(57)【要約】  本発明は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を数日または数週間の持続期間にわたって放出するための新規の製剤に関するものである。  本発明は、第１態様において、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）とポリマー（ＰＯ）のコロイド粒子を基にした水性懸濁液とを備える液体製剤に関するものであり、前記製剤は、以下の４つの条件：  （ａ）ポリマー（ＰＯ）が、グルタミン酸残基を含むポリアミノ酸であり、ここで、    一部のグルタミン酸残基は、それぞれがペンダントの陽イオン基（ＣＧ）を有し、前記陽イオン基は、互いに同一でも異なっていてもよく、    他のグルタミン酸残基は、それぞれがペンダントの疎水基（ＧＨ）を有し、前記疎水基（ＧＨ）は、互いに同一でも異なっていてもよいこと、  （ｂ）前記製剤のｐＨのｐＨｆ値が、３．０〜６．５の間であること；  （ｃ）前記ｐＨｆ値にて、ポリマー（ＰＯ）が、活性成分（ＡＰ）と自発的に非共有で会合しているコロイド溶液を形成すること；  （ｄ）１ｍｌの前記製剤が、体積１ｍｌのテスト緩衝溶液Ｔｐと混合する間に沈殿すること、  を満たす。  本発明はまた、かかる製剤を調製する方法と、かかる製剤を含む薬剤を調製する方法とに関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する液体製剤であって、前記製剤は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）と、ポリマー（ＰＯ）又はその製剤可能な塩のコロイド粒子を基にした水性懸濁液とを備えてなり、以下の４つの条件：
（ａ）ポリマー（ＰＯ）が、グルタミン酸残基を含むポリアミノ酸であり、ここで、
一部のグルタミン酸残基は、それぞれがペンダントの陽イオン基（ＣＧ）を有し、前記陽イオン基は、互いに同一でも異なっていてもよく、
他のグルタミン酸残基は、それぞれがペンダントの疎水基（ＧＨ）を有し、前記疎水基（ＧＨ）は、互いに同一でも異なっていてもよく、
任意には、更に他のグルタミン酸残基が、それぞれペンダントの中性基（ＮＧ）を有し、前記中性基（ＮＧ）は、互いに同一でも異なっていてもよく、
任意には、更に他のグルタミン酸残基が、未変性であること；
（ｂ）前記製剤のｐＨのｐＨｆ値が、３．０〜６．５の間であること；
（ｃ）前記ｐＨｆ値にて、ポリマー（ＰＯ）が、活性成分（ＡＰ）と自発的に非共有で会合しているコロイド溶液を形成すること；及び
（ｄ）１ｍｌの前記製剤が、体積１ｍｌのテスト緩衝溶液Ｔｐとの混合中に沈殿すること、
を満たすことを特徴とする製剤。
【請求項２】
前記製剤が、２００より大きい、好ましくは４００より大きい、好ましくは８００より大きい、更に好ましくは１５００より大きい沈殿因子ＰＦを有することを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記製剤が、５より大きい、好ましくは１０より大きい、好ましくは１５より大きい、更に好ましくは２０より大きい保持因子ＲＱを有することを特徴とする請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
ポリマー（ＰＯ）は、ｐＧｌｕ（ｘ）ＧＨ（ｙ）ＣＧ（ｚ）ＮＧ（１−ｘ−ｙ−ｚ）の構造で、合計の重合度（ＤＰ）が５０〜３００の間、好ましくは１００〜２５０の間である構造を有し、ここで、（ｘ）は０〜０．４５の間で、（ｙ）は０．０２〜０．３の間で、（ｚ）は０．４〜０．９８の間で、（１−ｘ−ｙ−ｚ）は０〜０．５の間であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製剤。
【請求項５】
前記陽イオン基（ＣＧ）は、半中和ｐＨが７．０未満の弱塩基から選択されることを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
前記陽イオン基（ＣＧ）は、少なくとも一つの第４級アンモニウム又は少なくとも一つの強塩基を含む陽イオン基から選択され、半中和ｐＨが８．０より大きいことを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
前記陽イオン基（ＣＧ）が、以下の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ３＋，Ｚ−（ここで、ｗは２〜６の間であり、好ましくはｗが４である）、
−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋，Ｚ−、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ３＋，Ｚ−、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ＋（ＣＨ３）３，Ｚ−、及び
下記式：
【化１】
2010526041.tif 000026
（式中、−Ｒ１は、アルコキシ、好ましくは−ＯＭｅもしくは−ＯＥｔであるか、又は−Ｒ１は、−ＮＨ２、アルキルアミノ−、好ましくは−ＮＨ−ＣＨ３もしくは−Ｎ（ＣＨ３）２であり；−Ｒ１３は、−（ＣＨ２）４−ＮＨ３＋，Ｚ−、−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋，Ｚ−、−（ＣＨ２）３−ＮＨ３＋，Ｚ−である）のアミノ酸残基又はアミノ酸誘導体、
から選択され、Ｚ−が、塩化物、硫酸塩もしくはリン酸塩又は酢酸塩であり、好ましくは塩化物であることを特徴とする請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
ｘが１０〜５５％の間であり、
ｙが２〜３０％の間であり、
ｚが１０％より大きいか又は１０％と等しく、（ｘ−１０）％から（ｘ＋１５）％の間であり、
中性基の数は１００％に到達するための追加のパーセンテージに相当しており、任意には０と等しくすることができることを特徴とする請求項３、６及び７のいずれかに記載の製剤。
【請求項９】
ｘが２０〜５５％の間であり、
ｙが２〜７．５％の間であり、
ｚが２０％より大きいか又は２０％と等しく、（ｘ−１０）％から（ｘ＋１５）％の間であり、
中性基の数は１００％に到達するための追加のパーセンテージに相当しており、任意には０と等しくすることができることを特徴とする請求項３、６及び７のいずれかに記載の製剤。
【請求項１０】
前記疎水基（ＧＨ）が、
・任意には少なくとも一つの不飽和結合及び／又は少なくとも一つのヘテロ原子を有することができる直鎖又は分岐Ｃ８〜Ｃ３０アルキル、
・任意には少なくとも一つの不飽和結合及び／又は少なくとも一つのヘテロ原子を有することができるＣ８〜Ｃ３０アルキルアリール又はアリールアルキル、並びに
・任意には少なくとも一つの不飽和結合及び／又は少なくとも一つのヘテロ原子を有することができるＣ８〜Ｃ３０（多）環式化合物、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の製剤。
【請求項１１】
前記中性基（ＮＧ）が、ヒドロキシエチルアミノ−ラジカル、ヒドロアルキルオキシ−ラジカル及びポリオキシアルキレンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項１２】
前記ポリマー（ＰＯ）が、グルタミン酸塩残基に結合したポリアルキレン（好ましくはポリエチレン）グリコールタイプのグラフト部を少なくとも一つ有することを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項１３】
前記ポリアミノ酸（ＰＯ）が、下記式（Ｉ）：
【化２】
2010526041.tif 000027
（式（Ｉ）中、
・Ａは、独立して、
−ＮＨＲ基（ここで、ＲはＨ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキル又はベンジルを示す）、
次式：
【化３】
2010526041.tif 000028
（式中：
Ｒ７は、ＯＨ、ＯＲ９又はＮＨＲ１０であり、
Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、独立して、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキル又はベンジルである）の末端アミノ酸残基又は末端アミノ酸誘導体、
であり；
・Ｂは、直接結合、又は二価、三価もしくは四価の結合基であり、好ましくは−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ５アルキル）−、アミノ酸（好ましくは天然アミノ酸）残基、ジオール残基、トリオール残基、ジアミン残基、トリアミン残基、アミノアルコール残基又は１〜６の炭素原子を有するヒドロキシ酸残基のラジカルから選択され；
・Ｄは、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アシル基又はピログルタミン酸塩であり；
・疎水基ＧＨは、それぞれが互いに独立して、
・任意には少なくとも一つの不飽和結合及び／又は少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯ及び／又はＮ及び／又はＳ）を有することができる直鎖又は分岐Ｃ８〜Ｃ３０アルキル、又は
・任意には少なくとも一つの不飽和結合及び／又は少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯ及び／又はＮ及び／又はＳ）を有することができるＣ８〜Ｃ３０アルキルアリール又はアリールアルキル、又は
・任意には少なくとも一つの不飽和結合及び／又は少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯ及び／又はＮ及び／又はＳ）を有することができるＣ８〜Ｃ３０（多）環式化合物、
から選択される基であり；
・Ｒ７０は、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ３＋（ここで、ｗは２〜６の間であり、好ましくはｗが４である）、
−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ３＋、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ＋（ＣＨ３）３、
下記式：
【化４】
2010526041.tif 000029
（式中、−Ｒ１１は、−Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、アルキルエステル（好ましくは−ＣＯＯＭｅ及び−ＣＯＯＥｔ）、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ３又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）２である）を有する基、
次式：
【化５】
2010526041.tif 000030
（式中、Ｘは、−Ｏ−又は−ＮＨ−で、Ｒ１２は、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキル又はベンジルで、Ｒ１３は、−（ＣＨ２）４−ＮＨ３＋、−（ＣＨ２）３ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋、−（ＣＨ２）３ＮＨ３＋である）のアミノ酸残基又はアミノ酸誘導体、
から選択される基であり、
前記Ｒ７０の対アニオンが、便宜の基であり、好ましくは塩化物であり；
・Ｒ９０は、ヒドロキシエチルアミノ−、ヒドロキシアルキルオキシ−、又はポリオキシアルキレンであり；
・ｐ，ｑ，ｒ及びｓは、正の整数であり；
・（ｐ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、疎水基ＧＨのモルグラフト度として定義され、２〜３０モル％の範囲であり、但し、各コポリマー鎖は、平均して、少なくとも三つの疎水性グラフト部を有しており；
・（ｑ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、陽イオン基のモルグラフト度として定義され、１０〜９８モル％の範囲であり；
