(57)【要約】  本発明は、コラーゲンに結合する第１のポリペプチドと、内皮前駆細胞に結合する第２のポリペプチドとを含む二重特異性融合タンパク質に関する。本発明はまた、血管および／または組織の病変を治療するための医薬組成物を製造するための二重特異性融合タンパク質の使用に関する。【選択図】なし
2010519234.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）コラーゲンに結合する第１のポリペプチドと、
（ｂ）内皮前駆細胞に結合する第２のポリペプチドと
を含む二重特異性融合タンパク質。
【請求項２】
第１のポリペプチドが、コラーゲン抗体、コラーゲン受容体、およびそれらの機能断片を含む群から選ばれるペプチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
コラーゲン受容体が、血小板の糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、ジスコイジン領域受容体１（ＤＤＲ−１）、ジスコイジン領域受容体２（ＤＤＲ−２）およびそれらの機能断片を含む群から選ばれることを特徴とする、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
第１のポリペプチドが、二量化ポリペプチドと結合した、ＧＰＶＩの細胞外部分、ＤＤＲ−１の細胞外部分、ＤＤＲ−２の細胞外部分、またはそれらの機能断片を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項５】
二量化ポリペプチドが、免疫グロブリンのＦｃ領域、またはＦｃ領域の二量化機能を有するその断片もしくは変異体を有することを特徴とする、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
第１のポリペプチドが添付の配列表における配列番号３、５または７のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項７】
第２のポリペプチドが抗原ＣＤ１３３に結合することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項８】
第２のポリペプチドがＣＤ１３３に対する抗体またはその機能断片であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質を含み、医薬的に許容される少なくとも１種の担体を含んでもよく、さらに医薬的かつ／または診断的活性物質を含んでもよい、医薬用かつ／または診断用組成物。
【請求項１１】
コラーゲンが露出している組織および血管の病変を治療するための医薬用かつ／または診断用組成物を調製するための、請求項１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１２】
血管病変の内皮再生のための、請求項１１に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１３】
血管および／または組織が、冠血管、脳への供給血管、四肢への供給血管、結合組織、骨、およびコラーゲンを含有する任意の血管または組織を含む群から選ばれることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１４】
組成物がバルーン付きカテーテルによる投与のために調製されることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
融合タンパク質の調製プロセスであって、
（ａ）（ｉ）可溶性糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、可溶性ジスコイジン領域受容体１（ＤＤＲ−１）および可溶性ジスコイジン領域受容体２（ＤＤＲ−２）を含む群より選ばれるポリペプチドおよび（ｉｉ）ＣＤ１３３に対する抗体を準備するステップと、
（ｂ）架橋剤を用いてＧＰＶＩ、ＤＤＲ−１またはＤＤＲ−２のアミノ基および抗体のアミノ基を修飾するステップと、
（ｃ）ＧＰＶＩ、ＤＤＲ−１またはＤＤＲ−２を還元するステップと、
（ｄ）還元したＧＰＶＩ、ＤＤＲ−１またはＤＤＲ−２とステップ（ｂ）で修飾した抗体とを結合させるステップと
を含む融合タンパク質の調製プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管または組織の病変を治療／診断するための、治療効果および診断効果を有する二重特異性融合タンパク質に関する。本発明はさらに、前記融合タンパク質をコードする核酸分子、前記融合タンパク質または核酸分子を含む医薬用かつ診断用組成物、血管／組織の病変を治療するための医薬組成物を調製するための前記融合タンパク質または核酸分子の使用、ならびに急性または慢性の血管疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓血管系の血管の損傷は、特に血管内へのステントすなわちステントグラフト移植の結果として生じる。このようなステントグラフトは、他の疾患または事象により影響を受けた血管内へ、周囲組織や器官への血液の供給を確保する目的で挿入するものである。
【０００３】
生理学的状態では、血液は閉鎖系である血管内を循環し、血流の停止や周囲組織への出血は見られない。言うまでもないが、血管壁が損傷すると血管壁の完全性が失われ、続いて周囲組織への出血が起こる。これを防ぐために、血小板と可溶性血漿成分とが結合し、損傷を封じて出血を止める効果のある止血用の血栓を形成する。血管に病変が生じると、止血に必要となる様々な細胞機序および生化学的機序が直ちに動き出す。内皮もまた、血漿リポタンパクの浸透性、白血球の接着、ならびに血栓形成促進／阻害因子および血管刺激物質の分泌を調節することによって、動脈の止血において中心的な役割を果たす。
【０００４】
内皮は、血栓が形成される内皮下層から血流を隔てる単層の血管内膜を形成している。血管壁の内皮が損傷し、内皮下マトリックスが露出した場合、止血の過程において、循環している血液中の潜在血小板が、露出したコラーゲンに接着する。この初期接着プロセスは血小板の細胞膜糖タンパク質受容体であるインテグリンによって制御され、接着の結果、血小板は形が変化し、活性化され、貯蔵顆粒から成分が放出される。このプロセスで、血小板の糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）が露出したコラーゲンと直接的に相互作用し、結合を安定させる。ＧＰＶＩは、最も重要なコラーゲン受容体として、コラーゲンとのより強固な直接結合を媒介するだけでなく、接着に必要な他の受容体の活性化を媒介する。血小板が接着した後、止血の次のステップである凝集が起こり、さらに血小板が蓄積して血栓をもたらす。
【０００５】
したがって、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）は、血小板表面に存在するコラーゲン受容体として血小板の活性化に決定的な役割を果たすが、同時に心筋梗塞の危険因子でもある。ＧＰＶＩを持たない血小板は、コラーゲンに接着せず、活性化能力や凝集力は顕著に低減される。
【０００６】
このような血栓の発生により、組織への血液供給はもはや保証されず、その結果、血栓より末梢部に位置する組織で虚血状態が生じることがある。
【０００７】
狭心症、心筋梗塞等の心血管疾患は、現在でも世界の死因の約３分の１を占めている。これらの疾患では、虚血の影響を受けた冠状動脈の迅速な再かん流が、心筋の損傷を防ぐために極めて重要である。
【０００８】
冠状動脈中の血流が減少すると、筋細胞に不可逆的な損傷が生じ、それによって心筋の機能代謝が停止し、その結果ついには壊死およびアポトーシスにより細胞破壊が起こる。
【０００９】
上述したように、経皮経管血管形成とステント移植とを組み合わせたものが、正常な冠循環の再建または治療を目的として、現在行われている。ステント移植の後、血管内の自由な血流が事実上再び確保されるが、生理学的条件において循環する血球と内皮下マトリックスとの間で障壁の役割を果たしている血管内皮は、損傷したままである。したがって、血小板の接着とそれに続く血栓形成、およびその結果として起こる急性心筋梗塞は、ステント移植後の主な合併症と言える。
