(57)【要約】  本発明は、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤である新規の化合物、並びに糖尿病及びそれと関連する他の症状の治療でのその使用に関する。更に、本発明は、該化合物を含有する医薬組成物、並びに該化合物及び医薬組成物を調製する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iの化合物
【化１】
2010540553.tif 000011
又はその塩、溶媒和物若しくは生理学的に機能性の誘導体。
【請求項２】
立体化学が、式IAで示されるものである、請求項1に記載の化合物。
【化２】
2010540553.tif 000012
【請求項３】
請求項1又は2に記載の化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体を含む、医薬組成物。
【請求項４】
請求項1又は2に記載の化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体及び一種又は複数の賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項５】
錠剤又はカプセルの形態の請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
請求項1又は2に記載の化合物、その製薬上許容される塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体及び少なくとも一種の賦形剤を含む医薬組成物を、哺乳動物に投与することを含む治療方法であって、前記治療が、糖尿病及び糖尿病と関連する症状からなる群から選択される疾患又は症状のためのものである、治療方法。
【請求項７】
前記糖尿病と関連する症状が、肥満、X症候群、インスリン抵抗性、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、高血糖症、高コレステロール血症、高インスリン血症、高脂血症、心血管疾患、発作、アテローム性動脈硬化症、リポタンパク質異常、高血圧、組織虚血、心筋虚血及び抑鬱からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
前記治療が、糖尿病のためのものである、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
活性な治療物質として使用するための、請求項1又は2に記載の化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体。
【請求項１１】
治療に使用するための、請求項1又は2に記載の化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体。
【請求項１２】
哺乳動物における、糖尿病、肥満、X症候群、インスリン抵抗性、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、高血糖症、高コレステロール血症、高インスリン血症、高脂血症、心血管疾患、発作、アテローム性動脈硬化症、リポタンパク質異常、高血圧、組織虚血、心筋虚血及び抑鬱からなる群から選択される疾患又は症状の治療に使用するための、請求項1又は2に記載の化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体。
【請求項１３】
糖尿病の治療に使用するための、請求項12に記載の化合物。
【請求項１４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項12に記載の化合物。
【請求項１５】
以下の工程、
a.  4-クロロ-2-ニトロベンゾエート及び[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]ボロン酸の、4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]-2-ニトロ安息香酸メチルへの変換、
b.  4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]-2-ニトロ安息香酸メチルの、4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]-2-ニトロ安息香酸への変換、
c.  4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]-2-ニトロ安息香酸の、メチルO-(1,1-ジメチルエチル)-N-({4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]-2-ニトロフェニル}カルボニル)-L-トレオニネートへの変換、
d.  メチルO-(1,1-ジメチルエチル)-N-({4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]-2-ニトロフェニル}カルボニル)-L-トレオニネートの、メチルN-({2-アミノ-4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]フェニル}カルボニル)-O-(1,1-ジメチルエチル)-L-トレオニネートへの変換、
e.  3,5-ジメチル-4-ニトロ安息香酸の、(3,5-ジメチル-4-ニトロフェニル)メタノールへの変換、
f.  (3,5-ジメチル-4-ニトロフェニル)メタノールの1,3-ジメチル-5-[(メチルオキシ)メチル]-2-ニトロベンゼンへの変換、
g.  1,3-ジメチル-5-[(メチルオキシ)メチル]-2-ニトロベンゼンの2,6-ジメチル-4-[(メチルオキシ)メチル]アニリンへの変換、
h.  2,6-ジメチル-4-[(メチルオキシ)メチル]アニリンの2-イソシアナト-1,3-ジメチル-5-[(メチルオキシ)メチル]ベンゼンへの変換、
i.  メチルN-({2-アミノ-4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]フェニル}カルボニル)-O-(1,1-ジメチルエチル)-L-トレオニネート及び2-イソシアナト-1,3-ジメチル-5-[(メチルオキシ)メチル]ベンゼンの、メチルO-(1,1-ジメチルエチル)-N-({2-{[({2,6-ジメチル-4-[(メチルオキシ)メチル]フェニル}アミノ)カルボニル]アミノ}-4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]フェニル}カルボニル)-L-トレオニネートへの変換、並びに
j.  メチルO-(1,1-ジメチルエチル)-N-({2-{[({2,6-ジメチル-4-[(メチルオキシ)メチル]フェニル}アミノ)カルボニル]アミノ}-4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]フェニル}カルボニル)-L-トレオニネートの、O-(1,1-ジメチルエチル)-N-({2-{[({2,6-ジメチル-4-[(メチルオキシ)メチル]フェニル}アミノ)カルボニル]アミノ}-4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]フェニル}カルボニル)-L-トレオニンへの変換
を含む、請求項1又は2に記載の化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤化合物、該化合物の医薬組成物、該化合物又はそれを含有する医薬組成物の糖尿病、糖尿病と関連する症状、及び／又は心筋虚血を含む組織虚血の治療での使用、並びに該化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の治療は、世界の大部分で依然として健康上の問題である。望ましくない副作用が最小限である経口摂取薬が、インスリン自己注射よりも望まれている。より良好で、副作用が少なく、長時間作用する又は異なる機構を介して作用する薬剤が、なおも必要とされている。
【０００３】
数種の薬剤が、糖尿病の治療に利用可能である。これらとしては、注射型インスリン、並びに経口摂取されるスルホニル尿素、グリピジド、トルブタミド、アセトヘキサミド、トラジミド、ビグアニド及びメトホルミン(グルコファージ)等の薬剤が挙げられる。インスリン自己注射は、経口摂取薬が有効でない糖尿病患者に必要とされる。1型糖尿病(インスリン依存性糖尿病とも呼ばれる)を有する患者は、通常、インスリンを自己注射することにより治療される。2型糖尿病(インスリン非依存性糖尿病とも呼ばれる)を患っている患者は、通常、食事療法、運動及び経口薬を組み合わせて治療される。経口薬が効かない場合、インスリンを処方し得る。糖尿病薬を経口摂取するとき、通常、1日複数回の投与が必要とされる場合が多い。
【０００４】