・（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、５０〜３００の範囲であり、好ましくは１００〜２５０の間であり；
・（ｒ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、０〜７８モル％の範囲であり；
・（ｓ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、０〜５５モル％の範囲である）を有することを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項１４】
ポリマー（ＰＯ）又はその製剤可能な塩の濃度が、前記製剤中４〜５０ｍｇ／ｍｌの間であることを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項１５】
活性成分（ＡＰ）濃度のポリマー（ＰＯ）又はその製剤可能な塩の濃度に対する比Ｒが、０．０００１〜１．５の間であることを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項１６】
二価の陽イオンＺｎ＋＋を、陽イオン基（ＣＧ）のモル濃度に対して０．０５〜２モル当量の割合で備えることを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項１７】
前記製剤が、追加される二価の陽イオンを備えていないことを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項１８】
前記活性成分（ＡＰ）が、タンパク質、糖タンパク質、一つ又はそれ以上のポリアルキレングルコール鎖と結合したタンパク質［好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）：「ＰＥＧ化タンパク質」］、ペプチド、多糖類、リポ糖類、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及びそれらの混合物からなる群から選択され、
更に好ましくは、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、ダーベポエチン等のエリスロポエチン、ヘモグロビンラフィマー、それらの類似体又はそれらの誘導体；オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、造血を刺激する因子及びそれらの混合物の他、アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ、第ＶＩＩ（ａ）因子又は第ＶＩＩ因子等の血液因子；ヘモグロビン、シトクロム、アルブミン、プロラクチン、ルリベリンの他、ロイプロリド、ゴセレリン、トリプトレリン、ブセレリン又はナファレリン等の黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）及び類似体；ＬＨＲＨアンタゴニスト、ＬＨＲＨ競合体、ヒト、ブタ又はウシの成長ホルモン（ＧＨｓ）、成長ホルモン放出因子、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、インターロイキン又はそれらの混合物（ＩＬ−２，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２）の他、インターフェロンアルファ、アルファ−２ｂ、ベータ、ベータ−１ａ又はガンマ等のインターフェロン；ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドモルフィン、アンジオテンシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）の他、ベクラペルミン、トラフェルミン、アンセスチム又はケラチノサイト成長因子等の成長因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ヘパリナーゼ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ｈＡＮＰ、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、ＶＥＧ−Ｆ、組換えＢ型肝炎表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）、レニン、サイトカイン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシジン、グラミシジン、エタネルセプト、イミグルセラーゼ、ドロトレコギンアルファ、シクロスポリン及び合成類似体、並びに酵素、サイトカイン、抗体、抗原及びワクチンの製剤可能な活性修飾体及び断片、リツキシマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、エファリズマブ及びセツキシマブ等の抗体の下位群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の製剤。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の液体製剤から得られた乾燥粉末の形態を備えることを特徴とする少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する固体の製剤。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれかに記載の少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する製剤を調製する方法であって、
１）３〜６．５の間のｐＨ値で、ポリアミノ酸ポリマー（ＰＯ）の水性コロイド溶液を準備する工程であって、前記ポリアミノ酸ポリマー（ＰＯ）がグルタミン酸残基を含み、ここで、
一部のグルタミン酸残基は、それぞれがペンダントの陽イオン基（ＣＧ）を有し、前記陽イオン基は、互いに同一でも異なっていてもよく、
他のグルタミン酸残基は、それぞれがペンダントの疎水基（ＧＨ）を有し、前記疎水基（ＧＨ）は、互いに同一でも異なっていてもよく、
任意には、更に他のグルタミン酸残基が、それぞれペンダントの中性基（ＮＧ）を有し、前記中性基（ＮＧ）は、互いに同一でも異なっていてもよく、
任意には、更に他のグルタミン酸残基が、未変性であり；
陽イオン基（ＣＧ）、疎水基（ＧＨ）、任意の中性基（ＮＧ）及び任意のグルタミン酸塩の各モル分率は、１ｍｌの前記製剤が体積１ｍｌのテスト緩衝溶液Ｔｐとの混合中に沈殿するほどである工程と；
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を工程１において得られたポリマー（ＰＯ）に加える工程であって、前記活性成分が前記ポリマーのコロイド溶液の粒子と非共有で会合している工程と、
を備えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一つ又は複数の活性成分（ＡＰ）、とくに一つ又は複数のタンパク質およびペプチド活性成分を持続放出する新規の製剤に関するものである。また、本願は、これらの製剤の用途または使用、とくに治療用途または使用に関するものである。これらの活性製剤は、ヒトの治療および動物の治療の両方に関するものである。
【０００２】
本明細書を通して用いるＡＰは、少なくとも一つの活性成分を示す。
【背景技術】
【０００３】
薬剤ＡＰ、とくに治療用ペプチド／タンパク質の持続放出の分野において、その目的は、多くが、患者に可能な限り健康体において観測される値に近い血漿ペプチドまたはタンパク質血漿濃度を再現することである。
【０００４】
この目的は、血漿におけるタンパク質の短い寿命に抵触し、これによって、治療用タンパク質の反復投与を導く。その結果として、治療用タンパク質の血漿濃度は、高濃度ピークおよび最低濃度によって特徴づけられるプロファイルを示す。濃度ピークは、健康体における基本濃度よりずっと高く、サイトカイン等の治療用タンパク質の高毒性のために非常に有害である。さらに、最低濃度は、治療効果を与えるのに必要な濃度より低く、その結果、患者に対して低い治療範囲および長期間の重篤な副作用をもたらす。
【０００５】
したがって、治療に対して理想的な値に近い治療用タンパク質の血漿濃度を患者において再現するため、製剤は、時間と共に血漿濃度の変動を制限するように、持続時間にわたって治療用タンパク質を放出できるようにすることが重要である。
【０００６】
さらに、この活性製剤は、好ましくは、当業者には既知である以下の要件を満たすべきである。
１．活性および非変性治療用プロテイン、例えば、ヒトタンパク質または合成タンパク質を持続放出し、血漿濃度を治療用の濃度に維持すること
２．容易に注入可能とするのに十分に低い注射での粘度
３．優れた毒性・耐性プロファイルを示す生体適合性および生分解性
【０００７】
これらの目的を達成する試みにおいて、従来技術において提示された最良のアプローチの一つは、治療用タンパク質を有するナノ粒子の比較的非粘性の液体懸濁液から成る治療用タンパク質の持続放出形態を開発することであった。これらの懸濁液によって、天然の治療用タンパク質を簡単に投与することが可能になる。
【０００８】
このようにして、フラメル・テクノロジーズは、治療用タンパク質が、疎水基および親水基を有するコポリアミノ酸のナノ粒子と会合する手段を提供してきた。
【０００９】
米国特許出願公開第２００６／００９９２６４号明細書（特許文献１）は、アスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基を備える両親媒性ポリアミノ酸を開示し、これらの残基の少なくとも一部は、例えば、少なくとも一つのα−トコフェロール残基を有するグラフトを持つ（合成もしくは天然由来のα−トコフェロールとグラフトしたポリグルタミン酸塩またはポリアスパラギン酸塩）。これらの「疎水的に変性された」ホモポリアミノ酸は、ｐＨ７．４の水性懸濁液において少なくとも一つの活性タンパク質（インスリン）と容易に会合することができるナノ粒子のコロイド懸濁液を水中で自発的に形成する。
【００１０】
特許文献１に記載の懸濁液によって「ベクトル化した」一つ又は複数の活性タンパク質（例えばインスリン）の生体内での放出時間は、長くなることによって効果が上がる。
【００１１】
放出時間の増加は、とくに国際公開第０５／０５１４１６号（特許文献２）に記載の製剤によって部分的に得られた。この出願は、皮下注射後、内因性アルブミンに接触してその患者のインサイチューでゲルを形成するような濃度で注射される疎水的に変性したポリ（Ｌ−グルタミン酸ナトリウム）のナノ粒子（０．００１〜０．５μｍ）のコロイド懸濁液を開示する。タンパク質は、その後、１週間の標準的な期間をかけてゆっくりと放出される。しかしながら、投与される治療用タンパク質の濃度が比較的高い場合、例えばヒト成長ホルモンのような場合には、放出時間が数日に限定される。
【００１２】
これらの製剤の放出時間は、さらに長くなることで効果が上がる。
【００１３】
皮下注射後の生体内でのＡＰの放出時間を長くするために提示された別の経路は、注射温度では液体であるが、温度が３７℃に上昇するとゲルを形成する製剤を使用するものである。
【００１４】
国際公開第９９／１８１４２号（特許文献３）および国際公開第００／１８８２１号（特許文献４）は、とくに注射によって温血動物に投与でき、また、生理的温度がゲル化温度より高いため生体内でゲル化した沈殿物を形成するポリマーを溶解状態又はコロイド状態で備えるＡＰの水溶液に関するものである。このようにして形成されるゲルは、持続的にＡＰを放出する。これらの特定の生分解性ポリマーは、ＡＢＡまたはＢＡＢのトリブロックであり、ここで、Ａ＝ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＡＧＡ）又はポリ乳酸（ＰＬＡ）であり、Ｂ＝ポリエチレングリコールである。これらトリブロックポリマーの液体からゲルへの転移温度は、例えば、３６℃、３４℃、３０℃および２６℃である。米国特許第６１４３３１４号明細書（特許文献５）に記載の類似のポリマー（Ａ）は、これらＡＢＡまたはＢＡＢのトリブロックポリマーの生体内での加水分解によって、局所的に十分な耐性がない酸をもたらす。
【００１５】
