(57)【要約】本発明はいくつかの型のヒト細胞の新規の酸性グリカンマーカの分析に関する。当該分析は質量分析法又は特異的な結合剤分子によって行われる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学構造の量及び存在を分析することによって、ヒト幹細胞又はその状態を分析する方法であって、
ａ．好ましくはタンパク質上の１のＮ−アセチルラクトサミン、又は、
ｂ．ＧＤ３ガングリオシドの１のラクトース残基、
につき少なくとも２のシアル酸残基を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記細胞の状態が、前記細胞の分化、細胞型、又はコンタミネーションに関して分析されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記シアル酸がＮｅｕＧｃ、ＮｅｕＡｃ、又はＮｅｕ−ＯＡｃであり、Ｎ−アセチルラクトサミンがＧａｌβ３／４ＧｌｃＮＡｃであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、シアル酸がジシアル酸のＮｅｕＸαＮｅｕＸエピトープを形成し、ＸがＡｃ又はＧｃ、好ましくはＡｃであり、更に「ジシアル酸」非還元末端エピトープと見なされることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法において、
ａ１）タンパク質及び／又はＮ−アセチルラクトサミンエピトープ上にある、特に、間葉、胚性、又は造血幹細胞の分析用のＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌ、及び／又は、
ａ２）ガングリオ系列ガングリオシドＧＤ３上にある、特に造血又は間葉細胞の分析用のＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌ、
として、ＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌエピトープが認識され、前記ジシアル酸エピトープが提供されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法において、タンパク質及び／又はＮ−アセチルラクトサミンエピトープ上のＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌとして、ＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌエピトープが認識され、前記ジシアル酸エピトープが提供されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法において、前記分析が質量分析法を用いることによって、又は前記エピトープを認識する特異的な結合物質／結合剤を用いることによって行われることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記結合剤がＳ２−５６６抗体であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法において、前記抗体が造血幹細胞又は分化した間葉細胞の認識用に用いられることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法において、前記結合剤がＧＤ３ガングリオシド抗体、又はＯＡｃＧＤ３認識抗体であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の方法において、前記抗体が造血幹細胞又は分化した間葉細胞の集団の認識用に用いられることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項６に記載の方法において、請求項７及び９に記載の前記抗体が同時に用いられることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法において、前記化学構造が「非直鎖状にジシアル酸付加された」Ｎ−アセチルラクトサミンであり、Ｇａｌの三位に一方のシアル酸、及びＧｌｃＮＡｃの六位に他方のシアル酸を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、前記化学構造がＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃ上にあり、ＸがＡｃ又はＧｃであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記化学構造が細胞のコンタミネーションに関する細胞の分析用に用いられ、前記化学構造が選択的にＮｅｕＧｃを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
分析用抗体の選択又は生成のための、請求項１ないし６又は１４のいずれか１項に記載の化学構造の使用であって、間葉、造血幹細胞、及びその直接的に分化した細胞の精製を含むことを特徴とする使用。
【請求項１７】
請求項１６に記載の使用において、前記エピトープの化学構造が請求項１ないし６又は１４のいずれか１項に記載の型のＮ−アセチルラクトサミンと、間葉、胚性、又は造血幹細胞からの細胞表面タンパク質のポリペプチドとを含むことを特徴とする使用。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載の使用において、前記エピトープが固相に固定化されるか、あるいは観察可能なタグで標識されることを特徴とする使用。
【請求項１９】
請求項１６又は１７に記載の使用において、前記エピトープがファージディスプレイライブラリ又は免疫の選択用に用いられることを特徴とする使用。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法において、前記化学構造が式Ｃ：ＳｋＨｎＮｐＦｑに従い、好ましくはＮ−単糖組成を有するＮ−グリカンであり、ｋが２ないし５の整数であり、ｎが３ないし６の整数であり、ｐが３ないし５の整数であり、ｑは０又は１となる整数であり、ＳがＮｅｕ５Ａｃ及び／又はＮｅｕ５Ｇｃであり、ＨがＤ−Ｍａｎ又はＤ−Ｇａｌの群から選択される六炭糖であり、ＮがＮ−Ｄ−アセチルヘキソサミン、好ましくはＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ、より好ましくはＧｌｃＮＡｃであり、ＦがＬ−フコースであることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法において、前記化学構造が１のジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法において、前記化学構造が式ＮｅｕＡｃαＮｅｕＡｃαＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃに従う１のジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンを含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法において、前記ジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンがＮｅｕＡｃαＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃαＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、及び／又はＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃであることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法において、Ｎ−グリカンの化学構造が、式ＯＳ１：（ＮｅｕＡｃα）ｍＧａｌβ（Ｆｕｃα３／４）ｎ１ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［Ｍａｎα６］ｎ２）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎ３ＧｌｃＮＡｃの式に従い、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が０又は１の整数であり、だたし、ｎ１が０の場合はｎ３は１、ｎ１が１の場合はｎ３は０とするか、あるいはｎ１及びｎ３の双方が０とし、ｍが２又は３の整数であることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法において、前記化学構造が式ＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃに従う１のジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンを含み、ＸがＡｃ又はＧｃであることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１０に記載の方法において、前記化学構造が組成Ｓ２Ｇ１Ｈ５Ｎ４及び／又はＳ１Ｇ２Ｈ５Ｎ４を有し、ＳがＮｅｕ５Ａｃであり、ＧがＮｅｕ５Ｇｃであり、ＨがＤ−Ｍａｎの群から選択される六炭糖であり、ＮがＮ−Ｄ−アセチルヘキソサミン、好ましくはＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ、より好ましくはＧｌｃＮＡｃであることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法において、Ｎ−グリカンの化学構造が式（ＮｅｕＸα）ｍ１ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［ＮｅｕＸα］ｍ２ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃに従い、ＸがＧｃかＡｃかのいずれかであり、ただし、少なくとも１のＧｃ又はＡｃが分子中にあり、ＧｃとＡｃの双方がジシアル酸エピトープ中にありうるとし、ｍ１が２かつｍ２が１であるか、あるいはｍ２が２かつｍ１が１であり、シアル酸残基がＧａｌにα３又はα６結合されるか、ＧｌｃＮＡｃにα６結合されるか、あるいは、互いにα８又はα９結合され、前記Ｇａｌ残基がβ３及び／又はβ４結合されることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の方法において、Ｎ−グリカンの化学構造が式ＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＮｅｕＸαＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、及び／又は、他の分枝異性体ＮｅｕＸαＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３／６（ＮｅｕＸαＧａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６／３）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃに従うことを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の方法において、グリカンが組成Ｓ２Ｈ４Ｎ５Ｆ１を有することを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の方法において、分化する細胞又は細胞型における差異が分析されることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の方法において、前記幹細胞がヒト造血幹細胞、胚性幹細胞，又は間葉幹細胞の群から選択されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［概要］
本発明は、いくつかの型のヒト細胞の新規の酸性グリカンマーカの分析に関する。当該分析は、質量分析法又は特異的な結合剤分子によって行われる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、ある好ましい様態においては、ジシアル酸エピトープに関し、２のシアル酸残基が、糖脂質の化学構造上、特にガングリオ系列ガングリオシドＧＤ３上にあり、異なる変異体を伴うＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌを有する「ジシアル酸（ｄｉｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ）」のような、末端部の非還元末端エピトープ中で互いに結合され、「ガングリオ系ジシアル酸（ｇａｎｇｌｉｏ  ｄｉｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ）」と見なされ、ある好ましい様態においては、ほとんど未知で希少なエピトープがタンパク質及び／又はＮ−アセチルラクトサミンの化学構造に結合され、「タンパク質／ＬａｃＮＡｃジシアル酸（ｐｒｏｔｅｉｎ／ＬａｃＮＡｃ  ｄｉｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ）」と見なされる。これらの化学構造は化学的に異なり、異なる方法で別個に細胞を特徴づける。本発明は好ましくは、造血又は間葉幹細胞、及びその分化した細胞のコンテキストにおけるＧＤ３認識抗体の使用、あるいは、タンパク質及び／又はＮ−アセチルラクトサミン上のジシアル酸エピトープを認識する異なる抗体を同時に用いる、ガングリオ系列の特異的なＧＤ３抗体の使用に関する。糖鎖付加の細胞型特異性のため、胚性幹細胞上に同定されるグリカンは、造血又は間葉幹細胞の糖鎖付加を予言しない。
【０００３】
バックグラウンドにおける異なる分鎖型糖脂質エピトープＧＤ２はＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３（ＧａｌＮＡｃβ４）Ｇａｌの糖脂質であり、特定の間葉幹細胞の調製時に認識されうる。これは異なる非還元末端の化学構造であり、本発明は特に抗体に関するものであり、交差反応しないか、あるいは、この化学構造を用いた非常に低い反応性を有していることは理解される。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ジシアル酸付加された異常なエピトープの量及び存在を分析することによって、以下の末端部の非還元末端化学構造を含むヒト幹細胞、好ましくはヒト造血幹細胞、胚性幹細胞、又は間葉幹細胞と、それから得られる分化細胞とを分析する方法に関する。
ａ）ある好ましい様態においては、ＸはＡｃ又はＧｃ、好ましくはＡｃであり、更に、「ジシアル酸」エピトープと見なされるＮｅｕＸαＮｅｕＸエピトープ、より好ましくはＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌエピトープ、更により好ましくは、ジシアル酸エピトープがＮ−アセチルラクトサミン上に提供される。本発明は、特に以下の２のサブタイプのＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌエピトープと、これらを認識する試薬とに関する。
ａ１）タンパク質及び／又はＮ−アセチルラクトサミンエピトープ上のＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌは、「タンパク質／ＬａｃＮＡｃジシアル酸」と見なされる。「タンパク質／ＬａｃＮＡｃジシアル酸」の検出は特に、造血幹細胞及びその分化細胞のコンテキストにおいて好ましい。
ａ２）ガングリオ系列ガングリオシドＧＤ３上のＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌは、「ガングリオ系ジシアル酸」と見なされる。「ガングリオ系ジシアル酸」は特に、間葉幹細胞、好ましくは臍帯血由来、及びより好ましくは、その骨原性又は脂肪生成方向へ分化する細胞のコンテキストにおいて好ましい。
ｂ）本発明は更に、Ｇａｌの三位に一方のシアル酸、及びＧｌｃＮＡｃの六位に他方のシアル酸を含む「非直鎖状にジシアル酸付加された」Ｎ−アセチルラクトサミンに関し、エピトープはＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃ上にあり、ＸはＡｃ又はＧｃである。
【０００５】
ある好ましい様態においては、本発明は脂質又はタンパク質に結合されたジシアル酸付加されたエピトープの分析に関する。
【０００６】
ある好ましい様態においては、ジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンはタンパク質に結合される。
【０００７】
分析は、質量分析法、及び／又は、「タンパク質／ＬａｃＮＡｃジシアル酸」及び／又は「ガングリオ系ジシアル酸」のような標的グリカンを認識する特異的な結合物質を用いることによって行われる。質量分析的なプロファイリングは正確な化学構造とは別個の、ジシアル酸付加された化学構造を含む異常な化学構造を明らかにでき、定量的で特異的な単糖組成の量は、特定の幹細胞クラス及び／又はその分化細胞に特徴づけられることが理解される。本発明は、末端部のジシアル酸付加されたエピトープを認識する特異的な結合剤分子によって、ジシアル酸付加された化学構造が認識できることを更に明らかにした。特に、化学構造がタンパク質結合されたグリカン上で認識された場合に、これらはＳ２−５６６（生化学工業株式会社）を含んだ。
【０００８】
分析すべき好ましい型のＮ−グリカンは、式Ｃ：ＳｋＨｎＮｐＦｑに従う好ましいＮ−単糖組成を有し、ｋは２ないし５の整数であり、ｎは３ないし６の整数であり、ｐが３ないし５の整数であり、ｑは０又は１となる整数であり、ＳはＮｅｕ５Ａｃ及び／又はＮｅｕ５Ｇｃであり、ＨはＤ−Ｍａｎ又はＤ−Ｇａｌの群から選択される六炭糖であり、ＮはＮ−Ｄ−アセチルヘキソサミン，好ましくはＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ、より好ましくはＧｌｃＮＡｃであり、ＦはＬ−フコースである。
【０００９】
本方法は、ある好ましい様態においては、Ｎ−グリカンに関し、Ｎ−グリカンは１のジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンを含み、好ましくはＮ−グリカンは式ＮｅｕＡｃαＮｅｕＡｃαＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃに従う１のジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンエピトープを含む。
【００１０】
ジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンエピトープはある好ましい様態においては、好ましくはＮｅｕＡｃαＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ又はＮｅｕＡｃαＮｅｕＡｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、更により好ましくはＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃを含むジシアル酸エピトープである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、異なるＧＤ３抗体でのＣＤ３４陽性及び陰性細胞のＦＡＣＳ染色の結果である。異なる抗ジシアル酸抗体での陽性染色を有するＣＤ３４＋及びＣＤ３４−細胞の割合が示される。抗体は品番ＭＡＢ４３０８のＣｈｅｍｉｃｏｎ社のＶＩＮ−ＩＳ−５６、品番５５４２７４のＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社のＭＢ３．６、品番ｍａｂ００１４のＣｏｖａｌａｂ社の４Ｆ６、及び生化学工業株式会社のＳ２−５６６（品番２７０５５４）であった。
【図２】図２は、ＧＤ３抗体での臍帯血由来の造血幹細胞のＦＡＣＳ染色の結果である。抗ＧＤ３のＳ２−５６６（生化学工業株式会社、品番２７０５５４）での陽性染色を有するＣＤ３４及びＣＤ１３３陽性細胞、ならびにＣＤ３４及びＣＤ１３３陰性細胞の割合が示される。
【図３】図３は、異なるＧＤ３抗体での間葉幹細胞（ＭＳＣ）、ならびに骨形成上分化された（ＯＧ）、及び脂肪生成上分化された（ＡＧ）細胞のＦＡＣＳ染色の結果である。間葉幹細胞は骨髄（Ａ）又は臍帯血（Ｂ）のいずれかから得られた。異なる抗ジシアル酸抗体での陽性染色を有する細胞の割合が示される。抗体は品番ＭＡＢ４３０８のＣｈｅｍｉｃｏｎ社のＶＩＮ−ＩＳ−５６、品番５５４２７４のＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社のＭＢ３．６、品番ｍａｂ００１４のＣｏｖａｌａｂ社の４Ｆ６、生化学工業株式会社のＳ２−５６６（品番２７０５５４）、及び品番Ｇ２００５−６７の米国Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社の４ｉ２８３であった。
【図４】図４は、抗体Ｓ２−５６６（生化学工業株式会社、品番２７０５５４）での、骨髄（ＢＭ）及び臍帯血（ＣＢ）からの、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、ならびに骨形成上分化された（ＯＧ）及び脂肪生成上の（ＡＧ）分化中の／分化した細胞のＦＡＣＳ分析である。
【図５】図５は、幹細胞命名法である。
【図６】図６は、抗ジシアル酸抗体による造血幹細胞ライセートの免疫ブロットである。ＣＤ３４＋及びＣＤ３４−細胞の細胞ライセートはＳ２−５６６（生化学工業株式会社、品番２７０５５４）及びＶＩＮ−ＩＳ−５６（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、品番ＭＡＢ４３０８）でブロットされ、可視化した検出タンパク質が示される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ジシアル酸付加された異常なエピトープの量及び存在を分析することによって、以下の末端部の非還元末端化学構造を含むヒト幹細胞と、それから得られる分化細胞とを分析する方法に関する。
ａ）ある好ましい様態においては、ＸはＡｃ又はＧｃ、好ましくはＡｃであり、更に、「ジシアル酸」エピトープと見なされるＮｅｕＸαＮｅｕＸエピトープ、より好ましくはＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌエピトープ、更により好ましくは、ジシアル酸エピトープがＮ−アセチルラクトサミン上に提供される。本発明は、特に以下の２のサブタイプのＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌエピトープと、これらを認識する試薬とに関する。
ａ１）タンパク質及び／又はＮ−アセチルラクトサミンエピトープ上のＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌは、「タンパク質／ＬａｃＮＡｃジシアル酸」と見なされる。「タンパク質／ＬａｃＮＡｃジシアル酸」の検出は特に、造血幹細胞及びその分化細胞のコンテキストにおいて好ましい。
ａ２）ガングリオ系列ガングリオシドＧＤ３上のＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌは、「ガングリオ系ジシアル酸」と見なされる。「ガングリオ系ジシアル酸」は特に、間葉幹細胞、好ましくは臍帯血由来、及びより好ましくは、その骨原性又は脂肪生成方向へ分化する細胞のコンテキストにおいて好ましい。
ｂ）本発明は更に、Ｇａｌの三位に一方のシアル酸、及びＧｌｃＮＡｃの六位に他方のシアル酸を含む「非直鎖状にジシアル酸付加された」Ｎ−アセチルラクトサミンに関し、エピトープはＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃ上にあり、ＸはＡｃ又はＧｃである。
【００１３】
ある好ましい様態においては、本発明は脂質又はタンパク質に結合されたジシアル酸付加されたエピトープの分析に関する。
【００１４】
ある好ましい様態においては、ジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンはタンパク質に結合される。
【００１５】
ある好ましい様態においては、ジシアル酸付加されたエピトープは、ａ）１のＮ−アセチルラクトサミンにつき少なくとも２のシアル酸残基を含み、シアル酸がＮｅｕＧｃ又はＮｅｕＡｃであり、Ｎ−アセチルラクトサミンがＧａｌβ３／４ＧｌｃＮＡｃである場合に、好ましくは１のジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンユニットを、末端部の非還元末端のジシアル酸付加された化学構造に関連する好ましい様態においては、ジシアル酸又は、非直鎖状にジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンを含むＮ−グリカン、ｂ）タンパク質によって、アスパラギンと還元末端部のＮ−グリカンのＧｌｃＮＡｃとの間の正常な結合を切断するＮ−グリコシダーゼ酵素を構成すべく、異常な基幹化学構造上に２のシアル酸を有する、Ｎ−グリカン又は同様の大きさのオリゴ糖を含むＮ−グリカン型の化学構造、である。ｂ）の群は異常なエピトープを含み、ＮｅｕＸα３末端を有する化学構造に位置的な分枝を示す、α３結合のシアル酸に主に特異的な型のシアリダーゼ酵素によって切断可能な２のシアル酸残基を含む。
【００１６】
［ジシアル酸エピトープ及びこれらを認識する結合剤］
好ましい脂質結合したＮｅｕＸαＮｅｕＸエピトープは、ＧＤ３ガングリオシド上にＮｅｕＸα８ＮｅｕＸα３Ｇａｌエピトープを含み、ＮｅｕＸα８ＮｅｕＸα３Ｇａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒの化学構造を有し、ＸはＡｃ又はＧｃにできる。ＧＤ３ガングリオシドは特に、造血幹細胞及び／又は間葉幹細胞、ならびにその分化細胞のキャラクタリゼーション用として好ましい。タンパク質及び／又はＮ−アセチルラクトサミンに結合されたエピトープＮｅｕＸα８ＮｅｕＸα３Ｇａｌ（βＧｌｃＮＡｃ）は、基幹にグルコース残基を含む糖脂質エピトープＮｅｕＸα８ＮｅｕＸα３Ｇａｌβ４ＧｌｃβＣｅｒと別個に、細胞を特徴づけることが明らかにされた。
【００１７】
［ジシアル酸Ｎ−アセチルラクトサミンエピトープ］
ジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンエピトープは、ある好ましい様態においては、好ましくはＮｅｕＡｃαＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ又はＮｅｕＡｃαＮｅｕＡｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、更により好ましくはＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃを含むジシアル酸エピトープである。
【００１８】
本発明は更に、特に化学構造がＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα３ＧａｌβＧｌｃＮＡｃ、好ましくはＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃのようなＮ−アセチルラクトサミン上で、好ましくはタンパク質上で認識される場合に、末端部のジシアル酸付加されたエピトープを認識する特異的な結合剤分子によって認識されうることを明らかにした。好ましい結合剤は特に化学構造がＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα３ＧａｌβＧｌｃＮＡｃ、好ましくはＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃのようなＮ−アセチルラクトサミン上で、好ましくはタンパク質上で認識される場合に、抗体Ｓ２−５６６（生化学工業株式会社）を含む。
【００１９】
［ガングリオ系及びタンパク質／ＬａｃＮＡｃのジシアル酸の結合剤の組合せ使用］
ある好ましい様態においては、本発明は特異的なジシアル酸認識抗体の組合せの使用に関し、第１の抗体は好ましくは特異的又は排他的に、タンパク質及び／又はラクトサミンに結合したエピトープＮｅｕＸα８ＮｅｕＸα３Ｇａｌ（βＧｌｃＮＡｃ）、好ましくはＮｅｕＸα８ＮｅｕＸα３Ｇａｌ（βＧｌｃＮＡｃ）を認識でき、第２の抗体は、タンパク質及び／又はラクトサミンに結合したエピトープではない、糖脂質上の、好ましくはＧＤ３上のエピトープＮｅｕＸα８ＮｅｕＸα３Ｇａｌを特異的又は排他的に認識する特異性を有する。
【００２０】
［排他的及び二重特異性のタンパク質／ｌａｃＮＡｃ及びガングリオ系のジシアル酸結合抗体］
異なるエピトープは「タンパク質／ＬａｃＮＡｃジシアル酸」と「ガングリオ系ジシアル酸」の結合抗体間で観察されうることは理解される。ある好ましい様態においては、本発明は排他的な特異性を有する方法及び結合剤試薬に関する。
【００２１】
ある好ましい様態においては、本発明は排他的な「ガングリオ系ジシアル酸」に特異的な結合剤に関し、抗体のような結合剤は「ガングリオ系ジシアル酸」に結合されるが、タンパク質又はＮ−アセチルラクトサミンに結合したエピトープを認識しない。
【００２２】
ある好ましい様態においては、本発明は排他的な「タンパク質／ＬａｃＮＡｃジシアル酸」に特異的な結合剤に関し、抗体のような結合剤は「タンパク質／ＬａｃＮＡｃジシアル酸」に結合されるが、「ガングリオ系ジシアル酸」エピトープを認識しない。
【００２３】
本発明は更に、二重特異性の抗体に関し、抗体は「ガングリオ系ジシアル酸」エピトープと、「タンパク質／Ｎ−アセチルラクトサミンジシアル酸」エピトープとの双方を認識できる。
【００２４】
［特異的な結合剤及び／又は質量分析法による分析］
分析は、質量分析法、及び／又は、特異的なグリカン結合物質を用いることによって好ましくは行われる。質量分析的なプロファイリングは正確な化学構造とは別個の、ジシアル酸付加された化学構造を含む異常な化学構造を明らかにでき、定量的で特異的な単糖組成の量は、細胞に特徴づけられることが理解される。
【００２５】
［好ましいＮ−グリカン化学構造］
分析すべき好ましい型のＮ−グリカンは、式Ｃ：ＳｋＨｎＮｐＦｑに従う好ましいＮ−単糖組成を有し、ｋは２ないし５の整数であり、ｎは３ないし６の整数であり、ｐが３ないし５の整数であり、ｑは０又は１となる整数であり、ＳはＮｅｕ５Ａｃ及び／又はＮｅｕ５Ｇｃであり、ＨはＤ−Ｍａｎ又はＤ−Ｇａｌの群から選択される六炭糖であり、ＮはＮ−Ｄ−アセチルヘキソサミン，好ましくはＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ，より好ましくはＧｌｃＮＡｃであり、ＦはＬ−フコースである。
【００２６】
本方法は、ある好ましい様態においては、Ｎ−グリカンに関し、Ｎ−グリカンは１のジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンを含み、好ましくはＮ−グリカンは、式ＮｅｕＡｃαＮｅｕＡｃαＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃに従う１のジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンエピトープを含む。化学構造用の好ましい結合剤は抗体Ｓ２−５６６（生化学工業株式会社）と同様の特異性を有する抗体を含む。
【００２７】
Ｎ−グリカンの化学構造は、式ＯＳ１：（ＮｅｕＡｃα）ｍＧａｌβ（Ｆｕｃα３／４）ｎ１ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［Ｍａｎα６］ｎ２）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎ３ＧｌｃＮＡｃの式に従い、ｎ１、ｎ２、及びｎ３は０又は１の整数であり、だたし、ｎ１が０の場合はｎ３は１、ｎ１が１の場合はｎ３は０とするか、あるいはｎ１及びｎ３の双方が０とし、ｍが２又は３の整数であることを特徴とする。
【００２８】
より好ましくは、Ｎ−グリカンの化学構造は、式（ＮｅｕＡｃα）ｍＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［Ｍａｎα６］ｎ２）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎ３ＧｌｃＮＡｃに従い、変数は式ＯＳ１に記載されたものと同様であり、更により好ましくは、ＮｅｕＡｃαＮｅｕＡｃαＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［Ｍａｎα６］ｎ２）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎ３ＧｌｃＮＡｃに従い、変数は式ＯＳ１に記載されたものと同様である。
【００２９】
［ジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンエピトープＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃ］
別個の様態においては、Ｎ−グリカンは式ＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃに従う１のジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンエピトープを含み、ＸはＡｃ又はＧｃであり、好ましくはＮ−グリカンは組成Ｓ２Ｇ１Ｈ５Ｎ４及びＳ１Ｇ２Ｈ５Ｎ４を有する。より好ましくは、Ｎ−グリカンの化学構造は、式（ＮｅｕＸα）ｍ１１ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［ＮｅｕＸα］ｍ２ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃに従い、ＸはＧｃかＡｃかのいずれかであり、ただし、少なくとも１のＧｃ又はＡｃが分子中にあり、ＧｃとＡｃの双方がジシアル酸エピトープ中にありうるとし、ｍ１が２かつｍ２が１であるか、あるいはｍ２が２かつｍ１が１であり、シアル酸残基はＧａｌにα３又はα６結合されるか、ＧｌｃＮＡｃにα６結合されるか、あるいは、互いにα８又はα９結合される。Ｇａｌ残基はβ３及び／又はβ４結合される。
【００３０】
より好ましくは、Ｎ−グリカンの化学構造は、式ＮｅｕＸαＧａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＮｅｕＸαＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、及び／又は、他の分枝異性体ＮｅｕＸαＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＮｅｕＸαＧａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃに従う。
【００３１】
［組成Ｓ２Ｈ４Ｎ５Ｆ１を有するジシアル酸付加されたグリカン］
本発明は更に、ジシアル酸付加されたグリカンに関し、組成Ｓ２Ｈ４Ｎ５Ｆ１を有し、好ましくはグリカンは式ＧｌｃＮＡｃβ｛（ＮｅｕＡｃα）２ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）［ＧｌｃＮＡｃβ］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃ｝、又は（ＮｅｕＡｃα）２ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）［ＧｌｃＮＡｃβ４］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃ、又は（ＮｅｕＡｃα）２ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧａｌＮＡｃβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃ、又はＮｅｕＡｃαＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＮｅｕＡｃαＧａｌＮＡｃＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃに従う化学構造を有する。
【００３２】
［好ましい細胞型］
分析すべき好ましい細胞は、幹細胞及びこれらから分化する細胞を含む。好ましい幹細胞はヒト造血幹細胞、胚性幹細胞，又は間葉幹細胞の群から選択され、好ましい細胞は直接的にそれから得られる。好ましくは、造血細胞及び間葉幹細胞は臍帯血又は骨髄由来のヒト細胞である。
【００３３】
［細胞の状態の分析］
本発明は特に、
ａ）細胞の分化状態、及び／又は、
ｂ）幹細胞と幹細胞から分化した細胞型との間で分析されうる好ましい様態においては、分化の分析が分化状態及び細胞型状態の双方の分析を含む、細胞型における差異、及び／又は、
ｃ）好ましくは、細胞培養又は精製試薬による抗原性又は免疫原性の炭水化物のような外来性物質の炭水化物の効果に関するコンタミネーション状態、
を好ましくは含む、幹細胞の状態の分析に関する。
【００３４】
特異的な様態においては、本発明はジシアル酸付加された化学構造の分析による、幹細胞の調製中のコンタミネーションの分析に関し、好ましくは特徴的なジシアル酸付加されたエピトープの分析と、ジシアル酸付加されたエピトープ中の異常なシアル酸、好ましくはＮｅｕＧｃの存在の分析とを好ましくは含む。本明細書で、用語「コンタミネーション（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）」は更に、外来性物質によるコンタミネーションの危険性を含み、コンタミネーションの分析は更に、本発明による細胞での使用を目的とした細胞培養物質のような外来性物質によるコンタミネーションの危険の分析を含む。
【００３５】
