(57)【要約】  太陽光により誘起される皮膚の老化（光老化）を防止するためのビオチンの使用、好ましくは（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）と特定の割合で組み合わせてのビオチンの使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
太陽光によって誘起されるコラゲナーゼを抑制するためのビオチンの使用。
【請求項２】
太陽光によって誘起されるコラーゲンおよび／またはエラスチンの分解を減少させるためのビオチンの使用。
【請求項３】
太陽光によって誘起される皺および小皺、並びに／または皮膚の老化を、防止および／まやは減少させるためのビオチンの使用。
【請求項４】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）と相乗的に組み合わせる請求項１〜３のいずれか一項に記載のビオチンの使用。
【請求項５】
組み合わせにおけるビオチンとＥＧＣＧとの比が、１：１〜１：５０００の範囲にあることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
組み合わせにおけるビオチンとＥＧＣＧとの比が、１：３〜１：３０００の範囲にあることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
組み合わせにおけるビオチンとＥＧＣＧとの比が、１：５〜１：１０００の範囲にあることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
経口消費に適した組成物中の活性成分としての請求項１〜７のいずれか一項に記載のビオチンおよびＥＧＣＧ（使用可能ならば）の使用。
【請求項９】
ビオチンとＥＧＣＧとの比が１：１〜１：５０００の範囲にあることを特徴とするビオチンおよび（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の組み合わせを含む経口用組成物。
【請求項１０】
ビオチンとＥＧＣＧとの比が１：３〜１：３０００の範囲にあることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
ビオチンとＥＧＣＧとの比が１：５〜１：１０００の範囲にあることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、太陽光により誘起される皮膚の老化（光老化）を防止するためのビオチンの新規の使用、好ましくは（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）と特定の割合で組み合わせてのビオチンの新規の使用に関する。
【０００２】
皮膚が慢性的に紫外線に曝されると、影響を受けた皮膚の部位に過角化症、ケラチノサイト形成不全症および真皮弾性線維症などの表皮および真皮の損傷を引き起こし、臨床的には光線性もしくは日光性角化症として現れる。皮膚の光損傷および光老化の分子レベルのメカニズムは広範な研究の主題であった。紫外線はあらゆる種類の上皮細胞成長因子およびサイトカイン受容体を活性化させる（リッティー（Ｒｉｔｔｉｅ）およびフィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）２００２）。このリガンド非依存性の受容体活性化は、転写因子ＡＰ−１を刺激するために集束する多数の下流シグナル伝達経路を誘起する。ＡＰ−１により上方制御される遺伝子に、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリーメンバーがある。
【０００３】
したがって、ＭＭＰはとりわけ太陽の紫外線照射による皮膚の損傷の原因であり、皮膚の色合いや弾力性に影響を及ぼし、早期老化に繋がる。ＭＭＰは皮膚の細胞外マトリックス中のコラーゲンやエラスチンを分解する。ＭＭＰの発現および活性が増加すると、コラーゲンタンパク質分解が加速され、コラーゲン発現の減少と相俟って皮膚の弾性線維症や皺を発生させる（ベルネブルク（Ｂｅｒｎｅｂｕｒｇ）２００３）。その症状としては、皮膚のガサガサ感、皺、斑状の色素沈着、弛みおよび色不良が挙げられる。
【０００４】
ＭＭＰは、最も重要かつ十分に研究された光老化関連遺伝子の一つである。したがって、光老化に関する食品成分の保護能力を確立するために、それらのＵＶＡ誘起によるＭＭＰ抑制効果を研究することは非常に重要である。
【０００５】
