(57)【要約】本発明は、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）活性化または阻害を通じて、Ｃ型肝炎といったフラビウィルス科のウィルスの複製を調整するための使用、方法および組成物に関する。より詳細には、本発明は治療を必要とする対象において、フラビウィルス感染の治療を目的とした薬剤を製造するための、ＦＸＲのアンタゴニストおよびその発現の阻害剤の使用に関する。本発明には、ググルステロンといったＦＸＲのアンタゴニストの使用や、ＦＸＲ発現の阻害剤の使用が含まれる。本発明はまた、ＨＣＶの複製を可能とする細胞培養系および、ＨＣＶ感染の診断、抗ウィルス化合物のスクリーニングおよびワクチンまたはウィルスタンパク質産生に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする対象におけるフラビウィルス科のメンバーによる感染の治療を目的とした薬剤を製造するためのファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）のアンタゴニストの使用。
【請求項２】
治療を必要とする対象における、急性又は慢性Ｃ型肝炎といったＨＣＶ感染の治療やＨＣＶ感染に関連する疾患の治療、あるいは肝線維症、肝硬変や肝細胞癌といった肝臓疾患の予防を目的とする薬剤を製造するためのＦＸＲのアンタゴニストの使用。
【請求項３】
前記アンタゴニストが４，１７（２０）−トランス−プレグナジエン−３，１６−ジオン又は４，１７（２０）−シス−プレグナジエン−３，１６−ジオンである請求項１又は２の使用。
【請求項４】
治療を必要とする対象におけるフラビウィルス科のメンバーによる感染の治療を目的とした薬剤を製造するためのＦＸＲ発現の阻害剤の使用。
【請求項５】
治療を必要とする対象における、急性又は慢性Ｃ型肝炎といったＨＣＶ感染の治療やＨＣＶ感染に関連する疾患の治療、あるいは肝線維症、肝硬変や肝細胞癌といった肝臓疾患の予防を目的とする薬剤を製造するためのＦＸＲ発現の阻害剤の使用。
【請求項６】
前記ＦＸＲ発現の阻害剤がｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである請求項４又は５の使用。
【請求項７】
インターフェロンαを用いた治療を受けた対象を治療するための請求項１〜６何れか１項の使用。
【請求項８】
ヌクレオシド類似体を用いた治療を受けた対象治療するための請求項１〜７何れか１項の使用。
【請求項９】
ＨＣＶプロテアーゼおよび／またはポリメラーゼの阻害剤を用いた治療を受けた対象を治療するための請求項１〜８何れか１項の使用。
【請求項１０】
フラビウィルス科のメンバーによる感染を治療するための、ＨＣＶ感染を治療するための、またはＨＣＶに関連した疾患を治療するための、ＦＸＲのアンタゴニストまたはＦＸＲ発現の阻害剤と、インターフェロンαを含む薬剤、ヌクレオシド類似体を含む薬剤およびＨＣＶプロテアーゼおよび／またはポリメラーゼの阻害剤からなる群から選ばれた少なくとも１つの薬剤と、を含むキット。
【請求項１１】
ＦＸＲ発現細胞用の培養培地、ＦＸＲ発現細胞および少なくとも１つのＦＸＲのアゴニストを含む、ＨＣＶの複製を可能とする細胞培養系。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのＦＸＲのアゴニストが、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、デヒドロコール酸、ウルソデオキシコール酸、コール酸、ファルネソールまたは（Ｅ）−［（テトラヒドロテトラメチルナフタレニル）プロペニル］安息香酸である請求項１１の細胞培養系。
【請求項１３】
前記ＦＸＲ発現細胞が、ヒト肝癌細胞系Ｈｕｈ７、Ｈｕｈ７−ＬｕｎｅｔまたはＨｅｐＧ２の細胞単層から選択される、請求項１１〜１２何れか１項の細胞培養系。
【請求項１４】
前記ＦＸＲ発現細胞が、ＦＸＲをコードする遺伝子を形質移入された細胞である、請求項１１〜１３何れか１項の細胞培養系。
【請求項１５】
ＨＣＶウィルスをさらに含む、請求項１１〜１４何れか１項の細胞培養系。
【請求項１６】
前記ＦＸＲ発現細胞が、複製ＨＣＶウィルス材料を形質移入された細胞である、請求項１１〜１５何れか１項の細胞培養系。
【請求項１７】
ＨＣＶ感染の診断、抗ウィルス化合物のスクリーニング、ＨＣＶウィルス粒子またはＨＣＶウィルスタンパク質の産生、または抗ＨＣＶワクチンの産生のための、請求項１１〜１６何れか１項の細胞培養系の使用。
【請求項１８】
対象においてＨＣＶ感染の診断をするためのインビトロの方法であって、
前記方法が、
ａ）ＦＸＲ発現細胞の培養物を提供するステップと、
ｂ）ＦＸＲ発現細胞の前記培養物を、対象から得た生体試料と共にインキュベートするステップと、
ｃ）ＦＸＲ発現細胞の前記培養物を、ステップ（ｂ）の前、後または同時に、少なくとも１種のＦＸＲのアゴニストと共にインキュベートするステップと、
ｄ）前記細胞を、ＨＣＶの複製が可能となるために十分な時間培養するステップと、
ｅ）ＨＣＶの複製のレベルを検出するステップ
からなるステップを含み、ＨＣＶの複製の検出が、前記対象がＨＣＶに感染していることを示唆する。
【請求項１９】
前記生体試料が、血液、血清、血漿または生体検査の際に単離された試料である請求項１８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）活性化または阻害を通じて、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）といったフラビウィルス科に属するウィルスの複製を調節するための使用、方法および組成物に関する。より詳細には、この発明は、治療を必要とする対象における、ＨＣＶといったフラビウィルス科のメンバーによる感染の治療を目的とした薬剤を製造するための、ＦＸＲのアンタゴニストまたは感染の発症の阻害剤の使用に関する。この発明は、また、ＨＣＶの複製を可能とする細胞培養系、並びにその細胞培養系の、ＨＣＶ感染を診断するための使用、抗ウィルス化合物または中和抗体をスクリーニングするための使用およびワクチンまたはウィルスタンパク産生のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは、フラビウィルス科、ヘパチウィルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）属に属する一本鎖のプラスＲＮＡウィルスである。
【０００３】
ＨＣＶの遺伝子は、非コード領域（ＮＣＲ）が両末端に位置する、約３０１０のアミノ酸残基のポリタンパク質をコードする一本のプラス鎖ＲＮＡを含む。５’−ＮＣＲは、ポリタンパク質をコードする領域の第１の部分と折り重なってヘアピンループや不対領域からなる複雑な構造となり、内部リボソーム侵入部位として機能することができる。これは、このウィルス遺伝子の翻訳が、多くの５’−末端ＡＵＧというよりも、ポリタンパク質の初めのＡＵＧコドンに向けられた翻訳の開始に対してキャップ非依存的であることを意味している。ＲＮＡの第２の構造は、３’−非翻訳領域としても記述されるものであり、この構造がウィルス遺伝子の複製においてある役割を果たしていると考えられているが、これに対して現在のところ直接的な確証はない。このポリタンパク質のＮ−末端は、３つの構造のタンパク質（コア、Ｅ１およびＥ２）から成り、このポリタンパク質からこれらのタンパク質を放出することは、細胞の小胞体と関連するシグナルペプチダーゼに依存している。このポリタンパク質の残りの部分から６つの非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ）を放出することは、ウィルスＮＳ２−ＮＳ３およびＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼの介在による。
【０００４】
世界中で１７０万人の患者、先進国における人口の約１％がＣ型肝炎ウィルスに感染していると見積もられている（Ｇｌｏｂａｌ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，１９９９）。急性ＨＣＶ感染症の多く（７０から８０％）は慢性化し、その一部は肝硬変や肝細胞癌へと進行する。
【０００５】
ＨＣＶに感染した患者の約９５％は、感染の急性期の間に黄疸を発症することはないが、症状として吐き気、食欲不振および／または倦怠感が生じることがある。ウィルスＲＮＡはまず、暴露後１〜２月に検出され、通常、肝臓障害マーカーであるアラニンアミノトランスフェラーゼの血液中レベルの上昇と同時にまたは続いて検出される。セロコンバージョンは暴露後約３月、ＮＳ３およびコア抗原の反応性の初期発見に伴って起こる。急性感染患者のうちの２０から５０％はウィルス感染を完治することができ、この結果には、Ｅ２タンパク質のＨＶＲおよびＮＳ３タンパク質の一部に対するＣＤ４＋応答に対する特定の抗体応答の存在が相関している。
【０００６】
Ｃ型慢性肝炎は、長年に渡って臨床的に無症状であるが、血清中のアラニンミノトランスフエラーゼレベルにおいて、断続的な上昇が大抵の場合存在するであろう。慢性的に感染した患者に基づいた組織学的な検査によれば、肝臓病変の何らかの兆候を示すことがあるが、これらの兆候は、大抵の場合とても穏やかである。典型的な病気の特徴としては、門脈領域にリンパ濾胞が、門脈周辺の炎症や胆管への損傷を伴って出現することである。極端な場合には、肝臓が硬変し、肝細胞結節間の繊維性組織の蓄積によって最終的に肝不全となってしまうことになる。肝臓の病状の程度は大抵、何年というよりも何十年という時間スケールではあるが、感染期間と共に拡大する。何故この進行の程度が患者間で異なるかは、十分に理解されていない。ウィルス遺伝子型タイプと進行との間の関係には相反する兆候が存在する、これはおそらく、ウィルス遺伝子型タイプ、感染してしまった年齢、感染の期間の間に根本的に存在する疫学的な関係によるものであるが、比較的急速な進行は免疫不全によると言える。肝臓移植者に関する複数の研究によれば、移植肝臓のより深刻な疾患が遺伝子タイプ１ｂのＨＣＶに感染した患者に起こることを示唆している。
【０００７】
肝細胞癌の進行とＨＣＶの感染との間には強い結びつきが存在すると言われているが、この進行は、ＨＣＶ感染患者のわずかな割合においてしか見られず、肝硬変の進行に続いて極めてゆっくりと進む場合もある。生体内での腫瘍形成のメカニズムは不明であるが、ＨＣＶのコアタンパク質が組織培養細胞の変換活性を制限し、複数の細胞周期遺伝子の転写を抑制する一方で、ＮＳ５Ａが転写活性化因子として振る舞い、インターフェロンによって生じる細胞タンパク質キナーゼであるＰＫＲを抑制してしまうと考えられる（Ｇａｌｅ．他、１９９７年）。
【０００８】
自己免疫疾患やリンパ増殖症候群、慢性疲労、本態性２型混合性クリオグロブリン血症、膜性増殖性糸球体腎炎や晩発性皮膚紫斑病（ｐｕｒｐｕｒａ  ｃｕｔａｎｅａ  ｔａｒｄｉａ）を含むさまざまな非肝疾患はＨＣＶ感染と関係している。これらの兆候は、ＨＣＶの肝外複製に対する証拠であるとの解釈がなされているが、慢性間疾患の結果または免疫複合体におけるＨＣＶの蓄積によって間接的に引き起こされている可能性もある。
【０００９】
最近の療法はペグインインターフェロン（ＩＦＮ）とリバビリン（１―β―Ｄ―リボフラノシル―１，２，４―トリアゾール―３―カルボキサミド）の組み合わせによる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染の転帰は患者間で異なり、抗ウィルス治療に対する持続的な反応の程度は、ウィルスおよび宿主の特徴に依存する。ＨＣＶの自然発生的な変異体は、６つの主要な遺伝子タイプに分類される。ウィルス遺伝子タイプは、治療応答に関連する主要因子のひとつである。実際に、持続性ウィルス学的著効（ＳＶＲ）は遺伝子タイプ１に感染した患者のたった４５％でしかないのに、遺伝子タイプ２または３に感染した患者のＳＶＲは８０％にまで達している（Ｆｅｌｄ  ＪＪ．他、２００５年）。その一方で宿主因子と関連する転帰は、年齢、種族、ボディーマスインデックスといった要因を含む。
【００１１】
肝臓生検材料においてウィルスＲＮＡの高レベルのものが現れ、また、アンチセンスウィルス遺伝子およびウィルス非構造タンパク質が共に肝細胞内で検出されることから、ＨＣＶの複製の主要部位は肝臓であると考えられている。しかしながら、ウィルスが体の他の部分でどの程度複製するかについては議論がある。第一に、肝臓は移植後常に再感染する。第二に、ＨＣＶは、ＨＣＶの高い変異率によって同一患者内に見られる変異体である擬似種として存在し、この変異体は異なる細胞のタイプから派生したものであると考えられる。そして最後に、低密度ＨＣＶ粒子は近年、脂質−ウィルス粒子（ｌｉｐｏ−ｖｉｒｏ−ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＬＶＰｓ））と説明されている。
【００１２】
ＬＶＰｓはトリグリセリドが豊富であり、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）およびアポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）を含むため、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬｓ）に似ている。これらＶＬＤＬ−類似粒子はＨＣＶ  ＲＮＡ、コアタンパク質（Ａｎｄｒｅ  Ｐ．他、２００２年）および外皮タンパク質Ｅ１、Ｅ２を含む。ＬＶＰｓの性質および生化学的組成は、これらの合成がａｐｏＢ含有リポタンパク質の生産に特化した臓器内で起こるであろうことを示唆している。ＨＣＶは肝臓内で複製を行い、ＶＬＤＬｓが肝臓によって合成されることから、ＬＶＰｓの生産について、肝臓は明らかに候補である。しかしながら、ＲＮＡ擬似種の比較をすると、肝臓とＬＶＰとではその数が同じでないとの証拠を与える。肝臓に加えて、ａｐｏＢリポタンパク質の唯一他の生産源として腸があり、腸はこれらの粒子の生産に重要な貢献をしている可能性がある。ＨＣＶ複製が腸で起こるという仮説に賛同できる。慢性的に感染した患者の小腸の上皮細胞にＨＣＶタンパク質が発見されているからである（Ｄｅｆｏｒｇｅｓ  Ｓ．他、２００４年）。
【００１３】
ウィルスの粒子形状であるリポタンパク質との関係とは別に、ＨＣＶの脂質代謝との相関について、多くの研究結果が示されている。Ｃ型肝炎は、肝臓脂肪症を促進するトリグリセリドの蓄積と頻繁に関係する（Ｒａｍａｌｈｏ  Ｆ、２００３年）。慢性ＨＣＶに感染した患者は、血液中の総コレステロール含量の減少を示した。この観察結果は他のウィルス肝炎では見られなかった（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓ．他、１９９６年）。細胞培養モデルや遺伝子導入マウスを用いて脂質代謝を変更するＨＣＶのコアおよびＮＳ５Ａタンパク質が示されている（Ｓｈｉ  ＳＴ．他、２００２年）。Ｓｕ他（Ｓｕ  Ａｌ．他、２００２年）は脂質代謝に関与する宿主遺伝子が、チンパンジーにおける感染の早い段階で差別的に調節されることを示している。彼らはまた、脂質の生合成経路に影響を与える薬物がＨＣＶレプリコン系におけるＨＣＶ複製を制御可能であることを示した。このことは、脂質生合成に関与するタンパク質が、形質移入されたＨｕｈ−７細胞の全長レプリコン中で上方制御される一方で脂肪酸酸化が下方制御される（Ｋａｐａｄｉａ  ＳＢ．他、２００５年）という近年のプロテオームの研究と一致する。最後に、ＨＣＶの脂質ラフトとの関係はこのウィルスの十分な複製のために非常に重要であることが実証されている（Ａｉｚａｌｉ  Ｈ．他、２００４年）。
【００１４】
このリポタンパク質の生産とは別に、脂質ホメオスタシスを行う他の合成経路であって、肝臓および腸に共通するものとしては、胆汁酸（ＢＡ）の腸肝循環がある。
【００１５】
血中胆汁酸は近年、ＳＶＲに到達しなかったことを予想する予後マーカーと説明されている（ｊｏｒｑｕｅｒａ  Ｆ．他、２００５年）。慢性Ｃ型肝炎において、ＢＡの血中濃度が高いことは、掻痒症やそれの進行症状と関係している。これら掻痒症の患者には、治療が功を奏しない場合が多い（Ｌｅｂｏｖｉｃｓ  Ｅ．他、１９９７年）。したがって、血中ＢＡの濃度が１５μＭであり、フェリチンが３００μｇ／ｍｌよりも高い場合には、治療が全く功を奏しないことが予測される（Ｊｏｒｑｕｅｒａ  Ｆ．他、２００５年）。
【００１６】
近年の研究（Ｃｈａｎｇ  ＫＯ．他、２００４年）によれば、ＢＡが豚の腸カリシウィルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｅｎｔｅｒｉｃ  ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ（ＰＥＣ））という、ＨＣＶと多くの共通点（両者ともに一本鎖のプラス鎖ＲＮＡ遺伝子を含むウィルスであり、腸細胞内に見られる）を有するウィルスの成長に必須な因子であることを報告している。
【００１７】
そこで、本発明は、ＨＣＶ感染症の治療のための新規な方法およびＨＣＶの体外複製のための新規な方法を含む、ＨＣＶの複製をインビトロするための新規な方法を提供する。本発明者らは、ＢＡがＨＣＶ  ＲＮＡ複製に関与していることを実際に立証した。サブゲノムレプリコンで一時的に形質移入されたＨｕｈ−７細胞系を用い、本発明者らは、ＢＡの生理学的かつ病理学的な濃度で細胞系を取り扱うことが、ＨＣＶの複製を大きく促進することを見出した。さらに、本発明者らは、ＦＸＲ−選択アゴニストおよびＦＸＲ−特異ｓｉＲＮＡを用いることで、Ｈｕｈ−７細胞内におけるＦＸＲ−依存性機構を経由して、遊離ＢＡがＨＣＶ  ＲＮＡの複製を促進したことを明確に立証した。最後に、ＢＡによるＨＣＶ  ＲＮＡ複製の促進が、ＦＸＲ−アンタゴニストとしてのググルステロン（ｇｕｇｇｕｌｓｔｅｒｏｎｅ）によって阻害されうることを本発明者らは示した。本発明者らは、このアンタゴニストがＩＦＮ−治療に対してよい影響をもたらすことを示した。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
したがって、本発明の第１の目的は、治療を必要とする対象におけるフラビウィルス科のメンバーによる感染の治療を目的とした薬剤を製造するための、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）のアンタゴニストの使用に関する。
【００１９】
本発明の第２の目的は、治療を必要とする対象における、急性もしくは慢性Ｃ型肝炎といったＨＣＶ感染に関連する疾患の治療、あるいは肝線維症、肝硬変や肝細胞癌といった肝臓疾患の予防を目的とする薬剤を製造するためのＦＸＲのアンタゴニストの使用に関する。
【００２０】
本発明の第３の目的は、治療を必要とする対象の、フラビウィルス科のメンバーによる感染の治療を目的としたＦＸＲの発現の阻害剤の使用に関する。
【００２１】
本発明の第４の目的は、治療を必要とする対象の急性もしくは慢性Ｃ型肝炎といったＨＣＶ感染に関連する疾患の治療、あるいは肝線維症、肝硬変や肝細胞癌といった肝臓病の予防を目的とした薬剤を製造するためのＦＸＲの発現の阻害剤の使用に関する。
【００２２】
本発明の第５の目的は、フラビウィルス科のメンバーによる感染の治療のための、ＨＣＶの治療のための、またはＨＣＶ感染に関連する疾患の治療のための、ＦＸＲのアンタゴニストまたはＦＸＲ発現の阻害剤を含む薬剤と、インターフェロンαを含む薬剤、ヌクレオシド類似体を含む薬剤およびＨＣＶプロテアーゼおよび／またはポリメラーゼを含む薬剤からなる群から選ばれた少なくとも１つの薬剤と、を含むキットに関する。
【００２３】
本発明の第６の目的は、ＦＸＲ発現細胞用の培養培地、ＦＸＲ発現細胞および少なくとも１つのＦＸＲのアゴニストを含む、ＨＣＶの複製を可能とする細胞培養系に関する。
【００２４】