【００１０】
血管の閉塞により虚血状態にあった領域の再かん流では、酸素を豊富に含んだ血液が供給される。その結果、細胞損傷が制限される一方、このプロセスは心筋の持続的な損傷に関係している。経皮経管冠状動脈形成、冠状動脈ステント移植、レーザーアブレーション血管形成等の介入療法または血栓溶解、繊維素溶解等の薬剤を用いた抗血栓療法が、心筋梗塞の急性治療として現在行われている。いずれの治療法も目的は同じであり、閉塞した血管をできるだけ早く再び開通させ、虚血組織の強制再かん流を目指すものである。
【００１１】
現在、移植後徐々に放出される薬剤をコートしたステントも使用されており、放出される薬剤によって治療する血管の内皮再生が遅れることから、ステント血栓症はこの方法における極めて重大な合併症である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の目的は、動脈硬化のプラークびらんを予防するために内皮の完全性を維持する新規な薬剤を提供し、従来技術の短所を克服することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、この目的は、（ａ）コラーゲンに結合する第１のポリペプチドと、（ｂ）内皮前駆細胞に結合する第２のポリペプチドとを含む二重特異性融合タンパク質によって達成される。
【００１４】
このようにして、発明の基をなす目的は完全に達成される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、「融合タンパク質」は、従来技術において知られた分子生物学的または化学的プロセスによってｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも調製できるハイブリッドタンパク質または人工タンパク質を意味するものと理解される。
【００１６】
前駆細胞は、一般に成体幹細胞から派生したものであり、再生能力については幹細胞の特性を持つ一方、他方では将来の機能領域に固定されているが、この「固定」はまだ可逆的なものである。また、血液中で循環している、内皮細胞へ分化する能力を持った細胞は、「内皮前駆細胞」と呼ばれる。このような内皮前駆細胞は特殊な細胞表面タンパク質を有しており、その細胞表面タンパク質に結合するポリペプチドによって捕捉される。
【００１７】
本明細書で、「ポリペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸がつながってできた任意の鎖を意味するものと理解される。また、「ポリペプチド」は、ポリペプチドと同様にいくつかのアミノ酸がつながってできたタンパク質も含む。安定した形状の完全な分子のみを「タンパク質」と呼ぶ場合もあり、この場合「ポリペプチド」や「ペプチド」は、安定した３次元構造を持たないより短いアミノ酸鎖を意味するものとして理解される。しかしながら、これらの用語間で明確な境界を引くことはできないため、本明細書では、「ポリペプチド」は、上述の定義によりタンパク質をも含むことを明示しておきたい。
【００１８】
したがって、融合タンパク質は、たとえば１種以上の化学試薬または遺伝子組換え技術によってポリペプチドを２つ（またはそれ以上）連結することによって調製できる。一方、本発明の融合タンパク質をコードする慣用の発現ベクターの使用により、該融合タンパク質を生成できる。これらの発現ベクターは適切な細胞へ導入され、次いで融合タンパク質が生成される。
【００１９】
本願発明者らは、本発明の融合タンパク質を用いて、露出したコラーゲンの表面にＣＤ３４＋幹細胞を補充できることを、自らの研究で実証できた。さらにまた、本願発明者らは、露出したコラーゲンに幹細胞を補充することによって、幹細胞が一定期間後には成熟内皮細胞へと成熟し、損傷した組織に内皮再生をもたらすことが可能であることを実証した。
【００２０】
したがって、本発明の融合タンパク質を用いれば、損傷した血管、または損傷もしくは他の影響によって表面にコラーゲンを放出または露出している任意の組織において、幹細胞とのコロニー形成およびその内皮細胞への成熟を利用した治療により、内皮再生および修復を行うことができる。その結果、ステント移植や化学物質による、血管を損傷する反応を防いだり、あるいはそのような反応が生じた後、それらを成功裡に治療することが可能となる。
【００２１】
現在約２７種類のコラーゲンが知られている。コラーゲンは体内のタンパク質総重量の４分の１を占め、割合としてはタンパク質中で最も多い。コラーゲンはそれぞれ、互いにしっかりと巻きついた３本の同一または異なるアルファ鎖から構成される。
【００２２】
内皮前駆細胞は骨髄由来の細胞であり、血管の修復および止血への関与が明らかな大型の非白血球細胞集団として循環している。本発明の二重特異性コンストラクトを使用し、流動条件下で、損傷したヒト組織へ幹細胞を補充することができた。
【００２３】
融合タンパク質の利点はさらに、たとえばバルーン付きカテーテルを使用して直接投与することができること、あるいは幹細胞の投与前に幹細胞集団と共培養できることであり、すなわち冠状動脈ステントの困難かつ高価なコーティングを必要としないことである。したがって、本発明の融合タンパク質は、損傷した血管の病変に幹細胞を補充するための極めて有効なツールであり、したがって、動脈硬化性疾患を治療するための有効な治療概念を示すものである。
【００２４】
一実施形態において、コラーゲン結合性の第１のポリペプチドは、コラーゲン抗体、コラーゲン受容体、およびそれらの機能断片を含む群から選ばれることが好ましい。とりわけコラーゲン受容体は、血小板の糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、ジスコイジン領域受容体１（ＤＤＲ−１）、ジスコイジン領域受容体２（ＤＤＲ−２）およびそれらの機能断片を含む群から選ばれることが好ましい。
【００２５】
上述したように、受容体ＧＰＶＩは、血小板における最も重要なコラーゲン受容体である。ＧＰＶＩは、血小板の凝集、分泌、形状変化および活性化を可能にする。ヒトＧＰＶＩは、２０個のアミノ酸からなるシグナル配列、２４７個のアミノ酸からなる細胞外領域、２１アミノ酸長の膜貫通領域、および５１アミノ酸長の細胞質尾部を含む。
【００２６】
ジスコイジン領域受容体１（ＤＤＲ−１）および２（ＤＤＲ−２）は、チロシンキナーゼ受容体であり、受容体細胞外領域のジスコイジン領域が特徴である。ジスコイジン領域受容体は、細胞外のジスコイジン領域、膜貫通領域、長い膜近傍領域および細胞内のキナーゼ領域から構成される。これらとコラーゲンとの結合については、従来技術（たとえば、Ｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｒｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｏｌｌａｇｅｎ”，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  （１９９７）  １：１３−２３参照）に記載されている。ＤＤＲ−１は９１３個のアミノ酸を含み、うち細胞外領域には１９〜４１６位のアミノ酸が含まれる。ＤＤＲ−２は８５５個のアミノ酸を含み、２２〜３９９位のアミノ酸が細胞外領域を構成している。
【００２７】
本発明の融合タンパク質は、露出したコラーゲンに対し、前記第１のポリペプチドである前記受容体または受容体断片を介して結合する。内皮前駆細胞すなわち特殊な幹細胞は、前記融合タンパク質に含まれる前記第２のポリペプチドを介して、露出したコラーゲンに補充される。具体的には、内皮前駆細胞が、自体の有するＣＤ１３３等の特殊な表面抗原を介して、該抗原を認識する融合タンパク質のポリペプチドと結合することにより補充される。このように補充された幹細胞は、一定の培養期間後には内皮細胞へと成熟するため、損傷した組織が再生される。その結果、コラーゲンの露出はなくなり、血小板も接着しなくなる。
【００２８】
一実施形態において、第１のポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域と結合した、ＧＰＶＩの細胞外部分、ＤＤＲ−１の細胞外部分、ＤＤＲ−２の細胞外部分、またはそれらの機能断片を有することが好ましい。
