(57)【要約】本発明は、ＥＧＦＲの発現を阻害する核酸分子を提供する。その核酸分子を用いる方法も提供される。本発明の一態様は、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体遺伝子の発現を下方調節する核酸分子であって、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡを標的とするヌクレオチド配列を含み、配列番号１〜１０または２１〜１２１に記載のポリヌクレオチド配列のいずれか１つを標的とするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。一部の実施形態において、核酸分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりＥＧＦＲ遺伝子の発現を下方調節する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子の発現を下方調節する核酸分子であって、配列番号１〜１０または２１〜１２１に記載のポリヌクレオチド配列のいずれか１つを標的とする核酸を含む核酸分子。
【請求項２】
前記核酸が、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１１〜２０および１２２〜３２３に記載の一本鎖ＲＮＡ配列のいずれか１つ、またはその二本鎖ＲＮＡを含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりＥＧＦＲ遺伝子の発現を下方調節する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項３に記載のｓｉＲＮＡ分子のいずれか１つまたは複数を含む組成物。
【請求項６】
標的化部分をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ヒスチジン−リジンコポリマーをさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
ＥＧＦＲを発現する癌を有し、前記癌を有するかまたは癌を有する危険性を示すことが疑われる対象において癌を治療または予防する方法であって、請求項５に記載の組成物を前記対象に投与し、これにより癌を治療または予防するステップを含む方法。
【請求項９】
前記癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳の癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頚癌、頭頚部癌、腎臓癌、子宮内膜癌、卵巣癌、髄膜腫、黒色腫、リンパ腫、および神経膠芽腫からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞内におけるＥＧＦＲの合成または発現を低下させる方法であって、前記細胞内に１つまたは複数のｓｉＲＮＡを導入するステップを含み、前記１つまたは複数のｓｉＲＮＡが配列番号１１〜２０または１２２〜３２３に記載の配列を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００７年６月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／９４５，８４２号、２００７年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／９９８，２８４号、２００８年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／１２４，２２３号、２００８年６月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／０６０，７２１号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、分子生物学および医学の分野にあり、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体の発現を調節する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＥＧＦＲは、細胞の増殖および分化の制御において重要な役割を果たすことが示されている、１７０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質である。ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ  ３（ＥｒｂＢ−３）、およびＨｅｒ  ４（ＥｒｂＢ−４）を含むＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーである。ＥＧＦＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインからなる。ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合するリガンドにより二量体化およびチロシンキナーゼ活性の活性化がもたらされ、細胞の増殖および分化をもたらす酵素的および生物学的事象の複雑なカスケードが誘発される。
【０００４】
ＥＧＦＲの過剰発現は、肺、腎臓、膵臓、乳房、頭頚部、胃、および結腸の悪性腫瘍を含む多くの悪性腫瘍と関連している。各種の細胞が、ＥＧＦＲの（１つまたは複数の）変異型を生成することが示されている。例えば、Ａ４３１ヒト類上皮癌細胞は、切断型ＥＧＦＲを生成することが示されている。
【０００５】
癌におけるＥＧＦＲの役割は、転移性の結腸癌、肺癌、膵臓癌、および頭頚部癌の治療のためのベクチビックスおよびエルビタックスならびにタルセバ（商標）などの低分子ＴＫｉなどの中和抗体を含む、複数のＥＧＦＲ阻害剤に対する近年のＦＤＡ承認により検証されている。
【０００６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法が、特定の遺伝子産物の発現を抑制するのに有効な手段として出現しつつあり、したがって、ＥＧＦＲ発現の調節のための多数の治療的、診断的、および研究的適用において独自に有用であると判明する可能性がある。本発明は、ＲＮＡｉ法を用いてこれらのタンパク質の発現を調節する組成物および方法を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、当技術分野では、癌および他の疾患の治療のための治療法として、ＥＧＦＲの発現を調節する組成物および方法に対する必要が存在する。本発明は、この利点および他の利点を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明の一態様は、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体遺伝子の発現を下方調節する核酸分子であって、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡを標的とするヌクレオチド配列を含み、配列番号１〜１０または２１〜１２１に記載のポリヌクレオチド配列のいずれか１つを標的とするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。具体的な実施形態において、核酸はｓｉＲＮＡ分子である。より具体的な実施形態において、ｓｉＲＮＡは、配列番号１１〜２０および１２２〜３２３に記載の一本鎖ＲＮＡ配列のいずれか１つ、またはその二本鎖ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、核酸分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりＥＧＦＲ遺伝子の発現を下方調節する。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子のいずれか１つまたは複数を含む組成物であって、ｓｉＲＮＡが配列番号１１〜２０および１２２〜３２３に記載の一本鎖ＲＮＡ配列のいずれか１つ、またはその二本鎖ＲＮＡを含む組成物を提供する。この点において、該組成物は、本発明の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００種以上のｓｉＲＮＡ分子を含みうる。具体的な実施形態において、ｓｉＲＮＡは、標的化部分を含む。
【００１０】
各種の実施形態において、本発明は、ＥＧＦＲを発現する癌を有し、該癌を有するかまたは癌を有する危険性を示すことが疑われる対象において癌を治療または予防する方法であって、配列番号１１〜２０および１２２〜３２３に記載の一本鎖ＲＮＡ配列のいずれか１つ、またはその二本鎖ＲＮＡを含む組成物を対象に投与し、これにより、癌を治療または予防するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、癌は、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳の癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頚癌、頭頚部癌、腎臓癌、子宮内膜癌、卵巣癌、髄膜腫、黒色腫、リンパ腫、および神経膠芽腫からなる群から選択される。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、ＥＧＦＲの合成または発現を阻害する方法であって、ＥＧＦＲを発現する細胞を１つまたは複数のｓｉＲＮＡと接触させるステップを含み、ｓｉＲＮＡが配列番号１１〜２０または１２２〜３２３に記載の配列を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明のこれらの態様および他の態様は、以下の詳細な説明を参照することで明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、特定のｓｉＲＮＡ分子によるｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｈＥＧＦＲの阻害を示す棒グラフである。ＨＴ−２９細胞において、ヒトＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡのヒトＥＧＦＲ遺伝子サイレンシング活性を調べた。細胞２×１０６個／２００ｕｌあたり４または８ｕｇのｓｉＲＮＡによる電気穿孔を介するトランスフェクション法を用いて、ＨＴ−２９細胞にＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後において、ｈＥＧＦＲ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、トランスフェクトされたＨＴ−２９細胞内におけるＥＧＦＲタンパク質の濃度を測定した。ｈＥＧＦＲタンパク質濃度は細胞内総タンパク質に対して標準化し、ｈＥＧＦＲの阻害百分率はｓｉＲＮＡを伴わないモック工程により処理された細胞に対して標準化した。５種すべてのｈＥＧＦＲ  ｓｉＲＮＡが、ｈＥＧＦＲ生成の阻害を示した。ｈＥＧＦＲ−２５−１およびｈＥＧＦＲ−２５−２が最も強力なｓｉＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後において、ｈＥＧＦＲタンパク質の７０％を超える阻害を示した。
【図２】図２は、２種のｓｉＲＮＡ分子による用量依存的なｈＥＧＦＲ阻害を示す棒グラフである。選択されたｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡであるｈＥＧＦＲ−２５−１およびｈＥＧＦＲ−２５−２を、それらがｈＥＧＦＲの発現を用量依存的に阻害する能力について調べた。電気穿孔を介するトランスフェクション法を用いて、ＨＴ−２９細胞に細胞２×１０６個／２００μｌあたり０．０１〜１０ｕｇの範囲のＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後において、ｈＥＧＦＲ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、トランスフェクトされたＨＴ−２９細胞内におけるＥＧＦＲタンパク質の濃度を測定した。ｈＥＧＦＲタンパク質濃度は細胞内総タンパク質に対して標準化し、ｈＥＧＦＲの阻害百分率はｓｉＲＮＡを伴わないモック工程により処理された細胞に対して標準化した。ｈＥＧＦＲ−２５−１およびｈＥＧＦＲ−２５−２のいずれもが、ｈＥＧＦＲ生成の用量依存的な阻害を示した。
【図３】図３は、Ａ４３１腫瘍の異種移植に対するｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ−ＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）ＮＰＸの腫瘍阻害効果を示す線グラフである。Ａ４３１（類上皮癌）異種移植モデルにおいて、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡを保有するＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）（ＰＴ−ＮＰＸ）の抗腫瘍効果を判定した。腫瘍細胞移植後第４日以降、１日おき６回にわたり、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡを保有するＰｏｌｙＴｒａｎ  ＮＰＸの静脈内投与により、確立されたＡ４３１腫瘍を有するマウスを治療した。治療対照は、治療なし（非治療）および６日間にわたり１００ｍｇ／ｋｇで毎日経口投与されたエルロチニブ（タルセバ（商標））を含んだ。ヒトＥＧＦＲ  ｓｉＲＮＡを保有するＰＴ−ＮＰＸによる治療は、非治療対照と比較してＡ４３１腫瘍の増殖を有意に阻害し、阻害効果は、タルセバ（商標）による治療対照よりも大きかった。
【図４】図４は、ＰＴ−ＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸによるＡ４３１腫瘍の増殖に対する阻害が、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ特異的であり、ＰＴ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸ製剤を必要とすることを示す線グラフである。ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡまたは陰性対照ｓｉＲＮＡを保有するＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）ナノ粒子（ＰＴ−ＮＰＸ）のほか、ＰｏｌｙＴｒａｎペプチド単独またはｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ単独をＡ４３１（類上皮癌）異種移植モデルにおいて調べた。腫瘍細胞移植後第５日以降、１日おき４回にわたり、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡもしくは陰性対照ｓｉＲＮＡ（２ｍｇ／ｋｇ）を保有するＰｏｌｙＴｒａｎ  ＮＰＸ、またはｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ単独、またはＰｏｌｙＴｒａｎペプチド単独の静脈内投与により、確立されたＡ４３１腫瘍を有するマウスを治療した。治療対照は、治療なし（非治療）を含んだ。非治療対照と比較して、Ａ４３１腫瘍の増殖を有意に阻害したのは、ヒトＥＧＦＲ  ｓｉＲＮＡを保有するＰＴ−ＮＰＸによる治療のみであった。対照ｓｉＲＮＡを保有するＰＴ−ＮＰＸ、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ単独、またはＰｏｌｙＴｒａｎペプチドを含む他のすべての治療群は、Ａ４３１腫瘍の増殖を阻害しなかった。
