(57)【要約】  本発明は、下記の化学式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的な塩に関する。  式中、交差している点線は、化学式（Ｉ）の分子にＲ１が結合して形成される結合を図示し、  Ｒ２およびＲ３が同時にＯＨではない場合、Ｒ２およびＲ３は独立してＯＨまたはＨであって、  ＲおよびＲ４が同時にＨではない場合、Ｒ４はＨまたはＲ５Ｃ（Ｏ）であって、  Ｒ５はＣ３〜Ｃ２６のアルケニルである。これらの化合物を製造および使用する方法も開示されている。2010540555.tif 000029
2010540555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式（Ｉ）による化合物、またはその薬学的な塩：
2010540555.tif 000020
式中、ＲはＨまたはＲ５Ｃ（Ｏ）であって、
Ｒ１が、
2010540555.tif 000021
であって、式中、交差している点線は、化学式（Ｉ）の分子にＲ１が結合して形成される結合を図示し、
Ｒ２およびＲ３が同時にＯＨではない場合、Ｒ２およびＲ３は独立してＯＨまたはＨであって、
ＲおよびＲ４が同時にＨではない場合、Ｒ４はＨまたはＲ５Ｃ（Ｏ）であって、
Ｒ５はＣ３〜Ｃ２６のアルケニルである。
【請求項２】
Ｒ５がＣ９〜Ｃ２６のアルケニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＲがＲ５Ｃ（Ｏ）であり、Ｒ１が、
2010540555.tif 000022
であって、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＯＨであり、Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＣＨ３−（ＣＨ２）７−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）７−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物と、
薬学的な賦形剤、希釈剤、および／または担体と、
を含む薬剤組成物。
【請求項５】
新生物性病態の患者を治療する方法であって、
新生物性病態を有する患者を選択するステップと、
化学式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的な塩：
2010540555.tif 000023
式中、ＲはＨまたはＲ５Ｃ（Ｏ）であって、
Ｒ１が、
2010540555.tif 000024
であって、式中、交差している点線は、化学式（Ｉ）の分子にＲ１が結合して形成される結合を図示し、
Ｒ２およびＲ３が同時にＯＨではない場合、Ｒ２およびＲ３は独立してＯＨまたはＨであって、
ＲおよびＲ４が同時にＨではない場合、Ｒ４はＨまたはＲ５Ｃ（Ｏ）であって、
Ｒ５はＣ３〜Ｃ２６のアルケニルである、化合物、またはその薬学的な塩を、
前記患者の新生物性病態を治療するのに効果的な状態下において、前記患者に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項６】
Ｒ５がＣ９〜Ｃ２６のアルケニルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記新生物性病態が癌性疾患である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記癌性疾患が、固形腫瘍、または血液癌、または悪性腫瘍である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記癌性疾患が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、または骨髄異形成症候群である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記固形腫瘍が、乳房、卵巣、前立腺、脳、膀胱、および肺からなる群から選択される組織の癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＲがＲ５Ｃ（Ｏ）であり、Ｒ１が、
2010540555.tif 000025
であって、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＯＨであり、Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＣＨ３−（ＣＨ２）７−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）７−である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
炎症性病態の患者を治療する方法であって、
炎症性病態を有する患者を選択するステップと、
化学式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的な塩：
2010540555.tif 000026
式中、ＲはＨまたはＲ５Ｃ（Ｏ）であって、
Ｒ１が、
2010540555.tif 000027
であって、式中、交差している点線は、化学式（Ｉ）の分子にＲ１が結合して形成された結合を図示し、
Ｒ２およびＲ３が同時にＯＨではない場合、Ｒ２およびＲ３は独立してＯＨまたはＨであって、
ＲおよびＲ４が同時にＨではない場合、Ｒ４はＨまたはＲ５Ｃ（Ｏ）であって、
Ｒ５はＣ３〜Ｃ２６のアルケニルである、化合物、またはその薬学的な塩を、
前記患者の炎症性病態を治療するのに効果的な状態下において、前記患者に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１３】
Ｒ５がＣ９〜Ｃ２６のアルケニルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記炎症性病態が、肺、結合組織、消化管、または血管系の炎症状態である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＲがＲ５Ｃ（Ｏ）であり、Ｒ１が、
2010540555.tif 000028
である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＯＨであり、Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＣＨ３−（ＣＨ２）７−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）７−である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年９月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／９７５，４３７号の利益を主張し、これは全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、アザシチジン類似体およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＤＮＡおよびＲＮＡの基礎的構成要素として見つかる天然ヌクレオシドの誘導体であるヌクレオシド類似体は、ヒトの癌またはウイルス性疾患の臨床治療にて効果的だが、古い時代には、このような化合物は抗結核薬として評価された。このような化合物は、４０年にわたって市場に出回っており、現在、およそ３５種類の製品が日常的に用いられている。下記の表１に図示されている天然ヌクレオシドは、２種類の窒素塩基、すなわち、プリン類（アデニンおよびグアニンによって例示されている）、および、ピリミジン類（チミン、ウラシル、およびシトシンによって例示されている）から、ならびに、単糖類のリボースまたはデオキシリボースから構成される。