国際出願第ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００２４４３号（特許文献６）は、本出願人によるものであり、ヒスチジン誘導体および疎水基によって変性されたポリグルタミン酸塩およびそれらの用途を開示する。
【００１６】
とくに、この出願は、ポリマーが酸性のｐＨで可溶であり、中性のｐＨで沈殿することを開示する。これにより、治療用タンパク質等の活性成分を放出するための製剤の調製が可能となる。
【００１７】
かかるポリマーを用いて持続放出するための自己沈澱水性液体製剤の開発との関連で、予想外にも、厳しい要件を満たす製剤がある特定の条件下でしか得られないことを見出した。
【００１８】
例えば、特許文献６に記載のポリマーｐＧｌｕＨｉｓＯＥｔ  α−トコフェロールは、ｐＨ５．５で処方され、４５ｍｇ／ｍｌのポリマーを備えるが、期待される結果につながらない。
【００１９】
出願人の長期にわたる研究は、ｉ）自己沈澱システムの要件を満たす陽イオン性ポリマー（ＰＯ）を備える製剤、及びｉｉ）かかる製剤を選択するための特定の条件の識別に至った。これらのポリマー（ＰＯ）は、特許文献６に記載のポリマーまたは陽イオン基を有し且つ疎水基を有する新規なポリマーの群のいずれか一方から選択できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第２００６／００９９２６４号明細書
【特許文献２】国際公開第０５／０５１４１６号
【特許文献３】国際公開第９９／１８１４２号
【特許文献４】国際公開第００／１８８２１号
【特許文献５】米国特許第６１４３３１４号
【特許文献６】国際出願第ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００２４４３号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の目的の一つは、疎水性側基を有する陽イオン性アミノ酸誘導体によって修飾され、活性成分（ＡＰ）を持ち、数日または数週間の持続期間を通して活性成分（ＡＰ）を放出するポリグルタミン酸塩ポリマーに基づく新規の製剤を提供することである。
【００２２】
本発明の他の目的は、疎水性側基を有する陽イオン性アミノ酸誘導体によって修飾されたポリグルタミン酸塩ポリマーに基づく新規の液体製剤を提供することであり、該製剤は活性成分（ＡＰ）を持ち、該製剤の組成および濃度によって、活性成分の放出時間を皮下投与に対して最適化することができる。
【００２３】
本発明の他の目的は、疎水性側基を有する陽イオン性アミノ酸誘導体によって修飾されたポリグルタミン酸塩ポリマーに基づく新規の液体製剤を提供することであり、該製剤は活性成分を持ち、製剤の組成は、活性成分（ＡＰ）の放出を数日または数週間にわたって可能とするようなものであり、ポリマーは可能な限り低い濃度である。
【００２４】
本発明の他の目的は、疎水性側基を有する陽イオン性アミノ酸誘導体によって修飾されたポリグルタミン酸塩ポリマーに基づく新規の液体製剤を提供することであり、該製剤は活性成分（ＡＰ）を持ち、該製剤の組成および濃度によって、細い針を通して簡単に注入することができる。
【００２５】
本発明の他の目的は、水溶液中で安定な疎水性側基を有する陽イオン性アミノ酸誘導体によって修飾されたポリグルタミン酸塩ポリマーに基づく新規の液体製剤を提供することである。
【００２６】
本発明の他の目的は、凍結乾燥された形態で貯蔵することができる疎水性側基を有する陽イオン性アミノ酸誘導体によって修飾されたポリグルタミン酸塩ポリマーに基づく新規の製剤を提供することである。
【００２７】
本発明の他の目的は、凍結乾燥後に容易に再分散させることのできる疎水性側基を有する陽イオン性アミノ酸誘導体によって修飾されたポリグルタミン酸塩ポリマーに基づく新規の製剤を提供することである。
【００２８】
本発明の他の目的は、疎水性側基を有する陽イオン性アミノ酸誘導体によって修飾されたポリグルタミン酸塩ポリマーに基づく新規の製剤を提供することであり、該製剤は活性成分（ＡＰ）を持ち、ここで、該製剤は、凍結乾燥された形態で安定である。
【００２９】
本発明の他の目的は、疎水性側基を有する陽イオン性アミノ酸誘導体によって修飾されたポリグルタミン酸塩ポリマーに基づく新規の製剤を提供することであり、ここで、該製剤は、その生物活性に影響を与えることなくタンパク質を放出する。
【００３０】
本発明の他の目的は、活性成分（ＡＰ）を持続放出するための固体製剤、特に、例えば吸入および肺内投与のための乾燥粉末の形態で提供することである。
【００３１】
本発明の他の目的は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出するための製剤を調製する新規の方法を提供することであり、この製剤は、とくに上述した製剤の内の一つである。
【００３２】
本発明の他の目的は、これらの製剤を用いた薬剤を調製するための新規の方法を提供することである。
【００３３】
長期にわたる広範囲の調査の後、出願人は、疎水性側基を有する陽イオン性アミノ酸誘導体によって修飾されたポリグルタミン酸塩ポリマーに基づく製剤が治療用タンパク質およびペプチドの持続放出を最適化することを見出した。
【００３４】
したがって、本発明は、第一に、例えば非経口経路を介して、容易に注入することができる少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出するための水性製剤に関するものであり、該製剤は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）と、ポリマー（ＰＯ）又はその製剤可能な塩のコロイド粒子に基づく水性懸濁液とを備えてなり、ここで、前記製剤は、以下の４つの条件：
（ａ）ポリマー（ＰＯ）が、グルタミン酸残基を含むポリアミノ酸であり、ここで、
一部のグルタミン酸残基は、それぞれがペンダントの陽イオン基（ＣＧ）を有し、前記陽イオン基は、互いに同一でも異なっていてもよく、
他のグルタミン酸残基は、それぞれがペンダントの疎水基（ＧＨ）を有し、前記疎水基（ＧＨ）は、互いに同一でも異なっていてもよく、
任意には、更に他のグルタミン酸残基が、それぞれペンダントの中性基（ＮＧ）を有し、前記中性基（ＮＧ）は、互いに同一でも異なっていてもよく、
任意には、更に他のグルタミン酸残基が、未変性であること；
（ｂ）前記製剤のｐＨ値（ｐＨｆ）が、３．０〜６．５の間であること；
（ｃ）ｐＨｆにて、ポリマー（ＰＯ）が、活性成分（ＡＰ）と自発的に非共有で会合しているコロイド溶液を形成すること；
（ｄ）１ｍｌの前記製剤が、体積１ｍｌのテスト緩衝溶液Ｔｐとの混合中に沈殿すること；
を満たす。
【００３５】
好ましくは、かかる製剤は、２００より大きい、好ましくは４００より大きい、好ましくは８００より大きい、さらに好ましくは１５００より大きい沈殿因子ＰＦを示す。
【００３６】
また、本発明は、例えば非経口経路を介して、容易に注入することができる少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出するための水性液体製剤に関するものであり、該製剤は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）と、ポリマー（ＰＯ）又はその製剤可能な塩のコロイド粒子に基づく水性懸濁液とを備えてなり、ここで、該製剤は、以下の４つの条件：
（ａ）ポリマー（ＰＯ）が、グルタミン酸残基を含むポリアミノ酸であり、ここで、
一部のグルタミン酸残基は、それぞれがペンダントの陽イオン基（ＣＧ）を有し、前記陽イオン基は、互いに同一でも異なっていてもよく、
他のグルタミン酸残基は、それぞれがペンダントの疎水基（ＧＨ）を有し、前記疎水基（ＧＨ）は、互いに同一でも異なっていてもよく、
任意には、更に他のグルタミン酸残基が、それぞれペンダントの中性基（ＮＧ）を有し、該中性基（ＮＧ）は、互いに同一でも異なっていてもよく、
任意には、更に他のグルタミン酸残基が、未変性であること；
（ｂ）前記製剤のｐＨ値（ｐＨｆ）が、３．０〜６．５の間であること；
（ｃ）ｐＨｆにて、ポリマー（ＰＯ）が、活性成分（ＡＰ）と自発的に非共有で会合しているコロイド溶液を形成すること；
（ｄ）前記製剤が、２００より大きい、好ましくは４００より大きい、好ましくは８００より大きい、さらに好ましくは１５００より大きい沈殿因子ＰＦを示すこと；
を満たす。
【００３７】
更に、この製剤は、好ましくは５より大きい、好ましくは１０より大きい、好ましくは１５より大きい、さらに好ましくは２０より大きい保持因子ＲＱを示す。
【００３８】
ポリマーの所定の濃度については、活性因子（ＡＰ）の放出速度が、ポリマーの組成、すなわち陽イオン基、疎水性サイドグラフト部、並びに任意には中性基およびグルタミン酸塩基のそれぞれのモル分率に大きく依存する。
【００３９】
また、本発明は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出するための製剤を調製する方法に関するものであり、この製剤は、特に上述の製剤であり、該方法は、
１）３〜６．５の間のｐＨ値で、グルタミン酸残基を含むポリアミノ酸ポリマー（ＰＯ）の水性コロイド溶液を準備する工程であって、ここで、
一部のグルタミン酸残基は、それぞれがペンダントの陽イオン基（ＣＧ）を有し、前記陽イオン基は、互いに同一でも異なっていてもよく、
他のグルタミン酸残基は、それぞれがペンダントの疎水基（ＧＨ）を有し、前記疎水基（ＧＨ）は、互いに同一でも異なっていてもよく、
任意には、更に他のグルタミン酸残基が、それぞれペンダントの中性基（ＮＧ）を有し、該中性基（ＮＧ）は、互いに同一でも異なっていてもよく、
任意には、更に他のグルタミン酸残基が、未変性であり；
陽イオン基（ＣＧ）、疎水基（ＧＨ）、任意の中性基（ＮＧ）および任意のグルタミン酸塩の各モル分率は、１ｍｌの前記製剤が体積１ｍｌのテスト緩衝溶液Ｔｐとの混合中に沈殿するほどである工程と；
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を工程１において得られたポリマー（ＰＯ）に加える工程であって、前記活性成分が前記ポリマーのコロイド溶液の粒子と非共有で会合している工程と、
を備えてなり、前記製剤の最終的な治療上での使用の直前（例えば３０分前）に前記活性成分を加える工程を行うことができる。
【００４０】
また、本発明は、特に、非経口、粘膜、皮下、筋内、皮内、経皮、腹腔内もしくは大脳内投与用、または腫瘍への投与用、或いは経口、経鼻、肺、膣もしくは眼球経路による投与用の薬剤を調製する方法に関するものであり、前記方法は、ここに記載される少なくとも一つの製剤を用いることから本質的になる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】例２．１（黒三角）、例２．３（黒菱形）、例３（黒四角）および例５（実線）に記載される製剤からのＩＦＮ−αの生体外での放出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
定義
本明細書において、「陽イオン基」という用語は、一つもしくはそれ以上のアミノ基又は一つもしくはそれ以上の第４級アンモニウムを備えるグルタミン酸基に共有結合している基を意味すると理解される。アミノ官能基の場合、該基は、主にそのｐＫａ以下のどんなｐＨでもイオン化し、第４級アンモニウムの場合には、該基がどんなｐＨでもイオン化している。他に特に規定がなければ、アルキルラジカルは、１〜１０の炭素原子を示す。
【００４３】
本明細書において、「中性基」という用語は、３〜１０の間のいずれのｐＨにおいても電荷を帯びない基を意味すると理解され、例えば、グルタミン酸残基のカルボキシル基でのエタノールアミノ、アルキレングリコール又はポリアルキレングリコールとの縮合によって得られる基が挙げられる。
【００４４】
本発明に係るポリマーの「製剤可能な塩」という用語は、ポリマーのイオン化した官能基と会合した対イオンを持つ全てのポリマーを包含すると理解される。
【００４５】
本明細書において、「溶液」という用語は、個々の鎖の形で溶媒とポリマーとの均一な溶液を意味すると理解される。
【００４６】
本明細書において、「コロイド溶液」という用語は、Ｔ'テストで測定したときにその平均径が０．５μｍ未満か又はそれに等しい粒子の懸濁液を意味すると理解される。
【００４７】
