(57)【要約】  複数の免疫原を含む、自発的に抗原性を補強する免疫原性組成物であって、各免疫原は、リポペプチドキャップ、ユニバーサルＴヘルパー配列、及びＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープを含む。免疫原は、１種以上のリンカー配列及び／又は極性荷電アミノ酸配列も含む。各免疫原のＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープは、アミノ酸配列Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｘａａ７−Ｌ−Ｘａａ９−Ｐ−Ｗ−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−アミド（配列番号１）を有し、式中、Ｘａａ７、Ｘａａ９、及びＸａａ１２のアミノ酸位置は、特定アミノ酸残基の選択肢から選択され、Ｘａａ１３〜Ｘａａ１６のアミノ酸位置は、存在しなくても特定アミノ酸残基の選択肢であってもよい。リポペプチドは、ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン又はトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン又はＮ−アセチル（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）であり、それぞれ任意の中性アミノ酸リンカーを有する。少なくとも４個の荷電極性アミノ酸の任意の極性配列は、免疫原の溶解性を高め、リポペプチドキャップのカルボキシ末端に位置付けられて中性リンカーアミノ酸が隣接していてもよく、又は免疫原のどこかに位置付けられる。組成物において、各免疫原は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープのアミノ酸位置Ｘａａ７、Ｘａａ９、又はＸａａ１２におけるアミノ酸変異によって他の免疫原と異なっている。そのような組成物は、被験者を免疫するために使用する場合、付帯的アジュバントを用いることなく、複数のＨＩＶ−１  Ｔａｔ変異体に対する幾何学的平均力価が１，０００，０００より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を誘導することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の免疫原を含む、自発的に抗原性を補強する免疫原性組成物であって、各免疫原は：
（ａ）  アミノ酸配列Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｘａａ７−Ｌ−Ｘａａ９−Ｐ−Ｗ−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−アミド（配列番号１）を有するＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ、式中、Ｘａａ７はＲ、Ｋ、Ｎ、及びＳから成る群より選択され、Ｘａａ９はＥ及びＤから成る群より選択され、Ｘａａ１２はＫ及びＮから成る群より選択され、Ｘａａ１３は存在しないかＨであり、Ｘａａ１４は存在しないかＰであり、Ｘａａ１５は存在しないかＧであり、そしてＸａａ１６は存在しないかＳである；
（ｂ）  ユニバーサルＴヘルパー配列；
（ｃ）  ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン、Ｎ−アセチル（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）、及びトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインから成る群より選択されるリポペプチドキャップ、
を含み、
ここで、組成物中の各免疫原は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープのアミノ酸位置Ｘａａ７、Ｘａａ９、又はＸａａ１２におけるアミノ酸変異によって他の免疫原と異なっている、前記免疫原性組成物。
【請求項２】
式Ｒ２−（Ｒ１−ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ）を有し、式中、Ｒ２はリポペプチドであり、Ｒ１はＴヘルパー配列である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
式Ｒ２−（ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ−Ｒ１）、又は
Ｒ２−Ｋ（ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ）−Ｒ１、又は
Ｒ２−Ｋ（Ｒ１）−ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ、
を有し、式中、Ｒ２はリポペプチドであり、Ｒ１はＴヘルパー配列である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
１〜１０個の中性アミノ酸のリンカー配列を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
リンカー配列が、Ｒ２のＣｙｓに結合してＲ２を免疫原の他の成分に連結しているか、又は免疫原の他の成分間に位置付けられる、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
そのリンカー配列を有するＲ２が、Ｒ１のアミノ端のα−アミノ官能基に連結している、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
Ｒ２が、Ｒ１とＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープのアミノ端とのあいだに位置付けられたＫ残基のε−アミノに連結している、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
Ｒ２が、ＨＩＶ−１  ＴａｔのエピトープのＣ端に位置付けられたＫ残基のε−アミノに連結している、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
各免疫原が、１個以上の中性リンカーアミノ酸が隣接していてもよく、且つ（ａ）Ｒ２のカルボキシ端の部分としての位置；（ｂ）Ｒ１の遊離アミノ端の位置；（ｃ）Ｂ細胞エピトープの遊離アミノ端の位置；（ｄ）Ｒ１のカルボキシ端の位置；（ｅ）Ｂ細胞エピトープのカルボキシ端の位置；（ｆ）ＫとＲ１とのあいだに介在する位置；及び（ｇ）ＫとＢ細胞エピトープとのあいだに介在する位置、から成る群より選択される位置に位置付けられた荷電極性アミノ酸の配列を更に含む、請求項２又は３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
リンカーが、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｇ−、及び−Ｇ−Ｓ−から成る群より選択される、請求項２又は４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
極性配列が、Ｋ、Ｅ、Ｄ、及びＲから成る群より個別に選択される４〜８個のアミノ酸の配列を含み、リンカーアミノ酸が隣接していてもよい、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
極性配列が、−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−、−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｓ−、Ｇ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｇ、Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｓ、及びＧ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｇ（配列番号６５、６４、７０、６９、及び７１）から成る群より選択される、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
Ｒ１配列が：
（ａ）  Ｑ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｘａａ（配列番号６）、式中、Ｘａａは存在しないかＬであり、任意のアミノ酸リンカーを有する;
（ｂ）  Ｘａａ１−Ｋ−Ｘａａ２−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ｔ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ａ−Ｘａａ３（配列番号４６）、式中、Ｘａａ１及びＸａａ３はそれぞれＤ−アラニンであり、Ｘａａ２はＬ−シクロヘキシルアラニンである；及び
（ｃ）  Ｆ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｆ−Ｗ−Ｌ−Ｒ−Ｖ−Ｐ−Ｋ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｈ−Ｌ−Ｅ−（配列番号２３）、
から成る群より選択される、請求項２又は３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
ＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープの１〜１６種以下の異なる変異体を含有する免疫原を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１５）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｋ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１６）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１８）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１７）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｋ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号２１）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１９）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号２２）、及び
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号２０）、
から成る群より選択される、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの１〜８種の異なる免疫優勢Ｂ細胞エピトープ変異体を含有する免疫原を含む、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１５）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｋ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１６）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１８）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１７）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｋ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号２１）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１９）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号２２）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号２０）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３２）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３３）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３４）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３５）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３６）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３７）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３８）、及び
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３９）、
から成る群より選択される、１〜１６種の異なる変異体を含有する免疫原を含む、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
各免疫原において、Ｒ２は、ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン、又はＮ−アセチル−（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）、又はトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインから成る群より選択され；Ｒ２は、−Ｓ−Ｓ−残基のアミノ酸リンカー配列を更に含み；そしてＲ１は、Ｂ細胞エピトープに連結している−Ｓ−アミノ酸リンカーを有するＱ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｌ（配列番号４７）である、請求項２、１５、又は１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
極性アミノ酸配列−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−（配列番号６５）が、リンカー残基−Ｓ−Ｓ−のあいだに位置付けられる、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
免疫被験者において、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの複数の免疫優勢エピトープ変異体配列に対する幾何学的平均力価が３００，０００より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を誘導する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
幾何学的平均力価（ＧＭＴ）が５００，０００より大きい、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
幾何学的平均力価（ＧＭＴ）が１００万より大きい、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
幾何学的平均力価（ＧＭＴ）が３００万より大きい、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の自発的に抗原性を補強する免疫原性組成物、及び好適な医薬担体又は賦形剤を含む医薬組成物であって、免疫被験者において、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの複数の免疫優勢エピトープ変異体配列に対する幾何学的平均力価が３００，０００より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を誘導する、前記医薬組成物。
【請求項２４】
幾何学的平均力価が１，０００，０００より大きい、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
複数のＨＩＶ−１株及びサブタイプに対する抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ産生を誘導する方法であって、有効な抗体誘導量の請求項２３又は２４に記載の医薬組成物で被験者を免疫することを含み、前記有効な量は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの複数の免疫優勢Ｂ細胞エピトープ変異体配列に対する幾何学的平均力価が３００，０００より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を誘導する、前記誘導方法。
【請求項２６】
幾何学的平均力価が１，０００，０００より大きい、請求項２５に記載の誘導方法。
【請求項２７】
幾何学的平均力価が３，０００，０００より大きい、請求項２５に記載の誘導方法。
【請求項２８】
初回プライミング有効量の組成物、その後ブースター有効量の組成物を被験者へ投与することを含む、請求項２５に記載の誘導方法。
【請求項２９】
プライミング量の少なくとも３週間後に第１ブースター有効量を被験者へ投与することを含む、請求項２８に記載の誘導方法。
【請求項３０】
プライミング量及び第１ブースター量の後に定期的に第２ブースター有効量を被験者へ投与することを含む、請求項２９に記載の誘導方法。
【請求項３１】
有効量が１０ｍｇ以下である、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の誘導方法。
【請求項３２】
有効量が１ｍｇ以下である、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の誘導方法。
【請求項３３】
有効量が０．１ｍｇ以下である、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の誘導方法。
【請求項３４】
プライミング有効量が１０ｍｇ未満の単位投薬量であり、２回のブースター有効量が第３週及び第６週に同一有効量で投与され、ＧＭＴが１００，０００より大きい、請求項２９に記載の誘導方法。
【請求項３５】
プライミング有効量が１０ｍｇ未満の単位投薬量であり、２回のブースター有効量が第３週及び第６週に同一有効量で投与され、ＧＭＴが１，０００，０００より大きい、請求項２９に記載の誘導方法。
【請求項３６】
請求項１に記載の免疫原性組成物を作製する方法であって、固相合成法を用いて免疫原を合成し、そしてＸａａ７、Ｘａａ９、及びＸａａ１２で示される変異体アミノ酸を等モル量で単一合成混合物中に導入することを含む、前記作製方法。
【請求項３７】
複数のＨＩＶ−１株及びサブタイプに対する抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ産生を誘導するための医薬の製造における、請求項１に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項３８】
組成物の用量が１ｍｇ以下である、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
組成物の用量が０．１ｍｇ以下である、請求項３７に記載の使用。
【請求項４０】
抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体の幾何学的平均力価が１００，０００より大きい、請求項３７に記載の使用。
【請求項４１】
抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体の幾何学的平均力価が５００，０００より大きい、請求項３７に記載の使用。
【請求項４２】
抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体の幾何学的平均力価が１，０００，０００より大きい、請求項３７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ＨＩＶ−１の短時間な変異性は、ユニバーサルなＨＩＶ−１治療用免疫原性組成物及び予防用免疫原性組成物を作製するための試みを挫折させてきた。しかしながら、ＨＩＶ−１にコードされ、ＨＩＶ−１感染細胞によって分泌され、そして非感染ＣＤ４＋  Ｔ細胞に取り込まれるＴａｔと呼ばれるトランス活性化タンパク質は、大規模なＨＩＶ−１複製に必要不可欠なものである。休止期ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＨＩＶ−１複製を持続させる主体「組織」であるが、ＨＩＶ−１複製を容認せず、Ｔａｔの活性化がそれを許容させる。したがって、循環Ｔａｔタンパク質が、ＨＩＶ−１ウイルス血症の維持に必要とされる必須経路を免疫学的に阻止するための有望な標的を提供する。
【０００２】
ｔａｔ遺伝子及びそのタンパク質は配列決定されており、ＨＩＶの提唱された治療への関与について研究されている（例えば米国特許第６，５２５，１７９号中の引用文献を参照されたい）。細胞によるＴａｔの取り込みは非常に強力であり、前記タンパク質の短い塩基性配列によって介在されると報告されている（Ｓ．Ｆａｗｅｌｌら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９１：６６４−６６８）。本発明者による先の科学出版物及び特許公報は、Ｔａｔのアミノ酸配列は非常に変化しやすいが、Ｔａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープであるエピトープ１は、アミノ酸４〜１６にわたっており、非常に保存され、７位で４倍変異（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、又はＳｅｒ）、９位で２倍変異（Ｇｌｕ又はＡｓｐ）、そして１２位で２倍変異（Ｌｙｓ又はＡｓｎ）を示すことを証明している。例えばＧ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、２：９６０；Ｇ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、２０００、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８：２７８９；１９９５年１１月３０日公開の国際公開公報ＷＯ９５／３１９９９号；１９９９年１月２１日公開の国際公開公報ＷＯ９９／０２１８５号；２００１年１１月８日公開の国際公開公報ＷＯ０１／８２９４４号；米国特許第５，８９１，９９４号；第６，１９３，９８１号；第６，３９９，０６７号；第６，５２４，５８２号；及び第６，５２５，１７９号；米国特許出願公開ＵＳ２００３／０，１６６，８３２号及びＵＳ２００３／０，１８０，３２６号を参照されたい。その後他の研究者らは、Ｔａｔ配列におけるこれらの変動性のいくつかについて記載している。例えば、とりわけ、Ｔｉｋｈｏｎｏｖら、２００３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７７（５）：３１５７−３１６６；Ｒｕｃｋｗａｒｄｔら、２００４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７８（２３）：１３１９０−１３１９６；並びに関連する国際公開公報ＷＯ２００５／０６２８７１号及びＷＯ２００４／０５６３１６号を参照されたい。