ある好ましい様態においては、ＮｅｕＧｃのコンタミネーションは非ヒト性物質のような外来性物質の炭水化物、好ましくは、動物性細胞（フィーダ細胞を含む）のような動物性（本明細書では非ヒト動物とする）物質、あるいは、糖タンパク質、単糖、オリゴ糖、グリカン、又は糖脂質のような動物性物質由来の細胞培養物質と接触中である細胞から分析される。ある好ましい様態においては、タンパク質に関連するコンタミネーションが分析され、本発明による細胞の糖タンパク質、及び／又は外来性物質の糖タンパク質の分析を含む。別個の好ましい様態においては、糖脂質に関連するが分析され、本発明による細胞の糖脂質、及び／又は外来性物質の糖脂質の分析を含む。
【００３６】
ある好ましい様態においては、細胞の分化及び／又は細胞型状態、ならびにコンタミネーション状態が分析される。
【００３７】
［少なくとも１のＮ−アセチルラクトサミン残基を含む新規のオリゴシアル酸付加されたＮ−グリカン］
本発明は、Ｎ−アセチルラクトサミン又は１のジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンユニットにつき少なくとも２のシアル酸残基を含む、幹細胞及び対応する分化細胞による新規のオリゴシアル酸付加されたＮ−グリカン化学構造を明らかにした。ある好ましい様態においては、グリカンは１のＮ−アセチルラクトサミン残基のみを含む、単分岐型グリカンである。幹細胞は好ましくはヒト幹細胞である。
【００３８】
本発明はＮ−アセチルラクトサミン及びグリカンを含む２のシアリル残基が、多数の型の幹細胞及び造血性、胚性及び間葉幹細胞を含むその派生物のキャラクタリゼーション用に有用であることを明らかにした。
【００３９】
［好ましい末端部の（ＮｅｕＡｃα）２ＧａｌβＧｌｃＮＡｃエピトープ］
ＬａｃＮＡｃジシアル酸である（ＮｅｕＡｃα）２ＧａｌβＧｌｃＮＡｃエピトープは
１）シアル酸が好ましくはα８及び／又はα９結合、より好ましくはα８結合によって互いに結合される、ジシアリル化学構造と、
２）シアル酸が１型のＮ−アセチルラクトサミン化学構造：ＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃ中のＧａｌ及びＧｌｃＮＡｃに結合され、ＸがＧｃ及び／又はＡｃである非直鎖状にジシアル酸付加された化学構造と、
の２の型の末端部化学構造に対応する。
【００４０】
［好ましい末端部のＮｅｕＡｃαＮｅｕＡｃαＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃエピトープ］
例えば、特異的なβ４ガラクトシダーゼ（例えば、肺炎球菌ガラクトシダーゼ）の消化によって観察可能な、２型のＮ−アセチルラクトサミンは胚性幹細胞のＮ−グリカン中の主要なグリカン型であり、従って、発明はより好ましくは、特にＳ２／３Ｈ３Ｎ４Ｆ０／１（例えば、式）中にある化学構造（例えば、以下のような式ＯＳ３）：ＮｅｕＡｃαＮｅｕＡｃα３／６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα３／６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、更に好ましくはＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、のオリゴシアリルエピトープに対応する、末端部のエピトープの化学構造に関することが理解される。これらの化学構造は胚性幹細胞で見られるＳ２Ｈ３Ｎ３／４Ｆ１の化学構造、並びに、相同的な造血細胞のＳ２／３Ｈ３Ｎ４Ｆ０／１の化学構造、間葉型細胞で見られるＳ２Ｈ３Ｎ３／４Ｆ０／１の化学構造、及び胚性幹細胞のＳ２Ｈ４Ｎ５Ｆ１の化学構造を含更なる末端部の末端部ＧｌｃＮＡｃが特に好ましい。
【００４１】
［好ましい末端部のＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃエピトープ］
ある好ましい様態においては、本発明は１型のＮ−アセチルラクトサミン化学構造：ＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃに関し、二分岐型グリカンを含むＮｅｕＧｃに関し、特に胚性幹細胞のＮ−グリカンを含むＮｅｕＧｃのコンテキストにおいて、ＸはＧｃ及び／又はＡｃであり、好ましくはＸ群のうちの少なくとも１つはＧｃである。
【００４２】
［単糖組成及び質量分析シグナル］
幹細胞のグライコーム中のオリゴシアル酸付加された化学構造の好ましい群は、以下の質量分析シグナルに対応するグリカン：
ｍ／ｚ  １６９４でのシグナル（Ｓ２Ｈ３Ｎ３）、
ｍ／ｚ  １８４０でのシグナル（Ｓ２Ｈ３Ｎ３Ｆ１）、
ｍ／ｚ  １８５６でのシグナル（Ｓ２Ｈ４Ｎ３）、
ｍ／ｚ  ２００２でのシグナル（Ｓ２Ｈ４Ｎ３Ｆ１）、
ｍ／ｚ  ２２９４でのシグナル（Ｓ３Ｈ４Ｎ３Ｆ１）、
ｍ／ｚ  ２４０８でのシグナル２４０８（Ｓ２Ｈ４Ｎ５Ｆ１）、
ｍ／ｚ  ２５２８でのシグナル（Ｓ２Ｇ１Ｈ５Ｎ４）、及び
ｍ／ｚ  ２５４４でのシグナル（Ｓ１Ｇ２Ｈ５Ｎ４）であり、
好ましい単糖組成はシグナルの後に付与している。ＳはＮｅｕ５Ａｃであり、ＧはＮｅｕ５Ｇｃであり、ＨはＤ−Ｍａｎ又はＤ−Ｇａｌの群から選択される六炭糖であり、ＮはＮ−Ｄ−アセチルヘキソサミン、好ましくはＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ、より好ましくはＧｌｃＮＡｃであり、ＦはＬ−フコースである。
【００４３】
好ましい単糖組成はこのように、式Ｃ：ＳｋＨｎＮｐＦｑに従い、ｋは２ないし５の整数であり、ｎは３ないし６の整数であり、ｐは３ないし５の整数であり、ｑは０又は１となる整数であり、ＳはＮｅｕ５Ａｃ又はＮｅｕ５Ｇｃであり、ＨはＤ−Ｍａｎ又はＤ−Ｇａｌの群から選択される六炭糖であり、ＮはＮ−Ｄ−アセチルヘキソサミン、好ましくはＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ、より好ましくはＧｌｃＮＡｃであり、ＦはＬ−フコースである。
【００４４】
脱プロトン化した単一荷電イオンのシグナルは、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって陰イオンモード分析用に与えられるが、単糖組成に基づき同じ分子組成に対応するいくつかの他のシグナルが、他の分析可能な非共有結合性の付加イオン（カリウム／ナトリウムの付加物のような）又はシグナル、又はグリカンの単糖組成に対応する組成物、又はグリカンの化学的派生物のように測定されうる
【００４５】
［Ｓ２／３Ｈ３Ｎ３／４Ｆ０／１の化学構造の好ましい群］
幹細胞のグライコーム中のオリゴシアル酸付加された化学構造の好ましい群は、
ｍ／ｚ  １６９４でのシグナル（Ｓ２Ｈ３Ｎ３）、
ｍ／ｚ  １８４０でのシグナル（Ｓ２Ｈ３Ｎ３Ｆ１）、
ｍ／ｚ  １８５６でのシグナル（Ｓ２Ｈ４Ｎ３）、
ｍ／ｚ  ２００２でのシグナル（Ｓ２Ｈ４Ｎ３Ｆ１）、
ｍ／ｚ  ２２９４でのシグナル（Ｓ３Ｈ４Ｎ３Ｆ１）
に対応するグリカンである。
【００４６】
この群は同様の単糖組成を含むことが理解される。グリカンは胚性幹細胞中、造血幹細胞中、及び間葉幹細胞中にあるオリゴシアル酸付加された化学構造を有する組成に類似する。このように、この型の化学構造は、多数の方の幹細胞に関する方法、特に分析用に好ましい。最も好ましくは、本発明はヒト幹細胞の認識に関する。
【００４７】
ある好ましい様態においては、本発明は、組成が式ＯＳ１：（ＮｅｕＡｃα）ｍＧａｌβ（Ｆｕｃα３／４）ｎ１ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［Ｍａｎα６］ｎ２）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎ３ＧｌｃＮＡｃに従う単分岐型でＮ−グリカン型の化学構造を含む場合に、組成Ｓ２Ｈ３Ｎ３、Ｓ２Ｈ３Ｎ３Ｆ１、Ｓ２Ｈ４Ｎ３、Ｓ２Ｈ４Ｎ３Ｆ１及びＳ３Ｈ４Ｎ３Ｆ１を有する、好ましいオリゴシアル酸付加されたＮ−グリカンの化学構造の分析に関し、ｎ１、ｎ２、及びｎ３は０又は１の整数であり、ただし、ｎ１が０の場合はｎ３は１、ｎ１が１の場合はｎ３は０とするか、あるいはｎ１及びｎ３の双方が０とし、ｍは２又は３の整数である。最も好ましくは、組成は式：（ＮｅｕＡｃα）ｍＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［Ｍａｎα６］ｎ２）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎ３ＧｌｃＮＡｃに従う化学構造を含み、変数は式ＯＳ１に記載されるのと同じである。
【００４８】
［質量分析法又は特異的な結合試薬による分析方法］
本発明は特に、特異的な結合剤試薬による、及び／又は、グリカン化学構造の質量分析的なプロファイリングによる末端部の化学構造の認識に関する。
【００４９】
ある好ましい様態においては、本発明は化学構造の認識、及び／又は化学構造に対応する質量分析シグナルに基づく組成に関する。
【００５０】
好ましい結合剤試薬は末端部のエピトープのような特徴的な化学構造のエピトープ、及び／又は、Ｍａｎαの分枝を含むか、あるいはＭａｎαの分枝を含まない単分岐型化学構造のような特徴的な分枝するエピトープに関する。別の好ましい様態においては、本発明はＮ−アセチルラクトサミンと、少なくとも２のシアル酸残基とを含む末端部のオリゴシアル酸エピトープの認識に関する。好ましい結合剤は抗体であり、より好ましくはモノクローナル抗体である。
【００５１】
ある好ましい様態においては、ＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃ、より好ましくはＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＧｃα６）ＧｌｃＮＡｃ、及び／又はＮｅｕＧｃα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＡｃα６）ＧｌｃＮＡｃの群から選択される化学構造のうち少なくとも１つを特に認識するモノクローナル抗体に関する。別個の様態においては、抗体はＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃに結合され、化学構造中のＮｅｕＧｃの存在とは本質的に独立して有効に結合され、このような抗体は化学構造のいくつかの異性体形態を有効に認識し、好ましい化学構造の認識に有効であることが理解される。
【００５２】
ある好ましい様態においては、ＮｅｕＡｃαＮｅｕＡｃα３／６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、より好ましくはＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、及び／又はＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃの群から選択される化学構造のうち少なくとも１つを特に認識するモノクローナル抗体に関する。ある好ましい様態においては、本発明はＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ、又はより短いエピトープであるＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃαＧａｌを認識する場合の抗体の使用に関し、これらに用いられる多数のこのような抗体及び方法は、当該技術分野で既知であることが理解される。
【００５３】
［ＣＤ１３３＋造血幹細胞のＮ−グライコーム中にオリゴシアル酸付加されたラクトサミン化学構造］
本発明は造血幹細胞中にある新規のオリゴシアル酸付加された化学構造を明らかにする。陰イオンモードにおけるＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析法はｍ／ｚ  １８５６及びｍ／ｚ  ２２９４でのシグナルを明らかにする。シグナルは臍帯血由来のＣＤ１３３陽性造血幹細胞中に特異的に存在するが、対応するＣＤ１３３陰性造血幹細胞にはないグリカンの化学構造を示す。表１を参照されたい。本発明はある好ましい様態においては、造血幹細胞の分析用の質量分析シグナルの使用に関する。
【００５４】
ｍ／ｚ  １８５６でのシグナルに割り当てられる好ましい単糖組成はＳ２Ｈ４Ｎ３であり、ｍ／ｚ  １８５６はＳ３Ｈ４Ｎ３Ｆ１である。
【００５５】
［好ましいＳ２／３Ｈ３Ｎ４Ｆ０／１の化学構造］
造血幹細胞のグライコーム中のオリゴシアル酸付加された化学構造の好ましい部分群はｍ／ｚ  １８５６でのシグナル（Ｓ２Ｈ４Ｎ３）及びｍ／ｚ  ２２９４でのシグナル（Ｓ３Ｈ４Ｎ３Ｆ１）に対応するグリカンである。これらは好ましい同様の組成群を形成する。グリカンは胚性幹細胞中及び間葉幹細胞中に存在するオリゴシアル酸付加された化学構造と組成において類似性を有する。このように、この型の化学構造は多重型の幹細胞に関する方法、特に分析に好ましい。
【００５６】
ある好ましい様態においては、組成が単分岐型でＮ−グリカン型の化学構造の式ＯＳ２：（ＮｅｕＡｃα）ｍＧａｌβ（Ｆｕｃα３／４）ｎ１ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎ３ＧｌｃＮＡｃを含む場合に、本発明は組成Ｓ２Ｈ３Ｎ３及びＳ２Ｈ４Ｎ３Ｆ１を有する、好ましいオリゴシアル酸付加されたＮ−グリカンの化学構造の分析に関し、ｎ１及びｎ３は０又は１の整数であり、ただし、ｎ１が０の場合はｎ３は１、ｎ１が１の場合は３２は０とし、ｍは２又は３の整数である。より好ましくは、組成は式（ＮｅｕＡｃα）２ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎ３ＧｌｃＮＡｃに従う化学構造を含み、変数は式ＯＳ３に記載のものと同様である。
【００５７】
［ヒト胚性幹細胞］
本発明は胚性幹細胞中に存在する新規のオリゴシアル酸付加された化学構造に関する。陰イオンモードにおけるＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析法はｍ／ｚ  １８４０及びｍ／ｚ  ２００２、ｍ／ｚ  ２４０８、ｍ／ｚ  ２５２８、ならびにｍ／ｚ  ２５４４でのシグナルを示した。シグナルは特定の分化段階で胚性幹細胞中に特異的に存在するが、コントロール細胞（ｍＥＦ）中に存在しないか、より弱く存在するグリカンの化学構造を示す。表２を参照されたい。本発明は好ましい様態においては、様々な分化段階での胚性型幹細胞の分析用の、特異的なシグナルの使用に関する。
【００５８】
ｍ／ｚ  １８４０でのシグナルに割り当てられる好ましい単糖組成はＳ２Ｈ３Ｎ３Ｆ１であり、ｍ／ｚ  ２００２でのシグナルについてがＳ２Ｈ４Ｎ３Ｆ１であり、ｍ／ｚ  ２４０８でのシグナルについてがＳ２Ｈ４Ｎ５Ｆ１であり、ｍ／ｚ  ２５２８でのシグナルについてがＳ２Ｇ１Ｈ５Ｎ４であり、ｍ／ｚ  ２５４４についてのシグナルがＳ１Ｇ２Ｈ５Ｎ４である。本発明はオリゴ糖及びオリゴ糖派生物、特に胚性幹細胞の分析用のグリコシド修飾及び／又は完全メチル化されたオリゴ糖組成に関する。
【００５９】
本発明は好ましい様態においては、様々な分化段階での胚性型幹細胞の分析用の好ましい単糖組成での、グリカン化学構造の使用に関する。
【００６０】
［好ましいＳ２Ｈ３Ｎ３／４Ｆ１の化学構造の部分群］
胚性幹細胞のグライコーム中のオリゴシアル酸付加された化学構造の好ましい部分群は、ｍ／ｚ  １８４０でのシグナル（Ｓ２Ｈ３Ｎ３Ｆ１）、及び同様の組成でのｍ／ｚ  ２００２でのシグナル（Ｓ２Ｈ４Ｎ３Ｆ１）に対応するグリカンである。グリカンは造血幹細胞中に存在するオリゴシアル酸付加された化学構造、及び間葉幹細胞中に存在するオリゴシアル酸付加された化学構造と、組成において類似性を有する。このように、この型の化学構造は多重型の胚性幹細胞に関する方法、特に分析に好ましい。
【００６１】
ある好ましい様態においては、組成が単分岐型でＮ−グリカン型の化学構造である式ＯＳ３：（ＮｅｕＡｃα）２Ｇａｌβ（Ｆｕｃα３／４）ｎ１ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［Ｍａｎα６］ｎ２）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎ３ＧｌｃＮＡｃを含む場合に、組成Ｓ２Ｈ３Ｎ３Ｆ１及びＳ２Ｈ３Ｎ４Ｆ１を有する好ましいオリゴシアル酸付加されたＮ−グリカンの化学構造の分析に関し、ｎ１、ｎ２及びｎ３は０又は１の整数であり、ただし、ｎ１が０の場合はｎ２は１、ｎ１が１の場合はｎ２は０とする。より好ましくは、組成は式（ＮｅｕＡｃα）２ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［Ｍａｎα６］ｎ２）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎ３ＧｌｃＮＡｃに従う化学構造を含み、変数は式ＯＳ３のものと同様である。
【００６２】
［好ましいＳ２Ｈ４Ｎ５Ｆ１の化学構造の部分群］
胚性幹細胞のグライコーム中のオリゴシアル酸付加された化学構造の好ましい部分群は、ｍ／ｚ  ２４０８でのシグナル（Ｓ２Ｈ４Ｎ５Ｆ１）に対応するグリカンである。グリカンは表２に示されるように、胚性幹細胞の分化中の量において特異な減少を伴う。このように、この型の化学構造は幹細胞、ある好ましい様態においては、胚性型幹細胞に関する方法、特に分析方法に好ましい。
【００６３】
［Ｓ２Ｈ４Ｎ５Ｆ１の化学構造を含む末端部のＧｌｃＮＡｃ］
ある好ましい様態においては、本発明は組成が末端部のジシアリル（ｄｉａｓｉａｌｙｌ）エピトープと、末端部のＨｅｘＮＡｃの化学構造とを有する二分岐型でＮ−グリカン型の化学構造を含む場合に、組成Ｓ２Ｈ４Ｎ５Ｆ１の化学構造を有する、好ましいオリゴシアル酸付加されたＮ−グリカンの化学構造の分析に関し、ある好ましい様態においては、ＧｌｃＮＡｃ残基である。ＧｌｃＮＡｃ残基はＧｌｃＮＡｃβ２と、末端部のＨｅｘＮＡｃの化学構造のようなＮ−グリカンの基幹に連結され、ある好ましい様態においては、Ｍａｎβ４の化学構造：ＧｌｃＮＡｃβ｛（ＮｅｕＡｃα）２ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）［ＧｌｃＮＡｃβ］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃ｝、より好ましくは（ＮｅｕＡｃα）２ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）［ＧｌｃＮＡｃβ４］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃに連結される更に分岐するＧｌｃＮＡｃと、に好ましくは対応する。
【００６４】
［Ｓ２Ｈ４Ｎ５Ｆ１の化学構造を含むＬａｃｄｉＮＡｃ］
ある好ましい様態においては、本発明は組成が末端部のＬａｃｄｉＮＡｃ化学構造を有する二分岐型でＮ−グリカン型の化学構造を含む場合に、組成Ｓ２Ｈ４Ｎ５Ｆ１の化学構造を有する、好ましいオリゴシアル酸付加されたＮ−グリカンの化学構造の分析に関する。ＬａｃｄｉＮＡｃエピトープは化学構造ＧａｌＮＡｃβＧｌｃＮＡｃ、好ましくはＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃを有し、好ましいシアル酸付加されたＬａｃｄｉＮＡｃエピトープは既知の哺乳類のグリカン化学構造に基づく、化学構造ＮｅｕＡｃα６ＧａｌＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃを有する。好ましいシアリルラクトサミンの化学構造はＮｅｕＡｃα３／６Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃを含む。