インスリンの適切な投与量の決定には、患者の尿中及び/又は血中の糖レベルを頻繁に試験する必要がある。過剰量のインスリンの投与は一般に、血中グルコースの軽度な異常から昏睡、更には死に及ぶ症状を有する低血糖を引き起こす。経口摂取薬も同様に望ましくない副作用がないわけではない。例えば、このような薬剤は、患者によっては効果がなく、胃腸障害を起こし、又は他の患者においては正常な肝機能を低下させる恐れがある。副作用が少ない改良された薬剤、及び/又は他が失敗した場合でもうまく機能する薬剤が常に必要とされている。
【０００５】
2型糖尿病、すなわちインスリン非依存性糖尿病では、肝グルコース産生が、重要な標的である。肝臓は、空腹状態における血漿グルコース濃度の主なレギュレーターである。2型糖尿病患者における肝グルコース産生速度は、非糖尿病患者と比較して、通常有意に上昇している。2型糖尿病患者に関しては、摂食又は食後の状態では、肝臓が総血漿グルコース供給において果たす役割は比例して低く、肝グルコース産生は異常に高い。
【０００６】
肝臓は、グリコーゲン分解(グルコースポリマーグリコーゲンの分解)及びグルコース新生(2-及び3-炭素前駆体からのグルコースの合成)によりグルコースを産生する。したがって、グリコーゲン分解は、肝グルコース産生の妨害のための重要な標的である。グリコーゲン分解が、2型糖尿病患者における不適切な肝グルコースの生産に寄与し得ることを示唆するいくつかの証拠がある。肝グリコーゲン蓄積症、例えばエルス病又はグリコーゲンホスホリラーゼ欠損症を有する患者は、一過性低血糖を示す場合が多い。更に、吸収後の正常なヒトでは、肝グルコース産生の最大約75%は、グリコーゲン分解から生じると推定されている。
【０００７】
グリコーゲン分解は、酵素グリコーゲンホスホリラーゼの組織特異的アイソフォームにより肝臓内、筋肉内及び脳内で行われる。この酵素は、グリコーゲン高分子を切断し、グルコース1-リン酸及び短縮型グリコーゲン高分子を放出する。
【０００８】
グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤としては、グルコース及びその類似体、カフェイン及び他のプリン類似体、様々な置換基を有する環状アミン、アシル尿素、並びにインドール様化合物が挙げられる。これらの化合物及びグリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤は、一般に、肝グルコース産生を減少させ、血糖を低下させることによる、2型糖尿病の治療における潜在的使用が主張されてきた。更に、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤は、血中グルコース濃度に感受性であることが望ましいと考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、所望されるのは、糖尿病及び/又は糖尿病と関連する症状の治療のための新しい化合物及びそれを含有する医薬組成物である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、式Iの化合物、
【化１】
2010540553.tif 000002
【００１１】
その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体を提供する。
【００１２】
式Iの化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体を含む医薬組成物も提供される。
【００１３】
更に、式Iの化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体、及び一種又は複数の賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００１４】
それに加えて更に、式Iの化合物、その製薬上許容される塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体、及び少なくとも一種の賦形剤を含む医薬組成物を哺乳動物、特にヒトに投与することを含む治療方法であって、前記治療が、糖尿病、糖尿病と関連する症状、及び心筋虚血を含む組織虚血からなる群から選択される疾患又は症状のためのものである、治療方法が提供される。
【００１５】
更に、(治療方法で)活性治療物質として使用するための式Iの化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体が提供される。哺乳動物、特にヒトにおける糖尿病、糖尿病と関連する症状、及び/又は心筋虚血を含む組織虚血の治療で使用するための式Iの化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体も提供される。
【００１６】
式Iの化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体を調製する方法も提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
筋肉組織におけるグリコーゲンホスホリラーゼの活性は、グルコースの産生、続いてエネルギー需要に重要である。運動時の筋グリコーゲンホスホリラーゼの阻害により、筋力低下及び筋肉組織の損傷に至る恐れがある。したがって、哺乳動物に経口投与された際、筋肉と比較して、肝臓中のグリコーゲンホスホリラーゼに対して大きな効果を示す、本発明の化合物を用いることが望ましい可能性がある。本発明の化合物は、経口投与後、肝グリコーゲン量に対して強い効果を示すが、筋グリコーゲンの量及び機能に対してほとんど効果を示さない。結果的に、本発明の化合物は、強力なインビボ活性を示し、許容できる溶解性及びバイオアベイラビリティを有し、かつ肝組織に対するその選択性から見て、改善された安全性/毒性プロファイルを有することができよう。
【００１８】
本発明は、式Iの化合物、
【化２】
2010540553.tif 000003
その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体を提供する。式Iの化合物の化学名は、O-(1,1-ジメチルエチル)-N-({2-{[({2,6-ジメチル-4-[(メチルオキシ)メチル]フェニル}アミノ)カルボニル]アミノ}-4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]フェニル}カルボニル)トレオニンである。
【００１９】
式Iの化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体は、立体異性体として存在し得る(例えば一つ又は複数の不斉炭素原子を含有する)。個々の立体異性体(鏡像異性体及びジアステレオマー)及びそれらの混合物は、本発明の範囲内に含まれる。また、本発明は、式Iにより表される化合物(塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体)の個々の異性体の、一つ又は複数のキラル中心が反転されているその異性体との混合物も包含する。同様に、式Iの化合物(塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体)が、該式で示されるもの以外の互変異性体で存在し得、これらも本発明の範囲内に含まれることが理解される。本発明が上に定義された特定の群の全ての組合せ及びサブセットを含むことを理解されたい。本発明の範囲は、立体異性体の混合物、並びに精製鏡像異性体又は鏡像的/ジアステレオマー的に富化された混合物を含む。式Iにより表される化合物の個々の異性体、並びにその任意の全て又は一部が平衡化された混合物も本発明の範囲内に含まれる。本発明はまた、該式により表される化合物、塩、溶媒和物又は誘導体、並びに一つ又は複数のキラル中心が反転されているその異性体との混合物も含む。本発明が上に定義された特定の群の全ての組合せ及びサブセットを含むことを理解されたい。
【００２０】
化合物の好ましい立体化学を、以下の式IAに示す：
【化３】
2010540553.tif 000004
【００２１】
本発明の化合物が、その製薬上許容される塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体の形態でも利用できることは、当業者であれば認識されよう。
【００２２】