【００２９】
ここで、たとえば従来技術として開示されている可溶性ＧＰＶＩを使用できることが利点として挙げられる。このような可溶性ヒトＧＰＶＩの調製については、Ｍａｓｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＩ  ｄｉｍｅｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｗａｌｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２００４；  １８：  ３９７−３９９に明確に記載されており、これを参照されたい。可溶性ＧＰＶＩは、免疫グロブリンＦｃ領域と結合した二量体形のみ、コラーゲンに対する親和性を示す。この可溶性ＧＰＶＩを作製するために、ヒトＧＰＶＩの細胞外部分をクローニングし、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域と結合させた。このＧＰＶＩ−Ｆｃタンパク質（以下可溶性ＧＰＶＩ−Ｆｃと呼ぶ）は、たとえばアデノウイルスを用いることにより、ヒトＨｅＬａ細胞株で発現させることができる。この可溶性ＧＰＶＩ−Ｆｃを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでコラーゲンへの接着を実証することができた。
【００３０】
本発明の融合タンパク質の機能を実現するために、可溶性ＧＰＶＩの完全なアミノ酸配列すなわち可溶性ＧＰＶＩと同一のアミノ酸配列を用いる必要がないことは、当業者には言うまでもないことである。本発明の融合タンパク質は、その第１のポリペプチドが可溶性ＧＰＶＩの一部または配列変異体を有し、該一部または配列変異体が減弱していてもＧＰＶＩの結合機能を維持していれば、その機能を果たす。周知のように、タンパク質構成アミノ酸は、４つのクラスすなわち極性アミノ酸、非極性アミノ酸、酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸に分類される。ある極性アミノ酸と別の極性アミノ酸、たとえばグリシンとセリンとを交換しても、一般に、対応するタンパク質の生物活性には変化がまったくないか、あったとしてもごくわずかの変化にすぎない。したがって、このようなアミノ酸交換が生じても、本発明の融合タンパク質の機能の大部分は影響を受けない。こうした背景の下、本発明はさらに、第１のポリペプチドとして、前記アミノ酸クラスのうち１つに属する１つ以上のアミノ酸が同じクラスに属する別のアミノ酸と交換されている、可溶性ＧＰＶＩの変異体である融合タンパク質をも包含する。これに関連して、このような配列変異体は、可溶性ＧＰＶＩのアミノ酸配列と約７０％、より好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０〜９５％程度の相同性を有することが好ましい。
【００３１】
「Ｆｃ」は「結晶性断片」を意味する。この断片は、ＩｇＧ分子をパパイン消化することにより、２つのＦａｂ断片とともに得られる。Ｆｃ領域は、対になったＣＨ２領域およびＣＨ３領域から構成され、ヒンジ領域を含み、また二量化機能に関与する免疫グロブリン部分を含む。市販品によるヒトＦｃ−ＤＮＡまたはマウスＦｃ−ＤＮＡ、すなわち市販のｃＤＮＡライブラリからＰＣＲによって単離されるか、または既にプラスミド内でクローニングされた形で市販されている（たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＵＳＡから入手可能）ものが、本発明において好ましく使用できる。
【００３２】
該Ｆｃ領域の断片または変異体も、場合によって減弱していても抗体の二量化機能を有している限り、本発明の第１のポリペプチドの機能を損うことなく使用できることは言うまでもない（Ｆｃの断片または変異体にも同様に適用可能な、上記ＧＰＶＩの断片または変異体に関する説明を参照のこと）。
【００３３】
これに関連して、補体結合領域およびＦｃ受容体結合領域が変異し、免疫系の活性化が大幅に低減されるかまたはまったく起こらないようなＦｃ領域の変異体または合成されたＦｃ断片が、好ましく用いられる。したがって、標的突然変異誘発によりたとえば３３１位のプロリンがセリンと交換され、２３４〜２３７位のテトラペプチドＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＧｌｙがＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａと交換されているＦｃフラグメントを用いることができる。
【００３４】
また別の実施形態では、第１のポリペプチドが添付の配列表における配列番号３、５または７のアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００３５】
配列番号３のアミノ酸配列はヒトＧＰＶＩの細胞外領域を表し、その全配列は配列番号１に再現されている。
【００３６】
配列番号５のアミノ酸配列はヒトＤＤＲ−１の細胞外領域を表し、その全配列は配列番号４に再現されている。また、配列番号６のアミノ酸配列は、ＤＤＲ−２配列を表し、その細胞外領域は配列番号７に示されている。
【００３７】
これに関連して、融合タンパク質は、添付の配列表における配列番号２のヌクレオチド配列を有する核酸分子部分にコードされる第１のポリペプチドを含んでもよい。
【００３８】
配列番号２のヌクレオチド配列は、ヒトＧＰＶＩをコードするヌクレオチド配列を表す。
【００３９】
配列番号２のヌクレオチド配列のみならず、遺伝暗号の縮重により、同じポリペプチドをコードする変異体もまたコラーゲン受容体の細胞外領域の調製に適していることは、言うまでもない。可能なコドン数がアミノ酸数より大きいために、このような遺伝暗号の縮重が起こることが知られている。ほとんどのアミノ酸には１つを超えるコドンがあり、たとえばアルギニン、ロイシンおよびセリンは最大６つのコドンによってコードされる。通常、３番目のコドンは、部分的にまたは完全に交換できる。こうした背景の下、遺伝暗号の縮重により、添付の配列表における配列番号２のヌクレオチド配列とは個々のヌクレオチドは異なるものの同様にＧＰＶＩおよびＤＤＲ−１またはＤＤＲ−２の細胞外領域をコードする核酸分子にコードされる第１のポリペプチドを含む融合タンパク質が提供される。このような変異体は、配列番号２のヌクレオチド配列と約７０％、より好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０〜９５％の相同性を有することが好ましい。
【００４０】
また別の実施形態では、第２のポリペプチドがＣＤ１３３に対する抗体またはその機能断片であることが好ましい。
【００４１】
抗原ＣＤ１３３は、造血幹細胞、内皮前駆幹細胞、および一部の上皮細胞上で発現する。したがって、該抗原はこれらの幹細胞のマーカーであり、これについては従来技術（たとえばＹｉｎ  ｅｔ  ａｌ．“ＣＤ１３３：  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ”，  Ｂｌｏｏｄ  （１９９７）  ９０：５００２−５０１２を参照）に十分に記載されている。したがって、この抗原を認識する抗体を介して、すなわち融合タンパク質の第２のポリペプチドへの結合により、この抗原を含む幹細胞もまた、コラーゲンに補充できる。
【００４２】
したがって、たとえば抗ＣＤ１３３抗体またはその機能断片を用いることが可能であり、これらはたとえばＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ドイツ・Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ）製の抗ＣＤ１３３抗体（クローン  Ｗ６Ｂ３Ｃ１）またはＡｂｃａｍ社（英国・ケンブリッジ）製のＣＤ１３３抗体等のように、現在市販されている。
【００４３】
抗体Ｗ６Ｂ３Ｃ１は、網膜芽細胞腫細胞株ＷＥＲＩ−ＲＢ−１を用いてマウスに免疫付与することにより得られた。
【００４４】
