(57)【要約】  有機材料が除去された骨基質材料と、上記有機材料に代わる代用材料とを含む骨基質であり、上記骨基質は、単一の骨片から形成されていることを特徴とする。
2010511474.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機材料が除去された骨基質材料と、
上記有機材料に代わる代用材料とを含む骨基質であって、
上記骨基質が単一の骨片から形成されていることを特徴とする骨基質。
【請求項２】
上記骨基質材料が、海綿質骨を代替するために使用可能なタイプの骨基質材料である、請求項１に記載の骨基質。
【請求項３】
上記骨基質材料が生体骨である、請求項１または２に記載の骨基質。
【請求項４】
上記骨基質材料が牛の骨である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の骨基質材料。
【請求項５】
上記牛の骨が、ＢＳＥが発生していないことが保証された国から得られたものである、請求項４に記載の骨基質材料。
【請求項６】
上記骨基質材料が、実質的に０．８ｇ／ｃｍ３以上のかさ密度を有している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の骨基質材料。
【請求項７】
上記代用材料が、合成リン酸カルシウム、ポリカプロラクトン、合成ヒドロキシアパタイト、または、藻類由来のヒドロキシアパタイトから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨基質。
【請求項８】
上記代用材料が有機材料に基づく基質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨基質。
【請求項９】
上記代用材料が、ケラチン、グルコサミン、軟骨、コンドロイチン、ゼラチン、酸化セルロースもしくはキトサン、骨髄穿刺液、骨成長ホルモン、および、骨形態形成タンパク質のうち１つ以上の成分を含む、請求項８に記載の骨基質。
【請求項１０】
上記代用材料が上記骨全体に浸透されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の骨基質。
ａ）単一の骨基質材料片から元々含まれている有機材料を除去するステップと、
ｂ）上記処理された骨基質材料に代用材料の溶液を浸透させるステップと、を含む骨基質の生産方法であって、
ｃ）上記処理された骨材料の内部にて上記代用材料を硬化させるステップ、
を特徴とする方法。
【請求項１１】
元々含まれている有機材料の除去は、水性媒体中にて熱処理および圧力処理を介して行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
元々含まれている有機材料を除去する上記ステップが焼結を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記処理された骨基質材料に対する代用材料の浸透は、真空下において行われる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
硬化させるステップが、溶媒のエバポレーション、硬化剤の作用、および／または、加熱の結果として生じる、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
添付の実施例を参照して明細書中に実質的に記載されている、骨基質。
【請求項１６】
添付の実施例を参照して明細書中に実質的に記載されている、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、医療用調製物およびその製造方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
具体的には、本発明は移殖用の骨材料の調製物に関する。骨移殖片または代用骨を用いる最終目的は、新しい骨が必要な領域に、新しい骨を最終産物として生成する治癒反応を開始することであると理解されるべきである。
【０００３】
本明細書は、内部の海綿状の骨である海綿質骨に関連するものとして骨インプラントについて記載している。逆に、皮質骨は骨格質量の大部分を構成するとともに、構造骨である。
【０００４】
従来、チタン（および／またはアルミニウムやバナジウムなどの他の金属）を浸透させた骨インプラントが、皮質骨の欠損を代替するため、または、治癒を可能にする構造的支持を提供するために使用されていた。
【０００５】
しかし、特に、皮質骨の内部に適合する海綿質骨の類似物を使用する場合、海面質骨のインプラントの毒性に関して大きな懸念がある。
【０００６】
海綿質骨または皮質骨が損傷を受けた、または、欠損したとき、一般的に、骨または骨の欠損の外科的修復術の一環として骨移殖片が使用される。正確な多孔性および内部の細孔構造が、治癒、すなわち、体内での再生反応、を大幅に促進することが示されてきた。上記理由から、合成等価体ではなく、類似の構造を有し、骨に基づき作製したインプラントの使用が望ましい。
【０００７】
ある処置では、患者自身の身体から摘出された骨である自家骨を使用する。この選択肢に関して、一般的に、患者は２つの個別の外科的処置を受ける。すなわち、一つは、健康な骨を取り除く処置であり、もう一つは、損傷を受けた領域の中にそれを移殖する処置である。
【０００８】
自家骨は、患者との高い適合性を有するとともに、長期間の適合、そして、必要な強度および生物学的機能を有することから、理想的なインプラントである。特に、下記の利点を含む。
・優れた骨形成能
・迅速な骨形成を可能にする細胞の提供
・受容床による骨誘導を可能にし、受容床は、非骨性組織の細胞機能を変えるとともに、非骨性組織に骨形成を行わせること
・組織適合性の差異、または、免疫学的問題がないこと
・結合の容易性
・疾病伝播がないこと
・自家海綿質骨は、生きた骨細胞、コラーゲン、ミネラル、マトリクスタンパク質に起因する骨形成性、骨誘導性、骨伝導性、および、新しい骨が形成されるときに共に結合される、大きな骨梁の表面領域を有すること。
【０００９】
しかし、上記処置は、下記のような多数の制限を有する。
・付加的な切開、または、より広範囲に渡る暴露、長時間に及ぶ手術時間、ならびに、血液の損失および外傷の増大
・痛み、および、潜在的感染または変形による術後の罹患率の増大
・健常組織の犠牲、および、ドナー骨の弱体化
・深刻な合併症のリスク
・サイズ、形状、量および質における制限（特に子供に関して、供給は制限される）。
【００１０】