【００６５】
本発明は特に、末端部のジシアリル（ｄｉａｓｉａｌｙｌ）エピトープ及び式（ＮｅｕＡｃα）２ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧａｌＮＡｃβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃに従う末端のＬａｃｄｉＮＡｃ化学構造、及び／又は、末端部のシアリルラクトサミンエピトープ及び式ＮｅｕＡｃαＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＮｅｕＡｃαＧａｌＮＡｃＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ＧｌｃＮＡｃに従うシアル酸付加されたＬａｃｄｉＮＡｃエピトープを有する組成に関する。シアリルＬａｃｄｉＮａｃを含む化学構造が必ずしも末端部のジシアリルエピトープを含まないが、グリカンは通常の２のシアル酸を含むグリカンとしてこの群に分類され、胚性幹細胞の分化と更に関連することは理解される。
【００６６】
［Ｓ２ＧｌＨ５Ｎ４及びＳ１Ｇ２Ｈ５Ｎ４を含む化学構造の好ましい部分群］
ある好ましい様態においては、本発明は、組成が２のＮ−アセチルラクトサミンと、好ましくはＮｅｕＧｃ（Ｇ）かＮｅｕＡｃ（Ｓ）かのいずれかの残基である３のシアル酸残基、ひいてはＮ−アセチルラクトサミンユニットにつき少なくとも２のシアル酸残基とを含む場合に、組成Ｓ２Ｇ１Ｈ５Ｎ４及びＳ１Ｇ２Ｈ５Ｎ４の化学構造を有する、好ましいオリゴシアル酸付加されたＮ−グリカンの化学構造の分析に関する。
【００６７】
この化学構造の群は胚性幹細胞のコンテキストにおいて特に好ましい。
動物性タンパク質によるコンタミネーションのコンテキストにおいて、ＮｅｕＧｃを含む化学構造を分析するのに有用であることは更に理解される。別の好ましい様態においては、組成は、グリカンの末端部のジシアル酸エピトープを認識する動物性タンパク質によるコンタミネーションのコンテキストにおいて分析される。特異的な好ましい様態においては、末端部のエピトープは、コンタミネーションするポテンシャルのある動物性タンパク質と同様の、１型のＮ−アセチルラクトサミンのジシアロエピトープＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）である。
【００６８】
本発明は好ましくは、式ＯＳ−Ｇｃ：（ＮｅｕＸα）ｍ１ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［ＮｅｕＸα］ｍ２ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃに従う化学構造に関し、ＸはＧｃかＡｃかのいずれかであり、ただし、少なくとも１のＧｃ又はＡｃが分子中にあり、ＧｃとＡｃの双方がジシアル酸エピトープ中にありうるとし、ｍ１が２かつｍ２が１であるか、あるいはｍ２が２かつｍ１が１であり、シアル酸残基はＧａｌにα３又はα６結合されるか、ＧｌｃＮＡｃにα６結合されるか、あるいは、互いにα８又はα９結合される。Ｇａｌ残基はβ３及び／又はβ４結合される。
【００６９】
ある好ましい様態においては、式ＯＳ−Ｇｃに従う化学構造は２型のＮ−アセチルラクトサミンと、２のシアル酸残基：（ＮｅｕＸα）ｍ１Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［ＮｅｕＸα］ｍ２Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、より好ましくはＮｅｕＸαＮｅｕＸαＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＮｅｕＸαＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、及び／又は、他の分枝異性体ＮｅｕＸαＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＮｅｕＸαＮｅｕＸαＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃと、を含む。
【００７０】
別個の好ましい様態においては、式ＯＳ−Ｇｃに従う化学構造は１型のＮ−アセチルラクトサミンと、２のシアル酸残基：ＮｅｕＸαＧａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＮｅｕＸαＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、及び／又は、他の分枝異性体ＮｅｕＸαＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＮｅｕＸαＧａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃと、を含む。
【００７１】
［間葉幹細胞］
本発明は間葉幹細胞と間葉幹細胞からの分化細胞とに存在する新規のオリゴシアル酸付加された化学構造に関し、ともに間葉型幹細胞とみなされる。陰イオンモードにおけるＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析法はｍ／ｚ  １６９４、ｍ／ｚ  １８４０、ｍ／ｚ  １８５６、及びｍ／ｚ  ２００２でのシグナルを示した。シグナルは特定の分化段階で間葉型細胞中に特異的に存在するが、細胞培養培地のコントロール（ヒトのＡＢ型血清を指すＡｂｓｅｒｕｍ、又はウシ胎仔血清を指すＦＣＳ）には存在しないグリカンの化学構造を示す。表３を参照されたい。本発明は好ましい様態においては、様々な分化段階での間葉型細胞の幹細胞の分析用の特異的なシグナルの使用に関する。
【００７２】
［好ましいＳ２Ｈ３Ｎ３／４Ｆ０／１の化学構造］
間葉幹細胞のグライコームにおけるオリゴシアル酸付加された化学構造の好ましい群は、
ｍ／ｚ  １６９４でのシグナル（Ｓ２Ｈ３Ｎ３）、
ｍ／ｚ  １８４０でのシグナル（Ｓ２Ｈ３Ｎ３Ｆ１）、
ｍ／ｚ  １８５６でのシグナル（Ｓ２Ｈ４Ｎ３）、及び
ｍ／ｚ  ２００２でのシグナル（Ｓ２Ｈ４Ｎ３Ｆ１）
に対応するグリカンである。この群は同様の単糖組成を含むことは理解される。グリカンは胚性幹細胞中に存在するオリゴシアル酸付加された化学構造、及び、造血幹細胞中のオリゴシアル酸付加された化学構造と組成において類似性を有する。このように、この型の化学構造は多重型の幹細胞、ある好ましい様態においては、間葉型幹細胞に関する方法、特に分析に好ましい。
【００７３】
ある好ましい様態においては、本発明は、組成が式ＯＳ４：（ＮｅｕＡｃα）２Ｇａｌβ（Ｆｕｃα３／４）ｎ１ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［Ｍａｎα６］ｎ２）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎ３ＧｌｃＮＡｃに従う単分岐型でＮ−グリカン型の化学構造を含む場合に、組成Ｓ２Ｈ３Ｎ３、Ｓ２Ｈ３Ｎ３Ｆ１、Ｓ２Ｈ４Ｎ３、及びＳ２Ｈ４Ｎ３Ｆ１を有する、好ましいオリゴシアル酸付加されたＮ−グリカンの化学構造の分析に関し、ｎ１、ｎ２、及びｎ３は０又は１の整数であり、だたし、ｎ１が０の場合はｎ３は１、ｎ１が１の場合はｎ３は０とするか、あるいはｎ１及びｎ３の双方が０とする。より好ましくは、組成は式（ＮｅｕＡｃα）２ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［Ｍａｎα６］ｎ２）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎ３ＧｌｃＮＡｃに従う化学構造を含み、変数は式ＯＳ４に記載のものと同様である。
【００７４】
［異常なジシアリル及び他のシアリルの化学構造の組成］
本発明は更に基幹化学構造と別個の、本発明による好ましいジシアリルエピトープに関する。本発明は特に、幹細胞のグリカンの化学構造、特に胚性幹細胞のグリカンの分析に関し、これらは陰性モードにおいてｍ／ｚ  １６７９の質量分析シグナルの組成Ｓ２Ｈ２Ｎ３Ｆ１と、ｍ／ｚ  １８００でのシグナルのＳ２Ｈ４Ｎ２Ｆ１とを有する異常なグリカンの化学構造を含む。シグナルは分化中に増加した。本発明は更に組成Ｓ１Ｈ６Ｎ４Ｆ１Ａｃ、Ｓ１Ｈ７Ｎ５Ｆ１Ａｃを有する異常なグリカンの質量シグナル及び／又は単糖組成の存在の特異的な分析に関し、本発明は、好ましくは化学構造がＮｅｕＡｃ上にある７、８、又は９−Ｏ−アセチル基の群、最も好ましくは９−ＯＡｃから選択される、Ｏ−アセチル基によって修飾されるシアル酸を含む場合の特異的な化学構造に関することが好ましい。本発明は特にシアル酸の認識に関し、化学構造Ａｃ−ＮｅｕＡｃα３／６ＧａｌβＧｌｃＮＡｃ中にある場合、シアルは質量分析スキャン中の質量分析フラグメントとして、又はエピトープを認識するモノクローナル抗体によって認識でき、好ましくはＮ−グリカンに結合される。本発明は特に、グリカンと、２段階又は３段階の細胞への胚性幹細胞の分化のコンテキストにおける、アセチル化されたシアル酸の分析に関する。
【００７５】
［幹細胞命名法］
本発明は総ての幹細胞型、特にヒト幹細胞の分析に関する。幹細胞の一般命名法は図５に記載する。本発明の代替的な命名法は、ある好ましい様態においては、図５に示されるように成体幹細胞の等価物（臍帯血型の物質を含む）である、初期のヒト細胞について述べている。骨髄及び血液中の成体幹細胞は「血液関連組織（ｂｌｏｏｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ）」からの幹細胞と等価である。
【００７６】
［好ましい型の初期のヒト細胞］
本発明は特異的に、組織起源の細胞及び／又はその分化状態に基づく、初期のヒト細胞と見なされる特異的な型の幹細胞に関する。
【００７７】
本発明は特異的に、多能性細胞を意味する初期のヒト細胞集団と、熟成した、細胞が得られるドナー個体及び組織型を含む細胞の起源に基づく、その得られた細胞集団とに関し、好ましい臍帯血、ならびに加齢した個体又は成体からの骨髄とを含む。
【００７８】
好ましい分化状態に基づく分類は、好ましくは「固形組織前駆体（ｓｏｌｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）」細胞、より好ましくは「間葉幹細胞」、又は、固形組織に分化するか、あるいは外胚葉性、中胚葉性、内胚葉性のいずれかの細胞に、より優先的には間葉幹細胞に分化することが可能な細胞を含む。
【００７９】
本発明は更に、細胞培養に関する状態に基づく初期のヒト細胞の分類と、２の主要な型の細胞物質とに関する。本発明は好ましくは、新鮮な細胞、凍結した細胞、及び培養した細胞を含む初期のヒト細胞の２の主要な細胞物質型に関する。
【００８０】
［臍帯血細胞、胚性型細胞、及び骨髄細胞］
本発明は特異的に、多能性細胞を意味する初期のヒト細胞集団と、熟成した、細胞が得られるドナー個体及び組織型を含む細胞の起源に基づく、その得られた細胞集団とに関し、
ａ）臍帯血及び関連物質に関する１）ヒト新生児のような初齢の細胞、及び２）胚性細胞型の物質
ｂ）好ましくは骨髄細胞を含む、ヒトの「血液関連組織」から好ましくは得られる、加齢した個体（非新生児、好ましくは成体）からの幹及び前駆体細胞を含む。
【００８１】
［固形組織、好ましくは間葉幹細胞に分化する細胞］
本発明は好ましい様態下においては特異的に、「固形組織前駆体」とみなされる非造血性組織に分化することが可能な細胞に関し、血液細胞以外の細胞に分化する細胞になる。より好ましくは、固形組織への分化のために生成される細胞集団は「間葉型細胞」であり、中胚葉起源の細胞、より好ましくは間葉幹細胞に有効に分化可能な多能性細胞である。ほとんどの従来技術は、本発明による間葉型細胞及び間葉幹細胞と非常に異なる特徴を有する造血細胞に関する。
【００８２】
本発明による好ましい固形組織前駆体は、選択された臍帯血の多能性細胞集団、臍帯血から培養された間葉幹細胞、骨髄から培養／取得された間葉幹細胞、及び胚性型細胞を含む。より特異的な様態においては、好ましい固形組織前駆体細胞は間葉幹細胞、より好ましくは「血液に関連する間葉細胞」であり、更により好ましいのは骨髄又は臍帯血から得られる間葉幹細胞である。
【００８３】
特異的な様態下では、臍帯血のより多くの造血幹細胞型としてのＣＤ３４＋細胞、又は通常のＣＤ３４＋細胞は、固形組織前駆体細胞から除外される。
【００８４】
［新鮮な細胞及び培養した細胞］
［新鮮な細胞］
本発明は特に、健常な個体からの新鮮な細胞、好ましくは非修飾細胞、及び非操作の細胞に関する。
【００８５】
本発明は、ある好ましい様態においては、ドナーから単離された、細胞培養で培養されない細胞を意味する「新鮮な細胞（ｆｒｅｓｈ  ｃｅｌｌ）」に関する。現行の細胞培養手順が細胞の状態を変化させることは本発明によって理解される。細胞物質に関し個体ドナーの実際の状態に密接に対応する新鮮な細胞、及びポテンシャルのある新鮮な細胞集団は、直接的な移植療法に有用であり、あるいは更なる細胞物質の生成のためのポテンシャルのある素材物質であるため、本発明は特異的に、新鮮な細胞集団の分析に関する。
【００８６】
本願発明者は初期のヒト細胞から、最も好ましくは臍帯血細胞から得られる、好ましい新鮮な細胞集団における差異を示すことができた。本発明者はヒト臍帯血から特に「相同的な細胞集団」を生成することができた。これは本発明の様々な態様で特に好ましい。本発明は更に、新鮮な細胞のための細胞精製プロセスに対する本発明の特異的な態様に関し、特にコンタミネーションのポテンシャルの分析及び細胞の精製中のその分析に関する。
【００８７】
より好ましい様態においては、新鮮な細胞は健常な個体に関する／健常な個体から得られる物質である。健常な個体はヒトが癌の治療下ではないことを意味するが、これはこのような治療が細胞の状態を有効に変化させるからであり、別の好ましい様態においては、健常なヒトは細胞の状態を変化させる他の状態を含む他の主要な病気の治療を受けている。新鮮な細胞が例えば、癌患者への細胞移植のために、このような患者から以前に収集した細胞を用いて生成されることが必要とされうる、いくつかの場合においては、別個の態様下で、本発明は更に、このような細胞物質についての発明の分析及び他の態様に関することが理解される。
【００８８】
［非修飾細胞］
更により好ましくは、新鮮な細胞は、成長因子又はサイトカイン放出に影響を与える治療によって生体内で修飾されない細胞であることを意味する「非修飾細胞（ｎｏｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ）」である。例えば、幹細胞はＣＳＦ（コロニ刺激成長因子）のような成長因子によって末梢血に放出されうる。このような治療は好ましい新鮮な細胞から細胞の状態を変えると見なされる。修飾は特に分化を生じさせることにより、細胞の総て又は一部に永続的な変化を生じさせうる。
【００８９】
［非操作の細胞］
更により好ましくは、新鮮な細胞は、細胞の状態を永続的に変える治療によって操作されない細胞であることを意味する「非操作の細胞（ｎｏｎ−ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ）」であり、永続的な操作は細胞の遺伝的化学構造の変化を含む。操作は例えば、遺伝子トランスフェクション、ウィルス形質導入、及び放射線によって、又は細胞の遺伝的化学構造に影響を与える化学物質による変異の誘発を含む。
【００９０】
［特定の特異的に選択された造血幹細胞集団を除外した限定された新鮮な細胞］
より好ましい限定された新鮮な細胞群は特に有効的に、細胞及びその前駆体を形成する固形組織に関する。特異的な様態下で、この群はａ）末梢血又は骨髄からＣＤ３４＋細胞として選択された細胞集団のような、より多くの特異的に選択された造血幹細胞様の細胞集団を含まず、ｂ）別の限定された様態においては、更に全骨髄及び末梢血の単核細胞が除外される。新鮮な細胞集団は、細胞がそのマーカに関連して選択されない場合に、部分的にＣＤ３４＋と同一の細胞を含むことができることが理解される。固形組織が細胞を形成する場合、マーカに関連して選択される完全な細胞集団は本発明によって好まれないことが理解される。別の限定された様態は、臍帯血から特異的に選択されたＣＤ３４＋細胞集団、及び／又は、臍帯血からの全単核細胞を除外する。本発明は更に、総てのＣＤ３４＋細胞集団、及び／又は末梢血、骨髄、及び臍帯血の総ての全細胞集団が除外される場合、限定された新鮮な細胞集団に関する。本発明は更に、ＣＤ３４＋細胞集団が除外される場合、及び、ＣＤ３４＋細胞集団と上述の総ての３の全細胞集団が除外される場合、限定された新鮮な細胞集団に関する。
【００９１】
［培養細胞］
本発明者は初期のヒト細胞中に特異的なグリカンの化学構造と、細胞が培養される場合の本発明による好ましいその部分集団とを発見した。本発明による特定の特異的な化学構造は特に培養細胞について明らかにされ、本発明による特異的なグリカンの特異的な変化は、培養細胞集団中で明らかにされた。
【００９２】
本発明は、特異的な細胞培養関連の試薬、方法、及び、細胞培養プロセス中に有害なポテンシャルのある炭水化物のコンタミネーションによる危険がある場合に用いられうる分析を明らかにした。
【００９３】
［培養した修飾細胞］
培養細胞が細胞増殖を促進するために修飾されうることは更に理解される。特異的な様態下で、本発明は、サイトカイン及び／又は成長因子の作用により修飾された細胞を意味する、培養した「修飾細胞（ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ）」のための、分析及び本発明の他の態様に関する。本発明者は培養細胞中の初期の変化の一部が、修飾の特定の範囲に関することに留意する。
【００９４】
本発明は好ましくは、操作されない場合の培養細胞に関する。本発明は更に、特に環境放射線のような環境因子や、細胞調製に対し蓄積する有害なポテンシャルのある代謝物によって非意図的に誘発される場合の、細胞集団中の操作によって誘発される変化の観測に関する。
【００９５】
［好ましい型の培養細胞］
本発明は特異的に、好ましい培養細胞のような培養された固形組織前駆体に関する。より好ましくは本発明は、培養のための好ましい細胞型としての間葉型細胞及び胚性型細胞に関する。更により好ましい間葉型細胞は間葉幹細胞、より好ましくは、臍帯血又は骨髄から得られる間葉幹細胞である。
【００９６】
別個の様態下では、本発明は更に、好ましい培養細胞群としての培養した造血幹細胞に関する。
【００９７】
［多能性培養細胞の部分群］
本発明は特に、培養した多能性細胞及び細胞集団に関する。好ましい多能性培養細胞は細胞培養中に濃縮される様々な多能性細胞集団を意味する。本発明者は人工的に成長させた幹細胞型の細胞集団の特異的な特徴を明らかにすることができた。本発明による多能性細胞は好ましくはヒト幹細胞である。
【００９８】
［培養した間葉幹細胞］
