によると、薬剤が高いＲ１／２（或いは更に、高い最小臨界ミセル濃度（最小ＣＭＣ）との組み合わせ）を示した場合、その薬剤はリン脂質症誘導のリスクが低い薬剤として分類される。一方、低いＲ１／２及び／又は低い最小臨界ミセル濃度（最小ＣＭＣ）との組み合わせの場合、例えば図３から明らかなように、その薬剤はリン脂質症誘導のリスクが高い薬剤であることを示す。
【００３１】
試験結果は、化合物が短鎖リン脂質と複合体を形成する傾向は、これらの化合物がリン脂質症を引き起こす傾向と良好な相関関係があり、従って、化合物が短鎖リン脂質と複合体を形成する傾向を直接測定することが、未知の化合物のリン脂質症誘導能の評価に有用であろうことを示している。
【実施例】
【００３２】
実施例では、適当量の薬剤粉末を秤量して溶解し、６２．５ｍＭのストック（stock）を得た。そこから１２．５ｍＭ及び２．５ｍＭの希釈液を作成した。ストックは、ＤＭＳＯには溶解せず水に可溶性であるゲンタマイシンと、ＤＭＳＯ及び水のいずれにも溶解せずエタノールに溶解する必要のあったタモキシフェンとを除いて、ＤＭＳＯ中で調製した。リン脂質１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスフォ−Ｌ−セリン］（ＤＣ８ＰＳ）をクロロホルムに溶解し、高精度の微量天秤を用いて重量測定法で濃度を測定した。
【００３３】
まず、リン脂質溶液を作成するために、クロロホルムに溶解した適当量のＤＣ８ＰＳを未使用の試験管に移し、窒素緩流下で蒸発乾燥させた。次いで、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を乾燥脂質に添加してＤＣ８ＰＳ濃度を５ｍＭとし、試料を振盪した。次いで６０℃で３０分間保温して振盪し、再度６０℃で３０分間保温した。
【００３４】
溶液を９６ウェルプレートにピペットで分注した。まず、５ｍＭのＤＣ８ＰＳ溶液１７５μＬを、９６ウェルプレート（８行１２列）の第１列（列１）の各ウェルに注入した。他の全てのウェルに、ＨＥＰＥＳ緩衝液１０５μＬを加えた。次いで、薬剤ストック７μＬを第１列のウェルに添加した。６２．５ｍＭの薬剤ストック（stock）、及び１２．５ｍＭ及び２．５ｍＭとなる薬剤ストック（stock）の希釈液により、それぞれ１：２、１：１０及び１：５０の薬剤：リン脂質比（モル比）が得られた。１：１モル比についても測定され、この場合、薬剤ストック１４μＬを第１列へ添加した。全ての測定プレートには、薬剤の代わりにＤＭＳＯ７μＬのみを添加した１行を更に用意した。従って、各プレートは、リン脂質のみの１列と、異なる薬剤及び／又は異なる薬剤：リン脂質比の７列とを含むことになる。
【００３５】
マルチチャンネル自動ピペットを用いて第１列のウェルの内容物を混合し、第１列の溶液７０μＬを第２列の緩衝液１０５μＬに移した。その後、第２列のウェルの内容物を混合して、溶液７０μＬを第３列のウェルの緩衝液１０５μＬに移した。これを第１１列に達するまで列ごとに繰り返した。これにより、隣接する列の間での希釈係数が約０．４となった。その結果、各列におけるリン脂質のおおよその濃度は以下のようになる（括弧内は列を示す）。５．０ｍＭ（１）、２．０ｍＭ（２）、０．８０ｍＭ（３）、０．３２ｍＭ（４）、０．１２８ｍＭ（５）、５１μＭ（６）、２０μＭ（７）、８．２μＭ（８）、３．３μＭ（９）、１．３μＭ（１０）、０．５２μＭ（１１）、０（１２）。それぞれの行は、例えば以下を含んでいる。Ａ行はリン脂質のみ、Ｂ行は薬剤１：リン脂質＝１：５０、Ｃ行は薬剤１：リン脂質＝１：１０、Ｄ行は薬剤１：リン脂質＝１：２、Ｅ行は薬剤２：リン脂質＝１：５０、Ｆ行は薬剤２：リン脂質＝１：１０、Ｇ行は薬剤２：リン脂質＝１：２、Ｈ行は薬剤３：リン脂質＝１：５０。
【００３６】
分注した９６ウェルプレート上の各ウェルから得た溶液５０μＬを、Kibron社製の測定プレート上の対応するウェルに移し、１０〜１５分間安定させた。その後、各ウェルにおける表面張力をKibron社製 Delta−８マルチチャンネル張力計を用いて測定し、表面張力が最小となる（表面圧力が最大となる）濃度を求めるための専用ソフトを用いて、臨界ミセル濃度を得た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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