ビオチンは水溶性ビタミンであり、皮膚、毛髪および爪の機能にとって重要である。ビオチンの欠乏は、鱗状のザラザラした皮膚や脆い爪の原因となる。さらに、ビオチンは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ミトコンドリアプロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼおよびミトコンドリアピルビン酸カルボキシラーゼなどのいくつかのカルボキシラーゼ酵素の二酸化炭素転位に関与する補酵素である。
【０００６】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、各種の皮膚コラゲナーゼを抑制する食品化合物の一つである（リー（Ｌｅｅ）ら、２００５）。用語「ＥＧＣＧ］は、本明細書で使用されるとき、（−）−エピガロカテキンガレートおよび／またはその誘導体（例えば、エステル化形態、グリコシド、硫酸塩など）の１種以上を意味する。
【０００７】
皮膚の太陽光誘起老化（光老化）を防止する活性成分を提供することが本発明の目的であった。用語「太陽光」は、本明細書で使用されるとき、自然および／または人工の太陽光を言い、ＵＶに加えて特にＩＲも包含する。したがって、活性成分は、皮膚のＵＶにより誘起される老化もＩＲにより誘起される老化も防止しなければならない。
【０００８】
驚くべきことに、太陽光で誘起されるコラーゲンおよび／またはエラスチンの分解、皺や小皺、および／または皮膚を老化させるコラゲナーゼを減少させるために、並びに／あるいは、太陽光で誘起されるコラゲナーゼを抑制するために、ビオチンを使用することによって、本発明の目的が達成されることが見出された。
【０００９】
さらに驚くべきことに、ビオチンとＥＧＣＧとの相乗的な組み合わせにより、本発明の目的がより好ましく達成されることが見出された。したがって、太陽光で誘起されるコラーゲンおよび／またはエラスチンの分解、皺や小皺、および／または皮膚を老化させるコラゲナーゼを減少させるために、並びに／あるいは、太陽光で誘起されるコラゲナーゼを抑制するために、ビオチンとＥＧＣＧの相乗的組み合わせを使用することがさらに好ましい。
【００１０】
活性成分は、経口用または局所／化粧用組成物として投与することができるが、経口投与が好ましい。
【００１１】
用語「経口用組成物」は、本明細書で使用されるとき、経口的に投与される組成物を意味する。したがって、本発明の経口用組成物は、食物、飼料および飲料に加える栄養補助剤として、栄養補助食品として、あるいは、固体（カプセル、錠剤など）または液体（溶液、懸濁液など）の医薬品製剤として使用することができる。さらに、用語「経口用組成物」は、また、本発明の活性成分の一方または両方を含有する食物、飼料および飲料を含む。
【００１２】
用語「局所用組成物」は、本明細書で使用されるとき、哺乳類の角質組織に局所的に適用可能な化粧用組成物を言う。用語「化粧用組成物」は、本明細書で使用されるとき、例えば、レンプ・レキシコン・ヘミー（Ｒｏｅｍｐｐ  Ｌｅｘｉｋｏｎ  Ｃｈｅｍｉｅ）、第１０版、１９９７、ゲオルグ・ティーメ・フェアラ−ク・シュトゥットガルト（Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の表題「Ｋｏｓｍｅｔｉｋａ」で定義されているような化粧用組成物を言う。
【００１３】
好ましい一実施形態においては、本発明は、また、ビオチンとＥＧＣＧの比が１：１〜１：５０００の範囲の相乗的組み合わせを含む経口用組成物に関する。
【００１４】
ビオチンとＥＧＣＧとの組み合わせが、ＵＶＡ誘起によるＭＭＰ１の抑制に優れた相乗的活性を示し、それにより老化防止／皺防止の効果を発揮することは、当業者に予想できることではなかった。ビオチンとＥＧＣＧの相乗的組み合わせは、実際に太陽／ＵＶ光に曝される数日から数週間前に与えられた場合にも、光老化を防止する。それは、強い太陽光への曝露、すなわち日光浴の直前、日光浴の間および／またはその後に摂取した場合でも、保護する。
【００１５】
