(57)【要約】  本発明は、カンナビジオールおよびデンビノビンを含有してなる組成物、および、例えば、胃腸の炎症性疾患の予防および治療のための、および胃腸の癌の予防および治療のための医薬としてのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表２に特定した明確な相乗作用濃度でカンナビジオールおよびデンビノビンを含有してなる組成物であって、デルタ−９−テトラヒドロカンナビジオールの含有率が当該組成物総重量の０．７％未満である組成物。
【請求項２】
大麻植物がカンナビスサティバ（Cannabis sativa）から選択される請求項１記載の組成物。
【請求項３】
大麻植物がカンナビスサティバ（Cannabis sativa）の変種ＣＡＲＭＡから選択される請求項２記載の大麻にもとづく組成物。
【請求項４】
医薬として使用するための請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
炎症性疾患の治療および／または予防に使用する請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
炎症性疾患の治療および／または予防のための医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項７】
癌の治療に使用する請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
癌の治療のための医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１種の非向精神性カンナビノイドおよび／または少なくとも１種のフェノール性もしくはフラボノイド化合物および／またはデンビノビンを含有してなる組成物、および胃腸の炎症性疾患の予防および治療のための、および胃腸の癌の予防および治療のためのそれらの使用に関する。本発明はまた植物カンナビスサティバ（Cannabis sativa）、特に選択された変種ＣＡＲＭＡから得られる植物抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
麻植物、カンナビスサティバ（Cannabis sativa）の治療的性質は、大昔の太古から知られているが、その代謝産物Δ−９−テトラヒドロカンナビノイド（ＴＨＣ）にもとづくその幸福感にあふれた作用およびその他の向精神作用を娯楽的に使用したことが、その可能性のある医薬としての適用を久しく制限してきた。ＴＨＣはＣＢ１受容体（カンナビノイドＩ型受容体）の強力なアゴニストであり、このアゴニストは神経細胞で高度に発現し、当該植物の向精神作用を仲介する役割を果たしている。また、ＴＨＣは数種のタイプの癌に対して研究されており（例えば、非特許文献１および２参照）、またＴＨＣがＣＢ１−依存性および非依存性経路両方により、抗腫瘍作用を及ぼし得るという証明が増加しつつあり（例えば、非特許文献３参照）、向精神活性を欠く他のＴＨＣ−類似体（合成または天然物）が、抗腫瘍活性を保持し得ることも示されている（例えば、非特許文献４参照）。カンナビスサティバ（C. sativa）は少なくとも４００種の化学成分を含み、その６０種以上がカンナビノイドの分類に属していることが判明している（例えば、非特許文献５参照）。
【０００３】
他方、カンナビスサティバは歴史的に、下痢、その他の胃腸障害の治療に使用されてきた。かかる歴史的使用の理由の一つは、エンドカンナビノイド系が消化系に広く分布しているという事実にある（例えば、非特許文献６参照）。他にも、最近の薬理学研究は、ＴＨＣが腸内粘膜下組織神経細胞中のＣＢ１受容体を活性化することにより、胃腸管の活動を阻害することを示している（例えば、非特許文献７参照）。幾つかの他の実験もまた、ＴＨＣが、腸内炎症性疾患（ＩＢＤ）を誘発したマウスにおいて、腸内の炎症を低減することを示している（例えば、非特許文献８参照）。しかしながら、カンナビスサティバに帰される抗炎症活性の多くには、ＴＨＣ以外の化合物が介在していると思われる（例えば、非特許文献９参照）。それにも拘らず、非向精神性カンナビノイド、例えば、カンナビジオール（ＣＢＤ）およびカンナビゲロール（ＣＢＧ）などを含有し、ＴＨＦを欠くカンナビス由来の植物抽出物の生物活性については、未だに研究されていない。
【０００４】
カンナビノイドに加えて、カンフラビン（Cannflavin）ＡおよびＢなどの他のフェノール性化合物が、植物カンナビスサティバから分離されている（例えば、非特許文献１０参照）。カンフラビンＡは、プロスタグランジンＥ２の放出を阻害し得ることから、潜在的な抗炎症活性を有する（例えば、非特許文献１１参照）。前炎症性プロスタグランジンＥ２は、アラキドン酸をプロスタグランジンと他の脂質メディエーターに変換するＣＯＸ−２の酵素活性により生産される。腫瘍サプレッサー腺腫性結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）の機能の欠如と、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の過剰発現との間の一過性の会合がインビボで証明され、それがＡＰＣはＣＯＸ−２の発現を制御するという仮説に導いた。さらに、ＣＯＸ−２インヒビターは結腸癌を予防する化学予防剤であるという証明もある（例えば、非特許文献１２および１３参照）。
【０００５】
非テルペノイド起源のフェナントレンキノンは、植物界においてその存在が比較的稀であるが、一方、酸素化されたフェナントレンはより広く分布する。１，４−フェナントレンキノンの３つの主要なグループは、それらの構造および生合成に従って、識別し得る。第一グループの代表は、ヒドロキシ−およびメトキシ−置換化合物、例えば、アンノキノン−Ａ、シプリペジン、デンビノビンおよびコンブレスタチン（combrestatin）である（例えば、非特許文献１４参照）。興味深いことに、デンビノビンは白血病および結腸癌細胞株に対して抗腫瘍活性を有することが示されている（例えば、非特許文献１５および１６参照）。デンビノビンはランのデンドロビウム・ノビレ（Dendrobium nobile）から最初に単離された（例えば、非特許文献１７参照）。しかしながら、１，４−フェナントレンキノンはヨーロッパの様々な場所で栽培したデンドロビウム・ノビレからは抽出できなかった（例えば、非特許文献１４参照）。さらに最近、ある種の麻（Cannabis cultivars）がデンビノビンを含有し、このものがＴ細胞においてＨＩＶ−１の複製を阻害し得ることが示されている（例えば、非特許文献１８参照）。
【０００６】
炎症と癌の関係は、ヴァーチョウ（Virchow）が１９世紀に最初に示唆した。しかし、二三年前、このことについて真の知識が知られるようになった。今日、慢性の感染症と炎症が腫瘍発生の高リスクファクターであり、すべての癌の１５ないし２０％がそれに当てはまることが知られている。炎症における最も重要な分子メディエーターは、腫瘍促進過程にも関与するＮＦ−κＢ（核因子カッパＢ）転写因子である（例えば、非特許文献１９参照）。慢性炎症におけるＮＦ−κＢの活性化は、取分け、胃腸の発癌現象に関わる場合、取分け、すべての結腸癌の５％までに現れる大腸炎関連癌（ＣＡＣ）において関連がある（例えば、非特許文献２０参照）。潰瘍性大腸炎の患者におけるＣＡＣの累積発生率は、８％と４３％の間で変動する（例えば、非特許文献２１参照）。ＮＦ−κＢは、基底膜におけるマクロファージの核内に、またＩＢＤおよび結腸直腸癌の患者の生体組織の上皮細胞に観察されている（例えば、非特許文献２２参照）。ポリープ状腺腫内のマクロファージにおけるＮＦ−κＢの活性化およびＣＯＸ−２発現の増加もまた示されている（例えば、非特許文献２３参照）。浸潤マクロファージにおけるＣＯＸ−２発現は、結腸発癌現象の進展における最初の過程と考えられる（例えば、非特許文献２４参照）。
【０００７】
ＮＦ−κＢの同定以来、その活性化経路に関与し、従って炎症と癌の原因となるタンパク質の多くが、多くの薬物の分子標的となり得ることが示唆されている。これら薬物の一部のものはこれまでに発見されたものであり、また一部は臨床試行にて試験されつつある（例えば、非特許文献２５参照）。実験モデルは、ＮＦ−κＢインヒビターが急性腸炎症性疾患に潜在的に活性であることを示唆している（例えば、非特許文献２６参照）。特定の動物モデルを使用することにより、最近、炎症に起因する結腸直腸癌の発生におけるＮＦ−κＢの役割が確認されている（例えば、非特許文献２７参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Guzman M著，「カンナビノイド；有力な抗癌剤（Cannabinoids; potential anticancer agents）」，Nat Rev Cancer. 2003 Oct; 3(10):745-55
【非特許文献２】Blazquez C, Casanova ML, Planas A, Del Pulgar TG, Villanueva C, Fernandez-Acenero MJ, Aragones J, Huffman JW, Jorcano JL, Guzman M著，「カンナビノイドによる腫瘍血管形成阻害（Inhibition of tumor angiogenesis by cannabinoids）」，FASEB J. 2003 Mar; 17(3): 529-31
【非特許文献３】Kogan NM著，「カンナビノイドと癌（Cannabinoids and cancer）」，Mini Rev Med Chem. 2005 Oct;5(10): 941-52
