(57)【要約】  下記の式、2010520950.tif 000053（点線は１または２の縮合芳香環の形成に必要な原子を表し、各環は５または６個の原子を含み、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して（非）置換のＣ１−Ｃ１５アルキル他の特定の基、Ｒ５およびＲ６は、互いに独立して（非）置換のＣ１−Ｃ１５アルキル他の特定の基、ＸはＯ、ＳまたはＣＲ７Ｒ８から、ＹはＯ、ＳまたはＣＲ９Ｒ１０から選ばれ、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立して（非）置換のＣ１−Ｃ１５アルキル他の特定の基、Ｒ７およびＲ８ならびに／またはＲ９およびＲ１０はまた、５または６個の原子を含む環、または４または５個の炭素と酸素を含むヘテロ環を形成し、Ｂは１〜５のメチンを含むポリメチンブリッジを表し、この基は特に独立して、非置換であるか、もしくは、（非）置換のＣ１−Ｃ１５アルキル他の特定の基で置換されている）のシアニン誘導体。用途：細胞中の生体分子の標識化用の蛍光化合物。
2010520950.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式、
【化１】
2010520950.tif 000039
（上記の式で、点線は１つまたは２つの縮合芳香環を形成するのに必要な原子を表し、それぞれの環は５または６個の原子を含み、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、
−水素原子、
−置換、または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基、
−Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、
−（Ｃ２−Ｃ１２）ジアルキルアミノ基、
−Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、
−（Ｃ２−Ｃ１２）ジアルキルアミド基、
−置換または非置換のアリール、アリールアルキルまたはアリールオキシ基、
−ハロゲン原子、
−ニトロ基、
−Ｌ１−Ｗ、Ｌ２−Ｍ、Ｌ２−ＡまたはＬ２−Ｇから選ばれる基、を表し、
Ｒ５およびＲ６は、互いに独立して、
−置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基、
−置換または非置換のアリールまたはアリールアルキル基、
−Ｌ１−Ｗ、Ｌ２−Ｍ、Ｌ２−Ａ、またはＬ２−Ｇから選ばれる基、を表し、
Ｘは、Ｏ、ＳまたはＣＲ７Ｒ８から選ばれ、
Ｙは、Ｏ、ＳまたはＣＲ９Ｒ１０から選ばれ、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立して、
−置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基、
−置換または非置換のアリール、アリールアルキルまたはアリールオキシ基、
−Ｌ１−Ｗ、Ｌ２−Ｍ、Ｌ２−ＡまたはＬ２−Ｇから選ばれる基、を表し、
Ｒ７およびＲ８ならびに／またはＲ９およびＲ１０はまた一緒に、５もしくは６個の原子を含む環、または４もしくは５個の炭素原子と酸素原子を含むヘテロ環を形成し、
Ｂは１〜５のメチンを含むポリメチンブリッジを表し、この中でメチン基は独立して、非置換であるか、もしくは、
−置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基、
−置換または非置換のアリール、アリールアルキルまたはアリールオキシ基、
−ニトロ基、
−Ｌ１−Ｗ、Ｌ２−Ｍ、Ｌ２−ＡまたはＬ２−Ｇから選ばれる基、で置換されているか、あるいは隣接するメチンの２つの置換基は一緒に、４、５もしくは６個の原子を含む飽和または不飽和の炭化水素環を形成することができ、この環は、場合によっては１つまたはそれ以上の、
−置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基、
−置換または非置換のアリール、アリールアルキルまたはアリールオキシ基、
−ハロゲン原子、
−ニトロ基、
−Ｌ１−Ｗ、Ｌ２−Ｍ、Ｌ２−ＡまたはＬ２−Ｇから選ばれる基、によって置換されており、
Ｌ１およびＬ２は結合腕であり、
Ｇは反応性基であり、
Ａは結合剤であり、
Ｍは結合された分子であり、
Ｗは、シアニン誘導体が、１つまたは２つのＬ１−Ｗ基、およびＬ２−Ａ、Ｌ２−ＧおよびＬ２−Ｍから選ばれる１つまたは２つの基を含むことを条件として、下記の：
【化２】
2010520950.tif 000040
（上記の式で、
Ｒ１１およびＲ１２は同一または異なっており、そして
−水素原子、
−非置換のＣ１−Ｃ５アルキル基、から選ばれ、
Ｒ１３およびＲ１４は同一または異なっており、そして
−水素原子、
−非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基、
−Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、
−Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボキシ基、
−Ｎ，Ｎ−（Ｃ２−Ｃ１２）ジアルキルアミド基、
−アミド基、
−式−Ｃ−Ｓ−ＣＯ−Ａｌｋの基、から選ばれ、
Ａｌｋは非置換の直鎖または分岐Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ１１およびＲ１２ならびに／またはＲ１３およびＲ１４はまた、一緒に次の式、
【化３】
2010520950.tif 000041
のフタリジル基を形成していてもよい）ホスファートまたはホスホナートエステルである）で表されるシアニン誘導体。
【請求項２】
下記の式、
【化４】
2010520950.tif 000042
【化５】
2010520950.tif 000043
（上記の式で、Ｒ１〜Ｒ６、Ｘ、ＹおよびＢ基は請求項１で定義した通りである）
の１つに相当する、請求項１記載の誘導体。
【請求項３】
ポリメチンブリッジＢが下記の式、
【化６】
2010520950.tif 000044
（上記の式でＲ１５およびＲ１６は、
−水素原子、
−置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基、
−置換または非置換のアリール、アリールアルキルもしくはアリールオキシ基、
−ハロゲン原子、
−ニトロ基、
−Ｌ２−Ｍ、Ｌ２−Ａ、Ｌ２−ＧまたはＬ１−Ｗから選ばれる基、から選ばれ、
Ｌ１およびＬ２は結合腕であり、
Ｇは反応性基であり、
Ａは結合剤であり、
Ｍは結合された分子であり、
Ｗはホスファートまたはホスホナートエステル（好ましくはジエステル）である）から選ばれることを特徴とする、請求項１または２記載の誘導体。
【請求項４】
ＸがＣＲ７Ｒ８基および／またはＹがＣＲ９Ｒ１０基（ここで、１つまたは２つのＲ１−Ｒ４基がＬ１−Ｗ基を表し、また１つまたは２つのＲ７〜Ｒ１０基がＬ２−Ａ、Ｌ２−ＧまたはＬ２−Ｍを表している）であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のシアニン誘導体。
【請求項５】
ＸがＣＲ７Ｒ８基および／またはＹがＣＲ９Ｒ１０基（ここで、Ｒ５および／またはＲ６がＬ１−Ｗ基を表し、また１つまたは２つのＲ７〜Ｒ１０基がＬ２−Ａ、Ｌ２−ＧまたはＬ２−Ｍ基を表している）であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のシアニン誘導体。
【請求項６】
Ｒ５および／またはＲ６がＬ１−Ｗを表し、またＲ１５またはＲ１６がＬ２−Ａ、Ｌ２−ＧまたはＬ２−Ｍ基を表していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のシアニン誘導体。
【請求項７】
１つまたは２つのＲ１〜Ｒ４基がＬ１−Ｗ基を表し、またＲ１５またはＲ１６が、Ｌ２−Ａ、Ｌ２−ＧまたはＬ２−Ｍ基を表していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のシアニン誘導体。
【請求項８】
Ｗ基がホスホナートジエステルであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載の誘導体。
【請求項９】
Ｗが下記の式、
【化７】
2010520950.tif 000045
（上記の式で、Ｒ１１およびＲ１２は同一であり、
−水素原子、
−非置換のＣ１−Ｃ５アルキル基、から選ばれ、
Ｒ１３およびＲ１４は同一であり、また以下の基：
−メチルカルボキシル（＝−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ３−＝アセトキシメチルエステル）、
−ターシャリ−ブチルカルボキシル（＝−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（ＣＨ３）３＝トリメチル−アセトキシメチルエステル）、
−メチルオキシカルボニル（＝−ＣＯ−ＯＣＨ３＝メチルグリコラートエステル）、
−メタンアミド（＝−ＣＯ−ＮＨ２＝グリコールアミドエステル）、
−Ｎ，Ｎ−ジメチルメタンアミド（＝−ＣＯ−Ｎ（ＣＨ３）２＝置換グリコールアミドエステル）、
−Ｎ−メチルメタンアミド、から選ばれる）
のホスホナートジエステルであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項記載のシアニン誘導体。
【請求項１０】
下記の式、
【化８】
2010520950.tif 000046
（ここで、
−Ｒ１およびＲ３は水素原子であり；
−Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、独立して置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基を表し；
−Ｒ５およびＲ６は、互いに独立して置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基を表し；
−Ｂは、１〜５の非置換メチンを含むポリメチンブリッジを表し；
−Ｒ１０は、Ｌ２−Ｍ、Ｌ２−ＡまたはＬ２−Ｇから選ばれる基を表し；
−Ｌ２は結合腕であり；
−Ｇは反応性基であり；
−Ａは結合剤であり；
−Ｍは結合した分子であり；、
−Ｒ２およびＲ４は同一であり、またＬ１−Ｗ基を表し；
−Ｌ１は、単結合または式−（ＣＨ２）ｎ−の基から選ばれた結合腕であり（ｎは２〜８の範囲の整数である）；
−Ｗは、下記の式
【化９】
2010520950.tif 000047
（ここで、Ｒ１１およびＲ１２は同一かまたは異なっており、また、
−水素原子；
−非置換のＣ１−Ｃ５アルキル基；から選ばれ；
Ｒ１３およびＲ１４は同一かまたは異なっており、また
−水素原子；
−非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基：
−Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基；
−Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニル基；
−Ｎ，Ｎ−（Ｃ２−Ｃ１２）ジアルキルアミド基；
−アミド基；
−式−Ｃ−Ｓ−ＣＯ−Ａｌｋの基（Ａｌｋは非置換の直鎖または分岐Ｃ１−Ｃ４アルキルである）から選ばれ；
Ｒ１１およびＲ１２並びに／またはＲ１３およびＲ１４はまた、一緒に下記の式、
【化１０】
2010520950.tif 000048
のフタリジル基を形成してもよい）で表される基から選ばれるホスホナートジエステルである）に相当することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載のシアニン誘導体。
【請求項１１】
下記の式、
【化１１】
2010520950.tif 000049
（ここで、
−Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は水素原子であり；
−Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は独立して置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基を表し；
−Ｂは１〜５の非置換メチンを含むポリメチンブリッジを表し；
−Ｒ１０はＬ２−Ｍ、Ｌ２−ＡまたはＬ２−Ｇから選ばれる基を表し；
−Ｌ２は結合腕であり；
−Ｇは反応性基であり；
−Ａは結合剤であり；
−Ｍは結合した分子であり；
−Ｒ５およびＲ６は同一であり、またＬ１−Ｗ基を表し；
−Ｌ１は単結合または式−（ＣＨ２）ｎ−の基から選ばれる結合腕であり（ｎは２〜８の範囲の整数である）；
−Ｗは下記の式、
【化１２】
2010520950.tif 000050
（ここで、
Ｒ１１およびＲ１２は同一かまたは異なっており、また、
−水素原子；
−非置換Ｃ１−Ｃ５アルキル基；から選ばれ、
Ｒ１３およびＲ１４は同一かまたは異なっており、また、
−水素原子；
−非置換Ｃ１−Ｃ１５アルキル基；
−Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基；
−Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニル基；
−Ｎ，Ｎ−（Ｃ２−Ｃ１２）ジアルキルアミド基；
−アミド基；
−式−Ｃ−Ｓ−ＣＯ−Ａｌｋの基（Ａｌｋは非置換の直鎖または分岐Ｃ１−Ｃ４アルキルである）から選ばれ；
Ｒ１１およびＲ１２並びに／またはＲ１３およびＲ１４はまた、一緒に下記の式、
【化１３】
2010520950.tif 000051
のフタリジル基を形成していてもよい）から選ばれる式を持つホスホナートジエステルである）に相当することを特徴とする請求項１〜３および５のいずれか１項記載のシアニン誘導体。
【請求項１２】
結合腕Ｌ１およびＬ２が、単共有結合、または炭素、窒素、リン、酸素および硫黄原子から選ばれた、水素以外に１〜２０個の原子を含む、間隔を開ける腕であることができ、この結合基は、直鎖もしくは分岐の、環状もしくはヘテロ環状の、また飽和もしくは不飽和の、そして炭素−炭素結合（単結合、二重結合、三重結合もしくは芳香族系であることができる）；炭素−窒素結合；窒素−窒素結合；炭素−酸素結合；炭素−硫黄結合；リン−酸素結合；リン−窒素結合；エーテル結合；エステル結合；チオエーテル結合；アミン結合；アミド結合；カルボキサミド結合；スルホンアミド結合；尿素結合；ウレタン結合；ヒドラジン結合；またはカルバモイル結合から選ばれる結合の組み合わせから構成されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項記載のシアニン誘導体。
【請求項１３】
結合基Ｌが、炭素、窒素、リン、酸素および硫黄原子から選ばれた、水素以外に１〜２０個の原子を含んでおり、また更に少なくとも１つのエーテル、チオエーテル、カルボキサミド、スルホンアミド、ヒドラジン、アミンもしくはエステル結合、および芳香族もしくはヘテロ芳香族結合を含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項記載のシアニン誘導体。
【請求項１４】
結合基Ｌが、以下の置換もしくは非置換の連鎖：ポリメチレン、アリーレン、アルキルアリーレン、アリーレンアルキルまたはアリールチオ、から選ばれることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項記載のシアニン誘導体。
【請求項１５】
