(57)【要約】  エポキシド加水分解酵素活性を有する２つの新規微生物、アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３及びクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２が記載される。これらの微生物からのエポキシド加水分解酵素は、速度論的分割方法によりラセミ混合物中の３，４−エポキシ酪酸エチルの一方の鏡像異性体を選択的に加水分解（エポキシド開環を経由）して、結果的に他方の鏡像異性体を蓄積するのに使用することができる。ラセミ体３，４−エポキシ酪酸エチルの速度論的分割方法において、前記微生物を調製する方法及びその使用も開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３の識別特性を特徴とする微生物アシネトバクターバウマニ、並びにその誘導体及び変異体を特徴とする、生物学的純粋培養物。
【請求項２】
微生物アシネトバクターバウマニの前記培養物が、水性栄養培地中での好気的培養時にエポキシド加水分解酵素を産生する、請求項１に記載の生物学的純粋培養物。
【請求項３】
前記水性栄養培地が、同化可能な炭素源、窒素源、及び無機物質源を含有する、請求項２に記載の生物学的純粋培養物。
【請求項４】
前記エポキシド加水分解酵素が、３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物中の（Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを優先的に加水分解して、（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシブタン酸エチルを形成させる、請求項２に記載の生物学的純粋培養物。
【請求項５】
微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３を培養することを含む、３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物を分割する方法であって、好気的条件下に水性栄養培地中で、前記ラセミ混合物存在下に、（Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを優先的に加水分解して、（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシブタン酸エチルを形成させる能力を特徴とする、前記方法。
【請求項６】
（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを製造する方法であって、
（ｉ）３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物を、全細胞、細胞抽出物、部分的精製酵素、精製酵素及びその混合物からなる群から選択される形態のエポキシド加水分解酵素とともにインキュベートすることであって、そこで、前記酵素及び前記酵素を含む前記細胞が、微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３からのものであり、前記混合物中の（Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを優先的に加水分解して、（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシブタン酸エチルを形成させる能力を特徴とする、前記インキュベートすること；並びに
（ｉｉ）前記反応培地から（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項７】
方法が、水性栄養培地中で、微生物の増殖培養において実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が好気的条件下に行なわれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が微生物の静止細胞を用いて水性緩衝液中で実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、微生物から単離される精製又は部分的精製エポキシド加水分解酵素を含有する、微生物を含まない反応培地中で実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２の識別特性、並びにその誘導体及び変異体を特徴とする、微生物クリプトコッカスアルビダスの生物学的純粋培養物。
【請求項１２】
微生物クリプトコッカスアルビダスの前記培養物が、水性栄養培地中での好気的培養時にエポキシド加水分解酵素を産生する、請求項１１に記載の生物学的純粋培養物。
【請求項１３】
前記水性栄養培地が同化可能な炭素源、窒素源、及び無機物質源を含有する、請求項１２に記載の生物学的純粋培養物。
【請求項１４】
前記産生されるエポキシド加水分解酵素が、３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物中の（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを優先的に加水分解して、（Ｒ）−３，４−ジヒドロキシブタン酸エチルを形成させることができる、請求項１２に記載の生物学的純粋培養物。
【請求項１５】
微生物クリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ８３０２を培養することを含む、３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物を分割する方法であって、好気的条件下に水性栄養培地中で、前記ラセミ混合物存在下に、（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを優先的に加水分解して、（Ｒ）−３，４−ジヒドロキシブタン酸エチルを形成させる能力を特徴とする、前記方法。
【請求項１６】
（Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを製造する方法であって、
（ｉ）３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物を、全細胞、細胞抽出物、部分的精製酵素、精製酵素及びその混合物からなる群から選択される形態のエポキシド加水分解酵素とともにインキュベートする工程であって、そこで、前記酵素及び前記酵素を含有する前記細胞が、微生物クリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２からのものであり、前記混合物中の（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを優先的に加水分解して、（Ｒ）−３，４−ジヒドロキシブタン酸エチルを形成させる能力を特徴とする、前記インキュベートする工程；並びに
（ｉｉ）前記反応培地から（Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを単離する工程、
を含む前記方法。
【請求項１７】
方法が、水性栄養培地中で、微生物の増殖培養において実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、好気的条件下に行なわれる、請求項ｌ７に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、前記微生物の静止細胞を用いて、水性緩衝液中で実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、微生物から単離される精製又は部分的精製エポキシド加水分解酵素を含有する、微生物を含まない反応培地中で実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
微生物エポキシド加水分解酵素を産生する方法であって、
（ｉ）同化可能な炭素源、窒素源、及び無機ミネラル源を含有する栄養培地中で、エポキシド加水分解酵素の形成に適した条件下に、微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３を好気的に培養する工程；
（ｉｉ）前記エポキシド加水分解酵素を産生するのに十分な時間の間、培養液をインキュベートする工程；並びに
（ｉｉｉ）前記栄養培地から前記エポキシド加水分解酵素を回収する工程、
を含む前記方法。
【請求項２２】
微生物エポキシド加水分解酵素を産生する方法であって、
（ｉ）同化可能な炭素源、窒素源、及び無機ミネラル源を含有する栄養培地中で、エポキシド加水分解酵素の形成に適した条件下に、微生物クリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２を好気的に培養する工程；