本発明の第７の目的は、上記細胞培養系の、ＨＣＶ感染の診断、抗ウィルス化合物のスクリーニング、ＨＣＶウィルス粒子もしくはＨＣＶウィルスタンパク質の産生または抗ＨＣＶワクチンの産生のための使用に関する。
【００２５】
本発明の第８の目的は、対象のＨＣＶ感染の診断のためのインビトロの方法であって、該方法が、
ａ）ＦＸＲ発現細胞の培養培地を提供するステップと、
ｂ）前記ＦＸＲ発現細胞を、該対象から得られた生体試料と共にインキュベートするステップと、
ｃ）前記ＦＸＲ発現細胞を、ステップ（ｂ）の前、後または同時に、少なくとも１つのＦＸＲのアゴニストと共にインキュベートするステップと、
ｄ）前記細胞を、ＨＣＶの複製が可能となるために十分な時間培養するステップと、
ｅ）ＨＣＶ複製のレベルを検出するステップと、
からなるステップを含み、
このＨＣＶ複製の検出は、該対象がＨＣＶに感染したことを示唆する方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義：
本明細書において使用される「Ｃ型肝炎ウィルス」または「ＨＣＶ」の用語は、病原株が引き起こす、非Ａ非Ｂ肝炎としても知られるＣ型肝炎のウィルス種をいう。したがって、「ＨＣＶｓ」の用語は、Ｃ型肝炎ウィルスを意味する。
【００２７】
「ＨＣＶ粒子」の用語は、ＨＣＶ構造タンパク質を含み、電子顕微鏡で観察可能なウィルス粒子を意味する。ＨＣＶ粒子はサイズが異なり、直径が３０〜６０ナノメートルである。加えて、ＨＣＶ粒子は、ショ糖密度勾配遠心分離法による浮遊密度が、低密度（＜１．０７ｇ／ｍｌ）から高密度（１．２５ｇ／ｍｌ）にまで及ぶという特筆すべき不均一性を示す。粒子密度の不均一性は、サイズのばらつき、エンベロープを持たないヌクレオカプシド粒子、およびヌクレオカプシド粒子の抗体またはリポタンパク質との結びつきによる。
【００２８】
本明細書において使用する「ＨＣＶウィルスＲＮＡ」の用語は、ＨＣＶ  ＲＮＡを含み、ＨＣＶ遺伝子、その断片、その転写物およびこれら由来の変位配列を言う。
【００２９】
「ＨＣＶの複製」の語句は、ＨＣＶ  ＲＮＡおよび／またはウィルス粒子の合成に繋がる分子過程またはプロセスを指す。
【００３０】
ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素といった発現産物を「コードする」ある「配列コード」またはある配列は、それが発現すると、そのＲＮＡ、そのポリペプチド、そのタンパク質またはその酵素となるヌクレオチド配列であり、すなわち、ヌクレオチド配列は、アミノ酸配列をそのポリペプチド、そのタンパク質またはその酵素にコードする。あるタンパク質のためのコード配列は開始コドン（通常、ＡＴＧ）および停止コドンを含む。
【００３１】
用語「遺伝子」は、アミノ酸の特定配列のコードに関するまたは該当するＤＮＡ配列を意味し、このアミノ酸の特定配列は、１以上のタンパク質または酵素の全部または一部を含み、また、例えばどの条件下でその遺伝子が発現されるかを決定するプロモーター配列等の制御ＤＮＡ配列を含有してもよいし、または含有しなくてもよい。いくつかの遺伝子は、非構造遺伝子であり、ＤＮＡからＲＮＡに転写されうるが、アミノ酸配列にまで翻訳されることはない。他の遺伝子は、構造遺伝子の制御因子として、またはＤＮＡ転写の制御因子として機能しうる。具体的に言えば、遺伝子という用語は、タンパク質をコードする遺伝子配列、すなわち、制御因子、プロモーター、イントロンおよびエクソン配列を含む配列を対象としてもよい。
【００３２】
本明細書において使用する「オリゴヌクレオチド」の用語は、核酸のことをいい、一般に少なくとも１０個の、好ましくは少なくとも１２個の、より好ましくは少なくとも１５個の、さらに好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドであり、好ましくは１００個よりも少ないヌクレオチド、さらに好ましくは７０個よりも少ないヌクレオチドであり、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリッド形成が可能なものをいう。
【００３３】
ここで用いられているように、特定のタンパク質（例えばＦＸＲ）の参照は、未変性のアミノ酸配列と同様に、それらの素性や生成のモードに関わらず変異体や変形体を有するポリペプチドをも含むことができる。未変性のアミノ酸配列を有するタンパク質は、自然界から得られるのと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質である（例えば自然発生ＦＸＲ）。このような未変性配列のタンパク質は、自然界から単離することができ、または標準的な組み換え、および／または合成方法によって作製することができる。未変性配列のタンパク質は、特に、天然の切断型または可溶型、天然の変異型（例えば選択的スプライス型）、天然の対立遺伝子多型および転写後修飾を含む型を包含する。未変性の配列タンパク質は、グリコシル化、リン酸化反応、またはいくつかのアミノ酸残基の別の修飾といった転写後修飾によるタンパク質を含む。
【００３４】
変異体とは、類似するアミノ酸配列を有し、ある程度、未変性なタンパク質の１以上の活性体を保有する未変性の配列タンパク質と機能的に等しいタンパク質をいう。変異体は、活性対を保有する断片をも含む。変異体は、未変性な配列と実質的に同一な（例えば８０、８５、９０、９５、９７、９９％、の配列同一性を有する）タンパク質をも含む。このような変異体は、欠失、挿入および／または置換といったアミノ酸変形体を有するタンパク質を含む。「欠失」とは、関連するタンパク質における１以上のアミノ酸残基の欠落をいう。「挿入」とは、関連するタンパク質における１以上のアミノ酸の追加をいう。「置換」とは、ポリペプチドにおける１以上のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基による交換をいう。通常、このような変質は自然界では起こりにくいため、変異体タンパク質の活性化は実質的には天然の配列タンパク質に類似している（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ  （１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。置換の場合、他のアミノ酸に交換されたアミノ酸は、類似する構造および／または化学的性質を有する場合が多い。挿入および欠失は、挿入位置に依存するものの、通常、１〜５個のアミノ酸の範囲で起こり、それ以上のアミノ酸が挿入または除去できる。変形体は、部位指定変異体導入法（Ｃａｒｔｅｒ，他．（１９８６）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４３３１、Ｚｏｌｌｅｒ他（１９８７）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７）、選択制限変異体導入法（Ｗｅｌｌｓ他（１９８６）  Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ  ３１７：４１５）、およびＰＣＲ変異体導入法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ．他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（２００１））といった、当技術分野で公知の方法を用いることにより作製できる。
【００３５】
アミノ酸の８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％が一致するか、または９０％以上、好ましくは９５％以上類似する（機能的に一致する）場合、２つのアミノ酸配列は「実質的に類似する」または「実質的に似ている」。似ているまたは類似する配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）Ｐｉｌｅｕｐプログラムを使うか、またはＢＬＡＳＴ，ＦＥＳＴＡなどといった他の配列比較アルゴリズムを使うことで識別されることが好ましい。
【００３６】
用語「発現」は、遺伝子または核酸の発現という意味で使われた場合には、遺伝子に含まれる情報を遺伝子産物に変換することをいう。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたはＲＮＡの他のタイプ）またはｍＲＮＡの翻訳によって生産されたタンパク質である可能性がある。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、編集といったプロセスによって修飾されたメッセンジャーＲＮＡや、例えばメチル化、アセチル化、ホスホン化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチン化、グリコシル化によって修飾されたタンパク質（例えばＦＸＲ）をも含む。
【００３７】
「発現の阻害剤」は、遺伝子の発現を抑制する生物学的作用を有する天然または人工の化合物をいう。したがって、「ＦＸＲの発現の阻害剤」は、ＦＸＲ遺伝子の発現を阻害する生物学的作用を有する天然のまたは人工の化合物を意味する。
【００３８】
「受容体」または「受容体分子」は、受容体−リガンド複合体からリガンドが結合する１以上の領域を含む可溶性または膜結合型／結合性のタンパク質またはグリコタンパク質である。リガンドと結合することで、受容体は活性となりまたは不活性となりアゴニストまたはアンタゴニストとなりうると共に、経路シグナル伝達を開始しまたは遮断しうる。
【００３９】
用語「ＦＸＲ」は、ファルネソイドＸ受容体をいい、ファルネソールの超生理学的レベルによって活性化される核受容体である（Ｆｏｒｍａｎ．他、Ｃｅｌｌ，１９９５，８１，６８７−６９３）。ＦＸＲは、ＮＲ１Ｈ４、レチノイドＸ受容体共役タンパク質１４（ＲＩＰ１４）および胆汁酸受容体（ＢＡＲ）としても知られている。ＦＸＲは、リガンドが活性化する転写因子の核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と共に、胆汁酸ホメオスタシスに欠かせないヘテロ二量体受容体を形成する（Ｆｏｒｍａｎ．他、１９９５年）。ＦＸＲは、肝臓、腎臓、腸、結腸、卵巣や副腎を含む様々な組織で発現する（Ｆｏｒｍａｎ．他、１９９５年）。保存されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）やＣ末端のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含むことで、ＦＸＲは、一次胆汁酸であるケノデオシコール酸（ＣＤＣＡ）や、そのタウリンおよびグリシン抱合体を含む様々な自然発生胆汁酸（ＢＡ）に結合し、活性化される（Ｍａｋｉｓｈｉｍａ．他、１９９９年、Ｐａｒｋｓ他１９９９年、Ｗａｎｇ他１９９９年）。活性化に際しては、ＦＸＲ−ＲＸＲ二量体がターゲット遺伝子のプロモーター領域と結合し、胆汁酸ホメオスタシスに関与するいくつかの遺伝子の発現を制御する。肝臓のＦＸＲターゲット遺伝子は２つの主なグループに分けられる（Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＡ．他、２００２年、Ｋａｐａｄｉａ  ＳＢ．他、２００５年）。第１のグループは、外部排出を増加させ、その合成を低下させることによって肝臓の胆汁酸濃度を低下させる。リン脂質転移タンパク質ＰＬＴＰやアポリポタンパク質といったＦＸＲターゲット遺伝子の第２のグループは、血液中のリポタンパク質レベルを制御し、血漿トリグリセリド濃度を低下させる。ＢＡ濃度の変化に応答したホメオトロピック信号を運ぶことにより、ＦＸＲは肝臓の成長や再生の制御において重要な役割をも担っている（Ｈｕａｎｇ  Ｗ．他、２００６年）。ＦＸＲ−制御遺伝子のより詳細なリストについては、例えば、ＷＯ０３／０１６２８８，２２−２３頁を参照されたい。米国特許第６，００５，０８６号は哺乳類のＦＸＲタンパク質をコードした核酸配列を開示している。ＦＸＲのためのヒトポリペプチド配列は、アクセスナンバーＮＭ＿００５１２３，Ｑ９６Ｒｌ１，ＮＰ＿００５１１４，  ＡＡＭ５３５５１，ＡＡＭ５３５５０，ＡＡＫ６０２７１の、ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅｓに預けられている。
【００４０】
「リガンド」または「受容体リガンド」は、受容体分子と結合して受容体−リガンド複合体を形成する天然化合物または合成化合物を意味する。
【００４１】
「アゴニスト」または「受容体アゴニスト」は、受容体と結合して受容体−アゴニスト複合体を形成する天然化合物または合成化合物であり、上記受容体や上記受容体−アゴニスト複合体を活性させることにより、経路シグナル伝達や更なる生体内過程にそれぞれ導く。
【００４２】
「アンタゴニスト」または「受容体アンタゴニスト」は、アゴニストの持つ生物学的効果と逆の生物学的効果を有する天然化合物または合成化合物である。アンタゴニストは受容体と結合し、受容体アゴニストの作用を遮断する。アンタゴニストは、アゴニストの作用を遮断するというその能力によって定義されるものである。
【００４３】
したがって、「ＦＸＲのアゴニスト」の用語は、ＦＸＲと結合し、遺伝子プロモーターにおけるＦＸＲ応答要素の依存のもとで、遺伝子の翻訳の促進といったＦＸＲの機能を活性化させる物質を意味する。
【００４４】
したがって、「ＦＸＲのアンタゴニスト」の用語は、ＦＸＲによって引き起こされる翻訳の促進といったＦＸＲの活性を阻害する物質を意味する。より具体的には、ＦＸＲと受容体の補助活性因子との結合を阻害する物質を意味する。
【００４５】
「有機小分子」の用語は、薬学業界で一般に用いられる有機分子に比べてサイズの小さいものをいう。この用語は、生態高分子を除く（例えば、タンパク質、核酸など）。小さい有機分子の好ましいサイズ範囲は、約５０００Ｄａ以下であり、より好ましくは２０００Ｄａ以下であり、最も好ましくは約１０００Ｄａ以下である。
【００４６】
ポリペプチド（すなわち、インターフェロン）またはヌクレオチド配列に関して言えば、「精製された」または「単離された」とは、同一のタイプの他の生体高分子が実質的に無い状況で、上記の分子が存在していることを意味する。本明細書で用いられる「精製された」とは、好ましくは重量で少なくとも７５％、より好ましくは重量で少なくとも８５％、更に好ましくは重量で９５％、最も好ましくは重量で少なくとも９８％の同一のタイプの生体高分子が存在していることを意味する。ある特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子とは、このポリペプチドをコードすることのない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子をいうが、この核酸分子は、化合物の基本的な特徴に悪影響を及ぼさない複数の付加的な塩基や塩基群を含んでいてもよい。
【００４７】
本明細書において使用する「対象」の用語は、げっ歯類、ネコ科、イヌ科、霊長類といった哺乳類を意味する。本発明に関して好ましい対象は、人間である。
【００４８】
「細胞培養系」の用語は、細胞の体外培養を可能にする系をいう。
【００４９】
本明細書において使用する「治療」とは、疾患または病態を阻害すること、すなわち疾患の進行を止めること；疾患または病態を軽減すること、すなわち病態の逆行を引き起こすこと；疾患による病態すなわち疾患の兆候を軽減することをいう。
【００５０】
本明細書において使用する「予防」とは、疾患または病態であることを診断されていない対象における疾患または病態の発生を予防することをいう。
【００５１】
治療法および治療的使用
本発明は、治療を必要とする対象における、フラビウィルス科に属するウィルスによる感染を治療するための使用、方法および組成物（医薬組成物など）を提供する。
【００５２】
一実施形態において、フラビウィルス科のメンバーは、日本脳炎ウィルスおよび西ナイルウィルスを含む、日本脳炎ウィルス群などのフラビウィルス属のメンバーであってよい。あるいは、フラビウィルス科のメンバーは黄熱病ウィルス群のメンバーであってよい。あるいは、フラビウィルス科のメンバーは、ウシウィルス性下痢ウィルス（ＢＶＤＶ−１および／またはＢＶＤＶ−２）、ブタコレラウィルス、ボーダー病ウィルスなどのペスチウィルス属のメンバーであってよい。あるいは、フラビウィルス科のメンバーは、Ｇ型肝炎ウィルス（ＨＧＶ）などのヘパシウィルス属のメンバーであってよい。
【００５３】
特定の実施形態において、本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染を治療するための使用、方法および組成物を提供する。より具体的には、本発明は、急性または慢性のＣ型肝炎、または自己免疫およびリンパ球増殖の疾患、慢性疲労、本態性混合型クリオグロブリン血症（ＩＩ型）、膜性増殖性糸球体腎炎ならびに晩発性皮膚紫斑病などのＣ型肝炎ウィルス感染に関連する疾患を治療するための使用、方法および組成物を提供する。本発明は、肝線維症、肝硬変または肝細胞癌などの、肝臓疾患の予防および治療のための使用、方法および組成物もまた包含する。
【００５４】
本発明者らは、ＢＡがＦＸＲ依存性シグナル伝達経路を介したＨＣＶ  ＲＮＡの複製に関与することを実際に立証した。したがって、ＦＸＲのシグナル伝達または発現を阻害することが、Ｃ型肝炎感染の治療のための有望なツールである。さらに、本発明は、持続的ウィルス陰性化の達成のため、または現行の治療後の持続的ウィルス陰性化率の増加のために適した、新規の使用、方法および組成物を提供する。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、「持続的ウィルス陰性化」（ＳＶＲ；「持続的陰性化（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」または「耐久性陰性化（ｄｕｒａｂｌｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」とも称する）という用語は、血清ＨＣＶ力価に関するＨＣＶ感染のための治療計画に対する個人の応答を指す。一般的に、「持続的ウィルス陰性化」は、治療休止後少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月または少なくとも約６ヶ月の期間、患者の血清中に見出される、検出可能なＨＣＶ  ＲＮＡがないことを指す（例えば、約５００未満、約２００未満または約５０未満のゲノムコピー／血清ｍｌ）。
【００５６】
それ故、本発明の目的は、治療を必要とする患者におけるフラビウィルス科のメンバーによる感染の治療を目的とする薬剤の製造のための、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）のアンタゴニストの使用である。
【００５７】
本発明の別の目的は、治療を必要とする患者における、急性もしくは慢性のＣ型肝炎などのＨＣＶ感染の治療またはＨＣＶ感染に関連する疾患の治療あるいは肝線維症、肝硬変または肝細胞癌などの肝臓疾患の予防を目的とする薬剤を製造するための、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）のアンタゴニストの使用である。
【００５８】
一実施形態において、ＦＸＲのアンタゴニストは、有機小分子であってよい。国際特許出願ＷＯ０２０６４１２５、ＷＯ０２２０４６３、ＷＯ０３０１５７７１、ＷＯ０３０１６２８８、ＷＯ２００４０４６０６８、米国特許出願第２００４１７６４２６号および米国特許第６９０６０５７号により、本発明に従ったＦＸＲのアンタゴニストとして使用できる有機小分子が開示されている（これらの各文献は、参照によりそれらの全体を組込む）。
【００５９】
例えば、ＷＯ０２０６４１２５は、化合物、Ｎ−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，６ジヒドロキシフェニル）ベンズアミドを開示し、米国特許第６９０６０５７号は、化合物、（Ｚ）−５−［２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）−２−（トリメチルシリル）ビニル］チオフェン−２−カルボン酸を開示している。
