(57)【要約】本発明は、アラザイムを有効成分とする肝機能保護用薬学的組成物に関するもので、詳細には、アラニコラプロテオチリクスが生産するアラザイムで構成される肝機能保護用薬学的組成物に関する。本発明のアラザイムは、損傷した肝でアポトーシスを抑制して、ＳＭＰ３０の発現を増加させて、Ｐ−ｓｍａｄ３発現を抑制して、アラザイムの肝保護効能によって中心静脈周辺の肝細胞損傷の抑制化を通じて肝細胞を保護する。したがって、肝機能保護用薬学的組成物として有用に使用することができる。2010514752.tif 000005
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラザイム（ａｒａｚｙｍｅ）を有効成分として含む肝機能保護用薬学的組成物。
【請求項２】
前記アラザイムが、
（ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、  
（ｂ）配列番号：１と７０％以上の相同性を有して、（ａ）のポリペプチドと生物学的に同等な機能を有するポリペプチド、及び  
（ｃ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドと生物学的に同等なポリペプチド
の中のいずれかひとつであることを特徴とする、請求項１記載の肝機能保護用薬学的組成物。
【請求項３】
前記アラザイムが、アラニコラプロテオチリクス（Ａｒａｎｉｃｏｌａ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）培養液から分離したものであることを特徴とする、請求項１記載の肝機能保護用薬学的組成物。
【請求項４】
前記アラニコラプロテオチリクスが、アラニコラプロテオチリクスＨＹ−３（受託番号：ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ）であることを特徴とする、請求項３記載の肝機能保護用薬学的組成物。
【請求項５】
肝疾患の予防及び治療に使用されることを特徴とする、請求項１〜請求項４のいずれか一項記載の肝機能保護用薬学的組成物。
【請求項６】
前記肝疾患が、急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬変症、肝性昏睡、アルコール性肝疾患及び肝癌からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項５記載の肝機能保護用薬学的組成物。
【請求項７】
肝疾患患者に薬学的有効量の請求項１記載の薬学的組成物を投与する工程を含む肝疾患治療方法。
【請求項８】
前記肝疾患が、急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬変症、肝性昏睡、アルコール性肝疾患及び肝癌からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項７記載の肝疾患治療方法。
【請求項９】
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを有効成分として含む肝機能保護用健康食品。
【請求項１０】
前記アラニコラプロテオチリクスが、アラニコラプロテオチリクスＨＹ−３（受託番号：ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ）であることを特徴とする、請求項９記載の肝機能保護用健康食品。
【請求項１１】
前記アラザイムが、
（ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、  
（ｂ）配列番号：１と７０％以上の相同性を有して、（ａ）のポリペプチドと生物学的に同等な機能を有するポリペプチド、及び
（ｃ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列からなり、（ａ）のポリペプチドと生物学的に同等なポリペプチド
の中のいずれかひとつであることを特徴とする、請求項９記載の肝機能保護用健康食品。
【請求項１２】
肝疾患の予防及び改善に使用されることを特徴とする、請求項９〜請求項１１のいずれか一項記載の肝機能保護用健康食品。
【請求項１３】
前記肝疾患が、急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬変症、肝性昏睡、アルコール性肝疾患及び肝癌からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１２記載の肝機能保護用健康食品。
【請求項１４】
アラザイムを有効成分として含む細胞死滅抑制剤。
【請求項１５】
アラザイムを有効成分として含むＰ−ｓｍａｄ３発現抑制剤。
【請求項１６】
アラザイムを有効成分として含む中心静脈周辺の肝細胞の損傷抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アラザイムを有効成分とする肝機能保護用薬学的組成物に関するもので、より詳細には、アラニコラプロテオチリクス（Ａｒａｎｉｃｏｌａ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）が生産するアラザイム（ａｒａｚｙｍｅ）を含む肝機能保護用薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
慢性肝疾患は、韓国内において成人病及び死亡の重要な原因として目立つようになってきている。肝臓は、大きな緩衝能力を有した器官であり、疾患の初期段階には自覚症状がなく、疾病がかなり進行した状態で発見される場合が多いのみならず、効果的な治療剤及び診断方法が不足しているのが実情である。肝疾患の原因としては、アルコール、薬物、化学薬品、ウイルス性肝炎、胆道疾患のような代謝性疾患、自己免疫性疾患などがあるが、その原因がよくわからない場合も多い。また、肝臓は、人体で血液の保存と循環、血液量調節と解毒作用の中枢であるが、最近、産業化によって増加した有害物質に曝露する機会が増加するようになり、絶え間ない解毒作用に苦しんでいる。特に、精神的ストレスの増加と飲みすぎ、喫煙などの原因によって肝損傷が増加することによって、免疫体系の異常を招来するとともに他の疾病の原因になる場合が増加している。
【０００３】
大部分の慢性肝疾患において、疾患の予後に重大な影響を及ぼす様々な合併症と肝癌などは、一旦、肝線維化と肝硬変に進行した後に発生する場合が大部分なので、肝線維化の過程に対する理解と肝線維化の進展を抑制する治療剤の開発が必要なのが実情である。現在、臨床で使用されている肝疾患調節薬としては、１９７０年代にドイツのマダウス（Ｍａｄａｕｓ）社で分離されたシリマリン（Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）、米国のパークデービス（Ｐａｒｋ  Ｄａｖｉｓ）社のアラ−ＡＭＰ（Ａｒａ−ＡＭＰ）、イタリアのセルビ（Ｓｅｌｖｉ）社のカーバイカ（Ｃａｒｂａｉｃａ）及び１９８０年代に中国中薬研究所のＤＤＢなどが使用されているが、前記の薬の副作用や治療効果が落ちるなどの問題点が発見されている。したがって、より経済的で安全な治療剤の開発が切実に求められている。
【０００４】