【図５】図５は、Ａ５４９腫瘍の異種移植に対するｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ−ＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）ＮＰＸの腫瘍抑制効果を示す線グラフである。ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡを保有するＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）（ＰＴ−ＮＰＸ）の抗腫瘍効果を、Ａ５４９（ＮＳＣＬＣ）異種移植モデルにおいて判定した。腫瘍細胞移植後第９日以降、１日おき６回にわたり、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡを保有するＰｏｌｙＴｒａｎ  ＮＰＸの静脈内投与により、確立されたＡ５４９腫瘍を有するマウスを治療した。治療対照は、治療なし（非治療）および６日間にわたり１００ｍｇ／ｋｇで毎日経口投与されたエルロチニブ（タルセバ（商標））を含んだ。ヒトＥＧＦＲ  ｓｉＲＮＡを保有するＰＴ−ＮＰＸによる治療は、非治療対照と比較してＡ５４９腫瘍の増殖を有意に阻害し、阻害効果は、タルセバ（商標）による治療対照よりも大きかった。対照ｓｉＲＮＡを保有するＰＴ−ＮＰＸは、Ａ５４９腫瘍の増殖に対する阻害効果を有さなかった。
【図６】図６は、ＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）の構造および組成を示す略図である。ＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）は、合成による生体分解性の陽イオン分枝ポリペプチドである。正に帯電したＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）ポリペプチドは、負に帯電したｓｉＲＮＡの担体および凝縮剤として用いられる。
【図７】図７は、ヒスチジン−リジンＨ３Ｋ４ｂポリペプチド構造を示すダイアグラムである。ヒスチジン−リジンＨ３Ｋ４ｂポリペプチドは、ＰＴ−ＮＰＸの調合に用いた。
【図８】図８は、ＰｏｌｙＴｒａｎ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸの電子画像である。ＰｏｌｙＴｒａｎペプチドをｓｉＲＮＡ（ｈＶＥＧＦに対する）と混合すると、溶液中に直径約１００ｎｍの球形ナノ粒子（ＰＴ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸ）が形成された。
【図９】図９は、ＰＴ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸの細胞内への取り込みを示す蛍光顕微鏡画像である。５ｕｇ／ｍＬに相当するｓｉＲＮＡ濃度で６時間にわたり、Ａｌｅｘａ４８８により標識されたｈＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を含有するＰＴ−ＮＰＸを、ＥＡ．ｈｙ９２６マウス内皮細胞にトランスフェクトした。細胞内で観察された蛍光発光により、ＰＴ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸの内在化が示唆される。
【図１０】図１０は、腫瘍内におけるＰＴ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸの組織内分布を示す蛍光顕微鏡画像である。蛍光標識されたｓｉＲＮＡ（Ａｌｅｘａ５５５により標識されたＱＩＡＧＥＮ社製のｈＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ）を保有するＰＴ−ＮＰＸを用いて、静脈内注射後におけるＰＴ−ＮＰＸの生体内分布を探索した。Ａ４３１異種移植を有するヌードマウスに、ＰＴ−ＮＰＸを静脈内注射した。注射の１時間後、腫瘍組織を除去し、凍結組織切片を調製した。腫瘍組織内において蛍光標識されたｓｉＲＮＡが見出されたことは、腫瘍組織内におけるＰＴ−ＮＰＸの分布が達成されたことを示す。非処理の腫瘍組織内において、自己蛍光バックグラウンドは見られなかった。
【図１１】図１１Ａ〜Ｃは、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡによるｈＶＥＧＦ遺伝子のサイレンシングを示す線グラフである。ＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞において、ヒトＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡの標的遺伝子サイレンシング活性を調べた。ＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後（図１１Ａ）、４８時間後（図１１Ｂ）、および７２時間後（図１１Ｃ）において、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて培地中におけるＶＥＧＦ濃度を測定した。調べた３種すべてのヒトＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡが、ＶＥＧＦ生成を用量依存的に阻害し、ナノモルまたはナノモル以下で効力を有する。
【図１２】図１２は、ＰＴ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸによるｈＶＥＧＦ遺伝子のサイレンシングを示す棒グラフである。ＶＥＧＦを発現するＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞株を、無血清培地中で４時間にわたり、ｈＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡを保有するＰＴ−ＮＰＸにより処理し、次いで、血清を補充した（１０％）。処理の７２時間後において、細胞溶解物を回収し、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＶＥＧＦを測定した。ｈＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡを含有するＰＴ−ＮＰＸにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｈＶＥＧＦ生成が抑制された。
【図１３】図１３は、Ａ４３１ヒト類上皮癌の腫瘍体積に対するＰＴ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸの効果を示す線グラフである。Ａ４３１ヒト類上皮癌細胞を、雌ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍体積が約８０〜１００ｍｍ３に達した時点で、２ｍｇ／ｋｇ相当のｓｉＲＮＡを伴うＰＴ−ＮＰＸを静脈内注射した。横軸下方の矢印により、注射スケジュールを示す。ヒトＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡまたはマウスＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡ（センス鎖：５’−ｇｇａａｇｇｃｃｃａｕｕｇａｇｕｃｃａａｃｕａｃａ−３’（配列番号３２７）およびアンチセンス鎖：５’−ｕｇｕａｇｕｕｇｇａｃｕｃａａｕｇｇｇｃｃｕｕｃｃ−３’（配列番号３２８））を含有するＰＴ−ＮＰＸによる治療は、非治療対照またはＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸ治療対照と比較して、有意に腫瘍の増殖を阻害した。抗腫瘍効果は、腹腔内注射による５ｍｇ／ｋｇでのアバスチンの効果と同等であった。ｈＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ治療動物またはｍＶＥＧＦＲ２  ＰＴ−ＮＰＸ治療動物のいずれにおいても、明白な体重減少または臨床的異常は観察されなかった。
【図１４】図１４は、ＰＴ−ｍＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸによる全身治療を介するＡ５４９腫瘍におけるマウスＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるノックダウンを示す棒グラフである。ＰＴ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸによるｉｎ  ｖｉｖｏにおける標的遺伝子のノックダウンを、Ａ５４９異種移植モデルにおいて検討した。異種移植腫瘍の確立後、３日間にわたり、毎日２ｍｇ／ｋｇでｍＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡ（センス鎖：５’−ｇｇａａｇｇｃｃｃａｕｕｇａｇｕｃｃａａｃｕａｃａ−３’（配列番号３２７）およびアンチセンス鎖：５’−ｕｇｕａｇｕｕｇｇａｃｕｃａａｕｇｇｇｃｃｕｕｃｃ−３’（配列番号３２８））または対照ｓｉＲＮＡを保有するＰＴ−ＮＰＸにより、マウス（ｎ＝６）を静脈内治療した。最終回注射の２４時間後において、腫瘍を除去し、腫瘍組織に由来する総ＲＮＡを単離し、相対定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにかけた。ＰＴ−ｍＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸによる治療の結果、Ａ５４９異種移植におけるｍＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡの有意なノックダウン（反復実験において３０〜９０％）がもたらされた。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＥＧＦＲの発現を調節するための核酸分子に関する。一部の実施形態において、核酸はリボ核酸（ＲＮＡ）である。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子は一本鎖または二本鎖である。この点において、ｓｉＲＮＡなど本発明の核酸に基づく分子は、ＥＧＦＲの発現を阻害または下方調節する。
【００１５】
本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子の発現および／または活性の調節に応答する形質、疾患、および状態の研究、診断、および治療のための化合物、組成物、および方法に関する。本発明はまた、このような形質、疾患、および状態の維持または発現を媒介するＥＧＦＲ遺伝子の発現経路または他の細胞過程に関与する遺伝子の発現および／または活性の調節に応答する形質、疾患、および状態に関連する化合物、組成物、および方法をも対象とする。具体的に述べると、本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子の発現に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する能力がある短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などの低分子核酸を含む二本鎖核酸分子に関し、このような低分子核酸のカクテルおよびこのような低分子核酸のナノ粒子製剤を含む。本発明はまた、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡ、および内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）もしくは内因性短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの内因性ＲＮＡ分子の機能を阻害するか、またはＲＩＳＣの機能を阻害して、このような内因性ＲＮＡまたはこのような内因性ＲＮＡと関連するタンパク質（例えば、ＲＩＳＣ）の調節機能に干渉することによりＥＧＦＲ遺伝子の発現を調節しうる他の核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ阻害剤もしくはｓｉＲＮＡ阻害剤またはＲＩＳＣ阻害剤）などの低分子核酸にも関し、このような低分子核酸のカクテルおよびこのような低分子核酸のナノ粒子製剤を含む。このような低分子核酸は、例えば、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳の癌、食道癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頚癌、頭頚部癌、および卵巣癌、黒色腫、リンパ腫、神経膠腫、多剤耐性癌、ならびに対象または生物におけるＥＧＦＲ遺伝子の発現または活性と関連する他の任意の癌性疾患および／または他の病態、状態、もしくは形質を予防、抑制、または軽減する組成物を提供するのに有用である。
【００１６】
「阻害する」または「下方調節する」とは、ＥＧＦＲ遺伝子の発現、もしくはＥＧＦＲタンパク質をコードするｍＲＮＡレベル、ＥＧＦＲタンパク質レベル、またはＥＧＦＲ活性を、本発明の核酸分子の不在下で観察されるレベル未満に低下させることを意味する。一実施形態において、本発明の核酸分子による阻害または下方調節は、同じ標的ＲＮＡに結合する能力はあるが、該ＲＮＡを切断または他の形でサイレンシングする能力はない不活性対照または弱力化された分子の存在下で観察されるレベル未満である。別の実施形態において、本発明の核酸分子による阻害または下方調節は、例えば、スクランブル配列またはミスマッチを有する核酸の存在下で観察されるレベル未満であることが好ましい。別の実施形態において、本発明の核酸分子によるＥＧＦＲの阻害または下方調節は、該核酸の存在下における方が、その不在下におけるよりも大幅である。
【００１７】
「調節する」とは、ＥＧＦＲ遺伝子の発現、またはＥＧＦＲタンパク質をコードするｍＲＮＡレベル、ＥＧＦＲタンパク質レベル、またはＥＧＦＲ活性を上方調節または下方調節して、発現、レベル、または活性が、本発明の核酸分子の不在下で観察されるよりも高度または低度であるようにすることを意味する。
【００１８】
