(57)【要約】  非天然アミノ酸、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド、ならびにこのような非天然アミノ酸およびポリペプチドを作製するための方法が本明細書に記載されている。非天然アミノ酸自体またはポリペプチドの一部としての非天然アミノ酸は、フェナジン置換基またはキノキサリン置換基を含んでいることができる。また、本明細書にはさらに翻訳後修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、そのような修飾をするための方法、およびそのようなポリペプチドを精製するための方法が開示されている。
2010514808.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１：
【化１】
2010514808.tif 000099
で示される構造を有し、
Ａは任意に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、一方の末端においてフェナジンを含んでいる部分またはキノキサリンを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
該リンカーは、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−から成る群より選択され、ｋは１、２、または３であり、Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、または置換低級アルキルであるか；あるいはＲ３およびＲ４または２つのＲ３基は、必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ”、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２、または−Ｌ−Ｚであるか；あるいは、
２つのＲ５基は、必要に応じて一緒になって、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールを形成し；
Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、保護基、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルであるか、あるいは２つ以上のＲ”が存在する場合に、２つのＲ”は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールを形成し；
Ｚは、水溶性ポリマー；ポリアルキレンオキシド；ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；少なくとも１つのアミノ酸；少なくとも１つの糖類；少なくとも１つのヌクレオチド；少なくとも１つのヌクレオシド；リガンド；ビオチン；ビオチンの類似体；検出可能な標識；およびそれらの任意の組合せから成る群より選択され；
Ｌは任意に、結合、アルキレン、置換アルキレン、シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、ヘテロアルキレン、置換へテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、置換アラルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＳ−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＳ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’）−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、または−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−であり；
ｋは０、１または２であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩、活性のある代謝産物、プロドラッグ、溶媒和物、多形、互変異性体、またはエナンチオマー。
【請求項２】
一般式３：
【化２】
2010514808.tif 000100
で示される構造を有し、
Ａは任意に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、一方の末端においてフェナジンを含んでいる部分またはキノキサリンを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
該リンカーは、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−から成る群より選択され、ｋは１、２、または３であり、Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、または置換低級アルキルであるか；あるいはＲ３およびＲ４または２つのＲ３基は、必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ”、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２、または−Ｌ−Ｚであるか；あるいは、
２つのＲ５基は、必要に応じて一緒になって、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールを形成し；
Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、保護基、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルであるか、あるいは２つ以上のＲ”が存在する場合に、２つのＲ”は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールを形成し；
Ｚは、水溶性ポリマー；ポリアルキレンオキシド；ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；少なくとも１つのアミノ酸；少なくとも１つの糖類；少なくとも１つのヌクレオチド；少なくとも１つのヌクレオシド；リガンド；ビオチン；ビオチンの類似体；検出可能な標識；およびそれらの任意の組合せから成る群より選択され；
Ｌは任意に、結合、アルキレン、置換アルキレン、シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、ヘテロアルキレン、置換へテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、置換アラルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＳ−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＳ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’）−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、または−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−であり；