本発明の塩は、絶対ではないが通常、製薬上許容される塩である。「製薬上許容される塩」という用語に包含される塩は、本発明の化合物の非毒性塩を指す。本発明の化合物の塩としては、製薬上許容される無機又は有機の酸又は塩基並びに四級アンモニウム塩から形成される慣用の塩を挙げることができる。こうした塩は酸付加塩を含み得る。一般に、塩は製薬上許容される無機及び有機酸から形成される。適当な酸塩のより具体的な例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、グリコール酸塩、ギ酸塩、乳酸塩、アレイック酸塩(aleic)、酒石酸塩、クエン酸塩、パルモイック酸塩(palmoic)、マロン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、フェニル酢酸塩、グルタミン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、フミック酸塩(fumic)、トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩(メシレート)、ナフタレン-2-スルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化水素酸塩、リンゴ酸塩、テロイック酸塩(teroic)、タンニン酸塩、ステロイック酸塩(steroic)などが挙げられる。
【００２３】
シュウ酸やトリフルオロ酢酸のような他の酸は、それ自体は製薬上許容されるものではないとしても、本発明の化合物及びその製薬上許容される塩を取得するための中間体として有用な塩の調製に有用であり得る。適当な塩基性塩のより具体的な例としては、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン塩、コリン塩、ジエタノールアミン塩、エチレンジアミン塩、N-メチルグルカミン塩、及びプロカイン塩が挙げられる。
【００２４】
他の代表的な塩としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、エデト酸カルシウム塩、カムシレート、炭酸塩、クラブラネート、クエン酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾルシン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物塩、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、マレイン酸一カリウム塩、粘液酸塩、ナプシレート、硝酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩(エムボネート)、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸/二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクレート、トシル酸塩、三ヨウ化エチル酸塩、及び吉草酸塩が挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「溶媒和物」という用語は、溶質(本発明においては、式Iの化合物、その塩又は生理学的に機能性の誘導体)及び溶媒により形成される化学量論の複合体を指す。本発明の目的のために、このような溶媒は、溶質の生物活性を妨害することはない。適切な溶媒の非限定的な例としては、それだけに限らないが水、メタノール、エタノール及び酢酸が挙げられる。好ましくは使用する溶媒は、製薬上許容される溶媒である。最も好ましくは、使用する溶媒が水であり、溶媒和物が水和物である。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「生理学的に機能性の誘導体」とは、哺乳動物に投与したとき、本発明の化合物又はその活性な代謝物を(直接又は間接的に)提供することができる、本発明の化合物の任意の製薬上許容される誘導体を指す。このような誘導体、例えばエステル及びアミドは、過度に実験するまでもなく、当業者には明白であろう。生理学的に機能性の誘導体を教示する範囲において、Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discover、第5版、第1巻: Principles and Practice（参照により本明細書に組込むものとする）の教示を挙げる。
【００２７】
式Iの化合物の製薬上許容される塩、溶媒和物及び生理学的に機能性の誘導体を調製する方法は、一般に当技術分野で知られている。例えば、Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery、第5版、第1巻: Principles and Practiceを参照されたい。
【００２８】
式Iの化合物(塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体)は、以下に概説されている方法により都合よく調製できる。前記ステップの順番は、本発明の実施に決定的に重要なものではなく、該方法は、当業者の知識に基づき任意の適切な順番でステップを行うことにより実施できる。更に、記載のステップの一部は、全ての中間体化合物を単離することなく合わせることができる。
【００２９】
式Iの化合物の合成の一つの一般的な方法を以下のスキーム1に概説する。市販の出発物質4-クロロ-2-ニトロ安息香酸メチル(2)及び[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]ボロン酸 (3)を、標準的条件下で、触媒、例えば限定するものではないがジクロロビス(トリシクロヘキシルホスフィン)パラジウム(II)又はジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)又はテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウムを用いて、アセトニトリル又はDME及び水のような溶媒中で、フッ化セシウム又は炭酸ナトリウムのような塩基の存在下でカップリングさせることにより中間体4を得ることができる。エステル中間体4の塩基性条件下での加水分解、例えばテトラヒドロフラン(THF)及び／又はメタノール(MeOH)及び／又は水及び／又は1,4-ジオキサンを含む溶媒中での水酸化リチウム又は水酸化ナトリウムにより、対応するカルボン酸 (5)が得られる。
【００３０】
中間体7はこのカルボン酸(5)をメチルO-(1,1-ジメチルエチル)-L-トレオニネート(6)又はその塩酸塩と標準的カップリング条件下で混合することにより形成する。こうした条件としては、限定するものではないが、EDC (1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)、PyBop (ヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-tris-ピロリジノ-ホスホニウム)、PyBrOP(ヘキサフルオロリン酸ブロモ-tris-ピロリジノ-ホスホニウム)、HOBT (N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)、HOAT (N-ヒドロキシ-9-アザベンゾトリアゾール)、又はDIC (N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド)、又はHATU (ヘキサフルオロリン酸2-(1H-9-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム)及びDIEA (N,N-ジイソプロピルエチルアミン)又はトリエチルアミンを室温で用いることが挙げられる。使用することのできる溶媒としては、DMSO、NMP又は好ましくはDMFが挙げられる。好ましい方法では中間体5及び中間体6を酢酸エチル中で、1-プロパンホスホン酸環状無水物及び、DIEA又はトリエチルアミンのような有機性塩基の存在下で一緒にし、中間体7を得る。
【００３１】
7のニトロ基の標準条件下での還元、例えば限定するものではないが、炭素上のパラジウムを水素雰囲気下で酢酸エチル又はメタノールのような溶媒中で作用させることなどにより中間体8を得ることができる。
【００３２】
中間体10は、中間体8をイソシアネート体である中間体9 (合成方法は以下に概説、スキーム２を参照されたい)及びジイソプロピルエチルアミン(DIEA)又はトリエチルアミンと、DMFのような溶媒中で混合することにより形成する。好ましくは、中間体8及び9をピリジン中で一緒にして中間体10を得る。
【００３３】
最終生成物は、エステル中間体10を塩基性条件下で、例えばテトラヒドロフラン(THF)及び／又はメタノール(MeOH)及び／又は水及び／又は1,4-ジオキサンを含む溶媒中の水酸化リチウム又は水酸化ナトリウムで切断することにより形成する。
【００３４】
スキーム１：式Ｉの化合物の合成
【化４】
2010540553.tif 000005
【００３５】
式Iの他の異性体の合成は、対応する異性体（これには式6のラセミ体も含まれる）を利用することにより達成することができる。
【００３６】