【００６０】
本発明に従って使用できる有機小分子の具体例は、ググルステロンであり得る。ググルツリー（コミフォラ・ムクル（Ｃｏｍｍｉｐｈｏｒａ  ｍｕｋｕｌ））の樹脂の抽出液は、ヒトにおいてＬＤＬ（低比重リポタンパク）コレステロール濃度を低下させることが実際に示された。植物ステロールであるググルステロン、［４，１７（２０）−プレグナジエン−３，１６−ジオン］は、この抽出液中の活性薬剤であり、非常に有効なＦＸＲのアンタゴニストとして示された（Ｕｒｉｚａｒ  ＮＬ他、１９９６年；Ｗｕ  Ｊ．他、２００２年）。ググルステロンには、２種の異性体：Ｚ−およびＥ−ググルステロンが存在する。国際特許出願ＷＯ２００４０９４４５０および米国特許出願第２００５０８５４５２号は、両方の異性体の調製の方法を記載している。Ｚ異性体（４，１７（２０）−トランス−プレグナジエン−３，１６−ジオン）は、式
【化１】
2010500328.tif 000002
の構造を有する。
【００６１】
Ｅ異性体（４，１７（２０）−シス−プレグナジエン−３，１６−ジオン）は、式
【化２】
2010500328.tif 000003
の構造を有する。
【００６２】
本発明に従って使用できる有機小分子の別の具体例は、ググルステロンの類似体である３−β−ヒドロキシ−５，１６−プレグナジエン−２０−オン（８０−５７４としても既知、Ｗｕ  Ｊ．他、２００２年）であり得る。前記化合物は、式
【化３】
2010500328.tif 000004
の構造を有する。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態において、前記ＦＸＲのアンタゴニストは、４，１７（２０）−トランス−プレグナジエン−３，１６−ジオンまたは４，１７（２０）−シス−プレグナジエン−３，１６−ジオンである。
【００６４】
好ましい実施形態において、前記ＦＸＲのアンタゴニストは、ググルステロン、３−β−ヒドロキシ−５，１６−プレグナジエン−２０−オン（８０−５７４）、Ｎ−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，６ジヒドロキシフェニル）ベンズアミドおよび（Ｚ）−５−［２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）−２−（トリメチルシリル）ビニル］チオフェン−２−カルボン酸を含む群から選択される。より好ましくは、前記ＦＸＲのアンタゴニストは、ググルステロンまたは３−β−ヒドロキシ−５，１６−プレグナジエン−２０−オン（８０−５７４）である。
【００６５】
本発明の別の目的は、治療を必要とする対象における、フラビウィルス科のメンバーによる感染の治療を目的とする薬剤の製造ための、ＦＸＲ発現の阻害剤の使用である。
【００６６】
本発明の別の目的は、治療を必要とする患者における、急性または慢性のＣ型肝炎などのＨＣＶ感染の治療またはＨＣＶ感染に関連する疾患の治療あるいは肝線維症、肝硬変または肝細胞癌などの肝臓疾患の予防を目的とする薬剤の製造のための、ＦＸＲ発現の阻害剤の使用である。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態において、前記ＦＸＲ発現の阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。
【００６８】
本発明における使用のためのＦＸＲ発現の阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築体に基づいていてよい。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＸＲ  ｍＲＮＡに結合し、それ故タンパク質の翻訳を防止し、またはｍＲＮＡ分解を促進し、それ故、細胞におけるＦＸＲタンパク質のレベルひいては活性を減少させることによって、ＦＸＲｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するために作用する。例えば、少なくとも約１５塩基の、ＦＸＲをコードするｍＲＮＡ転写配列のユニーク領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、従来のリン酸ジエステル技術により合成でき、例えば、静脈注射または注入により投与できる。配列が既知遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するアンチセンス技術を使用する方法は、当分野において周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号、第６，５６６，１３１号、第６，３６５，３５４号、第６，４１０，３２３号、第６，１０７，０９１号、第６，０４６，３２１号および第５，９８１，７３２号を参照されたい）。
【００６９】
阻害性低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明における使用のためにＦＸＲ発現の阻害剤として機能できる。ＦＸＲの遺伝子発現は、腫瘍、対象または細胞と、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、またはベクターあるいはＦＸＲ発現が特異的に阻害されるような低分子二本鎖ＲＮＡの産物をもたらす構築体と接触させることによって、減少させることができる（すなわち、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）。配列が既知な遺伝子に適切な、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択する方法は、当分野において周知である（例えば、Ｔｕｓｃｈｉ，Ｔ．他（１９９９年）、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．他（２００１年）、Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ．（２００２年）、ＭｃＭａｎｕｓ，ＭＴ．他（２００２年）、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲ．他（２００２年）、米国特許第６，５７３，０９９号および第６，５０６，５５９号ならびに国際特許公開番号ＷＯ０１／３６６４６、ＷＯ９９／３２６１９およびＷＯ０１／６８８３６を参照されたい）。
【００７０】
例えば、ＦＸＲに特異的なｓｉＲＮＡ二重鎖は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）によりＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（商標）（Ｍ−００３４１４−００−０００５ヒトＮＲ１  Ｈ４）として販売されている。ＦＸＲに特異的な前記ｓｉＲＮＡ二重鎖は、以下のとおりである、
−  Ｄ−００３４１４−０１、ＮＲ１Ｈ４（ＳＥＮＳ：ＣＡＡＧＵＧＡＣＣＵＣＧＡＣＡＡＣＡＡＵＵ、配列番号９およびＡＮＴＩＳＥＮＳ：５’−ＰＵＵＧＵＵＧＵＣＧＡＧＧＵＣＡＣＵＵＧＵＵ、配列番号１０）、
−  Ｄ−００３４１４−０２、ＮＲ１Ｈ４（ＳＥＮＳ：ＧＡＡＡＧＡＡＵＵＣＧＡＡＡＵＡＧＵＧＵＵ、配列番号１１およびＡＮＴＩＳＥＮＳ：５’−ＰＣＡＣＵＡＵＵＵＣＧＡＡＵＵＣＵＵＵＣＵＵ、配列番号１２）、
−  Ｄ−００３４１４−０３、ＮＲ１Ｈ４（ＳＥＮＳ：ＣＡＡＣＡＧＡＣＵＣＵＵＣＵＡＣＡＵＵＵＵ、配列番号１３およびＡＮＴＩＳＥＮＳ：５’−ＰＡＡＵＧＵＡＧＡＡＧＡＧＵＣＵＧＵＵＧＵＵ、配列番号１４）、
−  Ｄ−００３４１４−０４、ＮＲ１Ｈ４（ＳＥＮＳ：ＧＡＡＣＣＡＵＡＣＵＣＧＣＡＡＵＡＣＡＵＵ、配列番号１５およびＡＮＴＩＳＥＮＳ：５’−ＰＵＧＵＡＵＵＧＣＧＡＧＵＡＵＧＧＵＵＣＵＵ、配列番号１６）。
【００７１】
リボザイムもまた、本発明における使用のためにＦＸＲ発現の阻害剤として機能できる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、リボザイム分子と相補的標的ＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーション、その後のエンドヌクレアーゼ的切断を含む。ＦＸＲ  ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ的切断を、特異的かつ効率的に触媒する、加工されたヘアピン型またはハンマーヘッド型モチーフのリボザイム分子は、したがって本発明の範囲内で有用である。任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、リボザイム切断部位のための標的分子をスキャンすることにより初めに特定され、それらは典型的には以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含む。特定後、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約１５から２０リボヌクレオチドの短鎖ＲＮＡ配列の、オリゴヌクレオチド配列を不適切にし得る二次構造などの予測される構造特性が評価できる。候補標的の適性もまた、例えば、リボヌクレアーゼ・プロテクション・アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対するそれらの到達性を検査することにより評価できる。
【００７２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＦＸＲ発現の阻害剤として有用なリボザイムの両方は、既知の方法により調製できる。これらは、例えば、ホスホロアミダイト固相化学合成法などによる化学合成に関する技術を含む。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列の、インビトロまたはインビボの転写により発生させることができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組込む、幅広い種類のベクターに組込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な修飾が、細胞内安定性および半減期を上昇させる手段として導入できる。考えられる修飾は、限定するものではないが、分子の５’末端および／または３’末端への、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、あるいはオリゴヌクレオチド骨格内における、ホスホジエステラーゼ結合というよりもホスホロチオエートまたは２’−Ｏ−メチルを用いた修飾を含む。
【００７３】
国際特許出願ＷＯ０３０４４１６７およびＷＯ２００４０３０７５０は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＦＸＲ発現を調節するためにそれらを使用する方法を提供している。
【００７４】
ＷＯ０３０４４１６７は、以下の配列：配列番号：１１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２５、２６、２７、２８、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７８、８０、８２、８３、８４、８５、８７または８８を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示している。
【００７５】
ＷＯ２００４０３０７５０は、以下の配列：配列番号１から配列番号２１３８を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示している。
【００７６】
本発明の好ましい実施形態において、前記ＦＸＲ発現の阻害剤は、ＷＯ０３０４４１６７において開示された配列番号：１１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２５、２６、２７、２８、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７８、８０、８２、８３、８４、８５、８７または８８、ＷＯ２００４０３０７５０において開示された配列番号１から配列番号２１３８または本明細書の上部に記載した配列番号９から配列番号１６からなる群において選択されるｓｉＲＮＡ二重鎖を含む群から選択される。
【００７７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡｓおよびリボザイムは、単独またはベクターと合併してインビボで送達できる。広い意味では「ベクター」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡまたはリボザイム核酸の、細胞、好ましくはＦＸＲ発現細胞への送達を容易化する任意の媒体である。好ましくは、ベクターは、ベクターの不在下で生じるであろう分解の程度よりも低い分解の程度で上記核酸を細胞に輸送する。一般的に、本発明において有用なベクターは、限定するものではないが、プラスミド、ファージミド、ウィルス、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡまたはリボザイム核酸配列の挿入または組込みにより操作されたウィルス源または細菌源に由来する他の媒体を含む。ウィルスベクターは、好ましい型のベクターであり、限定するものではないが、以下のウィルスに由来する核酸配列を含む：モロニーマウス白血病ウィルス、ハーベイマウス肉腫ウィルス、マウス乳腺腫瘍ウィルスおよびラウス肉腫ウィルスなどのレトロウィルス；アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス；ＳＶ４０型ウィルス；ポリオーマウィルス；エプスタイン・バー・ウィルス；パピローマウィルス；ヘルペスウィルス；ワクシニアウィルス；ポリオウィルス；およびレトロウィルスなどのＲＮＡウィルス。名前を挙げていないが、当分野で既知の他のベクターも容易に用いることができる。
【００７８】
好ましいウィルスベクターは、非必須遺伝子が、対象となる遺伝子と取換えられている非細胞変性真核性ウィルスに基づく。非細胞変性ウィルスは、レトロウィルス（例えば、レンチウィルス）を含み、そのライフサイクルは、ウィルスのゲノムＲＮＡのＤＮＡへの逆転写、その後のプロウィルスの宿主の細胞ＤＮＡへの組込みを伴う。レトロウィルスはヒト遺伝子治療試験用に承認されている。複製欠損型（すなわち、所望のタンパク質の合成を誘導できるが、感染性粒子を作り出せない）レトロウィルスが最も有用である。このような遺伝的に改変されたレトロウィルス発現ベクターは、インビボの遺伝子の高効率形質導入にとって一般的有用性を有する。複製欠損型レトロウィルス作製の標準的プロトコル（外来性遺伝物質のプラスミドへの組込み、プラスミドのパッケージング細胞系への形質移入、パッケージング細胞系による組換えレトロウィルスの作製、組織培養培地からのウィルス粒子の回収、および標的細胞のウィルス粒子による感染のステップを含む）は、ＫＲＩＥＧＬＥＲ（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，“Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃ．Ｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０年）およびＭＵＲＲＹ（“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，１９９１年）により提供される。
【００７９】
特定の用途に好ましいウィルスは、アデノウィルスおよびアデノ随伴ウィルスであり、それらは遺伝子治療においてヒトに使用することが既に承認されている二本鎖ＤＮＡである。アデノ随伴ウィルスは、複製欠損型に組換えることができ、広範囲の細胞型および種に感染できる。さらに、アデノ随伴ウィルスは、熱および脂質溶媒に対する安定性；造血細胞を含む多種多様の系統の細胞における高頻度の形質導入；および重複感染阻害がなくそれ故複数系列の形質導入が可能であるなどの利点を有する。アデノ随伴ウィルスは、部位特異的な形でヒト細胞ＤＮＡに組入れることができ、その結果レトロウィルス感染の特徴である挿入遺伝子発現の挿入変異およびばらつきの可能性を最小にすると報告されている。さらに、野生型のアデノ随伴ウィルスによる感染は、選択圧がない場合は組織培養で１００継代を超えて継続されることから、アデノ随伴ウィルスのゲノムの組入れは、比較的安定な事象であることが示唆される。アデノ随伴ウィルスはさらに、染色体外のやり方でも機能できる。
【００８０】
他のベクターはプラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは、当分野において幅広く記載されており、当業者には周知である。例えば、ＳＡＮＢＲＯＯＫ他、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９年を参照されたい。ここ数年において、プラスミドベクターは、インビボにおいて抗原をコードする遺伝子を細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。プラスミドベクターは、多くのウィルスベクターにあるのと同じ安全性の懸念を有していないため、特に有利である。しかし、宿主細胞に適合するプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で動作可能なようにコードされた遺伝子からペプチドを発現できる。よく使用されるプラスミドのいくつかは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを含む。他のプラスミドは、当業者に周知である。さらにプラスミドは、特定のＤＮＡ断片を除去または付加するための制限酵素および連結反応を使用してカスタムデザインできる。プラスミドは、様々な非経口、粘膜および局所の経路により送達できる。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下または他の経路により注射できる。ＤＮＡプラスミドはまた、鼻内スプレーまたは鼻内滴下、肛門坐薬および経口により投与できる。ＤＮＡプラスミドはまた、遺伝子銃を使用して表皮または粘膜表面に投与できる。このプラスミドは、水溶液で、金粒子上に乾燥させて、または限定するものではないが、リポソーム、デンドリマー、蝸牛状剤およびマイクロカプセル化を含む別のＤＮＡ送達系と合わせて与えることができる。
【００８１】
本発明の別の目的は、ＨＣＶ感染または急性または慢性のＣ型肝炎などのＨＣＶ感染に関連する疾患の治療、あるいは肝線維症、肝硬変または肝細胞癌などの肝臓疾患の予防のための、治療有効量の少なくとも１種のＦＸＲのアンタゴニストまたはＦＸＲ発現の阻害剤を、それらを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
【００８２】
本発明の文脈において、本明細書中で使用する場合「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、このような用語が適用される疾患および病態あるいはこのような疾患および病態の症状の１つまたは複数の、進行の逆転、緩和、阻害、あるいは防止を意味する。
【００８３】
本発明によれば、「対象」または「患者」および「それらを必要とする対象」または「それらを必要とする患者」という用語は、Ｃ型肝炎ウィルスに感染した、または感染したと思われるヒトまたは非ヒトの哺乳動物を意図する。
【００８４】
