(57)【要約】  本発明は患者におけるデング熱の４種の血清型に対する防御を誘導するための方法であって、（ａ）デング熱第一血清型ワクチンウイルスを含む一価ワクチンの投与、および（ｂ）デング熱の４種の血清型ワクチンウイルスを含む四価ワクチンの投与を含み、投与（ｂ）が最初の投与（ａ）の少なくとも３０日後から最長１２ヶ月後に行われる、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デング熱ウイルスに対する免疫付与のための一価ワクチンおよび四価ワクチンの製造のためのデング熱ワクチンウイルスの使用であって、
（ａ）デング熱の第一血清型に対するワクチンウイルスを含む一価ワクチンの第一投与、
（ｂ）デング熱の４種の血清型に対するワクチンウイルスを含む四価ワクチンの第二投与を含み、該四価ワクチンは、一価ワクチンの投与の少なくとも３０日後、最長で１２ヶ月後に投与される、デング熱ワクチンウイルスの使用。
【請求項２】
第一投与（ａ）で用いられる該ワクチンウイルスがデング熱血清型１または２に対するワクチンウイルスからなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
第一投与（ａ）で用いられる該ワクチンウイルスがＶＤＶ１およびＶＤＶ２株からなる群より選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
四価ワクチンに用いられるワクチンウイルスがＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３および４である、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
血清型１、２、３および４のデング熱ワクチンウイルスの量が１０３から１０６ＣＣＩＤ５０の範囲内である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
一価ワクチンがＶＤＶ１またはＶＤＶ２を１０４ＣＣＩＤ５０含み、四価ワクチンがＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３および４を１０５ＣＣＩＤ５０含む、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
一価ワクチンがＶＤＶ１またはＶＤＶ２を１０４ＣＣＩＤ５０含み、かつ四価ワクチンがＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３を１０５ＣＣＩＤ５０およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を１０３ＣＣＩＤ５０含む、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
第二投与（ｂ）が第一投与（ａ）の３０日後から６０日後までに行われる、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
少なくとも、
（ａ）デング熱の第一血清型のワクチンウイルスを含む一価ワクチンが入った第一容器、
（ｂ）デング熱の４種の血清型に対するワクチンウイルスを含む四価ワクチンが入った第二容器、
を含む箱を含む、デング熱ウイルスに対する免疫付与キット。
【請求項１０】
少なくとも、
（ａ）ＶＤＶ１またはＶＤＶ２ワクチンウイルスを含む一価ワクチンが入った第一容器、
（ｂ）４種のＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３および４を含む四価ワクチンが入った第二容器
を含む、請求項９に記載の免疫付与キット。
【請求項１１】
一価ワクチンがＶＤＶ１またはＶＤＶ２を１０４ＣＣＩＤ５０含み、かつ四価ワクチンがＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３および４を１０５ＣＣＩＤ５０含む、請求項１０に記載の免疫付与キット。
【請求項１２】
一価ワクチンがＶＤＶ１またはＶＤＶ２を１０４ＣＣＩＤ５０含み、かつ四価ワクチンがＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３を１０５ＣＣＩＤ５０およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を１０３ＣＣＩＤ５０含む、請求項１０に記載の免疫付与キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は患者におけるデング熱の４種の血清型に対する防御を誘導するための方法であって、
（ａ）デング熱第一血清型ワクチンウイルスを含む一価ワクチンの第一投与、
（ｂ）デング熱の４種の血清型ワクチンウイルスを含む四価ワクチンの第二投与、
を含み、
第二投与（ｂ）が第一投与（ａ）の少なくとも３０日後から最長１２ヶ月後の間に行われる、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デング熱疾患は、フラビウイルス属の４種のウイルスによって引き起こされ、この血清型は似ているけれども抗原性の観点から区別できる（Ｇｕｂｌｅｒら，１９８８：節足動物媒介性ウイルス疾患の疫学．Ｍｏｎａｔｈ  ＴＰＭ編、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（ＦＬ）：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：２２３−６０；Ｋａｕｔｎｅｒら，１９９７，Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１３１：５１６−５２４；Ｒｉｇａｕ−Ｐｅｒｅｚら，１９９８，Ｌａｎｃｅｔ；３５２：９７１−９７７；Ｖａｕｇｈｎら，１９９７，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．；１７６：３２２−３０）。デング熱血清型に感染すると、非特異性ウイルス症候群から致死的となる重篤な出血性疾患の範囲にまで及ぶ臨床疾患が引き起こされ得る。蚊に刺された後のデング熱の潜伏期間は、およそ４日（３日から１４日の範囲）である。デング熱は二相性発熱、頭痛、身体中の痛み、衰弱、発疹、およびリンパ節腫大（Ｋａｕｔｎｅｒら，１９９７，Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１３１：５１６−５２４；Ｒｉｇａｕ−Ｐｅｒｅｚら，１９９８，Ｌａｎｃｅｔ；３５２：９７１−９７７）によって特徴付けられる。ウイルス血症期は発熱期と同じである（Ｖａｕｇｈｎら，１９９７，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．；１７６：３２２−３０）。デング熱は７ないし１０日間で回復するが、通常遷延性の無力症が生じる。白血球数および血小板数の減少がよく生じる。
