(57)【要約】本発明は、クラミジア属(Chlamydia)の種に由来する抗原をコードする単離された核酸分子、このような核酸分子を含むベクター、およびこのようなベクターを含む宿主細胞に関する。さらに、本発明は、クラミジア属の種に由来する抗原ならびにその断片および変種、このような抗原を作製する方法、ならびにこのような抗原を発現する細胞を作製する方法を提供する。より具体的には、このような抗原は、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)によって産生されるか、クラミジア・ニューモニエによって引き起こされる細菌感染症と関連する。さらに、本発明は、このような抗原に結合する抗体、このような抗体を産生するハイブリドーマ細胞、このような抗体を作製する方法、このような核酸分子、抗原、ベクターまたは抗体を含む薬学的組成物、薬学的組成物を調製するための、このような核酸分子、抗原、ベクターまたは抗体の使用、このような抗原に結合することができるか、またはこのような抗原の相互作用活性を低下もしくは阻害することができるアンタゴニストを特定する方法、クラミジア属による感染症を診断する方法、およびクラミジア属による感染症を治療または予防する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原またはその断片をコードする単離された核酸分子であって、
以下からなる群より選択される、核酸配列を含む単離された核酸分子:
a)SEQ ID NO: 1-98を含む群より選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子と少なくとも70％の配列同一性を有する核酸分子、
b)a)の核酸分子に相補的な核酸分子、
c)a)またはb)の核酸分子の少なくとも15個の連続した塩基を含む核酸分子、
d)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、a)、b)、またはc)の核酸分子にアニーリングする核酸分子、
e)遺伝暗号の縮重がなければ、a)、b)、c)またはd)において定義された核酸分子にハイブリダイズする核酸分子。
【請求項２】
SEQ ID NO: 1-98との配列同一性が、少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％、もしくは99％、または最も好ましくは100％である、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
核酸がDNAである、請求項1または2のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項４】
核酸がRNAである、請求項1または2のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項５】
ゲノムDNA、好ましくはクラミジア属(Chlamydia)の種に由来する、より好ましくはC.ニューモニエ(C.pneumoniae)、C.トラコマティス(C.trachomatis)、C.シタッシ(C.psittaci)、C.ペコラム(C.pecorum)、C.ムリダルム(C.muridarum)、またはC.スイス(C.suis) に由来する、最も好ましくはC.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシに由来するゲノムDNAから単離された、請求項1〜3のいずれか一項記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
コードされる抗原断片が、その活性断片または活性変種である、請求項1〜5のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項７】
クラミジア属に由来する、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスに由来する、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシに由来するポリペプチドもしくはペプチド断片を含むか、またはこのようなポリペプチドもしくはペプチド断片からなる抗原またはその断片をコードする、請求項1〜6のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか一項記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項９】
請求項1〜7のいずれか一項において定義された核酸分子によってコードされる抗原またはその断片の組換え発現用に適合された、請求項8記載のベクター。
【請求項１０】
請求項8または9において定義されたベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１１】
クラミジア属に感染しているヒトに由来する、またはクラミジア属に以前に感染したことのある非感染健常ヒトに由来する血清と免疫学的に反応する抗原であって、
クラミジア属に由来する、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスに由来する、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシに由来する単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種を含むか、あるいはこのような単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種からなる、抗原。
【請求項１２】
SEQ ID NO: 99-196からなる群より選択される単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種を含むか、あるいはこのような単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種からなる、抗原。
【請求項１３】
ポリペプチドが、請求項1〜7のいずれか一項において定義された核酸分子によってコードされる、請求項11または12記載の抗原。
【請求項１４】
抗原の活性断片が、前記ポリペプチドの、特に、SEQ ID NO: 99-196の、いずれかによって定義されるポリペプチドの少なくとも50％、特に少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、または98％、最も好ましくは99％からなる、請求項11〜13のいずれか一項記載の抗原。
【請求項１５】
抗原の活性変種が、前記ポリペプチドと、特に、SEQ ID NO: 99-196のいずれかによって定義されるポリペプチドと、少なくとも50％、特に少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、または98％、最も好ましくは99％の配列同一性を有する、請求項11〜14のいずれか一項記載の抗原。
【請求項１６】
抗原の活性断片が、SEQ ID NO: 123のアミノ酸2-872、SEQ ID NO: 124のアミノ酸2-812、SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514または516-1090、SEQ ID NO: 127のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 128のアミノ酸2-324、SEQ ID NO: 130のアミノ酸2-235、SEQ ID NO: 131のアミノ酸2-792、SEQ ID NO: 132のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245、SEQ ID NO: 138のアミノ酸2-393、SEQ ID NO: 139のアミノ酸2-237、SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620、SEQ ID NO: 155のアミノ酸2-287、SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231、SEQ ID NO: 157のアミノ酸2-550、SEQ ID NO: 165のアミノ酸2-644、SEQ ID NO: 168のアミノ酸2-343、SEQ ID NO: 170のアミノ酸2-325、SEQ ID NO: 171の2-458、もしくはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379を含むか、またはこのようなアミノ酸からなる、請求項14記載の抗原。
【請求項１７】
抗原の活性変種が、SEQ ID NO: 123のアミノ酸2-872、SEQ ID NO: 124のアミノ酸2-812、SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514または516-1090、SEQ ID NO: 127のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 128のアミノ酸2-324、SEQ ID NO: 130のアミノ酸2-235、SEQ ID NO: 131のアミノ酸2-792、SEQ ID NO: 132のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245、SEQ ID NO: 138のアミノ酸2-393、SEQ ID NO: 139のアミノ酸2-237、SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620、SEQ ID NO: 155のアミノ酸2-287、SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231、SEQ ID NO: 157のアミノ酸2-550、SEQ ID NO: 165のアミノ酸2-644、SEQ ID NO: 168のアミノ酸2-343、SEQ ID NO: 170のアミノ酸2-325、SEQ ID NO: 171の2-458、またはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379と、少なくとも50％、特に少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、または98％、最も好ましくは99％の配列同一性を有する、請求項16記載の抗原。
【請求項１８】
a)SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514からなる抗原の活性断片に対する、1〜570個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは、1〜500個、1〜400個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、もしくは1〜150個、さらにより好ましくは1〜100個、さらにより好ましくは1〜50個、最も好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、もしくは40個のさらなるアミノ酸残基、または
b)SEQ ID NO: 125のアミノ酸516-1090を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 125のアミノ酸516-1090からなる抗原の活性断片に対する、1〜510個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1〜400個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、もしくは1〜150個、さらにより好ましくは1〜100個、さらにより好ましくは1〜50個、最も好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、もしくは40個のさらなるアミノ酸残基、または
c)SEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379からなる抗原の活性断片に対する、1〜25個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、もしくは20個のさらなるアミノ酸残基、または
d)SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231からなる抗原の活性断片に対する、1〜20個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、もしくは15個のさらなるアミノ酸残基、または
e)SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620からなる抗原の活性断片に対する、1〜10個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、もしくは9個のさらなるアミノ酸残基、または
f)SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245からなる抗原の活性断片に対する、1〜5個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1個、2個、3個、もしくは4個のさらなるアミノ酸残基
によってさらに定義される、請求項16〜17のいずれか一項記載の抗原。
【請求項１９】
抗原と非相同の少なくとも1個のアミノ酸残基、好ましくはマーカータンパク質をさらに含むか、またはこのようなアミノ酸残基、好ましくはマーカータンパク質からさらになる、請求項11〜18のいずれか一項記載の抗原。
【請求項２０】
さらなるアミノ酸残基が、抗原のN末端に隣接するか、抗原のC末端に隣接するか、または抗原のN末端とC末端とに隣接する、請求項18または19記載の抗原。
【請求項２１】
さらなるアミノ酸残基が、
a)SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514もしくはそのC末端に由来する変種、あるいは
b)SEQ ID NO: 125のアミノ酸516-1090、SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245、SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620、SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231、もしくはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379、またはそのN末端に由来する変種
によって定義される抗原に隣接する、請求項18〜20のいずれか一項記載の抗原。
【請求項２２】
リーダー配列もしくは分泌配列、精製に用いられる配列、またはプロタンパク質配列をさらに含むか、あるいはこのような配列からさらになる、請求項11〜21のいずれか一項記載の抗原。
【請求項２３】
少なくとも1つのコアアミノ酸配列が、表1の「推定された免疫原性アミノ酸」または「推定されたクラスII制限T細胞エピトープ/領域」または「特定された免疫原領域の位置(aa)」の列において示され、
より好ましくは、該コアアミノ酸配列が、以下:
SEQ ID NO: 123のアミノ酸
2010530229.tif 000084
;SEQ ID NO: 124のアミノ酸
2010530229.tif 000085
;SEQ ID NO: 125のアミノ酸
2010530229.tif 000086
;SEQ ID NO: 126のアミノ酸
2010530229.tif 000087
;SEQ ID NO: 127のアミノ酸
2010530229.tif 000088
;SEQ ID NO: 128のアミノ酸
2010530229.tif 000089
;SEQ ID NO: 129のアミノ酸
2010530229.tif 000090
;SEQ ID NO: 130のアミノ酸
2010530229.tif 000091
;SEQ ID NO: 131のアミノ酸
2010530229.tif 000092
;SEQ ID NO: 132のアミノ酸
2010530229.tif 000093
;SEQ ID NO: 133のアミノ酸
2010530229.tif 000094
;SEQ ID NO: 134のアミノ酸
2010530229.tif 000095
;SEQ ID NO: 135のアミノ酸
2010530229.tif 000096
;SEQ ID NO: 136のアミノ酸
2010530229.tif 000097
;SEQ ID NO: 137のアミノ酸
2010530229.tif 000098
;SEQ ID NO: 138のアミノ酸
2010530229.tif 000099
;SEQ ID NO: 139のアミノ酸
2010530229.tif 000100
;SEQ ID NO: 140のアミノ酸
2010530229.tif 000101
;SEQ ID NO: 141のアミノ酸
2010530229.tif 000102
;SEQ ID NO: 142のアミノ酸
2010530229.tif 000103
;SEQ ID NO: 143のアミノ酸
2010530229.tif 000104
;SEQ ID NO: 144のアミノ酸
2010530229.tif 000105
;SEQ ID NO: 145のアミノ酸
2010530229.tif 000106
;SEQ ID NO: 146のアミノ酸
2010530229.tif 000107
;SEQ ID NO: 147のアミノ酸
2010530229.tif 000108
;SEQ ID NO: 148のアミノ酸
2010530229.tif 000109
;SEQ ID NO: 149のアミノ酸
2010530229.tif 000110
;SEQ ID NO: 150のアミノ酸
2010530229.tif 000111
;SEQ ID NO: 151のアミノ酸
2010530229.tif 000112
;SEQ ID NO: 152のアミノ酸
2010530229.tif 000113
;SEQ ID NO: 153のアミノ酸
2010530229.tif 000114
;SEQ ID NO: 154のアミノ酸
2010530229.tif 000115
;SEQ ID NO: 155のアミノ酸
2010530229.tif 000116
;SEQ ID NO: 156のアミノ酸
2010530229.tif 000117
;SEQ ID NO: 157のアミノ酸
2010530229.tif 000118
;SEQ ID NO: 158のアミノ酸
2010530229.tif 000119
;SEQ ID NO: 159のアミノ酸
2010530229.tif 000120
;SEQ ID NO: 160のアミノ酸
2010530229.tif 000121
;SEQ ID NO: 161のアミノ酸
2010530229.tif 000122
;SEQ ID NO: 162のアミノ酸
2010530229.tif 000123
;SEQ ID NO: 163のアミノ酸
2010530229.tif 000124
;SEQ ID NO: 164のアミノ酸
2010530229.tif 000125
;SEQ ID NO: 165のアミノ酸
2010530229.tif 000126
;SEQ ID NO: 166のアミノ酸
2010530229.tif 000127
;SEQ ID NO: 167のアミノ酸
2010530229.tif 000128
;SEQ ID NO: 168のアミノ酸
2010530229.tif 000129
;SEQ ID NO: 169のアミノ酸
2010530229.tif 000130
;SEQ ID NO: 170のアミノ酸
2010530229.tif 000131
;SEQ ID NO: 171のアミノ酸
2010530229.tif 000132
;SEQ ID NO: 172のアミノ酸
2010530229.tif 000133
;SEQ ID NO: 173のアミノ酸
2010530229.tif 000134
;SEQ ID NO: 174のアミノ酸
2010530229.tif 000135
;SEQ ID NO: 175のアミノ酸
2010530229.tif 000136
;SEQ ID NO: 176のアミノ酸4-14;SEQ ID NO: 177のアミノ酸18-35、47-55、65-82、106-112、および117-140;SEQ ID NO: 178のアミノ酸15-38;SEQ ID NO: 179のアミノ酸31-48、および50-55;SEQ ID NO: 181のアミノ酸6-14;SEQ ID NO: 182のアミノ酸4-10;SEQ ID NO: 183のアミノ酸9-18、および21-30;SEQ ID NO: 184のアミノ酸4-13、31-39、56-74、76-83、および85-91;SEQ ID NO: 185のアミノ酸8-32、38-49、および57-66;SEQ ID NO: 186のアミノ酸4-19、および25-31;SEQ ID NO: 187のアミノ酸1-9、17-25、38-49、および52-58;SEQ ID NO: 188のアミノ酸4-16、および20-27;SEQ ID NO: 189のアミノ酸20-26、および32-41;SEQ ID NO: 190のアミノ酸4-15、21-41、45-55、63-92、および105-123;SEQ ID NO: 192のアミノ酸4-17、および19-25;SEQ ID NO: 193のアミノ酸5-31、および33-50;SEQ ID NO: 194のアミノ酸10-17;SEQ ID NO: 195のアミノ酸4-21、および52-69;SEQ ID NO: 196のアミノ酸11-29;SEQ ID NO: 123のアミノ酸48-59、267-277、452-467、497-512、および659-673;SEQ ID NO: 124のアミノ酸315-326、428-442、741-756、および789-808;SEQ ID NO: 125のアミノ酸24-38、108-123、599-620、775-788、および939-949;SEQ ID NO: 126のアミノ酸17-30、40-59、71-83、93-113、216-231、260-277、371-385、および392-404;SEQ ID NO: 127のアミノ酸3-37、42-52、58-67、72-83、94-114、123-137、142-160、197-209、および218-250;SEQ ID NO: 128のアミノ酸7-22、24-35、78-93、97-110、124-136、162-176、193-209、213-225、および230-239;SEQ ID NO: 129のアミノ酸12-27、125-138、190-202、260-277、および394-417;SEQ ID NO: 130のアミノ酸9-21、26-37、49-63、84-97、107-120、127-137、142-154、197-208、および223-235;SEQ ID NO: 131のアミノ酸526-543、609-624、654-673、および682-699;SEQ ID NO: 132のアミノ酸7-25、45-63、91-122、173-183、および216-227;SEQ ID NO: 133のアミノ酸1-11、30-43、70-86、142-150、192-207、および217-229;SEQ ID NO: 134のアミノ酸428-440、561-572、859-870、919-930、および1055-1067;SEQ ID NO: 135のアミノ酸12-25、44-60、72-88、97-117、145-158、178-201、および211-221;SEQ ID NO: 136のアミノ酸6-26、1430-1441、および1648-1666;SEQ ID NO: 137のアミノ酸84-94、113-125、141-152、331-342、716-728、および743-763;SEQ ID NO: 138のアミノ酸17-27、110-120、166-179、220-234、251-262、282-294、322-339、354-366、および379-387;SEQ ID NO: 139のアミノ酸5-25、34-51、115-125、140-152、166-181、191-201、および215-233;SEQ ID NO: 140のアミノ酸20-31、159-177、235-244、362-371、および444-454;SEQ ID NO: 141のアミノ酸8-23、122-130、289-300、289-300、336-345、388-398、および590-614;SEQ ID NO: 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からなる群より選択される、
少なくとも1つのコアアミノ酸配列を含む抗原。
【請求項２４】
a)1〜50個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜30個、さらにより好ましくは多くとも1〜25個、さらにより好ましくは多くとも1〜10個、最も好ましくは1個、2個、3個、4個、もしくは5個のさらなるアミノ酸残基;および/または
b)コアアミノ酸配列と非相同の少なくとも1個のさらなるアミノ酸残基
からさらになる、請求項23記載の抗原。
【請求項２５】
さらなるアミノ酸残基が、コアアミノ酸配列のN末端に隣接するか、C末端に隣接するか、またはN末端とC末端とに隣接する、請求項24記載の抗原。
【請求項２６】
請求項23において定義された、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個のコアアミノ酸配列を含む、請求項23〜25のいずれか一項記載の抗原。
【請求項２７】
請求項1〜7のいずれか一項において定義された核酸分子を発現させる工程を含む、請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を作製する方法。
【請求項２８】
適切な宿主細胞を、請求項8または9において定義されたベクターで形質転換またはトランスフェクトする工程を含む、請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を発現する細胞を作製する方法。
【請求項２９】
抗原またはその活性断片もしくは活性変種が、クラミジア属、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシから単離される、請求項27または28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
ワクチンであることが好ましく、
請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは請求項1〜7のいずれか一項において定義された核酸分子、あるいは請求項8〜9のいずれか一項において定義されたベクターを含む、
薬学的組成物。
【請求項３１】
ワクチンであることが好ましく、
クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の、請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは請求項1〜7のいずれか一項において定義された核酸分子、あるいは請求項8〜9のいずれか一項において定義されたベクターを含む、
薬学的組成物。
【請求項３２】
免疫賦活物質、好ましくは、ポリカチオンポリマー、特に、ポリカチオンペプチド、免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)、特に、オリゴ(dIdC) 13、少なくとも2個のLysLeuLysモチーフを含有するペプチド、特に、ペプチド
2010530229.tif 000137
、神経刺激性化合物、特に、ヒト成長ホルモン、ミョウバン、フロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバント、またはその組み合わせをさらに含むことを特徴とする、請求項30または31記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
免疫賦活物質が、ポリカチオンポリマーおよび免疫賦活性デオキシヌクレオチドの組み合わせ、または少なくとも2個のLysLeuLysモチーフを含有するペプチドおよび免疫賦活性デオキシヌクレオチドの組み合わせ、好ましくは、
2010530229.tif 000138
およびオリゴ(dIdC) 13の組み合わせのどちらかである、請求項32記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
ポリカチオンペプチドがポリアルギニンである、請求項32または33記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の、請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは請求項1〜7のいずれか一項において定義された核酸分子、あるいは請求項8〜9のいずれか一項において定義されたベクター。
【請求項３６】
特に、クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の薬学的組成物を調製するための、請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、請求項1〜7のいずれか一項において定義された核酸分子、あるいは請求項8〜9のいずれか一項において定義されたベクターの使用。
【請求項３７】
請求項11〜26のいずれか一項において定義された、抗原またはその断片、好ましくは、その活性断片もしくはその変種、好ましくは、その活性変種の少なくとも選択部分に結合する、抗体または少なくともその有効部分。
【請求項３８】
モノクローナル抗体である、請求項37記載の抗体。
【請求項３９】
有効部分が、Fabフラグメント、F(ab)フラグメント、F(ab)Nフラグメント、F(ab) 2フラグメント、またはFvフラグメントを含む、請求項37または38記載の抗体。
【請求項４０】
キメラ抗体である、請求項37〜39のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４１】
ヒト化抗体である、請求項37〜40のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４２】
IgA抗体である、請求項37〜41のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４３】
請求項37〜42のいずれか一項において定義された抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項４４】
以下の工程を特徴とする、請求項37〜42のいずれか一項において定義された抗体を作製する方法:
a)請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を非ヒト動物に投与することによって、非ヒト動物において免疫応答を開始する工程、
b)該動物から、抗体含有体液を取り出す工程、および
c)該抗体含有体液をさらなる精製工程に供することによって、抗体を作製する工程。
【請求項４５】
以下の工程を特徴とする、請求項37〜42のいずれか一項において定義された抗体を作製する方法:
a)請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を非ヒト動物に投与することによって、非ヒト動物において免疫応答を開始する工程、
b)該動物から、脾臓または脾臓細胞を取り出す工程、
c)該脾臓または脾臓細胞のハイブリドーマ細胞を作製する工程、
d)該抗原またはその活性断片もしくは活性変種に特異的なハイブリドーマ細胞を選択およびクローニングする工程、
e)クローニングされた該ハイブリドーマ細胞を培養することによって抗体を作製する工程、ならびに
f)任意で、さらなる精製工程を行う工程。
【請求項４６】
請求項37〜42のいずれか一項記載の抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項４７】
クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の、請求項37〜42のいずれか一項記載の抗体、または請求項37〜42のいずれか一項記載の抗体を含む薬学的組成物。
【請求項４８】
クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の薬学的組成物の調製のための、請求項37〜42のいずれか一項において定義された抗体の使用。
【請求項４９】
以下の工程を含む、請求項11〜26のいずれか一項において定義された、抗原またはその活性断片もしくは活性変種に結合することができるアンタゴニストを特定する方法:
a)単離もしくは固定化された、請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種と候補アンタゴニストを、該候補アンタゴニストと該抗原またはその活性断片もしくは活性変種が結合する条件下、該候補アンタゴニストと該抗原またはその活性断片もしくは活性変種との結合に応答して検出可能なシグナルを発することができる成分の存在下で接触させる工程、および
b)該アンタゴニストと該抗原またはその活性断片もしくは活性変種との結合に応答して生じたシグナルの有無を検出する工程。
【請求項５０】
以下の工程を含む、請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種と、その相互作用パートナーとの相互作用活性を低下または阻害することができるアンタゴニストを特定する方法:
a)請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を準備する工程、
b)該抗原またはその活性断片もしくは活性変種に対する相互作用パートナー、特に、請求項37〜42のいずれか一項記載の抗体を準備する工程、
c)該抗原またはその活性断片もしくは活性変種と該相互作用パートナーを相互作用させて、相互作用複合体を形成する工程、
d)候補アンタゴニストを準備する工程、
e)該候補アンタゴニストと相互作用複合体との間で競合反応を起こす工程、
f)該候補アンタゴニストが、抗原またはその活性断片もしくは活性変種と相互作用パートナーとの相互作用活性を阻害または低下するかどうか決定する工程。
【請求項５１】
請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種の相互作用パートナーを単離および/または精製および/または特定するための、該抗原またはその活性断片もしくは活性変種の使用。
【請求項５２】
以下の工程を含む、クラミジア属生物による感染症を診断する方法:
a)被験体から得られた試料と、請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を接触させる工程;および
b)該試料中の、該クラミジア属生物に対する抗体の存在を検出する工程。
【請求項５３】
以下の工程を含む、クラミジア属生物による感染症を診断する方法:
a)被験体から得られた試料と、請求項37〜42のいずれか一項記載の抗体を接触させる工程;および
b)該試料中の、該クラミジア属生物の抗原の存在を検出する工程。
【請求項５４】
クラミジア属生物の抗原が、請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種である、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体がIgA抗体である、請求項52〜54のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
以下の工程を含む、クラミジア属生物による感染症を診断する方法:
a)被験体から得られた試料と、請求項1〜7のいずれか一項において定義された核酸分子またはその断片に特異的なプライマーまたはプローブを接触させる工程、および
b)該試料中の、このような核酸分子またはその断片の存在を検出する工程。
【請求項５７】
クラミジア属生物が、病原性クラミジア属生物、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシである、請求項52〜56のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
アプタマーおよびスピーゲルマーからなる群より選択される機能的核酸を調製するための、請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種の使用。
【請求項５９】
リボザイム、アンチセンス核酸、およびsiRNAからなる群より選択される機能的リボ核酸を調製するための、請求項1〜7のいずれか一項において定義された核酸分子の使用。
【請求項６０】
以下の工程を含む、動物またはヒトにおいて、好ましくはクラミジア属による感染症の治療を必要とする動物またはヒトにおいて、クラミジア属感染症を治療する方法:
治療的有効量の、請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは請求項1〜7のいずれか一項において定義された核酸分子、あるいは請求項8〜9のいずれか一項において定義されたベクター、あるいは請求項37〜42のいずれか一項において定義された抗体、あるいは請求項30〜34、46、または47のいずれか一項において定義された薬学的組成物を、該動物またはヒトに投与する工程。
【請求項６１】
以下の工程を含む、クラミジア属生物による感染症に対して動物またはヒトを免疫化する方法:
該動物またはヒトにおいて免疫応答を誘発するのに適した有効量の、請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは請求項1〜7のいずれか一項において定義された核酸分子、あるいは請求項8〜9のいずれか一項において定義されたベクター、あるいは請求項37〜42のいずれか一項において定義された抗体、あるいは請求項30〜34、46、または47のいずれか一項において定義された薬学的組成物を、該動物またはヒトに投与する工程。
【請求項６２】
以下の工程を含む、動物またはヒトにおいて、クラミジア属生物に対する免疫応答を刺激する方法:
該動物またはヒトにおいて免疫応答を刺激するのに適した有効量の、請求項11〜26のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは請求項1〜7のいずれか一項において定義された核酸分子、あるいは請求項8〜9のいずれか一項において定義されたベクター、あるいは請求項37〜42のいずれか一項において定義された抗体、あるいは請求項30〜34、46、または47のいずれか一項において定義された薬学的組成物を、該動物またはヒトに投与する工程。
【請求項６３】
クラミジア属生物が、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシである、請求項60〜62いずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラミジア属(Chlamydia)の種に由来する抗原をコードする単離された核酸分子、このような核酸分子を含むベクター、およびこのようなベクターを含む宿主細胞に関する。さらに、本発明は、クラミジア属の種に由来する抗原ならびにその断片および変種、このような抗原を作製する方法、ならびにこのような抗原を発現する細胞を作製する方法を提供する。より具体的には、このような抗原は、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)によって産生されるか、クラミジア・ニューモニエによって引き起こされる細菌感染症と関連する。さらに、本発明は、このような抗原に結合する抗体、このような抗体を産生するハイブリドーマ細胞、このような抗体を作製する方法、このような核酸分子、抗原、ベクターまたは抗体を含む薬学的組成物、薬学的組成物を調製するための、このような核酸分子、抗原、ベクターまたは抗体の使用、このような抗原に結合することができる、またはこのような抗原の相互作用活性を低下もしくは阻害することができるアンタゴニストを特定する方法、クラミジア属による感染症を診断する方法、およびクラミジア属による感染症を治療または予防する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
クラミジア・ニューモニエ(C.pneumoniae)は、偏性細胞内細菌であり、重大なヒト病原体と認識されている。クラミジア・ニューモニエは病院内および外来患者の肺炎および上気道疾患の一般的な原因であり、成人間の市中感染性肺炎症例の約7〜10％を占める(Montigiani, S. et al., 2002)。クラミジア・ニューモニエによる感染症は、気管支炎、副鼻腔炎、喘息性気管支炎、成人発症型喘息、および慢性閉塞性肺疾患(COPD; Murdin, A.D. et al., 2000)などの他の気道疾患とも関連づけられている。重要なことに、クラミジア・ニューモニエによる感染症は、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患とも関連づけられている。これは、例えば、血清疫学的研究またはアテローム性動脈硬化巣におけるC.ニューモニエの検出によって示された(Montigiani, S. et al., 2002)。
【０００３】
最近、起源不明の科であり、クラミジア目(Chlamydiales)の中の唯一のメンバーであるグラム陰性クラミジア科(Chlamydiaceae)が、16S rRNA系統樹によって、2つの属、クラミジア属およびクラミドフィラ属(Chlamydophila)に分類できることが示唆された(Everett, K.D. et al., 1999)。この示唆によれば、クラミジア属の中に3つの種:クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)、クラミジア・ムリダルム(Chlamydia muridarum)、およびクラミジア・スイス(Chlamydia suis)があることが説明されている。種クラミジア・シタッシ(Chlamydia psittaci)、クラミジア・ペコラム(Chlamydia pecorum)、およびクラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)は、クラミドフィラ・シタッシ(Chlamydophila psittaci)、クラミドフィラ・ペコラム(Chlamydophila pecorum)、およびクラミドフィラ・ニューモニエ(Chlamydophila pneumoniae)に改名されることが示唆された。それにもかかわらず、両属の細菌は生物学的特性および生化学的特性を共有している。本発明では、新たに示唆された命名法をまだ使用していないが、完全性を求めるために、種クラミジア・ニューモニエとクラミドフィラ・ニューモニエは同一であることを述べなければならない。
【０００４】
4種類の種から7つのクラミジア科ゲノムを配列決定することによって、宿主域および疾患の顕著な差は遺伝子内容の極めて微妙な変化によって引き起こされ得ることが証明されている(Read, T.D. et al., 2003)。クラミジア科は、真正細菌の中でかなり孤立した群として分類され、プランクトミセス属(planctomyces)と非常に弱いつながりしかない。従って、クラミジア科は、真正細菌の中で、いくつかの独特の特徴、特に、発生周期および膜構造を示す。クラミジア科には独特の二相の細胞周期がある。小さな細胞外型である基本小体(EB)が宿主に付着し、貪食される。その後に、ファゴソーム内で細胞内複製型である網状体(reticulate body)に変わる。偏性細胞内細菌として、クラミジア科は、真核細胞内で、真核細胞のエネルギー貯蔵およびヌクレオチドプールを消費して増殖する。クラミジア科は、哺乳動物および鳥類における多種多様な疾患の原因となっている。