（ｉｉ）前記エポキシド加水分解酵素を産生するのに十分な時間の間、培養液をインキュベートする工程；並びに
（ｉｉｉ）前記栄養培地から前記エポキシド加水分解酵素を回収する工程、
を含む前記方法。
【請求項２３】
３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物から（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを製造するための、全細胞、細胞抽出物、部分的精製酵素、精製酵素、及びその混合物からなる群から選択される形態にあるエポキシド加水分解酵素の使用であって、前記酵素が微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３由来のものである、前記使用。
【請求項２４】
３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物から（Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを製造するための、全細胞、細胞抽出物、部分的精製酵素、精製酵素、及びその混合物からなる群から選択される形態にあるエポキシド加水分解酵素の使用であって、前記酵素が微生物クリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２由来のものである、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
エナンチオピュアなキラル化合物は、化学及び製薬工業で重要な役割を果たしている。規制要件、すなわち医薬化合物のより低い毒性及びより高い効能への期待により、エナンチオピュアな化合物に対する需要が増加してきている。この趨勢に対応して、この増大する需要の要求を満たすべく商品化学工業においては、キラルな中間体又は「構成単位（building blocks）」を製造する新規な化学的及び生物学的製造方法の開発への関心が高まっている。例えば、化学工業において幅広い応用（例えば、多くのファインケミカルだけでなく医薬、農薬の合成のための）を有するキラルなエポキシドは、それらの製造に対する市場要求が高い。有機化学合成の主要課題は、高い立体及び位置選択性を有するこのような化合物を高収率で作り出すことである。
【０００２】
エナンチオピュアなキラルなエポキシドは、工業目的ためのより複雑な光学的に純粋な生物活性化合物の製造における重要中間体として使用することができる。特に、キラルなエポキシドである３，４−エポキシ酪酸エチル（ＥＥＢ）は、エチルエステル基とともに末端エポキシドを含み、そのエナンチオピュアな形態（すなわち、（Ｒ）−ＥＥＢ又は（Ｓ）−ＥＥＢ）においては、キラルな医薬及びファインケミカルの合成における不可欠の重要中間体である。ＥＥＢは、立体特異的開環反応を受けて二官能性化合物を形成するので、用途の広い合成中間体である。
【０００３】
（Ｒ）−ＥＥＢは直接に、抗癲癇及び抗高血圧活性を有する神経媒介物質（neuromediator）である（Ｒ）−δ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸（（Ｒ）−ＧＡＢＯＢ）に変換され（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４６，４２７７（１９９０）を参照のこと）、並びにうっ血性心不全又は不整脈を治療する食欲促進薬であり、脂肪代謝において必須の役割を有し、栄養補助食品及び抗肥満薬として幅広く適用可能な、（Ｒ）−カルニチン（ビタミンＢｔ）に変換される（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５３，１０４（１９８８）、米国特許第４，８６５，７７１号、第５，２４８，６０１号、及び第６，３４２，０３４号明細書を参照のこと）。（Ｒ）−ＥＥＢは、（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（（Ｒ）−ＣＨＢＥ）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，３３，１２１１（１９９２）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４９，３７０７（１９８４）を参照のこと）；及び（Ｒ）−４−ヒドロキシ−２−ピロリドン（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，６１４（１９７８）を参照のこと）の合成のためのＣ４キラルシントンとして利用される。（Ｒ）−ＥＥＢはまた、サリチレートエナミド抗癌剤、すなわちロバタミドＣ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５，７８８９（２００３）を参照のこと）及び修飾したカルニチン類似体である新規なナイトロジェンマスタード（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１１，３２５（２００３））の合成のための有用な中間体でもある。
【０００４】
更に、（Ｓ）−ＥＥＢは、効率的に（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルエステルに変換することができ、この化合物は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤であり、コレステロールを低下する超大型新薬であるアトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ（商標））を製造するために使用することができる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，３３，２２７９（１９９２）を参照のこと）。（Ｓ）−ＥＥＢはまた、脳機能増強剤としての使用のための又はアルツハイマー病のような認知症のための、心臓血管薬である（Ｓ）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１−ピロリジンアセトアミド（Ｏｘｉｒａｃｅｔａｍ（商標））の合成のための有用なキラル中間体でもある（ＷＯ９３／０６８２６を参照のこと）。（Ｓ）−ＥＥＢは、ＡＩＤＳ薬Ａｇｅｎｅｒａｓｅ（商標）のための中間体である（Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの合成に適用することができる（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７，１１８１（１９９５）を参照のこと）。更に、例えば、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−δ−ブチロラクトン（米国特許第６，２２１，６３９号明細書）及び（Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ブロモ酪酸（米国特許第６，７１３，２９０号明細書）のような価値のあるＣ４キラルシントンもまた、（Ｓ）−ＥＥＢから合成することができる。
【０００５】
上記のことに鑑みて、ＥＥＢが価値のある合成中間体であること、及びエナンチオピュアなＥＥＢを工業規模で製造する費用対効果の高い方法が非常に望ましいことは、明らかである。
【０００６】
化学的又は生物学的経路のいずれかにより、エナンチオピュアなＥＥＢを製造するためのアプローチがいくつか報告されてきた。或る場合においては、（Ｒ）−又は（Ｓ）−ＥＥＢは、３，４−ジヒドロキシブチロニトリルをスルホニルクロリドと反応させ、そのあと酸の存在下にアルコールと反応させ、そして塩基触媒による環化を伴うことにより合成された（米国特許第５，０７９，３８２号明細書を参照のこと）。しかしながら、このアプローチは、市販されていなくて製造するのに費用のかかるエナンチオピュアな出発物質の使用を必要とするので、商業的に実現可能なものではない。
【０００７】
別のアプローチにおいては、（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸及びその塩は、（Ｓ）−３−活性化（activated）−ヒドロキシブチロラクトンを開環反応にかけて、４−ヒドロキシ−３−活性化ヒドロキシ酪酸を得、これを環化して、エポキシドを形成させ、それから結果的にキラル中心の反転をもたらすことによって製造される（米国特許第６，２３２，４７８号、第６，３４２，０３４号明細書を参照のこと）。しかしながら、市販の（Ｓ）−３−ヒドロキシブチロラクトンの純度が低いために（純粋な（Ｓ）−３−ヒドロキシブチロラクトンの合成は知られていない）、このアプローチでは、所望の（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸生成物に多くの不純物を伴うものが製造されるので、多くの市販用には適していない。