反応性基Ｇが、以下の化合物、アクリルアミド、活性アミン（例えば、カダベリンまたはエチレンジアミン）、活性エステル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、アニリン、アジド、アジリジン、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、例えばモノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、ヒドラジン（ヒドラジドを含む）、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ハロゲン化スルホニル、チオール、ケトン、アミン、酸ハロゲン化物、ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、アジドニトロフェニル、アジドフェニル、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド、またはグリオキサル、そして特に下記の式、
【化１４】
2010520950.tif 000052
（ここで、ｎは０〜８の範囲であり、またｐは０または１であり、またＡｒは１〜３個のヘテロ原子を含む５員もしくは６員のヘテロ環であり、該ヘテロ原子は場合によってはハロゲン原子によって置換されていてもよい）の基、から誘導される基から選ばれることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項記載のシアニン誘導体。
【請求項１６】
Ａ基が、ベンジルグアニンまたはその誘導体の１つ（これはアルキルグアニントランスフェラーゼの基質である）、ハロアルカン（これはハロアルカン脱ハロゲン酵素の基質である）、特に、クロロアルカン、抗体、抗体断片、ペプチドアプタマー、ビオチン、二ヒ素化合物、トリメトロプリン、メトトレキサート、ＳＬＦ’、から選ばれることを特徴とする請求項１５記載のシアニン誘導体。
【請求項１７】
Ｍ基が、核酸、タンパク質、糖、脂質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、代謝中間体、酵素、ホルモンおよび神経伝達物質から選ばれる生体分子であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項記載のシアニン誘導体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項記載のシアニン誘導体の蛍光標識としての使用。
【請求項１９】
細胞中に存在する生体分子を標識化する方法であって、細胞外の媒体中に、請求項１〜１７のいずれか１項記載の、結合剤Ａを含む化合物を導入することからなり、前記の生体分子が結合ドメインを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、赤色および近赤外で光を吸収し、また蛍光を発するシアニン誘導体である。これらのシアニン誘導体は、細胞膜を通り抜けることができ、また官能化されていて、そしてそのために蛍光標識として容易に用いることができる。
【０００２】
本発明はまた、細胞中の分子の標識化を可能にする結合剤に共有結合している、本発明のシアニン誘導体を含む蛍光結合体に関する。本発明によるこのシアニン誘導体は、細胞中のタンパク質の標識化に特に適している。
【０００３】
最後に、本発明はまた、細胞中へと挿入することが望まれる物質に共有結合された本発明のシアニン誘導体を含む蛍光結合体に関し、この物質はこのシアニン誘導体と結合することによって蛍光性にされる。
【０００４】
本発明の他の主題は、本発明のシアニン誘導体の、生体細胞中に存在する標識製品への使用である。
【０００５】
本発明による化合物は、原形質膜の品位を改質することなく、特にこの膜を透過性の状態にすることを意図した製品を用いることなく、細胞内の媒体中に存在する生体分子の標識化に特に使用されるものである。
【０００６】
実際に、本発明による化合物は、それらが、凝集の問題を解決するために従来技術において慣用に用いられている、スルファート、スルホナート、ホスファート、またはカルボキシラート基を有しない場合には、親油性の性質を有している。これらの基は、ホスホナートもしくはホスファートエステル（好ましくはジエステル）で置換されており、それらはこれらの化合物の親油性の性質に影響を与えず、そして細胞内酵素による加水分解の後には、細胞内における凝集の現象を防ぐことを可能にする。
【０００７】
従って本発明はまた、結合剤を含む本発明によるシアニン誘導体の、蛍光標識としての使用に関する。
【０００８】
更に本発明は、細胞外の媒体中へ、結合剤を含む本発明による誘導体を導入することからなる無傷細胞中に存在する生体分子を標識化する方法に関し、前記の生体分子は結合ドメインを含んでいる。この方法は、細胞内部の化合物を、細胞の膜を透過性の状態にすることなく標識化することを可能にするので、非常に有利である。
【０００９】
可視および近赤外スペクトル領域において光を吸収および放射する蛍光染料が、生化学の、生物学の、そして診断の分野において、特にそれらのモル吸光および／またはそれらの高い蛍光量子収率のために、種々の分析用途に通常用いられている。
【００１０】
特に、シアニン誘導体だけが近赤外において吸収および放射し、この波長範囲は、蛍光標識として用いられる染料の光化学的分解に因る漂白を回避することを可能にするので、生体細胞の研究において特に有利な電磁気スペクトルの領域である（この現象は光子のエネルギーの関数として悪化し、そして従って近赤外においては非常に顕著ではない）。更に、生体分子は近赤外においては自己蛍光を示さず、このことは非特異性の背景ノイズの問題を限定的なものにする。
【００１１】
これらの利点にもかかわらず、多環式基および疎水性のポリメチン鎖の存在によるシアニンの親油性の性質は、蛍光標識としての良好な性能とは常には両立できなかった。例えば、シアニンは溶液中で凝集体を形成する傾向を有している。従って、インドシアニングリーンでは、それが１２５μＭ超の濃度で用いられた場合には、凝集体の形成による蛍光の減光の結果として、その量子収率が低下することを経験している。この現象は、かなり一般的であるが（これはまた、フルオレセインの場合にでも存在する）、特にシアニン系において著しい。
【００１２】
更に、そしてこの親油性の性質にかかわらず、シアニンは、その高分子量（７００〜８００ドルトンの水準）のために、生体膜を非常に不十分にしか透過せず、というよりも実際には全く透過しないが、一方で小さい分子、例えばフルオレセイン（３３７ドルトン）はこの不利益を示さない。
【００１３】
溶解性およびシアニンの凝集の問題を克服する技術的な解決策は非常に満足できるものではなかった。シアニンの、親油性ペプチドとの、ポリエチレングリコールとの、またはオリゴ糖との結合体が用いられており、また幾つかの研究が、近赤外への染料の使用およびそれらの生体分子との結合体についてなされてきている。この取り組みは、多段階の合成を要するという不都合を有しており、そのことは低い収率を意味している。更に、親水性のオリゴペプチドまたはオリゴ糖を使用する場合には、原価は高くなる可能性があり、またこれらの結合体の精製は、慣用の有機合成において用いられている精製とは別の精製技術が要求される。
【００１４】
光物理的特性、および従って蛍光トレーサとしての分析的性能を改善するために最も一般に用いられている取り組みは、インドール環系上に負電荷を持つ化学基、例えばスルホナート、および／またはアルキルスルホナート（スルホアルキル）およびまたカルボキシル基、を導入することにより親水性の性質を強化することによって、凝集の現象を制限するということであった。従って、スルホン化されていないインドシアニン誘導体（例えばシグマ（Sigma）からのＩＲ−７８６の商標名で知られている製品）は、１０μＭ未満の溶解度を有し、またそれらの水性媒体中での使用は補助剤（adjuvants）の使用を要求する。これらの誘導体のテトラスルホン化は水性媒体中の溶解性を１０ｍＭ超まで増加させることを可能にする。一方で、スルホン化は蛍光量子収率へは僅かな影響しか有しておらず、それはテトラスルホン化化合物について平均で１５％未満である。
【背景技術】
【００１５】
国際公開第２００５／０５６６８９号は、生理的ｐＨにおいて染料であり、シアニン骨格を有し、また負の電荷をもつ置換基を含む化合物に関する。
【００１６】
国際公開第２００５／０６１４５６号は、水溶性基を示すシアニン化合物を含む近赤外蛍光造影剤に関する。
【００１７】
国際公開第２００５／０８９８１３号は、シアニン染料および画像診断および治療法において用いられるそれらの生物学的結合体に関する。この結合体は、特にさまざまなビスおよびテトラキス（カルボン酸）同族体を備えた幾つかのシアニン染料とからなっている。
【００１８】
国際公開第２００５／０５６６８７号は、主題としてシアニン染料を有しており、そのメチン残基は置換されており、それは核酸の標識化のために適切であり、また特にスルホアルキルまたはカルボキシアルキル鎖によって置換されたシアニン誘導体からなっている。
【００１９】
国際公開第２００４／０３９８９４号は、官能化されたシアニン染料およびシアニン染料の調製における中間体として有用なそれらの誘導体、またこれらの染料の調製方法、ならびにそのように得られた染料に関する。このシアニン誘導体は全てスルホナート官能基を含んでいる。
【００２０】
国際公開第０３／０８２９８８号は、例えば生物医学画像に有用な、水溶性の近赤外蛍光色素に関する。
【００２１】
国際公開第０２／０６８５３７号は、蛍光染料、特には水に可溶で、また生体分子への攻撃のための付加的なサイトを含む、蛍光シアニン染料に関する。その水への溶解性は、スルホナート基の存在によって与えられている。
【００２２】
国際公開第０２／２４８１５号には、スルホナート基を含むシアニン誘導体が記載されている。
【００２３】
国際公開第０１／７７２２９号は、メチン鎖のメソ位にあるアルキル置換基、スルホアリール基および標的物質に結合することを可能にする少なくとも１つの反応性基を示すシアニン染料に関する。
【００２４】
国際公開第０１／５２７４６号は、医学画像および治療に適切な染料−ペプチド結合体に関する。これらの染料−ペプチド結合体は、さまざまなビスおよびテトラキス（カルボン酸）同族体を備えた幾つかのシアニン系の染料を含んでいる。
【００２５】
国際公開第００／６６６６４号は、環式のアザベンゾリウム（azabenzolium）断片を含む非対称のシアニン染料、特にカチオン性側鎖によって置換されたシアニン染料、単量体のまた二量体のシアニン染料、化学的に反応性のシアニン染料およびシアニン染料結合体に関する。
【００２６】
国際公開第０１／５７２３７号には、ＮＯ２基およびカルボン酸エステルを含む、非蛍光性のシアニンが記載されている。
【００２７】
シアニンの凝集の現象を低減する目的で、ホスホナート（ホスホン酸）官能基を用いる試みがなされている。［オズワルド（Oswald）  Ｂ．ら、新規なダイオードレーザーに準拠した蛍光色素分子ならびに、単分子検出、タンパク質標識化および蛍光共鳴エネルギー転移免疫測定法へのその応用、光化学光生物学（Photochem. Photobiol.）、２００１年、第７４巻、第２号、ｐ．２３７―２４５］
【００２８】
国際公開第０１／３６９７３号には、リン酸残基またはホスホン酸残基、またはそれらのモノエステルの塩を標識に導入することからなる、光標識の水への溶解性を改善する方法に関する。これらの標識は、生体分子、ポリマーおよび医薬品を標識化するのに有用である。この出願には特に、インドール環の窒素上にアルキルホスホナートモノエステルを持つペンタメチンシアニンが記載されている。
【００２９】
グルーバー（Gruber）ら、ジャーナルオブフルオレスセント（Journal of Fluorescence）、２００５年５月、第１５巻、第３号、ｐ．２０７−２１４、には、２種のシアニンから誘導された化合物（クロメオン（chromeon）５４６およびクロメオン６４２と称される）が記載されており、それでは窒素原子の１方がジメチレンの腕で担持されたホスホナートエチルエステルによって置換されており、また他方がポリメチレンの腕で担持されたＮ−ヒドロキシスクシンイミド反応性基によって置換されている。このホスホナート基は、これらの化合物が、先験的に、生物学的膜を透過することを可能にしないことに注目しなければならない。
【００３０】
マジエール（Mazieres）ら、染料および顔料（Dyes and Pigments）、２００７年、第７４巻、ｐ．４０４−４０９には、インドール環の窒素上でジエトキシホスホリルプロピル基によって置換された対称シアニンが記載されている。これらの化合物は、加水分解後に、水溶性のホンホン酸基を持つシアニンをもたらす。
【００３１】
米国特許出願公開第２００６／０１９９９５５号明細書には、シアニンの極性、および従ってその溶解性を増加させることを意図した両性イオンのホスホン酸塩を含むシアニンが記載されており、記載されているこれらの化合物はまた、スルホナート基を持っており、そして従って無傷細胞の細胞膜を透過できない。
【００３２】
近赤外において蛍光性であり、またカルボシアニン構造と併せて荷電した官能基、例えば上記したような基（スルファート、スルホナート、カルボキシル、ホスファートもしくはホスホナート）を有する染料が、それらの高分子量（例えばローダミンの３３４Ｄａに比べて）のために、また複数の電荷の存在によって、低い膜透過性を示すことが報告されている。電荷数の増加に伴って、蛍光染料は、細胞外の区画の中に留まることもまた観察されている［フランギオニ（Frangioni）  Ｊ．  Ｖ．、生体内の近赤外蛍光画像（In vivo near-infrared fluorescence imaging）、 Curr. Opin. Chem. Biol、２００３年、第７巻、第５号、ｐ．６２６−６３４］。最後に、この種の幾つかの蛍光化合物が同一の生体分子に付加している場合には、蛍光性の消滅が観察されている［リン（Lin）  Ｙ．ら、新規な近赤外シアニン蛍光色素：合成、特性および生体結合体化（Novel near-infrared cyanine fluorochromes: synthesis, properties and bioconjugation）、Bioconjug., Chem.、２００２年、第１３巻、第３号、ｐ．６０５−６１０］
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０５６６８９号
【特許文献２】国際公開第２００５／０６１４５６号
【特許文献３】国際公開第２００５／０８９８１３号
【特許文献４】国際公開第２００５／０５６６８７号
【特許文献５】国際公開第２００４／０３９８９４号
【特許文献６】国際公開第０３／０８２９８８号
【特許文献７】国際公開第０２／０６８５３７号
【特許文献８】国際公開第０２／２４８１５号
【特許文献９】国際公開第０１／７７２２９号
【特許文献１０】国際公開第０１／５２７４６号
【特許文献１１】国際公開第００／６６６６４号
【特許文献１２】国際公開第０１／５７２３７号
【特許文献１３】国際公開第０１／３６９７３号
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００６／０１９９９５５号
【非特許文献】
【００３４】
【非特許文献１】オズワルド（Oswald）  Ｂ．ら、新規なダイオードレーザーに準拠した蛍光色素分子ならびに、単分子検出、タンパク質標識化および蛍光共鳴エネルギー転移免疫測定法へのその応用、光化学、光生物学、２００１年、第７４巻、第２号、ｐ．２３７―２４５