（表１）
2010540555.tif 000003
【０００４】
当該天然ヌクレオシドは全て、下記の化学式Ａで図示されているような、いわゆるβ−Ｄ配置にて存在する。当該糖環上にある窒素塩基およびヒドロキシ−メチル側鎖は両方、当該糖環の平面の同じ側（シス）上にある。
2010540555.tif 000004
【０００５】
抗癌活性または抗ウイルス活性を有するヌクレオシド誘導体を得るために、当該窒素塩基および／または当該単糖類の何れかにおける化学的改良が行われてきた。例えば、当該窒素塩基においては、ハロゲン原子またはその他の官能基の添加、追加の窒素原子の挿入、または当該単糖環におけるリボースからアラビノースへの立体化学的変化、またはデオキシリボースへのヒドロキシル基の除去は、潜在的な治療的有用性を有する製品をもたらし得る。多くの製品においては、当該単糖環は保存され、一方、その他の製品においては、当該糖環は鎖に変化している。当該ヌクレオシド類似体は、良好から非常に優れた水溶解度を有する小分子である。
【０００６】
世界的なＡＩＤＳの蔓延が、作用機構の基礎知識および理解を強めたことが原因で、広範囲の研究および開発努力は、ヌクレオシド類似体の分野に向けられ、化学的改良などに起因する活性プロフィールにおける変化も、癌治療の分野に関連する。
【０００７】
ヌクレオシド類似体を含む多くの薬剤の一般的な欠点は、問題になっている実際の疾患の治療に対する、低い活性および劣った特異性である。このような問題のうちのいくつかは、製剤原料そのものの特有の活性に関連し得、いくつかは特定の抵抗機構（患者の体内に特有か、または、治療の間に得られるかの何れか、例えば、癌治療における多剤耐性（ＭＤＲ））に関連し得る。いくつかの問題は、相当の劣った輸送、または細胞取り込み、および活性化機構に関連し得る。いくつかの問題は、当該薬剤の急速な不活性化および／または排出に関連し得る。
【０００８】
ヌクレオシド類似体の効果は、天然ヌクレオシドを模倣するその能力にかなりの程度依存し、従って、ウイルス性酵素および／または細胞性酵素と相互作用し、核酸の代謝における重要工程を妨害または阻害する。その抗ウイルス活性または抗癌活性を発揮するためには、当該ヌクレオシド類似体は、ウイルス性キナーゼおよび／または細胞性キナーゼの作用を通じて、その単リン酸塩および二リン酸塩によって、その対応する三リン酸塩に転化することになる。一般的に、当該三リン酸塩は活性薬剤であるが、いくつかの製品、例えば、ゲムシタビンに関しては、当該二リン酸塩でさえ臨床的に有意な効果を発揮し得る。
【０００９】
病的、癌性、またはウイルスに感染した細胞または組織に到達するために、経腸投与または非経口投与をした後に、当該ヌクレオシド類似体は好ましい薬物動力学的特性を有するはずである。当該投与された薬剤の急速な排出に加え、多くのヌクレオシド類似体は、血流内および組織内の両方において非活性化され得る。例えば、シトシン誘導体は、単リン酸塩レベルであっても、デアミナーゼと呼ばれる酵素のクラスの作用を通じて、不活性なウラシル類似体に急速に脱アミノ化され得る。細胞取り込み、ひいては多くのヌクレオシド類似体の良好な治療効果は、膜結合性のヌクレオシド輸送タンパク質（濃縮型かつ拡散型のヌクレオシド輸送体と呼ばれる）に強く依存する。従って、このような特定の取り込み機構に依存しない化合物が求められている。さらに別の活性制限因子は、特に抗癌領域内において、細胞修復機構である。抗癌ヌクレオシド類似体の単リン酸塩は、細胞ＤＮＡ内に取り込まれ、それは、ｐ５３タンパク質に結合したエクソヌクレアーゼの活性が原因で、癌細胞のＤＮＡから除去されないはずである。しかしながら、健康な細胞のＤＮＡからのヌクレオシド類似体の除去が、当該薬剤の副作用を制限するために好ましい。
【００１０】
長年にわたって、かなりの程度まで活性を制限するいくつかまたは多くの特性を克服する、多くのヌクレオシド類似体が開発されてきた。例えば、アシクロビル（ＡＣＶ）を、優れた特異性を有する化合物を説明するための例として挙げることができる。ＡＣＶ−単リン酸塩は、ウイルス性キナーゼによってのみ生成でき、ＡＣＶが非感染細胞内で活性化できないことを意味する。この事実にもかかわらず、ＡＣＶは特に活性な製品ではない。ヌクレオシド類似体の活性化におけるしばしば律速な段階を回避するために、シドフォビルまたは単リン酸塩の製品等の、ヌクレオシド類似体の単リン酸塩、いくつかのホスホン酸塩の細胞内生成が展開されてきた。経口摂取を容易にするために、あるいは、体内に好ましい薬物動態を保証するために、ヘプセラ等の特定のプロドラッグが製造されてきた。
【００１１】
改善された臨床的有用性を促進するためにヌクレオシド類似体に対して為された構造的変化に加え、活性を改善するためのさらなる修飾が為されてきた。脂質部分の添加に起因する、修飾されたヌクレオシド類似体のいくつかの例がある（米国特許第６，１５３，５９４号（特許文献１）、第６，５４８，４８６号（特許文献２）、第６，３１６，４２５号（特許文献３）、および第６，３８４，０１９号（特許文献４）、欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−５６２６５号（特許文献５）および第ＥＰ−Ａ−３９３９２０号（特許文献６）、ならびに国際出願第ＷＯ ９９／２６９５８号（特許文献７））。これは、例えば、エステル結合、アミド結合、炭酸結合、またはカルバメート結合を通じた脂肪酸の結合によって実現できる。当該ヌクレオシド類似体のリン脂質誘導体等の、さらに精巧な製品を製造できる。Eur J Pharm Sci 11b Suppl 2: 15-27（２０００年）（非特許文献１）、欧州特許第５４５９６６号（特許文献８）、カナダ特許第２４６８０９９号（特許文献９）、ならびに米国特許第６，３７２，７２５号（特許文献１０）および第６，６７０，３４１号（特許文献１１）を参照されたい。このような類似体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはレトロウイルスによって引き起こされた感染症の治療および予防のために、特に適切な抗ウイルス活性を有すると記載されている。これらは悪性腫瘍の治療にも適している。当該ヌクレオシド類似体の脂質誘導体は、いくつかの役目を果たす。これらは、デアミナーゼのための基質ではないプロドラッグと見なされ得、その結果、血流内での輸送の間に、当該ヌクレオシド類似体を非活性化から保護し得る。当該脂質誘導体も、細胞膜を横断して効果的に輸送され得、当該ヌクレオシド類似体の改善された細胞内濃度をもたらし得る。脂質誘導体も、皮膚調製物、経口生成物（米国特許第６，５７６，６３６号（特許文献１２）、および国際出願第ＷＯ０１／１８０１３号（特許文献１３）を参照されたい）、または、腫瘍標的のために設計されたリポソーム（米国特許第５，２２３，２６３号（特許文献１４）を参照されたい）等の特定の調合物における使用により適し得る。
【００１２】
当該単糖環の保存されたβ−Ｄ配置を有するヌクレオシド類似体に対して、または、非環式側鎖を有するヌクレオシド類似体に対して、抗ウイルス活性または抗癌活性が、単不飽和ω−９のＣ１８およびＣ２０の脂肪酸の脂質誘導体の生成により、最も効果的に改善できるということが証明されている。Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol., 53-61（１９９９年）（非特許文献２）、Cancer Research 59: 2944-2949（１９９９年）（非特許文献３）、Gene Therapy, 5: 419-426（１９９８年）（非特許文献４）、Antiviral Research, 45: 157-167（２０００年）（非特許文献５）、および、Biochemical Pharmacology, 67: 503-511（２００４年）（非特許文献６）を参照されたい。当該好適な単不飽和の誘導体は、当該多不飽和の対応物より活性であるだけでなく、より結晶性が高く、かつ、当該脂質鎖の酸化に対してより化学的に安定である。従って、これらは、化学的観点および薬物製造の観点から、より好ましい化合物である。当該単不飽和ω−９のＣ１８およびＣ２０の脂肪酸は、多数の非ヌクレオシドの生物活性化合物の治療活性の改善に適しているということも証明されている（欧州特許第０９７７７２５号（特許文献１５）を参照されたい）。