中間体9の一の一般的合成方法を以下のスキーム２に概説する。11の水素化ホウ素ナトリウムを用いた、三フッ化ホウ素ジエチルエーテルの存在下での還元により中間体12が得られる。中間体12のメチル化は、水素化ナトリウムのような塩基での処理、及びそれに続くヨードメタン又はジメチル硫酸のようなメチル化剤を用いるDMF又はNMPのような溶媒中での処理により行うことができ、中間体13を得る。同様に12を水酸化ナトリウム水溶液及びトルエン中の塩化ベンジルトリエチルアンモニウムの存在下（二相系）で、ジメチル硫酸と反応させることにより中間体13を得ることができる。別の方法では、中間体12は標準条件を用いて、例えばジクロロメタン中の三臭化リンを用いた処理により、対応する臭化物へと変換することができる。得られる臭化物を、メタノール中のナトリウムメトキシドで処理することにより中間体13に変換することができる。中間体13の還元は、エタノール及び／又は水のような溶媒中で亜鉛及び塩基（例えば水酸化ナトリウム）を用いた処理により行うことができ、中間体14を得る。別の方法では、中間体13の還元は、エタノールのような溶媒中でPtO2及び水素を用いた処理により行うことができる。次いで中間体14のジクロロメタンのような溶媒中でのDIEAのような塩基及びホスゲン又はトリホスゲンを用いた処理により、中間体9を得る。
【００３７】
スキーム２：中間体９の合成
【化５】
2010540553.tif 000006
【００３８】
本発明は、式Iの化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体及び一種又は複数の賦形剤(医薬分野では担体及び/又は希釈剤とも呼ばれる)を含む医薬組成物(医薬製剤とも呼ばれる)を更に提供する。賦形剤は、製剤の他の成分と許容性であり、そのレシピエント(即ち、患者)に有害でないという意味において許容できる。
【００３９】
本発明の別の態様に従って、式Iの化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体と、少なくとも一種の賦形剤とを混合することを含む、医薬組成物の調製方法が提供される。
【００４０】
医薬組成物は、単位用量当たり所定量の活性成分を含有する単位投与剤形であってよい。このような単位は、治療上有効な量の式Iの化合物、その塩、溶媒和物若しくは生理学的に機能性の誘導体、又は、複数単位投与剤形が、所与の時間に投与され、所望の治療上有効な量を実現することができるように、治療上有効な量の一部分を含有することができる。好ましい単位用量製剤は、本明細書で上に列挙された１日用量若しくは分割用量、又はその適切な部分の活性成分を含有するものである。更に、このような医薬組成物は、製薬分野で周知の方法のいずれかにより調製できる。
【００４１】
医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば、経口(口腔又は舌下を含む)、直腸、鼻腔、局所(口腔、舌下又は経皮を含む)、膣又は非経口(皮下、筋肉内、静脈内又は皮内を含む)経路による投与に適合し得る。このような組成物は、製薬分野で公知の任意の方法により、例えば活性成分を賦形剤(複数可)と合わせることにより調製できる。
【００４２】
医薬組成物は、経口投与に適合するとき、錠剤又はカプセル等の個別の単位、散剤又は顆粒剤、水性液体又は非水性液体中の溶液剤又は懸濁液剤、可食性のフォーム剤又はホイップ剤、水中油型液体エマルジョン又は油中水型液体エマルジョンであってよい。本発明の化合物(塩、溶媒和物又は誘導体)又は本発明の医薬組成物は、「迅速溶解」薬として投与するために、キャンディー、ウエハー及び/又は舌テープ製剤に組み込むこともできる。
【００４３】
例えば、錠剤又はカプセル剤の形態での経口投与のために、活性薬剤成分を、経口用の非毒性の製薬上許容される不活性な担体、例えばエタノール、グリセロール、水等と組み合わせてもよい。散剤又は顆粒剤は、化合物を適切な微細粒径に粉砕して、同じように粉砕した医薬担体、例えばデンプン又はマンニトールのような食用炭水化物と混合することにより調製される。香味剤、保存料、分散剤及び着色剤も存在してよい。
【００４４】
カプセルは、上に記載されているように粉末混合物を調製し、形成されたゼラチン又は非ゼラチンシースに充填することにより製造される。流動化剤及び潤滑剤、例えばコロイドシリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、固体ポリエチレングリコールを、充填操作の前に粉末混合物に加えることもできる。崩壊剤又は可溶化剤、例えば寒天、炭酸カルシウム又は炭酸ナトリウムも、カプセルが摂取される際の薬剤の有効性を改善するために加えることができる。
【００４５】
更に、所望により又は必要に応じて、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤及び着色剤も混合物に組み込むことができる。適切な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えばグルコース又はβラクトース、トウモロコシ甘味料、天然ゴム及び合成ゴム、例えばアラビアゴム、トラガカント、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等が挙げられる。これらの剤形で使用する潤滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。崩壊剤としては、それだけに限らないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が挙げられる。
【００４６】
錠剤は、例えば、粉末混合物を調製し、顆粒又はスラグを形成し、潤滑剤及び崩壊剤を加え、次いで打錠することにより製剤化する。粉末混合物は、適切に細かく砕いた化合物と、上記の希釈剤又は基剤と、場合により結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース及びアルギン酸、ゼラチン若しくはポリビニルピロリドン、パラフィンのような溶解遅延剤、第4級塩のような再吸収促進剤、例えば、並びに/又は吸収剤、例えばベントナイト、カオリン若しくは第2リン酸カルシウムとを混合することにより調製される。粉末混合物は、結合剤、例えばシロップ、デンプンペースト、アラビアゴム粘液又はセルロース系若しくはポリマー系材料で濡らして、ふるいを強制通過させることにより顆粒化することができる。顆粒化の代替案として、粉末混合物を錠剤機にかけることもでき、その結果得られるのは不完全に形成されたスラッグであり、これが破壊されて顆粒となる。顆粒は、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク又は鉱物油を加えることにより滑らかにして、錠剤形成金型への粘着を防止することができる。次いで、潤滑化した混合物を打錠する。本発明の化合物(塩、溶媒和物又は誘導体)は、自由流動性の不活性担体と合わせて、顆粒化又はスラグ形成のステップを経ることなく直接錠剤へと打錠することもできる。シェラックのシーリングコート、糖又はポリマー材料のコーティング、及びワックスの光沢コーティングからなる透明又は不透明の保護コーティングを施してもよい。異なる単位用量を区別するためにこれらのコーティングに着色料を加えることもできる。
【００４７】
口腔液剤、例えば溶液剤、シロップ剤及びエリキシル剤は、所与の量が、所定量の活性成分を含有するように、単位投与剤形に調製することができる。シロップは、本発明の化合物(塩、溶媒和物又は誘導体)を適切に香味付けされた水性液剤に溶解させることにより調製でき、一方、エリキシルは、非毒性のアルコール性ビヒクルの使用により調製する。懸濁液剤は、本発明の化合物(塩、溶媒和物又は誘導体)を非毒性のビヒクルに分散させることにより製剤化することができる。可溶化剤及び乳化剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール及びポリオキシエチレンソルビトールエーテル、保存剤、香味添加剤、例えばペパーミントオイル、天然甘味料、サッカリン又は他の人工甘味料等も加えることができる。
【００４８】
適切な場合、経口投与のための単位投与製剤は、マイクロカプセル化することができる。該製剤は、例えば特定の材料をポリマー、ワックス等でコーティング、又はそれらに埋め込むことにより、放出を延長又は持続するように調製することもできる。
【００４９】
本発明において、医薬組成物の送達には錠剤及びカプセル剤が好ましい。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「治療」という用語は、予防を含み、既に罹患しているか、又は診断された患者又は被験者において、特定の疾患を緩和し、疾患の一若しくは複数の症状を除去又は低減し、疾患の進行を減速又は排除し、疾患の再発を防止又は遅延することを指す。予防(又は病気の発症の防止若しくは遅延)は、発症した疾患又は症状を有する患者に対するものと同一若しくは類似の方法で薬剤を投与することにより通常実現される。
【００５１】