他の選択肢としては、死体骨の使用がある。死体骨とは、死亡し、自らの身体組織および器官の提供を選択した他のヒトから摘出された骨である。残念ながら、これらの骨に関しては、産物の供給および純度についての懸念がある。例えば、外科医またはドナーバンカーが、ＨＩＶ、癌、および肝炎などの骨内の潜在的疾患を見落とす可能性があり、さらに、それらが被移殖者に移る可能性がある。また、患者は、上記供給源からの骨を使用することに関して、心理的問題または宗教的問題を抱え得る。
【００１１】
多種多様な合成材料が市販されているが、（ヒトの骨に類似する）身体的特性を有し、疾病リスクがなく、生体適合性を有し、骨伝導性を有し、かつ、上記工程を介して利用可能な骨再生（骨誘導）の可能性を併せ持つものは殆どない。
【００１２】
合成製品の一例が、Ｖｉｔｏｓｓ（登録商標）ブロックである。これらは、in vitroで非常に溶解性の高い材料であるβリン酸三カルシウムから構成されており、この溶解性は望ましいものではない。上記材料は有用である一方で、生体骨が持つのと同様の構造的統合性を有していない。さらに、これらの製品は、生体骨と比較して製造に非常にコストがかかる。
【００１３】
合成製品の他の例は、Ｃｅｒａｂｏｎｅインプラント（登録商標）およびＥｎｄｏｂｏｎインプラント（登録商標）を含む。これらはＶｉｔｏｓｓ（登録商標）のように分解されることはなく、元の骨における細孔構造の相互接続を維持するという利点を有する。しかし、これらは骨インプラントとして使用される場合、やはり欠点を有する。例えば、これらは、自家骨インプラントによって提供される骨誘導性などの生物学的機能を有していない。
【００１４】
適切な海綿質骨インプラントを見出すための他の試みは、ＰＣＴ／ＧＢ１９８９／０１０２０に記載されている。上記特許明細書は、牛の骨を挽いてゼラチンと混ぜ、インプラントを生成するという工程を記載している。しかし、この製品は、体内の統合性、治癒、および、再生反応を促進する、生体骨の内部構造を維持していない。
【００１５】
さらに、骨を粉にし、その粉状の骨を再構成してインプラントにするステップは、時間およびコストがかかるものである。
【００１６】
加えて、複数の骨片を用いるということは、インプラントの強度が落ちるとともに、体内に統合させることがより困難であり、製造がより難しいということを意味する。
【００１７】
また、ゼラチンが必ずしもプリオンを含まない材料とは限らないので、ゼラチンの使用についても懸念材料である。
【００１８】
ＢＳＥの発生を鑑みると、プリオンを含まない材料の入手は、非常に重要である。上記理由から、入手の容易な供給源である生体骨材料（牛の骨）が、食肉産業からの「廃棄産物」として豊富にあるにもかかわらず、広く用いられることはなかった。牛の（および、おそらくは他の動物の）材料が使用され得るとすれば、従来技術における多数の問題、すなわち、十分な強度、構造、および体内における統合性を有しており、十分に骨と類似している材料を見出すという問題が解決され得る。
【００１９】
欧州特許第１３３８２９１は、インプラントに使用される骨基質を生成する試みにおいて、牛および豚の骨を用いる。しかし、ＰＣＴ／ＧＢ１９８９／０１０２０に開示されたように、上記特許は、骨を粉にして海綿を形成し、これをゼラチンと混ぜて、インプラント可能な海綿の塊を形成することに頼っている。繰り返し述べるが、この骨基質は、生体骨と同じ構造または強度を有していない。
【００２０】
本明細書中に引用されたあらゆる特許または特許出願を含む全ての文献は、参照することによって本明細書に組み込まれている。いずれかの文献が従来技術を構成することは認められない。文献に関する議論は、それらの著者の主張について言及しており、本出願人は、引用文献の正確性および妥当性に対して批判する権利を保持している。本明細書において、多数の先行技術文献について言及されているが、この言及によって、これらの文献のいずれかが、当該分野、ニュージーランド、または他のいずれかの国における共通の一般認識の一部を形成すると認めるものではないことが明白にわかるだろう。
【００２１】
用語「含む」（comprise）は、様々な権利範囲において、限定的または包括的な意味のいずれかに該当すると認められる。本明細書の目的のために、特に言及がなければ、用語「含む」は、包括的な意味を有する。すなわち、それが直接指している列挙された構成要素だけでなく、特定されていない構成要素または要素をも含むことを意味する。また、この論拠は、方法または工程における１つ以上のステップに関して、用語「含んだ（comprised）」または「含んでいる（comprising）」が使用されるときにも、用いられる。
【００２２】
本発明は、上述の問題に取り組むこと、または、少なくとも、公衆に有益な選択肢を提供することを目的とする。
【００２３】
本発明のさらなる形態および利点は、例示によってのみ示される以下の明細書から明らかとなるであろう。
【００２４】
〔本発明の開示〕
本発明の一形態により、
有機材料が除去された骨基質材料と、
上記有機材料に代わる代用材料とを含む骨基質であって、
上記骨基質材料が単一の骨片から形成されていることを特徴とする骨基質が提供される。
【００２５】
本発明の一形態により、下記のステップを含む骨基質の製造方法が提供される。
ａ）単一の骨基質材料から元々含まれている有機材料を除去するステップ
ｂ）上記処理された骨基質材料に代用材料の溶液を浸透させるステップ。
【００２６】
上記方法は、
ｃ）上記処理された骨材料の内部にて代用材料を硬化させるステップ
を特徴とする。
【００２７】
好ましい実施形態において、本発明の骨基質は、骨インプラントとして使用されてもよく、本明細書ではそのように言及する。
【００２８】
しかし、当業者であれば、本発明の骨基質を他の目的に使用できることが容易にわかるだろう。例えば、骨基質を他の構造における間隙を充填する（または、増量の）ために使用できる。
【００２９】
また、骨関連ではないが、上記材料は、眼のインプラントに使用するためにも成形できる。
【００３０】
好ましい実施形態において、骨基質材料は、身体内の海綿質骨を代用するために使用できるタイプであってもよい。しかし、当業者であれば、本発明が、ある例において皮質骨を代用するために使用されてもよいことがわかる。
【００３１】
好ましい実施形態において、骨基質材料は、生体骨であってもよく、本発明においてそのように言及する。
【００３２】
骨基質材料は、その独自の工程を介して、多数のマクロ孔、および、マクロ孔の空隙の間に相互接続された管を保持することを理解されたい。それによって、生体材料の中枢における細胞の迅速なコロニー化が可能となる。
【００３３】
適合された多孔質構造は、骨細胞によって分解可能であるとともに新しい骨に代替可能な骨の代用物を得るために必要である。
【００３４】
好ましい実施形態において、骨基質材料は海綿質骨であってもよい。