本発明は特に間葉幹細胞に関する。最も好ましい型の間葉幹細胞は「血液関連の間葉細胞（ｂｌｏｏｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）」と見なされる血液関連組織、最も好ましくはヒト血液又は血液形成組織から、最も好ましくはヒト臍帯血又はヒト骨髄から得られるか、あるいは、別個の様態においては、胚性型細胞から得られる。臍帯血及び骨髄から得られる間葉幹細胞は別個であることが好ましい。
【００９９】
［培養した胚性型細胞及び細胞集団］
本発明者は本発明による培養した胚性型細胞の特異的な糖鎖付加の性質を明らかにできた。本発明は特異的に、本発明についての好ましい培養細胞としての様々な胚性型細胞に関する。
【０１００】
［初期の血液細胞集団及び対応する間葉幹細胞］
［臍帯血］
初期の血液細胞集団は、多能性細胞で濃縮された血液細胞物質を含む。好ましい初期の血液細胞集団は、多能性細胞、骨髄血液細胞、及び臍帯血細胞について濃縮された末梢血液細胞を含む。ある好ましい様態においては、本発明は初期の血液又は初期の血液由来の細胞集団から得られる間葉幹細胞、好ましくは細胞集団の分析に関する。
【０１０１】
［骨髄］
別個の好ましい、別の群の初期の血液細胞は骨髄血液細胞である。これらの細胞は更に多能性細胞を含む。ある好ましい様態においては、本発明は骨髄細胞集団から得られる間葉幹細胞、好ましくは細胞集団の分析に関する。
【０１０２】
［初期のヒト血液細胞の好ましい部分集団］
本発明は特異的に、初期のヒト細胞の部分集団に関する。ある好ましい様態においては、部分集団は抗体による選択によって、別の様態においては、特異的な細胞型に好ましい細胞培養によって生成される。ある好ましい様態においては、細胞は、好ましくは初期の血液細胞からの抗体選択方法によって生成される。好ましくは初期のヒト血液細胞は臍帯血細胞である。
【０１０３】
ＣＤ３４陽性細胞集団は比較的大きく異質性である。それは、特異的な細胞生成物を生成するのを目的とするいくつかのアプリケーションにとっ最適ではない。本発明は好ましくは、相同的な細胞集団と呼ばれる、ＣＤ３４マーカに結合させるのに選択されない細胞を意味する、特異的に選択される非ＣＤ３４の集団に関する。相同的な細胞集団は、例えばＣＤ１３３＋細胞集団に対応し、特異的に選択されたＣＤ３４＋細胞集団より小さくなるサイズを有する、より小さなサイズの単核細胞集団になり得る。好ましい相同的な、初期のヒト細胞の部分集団はＣＤ３４＋細胞集団より大きくなりうることは更に理解される。相同的な細胞集団はＣＤ３４＋細胞集団の部分集団にでき、好ましい様態においては、特異的にＣＤ１３３＋細胞集団又はＣＤ１３３型細胞集団である。本発明による「ＣＤ１３３型細胞集団（ＣＤ１３３−ｔｙｐｅ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」はＣＤ１３３＋細胞集団と同様であるが、ＣＤ１３３とは別のマーカに対して、好ましくは選択される。マーカは好ましくはＣＤ１３３で共発現されるマーカである。ある好ましい様態においては、本発明はＣＤ１３３型細胞集団としてのＣＤ１３３＋細胞集団又はＣＤ１３３＋部分集団に関する。好ましい相同的な細胞集団が更に特異的なＣＤ１３３型細胞として規定されうる以外の細胞集団を含むことは理解される。
【０１０４】
好ましくは相同的な細胞集団は、特異的な結合剤を、細胞集団の細胞表面マーカに結合することによって選択される。ある好ましい様態においては、相同的な細胞はＣＤ３４マーカと低い相関を有し、細胞表面上にあるＣＤ１３３と高い相関を有する細胞表面マーカによって選択される。好ましい細胞表面マーカは、ＣＤ１３３型細胞中に濃縮された、本発明によるα３にシアル酸付加された化学構造を含む。好ましくは完全な、純性のＣＤ１３３＋細胞集団は本発明による分析に好ましい。
【０１０５】
本発明はある好ましい様態においては、天然細胞に関し、遺伝的に修飾されない細胞を意味する。遺伝的修飾が修飾細胞から細胞及び基礎環境を変えることは知られている。本発明は更にある好ましい様態においては、新鮮な非培養細胞に関する。
【０１０６】
本発明は、特異的な分化能の細胞の分析のためのマーカの使用に関し、細胞は好ましくはヒト血液細胞、又は、より好ましくはヒト臍帯血細胞である。
【０１０７】
［細胞又は標的の化学構造を含む細胞成分を単離するための一般的方法］
本発明は、本発明により結合剤分子エピトープを接触させるステップを含む、細胞又は細胞成分の分画の単離方法に関する。対応する標的の化学構造は幹細胞上で発現され、細胞集団を含む、濃縮された標的の化学構造を単離するのに用いられる。
【０１０８】
細胞成分を単離する好ましい方法は、以下のステップ：
１）幹細胞標本を提供するステップと、
２）本発明による結合剤分子を、細胞又は細胞分画上にある、対応する標的の化学構造と接触させるステップと、
３）結合剤及び標的の化学構造の複合物を、細胞又は細胞物質の少なくとも一部から単離するステップと、
を含む。
【０１０９】
細胞の単離用の好ましい方法は、免疫磁気ビーズによる、又は他の細胞選別手段による、ある好ましい様態においてはＦＡＣＳによる選択を含む。
【０１１０】
本発明による細胞成分の単離は、特異的な結合剤によって結合されたグリカンの化学構造である、対応する標的の化学構造に本発明による結合剤分子を結合するステップを含む方法において、本発明による標的の化学構造を有するグリカンの増加（又は濃縮）量を含む分子分画の生成を意味する。
【０１１１】
成分は一般的に、細胞膜及び小器官分画と、可溶タンパク質、液体、及び遊離型のグリカン分画のような分画を有する可溶グリカンとを含む細胞膜分画といった細胞の化学構造の特異的な分画に濃縮されることは理解される。結合剤は全細胞分画に用いられうることは理解される。
【０１１２】
ある好ましい様態においては、標的の化学構造はプロテアーゼ又は洗浄性の可溶膜タンパク質により放出可能な細胞表面タンパク質のような、細胞タンパク質の分画内に濃縮される。
【０１１３】
［細胞及び／又は細胞相互作用の分析用の結合試薬の使用］
細胞表面上にある炭水化物の化学構造は、他の細胞を有し、細胞基質を取り囲む接触と関連することが理解される。従って、同定された細胞表面のグリカンの化学構造、及び特にこれらを特異的に認識する結合試薬は細胞の分析のために有用である。好ましい分析方法は、細胞を結合試薬と接触させるステップと、細胞に対する結合試薬の効果を評価するステップとを含む。ある好ましい様態においては、細胞は細胞培養状態下で結合剤と接触する。ある好ましい様態においては、結合剤は多原子価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）又はより好ましくは多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）の形態で、あるいは別の好ましい様態においては、表に付着した形態で表される。効果は特徴的な成長の変化、又は細胞内の細胞シグナルにできる。
【０１１４】
［ＦＡＣＳ及び抗体データ］
ＦＡＣＳデータはタンパク質／Ｎ−アセチルラクトサミン特異性を有する抗ジシアル酸抗体がＣＤ３４＋造血幹細胞の主要部分に有効に、及び、ＣＤ１３３＋により更に有効に標識されることを明らかにした。本発明はある好ましい様態においては、造血幹細胞用のマーカとしてタンパク質を保有するジシアル酸エピトープに関する。データは更に、「タンパク質／ＬａｃＮＡｃジシアル酸」抗体を用いて、ＣＤ３４＋細胞中に特異的に標識される単一のタンパク質を明らかにした。本発明は特に、造血幹細胞用のマーカとしてのタンパク質、及び／又はそのジシアル酸付加されたグリカンエピトープに関する。図６を参照されたい。
【０１１５】
蛍光標示式細胞分取器（Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）は好ましくは臍帯血由来の間葉細胞の分析用に用いられた。本明細書ではＦＡＣＳ分析は間葉幹細胞中の陽性細胞の少数集団、及び骨形成分化細胞における増加量、及び脂肪細胞の分化細胞における一般的に更に高い量を明らかにした。図３及び図４参照。本発明は特に、ＦＡＣＳ分析で示された標識パターンにより例示されたような、抗体の特異的な標識レベルを伴う相対量の細胞に基づく細胞の認識に関する。本発明は特に、造骨細胞（ＯＢ）の細胞と、脂肪細胞（ＡＣ）の分化細胞用に示されたような、新規の完全な標識細胞とにおいて、連続変化する標的抗原の量に関し、特に抗体の等価物で標識された場合、同様のＦＡＣＳパターンを有する細胞集団が用いられる。本発明は更に陽性選択で標識された特異的な細胞集団と、抗体による陰性選択での非標識細胞との分離に関し、選択的に更に、部分的に反応する細胞集団を分離する。本発明は更に特異的な間葉細胞集団のキャラクタリゼーションの方法に関し、細胞は本発明による抗体、好ましくは１又は複数の抗ジシアル酸エピトープの抗体で標識され、好ましくはその集団は本質的に図４によるＦＡＣＳ特性を有する。
【０１１６】
本発明は更に、好ましくはキャラクタリゼーション及び／又は細胞集団の治療の発達用のジシアリル（ｄｉａｓｉａｌｙｌ）エピトープに特異的な抗体へ結合される集団に，本質的に同様であることが好ましい、特異的な単離細胞に関する。本発明は本質的に、造血幹細胞又は分化した間葉細胞、及び細胞集団に関し、細胞はジシアル酸付加された特異的なエピトープ用の結合剤、好ましくは非還元末端の末端部のエピトープに特異的な抗体で標識される。
【０１１７】
［グライコーム物質からの、及び結合方法による細胞表面上の化学構造の認識］
本発明は質量分析法による物理化学的分析に加え、いくつかの方法が化学構造の分析のために有用であることを明らかにした。本発明は本質的に、ｉ）結合剤と見なされるグリカンを結合する分子による認識の方法に関する。これらの分子はグリカンを結合し、結合剤に結合される標識のような結合の観察を固有に可能にするステップを含む。好ましい結合剤は、ａ）抗体、レクチン、及び酵素のようなタンパク質、ｂ）タンパク質の結合領域及び部位のようなペプチド及びファージディスプレイのペプチド合成ライブラリ由来の類似体、ｃ）他のポリマ又はペプチド物質を模倣する有機体の骨格物質を含む。
【０１１８】
ペプチド及びタンパク質は好ましくは、タンパク質がモノクローナル抗体、グリコシダーゼ、グリコシル転位酵素、植物レクチン、動物レクチン、又はその模倣ペプチドの群から選択される場合、組換え型タンパク質、又はその派生型の、対応する炭水化物の認識領域であり、結合剤は検出可能な標識化学構造を含みうる。
【０１１９】
炭水化物の認識における酵素の属は、レクチン（酵素活性なしにタンパク質を結合する炭水化物）の属に連続する。ａ）天然のグリコシルトランスフェラーゼ（Ｒａｕｖａｌａら（１９８３）、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）３９９１−３９９５）及びグリコシダーゼ（Ｒａｕｖａｌａ及びＨａｋｏｍｏｒｉ（１９８１），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８８，１４９−１５９）はレクチン活性を有する。ｂ）酵素を結合する炭水化物は、触媒性のアミノ酸残基を変異することによって、レクチンへ修飾されうる（国際公開第９８４２８６４号；Ａａｌｔｏ  Ｊ．ら，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．（２００１），１８（１０）；７５１−８；Ｍｅｇａ及びＨａｓｅ（１９９４）ＢＢＡ  １２００（３）３３１−３を参照）。ｃ）天然レクチンは、グリコシダーゼに対し構造的に相同的であり、酵素及びレクチンの属の連続性を示すことで更に知られる（Ｓｕｎ，Ｙ−Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１），２７６（２０），１７５０７−１４）。酵素活性なしにタンパク質を結合する炭水化物としての抗体の属は更にレクチンの概念に非常に近いが、抗体はレクチンとして通常は分類されない。
【０１２０】
［ペプチドの明確性の概念及びタンパク質を結合する炭水化物の連続性の概念］
タンパク質がペプチド鎖からなり、ひいてはペプチドによる炭水化物の認識は明らかになることは更に理解される。例えば、タンパク質を結合する炭水化物の活性部位から得られるペプチドは炭水化物を認識できることは、当該技術分野で知られている（例えば、  Ｇｅｎｇ  Ｊ−Ｇ．ら（１９９２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８４６−５３）。上述のように、抗体フラグメントは結合タンパク質の記載の、及び遺伝子操作された変異体に含まれる。明らかに遺伝子操作された変異体は、酵素、抗体及びレクチンの含有型、切断型、又はフラグメント型のペプチドである。
【０１２１】
レクチンと延在する抗体エピトープとを含む、有用な結合剤の特異性は、（Ｄｅｂａｒａｙ及びＭｏｎｔｒｅｕｉｌ（１９９１），Ａｄｖ．Ｌｅｃｔｉｎ  Ｒｅｓ  ４，５１−９６；“Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ”，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ（２００１），４９１（Ａｌｂｅｒｔ  Ｍ  Ｗｕ編集）  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；“Ｌｅｃｔｉｎｓ”  ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００３），（Ｓｈａｒｏｎ、Ｎａｔｈａｎ及びＬｉｓ，Ｈａｌｉｎａ編集）Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅａｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のような概説及び研究書、及びｐｕｂｍｅｄ／ｅｓｐａｃｅｎｅｔのようなインターネットデータベース、又はｗｗｗ．ｇｌｙｃｏ．ｉｓ．ｒｉｔｓｕｍｃｉ．ａｃ．ｊｐのような抗体データベースから入手可能であり、モノクローナル抗体のグリカンの特異性を列挙する。
【０１２２】
［好ましい結合剤分子］
本発明は、本発明による細胞のキャラクタリゼーションに、及びより特異的には、本発明による好ましい細胞群及び細胞型に対して有用な様々な型の結合剤分子を明らかにした。好ましい結合剤分子は特異的な化学構造、又は細胞表面の炭水化物の上にある構造上の特徴に関する結合特異性に基づき分類される。好ましい結合剤は１以上の単糖残基を特異的に認識する。
【０１２３】
植物レクチンの総て又はほとんどのような現行の結合剤分子のほとんどは、その特異性において最適ではなく、通常様々な結合を有する１又はいくつかの単糖を雑に認識することは理解される。更に、レクチンの特異性はヒト型のいくつかのグリカンで通常上手く特徴付けされない。
【０１２４】
好ましい高特異性の結合剤は、
Ａ）少なくとも１の単糖残基と、これらと別の単糖との間の特異的な結合の化学構造を認識し、次の単糖残基はＭＳ１Ｂ１結合剤と見なされ、
Ｂ）更に好ましくはＭＳ２Ｂ１結合剤と見なされる第２の単糖残基の少なくとも一部分を認識し、
Ｃ）更により好ましくは、第２の結合の化学構造及び／又は第３の単糖残基の少なくとも一部分を認識し、ＭＳ３Ｂ２結合剤と見なされ、好ましくはＭＳ３Ｂ２は特異的で完全な三糖類の化学構造を認識し、
Ｄ）最も好ましくは、結合する化学構造は３の結合の化学構造を有する四糖類を少なくとも部分的に認識し、ＭＳ３Ｂ２結合剤と見なされ、
好ましくは結合剤は完全な四糖類配列を認識する。
【０１２５】
好ましい結合剤は天然のヒト及び／又は動物性の、あるいはグリカンの特異的な認識用に開発された他のタンパク質を含む。好ましい高特異性の結合剤のタンパク質は特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体、レクチン、好ましくは哺乳類若しくは動物レクチン、又は特異的なグリコシル転位酵素、より好ましくはグリコシダーゼ型の酵素、グリコシルトランスフェラーゼ、若しくはグリコシド転移中の酵素である。
【０１２６】
［抗体］
当該技術分野で知られる様々な手順が、ポリクローナル抗体のペプチドモチーフ及び部位又はそのフラグメントへの生成のために用いられうる。抗体の生成のために、いくつかの好適な宿主動物（限定しないが、ウサギ、マウス、ラット、又はハムスターを含む）は、ペプチド（免疫原性フラグメント）を伴う注射によって免疫化される。様々なアジュバントが免疫学的な応答を増加させるために用いられ、宿主の種に依存して、限定しないがフロイントの（完全及び不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、多価陰イオン、油乳濁液、スカシガイ・ヘモシアニン、ジニトロフェノールのような表面活性物質、及びＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ：カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウムパルバムのような有用なポテンシャルのあるヒトアジュバントを含む。
【０１２７】
１又は複数のペプチドモチーフに対するモノクローナル抗体は、培養中の連続株化細胞によって抗体分子の生成用に規定する技術を用いることによって調製できる。これらは限定しないがＫδｈｌｅｒらによって独創的に記載されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５）、及び近年のヒトＢ細胞のハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２，１９８３）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６，１９８５）を含み、総ては特異的に引用によって本明細書中に取り込まれる。抗体は更にクローン化された免疫グロブリンのｃＤＮＡからバクテリア中で生成されうる。組換え型ファージ抗体系の使用を伴い、バクテリア培養中に抗体を迅速に生成及び選択すること、及び、それらの化学構造を遺伝子操作することを可能にできる。
【０１２８】
ハイブリドーマ技術が用いられる場合、骨髄腫の株化細胞が用いられうる。ハイブリドーマを生成する融解手順での使用に適したこのような株化細胞は好ましくは、非抗体生成され、高融解効率を有し、所望の融解細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支持する特定の選択培地中の成長を不可能にする酵素欠損症を示す。例えば、免疫化された動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−Ｉ  １、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７、及びＳ１９４／５ＸＸ０  ＢｕＩを用いることができ、ラット用に、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０を用いることができ、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２，及びＵＣ７２９−６の総ては細胞融解で結合するのに有用にできる。
【０１２９】