「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」とは、遺伝子の対応するメッセンジャーＲＮＡ転写物を分解する細胞内酵素を活性化する能力がある所定の遺伝子配列にマッチする二本鎖ＲＮＡを意味する。これらのｄｓＲＮＡを短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称し、これらを用いて遺伝子発現を阻害することができる（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、４９４〜４９８頁；およびＢａｓｓ、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、４２８〜４２９頁を参照されたい）。本明細書で用いられる「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語はまた、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」の能力がある二本鎖ＲＮＡ分子も指し、短鎖干渉ＲＮＡ「ｓｉＲＮＡ」を含む（例えば、Ｂａｓｓ、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、４２８〜４２９頁；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、４９４〜４９８頁；ならびにＫｒｅｕｔｚｅｒら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ００／４４８９５号；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ０１／３６６４６号；Ｆｉｒｅ、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９９／３２６１９号；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ００／０１８４６号；ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅ、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ０１／２９０５８号；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９９／０７４０９号；およびＬｉら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ００／４４９１４号を参照されたい）。ｄｓＲＮＡは、２５マーでありうる。ｄｓＲＮＡは、平滑末端である場合もあり、一本鎖突出を含む場合もある。
【００１９】
「遺伝子」とは、ｍＲＮＡをコードする核酸を意味し、例えば、核酸配列は、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含むがこれらに限定されない。
【００２０】
「標的とする核酸」とは、マッチするか、相補的であるか、または別の形で結合するか、もしくは特異的にハイブリダイズし、これにより、標的配列を含む遺伝子の発現、またはＥＧＦＲタンパク質をコードするｍＲＮＡレベル、ＥＧＦＲタンパク質レベル、またはＥＧＦＲ活性を調節する、本発明で説明される核酸を意味する。
【００２１】
「相補性」とは、核酸が、従来のワトソン−クリック型または他の非従来型による別のＲＮＡ配列と（１つまたは複数の）水素結合を形成する能力を指す。本発明の核酸分子に関して、核酸分子のその標的配列または相補性配列との結合自由エネルギーは、関連する核酸機能、例えば、核酸の酵素的切断、アンチセンスまたは三重らせんによる阻害がなされることを可能とするのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒら、１９８７年、ＣＳＨ  Ｓｙｒｕｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．、第ＬＩＩ巻、１２３〜１３３頁；Ｆｒｉｅｒら、１９８６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８３巻、９３７３〜９３７７頁；Ｔｕｒｎｅｒら、１９８７年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、第１０９巻、３７８３〜３７８５頁を参照されたい）。パーセント相補性により、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック型の塩基対合）を形成しうる、核酸分子中における隣接残基の百分率が示される（例えば、１０残基中５、６、７、８、９、１０残基の相補性は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性である）。「完全に相補性の」とは、核酸配列のすべての隣接残基が、第２の核酸配列中における同数の隣接残基と水素結合することを意味する。
【００２２】
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」または「２’−ＯＨ」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’位においてヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。
【００２３】
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」とは、当技術分野で一般に知られる通り、細胞内における遺伝子発現を阻害または下方調節する生物学的過程を意味し、これは、短鎖干渉核酸分子を介する（例えば、ＺａｍｏｒｅおよびＨａｌｅｙ、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３０９巻、１５１９〜１５２４頁；ＶａｕｇｈｎおよびＭａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３０９巻、１５２５〜１５２６頁；Ｚａｍｏｒｅら、２０００年、Ｃｅｌｌ、第１０１巻、２５〜３３頁；Ｂａｓｓ、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、４２８〜４２９頁；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、４９４〜４９８頁；ならびにＫｒｅｕｔｚｅｒら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ００／４４８９５号；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ０１／３６６４６号；Ｆｉｒｅ、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９９／３２６１９号；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ００／０１８４６号；ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅ、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ０１／２９０５８号；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９９／０７４０９号；ならびにＬｉら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ００／４４９１４号；Ａｌｌｓｈｉｒｅ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、１８１８〜１８１９頁；Ｖｏｌｐｅら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、１８３３〜１８３７頁；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、２２１５〜２２１８頁；ならびにＨａｌｌら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、２２３２〜２２３７頁；ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、２０５６〜６０頁；ＭｃＭａｎｕｓら、２００２年、ＲＮＡ、第８巻、８４２〜８５０頁；Ｒｅｉｎｈａｒｔら、２００２年、Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖ．、第１６巻、１６１６〜１６２６頁；ならびにＲｅｉｎｈａｒｔおよびＢａｒｔｅｌ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、１８３１頁を参照されたい）。加えて、本明細書で用いられるＲＮＡｉという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、またはエピジェネティックスなど、配列特異的なＲＮＡ干渉を説明するのに用いられる他の用語と同義であることが意図される。例えば、本発明のｓｉＲＮＡ分子を用いて、転写後レベルまたは転写開始前の両方において遺伝子をエピジェネティックにサイレンシングすることができる。非限定的な例において、本発明のｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティック調節は、ｓｉＲＮＡを介するクロマチン構造またはメチル化パターンの改変による遺伝子発現の変更から生じうる（例えば、Ｖｅｒｄｅｌら、２００４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３０３巻、６７２〜６７６頁；Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａら、２００４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３０３巻、６６９〜６７２頁；Ａｌｌｓｈｉｒｅ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、１８１８〜１８１９頁；Ｖｏｌｐｅら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、１８３３〜１８３７頁；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、２２１５〜２２１８頁；およびＨａｌｌら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃ��、第２９７巻、２２３２〜２２３７頁を参照されたい）。別の非限定的な例において、本発明のｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、当技術分野で知られる通り、ｓｉＲＮＡを介するＲＩＳＣによるＲＮＡ（コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡ）の切断、または代替的に、翻訳阻害から生じうる。別の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、転写阻害から生じうる（例えば、Ｊａｎｏｗｓｋｉら、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、２１６〜２２２頁を参照されたい）。
【００２４】
一部の実施形態において、核酸阻害剤は、既知の任意のＥＧＦＲ配列に相補的な配列を含み、発現および／または活性の変化を有するその変異体、特に、疾患と関連する変異体を含む。ＥＧＦＲ変異体は、野生型のＥＧＦＲ配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する配列を含み、このようなＥＧＦＲ変異体は、チロシンキナーゼ活性の変化（上昇または低下）を示しうる。当業者が理解する通り、ＥＧＦＲ配列は、ＧＥＮＢＡＮＫまたはＳＷＩＳＳＰＲＯＴを含む各種の公開配列データベースのいずれかにおいて入手できる。一実施形態において、本発明の核酸阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、配列番号１〜１０または２１〜１２１（表１および３を参照されたい）に記載の特異的なＥＧＦＲ標的配列に対して相補的な配列を含む。このようなｓｉＲＮＡ分子の例はまた実施例においても示され、配列番号１１〜２０および１２２〜３２３（表２および４を参照されたい）にも記載されている。
【００２５】
「ベクター」とは、所望の核酸を送達するのに用いられる任意の核酸ベースおよび／またはウイルスベースの技法を意味する。
【００２６】
「対象」とは、本発明の核酸分子の受容者である生物を意味する。「対象」とはまた、本発明の核酸分子を投与することのできる生物も指す。一部の実施形態において、対象は哺乳類または哺乳類細胞である。さらなる実施形態において、対象は、ヒトまたはヒト細胞である。
【００２７】
核酸は、当技術分野で知られ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９９２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２１１巻、３〜１９頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９９／５４４５９号；Ｗｉｎｃｏｔｔら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２３巻、２６７７〜２６８４頁；Ｗｉｎｃｏｔｔら、１９９７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．、第７４巻、５９頁；Ｂｒｅｎｎａｎら、１９９８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．、第６１巻、３３〜４５頁；およびＢｒｅｎｎａｎ、米国特許第６，００１，３１１号で説明されるプロトコールを用いて合成することができる。核酸の合成では、５’端におけるジメトキシトリチル基および３’におけるホスホラミダイト基などの一般的な核酸防御基および核酸結合基が用いられる。非限定的な例において、小スケールの合成は、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドのための２．５分間の結合ステップおよび２’−デオキシヌクレオチドのための４５秒間の結合ステップを伴う０．２μＭスケールのプロトコールを用いるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３９４型合成器において実施される。代替的に、０．２μＭスケールでの合成は、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ社（カリフォルニア州、パロアルト）製の機器など、９６ウェルプレートによる合成器において、サイクルに最小限の改変を加えて実施することができる。２’−Ｏ−メチル残基の各結合サイクルでは、ポリマーに結合した５’−ヒドロキシル基に対する２’−Ｏ−メチルホスホラミダイト基の３３倍の超過（０．１１Ｍで６０μＬ＝６．６μＭ）およびＳ−エチルテトラゾール基の１０５倍の超過（０．２５Ｍで６０μＬ＝１５μＭ）を用いることができる。デオキシ残基の各結合サイクルでは、ポリマーに結合した５’−ヒドロキシル基に対するデオキシホスホラミダイト基の２２倍の超過（０．１１Ｍで４０μＬ＝４．４μＭ）およびＳ−エチルテトラゾール基の７０倍の超過（０．２５Ｍで４０μＬ＝１０μＭ）を用いることができる。トリチル画分の熱量定量により決定される、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３９４型合成器における平均結合収量率は、９７．５９９％であることが典型的である。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３９４型合成器のための他のオリゴヌクレオチド合成試薬は、以下のものを含む：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％のＴＣＡ（ＡＢＩ社製）である；ＴＨＦ中１６％のＮ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ社製）およびＴＨＦ中１０％の無水酢酸／１０％の２，６−ルチジン（ＡＢＩ社製）でキャッピングを行う；酸化溶液はＴＨＦ中１６．９ｍＭのＩ２、４９ｍＭのピリジン、９％の水である。Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ社製の合成グレードのアセトニトリルを、試薬ボトルから直接用いる。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製の固体から作製される。代替的に、ホスホロチオエート結合の導入には、ボカージ試薬（アセトニトリル中０．０５Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキサイド）が用いられる。