【００３５】
好ましい実施形態において、骨基質材料は、実質的に、または、０．８ｇ／ｃｍ３（立方体の物理次元を用いて、重量（立方体の重量）分析によって測定した）より大きいかさ密度を有していてもよい。
【００３６】
本発明者は、かさ密度の値が上記レベルを下回ると、焼結骨が内在性の機械的強度を殆ど有しないことを見出した。
【００３７】
好ましい実施形態において、骨基質材料は、豚、鹿、羊、および、ヒトの死体を含む様々な供給源から得られた骨であってもよい。
【００３８】
特に好ましい実施形態において、骨基質材料は牛から得られたものであってよく、本発明中においてそのように言及する。
【００３９】
牛の供給源から得られた骨基質材料を用いる一つの理由は、特に食肉処理場および動物／食肉処理工場からの豊富な供給があることにある。
【００４０】
牛から得られた骨を用いる他の大きな利点は、本発明の主要な形態が単一の骨片を用いてインプラントを生成するものだからである。
【００４１】
牛の骨は十分な大きさを有しており、その骨からサンプルを切断することができ、本発明に従って処理し、そして、大きさを決めて成形することができる。このとき、１個を上回る骨片を用いる必要がない。さらに、処理済みの余った骨の全てを空隙の充填物として使用することができる。
【００４２】
当業者であれば、有機材料を除去する処理、および、該有機材料を代用材料に代替する処理の前または後に、所望のインプラントサイズおよび形状になるまで、供給源の骨が切断および成形されてもよいことがわかる。
【００４３】
しかし、骨基質材料の供給源は制限として考えられるべきものではなく、一連の他の骨基質材料として、本発明に従って、例えば馬またはより大きい他の動物などを利用してもよい。
【００４４】
いくつかの骨インプラントは大きくなくてもよく、それゆえに、他の動物の供給源から骨基質材料を得られる可能性があることを理解すべきである。
【００４５】
牛の骨についての大きな問題は、多くの国において、狂牛病としても知られるＢＳＥ（牛海綿状脳症）が発生しているということである。この病気は、牛の製品から得られるプリオンというタンパク質の体内への摂取または導入によって、ヒトに取り込まれる。この疾病のヒト型は、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）として知られている。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態において、ニュージーランドおよびオーストラリアなどの、ＢＳＥが発生していないことが保証された国から骨基質を手に入れる。
ニュージーランドから得られる牛の骨は、ＢＳＥを含んでいない。ＢＳＥが発生していないことが保証された国から得られる牛の骨は、農業が盛んであること、および、牛の骨が食肉処理場および食肉処理工場の廃棄物として大量に存在することから、表面上は、相対的に廉価な材料である。
【００４７】
通常、牛の骨は下級の肥料として使用される。または、環境の中で処分されなければならない。
【００４８】
ＢＳＥが発生していないことが保証された国から得られる牛の骨は、大勢の群れおよび食肉処理工場から得られる。このことは、清潔でＢＳＥを含まない骨を供給するために「安全な」牛の群れを育てる必要がないことから、大きな利点である。
【００４９】
例えばヨーロッパやアメリカなどのＢＳＥ発生国から骨を得る場合、下記の欠点を含む数多くの欠点が存在する。
・使用の安全性を確保するために、骨材料の供給においてはるかに多くの注意が必要とされる。このため、必要な時間および労働力のためのコスト、ならびに、安全のためのコンプライアンスに要するコストが大幅に増大する。
・骨基質材料から有機材料を除去する上記ステップの間に、より一層の注意および品質管理が必要とされる。上記ステップが、骨材料が清潔でプリオンを含まないことを保証すべきであるが、骨がＢＳＥの発生が周知である国から得られた場合、より厳格な手続、検査、品質管理が必要となる。繰り返し述べるが、これによって生産コストが大幅に増大する。
【００５０】
また、廃棄物である骨材料の使用は、廃棄コストを下げる点、および、それまで捨てられていた廃棄物の量を減らす点において、好適である。
【００５１】
本発明者によると、骨の供給源に関わらず（供給源がヒト、牛などであっても）、プリオンを含む材料についてのあらゆる不安を和らげるためだけでなく、ＨＩＶ、癌および肝炎などの他の潜在的疾病を除去するためにも、骨内の有機材料の全てを除去すべきであることがわかった。
【００５２】
多くの方法によって有機材料を除去することができる。
【００５３】
本発明の一実施形態において、脂質有機材料におけるタンパク質の大半を除去するために、骨を水性媒体中にて加熱および加圧してもよい。
【００５４】
好ましい実施形態において、（熱および圧力によって処理された）骨は、さらに、残留するあらゆる有機材料を焼き尽くすために焼結されてもよい。
【００５５】
本発明者は、上記工程が効果的に骨を滅菌し、プリオンおよびその他の疾病を全く含まない産物を保証することを見出した。
【００５６】
上記は、有機材料の除去のみに好ましい方法であることを理解すべきである。
【００５７】
当業者であれば、骨基質材料から有機材料を除去するために、他の方法を使用してもよいことが容易に理解できるであろう。これらの方法は、これらの方法単独では十分な滅菌を実現できないと考えられるが、例えば、化学試薬または化学溶剤（例えば水酸化ナトリウム、過酸化水素、またはアセトンなど）を用いた処理などを含んでもよい。
【００５８】
有機物が除去された骨基質材料の含有物は、硬度がチョーク様であるものが多く、相応じて低強度であることがわかった。除去された有機材料の一部を形成するコラーゲンは、骨基質を強化するとともに、骨の成長のための構造を与えるものである。
【００５９】
（有機材料が除去された）骨は、必須の多孔構造を有する一方で、骨インプラントと、インプラントが挿入される身体の生理機能との容易な適合を可能にする内部材料を有していない。
【００６０】
したがって、本発明は、元々含まれている有機材料を代用材料に代替することを含む。
【００６１】
理想的には、代用材料は、自家骨の機能をある程度模倣する特性を有するものである。例えば、代用材料は骨基質に強度を与え、補強材としての機能を果たすものであってよい。代替的に、または、付加的に、代用材料は、自家骨と同様の生物学的機能を与えるものであってもよい。
【００６２】
これは、骨移殖片が機械的機能および生物学的機能という二元的な役割を果たすからである。初期段階においては、主に処置のために機械的強度が重要である。しかし、最終的には、被移殖者の骨への結合を可能にする生物活性が重要となる。