モノクローナル抗体の生成に加えて、「キメラ抗体」の生成用に開発した技術、つまり、適切な抗原特異性及び生物学的活性を有する分子を得るために、マウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングは用いることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｄ  ８１：６８５１−６８５５，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８，１９８４；Ｔａｋｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４；１９８５）。代替的には、単鎖抗体の生成（米国特許第４，９４６，７７８号）について記載された技術は、インフルエンザに特異的な単鎖抗体を生成するのに適用できる。
【０１３０】
分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、既知の技術によって生成できる。例えば、このようなフラグメントは限定しないが、抗体分子のペプシン消化によって生成されうるＦ（ａｂ’）２フラグメントと、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成できるＦａｂ’フラグメントと、パパイン及び還元剤で抗体分子を扱うことによって生成できる２のＦａｂフラグメントとを含む。
【０１３１】
非ヒト抗体は当該技術分野で既知のいずれかの方法によってヒト化できる。好ましい「ヒト化抗体」はヒト定常部を有する一方、抗体の可変部位又は少なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）は、非ヒト種から得られる。ヒト軽鎖の定常部はκ型又はλ型のいずれかの軽鎖からなるが、ヒト重鎖の定常部はＩｇＭ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＥのいずれかの免疫グロブリンからなる。
【０１３２】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野で公知である（米国特許第５，５８５，０８９号及び第５，６９３，７６２号を参照）。通常、ヒト化した抗体は非ヒトであるソースからフレームワーク領域に導入される１又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、ヒト抗体の対応する部位と齧歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部分を置換することによって、例えば、Ｊｏｎｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５，１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７，１９８８）及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６，１９８８）で記載の方法を用いて行われうる。操作された抗体を調製するための多数の技術は、例えば「Ｏｗｅｎｓ及びＹｏｕｎｇ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１６８：１４９−１６５，１９９４」に記載される。更なる変更は親和性又は免疫原性を修飾すべく抗体フレームワークにその後導入できる。
【０１３３】
［結合剤分子を含む方法］
［間葉細胞のグリカンの認識］
［通常の観察］
本発明は更に、末端部のグリカンの化学構造を認識する、更なる結合剤好ましくは特異的な抗体又はレクチンのスクリーニングのための、標的の化学構造及び特異的なグリカンの標的の化学構造の使用と、本発明によるスクリーニングによって生成された結合剤の使用に関する。スクリーニング用の好ましいツールは、本発明による１又はいくつかの造血幹細胞のグリカンエピトープと、更なるコントロールグリカンとを含むグリカンアレイである。本発明は既知の抗体のスクリーニングと、高特異性の抗体を見つけるための、公表された特異性の情報検索に関する。
【０１３４】
細胞の主要部分上で認識できる個体のマーカは、そのコンテキストにおいて関連する細胞が特異的なグリカンエピトープを発現しない場合に、細胞の認識及び／又は単離用に用いられうることは更に理解される。これらのマーカはマーカの発現が関連する細胞で低い又は存在しない場合に、例えば、組織又は細胞培養のような生物学的物質からの細胞集団の単離のために用いられうる。幹細胞を含む組織は通常、初期の幹細胞段階でこれらを含み、一致する高発現のマーカは細胞単離のために最適化又は選択されうることが理解される。特異的な分化状態を保存するために細胞培養状態を選択することは可能であり、主要な又は事実上の全細胞集団を認識する現存の抗体は、これらのコンテキストにおいては細胞の分析又は単離に対し有用である。
【０１３５】
ＦＡＣＳ分析のような方法は細胞上にある化学構造の定量的な決定を可能にし、ひいては細胞集団の一部を認識する抗体は更に細胞集団に対し特徴的である。
【０１３６】
本発明は更に、末端部のグリカンの化学構造を認識する、更なる結合剤好ましくは特異的な抗体又はレクチンのスクリーニングのための、標的の化学構造及び特異的なグリカンの標的の化学構造の使用と、本発明によるスクリーニングによって生成された結合剤の使用に関する。スクリーニング用の好ましいツールは、本発明による１又はいくつかの造血幹細胞のグリカンエピトープと、更なるコントロールグリカンとを含むグリカンアレイである。本発明は既知の抗体のスクリーニングと、高特異性の抗体を見つけるための、公表された特異性の情報検索に関する。更に、本発明はファージディスプレイライブラリからの化学構造の検索に関する。
【０１３７】
細胞の主要部分上で認識できる個体のマーカは、そのコンテキストにおいて関連する細胞が特異的なグリカンエピトープを発現しない場合に、細胞の認識及び／又は単離用に用いられうることは更に理解される。これらのマーカはマーカの発現が関連する細胞で低い又は存在しない場合に、例えば、組織又は細胞培養のような生物学的物質からの細胞集団の単離のために用いられうる。幹細胞を含む組織は通常、初期の幹細胞段階でこれらを含み、一致する高発現のマーカは細胞単離のために最適化又は選択されうることが理解される。ある好ましい様態においては、本発明は、好ましくは本発明によりグリカンエピトープを認識するモノクローナル抗体を含む、タンパク質を認識するアシアロガングリオシドのような、本発明の結合剤による間葉細胞の選択に関する。別個の様態においては、本発明は認識のために最適化されたレクチン又はレクチンに相同的なタンパク質の使用に関する。
【０１３８】
特異的な分化状態を保存するために細胞培養状態を選択することは可能であり、主要な又は事実上の全細胞集団を認識する現存の抗体は、これらのコンテキストにおいては細胞の分析又は単離に対し有用である。
【０１３９】
ＦＡＣＳ分析のような方法は細胞上にある化学構造の定量的な決定を可能にし、ひいては細胞集団の一部を認識する抗体は更に細胞集団に対し特徴的である。
【０１４０】
［組合せ］
集団の特異的な分析用のいくつかの抗体の組合せは、細胞集団を特徴付ける。ある好ましい様態においては、少なくとも１の「有効な結合抗体」は、細胞集団の主要部分（３５％超）又はほとんど（５０％）を認識し（好ましくは３０％以上、好ましさが増える順番で４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、最も好ましくは９０％以上）、少なくとも１の「非結合抗体」との組合せの分析方法に対して選択され、好ましくは少数部分を認識し（好ましくは方法の検出限界ないし低レベルの認識、好ましい順番に、細胞の１０％、７％、５％、２％又は１％未満、例えば細胞の０．２−１０％、より好ましくは細胞の０．２−５％、更により好ましくは０．５−２％、又は最も好ましくは０．５％−１．０％）、又は細胞集団の部分を認識せず（検出限界未満又はその点、例えば、好ましい順番に５％、２％、１％、０．５％、及び０．２％未満）、より好ましくは本発明による細胞集団の部分を実際に認識しない。更に別の様態においては、組合せ方法は「中程度の結合抗体」の使用を含み、細胞の実質的な部分を認識し、好ましくは５ないし５０％、より好ましくは７％ないし４０％、最も好ましくは１０ないし３５％になる。
【０１４１】
本発明は、互いの陽性及び陰性の標的を認識すべく、互いの末端部のエピトープを認識するいくつかの試薬、好ましくは少なくとの２の試薬、より好ましくは少なくとも３のエピトープ、更により好ましくは少なくとも４、更により好ましくは少なくとも５、更により好ましくは少なくとも６、更により好ましくは少なくとも７、及び最も好ましくは少なくとも８、の使用に関する。延在するエピトープを選択的及び特異的に認識する高特異性の結合剤を伴い、より少ない結合剤しか必要でなくなり、例えば、好ましくは少なくとも２の試薬、より好ましくは少なくとも３のエピトープ、更により好ましくは少なくとも４、更により好ましくは少なくとも５、最も好ましくは少なくとも６の抗体の組合せで用いられることが理解されるであろう。延在するエピトープを選択的及び特異的に認識する高特異性の結合剤は、延在するエピトープのうちの１つを、好ましさが増える順番で、少なくとも５、１０、２０、５０、又は１００倍の親和性で結合させ、抗体結合の親和性を測定するための方法は当該技術分野で公知である。本発明は更に、１の延在したエピトープであるが、更に同一の末端部の化学構造を有する、少なくとも１の、好ましくは少なくとも１の追加の延在したエピトープの有効な認識を可能にする低特異性の抗体の使用に関する。
【０１４２】
試薬は好ましさが増える順番で、細胞標識実験で示した５、１０、２０、４０、又は７０あるいは総ての試薬を含むアレイで好ましくは用いられる。
【０１４３】
抗体は本発明による標的の化学構造として明らかにされた特定のグリカンエピトープを認識する。抗体の特異性及び親和性はクローン官で変化することは理解される。特定のグリカンの化学構造を認識すると知られる特定のクローンは、必ずしも同一の細胞集団を認識するとは限らないことは理解された。
【０１４４】
［炭水化物阻害による細胞からの結合剤又は結合剤複合物の放出］
本発明はある好ましい様態においては、結合剤からのグリカンの放出に関する。これは、
ａ）結合剤を含む方法による細胞の濃縮又は単離後の可溶結合剤からの細胞の放出、
ｂ）細胞の濃縮又は単離後、又は細胞培養中、例えば細胞の継代中の固相に結合された結合剤からの放出
を含むいくつかの方法について好ましい。
【０１４５】
阻害する炭水化物は結合するレクチンのエピトープ又はその１又はそれ以上の部分に対応するように選択させる。好ましい炭水化物はオリゴ糖、単糖、及びその複合物を含む。炭水化物の好ましい濃度は、１ｍＭないし５００ｍＭの細胞によって許容可能な濃度を含み、より好ましくは１０ｍＭないし２５０ｍＭ、更により好ましくは１０ないし１００ｍＭであり、高濃度は単糖及び固相に結合した結合物を含む方法にとって好ましい。
【０１４６】
一価の阻害状態の例は、細胞がエピトープ及び／又は濃度の大きい固相に多価に結合され、又は多数／多価の複合物が調製される場合の阻害に関し、「Ｖｅｎａｂｌｅ  Ａ．ら（２００５），ＢＭＣ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ」に示される。本発明は更に、ＣＤ３４＋磁気ビーズからの細胞の放出について知られるのと同様に、プロテアーゼ消化による結合剤の放出の方法に関する。
【０１４７】
［固定化された結合剤］
本発明は幹細胞の培養のための又はそのコンテキストにおける特異的な結合剤の使用に関し、結合剤は固定化される。固定化は非共有結合性の固定化を含み、共有結合は固定化方法、及び更なる部分の特異的な固定化、及び非特異的な固定化を含む。
【０１４８】
好ましい非共有結合性の固定化方法は受動吸収法を含む。好ましい方法においては、細胞培養皿又はウェルのプラスチック面のような表面は結合剤で受動的に吸収される。好ましい方法は溶媒又は湿性状態の結合剤のタンパク質を表面に、好ましくは表面上に均一に吸収することを含む。好ましい均一な分布は、好ましくは１０分ないし３日、より好ましくは１時間ないし１日、最も好ましくは８ないし２０時間一晩中、吸収期間中にわずかな振とうを用いて生成される。固定化の洗浄ステップは好ましくは、レクチンの剥離を防ぐために遅い液流を用いて穏やかに行われる。
【０１４９】
［特異的な固定化］
特異的な固定化は、本発明による幹細胞の特異的な細胞表面のグリカンのような、リガンドであるグリカンへの結合剤の結合部位の結合を妨げないタンパク質部位での固定化を目的とする。好ましい特異的な固定化方法は結合剤のタンパク質／ペプチドの表面での特異的なアミノ酸残基の化学的な接合を含む。好ましい方法においては、システインのような特異的なアミノ酸残基は、固定化部位にクローン化され、接合はシステインから行われ、別の好ましい方法においては、Ｎ−末端部のシステインは過ヨウ素酸によって酸化され、アミノ−オキシ−メチルヒドロキシルアミン又はヒドラジンの化学構造のようなアルデヒド反応性試薬に接合し、更なる好ましい化学物質はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって販売されている「クリック」ケミストリと、Ｐｉｅｒｃｅ社及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社によって販売されている、アミノ酸特異的なカップリング試薬とを含む。好ましい特異的な固定化は、グリカンが結合部位に近くないか、長いスペーサが用いられる場合に、好ましくは結合剤のＯ−又はＮ−グリカンのようなタンパク質に結合された炭水化物から生じる。
【０１５０】
［グリカンに固定化された結合剤のタンパク質］
好ましいグリカンの固定化は反応性の官能基選択的なグリカンの連結基Ｒ１を通して生じ、化学基は結合剤のタンパク質部分に対し主要な又は結合破壊的な変化なしで、第２の官能基選択的な連結基Ｒ２に特異的に接合されうる。アルデヒド及びケトンと反応する官能基選択的な基はアミノ−オキシ−メチルヒドロキシルアミン又はヒドラジンの化学構造として含む。好ましいＲ１基はタンパク質の表面に化学的に合成されるアルデヒド又はケトンのようなカルボニルである。他の好ましい官能基選択的な基はマレイミド及びチオールを含み、「クリック」試薬はアジド及びそれに対する反応基を含む。好ましい合成ステップは、ａ）選択的に化学物質を酸化する炭水化物による、好ましくは過ヨウ素酸による化学的な酸化、又はｂ）ガラクトースオキシダーゼのような非還元末端の末端部の単糖を酸化する酵素による、又は、グリカンの末端部の単糖に修飾された単糖残基を転移することによる、酵素的な酸化を含む。当該技術分野に既知の酸化的な酵素又は過ヨウ素酸の使用は、Ｋａｂｉ−Ｆｒｅｎｓｅｎｉｕｓ社（国際公開第２００５ＥＰ０２６３７号、国際公開第２００４ＥＰ０８８２１号、国際公開第２００４ＥＰ０８８２０号、国際公開第２００３ＥＰ０８８２９号、国際公開第２００３ＥＰ０８８５８号、国際公開第２００５０９２３９１号、国際公開第２００５０１４０２４号、引用として完全に含まれる）、及び独国の研究所によるＨＥＳ多糖類を組換え型タンパク質に直接接合する特許出願に記載されている。末端部の単糖残基を転移するための好ましい方法は、本発明者の一部によるＵＳ２００５０１４７１８（引用として完全に含まれる）、又はＱａｓｂａ及びＲａｍａｋｒｉｓｈｍａｎ及びその同僚によるＵＳ２００７２５８９８６（引用として完全に含まれる）の特許出願に記載されるように、又は、Ｎｅｏｓｅ（ＵＳ２００４１３２６４０、引用として完全に含まれる）のグリコペグ化の特許において記載の方法を用いることによって、変異体であるガラクトシルトランスフェラーゼの使用を含む。
【０１５１】
［高特異性の化学タグを含む複合物］
ある好ましい様態においては、結合剤はタグに特異的にあるいは非特異的に接合され、Ｔと見なされ、リガンドＬによって特異的に認識可能となり、タグの例は、ビオチン結合リガンドである（ストレプト）アビジン、又は別のフルオロカルボニル若しくはペプチド／抗原に結合されるフルオロカルボニル、又はペプチド／抗原用の特異的な抗体等を含む。
【０１５２】
［好ましい複合物の化学構造］
好ましい複合物の化学構造は式ＣＯＮＪ：Ｂ−（Ｇ−）ｍＲ１−Ｒ２−（Ｓ１−）ｎＴ−に従い、ここでＢは結合剤であり、Ｇはグリカンであり（結合剤がグリカン接合された場合）、Ｒ１及びＲ２は化学選択的な連結基であり、Ｔはタグ、好ましくはビオチンであり、Ｌはタグ用に特異的に結合するリガンドであり、Ｓ１は選択的なスペーサ基、好ましくはＣ１−Ｃ１０アルキルであり、ｍ及びｎはそれぞれ、０又は１のいずれかとなる整数である。
【０１５３】
［結合剤の複合］
本発明は更に、固相を含む表面、又はポリマ等を含む基質への接合を含む結合剤の複合に関する。結合剤の交差連結、あるいは細胞に対する結合剤の効果を防ぐため、グリカンの結合剤を接合することは特に有用であることは理解されるであろう。
【０１５４】
複合物は式ＣＯＭＰ：Ｂ−（Ｇ−）ｍＲ１−Ｒ２−（Ｓ１−）ｎ（Ｔ−）ｐ（Ｌ−）ｒ（Ｓ２）ｓ−ＳＯＬに従う化学構造を含み、Ｂは結合剤であり、ＳＯＬは固相又は基質又は表面又は標識（更にリガンド接合された標識にできる）であり、Ｇはグリカンであり（結合剤がグリカン接合された場合）、Ｒ１及びＲ２は化学選択的な連結基であり、Ｔはタグ、好ましくはビオチンであり、Ｌはタグ用に特異的に結合するリガンドであり、Ｓ１は選択的なスペーサ基、好ましくはＣ１−Ｃ１０アルキルであり、ｍ、ｎ、ｐ、ｒ及びｓはそれぞれ、０又は１のいずれかとなる整数である。
［実施例］
【実施例１】
【０１５５】
［細胞標本の生成］
［造血幹細胞］
［臍帯の臍帯血の収集］
ヒト用語の臍帯の臍帯血（ＵＣＢ）ユニットが、母親のインフォームドコンセントの送達後収集され、ＵＣＢは収集の２４時間以内に処理された。単核細胞（ＭＮＣ）はＵＣＢをリン酸バッファ食塩水（ＰＢＳ）と  １：１で希釈し、その後のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）の密度勾配遠心分離（４００ｇ／４０分）で各ＵＣＢユニットから単離された。単核細胞フラグメントは勾配から収集され、ＰＢＳで２回洗浄された。
【０１５６】
［臍帯の臍帯血細胞の単離及び培養］
ヒト臍帯の臍帯血からのＣＤ３４陽性及び陰性細胞ならびにＣＤ１３３陽性及び陰性細胞は、Ｋｅｋａｒａｉｎｅｎら（２００６，ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，７：３０）に記載されるような磁気細胞分離及び二重選択装置（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社，独国）を用いて単離された。洗浄された細胞ペレットは質量分析又はウェスタンブロッティング分析前に、−７０℃で凍結され保存された。ＦＡＣＳ分析のために、細胞は新鮮に用いられた。
【０１５７】
［間葉幹細胞］
［臍帯血由来の間葉幹株化細胞］
［臍帯の臍帯血細胞の単離及び培養］
