(57)【要約】  本発明は、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来ペプチドデホルミラーゼ遺伝子の特定の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計に関する。マイコバクテリア培養でのこのアンチセンスヌクレオチドの使用は、酵素の安定性の維持にも機能の保持にも関与することが分かっている領域中にハイブリダイズすることによってペプチドデホルミラーゼ酵素の産生を阻害し、それによって細胞の増殖に影響を与える。本発明は、マイコバクテリア中のペプチドデホルミラーゼ酵素の必須性も立証し、それをこの微生物中の薬剤標的として特許請求する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４によって表されるマイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ［ｄｅｆ］遺伝子配列の挿入配列。
【請求項２】
マイコバクテリアに対する潜在的な薬剤標的として有用である、請求項１に記載の配列。
【請求項３】
ＸＴＸＲＲＲＧＶＶＩＮＰで示される１２アミノ酸を含む配列であって、Ｘが２０種の既知のアミノ酸のいずれか１種である、請求項１に記載の配列。
【請求項４】
配列が、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、ウシ結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、トリ結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）及びらい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）において９０から９５％類似する、請求項３に記載のアミノ酸配列。
【請求項５】
請求項１に記載の配列番号１４で表される遺伝子配列に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
１ヵ所（５’）又は全体のいずれかでホスホロチオエート修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドであることを特徴とする、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ（ｄｅｆ）遺伝子の短い領域内にハイブリダイズすることによって酵素ペプチドデホルミラーゼの産生を阻害する、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
マイコバクテリアに対する潜在的な薬剤である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの調製のための方法であって、
ａ．ヒト結核菌から、ペプチドデホルミラーゼ活性を有するポリペプチド（１９７アミノ酸）をコードする核酸配列（５９４ｂｐ）を含むポリヌクレオチド配列を単離するステップであって、ポリペプチドがヒト結核菌、スメグマ菌、ウシ結核菌、トリ結核菌、らい菌などの様々なマイコバクテリア種に存在し、配列番号８、９、１０、１１、１２によって表され、それら自体の間に９０から９５％の配列類似性を有するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）から単離された、ポリヌクレオチド配列番号１４によって表されるマイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ酵素中の領域並びに酵素の安定性及び機能の維持に関与するアミノ酸配列７４から８５を同定するステップであって、前記領域がステップ（ａ）において示すマイコバクテリア種の全てにおいて保存されているステップと、
ｃ．ステップ（ｂ）において同定されたペプチドデホルミラーゼ酵素の保存領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその許容される修飾物を調製するステップと、
ｄ．ステップ（ｃ）において調製されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して酵素活性及びマイコバクテリアの増殖を阻害するステップと
を含む上記方法。
【請求項１０】
マイコバクテリアに対する潜在的な薬剤標的として有用である、請求項１に記載のポリヌクレオチド挿入配列。
【請求項１１】
マイコバクテリアに対する潜在的な薬剤標的として有用である、請求項３に記載のマイコバクテリアのｄｅｆ遺伝子のアミノ酸配列。
【請求項１２】
マイコバクテリアの活性及び増殖を阻害するのに有用である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
結核の治療に有用な医療組成物であって、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項１に記載の領域と相互作用する任意の（単数又は複数の）生物的／非生物的化合物を、任意選択で、薬学的に許容される担体、添加剤又は希釈剤と共に含む上記医療組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコバクテリアに対する潜在的な薬剤標的として有用なマイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ酵素中の特定の領域の同定に関する。本発明はさらに、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来ペプチドデホルミラーゼ遺伝子の特定の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計に関する。マイコバクテリア培養でのこのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、酵素の安定性の維持にも機能の保持にも関与することが分かっている領域中にハイブリダイズすることによってペプチドデホルミラーゼ酵素の産生を阻害し、それによって細胞の増殖に影響を与える。本発明は、マイコバクテリア中のペプチドデホルミラーゼ酵素の必須性も立証し、それをこの微生物中の薬剤標的として特許請求する。
【背景技術】
【０００２】
過去数十年間に結核は、世界的に考慮すべきヒトの死亡原因として出現している。治療で一般に使用される１つ又は複数の抗マイコバクテリア剤に対して耐性を発達させているマイコバクテリア株の発生頻度が次第に増大していることが見出されている。したがって、この状況を克服するために、新規薬剤標的の同定によって達成され得る、より良い薬剤介入戦略を得る必要がある。この重要性において、酵素ペプチドデホルミラーゼは、マイコバクテリアのタンパク質合成全般において必須のステップであると考えられる新生ペプチドの脱ホルミル化に関与している。したがって、該酵素を阻害する任意の生物的／非生物的因子は、マイコバクテリアにおいてタンパク質合成全般を妨げることができ、その増殖を特異的に阻害する。
【０００３】
先行技術の記載
病原性微生物における薬剤耐性は、世界的な公衆衛生への重大な脅威として出現している。多数の抗生物質が使用されているにもかかわらず、それらが阻害する標的の種類は非常に限定的である。これらの抗生物質の長期間かつ過剰な使用の結果、病原性微生物において多剤耐性を生じた。したがって、抗菌剤のスペクトルを多様化するために、薬剤設計の改善を可能にする、合理的な手法に基づいた新規介入戦略を緊急に考案する必要がある。
【０００４】
タンパク質合成は、抗菌剤のための標的の豊富な供給源であると常に示されている。真核生物とは対照的に、原核生物におけるタンパク質合成は、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ｔＲＮＡで開始し、全ての新生ペプチドのアミノ末端でのホルミル化を生じる。しかし、Ｎ−ホルミルメチオニンは、真正細菌の成熟タンパク質において保持されず、ペプチドデホルミラーゼによって脱ホルミル化されると報告されている。このホルミル化／脱ホルミル化事象は、真正細菌のタンパク質合成において必須のステップであると考えられ、したがって該酵素の重要性は長い間予想されてきた。
【０００５】
入手可能なゲノム配列決定データは、ヒト結核菌（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：３８４９０１６５；配列番号８）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：５７６５１７８４）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：１６２７２５６５；配列番号２）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：１６２７２５６５；配列番号３）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：１４６２６９３７；配列番号４）、エンテロコッカス・フェアセリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅａｃｅｌｉｓ）（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：２９３７７５２４；配列番号５）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｒｏｌｉ）（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：４９０８９８０９；配列番号６）及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：１６０７８６３５；配列番号７）などの病原体を含む真正細菌系列全体にわたるペプチドデホルミラーゼ（ｄｅｆ）をコードする推定上の遺伝子の存在を明らかにした。以前の研究は、様々な微生物においてペプチドデホルミラーゼの活性を阻害する様々な化合物又は調製物及びそれらの誘導体の同定及び使用を示している（特許番号：ＷＯ０１３８５６１、ＷＯ２００５０２６１３３、ＷＯ２００５０３７２７２、ＷＯ２００５０９２８７２など）。
【０００６】
Ｔｏｍｉｏｋａ，Ｈによる文献（新規抗結核薬の開発についての展望（Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｄｒｕｇｓ）Ｋｅｋｋａｋｕ．８月；７７［８］５７３〜８４、２００２年）は、リファマイシン（リファブチン、リファペンチン及びリファラジル）、フルオロキノロン類（シプロフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、シタフロキサシン、モキシフロキサシンなど）及び新規マクロライド類（クラリスロマイシン、アジスロマイシン及びロキシスロマイシン）などの既存の薬剤の特定の新規誘導体の薬理学的状態全般を記載している。この文献は、新規抗マイコバクテリア剤、特にオキサゾリジノン（ＰＮＵ−１００４８０）、５’−ニトロイミダゾール（ＣＧＩ  １７３４１）、２−ピリドン（ＡＢＴ−２５５）、新規リミノフェナジン類、ニトロイミダゾピラン（ＰＡ−８２４）、新規ケトライド類（ＡＢＴ−７７３  テリスロマイシン）及びデフェンシン類（ヒト好中球ペプチド−Ｉ）を含む抗結核剤の開発の重要性を考察している。さらに、筆者らは、新規薬剤標的として特定の代謝酵素又は毒性因子をコードするマイコバクテリア遺伝子に特異的な阻害剤を設計する（戦略の１つは、確実にアンチセンス技術であり得る）可能性を記載している。事実、マイコバクテリア遺伝子の発現を休止するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、非常に一般的な技術であり（参考：Ｈａｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９、１５６１４〜１５６１９、２００２年）かつ、該文献で初めて述べられるのではない。
【０００７】
本発明は、マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ中に特異的に存在する挿入配列（アミノ酸７４〜８５から成り（図１及び図２を参照されたい）、酵素の機能の維持に関与する（図５は、この領域の欠失変異体が酵素活性を示さないことを示す）の重要性を強調する。さらに、挿入配列に対する（対応する核酸配列に相補的な）アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、ペプチドデホルミラーゼ酵素の発現を減少させ（抗ｍＰＤＦ抗体を使用するウェスタンブロット法によって図８に示す通り）、次いで培養中のマイコバクテリアの増殖阻害を生じる（図６Ａ及び図７の左パネル）。したがって、これらの結果は、本発明者らが発明したマイコバクテリア酵素の挿入領域の新規性を、この挿入領域に基づく阻害剤を設計する可能性の見地から示す（アンチセンス分子は、マイコバクテリア増殖に寄与するこの領域の重要性を明らかにするために使用されている）。
【０００８】
Ｃｙｎａｍｏｎら、２００４年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．５３：４０３〜４０５による他の文献において、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）綱から単離された抗生物質アクチノニン及びＢＢ３４９７（アクチノニンのヒロドキサム酸誘導体）が、活性部位に結合することによって様々な微生物由来のＰＤＦ酵素活性の阻害を示したことが記載されている。前記文献は、恐らくＰＤＦ酵素活性を阻害することによる、培養中のマイコバクテリアの増殖へのＢＢ３４９７の阻害作用について記載している。Ｃｙｎａｍｏｎら、２００４年は、彼らの文献において、既知のペプチドデホルミラーゼインヒビターがマイコバクテリアの増殖を阻害することを示した。一方、本発明者らは、本発明者らの研究をｍＰＤＦの特徴付けにより開始し、共有性があるにもかかわらず、それが他の細菌性相同体とは明確に異なることを立証した。ヒト結核菌のペプチドデホルミラーゼの配列分析によって、モチーフＩとＩＩの間に特徴的な挿入（残基７４〜８５）が存在していることが明らかになった（図１）。欠失変異体を用いた本出願の結果は、この酵素の機能に対して該領域が寄与していることを示している（図５）。今日までに特徴付けられたＰＤＦにおいて、本発明者らの分析から、挿入領域のアミノ酸構成は、マイコバクテリア種に特有であることが明らかとなった（図２）。さらに、この挿入領域に対する５’−ホスホチオレート（ｐｈｏｓｕｐｈｏｔｈｉｏｒａｔｅ）修飾アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドを使用して、本発明者らは、培養中のマイコバクテリアの増殖阻害を示し、本領域の重要性を立証した（図６Ａ）。さらに、マイコバクテリアに特異的な挿入配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）などの他の細菌由来のＰＤＦ酵素の機能に影響を有さない（図７の右パネルに示す通り）。したがって、本発明者らの結果は、挿入領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ酵素の発現を（図８）、したがってマイコバクテリアの増殖（図６Ａ及び図７の左パネル）を特異的に阻害することを明確に立証する。これにより、本発明者らは、本発明者らがマイコバクテリアにおける酵素の機能について重要であるマイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ酵素における領域（アミノ酸残基７４〜８５）を同定したことを主張する。マイコバクテリア酵素の該領域と相互作用し、かつこの酵素の発現又は産生に影響を与える任意の分子（生物的又は非生物的）は、マイコバクテリアの増殖を阻害できる（本発明者らは、これを該領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することによって立証した。それは、本発明者らの結論／発明を検証するための手法である）。したがって、本発明者らがマイコバクテリアにおいて初めて同定し、かつその重要性を立証した（図５から８）該領域（アミノ酸残基７４〜８５）は、明確に抗マイコバクテリア剤の開発のための薬剤標的である。