ｋは０、１または２であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩、活性のある代謝産物、プロドラッグ、溶媒和物、多形、互変異性体、またはエナンチオマー。
【請求項３】
一般式６：
【化３】
2010514808.tif 000101
で示される構造を有し、
Ａは任意に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、一方の末端においてフェナジンを含んでいる部分またはキノキサリンを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
該リンカーは、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−から成る群より選択され、ｋは１、２、または３であり、Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、または置換低級アルキルであるか；あるいはＲ３およびＲ４または２つのＲ３基は、必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ”、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２、または−Ｌ−Ｚであるか；あるいは、
２つのＲ５基は、必要に応じて一緒になって、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールを形成し；
Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、保護基、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルであるか、あるいは２つ以上のＲ”が存在する場合に、２つのＲ”は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールを形成し；
Ｚは、水溶性ポリマー；ポリアルキレンオキシド；ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；少なくとも１つのアミノ酸；少なくとも１つの糖類；少なくとも１つのヌクレオチド；少なくとも１つのヌクレオシド；リガンド；ビオチン；ビオチンの類似体；検出可能な標識；およびそれらの任意の組合せから成る群より選択され；
Ｌは任意に、結合、アルキレン、置換アルキレン、シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、ヘテロアルキレン、置換へテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、置換アラルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＳ−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＳ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’）−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、または−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−であり；
ｋは０、１または２であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩、活性のある代謝産物、プロドラッグ、溶媒和物、多形、互変異性体、またはエナンチオマー。
【請求項４】
上記Ｒ３およびＲ４がそれぞれ結合である、請求項１〜３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項５】
上記ＡおよびＢが結合である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
上記Ａがフェニレンまたは置換フェニレンであり、上記Ｂが結合である、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
上記Ｒ１およびＲ２がそれぞれ少なくとも１つのアミノ酸である、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
上記Ｒ１およびＲ２がそれぞれ少なくとも１つのアミノ酸である、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
上記Ｒ１およびＲ２がそれぞれ少なくとも２つのアミノ酸である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
上記Ｒ１およびＲ２がそれぞれ少なくとも２つのアミノ酸である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
上記Ａがフェニレンまたは置換フェニレンであり、Ｂが−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ’）−であり、Ｒ’が、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである、請求項１〜３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
【化４】
2010514808.tif 000102
から成る群より選択される、請求項３に記載の化合物。
【請求項１３】
【化５】
2010514808.tif 000103
から成る群より選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項１４】
上記Ｚが少なくとも１つのアミノ酸である、請求項１〜３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
上記Ｚが、蛍光性部分、燐光性部分、化学発光性部分、キレート化部分、電子密度の高い部分、磁性部分、インターカレートする部分、放射性部分、発色性部分、およびエネルギーを伝達する部分から成る群より選択される検出可能な標識である、請求項１〜３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｘが水溶性ポリマーである、請求項１〜３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
上記水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシドまたは置換ポリアルキレンオキシドを含んでいる、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
上記水溶性ポリマーが、−［（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−（水素、アルキル、または置換アルキル）］ｘを含んでおり、ｘは２０〜１０，０００である、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