【０００５】
種クラミジア・トラコマティスは、最もよく特徴付けられている。C.トラコマティスは、2つのヒト次亜種:トラコーマ(trachoma)および性病性リンパ肉芽腫(lymphogranuloma venereum)(LGV)からなる。以前、この種と一緒に分類されていたマウス株およびブタ株は、現在、別の種に属している(それぞれ、C.ムリダルムおよびC.スイス)。2つのC.トラコマティス次亜種の中にある血液型亜型は、トラコーマ、性感染症、一部の型の関節炎、ならびに新生児封入体結膜炎および肺炎の原因となる。トラコーマ次亜種には、現在、14の血液型亜型があり、感染は、主に、粘膜の上皮細胞に限定される。トラコーマ次亜種は、顎関節疾患患者から取り出された後方二層組織(posterior bilaminar tissue)でも検出されている。LGV次亜種は4つの血液型亜型L1、L2、L2a、およびL3からなり、これらはリンパ組織に侵入することができる。トラコーマ次亜種の特定の株は主に眼感染症において見られるが、トラコーマ次亜種の他の株およびLGVは本質的に生殖器感染症の原因となっている。LGV株は全身疾患の原因となっていると述べるべきである。歴史的に見て、クラミジア・トラコマティス微生物の特徴付けは、細胞培養での一連の単離の後に1957年になって初めて成功した。
【０００６】
種クラミジア・シタッシは、多くの動物、特に、鳥類に感染し、ヒトへと伝播する。これは、非定型肺炎、肝臓および腎臓の機能不全、心内膜炎、ならびに結膜炎の原因となる。
【０００７】
クラミジア・ペコラムはヒトに感染しないが、反芻動物の病原体である。
【０００８】
クラミジア・ニューモニエがヒト病原体と認められたのは1983年であった(Grayston, J.T. et al., 1986)。その後、この細菌には特別の注意が払われており、肺炎の10％、気管支炎および副鼻腔炎の5％がクラミジア・ニューモニエ起因する(Aldous, M.B. et al., 1992)と見積もられている(Gaydos, C.A. et al., 1994)。最近、この細菌と喘息疾患および心血管障害の発生が関係することにますます関心が高まっている。
【０００９】
血清学的研究から、クラミジア・ニューモニエ感染症は5〜16歳の小児においてよく見られることが分かっている。この年齢より前では、C.ニューモニエ抗体を見つけることは稀であり、入手可能な最良のデータから、小児は5歳頃に抗体陽転し始めることが分かっている。次に、抗体保有個体数の増加は20歳までの年齢と相関する。従って、成人の50％〜70％は抗体保有者である。誘導された抗体がある期間にわたって持続するのは、最初の感染後3年または長くても5年に限られるので、このことは、全生涯にわたって再感染が頻繁に起こることを示唆している。年間抗体陽転率は8〜16歳で約6〜8％であり(Kuo, C.-C. et al., 1995)、15歳前の疾患の血清有病率は両性別で同じである。この年齢の後、世界中の全ての地域で、女性より男性が頻繁に感染する。
【００１０】
これらのクラミジア属感染症は、世界全体にわたって地理的に非常に広範に見られ(Tong, C.Y. et al., 1993)、最も低い感染率は、カナダおよび北欧諸国などの北半球の先進国で観察される。対照的に、最も高い有病率は熱帯地方の発展途上国で見られ、このような国では、感染は5歳前に起こる場合がある。ヒトはクラミジア・ニューモニエの唯一知られている貯蔵庫であり、おそらく、感染は呼吸器分泌物による個人間伝播によって引き起こされると考えられる(Aldous, M.B. et al., 1992)。伝播の連鎖はまた間接的であるように見られる場合がある(Kleemola, M. et al., 1988)。このことは、有効な伝播によって引き起こされる感染と無症候性保菌者も存在する可能性とを示唆しており、この疾患の高い有病率を説明することができる。これはまた、クラミジア・ニューモニエが劣悪な環境で30時間まで生き残るという知見とも一致するが(Falsey, A.R. et al., 1993)、戸外でのこの微生物の感染性は、高い相対湿度の条件下で急速に低下する。潜伏期は、数週間であり、他の多くの呼吸器病原性細菌よりかなり長い。
【００１１】
クラミジア・ニューモニエによって引き起こされる主な臨床的発現は、本質的には、呼吸器疾患である。肺炎および気管支炎が最も頻繁に見られる。なぜなら、肺炎および気管支炎は臨床上明らかであり、感染病原体を同定できるからである。病原体の単離は難しいが、抗体検査を用いて診断を確定するには対をなす急性期血清と回復期血清とが必要とされる。クラミジア・ニューモニエによって引き起こされる無症候性疾患は、おそらく、非常に多い(例えば、Grayston, J.T., 1992)。他の症候群、例えば、副鼻腔炎、化膿性中耳炎(Ogawa, H. et al., 1992)、または咽頭炎が説明されており、喘息に似た呼吸器障害を伴う感染も説明されている(Hahn, D.L. et al., 1991)。クラミジア・ニューモニエはまた、類肉腫症、結節性紅斑とも関連付けられており(Sundelof, B. et al., 1993)、ギラン・バレー症候群の一症例が述べられている(Haidl, S. et al., 1992)。クラミジア・ニューモニエがライター症候群に関与することも評価されている(Braun, J. et al., 1994)。
【００１２】
西洋諸国での主な死因は、心血管疾患である。心臓病患者の抗体レベルが高いことが観察されたため、最初に、クラミジア・ニューモニエと、冠状動脈性心疾患および心筋梗塞などの心血管疾患の発症が関連することが疑われた(例えば、Shor, A. et al., 1992)。さらに、病理解剖学研究および微生物学研究によって血管においてC.ニューモニエを検出することができた。いくつかの国々からの研究も、クラミジア・ニューモニエ感染症が患者のアテローム障害と相関することを示している(例えば、Grayston, J.T. et al., 1996)。従って、この細菌は、新しいアテローム病変より古いアテローム病変によく見られるようにも見えるが、アテローム疾患のない被験体には見られない。従って、アテローム斑とクラミジア・ニューモニエの存在との相関関係が非常に強いことが、これらの研究によって裏付けられている。それにもかかわらず、この細菌が血管病変において果たす役割はまだ明確にされていない。
【００１３】
クラミジア・ニューモニエ感染症の治療のために、比較臨床試験から利用可能なデータはほんの少ししかない。ライム病およびマイコプラズマ感染症に似ており、C.ニューモニエが細胞内にいる性質のために、長期間の抗菌治療が必要とされる。この大規模な抗菌治療は、マクロファージからおよび感染動脈の内皮細胞からC.ニューモニエを根絶するのに必要である。ペニシリン、アンピシリン、またはスルファミドとは異なり、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、オフロキサシン、クリナフロキサシン、シプロフロキサシン、アジスロマイシン、クリンダマイシン、およびミノサイクリンなどの抗生物質は、クラミジア・ニューモニエに対してインビトロで抗生物質活性を示す。しかしながら、感染の再発を避けるために、どの治療も高用量で数週間続けなければならない。従って、今日では、より短くかつ良好な、忍容性のある治癒を可能にする、拡散、バイオアベイラビリティ、半減期を有する、2種類の新しいマクロライド系抗生物質であるクラリスロマイシンおよびアジスロマイシンを使用することが好ましい。残念なことに、クラミジア属に対する多くの従来の治療法は依然として失敗しており、その結果、再発率および罹患率が高い。従って、臨床研究の結果に基づく決定的証拠が無く、再感染も防ぐクラミジア・ニューモニエ感染症の有効かつ忍容性の高い治療法が依然として望まれている。
【００１４】
非常に重要な問題は、都合よくかつ迅速に実施することができ、感染の早期スクリーニングを可能にする、特異性および感度の高い診断の開発である。C.ニューモニエ感染症の検査診断は、微生物の単離および培養、血清学、ならびに/またはPCRによるDNAの検出に基づいている。残念なことに、クラミジア・ニューモニエ培養に基づく方法は遅く、適切な条件下での株の収集、保存、および保管に関与する困難のために、かなりのノウハウを必要とする。
【００１５】
C.ニューモニエは、患者からの鼻咽頭スワブもしくは咽頭スワブ、痰、または胸膜液から単離することができる。鼻咽頭は単離に最適な部位であるように見える(Block, S. et al.,1995)。単離されると、この生物は組織培養で増殖させる必要がある。C.ニューモニエは、気道組織に由来する細胞株、具体的には、Hep-2およびHL細胞株において容易に増殖する(Roblin, P.M. et al., 1992)。標本を72時間培養した後、培養の確定は、C.ニューモニエ種特異的またはクラミジア属特異的なフルオレセイン結合モノクローナル抗体を用いて行うことができる。
【００１６】
クラミジア属の血清学的診断は、通常、マイクロイムノフルオレッセンス検査を用いて行われる。この方法は、別個のドットとしてガラススライドに固定化されたクラミジア抗原特異的抗体を顕微鏡により検出することに基づいている。このアッセイは、臨床標本が、抗原と反応する抗体を含有する場合に陽性とみなす。次いで、この免疫反応を、フルオレセイン結合二次抗体を用いて視覚化する(Tuuminen, T. et al., 2000)。マイクロイムノフルオレッセンス検査は、非常に特異性および感度の高い方法であることが分かっている。しかしながら、検査を実施するために、特殊な蛍光顕微鏡装置および抗原として、精製された無傷の生物が必要であるので、標準的な検査室で使用するには不適当である。
【００１７】
他方で、抗原検出に基づく方法(酵素イムノアッセイ(EIA)、直接的蛍光抗体試験(DFA))、または核酸増幅(ポリメラーゼ連鎖反応(PCR))は、検査業務により適した検査を提供する。PCRは、迅速なC.ニューモニエ検出法の開発において最も有望な技術であるように見える。臨床標本中のこの病原体を検出する少なくとも19のインハウスPCRアッセイが文献に報告されている(Boman, J. et al., 1999)。しかしながら、これらのアッセイはどれも標準化されておらず、培養法と比較して十分に確証されておらず、市販されておらず、FDAにより認可されていない。これらの方法の大きな違いには、標本を収集および処理するやり方、プライマー設計、核酸抽出、ならびに増幅産物の検出および同定が含まれる。
【００１８】
従って、血清群を識別する、なおさらには、クラミジア・ニューモニエ種を識別する、信頼性が高く、感度が高く、かつ便利な検査が非常に望まれている。このことは、クラミジア・ニューモニエ感染症の症状がゆっくり現れ、これらの感染症と関連する病変の全てが特定されているとは限らないためいっそう重要である。さらに、これらの感染症と、重篤な慢性感染症、喘息、およびアテローム性動脈硬化症が関連することが疑われている。抗原検出に基づく感度および特異性の高い検査が開発されているが、標準化された、PCRに基づく検出プロトコールおよび検査が依然として必要とされている(Dowell, S.F. et al., 2001)。
【００１９】
クラミジア属による感染症は慢性および再発性であることが多い。このことは、クラミジア属に対する防御免疫が弱く、必ずしも殺菌性または滅菌性があるとは限らないことを示唆している。現在、クラミジア感染症に対する利用可能なワクチンはない。開発された検査および動物モデルの数は多いが、使用された抗原は、ヒトワクチンを開発するのに十分な防御免疫を誘導していない。
【００２０】
クラミジア・ニューモニエの生物学的特性、この細菌とその宿主の相互作用、宿主の免疫防御からの回避だけでなく、関連する病変の発生への関与をさらに詳しく理解すると、クラミジア属により誘導される疾患を良好に管理、治療、または予防できると考えられる。従って、特異性、有効性、および忍容性のある新たな予防法および治療法、新たな診断法、ならびに新たなワクチン戦略の開発を可能にする新規の分子ツールを使用することが絶対必要である。これは、まさに本発明の目的である。
【００２１】
ワクチンは多種多様な抗原を含有してもよい。抗原の例は、全滅生物もしくは弱毒化生物、これらの生物/組織の亜分画、タンパク質、または最も単純な形ではペプチドである。抗原はまた、グリコシル化されたタンパク質またはペプチドの形でも免疫系によって認識されることがあり、多糖または脂質でもよく、多糖または脂質を含有してもよい。例えば、細胞傷害性T細胞(CTL)は、主要組織適合複合体(MHC)と共に、短い、通常、8〜11アミノ酸長のペプチドの形をとる抗原を認識するので、短いペプチドを使用することができる。B細胞は、4〜5アミノ酸と短い線状エピトープならびに三次元構造(高次構造エピトープ)を認識することができる。
【００２２】
持続的な抗原特異的免疫応答を得るために、アジュバントが、免疫系の全ての細胞に関与する免疫カスケードを誘発する必要がある。主に、アジュバントは、いわゆる、抗原提示細胞(APC)に作用するが、アジュバントの作用様式は制限されない。これらの細胞が、通常、最初に抗原に遭遇した後に、プロセシングされた抗原または改変されていない抗原が免疫エフェクター細胞に提示される。中間の細胞タイプも関与することがある。生産的免疫応答では、適切な特異性を有するエフェクター細胞しか活性化されない。アジュバントはまた、抗原および共に注射され得る因子を局所に保つこともできる。さらに、アジュバントは、他の免疫細胞の化学誘引物質として作用してもよく、免疫系の刺激剤として局所および/または全身に作用してもよい。
【００２３】
ヒト免疫系によって産生され、ヒト血清中に存在する、クラミジア属に対する抗体は、抗原タンパク質がインビボで発現され、抗原タンパク質に免疫性があることを示している。血清抗体によって認識される線状エピトープの認識は、4〜5と短いアミノ酸の配列に基づいてもよい。もちろん、このことは、これらの短いペプチドが所定の抗体をインビボで誘導できることを必ずしも意味しているわけではない。このような理由で、規定されたエピトープ、ポリペプチド、およびタンパク質は、選択されたタンパク質に対するT細胞および抗体をインビボで誘導する能力について、動物(主にマウス)においてさらに試験しなければならない。
【００２４】
偏性細胞内寄生生物であるC.ニューモニエは、感染性、非複製性であり、代謝が比較的不活発な基本小体(EB)である小さな細胞外型と、感染性、複製性であり、代謝が活発な網状体である大きな細胞内型との独特の二相の生活環を有する。EBは感受性宿主細胞に付着し、食作用によって取り込まれる。細胞内でEBは網状体に戻り、複製した後、EBに戻り、その後に、宿主細胞が溶解される。C.ニューモニエに対する防御の免疫上相関関係にあるものははっきりとしていないが、ヒト感染の重要な局面を忠実に模倣しているマウスモデルを用いた研究から、特に、CD8+T細胞およびIFN-γがマウスでの防御に重要であることが分かっている(Wizel, B. et al., 2002)。さらに、CD4+T細胞は抗体分泌細胞に増殖および分化するようにB細胞を刺激するので重要である場合がある。Th1型CD4+T細胞はIFN-γも産生するので、いくつかの点で抗クラミジア免疫に寄与する可能性がある。C.ニューモニエは膜結合空胞の中に存在するので、好ましい抗原は感染細胞のサイトゾルに到達しなければならず、その後に、CD8+T細胞によってMHCクラスI-ペプチド複合体として認識される必要がある。以前に報告された抗原の大部分は、このようにサイトゾルに到達できるように見られ、細胞表面上に位置するか(例えば、外膜タンパク質)、または分泌される(例えば、Murdin, A.D. et al., 2000; Wizel, B. et al., 2002)。C.ニューモニエペプチドに特異的なCD8+CTLおよびその可溶性因子はクラミジアの増殖をインビトロで阻害できることが示されている(Wizel, B. et al., 2002)。T細胞性免疫応答に加えて、B細胞エピトープによって誘導された細胞壁タンパク質に対する抗体はT細胞性免疫応答を助け、複数の目的にかなう可能性がある。すなわち、付着を阻害し、栄養分の獲得を妨害し、免疫回避を阻害し、食作用を促進する可能性がある(Hornef, M. et al., 2002)。分泌タンパク質に対する抗体は、毒素または病原性成分としての分泌タンパク質の機能の中和において潜在的に有益である。細菌は分泌タンパク質を介して互いに情報交換していることも知られている。これらのタンパク質に対する中和抗体は、クラミジア種間または種内での、成長を促進するクロストークを妨害する。記載の実験アプローチは、ヒト血清から精製されたC.ニューモニエによって特異的に誘導される抗体の使用に基づいている。それによって、ゲノムスクリーニングによって同定された抗原は、宿主においてインビボで発現し、抗体応答を誘導できることが示された。多くのタンパク質について、B細胞エピトープおよびT細胞エピトープが同じタンパク質に存在することが示されているので、ゲノムスクリーニングによって同定された最も有望な候補は、インビボで強力なT細胞応答を誘導するかどうかさらに評価することができる。最初の工程として、潜在的なT細胞エピトープをインシリコで同定するために、バイオインフォマティクス分析が用いられており、次に、適切なマウス感染モデルにおいて試験することができる。従って、本発明は、クラミジア感染症を治療または予防する効率的なワクチンの候補を提供するために、実験による免疫原性タンパク質の同定と、バイオインフォマティクスによるT細胞エピトープの予測を組み合わせている。
【００２５】
ヒト抗原に対する交差反応性抗体を誘導する可能性があるという潜在的なリスクのために、ヒト用の不活化全細胞ワクチンの開発には懸念があった。従って、サブユニットワクチンは、クラミジア・ニューモニエによる感染症の予防において最大の可能性があるとみなされている。
【００２６】
3つのC.ニューモニエ分離株(AR39、J138、CWL029)の完全ゲノム配列が様々な機関によって決定された(Kalman, S. et al., 1999; Read, T.D. et al., 2000; Shirai, M. et al., 2000;http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/CMRHomePage.splも参照されたい)。2つのAR39株およびCWL029株は、それぞれ、1987年以前に米国、1994年に日本で単離されたが、これらの配列は高度に同一である。このことは、ヒトの歴史の中で最近になって分岐したことを示している。これら3つのC.ニューモニエ株に加えて、2つのC.トラコマティスD/UW-3/CX株(血液型亜型D)およびHAR-13株の配列(Kalman, S. et al., 1999; Stephens, R.S. et al., 1998; Carlson, J.H. et al., 2005)、関連するマウスC.ムリダルムMoPn株の配列(Read, T.D. et al., 2000)、ならびにC.シタッシの配列(Read, T.D. et al., 2003)が決定されている。
【発明の概要】
【００２７】
本発明の根底にある問題は、クラミジア属によって引き起こされる感染症に対する薬学的組成物、例えば、ワクチンを開発するための手段を提供することであった。より詳しくは、この問題は、薬学的組成物の調製に使用することができる、クラミジア属に由来する核酸分子あるいは抗原またはその断片もしくは変種の効率的な、関連する、かつ包括的なセットを提供することであった。なおさらなる問題は、抗原、その断片または変種を作製する方法および手段を提供することであった。さらに別の問題は、核酸または抗原を含む薬学的組成物を提供することであった。本発明のなおさらなる問題は、抗体、抗体を含む薬学的組成物、抗体を作製する方法、および薬学的調製物の調製のための抗体の使用を提供することであった。さらに、本発明の目的は、抗原またはその断片もしくは変種に結合することができるアンタゴニストを特定する方法を提供すること、ならびにこのような抗原とその相互作用パートナーとの相互作用活性を低下または阻害することができるアンタゴニストを特定する方法を提供することであった。本発明のさらなる問題は、クラミジア属生物による感染症を診断する方法を提供することであった。本発明の根底にあるさらに別の問題は、クラミジア属感染症を治療する方法を提供すること、および動物またはヒトを免疫化する方法を提供することであった。
【００２８】
本発明の根底にある問題は、1つの局面では、抗原またはその断片をコードする単離された核酸分子であって、以下からなる群より選択される核酸配列を含む単離された核酸分子によって解決される。
a)SEQ ID NO:1-98からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子と少なくとも70％の配列同一性を有する核酸分子、
b)a)の核酸分子に相補的な核酸分子、
c)a)またはb)の核酸分子の少なくとも15個の連続した塩基を含む核酸分子、
d)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、a)、b)、またはc)の核酸分子にアニーリングする核酸分子、および
e)遺伝暗号の縮重がなければ、a)、b)、c)またはd)において定義された核酸分子にハイブリダイズする核酸分子。
【００２９】
本発明の1つの態様では、SEQ ID NO:1-98との配列同一性は、少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％、もしくは99％、または最も好ましくは100％である。
【００３０】
1つの態様では、核酸はDNAである。
【００３１】
代わりの態様では、核酸はRNAである。
【００３２】
さらに別の態様では、核酸分子は、ゲノムDNA、好ましくはクラミジア属の種に由来する、より好ましくはC.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスに由来する、最も好ましくはC.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシに由来するゲノムDNAから単離される。
【００３３】
本発明の1つの態様では、コードされる抗原断片は、その活性断片もしくは活性変種である。
【００３４】
1つの態様では、核酸は、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスに由来するポリペプチドもしくはペプチド断片、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシに由来するポリペプチドもしくはペプチド断片を含むか、またはこのようなポリペプチドもしくはペプチド断片からなる、抗原またはその断片をコードする。
【００３５】
さらに、本発明の根底にある問題は、前記の核酸分子を含むベクターによって解決される。
【００３６】
1つの態様では、ベクターは、前記で定義した核酸分子によってコードされる抗原またはその断片の組換え発現用に適合される。
【００３７】
本発明はまた、前記で定義したベクターを含む宿主細胞に関する。
【００３８】
本発明の根底にある問題は、さらなる局面では、クラミジア属に感染しているヒトに由来する、またはクラミジア属に以前に感染したことのある非感染健常ヒトに由来する血清と免疫学的に反応する抗原であり、クラミジア属に由来する、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシに由来する単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種を含む抗原によって解決される。
【００３９】
本明細書で使用する「非感染健常ヒト」という用語は、病原体と複数回遭遇している、または複数回遭遇したことがあり、その結果、集落形成があり得るが、症状が全くないか、疾患が軽度である、個体を含む。この用語、および抗原を特定するために非感染健常ヒトの血清を選択した理由は、Nagy, E. et al. (2003)においてさらに定義されている。
【００４０】
本発明の別の局面は、SEQ ID NO: 99-196からなる群より選択される単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種を含むか、あるいはこのような単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種からなる、抗原に関する。
【００４１】
本発明の1つの態様では、前記ポリペプチドは、前記で定義した核酸分子によってコードされる。
【００４２】
別の態様では、抗原の活性断片は、前記ポリペプチドの、特に、SEQ ID NO: 99-196のいずれかによって定義されるポリペプチドの、少なくとも50％、特に少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、または98％、最も好ましくは99％からなる。
【００４３】
1つの態様では、抗原の活性変種は、前記ポリペプチドと、特に、SEQ ID NO: 99-196のいずれかによって定義されるポリペプチドと、少なくとも50％、特に少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、または98％、最も好ましくは99％の配列同一性を有する。
【００４４】
本発明の1つの態様では、抗原の活性断片は、SEQ ID NO: 123のアミノ酸2-872、SEQ ID NO: 124のアミノ酸2-812、SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514または516-1090、SEQ ID NO: 127のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 128のアミノ酸2-324、SEQ ID NO: 130のアミノ酸2-235、SEQ ID NO: 131のアミノ酸2-792、SEQ ID NO: 132のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245、SEQ ID NO: 138のアミノ酸2-393、SEQ ID NO: 139のアミノ酸2-237、SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620、SEQ ID NO: 155のアミノ酸2-287、SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231、SEQ ID NO: 157のアミノ酸2-550、SEQ ID NO: 165のアミノ酸2-644、SEQ ID NO: 168のアミノ酸2-343、SEQ ID NO: 170のアミノ酸2-325、SEQ ID NO: 171の2-458、またはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379を含むか、このようなアミノ酸からなる。
【００４５】
前記で列挙した断片は、別個のSEQ ID NOにおいてさらに定義される。すなわち、SEQ ID NO: 123のアミノ酸2-872はSEQ ID NO: 99と同一であり;SEQ ID NO: 124のアミノ酸2-812はSEQ ID NO: 100と同一であり、SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514はSEQ ID NO: 101と同一であり、SEQ ID NO: 125のアミノ酸516-1090はSEQ ID NO: 102と同一であり、SEQ ID NO: 127のアミノ酸2-252はSEQ ID NO: 104と同一であり、SEQ ID NO: 128のアミノ酸2-324はSEQ ID NO: 105と同一であり、SEQ ID NO: 130のアミノ酸2-235はSEQ ID NO: 106と同一であり、SEQ ID NO: 131のアミノ酸2-792はSEQ ID NO: 107と同一であり、SEQ ID NO: 132のアミノ酸2-252はSEQ ID NO: 108と同一であり、SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245はSEQ ID NO: 109と同一であり、SEQ ID NO: 138のアミノ酸2-393はSEQ ID NO:110と同一であり、SEQ ID NO: 139のアミノ酸2-237はSEQ ID NO: 111と同一であり、SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620はSEQ ID NO: 112と同一であり、SEQ ID NO: 155のアミノ酸2-287はSEQ ID NO: 114と同一であり、SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231はSEQ ID NO: 115と同一であり、SEQ ID NO: 157のアミノ酸2-550はSEQ ID NO: 116と同一であり、SEQ ID NO: 165のアミノ酸2-644はSEQ ID NO: 117と同一であり、SEQ ID NO: 168のアミノ酸2-343はSEQ ID NO: 118と同一であり、SEQ ID NO: 170のアミノ酸2-325はSEQ ID NO: 120と同一であり、SEQ ID NO: 171の2-458はSEQ ID NO: 121と同一であり、SEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379はSEQ ID NO: 122と同一である。
【００４６】
同定された抗原アミノ酸配列のうち3つが全オープンリーディングフレーム(ORF)と同一であったので、SEQ ID NO: 103はSEQ ID NO: 126と同一であり、SEQ ID NO: 113はSEQ ID NO: 151と同一であり、SEQ ID NO: 119はSEQ ID NO: 169と同一である。
【００４７】
別の態様では、抗原の活性変種は、SEQ ID NO: 123のアミノ酸2-872、SEQ ID NO: 124のアミノ酸2-812、SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514もしくは516-1090、SEQ ID NO: 127のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 128のアミノ酸2-324、SEQ ID NO: 130のアミノ酸2-235、SEQ ID NO: 131のアミノ酸2-792、SEQ ID NO: 132のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245、SEQ ID NO: 138のアミノ酸2-393、SEQ ID NO: 139のアミノ酸2-237、SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620、SEQ ID NO: 155のアミノ酸2-287、SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231、SEQ ID NO: 157のアミノ酸2-550、SEQ ID NO: 165のアミノ酸2-644、SEQ ID NO: 168のアミノ酸2-343、SEQ ID NO: 170のアミノ酸2-325、SEQ ID NO: 171の2-458、またはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379と、少なくとも50％、特に少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、または98％、最も好ましくは99％の配列同一性を有する。
【００４８】
さらに別の態様では、抗原は、以下によってさらに定義される。
a)SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514からなる抗原の活性断片に対する、1〜570個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは、1〜500個、1〜400個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、もしくは1〜150個、さらにより好ましくは1〜100個、さらにより好ましくは1〜50個、最も好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、もしくは40個のさらなるアミノ酸残基、または
b)SEQ ID NO: 125のアミノ酸516-1090を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 125のアミノ酸516-1090からなる抗原の活性断片に対する、1〜510個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1〜400個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、もしくは1〜150個、さらにより好ましくは1〜100個、さらにより好ましくは1〜50個、最も好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、もしくは40個のさらなるアミノ酸残基、または
c)SEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379からなる抗原の活性断片に対する、1〜25個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、もしくは20個のさらなるアミノ酸残基、または
d)SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231からなる抗原の活性断片に対する、1〜20個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、もしくは15個のさらなるアミノ酸残基、または
e)SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620からなる抗原の活性断片に対する、1〜10個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、もしくは9個のさらなるアミノ酸残基、または
f)SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245からなる抗原の活性断片に対する、1〜5個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1個、2個、3個、もしくは4個のさらなるアミノ酸残基。
【００４９】
さらなるアミノ酸残基は、前記で定義した抗原と相同でもよい。相同とは、断片を得たクラミジア属抗原のアミノ酸配列と同一または類似の任意のアミノ酸残基を指す。
【００５０】
その代わりとして、またはさらに、ポリペプチドは、抗原、任意で、前記で定義したさらなる配列、および抗原と非相同の少なくとも1個のアミノ酸残基を含んでもよく、これらからなってもよい。
【００５１】
本発明の1つの態様では、抗原は、抗原と非相同の少なくとも1個のアミノ酸残基、好ましくはマーカータンパク質のアミノ酸配列をさらに含み、またはこれからさらになる。
【００５２】
前記で定義したさらなる配列またはアミノ酸残基は、任意のアミノ酸でよく、L-アミノ酸および/またはD-アミノ酸、天然アミノ酸、および別のアミノ酸でもよい、アミノ酸残基からなる。好ましくは、アミノ酸は、任意の天然アミノ酸、例えば、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンである。
【００５３】
しかしながら、アミノ酸はまた修飾アミノ酸または稀なアミノ酸でもよい。これらの例は、2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-ジアミノ酪酸、デスモシン、2,2’-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ-ヒドロキシリジン、3-ヒドロキシプロロイン(3-hydroxyproloine)、4-ヒドロキシプロロイン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、6-N-メチルリジン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシンまたはオルニチンである。さらに、アミノ酸は、翻訳後修飾などの修飾に供されてもよい。修飾の例には、アセチル化、アミド化、ブロッキング、ホルミル化、γ-カルボキシグルタミン酸ヒドロキシル化、グリコシル化(glycosilation)、メチル化、リン酸化、および硫酸化が含まれる。複数のさらなるアミノ酸残基または非相同アミノ酸残基がペプチドに存在する場合、これらのアミノ酸残基は同じでもよく、互いに異なってもよい。
【００５４】
「非相同アミノ酸」または「抗原と非相同のアミノ酸」という特徴は、クラミジア属、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシの任意の天然タンパク質の中で、抗原に隣接して位置するアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸を指す。従って、少なくとも1個の非相同アミノ酸を含む本発明のタンパク質は、クラミジア属、好ましくは、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシの任意の天然タンパク質またはその断片とは異なるタンパク質を指す。
【００５５】
1つの態様では、さらなるアミノ酸残基は、抗原のN末端に隣接するか、C末端に隣接するか、またはN末端とC末端とに隣接する。
【００５６】
別の態様では、さらなるアミノ酸残基は、以下によって定義される抗原に隣接する。
a)SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514もしくはそのC末端に由来する変種、あるいは
b)SEQ ID NO: 125のアミノ酸516-1090、SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245、SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620、SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231、もしくはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379、またはそのN末端に由来する変種。
【００５７】
別の態様では、抗原は、リーダー配列もしくは分泌配列、精製に用いられる配列、またはプロタンパク質配列をさらに含むか、あるいはこのような配列からさらになる。
【００５８】
本発明の根底にある問題は、別の局面では、表1の「推定された免疫原性アミノ酸」または「推定されたクラスII制限T細胞エピトープ/領域」または「特定された免疫原領域の位置(aa)」の列において示されたコアアミノ酸配列を含む抗原によって解決される。より好ましくは、コアアミノ酸配列は、
SEQ ID NO: 123のアミノ酸
2010530229.tif 000002
;SEQ ID NO: 124のアミノ酸
2010530229.tif 000003
;SEQ ID NO: 125のアミノ酸
2010530229.tif 000004
;SEQ ID NO: 126のアミノ酸
2010530229.tif 000005
;SEQ ID NO: 127のアミノ酸
2010530229.tif 000006
;SEQ ID NO: 128のアミノ酸
2010530229.tif 000007
;SEQ ID NO: 129のアミノ酸
2010530229.tif 000008
;SEQ ID NO: 130のアミノ酸
2010530229.tif 000009
;SEQ ID NO: 131のアミノ酸
2010530229.tif 000010
;SEQ ID NO: 132のアミノ酸
2010530229.tif 000011
;SEQ ID NO: 133のアミノ酸
2010530229.tif 000012
;SEQ ID NO: 134のアミノ酸
2010530229.tif 000013
;SEQ ID NO: 135のアミノ酸
2010530229.tif 000014
;SEQ ID NO: 136のアミノ酸
2010530229.tif 000015
;SEQ ID NO: 137のアミノ酸
2010530229.tif 000016
;SEQ ID NO: 138のアミノ酸
2010530229.tif 000017
;SEQ ID NO: 139のアミノ酸
2010530229.tif 000018
;SEQ ID NO: 140のアミノ酸
2010530229.tif 000019
;SEQ ID NO: 141のアミノ酸
2010530229.tif 000020
;SEQ ID NO: 142のアミノ酸
2010530229.tif 000021
;SEQ ID NO: 143のアミノ酸
2010530229.tif 000022
;SEQ ID NO: 144のアミノ酸
2010530229.tif 000023
;SEQ ID NO: 145のアミノ酸
2010530229.tif 000024
;SEQ ID NO: 146のアミノ酸
2010530229.tif 000025
;SEQ ID NO: 147のアミノ酸
2010530229.tif 000026
;SEQ ID NO: 148のアミノ酸
2010530229.tif 000027
;SEQ ID NO: 149のアミノ酸
2010530229.tif 000028
;SEQ ID NO: 150のアミノ酸
2010530229.tif 000029
;SEQ ID NO: 151のアミノ酸
2010530229.tif 000030
;SEQ ID NO: 152のアミノ酸
2010530229.tif 000031
;SEQ ID NO: 153のアミノ酸
2010530229.tif 000032
;SEQ ID NO: 154のアミノ酸
2010530229.tif 000033
;SEQ ID NO: 155のアミノ酸
2010530229.tif 000034
;SEQ ID NO: 156のアミノ酸
2010530229.tif 000035
;SEQ ID NO: 157のアミノ酸
2010530229.tif 000036
;SEQ ID NO: 158のアミノ酸
2010530229.tif 000037
;SEQ ID NO: 159のアミノ酸
2010530229.tif 000038
;SEQ ID NO: 160のアミノ酸
2010530229.tif 000039
;SEQ ID NO: 161のアミノ酸
2010530229.tif 000040
;SEQ ID NO: 162のアミノ酸
2010530229.tif 000041
;SEQ ID NO: 163のアミノ酸
2010530229.tif 000042
;SEQ ID NO: 164のアミノ酸
2010530229.tif 000043
;SEQ ID NO: 165のアミノ酸
2010530229.tif 000044
;SEQ ID NO: 166のアミノ酸
2010530229.tif 000045
;SEQ ID NO: 167のアミノ酸
2010530229.tif 000046
;SEQ ID NO: 168のアミノ酸
2010530229.tif 000047
;SEQ ID NO: 169のアミノ酸
2010530229.tif 000048
;SEQ ID NO: 170のアミノ酸
2010530229.tif 000049
;SEQ ID NO: 171のアミノ酸
2010530229.tif 000050
;SEQ ID NO: 172のアミノ酸