【０００９】
Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ，Ｋ．Ｍ．２０００年  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４月１８日；３９［１５］：４５４３〜５１は、ヒト結核菌を含む様々な病原性細菌の全ゲノムについての近年の情報を報告し、新規薬剤標的をコードする遺伝子の同定における進歩を促進する優れたプラットホームを確実に提供している。病原性微生物の代謝及び生存に関与するタンパク質をコードする必須遺伝子は、常に優先的なワクチン候補である。同様に、ペプチドデホルミラーゼは、原核生物においてＮ−ホルミル化ポリペプチドの翻訳後修飾に関与する必須酵素の１つである（Ｍａｚｅｌら、１９９４年、Ｍａｒｇｏｌｉｓら、２０００年及び２００１年）。それは、多数の真正細菌において亜鉛又は鉄のいずれかを含むメタロプロテアーゼとして特徴付けられている。細菌細胞においてそれが必須であるという特徴により、それが抗菌性薬剤設計の魅力的な標的となる。上記で挙げた文献において筆者らは、彼らが、活性部位に結合することによって、大腸菌及び枯草菌由来の精製組換えペプチドデホルミラーゼの強力で可逆的な阻害剤として作用する一連のペプチド性チオールを合理的に設計かつ合成したことを述べた。ＰＤＦ阻害剤は、細菌の溶菌を誘導し、枯草菌、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）及び大腸菌に対して殺菌性であることが検査されている。しかし、本発明は、具体的にヒト結核菌に焦点を置く。筆者らは、精製したマイコバクテリア酵素及びマイコバクテリアの増殖へのこれらの化合物の作用を述べていない。一方、本発明者らの研究は、マイコバクテリアＰＤＦを具体的に扱い、マイコバクテリア酵素に特異的な挿入配列が新規の抗マイコバクテリア剤を開発するために注目され得ることを初めて主張する。
【００１０】
近年、本発明者らは、ヒト結核菌からの５９４塩基対ｄｅｆ遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ２８ｃベクターへのクローニング後に、それをヒスチジンタグ付き融合タンパク質として大腸菌内で発現させた（Ｓａｘｅｎａ及びＣｈａｋｒａｂｏｒｔｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ（３３２）：４１８〜４２５，（２００５年））。原子吸光分析は、ｍＰＤＦがＦｅ＋２含有酵素であることを明らかにしたが、その活性は３０℃で、４時間程度の半減期を有して非常に安定であった。さらに、Ｈ２Ｏ２などの酸化剤への耐性を示してその特性を維持した（Ｓａｘｅｎａ及びＣｈａｋｒａｂｏｒｔｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３３２：４１８〜４２５，２００５年）；Ｓａｘｅｎａ及びＣｈａｋｒａｂｏｒｔｉ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８７：８２１６〜８２２０、２００５年）。環境中の酸素によるＦｅ＋２からＦｅ＋３への転換は、大腸菌中の該メタロプロテアーゼの不活性化を生じることから（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎら、Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ３６：１３９１０〜１３９１８、１９９７年）、これは、ヒト結核菌が宿主内で有効な病原体として生存するために酸化ストレスに対処しているという事実を考慮すると重要な観察であると考えられる。
【００１１】
このことにより、マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ酵素が特徴付けられた。他の研究（特許番号ＷＯ０２０７４９０３）とは対照的に、本発明者らの発明は、酵素活性及び該微生物の培養中での増殖を阻害し、その必須性及び薬剤標的としての可能性を立証する、マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ遺伝子（ｄｅｆ）の特定のヌクレオチド領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の主な目的は、配列番号１４によって表される、マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ［ｄｅｆ］遺伝子配列を提供することである。
【００１３】
したがって、本発明の他の目的は、マイコバクテリアに対する潜在的な薬剤標的として有用である、マイコバクテリアｄｅｆ遺伝子のアミノ酸配列７４から８５を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することである。
【００１５】
さらに本発明の他の目的は、マイコバクテリアの活性及び増殖を阻害するのに有用なオリゴヌクレオチドを提供することである。
【００１６】
さらに本発明の他の目的は、マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼに対する修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製のための方法を提供することである。
【００１８】
さらに本発明の他の目的は、オリゴヌクレオチドを、任意選択で、薬学的に許容される担体、添加剤又は希釈剤と共に含む、結核の治療に有用な医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
したがって、本発明は、ＸＴＸＲＲＲＧＶＶＩＮＰで表される１２アミノ酸（配列中、Ｘは、２０種の既知のアミノ酸のいずれか１種）に対応する配列番号１４によって表されるマイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ［ｄｅｆ］遺伝子配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、この領域内にハイブリダイズすることによってペプチドデホルミラーゼ酵素の産生を阻害し、それによってマイコバクテリア細胞の増殖に影響を与えるための、マイコバクテリア培養でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。ヒト結核菌由来のペプチドデホルミラーゼ酵素内の領域（アミノ酸配列７４から８５）は、酵素の安定性の維持にもマイコバクテリア酵素の機能の保持にも関与することが分かり、このことによってその重要性が強調される。前記オリゴヌクレオチドで処理した培養中のマイコバクテリア細胞の増殖の妨害は、マイコバクテリアにおけるペプチドデホルミラーゼ酵素の必須性をさらに立証するものであり、したがって、この微生物中の薬剤標的としてそれを特許請求する。本発明はさらに、ＸＴＸＲＲＲＧＶＶＩＮＰで表される１２アミノ酸（配列中、Ｘは、２０種の既知のアミノ酸のいずれか１種）を含み、ヒト結核菌、スメグマ菌、ウシ結核菌、トリ結核菌及びらい菌において９０から９５％類似するマイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ［ｄｅｆ］配列を提供する。マイコバクテリアのｄｅｆ遺伝子の前記アミノ酸配列は、マイコバクテリアに対する潜在的な薬剤標的である。
【００２０】
本発明の一実施形態において、マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ［ｄｅｆ］遺伝子配列は、配列番号１４によって表される。
【００２１】
本発明の他の実施形態において、前記配列は、マイコバクテリアに対する潜在的な薬剤標的として有用である。
【００２２】
本発明のさらに他の実施形態において、その配列は、ＸＴＸＲＲＲＧＶＶＩＮＰで表される１２アミノ酸（配列中、Ｘは、２０種の既知のアミノ酸のいずれか１種）を含む。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態において、アミノ酸配列は、ヒト結核菌、スメグマ菌、ウシ結核菌、トリ結核菌及びらい菌において９０から９５％類似する。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、配列番号１４によって表される遺伝子配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、それが１ヵ所（５’）又は全体にわたってホスホロチオエート修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドであることを特徴とする。
【００２６】
本発明のさらに他の実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ（ｄｅｆ）遺伝子の短い領域内にハイブリダイズすることによって酵素ペプチドデホルミラーゼの産生を阻害する。
【００２７】
本発明の他の実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、マイコバクテリアに対する潜在的な薬剤標的である。
【００２８】
本発明のさらに他の実施形態は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製のための方法であり、前記方法は、ペプチドデホルミラーゼ活性を有するポリペプチド（１９７アミノ酸）をコードする核酸配列（５９４ｂｐ）を含むヒト結核菌由来のポリヌクレオチド配列を単離するステップであって、ポリペプチドがヒト結核菌、スメグマ菌、ウシ結核菌、トリ結核菌、らい菌などの様々なマイコバクテリア種において存在し、配列番号８、９、１０、１１、１２によって表され、それら自体において少なくとも９０から９５％の類似性を有するステップと、ステップ（ａ）から単離された、配列番号１４のポリヌクレオチド配列によって表されるマイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ酵素中の領域並びに酵素活性及び機能の維持に関与するアミノ酸配列７４から８５を同定するステップであって、前記領域が全てのマイコバクテリア種において保存されているステップと、ペプチドデホルミラーゼ酵素の保存領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその許容される修飾物を調製するステップと、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して酵素活性及びマイコバクテリアの増殖を阻害するステップとを含む。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態は、マイコバクテリアに対する潜在的な薬剤標的としてのポリヌクレオチド配列の使用である。
【００３０】
本発明のさらに他の実施形態は、マイコバクテリアに対する潜在的な薬剤標的としての、マイコバクテリアのｄｅｆ遺伝子のアミノ酸配列の使用である。
【００３１】
本発明の他の実施形態は、マイコバクテリアの活性及び増殖を阻害するためのオリゴヌクレオチドの使用である。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドを、任意選択で、薬学的に許容される担体、添加剤又は希釈剤と共に含む医薬組成物が提供され、前記組成物は、結核の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒト結核菌のペプチドデホルミラーゼの配列分析が、モチーフＩとＩＩの間に特徴的な挿入（残基７４〜８５）の存在を明らかにしたことを示す図である。全ての真正細菌性ＰＤＦのアミノ酸配列の分析は、３種の（Ｉ：ＧＸＧＸＡＡＸＱ、ＩＩ：ＥＧＣＬＳ及びＩＩＩ：ＱＨＥＸＸＨ、配列中、Ｘは任意の疎水性残基）高度に保存されたモチーフの存在を明らかにした。
【図２】様々なマイコバクテリア種のＰＤＦ配列のアラインメントを示す図である。様々なマイコバクテリア種間で比較する場合、ヒト結核菌ペプチドデホルミラーゼの挿入領域は、８４％程度の同一性を示す。
【図３】発現ベクター中のマイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ遺伝子のクローニングを模式的に示す図である。
【図４】大腸菌内で発現させたヒト結核菌のペプチドデホルミラーゼの精製を示す図である。左パネル：レーン１、分子量マーカー；レーン２、ｐＥＴ−ＰＤＦで形質転換した細胞の粗抽出物；レーン３、ｐＥＴ−ＰＤＦで形質転換した細胞のＩＰＴＧ誘導後の粗抽出物；レーン４、低速上清画分；レーン５、低速遠心分離後に得られた沈澱画分；レーン６、尿素で可溶化した上清画分；レーン７、尿素で可溶化した低速遠心分離後の沈澱画分；レーン８、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂精製タンパク質。右パネル：レーン１、ｐＥＴ−ＰＤＦで形質転換した細胞の粗抽出物；レーン２、ｐＥＴ−ＰＤＦで形質転換した細胞のＩＰＴＧ誘導後の粗抽出物；レーン３、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂精製タンパク質。矢印は、精製ｍＰＤＦの位置を示す。
【図５】大腸菌で発現させたヒト結核菌のペプチドデホルミラーゼの精製を示すグラフである。挿入領域全体の欠失（残基７４〜８５にわたるΔＩＲ変異体）は、タンパク質濃度の関数として測定した場合に、酵素活性を完全に消失させた（図５）。したがって、この結果は、ヒト結核菌ペプチドデホルミラーゼの酵素活性に対する挿入領域の重要性を示した。
【図６Ａ】増殖におけるマイコバクテリアペプチドデホルミラーゼの保存された挿入領域のアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響を示すグラフである。未処理培養物と比較して、本発明者らの結果は、ＰＳ−ＯＤＮ１の存在下で増殖させたスメグマ菌培養物の増殖において１／５の減少（図６Ａ）を示した。
【図６Ｂ】３’フロウレセイン（Ｆｌｏｕｒｅｓｅｅｉｎ）結合ＰＳ−ＯＤＮ１で処理した細胞の共焦点顕微鏡分析の図である。
【図７】マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼの保存された挿入領域のアンチセンスオリゴヌクレオチドへの反応における様々な細菌増殖を示すグラフである。
【図８】アンチセンスオリゴヌクレオチド処理への反応におけるペプチドデホルミラーゼタンパク質の発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、重篤な疾病である結核を生じる病原性細菌ヒト結核菌由来のペプチドデホルミラーゼを扱う。本発明は、ヒト結核菌由来ペプチドデホルミラーゼの特定の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計に関する。ヒト結核菌由来のペプチドデホルミラーゼ酵素内の領域は、酵素の安定性の維持及びマイコバクテリア酵素の機能の保持に関与する。マイコバクテリア培養へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、領域内にハイブリダイズすることによってペプチドデホルミラーゼ酵素の産生を阻害し、次いでマイコバクテリア細胞の増殖に影響を与える。
【００３５】