【００１３】
ヌクレオシド類似体の比較的新たなサブグループは、いわゆるアザ−Ｃ誘導体である。このクラスの化合物において、当該ピリミジン塩基内の５位にあるＣＨ基は、下記の化学式Ｂに示されるように、窒素原子と交換される。
2010540555.tif 000005
【００１４】
異常なＤＮＡのメチル化によって発現制御させられた腫瘍抑制遺伝子は、これら新規の化学療法薬による再活性化のための潜在的標的である。ＤＮＡのメチル化および抗白血病薬の有力な阻害剤、アザ−シチジンおよび５−アザ−２’−デオキシシチジンの誘導体（５−アザ−Ｃ、５−アザ−ＣｄＲ、デシタビン）は、発現制御した腫瘍抑制遺伝子を再活性化できる。高濃度では、当該化合物は細胞障害性であるが、より低い濃度では、低メチル化は細胞株の分化に繋がる。当該化合物は、デオキシシチジンキナーゼによる代謝活性化を必要とし、ＤＮＡのメチルトランスフェラーゼの阻害を引き起こす。これら誘導体の治癒可能性に対する１つの障害は、シチジンデアミナーゼ（ＣＤ）によるこれらの急速なインビボでの不活性化である。水溶液中での不安定性、ならびにその副作用プロフィールは、その臨床活性を制限している。
【００１５】
本発明は、当該分野におけるこれらの欠陥またはその他の欠陥を克服することに関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第６，１５３，５９４号
【特許文献２】米国特許第６，５４８，４８６号
【特許文献３】米国特許第６，３１６，４２５号
【特許文献４】米国特許第６，３８４，０１９号
【特許文献５】欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−５６２６５号
【特許文献６】欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−３９３９２０号
【特許文献７】ＷＯ９９／２６９５８号
【特許文献８】欧州特許第５４５９６６号
【特許文献９】カナダ特許第２４６８０９９号
【特許文献１０】米国特許第６，３７２，７２５号
【特許文献１１】米国特許第６，６７０，３４１号
【特許文献１２】米国特許第６，５７６，６３６号
【特許文献１３】ＷＯ０１／１８０１３号
【特許文献１４】米国特許第５，２２３，２６３号
【特許文献１５】欧州特許第０９７７７２５号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Eur J Pharm Sci 11b Suppl 2: 15-27（２０００年）
【非特許文献２】Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol., 53-61（１９９９年）
【非特許文献３】Cancer Research 59: 2944-2949（１９９９年）
【非特許文献４】Gene Therapy, 5: 419-426（１９９８年）
【非特許文献５】Antiviral Research, 45: 157-167（２０００年）
【非特許文献６】Biochemical Pharmacology, 67: 503-511（２００４年）
【発明の概要】
【００１８】
本発明の一態様は、化学式（Ｉ）による化合物、またはその薬学的な塩に関する：
2010540555.tif 000006
式中、Ｒは、Ｈ、Ｒ５Ｃ（Ｏ）であり、Ｒ１が、
2010540555.tif 000007
であって、
式中、交差している点線は、化学式（Ｉ）の分子にＲ１が結合して形成される結合を図示し、Ｒ２およびＲ３が同時にＯＨではない場合、Ｒ２およびＲ３は独立してＯＨまたはＨであり、ＲおよびＲ４が同時にＨではない場合、Ｒ４はＨまたはＲ５Ｃ（Ｏ）であり、Ｒ５はＣ３〜Ｃ２６のアルケニルである。
【００１９】
本発明の別の態様は、化学式（Ｉ）の化合物、ならびに、薬学的な賦形剤、希釈剤、および／または担体を含む薬剤組成物に関する。
【００２０】
本発明のさらなる一態様は、新生物性病態の患者を治療する方法に関する。当該方法は、新生物性病態を有する患者を選択することと、当該患者における新生物性病態を治療するのに効果的な状態下において、上記に記載の化学式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的な塩を当該患者に投与することとを含む。
【００２１】
本発明のさらなる一態様は、炎症性病態の患者を治療する方法に関する。当該方法は、炎症性病態を有する患者を選択することと、当該患者における炎症性病態を治療するのに効果的な状態下において、上記に記載の化学式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的な塩を当該患者に投与することとを含む。
【００２２】
バッファおよび血漿中におけるアザ−Ｃの不安定性は十分に知られている（Israili et al., Cancer Research 36, 1453-1461（１９７６年）、Rudek et al., J Clin Oncol, 23:17, 3906-3911（２００５年）、Rustum et al., J Chromat, 421:12, 387-91（１９８７年）、Zhao et al., J Chromat B, 813, 81-88（２００４年）を参照されたく、これは全体として参照することにより本明細書に盛り込まれている）。臨床的血漿試料中において、アザ−Ｃに関して１．５０±２．３０時間の平均末端半減期が報告されている（Rudek et al., J Clin Oncol, 23:17, 3906-3911（２００５年）を参照されたく、これは全体として参照することにより本明細書に盛り込まれている）。インビトロにおいて、４．５日の貯蔵の後に、−６０℃でもアザ−Ｃの２０％の損失が記録され、室温で貯蔵された場合、０．５時間以内に１０％の損失が記録される（Zhao et al., J Chromat B, 813, 81-88（２００４年）を参照されたく、これは全体として参照することにより本明細書に盛り込まれている）。アザ−Ｃの最大の不安定性は、その後の蟻酸の脱離を伴う５−アザ−ピリミジン環の急速な（可逆である第１段階）開環が原因であると考えられる（Chan et al., J Pharma Sci, 68;7, 807-12（１９７９年）を参照されたく、これは全体として参照することにより本明細書に盛り込まれている）。その他の分解経路は、４位のアミノ基の脱アミノ化、ならびに、Ｄ−リボースおよび５−アザシトシンを生成するグリコシド結合の加水分解であると考えられる。当該好適なアザ−Ｃの脂質誘導体は意外にも、アザ−Ｃ自体より大幅に良好な血漿安定性プロフィールを有するということが分かっている。当該化合物は、実験条件下において、室温で少なくとも４時間、空白のヒト血漿マトリックス中において安定（初期状態の残存率≧９４％）であり、いかなる有意な分解生成物も、血漿タンパク質の沈殿の後に、抽出後の上清中で観測されなかった。当該好適な脂質化合物の血漿安定性は、３７℃で貯蔵された場合にさらに検査された。当該化合物のアザ部分またはその他の分解物の開環は、当該脂質側鎖がアザ−Ｃに結合する場合に大幅に減少するということが示されている。