2010530229.tif 000051
;SEQ ID NO: 173のアミノ酸
2010530229.tif 000052
;SEQ ID NO: 174のアミノ酸
2010530229.tif 000053
;SEQ ID NO: 175のアミノ酸
2010530229.tif 000054
;SEQ ID NO: 176のアミノ酸4〜14；
;SEQ ID NO: 177のアミノ酸
2010530229.tif 000055
;SEQ ID NO: 178のアミノ酸15-38;SEQ ID NO: 179のアミノ酸31-48、および50-55;SEQ ID NO: 181のアミノ酸6-14;SEQ ID NO: 182のアミノ酸4-10;SEQ ID NO: 183のアミノ酸9-18、および21-30;SEQ ID NO: 184のアミノ酸4-13、31-39、56-74、76-83、および85-91;SEQ ID NO: 185のアミノ酸8-32、38-49、および57-66;SEQ ID NO: 186のアミノ酸4-19、および25-31;SEQ ID NO: 187のアミノ酸1-9、17-25、38-49、および52-58;SEQ ID NO: 188のアミノ酸4-16、および20-27;SEQ ID NO: 189のアミノ酸20-26、および32-41;SEQ ID NO: 190のアミノ酸4-15、21-41、45-55、63-92、および105-123;SEQ ID NO: 192のアミノ酸4-17、および19-25;SEQ ID NO: 193のアミノ酸5-31、および33-50;SEQ ID NO: 194のアミノ酸10-17;SEQ ID NO: 195のアミノ酸4-21、および52-69;SEQ ID NO: 196のアミノ酸11-29;SEQ ID NO: 123のアミノ酸48-59、267-277、452-467、497-512、および659-673;SEQ ID NO: 124のアミノ酸315-326、428-442、741-756、および789-808;SEQ ID NO: 125のアミノ酸24-38、108-123、599-620、775-788、および939-949;SEQ ID NO: 126のアミノ酸17-30、40-59、71-83、93-113、216-231、260-277、371-385、および392-404;SEQ ID NO: 127のアミノ酸3-37、42-52、58-67、72-83、94-114、123-137、142-160、197-209、および218-250;SEQ ID NO: 128のアミノ酸7-22、24-35、78-93、97-110、124-136、162-176、193-209、213-225、および230-239;SEQ ID NO: 129のアミノ酸12-27、125-138、190-202、260-277、および394-417;SEQ ID NO: 130のアミノ酸9-21、26-37、49-63、84-97、107-120、127-137、142-154、197-208、および223-235;SEQ ID NO: 131のアミノ酸526-543、609-624、654-673、および682-699;SEQ ID NO: 132のアミノ酸7-25、45-63、91-122、173-183、および216-227;SEQ ID NO: 133のアミノ酸1-11、30-43、70-86、142-150、192-207、および217-229;SEQ ID NO: 134のアミノ酸428-440、561-572、859-870、919-930、および1055-1067;SEQ ID NO: 135のアミノ酸12-25、44-60、72-88、97-117、145-158、178-201、および211-221;SEQ ID NO: 136のアミノ酸6-26、1430-1441、および1648-1666;SEQ ID NO: 137のアミノ酸84-94、113-125、141-152、331-342、716-728、および743-763;SEQ ID NO: 138のアミノ酸17-27、110-120、166-179、220-234、251-262、282-294、322-339、354-366、および379-387;SEQ ID NO: 139のアミノ酸5-25、34-51、115-125、140-152、166-181、191-201、および215-233;SEQ ID NO: 140のアミノ酸20-31、159-177、235-244、362-371、および444-454;SEQ ID NO: 141のアミノ酸8-23、122-130、289-300、289-300、336-345、388-398、および590-614;SEQ ID NO: 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【００５９】
1つの態様では、さらに、抗原は、以下からなる。
a)1〜50個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜30個、さらにより好ましくは多くとも1〜25個、さらにより好ましくは多くとも1〜10個、最も好ましくは、1個、2個、3個、4個、もしくは5個のさらなるアミノ酸残基;および/または
b)コアアミノ酸配列と非相同の少なくとも1個のアミノ酸残基。
【００６０】
前記のさらなるアミノ酸残基は、前記でさらに定義される。
【００６１】
別の態様では、前記のアミノ酸残基は、コアアミノ酸配列のN末端に隣接するか、C末端に隣接するか、またはN末端とC末端とに隣接する。
【００６２】
本発明の1つの態様では、抗原は、前記で定義した、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個のコアアミノ酸配列を含む。
【００６３】
本発明の根底にある問題は、別の局面では、前記で定義した核酸分子を発現させる工程を含む、本発明において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を作製する方法によって解決される。
【００６４】
さらに、本発明は、適切な宿主細胞を前記で定義したベクターで形質転換またはトランスフェクトする工程を含む、前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種を発現する細胞を作製する方法に関する。
【００６５】
1つの態様では、抗原またはその活性断片もしくは活性変種は、クラミジア属、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシから単離される。
【００６６】
本発明の根底にある問題は、別の局面では、前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは前記で定義した核酸分子、あるいは前記で定義したベクターを含む、薬学的組成物、好ましくは、ワクチンによって解決される。
【００６７】
本発明の別の局面は、クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の、前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは前記で定義した核酸分子、あるいは前記で定義したベクターを含む、薬学的組成物、好ましくは、ワクチンを提供する。
【００６８】
好ましい態様では、本発明の薬学的組成物は、免疫賦活物質、好ましくは、ポリカチオンポリマー、特に、ポリカチオンペプチド、免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)、特に、オリゴ(dIdC) 13、少なくとも2個のLysLeuLysモチーフを含有するペプチド、特に、
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、神経刺激性化合物、特に、ヒト成長ホルモン、ミョウバン、フロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバント、またはその組み合わせをさらに含む。
【００６９】
本発明の薬学的組成物のより好ましい態様では、免疫賦活物質は、ポリカチオンポリマーおよび免疫賦活性デオキシヌクレオチドの組み合わせ、または少なくとも2個のLysLeuLysモチーフを含有するペプチドおよび免疫賦活性デオキシヌクレオチドの組み合わせ、好ましくは、
2010530229.tif 000057
およびオリゴ(dIdC) 13の組み合わせのどちらかである。
【００７０】
本発明の薬学的組成物のさらにより好ましい態様では、ポリカチオンポリマーは、ポリカチオンペプチド、特に、ポリアルギニンである。
【００７１】
本発明のさらに別の局面は、クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の、前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは前記で定義した核酸分子、あるいは前記で定義したベクターを提供する。
【００７２】
本発明の別の好ましい態様は、クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の薬学的組成物、特に、ワクチンを調製するための、前記で定義した抗原、その活性断片もしくは活性変種、前記で定義した核酸分子、または前記で定義したベクターの使用に関する。
【００７３】
本発明の根底にある問題は、さらなる局面では、前記で定義した抗原またはその断片の、好ましくは抗原の活性断片または変種の、好ましくは抗原の活性変種の少なくとも選択部分に結合する、抗体または少なくともその有効部分によって解決される。
【００７４】
好ましい態様では、抗体はモノクローナル抗体である。
【００７５】
別の好ましい態様では、前記有効部分は、Fabフラグメント、F(ab)フラグメント、F(ab)Nフラグメント、F(ab) 2フラグメント、またはFvフラグメントを含む。
【００７６】
本発明のさらに別の態様では、抗体はキメラ抗体である。
【００７７】
さらに別の態様では、抗体はヒト化抗体である。
【００７８】
さらなる態様では、抗体はIgA抗体である。
【００７９】
本発明の別の局面は、前記で定義した抗体を産生するハイブリドーマ細胞株に関する。
【００８０】
さらに、本発明の根底にある問題は、前記で定義した抗体を作製する方法によって解決される。前記方法は、以下の工程を特徴とする。
a)前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種を非ヒト動物に投与することによって、非ヒト動物において免疫応答を開始する工程、
b)前記動物から、抗体含有体液を取り出す工程、および
c)前記抗体含有体液をさらなる精製工程に供することによって、抗体を作製する工程。
【００８１】
さらに、本発明は、以下の工程を特徴とする、前記で定義した抗体を作製する方法に関する。
a)前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種を非ヒト動物に投与することによって、非ヒト動物において免疫応答を開始する工程、
b)前記動物から、脾臓または脾臓細胞を取り出す工程、
c)前記脾臓または脾臓細胞のハイブリドーマ細胞を作製する工程、
d)前記抗原またはその活性断片もしくは活性変種に特異的なハイブリドーマ細胞を選択およびクローニングする工程、
e)クローニングされた前記ハイブリドーマ細胞を培養することによって抗体を作製する工程、ならびに
f)任意で、さらなる精製工程を行う工程。
【００８２】
本発明の別の局面は、前記で特定された抗体を含む薬学的組成物に関する。
【００８３】
なおさらなる局面は、クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の、前記で定義した抗体または前記で定義した抗体を含む薬学的組成物に関する。
【００８４】
本発明の根底にある問題は、別の局面では、クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の薬学的組成物の調製のための、前記で定義した抗体の使用によって解決される。
【００８５】
別の局面によれば、本発明は、本発明に開示される抗原またはその活性断片もしくは活性変種に結合する、またはこれらに結合することができる、アンタゴニストを提供する。なおさらなる局面によれば、本発明によるアンタゴニストは、本発明による抗原またはその活性断片もしくは活性変種とその相互作用パートナーとの相互作用活性を低下または阻害することができるアンタゴニストである。このような相互作用パートナーは、好ましい態様では、前記抗原またはその活性断片もしくはその活性変種の抗体もしくは受容体、好ましくは、生理学的受容体である。
【００８６】
別の局面によれば、本発明は、前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種に結合することができるアンタゴニストを特定する方法を提供する。前記方法は、以下の工程を含む。
a)単離もしくは固定化された、前記で定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種と候補アンタゴニストを、前記候補アンタゴニストと前記抗原またはその活性断片もしくは活性変種が結合する条件下、候補アンタゴニストと前記抗原またはその活性断片もしくは活性変種との結合に応答して検出可能なシグナルを発することができる成分の存在下で接触させる工程、および
b)アンタゴニストと前記抗原またはその活性断片もしくは活性変種との結合に応答して生じたシグナルの有無を検出する工程。
【００８７】
本発明の根底にある問題は、前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種と、その相互作用パートナーとの相互作用活性を低下または阻害することができるアンタゴニストを特定する方法によってさらに解決される。前記方法は、以下の工程を含む。
a)前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種を準備する工程、
b)前記抗原またはその活性断片もしくは活性変種に対する相互作用パートナー、特に、前記で定義した抗体を準備する工程、
c)前記抗原またはその活性断片もしくは活性変種と前記相互作用パートナーを相互作用させて、相互作用複合体を形成する工程、
d)候補アンタゴニストを準備する工程、
e)候補アンタゴニストと相互作用複合体との間で競合反応を起こす工程、
f)候補アンタゴニストが、抗原またはその活性断片もしくは活性変種と相互作用パートナーとの相互作用活性を阻害または低下するかどうか決定する工程。
【００８８】
さらに、本発明は、前記の抗原またはその活性断片もしくは活性変種の相互作用パートナーを単離および/または精製および/または特定するための、前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種のいずれかの使用に関する。
【００８９】
本発明の別の局面は、クラミジア属生物による感染症を診断する方法に関する。前記方法は、以下の工程を含む。
a)被験体から得られた試料と、前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種を接触させる工程;および
b)試料中の、前記クラミジア属生物に対する抗体の存在を検出する工程。
【００９０】
前記方法の1つの態様によれば、クラミジア属生物に対する1つまたは複数の抗体の存在は、クラミジア属生物による感染症を示す。
【００９１】
前記方法の別の態様では、抗体はIgA抗体である。
【００９２】
さらに別の局面では、本発明は、クラミジア属生物による感染症を診断する方法に関する。前記方法は、以下の工程を含む。
a)被験体から得られた試料と、前記で定義した抗体を接触させる工程;および
b)試料中の、前記クラミジア属生物の抗原の存在を検出する工程。
【００９３】
前記方法の1つの態様では、前記クラミジア属生物の抗原は、前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種である。
【００９４】
前記方法の1つの態様によれば、前記クラミジア属生物の1つまたは複数の抗原の存在は、クラミジア属生物による感染症を示す。
【００９５】
前記方法の別の態様では、抗体はIgA抗体である。
【００９６】
さらに別の局面は、クラミジア属生物による感染症を診断する方法に関する。前記方法は、以下の工程を含む。
a)被験体から得られた試料と、前記で定義した核酸分子またはその断片に特異的なプライマーまたはプローブを接触させる工程、および
b)試料中の、このような核酸分子またはその断片の存在を検出する工程。
【００９７】
前記方法の1つの態様によれば、1つまたは複数の前記核酸分子またはその断片の存在は、クラミジア属生物による感染症を示す。
【００９８】
本発明はまた、本発明による抗原またはその断片の発現に関連する疾患をインビトロで診断する方法も提供する。この方法は、本発明による前記の抗原もしくはその断片をコードする核酸配列の存在を確認する工程、または本発明による抗原もしくはその断片の存在を確認する工程を含む。
【００９９】
クラミジア属生物による感染症を診断する前記の方法のいずれかの態様では、クラミジア属生物は、病原性クラミジア属生物、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、最も好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシである。
【０１００】
さらに、本発明は、本発明において定義された抗原またはその断片もしくは変種に結合するペプチドであるアンチカリン(anticaline)を作製するための、本発明において定義された抗原またはその断片もしくは変種の使用を提供する。
【０１０１】
さらに、本発明は、アプタマーおよびスピーゲルマー(spiegelmer)からなる群より選択される機能的核酸を調製するための、前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種の使用を提供する。
【０１０２】
別の局面では、本発明は、リボザイム、アンチセンス核酸およびsiRNAからなる群より選択される機能的リボ核酸を調製するための、前記で定義した核酸分子の使用を提供する。
【０１０３】
さらに、本発明の根底にある問題は、動物またはヒトにおいて、好ましくは、クラミジア属による感染症の治療を必要とする動物またはヒトにおいて、クラミジア属による感染症を治療する方法によって解決される。前記方法は、治療的有効量の、前記局面のいずれかにおいて定義された、抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは核酸分子、あるいはベクター、あるいは抗体、あるいは薬学的組成物を前記動物またはヒトに投与する工程を含む。
【０１０４】
1つの態様では、クラミジア属による感染症は、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症である。
【０１０５】
本発明の根底にある問題は、別の局面では、クラミジア属生物による感染症に対して動物またはヒトを免疫化する方法によって解決される。前記方法は、前記動物またはヒトにおいて免疫応答を誘発するのに適した有効量の、前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは前記で定義した核酸分子、あるいは前記で定義したベクター、あるいは前記で定義した抗体、あるいは前記で定義した薬学的組成物を、前記動物またはヒトに投与する工程を含む。
【０１０６】
クラミジア属生物による感染症に対して動物またはヒトを免疫化する前記方法の1つの態様では、クラミジア属生物は、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシである。
【０１０７】
本発明の根底にある問題は、さらに別の局面では、動物またはヒトにおいて、クラミジア属生物に対する免疫応答を刺激する方法によって解決される。前記方法は、前記動物またはヒトにおける免疫応答を刺激するのに適した有効量の、前記で定義した抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは前記で定義した核酸分子、あるいは前記で定義したベクター、あるいは前記で定義した抗体、あるいは前記で定義した薬学的組成物を、前記動物またはヒトに投与する工程を含む。
【０１０８】
動物またはヒトにおいて、クラミジア属生物に対する免疫応答を刺激する前記方法の1つの態様では、クラミジア属生物は、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシである。
【０１０９】
本発明において定義された抗原が用いられる様々な方法および使用はまた、それぞれ、このような抗原の断片、好ましくはこのような抗原の活性断片またはこのような抗原の変種、好ましくはこのような抗原の活性変種、好ましくは本明細書に記載のものを用いて実行または実施できることは本発明の範囲内である。さらにまたはその代わりに、本発明による抗原と相互作用する、または本発明による抗原を標的とすると本明細書において開示された様々な種類の化合物が、前記抗原の活性断片もしくは活性変種と相互作用するか、または前記抗原の活性断片または活性変種を標的とすることも本発明の範囲内である。
【０１１０】
抗体が用いられる実施における、それぞれのおよび任意の方法はまた、抗体の代わりに、本明細書において定義されるアンチカリンまたは機能的核酸が用いられる時にも原則として実施可能なことも本発明の範囲内である。このような機能的核酸はアプタマーおよびスピーゲルマーからなる群より選択されることが好ましい。これは本願の様々な使用に等しく適用される。
【０１１１】
好ましい態様では、本明細書において開示される抗原の断片は、このような抗原の少なくとも1つの特徴を示す、このような抗原の一部である。好ましくは、このような特徴は、感染症治療のための適性、ヒトを含む動物の免疫化、および/またはヒトを含む動物における免疫応答の刺激からなる群より選択される特徴である。
【０１１２】
クラミジア属、より具体的にはC.ニューモニエに関して本明細書においてなされた任意の開示が、どのクラミジア属の種にも等しく適用可能であることも本発明の範囲内である。クラミジア属の種は、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシである。
【０１１３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」、または「抗原」という用語は本明細書全体を通じて同義に用いられ、本発明による抗原のそれぞれのおよび任意の変種、断片、類似体または誘導体、特に、本明細書に記載のものも含めて、本発明による抗原を包括的に指している。ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、または抗原という用語が本明細書において用いられる時はいつでも、かつ特に明記されていなければ、それぞれの開示は、本発明による抗原のそれぞれのおよび任意の変種、断片、類似体または誘導体、特に、本明細書に記載のものも含めて、本発明によるどの抗原についても、または本発明によるどの抗原に関してもなされる。本発明によるポリペプチド、ペプチド、タンパク質、または抗原という用語によってカバーされる任意の前述の化合物に関して述べられたどの使用または局面も、本発明によるポリペプチド、ペプチド、タンパク質、または抗原という用語によってカバーされる、それぞれのおよび他の任意の前述の化合物にも適用されるものとすることも理解されるはずである。
【０１１４】
本発明は、複数のヒト血漿プールからの抗体調製物およびC.ニューモニエゲノムに由来する表面発現ライブラリーを用いて、単離された核酸分子、ならびに単離された核酸分子によってコードされる抗原、その活性断片および活性変種の効率的な、関連する、かつ包括的なセットを有利に提供する。従って、本発明は、病原性のクラミジア属の種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによって引き起こされる感染症に対して有効な抗体の調製および化合物の特定のための手順において有用な、C.ニューモニエ抗原、ワクチン、診断薬、および製品の幅広く感じられている要望を満たす。
【０１１５】
有効なワクチンは、全ての株で発現され、かつ前記の病原性クラミジア属、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシの細胞表面成分に対する高親和性の豊富な抗体を誘導することができるタンパク質またはポリペプチドからならなければならない。抗体は、オプソニン化の場合にはIgG1および/またはIgG3、付着および毒素作用の中和の場合には任意のIgGサブタイプおよび/またはIgAでなければならない。
【０１１６】
C.ニューモニエは気道の粘膜上皮を介して宿主に感染し、従って、粘膜免疫は感染を管理するのに重要であると考えられている。IgAは、粘膜部位において誘導される主要な免疫グロブリン(Ig)アイソタイプであり、これらの部位での防御機能を媒介すると考えられている。
【０１１７】
実際に、IgA欠損マウスは野生型マウスより感染しやすいことが観察された(Rodriguez, A. et al., 2006)。このことは、IgA局所応答がC.ニューモニエ感染症からの気道の防御において役割を果たしている可能性があることを示している。
【０１１８】
IgAは、C.ニューモニエに感染した後、患者の血清および痰試料の両方において検出することができる(Ciarrocchi, G. et al., 2004)。従って、本発明の方法において関連抗原を同定するためにIgA抗体が選択された。従って、このIgAスクリーニングによって同定された抗原、ならびに本発明による方法によって作製されたそれぞれのIgA抗体は、クラミジア属の種による感染症、特に、C.ニューモニエ感染症を治療または予防するための薬学的組成物として使用するのに適している。
【０１１９】
化学的に規定されたワクチンは、前記の病原性クラミジア属のヒト組織交差反応成分またはオプソニン化阻害成分、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシのヒト組織交差反応成分またはオプソニン化阻害成分を排除することができ、防御抗体および/または防御免疫応答を誘導する個々のポリペプチドを選択することができるので、全細胞ワクチン(弱毒化または死菌)と比較して明らかに優れているはずである。
【０１２０】
本発明の好ましい態様では、核酸分子は、SEQ ID NO: 1-98に示したヌクレオチド配列に対して全長にわたって70％の同一性を示す。SEQ ID NO: 1-98に示した核酸分子に対して全長にわたって少なくとも 80％または少なくとも 85％ 同一の領域を含む核酸がより好ましい。これに関して、SEQ ID NO: 1-98に示したヌクレオチド配列に対して全長にわたって少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、または96％同一の核酸分子が特に好ましい。さらに、少なくとも97％の同一性を有する核酸分子が極めて好ましく、少なくとも98％および少なくとも99％の同一性を有する核酸分子が特に極めて好ましく、少なくとも99％または99.5％の同一性を有する核酸分子がさらに好ましく、100％の同一性を有する核酸分子が特に好ましい。さらに、これに関して好ましい態様は、SEQ ID NO: 99-196に示した成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持する抗原またはその断片(ポリペプチド)をコードする核酸である。本発明による核酸分子は、タンパク質、好ましくは、抗原をコードすることもまた本発明の範囲内である。なおさらに、SEQ ID NO: 99-196によって定義される分子がタンパク質、好ましくは、抗原であることもまた本発明の範囲内である。
【０１２１】
当技術分野において公知の、および本明細書において用いられる同一性は、配列比較によって求められる2つまたはそれ以上のポリペプチド配列間または2つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当技術分野において、同一性はまた、ポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味し、場合によっては、このような配列間のマッチによって求められることがある。同一性は容易に計算することができる。2つのポリヌクレオチド配列間または2つのポリペプチド配列間の同一性を測定する多くの方法が存在するが、この用語は当業者に周知である(例えば、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987)。同一性を求める好ましい方法は、試験配列間の最大マッチを与えるように設計されたものである。同一性を求める方法はコンピュータプログラムにおいて体系化されている。2つの配列間の同一性を求める好ましいコンピュータプログラム方法には、GCGプログラムパッケージ(Devereux, J. et al., 1984)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Altschul, S. et al., 1990)が含まれるが、これに限定されない。
【０１２２】
SEQ ID NO:1〜98を参照して本明細書において説明された核酸分子は本明細書において第1の選択肢として言及されたが、この核酸分子の第2の選択肢として、本発明による核酸分子は、本明細書において第1の選択肢に従って説明された核酸に少なくとも本質的に相補的な核酸分子でもよい。個々の核酸分子は、別の個々の核酸分子に少なくとも本質的に相補的であることが当業者により認められるであろう。本明細書で使用する、相補的とは、核酸鎖がワトソン・クリック塩基対形成を介して第2の核酸鎖と塩基対形成することを意味する。本明細書で使用する、本質的に相補的とは、それぞれの鎖の全ての塩基について塩基対形成が起こっておらず、ある特定の数またはパーセントの塩基が対形成していないか誤って対形成していることを意味する。正しく対形成している塩基のパーセントは、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは80％、さらに好ましくは90％、最も好ましくは90％超の任意のパーセントである。このようなさらに高いパーセントには、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％および100％が含まれ、このような定義は、この種の用語が用いられる本願のそれぞれの局面に適用することができる。マッチ塩基のパーセントが70％であるときは相同とみなされ、この程度のマッチ塩基対を有するハイブリダイゼーションはストリンジェントであるとみなされることに留意しなければならない。この種のストリンジェントなハイブリダイゼーションのハイブリダイゼーション条件は、Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., 1987)から選択することができる。より詳しくは、ハイブリダイゼーション条件は以下でもよい。
-ハイブリダイゼーションを、例えば、5xSSPE、5xデンハルト試薬、0.1％SDS、100g/mLの切断(sheared)DNA中68℃で行う。
-0.2xSSC、O.1％SDS中、42℃で中程度のストリンジェンシー洗浄を行う。
-0.1xSSC、0.1％SDS中、68℃で高ストリンジェンシー洗浄を行う。
【０１２３】
GC含量50％のゲノムDNAのTMは約96℃である。1％のミスマッチがあると、TMは約1℃下がる。
【０１２４】
さらに、原則的に、本明細書に記載のさらなる任意のハイブリダイゼーション条件も適用することができる。
【０１２５】
もちろん、ある特定のコード配列の開示によって、本発明によって同定されたものと同じポリペプチド分子をコードする全ての核酸配列分子が包含される。なぜなら、ある特定のポリペプチド分子をコードする全ての可能性のある核酸分子を明確に決めるために、遺伝暗号の縮重を、このような縮重核酸分子の数が多い場合があっても、直接適用できるからである。完全長抗原を使用した場合と同じ効果を得ることができるように、ある特定の抗原の活性断片または活性変種が使用に適した抗原をコードしている限り、このことは活性断片または活性変種にも適用することができる。好ましくは、このような抗原またはその活性断片もしくは活性変種は、ワクチン接種用途において、例えば、能動ワクチンまたは受動ワクチンとして使用することができる。
【０１２６】
本発明による核酸分子はまた、第3の選択肢として、上記の本発明による核酸分子の第1および第2の選択肢による核酸分子の少なくとも15塩基の配列を含む核酸でもよい。好ましくは、塩基は連続した塩基配列を形成する。しかしながら、配列が、多数の塩基によって分離された2つまたはそれ以上の部分からなることも本発明の範囲内である。
【０１２７】
本発明による核酸分子は、本明細書において開示した配列に由来する、好ましくは少なくとも20、さらにより好ましくは少なくとも30、特に少なくとも50の連続した塩基からなってもよい。適切な長さは目的の使用分野によって容易に最適化することができる(例えば、(PCR)プライマー、プローブ、捕捉分子(例えば、(DNA)チップ上のもの)など)。好ましい核酸分子は、少なくとも、表1に列挙した1つまたは複数の免疫原性アミノ酸配列の連続した15塩基部分を含有する。具体的には、(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgiまたはhttp://pedant.gsf.de/およびhttp://cmr.tigr.org/)で入手可能なC. ニューモニエAR39、CWL029、TW183およびJ138のゲノム配列と比較して、1個または複数の、好ましくは2個を超える、特に5個を超える非同一核酸残基を示す、本願の配列プロトコールに含まれる任意の配列のDNA配列の連続した部分を含有する核酸が好ましい。特に好ましい非同一核酸残基は、非同一アミノ酸残基につながる残基である。好ましくは、核酸配列は、前記の公表または列挙されたC. ニューモニエ対応物と比較して少なくとも1個、好ましくは少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個の異なるアミノ酸残基を有する、ポリペプチド、タンパク質、または抗原をコードする。好ましくは、この種のポリペプチド、タンパク質、または抗原は依然として、同一のアミノ酸残基を有すると本明細書において開示した分子の特徴の少なくとも1つを有する。少なくとも6個、7個、または8個のアミノ酸残基を有し、本明細書に記載の核酸によりコードされる、本明細書において開示した、例えば、配列表に開示したタンパク質の断片または抗原の断片である、このような単離されたポリペプチドも好ましい。
【０１２８】
本発明による核酸分子はまた、第4の選択肢として、本明細書において開示される第1、第2および第3の選択肢による本発明の核酸のいずれかとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアニーリングする核酸分子でもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、本明細書に記載のものである。
【０１２９】
最後に、本発明による核酸分子は、第5の選択肢として、遺伝暗号の縮重がなければ、本明細書において概説される第1、第2、第3および第4の選択肢による本発明の核酸分子のいずれかとハイブリダイズする核酸分子でもよい。この種の核酸分子は、好ましくは、本発明による核酸が本発明による抗原またはその断片もしくは変種をコードすることを指す。この種の核酸分子は、本発明による核酸分子の検出において特に有用であり、従って、それぞれの微生物、例えば、C. ニューモニエまたは任意の病原性クラミジア属の種、特に、本明細書において開示されたそれらの病原性クラミジア属の種、およびこれらの種の微生物が関与する任意の疾患または疾患状態の診断において有用である。好ましくは、このような微生物、特に、日和見性微生物は、このような疾患の直接的または間接的な原因となっている。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、本明細書に記載の第4の選択肢に関して記載したストリンジェントな条件下で起こってもよく、行われてもよい。
【０１３０】
本明細書で使用する核酸分子は、一般的に、クローニングによって得られた、または化学合成法によって作製された、またはその組み合わせによる、mRNAもしくはcRNAなどの任意のリボ核酸分子、または、例えば、cDNAおよびゲノムDNAを含むデオキシリボ核酸分子を指す。核酸分子は、非改変RNAまたは非改変DNAでもよく、改変RNAまたは改変DNAでもよい。従って、例えば、本明細書で使用する核酸分子は、特に、一本鎖DNAおよび二本鎖DNA、一本鎖RNAおよび二本鎖RNAの混合物であるDNA、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖、またはより典型的には二本鎖、または三本鎖、または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物でもよいDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子を指す。さらに、本明細書で使用する核酸分子は、RNA、またはDNA、またはRNAとDNAの両方を含む三本鎖領域を指す。このような領域にある鎖は同じ分子に由来してもよく、異なる分子に由来してもよい。領域は、1つまたは複数の分子に由来してもよいが、より典型的には、いくつかの分子の一領域のみを含む。多くの場合、三重らせん領域の分子の1つはオリゴヌクレオチドである。1本鎖DNAは、センス鎖とも知られるコード鎖でもよく、アンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖でもよい。本明細書で使用する、核酸分子という用語は、1つまたは複数の修飾塩基を含有する前記のDNAまたはRNAを含む。従って、安定性またはその他の理由のために改変された骨格を有するDNAまたはRNAは、この用語が本明細書において意図されるように核酸分子である。さらに、二例しか挙げないが、珍しい塩基、例えば、イノシン、または修飾塩基、例えば、トリチル化塩基を含むDNAまたはRNAは、この用語が本明細書において用いられるように、核酸分子である。当業者に公知の多くの有用な目的にかなう様々な改変をDNAおよびRNAに加えることができることが理解されると思われる。核酸分子という用語が本明細書で用いられる時、特に、このような化学的に改変された形態の核酸分子、酵素的に改変された形態の核酸分子、または代謝的に改変された形態の核酸分子、ならびにウイルスならびに単細胞および複合細胞を含む細胞に特徴的な化学形態のDNAおよびRNAを含む。核酸分子という用語はまた、オリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い短い核酸分子も含む。「ポリヌクレオチド」および「核酸」または「核酸分子」は本明細書において同義に用いられることが多い。
【０１３１】
本発明において提供される核酸分子はまたは、本願の配列表に示した核酸分子配列、より具体的には、C. ニューモニエコード領域の核酸分子配列より長いまたは短い、非常に多くの独特の断片も含み、これらは標準的なクローニング法によって作製することができる。独特であるためには、断片は、他の公知の核酸配列と区別できるほど十分な大きさでなければならず、任意の選択されたC. ニューモニエ断片と、生物配列(biosequence)データベース、例えば、GenBankのヌクレオチド配列を比較することによって最も容易に決定される。C. ニューモニエに関する任意の局面において本明細書において言われたものは、本明細書に記載の他のクラミジア属の種、より好ましくは、本明細書に記載の任意の病原性クラミジア属の種のいずれにも等しく適用されると当業者に理解されると思われる。
【０１３２】
さらに、本発明に包含される核酸分子およびポリペプチドに対して改変を加えることができる。例えば、核酸は、遺伝暗号の縮重の結果である配列も含む。20種類の天然アミノ酸があり、これらのほとんどは複数のコドンによって特定される。従って、核酸によってコードされるポリペプチドに影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行うことができる。従って、抗原またはその断片をコードする全ての核酸分子が本発明に包含される。
【０１３３】
さらに、融合タンパク質を作り出すために、本発明により提供される抗原またはその断片をコードする任意の核酸分子は、標準的な技法、例えば、標準的なクローニング法を用いて、C. ニューモニエの調節配列でも異種の調節配列でも任意の望ましい調節配列に、異種のリーダー配列に、異種マーカー配列に、異種コード配列でも機能的に連結することができる。
【０１３４】
さらに、本発明は、配列表に示したC. ニューモニエの推定アミノ酸配列を有する、断片、抗原およびその断片の類似体および誘導体をコードする本明細書に記載の核酸分子の変種に関する。核酸分子の変種は、天然の変種、例えば、天然の対立遺伝子変種でもよく、天然に生じることが知られていない変種でもよい。このような非天然の核酸分子変種は、核酸分子、細胞または生物に適用される変異誘発法を含む変異誘発法によって作ることができる。
【０１３５】
これに関する変種の中には、ヌクレオチド置換、欠失、または付加によって上述の核酸分子と異なる変種がある。置換、欠失、または付加は1つまたは複数のヌクレオチドを伴ってもよい。変種は、コード領域または非コード領域が変化したものでもよく、その両方が変化したものでもよい。コード領域の変化は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を生じてもよい。配列表に示したC. ニューモニエ配列を有し、いくつかの、数個の、5〜10個、1〜5個、1〜4個、3個、2個、1個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加が任意の組み合わせでなされている、または置換、欠失、もしくは付加がなされていない、変種、類似体、誘導体もしくは断片、または断片の変種、類似体もしくは誘導体をコードする核酸分子が好ましい。これらの中で特に好ましいのは、配列表に示したC. ニューモニエポリペプチドの性質および活性を変えない、サイレントな置換、付加、および欠失である。これに関して、保存的置換も特に好ましい。
【０１３６】
本発明の核酸分子はまた、本発明のポリペプチドをコードする完全長cDNAおよびゲノムクローンを単離するための、ならびに本発明の核酸分子と高い配列類似性を有する他の遺伝子のcDNAおよびゲノムクローンを単離するための、ハイブリダイゼーションプローブ、例えば、RNA用、cDNA用、およびゲノムDNA用のハイブリダイゼーションプローブとしても使用することができる。このようなプローブは、一般的に、少なくとも15塩基を含む。好ましくは、このようなプローブは、少なくとも20塩基、少なくとも25塩基、または少なくとも30塩基を有し、少なくとも50塩基を有することもある。特に好ましいプローブは少なくとも30塩基を有し、50塩基またはそれ以下、例えば、30塩基、35塩基、40塩基、45塩基、または50塩基を有する。
【０１３７】
例えば、本発明の核酸分子のコード領域は、オリゴヌクレオチドプローブ合成用の公知のDNA配列を用いて関連ライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。次いで、本発明の遺伝子に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを用いて、cDNA、ゲノムDNA、またはmRNAのライブラリーをスクリーニングして、プローブがどのライブラリーメンバーにハイブリダイズするか決定する。
【０１３８】
本発明の核酸分子およびポリペプチドは、本明細書においてさらに議論するように、薬学的組成物の開発もしくは調製および/または疾患、特に、ヒト疾患の診断薬のための試薬および材料として使用することができる。
【０１３９】
