(57)【要約】εＰＫＣのＣ２領域に由来するペプチドおよびそれらの使用方法を記載する。これらのペプチドは、急性虚血性心疾患の動物モデルにおいてεＰＫＣの活性を調節する。一局面では、εＰＫＣのＣ２ドメインに由来する連続アミノ酸配列を含むペプチドを治療有効量投与することを含む、哺乳動物対象の虚血性心臓障害を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、このペプチドは、εＰＫＣのＣ２ドメインのアミノ酸残基８５〜９２に対応するアミノ酸配列を含まない。具体的な実施形態では、εＰＫＣペプチドは、ψεＲＡＣＫ（配列番号１８）ではない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
εＰＫＣのＣ２ドメインに由来する連続アミノ酸配列を含むペプチドを治療有効量投与することを含む、哺乳動物対象の虚血性心臓障害を調節する方法。
【請求項２】
前記ペプチドが、εＰＫＣのＣ２ドメインのアミノ酸残基８５〜９２に対応するアミノ酸配列を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記εＰＫＣペプチドが、ψεＲＡＣＫ（配列番号１８）ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記εＰＫＣペプチドが、εＰＫＣのアミノ酸残基２８〜３５、４９〜６０および７４〜７９に対応する連続アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記εＰＫＣペプチドが、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１６からなる群から選択された配列に対応する連続アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記εＰＫＣペプチドが、εＰＫＣのアミノ酸残基２８〜３５、４９〜５３および７４〜７９に対応する連続アミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記εＰＫＣペプチドが、配列番号９、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択された配列に対応する連続アミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記εＰＫＣペプチドが、εＰＫＣのＣ２ドメインのベータ−サンドイッチ領域に対応する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、前記ペプチド阻害剤の細胞取り込みを増加させるペプチドと結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチド阻害剤の細胞取り込みを増加させる前記ペプチドがＴＡＴである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物対象が心臓移植患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）のＣ２ドメインに由来する連続アミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、前記ＰＫＣの活性を調節するペプチド。
【請求項１３】
タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の前記Ｃ２ドメインがεＰＫＣのＣ２ドメインである、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドが、εＰＫＣのＣ２ドメインのアミノ酸残基１４〜２１または８５〜９２に対応する配列を含まない、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドが、εＶ１−２（配列番号７）またはψεＲＡＣＫ（配列番号１８）ではない、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記ペプチドがεＰＫＣの活性化剤である、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１７】
ＰＫＣのＣ２ドメインに由来する前記アミノ酸配列が、εＰＫＣのアミノ酸残基２８〜３５、４９〜６０および７４〜７９に対応する、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
ＰＫＣのＣ２ドメインに由来する前記アミノ酸配列が、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１６からなる群から選択された配列に対応するアミノ酸配列である、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１９】
ＰＫＣのＣ２ドメインに由来する前記アミノ酸配列が、εＰＫＣのアミノ酸残基２８〜３５、４９〜５３および７４〜７９に対応する、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項２０】
ＰＫＣのＣ２ドメインに由来する前記アミノ酸配列が、配列番号９、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択された配列に対応するアミノ酸配列である、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチドが、哺乳動物対象における虚血性心臓障害を軽減させる、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項２２】
前記ペプチドが、哺乳動物対象における虚血性心臓障害を軽減させる、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２３】
前記ペプチドがεＰＫＣの阻害剤である、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項２４】
ＰＫＣのＣ２ドメインに由来する前記アミノ酸配列が、εＰＫＣのアミノ酸残基４０〜４７、６２〜６７および１１９〜１２４に対応する、請求項２３に記載のペプチド。
【請求項２５】
ＰＫＣのＣ２ドメインに由来する前記アミノ酸配列が、配列番号１１、配列番号１４および配列番号２１からなる群から選択された配列に対応するアミノ酸配列である、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２６】
前記ペプチドが、前記ペプチド阻害剤の細胞取り込みを増加させるペプチドと結合している、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項２７】
前記ペプチド阻害剤の細胞取り込みを増加させる前記ペプチドがＴＡＴである、請求項２６に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権益に関する陳述
本研究の一部は、ＮＩＨ助成金ＨＬ５２１４１により援助されたものである。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【０００２】
本明細書で記載した内容は、Ｃ２ドメインにまたがるＰＫＣポリペプチドの領域に由来するペプチドに関する。このペプチドは、ＰＫＣの活性を調節し、例えば、急性虚血性心疾患および脳卒中の重症度を低下させるのに有用である。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）酵素は、アポトーシス（１４、１５）、細胞増殖（１６〜１８）、分泌（１９）、ならびに虚血性心疾患（４、２０〜２２）および脳卒中（２３、２４）を含む疾患状態に関与するセリンおよびトレオニンタンパク質キナーゼのファミリーである。ＰＫＣ活性化には、負に荷電したリン脂質およびホスファチジルセリンへの結合が関与する。様々なＰＫＣアイソザイムは、Ｃａ２＋および脂質由来のセカンドメッセンジャー、例えば、ジアシルグリセロールを含むその他の調節因子に対して異なる感受性を有する（２５）。１種または複数の結合事象によって活性化された後、ＰＫＣアイソザイムは、可溶性細胞画分から微粒子細胞画分に移行する（２６）ことが知られている。この微粒子細胞画分は、細胞膜、核、ミトコンドリアおよびその他の成分を含有する（２７、２８）。
【０００４】
ＰＫＣのアミノ酸１次配列は一般的に、２種類のドメイン、（ｉ）Ｎ末端調節ドメインおよび（ｉｉ）保存されたＣ末端触媒ドメインに分けることができる。調節ドメインには、セカンドメッセンジャーおよびリン脂質との相互作用を媒介し、一般的に分子間および分子内のタンパク質−タンパク質相互作用を調節するＣ１およびＣ２ドメインが含まれる。アミノ酸１次配列、高次構造、シグナル伝達ドメインのコピー数の違いは、様々なＰＫＣアイソザイムの活性および／または特異性の違いに関与する（２５、３０）。少なくとも１種のＰＫＣサブファミリーのＣ２ドメインは、その他のファミリーメンバーのＣ２ドメインとの相同性が認められるまで、「Ｖ１」領域と呼ばれた（２９）。
【０００５】