【０００３】
出血性デング熱は、重篤な内出血と合併して血液量減少や低血圧症（ショック症候群を伴うデング熱）に至る恐れがある恒常性異常および血管透過性の増加によって特徴付けられる重篤な熱性疾患である。出血性デング熱の致死率は、治療が行なわれないと１０％までにのぼるが、治療経験のあるほとんどのセンターでは、１％以下である（ＷＨＯ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，１９８６．デング出血熱：診断，治療および制御，ｐ１−２．世界保健機関，ジュネーブ，スイス）。
【０００４】
通常行なわれるデング熱の検査室診断はウイルスの単離および／またはデング熱ウイルスに特異的な抗体の検出に基づくものである。
【０００５】
デング熱はマラリアに次いで二番目に重要な熱帯伝染病であり、世界人口の半分以上が流行性伝播の危険性がある地域に住んでいる。毎年、デング熱の件数は５千万から１億と見積もられ、出血性デング熱で５０万人の患者が入院し、２万５千人が命を落としている。デング熱はアジア、太平洋領域、アフリカ、ラテンアメリカ、およびカリブ海における風土病である。１００以上の熱帯国はデング熱ウイルス感染が多く発生し、出血性デング熱はこれらの国のうち６０カ国で報告されている（Ｇｕｂｌｅｒ，２００２，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１０：１００−１０３；Ｍｏｎａｔｈ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．；９１：２３９５−２４００）。よく記載される因子のいくつかはデング熱に関連しているように思われる：人口増加；特に貧困を伴う、無計画で無制御の都市化；飛行機旅行の増加；蚊の効果的な制御手段の欠如ならびに衛生社会基盤および公衆衛生の悪化（Ｇｕｂｌｅｒ，２００２，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１０：１００−１０３）。旅行者および国外居住者はデング熱について警告されることが多くなっている（Ｓｈｉｒｔｃｌｉｆｆｅら，１９９８，Ｊ．Ｒｏｙ．Ｃｏｌｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｏｎｄ．；３２：２３５−２３７）。デング熱が風土病である熱帯に配置された米軍の間で、デング熱は熱性疾患の主要因の一つである（ＤｅＦｒａｉｔｅｓら，１９９４，ＭＭＷＲ  １９９４；４３：８４５−８４８）
【０００６】
ウイルスは、ヒトと、ヒトを好んで日中刺咬する屋内に生息する蚊のネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）との間を循環して維持される。ヒトへの感染は、感染したネッタイシマカが血液を摂取している間に、ウイルスが注入されることによって起こる。唾液中のウイルスは主に血管外組織に沈着している。接種後に最初に感染する細胞型は樹状細胞であり、その後リンパ節に移動する（Ｗｕら，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．；７：８１６−８２０）。皮膚およびリンパ節での最初の複製の後、急性の発熱期間中に、一般的に３から５日間、ウイルスは血中に現れる。
【０００７】
単球およびマクロファージは、樹状細胞とともに、デング熱ウイルスの最初の標的である。ホモタイプの再感染に対する防御は完全であり、おそらく生涯維持されるが、多種のデング熱型での交差防御は数週間から数ヶ月しか続かない（Ｓａｂｉｎ，１９５２，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．；１：３０−５０）。したがって、患者は異なる血清型に感染する可能性がある。デング熱による二度目の感染は、理論上、重篤なデング熱疾患を発症する危険要因である。しかしながら、出血性デング熱は多因性である：これらの因子は関係するウイルス株や患者の年齢、免疫状態、遺伝的素因を含む。２つの因子が出血性デング熱の発症に大きな影響を与える：高ウイルス血症を伴う急速なウイルス複製（ウイルス血症レベルに関係する疾病の重症度；Ｖａｕｇｈｎら，２０００，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．；１８１：２−９）および炎症メディエータの高レベル放出を伴う多大な炎症反応（ＲｏｔｈｍａｎおよびＥｎｎｉｓ，１９９９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２５７：１−６）。デング熱に対する具体的な治療はない。デング熱の治療は、ベッドでの拘束、解熱剤と鎮痛剤による熱と痛みの制御、および適切な水分摂取といった対症的なものである。出血性デング熱の治療には水分の喪失に対する均衡、凝固因子の交換およびヘパリン注入が必要である。
【０００８】
予防対策としては、現在のところベクターを制御することおよび高価で実施が困難である個人的防御策を講じることに基づいている。デング熱に対するワクチンは現時点で承認されていない。デング熱の４種の血清型が世界中で流行することを考慮し、そして、それらが出血性デング熱のケースに関与していると報告されているのであるから、免疫付与によりデング熱ウイルスの４種の血清型を防御することが理想とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
四価ワクチンを接種した場合、１種だけまたは多くとも３種の血清型に対する応答が優勢に誘導されることがある。したがって、異種血清型間で起こる干渉を軽減し得る方法およびデング熱の４種の血清型に対する中和抗体を誘導し得る方法が必要である。
【００１０】
本発明者らは、４種の血清型に対する応答を誘導するためのワクチン製剤が、１種だけの血清型の弱毒化生ワクチンによる予備免疫付与後に投与された（ここで、第二ワクチン投与は第一投与の３０日後から１２ヶ月後の間に投与される）４種の血清型を中和化する抗体を含む免疫応答を引き起こすことができることを見出した。
【００１１】
本発明者らは、特に、接種されたすべてのサルにおいて、一価ＤＥＮ−２免疫付与後に四価のＤＥＮ−１、２、３、４を接種することにより４種の血清型に対する免疫応答が誘導されたことを示した。それに対して、４価のワクチンを接種しただけでは、追加免疫した後であっても、４種の血清型のうち２種の血清型に対してしか満足な応答が誘導されなかった。
【００１２】