最近、肝線維化と肝硬化は、細胞、サイトカイン及び細胞外基質（ＥＣＭ）間の複雑な相互作用によって誘発されることが知られている。損傷を受けた肝細胞は、クッパー（ｋｕｐｆｆｅｒ）細胞によって食細胞作用が起き、さらに活性化したクッパー細胞が各種サイトカインを分泌して肝星状細胞を活性化させるということが一般的な機序であり、損傷した肝細胞が直接的に肝星状細胞を活性化させるという自己分泌（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）に対する報告もある。すなわち、様々な原因によって肝細胞が損傷を受けてアポトーシスが起きると、ＴＧＦ−１が発現されてこれにより肝星状細胞が活性化すると、活性化した肝星状細胞によってＴＧＦ−１が再度発現されて肝細胞の死滅がより誘発される悪循環が進行され得るので、深刻な肝疾患が誘発され得る（Ｓｕｎ  Ｆ，等，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．，２００１年２月１４日，第１５３５（２）巻，１８６−１９１頁（非特許文献１）；Ｊｅｏｎｇ  ＷＩ，等，Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｔ．，２００４年１２月，第２４（６）巻，２４８−２５４頁（非特許文献２）；Ｍａｒｃｉｎ  Ｓｔｏｐａ，等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年９月，第２９３０８−２９３１７頁（非特許文献３）；Ｊｅｏｎｇ  Ｗ．Ｉ，等，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００２年，第２２（２Ａ）巻，８６９−８７７頁（非特許文献４）；Ｉｓｈａｋ  ｋｇ，等，Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｅｓ．，１９９１年，第１５巻，４５−６６頁（非特許文献５）；大韓民国特許第２００１−００３６４６３号（特許文献１））。
【０００５】
今まで肝機能保護用薬学的組成物を探索するために、微生物、植物及び化学合成剤などを使用して多くの研究がなされているが、材料確保の難しさなどによって商業化が難しいのが実情である。
【０００６】
本発明者等は、新しいタンパク質分解酵素を開発するために努力した結果、韓国産ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ）から新規微生物であるアラニコラプロテオチリクス（Ａｒａｎｉｃｏｌａ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＨＹ−３菌株（受託番号：ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ；ＷＯ  ０１／５７２２２号（特許文献２））を分離し、本菌株から新規なタンパク質分解酵素であるアラザイムを分離した。アラザイムは、低温と高い塩濃度で安定したタンパク質分解活性を示すだけでなく、人の体温である３７℃で最も高い活性を示し、広いｐＨ範囲でも安定した活性を示すことを発見して本タンパク質分解酵素の遺伝子を確認した（ＷＯ０１／５７２２２号（特許文献２））。
【０００７】
本発明者等は、アラニコラプロテオチリクス菌株に由来したアラザイムの効果を調査した結果、アラザイムが、損傷された肝を効果的に保護することを確認して、肝機能保護用薬学的組成物として有用に使用できることを明らかにして本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】大韓民国特許第２００１−００３６４６３号
【特許文献２】ＷＯ０１／５７２２２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｕｎ  Ｆ，等，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．，２００１年２月１４日，第１５３５（２）巻，１８６−１９１頁
【非特許文献２】Ｊｅｏｎｇ  ＷＩ，等，Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｔ．，２００４年１２月，第２４（６）巻，２４８−２５４頁
【非特許文献３】Ｍａｒｃｉｎ  Ｓｔｏｐａ，等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年９月，第２９３０８−２９３１７頁
【非特許文献４】Ｊｅｏｎｇ  Ｗ．Ｉ，等，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００２年，第２２（２Ａ）巻，８６９−８７７頁
【非特許文献５】Ｉｓｈａｋ  ｋｇ，等，Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｅｓ．，１９９１年，第１５巻，４５−６６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、アラニコラプロテオチリクスが生産したアラザイムの肝機能保護用薬学的組成物としての新しい用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は、アラザイムを有効成分として含む肝機能保護用薬学的組成物を提供する。
【００１２】
また、肝疾患患者に前記の薬学的組成物を有効量投与する工程を含む肝疾患治療方法を提供する。
【００１３】
また、アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを有効成分として含む肝機能保護用健康食品を提供する。
【００１４】
また、アラザイムを有効成分として含む細胞死滅抑制剤を提供する。
【００１５】
また、アラザイムを有効成分として含むＰ−ｓｍａｄ３発現抑制剤を提供する。
【００１６】
同時に、アラザイムを有効成分として含む中心静脈周辺の肝細胞の損傷抑制剤を提供する。
【００１７】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１８】
本発明は、アラザイムを有効成分として含む肝機能保護用薬学的組成物を提供する。
【００１９】
本発明のアラザイムは、前記アラニコラプロテオチリクス菌株が生産する酵素であり、１）アラニコラプロテオチリクス菌株を培養して培養液を得る工程、２）前記培養液をろ過して上澄み液を得る工程、及び、３）上澄み液内に含まれた前記アラザイムを樹脂を使用して精製する工程で製造することができる（ＷＯ  ０１／５７２２２号）。アラザイムを生産する微生物としてアラニコラプロテオチリクス菌株を使用することが好ましく、韓国生命工学研究院遺伝子銀行に１９９６年７月２９日付けで寄託された受託番号ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ号のアラニコラプロテオチリクスＨＹ−３を使用することがより好ましいが、これに限定されるものではない。アラニコラプロテオチリクスＨＹ−３菌株は、クモの腸内から分離した好気性のグラム陰性細菌であり、０．５〜０．８ｍｍサイズの球形で、運動性を有していて、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）には陽性反応を、オキシダーゼ（ｏｘｉｄａｓｅ）には陰性反応を示す（大韓民国特許第０２２００９１号）。本発明では、前記のような方法で得られたアラザイムを使用した。
【００２０】
本発明のアラザイムは、（ａ）配列番号：１で記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）配列番号：１と７０％以上相同性を有して、（ａ）のポリペプチドと生物学的に同等な機能を有するポリペプチド、及び、（ｃ）配列番号：１で記載されるアミノ酸配列で一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド配列を有するが、（ａ）のポリペプチドと生物学的に同等なポリペプチドを含むタンパク質であってもかまわない。
【００２１】
ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）は、肝で抗酸化効果があることが知られていて、四塩化炭素（ＣＣｌ４）による急性肝損傷を誘導した時、肝臓内に存在したビタミンＣの量が減少するのと同時に、四塩化炭素の酸化的ストレスが肝細胞に加えられて、それにより肝細胞の細胞死滅や壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を誘発する。
【００２２】