【００６３】
本発明に様々な代用材料を利用できる。これらは（β−リン酸三カルシウムなどの）合成リン酸カルシウム、合成ヒドロキシアパタイト、あるいは、藻類または珊瑚由来のヒドロキシアパタイトを含む。
【００６４】
リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト）由来の材料は、生体適合性があるとともに、骨への化学的結合を可能にすることが知られている。リン酸カルシウム由来の材料は、化学組成が骨のそれと類似しているので、ヒトの手術において骨修復材料として広く使用されている。これは、好ましい代用材料である。
【００６５】
リン酸カルシウムアパタイト（ＣＰＡ）は、その生体適合性から、最も重要な移殖可能な材料の一つとして知られる。生体骨は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）を約７０重量％および５０体積％含む、ＣＰＡである。
【００６６】
好ましい実施形態において、代用材料は、合成製品よりも優れた利点を多数有しているので、有機材料に基づく基質であってもよい。利点としては下記のものが含まれる。
第一に、有機基質は毒性の問題を孕む可能性が低い。
第二に、有機基質は、骨構造に対して付加的な強度を与える。
さらに、有機材料は、被移殖者の身体への骨の結合を可能にする、促進する、または、開始させる可能性がある。すなわち、身体が有機構造を分解して有機構造をコラーゲン線維に代替することができ、さらに、体内の骨インプラントの位置およびその全体の強度を向上させることができる。
【００６７】
本発明に使用可能な、多くの適切な有機基質材料が存在する。上記材料は（限定されないが）、下記を含む。
・羊毛由来のケラチン
・甲殻類、（サメの骨格などの）軟骨、および、時にはトウモロコシから得られるグルコサミン
・純粋な動物の軟骨から得られるコンドロイチン、または、
・動物由来のゼラチン
・（好ましくは自家の）骨髄穿刺液。
【００６８】
動物を供給源とする代用材料を用いる一つの問題は、最初に骨基質材料から元々含まれている有機材料を取り除くことによって除去された病気のいくつかを再導入するリスクがあることだと理解すべきである。これは、代用材料が陸生動物由来のものである場合、特に当てはまる。動物から得た補強材料を用いる場合、このことを考慮に入れる必要があり、無菌状態の材料が使用されていることを保証するために十分な検査を行う必要がある。補強材料が無菌であることを保証するための、補強材料に対する厳密な処理は、製造コストおよび骨基質製品のコストを増大させる可能性がある。
【００６９】
動物由来の補強材料、例えばサメ由来の材料を用いることに関する他の懸念は、それらが、体内に含む高レベルの重金属に関する毒性の問題を有し得るとともに、高レベルの重金属が患者に導入され得ることにある。
【００７０】
他の実施形態において、補強材料は、植物から抽出された、例えば酸化セルロースなどであってもよい。
【００７１】
また、好ましい実施形態において、代用材料は生理活性を有する材料であってもよいし、または、生理活性を有する材料を含むものであってもよい。すなわち、代用材料は、患者体内への骨基質の結合を開始させる、または、促進することができる。これにより、回復時間を大幅に低減することができ、インプラントの強度および統合性を増大させることができる。
【００７２】
代用材料は、例えば、その内部に多数の生理活性成分を含んでいてもよく、それによって、骨をより容易に体内に統合させることができ、および／または、骨形態形成タンパク質、骨および成長ホルモン、または、被移殖者の骨髄から得られた細胞のような自家細胞、などの骨の治癒を促進させることができる。
【００７３】
特に好ましい実施形態において、好ましい有機材料は、甲殻類の殻由来のキトサンであり得る。
【００７４】
キトサンは、生分解性であり、コラーゲン線維に代替することができる生理活性を有すると考えられているため、本発明に特に適している。
【００７５】
他の実施形態において、代用材料は合成材料であってもよい。適切な合成材料の一例は、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）であり、これは、原油の化学合成から得られる、生分解可能な熱可塑性ポリマーである。この材料は合成材料であるが、頭蓋骨の穴の修復においてチタンの代わりに既に使用されており、骨に適合することが知られているという利点がある。
【００７６】
他の代替的な実施形態において、代用材料は、上述の成分の組合せ、または、上述の成分のうちの一つ（またはそれ以上）と他の生体適合性を有する成分との組合せであってもよい。
【００７７】
本発明の重要な形態は、連結強度、生体適合性、および、処理特性のため、単一の骨片を使用して骨基質（インプラント）を製造することにある。
【００７８】
しかし、より大きな骨片を使用することに関する固有の問題があり、発明者は、本発明を実施するためにその問題を克服する必要がある。
【００７９】
従来技術において使用されていたもの（それらは通常粉砕された骨を使用している）より大きい骨片を用いることに関する主な問題点は、生体骨の構造全体に代用材料を浸透させる必要があることである。
【００８０】
この浸透は、従来技術において使用されている粉砕された骨片に関しては、自然な拡散作用と、孔への接触可能性がより大きいこととの結果として、比較的容易に達成される。
【００８１】
しかし、代用材料が相対的に大きい骨片内および生体骨の構造という相対的に長い距離を移動しなければならないため、完全な浸透および所望の強度を得ることが難しく、また、骨全体の不純物を洗い流すことも困難になる。
【００８２】
上記問題を解決する方法として、代用材料の粘度を下げ、代用材料が多孔質の骨構造に、より容易に流入できるようにすることが挙げられる。しかし、これは強度の低下を招き得るとともに、代用材料が骨から流出し得る。
【００８３】
したがって、本発明の或る実施形態によると、骨内の補強材料を硬化させるステップを提供する。
【００８４】
本明細書中に使用される用語「硬化させる」は、代用材料が骨内に確実に定着できるようにするあらゆる工程を指すために用いられることを理解すべきである。
【００８５】
したがって、「硬化」工程は、代用材料が骨における多孔質構造に浸透した後で、代用材料の粘度を変化させる工程であり得る。
【００８６】
硬化工程は、注入される材料に応じて、様々な手段によって達成され得る。
【００８７】
例えば、一実施形態において、代用材料が骨内に十分に速く注入され、材料が定着／硬化するまでに骨に浸透するように、真空工程が使用されてもよい。
【００８８】