【非特許文献２】グルーバー（Gruber）ら、ジャーナルオブフルオレスセント（Journal of Fluorescence）、２００５年５月、第１５巻、第３号、ｐ．２０７−２１４
【非特許文献３】マジエール（Mazieres）ら、染料および顔料（Dyes and Pigments）、２００７年、第７４巻、ｐ．４０４−４０９
【非特許文献４】フランギオニ（Frangioni）  Ｊ．  Ｖ．、生体内の近赤外蛍光画像（In vivo near-infrared fluorescence imaging）、 Curr. Opin. Chem. Biol、２００３年、第７巻、第５号、ｐ．６２６−６３４
【非特許文献５】リン（Lin）  Ｙ．ら、新規な近赤外シアニン蛍光色素：合成、特性および生体結合体化（Novel near-infrared cyanine fluorochromes: synthesis, properties and bioconjugation）、Bioconjug., Chem.、２００２年、第１３巻、第３号、ｐ．６０５−６１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
それ故に、細胞膜を透過することができ、凝集する傾向を示さない、また蛍光標識として用いることができる、シアニン誘導体への要求が存在している。凝集を克服するための従来技術の解決策（負に帯電した基の付加）は良好な膜透過性とは矛盾することに注目することが重要である。反対に、膜を透過することができる親油性のシアニンは凝集する傾向にある。
【００３６】
染料が細胞の膜を透過する傾向を支配するパラメータが知られている（親油性、極性および電荷、それらは統合して、両親媒性の性質、分子の大きさおよび形状を決める）が、しかしながらそれらの相対的影響およびそれらの膜を透過する特性の予測ツールとしての使用は限定されたままである。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
これらの障害にもかかわらず、細胞膜を透過することができ、しかしながら凝集および溶解性の問題を示さない、新規なシアニン誘導体が開発された。
【００３８】
本発明によるシアニンは、
・結合腕を通してシアニンにグラフトした、少なくとも１つのホスファートエステル（好ましくはジエステル）または１つのホスホナートエステル（好ましくはジエステル）、および
・官能基または結合剤、あるいはまた標識化された形態で細胞中に挿入されることが望まれる結合された物質（この官能基、結合剤または物質は結合腕によって担持されている）、を含む際立った特徴を含んでいる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明による化合物は、それらがシアニンに特有な疎水基（多環、ポリメチン鎖）を含み、また極性基、例えば従来技術において凝集および溶解性の問題を克服するために与えられたような基、を含まない限り細胞膜を透過することができ、本発明による化合物はスルファート、スルホナート、ホスファート、ホスホナートまたはカルボキシレート基を含まない。
【００４０】
一方、本発明によるシアニン誘導体は少なくとも１つのホスファートまたはホスホナートエステル（好ましくはジエステル）を含み、これらの基は細胞の細胞質中で加水分解を受けるという際立った特徴を有しており、この加水分解は細胞酵素、特にホスホジエステラーゼ、によって触媒され、このことは、酵素過程を妨害するであろうシアニン構造の存在にも拘わらずその通りである。
【００４１】
更に、本発明によるシアニン誘導体は官能化されており、そのことで当業者は、かれらが標識化したいと望むいかなる基もしくは分子にでも、それらを結合することが可能になる。本発明による製品はまた、それらの製品が、適当な結合ドメインを含む生体分子を標識化することを可能にする結合剤を含んでいる。
【００４２】
これらの特徴は本発明によるシアニン誘導体を、細胞内の生体分子の、蛍光性の化合物による標識化に特に適した化合物にさせており、この蛍光性の化合物は励起することができ、また細胞を必ずしも透過性にすることなく、赤および近赤外に放射する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】（原文記載なし）
【図２】（原文記載なし）
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明による蛍光性の化合物は、下記の式（Ｉ）のシアニン誘導体である。
【００４５】
【化１】
2010520950.tif 000003
【００４６】
上記の式で、点線は１つまたは２つの縮合芳香環を形成するのに必要な原子を表し、それぞれの環は５または６個の原子を含み、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、
−水素原子、
−置換、または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基、
−Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、
−（Ｃ２−Ｃ１２）ジアルキルアミノ基、
−Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、
−（Ｃ２−Ｃ１２）ジアルキルアミノ基、
−置換または非置換のアリール、アリールアルキルまたはアリールオキシ基、
−ハロゲン原子、
−ニトロ基、
−Ｌ１−Ｗ、Ｌ２−Ｍ、Ｌ２−ＡまたはＬ２−Ｇから選ばれる基、を表し、
Ｒ５およびＲ６は、互いに独立して、
−置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基、
−置換または非置換のアリールまたはアリールアルキル基、
−Ｌ１−Ｗ、Ｌ２−Ｍ、Ｌ２−Ａ、またはＬ２−Ｇから選ばれる基、を表し、
Ｘは、Ｏ、ＳまたはＣＲ７Ｒ８から選ばれ、
Ｙは、Ｏ、ＳまたはＣＲ９Ｒ１０から選ばれ、
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は独立して、
−置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基、
−置換または非置換のアリール、アリールアルキルまたはアリールオキシ基、
−Ｌ１−Ｗ、Ｌ２−Ｍ、Ｌ２−ＡまたはＬ２−Ｇから選ばれる基、を表し、
【００４７】
Ｒ７およびＲ８ならびに／またはＲ９およびＲ１０はまた一緒に、５もしくは６個の原子を含む環、または４もしくは５個の炭素原子と酸素原子を含むヘテロ環を形成し、
Ｂは１〜５のメチンを含むポリメチンブリッジを表し、この中でメチン基は独立して、非置換であるか、もしくは、
−置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基、
−置換または非置換のアリール、アリールアルキルまたはアリールオキシ基、
−ニトロ基、
−Ｌ１−Ｗ、Ｌ２−Ｍ、Ｌ２−ＡまたはＬ２−Ｇから選ばれる基、で置換されているか、あるいは隣接するメチンの２つの置換基は一緒に、４、５もしくは６個の原子を含む飽和または不飽和の炭化水素環形成することができ、この環は、場合によっては１つまたはそれ以上の、
−置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基、
−置換または非置換のアリール、アリールアルキルまたはアリールオキシ基、
−ハロゲン原子、
−ニトロ基、
−Ｌ１−Ｗ、Ｌ２−Ｍ、Ｌ２−ＡまたはＬ２−Ｇから選ばれる基、によって置換されている。
【００４８】
Ｌ１およびＬ２は結合腕であり、
Ｇは反応性基であり、
Ａは結合剤であり、
Ｍは結合された分子であり、
Ｗは、シアニン誘導体が、１つまたは２つのＬ１−Ｗ基、およびＬ２−Ａ、Ｌ２−ＧおよびＬ２−Ｍから選ばれる１つまたは２つの基を含むことを条件として、下記に定義されるホスファートまたはホスホナートエステル（好ましくはジエステル）である。
【００４９】
本発明の式（Ｉ）のシアニン誘導体は、対イオン「Ｚ」（表記されてはいない）を含み、シアニン誘導体の正もしくは負の電荷を平衡させる。
【００５０】
対イオンの性質は、本発明では本質的なことではなく、それは用いられる合成方法またはその中でシアニン誘導体が発生する媒体によって決まる。
【００５１】
例えば、Ｚは、
−ヨウ化物によるアルキル化、例えばＣＨ３ＣＨ３Ｉ、の場合にはＩ−、
−加水分解がＨＣｌで行われるならばＣｌ−、
−トリフルオロ酢酸（ＣＦ３ＣＯＯＨ）またはギ酸（ＨＣＯＯＨ）のそれぞれの存在下での、逆相ＨＰＬＣによる精製の場合には、ＣＦ３ＣＯＯ−またはＨＣＯＯ−、である。
【００５２】
有利には、対イオンＺはＩ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＨＣＯＯ−またはＮａ＋から選ばれる。
【００５３】
定義
本発明においては、それぞれの基は以下の意味を有している。
・Ｃ１−Ｃ１５アルキル基：直鎖、分岐または環状（この場合、場合によってはヘテロ原子、例えばＯ、ＳもしくはＮによって中断されている）炭化水素鎖で、１〜１５個の炭素原子を含んでおり、また場合によっては１つまたはそれ以上の、以下の基、クロロ、フルオロ、ブロモ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ２−Ｃ１２ジアルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボキシレート、Ｎ，Ｎ−（Ｃ２−Ｃ１２）ジアルキルアミドもしくはアミド、によって置換されている。
アルキル基の例としては、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、ブチル、ターシャリブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−デシル、ｎ−ドデシル、シクロへキシルまたはオクチルが挙げられる。
【００５４】
・Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基：直鎖または分岐炭化水素鎖で、酸素原子に結合する１〜６個の炭素原子を含んでいる。アルコキシ基の例としては、次の基、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ターシャリブトキシおよびｎ−ブトキシが挙げられる。
【００５５】
・Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基：直鎖または分岐炭化水素鎖で、カルボキシル基−ＯＯＣ−の酸素に結合する１〜６個炭素原子を含んでいる。
【００５６】
・Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボキシル基：直鎖または分奇異炭化水素鎖で、カルボキシル基−ＣＯＯ−の炭素に結合する１〜６個の炭素原子を含んでいる。
【００５７】
・（Ｃ２−Ｃ１２）ジアルキルアミノ基：２つの直鎖または分岐アルキル基を含む窒素で、このアルキル基は同一かもしくは異なっており、またそれぞれ２〜１２個の炭素原子で構成されている。
【００５８】
・Ｎ，Ｎ−（Ｃ２−Ｃ１２）ジアルキルアミド基：（Ｃ２−Ｃ１２）ジアルキルアミノ基で、カルボニル基−ＣＯ−の炭素に結合している。
【００５９】
・Ｃ５−Ｃ１４アリール基：５または６個の炭素原子を含む芳香環、または８〜１０個の原子を含む芳香族二環または１０〜１４個の原子を含む芳香族三環。このアリール基は、場合によっては以下の基、Ｃ１−Ｃ１５アルキル、クロロ、フルオロ、ブロモ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、ジ（Ｃ１−Ｃ１５）アルキルアミノまたはＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニルから選ばれる１つまたはそれ以上の置換基によって置換されていてもよい。
【００６０】
・５〜１０元素を含むヘテロアリール基：５〜１０個の炭素原子を含む単環もしくは多環を有するアリール基で、炭素原子の少なくとも１つはＮ、ＯまたはＳから選ばれるヘテロ原子によって置き換えられている。ヘテロアリール基は、場合によっては以下の基、Ｃ１−Ｃ１５アルキル、クロロ、フルオロ、ブロモ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、ジ（Ｃ１−Ｃ１５）アルキルアミノまたはＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、から選ばれる１つまたはそれ以上の置換基によって置換されていてもよい。
ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、ピリジル、チエニル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイミダゾリル、キノリル、ベンゾフラニル、インドリル、カルバゾリル、クマリニルおよびベンゾクマリニルが挙げられる。
【００６１】
・Ｃ６−Ｃ２５アリールアルキル基：Ｃ１−Ｃ１５アルキル基に結合したＣ５−Ｃ１０アリール基。
【００６２】
・ハロゲン：クロロ−、フルオロ−、ヨード−またはブロモ−。
【００６３】
・結合腕Ｂ：炭素、窒素、リン、酸素および硫黄原子から選ばれる、水素を除いて１〜２０個の原子を含む単共有結合または中間腕（spacing arm）であることができ、この結合基は直鎖もしくは分岐状、環状もしくはヘテロ環状また飽和もしくは不飽和であり、また以下の結合から選ばれる結合の組み合わせで構成されている：炭素−炭素結合（一重、二重、三重もしくは芳香族であってよい）、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、リン−酸素結合、リン−窒素結合、エーテル結合、エステル結合、チオエーテル結合、アミン結合、アミド結合、カルボキサミド結合、スルホンアミド結合、尿素結合、ウレタン結合、ヒドラジン結合、またはカルバモイル結合。
【００６４】
・無傷細胞：例えば、細胞の膜を透過性の状態にすることを意図した化学的処理を受けていない細胞のように、膜の品位および細胞内の品位が維持されている細胞を意味している。
【００６５】
本発明の好ましい化合物
本発明による好ましいシアニン誘導体は、下記の式に相当する化合物であり、その中でＲ１〜Ｒ６、Ｂ、ＸおよびＹ基は上記で定義した通りである。
【００６６】
【化２】
2010520950.tif 000004
【００６７】
【化３】
2010520950.tif 000005
【００６８】
ポリメチンブリッジＢ
本発明の化合物は、環状構造の間にポリメチンブリッジを含んでいる。上記に示した通りに、これらのメチンは置換されていてもよく、または隣接するメチンが一緒に、４、５もしくは６個の元素（これらの元素は場合によっては置換されていてもよい）を含む、飽和もしくは不飽和の炭化水素環を形成していてもよい。
【００６９】
本発明の好ましい化合物は、非置換のメチンを含むか、あるいは中央のメチンのみが置換されているか、あるいはまた中央の２つのメチンが環を形成している。
【００７０】
説明の目的で、また暗黙に限定することなく、このブリッジは以下のポリメチン鎖であることができる：
【００７１】
【化４】
2010520950.tif 000006
【００７２】
上記の式でＲ１５およびＲ１６は、
−水素原子、
−置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基、