ＳＭＰ３０（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ３０）は、生体の老化標識タンパク質として肝細胞、腎臓細尿管、上皮細胞で多く発現される。ラットにおいてＳＭＰ３０は、生後、肝で１２週齢まで漸次的に増加して、１２週齢の時その発現程度が最高値に至って、その後は漸次的に老化が進行するにつれて発現量が減ることが知られていて、老化進行中のＳＭＰ３０の発現量減少は、性ホルモンとは関係なく独立的に進行されることが知られている。前記タンパク質の主な機能は、細胞自滅死から細胞を保護して生体内ビタミンＣの生合成過程で、グルコノラクトナーゼ（ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ）の役割を遂行することで、ビタミンＣ生成を増加させて生体内ビタミンＣ生合成を増加させる。結果的に、ＳＭＰ３０によって増加されたビタミンＣは、損傷された細胞で抗酸化剤の役割をするようになり、したがって、細胞の自滅死と壊死を減少させる。また、ＳＭＰ３０は、細胞の自滅死時に細胞質内に流入されるカルシウムを細胞外に排出させる機能を遂行することで、細胞の自滅死を防止する機能も有する。
【００２３】
本発明者等は、ＳＭＰ３０不在時のアラザイムの肝保護効能をビタミンＣと比較観察するために、ＳＭＰ３０をノックアウト（ｋｎｏｃｋ  ｏｕｔ）したマウスを使用した。正常のＣ５７ＢＬ／６（ＷＴ）マウスとＳＭＰ３０ノックアウト（Ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）Ｃ５７ＢＬ／６（ＫＯ）マウスにおいて、ビタミンＣとアラザイムを投与して急性肝損傷を誘導した場合、肝細胞の壊死が抑制されることを組織学的に観察することができた。これは、肝損傷が少ないということを意味する（図１、２参照）。
【００２４】
また、ＳＭＰ３０ノックアウトマウスの肝細胞では、ＳＭＰ３０の免疫反応が観察されなかったが、正常マウスの肝細胞では、特異的にＳＭＰ３０免疫陽性反応が観察された。ビタミンＣとアラザイムを処理したマウスでは、処理しないマウスよりＳＭＰ３０がさらに強く発現されることを観察することができた（図３、４、５、６参照）。ＳＭＰ３０は、細胞損傷においてカルシウムの細胞質内蓄積抑制や抗酸化作用を有するので、アラザイムを処理したマウスでのＳＭＰ３０タンパク質の発現は、細胞自滅死と壊死を抑制するとみられる。
【００２５】
Ｐ−ｓｍａｄ３は、肝に損傷が加えられて炎症と線維化が進行される時、発現が高く現われる。肝に損傷が加えられると、ＴＧＦ−１が肝細胞、リンパ球、肥満細胞、大食細胞で合成され、このＴＧＦ−１は、肝細胞に存在するＴＧＦ−１受容体ＩＩ（ＴＧＦ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩ）に結合して、ＴＧＦ−１受容体ＩＩを活性化させて、活性化したＴＧＦ−１受容体ＩＩは、ＴＧＦ−１受容体Ｉをリン酸化させて活性化させる。リン酸化されたＴＧＦ−１受容体Ｉは、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３をリン酸化させてリン酸化された  Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３（Ｐ−ｓｍａｄ２／３）は、Ｓｍａｄ４とヘテロオリゴマー（ｈｅｔｅｒｏｏｌｉｇｏｍｅｒ）を形成して肝細胞の核内に移動し、標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）の転写を刺激するようになる。ゆえに、Ｐ−ｓｍａｄ３が強く発現されると、それはそれだけ肝細胞に多くの損傷が加えられたことを意味するとみることができる。
【００２６】
正常マウスグループでは、ビタミンＣとアラザイムを処理したグループ（Ｇ３、Ｇ４）より、四塩化炭素だけ投与したグループ（Ｇ２）からＰ−ｓｍａｄ３の強い免疫反応が観察された。ＳＭＰ３０ノックアウトマウスでは、アラザイムを処理したグループ（Ｇ８）より四塩化炭素単独またはビタミンＣを投与したグループ（Ｇ６、Ｇ７）で強い免疫陽性反応が観察された（図７、８、９、１０  参照）。四塩化炭素によって同じ損傷を加えても、ＳＭＰ３０が発現されないＳＭＰ３０ノックアウトマウスのグループで、より大きな肝細胞損傷を起こすことが分かった。また、ビタミンＣを投与したマウスでよりアラザイムを投与したマウスの肝で、Ｐ−ｓｍａｄ３の発現が少なく現われている。これは、アラザイムが、ＴＧＦ−による慢性炎症刺激を抑制するということを裏付け、肝細胞保護の効能が非常に優れていることを示している。一方、Ｓｍａｄは、正常マウスとＳＭＰ３０ノックアウトマウスの肝細胞で、特別な差なしに発現した（図１１、１２、１３参照）。
【００２７】
ＣＹＰ２Ｅ１の発現は、アラザイムを投与したマウスの肝細胞でのみ増加した（図１４、１５参照）。これは、アラザイムを処理しないグループでは、中心静脈周辺の肝細胞がすでに自滅死したか壊死によって、ＣＹＰ２Ｅ１が発現されないでアラザイムの肝保護効能によって中心静脈周辺の肝細胞に、ある程度の損傷のみ加えられてＣＹＰ２Ｅ１が発現されたものと思慮される。
【００２８】
四塩化炭素の代謝過程でシトクロムＰ４５０（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０；ＣＹＰ）によって、Ｃ−Ｃｌ結合から電子が移動してラジカルを形成することから代謝が始まる。トリクロロメチルラジカルは、酸化反応と還元反応をすべて経ることができ、ＣＹＰ２Ｅ１と２Ｂ１／２Ｂ２が四塩化炭素を不活性化させて、この反応によってＣＹＰ２Ｅ１のタンパク質総量が減少するので、結局は、ＣＹＰ２Ｅ１の発現を持続的に増加させる。
【００２９】
前記のようにアラザイムを処理すると、損傷された肝細胞で肝細胞の壊死を防ぎ、ＳＭＰ３０の発現が増大されてＰ−ｓｍａｄ３の発現は減少し、アラザイムの肝保護効能によって化学物質等による中心静脈周辺の肝細胞の損傷を抑制化して、ＣＹＰ２Ｅ１の発現が現われた。このようにして本発明のアラザイムは、効果的に肝を保護することを確認することができた。また、アラザイムをメスのウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットに経口投与して毒性実験を遂行した結果、０、１２５０、２５００及び５０００ｍｇ／ｋｇ濃度で、一般症状と肉眼病理所見で何らの異常所見が認められなかった。以上のように経口投与毒性試験による５０％致死量（ＬＤ５０）は、少なくとも５，０００ｍｇ／ｋｇ以上の安全な物質であると判断される。ゆえに、本発明のアラザイムは、肝機能保護用薬学的組成物として提供することができ、肝疾患予防及び治療に使用される肝機能保護用薬学的組成物としても提供することができる。前記肝疾患には、急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬変症、肝性昏睡、アルコール性肝疾患及び肝癌などが含まれる。
【００３０】
本発明のアラザイムに追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。投与のためには、追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中で１成分以上を混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化できる。さらに、当分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，１８ｔｈ，１９９０年）に開示されている方法を使用して、各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化することができる。
【００３１】
また、肝疾患患者に前記の薬学的組成物を有効量投与する工程を含む肝疾患治療方法を提供する。前記肝疾患は、急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬変症、肝性昏睡、アルコール性肝疾患及び肝癌を含む。
【００３２】
本発明の肝機能保護用薬学的組成物は、目的とする方法によって非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）したり経口投与することができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。本発明によるアラザイムの一日投与量は、０．０１〜５０００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、一日一回ないし数回に分けて投与することがより好ましいが、これに限定されるものではなくて、施術する医師の判断の下に増減することができる。