本開示の内容において、多数の用語が使用される。用語「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」、「単離されたポリヌクレオチド配列」、「ポリペプチド」及び「ポリペプチド配列」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド／アミノ酸配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、１本鎖又は２本鎖のいずれかであるＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーであり得る。同様にポリペプチドは、機能性タンパク質を翻訳するために様々な方法で配置される２０種の異なるアミノ酸のポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態であるポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの配列を含み得る。本明細書で使用する「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸断片を意味する。「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおけるコード配列によって決定される特定の順序で配置されたアミノ酸鎖である。各タンパク質又はポリペプチドは、独自の機能を有する。
【００３６】
タンパク質を記載する場合に使用される「成熟タンパク質」又は用語「成熟」は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチドを意味する。
【００３７】
本明細書において使用される用語「領域」は、長い配列の一部を含み、そのような保存されている部分配列が機能において重要であり、かつ新規標的を同定するために使用できることが予想される、核酸又はアミノ酸の短い保存配列を意味する。
【００３８】
任意の所与の保存配列中の１つ又は２つの保存アミノ酸が、真の相同体で異なる可能性があることが、予想される。
【００３９】
本明細書において使用する用語「実質的に類似」は、１つ又は複数のヌクレオチド塩基の変化が１つ又は複数のアミノ酸の置換を生じるが、しかしヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの機能的特性に影響しない核酸断片を意味する。
【００４０】
「実質的に類似」は、１つ又は複数のヌクレオチド塩基の変化が、例えばアンチセンス技術を通じた遺伝子サイレンシングによる遺伝子発現の変化を介在するための核酸断片の能力に影響しない核酸断片も意味する。
【００４１】
ヒト結核菌の特定の配列に基づいて設計された、本研究において使用されるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、スメグマ菌の増殖を２種の配列間において配列の１００％の同一性を共有することなく阻害する。さらに、実質的に類似な核酸断片は、そのハイブリダイズする能力によっても特徴付け得る。そのような相同性の推定は、ストリンジェントな条件下でのＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡのいずれかのハイブリダイゼーションによって提供される。
【００４２】
さらに、アミノ酸又はヌクレオチドの配列の「実質的な部分」は、アミノ酸又はヌクレオチドの配列が含むタンパク質又は遺伝子の推定的同定をもたらすために十分であるアミノ酸又はヌクレオチドの配列を含む。
【００４３】
本明細書において使用する「増殖阻害」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理及び未処理の微生物のコロニー形成単位及び増殖曲線における相違について関する。
【００４４】
「ＰＣＲ」又は「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡセグメントの増幅のために使用される周知の技術である（米国特許第４６８３１９５号及び第４８００１５９号）。
【００４５】
配列番号１は、黄色ブドウ球菌ポリペプチドデホルミラーゼのアミノ酸配列である（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：５７６５１７８４）。
【００４６】
配列番号２は、肺炎連鎖球菌ポリペプチドデホルミラーゼのアミノ酸配列である（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：１５８５８８４６）。
【００４７】
配列番号３は、インフルエンザ菌ポリペプチドデホルミラーゼのアミノ酸配列である（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：１６２７２５６５）。
【００４８】
配列番号４は、レプトスピラ・インテロガンスポリペプチドデホルミラーゼのアミノ酸配列である（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：１４６２６９３７）。
【００４９】
配列番号５は、エンテロコッカス・フェアセリスポリペプチドデホルミラーゼのアミノ酸配列である（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：２９３７７５２４）。
【００５０】
配列番号６は、ヘリコバクター・ピロリポリペプチドデホルミラーゼのアミノ酸配列である（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：４９０８９８０９）。
【００５１】
配列番号７は、枯草菌ポリペプチドデホルミラーゼのアミノ酸配列である（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：１６０７８６３５）。
【００５２】
配列番号８は、ヒト結核菌ポリペプチドデホルミラーゼのアミノ酸配列である（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：３８４９０１６５）。
【００５３】
配列番号９は、スメグマ菌ポリペプチドデホルミラーゼのアミノ酸配列である（ＭＳＭＥＧ０８２６ペプチドデホルミラーゼ（ｄｅｆ）［３．５．１．８８］｛Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ＭＣ２｝（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｒ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｉｇｒ−ｓｃｒｉｐｔｓ／ＣＭＲ／ＧｅｎｏｍｅＰａｇｅ．ｃｇｉ？ｏｒｇ＿ｓｅａｒｃｈ＝＆ｏｒｇ＝ｇｍｓ）。
【００５４】
配列番号１０は、ウシ結核菌ポリペプチドデホルミラーゼのアミノ酸配列である（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：３１６１７０４６）。
【００５５】
配列番号１１は、トリ結核菌ポリペプチドデホルミラーゼのアミノ酸配列である（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：４１３９８７２１）。
【００５６】
配列番号１２は、らい菌ポリペプチドデホルミラーゼのアミノ酸配列である（ＮＣＢＩ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＧＩ：１３０９３４２８）。
【００５７】
配列番号８  ヒト結核菌ｇｉ：３８４９０１６５
【化１】
2010505389.tif 000002
配列番号９  ＭＳＭＥＧ０８２６ペプチドデホルミラーゼ（ｄｅｆ）［３．５．１．８８］｛Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ＭＣ２）（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）
【化２】
2010505389.tif 000003
配列番号１０  ウシ結核菌ｇｉ：３１６１７０４６
【化３】
2010505389.tif 000004
配列番号１１  トリ結核菌ｇｉ：４１３９８７２１
【化４】
2010505389.tif 000005
配列番号１２  らい菌ｇｉ：１３０９３４２８
【化５】
2010505389.tif 000006
（配列番号８、９、１０、１１、１２における１２アミノ酸挿入領域を太字で示す）
【００５８】
ヒト結核菌由来ペプチドデホルミラーゼオープンリーディングフレーム（ｍＰＤＦ）の特徴付け：
ゲノムＤＮＡをヒト結核菌ＩＩ３７Ｒａ株から単離し、ｍＰＤＦ遺伝子（ｄｅｆ）のＰＣＲ増幅に使用した。使用されたプライマー（ＮｄｅＩ部位が組み込まれたＣＲ１：５’ＣＡＴＡＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＣ３’及びＣＲ３：５’ＣＣＡＴＴＡＧＴＧＡＣＣＧＡＡＣＧＧＧ３’）は、発表されたヒト結核菌ゲノム（Ｃｏｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ．３９３．５３７〜５４４（１９９８年））のｄｅｆ（Ｒｖ０４２９ｃ）配列に基づいて設計した。ｄｅｆオープンリーディングフレーム（５９４ｂｐ）は、Ｅｘｐａｎｄ  ｌｏｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）を製造者の推奨する手順に従って使用してＰＣＲ増幅した。ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー）での処理に続いて、ＰＣＲ増幅断片を最初にｐＵＣ１９ベクター中にクローニングし（ｐＵＣ−ＰＤＦ；図３）、その核酸配列を、自動化配列決定装置を使用して決定した。構築物は、次いでｐＥＴ２８ｃのＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位でのｄｅｆオープンリーディングフレームのサブクローニングに使用し、大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した（ｐＥＴ−ＰＤＦ；図３）。目的遺伝子を含有するクローンは、制限分析によって確認した。
【００５９】
ｐＥＴ−ＰＤＦを過剰発現用に大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した（ＤＥ３）。タンパク質の精製のために、これらのコロニーの一晩培養物（カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地中で、３７℃、１５時間程度）を再接種し、ＯＤ６００で０．８程度まで増殖させた。次いで細胞を２５℃で０．４ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、１２時間後に回収し、溶解緩衝液（５ｍＭ  ＤＴＴ、カタラーゼ１０μｇ／ｍｌ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、ペプスタチン１μｇ／ｍｌ及びロイペプチン１μｇ／ｍｌを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液  ｐＨ７．４）中に懸濁した。細胞を超音波処理し、沈殿物画分（１２０００ｘｇ程度、４℃、３０分間）を３Ｍ尿素及び２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む溶解緩衝液に再懸濁した。遠心分離後、上清画分を透析（４℃、１４時間）して尿素を除去し、製造者の推奨する手順に従ってＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。最後に、ｍＰＤＦを溶出緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール及びカタラーゼ１０μｇ／ｍｌを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液  ｐＨ７．４）中で溶出し、タンパク質濃度をブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｍ．Ｍ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２  ２４８〜２５４  １９７６年）に従って推定した。
【００６０】
精製の様々な段階でのｍＰＤＦタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、その同一性を抗ヒスチジン抗体を使用するウェスタンブロット法で確認した（図４）。精製したｍＰＤＦ保存物のタンパク質濃度は、３．５ｍｇ／ｍｌに保ち、使用まで−８０℃で保存した。アッセイでの使用の前にｍＰＤＦを希釈緩衝液（ＢＳＡ  １ｍｇ／ｍｌ及びカタラーゼ１０μｇ／ｍｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液  ｐＨ７．４）中に希釈し、タンパク質濃度を３．５μｇ／ｍｌに調整した。原子吸光分析をｍＰＤＦ試料３０μｇ（２０ｍＭリン酸緩衝液  ｐＨ７．４中に調製）をグラファイト炉に注入することによって実施した。ｍＰＤＦ中に存在する鉄含有量を、ＦｅＳＯ４  １〜１０μｇを使用して作製した標準曲線を使用して算出した。これは触媒コアにおける鉄の存在（ｍＰＤＦポリペプチド１ｍｏｌ当たり鉄０．９４±０．２１ｍｏｌ、ｎ＝４）を明らかにした。
【００６１】
メチオニンを脱ホルミル化するｍＰＤＦの能力は、Ｇｒｏｃｈｅらによって記載された方法（Ｇｒｏｃｈｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４６  ３４２〜３４６  １９９８年）をわずかに変更して分光光度的なアッセイで評価した。アッセイは、５０μｌ反応用量で実施し、１×アッセイ緩衝液（１００μｇ／ｍｌカタラーゼを含む１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４）中のｍＰＤＦタンパク質（通常７０ｎｇ）を基質（０から８０ｍＭ  Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ａｌａ、Ｓｉｇｍａ、米国）と共に３０℃、３０分間インキュベートした。反応を４％  ＨＣｌＯ４  ５０μｌの添加によって終止させ、さらにＴＮＢＳＡ試薬（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液ｐＨ８．４中、０．０１％）と共にインキュベートした（３７℃、２時間）。１０％ＳＤＳ（２５０μｌ）及び１Ｎ  ＨＣｌ（１２５μｌ）の添加に続いて、一級アミンとＴＮＢＳＡとの反応によって生成された高度に発色性の誘導体を３３５ｎｍで測定した（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、１９９６年、ｐｐ１１２〜１１３）。得られた値をブランク（ｍＰＤＦ酵素を除く全ての成分）の読み値を減算することによって補正した。標準曲線は、既知量のメチオニン（０〜４２．８ｎｍｏｌ）で作製した。Ｎ−ホルミル−メチオニン−アラニンを基質として使用する３回の独立した実験由来の触媒パラメーターの決定は、ｍＰＤＦが４．１±０．２ｍＭのミカエリスメンテン定数（Ｋｍ）、タンパク質１ｍｇ当たり１３．３±０．７μｍｏｌ／分の最大速度（Ｖｍａｘ）、及び１２２０±６Ｍ−１ｓ−１の触媒効率（）を有する活性酵素であることを示した。
【００６２】
マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ酵素活性は、高度に安定であり、過酸化水素などの酸化剤に耐性であった：
時間の関数として測定した場合に上記で挙げたＴＮＢＳＡアッセイにおける組換えタンパク質（濃度３．５μｇ／ｍｌで一定）の酵素活性は、半減期４．１±０．７時間を示した。したがって、その金属結合コアのＦｅ＋２の存在にもかかわらず、組換えｍＰＤＦは、大腸菌のそれと比較して非常に安定であると確かめられた。この観察は、ヒト結核菌が宿主内でのその生存のために酸化ストレスに対処しているという事実と共に、本発明者らをＨ２Ｏ２（過酸化水素）などの酸化剤のｍＰＤＦの脱ホルミル化能への影響の測定に導いた。マイクロモル濃度が、大腸菌の酵素の急速かつ完全な失活を生じると報告されている（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ及びＰｅｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３  ２２３０５〜２２３１０  １９９８年）一方で、本発明者らは、５００ｍＭ  Ｈ２Ｏ２でのプレインキュベーション（１反応当たりタンパク質７０ｎｇで、３０℃、２時間まで）が未処理対照と比較してｍＰＤＦの脱ホルミル化能に有意な影響を示さなかったことを見出した。したがって、本発明者らの結果は、他の細菌性相同体との共有性にもかかわらずｍＰＤＦは、その作用において差異を明確に維持したことを立証した。