上記のアンタゴニストまたは発現の阻害剤の「治療有効量」によってとは、任意の治療に適用できる、妥当なベネフィット／リスク比でＣ型肝炎ウィルス感染を治療するためのアンタゴニストまたは発現の阻害剤の十分な量を意味する。しかし、本発明の化合物および組成物の１日の総使用量は、正常な医療的判断の範囲内で主治医により決定されることは理解されるであろう。任意の特定の患者のための、特定の治療的有効投与量は、治療される疾患および疾患の重症度；用いる特定の化合物の活性；用いる特定の組成物、患者の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事；投与の時間、投与経路および用いる特定の化合物の排泄率；治療期間；用いる特定のポリペプチドと併用するまたは同時に使用する薬剤を含む様々な因子；ならびに当医療分野において周知の因子などに依存する。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルより低いレベルで化合物の投与量を開始すること、および所望の治療効果を達成するまで徐々に投与量を増加することは当分野の技術の十分範囲内である。しかし、製品の１日の投与量は、０．０１から１０００ｍｇ／成人／日の広範囲にわたって変更できる。治療される患者に対する症状による投与量の調整のために、組成物は、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００ｍｇの活性成分を含むことが好ましい。薬剤は、典型的には約０．０１から約５００ｍｇの活性成分を含み、好ましくは１ｍｇから約１００ｍｇの活性成分を含む。薬剤の有効量は、０．０００２ｍｇから約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日、特に約０．００１ｍｇから７ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与レベルで通常供給される。
【００８５】
上記の投与計画のいずれによっても、ＨＣＶ感染と診断された個人に投与できる。上記の治療計画のいずれによっても、ＨＣＶ感染に関する今までの治療が失敗した個人（治療が失敗した患者）に投与できる。
【００８６】
本明細書中で使用する場合「治療が失敗した患者」は全般に、ＨＣＶに関する今までの治療に対して応答が失敗した（「非応答者」と称する）または今までの治療に対して初めは応答したが、患者において治療応答が維持されなかった（「再燃者（ｒｅｌａｐｓｅｒ）と称する」、ＨＣＶ感染患者を指す。今までの治療は一般的に、ＩＦＮ−α単独療法またはＩＦＮ−α併用療法による治療を含むことができ、併用療法はＩＦＮ−αおよびリバビリンなどの抗ウィルス剤の投与を含み得る。
【００８７】
ＨＣＶに感染していると臨床的に診断された個人は、多くの実施形態において特定の対象となる。ＨＣＶに感染している個人は、それらの血液中にＨＣＶ  ＲＮＡを有する、および／またはそれらの血清中に抗ＨＣＶ抗体を有すると特定される。このような個人は、抗ＨＣＶ  ＥＬＩＳＡが陽性の個人を含む。このような個人は、必ずしもそうではないが、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルもまた上昇していると思われる。ＨＣＶに感染していると臨床的に診断された個人は、ナイーブな個人（例えばＨＣＶに関していままで治療されたことがない個人、特にＩＦＮ−αに基づく治療および／またはリバビリンに基づく治療を今までに受けたことがない個人）およびＨＣＶに関する前回の治療が失敗している個人（「治療の失敗した」患者）を含む。
【００８８】
治療が失敗した患者は、非応答者、すなわちＨＣＶ力価がＨＣＶに関する今までの治療、例えば、今までのＩＦＮ−α単独療法、今までのＩＦＮ−αおよびリバビリン併用療法あるいは今までのペグ化ＩＦＮ−αおよびリバビリン併用療法により、有意にまたは十分に減少しなかった個人を含む。治療が失敗した患者は、再燃者、すなわち今までのＩＦＮ−α単独療法、今までのＩＦＮ−αおよびリバビリン併用療法あるいは今までのペグ化ＩＦＮ−αおよびリバビリン併用療法を受け、ＨＣＶ力価が減少し、その後上昇した個人などの、ＨＣＶに関して以前に治療を受けた個人を含む。
【００８９】
他の実施形態において、本発明は、上に述べたように治療を必要とする対象に治療有効量の上記のようなＦＸＲのアンタゴニストまたはＦＸＲ発現の阻害剤を投与することを含み、前記対象が非応答者または再燃患者である、ＨＣＶ感染の治療のための方法を提供する。
【００９０】
一実施形態において、本発明は、上記のようなＦＸＲのアンタゴニストまたはＦＸＲの阻害剤の、インターフェロンαを用いた治療を受けた対象を治療するための使用に関する。
【００９１】
他の実施形態において、本発明の方法は、対象に有効量のインターフェロンα（ＩＦＮ−α）を投与することをさらに含む。
【００９２】
任意の既知のＩＦＮ−αが、本発明に使用できる。本明細書中で使用する場合、「インターフェロン−α」または「ＩＦＮ−α」という用語は、ウィルスの複製および細胞増殖を阻害し免疫応答を調節する、関連するポリペプチドのファミリーに関する。「ＩＦＮ−α」という用語は、天然に存在するＩＦＮ−α；合成ＩＦＮ−α；誘導体化ＩＦＮ−α（例えば、ペグ化ＩＦＮ−α、グリコシル化ＩＦＮ−αなど）；および天然に存在するＩＦＮ−αまたは合成ＩＦＮ−αの類似体；天然に存在するＩＦＮ−αに関して記載したような抗ウィルス特性を有する、本質的に任意のＩＦＮ−αを含む。適切なインターフェロンαは、限定するものではないが、天然に存在するＩＦＮ−α（限定するものではないが、天然に存在するＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−α２ｂを含む）；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，Ｎ．Ｊ．から入手可能なＩｎｔｒｏｎＡインターフェロンなどの組換えインターフェロンα−２ｂ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，Ｎ．Ｊ．から入手可能なＲｏｆｅｒｏｎインターフェロンなどの組換えインターフェロンα−２ａ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ，Ｃｏｎｎ．から入手可能なＢｅｒｏｆｏｒ  α２インターフェロンなどの組換えインターフェロンα−２Ｃ；Ｓｕｍｉｔｏｍｏ，Ｊａｐａｎから入手可能なＳｕｍｉｆｅｒｏｎまたはＧｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎから入手可能なＷｅｌｉｆｅｒｏｎインターフェロンα−ｎ１（ＩＮＳ）などの天然インターフェロンαの精製ブレンドであるインターフェロンα−ｎ１；およびＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより作製され、Ａｌｆｅｒｏｎの商標で、Ｐｕｒｄｕｅ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃｏ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．から入手可能な、天然インターフェロンαの混合体であるインターフェロンα−ｎ３を含む。
【００９３】
「ＩＦＮ−α」という用語は、血清の半減期などの特定の特性を改変するために誘導体化された（例えば、化学修飾された）ＩＦＮ−αの誘導体もまた包含する。このように、「ＩＦＮ−α」という用語は、グリコシル化ＩＦＮ−α；ポリエチレングリコールを用いて誘導体化されたＩＦＮ−α（「ペグ化ＩＦＮ−α」）；などを含む。ペグ化ＩＦＮ−αおよびこれを作製する方法は、例えば、米国特許第５，３８２，６５７号；第５，９８１，７０９号および第５，９５１，９７４号に述べられている。ペグ化ＩＦＮ−αは、限定するものではないが、ＰＥＧが結合した、インターフェロンα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ，Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，Ｎ．Ｊ．）、インターフェロンα２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、インターフェロンα−２ｃ（Ｂｅｒｏｆｏｒ  Ａｌｐｈａ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；および天然に存在するインターフェロンαのコンセンサス配列の決定により定義されたコンセンサスインターフェロン（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（ｌｎｔｅｒＭｕｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｂａｎｅ，Ｃａｌｉｆ．）を含む、ＰＥＧと上記のＩＦＮ−α分子のいずれかとの結合体を包含する。
【００９４】
別の実施形態において、本発明は、上記のようなＦＸＲのアンタゴニストまたはＦＸＲの阻害剤の、ヌクレオシド類似体を用いた治療を受けた対象の治療のための使用に関する。
【００９５】
他の実施形態において、本発明の方法は、持続的ウィルス陰性化を達成するために、有効量のヌクレオシド類似体を対象に投与することをさらに含む。前記ヌクレオシド類似体は、リバビリンまたはその誘導体であってよい。
【００９６】
リバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）は、ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能なヌクレオシド類似体であり、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，化合物番号８１９９，第１１版に記載されている。その製造および処方は、米国特許第４，２１１，７７１号に記載されている。
【００９７】
本発明は、米国特許第６，２７７，８３０号または国際特許出願Ｗ０２００６０６７６０６に記載されたような、リバビリン誘導体の使用もまた企図する。他の誘導体は、リバビリンのＬ型光学異性体であるレボビリン（Ｌｅｖｏｖｉｒｉｎ）またはリバビリンの３−カルボキサミジン誘導体であるビラミジン（Ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ）を含む。
【００９８】
別の実施形態において、本発明は、インターフェロン−αおよびヌクレオシド類似体を用いた治療を受けた対象を治療するための、上記のようなＦＸＲのアンタゴニストまたはＦＸＲの阻害剤の使用に関する。
【００９９】
他の実施形態において、本発明の方法は、有効量の、上記の物のようなインターフェロンα（ＩＦＮ−α）およびヌクレオシド類似体を投与することをさらに含む。
【０１００】
別の実施形態において、本発明は、上記のようなＦＸＲのアンタゴニストまたはＦＸＲの阻害剤の、ＨＣＶプロテアーゼおよび／またはポリメラーゼの阻害剤を用いた治療を受けた対象を治療するための使用に関する。
【０１０１】
他の実施形態において、本発明の方法は、有効量のＨＣＶポリメラーゼの阻害剤を、対象に投与することをさらに含む。このような阻害剤は、限定するものではないが、米国特許第６，４７９，５０８号に開示された化合物；国際特許出願ＷＯ０３０１０１４０、ＷＯ０３００７９４５、ＷＯ０３０１０１４１、ＷＯ０１４７８８３のいずれかにおいて開示された化合物、Ｚｈｏｎｇ他（２００３年）に開示されたジヌクレオチド類似体；Ｄｈａｎａｋ他（２００２年）に開示されたベンソチアジアジン化合物；ＷＯ０２１００８４６またはＷＯ０２００８５１、ＷＯ０１８５１７２、ＷＯ０２０９８４２４、ＷＯ０００６５２９、ＷＯ０２０６２４６、ＷＯ０３０００２５４、またはＥＰ１  ２５６，６２８Ａ２に開示されたＮＳ５Ｂ阻害剤を含む。
【０１０２】
他の実施形態において、本発明の方法は、対象に有効量のＨＣＶプロテアーゼ阻害剤を投与することを、さらに含む。ＮＳ３プロテアーゼの阻害剤は、限定するものではないが、国際特許出願ＷＯ０３０６６１０３、ＷＯ２００４１０３９９６またはＷＯ２００４０９３９１５に開示されたような化合物を含む。ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤のペプチド類似体は、特許出願ＧＢ２，３３７，２６２；ＪＰ１０２９８１５１；ＪＰ１１１２６８６１；ＪＰ１１２９２８４０；ＪＰ２００１−１０３９９３；米国特許第６，１５９，９３８号；米国特許第６，１８７，９０５号；ＷＯ９７／４３３１０；ＷＯ９８／１７６７９；ＷＯ９８／２２４９６；ＷＯ９８／４６５９７；ＷＯ９８／４６６３０；ＷＯ９９／３８８８８；ＷＯ９９／５０２３０；ＷＯ９９／６４４４２；ＷＯ９９／０７７３３；ＷＯ９９／０７７３４；ＷＯ００／０９５４３；ＷＯ００／０９５５８；ＷＯ００／２０４００；ＷＯ００／５９９２９；ＷＯ００／３１１２９；ＷＯ０１／０２４２４；ＷＯ０１／０７４０７；ＷＯ０１／１６３５７；ＷＯ０１／３２６９１；ＷＯ０１／４０２６２；ＷＯ０１／５８９２９；ＷＯ０１／６４６７８；ＷＯ０１／７４７６８；ＷＯ０１／７７１１３；ＷＯ０１／８１３２５；ＷＯ０２／０８１８７；ＷＯ０２／０８１９８；ＷＯ０２／０８２４４；ＷＯ０２／０８２５１；ＷＯ０２／０８２５６；ＷＯ０２／１８３６９；ＷＯ０２／６０９２６およびＷＯ０２／７９２３４に開示された任意の化合物を含む。ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの阻害剤もまた、ＷＯ０３／０６４４５６、ＷＯ０３／０６４４１６、ＷＯ０２／０６０９２６、ＷＯ０３／０５３３４９、ＷＯ０３／０９９３１６、ＷＯ０３／０９９２７４、ＷＯ２００４／０３２８２７およびＷＯ２００４／０４３３３９に開示されている。ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼのアシルスルファミド阻害剤もまた、ＷＯ２００５／０４６７１２またはＷＯ２００６００００８５に記載されている。ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼの阻害剤は、特許出願ＷＯ２００５００７６８１、ＷＯ２００５０３５５２５またはＷＯ２００５０２８５０２に記載されている。
【０１０３】
他の実施形態において、本発明の方法は、対象に有効量のスタチン化合物を投与することをさらに含む。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤であるスタチンは、抗ＨＣＶ薬として有用である可能性がある（Ｉｋｅｄａ  Ｍ．他、２００６年，Ｋａｐａｄｉａ  ＳＢ．他、２００５年，Ｙｅ  Ｊ．他、２００３年）。
【０１０４】
別の実施形態において、本発明は、上記のようなＦＸＲのアンタゴニストまたはＦＸＲの阻害剤の、インターフェロン−α、ヌクレオシド類似体ならびに、ＨＣＶプロテアーゼおよび／またはポリメラーゼの阻害剤を用いた治療を受けた対象の治療のための使用に関する。
【０１０５】
本発明の別の目的は、フラビウィルス科のメンバーによる感染の治療のための、またはＨＣＶ感染の治療のための、またはＨＣＶ感染に関連する疾患の治療のための、ＦＸＲのアンタゴニストまたはＦＸＲ発現の阻害剤を含む薬剤、ならびにインターフェロン−αを含む薬剤、ヌクレオシド類似体を含む薬剤およびＨＣＶプロテアーゼおよび／またはポリメラーゼの阻害剤を含む薬剤からなる群から選択される少なくとも１種の薬剤を含むキットである。
【０１０６】
スクリーニング方法
さらなる実施形態において、本発明によるＦＸＲのアンタゴニストは、当分野において周知の、任意のスクリーニング方法により得られる。
【０１０７】
例えば、ＦＸＲのアンタゴニストのインビトロのスクリーニング方法は、（ａ）ＦＸＲをコードするＤＮＡを形質移入し、発現させた細胞と、ＦＸＲに特異的に結合することが既知のリガンド（例えば、ＢＡなどの天然のリガンド）とを接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、候補化合物と接触させるステップ；（ｃ）前記候補化合物の存在下での、ＦＸＲに結合することが既知のリガンドの結合と、前記候補化合物の不在下での、ＦＸＲに結合することが既知のリガンドの結合とを比較するステップおよび（ｄ）ＦＸＲに結合することが既知のリガンドの結合を減少させる候補化合物を積極的に選択するステップからなるステップを含んでよい。
【０１０８】
本発明による、他の適切なインビトロのスクリーニング方法は、後でＦＸＲのリガンドの結合ドメインを有するポリペプチド（例えば、完全長ＦＸＲポリペプチド）とさらにインキュベートする、標識した候補化合物を使用して実施できる。標識は放射性同位体、免疫化学的標識、蛍光色素分子などを含む。当業者は、遊離の標識候補治療薬から、結合した標識候補治療薬を分離する様々な方法を認識するであろう。標識候補治療薬の、ＦＸＲポリペプチドについての親和性は、標準的なリガンド結合方法を使用して計算できる。
【０１０９】
本発明による、別の型のスクリーニング方法は、試験化合物のＦＸＲの、ＦＸＲのためのリガンドの結合を調節する能力を試験するステップからなり得る。例えば、これらは、候補治療薬の存在下での、標識ＦＸＲリガンドとの直接結合アッセイとして実施できる。本アッセイは、試験化合物を、ＦＸＲポリペプチドの少なくとも１つのリガンド結合ドメインおよびＦＸＲのためのリガンドを含むアッセイ混合物に配置するステップを伴う。ＦＸＲリガンドとＦＸＲとの結合に関する結果を確定する。ＦＸＲポリペプチドまたはＦＸＲリガンド結合ドメインを有するポリペプチドに結合する、標識ＦＸＲリガンドの量を減少させる試験化合物は、ＨＣＶの複製を阻害するその能力に関するその後のスクリーニングの対象である。前記スクリーニング方法に使用できる適切な技術は、ＷＯ００／０１６６３または米国特許第６，７４０，７５６号の文献に記載されたような均一時間分解蛍光（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＨＴＲＦ）アッセイであってよい。
【０１１０】
本発明のインビトロスクリーニング方法における使用に適したリガンドは、限定するものではないが、胆汁酸およびＣＤＣＡ（ケノデオキシコール酸）、ＧＣＤＣＡ（グリコケノデオキシコール酸）、ＴＣＤＣＡ（タウロケノデオキシコール酸）、ＧＣＡ（グリココール酸）、ＴＣＡ（タウロコール酸）、ＤＣＡ（デオキシコール酸）、ＬＣＡ（リトコール酸）、ＤＨＣＡ（デヒドロコール酸）、ＵＤＣＡ（ウルソデオキシコール酸）およびＣＡ（コール酸）などの関連する化合物を含む。さらなる胆汁酸および他のリガンドは、例えば、Ｍａｋｉｓｈｉｍａ他、（１９９９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１３６２〜１３６５ページに記載されている。本アッセイは、ＦＸＲが相互作用するコアクチベーターおよびコリプレッサーを用いることができる。
【０１１１】
国際特許出願ＷＯ００４０９６５、ＷＯ０２０６４１２５、ＷＯ０３０３０６１２は、本発明によるＦＸＲのアンタゴニストの特定に適切であり得る、インビトロのスクリーニング方法を記載している。
【０１１２】
さらに、国際特許出願ＷＯ２００４０４６３２３は、結晶形態のファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む組成物を提供する。前記文献は、ＦＸＲのアンタゴニストをスクリーニングするためにこの構造情報を使用するインシリコの方法を、さらに提供する。
【０１１３】