−置換または非置換のアリール、アリールアルキルもしくはアリールオキシ基、
−ハロゲン原子、
−ニトロ基、
−Ｌ２−Ｍ、Ｌ２−Ａ、Ｌ２−ＧまたはＬ１−Ｗから選ばれる基、から選ばれ、
Ｌ１およびＬ２は結合腕であり、
Ｇは反応性基であり、
Ａは結合剤であり、
Ｍは結合された分子であり、
Ｗはホスファートまたはホスホナートエステル（好ましくはジエステル）である。
【００７３】
好ましくは、ポリメチンブリッジは、以下の式の１つに相当する。
【００７４】
【化５】
2010520950.tif 000007
【００７５】
ホスファートまたはホスホナートエステル（好ましくはジエステル）
本発明によるシアニン誘導体上に存在する腕によって担持されているホスファートまたはホスホナートエステル（好ましくはジエステル）は、以下のような幾つかの技術的利点を与える：ホスファートまたはホスホナートエステルは化合物の極性を増加させず、また従ってそれらが脂質生体膜を透過することを促進し、更に、一旦細胞内に入ると、ホスファートまたはホスホナートエステル（好ましくはジエステル）は細胞酵素によって加水分解されてホスファートまたはホスホナート基を与える。これらのホスファートまたはホスホナート基は、本発明によるシアニンの、特にタンパク質の標識化における有効性に寄与するが、それはそれらがシアニンをこの用途に用いる場合に通常観察される凝集の現象を克服すことを可能にするからである。
【００７６】
これらの基は、当業者に知られている合成方法に従ってシアニンにグラフトすることができる。例えば、芳香族環系へのホスホナートエステルの導入は、次の文献中に記載された手順に従って、実施例１３に記載したように、臭素化誘導体、例えば５−ブロモ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール、から出発して実施される［ヒラオ（ひらお）  Ｔ．ら、ジアルキルアレーンホスホナートの新規な合成（A Novel Synthesis of Dialkyl Arenephosphonates）、合成（Synthesis）、１９８１年、（１）、ｐ．５６−５７］。下記の実験部分に、ホスファートまたはホスホナートエステルを含むシアニン誘導体の合成の経路を示す。
【００７７】
ホスファートエステルがシアニンの芳香族環上に導入される場合には、これらの基は必ず結合腕によって担持されていなければならない。
【００７８】
ホスファートまたはホスホナートエステル（好ましくはジエステル）基Ｗは以下の式を有している：
【００７９】
【化６】
2010520950.tif 000008
【００８０】
上記の式で、Ｒ１１およびＲ１２は同一または異なっており、そして
−水素原子、
−非置換のＣ１−Ｃ５アルキル基、から選ばれ、
Ｒ１３およびＲ１４は同一または異なっており、そして
−水素原子、
−非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基、
−Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、
−Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボキシ基、
−Ｎ，Ｎ−（Ｃ２−Ｃ１２）ジアルキルアミド基、
−アミド基、
−式−Ｃ−Ｓ−ＣＯ−Ａｌｋの基、から選ばれ、
Ａｌｋは非置換の直鎖または分岐Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ１１およびＲ１２ならびに／またはＲ１３およびＲ１４はまた、一緒に次の式のフタリジル基を形成していてもよい。
【００８１】
【化７】
2010520950.tif 000009
【００８２】
本発明による特に好ましいシアニン誘導体は、ホスファート／ホスホナートエステルがシアニンのインドール芳香環にグラフトしているものである。
【００８３】
下記の一般式のホスホナートジエステルが好ましい。
【００８４】
【化８】
2010520950.tif 000010
【００８５】
上記の式で、Ｒ１１およびＲ１２は同一であり、
−水素原子、
−非置換のＣ１−Ｃ５アルキル基、から選ばれ、
Ｒ１３およびＲ１４は同一であり、また以下の基から選ばれる：
−メチルカルボキシル（＝−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ３−＝アセトキシメチルエステル）、
−ターシャリ−ブチルカルボキシル（＝−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（ＣＨ３）３＝トリメチル−アセトキシメチルエステル）、
−メチルオキシカルボニル（＝−ＣＯ−ＯＣＨ３＝メチルグリコラートエステル）、
−メタンアミド（＝−ＣＯ−ＮＨ２＝グリコールアミドエステル）、
−Ｎ，Ｎ−ジメチルメタンアミド（＝−ＣＯ−Ｎ（ＣＨ３）２＝置換グリコールアミドエステル）、
−Ｎ−メチルメタンアミド。
【００８６】
特に、下記のホスホナートエステルを含むシアニン誘導体は、細胞酵素によって、単純なアルキルエステルよりもより容易に加水分解される。
アセトキシメチルエステル
【００８７】
【化９】
2010520950.tif 000011
【００８８】
アセトキシメチルエステル（メチル基は、場合によってはＨまたはＣ１−Ｃ５アルキル基によって置換されている）：
【００８９】
【化１０】
2010520950.tif 000012
【００９０】
トリメチルアセトキシメチルエステル：
【００９１】
【化１１】
2010520950.tif 000013
【００９２】
メチルグリコラートまたはエチルグリコラートエステル（グリコール酸＝ＨＯＣＨ２ＣＯＯＨ、メチルグリコラート＝ＨＯＣＨ２ＣＯＯＭｅ）
【００９３】
【化１２】
2010520950.tif 000014
【００９４】
非置換グリコールアミドエステル（グリコールアミド＝ＨＯＣＨ２ＣＯＮＨ２）
【００９５】
【化１３】
2010520950.tif 000015
【００９６】
置換グリコールアミドエステル（Ｎ−メチルグリコールアミド＝ＨＯＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ３またはＮ，Ｎ−ジメチルグリコールアミド）：
【００９７】
【化１４】
2010520950.tif 000016
【００９８】
上記の式（Ｉ）の化合物または本発明の好ましい化合物の間で、以下のものが極めて特別に優先される。
１）化合物において、
−ＸがＣＲ７Ｒ８基および／またはＹがＣＲ９Ｒ１０基；
−１つまたは２つのＲ１〜Ｒ４基がＬ１−Ｗ基を表し；また
−１つまたは２つのＲ７〜Ｒ１０基がＬ２−Ａ、Ｌ２−ＧまたはＬ２−Ｍを表している、化合物。
２）化合物において、
−ＸがＣＲ７Ｒ８基および／またはＹがＣＲ９Ｒ１０基；
−Ｒ５および／またはＲ６がＬ１−Ｗ基を表し；また
−１つまたは２つのＲ７〜Ｒ１０基がＬ２−Ａ、Ｌ２−ＧまたはＬ２−Ｍ基を表している化合物。
３）化合物において、
−Ｒ５および／またはＲ６がＬ１−Ｗを表し；
−ポリメチンブリッジＢのＲ１５またはＲ１６がＬ２−Ａ、Ｌ２−ＧまたはＬ２−Ｍ基を表している化合物。
４）化合物において、
−１つまたは２つのＲ１〜Ｒ４基がＬ１−Ｗ基を表し；また
−ポリメチンブリッジＢのＲ１５またはＲ１６が、Ｌ２−Ａ、Ｌ２−ＧまたはＬ２−Ｍ基を表している化合物。
【００９９】
本発明の特に好ましい化合物の群は、下記の式の化合物で構成されている。
【０１００】
【化１５】
2010520950.tif 000017
【０１０１】
ここで、
−Ｒ１およびＲ３は水素原子であり；
−Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、独立して置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基を表し；
−Ｒ５およびＲ６は、互いに独立して置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基を表し；
−Ｂは、１〜５の非置換メチンを含むポリメチンブリッジを表し；
−Ｒ１０は、Ｌ２−Ｍ、Ｌ２−ＡまたはＬ２−Ｇから選ばれる基を表し；
−Ｌ２は結合腕であり；
−Ｇは反応性基であり；
−Ａは結合剤であり；
−Ｍは結合した分子であり；、
−Ｒ２およびＲ４は同一であり、またＬ１−Ｗ基を表し；
−Ｌ１は、単結合または式−（ＣＨ２）ｎ−の基から選ばれた結合腕であり（ｎは２〜８の範囲の整数である）；
−Ｗは、下記の式を持つ基から選ばれるホスホナートジエステルである：
【０１０２】
【化１６】
2010520950.tif 000018
【０１０３】
ここで、Ｒ１１およびＲ１２は同一かまたは異なっており、また、
−水素原子；
−非置換のＣ１−Ｃ５アルキル基；から選ばれ；
Ｒ１３およびＲ１４は同一かまたは異なっており、また
−水素原子；
−非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基：
−Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基；
−Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニル基；
−Ｎ，Ｎ−（Ｃ２−Ｃ１２）ジアルキルアミド基；
−アミド基；
−式−Ｃ−Ｓ−ＣＯ−Ａｌｋの基（Ａｌｋは非置換の直鎖または分岐Ｃ１−Ｃ４アルキルである）から選ばれ；
Ｒ１１およびＲ１２並びに／またはＲ１３およびＲ１４はまた、一緒に下記の式のフタリジル基を形成してもよい：
【０１０４】
【化１７】
2010520950.tif 000019
【０１０５】
本発明の特に好ましい化合物の他の群は、下記の式の化合物から構成される。
【０１０６】
【化１８】
2010520950.tif 000020
【０１０７】
ここで、
−Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は水素原子であり；
−Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は独立して置換または非置換のＣ１−Ｃ１５アルキル基を表し；
−Ｂは１〜５の非置換メチンを含むポリメチンブリッジを表し；
−Ｒ１０はＬ２−Ｍ、Ｌ２−ＡまたはＬ２−Ｇから選ばれる基を表し；
−Ｌ２は結合腕であり；
−Ｇは反応性基であり；
−Ａは結合剤であり；
−Ｍは結合した分子であり；
−Ｒ５およびＲ６は同一であり、またＬ１−Ｗ基を表し；
−Ｌ１は単結合または式−（ＣＨ２）ｎ−の基から選ばれる結合腕であり（ｎは２〜８の範囲の整数である）；
−Ｗは下記の式から選ばれる式を持つホスホナートジエステルである：
【０１０８】
【化１９】
2010520950.tif 000021
【０１０９】
ここで、
Ｒ１１およびＲ１２は同一かまたは異なっており、また、
−水素原子；
−非置換Ｃ１−Ｃ５アルキル基；から選ばれ、
Ｒ１３およびＲ１４は同一かまたは異なっており、また、
−水素原子；
−非置換Ｃ１−Ｃ１５アルキル基；
−Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基；
−Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニル基；
−Ｎ，Ｎ−（Ｃ２−Ｃ１２）ジアルキルアミド基；
−アミド基；
−式−Ｃ−Ｓ−ＣＯ−Ａｌｋの基（Ａｌｋは非置換の直鎖または分岐Ｃ１−Ｃ４アルキルである）から選ばれ；
Ｒ１１およびＲ１２並びに／またはＲ１３およびＲ１４はまた一緒に、下記の式のフタリジル基を形成していてもよい：
【０１１０】
【化２０】
2010520950.tif 000022
【０１１１】
結合剤Ａ
本発明によるシアニン誘導体は結合腕によって担持される結合剤を含んでいてもよい。好ましくは、この結合剤は細胞膜を透過することができる。
【０１１２】
この結合剤の役割は、シアニンと、例えば細胞内に在る標的分子との共有または非共有結合を可能にさせることである。この目的のために、標的分子は適切な結合ドメインを含んでいなければならない。標的分子が細胞内に在る場合には、結合剤は、それ自身が原形質膜を透過することができることが必要である。
【０１１３】
結合剤Ａは従って、標的分子に対して特異的な、抗体、抗体断片またはペプチドアプタマーであることができる。これらの抗体、抗体断片またはアプタマーは、標的分子中に天然に存在するドメインまたは、当業者、特には分子生物学技術の当業者によく知られた技術（この技術はタンパク質タグの生体分子への導入を可能とさせる）によってこの分子内に導入されたドメインもまた認識することができる。
【０１１４】
結合剤およびドメインは、一対の結合パートナーの構成員であることができ、２つの構成員は、例えば以下の対におけるように、非共有で結合することができる。
・アビジン（またはストレプトアビジン）／ビオチン：この対は、細胞によって発現された注目するタンパク質を、アビジンまたはストレプトアビジンの結合ドメインとの融合タンパク質の形態で標識化するのに用いられる。この場合には、本発明によるシアニン誘導体は、結合剤としてビオチンに結合する。
この（ストレプト）アビジン／ビオチン対は当業者に知られており、当業者が本発明によるシアニン誘導体とビオチンを結合するのに困難はない。
【０１１５】
・二ヒ素／テトラシステイン単位化合物：この結合パートナーの対はアダムスらによって最初に記載された（「生体外および生体内でのタンパク質標識化のための新規な二ヒ素配位子およびテトラシステインモチーフ：合成および生物学的応用」（“New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications”）、 J. Am. Chem. Soc.、２００２年５月２９日、第１２４巻、第２１号、ｐ．６０６３〜６０７６）。二ヒ素単位に結合した、本発明によるシアニン誘導体は、細胞によって発現された注目するタンパク質を、二ヒ素単位と結合することのできるテトラシステインドメインとの融合タンパク質の形態で、標識化することを可能にする。テトラシステインドメインの配列はＣｙｓ−Ｃｙｓ−ａａ１−ａａ２−Ｃｙｓ−Ｃｙｓである（ここで、ａａ１およびａａ２はいずれかの天然アミノ酸であり、また好ましくはａａ１はＰｒｏ、そしてａａ２はＧｌｙである）。
【０１１６】
・メトトレキサート（またはトリメトプリム）／ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）：ＤＨＦＲと化合物、例えばメトトレキサートもしくはトリメトプリムとの間の高度な親和結合が、特にミラーらによって記載されている（「メトトレキサート複合体：生体内タンパク質タグ中の分子」“Methotrexate conjugates: a molecular in vivo protein tag”、 Angew. Chem. Int. Edn. Engl.、２００４年、第４３巻、ｐ．１６７２〜１６７５）。結合剤としてメトトレキサートまたはトリメトプリムに結合している本発明によるシアニン誘導体は、細胞によって発現された注目するタンパク質を、ＤＨＦＲとの融合タンパク質の形態で、標識化することを可能にする。
【０１１７】
・ＳＬＦ’／ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）：クラクソン（Clackson）らは、タンパク質ＦＫＢＰの突然変異体に結合する人工の配位子ＳＬＦ’で構成される対を記載している（“Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity”、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 １９９８年９月１日、第９５巻、第１８号、ｐ．１０４３７〜１０４４２）。