【００６３】
酵素安定性の維持に関与するマイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ酵素における挿入領域の同定
他のグラム陽性細菌（ＩＩ型クラス）と同様に、ｍＰＤＦは、保存されたモチーフＩとＩＩの間に挿入（アミノ酸残基７４〜８５；図１中のＩＲ）を有した。本発明者らは、挿入配列（１２アミノ酸「ＭＴＡＲＲＲＧＶＶＩＮＰ」が欠失、ＩＲと表す）でのｍＰＤＦの欠失変異体をＰＣＲに基づく変異誘発法（Ｓｈｉｒｌｅｙ，Ｋ．ら、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｐｐ１４３〜１５５  ｉｎ  Ｃ．Ｗ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、Ｇ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、（編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９９５年）を採用して作製した。次いでこれらの領域のｍＰＤＦの脱ホルミル化能への寄与を査定する酵素活性を評価した。ｍＰＤＦの酵素活性は、上記で挙げたＴＮＢＳＡアッセイにおいて基質としてＮ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ａｌａを使用して、カタラーゼ及びＢＳＡの存在下で決定した。発現させた変異体タンパク質（ＩＲ）は、ウェスタンブロット法によって確認された通り抗ヒスチジンタグ抗体によって認識された。アッセイにおいて過剰量のタンパク質（２０μｇを５ｍＭ  Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ａｌａとインキュベートした）を使用してもＩＲ変異体は、いかなる脱ホルミル化活性も示さなかった（図５）。
【００６４】
挿入領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、培養中のマイコバクテリアの増殖及びペプチドデホルミラーゼ酵素の産生を阻害する：
多くの病原性細菌におけるｄｅｆ遺伝子の必須性は、有望な薬剤標的としてのその使用を導いた（Ｙｕａｎら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ６、９５４〜９６１（２００１年）。該酵素の阻害剤と共にインキュベートする培養は、細菌の増殖に影響を与えることが報告されている（Ｃｌｅｍａｎｔｓら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５、５６３〜５７０  ２００１年及びＣｙｎａｍｏｎら、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５３、４０３〜４０５  ２００４年）。挿入配列がｍＰＤＦの酵素活性の維持に不可欠であることから、本発明者らは、ヒト結核菌の遺伝的研究のためのモデルとしてしばしば使用されている、高増殖性腐生菌、スメグマ菌ｍｃ２１５５株の増殖プロファイルへの該領域の寄与をさらに検討した（Ｆｌｉｎｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１、１２５９８〜１２６０３  ２００４年）。この目的のために、全てのマイコバクテリア種において大部分保存されている領域（ヒト結核菌ｄｅｆの２１９〜２４９塩基）（ヒト結核菌とスメグマ菌のｄｅｆの間でヌクレオチドレベルで７３％程度相同）にわたるように設計した５’ホスホチオレート修飾アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド、ＰＳ−ＯＤＮ１の存在下で細菌培養物を増殖させた。
【００６５】
細菌の増殖プロファイルは、６００ｎｍでの吸光度を記録すること及びコロニー形成単位を計ることによって様々な時間間隔（０〜２４時間）で測定した。未処理培養物と比較して、本発明者らの結果は、ＰＳ−ＯＤＮ１で処理した場合に２４時間でスメグマ菌の増殖において１／５の減少を示した（図６Ａ及び７、左パネル）。この発見は、全ての塩基がホスホチオレート修飾を有する該領域（ヒト結核菌ｄｅｆの２２９〜２５５塩基にわたる、ヒト結核菌とスメグマ菌の間のヌクレオチド配列で８６％相同）内の他のアンチセンスデオキシリボヌクレオチド（ＰＳ−ＯＤＮ２）を使用することによって確認された（図６Ａの挿入図）。本発明者らは、細菌培養物を非相同性配列（ヒト結核菌とスメグマ菌のｄｅｆの１００〜１１７塩基間で２２％相同）に基づいて設計された非特異的５’ホスホチオレート修飾アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド、ＰＳ−ＯＤＮ３で処理した場合に上記の増殖阻害を観察しなかった。ＰＳ−ＯＤＮ１は、マイコバクテリア特異的であることから（挿入配列は他の細菌中に無かった）、大腸菌の増殖プロファイルに影響を有さなかった（図７、右パネル）。
【００６６】
ＰＳ−ＯＤＮ１がスメグマ菌細胞内に浸透したことを確認するために、それを３’末端でフロウレセインと結合させ（ＰＳ−ＯＤＮ４）、２４時間の処理後、共焦点顕微鏡で可視化した場合に蛍光を呈した（図６Ｂ）。したがって、これら全ての証拠は、ＰＳ−ＯＤＮがマイコバクテリア種に特有の挿入配列を標的とし、細胞内に浸透し、かつスメグマ菌の増殖を特異的に阻害したことを立証する。
【００６７】
ＰＳ−ＯＤＮがスメグマ菌で天然ＰＤＦタンパク質の発現を阻害するかどうかを決定するために、培養物をＰＳ−ＯＤＮ１の存在下又は不在下で２４時間増殖させた。培養物を沈澱させた後、処理及び未処理細胞溶解物の両方の細胞の可溶性画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に調製した。これらの試料を次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ（添加したタンパク質量＝溝１つ当たり５０μｇ）及び組換えｍＰＤＦに対するポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット法に使用した。未処理対照（添加対照として提供されるポンソーＳ染色ブロットを参照されたい、図８、上パネル）と比較して、ＰＳ−ＯＤＮ１で処理したスメグマ菌細胞において、内在性ＰＤＦタンパク質の発現レベルにおける有意な減少が認められた（図８、下パネル）。総合すると本発明者らの結果は、挿入配列が該酵素の機能に対して重要な役割を演じていることを立証する。
【００６８】
以下の実施例は、本発明の例示のために提供され、したがって本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６９】
（実施例１）
ｍＰＤＦのヌクレオチド由来アミノ酸配列をＮＩＨのメールサーバーを使用してＢＬＡＳＴ−Ｐプログラムにおける「ｎｒ」データベースと比較した（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２、１９９７年）。検索した配列の多重配列アラインメントをＣｌｕｓｔａｌ  Ｘ  １．８１プログラムを使用して実行した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：４８７６〜４８８２、１９９７年）。全ての真正細菌のＰＤＦのアミノ酸配列の分析は、文献におけるＩ型（グラム陰性）及びＩＩ型（グラム陽性）クラスとしてのその一般的分類によらない、３種（Ｉ：ＧＸＧＸＡＡＸＱ、ＩＩ：ＥＧＣＬＳ及びＩＩＩ：ＱＨＥＸＸＨ、配列中、Ｘは任意の疎水性残基）の高度に保存されたモチーフ（図１）の存在を明らかにした。本発明者らは、ｍＰＤＦのヌクレオチド由来アミノ酸配列をＩ型（大腸菌）及びＩＩ型（黄色ブドウ球菌）の両クラスに属する十分に特徴付けられた典型例と比較した。ヒト結核菌ペプチドデホルミラーゼ配列の分析は、ｍＰＤＦが挿入（アミノ酸残基７４〜８５；図１においてＩＲと表記）を有することを明らかにした。次いで、様々なマイコバクテリア種のＰＤＦ配列をアラインした。様々なマイコバクテリア種間で比較した場合、ヒト結核菌ペプチドデホルミラーゼの挿入領域は８４％程度の同一性を示す（図２）。
【００７０】
ヒト結核菌酵素と他の細菌性鉄含有ペプチドデオルミラーゼ（ｄｅｏｒｍｙｌａｓｅｓ）の配列アラインメント：
大腸菌、黄色ブドウ球菌及びヒト結核菌由来の鉄含有ペプチドデホルミラーゼのヌクレオチド由来アミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌ  Ｘ  １．８４プログラムを使用してアラインした。星印及び点を、それぞれ同一及び類似のアミノ酸を示すために使用する。ΔＩＲ変異体を作製するために欠失させた挿入領域（７４〜８５）を構成するアミノ酸に下線を付けている。
【００７１】
様々なマイコバクテリア種由来のペプチドデホルミラーゼ酵素の多重配列アラインメント：ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを通じて検索したマイコバクテリアの配列をＣｌｕｓｔａｌ  Ｘ  １．８４プログラムによってアラインした。保存された残基を含むマイコバクテリアデホルミラーゼに特異的な挿入領域に下線を付けている。星印及び点を使用して、それぞれ同一及び類似のアミノ酸を示す。
【００７２】
（実施例２）
ｄｅｆオープンリーディングフレーム（５９４塩基）をヒト結核菌由来ゲノムＤＮＡを使用して、アニーリング温度５０℃でＰＣＲ増幅した。使用したプライマー（ＮｄｅＩ部位が組み込まれたＣＲ１：５’ＣＡＴＡＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＣ３’及びＣＲ３：５’ＣＣＡＴＴＡＧＴＧＡＣＣＧＡＡＣＧＧＧ３’）は、発表されたヒト結核菌ゲノム（Ｃｏｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ．３９３  ５３７〜５４４  １９９８年）のｄｅｆ（Ｒｖ０４２９ｃ）配列に基づいて設計した。ＰＣＲは、製造者の推奨する手順に従って、Ｅｘｐａｎｄ  ｌｏｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して実施した。
【００７３】
ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー）での処理に続いて、ＰＣＲ増幅断片を最初にｐＵＣ１９ベクターのＳｍａＩ部位に標準的手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌ，Ｄ．．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、米国  ２００１年）に従ってクローニングし（ｐＵＣ−ｍＰＤＦ）、その核酸配列を自動化配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して決定した。ｐＵＣ１９へのクローニングに続く該断片の配列決定は、発表されたヒト結核菌のｄｅｆ配列（Ｃｏｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３９３  ５３７〜５４４  １９９８年）とヌクレオチドレベルで１００％の同一性を示した。
【００７４】
ｍＰＤＦの酵素的性質を特徴付けるために、ｄｅｆオープンリーディングフレームを含む５９４ｂｐ断片をｐＵＣ−ｍＰＤＦの制限酵素ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでの制限酵素消化によって切り出し、標準的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌ，Ｄ．．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、米国  ２００１年）に従ってｐＥＴ２８ｃの対応する部位に連結した。これによりｐＥＴ−ｍＰＤＦとして表す構築物を生じ（図３）、それを組換えタンパク質を得るために大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した（ＤＥ３）。プラスミドｐＥＴ−ｍＰＤＦを有する宿主細胞から調製した細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＩＰＴＧ誘導後に３０ｋＤａ程度のタンパク質の過剰発現を示した（図４、左パネル、レーン２と３を比較されたい）。
【００７５】
過剰発現されたタンパク質が沈澱画分に確認され（図４、左パネル、レーン４と５を比較されたい）、それを３Ｍ尿素で可溶化し（図４、左パネル、レーン６）、２０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。続く、Ｎｉ−ＮＴＡカラムでの可溶性タンパク質のアフィニティー精製（図４、左パネル、レーン８）は、３１±１．４ｋＤａ（平均±ＳＤ、ｎ＝７）の分子量を明らかにした。発現されたタンパク質は、アミノ末端に、ポリヒスチジン領域（６残基）のアミノ酸を含むベクター由来のさらなる１９アミノ酸（ＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨ）を有していた。アミノ末端の伸長は、タンパク質のアフィニティー精製を促進するだけでなく、抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体を使用するウェスタンブロット法におけるｍＰＤＦタンパク質の検出の手段も提供する（図４、右パネル、レーン２及び３）。該構築物は、本発明者らの研究において野生型として設計された。
【００７６】
発現ベクター中でのマイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ遺伝子のクローニングの模式的表示：ｄｅｆオープンリーディングフレーム（５９４ｂｐ）をヒト結核菌由来ゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅した。ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー）での処理に続いて、ＰＣＲ増幅断片をｐＵＣ１９ベクターのＳｍａＩ部位にクローニングし（ｐＵＣ−ＰＤＦ）、その核酸配列を制限酵素消化に続く核酸配列決定によって確認した。構築物を、続いてｐＥＴ２８ｃのＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位でのオープンリーディングフレームのサブクローニングのために使用し、ｐＥＴ−ＰＤＦ（ＷＴ）を得るために大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した。所望の位置に変異を含むＰＣＲ増幅産物を独自のＳａｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＥＴ−ＰＤＦ構築物の対応する部位に組み込んだ。
【００７７】
図４：大腸菌中で発現させたヒト結核菌のペプチドデホルミラーゼの精製
ｐＥＴ−ＰＤＦ又は欠失変異体（ＩＲ）を有するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の一晩培養物を本文に記載の通り処理した。精製の様々な段階でのタンパク質試料を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてクーマシーブリリアントブルー染色（左パネル）及び抗ヒスチジン抗体を使用するウェスタンブロット法（右パネル）に使用した。左パネル：レーン１、分子量マーカー；レーン２、ｐＥＴ−ＰＤＦで形質転換した細胞の粗抽出物；レーン３、ｐＥＴ−ＰＤＦで形質転換した細胞のＩＰＴＧ誘導後の粗抽出物；レーン４、低速上清画分；レーン５、低速遠心分離後に得られた沈澱画分；レーン６、尿素で可溶化した上清画分；レーン７、尿素で可溶化した低速遠心分離後の沈澱画分；レーン８、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂精製タンパク質。右パネル：レーン１、ｐＥＴ−ＰＤＦで形質転換した細胞の粗抽出物；レーン２、ｐＥＴ−ＰＤＦで形質転換した細胞のＩＰＴＧ誘導後の粗抽出物；レーン３、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂精製タンパク質。矢印は、精製ｍＰＤＦの位置を示す。数字は、マーカータンパク質の分子量の大きさを示す。