本明細書においてこれまでに記載したインビトロまたはインシリコのスクリーニングの実施形態のいずれか１つの終りに積極的に選択された候補化合物を、その抗ＨＣＶの生物学的特性のさらなるアッセイを考慮して、さらなる選択ステップに供することができる。この目的に関して、上記のような一般的なインビトロのスクリーニング方法を用いて積極的に選択された候補化合物は、ＨＣＶの複製を阻害するそれらの能力に関してさらに選択できる。特定の実施形態において、実施例に記載されたようなレプリコン系を使用することによって、ＨＣＶの複製を阻害する能力を分析する。簡潔に言うと、レプリコンは、ＨＣＶ  ＩＲＥＳの下流にホタルルシフェラーゼ（フォチナス・フィラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））レポーターおよびＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの下流にポリプロテインＮＳ３からＮＳ５Ｂをコードする配列を含むバイシストロニックＲＮＡである。前記レプリコンは、その後、Ｈｕｈ７細胞などのＦＸＲを発現する細胞に形質移入する。それ故、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製の上方制御は、レプリコン系を形質移入された細胞内のルシフェラーゼ活性の増加をもたらす。
【０１１４】
したがって、本発明は、ＨＣＶの複製を阻害する化合物の細胞内スクリーニングのための方法を提供し、前記方法は、
ａ）上記の様なインビトロのスクリーニング方法に従って特定されたＦＸＲのアンタゴニストを提供するステップと、
ｂ）上記のようなレプリコン系を形質移入された細胞を提供するステップと、
ｃ）ステップａ）のＦＸＲのアンタゴニストとステップｂ）の細胞とを接触させるステップと、
ｄ）前記レプリコン系のルシフェラーゼ活性を検出するステップと、
ｅ）前記ルシフェラーゼ活性と、前記ＦＸＲのアンタゴニストの不在下で得られたルシフェラーゼ活性とを比較するステップと
を含み、前記ＦＸＲアンタゴニストの不在下で得られたルシフェラーゼ活性と比較して、前記ＦＸＲアンタゴニストの存在下で得られたルシフェラーゼ活性が減少することが、前記ＦＸＲアンタゴニストがＨＣＶの複製を阻害できることを示唆している。
【０１１５】
医薬組成物
本発明のアンタゴニストまたは発現の阻害剤は、医薬として許容可能な賦形剤と、場合により生分解性ポリマーなどの持続放出性のマトリックスと組み合わせて、治療用組成物を形成できる。
【０１１６】
「医薬として」または「医薬として許容可能な」は、哺乳類、特にヒトに、必要に応じて投与した場合に、拒絶反応、アレルギー反応または他の有害反応を引き起こさない分子的実体および組成物を指す。医薬として許容可能な担体または賦形剤は、非毒性の、固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、任意の型のカプセル化材料あるいは補助製剤を指す。
【０１１７】
経口、舌下の、皮下の、筋肉内の、静脈内の、経皮的な、局所的な、または直腸の投与用の本発明の医薬組成物において、有効成分は、単独または別の有効成分と組み合わせて、単位投与形態で、従来の医薬的支持体との混合物として、動物および人間に投与できる。適切な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒および経口の懸濁液または溶液などの経口経路形態、舌下および口腔投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下の、経皮的な、局所的、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下の、経皮的な、髄腔内および鼻腔内の投与形態ならびに直腸内投与形態を含む。
【０１１８】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤のための、医薬として許容可能な媒体を含む。これらは、具体的には、等張性の滅菌した塩水（モノナトリウムまたはジナトリウムのリン酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなど、あるいはこのような塩の混合物）または状況次第で、滅菌した水または生理食塩水に添加した後に注射溶液の構築を可能にする、乾燥、特に凍結乾燥組成物であってよい。
【０１１９】
注射使用に適した医薬形態は、滅菌水溶液または水分散液；ゴマ油、ピーナッツ油または含水プロピレングリコールを含む製剤；ならびに滅菌注射溶液または分散液のその場の調製用の滅菌粉末を含む。全ての場合において、形態は、滅菌されなくてはならず、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性であるべきである。形態は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌およびカビなどの微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【０１２０】
遊離の塩基または薬理学的に許容可能な塩として、本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合して水で調製できる。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物ならびに油で調製できる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製品は、微生物の増殖を防止するために、保存料を含む。
【０１２１】
本発明のアンタゴニストまたは発現の阻害剤は、中性または塩の形態で組成物中に処方できる。医薬として許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ酸と共に形成される）を含み、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成される。遊離のカルボキシル基と共に形成される塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄などの無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来し得る。
【０１２２】
担体はさらに、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体プロピレングリコールなど）、それらの適切な混合物および植物油を含む、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子径の保持によって、および界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の作用からの保護は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによって達成できる。
【０１２３】
滅菌注射用組成物は、適切な溶媒において、必要とされる量で、活性ポリペプチドと、上に列挙した様々な他の原料とを組み合わせ、必要に応じてその後ろ過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、塩基性分散媒および上に列挙されたものから必要とされる他の原料を含む滅菌媒体と組み合わせることによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分に任意の追加の所望の原料を加えた粉末を、あらかじめろ過滅菌してあるそれらの溶液から得る真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１２４】
製剤後、溶液は、投与形態に適した形で、治療的に有効な量で投与される。製剤は、上記の注射溶液の型などの様々な投与形態で、容易に投与できるが、薬剤放出カプセルなどもまた用い得る。
【０１２５】
水溶液での非経口投与に関しては、例えば、溶液は、必要に応じて適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、はじめに十分な塩水またはグルコースを用いて等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下のおよび腹腔内の投与に、特に適している。これに関連して、採用可能な滅菌水性媒体は、本開示を考慮すれば当業者には既知であろう。例えば、一投与量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入流動体に加えるか、または注入予定部位に注入するかのいずれかが可能である。用量のいくらかの変更は、治療される対象の病態次第で必然的に行われる。いずれにしても、投与に責任をもつ人物が、個々の対象のための適切な投与量を決定する。
【０１２６】
本発明のアンタゴニストまたは発現の阻害剤は、治療用混合物内に、約０．０００１から１．０ｍｇまたは約０．００１から０．１ｍｇまたは約０．１から１．０またはさらに約１０ｍｇ／投与量ほどまで含むように処方できる。複数投与量もまた投与できる。
【０１２７】
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与用に処方された、本発明の化合物に加えて、他の医薬として許容可能な形態は、例えば、錠剤または他の経口投与用固体；リポソーム製剤；持続放出カプセル；および現在使用されている任意の他の形態を含む。
【０１２８】
ＨＣＶのインビトロ複製のための系
本発明者らは、ＢＡがＦＸＲ依存性シグナル伝達経路を介したＨＣＶ  ＲＮＡの複製に関与することを、実際に立証した。したがって、特定の理論にも拘泥するものではないが、本発明者らは、この観察結果が、天然の肝細胞または肝臓癌細胞系がＨＣＶウィルスによってインビトロで感染できない理由を説明していると考える。したがって、本発明は、大量のＨＣＶの、インビトロの複製を達成するために適した方法を提供する。
【０１２９】
したがって、本発明の目的は、ＦＸＲ発現細胞のための培養培地、ＦＸＲ発現細胞および少なくとも１種のＦＸＲのアゴニストを含む、ＨＣＶの複製を可能にする細胞培養系に関する。
【０１３０】
「ＦＸＲ発現細胞」という用語は、天然に、または天然にではなくＦＸＲを発現する細胞を意味する。
【０１３１】
一般的に、ＦＸＲは、肝臓、腎臓、腸、結腸、卵巣および副腎を含む様々な組織で発現する（Ｆｏｒｍａｎ他、１９９５年）。したがって、ＦＲＸ発現細胞は、上記の組織から単離された任意の細胞を含む。特定の実施形態において、ＦＸＲ発現細胞は、単離された肝細胞および腸細胞を含む。他の特定の実施形態において、ＦＸＲ発現細胞は、肝臓または腸の一次組織培養からなる。ＦＸＲ発現細胞はまた、上記の組織に由来する細胞系から単離され得る。本発明の好ましい実施形態において、前記発現ＦＸＲ細胞はヒト肝癌細胞系Ｈｕｈ７（Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ  Ｈ．他、１９８２年）またはＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ（Ｑｕｉｎｋｅｒｔ  Ｄ．他、２００５年）またはＨｅｐＧ２の細胞単層から選択される。
【０１３２】
他の実施形態において、ＦＸＲ発現細胞は、ＦＸＲをコードする遺伝子を形質移入された細胞であってよい。
【０１３３】
他の実施形態において、ＦＸＲ発現細胞は、細胞がＦＸＲを過剰発現するような方法で形質移入された細胞であってよく、これは、前記細胞により発現したＦＸＲのレベルが、天然にＦＸＲを発現する細胞において発現したＦＸＲのレベルより、少なくとも１．２、好ましくは少なくとも１．５およびより好ましくは少なくとも２倍高いことを意味する。
【０１３４】
「形質移入」という用語は、外来核酸の細胞への導入を意味し、それ故「形質移入」という用語は、本発明において「形質導入」および「感染」という用語を含む。導入遺伝子または導入配列はさらに、「クローン」または「外来」の遺伝子または配列とも呼ぶことができ、開始、終止、プロモーター、シグナル、分泌などの制御または調節の配列、あるいは細胞の分子機構によって使用される他の配列を含む。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受容し、発現する宿主細胞は、「形質移入され」ており、「形質移入体」または「組換え細胞」である。
【０１３５】
組換えＤＮＡ技術は、当分野において周知である。例えば、ＦＸＲをコードする遺伝子またはその断片を、発現ベクターに組込むことができる。その後、このようなベクターを、所望のポリペプチドを発現する適切な真核生物宿主細胞に導入する。
【０１３６】
広範囲の宿主／発現ベクターの組み合わせを、ＦＸＲをコードする核酸の発現に用いることができる。使用できる有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体および合成ＤＮＡの配列セグメントを含む。適切なベクターは、限定するものではないが、ＳＶ４０およびｐｃＤＮＡの誘導体ならびにｃｏｌ  Ｅｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体などの既知の細菌プラスミド、ＲＰ４などのプラスミド、ＮＭ９８９などのファージＩの多くの誘導体などのファージＤＮＡ、ならびにＭ１３および線維状一本鎖ファージＤＮＡなどの他のファージＤＮＡ、２ミクロンプラスミドまたは２ミクロンプラスミドの誘導体などの酵母プラスミド、ならびにセントロメアおよび統合的酵母シャトルベクター；昆虫または哺乳動物の細胞において有用なベクターなどの、真核生物細胞において有用なベクター；ファージＤＮＡまたは発現調節配列などを用いるために修飾されたプラスミドなどの、プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクターを含む。
【０１３７】
結果として、哺乳動物の、典型的にはヒトの細胞は、本明細書中において定義されたように核酸または組換えベクターによって形質移入できる。適切な細胞の例は、限定するものではないが、ＶＥＲＯ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２などのＨＥＬＡ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１などのＣＨＯ細胞系、ＣＯＳ−７細胞およびＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０細胞などのＣＯＳ細胞、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６３６１などの３Ｔ３、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２細胞、２９３Ｔ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７１１などのＳｆ９細胞ならびにＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０などのＣｖ１細胞を含む。
【０１３８】
ＦＸＲアゴニストは、胆汁酸およびＣＤＣＡ（ケノデオキシコール酸）、ＧＣＤＣＡ（グリコケノデオキシコール酸）、ＴＣＤＣＡ（タウロケノデオキシコール酸）、ＧＣＡ（グリココール酸）、ＴＣＡ（タウロコール酸）、ＤＣＡ（デオキシコール酸）、ＬＣＡ（リトコール酸）、ＤＨＣＡ（デヒドロコール酸）、ＵＤＣＡ（ウルソデオキシコール酸）およびＣＡ（コール酸）を含む関連する化合物などのＦＸＲの天然のアゴニストの中から選択できる。さらなる胆汁酸および他のアゴニストは、例えば、Ｍａｋｉｓｈｉｍａ他、（１９９９年）に記載されている。ＦＸＲアゴニストはまた、限定するものではないが、特許出願ＷＯ０３０９０７４５、ＷＯ０３０８０８０３、ＷＯ０３０１６２８８、ＷＯ２００４０４６１６２、ＷＯ２００４０４８３４９、ＷＯ２００５０８２９２５、ＷＯ２００５０９７０９７、ＷＯ２００５０９２３２８、ＵＳ２００６１２８７６４、ＵＳ２００５０８００６４およびＪＰ２００５２８１１５５に記載されたものを含む。ＦＸＲのアゴニストはまた、限定するものではないが、コレステロール（Ｃｈｏ）、２２−ヒドロキシコレステロール（２２−ＯＨ−ｃｈｏ）、２５−ヒドロキシコレステロール（２５−ＯＨ−ｃｈｏ）、プレグネノロン、プロゲステロン、デキサメタゾン（ＤＸＭ）、（Ｅ）−［（テトラヒドロテトラメチルナフタレニル）プロペニル］安息香酸（ＴＴＮＰＢ）、ファルネソールおよびレチノイン酸（ＲＡ）を含む。
【０１３９】
本発明の好ましい実施形態において、ＦＸＲのアゴニストは、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、デヒドロコール酸、ウルソデオキシコール酸、コール酸、ファルネソールまたは（Ｅ）−［（テトラヒドロテトラメチルナフタレニル）プロペニル］安息香酸である。
【０１４０】
本発明の一実施形態において、上記のような細胞培養系は、ＨＣＶウィルスをさらに含む。ＨＣＶウィルスは、様々な起源および任意の遺伝子型から単離できる。ＨＣＶウィルスは、ＨＣＶに感染した対象から単離できる。本発明の別の実施形態において、該細胞培養系は、ＨＣＶレプリコンなどの複製ＨＣＶウィルス材料を形質移入されたＦＸＲ発現細胞を含む。レプリコンは、限定するものではないが、任意のＨＣＶ遺伝子型または生体試料から構築できる。前記レプリコンは、後述の実施例において記載されるものであってよい。
【０１４１】
本発明の１つの目的は、上記のような細胞培養系の、ＨＣＶ感染の診断あるいは抗ウィルス化合物のスクリーニングあるいはＨＣＶウィルス粒子またはＨＣＶウィルスタンパク質の作製あるいは抗ＨＣＶワクチンの作製のための使用である。
【０１４２】
本発明はまた、対象においてＨＣＶ感染の診断をするためのインビトロの方法を提供し、前記方法は、
ａ）ＦＸＲ発現細胞の培養物を提供するステップと、
ｂ）ＦＸＲ発現細胞の前記培養物を、対象から得た生体試料と共にインキュベートするステップと、
ｃ）ＦＸＲ発現細胞の前記培養物を、ステップ（ｂ）の前、後または、ステップ（ｂ）と同時に、少なくとも１種のＦＸＲのアゴニストと共にインキュベートするステップと、
ｄ）前記細胞を、ＨＣＶの複製が可能となるために十分な時間培養するステップと、
ｅ）ＨＣＶの複製のレベルを検出するステップ
からなるステップを含み、ＨＣＶの複製の検出が、前記対象がＨＣＶに感染していることを示唆する。
【０１４３】
生体試料は、限定するものではないが、血液、血清、血漿または生体検査の際に単離された試料に由来し得る。
【０１４４】
ＨＣＶ複製の検出は、当分野において既知の任意の技術により実施できる。このような技術は、抗ＨＣＶ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）を含むことができ、これは、ＨＣＶタンパク質に関して試験する。ＲＮＡの増幅試験（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応つまりＰＣＲ、分岐ＤＮＡ法）による、ＨＣＶの複製に関する試験が使用できる。ＨＣＶ  ＲＮＡの合成は、リアルタイムＰＣＲのために設計された装置を使用して単一ステップでＲＴ−ＰＣＲにより、またはＨＣＶ特異的放射性プローブを使用して、フィルター上でのＲＮＡのハイブリダイゼーションにより実際に分析できる。例として、単離ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による逆転写および増幅などの、ＨＣＶゲノムの増幅を可能にする特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用した、逆転写および増幅の連結に供し得る。その後、直接配列決定を実施し、前記対象に感染しているＨＣＶの遺伝子型を決定できる。
【０１４５】
陽性結果は、試料中の感染ウィルスの存在を示唆する、したがって、活動性感染および感染の広がりの可能性および／または肝線維症、肝硬変および肝細胞癌などの肝臓疾患の進行を示唆する。
【０１４６】
本発明はまた、対象においてＨＣＶ感染の診断をするための別のインビトロの方法を提供する。この代替の方法は、対象からの生体試料におけるＨＣＶに対する抗体の検出を可能にし、前記方法は、
ａ）ＦＸＲ発現細胞の培養物を提供するステップと、