代用材料の定着は、例えば、溶媒のエバポレーション、硬化剤の作用、および／または熱処理の結果であり得る。
【００８９】
本発明が従来技術よりも優れた利点を多数有することは、明らかである。この利点とは、下記を含む。
・自家骨を使用する必要性がない点、自家骨使用に伴う慢性疾患などの問題を回避する点、および、多くの場合、摘出手術による痛み、血液の損失、感染の可能性、長期間の入院および治癒にかかる時間を低減させる点である。また、第二手術は、財務上のコストを大幅に増大させる。本発明は、第二の手術部位を必要としない。
・体内での治癒および再生反応を促進するために必要な、正確な多孔性および内部細孔を維持する。また、骨基質内において組織が内部成長するために必要な組織構造が存在しているので、人工的な工程を介して組織を生成させる必要性がなくなる。
・同種移殖片は第二手術の必要性を排除するが、移殖された骨が被移殖者の骨と適合しない可能性があり、最終的には拒絶される可能性がある。また、同種移殖片は、ＡＩＤＳまたは肝炎を含む様々なウイルスを患者に導入するという、可能性は低いが厄介なリスクを孕んでいる。同種移殖片は、無菌製品を保証するために本発明に従って処理され得る。また、牛の骨から得られた骨基質についても無菌である。
・少なくとも下記の用途において使用される。
‐人工股関節全置換術における欠損充填
‐脊椎固定術
‐手および足の外科手術
‐単純骨折および複雑骨折の修復
‐関節の再構成
‐非癒合または偽関節、関節固定術および骨切術
‐補綴再生手術
‐脊椎融合術
‐嚢胞治療
‐患肢救済術。
・単一の骨を破壊して組み立て直す必要がないので、処理時間が短い。
・疾病を含まないインプラントである。本発明の骨基質は、病原菌およびプリオンを含まないことを保証できるものであり、これは、インプラントを受容するエンドユーザにとって望ましく、流通可能な特性である。
・被移殖者の体内における所望の強度および統合性を有する。
・骨内の材料を硬化させる過程によって、上述の利点の全てを有する、より大きい骨片を使用することができる。
・修正を加えていない焼結骨産物とは対照的に、骨基質構造内に補強材料を浸透させることによって、強化がもたらされると推定される。
・牛の骨は、ニュージーランドにおいて、ＢＳＥを含まない大群の牛から容易に、かつ、比較的廉価で手に入る。
・骨基質は、あらゆる有害なタンパク性成分が燃え尽きてプリオン伝染のリスクをゼロにするように処理（例えば焼結）される。
・有機材料は、天然由来の成分（例えばキトサン）に代替される。したがって、骨基質に、牛、ヒトまたは他のＣＪＤ認知症を発症しやすい哺乳類のコラーゲン（プリオンの潜在的供給源）が再浸透することがない。
・生理活性成分の使用を介して代用骨の結合を強める。
・したがって、上記工程は、プリオンを含む（prion-ridden）牛の骨が使用された場合であっても、世界中のどこでも容易に使用することができる。
・上記工程は、管理された群れの育成を必要としないので、供給材料の価格は相対的に安い。
・骨基質は、所望の形状に容易に成形することができる。これは、骨基質材料が、（その処理の初期段階において）焼結されたチョーク様の単一の骨片であり、この単一の骨片が所望の形状に成形され得るとともに、さらに、浸透され得るためである。
・本発明の工程は、骨基質材料および補強材料の両方が、さもなくば廃棄される副産物（すなわち、食肉処理場の廃棄物および甲殻類の硬組織）を利用している。
・浸透材料は、骨の治癒を促進する薬物（例えば骨形態形成タンパク質）を含むように変更され得る。
【００９０】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の更なる形態は、例示のみを目的とする下記の説明および添付図面の参照によって明らかとなるであろう。
図１は、焼結された海綿質骨（ＳＣＢＢ）の骨インプラントのサンプル、および、有機補強材料を浸透させたＳＣＢＢの骨インプラントのサンプルを示す。
図２は、生の骨、補強および焼結された骨、ならびに、焼結された骨に関する圧力対ひずみを示すグラフである。
図３は、蒸留水による時間単位の洗浄後の、サンプルにおけるアンモニアＮのモル総数の平均を示す。比較対照データにはアンモニアＮが存在しなかった。
図４は、蒸留水による時間単位の洗浄後の、サンプルにおけるＣｌのモル総数の平均を示す。
図５は、Ｌｏｇ１０硬度対Ｌｏｇ１０見掛け密度の関係を示す。
【００９１】
〔発明を実施するための最良の形態〕
理想的な骨基質移殖材料は、下記の特徴を含んでおり、それらの多くは、物理的特徴であり、競合製品によって特徴付けられてきたものである。
・組成物（ヒドロキシアパタイトおよびキトサンの比率）
‐優れた点：骨代替率の制御
‐利益：生体骨と同じ質を有する新たに形成される骨、ヒトの骨の再形成に適した吸収運動
・多孔率％
‐優れた点：骨内成長と機械的特性とのバランス
‐利益：迅速な骨内成長、材料の使用のしやすさ
・マクロ多孔率％
‐優れた点：生体材料の中枢における骨細胞のコロニー形成
‐利益：材料における均質な骨内成長
・ミクロ多孔率
‐優れた点：代替物における生体液の拡散
‐利益：材料の栄養素の拡散、細胞内の不要物の排出、有利なイオン交換（溶解−沈着）を可能にする。
・相互結合
‐優れた点：生体材料の中枢における迅速な細胞のコロニー形成
‐利益：迅速な骨内成長
・圧縮強さ：＞１０ＭＰａ
‐優れた点：機械的特性
‐利益：外科手術における材料の使用のしやすさ。代替物の安定性。
これを達成しようとする方法を以下に記す。
牛の海綿質骨は、廃棄される供給食料として（プリオンを含まないことで知られる）ニュージーランド食肉産業から得られる。
骨のサンプルは、所望の形状および大きさに切断され、そして、水性媒体中にて熱および圧力を加えられ、タンパク質および脂質有機材料の大部分を除去される。
処理済みの骨は、１０００℃で３時間、実質的に焼結され、残りの有機材料を焼却する。そして、（焼却による）滅菌手段によって、プリオンを全く含まない材料で構成された製品が保証される。
チョーク様の骨は、低強度をもたらす。
【００９２】
（例１）
代用材料は、キトサン２．５ｇおよびＣａＨＰＯ４１．５ｇを、ＨＣｌによって酸性化した水２５０ｍＬの中において溶解させることによって調製され、１％ｗ／ｖのキトサン溶液、および、０．６％ｗ／ｖのリン酸水素カルシウム溶液が生成される。
【００９３】
水の粘度よりも僅かに高い粘度を有する上記溶液は、真空にすることが可能な容器内に、焼結された牛の海綿質骨（ＳＣＢＢ）を載置することによって、ＳＣＢＢの中に浸透する。次いで、真空を誘導する。十分な真空状態に達すると、真空ラインが閉鎖され、浸透ラインが開き、焼結された骨の中に液体が流れ込むことができる。キトサン溶液は、ＳＣＢＢ孔の中に注入され、さらに、ＳＣＢＢの構造的な骨梁内の微細なすき間の中にも注入される。