上記水溶性ポリマーが、約２〜約４０ＫＤａの分子量を有するｍ−ＰＥＧである、請求項１６に記載の化合物。
【請求項２０】
請求項１〜３の何れか１項に記載の化合物の構造を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸、を含んでいるポリペプチド。
【請求項２１】
治療ポリペプチドの天然アミノ酸が上記非天然アミノ酸で置換されている、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンから成る群より選択される、請求項２１に記載の治療ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項２１に記載のポリペプチドを製造する方法であって、少なくとも１つの非天然アミノ酸を該ポリペプチドの末端または内部に組み込む工程を含んでいる方法。
【請求項２４】
翻訳系を用いて、上記非天然アミノ酸が上記ポリペプチドの特定の部位に組み込まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
上記翻訳系が、細菌の細胞、古細菌の細胞、および真核細胞から成る群より選択される細胞を含んでいるインビトロの翻訳系である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
一般式（ＶＩＩ）：
【化６】
2010514808.tif 000104
で示される構造を有する非天然アミノ酸を、１，２−ジカルボニルを含んでいる化合物と反応させる工程を含んでおり、
Ａは任意に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、一方の末端においてフェナジンを含んでいる部分またはキノキサリンを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
該リンカーは、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−から成る群より選択され、ｋは１、２、または３であり、Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、または置換低級アルキルであるか；あるいはＲ３およびＲ４または２つのＲ３基は、必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒａはそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである、請求項２または３に記載の化合物を製造するための方法。
【請求項２７】
上記Ａが結合である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
一般式（ＶＩＩ）で示される構造が、一般式（ＶＩＩＩ）：
【化７】
2010514808.tif 000105
に相当する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
上記一般式（ＶＩＩＩ）で示される構造が、
【化８】
2010514808.tif 000106
から成る群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
上記一般式（ＶＩＩ）で示される構造が、一般式（ＩＸ）：
【化９】
2010514808.tif 000107
に相当する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
上記一般式（ＩＸ）で示される構造が、
【化１０】
2010514808.tif 000108
から成る群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
一般式（Ｉ）：
【化１１】
2010514808.tif 000109
で示される構造を有する非天然アミノ酸を、１，２ジアリールアミンを含んでいる化合物と反応させる工程を含んでおり、
Ａは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２、または３であり、Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり：
Ｊは、
【化１２】
2010514808.tif 000110
であり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、または置換低級アルキルであるか、あるいはＲ３およびＲ４または２つのＲ３基は、必要に応じて一緒になって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成する、請求項１に記載の化合物を製造する方法。
【請求項３３】
上記一般式（Ｉ）で示される構造が、
【化１３】
2010514808.tif 000111
に相当する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
上記一般式（ＩＩ）で示される構造が、
【化１４】
2010514808.tif 000112
に相当し、
Ｒａはそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記Ｂが結合である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
上記Ｒ１が少なくとも１つのアミノ酸であり、上記Ｒ２が少なくとも１つのアミノ酸である、請求項３２〜３５の何れか１項に記載の方法。
【請求項３７】
障害、病気、または疾病の処置が必要な被験体の障害、病気、または疾病を処置するための方法であって、
障害、病気、または疾病は、治療ポリペプチドを投与することによって治療可能であり、
障害、病気、または疾病の処置が必要な被験体に治療に効果的な量の修飾された形態の治療ポリペプチドを投与する工程を含んでおり、
治療ポリペプチドは、障害、病気、または疾病を処置する治療活性を有しており、
修飾は、修飾された形態の治療ポリペプチドの治療活性を破壊するものではなく、
修飾された形態の治療ポリペプチドは、請求項１〜３の何れか１項に記載の化合物の構造を有する非天然アミノ酸を組み込んでおり、
非天然アミノ酸は該治療ポリペプチド内の特定の部位に存在している、方法。
【請求項３８】
上記Ｒ３およびＲ４がそれぞれ結合である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
上記ＡおよびＢが結合である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
上記Ａがフェニレンまたは置換フェニレンであり、上記Ｂが結合である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
上記Ａがフェニレンまたは置換フェニレンであり、上記Ｂが−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ’）−であり、Ｒ’がＨ、アルキル、または置換アルキルである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