したがって、本発明に係る方法によって生じた免疫応答は量的および質的（すべての血清型を網羅する）な面で優れている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって第一の対象によれば、本発明は、患者におけるデング熱の４種の血清型に対する中和抗体応答の誘導を可能にする方法であって、
（ａ）デング熱第一血清型ワクチンウイルスを含む一価ワクチンの第一投与、
（ｂ）デング熱の４種の血清型ワクチンウイルスを含む四価ワクチンの第二投与、
を含み、かつ
第二投与（ｂ）が第一投与（ａ）の少なくとも３０日後、最長で１２ヶ月後に行われることを含む方法に関する。
【００１４】
本発明に係る免疫付与方法の特定の実施態様によれば、第一投与（ａ）に用いられる該ワクチンウイルスは、デング熱血清型１または２ワクチンウイルスからなる群より選択される。
【００１５】
本発明に係る免疫付与方法の他の特定の実施態様によれば、第一投与（ａ）に用いられる該ワクチンウイルスは、ＶＤＶ１およびＶＤＶ２株からなる群より選択される。
【００１６】
本発明に係る方法の他の特定の実施態様によれば、四価ワクチンに用いられる該ワクチンウイルスは、ＣｈｉｍｅｒｉｖａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３および４からなる群より選択される。
【００１７】
本発明に係る方法の他の特定の実施態様によれば、デング熱血清型１、２、３および４のワクチンウイルスの量は１０３から１０６ＣＣＩＤ５０の範囲内である。
【００１８】
本発明に係る方法の他の特定の実施態様によれば、一価ワクチンはＶＤＶ１またはＶＤＶ２を１０４ＣＣＩＤ５０含み、四価ワクチンはＣｈｉｍｅｒｉｖａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３を１０５ＣＣＩＤ５０およびＣｈｉｍｅｒｉｖａｘＴＭＤＥＮ−４を１０３ＣＣＩＤ５０含む。
【００１９】
本発明に係る方法の他の実施態様によれば、第二投与（ｂ）は第一投与（ａ）の後３０から６０日までに行われる。
【００２０】
本発明の他の対象は、デング熱ウイルスに対する免疫付与キットであって、少なくとも（ａ）デング熱第一血清型ワクチンウイルスを含む一価の組成物またはワクチンが入った第一容器、（ｂ）デング熱の４種の血清型ワクチンウイルスを含む四価組成物またはワクチンが入った第二容器、を収納している箱を含む。
【００２１】
一つの実施態様によれば、本発明に係るキットは少なくとも：
（ａ）ＶＤＶ１またはＶＤＶ２ワクチンウイルスを含む一価ワクチンが入った第一容器、
（ｂ）４つのＣｈｉｍｅｒｉｖａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３および４を含む四価ワクチンが入った第二容器を含む。
【００２２】
特定の実施態様によれば、本発明に係るキットは、ＶＤＶ１またはＶＤＶ２の１０４ＣＣＩＤ５０を含む一価ワクチンおよびＣｈｉｍｅｒｉｖａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３の１０５ＣＣＩＤ５０とＣｈｉｍｅｒｉｖａｘＴＭＤＥＮ−４の１０３ＣＣＩＤ５０を含む四価ワクチンを含む。
【００２３】
したがって、本発明は、デング熱ウイルスに対する免疫付与のための、一価ワクチンおよび四価ワクチンの製造のためのデング熱ワクチンウイルスの使用に関し、ここで、一価ワクチンはデング熱第一血清型ワクチンウイルスを含み、四価ワクチンはデング熱の４種の血清型ワクチンウイルスを含み、該四価ワクチンは一価ワクチンの投与の少なくとも３０日後、最長１２ヶ月後に投与される。
【００２４】
以下の説明において本発明をより詳細に説明する。
【００２５】
定義
「デング熱ウイルス」または「ＤＥＮ」は、フラビウイルス科フラビウイルス属に属するプラス一本鎖ＲＮＡウイルスである。ゲノムＲＮＡは５’末端にＩ型キャップを含み、３’末端にポリ−Ａテールを欠く。ゲノム構成は以下の要素を含む：５’非コード領域（ＮＣＲ）、構造タンパク質（カプシド（Ｃ）、前膜／膜（ｐｒＭ／Ｍ）、エンベロープ（Ｅ））および非構造タンパク質（ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５）、および３’ＮＣＲ。ウイルスゲノムＲＮＡはカプシドタンパク質と結合してヌクレオカプシドを形成する。他のフラビウイルスの場合と同様に、ＤＥＮウイルスゲノムは、単一のポリタンパク質に翻訳される連続したコード領域をコードしている。
【００２６】
本発明において、「デング熱ワクチンウイルス」とは、中和抗体を含む特定の免疫応答を誘導することができるデング熱ウイルスのいずれかのウイルス形態を意味し、好ましくはデング熱ウイルスによる感染に対する、ヒトにおける免疫付与プログラムに関連して使用され得るデング熱ウイルスのすべてのウイルス形態を意味する。したがって、デング熱ワクチンウイルスとは、不活性化ウイルス、弱毒化ウイルス、またはデング熱ウイルスの外膜タンパク質などの組み換えタンパク質を意味する。
【００２７】
ワクチンウイルスは、許容細胞においてもはや複製されなければ、「不活性化」されたものとみなす。
【００２８】
ワクチンウイルスは、Ｈｕｈ−７、ベロ（ＶＥＲＯ）および／またはＣ６／３６肝細胞上で３７℃または３９℃で成長させた後、同じ力価計測方法を用いて計測したとき、該ワクチンウイルスが、同じ培養条件下で野生型親株を用いて得られる最大力価の少なくとも１０分の１の最大力価となった場合、「弱毒化」されたものと考えられる。したがって、本発明では、上記に示された３つの細胞のうち少なくとも１つの細胞において成長が抑制されたことを示すワクチンウイルスは「弱毒化」されたものとみなす。
【００２９】
ヒトに用いられ得るワクチンウイルスは正の効果対リスク比を有し、該比は一般的に製造承認を得るための法定要件を満たすことができる。本発明に用いられるデング熱ワクチンウイルスは好ましくはヒトに病気を誘発しないような弱毒化ウイルスである。ワクチンウイルスは、有利には、接種したヒトの大半においてせいぜい中程度（すなわち、中から弱、またはゼロ）の副作用しか引き起こさないと同時に、中和抗体反応を誘導する能力を保持している。
【００３０】