【００９４】
浸透の後で、サンプルが取り除かれ、下記に概説する硬化方式に従ってＮＨ３（ｇ）の雰囲気下に置かれ、そして、下記に概説する洗浄工程に従って洗浄される。
【００９５】
サンプルは、風乾され、機械的に強化された骨代用バイオインプラントが生成される。該バイオインプラントは、生体適合性および生体吸収性を有する一方で、生きた骨組織と同等の孔の大きさおよび内部細孔構造を維持している。
【００９６】
正確な多孔率および内部細孔構造は、治癒および体内での再生反応を大幅に促進することが示された。
【００９７】
キトサンを浸透させた材料は、体内において、それ単独では抗原反応を誘発することはないことが示されたので、骨の代用生体材料〔１１〕として理想的な候補とする。
【００９８】
これらのキトサンを浸透させたＳＣＢＢサンプルの圧縮ひずみ下での降伏強度は、生の骨のそれよりも低い傾向があるが、続く上記サンプルの圧縮応力対ひずみの分析結果は、骨としての特性を示している。
【００９９】
浸透の度合いは、走査型電子顕微鏡法、色素追跡、および、赤外顕微鏡法によって決定した。
【０１００】
図１は、ＳＣＢＢおよび代用材料を浸透させた２つの焼結骨のサンプルを示す。
【０１０１】
機械的強度は、インストロン装置における圧縮試験によって検査された。純粋な焼結骨と生の骨と処理されたサンプルとの比較は、降伏強度、ヤング率および応力／ひずみのプロファイルを基準に行われた。原材料（ＳＣＢＢ）の構造および密度において生得的な違いがあるため、統計的アプローチでは、ＳＣＢＢと浸透補強されたサンプルとの比較を行う必要があった。
【０１０２】
上記統計的分析は、一連のステップで行われた。第一に、多数の未処理ＳＣＢＢサンプルに対して圧縮検査が行われた。見掛けの密度は、単に、サンプルの質量を容積で割ることによって計算された。このデータおよび圧縮試験データから、最大応力対見掛けの密度の相関図を作成した。
【０１０３】
続いて行った、補強されたサンプルの検査の結果は、ゲージング向上の手段を用いてこの基準値と比較されたか、または、物理的特性と比較された。最初の結果は、いくつかのの有機材料が僅かに高い最大応力値をもたらしたことを示した。意義深いことに、図２に示すように、応力／ひずみのプロファイルは、焼結骨のプロファイルではなく、生の海綿質骨のプロファイルに似た形状をとり始めた。プロファイルによると、応力が破損を招いた後で、補強かつ焼結された骨はそれでもある程度の機械的強度を保っていた。これは、破損後に機械的強度を完全に失うことを示す焼結骨と全く対照的である。
【０１０４】
（例２）
他のＳＣＢＢサンプルは、上述のＮａＯＨ溶液を用いる「硬化」工程を含まない点を別として、上述の工程と同様の工程を介して作成される。
【０１０５】
ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解するとともに、ＳＣＢＢの中に浸透する。そして、ＴＨＦ溶液は、エバポレーションを可能にし、補強された焼結骨サンプルの生成を可能にする。ＰＣＬは生体適合性を有するポリマーであり、体内において無毒の副産物に分解される。
【０１０６】
酸化セルロースや羊毛繊維由来のケラチンなどの他の強化材料は、原則として、上述の工程によってＳＣＢＢの中に浸透する。
【０１０７】
最終的に、廉価かつ広く入手可能な原材料（廃棄する牛の骨）は、高い生体適合性を有する骨代用バイオインプラント材料に変換される。該骨代用バイオインプラントは、非加工の焼結骨よりも優れた機械的特性を有しており、骨に起因するプリオン伝播のリスクを全く有しない。
【０１０８】
（生体適合性）
非特許文献１に示されるように、従来、牛の焼結骨はin vivoでの生体適合性を有することが示されており、その中で、脊椎手術における焼結骨の使用が成功している。
【０１０９】
また、非特許文献２、３において、焼結されず除タンパクされた牛の海綿質骨が、羊および犬モデルにおいて骨伝導性を有すると示された。
【０１１０】
さらに、本発明において使用可能なポリカプロラクトン、キトサン、および、シリカなどの補強材料は、先行文献４〜６に基づいて、それぞれ生体適合性を有する（または、混合材料において使用される場合に生体適合性を助ける）ものとして示された。
【０１１１】
（補強材料の範囲）
下記の補強材料が、硬化工程における実験に使用された。
・キトサン
・キトサン+リン酸カルシウム（同時沈着）
・キトサン+ＴＥＯＳ
・キトサン+ゲニピン
・キトサン+ゲニピン+リン酸カルシウム（同時沈着）
・キトサン+チタンテトラプロポキシド
・ポリカプロラクトン。
【０１１２】
（硬化方式）
サンプルは、濃縮されたＮＨ３（ａｑ）から生成されたＮＨ３（ｇ）雰囲気下に載置することによって硬化した。
【０１１３】
ＮＨ３（ｇ）は、骨基質の孔を満たす浸透溶液の中に拡散して溶解する。その中で、ＮＨ３（ｇ）は加水分解を行って水酸化物を生成する。そして、水酸化物が、キトサンおよび存在する場合は付属の材料を硬化させる役割を果たす。
【０１１４】
硬化は、直径１２ｍｍ、高さ１５ｍｍの寸法のサンプルに関して、１時間以内に見られた。一般的に、完全に硬化させるため、サンプルを、単純にＮＨ３（ｇ）雰囲気下に一晩置いた。
【０１１５】
（洗浄工程）
硬化後、サンプルを蒸留水で洗浄し、キトサンおよび他の成分を溶解するのに使用した酸性の余分なアンモニアおよびアンモニア塩を除去した。
【０１１６】
穏やかに攪拌された水の入った容器内にサンプルを配置することによって、洗浄を行った。サンプル毎に４００ｍＬの蒸留水を用いて、１時間毎に水を取り替えた。
【０１１７】
アンモニア残留物および他の残留物を、制御レベル、すなわち、これらの不純物のレベルにおいてそれ以上の減少が検出されないレベルまで近づけるため、洗浄を３回繰り返す必要があることがわかった。
【０１１８】
図３および４は、１時間の洗浄サイクル後にサンプル内に残ったアンモニア／アンモニウム（総アンモニアＮ）および（キトサンを溶解させるためのＨＣｌの使用によって生じる）塩化物のレベルを示す。
【０１１９】
特に、図３は、蒸留水による数時間の洗浄後の、サンプルにおけるアンモニアＮのモル総数平均を示す。比較対照のサンプルにはアンモニアＮが存在しなかった。
【０１２０】
図４は、蒸留水による数時間の洗浄後のサンプルにおけるＣｌのモル平均数を示す。
【０１２１】
（骨基質の好ましい特性）
骨基質の好ましい特性は、０．８ｇ／ｃｍ３を上回るかさ密度（（立方体の物理次元を用いて、重量（立方体の重量）分析によって測定した））を有している牛の海綿質骨である。
【０１２２】
上記かさ密度値を下回ると、焼結骨は内在機械的強度を殆ど有しなくなることがわかった。