オリゴヌクレオチドである本発明の核酸分子は、本明細書において全体または一部が同定されたC. ニューモニエ遺伝子が感染組織、例えば、皮膚、滑液、もしくは血液の中で存在するかどうか、および/または転写されているかどうか決定するために本明細書に記載の方法、好ましくは、PCRについて述べられた方法において使用することができる。このような配列はまた、病原体が獲得した感染段階または感染型の診断においても有用であると認められる。この目的および他の目的のために、本明細書に記載の本発明による核酸またはポリペプチドの少なくとも1つを含む当技術分野において公知のアレイを使用することができる。
【０１４０】
本発明による核酸分子は、核酸分子およびこれらの核酸を含有する生物または試料の検出に使用することができる。好ましくは、このような検出は、診断のための、より好ましくは、クラミジア属またはクラミジア属の他の任意の病原体種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシの有無に関連または関係する疾患の診断のための検出である。
【０１４１】
クラミジア属またはクラミジア属の他の任意の病原体種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシに感染した真核生物(本明細書において「個体」ともいう)、特に、哺乳動物、特に、ヒトは、様々な技法によってDNAレベルで検出される本発明による任意の核酸分子を検出することによって特定することができる。クラミジア属または前記の他の病原性クラミジア属と他の生物と区別するのに好ましい核酸分子候補を得ることができる。
【０１４２】
本発明は、クラミジア属またはクラミジア属の他の任意の病原体種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症から生じた疾患を診断する方法を提供する。この方法は、本明細書において開示した、より好ましくは、配列表に示した核酸分子の配列を有する核酸分子の発現レベルの上昇を、個体から単離された試料または個体に由来する試料から決定する工程を含む。核酸分子の発現は、核酸分子の定量のための当技術分野において周知の方法のいずれか1つ、例えば、PCR、RT-PCR、RNase保護、ノザンブロッティング、ならびに本明細書に記載の他のハイブリダイゼーション法およびアレイを用いて測定することができる。
【０１４３】
本明細書で使用する単離とは、その天然の状態から「人の手によって」分離されていることを意味する。すなわち、それが天然に存在する場合、その元の環境から変化もしくは取り出されているか、またはその両方である。例えば、天然状態において生物に天然に存在する天然の核酸分子またはポリペプチドは「単離」されていないが、同じ核酸分子またはポリペプチドがその天然状態の共存する材料から分離されていると、この用語が本明細書において用いられるように「単離」されている。単離の一部としてまたは単離の後に、このような核酸分子は、例えば、変異誘発、融合遺伝子の形成、ならびに宿主内での増殖または発現のために、他の核酸分子、例えば、DNAに接続することができる。単離された核酸分子は単独で、または他の核酸分子、例えば、ベクターと接続させて、培養宿主細胞または生物内の宿主細胞に導入することができる。培養宿主細胞または生物内の宿主細胞に導入されても、このようなDNAは、この用語が本明細書において用いられるように単離されている。なぜなら、このようなDNAは、天然の形態または環境にはないからである。同様に、核酸分子およびポリペプチドは、組成物、例えば、培地調合物、核酸分子またはポリペプチドを、例えば、細胞に導入するための溶液、化学反応または酵素反応のための組成物または溶液、例えば、天然組成物でない組成物または溶液の中にあってもよく、これらの中では、この用語が本明細書において用いられるように、この用語の意味の範囲内で、単離された核酸分子またはポリペプチドのままである。
【０１４４】
核酸は、例えば、当業者に公知の方法によって、クラミジア属またはクラミジア属の他の任意の病原体種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシから単離することができる。同じことが本発明によるポリペプチドに当てはまる。
【０１４５】
好ましくは、本発明の核酸分子は、最初に、インビトロで、例えば、化学合成によって、または細胞培養で形成され、その後に、単離または精製されてもよい。一般的に、核酸は、エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼおよび/またはポリメラーゼおよび/またはリガーゼおよび/またはリコンビナーゼによって核酸を操作することによって得られてもよく、当業者に公知の他の核酸作製法によって得られてもよい。
【０１４６】
SEQ ID NO:1〜98によって定義される核酸配列は、ベクターに挿入された断片に含まれ、SEQ ID NO:99〜196により定義される最初のアミノ酸をコードする最初の完全コドンから始まる。しかしながら、組換えによる作製の場合、クローニングおよび発現を容易にするために、さらなる核酸が有用または必要な場合がある。
【０１４７】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。さらに、ベクターは、宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列、例えば、複製起点、1つもしくは複数の治療用遺伝子および/または選択マーカー遺伝子、ならびに当技術分野において公知の他の遺伝因子、例えば、コードタンパク質の転写、翻訳、および/または分泌を指向する調節エレメントを含んでもよい。ベクターは、細胞に形質導入、細胞を形質転換、または細胞に感染して、細胞に天然にあるもの以外の核酸および/またはタンパク質を細胞が発現するように使用することができる。ベクターは、任意で、核酸を細胞に入れるのを助ける材料、例えば、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティングなどを含む。
【０１４８】
本発明はまた、本発明のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による本発明によるポリペプチドの作製に関する。
【０１４９】
本発明によるポリペプチドを発現するために様々な発現ベクターを使用することができる。一般的に、この点に関する発現のために、宿主内でポリペプチドを発現するように核酸を維持、増殖、または発現するのに適した任意のベクターを使用することができる。本発明のこの局面によれば、ベクターは、例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファージベクター、一本鎖または二本鎖RNAもしくはDNAウイルスベクターでもよい。本明細書において開示した出発プラスミドは市販されているか、公的に入手可能であるか、周知の公表された手順を日常的に適用することによって、入手可能なベクターから構築することができる。ある点では、ベクターの中で、本発明による核酸分子およびポリペプチドを発現するためのベクターが好ましい。宿主細胞内の核酸構築物は従来どおり用いて、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を産生することができる。または、本発明によるポリペプチドは、従来のペプチド合成機によって合成により作製することができる。成熟タンパク質を、適切なプロモーターの制御下で哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞の中で発現させることができる。無細胞翻訳系も使用して、本発明のDNA構築物に由来するRNAを用いて、このようなタンパク質を産生することができる。
【０１５０】
宿主細胞は、本発明の核酸分子を組み込み、本発明の核酸分子を発現するように遺伝子操作することができる。適した宿主の代表例には、細菌細胞、例えば、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトマイセス属(Streptomyces)および枯草菌(Bacillus subtilis)細胞;真菌細胞、例えば、酵母細胞およびアスペルギルス属(Aspergillus)細胞;昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ(Drosophila)S2およびスポドプテラ属(Spodoptera)Sf9細胞;動物細胞、例えば、CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、Vero、PER.C6（登録商標）およびBowes黒色腫細胞;および植物細胞が含まれる。
【０１５１】
宿主細胞は、例えば、従来の手段、例えば、エレクトロポレーションによって、転写調節配列の制御下にある本発明の核酸を含有する少なくとも1つの発現ベクターを用いてトランスフェクトすることができる。
【０１５２】
本発明の別の局面によれば、新規のポリペプチドの包括的なセットが提供される。このようなポリペプチドは、本明細書において既に述べたように、本明細書において開示した抗原およびその断片、好ましくは、その活性断片およびその変種、好ましくは、その活性変種である。好ましくは、本発明によるポリペプチドは抗原およびその断片である。本発明の好ましい態様では、アミノ酸配列、好ましくは、本明細書に記載の核酸分子およびその断片のいずれか1つによりコードされるアミノ酸配列を含む抗原が提供される。本発明の別の好ましい態様では、SEQ ID NO:99〜196からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質および抗原ならびにその活性断片および活性変種の新規のセットが提供される。
【０１５３】
本発明によるポリペプチド、すなわち、本発明によって提供される抗原は、好ましくは、配列表に示した任意のポリペプチドまたは分子、ならびにこのような本発明によるポリペプチドと少なくとも70％の同一性、好ましくは、このような本発明によるポリペプチドと少なくとも80％または85％の同一性、より好ましくは、このような本発明によるポリペプチド、より好ましくは、配列表に示したポリペプチドと少なくとも90％の類似性(より好ましくは、少なくとも90％の同一性)、さらにより好ましくは、このような本発明によるポリペプチドと少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、または99.5％の類似性(さらにより好ましくは、少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、または99.5％の同一性)を有するポリペプチドを含み、また、このようなポリペプチドの部分も含み、このようなポリペプチドの部分は、一般的に少なくとも4個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも8個の、さらにより好ましくは少なくとも30個の、さらにより好ましくは多くとも50個のアミノ酸、例えば、4個、8個、10個、20個、30個、35個、40個、45個、または50個のアミノ酸を含有する。好ましい態様では、このような部分は本発明によるポリペプチドの活性断片である。
【０１５４】
本発明はまた、本発明によるポリペプチドの断片、類似体、および誘導体に関する。「断片」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、このようなポリペプチド、好ましくは、配列表に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドについて言及しているときは、このようなポリペプチドと本質的に同じ、または類似の生物学的活性を保持しているポリペプチドを意味する。本明細書で使用する「類似の生物学的活性」という用語の意味は、好ましくは、検討されているポリペプチドに左右される、より具体的には、その機能に左右されると当業者に認められると思われる。本明細書で使用する「生物学的活性」という用語は、以下でさらに定義される。より好ましくは、類似の生物学的機能または生物学的活性は、活性、親和性、免疫原性、安定性、および/または特異性の程度の点で、非断片または非誘導体の機能とは異なる。好ましい態様では、この差は、50％未満、75％未満、または90％未満である。
【０１５５】
1つの態様では、本発明によるポリペプチドの断片、誘導体、変種または類似体は、1)アミノ酸残基の1つまたは複数が、保存的アミノ酸残基または非保存的アミノ酸残基(好ましくは、保存的アミノ酸残基)で置換されたものであり、このような置換アミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされるものでもよく、コードされないものでもよい、あるいは2)アミノ酸残基の1つまたは複数が置換基を含むもの、あるいは3)本発明によるポリペプチドまたはその断片が、別の化合物、例えば、本発明によるポリペプチドのまたはその断片の半減期を延ばす化合物、例えば、ポリエチレングリコールと融合したもの、あるいは4)さらなるアミノ酸、例えば、リーダー配列もしくは分泌配列、または本発明によるポリペプチドもしくはその断片の精製に用いられる配列、またはプロタンパク質配列が、本発明によるポリペプチドまたはその断片と融合したものである。このような断片、誘導体、変種および類似体は、本明細書の開示から当業者の範囲内とみなされる。
【０１５６】
本発明はまた、異なるクラミジア属の種、好ましくは、病原性のクラミジア属の種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシのタンパク質および抗原、好ましくは、ホモログであるタンパク質および抗原に関する。このようなホモログは、本明細書において開示した核酸配列およびアミノ酸配列に基づいて簡単に単離することができる。
【０１５７】
各病原体について現在まで区別されている複数の血清型、遺伝子型、または臨床株があり、タイピングは、血清型に特異的な抗血清または分子アプローチに基づいている。従って、あらゆる血清型、遺伝子型、または株について、すべての抗原の存在を確認することができる。異なるクラミジア属感染症への様々な血清型の寄与は、異なる年齢群、特に、地域によって異なる。最も価値のある防御抗原が様々な臨床株の中で保存されている必要があることは重要な局面である。
【０１５８】
さらに、このような抗原、変種、類似体、誘導体、およびその断片、ならびに断片の変種、類似体、および誘導体を含む融合ポリペプチドも本発明に包含される。このような融合ポリペプチドおよびタンパク質、ならびにこれらをコードする核酸分子は、融合タンパク質をコードする組換えポリ核酸の作製および発現のための標準的な組換え法を含む標準的な技法を用いて容易に作ることができる。
【０１５９】
本発明の別の態様では、前記で定義したペプチドは、非改変ペプチドと本質的に同じ活性(断片および変種について前記で定義した)を有し、任意で、他の望ましい特性を有する誘導体を作製するように様々な化学的技法によって改変することができる。例えば、タンパク質のカルボン酸基はC末端にあっても側鎖にあっても、薬学的に許容されるカチオンの塩の形で提供されてもよく、エステルを形成するようにエステル化されてもよく、アミドに変換されてもよい。ペプチドのアミノ基はアミノ末端にあっても側鎖にあっても、薬学的に許容される酸添加塩、例えば、HCl塩、HBr塩、酢酸塩、安息香酸塩、トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、および他の有機塩の形をとってもよく、アミドに変換されてもよい。ペプチド側鎖のヒドロキシル基は、よく認識された技法を用いて、アルコキシまたはエステルに変換することができる。ペプチド側鎖のフェニルおよびフェノール環は、1つまたは複数のハロゲン原子、例えば、フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、またはそのアルキル、アルコキシ、カルボン酸およびそのエステル、またはこのようなカルボン酸のアミドで置換することができる。チオールは、よく認識されている多数の保護基のいずれか1つ、例えば、アセトアミド基を用いて保護することができる。
【０１６０】
これに関してさらに特に好ましいのは、本明細書において開示した、好ましくは、配列表に示した本発明による任意のポリペプチドのアミノ酸配列を有し、いくつかの、数個の、5〜10個、1〜5個、1〜3個、2個、1個のアミノ酸残基が任意の組み合わせで置換、欠失、または付加されている、または置換、欠失、もしくは付加がなされていない、変種、類似体、誘導体および断片、ならびに断片の変種、類似体および誘導体である。これらの中で特に好ましいのは、本発明のペプチドの性質および活性を変えない、サイレントな置換、付加、および欠失である。これに関して、保存的置換も特に好ましい。配列表に示したアミノ酸配列を有し、置換のないペプチドが最も極めて好ましい。
【０１６１】
本明細書において開示した様々な態様における任意の抗原の変種、特に、本明細書においてSEQ ID NO: 99-196と特定した抗原およびペプチドは、典型的には、バイオインフォマティクスによって特徴付けることもできる。配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxと併用するために、NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul, S. et al., 1990)などの各ツールが、米国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(NCBI, Bethesda, MD)を含むいくつかの情報源から、およびインターネット上で入手可能である。少なくとも35個のアミノ酸のアミノ酸配列を比較するために、デフォルトパラメータ(gapped blastp; gap existence cost 11、およびper residue gap cost 1)に設定されたデフォルトBLOSUM62マトリックスを用いて、NCBI Blast 2.0のBlast 2配列機能を使用した。(約35アミノ酸より少ない)短いペプチドをアラインメントする時には、アラインメントは、Blast 2配列機能を使用し、デフォルトパラメータ(open gap 9、extension gap 1ペナルティ)に設定されたPAM30マトリックスを用いて行う。このような短いウィンドウ、例えば、15アミノ酸またはそれ以下にわたる配列同一性を求める方法は、Bethesda, Marylandにある米国立バイオテクノロジー情報センターによって管理されているウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)において説明されている。
【０１６２】
抗原の活性変種は、相反することが明記されていなければ、抗原のそれぞれのおよび任意の変種、断片、類似体または誘導体も含む、抗原の配列変化によって得られる。ここで、配列変化を有する本発明によるポリペプチドは、免疫応答を誘導する能力、および/またはクラミジア属生物に対する防御を示す能力、例えば、マウスのクラミジア属感染症モデルにおいてクラミジア属に対する防御を示す能力を含む、本発明による変化していないポリペプチドの機能を保持する、例えば、完全抗原により表される生物学的活性と類似の生物学的活性を有する。適切な マウスモデルは、例えば、Yang, Z.P. et al. (1993)に記載のマウス肺炎モデル;Little, C.S. et al. (2004)に記載のマウスアルツハイマー病モデル;Marangoni, A. et al. (2006)に記載のマウス原発性胆汁性肝硬変モデル、および/またはHauer, A.D. et al. (2006)に記載のマウスアテローム性動脈硬化症モデルである。
【０１６３】
本発明による変化していないポリペプチドの機能を保持するさらなる例は、変化していない形態の本発明によるポリペプチドが結合するポリペプチド特異的抗体に、抗原の活性変種が特異的に結合することである。「生物学的機能」または「生物学的活性」とは、好ましくは、ポリペプチドの機能が細胞および生物の成長または生存にそれぞれ必要でなくても、ポリペプチドが天然に生じる細胞または生物でのポリペプチドの機能を意味する。例えば、ポーリンの生物学的機能は、細胞外培地に存在する化合物が細胞に流入するのを可能にすることである。生物学的機能は抗原機能とは異なる。本発明によるポリペプチドは複数の生物学的機能を有してもよい。
【０１６４】
このような変種の配列変化には、保存的置換、欠失、変異、および挿入が含まれ得るが、これに限定されない。好ましい変種の中には、保存的アミノ酸置換だけ基準と異なるものがある。保存的置換は、本発明によるポリペプチドの所定のアミノ酸を、類似の特徴の別のアミノ酸で置換すること、すなわち、側鎖および化学的特性に関連性があるアミノ酸ファミリーの中で起こる置換である。このようなファミリーの例は、塩基性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸、非極性脂肪族側鎖を有するアミノ酸、非極性芳香族側鎖を有するアミノ酸、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸、小さな側鎖を有するアミノ酸、大きな側鎖を有するアミノ酸などである。保存的置換として典型的にみられるのは、脂肪族アミノ酸、Ala、Val、LeuおよびIleの間での1つを他のものへの置換;ヒドロキシル残基SerおよびThrの交換、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnおよびGlnの間での置換、塩基性残基LysおよびArgの交換、ならびに芳香族残基PheおよびTyrの間での交換である。
【０１６５】
1つの態様では、1つの保存的置換がペプチドに含まれる。別の態様では、2つまたはそれ以下の保存的置換がペプチドに含まれる。さらなる態様では、3つまたはそれ以下の保存的置換がペプチドに含まれる。
【０１６６】
保存的アミノ酸置換の例には、以下に列挙した保存的アミノ酸置換が含まれるが、これに限定されない。
2010530229.tif 000058
【０１６７】
好ましくは、活性変種は、クラミジア属感染患者のヒト血清と反応性を示し、より好ましくは、セロコンバージョンを媒介し、最も好ましくは、殺菌活性を示す。活性変種のこれらの特徴は、例えば、実施例に詳述したように評価することができる。本発明の文脈において、特異的抗体(好ましくは、動物、例えば、マウス、ウサギにおいて組換えタンパク質に対して産生されたポリクローナル抗体、またはマウスにおいて作製されたまたはモノクローナル抗体)に特異的に結合する変種は、変種の活性が、配列変化のない抗原の活性の少なくとも10％、好ましくは少なくとも25％、より好ましくは少なくとも50％、さらにより好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％、特に少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも99％に達すれば、クラミジア属感染患者からのヒト血清との反応性を示すか、セロコンバージョンを媒介するか、または殺菌活性を示す。
【０１６８】
前記の活性変種には、天然の対立遺伝子変種、ならびに変種または他の任意の非天然変種が含まれる。当技術分野において公知のように、対立遺伝子変種は、前記のようにポリペプチド生物学的機能を本質的に変えない1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有することを特徴とする別の形態の(ポリ)ペプチドである。
【０１６９】
生物界のどんな種の中でも、対立遺伝子変異は普通のことである。例えば、どんな細菌種でも、例えば、C. ニューモニエでも、通常、マイナー対立遺伝子変異だけ互いに異なる様々な株(クローン生殖を特徴とする)によって表される。実際に、異なる株において同じ生物学的機能を果たすポリペプチドは、それぞれの株において同一でないアミノ酸配列を有することがある。このような対立遺伝子変異はヌクレオチドレベルで等しく反映される。
【０１７０】
外膜タンパク質Aについて述べられたように(Brunelle, B.W. et al., 2006)、対立遺伝子変異はクラミジア属の種の中で非常によく見られる。
【０１７１】
好ましい態様では、アミノ酸の交換、欠失または挿入によって、本発明によるポリペプチドから得られた活性変種または活性断片は、活性(本明細書において定義した、反応性、セロコンバージョンおよび/または殺菌活性)を保存することがあり、より好ましくは、このような活性を改善することがある。さらに、これらのポリペプチドは、同じT細胞応答または好ましくは改善したT細胞応答を誘発するエピトープをカバーしてもよい。これらエピトープは、本明細書においてさらに定義される「ヘテロクリティック」と呼ばれる。これらエピトープは、MHC/HLA分子に対して同様のまたは好ましくはより高い親和性を有し、元のエピトープに対するT細胞受容体(TCR)を同様にまたは好ましくはより強く刺激する能力を有する。ヘテロクリティックエピトープは、合理的な設計によって、すなわち、例えば、Rammensee H. et al. (1999)に記載のようにMHC/HLAへの結合への個々の残基の寄与を考慮に入れることと、TCRと潜在的に相互作用する残基を系統的に交換し、結果として生じた配列を元のエピトープに対するT細胞を用いて試験することを組み合わせて得ることができる。このような設計は、過度の実験なく当業者に可能である。
【０１７２】
本発明のさらにより好ましい態様では、本発明によるポリペプチドの活性変種は、本明細書において開示した任意のポリペプチドであり、より具体的には、SEQ ID NO:99〜196のいずれかのポリペプチドと少なくとも50％の配列同一性を有する、特に、SEQ ID NO:99〜196のいずれかのポリペプチドと少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％、最も好ましくは99％の配列同一性を有する、SEQ ID NO:99〜196によって定義される任意のポリペプチドであり、および/または前記で定義した保存的置換によって、SEQ ID NO:99〜196の任意の配列のポリペプチドから得られるものである。
【０１７３】
本発明によるポリペプチドならびにその断片および変種はまた、改変エピトープを含むか、または改変エピトープからなる。改変エピトープでは、好ましくは、所定のエピトープの1個または2個のアミノ酸が、例えば、Tourdot, S. et al., （2000）に開示される規則に従って改変または置換されており、このような改変エピトープをコードする核酸配列も同様である。本発明によるポリペプチドによって示されるエピトープは、本明細書において本発明のエピトープとも呼ばれる。
【０１７４】
エピトープのT細胞活性化能を改善する、保存する、または少なくとも有意に妨げないアミノ酸交換によって本発明のエピトープから得られるエピトープも本発明によるエピトープに含まれることは明らかである。従って、本発明のエピトープは、C. ニューモニエ由来の元の配列を含有しないが、同じT細胞応答または好ましくは改善したT細胞応答を誘発するエピトープも含む。これらエピトープは「ヘテロクリティック」と呼ばれ、MHC/HLA分子に対して同様のまたは好ましくはより高い親和性を有する必要があり、元のエピトープに対するT細胞受容体(TCR)を同様にまたは好ましくはより強く刺激する能力を有する必要がある。
【０１７５】
エピトープ、より具体的にはヘテロクリティックエピトープを特定する別の可能性があるものには、本発明のエピトープの1つまたはいくつかに対するT細胞を用いたペプチドライブラリーのスクリーニングが含まれる。1つの好ましい手法が合成ペプチドライブラリーの位置スキャニング(positional scanning)である。このようなアプローチは、例えば、Hemmer, B. et al., (1999)およびその参考文献に詳述されている。
【０１７６】
本明細書において開示される、本発明から得られるアミノ酸配列によって表されるエピトープまたはヘテロクリティックエピトープの代わりとして、本明細書において「ペプチドミメティカ(peptidemimetica)」または「レトロインバースペプチド(retro-inverse-peptide)」とも呼ばれる、これらのエピトープを模倣する物質または化合物も適用することができ、従って、本発明の範囲内である。
【０１７７】
改善されたエピトープの設計の別の局面は、T細胞を刺激する能力を高める物質を用いたそれらの製剤または改変である。これらには、Tヘルパー細胞エピトープ、脂質もしくはリポソーム、またはWO 01/78767に記載の好ましい改変が含まれる。
【０１７８】
エピトープのT細胞刺激能を高める別の手法は、免疫刺激物質、例えば、サイトカインまたはケモカイン、例えば、インターロイキン-2、-7、-12、-18、クラスIおよびIIインターフェロン(IFN)、特に、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α、flt3-リガンド、およびその他を用いたそれらの製剤である。
【０１７９】
本発明によるポリペプチドは、好ましくは、単離された形で提供され、好ましくは、均一になるまで精製されている。
【０１８０】
本発明の別の態様では、変種は断片である。断片は、前記で定義した抗原から1つまたは複数のアミノ酸欠失によって得られていることを特徴とする。欠失は、C末端にあってもよく、N末端にあってもよく、および/または内部にあってもよい。好ましくは、断片は、多くとも10、20、30、40、50、60、80、100、150、または200、より好ましくは、多くとも10、20、30、40、または50、さらにより好ましくは、多くとも5、10、または15、さらにより好ましくは、多くとも5または10、最も好ましくは、1、2、3、4、または5の欠失によって得られる。本発明の活性断片は、免疫応答を誘導する能力、ならびに/またはクラミジア属に対する防御を示す能力、例えば、前記のようなクラミジア属感染のマウスモデルにおいてクラミジア属に対する防御を示す能力を含む、完全抗原により表される生物学的活性と類似の生物学的活性を有することを特徴とする。断片の活性が、配列変化のない抗原の活性の少なくとも10％、好ましくは少なくとも25％、より好ましくは少なくとも50％、さらにより好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％、特に少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも99％に達すれば、抗原の断片は本発明の文脈では活性がある。これらの断片は、約50〜80アミノ酸長と短い長さを含めて任意の望ましい長さで設計または入手することができる。
【０１８１】
さらなる態様では、断片、より好ましくは、本発明によるポリペプチドの活性断片は、本発明によるポリペプチドならびにこのような断片の組み合わせの構造的性質または機能的性質、すなわち、αヘリックスおよびαヘリックス形成領域、βシートおよびβシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可動性領域、表面形成領域、基質結合領域、ならびに高抗原性指数領域を含む断片を特徴とする。好ましい領域は、本発明によるポリペプチドの抗原性および抗体結合活性を媒介する領域である。これに関して、本発明の抗原およびその断片の化学的活性、生物学的活性、または他の活性を有する断片が、類似の活性もしくは改善した活性を有する断片または望ましくない活性が低下した断片も含めて最も極めて好ましい。このような改善した活性は免疫原性および安定性であり、このような低下する望ましくない活性は、酵素機能および毒性機能ならびにヒト交差反応性抗体の産生である。特に好ましいのは、クラミジア属または他の任意の病原性クラミジア属の種の生存に必須の機能あるいはヒトにおいて疾患を引き起こす能力を付与する、受容体または酵素ドメインを含む断片である。本発明によるポリペプチドのさらに好ましい断片は、動物、特に、ヒトにおける抗原決定基または免疫原決定基を含むかまたは含有する断片である。このような断片は抗原性断片とも呼ばれる。
【０１８２】
抗原性断片は、好ましくは、それ自体で抗原性のある断片、またはハプテンとして提供される時に抗原性となり得る断片と定義される。従って、1つのアミノ酸交換を示す抗原または抗原性断片、特に、長い断片の場合では、いくつかのアミノ酸交換しか示さない抗原または抗原性断片もまた、アミノ酸が交換されたこのような断片の抗原性または抗原能が交換によりひどく損なわれていなければ、すなわち、抗原が接種された個体における適切な免疫応答の誘発に適しており、個体の血清に由来する個体抗体調製物によって特定されれば、本発明により可能である。
【０１８３】
本発明によるポリペプチドのこのような断片の好ましい例は、表1の「推定された免疫原性アミノ酸」または「推定されたクラスII制限T細胞エピトープ/領域」または「特定された免疫原性領域の位置(aa)」の列において示されたコアアミノ酸配列である。
【０１８４】
表1に列挙した、これらの全ての断片は個々に、およびそれぞれ独立して、本発明の好ましい選択された局面を形成する。
【０１８５】
本発明はまた、特に、上述の断片、変種、活性変種、および活性断片をコードする核酸分子、断片、変種、活性変種、および活性断片をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、特に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、ならびに断片をコードする核酸分子を増幅するための核酸分子、例えば、PCRプライマーに関することが認められると考えられる。これらに関して、好ましい核酸分子は、前記のように好ましい断片に対応する核酸分子である。
【０１８６】
本発明によるポリペプチドは、改変された形態、例えば、融合タンパク質として発現してもよく、分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能領域を含んでいてもよい。従って、例えば、精製の間または後の操作および保存の間の宿主細胞内での安定性および持続性を改善するさらなるアミノ酸、特に、荷電アミノ酸領域を、ポリペプチドのN末端またはC末端に付加することができる。また、精製を容易にする領域または発現を強化する領域をポリペプチドに付加してもよい。このような領域はポリペプチドの最終調製の前に除去することができる。特に、分泌もしくは排出を生じさせるため、安定性を改善するため、発現を強化するため、または精製を促進するために、ペプチド部分をポリペプチドに付加することはよく知られており、当技術分野において日常的な技法である。好ましい融合タンパク質は、ポリペプチドの可溶化または精製に有用な免疫グロブリンからの異種領域を含む。例えば、EP 0 464 533は、イムノグロビン(immunoglobin)分子の定常部の様々な部分と別のタンパク質またはその部分を含む融合タンパク質を開示している。創薬では、例えば、アンタゴニストを特定するハイスループットスクリーニングアッセイのために、タンパク質と抗体Fc部分が融合されている。例えば、(Bennett, D. et al., 1995)および(Johanson, K. et al., 1995)を参照されたい。融合はまた、脂質および炭水化物を含むアミノ酸以外の部分と融合または結合した本発明によるポリペプチドを含んでもよい。さらに、本発明の抗原は、先行技術に述べられている他の接種用薬剤、ならびに他の微生物に由来する他の種の接種用薬剤と併用されてもよい。このようなタンパク質は、広域クラミジア属分離株によって引き起こされる疾患の予防、治療、および診断において有用である。
【０１８７】
さらなる態様では、本発明のペプチドは、抗タグ物質が選択的に結合することができるエピトープをもたらすエピトープタグに融合される。エピトープタグは、一般的に、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置されるが、生物学的活性が許す限り内部の挿入または置換として組み込まれてもよい。このようなエピトープタグがつけられた形のペプチドの存在は、タグ化ペプチドに対する抗体などの物質を用いて検出することができる。また、エピトープタグを設けると、ペプチドを、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別のタイプのアフィニティマトリックスを用いたアフィニティ精製によって容易に精製することができる。様々なタグポリペプチドおよびその抗体が当技術分野において周知である。例には、ポリヒスチジン(poly-his)、ポリヒスチジン-グリシン(poly-his-gly)タグ、HAタグポリペプチド、c-mycタグ、Strepタグ、およびFLAGタグが含まれる。
【０１８８】
本発明のポリペプチドは、多くの任意の従来技法よって調製することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、化学合成ならびにバイオテクノロジー手段によって生成することができる。後者は、本発明による核酸を含有するベクターによる宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換を含む。好ましい態様では、ベクターは、本発明によるベクターである。本発明によるポリペプチドのバイオテクノロジーによる生成は、トランスフェクションまたは形質転換された宿主細胞を、タンパク質発現が可能であり、かつ当業者に公知の条件下で培養することを含む。発現タンパク質は、当業者に公知の適切な手段によって、細胞(または細胞外に発現された場合には培地)から、単離された形、任意で精製された形で回収される。例えば、タンパク質は、細胞溶解後に可溶性の形で単離されるか、公知の技法を用いて、例えば、塩化グアニジン(guanidine chloride)中に抽出される。本発明のポリペプチドおよび抗原を含む分子は、様々な任意の従来方法を用いてさらに精製することができる。従来方法には、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、液体クロマトグラフィー、例えば、HPLC、FPLCなどを用いた順相または逆相液体クロマトグラフィー;アフィニティクロマトグラフィー(例えば、無機リガンドまたはモノクローナル抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィー)、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、固定化金属キレートクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが含まれるが、これに限定されない。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、最も適切な単離法および精製法を選択することができる。このような精製を用いると、微生物の他のタンパク質性材料および非タンパク質性材料を実質的に含まない形で抗原が得られる。
【０１８９】
本発明によるポリペプチドを調製する代わりのアプローチは、酵素消化によって、例えば、タンパク質の特定のアミノ酸残基によって定義される部位を切断することが知られている酵素を用いてタンパク質を処理することによって、または適切な制限酵素でDNAを消化し、消化されたDNAを発現させ、望ましい断片を単離することによって、公知のペプチドの断片を作製することを伴う。さらに別の適切な技法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、望ましいペプチド断片をコードするDNA断片を単離および増幅することを伴う。DNA断片の望ましい末端を規定するオリゴヌクレオチドは、PCRにおいて5'プライマーおよび3'プライマーとして用いられる。公知の配列を有するDNA、従って、タンパク質の予め決められた部位に、変異、例えば、欠失、挿入および置換を作る技法は周知である。従来技法、例えば、PCRを用いる当業者であれば、本明細書において提供される抗原およびペプチドを容易に使用して、他の類似のタンパク質を同定および単離することができる。このような方法は日常的なものであり、本明細書において提供される情報があれば過度の実験を必要とするとみなされない。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘発(Carter, P. et al., 1985; Zoller, M.J. et al., 1987)、カセット変異誘発(Wells、J.A. et al., 1985)、制限選択変異誘発(Wells, J.A. et al., 1986)、PCR変異誘発を用いて、変異を加えることができる。または、本発明のペプチドを生成するために、クローニングされたDNAに対して他の公知の技法を実施することができる。
【０１９０】
本発明によるポリペプチドは、生物またはタンパク質もしくは抗原を、その断片を含めて含有する試料において生物を検出するのに使用することができる。好ましくは、このような検出は、診断のための検出であり、より好ましくは、疾患の診断、最も好ましくは、グラム陰性細菌、特に、病原性のクラミジア属の種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシの存在または存在量に関連または関係する疾患の診断のための検出である。
【０１９１】
本発明による核酸はまた、試料中の生物の診断または検出にも使用することもできる。生物は、好ましくは、本発明によるポリペプチドおよび本発明による抗体の使用に関してそれぞれ開示されたものと同じ生物である。基本的に、本開示を考慮すれば、このような診断および検出のためのアッセイおよび方法をそれぞれ設計および実施することは当業者の技術の範囲内である。より好ましくは、このような診断または検出では、本発明による核酸分子と特異的に相互作用するプライマーまたはプローブが用いられる。このようなプライマーおよびプローブの長さおよび設計は、それぞれ、実施される特定の方法または診断に応じて異なる。好ましい態様では、例えば、PCRに基づく検出システムまたは診断システム、すなわち、方法またはアッセイのためにプライマーが用いられる場合、プライマーの長さは、約10ヌクレオチド〜約30ヌクレオチド、より好ましくは、約16〜25ヌクレオチドである。プローブに基づく検出システムまたは診断システムの場合、プローブの長さは、好ましくは、プライマーに基づくシステムについて特定されたものとほぼ同じである。さらに、プローブに基づくシステムの場合、プローブは、プローブの検出を直接的または間接的に可能にする部分を含む。直接検出のためのこのような部分は、当業者に公知の放射性標識でもよく、蛍光標識でもよい。間接検出のためのこのような部分はビオチンでもよく、さらなる化合物との相互作用を媒介する他の任意の部分でもよく、化合物は相互作用後に検出可能となるように標識される。
【０１９２】
本発明はまた、診断アッセイ、例えば、細胞および組織における本発明によるポリペプチド、より好ましくは、本発明の抗原およびその断片のレベルを、正常レベルおよび異常レベルの決定も含めて検出するための定量的診断アッセイに関する。従って、例えば、正常対照組織試料と比較して本発明によるポリペプチドの過剰発現を検出するための本発明による診断アッセイは、感染の存在を検出するのに、例えば、感染生物を特定するのに使用することができる。宿主に由来する試料におけるこのようなポリペプチドのレベルの決定に用いることができるアッセイ技法は当業者に周知である。このようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびELISAアッセイが含まれる。これらの中で、ELISAおよびウェスタンブロット分析が好ましいことが多い。ELISAアッセイは、最初に、本発明によるポリペプチドの1つに特異的な抗体、好ましくは、モノクローナル抗体を調製することを含む。さらに、一般的に、モノクローナル抗体に結合するレポーター抗体が調製される。レポーター抗体は、検出試薬、例えば、放射性試薬、蛍光試薬、または酵素試薬、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素に取り付けられる。本発明によるポリペプチド、より好ましくは、本発明による抗原およびその断片の1つまたはいくつか、試験しようとする患者または被験体の血清中の反応性抗体を検出するためにELISAプレートに固定化することができる。