本発明に使用され得るデング熱ワクチンウイルスの限定されない例として、たとえば、弱毒化株ＶＤＶ−１またはＶＤＶ−２、ＷＯ０２／６６６２１、ＷＯ００５７９０４、ＷＯ００５７９０８、ＷＯ００５７９０９、ＷＯ００５７９１０、ＷＯ０２／０９５００７５およびＷＯ０２／１０２８２８の出願に記載された株、またはキメラなど不活性化ワクチンウイルス、弱毒化ワクチンウイルスを言及してもよい。キメラウイルスは上記に定義された弱毒化ウイルスの特徴を有しているという特殊性がある。デング熱ウイルスエンベロープタンパク質を発現し、エンベロープタンパク質が由来する血清型を中和化する抗体を含む免疫応答を誘導するキメラウイルスを本発明に使用することができる。限定されない例として、たとえば特許出願ＷＯ９８／３７９１１に記載されるデング熱ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭ、および、たとえば特許出願ＷＯ９６４０９３３およびＷＯ０１６０８４７に記載されるデング／デングキメラを言及してもよい。デング熱血清型１ワクチンウイルスは、たとえば、ＶＤＶ１ワクチン株またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１であり、特に、ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−１ウイルス、あるいはＤＥＮ−１  １６００７／ＰＤＫ１３株である。デング熱血清型２ワクチンウイルスは、たとえば、ＶＤＶ２ワクチン株またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２であり、特に、ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−２ウイルス、あるいはＤＥＮ−２  １６６８１／ＰＤＫ５３株である。デング熱血清型３ワクチンウイルスは、たとえば、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３であり、特に、ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−３ウイルスである。デング熱血清型４ワクチンウイルスは、たとえば、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４であり、特に、ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−４ウイルスである。記載された株およびそれらを得るための方法の詳細な説明に関して、本発明に言及することができる。
【００３１】
「ＶＤＶ」または「ベロデング熱ワクチン」は、ベロ細胞に適応し、すなわち、ベロ細胞上で有意なレベルで再現性をもって複製することができ）、霊長類および特にヒトにおいて中和抗体を誘導することを含めて、特異的体液性応答を誘導することができる弱毒化生デング熱ウイルス株を意味する。
【００３２】
「ＶＤＶ−１」は、ＰＤＫ細胞上で１１回継代された、野生型株ＤＥＮ−１  １６００７から得られる株（ＤＥＮ−１  １６００７／ＰＤＫ１１）であり、その後ベロ細胞で３２℃にて増幅され、そのＲＮＡを精製して、ベロ細胞にトランスフェクトした。ＶＤＶ−１株は、ワクチン株ＤＥＮ−１  １６００７／ＰＤＫ１３（ＰＤＫ−初代犬腎−細胞での１３継代）と比較して、１４個の付加的変異を有する。「ＬＡＶ１」とも呼ばれるＤＥＮ−１  １６００７／ＰＤＫ１３株は、マヒドール大学の特許出願ＥＰ１１５９９６８号に記載されており、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に番号Ｉ−２４８０のもと寄託された。ＶＤＶ−１株の完全な配列は配列番号１に記載されている。該株は該配列から容易に再現することができる。ＶＤＶ−１株の調製方法および特徴づけは、Ｓａｎｏｆｉ−ＰａｓｔｅｕｒおよびＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎのＷＯ２００６／１３４４３３号に記載されている。
【００３３】
「ＶＤＶ−２」は、ＰＤＫ細胞上で５０回継代された、野生型株ＤＥＮ−２  １６６８１から得られる株（ＤＥＮ−２  １６６８１／ＰＤＫ５０）から得られ、プラーク精製され、そのＲＮＡが抽出され、精製された後、該株をベロ細胞にトランスフェクトした。その後ＶＤＶ−２株は、プラーク精製およびベロ細胞における増幅によって得られた。ＶＤＶ−２株はワクチン株ＤＥＮ−２  １６６８１／ＰＤＫ５３（ＰＤＫ細胞での５３回継代）と比較して１０個の付加的変異があり、そのうち４つの変異はサイレントである。「ＬＡＶ２」とも呼ばれるＤＥＮ−２  １６６８１／ＰＤＫ５３株は、マヒドール大学の特許出願ＥＰ１１５９９６８に記載されており、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  （ＣＮＣＭ）に番号Ｉ−２４８１のもと寄託された。ＶＤＶ−２株の完全な配列は配列番号２に示される。ＶＤＶ−２株は該配列から容易に再現され得る。ＶＤＶ−２の調製方法および特徴づけはＳａｎｏｆｉ−ＰａｓｔｅｕｒおよびＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎの国際特許出願ＷＯ２００６／１３４４３３に記載されている。
【００３４】
ＶＤＶ１および２株は、ベロ細胞における増幅によって調製される。生成されたウイルスを採取し、濾過によって細胞の残骸を精製した。ＤＮＡは酵素処理によって消化される。不純物は限外濾過によって除去される。濃縮方法を用いて感染力価を向上させることができる。安定剤の追加後、使用するまで凍結乾燥または凍結状態で株を保存し、その後必要なときに即座に復元させる。
【００３５】
「ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭデング熱」または「ＣＹＤ」という用語は、前膜（ｐｒｅｍｅｍｂｒａｎｅ）およびエンベロープタンパク質をコードしている配列がＤＥＮウイルスのそれと置換している黄熱（ＹＦ）ウイルスの骨格を含むキメラ黄熱（ＹＦ）ウイルスを意味する。したがって、デング熱血清型１株（ＤＥＮ−１）のｐｒＭおよびＥ配列を含むキメラＹＦウイルスを「ＣＹＤ−１またはＣＹＤ  ＤＥＮ１」と呼ぶ。ＤＥＮ−２株のｐｒＭおよびＥ配列を含むキメラＹＦを「ＣＹＤ−２またはＣＹＤ  ＤＥＮ２」とする。ＤＥＮ−３株のｐｒＭおよびＥ配列を含むキメラＹＦを「ＣＹＤ−３またはＣＹＤ  ＤＥＮ３」とする。ＤＥＮ−４株のｐｒＭおよびＥ配列を含むキメラＹＦを「ＣＹＤ−４またはＣＹＤ  ＤＥＮ４」とする。これらＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭデング熱の調製は、国際特許出願ＷＯ９８／３７９１１およびＷＯ０３／１０１３９７に詳述されており、調製方法の明確な記載として挙げることができる。実施例に記載されたキメラは、ＤＥＮ１  ＰＵＯ３５９（ＴＹＰ１１４０）、ＤＥＮ２  ＰＵ０２１８、ＤＥＮ３  ＰａＨ８８１／８８およびＤＥＮ４  １２８８（ＴＶＰ９８０）株に由来のｐｒＭおよびＥ配列を用いて生成された。本発明において、デング熱ウイルスのいずれの株をキメラ構築のために用いてもよい。