結合剤としてＳＬＦ’に結合した本発明によるシアニン誘導体は、細胞によって発現された注目するタンパク質を、ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）との融合タンパク質の形態で、標識化することを可能にする。
【０１１８】
本発明によるシアニン誘導体の結合剤Ａはまた、標識化することが望まれる注目される分子上に存在する結合ドメインと、共有結合による結合を可能にする薬剤であることができる。
【０１１９】
特に、この結合剤は細胞中に存在する「自殺」酵素のための基質であることができる。この場合には、結合ドメインは従って自殺酵素であり、また自殺酵素と、識別化することが望まれる注目するタンパク質とで構成される融合タンパク質の形態で、細胞によって発現される。自殺酵素は、特異的突然変異によって改質された酵素活性を有するタンパク質であり、その特異的突然変異はこのタンパク質に迅速かつ共有結合で基質に結合する能力を与える。これらの酵素は、それぞれが単一の蛍光性分子にのみ結合することができるので、「自殺」酵素と呼ばれており、活性酵素は基質に付着することによってブロックされている。
【０１２０】
自殺酵素は最近、タンパク質を標識化する方法において用いられている：これらの方法は、標識化が望まれるタンパク質と自殺酵素を含む融合タンパク質を製造することからなっており、またこの融合タンパク質を、例えばこの自殺酵素のための基質に共有結合した標識蛍光色素分子と接触させることからなっている。
【０１２１】
最近では、自殺酵素の２つの既知の群がこの種の標識化を可能にしている：
−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼの突然変異体（またはコバリス（Covalys）によって市販されている「スナップタグ（SnapTag）」であり、国際公開第０２／０８３９３７号に記載されている）、このための基質はベンジルグアニンまたはベンジルグアニン誘導体である。ベンジルグアニン誘導体は、改質されているベンジルグアニンを意味していると理解されるが、しかしながら、それにも係わらず自殺酵素によって認識される。このような基質は、国際公開第２００５／０８５４７０号および国際公開第２００４／０３１４０５号に記載されている。
−ハロアルカン脱ハロゲン酵素の突然変異体（プロメガ（Promega）によって市販されている「ハロタグ（HaloTag）」、これはまた自殺型の酵素反応を起こし（国際公開第２００４／０７２２３２号中に記載されている技術）、このための基質はハロアルカン、好ましくはクロロアルカンである。基質は、国際公開第２００４／０７２２３２号および国際公開第２００６／０９３５２９号中に記載されている。
【０１２２】
本発明によるシアニン誘導体でこのような自殺酵素を標識化することが望ましい場合には、このシアニンは結合剤を含み、この結合剤はベンジルグアニン基（またはその誘導体の１種）またはハロアルカン（好ましくはクロロアルカン）であり、結合腕を経由してシアニンに結合している。
【０１２３】
要約すると、本発明によるシアニン誘導体の結合剤Ａは、非共有結合パートナーの対の一員であることもでき、または共有結合パートナーの対の一員であることもできる。
【０１２４】
特に、Ａは以下の化合物から選ぶことができる：抗体、抗体断片、ペプチドアプタマー、ビオチン、二ヒ素化合物、トリメトロプリン（trimetroprine）、メトトレキサート、ＳＬＦ’、ベンジルグアニン族またはクロロアルカン。
【０１２５】
本発明によるシアニン誘導体は、反応性基Ｇを含むことができ、この基は、他の物質または分子上に存在する官能基と反応して共有結合を形成することができる。この場合には、反応性基Ｇは、本発明によるシアニン誘導体と結合することが望まれるこの物質または分子上の官能基と反応するであろう。
【０１２６】
通常は、この反応性基は求電子性または求核性基であり、それらは、それぞれが適切な球核性または求電子性基と引き合わされた場合に共有結合を形成することができる。反応性基を含むシアニン誘導体と、官能基を備え、結合したＭとなる分子との間の結合反応は、反応性基の１つまたはそれ以上の原子を含む共有結合の形成をもたらす。例として、求電子性／求核性基の対および、それらが一緒に引き合わされた場合に形成される共有結合の種類を以下に列挙した。
【０１２７】
【表１】
2010520950.tif 000023
【０１２８】
＊：活性化されたエステルは式ＣＯＹの基を意味すると理解され、ここでＹは、
・スクシンイミジルオキシ（−Ｃ４Ｈ４Ｏ２）またはスルホスクシンイミジルオキシ（−ＯＣ４Ｈ３Ｏ２−ＳＯ３Ｈ）基から選ばれる離脱基；
・非置換の、または少なくとも１種の求電子性置換基、例えばニトロ、フルオロ、クロロ、シアノまたはトリフルオロメチル基によって置換され、その結果、活性化アリールエステルを形成するアリールオキシ基；
・カルボジイミド基によって活性化されたカルボン酸（無水物−ＯＣＯＲａまたはＯＣＮＲａＮＨＲｂを形成しており、ＲａおよびＲｂは同一または異なっており、またＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシまたはシクロへキシル基）；
・３−ジメチルアミノプロピルまたはＮ−モルホリノエチル、である。
【０１２９】
限定されない例として、結合されるＭであるべき物質または分子は、以下の官能基、アミン、アミド、チオール、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、第二級アミン、ハロゲン化物、エポキシド、カルボキシリレート（carboxylylate）エステル、カルボン酸、二重結合を含む基またはこれらの官能基の組み合わせ、の少なくとも１種を含み、反応性基Ｇがこれと反応する。
【０１３０】
分子Ｍに担持され、反応性基Ｇと反応する官能基としては、例えば、アミン、チオール、アルコール、アルデヒドまたはケトン基が挙げられる。好ましくは、反応性基Ｇはアミンまたはチオール官能基と反応する。
【０１３１】
これらの官能基を導入する方法は特に、シー． ケスラー（C. Kessler）ら著、エル．ジェイ．クシチュカ（L. J. Kricka）編集、Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing、第２版、ロンドン、アカデミックプレスリミティッド（Academic Press Ltd.）発行、１９９５年、ｐ．６６〜７２の中に記載されている。
【０１３２】
好ましくは、反応性基Ｇは、以下の化合物の１種から誘導される基である：アクリルアミド、活性アミン（例えば、カダベリンまたはエチレンジアミン）、活性エステル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、アニリン、アジド、アジリジン、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、例えばモノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、ヒドラジン（ヒドラジドを含む）、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ハロゲン化スルホニル、またはチオール、ケトン、アミン、酸ハロゲン化物、ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、アジドニトロフェニル、アジドフェニル、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド、またはグリオキサル、そして特に下記の式の基：
【０１３３】
【化２１】
2010520950.tif 000024
【０１３４】
ここで、ｎは０〜８の範囲であり、またｐは０または１であり、またＡｒは１〜３個のヘテロ原子を含む５員もしくは６員のヘテロ環であり、該ヘテロ原子は場合によってはハロゲン原子によって置換されていてもよい。
【０１３５】
好ましくは、反応性基Ｇはカルボン酸、カルボン酸スクシンイミジルエステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イソチオシアネート、マレイミド基または脂肪族アミンである。
【０１３６】
結合された分子Ｍ
本発明によるシアニン誘導体は細胞中で発生する化合物の蛍光標識化において特に有利であるが、このシアニン誘導体は慣用の結合技術によって、また以下に記載する反応性基を用いることによって、いずれの種類の分子とも結合することができる。
【０１３７】
結合された分子Ｍは、例えば生体分子であることができる。生体分子とは、生体中に存在する分子、そして特に有機体の組織を構成する分子、またエネルギーの生成および転換または生体信号の伝達に関わる分子を意味していると理解される。この定義には、核酸、タンパク質、糖、脂質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、代謝中間体、酵素、ホルモンおよび神経伝達物質が包含される。
【０１３８】
結合腕
本発明によるシアニン誘導体は、反応性基Ｇ、結合剤Ａ、結合した分子Ｍまたはホスファートもしくはホスホナートエステル（好ましくはジエステル）Ｗを含んでいる。これらの基のそれぞれは、結合腕を介してシアニンに結合している。
【０１３９】
シアニンがこれらの基の幾つか、例えば２つのホスホナート基および結合剤、を含んでいる場合には、これらの基は同一のまたは異なる腕によって担持されていることができる。
【０１４０】
Ｇ、Ｍ、ＡまたはＷ基を担持する結合腕Ｌは、単共有結合、または水素以外に１〜２０個の、炭素、窒素、リン、酸素および硫黄原子から選ばれる原子を含む、間隔を開ける腕（spacing arm）であることができ、この結合腕は、直鎖もしくは分岐の、環状もしくはヘテロ環状の、また飽和もしくは不飽和の、そして炭素−炭素結合（単結合、二重結合、三重結合もしくは芳香族系であることができる）；炭素−窒素結合；窒素−窒素結合；炭素−酸素結合；炭素−硫黄結合；リン−酸素結合；リン−窒素結合；エーテル結合；エステル結合；チオエーテル結合；アミン結合；アミド結合；カルボキサミド結合；スルホンアミド結合；尿素結合；ウレタン結合；ヒドラジン結合；またはカルバモイル結合から選ばれる結合の組み合わせから構成される。
【０１４１】
好ましくは、結合腕Ｌは、水素以外に１〜２０個の原子を含んでおり、この原子はＣ、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳから選ばれ、またエーテル、チオエーテル、カルボキサミド、スルホンアミド、ヒドラジン、アミンもしくはエステル結合、および芳香族もしくはヘテロ芳香族結合の組み合わせを含むことができる。
【０１４２】
好ましくはＬは炭素−炭素単結合の組み合わせ、およびカルボキサミドもしくはチオエーテル結合から構成される。
【０１４３】
例としては、Ｌは以下の連鎖：ポリメチレン、アリーレン、アルキルアリーレン、アリーレンアルキルまたはアリールチオ、から選ぶことができる。
【０１４４】
有利な態様によれば、結合腕Ｌは、直鎖または分岐したＣ１〜Ｃ２０アルキレン基から選ばれる二価の有機基（このアルキレン基は場合によっては１つまたはそれ以上の二重結合または三重結合を含み、および／または場合によっては１つまたはそれ以上のヘテロ原子、例えば酸素、窒素、硫黄もしくはリン、を含んでいる）または１つもしくはそれ以上のカルバモイルもしくはカルボキサミド基；Ｃ５-Ｃ８シクロアルキレン基およびＣ６-Ｃ１４アリーレン基（このアルキレン、シクロアルキレンもしくはアリーレン基は場合によっては、アルキル、アリールもしくはスルホナート基によって置換されていてもよい）で構成される。
【０１４５】
特に、結合基Ｌは以下の基から選ばれる：
【０１４６】
【化２２】
2010520950.tif 000025
【０１４７】
【化２３】
2010520950.tif 000026
【０１４８】
ここで、
−ｎおよびｍは２〜１６、好ましくは２〜８の整数であり；
−ｐおよびｒは、１〜１６、好ましくは１〜５の整数である。
【０１４９】
反応性基がカルバモイル基であり、また物質または分子Ｍ上の官能基がアミドもしくはチオエーテル基である場合には、結合基１）〜９）が特に適切である。
【０１５０】
反応性基がエーテル基であり、また物質または分子Ｍ上の官能基がアミドもしくはチオエーテル基である場合には、結合基２）、６）、７）および１０）〜１２）が特に適切である。
【０１５１】
本発明の化合物の中で、以下の化合物の群の１つが極めて特別に選好される：
−式（Ｉ）の化合物で、ＸがＣＲ７Ｒ８基、および／またはＹがＣＲ９Ｒ１０基、Ｒ１〜Ｒ４基の１つまたは２つがＬ１−Ｗ基を表し、またＲ７〜Ｒ１０の１つまたは２つがＬ２−Ａ、Ｌ２−ＧまたはＬ２−Ｍを表す；
−式（Ｉ）の化合物で、ＸがＣＲ７Ｒ８基および／またはＹがＣＲ９Ｒ１０基、Ｒ５および／またはＲ６はＬ１−Ｗを表し、またＲ７〜Ｒ１０基の１つまたは２つがＬ２−Ａ、Ｌ２−ＧまたはＬ２−Ｍ基を表す；
−式（Ｉ）の化合物で、Ｒ５および／またはＲ６はＬ１−Ｗ基を表し、またポリメチンブリッジＢは上記の式から選ばれ、その中でＲ１５またはＲ１６はＬ２−Ａ、Ｌ２−ＧまたはＬ２−Ｍ基を表す；
−式（Ｉ）の化合物で、Ｒ１〜Ｒ４基の１つまたは２つはＬ１−Ｗ基を表し、またポリメチンブリッジＢは上記の式から選ばれ、その中でＲ１５またはＲ１６はＬ２−Ａ、Ｌ２−ＧまたはＬ２−Ｍ基を表す。
【０１５２】
これらの化合物の中で、点線がフェニル基を表し、またポリメチンブリッジが以下の式の１つに相当する化合物が極めて特別に選好される：
【０１５３】
【化２４】
2010520950.tif 000027
【０１５４】
合成方法
シアニン誘導体の合成は広く文献中に記載されており、また当業者は、本発明による誘導体を調製するためにそれらを参照することができる。シアニンの合成は一般に３種の出発反応体：多環式基（複数）およびメチン鎖の使用に基づいている。これらの３つの反応体は、望ましい置換基を担持するように、それらの縮合の前もしくは後に改質される。
【０１５５】
従来技術の、シアニンの製造において用いられる中間体の合成の情報が、特に下記の文献から入手可能である：
−ムジュムダール（Mujumdar）ら、「シアニン染料標識化試薬：スルホインドシアニンスクシンイミジルエステル（Cyanine dye labeling reagents: sulfoindocyanine succinimidyl esters）」、Bioconjug. Chem.、１９９３年、第４巻、第２号、ｐ．１０５〜１１１
−ムジュムダール（Mujumdar）ら、「シアニン標識化試薬：スルホベンズインドシアニンスクシンイミジルエステル（Cyanine-Labeling Reagents: Sulfobenzindocyanine Succinimidyl Esters）」、Bioconjugate Chem.、１９９６年、第７巻、第３号、ｐ．３５６〜３６２
これらの文献は、当業者がシアニンの合成に必要な中間体を合成することを可能にする。
−フンエスシー（Hung、Ｓ．Ｃ．）ら、「エネルギー伝達プライマーにおけるドナー発色団としての、大きな吸収断面積を備えたシアニン染料（Cyanine Dyes with High Absorption Cross Section as Donor Chromophores in Energy Transfer Primers）」、Analytical Biochemistry、１９９６年、第２４３巻、第１号、ｐ．１５〜２７
【実施例】
【０１５６】