【非特許文献４】Ligresti A, Moriello AS, Starowicz K, Matias I, Pisanti S, De Petrocellis L, Laezza C, Portella G, Bifulco M, Di Marzo V著，「ヒト乳癌に対するカンナビジオールの作用を強調する植物カンナビノイドの抗腫瘍活性（Antitumor activity of plant cannabinoids with emphasis on the effect of cannabidiol on human beast carcinoma）」，J Pharmacol Exp Ther. 2006 Sep; 318(3): 1375-87
【非特許文献５】Stern E, Lambert DM著，「医化学は植物カンナビノイドの周辺で努力している（Medicinal Chemistry endeavors around the phytocannabinoids）」，Chem Biodivers. 2007 Aug;4(8): 1707-28
【非特許文献６】Kulkarni-Narla A, Brown DR著，「ブタ腸内神経系におけるＣＢ１−カンナビノイド受容体免疫反応性の局在化（Localization of CB1-cannabinoid receptor immunoreactivity in the porcine enteric nervous system）」，Cell Tissue Res. 2000 Oct; 302(1): 73-80
【非特許文献７】Mathison R, Ho W, Pittman QJ, Davison JS, Sharkey KA著，「リポ多糖類処理ラットにおける胃腸管輸送促進に対するカンナビノイド受容体−２活性化の影響（Effects of cannabinoid receptor-2 activation on accelerated gastrointestinal transit in lipopolysaccharide-treated rats）」, Br J Pharmacol. 2004 Aug; 142(8): 1247-54
【非特許文献８】Massa F, Marsicano G, Hermann H, Cannich A, Monory K, Cravatt BF, Ferri Gl, Sibaev A, Storr M, Lutz B著，「内在性カンナビノイド系は結腸の炎症に対して保護する（The endogenous cannabinoid system protects against colonic inflammation）」，J Clin Invest. 2004 Apr; 113(8): 1202-9
【非特許文献９】Klein TW, Newton CA著，「カンナビノイドにもとづく薬物の治療可能性（Therapeutic potential of cannabinoid-based drugs）」，Adv Exp Med Biol. 2007; 601: 395-413
【非特許文献１０】Barrett ML, Scutt AM, Evans FJ著，「カンナビスサティバエルからのプレニル化フラボン、カンフラビンＡおよびＢ（Cannflavin A and B, prenylated flavones from Cannabis sativa L）」，Experientia, 1986 Apr 15; 42(4): 452-3
【非特許文献１１】Barrett ML, Gordon D, Evans FJ著，「カンナビスサティバエルからのカンフラビンの単離―プロスタグランジン産生の新規インヒビター（Isolation from Cannabis sativa L. of cannflavin--a novel inhibitor of prostaglandin production）」，Biochem Pharmacol. 1985 Jun 1; 34(11): 2019-24
【非特許文献１２】Eisinger AL, Prescott SM, Jones DA, Stafforini DM著，「結腸癌におけるシクロオキシゲナーゼ−２とプロスタグランジンの役割（The role of cyclooxygenase-2 and prostaglandins in colon cancer）」，Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2007 Jan; 82(1-4): 147-54
【非特許文献１３】Harris RE, Beebe-Donk J, Alshafie GA著，「シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）封鎖による癌の化学的予防：事例対照研究の結果（Cancer chemoprevention by cyclooxygenase 2 (COX-2) blockade: results of case control studies）」，Subcell Biochem. 2007; 42: 193-212
【非特許文献１４】Krohn, K., Loocka, U., Paavilainena, K., Hausenb, B.M., Schmallec HW, and Kieseled H.著，「アンノキノン−Ａ、シプリペジンメチルエーテル、デンビノビンおよび関連する１，４−フェナントレンキノンの合成および電気化学（Synthesis and electrochemistry of annoquinone-A, cypripedin methyl ether, denbinobin and related 1,4-phenanthrenequinones）」，ARKIVOC 2001 (i) 88-130
【非特許文献１５】Yang KC, Uen YH, Suk FM, Liang YC, Wang YJ, Ho YS, Li IH, Lin SY著，「結腸癌細胞におけるデンビノビン誘発抗腫瘍発生作用の分子機構（Molecular mechanisms of denbinobin-induced anti-tumorigenesis effect in colon cancer cells）」，World J Gastroenterol. 2005 May 28; 11(20): 3040-5
【非特許文献１６】Huang YC, Guh JH, Teng CM著，「ヒトＫ５６２白血病細胞におけるデンビノビン仲介抗癌作用；チューブリン重合およびＢｃｒ−Ａｂｉ活性における役割（Denbinobin-mediated anticancer effect in human K562 leukemia cells; role in tubulin polymerization and Bcr-Abｌ activity）」，J Biomed Sci. 2005; 12(1): 113-21
【非特許文献１７】Lee YH, Park JD, Baek NI, Kim SI, Ahn BZ著，「デンドロビウム・ノビレの気中部分からのインビトロおよびインビボ抗腫瘍性フェナントレン類（In vitro and in vivo antitumoral phenanthrenes from the aerial parts of Dendrobium nobile）」，Planta Med 1995; 61: 178-180
【非特許文献１８】Sanchez-Duffhues, G. Caballero, F.J., Calzado, M.A., Maxia, L., Appendino, G, Schmitz, L., and Munoz E著，EI denbinobin aislado del Cannabis sativa es un potente inhibidor de la replicacion del VIH-1 por actuar sobre la ruta de NF-kB. 2006. 7a Reunion Anual. Sociedad Espanola de Investigacion sobre Cannabinoides
【非特許文献１９】Karin M, Greten FR著，「炎症と免疫を癌の発生と進行に繋ぐＮＦ−カッパＢ（NF-kappaB: linking inflammation and immunity to cancer development and progression）」，Nat Rev Immunol. 2005 Oct; 5(10): 749-59
【非特許文献２０】Chung DC著，「結腸直腸癌の遺伝的基本原理；腫瘍形成の臨界経路についての洞察（The genetic basis of colorectal cancer; insights into critical pathways of tumorogenesis）」，2000. Gastroenterology 119: 854-865
【非特許文献２１】Ekbom A著，「潰瘍性大腸炎における癌のリスク（Risk of cancer in ulcerative colitis）」，1998. J. Gastroenterol. Surg. 2: 312-313
【非特許文献２２】Boone DL, Lee EG, Libby S. Gibson PJ, Chien M, Chan F, Madonia M, Burkett PR, Ma A著，「ＮＦ−カッパＢ調節を理解する上での最近の進歩（Recent advances in understanding NF-kappaB regulation）」，Inflamm Bowel Dis. 2002 May; 8(3): 201-12