上記Ｚが少なくとも１つのアミノ酸である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
上記Ｚが、蛍光性部分、燐光性部分、化学発光性部分、キレート化部分、電子密度の高い部分、磁性部分、インターカレートする部分、放射性部分、発色性部分、およびエネルギーを伝達する部分から成る群より選択される検出可能な標識である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
Ｘが水溶性ポリマーである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
上記水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシドまたは置換ポリアルキレンオキシドを含んでいる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
上記水溶性ポリマーが、−［（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−（水素、アルキル、または置換アルキル）］ｘを含んでおり、ｘは２０〜１０，０００である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
上記水溶性ポリマーが、約２〜約４０ＫＤａの分子量を有するｍ−ＰＥＧである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
上記治療ポリペプチドが、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンから成る群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
患者中の修飾された形態のポリペプチドの存在を検出する方法であって、
効果的な量の修飾された形態のポリペプチドを患者に投与する工程を含んでおり、
修飾は、修飾された形態のポリペプチドの活性を破壊するものではなく、
修飾された形態のポリペプチドは、請求項１〜３の何れか１項に記載の化合物の構造を有する非天然アミノ酸を組み込んでおり、
非天然アミノ酸は該ポリペプチド内の特定の部位に存在しており、
修飾されていない形態のポリペプチドは、天然に生じるポリペプチドまたは治療ポリペプチドである、方法。
【請求項５０】
上記Ｒ３およびＲ４がそれぞれ結合である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
上記ＡおよびＢが結合である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
上記Ａがフェニレンまたは置換フェニレンであり、上記Ｂが結合である、請求項５０に記載の化合物。
【請求項５３】
上記Ａがフェニレンまたは置換フェニレンであり、上記Ｂが−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ’）−であり、Ｒ’がＨ、アルキル、または置換アルキルである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
上記Ｚが少なくとも１つのアミノ酸である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
上記Ｚが、蛍光性部分、燐光性部分、化学発光性部分、キレート化部分、電子密度の高い部分、磁性部分、インターカレートする部分、放射性部分、発色性部分、およびエネルギーを伝達する部分から成る群より選択される検出可能な標識である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
上記Ｘが水溶性ポリマーである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
上記水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシドまたは置換ポリアルキレンオキシドを含んでいる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
上記水溶性ポリマーが、−［（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−（水素、アルキル、または置換アルキル）］ｘを含んでおり、ｘは２０〜１０，０００である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
上記水溶性ポリマーが、約２〜約４０ＫＤａの分子量を有するｍ−ＰＥＧである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
修飾されていない形態の上記ポリペプチドが、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンから成る群より選択される治療ポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項６１】
上記非天然アミノ酸が蛍光性である、請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
上記非天然アミノ酸の側鎖が、式（ＸＸＸＶＩ）：
【化１５】
2010514808.tif 000113
で示される構造に相当する部分を含んでいる、請求項４９に記載の方法。
【請求項６３】
上記式（ＸＸＸＶＩ）で示される構造を含んでいるポリペプチドが、障害、病気、または疾病のためのバイオマーカーと結合する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
上記疾病が癌である、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願〕
本出願は、米国特許出願第６０／８８２，５５０号明細書（２００６年１２月２８日出願）の利益を主張するものである。
【０００２】
〔技術分野〕
本発明は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸を少なくとも１つ含むポリペプチド、当該非天然アミノ酸およびポリペプチドを製造する方法、ならびに診断、環境、産業、および治療に使用するための、当該非天然アミノ酸およびポリペプチドの使用に関する。
【０００３】
〔背景技術〕
遺伝的にコードされていないアミノ酸（つまり、非天然アミノ酸）を、タンパク質に組み込むことができれば、天然に生じる官能基（リジンのイプシロン位の−ＮＨ２、システインのスルフィドリル（−ＳＨ）、ヒスチジンのイミノ基など）に代わる有益な化学官能基を導入することができる。２０の一般的な遺伝的にコードされたアミノ酸において見られる官能基に対して不活性であるが、非天然アミノ酸に組み込まれ得る官能基と首尾よく効率的に反応して、安定な連結を形成する特定の化学官能基が知られている。
【０００４】
タンパク質には発見されず、２０の一般的な遺伝的にコードされたアミノ酸に見られる官能基の全てに対して化学的に不活性であり、特定の官能基を含んでいる試薬と効率的かつ選択的に反応して、安定な共有連結を形成し得る化学官能基を選択的に導入する方法は、現在利用可能である。
【０００５】
〔発明の要旨〕