【００３３】
また、アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを有効成分として含む肝機能保護用健康食品を提供する。
【００３４】
本発明のアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを食品添加物に使用する場合、アラニコラプロテオチリクスの培養液または前記のアラザイムをそのまま添加したり他の食品または食品成分とともに使用することができ、一般的な方法によって適切に使用することができる。アラザイムは、前記のような同一な方法で得て使用する。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）によって相応しく決定することができる。一般的に、食品または飲料の製造時には、本発明のアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムは、原料に対して０．０１〜１０重量部、好ましくは０．０５〜１重量部の量で添加する。しかし、健康及び衛生を目的としたりまたは健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下であり得るが、安全性面で何らの問題がないので、有効成分は、前記範囲以上の量でも使用することができる。
【００３５】
前記食品の種類には、特別な制限はない。前記物質を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、一般的な意味での健康食品をすべて含む。
【００３６】
本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料と同様、様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物としては、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、サイクロデキストリンのようなポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。甘味料としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の飲料組成物１００ｍｌ当り一般的に約０．０１〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２〜０．０３ｇである。
【００３７】
前記の他に、アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムは様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などに添加することができる。その他に、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉にもアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを添加することができる。このような成分は、独立的にまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明のアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム１００重量部当り０．０１〜０．１重量部の範囲で選択することが一般的である。
【００３８】
また、本発明は、アラザイムを有効成分として含む細胞死滅抑制剤を提供する。
【００３９】
また、本発明は、アラザイムを有効成分として含むＰ−ｓｍａｄ３発現抑制剤を提供する。
【００４０】
同時に、本発明は、アラザイムを有効成分として含む中心静脈周辺の肝細胞の損傷抑制剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】正常（ＷＴ）マウスとＳＭＰ３０ノックアウト（ＫＯ）マウスで急性に損傷された肝の組織学的写真である（Ｈ＆Ｅ染色、Ａ：普通倍率×３３、Ｂ：普通倍率×１３２）：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理；赤線：静脈中心（ＣＶ）周囲の壊死性部分；及び矢印：損傷された肝細胞。
【図２】肝損傷に対して組織生理学的に観察された数値を示したグラフである：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理；肝損傷程度０：損傷の形態的証拠なし；肝損傷程度１：中心静脈周囲５個の肝細胞でのみ周辺壊死が均等に見られる；肝損傷程度２：損害を受けていない部分と中心静脈周囲５個の肝細胞でのみ周辺壊死が均等に見られる；及び、肝損傷程度３：中心静脈５個の肝細胞以外の中央部まで侵犯した広範囲な肝細胞の壊死。
【図３】正常マウスとＳＭＰ３０ノックアウトマウスで、急性肝損傷に対するＳＭＰ３０の免疫組織化学的写真である（普通倍率×１３．２及び×６６）：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；及び、Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理。
【図４】ＳＭＰ３０の免疫組織化学的発現程度を示したグラフである：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；及び、Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理。
【図５】正常マウスとＳＭＰ３０ノックアウトマウスで急性肝損傷に対するＳＭＰ３０の免疫ブロッティングを示した写真である：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；及び、Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理。
【図６】ＳＭＰ３０の免疫ブロッティング発現程度を示したグラフである：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；及び、Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理。
【図７】正常マウスとＳＭＰ３０ノックアウトマウスで、急性肝損傷に対するＰ−ｓｍａｄ３の免疫組織化学的写真である（普通倍率×１３２）：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；及び、Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理。
【図８】Ｐ−ｓｍａｄ３の免疫組織化学的発現程度を示したグラフである：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；及び、Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理。
【図９】正常マウスとＳＭＰ３０ノックアウトマウスで、急性肝損傷に対するＰ−ｓｍａｄ３の免疫ブロッティングを示した写真である：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；及び、Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理。
【図１０】Ｐ−ｓｍａｄ３の免疫ブロッティング発現程度を示したグラフである：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；及び、Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理。