【非特許文献２３】Hardwick JC, van den Brink GR, Offerhaus GJ, van Deventer SJ, Peppelenbosch MP著，「ＮＦ−カッパＢ、ｐ３８  ＭＡＰＫおよびＪＮＫは、ヒト結腸ポリープ腺腫の間質において高度に発現され、活性である（NF-kappaB, p38 MAPK and JNK are highly expressed and active in the stroma of human colonic adenomatous polyps）」，Oncogene. 2001 Feb 15; 20(7): 819-27
【非特許文献２４】Janne PA, Mayer RJ著，「結腸直腸癌の化学的予防（Chemoprevention of colorectal cancer）」，N Engl J Med. 2000 Jun 29; 342(26): 1960-8
【非特許文献２５】Karin M, Yamamoto Y, Wang QM著，「ＩＫＫ  ＮＦ−カッパＢシステム；薬物開発の宝庫（The IKK NF-kappaB system: a treasure trove for drug development）」，Nat Rev Drug Discov. 2004 Jan; 3(1): 17-26
【非特許文献２６】Taylor C, Jobin C著，「ユビキチンタンパク質の修飾とシグナル伝達：炎症性腸疾患への関係（Ubiquitin protein modification and signal transduction: implications for inflammatory bowel diseases）」，Inflamm Bowel Dis. 2005 Dec; 11(12): 1097-107
【非特許文献２７】Greten FR, Eckmann L, Greten TF, Park JM, Li ZW, Egan LJ, Kagnoff MF, Karin M著，「ＩＫＫベータは大腸炎関連癌のマウスモデルにおいて、炎症と発癌現象とを関連させる（IKKbeta links inflammation and tumorigenesis in a mouse model of colitis-associated cancer）」，Cell. 2004 Aug 6; 118(3); 285-96
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、少なくとも１種の非向精神性カンナビノイド化合物および／または少なくとも１種のフェノール性もしくはフラボノイド化合物および／または１，４−フェナントレンキノンデンビノビンからなる組成物、および胃腸の炎症性疾患および／または癌疾患の予防および治療のためのその使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第一の側面は、限定されるものではないが、カンナビゲロールもしくはカンナビジオールからなるリストより選択される少なくとも１種の非向精神性カンナビノイド化合物、および／またはカンニプレン、カンナビスピラノール、カンフラビン−Ａもしくはカンフラビン−Ｂからなるリストより選択される少なくとも１種のフェノール性もしくはフラボノイド化合物；およびデンビノビンを含有してなる組成物に関係する。本組成物は他の化合物をも含有し得るが、テトラヒドロカンナビノイド（ＴＨＣ）が組成物中に存在する場合、その含量は組成物の総重量の０．７％未満である。
【００１１】
本発明の一実施態様において、当該組成物はカンナビゲロールおよびカンナビジオールを含有してなり、その比は好ましくはそれぞれ５：１ないし１：１であり、より好ましくは、カンナビゲロールおよびカンナビジオールの比が、４：１または３：１である。好適な実施態様において、当該組成物はさらにカンフラビン−Ａおよびデンビノビンを含有してなり、それらはより好ましくは、該組成物の総重量に関して、カンナビゲロール２０〜４５％、カンナビジオール２〜１５％、カンフラビン−Ａ１〜５％およびデンビノビン０．１〜１％の範囲内である。さらにより好ましくは、それぞれカンナビゲロール３０〜３５％、カンナビジオール６〜１０％、カンフラビン−Ａ２〜４％およびデンビノビン０．４〜０．７％の範囲内である。
【００１２】
他のカンナビノイド、例えば、カナナビクロメン（ＣＢＣ）およびカルマゲロール（ジヒドロキシ−ＣＢＧ）など、および他のスチルベノイド、例えば、カンニプレン、カンナビスピラノール、カンナビスピランなどが、当該組成物中に含まれていてもよい。
【００１３】
上記した化合物の一部のもの、取分け、カンナビゲロール、カンナビジオール、カンニプレン、カンナビスピラノール、カンフラビン−Ａ、デンビノビンおよびカンナビスピランは、以下の構造式で表わされる：
【００１４】
【化１】
2010540587.tif 000002
【００１５】
これらの組成物のカンナビゲロール、カンナビジオール、カンフラビン−Ａおよびデンビノビンは、少なくとも１種の大麻植物からの少なくとも１種の抽出物から抽出し得た。従って、本発明のもう一つの側面は、少なくとも１種の非向精神性カンナビノイド化合物および／または少なくとも１種のフェノール性もしくはフラボノイド化合物および／または１，４−フェナントレンキノンデンビノビンを含有する大麻にもとづく組成物である。
【００１６】
本明細書にて使用する場合、「大麻にもとづく組成物」という用語は、本発明にて言及した生物活性化合物を含有するアセトンまたは分配植物抽出物についていう。
【００１７】
好適な実施態様において、大麻植物はカンナビスサティバ、より好ましくはカンナビスサティバの変種ＣＡＲＭＡから選択される。
【００１８】
従って、本発明は、胃腸管の炎症性疾患および癌疾患の予防および治療のための生薬療法であって、選択されたカンナビスサティバのＣＡＲＭＡと呼称される変種から単離されるアセトン抽出物により、または分配抽出物により提供される非向精神性カンナビノイド類のカンナビゲロールおよびカンナビジオール、フラボノイドカンフラビンＡ、および１，４−フェナントレンキノンデンビノビンからなる組合わせを使用する療法を提供する。
【００１９】
炎症のための特別の適切なモデルを用いて、本発明は、これらの組成物が標準的な抽出物に含まれる化合物の相乗作用または相加作用により、「インビボ」および「インビトロ」で強力な抗炎症活性を有することを示す証拠を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、ＣＡＲＭＡ由来抽出物が胃腸管細胞株に対して細胞傷害性であり、哺乳動物において、アゾキシメタン誘発結腸癌と血管形成に対抗して保護作用を示すことを提示する。併用療法のための典型的な用量プロトコールは、限定されることなく提供される。本発明の様々なその他の目的および有利な点は、本発明の図面および以下の記載から当業者に自明となろう。
【００２１】
ＣＡＲＭＡ由来の抽出物およびその化合物、カンナビゲロール、カンナビジオール、カンフラビン−Ａ、およびデンビノビンは（単独または組み合わせで）、腸内炎症の生理病理学に関与する前炎症性事象を阻害する。この知見は、有害な毒性学的性質が最少であるカンナビスサティバにもとづく非向精神性生薬療法の医薬製剤の製剤化にとって本質的なものである。
【００２２】
従って、本発明の別の側面は、上記のように、少なくとも１種の非向精神性カンナビノイド化合物および／または少なくとも１種のフェノール性もしくはフラボノイド化合物および／または１，４−フェナントレンキノンデンビノビンを含有してなる組成物の医薬としての使用に関する。好適な実施態様において、これらの組成物の使用は、炎症性疾患の予防および／または治療のため、または癌の予防および／または治療のための医薬の製造のためのものである。
【００２３】
本明細書および請求項の全般にわたり、「含んでなる」という用語、およびその変形は、他の技術上の特徴、成分、または工程を排除しようとするものではない。本発明のさらなる目的、有利な点および特徴は、本明細書の審査に際し当業者に明白となるか、または本発明の実施により学習し得る。以下に示す実施例および図面は、説明のために提供されるものであり、本発明を制限しようとするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、カンナビスサティバ（変種ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ）からのアセトン抽出物中のカンナビノイド類（ＣＢＧ＋ＣＢＤ）、カンフラビンＡ、カンニプレン、カンナビスピラノールおよびデンビノビンの含量についてのＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図２】図２は、カンナビスサティバ（変種ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ）抽出物のＴＮＦ−α−誘発ＮＦ−κＢ転写活性に対する阻害作用を示す。
【図３】図３は、カンナビスサティバ（変種ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ）抽出物の、ＤＮＡへのＮＦ−κＢの結合活性に対する阻害作用を示す。
【図４】図４は、カンナビスサティバ（変種ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ）抽出物の、生化学的ＮＦ−κＢシグナル伝達経路に対する作用を示す。