【００２８】
「ヌクレオチド」とは、リン酸化した糖とのＮ−グリコシド結合中におけるヘテロ環窒素塩基を意味する。当技術分野において、ヌクレオチドは、当技術分野でよく知られる天然塩基（標準）および改変塩基を含むことが認知されている。このような塩基は、一般に、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは、一般に、塩基、糖基、およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖部分、リン酸部分、および／または塩基部分において改変されない場合もあり、改変される場合もある（互換的に、ヌクレオチド類似体、改変ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチド、およびその他とも称する；例えば、ＵｓｍａｎおよびＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、前出；Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９３／１５１８７号；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ、前出を参照されたい）。Ｌｉｍｂａｃｈら、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２２巻、２１８３頁により概括される通り、当技術分野では、改変核酸塩基のいくつかの例が知られる。核酸中に導入されうる例示的な化学改変核酸塩基およびその他の天然核酸塩基は、例えば、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、または６−アザピリミジンもしくは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、キュエソシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、ワイブトシン、ワイブトキソシン、４−アセチルチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキュエオシン、１−メチルアデノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、３−メチルシチジン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、ベータ−Ｄ−マンノシルキュエオシン、ウリジン−５−オキシ酢酸、２−チオシチジン、トレオニン誘導体、およびその他を含む（Ｂｕｒｇｉｎら、１９９６年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３５巻、１４０９０頁；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ、前出）。この態様における「改変塩基」とは、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルまたはそれらの同等物以外のヌクレオチド塩基を意味し、このような塩基は、例えば、酵素的核酸分子の触媒性コア内および／または該核酸分子の基質結合領域における任意の位置で用いることができる。
【００２９】
「ヌクレオシド」とは、糖とのＮ−グリコシド結合中におけるヘテロ環窒素塩基を意味する。当技術分野において、ヌクレオシドは、当技術分野でよく知られる天然塩基（標準）および改変塩基を含むことが認知されている。このような塩基は、一般に、ヌクレオシド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオシドは、一般に、塩基および糖基を含む。ヌクレオシドは、糖部分および／または塩基部分において改変されない場合もあり、改変される場合もある（互換的に、ヌクレオシド類似体、改変ヌクレオシド、非天然ヌクレオシド、非標準ヌクレオシド、およびその他とも称する；例えば、ＵｓｍａｎおよびＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、前出；Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９３／１５１８７号；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎを参照されたい）。Ｌｉｍｂａｃｈら、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２２巻、２１８３頁により概括される通り、当技術分野では、改変核酸塩基のいくつかの例が知られる。核酸中に導入されうる例示的な化学改変核酸塩基およびその他の天然核酸塩基は、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、または６−アザピリミジンもしくは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、キュエソシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、ワイブトシン、ワイブトキソシン、４−アセチルチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキュエオシン、１−メチルアデノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、３−メチルシチジン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、ベータ−Ｄ−マンノシルキュエオシン、ウリジン−５−オキシ酢酸、２−チオシチジン、トレオニン誘導体、およびその他を含む（Ｂｕｒｇｉｎら、１９９６年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３５巻、１４０９０頁；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ、前出）。この態様における「改変塩基」とは、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルまたはそれらの同等物以外のヌクレオシド塩基を意味し、このような塩基は、例えば、酵素的核酸分子の触媒性コア内および／または該核酸分子の基質結合領域における任意の位置で用いることができる。
【００３０】
一部の実施形態では、細胞内で真核細胞プロモーターから本発明の核酸分子を発現させることができる（例えば、ＩｚａｎｔおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２２９巻、３４５頁；ＭｃＧａｒｒｙおよびＬｉｎｄｑｕｉｓｔ、１９８６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８３巻、３９９頁；Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８８巻、１０５９１〜５頁；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、１９９２年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．、第２巻、３〜１５頁；Ｄｒｏｐｕｌｉｃら、１９９２年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、第６６巻、１４３２〜４１頁；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら、１９９１年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  、第６５巻、５５３１〜４頁；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８９巻、１０８０２〜６頁；Ｃｈｅｎら、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２０巻、４５８１〜９頁；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４７巻、１２２２〜１２２５頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２３巻、２２５９頁；Ｇｏｏｄら、１９９７年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第４巻、４５頁）。当業者は、真核細胞内で適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから任意の核酸を発現させうることを認識するであろう。このような核酸の活性は、酵素的核酸による一次転写物からのそれらの放出により増強することができる（Ｄｒａｐｅｒら、ＰＣＴ  ＷＯ９３／２３５６９；およびＳｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａら、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．、第２７集、１５〜１６頁；Ｔａｉｒａら、１９９１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１９巻、５１２５〜３０頁；Ｖｅｎｔｕｒａら、１９９３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２１巻、３２４９〜５５頁；Ｃｈｏｗｒｉｒａら、１９９４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第２６９巻、２５８５６頁）。
【００３１】
本発明の別の態様において、ＲＮＡ分子など本発明の核酸分子は、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクター内に挿入された転写単位（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅら、１９９６年、ＴＩＧ．、第１２巻、５１０頁を参照されたい）から発現される。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであることが好ましい。ＲＮＡを発現するウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスに基づいて構築されうるが、これらに限定されない。核酸分子を発現する能力がある組換えベクターは、上記で説明された通りに送達され、標的細胞内で存続することが好ましい。代替的に、核酸分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを用いることもできる。このようなベクターは、必要に応じて反復投与することができる。発現すると、核酸分子は、標的ｍＲＮＡに結合する。核酸分子を発現するベクターの送達は、静脈内投与または筋肉内投与によるなどの全身投与も可能であり、患者または対象から外植された標的細胞の投与後における患者または対象内への再導入によることも可能であり、あるいは所望の標的細胞内への導入を可能とする他の任意の手段によることも可能である（総説については、Ｃｏｕｔｕｒｅら、１９９６年、ＴＩＧ．、第１２巻、５１０頁を参照されたい）。
【００３２】
一態様において、本発明は、本発明の少なくとも１種の核酸分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。本発明の核酸分子をコードする核酸配列は、該核酸分子の発現を可能とする形で作動的に連結される。
【００３３】
別の態様において、本発明は、ａ）転写開始領域（例えば、真核細胞ｐｏｌＩ、ＩＩ、またはＩＩＩの開始領域）、ｂ）転写終結領域（例えば、真核細胞ｐｏｌＩ、ＩＩ、またはＩＩＩの終結領域）、ｃ）本発明の少なくとも１種の核酸触媒をコードする核酸配列を含み、前記配列が前記核酸分子の発現および／または送達を可能とする形で前記開始領域および前記終結領域に作動的に連結されている発現ベクターを特徴とする。該ベクターは、場合によって、本発明の核酸触媒および／またはイントロン（介在配列）をコードする配列の５’側または３’側に作動的に連結される、タンパク質に対応するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含みうる。
【００３４】