本明細書において、（例えば、非経口経路により）「容易に注入可能な製剤」という用語は、２０℃での動的粘度が１０００ｍＰａ．ｓ．未満か又はそれに等しい製剤を意味すると理解される。好ましくは、２０℃で測定した該製剤の動的粘度は、１０００ｓ−１のせん断勾配に対して、好ましくは５００ｍＰａ．s．未満か又はそれに等しく、好ましくは２〜２００ｍＰａ．ｓ．の間であり、例えば１．０〜１００ｍＰａ．ｓ．の間であり、実際には１．０〜５０ｍＰａ．ｓ．の間である。
【００４８】
本明細書において、「小分子」という用語は、分子量が１ｋＤａ未満の分子、特には非タンパク性分子を意味すると理解される。
【００４９】
本明細書において、「ｐＨｆ」という用語は、本発明に従う製剤のｐＨを意味すると理解される。
【００５０】
本明細書において、「ｐＨ＊」という用語は、Ｐテストを用いて測定されるポリマーＰＯに基づく製剤の沈澱のｐＨを意味すると理解される。
【００５１】
５００ｎｍにて吸光度を測定することによって沈澱ｐＨ＊のｐＨを測定するためのＰテスト
０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む１又は２ｍｇ／ｍｌのポリマーＰＯ濃縮液を、酢酸又は１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を加えることによってｐＨ４にし、２４時間攪拌しながら置いておく。その後、この溶液を０．８〜０．２μｍフィルタに通して濾過する。次いで、この溶液を０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液で滴定し、ポリマーＰＯ溶液の５００ｎｍでの吸光度の変化を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ３５ＵＶ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒタイプの装置を用いて、前記溶液のｐＨの関数として記録する。沈澱のｐＨ（ｐＨ＊）は、吸光度が急激に増加して１より大きな値に到達するときのｐＨの値に相当する。
【００５２】
本明細書において、「テスト緩衝溶液Ｔｐ」という用語は、３０ｍｇ／ｇウシアルブミン画分Ｖ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０１Ｍのリン酸緩衝液、０．００２７Ｍの塩化カリウム、０．１３７Ｍの塩化ナトリウム（ＡｌｄｒｉｃｈのＰＢＳ）および０．０１５Ｍの酢酸アンモニウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）を備える水性媒体を意味すると理解される。
【００５３】
本明細書において、「Δｎ」という用語は、ポリマーＰＯ １ｍｇを備えるコロイド溶液０．５ｍｌをｐＨｆからｐＨ＊にするのに必要な水酸化ナトリウムのモル数を意味すると理解され、前記数は、従来の酸／塩基滴定法ＴＭによって得られる。
【００５４】
０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２ｍｇ／ｍｌに濃縮された高分子電解質の溶液を酢酸又は１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を加えることによってｐＨ４にする。その後、この溶液を０．０５Ｍの水酸化ナトリウム溶液で滴定し、ｐＨの変化を、加えた水酸化ナトリウムの量の関数として記録する。Δｎの測定は、ｐＨｆからｐＨ＊にｐＨを変化させるのに必要な水酸化ナトリウムの量を単純に読み取ることで行われる。
【００５５】
本明細書において、生理学的ｐＨは、例えば、７．２±０．４に等しいと定義される。
【００５６】
本明細書において、「高分子電解質」という用語は、水中でイオン化することが可能な基を有するポリマーであって、該ポリマー上で電荷を生成するポリマーを意味すると理解される。
【００５７】
保持因子ＲＱを測定するためのＱテスト
本発明に従う体積Ｖの製剤は、すぐに投与できる状態にあり、２５℃にて２００μｌのラット血清プールに加えられる。そのナノ粒子が沈殿した後、浮遊物中の遊離タンパク質濃度をＥＬＩＳＡテストによって測定する。
体積Ｖの値を増大させるために同じテストを繰り返すことによって、製剤の体積のＶ*値を決定でき、該Ｖ*値では、浮遊物中の遊離タンパク質のモル分率が１０％より大きくなることが認められている
保持因子ＲＱは、２００μｌラット血清に対する体積Ｖ＊の比によって与えられる。
例えば、Ｖ＊＝１ｍｌに対して、ＲＱ＝５である。
【００５８】
ポリマーＰＯコロイド溶液の粒子の大きさを評価するため、Ｔ'テストを用いることが好ましい。Ｔ'テストの結果は、平均流体力学的直径である。
【００５９】
準弾性光散乱によってナノ粒子の大きさを測定するためのＴ'テスト
本発明に従うポリマーの粒子の平均流体力学的直径は、以下に規定される手法Ｍｄに従って測定される。
０．１５ＭのＮａＣｌ媒体中、ポリマー溶液を１または２ｍｇ／ｍｌの濃度で準備し、２４時間攪拌して置いておく。その次に、これらの溶液を０．８〜０．２μｍのフィルタに通して濾過した後、波長６３２．８ｎｍの垂直に偏光したＨｅ−Ｎｅレーザービームで動作するＭａｌｖｅｒｎ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｇｏｎｉｏｍｅｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ型の装置を用いた動的光散乱において分析する。ポリマーナノ粒子の流体力学的直径は、「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ」，第２２巻，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，編集Ｒ．Ｚａｎａ，第３章，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，１９８４の研究に説明されるように、キュムラント法による電界の自己相関関数から算出される。
【００６０】
本明細書において、「ナノ粒子」という用語は、Ｔ'テストに従って平均直径が２〜５００ｎｍの間である粒子を表現する。
【００６１】
活性成分の放出を測定するためのＬテスト
３０ｍｇ／ｇのウシアルブミン画分Ｖ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０１Ｍのリン酸緩衝液、０．００２７Ｍの塩化カリウム、０．１３７Ｍの塩化ナトリウム（ＡｌｄｒｉｃｈのＰＢＳ）および０．０１５Ｍの酢酸アンモニウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）を備えた流量２．８３ｍｌ／ｈの水性媒体によって水浴したポリウレタン／ポリエーテル（ＰＵ−ＰＥ）発泡体からなる辺長１．５ｃｍの立方体中に、５０μｌの製剤を注入する。サンプルは、連続相から定期的に回収され、そのサンプルのタンパク質含有量をＥＬＩＳＡによって分析する。
【００６２】
次いで、課された流速で測定した濃度を分けてタンパク質の流量と、回収された各サンプルについて測定した値を加算することで放出されたタンパク質の全重量とをプロットすることができる。
【００６３】
本発明の意義の範囲内で、「タンパク質」という用語は、タンパク質またはペプチドを意味し、ペプチドはオリゴペプチドであろうとポリペプチドであろうと問わない。このタンパク質またはこのペプチドは、例えば一つまたはそれ以上のポリオキシエチレン基をグラフトすることによって変性してもよいし、変性しなくてもよい。
【００６４】
本明細書において、「を有する（to carry）」という表現は、有される基がペンダントであり（又は垂れ下がっており）、すなわち、前記基がグルタミン酸残基に関する側基であり、それを有するグルタミン酸残基のγ位におけるカルボニル官能基の置換基である。
【００６５】
また、本発明のポリグルタミン酸塩は、陽イオン基を有する。この基は、好ましくはアミド又はエステル結合を介してグルタミン酸基にグラフト又は結合する。
【００６６】
ポリマー（ＰＯ）は、ｐＧｌｕ（ｘ）ＧＨ（ｙ）ＣＧ（ｚ）ＮＧ（１−ｘ−ｙ−ｚ）の構造を示すことが好ましく、合計の重合度（ＤＰ）が５０〜３００の間、好ましくは１００〜２５０の間、更に好ましくは１５０〜２５０の間である。
【００６７】
本発明の代替の態様によれば、陽イオン基（ＣＧ）は、半中和ｐＨが７．０未満の弱塩基から選択できる。
【００６８】
かかる陽イオン基（ＣＧ）は、例えば、ヒスチジンエステル、好ましくはそのメチルエステル及びそのエチルエステル、ヒスチジノール、ヒスタミン、ヒスチジンアミド、ヒスチジンアミドのＮ−モノメチル誘導体及びヒスチジンアミドのＮ，Ｎ'−ジメチル誘導体から成る群から選択されたヒスチジン誘導体から得られる。
【００６９】
この場合、ｘ、ｙ及びｚの値は、ｘが０〜４５％の間、ｙが２〜３０％の間、ｚが４０〜９８％の間、１−ｘ−ｙ−ｚが０〜５０％の間となるようにすることができる。
【００７０】
また、ｘ、ｙ及びｚの値は、ｘが０〜４５％の間、ｙが２〜３０％の間、ｚが４０〜６０％の間、１−ｘ−ｙ−ｚが０〜５８％の間となるようにすることもできる。
【００７１】
また、ｘ、ｙ及びｚの値は、ｘが０〜４５％の間、ｙが１５〜３０％の間、ｚが４０〜６０％の間、１−ｘ−ｙ−ｚが０〜４５％の間となるようにすることもできる。
【００７２】
ポリマーＰＯが中性基（ＮＯ）を有していない場合、ｘ、ｙ及びｚの値は、ｘが０〜４５％の間、ｙが２〜３０％の間、ｚが４０〜９８％の間となるようにすることができる。
【００７３】
本発明の他の代替の態様によれば、陽イオン基（ＣＧ）は、少なくとも一つの第４級アンモニウム又は半中和ｐＨが８．０より大きい少なくとも一つの強塩基を備えるものから選択できる。
【００７４】
かかる陽イオン基（ＣＧ）は、以下に示す前駆体から得られることができる。
２〜６の炭素原子を有する直鎖ジアミン、好ましくはプトレッシン
アグマチン
酸素を介して結合したエタノールアミン
酸素を介して結合したコリン
側鎖が中性のｐＨにて正に帯電しているアミノ酸のエステル又はアミド誘導体、すなわち、α位のアミン官能基を介して結合したリシン、アルギニン又はオルニチン
【００７５】
この場合、ｘ、ｙ及びｚの値は、
ｘが、１０〜５５％の間であり、
ｙが、２〜３０％の間であり、
ｚが、１０％より大きいか又は等しく、（ｘ−１０）％と（ｘ＋１５）％の間であり、
中性基の数が、１００％に到達するための追加のパーセンテージに相当しており、任意には０に等しく
なるようにすることができる。
【００７６】
また、ｘ、ｙ及びｚの値は、
ｘが、２０〜５５％の間であり、
ｙが、２〜７．５％の間であり、
ｚが、２０％より大きいか又は等しく、（ｘ−１０）％と（ｘ＋１５）％の間であり、
中性基の数が、１００％に到達するための追加のパーセンテージに相当しており、任意には０に等しく
なるようにすることもできる。
【００７７】
また、ｘが１０〜５５％の間、ｙが２〜３０％の間、ｚが１０〜５５％の間、１−ｘ−ｙ−ｚが０〜６０％の間となるように、ｘ、ｙ及びｚを選択することもできる。
【００７８】
また、ｘ、ｙ及びｚの値は、ｘが１０〜２０％の間、ｙが２〜３０％の間、ｚが１０〜３０％の間、１−ｘ−ｙ−ｚが２０〜７８％の間となるようにすることもできる。
【００７９】
また、ｘ、ｙ及びｚの値は、ｘが１０〜２０％の間、ｙが１５〜３０％の間、ｚが１０〜３０％の間、１−ｘ−ｙ−ｚが２０〜６５％の間となるようにすることもできる。
【００８０】
ポリマーＰＯが中性基（ＮＯ）を有していない場合、ｘ、ｙ及びｚの値は、ｘが１０〜５５％の間、ｙが２〜３０％の間、ｚが４０〜６０％の間となるようにすることができる。
【００８１】
有利には、本発明に従うポリアミノ酸は、例えば、α−Ｌ−グルタミン酸塩又はα−Ｌ−グルタミン酸のホモポリマーである。
【００８２】
本発明のグルタミン酸塩残基を官能基化するのに使用できる陽イオン基は、互いに同一でも異なっていてもよく、
・ヒスチジンエステル、好ましくはそのメチルエステル及びそのエチルエステル、ヒスチジノール、ヒスタミン、ヒスチジンアミド、ヒスチジンアミドのＮ−モノメチル誘導体及びヒスチジンアミドのＮ，Ｎ'−ジメチル誘導体からなる群から選択されるヒスチジン誘導体と一致するか、又は
・下記一般式：
【化１】
2010526041.tif 000002
（式中：
Ｘ＝Ｏ又はＮＨ
Ｙ＝独立してＨ又はＣＨ３
Ｌ＝カルボキシル官能基又はその誘導体で任意に置換される直鎖（Ｃ２〜Ｃ６）アルキレン）を有する。