【図５】図５は、カンナビスサティバ（変種ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ）抽出物の、ＬＰＳ−活性化ヒト単球におけるＩＬ−１βの放出に対する作用を示す。
【図６】図６は、カンナビスサティバ（変種ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ）抽出物の、ＬＰＳ−活性化ヒト単球におけるＴＮＦαの放出に対する作用を示す。
【図７】図７は、カンナビスサティバ（変種ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ）抽出物の、胃腸管癌細胞株に対する細胞傷害作用を示す。
【図８】図８は、マウスに経口投与したカンナビスサティバ（変種ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ）抽出物の、デキストラン硫酸誘発結腸炎症に対する防御作用を示す（巨視的評点）。
【図９】図９は、マウスに経口投与したカンナビスサティバ（変種ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ）抽出物の、デキストラン硫酸誘発結腸炎症に対する防御作用を示す（組織学的評価）。
【図１０】図１０は、マウスに経口投与したカンナビスサティバ（変種ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ）抽出物の、アゾキシメタン／ＤＳＳ誘発結腸癌疾患における体重喪失に対する作用を示す。
【図１１】図１１は、マウスに経口投与したカンナビスサティバ（変種ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ）抽出物の、アゾキシメタン／ＤＳＳ誘発結腸癌疾患に対する保護作用を示す（Ａ：死亡率；Ｂ：個々の動物における結腸腫瘍の数）。
【図１２】図１２は、マトリゲル注射マウスに経口投与したカンナビスサティバ（変種ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ）抽出物の抗血管形成作用を示す。
【図１３】図１３は、ＴＮＦα−誘発ＮＦ−κＢ活性化に対するカンナビゲロール、カンナビジオール、デンビノビンまたはカンフラビン−Ａの作用を示す。
【図１４】図１４は、ＬＰＳ誘発ＩＬ−１β放出に対するカンナビゲロール、カンナビジオール、デンビノビンまたはカンフラビン−Ａの作用を示す。
【図１５】図１５は、ＬＰＳ誘発ＴＮＦα放出に対するカンナビゲロール、カンナビジオール、デンビノビンまたはカンフラビン−Ａの作用を示す。
【図１６】図１６は、胃腸管癌細胞株に対するカンナビゲロールおよびカンナビジオールの細胞傷害作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
カンナビスサティバ変種ＣＡＲＭＡは、雌雄異株変種（カルマグノラ；Carmagnola）と組合わせたイタリア産雌雄同株材料（イタリア南部）を用いて取得した。この新種の主たる特性は、化学型安定かつ特異的であり、伝統的なイタリア産雌雄異株変種の線維質と形状の組合わさった雌雄同株の性質である。この変種のカンナビノイド組成は、その植物のすべてで同一である。それらはカンナビゲロール（ＣＢＧ）およびカンナビジオール（ＣＢＤ）を産生する。平均して、総カンナビノイド含量の９５％がＣＢＧおよびＣＢＤであり、極めて限られた濃度のデルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）が存在する。最適の播種日：４月１０日、イタリア。植物生産の収穫時期は８月の初旬であり、種子の収穫は９月の中旬になし得た。
【００２６】
育種計画（最初の地での雌成分を明らかにする）：
１９９８年：カルマグノラ（単植ＣＡＲ−Ｙ）を南部イタリア遺伝子型（Ｆ１）の雌雄同株植物と交雑した。すべての植物がカンナビゲロールおよびカンナビジオール化学型を含む。１９９８年：カルマグノラ（ＣＡＲ−Ｙ）を雌雄同株Ｆ１植物で受粉させた（最初の戻し交雑、ＢＣ１）。１９９９年：カルマグノラ（ＣＡＲ−Ｙ）を雌雄同株ＢＣ１で受粉させた（第二回目の戻し交雑、ＢＣ２）。１９９９年：カルマグノラ（ＣＡＲ−Ｙ）を雌雄同株ＢＣ２で受粉させた（第三回目の戻し交雑、ＢＣ３）。２０００年：カルマグノラ（単超植物）を２０  ＢＣ３雌雄同株植物で受粉させた。２００１年：隔離圃場での形態学的化学的選択による変種Ｒ１の大量生産。２００２年：隔離圃場での形態学的化学的選択による変種Ｒ２の大量生産（ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ変種）。
【００２７】
ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の生産：
乾燥粉末状の植物材料（頭状花、８５０ｇ）をオーブン内にて１２０℃で２時間加熱する。冷却後、脱カルボキシル化植物材料をアセトンで抽出する（３×５Ｌ、各１時間）。プールしたアセトン抽出物を蒸発させ、黒褐色ガム（８２ｇ）を得る。粗抽出物はカンナビノイド類とフェノール体の間に、約８：１の比を有する。分配抽出の場合は、一次アセトン抽出物をヘキサンと水性メタノール間に分配したものであり、カンナビノイド類とフェノール体の間に、約１：１の比を有する。抽出物の生産収率は、乾燥植物材料の４％ないし８％であった。
【００２８】
ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧアセトン抽出物中のカンナビノイド類の含量は以下のとおりであった：１）カンナビゲロール（ＣＢＧ）：３５〜４５％；２）カンナビジオール（ＣＢＤ）：３〜１０％；３）Δ−９−テトラヒドロカンナビノイド（ＴＨＣ）：０．０〜０．７％；および４）カルマゲロール（ジヒドロキシ−ＣＢＧ）：０．２〜２％。
【００２９】
ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧアセトン抽出物中のフェノール性化合物の含量は以下のとおりであった：１）カンフラビンＡ：２〜４％；２）カンフラビンＢ：１〜２％；３）カンニプレン：４〜５％；４）カンナビスピラノール：０．５〜２％；５）カンナビスピラノン：１〜４％。
ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧアセトン抽出物中の１，４−フェナントレンキノン類の含量は以下のとおりであった：デンビノビン：０．２〜１％。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例は説明のためにのみ提供するものであり、限定するためのものではない。当業者は決定的なものではない様々なパラメーターを変更または改変しても、本質的に同一の結果が得られるであろうことを容易に認識しよう。
【００３１】
実施例１
カンナビスサティバ（変種ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ）からのアセトン抽出物中のカンナビノイド類（ＣＢＧ＋ＣＢＤ）、カンフラビンＡ、カンニプレン、カンナビスピラノールおよびデンビノビンの含量プロフィールのＨＰＬＣ特性化
粉末化植物材料（１ｇ）をアセトンで徹底的に抽出した。抽出物を水−メタノール（９：１、１ｍＬ）とヘキサン（４ｍＬ）間に分配した。低部メタノール相を蒸発させ、メタノール（０．２ｍＬ）に溶解し、以下の条件により、シンメトリーＣ−１８カラム（５ミクロン、４．６×１５０ｍｍ、ウォーターズ）上、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。
【００３２】
検出：ＵＶ（２１０および２７２ｎｍ）
流速：１ｍｌ／分
溶媒Ａ：０．５％ｖ／ｖオルトリン酸／水
溶媒Ｂ：アセトニトリル  
勾配：時間    ０    ８      １４    ２４    ３０
％Ｂ  ４０    ４０    ５０    ９０    ９９
図１（ＦＩＧ．１）および表１参照
【００３３】
【表１】
2010540587.tif 000003
【００３４】
実施例２
カンナビスサティバ（変種ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ）から単離された生物活性化合物の単離と構造決定
植物材料（２００ｇ）をオーブン中、１２０℃で２時間加熱した。冷却後、これをアセトンで徹底的に抽出し、暗黒色の残渣（１６．４ｇ）を得て、これをメタノール（７０ｍＬ）に溶解し、４０ｇのＲＰ１８シリカゲル上で濾過した。濾過床をさらに５０ｍＬのメタノールで洗い、プールした濾液を蒸発させ、１１．８ｇの残渣を得た。これをシリカゲル上、重力カラムクロマトグラフィーにより分画し、４種のサブフラクション（Ａ〜Ｄ）を得た。サブフラクションＡをヘキサンから結晶化して４．７０ｇのＣＢＧを白色粉末として得た。母液はヘキサン−メタノールから２回結晶化し、２３０ｍｇのＣＢＤを得た。サブフラクションＢはエーテルから結晶化し、１０ｍｇのデンビノビンを得た。母液を分取ＨＰＬＣ（ヘキサン−酢酸エチル＝７：３）により精製して、８５ｍｇのカンニプレン、さらに１２ｍｇのデンビノビン、および２１ｍｇのカンフラビンＡを得た。サブフラクションＣはエーテルから結晶化して、１８ｍｇのカンビスピラノールおよびカンフラビンＡとＢの混合物を得、さらにＨＰＬＣにより分離して、１２ｍｇのカンフラビンＡおよび８ｍｇのカンフラビンＢを得た。サブフラクションＤは分取ＨＰＬＣ（ヘキサン−酢酸エチル＝５：５）により精製して、１２ｍｇのジヒドロキシカンナビゲロール（＝カルマゲロール）および１６ｍｇのカンナビスピラノンを得た。
【００３５】
実施例３
ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物はＴＮＦα誘発ＮＦ−κＢ転写活性を阻害する。
本実施例は、ＮＦ−κＢ依存性遺伝子転写活性に対するＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物による阻害を説明することにより、本発明方法のインビトロの効果を証明する。
【００３６】
ＮＦ−κＢ依存性転写活性の阻害におけるＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の効力は、ジャーカット−ＬＴＲ−Ｌｕｃ細胞株にてアッセイした。ジャーカット−５．１細胞株は、ＨＩＶ−１−ＬＴＲプロモーターにより推進されるルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを安定的に形質移入したＴ細胞株である。この細胞株はＴＮＦ−αに対して高度に反応性であり、古典的ＮＦ−κＢ経路を活性化する。それ故、前炎症性サイトカインＴＮＦ−αは、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターのＮＦ−κＢ依存性転写活性を誘発する（Sancho R, Calzado MA, Di Marzo V, Appendino G, Munoz E.  Anandamide inhibits nuclear factor-kappaB activation through a cannabinoid receptor-independent pathway（アナンダミドはカンナビノール受容体−非依存性経路を介して核因子−カッパＢ活性化を阻害する）.  Mol Pharmacol. 2003 Feb;63(2): 429-38）。この細胞性モデルは天然および合成ＮＦ−κＢインヒビターのスクリーニングに広く使用されてきた（Appendino G, Ottino M, Marquez N, Bianchi F, Giana A, Ballero M, Sterner O, Fiebich BL, Munoz E.  Arzanol, an anti-inflammatory and anti-HIV-1 phloroglucinol alpha-Pyrone from Helichrysum italicum ssp. microphyllum（アルザノール、ヘリクリサム・イタリクムｓｓｐミクロフィラムからの抗炎症性抗−ＨＩＶ−１フロログルシノール・アルファ−ピロン）. J Nat Prod. 2007 Apr;70(4): 608-12; Appendino G, Maxia L, Bascope M, Houghton PJ, Sanchez-Duffhues G, Munoz E, Sterner O. A meroterpenoid NF-kappaB inhibitor and drimane sesquiterpenoids from Asafetida（アギ（阿魏）からのメロテルペノイドＮＦ−カッパＢインヒビターおよびドリマンセスキテルペノイド）. J Nat Prod. 2006 Jul; 69(7): 1101-4; Marquez N, Sancho R, Bedoya LM, Alcami J, Lopez-Perez JL, Feliciano AS, Fiebich BL, Munoz E. Mesuol, a natural occurring 4-phenylcoumarin, inhibits HIV-1 replication by targeting the NF-kappaB pathway（メスオール、天然産４−フェニルクマリンは、ＮＦ−カッパＢ経路を標的とすることにより、ＨＩＶ−１複製を阻害する）. Antiviral Res. 2005 Jun;66(2-3): 137-45）。ジャーカット５．１細胞は、ＤＭＳＯに溶解したＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の濃度を上昇させながら、３０分間、前培養し、次いで、ＴＮＦ−アルファ（２ｎｇ／ｍｌ）により６時間、刺激した。細胞をＰＢＳにより２回洗浄し、２５ｍＭトリスリン酸、ｐＨ７．８、８ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１ｍＭ−ＤＴＴ、１％トリトンＸ−１００、および７％グリセロール中、室温で１５分間、溶解させた。次いで、溶解液を遠心し、その上清を用いて、オートルーマット（Autolumat）ＬＢ９５１０（バーソルドテクノロジー；Berthold Technologies）により、ルシフェラーゼ活性を測定した。タンパク質濃度はブラッドフォード法（バイオ−ラッド、リッチモンド、カリフォルニア）により測定した。結果は活性化の百分比として表す（ＣＡＲＢＡ−ＣＢＧ抽出物の不存在下に、ＴＮＦ−α処理細胞で得られる値ｐｆ  Ｒ．Ｌ．Ｕ．を活性１００％とみなす）。結果は３回の異なる実験の平均±ＳＤを表わし、ＣＡＲＢＡ−ＣＢＧ抽出物が、濃度依存的にＴＮＦα誘発ＮＦ−κＢトランス活性化を阻害することを示す（図２）。
【００３７】
実施例４
ＣＡＲＢＡ−ＣＢＧ抽出物はＤＮＡに結合するＴＮＦα誘発ＮＦ−κＢ活性を阻害する。
本実施例では、ＮＦ−κＢ−ＤＮＡ結合活性に対するＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物による阻害を説明することにより、本発明方法のインビトロの効果を証明する。
【００３８】
ＤＮＡに結合するＮＦ−κＢ転写因子の阻害を、電気泳動移動度シフトアッセイによりアッセイした（Sancho R, Calzado MA, Di Marzo V, Appendino G, Munoz E.  Anandamide inhibits nuclear factor-kappaB activation through a cannabinoid receptor-independent pathway（アナンダミドはカンナビノール受容体−非依存性経路を介して核因子−カッパＢ活性化を阻害する）. Mol Pharmacol. 2003 Feb;63(2): 429-38）。ジャーカット−５．１細胞は、ＤＭＳＯに溶解したＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の不存在下に、またはその濃度を上昇させてＴＮＦαで刺激した。次いで、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、核抽出物からタンパク質を単離した。タンパク質濃度はブラッドフォード法により定量した。電気泳動移動度シフトアッセイの場合、共通オリゴヌクレオチドプローブＮＦ−κＢを［γ−３２Ｐ］ＡＴＰにより末端標識した。結合反応混合物は、３μｇの核抽出物、０．５μｇのポリ（ｄｌ−ｄＣ）、２０ｍＭヘペス（ｐＨ７）、７０ｍＭ−ＮａＣｌ、２ｍＭ−ＤＴＴ、０．０１％ＮＰ−４０、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、４％ファイコール、および１００，０００ｃｐｍの末端標識ＤＮＡフラグメントを、総容量２０μｌ中に含有していた。４℃で３分間インキュベートした後、混合物を、８９ｍＭトリス−ホウ酸塩、８９ｍＭホウ酸および１ｍＭ−ＥＤＴＡを含有する未変性の６％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動した。ゲルを３０分間、２２５Ｖで前電気泳動に付し、次いでサンプルの負荷後に２時間、電気泳動した。これらのゲルを乾燥し、−８０℃でＸ線フィルムに露出した。ジャーカットＴ細胞中、抽出物ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧがＴＮＦα誘発のＮＦ−κＢ結合活性に対し、用量関連の低下を誘導することが示される（図３）。
【００３９】
実施例５
ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物はＴＮＦα誘発のＩκＢα分解とｐ６５リン酸化を阻害する。
本実施例では、古典的ＮＦ−κＢ経路を活性化する生化学的シグナル伝達経路に対するＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物による阻害を説明することにより、本発明方法のインビトロの効果を証明する。
【００４０】
ＴＮＦα誘発のＩκＢαのリン酸化と分解に対する、またｐ６５（セリン５３６）リン酸化に対するＣＡＲＭＡ−ＣＢＧの阻害作用を免疫ブロットにより検討した。ジャーカット−５．１細胞を、ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物（２５μｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下に、ＴＮＦα（２ｎｇ／ｍｌ）で５、１５または３０分間刺激した。次いで、細胞をＰＢＳで洗い、０．５％ＮＰ−４０を含有する５０μｌの細胞溶解バッファー（２０ｍＭヘペス（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ−ＫＣｌ、０．１５ｍＭ−ＥＧＴＡ、０．１５ｍＭ−ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ−Ｎａ３ＶＯ４、５ｍＭ−ＮａＦＩ、１ｍＭ−ＤＴＴ、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．５μｇ／ｍｌのペプスタチン、０．５μｇ／ｍｌのアプロチニン、および１ｍＭ−ＰＭＳＦ）中で、細胞からタンパク質を抽出した。タンパク質濃度はブラッドフォード法により定量し、３０μｇのタンパク質をレムリ（Laemmli）バッファー中で沸騰させ、１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した。分離したタンパク質をニトロセルロースメンブレンに１時間で移した（１００Ｖで０．５Ａ；４℃）。ブロットは、０．１％トゥイーン２０および５％脱脂ドライミルクを含有するＴＢＳ溶液中、４℃で一夜ブロックし、ＩκＢα、リン光体−ＩκＢα、総ｐ６５、リン光体−ｐ６５およびチューブリンの免疫検出は、ＥＣＬシステムを用いて、特異的ｍＡｂ類およびＨＲＰ−標識二次抗体により実施した（図４）。