ｂ）ＦＸＲ発現細胞の前記培養物をＨＣＶウィルスと共にインキュベートする、または複製ＨＣＶウィルス材料を前記細胞に形質移入するステップと、
ｃ）ＦＸＲ発現細胞の前記培養物を、ステップ（ｂ）の前、後または、ステップ（ｂ）と同時に、少なくとも１種のＦＸＲのアゴニストと共にインキュベートするステップと、
ｄ）前記細胞を、ＨＣＶウィルスタンパク質を産生させるために培養するステップと、
ｅ）ＦＸＲ発現細胞の前記培養物を、対象から得られた生体試料と共に、試料中のＨＣＶ特異的抗体と、ＨＣＶタンパク質とが相互作用可能な条件下でインキュベートするステップと、
ｆ）試料中の抗体と、ＨＣＶ由来タンパク質との結合を検出するステップ
を含み、前記結合が、試料が由来した対象におけるＨＣＶ感染の存在を示唆する。
【０１４７】
前述の方法において、生体試料は、限定されることなく、血液、血清、血漿、血液細胞、リンパ球または肝臓組織の生体検査に由来できる。前述の診断方法に有用なタンパク質および細胞分画の単離に関する技術もまた、当分野において周知である。
【０１４８】
上記の様な細胞培養系はまた、大量のウィルス粒子および／またはＨＣＶ由来タンパク質を産生するために有用であり得る。ＨＣＶ粒子は、実際に以下に記載する方法に従って得られる細胞培養物から（またはそれらの培養培地から）、ウィルス粒子の形成が可能な条件下で単離できる。
【０１４９】
本発明はまた、ＨＣＶウィルス粒子またはＨＣＶウィルスタンパク質を産生する方法にも関し、前記方法は、
ａ）ＦＸＲ発現細胞の培養物を提供するステップと、
ｂ）ＦＸＲ発現細胞の前記培養物をＨＣＶウィルスと共にインキュベートする、または複製ＨＣＶウィルス材料を前記細胞に形質移入するステップと、
ｃ）ＦＸＲ発現細胞の前記培養物を、ステップ（ｂ）の前、後または、ステップ（ｂ）と同時に、少なくとも１種のＦＸＲのアゴニストと共にインキュベートするステップと、
ｄ）前記細胞を培養するステップ
からなるステップを含む。
【０１５０】
特定の実施形態において、上記のような細胞培養系により産生されたウィルス粒子は、抗ウィルス免疫応答を惹起するために個体に投与できる弱毒化組換えワクチンを作製するのに有用であり得る。
【０１５１】
あるいは、上記の様な細胞培養系により発現される、単離されたＨＣＶ由来タンパク質は、ＨＣＶワクチンを作製するための出発物質であり得る。
【０１５２】
さらにあるいは、該細胞培養系により発現される、単離されたＨＣＶ由来タンパク質および／またはウィルス粒子は、前記ＨＣＶ由来タンパク質および／またはウィルス粒子に対する抗体、特に中和特性を有する抗体の作製に有用であり得る。細胞培養物から単離されたＨＣＶ由来タンパク質の量を、抗ＨＣＶ抗体を作製するために動物に投与できる。ＨＣＶに対する抗体を作製するさらなる方法は、ＨＣＶ由来タンパク質との反応性に関するヒト抗体ライブラリィをスクリーニングするステップおよび反応性抗体を発現するライブラリィからクローンを選択するステップを含む。あるいは、モノクロナール抗ＨＣＶ抗体は、当分野において周知の技術を使用して、ハイブリドーマ細胞系において作製できる。
【０１５３】
上述の方法により作製された抗体は、ＨＣＶ感染を治療するための治療目的において有用であり得る。前記抗体は、対象においてＨＣＶ感染を診断するために有用であり得る。したがって、前記抗体は、対象においてＨＣＶ感染を診断するためのキットの作製に使用できる。本発明に従って調製されたＨＣＶ特異的抗体は、様々な生体試料において、ＨＣＶの存在および／または繁殖を検出するために使用できる。
【０１５４】
本発明の細胞培養系は、特定の遺伝型の使用に限定されるものではないので、前記系は、したがって新規のワクチンおよび／または抗ウィルス分子のスクリーニングおよび／または作製、特にウィルス周期の段階の１つに対する活性分子のスクリーニングのために有用であり得る。前記培養系は、ＨＣＶ感染および／または複製および／またはビリオンの構築を調節できる薬剤の、インビトロのスクリーニングに有用であり得る。
【０１５５】
本発明は、抗ウィルス分子をスクリーニングする方法に関し、前記方法は、
ａ）ＦＸＲ発現細胞の培養物を提供するステップと、
ｂ）ＦＸＲ発現細胞の前記培養物をＨＣＶウィルスと共にインキュベートする、または複製ＨＣＶウィルス材料を前記細胞に形質移入するステップと、
ｃ）ＦＸＲ発現細胞の前記培養物を、ステップ（ｂ）の前、後または、ステップ（ｂ）と同時に、少なくとも１種のＦＸＲのアゴニストと共にインキュベートするステップと、
ｄ）ＦＸＲ発現細胞の前記培養物を、ステップ（ｂ）または（ｃ）の前、後または、ステップ（ｂ）または（ｃ）と同時に、候補化合物と共にインキュベートするステップと、
ｅ）ＨＣＶの複製および／またはＨＣＶ関連タンパク質の発現および／またはＨＣＶウィルス粒子のレベルを測定するステップ
からなるステップを含む。
【０１５６】
候補化合物の不在下で観察された、ＨＣＶの複製および／またはＨＣＶ関連タンパク質の発現および／またはＨＣＶウィルス粒子のレベルに対する、候補化合物の存在下で観察された、ＨＣＶの複製および／またはＨＣＶ関連タンパク質の発現および／またはＨＣＶウィルス粒子のレベルの低下は、候補化合物の阻害活性を示唆する。
【０１５７】
例えば、ウィルス粒子形成の阻害は、顕微鏡によって検出できる（直接または免疫染色後に実施できる）；また、産生されたＨＣＶウィルス粒子の感染性の変化は、細胞培養培地からそれらを単離し、ナイーブ細胞または感受性の動物モデルに適用することによって分析できる。
【０１５８】
具体的な実施形態において、本発明の細胞培養系は、潜在的抗ＨＣＶ治療薬のハイスループット一次スクリーニングのための簡便な系を提供する。このようなハイスループットスクリーニング系は、試験化合物の細胞培養系への適用するステップ（例えば、９６または３２４ウェルのマイクロタイタープレートにおいて増殖させる）、その後の、ＨＣＶの複製および／またはＨＣＶ関連タンパク質の発現および／またはＨＣＶ粒子の産生における変化を測定する（例えば、マルチプレートリーダーまたはスキャナーを使用する）ステップを伴う。
【０１５９】
本発明によれば、候補治療化合物は、限定されることなく、小分子、阻害性ペプチド、阻害性（例えば、トランスドミナントネガティブ）タンパク質、抗体、具体的には中和抗体、リボザイムならびにアンチセンス核酸を含む。
【０１６０】
本明細書中に記載のように、上記のようなインビトロのスクリーニング方法を使用して特定された抗ＨＣＶ治療化合物を、感受性の動物モデルにおける二次スクリーニングを使用して、ＨＣＶの繁殖に作用するそれらの能力に関してさらなる特徴付けができる。ＨＣＶの親和性に基づく、本発明の好ましい小動物モデルは、ツパイの、ツパイア・ベランゲリ・キネンシス（Ｔｕｐａｉａ  ｂｅｌａｎｇｅｒｉ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）である。好ましい大型動物モデルはチンパンジーである。実験動物を、最も強力な阻害効果を生みだす候補化合物を用いて治療する（対照の動物は治療せず、可能な場合は陽性対照もまた用い得る）。動物をウィルスによる感染から保護する、および／または病原性をもたらすウィルスの繁殖を阻害する化合物は、ＨＣＶ感染の治療／予防用薬剤の開発のための魅力的な候補である。さらに、動物モデルは、薬物動態的および毒物学的研究に関する基盤を提供する。
【０１６１】
本発明を、以下の図面および実施例を鑑みて、さらに例示する。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】ＤＣＡによる、ＨＣＶレプリコン１ｂの複製の増強を示す図である。ＤＣＡの短期効果：Ｈｕｈ７細胞に、エレクトロポレーションにより、複製レプリコンＲ１ｂ（四角）または欠損型レプリコンＲｐ−ｄｅｌ（三角、破線）のどちらかを形質移入した。エレクトロポレーションの４時間後、細胞を、ＤＣＡ（１００μＭ）で処理した（黒いドット）、または処理しなかった（白いドット）。ＤＣＡ処理の、表示の日数の後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性（相対光度単位、ＲＬＵ）を測定した。結果は、４時間後のルシフェラーゼの相対比率として示し、三連の平均±Ｓ．Ｄ．である。
【図２】ＤＣＡによる、ＨＣＶレプリコン１ｂの複製の増強を示す図である。ＤＣＡの長期効果：Ｈｕｈ７細胞を、Ａに記載のように処理した。ＤＣＡは、横座標のすぐ上のハッチング棒により示されたように、各継代後２４時間を除いて、培養の間ずっと培養培地に存在した。細胞を、破線で示したように、形質移入後７２時間、その後７、１０および１４日に１：３に希釈して継代した。細胞を、ルシフェラーゼ活性（矢印）を測定するための所与の時点で回収した。結果を、図１で前述したように表す。
【図３】ルシフェラーゼ活性とＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡのコピー数との相関関係を示す図である。Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞に、エレクトロポレーションにより、Ｒ１ｂを形質移入した。エレクトロポレーションの４時間後、細胞を、ＤＣＡ（２５μＭおよび１００μＭ）で処理した、または処理しなかった。細胞を、１：３の希釈で、１回継代した。形質移入後６日目に、細胞の一部を、ルシフェラーゼ活性の測定のために溶解し、他の部分をＲＮＡレベルの定量化に使用した。ＨＣＶ  ＲＮＡレベルを、ＲＱ−ＰＣＲにより測定し、全ＲＮＡ定量法を使用して正規化した。
【図４】ＢＡを含むＦＸＲのリガンドが、ＨＣＶの複製を上方制御することを示す図である。  Ａ．遊離および抱合ＢＡの、サブゲノムＨＣＶ  ＲＮＡの複製に関する用量応答効果。Ｈｕｈ７細胞に、エレクトロポレーションにより、複製レプリコンＲ１ｂを形質移入した。エレクトロポレーションの４時間後、Ｈｕｈ７細胞を、１０、５０または１００μＭの、遊離の胆汁酸ＤＣＡ（左のパネルの黒い棒）およびＣＤＣＡ（右のパネルの黒い棒）ならびにそれらのグリコ（Ｇ）、またはタウロ（Ｔ）抱合誘導体（白い棒）で７２時間処理した。未処理細胞を、（Ｒ１ｂのみを用いた）を、破線の棒として示した。結果を、図１で前述したように表す。  Ｂ．ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）のアゴニストのみがＨＣＶ  ＲＮＡの複製を上方制御する。細胞を、１００μＭの、表示の胆汁酸［ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、コール酸（ＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）］または以下のステロイド：それぞれ１０μＭの、コレステロール（Ｃｈｏ）、デキサメタゾン（ＤＸＭ）、プレグネノロン、ファルネソール、ＴＴＮＰＢ；５μＭの、２２−ヒドロキシコレステロール（２２−ＯＨ−Ｃｈｏ）、プロゲステロン；１μＭの、２５−ヒドロキシコレステロール（２５−ＯＨ−ｃｈｏ）および９−ｃｉｓレチノイン酸、の１つで７２時間処理した。ＦＸＲのアゴニストは、黒い棒として示し、一方、他のＮＲ１のアゴニストは、白い棒として示す。結果を、図１で前述したように表す。
【図５】ＦＸＲの阻害によりＨＣＶ  ＲＮＡの複製が減少することを示した図である。  Ａ．ググルステロンが、基本の、およびＢＡにより誘導されるＨＣＶの複製を阻害することを示す。Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞に、Ｒ１ｂを形質移入した。エレクトロポレーションの４時間後、細胞を、１００μＭのＣＤＣＡおよび異なる濃度のググルステロン（０．０１μＭから２０μＭまで）で７２時間処理した、または処理しなかった。結果を、図１で前述したように表す。  Ｂ．ＦＸＲのサイレンシングが、Ｈｕｈ７細胞におけるＣＤＣＡによるＨＣＶの複製の上方制御を消失させる。Ｈｕｈ７細胞に、６０ｎＭの、ＦＸＲに特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖（黒い棒）またはＧＡＰＤＨ（白い棒）を形質移入した。一晩インキュベートした後で、細胞に、Ｒ１ｂを形質移入し、ＣＤＣＡで処理した（１００μＭ、右のパネル）または処理しなかった（左のパネル、Ｒ１ｂのみ）。ルシフェラーゼ活性を、エレクトロポレーションの７２時間後に測定した。結果を、図１で前述したように表す。グラフの下の値は、ＦＸＲの不活性化による、複製の阻害パーセントを示す。これらの阻害率の有意性は、スチューデントｔ検定によるｐ値としてその下に示す。  Ｃ．ＦＸＲ、ＧＡＰＤＨおよびＲｉｂＳ１２の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示した図である。ｓｉＲＮＡの形質移入後４８時間で、全ＲＮＡをＨｕｈ７細胞から抽出し、ＦＸＲ、ＧＡＰＤＨおよびＲｉｂＳ１２に関するＲＴ−ＰＣＲを、材料と方法に記載したように実施した。ＲｉｂＳ１２に関するＲＴ−ＰＣＲは、内部対照として実施した。ＲＴ−ＰＣＲ産物（ＦＸＲに関して３６２ｐｂ、ＧＡＰＤＨに関して１９９ｐｂおよびＲｉｂＳ１２に関して３３８ｐｂ）を、３％アガロースゲル電気泳動の後で、臭化エチジウムを用いて染色することによって検出した。
【図６】ＩＦＮおよびＦＸＲの調節因子は、独立してＨＣＶ  ＲＮＡの複製に作用する。形質移入されたＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞を、用量を漸増させたＩＦＮ−α２ｂで７２時間処理した。使用した条件は、Ｒ１ｂ単独（白い四角）、Ｒ１ｂ＋１０μＭのＧＧＳ（白い三角）、Ｒｉｂ＋１００μＭのＣＤＣＡ（黒い四角）およびＲｉｂ＋前と同じ濃度のＣＤＣＡ＋前と同じ濃度のＧＧＳ（×と破線）であった。結果を、図１で前述したように表す。
【図７】異なるＨＣＶ遺伝型に関するＦＸＲの異なる活性を示す図である。Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞に、遺伝型１ａのレプリコン（Ｒ１ａ、左のパネル）または遺伝型１ｂのレプリコン（Ｒ１ｂ、右のパネル）のどちらかを形質移入した。エレクトロポレーションの４時間後、細胞を、１００μＭのＣＤＣＡ（黒い棒）または１０μＭのＧＧＳ（破線の棒）のどちらかで処理した。ｍｏｃｋ処理細胞を、白い棒として示す。結果を、図１で前述したように表す。
【実施例】
【０１６３】
材料と方法
材料：Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈから入手したＩＦＮａ−２ｂは別として、本研究で使用したすべての化学薬品は、Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。
【０１６４】
被験ＢＡは、コール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）およびウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）を含む。
【０１６５】
使用した核内受容体アゴニストは、コレステロール（Ｃｈｏ）、２２−ヒドロキシコレステロール（２２−ＯＨ−ｃｈｏ）、２５−ヒドロキシコレステロール（２５−ＯＨ−ｃｈｏ）、プレグネノロン、プロゲステロン、デキサメタゾン（ＤＸＭ）、（Ｅ）−［（テトラヒドロテトラメチルナフタレニル）プロペニル］安息香酸（ＴＴＮＰＢ）、ファルネソールおよびレチノイン酸（ＲＡ）であった。
【０１６６】
ググルステロン（ＧＧＳ）［トランス−４，１７（２０）−プレグナジエン−３，１６−ジオン］を、ＦＸＲのアンタゴニストとして使用した。
【０１６７】
全ての化合物を、それらの溶解性に従って、水、エタノールまたはジメチルスルホキシドにおいて１０ｍＭのストック溶液として調製した。これらのストック溶液を、完全ＤＭＥＭで使用溶液として１０倍に即時希釈し、エレクトロポレーションの４時間後に細胞培養物に加え、最終的な所望の濃度を得た。
【０１６８】
抗体：ＮＳ４Ａ（２Ｅ３Ｃ２）（Ｆｅｒｒｉｅｕ−Ｗｅｉｓｂｕｃｈ  Ｃ．他、２００６年）、ＮＳ５Ａ（４Ｆ３Ｈ２）（Ｄｅｆｏｒｇｅｓ，Ｓ．他、２００４年）モノクロナール抗体は、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘのご厚意により提供された。ＦＩＴＣ−結合Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、二次抗体として使用した。
【０１６９】
細胞培養：ヒト肝癌細胞系Ｈｕｈ７（Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ  Ｈ．他、１９８２年）またはＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ（Ｑｕｉｎｋｅｒｔ  Ｄ．他、２００５年）の細胞単層を、３７℃において、加湿５％ＣＯ２雰囲気で、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％の非必須アミノ酸、５０Ｕのペニシリン、５０μｇのストレプトマイシン（すべてＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅから入手）および１０％ウシ胎児血清（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、Ａｉｄｅｎｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したダルベッコ変法最小基礎培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）を指す「完全培地」で日常的に増殖させた。ナイーブ細胞を、０．０５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、一週間に二回継代し、１：３から１：５の希釈で播いた。
【０１７０】
レプリコン：３種のサブゲノムレプリコン：それらの遺伝型の起源によりＲ１ａおよびＲ１ｂと呼ばれる２種の複製型、およびＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｒｐ−ｄｅｌ）に変異を有し、それ故複製ができず、全ての実験において陰性対照として使用した、Ｒ１ｂレプリコンの誘導体を、本研究に使用した。それらは、ホタルルシフェラーゼ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）レポーター遺伝子をＨＣＶ  ＩＲＥＳの下流に含むバイシストニックＲＮＡであり、脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳの下流のポリプロテインＮＳ３からＮＳ５Ｂをコードする配列である。レプリコンを作製するために使用したプラスミド構築体のｐＦＫ−Ｉ−３４１−ＰＩ−Ｉｕｃ／ＮＳ３−３’／ＥＴ（２７）（Ｒ１ｂ用）、ｐＦＫ−Ｉ−３４１−ＰＩ−ｌｕｃ／ＮＳ３−３’／ＧＮＤ（Ｒｐ−ｄｅｌ用）およびｐＦＫ−Ｉ−３４１−ＰＩ−Ｉｕｃ／ＮＳ３−３’／Ｈ７７／ＤＲ（Ｒ１ａ）は、Ｒａｌｆ  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した（Ｋｒｏｎｋｅ  Ｊ．他、２００４年；Ｌｏｈｍａｎｎ  Ｖ．他、２００３年）。
【０１７１】