核酸分子配列の転写は、真核細胞ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）、同ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）、または同ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）のプロモーターから駆動される。ｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターからの転写物は、すべての細胞内において高レベルで発現され、所与の細胞型における所与のｐｏｌＩＩプロモーターレベルは、近傍に存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核細胞ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適切な細胞内で発現している場合は、原核細胞ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた用いることができる（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ、１９９０年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８７巻、６７４３〜７頁；Ｇａｏおよび  Ｈｕａｎｇ、１９９３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２１巻、２８６７〜７２頁；Ｌｉｅｂｅｒら、１９９３年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第２１７巻、４７〜６６頁；Ｚｈｏｕら、１９９０年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、第１０巻、４５２９〜３７頁）。このようなプロモーターから発現されるリボザイムなどの核酸分子は、哺乳類細胞内で機能しうることが、複数の研究者により示されている（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、１９９２年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．、第２巻、３〜１５頁；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８９巻、１０８０２〜６頁；Ｃｈｅｎら、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２０巻、４５８１〜９頁；Ｙｕら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第９０巻、６３４０〜４頁；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら、１９９２年、ＥＭＢＯ  Ｊ．、第１１巻、４４１１〜８頁；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ、第９０巻、８０００〜４頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２３巻、２２５９頁；ＳｕｌｌｅｎｇｅｒおよびＣｅｃｈ、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６２巻、１５６６頁）。より具体的に述べると、Ｕ６核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードする遺伝子に由来する転写単位などの転写単位が、細胞内において高濃度のリボザイムなど所望のＲＮＡ分子を生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、前出；ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、１９９６年、前出；Ｎｏｏｎｂｅｒｇら、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、第２２巻、２８３０頁；Ｎｏｏｎｂｅｒｇら、米国特許第５，６２４，８０３号；Ｇｏｏｄら、１９９７年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、第４巻、４５頁；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９６／１８７３６号）。上記のリボザイム転写単位は、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（アデノウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクターなど）、またはウイルスＲＮＡベクター（レトロウイルスまたはアルファウイルスベクターなど）を含むがこれらに限定されない、哺乳類細胞内への導入のための各種のベクター内に組み込むことができる（総説については、ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、１９９６年、前出を参照されたい）。
【００３５】
別の態様において、本発明は、本発明の少なくとも１種の核酸分子の発現を可能とする形で、該核酸分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。一実施形態において、発現ベクターは、ａ）転写開始領域、ｂ）転写終結領域、ｃ）少なくとも１種の前記核酸分子をコードする核酸配列を含み、前記配列は前記核酸分子の発現および／または送達を可能とする形で前記開始領域および前記終結領域に作動的に連結されている。
【００３６】
別の実施形態において、発現ベクターは、ａ）転写開始領域、ｂ）転写終結領域、ｃ）オープンリーディングフレーム、ｄ）少なくとも１種の前記核酸分子をコードする核酸配列を含み、前記配列は前記オープンリーディングフレームの３’端に作動的に連結され、前記配列は前記核酸分子の発現および／または送達を可能とする形で前記開始領域、前記オープンリーディングフレーム、および前記終結領域に作動的に連結されている。さらに別の実施形態において、発現ベクターは、ａ）転写開始領域、ｂ）転写終結領域、ｃ）イントロン、ｄ）少なくとも１種の前記核酸分子をコードする核酸配列を含み、前記配列は前記核酸分子の発現および／または送達を可能とする形で前記開始領域、前記イントロン、および前記終結領域に作動的に連結されている。
【００３７】
さらに別の実施形態において、発現ベクターは、ａ）転写開始領域、ｂ）転写終結領域、ｃ）イントロン、ｄ）オープンリーディングフレーム、ｅ）少なくとも１種の前記核酸分子をコードする核酸配列を含み、前記配列は前記オープンリーディングフレームの３’端に作動的に連結され、前記配列は前記核酸分子の発現および／または送達を可能とする形で前記開始領域、前記イントロン、前記オープンリーディングフレーム、および前記終結領域に作動的に連結されている。
【００３８】
核酸分子の使用および投与の方法
核酸分子の送達法は、Ａｋｈｔａｒら、１９９２年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．、第２巻、１３９頁に説明されており、「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ａｋｈｔａｒ編；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５では、酵素的ＲＮＡ分子の送達についての一般的な方法がさらに説明されている。これらのプロトコールは、事実上任意の核酸分子の送達に用いることができる。核酸分子は、リポソーム内への封入、イオントフォレーシス、またはハイドロゲル、シクロデキストリン、生体分解性ナノカプセル、および生体接着性マイクロスフェアなど他の媒体内への組み込みによる方法を含むがこれらに限定されない、当業者に知られる各種の方法により細胞へと投与することができる。代替的に、核酸／媒体の組合せは、直接の注射または注入ポンプの使用により局所送達される。例えば、本発明の核酸および組成物は、腫瘍内に直接投与することができる。他の送達経路は、経口送達（錠剤または丸薬の形態）および／または髄腔内送達（Ｇｏｌｄ、１９９７年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、第７６巻、１１５３〜１１５８頁）を含むがこれらに限定されない。他の手法は、例えば、コンジュゲートおよび生体分解性ポリマーの使用によるなど、各種の輸送システムおよび担体システムの使用を含む。ＣＮＳ送達を含む薬剤送達戦略に関する包括的な総説については、Ｈｏら、１９９９年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、第１巻、３３６〜３４３頁；およびＪａｉｎ、「Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ」、Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ社、１９９８年；およびＧｒｏｏｔｈｕｉｓら、１９９７年、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏ  Ｖｉｒｏｌ．、第３巻、３８７〜４００頁を参照されたい。核酸の送達および投与についてのより詳細な説明は、Ｓｕｌｌｉｖａｎら、前出；Ｄｒａｐｅｒら、ＰＣＴ  ＷＯ９３／２３５６９；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９９／０５０９４；およびＫｌｉｍｕｋら、ＰＣＴ  ＷＯ９９／０４８１９に記載されている。
【００３９】
本発明の分子は、医薬作用物質として用いることができる。医薬作用物質により、対象における病態の出現が予防、阻害されるか、またはそれが治療される（その症状がある程度緩和される、好ましくはそのすべての症状が緩和される）。
【００４０】
本発明の負に帯電したポリヌクレオチドは、安定化剤、緩衝剤などを伴うかまたは伴わない任意の標準的な手段により対象内に投与および導入して、医薬組成物を形成することができる。リポソーム送達機構を用いることが望ましい場合、リポソーム形成の標準的なプロトコールに従うことができる。本発明の組成物はまた、経口投与のための錠剤、カプセル、またはエリキシル剤；直腸内投与のための坐剤；滅菌溶液；注射投与のための懸濁液；および当技術分野で知られる他の組成物としても用いることができる。
【００４１】
本発明はまた、説明される化合物の薬学的に許容される製剤も含む。これらの製剤は、上記の化合物の塩、例えば、酸添加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、酢酸塩、およびベンゼンスルホン酸塩を含む。
【００４２】
薬理学的組成物または製剤とは、細胞または対象、好ましくはヒトへの投与、例えば、全身投与に適する形態での組成物または製剤を指す。適切な形態は、部分的に、例えば、経口、経皮、または注射などの使用または侵入経路に依存する。このような形態は、組成物または製剤が標的細胞に到達するのを妨げないものとする。例えば、血流中に注射される薬理学的組成物は、可溶性であるものとする。当技術分野では他の因子が知られており、組成物または製剤がその効果を及ぼすことを妨げる毒性および形態などの考慮内容を含む。
【００４３】
「全身投与」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血流中における薬剤の全身吸収または蓄積の後の全身における分布を意味する。全身吸収をもたらす投与経路は、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内、および筋肉内を含むがこれらに限定されない。これらの各投与経路により、所望の負に帯電した核酸が、接触可能な疾患組織に曝露される。循環中への薬剤の投入速度は、分子量または分子サイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリポソームまたは他の薬剤担体の使用により、例えば、細網内皮系（ＲＥＳ）組織など、一部の組織型内に薬剤を潜在的に局在化させることができる。リンパ球およびマクロファージなどの細胞の表面との薬剤の会合を促進しうるリポソーム製剤もまた有用である。この手法により、癌細胞などの異常な細胞のマクロファージおよびリンパ球による免疫認識の特異性を活用することで、標的細胞への薬剤送達の増強をもたらすことができる。
【００４４】
薬学的に許容される製剤とは、その所望の活性に最も適する物理的な位置における本発明の核酸分子の有効な分布を可能とする組成物または製剤を意味する。本発明の核酸分子を伴う製剤に適する作用物質の非限定的な例は、ＰＥＧ結合核酸、リン脂質結合核酸、親油性部分を含有する核酸、ホスホロチオエート、各種組織への薬剤の侵入を増強するＰ−糖タンパク質阻害剤（プルロニックＰ８５など）；植え込み後における持続放出送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）マイクロスフェア（Ｅｍｅｒｉｃｈ，  ＤＦら、１９９９年、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、第８巻、４７〜５８頁、マサチューセッツ州、ケンブリッジ、Ａｌｋｅｒｍｅｓ社製）などの生体分解性ポリマー；および血液脳関門を越えての薬剤送達が可能であり、ニューロンへの取り込み機構の変更が可能である、ポリブチルシアノアクリレートから作製されたナノ粒子などの充填ナノ粒子（Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、第２３巻、９４１〜９４９頁、１９９９年）を含む。
【００４５】
本発明はまた、ポリ（エチレングリコール）脂質を含有する表面改変リポソーム（ＰＥＧ改変リポソーム、分枝リポソームおよび非分枝リポソームもしくはこれらの組合せ、または長時間循環型リポソームもしくはステルスリポソーム）を含む組成物の使用も特徴とする。本発明の核酸分子はまた、多様な分子量を有する共有結合したＰＥＧ分子も含みうる。これらの製剤により、標的組織内における薬剤蓄積を増加させる方法が与えられる。このクラスの薬剤担体は、単核食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン化および除去に対して耐性であり、これにより、より長時間にわたる血中循環時間および封入された薬剤に対する組織曝露の増強が可能となる（Ｌａｓｉｃら、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．、１９９５年、第９５巻、２６０１〜２６２７頁；Ｉｓｈｉｗａｔａら、Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．、１９９５年、第４３巻、１００５〜１０１１頁）。このようなリポソームは、おそらくは血管新生の生じた標的組織における溢出および取り込みにより、腫瘍内に選択的に蓄積されることが示されている（Ｌａｓｉｃら、  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５年、第２６７巻、１２７５〜１２７６頁；Ｏｋｕら、１９９５年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、第１２３８巻、８６〜９０頁）。長時間循環型リポソームにより、特に、ＭＰＳ組織内に蓄積されることが知られる従来の陽イオンリポソームと比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態特性および薬力学特性が増強される（Ｌｉｕら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９９５年、第４２巻、２４８６４〜２４８７０頁；Ｃｈｏｉら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９６／１０３９１号；Ａｎｓｅｌｌら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９６／１０３９０号；Ｈｏｌｌａｎｄら、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９６／１０３９２号）。長時間循環型リポソームはまた、その肝臓および脾臓など代謝的に侵襲性のＭＰＳ組織における蓄積を回避する能力に基づき、陽イオンリポソームと比較してより大幅に薬剤をヌクレアーゼ分解から防御する可能性も高い。