【０００３】
Ｔａｔタンパク質に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が動物で作製され、Ｔａｔタンパク質の取り込みをｉｎ  ｖｉｔｒｏでブロックすることが示されており、組織培養培地に添加したＴａｔタンパク質に対するそのようなモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＩＶ−１感染を弱毒化した（例えば米国特許第６，５２４，５８２号中の引用文献を参照されたい）。これら抗体の組み合わせ、特に１種のエピトープ１変異体に対する抗体とそれぞれ異なるエピトープ１変異体に結合する１種以上の抗体との組み合わせで形成される組成物は、Ｂクレード及び非ＢクレードともにＨＩＶ−１の複数の株及びサブタイプに特徴的な非常に多くのＴａｔ変異体配列に結合可能である。これらの抗体組成物は、被験者を受動免疫するため、即ち初期感染のあいだ及び／又は血清変換後のウイルス量がより少ないあいだにＨＩＶ−１感染性を阻害するために設計されており、したがってＡＩＤＳへの進行を遅延させる。更に、そのような抗Ｔａｔ抗体のこれらの得られる組成物又は混合物は、ウイルスの多くの株及びサブタイプに対する治療となり、したがって、さまざまなそして株特異的な治療剤に対する必要性を除去する。ＨＩＶ−１感染を治療するための各種受動免疫組成物の開発において多くの研究が進行中である。
【０００４】
組成物が宿主において抗Ｔａｔ抗体を誘導する活性な免疫は、治療及び予防に代替アプローチを提供する。発明者自身の出版物、及びその他によってそのような免疫が提唱されている。しかしながら、現在まで、ＡＩＤＳを有効に治療又は予防するのに十分な免疫応答を誘導可能な、「ユニバーサル」なＨＩＶ−１治療用免疫原性組成物及び予防用免疫原性組成物を作製し、使用するための新規で有用な組成物及び方法に対する必要性が当該技術分野に依然として存在する。そのような組成物は、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）に慢性的に感染している症候性又は非症候性の被験者に免疫してＡＩＤＳへの進行を最小限にするため（治療用組成物）、及び非感染被験者を免疫してその後のＨＩＶ−１感染後の慢性ウイルス血症やＡＩＤＳの確立を妨げるため（予防免疫）に有用であろう。当該技術分野において満たされていない必要性は、複数のＴａｔエピトープ１変異体（したがって複数のＨＩＶ−１株及びサブタイプ）に対して誘導された抗体力価を得るために十分な方法でＴａｔエピトープ１の変異体を提供し、その力価は十分に高く、組成物の頻繁な反復再投与の必要性を回避する治療用又は予防用組成物を提供することである。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本明細書に記載の組成物及び方法は、当該技術分野におけるこの必要性に取り組むための予防剤及び／又は治療剤として有用である。
【０００６】
１つの側面では、複数の株及びサブタイプのＨＩＶ−１による感染予防に有用な、自発的に抗原性を補強する免疫原性組成物を記載する。この組成物には複数の免疫原が含まれ、各免疫原は、リポペプチドキャップ（Ｒ２）、ユニバーサルＴヘルパー配列（Ｒ１）、及びＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープで構成される。１つの態様では、各免疫原は、式：Ｒ２−（Ｒ１−ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ）（式Ｉ）を有する。この式によれば、Ｒ２は免疫原中に３カ所の位置的配置を有する。１つの態様では、Ｒ２リポペプチドキャップ（図８Ａ〜図８Ｃを参照されたい）は、そのＣｙｓを介して、又は１０アミノ酸以下の任意のリンカー配列を介して、Ｔヘルパー配列Ｒ１のアミノ端アミノ酸のαアミノ基に連結しており、Ｒ１はＢ細胞エピトープのアミノ端に連結している。他の態様では、Ｒ２リポペプチドキャップは、そのＣｙｓ又はその任意のリンカーアミノ酸を介して、Ｒ１  Ｔヘルパー配列とＢ細胞エピトープとのあいだに挿入されたリジン残基のε−アミノ基に連結している。更に他の態様では、Ｒ２リポペプチドは、そのＣｙｓ又はその任意のリンカーアミノ酸を介して、免疫原のＢ細胞エピトープのＣ端に挿入されたリジン残基のε−アミノ基に連結している。
【０００７】
更に他の態様では、Ｒ１ヘルパー配列とＢ細胞エピトープは逆の順序でもよく、Ｒ２リポペプチドキャップは、上記３カ所の位置のうちいずれか１カ所においてそのリンカーアミノ酸を介して連結している。本明細書に開示の代替式によるものなど、更に他の順序の免疫原成分の配列が意図される。
【０００８】
いくつかの態様では、Ｒ２リポペプチドキャップは、１〜１０個の中性アミノ酸のリンカーを含み、免疫原の他の成分に連結している。他の態様では、類似のリンカーを使用して、免疫原の他の成分を一緒に連結する。
【０００９】
更なる態様では、リンカー配列を提供するか又は提供しない荷電極性アミノ酸の配列が免疫原のさまざまな位置に存在する。１つの態様では、荷電極性配列は、Ｒ２キャップのＣｙｓの後に、又はＲ２リポペプチドキャップの任意のリンカー中性アミノ酸とＲ１ヘルパー配列とのあいだに挿入される。他の態様では、リンカー単独で又はそのような極性配列とともに、Ｒ１ヘルパー配列とＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープとのあいだにいずれかの順序で挿入される。更に他の態様では、リンカー単独で又はそのような極性配列とともに、Ｒ１又はＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープのカルボキシ端に挿入され、いずれにしても免疫原のＣ端に位置付けられる。更なる態様では、いずれかが免疫原のアミノ端に位置付けられている場合は、リンカー単独で又はそのような極性配列とともに、Ｒ１又はＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープのアミノ端に挿入される。
【００１０】
各免疫原に関する特定の態様では、Ｒ２は、以下に記載のように、１個又は１０個以下の中性リンカーアミノ酸を含んでいてもよい、図８Ａのジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）である。各免疫原に関する特定の態様では、Ｒ２は、図８ＢのＮ−アセチル（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）（ＮＡｃ−（Ｐａｍ２）Ｃ）であり、任意のリンカーアミノ酸を含むこともできる。各免疫原に関する特定の態様では、Ｒ２は、図８Ｃのリポペプチド  トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）であり、任意にリンカー配列を含むことができる。
【００１１】
これら免疫原性組成物の１つの態様では、上記広範な式の各免疫原は、組成物中の同一式の他の免疫原と、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープ（即ちエピトープ１）のアミノ酸位置Ｘａａ７、Ｘａａ９、又はＸａａ１２におけるアミノ酸変異によって異なっている。これら免疫原性組成物の１つの態様では、Ｒ１成分、Ｒ２成分、及びＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ成分の配列が異なるか、あるいはＲ１成分及び／又はＲ２（Ｐａｍ２Ｃｙｓ又はＮＡｃ（Ｐａｍ２）Ｃ又はＰａｍ３Ｃｙｓ）成分の同一性が異なる、本明細書における広範な式の複数の免疫原は、混合物中で組み合わせることができる。そのような組成物は、被験者を免疫するために使用する場合、幾何学的平均力価（ＧＭＴ）が少なくとも５０，０００、少なくとも３００，０００、又は１００万より大きい、ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質（Ｂクレード及び非Ｂクレード）の複数の変異体と反応性の抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を誘導する。
【００１２】
他の側面では、医薬組成物は、本明細書に規定する自発的に抗原性を補強する免疫原性組成物、及び好適な医薬担体又は賦形剤を含む。この組成物は、哺乳動物被験者をそれで免疫する場合、Ｔａｔの複数の免疫優勢エピトープ（即ちエピトープ１）変異体に対するＧＭＴが５０，０００より大きく、又は３００，０００より大きく、又は１００万より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を誘導することも立証している。他の態様では、この組成物は、哺乳動物被験者をそれで免疫する場合、Ｔａｔの複数のエピトープ１変異体に対するＧＭＴが１，０００，０００より大きく、そして３，０００，０００に至るまでの抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を誘導することも立証している。
【００１３】
更に他の側面では、本明細書に記載の有効な抗体誘導量の免疫原性組成物又は医薬組成物で被験者を免疫することによって、複数のＨＩＶ−１株及びサブタイプに対するＧＭＴが高い抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ産生を誘導する方法を提供する。特定の態様では、Ｔａｔの複数の免疫優勢Ｂ細胞エピトープ変異体に対するＧＭＴは５０，０００より大きい。他の態様では、特に、本方法が組成物のプライム用量及び１回以上のブースター用量を使用する態様では、Ｔａｔの複数の免疫優勢エピトープ変異体に対するＧＭＴは顕著に高く、例えばおよそ１００，０００より大きく、３００，０００より大きく、又は１，０００，０００より大きい。
【００１４】
他の側面では、ＨＩＶ−１感染を治療及び／又は予防するための医薬の製造における上記免疫原の使用を提供するものである。医薬は、複数のＨＩＶ−１株及びサブタイプに対するＧＭＴが高い抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ産生を誘導する。
【００１５】
更に他の側面では、本明細書に記載の組成物を作製する方法は、上記式においてＸａａ７、Ｘａａ９、及びＸａａ１２で示される変異体アミノ酸を等モル量で単一合成混合物中に導入することを包含する。
【００１６】
更に他の側面では、免疫原内の少なくとも１カ所の位置に荷電極性残基を導入することにより水溶性を付与し、水性製剤及び／又は凍結乾燥製剤を容易にする。
【００１７】
これらの方法及び組成物の他の側面及び利点を、以下の詳細な説明において更に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、Ｔａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープ（即ちＴａｔエピトープ１；ＴＥＰ１）免疫原によってアジュバントを加えることなく誘導された幾何学的平均力価（ＧＭＴ）を有する抗Ｔａｔ抗体を示すグラフである。Ｔａｔの２種の一般的な免疫優勢エピトープ変異体Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ（Ｔａｔの免疫優勢エピトープ７位、９位、及び１２位に存在するアミノ酸残基を確認する上でＲＥＫとも称する）（配列番号７）及びＶ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｎ（上記と同一の理由で本明細書においてＮＥＮとも称する）（配列番号１１）を含有する２種のｒＴａｔで免疫したマウス由来の免疫血清からこれらの結果をプロットした。図１のＸ軸の下に特定した免疫原には、実施例１に記載のように合成して同定した実験用免疫原（Ｐａｍ２−ＱＹＩＫ−ＴＥＰ１及びＰａｍ３−ＱＹＩＫ−ＴＥＰ１）並びに余り有効でない免疫原（ＱＹＩＫ−ＴＥＰ１及びＰＡＭ２Ｋ−ＱＹＩＫ−ＴＥＰ１）が含まれる。実験用免疫原で免疫したマウスの血清は、ＧＭＴ＞５０，０００の抗Ｔａｔ抗体を示し、これらは対照免疫原によって誘導された抗体のＧＭＴよりも劇的に高かった。これらの結果は、液性免疫応答を増強するための実験用免疫原におけるリポペプチドキャップの必要性、並びに構造特異的リポペプチドキャップの必要性を立証しており、即ち、Ｐａｍ２Ｋのリポペプチドとしての使用は、実験用免疫原で誘導される高ＧＭＴ抗体を得るには十分でなかった。
【図２】図２は、式（Ｔａｔ１の免疫優勢エピトープを太字の１文字アミノ酸略語で、ゆらぎを括弧内に示す）：
【化１】
2010500407.tif 000002
に包含される全実験用免疫原の混合物で免疫した１匹のマウスの血清中の抗体の、組換え全長Ｔａｔの全変異体（１〜７２アミノ酸）に対する力価を示すグラフであり、変異体は発生率の順にＸ軸に沿って左から右へ表示されている。アミノ酸Ｒ７、Ｅ９、及びＫ１２、又はＮ７、Ｅ９、及びＮ１２の優勢なｒＴａｔ変異体、例えばＲＥＫ（Ｂクレード）及びＮＥＮ（非Ｂクレード）は網掛けされている。変異体を表１及び実施例２に特定する。血清は、Ｔａｔの全８種の免疫優勢エピトープ変異体に対し、幾何学的平均抗体力価＞１００，０００を示した。
【図３】図３は、実験用免疫原Ｐａｍ２Ｃ−Ｓ−Ｓ−マウスＴヘルパー配列−Ｖ−Ｄ−Ｐ−（Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｓ）−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−（Ｋ／Ｎ）−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−アミド（配列番号３；Ｔａｔアミノ酸残基７位及び１２位が「ゆらぎ」）で、第０日に１ｍｇ腹腔内プライミング用量、その後第２週に１ｍｇ腹腔内ブースター、そして第３０週に０．３ｍｇ腹腔内第２ブースターのプロトコールにより免疫した２匹のマウス由来血清の逐次力価を示すグラフである。Ｔａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープ変異体  配列番号１５：Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−（ＲＥＫ）（○、ＲＥＫに対するマウス１；及び△、ＲＥＫに対するマウス２）及び配列番号１９：Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−（４アミノ酸のＣ端隣接配列−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−を有するＮＥＮ）（◇、ＮＥＮに対するマウス１；及び▽、ＮＥＮに対するマウス２）に対して血清を滴定した。抗体力価は、第４週〜第１６週に幾分減少し、第２８週まで８０，０００で安定なままであった。抗体力価は、第３０週の０．３ｍｇブースト後２週間顕著な増加を示す。これらのデータは、プライム・ブースト法は少なくとも４ヶ月間有効レベルを維持することができ、その後の追加ブーストは力価を更に増加させることを立証している。
【図４】図４は、実施例４Ａに記載のような、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１複製のためのＴａｔ誘導性の許容の抗体阻害に関するバイオアッセイのグラフである。データは、ＨＩＶ−１複製のためのＰＢＭＣのＴａｔ誘導性の許容の抗Ｔａｔ  Ｍａｂによる阻害を示している。下部の点線は、ＴａｔのないバックグラウンドＨＩＶ−１  ｐ２４レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す；そして上部の線は、１０ｎｇ／ｍｌ  Ｔａｔを有する平均ＨＩＶ−１  ｐ２４レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す。阻害の用量反応曲線を作成したところ、３μｇ／ｍｌ抗Ｔａｔモノクローナル抗体（Ｍａｂ）及び１０μｇ／ｍｌ抗Ｔａｔモノクローナル抗体はそれぞれ８７％及び９７％阻害を生じ、統計的に非常に有意である（それぞれＰ＜０．００１及び０．０００１）。
【図５】図５は、実施例４ＢのＥＬＩＳＡにおける、図４で使用したのと同一の抗Ｔａｔ  ＭＡｂによる％阻害又は遊離Ｔａｔ濃度の低下を示すグラフである。３〜１０μｇ／ｍｌの範囲にわたって完全阻害が観察され、これはＴａｔに対する抗体力価１２，０００〜４０，０００に相当する。
【図６】図６は、実施例４ＢのＥＬＩＳＡにおける、高力価マウス抗Ｔａｔ血清の希釈による％阻害又は遊離Ｔａｔ濃度の低下を示すグラフである。遊離Ｔａｔ濃度の最大阻害は、１２，０００〜４０，０００力価範囲で生ずる。
【図７】図７Ａは、実施例４ＢのＥＬＩＳＡにおける、中等度力価の抗Ｔａｔ血清マウス５匹／群）の使用による％阻害又は遊離Ｔａｔ濃度の低下を立証しているグラフである。マウス血清の力価は２５６，０００であり、１０％希釈で力価２５，０００、１％希釈で力価２，５００であった。試験ＲＥＫ（◇）は、実験用免疫原で免疫したマウスの、ＲＥＫ  Ｔａｔ変異体に対して試験した血清である。対照ＲＥＫ（◇、太字の菱形）は、ＲＥＫ  Ｔａｔ変異体に対して試験した正常マウス血清である。対照における高濃度Ｔａｔと比較して、１％希釈した免疫マウス血清では遊離Ｔａｔ濃度の４９％阻害を示し、１０％希釈では血清は９２％阻害を示した。  図７Ｂは、実施例４ＢのＥＬＩＳＡにおける、中等度力価の抗Ｔａｔ血清（マウス５匹／群）の使用による％阻害又は遊離Ｔａｔ濃度の低下を立証しているグラフである。マウス血清の抗体力価は２５６，０００であり、１０％希釈で力価２５，０００、１％希釈で力価２，５００であった。試験ＮＥＮ（◇）は、実験用免疫原で免疫したマウスの、ＮＥＮ  Ｔａｔ変異体に対して試験した血清である。対照ＮＥＮ（◇、太字の菱形）は、ＮＥＮ変異体に対して試験した正常マウス血清である。対照における高濃度Ｔａｔと比較して、１％希釈した試験ＮＥＮでは遊離Ｔａｔ濃度の３３％阻害を示し、１０％希釈では８７％阻害を示した。
【図８】図８Ａは、リポペプチドキャップ、ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン（Ｐａｍ２Ｃ又はＰａｍ２Ｃｙｓ）の化学構造である。  図８Ｂは、リポペプチドキャップ、Ｎ−アセチル（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）（ＮＡｃ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）又はＮＡｃ（Ｐａｍ２Ｃ））の化学構造である。  図８Ｃは、リポペプチドキャップ、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン（Ｐａｍ３Ｃ又はＰａｍ３Ｃｙｓ）の化学構造である。
【図９】図９は、式：
【化２】
2010500407.tif 000003
に包含される全実験用免疫原の混合物で免疫した１匹のラットの血清中の抗体の、ゆらぎ位置７位、９位、及び１２位におけるアミノ酸残基によって名付けられた８種の全長ｒＴａｔ（１〜７２アミノ酸）変異体タンパク質（ＲＥＫ、ＫＥＫ、ＳＥＫ、ＮＥＫ、ＮＥＮ、ＮＤＮ、ＫＥＮ、及びＳＥＮ）に対する力価を示すグラフである。各点は、８種の変異体のうち１種に対するＧＭＴを表す。血清は、全８種のＴａｔのエピトープ１変異体に対して抗体力価＞１，０００，０００を示した。第０日にプライム、第３週に第１ブースト、第６週に第２ブースト、及び第８週に力価測定のために出血させるという好ましい免疫法を用いた。
【図１０】図１０は、実施例８のＴａｔ枯渇アッセイの結果を示すグラフである。溶液中に残留する各遊離全長ｒＴａｔ変異体（上記のように命名）の濃度を、１％又は１０％ラット免疫血清（プロテインＡビーズに結合した実施例１の免疫原で免疫したラットから採取）とともにインキュベーション後に測定した。遊離Ｔａｔを、正常非免疫ラット血清対照（１％又は１０％正常ラット血清プロテインＡコーティングビーズに曝露後の遊離Ｔａｔ）に対する割合で表した。点線は１０％遊離Ｔａｔである。
【図１１】図１１は、Ｐａｍ３Ｃのリンカー（即ち−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｓ−）（配列番号６４）が隣接した極性荷電配列を有する式：
【化３】
2010500407.tif 000004
に包含される全実験用免疫原の混合物で免疫したラットの血清中の抗体の長期間の力価を示すグラフである。この免疫原を「ＴＵＴＩ−Ｋ４」と称する。第０日に０．１ｍｇ  ＴＵＴＩ−Ｋ４（▽）、又は１ｍｇ  ＴＵＴＩ−Ｋ４（◇）、又は１０ｍｇ  ＴＵＴＩ−Ｋ４（●）を各用量について３匹のラットにそれぞれ投与し、第３週に同一用量でブーストした。全長ｒＴａｔ（１〜７２アミノ酸）変異体タンパク質ＲＥＫに対する力価を測定する。第５週までに、１０ｍｇ及び１ｍｇ用量はともにＧＭＴ約１，０００，０００を提供し、０．１ｍｇ用量はＧＭＴ約５００，０００を提供した。これらの力価は全て、遊離Ｔａｔレベルの９９％を超える低下に関連している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本明細書に記載の組成物及び方法は、ヒト被験者において複数の株及びサブタイプのＨＩＶ−１感染の治療、進行抑制、及び予防に使用するための、治療用及び予防用免疫原性組成物に関する当該技術分野における必要性に取り組むものである。１つの態様では、これらの組成物は、あらゆる種類のＨＩＶ−１株及びサブタイプに対して有効な製剤並びに治療的及び予防的療法の適用を包含する。「ユニバーサルな」ＨＩＶ−１予防用及び治療用免疫原性組成物、即ち複数のＨＩＶ−１株及びサブタイプ、特に、最も頻繁に発生するそれらの株及びサブタイプのＴａｔタンパク質を阻止する上で有効な組成物を作製するために、発明者は複数の課題を克服した。本明細書に記載の組成物は、（１）免疫原性エピトープのペプチド配列内に変動性を組み込んでユニバーサルな組成物を作製し；（２）ヒトへの使用に許容可能な強力な免疫原性部分を作製し；そして（３）注射用蒸留水で容易に再構成される凍結乾燥産物として提供することができる、水性溶媒に可溶性の免疫原を作製する。単一免疫原では、複数のＨＩＶ−１  Ｔａｔサブタイプ及び株に対し、Ｂ細胞応答とともに、ヘルパーＴ細胞応答を同時に高める選択配列を、自発的に抗原性を補強する特に望ましいリポタンパク質と組み合わせ、得られる配列を修飾して水溶性を高める。この組み合わせは、並外れて高い、持続的レベルの抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体力価をｉｎ  ｖｉｖｏで引き出す組成物を生ずる。