【図１１】正常マウスとＳＭＰ３０ノックアウトマウスで、急性肝損傷に対するｓｍａｄ３の免疫組織化学的写真である（普通倍率×６６）：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；及び、Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理。
【図１２】Ｓｍａｄ３の免疫組織化学的発現程度を示したグラフである：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；及び、Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理。
【図１３】Ｓｍａｄ３の免疫ブロッティング発現程度を示したグラフである：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；及び、Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理。
【図１４】正常マウスとＳＭＰ３０ノックアウトマウスで急性肝損傷に対するＣＹＰ２Ｅ１の免疫組織化学的写真である（普通倍率×６６）：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；及び、Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理。
【図１５】ＣＹＰ２Ｅ１の免疫組織化学的発現程度を示したグラフである：    Ｇ１：正常マウス、オリーブ処理；Ｇ２：正常マウス、四塩化炭素処理；Ｇ３：正常マウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；Ｇ４：正常マウス、アラザイム、四塩化炭素処理；Ｇ５：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、オリーブ処理；Ｇ６：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、四塩化炭素処理；Ｇ７：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、ビタミンＣ、四塩化炭素処理；及び、Ｇ８：ＳＭＰ３０ノックアウトマウス、アラザイム、四塩化炭素処理。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、本発明を実施例、実験例及び製剤例によって詳しく説明する。但し、下記実施例、実験例及び製剤例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記実施例、実験例及び製剤例に限定されるものではない。
【００４３】
＜実施例１＞アラザイムの製造
本発明の有効成分であるアラザイムを製造するために、アラニコラプロテオチリクスＨＹ−３菌株（ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ）を培養培地（バクトトリップトン０．５％、酵母抽出物０．５％、塩化ナトリウム０．１％、塩化カリウム０．０５％、塩化カルシウム０．０２％、硫酸マグネシウム０．０２％）で、２２℃で１８時間培養した。培養液を２μｍ膜ろ過を使用して菌体と上澄み液を分離した後、分離した上澄み液を１０ｋＤａの膜ろ過を使用して濃縮した。本発明のアラザイムは、基本的に陰イオンの特性を有するので、濃縮液を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で前処理したＤＥＡＥ−セルローズ（ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）を使用したイオン交換樹脂と２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に前処理したセファデックスＧ−７５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５）を使用したゲルろ過交換樹脂を使用して精製をした。精製された酵素液は、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）で電気泳動をしてバンド傾向を確認したが、その結果、本発明のアラザイムは、小単位を持たない単一体（ｍｏｎｏｍｅｒ）であり、約５１．５ｋＤａの分子量を有するバンドを示すことを確認した。ただ、アラザイムの生産のためのアラニコラプロテオチリクスＨＹ−３菌株（ＫＣＴＣ０２６８ＢＰ）は、多様な産業用培地で生産でき、生産された培養液も多様な方法で分離及び精製して使用することができる。本発明のアラザイムは、配列番号：１で表わされるポリペプチド配列を有し、配列番号：２で表わされるポリヌクレオチド配列を有する。
【００４４】
＜実験例１＞試験群の構成及び投与
ＳＭＰ３０は、重要な老化標識タンパク質で体内のビタミンＣ合成過程に関与し、ビタミンＣ合成を増加させることで抗酸化剤としての役割もする。本発明には、１２週齢、オス、正常のＣ５７ＢＬ／６（ＷＴ）マウスとＳＭＰ３０ノックアウト（Ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）Ｃ５７ＢＬ／６（ＫＯ）マウスを使用して、四塩化炭素による肝損傷時ＳＭＰ３０とアラザイムの関連性を観察した。ＳＭＰ３０ノックアウト（Ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）Ｃ５７ＢＬ／６（ＫＯ）マウスは、東京都老人総合研究所（Ｔｏｋｙｏ  Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｔａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ）からＳＭＰ３０ＫＯ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスのオス１０匹及びメス２０匹の分譲を受けて、慶北大学校獣医科大学病理学教室動物室で飼育した。飼育を通じて生まれたＦ１マウス中にＰＣＲを使用した尾ＤＮＡジェノタイピング（ｔａｉｌ  ＤＮＡ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を通じてノックアウト（ｋｎｏｃｋ  ｏｕｔ）マウスのみを選別した。
【００４５】
正常マウスは、入手後、動物室で約７日間検疫及び順化させ、順化期間中一般症状を観察して元気な動物のみを選抜して試験に使用した。正常マウスとＳＭＰ３０ノックアウトマウスは、すべて１２週齢であり、グループ間の週齢の差は排除した。
【００４６】
本発明で使用したラットの場合、温度２２±３℃、相対湿度５０±１０％、照明時間１２時間（０８：００点等〜２０：００消灯）に設定された自動温湿度調節装置が設置された動物室で順化及び飼育した。環境条件は、定期的（３ヶ月に１回）に測定した。環境測定の結果、試験に影響を及ぼすと思慮される変動は認められなかった。全試験期間ポリカーボネート製飼育箱［２４０Ｗ×３９０Ｌ×１７５Ｈ（ｍｍ）］に５匹以下ずつ収容した。個体識別は、油性マジックペンを使用した皮膚標識法と飼育箱別個体識別カード表示法を使用した。飼料は、実験動物用固形飼料（ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，５０５  Ｎｏｒｔｈ  ４ｔｈ  Ｓｔｒｅｅｔ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ｉｎ  ４７３７４，米国）を放射線照射（１３．２ｋＧｙ）滅菌して自由摂取させた。水は、カーボンフィルターを通じて浄化した上水道水を水差しを使用して自由摂取させた。本発明の肝損傷物質に使用された四塩化炭素は、０．４ｍｌ／ｋｇの濃度でオリーブオイルに希釈して単回投与して、投与後２４時間目に剖検を実施した。
【００４７】