【００３６】
好ましくは、キメラＹＦウイルスは、弱毒化黄熱株ＹＦ１７Ｄ（Ｔｈｅｉｌｅｒ  Ｍ，およびＳｍｉｔｈ  ＨＨ（１９３７）Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  ６５，ｐ７６７−７８６．）の骨格を含む（ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−１，ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−２，ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−３，ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−４ウイルス）。使用することができるＹＦ１７Ｄ株の例は、ＹＦ１７Ｄ２０４（ＹＦ−Ｖａｘ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｓｗｉｆｗａｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ；Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｍａｒｃｙ  ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ；ＡＲＩＬＶＡＸＴＭ，Ｃｈｉｒｏｎ，Ｓｐｅｋｅ，Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ，ＵＫ；ＦＬＡＶＩＭＵＮ（登録商標），Ｂｅｒｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；ＹＦ１７Ｄ−２０４  Ｆｒａｎｃｅ（Ｘ１５０６７，Ｘ１５０６２）；ＹＦ１７Ｄ−２０４，２３４  ＵＳ（Ｒｉｃｅら．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：７２６−７３３），または他の関連株ＹＦ１７ＤＤ（Ｇｅｎｂａｎｋ  受入番号Ｕ１７０６６），ＹＦ１７Ｄ−２１３（Ｇｅｎｂａｎｋ  受入番号Ｕ１７０６７）およびＧａｌｌｅｒらによって記載されたＹＦ１７ＤＤ株（１９９８，  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １６（９／１０）：１０２４−１０２８）を含む。ヒトに用いるために弱毒化された他の黄熱ウイルス株を、キメラ構築のために、本発明において用いることができる。
【００３７】
特定の実施態様によれば、多様な投与経路に使用される各血清型に関して、ワクチンウイルスはワクチン中１０３から１０５ＣＣＩＤ５０までの量で存在する。
【００３８】
特定の実施態様によれば、ワクチンウイルスＶＤＶ１またはＶＤＶ２は１０４ＣＣＩＤ５０程度で一価ワクチンとして存在する。
【００３９】
特定の実施態様によれば、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３は１０５ＣＣＩＤ５０で四価ワクチン中に存在し、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４は１０３ＣＣＩＤ５０で四価ワクチン中に存在する。
【００４０】
各一価のＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭデング熱ワクチンウイルス（血清型１、２、３および４）はベロ細胞において各血清型を増幅することによって調製された。さらに具体的には、４つのウイルスは、無血清培地中にて接着ベロ細胞において別々に生成される。濾過によって細胞残屑を除去し精製したウイルス採取物は、その後宿主細胞からＤＮＡを取り出すために、限外濾過およびクロマトグラフィによって濃縮、精製される。ワクチン株は、安定剤の添加後、使用するまで凍結または凍結乾燥された状態で保存され、その後必要に応じて復元される。同じ方法が４つのキメラに適用される。
【００４１】
医薬上許容される賦形剤に加えて、単一のデング熱ウイルス血清型のワクチンウイルスを含有する場合、用量、組成物またはワクチンは「一価」である。デング熱の４種の血清型のワクチンウイルスを含有する場合、用量、組成物またはワクチンは「四価」である。多価組成物は一価組成物を単に混合することによって得られる。
【００４２】
「患者」という語は、デング熱に感染することがある個人（子どもまたは大人）を意味し、特に、感染の恐れのある個人たとえばデング熱が存在する地域に旅行した個人またはそれらの地域に在住する個人を意味する。したがってこの用語は、デング熱ウイルスに対してナイーブである個人またはナイーブでない個人を含有する。
【００４３】
最初の一価免疫付与に続く四価免疫付与
【００４４】
第一の態様において、本発明はデング熱ウイルスに対する免疫付与方法に関する。
【００４５】
本発明者らは、特に、一価ワクチンの第一投与の３０日後から１２ヶ月後までに４種の血清型を投与することによって、４種の血清型に対して効果的な防御が得られることを実際に示した。したがって、本発明による方法はデング熱に対する免疫付与対策に関する特に興味深いものである。
【００４６】
本発明によれば、第一免疫付与はデング熱の４種の血清型のうちいずれかのワクチンウイルスを含む一価の組成物またはワクチンを用いて行われ、第二投与は４種すべてのワクチン血清型を用いて行われる。特定の実施態様によれば、第一投与にはデング熱血清型１または２ワクチンウイルス、好ましくは、血清型２が用いられる。好ましくは、第一投与で使われるデング熱ワクチンウイルスは弱毒化デング熱ウイルスであり、キメラウイルスで構成されていない。特定の実施態様によれば、ＶＤＶ１またはＶＤＶ２株、好ましくは、ＶＤＶ２株が、第一投与のワクチンウイルスとして使用される。
【００４７】
第二投与には、弱毒生ワクチンウイルスが用いられ、好ましくはデング熱ウイルスの４種の血清型に関する抗原を発現するキメラウイルス、特に、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３および４が用いられる。
【００４８】
特定の実施態様によれば、本発明は以下の系を対象とする：
（ａ）ＶＤＶ１  （ｂ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１、２、３および４
（ａ）ＶＤＶ２  （ｂ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１、２、３および４。
【００４９】