【００７８】
挿入領域７４から８５の重要性を立証するために、本発明者らは、ヒト結核菌ペプチドデホルミラーゼのアミノ酸残基７４〜８５を欠失した変異体をＰＣＲに基づく手法を使用して構築した。変異体は、ｐＵＣ−ＰＤＦを鋳型として使用してＰＣＲに基づく方法に従って作製した（Ｓｈｉｒｌｅｙ，Ｋ．ら、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｐｐ１４３〜１５５  ｉｎ  Ｃ．Ｗ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、Ｇ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、（編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９９５年）。ＰＣＲは、２種の外部（プライマーＣＲ２６：５’ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＡＧＴＣＧＴＡＣＣＣ３’及びＣＲ２７：５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＴＧＡＣＣＧＡＡＣＧＧ３’）並びに２種の内部プライマー（アミノ酸残基７４〜８５に対応する３６塩基対を除いて設計したＣＲ８８：５’ＧＣＧＧＡＣＣＧＣＧＣＡＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＣＣＴＣ３’及びＣＲ８７：５’ＧＡＧＧＴＣＴＣＡＡＧＣＡＣＴＧＣＧＣＧＧＴＣＣＧ３’）で実施した。所望の変異を作製するために、２セットの一次ＰＣＲ反応（ＰＣＲプライマーＣＲ２７／ＣＲ８７及びＣＲ２６／ＣＲ８８並びに鋳型としてｐＵＣ−ＰＤＦを使用する）を実施した。一次反応で得られた増幅産物を１：１の割合で混合した。混合後、ＰＣＲ産物を二回目のＰＣＲを実施するための鋳型として外部プライマー（ＣＲ２６／ＣＲ２７）と共に使用した。所望の変異を含む最終ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで精製し、ＳａｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＥＴ−ｍＰＤＦの対応する部位に組み込んだ（図３）。本方法で得られた変異体構築物は、ｐＥＴ−ΔＩＲ  ＰＤＦと表した。該（変異体構築物）を発現させ、上記の野生型と同様に精製した。次いで野生型及び変異タンパク質の酵素活性を測定した。
【００７９】
ｍＰＤＦ又は変異タンパク質のメチオニンを脱ホルミル化する能力は、他に記載の方法（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、１９９６年、ｐｐ  １１２〜１１３）をわずかに変更して分光光度的アッセイにおいて評価した。簡潔には、５０μｌ反応用量中で１×アッセイ緩衝液（１００μｇ／ｍｌカタラーゼを含む１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４）中のｍＰＤＦ又は変異タンパク質（通常３２ｎｇ〜２０μｇ）を、基質（５ｍＭ  Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ａｌａ、Ｓｉｇｍａ、米国）と共に３０℃、３０分間インキュベートした。反応を４％  ＨＣｌＯ４  ５０μｌの添加によって終止させ、さらにトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）試薬（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ８．４中に０．０１％）と共にインキュベートした（３７℃、２時間）。１０％ＳＤＳ（２５０μｌ）及び１Ｎ  ＨＣｌ（１２５μｌ）の添加に続いて、一級アミンとＴＮＢＳＡとの反応によって生成された高度に発色性の誘導体を３３５ｎｍで測定した。得られた値は、ブランク（酵素を除く全ての成分）の読み値を減算することによって補正した。標準曲線は、既知量のメチオニン（０〜４２．８ｎｍｏｌ）で作製し、ｍＰＤＦの酵素活性は、タンパク質１ｍｇ当たり、１分間に産生される遊離アミノ基のｎｍｏｌ数として表した。最後にデータは、少なくとも３回の独立した実験からの平均±ＳＤの形式で表した。挿入領域全体の欠失（残基７４〜８５にわたるΔＩＲ変異体）は、タンパク質の関数として測定した場合、酵素活性を完全に消失させた（図５）。したがって、この結果は、挿入領域のヒト結核菌ペプチドデホルミラーゼの酵素活性に対する重要性を示した。
【００８０】
ヒト結核菌ペプチドデホルミラーゼの酵素活性についての変異の影響
欠失変異体（ΔＩＲ  ７４〜８５）を本文に記載の通りＰＣＲに基づく突然変異誘導法を使用して作製した。発現に続いて、野生型及びｍＰＤＦ変異体タンパク質を精製した。変異体ΔＩＲ（７４〜８５）及び野生型（ＷＴ）の脱ホルミル化能は、５ｍＭ  Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ａｌａを基質として使用してタンパク質濃度の増加（０．０３２、０．１６、０．８、４．０、２０μｇ）の関数として比較した。
【００８１】
（実施例３）
本発明者らは、ヒト結核菌の遺伝子研究のモデルとしてしばしば使用されている、高増殖性腐生菌、スメグマ菌ｍｃ２１５５株の増殖プロファイルへの該領域の寄与をさらに検討した（Ｆｌｉｎｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１、１２５９８〜１２６０３  ２００４年）。スメグマ菌細胞１×１０５個程度（コンフルエント培養物由来、細胞数は系列希釈で調整）を培地（１０％ＡＤＣを補充した７Ｈ９ミドルブルック培地）３ｍｌ中の１０μＭ  ＰＳ−ＯＤＮ１とインキュベートした。ＰＳ−ＯＤＮ１は、全てのマイコバクテリア種において大部分が保存されている領域（ヒト結核菌ｄｅｆの２１９〜２４９塩基）（ヒト結核菌とスメグマ菌のｄｅｆの間でヌクレオチドレベルで７３％程度相同）にわたるように設計した。少量の一定分量を様々な時間間隔（０、６、１２、２４時間後）で採取し、ＰＳ−ＯＤＮ１で処理及び未処理の細菌培養物の増殖プロファイルを得るために６００ｎｍでの光学密度を記録した。同時に、様々な時間間隔で回収した細菌細胞を洗浄し、系列希釈後に７Ｈ１０ミドルブルックアガー（１０％ＡＤＣを補充）上に蒔き、３７℃、３日間のインキュベーションの後にコロニー形成単位を計った。未処理培養物と比較して、本発明者らの結果は、ＰＳ−ＯＤＮ１の存在下で増殖させたスメグマ菌培養物の増殖において１／５の減少（図６Ａ及び７）を示した（同様の増殖プロファイルが、培養物の光学密度を６００ｎｍで決定すること及びプレート上に得られたコロニーの数を数えることによって増殖を測定した場合に得られた）。この発見を全ての塩基がホスホチオレート修飾を有する、領域（ヒト結核菌ｄｅｆの２２９〜２５５塩基にわたる、ヒト結核菌とスメグマ菌の間でヌクレオチド配列で８６％相同）内の他のアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＰＳ−ＯＤＮ２）を使用することによって確認した（図６Ａの挿入図）。
【００８２】
さらに、ＰＳ−ＯＤＮ１がスメグマ菌細胞に浸透したことを確認するために、ＰＳ−ＯＤＮ１に３’フロウレセイン標識を結合し、マイコバクテリア培養物（スメグマ菌細胞１×１０５個程度を、１０％ＡＤＣを補充した７Ｈ９ミドルブルック培地３ｍｌ中の１０μＭ  ＰＳ−ＯＤＮとインキュベートし、３７℃／２００ｒｐｍで２４時間増殖させた）の処理のために使用した。実験の終了時に、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）での洗浄に続いて、３’フロウレセインと結合したＰＳ−ＯＤＮ１で処理した細胞を、共焦点顕微鏡で可視化した場合に、蛍光を呈した（図６Ｂ）。ＰＳ−ＯＤＮ１がマイコバクテリア特異的であることから、挿入配列が無い大腸菌において培養物を１０μＭ  ＰＳ−ＯＤＮ１で処理した場合にはその増殖に影響を与えなかった（図７、右パネル）。したがって、これら全ての証拠は、ＰＳ−ＯＤＮがマイコバクテリア種に特有の挿入配列を標的とし、細胞内に浸透しかつスメグマ菌の増殖を特異的に阻害したことを立証する。
【００８３】
マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼの保存された挿入領域のアンチセンスオリゴヌクレオチドの増殖における影響。スメグマ菌培養物（アルブミン、ブドウ糖及びカタラーゼの混合物を１０％補充したミドルブルック７Ｈ９培地３ｍｌ中の細胞１×１０５個）を、マイコバクテリア種に典型的な挿入領域に対して設計したＰＳ−ＯＤＮ（１０μＭ）と共にインキュベートした。一定分量を様々な時間間隔（０、６、１２、２４時間後）で採取し、ＰＳ−ＯＤＮで処理及び未処理の細菌培養物の増殖プロファイルを得るために６００ｎｍでの光学密度を記録した。挿入図：非相同性配列（ヒト結核菌とスメグマ菌のｄｅｆの１００〜１１７塩基間で２２％相同）に基づいて設計された非特異的５’ホスホチオレート修飾アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド、ＰＳ−ＯＤＮ３で処理し、上記の通り増殖させた場合のマイコバクテリア培養物、本発明者らは、上記の増殖阻害を観測しなかった、（Ｂ）３’フロウレセイン結合ＰＳ−ＯＤＮで２４時間処理した細菌細胞を共焦点顕微鏡下で可視化した。上パネル：未処理スメグマ菌、下パネル：３’フロウレセイン結合ＰＳ−ＯＤＮで処理したスメグマ菌。
【００８４】
マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼの保存された挿入領域のアンチセンスオリゴヌクレオチドへの反応における様々な細菌の増殖  様々な時間間隔で採取した１０μＭ  ＰＳ−ＯＤＮ（マイコバクテリア種に特異的な挿入領域に対して設計された）の存在下及び不在下で増殖させた細菌培養物（細胞１×１０５個、スメグマ菌は、アルブミン、ブドウ糖及びカタラーゼの混合物を１０％補充した３ｍｌミドルブルック７Ｈ９培地、大腸菌は、３ｍｌ  Ｌａｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地）を洗浄し、系列希釈後に、アルブミン、ブドウ糖及びカタラーゼの混合物を１０％補充したミドルブルック７Ｈ１０アガー（スメグマ菌）又は、Ｌａｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉアガー（大腸菌）プレートに蒔いた。３７℃、３日間（スメグマ菌）及び１２時間（大腸菌）のインキュベーション後に得られたコロニーを計測し、未処理培養物増殖の百分率としてプロットした。
【００８５】
（実施例４）
ＰＳ−ＯＤＮがスメグマ菌において天然ＰＤＦタンパク質の発現を阻害するかどうかを決定するために、培養物をＰＳ−ＯＤＮ１の存在下又は不在下で２４時間増殖させた。培養物を沈澱させた後、処理及び未処理の両方の細胞の可溶性画分、溶解物を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に調製した。これらの試料を次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ（添加したタンパク質量＝溝１つ当たり５０μｇ）及び組換えｍＰＤＦに対するポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット法に使用した。未処理対照（添加対照として提供するポンソーＳ染色ブロットを参照されたい、図８、上パネル）と比較して、ＰＳ−ＯＤＮ１で処理したスメグマ菌細胞において、内在性ＰＤＦタンパク質の発現レベルにおける顕著な減少が認められた（図８、下パネル）。総合すると本発明者らの結果は、挿入配列が該酵素の機能に対して重要な役割を演じることを立証する。
【００８６】
図８：アンチセンスオリゴヌクレオチド処理への反応におけるペプチドデホルミラーゼタンパク質の発現  スメグマ菌培養物（アルブミン、ブドウ糖及びカタラーゼの混合物を１０％補充したミドルブルック７Ｈ９培地３ｍｌ中の細胞１×１０５個）を、マイコバクテリア種に特有である挿入領域に対して設計したＰＳ−ＯＤＮ（１０μＭ）と共に２４時間インキュベートした。細胞を回収し、超音波処理し、タンパク質量推定の後に上清画分（１３２００ｒｐｍ）を次に使用した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（処理及び未処理試料について溝１つ当たりタンパク質５０μｇを添加）で分離したタンパク質を精製した組換えｍＰＤＦに対して作製したポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット分析に使用した。上パネル：ｍＰＤＦに対するポリクローナル抗体をプローブとしたブロット、レーン１；Ｎｉ−ＮＴＡ精製ｍＰＤＦ（対照として）、レーン２；未処理スメグマ菌由来上清画分、レーン３；１０μＭ  ＰＳ−ＯＤＮで処理したスメグマ菌由来上清画分、レーン４；着色タンパク質分子量マーカー。下パネル：添加対照として示す、ポンチョーＳ（Ｐｏｎｃｈｅａｕ  Ｓ）で染色した同じブロット。
【００８７】
利点：
過去数十年において、結核は世界中で数百万人の死の原因となる世界的な健康への脅威として再出現している。いくつかの抗結核薬が既知であるにもかかわらず、病原性マイコバクテリア種からの１剤又は多剤耐性株の出現が、この恐ろしい疾病の復活の主な原因の１つとして広く考えられている。この状況を克服するために、新規の薬剤介入戦略を緊急に開発する必要がある。この目的を達するために、薬剤標的の同定は、最初の必要事項である。本明細書において、本発明は、抗菌化合物のスクリーニングのための標的の豊富な供給源であることが常に証明されている、マイコバクテリアのタンパク質合成全般に焦点を置く。真核生物の細胞質タンパク質の合成とは対照的に、ホルミル化／脱ホルミル化事象は、真正細菌において必須のステップであると考えられ、したがってＰＤＦ酵素の重要性は長い間予想されてきた。様々な細菌性ＰＤＦでの共有性にもかかわらず、マイコバクテリアＰＤＦはいくつかの独特の特徴を有する。それらの内、挿入（残基７４〜８５）配列（マイコバクテリア種のみに特異的）の酵素安定性及び該タンパク質の機能の維持における寄与は、重要な性質であり、今日まで他のいかなる細菌からも報告されていない。挿入配列に対して設計及び合成されたホスホチオレート修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、培養中のマイコバクテリアの増殖及びマイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ酵素の発現を妨げる。したがってこれらの結果は、それに基づく合理的薬剤設計が可能である、マイコバクテリア酵素の挿入領域の新規性を強調する。このため本発明は、マイコバクテリア酵素の該領域と相互作用し、かつマイコバクテリア増殖を阻害できる該酵素の発現又は産生に影響を与える任意の（生物的又は非生物的）抗マイコバクテリア化合物の同定／開発において明確に有利となる。
【図４】
2010505389.tif 000007
【図１】
2010505389.tif 000008
【図２】
2010505389.tif 000009
【図３】
2010505389.tif 000010
【図５】
2010505389.tif 000011
【図６Ａ】
2010505389.tif 000012
【図６Ｂ】
2010505389.tif 000013
【図７】
2010505389.tif 000014
【図８】
2010505389.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月8日(2008.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリアデホルミラーゼペプチドの挿入配列をコードするポリヌクレオチド配列に相補的であり、配列番号１４によって表されるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