Ｃ２ドメインの小さな領域が、タンパク質−タンパク質相互作用を調節することが示された（２、５）。特に、Ｃ２ドメインの１領域に由来するいくつかのペプチドは、ＰＫＣの競合阻害剤として作用することが示された（１）。εＰＫＣとそのアンカータンパク質εＲＡＣＫとの間の相互作用を妨害するペプチドは、εＰＫＣ活性を阻害した（５）。自己抑制的分子内相互作用を妨害するペプチドは、ＰＫＣ活性を高め、虚血性心疾患の動物モデルにおける虚血死を減少させた（４、５、７）。Ｃ２の同領域から、アミノ酸６〜１０個の関連ペプチドが同定され（５、２２、３１〜３４）、対応するＰＫＣアイソザイムの生物学的活性の調節に選択的かつ効果的であることが示された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そのような研究は、Ｃ２ドメインの小さな領域に限定されている。ＰＫＣ活性を調節するＣ２ドメインの他の領域を同定し、そのような領域をベースにした選択的なペプチド阻害剤を開発することが依然として必要である。そのようなペプチドは、薬剤開発の候補である（６、９、１０、１２、１８、２３、２８、３５〜４１）。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（参考文献）
以下の引用文献ならびに本テキストにおいて引用されている付加の引用文献は、本明細書において、それらの全体を参考として援用する。
【０００８】
【数１】
2010505841.tif 000002
【０００９】
【数２】
2010505841.tif 000003
【００１０】
【数３】
2010505841.tif 000004
要旨
以下の局面および以下に記載し例示したそれらの実施形態は、具体例および実例を意味しており、範囲を制限するものではない。
【００１１】
一局面では、εＰＫＣのＣ２ドメインに由来する連続アミノ酸配列を含むペプチドを治療有効量投与することを含む、哺乳動物対象の虚血性心臓障害を調節する方法を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、このペプチドは、εＰＫＣのＣ２ドメインのアミノ酸残基８５〜９２に対応するアミノ酸配列を含まない。具体的な実施形態では、εＰＫＣペプチドは、ψεＲＡＣＫ（配列番号１８）ではない。
【００１３】
いくつかの実施形態では、εＰＫＣペプチドは、εＰＫＣのアミノ酸残基２８〜３５、４９〜６０および７４〜７９に対応する連続アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、εＰＫＣペプチドは、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１６からなる群から選択された配列に対応する連続アミノ酸配列を含む。
【００１４】
具体的な実施形態では、εＰＫＣペプチドは、εＰＫＣのアミノ酸残基２８〜３５、４９〜５３および７４〜７９に対応する連続アミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、εＰＫＣペプチドは、配列番号９、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択された配列に対応する連続アミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、εＰＫＣペプチドは、εＰＫＣのＣ２ドメインのベータ−サンドイッチ領域に対応する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、このペプチドは、ペプチド阻害剤の細胞取り込みを増加させるペプチドと結合させる。具体的な実施形態では、ペプチド阻害剤の細胞取り込みを増加させるペプチドはＴＡＴである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、哺乳動物対象は心臓移植患者である。
【００１８】
他の局面では、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）のＣ２ドメインに由来する連続アミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、ＰＫＣの活性を調節する単離ペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）のＣ２ドメインはεＰＫＣのＣ２ドメインである。
【００１９】
いくつかの実施形態では、このペプチドは、εＰＫＣのＣ２ドメインのアミノ酸残基１４〜２１または８５〜９２に対応する配列を含まない。具体的な実施形態では、このペプチドは、ペプチドεＶ１−２（配列番号７）またはψεＲＡＣＫ（配列番号１８）ではない。
【００２０】
いくつかの実施形態では、このペプチドはεＰＫＣの活性化剤である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＰＫＣのＣ２ドメインに由来するアミノ酸配列は、εＰＫＣのアミノ酸残基２８〜３５、４９〜６０および７４〜７９に対応する。いくつかの実施形態では、ＰＫＣのＣ２ドメインに由来するアミノ酸配列は、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１６からなる群から選択された配列に対応するアミノ酸配列である。
【００２２】
具体的な実施形態では、ＰＫＣのＣ２ドメインに由来するアミノ酸配列は、εＰＫＣのアミノ酸残基２８〜３５、４９〜５３および７４〜７９に対応する。具体的な実施形態では、ＰＫＣのＣ２ドメインに由来するアミノ酸配列は、配列番号９、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択された配列に対応するアミノ酸配列である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、このペプチドは、哺乳動物対象における虚血性心臓障害を減らす。具体的な実施形態では、このペプチドは、哺乳動物対象における虚血性心臓障害を減らす。
【００２４】
いくつかの実施形態では、このペプチドはεＰＫＣの阻害剤である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ＰＫＣのＣ２ドメインに由来するアミノ酸配列は、εＰＫＣのアミノ酸残基４０〜４７、６２〜６７および１１９〜１２４に対応する。いくつかの実施形態では、ＰＫＣのＣ２ドメインに由来するアミノ酸配列は、配列番号１１、配列番号１４および配列番号２１からなる群から選択された配列に対応するアミノ酸配列である。
【００２６】
具体的な実施形態では、このペプチドを、ペプチド阻害剤の細胞取り込みを増加させるペプチドと結合させる。具体的な実施形態では、そのペプチド阻害剤の細胞取り込みを増加させるペプチドはＴＡＴである。
【００２７】
前述の例示的局面および実施形態に加えて、図面を参照し、以下の説明を検討することによって、さらなる局面および実施形態が明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１−１】εＰＫＣのＣ２ドメインの空間充填モデルを示した図であり、機能に基づいた残基の表面配置を示している。右の構造（図１Ｂ）は、左の構造（図１Ａ）に対して１８０°回転している。
【図１−２】Ｃ２ドメインの対応するα炭素トレース構造を示す図である。右の構造（図１Ｄ）は、左の構造（図１Ｃ）に対して１８０°回転している。
【図２】図２Ａは、細胞中におけるεＰＫＣのトランスロケーションのイムノブロット分析および得られたグラフを示す図である。図２Ｂは、細胞中におけるεＰＫＣのトランスロケーションに対する様々なペプチドの効果をまとめて示したヒストグラムである。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、初代筋肉細胞中におけるＭＡＲＣＫＳリン酸化に対するＣ２由来ペプチドの効果の分析を示す図である。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、虚血および再灌流のｅｘ  ｖｉｖｏモデルにおけるＣ２由来ペプチドの効果の分析を示す図である。（Ａ）組織梗塞を評価するため、ＴＴＣで染色した処理心臓および対照心臓の断面図。（Ｂ）染色に基づいた相対的な梗塞の大きさを示した図。
【図５−１】εＰＫＣ（Ａ）、δＰＫＣ（Ｂ）、αＰＫＣ（Ｃ）およびζＰＫＣ（Ｄ）からのＣ２由来ペプチドでｉｎ  ｖｉｖｏにおいて処理した後の心臓組織におけるεＰＫＣのトランスロケーションのイムノブロット分析および得られたグラフを示す図である。
【図５−２】εＰＫＣ（Ａ）、δＰＫＣ（Ｂ）、αＰＫＣ（Ｃ）およびζＰＫＣ（Ｄ）からのＣ２由来ペプチドでｉｎ  ｖｉｖｏにおいて処理した後の心臓組織におけるεＰＫＣのトランスロケーションのイムノブロット分析および得られたグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
Ｉ．εＰＫＣのＣ２ドメインに由来するペプチド
εＰＫＣのＣ２ドメインの一部に由来する２種類のペプチドは、εＰＫＣ活性を選択的に調節することが以前に示された。１つのペプチド（εＶ１−２）は、εＰＫＣとそのアンカータンパク質、εＲＡＣＫとの間の相互作用を妨害した（５）。もう一つのペプチドは、ＰＫＣの自己抑制的分子内相互作用を妨害した（４）。後者のペプチドは、ＰＫＣ活性を（εＲＡＣＫへの結合のように）上昇させたので、ψεＲＡＣＫと名付けられた。今までは、Ｃ２ドメインのその他の領域がＰＫＣ活性を調節するかどうか、生物学的活性を備えたペプチドがこれらの領域のアミノ酸配列に由来する可能性があるかどうかはわからなかった。