【０１２３】
（骨のクリーニング方法）
１５ｐｓｉで、水中にて６時間オートクレーブにかけることが推奨される。水は２時間毎に交換する。次に、骨を乾燥させ、１０００℃のマッフル炉内にて３時間、焼結する。
【０１２４】
（機械的データ）
図５は、（補強材料としてキトサンおよびキトサン／リン酸カルシウムをそれぞれ含む）基質ＢおよびＣと称した浸透サンプルが、同等の浸透されていない牛の焼結骨およびポリカプロラクトンを浸透させた焼結骨よりも、表面上は、大きいＬｏｇ１０硬度値を表すことを示している。
【０１２５】
特に、図５は、Ｌｏｇ１０硬度対Ｌｏｇ１０見掛け密度の関係を示す。
【０１２６】
〔非特許文献〕
１．Minamide, A., et al., The use of sintered bone in spinal surgery. European Spine Journal, 2001. 10(0): p. S185-S188
２．Worth, A.J., et al., Combined xeno/auto-grafting of a benign osteolytic lesion in a dog, using a novel bovine cancellous bone biomaterial. Clinical Communication, In Press
３．Worth, A., et al., The evaluation of processed cancellous bovine bone as a bone graft substitute. Clinical Oral Implant Research, 2005. 16: p. 379-386
４．VandeVord, P. J., et al., Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. Journal of Biomedical Materials Research, 2002. 59(3): p.585-590
５．Gough, J. E., et al., Craniofacial osteoblast responses to polycaprolactone produced using a novel boron polymerisation technique and potassium fluoride post-treatment. Biomaterials, 2003. 24(27): p. 4905-4912
６．Koo, H. -J., et al., Antiinflammatory effects of genipin, an active principle of gardenia. European journal of pharmacology 2004. 495(2-3): p. 201-208
７．Madihally, S. V. and H. W. T. Matthew (1999). "Porous chitosan scaffolds for tissue engineering." Biomaterials 20: 1133-1142
本発明の形態は、単なる例示によって説明されており、添付の特許請求の範囲における本発明の範囲を逸脱することなく、本発明に対して変更および追加が行われてもよいことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】焼結された海綿質骨（ＳＣＢＢ）の骨インプラントのサンプル、および、有機補強によって浸透されたＳＣＢＢの骨インプラントのサンプルを示す。
【図２】生の骨、補強および焼結された骨、ならびに、焼結された骨に関する圧力対ひずみを示すグラフである。
【図３】蒸留水による時間単位の洗浄後の、サンプルにおけるアンモニアＮのモル総数の平均を示す。比較対照データにはアンモニアＮが存在しなかった。
【図４】図４は、蒸留水による時間単位の洗浄後の、サンプルにおけるＣｌのモル総数の平均を示す。
【図５】Ｌｏｇ１０硬度対Ｌｏｇ１０見掛け密度の関係を示す。
【図１ａ】
2010511474.tif 000003
【図１ｂ】
2010511474.tif 000004
【図１ｃ】
2010511474.tif 000005
【図２】
2010511474.tif 000006
【図３】
2010511474.tif 000007
【図４】
2010511474.tif 000008
【図５】
2010511474.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月12日(2008.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機材料が除去された骨基質材料と、
上記有機材料に代わる代用材料とを含む骨基質であって、
上記代用材料を沈着させることによって、当該代用材料が上記骨基質材料の内部に固定化されているとともに、
上記骨基質が単一の骨片から形成されていることを特徴とする骨基質。
【請求項２】
上記骨基質材料が、海綿質骨を代替するために使用可能なタイプの骨基質材料である、請求項１に記載の骨基質。
【請求項３】
上記骨基質材料が生体骨である、請求項１または２に記載の骨基質。
【請求項４】
上記骨基質材料が牛の骨である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の骨基質材料。
【請求項５】
上記牛の骨が、ＢＳＥが発生していないことが保証された国から得られたものである、請求項４に記載の骨基質材料。
【請求項６】
上記骨基質材料が、実質的に０．８ｇ／ｃｍ３以上のかさ密度を有している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の骨基質材料。
【請求項７】
上記代用材料が、合成リン酸カルシウム、ポリカプロラクトン、合成ヒドロキシアパタイト、または、藻類由来のヒドロキシアパタイトから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨基質。
【請求項８】
上記代用材料が有機材料に基づく基質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨基質。
【請求項９】
上記代用材料が、ケラチン、グルコサミン、軟骨、コンドロイチン、ゼラチン、酸化セルロースもしくはキトサン、骨髄穿刺液、幹細胞、骨成長ホルモン、および、骨形態形成タンパク質のうち１つ以上の成分を含む、請求項８に記載の骨基質。
【請求項１０】