収集された臍帯の臍帯血から、ＣＤ４５／グリコホリンＡ（ＧｌｙＡ）陰性細胞の選択が免疫標識された磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて行われた。ＭＮＣはＣＤ４５及びＧｌｙＡの双方の磁気ミクロビーズを用いて同時に３０分間インキュベートされ、製造者の指示（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）に従い、ＬＤカラム（ＬＤ  ｃｏｌｕｍｎ）を用いて陰性で選択された。ＣＤ４５／ＧｌｙＡの陰性  溶離分画及び陽性分画の双方が収集され、培養培地で懸濁され、計数された。ＣＤ４５／ＧｌｙＡ陽性細胞は、フィブロネクチン（ＦＮ）でコーティングされた１ｘ１０６／ｃｍ２の密度での６ウェルプレートに蒔かれた。ＣＤ４５／ＧｌｙＡ陰性細胞は約１ｘ１０４細胞／ウェルのＦＮコーティングされた９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）に蒔かれた。非接着性の細胞のほとんどが培地が次の日に交換された時に除去された。非接着性の細胞の残りは、次の週に２度の培地交換中に除去された。
【０１５８】
細胞は、５６％のＤＭＥＭ低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ、Ｇｉｂｃｏ社、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）、４０％のＭＣＤＢ−２０１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、２％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１ｘペニシリン−ストレプトマイシン（双方ともＧｉｂｃｏ社から入手）、１ｘＩＴＳ液体培地栄養補助剤（インスリン−トランスフェリン−セレニウム）、１ｘリノール酸−ＢＳＡ、５ｘ１０−８Ｍのデキサメタゾン、０．１ｍＭのＬ−アスコルビン酸−２−リン酸塩（以上の３つ総てはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手）、１０ｎＭのＰＤＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ＲｎＤＳｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）、及び１０ｎＭのＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）からなる培地中で初期培養された。後の継代において（７継代後）、細胞は更にＦＣＳ濃度が１０％に増加する以外は、同一の増殖培地で培養された。
【０１５９】
プレートはコロニに対してスクリーニングされ、コロニ中の細胞が８０ないし９０％のコンフルエントである場合、細胞は継代培養された。第１の継代で細胞数がまだ小さい場合、細胞は室温でトリプシン／ＥＤＴＡのミネラル量（０．２５％／１ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ社）で脱離され、トリプシンはＦＣＳで阻害された。細胞は無血清培地で流され、血清濃度を２％に調節した標準的な培養液に懸濁した。細胞は約２０００ないし３０００／ｃｍ２で蒔かれた。後の継代において、細胞は規定の時点で規定の領域からトリプシン／ＥＤＴＡで脱離され、血球計数器で計数され、２０００ないし３０００細胞／ｃｍ２の密度で再度蒔かれた。
【０１６０】
［骨髄由来の間葉幹株化細胞］
［骨髄由来の幹細胞］
骨髄（ＢＭ）由来のＭＳＣはＬｅｓｋｅｌａら（２００３）により述べられたように取得された。手短には、整形外科中に得られた骨髄はα−ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｌｐｈａ−Ｍｅｄｉｕｍ）で培養され、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％のＦＣＳ、１ｘペニシリン−ストレプトマイシン及び２ｍＭのＬ−グルタミン（総てＧｉｂｃｏ社）とともに補充された。２日の細胞接着期間後、細胞はＣａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で洗浄され、同一の培地で２０００ないし３０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞を蒔き、ほぼコンフルエンスまで週に２回新鮮な培地と交換することによって更に継代培養される。
【０１６１】
［間葉幹細胞表現型の決定］
ＵＢＣ及びＢＭの双方由来の間葉幹細胞は、フローサイトメトリ（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によって表現型化された。ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ７３及びＨＬＡ−ＡＢＣ（総てはカリフォルニア州サンホゼのＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）、ＣＤ１０５（英国ケンブリッジのＡｂｅａｍ社、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ）、ＣＤ１３３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）接合型抗体は、直接標識のために用いられた。適切なＦＩＴＣ及びＰＥ接合型のアイソタイプのコントロール（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）が用いられた。ＣＤ９０及びＨＬＡ−ＤＲに対する非接合型の抗体（双方、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手）は、間接的な標識用に用いられた。間接的な標識のために、ＦＩＴＣ接合型のヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社）が第２の抗体として用いられた。
【０１６２】
ＵＢＣ由来の細胞は造血性マーカのＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４及びＣＤ１３３に対し陰性であった。細胞はＣＤ１３（アミノペプチダーゼＮ）、ＣＤ２９（β１−インテグリン）、ＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体）、ＣＤ７３（ＳＨ３）、ＣＤ９０  （Ｔｈｙｌ）、ＣＤ１０５（ＳＨ２／エンドグリン）、及びＣＤ４９ｅについて陽性に染色した。細胞は更にＨＬＡ−ＡＢＣについて陽性に染色したが、ＨＬＡ−ＤＲについては陰性であった。ＢＭ由来の細胞は同様の表現型を有することを示した。それらはＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲについては陰性であるが、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＨＬＡ−ＡＢＣについては陽性であった。
【０１６３】
［脂肪生成分化］
ＵＣＢ由来のＭＳＣの脂肪生成ポテンシャルを評価するために、細胞は３の複製ウェルにおける２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）に３ｘ１０３／ｃｍ２の密度で蒔かれた。ＵＣＢ由来のＭＳＣは、標本がグライコーム分析用に調製される前に、ＤＭＥＭ低グルコース、２％のＦＣＳ（双方ともＧｉｂｃｏ社から入手）、１０μｇ／ｍｌのインスリン、０．１ｍＭのインドメタシン、０．１μＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、及びペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）からなる脂肪生成誘発培地中で５週間培養された。培地は分化培養中に週に２回交換された。
【０１６４】
［骨原性分化］
ＵＣＢ及びＢＭ由来のＭＳＣの骨原性分化を誘発するために、細胞は２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）上に３ｘ１０３／ｃｍ２の密度で標準的な増殖培地中に蒔かれた。次の日に、培地は１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．１μＭのデキサメタゾン、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸、０．０５ｍＭのＬ−アスコルビン酸−２−リン酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、及びペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）で補充されるα−ＭＥＭからなる骨原性誘発培地を交換した。ＢＭ由来のＭＳＣはグライコーム分析用に標本を調製する前に、週に２回培地を交換して３週間培養した。
【０１６５】
［胚性幹細胞］
［ヒト胚性幹株化細胞（ｈＥＳＣ）］
フィンランドのｈＥＳＣ株であるＦＥＳ  ２１、ＦＥＳ  ２２、ＦＥＳ  ２９、及びＦＥＳ  ３０の生成は述べられた（Ｍｉｋｋｏｌａら、２００６  ＢＭＣ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．６：４０）。手短には、分析された株化細胞のうちの２つはマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダに初期に由来し、その上で培養され、２つはヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）のフィーダ細胞上にある。本研究について、株の総てはＨＦＦフィーダ細胞上に転移され、ノックアウト血清リプレースメント（Ｇｉｂｃｏ社）を用いて補充される無血清培地に培養される。胚様体（ＥＢ）の形態を誘発するために、ｈＥＳＣコロニは最初は１０ないし１４日間成長するのを許容し、その後、コロニは小さな断片に切断され、非接着性のペトリ皿の上に転移され、懸濁培養を形成した。形成されたＥＢは、ｂＦＧＦなしで標準的な培養液中で次の１０日間、懸濁状態で培養した。更なる分化（段階３の分化細胞への）のために、ＥＢはインスリン−トランスフェリン−セレニウムで補充される培地において、ゼラチンコーティングされた培養皿に転移され、１０日間培養された。
【実施例２】
【０１６６】
［質量分析グライコームシグナルのジシアル酸付加された化学構造への割当て］
［グライコーム分析用に収集された細胞］
［間葉幹細胞］
１ｍｌの細胞培養培地はグライコーム分析用に保存され、培地の残りは吸引によって除去された。細胞培養プレートはｐＨ７．２のＰＢＳバッファで洗浄された。ＰＢＳは吸引され、細胞は５ｍｌのＰＢＳで掻爬及び収集した（２回繰り返し）。この時点で、小さな細胞分画（１０μｌ）は細胞計数のために取られ、標本の残りは４００ｇで５分間遠心分離した。上澄みは吸引され、ペレットは更に２回ＰＢＳで洗浄した。細胞は１．５ｍｌのＰＢＳで収集され、５０ｍｌの管から１．５ｍｌの収集管に転移され、５４００ｒｐｍで７分間遠心分離した。上澄みは吸引され、洗浄が１回以上繰り返された。細胞ペレットは−７０℃で保存され、グライコーム分析用に用いられた。
【０１６７】
［胚性幹細胞］  
グリカン分析のために、細胞は機械的に収集され、洗浄され分析まで凍結保存された。蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析において、機械的に単離されたｈＥＳＣコロニからの７０ないし９０％の細胞は、一般的にＴｒａ１−６０及びＴｒａ１−８１陽性であった。分化プロトコルは神経上皮細胞の発達に好ましいが、別の末端部の分化細胞型への分化に関連しない。段階３の培養は、線維芽細胞及びニューロンの形態によって支配される異種起源の細胞集団からなった。
【０１６８】
［造血幹細胞］  
単離及び洗浄された細胞ペレットは質量分析的なグリカン分析前に−７０℃で凍結及び保存された。
【０１６９】
［質量分析的な分析用のグリカン単離］
アスパラギン結合されたグリカンは、本質的に述べられた（Ｎｙｍａｎら，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５３：４８５）ようなフロボバクテリウム・メニンゴゼプチクムのＮ−グリコシダーゼＦの消化（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、米国）によって細胞糖タンパク質から脱離された。細胞のコンタミネーションは、−２０℃で８０ないし９０％（ｖ／ｖ）のアセトン水溶液でグリカンを沈殿し、６０％（ｖ／ｖ）の氷冷メタノールで抽出することによって除去された。グリカンはＣ１８シリカ樹脂（ＢｏｎｄＥｌｕｔ、Ｖａｒｉａｎ社、米国）を通って水中を通過させ、多孔性黒鉛状炭素（Ｃａｒｂｏｇｒａｐｈ、Ａｌｌｔｅｃｈ社、米国）に吸収させた。炭素カラムは水で洗浄され、次いで中性のグリカンは水中の２５％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）と、水中の２５％アセトニトリル（ｖ／ｖ）中の０．０５％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸でシアル酸付加されたグリカンで溶離された。双方のグリカン分画は強い陽イオン交換樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国）及びＣ１８シリカ樹脂（ＺｉｐＴｉｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国）を通して水中に更に通過させた。シアル酸付加されたグリカンは更にｎ−ブタノール：エタノール：水（１０：１：２、ｖ／ｖ）で結晶セルロースに吸収し、同一の溶媒で洗浄され、５０％のエタノール：水（ｖ／ｖ）によって溶離することによって精製された。総ての上のステップは小型化クロマトグラフィカラム上で行われ、小さな溶離及び処理量が用いられた。
【０１７０】
［質量分析法］
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、本質的に述べられた（Ｓａａｒｉｎｅｎら，１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５９：８２９）ようなＢｒｕｋｅｒ  Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＴＯＦ／ＴＯＦ装置（Ｂｒｕｋｅｒ社、独国）で行われた。中性かつシアル酸付加されたグリカン成分の相対モル存在比は、中性かつシアル酸付加されたＮ−グリカン分画として別個に分析された場合に、質量スペクトル中の相対シグナル強度に基づき、正確に割り当てできる。質量分析的な分析方法の各ステップは、ヒト細胞から抽出された合成グリカンの混合物又はグリカン混合物による再現性のために制御された。
【０１７１】
［データ分析］
質量分析的な未処理データは、重複する同位体パターンの効果、多数のアルカリ金属付加物のシグナル、還元オリゴ糖から水を除去した生成物、及び標本中の元のグリカンから生じない他の干渉する質量分析シグナルを除去することによりグリカン特性に変換する。存在するグリカン特性における、得られたグリカンシグナルは、１００％に正規化され、標本間の比較を可能にした。
【０１７２】
グライコーム特性において、生成された多数の「異常な」質量シグナルは表１ないし３に記載のジシアル酸又はオリゴシアル酸付加された単糖組成物に割り当てられるように操作された。特異的なシアリダーゼ及びガラクトシダーゼによるグリコシダーゼ分析は、構造上の情報を増加させ、より特異的な割り当てを可能にするために行われた。ストレプトコッカスのα３−シアリダーゼに対する感受性を有する化学構造部分のために、代替的に異常な割当てが明らかにされた。データと、２のシアル酸及び１のＮ−アセチルラクトサミンユニット、又は３のシアル酸及び２のＮ−アセチルラクトサミンユニットの存在に基づいて、表１ないし３、及び記載の式に概略的に示された化学構造が得られた。
【実施例３】
【０１７３】
［抗ジシアリル抗体による造血性及び間葉幹細胞のＦＡＣＳ分析］
［造血幹細胞］
造血性細胞のＦＡＣＳ分析は、幹細胞集団の抗体ＣＤ３４及びＣＤ１３３での二重の標識分析を用いて臍帯血単核細胞集団で実行された。図１は異なるＧＤ３抗体でのＣＤ３４陽性及び陰性細胞の染色結果を示す。ＶＩＮ−ＩＳ−５６は（品番ＭＡＢ４３０８）でＣｈｅｍｉｃｏｎから入手され、ＭＢ３．６はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（品番５５４２７４）から入手され、４Ｆ６はＣｏｖａｌａｂ社（品番ｍａｂ００１４）から入手され、Ｓ２−５６６は生化学工業株式会社（品番２７０５５４）から入手された。データは特に、タンパク質上の好ましいジシアル酸エピトープを認識できることが知られる（Ｓａｔｏ  Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．，Ｃｈｅｍ  ２００，２７５：１５４２２）、抗体Ｓ２−５６６による大多数のＣＤ３４＋細胞の有効かつ特異的な標識を明らかにした。抗体ＭＢ３．６及び４Ｆ６は有効なタンパク質認識を有することが報告されていないが、幹細胞集団に好ましいより低い反応性を通して、部分的であるようないくつかの相互反応を有することができる。抗体ＶＩＮ−ＩＳ−５６は造血幹細胞の優先的でない標識を示した。
【０１７４】
図２は抗ＧＤ３のＳ２−５６６（生化学工業株式会社）で標識された臍帯血由来の造血幹細胞、ＣＤ３４及びＣＤ１３３陽性細胞，及びＣＤ３４及びＣＤ１３３陰性細胞のＦＡＣＳ染色の結果を示す。ＣＤ１３３＋細胞の高い染色効果は抗体がＣＤ３４＋よりもより原始的な幹細胞集団を認識したことを示す。データは特に臍帯血に由来する造血幹細胞の認識及び単離に特に有用であることを明らかにした。対応する陰性細胞での低い反応性は、上述の抗体を用いた磁気粒子細胞精製法のようなＦＡＣＳ又は他の単離方法は高く濃縮された幹細胞分画を精製することが示された。本発明は特に造血幹細胞の分析及び単離用のジシアル酸エピトープを認識する結合剤の使用に関する。抗体は更に造血幹細胞集団のキャラクタリゼーションに有用であった。
【０１７５】
［間葉幹細胞］
図３は間葉幹細胞（ＭＳＣ）ならびに骨形成上（ＯＧ）及び脂肪生成上（ＡＧ）の分化細胞のＦＡＣＳ染色の結果を示す。骨髄（ＢＭ）由来のＭＳＣ染色は図３Ａに可視化され、臍帯血（ＣＢ）由来のものは異なる抗ジシアル酸抗体を伴い図３Ｂに示した。ＶＩＮ−ＩＳ−５６は（品番ＭＡＢ４３０８）でＣｈｅｍｉｃｏｎから入手され、ＭＢ３．６はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（品番５５４２７４）から入手され、４Ｆ６はＣｏｖａｌａｂ社（品番ｍａｂ００１４）から入手され、Ｓ２−５６６は生化学工業株式会社（品番２７０５５４）から入手され、４ｉ２８３は米国Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社（品番Ｇ２００５−６７）から入手された。総てのＧＤ３抗体は細胞分化状態に関する差異を有さずにＢＭ由来細胞の一部分だけを標識した。代わりに、総ての神経節特異的なＧＤ３抗体が試験されて、骨原性又は脂肪生成のいずれかの方向に分化する臍帯血由来のＭＳＣの顕著に増大する標識があった。はっきりとした差異は「タンパク質／ラクトサミンジシアル酸」の抗体Ｓ２−５６６及び他の「神経節ジシアル酸」のＧＤ３抗体で明らかではなかった。ＭＢ３．６はしかしながら、Ｓ２−５６６と同様の特異性を有すると見なされ、図３Ｂにあるような特に分化した臍帯血の間葉幹細胞の認識のためにあまり好ましくない代替物であると見なされる。本発明は更に、Ｏ−アセチルＧＤ３由来のシアル酸標識抗体（４ｉ２８３、米国Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）の完全に異なる特異性を明らかにした。幹細胞又はその分化細胞への結合は観察されなかった。