【００３０】
本発明の組成物および方法は、完全なεＰＫＣ  Ｃ２ドメインのアミノ酸配列に対応する（すなわち、配列に由来する）生物学的に活性のあるペプチド（すなわち、Ｃ２由来ペプチド）の同定に基づく。図１Ａ〜１Ｄは、空間充填様式（図１Ａおよび１Ｂ）およびリボン様式（図１Ｃおよび１Ｄ）でεＣ２ドメインの構造を示している（４９）。図１Ｃおよび１Ｄにおける様々な領域の数字は、εＣ２ドメインの以下のアミノ酸一次配列（配列番号１）で示された数字に対応する。
【００３１】
【化１】
2010505841.tif 000005
前記の配列において、「Ｅ」はβ鎖領域を示し、「Ｈ」はヘリックス領域を示す。無秩序なループ領域における残基は空白として示されている（すなわち、ＥまたはＨの印がない）。下線を引いた配列は、本発明の実験で使用したペプチドに対応する。網掛けおよび箱囲いは、重複するペプチドに存在する配列を表す。前述のεＶ１−２およびψεＲＡＣＫペプチドの位置も示してある。εＰＫＣの残基１〜１３６を示す。εＣ２領域は、残基１〜１３１（すなわち、Ｍｅｔ−１からＬｅｕ−１３１）に対応する。
【００３２】
最も強い活性化型Ｃ２由来ペプチドは、ベータサンドイッチの片面に位置づけられ（中間の灰色）、一方、４種の阻害型Ｃ２由来ペプチドのうち３種は濃い灰色の領域に位置づけられた（図１Ａおよび１Ｂ）。生物学的活性がないＣ２由来ペプチドは、淡い灰色の領域に位置づけられた。領域１、２、３、５、６および９およびψεＲＡＣＫ領域に対応するＣ２由来ペプチドは全て、εＰＫＣ特異的活性化剤（図１Ｃおよび１Ｄ）であった。領域１１および１３に対応するＣ２由来ペプチドは、非特異的ＰＫＣ活性化剤であった。εＶ１−２領域および領域４、７および１２に対応するＣ２由来ペプチドは、εＰＫＣ特異的阻害剤であった。領域８および１０に対応するＣ２由来ペプチドは、不確定の結果を生じた。これらの結果を表１にまとめて示す。様々なペプチドについて、本文ならびに表２および表３においてより詳細に説明する。
【００３３】
特定の理論に拘束されることなく、Ｃ２ドメインが重要なタンパク質−タンパク質相互作用に関与し、Ｃ２ドメインに由来するペプチドがεＰＫＣ結合タンパク質との分子内相互作用および／または分子間相互作用の調節に有用であることが示唆される。阻害ドメインとの分子内相互作用または阻害タンパク質との分子間相互作用に関与するＣ２ドメインの領域に対応するペプチドは、阻害的相互作用を分断するので、εＰＫＣのアゴニストである。例えばεＲＡＣＫのように、Ｃ２活性化タンパク質の結合部位に対応するペプチドは、アンタゴニストである。
【００３４】
その他のＰＫＣアイソザイムのＣ２ドメインの折り畳みは、εＰＫＣのＣ２ドメインの折り畳みと構造的に類似しているので、他のアイソザイムの相同な位置に由来するペプチドは、コグネイトＰＫＣアイソザイムに対して類似の生物学的活性を有する可能性が高い。様々なＰＫＣアイソザイム間の相同性を例示するために、いくつかのＰＫＣ  Ｃ２ドメインのアラインメントを以下に示す（４９、５７、５８）。アイソザイム特異的活性化剤であることが示された単離ペプチドは、淡い灰色で強調している。アイソザイム特異的阻害剤であることが示された単離ペプチドは、濃い灰色で強調している。非特異的活性化剤であることが示された単離ペプチドは、太字で示している。
いくつかのＰＫＣアイソザイムのＣ２ドメインのアラインメント
【００３５】
【化２】
2010505841.tif 000006
Ｃ２ドメインの相同体は、その多くがシグナル伝達タンパク質であるところの６０個を上回る種々のタンパク質中に存在するので（５９）、本研究の結果は、限定はしないが５−リポキシゲナーゼ（６０）、プレクストリン（６１）および腫瘍壊死因子ファミリーのメンバー（６２）を含むＰＫＣ以外のタンパク質にも当てはまる可能性が高い。
【００３６】
本発明のペプチドおよび方法を支持するために実施した実験を以下に説明する。
【００３７】
【表１】
2010505841.tif 000007
ＩＩ．本発明を支持するために実施した実験
εＰＫＣのＣ２ドメイン（Ｖ１ドメインとしても知られている（２９）、残基１〜１３１）にわたるアミノ配列に由来する５〜９残基のペプチド１３個を合成し、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける生物学的アッセイを使用して、εＰＫＣ活性化を調節する能力について試験した。指示したＣ２由来ペプチドに加えて、３種類のペプチド、特に、既に確立されているペプチド活性化剤（ψεＲＡＣＫ）および阻害剤（εＶ１−２）のスクランブル型、および、ＴＡＴ担体ペプチド単独、を対照として合成した。既に説明したように、これらのペプチドを、細胞を貫通する「担体」ペプチド（すなわち、ＴＡＴ４７〜５７）に結合させることによって、「積荷」として細胞内に導入した（４３、４４）。表２および表３に、本発明のペプチドおよび方法を支持するための実験で試験したペプチド全てを、アミノ酸配列、配列番号およびＣ２（Ｖ１）ドメインの対応領域を含めて挙げる。
【００３８】
εＰＫＣに対するＴＡＴ結合ペプチドの効果を調べるために、４種類のアッセイ、（ｉ）培養細胞中におけるεＰＫＣのトランスロケーション（２６）、（ｉｉ）培養細胞中におけるＰＫＣ基質ＭＡＲＣＫＳのリン酸化（４１、５０）、（ｉｉｉ）完全な心臓を使用してｅｘ  ｖｉｖｏにおいて実施した心保護アッセイ（４、６、７）、および（ｉｖ）腹腔内単回注射後のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＫＣのトランスロケーション（４８）、を使用した。
【００３９】
Ａ．細胞中におけるεＰＫＣのトランスロケーション
活性化すると、ＰＫＣは可溶性細胞画分から微粒子細胞画分に移行し、このトランスロケーションはイムノブロット分析によってモニターすることができる（２６）。ペプチドのＰＫＣトランスロケーションに対する効果は、細胞を最大下濃度のＰＭＡで処理するとよりよく認められることが以前に決定されている（２２、４２）。高濃度のＰＭＡ（非生理学的活性化剤）は、ペプチド活性化剤単独によって刺激されるトランスロケーションよりも大きな程度のＰＫＣのトランスロケーションを刺激する（５１）。ペプチド処理後のＰＫＣのトランスロケーションは、大量のＰＭＡで認められるよりも少ないが、その他の実験データとより相関していることが示された（４、６、２２））。
【００４０】
ＰＭＡ刺激前にほとんどのペプチドで前処理すると、ペレット画分中のεＰＫＣ量が増加し、可溶性画分中の量が減少したので、これらのペプチドがεＰＫＣのトランスロケーションを刺激（活性化）することが示唆された。図２Ａは、代表的なイムノブロット分析およびそのデータに伴ったグラフを示す。ＰＭＡ  ３ｎＭで７分間最適以下で刺激する前に、５００ｎＭの代表的な活性化剤（ペプチド２）または阻害剤（ペプチド７）を細胞とともに１５分間予めインキュベートした。
【００４１】
【表２】
2010505841.tif 000008
【００４２】
【表３】
2010505841.tif 000009
ペプチド２による前処理によって、ＴＡＴ対照ペプチドによる前処理と比較してεＰＫＣのトランスロケーションの量が約３０％増加した（ｎ＝５、ｐ＜０．０５）。ペプチド７による前処理によって、ＴＡＴ対照ペプチドによる前処理と比較してεＰＫＣのトランスロケーションの量が約５０％減少した（ｎ＝３、ｐ＜０．０１）。マイクロソフトエクセルを使用して、スチューデントｔ検定によって統計学的に有意であることが決定された。
【００４３】
図２Ｂで示されたヒストグラムは、細胞内のεＰＫＣのトランスロケーションに対する様々なペプチドの効果をまとめて示している。前述した通り、トランスロケーションの増加はＰＫＣの活性化を示し、トランスロケーションの減少は阻害を示す。ペプチドは全て、εＰＫＣのトランスロケーションを変化させた。４種類のペプチド、すなわち、ペプチド４、７、１２およびεＶ１−２（εＰＫＣ選択的阻害剤であることが既に報告されている）によってＰＭＡ刺激前に前処理すると、ペレット画分中のεＰＫＣの量が対照と比較して減少する結果となり、これらのペプチドがεＰＫＣのトランスロケーションの阻害剤として作用し得ることが示唆された。スクランブルεＶ１−２ペプチド（ＬＳＥＴＫＰＡＶ））はまた、ＣＨＯ細胞中におけるεＰＫＣのトランスロケーションを刺激したが、この結果は本明細書で説明したその他のアッセイからは明らかではなかった。ＴＡＴ担体ペプチドのみで前処理すると、ＰＫＣのトランスロケーションに影響はなかった。マイクロソフトエクセルを使用して、スチューデントｔ検定によって決定されたように、全データは、統計学的に有意であった（ｎ＞３、ｐ＜０．０５）。
【００４４】
Ｂ．細胞中のＰＫＣ基質のリン酸化
トランスロケーションは迅速で簡便なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイであるが、ＰＫＣ活性化を厳密には示していない（２６）。ＰＫＣ活性化のより直接的でより高感度な測定は、ＰＫＣ基質のリン酸化である。εＰＫＣ特異的基質は知られていないので、ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）を使用した。ＭＡＲＣＫＳは、ＰＫＣ活性化後、セリン残基を強くリン酸化する、広く分布しているアクチン架橋タンパク質である（５０、５２）。