【０１９３】
ウェスタンブロットアッセイでは、最初に、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、本発明によるポリペプチドが個々にまたは組み合わされて分離され、その後に、固体支持体マトリックス、例えば、ニトロセルロース、ナイロンまたはその組み合わせに転写および固定化される。レポーター抗体と共に反応性抗体を検出することができる。レポーター抗体は、検出試薬、例えば、放射性試薬、蛍光試薬、または酵素試薬、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素に取り付けられる。
【０１９４】
本発明によるポリペプチド、または本発明による核酸分子、または本明細書に記載のように本発明による核酸分子に対して作られたプライマーもしくはプローブはまた、アレイの目的で、またはアレイと共に使用することができる。本発明による核酸分子ならびに本発明による核酸分子に対して作られたプライマーおよびプローブの場合、プローブおよびプライマーの長さは、好ましくは、約25〜約75ヌクレオチド、より好ましくは、約35〜約50ヌクレオチドの範囲内でもよい。より詳しくは、本発明によるポリペプチドの少なくとも1つを支持体上に固定化することができる。支持体は、典型的には、様々な本発明によるポリペプチドならびに/または抗原およびその断片を含む。ここで、多様性は、本発明による抗原およびその断片ならびに/または異なる抗原およびその断片の1つもしくはいくつかを用いることによって作り出すことができる。このようなアレイならびに任意のアレイの特徴は、一般的に、支持体上またはその表面上の別個のまたは予め定義された領域または位置に、別個のポリペプチドが固定化されることである。このために、アレイの別個の位置または領域にあるあらゆる活性を、特定のポリペプチドと相関付けることができる。支持体上に固定化された、異なるポリペプチド、より好ましくは、異なる抗原およびその断片の数は、それぞれ、10種類と少数から数千種類のポリペプチドならびに抗原およびその断片でもよい。1cm2当たりの前記分子の密度は、好ましい態様では、1cm2当たり10種類という少数のこのようなペプチド〜1cm2当たり少なくとも400種類のこのようなポリペプチドであり、より詳しくは、1cm2当たり少なくとも1,000種類のこのようなポリペプチドであり、より好ましくは、1cm2当たり種類の抗原およびその断片である。本発明によるポリペプチドの固定化および本発明によるポリペプチドの使用について本明細書において言われたものは、当業者に認められるように、核酸分子ならびに核酸分子に対して作られたプライマーおよびプローブにもそれぞれ当てはまる。
【０１９５】
このようなアレイの製造は当業者に公知であり、例えば、米国特許第5,744,309号に記載されている。アレイは、好ましくは、少なくとも第1の表面を有する平面状、多孔性、または非孔性の固体支持体を含む。本発明によるポリペプチドは前記表面上に固定化される。好ましい支持体材料は、特に、ガラスまたはセルロースである。アレイが本明細書に記載の診断用途のいずれかに用いられることもまた本発明の範囲内である。本発明によるポリペプチドの他に本発明による核酸分子も前記のアレイの作製に使用することができ、原則的に、ポリペプチドを含有するアレイについて開示された全ての目的に使用することができる。このことは、抗体、好ましくは、モノクローナル抗体、特に、本明細書に記載のモノクローナル抗体から作られたアレイにも当てはまる。
【０１９６】
さらなる局面では、本発明は、本発明による任意のポリペプチドに対する抗体、本発明によるその誘導体、断片、変種、活性断片および活性変種に関する。本発明は、例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメントまたはFab発現ライブラリーの産物を含む。抗体がキメラでもよい、すなわち、その異なる部分が異なる種に由来するか、または少なくともそれぞれの配列が異なる種から得られることは本発明の範囲内である。
【０１９７】
このような抗体は、一般的に、特に、本発明の配列に対応する抗原およびその断片に対して作られ、本発明によるポリペプチドを動物に直接注射することによって、または前記ポリペプチドを動物、好ましくは、非ヒトに投与することによって得ることができる。次いで、このように得られた抗体は、前記ポリペプチドそれ自体に結合する。このようにして、前記ポリペプチドの断片しかコードしない配列でも、本発明による天然のポリペプチド全体に結合する抗体を作製するのに使用することができる。次いで、このような抗体は、抗原およびその断片を発現する組織から本発明によるポリペプチドを単離するのに使用することができる。この手順は、前記ポリペプチドの断片、変種、活性断片および活性変種にも当てはまることが当業者に理解されると思われる。
【０１９８】
本発明の別の局面は、本発明による抗体を作製する方法に関する。これは、例えば、本発明によるペプチドまたは組成物に特異的に結合することができる、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリー産物を含む。
【０１９９】
好ましい態様において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、もしくはヒト化抗体、または機能的に活性のあるそのフラグメントである。別の好ましい態様において、機能的に活性のあるフラグメントはFabフラグメントを含む。
【０２００】
本発明によるペプチドまたは抗原または組成物に対して作製された抗体は、本発明によるペプチドまたは抗原または組成物を動物に直接注射することによって、あるいは本発明によるペプチドまたは抗原または組成物を動物、好ましくは、非ヒトに投与することによって得ることができる。次いで、このように得られた抗体は、本発明によるペプチドまたは抗原または組成物に結合する。次いで、このような抗体は、反応性の抗原、ペプチド、またはタンパク質を、これらを発現する組織から単離するのに使用することができる。
【０２０１】
モノクローナル抗体の調製のために、(Kohler, G. et al., 1975において最初に述べられた)連続継代性細胞系培養によって産生される抗体を提供する、当技術分野において公知の任意の技術を使用することができる。
【０２０２】
単鎖抗体の産生について記載されている技術(米国特許第4,946,778号)は、本発明による多様な態様において、免疫原性抗原およびその断片に対する単鎖抗体を産生するように適合させることができる。また、トランスジェニックマウス、または他の生物、例えば、他の哺乳動物を用いて、本発明によるポリペプチドに対するヒト化抗体を発現させることができる。
【０２０３】
抗体はまた、ハイブリドーマ細胞株を用いて産生することもできる。
【０２０４】
本発明のなおさらなる局面は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株に関する。
【０２０５】
望ましいモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株は周知の従来技法によって作製される。ハイブリドーマ細胞は、正常な活性化抗体産生B細胞と骨髄腫細胞を融合することによって作製することができる。本発明の文脈において、ハイブリドーマ細胞は、本発明の抗原に特異的に結合する抗体を産生することができる。
【０２０６】
同様に、これらの抗原に対して作られたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に公知の組換え技法を適用することによって、望ましい高力価抗体が作製される(例えば、PCT特許出願PCT/GB85/00392;英国特許出願公開第GB2188638A号; Amit, A.G. et al., 1986; Queen, C. et al., 1989; PCT 特許出願WO90/07861; Riechmann, L. et al., 1988; Huse, W.D. et al., 1988を参照されたい)。
【０２０７】
または、抗体は、ディスプレイライブラリーを用いて作製することができる。例えば、ファージディスプレイ技術またはリボソームディスプレイを利用して、それぞれの標的抗原に結合する抗体を有するようにスクリーニングされたヒト由来リンパ球のPCR増幅v-遺伝子レパートリーから、またはナイーブライブラリーから、本発明によるポリペプチドに対して結合活性を有する抗体遺伝子を選択することができる(McCafferty, J. et al., 1990; Marks, J. et al., 1992)。これらの抗体の親和性は、鎖シャフリング(chain shuffling)によっても改善することができる(Clackson, T. et al., 1991)。
【０２０８】
2つの抗原結合ドメインが存在する場合、各ドメインは異なるエピトープに対するものでもよい。これは「二重特異性」抗体と呼ばれる。
【０２０９】
前記の抗体は、アフィニティクロマトグラフィーにより単離および/または精製するために抗体を固体支持体に取り付けることによって、本発明によるポリペプチドを発現するクローンを単離または同定するのに使用することができる。
【０２１０】
従って、特に、本発明によるポリペプチドに対する抗体は、感染症、特に、細菌感染症、特に、病原性のクラミジア属の種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシから生じる感染症を阻害および/または治療するのに使用することができる。
【０２１１】
本発明によるポリペプチド、より具体的には抗原およびその断片は、多様な態様において、本発明のある特定の局面を形成する、抗原的に、エピトープ的に、または免疫学的に等価な誘導体を含む。本明細書で使用する「抗原的に等価な誘導体」という用語は、前記ポリペプチドに対して特定の抗体が産生された時に、病原体と哺乳動物宿主の相互作用を妨害する特定の抗体によって特異的に認識される、このような本発明によるポリペプチドまたはその等価物を包含する。本明細書で使用する「免疫学的に等価な誘導体」という用語は、適切な製剤の中に用いられた時に、病原体と哺乳動物宿主の相互作用を妨害するように作用する抗体を脊椎動物において産生する、ペプチドまたはその等価物を包含する。
【０２１２】
本発明によるポリペプチド、より具体的には、抗原およびその断片、多様な態様では、例えば、抗原的もしくは免疫学的に等価な誘導体、またはその融合タンパク質は、マウスまたは他の動物、例えば、ラットもしくはニワトリを免疫化する抗原として使用することができる。融合タンパク質は、本発明によるポリペプチドに安定性をもたらし得る。このようなポリペプチドは、例えば、免疫原性の担体タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)と接合することによって結合することができる。または、多コピーの本発明によるポリペプチドを含む抗原性ペプチド、より好ましくは、抗原およびその断片、または抗原的もしくは免疫学的に等価な抗原およびその断片は、免疫原性が改善して担体が不要となるほど十分に抗原性がある場合がある。
【０２１３】
好ましくは、抗体またはその誘導体は、個体において免疫原性が低くなるよう改変される。例えば、個体がヒトの場合、抗体は最も好ましくは「ヒト化」することができる。ヒト化抗体では、例えば、(Jones, P. et al., 1986)または(Tempest, P. et al., 1991)に記載のように、ハイブリドーマ由来抗体の相補性決定領域がヒトモノクローナル抗体に移植されている。
【０２１４】
遺伝子による免疫化における本発明による核酸分子の使用では、好ましくは、適切な送達法、例えば、プラスミドDNAの筋肉への直接注射、特定のタンパク質担体と複合化したDNAの送達、DNAとリン酸カルシウムとの共沈、様々な形態のリポソームへのDNAのカプセル封入、パーティクルボンバードメント(Tang, D. et al., 1992；Eisenbraun, M. et al., 1993)、およびクローニングされたレトロウイルスベクターを用いたインビボ感染(Seeger, C. et al., 1984)が用いられる。
【０２１５】
さらなる局面では、本発明は、本発明による任意のポリペプチドへのペプチド結合、およびこのようなペプチドを調製する方法に関する。前記の方法は前記ポリペプチドの使用を特徴とし、基本工程は当業者に公知である。
【０２１６】
このようなペプチドは、最新技術による方法、例えば、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイを用いて作製することができる。ファージディスプレイの場合、基本的に、ペプチドライブラリーをファージの形で作製し、この種のライブラリーを、標的分子、本件では、本発明によるポリペプチドと接触させる。その後に、標的分子に結合しているペプチドを、それぞれの反応から、好ましくは、標的分子との複合体として取り出す。結合特性は、少なくともある程度まで、特に、実現した実験状況、例えば、塩濃度などに左右されることが当業者に公知である。より高い親和性またはより大きな力を用いて、標的分子に結合していないペプチドをライブラリーの非結合メンバーから分離した後、任意で、標的分子およびペプチドの複合体から標的分子も除去した後に、続いて、それぞれのペプチドを特徴付けることができる。特徴付けの前に、任意で、例えば、ペプチドコードファージを増殖させることによって、増幅工程が行われる。特徴付けは、好ましくは、標的結合ペプチドの配列決定を含む。基本的に、ペプチドの長さに制限はない。しかしながら、好ましくは、長さが約8〜20アミノ酸のペプチドが、それぞれの方法で得られる。ライブラリーのサイズは、約102〜1018、好ましくは、108〜1015種類のペプチドでもよいが、これに限定されない。好ましい態様では、このようなペプチドは高親和性結合ペプチドである。さらにより好ましい態様では、ペプチドはペプチドアプタマーである。
【０２１７】
本明細書で使用するペプチドアプタマーは、特定の標的分子に結合するペプチド分子を指す。ペプチドアプタマーは、細胞内で他のタンパク質相互作用を妨害するように設計されている。ペプチドアプタマーは、タンパク質骨格の両端に取り付けられた可変ペプチドループからなる。この二重の構造制約は、ペプチドアプタマーの結合親和性を抗体に匹敵するレベル(ナノモル範囲)まで大幅に高める。可変ループの長さは、典型的には、10〜20アミノ酸からなり、骨格は、溶解度およびコンパシティ(compacity)の特性が優れている任意のアミノ酸でよい。現在、細菌タンパク質チオレドキシン-Aが、最も用いられている骨格タンパク質であり、可変ループは還元活性部位の中に挿入される。この還元活性部位は、野生型タンパク質では-Cys-Gly-Pro-Cys-ループであり、2個のシステイン側鎖はジスルフィド結合を形成することができる。ペプチドアプタマーは様々な系を用いて選択することができるが、最も用いられているものは、現在、酵母ツーハイブリッドシステムである。リガンド調節ペプチドアプタマー(LiRPA)の選択が証明されている。三量体FKBP-ラパマイシン-FRB構造に基づく新規の骨格タンパク質から7アミノ酸ペプチドをディスプレイすることによって、ランダムペプチドと標的分子の相互作用を低分子ラパマイシンまたは非免疫抑制類似体により制御することができる。
【０２１８】
前記のような特定の形の標的結合ペプチドは、いわゆる「アンチカリン」であり、特に、独国特許出願DE 19742706に記載されている。本発明はまた、本発明によるポリペプチドに特異的に結合するペプチド、ならびに本明細書に記載の任意の治療用途および診断用途のための、好ましくは、抗体のための、その使用に関する。
【０２１９】
さらなる局面において、本発明は、本発明による任意のポリペプチドと相互作用する機能的核酸、およびこのような機能的核酸を調製する方法に関する。前記方法は本発明によるポリペプチドの使用を特徴とし、基本工程は当業者に公知である。機能的核酸は、好ましくは、核酸アプタマーおよびスピーゲルマーである。本発明はまた、本発明によるポリペプチドに特異的に結合する核酸アプタマーおよびスピーゲルマー、ならびに本明細書に記載の任意の治療用途および診断用途のための、好ましくは、抗体のための、その使用に関する。
【０２２０】
核酸アプタマーは、標的分子と特異的に相互作用する、一本鎖または二本鎖のD-核酸である。アプタマーの調製または選択は、例えば、欧州特許EP 0 533 838に記載されている。基本的には以下の工程が行われる。第1に、核酸、すなわち、潜在的アプタマーの混合物を準備する。ここで、それぞれの核酸は、典型的には、数個、好ましくは少なくとも8個のそれに続くランダムヌクレオチドのセグメントを含む。その後に、この混合物と標的分子を接触させる。これによって、例えば、候補混合物と比較して標的に対する高い親和性またはより強い力に基づいて、核酸は標的分子に結合する。その後に、結合した核酸を混合物の残りから分離する。任意で、このように得られた核酸を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅する。これらの工程を数回繰り返して、最終的に標的に特異的に結合する核酸の比が増した混合物が得られる。次いで、これから最終的な結合核酸が任意で選択される。これらの特異的に結合する核酸はアプタマーと呼ばれる。アプタマーを作製または同定する方法のいずれの段階においても、個々の核酸の混合物の試料を採取して、標準的な技法を用いてその配列を決定できることは明らかである。例えば、アプタマーの作製の当業者に公知の特定の化学基を導入することによって、アプタマーを安定化できることは本発明の範囲内である。このような改変は、例えば、ヌクレオチドの糖部分の2'位へのアミノ基の導入でもよい。アプタマーは現在、治療剤として用いられている。しかしながら、このように選択または作製されたアプタマーを、標的バリデーションのために、および/または、薬学的組成物、好ましくは低分子に基づく薬学的組成物の開発のためのリード物質として使用できることもまた本発明の範囲内である。これは、実際には、競合アッセイにより行われる。競合アッセイでは、標的分子とアプタマーとの特異的相互作用が候補薬剤によって阻害され、これによって、それぞれの薬剤候補が標的およびアプタマーの複合体からアプタマーを置換すると、標的とアプタマーの間の相互作用を特異的に阻害することができ、相互作用が特異的であれば、候補薬剤は少なくとも原則的には標的のブロックに適しており、従って、このような標的を含むそれぞれの系における生物学的利用能または生物学的活性を減少させると考えることができる。次いで、このように得られた低分子は、その物理的、化学的、生物学的、および/または医学的な特徴、例えば、毒性、特異性、生分解性およびバイオアベイラビリティを最適化するために、さらなる誘導体化および改変に供することができる。
【０２２１】
スピーゲルマーおよびその作製または調製は同様の原理に基づいている。スピーゲルマーの調製は国際特許出願WO 98/08856に記載されている。スピーゲルマーはL-核酸であり、これは、スピーゲルマーがアプタマーのようにD-ヌクレオチドではなくL-ヌクレオチドから構成されることを意味する。スピーゲルマーは生物系において非常に高い安定性を有することを特徴とし、アプタマーと同様に、スピーゲルマーの標的分子と特異的に相互作用する。スピーゲルマーを作製する方法では、D-核酸の不均一な集団を作り出し、この集団を標的分子の鏡像異性体、本件では、例えば、本発明による抗原およびその断片の天然のL-鏡像異性体のD-鏡像異性体と接触させる。その後に、標的分子の鏡像異性体と相互作用しないD-核酸を分離する。しかし、標的分子の鏡像異性体と相互作用するD-核酸を分離し、任意で、同定および/または配列決定し、その後に、D-核酸から得られた核酸配列情報に基づいて、対応するL-核酸を合成する。これらのL-核酸は、標的分子の鏡像異性体と相互作用する前述のD-核酸と配列の点では同じであり、その鏡像異性体ではなく、天然の標的分子と特異的に相互作用する。アプタマーの作製方法と同様に、様々な工程を数回繰り返して、標的分子の鏡像異性体に特異的に相互作用する核酸を濃縮することも可能である。
【０２２２】
さらなる局面において、本発明は、本発明による任意の核酸分子と相互作用する機能的核酸、およびこのような機能的核酸の調製方法に関する。前記方法は、本発明による核酸分子およびそのそれぞれの配列を使用することを特徴とし、基本工程は当業者に公知である。機能的核酸は、好ましくは、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびsiRNAである。本発明はまた、本発明によるポリペプチドに特異的に結合する、この種の機能的核酸、ならびに本明細書に記載の治療用途および診断用途のいずれか、好ましくは、抗体のための、その使用に関する。
【０２２３】
リボザイムは触媒活性のある核酸であり、好ましくは、RNAからなり、基本的には2つの部分を含む。第1の部分は触媒活性を示すのに対して、第2の部分は、標的核酸、本件では本発明によるポリペプチドをコードする核酸との特異的相互作用を担う。標的核酸とリボザイムの第2の部分が相互作用すると、典型的には、2本のハイブリダイズ鎖にある本質的に相補的な塩基配列がハイブリダイゼーションおよびワトソン・クリック塩基対形成することにより相互作用すると、触媒活性部分が活性となり得る。このことは、リボザイムの触媒活性がホスホジエステラーゼ活性である場合、リボザイムが分子内または分子間で標的核酸を触媒することを意味する。その後に、さらに標的核酸が分解され、最終的に、標的核酸ならびに標的核酸に由来するタンパク質が分解され得る。リボザイム、その使用および設計原理は当業者に公知であり、例えば、(Doherty, E. et al., 2001)および(Lewin, A. et al., 2001)に記載されている。
【０２２４】
薬学的組成物調製用のおよび診断剤としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性および設計は、それぞれ、同様の作用機序に基づいている。基本的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基相補性に基づいて、標的RNA、好ましくはmRNAにハイブリダイズし、それによってRNase Hが活性化される。RNase Hは、ホスホジエステル結合DNAおよびホスホロチオエート結合DNAの両方によって活性化される。しかしながら、ホスホロチオエート結合DNAを除き、ホスホジエステル結合DNAは細胞ヌクレアーゼによって急速に分解される。これらの耐性のある非天然DNA誘導体はRNAとハイブリダイゼーションしてもRNase Hを阻害しない。言い換えると、アンチセンスポリヌクレオチドはDNA RNAハイブリッド複合体としてのみ有効である。この種のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、特に、米国特許第5,849,902号および同第5,989,912号に記載されている。言い換えると、適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的分子の核酸配列、本件では、本発明による抗原およびその断片の核酸分子の核酸配列に基づいて、原則的に、それぞれの核酸配列を推定することができる標的タンパク質から、または、核酸配列、特に、mRNAを知ることによって塩基相補性の原理に基づいて設計することができる。
【０２２５】
短いホスホロチオエートDNA配列(3〜9塩基)を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが特に好ましい。細菌RNase Hの活性化には最低3個のDNA塩基が必要であり、哺乳動物RNase H活性化には最低5個の塩基が必要である。これらキメラオリゴヌクレオチドでは、RNase H基質を形成する中心領域と、RNase H基質を形成しない改変ヌクレオチドからなるハイブリダイズ「アーム」が隣接している。キメラオリゴヌクレオチドのハイブリダイズアームは、例えば、2'-O-メチルまたは2'-フルオロによって改変されていてもよい。代わりのアプローチでは、アームにメチルホスホネート結合またはホスホルアミダート結合が用いられた。本発明の実施に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドのさらなる態様は、P-メトキシオリゴヌクレオチド、部分P-メトキシオリゴデオキシリボヌクレオチド、またはP-メトキシオリゴデオキシリボヌクレオチドである。
【０２２６】
本発明に特に関連し、かつ有用なものは、前述の2つの米国特許においてさらに詳しく説明されるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは天然の5'=>3'連結ヌクレオチドを含有しない。もっと正確に言うと、これらのオリゴヌクレオチドは、2タイプのヌクレオチド:RNase Hを活性化する2'-デオキシホスホロチオエート、およびRNase Hを活性化しない2'-改変ヌクレオチドを有する。2'-改変ヌクレオチド間の連結は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはP-エトキシホスホジエステルでもよい。RNase Hの活性化は、連続したRNase H活性化領域によって達成される。RNase H活性化領域は、細菌RNase Hの活性化には3〜5個の2'-デオキシホスホロチオエートヌクレオチドを含み、真核生物、特に、哺乳動物RNase Hの活性化には5〜10個の2'-デオキシホスホロチオエートヌクレオチドを含む。分解からの保護は、5'末端塩基および3'末端塩基を高度にヌクレアーゼ耐性にし、任意で、3'末端ブロック基を配置することによって達成される。
【０２２７】
より詳しくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、5'末端および3'末端;ならびに2’-改変ホスホジエステルヌクレオチドおよび2’-改変P-アルキルオキシホスホトリエステルヌクレオチドからなる群より独立して選択される、位置11〜59の5'=>3'連結ヌクレオチドを含む。ここで、5'末端ヌクレオシドは、3〜10個の連続したホスホロチオエート連結デオキシリボヌクレオチドのRNase H活性化領域に取り付けられ、前記オリゴヌクレオチドの3'末端は、逆位デオキシリボヌクレオチド、1〜3個のホスホロチオエート2’-改変リボヌクレオチドの連続した配列、ビオチン基、およびP-アルキルオキシホスホトリエステルヌクレオチドからなる群より選択される。
【０２２８】
5'末端ヌクレオシドがRNase H活性化領域に取り付けられていないが、3'末端ヌクレオシドが上記の通りであるアンチセンスオリゴヌクレオチドも使用することができる。また、前記オリゴヌクレオチドの3'末端ではなく5'末端が特定の基から選択される。
【０２２９】
本発明による核酸ならびにポリペプチドは、多様な態様において、薬学的組成物、特に、ワクチンとして、または薬学的組成物、特に、ワクチンの調製に使用することができる。好ましくは、このような薬学的組成物、好ましくは、ワクチンは、クラミジア属の種、好ましくは、病原性のクラミジア属によって、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによって、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによって引き起こされる、またはこれらに関する、またはこれらと関連する疾患の予防用または治療用の薬学的組成物である。本発明の別の局面は、個体、特に、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法に関する。前記方法は、抗体を産生して、前記微生物による感染症から個体を守るのに十分な、多様な態様における本発明によるポリペプチドまたはその断片もしくは変種を個体に接種する工程を含む。
【０２３０】
本発明のさらに別の局面は、個体における免疫応答の誘導方法に関する。前記方法は、疾患が既に個体において確立しているかどうかに関係なく、免疫応答を誘導して、抗体を産生するか、またはサイトカイン産生T細胞もしくは細胞傷害性T細胞いずれかの細胞性T細胞応答を生じさせて、疾患から個体を守るために本発明によるポリペプチドをインビボで発現するための、本発明による核酸分子、好ましくは、多様な態様における抗原およびその断片を機能的にコードする核酸分子を、遺伝子療法または他の方法を介して送達する工程を含む。遺伝子を投与する方法の1つは、粒子上のコーティングとして、または他の方法により、遺伝子を加速して望ましい細胞の中に入れる方法である。
【０２３１】
本発明のさらなる局面は、免疫応答を誘導することができる宿主に導入されると、このような宿主において免疫応答を誘導する免疫学的組成物に関する。ここで、前記組成物は、多様な態様における本発明によるポリペプチドの少なくとも1つをコードおよび発現する組換えDNAを含む。免疫応答は治療または予防に用いられてもよく、抗体免疫、または細胞性免疫、例えば、CTLもしくはCD4+T細胞を生じる細胞性免疫の形をとってもよい。
【０２３２】
本発明によるポリペプチドは、多様な態様では、それ自体では抗体を産生できないが、第1のタンパク質を安定化し、免疫原性および防御特性を有する融合タンパク質を産生することができる共タンパク質と融合することができる。この融合組換えタンパク質は、好ましくは、抗原性のある共タンパク質、例えば、タンパク質を可溶化し、その産生および精製を容易にする比較的大きな共タンパク質であるグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)またはβガラクトシダーゼをさらに含む。さらに、共タンパク質は、免疫系を全身刺激するという意味ではアジュバントとしても作用することができる。共タンパク質は、第1のタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれに取り付けられてもよい。
【０２３３】
本明細書に記載のクラミジア属の任意の種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の動物モデルでの、このような遺伝子による免疫化実験において、多様な態様における本発明による核酸分子を使用する方法も本発明により提供される。このような分子は、予防的免疫応答または治療的免疫応答を惹起することができるタンパク質エピトープを同定するのに特に有用である。このアプローチを用いると、哺乳動物、特に、ヒトにおける、本明細書に記載のクラミジア属の種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の予防剤または治療法を開発するために、感染症に抵抗または感染症を排除することに成功した動物の必須の臓器から、特に価値のあるモノクローナル抗体を後で調製することが可能になる。
【０２３４】
多様な態様における本発明によるポリペプチドは、例えば、損傷した組織への細菌の付着をブロックすることによって細菌の侵入を防ぐ特異的抗体を産生するために宿主へのワクチン接種用の抗原として使用することができる。組織損傷およびこのように損傷した組織の例には、皮膚または結合組織および粘膜組織での創傷、例えば、ウイルス感染(特に、呼吸器感染、例えば、インフルエンザ)、機械的損傷、化学的損傷もしくは熱による損傷、または留置装置の埋め込みによって引き起こされる創傷、あるいは粘膜、例えば、口、乳腺、尿道、もしくは膣での創傷が含まれる。
【０２３５】
本発明はまた、多様な態様における本発明によるポリペプチドの1つまたはいくつかを、1つもしくは複数の適切な担体および/または賦形剤を含むワクチン製剤とともに含む。本発明において有用な薬学的に許容される担体および/または賦形剤は従来のものであり、緩衝剤、安定剤、希釈剤、防腐剤、および可溶化剤を含んでもよい。Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)は、本明細書において開示した(ポリ)ペプチドの薬学的送達に適した組成物および製剤について述べている。一般的に、担体または賦形剤がどういったものであるかは、使用されている特定の投与方法に左右される。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして薬学的および生理学的に許容される液体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどを含む注射液を含む。固体組成物(例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセルの形)の場合、従来の無毒の固体担体は、例えば、薬品用のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含んでもよい。生物学的に中性の担体に加えて、投与しようとする薬学的組成物は、微量の無毒の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびpH緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有してもよい。
【０２３６】
本発明による前記ポリペプチドは胃の中で分解されることがあるので、好ましくは、非経口投与される。非経口投与には、例えば、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、鼻腔内投与、または経皮投与が含まれる。非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を個体の体液、好ましくは、血液と等張にする溶質を含有してもよい、水性または非水性の滅菌注射溶液;ならびに懸濁剤または増粘剤を含んでいてもよい、水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または複数用量の容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルに入れて提供されてもよく、使用の直前に滅菌液体担体の添加のみ必要とする凍結乾燥状態で保存されてもよい。ワクチン製剤は、製剤の免疫原性を増強するためのアジュバント系、例えば、当技術分野において公知の水中油型系および他の系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性に左右され、日常的な実験によって容易に決定することができる。
【０２３７】
別の局面によれば、本発明は、本明細書に記載のクラミジア属の様々な種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシに対する、多様な態様における本発明によるポリペプチドの1つまたはいくつかを含む薬学的組成物に関する。このような薬学的組成物は、前記クラミジア属の種に対する前記ポリペプチドの1つ、好ましくは、少なくとも2つまたはそれ以上を含んでもよい。任意で、組み合わせ薬学的組成物では、このようなポリペプチドはまた、なおさらなる病原体に対する抗原と組み合わされてもよい。好ましくは、前記の薬学的組成物は、クラミジア属の種、より好ましくは、病原性のクラミジア属の種、例えば、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、もしくはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、もしくはC.シタッシ、および/またはワクチンに含まれたことのある抗原を有する他の病原体によって引き起こされる感染症を予防または治療するためのワクチンである。
【０２３８】
さらなる局面によれば、本発明は、本発明による核酸分子を含む薬学的組成物に関する。このような薬学的組成物は、本発明によるポリペプチドをコードする本発明による1つまたは複数の核酸分子を含んでもよい。任意で、本発明によるポリペプチドをコードするこのような核酸分子は、組み合わせ薬学的組成物では、他の病原体に対する抗原をコードする核酸分子と組み合わされる。好ましくは、前記の薬学的組成物は、クラミジア属の種、より好ましくは、本明細書において開示される病原性のクラミジア属の種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、もしくはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、もしくはC.シタッシ、および/またはワクチンに含まれたことのある抗原を有する他の病原体によって引き起こされる感染症を予防または治療するためのワクチンである。
【０２３９】
薬学的組成物は、任意の適切な補助物質、例えば、緩衝剤物質、安定剤、またはさらなる活性成分、特に、薬学的組成物および/もしくはワクチンの製造と関連することが知られている成分を含有してもよい。
【０２４０】
好ましい態様では、薬学的組成物は、免疫賦活物質、例えば、アジュバントをさらに含む。アジュバントは投与方法に基づいて選択することができ、ポリカチオン物質、特に、ポリカチオンペプチド、免疫賦活性核酸分子、好ましくは、免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)、特に、オリゴ(dIdC) 13、少なくとも2個のLysLeuLysモチーフを含有するペプチド、特に、ペプチド
2010530229.tif 000059
、ミョウバン、鉱油をベースとするアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、神経刺激性化合物、特に、ヒト成長ホルモン、または前述のアジュバントの1つもしくは複数の任意の組み合わせを含んでもよい。他の適切なアジュバントは、Montanide Seppic不完全アジュバント、例えば、ISA、水中油型エマルジョンアジュバント、例えば、Ribiアジュバント系、syntaxムラミルジペプチド含有アジュバント製剤、もしくはアルミニウム塩アジュバント、またはその組み合わせからなる群より選択されてもよい。
【０２４１】
本発明において使用する「オリゴ(dIdC) 13」という用語は、ホスホジエステル骨格の、13個のデオキシ(イノシン-シトシン)モチーフを含有する一本鎖DNA分子を意味し、[オリゴ-d(IC) 13]という用語によっても定義される。正確な配列は、
2010530229.tif 000060
である。オリゴ(dIdC) 13は、例えば、WO 01/93903およびWO 01/93905に記載のように、(オリゴ-dIC26);オリゴ-dIC26-mer;オリゴ-デオキシIC,26-mer;またはオリゴ-dIC,26-merという用語によっても定義することができる。
【０２４２】
薬学的組成物、特に、ワクチンは、多様な態様における本発明によるポリペプチドの1つもしくはいくつか、および/または本発明による核酸分子に加えて、生物学的または薬学的に活性のある他の化合物を含むことも本発明の範囲内である。好ましくは、ワクチン組成物は、少なくとも1種類のポリカチオンペプチドを含む。本発明に従って用いられるポリカチオン化合物は、WO 97/30721に従って特徴的な効果を示す任意のポリカチオン化合物でもよい。好ましいポリカチオン化合物は、塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸、またはその混合物より選択される。これらのポリアミノ酸は、少なくとも4個のアミノ酸残基(WO 97/30721)の鎖長を有しなければならない。特に好ましいのは、ポリリジン、ポリアルギニン、および8個超、特に、20個超の範囲のアミノ酸残基において20％超、特に、50％超の塩基性アミノ酸を含有するポリペプチドのような物質、またはその混合物である。好ましい他のポリカチオンおよびその薬学的組成物はWO 97/30721(例えば、ポリエチレンイミン)およびWO 99/38528に記載されている。好ましくは、これらのポリペプチドは、20〜500個のアミノ酸残基、特に、30〜200個の残基を含む。
【０２４３】
これらのポリカチオン化合物は化学的にまたは組換えによって作製されてもよく、天然供給源に由来してもよい。
【０２４４】
カチオン(ポリ)ペプチドは、(Ganz, T., 1999)に概説されている性質を有する抗菌剤でもよい。これらの(ポリ)ペプチドは原核生物または動物または植物に由来してもよく、化学的にまたは組換えによって作製されてもよい(WO 02/13857)。ペプチドはまたデフェンシンのクラスに属するものでもよい(WO 02/13857)。このようなペプチドの配列は、例えば、以下のインターネットアドレス:http://www.bbcm.univ.trieste.it/〜tossi/pag2.htmlのAntimicrobial Sequence Databaseにおいて見られる。
【０２４５】
このような宿主防御ペプチドまたは防御物質(defensives)もまた本発明によるポリカチオンポリマーの好ましい形である。一般的に、最終産物として、適応免疫系、好ましくは、APC(樹状細胞を含む)によって媒介される適応免疫系の活性化(またはダウンレギュレーション)を可能とする化合物がポリカチオンポリマーとして用いられる。
【０２４６】
本発明におけるポリカチオン物質として使用するのに特に好ましいのは、カテリシジンに由来する抗菌ペプチドまたはその誘導体(参照により本明細書に組み入れられる、国際特許出願WO 02/13857)、特に哺乳動物カテリシジン由来の抗菌ペプチド、好ましくはヒト、ウシまたはマウス由来の抗菌ペプチドである。
【０２４７】
天然供給源由来のポリカチオン化合物には、HIV-REVまたはHIV-TAT(HIV-REVまたはHIV-TATに由来するカチオンペプチド、アンテナペディアペプチド、キトサンまたは他のキチン誘導体)、あるいはこれらのペプチドまたはタンパク質に由来する、生化学的にまたは組換えによって作製された他のペプチドが含まれる。他の好ましいポリカチオン化合物は、カテリン(cathelin)またはカテリンに関連または由来する物質である。例えば、マウスカテリンはアミノ酸配列
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を有するペプチドである。関連するまたは由来するカテリン物質は、少なくとも15〜20個のアミノ酸残基を有するカテリン配列の全部または一部を含む。誘導には、20種類の標準アミノ酸以外のアミノ酸による天然アミノ酸の置換または改変が含まれ得る。さらに、さらなるカチオン性残基を、このようなカテリン分子に導入することができる。これらのカテリン分子は、抗原と組み合わされることが好ましい。これらのカテリン分子は、驚くべきことに、さらなるアジュバントを添加しなくても抗原のアジュバントとして有効であることも判明している。従って、さらなる免疫活性化物質とともに、またはそれをともなわずに、ワクチン製剤中に有効なアジュバントとしてこのようなカテリン分子を使用することができる。
【０２４８】
本発明に従って用いられる別の好ましいポリカチオン物質は、3〜7個の疎水性アミノ酸のリンカーによって分けられた少なくとも2個のKLKモチーフを含有する合成ペプチドである(参照により本明細書に組み入れられる、国際特許出願WO 02/32451)。
【０２４９】
本発明の薬学的組成物は免疫賦活性核酸をさらに含んでもよい。免疫賦活性核酸は、例えば、中性または人工のCpG含有核酸、非脊椎動物に由来する短い核酸配列、または非メチル化シトシン-グアニンジ-ヌクレオチド(CpG)をある特定の塩基の状況で含有する短いオリゴヌクレオチド(ODN)の形である(例えば、WO 96/02555に記載)。または、例えば、WO 01/93903に記載のイノシンおよびシチジンに基づく核酸、またはデオキシ-イノシンおよび/またはデオキシウリジン残基を含有するデオキシ核酸(参照により本明細書に組み入れられる、WO 01/93905およびWO 02/095027に記載)もまた、好ましくは、本発明に関連する免疫賦活性核酸として使用することができる。好ましくは、異なる免疫賦活性核酸の混合物を本発明に従って使用することができる。
【０２５０】