【００８３】
従って、本発明に使用できる陽イオン基は、下記式：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ３＋，Ｚ−（ここで、ｗは２〜６の間であり、好ましくはｗが４である）、
−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋，Ｚ−、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ３＋，Ｚ−、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ＋（ＣＨ３）３，Ｚ−、
下記式：
【化２】
2010526041.tif 000003
（式中、−Ｒ１は、アルコキシ、好ましくは−ＯＭｅもしくは−ＯＥｔであるか、または−Ｒ１は、−ＮＨ２、アルキルアミノ、好ましくは−ＮＨ−ＣＨ３もしくは−Ｎ（ＣＨ３）２であり；−Ｒ１３は、−（ＣＨ２）４−ＮＨ３＋，Ｚ−、−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋，Ｚ−、−（ＣＨ２）３−ＮＨ３＋，Ｚ−である）のアミノ酸残基又はアミノ酸誘導体、
の内の一つを有することができ、ここで、Ｚ−は、塩化物、硫酸塩、リン酸塩又は酢酸塩であり、好ましくは塩化物である。
【００８４】
例えば、陽イオン基は、下記式：
【化３】
2010526041.tif 000004
（式中、−Ｒ１は、アルコキシ又はアルキルアミノ基、好ましくは−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３又は−Ｎ（ＣＨ３）２であり、−Ｒ２は、水素又は−ＣＨ２ＯＨもしくは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１である）を有することができる。
【００８５】
好ましい実施形態によれば、本発明のポリアミノ酸は、平均して、ポリマー鎖につき少なくとも三つの疎水基（ＧＨ）を有する。
【００８６】
有利には、疎水基ＧＨの少なくとも一つが、疎水基ＧＨをポリグルタミン酸塩鎖（例えば、ポリグルタミン酸塩骨格の主鎖）に結合できる少なくとも一つのスペーサー接続部（または残基）（スペーサー）を備える疎水性グラフト部中に含まれる。この接続部は、例えば、少なくとも一つの直接的な共有結合及び／又は少なくとも一つのアミド結合及び／又は少なくとも一つのエステル結合を備えることができる。例えば、接続部は、ポリグルタミン酸塩の構成単量体単位以外の「アミノ酸」残基、アミノアルコールの誘導体、ポリアミン（例えばジアミン）の誘導体、ポリオール（例えばジオール）の誘導体及びヒドロキシ酸の誘導体からなる群に属するタイプとすることができる。
【００８７】
ＧＨのポリグルタミン酸塩鎖へのグラフトは、ポリグルタミン酸塩鎖に結合できるＧＨ前駆体の使用を含むことができる。
【００８８】
ＧＨの前駆体は、実際には限定されず、アルコール及びアミンからなる群から選択され、当業者によれば容易に官能基化される。
【００８９】
好ましい実施形態によれば、疎水性グラフト部の疎水基ＧＨは、８〜３０個の炭素原子を有する。
【００９０】
これらの疎水基（ＧＨ）は、有利に、
・任意には少なくとも一つの不飽和結合及び／又は少なくとも一つのヘテロ原子を有することができる直鎖又は分岐Ｃ８〜Ｃ３０アルキル、
・任意には少なくとも一つの不飽和結合及び／又は少なくとも一つのヘテロ原子を有することができるＣ８〜Ｃ３０アルキルアリール又はアリールアルキル、並びに
・任意には少なくとも一つの不飽和結合及び／又は少なくとも一つのヘテロ原子を有することができるＣ８〜Ｃ３０（多）環式化合物、
からなる群から慎重に選択される。
【００９１】
ＧＨと共に疎水性グラフト部を形成する接続部は、二価、三価又は四価の接続部（実際には五価又はそれ以上さえもある）とすることができる。二価の接続部の場合、疎水性グラフト部は単一のＧＨ基を有するのに対し、三価の接続部は、疎水性グラフト部上に二分の性質を与え、すなわち、該グラフト部が二つのＧＨ「腕」を示す。三価の接続部の例には、「アミノ酸」残基、例えば「グルタミン酸」、又はポリオール残基、例えばグリセロールが含まれる。従って、二分のＧＨを備える疎水性グラフト部の有利であるが非限定的な二つの例は、ジアルキルグリセロール及びグルタミン酸ジアルキルである。
【００９２】
疎水基ＧＨは、例えば、オクタノール、ドデカノール、テトラデカノール、ヘキサデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、トコフェロール、及びコレステロールよりなる群から選択される基に由来する。
【００９３】
上述のように、中性基（ＮＧ）は、ヒドロキシエチルアミノ−ラジカル、ヒドロキシアルキルオキシ−ラジカル又はポリオキシアルキレンの基から選択できる。
【００９４】
他の代替の態様によれば、本発明に用いるポリグルタミン酸塩はまた、グルタミン酸塩残基に結合したポリアルキレン（好ましくはポリエチレン）グリコール型のグラフト部を少なくとも一つ有することができる。
【００９５】
好ましくは、本発明に従うポリグルタミン酸塩の骨格は、α−Ｌ−グルタミン酸塩及び／又はα−グルタミン酸残基を備える。
【００９６】
更に好ましくは、本発明に用いるポリグルタミン酸塩が、下記式（Ｉ）：
【化４】
2010526041.tif 000005
（式（Ｉ）中、
・Ａは、独立して、
ＮＨＲ基（ここで、ＲはＨ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキル又はベンジルを示す）、
次式：
【化５】
2010526041.tif 000006
（式中：
Ｒ７は、ＯＨ、ＯＲ９又はＮＨＲ１０であり、
Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、独立して、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキル又はベンジルである）の末端アミノ酸残基又は末端アミノ酸誘導体、
であり；
・Ｂは、直接結合、又は二価、三価もしくは四価の結合基であり、好ましくは−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ５アルキル）−、アミノ酸（好ましくは天然アミノ酸）残基、ジオール残基、トリオール残基、ジアミン残基、トリアミン残基、アミノアルコール残基又は１〜６の炭素原子を有するヒドロキシ酸残基から選択され；
・Ｄは、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アシル基又はピログルタミン酸塩であり；
・疎水基（ＧＨ）は、それぞれが互いに独立して、
・任意には少なくとも一つの不飽和結合及び／又は少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯ及び／又はＮ及び／又はＳ）を有することができる直鎖または分岐Ｃ８〜Ｃ３０アルキル、又は
・任意には少なくとも一つの不飽和結合及び／又は少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯ及び／又はＮ及び／又はＳ）を有することができるＣ８〜Ｃ３０アルキルアリール又はアリールアルキル、又は
・任意には少なくとも一つの不飽和結合及び／又は少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯ及び／又はＮ及び／又はＳ）を有することができるＣ８〜Ｃ３０（多）環式化合物、
から選択される基であり；
好ましくは、疎水基（ＧＨ）の少なくとも一つが、グラフトによって、オクタノール、ドデカノール、テトラデカノール、ヘキサデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、トコフェロール及びコレステロールからなる群から選択される前駆体から得られ、Ｂが直接結合を表し；
・Ｒ７０は、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ３＋（ここで、ｗは２〜６の間であり、好ましくはｗが４である）、
−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ３＋、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ＋（ＣＨ３）３、
下記式：
【化６】
2010526041.tif 000007
（式中、−Ｒ１１は、−Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、アルキルエステル（好ましくは−ＣＯＯＭｅ及び−ＣＯＯＥｔ）、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ３又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）２である）のラジカル、
次式：
【化７】
2010526041.tif 000008
（式中、Ｘは、−Ｏ−又は−ＮＨ−で、Ｒ１２は、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキル又はベンジルで、−Ｒ１３は、−（ＣＨ２）４−ＮＨ３＋、−（ＣＨ２）３ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋、−（ＣＨ２）３ＮＨ３＋である）のアミノ酸残基又はアミノ酸誘導体、
から選択される基であり、
Ｒ７０基の対アニオンが、便宜の基であり、特に塩化物、硫酸塩、リン酸塩又は酢酸塩から選択され、好ましくは塩化物であり；
・Ｒ９０は、ヒドロキシエチルアミノ−、ヒドロキシアルキルオキシ−、又はポリオキシアルキレンであり；
・ｐ，ｑ，ｒ及びｓは、正の整数であり；
・（ｐ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、疎水基ＧＨのモルグラフト度として定義され、２〜３０モル％の範囲であり、但し、各コポリマー鎖は、平均して、少なくとも三つの疎水性グラフト部を有しており；
・（ｑ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、陽イオン基のモルグラフト度として定義され、１０〜９８モル％の範囲であり；
・（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、５０〜３００の範囲であり、好ましくは１００〜２５０の間であり；
・（ｒ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、０〜７８モル％の範囲であり；
・（ｓ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、０〜５５モル％の範囲である）を有し、また、その製剤可能な塩を包含する。
【００９７】
更に、ヒスチジンに由来する式（Ｉ）のポリアミノ酸の調製及び合成に関する詳細に関しては、特許出願ＦＲ ０５ ５３３０２を参照されたい。
更に、ヒスチジンに由来するもの以外の式（Ｉ）のポリアミノ酸の調製及び合成に関する詳細に関しては、仏国特許出願ＦＲ ０７ ０３１８５を参照されたい。
【００９８】
好ましくは、疎水基ＧＨ及び陽イオン基は、ペンダント（又は垂れ下がっている）基としてランダムに位置している。
【００９９】
概して、上述の一般式（Ｉ）は、単にブロックコポリマーだけでなく、ランダムコポリマー又はマルチブロックコポリマーをも示すものとして解釈されるべきである。
【０１００】
好ましくは、本発明に従う製剤中のポリマー（ＰＯ）の濃度は、特に活性成分（ＡＰ）が治療用タンパク質である場合、４〜５０ｍｇ／ｍｌの間とすることができる。この濃度の範囲内では、小口径の針、例えばゲージ２７、更にはゲージ２９の針によって、製剤を容易に注入することができる。例２、３及び４は、かかる製剤を詳細に説明する。
【０１０１】
好ましくは、本発明に従う製剤中のポリマー（ＰＯ）の濃度が、５〜３０ｍｇ／ｍｌの間とすることができ、更に好ましくは５〜１５ｍｇ／ｍｌの間である。
【０１０２】
有利には、活性成分（ＡＰ）濃度のポリマー（ＰＯ）濃度に対する比Ｒが、０．０００１〜１．５の間とすることができる。また、この比Ｒは、０．０１〜１．２の間とすることもできる。
【０１０３】