Ｉ．  組成物
１つの態様では、自発的に抗原性を補強する免疫原性組成物は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔペプチドを使用する特異的に設計されたさまざまな免疫原の混合物を含み、複数のＨＩＶ−１株のＴａｔタンパク質に対する幾何学的平均力価が５０，０００より大きく、３００，０００より大きく、そして１００万より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を組成物が誘導することを可能にする。本明細書で用いるような各「免疫原」は、天然には発生しないが、合成技術、例えば核酸又はアミノ酸の化学合成技術によって作製することができる組成物である。この化学合成は完全に拡張性があり、多量の免疫原を作製するための比較的安価なプロセスを可能にする。当該技術分野に熟練した者の選択で、組換えＤＮＡの調製及び発現も利用し、免疫原のある部分を構築することも可能である。
【００２０】
１つの態様では、免疫原性組成物は、１種以上の免疫原を含み、各免疫原には、リポタンパク質キャップ（Ｒ２）、ユニバーサルＴヘルパー配列（Ｒ１）、及びＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質の免疫優勢Ｂ細胞エピトープが含まれる。これら免疫原成分について以下に詳細に記載する。更なる態様では、免疫原性組成は、１種以上の以下の免疫原を含む：
式Ｉ：        Ｒ２−（Ｒ１−ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ）、あるいは
式ＩＩ：      Ｒ２−（ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ−Ｒ１）、あるいは
式ＩＩＩａ：  Ｒ２−Ｋ（ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ）−Ｒ１、あるいは
式ＩＩＩｂ：  Ｒ２−Ｋ（Ｒ１）−ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ。
【００２１】
式Ｉ及び式ＩＩではそれぞれ、Ｒ２リポペプチドキャップは、本明細書に記載のように、３カ所のうち１カ所の位置をとることができる。１つの態様では、Ｒ２キャップは、Ｒ２のＣｙｓ又はその任意のリンカーアミノ酸を介して、Ｒ１（式Ｉ）又はＢ細胞エピトープ（式ＩＩ）のいずれかのＮ端アミノ酸のα−アミノに連結している。上記式の他の態様では、任意のリジン残基（Ｋ）が、Ｒ１  Ｔヘルパー配列とＢ細胞ペプチドとのあいだ（式Ｉ）、Ｂ細胞ペプチドとＲ１とのあいだ（式ＩＩ）、Ｒ１のＣ末端（式ＩＩ）、又はＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープのＣ末端（式Ｉ）に挿入されている。Ｒ２は、これら後者の態様では、Ｒ２のＣｙｓ又はその任意のリンカーアミノ酸を介して、挿入されたＫのε−アミノ基に連結している。
【００２２】
式ＩＩＩａにおいて、Ｋは挿入されたリジン残基である。括弧内のＢ細胞エピトープは、そのカルボキシ端でＫのε−アミノ基に結合している。Ｒ１のアミノ端は、Ｋ残基のカルボキシ端に直接結合している。同様に、式ＩＩＩｂにおいて、Ｋは挿入されたリジン残基である。括弧内のＲ１は、そのカルボキシ端でＫのε−アミノ基に結合している。Ｂ細胞エピトープのアミノ端は、Ｋ残基のカルボキシ端に直接結合している。
【００２３】
特定の態様では、Ｒ２には、長さ０〜１０アミノ酸の中性アミノ酸配列又はリンカー配列が含まれ、Ｒ２のリポペプチドを他の成分へ連結して免疫原を形成する。他の態様では、任意のリンカーは、選択した式に依存して、Ｒ１のアミノ端若しくはカルボキシ端に、又はＢ細胞エピトープのアミノ端若しくはカルボキシ端に存在する。他の態様では、溶解性を高めるため、荷電極性アミノ酸配列が、隣接リンカーアミノ酸とともに又は隣接リンカーアミノ酸なしで式の成分間又は免疫原のカルボキシ端において免疫原の式に挿入されている。リンカー配列及び極性荷電配列について以下に詳細に記載する。
【００２４】
本明細書に記載の免疫原は、上記式の選択に基づいて各種構造を形成することができる。式Ｉの免疫原の１つの態様では、Ｒ２リポペプチドキャップは、Ｃｙｓ及び任意に１個以上の中性リンカーアミノ酸を含有するが、Ｂ細胞エピトープに連結しているＲ１  Ｔヘルパー配列のアミノ端でα−アミノ基に連結しており、したがって直鎖状構築物を形成する。任意の極性荷電配列は、Ｒ２のＣｙｓの後に、又はＲ２リンカーアミノ酸間に位置し、したがってＲ１に連結しているが、溶解性を高めるために、免疫原のＲ１及びＢ細胞エピトープのアミノ末端又はカルボキシ末端における追加位置に位置付けられてもよい。この式の免疫原を以下の実施例に記載する。式Ｉの免疫原の他の態様では、Ｒ２は、そのＣｙｓ又はその任意のリンカーアミノ酸のみを介して及び／又は中性リンカーアミノ酸が隣接していてもよい荷電極性配列を介して、Ｒ１とＢ細胞エピトープの第１Ｎ端アミノ酸残基とのあいだに位置付けられたＫ残基のε−アミノ基に連結している。式Ｉで定義されるような免疫原の更に他の態様では、Ｒ２は、そのＣｙｓ、その任意のリンカーアミノ酸、及び／又は極性荷電配列を介して、Ｂ細胞エピトープのＣ端に位置付けられたＫ残基のε−アミノ基に連結している。
【００２５】
本明細書に記載のような免疫原の更に他の態様は、式ＩＩの形態を取ることができる。多くの態様では、Ｒ２リポペプチドキャップのアミノ末端は遊離しており、即ちＲ１ヘルパー配列とＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープとのあいだに結合していない。式ＩＩの免疫原の１つの態様では、その任意のリンカーアミノ酸及び／又は極性荷電アミノ酸配列を有するＲ２リポペプチドキャップは、Ｒ１ヘルパー配列に連結しているＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープのアミノ端のα−アミノ基に連結している。式ＩＩの他の免疫原では、Ｒ２リポペプチドキャップは、そのＣｙｓ、その任意のリンカーアミノ酸、及び／又はその極性荷電配列、又はそれらの組み合わせを介して、ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープとＲ１の第１Ｎ端アミノ酸残基とのあいだに位置付けられたＫ残基のε−アミノ基に連結している。他の態様では、Ｒ２リポペプチドキャップは、上記のように、式ＩＩのＲ１のＣ端に位置付けられたＫ残基のε−アミノ基に連結している。任意のリンカー及び／又は極性荷電配列は、１種以上のこれら免疫原成分のあいだに位置付けることができる。他の代替免疫原は、本明細書の教示があれば当該技術分野に熟練した者によって、これらの成分及び式を使用して設計することができる。
【００２６】
１つの態様では、免疫原性組成物は、上記式のうちの１つで規定される単一免疫原又は複数の同一免疫原を含有する。他の態様では、２種以上の異なる免疫原が組成物中に存在する。更なる態様では、２種以上の免疫原はそれぞれ異なる式である。同一の式又は異なる式である２種以上の異なる免疫原を含有する１つの態様では、組成物中の各免疫原は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープのアミノ酸位置Ｘａａ７、Ｘａａ９、又はＸａａ１２におけるアミノ酸変異によって組成物中の他の免疫原と異なっている。したがって、免疫原性組成物の１つの態様は、上記式Ｉ又は式ＩＩの２種のそのような免疫原を含有する。他の態様では、免疫原性組成物は、３種以上のそのような免疫原を含有する。更なる態様では、免疫原は、以下で考察するＴａｔのエピトープ中の７位、９位、又は１２位における１カ所以上の可変アミノ酸位置のアミノ酸変異によって、組成物中の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩａ、又は式ＩＩＩｂの他の免疫原のＨＩＶ−１  Ｔａｔの他のエピトープと異なるＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープを有する。他の態様では、免疫原性組成物は、式中のＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープのこれらアミノ酸位置のうち１カ所以上のアミノ酸変異によって異なる少なくとも２種、３種、４種、６種、８種、１２種、又は少なくとも１６種の異なる免疫原を含有する。特定の態様では、免疫原性組成物は、それら可変残基で異なるＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープペプチドを有する少なくとも３種、４種、５種、６種、７種、又は８種の免疫原を含有する。
【００２７】
他の態様では、組成物は、Ｒ１  Ｔ細胞ヘルパー配列の同一性が異なる２種以上の免疫原を有する。更に他の態様では、組成物中の異なる免疫原は、同一又は異なるＲ１をそれぞれ有することができる。他の態様では、組成物中の各免疫原は、異なる式、例えば式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩａ、及び／又は式ＩＩＩｂのうちの１つを有することができる。
Ａ．  ＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープ１成分
上記免疫原のＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープは式ＩＶの免疫優勢エピトープ：
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｘａａ７−Ｌ−Ｘａａ９−Ｐ−Ｗ−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６（配列番号１）である。式ＩＶでは、Ｘａａ７はアミノ酸Ｒ、Ｋ、Ｎ、又はＳのうちの１つである。Ｘａａ９はアミノ酸Ｅ又はＤである。Ｘａａ１２はＫ又はＮである。アミノ酸Ｘａａ１３〜Ｘａａ１６は、免疫原に含まれる任意の隣接配列を表す。Ｘａａ１３〜Ｘａａ１６の１個以上のアミノ酸は存在しなくともよい。これらのアミノ酸は免疫原性を高めるが、免疫優勢エピトープの本質的部分ではない。したがって、式ＩＶのＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープは、本明細書において、Ｘａａ１３〜Ｘａａ１６が存在しないか又はこれら４残基が存在するいずれかをさまざまに表すことができる。したがって、ある態様では、Ｘａａ１３は存在しないかＨであり、Ｘａａ１４は存在しないかＰであり、Ｘａａ１５は存在しないかＧであり、そしてＸａａ１６は存在しないかＳである。
【００２８】
７位、９位、及び１２位のアミノ酸のさまざまな選択によって形成される１６種の可能な変異体の中で、８種の変異体は免疫学的に異なる野生型変異体であることが知られている。残り８種の他の変異体は天然に発生することが知られている。免疫優勢ペプチドの８種の免疫学的に異なる変異体を、表１に示すように、７位、９位、及び１２位のアミノ酸のみを特定する簡単な参照によって特定する。以下の表１に列挙する同一エピトープペプチドは、Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ配列が隣接する場合、それぞれ配列番号１５〜２２として特定される。これら簡単な参照を本明細書全体で使用する。
【００２９】
【表１】
2010500407.tif 000005
【００３０】
したがって、１つの態様では、組成物を形成する免疫原のＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープは、任意の隣接配列のない、これら８種のペプチドの中から選択される。他の態様では、免疫原中の８種のペプチドには、免疫原性を高めるため、各ペプチドのＣ端に残基Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号４）が含まれる。更に他の態様では、１種以上のペプチドは、わずか１個、２個、又は３個の隣接アミノ酸を含有する。更に他の態様では、なし、１個、２個、３個、又は４個の隣接アミノ酸を含有するＢ細胞エピトープペプチド混合物を免疫原に使用する。
【００３１】
組成物が単一免疫原を含有する１つの態様では、上記免疫原のうちの１種を使用する。本明細書に規定する組成物の更なる態様では、式ＩＶの少なくとも２種、少なくとも３種、４種、５種、６種、７種、又は８種の上記Ｔａｔ変異体エピトープが、自発的に抗原性を補強する組成物の各種態様を形成する個々の免疫原に含有される。
【００３２】
組成物をどのように作製するかに応じて、他の免疫原性組成物は、８種より多い異なるＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープペプチドを含有することができる。したがって、組成物は、アミノ酸位置Ｘａａ７、Ｘａａ９、及びＸａａ１２において異なる８〜１６種の可能な種々のＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープ変異体配列を含有することができ、それにより、上記８種のペプチドへ以下の追加のペプチド成分を付加する。隣接アミノ酸のないこれら追加の８種の変異体を以下の表２に報告し、簡単な参照を本明細書全体で使用する。
【００３３】
【表２】
2010500407.tif 000006
【００３４】
先に言及したように、特定の態様では、これら組成物の免疫原中のＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープは、組成物中のＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープの免疫原性を高めるために、各エピトープのカルボキシ端に隣接配列Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓも含有する。隣接配列を有する表２に列挙したような同一エピトープをそれぞれ配列番号３２〜３９と特定する。
【００３５】
したがって、１つの態様では、免疫原性組成物は、式Ｉ〜式ＩＩのそれぞれに関し１〜１６種以下の異なる免疫原を含有し、これらは免疫原のＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープが異なっている。更なる態様では、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープ端における隣接アミノ酸Ｘａａ１３〜Ｘａａ１６の存在によって追加の変動性を導入することができる。
【００３６】
組成物中に存在することができる得られる免疫原は、以下のように、式Ｉによって個々に規定される（Ｒ２を上記のような３カ所うちの１カ所の位置に有し、任意のリンカー及び／又は極性荷電配列を本明細書に記載のような１カ所以上の位置に含む）：
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号１５）、
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号１６）、
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号１７）、
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号１８）、
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号１９）、
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号２０）、
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号２１）、
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号２２）、
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号３２）、
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号３３）、
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号３４）、
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号３５）、
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号３６）、
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号３７）、
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号３８）、及び
Ｒ２−（Ｒ１−配列番号３９）。
【００３７】
それぞれ配列番号１５〜２２のＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープを有するこの上記リスト中の最初の８種の免疫原が、１〜８種の異なる免疫原を含有する組成物に最も好ましい。９種以上の免疫原を含有する組成物では、リスト中の最後の８種の免疫原の中から追加の免疫原を選択する。しかしながら、このリストからのＢ細胞エピトープの他の組み合わせも本明細書に記載の免疫原に有用である。
【００３８】
組成物中に存在することができる同様に得られる免疫原は、以下のように、式ＩＩによって個々に規定される（Ｒ２を上記のような３カ所のうちの１カ所の位置に有し、任意のリンカー及び／又は極性荷電配列を本明細書に記載のような１カ所以上の位置に含む）：
Ｒ２−（配列番号１５−Ｒ１アミド）、
Ｒ２−（配列番号１６−Ｒ１アミド）、
Ｒ２−（配列番号１７−Ｒ１アミド）、
Ｒ２−（配列番号１８−Ｒ１アミド）、
Ｒ２−（配列番号１９−Ｒ１アミド）、
Ｒ２−（配列番号２０−Ｒ１アミド）、
Ｒ２−（配列番号２１−Ｒ１アミド）、
Ｒ２−（配列番号２２−Ｒ１アミド）、
Ｒ２−（配列番号３２−Ｒ１アミド）、
Ｒ２−（配列番号３３−Ｒ１アミド）、
Ｒ２−（配列番号３４−Ｒ１アミド）、
Ｒ２−（配列番号３５−Ｒ１アミド）、
Ｒ２−（配列番号３６−Ｒ１アミド）、
Ｒ２−（配列番号３７−Ｒ１アミド）、
Ｒ２−（配列番号３８−Ｒ１アミド）、及び
Ｒ２−（配列番号３９−Ｒ１アミド）。
【００３９】
１つの態様では、組成物は、上記式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩａ、又は式ＩＩＩｂにおいて表１の最初の８種のＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープ配列、即ち配列番号７〜１４又は同一式内に隣接アミノ酸を有する配列番号１５〜２２を含有する免疫原から選択される３〜８種以下の異なる免疫原を含有する。更に他の組成物は、各リストからの９〜全１６種以下の異なるＨＩＶ−１の免疫優勢エピトープペプチド、又は表１及び表２のＴａｔの免疫優勢エピトープ配列（Ｃ端隣接アミノ酸は存在するか又は存在しない）を含有する。更に他の態様では、組成物は、わずか１個、２個、又は３個の隣接アミノ酸を有する上記免疫原のいずれかを含めることができる。
【００４０】
上記免疫原の中でＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープを修飾することも可能である。例えば、他のＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープは、相同の又は類似の修飾免疫優勢エピトープ配列を含めることができ、ここで、式：Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｘａａ７−Ｌ−Ｘａａ９−Ｐ−Ｗ−Ｘａａ１２（配列番号２）中の非可変アミノ酸（即ち、１文字と下付き文字とで表記されていないもの）は、類似の特徴を有するアミノ酸残基で個別に保存的置換することができる。例えば、配列番号２の非可変アミノ酸残基は、同一電荷及び／又は類似側鎖長を有する他のアミノ酸残基で置換することができる。１例として、Ｔａｔのアミノ酸残基８のロイシンは、時にＴａｔ配列において天然に生ずるようにイソロイシンで置換することができる。同様に、配列番号２の非可変天然アミノ酸は、非天然アミノ酸残基、即ち化学構造に修飾を有するアミノ酸、例えばＤ−アミノ酸；非天然側鎖を有するアミノ酸、Ｎ−メチル化アミノ酸などで置換することができる。とりわけ、Ｎ−メチル化アミノ酸に関する引用文献を参照されたい。例えばＬ．Ａｕｒｅｌｉｏら、２００２、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４（２１）：３７６７−３７６９、及びその中の引用文献を参照されたい。
【００４１】
更に、免疫優勢エピトープの式：Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｘａａ７−Ｌ−Ｘａａ９−Ｐ−Ｗ−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６（配列番号１）の４〜１２個のＴａｔアミノ酸残基を組み込んでいるが、Ｎ端及び／又はＣ端に追加のアミノ酸を含有する、より長いペプチドを使用することができる。しかしながら、そのように長い配列は免疫原に機能的相違を提供しそうにない。例えば、上記のようなＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープは、Ｃ端の隣接アミノ酸を有することなく、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの長さ９アミノ酸残基を含有する。しかしながら、他のＴａｔの免疫優勢エピトープペプチドは、そのようなアミノ酸（可変アミノ酸７、９、及び１２を含むことが好ましい）の長さ約６残基のより短い配列から約２５アミノ酸残基まで含有することができる。更に他の免疫優勢ペプチドは、ＨＩＶ−１  ＴａｔのＮ端配列より多くを含有することができる。あるいは、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープの隣接配列Ｘａａ１３〜Ｘａａ１６のＨ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号４）を、免疫優勢エピトープペプチドの免疫原性を高める他の配列で同様に置換することができる。更に他の態様では、Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号４）アミノ酸のそれぞれを、Ｔａｔの免疫優勢エピトープの不可変アミノ酸残基に関して上記したような修飾物で個別に置換することができる。