【０００８】
別のアプローチにおいては、ラセミ体ＥＥＢは、キラルな（ｓａｌｅｎ）ＣｏＩＩＩ錯体により触媒される加水分解性速度論的分割によって、（Ｒ）−ＥＥＢに分割された（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４，１３０７（２００２）、米国特許第６，６９３，２０６号明細書を参照のこと）。この方法では、回収未反応エポキシド及び高度にエナンチオ高含有形態にある１，２−ジオール生成物の両方が生じた（すなわち、＞９９％ｅｅ、（Ｒ）−ＥＥＢについての収率４５．６％）。しかしながら、このアプローチに記載された反応方法では、反応方法の初期に発熱であり、反応混合物を低温（すなわち、０℃）に保持しなければならないので、付加的な処理手段が必要となる。更に、このアプローチは、（Ｓ）−ＥＥＢの製造に適用可能ではない。
【０００９】
生体触媒的アプローチにおいては、ラセミ体の３，４−エポキシ酪酸アルキルエステルの速度論的分割に、精製したエステラーゼが適用された。例えば、（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸ｉｓｏ−及びｎ−ブチルは、市販の酵素、ステアプシン（ブタ膵臓から単離）を用いて、９５％ｅｅで、収率約３３〜３８％で製造された（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５３，１０４（１９８８）、米国特許第４，８６５，７７１号、第５，２４８，６０１号明細書、ＥＰ２３７９８３Ａ２を参照のこと）。別の例においては、ラセミ体の３，４−エポキシ酪酸メチルのエナンチオ選択的加水分解に対してブタ肝臓エステラーゼを用いて、中程度のエナンチオマー比の値（Ｅ＝１１）で（Ｒ）−エポキシドを得た（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３０，２５１３（１９８９）を参照のこと）。しかしながら、これらの酵素を用いる速度論的分割方法は、高価な市販用のステアプシン（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５３，１０４（１９８８）、米国特許第４８６５７７１号及び第５２４８６０１号明細書、ＥＰ２３７９８３Ａ２）又はエステラーゼ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３０，２５１３（１９８９））（両方とも哺乳類源に由来する）を大量に使用することが必要であるので、工業的方法には適用できない。更に、ブタ肝臓エステラーゼの場合においては、中程度のエナンチオ選択性及び低い反応率が観察されている。
【００１０】
ラセミ体エポキシドの速度論的分割によりキラルなエポキシド及びビシナルジオールを製造する目的で、微生物のエポキシド加水分解酵素（ＥＨ）を生体触媒として使用する方法が、近年認められるようになってきた。図１に示すように、ラセミ体エポキシドの選択的加水分解により、高い鏡像体過剰率（ｅｅ）の値で、対応するジオール及び未反応エポキシドの両方を生成することができる。微生物ＥＨを用いて、小規模合成において良好なエナンチオ選択性でエポキシド及びジオールを製造するいくつかの成功例が見出されている（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２，５５２（２００１）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５，１１２（２００１）を参照のこと）。しかしながら、ラセミ体エポキシドのＥＨ触媒を用いる分割のための幅広い工業的基盤を実現し得る前に、このアプローチに対するいくつかの限界に注意を向ける必要がある。
【００１１】
第一に、この変換のために利用可能なＥＨ酵素の数がまだ少なく、しかも合成応用に見込みのあるＥＨ酵素の数は、なおさらまれである（米国特許第５，８４９，５６８号及び第６，３８７，６６８号明細書を参照のこと）。特に、利用可能な株をスクリーニングすることによる新規なＥＨの発見は、現在のところ、培養物コレクション（culture collections）が限られていること及び強力なスクリーニングアッセイが欠けていることにより妨げられている。第二に、多くの周知のＥＨ酵素では、基質の範囲が限られている。実際に、利用可能な酵素のうちで、多くのものは、一方の鏡像異性体だけに選択性を有し、その結果、特定の化合物について、両方の鏡像異性体へのアクセスが可能ではない。最後に、多くのＥＨ触媒分割方法においては、酵素に対する触媒効率が低いために、酵素濃度（全細胞又は粗抽出物のいずれか）が高いこと及び基質濃度がかなり低いことが、必要とされる。
【００１２】
上記のことに鑑みて、当該技術分野においては、エナンチオ高含有のエポキシド（及びビシナルジオール）への、特にエナンチオ高含有のエポキシドＥＥＢに対する合成的アクセスが可能となるように、ラセミ体エポキシドの速度論的分割のために利用し得る生体触媒に対する必要性が依然として残っている。生体触媒を利用する速度論的分割方法は、費用対効果が大きくしかも工業的規模の方法に対して適用可能でもあることが望ましい。本発明は、この必要性及びその他の必要性を満たすものである。
【発明の要約】
【００１３】
或る観点においては、本発明は、ＡＴＣＣ番号：ＰＴＡ−８３０３の識別特性を特徴とする微生物アシネトバクターバウマニ（Acinetobacter baumannii）、並びにその誘導体及び変異体の生物学的純粋培養物を提供する。
【００１４】
別の観点においては、本発明は、微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３を培養することを含む、３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物を分割する方法であって、好気的条件下に水性栄養培地（aqueous nutrient medium）中で、ラセミ混合物存在下に、（Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを優先的に加水分解して、（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシブタン酸エチルを形成させる能力を特徴とする、前記方法を提供する。
【００１５】
更に別の観点においては、本発明は、（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを製造する方法であって、前記方法が：（ｉ）３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物を、全細胞、細胞抽出物、部分的精製酵素、精製酵素及びその混合物からなる群から選択される形態のエポキシド加水分解酵素とともにインキュベートすることであって、そこで、酵素及び酵素を含む細胞が、微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３からのものであり、混合物中の（Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを優先的に加水分解して、（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシブタン酸エチルを形成させる能力を特徴とする、前記インキュベートすること；並びに（ｉｉ）反応培地から（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを単離すること、を含む前記方法を提供する。
【００１６】
別の観点においては、本発明は、ＡＴＣＣ番号：ＰＴＡ−８３０２の識別特性を特徴とする微生物クリプトコッカスアルビダス（Cryptococcus albidus）、並びにその誘導体及び変異体の生物学的純粋培養物を提供する。
【００１７】
別の観点においては、本発明は、微生物クリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２を培養することを含む、３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物を分割する方法であって、好気的条件下に水性栄養培地中で、ラセミ混合物存在下に、（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを優先的に加水分解して、（Ｒ）−エチル−３，４−ジヒドロキシブタン酸を形成させる能力を特徴とする、前記方法を提供する。
【００１８】