【００４５】
野生型マウス（ＷＴ、図３Ａおよび３Ｃ）またはεＰＫＣノックアウトマウス（ＫＯ、図３Ｂ）の初代マウス筋肉細胞を、細胞溶解する前に、各ペプチド１μＭと１５分間（図３Ａおよび３Ｂ）または３０分間（図３Ｃ）インキュベートし、その後、ＭＡＲＣＫＳリン酸化のレベルを、リン酸化ＭＡＲＣＫＳに特異的な抗体を使用して測定した。このアッセイは以前、インテグリン誘導性ε、α、およびδＰＫＣ活性化がＭＡＲＣＫＳリン酸化を導くことを示すために使用された（４１）。示されたデータは、（各カラムで示した）いくつかの実験から得られたものであり、マイクロソフトエクセルを使用して、スチューデントｔ検定によって統計学的に有意であることが決定された。
【００４６】
濃い灰色の棒は、対照と比較して有意差がないことを示しており、図３Ｂの淡い灰色の棒は統計学的に有意でない効果の傾向を示しており、白色の棒は有意な効果を示している。アクチンは、添加対照として使用した。全体で、ペプチドの１１個がペプチドなしの処理またはＴＡＴ対照による処理と比較してＭＡＲＣＫＳリン酸化を増加させ（図３Ａおよび表２）、これらのペプチドがＰＫＣ活性化剤であることを示している。対照のペプチドスクランブルεＶ１−２またはスクランブルψεＲＡＣＫで処理した後では、ＭＡＲＣＫＳリン酸化に変化は認められなかった。ペプチド８のみがＭＡＲＣＫＳリン酸化に対して決定的な効果を有さなかった。
【００４７】
εＰＫＣノックアウト（ＫＯ）マウスおよびそれら由来の細胞が利用可能であるため、ＭＡＲＣＫＳリン酸化アッセイの有用性が高まった。ＷＴマウスおよびεＰＫＣ  ＫＯマウスから得られた両方の細胞においてリン酸化ＭＡＲＣＫＳレベルが変化した場合は、ＴＡＴ結合ペプチドの効果がεＰＫＣに選択ではないことを示した。しかし、ＷＴマウスから得られた細胞のみにおいて変化した場合は、ＴＡＴ結合ペプチドの効果がεＰＫＣアイソザイムに特異的であることを示した。ペプチドのほとんど（１１個の活性化剤のうち６個、ペプチド１、２、３、５、９およびψεＲＡＣＫ）が、ＷＴにおいてＭＡＲＣＫＳリン酸化を増加させたが、ＫＯ筋肉細胞では増加させなかったので、εＰＫＣに選択的な活性化剤である（図３Ａおよび３Ｂ、表２）。いくつかのペプチド（例えば、ペプチド１１および１３）は両細胞型においてＭＡＲＣＫＳリン酸化を増加させたので、εＰＫＣ特異的ではない。ＫＯにおいてＭＡＲＣＫＳリン酸化に影響を及ぼし、ＷＴ細胞では影響を及ぼさないというペプチドはなかった。ＭＡＲＣＫＳリン酸化アッセイは、機能の向上（すなわち、ＰＫＣ活性化）を示すために主に使用されたが、それにもかかわらず、ペプチド４、７、１２およびεＶ１−２は、ＷＴ細胞においてＭＡＲＣＫＳリン酸化を阻害した。
【００４８】
このリン酸化アッセイによって、εＰＫＣのＣ２ドメインに由来するいくつかのペプチドはＰＫＣの活性に影響を及ぼし、これらのペプチドの一部はアイソザイム選択的であることが示唆された。
【００４９】
Ｃ．ｅｘ  ｖｉｖｏにおける心保護
虚血および再潅流のｅｘ  ｖｉｖｏモデル（４７）を使用して、Ｃ２由来ペプチドをさらに特徴付けた。研究によって、虚血発症前に心臓においてεＰＫＣを活性化すると心筋の障害軽減がもたらされることが示された（４、７、５３〜５５）。（ランゲンドルフ装置を使用して）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて虚血および再潅流を受けた心臓をψεＲＡＣＫペプチドで前処理すると、障害（梗塞）の軽減がもたらされた（４、４３）。その他のＰＫＣアイソザイム（例えば、βＰＫＣ（４３））は、心保護に何ら影響を及ぼさず、εＰＫＣ活性化に逆効果さえ有するので（例えば、δＰＫＣ活性化は障害を増大させる（２２））、εＣ２由来ペプチドで灌流した後の心保護における変化は、εＰＫＣの調節のみを示している。
【００５０】
図４Ａおよび４Ｂは、虚血および再灌流のｅｘ  ｖｉｖｏモデルにおけるＣ２由来ペプチドの効果の分析を示す。図４Ａは、組織の梗塞を評価するために、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）で染色した処理心臓および対照心臓の代表的な横断面を示す。生きている組織は暗色に染色されたが、死んでいる組織は白色のままであった。図４Ｂは、染色に基づいた梗塞の大きさの定量化を示す。このデータは、（各カラムで示した）いくつかの実験の平均であり、統計学的な有意差は、マイクロソフトエクセルを使用したスチューデントｔ検定によって決定された。棒の網掛けは図３と同様である。ペプチドεＶ１−２を除いて、トランスロケーションまたはＭＡＲＣＫＳリン酸化アッセイで阻害活性を示したペプチド（すなわち、ペプチド４、７および１２）はいずれもｅｘ  ｖｉｖｏアッセイでは試験しなかった。
【００５１】
ＴＴＣ染色によって観察された障害のレベル（図４Ａ）およびＣＰＫの放出（筋肉が損傷を受けたとき筋細胞から放出される細胞質酵素、図４Ｂ）に基づいて、ペプチド２、５、６および９ならびに既に特徴付けられているεＰＫＣ選択的アゴニスト、ψεＲＡＣＫは心保護的であることが結論づけられ、これらのペプチドはεＰＫＣ選択的活性化剤であることが示された。ペプチド１および３は、心保護傾向があることが示されたが、そのデータは統計学的に有意ではなかった。ＷＴおよびＫＯ骨格筋細胞においてＭＡＲＣＫＳリン酸化を誘導しなかった４種類のペプチド、すなわち、ペプチド８および３種類の対照ペプチド（スクランブルεＶ１−２、スクランブルψεＲＡＣＫおよびＴＡＴ）は、心保護的ではなかった。ＷＴおよびＫＯ細胞の両方においてＭＡＲＣＫＳリン酸化を誘導するペプチド１１および１３はまた、おそらくεＰＫＣに加えて、対立アイソザイムδＰＫＣを活性化するので、心保護的ではなかった（２２）。ペプチド９による処理は、虚血を４０分の代わりに３０分のみ受けた心臓に関することに注意されたい。ｅｘ  ｖｉｖｏにおける心保護アッセイのこれらの結果を表２にまとめて示す。
【００５２】
Ｄ．ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＫＣのトランスロケーション
さらなるｉｎ  ｖｉｖｏ研究において、ペプチドの活性および選択性について、マウスに腹腔内（ＩＰ）注射によって注射した代表的ペプチドを使用して調べ、心臓におけるεＰＫＣ、δＰＫＣ、αＰＫＣおよびζＰＫＣのトランスロケーションの量を決定した。これら４種類のＰＫＣアイソザイムは、ＰＫＣの３種類の主要なサブファミリーのそれぞれを表す。特に、εＰＫＣおよびδＰＫＣは新規ＰＫＣファミリーのメンバーであり（カルシウム非感受性、ジアシルグリセロール感受性）、αＰＫＣは古典型ＰＫＣであり（カルシウムおよびジアシルグリセロール感受性）、ζＰＫＣは非定型ＰＫＣ（カルシウムおよびジアシルグリセロール非感受性）である。以前の研究によって、腹腔内に単回注射した後、心臓およびその他の器官におけるＰＫＣのトランスロケーションに対するＰＫＣ調節ペプチドの効果が示された（４８）。
【００５３】
マウス心臓の微粒子画分中におけるεＰＫＣ、δＰＫＣ、αＰＫＣおよびζＰＫＣのレベルは、各ペプチド２０ｎｍｏｌをＩＰ注射してから１５分後にイムノブロットによってアッセイした（図５Ａ〜５Ｄ）。添付したグラフは、２種類の実験に基づいた量を示したもので、微粒子画分／全画分における増加倍率（＋／−標準誤差）として計算し、アクチン添加対照に対して正規化し、対照ＴＡＴペプチドと比較している。ψεＲＡＣＫペプチド、ペプチド１およびペプチド５は、εＰＫＣのトランスロケーションを引き起こしたが、δＰＫＣ、ζＰＫＣおよびαＰＫＣは引き起こさなかったので、これらのペプチドはεＰＫＣ選択的活性化剤であることが示された。ペプチド１１および１３は、εＰＫＣノックアウトマウスの筋細胞中においてＭＡＲＣＫＳリン酸化を引き起こしたので（図３）、これらはいくつかのＰＫＣアイソザイムを活性化したと結論づけられる。さらに、これらのペプチドは、心臓を虚血障害から保護しなかったので、これらは心保護アイソザイム、εＰＫＣ（４、２２、５６）およびδＰＫＣなどの心臓障害を媒介する１種または複数のアイソザイム（２２、３８）の両方を活性化するものと考えられる。ペプチド１１をＩＰ注射すると、δＰＫＣ、αＰＫＣおよびεＰＫＣの実質的なトランスロケーションが引き起こされ（図５Ｃ）、ペプチド１１がＰＫＣの無差別な活性化剤であると示唆したその他の所見と一致した。
【００５４】
可溶性細胞画分にのみ存在する非定型ζＰＫＣは、試験したいかなるペプチドにも応答してトランスロケーションすることはなかった（図５Ｄ）。対照ペプチド（スクランブルεＶ１−２）は、εＰＫＣもδＰＫＣも増加させなかった（図５Ｃ）。
【００５５】
Ｅ．結果の概要