実験的な例によって、更に本発明による幾つかの誘導体の合成を説明する。
【０１５７】
これらの例の中では、以下の省略形が用いられる：
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＴＳＴＵ：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルスクシンイミドウロニウムテトラフルオロボラート
ＴＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
ＨＰＬＣ：高性能液体クロマトグラフィー
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高性能液体クロマトグラフィー
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＭＳ：質量分析法
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ｔＲ：保持時間
ＤＹ６４７:ダイオミクス（Dyomics）から市販されている蛍光色素分子であり、水、メタノールおよびＤＭＳＯに可溶であり、またＣｙ５のスペクトル特性と同様のスペクトル特性を有している。
ＤＹ６４７−ＮＨＳ：ＤＹ６４７のＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体
ＤＭＥＭ：ダルベッコの変性基礎培地として知られている培地の頭字語
ＤＡＰＩ：環系のための４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール染料
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＢＧ：ベンジルグアニン
ＢＧ−ＣＹ５：ベンジルグアニン−シアニン−ＣＹ５結合体
ＣＹ５：アマシャム ファルマシア バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）から市販されている、５つのメチンを含むポリメチンブリッジを有するインドシアニン
ＢＧ−ＤＹ６４７：ベンジルグアニン−ＤＹ６４７結合体
【０１５８】
実施例１：１−［２−（ジエトキシホスホリル）−エチル］−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムブロミドの合成
【０１５９】
【化２５】
2010520950.tif 000028
【０１６０】
１．５９ｇ（１０．０ミリモル）の２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドールおよび２．９４ｇ（１２．０ミリモル）のジエチルブロモエチルホスホナートを混合し、そして７０℃で４０時間、攪拌しながら加熱した。反応混合物を冷却した後、１０ｍＬのメタノールを加え、そして次いで３０ｍＬの水を加えた。目的の化合物を、１：１〜５：１の範囲の勾配のメタノール／水で、カラムクロマトグラフィー（シリカＲＰ−１８）によって分離した。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：３２４．２。収率：７７５ｍｇ（１９％）。
【０１６１】
実施例２：３−（３−カルボキシプロピル）−１−［２−（ジエトキシホスホリル）エチル］−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウムクロリドの合成
【０１６２】
【化２６】
2010520950.tif 000029
【０１６３】
２．３１ｇ（１０．０ミリモル）の３−（３−カルボキシプロピル）−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドールおよび２．９４ｇ（１２．０ミリモル）のジエチルブロモエチルホスホナートを１０ｍＬのエタノールに溶解し、そして７０℃で６４時間攪拌した。周囲温度に戻した後に、残った液体を２０ｍＬの水で２回抽出した。液相２つを混合して、２０ｍＬのジエチルエーテルで２回抽出した。水相中に残った目的の生成物を、１：３〜３：２の範囲の勾配のメタノール／水（それぞれの溶媒は２体積％の３Ｍ塩酸を含んでいる）で、カラムクロマトグラフィーによって分離した。目的の生成物を含む溶液を重炭酸ナトリウムで中和し、そしてその混合物を濃縮し、そして次いでシリカＲＰ−１８の短いカラム上に堆積した。水での洗浄によって無機塩を除去した後に、ナトリウム塩の形態の生成物をメタノールで溶出した。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：３９６．２。収率：５７５ｍｇ（１２％）。
【０１６４】
実施例３：１−［２−（ジエトキシホスホリル）−エチル］−３，３−ジメチル−２−（（１Ｅ，３Ｅ）−４−（フェニルアミノ）ブタ−１，３−ジエニル）−３Ｈ−インドリウムクロリドの合成
【０１６５】
【化２７】
2010520950.tif 000030
【０１６６】
４０４ｍｇ（１．０ミリモル）の１−［２−（ジエトキシホスホリル）エチル］−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムブロミドおよび２８５ｍｇ（１．１ミリモル）のマロンアルデヒド（malonic aldehyde）ジアニリドヒドロクロリドを１０ｍＬの酢酸および無水酢酸の混合物（Ｖ／Ｖ＝３：２）に溶解し、そしてこの混合物を６０℃で８時間攪拌した。周囲温度に戻した後に、１５０ｍＬの水を加えた。この溶液をシリカＲＰ−１８のカラム上に堆積した。２００ｍＬの水で洗浄した後に、目的の生成物を１：２〜３：２の範囲の勾配のアセトニトリル／水（それぞれの溶媒は２体積％の３ＭＨＣｌを含んでいる）で溶出した。目的の生成物を含んでいるこの溶液を重炭酸ナトリウムで中和し、そしてこの混合物を濃縮し、そして次いでシリカＲＰ−１８の短いカラム上に堆積した。水での洗浄によって無機塩を除去した後に、ナトリウム塩の形態の生成物をメタノールで溶出した。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：４５３．２。収率：７６ｍｇ（１４％）。
【０１６７】
実施例４：２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−５−［３−（３−カルボキシプロピル）−１−［２−（ジエトキシホスホリル）エチル］−３−メチル−１，３−ジヒドロインドール−（２Ｅ）−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−１−［２−（ジエトキシホスホリル）エチル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウムクロリド（ジエチルホスホノエステルの形態のシアニン１）の合成
【０１６８】
【化２８】
2010520950.tif 000031
【０１６９】
実施例２で得た、３−（３−カルボキシプロピル）−１−［２−（ジエトキシホスホリル）エチル］−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウムクロリド４８ｍｇ（１００マイクロモル）、実施例３で得た、１−［２−ジエトキシホスホリル）エチル］−３，３−ジメチル−２−（（１Ｅ，３Ｅ）−４−フェニルアミノ）ブタ−１，３−ジエニル）−３Ｈ−インドリウムクロリド５３ｍｇ（１００マイクロモル）および２５ｍｇ（３００マイクロモル）の酢酸ナトリムを、５ｍＬの酢酸と無水酢酸との混合物（ｖ／ｖ＝３：２）に溶解し、そしてこの混合物を６０℃で３時間攪拌した。真空下で濃縮した後に、残渣を先ず１ｍＬのメタノールに溶解し、そして２ｍＬの水を加えた。目的の生成物を、シリカＲＰ−１８のカラム上でのクロマトグラフィーによって分離したが、溶出は１：１〜９：１の範囲の勾配のメタノール／水で行った。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：７５５．３。収率：３２ｍｇ（３８％）。
【０１７０】
実施例５：ビス（ジエチルホスホノエステル）の形態のシアニン１のアミノエチルアミド誘導体の合成
【０１７１】
【化２９】
2010520950.tif 000032
【０１７２】
注目する分子、例えば細胞内の標識化を可能にする、酵素のための基質、をグラフトするのが可能なように、第１級アミン基が導入された。
実施例４で得られた、ビス（ジエチルホスホノエステル）の形態のシアニン１の溶液（１００μＬのＤＭＦ中に１６０ナノモル）を、５当量のジイソプロピルエチルアミン、２．５当量のターシャリブチル−Ｎ−（２−アミノエチル）カルバメート（Ｎ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン）および２当量のＴＢＴＵで処理した。周囲温度で、２４時間後に、この出発物質（ｔＲ＝１５．７分）は新しい生成物（ｔＲ＝１６．８分）に転換された。
ＨＰＬＣ条件：カラム、リクロスフェア（Lichrospher）（登録商標）１００、ＲＰ１８、５μｍ、１２５ｍｍ×４ｍｍ；水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリル（ＡＣＮ）の勾配（１ｍＬ／分）。アイソクラティック５％ＡＣＮ３分間、１２分間で５％〜１００％の直線勾配。
アセトニトリル中に溶解された、得られた中間体生成物を、トリフルオロ酢酸（ＡＣＮ／ＴＦＡ：２／１（ｖ／ｖ））で処理した。脱保護されたアミンを有する生成物（ｔＲ＝１１．５分）を半調製用のＨＰＬＣ（カラム、グレース・バイダックプロテインアンドペプチド（Grace-Vydac Protein & Peptide）Ｃ１８、２１８ＴＰ５１０）、流速４ｍＬ／分、分析用勾配と同じくＡＣＮ／水中０．１％ＴＦＡ勾配、によって分離した。
【０１７３】
実施例７：ビス（ジエチルホスホノエステル）の形態のシアニン１のＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体の合成
実施例４で得たビス（ジエチルホスホノエステル）の形態のシアニン（１．５ｍｇ、１．７９マイクロモル）を７０μＬの無水ＤＭＦ中に溶解し、そして１．２５μＬのＤＩＰＥＡおよび０．５５ｍｇのＴＳＴＵを加えた。ＨＰＬＣ分析（カラム、リクロスフェア（Lichrospher）（登録商標）１００、ＲＰ１８、５μｍ、１２５ｍｍ×４ｍｍ；水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリル（ＡＣＮ）の勾配（１ｍＬ／分）。アイソクラティック０％ＡＣＮ５分間、１３分間で０％〜８５％の直線勾配、そして次いで２分間で８５％〜１００％）によって、開始物質（ｔＲ＝１７．３分）よりも長い保持時間（ｔＲ＝１７．８分）を示すピークが形成されたことが観察された。この生成物を半調製用のＨＰＬＣ（カラム、グレース・バイダックプロテインアンドペプチド（Grace-Vydac Protein & Peptide）Ｃ１８、２１８ＴＰ５１０）、流速５ｍＬ／分、分析用勾配と同じくＡＣＮ／水中０．１％ＴＦＡ勾配、で分離した。収率：１．１マイクロモル（６０％）
【０１７４】
実施例８：ビス（ジエチルホスホノエステル）の形態のシアニン１のベンジルグアニン誘導体の合成
７０μＬの無水ＤＭＦ中の、文献［ジェンドライツィヒエス（Gendreizig S.）ら、「共有標識化による生体内誘導タンパク質二量化（Induced protein dimerization in vivo through covalent labeling）」、J. Am. Chem. Soc.、２００３年、第１２５巻、第４９号、ｐ．１４９７０］の手順に従って調製したＯ６−［４−（（１３−アミノ−２，５，８，１１−テトラオキサトリデシル）オキシメチル）−ベンジル］グアニン（０．４６マイクロモル）を、０．３μＬのＤＩＰＥＡおよび、０．４６μＬの実施例７に従って調製したシアニンビス（ジエチルホスホノエステル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体で処理した。ＨＰＬＣ分析（カラム、リクロスフェア（Lichrospher）（登録商標）１００、ＲＰ１８、５μｍ、１２５ｍｍ×４ｍｍ；水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリル（ＡＣＮ）の勾配（１ｍＬ／分）。アイソクラティック０％ＡＣＮ５分間、１３分間で０％〜７０％の直線勾配、そして次いで２分間で８５％〜１００％、２８０ｎｍで検出）によって、出発のグアニン誘導体（ｔＲ＝１２．１分）に相当するピークの消失が観察され、またより長い保持時間（ｔＲ＝１６．４分）を示すピークの形成が観察された。この生成物を半調製用のＨＰＬＣ（カラム、グレース・バイダックプロテインアンドペプチド（Grace-Vydac Protein & Peptide）Ｃ１８、２１８ＴＰ５１０）、流速５ｍＬ／分、分析用勾配と同じくＡＣＮ／水中０．１％ＴＦＡ直線勾配、で分離した。収率：０．３０マイクロモル（６６％）。ＵＶ（Ｈ２Ｏ）６４３（１８００００Ｍ−１．ｃｍ−１）、２８０ｎｍ（１６８００Ｍ−１．ｃｍ−１）。ＭＳ：（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）／ＩＤＡＡ（マトリックス＝トランス−インドールアクリル酸）ｍ／ｚ＝１１８５．３（計算値１１８５．３６）。
【０１７５】
実施例９：ＤＹ６４７のベンジルグアニン誘導体の合成
２００μＬの無水ＤＭＦ中の、文献（ケプラーエス（Keppler S.）ら、「融合タンパク質の生体内での微小分子での共有標識化の一般的方法（A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo）」、Nature Biotechnology、２００３年、第２１巻、第１号、ｐ．８６〜８９）に従って調製したＯ６−［４−（アミノメチル）ベンジル］グアニン（０．９ｍｇ、３．３マイクロモル）を、２．５マイクロモルのＤＹ６４７のＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体（シアニン／ダイオミクス（Dyomics）のスルホン酸化した類似物）で、周囲温度で１６時間にわたり処理した。ＨＰＬＣ分析（カラム、Ｘ−ブリッジ、Ｃ１８、５μｍ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ；水中の０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリル（ＡＣＮ）の勾配（１ｍＬ／分）。アイソクラティック１０％ＡＣＮ５分間、２４分間で１０％〜４０％の直線勾配、２８０ｎｍで検出）によって、出発のグアニン誘導体（ｔＲ＝５．８分）に相当するピークの消失が観察され、また反応物ＤＹ６４７−ＮＨＳに相当するピークよりも短い中間の保持時間（ｔＲ＝１９．８分）を示す新しいピークの形成が観察された。この生成物を半調製用のＨＰＬＣ（カラム、Ｘ−ブリッジＣ１８、１０ｍｍ×２５０ｍｍ）、流速５ｍＬ／分、分析用勾配と同じくＡＣＮ／水中０．０５％ＴＦＡ直線勾配、で分離した。収率：１．６０マイクロモル（６４％）（供給したＤＹ６４７−ＮＨＳに関して）。ＵＶ（Ｈ２Ｏ）６４３（２５００００Ｍ−１．ｃｍ−１）、２８０ｎｍ（１６２００Ｍ−１．ｃｍ−１）。ＬＣ−ＭＳ：（ＥＳ＋−ＴＯＦ）ｍ／ｚ＝８９５．４（計算値８９５．１０）。
【０１７６】
実施例１０：シアニンＣＹ５のベンジルグアニン誘導体の合成