前述の任意のポリカチオン化合物が前述の任意の免疫賦活性核酸と組み合わされることもまた、本発明の範囲内である。好ましくは、このような組み合わせは、参照により本明細書に組み入れられるWO 01/93905、WO 02/32451、WO 01/54720、WO 01/93903、WO 02/13857、およびWO 02/095027、およびWO 03/047602に記載のものに従う。
【０２５１】
さらに、またはその代わりとして、このようなワクチン組成物は、本発明によるポリペプチド、および本発明による核酸分子、好ましくは、本発明によるコード核酸分子に加えて、神経刺激性化合物を含んでもよい。好ましくは、神経刺激性化合物は、例えば、WO 01/24822に記載のヒト成長因子である。また好ましくは、神経刺激性化合物は、前述の任意のポリカチオン化合物および/または免疫賦活性核酸と組み合わされる。
【０２５２】
また、本発明による薬学的組成物は、以下の化合物:本発明による核酸分子、多様な態様における本発明によるポリペプチド、本発明によるベクター、本発明による細胞、本発明による抗体、本発明による機能的核酸、および本発明による結合ペプチド、例えば、アンチカリンおよび高親和性結合ペプチドおよびペプチドアプタマー、本発明による任意のアゴニストおよびアンタゴニスト、好ましくは、本明細書に記載のようにスクリーニングされたアゴニストおよびアンタゴニストの少なくともいずれか、またはその組み合わせを含む薬学的組成物である。これに関連して、これらの化合物はいずれも、細胞、組織または生物と使用するために非滅菌担体または滅菌担体、例えば、被験体への投与に適した薬学的担体と組み合わせて使用することができる。このような組成物は、例えば、培地添加物または治療的有効量の本発明の抗原およびその断片、ならびに薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。このような担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせが含まれ得るが、これに限定されない。製剤は投与方法に適合しなければならない。
【０２５３】
組成物は、例えば、被験体を免疫化または治療するのに使用することができる。薬学的組成物は、本発明のペプチドの少なくとも1つを含む。しかしながら、薬学的組成物はまた、本発明の様々なペプチド(断片および他の変種を含む)を含有し、任意で、他の病原体の様々な抗原性のタンパク質またはペプチドと混合したカクテル(すなわち、単一混合物)も含有してよい。これらのペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはその断片もしくは変種のこのような混合物は、例えば、広域クラミジア属分離株に対する望ましい抗体の作製において有用である。本発明のペプチドはまた、薬学的に許容される塩の形でも使用することができる。本発明のペプチドと塩を形成することができる適切な酸および塩基は当業者に周知であり、無機および有機の酸および塩基を含む。
【０２５４】
本発明のさらに別の局面は、以下:
(i)本発明の核酸および/またはそれに相補的な核酸
からなる群より選択される核酸、ならびに
(ii)任意で、薬学的に許容される担体または賦形剤
を含有する薬学的組成物である。
【０２５５】
さらに、核酸配列は単独で、あるいは他の病原性微生物の抗原または他の病原性微生物に対する抗体をコードする他の核酸配列と組み合わせて、薬学的組成物の成分として使用することができる。組成物は、クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症によって引き起こされる疾患を有するヒトおよび/または動物を免疫化または治療するのに使用することができる。薬学的に許容される担体または賦形剤は前記で定義したものでもよい。
【０２５６】
別の態様では、さらに、本発明の核酸配列は単独で、または他の病原性微生物に由来する他の抗原または抗体をコードする核酸配列と共に、被験体内で病原体に対する防御免疫応答を能動的に誘導するように向けられた組成物において使用することができる。本発明のこれらの成分は、ヒトおよび/または動物において、クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症に対する防御免疫応答を誘導する方法において有用である。
【０２５７】
治療用組成物またはワクチン組成物の調製において使用する場合、核酸送達のための組成物および方法が有用であり、当業者に公知である。本発明の核酸は、本発明の方法または本明細書に記載の組成物において、裸のDNAとして投与されるDNA配列として、または薬学的に許容される担体と結合したDNA配列として用いられてもよく、抗原、ペプチド、またはポリペプチドのインビボ発現をもたらす。いわゆる「裸のDNA」は、患者においてインビボで本発明の抗原、ペプチド、またはポリペプチドを発現させるために使用することができる(「裸のDNA」の類似の使用について述べている、例えば、Cohen, J., 1993を参照されたい)。例えば、調節配列と結合した「裸のDNA」を、例えば、注射によって、治療のために、またはワクチン組成物の一部として投与することができる。
【０２５８】
または、本発明の抗原もしくはペプチドをコードする核酸またはそれに相補的な核酸は、本発明の抗原またはペプチドまたはポリペプチドをインビボで発現させるために、例えば、抗体を誘導するために、薬学的組成物と共に使用することができる。
【０２５９】
本発明の好ましい態様は、本発明による核酸がベクターおよび/または細胞の中に含まれる薬学的組成物に関する。本発明の文脈において適切なベクターおよび細胞は前述されている。ベクターは、特に、DNAワクチンに用いられる。送達に適したベクターは当業者により容易に選択することができる。インビボ遺伝子送達用の例示的なベクターは様々な学術的および商業的な供給元から容易に入手可能であり、例えば、アデノ随伴ウイルス(国際特許出願番号PCT/US91/03440)、アデノウイルスベクター(Kay, M. et al., 1994; Ishibashi, S. et al., 1993)、または別のウイルスベクター、例えば、様々なポックスウイルス、ワクシニアなどを含む。細胞染色体に外因性DNAを組み込むには、組換えウイルスベクター、例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルスが好ましい。
【０２６０】
本発明の薬学的組成物は、例えば、特に、局所経路、経口経路、肛門経路、腟経路、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、鼻腔内経路、気管内経路または皮内経路による投与を含む、任意の有効な従来のやり方で投与することができる。
【０２６１】
療法において、または予防薬として、本発明の薬学的組成物の活性薬剤は、注射用組成物として、例えば、滅菌水性分散液、好ましくは、等張性の滅菌水性分散液として個体に投与することができる。
【０２６２】
好ましくは、本発明の薬学的組成物は、鼻腔内に、例えば、エアゾール製剤として投与することができる。
【０２６３】
一般的に、鼻腔内ワクチン接種は、針に基づく注射の代わりとなる魅力的な非侵襲的ワクチン接種であり、粘膜表面において優れた防御をもたらす。さらに、鼻腔内免疫化後に、粘膜免疫ならびに全身免疫を誘導することができる。
【０２６４】
前述の刊行物、Rodriguez A. et al., (2006)の研究では、DNAワクチンで鼻腔内免疫化することによって、マウスにおいてC.ニューモニエ感染症を防いだことが示されている。また、タンパク質ワクチンで鼻腔内免疫化することによってマウス気道での局所免疫応答も誘導された。
【０２６５】
従って、鼻腔内用途は、本発明によるクラミジア属ワクチン、特に、C.ニューモニエワクチンに特に適している。
【０２６６】
または、組成物、好ましくは、薬学的組成物は、局所塗布用に、例えば、軟膏、クリーム、ローション剤、眼軟膏、点眼薬、点耳剤、口内洗浄剤、含浸処理した包帯および縫合糸、ならびにエアゾール剤の形で処方されてもよく、例えば、防腐剤、薬物浸透を助ける溶媒、ならびに軟膏およびクリームに含まれる軟化薬を含む適切な従来の添加物を含有してもよい。このような局所製剤はまた、適合性の従来の担体、例えば、クリームまたは軟膏の基剤、ローション剤の場合はエタノールまたはオレイルアルコールを含有してもよい。このような担体は、製剤の約1％〜約98重量％を構成してもよく、より通常は、製剤の約80重量％までを構成する。
【０２６７】
前記の療法に加えて、本発明の組成物は、一般的に、創傷組織内の曝露したマトリックスタンパク質に細菌が付着するのを防ぐ創傷治療剤として、および歯科治療における予防的使用のために抗生物質予防法の代替としてまたは抗生物質予防法と共に使用することができる。
【０２６８】
好ましい態様では、薬学的組成物はワクチン組成物である。好ましくは、このようなワクチン組成物は、都合よく、注射液の形をとっているか、鼻腔内送達用のエアゾール製剤に含まれる。免疫応答を高めるために、従来のアジュバントを使用することができる。タンパク質抗原をワクチン接種するのに適した単位用量は、成人の場合、0.02〜3μg抗原/kg体重、小児の場合、0.2〜10μg抗原/kg体重であり、このような用量は、好ましくは、1〜3回、2〜24週間の間隔をあけて投与される。
【０２６９】
本発明の抗原、核酸、ベクター、抗体、または薬学的組成物の「有効量」または「治療的有効量」は、インビボで効果を示すことができる量、例えば、クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の徴候または症状を予防または寛解することができる量として計算することができる。このような量は当業者によって決定することができる。
【０２７０】
指示された用量の範囲であれば、適切な個体への投与を妨げる毒性有害作用は本発明の化合物で予想されない。
【０２７１】
さらなる態様では、本発明は、上述の本発明の組成物の成分の1つまたは複数が充填された1つまたは複数の容器を備える診断用および薬品用のパックおよびキットに関する。前記の成分は、有用な量、投与量、処方、または組み合わせで存在してもよい。このような容器には、薬品または生物学的製品の調製、使用、または販売を規制する政府機関によって定められた形式で、ヒト投与のための製品の調製、使用または販売が政府機関によって許可されたことを示す貼り紙が添付されてもよい。
【０２７２】
本発明に関して、本明細書において開示される使用、例えば、薬学的組成物またはワクチンの使用に関連する疾患は、特に、クラミジア属、より好ましくは、任意の病原性のクラミジア属の種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによって引き起こされる、またはこれらに関する、またはこれらと関連する疾患または疾患状態である。本発明に従って予防および/または治療しようとする細菌感染症に関する、または細菌感染症によって引き起こされる、または細菌感染症に関連する疾患には、慢性感染症が含まれる。よく見られる部位には上気道および下気道が含まれる。この範囲の臨床的症候群には、肺炎、上気道疾患、気管支炎、副鼻腔炎、喘息性気管支炎、成人発症型喘息、および慢性閉塞性肺疾患が含まれる。さらに、クラミジア属感染症はまた、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患ならびにアルツハイマー病とも関連づけられてきた。
【０２７３】
生物、例えば、任意の動物またはヒトと、クラミジア属の種、好ましくは、病原性のクラミジア属の種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシとの接触に直接的または間接的に関連または起因する、本明細書に記載の症状、疾患、障害、または症候群がそれぞれ、またはいずれも、別々におよび独立して、本発明の意味での適応症、疾患、または障害であることは本発明の範囲内である。従って、および単なる例示として、本願の意味での疾患は、肺炎ならびに気管支炎および慢性閉塞性肺疾患である。
【０２７４】
本明細書に記載の様々な化合物を使用することができる疾患はまた、本発明によるポリペプチドが発現している疾患、または本明細書に記載の化合物、例えば、本発明によるポリペプチド、ワクチン、抗体、ならびに任意のアプタマーおよびスピーゲルマーがそれぞれ治療および/またはその診断に適している任意の疾患であることは本発明の範囲内である。このような潜在的な使用は、交差反応性および相同性からそれぞれ生じてもよい。本発明による薬学的組成物に関して述べられたいずれの疾患も本明細書に記載の薬学的組成物を使用することができ、逆もまた同じであることが当業者に理解される。
【０２７５】
本発明の文脈における治療とは、治療と、予防的処置または防止的処置との両方を指す。ここで、目的は、標的とする病的状態または障害を予防または減速(緩和)することである。治療を必要とする人には、すでに障害がある人、ならびに障害を起こしやすい人、または障害を予防しようとする人が含まれる。
【０２７６】
なおさらなる態様では、本発明は、本発明による任意のポリペプチドまたは本発明による任意の核酸を用いたスクリーニング方法に関する。このようなスクリーニング方法は当業者に公知であり、アゴニストまたはアンタゴニストがスクリーニングされるように設計することができる。このようなスクリーニング方法に関して、好ましくは、本件では、本発明による任意の抗原およびその断片と相互作用パートナーとの結合を阻害または阻止するアンタゴニストがスクリーニングされる。このような相互作用パートナーは天然の相互作用パートナーでもよく、非天然の相互作用パートナーでもよい。
【０２７７】
本発明はまた、本発明によるポリペプチドまたは本発明の核酸分子の機能、例えば、結合分子との相互作用を増強するもの(アゴニスト)または阻害するもの(アンタゴニスト)を同定するための化合物スクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法はハイスループットを伴ってもよい。
【０２７８】
例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、本発明によるポリペプチドの相互作用パートナーは、合成反応混合物、細胞区画、例えば、膜、細胞エンベロープもしくは細胞壁、または、そのいずれかの調製物でもよく、本発明によるポリペプチドに結合する分子を発現する細胞から調製されてもよい。調製物を、アゴニストまたはアンタゴニストでもよい候補分子の非存在下または存在下で、標識された形のこのようなポリペプチドと共にインキュベートする。候補分子が結合分子に結合する能力は、標識リガンドの結合の減少に反映される。無報酬で結合する分子、すなわち、前記ポリペプチドの機能効果を誘導することなく結合する分子は、良好なアンタゴニストである可能性が最も高い。良好に結合し、本発明によるポリペプチドと同じまたは密接に関連する機能効果を誘発する分子は、良好なアゴニストである。
【０２７９】
潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストの機能効果は、例えば、候補分子と細胞または適切な細胞調製物が相互作用した後にレポーター系の活性を求め、その効果と、本発明によるポリペプチドまたは前記ポリペプチドと同じ効果を誘発する分子の効果を比較することによって測定できる。これに関して有用であり得るレポーター系には、生成物に変換される比色用標識基質、本発明によるポリペプチドの機能活性の変化に応答するレポーター遺伝子、および当技術分野において公知の結合アッセイが含まれるが、これに限定されない。
【０２８０】
アンタゴニストのアッセイの別の例は競合アッセイである。競合アッセイは、本発明によるポリペプチドおよび潜在的なアンタゴニストと、膜結合型結合分子、組換え結合分子、天然の基質もしくはリガンド、または基質模倣物もしくはリガンド模倣物とを、競合阻害アッセイに適した条件下で組み合わせるものである。潜在的なアンタゴニストの有効性を評価するために、本発明によるポリペプチドが結合分子に結合した分子数または生成物に変換した分子数を正確に求めることができるように、本発明によるポリペプチドは、例えば、放射能または比色化合物によって標識することができる。
【０２８１】
潜在的なアンタゴニストには、本発明によるポリペプチドに結合し、それによって、その活性を阻害または消失させる、有機低分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体が含まれる。潜在的なアンタゴニストはまた、本発明によるポリペプチドの機能的活性を誘導することなく結合分子の同じ部位に結合する、有機低分子、ペプチド、ポリペプチド、例えば、密接に関連するタンパク質または抗体でもよい。
【０２８２】
潜在的なアンタゴニストには、本発明によるポリペプチドの結合部位に結合し、結合部位を占有して、正常な生物学的活性が阻止されるように細胞結合分子との結合を妨げる低分子が含まれる。低分子の例には、有機低分子、ペプチドまたはペプチド様分子が含まれるが、これに限定されない。
【０２８３】
他の潜在的なアンタゴニストにはアンチセンス分子が含まれる(これらの分子の説明については、(Okano, H. et al., 1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION; CRC Press, Boca Raton, FL (1988)を参照されたい)。
【０２８４】
好ましい潜在的なアンタゴニストには、本発明の抗原およびその断片の誘導体が含まれる。
【０２８５】
本明細書で使用する、本発明によるポリペプチドの活性は、その任意の相互作用パートナーと結合する能力、またはそのもしくは任意の相互作用パートナーに結合する、このような能力の程度である。
【０２８６】
特定の局面において、本発明は、感染後遺症の原因となる、病原体と哺乳動物宿主との初期の物理的相互作用を妨害するための、本発明によるポリペプチド、本発明の抗原およびその断片、核酸分子または阻害剤の使用を提供する。特に、本発明の分子は、i)哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質への、本明細書において開示されるクラミジア属の種、より好ましくは、その病原性種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシの付着の阻止;ii)哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質と、組織反応を媒介する細菌タンパク質との間の細菌付着のブロック;iii)免疫防御の回避;iv)留置装置移植または他の外科法以外の方法によって開始する感染症における発病の通常進行のブロック、例えば、栄養分の獲得の阻害を介したブロックにおいて使用することができる。
【０２８７】
本明細書において提供されるDNAコード配列はそれぞれ、抗菌化合物の発見、開発、および/または調製において使用することができる。コードされているタンパク質は発現すると、抗細菌薬スクリーニングの標的として使用することができる。さらに、コードされているタンパク質のアミノ末端領域をコードするDNA配列、またはそれぞれのmRNAのShine-Delgarno配列もしくは他の翻訳促進配列を用いて、関心対象のコード配列の発現を制御するアンチセンス配列を構築することができる。
【０２８８】
アンタゴニストおよびアゴニストは、例えば、クラミジア属の種、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症から生じた疾患を阻害するのに使用することができる。
【０２８９】
なおさらなる局面では、本発明は親和性装置に関する。このような親和性装置は、少なくとも、支持体材料および支持体材料に取り付けられた本発明による任意のポリペプチドを含む。前記ポリペプチドには、その標的細胞または標的分子またはその相互作用パートナーに対して特異性があるので、前記ポリペプチドを用いると、結合条件が合えば、支持体材料に適用された任意の種類の試料から相互作用パートナーを選択的に取り出すことができる。試料は生物学的試料または医学的試料でよい。試料には、発酵ブロス、細胞片、細胞調製物、組織調製物、臓器調製物、血液、尿、リンパ液、羊水などが含まれるが、これに限定されない。
【０２９０】
本発明によるポリペプチドは、共有結合によりマトリックスに取り付けられてもよく、非共有結合によりマトリックスに取り付けられてもよい。適切な支持体材料は当業者に公知であり、セルロース、ケイ素、ガラス、アルミニウム、常磁性ビーズ、デンプン、およびデキストランからなる群より選択することができる。
【０２９１】
本発明は、以下の図面、表、実施例および配列表によってさらに説明され、これらからさらなる特徴、態様、および利点を理解することができる。本実施例は例示に過ぎず、開示を限定するものではないことが理解されると思われる。
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１】病原体特異的抗体の供給源としてのヒト血清の特徴付けを示す。
【図２】ライブラリーの特徴付けを示す。
【図３】ビオチン化ヒトIgAを用いたMACSによる細菌細胞の選択を示す。
【図４】それぞれの細菌病原体の臨床分離株における選択された抗原の遺伝子分布を求めるPCR分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【０２９３】
本明細書において言及されることがある図面および表を以下でさらに詳細に説明する。
【０２９４】
図1は、イムノブロッティングにより測定した時の、抗C.ニューモニエ抗体についてのヒト血清の特徴付けを示す。クラミジア属基本小体(EB)調製物を用いたIgG-ELISAによって、抗C.ニューモニエIgG抗体レベルの高い血清を前もって選択した。C.ニューモニエAR39に感染したHeLa細胞から単離した基本小体のタンパク質をSDS-PAGEゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に転写した。5,000xに希釈した選択した患者血清を用いた代表的な実験の結果を示した。抗ヒトIgG二次抗体試薬を用いてブロットを発色させた。最も反応した試料を選択して、スクリーニングプールに含めた(＊を付けて示した)。Mw:分子量マーカー。
【０２９５】
図2(A)は、クラミジア・ニューモニエAR39大断片ゲノムライブラリー,LCPn-50の断片サイズ分布を示す。ランダムに選択した480個のクローンを配列決定した後、ベクター残基を無くすために配列を切り取り、様々なゲノム断片サイズを有するクローンの数をプロットした。(B)は、ランダムに配列決定したLCPn-50クローンの同じセットがC.ニューモニエ染色体(AR39ゲノムデータによる)の上に分布している図を示す。四角は、アノテートされたORFとマッチする配列を示し、ダイヤモンド形は、非コード染色体配列と完全にマッチしたクローンを示し、それぞれ、+/+方向または+/-方向である。丸は、キメラ配列を有する全クローンの位置を定める。方向のために距離の数値(塩基対)を環状ゲノム上に示した。ライブラリー内の様々なクローンセットを、図の下に数値およびパーセントを付けて分けた。
【０２９６】
図3(A)は、ヒトIgAによるMACS選択を示す。pMAL9.1の中に入れたLCPn-50ライブラリーを、15〜30μgのIgA(P14-IgA,ヒト血清から精製)および10μgのビオチン化抗ヒトIgA抗体を用いてスクリーニングした。陰性対照として、スクリーニング用のライブラリー細胞に血清を添加しなかった。2回の選択それぞれについて、1回目および/または2回目の溶出後に選択された細胞の数を示した。(B)は、イムノブロット分析によって分析した時の、細菌表面ディスプレイによって選択された特異的クローン(1-22)と、濃度1μg/mLの、MACSによる選択に使用したヒト血清IgAプール(P14-IgA)との反応性を示す。
【０２９７】
図4は、2つの遺伝子の遺伝子分布分析のために、それぞれのオリゴヌクレオチドならびに17個のC.ニューモニエ株およびC.トラコマティス株を用いたPCR分析の一例を示す。ゲノムDNAは1:25〜1:50に希釈して使用した。2マイクロリットルの各PCRを1％アガロースゲルにロードした。C.ニューモニエからの抗原CP0238およびCP0242に由来するPCR断片の推定サイズは、それぞれ、683bpおよび935bpである。1-13、15-17は、表2に示した株または臨床分離株である。-:ゲノムDNAなし;+:C.ニューモニエAR39株(表2の株14)のゲノムDNA。
【０２９８】
表1は、C.ニューモニエAR39のゲノムライブラリーおよびヒト血清を用いて行った全てのスクリーニングをまとめたものを示す。
【０２９９】
表2は、遺伝子分布分析に使用した株を示す。
【０３００】
表3は、それぞれの細菌種の様々な株における選択された数の抗原についての遺伝子分布分析をまとめたものを示す。
【０３０１】
（表１）細菌表面ディスプレイによって同定された免疫原性タンパク質
2010530229.tif 000062
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A,lamBの中にあるC.ニューモニエAR39の50bpライブラリー(LCPn-50)とP14-IgA(切り取り後のクローン数:767);B,fhuAの中にある300bpライブラリー(LCPn-300)とP14-IgA(883)。ORFによって選択されたクローン番号を列挙し、免疫原性領域を、選択されたクローンによって示した。CP0019,C.ニューモニエのアノテートされた読み枠;ARF0008,CP0008の別の読み枠にある新規の推定ORF;CRF0082,CP0082の補完的な読み枠にある新規の推定ORF。*、抗体応答の誘導が可能な、5アミノ酸より長い配列の推定は、プログラムANTIGENIC(Kolaskar, A.S. and Tongaonkar, P.C., 1990)を用いて行った; **,クラスII制限T細胞応答の誘導が可能な配列の推定は、プログラムIEDB Analysis resource (Bui, H.H. et al., 2005)を用いて行った。推定は、12のMHC II型HLA DRB1*0101、*0301、*0401、*0405、*0701、*0802、*0901、*1101、*1302、*1501、HLADRB4*0101、およびHLADRB5*0101について行った。IC50=5000nMより強い結合を有するエピトープを選択した。
【０３０２】
（表２）遺伝子分布分析に使用した株のリスト
2010530229.tif 000079
表2は、遺伝子分布研究のために分析したC.ニューモニエおよびC.トラコマティスの株を示す。種および株の供給源を示す。C.ニューモニエAR39はゲノムライブラリー作製に使用した。
【０３０３】
（表３）C.ニューモニエおよびC.トラコマティスの様々な株における選択された数の抗原についての遺伝子分布分析
2010530229.tif 000080
表2に示したように、PCRの陽性対照であるAR39株を含む17のクラミジア属株を、関連する抗原をコードする遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを用いたPCRによって試験した。この遺伝子分布表は、各遺伝子についての15のC.ニューモニエ株および2つのC.トラコマティス株からのPCR陽性結果の数を列挙し、C.ニューモニエおよびC.トラコマティスの多様な分離株に遺伝子が存在し、保存されていることを示すものである(例えば:14/1;14のC.ニューモニエおよび1つのC.トラコマティス株が陽性)。
【０３０４】
実施例
実施例1:本発明によるペプチドを同定するための一般的なスクリーニング手順
本発明に用いられたアプローチは、C.ニューモニエによってコードされるタンパク質またはペプチドと、ヒト血清中に存在する抗体との相互作用に基づいている。ヒト免疫系によって産生され、ヒト血清中に存在する、C.ニューモニエに対する抗体は、抗原タンパク質がインビボで発現され、抗原タンパク質に免疫性があることを示している。さらに、前もって選択した血清のプールを用いて、細菌表面ディスプレイ発現ライブラリーによって同定された抗原タンパク質を、選択または作製された個々の血清による2回目および3回目のスクリーニングにおいて処理する。従って、本発明は、薬学的組成物、特に、C.ニューモニエによって引き起こされる感染症を予防するワクチンとしての抗原の効率的な、関連する、包括的なセットを供給する。
【０３０５】
本発明による抗原の包括的なセットを同定するための抗原同定プログラムでは、C.ニューモニエに由来する少なくとも2種類の細菌表面発現ライブラリーが、いくつかの血清プールまたは血漿画分(抗体プール)を用いてスクリーニングされる。抗体プールは、C.ニューモニエの抗原化合物、例えば、全細胞、総抽出物に対して試験されている血清収集物に由来する。高いELISA価を有することが決定された血清は、本発明に適用されるスクリーニング方法において関連性があると見なされるためには、イムノブロッティングにおいて複数のタンパク質と反応しなければならない。
【０３０６】
本発明で使用する発現ライブラリーは、可能性のある全ての抗原、例えば、C.ニューモニエの全ての分泌型タンパク質および表面タンパク質に由来する抗原を発現しなければならない。細菌表面ディスプレイライブラリーは、C.ニューモニエの発現ペプチド配列のセット(全体)を、細菌宿主膜にある2種類の選択された外膜タンパク質(LamBおよびFhuA)上にディスプレイする細菌宿主の組換えライブラリーによって表される(Georgiou, G., 1997;Etz, H. et al., 2001)。組換え発現ライブラリーを用いる利点の一つは、同定された、血清に反応した抗原の産生が、さらなる組換えDNA技術またはクローニング工程を必要とせずに、スクリーニングおよび選択された抗原発現クローンのコード配列を発現することによって直ちに可能となることである。
【０３０７】
説明された本発明によるプログラムによって同定された抗原の包括的なセットを、もう1回またはそれ以上のスクリーニングによってさらに分析することができる。従って、免疫原性があると特定された選択ペプチドに対して作製した個体抗体調製物または抗体を使用することができる。好ましい態様によれば、2回目のスクリーニング用の個体抗体調製物は、健常成人、および/またはある特定の最低値を上回る抗体価を示す、抗原暴露された成人に由来する。例えば、抗体価は、試験したヒト(患者または健常個体)の血清の80パーセンタイルを超える、好ましくは、90パーセンタイルを超える、特に、95パーセンタイルを超える。このような高力価の個体抗体調製物を、2回目のスクリーニングで用いることにより、C.ニューモニエに由来する抗原およびその断片を非常に選択的に同定することが可能になる。
【０３０８】
包括的スクリーニング手順の後に、組換えタンパク質として発現させた、もしくは原核生物発現系において発現できなければインビトロ翻訳産物として発現させた、選択された抗原タンパク質、または合成により生成された抗原ペプチドを、2回目のスクリーニングにおいて免疫原性を評価するために、大きなヒト血清収集物(最低約20個の健常人血清および患者血清)を用いた一連のELISAおよびウェスタンブロッティングアッセイによって試験することができる。
【０３０９】
個体抗体調製物(選択された血清でもよい)を用いて、1回目からの見込みのある全ての候補から、血清に反応した全ての抗原の中で最も見込みのある候補を選択的に同定できることが重要である。従って、好ましくは、2回目のスクリーニングにおけるこれらの抗原の同定では、少なくとも10個の個体抗体調製物(すなわち、選択された病原体に暴露された少なくとも10人の個体に由来する抗体調製物(例えば、血清))を使用しなければならない。もちろん、10個未満の個体調製物を使用することも可能であるが、この工程の選択性が少数の個体抗体調製物では最適でない場合がある。他方で、所定の抗原(またはその抗原断片)が少なくとも10個の個体抗体調製物、好ましくは少なくとも30個、特に少なくとも50個の個体抗体調製物によって認識されるのであれば、この抗原の同定は適切な同定に十分な選択性もある。もちろん、血清反応性は、可能な限り多くの(例えば、100個超、さらには1,000個超の)個体調製物を用いて試験することができる。
【０３１０】
従って、本発明の方法による抗体調製物の関連部分は、好ましくは、少なくとも10個の、より好ましくは、少なくとも30個の、特に、少なくとも50個の個体抗体調製物でなければならない。その代わりとして(または組み合わせて)、抗原はまた、好ましくは、2回目のスクリーニングにおいて使用した全ての個体抗体調製物の少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、特に少なくとも40％を用いて同定することもできる。
【０３１１】
本発明の好ましい態様によれば、2回目のスクリーニング用の個体抗体調製物を調製するのに用いられる(または抗体調製物として用いられる)血清は、C.ニューモニエ(例えば、この病原体の調製物、例えば、溶解産物、細胞壁成分、および組換えタンパク質)に対する力価によって選択される。好ましくは、生物全体(総溶解産物または全細胞)がELISAの抗原として用いられる場合、一部は、1,000Uを上回る、特に、5,000Uを上回るIgG価(U=単位、所定の希釈でのOD405nm測定値から計算する)によって選択される。
【０３１２】
血清抗体によって認識される線状エピトープの認識は、4〜5と短いアミノ酸の配列に基づいてもよい。もちろん、このことは、これらの短いペプチドが所定の抗体をインビボで誘導できることを必ずしも意味しているわけではない。このような理由で、規定されたエピトープ、ポリペプチド、およびタンパク質は、選択されたタンパク質に対する抗体をインビボで誘導する能力について、動物(主にマウス)においてさらに試験しなければならない。
【０３１３】
細胞外細菌の好ましい抗原は細胞表面上に位置するか、または分泌されたものであり、従って、細胞外で接近可能なものである。宿主細胞内で細胞内段階を有する細菌に由来する抗原は細胞内位置から得られてもよいが、抗原として宿主細胞上に提示される必要がある。細胞壁タンパク質に対する抗体は、複数の目的、すなわち、付着の阻害、栄養分の獲得の妨害、免疫回避の阻害、および食作用の促進にかなうと期待されている(Hornef, M. et al., 2002)。分泌タンパク質に対する抗体は、毒素または病原性成分としての分泌タンパク質の機能の中和において有益である。細菌は分泌タンパク質を介して互いに情報交換していることも知られている。これらのタンパク質に対する中和抗体は、感染症を引き起こす病原体種間または種内での、成長を促進するクロストークを妨害する。バイオインフォマティクス分析(シグナル配列、細胞壁局在化シグナル、膜貫通ドメイン)が細胞表面局在または分泌の評価に非常に有用であることが判明した。この実験アプローチには、対応するエピトープおよびタンパク質を有する抗体のヒト血清からの単離、ならびに細菌表面ディスプレイスクリーニングにより選択された(ポリ)ペプチドに対するマウスにおける免疫血清の作製が含まれる。次いで、これらの血清を、3回目のスクリーニングにおいて、以下のアッセイ:様々な条件下で増殖させたC.ニューモニエの細胞表面染色(FACSまたは顕微鏡観察)、中和能(毒素、付着)の測定、ならびにオプソニン化および食作用の促進(インビトロ食作用アッセイ)の少なくとも1つの試薬として使用する。
【０３１４】
このような目的で、細菌大腸菌クローンをマウスに直接注射し、免疫血清を採取し、関連するインビトロアッセイにおいて試験する。または、ペプチドまたはタンパク質を基質として用いて、特異的抗体をヒトまたはマウスの血清から精製することができる。
【０３１５】
本明細書において使用した抗原同定方法によれば、驚くべきことに、本発明は、特に、本明細書に記載のC.ニューモニエの包括的な新規の核酸および新規のタンパク質、抗原およびその断片のセットを提供することができる。本発明による、このような抗原をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、SEQ ID NO: 1-98に個々に示したヌクレオチド配列を有し、コードされる対応するアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 99-196に示したアミノ酸配列を有する。
【０３１６】
ある特定の抗原の全ての線状断片は、少なくとも10アミノ酸の長さを有し、1アミノ酸だけ重複するペプチドのセットによって、タンパク質抗原の配列全体を分析することによって同定することができる。その後に、完全長の発現タンパク質またはそのドメインポリペプチドと血清を用いて抗原を分析することによって、非線状エピトープを同定することができる。タンパク質の別個のドメインが、ネイティブタンパク質とは無関係に3D構造を形成するのに十分だとすると、それぞれの組換えドメインポリペプチドまたは合成により生成されたドメインポリペプチドを血清によって分析すれば、マルチドメインタンパク質の個々のドメイン内の高次構造エピトープが同定できると考えられる。ドメインが線状エピトープおよび高次構造エピトープを有する抗原の場合、線状エピトープに対応するペプチドによる競合実験を用いて、高次構造エピトープの存在を確認することができる。
【０３１７】
実施例2:抗クラミジア属抗体に基づくヒト血清試料の特徴付けおよび選択、ならびに抗体スクリーニング試薬の調製
実験手順
酵素結合免疫測定法(ELISA)
高度に精製され、特異的な抗原を使用する市販のELISAキット, Chlamydien-IgG-ELISA medac (Medac Gmbh, Germany)を用いて、抗C.ニューモニエ抗体価を測定した。3種類の血清希釈液、400x、200x、100xを試験し、反応性を力価>1:400;1:400;1:200;1:100、および<1:100で表した。
【０３１８】
イムノブロッティング
基本小体(EB)を細菌抗原抽出物として使用し、Wang et al. (1991)に従って、C.ニューモニエAR39に感染したHeLa細胞培養から単離した。EBの感染性を破壊し、SDSおよび2-メルカプトエタノールを含有するSDS-PAGE試料緩衝液を添加することによって、タンパク質を可溶化した。約5μgの総タンパク質を、BioRad Mini-Protean 3 Cell電気泳動システムを用いてSDS-PAGEで分離し、タンパク質をニトロセルロース膜(ECL, Amersham Pharmacia)に転写した。5％ミルクで一晩ブロッキングした後、ヒト血清を5,000xに希釈して添加し、検出にはHRP標識抗ヒトIgGを使用した。
【０３１９】
ゲノムスクリーニング用抗体の精製
スクリーニング手順に使用した血清プールの全抗クラミジア価に基づいて、5個の血清を選択した。熱失活血清と全細胞大腸菌細胞(DH5αをpHIE11で形質転換し、細菌表面ディスプレイに使用したものと同じ条件下で増殖させた)をインキュベートすることによって、大腸菌タンパク質に対する抗体を除去した。プールされ、枯渇された血清から高度に濃縮されたIgA調製物を、ストレプトアビジン-アガロース(GIBCO BRL)に固定化したビオチン標識抗ヒトIgA(Southern Biotech)を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。IgA精製の効率はSDS-PAGEおよびタンパク質濃度測定(OD280nm)によってチェックした。
【０３２０】
結果
前記のように、ヒト免疫系によって産生され、ヒト血清中に存在する、C.ニューモニエに対する抗体は、抗原タンパク質がインビボで発現され、抗原タンパク質に免疫性があることを示している。これらの分子は、抗クラミジア特異的抗体と対応するC.ニューモニエペプチドまたはタンパク質の相互作用に基づく本発明に記載のアプローチにおいて個々の抗原を同定するのに不可欠である。関連する抗体レパートリーを利用するために、C.ニューモニエ関連感染症、例えば、肺炎および気管支炎の症状を有する患者からヒト血清を収集した。C.ニューモニエは、血清学的な医学検査によって原因となる病原体(agent)であることが示された。
【０３２１】
クラミジア・ニューモニエによる感染症は、この病原体が日常的な微生物学的方法によって培養できなかったので血清学によって検出および診断した。抗原検出に基づく特異性および感度の高い診断キットが開発されており、市販されている。本発明者らは、クラミジア属の種によって引き起こされる急性感染、慢性感染、および持続感染の診断に診療所で日常的に用いられる標準的なクラミジア属ELISAキットによって検出された、C.ニューモニエに対して高力価を有する患者血清を選択した。185の血清試料を試験した。これらは全て、クラミジア・ニューモニエ特異的抗体が存在するかどうか診断する試験のために、臨床症状に基づいて選択された個体に由来する。83の血清が>1:400の抗体価を示し、34の血清が約1:400の抗体価を示し、14の血清が1:200の抗体価を示し、20の血清が1:100の抗体価を示し、34の血清が<1:100の抗体価を示した。疫学研究によれば、C.ニューモニエの保菌および感染は広範であり、生涯にわたって再感染が頻繁に起こる。このような理由で、血清の一次選択は、非特異的な偽陽性診断のリスクを下げるために、IgG価が最も高い(>400)試料を特定することを目的とした。
【０３２２】
この後に、C.ニューモニエに存在する複数のタンパク質抗原に対する抗体反応性を確実にするために、前もって選択した血清をイムノブロッティングによって分析した。図1に示した代表的なイムノブロットは、インビトロ培養した感染ヒト細胞(HeLa)から単離した基本小体タンパク質に対して試験した時に、個々の血清を用いて異なる反応性パターンが検出されたことを証明している。これらのイムノブロット分析に基づいて異なる反応性パターンを表す血清を選択するように、特別の注意を払った。
【０３２３】
豊富な抗体をさらに濃縮するために、5個の選択した血清をプールしたが、これらは、異なる個体の抗体レパートリーをなお表していている。IgG抗体について入手したデータに基づいて、プールした血清(個々の血清P922、P923、P925、P928、およびP949を含む;最後の3つは図1に示した)から、IgAをアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、細菌表面ディスプレイスクリーニングでのバックグラウンドを避けるために大腸菌反応性抗体を枯渇させた。
【０３２４】
実施例3:C.ニューモニエの非常にランダムな、フレーム選択した、小断片のゲノムDNAライブラリーの作製
実験手順
クラミジアゲノムDNAの調製
C.ニューモニエAR39を、Campell, L.A. et al., (1989)に記載のように培養した。基本小体(EB)を単離し、ゲノムDNAの調製に使用した。C.ニューモニエEBからのゲノムDNAは、Cox, R.L. et al.(1988)に記載のように調製した。最終的なゲノムDNA調製物をddH2Oに溶解した。
【０３２５】
ゲノムDNA小断片の調製
C. ニューモニエAR39ゲノムDNAを、カップホーン(cup-horn)超音波処理器(BB5カップホーンを備えたBandelin Sonoplus UV 2200超音波処理器、100％出力で10秒のパルス)を用いて機械的に剪断して150〜300bpのサイズの断片にするか、または、穏やかなDNase I(Novagen)処理によって50〜70bpのサイズの断片にした。超音波処理によって、非常に密な断片サイズ分布が得られ、この時、DNAが150〜300bpサイズ範囲の断片に分解されることが観察された。しかしながら、超音波により誘導された流体力学的剪断力にDNAを大規模に暴露したにもかかわらず、それに続く断片サイズの減少は効率的かつ再現可能に達成できなかった。従って、50〜70bpのサイズの断片は、Novagenのショットガン切断キットを用いた穏やかなDNase I処理によって得た。キットに付いているDNase Iの1:20希釈を調製し、酵素による二本鎖の切断を確実にするために、MnCl2の存在下、60μL体積で、消化を20℃で5分間行った。反応を2μLの0.5M EDTAで止め、断片化効率を2％TAE-アガロースゲルで評価した。この処理の結果、ゲノムDNAが全て約50〜70bpの断片へと断片化された。末端の効率的なフラッシング(flushing)を確実にするために、T4 DNAポリメラーゼを用いて100μMの各dNTPの存在下で、断片を2回平滑末端化した。断片を連結反応にすぐに使用したか、または後で使用するために-20℃で凍結した。