代替の態様によれば、本発明に従う製剤は、陽イオン基（ＣＧ）のモル濃度に対して、の二価の陽イオンＺｎ＋＋を０．０５〜２モル当量の割合で備えることができる。
【０１０４】
特に、本発明に従う製剤は、陽イオン基（ＣＧ）のモル濃度に対して、追加された二価の陽イオンＺｎ＋＋を０．２５〜０．７５モル当量の割合で備えることができ、好ましくは０．５ｅｑに等しく、更に好ましくは、陽イオン基（ＣＧ）が、ヒスチジンエステル、好ましくはそのメチルエステル及びそのエチルエステル、ヒスチジノール、ヒスタミン、ヒスチジンアミド、ヒスチジンアミドのＮ−モノメチル誘導体及びヒスチジンアミドのＮ，Ｎ'−ジメチル誘導体からなる群から選択されたヒスチジン誘導体から得られる場合である。
【０１０５】
他の代替の態様によれば、本発明に従う製剤は、追加される二価の陽イオンを備えていない。
【０１０６】
本発明に用いるポリマーは、２０００〜２０００００ｇ／ｍｏｌの間のモル質量を有し、好ましくは５０００〜１０００００ｇ／ｍｏｌの間である。
【０１０７】
本発明の特に好適な実施形態によれば、陽イオン基（ＣＧ）が半中和ｐＨが７．０未満の弱塩基から選択される場合、本発明に用いるポリマー（ＰＯ）は、ｐＧｌｕ（ｘ）ＧＨ（ｙ）ＣＧ（ｚ）ＮＧ（１−ｘ−ｙ−ｚ）の構造を示し、ｘは０〜２０％の間で、ｙは２〜３０％の間で、ｚは６０〜９５％の間で、１−ｘ−ｙ−ｚは０〜１５％の間となる。
【０１０８】
また、ｘ、ｙ及びｚの値は、ｘが０〜２０％の間、ｙが２〜１０％の間、ｚが７５〜９５％の間、１−ｘ−ｙ−ｚが０〜１５％の間となるようにすることもできる。
【０１０９】
また、ｘ、ｙ及びｚの値は、ｘが０〜２０％の間、ｙが１５〜２５％の間、ｚが６０〜８０％の間、１−ｘ−ｙ−ｚが０〜１５％の間となるようにすることもできる。
【０１１０】
ポリマーＰＯが中性基（ＮＧ）を有していない場合、ｘ、ｙ及びｚの値は、ｘが０〜２０％の間、ｙが２〜３０％の間、ｚが６０〜９５％の間となるようにすることができる。
【０１１１】
本発明の他の好適な実施態様によれば、陽イオン基（ＣＧ）が第４級アンモニウム又は半中和ｐＨが８．０より大きい少なくとも一つの強塩基を含む群から選択される場合、ｘ、ｙ及びｚの値は、ｘが１０〜５０％の間、ｙが２〜３０％の間、ｚが１５〜５０％の間、１−ｘ−ｙ−ｚが１０〜５５％の間となるようにすることができる。
【０１１２】
また、ｘ、ｙ及びｚの値は、ｘが１５〜３０％の間、ｙが２〜３０％の間、ｚが１５〜２５％の間、１−ｘ−ｙ−ｚが４０〜５５％の間となるようにすることもできる。
【０１１３】
また、ｘ、ｙ及びｚの値は、ｘが２５〜５０％の間、ｙが２〜３０％の間、ｚが２５〜５０％の間、１−ｘ−ｙ−ｚが１０〜３０％の間となるようにすることもできる。
【０１１４】
ポリマーＰＯが中性基（ＮＧ）を有していない場合、ｘ、ｙ及びｚの値は、ｘが１０〜５５％の間、ｙが２〜３０％の間、ｚが４０〜６０％の間となるようにすることもできる。
【０１１５】
陽イオン電荷が過剰であるため、本発明に用いるポリマーＰＯは、陽イオン性であり、製剤のｐＨｆ値で可溶である。この電荷は、中性ｐＨにて部分的又は完全に中和されるため、ポリマーが沈殿する。理論によって制限されるものではないが、ｐＨの上昇により誘発されるこの沈殿現象は、製剤ｐＨと生理学的ｐＨの間でポリマーに対する全電荷の減少と、疎水性側基の存在とに起因すると思われる。
【０１１６】
変性ポリグルタミン酸塩の残りのカルボキシル官能基は、ｐＨ及び組成に応じて、中性（ＣＯＯＨ形態）であるか又はイオン化されている（ＣＯＯ−陰イオン）と理解すべきである。そのため、ｉ）グルタミン酸塩残基もしくはグルタミン酸の残基又はｉｉ）ポリグルタミン酸もしくはポリグルタミン酸塩という用語の双方を同じ意味で用いることができる。
【０１１７】
同様に、アミノ基は、主にそのｐＫａより下のどんなｐＨでもイオン化されることになり、また、第４級アンモニウムはどんなｐＨでもイオン化されることになる。
【０１１８】
水溶液中では、対カチオンは、ナトリウム、カルシウムもしくはマグネシウム等の金属陽イオン、又はトリエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタンもしくはポリエチレンイミン等のポリアミン等の有機陽イオンとなり得る。それが二価である場合、対カチオンは、二つの閉鎖した一価の陰イオン基を塩化することができる。
【０１１９】
陽イオン基の対アニオンは、塩化物、硫酸塩、リン酸塩又は酢酸塩からなる群から選択されるのが好ましい。
【０１２０】
それが二価である場合、対アニオンは、二つの閉鎖した一価の陽イオン基を塩化することができる。
【０１２１】
本明細書において、本発明に従うポリマーの「製剤可能な塩」という用語は、ポリマーのイオン化した官能基と会合した対イオンを持つ全てのポリマーを含むと理解される。
【０１２２】
本発明に用いるのに適切なポリアミノ酸は、例えば、当業者に知られた法によって得られる。第一に、α型のポリアミノ酸を得るために最も広く用いられている技術は、例えば、論文「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１９７６，１５，１８６９」及びＨ．Ｒ．Ｋｒｉｃｈｅｌｄｏｒｆによる研究「ａｌｐｈａ−Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙ  Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９８７）に記載されるように、Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物（ＮＣＡ）の重合に基づいている。ＮＣＡ誘導体は、好ましくは、ＮＣＡ−Ｇｌｕ−Ｏ−Ｒ３（Ｒ３＝メチル、エチル又はベンジル）である。その後、ポリマーは、酸の形でポリマーを得るための適切な条件下で加水分解される。これらの方法は、出願人の特許ＦＲ−Ａ−２ ８０１ ２２６にて与えられた説明によって引き出される。
【０１２３】
本発明に従って使用できるいくらかのポリマーは、例えば、様々な重量を有するポリ（α−Ｌ−グルタミン酸）、ポリ（α−Ｄ−グルタミン酸）、ポリ（α−Ｄ，Ｌ−グルタミン酸塩）及びポリ（γ−Ｌ−グルタミン酸）のタイプであり、商業的に入手できる。
【０１２４】
ＧＨグラフト部のポリマーの酸性基とのカップリングは、カップリング剤としてのカルボジイミド及び任意の４−ジメチルアミノピリジン等の触媒の存在下、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の適切な溶媒中でのポリアミノ酸の反応によって容易に行われる。カルボジイミドは、例えば、ジシクロへキシルカルボジイミド又はジイソプロピルカルボジイミドである。グラフト度は、成分及び反応物質の化学量論又は反応時間によって化学的に制御される。「スペーサー」によって官能基化した疎水性グラフト部は、通常のペプチドカップリング又は酸性触媒による直接縮合によって得られる。
【０１２５】
カチオン性基及び任意には中性基のポリマーの酸性官能基とのカップリングは、カップリング剤としてのクロロホルマートの存在下、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の適切な溶媒中、第二の段階において同時に行われる。
【０１２６】
カチオン性基が化学的に差異のない二つのアミノ官能基を有する場合（例えば、直鎖ジアミン）、二つの官能基のうち一つを保護する形でそれを導入することができる。その後、保護基を開裂する最終段階を加える。
【０１２７】
上記基をカップリングするための重合化学及び反応は、標準となっており、当業者によく知られている（例えば、上述の出願人による特許又は特許出願参照）。
【０１２８】
本発明に従う製剤の調製例については、以下に述べる実施例にて詳細に説明する。
【０１２９】
上述の本発明に従う製剤の特徴によって、当業者は、ポリマーＰＯに基づく全ての製剤から、条件（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を同時に満たし、このため、前述した要件に対して最適なものを選択することができる。
【０１３０】
条件（ｃ）及び（ｄ）は、特に選択的である。製剤がｐＨｆでコロイド溶液を形成しない場合、当業者は、このｐＨ値で、多くの非電離モノマーを示すポリマーを選択することになる。一方、ポリマーが沈殿する場合には、このｐＨでイオン化されるモノマーの数を増やすことが望ましい。
【０１３１】
しかしながら、直観で分かるものではないが、ｐＨｆにてコロイド溶液になり、生理学的ｐＨで沈殿する製剤の中には、条件（ｄ）を満たさないので除外されるものもあるはずであることを指摘することは重要である。従って、条件（ｄ）は、当業者にとって本発明に従う製剤を選択するのに便利な方法である。
【０１３２】
条件（ｄ）は、本発明に従う製剤が生理学的ｐＨより低いか又はそれに等しいｐＨに対して沈殿することを意味することを指摘することは重要である。これは、本発明に従う酸性の製剤１ｍｌと緩衝溶液Ｔｐ １ｍｌとを混合した後、その緩衝溶液のｐＨより低いか又はそれに等しいｐＨ値、即ち＜７．２で沈殿が見られるからである。
【０１３３】
本発明に従う製剤を選択する第二の方法は、沈殿因子ＰＦを推定することである。この因子は、以下の方法で評価される。
ａ）ｐＨ＊として記録される沈殿ｐＨの測定
酸性ｐＨｆ３〜６．５にて、ＡＰを持つコロイド溶液は、ナノ粒子を備える透明の液体として存在し、該ナノ粒子の平均流体力学的直径は、Ｔ'テストに従い動的光散乱によって測定したところ、０．５μｍ未満か又はそれに等しく、好ましくは５〜５００ｎｍの間であり、更に好ましくは１０〜８０ｎｍの間である。ｐＨを高めると、本発明に従う溶液は、生理学的ｐＨより低いか又はそれに等しいｐＨに対して沈殿する必要がある。該溶液が沈殿するｐＨ＊値は、Ｐテストに従って測定される。
ｂ）ＰＦの測定
ＴＭ法に従って、ポリマーＰＯ１ｍｇを備えるコロイド溶液０．５ｍｌをｐＨｆからｐＨ*にするのに必要な水酸化ナトリウムのモル数，Δｎの測定である。
Ｃを製剤中のポリマーＰＯの濃度とし（ｍｇ／ｇで表す）、ｙを疎水性サイドグラフト部を有するポリマーＰＯの単量体のモル分率とすることによって、製剤の沈殿因子ＰＦは、下記式：
【数１】
2010526041.tif 000009
によって求められる。沈殿因子ＰＦの計算例は、実施例において与えられる。
【０１３４】
本発明の特定の実施において、本発明に従う製剤は、沈殿因子ＰＦが２００より大きいことを特徴とし、好ましくは４００より大きく、より好ましくは８００より大きく、更に好ましくは１５００より大きい。
【０１３５】
本発明に従う製剤の驚くべき態様は、生理学的ｐＨにて沈殿する間に形成されるポリマー鎖の網状構造によって、活性成分（ＡＰ）の放出を遅らせることができるが、その粒子の中心でこの同じ活性成分（ＡＰ）を補足しない。従って、本発明に従う製剤は、活性成分（ＡＰ）の持続的放出と良好な生物学的利用能の両方を得ることができる。
【０１３６】
活性成分（ＡＰ）は、好ましくは、タンパク質、糖タンパク質、一つまたはそれ以上のポリアルキレングルコール鎖と結合したタンパク質［好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）：「ＰＥＧ化タンパク質」］、ペプチド、多糖類、リポ糖類、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド及びそれらの混合物からなる群から選択され、