Ｏ６−［４−（アミノメチル）ベンジル］グアニン（０．８ｍｇ、３．３マイクロモル）を、単一反応性のシアニンＣＹ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体（ムンジュムダールアールビー（Munjumdar R. B.）ら、Bioconjug. Chem.、１９９３年、第４巻、第２号、ｐ．１０５〜１１１）（２６．５マイクロモル）および４００μＬの無水ＤＭＦ中の３マイクロモルのＤＩＰＥＡで、周囲温度で、９０分間処理した。ＨＰＬＣ分析（カラム、リクロスフェア（Lichrospher）（登録商標）１００、ＲＰ１８、５μｍ、１２５ｍｍ×４ｍｍ；水中の０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリル（ＡＣＮ）の勾配（１ｍＬ／分）。アイソクラティック５％ＡＣＮ５分間、１４分間で５％〜５５％の直線勾配、６００ｎｍで検出）によって、誘導体ＣＹ５−ＮＨＳ（ｔＲ＝１５．５分）に相当するピークの消失が観察され、また結合体に相当するより短い保持時間（ｔＲ＝１４．９分）を示すピークが観察され、これを半調製用のＨＰＬＣ（カラム、グレース・バイダックプロテインアンドペプチド（Grace-Vydac Protein & Peptide）Ｃ１８、２１８ＴＰ５１０）、流速５ｍＬ／分、分析用勾配と同じくＡＣＮ／水中０．０５％ＴＦＡ直線勾配、で分離した。ＵＶ（Ｈ２Ｏ）６４７（２５００００Ｍ−１．ｃｍ−１）、２８０ｎｍ（１４０００Ｍ−１．ｃｍ−１）。ＬＣ−ＭＳ： （ＥＳ＋−ＴＯＦ）ｍ／ｚ＝９０９．１５（計算値９０９．１０）。
【０１７７】
実施例１１：ＤＹ６４７、ＣＹ５およびビス（ジエチルホスホノエステル）の形態のシアニン１とのベンジルグアニン結合体の細胞透過性試験
用いた細胞は、ＮＬＳ配列によって核内でスナップタグ（SnapTag）を発現する安定なＣＨＯ株に由来する。この化合物を、培地（１０％の不活性化されたＳＶＦを補給されたＤＭＥＭ培地、６０℃で３０分間）へ５マイクロモルの濃度で加え、そして細胞に接触させて１時間放置した。この定温放置の後に、培地で３回の洗浄操作を行った。基質によるスナップタグ（SnapTag）の標識化を可能にするために、単に培地の中での定温放置を更に１時間行った。次いで、顕微鏡分析の前に、ＤＡＰＩで環系の染色を行った。
結合体ＢＧ−ＤＹ６４７およびＢＧ−ＣＹ５との細胞の定温放置は、非常に強い画像を生成はしなかった：増幅率を大きくすると、蛍光発光は単に背景ノイズの形態で観察され、このことは、試験した結合体は、細胞の原形質膜を透過していないことを示している。対照的に、実施例８に従って調製した結合体ＢＧ−ＣＥＰ（ＢＧ−シアニンエチルホスホナート）との細胞の定温放置では、細胞内に位置する強い蛍光発光を生成し、この化合物が原形質膜を透過していることを示している。上記の画像を図１に示した。
【０１７８】
実施例１２：２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［３−（３−カルボキシプロピル）−１−［２−（エトキシホスホリル）エチル］−３−メチル−１，３−ジヒドロインドール−２Ｈ−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−１−［２−（エトキシホスホリル）エチル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウムブロミド（エチルホスホノエステルの形態のシアニン１）の合成
【０１７９】
【化３０】
2010520950.tif 000033
【０１８０】
実施例４のジエチルホスホノエステルの形態のシアニン１（１００ナノモル）を１００μＬのジクロロメタン（エタノールがない）に溶解し、そして次いでトリメチルシリルブロミド（１２マイクロモル）［マッケナシーイー（McKenna C. E.）ら、Tetrahedron Lett.、１９７７年、第１８巻、第２号、ｐ．１５５〜１５８］を加え、１時間３０分後、沈殿を観察したが、この溶液を蒸発させ、そして残渣を水とアセトニトリルの混合物中に溶解し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣ（シマズＳＰＤ−Ｍ１０Ａダイオードアレイ検出器、メルク（Merck）Ｌ６２００Ａポンプ、バイダック（Vydac）２１８ＴＰ５１０カラム）によって精製した。Ａ：ＴＦＡ０．１％を含むＨ２Ｏ、Ｂ：アセトニトリル。流速＝４ｍＬ／分。１５分間で、５％ＡＣＮ〜１００％ＡＣＮの直線勾配。出発物質（ｔＲ＝１１．９分）から、２つのエチルホスホノエステル官能基を担持する目的の化合物（ｔＲ＝０．１分）を主に得た。
３つのエチル基を有するジホスホノシアニンと１つのエチル基を有するジホスホノシアニンにそれぞれ相当する、ｔＲ＝１０．６分およびｔＲ＝９．７分のピークも観察された。
【０１８１】
実施例１３：２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（３−（５−カルボキシペンチル）−４−エチル−３−メチル−５−ホスホノ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−５−ホスホノ−３，３−ジメチル−１−（４−エチル）−３Ｈ−インドリウム誘導体の調製
この化合物の合成の過程は反応スキーム１に示した。
【０１８２】
１３．１．  ５−ブロモ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール（１４ａ）：
４−ブロモフェニルヒドラジンヒドロクロリド１３（６．５ｇ）および３−メチル−２−ブタノン（６．４ｍＬ）を、触媒量の酢酸を含むベンゼン中に溶解し、そしてこの混合物を水と共沸させて還流した（１６時間）。濃縮した混合物を酢酸（７０ｍＬ）中に溶解し、そして油浴（１２０℃）上で１２時間加熱し、固体生成物の形成が観察された。ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８、１％のＴＦＡを含む水中のアセトニトリルの勾配）による分析で、新規な生成品の形成が示された。真空下での蒸発の後に、残渣を酢酸エチルに溶解し、そして有機相を炭酸水素ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、また蒸発させた。粗生成物をシリカ上のフラッシュ・クロマトグラフィーによって精製し、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配で溶出を行ない、５．５ｇ（８０％）の純粋な生成物を得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝７．５（１Ｈ，ｄ）、７．２〜７．３（２Ｈ，ｍ）、２．３（３Ｈ，ｓ）、１．３（６Ｈ，ｓ）［レッチャーアールエム（Letcher R. M.)ら、J. Chem. Soc. Perkin Trans.、１９９３年、第１巻、ｐ．９３９〜９４４］
【０１８３】
１３．２．  ５−（ジエトキシホスホノ）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール（１５ａ）
５−ブロモ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール１４ａ（５ｇ、２１ミリモル）をトルエン（５ｍＬ）中に溶解し、脱ガスを行い、そして次いでトリエチルアミン（３．２ｍＬ）、亜リン酸ジエチル（３ｍＬ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１．２ｇ）を加え、この混合物を、窒素下で、そして攪拌しながら８０℃で３時間加熱した。クロマトグラフィー（フラッシュ・クロマトグラフィー）をシリカ上で行い、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配で溶出を行い、３ｇ（４８％）の純粋な生成物を得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝７．７（２Ｈ，ｍ）、７．６（１Ｈ，ｍ）、４．１３（４Ｈ，ｍ）、２．３（３Ｈ，ｓ）、１．３（９Ｈ，ｍ）。
【０１８４】
１３．３．  ５−（ジエトキシホスホノ）−１−エチル−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムヨージド（１６ａ）
５−（ジエトキシホスホノ）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール１５ａ（３ｇ）をヨウ化エチル（１０ｍＬ）で、窒素下での還流で、１６時間処理した。このヨウ化エチルを真空下で蒸発させ、そして残渣をヘキサンから粉末化し、遠心分離によって収集し、そして乾燥した。これをそのまま下記の反応において用いた。
【０１８５】
１３．４．  ５−（ホスホノ）−１−エチル−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムブロミド
文献［マッケナシーイー（McKenna C. E.）ら、Tetrahedron Lett.、１９７７年、第１８巻、第２号、ｐ．１５５〜１５８］の手順に従って、５−（ジエトキシホスホノ）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムヨージド１６ａを、ジクロロメタン（５ｍＬ）中の過剰のトリメチルシリルブロミドで処理した。完全に脱保護された誘導体を、そのようにして「ホスホン酸」の形態１７ａで得た。
【０１８６】
１３．５．  ３，３−ジメチル−１−エチル−２−（（１Ｅ，３Ｅ）−４−（フェニルアミノ）ブタ−１，３−ジエニル）−５−（ホスホノ）−３Ｈ−インドリウムクロリド（１８）の調製
１−エチル−５−（ホスホノ）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムブロミド１７ａ（１０ミリモル）を、無水酢酸（１０ｍＬ）およびマロニックアルデヒドジアニリド（２０ミリモル）で処理し、６０℃で８時間反応させた。この反応混合物を冷却し、エーテル（５０ｍＬ）およびヘキサン（５０ｍＬ）を加え、そして次いで沈降によって油状生成物（これは目的とするアニル（anil）である）を分離した。クロマトグラフィー（ＲＰ−１８、実施例３）によって精製し、アニル（anil）１８を得た。収率：ｇ（４０％）。
【０１８７】
１３．６．  ５−ブロモ−３−（５−カルボキシペンチル）−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドール（１４ａ）の調製
４−ブロモフェニルヒドラジンヒドロクロリド１３（６．５ｇ）および７−メチル−８−オキソノナン酸（６．７ｇ）［リョンワイイー（Leung Wai-Yee）によって国際公報第０２／２６８９１号に記載された方法に従って、エチル２−メチルアセトアセテートおよびエチル６−ブロモヘキサノエートから調製された］を酢酸（５０ｍＬ）中で５時間還流した。蒸発後に、この生成物をシリカ上のフラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量１１ｇ）。
【０１８８】
１３．７．  ３−（５−カルボキシペンチル）−５−（ジエトキシホスホノ）−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドール（１５ｂ）の調製
５−ブロモ−３−（５−カルボキシペンチル）−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドール（１４ｂ）を例１３．２中に記載したように亜リン酸ジエチルで処理して誘導体１５ｂを得た。
【０１８９】
１３．８．  ３−（５−カルボキシペンチル）−５−（ジエトキシホスホノ）−２，３−ジメチル−１−エチル−３Ｈ−インドリウムヨージド（１６ｂ）の調製
３−（５−カルボキシペンチル）−５−（ジエトキシホスホノ）−２，３−ジメチル−３Ｈ−インドール（１５ｂ）をヨウ化エチルで処理（例１３．３を参照）して、化合物１６ｂを得た。
【０１９０】
１３．９．  ３−（５−カルボキシペンチル）−２，３−ジメチル−１−エチル−５−（ホスホノ）−３Ｈ−インドリウムブロミド（１７Ｂ）の調製
３−（５−カルボキシペンチル）−５−（ジエトキシホスホノ）−２，３−ジメチル−１−エチル−３Ｈ−インドリウムヨージド（１６ｂ）をトリメチルシリルブロミドで処理（例１３．４を参照）して、化合物１７ｂを得た。
【０１９１】
１３．１０．  カルボキシレート官能化ジホスホノシアニン（１９）
２−｛（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−［３−（５−カルボキシペンチル）−３−メチル−４−エチル−５−ホスホノ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］ペンタ−１，３−ジエニル｝−５−ホスホノ−３，３−ジメチル−１−（４−エチル）−３Ｈ−インドリウム
アニル（anil）１８（ｇ、７ミリモル）および３−（５−カルボキシペンチル）−２，３−ジメチル−１−（４−エチル）−５−（ホスホノ）−３Ｈ−インドリウムブロミド（１７ｂ）をジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中に溶解し、トリエチルアミン（１ｍＬ）および無水酢酸（１ｍＬ）を加えた、そしてこの混合物を６０℃で１時間加熱した。これを冷却し、エチルエーテル（５０ｍＬ）を加え、そして沈殿を集め、希塩酸（２Ｎ）中に溶解し、そして次いでクロマトグラフィー（リクロプレップメルク（Lichroprep Merck）Ｃ１８）によって精製し、１）酢酸ナトリウム溶液（１．５ｍＭ）および２）蒸留水で溶出を行ない、次いで目的の生成品１９をエタノール／水（４／６）混合物で溶出した。このようにしてジホスホノシアニン１９をナトリウム塩の形態で得た。目的のジホスホノシアニン１９の他に、１８と化合物１７ａ（これは１８の混入物質である）との結合に由来する、官能化されていないジホスホノシアニン２０も観察されたが、これらの２つの化合物は逆相クロマトグラフィーによって分離可能であった。ＨＰＬＣ（シマズＳＰＤ−Ｍ１０Ａダイオードアレイ検出器、メルク（Merck）Ｌ６２００Ａポンプ、バイダック（Vydac）２１８ＴＰ５１０カラム）。Ａ：ＴＦＡを０．１％含むＨ２Ｏ。Ｂ：アセトニトリル。流速＝4ｍＬ／分。２３分間で５％ＡＣＮ〜６０％ＡＣＮの直線勾配。化合物１９：ｔＲ＝１４．８分（注：化合物２０は、同じ条件下でｔＲ＝１４分を示す）。収率：０．５ｇ（８％）。ＭＳ（ＥＳ−）ｍ／ｚ＝６６９．３（１００％）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ＝６７１．２（６０％）。
ＵＶ／Ｖｉｓスペクトル：λｍａｘ（ＰＯ４緩衝液０．１Ｍ  ｐＨ７）＝６４９ｎｍ（ε６４９９８０００Ｍ−１．ｃｍ−１）Ａ６４９／Ａ６０４比＝２．６。
蛍光スペクトル：パーキンエルマー（Perkin-Elmer）ＬＳ５０装置で測定、試料は、ＢＳＡを０．１％含むリン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ７で希釈した（励起波長において、最大吸光度＝０．０４）。励起：６００ｎｍ（１０ｎｍ）。放射（最大）＝６７０．５ｎｍ（量子収率＝１３％）。
【０１９２】
実施例１４：アミン官能化したジホスホノシアニンテトラエステル（２４）（反応スキーム２を参照）
１４．１．  Ｎ−Ｂｏｃ誘導体（２１）