【００４６】
さらなる実施形態において、本発明は、ＵＳ２００３／０１６６６０１で説明される通りに調製されるｓｉＲＮＡ組成物などの核酸組成物を含む。この点において、一実施形態では、本発明は、１）核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）およびポリエチレンイミンを含むコア複合体と、２）ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＶＳを含む外殻部分および標的化部分とを含む、本明細書で説明されるｓｉＲＮＡ組成物を提供する。
【００４７】
本発明の一部の実施形態では、上記で説明された標的化部分を用いて、対象細胞を（１つまたは複数の）ｓｉＲＮＡの標的とする。
【００４８】
したがって、一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子を含む組成物は、ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物（「ベクター」）の標的組織または標的細胞との高度に特異的な相互作用を可能とする細胞表面受容体または他の細胞表面マーカーに対するリガンドなど、少なくとも１つの標的化部分を含む。より具体的に述べると、一実施形態において、ベクターは、非遮蔽リガンドまたは遮蔽リガンドを含むことが好ましい。ベクターは、標的とされる細胞型に応じて、２つ以上の標的化部分を含みうる。多重（２つ以上の）標的化部分の使用により細胞標的化におけるさらなる選択性を提供することができ、また、標的細胞に対するベクター結合のより高度な親和性および／または結合活性にも寄与することができる。ベクター上に複数の標的化部分が存在する場合、標的化部分の相対的なモル比を変化させて、最適の標的化効率を提供することができる。この形で細胞結合および細胞選択性を最適化する方法は、当技術分野で知られている。当業者はまた、当技術分野では細胞選択性および親和性ならびに結合効率を測定するアッセイが知られており、これらを用いて、（１つまたは複数の）標的化リガンドの性質および量を最適化することができることも認めるであろう。
【００４９】
適切なリガンドは、ＲＧＤおよび腫瘍細胞または内皮細胞の表面上における受容体に対するモノクローナル抗体を含むがこれらに限定されない。
【００５０】
標的化部分の別の例は、シアリル−Ｌｅｗｉｓであり、この場合、組成物により炎症領域を治療することが意図される。ファージディスプレイ（Ｆ．  Ｂａｒｔｏｌｉら、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、「Ｖｅｃｔｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（コールドスプリングハーバー研究所１９９９年会議の抄録）、１９９９年、４頁）および微生物ディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、「Ｕｌｔｒａ−Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｅｄ  ｂｙ  ＦＡＣＳ」、「Ｖｅｃｔｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（コールドスプリングハーバー研究所１９９９年会議の抄録）、１９９９年、３頁）などの方法を用いて、他のペプチドリガンドを同定することができる。このようにして同定されたリガンドは、本発明での使用に適する。
【００５１】
「ＤＮＡシャフリング」（Ｗ．  Ｐ．  Ｃ．  Ｓｔｒｅｍｍｅｒ、「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｂｙ  ＤＮＡ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、「Ｖｅｃｔｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（コールドスプリングハーバー研究所１９９９年会議の抄録）、１９９９年、５頁）など、標的組織および標的細胞に対する強力で選択的な結合を引き起こす新規のペプチド配列を作製する方法が開発されており、これらの新規の配列によるペプチドは本発明に適するリガンドである。多くの形態で存在し、細胞により一般的に用いられるリガンドである天然の炭水化物（Ｋｒａｌｉｎｇら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈ．、１９９７年、第１５０巻、１３０７頁）のほか、その一部がＤ−アミノ酸およびペプチド模倣剤など、天然リガンドの類似体である場合もあり、組合せ化学（Ｐ．  Ｄ．  Ｋａｓｓｎｅｒら、「Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  （ＬＩＶＥθ）：  Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、「Ｖｅｃｔｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（コールドスプリングハーバー研究所１９９９年会議の抄録）、１９９９年、８頁）などの医化学の技法により同定される他の化学種である場合もある新規の化学種など、リガンドの他の化学的形態も本発明に適する。
【００５２】
さらなる実施形態において、本発明は、米国特許第７，１６３，６９５号、同第７，０７０，８０７号、および同第６，６９２，９１１号で説明される、送達用に調製される核酸組成物を含む。この点において、一実施形態では、本発明は、米国特許第７，１６３，６９５号、同第７，０７０，８０７号、および同第６，６９２，９１１号で説明されるヒスチジン−リジンコポリマー（本明細書ではＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）とも称する）を、単独であるか、またはＰＥＧ（例えば、分枝ＰＥＧもしくは非分枝ＰＥＧまたはこれらの混合物）との組合せであるか、もしくはＰＥＧおよび標的化部分との組合せで含む組成物中において、本発明の核酸を提供する。
【００５３】
本発明はまた、保存または投与のために調製され、薬学的に許容される担体または希釈剤中に薬学的有効量の所望化合物を含む組成物も含む。治療用に許容される担体または希釈剤は製薬技術分野でよく知られており、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２０版、メリーランド州、ボルチモア、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ社、２０００年において説明されている。例えば、防腐剤、安定化剤、染料、および芳香剤を与えることができる。これらは、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルを含む。加えて、抗酸化剤および懸濁化剤を用いることができる。
【００５４】
薬学的有効用量とは、病態の出現を予防、阻害するか、またはそれを治療する（その症状をある程度緩和する、好ましくはそのすべての症状を緩和する）のに必要な用量である。薬学的有効用量は、疾患の種類、用いられる組成物、投与経路、治療される哺乳類の種類、考慮される特定の哺乳類の身体的特性、併用薬剤、および医療技術分野において当業者が認める他の因子に依存する。一般に、負に帯電したポリマーの効力に応じて、０．１ｍｇ／体重ｋｇ／日〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／日の量の有効成分が投与される。
【００５５】
本発明の核酸分子およびその製剤は、従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、および媒体を含有する投与単位製剤により、経口投与、局所投与、非経口投与、吸入もしくは噴霧投与、または直腸内投与することができる。本明細書で用いられる非経口という用語は、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、または髄腔内の注射法または注入法などを含む。加えて、本発明の核酸分子および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤が提供される。本発明の１つまたは複数の核酸分子は、１つまたは複数の非毒性の薬学的に許容される担体および／または希釈剤および／またはアジュバントならびに所望の場合は他の有効成分と会合して存在しうる。本発明の核酸分子を含有する医薬組成物は、経口用に適する形態、例えば、錠剤、トローチ、ドロップ、水性もしくは油性の懸濁液、分散粉末もしくは分散顆粒、乳剤、硬質もしくは軟質のカプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤でありうる。
【００５６】
本発明の核酸組成物は、標的遺伝子（例えば、ＥＧＦＲ）の同じであるかもしくは異なる領域を標的とするかまたは他の対象遺伝子を標的とする他の核酸組成物と組み合わせて用いることができる。本発明の核酸組成物はまた、化学療法、放射線療法、または低分子レジメンなど、任意の各種の治療モダリティーと組み合わせても用いることができる。
【００５７】
経口用を目的とする組成物は、医薬組成物の製造について当技術分野で知られる任意の方法により調製することができ、このような組成物は、薬学的に洗練される催嗜好性の製剤を提供するために、１つまたは複数のこのような甘味剤、芳香剤、着色剤、または防腐剤を含有しうる。錠剤は、錠剤の製造に適する非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合された有効成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；造粒剤および崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、またはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、またはアカシアガム；および潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、または滑石でありうる。錠剤は、被覆しない場合もあり、既知の技法により被覆する場合もある。場合によっては、こうした被覆を既知の技法により調製し、消化管における分解および吸収を遅延させ、これにより、長時間にわたる持続的な作用をもたらすこともできる。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延物質を用いることができる。
【００５８】
経口用製剤はまた、有効成分が不活性の固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、もしくはカオリンと混合される硬質ゼラチンカプセル、または有効成分が水もしくは油媒体、例えば、ラッカセイ油、液体パラフィン、もしくはオリーブ油と混合される軟質ゼラチンカプセルとしても提示することができる。
【００５９】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適する賦形剤と混合された活性物質を含有する。こうした賦形剤は、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、およびアカシアガムであり；分散化剤または保湿剤は、天然のリン脂質、例えば、レシチン、またはアルキレンオキサイドの脂肪酸との縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキサイドの長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなど、エチレンオキサイドの脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、またはエチレンオキサイドの脂肪酸および無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートである。水性懸濁液はまた、１つまたは複数の防腐剤、例えば、エチルｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の芳香剤、およびスクロースまたはサッカリンなど、１つまたは複数の甘味剤も含有しうる。
【００６０】
油性懸濁液は、植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはココナッツ油、または液体パラフィンなどの鉱物油中に有効成分を懸濁させることにより調合することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜蝋、硬質パラフィン、またはセチルアルコールを含有しうる。甘味剤および芳香剤を添加して、催嗜好性の経口調製物を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により保存することができる。
【００６１】
水の添加による水性懸濁液の調製に適する分散可能な粉末および顆粒により、分散剤または保湿剤、懸濁化剤および１つまたは複数の防腐剤と混合された有効成分が提供される。適切な分散剤もしくは保湿剤または懸濁化剤は、既に上述された分散剤もしくは保湿剤または懸濁化剤により例示される。さらなる賦形剤、例えば、甘味剤、芳香剤、および着色剤もまた存在しうる。
【００６２】
本発明の医薬組成物はまた、水中油乳剤の形態でもありうる。油相は、植物油もしくは鉱物油またはこれらの混合物でありうる。適切な乳化剤は、天然ガム、例えば、アカシアガムまたはトラガカントガム、天然リン脂質、例えば、大豆、レシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトールに由来するエステルまたは部分エステル、無水物、例えば、ソルビタンモノオレエート、ならびに前記部分エステルのエチレンオキサイドとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートでありうる。乳剤はまた、甘味剤および芳香剤も含みうる。
【００６３】
シロップおよびエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース、またはスクロースと共に調合することができる。このような製剤はまた、粘滑剤、防腐剤、ならびに芳香剤および着色剤も含みうる。医薬組成物は、水性または油性の滅菌注射用懸濁液の形態でありうる。この懸濁液は、上述されたこれらの適切な分散化剤または保湿剤および懸濁化剤を用いる既知の技術に従い調合することができる。滅菌注射用製剤はまた、許容可能な非毒性の非経口希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液でありうる。用いうる許容可能な媒体および溶媒には、水、リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、従来は、滅菌固定油が溶媒または懸濁化媒体として用いられている。この目的では、合成モノグリセリドまたは同ジグリセリドを含む任意のブランドの固定油を用いることができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の調製に用いられる。