本発明によれば、「ワクチン組成物」とは、デング熱ワクチンウイルスの「免疫効果のある量」、つまり、たとえば、下記実施例１に記載されているように血清中和試験によって明らかにされ得る中和抗体を含む特定の免疫応答を誘導するデング熱ワクチンウイルスの十分量を含む組成物を意味する。そのようにして測定された中和抗体力価が１：１０（単位：１／希釈）以上である場合、血清は、中和抗体の存在について陽性であるとみなされる。
【００５０】
ワクチン株の量は、ウイルスプラーク形成単位（ＰＦＵ）または５０％組織培養感染用量または５０％細胞培養感染用量（ＣＣＩＤ５０）という用語で一般的に表される。たとえば、本発明に係る組成物は、一価または四価組成物としてデング熱血清型１、２、３および４ワクチンウイルスを１０から１０６ＣＣＩＤ５０、特に１０３から１０５ＣＣＩＤ５０含むことができる。したがって、本発明の組成物または使用において、デング熱血清型１、２、３および４ワクチンウイルス用量は、１０、１０２、１０３、１０４、１０５または１０６ＣＣＩＤ５０など、１０から１０６ＣＣＩＤ５０の範囲内が好ましく、特に１０３から１０５ＣＣＩＤ５０が好ましい。ワクチンウイルスは、使用されるワクチンウイルスの性質および得られる免疫応答の強度に応じて調節され得る、同一または別の用量で使用され得る。
【００５１】
本発明に係る方法の特定の実施態様によれば、一価および四価組成物またはワクチンにおける弱毒生ワクチンウイルスの量は１０３から１０５ＣＣＩＤ５０である。特定の実施態様によれば、一価ワクチンはＶＤＶ１またはＶＤＶ２、好ましくはＶＤＶ２を１０４ＣＣＩＤ５０含む。特定の実施態様によれば、四価ワクチンは、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３および４を１０５ＣＣＩＤ５０含む。一つの有利な実施態様によれば、四価ワクチンは、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１、２および３を１０５ＣＣＩＤ５０およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を１０３ＣＣＩＤ５０含む。
【００５２】
本発明によれば、第二投与（ｂ）は投与（ａ）の３０日後、最長でも１２ヶ月後に行われる。有利な実施態様によれば、第二投与は第一投与（ａ）の３０日後から６０日後までに行われる。
【００５３】
中和抗体応答は有利に持続的である、すなわち、第二投与の少なくとも６ヶ月後まで血清中で検出され得る。
【００５４】
ワクチンウイルスは、当業者に知られている如何なる方法によっても調製され得る組成物またはワクチンの形態で投与される。習慣的に、ウイルスは、凍結乾燥された形態が一般的であり、水もしくはリン酸緩衝生理食塩水などの医薬上許容され得る賦形剤、湿潤剤または安定剤を用いて混合される。「医薬上許容され得る賦形剤」とは、ヒトまたは動物において如何なる二次反応も、たとえばアレルギー反応も起こさない、溶媒、分散媒質、充填剤などのいずれかを意味する。賦形剤は、選択される医薬形態、投与経路および経路に基づいて選択される。適当な賦形剤、および医薬処方に関する必要条件もまた、当該分野における参考資料を代表する、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”に記載される。
【００５５】
好ましくは、ワクチン組成物は注入可能な形態で調製され、液剤、懸濁剤または乳剤の形態をとってもよい。組成物は、特に、ｐＨをおよそ６と９との間（周囲温度でｐＨメーターを用いて決定される）に維持するような方法で緩衝された水溶液を含んでもよい。
【００５６】
アジュバンドを加える必要はないけれども、組成物はこのような化合物、すなわち同時に投与されたワクチンウイルスによって誘発される細胞性または体液性免疫応答を増大、刺激または強化する物質を含んでもよい。当業者は、ワクチンの分野で通常使われるアジュバンドの中から本発明に適したアジュバンドを選択することができるであろう。
【００５７】
本発明に係る組成物またはワクチンは、免疫付与において通常使用される如何なる方法によっても投与されてもよく、例えば、非経口で（特に、皮内投与で、皮下に、または筋肉注射で）、好ましくは皮下に投与される。好ましくは、組成物またはワクチンは皮下に、有利には、左三角筋部または右三角筋部に投与される注射用組成物である。
【００５８】
投与されるワクチン組成物の量は投与経路に依る。皮下注射の場合、その量は概して０．１と１．０ｍｌとの間であり、好ましくはおよそ０．５ｍｌである。
【００５９】
血清型１から４すべてを投与する最適期は、デング熱ウイルスへの暴露のおよそ１から３ヶ月前である。免疫付与は、大人と子どもにおけるデング熱ウイルスによる感染に対する予防的治療として投与されてもよい。したがって、標的母集団はデング熱ウイルスに対してナイーブな（すなわち、これまでに免疫付与していない）人またはナイーブでない人を含む。
【００６０】
デング熱血清型１から４ワクチンウイルスの追加免疫投与は、また、本発明に係る第二投与（ｂ）の、例えば６ヶ月後と１０年後との間に、さらに例えば、６ヶ月後、１年後、３年後、５年後または１０年後にされてもよい。追加免疫投与は、有利には、同じ組成物またはワクチン（すなわち、同じワクチンウイルス）を用いて、そして好ましくは、第二投与（ｂ）と同じ投与条件下（解剖学的部位および投与経路）で行われる。
【００６１】
干渉現象は、他の血清型に関して１つまたはそれ以上の血清型の優性によって説明することができ、したがって、候補ワクチン（ＶＤＶまたはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭ）の調製に利用される技術から独立している。したがって、本発明による方法は、一般的にすべてのデング熱ワクチンウイルスに適用することができる。
【００６２】
したがって、本発明はまた、デング熱ウイルスに対する免疫付与のための一価ワクチンおよび四価ワクチンの製造のためのデング熱ワクチンウイルスの使用を含むよう糸されており、該一価ワクチンはデング熱第一血清型ワクチンウイルスを含み、四価ワクチンは、デング熱の４種の血清型に対するワクチンウイルスを含み、四価ワクチンは一価ワクチンの投与の少なくとも３０日後、１２ヶ月後までに投与される。
【００６３】
本発明に係る使用に関するワクチンおよび使用条件の記載に関しては、本発明に係る免疫付与方法に関する上記記載に言及することができる。
【００６４】
他の態様によれば、本発明はデング熱ウイルスの４種の血清型に対する免疫付与キットを対象とする。本発明によるキットは、提案された免疫付与方法に関する上記定義された組成物またはワクチンを含む。したがって、本発明による該キットは、組成物またはワクチンおよび有利には、該組成物またはワクチンの投与に関する有効な情報を含む説明書が入った各種容器が含まれている箱を含む。