正常マウスとＳＭＰ３０ノックアウトマウスをそれぞれ陰性対照群（Ｇ１、Ｇ５）、陽性対照群（Ｇ２、Ｇ６）、実験群１（Ｇ３、Ｇ７）、実験群２（Ｇ４、Ｇ８）の８グループに５匹ずつ区分した（表１）。陰性対照群（Ｇ１、Ｇ５）のマウスには、オリーブオイルを腹腔に単回投与し、陽性対照群（Ｇ２、Ｇ６）には、四塩化炭素（０．４ｍｌ／ｋｇ）を単回腹腔投与した。実験群１（Ｇ３、Ｇ７）は、四塩化炭素を投与する一日前にビタミンＣを１００ｍｇ／ｋｇの濃度で上水道水（ｔａｐ−ｗａｔｅｒ）に溶解させて経口投与後、四塩化炭素（０．４ｍｌ／ｋｇ）を腹腔投与した。実験群２（Ｇ４、Ｇ８）には、やはり四塩化炭素を投与する１日前にアラザイムを１００ｍｇ／ｋｇの濃度で上水道水に溶解させて経口投与後四塩化炭素（０．４ｍｌ／ｋｇ）を腹腔に単回投与した。四塩化炭素を腹腔投与して２４時間後にすべてのマウスの剖検を実施し、病理組織学的検査のために各動物ごとに臓器サンプルを採取した。
【００４８】
実験群の構成は、下記の表１のとおりである。
【００４９】
（表１）実験群の構成
2010514752.tif 000003
動物：１２週齢、オス、正常のＣ５７ＢＬ／６（ＷＴ）マウス及びＳＭＰ３０ノックアウト（ＫＯ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス
アラザイム処理：四塩化炭素処理前の経口投与（１００ｍｇ／ｋｇ）
ビタミンＣ処理：四塩化炭素処理前の経口投与（１００ｍｇ／ｋｇ）
四塩化炭素処理：腹腔投与（０．４ｍｌ／ｋｇ＝１０％ＣＣｌ４  ４ｍｌ／ｋｇ）
【００５０】
＜実験例２＞肝細胞の組織病理学的観察
四塩化炭素による肝損傷時アラザイムの効果を組織病理学的で検査するために、剖検時に採取された肝を１０％中性ホルマリンを使用して固定して保存した後、固定組織を１０％中性ホルマリンを使用した固定組織を自動組織処理器で（ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）で組織処理を遂行した。組織処理過程を経た肝細胞は、パラフィン包埋後、４μｍの厚さで組織を切片化し、乾燥させてヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）をした後、光学顕微鏡で観察した。
【００５１】
四塩化炭素を投与して２４時間後、部検したマウスの肝のＨ＆Ｅ染色結果では、全体的に正常マウス（Ｇ１〜Ｇ４）に比べて、ＳＭＰ３０ノックアウトマウス（Ｇ５〜Ｇ８）で小葉中心性壊死所見と炎症反応が多いことを観察することができた。また、正常マウス（Ｇ１〜Ｇ４）とＳＭＰ３０ノックアウトマウス（Ｇ５〜Ｇ８）全て、ビタミンＣとアラザイムを投与したグループで肝細胞の壊死所見が抑制されることを観察することができた（図１、２）。
【００５２】
肝損傷に対する組織生理学的に観察された数値は、下記の表２に示すとおりである。
【００５３】
（表２）肝損傷に対する組織生理学的に観察された数値
2010514752.tif 000004
【００５４】
＜実験例３＞肝細胞でのＳＭＰ３０の発現観察
＜３−１＞肝細胞でのＳＭＰ３０の免疫組織化学的観察
ＳＭＰ３０の免疫組織化学的観察のために、ホルマリンに固定した後に製作されたパラフィン包埋組織を４μｍの厚さに薄切りして脱パラフィンした後、内因性過酸化酵素の活性を抑制させるために、３％Ｈ２Ｏ２に３０分間処理して、０．０１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、組織の抗原発現を増加させるために０．０１Ｍのクエン酸塩緩衝液で処理して、マイクロ波で高熱処理した。非特異的反応を抑制するために、２０ｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで３７℃で１０分間処理した後、リン酸緩衝食塩水で洗浄後、１時間ブロッキングさせた。その後、１次抗体であるＳＭＰ３０（１：５０００、Ａｋｉｈｉｔｏ  Ｉｓｈｉｇａｍｉ，日本）を４℃で一晩処理した後、ＰＢＳ緩衝液で５分間３回洗浄してビオチンと結合させた。ビオチンと結合した１次抗体を緩衝液で洗浄した後、ストレプトアビジンに接合されたＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ−Ｒｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を付着させて、緩衝液で洗浄した後、Ｈｉｓｔｏｓｔａｎｔｉｎ−ｐｌｕｓ  ｂｕｌｋ  ｋｉｔ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，米国）で３７℃で３０分間反応させて充分に洗浄した後、３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ，Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，米国）溶液で発色させて蒸留水で洗浄した後、Ｍｅｙｅｒ’ｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，米国）で対照染色を実施して光学顕微鏡で観察した。
【００５５】
ＳＭＰ３０の免疫組織化学的観察の結果、ＳＭＰ３０ノックアウトマウスでは、ＳＭＰ３０の免疫反応が観察されず、正常マウスでは、肝細胞で特異的にＳＭＰ３０免疫陽性反応が観察された（図３、４）。正常マウスグループの陰性対照群（Ｇ１）で発現されるＳＭＰ３０の発現程度が、四塩化炭素損傷を受けたグループ（Ｇ２）のＳＭＰ３０発現程度より非常に高いことを観察することができる。一方、ビタミンＣまたはアラザイムを処理したグループ（Ｇ３、Ｇ４）では、ＳＭＰ３０発現が四塩化炭素のみを処理した陽性対照群（Ｇ２、Ｇ６）よりより強く発現されることを観察することができた。
【００５６】
＜３−２＞肝細胞でのＳＭＰ３０の免疫ブロッティングによるタンパク質発現の分析
肝細胞でのＳＭＰ３０の免疫ブロッティングによるタンパク質発現分析のために、−７０℃に冷凍された肝組織を０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）と蛋白質分解酵素抑制剤カクテルタブレット（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔ，Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を溶解させたＲＩＰＡ緩衝液に均質化させた。均質化された肝サンプルを４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して脂肪を除去後、上澄み液を得た。上澄み液をまた１４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離して上澄み液を得た。ブラッドフォード方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、タンパク質濃度を測定して各タンパク質サンプルを８０ｇ／ウェルで１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）に電気泳動した。電気泳動されたゲル内のタンパク質をＰＶＤＦ膜（ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆ Ｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，ドイツ）に電気移動（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）を遂行した。同じ量のタンパク質がローディングされたものをクマシブルー染色を通じて確認した。３％牛血清アルブミンをリン酸緩衝食塩水に溶解させたブロッキング溶液で１時間ブロッキング過程を経た後、ＳＭＰ３０（１：５，０００，Ａｋｉｈｉｔｏ  Ｉｓｈｉｇａｍｉ，日本）、β−アクチン（１：５００  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ，米国）に反応させた。０．５％ツイーン２００が溶解されたＴＢＳ緩衝液で充分に洗浄して、１次抗体に対応する２次抗体である抗−ウサギ−ＨＲＰ−抗体（Ａｋｉｈｉｔｏ  Ｉｓｈｉｇａｍｉ，日本）を１：１，０００〜１：２，０００の割合に希釈して室温で１時間反応させた。また、ＴＢＳ緩衝液で充分に洗浄後、特異的な反応を観察するためにｓｕｐｅｒ  ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ，米国）と反応させて、医学用Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ，Ｔｏｋｙｏ，日本）に曝露させた。