本発明は、糖尿病、並びに糖尿病と関連する疾患、例えば肥満、X症候群、インスリン抵抗性、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、高血糖症、高コレステロール血症、高インスリン血症、高脂血症、心血管疾患、発作、アテローム性動脈硬化症、リポタンパク質異常、高血圧、組織虚血、心筋虚血及び抑鬱を患う哺乳動物、特にヒトにおける治療方法を提供する。このような治療は、治療上有効な量の式Iの化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体を、前記哺乳動物、特にヒトに投与するステップを含む。治療は、式Iの化合物、その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体を含有する治療上有効な量の医薬組成物を、前記哺乳動物、特にヒトに投与するステップも含むことができる。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、例えば研究者又は臨床医により求められている、組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を誘発するであろう、薬剤又は医薬品の量を意味する。
【００５３】
「治療上有効な量」という用語は、このような量を与えられていない対応する被験者と比較したとき、向上した疾患、障害若しくは副作用の治療、治癒、予防若しくは軽減、又は疾患若しくは障害の進行速度の低下をもたらす任意の量を意味する。この用語はまた、正常な生理学的機能を高めるのに有効な量もその範囲に含む。治療方法で使用するために、治療上有効な量の式Iの化合物、並びにその塩、溶媒和物及び生理学的に機能性の誘導体を、そのままの化学物質として投与してもよい。また、活性成分を医薬組成物として提供することもできる。
【００５４】
治療で使用するために、治療上有効な量の式Iの化合物(その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体)をそのままの化学物質として投与することも可能だが、通常はそれを、医薬組成物又は製剤の活性成分として提供する。
【００５５】
本発明の化合物(塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体)の正確な治療上有効量は、それだけに限らないが、治療する被験者(患者)の年齢及び体重、治療を必要とする具体的な障害及びその重症度、医薬製剤/組成物の性質、投与経路を含む、いくつかの因子に依存し、最終的には担当の医師又は獣医の裁量による。通常、式Iの化合物(その塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体)は、1日当たり約0.1〜100mg/kg受容者(患者、哺乳動物)体重の範囲、より典型的には1日当たり0.1〜10mg/kg体重の範囲での治療のために投与される。許容できる1日量は、約1〜約1000mg/日、好ましくは約1〜約100mg/日であってよい。この量は、1日当たりの総量が同じになるように、1日当たり単回量、又は1日当たり何回か(例えば、2回、3回、4回、5回以上)の分割用量で投与してもよい。本発明の化合物の塩、溶媒和物又は生理学的に機能性の誘導体の有効量は、式Iの化合物自体の有効量の比として決定することができる。類似の投与量は、治療について本明細書で示されている他の症状の治療(予防を含む)に適するものであるべきである。一般に、適切な投与量の決定は、薬剤分野又は製薬分野の当業者であれば容易に達成することができる。
【００５６】
更に、本発明は、式Iの化合物、その塩、溶媒和物若しくは生理学的に機能性の誘導体、又はそれらの医薬組成物と少なくとも一種の他の抗糖尿病薬とを共に包含する。このような抗糖尿病薬としては、例えば注射型のインスリン、並びに経口摂取されるスルホニル尿素、チアゾリジンジオン、グリピジド、グリメピリド、トルブタミド、アセトヘキサミド、トラジミド、ビグアニド、ロシグリタゾン、メトホルミン(グルコファージ)、シタグリプチン(ジャヌビア)の塩又はそれらの組合せ等の薬剤を挙げることができる。本発明の化合物が、別の抗糖尿病薬と組み合わせて使用されるとき、その組合せの各化合物又は薬剤の用量は、該薬剤又は化合物が単独で使用されるときの用量とは異なる場合があることを当業者であれば認識されよう。適切な用量は、当業者であれば容易に認識され、決定されよう。式Iの化合物(その塩、溶媒和物、生理学的に機能性の誘導体)及び他の治療活性剤(複数可)の適切な用量、並びに投与の相対的なタイミングは、所望の複合治療効果を実現するために選択され、担当の医師又は臨床医の専門知識及び裁量による。
【００５７】
（実施例）
以下の実施例は、例示のみを意図し、何ら本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明は特許請求の範囲により定義される。特に断らない限り、試薬は、市販されているか、又は文献の手順に従って調製される。
【実施例１】
【００５８】
式IAの化合物: O-(1,1-ジメチルエチル)-N-({2-{[({2,6-ジメチル-4-[(メチルオキシ)メチル]フェニル}アミノ)カルボニル]アミノ}-4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]フェニル}カルボニル)-L-トレオニンの調製
ステップ1.  4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]-2-ニトロ安息香酸メチル
２つのマイクロ波バイアルにそれぞれ、4-クロロ-2-ニトロ安息香酸メチル(0.5 g, 2.32 mmol), [6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]ボロン酸 (0.51 g, 3.48 mmol), ジクロロビス(トリシクロヘキシルホスフィン)パラジウム(II) (0.137 g, 0.186 mmol)及びフッ化セシウム (1.76 g, 11.6 mmol)を充填した。各バイアルにアセトニトリル(9 mL)及び水(1.5 mL)を加えた。各バイアルを150℃で6分加熱した。室温に冷却後、バイアルの内容物を合わせ、酢酸エチル(100 mL)で希釈し、50%塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。この物質を、別の0.5 gスケールの(4-クロロ-2-ニトロ安息香酸)反応と合わせ、ヘキサン/酢酸エチルを用いたシリカゲルでクロマトグラフィーを行い、2.0 gの生成物を黄色の油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.44 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.87-7.80 (m, 3H), 6.88 (d, J=8.7 Hz, 1 H), 4.01 (s, 3H), 3.94 (s, 3H)。
【００５９】
ステップ2.  4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]-2-ニトロ安息香酸
水(15 mL)中の水酸化リチウム一水和物(1.748 g, 41.6mmol)を、THF (50 mL)及びメタノール(20 mL)中の4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]-2-ニトロ安息香酸メチル (2.0 g, 6.94 mmol)溶液に加えた。混合物を室温で約4.5時間攪拌した。この反応混合物を1N HCl水溶液 (100 mL)で酸性化し、酢酸エチルで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、1.9 g (収率100%)の灰白色固形物を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 13.9 (brs, 1H), 8.65 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 8.27 (d, J= 1.6 Hz, 1H), 8.18 (dd, J= 2.6,8.7, 1H), 8.08 (dd, J= 1.9. 8.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 3.91 (s, 3H)。
【００６０】
ステップ3.  メチルO-(1,1-ジメチルエチル)-N-({4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]-2-ニトロフェニル}カルボニル)-L-トレオニネート