マイコバクテリアデホルミラーゼペプチドがＸＴＸＲＲＲＧＶＶＩＮＰで示される１２アミノ酸を含み、Ｘが２０種の既知のアミノ酸のいずれか１種である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
アミノ酸配列が、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、ウシ結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、トリ結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）及びらい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）において９０から９５％類似する、請求項２に記載のアンチセンス。
【請求項４】
１ヵ所（５’）又は全体のいずれかでホスホロチオエート修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの調製のための方法であって、
ａ．ヒト結核菌から、ペプチドデホルミラーゼ活性を有するポリペプチド（１９７アミノ酸）をコードする核酸配列（５９４ｂｐ）を含むポリヌクレオチド配列を単離するステップであって、ポリペプチドがヒト結核菌、スメグマ菌、ウシ結核菌、トリ結核菌、らい菌などの様々なマイコバクテリア種に存在し、配列番号８、９、１０、１１、１２によって表され、それら自体の間に９０から９５％の配列類似性を有するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）から単離された、マイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ酵素中の領域並びに酵素の安定性及び機能の維持に関与するアミノ酸配列７４から８５を同定するステップであって、前記領域がステップ（ａ）において示すマイコバクテリア種の全てにおいて保存されているステップと、
ｃ．ステップ（ｂ）において同定されたペプチドデホルミラーゼ酵素の保存領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその許容される修飾物を調製するステップと
を含む上記方法。
【請求項６】
結核の治療に有用な医療組成物であって、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項１に記載の領域と相互作用する（単数又は複数の）生物的／非生物的化合物を、任意選択で、薬学的に許容される担体、添加剤又は希釈剤と共に含む上記医療組成物。
【請求項７】
薬剤標的としての、請求項２に記載のマイコバクテリアデホルミラーゼペプチドの挿入配列の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
利点：
過去数十年において、結核は世界中で数百万人の死の原因となる世界的な健康への脅威として再出現している。いくつかの抗結核薬が既知であるにもかかわらず、病原性マイコバクテリア種からの１剤又は多剤耐性株の出現が、この恐ろしい疾病の復活の主な原因の１つとして広く考えられている。この状況を克服するために、新規の薬剤介入戦略を緊急に開発する必要がある。この目的を達するために、薬剤標的の同定は、最初の必要事項である。本明細書において、本発明は、抗菌化合物のスクリーニングのための標的の豊富な供給源であることが常に証明されている、マイコバクテリアのタンパク質合成全般に焦点を置く。真核生物の細胞質タンパク質の合成とは対照的に、ホルミル化／脱ホルミル化事象は、真正細菌において必須のステップであると考えられ、したがってＰＤＦ酵素の重要性は長い間予想されてきた。様々な細菌性ＰＤＦでの共有性にもかかわらず、マイコバクテリアＰＤＦはいくつかの独特の特徴を有する。それらの内、挿入（残基７４〜８５）配列（マイコバクテリア種のみに特異的）の酵素安定性及び該タンパク質の機能の維持における寄与は、重要な性質であり、今日まで他のいかなる細菌からも報告されていない。挿入配列に対して設計及び合成されたホスホチオレート修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、培養中のマイコバクテリアの増殖及びマイコバクテリアペプチドデホルミラーゼ酵素の発現を妨げる。したがってこれらの結果は、それに基づく合理的薬剤設計が可能である、マイコバクテリア酵素の挿入領域の新規性を強調する。このため本発明は、マイコバクテリア酵素の該領域と相互作用し、かつマイコバクテリア増殖を阻害できる該酵素の発現又は産生に影響を与える任意の（生物的又は非生物的）抗マイコバクテリア化合物の同定／開発において明確に有利となる。
［配列表］
SEQUENCE LISTING
<210>  1
<211>  162
<212>  PRT
<213>  Staphylococcus aureus
<400>  1
Met Ala Ile Lys Lys Leu Val Pro AlaSer His Pro Ile Leu Thr Lys 
1               5                   10                  15      
Lys Ala GlnAla Val Lys Thr Phe Asp Asp Ser Leu Lys Arg Leu Leu 
20                  25                  30          
Gln Asp Leu Glu Asp Thr Met TyrAla Gln Glu Ala Ala Gly Leu Cys 
35                  40                  45              
Ala Pro Gln Ile Asn Gln Ser Leu Gln Val Ala Ile Ile Asp Met Glu 
50                  55                  60                  
Met Glu Gly Leu Leu Gln Leu Val Asn Pro Lys Ile Ile Ser Gln Ser 
65                  70                  75                  80  
Asn Glu Thr Ile Thr Asp Leu Glu Gly Ser Ile Thr Leu Pro Asp Val 
85                  90                  95      
Tyr Gly Glu Val Thr Arg Ser LysMet Ile Val Val Glu Ser Tyr Asp 
100                 105                 110         
Val Asn Gly Asn Lys Val Glu Leu Thr Ala His Glu Asp Val Ala Arg 
115                 120                 125             
Met Ile Leu His Ile Ile Asp Gln Met Asn Gly Ile Pro Phe Thr Glu 
130                 135                 140                 
Arg Ala Asp Arg Ile Leu Thr Asp Lys Glu Val Glu AlaTyr Phe Ile 
145                 150                 155                 160 
Asn Asp 
<210>  2
<211>  203
<212>  PRT
<213>  Streptococcus pneumoniae 
<400>  2
Met Ser Ala Ile Glu Arg Ile Thr Lys Ala Ala His Leu Ile Asp Met 
1               5                   10                  15      
Asn Asp Ile Ile Arg Glu Gly Asn Pro Thr Leu Arg Thr Val Ala Glu 
20                  25                  30          
Glu Val Thr Phe Pro Leu Ser Asp Gln Glu Ile Ile Leu Gly Glu Lys 
35                  40                  45              
Met Met Gln Phe Leu Lys His Ser Gln Asp Pro Val Met Ala Glu Lys 
50                  55                  60                  
Met Gly Leu Arg Gly Gly Val Gly LeuAla AlaPro Gln Leu Asp Ile 
65                  70                  75                  80  
Ser Lys Arg Ile Ile Ala Val Leu Val Pro Asn Ile Val Glu Glu Gly 
85                  90                  95      
Glu Thr Pro Gln Glu AlaTyr Asp Leu Glu Ala Ile Met Tyr Asn Pro 
100                 105                 110         
Lys Ile Val Ser His Ser Val Gln Asp Ala AlaLeu Gly Glu Gly Glu 
115                 120                 125             
Gly Cys Leu Ser Val Asp Arg Asn Val Pro Gly Tyr Val Val Arg His 
130                 135                 140                 
Ala Arg Val Thr Val Asp Tyr Phe Asp Lys Asp Gly Glu LysHis Arg 
145                 150                 155                 160 
Ile Lys Leu LysGly Tyr Asn Ser Ile Val Val Gln His Glu Ile Asp 
165                 170                 175     
His Ile Asn Gly Ile Met Phe Tyr Asp Arg Ile Asn Glu Lys Asp Pro 
180                 185                 190         
Phe Ala Val Lys Asp Gly Leu Leu Ile Leu Glu 
195                 200             
<210>  3
<211>  169
<212>  PRT
<213>  Haemophillus influenzae
<400>  3
Met Thr Ala Leu Asn Val Leu Ile Tyr Pro Asp Asp His Leu Lys Val 
1               5                   10                  15      
Val Cys Glu Pro Val Thr Lys Val Asn Asp Ala Ile Arg Lys Ile Val 
20                  25                  30          
Asp Asp Met Phe Asp Thr Met Tyr Gln Glu Lys Gly Ile Gly Leu Ala
35                  40                  45              
Ala Pro Gln Val Asp Ile Leu Gln Arg Ile Ile Thr Ile Asp Val Glu 
50                  55                  60                  
Gly Asp Lys Gln Asn Gln Phe Val Leu Ile Asn Pro Glu Ile Leu Ala
65                  70                  75                  80  
Ser Glu Gly Glu Thr Gly Ile Glu Glu Gly Cys Leu Ser Ile Pro Gly 
85                  90                  95      
Phe Arg Ala Leu Val Pro Arg Lys Glu Lys Val Thr Val Arg AlaLeu 
100                 105                 110         
Asp Arg Asp Gly Lys Glu Phe Thr Leu Asp Ala Asp Gly Leu Leu Ala 
115                 120                 125             
Ile Cys Ile Gln His Glu Ile Asp His Leu Asn Gly Ile Leu Phe Val 
130                 135                 140                 
Asp Tyr Leu Ser Pro Leu Lys Arg Gln Arg Ile Lys Glu Lys Leu Ile 
145                 150                 155                 160 
Lys Tyr Lys Lys Gln Ile AlaLys Ser 
165                 
<210>  4
<211>  178
<212>  PRT
<213>  Leptospira interrogans
<400>  4
Met Ser Val Arg LysIle Leu Arg Met Gly Asp Pro Ile Leu Arg Lys 
1               5                   10                  15      
Ile Ser Glu Pro Val Thr Glu Asp Glu Ile Gln Thr Lys Glu Phe Lys 
20                  25                  30          
Lys Leu Ile Arg Asp Met Phe Asp Thr Met Arg His Ala Glu Gly Val 
35                  40                  45              
Gly Leu Ala Ala Pro Gln Ile Gly Ile Leu LysGln Ile Val Val Val 
50                  55                  60                  
Gly Ser Glu Asp Asn Glu Arg Tyr Pro Gly Thr Pro Asp Val Pro Glu 
65                  70                  75                  80  