本発明の目的においては、ＣＤ１３３に対する任意の抗体またはその機能断片を使用できることは言うまでもない。適切な抗原を使用することによって、当技術分野における従来技術（たとえばハイブリドーマ技術、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによる  “Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９７５）  ２５６：４９５−７参照）を使用して、さらなる新規な抗ＣＤ１３３抗体を作製することができる。
【００４５】
本発明において、抗体の「機能断片」は、由来元である抗体全体と同じ機能すなわち結合特異性を有する任意の抗体部分を意味する。
【００４６】
従来技術で既知のマウス抗ＣＤ１３３抗体から、このヒト化抗体をまず得て、これを用いて融合コンストラクトを調製できることは言うまでもない。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の超可変領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ（相補性決定領域））配列とマウス免疫グロブリン遺伝子のＣＤＲ配列とが交換されている組換え抗体である。マウスモノクローナル抗体の抗原特異性は、このヒト化によってヒト抗体に伝達される。このようにして、受容生物内でこれらの分子に対する完全な耐性が生じ、結果として、ヒト抗マウス抗体反応が回避される。このような抗体はキメラ抗体とも呼ばれる。
【００４７】
別の実施形態において、第１のポリペプチドを第２のポリペプチドに連結するさらなるペプチド要素が、融合タンパク質内で提供される。この方法により、この２つのポリペプチドを架橋またはリンカーによっても連結することができ、それぞれのポリペプチドの機能性すなわち各々の結合部位の認識特異性も同時に保持される。
【００４８】
本発明はさらに、請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質を含み、医薬的に許容される少なくとも１種の担体を含んでもよく、さらに医薬的かつ／または診断的活性物質を含んでもよい、医薬用かつ／または診断用組成物に関する。
【００４９】
さらに添加剤を含んでもよい、診断的かつ医薬的に許容される担体は、従来技術において公知であり、たとえばＫｉｂｂｅ  Ａ．による“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ  ２０００に記載されている。本発明によれば、添加剤は、診断または治療における本発明の組成物の使用に好ましい任意の化合物または組成物を含み、塩、結合剤、およびその他製剤に通常使用される物質がこれに該当する。
【００５０】
本発明はさらに、血管の病変を治療するための医薬用かつ／または診断用組成物を調製するための前記融合タンパク質の使用に関し、該血管および／または組織は、冠血管、脳への供給血管、四肢への供給血管、結合組織、骨、およびコラーゲンを含有する任意の血管または組織を含む群から選ばれる。
【００５１】
本発明によって調製され、本発明による融合タンパク質を含む組成物は、血管または組織の病変によって引き起こされる疾患（病変のために血栓を形成する内皮下層が露出し、血栓形成に至る可能性のある）を治療するための極めて有効なツールを提供する。
【００５２】
これに関連して、一実施形態では、本発明の組成物がバルーン付きカテーテルによる投与のために調製されることが好ましい。
【００５３】
あるいは、該組成物または融合タンパク質が、幹細胞の投与前に該細胞と共培養されることが好ましい。
【００５４】
これは、冠状動脈のステントに困難かつ高価なコーティングを施すプロセスが回避されるという利点を有する。
【００５５】
本発明はさらに、融合タンパク質の調製プロセスであって、（ａ）可溶性糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）およびＣＤ１３３に対する抗体を準備するステップと、（ｂ）架橋剤を用いてＧＰＶＩおよび抗体のアミノ基を修飾するステップと、（ｃ）ＧＰＶＩを還元するステップと、（ｄ）還元したＧＰＶＩとステップ（ｂ）で修飾した抗体とを結合させるステップとを含む融合タンパク質の調製プロセスに関する。
【００５６】
具体的には、本発明の調製プロセスにおける架橋剤は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオン酸エステル（ＳＰＤＰ）であることが好ましい。
【００５７】
あるいは、従来技術において公知である他の任意の架橋剤または結合プロセス、たとえばチオエーテル架橋剤または組換えＤＮＡ技術による結合を用いることもできる。
【００５８】
本発明による調製プロセスは、診断／治療の目的または使用に適した融合タンパク質を提供できる。
【００５９】
上述した特徴および以下で具体的に説明する特徴が、個々に挙げた特定の組合せだけでなく、本発明の状況から逸脱することなく他の組合せまたは単独で使用できることは言うまでもない。
【００６０】
本発明を、以下の実施例および図においてより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明による二重特異性コンストラクトの一実施形態を示す図であり、該コンストラクトはコラーゲンと幹細胞抗原ＣＤ１３３とに対するものである。
【００６２】
図２は、可溶性コラーゲン受容体ＧＰＶＩとＣＤ１３３に対する抗体とからなる特異的ＧＰＶＩ／ＣＤ１３３コンストラクトを用いて露出したコラーゲンに内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を補充することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮細胞が発生することを示す。
【図２ａ】静的接着アッセイ
【図２ｂ】動的アッセイ
【図２ｃ】内皮コロニーの形成
【図２ｄ】ＣＤ３１およびＣＤ１４６のマーカー発現
【図２ｅ】ｖＷＦ／エンドグリンの発現
【図２ｆ】電子顕微鏡によるＷｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ体の検出
【図２ｇ】ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３による、固定化したコラーゲンに対するＥＰＣの強い特異的接着（フィブロネクチンに対する接着との比較）
【図２ｈ】ＣＸＣＬ７と比較してより効果的なＧＰＶＩ−ＣＤ１３３による、ＥＰＣのコラーゲンへの補充。
【００６３】
図３は、ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３コンストラクトが、インビボで血管病変にＥＰＣを補充し、組織の完全性の回復を強化することを示す。
【図３ａ】試験動物の頸動脈の損傷およびＤＣＦ染色したＥＰＣの注入
【図３ｂ】試験動物の頸動脈の損傷およびＤＣＦ染色したＥＰＣの注入
【図３ｃ】ＤＣＦ染色した組織切片の２光子顕微鏡像
【図３ｄ】ヒトａｌｕ配列に対する組織切片のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
【図３ｅ】ＨＥ染色した内皮細胞；ヒトａｌｕ配列に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
【図３ｆ】ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３による顕著な内膜中膜比減少効果
【実施例】
【００６４】
血管病変に骨髄幹細胞を補充するための二重特異性タンパク質／モノクローナル抗体コンストラクトの調製
材料および方法
試薬