【００４１】
実施例６
ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物は、ＬＰＳ−刺激ヒト単球中のＩＬ−１βの放出を阻害する。
本実施例では、ＬＰＳ−刺激単球による前炎症性サイトカインＩＬ−１βの放出に対するＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の阻害作用を説明することにより、本発明方法のインビトロの効果を証明する。
【００４２】
ＩＬ−１β放出に対するＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の阻害作用は、ヒト末梢単核食細胞にて検討した。健常なヒト提供者からの単球を完全無内毒素培養により、標準的プロトコール（ファイコール勾配調製）に従い調製した。５０ｍｌチューブを使用し、２５ｍｌのファイコールに健常血液提供者からの２５ｍｌのバフィーコートの血液を負荷した。勾配は、１，８００ｒｐｍ、２０℃、４０分間の遠心分離により、低加速と制動装置を用いて確立した。間期の末梢血単核細胞を注意しながら取り出し、５０ｍｌの予め加温したリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、次いで、１，６００ｒｐｍ、２０℃で１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを５０ｍｌのＰＢＳで洗い、上記同様に遠心分離した。次いで、ペレットを、１０％ヒト血清を補充した５０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０低内毒素培地（ＰＡＡ）に再懸濁した。粒子カウンターにて細胞量を計数した後、細胞をＥＬＩＳＡ用２４穴プレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ２にてインキュベートした。培地と非接着細胞（リンパ球）を除去し、１％ヒト血清含有の新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地を添加した。単球は、ＤＭＳＯに溶解したＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の不存在下に、またはその濃度を上昇させてＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。ＩＬ−１βの産生をＥＬＩＳＡにより定量した。その抽出物はＬＰＳ−刺激細胞におけるＩＬ−１βの放出を濃度依存的に有意に阻害した。ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ不存在下のＬＰＳ−仲介活性化を、任意に、ＩＬ−１β放出１００％とした（図５）。
【００４３】
実施例７
ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物はＬＰＳ−刺激ヒト単球におけるＴＮＦαの放出を阻害する。
本実施例では、ＬＰＳ−刺激単球による前炎症性サイトカインＴＮＦ−αの放出に対するＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の阻害作用を説明することにより、本発明方法のインビトロの効果を証明する。
【００４４】
ＴＮＦ−α放出に対するＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の阻害作用は、ヒト末梢単核食細胞にて検討した。単球を実施例６同様に単離し、ＤＭＳＯに溶解したＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の不存在下に、またはその濃度を上昇させてＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。ＴＮＦ−αの産生をＥＬＩＳＡにより定量した。その抽出物はＬＰＳ−刺激細胞におけるＴＮＦ−αの放出を濃度依存的に有意に阻害した。ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ不存在下のＬＰＳ−仲介活性化を、任意に、ＴＮＦ−αの放出１００％とした（図６）。
【００４５】
実施例８
ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物は胃腸管癌細胞株ＡＧＳおよびＨＣＴ−１１６において細胞傷害性を誘発する
本実施例では、ＡＧＳ（胃癌）およびＨＣＴ−１１６（結腸癌）腫瘍細胞株に対するＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の細胞傷害作用を説明することにより、本発明方法のインビトロの抗腫瘍作用を証明する。
【００４６】
ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の細胞傷害作用は、ＭＴＴアッセイ法により検討した。簡単に説明すると、ＡＧＳおよびＨＴＣ１１６細胞を、９６穴プレート中、１．０×１０４細胞/ｍｌの密度、１穴あたり１００μｌの細胞懸濁液として培養し、１０％子牛血清含有ＤＭＥＭ中で１２時間培養した。ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の濃度を上昇させながら、または上昇させることなく、２４時間、細胞を処理した。その後、ＭＴＴ：ＤＭＥＭ（１：２）の混合液から５０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）を各穴に加え、細胞を暗所にて３７℃で４時間インキュベートし、次いで、反応を停止させた。上清を除き、各穴に１００μｌのＤＭＳＯを加え、１０分間ゆるやかに振盪した。最後に、多機能マイクロプレートリーダー（テカン・ゲニオス・プロ；TECAN GENios Pro）を用いて、５７０ｎｍでの吸光度を測定した。該抽出物は、未処理細胞に１００％を割り振った生存率を有意に低下させた（図７）。
【００４７】
実施例９
ＤＳＳ−誘発炎症性腸疾患に対するＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の保護作用（巨視的評価）
本実施例では、ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物による経口処置が、スイスマウスにおいて化学的に誘発した結腸炎症性疾患の発症を予防することを説明することにより、本発明方法の抗炎症性効果を「インビボ」で証明する。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）−誘発炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、潰瘍性疾患に見られる病理学の一部を模倣して示すマウスモデルである（Neurath MF, Fuss I, Schurmann G, Pettersson S, Arnold K, Muller-Lobeck H, Strober W, Herfarth C, Buschenfelde KH. Cytokine gene transcription by NF-kappa B family members in patients with inflammatory bowel disease（炎症性腸疾患の患者におけるＮＦ−カッパＢファミリーメンバーによるサイトカイン遺伝子転写）. Ann N Y Acad Sci. 1998 Nov 17;859: 149-59）。
【００４８】
スイスマウス（対照群、ｎ＝７）およびＣＡＲＭＡ−ＣＢＧマウス（２つのＣＢＧ群、ｎ＝６）に、３％（ｗ／ｖ）ＤＳＳ（ＭＷ：３６０００〜５００００；ＩＣＮファーマシューティカル・インク；カリフォルニア、米国）を飲料水として７日間投与した。第１日から第７日まで、ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ群に、５０ｍｇ／Ｋｇまたは１００ｍｇ／Ｋｇを１日１回、経口投与した。ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物を１０％クレモホアー（Chremophor）含有生理食塩水溶液に溶解した。ＤＳＳ投与終了後、マウスをエーテル麻酔により犠牲とし、結腸を取り出し、大腸炎について調べた。最終の疾患評点は以下の３つの異なる評点の組み合わせとした：１）ストール（Stool）評点；０＝正常；１＝不規則形状のペレット；２＝無定形湿潤ペレット；３＝下痢（血液の存在で１点追加）：２）結腸長さ評点；０＝＜５％短縮；１＝５〜１４％短縮；２＝１５〜２４％短縮；３＝２５〜３５％短縮；４＝＞３５％短縮：３）結腸損傷評点；０＝正常；１＝緩和な炎症；２＝より広範に分布する炎症；３＝さらにより広範に分布する炎症（図８）。
【００４９】
実施例１０
ＤＳＳ−誘発炎症性腸疾患に対するＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の保護作用（組織学的評価）