HATU (3.95 g, 10.4 mmol)を、DMF (100 mL)中の4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]-2-ニトロ安息香酸 (1.90 g, 6.93 mmol)、メチルO-(1,1-ジメチルエチル)-L-トレオニネート塩酸 (1.72 g, 7.6 mmol)及びジイソプロピルエチルアミン (1.79 g, 13.86 mmol)の溶液に加えた。この混合物を室温で約24時間攪拌した。DMFの大部分を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチル(100 mL)に溶解し、1N HCl (50 mL)、飽和重炭酸ナトリウム(50 mL)及び塩水 (50 mL)で洗浄した。酢酸エチル相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。ヘキサン/酢酸エチルを用いたクロマトグラフィーから、2.9 g (収率94%)の琥珀色の油状物として生成物が得られた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.44 (d, J= 2.6 Hz, 1H), 8.21 (d, J= 1.9 Hz, 1H), 7.85-7.81 (m, 2H), 7.73 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 6.89 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 6.66 (d, J = 9.5 Hz, 1 H), 4.76 (dd, J = 1.7, 9.3 Hz, 1 H), 4.36 (m, 1 H), 4.01 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 1.36 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.13 (s, 9H)。
【００６１】
ステップ4.  メチルN-({2-アミノ-4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]フェニル}カルボニル)-O-(1,1-ジメチルエチル)-L -トレオニネート
パラジウム (炭素上10%, 2.0 g)を、メタノール (125 mL)中のメチルO-(1,1-ジメチルエチル)-N-({4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]-2-ニトロフェニル}カルボニル)-L-トレオニネート (2.90g, 6.51 mmol)の溶液に窒素雰囲気下で加えた。反応を脱気し、水素でフラッシュした。次いで混合物を水素雰囲気下で約18時間攪拌した。窒素でフラッシュ後に、この混合物を濾過し溶媒を減圧下で蒸発させ、2.45g (収率91%)の生成物を泡状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.39 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 2.5, 8.6 Hz, 1 H), 7.55 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 6.88-6.81 (m, 4H), 5.61 (brs, 2H), 4.68 (dd, J = 1.9, 9.3 Hz, 1 H), 4.33-4.31 (m, 1 H), 3.98 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 1.27 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.16 (s, 9H)。
【００６２】
ステップ5. (3,5-ジメチル-4-ニトロフェニル)メタノール
THF (100 mL)中の水素化ホウ素ナトリウム(2.91 g, 76.7 mmol)の懸濁物に3,5-ジメチル-4-ニトロ安息香酸 (8.5 g, 43.55 mmol)を加え、約5分攪拌した後に、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル (14.53 g, 102.4 mmol)を滴下した。反応を室温で約16時間攪拌した。反応物をゆっくり水(150 mL)に注ぎ、次いで酢酸エチル (2×300 mL)で抽出し、有機相を塩水で洗い硫酸ナトリウムで乾燥し減圧下で濃縮して、8.05 g (収率102%)の生成物を灰白色の固形物として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7.19 (s, 2H), 4.48 (s, 2H), 2.23 (s, 6H)。
【００６３】
ステップ6.  1,3-ジメチル-5-[(メチルオキシ}メチル]-2-ニトロベンゼン
DMF (150 mL)中の(3,5-ジメチル-4-ニトロフェニル)メタノール (7.0 g, 38.68 mmol)に水素化ナトリウム(1.85 gの60%油分散液、46.36 mmol)を加えた。約40分攪拌した後、ヨウ化メチルを添加し、反応を室温で３日間攪拌した。水(500 mL)をゆっくり加えることにより反応を停止させ、酢酸エチル(2×500 mL)で抽出した。有機相を塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル(酢酸エチル/ヘキサン)でのクロマトグラフィーに供し、5.3 g (70%)の生成物を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) 8 ppm: 7.09 (s, 2H), 4.42 (s, 2H), 3.41 (s, 3H), 2.31 (s,6H)。
【００６４】
ステップ7.  2,6-ジメチル-4-[(メチルオキシ)メチル]アニリン
1,3-ジメチル-5-[(メチルオキシ)メチル]-2-ニトロベンゼン(5.0 g, 25.6 mmol)をEtOH (120 mL)中に溶解し、80℃に加温した。水(10 mL)中のNaOH (5.9 g, 128 mmol)の溶液を加え、次いで亜鉛(15 g, 230 mmol)を5 gずつ添加した。添加が完了したら、この溶液を約4時間還流し、次いで冷却し、室温で３日間攪拌した。次いでこの混合物を濾過し、濾液を濃縮し、残渣を酢酸エチル及び塩水に分配した。塩水相を酢酸エチルで抽出し、あわせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル (酢酸エチル/ヘキサン)でのクロマトグラフィーに供して、4.5 g (106%)の生成物を油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 6.93 (s, 2H), 4.31 (s, 2H), 3.58 (brs, 2H), 3.34 (s, 3H), 2.18 (s, 6H)。
【００６５】
ステップ８.  2-イソシアナト-1,3-ジメチル-5-[(メチルオキシ)メチル]ベンゼン
ジクロロメタン(200 mL)中の2,6-ジメチル-4-[(メチルオキシ)メチル]アニリン (3.45 g, 20.88 mmol)、及びN,N-(ジイソプロピル)アミノメチルポリスチレン(PS-DIEA, Argonaut, 17.6 g, 3.56 mmol/gのロード)の混合物に、ホスゲン(5.17 gの25%トルエン溶液, 52.2 mmol)を約2〜3分にわたり添加した。この混合物を室温で約24時間攪拌し、次いで濾過してPS-DIEAを除いた。減圧下での濃縮により4.0 g (100%)の生成物を黄褐色の油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 7.02 (s, 2H), 4.36 (s, 2H), 3.38 (s, 3H), 2.32 (s, 6H)。
【００６６】
ステップ9.  メチルO-(1,1-ジメチルエチル)-N-({2-{[({2,6-ジメチル-4-[(メチルオキシ)メチル]フェニル}アミノ)カルボニル]アミノ}-4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]フェニル}カルボニル)-L-トレオニネート