別の観点においては、本発明は、（Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを製造する方法を提供するものであって、前記方法は、
（ｉ）３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物を、全細胞、細胞抽出物、部分的精製酵素、精製酵素及びその混合物からなる群から選択される形態のエポキシド加水分解酵素とともにインキュベートする工程であって、そこで、酵素及び酵素を含む細胞が、微生物クリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２からのものであり、混合物中の（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを優先的に加水分解して、（Ｒ）−エチル−３，４−ジヒドロキシブタン酸を形成させる能力を特徴とする、前記インキュベートする工程；並びに
（ｉｉ）反応培地から（Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを単離する工程を含む。
【００１９】
別の観点においては、本発明は、（ｉ）同化可能な炭素源、窒素源、及び無機ミネラル源を含有する栄養培地中で、エポキシド加水分解酵素の形成に適した条件下に、微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３を好気的に培養する工程；（ｉｉ）エポキシド加水分解酵素を産生するのに十分な時間の間、培養液をインキュベートする工程；並びに（ｉｉｉ）栄養培地からエポキシド加水分解酵素を回収する工程を含む、微生物エポキシド加水分解酵素を産生する方法を提供する。
【００２０】
別の観点においては、本発明は、（ｉ）同化可能な炭素源、窒素源、及び無機ミネラル源を含有する栄養培地中で、エポキシド加水分解酵素の形成に適した条件下に、微生物クリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２を培養する工程；（ｉｉ）エポキシド加水分解酵素を産生するのに十分な時間の間、培養液をインキュベートする工程；並びに（ｉｉｉ）栄養培地からエポキシド加水分解酵素を回収する工程を含む、微生物エポキシド加水分解酵素を産生する方法を提供する。
【００２１】
別の観点においては、本発明は、３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物から（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを製造するための、全細胞、細胞抽出物、部分的精製酵素、精製酵素、及びその混合物からなる群から選択される形態にあるエポキシド加水分解酵素の使用を提供するものであって、前記酵素が微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３由来のものである、前記使用を提供する。
【００２２】
別の観点においては、本発明は、３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物から（Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸エチルを製造するための、全細胞、細胞抽出物、部分的精製酵素、精製酵素、及びその混合物からなる群から選択される形態にあるエポキシド加水分解酵素の使用を提供するものであって、前記酵素が微生物クリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２由来のものである、前記使用を提供する。
【００２３】
本発明のその他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な記載及び図面から、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
図１は、エポキシド加水分解酵素を用いるラセミ体エポキシドのエナンチオ選択的加水分解を説明する合成反応工程式を示す。
【００２５】
図２は、微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３の顕微鏡画像を示す。
【００２６】
図３は、ｒａｃ−ＥＥＢの合成を説明する。
【００２７】
図４は、本発明の微生物の発見に利用された研究戦略を説明する。
【００２８】
図５は、反応混合物中に存在する（Ｒ）−及び（Ｓ）−ＥＥＢ濃度を、アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３からのＥＨにより触媒されるｒａｃ−ＥＥＢの速度論的分割方法の間の時間の関数として説明するグラフを示す。
【００２９】
図６Ａ及び図６Ｂは、３，４−エポキシ酪酸アルキルの合成反応工程式を示す。
【発明の詳細な説明】
【００３０】
定義及び略語
本明細書で使用する用語「エナンチオ選択性」は、「Ｅ」値により測定されるが、ラセミ体基質から、生成物ラセミ混合物中の一方の鏡像異性体の方を、他方の鏡像異性体と比較して生じさせるための酵素の選択能力を含む；換言すれば、Ｅ値は、鏡像異性体間を区別する酵素の能力の指標である。非選択的反応では、Ｅ値が１となるのに対して、一般に、２０を超えるＥ値を有する分割は、合成において有用であると考えられる。エナンチオ選択性は、鏡像異性体間の変換速度の違いに存在する。鏡像異性体のうちの一方の含有量が高い反応生成物が得られる；逆に、残った基質は、他方の鏡像異性体の含有量が高い。実用目的のためには、一般に、鏡像異性体のうちの一方が大過剰で得られることが望ましい。
【００３１】
Ｅの計算は、３つの変数、すなわち（１）出発物質の鏡像異性体純度（ｅｅｓ）；（２）生成物の鏡像異性体純度（ｅｅｐ）；及び（３）変換の程度（ｃ）、のうちの２つの測定値に基づいている。次いで、以下の３つの式のうちの１つを用いることができる（Ｈｙｄｏｌａｓｅｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｏｍｓｃｈｅｕｅｒ，Ｕ．Ｔ．ａｎｄ  Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ，Ｒ．Ｊ．（１９９９）Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｓｅｃｔｉｏｎ  ３．１．１；及びＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：７２９４−７２９９（１９８２）を参照のこと）。
【数１】
2010532992.tif 000003
【数２】
2010532992.tif 000004
【数３】
2010532992.tif 000005
【００３２】
本明細書で使用する用語「鏡像体過剰率」又は記号「ｅｅ」は、そのような鏡像異性体のラセミ混合物中の、他方の鏡像異性体に対する、一方の鏡像異性体（（Ｒ）−型又は（Ｓ）−型に関わらず）の量又は超過量を含む。鏡像体過剰率パーセントは、定量的に式（２）により表される：
【数４】
2010532992.tif 000006
（式中、Ｒは、（Ｒ）−型鏡像異性体のモル濃度であり、Ｓは、（Ｓ）−型鏡像異性体のモル濃度である）
【００３３】
キラル化合物のラセミ混合物の酵素的分割に関するｅｅ及びエナンチオ選択性の計算は、更に米国特許第５，５４１，０８０号明細書、及び米国出願公開第２００５／００２６２６０号明細書に記載されている。前記文献は全目的に対して参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００３４】
本明細書で使用する「ＡＴＣＣ」には、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９  ＵＳＡにある米国タイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）国際寄託機関が含まれる。「ＡＴＣＣ番号」は、ＡＴＣＣに寄託した培養物の寄託番号である。
【００３５】
本明細書で使用する用語「その誘導体及び変異体」には、微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３又はクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２の記載を参照して使用するが、前述のＡＴＣＣ番号を有する微生物に本質的に対応する微生物が含まれる。用語「本質的に対応する」は、自然に存在する変異及びエナンチオ選択性のＥＨ活性を示す微生物の人工的変異、を意味する。具体的には、変異は、微生物から単離し得るＥＨ及びその機能的断片における変異及びＥＨと、その機能的断片をコード化する生物体のゲノムにおける変異とに関するものである。
【００３６】