本実施例では、ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物による経口処置が、スイスマウスにおける化学的に誘発した結腸炎症性疾患の発症を予防することを説明することにより、本発明方法の抗炎症性作用を「インビボ」で証明する。対照からの結腸組織、またはＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物で経口処理もしくは未処理のＤＳＳ−惹起動物からの結腸組織をパラホルムアルデヒド（４％）で固定した。６μＭの矢状切片をミクロトームで作り、その標品をヘマトキシリン−エオシンで染色した。ＤＤＳ−処理マウスからの結腸は広範囲の上皮損傷を示し、炎症細胞の経壁浸潤を伴っていた。対照的に、ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧで経口処理したマウスでは、ＩＤＢのＤＳＳ誘発の間、腺上皮が高度に保存され、固有層には炎症性細胞が殆ど認められなかった（図９）。
【００５０】
実施例１１
マウスにおけるアゾキシメタン誘発結腸癌に対しての経口投与したＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物の抗腫瘍作用
本実施例では、ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物による経口処置が、マウスにおける大腸炎関連癌（ＣＡＣ）を顕著に予防することを説明することにより、本発明方法の抗腫瘍作用を「インビボ」で証明する。化学的突然変異誘発剤であるアゾキシメタンの単回注射処置に続いて、デキストラン硫酸ナトリウムで経口処置した動物を、ヒトの結腸癌発癌を模倣して示すマウスモデルとする（Suzuki R, Kohno H, Sugie S, Nakagama H, Tanaka T. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice（マウスにおけるアゾキシメタンおよびデキストラン硫酸ナトリウム誘発結腸癌発癌に対する感受性の種差）. Carcinogenesis. 2006 Jan;27(1): 162-9）。
【００５１】
６〜８週令のマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊを本研究に使用した。動物はすべてプラスティックケージ（５または６匹／ケージ）に収容し、飲料水とペレット状基礎飼料に接近自由とし、湿度、照明（１２／１２時間の明暗サイクル）および温度（２３〜２６℃）条件の制御下に置いた。マウスは体重により無作為に実験群と対照群に分けた。結腸発癌性アゾキシメタン（ＡＯＭ）はシグマ・ケミカルズ（株）より購入した。マウスには１２．５ｍｇ／ｋｇのＡＯＭを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。注射の５日後に、２．５％ＤＳＳ（ＭＷ３６〜５０ｋＤａ）を飲料水として５日間投与し、次いで、１６日間、通常の水を与えた。このサイクルを２回（２．５％ＤＳＳを５日間および２％ＤＳＳを４日間）繰返し、最終サイクルの１０日後にマウスを犠牲にした。
【００５２】
１０％クレモホアー含有生理食塩水溶液に溶解したＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物を、ＤＳＳの投与期間に、指定の群に経口投与した。処置は毎日実施し、休止期間に、抽出物を週に３回投与した。最終サイクルの１０日後に、マウスを犠牲にした。各マウスの全腸管を取り出し、シリンジによりＰＢＳ中ゆるやかにすすぎ、全長を開いた。腫瘍の計測は盲検様式で実施した；我々のデータは、ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物で処置した動物が１匹あたり平均６ヶ所の腫瘍を発生させたのに比較し、対照群では１匹あたり平均１６ヶ所の腫瘍が発生した（図１１Ｂ）。
【００５３】
体重の調節もすべての群について毎週実施した。全過程の間に、体重の増加が対照群に観察された。体重減少はＤＳＳを投与した両群において、最初のＤＳＳ期間に観察された。処置の第６週後、ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ−処置群では、ＡＯＭ／ＤＳＳを投与した未処置群に比較して、有意な回復が観察された（図１０）。
【００５４】
最終的に、死亡率は、対照群（ＡＯＭ＋ＤＳＳ；ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧなし）の５０％から、ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ−処置群では０％に低下した（図１１Ａ）。
【００５５】
実施例１２
ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物のインビボ抗血管形成作用
本実施例では、ＣＡＲＭＡ−ＣＢＧ抽出物による経口処置が、マウスにおける血管形成を顕著に防止することを説明することにより、本発明方法の抗血管形成作用を「インビボ」で証明する。
【００５６】
方法
８週令のメスＢａｌｂ／ｃマウスを１群１０匹として、４つの群に分けた。実験の前日に、凍結したマトリゲルの１０ｍｌ瓶を４℃として融解した。実験当日、３０μｌのヘパリン（１６０００Ｕ／ｍｌ）および３０μｌのａＦＧＦ（０．２５μｇ／ｍｌ）をマトリゲル（７．５ｍｌ）と４℃で混合した。別に２．５ｍｌのマトリゲルを４℃で１０μｌのヘパリン（１６０００Ｕ／ｍｌ）および１０μｌの無菌ＰＢＳと混合し、対照動物に注射した（ａＦＧＦ含まず）。マウスにはいずれも２５  ３／８−Ｇ針を装着したシリンジで、該混合物２５０μｌを皮下注射した。注射は胸郭内に、胸骨近傍ではあるが、腋窩リンパ節から充分に下に離して実施した。３群にはマトリゲル／ａＦＧＦ／ヘパリン混合物を注射し、１群（内部対照として使用）にはマトリゲル／ヘパリン／ＰＢＳ調製品を注射した。翌日、偽薬（プラシーボ）または大麻抽出物での経口処置を開始した。５日間は、実験動物をプラシーボ−クレモホアー１０％（Ｉ群およびＩＩ群）および大麻抽出物ＣＢＧ（III群、１００ｍｇ／Ｋｇ）で処置した。連日処置の５日後、動物をＣＯ２で安楽死させ、ゲルをハサミとピンセットで抽き出した。抽き出したマトリゲルを９容量部のＰＢＳ中、ホモジナイザーで均一化した。各サンプルからの１５μｌを１００μｌの９０％氷酢酸に溶解し、少なくとも２０分間放置した。各サンプルから１０μｌ、およびヘモグロビン標準（０．６、０．３、０．１５、０．０７５、０．０３７５、０．０１８８および０．００９ｍｇ／ｍｌ）を、１４０μｌのＴＭＢ（５ｍｇ／ｍｌ）を容れた９６穴プレートに加えた。最後に、１５０μｌの０．３％過酸化水素をプレートに加え、混合した。プレートリーダーを用い、６００ｎｍ（５５０ｎｍ）での吸光度の変化を測定し、標準に比較することにより、サンプル中のヘモグロビン濃度を計算した（図１２）。
【００５７】
実施例１３
リンパ系細胞におけるカンナビゲオール（ＣＢＧ）、またはカンナビジオール（ＣＢＤ）、またはカンフラビンＡまたはデンビノビンいずれかによる転写因子κＢ（ＮＦ−κＢ）のＴＮＦ−α誘発活性化の阻害
ＨＩＶ−１−ＬＴＲ−ｌｕｃのＮＦ−κＢ依存性転写を定量するために、５．１細胞をＣＢＧ、またはＣＢＤ、またはカンフラビンＡまたはデンビノビンのいずれかと指示どおりに、３０分間、前培養し、次いで、ＴＮＦ−αにて６時間刺激し、上記のようにルシフェラーゼ活性を測定した。タンパク質濃度はブラッドフォード法により定量した（バイオ−ラッド、リッチモンド、カリフォルニア）。結果を活性化の百分比として示す（ＴＮＦ−α処置のみの細胞を１００％活性化とみなす）。結果は３回の異なる実験の平均±ＳＤを表わす。５．１安定的形質移入細胞株を用いて、デンビノビンが濃度依存的に、ＴＮＦ−α誘発ＨＩＶ−１−ＬＴＲトランス活性化を強力に阻害し、それに次いで、ＣＢＤ、カンフラビンＡおよびＣＢＤが阻害することを示した（図１３）。
【００５８】
実施例１４
リンパ系細胞において、カンナビゲオール（ＣＢＧ）、またはカンナビジオール（ＣＢＤ）、またはカンフラビンＡ、またはデンビノビンのいずれかと組合わせたＣＢＧ、またはＣＢＤ、またはカンフラビンＡ、またはデンビノビンいずれかによる転写因子κＢ（ＮＦ−κＢ）のＴＮＦ−α誘発活性化の阻害により生ずる相加または相乗作用
カンナビゲオール（ＣＢＧ）、またはカンナビジオール（ＣＢＤ）、またはカンフラビンＡまたはデンビノビンのいずれかを組合わせて、指定どおりに試験し、ＮＦ−κＢ依存性ルシフェラーゼ遺伝子レポーターアッセイにて分析した；この場合、ルシフェラーゼ遺伝子産物の量は、ＮＦ−κＢ転写活性化の程度を反映する。
【００５９】
単独で試験した化合物で得られた結果と比較すると、これらの化合物が、対として組合わせた場合、相加または相乗作用を示すことが示された。
【００６０】
ＣＢＧは、ＣＢＤまたはデンビノビンとのいずれの組合わせでも相加作用を示したが、ＣＢＤまたはカンフラビンＡまたはデンビノビンのいずれかとを指示濃度で組合わせた場合、相乗作用を示した。
【００６１】
ＣＢＤは、カンフラビンＡまたはデンビノビンのいずれかと、試験した濃度に依存的に相加効果または相乗効果を示した。
カンフラビンＡは、デンビノビンと組合わせた場合、すべての試験濃度で相加作用を示した。
【００６２】
【表２】
2010540587.tif 000004
【００６３】
表２は、ＴＮＦα−誘発ＮＦ−κＢ活性化の阻害に対するカンナビゲロール、カンナビジオール、デンビノビンおよびカンフラビン−Ａの相乗作用または相加作用を示す。