ビオチンがＥＧＣＧと組み合わせて使用される場合、本発明によれば、（−）−エピガロカテキンガレート自体を使用することが好ましい。本発明のさらに好ましい実施形態において使用されるＥＧＣＧは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９２％、特に好ましくは少なくとも９４％の純度を有する。また、例であり、かつ好ましくもある、米国特許第６，３８３，３９２号明細書、欧州特許第１１０３５５０号明細書、米国特許出願第１０／２４６１１２号明細書および欧州特許第１０７７２１１号明細書に記載のいずれかの方法で得られるような、その全量を基準にして少なくとも８０％（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９２％、特に好ましくは少なくとも９４％）の量のＥＧＣＧを含有する水性緑茶抽出物が、特に好ましい。ガロカテキンガレート、カテキンガレート、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、ガロカテキンおよびエピカテキンなどの他のポリフェノールおよびカテキンは、緑茶抽出物の全重量を基準にして重量％以下であることが好ましい。ガロカテキンガレートの量が２．５重量％以下で、かつ／またはエピカテキンガレートの量が５重量％以下（好ましくは３重量％以下）であるとより好ましい。
【００１６】
本発明によれば、それぞれ緑茶抽出物の全重量を基準にして、緑茶抽出物中のカフェインの量が２．５重量％以下、好ましくは０．１重量％以下で、かつ／または没食子酸の量が０．１重量％以下であることが有利である。
【００１７】
ビオチンがＥＧＣＧと組み合わせて使用される場合、ビオチンとＥＧＣＧとの比が１：１〜１：５０００の範囲、好ましくは１：３〜１：３０００の範囲、特に好ましくは１：５〜１：１０００の範囲にあることが、本発明において有利である。
【００１８】
活性成分が経口用途用に意図される場合、本発明によれば、その１日当たりの有効量（「１日投与量」）が下記に示す範囲となるように活性成分を投与することが有利である。したがって、１日投与量を全て１度に（１回の投与で）投与しても、あるいは複数回の投与で与えてもかまわない。
【００１９】
ビオチン：体重約７０ｋｇのヒトの１日投与量は、４０ｍｇ、好ましくは２５ｍｇを超えないようにすべきであり、体重約７０ｋｇのヒトの１日量は、０．０３〜４０ｍｇとすることが有利であり、０．０６〜２５ｍｇとすることがより好ましい。
【００２０】
ＥＧＣＧ：体重約７０ｋｇのヒトの１日投与量：５０〜６００ｍｇ、体重約７０ｋｇのヒトの好ましい１日投与量：１５０〜３００ｍｇ。
【００２１】
組成物を経口投与用に錠剤、カプセル、顆粒または粉末の形態で調製する場合、担体としてラクトース、サッカロース、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、デンプン、デキストリンおよび／またはマルトデキストリン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムおよび／またはリン酸水素カルシウム、カオリン、結晶性および／または微結晶性セルロース、並びに／あるいはケイ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース溶液、デンプンおよび／または加水分解デンプン溶液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルデンプン、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、リン酸カルシウムおよび／またはポリビニルピロリドンなどのバインダー；乾燥デンプン、クロスカルメロース、クロスポビドン、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプンおよび／またはラクトースなどの分解剤；ステアリン酸、カカオバターおよび／または水素化オイルなどの分解防止剤；４級アンモニウム塩基および／またはラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収剤；グリセロールおよび／またはデンプンなどの保湿剤；デンプン、ラクトース、カオリン、ベントナイトおよび／またはコロイダルシリカなどの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末および／またはポリエチレングリコールなどの潤滑剤；サッカロース、オレンジの皮、クエン酸および／またはコハク酸などを使用することができる。
【００２２】
組成物を錠剤の形態で調製する場合、これらは通常のコーティング材で被包した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチンコーティング錠、腸溶性コーティング錠、フィルムコーティング錠、二重コーティング錠、多層コーティング錠などとして提供することができる。カプセルは、本発明の化合物を上で例示した各種担体またはこの分野の最先端の技術によるものと混合し、その混合物を硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填することによって調製される。