【０１７６】
図４は抗体Ｓ２−５６６（生化学工業株式会社）を用いた骨髄（ＢＭ）及び臍帯血（ＣＢ）からの間葉幹細胞（ＭＳＣ）ならびに骨形成上（ＯＧ）及び脂肪生成上（ＡＧ）の分化細胞のより特異的なＦＡＣＳ分析を示す。
【実施例４】
【０１７７】
［抗ジシアル酸抗体を用いた造血幹細胞ライセートの免疫ブロット］
ヒト臍帯の臍帯血からのＣＤ３４陽性及び陰性細胞は実施例１に記載のように磁気細胞分離を用いて単離された。細胞ペレットは−７０℃で凍結及び保存された。解凍された細胞は、氷上で１５分間６０ｘ１０６細胞／ｍｌでのプロテアーゼ阻害剤を伴い、ｐＨ７．４で、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭのナトリウムリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ中に溶解された。多数の臍帯の臍帯血ユニットからのライセートは一緒に貯蔵された。貯蔵されたライセートは、１３，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離によって洗浄された。
【０１７８】
レーンごとの２７μｇの全タンパク質の細胞ライセート（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で決定）は、ＰＶＤＦ膜上へ更にブロットされる１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで動作させた。膜は０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中の１％のＢＳＡでブロックされた。膜は第１の抗体Ｓ２−５６６（生化学工業株式会社）（ＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．１％のＢＳＡ）で＋４℃で一晩インキュベートされた。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄後、膜は過酸化物接合型のヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（１：５０００希釈、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でインキュベートされた。検出はＡｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬウエスタンブロッティング試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて行われた。
【０１７９】
図６は抗ジシアル酸のＳ２−５６６（生化学工業株式会社）のＣＤ３４＋造血幹細胞ライセートのタンパク質への特異的な結合を明らかにする。特定のタンパク質はゲルで可視化された分子重量マーカから算出される、約４５ｋＤａの分子重量を有する。対応する分化したＣＤ３４−細胞においては、染色が可視化できなかった。コントロール実験においては、既知の糖脂質抗体ＶＩＮ−ＩＳ−５６は、造血幹細胞ライセートのブロットにおいていかなる糖タンパク質へのいかなる強い又は特異的な結合をも示さなかった。
［表］
［表１：ＣＤ１３３＋造血幹細胞のＮ−グライコームにおける、オリゴシアル酸付加されたラクトサミンの化学構造の存在］
【０１８０】
【表１】
2010519922.tif 000002
ｍ／ｚは質量対変化の比率を示し、％は細胞の全グライコームからのグリカン型の相対量を示す。好ましい化学構造型は、カラーコード化した化学構造において示され、四角形（青／暗色）がＧｌｃＮＡｃであり、丸形がＭａｎ（緑）、黄色がＧａｌ（明色）、ＮｅｕＮＡｃは菱形によって示される。
［表２：ヒト胚性幹細胞のＮ−グライコームにおけるオリゴシアル酸付加された化学構造の存在］
【０１８１】
【表２】
2010519922.tif 000003
ｍ／ｚは質量対変化の比率を示し、％は細胞の全グライコームからのグリカン型の相対量を示す。好ましい化学構造型はカラーコード化した化学構造において示され、四角形（青／暗色）がＧｌｃＮＡｃであり、丸形がＭａｎ（緑）、黄色がＧａｌ（明色）、ＮｅｕＮＡｃは菱形（マゼンダ）、ＮｅｕＧｃが菱形（ライトブルー）によって示され、Ｓｔ１は段階１であり（未分化）、Ｓｔ２は段階２であり（分化）、Ｓｔ３は段階３（分化）であり、ｍＥＦはコントロールのマウスフィーダ細胞である。化学構造は、単糖組成Ｓ２Ｈ３Ｎ３Ｆ１、Ｓ２Ｈ４Ｎ３Ｆ１、Ｓ２Ｈ４Ｎ５Ｆ１、二分岐型化学構造３／α６／α８結合のシアル酸であるＳ２Ｇ１Ｈ５Ｎ４、及びＳ１Ｇ２Ｈ５Ｎ４に対応する。
［表３：間葉幹細胞及びその由来する細胞集団の異なる型におけるグリカン型の相対量］
【０１８２】
【表３】
2010519922.tif 000004
ｍ／ｚは質量対変化の比率を示し、％は細胞の全グライコームからのグリカン型の相対量を示す。例示的な化学構造型は、カラーコード化した化学構造において示され、四角形（青／暗色）がＧｌｃＮＡｃであり、丸形がＭａｎ（緑）、Ｇａｌ（黄色／明色）、ＮｅｕＮＡｃは菱形（マゼンダ）によって示される。ＢＭ  ＭＳＣは骨髄の間葉幹細胞（２の別個のデータセットが示される）を示し、“ｏｓｔｅｏｇｅｅｎｉｓｅｔ”は骨原性細胞に分化した骨髄の間葉幹細胞を示す。
【図１】
2010519922.tif 000005
【図２】
2010519922.tif 000006
【図３】
2010519922.tif 000007
【図４】
2010519922.tif 000008
【図５】
2010519922.tif 000009
【図６】
2010519922.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月8日(2009.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞を含む細胞標本中の化学構造の量及び存在を分析することによって、ヒト幹細胞又はそれから得られる分化細胞の状態を分析する方法であって、前記化学構造が、
ａ．前記ヒト細胞が間葉、胚性、又は造血幹細胞である場合は、１のＮ−アセチルラクトサミン、
及び／又は、
ｂ．前記ヒト細胞が分化した間葉細胞、又は造血幹細胞である場合は、ＧＤ３ガングリオシドの１のラクトース残基、
につき少なくとも２のシアル酸残基を含み、ただし、前記シアル酸がＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌの化学構造か、一方のシアル酸をＧａｌの三位に、及び、他方のシアル酸をＧｌｃＮＡｃの六位に含む、非直鎖状にジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンかを形成することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記細胞の状態が前記細胞の分化に関して分析されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法において、前記シアル酸がＮｅｕＧｃ、ＮｅｕＡｃ、又はＮｅｕ−ＯＡｃであり、前記化学構造がＮ−アセチルラクトサミンＧａｌβ３／４ＧｌｃＮＡｃを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、シアル酸がジシアル酸のＮｅｕＸαＮｅｕＸエピトープを形成し、ＸがＡｃ又はＧｃ、好ましくはＡｃであり、更に「ジシアル酸」非還元末端エピトープと見なされることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法において、
ａ１）タンパク質及び／又はＮ−アセチルラクトサミンエピトープ上にある、分化した間葉細胞又は造血幹細胞の分析用のＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌ、
及び／又は、
ａ２）ガングリオ系列ガングリオシドＧＤ３上にある、造血幹細胞の分析用、又は、請求項１のａ．の事項に記載の化学構造と組み合わせた、分化した間葉細胞の分析用のＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌ、
として、ＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌエピトープが認識され、前記ジシアル酸エピトープが提供されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、タンパク質及び／又はＮ−アセチルラクトサミンエピトープ上のＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌとして、ＮｅｕＮＡｃα８ＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌエピトープが認識され、前記ジシアル酸エピトープが提供され、前記細胞が造血幹細胞又は分化した間葉細胞であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法において、前記分析が質量分析法を用いることによって、又は前記エピトープを認識する特異的な結合物質／結合剤を用いることによって行われることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記結合剤がＳ２−５６６抗体であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法において、前記結合剤がＧＤ３ガングリオシド抗体、又はＯＡｃＧＤ３認識抗体であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法において、前記抗体が造血幹細胞又は分化した間葉細胞の集団の認識用に用いられることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項６に記載の方法において、請求項８及び１０に記載の前記抗体が同時に用いられることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記抗体が分化した間葉細胞を分析するのに用いられることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法において、前記化学構造が「非直鎖状にジシアル酸付加された」Ｎ−アセチルラクトサミンであり、Ｇａｌの三位に一方のシアル酸、及びＧｌｃＮＡｃの六位に他方のシアル酸を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、前記化学構造がＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃ上にあり、ＸがＡｃ又はＧｃであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記化学構造が細胞のコンタミネーションに関する細胞の分析用に用いられ、前記化学構造が選択的にＮｅｕＧｃを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
分析用抗体の選択又は生成のための、請求項１ないし６又は１４のいずれか１項に記載の化学構造の使用であって、分化した間葉細胞、造血幹細胞、及びその直接的に分化した細胞の精製を含み、前記分析が請求項１に記載に従って行われることを特徴とする使用。
【請求項１７】
請求項１６に記載の使用において、前記エピトープの化学構造が請求項１ないし６又は１４のいずれか１項に記載の型のＮ−アセチルラクトサミンと、間葉、胚性、又は造血幹細胞からの細胞表面タンパク質のポリペプチドとを含むことを特徴とする使用。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載の使用において、前記エピトープが固相に固定化されるか、あるいは観察可能なタグで標識されることを特徴とする使用。
【請求項１９】
請求項１６又は１７に記載の使用において、前記エピトープがファージディスプレイライブラリ又は免疫の選択用に用いられることを特徴とする使用。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法において、前記化学構造が式Ｃ：ＳｋＨｎＮｐＦｑに従い、好ましくはＮ−単糖組成を有するＮ−グリカンであり、ｋが２ないし３の整数であり、ｎが３又は５の整数であり、ｐが３又は４の整数であり、ｑは０又は１となる整数であり、ただし、ｎが３の場合はｐは３又は４であるとし、あるいは、ｎが５の場合はｐは４、ｋは３であるとし、ＳがＮｅｕ５Ａｃ及び／又はＮｅｕ５Ｇｃであり、ＨがＤ−Ｍａｎ又はＤ−Ｇａｌの群から選択される六炭糖であり、ＮがＮ−Ｄ−アセチルヘキソサミン、好ましくはＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ、より好ましくはＧｌｃＮＡｃであり、ＦがＬ−フコースであることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法において、前記化学構造が１のジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法において、前記化学構造が式ＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃに従う１のジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンを含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法において、前記ジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンがＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ又はＮｅｕＡｃα８ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃであることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法において、Ｎ−グリカンの化学構造が、式ＯＳ１：（ＮｅｕＡｃα）ｍＧａｌβ（Ｆｕｃα３／４）ｎ１ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［Ｍａｎα６］ｎ２）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４（Ｆｕｃα６）ｎ３ＧｌｃＮＡｃの式に従い、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が０又は１の整数であり、だたし、ｎ１が０の場合はｎ３は１、ｎ１が１の場合はｎ３は０とするか、あるいはｎ１及びｎ３の双方が０とし、ｍが２又は３の整数であり、シアル酸残基がＧａｌにα３結合され、互いにα８結合されることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法において、前記化学構造が式ＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃに従う１のジシアル酸付加されたＮ−アセチルラクトサミンを含み、ＸがＡｃ又はＧｃであることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１０に記載の方法において、前記化学構造が組成Ｓ２Ｇ１Ｈ５Ｎ４及び／又はＳ１Ｇ２Ｈ５Ｎ４を有し、ＳがＮｅｕ５Ａｃであり、ＧがＮｅｕ５Ｇｃであり、ＨがＤ−Ｍａｎ又はＤ−Ｇａｌの群から選択される六炭糖であり、ＮがＮ−Ｄ−アセチルヘキソサミン、好ましくはＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ、より好ましくはＧｌｃＮＡｃであることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法において、Ｎ−グリカンの化学構造が式（ＮｅｕＸα）ｍ１ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（［ＮｅｕＸα］ｍ２ＧａｌβＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃに従い、ＸがＧｃかＡｃかのいずれかであり、ただし、少なくとも１のＧｃ又はＡｃが分子中にあり、ＧｃとＡｃの双方がジシアル酸エピトープ中にありうるとし、ｍ１が２かつｍ２が１であるか、あるいはｍ２が２かつｍ１が１であり、シアル酸残基がＧａｌにα３結合され、互いにα８結合され、前記Ｇａｌ残基がβ３及び／又はβ４結合されることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の方法において、Ｎ−グリカンの化学構造が式ＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＮｅｕＸαＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ、及び／又は、他の分枝異性体ＮｅｕＸαＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３／６（ＮｅｕＸα３Ｇａｌβ３（ＮｅｕＸα６）ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６／３）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃに従い、ＸがＧｃかＡｃかのいずれかであり、ただし、少なくとも１のＧｃ又はＡｃが分子中にあり、ＧｃとＡｃの双方がジシアル酸エピトープ中にありうるものとすることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の方法において、グリカンが組成Ｓ２Ｈ４Ｎ５Ｆ１を有し、ＳがＮｅｕ５Ａｃ及び／又はＮｅｕ５Ｇｃであり、ＨがＤ−Ｍａｎ又はＤ−Ｇａｌの群から選択される六炭糖であり、ＮがＧｌｃＮＡｃであり、ＦがＬ−フコースであることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の方法において、分化する細胞又は細胞型における差異が分析されることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の方法において、Ｎ−アセチルラクトサミン上の、好ましくはタンパク質上、及び、ＧＤ３ガングリオシドの１のラクトース残基上の、双方の化学構造が分析されることを特徴とする方法。
【国際調査報告】
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