ＨＣＶレプリコンの転写産物を作製するために、プラスミドＤＮＡをまずＡｓｅｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄｓ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｓａｉｎｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＳｃａｌ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍｅｙｌａｎ，Ｆｒａｎｃｅ）により制限した。その後、フェノール−クロロホルムによる抽出およびエタノール沈殿の後で、ＲＮａｓｅを含まない水にＤＮＡを溶解し、ＲｉｂｏＭａｘ  ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ）によるインビトロの転写に使用した。反応混合物は、８０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２４ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのスペルミジン、４０ｍＭのジチオストレイトール（ＤＴＴ）、それぞれ３ｍＭのヌクレオシドトリフォスフェート、５μｇの制限プラスミドＤＮＡおよび１０ＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含んだ。転写を、４時間の間３７℃で実施し、プラスミドＤＮＡμｇ当たり２ＵのＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に、３７℃において、２０分インキュベートして終了した。
【０１７２】
転写産物を抽出し、酸性のフェノール−クロロホルムを用いて精製し、その後イソプロパノールを用いて沈殿させ、ＲＮａｓｅを含まない水に溶解した。ＲＮＡの完全性を、変性アガロースゲル電気泳動により調べ、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、濃度を測定した。
【０１７３】
ＲＮＡの形質移入：レプリコンを、Ｈｕｈ７細胞にエレクトロポレーションにより形質移入した。
【０１７４】
Ｈｕｈ７細胞のサブコンフルエントな単層を培養皿からトリプシン処理によって分離し、完全ＤＭＥＭですすいだ。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて１度洗浄し、計測し、細胞１０７個／ｍＬでＣｙｔｏｍｉｘ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｆｆ，ＭＪ．他、１９９２年）に再懸濁した。４００μＬの細胞懸濁液を、８μｇのＲＮＡ（Ｒ１ａ、Ｒ１ｂまたはＲｐ−ｄｅｌ）と、穏やかにピぺッティングすることにより混合し、０．４ｃｍ幅のエレクトロポレーション用キュベット（ＢｉｏＲａｄ）に移した。混合物を、速やかに２７０Ｖ、９５０μＦおよび最大抵抗において、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、１回の電気パルスに供した。
【０１７５】
エレクトロポレーション後、４００μＬの各細胞懸濁液を９ｍＬの完全ＤＭＥＭで希釈し、２４−ウェルプレート（１ｍＬ／ウェル）に播くまで一緒にプールした。
【０１７６】
ルシフェラーゼアッセイ：細胞を、ＰＢＳで洗浄し、８０μＬの１×ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてプレートから掻き取った。４０μＬの溶解物を、９６ウェルプレートに移し、２００μＬのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。相対光度単位（ＲＬＵ）として表した発光を、シンチレーションカウンター（Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、１０秒間、速やかに測定した。
【０１７７】
データは、３連の培養の平均である。Ｋｒｉｅｇｅｒ他に従って、エレクトロポレーションの４時間後に回収した細胞のルシフェラーゼ活性を、形質移入効率を確定するために使用した（Ｋｒｉｅｇｅｒ  Ｎ．他、２００１年）。この値を、エレクトロポレーションの４時間後に得られた値の相対比率として表した。特に明示しない限り、ＲＬＵ値は、細胞がコンフルエントであった場合、形質移入の７２時間後に確定した。
【０１７８】
ＨＣＶ  ＲＮＡの定量化：エレクトロポレーションを行った細胞を、２５および１００μＭのＤＣＡで６日間処理した、または処理しなかった。全ＲＮＡを、培養細胞から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｓ．Ａ．，Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、製造業者の指示に従って抽出し、分光光度法により２６０ｎｍにおいて定量化した。Ｒｐのマイナス鎖の定量化は、前述のような５’ＨＣＶ非翻訳領域のリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＱ−ＰＣＲ）により実施した（Ｋｏｍｕｒｉａｎ−Ｐｒａｄｅｌ  Ｆ．他、２００４年）。簡潔に言うと、全ＲＮＡの４μＬを、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）逆転写キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＨＣＶ  ５’ＵＴＲのマイナス鎖に特異的なプライマータグＲＣ１（配列番号１、５’  ＧＧＣ  ＣＧＴ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＧＡＡ  ＴＡＡ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＴＡＧ  ＴＡ  ３’）を用いて逆転写し、８分７０℃、その後５分４℃の変性ステップの後、ＲＮＡの鋳型を、６０℃で１時間、７．５ＵのＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素および２０ＵのＲＮａｓｅＯＵＴと共にインキュベートした。転写を、５分９５℃、その後５分４℃でインキュベートすることにより終了させた。２μＬの合成ｃＤＮＡを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍｅｙｌａｎ，Ｆｒａｎｃｅ）で、５ｐｍｏｌのプライマー対タグＲＣ１およびＲＣ２１（配列番号２、５’ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＧＧＧ  ＣＡＣ  ＴＣＧ  ＣＡＡ  ＧＣ  ３’）を使用して、最終容量２０μＬで、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｋｉｔを用いて、リアルタイム定量的ＰＣＲに供した。熱サイクル条件は以下の通りであった：９５℃で１２０秒の初めの変性ステップの後、ＰＣＲは、変性（９５℃で２秒）、アニーリング（６０℃で５秒）および伸長（７２℃で１５秒）の４５サイクルからなった。各ステップに関して、温度遷移速度は、２０℃／秒であり、蛍光観察は各伸長ステップの後に行った。選択されたプライマーにより提供される特異性は、増幅産物の溶融曲線分析によって確認できた。定量化は、外部標準曲線を使用して実施した。
【０１７９】
低分子干渉ＲＮＡ実験：Ｈｕｈ７細胞を、１００ｍｍのペトリ皿に、細胞５．１０６個／皿で播いた。一晩接着させた後、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の形質移入を、１０μｇ／ｍＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００ｎＭのｓｉＲＮＡを含むＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、４時間実施した。その後、培地を新鮮な完全ＤＭＥＭに交換した。一晩インキュベートした後で、Ｒ１ｂを、エレクトロポレーションにより、先に記載したプロトコルに従って形質移入した。ＦＸＲに特異的なｓｉＲＮＡ二重鎖（ｓｉＦＸＲ）は、Ｄｈａｒｍａｋｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（商標）（Ｍ−００３４１４−００−０００５ヒトＮＲ１  Ｈ４）として購入した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼであるＧＡＰＤＨに特異的なｓｉＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から購入し、非特異的効果を試験するための対照として使用した。
【０１８０】
ＲＮＡノックダウンの効率を、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、ＲＴ−ＰＣＲにより調べた。全ＲＮＡを、エレクトロポレーションの４時間後に、ＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して単離した。ＰＣＲのプライマーは、ＦＸＲ用には５’ＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＧＴＧＧＴＡＣＴＣＴＣ３’（配列番号３）、５’ＣＡＴＴＣＡＧＣＣＡＡＣＡＴＴＣＣＣＡＴＣＴＣ３’（配列番号４）、ＧＡＰＤＨ用には、５’ＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ３’（配列番号５）、５’ＣＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧ３’（配列番号６）、内部対照として使用したハウスキーピング遺伝子リボソームＳ１２用には、５’ＧＧＡＧＧＴＧＴＡＡＴＧＧＡＣＧＴＴＡ３’（配列番号７）、５’ＣＴＧＡＧＡＣＴＣＣＴＴＧＣＣＡＴＡＧ３’（配列番号８）であった。ＰＣＲのパラメーターは、２分９４℃の変性後、９４℃で３０秒、５２℃（ＦＸＲおよびＲｉｂＳ１２用）または６０℃（ＧＡＰＤＨ用）で３０秒、７２℃で４５秒を、２５（ＧＡＰＤＨ用）または３０（ＦＸＲおよびＲｉｂＳ１２用）サイクルであった。
【０１８１】
免疫蛍光染色：エレクトロポレーションの３日後、細胞を、８ウェルのチャンバースライドに、細胞５×１０４個／ウェルの濃度で播いた。２４時間後、スライドを、ＰＢＳで洗浄し、２／３アセトン−エタノールで５分間、−２０℃において固定し、その後５０分間、０．２ＭのＰＢＳ−グリシンで遮断した。一次抗体を、０．２ＭのＰＢＳ−グリシンで１：５００に希釈して細胞に加え、１時間、室温においた。ＰＢＳで３回洗浄した後、フルオレセイン結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、０．２ＭのＰＢＳ−グリシンで１：５０に希釈して細胞に加え、４０分間、室温においた。その間に、細胞を、Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて対比染色した。
【０１８２】
ＦＡＣＳ分析：エレクトロポレーションの７２時間後、単一細胞懸濁液を、ＦＡＣＳ分析のために調製した。簡潔に言うと、細胞０．８．１０６個を固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて１５分間室温で膜透過性にした。細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で１：５００に希釈した一次抗体で３０分間染色した。結合モノクロナール抗体を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで１：１００に希釈した二次抗体と共に３０分間、４℃においてインキュベートすることにより検出した。染色細胞をＰＢＳ中で再懸濁した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ３Ｃ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。
【０１８３】
結果
Ｈｕｈ７およびＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔの形質移入細胞におけるＨＣＶ  ＲＮＡの複製についてのＢＡの効果：Ｈｕｈ７細胞をまず、ＢＡの全プールのおよそ２０％に相当する、ヒトの胆汁において見出される主要な二次ＢＡである、ＤＣＡで処理した（Ｋｕｌｌａｋ−Ｕｂｌｉｃｋ  ＧＡ．他、２００４年）。ＤＣＡを、細胞培養培地に、肝炎の際に通常測定される血清ＢＡの濃度に対応する１００μＭの濃度で、加えた（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓ．他、１９９６年）。遺伝型ｌｂレプリコン（Ｒ１ｂ）の複製についての効果を、ＨＣＶ  ＲＮＡのレプリコンの発現に依存した状態でルシフェラーゼ活性を測定することにより、細胞がコンフルエントになるまで、毎日観察した。未処理の細胞と比較して、ＤＣＡ処理した細胞の死亡率が増加しなかったことに気がつかされる。エレクトロポレーションの４時間後、レプリコンＲ１ｂおよび複製欠損対照レプリコン（Ｒｐ−ｄｅｌ）により処理された細胞におけるルシフェラーゼ活性は、非常に似ており、エレクトロポレーションされたＲＮＡの翻訳、したがって形質移入効率を反映していた。それ以降、Ｒｐ−ｄｅｌ処理細胞におけるルシフェラーゼ活性は、継続的に減少し、７２時間には、バックグラウンドレベルに達し、（図１）複製が起こらない場合にルシフェラーゼ活性が消失することが確認された。ＤＣＡ処理Ｒｐ−ｄｅｌ細胞のルシフェラーゼ活性曲線は、未処理Ｒｐ−ｄｅｌ細胞の曲線に正確に重なり、ＤＣＡがＲＮＡの安定性またはＨＣＶタンパク質の半減期を増加しなかったことを暗示する。Ｒ１ｂを形質移入した細胞において、ルシフェラーゼ活性は、はじめは減少し、その後４８時間で安定し、低いレベルで安定を維持する。それに反して、ＤＣＡ処理Ｒ１ｂ細胞のルシフェラーゼ活性は、細胞がコンフルエントになった場合、ＤＣＡ処理後特に７２時間で有意に高く、１５倍の増加を示す。本発明者らはその後、これらの高い複製レベルが、いくらか継代した後に時間と共に維持され得るかどうかを評価したかった。細胞を、それらがコンフルエントになった時に（３または４日毎）分割し、１：３に希釈して再度播いた。ＢＡを、細胞を回復させ、ＢＡの分泌の自然な剰余を刺激するために、それぞれの継代後２４時間に加えた。ルシフェラーゼ活性の高いレベルは、２週間を超えて維持できた（図２）。しかし、ルシフェラーゼ活性は、処理の７２時間後にわずかに増加しただけで、それ故この時点をその後の実験において選択した。
【０１８４】
ＢＡ処理に関して、ルシフェラーゼ活性は、高度に許容な細胞系Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔにおいて、Ｈｕｈ７においてと同じ割合で変化する（データ非掲載）。本発明者らは、その後観察された効果が、複製についての直接の効果であったことを確認したかった。複製率は、Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞において、Ｈｕｈ７細胞におけるより高い（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓ．他、１９９６年）ので、それらの細胞を、ＲＱ−ＰＣＲによる、ＨＣＶ  ＲＮＡのマイナス鎖中間体の定量化に使用した。図３に示すように、ＨＣＶ  ＲＮＡのレベルは、ＤＣＡ処理についてのルシフェラーゼ活性と同じ割合で増加した。
【０１８５】
これらのデータ全体は、ルシフェラーゼ活性のＤＣＡにより誘導された増加は、タンパク質またはＲＮＡの安定からではなく、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製の上方制御からもたらされることを示唆する。
【０１８６】
ＢＡの効果は、核内受容体ＦＸＲにより仲介される：用量応答実験を、その後主な一次および二次ＢＡ（それぞれ、ＣＤＣＡおよびＤＣＡ）の遊離型（疎水性）および抱合型（水溶性）を用いて実施した（図４Ａ）。ＢＡを、健康な個体の血清において観察される濃度（およそ５から１０μＭ）、または慢性胆汁うっ滞性肝炎の際に観察される濃度（およそ１００μＭ）で加えた（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓ．他、１９９６年）。ルシフェラーゼ活性についての遊離のＤＣＡおよびＣＤＣＡの効果は、用量応答であり、いくらかの特異的活性は、ＣＤＣＡに関しては１０μＭほどの低い濃度でもすでに検出可能であり、１００μＭで最大濃度に達する。より高い濃度（２００μＭを超える）は、レプリコンを形質移入した細胞にとっては有害であった（非掲載）。ＣＤＣＡは、ＤＣＡより効果的にＨＣＶ  ＲＮＡの複製を上方制御すると思われた。３０を超える同様の実験の結果は、これらの遊離のＢＡの明確に高い効果を常に示した。１００μＭのＣＤＣＡを用いて処理したＲ１ｂのＨｕｈ７またはＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞におけるルシフェラーゼ活性は、基礎レベルの１０から２０倍で一定であった。それに反して、グリコ−、またはタウロ−抱合誘導体は、効果が観察されない、または非常にわずかな効果のみが観察できた。抱合型または遊離のＢＡの両方とも、細胞膜受容体ＴＧＲ５に結合するが、遊離のＢＡのみが、肝癌細胞系において発現しない活性化核内受容体である特定の輸送体の存在なしに細胞膜を越えられる（Ｂｒｏｗｎ  ＭＳ．他、１９９７年）。したがって、遊離ＢＡ型に限定されたＢＡのＨＣＶ  ＲＮＡの複製についての効果は、核内受容体により仲介される機序を示唆する。
【０１８７】
ＢＡ、ステロールおよび脂肪酸は、肝臓および腸において発現する核内受容体のＮＲ１ファミリーの天然のリガンドに構造的に関連がある。ナノモル範囲で標準ステロイド受容体を活性化する内分泌分子とは反対に、これらの受容体のリガンド（ＢＡ、脂質およびステロイド）は、高濃度で生理学的に存在し（μＭ範囲）（Ｆｒａｎｃｉｓ  ＧＡ．他、２００３年）、それらの受容体を、１０〜１５μＭのＥＣ５０が活性化する（Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＡ．他、２００２年）。本研究に使用したＮＲ１アゴニストの濃度は、Ｐａｒｋｓ他、の研究（Ｐａｒｋｓ  ＤＪ．他、１９９９年）に従って選択し、顕微鏡観察およびトリパンブルーを用いた色素排除試験（Ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）による評価の後で、Ｈｕｈ７細胞に細胞毒性を示さなかった最も高い濃度であった。ＢＡは、ＦＸＲのための天然のリガンドとして、近年記載された（Ｍａｋｉｓｈｉｍａ  Ｍ．他、２００２年；Ｐａｒｋｓ  ＤＪ．他、１９９９年）。ＢＡが、ＦＸＲを介してＨＣＶ  ＲＮＡの複製に関するこれらの効果を仲介したかどうかを調べるために、本発明者らは、超生理学的濃度でＦＸＲを活性化する先に記載した２種のＦＸＲリガンド、つまりファルネソールおよび合成レチノイドのＴＴＮＰＢをそれぞれ１０μＭで、およびＣＡ、ＬＣＡおよびＵＤＣＡなどの他のＢＡを全て１００μＭの濃度で含む、ＦＸＲリガンドのパネルを試験した（図４Ｂ）。本発明者らは、ＣＤＣＡが最も有力な活性因子であり、続いて二次ＢＡであるＤＣＡおよびＬＣＡが有力であることを見出した。ＣＡおよびＵＤＣＡは、ほんのわずかな活性を示した。ルシフェラーゼ活性もまた、ファルネソールおよびＴＴＮＰＢによりわずかに増加した。これらの結果は、全てのＦＸＲアゴニストが、ＨＣＶの複製を増強できることを示唆する。ＨＣＶの複製についての活性のプロフィールは、ＦＸＲの活性化に関して公になっているリガンドのパターンに非常に類似しており（Ｍａｋｉｓｈｉｍａ  Ｍ．他、２００２年）、ＦＸＲが、Ｈｕｈ７細胞においてＨＣＶ  ＲＮＡの複製についてのＢＡの効果を仲介する受容体であることを示唆する。
【０１８８】