【００２３】
アザ−Ｃの急速な分解は、アザ−Ｃの臨床的使用にとって障害である。アザ−Ｃに対する当該脂質誘導体の促進された血漿安定性は、当該脂質誘導体の高くかつ持続した患者血漿濃度の両方を生成し得る。これは、最初はアザ−Ｃ自体よりも良好な組織／器官／腫瘍の分布、および当該薬剤に対する細胞の曝露、および当該薬剤の取り込み、その後、アザ−Ｃ−５’−エステル結合の分子内加水分解の後に、アザ−Ｃに対するより良好な腫瘍細胞ＤＮＡの曝露をもたらし得る。
【００２４】
本発明の実施形態は、アザシチジンおよびデオキシシチジン（例えば、５−アザ−２’−デオキシシチジン）の修飾を通じ、アザシチジンおよびデオキシシチジン（例えば、５−アザ−２’−デオキシシチジン）と比較して、驚くほど様々な特性を有する新規の分子を作り出す。これは、血液悪性腫瘍に限定されるアザシチジンおよびデオキシシチジン（例えば、５−アザ−２’−デオキシシチジン）の抗癌活性を優に超える活性を有する一連の化合物を作り出す。これら新規の化合物は、乳がんおよび子宮頸癌を含む広範囲にわたる固形腫瘍に対して抗癌効果を有する。当該化合物も、治療に対して抵抗性がある癌に対して驚くほど活性であり、それ故、現在では治療選択が限定される固形腫瘍において治療上の利点を提供できる。本発明の実施形態は、選択肢および効果が限定されたままである癌を治療するための治療上の用途を有し、満たされていない必要性を満たす。
【００２５】
これらの化合物は、制限された曝露の後に活性のより早い発現を示し、それ故、臨床的設定における短期間の治療の後のみ効果的であり得る。これは、親薬物と比較して、より短く、より少ない回数の治療曝露、および、薬物関連の毒性の減少となるだろう。これは、改善された治療指数を提供するだろう。
【００２６】
当該脂質（エステルおよびアミドを両方含む）成分の添加を用いた構造の改変は、アゾールシチジン環、ひいては、エピジェネティックな機構に対する分子の効果を保存する。エピジェネティックな調節は、癌および炎症における遺伝子発現を改変するための重要な機構を提供する。これら新規の化合物は、アザシチジンより低い濃度で活性を有し、それ故、より有力である。改変された活性スペクトルを有するこれらの化合物は、固形腫瘍および炎症性疾患のエピジェネティックな標的を調節できる。
【００２７】
エピジェネティックな機構は、炎症誘発状態において重要であり、肺、結合組織、消化管、または血管系の炎症状態が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は、エピジェネティックな機構を標的とすることによって、これらの疾患の原因である炎症過程を減少または反転できる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、白血病および固形腫瘍の細胞株に対する、５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩（ＣＰ）および５−アザＣの細胞毒性比較のグラフである。細胞毒性はＷＳＴ−１アッセイで決定した。ＩＣ５０はCalcySynソフトウェアを用いて計算した。当該細胞は２４時間処理し（図１Ａ）、または、当該細胞は２４時間、４８時間、および７２時間処理した（図１Ｂ）。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、白血病細胞における５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩によるアポトーシス誘導のグラフである。図２Ａでは、ＨＬ６０細胞、Ｋ５６２細胞、およびＵ９３７細胞を、未処理のまま、または、２４時間、５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩（ＣＰ）（０．５μＭ〜４μＭ）で処理した。アポトーシス発現細胞の百分率は、アクリジンオレンジおよび臭化エチジウムで着色した後に、蛍光顕微鏡を用いて決定した。図２Ｂでは、ＨＬ６０およびＫ５６２の両方を、未処理のままにした。または、２４時間５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩（１μＭ、２μＭ、または４μＭ）で処理した。アポトーシス発現細胞の百分率は、アネキシンＶおよびＰＩ着色を用いたフローサイトメトリーによって決定した。
【図３】細胞周期に対する、５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩（ＣＰ）の曝露の効果のグラフである。フローサイトメトリーによるＤＮＡ内容物の解析のために処理される前に、細胞は望ましい長さの時間培養した。パネル内の数値は、ｓｕｂ−Ｇ１ＤＮＡの内容物を有するゲートされた細胞集団を表す。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩および５−アザＣの分化誘導グラフである。Ｋ５６２およびＵ９３７を、１４日間５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩（ＣＰ）または５−アザＣ（０．１２５μＭ〜１μＭ）に曝露した。０日目の初期処理の後に、４日目、７日目、および１０日目に薬剤の新たな部分に細胞を曝露した。当該分化はＮＢＴ（Ｕ９３７）によって（図４Ａ）、または、ベンジジン着色（Ｋ５６２）によって（図４Ｂ）評価した。
【図５】アザ−Ｃまたは５’−アザ−Ｃ−５'−エライジン酸エステルに曝露されたＵ９３７細胞内で測定された、リポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激されたＮＦκＢルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の一態様は、化学式（Ｉ）による化合物、またはその薬学的な塩に関する：
2010540555.tif 000008
式中、ＲはＨ、Ｒ５Ｃ（Ｏ）であり、Ｒ１は、
2010540555.tif 000009
であり、
式中、交差している点線は、化学式（Ｉ）の分子にＲ１が結合して形成される結合を図示し、Ｒ２およびＲ３が同時にＯＨではない場合、Ｒ２およびＲ３は独立してＯＨまたはＨであり、ＲおよびＲ４が同時にＨではない場合、Ｒ４はＨまたはＲ５Ｃ（Ｏ）であり、Ｒ５はＣ３〜Ｃ２６のアルケニルである。
【００３０】
特定の実施形態では、Ｒ５はＣ９〜Ｃ２６のアルケニルであり得る。
【００３１】
好適な一実施形態では、ＲはＲ５Ｃ（Ｏ）であり、Ｒ１は、
2010540555.tif 000010
であり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＯＨであり、Ｒ４はＨであり、Ｒ５はＣＨ３−（ＣＨ２）７−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）７−である。
【００３２】
本発明のより広範な態様は、化学式（Ｉ）’による化合物に関する：
2010540555.tif 000011
式中、Ｒは、Ｈ、Ｒ５Ｃ（Ｏ）、Ｒ５ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）、またはＲ５ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）であり、Ｒ１は、
2010540555.tif 000012
であり、
式中、交差している点線は、化学式（Ｉ）’の分子にＲ１が結合して形成される結合を図示し、Ｒ２およびＲ３が同時にＯＨではない場合、Ｒ２およびＲ３は独立してＯＨまたはＨであり、ＲおよびＲ４が同時にＨではない場合、Ｒ４は、Ｈ、Ｒ５Ｃ（Ｏ）、Ｒ５ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）、またはＲ５ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）であり、Ｒ５はＣ３〜Ｃ２６のアルケニル、またはその薬学的な塩である。