カルボキシル化官能化ジホスホノシアニン１９（２４ｍｇ、３２．６マイクロモル）をＤＭＦ（２ｍＬ）中に溶解し、そして９μＬのＤＩＰＥＡおよびＴＳＴＵ溶液（５００μＬのＤＭＦ中に３５ｍｇ）を加えた。２０分後に、エチレンジアミンのモノ−Ｂｏｃ誘導体を加えた。１時間の反応後に、実施例１２中に記載したように、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製を行った。この結果、Ｎ−ＢＯＣ誘導体２１を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ＝８１１．６（１００％）、Ｃ４１Ｈ５５Ｎ４Ｏ９Ｐ２と計算された。
【０１９３】
１４．２．  シアニンジ（ホスホノメチルグリコールモノエステル）のＮ−ＢＯＣ誘導体（２２）
Ｎ−ＢＯＣ誘導体（２１）（３ｍｇ、４．７マイクロモル）を無水ＤＭＦ（５５０μＬ）および無水トリエチルアミン（水素化カルシウム上で蒸留、１４μＬ，１００マイクロモル）に溶解し、そしてブロモ酢酸メチル（１０μＬ，１０５マイクロモル）を加えた。この混合物をアルゴンの下で、７０℃で１６時間加熱した。この反応混合物を、実施例１２中に記載したように、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した（カラム、バイダック（Vydac）２１８ＴＰ５１０、Ａ：ＴＦＡを０．１％含むＨ２Ｏ。Ｂ：アセトニトリル。流速＝４ｍＬ／分。４０分間で５％ＡＣＮ〜１００％ＡＣＮの直線勾配）。出発物質（ｔＲ＝１６分）から、２つのホスホノグリコールエステル官能基を有する目的の化合物２２（ｔＲ＝２２．６分）を主に得た。収率１５％。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ＝９５７．５（１００％）、Ｃ４７Ｈ６６Ｎ４Ｏ１３Ｐ２と計算された。
【０１９４】
１４．３．  シアニンジ（ホスホノメチルおよびメチルグリコールジエステル）のＮ−ＢＯＣ誘導体（２３）
方法Ａ：  ホスホノモノグリコールエステル誘導体（２２）をヨウ化メチルで処理した。その結果、それぞれのホスホン酸基をホスホノメチルおよびメチルグリコールジエステル形態で有する誘導体２３を得た。
方法Ｂ：  ＤＭＦ中のホスホノモノグリコールエステル誘導体（２２）をメタノールの存在下でＢＯＰで処理して生成品２３を得た。この生成品をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した（カラム、バイダック（Vydac）２１８ＴＰ５１０、Ａ：ＴＦＡを０．１％含むＨ２Ｏ。Ｂ：アセトニトリル。流速＝４ｍＬ／分。４０分間で５％ＡＣＮ〜１００％ＡＣＮの直線勾配）。目的の化合物２３（ｔＲ＝３１．７分）が主に観察された。収率５０％。ＵＶ（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ、１／１）、λｍａｘ＝６４６．５ｎｍ、Ａ６４６／Ａ６００比＝３．７。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ＝９８５．６（１００％）、Ｃ４９Ｈ７１Ｎ４Ｏ１３Ｐ２と計算された。
【０１９５】
１４．４．  アミン官能化シアニンジ（ホスホノメチルおよびメチルグリコールジエステル）（２４）
シアニンジ（ホスホノメチルおよびメチルグリコールジエステル）２３を、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸で処理した（２０℃で３０分間）。溶媒を蒸発させた後に、この生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。この結果、アミノ官能化されたシアニンテトラエステル２４を得た。
【０１９６】
実施例１５：  ジホスホノシアニンテトラエステルベンジルグアニン誘導体（２６）の合成（反応スキーム２）
上述のように得たシアニン２４を、ＤＩＰＥＡを含むＤＭＦ中に溶解し、そしてＮＨＳエステル２５［ＤＭＦ中での、過剰のＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベラート）とＯ６−［４−（アミノメチル）ベンジル］グアニン（ケプラーエス（Keppler S.）ら、Nature Biotechnology、２００３年、第２１巻、第１号、ｐ．８６〜８９）との反応によって得た］で処理し、この生成物２５を、前述の実施例中のシアニンの精製に用いた条件と同様の条件下でＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。ベンジルグアニン基によって２つのホスホノメチルおよびメチルグリコールエステルの混合した官能基を担持する目的の化合物２６を、ＲＰ−ＨＰＬＣ（カラム、バイダック（Vydac）２１８ＴＰ５１０、Ａ：ＴＦＡを０．１％含むＨ２Ｏ。Ｂ：アセトニトリル。流速＝４ｍＬ／分。４０分間で５％ＡＣＮ〜１００％ＡＣＮの直線勾配）による精製の後に得た。収率４６％。ＵＶ（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ、１／１）、λｍａｘ＝６５０ｎｍ、Ａ６４７／Ａ６００比＝３．４。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ＝１２９３．８（Ｍ−Ｈ）＋、Ｃ６５Ｈ８７Ｎ１０Ｏ４Ｐ２と計算された。
【０１９７】
実施例１６：  シアニンジ（ホスホノメチルグリコールジエステル）のベンジルグアニン誘導体（２９）（反応スキーム３を参照）
ＤＭＦ中のホスホノモノグリコールエステル誘導体（２２）を、グリコール酸メチルの存在下で、ＢＯＰで処理し、生成品２７を得た。この生成品をＲＰ−ＨＰＬＣ（カラム、バイダック（Vydac）２１８ＴＰ５１０、Ａ：ＴＦＡを０．１％含むＨ２Ｏ。Ｂ：アセトニトリル。流速＝４ｍＬ／分。４０分間で５％ＡＣＮ〜１００％ＡＣＮの直線勾配）によって精製した。３つのメチルグリコールエステル官能基を担持する化合物（ｔＲ＝２９．９分）および４つのメチルグリコールエステル官能基を担持する目的の化合物２７が観察された。収率２０％。ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ＝１１０２、Ｃ５３Ｈ７５Ｎ４Ｏ１７Ｐ２と計算された。
【０１９８】
誘導体２７を、ＢＯＣ保護基を取り除くために純粋なトリフルオロ酢酸で１５分間処理し、そして次いで真空下での蒸発およびトルエンとの共蒸発の後に、このようにして得た生成物２８をＤＩＰＥＡを含むＤＭＦ中に溶解し、そしてＤＭＦ中での過剰のＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベラート）とＯ６−［４−（アミノメチル）ベンジル］グアニンとの反応によって得たＮＨＳエステル２５で処理した（生成品２５は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって、前述の実施例中のシアニンの精製に用いた条件と同様の条件下で精製した）。４つのメチルグリコールエステル官能基を担持し、またベンジルグアニンによって官能化された目的の化合物２９を、ＲＰ−ＨＰＬＣ（カラム、バイダック（Vydac）２１８ＴＰ５１０、Ａ：ＴＦＡを０．１％含むＨ２Ｏ。Ｂ：アセトニトリル。流速＝４ｍＬ／分。４０分間で５％ＡＣＮ〜１００％ＡＣＮの直線勾配）による精製の後に得た。
【０１９９】
ＨＰＬＣ精製の結果として得られた画分の蒸発およびトルエンとの共蒸発の後に、生成物２９を得た。これを、次いでＤＭＳＯ中に溶解し、そして−２０℃で貯蔵した。
収率７０％。ＵＶ（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ、１／１）、λｍａｘ＝６４７ｎｍ、Ａ６４７／Ａ６００比＝３．５、ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ＝１４０９．６（Ｍ−Ｈ）＋、Ｃ６９Ｈ９１Ｎ１０Ｏ１８Ｐ２と計算された。
【０２００】
実施例１７：  異なるシアニン誘導体の量子収率の比較
本発明によるシアニン誘導体のホスファート／ホスホナートエステル官能基は、細胞中で細胞酵素によって加水分解されて、ホスファート／ホスホナート官能基を与える。ホスホナート基を担持するシアニン誘導体の量子収率（従って、エステル官能基の加水分解後に、細胞中に存在する本発明による化合物に相当する）を、ホスファート／ホスホナートエステル官能基の位置が、化合物の光物理的性質に影響するか否かを調べるために測定した。
【０２０１】
【表２】
2010520950.tif 000034
【０２０２】
これらの結果は、インドール環上にホスホナート官能基を含むシアニンは、インドール環の窒素上にホスホナートを含むシアニンの量子収率よりも、３倍高い量子収率を有することを示している。
【０２０３】
実施例１８：  シアニンジ（ホスホノメチルグリコールモノエステル）のベンジルグアニン誘導体（３１）（反応スキーム４参照）
実施例１４中に記載したホスホノモノグリコールエステル誘導体（２２）を、ＢＯＣ保護基を取り除くために、純粋なトリフルオロ酢酸中で１５分間処理し、そして次いで、真空下での蒸発およびトルエンとの共蒸発の後に、結果として得た生成品３０をＤＩＰＥＡを含むＤＭＦ中に溶解し、そして実施例１６中に記載したように調製したＮＨＳエステル２５で処理した。２つのメチルグリコールエステル官能基およびベンジルグアニン基によって官能化された目的の化合物３１を、ＰＲ−ＨＰＬＣ（カラム、バイダック（Vydac）２１８ＴＰ５１０、Ａ：ＴＦＡを０．１％含むＨ２Ｏ。Ｂ：アセトニトリル。流速＝４ｍＬ／分。４０分間で５％ＡＣＮ〜１００％ＡＣＮの直線勾配）による精製の後に得た。ＨＰＬＣ精製の結果として得られた画分の蒸発およびトルエンとの共蒸発の後に、この生成物を得た。これを、次いでＤＭＳＯ中に溶解し、そして−２０℃で貯蔵した。収率５３％。ＵＶ（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ、１／１）、λｍａｘ＝６４８ｎｍ、Ａ６４８／Ａ６００比＝３．２、ＭＳ（ＥＳ−）ｍ／ｚ＝１２６３．６（Ｍ−２Ｈ）−、Ｃ６３Ｈ８２Ｎ１０Ｏ１４Ｐ２と計算された。
【０２０４】
実施例１９：  無傷生体細胞に加えられた化合物２９による細胞内タンパク質の標識化およびＨＴＲＦ測定による標識化の検出
この例は、ホスホナートエステルを含み、そして「スナップタグ」自殺酵素（ＳＴ２６）のための基質（ベンジルグアニン、ＢＧ）に結合した、本発明による化合物が、ホスホナートエステルを含まないシアニン（ＤＹ−６４７）の使用とは対照的に、細胞膜を透過し、また細胞によって注目され、またスナップタグ酵素（ＳＴ１２）を含む融合タンパク質を標識化することができることを示すことを目的としている。
【０２０５】
このＨＴＲＦ技術を、細胞によって生成され、ユウロピウムトリスビピリジンクリプタートと結合したａｎｔｉ−ＧＳＴ抗体（ａｎｔｉ−ＧＳＴ−ＥｕＴＢＰ）を通して間接的に標識化された、組み換えタンパク質ＧＳＴ−ＳＴ２６−Ｆｌａｇを用いることによって、生体細胞に、本発明によるシアニン誘導体によってタンパク質の細胞内標識化を試験するのに用いた。
【０２０６】
培養の後に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、リポフェクトアミン（lipofectamine）２０００（形質移入溶液５０μＬ当たり０．８μＬ、リポフェクトアミン（商標）形質移入試薬、インビトロジェンインク（Invitorogen Inc.）、カールズバッド、カリフォルニア）の存在下に、黒色９６ウェルのマイクロプレート中で、ウェル当たり５００００細胞の割合で、形質移入した。形質移入した細胞は、次いで３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。形質移入に用いたプラスミドは、プラスミドｐＳＥＭ−ＧＳＴ−ＳＴ２６−Ｆｌａｇ（８０ｎｇ／ウェル）であり、ＧＳＴおよびＦｌａｇの配列を、コバリス（Covalys）の市販キットの以下の手順に従って、プラスミドｐＳＥＭＳ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｇａｔｅｗａｙ中に導入して、細胞による融合タンパク質ＧＳＴ−ＳＴ２６−Ｆｌａｇの合成を生じさせることによって得た。この手順は、文献［ケイジョンソン（K. Johnsson）ら、Engineering Substrate Specificity of O6-Alkylguanine-DNA Alkyltransferase for Specific Protein Labeling in Living Cells、ChemBioChem、２００５年、第６巻、第７号、ｐ．１２６３〜１２６９］中に記載されたものと同様である。
【０２０７】
翌日、この細胞をＢＧ−ＤＹ６４７または化合物２９（実施例１６に従って調製した）ともに培養し、ＤＭＳＯ中の溶液の形態で、５０μＬの培地中に、最終的に５μＭの基質濃度を有するように加えた。この細胞を、２０℃で３時間培養し、そして次いで培地を用いて洗浄した。
【０２０８】
完全標識化：  基質を、「１００％標識化」を調べるために用いられるウェルの一部に、ユウロピウムクリプタート（ＥｕＴＢＰ）に結合したａｎｔｉ−ＧＳＴ抗体、ａｎｔｉ−ＧＳＴ−ＥｕＴＢＰ（最終１ｎＭ、ＧＳＴタグチェックキット、名称６２ＧＳＴＰＥＢ、シスバイオ（Cisbio））、をも含む、溶解緩衝液（ｃＡＭＰキット、シスバイオ（Cisbio））中に最終１００ｎＭ（ＢＧ−ＤＹまたは化合物２９、ウェルによって）で、加えた。
【０２０９】
受動的な（Passive）標識化：同じ溶解緩衝液中の、抗体ａｎｔｉ−ＧＳＴ−ＥｕＴＢＰ（最終１ｎＭ）だけを、細胞内標識化のパーセンテージを調べるのに用いられる他のウェルへ加えた（これを、そのようにしてＤＹ６４７か化合物２９のいずれかとともに培養した）。
【０２１０】
対照のウェルを形成するために、「エンプティ（empty）」プラスミド、すなわち注目する配列をコードしていないプラスミドを形質移入された細胞を含むウェルもまた調製した。
【０２１１】
６６５ｎｍの蛍光発光をＨＴＲＦリーダー（ルビースター（BUBYstar）、ＢＭＧラボテクノロジーズ（Labtechnologies））上で測定した。受動的な（passive）標識化で得られた６６５ｎｍの信号を、完全標識化で得た６６５ｎｍの信号で割ることによって得た、細胞内標識化のパーセンテージを、図２に示した。
【０２１２】
基質２９の存在下での細胞内標識化のパーセンテージは、参照基質ＤＹ−６４７（これは細胞中へ不十分にしか浸透しない）の存在下で得た標識化のパーセンテージよりもかなり大きいことが観察された。
【０２１３】
従って、この例は化合物２９が細胞膜を透過し、またこのことが細胞内タンパク質の標識化を可能にしており、またホスファートまたはホスホナートエステルを担持していない化合物ＢＧ−ＤＹ−６４７ではそうではない、ことを裏付けている。
【０２１４】
【化３１】
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【０２１５】
【化３２】
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【０２１６】
【化３３】
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【０２１７】
【化３４】
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【産業上の利用可能性】
【０２１８】
本発明によるシアニン誘導体は、細胞中のタンパク質の標識化に特に適している。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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