【００４２】
更に他の態様では、本明細書に記載の免疫優勢エピトープ免疫原とともに使用するための代替免疫原を調製することができる。例えば以下の実施例１の代替免疫原の記載を参照されたい。そのような代替免疫原の使用は、本明細書に記載の免疫優勢エピトープ免疫原を含有する免疫原性組成物によって誘導されるＨＩＶ−１  Ｔａｔに対する応答を高めることができる。
Ｂ．  ユニバーサルＴヘルパー配列Ｒ１
本明細書に記載の免疫原性組成物の免疫原の他の成分は、免疫原中のＢ細胞エピトープ、即ちＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープの免疫原性を高めるために用いるユニバーサルＴヘルパーエピトープである。「Ｔヘルパーエピトープ」という用語は、１種以上のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子との関連でＴヘルパーリンパ球を活性化するアミノ酸鎖を意味することを意図するものであり、免疫原のＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープに対する抗体応答を高める。特定の態様では、免疫原のＴヘルパーエピトープ成分は、大部分の個体に存在するＴヘルパー細胞によって認識されるものである。これは、多くの、大部分の、又は全てのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドを選択することによって達成することができる。これらは、「ＨＬＡで緩く拘束された」又は「無差別」Ｔヘルパー配列として知られている。特に、無差別Ｔ細胞エピトープは、上記式においてＲ１部分として用いられる。選択した免疫原の式に応じて、Ｒ１配列は、ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープに、エピトープのアミノ端又はカルボキシ端において直接又は任意のリンカー及び／又は極性荷電配列を介して連結することができる。
【００４３】
また、選択した免疫原の式に応じて、Ｒ１とＲ２との連結は以下のうちの１つである：Ｒ２は、そのＣｙｓ又はその任意のリンカーアミノ酸及び／又は極性荷電配列を介して、Ｒ１のＮ端アミノ酸のα−アミノに連結している。あるいは、Ｒ２は、そのＣｙｓ又はその任意のリンカーアミノ酸及び／又は極性荷電配列を介して、Ｒ１とＢ細胞エピトープとのあいだに挿入された追加のリジン残基のε−アミノ基に連結している。あるいは更に、Ｒ１が免疫原のカルボキシ端に位置付けられている場合、Ｒ２は、そのＣｙｓ又はその任意のリンカーアミノ酸及び／又は極性荷電配列を介して、Ｒ１のカルボキシ端に挿入されたリジンのε−アミノ基に連結することができる。
【００４４】
多くの無差別又はユニバーサルＴヘルパー配列は、さまざまな供給源、例えば微生物において天然に生じ、又は人工的に操作された配列である。そのような好適なＴ細胞エピトープは公知であり、これらの免疫原及び組成物におけるこの使用のために選択することができる。
【００４５】
１つの態様では、そして以下の実施例で例示するように、本明細書の式Ｉ又は式ＩＩに記載のような免疫原のＲ１  Ｔヘルパー配列は、配列番号６：Ｑ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｘａａの配列を有し、式中、Ｘａａは存在しないかＬである。この配列は破傷風毒素のアミノ酸８３０〜８４３（８４４）に天然に見られる；Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら、１９８９、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：２２３７を参照されたい。Ｒ１として有用な他のそのような破傷風毒素配列（破傷風毒素のアミノ酸９４７〜９６７）は、配列番号２３：Ｆ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｆ−Ｗ−Ｌ−Ｒ−Ｖ−Ｐ−Ｋ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｈ−Ｌ−Ｅの配列、又は破傷風トキソイドのアミノ酸９５０〜９６９のようなその誘導体を有する。Ｒｅｅｃｅ  ＪＣら、１９９４、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７２：２４１−５４を参照されたい。式ＩのＲ１として使用するための更に他の破傷風トキソイドＴ細胞ヘルパー配列には、破傷風トキソイドのアミノ酸６３２〜６５１である配列番号４０：Ｉ−Ｄ−Ｋ−Ｉ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｓ−Ｔ−Ｉ−Ｖ−Ｐ−Ｙ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｎ−Ｉの配列、破傷風トキソイドのアミノ酸５８０〜５９９である配列番号４１：Ｎ−Ｓ−Ｖ−Ｄ−Ｄ−Ａ−Ｌ−Ｉ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｋ−Ｉ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｆ−Ｐ−Ｓ−Ｖ、破傷風トキソイドのアミノ酸９１６〜９３２である配列番号４２：Ｐ−Ｇ−Ｉ−Ｎ−Ｇ−Ｋ−Ａ−Ｉ−Ｈ−Ｌ−Ｖ−Ｎ−Ｎ−Ｅ−Ｓ−Ｓ−Ｅ、及び破傷風トキソイドのアミノ酸８３０〜８４２である配列番号４３：Ｚ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅが含まれる。免疫原のＲ１として有用な更に他のユニバーサルＴ細胞ヘルパー配列に関し、例えば、全て本明細書に援用される、Ｈｏら、１９９０、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０：４７７；Ｖａｌｍｏｒｉら、１９９２、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４９：７１７−７２１；Ｃｈｉｎら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８１：４２８；Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、１９９５、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９５：３４１；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、１９９７、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：１３８３；Ｋａｕｍａｙａ  ＰＴＰら、１９９３、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ６：８１−９４（１９９３）；及びＤｉｅｔｈｅｌｍ−Ｏｋｉｔａ  ＢＭら、２０００、Ｊ  Ｉｎｆ  Ｄｉｓ  １７５：３８３−９１を参照されたい。また、本明細書に記載の免疫原のＲ１として使用できる特定のジフテリア毒素Ｔ細胞ヘルパー配列について考察している、本明細書に援用される、Ｒａｊｕら、１９９５、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２５：３２０７−１４及びＤｉｅｔｈｅｌｍ−Ｏｋｉｔａ  ＢＭら、２０００、Ｊ  Ｉｎｆ  Ｄｉｓ  １８１：１０００−９を参照されたい。上記式のＲ１のためのＴヘルパーエピトープ配列として有用であり得る更に他の配列は、本明細書に援用されるＮａｒｄｉｎら、２００１、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：４８１−９に開示されている。
【００４６】
無差別な他のＴヘルパー配列の例には、熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質３７８〜３９８位（Ｄ−Ｉ−Ｅ−Ｋ−Ｋ−Ｉ−Ａ−Ｋ−Ｍ−Ｅ−Ｋ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｖ−Ｆ−Ｎ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ｓ；配列番号４４）、及び連鎖球菌の１８ｋＤタンパク質１１６位（Ｇ−Ａ−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ａ；配列番号４５）のような抗原由来配列が含まれる。例えば本明細書に援用される米国特許第７，０２６，４４３号を参照されたい。
【００４７】
Ｒ１ユニバーサルＴ細胞ヘルパー配列は、例えば米国特許第５，７３６，１４２号（例えば本明細書に援用されるＰＣＴ公開公報ＷＯ９５／０７７０７号を参照されたい）に記載のＰａｎ  ＨＬＡ  ＤＲ結合（ＰＡＤＲＥ）分子（エピミューン、カリフォルニア州サンディエゴ）のような人工的に操作された配列であることもできる。これらの合成化合物は、大部分のＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子に最も好ましく結合するように設計されている。他の例には、ＤＲ  １−４−７スーパーモチーフ、又はＤＲ３モチーフのいずれかを有するペプチドが含まれる。これらの配列は、Ｂ細胞及びマクロファージ及び樹状細胞上のクラス２主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原によって認識され、Ｂ細胞による抗原提示を高める。
【００４８】
したがって、１つの態様では、Ｒ１  Ｔヘルパー配列は、配列番号４６：Ｘａａ１−Ｋ−Ｘａａ２−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ｔ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ａ−Ｘａａ３の式によって規定され、式中、Ｘａａ１及びＸａａ３はＤ−Ａｌａ又はＬ−Ａｌａから個別に選択され、そしてＸａａ２はＬ−シクロヘキシルアラニン、Ｐｈｅ、又はＴｙｒである。これらのＴヘルパー配列は、ＨＬＡ型にかかわらず、大部分のＨＬＡ−ＤＲアレルに結合し、大部分の個体由来Ｔヘルパーリンパ球の応答を刺激することがわかっている。１つの態様では、Ｒ１は上記式を有し、式中、Ｘａａ１及びＸａａ３はともにＤ−Ａｌａであり、そしてＸａａ２はシクロヘキシルアラニンである。他のＰＡＤＲＥ配列には、全て「Ｌ」天然アミノ酸で構成されるｐａｎ−ＤＲ結合エピトープの代替物が含まれ、エピトープをコードする核酸の形態で提供することができる。更に他のＰＡＤＲＥ配列は、全て本明細書に援用される、Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、１９９５、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９５：３４１；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７５１−６１；Ｄｅｌ  Ｇｕｅｒｃｉｏ  Ｍ−Ｆら、１９９７、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：４４１−８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊら、２０００、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：１６２５−３３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊら、２００４、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：２３６２−７；及びＡｇａｄｊａｎｙａｎ  ＭＧら、２００５、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４：１５８０−６に開示されている。
【００４９】
これらのＴヘルパーペプチド配列Ｒ１は、修飾して生物学的特性を変更することもできる。例えば、それらは、Ｄ−アミノ酸又は他のアミノ酸修飾を含むように修飾し、プロテアーゼに対する耐性を高めて血清半減期を延長させることができる。更に、これらの無差別Ｔ細胞ヘルパー配列又はＲ１配列は、以下に考察するように、リンカー配列及び／又は極性荷電配列を更に含めることができる。
【００５０】
当該技術分野に熟練した者は、他の公知の無差別Ｔ細胞ヘルパー配列の中から選択して、本明細書に記載のような免疫原性組成物のための他の特異的免疫原を設計することが予想される。以下に記載の特異的態様は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質に対する幾何学的平均力価（ＧＭＴ）が高い抗体を誘導する上で、免疫原内で有用なユニバーサルＴヘルパー配列について説明する。
Ｃ．  リポペプチドキャップ成分Ｒ２
本明細書に記載の免疫原の他の成分はリポペプチド成分であり、好ましくは「リポペプチドキャップ」（Ｒ２）であり、本明細書に記載のようなＨＩＶ−１予防用及び治療用免疫原性組成物に必要とされる、ＧＭＴが５０，０００より大きく、又は３００，０００より大きく、又は１，０００，０００より大きい抗体を誘導するために免疫原の他の成分と協調して作用する。リポペプチドは、ウイルス抗原に対するＣＴＬをプライミングし、また、特定抗原に対する液性抗体応答をｉｎ  ｖｉｖｏで高めることが可能な物質として同定されている。したがって、免疫原のＲ２部分は、以下に記載のように、それにＣｙｓ及び任意に１〜１０個以下の中性アミノ酸リンカー残基及び／又は任意に荷電極性アミノ酸の配列を結合させた望ましいリポペプチド成分の中から選択される。１つの態様では、Ｒ２リポペプチドは、直接、又はその任意のリンカー及び／又は極性荷電アミノ酸を介して、免疫原のアミノ端のα−アミノ基に結合している。即ちＲ１  Ｔ細胞ヘルパー配列のアミノ端に結合しているか、又はＲ１が異なる位置にある場合は直接ＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープに結合している。免疫原の他の態様では、Ｒ２リポペプチドは、直接、そのＣｙｓを介して、又はその任意の１〜１０個以下の中性アミノ酸リンカー残基及び／又は任意に荷電極性アミノ酸の配列を介して、Ｒ１とＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープの第１Ｎ端アミノ酸残基とのあいだに位置付けられたＫ残基のε−アミノに結合している。更なる態様では、免疫原のＲ２リポペプチドキャップは、直接、そのＣｙｓを介して、又はその任意の１〜１０個以下の中性アミノ酸リンカー残基及び／又は任意に荷電極性アミノ酸の配列を介して、免疫原のＣ端、即ちＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープ又はＲ１のＣ端に位置付けられたＫ残基のε−アミノに連結している。更なる態様では、免疫原のＲ２リポペプチドキャップは、直接、そのＣｙｓを介して、又はその任意の１〜１０個以下の中性アミノ酸リンカー残基及び／又は任意に荷電極性アミノ酸の配列を介して、Ｂ細胞エピトープ又はＲ１のＮ端に直接連結しているＫ残基に連結している。この構造では、Ｂ細胞エピトープ又はＲ１は、そのカルボキシ端を介して、Ｋ残基のε−アミノ基に連結することができる（式ＩＩＩａ又は式ＩＩＩｂを参照されたい）。
【００５１】
そのような使用のための特異的Ｒ２リポペプチドには、例えば大腸菌リポタンパク質のＮ端配列が含まれる。１つの態様では、Ｒ２は、２つのアミノ酸リンカー及び／又は極性荷電配列を有する、図８Ａのジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）であるリポペプチドである。他の態様では、Ｒ２は、そのアミノ酸リンカー及び／又は極性荷電配列を有する、図８Ｃのトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）であるリポペプチドである。
【００５２】
他のＲ２キャップには、Ｒ−（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリル）システインが含まれ、式中、Ｒは、水素、１〜６個のＣ原子のアルキル、アルケニル、又はアルキニルから成る群である。１つの態様では、Ｒ２は、任意のアミノ酸リンカー及び／又は極性荷電配列を有する、図８ＢのＮ−アセチル（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）（（ＮＡｃ（Ｐａｍ２Ｃ））であるリポペプチドである（ＲはＮ−アセチルである）。他の潜在的Ｒ２部分は、ヘキサデカン酸、Ｈｄａ、及びマクロファージ活性化ペプチドＭＡＬＰ−２である。
【００５３】
そのようなリポペプチドキャップは、全て本明細書に援用される以下の引用文献：Ｄｅｒｅｓら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：５６１；Ｗｅｉｓｍｕｌｌｅｒら、１９８９、Ｖａｃｃｉｎｅ  ７：２９；Ｍｅｔｚｇｅｒら、１９９１、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  ３８：５４５；Ｍａｒｔｉｎｏｎら、１９９２、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４９：３４１６；Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、１９９５、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９５：３４１；Ｍｕｈｌｒａｄｔら、１９９７、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８５：１９５１；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、１９９９、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：３０８８；Ｚｅｎｇら、２００２、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：４９０５；Ｂｏｒｚｕｔｓｋｙら、２００３、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３３：１５４８；Ｓｃｇｊｅｔｎｅら、２００３、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３２；Ｊａｃｋｓｏｎら、２００４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１５４４０；Ｂｏｒｚｕｔｓｋｙら、２００５、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４：６３０８；Ｍｕｈｌｒａｄｔ  ＰＦら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １１：１９５１−８（１９９７）；Ｏｂｅｒｔ  Ｍら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：１６１−９（１９９７）；Ｚｅｎｇ  Ｗら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８：１０３１−９（２０００）；Ｇｒａｓ−Ｍａｓｓｅ  Ｈ、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３８：４２３−３１（２００１）；Ｚｅｎｇ  Ｗら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：４９０５−１２（２００２）；Ｓｃｈｊｅｔｎｅ  ＫＷら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３２−６（２００３）；Ｓｐｏｈｎ  Ｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：２４９４−９（２００４）；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＤＣら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１５４４０−５（２００４）；Ｚｅｎｇ  Ｗら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２３：４４２７−３５（２００５）；国際特許出願公開公報ＷＯ２００６／０２６８３４号、ＷＯ２００６／０４００７６号、ＷＯ２００４／０１４９５６号、又はＷＯ２００４／０１４９５７号に記載のものから選択し、合成し、調製することができる。
【００５４】
１つの態様では、特に有効な免疫原性組成物は、Ｐａｍ２ＣＳＳのＲ２、即ちリンカー、例えばＳｅｒ−Ｓｅｒ、及び／又は極性荷電配列を介して結合している、ジパルミトイル−Ｓ−グリセリル−Ｃｙｓのジパルミチン酸部分を含む。リンカーを有するＰａｍ２Ｃは、本明細書に援用されるＰＣＴ公開公報ＷＯ２００４／０１４９５７号に記載されている。他の態様では、特に有効な免疫原性組成物は、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−のＲ２、即ちジパルミトイル−Ｓ−グリセリル−Ｃｙｓのトリパルミチン酸部分を含み、これはリンカー、例えばＳｅｒ−Ｓｅｒを介して結合している。
【００５５】
他の態様では、Ｒ２はＮＡｃ（Ｐａｍ２Ｃ）−Ｓ−Ｓ−、即ちＮ−アセチル（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）のジパルミチン酸部分であり、これはリンカー、例えばＳｅｒ−Ｓｅｒを介して結合している。
【００５６】