上記代用材料が上記骨全体に浸透されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の骨基質。
【請求項１１】
ａ）単一の骨基質材料片から元々含まれている有機材料を除去するステップと、
ｂ）上記処理された骨基質材料に代用材料の溶液を浸透させるステップと、を含む骨基質の生産方法であって、
ｃ）沈着させることによって、上記処理された骨材料の内部にて上記代用材料を固定化させるステップ、
を特徴とする方法。
【請求項１２】
元々含まれている有機材料の除去は、水性媒体中にて熱処理および圧力処理を介して行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
元々含まれている有機材料を除去する上記ステップが焼結を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
上記処理された骨基質材料に対する代用材料の浸透は、真空下において行われる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
硬化させるステップが、溶媒のエバポレーション、硬化剤の作用、および／または、加熱の結果として生じる、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
添付の実施例を参照して明細書中に実質的に記載されている、骨基質。
【請求項１７】
添付の実施例を参照して明細書中に実質的に記載されている、方法。
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月6日(2009.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨基質材料と代用材料とを含んでいる骨基質であって、
上記骨基質材料は、その生来の有機材料が除去されており、
上記代用材料が、上記生来の有機材料を置き換えており、
ｐＨの調整により上記代用材料を沈着させることによって、当該材料が上記骨基質材料の内部に固定化されており、
上記骨基質が単一の骨片から形成されていることを特徴とする骨基質。
【請求項２】
上記骨基質材料が生体骨である、請求項１に記載の骨基質。
【請求項３】
上記骨基質材料が牛の骨である、請求項１または２に記載の骨基質。
【請求項４】
上記骨基質材料が、実質的に０．８ｇ／ｃｍ３以上のかさ密度を有している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の骨基質。
【請求項５】
上記骨基質が、実質的に１０ＭＰａ以上の圧縮強さを有している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の骨基質。
【請求項６】
上記代用材料が、合成リン酸カルシウム、ポリカプロラクトン、合成ヒドロキシアパタイト、藻類由来のヒドロキシアパタイト、珊瑚由来のヒドロキシアパタイト、ケラチン、グルコサミン、軟骨、コンドロイチン、ゼラチン、酸化セルロース、キトサン、骨髄穿刺液、および、骨成長ホルモンからなる群から選択される成分を含んでいる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の骨基質。
【請求項７】
上記代用材料がリン酸カルシウムおよびキトサンを含んでいる、請求項６に記載の骨基質。
【請求項８】
上記代用材料が有機材料に基づく基質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の骨基質。
【請求項９】
上記代用材料が、ケラチン、グルコサミン、軟骨、コンドロイチン、ゼラチン、酸化セルロースもしくはキトサン、骨髄穿刺液、骨成長ホルモン、および、骨形態形成タンパク質からなる群から選択される成分を含んでいる、請求項８に記載の骨基質。
【請求項１０】
上記単一の骨片が、ＢＳＥが発生していないことが保証された供給源から得られたものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の骨基質。
【請求項１１】
単一の骨基質材料片から生来の有機材料を除去して、処理された骨基質材料を形成するステップと、
上記処理された骨基質材料に代用材料を浸透させるステップと、
ｐＨの調整により上記代用材料を沈着させることによって、上記処理された骨材料の内部にて当該代用材料を固定化するステップと、
を包含する、骨基質の生産方法。
【請求項１２】
上記生来の有機材料の除去は、水性媒体中における熱処理および圧力処理を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記処理された骨基質材料に対する代用材料の浸透は、真空の使用を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記代用材料がキトサンおよびリン酸カルシウムを含んでおり、上記骨基質が実質的に１０ＭＰａ以上の圧縮強さを有している、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
上記代用材料のｐＨの調整が上記ｐＨを上昇させることを含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
上記単一の骨基質材料片が、ＢＳＥが発生していないことが保証された供給源から得られたものである、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＢＳＥが発生していないことが保証された供給源から得られたものである単一の骨基質材料片から、上記生来の有機材料を除去して、処理された骨基質材料を形成するステップと、
上記処理された骨基質材料に代用材料の溶液を浸透させるステップと、
上記代用材料を上記処理された骨材料の内部にて定着させるステップと、
を包含する、骨基質の生産方法。
【請求項１８】
上記代用材料を定着させるステップが、溶媒のエバポレーション、硬化剤の作用、または、加熱を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記処理された骨基質材料に代用材料を浸透させるステップが、真空の使用を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記代用材料が、キトサンおよびリン酸カルシウムを含んでおり、上記骨基質が実質的に１０ＭＰａ以上の圧縮強さを有している、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2010511474.tif 000010
2010511474.tif 000011
2010511474.tif 000012