Ｂｉｏｃｏｌｌ分離溶液はＢｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ社（ドイツ・ベルリン）から、また内皮細胞用基礎培地（ＥＢＭ）はＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社（ニュージャージー州・イーストラザフォード）の“ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ”（ＥＧＭ）を市販品として入手した。コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、ラミニン、ビトロネクチン、フィブリノゲンおよびフィブロネクチンはＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社（ドイツ・ハイデルベルク）から、ヒトＶＥＧＦはＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（ニュージャージー州・ロッキーヒル）から、またマウス抗ｖＷＦ１次抗体およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８ファロイジンはＣｈｅｍｉｃｏｎ社（カリフォルニア州・テメキュラ）から市販品を入手した。ＤＡＰＩ、Ｃｙ３標識２次抗体（ヤギ抗マウス）および“Ｃｅｌｌｔｒａｃｋｅｒ  Ｖｙｂｒａｎｄ  ＤｉＤ”は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（ドイツ・カールスルーエ）から市販品を入手した。
【００６５】
ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ１３３＋細胞の単離および培養
ヒトＣＤ３４＋細胞およびＣＤ１３３＋細胞は、Ｌａｎｇらの記載（“Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１３３＋  ａｎｄ  ＣＤ３４＋  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｄｏｎｏｒｓ”，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００４；  １２４：  ７２−７９）に従ってヒトの臍帯血から単離し、培養した。ドナー細胞は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）１×１０μｇ／ｋｇの投与により５日間刺激して動員し、白血球除去血輸血１〜３プロセスにより回収した。自動分離装置ＣＬＩＮＩＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、ドイツ・ベルギッヒグラヂバッハ）を用いて、抗ＣＤ３４＋または抗ＣＤ１３３＋抗体でコートしたマイクロビーズにより前駆細胞を選択した。細胞の分離の前後に、抗ＣＤ３４＋、抗ＣＤ１３３＋、抗ＣＤ３＋、抗ＤＣ１９＋および抗ＣＤ４５＋抗体で細胞集団を染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ドイツ・ハイデルベルク）の蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いて分析した。
【００６６】
ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３＋ｍＡＢコンストラクトの調製
露出したコラーゲンに対する幹細胞の接着を達成するため、二重特異性コンストラクト（融合タンパク質）を調製した。このために、可溶性ＧＰＶＩ−Ｆｃおよび抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体を使用した。可溶性ＧＰＶＩは、前述の通りに調製した。これに関しては、ＧＰＶＩコンストラクトの調製について明示的に言及している上記Ｍａｓｓｂｅｒｇらの刊行物を参照されたい。簡単に言えば、ＧＰＶＩの細胞外領域をヒトＦｃ領域に融合させた。このためのＦｃは、ヒトの心臓ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国・カリフォルニア州パロアルト）から増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応用のプライマーペアおよび諸条件は、Ｍａｓｓｂｅｒｇらによる引用刊行物に記載されている。ＰＣＲ断片はＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによってクローニングし、ｐＡＤＴｒａｃｋ  ＣＭＶプラスミドを作成した。ヒトＧＰＶＩの細胞外領域をクローニングするために、培養した巨核球（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ・ヒルデン）から全ＲＮＡを単離した。逆転写後、生成したｃＤＮＡ１００ｎｇを鋳型として、ヒトＧＰＶＩのＰＣＲ増幅を行った（プライマーおよびＰＣＲ条件に関しては、引用刊行物を参照のこと）。ＰＣＲ断片がＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩによってｐＡＤＴｒａｃｋ  ＣＭＶ  Ｆｃプラスミドへとクローニングされ、その結果、特異的ヒンジ領域を含むヒトＦｃ領域と融合したＧＰＶＩのヒト細胞外領域を含むプラスミドが得られた。
【００６７】
ＣＤ１３３反応性モノクローナル抗体（ｍＡＢ）Ｗ６Ｂ３Ｃ１は、６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＷＩＧＡ社、ドイツ・ズルツフェルト）に対し、網膜芽細胞腫細胞株ＷＥＲＩ−ＲＢ−１で免疫付与することによって作製した。このモノクローナル抗体のＣＤ１３３特異性は、英国で開催された第７回国際白血球会議で確認済である（Ｂｕｈｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  “ＣＤ１３３  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒｅｐｏｒｔ．  Ｉｎ：  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＶＩＩ．  Ｗｈｉｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．”  Ｍａｓｏｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．），  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ２００２，  ６２２−６２３を参照のこと）。
【００６８】
２つのタンパク質を結合させるために、ヘテロ２官能性試薬ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオン酸エステル）を、Ｃａｒｌｓｓｏｎらの方法（“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １７３：７２３  （１９７８））に従って使用した。これを行うため、２つのタンパク質のアミノ基を、ＳＰＤＰを用いて修飾した。修飾したＧＰＶＩタンパク質は、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）で還元し、ＳＰＤＰで修飾した非還元ＣＤ１３３抗体と結合させた。結合混合物は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００カラムを用いたゲル濾過により精製した。
【００６９】
このように得られた二重特異性コンストラクトを図１に示す。
【００７０】
静的・動的接着アッセイ
静的接着
静的条件において、融合タンパク質存在下および非存在下で様々な細胞外マトリックスタンパク質に対する前駆細胞の接着を測定するため、９６ウェルプレートをコラーゲンＩ、フィブリノゲン、フィブロネクチンまたはビトロネクチン（各１０μｇ／ｍｌ）で一晩コートした。さらに、コラーゲンＩでコートした９６ウェルプレートを、融合タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）とともに１時間前インキュベートした。コンストラクトの個々の構成要素は、合わせてまたは単独で、負の対照として利用した。次いで、前駆細胞を加え、１時間インキュベートした。タイロード緩衝液を用いて洗浄ステップを注意深く３回繰り返した後、残った接着前駆細胞を位相差顕微鏡検査により計数した。
【００７１】
動的接着