前記の実験で試験したペプチドは、εＣ２ドメインのβシート領域のほとんど全部、および、εＣ２ドメインの上部および下部ループ領域の一部を網羅していた（図１Ａ〜１Ｄ）。各プチドの生物学的活性を表１に示す。εＰＫＣのＣ２ドメインに由来するペプチドは全て、２種類の細胞をベースにしたアッセイ（すなわち、トランスロケーションおよびＭＡＲＣＫＳリン酸化、図２および３）においてεＰＫＣの活性を調節した。εＰＫＣのトランスロケーションの増加およびＭＡＲＣＫＳリン酸化の増加によって示されるように、これらのうち、１０個のペプチドがεＰＫＣ活性化剤であった（ペプチド１、２、３、５、６、９、１０、ψεＲＡＣＫ、１１および１３）。これらのペプチドは、εＰＫＣ残基４〜１２、２８〜４１、４９〜６０、７４〜９２、１１２〜１１８および１２５〜１３１に対応する。２種類の細胞をベースにしたアッセイにおいてεＰＫＣを活性化した５種類のペプチド、すなわち、εＰＫＣ残基２８〜３５、４９〜６０、７４〜７９、および８５〜９２に対応するペプチド２、５、６、９およびψεＲＡＣＫは、心保護的であった（図４）。これらの５種類のペプチドのうち、４種類（ペプチド２、５、９およびψεＲＡＣＫ、すなわち、残基２８〜３５、４９〜５３、７４〜７９および８５〜９２）は、ＷＴまたはεＰＫＣ  ＫＯマウスから得られた細胞を使用したＭＡＲＣＫＳリン酸化によって測定すると、εＰＫＣ選択的であった（図３）。
【００５６】
ペプチド２種（ペプチド１１および１３）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＰＫＣを活性化したが、εＰＫＣ選択的ではなかった（図２および３）。これらのペプチドは、εＰＫＣ残基１１２〜１１８および１２５〜１３１に対応する。この２種類のペプチドは、虚血および再灌流からの心保護をもたらさなかったので（図４）、虚血による心臓障害を増大させるＰＫＣアイソザイム（例えば、δＰＫＣ）に影響を及ぼすことが示唆された（２２）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるトランスロケーションの研究によって、ペプチド１１がδおよびεＰＫＣならびにαＰＫＣを活性化したことが確認された（図５）。
【００５７】
４種類のペプチド（ペプチドεＶ１−２、４、７および１２）は、εＰＫＣ阻害剤であった（図２および３）。これらのペプチドは、εＰＫＣ残基１４〜２１、４０〜４７、６２〜６７および１１９〜１２４に対応する。
【００５８】
総合すると、これらの結果によって、ペプチドによって表されたＣ２ドメインの特定の領域に応じて、εＣ２ドメイン由来ペプチドが活性化剤または阻害剤としてεＰＫＣの生物学的活性を調節する能力が示される。
【００５９】
ＩＩＩ．処理方法
本明細書で記載したデータは、εＰＫＣのＣ２領域に由来する活性化剤ペプチドが虚血性心臓障害の動物モデルにおいて心保護的であることを示している。このようなペプチドは、虚血後の心不全の進展の遅延または阻害、生存期間の延長、左室径短縮率の減少、体重に対する左心室重比の減少、線維症の減少、対象におけるＥＫＧ／ＥＣＧの健康な動物におけるＥＫＧ／ＥＣＧへの近似、および／または、それらの組み合わせに有用である。これらのペプチドは、移植操作中の虚血障害から心臓を保護するために特別な重要性を有するかもしれない。
【００６０】
ヒトまたはその他の動物（好ましくは哺乳動物）に投与するためのＣ２由来ペプチドは、天然のアミノ酸、例えば、Ｌ−アミノ酸または非天然アミノ酸、例えば、Ｄ−アミノ酸を含んでよい。ペプチド中のアミノ酸は、ペプチド結合によって結合していてよく、または、本明細書で説明した改変ペプチド中では、非ペプチド結合によって結合していてよい。アミノ酸を結合するアミド結合には多種多様な改変を行うことができ、当該分野では公知である。そのような改変は、一般的な総説（例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，  Ｒ．Ｍ．、２００３年、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、４６巻、５５５３頁、Ｒｉｐｋａ，  Ａ．Ｓ．およびＲｉｃｈ，  Ｄ．Ｈ．、１９９８年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２巻、４１１頁）に論じられている。これらの改変は、ペプチドの効力を増大させるか、ペプチドの半減期を延長させることによって、ペプチドの特性を改善するように設計される。
【００６１】
ペプチドの効力は、立体的可動性を制限することによって増加させることができる。これは、例えば、アミド結合の窒素またはアルファ炭素に付加的アルキル基を配置することを含めて、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎらのペプトイド戦略およびＧｏｏｄｍａｎらのアルファ改変などによって実現することができる（例えば、１９９６年、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．  Ｃｈｅｍ．、６８巻、１３０３頁を参照）。アミド窒素およびアルファ炭素を一緒に結合させて、さらに制約することができる（Ｓｃｏｔｔら、２００４年、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔｓ．、６巻、１６２９〜３２頁）。
【００６２】
ペプチドの半減期は、ペプチド鎖に分解不可能な部分を導入することによって増加させることができる。これは、例えば、尿素残基（Ｐａｔｉｌら、２００３年、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６８巻、７２７４〜８０頁）またはアザ−ペプチド結合（ＺｅｇａおよびＵｒｌｅｂ、２００２年、Ａｃｔａ  Ｃｈｉｍ．  Ｓｌｏｖ．、４９巻、６４９〜６２頁）によるアミド結合の置換によって実現することができる。ペプチド鎖に導入することができる分解不可能な部分のその他の例には、さらなる炭素「ベータペプチド」（Ｇｅｌｌｍａｎ，  Ｓ．Ｈ．、１９９８年、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．、３１巻、１７３頁）またはエテン単位（Ｈａｇｉｈａｒａら、１９９２年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１１４巻、６５６８頁）のその鎖への導入、またはヒドロキシエチレン部分の使用（Ｐａｔａｎｉ，  Ｇ．  Ａ．およびＬａｖｏｉｅ，  Ｅ．  Ｊ．、１９９６年、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．、９６巻、３１４７〜７６頁）が含まれ、これらはまた当該分野では公知である。さらに、１種または複数のアミノ酸を、等電子部分、例えば、Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎらのピロリノン（２０００年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２２巻、１１０３７頁）またはテトラヒドロピラン（Ｋｕｌｅｓｚａ，  Ａ．ら、２００３年、Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔｓ．、５巻、１１６３頁）などによって置換することができる。半減期を延長するための一般的な改変は、ペグ化である。
【００６３】
ペプチドは、主にＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのアミノ酸配列を参照にして説明したが、ペプチドは本明細書で記載した特異的なアミノ酸配列に限定されないことは理解されたい。当業者であれば、本明細書で記載したようなアミノ酸配列相同性および有利な機能性のため、本明細書で説明した配列に関連するかまたは十分類似しているが、長さが異なり構成要素が異なる、例えば、アミノ酸の挿入、置換、欠失などを有するポリペプチドが、変異および／または進化の過程を通じて生じ得ることを認識するだろう。
【００６４】
本明細書で記載したペプチドは、本明細書で記載したアミノ酸配列に少なくとも約５０％の同一性があり、類似の様式の機能を有する、本明細書で記載したアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を包含する。好ましくは、アミノ酸配列は、記載した配列との同一性が少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である。パーセント同一性値の例は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％である。パーセント同一性は、例えば、国立衛生研究所（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）で利用可能なバージョン２．２．９を含むＡｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを使用して、配列情報を比較することによって決定することができる。このＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ．のアラインメント法（１９９０年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７巻、２２６４〜６８頁）に基づいており、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年、Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜１０頁）、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０巻、５８７３〜７７頁）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻、３３８９〜３４０２頁）で論じられている通りである。