【００３３】
化学式（Ｉ）’による化合物の好適な一実施形態では、ｋは７であり、ｎは７である。特定の実施形態では、Ｒ１は、
2010540555.tif 000013
であり、
式中、交差している点線は、化学式（Ｉ）’の分子にＲ１が結合して形成される結合を図示する。いくつかの実施形態では、Ｒ４はＨであり得る。特定の実施形態では、ＲはＲ５Ｃ（Ｏ）であり、ｋは７であり、ｍは０であり、ｎは７であり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＯＨである。特定の実施形態では、Ｒ５はＣ９〜Ｃ２６のアルケニルである。
【００３４】
本発明の別の態様は、化学式（Ｉ）の化合物、ならびに、薬学的な賦形剤、希釈剤、および／または担体を含む薬剤組成物に関する。
【００３５】
本発明の薬剤は、経口で、非経口で、例えば、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内滴下によって、または、鼻、喉、および気管支の粘膜等の粘膜への使用によって投与できる。これらは、単独で、または、適切な薬学的な担体とともに投与してもよく、錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、または乳濁液等の固状または液状であり得る。
【００３６】
本発明の活性薬剤は、例えば、不活性希釈剤とともに、または、吸収可能な食用担体とともに、経口で投与してもよく、あるいは、これは硬いか軟らかいカプセル殻内に封入され得、あるいは、これは錠剤に圧縮され得、あるいは、これは食事療法の食物とともに直接取り込まれ得る。経口での治療的投与に関しては、これら活性薬剤は賦形剤とともに取り込まれ得、錠剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、およびシロップなどの形態で用いられ得る。このような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性薬剤を含むはずである。これら組成物中の薬剤の百分率は当然変動し得、当該単位の重量の約２％から約６０％の間に都合よくなり得る。このような治療に有用な組成物中の活性薬剤の量は、適切な用量が得られるようなものである。本発明による好適な組成物は、経口用量単位が約１ｍｇおよび２５０ｍｇの間の活性薬剤を含むように調製される。
【００３７】
当該錠剤およびカプセルなども、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチン等の結合剤、第二リン酸カルシウム等の賦形剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギニン酸等の分解剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑剤、スクロース、ラクトース、またはサッカリン等の甘味剤を含み得る。当該用量単位形態がカプセルである場合、それは、上記種類の物質に加え、脂肪油等の液体担体を含み得る。
【００３８】
様々なその他の物質は、被覆物として、または、当該用量単位の物理的形態を修飾するために存在し得る。例えば、錠剤は、セラック、糖、またはその両方で被覆され得る。シロップは、当該活性成分に加え、甘味剤としてスクロース、保存料としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、染料、およびサクランボまたはオレンジの香味料等の調味料を含み得る。
【００３９】
これらの活性薬剤も非経口で投与され得る。これらの活性薬剤の溶液または懸濁液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合された水の中で調製できる。分散液も、油中のグリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中にて調製できる。実例の油は、石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ラッカセイ油、大豆油、または鉱油である。一般的には、水、塩水、水性デキストロース、および関連する糖溶液、ならびに、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコール類は、好適な液体担体であり、具体的には注入可能な溶液のためのものである。通常の貯蔵状態または使用状態において、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存料を含む。
【００４０】
注入可能な用途に適切な薬学的形態としては、無菌の水溶液または分散液、および無菌の注入可能な溶液または分散液の即時調製物のための無菌の粉末が挙げられる。いかなる場合であっても、当該形態は無菌でなければならず、容易な注入可能性が存在する程度まで流動的でなければならない。それは製造および貯蔵の状態下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。当該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、これらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。
【００４１】
本発明の薬剤も、エアゾールの形態で気道に直接投与してもよい。エアゾールとしての使用に関して、溶液または懸濁液中の本発明の薬剤は、適切な推進剤、例えば、従来の補助剤を有するプロパン、ブタン、またはイソブタンのような炭化水素の推進剤とともに加圧されたエアゾールの容器内に封入され得る。本発明の物質も、噴霧器または霧吹き等の非加圧形態で投与してもよい。
【００４２】
本発明のさらなる一態様は、新生物性病態の患者を治療する方法に関する。当該方法は、新生物性病態を有する患者を選択することと、当該患者の新生物性病態を治療するのに効果的な状態下において、上記に記載の化学式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的な塩を当該患者に投与することとを含む。
【００４３】
特定の実施形態では、当該新生物性病態は癌性疾患である。当該癌性疾患は、固形腫瘍、または血液癌、または悪性腫瘍であり得る。当該癌性疾患は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、または骨髄異形成症候群であり得る。
【００４４】
特定の実施形態では、当該固形腫瘍は、乳房組織、卵巣組織、前立腺組織、脳組織、膀胱組織、および肺組織等の組織の癌であり得る。
【００４５】
本発明のさらなる一態様は、炎症性病態の患者を治療する方法に関する。当該方法は、炎症性病態を有する患者を選択することと、当該患者における炎症性病態を治療するのに効果的な状態下において、上記に記載の化学式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的な塩を当該患者に投与することとを含む。
【００４６】
特定の実施形態では、当該炎症性病態は、肺、結合組織、消化管、および血管系の炎症症状である。
【００４７】
本明細書で他に画定されていない限り、本願に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に要求されていない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含むものとする。
【００４８】
実施例
実施例１
試薬、細胞株、および細胞培養