【０３２６】
ベクターの説明
ベクターpMAL4.31は、βラクタマーゼ(bla)遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置換したpASK-IBAバックボーン(Skerra, A., 1994)上に構築した。さらに、bla遺伝子をマルチクローニングサイトにクローニングした。細胞膜を横切る効率的な分泌を可能にするために、成熟βラクタマーゼをコードする配列の前にompAリーダーペプチド配列を配置した。リーダーペプチダーゼ切断部位のすぐ後ろの配列の融合を避けるために、ompAリーダーペプチド配列の後に、成熟βラクタマーゼの最初の12アミノ酸(スペーサー配列)をコードする配列をさらに配置した。なぜなら、例えば、この領域にある正に荷電したアミノ酸のクラスターが、細胞膜を横切る転移を減少または無くすからである(Kajava, A. et al., 2000)。SmaI制限部位はライブラリー挿入に役立つ。選択された断片の回収に用いた上流FseI部位および下流NotI部位がSmaI部位に隣接する。bla遺伝子が-1のリーディングフレームにて転写されると、NotI部位の15bp後に終止コドンが生じるように、3つの制限部位は12アミノ酸スペーサー配列をコードする配列の後に挿入される。+1bpが挿入されるとblaのORFが回復し、その結果、βラクタマーゼタンパク質が生じ、結果としてアンピシリン耐性が獲得される。
【０３２７】
ベクターpMAL9.1は、lamB遺伝子をpEH1(Hashemzadeh-Bonehi, L. et al., 1998)のマルチクローニングサイトにクローニングすることによって構築した。その後に、制限部位FseI、SmaIおよびNotIを含有する配列を、lamBのアミノ酸154の後に挿入した。この挿入のためのリーディングフレームは、プラスミドpMAL4.31からのFseIおよびNotIによる消化により切り出された、フレーム選択したDNA断片の導入によって、lamBおよびそれぞれのインサートの連続的なリーディングフレームが生じるように構築した。
【０３２８】
ベクターpHIE11は、pEH1のマルチクローニングサイトにfhuA遺伝子をクローニングすることによって構築した。その後、制限部位FseI、XbaIおよびNotIを含有する配列を、fhuAのアミノ酸405の後に挿入した。この挿入のためのリーディングフレームは、プラスミドpMAL4.31からのFseIおよびNotIによる消化により切り出され、フレーム選択したDNA断片の導入によって、fhuAおよびそれぞれのインサートの連続的なリーディングフレームが生じるように選択した。
【０３２９】
クローニングおよびフレーム選択用のライブラリーの評価
C. ニューモニエAR39 DNA断片をベクターpMAL4.31のSmaI部位に連結した。組換えDNAをDH10Bエレクトロコンピテント大腸菌細胞(GIBCO BRL)にエレクトロポレーションし、形質変換体をカナマイシン(50μg/ml)およびアンピシリン(50μg/ml)を添加したLB寒天に播いた。プレートを37℃で一晩インキュベートし、コロニーをラージスケールDNA抽出のために収集した。代表的なプレートを、コロニーPCR分析用およびラージスケール配列決定用のコロニーを収集するために保管および保存した。簡単なコロニーPCRアッセイを用いて、最初に、大まかな断片サイズ分布および挿入効率を決定した。配列決定データから、正確な断片サイズを評価し、挿入部位における接合部の完全性およびフレーム選択の正確さ(3n+1規則)を評価した。
【０３３０】
クローニングおよび細菌表面ディスプレイ用ライブラリーの評価
ゲノムDNA断片を、C. ニューモニエライブラリーを含有するpMAL4.31ベクターから、制限酵素FseIおよびNotIによって切り出した。次いで、断片の全集団を、FseIおよびNotIで消化したプラスミドpMAL9.1(LamB)またはpHIE11(FhuA)に移した。8bp GCリッチ配列を認識する、これら2つの制限酵素を用いることにより、pMAL4.31ベクターにおいて選択されたリーディングフレームが、プラットフォームベクターのそれぞれにおいて維持される。次いで、プラスミドライブラリーを用いたエレクトロポレーションによって、大腸菌DH5α細胞を形質転換した。細胞を、50μg/mLカナマイシンを添加したラージLB-寒天プレートに播き、37℃で一晩、明らかに目に見えるシングルコロニーが得られる密度で増殖させた。次いで、細胞を、これらのプレートの表面から掻き取り、新しいLB培地で洗浄し、ライブラリースクリーニングのためにアリコートに分けて-80℃で保存した。
【０３３１】
結果
フレーム選択用ライブラリー
2つのライブラリー(LCPn-50およびLCPn-300)をpMAL4.31ベクター中に作成し、サイズはそれぞれ約50bpおよび約300bpであった。各ライブラリーについて、約1μgのpMAL4.31プラスミドDNAおよび50ngの断片化ゲノムC.ニューモニエAR39 DNAの連結と、その後の形質転換とにより、フレーム選択後に6x104〜3x105のクローンが得られた。ライブラリーのランダム性を評価するために、LCPn-50の480個のランダムに選択したクローンを配列決定した。ベクター配列を切り取った後、390個をバイオインフォマティクス分析に供することができた。このことは、これらのクローンのうち、2回以上存在するクローンはごくわずかしかないことを示している。さらに、クローンの98％が25〜100bpのサイズ範囲にあり、平均サイズが46bpであることが分かった(図2)。ほぼ全ての配列が3n+1規則に従った。このことは、全てのクローンが適切にフレーム選択されたことを示している。
【０３３２】
細菌表面ディスプレイライブラリー
ペプチドを大腸菌表面上にディスプレイするには、フレーム選択ベクターpMAL4.31からのLCPnライブラリーからのインサートを、ディスプレイプラスミドpMAL9.1(LamB)またはpHIE11(FhuA)に導入することが必要であった。ゲノムDNA断片をFseIおよびNotI制限によって切り出し、5ngのインサートと0.1μgのプラスミドDNAを連結し、次いで、DH5α細胞を形質転換して、2x105〜2x106クローンを得た。クローンをLBプレートから掻き取り、さらに増幅させずに凍結した。
【０３３３】
実施例4:細菌表面ディスプレイゲノムライブラリーおよびヒト血清を用いた、C.ニューモニエからの免疫原性の高いペプチド配列の同定
実験手順
MACSスクリーニング
所定のライブラリーから約2.5x108細胞を、50μg/mLカナマイシンを添加したLB培地5mL中37℃で2時間増殖させた。発現は、1mM IPTGの添加により30分間誘導した。細胞を新鮮なLB培地で2回洗浄し、約2x107細胞をLB培地100μLに再懸濁し、エッペンドルフチューブに移した。
【０３３４】
血清から精製され、ビオチン化したヒトIgA 10〜20μgを細胞に添加し、懸濁液をおだやかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートした。LB培地900μLを添加し、懸濁液を混合し、その後に、6,000rpm、4℃で10分間、遠心分離した。細胞をLB 1mLで1回洗浄し、次いで、LB培地100μLに再懸濁した。ストレプトアビジン(Miltenyi Biotech, Germany)に結合したMACSマイクロビーズ10μLを添加し、インキュベーションを4℃で20分間続けた。その後、LB培地900μLを添加し、MACSマイクロビーズ細胞懸濁液を、磁石に固定した平衡化MSカラム(Miltenyi Biotech, Germany)にロードした。(MSカラムは、70％EtOH 1mLで1回、LB培地2mLで2回洗浄することによって平衡化した。)
【０３３５】
次いで、カラムをLB培地3mLで3回洗浄した。磁石を取り除いた後、細胞をLB培地2mLで洗浄することにより溶出した。LB培地3mLでカラムを洗浄した後、2mLの溶出液を再び同じカラムにロードし、洗浄および溶出のプロセスを繰り返した。3回目のローディング、洗浄および溶出のプロセスを行い、その結果、最終溶出液は2mlとなった。2回目の選択の後に選択された細胞を、50μg/mLカナマイシンを添加したLB-寒天プレートにプレートし、37℃で一晩増殖させた。
【０３３６】
配列決定およびウェスタンブロット分析による、選択されたクローンの評価
ランダムに選択されたクローンを、50μg/mLカナマイシンを添加したLB培地3mL中37℃で一晩増殖させて、標準的手順を用いてプラスミドDNAを調製した。配列決定はMWG(Germany)またはAgowa(Germany)で行った。
【０３３７】
ウェスタンブロット分析のために、約10〜20μgの総細胞タンパク質を10％SDS-PAGEによって分離し、HybondCメンブレン(Amersham Pharmacia Biotech, England)にブロッティングした。LamB融合タンパク質またはFhuA融合タンパク質を、ヒト血清を一次抗体として約1:3,000〜1:5,000の希釈で用い、HRP結合抗ヒトIgA抗体を二次抗体として1:5,000の希釈で用いて検出した。検出はECL検出キット(Amersham Pharmacia Biotech, England)を用いて行った。または、融合タンパク質を検出するために、一次抗体としてウサギ抗FhuA抗体またはウサギ抗LamBポリクローナル免疫血清と、それぞれのHRP結合二次抗体を組み合わせて使用した。
【０３３８】
結果
ビオチン化IgAを用いた磁気活性化細胞ソーティング(MACS)による細菌表面ディスプレイライブラリーのスクリーニング
pMAL9.1中のライブラリーLCPn-50およびpHIE11中のLCPn-300を、患者血清からのビオチン化ヒトIgAプールを用いてスクリーニングした(実施例2:ゲノムスクリーニング用抗体の調製、および実施例2の結果の最後の段落を参照されたい)。この選択手順は実験手順に記載のように行った。図3Aは、LCPn-50ライブラリーおよびP14-IgAのスクリーニングを用いて入手したデータを示している。MACSスクリーニングからの1回目の選択サイクル後のコロニー数から分かるように、最終的に回収された細胞の総数は、1x108細胞から約5x104細胞へと劇的に減少したのに対して、抗体を用いなかった選択では約1x104細胞の数値へと減少した(図3A)。2回目の後に、P14-IgAを用いて約1x104細胞が回収されたのに対して、ヒト血清からのIgAが添加されない時には、1〜2x103細胞しか回収されなかった。このことは、選択がC.ニューモニエ特異的抗体に依存したことをはっきりと示している。スクリーニングの性能を評価するために、25個の選択されたクローンをランダムに選び、スクリーニングIgAプール(P14-IgA)を用いてイムノブロット分析に供した(図3B)。この分析により、選択されたクローンの約80％が、関連する血清に存在する抗体と反応性を示したのに対して、C.ニューモニエ特異的インサートを含まないLamBを発現する対照株は同じ血清と反応しないことが明らかになった(示さず)。一般的に、反応性の割合は40〜80％の範囲内にあることが観察された。コロニーPCR分析により、選択された全てのクローンは、予想されたサイズ範囲内のインサートを含有することが示された。
【０３３９】
この後に、ランダムに選ばれた多数のクローン(スクリーニング当たり約600個のクローン)を配列決定することによって、スクリーニングに使用したヒト血清抗体により特異的に認識される遺伝子および対応するペプチド配列またはタンパク質配列が同定された。特異的クローンが選択される頻度は、このクローンによって提示されるエピトープを認識する、選択に用いられた血清中の特異的抗体の存在量および/または親和性を少なくとも部分的に反映している。これに関して、一部のORFに由来するクローン(例えば、CP0210、CP0212)はかなり頻繁に(27〜50回)選ばれたことは興味を引く。このことは、これらの免疫原性が高いことを示している。表1は、実施された2回のスクリーニングについて得られたデータをまとめたものである。表1に示した全てのクローンは、シングルクローンからの全細胞抽出物を用いたイムノブロット分析によって、それぞれのスクリーニングにおいて使用したヒト血清プールと示された反応性を示すことが確認されている。表1から分かるように、様々なサイズのタンパク質断片がプラットフォームタンパク質によって表面上にディスプレイされるので、それぞれのORFの別個の領域に免疫原性があると特定された。
【０３４０】
さらに、細菌表面ディスプレイスクリーニングによって同定された遺伝子の多くが、機能が割り当てられていないC.ニューモニエタンパク質をコードするか、または以前のバイオインフォマティクス分析によって予測されたことのないタンパク質さえも構成し得ることは注目に値する。従って、これらの候補の多くはC.ニューモニエの新規の抗原性タンパク質を構成する。
【０３４１】
実施例5:C.ニューモニエから同定された免疫原性の高いタンパク質を用いた遺伝子分布研究
実験手順
PCRによる抗原の遺伝子分布
理想的なワクチン抗原とは、ワクチンの対象となる標的生物の全てまたは大多数の株に存在する抗原であろう。同定されたC.ニューモニエ抗原をコードする遺伝子が関連する株に遍在するかどうかを確認するために、一連の独立した細菌分離株に対して、関心対象の遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCRを行った。プライマーとしてのオリゴヌクレオチド配列を、全ての同定されたORFについて、約1,000bpの産物を生じるように、可能であれば、全ての同定された免疫原性エピトープをカバーするように設計した。
【０３４２】
ゲノムDNAを調製するために、1枚の6ウェルプレート中で培養したクラミジア属細胞を採取し、Falconチューブに移した。細胞をガラスビーズの存在下で10分間振盪することによって破壊し、その後に900rpm、4℃で5分間遠心分離することによって、細胞片を除去した。上清を13,000rpm、10℃で1時間遠心分離して、染色体DNAを収集した。ペレットをPBS 1mLに再懸濁し、200μLアリコートにして保存した。ゲノムDNAの抽出は、QIAamp DNA Miniキット(Qiagen)を用いて製造業者の推奨に従って行った。
【０３４３】
PCRはTaqポリメラーゼ(1U)、200nM dNTP、10pMolの各オリゴヌクレオチド、およびキットを製造業者の説明書に従って用いて(Invitrogen, The Netherlands)、反応体積25μLで行った。個々のプライマー対に条件を合わせなければならなかった場合を除いて、標準として、30サイクル(1x:5分95℃、30x:30秒95℃、30秒56℃、30秒72℃、1x4分72℃)を行った。
【０３４４】
結果
免疫原性タンパク質をコードする同定された27の遺伝子を、17種類のクラミジア属株(15種類のC.ニューモニエおよび2種類のC.トラコマティス;表2)に存在するかどうかPCRによって試験した。偽陰性結果を排除するために、ネガティブなPCRデータは全て、独立した実験によって確認した。それぞれの特定の遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを使用したため、ネガティブなPCRは、オリゴヌクレオチドの3’領域にミスマッチがあることにも起因している可能性がある。だが、ほとんどの場合、遺伝子が存在しないことを、さらなる手段によって確認するのは絶対必要だとみなされなかった。85％(27のうち23)がC.ニューモニエ株の>90％(>13/15)において検出されたのに対して、1つだけがC.ニューモニエ株の>75％(<12/17)において見られず、従って、十分に保存されていないと分類された。さらに、いくつかの遺伝子は、分析した2種類のC.トラコマティス株にも存在した(例えば、CP0064、CP0664)。一例として、図4は、示された17種類全ての株を用いた、2つのC.ニューモニエ抗原CP0238およびCP0242に対するPCR反応を示している。はっきりと目に見えるように、CP0242遺伝子は、分析した全ての株に存在するが、CP0238遺伝子は3つの株において存在せず、さらに5〜6つの株からは弱くしか増幅されない。選択された抗原に関する全ての結果を表3にまとめた。重要なことに、試験した抗原の90％超が、分析したクラミジア・ニューモニエ株の中で、遺伝子特異的PCR産物の存在およびサイズに関して良好に保存されている。従って、これらの抗原は、ワクチンの可能性を評価するさらなる研究を保証する価値のある候補である。
【０３４５】
実施例6:選択された抗原内でのHLAクラスII制限T細胞エピトープまたはエピトープ領域の特定
実験手順
HLAクラスII制限エピトープの推定
細菌ディスプレイによって同定された抗原内のHLAクラスII制限エピトープの推定は、プログラムIEDB Analysis resource (Bui, H.H. et al., 2005)を用いて行った。推定は、12のMHC II型HLA DRB1*0101、*0301、*0401、*0405、*0701、*0802、*0901、*1101、*1302、*1501、HLADRB4*0101、およびHLADRB5*0101について行った。IC50=5000nMより強い結合を有するエピトープを選択した。エピトープの大部分が位置する領域を決定するために、各対立遺伝子の10個の最も強い結合エピトープの局在を決定した。これにより、異なる対立遺伝子に由来するエピトープが同じ領域に結合するかどうかが分かった。次いで、これらの領域を、IEDBプログラムにおいてMHCII結合ペプチドについて選択および分析した。少なくとも4つのMHCII対立遺伝子においてヒットを含む領域を選択した。より大きな領域においてエピトープが連続して重複する場合にのみ、全体領域(潜在的に、25アミノ酸より大きい)を示した。
【０３４６】
結果
T細胞エピトープは、細胞(T細胞)免疫応答を刺激する非自己(または自己)タンパク質から得られる情報の最小必須単位である。それらは、抗原提示細胞表面にあるMHCクラスI分子またはクラスII分子の間隙(cleft)にあり、T細胞受容体(TCR)に提示される。TCRと、MHC分子の間隙にある病原体由来ペプチドエピトープとの相互作用によって誘発される以下の細胞事象カスケードは、細胞免疫系に、細菌、ウイルス、または寄生生物が存在することを伝えるのに役立つ。エピトープ特異的T細胞応答の誘導は、現在、従来のワクチンが存在しない病原体に対する免疫応答を改善する可能性があり、従って、それぞれの病原体による感染を防ぐ、または感染を取り除く手段となるかもしれない。バイオインフォマティクスによりT細胞エピトープを予測する方法の精度は顕著であり(Martin, W. et al., 2003)、従って、B細胞エピトープを実験によって同定することに基づいた、細菌表面ディスプレイによる記載の抗原同定アプローチを補完する方法を提供する。ヒト血清中の抗体による認識に基づいて同定された抗原に対応するORFは線状T細胞エピトープも含有する可能性が最も高いので、本発明の目的は、列挙された抗原のT細胞エピトープのセットも提供することであった。
【０３４７】
対応するHLAクラスIIヘルパーエピトープを分子的に規定することは、免疫記憶を誘導することができる合成抗クラミジアワクチンを設計するのに有用である。なぜなら、クラミジア抗原に由来するヘルパーエピトープは、「同族援助(cognate help)」を、これらの抗原またはその断片に対するB細胞応答に提供するからである。さらに、これらのヘルパーエピトープを用いて、例えば、炭水化物のようなT非依存性抗原に対する記憶を誘導することが可能である(結合体ワクチン)。MHCクラスII分子は、11〜25のアミノ酸(と9アミノ酸の認識配列)からなるペプチドに結合し、主にCD4+ヘルパーT細胞によって認識される。表1から明らかなように、細菌表面ディスプレイによって同定されたほぼ全ての抗原は、多数の潜在的なMHCクラスII制限エピトープを含有し、これらは、同定されたB細胞エピトープとも重複している可能性がある(例えば、CP0444)。
【０３４８】
さらに、細胞内クラミジア・ニューモニエは、HLAクラスI制限エピトープを認識するCD8+細胞傷害性T細胞によって排除することができる。一般的に、MHCクラスI分子は、長さが8〜10のアミノ酸と2個の保存されたアンカー残基ペプチドを提示する。防御免疫応答の状況において、エピトープ特異的T細胞は記憶細胞として持続することができ、従って、病原体に遭遇すると迅速に応答することができる。従って、また2つのタイプの細胞免疫応答が補完するので、クラスI制限エピトープおよびクラスII制限エピトープの両方を含有するように予防用ワクチンならびに治療用ワクチンを設計すべきである。エピトープはバイオインフォマティクスアルゴリズムを用いて予測することもできるが、ここでは具体的に列挙しない。
【０３４９】
抗原の同定されたペプチドまたは断片(例えば、重複する15 mer)を合成し、様々なMHC分子にインビトロで結合する能力について試験することができる。これらの免疫原性は、T細胞の、ペプチド(抗原)に由来する増殖(BrdUもしくは3H-チミジン取り込み)またはサイトカイン分泌(ELIspot,細胞内サイトカイン染色)をインビトロで評価することによって試験することができる(Schmittel, A. et al., 2000; Sester, M. et al., 2000)。これに関しては、例えば、異なるクラミジア感染のある患者の集団または集落形成している集団と、最近、感染しておらず、集落形成していない健常個体とにおいて、クラミジア抗原または選択されたその無差別(promiscuous)ペプチドもしくは断片に対するT細胞応答の量的および質的な差を決定すると面白いと考えられる。さらに、推定されたペプチドの免疫原性はHLA-トランスジェニックマウスにおいて試験することができる(Sonderstrup, G. et al., 1999)。
【０３５０】
さらに、抗原/エピトープをマウスに注射することができ、次いで、誘導された抗体およびT細胞応答を決定することができる。ワクチン接種を介して抗原によって誘導される抗体およびT細胞の防御能は動物モデルにおいて評価することができる。これらのアプローチは全て当業者に利用可能である。
【０３５１】
参考文献
本明細書において省略されたバージョンで列挙された以下の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
2010530229.tif 000081
2010530229.tif 000082
2010530229.tif 000083
【０３５２】
明細書、特許請求の範囲、および/または図面に開示される本発明の特徴は別々に、かつその任意の組み合わせで、本発明を様々な形で実現するのに重要であり得る。
【図１】
2010530229.tif 000139
【図２】
2010530229.tif 000140
【図３】
2010530229.tif 000141
【図４】
2010530229.tif 000142
【配列表】
2010530229000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年3月24日(2010.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原またはその断片をコードする単離された核酸分子であって、
以下からなる群より選択される、核酸配列を含む単離された核酸分子:
a)SEQ ID NO: 1-98を含む群より選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子と少なくとも70％の配列同一性を有する核酸分子、
b)a)の核酸分子に相補的な核酸分子、
c)a)またはb)の核酸分子の少なくとも15個の連続した塩基を含む核酸分子、
d)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、a)、b)、またはc)の核酸分子にアニーリングする核酸分子、
e)遺伝暗号の縮重がなければ、a)、b)、c)またはd)において定義された核酸分子にハイブリダイズする核酸分子。
【請求項２】
a)SEQ ID NO: 1-98との配列同一性が、少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％、もしくは99％、または最も好ましくは100％であり、
b)核酸がDNAもしくはRNAであり、
c)核酸分子が、ゲノムDNA、好ましくはクラミジア属(Chlamydia)の種に由来する、より好ましくはC.ニューモニエ(C.pneumoniae)、C.トラコマティス(C.trachomatis)、C.シタッシ(C.psittaci)、C.ペコラム(C.pecorum)、C.ムリダルム(C.muridarum)、またはC.スイス(C.suis) に由来する、最も好ましくはC.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシに由来するゲノムDNAから単離され、
d)コードされる抗原断片が、その活性断片または活性変種であり、かつ/または
e)核酸分子が、クラミジア属に由来する、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスに由来する、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシに由来するポリペプチドもしくはペプチド断片を含むか、またはこのようなポリペプチドもしくはペプチド断片からなる抗原またはその断片をコードする、
請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
特に、請求項1または2において定義された核酸分子によってコードされる抗原またはその断片の組換え発現用に適合され、かつ/または
特に、宿主細胞内にある、
請求項1または2のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４】
クラミジア属に感染しているヒトに由来する、またはクラミジア属に以前に感染したことのある非感染健常ヒトに由来する血清と免疫学的に反応する抗原であって、
クラミジア属に由来する、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスに由来する、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシに由来する単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種を含むか、あるいはこのような単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種からなる、抗原。
【請求項５】
SEQ ID NO: 99-196からなる群より選択される単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種を含むか、あるいはこのような単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種からなる、抗原。
【請求項６】
a)前記ポリペプチドが、請求項1または2において定義された核酸分子によってコードされ、
b)抗原の活性断片が該ポリペプチドの、特に、SEQ ID NO: 99-196のいずれかによって定義されるポリペプチドの少なくとも50％、特に少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、または98％、最も好ましくは99％からなり、
特に、該抗原の活性断片が、SEQ ID NO: 123のアミノ酸2-872、SEQ ID NO: 124のアミノ酸2-812、SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514または516-1090、SEQ ID NO: 127のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 128のアミノ酸2-324、SEQ ID NO: 130のアミノ酸2-235、SEQ ID NO: 131のアミノ酸2-792、SEQ ID NO: 132のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245、SEQ ID NO: 138のアミノ酸2-393、SEQ ID NO: 139のアミノ酸2-237、SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620、SEQ ID NO: 155のアミノ酸2-287、SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231、SEQ ID NO: 157のアミノ酸2-550、SEQ ID NO: 165のアミノ酸2-644、SEQ ID NO: 168のアミノ酸2-343、SEQ ID NO: 170のアミノ酸2-325、SEQ ID NO: 171の2-458、もしくはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379を含むか、またはこのようなアミノ酸からなり、
c)該抗原の活性変種が、該ポリペプチドと、特に、SEQ ID NO: 99-196のいずれかによって定義されるポリペプチドと、少なくとも50％、特に少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、または98％、最も好ましくは99％の配列同一性を有し、
特に、該抗原の活性変種が、SEQ ID NO: 123のアミノ酸2-872、SEQ ID NO: 124のアミノ酸2-812、SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514または516-1090、SEQ ID NO: 127のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 128のアミノ酸2-324、SEQ ID NO: 130のアミノ酸2-235、SEQ ID NO: 131のアミノ酸2-792、SEQ ID NO: 132のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245、SEQ ID NO: 138のアミノ酸2-393、SEQ ID NO: 139のアミノ酸2-237、SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620、SEQ ID NO: 155のアミノ酸2-287、SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231、SEQ ID NO: 157のアミノ酸2-550、SEQ ID NO: 165のアミノ酸2-644、SEQ ID NO: 168のアミノ酸2-343、SEQ ID NO: 170のアミノ酸2-325、SEQ ID NO: 171の2-458、またはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379と、少なくとも50％、特に少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、96％、97％、または98％、最も好ましくは99％の配列同一性を有し、
d)該抗原が、
i)SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514を含む該抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514からなる該抗原の活性断片に対する、1〜570個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは、1〜500個、1〜400個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、もしくは1〜150個、さらにより好ましくは1〜100個、さらにより好ましくは1〜50個、最も好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、もしくは40個のさらなるアミノ酸残基、または
ii)SEQ ID NO: 125のアミノ酸516-1090を含む該抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 125のアミノ酸516-1090からなる該抗原の活性断片に対する、1〜510個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1〜400個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、もしくは1〜150個、さらにより好ましくは1〜100個、さらにより好ましくは1〜50個、最も好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、もしくは40個のさらなるアミノ酸残基、または
iii)SEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379を含む該抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379からなる該抗原の活性断片に対する、1〜25個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、もしくは20個のさらなるアミノ酸残基、または
iv)SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231を含む該抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231からなる該抗原の活性断片に対する、1〜20個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、もしくは15個のさらなるアミノ酸残基、または
v)SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620を含む該抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620からなる該抗原の活性断片に対する、1〜10個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、もしくは9個のさらなるアミノ酸残基、または
vi)SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245を含む該抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245からなる該抗原の活性断片に対する、1〜5個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1個、2個、3個、もしくは4個のさらなるアミノ酸残基
によってさらに定義され、
特に、該さらなるアミノ酸残基が、該抗原のN末端に隣接するか、該抗原のC末端に隣接するか、または該抗原のN末端とC末端とに隣接し、かつ/または
特に、該さらなるアミノ酸残基が、
(I)SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514もしくはそのC末端に由来する変種、または
(II)SEQ ID NO: 125のアミノ酸516-1090、SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245、SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620、SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231、もしくはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379、またはそのN末端に由来する変種
によって定義される該抗原に隣接し、
e)該抗原が、該抗原と非相同の少なくとも1個のアミノ酸残基、好ましくはマーカータンパク質をさらに含むか、またはこのようなアミノ酸残基、好ましくはマーカータンパク質からさらになり、
特に、該さらなるアミノ酸残基が、該抗原のN末端に隣接するか、該抗原のC末端に隣接するか、または該抗原のN末端とC末端とに隣接し、かつ/または
特に、該さらなるアミノ酸残基が、
(I)SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514もしくはそのC末端に由来する変種、または
(II)SEQ ID NO: 125のアミノ酸516-1090、SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245、SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620、SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231、もしくはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379、またはそのN末端に由来する変種
によって定義される該抗原に隣接し、かつ/あるいは
f)該抗原が、リーダー配列もしくは分泌配列、精製に用いられる配列、またはプロタンパク質配列をさらに含むか、あるいはこのような配列からさらになる、
請求項4または5記載の抗原。
【請求項７】
少なくとも1つのコアアミノ酸配列が、表1の「推定された免疫原性アミノ酸」または「推定されたクラスII制限T細胞エピトープ/領域」または「特定された免疫原領域の位置(aa)」の列において示され、
より好ましくは、該コアアミノ酸配列が、以下:
SEQ ID NO: 123のアミノ酸
2010530229.tif 000143
;SEQ ID NO: 124のアミノ酸
2010530229.tif 000144
;SEQ ID NO: 125のアミノ酸
2010530229.tif 000145
;SEQ ID NO: 126のアミノ酸
2010530229.tif 000146
;SEQ ID NO: 127のアミノ酸
2010530229.tif 000147
;SEQ ID NO: 128のアミノ酸
2010530229.tif 000148
;SEQ ID NO: 129のアミノ酸
2010530229.tif 000149
;SEQ ID NO: 130のアミノ酸
2010530229.tif 000150
;SEQ ID NO: 131のアミノ酸
2010530229.tif 000151
;SEQ ID NO: 132のアミノ酸
2010530229.tif 000152
;SEQ ID NO: 133のアミノ酸
2010530229.tif 000153
;SEQ ID NO: 134のアミノ酸
2010530229.tif 000154
;SEQ ID NO: 135のアミノ酸
2010530229.tif 000155
;SEQ ID NO: 136のアミノ酸
2010530229.tif 000156
;SEQ ID NO: 137のアミノ酸
2010530229.tif 000157
;SEQ ID NO: 138のアミノ酸
2010530229.tif 000158
;SEQ ID NO: 139のアミノ酸
2010530229.tif 000159
;SEQ ID NO: 140のアミノ酸
2010530229.tif 000160
;SEQ ID NO: 141のアミノ酸
2010530229.tif 000161
;SEQ ID NO: 142のアミノ酸
2010530229.tif 000162
;SEQ ID NO: 143のアミノ酸
2010530229.tif 000163
;SEQ ID NO: 144のアミノ酸
2010530229.tif 000164
;SEQ ID NO: 145のアミノ酸
2010530229.tif 000165
;SEQ ID NO: 146のアミノ酸
2010530229.tif 000166
;SEQ ID NO: 147のアミノ酸
2010530229.tif 000167
;SEQ ID NO: 148のアミノ酸
2010530229.tif 000168
;SEQ ID NO: 149のアミノ酸
2010530229.tif 000169
;SEQ ID NO: 150のアミノ酸
2010530229.tif 000170
;SEQ ID NO: 151のアミノ酸
2010530229.tif 000171
;SEQ ID NO: 152のアミノ酸
2010530229.tif 000172
;SEQ ID NO: 153のアミノ酸
2010530229.tif 000173
;SEQ ID NO: 154のアミノ酸
2010530229.tif 000174
;SEQ ID NO: 155のアミノ酸
2010530229.tif 000175
;SEQ ID NO: 156のアミノ酸
2010530229.tif 000176
;SEQ ID NO: 157のアミノ酸
2010530229.tif 000177
;SEQ ID NO: 158のアミノ酸
2010530229.tif 000178
;SEQ ID NO: 159のアミノ酸
2010530229.tif 000179
;SEQ ID NO: 160のアミノ酸
2010530229.tif 000180
;SEQ ID NO: 161のアミノ酸
2010530229.tif 000181
;SEQ ID NO: 162のアミノ酸
2010530229.tif 000182
;SEQ ID NO: 163のアミノ酸
2010530229.tif 000183
;SEQ ID NO: 164のアミノ酸
2010530229.tif 000184
;SEQ ID NO: 165のアミノ酸
2010530229.tif 000185
;SEQ ID NO: 166のアミノ酸
2010530229.tif 000186
;SEQ ID NO: 167のアミノ酸
2010530229.tif 000187
;SEQ ID NO: 168のアミノ酸
2010530229.tif 000188
;SEQ ID NO: 169のアミノ酸
2010530229.tif 000189
;SEQ ID NO: 170のアミノ酸
2010530229.tif 000190
;SEQ ID NO: 171のアミノ酸
2010530229.tif 000191
;SEQ ID NO: 172のアミノ酸
2010530229.tif 000192
;SEQ ID NO: 173のアミノ酸
2010530229.tif 000193
;SEQ ID NO: 174のアミノ酸
2010530229.tif 000194
;SEQ ID NO: 175のアミノ酸
2010530229.tif 000195
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からなる群より選択される、
少なくとも1つのコアアミノ酸配列を含む抗原。
【請求項８】
前記抗原が、
a)1〜50個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜30個、さらにより好ましくは多くとも1〜25個、さらにより好ましくは多くとも1〜10個、最も好ましくは1個、2個、3個、4個、もしくは5個のさらなるアミノ酸残基;および/または
b)コアアミノ酸配列と非相同の少なくとも1個のさらなるアミノ酸残基
からさらになり、
特に、該さらなるアミノ酸残基が、該コアアミノ酸配列のN末端に隣接するか、C末端に隣接するか、またはN末端とC末端とに隣接し、かつ/あるいは
特に、該抗原が、請求項7において定義された、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個のコアアミノ酸配列を含む、
請求項7記載の抗原。
【請求項９】
請求項1または2において定義された核酸分子を発現させる工程を含む、請求項4〜8のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を作製する方法。