【００６５】
本発明で有利に利用できるペプチドの誘導体を得るために、保存的アミノ酸置換をアミノ酸配列に行うことができる。保存的アミノ酸置換には、当該分野で公知であるように、また本明細書で参照したように、例えば、構造、大きさおよび／または化学的特性に関して類似の側鎖を有するアミノ酸でタンパク質中のアミノ酸を置換することが含まれる。例えば、以下の群のそれぞれのアミノ酸は、同群のその他のアミノ酸で交換可能である。グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、セリンおよびトレオニンなどの非芳香族でヒドロキシル基含有側鎖を有するアミノ酸、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖を有するアミノ酸、グルタミンおよびアスパラギンを含む、アミド側鎖を有するアミノ酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンを含む、塩基性アミノ酸、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを含む、芳香族環側鎖を有するアミノ酸およびシステインおよびメチオニンを含む硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸。さらに、アスパラギン酸、グルタミン酸およびそれらのアミドはまた、本明細書では交換可能であると見なす。
【００６６】
いくつかの実施形態では、Ｃ２由来ペプチドを、ペプチド阻害剤の細胞取り込みを増加させることができる細胞透過性担体タンパク質またはペプチドと結合させる。一例では、ショウジョウバエのアンテナペディアホメオドメイン由来配列（ＣＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号３２）を、Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，  Ｌ．ら（１９９５年、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１５巻、７１５８〜６７頁）およびＪｏｈｎｓｏｎ，  Ｊ．Ａ．ら（１９９６年、Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ、７９巻、１０８６頁）で論じられたようなＮ末端Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を介した架橋結合によって、Ｃ２由来ペプチドに付加させる（すなわち、結合させる）。いくつかの実施形態では、Ｃ２由来ペプチドは、細胞透過性担体ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端のシステイン残基間に結合させる。このようなシステイン残基は、天然に生じるペプチド配列の一部であってよく、または天然に生じるペプチド配列に付加してよい。
【００６７】
本発明のペプチドは、トランス活性化調節タンパク質（Ｔａｔ）由来輸送ポリペプチド（例えば、Ｖｉｖｅｓら、（１９９７年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ、２７２巻、１６０１０〜１７頁）、米国特許第５８０４６０４号および遺伝子バンク受入番号ＡＡＴ４８０７０に記載されたようなヒト免疫不全ウイルス１型由来のＴａｔのアミノ酸４７〜５７（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号３１））によって、またはＭｉｔｃｈｅｌｌら（２０００年、Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．、５６巻、３１８〜２５頁）およびＲｏｔｈｂａｒｄら（２０００年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、６巻、１２５３〜５７頁）に記載されたようなポリアルギニンで改変した。このようなＴＡＴ由来細胞透過性担体ペプチドは、直前に記載したように、システイン残基間のＣ２由来ペプチドに結合することができる。
【００６８】
ＰＫＣ配列および細胞透過性担体ペプチド配列の両方を有するＣ２由来ペプチドはまた、追加のシステイン残基を有するものも有さないものも、例えば、阻害剤ペプチドおよび細胞透過性担体ペプチド配列の両方を有する単一のペプチドを作製するための標準的方法を使用して合成することができる。Ｃ２由来ペプチドは、ペプチドの細胞取り込みを増加させるために、当業者に公知のその他の方法によって改変することができる。
【００６９】
Ｃ２由来ペプチドは、様々な形態で有利に投与することができる。例えば、Ｃ２由来ペプチドは、舌下投与のために錠剤形態で、溶液またはエマルジョンで投与することができる。Ｃ２由来ペプチドはまた、薬剤として許容される担体または媒体と混合することができる。この媒体は、例えば、非経口投与に適した、水、生理食塩水もしくはその他の水性溶液を含む液体であってよく、または油もしくはエアロゾルであってよい。担体は、静脈内投与または動脈内投与のために選択してよく、当該分野で公知の保存剤、静菌剤、緩衝剤および抗酸化剤を含む滅菌された水性または非水性溶液を含んでよい。エアロゾル形態では、阻害剤は、分散性を最適にするために、当該分野で公知の粒子の大きさ、形態および表面エネルギーを含む特性を備えた粉末として使用することができる。錠剤の形態では、固形担体には、例えば、乳糖、澱粉、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、合成もしくは天然のカルシウムアロケート（ａｌｌｏｃａｔｅ）、酸化マグネシウム、乾燥水酸化アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、重炭酸ナトリウム、乾燥酵母またはそれらの組み合わせを含めることができる。錠剤は、好ましくは、経口での溶解を助ける１種または複数の薬剤を含む。Ｃ２由来ペプチドはまた、当該分野で公知のその他の類似の薬物を投与する形態で投与することができる。
【００７０】
Ｃ２由来ペプチドは、様々な経路によって患者に投与することができる。例えば、ペプチドは、腹腔内、静脈内、動脈内、皮下または筋肉内を含む非経口的に投与することができる。Ｃ２由来ペプチドはまた、直腸内および膣内を含む粘膜表面を介して投与することができ、吸入を含む鼻腔内、舌下、眼球内および経皮的に投与することができる。これらの投与経路の組み合わせもまた、想定される。好ましい投与様式は、動脈から、または閉塞したもしくは部分的に閉塞しているような動脈に接続した動脈からの注入もしくは再灌流による。「部分的に閉塞した動脈」とは、本明細書では、虚血性発作または心臓の血管に影響を及ぼすその他の低酸素事象の後で、このような事象または発作がおこる前の血流と比較すると、血流が減少している動脈を意味する。
【００７１】
ある実施形態では、Ｃ２由来ペプチドは、第２の治療薬を有する組成物中において一緒に投与することができる。この方法では、当業者であれば、虚血性心不全の進展を遅延するため、または阻害するための薬剤を調製するために、Ｃ２由来ペプチドは、個別に、第２の治療薬と組み合わせて、またはそれと一緒にして、使用できるということを理解するだろう。
【００７２】
他の局面および実施形態は、本発明の教示を考慮すれば当業者には明らかであろう。前記の説明および以下の実施例は、限定を意味するものではない。
【実施例】
【００７３】
実験方法
ペプチド合成−ペプチドは、Ａｎａｓｐｅｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡによって、合成され、システインＳ−Ｓ結合を介してＴＡＴ担体ペプチド（残基４７〜５７）に結合した。ペプチドは５個から８個の残基であり、εＰＫＣのＣ２／Ｖ１ドメインの配列を表している。３種の対照ペプチド、スクランブルεＶ１−２、スクランブルεψＲＡＣＫおよびＴＡＴ担体ペプチドのみも合成した。配列を含む合成ペプチドの概要は表１を参照のこと。
【００７４】
細胞中におけるＰＫＣのトランスロケーション−ＣＨＯ細胞の可溶性画分から微粒子画分へのεＰＫＣのトランスロケーションは、活性化（膜結合）εＰＫＣの相対量を評価するために使用したが、既に記載されたアッセイである（４２）。トランスロケーションは、微粒子画分におけるＰＫＣの量の増加または可溶性画分における減少が証拠となる。簡単に説明すると、刺激後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、ホモゲナイズ緩衝液で掻き取り、（２５Ｇ５／８”）シリンジ針に通し、４℃において１００，０００ｇで３０分間回転させた。その後、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むホモゲナイズ用緩衝液でペレットを再懸濁した。適用できる場合、刺激前に細胞をペプチド５００ｎＭで１５分間予めインキュベートした。ＰＫＣを最大下レベルの一般的なＰＫＣ活性化剤、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ、３ｎＭ）で刺激した。次に、その試料をウェスタンブロットで分析した。εＰＫＣに対する抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から入手し、１：５００に希釈して使用した。添加対照として使用したアクチンに対する抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手し、１：１０００に希釈して使用した。