【００６４】
本発明の核酸はまた、例えば、薬剤の直腸内投与のための坐剤の形態でも投与することができる。これらの組成物は、薬剤を、常温では固体であるが直腸内温度では液体となり、したがって、直腸内では溶けて薬剤を放出する、適切な非刺激性賦形剤と混合することにより調製することができる。このような物質は、ココアバターおよびポリエチレングリコールを含む。
【００６５】
本発明の核酸分子は、滅菌媒体により非経口投与することができる。薬剤は、用いられる媒体および濃度に応じて、媒体中に懸濁または溶解させることができる。局所麻酔剤などのアジュバント、防腐剤、および緩衝剤を媒体中に溶解させることができて有利である。
【００６６】
１日当たり体重キログラム当たり約０．０１ｍｇ〜約１４０ｍｇのオーダーの用量レベルが、本明細書で説明される疾患状態の治療に有用である（１日当たり患者または対象当たり約０．５ｍｇ〜約７ｇ）。担体物質と組み合わされて単一剤形を提供しうる有効成分量は、治療される宿主および具体的な投与方式に応じて変化する。用量単位は、一般に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの有効成分を含有する。
【００６７】
任意の特定の患者または対象に対する特定の投与レベルは、用いられる特定の化合物活性、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、および排出速度、薬剤の組合せ、ならびに治療を受ける特定の疾患の重症度を含む各種の因子に依存する。
【００６８】
非ヒト動物に対する投与の場合、組成物はまた、動物飼料または飲用水に添加することもできる。動物が餌と共に治療に適切な量の組成物を摂取するように、動物試料および飲用水による組成物を調合するのが好都合でありうる。また、飼料または飲用水に対する添加用の事前混合物として組成物を提示するのも好都合でありうる。
【００６９】
本発明の核酸分子はまた、全般的な治療効果を増大させる他の治療化合物と組み合わせて対象に投与することもできる。適応を治療するための複数化合物の使用により、副作用の存在を軽減する一方で、有益効果を増大させることができる。
【００７０】
本発明の核酸ベースの阻害剤は、標的細胞または標的組織に直接添加するか、または陽イオン脂質と複合させるか、リポソーム内に封入するか、もしくは別の形で送達することができる。核酸または核酸複合体は、その生体ポリマーへの組み込みを伴うかまたは伴わない注射または注入ポンプにより、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで関連する組織に局所的に投与することができる。
【００７１】
本発明の核酸分子は、ＥＧＦＲ遺伝子内における異なる標的配列を標的とするかまたは他の遺伝子内における配列を標的とする複数の核酸分子（ｓｉＲＮＡ）を含む組成物中で用いることができる。
【００７２】
本発明の核酸分子を個別にまたは他の薬剤と組み合わせてもしくはこれらと共に用いて、ＥＧＦＲの発現および／または活性の変化と関連する疾患または状態を治療することができる。したがって、本明細書で説明される低分子核酸は、例えば、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳の癌、食道癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頚癌、頭頚部癌、および卵巣癌、黒色腫、リンパ腫、神経膠腫、多剤耐性癌、ならびに対象または生物におけるＥＧＦＲ遺伝子の発現または活性と関連する他の任意の癌性疾患および／または他の病態、状態、もしくは形質を予防、抑制、または軽減する組成物を提供するのに有用である。
【００７３】
本発明の核酸分子はまた、個別にまたは他の薬剤と組み合わせてもしくはこれらと共に用いて、ＥＧＦＲの活性および／または発現の変化と関連する疾患または状態を発現する危険性を示すことが疑われる個体において、こうした疾患または状態を予防することができる。例えば、ＥＧＦＲの発現レベルと関連する疾患または状態を治療または予防するためには、当業者に明らかである通り、治療に適切な条件下で、個別にまたは１つまたは複数の薬剤との組合せにより、該疾患もしくは状態を有するかまたは該疾患もしくは状態を発現する危険性を示すことが疑われる対象を治療することもでき、他の適切な細胞を治療することもできる。したがって、本発明は、ＥＧＦＲ発現の調節に対して応答する疾患または状態を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に配列番号１１〜２０および１２２〜３２３に記載の核酸分子など、１つまたは複数の本発明の核酸分子を含む有効量の組成物を投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態において、本発明は、ＥＧＦＲの発現と関連する疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に配列番号１１〜２０および１２２〜３２３に記載の核酸分子など、１つまたは複数の任意の有効量の本発明の核酸分子を投与して対象におけるＥＧＦＲの発現を下方調節し、これにより、ＥＧＦＲの発現と関連する疾患を治療または予防するステップを含む方法を提供する。この点において、本発明の組成物は、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳の癌、食道癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頚癌、頭頚部癌、髄膜腫、腎臓癌、子宮内膜癌、および卵巣癌、黒色腫、リンパ腫、神経膠芽腫、多剤耐性癌、ならびにＥＧＦＲ発現の調節に応答する他の任意の癌性疾患または他の状態を治療または予防する方法に用いることができる。
【００７４】
さらなる実施形態において、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、またはリボザイムなど、本発明の核酸分子は、本明細書で説明される状態または疾患を治療する他の既知の治療と組み合わせて用いることができる。例えば、説明される分子は、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳の癌、食道癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頚癌、頭頚部癌、髄膜腫、腎臓癌、子宮内膜癌、および卵巣癌、黒色腫、リンパ腫、神経膠芽腫、多剤耐性癌、ならびにＥＧＦＲ発現の調節に応答する他の任意の癌性疾患または他の状態を治療する１つまたは複数の既知の治療剤または診断剤と組み合わせて用いることができる。別の実施形態では、本発明の核酸分子を用いて、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、乳癌、頭頚部癌、胃癌、または結腸癌を治療することができる。
【００７５】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子と共に用いて本明細書で説明される癌を治療しうる治療剤は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、マイコフェノレート、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体など他の免疫除去剤、または他の抗体療法、シトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、マイコフェノール酸、ステロイド、サイトカイン、および照射などの作用因子を含みうる。これらの薬剤は、カルシウムに依存するホスファターゼであるカルシニューリンを阻害する（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）か、または成長因子が誘導するシグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ、第６６巻、８０７〜８１５頁、１９９１年；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎ．、第７３巻、３１６〜３２１頁、１９９１年；Ｂｉｅｒｅｒら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎ．、第５巻、７６３〜７７３頁、１９９３年）。さらなる実施形態において、本発明のＲＮＡ分子は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を用いるＴ細胞除去療法と共に（例えば、その前、それと同時、またはその後に）患者に投与される。別の実施形態において、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する作用物質、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去療法後に投与される。
【００７６】
さらなる実施形態では、米国特許出願公開第２００５／０１８６５８６号、同第２００５／０１８１３８２号、および／または同第２００６／０１３４７８７号に従い、ｓｉＲＮＡのセンス鎖配列を改変することで、ｓｉＲＮＡ二本鎖に１つまたは複数のミスマッチを導入することにより本発明のＲＮＡ分子を改変し、とりわけ、該分子の５’側アンチセンス端の安定性を低下させて、適正鎖をＲＩＳＣ複合体内へと優先的に導入することもでき、標的効果を低下させることもできる。加えて、ＵＳ２００５／００３７９８８に従い、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とそれに相補的な標的ｍＲＮＡとの間にゆらぎ塩基対（Ｇ／Ｕ）を導入することにより本発明のＲＮＡ分子を改変し、とりわけ、ＲＩＳＣの代謝回転を増大させることができる。
【００７７】
本明細書で説明されるＥＧＦＲの発現と関連する疾患または状態を有するかまたはこれを有する危険性を示すことが疑われる対象を同定する組成物および方法は、当技術分野で知られている。
【実施例】
【００７８】
（実施例１）
Ａ４３１モデルにおいてＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）と共に調合され全身送達されたｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡに由来する抗腫瘍効果
図３：Ａ４３１腫瘍の異種移植に対するｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ−ＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）ＮＰＸの腫瘍抑制効果
ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡを保有するＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）（ＰＴ−ＮＰＸ）（図６）の抗腫瘍効果を、Ａ４３１異種移植モデルにおいて判定した。Ａ４３１ヒト類上皮癌細胞（１匹当たり細胞５×１０６個）を、雌ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍サイズが約８０〜１００ｍｍ３であった腫瘍細胞移植後第４日以降、１日おき６回にわたり、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ（ｈＥＧＦＲ−２５−１およびｈＥＧＦＲ−２５−２の１：１混合物、２ｍｇ／ｋｇ）を保有するＰｏｌｙＴｒａｎ  ＮＰＸの静脈内投与により、確立された腫瘍を有するマウスを治療した。ＰｏｌｙＴｒａｎ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸは、３：１の比（ｗ／ｗ）でＰｏｌｙＴｒａｎペプチドをｓｉＲＮＡと混合することにより調製され、ＮＰＸの粒子サイズは、約１００ｎｍである。治療対照は、治療なし（非治療）および６日間にわたり１００ｍｇ／ｋｇで毎日経口投与されたエルロチニブ（ＦＤＡにより承認されたＥＧＦＲ阻害剤であるタルセバ（商標））を含んだ。腫瘍サイズは、ＰＴ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸ投与前に１日おきに測定した。
【００７９】
２ｍｇ／ｋｇでヒトＥＧＦＲ  ｓｉＲＮＡを保有するＰＴ−ＮＰＸによる治療は、非治療対照と比較してＡ４３１腫瘍の増殖を有意に阻害し、阻害効果は、タルセバ（商標）による治療対照よりも大きかった。
【００８０】
（実施例２）
全身送達されたＰＴ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸに由来する抗腫瘍効果はｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ特異的であり、ＰＴ−ＮＰＸ製剤を必要とする
図４：ＰＴ−ＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸによるＡ４３１腫瘍の増殖に対する阻害は、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ特異的であり、ＰＴ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸ製剤を必要とする
実施例１における抗腫瘍効果がｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ特異的であり、ＰＴ−ＮＰＸを伴うｓｉＲＮＡ製剤を必要とすることを確認するため、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡまたは陰性対照ｓｉＲＮＡを保有するＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）（ＰＴ−ＮＰＸ）のほか、ＰｏｌｙＴｒａｎペプチド単独またはｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ単独をＡ４３１異種移植モデルにおいて調べた。Ａ４３１ヒト類上皮癌細胞（１匹当たり細胞５×１０６個）を、雌ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍サイズが約８０〜１００ｍｍ３であった腫瘍細胞移植後第５日以降、１日おき４回にわたり、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ（ｈＥＧＦＲ−２５−１およびｈＥＧＦＲ−２５−２の１：１混合物、２ｍｇ／ｋｇ）もしくは陰性対照ｓｉＲＮＡ（２ｍｇ／ｋｇ）を保有するＰｏｌｙＴｒａｎ  ＮＰＸ、またはｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ単独（ｈＥＧＦＲ−２５−１およびｈＥＧＦＲ−２５−２の１：１混合物、２ｍｇ／ｋｇ）、またはＰｏｌｙＴｒａｎペプチド単独（６ｍｇ／ｋｇのペプチド）の静脈内投与により、確立された腫瘍を有するマウスを治療した。ＰｏｌｙＴｒａｎ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸは、３：１の比（ｗ／ｗ）でＰｏｌｙＴｒａｎペプチドをｓｉＲＮＡと混合することにより調製され、ＮＰＸの粒子サイズは、約１００ｎｍである。治療対照は、治療なし（非治療）を含んだ。腫瘍サイズは、試験物の投与前に１日おきに測定した。