【００２３】
本発明の組成物には、例えば、バランスのとれた良好な栄養を維持するため、あるいは、ある食物では欠乏する必須栄養素を十分な量で得るために、マルチビタミンおよびミネラルの補給剤を加えることができる。マルチビタミンおよびミネラルの補給剤は、病気の予防や、生活パターンおよび糖尿病で往々にしてよく見られる不適切な食生活から来る栄養の損失および欠乏を防ぐためにも有用である。
【００２４】
本発明の組成物は、食物または飲料物の組成物とすることができる。飲料物としては、例えば、スポーツドリンク、エネルギードリンクもしくは他のソフトドリンク、または他の任意の適切な飲料調製品が挙げられる。
【００２５】
スポーツドリンクは、スポーツ選手の水分補給と同時に、電解質、糖および他の栄養素を補給する飲料である。スポーツドリンクは、通常、アイソトニック、すなわち、ヒトの体と同じ割合の栄養素を含有している。
【００２６】
エネルギードリンクは、（合法の）興奮剤、ビタミン（特にビタミンＢ）および／またはミネラルを含有し、飲んだ人に爆発的な活力を与えることを意図した飲料である。よく使用される成分としては、カフェイン、ガラナ（ガラナ植物から得られるカフェイン）および／またはタウリン、各種形態の朝鮮人参、マルトデキストリン、イノシトール、カルニチン、クレアチン、グルクロノラクトン、コエンザイムＱ１０および／またはイチョウ葉エキスが挙げられる。糖、またはグルコースを高濃度で含有するものがあり、一方では糖アルコールおよび／またはシクラミン酸Ｃａまたはアスパルテームなどの人工甘味料で全体的にまたは部分的に甘味を付けたものもある。そのような飲料の多くは、風味および／または色が付けられている。
【００２７】
ソフトドリンクはアルコールを含まない飲料である。一般に、この用語は冷たい飲料にのみ使用される。ホットチョコレート、茶およびコーヒーは、ソフトドリンクとはみなさない。この用語は、本来、炭酸飲料のみを指すものであり、今でも広くそのように使用されている。
【００２８】
組成物が次の食品の１つの形態で調製される場合、組成物中のビオチン量および、必要であれば、ＥＧＣＧ量は次表に示す範囲から選択されると、本発明によれば有利である。
【００２９】
【表１】
2010526784.tif 000002
【００３０】
組成物が錠剤またはカプセルの形態で調製される場合、組成物中のビオチン量および、必要であれば、ＥＧＣＧ量は次表に示す範囲から選択されると、本発明によれば有利である。
【００３１】
【表２】
2010526784.tif 000003
【００３２】
［実施例１］
［ＵＶ−Ａ誘起によるマトリックスメタロプロテアーゼ−１発現の抑制に対するＥＧＣＧおよびビオチンの相乗的効果］
抗生物質／抗真菌剤、２ｍＭＬ−グルタミンおよび７．５％牛胎児血清を加えた、グルタミンを含まないＥＭＥＭ（アール最少必須培地）を用い、３７℃／５％ＣＯ２で、一次ヒト皮膚線維芽細胞を培養し、１００％密集度にまで増殖させた。照射４８時間前に細胞に所望の化合物を加え、ＥＭＥＭ（ＡＢ／ＡＭ、Ｌ−グルタミンおよび２％ＦＣＳ含有）中で予備インキュベートを行った。２４時間後、培地を物質（新たに調製）を含む新鮮な培地に交換した。照射のために培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で６回洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に交換した。その後、プレートを３０Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ１に曝露した。ＵＶＡ１の出力は約１５０ｍＷ／ｃｍ２とした。照射後、細胞マイクロプレート中のリン酸緩衝生理食塩水を物質（新たに調製）を含む培養培地（＋７．５％ＦＣＳ）に交換し、細胞をＣＯ２インキュベータ中でさらに２４時間インキュベートした（ＭＭＰ−１測定）。培養培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗い、プレート全体を液体窒素中で凍結させた。ＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔｓ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）；ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用して全ＲＮＡを分離した。