【００６５】
したがって、一つの実施態様によれば、本発明はデング熱ウイルスに対する免疫付与のためのキットに関し、少なくとも（ａ）デング熱第一血清型ワクチンウイルスを含む一価ワクチンが入った第一容器および（ｂ）デング熱の４種の血清型に対するワクチンウイルスを含む四価ワクチンが入った第二容器を含む箱を含む。
【００６６】
本発明に係るキットに使用され得るワクチン、組成物またはデング熱ワクチンウイルスの記載に関しては、本発明による免疫付与方法に関する上記記載に言及することができる。
【００６７】
特定の実施態様によれば、本発明によるキットは少なくとも：
（ａ）ＶＤＶ１またはＶＤＶ２ワクチンウイルスを含む一価ワクチンが入った第一容器、および
（ｂ）４種のＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３および４を含む四価ワクチンが入った第二容器
を含む。
【００６８】
特定の実施態様によれば、本発明によるキットは、少なくとも、ＶＤＶ１またはＶＤＶ２を１０４ＣＣＩＤ５０含む一価ワクチンおよびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１、２、３を１０５ＣＣＩＤ５０を含み、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を１０３ＣＣＩＤ５０含む四価ワクチンを含む。
【００６９】
本発明によるキットは、上述したように、たとえば一つの容器または複数の容器を含んでもよい。
【００７０】
使用されるワクチンが凍結乾燥された形態である場合、キットは、有利には、注入可能なワクチン用量を復元するために用いることができる希釈剤が入った、少なくとも一つの追加容器を含む。如何なる医薬上許容される希釈剤も本発明の目的のために用いることができ、通常、水またはリン酸塩緩衝水溶液を用いることができる。
【００７１】
本発明を以下の実施例を用いて説明する。
【実施例１】
【００７２】
実施例１：サルにおいて、一価組成物に続き四価組成物を逐次投与することによるデング熱ウイルスの４種の血清型に対する免疫付与
ウイルス血症および免疫原性についてサルをモデルに試験した。特にウイルス血症は、ヒトの疾病の毒性および重症度に関連する一つの要因として認定され、したがって考慮されるべき重要なパラメーターを構成する。免疫原性に関しては、付与された防御を評価する上で主要なパラメーターである。
【００７３】
１．１  材料および方法
サルにおける実験は、動物実験に関する欧州指針にしたがって行われた。免疫付与はモーリタニア由来のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）で実施された。サルを免疫付与前６週間隔離した。
【００７４】
サルの腕の皮下にワクチン組成物０．５ｍｌを接種して、免疫を付与した。ケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ，Ｍｅｒｉａｌ）で浅麻酔させた後、鼠径部または伏在静脈から穿刺して血液を採取した。免疫付与後０日目と２８日目に抗体応答反応を評価するために血液５ｍｌを採取し、一方２日目から１０日目の間、ウイルス血症を評価するために血液１ｍｌを採取した。血液を氷上に集め、血清が分離するまで氷上で保管した。実施するために、血液を４℃で２０分間遠心分離し、回収した血清を試験まで−８０℃で保管した。
【００７５】
ウイルス血症の測定
免疫付与後のウイルス血症を定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によりモニターした。ＤＥＮ１およびＤＥＮ２株のＮＳ５遺伝子に位置するプライマーおよびプローブの２組のセットをＶＤＶ−１  ＲＮＡおよびＶＤＶ−２  ＲＮＡの定量にそれぞれ用いた。ＹＦウイルスのＮＳ５遺伝子に位置する２つのプライマーおよび１つのプローブの３組目のセットをＣＹＤ  ＲＮＡを定量するために用いた。最後に、ＹＦ  ＮＳ５  ＲＮＡ陽性サンプルにおける血清型を同定するために、Ｅ（ＤＥＮ）／ＮＳ１（ＹＦ）遺伝子の接合点に位置する各種ＣＹＤ血清型に特異的なプライマーおよびプローブの４組のセットを使用した（表１参照）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイの内部基準として含まれる一連の合成ＲＮＡを産生するために、各ＰＣＲによって標的とされた領域を含む７つのプラスミドを、Ｔ７プロモーターの制御下でインビトロにおいて転写した。これらの合成ＲＮＡを分光分析により測定し、得られたＲＮＡ量をＲＮＡコピー数に変換し、ＧＥＱ（ゲノム等量）として表した。
【００７６】
Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌからの“Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ９６ｖｉｒｕｓＴＭ”ＲＮＡ抽出キットを用いて、使用説明書にしたがってサル血清０．１４０ｍｌを抽出し、その後精製されたＲＮＡを、リボヌクレアーゼを含まない水０．１４０ｍｌ（０．０９０ｍｌ、次いで０．０５ｍｌ）で溶出させた。冷凍と解凍の繰り返しを避けるために、抽出後即座に、ＲＮＡ調合液５μｌで最初の定量をおこなった。残りは７０℃で冷凍した。
【００７７】
反応混合物は、“Ｑｉａｇｅｎ  ＱａｕｎｔｉｔｅｃｔＴＭｐｒｏｂｅｓ”ＲＴ−ＰＣＲ定量キット（Ｑｉａｇｅｎ）の成分に加えて、各プライマー１０ピコモル、各プローブ４ピコモルおよびＲＮＡ５μｌを含んで、合計２５μｌとした。試験されるＲＮＡの場合、精製された調合液５μｌを、予め希釈することなく反応混合物に直接入れた。リボヌクレアーゼを含まない水で合成ＲＮＡを１／１０に希釈し、５μｌ中およそ１０から１０６ＧＥＱを含む７つの希釈液を、検量線を書くために平行して定量した。
【００７８】
Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍからのＡＢＩＰｒｉｓｍ  ７００ＴＭ装置を用いて、以下のプログラムにて定量化反応を行なった：５０℃／３０分、９５℃／１５分、次いで９５℃／１５秒−６０℃／６０秒を４０サイクル。
【００７９】
試験におけるウイルス性ＲＮＡの定量限界はＰＣＲ対象（標準偏差：＋／−０．３ｌｏｇ１０）によって２．９から３．３ｌｏｇ１０ＧＥＱ／ｍｌ（８００から２０００ＧＥＱ／ｍｌ；４から１０ＧＥＱ／反応）である。
【００８０】