【００８１】
非治療対照と比較して、Ａ４３１腫瘍の増殖を有意に阻害したのは、２ｍｇ／ｋｇでヒトＥＧＦＲ  ｓｉＲＮＡを保有するＰＴ−ＮＰＸによる治療のみであった。対照ｓｉＲＮＡを保有するＰＴ−ＮＰＸ、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ単独、またはＰｏｌｙＴｒａｎペプチドを含む他のすべての治療群は、Ａ４３１腫瘍の増殖を阻害しなかった。
【００８２】
（実施例３）
Ａ５４９モデルにおいてＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）と共に調合され全身送達されたｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡに由来する抗腫瘍効果
図５：Ａ５４９腫瘍の異種移植に対するｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ−ＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）ＮＰＸの腫瘍抑制効果
Ａ４３１モデルに加えて、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡを保有するＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）（ＰＴ−ＮＰＸ）の抗腫瘍効果を、Ａ５４９異種移植モデルにおいて判定した。Ａ５４９ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞（１匹当たり細胞５×１０６個）を、雌ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍サイズが約８０〜１００ｍｍ３であった腫瘍細胞移植後第９日以降、１日おき６回にわたり、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ（ｈＥＧＦＲ−２５−１およびｈＥＧＦＲ−２５−２の１：１混合物、２ｍｇ／ｋｇ）または陰性対照ｓｉＲＮＡ（２ｍｇ／ｋｇ）を保有するＰｏｌｙＴｒａｎ  ＮＰＸの静脈内投与により、確立された腫瘍を有するマウスを治療した。ＰｏｌｙＴｒａｎ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸは、３：１の比（ｗ／ｗ）でＰｏｌｙＴｒａｎペプチドをｓｉＲＮＡと混合することにより調製され、ＮＰＸの粒子サイズは、約１００ｎｍである。治療対照は、治療なし（非治療）および６日間にわたり１００ｍｇ／ｋｇで毎日経口投与されたエルロチニブ（ＦＤＡにより承認されたＥＧＦＲ阻害剤であるタルセバ（商標））を含んだ。腫瘍サイズは、ＰＴ−ｓｉＲＮＡ  ＮＰＸ投与前に１日おきに測定した。
【００８３】
２ｍｇ／ｋｇでヒトＥＧＦＲ  ｓｉＲＮＡを保有するＰＴ−ＮＰＸによる治療は、非治療対照と比較してＡ５４９腫瘍の増殖を有意に阻害し、阻害効果は、タルセバ（商標）による治療対照よりも大きかった。対照ｓｉＲＮＡを保有するＰＴ−ＮＰＸは、Ａ５４９腫瘍の増殖に対する阻害効果を有さなかった。
【００８４】
（実施例４）
ｓｉＲＮＡ分子はヒトＥＧＦＲの発現を阻害する
ヒトＥＧＦＲ遺伝子の公表配列（ＮＭ＿００５２２８）を用いて、２５マーのヒトＥＧＦＲ  ｓｉＲＮＡ分子を設計した。表１は、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡの標的配列候補を示す。
【００８５】
【表１】
2010530754.tif 000002
標準的な技法を用いて、候補ｓｉＲＮＡ分子を合成した。ｓｉＲＮＡの候補を表２に示す。
【００８６】
【表２−１】
2010530754.tif 000003
【００８７】
【表２−２】
2010530754.tif 000004
ｈＥＧＦＲ遺伝子のノックダウン活性について、上記の候補をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングした。ｓｉＲＮＡ候補（表２）による電気穿孔を用いてＨＴ−２９細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの７２時間後において、市販されるＥＬＩＳＡキットを用いてｈＥＧＦＲタンパク質発現をアッセイした（図１を参照されたい）。
【００８８】
用量滴定実験における活性について、２種のｓｉＲＮＡ候補であるｈＥＧＦＲ−２５−１およびｈＥＧＦＲ−２５−２をさらに調べた。図２に示す通り、これら２種のｈＥＧＦＲ  ｓｉＲＮＡ候補は、用量依存的にｈＥＧＦＲの発現を阻害した。
【００８９】
まとめると、この実験は、多数のｓｉＲＮＡ候補によるＥＧＦＲの発現に対する阻害の成功を示す。これらのｓｉＲＮＡ候補は、疾患の治療に用いることができる。
【００９０】
（実施例５）
ヒトＥＧＦＲ発現の阻害のためのｓｉＲＮＡ候補分子
調べたアルゴリズムを用い、また、ヒトＥＧＦＲ遺伝子の公表配列（ＮＭ＿００５２２８）を用いて、２５マーのヒトＥＧＦＲ  ｓｉＲＮＡ分子を設計した。表３は、ｈＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡの標的配列候補を示す。
【００９１】
【表３−１】
2010530754.tif 000005
【００９２】
【表３−２】
2010530754.tif 000006
【００９３】
【表３−３】
2010530754.tif 000007
【００９４】
【表３−４】
2010530754.tif 000008
【００９５】
【表３−５】
2010530754.tif 000009
ｈＥＧＦＲの候補ｓｉＲＮＡ分子は、以下の表４に示され、配列番号１２２〜３２３に記載される。
【００９６】
【表４−１】
2010530754.tif 000010
【００９７】
【表４−２】
2010530754.tif 000011
【００９８】
【表４−３】
2010530754.tif 000012
【００９９】
【表４−４】
2010530754.tif 000013
【０１００】
【表４−５】
2010530754.tif 000014
【０１０１】
【表４−６】
2010530754.tif 000015
【０１０２】
【表４−７】
2010530754.tif 000016
【０１０３】
【表４−８】
2010530754.tif 000017
本実施例で説明される候補ｓｉＲＮＡ分子は、ｈＥＧＦＲ発現の阻害に用いることができ、各種の治療状況、例えば、動脈弁疾患などの心血管障害および乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳の癌、食道癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮頚癌、頭頚部癌、髄膜腫、腎臓癌、子宮内膜癌、および卵巣癌、黒色腫、リンパ腫、神経膠芽腫、多剤耐性癌、ならびに対象または生物におけるｈＥＧＦＲ遺伝子の発現または活性と関連する他の任意の癌性疾患および／または他の病態、状態、もしくは形質を含むがこれらに限定されない癌の治療において有用である。
【０１０４】
本明細書において参照され、かつ／または出願データシートに列挙される上記すべての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
前述より、本明細書では、本発明の特定の実施形態が例示を目的として説明されたが、本発明の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、各種の改変を行うことができる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。
【０１０６】
【数１】
2010530754.tif 000018
【０１０７】
【数２】
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【０１０８】
【数３】
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【０１０９】
【数４】
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【０１１０】
【数５】
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【０１１１】
【数６】
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【０１１２】
【数７】
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【０１１３】
【数８】
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【０１１４】
【数９】
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【０１１５】
【数１０】
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【０１１６】
【数１１】
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【０１１７】
【数１２】
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【０１１８】
【数１３】
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【０１１９】
【数１４】
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【０１２０】
【数１５】
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【０１２１】
【数１６】
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【０１２２】
【数１７】
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【０１２３】
【数１８】
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【０１２４】
【数１９】
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【０１２５】
【数２０】
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【０１２６】
【数２１】
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【０１２７】
【数２２】
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【０１２８】
【数２３】
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【０１２９】
【数２４】
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【０１３０】
【数２５】
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【０１３１】
【数２６】
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【０１３２】
【数２７】
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【０１３３】
【数２８】
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【０１３４】
【数２９】
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【０１３５】
【数３０】
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【０１３６】
【数３１】
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【０１３７】
【数３２】
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【０１３８】
【数３３】
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【０１３９】
【数３４】
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【０１４０】
【数３５】
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【０１４１】
【数３６】
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【０１４２】
【数３７】
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【０１４３】
【数３８】
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【０１４４】
【数３９】
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【０１４５】
【数４０】
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【０１４６】
【数４１】
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【０１４７】
【数４２】
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【０１４８】
【数４３】
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【数７０】
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【０１７６】
【数７１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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