５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩（ＣＰまたはＣＰ−４２００）をClavis Pharma AS社より購入し、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１をRoche Applied Science社（ドイツ、マンハイム）より購入し、ＰＩおよびアネキシンＶ−ＦＩＴＣのアポトーシスキットをBD Biosciences（カリフォルニア州、パロアルト）より購入し、５−アザシチジン（５−アザＣ）、臭化エチジウム（ＥＢ）、アクリジンオレンジ（ＡＯ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ホルボール−１２−ミリスチン酸−１３−酢酸塩（ＴＰＡ）をSigma Chemical社（ミズーリ州、セントルイス）より購入した。
【００４９】
ヒト前骨髄球白血病の細胞株であるＨＬ６０、ヒト組織球性リンパ腫であるＵ９３７、ヒト慢性骨髄性白血病であるＫ５６２、ヒト急性Ｔ細胞であるジャーカット、乳腺腺癌であるＭＣＦ−７、膀胱癌である５６３７、前立腺癌であるＤＵ−１４５をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより購入した。ジャーカット以外の全ての細胞株を、３７℃で５％のＣＯ２の雰囲気において、１０％の加熱不活性化したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したRPMI 1640培地（Gibco社、英国、グラスゴー）中で保持した。１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１０％のＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したRPMI 1640培地中でジャーカット細胞を培養した。
【００５０】
実施例２
細胞毒性アッセイ
５−アザシチジンの脂質の細胞毒性を、生存細胞中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによる、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１（４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ジスルホン酸ベンゼン）の開裂に基づく比色分析アッセイによって決定した。９６ウェルの平底マイクロプレート中における様々な濃度の５−アザシチジンの脂質を含む培地または含まない培地中で、１×１０６／ｍｌ（ＨＬ６０細胞）または１．２５×１０５／ｍｌ（Ｕ９３７、Ｋ５６２、およびジャーカット）の初期濃度で細胞を播種し、２４時間から７２時間培養した。ＭＣＦ−７細胞、ＤＵ−１４５細胞、および５６３７細胞（１×１０４／ｍｌ）を播種し、２４時間付着および分散させた。様々の濃度の5-アザシチジン脂質を加え、培養物をさらに２４〜７２時間維持した。ＷＳＴ−１試薬とともに１時間培養物を培養した。６５０ｎｍの参照波長とともに４５０ｎｍにおいて、マイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instruments社、Elx 800）によってホルマザンの生成を測定した。未処理の細胞と比較して増殖阻害率（％）を決定した。CalcuSynソフトウェア（Biosoft社）を用いてＩＣ５０値を計算した。
【００５１】
実施例３
アポトーシス発現細胞の定量
アネキシンＶ−ＦＩＴＣで着色した後、形態学的基準および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いてアポトーシス発現細胞を画定した。形態学的分析のために、１００μｇ／ｍｌのＡＯおよび１００μｇ／ｍｌのＥＢを含む１μｌの原液を、２５μｌの細胞懸濁液に添加した。蛍光顕微鏡検査法を用いて、当該アポトーシス発現細胞およびアポトーシス小体を分析した。合計３００個の細胞を数えた後、アポトーシス発現細胞の百分率を計算した。ＦＡＣＳ分析のために、ＰＢＳで２×１０５から５×１０６の細胞を洗浄し、その後、メーカーから提供されたアネキシンＶ−ＦＩＴＣのアポトーシス検出キットの教示に従って、アネキシンＶ−ＦＩＣＳおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で標識付けした。FACSCAN（Becton Dickinson社、カリフォルニア州、サンノゼ）で５１８ｎｍおよび６２０ｎｍにおいて、ＦＩＴＣおよびＰＩの蛍光信号をそれぞれ検出した。Ｘ軸上にアネキシンＶ−ＦＩＴＣの蛍光の記録を表示し、Ｙ軸上にＰＩの蛍光の記録を表示した。CellQuestプログラム（Becton Dickinson社）によって当該データを解析した。各解析につき、１０，０００細胞の事象を記録した。
【００５２】
実施例４
細胞周期
遠心分離によって細胞をペレット状にし、ＰＢＳで２回洗浄し、７０％（v／v）の冷エタノール（−２０℃）で固定し、少なくとも２４時間４℃で貯蔵した。当該細胞をＰＢＳ中で洗浄した。ＰＩ／リボヌクレアーゼの着色溶液で細胞のペレットを着色した。室温にて３０分の間、暗所で当該細胞懸濁液を培養した。FACSCaliburフローサイトメトリー（Becton Dickinson社、カリフォルニア州、マウントビュー）を用いてＤＮＡ内容物を決定した。当該細胞周期のＳｕｂ−Ｇ１段階、Ｇ１段階、Ｓ段階、およびＧ２／Ｍ段階における細胞の百分率を、ＤＮＡヒストグラム適合プログラム（Becton Dickinson社）を用いて決定した。試料当たり最小でも１０，０００種の事象を記録した。
【００５３】
実施例５
アザ−Ｃ−５’−オレイン酸エステルの合成
オレイン酸（１．７７ｍｍｏｌ、５００ｍｇ）をトルエン（３ｍｌ）中に溶解させた。ＤＭＦ（１０μｌ）を添加し、その後、室温で１０分にわたって塩化オキサリル（３．６ｍｍｏｌ、４５７ｍｇ）を添加した。３時間後、当該トルエンを真空内で除去した。
【００５４】
アザ−Ｃ（１．７５ｍｍｏｌ、４２７ｍｇ）をＤＭＡ（６ｍｌ）中で懸濁させ、ＨＣｌ（Ｅｔ２Ｏ中で１Ｍ、２．０ｍｍｏｌ、２．０ｍｌ）を添加し、室温で５分経過した後、当該Ｅｔ２Ｏを真空内で除去した。得られた混濁液を氷水浴内で冷却し、ＤＭＡ（２ｍｌ）中に溶解させた当該酸塩化物を、２時間にわたって添加した。当該反応混合物を一晩撹拌する間、温度はゆっくりと室温に到達し、その後、３０℃で２時間それを加熱した。室温まで冷却した後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および飽和ＥｔＯＡｃ水溶液（各２５ｍｌ）の間で当該反応混合物を分割した。さらなる３×２５ｍｌのＥｔＯＡｃで当該水相を抽出した。当該有機相を混合し、塩水で洗浄し、乾燥した（ＭｇＳＯ４）。当該溶媒の真空内での除去後、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、２．５％、５％、および１０％のＭｅＯＨを有するＣＨ２Ｃｌ２）によって、当該未精製で油質の生成物を精製した。収量（率）：１１０ｍｇ（１３％）
【００５５】
実施例６
５−アザシチジン−５’−エライジン酸エステルの合成