【００６４】
実施例１５
単球におけるカンナビゲロール（ＣＢＧ）、またはカンナビジオール（ＣＢＤ）またはデンビノビンのいずれかによる前炎症性サイトカインＩＬ−１のＬＰＳ−誘発産生阻害
単球を上記のように健常人提供者から単離し、次いで、指定どおりにＤＭＳＯに溶解したＣＢＧ、またはＣＢＤまたはデンビノビンの存在下または不存在下に、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処置した。ＩＬ−１の産生をＥＬＩＳＡにより定量した；値は２回の独立した実験からの平均値を示す。完全なＬＰＳ−仲介活性化を任意に１００％とした。
【００６５】
それぞれの化合物が、培地中へのＬＰＳ−誘発ＩＬ−１分泌を、濃度依存的に有意に低下させた；最も強力なのはデンビノビンであり、ＣＢＤおよびＣＢＧがそれに続いた（図１４）。
【００６６】
実施例１６
単球において、カンナビゲオール（ＣＢＧ）、またはカンナビジオール（ＣＢＤ）、またはカンフラビンＡ、またはデンビノビンのいずれかと組合わせたＣＢＧ、またはＣＢＤ、またはカンフラビンＡ、またはデンビノビンいずれかによる前炎症性サイトカインＩＬ−１のＬＰＳ−誘発産生の阻害により生ずる相加または相乗作用
健常人提供者からの単球をＣＢＧ、またはＣＢＤ、またはカンフラビンＡまたはデンビノビンまたは指示した組合せのいずれかの存在下または不存在下に、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処置した。ＩＬ−１の産生はＥＬＩＳＡにより定量した；値は２回の独立した実験からの平均値を示す。
【００６７】
結果を単独で試験した化合物で得られた結果と比較した；そしてこれらの化合物が、対として組合わせた場合、それぞれの場合に採用した化合物の濃度に依存的に、相加作用または相乗作用を示すことを示した。
【００６８】
ＣＢＧは、ＣＢＤまたはデンビノビンと組合わせて、相加作用を示したが、カンフラビンＡまたはデンビノビンのいずれかと指示濃度で組合わせた場合、相乗作用を示した。
【００６９】
ＣＢＤは、カンフラビンＡまたはデンビノビンと組合わせて、相加作用を示したが、試験した濃度によっては、カンフラビンＡとで相乗効果を示した。
カンフラビンＡはデンビノビンと組合わせた場合、相乗作用を示した。
【００７０】
【表３】
2010540587.tif 000005
【００７１】
表３は、ＬＰＳ−誘発ＩＬ−１β放出に対するカンナビゲロール、カンナビジオール、デンビノビンおよびカンフラビンＡの相乗作用または相加作用を示す。
【００７２】
実施例１７
単球におけるカンナビゲロール（ＣＢＧ）、またはカンナビジオール（ＣＢＤ）、またはデンビノビンのいずれかによる前炎症性サイトカインＴＮＦ−αのＬＰＳ−誘発産生の阻害
ＴＮＦ−αの産生は、指示通りに、ＣＢＧ、またはＣＢＤまたはデンビノビンのいずれかの存在下、または不存在下に、上記のように、ＬＰＳ−処置単球の上清について、ＥＬＩＳＡにより定量した。
【００７３】
それぞれの化合物が、培地中へのＬＰＳ−誘発ＴＮＦ−α分泌を、濃度依存的に有意に低下させた；最も強力なのはデンビノビンであり、ＣＢＤおよびＣＢＧがそれに続いた（図１５）。
【００７４】
実施例１８
単球において、カンナビゲオール（ＣＢＧ）、またはカンナビジオール（ＣＢＤ）、またはカンフラビンＡ、またはデンビノビンのいずれかと組合わせたＣＢＧ、またはＣＢＤ、またはカンフラビンＡ、またはデンビノビンいずれかによる前炎症性サイトカインＴＮＦ−αのＬＰＳ−誘発産生の阻害により生ずる相加または相乗作用
健常人提供者からの単球を、指示通りに組合わせたＣＢＧ、またはＣＢＤ、またはカンフラビンＡまたはデンビノビンいずれかの存在下または不存在下に、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。ＴＮＦ−αの産生は、上記のように、ＥＬＩＳＡにより定量した。
【００７５】
結果を単独で試験した化合物で得られた結果と比較した；そしてこれらの化合物が、対として組合わせた場合、それぞれの場合に使用した化合物の濃度に依存的に、相加作用または相乗作用を示すことを示した。
【００７６】
ＣＢＧは、ＣＢＤまたはデンビノビンと組合わせて、相加作用を示したが、カンフラビンＡまたはデンビノビンのいずれかと指示濃度で組合わせた場合、相乗作用を示した。
【００７７】
ＣＢＤは、カンフラビンＡまたはデンビノビンと組合わせて、相加作用を示したが、カンフラビンＡと組合わせた場合、試験した濃度によては相乗効果を示した。
カンフラビンＡはデンビノビンと組合わせた場合、相乗作用を示した。
【００７８】
【表４】
2010540587.tif 000006
【００７９】
表４は、ＬＰＳ−誘発ＴＮＦ−α放出に対するカンナビゲロール、カンナビジオール、デンビノビンおよびカンフラビン−Ａの相乗作用または相加作用を示す。
【００８０】
実施例１９
胃腸管癌細胞株ＡＧＳ、ＨＣＴ−１１６およびＳＷ４８０におけるカンナビゲロール（ＣＢＧ）およびカンナビジオール（ＣＢＤ）の相加細胞傷害活性
本実施例は、ＡＧＳ（胃癌）、ＨＣＴ−１１６およびＳＷ４８０（結腸癌）腫瘍細胞株に対するカンナビジオール（ＣＢＤ）およびカンナビゲロール（ＣＢＧ）間の組合わせの細胞傷害作用を説明することにより、本発明方法のインビトロの抗腫瘍作用を証明する。
【００８１】
カンナビゲロール（ＣＢＧ）およびカンナビジオール（ＣＢＤ）単独の、または組合わせでの細胞傷害作用は、カルセイン（Calcein）−ＡＭアッセイ法により検討した。簡単に説明すると、ＡＧＳ、ＳＷ４８０およびＨＴＣ１１６細胞を、９６穴プレート中、１．０×１０４細胞/ｍｌの密度、１穴あたり２００μｌの細胞懸濁液とし、１０％子牛血清含有ＤＭＥＭ中で培養した。細胞は、ＣＢＤ、ＣＢＧまたは両化合物の組合わせを加え、または加えずに、２４時間処理した；その後、穴を洗浄し、細胞をカルセイン−ＡＭ（１μＭ）（モレキュラー・プローブス）と３０分間インキュベートした。次いで、生存細胞の蛍光をマイクロタイタープレートリーダー（テカン・ジーニアス・プロ）にて検出した。蛍光強度は該化合物により誘発される細胞死に逆比例した。結果は生存細胞の百分比として表わす（対照未処理細胞を生存率１００％の値とする）。ＣＢＤおよびＣＢＧの両方が当該３種の細胞株において細胞傷害性を誘発した；また、細胞を両化合物の組合わせで処理した場合、相加作用が観察された（図１６）。
【図１】
2010540587.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010540587.tif 000013
【図８】
2010540587.tif 000014
【図９】
2010540587.tif 000015
【図１０】
2010540587.tif 000016
【図１１】
2010540587.tif 000017
【図１２】
2010540587.tif 000018
【図１３】
2010540587.tif 000019
【図１４】
2010540587.tif 000020
【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年6月2日(2010.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンナビジオールおよびデンビノビンを含有してなり、デルタ−９−テトラヒドロカンナビジオールの含有率が当該組成物総重量の０．７％未満である組成物であって、
ａ）カンナビジオールが１０μＭと２０μＭの間の濃度で存在する時に、デンビノビンが０．２５μＭと０．５μＭの間の濃度で存在し、
ｂ）カンナビジオールが１０μＭの濃度で存在する時に、デンビノビンが０．２５μＭと１μＭの間の濃度で存在する組成物。
【請求項２】
前記組成物は大麻にもとづく組成物である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記カンナビジオールおよびデンビノビンは少なくとも１種の大麻植物からの少なくとも１種の抽出物から誘導されたものである請求項１または２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
前記大麻植物がカンナビスサティバ（Cannabis sativa）から選択される請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記大麻植物がカンナビスサティバ（Cannabis sativa）の変種ＣＡＲＭＡから選択される請求項４記載の大麻にもとづく組成物。
【請求項６】
医薬として使用するための請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
炎症性疾患の治療および／または予防に使用する請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
炎症性疾患の治療および／または予防のための医薬の製造における請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項９】
癌の治療および／または予防のために使用する請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
癌の治療および／または予防のための医薬の製造における請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【国際調査報告】
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