本明細書で使用する用語「反応培地」は、酵素触媒（例えば、ＥＨ）及び少なくとも１の基質（例えば、ｒａｃ−ＥＥＢ）がその中に混ぜ合わされている（例えば、溶解、混合、懸濁により）溶液を含む。培地は、好ましくは緩衝化した、水性のものであることができ、水に加えて又は水の代わりに溶媒を含有することができる。反応培地中の溶媒の量は、反応培地の約０〜約１００％であることができる。
【００３７】
３，４−エポキシ酪酸エチルは、ＥＥＢと略記する。
【００３８】
（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸エチルは、（Ｒ）−ＥＥＢと略記する。
【００３９】
（Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸エチルは、（Ｓ）−ＥＥＢと略記する。
【００４０】
（Ｒ）−３，４−ジヒドロキシブタン酸エチルは、（Ｒ）−ジオールと略記する。
【００４１】
（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシブタン酸エチルは、（Ｓ）−ジオールと略記する。
【００４２】
エポキシド加水分解酵素は、ＥＨと略記する。
【００４３】
Ｉ．組成物
本発明は、それぞれエポキシド加水分解酵素（ＥＨ）活性を有する、２つの新規微生物の発見を基にしている。これらの微生物からのＥＨは、エポキシド開環により、３，４−エポキシ酪酸アルキル、好ましくは３，４−エポキシブタン酸エチル（ＥＥＢ）のうちの一方の鏡像異性体を、他方の鏡像異性体に優先して加水分解することができる。
【００４４】
１．アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３
本出願の発明者は、ＥＥＢのラセミ混合物（すなわち、ｒａｃ−ＥＥＢ）中の（Ｒ）−鏡像異性体に優先して、ＥＥＢの（Ｓ）−鏡像異性体と選択的に反応して（そして加水分解して）、（Ｓ）−３，４−ジヒドロキシブタン酸エチル（すなわち、（Ｓ）−ジオール）を形成することができるＥＨを産生する細菌性微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３を発見した（反応工程式１Ａを参照のこと）。
【化１】
2010532992.tif 000007
【００４５】
従って、或る観点においては、本発明は、アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３並びにその誘導体及び変異体の生物学的純粋培養物を提供する。アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３の顕微鏡画像を、図２に示す。アシネトバクターバウマニの生物学的純粋培養物は、水性栄養培地、好ましくは同化可能な炭素源、窒素源及び無機物質源を含有する水性栄養培地中での好気的培養時に、ＥＨを産生する。微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３の生物学的純粋培養物が産生するＥＨは、ＥＥＢのラセミ混合物中の（Ｓ）−ＥＥＢを優先的に加水分解して、（Ｓ）−ジオールを形成する。
【００４６】
アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３の微生物特性を、下記表１Ａに要約する。
【表１Ａ】
2010532992.tif 000008
【００４７】
２．クリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２
また、本出願の発明者は、ＥＥＢのラセミ混合物中の（Ｓ）−鏡像異性体に優先して、ＥＥＢの（Ｒ）−鏡像異性体と選択的に反応することができるＥＨを産生する、酵母微生物クリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２をも発見した（反応工程式１Ｂを参照のこと）。
【化２】
2010532992.tif 000009
【００４８】
したがって、別の観点においては、本発明は、クリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２並びにその誘導体及び変異体の生物学的純粋培養物を提供する。クリプトコッカスアルビダスの生物学的純粋培養物は、水性栄養培地、好ましくは同化可能な炭素源、窒素源及び無機物質源を含有する水性栄養培地中での好気的培養時に、ＥＨを産生する。クリプトコッカスアルビダスの生物学的純粋培養物が産生するＥＨは、ＥＥＢのラセミ混合物中の（Ｒ）−ＥＥＢを優先的に加水分解して、（Ｒ）−ジオールを形成する。
【００４９】
クリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２の微生物特性を、下記表１Ｂに要約する。
【表１Ｂ】
2010532992.tif 000010
【００５０】
３．微生物培養：
ＥＨ活性を含む微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３又はクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２は、適切な基本培地中で培養して増殖することができる。微生物の増殖が可能であれば、この目的に使用する培地については特に制限はない。通常、この培地は、必要な時に、普通の同化可能な炭素源、窒素源及び無機物質源を含有する水性栄養培地である。
【００５１】
例えば、微生物が任意の炭素源を利用できるならば、それを使用することができる。使用することができる炭素源の具体的な例としては、糖（例えば、グルコース、フルクトース、マルトース及びアミロース）、アルコール（例えば、ソルビトール、エタノール及びグリセリン）、有機酸（例えば、フマル酸、クエン酸、酢酸及びプロピオン酸）及びその塩、炭化水（例えば、パラフィン）、並びに、それらの混合物が挙げられる。
【００５２】
使用することができる窒素源の例としては、無機塩のアンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウム）、有機酸のアンモニウム塩（例えば、フマル酸アンモニウム及びクエン酸アンモニウム）、硝酸塩（例えば、硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム）、有機窒素化合物（例えば、ペプトン、酵母エキス、肉抽出物及びトウモロコシ浸出液）、並びに、それらの混合物が挙げられる。
【００５３】
加えて、培地に使用される普通の栄養源（例えば、無機塩、微量金属塩及びビタミン）も、適切に混合して使用することができる。
【００５４】
培養条件について特に制限はない。培養は、例えば、好気的条件下に、ｐＨ及び温度を、それぞれｐＨを５〜８の範囲で、温度を１５〜４０℃の範囲で、適切に制御しながら、約１２〜約４８時間実施することができる。望ましいｐＨは、任意の緩衝剤（例えば、ＫＨ２ＰＯ４緩衝剤、及びモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）など）の使用によって、又は生得的に緩衝特性を所有し得る栄養材料の添加によって、制御することができる。
【００５５】
微生物の増殖が完結した後、細胞を、従来の方法、例えば、遠心分離及び濾過によって回収し、次いで洗浄して、適当な緩衝液に再懸濁する。
【００５６】
４．エポキシド加水分解酵素の精製
エポキシド加水分解酵素（ＥＨ）は、本明細書に説明する方法によって、微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３又はクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２から単離して、精製することができる。第一に、微生物細胞抽出液は、アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３又はクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２の細胞から、物理的方法（例えば、超音波粉砕）又は細胞壁溶解酵素を用いる酵素的方法を用いて細胞をバラバラにして、遠心分離などにより不溶性画分を除去することによって調製される。
【００５７】
次いで、ＥＨは、上記の方法で得られる細胞抽出液から、普通のタンパク質精製法（例えば、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー又はゲル濾過クロマトグラフィー）を組み合わせて、精製することができる。
【００５８】
アニオン交換クロマトグラフィーで使用する担体の例は、Ｑ−セファロースＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）である。ＥＨを含有する細胞抽出液を、前記担体を充填したカラムの中を通過させるとき、ｐＨ８．５の条件下に、ＥＨは、非吸着画分中に回収される。