感染力価とウイルス性ＲＮＡ定量化との相関関係は、免疫付与（ＣＹＤまたはＶＤＶ）に使用される既知量のウイルスの感染粒子が添加された陰性サル血清試料（ＤＯ）０．１４０ｍｌを分析することにより、アッセイと平行して確立した。該対照血清を、５μｌ中およそ１ＰＦＵと１００ＰＦＵ（それぞれ２．３および４．３ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌ）を含む２つの希釈率にて調製した。
【００８１】
実施例で用いる試験において、ＧＥＱとＰＦＵとの相関関係は以下のとおりである：ＹＦまたはＣＹＤに対して陽性の血清についてＧＥＱ／ＰＦＵ比２．７ｌｏｇ１０（すなわち、１ＰＦＵ＝５００ＧＥＱ）。ＶＤＶ１またはＶＤＶ２に対して陽性の血清についてＧＥＱ／ＰＦＵ比２．５ｌｏｇ１０（すなわち、１ＰＦＵ＝３２０ＧＥＱ）。
【００８２】
定量限界は，ｑＲＴ−ＰＣＲ  ＹＦおよびＣＹＤに対して＜３．３ｌｏｇ１０ＧＥＱ／ｍｌ（すなわち、＜４ＰＦＵ／ｍｌ）ならびにｑＲＴ−ＰＣＲ  ＶＤＶ１およびＶＤＶ２に対して＜２．９ｌｏｇ１０ＧＥＱ／ｍｌ（すなわち、＜２．５ＰＦＵ／ｍｌ）。
【００８３】
使用されるプライマーおよびプローブを表１に示す。表中、各アッセイにつき、センスおよびアンチセンスプライマーならびにプローブが順に挙げられている。
【００８４】
【表１】
2010511022.tif 000002
中和抗体測定（血清中和反応試験）（ＳＮ５０）
【００８５】
慣用的に、デング熱抗体測定はＰＲＮＴ５０（５０％ＰＦＵ数減少中和試験）を用いて確立される。この試験は多くの時間と労力を費やし、多くの材料を使用することから、我々はＣＣＩＤ５０試験により測定されたユニットの数値の５０％減少に基づいてＳＮ５０試験を開発した。
【００８６】
９６ウェルプレートにおいて、補体除去された血清０．１２０ｍｌを各ウェルの希釈液（ＩＳＣＯＶＥ  ４％  ＦＣＳ）０．４８０ｍｌに加える。血清０．１５０ｍｌを希釈液０．４５０ｍｌに入れることで６倍連続希釈液を調製する。２５ＣＣＩＤ５０／ウェルを得るために各ウェルに２．７ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／ｍｌでのウイルス希釈液４５０μｌを加える。プレートは３７℃にて１時間インキュベートする。次いで各希釈液０．１ｍｌを、実験開始３日前に４％ＦＣＳを含むＩＳＣＯＶＥ０．１ｍｌ中８０００細胞／ウェルの密度でベロ細胞が播種されている９６ウェルプレート中の６ウェルに分配する。６日間、３７℃でインキュベートした後、５％ＣＯ２存在中、エタノール／アセトン（７０／３０）混合液を用いて４℃で、１５分間細胞を固定し、次いでＰＢＳで３回洗浄して、抗フラビウイルスモノクローナル抗体（ＡＴＣＣ  Ｈ−Ｂ１１２ハイブリドーマから得られたｍＡｂ４Ｇ２）の１／２０００希釈液０．０５ｍｌの存在下で３７℃にて１時間インキュベートする。その後、プレートを２回洗浄し、アルカリホスファターゼが接合された抗マウスＩｇＧの１／１０００希釈液０．０５ｍｌの存在下で３７℃にて１時間インキュベートする。着色された基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）０．０５ｍｌを加えることで溶菌プラークを視覚化する。中和抗体力価を以下に示されるカルバーの公式（Ｋａｒｂｅｒ  ｆｏｒｍｕｌａ）を用いて算出する：
ｌｏｇ１０ＳＮ５０＝ｄ＋ｆ／Ｎ（Ｘ＋Ｎ／２）
式中、
ｄは１００％中和（すなわち６つの陰性複製物、すなわち感染の徴候を示さない複製物）を生じさせる希釈率であり、
ｆはｌｏｇ１０で示される希釈係数であり（たとえば、１：４の希釈係数なら、ｆ＝０．６）、
Ｎは複製物／希釈率の数であり（Ｎ＝６）、
Ｘは感染の徴候を示さないウェルの合計数、ただし希釈率ｄを除く、
ウイルス検出限界は１０ＳＮ５０（すなわち１．０ｌｏｇ１０ＳＮ５０）である。
【００８７】
中和に用いられたウイルス株はＤＥＮ１  １６００７、ＤＥＮ２  １６６８１、ＤＥＮ３  １６５６２またはＤＥＮ４  １０３６株であった。
【００８８】
対照について、最初のウイルス希釈を再滴定した。
【００８９】
ＳＮ５０試験で測定される中和力価とＰＲＮＴ５０試験で通常測定される中和力価との相関関係は以下のとおりである：
ｌｏｇ１０ＰＲＮＴ５０＝ｌｏｇ１０ＳＮ５０＋０．２
【００９０】
１．２  同時免疫付与の評価
年齢および体重の等しい１群４匹のサル、計２群に免疫付与した（表２参照）。
【００９１】
免疫付与は、四価ワクチンに関してＣＹＤ  ＤＥＮ１から４血清型をそれぞれ１０５ＣＣＩＤ５０および一価ＶＤＶ−２を１０４ＣＣＩＤ５０の量で、針２３Ｇ１を用いて腕の皮下に注射した。
【００９２】
表２：群の組成と免疫付与プロトコル
【表２】
2010511022.tif 000003
【００９３】
１回の免疫付与後（Ｄ０＋２８）と２回の免疫付与後（Ｄ５６＋２８）に得られた免疫原性の結果を表３に示す。
【００９４】
ウイルス血症の結果を表４に示す。
【００９５】
【表３】
2010511022.tif 000004
【００９６】
【表４】
2010511022.tif 000005
【００９７】
簡単に、結果を以下のようにまとめることができる：
−本発明に係る投与経路により、四価ワクチンによる同一の２回の免疫付与を含む系によって得られた中和抗体応答において質的かつ量的に増加が得られる。
−最初に一価ＶＤＶ２免疫付与後に行われる１回のＣＹＤ−１、２、３、４免疫付与は、四価ワクチンを２回免疫付与することを含む系とは違って、すべてのサルで４種の血清型に対して高いレベルの応答を誘導する。
−予想通り、ＶＤＶ２を用いて行われる最初の免疫付与は、ほとんど血清型２のみに向けられる応答を引き起こすが、数匹において、血清型１および４に対して交差反応が低レベルで起こった。
−ウイルス血症は最初の免疫付与後にＶＤＶ２で観察され、第二投与（ｂ）後ＣＹＤ−４によって優勢的に引き起こされる（群１）。ナイーブな動物において四価ワクチンを用いて第一投与した後誘導されるウイルス血症において目立った違いは観察されなかった（群２）。したがって、本発明によって提案された系は、第二投与後血清型１、３および４のウイルス血症の発症を促進しないと結論づけることができる。
【００９８】
したがって、実施例は、本発明に係る免疫付与方法が、デング熱ワクチンウイルスの安全性に悪影響を及ぼすことなく、デング熱ワクチンウイルスの免疫原性を改良することを示す。
【００９９】
本出願に引用されるすべての刊行物は参照することにより全体として組み込まれる。
【配列表】
2010511022000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月23日(2009.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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