５−アザシチジン（４．１ｍｍｏｌ、１．００ｇ）を乾燥ＤＭＡ（１５ｍｌ）中で懸濁させ、ジエチルエーテル中のＨＣｌの溶液（４．９ｍｍｏｌ、１Ｍ、４．９ｍｌ）を室温でゆっくりと添加し、透明な溶液を生成した。その後、当該エーテルを真空内で除去し、わずかに混濁した溶液をもたらした。乾燥ＤＭＡ（８ｍｌ）中における塩化エライドイル（４．８ｍｍｏｌ、１．４４ｇ）の溶液を、室温で１時間にわたって添加した。その後、一晩３０℃で当該反応混合物を加熱し、室温まで冷却し、メタノール（０．０５ｍｌ）で反応を停止した。少なくとも１時間後に、約１０−２ｍｂａｒで当該反応混合物を濃縮し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および飽和酢酸エチル水溶液の間で当該残留物を分割した。水相は酢酸エチルで抽出した。その後、当該有機相を混合し、洗浄し（塩水）、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、０％〜１０％のメタノールを伴うＣＨ２Ｃｌ２）による精製で、０．９ｇ（４３％）の生成物が生じた。
【００５６】
実施例７
腫瘍細胞に対する５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩のインビトロでの影響
白血病および固形腫瘍の細胞株に対する、５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩および５−アザＣの細胞毒性を比較した。５−アザＣと比較すると、５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩の細胞毒性効果は、研究が行われた全ての細胞株内においてより高かった。固形腫瘍と比較すると、白血病細胞株は、５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩（ＣＰ）および５−アザＣの両方に対してより鋭敏に反応した。表２（下記）および図１Ａ〜１Ｂを参照されたい。
【００５７】
（表２）
2010540555.tif 000014
白血病および固形腫瘍の細胞株に対する、５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩（ＣＰ）および５−アザＣの細胞毒性の比較（ＩＣ５０値）。２４時間、４８時間、および７２時間当該細胞を処理し、ＷＳＴ−１アッセイで細胞毒性を決定した。CalcuSynソフトウェアを用いてＩＣ５０値を計算した。
【００５８】
アザシチジンでは観測されない５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩の活性の早期の発現は驚くべき結果である。
【００５９】
実施例８
白血病細胞におけるアポトーシスの誘導
ＨＬ６０細胞、Ｋ５６２細胞、およびＵ９３７細胞を、未処理のままにし、または、２４時間、５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩（０．５μＭ〜４μＭ）で処理した。アポトーシス発現細胞の百分率は、アクリジンオレンジおよび臭化エチジウムで着色した後に、蛍光顕微鏡を用いて決定した（図２Ａを参照）。もう一方の組の実験では、ＨＬ６０およびＫ５６２を、未処理のままにし、または、２４時間、５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩（１μＭ、２μＭ、または４μＭ）で処理した。アポトーシス発現細胞の百分率は、アネキシンＶおよびＰＩ着色を用いたフローサイトメトリーによって決定した。両方の方法は、５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩が、濃度に依存するアポトーシス発現細胞数の増加を誘導するということを証明した。（図２Ａおよび２Ｂを参照のこと。）
【００６０】
実施例９
細胞周期の進行
細胞周期に対する５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩への曝露の影響を研究した。フローサイトメトリーによるＤＮＡ内容物の解析のために処理する前に、細胞を示した長さの時間培養した。パネル内の数値は、ｓｕｂ−Ｇ１ＤＮＡの内容物を有するゲートされた細胞集団を表す。処理の２４時間後に、最も重大な変化を観測した。対照（８．３％）と比較すると、ｓｕｂ−Ｇ１段階（アポトーシス発現細胞）における百分率が、２μＭの５−アザシチジン−５’−エライジンで処理した細胞内において、最大で３３．６％まで増加し、Ｇ１段階、Ｓ段階、およびＧ２／Ｍ段階では減少した。図３および下記の表３に結果をまとめる。これらの結果は、５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩によるアポトーシスの誘導を裏付け、濃度に依存するかたちで５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩が当該細胞周期に影響を与えるということを証明した。
【００６１】
（表３）
2010540555.tif 000015
細胞周期に対する５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩（ＣＰ）の曝露の影響。フローサイトメトリーによるＤＮＡ内容物の解析のために処理する前に、細胞を示した長さの時間培養した。示されている数字は、様々な段階における細胞の百分率である。
【００６２】
実施例１０
分化の誘導
形態に関して細胞の分化を研究した。単独の曝露（９６時間）は全く影響を有しなかったので、１１日間（ＨＬ６０細胞）、または１４日間（Ｕ９３７細胞およびＫ５６２細胞）、５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩または５−アザＣに細胞を曝露した。０日目での初期処理の後に、４日目、７日目、および１０日目に、薬剤の新たな部分に対して細胞を曝露した。ＮＢＴ還元アッセイ（Ｕ９３７およびＨＬ６０）によって、または、ベンジジン着色（Ｋ５６２）によって、当該分化を評価した。５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩はわずかにより効果的であったが、薬剤は両方ともそれほど著しい分化を誘導しなかった。図４Ａ〜４Ｂを参照されたい。
【００６３】
実施例１１
プールしたヒト血漿中の５−アザ−５’−エライジン酸エステルの代謝安定性
５種類の濃度レベル（それぞれ、０．１μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、および３０μＭ）にて、５−アザ−Ｃ−５’−エライジン酸エステルをプールしたヒト血漿中に添加した。３７℃で撹拌回分水中にて当該混合物を培養する。一定分量（１００μｌ）の当該培養液を、設定した培養時間（０分、１５分、３０分、６０分、および１２０分）で３度（ｎ＝３）吸引し、０．１％の蟻酸（３００μｌ）を含むアセトニトリルを用いて血漿タンパク質を直ちに沈殿させた。１種類の濃度（１μＭ）の培養にてアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中において、試験化合物およびアザ−Ｃを用いて陰性対照を調製した。遠心分離後、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ解析のために当該上澄みを直接導入した。表４を参照されたい。
【００６４】
（表４）プールしたヒト血漿中における５−アザ−５’−エライジン酸エステルの代謝安定性
2010540555.tif 000016
【００６５】
実施例１２
アザ−Ｃおよび５−アザ−Ｃ−５’−エライジン酸の細胞毒性