本明細書には、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術および方策が記載されている。一態様では、方法、組成物、技術および方策は、非天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸のポリペプチドを誘導体化するためのものである。一実施形態では、上記方法、組成物、技術および方策は、化学的誘導体化に関し、他の実施形態では生物学的誘導体化に関し、さらに別の実施形態では物理的誘導体化に関し、さらに別の実施形態ではそれら誘導体化の組合せに関する。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は位置選択的である。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は位置特異的である。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は、室温（ambient temperature）において迅速である。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は、水溶液において起こる。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は、約２〜約１０のｐＨ（約３〜約８のｐＨ、約４〜約１０のｐＨ、約４〜約８のｐＨ、約４．５〜約７．５のｐＨ、約４〜約７のｐＨ、約３〜約４のｐＨ、約７〜約８のｐＨ、約４〜約６のｐＨ、約４のｐＨ、および約６のｐＨを含む）において起こる。さらなる、または別の実施形態では、上記誘導体化は、促進剤の添加によって、非天然アミノ酸を含んでいる試薬と、誘導体化試薬との両方において、化学量論的、ほぼ化学量論的、または化学量論様である。さらなる、または別の実施形態では、促進剤の添加によって、化学量論的、ほぼ化学量論的、または化学量論様に、所望の基を非天然アミノ酸のポリペプチドに組み込むことができる方策、反応混合物、合成条件が提供される。
【０００６】
一態様では、非天然アミノ酸は、キノキサリン連結またはフェナジン連結に基づいて、ペプチドおよびタンパク質を化学的に誘導体化するためのものである。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸は、誘導体化分子と反応することによってキノキサリン連結またはフェナジン連結を生じる官能基を側鎖に有する。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸は、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンの側鎖を有するアミノ酸から選択される。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸は、保護またはマスクキングされた１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンの側鎖を有するアミノ酸から選択される。さらに、１，２−ジカルボニルの側鎖の同等物、あるいは１，２−ジカルボニル側鎖の保護またはマスクキングされた同等物も含まれる。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸は、上述した官能基の１つを含むこと以外は、天然アミノ酸と構造的に類似している。他の、またはさらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、フェニルアラニンまたはチロシン（芳香族アミノ酸）と類似する一方で、別の実施形態では、アラニンおよびロイシン（疎水性アミノ酸）と類似している。一実施形態では、非天然アミノ酸は、天然アミノ酸が有する性質と異なる性質を有している。一実施形態では、このような異なる性質は、側鎖の化学反応性である。さらなる実施形態では、この異なる化学反応性によれば、ポリペプチドのユニットである間に非天然アミノ酸の側鎖は同じポリペプチド内の天然アミノ酸ユニットの側鎖が反応を受けないにもかかわらず、反応を受けることができる。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖は、天然に生じるアミノ酸の化学的性質に直交な化学的性質を有している。本段落における上記実施形態の何れにおいても、非天然アミノ酸は、分離した分子として存在し、どちらかの末端に少なくとも１つのアミノ酸が付加している（任意の長さのポリペプチドを含む）。
【０００７】
別の実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、１つ以上の非天然アミノ酸が任意の長さのポリペプチドに組み込まれており、天然に生じるアミノ酸または非天然アミノ酸がさらに組み込まれていてもよい。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸は、インビボでのタンパク質の翻訳中に部位特異的に組み込まれる。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、誘導体化分子と反応し、キノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを生成する。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンの側鎖、保護またはマスクキングされた１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンの側鎖、１，２−ジカルボニルの側鎖の同等物、および１，２−ジカルボニルの側鎖の保護またはマスクキングされた同等物を有する１つ以上のアミノ酸を含む。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、上述した官能基の１つを含むこと以外は天然アミノ酸と構造的に類似している非天然アミノ酸を１つ以上含み、いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、フェニルアラニンまたはチロシン（芳香族アミノ酸）と類似し、また別の実施形態では、アラニンおよびロイシン（疎水性アミノ酸）と類似している。一実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、天然アミノ酸が有する性質とは異なる性質を有する非天然アミノ酸を１つ以上含む。一実施形態では、このような異なる性質は、側鎖の化学反応性である。さらなる実施形態では、この異なる化学反応性によれば、ポリペプチドのユニットである間に非天然アミノ酸の側鎖は、同じポリペプチド内の天然アミノ酸ユニットの側鎖が反応を受けないにもかかわらず、反応を受けることができる。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖は、非天然アミノ酸のポリペプチドの天然に生じるアミノ酸の化学的性質に直交な化学的性質を有している。
【０００８】