先に記載したように、このＲ２リポペプチドは、直接、そのＣｙｓを介して、又はその任意の１〜１０個以下の中性アミノ酸リンカー残基及び／又は任意に荷電極性アミノ酸の配列を介して、Ｒ１  Ｔ細胞ヘルパー配列のアミノ端のα−アミノ基に連結しており、Ｒ１は順にＢ細胞エピトープに連結している。式ＩＩにおけるようにＢ細胞エピトープとＴヘルパー配列が逆である場合、このＲ２リポペプチドは、そのＣｙｓを介して、又はその任意のリンカー及び／又は任意の極性荷電配列を介して、Ｂ細胞エピトープのアミノ端のα−アミノ基に連結しており、Ｂ細胞エピトープは順にＲ１に連結している。あるいは、Ｒ２は、そのＣｙｓ、その好適なリンカーアミノ酸及び／又は極性荷電アミノ酸配列を介して、免疫原のＲ１とＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープ成分の第１Ｎ端アミノ酸残基とのあいだに位置付けられたＫ残基のε−アミノに連結している。この同一構造は、式ＩＩにおけるようにＲ１とＢ細胞エピトープが逆である場合にもあてはまる。更に他の代替免疫原構造では、Ｒ２は、そのＣｙｓ、その任意のリンカーアミノ酸及び／又は極性荷電アミノ酸配列を介して、免疫原のＣ端に挿入されたＫ残基のε−アミノに連結している。例えば、Ｒ１がＢ細胞エピトープに連結している場合、リジン残基をＢ細胞エピトープのＣ端に挿入し、Ｒ２をリンカーを介してそのリジンのε−アミノ基に連結することができる。この構造は、式ＩＩにおけるようにＢ細胞エピトープとＲ１基が逆である場合に類似する。同様に、式ＩＩＩａ及び式ＩＩＩｂの免疫原は、上記のようにこのＲ２キャップを用いている。全ての態様において、Ｒ２リポペプチドキャップのＮ末端は遊離しており、免疫原の他の成分に結合していない。
【００５７】
Ｒ２キャップは、免疫原性組成物を形成する式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩａ、及び／又は式ＩＩＩｂの免疫原において抗体応答を高め、非常に有効であることが判明している。Ｒ２と免疫原のＲ１及び／又はＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープとのさまざまな結合の更に他の態様が、上記式Ｉ及び式ＩＩに具体化されている。
Ｄ．  任意のリンカー及び極性配列
Ｒ２キャップはそのＣｙｓを介して直接連結することができ、Ｔ細胞ヘルパー配列Ｒ１は、免疫原のＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ成分にいずれの順序でも直接連結することができるが、リンカーを任意に導入して、Ｒ２リポペプチドキャップ成分のＣ末端を各免疫原の他のいずれかの成分に連結することが望ましい。他の態様では、リンカーアミノ酸又は配列は、Ｂ細胞エピトープとＲ１ヘルパー配列とのあいだにも用いられる。他の態様では、アミノ酸配列は、免疫原の式に応じて、免疫原の１つの成分を他の成分へカップリングするためにＲ１ヘルパー配列又はＢ細胞ペプチドのＮ端又はＣ端に結合した任意のリンカーとして用いるか、又は免疫原のアミノ端又はカルボキシ端に位置付けられる。
【００５８】
Ｒ２キャップ内に位置付けられるか又は免疫原のどこかに位置する「リンカー」は、典型的には、生理的条件下で実質的に非荷電のアミノ酸又はアミノ酸模倣物のような１〜１０個の比較的小さい中性分子で構成される。リンカーは、典型的には、例えばＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、又は非極性アミノ酸若しくは中性極性アミノ酸の他の中性リンカーから選択される。任意のリンカーは、同一残基で構成される必要はなく、したがって、ヘテロオリゴマー、例えばＧｌｙ−Ｓｅｒ−でも、ホモオリゴマー、例えばＳｅｒ−Ｓｅｒでもよい。存在する場合は、１つの態様におけるリンカーは少なくとも１個のアミノ酸残基、例えばＳｅｒ又はＧｌｙである。他の態様では、リンカーは少なくとも２個アミノ酸残基、例えばＳｅｒ−Ｓｅｒ又はＧｌｙ−Ｓｅｒである。更に他の態様では、３〜６個のアミノ酸残基、１０個以下の残基、又はそれ以上の残基を用いてリンカーを形成する。したがって、特定の態様では、リンカー配列には、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、若しくは１０個のアミノ酸又は模倣物が含まれる。
【００５９】
例えば、リンカーを用いて、Ｒ２のリポペプチドキャップを免疫原の他の成分へカップリングすることができる。１つの態様では、リンカーはジペプチドＳｅｒ−Ｓｅｒである。他の態様では、リンカーはＧｌｙ−Ｇｌｙである。更に他の態様では、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ又はＳｅｒ−Ｇｌｙなどのヘテロオリゴマーを用いてもよい。他の態様では、−Ｓｅｒ−などのリンカーは、Ｔヘルパー配列Ｒ１を免疫原のＢ細胞エピトープのＮ端アミノ酸に連結するか、又はＢ細胞エピトープをＲ１のＮ端アミノ酸に連結する。
【００６０】
免疫原の他の態様では、荷電極性アミノ酸の配列は、比較的非荷電のリンカー配列内に導入されるか、又はそれと置換される。荷電極性配列の導入は、以下の実施例で立証するように、組成物の水溶性を高めることがわかっている。例えば、これら荷電極性配列は、緩衝液を必要とすることなく、注射用蒸留水及び任意に等張性のためのマンニトールを有する製剤中の免疫原の溶解性を高めるために使用される。これら荷電極性配列は、免疫原を容易に調製し、可溶化し、凍結乾燥することを可能にする。これら極性配列は、溶解性を高めることによって、Ｂ細胞エピトープの免疫原性を高めることにも有用であり得る。
【００６１】
１つの態様では、極性配列は、４個、５個、６個、７個、又は８個の荷電極性アミノ酸で構成される。更なる態様では、極性配列は、４個のアミノ酸で構成される。更に他の態様では、極性配列は、６個のアミノ酸で構成される。１つの態様では、極性配列は、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸から選択されるアミノ酸で構成される。更なる態様では、極性配列は、リジン、アルギニン、及びアスパラギン酸から選択されるアミノ酸で構成される。他の態様では、極性配列中のアミノ酸は同一である。更なる態様では、２個、３個、又は４個の異なるアミノ酸を極性配列に用いる。したがって、１つの態様では、極性荷電配列は、−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、又は−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−、又は−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−（それぞれ配列番号６５、６６、６７、及び６８）であるか、あるいは４〜８個の同一若しくはさまざまな極性荷電アミノ酸の反復である。
【００６２】
任意に、極性アミノ酸配列は、いずれかの端でリンカーのアミノ酸に隣接され、配列−リンカーアミノ酸−（極性アミノ酸）ｎ−リンカーアミノ酸−を形成しており、式中、ｎは極性アミノ酸数、例えば４〜８個である。あるいは、隣接リンカー（中性、非荷電）アミノ酸を用いることなく極性アミノ酸配列を用いることができる。１つの態様では、極性アミノ酸配列を有するリンカーは、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号６４）、即ちＳｅｒ−Ｓｅｒリンカー内に４個の同一アミノ酸極性配列、即ちＳｅｒ−［Ｌｙｓ］４−Ｓｅｒ（配列番号６４）で構成される。他の態様では、極性配列を含有するアミノ酸リンカーは、Ｓｅｒ−［Ｌｙｓ］６−Ｓｅｒ（配列番号６９）である。他の態様では、極性配列を有するリンカーは、Ｇｌｙ−［Ｌｙｓ］４−Ｇｌｙ（配列番号７０）又はＧｌｙ−［Ｌｙｓ］６−Ｇｌｙ（配列番号７１）である。更に他の態様では、極性配列を有するリンカーは、−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−）−Ｓｅｒ−（配列番号７２）である。上記のように、この配列の反復は、上記定義及び−リンカーアミノ酸−（極性アミノ酸）ｎ−リンカーアミノ酸の式があれば、当該技術分野に熟練した者によって組み立てることができる。
【００６３】
したがって、１つの特異的態様では、極性荷電配列を含有するアミノ酸リンカー、又はリンカー単独、又は極性荷電配列単独は、免疫原成分Ｒ２とそれが連結している免疫原の他のいずれかの成分とのあいだに位置付けられる。他の態様では、リンカー及び／又は極性配列は、Ｒ１と免疫原の他のいずれかの成分とのあいだに位置付けられる。更に他の態様では、リンカー及び／又は極性配列は、Ｂ細胞エピトープと免疫原の他のいずれかの成分とのあいだに位置付けられる。他の態様では、極性配列は、隣接リンカーアミノ酸とともに又は隣接リンカーアミノ酸なしで、Ｂ細胞エピトープ又はＲ１の遊離端、即ち、免疫原の端のＢ細胞エピトープ又はＲ１ヘルパー配列の遊離Ｎ端又はＣ端のような免疫原の外側へ結合することができる。
【００６４】
他の態様では、極性荷電配列は、隣接リンカーアミノ酸とともに又は隣接リンカーアミノ酸なしで免疫原内に１カ所のみ存在し、例えばＲ２のジパルミチン酸部分又はトリパルミチン酸部分のカルボキシ端リンカー−Ｓｅｒ−にのみ結合しており、Ｒ２を、Ｒ１若しくはＢ細胞エピトープに、又は免疫原内に挿入されたリジンに連結する。更に他の態様では、リンカー及び／又は極性配列は、免疫原の複数の位置（即ち２カ所以上）に存在する。
【００６５】
免疫原性組成物を形成する各免疫原のＲ１成分、Ｒ２成分、及びＢ細胞エピトープ成分は、各成分の端へリンカーアミノ酸及び／又は極性荷電配列を付加することによって修飾し、担体支持体又はより大きなペプチドへのカップリング、ペプチド又はオリゴペプチドの物理的又は化学的特性の修飾、などを提供することもできる。
Ｅ．  特異的態様
式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩａ、又は式ＩＩＩｂの免疫原の特異的態様を以下の実施例で使用し、以下の免疫原も含める。１つの態様では、各免疫原において、Ｒ２は、チオールグリセリル基を介してシステインに連結した２単位のパルミチン酸及び−Ｓ−Ｓ−残基のアミノ酸リンカー配列で形成され、−Ｓ−Ｓ−残基はＲ２をＲ１  Ｔヘルパー配列の第１アミノ酸に連結している。Ｒ１は、−Ｓ−のアミノ酸リンカーを有するＱ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｌ（配列番号４７）であり、−Ｓ−はＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープのＮ端アミノ酸残基に連結しており、Ｂ細胞エピトープは上記のようにＴａｔのアミノ酸７位（Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｓ）、アミノ酸９位（Ｅ／Ｄ）、及びアミノ酸１２位（Ｋ／Ｎ）に異なるアミノ酸の選択肢を含有する。したがって、式Ｉの１つの免疫原は以下のように規定される：
配列番号４８：Ｐａｍ２Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｑ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｖ−Ｄ−Ｐ−（Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｓ）−Ｌ−（Ｅ／Ｄ）−Ｐ−Ｗ−（Ｋ／Ｎ）−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−アミド。
【００６６】
更なる態様では、４個のリジンの極性配列（下線）をリンカー配列（−Ｓ−Ｓ−）内に導入し、Ｒ２とＲ１とを接続する。式Ｉのこの更なる免疫原を以下のように規定する：
配列番号６０：Ｐａｍ２Ｃ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｓ−Ｑ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｖ−Ｄ−Ｐ−（Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｓ）−Ｌ−（Ｅ／Ｄ）−Ｐ−Ｗ−（Ｋ／Ｎ）−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−アミド。
【００６７】
更なる態様では、４個のリジンの極性配列（下線）を含有するリンカーを利用して、Ｒ１ヘルパー配列をＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープ成分に連結する。式Ｉのこの更なる免疫原を以下のように規定する：
配列番号６１：Ｐａｍ２Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｑ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｓ−Ｖ−Ｄ−Ｐ−（Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｓ）−Ｌ−（Ｅ／Ｄ）−Ｐ−Ｗ−（Ｋ／Ｎ）−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−アミド。
【００６８】
更なる態様では、４個のリジンの極性配列（下線）を含有するリンカーを免疫原内の２カ所に、即ちリポペプチドを配列の残りに連結するため、及びＲ１をＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープ成分に連結するためのＲ２リンカーの部分として利用する。式Ｉのこの更なる免疫原を以下のように規定する：
配列番号６２：Ｐａｍ２Ｃ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｓ−Ｑ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｓ−Ｖ−Ｄ−Ｐ−（Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｓ）−Ｌ−（Ｅ／Ｄ）−Ｐ−Ｗ−（Ｋ／Ｎ）−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−アミド。
【００６９】
他の態様では、各免疫原において、Ｒ２は、グリセリル基を介してＮ−アセチルシステインの硫黄に連結した２単位のパルミチン酸（図８Ｂを参照されたい）及び−Ｓ−Ｓ−残基のアミノ酸リンカー配列で形成され、−Ｓ−Ｓ−残基はＲ２をＲ１の第１アミノ酸に連結している。Ｒ１は−Ｓ−のアミノ酸リンカーを有するＱ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｌ（配列番号４７）であり、−Ｓ−はＨＩＶ−１  ＴａｔのエピトープのＮ端アミノ酸残基に連結しており、Ｔａｔのエピトープは、上記のようにＴａｔのアミノ酸７位（Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｓ）、アミノ酸９位（Ｅ／Ｄ）、及びアミノ酸１２位（Ｋ／Ｎ）に異なるアミノ酸選択肢を含有している。したがって、式Ｉの１つの免疫原を以下のように規定する：
配列番号４９：ＮＡｃ（Ｐａｍ２Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｑ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｖ−Ｄ−Ｐ−（Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｓ）−Ｌ−（Ｅ／Ｄ）−Ｐ−Ｗ−（Ｋ／Ｎ）−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−アミド。更なる態様では、上記を反映したＰａｍ２Ｃを含有する態様と平行して極性配列を包含する。
【００７０】
他の態様では、各免疫原において、Ｒ２は、グリセリル基を介してパルミチル−システインの硫黄に連結した２単位のパルミチン酸及び−Ｓ−Ｓ−残基のアミノ酸リンカー配列で形成され、−Ｓ−Ｓ−残基はＲ２をＲ１に連結している。Ｒ１は、−Ｓ−のアミノ酸リンカー有するＱ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｌ（配列番号４７）であり、−Ｓ−はＨＩＶ−１  ＴａｔのエピトープのＮ端アミノ酸残基に連結している。したがって、式Ｉの他の免疫原を以下のように規定する：
配列番号５０：同一可変アミノ酸残基を有する、Ｐａｍ３Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｑ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｖ−Ｄ−Ｐ−（Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｓ）−Ｌ−（Ｅ／Ｄ）−Ｐ−Ｗ−（Ｋ／Ｎ）−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−アミド。更なる態様では、上記を反映したＰａｍ２Ｃを含有する態様と平行して極性配列を包含する。
【００７１】
Ｐａｍ３ＣＳＳ−又はＰａｍ２ＣＳＳ−又はＮＡｃ（Ｐａｍ２）ＣＳＳ−を含有する部分が、ユニバーサルＴヘルパー配列とＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープとのあいだに挿入されたリジンのε−アミノにカップリングしている態様では、式Ｉの免疫原は、以下のように、挿入されたＫ残基（太字）を介して結合したリポペプチドキャップを有する配列番号５１として規定される。
【００７２】
【化４】
2010500407.tif 000007
【００７３】
更なる態様では、上で定義した通りの極性配列を含むリンカーを、Ｔヘルパー配列をＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープ配列に連結する−Ｓ−の場所へ挿入することができ、及び／又は極性配列を、ユニバーサルＴヘルパー配列とＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープとのあいだに挿入したリジンのε−アミノへＰａｍ２Ｃキャップを接続するＳｅｒ（−Ｓ−）間に挿入することができる。
【００７４】
Ｐａｍ３ＣＳＳ−又はＰａｍ２ＣＳＳ−又はＮＡｃ（Ｐａｍ２）Ｃ−Ｓ−Ｓ−を含有する部分が、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープペプチドのカルボキシ端に挿入されたリジンのε−アミノにカップリングしている態様では、式Ｉの免疫原は、以下のように、Ｃ端に挿入されたＫ残基（太字）を介して結合したリポペプチドキャップを有する配列番号５２として定義される。
【００７５】
【化５】
2010500407.tif 000008
【００７６】
更なる態様では、上で定義した通りの極性配列を含むリンカーは、Ｔヘルパー配列をＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープ配列に連結する−Ｓ−の場所へ挿入することができ、及び／又は極性配列を、ＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープ１ペプチドのカルボキシ端に挿入されたリジンのε−アミノへＰａｍキャップを接続するセリン間へ挿入することができる。
【００７７】
Ｐａｍ３ＣＳＳ−又はＰａｍ２ＣＳＳ−又はＮＡｃ（Ｐａｍ２）Ｃ−Ｓ−Ｓ−を含有する部分が、ＨＩＶ−１  ＴａｔのエピトープとユニバーサルＴヘルパー配列とのあいだに挿入されたリジンのε−アミノへカップリングしている態様では、式ＩＩの免疫原は、以下のように、挿入されたＫ残基を介して結合したリポペプチドキャップを有する配列番号５３として規定される。
【００７８】
【化６】
2010500407.tif 000009
【００７９】
更なる態様では、上で定義した通りの極性配列を含むリンカーは、Ｒ１  Ｔヘルパー配列をＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ配列に連結する−Ｓ−の場所へ挿入することができ、及び／又は極性配列は、ユニバーサルＴヘルパー配列とＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープとのあいだに挿入されたリジンのε−アミノへＰａｍキャップを接続する−Ｓ−Ｓ−間へ挿入することができる。
【００８０】
Ｒ１ヘルパー配列が、挿入されたＫ及びＳを介して、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープのＮ端アミノ酸へカップリングし、Ｐａｍ３ＣＳＳ−又はＰａｍ２ＣＳＳ−又はＮＡｃ（Ｐａｍ２）Ｃ−Ｓ−Ｓを含有する部分が、同一リジン残基のε−アミノを介してカップリングしている態様では、免疫原は、以下のように、挿入されたＫ残基を介して結合したリポペプチドキャップを有する配列番号５４として規定される。
【００８１】
【化７】
2010500407.tif 000010
【００８２】
更なる態様では、上記式Ｉ及び式ＩＩの態様に関して記載したものと平行して、極性配列を含むリンカーを挿入することができる。
【００８３】
Ｐａｍ３ＣＳＳ−又はＰａｍ２ＣＳＳ−又はＮＡｃ（Ｐａｍ２）Ｃ−Ｓ−Ｓ−を含有する部分が、挿入されたリジン及びセリンスペーサーを介してＲ１ヘルパー配列のＮ端アミノ酸へカップリングし、ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープが同一リジン残基のε−アミノを介してカップリングしている式ＩＩＩの他の態様では、免疫原は以下のように規定される。
【００８４】
【化８】
2010500407.tif 000011
【００８５】
免疫原の更に他の態様は、式ＩＩＩｂを使用する。更なる態様では、上記を反映したＰａｍ２Ｃを含有する態様と平行して、極性配列を包含する。
【００８６】
上で定義した通りの、そして以下の実施例で説明するような２種以上の免疫原を含有する免疫原性組成物は、以下で更に詳細に考察するように、複数のＨＩＶ−１  Ｔａｔ変異体に対する幾何学的平均力価が５０，０００より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を哺乳動物において誘導する能力を特徴とする。他の態様では、以下の実施例で例示するように、ＧＭＴＳは３００，０００より大きく、又は１，０００，０００より大きく、又は３，０００，０００より大きい。
【００８７】
上記教示があれば、当該技術分野に熟練した者は、上記成分の中から選択することによって、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩａ、及び／又は式ＩＩＩｂに適合する他の免疫原を容易に設計することができる。
ＩＩ．  免疫原及び免疫原性組成物の作製方法