ＬＣＡもまた、ＰＸＲのためのリガンドであるので、本発明者らは、ＰＸＲを活性化することが示されている、プレグネノロン（１０μＭ）、プロゲステロン（５μＭ）、デキサメタゾン（合成グルココルチコイド）（１０μＭ）を含む天然発生のステロイドを試験した（Ｇｏｏｄｗｉｎ  Ｂ．他、２００３年）。これらの化合物はどれも、ルシフェラーゼ活性の上方制御を少しも誘導しなかった。他の核内受容体との交差反応の可能性をさらに排除するために、本発明者らは、肝臓Ｘ受容体であるＬＸＲのためのリガンドであるオキシステロール（コレステロール（１０μＭ）、２２−ヒドロキシコレステロール（５μＭ）または２５−ヒドロキシコレステロール（１μＭ））などのＮＲ１ファミリーの受容体に結合することが既知の、構造的に関連した化合物を試験した。それらはいずれも、複製についての効果を少しも示さなかった。これらの受容体のヘテロダイマーパートナーであるＲＸＲの９−ｃｉｓ−レチノイン酸による活性化すらも示さなかった。
【０１８９】
それ故、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製は、ファルネソイド核内受容体であるＦＸＲのアゴニストによる上方制御である。
ＦＸＲの阻害により、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製が減少される：本発明者らは、次に、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製についてのＢＡの効果が、ＦＸＲのアンタゴニストにより遮断できるかどうかを疑問に思った。ググルステロン（ＧＧＳ）は、インディアン・ググルツリー（コミフォラ・ムクル）から抽出される天然のステロールであり、これはマイクロモル範囲でＦＸＲに拮抗する（Ｕｒｉｚａｒ  ＮＬ．他、２００２年）。ＧＧＳを、細胞培養物に加えた場合、ＣＤＣＡの効果は用量依存的な形で阻害された（図５Ａ）。同様の結果を、ＤＣＡで処理した細胞に関しても得ることができた（データ非掲載）。明らかにＧＧＳは、ＢＡの刺激無しに、ＨＣＶの基礎複製をさらに阻害できた。胆汁塩排泄ポンプのプロモーターに推進されるルシフェラーゼ構築体を有するＨｅｐＧ２細胞におけるトランス活性化アッセイにおいて、ＧＧＳ単独ではＦＸＲの活性に効果はなかったことは興味深い（Ｕｒｉｚａｒ  ＮＬ．他、２００２年）。これは、細胞のＢＡ合成およびＢＡの細胞内含有量による可能性がある、Ｈｕｈ７細胞におけるＦＸＲの基礎活性と思われる。ＦＸＲ活性の基礎レベルは、他の関連プロモーターを活性化するために十分であり得（Ｌａｆｆｉｔｔｅ  ＢＡ．他、２０００年）、したがって外因性のＦＸＲの活性化が存在しない場合のＧＧＳの阻害に感受性がある。基礎活性の半分（ＩＣ５０）の減少を起こす阻害濃度は、およそ２μＭであり、これはＦＸＲの特異的阻害の範囲内である（Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ  Ｈ．他、１９８２年）。２０μＭのＧＳＳは、複製をほぼ全て阻害した（９５％まで）。より高い濃度（４０μＭ）は、レプリコンを形質移入した細胞にとって有害であった。
【０１９０】
ＧＧＳが、いくつかの他のステロイド受容体のための高親和性リガンドであったことが最近公開された（Ｂｕｒｒｉｓ  ＴＰ．他、２００５年）。本発明者らは、ＦＸＲ遺伝子サイレンシング実験を実施することにより、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製の調節におけるＦＸＲの役割をさらに確認した。エレクトロポレーションおよびＢＡの添加の２４時間前に、Ｈｕｈ７細胞にｓｉＲＮＡ二重鎖を形質移入し、ＦＸＲまたはＧＡＰＤＨの遺伝子サイレンシングを誘導した。図５Ｂに示したように、ＣＤＣＡの活性は、エレクトロポレーションの３日後に、有意に７７％減少した（スチューデントｔ検定、ｐ＝０．０００１）。ｓｉＲＮＡの効率は、ＦＸＲおよびＧＡＰＤＨの転写産物のＲＴ−ＰＣＲ分析により、それらの形質移入の４８時間後に確認した（図５Ｃ）。全体として、これらの結果は、この受容体の特異的拮抗作用が、外来性ＢＡを添加しなくてもＨＣＶ  ＲＮＡの複製を阻害できることを示唆している。
【０１９１】
ＦＸＲ調節因子は、ＨＣＶタンパク質の発現を修飾する：その後本発明者らは、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製の調節が、タンパク質の発現における調節と相関したかどうかを調査した。この目的のために、本発明者らは、ＦＸＲ調節因子の効果を、非構造タンパク質であるＮＳ４ａおよびＮＳ５ａを免疫標識することによって、個々の細胞レベルで調べた。Ｒｐ−ｄｅｌ形質移入細胞を、陰性対照として使用した。これらの対照細胞において複製は起こらないので、ＨＣＶタンパク質は培養の３日後にも検出されなかった。これに反して、細胞においては複製が起こり（すなわち、Ｒ１ｂが形質移入された）、有意な数の陽性細胞が、抗ＮＳ４ａまたは抗ＮＳ５ａ抗体のどちらかと共に検出できた。これらの陽性細胞を、ＮＳ５ａ標識のＦＡＣＳ分析により定量化し、２２％であった。ＣＤＣＡ処理培養物は、陽性細胞の数において中程度の増加（２７％）のみを示したが、陽性細胞における平均蛍光強度は実質的に１６から３９に増加した。これらの結果は、レプリコンを含有する細胞の繁殖における増加ではなく、大部分は感染細胞内の複製およびゲノムの発現の増加であることを示唆した。再度ＧＧＳは、ほぼ完全にＮＳ４ａおよびＮＳ５ａの発現を破壊し、処理の３日後には残存する陽性細胞がわずか４％であり、これらの細胞における蛍光強度は非常に弱かった。このことは、ＦＸＲのアンタゴニストが、感染細胞においてＨＣＶのクリアランスの達成に役立っていた可能性を示唆する。
【０１９２】
ＩＦＮおよびＦＸＲの調節因子は、独立してＨＣＶ  ＲＮＡの複製に作用する：ＢＡが、２’５’オリゴアデニル酸シンターゼ活性（ＯＡＳ）を阻害することにより、ＩＦＮシグナル伝達経路を調節できたこと（Ｐｏｄｅｖｉｎ  Ｐ．他、１９９９年）およびそれらがＩＦＮにより誘導されるＳＴＡＴ１のリン酸化を下方制御し、それ故、ＰＥＣの複製が可能であることが提唱されたこと（Ｃｈａｎｇ  ＫＯ．他、２００４年）が示唆されてきたので、本発明者らは、ＢＡによるＨＣＶ  ＲＮＡの上方制御もまた、本発明者らの系におけるＩＦＮ活性に対する干渉により起こるのかどうか疑問に思った。この疑問に対処するために、本発明者らは、Ｒ１ｂ形質移入細胞を、０から５０Ｕ／ｍＬの濃度範囲のＩＦＮを用いて、ＣＤＣＡ処理と併せて、またはＣＤＣＡ処理はせずに処理した。
【０１９３】
ＣＤＣＡの存在下で期待されたように、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製は、未処理細胞におけるよりも非常に大幅に上昇した（図６）。それにもかかわらず、ＢＡ未処理細胞に関しては、ＩＦＮ処理は、この複製を依然として徐々に阻害できた。両方の条件において、ＩＦＮ処理は、０．１Ｕ／ｍＬから有効になり始め、ＩＣ５０は、非常に近い（それぞれ０．２５Ｕ／ｍＬおよび０．３Ｕ／ｍＬ）。したがって、ＢＡは、ＩＦＮ−αの活性に影響を与えていない。ＢＡによるＨＣＶ  ＲＮＡの複製の上方制御は、これらの細胞において、ＩＦＮ経路の阻害に関して独立している。
【０１９４】
さらに、１０μＭのＧＧＳと、所与の濃度のＩＦＮとを合わせることにより、ルシフェラーゼ活性をさらに約１０倍減少させることができた。９０％の複製阻害が、０．９Ｕ／ｍＬのＩＦＮを、ｍｏｃｋおよびＣＤＣＡ処理細胞に用いることで達成できた。ＧＧＳの１０μＭを培養物に加えた場合、同じレベルの阻害が、わずか０．１（ｍｏｃｋ）または０．２Ｕ／ｍＬ（ＣＤＣＡ）のＩＦＮを用いて達成できた。それ故、ＩＦＮおよびＧＧＳの効果は独立していると思われた。それ故、ＦＸＲは、ＳＶＲ率の上昇またはＩＦＮ毒性二次効果の減少のどちらかを行う、ＩＦＮと組み合わせた抗ＨＣＶ治療に関する標的として予測できた。
【０１９５】
異なるＨＣＶ遺伝型についてのＦＸＲ調節の比較効果：今まで本研究に使用したＣｏｎ１−遺伝型ｌｂレプリコンは別として、１つの他の遺伝型に由来する１つの他のレプリコンが開発された。Ｈ７７株に由来する遺伝型ｌａレプリコンは、Ｈｕｈ７−ＬｕｎｅｔまたはＨｕｈ７．５などの高度に許容な細胞系を、複製のために必要とする（Ｂｌｉｇｈｔ  ＫＪ．他、２００２年。これらのレプリコンもまた、ＦＸＲの調節に感受性であるかどうかを評価するために、Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞に、Ｒ１ｂおよびＲ１ａを並行して形質移入し、ＦＸＲのアゴニストとしてＣＤＣＡ、またはＦＸＲのアンタゴニストとしてＧＧＳを用いて処理した（図７）。遺伝型ｌａレプリコンは、ＦＸＲの調節に対する応答において、処理後７２時間で遺伝型１ｂと同じ挙動を示した。
【０１９６】
考察：
細胞を、生理的および病理学的な濃度のＢＡを用いて処理することにより、ＨＣＶの５’非翻訳領域の制御の下で、ルシフェラーゼ遺伝子を担持する遺伝型１のバイシストロニック  サブゲノム  ＨＣＶ  レプリコンを含有する細胞において、ルシフェラーゼ活性が非常に、１０倍を超えるまでに増強された。ＲＮａｓｅに対する保護などの、ＢＡによるレプリコンの安定効果の可能性を除いて、複製欠損レプリコンについてはＢＡの効果は見られなかった。ＢＡ処理の後で、ルシフェラーゼ活性変化と同じ割合での、ＨＣＶ  ＲＮＡのマイナス鎖の数の直接の増加、強制的複製仲介もまた観察された。それ故、遺伝型１のＨＣＶのサブゲノムレプリコンの複製は、Ｈｕｈ７細胞系においてＢＡ誘導性経路により高度に刺激されると思われた。細胞膜を自由に超えられる非抱合ＢＡのみが、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製を調節でき、機序が核内受容体に依存することを示唆する。実際に、遊離のＢＡの中で、ＦＸＲのリガンドのみが、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製について活性であり、一方、ＦＸＲのアンタゴニストであるＧＧＳおよびｓｉＲＮＡによるＦＸＲの無効化により、ＢＡ誘導性のＨＣＶ  ＲＮＡの複製が無効になった。さらに、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製の基礎レベルでさえ、外来性ＢＡの不在の下、ＧＧＳにより阻害され、活性化ＦＸＲの基礎細胞レベルが、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製を維持するために必要であることを示唆する。
【０１９７】
これらの結果は、少なくとも遺伝型１のＨＣＶ  ＲＮＡの複製に必要なＦＸＲに依存する、ＢＡシグナル伝達系を特定するものである。この経路をさらに特徴付けるために、本発明者らは、この経路とインターフェロン１型の抗ウィルス活性との関連の可能性を問うた。実際に、抱合および非抱合のＢＡ両方による細胞膜受容体ＴＧＲ５の活性化は、細胞内ｃＡＭＰレベルを増加させる、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路を活性化し、１型ＩＦＮによるＳＴＡＴ１のリン酸化を阻害する（Ｃｈａｎｇ  ＫＯ．他、２００４年）。ＢＡは、ＴＧＲ５の刺激を介したブタ腸内ウィルスの複製のために、インビトロで必要とされることが示された。しかし、本研究において、抱合ＢＡの効果がなければ、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製の調節においてＴＧＲ５の役割は与えられそうになかった。さらに、ＢＡ、さらにより具体的には非抱合ＣＤＣＡが、肝癌細胞系においてＩＦＮシグナル伝達経路の異なるステップを調節でき、ＯＡＳ、ＭｘＡおよびＩＦＮ応答の主要なタンパク質であるＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼであるＰＫＲの発現の誘導および活性化を阻害することが提唱されている（Ｐｏｄｅｖｉｎ  Ｐ．他、１９９９年）。ＨＣＶ  ＲＮＡの複製についてのＢＡの効果は、未処理細胞においてと同様に、ＣＤＣＡ処理細胞において活性であった、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製を抑制するためのＩＦＮ処理の有効性を、ＣＤＣＡが阻害しなかったので、ＩＦＮの調節から独立していると思われた。したがって、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製のＦＸＲ依存性活性化は、ＩＦＮの抗ウィルス活性の阻害に頼ってはいない。
【０１９８】
コレステロールは、肝臓によるＢＡ合成の第１ステップを調節するコレステロール７ａ−ヒドロキシラーゼＣＹＰ７Ａ１によって、ＢＡに分解される。ＢＡの細胞内レベルにより、２つの機序を介したこの酵素に関するネガティブフィードバックによって、コレステロールの分解が制御される。まず、ＦＸＲのＢＡ誘導性活性化により、スモールヘテロダイマーパートナー（ＳＨＰ）の発現が調節され、これにより、その後７ａヒドロキシラーゼＣＹＰ７Ａ１プロモーターが抑制される（Ｇｏｏｄｗｉｎ  Ｂ．他、２００３年）。ネガティブフィードバックの第２の機序はＪＮＫ経路であることが暗示され、ＳＨＰおよびＦＸＲから独立している（Ｌｉ  Ｔ．他、２００６年）。コレステロールの分解を遮断することは、細胞のコレステロール負荷を増加させるはずであると思われる。高レベルのコレステロールは、順に、コレステロール及び非ステロールのイソプレノイド産物を産生するメバロン酸経路の第１酵素であるＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼを、小胞体膜内にその転写活性因子のＳＲＥＢＰ−１を維持することによって、下方制御する（Ｂｒｏｗｎ  ＭＳ．他、１９９７年）。さらに、ＦＸＲのＢＡ誘導性活性化もまた、ＳＲＥＢＰ−１ｃの発現を減少させる（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｍ．他、２００４年）。それ故、細胞をＢＡで処理することにより、いくつかの機序を介してＳＲＥＢＰ活性が抑制され、続いてメバロン酸経路が阻害され、ゲラニルゲラニオールを含むイソプレノイドのプールが少なくなる。ＨＣＶ  ＲＮＡの複製は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤であるスタチンによって阻害される（Ｉｋｅｄａ  Ｍ．他、２００６年、Ｋａｐａｄｉａ  ＳＢ．他、２００５年、Ｙｅ  Ｊ．他、２００３年）。スタチンのＨＣＶ  ＲＮＡの複製についての阻害剤効果は、メバロン酸の添加により、およびより強力にはゲラニルゲラニオールの添加により救済することができる。実際に、Ｆｂｌ２のプレニル化、すなわち、システインチオエステルの形成を介したゲラニルゲラニオールの共有結合が、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に必要とされることが示された（Ｗａｎｇ  Ｃ．他、２００５年）。ＢＡが、タンパク質のプレニル化の修飾を介して作用していた場合、それらは、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製を助けるのではなく、その複製を減少させることになる。この仮定に一致して、ＢＡ処理細胞は、感受性を維持し、ゲラニルゲラニオールの添加に対して、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に関して未処理細胞よりもさらにより感受性であった（データ非掲載）。興味深いことに、スタチンは、ＲＮＡおよびタンパク質のレベルの両方でＦＸＲの発現を減少させ、そのＤＮＡ結合活性を下方制御する（Ｈａｂｅｏｓ  Ｉ．他、２００５年）。それ故、スタチンによるＨＣＶ  ＲＮＡの複製の阻害もまた、ＦＸＲの下方制御に一部関連している可能性がある。
【０１９９】
コレステロールおよびＢＡ合成経路の調節に加えて、ＦＸＲは、脂質およびトリクリセリドの代謝の他の多くの遺伝子をさらに制御する（Ｋａｌａａｎｙ  ＮＹ．他、２００６年）。これらの細胞内脂質の修飾により、細胞膜の脂質組成を修正できる。いくつかのグループがＨＣＶ  ＲＮＡの複製は、コレステロールおよびスフィンゴリピドに富んだ膜ミクロドメインである脂質ラフトドメイン内で起こることを立証しているので、このような修飾は、ＨＣＶの複製に有利に働く（Ａｉｚａｋｉ  Ｈ．他、２００４年）。興味深いことに、最近、ＦＸＲのＢＡ依存性活性化が、正常な肝臓の再生に必要とされることが示された（Ｈｕａｎｇ  Ｗ．他、２００６年）。ＢＡレベルの上昇は肝臓の再生を加速し、レベルの低下は部分的肝切除後の肝臓の成長を阻害する。ＦＸＲは、恒常性を、適切な代謝標的遺伝子の発現を制御することによってのみではなく、ホメオトロフィック（ｈｏｍｅｏｔｒｏｐｈｉｃ）な肝臓の成長を駆動することによっても促進することが提唱された。ＨＣＶの複製は、細胞増殖に依存するので（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ  Ｔ．他、２００１年）、ＢＡは、ＦＸＲの活性化を介して肝臓の成長を促進することによって、ＨＣＶの複製をさらに刺激する可能性がある。
【０２００】
ＢＡは、肝臓において、高濃度で見出される天然のリガンドである。被験ＢＡのなかでも、ＣＤＣＡは、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製について最も大きな活性を示した。ＢＡのレベル、特に一次ＢＡであるＣＤＣＡのレベルは、慢性肝炎において増強される。これらの肝臓において、ＣＤＣＡは、全ＢＡの６０％を占める（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓ．他、１９９６年）。高レベルのＢＡを有する患者、特に掻痒を有する患者は、抗ウィルス療法に対してあまり応答しない（Ｊｏｒｑｕｅｒａ  Ｆ．他、２００５年、Ｌｅｂｏｖｉｃｓ  Ｅ．他、１９９７年）。この問題は、ナチュラルキラー細胞についてのＣＤＣＡの免疫抑制効果によって一部説明できる（Ｈｉｒａｔａ  Ｍ．他、２００２年）ことが提唱された。ＨＣＶ  ＲＮＡの刺激に依存するＦＸＲのＢＡ誘導性活性化から、治療のためのＳＶＲに対する高レベルのＢＡの陰性適中率についてのより率直な説明がもたらされる。ＢＡの陰性適中率は、特定のＨＣＶの遺伝子型には相関していないように見える（Ｊｏｒｑｕｅｒａ  Ｆ．他、２００５年）。
【０２０１】
腸細胞は、ＨＣＶのための保有および複製部位であることが提唱されている（Ｂｌｉｇｈｔ  ＫＪ．他、２００２年、Ｄｅｆｏｒｇｅｓ  Ｓ．他、２００４年）。ＢＡの腸−肝循環は、腸細胞を高濃度のＢＡに曝す。ＦＸＲはまた、腸において発現するので、（Ｆｏｒｍａｎ  ＢＭ．他、１９９５年）、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製を刺激するＦＸＲ依存性ＢＡシグナル伝達経路は、腸がＨＣＶの血漿ウィルス量、特にカイロミクロン様粒子に関連するウィルスの循環に関して貢献しているという仮定をさらに強固にしている（Ｄｉａｚ  Ｏ．他、２００６年）。
【０２０２】
それ故本研究は、ＦＸＲが、少なくともＨｕｈ７細胞における高度のＨＣＶ  ＲＮＡの複製、および遺伝型１のレプリコンにとって重要であることを立証した。それ故、ＦＸＲは、特にそれらの複製のために高レベルのＢＡを得る遺伝型１に感染した患者のための、抗ＨＣＶ療法のための治療標的として予測され得る。さらに、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製のＦＸＲ依存性刺激は、ＩＦＮの作用から独立しているように思われたので、それ故ＦＸＲのアンタゴニストは、ＩＦＮの投与量を低下させ、したがってＩＦＮの有害な二次効果を減少させるため、または標準的療法プロトコルの後のＳＶＲの比率を増加させるためのどちらかに使用できるであろう。
【０２０３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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