メチルN-({2-アミノ-4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]フェニル}カルボニル)-O-(1,1-ジメチルエチル)-L-トレオニネート (2.45 g, 5.89 mmol)及び2-イソシアナト-1,3-ジメチル-5-[(メチルオキシ)メチル]ベンゼン (2.25 g, 11.79 mmol)をピリジン(80 mL)中に溶解し約24時間攪拌した。反応を減圧下で濃縮し残渣を酢酸エチルに溶解し次いで濾過した。酢酸エチル相を重炭酸ナトリウム及び塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムでの乾燥、濾過、及び減圧下での濃縮後に、残渣をシリカゲル (酢酸エチル/ヘキサン)でのクロマトグラフィーに供して、3.2 g (89 %)の生成物を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 10.20 (brs, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.46 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.89 (dd, J = 2.7, 8.5 Hz, 1H), 7.59 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 7.21 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 7.10 (s, 2H), 6.82 (m, 2H), 5.97 (brs, 1 H), 4.51 (m, 1 H), 4.43 (s, 2H), 4.29 (m, 1 H), 3.98 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.39 (s, 3H), 2.31 (s, 6H), 1.20 (d, J = 5.6, 3H), 1.14 (s, 9H)。
【００６７】
ステップ10. O-(1,1-ジメチルエチル)-N-({2-{[({2,6-ジメチル-4-[(メチルオキシ)メチル]フェニル}アミノ)カルボニル]アミノ}-4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]フェニル}カルボニル)-L-トレオニン
メチルO-(1,1-ジメチルエチル)-N-({2-{[({2,6-ジメチル-4-[(メチルオキシ)メチル]フェニル}アミノ)カルボニル]アミノ}-4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]フェニル}カルボニル)-L-トレオニネート (3.2 g, 5.27 mmol)をTHF (150 mL)及びメタノール (50 mL)中に溶解した。これに水(50 mL)中の水酸化リチウム一水和物(1.328 g, 31.6 mmol)を加えた。この混合物を室温で約24時間攪拌した。この混合物に1N HCl (200 mL)を加え、酢酸エチル (2×300 mL)で抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、3.16 g (100 %)の生成物を白色の泡状物として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12.84 (brs, 1H), 10.12 (brs, 1H), 8.77 (brs, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.46 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.10 (brs, 1H), 7.95 (dd, J = 2.4, 8.5 Hz, 1H), 7.76 (brs, 1H), 7.33 (dd, J = 1.7, 8.3 Hz, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.92 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.44 (m, 1H), 4.32 (s, 2H), 4.18 (m, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.26 (s, 3H), 2.17 (s, 6H), 1.18-1.13 (m, 12H). ES MS m/z 593 (M+H)。
【実施例２】
【００６８】
式IAの化合物のカリウム塩の調製
カリウムO-(1,1-ジメチルエチル)-N-({2-{[({2,6-ジメチル-4-[(メチルオキシ)メチル]フェニル}アミノ)カルボニル]アミノ}-4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]フェニル}カルボニル)-L-トレオニネート
アセトニトリル(100 mL)中のO-(1,1-ジメチルエチル)-N-({2-{[({2,6-ジメチル-4-[(メチルオキシ)メチル]フェニル}アミノ)カルボニル]アミノ}-4-[6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル]フェニル}カルボニル)-L-トレオニン(1.0 g, 1.69 mmol)にt-ブトキシドカリウム (THF、1.69 mL中、1.0 M)を加える。混合物を約15分攪拌し、溶媒を減圧下で除去して生成物を得る。
【００６９】
生物学的プロトコル
式Iの化合物、その塩、溶媒和物、若しくは生理学的に機能性の誘導体の、動物特に哺乳動物（例えばヒト）における疾患（本明細書に詳細に記載したものなど）の治療又は予防における有用性は、以下に述べるインビトロ及びインビボのアッセイも含めた当業者に知られている慣用のアッセイにおける活性によって実証することができる。
【００７０】
精製グリコーゲンホスホリラーゼ（GP）酵素［この場合グリコーゲンホスホリラーゼは、活性化「a」状態にある（ヒト肝グリコーゲンホスホリラーゼ（HLGPa）と呼ばれる）］は、以下の方法により、得ることができる。
【００７１】
ヒト肝グリコーゲンホスホリラーゼの適切なクローニング及び発現
ヒト肝グリコーゲンホスホリラーゼcDNAは市販のヒト肝cDNAライブラリー（BD Biosciences社）からポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅した。このcDNAを、プライマー5'GGCGAAGCCCCTGACAGACCAGGAGAAG3'を5'CGATGTCTGAGTGGATTTTAGCCACGCC3'と共に、及び、5'GGATATAGAAGAGTTAGAAGAAATTG3'を5'GGAAGCTTATCAATTTCCATTGACTTTGTTAGATTCATTGG3'と共に用いて２つの重複フラグメントとして増幅した。PCR条件は、94℃  1分、55℃  1分、72℃  2分（40サイクル）であり、酵素Pfu Turbo（Stratagene社）、0.5％DMSO、250μM各ヌクレオチド三リン酸、及び0.4μM各プライマー、並びにポリメラーゼの製造者が推奨する緩衝液を用いた。各PCRフラグメントを分子的にクローニングし、各挿入物のDNA配列を決定した。このグリコーゲンホスホリラーゼcDNAの２つのDNAフラグメントをこのあと細菌性発現プラスミドpTXK1007LTev（GlaxoSmithKline社）中に一緒に合わせて、メチオニン−グリシン−アラニン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−グリシン−グリシン−グルタメート−アスパラギン−ロイシン−チロシン−フェニルアラニン−グルタミン−グリシン−グリシン−のためのコドンに５’末端で融合された完全長cDNAを作出した。このタンパク質産物は、6×ヒスチジンタグ、その後ろにTevプロテアーゼ開裂部位をもつこととなる。pTXK1007LTev中のこのcDNAの双方の鎖のDNA配列を決定した。
【００７２】
ヒト肝グリコーゲンホスホリラーゼの精製
凍結細胞ペースト（100g）を解凍し、1200mLの50mM Tris、100mM NaCl、15mMイミダゾール、pH 8.0中に懸濁させた。細胞をPolytron（Brinkmann社、PT10-35）で穏やかに分離し、次いでAVPホモジナイザーを２回通過させた。この大腸菌細胞溶解産物を27,500×gの45分間遠心分離によって清澄化し、0.8ミクロンフィルターで濾過した。この溶液を、50mM Tris、100mM NaCl、及び15mMイミダゾール（pH 8.0）で予め平衡化されている21mL Ni-NTA Superflow（Qiagen社）カラム（ID 26mm × H 4.0cm）に適用した。カラムを、A280がベースラインに戻るまで平衡緩衝液で洗った。弱結合タンパク質をこの同じ緩衝液中50mMイミダゾールの10ベッドカラム容量でカラムから溶離させた。グリコーゲンホスホリラーゼを100mMイミダゾールと250mMイミダゾールの濃度ステップで溶離させた。100mM画分及び250mM画分の双方をプールし、次いで50mM Tris、pH 8.0の緩衝液で5フォールドに希釈した。この溶液を、50mM Tris、pH8.0で予め平衡化した21mL Q高速流動カラム（Amersham Pharmacia Biotech AB社、ID 2.6cm × H 4.0cm）に充填した。グリコーゲンホスホリラーゼを、50mM Tris、pH8.0中1M NaClの0〜30％の連続濃度勾配（緩衝液B）で溶離させた。15％と20％緩衝液Bとの間で得られた精製グリコーゲンホスホリラーゼの画分をプールし、microfuge管の中に分注し、−80℃で貯蔵した。この精製画分は、SDS-PAGEゲル上で約100kdのシングルバンドを形成した。
【００７３】
ヒト肝グリコーゲンホスホリラーゼの活性化