免疫原は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープアミノ酸７位、９位、及び１２位に「ゆらぎ」を含有する上記式にしたがい、固相又は溶液中で化学合成を行うことによって調製することができる。いずれの合成技術も当該技術分野に熟練した者に周知である。例えば、そのような技術は、Ａｔｈｅｒｔｏｎ＆Ｓｈｅｐａｒｄ、『固相ペプチド合成』（ＩＲＬ出版、オックスフォード、１９８９）；Ｓｔｅｗａｒｔ＆Ｙｏｕｎｇ、『固相ペプチド合成』第２版（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、１９８４）；及びＨｏｕｂｅｎｗｅｙｌ、“Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｄｅｒ  ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ”［有機化学方法］、Ｅ．Ｗｕｎｓｃｈにより出版、第１５−Ｉ巻及びＩＩ巻、シュトゥットガルト、１９７４などの慣用のテキストに、また、本明細書にその全体が援用される以下の記事：Ｐ  Ｅ  Ｄａｗｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４；２６６（５１８６）：７７６−９）；Ｇ  Ｇ  Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒら（１９９９；３（６）：６６５−７１）；Ｐ  Ｅ  Ｄａｗｓｏｎら（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００；６９：９２３−６０）に記載されている。各種の自動合成装置又はコンピュータプログラム可能な合成装置が市販されており、公知のプロトコールにしたがって使用することができる。更に、個々のペプチドエピトープを化学連結により結合させてより大きいペプチドを作製することができ、これらは依然として本明細書に記載の式Ｉ又は式ＩＩの免疫原の範囲内である。
【００８８】
望ましくは、合成には、ＲＡＭＡＧＥ樹脂上のＨＢＴＵを用いるＦｍｏｃ化学を用いるなど、最初に最もＣ端のアミノ酸残基を固体支持体上に固定することによって免疫原をＣ端からＮ端の方向へ構築することが含まれる。アミノ酸を順次付加するあいだ、Ｘａａ７、Ｘａａ９、及びＸａａ１２の「ゆらぎ」位置で示される変異体アミノ酸を等モル量で単一合成混合物中に導入する。得られる免疫原性混合物内に存在する「異なる」ＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢エピトープ配列数を、これらのゆらぎ位置に導入されるアミノ酸を制御することによって操作することができる。例えば、必要に応じて、７位にわずか２残基、９位に２残基、そして１２位に１残基を導入し、わずか４種（２×２×１）の異なるＨＩＶ  Ｔａｔのエピトープ成分を含有する混合物を得ることができる。他の態様では、７位に３つのゆらぎ、９位に１つのゆらぎ、そして１２位に２つのゆらぎを導入して、６種（３×２×１）の異なるＨＩＶペプチド成分を得ることができる。同様にして、全ての可能なゆらぎ選択肢（４×２×２）を導入することによって、単一合成混合物中に全１６種の異なるＴａｔ配列を得ることができる。ゆらぎのいずれか他の可変付加により、１〜１６種の異なるペプチド免疫原を含有する混合物を生ずることができる。ＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープを組み立てた後にユニバーサルＴヘルパー配列を導入する。合成により、示したＴａｔのエピトープゆらぎ位置において異なる１〜１６種以下の異なる免疫原を含有する混合物を生ずる。
【００８９】
次に、本明細書に援用されるＰＣＴ公開公報ＷＯ２００４／０１４９５７号に記載のように、本質的にリポアミノ酸としてリポペプチドキャップを合成する。例えば、１つの態様では、Ｐａｍ２Ｃｙｓ又はＮＡｃ（Ｐａｍ２）Ｃｙｓ又はＰａｍ３Ｃｙｓリポペプチドキャップを、合成Ｔａｔエピトープのゆらぎ配列及びＴヘルパー配列上に、各リポペプチド部分をキャップのＣｙｓアミノ酸を介して又は任意のリンカー及び／又は極性アミノ酸配列を介してＴヘルパー配列のＮ端アミノ酸のα−アミノ基へ、又はＴヘルパー配列とＴａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープゆらぎペプチドとの間に挿入されたリジンのεアミノ基へ、又はＴａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープ配列のＣ端へ導入されたリジンのεアミノ基へ共有結合的に結合させることによって導入する。次に得られる免疫原を標準法、例えばトリフルオロ酢酸（試薬Ｋ）を用いて樹脂から切断し、やはり慣用の手順、例えばＢＩＯ−ＲＡＤ酢酸樹脂を用いて任意に塩に変換する。
【００９０】
得られる組成物は１〜１６種以下の異なる免疫原を含有し、それぞれ、Ｒ１若しくはＢ細胞エピトープのＮ端のα−アミノ基へ、Ｒ１とＢ細胞エピトープとのあいだに挿入されたリジン残基のεアミノ基へ、又はＲ１若しくはＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープのＣ端に挿入されたリジン残基へ結合したリポペプチドキャップを有する。他の態様では、各免疫原は異なるＲ１ヘルパーを有することができる。１つの態様では、組成物は、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩａ、又は式ＩＩＩｂに記載のように、組成物中の他の免疫原とは異なる位置にリポペプチドキャップを有する免疫原を含有することができる。
【００９１】
例示的合成を実施例１に記載する。このようにして免疫原を合成することによって、最終免疫原性組成物の１つの態様は、現在までに報告されているＨＩＶ−１  Ｔａｔ変異体を９５％より多く含む１６種の配列の順列（４×２×２）を含有する。免疫原性組成物は、最低限精製して溶媒及び試薬を除去することができる。組成物の安全性試験を通過するための厳密な精製は必要ないようである。次にこの合成された混合物を、部分的に精製したか又は未精製型で動物に試験し、又はヒトに用いることができる。しかしながら、必要であれば任意の慣用精製スキームを用いてもよい。
【００９２】
上記合成法はその簡便性に関して望ましいが、免疫原を調製する代替法には、組換えＤＮＡ技術の使用が含まれる。当該技術分野において周知のように、ヌクレオチド配列（ＨＩＶ  Ｔａｔペプチドをコードする）、任意のリンカー（例えば溶解性のための極性配列とともに又は伴わずに）、Ｔ細胞ヘルパー配列、及びリンカー（リポペプチドキャップ用）を発現ベクターへ挿入し、適切な宿主細胞へ形質転換又は形質導入し、発現に好適な条件下で培養する。これらの手順は、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、『分子クローニング、実験室マニュアル』、コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）に記載のように、当該技術分野において一般に公知である。リポペプチドキャップの結合は上記のような合成法を包含する。
【００９３】
当該技術分野に熟練した者は、これらの方法にしたがうことによって、１〜１６種の異なるＨＩＶ  Ｔａｔのエピトープを含有する２〜１６種の異なる免疫原を含有する様々な免疫原性組成物を容易に作製することができる。上で提示するように、個々のアミノ酸の修飾、任意リンカー配列の使用、異なるＴ細胞ヘルパー若しくはリポペプチドキャップの使用、より大きいかより小さいＴａｔペプチドの使用、又はそのような修飾配列で作られた異なる免疫原性組成物の組み合わせのように、免疫原の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩａ、又は式ＩＩＩｂの各種成分を個別に又はまとめて修飾する場合、更に他の組み合わせを得ることができる。
【００９４】
そのような免疫原性組成物は、ＨＩＶ−１感染を予防するか、又は少なくとも部分的に既存の疾患の症状の進行を阻むか若しくは遅らせるのに十分な幾何学的平均力価（ＧＭＴ）を有する抗Ｔａｔ抗体を誘導することによって、ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質に対する予防的免疫応答又は治療的免疫応答をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導することができる。力価は、対照値の平均＋８標準偏差（ＳＤ）のレベルで依然として検出される最大血清希釈の逆数である。幾何学的平均力価（ＧＭＴ）は、２以上の血清の各力価をｌｏｇ１０に変換し、これらのｌｏｇ１０値を平均することによって決定される。この後者の値の真数がＧＭＴである。多くの態様では、ＧＭＴは３以上の個別の力価から決定される。個々の力価よりもＧＭＴを使用することで範囲から極端にはずれた結果を最小限にし、したがって精度を高める。
【００９５】
１つの態様では、上記のような免疫原性組成物は、Ｔａｔの複数の免疫優勢エピトープ変異体に対するＧＭＴが５０，０００より大きく、又は３００，０００より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を誘導する。特定の態様では、免疫原性組成物は、Ｔａｔの複数の免疫優勢エピトープ変異体に対するＧＭＴが１００，０００より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する。他の態様では、誘導された抗体は、Ｔａｔの複数の免疫優勢エピトープ変異体に対する力価が５００，０００より大きい。更に他の態様では、免疫原性組成物は、Ｔａｔの複数の免疫優勢エピトープ変異体に対するＧＭＴが１，０００，０００より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を誘導する。更に他は、Ｔａｔの複数の免疫優勢エピトープ変異体に対するＧＭＴが３，０００，０００より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を誘導する。
【００９６】
以下の実施例は、実験動物における実験について報告するものであり、本明細書に記載の免疫原性組成物によって誘導される並外れた力価の証拠を提供する。医薬組成物に使用する他の成分の選択及び組成、並びにこれら組成物の投与方法及び投与経路に応じて、そのようなＧＭＴ応答の誘導が、具体的に例示したもの以外の組成物についても予期される。
ＩＩＩ．  治療用／予防用の医薬組成物及び方法
式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩａ、又は式ＩＩＩｂの上記免疫原を含有する医薬組成物は、ＨＩＶ−１感染の治療処置に及び／又は予防用免疫原性組成物として有用である。各種態様では、医薬組成物は、上記式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩａ、又は式ＩＩＩｂの複数の異なる免疫原、及び医薬的に許容可能な担体を含有する、自発的に抗原性を補強する免疫原性組成物を使用する。上記のようにして調製した未精製免疫原性ペプチド免疫原の混合物は、許容可能な担体、このましくは水性担体に溶解又は懸濁させることが望ましい。
【００９７】
本明細書に規定するように、これら免疫原性組成物における使用に好適な医薬的に許容可能な担体は、当該技術分野に熟練した者に周知である。１つの態様では、好ましい医薬担体は、約４５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加された等張性のためのマンニトールとともに注射用蒸留水を含有する。他の可能な担体には、限定されるものではないが、そしてｐＨ調整に依存するが、緩衝用水、０．８％生理食塩水のような緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝液、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、アルコール性／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液が含まれる。他の慣用的に使用される希釈剤、アジュバント、及び賦形剤は、慣用技術にしたがい添加することができる。そのような担体には、エタノール、ポリオール、及びそれらの好適な混合物、植物油、並びに注射用有機エステルを含めることができる。緩衝液及びｐＨ調整剤を使用することもできる。緩衝液には、限定されるものではないが、有機酸又は有機塩基から調製される塩が含まれる。代表的な緩衝液には、限定されるものではないが、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、若しくはフタル酸の塩のような有機酸塩、例えばクエン酸塩、トリス、塩酸トリメタミン、又はリン酸緩衝液が含まれる。非経口用担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲル・デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は固定油を含めることができる。静脈内用担体には、リンゲル・デキストロースなどをベースとしたもののような流体及び栄養補給液、電解質補給液を含めることができる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどのような防腐剤及び他の添加剤を医薬担体に提供することもできる。これら免疫原性組成物は担体の選択によって限定されるものではない。上記成分から、適切なｐＨ等張性、安定性、及び他の慣用の特徴を有するこれら医薬的に許容可能な組成物を調製することは、当該技術分野の技術範囲内である。例えば、レミントン：『薬学の科学と実践』、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ出版、２０００；及び『医薬賦形剤便覧』、第４版、Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅら編、ＡＰｈＡ出版、２００３などのテキストを参照されたい。
【００９８】
任意に、医薬組成物は、アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムのような弱いアジュバントを含有することもできる。
【００９９】
医薬製剤中の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩａ、又は式ＩＩＩｂの免疫原の量は広く、即ち重量で約０．１ｍｇ／ｍＬ未満から、通常約２ｍｇ／ｍＬ又は少なくとも約２ｍｇ／ｍＬから、２０ｍｇ／ｍＬもの量まで、あるいは５０ｍｇ／ｍＬに至る量又は５０ｍｇ／ｍＬ以上まで変化させることができ、選択した具体的投与様式にしたがい、流体容積、粘度などによって最初に選択されるであろう。
【０１００】
免疫原性組成物のヒトの単位用量の形態は、典型的にはヒト単位用量の許容可能な担体、好ましくは水性担体を含む医薬組成物中に含まれ、そのような組成物をヒトへ投与するために用いられることが当該技術分野に熟練した者に公知の流体容量で投与される（例えばレミントンの『薬学』、第１７版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ出版、ペンシルバニア州イーストン、１９８５を参照されたい）。
【０１０１】
これら組成物を、生物学的物質に対する滅菌濾過のような慣用の周知滅菌技術で滅菌することができる。得られる水溶液をそのまま使用するために包装することができる。少なくとも１つの極性配列、例えば−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−（配列番号６５）が組成物の免疫原中に存在する特定の態様では、水溶液を凍結乾燥し、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液と組み合わされる。
【０１０２】
したがって、更に他の側面は、上で提示したように、複数のＨＩＶ−１株及びサブタイプに対するＧＭＴが５０，０００、又は３００，０００より大きく、又は１，０００，０００より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ産生を誘導する方法である。１つの態様では、医薬組成物は、ウイルス感染を処置又は制御するために、ＨＩＶ−１に感染したヒトへ治療的に投与することができる。そのような感染したヒトは無症候性でも症候性でもよい。医薬組成物は、感染被験者における慢性的ウイルス増殖を低下させ、ＡＩＤＳへの進行を最小限にするのに有用である。また、そのような患者には、ＨＩＶ−１に感染した妊娠女性、感染した母親の新生児、及び汚染が予想される非免疫患者（例えばＨＩＶ−１に感染したヒトが使用した針を不注意に「突き刺した」ヒト）がいる。他の態様では、医薬組成物は、ＨＩＶ−１感染を予防するための予防用免疫原性組成物として健常被験者へ投与する。
【０１０３】
本方法は、複数のＨＩＶ−１  Ｔａｔ変異体に対するＧＭＴが５０，０００より大きく、３００，０００より大きく、１，０００，０００より大きく、又は３，０００，０００より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を誘導するように、有効抗体誘導量の本明細書に記載の医薬組成物を被験者へ投与することを包含する。上記のように、この方法は、同様に非常にＧＭＴが高い抗体を誘導する。既に感染した患者では、抗体は慢性ＨＩＶウイルス血症の維持をブロックし、したがってＡＩＤＳへの進行を妨げる。この方法は、組成物を反復投与するが低頻度の間隔、例えば６ヶ月毎に投与することを包含することができる。健常患者では、予防用免疫原性組成物は、急性ＨＩＶウイルス血症が弱まった後で慢性ウイルス血症の設定確立をブロックする抗体を免疫被験者に提供する。
【０１０４】
この方法の１つの態様では、これら医薬組成物の投与経路は皮下注射である。他の好適な投与経路には、限定されるものではないが、経鼻、経口、膣内、又は直腸内のような粘膜内、並びに非経口、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び動脈内が含まれる。適切な経路は、組成物の性質、即ち予防用免疫原性組成物として又は治療用免疫原性組成物としての性質、並びに患者の年齢、体重、性別、及び総体的な健康の評価、並びに免疫原性組成物中に存在する成分、並びに関与する医師による類似要因を含めた各種検討事項に応じて選択される。
【０１０５】
同様に、自発的に抗原性を補強する免疫原性組成物の好適用量は、患者が既に感染しているか、治療的処置を必要としているのか予防用免疫原性組成物処置を必要としているのか、患者の健康、年齢、及び体重にかかわらず、当該技術分野に熟練した者によって容易に決定される。投与方法及び投与経路並びに組成物中の追加成分の存在も組成物の投薬量や量に影響を与え得る。有効用量のそのような選択及び上方又は下方調整は、当該技術分野の技術範囲内である。顕著な副作用を伴うことなく患者に好適な応答を生ずるのに必要な組成物量は、これらの要因に応じて変化する。好適用量は当該技術分野に熟練した者によって容易に決定される。好適用量は上記のように医薬組成物中に処方され（例えば、約０．１ｍＬ〜約２ｍＬの生理的適合担体に溶解させる）、好適手段で送達される。投薬量は典型的には「単位投薬量」で表し、用量／被験者、例えば１ｍｇ免疫原の単位投薬量として規定される。あるいは、投薬量は、体重を８０ｋｇとする治療的換算の基準を用いて、量／被験者又は患者の体重で表すことができる。例えば、１ｍｇ単位用量／被験者は約１２．５μｇ／ｋｇ体重に等しい。
【０１０６】
１つの態様では、意図する治療効果又は予防効果は、プライミング／ブースティング投与法によって与えられる。例えば、１つの態様における初回の治療的投与のための投薬量又は治療用若しくは予防用免疫原性組成物の第１プライミング投与のための投薬量は、約０．０１ｍｇ未満〜１００ｍｇの免疫原の「単位投薬量」である。１つの態様では、単位投薬量は０．０１ｍｇである。他の態様では、単位投薬量は０．１ｍｇである。他の態様では、単位投薬量は１ｍｇである。更に他の態様では、単位投薬量は１０ｍｇである。したがって、特定の態様では、ヒトの初回プライミング投薬量は、非常に低量の単位投薬量である少なくとも約０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．０７ｍｇ、０．０８ｍｇ、０．０９ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇから、より高量の投薬量である少なくとも１ｍｇ、少なくとも３ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも７ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１２ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２０ｍｇまでの範囲であり得る。更に他のヒトの投薬量は、２１〜３０ｍｇ、３１〜４０ｍｇ、４１〜５０ｍｇ、５１〜６０ｍｇ、６１〜７０ｍｇ、７１〜８０ｍｇ、８１〜９０ｍｇ、及び９１〜１００ｍｇ／７０〜８０ｋｇ被験者の範囲である。更に高量の投薬量でさえも意図することができる。
【０１０７】
１つの態様では、用いる治療用免疫原性組成物又は予防用免疫原性組成物のブースティング投薬量は、上記プライミング投薬量と同一である。上記プライミング投薬量と同一の特異的単位投薬量又は単位投薬量範囲は、ブースティング投薬量に使用することができる。したがって、特定の態様では、ヒトのブースティング投薬量は、単位投薬量範囲内で、約０．０１ｍｇ未満〜１００ｍｇの免疫原の「単位投薬量」が起こり得る。１つの態様では、単位投薬量は０．１ｍｇである。他の態様では、単位投薬量は１ｍｇである。更に他の態様では、単位投薬量は１０ｍｇである。したがって、特定の態様では、ヒトのブースター単位投薬量は、非常に低量の単位投薬量である少なくとも約０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．０７ｍｇ、０．０８ｍｇ、０．０９ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇから、より高量の投薬量である少なくとも１ｍｇ、少なくとも３ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも７ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１２ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２０ｍｇまでの範囲であり得る。更に他のヒトの投薬量は、２１〜３０ｍｇ、３１〜４０ｍｇ、４１〜５０ｍｇ、５１〜６０ｍｇ、６１〜７０ｍｇ、７１〜８０ｍｇ、８１〜９０ｍｇ、及び９１〜１００ｍｇ／７０〜８０ｋｇ被験者の範囲である。更に高量の投薬量でさえも意図することもできる。
