(57)【要約】尿試料中の少なくとも１つの検体の濃度を正規化するための方法であって、以下の工程：ａ）少なくとも１つの検体の濃度を測定する工程；ｂ）少なくとも１つのコラーゲンまたはコラーゲン断片の濃度を測定する工程；ｃ）前記少なくとも１つのコラーゲンまたはコラーゲン断片の濃度に対して、前記少なくとも１つの検体の濃度を正規化する工程、を含む、前記方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿試料中の少なくとも１つの検体の濃度を正規化するための方法であって、
以下の工程：
ａ）少なくとも１つの検体の濃度を測定する工程；
ｂ）少なくとも１つのコラーゲンまたはコラーゲン断片の濃度を測定する工程；
ｃ）前記少なくとも１つのコラーゲンまたはコラーゲン断片の濃度に対して、前記少なくとも１つの検体の濃度を正規化する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
検体の濃度を測定する前に、尿試料をいくつかの副次標本にさらに分離することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離は、
−アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過、のような、ＦＰＬＣまたはＨＰＬＣを任意に使用するクロマトグラフィー法；
−ＳＥＬＤＩ法、ＣｌｉｎＰｒｏｔ法のような、特定の材料への吸着；
−ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動のような、電気泳動法、
により達成されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記副次標本中の検体および／またはコラーゲンもしくはコラーゲン断片の含有量の測定は、ＵＶ／Ｖｉｓ検出器、蛍光検出器、屈折率検出器、ダイオードアレイ検出器、質量分析計、ゲルスキャナー、染色または誘導体化、およびその後の適当な手段による検出、により達成されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのコラーゲンまたはコラーゲン断片は、その移動または保持時間および任意に更に、マススペクトル、ＵＶ／Ｖｉｓスペクトル、蛍光スペクトル、特定のリガンド、例えば、抗体、に対するアフィニティ、のような適当なパラメータによって同定されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのコラーゲン断片は、配列番号１〜４２のペプチドから選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つまたは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも５、１０、２０、３０、４０または５０のコラーゲンまたはコラーゲン断片の濃度が測定され、かつ正規化のために使用されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記正規化は、線形回帰により達成されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
尿試料中の検体濃度の正規化のためのコラーゲンまたはコラーゲン断片の使用。
【請求項１０】
前記コラーゲン断片は、配列番号１〜４２のペプチドから選択されることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
少なくとも２つまたは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも５、１０、２０、３０、４０または５０のコラーゲンまたはコラーゲン断片が、正規化のために使用されることを特徴とする、請求項９または１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿試料中の検体の濃度を正規化するための(for normalizing)方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿試料は、長年にわたり医学的臨床検査のために使用されている。尿試料は、医学的側面において興味深い様々な物質、例えば、薬剤または違法薬物の分解産物、ホルモン、病原体、たんぱく質等を含む。
【０００３】
従来、尿試料の評価のためには、多くの場合、総たんぱく質含有量（のみ）が考えられていたのに対し、特に、尿中のたんぱく質の組成も関連する医学的情報を含むことが、ますます多く認識されている。
【０００４】
ＷＯ ０１／８４１４０およびＷＯ ２００４／０６８１３０は、液体試料中、例えば尿試料中のたんぱく質およびペプチドパターンを測定するための方法および装置を記載している。
【０００５】
ＷＯ ２００５／０２４４０９は、体液の試料中に含まれるポリペプチドおよび病状を認識するためのマーカーの定量的評価のための装置および方法を記載している。例えば、異なる病気が異なるポリペプチドマーカーの発生にどのように関連するかが示されている。異なるポリペプチドが、健康な患者と比べて特定の病気において多少頻繁に発生することが観察されている。
【０００６】
特にＷＯ ２００６／１０６１２９は、２つの状態、例えば健康な状態と病気の状態を、試料中のマーカーの発生によらずその振幅（amplitude）、即ち濃度によって区別する振幅マーカーを記載している。ＷＯ ２００６／１０６１２９では、異なる試料の異なるたんぱく質濃度を補正するために、質量分析計による試料の検査後に、総振幅を１００万カウントに対して正規化している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ ０１／８４１４０
【特許文献２】ＷＯ ２００４／０６８１３０
【特許文献３】ＷＯ ２００５／０２４４０９
【特許文献４】ＷＯ ２００６／１０６１２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、試料中の異なる濃度の検体を比較し、それにより参照試料と測定試料との間のより良好な比較可能性（comparability）を達成するために、より具体的な正規化手順が依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
驚くべきことに、この目的は、尿試料中の少なくとも１つの検体の濃度を正規化するための方法であって、以下の工程：
ａ）少なくとも１つの検体の濃度を測定する工程；