アザ−Ｃおよび５−アザ−Ｃ−５’−エライジン酸の細胞毒性を、乳癌の細胞株であるＭＴ−３，および、アドリアブラスチン耐性の細胞株であるＭＴ−３／ＡＤＲ中で決定した。ＭＴ−３／ＡＤＲは、ＭＤＲ−１／ｐ−糖タンパク質を過剰に発現する。２ｍＭのグルタミンおよび１０％のＦＢＳを有するRPMI 1640培地中の、ウェル当たり５×１０３個の細胞を、９６ウェルプレート内に当該細胞を播種した。２４時間当該細胞を培養した。当該試験化合物をＤＭＳＯに溶解させ、使用直前に培地中でさらに希釈した。試験濃度当たり６個のウェルを用いた。２４時間試験化合物で当該細胞を培養した。２０μｌの新たに調製したＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、４時間培養した。０．０１μＭから１００μＭの範囲にある８つの異なる濃度に基づき、グラフを使って示している増殖曲線からＩＣ５０値を決定した。結果を表５に示す。ＭＴ−３乳癌細胞株中では、アザ−Ｃおよび５−アザ−Ｃ−５’−エライジン酸に対して同様の活性を観測したが、ＭＴ−３／ＡＤＲ耐性の細胞株中では、アザ−Ｃの活性が欠失した。最大１００μＭの試験濃度範囲内では全く活性を観測しなかったものの、当該耐性細胞株および当該非耐性ＭＴ−３株内で、同様のＩＣ５０値を有する５−アザ−Ｃ−５’−エライジン酸は活性であった。これは耐性癌の治療において重要であり得る。表５を参照されたい。
【００６６】
（表５）多剤耐性を有するか有しない乳癌の細胞株であるＭＴ−３中の、および５−アザ−Ｃ−５’−エライジン酸の細胞毒性
2010540555.tif 000017
【００６７】
実施例１３
アザ−Ｃおよび５−アザ−Ｃ−５’−エライジン酸のヌクレオシド輸送体の阻害の影響
細胞毒性に対するヌクレオシド輸送体の阻害の影響を、アザ−Ｃおよび５−アザ−Ｃ−５’−エライジン酸に対して、Hela変異頸癌細胞内で評価していた。受動拡散型ヌクレオシド輸送体であるｈＥＮＴ１およびｈＥＮＴ２の阻害剤としてジピリダモールを用いた。２ｍＭのグルタミンおよび１０％のＦＢＳを有するRPMI 1640培地中の、ウェル当たり５×１０３個の細胞を、９６ウェルプレート内に当該細胞を播種した。２４時間当該細胞をあらかじめ培養した。当該試験化合物の添加の３０分前に、ジピリダモール（１０μＭ）を当該細胞に添加した。当該試験化合物をＤＭＳＯ中に溶解させ、使用直前に培地中でさらに希釈した。試験濃度当たり６個のウェルを用いた。７２時間試験化合物とともに当該細胞を培養した。２０μｌの新たに調製したＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、４時間培養した。０．０１μＭから１００μＭの範囲にある８つの異なる濃度に基づき、グラフを使って示している増殖曲線からＩＣ５０値を決定した。その結果を表６に示す。ヌクレオシド輸送体の阻害剤であるジピリダモールの添加によってアザ−Ｃの活性を３倍減少させ、アザ−Ｃの流入および流出が、当該ヌクレオシド輸送体であるｈＥＮＴ１およびｈＥＮＴ２にある程度依存するということを示唆した。５−アザ−Ｃ−５’−エライジン酸の細胞毒性を維持するだけでなく、ｈＥＮＴ１およびｈＥＮＴ２のヌクレオシド輸送体をジピリダモールの使用によって阻害した時に５０倍増加させた。当該ヌクレオシド輸送体を阻害する細胞中における増加した活性は驚くべきものであり、ヌクレオシド輸送体の欠如によって引き起こされた治療に対する耐性を有する患者の体内において、さらにより高い活性を示し得る。表６を参照されたい。
【００６８】
（表６）ヌクレオシド輸送体の阻害剤を伴うか伴わないHela頸癌細胞中の、アザ−Ｃおよび５−アザ−Ｃ−５’−エライジン酸の細胞毒性
2010540555.tif 000018
【００６９】
実施例１４
核転写因子−κＢ（ＮＦκＢ）の活性化
炎症に対する影響を判断するために、核転写因子―κＢ（ＮＦκＢ）の活性化を評価した。ＮＦκＢは、多数の免疫反応および炎症反応の両方、発現過程、細胞増殖、およびアポトーシスに関連する。
【００７０】
３つのＮＦκＢ結合部位を含む、ルシフェラーゼレポーターと安定的にトランスフェクトしたヒト単球細胞株であるＵ９３７内において、ＮＦκＢ誘導のルシフェラーゼ活性に対するアザ−Ｃおよび５−アザ−Ｃ−５’−エライジン酸の影響を決定するために、ＮＦκＢ−ルシフェラーゼのレポーター遺伝子を用いた。１０ｎＭの濃度のアザ−Ｃまたは５−アザ−Ｃ−５’−エライジン酸の当該培地への添加の前に３０分間、１μｇ／ｍｌのリポ多糖類（ＬＰＳ）を用いてＮＦκＢの誘導を行った。１０％のウシ胎仔血清を含むRPMI-1640培地中で当該細胞を培養した。ＬＰＳでの刺激の前に、２％のウシ胎仔血清のみを含む培地に当該細胞を移した。１時間後、３時間後、または６時間後に、IVIS imaging System 100（Xenogen社、米国）で撮像することによってルシフェラーゼ活性を測定した。当該ＬＰＳの刺激は、当該ＤＭＳＯで処理した対照細胞の中で、その後の６時間を越える時間とともに増加した。１０ｎＭのアザ−Ｃに対する曝露は、当該ＤＭＳＯで処理した対照と比較して、当該ＬＰＳ誘導のＮＦκＢの活性を増加させた。５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩は、ＬＰＳで刺激したＮＦκＢの活性において、当該ＤＭＳＯの対照と異ならなかった。一般的に、アザシチジンに対して観測されたＮＦκＢの陽性刺激は明確ではなく、当該ＬＰＳの刺激は５’−アザ−Ｃ−５’−エライジン酸によってこれ以上増加しないということは明確である。図５を参照されたい。
【００７１】
実施例１５
アザシチジンまたは５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩での処理後の、乳癌細胞株内のエストロゲン受容体β（ＥＲβ）の遺伝子発現
定量的実時間ＰＣＲ（TaqMan）によって、エストロゲン受容体βの遺伝子発現（ＲＮＡレベルにおいて決定した）を決定した。エストロゲン欠乏培地（２％のグルタミン、および、１０％のチャコール−デキストランで処理したウシ胎仔血清を有するフェノールレッドを含まないRPMI）中で、ＭＣＦ−７乳癌細胞を増殖させた。２５ｃｍ２のフラスコ内に当該細胞を播種し、１μＭのアザシチジンまたは５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩の処理前に２４時間付着させた。１つの未処理の対照を対照として含めた。当該化合物に対する５日の曝露後に当該細胞を回収し、トリプシン処理によってこれを回収し、洗浄して液体窒素中で瞬間凍結した。
【００７２】
およそ１０６個の瞬間凍結したＭＣＦ−７細胞から、全てのＲＮＡを抽出した。当該ＲＮＡの濃度および純度を測定し、TaqMan社製逆転写試薬（N808-0234）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。標準プロトコルおよびあらかじめ混合したＰＣＲ試薬を用いて実時間計量を行った。Applied Biosystems社から、ＥＲβ（ＩＤ：Ｈｓ００２３０９５７＿ｍ１）、および、ハウスキーピング遺伝子であるヒドロシルメチルビランシンターゼＨＭＢＳ(ＩＤ：Ｈｓ００６０９２９７＿ｍ１)用のプライマープローブの混合物を注文した。比較デルタ−デルタＣｔ法を用いて遺伝子発現を計算した。ＥＲβの発現の誘導は、アザシチジンに対する曝露の後のわずか２．５１倍と比較して、５−アザシチジン−５’−エライジン酸塩に対する曝露の後に５．２６倍となった。表７を参照されたい。これは、ホルモン感受性を回復できるホルモン難治性腫瘍において非常に適切であり得る。表７を参照されたい。
【００７３】
（表７）
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【００７４】
好適な実施形態が本明細書で詳細に描写および記載されているものの、様々な修正、付加、および置換などは、本発明の趣旨から逸脱することなく行うことができ、これらはそれ故、下記の特許請求の範囲にて画定されている本発明の範囲内にあると見なされるということが、関連分野の当業者にとって明白となるだろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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