更に好ましくは、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、ダーベポエチン等のエリスロポエチン、ヘモグロビンラフィマー、それらの類似体又はそれらの誘導体；オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、造血を刺激する因子及びそれらの混合物の他、アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ、第ＶＩＩ（ａ）因子又は第ＶＩＩ因子等の血液因子；ヘモグロビン、シトクロム、アルブミン、プロラクチン、ルリベリンの他、ロイプロリド、ゴセレリン、トリプトレリン、ブセレリン又はナファレリン等の黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）及び類似体；ＬＨＲＨアンタゴニスト、ＬＨＲＨ競合体、ヒト、ブタ又はウシの成長ホルモン（ＧＨｓ）、成長ホルモン放出因子、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、インターロイキン又はその混合体（ＩＬ−２，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２）の他、インターフェロンアルファ、アルファ−２ｂ、ベータ、ベータ−１ａ又はガンマ等のインターフェロン；ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドモルフィン、アンジオテンシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）の他、ベクラペルミン、トラフェルミン、アンセスチム又はケラチノサイト成長因子等の成長因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ヘパリナーゼ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ｈＡＮＰ、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、ＶＥＧ−Ｆ、組換えＢ型肝炎表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）、レニン、サイトカイン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシジン、グラミシジン、エタネルセプト、イミグルセラーゼ、ドロトレコギンアルファ、シクロスポリン及び合成類似体、並びに酵素、サイトカイン、抗体、抗原及びワクチンの製剤可能な修飾体及び断片、リツキシマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、エファリズマブ及びセツキシマブ等の抗体の下位群から選択される。
【０１３７】
他の適切な活性成分は、多糖類（例えばヘパリン）及びオリゴ−又はポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、抗体及び生細胞である。活性成分の他の分類は、中枢神経系で作用する医薬品物質、例えば、リスペリドン、ズクロペンチキソール、フルフェナジン、ペルフェナジン、フルペンチキソール、ハロペリドール、フルスピリレン、クエチアピン、クロザピン、アミスルプリド、スルピリド、ジプラシドン等を含む。
【０１３８】
代替の態様によれば、活性成分は、アントラサイクリン、タキソイドもしくはカンプトテシンのファミリーに属するか又はロイプロリドもしくはシクロスポリン等のペプチドのファミリーに属する疎水性、親水性又は両親媒性の有機小分子、及びそれらの混合物である。
【０１３９】
他の代替の態様によれば、活性成分は、有利には、以下に示す活性物質のファミリーの内の少なくとも１種から選択される。アルコール依存症の治療薬、アルツハイマー病の治療薬、麻酔薬、末端肥大症の治療薬、鎮痛剤、抗ぜんそく薬、アレルギーの治療薬、抗癌剤、抗炎症薬、抗凝結剤及び抗トロビン薬、抗けいれん剤、抗てんかん薬、抗糖尿病薬、制吐薬、抗緑内障薬、抗ヒスタミン剤、抗感染薬、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗パーキンソン薬、抗コリン作用薬、咳止め、炭酸脱水酵素阻害薬、心血管作動薬、脂質低下薬、抗不整脈剤、血管拡張剤、抗狭心症薬、降圧剤、血管保護剤、コリンエステラーゼ阻害剤、中枢神経系疾患の治療薬、中枢神経系の刺激剤、避妊薬、受精促進剤、子宮陣痛の誘導剤及び阻害剤、嚢胞性線維症の治療薬、ドーパミン受容体作用薬、子宮内膜症の治療薬、勃起障害の治療薬、不妊治療の薬、消化器疾患の治療薬、免疫刺激剤及び免疫抑制剤、記憶障害の治療薬、抗片頭痛薬、筋弛緩剤、ヌクレオシド類似体、骨粗鬆症の治療薬、副交感神経興奮薬、プロスタグランジン、精神刺激薬、鎮静剤、睡眠薬及び精神安定剤、神経安定剤、抗不安薬、精神刺激薬、抗うつ剤、皮膚治療薬、ステロイド及びホルモン、アンフェタミン、食欲抑制剤、ノンアナルジージクペインキラー（nonanalgesic painkiller）、バルビツール酸系催眠薬、ベンゾジアゼピン、下剤、向精神薬、並びにこれらの製品の組み合わせである。
【０１４０】
本発明に従う製剤を、経口的に、非経口的に、経鼻的に、膣内に、眼球に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、皮内に、経皮的に、腹腔内に、脳内に、又は口腔内に投与することができる。
【０１４１】
他の態様によれば、本発明は、少なくとも一つの活性成分を持続放出するためのポリマーＰＯに基づいた製剤を調製する方法を提供するものであり、該製剤は、特に上述のものであり、前記方法は、
１）３〜６．５の間のｐＨ値で、ポリアミノ酸ポリマー（ＰＯ）の水性コロイド溶液を準備する工程であって、陽イオン基（ＣＧ）、疎水基（ＧＨ）、任意の中性基（ＮＧ）及び任意のグルタミン酸塩の各モル分率が、１ｍｌの前記製剤が体積１ｍｌのテスト緩衝溶液Ｔｐとの混合中に沈殿するほどである工程と；
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を工程１において得られたポリマー（ＰＯ）に加える工程であって、前記活性成分が前記ポリマーのコロイド溶液の粒子と非共有で会合している工程と、
を備える。
【０１４２】
本発明に従う方法の必須の特徴は、高分子電解質ポリマー（ＰＯ）粒子のコロイド溶液と活性成分（ＡＰ）との単純な混合によって、活性成分を持つ粒子が３〜６．５の間のｐＨｆにて自発的に形成されることである。
【０１４３】
タンパク質、ペプチド又は小分子等の活性成分は、ポリアミノ酸タイプのポリマー（ＰＯ）と自発的に会合することができる。
【０１４４】
本発明の特定の実施において、活性成分（ＡＰ）による高分子電解質ポリマー（ＰＯ）ナノ粒子の積み込みは、活性成分（ＡＰ）の溶液を高分子電解ポリマー（ＰＯ）のコロイド溶液と単純に混合することによって行われる。この会合は、純粋に物理的であり、活性成分（ＡＰ）とポリマー（ＰＯ）間の共有結合の形成を必要としない。理論に制限されるものではないが、この非特異的な会合は、ポリマー（ＰＯ）と活性成分（ＡＰ）間の疎水的及び／又は静電気的な相互作用によって起こると考えられる。ペプチドの性質を持つ特定の受容体又は抗原／抗体もしくは酵素／基質タイプの特定の受容体を介して、ＡＰをＰＯナノ粒子に結合する必要がなく、多くの場合、望ましくないことさえあることに注意すべきである。
【０１４５】
本発明に従う方法の好ましい実施形態においては、該方法は、得られた粒子の化学的な架橋の工程を含まない。従って、得られる粒子は、化学的に架橋されないが、それでも持続時間にわたって活性成分（ＡＰ）を放出する。この化学的な架橋がないことは、決定的な利点である。これは、化学的な架橋がないことによって、活性成分（ＡＰ）を備える粒子を架橋する工程の間に起こり得る活性成分（ＡＰ）の化学分解を避けることができるからである。これは、かかる化学的な架橋が一般に重合可能なものの活性化によって行われ、ＵＶ放射物又はグルタルアルデヒド等の変性剤を元来含むからである。
【０１４６】
有利には、本発明に従う方法は、乾燥粉末の形態で粒子を得るために、例えば凍結乾燥によって、液体製剤を脱水する工程を備える。
【０１４７】
また、本発明は、上述した水性懸濁液を備える液体製剤から得られた乾燥粉末の形態を備える少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出するための固体の製剤に関するものである。
【０１４８】
乾燥粉末は、本発明に従う液体製剤をｐＨ７にして生体外でそれを沈殿させ、次いで、例えば凍結乾燥によってそれを脱水することで得られることができる。
【０１４９】
有利には、かかる固体製剤は、吸入投与及び肺内投与に使用される。
【０１５０】
他の態様によれば、本発明の対象は、薬剤を調製する方法であり、特に、経口、経鼻、肺、膣又は眼球経路による、非経口、粘膜、皮下、筋内、皮内、経皮、腹腔内もしくは脳内投与又は腫瘍への投与用の薬剤を調製する方法であり、前記方法は、上述の製剤の少なくとも一つを用いることから本質的になる。
【実施例】
【０１５１】
１）合成
ａ）比較：疎水基を有する陰イオン高分子電解質ポリマーＰＯの合成（合成起源のα−トコフェロールでグラフトしたポリグルタミン酸塩）
ポリオキシエチレン基準に対して約１６９００Ｄａに相当する重量のα−Ｌ−ポリグルタミン酸１５ｇを８０℃で加熱しながらジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２８８ｍｌ中に溶解させ、ポリマーを溶解させた。その溶液を１５℃に冷却し、あらかじめ８ｍｌのＤＭＦ中に溶解させた２．５ｇのＤ，Ｌ-α−トコフェロール（＞９８％、Ｆｌｕｋａ（登録商標）から得られる）と、あらかじめ１ｍｌのＤＭＦ中に溶解させた２８０ｍｇの４−ジメチルアミノピリジンと、あらかじめ６ｍｌのＤＭＦ中に溶解させた１．６ｇのジイソプロピルカルボジイミドとを続けて加える。３時間攪拌した後、反応媒体を、１５％の塩化ナトリウムと塩酸を含む水１２００ｍｌ（ｐＨ２）に注ぎ込む。その後、沈澱したポリマーを濾過によって回収し、０．１Ｎの塩酸、水、及びジイソプロピルエーテルで洗浄する。その後、ポリマーを真空下４０℃のオーブン中で乾燥させる。およそ９０％の収率を得る。モル質量を立体排除クロマトグラフィーによって測定したところ、ポリオキシエチレン基準に対して１５５００である。グラフトしたトコフェロールのレベルをプロトンＮＭＲ分光法によって測定したところ、５．１モル％である。
【０１５２】
ｂ）陽イオン高分子電解質ポリマーＰＯ−Ａ１の合成（合成起源のα−トコフェロールとヒスチジンアミドとでグラフトしたポリグルタミン酸塩）
【化８】
2010526041.tif 000010
指数及び基：ｍ＝１１、ｐ＝２０９、ｑ＝０、Ｔ＝Ｄ，Ｌ−α−トコフェロール（Ｔ）
【０１５３】
５％ラセミ体のα−トコフェロールでランダムにグラフトしたＤＰが２２０のポリ（グルタミン酸）３ｇをＮＭＰ３８ｍｌ中に８０℃で加熱することにより溶解させる。この溶液を０℃に冷却し、２．７４ｇのクロロギ酸イソブチルと、次いで２．２ｍｌのＮ−メチルモルホリンとを加える。０℃にて温度を維持しながら反応媒体を１０分間攪拌する。同時に、８．６５ｇのヒスチジンアミド・二塩酸塩を１０８ｍｌのＮＭＰ中に懸濁させる。その次に、１０．６ｍｌのトリエチルアミンを加え、得られた懸濁液を２０℃で数分間攪拌した後、０℃に冷却する。次いで、活性化したポリマーの溶液をヒスチジンアミド懸濁液に加える。反応媒体を０℃で２時間攪拌した後、２０℃で一晩攪拌する。その後、０．６２ｍｌの３５％ＨＣｌと、次いで８３ｍｌの水とを加える。その後、得られた溶液をｐＨ３〜４の水５００ｍｌに注ぎ込む。その後、その溶液を８分量の食塩水（０．９％のＮａＣｌ）と４分量の水に対してダイアフィルターで濾過する。その後、ポリマー溶液を３００ｍｌの体積に濃縮する（ポリマー濃度は１８ｍｇ／ｇである）。グラフトしたヒスチジンアミドの割合は、Ｄ２Ｏ中での１Ｈ ＮＭＲにより測定したところ、９５％である。
【０１５４】
ｃ）陽イオン高分子電解質ポリマーＰＯ−Ａ２の合成（合成起源のα−トコフェロールとヒスチジンアミドとでグラフトしたポリグルタミン酸塩）
【化９】
2010526041.tif 000011
指数及び基：ｍ＝４４、ｐ＝１５４、ｑ＝２２、Ｔ＝Ｄ，Ｌ−α−トコフェロール（Ｔ）
【０１５５】
２０％ラセミ体のα−トコフェロールでランダムにグラフトしたＤＰが２２０のポリ（グルタミン酸）１０ｇをＮＭＰ１２５ｍｌ中に８０℃で加熱することにより溶解させる。この溶液を０℃に冷却し、５．５ｇのクロロギ酸イソブチルと、次いで４．４ｍｌのＮ−メチルモルホリンとを加える。０℃にて温度を維持しながら、反応媒体を１０分間攪拌する。同時に、１２．９ｇのヒスチジンアミド・二塩酸塩を１６１ｍｌのＮＭＰ中に懸濁させる。その次に、１５．８ｍｌのトリエチルアミンを加え、得られた懸濁液を２０℃で数分間攪拌した後、０℃に冷却する。次いで、活性化したポリマーの溶液をヒスチジンアミド懸濁液に加える。反応媒体を０℃で２時間攪拌した後、２０℃で一晩攪拌する。その後、１．４６ｍｌの３５％ＨＣｌと、次いで２００ｍｌの水とを加える。更に、２００ｍｌの水と、その後に６５０ｍｌのエタノールを加え、その次に、ｐＨ３〜４の水６５０ｍｌ中に注ぎ込む。その後、その溶液を８分量の食塩水（０．９％のＮａＣｌ）と４分量の水に対してダイアフィルターで濾過する。最終的に、ポリマー溶液を２５０ｍｌの体積に濃縮する（ポリマー濃度は５０ｍｇ／ｇである）。グラフトしたヒスチジンアミドの割合は、Ｄ２Ｏ中での１Ｈ ＮＭＲにより測定したところ、７０％である。