ｂ）少なくとも１つのコラーゲンまたはコラーゲン断片の濃度を測定する工程；
ｃ）前記少なくとも１つのコラーゲンまたはコラーゲン断片の濃度に対して、前記少なくとも１つの検体の濃度を正規化する工程、
を含む、前記方法、
によって達成することができる。
【００１０】
本発明による方法は、幅広い用途を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例２における回帰の質を示す。
【図２】実施例３における回帰の質を示す。
【図３−１】表１に示すコラーゲン断片の配列を示す。
【図３−２】表１に示すコラーゲン断片の配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
まず、検体、コラーゲンまたはコラーゲン断片の含有量が測定される。測定のためには、例えば、ＵＶ／Ｖｉｓ検出器、蛍光検出器、屈折率検出器、ダイオードアレイ検出器、質量分析計、ゲルスキャナー、たんぱく質の染色、例えば、クマシーブリリアントブルー（Coomassie brilliant blue）、銀染色法、Cy2、Cy3、Cy5など、または誘導体化、例えば、ITRAC (isotope tags for relative and absolute qualification) およびICAT(isotope coded affinity tagging)、ならびにその後の誘導体化されたペプチドの検出、を使用することができる。
【００１３】
本発明によれば、コラーゲンまたはコラーゲン断片が、試料の正規化のために使用される。少なくとも１つのコラーゲンまたはコラーゲン断片が、試料中で同定される。この目的のために、特に、マススペクトル、ＵＶ／Ｖｉｓスペクトル、蛍光スペクトルまたは特定のリガンド、例えば特定の抗体、に対するアフィニティによって任意に完結される移動および保持時間による同定が適当である。
【００１４】
検体の濃度は、その後、前記少なくとも１つのコラーゲンまたはコラーゲン断片の濃度に対して正規化され得る。即ち、検体の濃度は、参照コラーゲンまたはコラーゲン断片の濃度に対して測定される。
【００１５】
しかし、好ましくは、１つのコラーゲンまたはコラーゲン断片ではなく、いくつかの、例えば、２つもしくは３つもしくは４つもしくは５つまたは１０、２０、３０、４０もしくは５０のコラーゲンまたはコラーゲン断片が、正規化のために使用される。
【００１６】
好ましい態様において、検体は、いずれのヒドロキシピリジニウムコラーゲン架橋も含まず、特に、ヒドロキシリシルピリジノリン(Pyd)およびデオキシピリジノリン(Dpd)を含まない。好ましくは、他のいずれの検体の濃度の正規化のためにも、これら化合物を使用しない。
【００１７】
好ましく使用されるコラーゲン断片を、以下の表に記載する。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
配列を、図３に示す。
【００２０】
本発明は、特に、上記コラーゲン断片による、尿試料の検体濃度を正規化するためのコラーゲン断片の使用にも関する。
【００２１】
その含有量が正規化される好ましい検体には、特に、たんぱく質、ペプチド、脂質、代謝産物、塩、および他のイオン性化合物、炭水化物が含まれる。
【００２２】
ペプチド濃度を正規化するための方法の使用が、特に好ましい。
【００２３】
一態様では、試料は、まず副次標本(subsamples)にさらに分離される(subdivided)。
【００２４】
これを達成するために、異なる方法、例えば：
−アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過、のような、ＦＰＬＣまたはＨＰＬＣを任意に使用するクロマトグラフィー法；
−ＳＥＬＤＩ法、ＣｌｉｎＰｒｏｔ法のような、特定の材料への吸着；
−ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動のような、電気泳動法、
を使用することができる。
【実施例】
【００２５】
本発明を、以下の実施例により更に説明する。
【００２６】
実施例１
尿試料を、ＨＰＬＣを用いてダウンストリーム(downstream)ダイオードアレイ検出器(DAD)により検査した。生データを表に示す。ピークは、DADにおける保持時間およびスペクトルによって同定した。これら４つのコラーゲン断片について予め測定していた標準(standard)と測定(measurement)とを比較し、それぞれについて換算因子を算出した。これら因子の平均（この場合は0.80761277）を、他のすべてのシグナルに対する正規化因子（normalizing factor）として使用した。正規化されたシグナルを、最後の欄に記載する。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
実施例２
尿試料を、ソンボーンカードら（Thongboonkerd et al.）、Kidney Int 62: 1461-1469 (2002)に記載されているような2D電気泳動によって、３〜１０のｐＨ範囲にわたって、長さ２２ｃｍのポリアクリルアミドゲルを用いて分離した。ゲルをクマシー染色によって染色し、免疫学的方法（ウエスタンブロット）を用いて並行して調製したゲルにおいてコラーゲンを検出した。これら５つのたんぱく質について予め測定した標準を使用し、線形回帰（linear regression）を実施した。この較正式により、更に値を換算した。式は、Y = 103.82x − 127449であった。Ｒ2値は0.957であった。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
回帰の質を、図１に示す。
【００３１】
実施例３
尿試料を、質量分析計を組み合わせたキャピラリー電気泳動によって検査した。それにより２７個のコラーゲン断片を同定することができ、それをその後予め測定していた標準と比較した。この後、直線は必ずゼロの値を通るという条件による線形回帰を用いて正規化を行った。対応する測定データおよび較正を、以下の表に示す。
【００３２】
【表４】
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【００３３】
回帰の質を、図２に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【国際調査報告】
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