ヒト肝グリコーゲンホスホリラーゼの活性化（すなわち、不活性HLGPb形から活性HLGPaの形への変換）は、固定化ホスホリラーゼキナーゼでHLGPbをリン酸化することで行った。
【００７４】
ホスホリラーゼキナーゼ（Sigma社、P-2014）10mgを100mM HEPES、80mM CaCl2（pH7.4）2.5mL中に溶解させ、同じ緩衝液中で前以って平衡化してあるAffi-Gel（Active Ester Agarose、BioRad #153-6099）ビーズ1mLと一緒に穏やかに混合した。この混合物を4℃で4時間揺動した。ビーズを一度同じ緩衝液で洗い、50mM HEPES、1Mグリシンメチルエステル（pH8.0）の溶液で室温にて１時間ブロックした。ビーズをこのあと50mM HEPES、1mM β−メルカプトエタノール（pH7.4）で洗い、4℃で貯蔵した。
【００７５】
凍結精製グリコーゲンホスホリラーゼ（HLGPb）を4℃で解凍し、そのあと50mM HEPES、100mM NaCl（pH7.4）の中に一晩透析させた。この透析HLGPb 15mg、3mM ATP及び5mM MgCl2を、50mM HEPES、100mM NaCl（pH7.4）で平衡化された調製Affi-Gel固定化ホスホリラーゼキナーゼビーズ500μLと一緒にインキュベーションした。リン酸化の程度を、以下に略述されているアッセイシステムを用いて活性の増加を10分間隔で追跡することによりモニタリングした。簡潔には、このアッセイには、0.1μMヒト肝グリコーゲンホスホリラーゼ、50mM HEPES、100mM KCl、2.5mM EGTA、MgCl2、3.5mM KH2PO4、0.5mM DTT、0.4mg/mLグリコーゲン、7.5mMグルコース、0.50mM β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（β-NAD）、3U/mLホスホグルコムターゼ、及び5U/mLグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼが含まれている。340nmにおけるNAD+の低下を追跡することで活性をモニタリングした。反応は、さらなる活性の増加が観測されなくなったときに（30〜60分）ビーズを混合物から取り出すことで停止させた。サンプルを質量分光分析で分析することによってリン酸化をさらに確認した。活性化サンプルを含有している上澄み液を50mM HEPES、100mM NaCl（pH7.4）に一晩透析させた。得られた最終サンプルを等容積のグリセロールと一緒に混合し、microfuge管の中に小分けし、そして−20℃で貯蔵した。
【００７６】
ヒト肝グリコーゲンホスホリラーゼａ  酵素的活性アッセイ
グリコーゲンホスホリラーゼ活性形（HLGPa）の小分子（＜1000Da.）化合物に対する応答を測定する酵素的アッセイを開発した。このアッセイは薬理学的に関係のあるグリコーゲン分解反応をモニタリングするように設計されており、グリコーゲン及び無機リン酸からのグルコース−１−リン酸の生成を、ホスホグルコムターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、NADHオキシダーゼ、及びホースラディッシュ・ペルオキシダーゼとカップリングさせて蛍光産物レゾルフィン［resorufin］を生成させることによって行われる。各試薬成分の濃度は以下のとおりであった：15nMヒト肝グリコーゲンホスホリラーゼa、1mg/mLグリコーゲン、5mM K2HPO4、40 U/mLホスホグルコムターゼ（Sigma社）、20 U/mLグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（Sigma社）、200nM Thermus thermophilus NADHオキシダーゼ（Park, H.J.; Kreutzer, R.; Reiser, C.O.A.; Sprinzl, M.; Eur. J. Biochem. 1992, 205, 875-879に記載のように調製）、2U/mLホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Sigma社）、30μM FAD、250μM NAD+、50μMアンプレックス・レッド［amplex red］、+/-10mMグルコース。使用したベースアッセイ緩衝液は50mM HEPES、100mM NaCl（pH7.6）であった。グリコーゲンホスホリラーゼのグルコース感応型阻害物質を識別するうえでの助けとするために、アッセイは、10mMグルコース有りと無しで行った。HLGPa非特異的レゾルフィン生成に寄与し得る汚染性成分をアッセイから除外するために、試薬は２つの２×濃縮カクテルとして調製した。ベースアッセイ緩衝液中にカタラーゼ・コート・アガロースビーズが入った溶液を調製した。第１のカクテル（カクテル#1）は、Thermus thermophilus NADHオキシダーゼ、NAD+、グリコーゲン、ホスホグルコムターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、K2HPO4、FAD、及び50 U/mLカタラーゼ・コート・アガロースビーズ+/-10mMグルコースからなっていた。この溶液を25℃で30分間インキュベーションしたあとアンプレックス・レッドを加え、そしてカタラーゼ・コート・アガロースビーズを遠心分離により取り除き、上澄み液をそのままにした。第２のカクテル（カクテル#2）は、ヒト肝グリコーゲンホスホリラーゼ-a及びホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを含んでいた（+/-10mMグルコース）。アッセイは、本発明の化合物をカクテル＃２と一緒にして15分間予備インキュベーションし、そのあとカクテル＃１を加えて反応を開始させることで行った。アッセイは、96（黒色1/2容量Costar#3694）若しくは384ウェルマイクロタイタープレート（小容量黒色Greiner）中で行った。生成物形成による蛍光発光の変化を蛍光プレートリーダー（Molecular Devices SpectraMax M2）を用いて560nm励起と590nm発光にて測定した。実施化合物１の活性を以下の表１に示す。
【表１】
2010540553.tif 000007
【００７７】
インビボのグルカゴンチャレンジモデル
頸静脈にカニューレを挿入した雄CDラット(220〜260g)(Charles Rivers、Raleigh、NC)をカニューレ挿入の1〜2日後に入手し、飼料(Lab Diet 5001、PMI Nutrition International社、Brentwood、MO)及び水を自由に摂取できるようにしながらAlpha-dri(商標)敷き藁(Shepherd Specialty Papers, Inc.社、Kalamazoo、MI)に個別に収容し、グルカゴンチャレンジ試験前の3〜4日間21℃及び50%の相対湿度にて12時間の明/暗のサイクルで飼育した。試験日に、ラットを体重毎に治療群(N=4〜5)に分類し、清潔なAlpha Dri敷き藁を敷いたシューボックスケージに個別に収容した。カニューレ経路を、血液0.2mlを除去することにより開放し、滅菌食塩水0.2mlを流した。1時間の順化後、血液試料を収集し、基底グルコースを決定し、ラットにビヒクル(5%DMSO:30%Solutol HS15:20%PEG400:45%25mM N-メチルグルカミン)又は薬剤(5ml/kg)を経口投与した。薬剤を投与してから2時間後、時間ゼロの血液試料(0.4ml)をグルコースの決定のために採血し、ラットに頸静脈からSandostatin 0.5mg/kg(Novartis Pharmaceuticals Corp.社、East Hanover、NJ)及びグルカゴン10μg/kg(Bedford Laboratories、Bedford、OH)を投与した。血液試料をグルコース決定のために10分後及び20分後に採血した。全血をTerumo Capiject採血管(Terumo Medical Corp.社、Elkton、MD)に入れ、室温で20〜30分間放置し、次いで遠心分離(3000×G)して、血清を得た。血清グルコースレベルを、Olympus AU640(商標)臨床化学免疫分析器(Olympus America Inc.社、Melville、NY)を用いて決定した。ビヒクルグルコースAUCの%還元(%R)を、式：
【数１】
2010540553.tif 000008
を用いて各薬剤治療に対して計算し、AUCを、式：
【数２】
2010540553.tif 000009
を用いて血清グルコース値から計算した。実施例化合物1の活性を以下の表2に示す。
【表２】
2010540553.tif 000010
【配列表】
2010540553000001.app
【国際調査報告】
2010540553.tif 000013
2010540553.tif 000014