ＲＮＡ濃度を２６０／２８０での光計測により測定した。全ＲＮＡ（７５ｎｇ）のアリコットを、ＲＴ−ＰＣＲ用ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ合成システムを使用してｃＤＮＡ合成に供した。各化合物について２つのサンプルを分析した。ＰＣＲ反応を、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ドイツ）を使用し、Ｏｐｔｉｃｏｎ  １（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）、マサチューセッツ州（ＭＡ）、米国（ＵＳＡ））により行った。リアルタイムＰＣＲのコントロール細胞と処理細胞の相対的発現の比較には、２（−ｄｅｌｔａ  ｄｅｌｔａ  Ｃ（Ｔ））法を使用した。
【００３３】
結果を表１に要約する。非照射細胞（示さず）で検出されたレベルに較べて、ＵＶ−Ａ処理によってＭＭＰ−１  ＲＮＡはおよそ１０倍増加した。ＥＧＣＧおよびビオチンは、この発現をそれぞれ１３％および６６％減少させた。一方、物質を組み合わせると、ＵＶ−Ａ誘起によるＭＭＰ−１発現は完全に抑制された。このことは、観察された抑制と予測された抑制（各化合物単独の値の合計）との間に正の値（すなわち２１％）の開きがあったことから、ＥＧＣＧおよびビオチンがＭＭＰ−１の調節に対して相乗効果を発揮することを意味している。
【００３４】
【表３】
2010526784.tif 000004
【００３５】
［実施例２］
［長期の老化防止用錠剤］
［組成］
【００３６】
【表４】
2010526784.tif 000005
【００３７】
［調製］
ビオチン、ＴｅａｖｉｇｏＴＭＴＧ、凝集ラクトース、微結晶セルロース、二酸化ケイ素およびクロスポビドンを適当な容器に入れ、タンブラーミキサーにより２０分間混合した。ステアリン酸マグネシウムを１ｍｍの篩を通して加え、この組成物を再び２分間混合した。
【００３８】
この粉末を、Ｋｏｒｓｃｈ  ＸＰ１タブレットプレス（パンチサイズ１７×７．８７ｍｍの楕円形）により錠剤に圧縮した。
【００３９】
春、すなわち日光曝露が増大する少なくとも２ヶ月前から、１日１錠を摂取し、シーズンを通して維持する。
【００４０】
［実施例３］
［老化防止促進用インスタントドリンク］
［組成］
【００４１】
【表５】
2010526784.tif 000006
【００４２】
［調製］
全ての成分を５００μｍの篩で篩う。粉末を適当な容器に入れタンブラーブレンダーで少なくとも２０分間混合する。３５ｇの粉末を使用し、水を加えて１リットルの飲料とする。
【００４３】
１回分の即席ドリンク２４０ｍ当たり５０ｍｇのＥＧＣＧおよび０．５ｍｇのビオチンを、インスタントドリンクは含んでいる。
【００４４】
大量のまたは日光浴の途中およびその後で、１日３回までの摂取が推奨される。
【００４５】
［実施例４］
［基本の老化防止を持続させるためのミント］
［組成］
【００４６】
【表６】
2010526784.tif 000007
【００４７】
［調製］
ＴｅａｖｉｇｏＴＭＴＧ、ビオチン、アスコルビン酸微細顆粒、ソルビトール、芳香剤、甘味料およびＰＥＧ６０００をドラムに仕込み、タンブラーミキサーで１０分間混合する。ソルビトールおよび二酸化ケイ素を１ｍｍの篩に通して別のドラムに入れ、１０分間混合する。２つの粉末混合物を合わせ、再び１０分間混合する。ステアリン酸マグネシウムを１ｍｍの篩を通して加え、この組成物を再び２分間混合した。
【００４８】
この粉末を、Ｋｏｒｓｃｈ  ＸＰ１タブレットプレス（パンチサイズ８ｍｍの円形）により錠剤に圧縮した。
【００４９】
１日に５個までのミントが推奨される。
【００５０】
ＴＥＡＶＩＧＯＴＭＴＧ：ＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓの商品；
ＴａｂｌｅｔｔｏｓｅＴＭ８０：Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｎ．Ｖ．の商品；
ＡｅｒｏｓｉｌＴＭ２００：Ｄｅｇｕｓｓａの商品；
ＰｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅＴＭＸＬ１０：ＩＳＰの商品。
【国際調査報告】
2010526784.tif 000008
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2010526784.tif 000010