【０１５６】
ｄ）陽イオン高分子電解質ポリマーＰＯ−Ｂの合成（合成起源のα−トコフェロールと、エタノールアミンと、アルギニンアミドとでグラフトしたポリグルタミン酸塩）
【化１０】
2010526041.tif 000012
指数及び基：Ｔ＝Ｄ，Ｌ−α−トコフェロール（Ｔ）、ｐ＝１１、ｑ＝８８、ｒ＝４８、ｓ＝７３
【０１５７】
５％ラセミ体のα−トコフェロールでランダムにグラフトしたＤＰが２２０のポリ（グルタミン酸）１０ｇをＮＭＰ１２５ｍｌ中に８０℃で溶解させる。この溶液を０℃に冷却し、５．６ｍｌのクロロギ酸イソブチルと、次いで４．８ｍｌのＮ−メチルモルホリンとを加える。この反応混合物を０℃で１５分間攪拌する。同時に、７．４ｇのアルギニンアミド・二塩酸塩をＮＭＰ９３ｍｌ中に懸濁させ、次いで４．７ｍｌのトリエチルアミンと、１．２ｍｌのエタノールアミンとを加える。得られた懸濁液を２０℃で数分間攪拌した後、０℃に冷却する。次いで、活性化したポリマーの乳濁液をこの懸濁液に加え、反応混合物を０℃で２時間攪拌した後、２０℃で一晩攪拌する。２．０７ｍｌの３５％ＨＣｌ溶液と、次いで２００ｍｌの水とを加えた後、反応混合物を、ＨＣｌによってｐＨ＝３まで酸性にされた水６７０ｍｌ中に滴下し、該ｐＨは１ＮのＨＣｌ溶液で約３に維持される。得られた溶液を８分量の食塩水（０．９％）と４分量の水に対してダイアフィルターで濾過し、約２５０ｍｌの体積に濃縮する。グラフトしたアルギニンアミドとグラフトしたエタノールアミンの割合は、Ｄ２Ｏ中でのプロトンＮＭＲにより測定したところ、それぞれ４０％と２２％である。
【０１５８】
２）例１（比較）：陽イオン誘導体を有していないポリマーＰＯに基づく製剤（合成ａ）
合成ａ）に従って得られたポリマーＰＯを用いる。
ＰＯ溶液１２．６４ｇを水２．１９ｇで希釈することで、ポリマーＰＯのコロイド溶液２４ｍｇ／ｇを得る。その次に、必要量のＮａＣｌ水溶液とＮａＯＨ溶液とをそれぞれ導入することによって、コロイドＰＯ溶液のオスモル濃度及びそのｐＨを２９０ｍＯｓｍ及びｐＨ６．９５に調整する。
以下、得られた製剤の特性を表に示す。
粒径をＴ'テストに従って測定する。
【表１】
2010526041.tif 000013
上述のポリマーＰＯに基づく製剤は、該製剤１ｍｌを緩衝溶液Ｔｐ１ｍｌに加える間に沈殿しない。
【０１５９】
３）例２：ポリマーＰＯ−Ａ１に基づく製剤
３．１）例２．１：ＰＯ−Ａ１の濃度が１０ｍｇ／ｇと等しく、ＩＦＮ-αを備える
ａ）ＰＯ−Ａ１のコロイド溶液の調製
上述の合成ｂ）に従って得られたポリマーＰＯ−Ａ１を用いる。
ＰＯ−Ａ１を水で希釈し、ｐＨを（適切なＮａＯＨ溶液で）調整し、オスモル濃度を（適切なＮａＣｌ溶液で）調整する。
【表２】
2010526041.tif 000014
得られたポリマーＰＯ−Ａ１に基づくコロイド溶液は、該溶液１ｍｌを緩衝溶液Ｔｐ１ｍｌに加える間に沈殿し、それは沈殿因子ＰＦ＝８６０であることを特徴とする。ポリマーＰＯ−Ａ１は、ｐＨ＊が６．５に等しいことを特徴とする。
【０１６０】
ｂ）タンパク質のポリマーＰＯ−Ａ１との会合
２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−α２．１８ｇをＰＯ−Ａ１のコロイド溶液８ｇに加え、適切なＮａＣｌ溶液（０．１８ｇ）で希釈することによって、最終濃度を調整する。
【０１６１】
ｃ）２５℃で一晩の会合
以下、最終製剤の特徴を表に示す。
粒径をＴ'テストに従って測定する。
【表３】
2010526041.tif 000015
【０１６２】
３．２）例２．２：ＰＯ−Ａ１の濃度が４５ｍｇ／ｇに等しい
上述の合成ｂ）に従って得られたポリマーＰＯ−Ａ１を用いる。
ＰＯ−Ａ１を水で希釈し、ｐＨを（適切なＮａＯＨ溶液で）調整し、オスモル濃度を（適切なＮａＣｌ溶液で）調整する。
【表４】
2010526041.tif 000016
得られたポリマーＰＯ−Ａ１に基づくコロイド溶液は、該溶液１ｍｌを緩衝溶液Ｔｐ１ｍｌに加える間に沈殿せず、沈殿因子ＰＦが１６６に等しいことを特徴とする。
【０１６３】
３．３）例２．３：ＰＯ−Ａ１の濃度が１０ｍｇ／ｇに等しく、ＩＦＮ-α及び陽イオンＺｎ＋＋を備える
ａ）０．５ｅｑ．のＺｎ＋＋を備えるＰＯ−Ａ１のコロイド溶液の調製
上述の合成ｂ）に従って得られたポリマーＰＯ−Ａ１を用いる。
ＰＯ−Ａ１を水で希釈し、ｐＨを（適切なＮａＯＨ溶液で）調整し、オスモル濃度を（適切なＮａＣｌ溶液で）調整する。
【表５】
2010526041.tif 000017
【０１６４】
ｂ）タンパク質のポリマーＰＯ−Ａ１との会合
２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−α２．１７ｇを段階ａ）で調製したＰＯ−Ａ１のコロイド溶液７．９６ｇに加え、適切なＮａＣｌ溶液（０．１８ｇ）で希釈することによって、最終濃度を調整する。
【０１６５】
ｃ）２５℃で一晩の会合
【０１６６】
ｄ）陽イオンＺｎ＋＋の添加
溶液中に存在する陽イオン誘導体当たり０．５モル当量の陽イオンＺｎ＋＋を達成するため、濃縮された２０４ｍｇ／ｇのＺｎＣｌ２溶液の必要量を先の製剤に加える。
以下、最終製剤の特徴を表に示す。
粒径をＴ'テストに従って測定する。
【表６】
2010526041.tif 000018
得られたポリマーＰＯ−Ａ１に基づくコロイド溶液は、該溶液１ｍｌを緩衝溶液Ｔｐ１ｍｌに加える間に沈殿し、沈殿因子ＰＦが８６０に等しいことを特徴とする。陽イオン誘導体当たり０．５モル当量の陽イオンＺｎ＋＋を備えるポリマーＰＯ−Ａ１は、ｐＨ＊が４．８に等しいことを特徴とする。
【０１６７】
４）例３：ＩＦＮ−αを備える３０ｍｇ／ｇのポリマーＰＯ−Ａ２に基づく製剤
ａ）ＰＯ−Ａ２のコロイド溶液の調製
上述の合成ｃ）に従って得られたポリマーＰＯ−Ａ２を用いる。
ＰＯ−Ａ２を水で希釈し、ｐＨを（適切なＮａＯＨ溶液で）調整し、オスモル濃度を（適切なＮａＣｌ溶液で）調整する。
【表７】
2010526041.tif 000019
得られたポリマーＰＯ−Ａ２に基づくコロイド溶液は、該溶液１ｍｌを緩衝溶液Ｔｐ１ｍｌに加える間に沈殿し、沈殿因子ＰＦが８４０に等しいことを特徴とする。ポリマーＰＯ−Ａ２は、ｐＨ＊が６．５に等しいことを特徴とする。
【０１６８】
ｂ）タンパク質のポリマーＰＯ−Ａ２との会合
２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−α２．１８ｇをＰＯ−Ａ２のコロイド溶液８ｇに加え、適切なＮａＣｌ溶液（０．１８ｇ）で希釈することによって、最終濃度を調整する。
【０１６９】
ｃ）２５℃で一晩の会合
以下、最終製剤の特徴を表に示す。
粒径をＴ'テストに従って測定する。
【表８】
2010526041.tif 000020
【０１７０】
５）例４：ＩＦＮ−αを備えるか又は備えていないポリマーＰＯ−Ｂに基づく製剤
５．１）例４．１：ＰＯ−Ｂの濃度が１０ｍｇ／ｇに等しく、ＩＦＮ-αを備える
ａ）ＰＯ−Ｂのコロイド溶液の調製
上述の合成ｄ）に従って得られたポリマーＰＯ−Ｂを用いる。
ＰＯ−Ｂを水で希釈し、ｐＨを（適切なＮａＯＨ溶液で）調整し、オスモル濃度を（適切なＮａＣｌ溶液で）調整する。
【表９】
2010526041.tif 000021
得られたポリマーＰＯ−Ｂに基づくコロイド溶液は、該溶液１ｍｌを緩衝溶液Ｔｐ１ｍｌに加える間に沈殿し、沈殿因子ＰＦが１１５０に等しいことを特徴とする。ポリマーＰＯ−Ｂは、ｐＨ＊が５に等しいことを特徴とする。
【０１７１】
ｂ）タンパク質のポリマーＰＯ−Ｂとの会合
２．７ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−α１．８ｇをＰＯ−Ｂのコロイド溶液８ｇに加え、適切なＮａＣｌ溶液で希釈することによって、最終濃度を調整する。
【０１７２】
ｃ）２５℃で一晩の会合
粒径をＴ'テストに従って測定する。
以下、最終製剤の特徴を表に示す。
【表１０】
2010526041.tif 000022
上記のようにして得た製剤は、Ｑテストにおいて保持因子ＲＱが５より大きいことを特徴とする（ＲＱ＝５での遊離ＩＦＮ−αの割合についてのＥＬＩＳＡテスト：８％）。
【０１７３】
５．２）例４．２：ＰＯ−Ｂの濃度が４５ｍｇ／ｇに等しい
上述の合成ｄ）に従って得られたポリマーＰＯ−Ｂを用いる。
ＰＯ−Ｂを水で希釈し、ｐＨを（適切なＮａＯＨ溶液で）調整し、オスモル濃度を（適切なＮａＣｌ溶液で）調整する。
【表１１】
2010526041.tif 000023
得られたポリマーＰＯ−Ｂに基づくコロイド溶液は、該溶液１ｍｌを緩衝溶液Ｔｐ１ｍｌに加える間に沈殿し、沈殿因子ＰＦが２５６に等しいことを特徴とする。ポリマーＰＯ−Ｂは、ｐＨ＊が５に等しいことを特徴とする。
【０１７４】
６）例５（比較）：ＩＦＮ−αを備えるＰＯに基づく粒子の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＯを用いる。
ポリマーＰＯを水中に溶解することで、ポリマーＰＯのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．５２に調整する。必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することで溶液のオスモル濃度を１０８ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＯの濃度を２９．０５ｍｇ／ｇに調整する。
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αを先のポリマーＰＯコロイド溶液に加える。２５℃で一晩、会合を形成する。
以下、得られた粒子の特徴を表に示す。
粒径をＴ'テストに従って測定する。
【表１２】
2010526041.tif 000024
【０１７５】
７）例２、３及び５の生体外での結果
このために、本発明に従う製剤からの活性成分の放出をＬテストによって測定する。
Ｌテストにおける放出を時間と共に放出されるタンパク質の割合の形式で図１に示す。
比較の例５の製剤は、ＰＯの粒子を２３ｍｇ／ｇで含んでおり、１０時間で放出されたタンパク質が９３％であることを特徴とする放出プロファイルを示す。
例２．１及び３の製剤は、４８時間でそれぞれ６７％及び６５％の注入されたタンパク質を放出するという遅延放出プロファイルを示す。
例２．３の粒子の場合、実験の終わりでゼロにならない放出流量の形成が観察され、４８時間で注入されたタンパク質の５９％が放出される。
【０１７６】
８）例２、３及び５の生体内での結果
４４匹のラットを８又は１２匹の５グループに分け、並行して即時放出ＩＲ製剤もしくは比較の例５に対応する持続放出製剤、又は本発明の例２及び３の製剤の一つを３００μｇ／ｋｇの投与量で受けた。
以下、薬物動態の結果を表に示す。
【表１３】
2010526041.tif 000025
【０１７７】
Ｃｍａｘは、すべての動物に対するタンパク質の平均最大血漿中濃度を示す。
Ｔｍａｘ中央値は、血漿中濃度が最大となる時間の中央値を示す。
ＡＵＣは、時間の関数として血漿中濃度の曲線下平均面積を示す。
Ｔ５０％ＡＵＣは、曲線下面積がその合計値の５０％に到する平均時間を示す。
ＲＢＡは、検討中の製剤の曲線下面積のＩＦＮ  ＩＲ製剤の曲線下面積に対する比を示す。
【０１７８】
すべての製剤は、ＩＲに対してＣｍａｘの低下を伴う持続放出プロファイルを示す。
比較例５との比較すると、本発明に従う全ての製剤の終わりの傾きがより小さく、持続した残留吸着を示唆する。
例２．１及び例３の製剤（１０ｍｇ／ｇ  ＰＯ−Ａ１および３０ｍｇ／ｇ  ＰＯ−Ａ２）に関しては、それぞれのＲＢＡ値が５７％及び約１００％を示す５日以上かけての持続放出に（比較例５の製剤の約３日と比較して）注目すべきである。
【図１】
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【国際調査報告】
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