顕微鏡のスライドガラスをコラーゲンＩ（１０μｇ／ｍｌ）でコートし（  Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “ＡＤＡＭ  １５  ｉｓ  ａｎ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ２００５；  ９４：５５５−５６１を参照）、フローチャンバー（Ｏｌｉｇｅｎｅ社、ドイツ・ベルリン）に挿入した。次いで、融合タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）を３０分間かけてコラーゲンの表面に加えた。個々の構成要素を合わせてまたは単独で実験を行い、負の対照とした。タイロード−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ２．５ｍｍｏｌ／ｌ；  ＮａＣｌ  １５０ｍｍｏｌ／ｌ；  ＫＣｌ  １ｍｍｏｌ／ｌ；  ＮａＨＣＯ３  ２．５ｍｍｏｌ／ｌ；  ＮａＨ２ＰＯ４  ０．３６ｍｍｏｌ／ｌ；  グルコース５．５ｍｍｏｌ／ｌ；  ＢＳＡ  １ｍｇ／ｍｌ，  ｐＨ  ７．４；  ＣａＣｌ２  １ｍｍｏｌ／ｌ；  ＭｇＣｌ２  １ｍｍｏｌ／ｌを含有、いずれもＳｉｇｍａ社、ドイツ・タウフキルヘンより入手）に懸濁した細胞を、せん断速度２，０００ｓ−１でかん流させた。実験はすべてリアルタイムで録画し、オフラインで評価した。
【００７２】
コロニー形成アッセイおよびフローサイトメトリー
ＣＤ３４＋前駆細胞を以下の様々な条件下でヒトコラーゲンＩ上に播種した：
ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３コンストラクト（１０μｇ／ｍｌ）、該コンストラクトの２つの構成要素（負の対照）、および正の対照としてのフィブロネクチン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ドイツ・ハイデルベルク）の添加・非添加。
細胞は、いずれの場合も、５％の加熱不活化したウシ胎仔血清、５．０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子、０．２μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、０．５μｇ／ｍｌの血管内皮成長因子、１０ｎｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞因子、２０ｎｇ／ｍｌのＲ３インスリン様成長因子１、および１μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、ドイツ・ハイデルベルク）を含む内皮細胞用成長培地ＭＶ２中で数日間培養した。４８時間後、非接着細胞を除去した。４日目に、内皮コロニー形成単位（コロニー数／１０６細胞）を計測した。細胞はＰＢＳで洗浄、再懸濁し、ポリグロビン（Ｂａｙｅｒ  Ｖｉｔａｌ社、ドイツ・レバークーゼン）とともに１５分間インキュベートした。さらに洗浄し、ＦＩＴＣ標識した抗ＣＤ３１抗体（クローン５．６；  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ドイツ・クレーフェルト）および抗ＣＤ１６４抗体（クローン１２８０１８；  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ドイツ・ヴィースバーデン）とともに室温で３０分間インキュベートした。さらに１度洗浄した後、細胞をＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ドイツ・ハイデルベルク）で分析した。
【００７３】
透過電子顕微鏡検査および免疫蛍光顕微鏡検査
内皮前駆細胞（ＥＰＣ）（２×１０８／ｍｌ）を、ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３＋ｍＡＢでコートしたウェル内の培地ＭＶ２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）中で８日間培養した。また、位相差コントロールを毎日行った。次いで、細胞をＫａｒｎｏｖｓｋｙ液で固定し、四酸化オスミウムで後固定を行い、グリシジル・エーテルに包埋した後、顕微鏡検査を行った。
【００７４】
免疫蛍光顕微鏡検査用には、上記培養した細胞を蛍光標識抗体でインキュベートした。各インキュベーションステップ間で、細胞をＰＢＳで注意深く洗浄した。幹細胞は、２％のホルムアルデヒド液中で２０分間固定した。次いで、細胞を３％グリシンで洗浄し、抗ｖＷＦ１次抗体（ヒト；５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳとともに３０分間インキュベートした。ウシ血清アルブミン（３％）を用いて非特異性結合を阻害した（１時間）。その後、２次抗体（ヤギ抗マウス；５μｇ／ｍｌ）を加え、さらに３０分間反応させた。さらにローダミン・ファロイジン（５μｇ／ｍｌ；細胞骨格の検出）およびＤＡＰＩ（５μｇ／ｍｌ；細胞核の検出）を加え、３０分間反応させた。試料は、標準的な免疫蛍光顕微鏡検査によって分析した。
【００７５】
頸動脈の結紮および生体顕微鏡検査によるＥＰＣ接着の検査
ｉｎ  ｖｉｖｏでの前駆細胞の補充におけるＧＰＶＩ−ＣＤ１３３コンストラクトの効果を調べるために、既に記載されている通りに（Ｍａｓｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ”，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９６：  ８８７−８９６  （２００２）参照）生体顕微鏡検査を行った。実験の前に、ＥＰＣを５−カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＤＣＦ）で染色し、ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３コンストラクト（１０μｇ／ｍｌ）または該コンストラクトの２つの構成要素（各１０μｇ／ｍｌ）とともに３０分間インキュベートした。野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）にミダゾラム（体重１ｋｇ当たり５ｍｇ；  Ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ社）、メデトミジン（体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ；  Ｐｆｉｚｅｒ社）およびフェンタニル（体重１ｋｇ当たり０．０５ｍｇ；  ＣｕｒａＭｅｄ／Ｐｈａｒａｍ社）を腹腔内注射することによって麻酔をかけた。ポリエチレンカテーテル（Ｐｏｒｔｅｘ）を右側頸静脈へ挿入し、上記蛍光標識したＥＰＣ（５×１０５／ｍｌ）を静脈内へ注入した。右側頸動脈を露出し、血管損傷を誘導するために、ｃａｒｏｔｉｄ  ｆｏｒｋ近傍を５分間強く結紮した。血管損傷の前後における、蛍光標識したＥＰＣと損傷した血管壁との相互作用を可視化するため、１００Ｗの落射ＨＢＯ水銀ランプを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｔｅｃｈ顕微鏡（２０×水浸レンズ、Ｗ  ２０×／０．５；  Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ社）を使用して、右側頸動脈のｉｎ  ｓｉｔｕ生体ビデオ顕微鏡検査を行った。血管壁と最初に接触した後、表面移動速度が平均速度より顕著に遅い細胞、または強固に接着した細胞を、結合ＥＰＣと定義した。接着したＥＰＣの数は、１０秒間移動しない細胞、または内皮表面から離れなかった細胞を計数することにより測定した。この数を内皮表面１ｍｍ２当たりの細胞数として表す。
【００７６】
２光子顕微鏡検査
２光子顕微鏡検査は、ｖａｎ  Ｚａｎｄｖｏｏｒｔらが既に“Ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｔｅｈ  ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｗａｌｌ：  ａ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｓｔｕｄｙ”，  Ｊ．  Ｖａｓｃ．  Ｒｅｓ．  ４１：  ５４−６３  （２００４）に記載したものと実質的に同様に実施した。簡単に言えば、マウスを生体顕微鏡検査後に犠死させ、頸動脈を注意深く摘出し、ＰＢＳで洗浄後パラフィンに包埋し、４μｍ切片を調製した。次いで、切片を染色し、ＢｉｏＲａｄ  ２１００ＭＰを用いた２光子レーザー走査顕微鏡（ＴＰＬＳＭ）法によって分析した。