【００５９】
カチオン交換クロマトグラフィーで使用する担体の例は、ＭｏｎｏＳ  ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）である。ＥＨを含有する細胞抽出液を、前記担体を充填したカラムの中を通過させることにより、担体（カラム中の）上にＥＨを吸着させ、次いでカラムを洗浄した後、高い塩濃度を有する緩衝液を用いて、ＥＨを溶離する。その時に、塩濃度を、逐次的に増加させるか又は勾配的に増加させることができる。例えば、ＭｏｎｏＳ  ＨＲを使用する場合においては、担体上に吸着されたＥＨは、約０．２〜約０．５ＭのＮａＣｌ濃度で溶離される。
【００６０】
次いで、上記の方法で精製したＥＨを、ゲル濾過クロマトグラフィーなどによって更に均質に精製することができる。ゲル濾過クロマトグラフィーで使用する担体の例は、セファデックス２００ｐｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）である。
【００６１】
ＥＨを含有する画分（前述の精製手順において）は、後記の速度論的分割方法に従い、各画分の酵素活性をアッセイすることによって確認することができる。
【００６２】
ＩＩ．方法
微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３及びクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２はそれぞれ、相補的な活性を有するＥＨを産生する。そして、ＥＥＢの一方の鏡像異性体（例えば、（Ｒ）−鏡像異性体）の選択的分解により、すなわちエポキシド開環（加水分解）を経由して、結果的に他方の鏡像異性体（例えば、（Ｓ）−鏡像異性体）を蓄積することにより、工業規模でのラセミ体ＥＥＢの速度論的分割に対して、用途の広い生体触媒として用いることができる。
【００６３】
従って、別の観点においては、本発明は、微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３又はクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２を培養することを含む、ＥＥＢのラセミ混合物を分割する方法であって、好気的条件下に水性栄養培地中で、ラセミ混合物存在下に、（Ｓ）−ＥＥＢ又は（Ｒ）−ＥＥＢをそれぞれ優先的に加水分解して、（Ｓ）−ジオール又は（Ｒ）−ジオールをそれぞれ形成させる、その能力を特徴とする、前記方法を提供するものである。
【００６４】
微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３又はクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２が産生するＥＨは、上記の速度論的分割方法を触媒する原因となり、これらの微生物からのＥＨは、ラセミ体ＥＥＢから、エナンチオ高含有の形態にあるＥＥＢの（Ｒ）−又は（Ｓ）−鏡像異性体を製造する方法において使用することができる。これらの微生物からのＥＨは、部分的精製酵素、精製酵素、又はその混合物として、全細胞、細胞抽出物形態を含む、任意の形態で使用することができる。
【００６５】
従って、更に別の観点においては、本発明は、（Ｒ）−ＥＥＢ又は（Ｓ）−ＥＥＢを製造する方法であって、前記方法が：
（ｉ）ＥＥＢのラセミ混合物を、全細胞、細胞抽出物、部分的精製酵素、精製酵素、及びその混合物からなる群から選択される形態のＥＨとともにインキュベートすることであって、そこで、酵素及び酵素を含む細胞が、微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３又はクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２それぞれからのものであり、混合物中の（Ｓ）−ＥＥＢ又は（Ｒ）−ＥＥＢをそれぞれ優先的に加水分解して、（Ｓ）−ジオール又は（Ｒ）−ジオールをそれぞれ形成させて、結果的に反応培地中に（Ｒ）−ＥＥＢ又は（Ｓ）−ＥＥＢをそれぞれ蓄積する、その能力を特徴とする、前記インキュベートすること；並びに
（ｉｉ）反応培地から（Ｒ）−ＥＥＢ又は（Ｓ）−ＥＥＢをそれぞれ単離すること、を含む前記方法を提供するものである。
或る実施態様においては、方法は、水性栄養培地中で、好ましくは好気的条件下に、微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３又はクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２の増殖培養において実施される。別の実施態様においては、方法は、アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３又はクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２微生物の全細胞（例えば、静止細胞）を用いて、好ましくは水性緩衝液中で、実施される。微生物の全細胞は、湿細胞ペレットとして又は凍結乾燥粉末として製造することができる。更に別の実施態様においては、方法は、微生物から単離される精製又は部分的精製ＥＨを含有する、微生物を含まない反応培地中で実施される。
【００６６】
関連する観点においては、本発明はまた、（ｉ）同化可能な炭素源、窒素源及び無機ミネラル源を含有する栄養培地中で、エポキシド加水分解酵素の形成に適した条件下に、微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３又はクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２を好気的に培養する工程；（ｉｉ）エポキシド加水分解酵素を産生するのに十分な時間の間、培養液をインキュベートする工程；並びに（ｉｉｉ）栄養培養培地からエポキシド加水分解酵素を回収する工程を含む、微生物エポキシド加水分解酵素（ＥＨ）を産生する方法をも提供するものである。
【００６７】
別の関連する観点においては、本発明は、３，４−エポキシ酪酸エチルのラセミ混合物から（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸エチル又は（Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸エチルをそれぞれ製造するための、全細胞、細胞抽出物、部分的精製酵素、精製酵素、及びその混合物からなる群から選択される形態のエポキシド加水分解酵素の使用を提供するものであって、前記酵素が微生物アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３又はクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２由来のものである、前記使用を提供する。
【００６８】
本発見では、アシネトバクターバウマニ又はクリプトコッカスアルビダスそれぞれによって触媒される微生物速度論的分割方法を経由して、ＥＥＢの（Ｒ）−又は（Ｓ）−鏡像異性体のいずれかの合成的アクセスが可能となる。エナンチオ高含有のＥＥＢを製造する本微生物速度論的分割方法は、現在周知の方法の利点の多くを有している。例えば、本発明の方法では、ビニル酢酸、アルコール及びｍ−ＣＰＢＡのような安価なバルク試薬から廉価に合成することができるラセミ体ＥＥＢを出発物質として使用する。（図３を参照のこと）。更に、本発明に記載する速度論的分割方法は、温和な反応条件（例えば、周囲温度）下に実施することができ、それによりエナンチオ高含有の生成物が分解して収率を低下させる機会を低減することができる。
【００６９】
本明細書に開示される速度論的分割方法により産生されるエナンチオ高含有の生成物は、医薬、農薬、及びファインケミカル工業において高い価値のある化合物のための合成中間体として有用である。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例は、本発明を説明するために与えられるものであり、決して発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。発明の完全な範囲は、本明細書に示される特許請求の範囲により定義される。
【００７１】
《実施例１》
以下の実施例では、微生物からＥＨ活性の発見のための一般的研究戦略を記載する。
【００７２】
アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３又はクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２は、次のことを含む研究戦略において発見した：１）ＥＨ活性を含有する可能性がある自然環境（例えば、土壌試料）から微生物の単離；２）ＥＨ活性を有する微生物を同定する高速大量処理（high throughput）（ＨＴＳ）スクリーニング及びＥＨ活性を有する微生物のエナンチオ選択的スクリーニング；３）ＥＨ活性を有する新たに単離した純粋な微生物の同定及びキャラクタリゼーション；並びに４）速度論的分割目的のための、新たに単離した純粋な微生物のＥＨ活性の最適化（図４を参照のこと）。
【００７３】
１．環境源から微生物の単離
土壌試料を、さまざまな自然環境から集め、そのあと基礎栄養物を含有する培養液中に接種する。予備培養の後、細胞を固体培地上で再び培養して、単一コロニーとして単離する。
【００７４】
２．ＥＨ活性を有する微生物のためのＨＴＳスクリーニング及びエナンチオ選択的スクリーニング
アルケン（例えば、ヘキセン、ヘプテン、オクテン又はヘキサデセン）を、モノオキシゲナーゼによりエポキシドへ変換し、次いでエポキシド加水分解酵素に触媒される加水分解を経由して、又はエポキシド異性化酵素により触媒されるエポキシドの転位によって、ビシナルジオール、アルデヒド若しくはケトンまで分解する（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，８，６５（１９９７）を参照のこと）。このようにして、単独炭素源としての脂肪族アルケン上に単離される株は、エポキシド加水分解酵素活性を有し得、ラセミ体エポキシドのエナンチオ選択的加水分解のために有用であり得る。土壌試料からの様々な微生物を、単独炭素源としてのアルケンの利用について試験した。得られた陽性の微生物を再び培養してから、基質としてＥＥＢを用いて、キラルＧＣ又はＨＰＬＣにより、そのエナンチオ選択性について試験する。
【００７５】
３．微生物の同定
ＥＨ活性を有する新たに単離した微生物を、その形態学、グラム染色試験、生理学的及び生物学的試験（例えば、炭素源及び窒素源の同化作用、カタラーゼ活性の検出及び発酵実験）に基づいて同定した。
【００７６】
４．新たに単離した微生物によるＥＥＢの速度論的分割
選択された微生物は、ラセミ体ＥＥＢの速度論的分割を触媒するために使用することができる。選択された微生物は、全細胞及び／又は細胞抽出物の形態にある生体触媒として用いることができる。代わりに、選択された微生物から単離したＥＨ（例えば、部分的精製酵素又は精製酵素の形態にある）は、触媒としても用いることができる。選択された微生物からの全細胞、細胞抽出物、部分的精製酵素、又は精製酵素の任意の混合物は、生体触媒としても使用することもできる。産業上の利用に対しては、生体触媒が効果的で安定であることが望ましい。陽性の微生物からのＥＨ含量及びＥＨ活性を増加するために、培養液及び増殖条件の両方の最適化が行なわれる。その場合、各栄養成分及びその最適濃度が決定されるべきであり、そのあと細胞増殖を制御し、高いＥＨ特異的活性を有する生体触媒の最高量を達成する。
【００７７】
《実施例２》
ＥＨ活性を含む特定の微生物、アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３及びクリプトコッカスアルビダスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２は、下記に議論される特定の研究戦略を利用して発見された。エナンチオ高含有のＥＥＢの製造におけるその使用もまた、次の実施例に記載する。
【００７８】
１．環境源から微生物の単離
土壌試料に由来する微生物は、バクトペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、及びＮａＣｌ  １０ｇ／ｌからなる栄養培養液（ｐＨ７．０）中、３０℃で増殖させた。単独の炭素源として２％（ｖ／ｖ）の脂肪族アルケン、例えばヘキセン、ヘプテン、オクテン又はヘキサデセンを含有する培地中で数回継代培養した後、同じ培地を含有する寒天プレート上に繰り返しストリーキングを実施した。培地組成を、表２に示した。
【表２】
2010532992.tif 000011
【００７９】
２．ＥＨ活性を有する微生物に対するＨＴＳスクリーニング及びエナンチオ選択的スクリーニング
栄養培養液中で増殖したアルケン利用株を、ゴム隔膜で密封した５ｍｌネジ蓋瓶中、１０ｍＭ  ＥＥＢ（Ｊｕｅｌｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を追加した、２ｍｌの１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁して、電磁撹拌子を用いて３０℃で６時間撹拌した。反応混合物を、等容量の酢酸エチルで抽出し、１０，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離をしてから、有機層を、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析した。キラルＧＣは、水素炎イオン化検出器を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０シリーズシステムにより行なった。キャリヤーガスとしてＨｅを用いて、試料を注入（１μｌ）した。注射器及び検出器の温度は、それぞれ２００℃及び２５０℃であった。ＥＥＢの鏡像異性体純度は、溶融シリカシクロデキストリンキャピラリーβ−ＤＥＸ  ２２５カラム（長さ３０ｍ，内径０．２５ｍｍ，及び膜厚０．２５μｍ，Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ．）を用いて、温度勾配条件（カラム，３℃／ｍｉｎの速度で８０〜１５０℃）下に測定した。標準として市販の（Ｒ）−又は（Ｓ）−ＥＥＢを用いた（Ｊｕｅｌｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。アルケン利用株のエポキシド加水分解酵素及びそのエナンチオ選択性は、基質としてＥＥＢを用いてスクリーニングした。未確認株Ｌ８Ｇ１Ｂ及びＬＬ１１Ａ５の場合に、ＥＥＢのエナンチオ選択的分解が観察された。ＬＬ１１Ａ５が（Ｒ）−ＥＥＢを優先的に加水分解したのに対して、Ｌ８Ｇ１Ｂは、（Ｓ）−特異的分解活性を示した。
【００８０】
３．微生物の同定
ＥＨ活性を含有する新たに単離した微生物、Ｌ８Ｇ１Ｂ及びＬＬ１１Ａ５は、それらの形態学、グラム染色試験、生理学的及び生物学的試験（例えば、炭素源及び窒素源の同化作用、カタラーゼ活性の検出及び発酵実験）に基づいて同定した。Ｌ８Ｇ１Ｂは、ＡＰＩ  ２０ＮＥキット及びａｐｉｗｅｂ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、表１Ａ（上記）に示す特徴的特性により、アシネトバクターバウマニと同定された。ＬＬ１１Ａ５は、その形状、サイズ、グラム試験、及び同化パターンに基づいて酵母株と分類された。これは、細首の出芽及びムコイドコロニーを有し、グラム陽性の結果を示した。これは、ＡＰＩ  ２０Ｃ  ＡＵＸ及びａｐｉｗｅｂ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、表１Ｂに示す様々な炭素源に対する同化作用結果を有し、クリプトコッカスアルビダスと同定された。
【００８１】
４ａ．（Ｒ）−ＥＥＢを製造するための速度論的分割
アシネトバクターバウマニを、８．５ｇグルコース／ｌ、２ｇ酵母エキス／ｌ、０．８５ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ／ｌ、１．５５ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４／ｌ、及び１０ｍｌ微量元素溶液／ｌを含有する培地上で、３０℃で２４時間培養した。微量元素溶液は、ＥＤＴＡ  １．０ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ  ０．０４ｇ／ｌ、ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ  １０ｇ／ｌ、及び（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２００ｇ／ｌからなる。細胞を、遠心分離により回収して、蒸留水で２回洗浄した。湿細胞ペレット（乾燥細胞重量３５０ｍｇ）を、５０ｍｌのネジ蓋瓶中、１０ｍｌの１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。基質としてラセミ体ＥＥＢを最終濃度２０ｍＭで添加することにより、速度論的分割を開始した。反応は、振盪培養器中、３０℃、２５０ｒｐｍで実施した。速度論的分割方法は、定期的に試料を取ることによりモニターして、残存エポキシドのｅｅ値が１００％に達したときに停止させた。反応混合物から試料（０．２ｍｌ）を取り出し、そのあと酢酸エチル（０．２ｍｌ）で抽出して、有機層中に残ったエポキシドの絶対配置を、この実施例の第２項に記載したキラルＧＣにより決定した。収率は、最多量鏡像異性体の濃度をそのラセミ体の初期濃度で割って計算した百分率で表す。細菌アシネトバクターバウマニＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３の新たに単離した全細胞は、ＥＥＢをエナンチオ選択的に加水分解することができ、（２時間後に）エナンチオピュアな（Ｒ）−ＥＥＢ（１００％ｅｅ，収率４６％）を産生した。速度論的分割方法の間、反応混合物中に存在する（Ｒ）−及び（Ｓ）−ＥＥＢの濃度を時間の関数として示すグラフが、図５に見出される。この反応に対する鏡像異性体率の値（Ｅ）は、７１である。生じたジオールは、１−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドで誘導体化して、キラルＨＰＬＣにより分析した（Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ，９９．２：０．８（ヘキサン：ＥｔＯＨ），１ｍｌ／ｍｉｎ，２３０ｎｍ）。