【０１０８】
代替態様では、ブースティング投薬量は、上で特定したプライミング投薬量よりも低量である。
【０１０９】
１つの態様では、第１「ブースティング」は、初回プライミング用量の数週間以内に投与される。１つの態様では、ブースティング用量は、プライミング用量の少なくとも３週間後に投与され、その後、先のブースティング用量から３週間以降に再ブースト投与される。他の態様では、第１ブースティング用量は、プライミング用量後約３〜４週間に投与される。追加のブースティング投薬量は、第１ブースター用量後、少なくとも３週間以降、より好適には約６ヶ月〜１年以上後に投与される。投与プロトコールの他の態様では、本明細書に記載の自発的に抗原性を補強する免疫原性組成物のプライミング投薬量は、約１０ｍｇ投与される。その後の第１ブースティング投薬量（例えば０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、１ｍｇ、又は１０ｍｇ）は、プライミング投薬量の少なくとも３週間後に投与される。その後、追加のブースティング投薬量は、先のブースティング投薬量から６ヶ月毎、１年まで投与される。
【０１１０】
プライミング／ブースティング投与計画のタイミング及び投薬量は、患者の健康状態、例えば身長、体重、年齢、一般的な身体の健康、他の医薬などに関連した通常の検討事項とともに、患者の血液から採取した特異的抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体の力価を測定することによって決定されるように、患者の応答及び状態に応じて、関与する医師によって選択することができる。
【０１１１】
予防／治療方法の１つの態様は、約１０ｍｇ以下、１ｍｇ以下、又は０．１ｍｇ以下の単位投薬量でプライミング有効量の免疫原性組成物を投与することを包含し、第３週及び第６週に同一有効単位投薬量で投与される２回のブースターによる投与が続く。この方法は、ＧＭＴが１００，０００より大きい抗体を誘導する。
【０１１２】
予防／治療方法の他の態様は、約１０ｍｇ以下、１ｍｇ以下、又は０．１ｍｇ以下の単位投薬量でプライミング有効量の免疫原性組成物を投与することを包含し、第３週及び第６週に同一有効投薬量で投与される２回のブースターによる投与が続く。この方法は、ＧＭＴが１，０００，０００より大きい抗体を誘導する。
【０１１３】
投与は、少なくとも臨床症状又は臨床検査が、ウイルス感染が排除されているか軽減されていることを示すまで、及びその後一定期間継続することが好ましい。投薬量、投与経路、及び投与予定は、当該技術分野において公知の手順にしたがって調整される。
【０１１４】
予防用免疫原性組成物用途に関し、プライミング及びブースティング投薬量は、治療用免疫原性組成物のブースティング投薬量と類似しているが、予防用免疫原性組成物の初回投与後約２週間〜６ヶ月の特定の規定する期間に投与される。おそらく追加の予防用免疫原性組成物をその後投与することが望ましいかもしれない。
【０１１５】
以下の実施例に示すように、本明細書に記載の例示的医薬組成物又は免疫原性組成物によって誘導される高ＧＭＴの抗体は、治療用途でもワクチン用途でも高頻度のブースティング投薬量の必要性を減少させることができる。
【０１１６】
本明細書に記載の方法の更に他の態様では、組成物は、他のＨＩＶ−１抗ウイルス療法又は医薬投与計画とともに、又はそれに続いて用いることができる。
【０１１７】
以下の実施例は、上で考察した組成物及び方法の特定の態様について説明するものである。これらの実施例は、特許請求の範囲及び明細書の開示を限定するものではない。
ＩＶ．  実施例
【実施例１】
【０１１８】
本発明の免疫原性組成物の作製
Ａ．  実験用免疫原
複数の異なるＴａｔペプチド成分（太字）、Ｔ細胞ヘルパー配列（イタリック体及び太字）、リンカーアミノ酸（イタリック体のみ）、及びＰａｍ２Ｃ−又はＰａｍ３Ｃ−リポタンパク質キャップを含有する上記のような各種免疫原性組成物を下式にしたがい調製した（ＮＡｃ（Ｐａｍ２）Ｃ−Ｓ−Ｓでキャップされた式は、この式によって記載されるＰａｍ２Ｃ及びＰａｍ３Ｃでキャップされた免疫原と同様に調製されるはずであることに注意されたい）。
【０１１９】
【化９】
2010500407.tif 000012
【０１２０】
類似の結果を生ずることが予想される他の類似組成物と類似の方法で代替免疫原を調製する。そのような類似免疫原には、例えば以下が含まれる。
【０１２１】
【化１０】
2010500407.tif 000013
【０１２２】
先の３つの式のうち第１の式にしたがって調製されるＰａｍ２Ｃ−及びＰａｍ３Ｃ−免疫原は、Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社又はＭｉｍｏｔｏｐｅｓ，Ｐｔｙ社により、慣用の固相合成技術及び自動合成装置を用いて合成された。アミド化したＣ端のセリンから開始して、合成サイクルはＴａｔエピトープ１のＣ端においてＮ端方向へ進行し、リンカーアミノ酸を介し、ヘルパーＴ細胞エピトープ配列（例えば破傷風トキソイド無差別Ｔヘルパー配列Ｑ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｌ；配列番号４７である）を介し、そしてＮ端のＳｅｒ−Ｓｅｒを介した。アミノ酸７位、９位、及び１２位に対応する「ゆらぎ」位置に、それぞれ等モル量の４種、２種、及び２種の必要なアミノ酸（上記式中の括弧内）を加えた。
【０１２３】
トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン及びｆｍｏｃ保護ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインはＢａｃｈｅｍにより合成され、記載のような新生ペプチド鎖のＮ端セリンにカップリングさせた。トリフルオロ酢酸を用いてリポペプチドを樹脂から切断し、ペプチドを脱保護した。得られる免疫原性産物を乾燥させ、次に水溶液中に取り、酢酸塩の形態に変換し、乾燥させた。
【０１２４】
最終産物を、アミノ酸の適切な含量についてアミノ酸解析で確認し、質量分析で確認したところ、複雑なピークのパターンを見せた。純度は一般におよそ７０％であると概算したが、得られるリポペプチドは更に精製しなかった。合成し、試験した免疫原に用いたＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープを、２つの式において配列番号１５〜２２及び３２〜３９として列挙する。
【０１２５】
【化１１】
2010500407.tif 000014
【０１２６】
Ｂ．  対照免疫原
上で考察した免疫原と比較するため、上記合成手順を使用して、以下の実施例に用いる他の免疫原も調製した。そのような「対照」免疫原は、Ｔａｔエピトープ１へ融合したＴ細胞ヘルパー配列のみを含有する免疫原であり、即ち以下の式である。
【０１２７】
【化１２】
2010500407.tif 000015
【０１２８】
同様に、リポペプチドキャップＰａｍ−２Ｋを上記免疫原のＰａｍ−２Ｃの位置に含有する対照免疫原、即ち以下の式は、図面中、Ｐａｍ２Ｋ−ＱＹＩＫ−ＴＥＰ１として特定した。
【０１２９】
【化１３】
2010500407.tif 000016
【実施例２】
【０１３０】
免疫プロトコール及びＴａｔ試薬
Ａ．  免疫
動物はＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社にて免疫前に少なくとも１週間順応させた。ＢＡＬＢｃ及びＣ５７ＢＬ６／ＢＡＬＢｃ  Ｆ１マウスを用いた。示したように、ルイスラットを用いた。
【０１３１】
実施例１に記載のようにして調製した免疫原を緩衝生理食塩水に取り、マウス及びラットに腹腔内注射、並びにウサギに皮下注射した。特に明記しない限り、マウスを１ｍｇの免疫原で第０日及び第２週に腹腔内免疫し、滴定のため血清を第４週に採取した。他の投与計画及び種は図面に記載した通りである。
【０１３２】
表３は、以下の実施例で使用する免疫プロトコール及び動物血清のＧＭＴについて説明する。
【０１３３】
【表３】
2010500407.tif 000017
【０１３４】
本明細書で考察する免疫原に用いる破傷風トキソイドＴ細胞ヘルパー配列はもともとヒト細胞において無差別ヘルパー活性を有することが発見されたものであり、複数の動物種において幅広い活性を有すると思われることに注意されたい。
Ｂ．  組換え全長Ｔａｔ
ｒＴａｔ−Ｈｉｓ６はＡＴＧ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社によって作製された。コンセンサスＨＩＶ−１  Ｔａｔ  ＨＸＢＩＩＩ配列を部位特異的突然変異誘発法で修飾し、８種の全長（１〜７２アミノ酸）免疫優勢Ｔａｔ変異体を作製し、これらを上記表１にＲＥＫ、ＫＥＫ、ＳＥＫ、ＮＥＫ、ＮＥＮ、ＮＤＮ、ＫＥＮ、ＮＥＮ、及びＳＥＮとして特定した。
【０１３５】
各変異体を大腸菌で発現させ、非変性型で抽出し、ニッケルカラムで非変性条件下にて単離した。透析してイミダゾールを除去後、アリコートを−７０℃で凍結保存した。これらの調製物を、以下に記載するように、バイオアッセイに、及び抗Ｔａｔ結合の抗体滴定の基質として用いた。
【実施例３】
【０１３６】
血清の滴定
抗Ｔａｔ力価を測定するために慣用のＥＬＩＳＡ法で血清をアッセイした。簡潔に言えば、Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノプレートを２ｎｇ／ウェルのｒＴａｔでコーティングし、２２℃で１時間又は４℃で一晩インキュベーションした。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００緩衝液で徹底洗浄後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングし、再洗浄し、血清希釈を適用し、２２℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、プレートをＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００緩衝液で再度徹底洗浄し、１／１０，０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体（又はラット若しくはウサギに適切な試薬）を適用した。次にプレートを２２℃で１時間インキュベーションし、その後徹底洗浄し、ＡＢＴＳを用いてシェーカーテーブル上で室温にて４５分間現像した。４０５ｎｍにて吸光度を測定した。血清が欠如している対照ウェルを測定し、滴定終点は、ＯＤが平均＋８ＳＤより高い最低希釈の逆数とした。
Ａ．  実験用免疫原で免疫した動物と対照免疫原で免疫した動物との幾何学的平均抗体力価（ＧＭＴ）の比較
図１は、２種の一般的エピトープ１変異体、Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ（配列番号７）及びＶ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｎ（配列番号１１）を含有する２種のｒＴａｔに対する、免疫マウス由来免疫血清の幾何学的平均力価（ＧＭＴ）を示すグラフである。図１のＸ軸の下に特定した免疫原は、実施例１に記載のようにして合成し、その実施例で特定されている。Ｔヘルパー配列として用いる免疫原は、ヒトに用いるために記載した破傷風トキソイド無差別Ｔヘルパー配列（Ｑ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｌ；配列番号４７）又は無差別ヒトＤＲ結合のために操作したＰＡＤＲＥ  Ｔヘルパー配列（Ｘａａ１−Ｋ−Ｘａａ２−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ｔ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ａ−Ｘａａ３；配列番号４６）であり、式中、Ｘａａ１及びＸａａ３はそれぞれＤ−アラニンであり、Ｘａａ２はＬ−シクロヘキシルアラニンである。ＰＡＤＲＥ含有免疫原に関するデータは図面に示していない。
【０１３７】
図１の結果は、これらＴａｔ変異体単独に対する血清の交差反応性欠如とは逆に、免疫血清は２種の一般的Ｔａｔエピトープ１変異体と同様に反応したことを示している。実験用リポペプチド免疫原は、ＧＭＴが５０，０００より大きいことを実証する抗体を誘導した。逆に、リポペプチドキャップが欠如している免疫原及びＰａｍ２ＫＳＳキャップを有する免疫原も含め、Ｐａｍ２ＣＳＳ−又はＰａｍ３ＣＳＳ−Ｎ端キャップが欠如している免疫原は、最大ＧＭＴが２〜３，０００の抗体を誘導した。
Ｂ．  実験用免疫原で免疫した動物のｒＴａｔ変異体に対するＧＭＴ
実施例１の式
【０１３８】
【化１４】
2010500407.tif 000018
【０１３９】
の実験用免疫原で免疫した１匹のマウス由来の血清を、抗Ｔａｔ抗体力価について試験した。図２は、Ｘ軸に沿って提示した全長変異体組換えＴａｔタンパク質、即ち上記表１に特定されているようなＲＥＫ、ＮＥＮ、ＫＥＫ、ＫＥＮ、ＳＥＫ、ＮＥＫ、ＳＥＮ、及びＮＤＮ、即ちそれぞれ配列番号１５、１９、１６、２１、１７、１８、２２、及び２０に対する、血清中の抗体のＧＭＴを示すグラフである。
【０１４０】
Ｔａｔ変異体ＲＥＫ（Ｂクレード）及びＮＥＮ（非Ｂクレード）は最も頻出するものであり、図２において網掛けされている。血清は、全てのＴａｔエピトープ１変異体に対するＧＭＴが＞１００，０００を示した。
Ｃ．  実験用免疫原のブースター用量のＧＭＴに対する効果
２匹のマウスを、第０日に１ｍｇの腹腔内プライミング用量、その後第２週に１ｍｇの腹腔内ブースター、そして第３０週に０．３ｍｇの腹腔内第２ブースターというプロトコールにて、実験用免疫原Ｐａｍ２Ｃ−Ｓ−Ｓ−マウスＴヘルパー配列−Ｖ−Ｄ−Ｐ−（Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｓ）−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−（Ｋ／Ｎ）−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−アミド（配列番号３；Ｔａｔアミノ酸残基７及び１２が「ゆらぎ」）で免疫した。全長Ｔａｔ変異体ＲＥＫ（配列番号１５）及びＮＥＮ（配列番号１９）に対して血清を滴定した。力価は第４週〜第１６週に幾分低下し、第２８週にわたって８０，０００にて安定に維持され、その後、第３０週の０．３ｍｇブースト後２週間顕著な上昇を示した。図３は、２匹のマウス血清に関するこれらの結果を示すグラフである。
【実施例４】
【０１４１】
Ｔａｔ活性及び抗体による阻害のバイオアッセイ
Ａ．  バイオアッセイ
ＨＩＶ−１は、休止期ＣＤ４＋  Ｔ細胞へ入ることができるが、Ｔ細胞が活性化されないと複製することができない。Ｔａｔはヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）においてＣＤ４＋  Ｔ細胞を活性化する。このＴａｔ誘導性の活性化及びＨＩＶ−１複製に対する寛容性は、Ｌｉら、１９９７、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：８１１６において考察されているように、抗Ｔａｔ抗体によって阻害することができた。以下のようにして実施した、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１複製に対するＴａｔ誘導性の寛容性の抗体による阻害に関するバイオアッセイは、これらの観察に基づいている。
【０１４２】
ＰＢＭＣは、Ａｓｔａｒｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから入手したものであり、所定の献血において同一ドナーから採取した３０本の凍結ＰＢＭＣアリコートで構成されていた。細胞を溶解し、適切に希釈し、平底９６穴組織培養プレートに入れた５００，０００個の細胞を含有する１００μｌ培地（完全ＲＰＭＩ培地、ギブコ）中で分散させた。適切な濃度のｒＴａｔ又はｒＴａｔ／Ａｂ溶液を加えた（室温で３０分間のプレインキュベーション後）。５〜６％ＣＯ２及び８０〜９０％湿度にてプレートを３７℃で５日間インキュベーションした。５日目に培地をピペットでウェルに入れ、細胞をプレート表面から剥がした。細胞をＶ底９６穴プレートへ移し、４００×Ｇ（約１３００ｒｐｍ）にて１０分間室温で遠心分離し、その後培地を除去した。原液ＨＩＶ−１（ＨＸＢＩＩＩ）（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ社）を１／１０希釈したもの１００μｌを加え、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて４時間インキュベーションした。徹底洗浄後、細胞を培地中で更に４日間インキュベーションした。次に細胞を上記のように遠心分離し、ＨＩＶ−１  ｐ２４レベルのＥＬＩＳＡ測定（Ｘｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ社製キット）用に培地を回収した。製造者の指示にしたがいｐ２４アッセイを行った。
【０１４３】
代表的バイオアッセイの結果を図４に示す。下部の点線はＴａｔを含まないバックグラウンドＨＩＶ−１  ｐ２４レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示し、上部の線は１０ｎｇ／ｍｌ  Ｔａｔを有する平均ｐ２４レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す。３μｇ／ｍｌ抗Ｔａｔモノクローナル抗体（Ｍａｂ）及び１０μｇ／ｍｌ抗Ｔａｔモノクローナル抗体を用いて阻害の用量反応曲線を作成したところ、それぞれ８７％及び９７％阻害を生じ、非常に統計的に有意であった（それぞれＰ＜０．００１及び０．０００１）。
【０１４４】
正常マウス血清（ＮＭＳ）は、Ｔａｔ非存在下でさえこのアッセイで予測できない効果を有していた。したがって、抗Ｔａｔ  Ｍａｂと力価比較するために、１０μｇ／ｍｌのＭａｂをＮＭＳへ加えた。この「抑圧された」ＮＭＳのＴａｔに対する力価を実施例３に記載のようにして測定した。１０μｇ／ｍｌ抗Ｔａｔ  Ｍａｂの力価は４０，０００であり、これは、Ｔａｔ誘導性のＨＩＶ−１複製の＞９０％阻害を与えるために免疫マウスにおいて必要とされるであろう血清力価の概算値、即ち１２，０００〜４０，０００を提供した。
Ｂ．  抗体による遊離Ｔａｔ濃度の阻害
毒素の抗体処理は、高親和性抗体による毒素の結合が前提となっており、遊離毒素濃度を低下させ、それにより毒素に関連する毒性をブロックする（Ｎｏｗａｌｏｗｓｋｉら、２００２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１１３４６）。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも当てはまる（前記）。したがって、抗Ｔａｔ  Ｍａｂ及び免疫抗Ｔａｔ血清による遊離Ｔａｔ濃度の低下を測定するためのアッセイを行い、独立した手順により、ＨＩＶ−１複製をｉｎ  ｖｉｖｏで制御するために必要な力価の上記概算値を検証した。
【０１４５】
このＴａｔ  ＥＬＩＳＡアッセイの原理は、抗Ｔａｔ  Ｍａｂ又は抗Ｔａｔ免疫血清を、正常ＩｇＧ又はＮＭＳ対照と平行して、プロテインＡコーティングビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｐｌｕｓ  ｒｅｓｉｎ）を用いて結合させることである。必要な希釈にてこれを行い、チューブを室温にて少なくとも１時間チューブローテーター上でインキュベーションした。次にチューブをマイクロ遠心機にて６，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、樹脂を沈殿させ、血清サンプルを取り出した。次に樹脂を徹底洗浄し；Ｔａｔ溶液（２００ｎｇ／ｍｌ）を加え；チューブを室温にて少なくとも１時間チューブローテーター上でインキュベーションした。次にチューブを６，０００ｒｐｍにて３０秒間遠心分離し、樹脂を沈殿させ、解析のために上清を新たなチューブへ取り出した。
【０１４６】
Ｔａｔ  ＥＬＩＳＡは、プレートのコーティングに高親和性抗Ｔａｔ免疫優勢エピトープＭａｂを使用し、検出抗体としてポリクローナルウサギ抗Ｔａｔエピトープ２（１／４，０００）を使用する。エピトープ２配列は、保存されたＨＩＶ−１  Ｔａｔ配列Ｋ−（Ａ／Ｇ）−Ｌ−Ｇ−Ｉ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ（配列番号５）である。ｒＴａｔ（実施例２）を用いて検量線を作成する。次に試験上清及び対照上清中の未結合Ｔａｔ濃度を用いて、抗Ｔａｔ曝露条件における遊離Ｔａｔ濃度の％阻害を対照濃度との比較により計算する。
【０１４７】
図５及び図６は、そのようなアッセイ実験を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＩＶ−１複製を制御するために必要な力価が１２，０００〜４０，０００であるという先の概算の正当性を実証している。図５は、抗Ｔａｔ  Ｍａｂによる遊離Ｔａｔ濃度の％阻害を示しており、３〜１０μｇ／ｍｌの範囲で完全阻害され、これはＴａｔに対する力価１２，０００〜４０，０００に相当する（上記を参照されたい）。図６は、高力価（６４０，０００）マウス抗Ｔａｔ血清を希釈して実施した同様の実験を示している。やはり遊離Ｔａｔ濃度の最大阻害は、１２，０００〜４０，０００の力価範囲で生じている。
【０１４８】
１０％及び１％希釈のＴａｔ免疫血清及び正常マウス血清にて、同様に第２のＥＬＩＳＡ実験を５重に行った；２種の最も一般的な形態である免疫優勢エピトープＲＥＫ配列（配列番号７）又はＮＥＮ配列（配列番号１１）を有する２種の組換えＴａｔタンパク質のそれぞれに対する免疫血清のＴａｔ抗体力価は２５６，０００であった。２種のＴａｔ変異体の減少を試験した。
【０１４９】
図７Ａ及び図７Ｂは、血清中の抗体による％阻害又は遊離Ｔａｔの減少を実証している。１０％希釈の力価は２５，０００、１％希釈の力価は２，５００であった。実験用免疫原（試験ＲＥＫ）で免疫したマウス血清は、ＲＥＫ  Ｔａｔ変異体に対して試験したところ、対照の高Ｔａｔ濃度と比較して、１％希釈では遊離Ｔａｔ濃度の４９％阻害を、１０％希釈では９２％阻害を示した。ＮＥＮに対して試験した免疫マウス血清で同様の結果を示した。対照の高Ｔａｔ濃度と比較して、１％希釈では遊離Ｔａｔ濃度の３３％阻害を測定した；一方、１０％希釈では８７％阻害を測定した。これらの阻害は、図面に提示したＰ値によって示すように統計的に有意であった。