【００７７】
ブタ損傷血管に対するＥＰＣ接着のｅｘ  ｖｉｖｏ検査
幹細胞を単離し、Ｖｙｂｒａｎｔ  ＤｉＤで２０分間標識した後、ＥＢＭ培地に再懸濁した。ヒト静脈をｅｘ  ｖｉｖｏフローに加えた。栄養上の理由から、該血管は培地に囲まれた状態に置かれた。バルーン付きカテーテルによって血管に損傷を与え、次いで、ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３ｍＡｂコンストラクトで３０分間コートした。次いで、ＥＰＣを該静脈に２時間通し、血管の損傷領域に細胞を接着させた。次いで、自然な生理的せん断応力下での接着安定性をテストするために、高いせん断速度条件下、静脈を３７℃のＥＢＭで２４時間十分に洗浄した。その後、バイオリアクターから血管を取り出し、４％ＰＦＡで２４時間固定し、細胞補充をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって分析した。
【００７８】
損傷血管内皮再生のｉｎ  ｖｉｖｏ検査
野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスを、ｉｎ  ｖｉｖｏ接着の検査と同様の手順で処置した（上記参照）。ＥＰＣ（５×１０５／ｍｌ）をＧＰＶＩ−ＣＤ１３３コンストラクト（１０μｇ／ｍｌ）または該コンストラクトの２つの構成要素を合わせたもの（各１０μｇ／ｍｌ）で２時間処理し、右側頸静脈の傷を塞いだ。その後も動物は生きていた。２週間後、動物を犠死させ、頸動脈から試料を採取した。内皮細胞の再生を、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色によって調べた。さらにＥｌａｓｔｉｃａ  ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ染色を行った。局所的な再生機序とヒトＥＰＣが誘導する回復とを区別するために、ヒト細胞に特異的なａｌｕ配列を使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。
【００７９】
パラフィン切片の免疫組織化学検査
マウス血管からのパラフィン切片を使用して、免疫組織化学検査を行った。切片の顕微鏡用スライドをキシレン（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ社、ドイツ・カールスルーエ）で脱パラフィン処理し、エタノール濃度を下げることによって（１００％，９０％，７０％，５０％）再水和を行った。次いで、この顕微鏡用スライドを、ＰＢＳで十分に洗浄した。さらに、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ社、スイス・ブックス）含むＰＢＳ溶液を用いて膜透過を、次いで１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国・セントルイス）を用いてブロッキングを、それぞれ２０分間実施した。次いで、顕微鏡用スライドを、抗ｖＷＦ１次抗体（２．５μｇ／ｍｌ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国・テメキュラ）とともに４℃で１２時間インキュベートした。その後、ヤギ抗ウサギ２次抗体（５μｇ／ｍｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（ドイツ・カールスルーエ）および０．１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ社、ドイツ・カールスルーエ）を室温で加え、さらに１２０分間反応させた。顕微鏡用スライドは、ＰＢＳで十分に洗浄し、蒸留水で洗い流し、乾燥した後、カイザーゼラチン（Ｍｅｒｃｋ社、ドイツ・ダルムシュタット）で封入し、分析した。
【００８０】
新生内膜の測定
雄性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、前述の手順と同様の手順により処置した（「頚動脈の結紮」参照）。頸動脈結紮の代わりに、ワイヤーを用いて損傷を与えた。あらかじめＧＰＶＩ−ＣＤ１３３コンストラクト（１０μｇ／ｍｌ）または該コンストラクトの２つの構成要素を合わせたもので（各１０μｇ／ｍｌ）３０分間処理したＥＰＣ（５×１０５／ｍｌ）を尾静脈に注射し、傷を塞いだ。動物は生きたままにしておいた。１４日後または２１日後に動物を犠死させ、頸動脈から試料を採取した。これをパラフィンブロックに包埋し、近位端から遠位端へと５μｍの切片を作製した。ｃａｒｏｔｉｄ  ｆｏｒｋ下の１０切片を使用して、プラーク形成の定量化を行った。断面の新生内膜は、画像解析ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ社）を使用して測定した。新生内膜は、内弾性板に隔てられた領域と内腔領域との差として、一匹ごとに測定した。中膜は、同様の方法で、具体的には内弾性板に隔てられた領域と外弾性板に隔てられた領域との差として測定した。結果を、新生内膜を中膜で除した内膜／中膜比で表す。
【００８１】
二重超音波造影による血管抵抗係数の測定
動物に麻酔をかけ、既に記載されている通りに（Ｍａｓｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ”，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９６：  ８８７−８９６  （２００２）参照）、二重超音波造影によって頸動脈を可視化した。簡単に言えば、収縮期最大血流速度Ｖｓｙｓと拡張期血流速度Ｖｄｉａとを測定した。頸動脈の抵抗係数は、ＶｓｙｓとＶｄｉａとの差をＶｓｙｓで除した値として測定した。
【００８２】
データおよび統計値の提示
各群の平均値を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）またはステューデントのｔ検定を用いて比較した。データを、平均値±標準偏差として示す。Ｐ＜０．０５は統計的に有意と見なした。
【００８３】
結果
骨髄由来のヒト幹細胞を使用し、まず固定化コラーゲンＩに対するＥＰＣの接着を、静的接着アッセイ、およびフローチャンバーモデルを用いた動脈せん断条件下でのアッセイによって調べた。
【００８４】
静的接着アッセイでは、９６ウェルプレートをコラーゲンＩでコートし、記載の生成物（１０μｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。次いで、ＥＰＣ（ＣＤ３４＋細胞）を加え、６０分間のインキュベートを行い、ＰＢＳで洗浄した。コラーゲン表面にＧＰＶＩ−ＣＤ１３３コンストラクト（「ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３」，１０μｇ／ｍｌ）を加えてインキュベートすると、コラーゲンのみの場合と比較して、接着は５倍に（図２ａ参照；静的モデル）、またフローチャンバー（２，０００秒−１）（図２ｂ）においては１０倍に増大した。該コンストラクトの２つの個々の構成要素（各１０μｇ／ｍｌ）を用いた場合には、接着の増加は見られなかった。４回行った実験の平均値および標準偏差を示す。＊は、図２ａではｐ＝０．０２１、図２ｂではｐ＝０．０２５を意味する。この結果より、コンストラクトが生理学的フロー条件下でさらに効率的であることを意味する。さらに、さらなる実験から、ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３コンストラクトによって増加したＥＰＣの接着は、フィブロネクチンと比較して、固定化コラーゲンに特異的であることを実証できた（図２ｇ参照）。
【００８５】
いずれの図においても、コンストラクトの使用を「ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３」、２つの構成要素の使用を「ＧＰＶＩ＋ＣＤ１３３」で示す。
【００８６】