【００５７】
ＳＭＰ３０のタンパク質発現分析の結果、正常マウスではＳＭＰ３０の発現を観察することができたが、ＳＭＰ３０ノックアウトマウスの全グループでＳＭＰ３０に対する免疫陽性反応が観察されなかった（図５、６）。
【００５８】
正常マウスグループにおいては、オリーブオイルを単一投与した陰性対照群でＳＭＰ３０が最も強く発現され、四塩化炭素だけ投与したグループ（Ｇ２）のＳＭＰ３０発現が抑制されることを観察することができた。また、ビタミンＣ（Ｇ３）とアラザイム（Ｇ４）を投与したグループでは、四塩化炭素単独投与群よりＳＭＰ３０の発現が高く観察された。
【００５９】
＜実験例４＞肝細胞でのＰ−ｓｍａｄ３の発現観察
＜４−１＞肝細胞でのＰ−ｓｍａｄ３の免疫組織化学的観察
肝細胞でのＰ−ｓｍａｄ３の免疫組織化学的観察のために、前記実験例３−１と同じ過程で遂行し、１次抗体ＳＭＰ３０の代わりに１次抗体Ｐ−ｓｍａｄ３（１：２００，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ、米国）を使用した。
【００６０】
Ｐ−ｓｍａｄ３の免疫組織化学的観察の結果、正常マウスグループでは、ビタミンＣとアラザイムを処理したグループ（Ｇ３、Ｇ４）より四塩化炭素だけ投与したグループ（Ｇ２）から、Ｐ−ｓｍａｄ３の強い免疫陽性反応が観察された。ＳＭＰ３０ノックアウトマウスでは、アラザイムを処理したグループ（Ｇ８）より四塩化炭素単独またはビタミンＣを投与したグループ（Ｇ６、Ｇ７）で、強い免疫陽性反応が観察された（図７、８）。また、ビタミンＣ（Ｇ３、Ｇ７）よりアラザイムを投与したグループ（Ｇ４、Ｇ８）でＰ−ｓｍａｄ３の発現が低かった。
【００６１】
＜４−２＞肝細胞でのＰ−ｓｍａｄ３の免疫ブロッティングによるタンパク質発現の分析
肝細胞でのＰ−ｓｍａｄ３の免疫ブロッティングによるタンパク質発現の観察のために、前記実験例３−２と同じ過程で遂行し、１次抗体ＳＭＰ３０の代わりに１次抗体Ｐ−ｓｍａｄ３（１：２００，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ，米国）を使用し、２次抗体に抗−ウサギ−ＨＲＰ−抗体（１：１，０００〜１：２，０００，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ，米国）を使用した。
【００６２】
Ｐ−ｓｍａｄ３は、全体的に正常マウス（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４）よりＳＭＰ３０ノックアウトマウス（Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８）で強く発現され、その中でも四塩化炭素だけ投与したＳＭＰ３０ノックアウトマウスグループ（Ｇ６）で最も強く発現され、ビタミンＣを投与したグループとアラザイムを投与したグループでは、発現が抑制されることを観察することができた（図９、１０）。
【００６３】
＜実験例５＞肝細胞でのＳｍａｄ３の観察
＜５−１＞肝細胞でのＳｍａｄ３の免疫組織化学的観察
肝細胞でのＳｍａｄ３の免疫組織化学的観察のために、前記実験例３−１と同じ過程で遂行し、１次抗体ＳＭＰ３０の代わりに１次抗体Ｓｍａｄ３（１：１００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ，米国）を使用した。
【００６４】
Ｓｍａｄ３の免疫組織化学的観察の結果、各グループごとに発現されるすべてＳｍａｄ３の発現程度は、類似に一定して現われた。ＳＭＰ３０ノックアウトマウスと正常マウスの肝でも大きな差は観察されなかった。全実験群において、Ｓｍａｄ３免疫反応における有意な差は、観察されなかった（図１１、１２）。
【００６５】
＜５−２＞肝細胞でのＳｍａｄ３の免疫ブロッティングによるタンパク質発現の分析
肝細胞でのＳｍａｄ３の免疫ブロッティングによるタンパク質発現の観察のために、前記実験例３−２と同じ過程で遂行し、１次抗体ＳＭＰ３０の代わりに１次抗体Ｓｍａｄ３（１：１００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ，米国）を使用し、２次抗体に抗−ウサギ−ＨＲＰ−抗体（１：１，０００〜１：２，０００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ，米国）を使用した。
【００６６】
Ｓｍａｄ３のタンパク質発現を分析した結果、Ｓｍａｄ３の発現においては、全試験群で有意な差が観察されなかった（図１３）。正常マウスグループ（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４）とＳＭＰ３０ノックアウトマウスグループ（Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８）の肝のｓｍａｄ３発現差はなく、すべてのグループで一定に発現されることを観察することができた。
【００６７】
＜実験例６＞肝細胞でのＣＹＰ２Ｅ１の免疫組織化学的観察
肝細胞でのＣＹＰ２Ｅ１の免疫組織化学的観察のために、前記実験例３−１と同じ過程で遂行し、１次抗体ＳＭＰ３０の代わりに１次抗体ＣＹＰ２Ｅ１（１：８００  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ、米国）を使用した。
【００６８】
ＣＹＰ２Ｅ１の免疫組織化学的観察の結果、ＣＹＰ２Ｅ１の発現は、アラザイムを投与したグループでのみ、強い免疫陽性反応が観察され、他のグループでは、発現程度において大きな差を観察することができなかった（図１４、１５）。アラザイムが処理されたグループ（Ｇ４、Ｇ８）でのみ発現される傾向を示した。
【００６９】
＜実験例７＞アラザイムの急性毒性実験
本発明のアラザイムに対する急性毒性を調べるために、下記のような実験を遂行した。
【００７０】
ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）系統の９週齢特定病原体不在（ＳＰＦ）メスのラット（（株）オリエント、大韓民国、ソウル）に対して、それぞれ４匹ずつ４群に分けて、温度２２±３℃、湿度５５±１０％、照明１２Ｌ／１２Ｄ条件の動物室内で飼育した。ラット入手後、動物室で１週間検疫及び順化過程を経た。全試験期間の間、ポリカーボネート製飼育箱［２４０Ｗ×３９０Ｌ×１７５Ｈ（ｍｍ）］で５匹以下ずつ収容した。個体識別は、油性マジックペンを使用した皮膚標識法と飼育箱別個体識別カード表示法を使用した。実験動物用固形飼料（ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国）は滅菌し、水は上水道水を水差しを使用して自由に摂取させた。
【００７１】
前記実施例のアラザイムを０、１２５０、２５００及び５０００ｍｇ／ｋｇの濃度で注射用滅菌注射用水に溶解して、１０ｍｌ／ｋｇの用量に調剤してラットに経口投与用ゾンデ（ｚｏｎｄｅ）を使用して単回経口投与した。一週間の順化期間を経て、４つのグループに分離した後、１０週齢のラットにアラザイム濃度別で投与した後、一般症状観察を実施した後、アラザイムの臓器に対する実質毒性を評価するために２４時間後に剖検を実施した。
【００７２】
メスのラットにアラザイムを経口投与した後、試験物質投与による一般症状を正確に観察して毒性を評価するために、動物の行動、外観、機能に対する観察を実施した。
【００７３】
実験の結果、アラザイム投与後の動物の活動性、歩行、気質、ひきつけなどにいては何らの異常症状が観察されず、被毛状態、眼球周辺、耳、生殖器、四肢状態、尾状態などの動物の外観観察及び呼吸状態、唾液分泌、糞便、嘔吐などの機能観察でも何らの異常症状が観察されなかった。アラザイム投与後２４時間に、剖検を実施した。肉眼剖検所見でも、全臓器でアラザイム投与による何らの異常も観察されなかった。アラザイム致死量（ＬＤ５０）は、５０００ｍｇ／ｋｇ以上の高濃度であると判断される。顕微鏡学的観察において、肝、心臓、肺、すい臓などの実質臓器では、何らの病理学的異常所見が観察されなかった。