Arg Ile Ile Leu Asn Pro Val Ile Thr Pro Leu Thr Lys Asp Thr Ser 
85                  90                  95      
Gly Phe Trp Glu Gly Cys Leu Ser Val Pro Gly Met Arg Gly Tyr Val 
100                 105                 110         
Glu Arg Pro Asn Gln Ile Arg Met Gln Trp Met Asp Glu Lys Gly Asn 
115                 120                 125             
Gln Phe Asp Glu Thr Ile Asp Gly Tyr Lys AlaIle Val Tyr Gln His 
130                 135                 140                 
Glu Cys Asp His Leu Gln Gly Ile Leu Tyr Val Asp Arg Leu Lys Asp 
145                 150                 155                 160 
Thr Lys Leu Phe Gly Phe Asn Glu Thr Leu Asp Ser Ser His Asn Val 
165                 170                 175     
Leu Asp 
<210>  5
<211>  187
<212>  PRT
<213>  Enterococcus faecelis
<400>  5
Met Ile Thr Met LysAsp Ile Ile Arg Glu Gly Asn Pro Thr Leu Arg 
1               5                   10                  15      
Ala Val AlaGlu Glu Val Pro Val Pro Ile Thr Glu Glu Asp Arg Gln 
20                  25                  30          
Leu Gly Glu Asp Met Leu Thr Phe Leu Lys Asn Ser Gln Asp Pro Val 
35                  40                  45              
Lys Ala Glu Glu Leu Gln Leu Arg Gly Gly Val Gly Leu AlaAla Pro 
50                  55                  60                  
Gln Leu Asp Ile Ser Lys Arg Ile Ile Ala Val His Val Pro Ser Asn 
65                  70                  75                  80  
Asp Pro Glu Asn Glu Thr Pro Ser Leu Ser Thr Val Met Tyr Asn Pro 
85                  90                  95      
Lys Ile Leu Ser His Ser Val Gln Asp Val Cys Leu Gly Glu Gly Glu 
100                 105                 110         
Gly Cys Leu Ser Val Asp Arg Asp Val Pro Gly Tyr Val Val Arg His 
115                 120                 125             
Asn Lys Ile Thr Val Ser Tyr Phe Asp Met Ala Gly Glu Lys His Lys 
130                 135                 140                 
Val Arg Leu Lys Asn Tyr Glu Ala Ile Val Val Gln His Glu Ile Asp 
145                 150                 155                 160 
His Ile Asn Gly Ile Met Phe Tyr Asp His Ile Asn Lys Glu Asn Pro 
165                 170                 175     
Phe Ala Leu LysGlu Gly Val Leu Val Ile Glu 
180                 185         
<210>  6
<211>  174
<212>  PRT
<213>  Helicobacter pylori
<400>  6
Met AlaLeu Leu Glu Ile Ile His Tyr Pro Ser Lys Ile Leu Arg Thr 
1               5                   10                  15      
Ile Ser Lys Glu Val Val Ser Phe AspAla Lys Leu His Gln Gln Leu 
20                  25                  30          
Asp Asp Met Tyr Glu Thr Met IleAla Ser Glu Gly Ile Gly Leu Ala 
35                  40                  45              
Ala Ile Gln Val Gly Leu Pro Leu Arg Met Leu Ile Ile Asn Leu Pro 
50                  55                  60                  
Gln Glu Asp Gly Val Gln His LysGlu Asp Cys Leu Glu Ile Ile Asn 
65                  70                  75                  80  
Pro Lys Phe Ile Glu Thr Gly Gly Ser Met Met Tyr Lys Glu Gly Cys 
85                  90                  95      
Leu Ser Val Pro Gly Phe Tyr Glu Glu Val Glu Arg Phe Glu Lys Val 
100                 105                 110         
Lys Ile Glu Tyr Gln Asn Arg Phe AlaGlu Val Lys Val Leu Glu Ala 
115                 120                 125             
Ser Glu Leu Leu Ala Val Ala Ile Gln His Glu Ile Asp His Leu Asn 
130                 135                 140                 
Gly Val Leu Phe Val Asp Lys Leu Ser Ile Leu Lys Arg Lys Lys Phe 
145                 150                 155                 160 
Glu Lys Glu Leu Lys Glu Leu Gln Lys Lys Gln Lys His Lys 
165                 170                 
<210>  7
<211>  160
<212>  PRT
<213>  Bacillus subtilis
<400>  7
Met Ala Val Lys Lys Val Val Thr His Pro AlaGlu Val Leu Glu Thr 
1               5                   10                  15      
Pro Ala Glu Thr Val Thr Val Phe Asp Lys Lys Leu Lys Lys Leu Leu 
20                  25                  30          
Asp Asp Met Tyr Asp Thr Met Leu Glu Met Asp Gly Val Gly Leu Ala
35                  40                  45              
Ala Pro Gln Ile Gly Ile Leu Lys Arg Ala AlaVal Val Glu Ile Gly 
50                  55                  60                  
Asp Asp Arg Gly Arg Ile Asp Leu Val Asn Pro Glu Ile Leu Glu Lys 
65                  70                  75                  80  
Ser Gly Glu Gln Thr Gly Ile Glu Gly Cys Leu Ser Phe Pro Asn Val 
85                  90                  95      
Tyr Gly Asp Val Thr Arg AlaAsp Tyr Val Lys Val Arg AlaPhe Asn 
100                 105                 110         
Arg Gln Gly Lys Pro Phe Ile Leu GluAla Arg Gly Phe Leu Ala Arg 
115                 120                 125             
Ala Val Gln His Glu Met Asp His Leu Asp Gly Val Leu Phe Thr Ser 
130                 135                 140                 
Lys Ile Ser Lys Tyr Tyr Thr Glu Asp Glu Leu Ala Asp Met Glu Gly 
145                 150                 155                 160 
<210>  8
<211>  197
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium tuberculosis
<400>  8
Met AlaVal Val Pro Ile Arg Ile Val Gly Asp Pro Val Leu His Thr 
1               5                   10                  15      
Ala Thr Thr Pro Val Thr Val Ala Ala Asp Gly Ser Leu Pro Ala Asp 
20                  25                  30          
Leu Ala Gln Leu IleAla Thr Met Tyr Asp Thr Met AspAla AlaAsn 
35                  40                  45              
Gly Val Gly Leu Ala AlaAsn Gln Ile Gly Cys Ser Leu Arg Leu Phe 
50                  55                  60                  
Val Tyr Asp Cys Ala Ala Asp Arg Ala Met Thr AlaArg Arg Arg Gly 
65                  70                  75                  80  
Val Val Ile Asn Pro Val Leu Glu Thr Ser Glu Ile Pro Glu Thr Met 
85                  90                  95      
Pro Asp Pro Asp Thr Asp Asp Glu Gly Cys Leu Ser Val Pro Gly Glu 
100                 105                 110         
Ser Phe Pro Thr Gly Arg AlaLys Trp AlaArg Val Thr Gly Leu Asp 
115                 120                 125             
Ala Asp Gly Ser Pro Val Ser Ile Glu Gly Thr Gly Leu Phe Ala Arg 
130                 135                 140                 
Met Leu Gln His Glu Thr Gly His Leu Asp Gly Phe Leu Tyr Leu Asp 
145                 150                 155                 160 
Arg Leu Ile Gly Arg Tyr AlaArg Asn Ala Lys Arg Ala Val Lys Ser 
165                 170                 175     
His Gly Trp Gly Val Pro Gly Leu Ser Trp Leu Pro Gly Glu Asp Pro 
180                 185                 190         
Asp Pro Phe Gly His 
195         
<210>  9
<211>  198
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium smegmatis
<400>  9
Met AlaVal Val Pro Ile Arg Ile Val Gly Asp Pro Val Leu His Thr 
1               5                   10                  15      
Pro Thr Glu Pro Val Pro Val Gly Pro Asp Gly Ser Leu Pro Asp Asp 
20                  25                  30          
Leu Pro Ala Leu Ile Gln Asp Met Phe Asp Thr Met Asp Ala AlaAsn 
35                  40                  45              
Gly Val Gly Leu Ala Ala Asn Gln Ile Gly Val Ala LysArg Leu Phe 
50                  55                  60                  
Val Tyr Asp Cys Ala Pro Thr Arg Gly Gln Thr Thr Arg Arg Arg Gly 
65                  70                  75                  80  