【請求項１０】
ワクチンであることが好ましく、
請求項4〜8のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは請求項1または2において定義された核酸分子、あるいは請求項3において定義されたベクターを含む、
薬学的組成物。
【請求項１１】
a)ワクチンとして使用するための、
b)クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の、
c)特に、免疫賦活物質が、ポリカチオンポリマーおよび免疫賦活性デオキシヌクレオチドの組み合わせ、または少なくとも2個のLysLeuLysモチーフを含有するペプチドおよび免疫賦活性デオキシヌクレオチドの組み合わせ、好ましくは、KLKLLLLLKLKおよびオリゴ(dIdC) 13の組み合わせのどちらかであり、かつ/または
特に、ポリカチオンペプチドがポリアルギニンである、
該免疫賦活物質、好ましくは、ポリカチオンポリマー、特に、該ポリカチオンペプチド、免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)、特に、オリゴ(dIdC) 13、少なくとも2個のLysLeuLysモチーフを含有するペプチド、特に、ペプチドKLKLLLLLKLK、神経刺激性化合物、特に、ヒト成長ホルモン、ミョウバン、フロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバント、またはその組み合わせ
をさらに含むことを特徴とする、
請求項10記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
特に、
a)抗体がモノクローナル抗体であり、
b)有効部分が、Fabフラグメント、F(ab)フラグメント、F(ab)Nフラグメント、F(ab) 2フラグメント、またはFvフラグメントを含み、
c)該抗体がキメラ抗体であり、
d)該抗体がヒト化抗体であり、かつ/もしくは
e)該抗体がIgA抗体である、
医用薬剤として使用するための、かつ/または
f)クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の、
請求項4〜8のいずれか一項において定義された、抗原またはその断片、好ましくは、その活性断片もしくはその変種、好ましくは、その活性変種の少なくとも選択部分に結合する、抗体または少なくともその有効部分。
【請求項１３】
請求項12において定義された抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項１４】
以下の工程を特徴とする、請求項12において定義された抗体を作製する方法:
a)請求項4〜8のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を非ヒト動物に投与することによって、非ヒト動物において免疫応答を開始する工程、
b)該動物から、抗体含有体液を取り出す工程、および
c)該抗体含有体液をさらなる精製工程に供することによって、抗体を作製する工程。
【請求項１５】
以下の工程を特徴とする、請求項12において定義された抗体を作製する方法:
a)請求項4〜8のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を非ヒト動物に投与することによって、非ヒト動物において免疫応答を開始する工程、
b)該動物から、脾臓または脾臓細胞を取り出す工程、
c)該脾臓または脾臓細胞のハイブリドーマ細胞を作製する工程、
d)該抗原またはその活性断片もしくは活性変種に特異的なハイブリドーマ細胞を選択およびクローニングする工程、
e)クローニングされた該ハイブリドーマ細胞を培養することによって抗体を作製する工程、ならびに
f)任意で、さらなる精製工程を行う工程。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９１】
本発明は、以下の図面、表、実施例および配列表によってさらに説明され、これらからさらなる特徴、態様、および利点を理解することができる。本実施例は例示に過ぎず、開示を限定するものではないことが理解されると思われる。
[請求項101]
抗原またはその断片をコードする単離された核酸分子であって、
以下からなる群より選択される、核酸配列を含む単離された核酸分子:
a)SEQ ID NO: 1-98を含む群より選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸分子、
b)a)の核酸分子に相補的な核酸分子、
c)a)またはb)の核酸分子の少なくとも15個の連続した塩基を含む核酸分子、
d)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、a)、b)、またはc)の核酸分子にアニーリングする核酸分子、
e)遺伝暗号の縮重がなければ、a)、b)、c)またはd)において定義された核酸分子にハイブリダイズする核酸分子。
[請求項102]
SEQ ID NO: 1-98との配列同一性が、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、もしくは99%、または最も好ましくは100%である、請求項101記載の単離された核酸分子。
[請求項103]
核酸がDNAである、請求項101または102のいずれか一項記載の核酸分子。
[請求項104]
核酸がRNAである、請求項101または102のいずれか一項記載の核酸分子。
[請求項105]
ゲノムDNA、好ましくはクラミジア属(Chlamydia)の種に由来する、より好ましくはC.ニューモニエ(C.pneumoniae)、C.トラコマティス(C.trachomatis)、C.シタッシ(C.psittaci)、C.ペコラム(C.pecorum)、C.ムリダルム(C.muridarum)、またはC.スイス(C.suis) に由来する、最も好ましくはC.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシに由来するゲノムDNAから単離された、請求項101〜103のいずれか一項記載の単離された核酸分子。
[請求項106]
コードされる抗原断片が、その活性断片または活性変種である、請求項101〜105のいずれか一項記載の核酸分子。
[請求項107]
クラミジア属に由来する、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスに由来する、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシに由来するポリペプチドもしくはペプチド断片を含むか、またはこのようなポリペプチドもしくはペプチド断片からなる抗原またはその断片をコードする、請求項101〜106のいずれか一項記載の核酸分子。
[請求項108]
請求項101〜107のいずれか一項記載の核酸分子を含む、ベクター。
[請求項109]
請求項101〜107のいずれか一項において定義された核酸分子によってコードされる抗原またはその断片の組換え発現用に適合された、請求項108記載のベクター。
[請求項110]
請求項108または109において定義されたベクターを含む、宿主細胞。
[請求項111]
クラミジア属に感染しているヒトに由来する、またはクラミジア属に以前に感染したことのある非感染健常ヒトに由来する血清と免疫学的に反応する抗原であって、
クラミジア属に由来する、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスに由来する、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシに由来する単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種を含むか、あるいはこのような単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種からなる、抗原。
[請求項112]
SEQ ID NO: 99-196からなる群より選択される単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種を含むか、あるいはこのような単離されたポリペプチドまたはその活性断片もしくは活性変種からなる、抗原。
[請求項113]
ポリペプチドが、請求項101〜107のいずれか一項において定義された核酸分子によってコードされる、請求項111または112記載の抗原。
[請求項114]
抗原の活性断片が、前記ポリペプチドの、特に、SEQ ID NO: 99-196の、いずれかによって定義されるポリペプチドの少なくとも50%、特に少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、96%、97%、または98%、最も好ましくは99%からなる、請求項111〜113のいずれか一項記載の抗原。
[請求項115]
抗原の活性変種が、前記ポリペプチドと、特に、SEQ ID NO: 99-196のいずれかによって定義されるポリペプチドと、少なくとも50%、特に少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、96%、97%、または98%、最も好ましくは99%の配列同一性を有する、請求項111〜114のいずれか一項記載の抗原。
[請求項116]
抗原の活性断片が、SEQ ID NO: 123のアミノ酸2-872、SEQ ID NO: 124のアミノ酸2-812、SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514または516-1090、SEQ ID NO: 127のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 128のアミノ酸2-324、SEQ ID NO: 130のアミノ酸2-235、SEQ ID NO: 131のアミノ酸2-792、SEQ ID NO: 132のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245、SEQ ID NO: 138のアミノ酸2-393、SEQ ID NO: 139のアミノ酸2-237、SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620、SEQ ID NO: 155のアミノ酸2-287、SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231、SEQ ID NO: 157のアミノ酸2-550、SEQ ID NO: 165のアミノ酸2-644、SEQ ID NO: 168のアミノ酸2-343、SEQ ID NO: 170のアミノ酸2-325、SEQ ID NO: 171の2-458、もしくはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379を含むか、またはこのようなアミノ酸からなる、請求項114記載の抗原。
[請求項117]
抗原の活性変種が、SEQ ID NO: 123のアミノ酸2-872、SEQ ID NO: 124のアミノ酸2-812、SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514または516-1090、SEQ ID NO: 127のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 128のアミノ酸2-324、SEQ ID NO: 130のアミノ酸2-235、SEQ ID NO: 131のアミノ酸2-792、SEQ ID NO: 132のアミノ酸2-252、SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245、SEQ ID NO: 138のアミノ酸2-393、SEQ ID NO: 139のアミノ酸2-237、SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620、SEQ ID NO: 155のアミノ酸2-287、SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231、SEQ ID NO: 157のアミノ酸2-550、SEQ ID NO: 165のアミノ酸2-644、SEQ ID NO: 168のアミノ酸2-343、SEQ ID NO: 170のアミノ酸2-325、SEQ ID NO: 171の2-458、またはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379と、少なくとも50%、特に少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、96%、97%、または98%、最も好ましくは99%の配列同一性を有する、請求項116記載の抗原。
[請求項118]
a)SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514からなる抗原の活性断片に対する、1〜570個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは、1〜500個、1〜400個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、もしくは1〜150個、さらにより好ましくは1〜100個、さらにより好ましくは1〜50個、最も好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、もしくは40個のさらなるアミノ酸残基、または
b)SEQ ID NO: 125のアミノ酸516-1090を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 125のアミノ酸516-1090からなる抗原の活性断片に対する、1〜510個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1〜400個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、もしくは1〜150個、さらにより好ましくは1〜100個、さらにより好ましくは1〜50個、最も好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、もしくは40個のさらなるアミノ酸残基、または
c)SEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379からなる抗原の活性断片に対する、1〜25個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、もしくは20個のさらなるアミノ酸残基、または
d)SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231からなる抗原の活性断片に対する、1〜20個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1個、2個、3個、4個、5個、10個、もしくは15個のさらなるアミノ酸残基、または
e)SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620からなる抗原の活性断片に対する、1〜10個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、もしくは9個のさらなるアミノ酸残基、または
f)SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245を含む抗原の活性断片に対する、もしくはSEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245からなる抗原の活性断片に対する、1〜5個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1個、2個、3個、もしくは4個のさらなるアミノ酸残基
によってさらに定義される、請求項116〜117のいずれか一項記載の抗原。
[請求項119]
抗原と非相同の少なくとも1個のアミノ酸残基、好ましくはマーカータンパク質をさらに含むか、またはこのようなアミノ酸残基、好ましくはマーカータンパク質からさらになる、請求項111〜118のいずれか一項記載の抗原。
[請求項120]
さらなるアミノ酸残基が、抗原のN末端に隣接するか、抗原のC末端に隣接するか、または抗原のN末端とC末端とに隣接する、請求項118または119記載の抗原。
[請求項121]
さらなるアミノ酸残基が、
a)SEQ ID NO: 125のアミノ酸2-514もしくはそのC末端に由来する変種、あるいは
b)SEQ ID NO: 125のアミノ酸516-1090、SEQ ID NO: 135のアミノ酸8-245、SEQ ID NO: 140のアミノ酸16-620、SEQ ID NO: 156のアミノ酸27-231、もしくはSEQ ID NO: 172のアミノ酸31-379、またはそのN末端に由来する変種
によって定義される抗原に隣接する、請求項118〜120のいずれか一項記載の抗原。
[請求項122]
リーダー配列もしくは分泌配列、精製に用いられる配列、またはプロタンパク質配列をさらに含むか、あるいはこのような配列からさらになる、請求項111〜121のいずれか一項記載の抗原。
[請求項123]
少なくとも1つのコアアミノ酸配列が、表1の「推定された免疫原性アミノ酸」または「推定されたクラスII制限T細胞エピトープ/領域」または「特定された免疫原領域の位置(aa)」の列において示され、
より好ましくは、該コアアミノ酸配列が、以下:
SEQ ID NO: 123のアミノ酸
2010530229.tif 000196
;SEQ ID NO: 124のアミノ酸
2010530229.tif 000197
;SEQ ID NO: 125のアミノ酸
2010530229.tif 000198
;SEQ ID NO: 126のアミノ酸
2010530229.tif 000199
;SEQ ID NO: 127のアミノ酸
2010530229.tif 000200
;SEQ ID NO: 128のアミノ酸
2010530229.tif 000201
;SEQ ID NO: 129のアミノ酸
2010530229.tif 000202
;SEQ ID NO: 130のアミノ酸
2010530229.tif 000203
;SEQ ID NO: 131のアミノ酸
2010530229.tif 000204
;SEQ ID NO: 132のアミノ酸
2010530229.tif 000205
;SEQ ID NO: 133のアミノ酸
2010530229.tif 000206
;SEQ ID NO: 134のアミノ酸
2010530229.tif 000207
;SEQ ID NO: 135のアミノ酸
2010530229.tif 000208
;SEQ ID NO: 136のアミノ酸
2010530229.tif 000209
;SEQ ID NO: 137のアミノ酸
2010530229.tif 000210
;SEQ ID NO: 138のアミノ酸
2010530229.tif 000211
;SEQ ID NO: 139のアミノ酸
2010530229.tif 000212
;SEQ ID NO: 140のアミノ酸
2010530229.tif 000213
;SEQ ID NO: 141のアミノ酸
2010530229.tif 000214
;SEQ ID NO: 142のアミノ酸
2010530229.tif 000215
;SEQ ID NO: 143のアミノ酸
2010530229.tif 000216
;SEQ ID NO: 144のアミノ酸
2010530229.tif 000217
;SEQ ID NO: 145のアミノ酸
2010530229.tif 000218
;SEQ ID NO: 146のアミノ酸
2010530229.tif 000219
;SEQ ID NO: 147のアミノ酸
2010530229.tif 000220
;SEQ ID NO: 148のアミノ酸
2010530229.tif 000221
;SEQ ID NO: 149のアミノ酸
2010530229.tif 000222
;SEQ ID NO: 150のアミノ酸
2010530229.tif 000223
;SEQ ID NO: 151のアミノ酸
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;SEQ ID NO: 152のアミノ酸
2010530229.tif 000225
;SEQ ID NO: 153のアミノ酸
2010530229.tif 000226
;SEQ ID NO: 154のアミノ酸
2010530229.tif 000227
;SEQ ID NO: 155のアミノ酸
2010530229.tif 000228
;SEQ ID NO: 156のアミノ酸
2010530229.tif 000229
;SEQ ID NO: 157のアミノ酸
2010530229.tif 000230
;SEQ ID NO: 158のアミノ酸
2010530229.tif 000231
;SEQ ID NO: 159のアミノ酸
2010530229.tif 000232
;SEQ ID NO: 160のアミノ酸
2010530229.tif 000233
;SEQ ID NO: 161のアミノ酸
2010530229.tif 000234
;SEQ ID NO: 162のアミノ酸
2010530229.tif 000235
;SEQ ID NO: 163のアミノ酸
2010530229.tif 000236
;SEQ ID NO: 164のアミノ酸
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;SEQ ID NO: 165のアミノ酸
2010530229.tif 000238
;SEQ ID NO: 166のアミノ酸
2010530229.tif 000239
;SEQ ID NO: 167のアミノ酸
2010530229.tif 000240
;SEQ ID NO: 168のアミノ酸
2010530229.tif 000241
;SEQ ID NO: 169のアミノ酸
2010530229.tif 000242
;SEQ ID NO: 170のアミノ酸
2010530229.tif 000243
;SEQ ID NO: 171のアミノ酸
2010530229.tif 000244
;SEQ ID NO: 172のアミノ酸
2010530229.tif 000245
;SEQ ID NO: 173のアミノ酸
2010530229.tif 000246
;SEQ ID NO: 174のアミノ酸
2010530229.tif 000247
;SEQ ID NO: 175のアミノ酸
2010530229.tif 000248
;SEQ ID NO: 176のアミノ酸4-14;SEQ ID NO: 177のアミノ酸18-35、47-55、65-82、106-112、および117-140;SEQ ID NO: 178のアミノ酸15-38;SEQ ID NO: 179のアミノ酸31-48、および50-55;SEQ ID NO: 181のアミノ酸6-14;SEQ ID NO: 182のアミノ酸4-10;SEQ ID NO: 183のアミノ酸9-18、および21-30;SEQ ID NO: 184のアミノ酸4-13、31-39、56-74、76-83、および85-91;SEQ ID NO: 185のアミノ酸8-32、38-49、および57-66;SEQ ID NO: 186のアミノ酸4-19、および25-31;SEQ ID NO: 187のアミノ酸1-9、17-25、38-49、および52-58;SEQ ID NO: 188のアミノ酸4-16、および20-27;SEQ ID NO: 189のアミノ酸20-26、および32-41;SEQ ID NO: 190のアミノ酸4-15、21-41、45-55、63-92、および105-123;SEQ ID NO: 192のアミノ酸4-17、および19-25;SEQ ID NO: 193のアミノ酸5-31、および33-50;SEQ ID NO: 194のアミノ酸10-17;SEQ ID NO: 195のアミノ酸4-21、および52-69;SEQ ID NO: 196のアミノ酸11-29;SEQ ID NO: 123のアミノ酸48-59、267-277、452-467、497-512、および659-673;SEQ ID NO: 124のアミノ酸315-326、428-442、741-756、および789-808;SEQ ID NO: 125のアミノ酸24-38、108-123、599-620、775-788、および939-949;SEQ ID NO: 126のアミノ酸17-30、40-59、71-83、93-113、216-231、260-277、371-385、および392-404;SEQ ID NO: 127のアミノ酸3-37、42-52、58-67、72-83、94-114、123-137、142-160、197-209、および218-250;SEQ ID NO: 128のアミノ酸7-22、24-35、78-93、97-110、124-136、162-176、193-209、213-225、および230-239;SEQ ID NO: 129のアミノ酸12-27、125-138、190-202、260-277、および394-417;SEQ ID NO: 130のアミノ酸9-21、26-37、49-63、84-97、107-120、127-137、142-154、197-208、および223-235;SEQ ID NO: 131のアミノ酸526-543、609-624、654-673、および682-699;SEQ ID NO: 132のアミノ酸7-25、45-63、91-122、173-183、および216-227;SEQ ID NO: 133のアミノ酸1-11、30-43、70-86、142-150、192-207、および217-229;SEQ ID NO: 134のアミノ酸428-440、561-572、859-870、919-930、および1055-1067;SEQ ID NO: 135のアミノ酸12-25、44-60、72-88、97-117、145-158、178-201、および211-221;SEQ ID NO: 136のアミノ酸6-26、1430-1441、および1648-1666;SEQ ID NO: 137のアミノ酸84-94、113-125、141-152、331-342、716-728、および743-763;SEQ ID NO: 138のアミノ酸17-27、110-120、166-179、220-234、251-262、282-294、322-339、354-366、および379-387;SEQ ID NO: 139のアミノ酸5-25、34-51、115-125、140-152、166-181、191-201、および215-233;SEQ ID NO: 140のアミノ酸20-31、159-177、235-244、362-371、および444-454;SEQ ID NO: 141のアミノ酸8-23、122-130、289-300、289-300、336-345、388-398、および590-614;SEQ ID NO: 142のアミノ酸84-97、141-152、181-189、318-328、439-447、498-512、656-668、および819-828;SEQ ID NO: 143のアミノ酸3-17、53-72、187-199、452-465、468-483、および592-601;SEQ ID NO: 144のアミノ酸7-21、74-84、91-101、119-130、363-372、および387-396;SEQ ID NO: 145のアミノ酸2-13、542-552、627-637、652-660、および798-807;SEQ ID NO: 146のアミノ酸7-23、173-185、530-540、および726-734;SEQ ID NO: 147のアミノ酸10-24、1065-1079、1101-1110、および1141-1156;SEQ ID NO: 148のアミノ酸80-90、212-221、233-243、286-296、356-367、531-541、および859-869;SEQ ID NO: 149のアミノ酸3-14、31-45、51-69、70-91、152-165、257-268、および299-311;SEQ ID NO: 150のアミノ酸42-51、62-75、79-88、264-276、336-353、および398-406;SEQ ID NO: 151のアミノ酸17-32、44-70、89-103、122-133、および150-165;SEQ ID NO: 152のアミノ酸4-13、23-40、61-74、169-191、203-212、および289-297;SEQ ID NO: 153のアミノ酸3-20、48-59、75-83、および104-122;SEQ ID NO: 154のアミノ酸191-200、276-285、307-321、523-535、568-577、721-729、および772-780;SEQ ID NO: 155のアミノ酸6-17、79-88、98-107、125-137、159-167、173-191、および267-276;SEQ ID NO: 156のアミノ酸6-27、36-45、147-157、および172-197;SEQ ID NO: 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からなる群より選択される、
少なくとも1つのコアアミノ酸配列を含む抗原。
[請求項124]
a)1〜50個のさらなるアミノ酸残基、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜30個、さらにより好ましくは多くとも1〜25個、さらにより好ましくは多くとも1〜10個、最も好ましくは1個、2個、3個、4個、もしくは5個のさらなるアミノ酸残基;および/または
b)コアアミノ酸配列と非相同の少なくとも1個のさらなるアミノ酸残基
からさらになる、請求項123記載の抗原。
[請求項125]
さらなるアミノ酸残基が、コアアミノ酸配列のN末端に隣接するか、C末端に隣接するか、またはN末端とC末端とに隣接する、請求項124記載の抗原。
[請求項126]
請求項123において定義された、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個のコアアミノ酸配列を含む、請求項123〜125のいずれか一項記載の抗原。
[請求項127]
請求項101〜107のいずれか一項において定義された核酸分子を発現させる工程を含む、請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を作製する方法。
[請求項128]
適切な宿主細胞を、請求項108または109において定義されたベクターで形質転換またはトランスフェクトする工程を含む、請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を発現する細胞を作製する方法。
[請求項129]
抗原またはその活性断片もしくは活性変種が、クラミジア属、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシから単離される、請求項127または128のいずれか一項記載の方法。
[請求項130]
ワクチンであることが好ましく、
請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは請求項101〜107のいずれか一項において定義された核酸分子、あるいは請求項108〜109のいずれか一項において定義されたベクターを含む、
薬学的組成物。
[請求項131]
ワクチンであることが好ましく、
クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の、請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは請求項101〜107のいずれか一項において定義された核酸分子、あるいは請求項108〜109のいずれか一項において定義されたベクターを含む、
薬学的組成物。
[請求項132]
免疫賦活物質、好ましくは、ポリカチオンポリマー、特に、ポリカチオンペプチド、免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)、特に、オリゴ(dIdC) 13、少なくとも2個のLysLeuLysモチーフを含有するペプチド、特に、ペプチド
2010530229.tif 000249
、神経刺激性化合物、特に、ヒト成長ホルモン、ミョウバン、フロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバント、またはその組み合わせをさらに含むことを特徴とする、請求項130または131記載の薬学的組成物。
[請求項133]
免疫賦活物質が、ポリカチオンポリマーおよび免疫賦活性デオキシヌクレオチドの組み合わせ、または少なくとも2個のLysLeuLysモチーフを含有するペプチドおよび免疫賦活性デオキシヌクレオチドの組み合わせ、好ましくは、
2010530229.tif 000250
およびオリゴ(dIdC) 13の組み合わせのどちらかである、請求項132記載の薬学的組成物。
[請求項134]
ポリカチオンペプチドがポリアルギニンである、請求項132または133記載の薬学的組成物。
[請求項135]
クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の、請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは請求項101〜107のいずれか一項において定義された核酸分子、あるいは請求項108〜109のいずれか一項において定義されたベクター。
[請求項136]
特に、クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の薬学的組成物を調製するための、請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、請求項101〜107のいずれか一項において定義された核酸分子、あるいは請求項108〜109のいずれか一項において定義されたベクターの使用。
[請求項137]
請求項111〜126のいずれか一項において定義された、抗原またはその断片、好ましくは、その活性断片もしくはその変種、好ましくは、その活性変種の少なくとも選択部分に結合する、抗体または少なくともその有効部分。
[請求項138]
モノクローナル抗体である、請求項137記載の抗体。
[請求項139]
有効部分が、Fabフラグメント、F(ab)フラグメント、F(ab)Nフラグメント、F(ab) 2フラグメント、またはFvフラグメントを含む、請求項137または138記載の抗体。
[請求項140]
キメラ抗体である、請求項137〜139のいずれか一項記載の抗体。
[請求項141]
ヒト化抗体である、請求項137〜140のいずれか一項記載の抗体。
[請求項142]
IgA抗体である、請求項137〜141のいずれか一項記載の抗体。
[請求項143]
請求項137〜142のいずれか一項において定義された抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株。
[請求項144]
以下の工程を特徴とする、請求項137〜142のいずれか一項において定義された抗体を作製する方法:
a)請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を非ヒト動物に投与することによって、非ヒト動物において免疫応答を開始する工程、
b)該動物から、抗体含有体液を取り出す工程、および
c)該抗体含有体液をさらなる精製工程に供することによって、抗体を作製する工程。
[請求項145]
以下の工程を特徴とする、請求項137〜142のいずれか一項において定義された抗体を作製する方法:
a)請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を非ヒト動物に投与することによって、非ヒト動物において免疫応答を開始する工程、
b)該動物から、脾臓または脾臓細胞を取り出す工程、
c)該脾臓または脾臓細胞のハイブリドーマ細胞を作製する工程、
d)該抗原またはその活性断片もしくは活性変種に特異的なハイブリドーマ細胞を選択およびクローニングする工程、
e)クローニングされた該ハイブリドーマ細胞を培養することによって抗体を作製する工程、ならびに
f)任意で、さらなる精製工程を行う工程。
[請求項146]
請求項137〜142のいずれか一項記載の抗体を含む、薬学的組成物。
[請求項147]
クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の、請求項137〜142のいずれか一項記載の抗体、または請求項137〜142のいずれか一項記載の抗体を含む薬学的組成物。
[請求項148]
クラミジア属による、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイスによる、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシによる感染症の治療用または予防用の薬学的組成物の調製のための、請求項137〜142のいずれか一項において定義された抗体の使用。
[請求項149]
以下の工程を含む、請求項111〜126のいずれか一項において定義された、抗原またはその活性断片もしくは活性変種に結合することができるアンタゴニストを特定する方法:
a)単離もしくは固定化された、請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種と候補アンタゴニストを、該候補アンタゴニストと該抗原またはその活性断片もしくは活性変種が結合する条件下、該候補アンタゴニストと該抗原またはその活性断片もしくは活性変種との結合に応答して検出可能なシグナルを発することができる成分の存在下で接触させる工程、および
b)該アンタゴニストと該抗原またはその活性断片もしくは活性変種との結合に応答して生じたシグナルの有無を検出する工程。
[請求項150]
以下の工程を含む、請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種と、その相互作用パートナーとの相互作用活性を低下または阻害することができるアンタゴニストを特定する方法:
a)請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を準備する工程、
b)該抗原またはその活性断片もしくは活性変種に対する相互作用パートナー、特に、請求項137〜142のいずれか一項記載の抗体を準備する工程、
c)該抗原またはその活性断片もしくは活性変種と該相互作用パートナーを相互作用させて、相互作用複合体を形成する工程、
d)候補アンタゴニストを準備する工程、
e)該候補アンタゴニストと相互作用複合体との間で競合反応を起こす工程、
f)該候補アンタゴニストが、抗原またはその活性断片もしくは活性変種と相互作用パートナーとの相互作用活性を阻害または低下するかどうか決定する工程。
[請求項151]
請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種の相互作用パートナーを単離および/または精製および/または特定するための、該抗原またはその活性断片もしくは活性変種の使用。
[請求項152]
以下の工程を含む、クラミジア属生物による感染症を診断する方法:
a)被験体から得られた試料と、請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種を接触させる工程;および
b)該試料中の、該クラミジア属生物に対する抗体の存在を検出する工程。
[請求項153]
以下の工程を含む、クラミジア属生物による感染症を診断する方法:
a)被験体から得られた試料と、請求項137〜142のいずれか一項記載の抗体を接触させる工程;および
b)該試料中の、該クラミジア属生物の抗原の存在を検出する工程。
[請求項154]
クラミジア属生物の抗原が、請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種である、請求項153記載の方法。
[請求項155]
前記抗体がIgA抗体である、請求項152〜154のいずれか一項記載の方法。
[請求項156]
以下の工程を含む、クラミジア属生物による感染症を診断する方法:
a)被験体から得られた試料と、請求項101〜107のいずれか一項において定義された核酸分子またはその断片に特異的なプライマーまたはプローブを接触させる工程、および
b)該試料中の、このような核酸分子またはその断片の存在を検出する工程。
[請求項157]
クラミジア属生物が、病原性クラミジア属生物、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシである、請求項152〜156のいずれか一項記載の方法。
[請求項158]
アプタマーおよびスピーゲルマーからなる群より選択される機能的核酸を調製するための、請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種の使用。
[請求項159]
リボザイム、アンチセンス核酸、およびsiRNAからなる群より選択される機能的リボ核酸を調製するための、請求項101〜107のいずれか一項において定義された核酸分子の使用。
[請求項160]
以下の工程を含む、動物またはヒトにおいて、好ましくはクラミジア属による感染症の治療を必要とする動物またはヒトにおいて、クラミジア属感染症を治療する方法:
治療的有効量の、請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは請求項101〜107のいずれか一項において定義された核酸分子、あるいは請求項108〜109のいずれか一項において定義されたベクター、あるいは請求項137〜142のいずれか一項において定義された抗体、あるいは請求項130〜134、146、または147のいずれか一項において定義された薬学的組成物を、該動物またはヒトに投与する工程。
[請求項161]
以下の工程を含む、クラミジア属生物による感染症に対して動物またはヒトを免疫化する方法:
該動物またはヒトにおいて免疫応答を誘発するのに適した有効量の、請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは請求項101〜107のいずれか一項において定義された核酸分子、あるいは請求項108〜109のいずれか一項において定義されたベクター、あるいは請求項137〜142のいずれか一項において定義された抗体、あるいは請求項130〜134、146、または147のいずれか一項において定義された薬学的組成物を、該動物またはヒトに投与する工程。
[請求項162]
以下の工程を含む、動物またはヒトにおいて、クラミジア属生物に対する免疫応答を刺激する方法:
該動物またはヒトにおいて免疫応答を刺激するのに適した有効量の、請求項111〜126のいずれか一項において定義された抗原またはその活性断片もしくは活性変種、あるいは請求項101〜107のいずれか一項において定義された核酸分子、あるいは請求項108〜109のいずれか一項において定義されたベクター、あるいは請求項137〜142のいずれか一項において定義された抗体、あるいは請求項130〜134、146、または147のいずれか一項において定義された薬学的組成物を、該動物またはヒトに投与する工程。
[請求項163]
クラミジア属生物が、好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、C.シタッシ、C.ペコラム、C.ムリダルム、またはC.スイス、より好ましくは、C.ニューモニエ、C.トラコマティス、またはC.シタッシである、請求項160〜162いずれか一項記載の方法。
【国際調査報告】
2010530229.tif 000251
2010530229.tif 000252
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