【００８２】
４ｂ．（Ｓ）−ＥＥＢを製造するための速度論的分割
クリプトコッカスアルビダスを、この実施例の第４ａ項に記載したものと同じ培地上で、３０℃で培養した。細胞を、遠心分離により回収して、蒸留水で２回洗浄した。湿細胞ペレット（乾燥細胞重量７１０ｍｇ）を、５０ｍｌのネジ蓋瓶中、１０ｍｌの１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。基質としてラセミ体ＥＥＢを最終濃度２０ｍＭで添加することにより、速度論的分割方法を開始した。反応は、振盪培養器中、３０℃、２５０ｒｐｍで実施した。速度論的分割方法は、定期的に試料を取ることによりモニターして、残存エポキシドのｅｅ値が１００％に達したときに停止させた。反応混合物から定期的に試料（０．２ｍｌ）を取り出し、そのあと酢酸エチル（０．２ｍｌ）で抽出して、有機層中に残ったエポキシドの絶対配置を、この実施例の第２項に記載したキラルＧＣにより決定した。収率は、最多量鏡像異性体の濃度をそのラセミ体の初期濃度で割って計算した百分率で表す。ＥＥＢのエナンチオ選択的加水分解により、４時間後に、エナンチオピュアな（Ｓ）−ＥＥＢ（１００％ｅｅ，収率２６％）を生じた。生じたジオールは、１−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドで誘導体化して、キラルＨＰＬＣにより分析した（Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ，９９．２：０．８（ヘキサン：ＥｔＯＨ），１ｍｌ／ｍｉｎ，２３０ｎｍ）。
【００８３】
《実施例３》
次の実施例は、エナンチオ選択的エポキシド開環を経由する、アシネトバクターバウマニ及びクリプトコッカスアルビダスによる、様々なラセミ体３，４−エポキシ酪酸アルキルの速度論的分割を説明する。
【００８４】
ラセミ体３，４−エポキシ酪酸アルキルの合成：
速度論的分割のための基質、すなわち３，４−エポキシ酪酸アルキルは、３−ブテン酸を酸触媒を用いてエステル化し、そのあと３−クロロ過安息香酸（ｍ−ＣＰＢＡ）でエポキシ化することにより合成した（図６Ａを参照のこと）。（Ｒ）−３，４−エポキシ酪酸アルキルもまた、相当するアルコールで（Ｒ）４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸をエステル化し、そのあと塩基触媒を用いて環形成することにより合成して、キラルＧＣ分析のための標準として使用した（図６Ｂを参照のこと）。
【００８５】
３，４−エポキシ酪酸アルキルの速度論的分割：
アシネトバクターバウマニ及びクリプトコッカスアルビダスを、実施例２の第４ａ項で用いたものと同じ培地上で、３０℃で培養した。細胞は、遠心分離により回収して、蒸留水で２回洗浄した。湿細胞ペレット（それぞれの株に対する乾燥細胞重量１５ｍｇ）を、１．５ｍｌのネジ蓋管中、０．２ｍｌの１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。基質としてラセミ体３，４−エポキシ酪酸アルキルを最終濃度２０ｍＭで添加することにより、速度論的分割方法を開始した。反応は、振盪培養器中、３０℃、２５０ｒｐｍで実施した。反応は、培養３時間後に、０．２ｍｌの酢酸エチルを添加することにより停止させた。残ったエポキシドを、キラルＧＣで分析した。結果を表３に示す（下記）。
【００８６】
ＧＣは、ＦＩＤ検出器を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０シリーズＧＣシステムにより行なった。キャリヤーガスとしてＨｅを用いて、有機層を注入（１μｌ）した。注射器及び検出器の温度は、それぞれ２００℃及び２５０℃であった。３，４−エポキシ酪酸アルキルの鏡像異性体純度は、溶融シリカシクロデキストリンキャピラリーβ−ＤＥＸ２２５カラム（長さ３０ｍ，内径０．２５ｍｍ，及び膜厚０．２５μｍ，Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ）を用いて、温度勾配条件（ＭＥＢ及びＥＥＢについては３℃／ｍｉｎの速度で８０℃〜１５０℃，ＢＥＢについては１℃／ｍｉｎの速度で６０℃〜１２０℃，ＴＥＢについては１℃／ｍｉｎの速度で６０℃〜１００℃，ＯＥＢ及びＺＥＢについては１℃／ｍｉｎの速度で６０℃〜１８０℃）下に測定した。
【表３】
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【００８７】
《実施例４》
次の実施例は、微生物の凍結乾燥細胞粉末を用い、ラセミ体ＥＥＢのエナンチオ選択的分解による（エポキシド開環による）、ラセミ体ＥＥＢの速度論的分割を説明する。
【００８８】
−７０℃の冷凍庫で３ヶ月間保存したアシネトバクターバウマニ及びクリプトコッカスアルビダスを、実施例２の第４ａ項で用いたものと同じ培地上で、３０℃で培養した。細胞は、遠心分離により回収して、蒸留水で２回洗浄した。湿細胞ペレットを、−２０℃で２時間凍結させ、次いで一晩凍結乾燥した。細胞の乾燥した粉末（１５ｍｇ）を、１．５ｍｌのネジ蓋瓶中、０．２ｍｌの１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。基質としてラセミ体ＥＥＢを最終濃度２０ｍＭで添加することにより、速度論的分割を開始した。反応は、振盪培養器中で、３０℃、２５０ｒｐｍで実施した。速度論的分割は、定期的に試料を取ることによりモニターして、残りのエポキシドのｅｅ値が１００％に達したときに停止させた。凍結乾燥した細胞もまた、高収率を伴うエナンチオ選択的分解パターンを示した。アシネトバクターバウマニ及びクリプトコッカスアルビダスは、ラセミ体ＥＥＢを分割して、それぞれ収率４０％（１時間）及び１８％（３時間）で、（Ｒ）−及び（Ｓ）−ＥＥＢを生じた。
【００８９】
前述の発明は、理解を明確にする目的で、説明図及び実施例によっていくらか詳細に記載してきたけれども、当業者ならば、添付した特許請求の範囲の範囲内で、ある程度の変更及び修正を実施し得ることは理解されるであろう。更に、本明細書に与えた各引用文献は、あたかも各引用文献が個別に参照することにより組み込まれたかのように、それと同一程度に、その全体において参照することにより組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年6月3日(2010.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０３の微生物アシネトバクターバウマニ、並びにその誘導体及び変異体の、生物学的純粋培養物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３０２の微生物クリプトコッカスアルビダス、並びにその誘導体及び変異体の、生物学的純粋培養物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
使用することができる窒素源の例としては、無機酸のアンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウム）、有機酸のアンモニウム塩（例えば、フマル酸アンモニウム及びクエン酸アンモニウム）、硝酸塩（例えば、硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム）、有機窒素化合物（例えば、ペプトン、酵母エキス、肉抽出物及びトウモロコシ浸出液）、並びに、それらの混合物が挙げられる。
【国際調査報告】
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