Val Val Ile Asn Pro Val Leu Glu Thr Ser Glu Val Pro Glu Thr Met 
85                  90                  95      
Pro Asp Pro Asp Glu Asp Glu Glu Gly Cys Leu Ser Val Pro Gly Glu 
100                 105                 110         
Asn Phe Pro Thr Gly Arg AlaAsp Trp AlaArg Val Thr Gly Leu Asp 
115                 120                 125             
Ala Asp Gly Ser Pro Ile Thr Leu Glu Gly Glu Asp Leu Phe Ala Arg 
130                 135                 140                 
Met Leu Gln His Glu Thr Gly His Leu Asp Gly Phe Leu Tyr Leu Asp 
145                 150                 155                 160 
Arg Leu Val Gly Arg Tyr AlaArg Ala Ala Lys Lys Ala Val Lys Arg 
165                 170                 175     
Asn Gly Trp Gly Gly Val Pro Gly Leu Ser Trp Met Pro Gly Glu Val 
180                 185                 190         
Pro Asp Pro Phe Gly His 
195             
<210>  10
<211>  197
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium bovis
<400>  10
Met Thr Val Val Pro Ile Arg Ile Val Gly Asp Pro Val Leu His Thr 
1               5                   10                  15      
Ala Thr Thr Pro Val Thr Val Ala Ala Asp Gly Ser Leu Pro Ala Asp 
20                  25                  30          
Leu Ala Gln Leu IleAla Thr Met Tyr Asp Thr Met AspAla AlaAsn 
35                  40                  45              
Gly Val Gly Leu Ala AlaAsn Gln Ile Gly Cys Ser Leu Arg Leu Phe 
50                  55                  60                  
Val Tyr Asp Cys Ala Ala Asp Arg Ala Met Thr AlaArg Arg Arg Gly 
65                  70                  75                  80  
Val Val Ile Asn Pro Val Leu Glu Thr Ser Glu Ile Pro Glu Thr Met 
85                  90                  95      
Pro Asp Pro Asp Thr Asp Asp Glu Gly Cys Leu Ser Val Pro Gly Glu 
100                 105                 110         
Ser Phe Pro Thr Gly Arg AlaLys Trp AlaArg Val Thr Gly Leu Asp 
115                 120                 125             
Ala Asp Gly Ser Pro Val Ser Ile Glu Gly Thr Gly Leu Phe Ala Arg 
130                 135                 140                 
Met Leu Gln His Glu Thr Gly His Leu Asp Gly Phe Leu Tyr Leu Asp 
145                 150                 155                 160 
Arg Leu Ile Gly Arg Tyr AlaArg Asn Ala Lys Arg Ala Val Lys Ser 
165                 170                 175     
His Gly Trp Gly Val Pro Gly Leu Ser Trp Leu Pro Gly Glu Asp Pro 
180                 185                 190         
Asp Pro Phe Gly His 
195         
<210>  11
<211>  197
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium avium
<400>  11
Met AlaVal Val Pro Ile Arg Ile Val Gly Asp Pro Val Leu His Thr 
1               5                   10                  15      
Pro Thr Gln Pro Val Pro Val Gly Asp Asp Gly Ser Leu Pro AlaAsp 
20                  25                  30          
Leu Gly Lys Leu IleAla Asp Met Tyr Asp Thr Met AspAla AlaHis 
35                  40                  45              
Gly Val Gly Leu Ala AlaAsn Gln Ile Gly Val Gly Leu Arg Val Phe 
50                  55                  60                  
Val Tyr Asp Cys Ala Asp Asp Arg Gly Leu Thr Glu Arg Arg Arg Gly 
65                  70                  75                  80  
Val Val Val Asn Pro Val Leu Glu Thr Ser Glu Ile Pro Glu Thr Met 
85                  90                  95      
Pro Asp Pro Asp Thr Asp Asp Glu Gly Cys Leu Ser Val Pro Gly Glu 
100                 105                 110         
Ser Phe Pro Thr Gly Arg AlaSer Trp AlaArg Val Thr Gly Leu Asp 
115                 120                 125             
Ala Asp Gly Asn Pro Val Ser Ile Glu Gly His Gly Leu Phe Ala Arg 
130                 135                 140                 
Met Leu Gln His Glu Thr Gly His Leu Asp Gly Phe Leu Tyr Leu Asp 
145                 150                 155                 160 
Arg Leu Ile Gly Arg Tyr AlaArg Ser Ala Lys Arg Ala Val Lys Ser 
165                 170                 175     
His Asn Trp Gly Val Pro Gly Leu Ser Trp Met Pro Gly Glu Gly Pro 
180                 185                 190         
Asp Pro Phe Gly His 
195         
<210>  12
<211>  197
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium leprae
<400>  12
Met Ala Ile AlaPro Ile Arg Ile Val Gly Asp Pro Val Leu His Thr 
1               5                   10                  15      
Pro Thr Ala Pro Val Gln Val Ala Ala Asp Gly Ser Leu Pro Ala Asn 
20                  25                  30          
Leu Asn Gly Leu Ile Ser Thr Met Tyr Asp Thr Met Asp Ala Ala His 
35                  40                  45              
Gly Val Gly Leu Ala AlaAsn Gln Ile Gly Tyr Gly Leu Arg Val Phe 
50                  55                  60                  
Val Tyr Asp Cys Ala Glu Asp Cys Arg Gln Thr Ala Arg Arg Arg Gly 
65                  70                  75                  80  
Val Val Ile Asn Pro Ile Leu Glu Thr Ser Glu Ile Pro Glu Thr Met 
85                  90                  95      
Pro Asp Pro Asp Thr Asp Asn Glu Gly Cys Leu Ser Val Pro Gly Glu 
100                 105                 110         
Ser Phe Pro Ile Gly Arg AlaGln Trp AlaArg Val Thr Gly Leu Asp 
115                 120                 125             
Ala Asp Gly Asn Pro Val Thr Thr Glu Gly Thr Gly Leu Phe Ala Arg 
130                 135                 140                 
Met Leu Gln His Glu Thr Gly His Leu Asp Gly Phe Leu Tyr Leu Asp 
145                 150                 155                 160 
Tyr Leu Ile Gly Arg His AlaArg Ser Ala Lys Arg Ala Ile Lys Ser 
165                 170                 175     
Arg His Trp Gly Val Pro Gly Leu Ser Trp Met Pro Gly Glu Val Pro 
180                 185                 190         
Asp Pro Phe Gly Pro 
195         
<210>  14
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  配列番号２１中のヒト結核菌デホルミラーゼ遺伝子配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(30)
<223>  ヒト結核菌デホルミラーゼ遺伝子配列に対する５’−３’アンチセンスオリゴヌクレオチド
<400>  14
gatgaccaca ccgcgtcggc gggcggtcat                                      30
<210>  15
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  ヒト結核菌由来ゲノムＤＮＡ  ５’−３’デホルミラーゼオープンリーディングフレーム（５９４ｂｐ）
<400>  15
catatggcag tggtaccc                                                   18
<210>  16
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  ヒト結核菌由来ゲノムＤＮＡ  ５’−３’デホルミラーゼオープンリーディングフレーム（５９４ｂｐ）
<400>  16
ccattagtga ccgaacggg                                                  19
<210>  17
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  ヒト結核菌デホルミラーゼポリペプチドのアミノ酸７４〜８５を欠失しているデホルミラーゼタンパク質の変異のための外部プライマー
<400>  17
ggaattccat atggcagtcg taccc                                           25
<210>  18
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  ヒト結核菌デホルミラーゼポリペプチドのアミノ酸７４〜８５を欠失しているデホルミラーゼタンパク質の変異のための外部プライマー
<400>  18
cccaagcttt tagtgaccga acgg                                            24
<210>  19
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  ヒト結核菌デホルミラーゼポリペプチドのアミノ酸７４〜８５を欠失しているデホルミラーゼタンパク質の変異のための内部プライマー
<400>  19
gcggaccgcg cagtgcttga gacctc                                          26
<210>  20
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  ヒト結核菌デホルミラーゼポリペプチドのアミノ酸７４〜８５を欠失しているデホルミラーゼタンパク質の変異のための内部プライマー
<400>  20
gaggtctcaa gcactgcgcg gtccg                                           25
【国際調査報告】
2010505389.tif 000016
2010505389.tif 000017
2010505389.tif 000018