【００７５】
細胞中におけるＰＫＣ基質リン酸化−一般的なＰＫＣ基質であるミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）のリン酸化は、細胞溶解物のウェスタンブロットによってモニターした。ペプチドによるＰＫＣ活性化およびεＰＫＣに対するそれらの特異性を評価するために、前述のように（４６）、野生型初代骨格筋細胞におけるＭＡＲＣＫＳリン酸化をεＰＫＣノックアウトマウスから単離した初代骨格筋細胞におけるＭＡＲＣＫＳリン酸化と比較した（４５）。初代骨格筋細胞は、既に発表されたように調製した（４６）。εＫＯ細胞は、εＰＫＣノックアウトマウスから調製した（４５）。εＰＫＣ阻害アッセイについては、ＷＴ細胞をペプチド７  １μＭで１５分間処理し、その後、細胞を溶解する前に、ψεＲＡＣＫ（５００ｎＭ）を３０分間添加した。リン酸化ＭＡＲＣＫＳに対する抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から入手し、１：５００に希釈して使用した。添加対照として使用したアクチンに対する抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手し、１：１０００に希釈して使用した。
【００７６】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおける心保護−虚血前にεＰＫＣを活性化することによって、急性虚血性心臓障害のｅｘ  ｖｉｖｏモデルにおいて心保護がもたらされる（１３）が、以前に記載されたアッセイである（４７）。簡単に説明すると、ウィスターラット（３００ｇから３５０ｇ）をヘパリン処理し（１０００Ｕ／ｋｇ  ＩＰ）、その後ペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）で麻酔した。心臓を迅速に摘出し、次いで、ランゲンドルフ心灌流システムによって、ＮａＣｌ（１２０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＫＣｌ（５．８ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＮａＨ２ＰＯ４（１．２ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４（１．２ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＣａＣｌ２（１．０ｍｍｏｌ／Ｌ）およびデキストロース（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を含有する酸素化Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液、ｐＨ７．４で３７℃において灌流した。冠状動脈流は一定流速１０ｍＬ／分を使用した。心臓を熱ジャケットオーガンバス（Ｏｒｇａｎ  ｂａｔｈ）に３７℃で浸漬した。冠状動脈流出液を収集し、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）放出を測定した。平衡になってから１０分後、心臓を４０分間全虚血し、６０分間再灌流した。虚血前に、心臓をＴＡＴ結合ペプチド１μＭで１０分間灌流した。心筋細胞溶解の基準である放出ＣＰＫの相対量に加えて、組織損傷は、以前に記載したように（３８）、梗塞を起こした（死んだ）組織の量を定量するための心臓横断面のトリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）染色によって評価した。
【００７７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアイソザイム選択性−活性化剤ペプチドが引き起こすＭＡＲＣＫＳリン酸化および心臓における虚血−再灌流による障害の減少が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるεＰＫＣのトランスロケーションを誘導することを測定するために、既に報告したように（４８）、生理食塩水２００μｌに溶かしたそれぞれのペプチド２０ｎｍｏｌを１５〜２０ｇのマウスの腹腔内に注射した。１５分後、マウスを屠殺し、心臓および脳を採取した。マウス組織から可溶性画分および微粒子画分を前述のように調製した（４８）。ε、ζおよびδＰＫＣのトランスロケーションは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡの選択的抗ＰＫＣ抗体を使用してウェスタンブロット分析により測定し、その抗体は１：５００希釈で使用した。筋節アクチン（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）を全画分の添加対照として使用した。
【００７８】
いくつかの例示の局面および実施形態を前記に説明したが、当業者であれば、ある種の変更、変形、付加およびそれらの部分的な組み合わせは理解できよう。したがって、以下に添付した特許請求の範囲および以下に紹介した特許請求の範囲は、このような変更、変形、付加および部分的組み合わせ全てをそれらの真の発明の意図および範囲内であるように含むと解釈するものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年10月2日(2009.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
εＰＫＣのＣ２ドメインに由来する連続アミノ酸配列を含むペプチドを治療有効量含む、哺乳動物対象の虚血性心臓障害を調節するための薬剤組成物であって、該εＰＫＣのＣ２ドメインが配列番号１によって表される、薬剤組成物。
【請求項２】
前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基８５〜９２に対応するアミノ酸配列を含まない、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
前記εＰＫＣペプチドが、ψεＲＡＣＫ（配列番号１８）ではない、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記εＰＫＣペプチドが、εＰＫＣのアミノ酸残基２８〜３５、４９〜６０および７４〜７９に対応する連続アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
前記εＰＫＣペプチドが、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１６からなる群から選択された配列に対応する連続アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
前記εＰＫＣペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基２８〜３５、４９〜５３または７４〜７９に対応する連続アミノ酸配列を含む、請求項４に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
前記εＰＫＣペプチドが、配列番号９、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択された配列に対応する連続アミノ酸配列を含む、請求項５に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
前記εＰＫＣペプチドが、εＰＫＣのＣ２ドメインのベータ−サンドイッチ領域に対応する、請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
前記ペプチドが、配列番号１に由来する連続アミノ酸配列を含むペプチドの細胞取り込みを増加させるペプチドと結合している、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
前記εＰＫＣのＣ２ドメインに由来する連続アミノ酸配列を含むペプチドの細胞取り込みを増加させる前記ペプチドがＴＡＴである、請求項９に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
前記哺乳動物対象が心臓移植患者である、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）のＣ２ドメインに由来する連続アミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、前記ＰＫＣの活性を調節するペプチド。
【請求項１３】
タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の前記Ｃ２ドメインがεＰＫＣのＣ２ドメインであり、該εＰＫＣのＣ２ドメインが配列番号１によって表される、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基１４〜２１または８５〜９２に対応する配列を含まない、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドが、εＶ１−２（配列番号７）またはψεＲＡＣＫ（配列番号１８）ではない、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記ペプチドがεＰＫＣの活性化剤である、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１７】
配列番号１に由来する前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸残基２８〜３５、４９〜６０または７４〜７９に対応する、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
配列番号１に由来する前記アミノ酸配列が、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１６からなる群から選択される、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１９】
配列番号１に由来する前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸残基２８〜３５、４９〜５３および７４〜７９に対応する、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項２０】
配列番号１に由来する前記アミノ酸配列が、配列番号９、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択される、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチドが、哺乳動物対象における虚血性心臓障害を軽減させる、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項２２】
前記ペプチドが、哺乳動物対象における虚血性心臓障害を軽減させる、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２３】
前記ペプチドがεＰＫＣの阻害剤である、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項２４】
配列番号１に由来する前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸残基４０〜４７、６２〜６７または１１９〜１２４に対応する、請求項２３に記載のペプチド。
【請求項２５】
配列番号１に由来する前記アミノ酸配列が、配列番号１１、配列番号１４および配列番号２１からなる群から選択される、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２６】
前記ペプチドが、ＰＫＣのＣ２ドメインに由来する連続アミノ酸配列を含むペプチドの細胞取り込みを増加させるペプチドと結合している、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項２７】
前記ＰＫＣのＣ２ドメインに由来する連続アミノ酸配列を含むペプチドの細胞取り込みを増加させる前記ペプチドがＴＡＴである、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項２８】
前記ペプチドが、配列番号１の約５と９の間のアミノ酸残基の連続配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項２９】
前記ペプチドが、配列番号１の約５と９との間のアミノ酸残基の連続配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１２に記載の薬剤組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
εＰＫＣのＣ２ドメインに由来する連続アミノ酸配列を含むペプチドを治療有効量投与することを含む、哺乳動物対象の虚血性心臓障害を調節する方法。
（項目２）
上記ペプチドが、εＰＫＣのＣ２ドメインのアミノ酸残基８５〜９２に対応するアミノ酸配列を含まない、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記εＰＫＣペプチドが、ψεＲＡＣＫ（配列番号１８）ではない、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記εＰＫＣペプチドが、εＰＫＣのアミノ酸残基２８〜３５、４９〜６０および７４〜７９に対応する連続アミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記εＰＫＣペプチドが、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１６からなる群から選択された配列に対応する連続アミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記εＰＫＣペプチドが、εＰＫＣのアミノ酸残基２８〜３５、４９〜５３および７４〜７９に対応する連続アミノ酸配列を含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
上記εＰＫＣペプチドが、配列番号９、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択された配列に対応する連続アミノ酸配列を含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
上記εＰＫＣペプチドが、εＰＫＣのＣ２ドメインのベータ−サンドイッチ領域に対応する、項目２に記載の方法。
（項目９）
上記ペプチドが、上記ペプチド阻害剤の細胞取り込みを増加させるペプチドと結合している、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記ペプチド阻害剤の細胞取り込みを増加させる上記ペプチドがＴＡＴである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記哺乳動物対象が心臓移植患者である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）のＣ２ドメインに由来する連続アミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、上記ＰＫＣの活性を調節するペプチド。
（項目１３）
タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の上記Ｃ２ドメインがεＰＫＣのＣ２ドメインである、項目１２に記載のペプチド。
（項目１４）
上記ペプチドが、εＰＫＣのＣ２ドメインのアミノ酸残基１４〜２１または８５〜９２に対応する配列を含まない、項目１３に記載のペプチド。
（項目１５）
上記ペプチドが、εＶ１−２（配列番号７）またはψεＲＡＣＫ（配列番号１８）ではない、項目１３に記載のペプチド。
（項目１６）
上記ペプチドがεＰＫＣの活性化剤である、項目１４に記載のペプチド。
（項目１７）
ＰＫＣのＣ２ドメインに由来する上記アミノ酸配列が、εＰＫＣのアミノ酸残基２８〜３５、４９〜６０および７４〜７９に対応する、項目１６に記載のペプチド。
（項目１８）
ＰＫＣのＣ２ドメインに由来する上記アミノ酸配列が、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１６からなる群から選択された配列に対応するアミノ酸配列である、項目１６に記載のペプチド。
（項目１９）
ＰＫＣのＣ２ドメインに由来する上記アミノ酸配列が、εＰＫＣのアミノ酸残基２８〜３５、４９〜５３および７４〜７９に対応する、項目１７に記載のペプチド。
（項目２０）
ＰＫＣのＣ２ドメインに由来する上記アミノ酸配列が、配列番号９、配列番号１２および配列番号１６からなる群から選択された配列に対応するアミノ酸配列である、項目１８に記載のペプチド。
（項目２１）
上記ペプチドが、哺乳動物対象における虚血性心臓障害を軽減させる、項目１７に記載のペプチド。
（項目２２）
上記ペプチドが、哺乳動物対象における虚血性心臓障害を軽減させる、項目１８に記載のペプチド。
（項目２３）
上記ペプチドがεＰＫＣの阻害剤である、項目１５に記載のペプチド。
（項目２４）
ＰＫＣのＣ２ドメインに由来する上記アミノ酸配列が、εＰＫＣのアミノ酸残基４０〜４７、６２〜６７および１１９〜１２４に対応する、項目２３に記載のペプチド。
（項目２５）
ＰＫＣのＣ２ドメインに由来する上記アミノ酸配列が、配列番号１１、配列番号１４および配列番号２１からなる群から選択された配列に対応するアミノ酸配列である、項目２１に記載のペプチド。
（項目２６）
上記ペプチドが、上記ペプチド阻害剤の細胞取り込みを増加させるペプチドと結合している、項目１２に記載のペプチド。
（項目２７）
上記ペプチド阻害剤の細胞取り込みを増加させる上記ペプチドがＴＡＴである、項目２６に記載のペプチド。
前述の例示的局面および実施形態に加えて、図面を参照し、以下の説明を検討することによって、さらなる局面および実施形態が明らかになるであろう。
【国際調査報告】
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