ＥＰＣの走化性および細胞外マトリックス構成要素に対する接着が、ケモカインＣＸＣＬ７によって顕著に増大し得ることが、最近実証された。これに関して、さらなる実験から、ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３コンストラクトによって、ＣＸＣＬ７よりもさらに効率良く、固定化コラーゲンにＥＰＣを補充できることを実証できた（図２ｈ参照）。
【００８７】
結合したＥＰＣは、内皮層に融合し、血管完全性の回復に寄与する。そこで、引き続き実験を行い、コンストラクトの使用後に細胞が内皮細胞への分化能を失っていないことを実証した。さらに、コンストラクトへの曝露後、ＥＰＣが小さく丸味のある外観から内皮細胞特有の形へと急速に形態学的変化を遂げることが観察された。コンストラクトを用いてＥＰＣを培養すると、個々の構成要素（負の対照）を用いた場合と比較して、ＥＰＣの内皮コロニー形成能が４日目以降顕著に増大し、正の対照であるフィブロネクチンを用いた場合と同程度であった（図２ｃ参照；使用した細胞１０６個当たりのコロニー数）。独立した３〜５回の実験の平均値±標準偏差を示す。＊はｐ＝９．００１に相当する。
【００８８】
さらに、発生する細胞が、内皮表面マーカーである細胞マーカーＣＤ３１およびＣＤ１４６に対して陽性であることを、フローサイトメトリーを用いて実証することができた（図２ｄ参照）。さらにまた、発生する細胞を染色すると、成熟内皮細胞マーカーであるｖＷＦ／エンドグリンおよびファロイジンに対して陽性であった。検出には、標準的な免疫蛍光顕微鏡検査法または共焦点免疫蛍光顕微鏡検査法を用いた（図２ｅ参照）。さらにまた、コンストラクトを用いてＥＰＣを８日間培養すると、成熟内皮細胞の典型的特徴であるＷｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ体が透過電子顕微鏡検査において明確に検出された（図２ｆに矢印で示す；約３００ｎｍ×６０ｎｍ；拡大率  ×８０，０００）。未処理のＣＤ３４＋では、Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ体は見られなかった。
【００８９】
これらの結果をｉｎ  ｖｉｖｏで確認するために、損傷頸動脈を有するマウスモデルおよび生体蛍光顕微鏡検査を使用した。左頸動脈に強く損傷を与える前に、ＤＣＦで染色したＥＰＣを右頸静脈から注入し、損傷前、５分後および３０分後のＥＰＣ接着を調べた。ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３コンストラクト（「ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３」，１０μｇ／ｍｌ）を用いて細胞をあらかじめインキュベートすると、コンストラクトの２つの構成要素（各１０μｇ／ｍｌ）が個々に存在する場合と比較して、接着するＥＰＣの数は顕著に増加した（図３ａおよび図３ｂ参照）。＊は、ｐ＝０．０３８（強固な接着）、ｐ＝０．０２５（一時的接着）を意味する．
【００９０】
これらの検査の後、頸動脈を摘出し、２光子顕微鏡検査を行った。赤色の核を有する緑色（ＤＣＦで染色された）細胞の明らかな蓄積が、内弾性板の内腔側にある露出領域で観察された（図３ｃ）。
【００９１】
これらの結果をヒトと同等のシステムに適用するために、ｅｘ  ｖｉｖｏフローモデルを使用した。このために、ブタの血管で２時間のかん流を行った後、ＥＰＣを使用する前に、バルーン付きカテーテルで損傷を与えた。次いで、血管を固定し、ヒトに特異的な配列を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、細胞の補充を調べた。ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３コンストラクトの使用によって、幹細胞の補充を顕著に増加させることができた。増加の程度は、損傷のない血管のおよそ５０倍（図示せず）、コンストラクトを使用していない損傷血管のおよそ２５倍、またコンストラクトの２つの構成要素が個々に存在する場合のおよそ１０倍であった（図３ｄ）。＊はコンストラクトの２つの個々の構成要素との比較におけるｐ＜０．００１を意味する。
【００９２】
損傷を受けたマウス動脈を、二重特異性コンストラクトで処理したＥＰＣに曝露すると、ｅｘ  ｖｉｖｏで８日（データ示さず）、ｉｎ  ｖｉｖｏで１４日にわたって、内皮細胞の産生が観察された。しかし、２つの個々の構成要素で処理したＥＰＣに曝露した後には、このような産生は見られなかった（図３ｅ；ＨＥ染色）。投与した細胞による効果と局所的な再生機序による効果とを区別するために、免疫不全のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにヒトＥＰＣを投与した。次いで、Ａｌｕプローブを使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。この特異的Ａｌｕプローブは、ヒトのＡｌｕ繰り返し配列のコンセンサス配列に対応しており、異種移植においてヒト細胞に限定した検出を可能にする。そこで、頸動脈の損傷および細胞投与の１４日後に、マウスを犠死させた。染色に対して陽性であった腔内細胞を、ヒト細胞由来の細胞と判定した。これらの結果から、血管病変の新生内皮細胞は、本質的に外部から注入されたＥＰＣ由来であることがわかる。
【００９３】
さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管再生におけるＧＰＶＩ−ＣＤ１３３の機能的重要性を評価するために、ワイヤーによる損傷後の新生内膜の形成について調べた。損傷から２週間後、内膜／中膜比および血管抵抗係数の低下傾向が観察された。これは、二重超音波造影術によって判定されたが、統計的に有意ではなかった（データ示さず）。ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３の投与が、頸動脈損傷の３週間後に内膜／中膜比を顕著に低下させることは、血管再生における所期の効果を示すものであり、特筆すべきことである（図３ｆ参照）。これらの実験でも、コンストラクト（ＧＰＶＩ−ＣＤ１３３）または個々の構成要素を合わせたもの（ＧＰＶＩ＋ＣＤ１３３）を投与した。図３ｆにおいて、「＊」は対照と比較してｐ＝０．０３であることを意味し、ｎ＝５〜６、１匹当たり１０切片の分析を行った。
【００９４】
要約すると、発明者らは、本発明の融合タンパク質（以上および以下で「コンストラクト」とも呼ばれる）を用いることで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、およびヒトの血管内で、露出したコラーゲン表面および損傷を受けた血管上にＥＰＣ（すなわちＣＤ３４＋幹細胞）を蓄積させることが可能であることを実証できた。発明者らはさらに、該幹細胞を該融合タンパク質とともにより長く培養することによって、成熟内皮細胞への分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実現できることを実証できた。
【００９５】
この結果から、損傷した血管／組織に対する可能な治療法として、該当する血管に、たとえばカテーテルによって融合タンパク質またはその変異体を挿入できること、またはこれらを投与前に幹細胞とともに培養できることがわかる。
【００９６】
この結果から、本発明の融合タンパク質を用いることで、循環している内皮前駆細胞をコラーゲンに富む血管病変上に捕捉できることが示され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、いずれの実験においても実証された。さらにまた、この融合タンパク質は、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の内皮細胞へ分化を増大させ、血管病変の内皮再生を増大させる。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図２ｈ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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