【００７４】
下記に本発明の組成物のための製剤例を例示する。
【００７５】
＜製剤例１＞薬学的製剤の製造
＜１−１＞散剤の製造
アラザイム                                            ２ｇ
乳糖                                                  １ｇ
前記の成分を混合した後、気密包に充填して散剤を製造した。
【００７６】
＜１−２＞錠剤の製造
アラザイム                                          １００ｍｇ
とうもろこし澱粉                                     １００ｍｇ
乳糖                                               １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                                 ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
【００７７】
＜１−３＞カプセル剤の製造
アラザイム                                          １００ｍｇ
とうもろこし澱粉                                     １００ｍｇ
乳糖                                                      １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                                 ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【００７８】
＜１−４＞注射液剤の製造
アラザイム                                          １０μｇ／ｍｌ
薄い塩酸ＢＰ                                       ｐＨ７．６になるまで
注射用塩化ナトリウムＢＰ                               最大１ｍｌ
適当な容積の注射用塩化ナトリウムＢＰの中にアラザイムを溶解させて、生成された溶液のｐＨを薄い塩酸ＢＰを使用してｐＨ７．６に調節して、注射用塩化ナトリウムＢＰを使用して容積を調節して充分に混合した。溶液を透明ガラスの５ｍｌタイプＩアンプル中に充填させて、ガラスを溶解させることで入口を封入して、１２０℃で１５分以上オートクレーブさせて殺菌して注射液剤を製造した。
【００７９】
＜製剤例２＞食品の製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液、またはそれから分離したアラザイムを含む食品を下記のように製造した。
【００８０】
＜２−１＞小麦粉食品の製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．１〜１０．０重量部を小麦粉に添加して、この混合物を使用して通常の方法でパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造して、健康増進用食品を製造した。
【００８１】
＜２−２＞スープ及び肉汁（ｇｒａｖｉｅｓ）の製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．１〜１．０重量部をスープ及び肉汁に添加して、通常の方法で健康増進用肉加工製品、麺類のスープ及び肉汁を製造した。
【００８２】
＜２−３＞グランウドビーフの製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム１０重量部をグラウンドビーフに添加して、通常の方法で健康増進用グラウンドビーフを製造した。
【００８３】
＜２−４＞乳製品の製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．１〜１．０重量部を牛乳に添加して、前記牛乳を使用して通常の方法で、バター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。
【００８４】
＜２−５＞禅食（Ｓｕｎｓｉｋ）の製造
玄米、麦、もち米、鳩麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎した後粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【００８５】
黒豆、黒ごま、えごまも公知の方法で蒸して乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【００８６】
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを真空濃縮機で減圧、濃縮して、噴霧、熱風乾燥器で乾燥して得た乾燥物を粉砕機で粒度６０メッシュに粉砕して乾燥粉末を得た。
【００８７】
前記で製造した穀物類、種実類及びアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムの乾燥粉末を、次の割合で配合して通常の方法で製造した。
穀物類（玄米３０重量部、鳩麦１５重量部、麦２０重量部）、
種実類（えごま７重量部、黒豆８重量部、黒ごま７重量部）、
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムの乾燥粉末（１重量部）、
霊芝（０．５重量部）、
地黄（０．５重量部）。
【００８８】
＜製剤例３＞飲料の製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを含む飲料を次のように製造した。
【００８９】
＜３−１＞健康飲料の製造
液状果糖（０．５％）、オリゴ糖（２％）、砂糖（２％）、食塩（０．５％）、水（７５％）のような副材料とアラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイムを均質に配合して瞬間殺菌をした後、これをガラス瓶、ペット瓶など小包装容器に包装して健康飲料を製造した。
【００９０】
＜３−２＞野菜ジュースの製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．５ｇをトマトまたはにんじんなどの野菜のジュース１，０００ｍｌに加えて、通常の方法で健康増進用野菜ジュースを製造した。
【００９１】
＜３−３＞果物ジュースの製造
アラニコラプロテオチリクスの培養液またはそれから分離したアラザイム０．１ｇをリンゴまたはブドウなどの果物のジュース１，０００ｍｌに加えて、通常の方法で健康増進用果物ジュースを製造した。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
前記で詳しく見たように、本発明のアラニコラプロテオチリクスが生産するアラザイムは、損傷した肝細胞で肝細胞の壊死を防ぎ、ＳＭＰ３０の発現を増加させて、Ｐ−ｓｍａｄ３の発現は減少させて、アラザイムの肝保護効能によって中心静脈周辺の肝細胞損傷を抑制化するので、肝機能保護用薬学的組成物として使用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９３】
配列番号：１は、アラニコラプロテオチリクスのポリペプチド配列である。
配列番号：２は、アラニコラプロテオチリクスのポリヌクレオチド配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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