【実施例５】
【０１５０】
力価−ワクチン構築、用量、頻度、及び種の効果
Ａ．  免疫
動物は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社にて免疫前に少なくとも１週間順応させた。ＢＡＬＢｃ及びＣ５７ＢＬ６／ＢＡＬＢｃ  Ｆ１マウスを用いた。記載のようにルイスラットを用いた。実施例１に記載のようにして調製した免疫原を緩衝生理食塩水中に取り、マウス及びラットに腹腔内注射し、カニクイザルに皮下投与した。第０日及び第２週（第１４日）に動物を免疫原で免疫し、第４週（第２８日）に滴定のため血清を採取した。用量／動物を抗Ｔａｔ力価とともに表４に記載する。
【０１５１】
【表４】
2010500407.tif 000019
【０１５２】
Ｂ．  結果
ラット及びサルに関して１０．０ｍｇ／動物の最適用量を同定した。匹敵する用量／動物を用いたところ、サルにおける力価はラットよりも大きく、ラットにおける力価はマウスよりも大きかった。毒性は用量／ｋｇに関係するようであるが、免疫原性は関係しないようである。Ｐａｍ２Ｃでキャップされた免疫原は、Ｐａｍ３Ｃでキャップされた免疫原よりも高い力価を誘導することがわかった。
【実施例６】
【０１５３】
用法・用量の最適化
Ａ．  免疫
動物は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社にて免疫前に少なくとも１週間順応させた。ＢＡＬＢｃ及びＣ５７ＢＬ６／ＢＡＬＢｃ  Ｆ１マウスを用いた。実施例１に記載のようにして調製したＰａｍ２Ｃでキャップされた免疫原を緩衝生理食塩水に取り、腹腔内注射した。１．０ｍｇ／マウスのＰａｍ２Ｃでキャップされた免疫原を３回注射することによりマウスを免疫し、第１ブースト前、及び表５による各ブーストの２週間後に力価を測定した。表５に示すように血清を採取した。
【０１５４】
【表５】
2010500407.tif 000020
【０１５５】
Ｂ．  結果
３週毎の連続的注射が最高の力価を提供した。表４のデータ（実施例５を参照されたい）に基づき、このプロトコールがラット及びサルにおいて更に高い力価でさえ誘導することが予想される。
【実施例７】
【０１５６】
Ｐａｍ３Ｃでキャップされたペプチドで免疫したラットのＧＭＴ
実施例６のプロトコールにしたがい、実施例１の式
【０１５７】
【化１５】
2010500407.tif 000021
【０１５８】
に包含される全実験用免疫原の混合物で免疫したラット由来の血清を抗Ｔａｔ抗体力価について試験した。図９は、８点それぞれが１種のＴａｔ変異体に対する血清中の抗体のＧＭＴを表すグラフである。血清のＧＭＴは＞１，０００，０００であった。
【実施例８】
【０１５９】
免疫血清による遊離Ｔａｔレベルの低下
Ａ．  Ｔａｔ枯渇アッセイ
抗体を保持するがｒＴａｔの拡散は容認する膜の欠如により、Ｔａｔ枯渇を測定するための古典技術を使用することはできなかった。簡潔に言えば、このアッセイは、ｒＴａｔへ曝露する抗体でコーティングしたビーズを使用し、インキュベーションする。抗体は溶液中のＴａｔ量に応じてＴａｔに結合する。したがって、このアッセイは、血清中の抗体が全長組換えＴａｔの量を枯渇させるのはどのウェルかを測定する。
【０１６０】
対照：ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ（１０％又は１％）で免疫していない正常ラット血清をプロテインＡビーズに結合させ、洗浄した。
【０１６１】
サンプル：免疫ラットの１０％及び１％血清のＩｇＧをプロテインＡビーズに結合させ、洗浄した。実施例３に記載の方法にしたがって測定したところ、未希釈血清の抗Ｔａｔ力価は１，０００，０００である。
【０１６２】
次に対照及びサンプルのプロテインＡビーズを室温で３０分間ｒＴａｔ溶液とともにインキュベーションした。遠心分離後、上清中のＴａｔレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。１０％又は１％の免疫血清コーティングプロテインＡビーズへの曝露後の遊離Ｔａｔを、それぞれ１０％又は１％の正常マウス血清コーティングプロテインＡビーズへ曝露後の遊離Ｔａｔに対する割合で表した。
Ｂ．  結果
図１０はアッセイの結果を反映している。１０％の血清は上清中でおよそ９０％のＴａｔに結合することがわかった。同様に、１％の血清は上清中でおよそ５０％のＴａｔに結合することがわかった。
【実施例９】
【０１６３】
リポペプチドキャップのリンカー内への極性荷電配列の挿入による水可溶化
本明細書に記載のようなＰａｍ２Ｃｙｓ又はＰａｍ３Ｃｙｓ又はＮＡｃ（Ｐａｍ２）Ｃとともに設計した免疫原は、水性溶媒に不溶であることがわかった。全３種のリポペプチドキャップを有するリポペプチドの水性溶媒への溶解性を達成するため、これら免疫原をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、リン酸緩衝生理食塩水で希釈して５〜１０％ＤＭＳＯとした。これは乳白色の幾分混濁した溶液を生じ、これを動物へ注射した。
【０１６４】
Ｐａｍ２ＣＳＫＫＫＫＳ（配列番号７３）でキャップされたリポペプチドを合成したところ、溶解性が向上し、透明溶液を生ずることがわかった。溶解性は低下したｐＨ値で最高であり、ｐＨ４．０で最適であり、ｐＨ５．０〜６．０では透明溶液を得るために最初に加温と攪拌が必要であった。４℃で一晩保存後も透明溶液を維持した。得られた結果の詳細は、以下の表６に反映されている。Ｐａｍ２ＣＳＫＫＫＫＳ（配列番号７３）でキャップされたリポペプチドは、注射用蒸留水中の２５ｍｇ／ｍＬマンニトールにも完全に可溶性であり、容易に凍結乾燥されて「ケーク」を形成し、これは加えた注射用蒸留水に完全に溶解性であった。
【０１６５】
【表６】
2010500407.tif 000022
【実施例１０】
【０１６６】
荷電極性配列含有免疫原で免疫したラットのＧＭＴ
１群あたり３匹のラットを、Ｐａｍ３Ｃのリンカーに隣接した極性荷電配列（即ち−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｓ−）を有する式
【０１６７】
【化１６】
2010500407.tif 000023
【０１６８】
に包含される全実験用免疫原の混合物にて異なる投薬量／群で免疫した。この免疫原を「ＴＵＴＩ−Ｋ４」と称する。各ラットに、０．１ｍｇ  ＴＵＴＩ−Ｋ４、又は１ｍｇ  ＴＵＴＩ−Ｋ４、又は１０ｍｇ  ＴＵＴＩ−Ｋ４の用量を第０日に投与した。各ラットを同一用量で第３週にブーストした。各ラットの、全長組換えＴａｔ（１〜７２アミノ酸）ＲＥＫ変異体タンパク質に対する血清抗体力価を測定した。
【０１６９】
図１１のグラフに示すように、第５週までに、全ての用量は約５００，０００（０．１ｍｇ用量）又は約１，０００，０００（１ｍｇ及び１０ｍｇ用量）のＧＭＴを提供した。これらの力価は全て９９％を超える遊離Ｔａｔレベルの低下に関連している。１０ｍｇ群においてより急速に初期力価が上昇したにもかかわらず、１ｍｇ／ラットを投与されたラットは５週間にわたり同一力価を達成したように見えた。第８週に投与すべき第２ブースト後に得られる力価は３，０００，０００を超えることが期待される。
【０１７０】
このデータに基づき、この免疫原は、良好な治療的力価を達成するために必要とされるワクチン量において１０〜１００倍の用量低下を可能にすることが期待される。例えば、０．１ｍｇ／ｍＬもの低用量、又は０．０１ｍｇ／ｍＬであっても、治療的に有効な力価を達成すると思われる。そのように低い治療的有効用量は、劇的且つ予想外の治療効果及び費用便益を世界中の患者集団に提供するであろう。
【０１７１】
上で説明した態様の数多くの修飾及び変異は、本明細書に含まれるものであり、当該技術分野に熟練した者にとって自明であることが予想される。本明細書に記載の組成物及びプロセスに対するそのような修飾及び改変は、本明細書に添付の特許請求の範囲内に包含されると考えられる。先に列挙又は参照した全ての文献は、米国仮出願第６０／８３７，４９３号を含め、添付の配列表とともに本明細書に援用される。
【図１】
2010500407.tif 000024
【図２】
2010500407.tif 000025
【図３】
2010500407.tif 000026
【図４】
2010500407.tif 000027
【図５】
2010500407.tif 000028
【図６】
2010500407.tif 000029
【図７】
2010500407.tif 000030
【図８Ａ】
2010500407.tif 000031
【図８Ｂ】
2010500407.tif 000032
【図８Ｃ】
2010500407.tif 000033
【図９】
2010500407.tif 000034
【図１０】
2010500407.tif 000035
【図１１】
2010500407.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月17日(2009.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の免疫原を含む、自発的に抗原性を補強する免疫原性組成物であって、各免疫原は：
（ａ）  アミノ酸配列Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｘａａ７−Ｌ−Ｘａａ９−Ｐ−Ｗ−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−アミド（配列番号１）を有するＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ、式中、Ｘａａ７はＲ、Ｋ、Ｎ、及びＳから成る群より選択され、Ｘａａ９はＥ及びＤから成る群より選択され、Ｘａａ１２はＫ及びＮから成る群より選択され、Ｘａａ１３は存在しないかＨであり、Ｘａａ１４は存在しないかＰであり、Ｘａａ１５は存在しないかＧであり、そしてＸａａ１６は存在しないかＳである；
（ｂ）  ユニバーサルＴヘルパー配列（Ｒ１）；及び
（ｃ）  ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン、Ｎ−アセチル（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）、及びトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインから成る群より選択されるリポペプチドキャップ（Ｒ２）、
を含み、
ここで、組成物中の各免疫原は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープのアミノ酸位置Ｘａａ７、Ｘａａ９、又はＸａａ１２におけるアミノ酸変異によって他の免疫原と異なっている、前記組成物。
【請求項２】
Ｒ２−（Ｒ１−ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ）；
Ｒ２−（ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ−Ｒ１）；
Ｒ２−Ｋ（ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ）−Ｒ１、式中、Ｋはリジン残基である；及び
Ｒ２−Ｋ（Ｒ１）−ＨＩＶ−１  ＴａｔのＢ細胞エピトープ、式中、Ｋはリジン残基である、
から成る群より選択される式を有する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
１〜１０個の中性アミノ酸のリンカー配列を更に含む、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
リンカー配列がＲ２のＣｙｓに結合してＲ２を免疫原の他の成分に連結しているか、又はリンカー配列が免疫原の他の成分間に位置付けられている、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
（ａ）  そのリンカー配列を有するＲ２が、Ｒ１のアミノ端のα−アミノ官能基に連結しているか；
（ｂ）  Ｒ２が、Ｒ１とＨＩＶ−１  Ｔａｔのエピトープのアミノ端とのあいだに位置付けられたＫ残基のε−アミノに連結しているか；又は
（ｃ）  Ｒ２が、ＨＩＶ−１  ＴａｔのエピトープのＣ端に位置付けられたＫ残基のε−アミノに連結している、
請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
各免疫原が、１個以上の中性リンカーアミノ酸が隣接していてもよい荷電極性アミノ酸の配列を更に含む、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
荷電極性アミノ酸及び任意の隣接アミノ酸の配列が：
（ａ）  Ｒ２のカルボキシ端の部分としての位置；
（ｂ）  Ｒ１の遊離アミノ端の位置；
（ｃ）  Ｂ細胞エピトープの遊離アミノ端の位置；
（ｄ）  Ｒ１のカルボキシ端の位置；
（ｅ）  Ｂ細胞エピトープのカルボキシ端の位置；
（ｆ）  ＫとＲ１とのあいだに介入する位置；及び
（ｇ）  ＫとＢ細胞エピトープとのあいだに介入する位置、
から成る群より選択される位置に位置付けられる、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
リンカーが、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｇ−、及び−Ｇ−Ｓ−から成る群より選択される、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
極性配列が、Ｋ、Ｅ、Ｄ、及びＲから成る群より個別に選択される４〜８個のアミノ酸の配列を含み、中性リンカーアミノ酸が隣接していてもよい、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
極性配列が、−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−、−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｓ−、Ｇ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｇ、Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｓ、及びＧ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｇ（配列番号６５、６４、７０、６９、及び７１）から成る群より選択される、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
Ｒ１配列が：
（ａ）  Ｑ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｘａａ（配列番号６）、式中、Ｘａａは存在しないかＬであり、任意のアミノ酸リンカーを有する;
（ｂ）  Ｘａａ１−Ｋ−Ｘａａ２−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ｔ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ａ−Ｘａａ３（配列番号４６）、式中、Ｘａａ１及びＸａａ３はそれぞれＤ−アラニンであり、Ｘａａ２はＬ−シクロヘキシルアラニンである；及び
（ｃ）  Ｆ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｆ−Ｗ−Ｌ−Ｒ−Ｖ−Ｐ−Ｋ−Ｖ−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｈ−Ｌ−Ｅ−（配列番号２３）、
から成る群より選択される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
ＨＩＶ−１  Ｔａｔの免疫優勢Ｂ細胞エピトープの１〜１６種以下の異なる変異体を含有する免疫原を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
変異体が、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１５）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｋ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１６）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１８）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１７）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｋ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号２１）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号１９）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号２２）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号２０）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３２）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３３）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３４）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｋ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３５）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３６）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３７）、
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３８）、及び
Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｗ−Ｎ−Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｓ（配列番号３９）、
から成る群より選択される、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
変異体が配列番号１５〜２０であるか；又は変異体が配列番号１５〜１９あるか；又は変異体が配列番号１５〜１８及び２０であるか；又は変異体が配列番号１５〜１８及び２１であるか；又は変異体が配列番号１５〜１８及び２２である、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
各免疫原において、Ｒ２は、ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン又はＮ−アセチル−（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）又はトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインから成る群より選択され；Ｒ２は、−Ｓ−Ｓ−残基のアミノ酸リンカー配列を更に含み；そしてＲ１は、それをＢ細胞エピトープに連結している−Ｓ−のアミノ酸リンカーを有するＱ−Ｙ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｎ−Ｓ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｔ−Ｅ−Ｌ（配列番号４７）である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
極性アミノ酸配列−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−（配列番号６５）が、リンカー残基−Ｓ−Ｓ−のあいだに位置付けられる、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
免疫被験者において、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの複数の免疫優勢エピトープ変異体配列に対する幾何学的平均力価が３００，０００より大きく、３百万より大きい値に至るまでの抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を誘導する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の自発的に抗原性を補強する免疫原性組成物、及び好適な医薬担体又は賦形剤を含む医薬組成物であって、免疫被験者において、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの複数の免疫優勢エピトープ変異体配列に対する幾何学的平均力価が３００，０００より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を誘導する、前記医薬組成物。
【請求項１９】
複数のＨＩＶ−１株及びサブタイプに対する抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ産生を誘導する方法であって、有効な抗体誘導量の請求項１８に記載の医薬組成物で被験者を免疫することを含み、前記有効な量は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔの複数の免疫優勢Ｂ細胞エピトープ変異体配列に対する幾何学的平均力価が３００，０００より大きい抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体を誘導する、前記誘導方法。
【請求項２０】
複数のＨＩＶ−１株及びサブタイプに対する抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ産生を誘導するための医薬の製造における、請求項１に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項２１】
請求項１に記載の免疫原性組成物を作製する方法であって、固相合成法を用いて免疫原を合成し、そしてＸａａ７、Ｘａａ９、及びＸａａ１２で示される変異体アミノ酸を等モル量で単一合成混合物中に導入することを含む、前記作製方法。