他の態様では、誘導体化分子は、キノキサリンまたはフェナジンの連結に基づいて、誘導体化された非天然アミノ酸のポリペプチドを製造するためのものである。一実施形態では、１，２−ジカルボニルで置換された分子が、１，２−アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを誘導体化するために用いられ、キノキサリン連結またはフェナジン連結を形成する。他の実施形態では、１，２−アリールジアミンで置換された分子が、１，２−ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを誘導体化するために用いられ、キノキサリン連結またはフェナジン連結を形成する。さらなる、または別の実施形態では、キノキサリン連結またはフェナジン連結に基づいて誘導体化された非天然アミノ酸のポリペプチドを製造するための、１，２−ジカルボニルおよび１，２−アリールジアミンで置換された分子は、以下の物質より選択される基を含む：標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチドあるいはポリペプチド類似体、抗体または抗体断片、金属キレート剤、補助因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分（ｍｏｉｅｔｙ）、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分（photocaged moiety）、化学線によって励起可能な部分、リガンド、光異性体化可能な部分、ビオチン、ビオチンの類似体、重原子を組み込んでいる部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、伸長した側鎖、炭素連結した糖、酸化還元活性化剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識されている部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、インターカレートする基、発色団、エネルギー伝達剤、生物学的に活性な剤、検出可能な標識、低分子、阻害性リボ核酸、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット、ナノ伝達物質、放射線伝達物質、抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）、受容体、逆ミセル、ならびにそれらの任意の組合せ。さらなる、または別の実施形態では、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンで置換された分子は、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンで置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖は、非天然アミノ酸が１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンで置換された分子と選択的に反応することができるという、天然に生じるアミノ酸の化学的性質に対して直交な化学的性質を有している。
【０００９】
上述した実施形態に関するさらなる態様では、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドは、誘導体化分子と非天然アミノ酸のポリペプチドとの反応の結果生じるものである。一実施形態では、１，２−アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、１，２−ジカルボニルで置換された分子によって誘導体化され、キノキサリン連結またはフェナジン連結を形成する。他の実施形態では、１，２−ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、１，２−アリールジアミンで置換された分子によって誘導体化され、キノキサリン連結またはフェナジン連結を形成する。さらなる、または別の実施形態では、キノキサリンまたはフェナジンで誘導体化された非天然アミノ酸のポリペプチドは、以下の物質から選択される基を含む：標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチドあるいはポリペプチド類似体、抗体または抗体断片、金属キレート剤、補助因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分、化学線によって励起可能な部分、リガンド、光異性体化可能な部分、ビオチン、ビオチンの類似体、重原子を組み込んでいる部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、伸長した側鎖、炭素連結した糖、酸化還元活性化剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識されている部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、インターカレートする基、発色団、エネルギー伝達剤、生物学的に活性な剤、検出可能な標識、低分子、阻害性リボ核酸、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット、ナノ伝達物質、放射線伝達物質、抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、ならびにそれらの任意の組合せ。好ましい実施形態においては、キノキサリンまたはフェナジンで誘導体化された非天然アミノ酸のポリペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を含んでいる。さらなる実施形態には、すでに修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドが、さらに任意に修飾されたものが含まれる。
【００１０】
別の態様では、一官能性リンカー、二官能性リンカーおよび多官能性リンカーは、キノキサリン連結またはフェナジン連結の形成に基づいて、誘導体化された非天然アミノ酸のポリペプチドを生成するためのものである。一実施形態では、（二官能性、および多官能性の）分子リンカーは、キノキサリン連結またはフェナジン連結を形成することによって、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを、他の分子に接続するために用いられる。１，２−アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを利用する実施形態では、分子リンカーは、その一方の末端に１，２−ジカルボニル基を含んでいる。１，２−ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを利用する実施形態では、分子リンカーは、その一方の末端に１，２−アリールジアミン基を含んでいる。さらなる、または別の実施形態では、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンで置換されたリンカー分子は、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンで置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー分子である。さらなる実施形態では、語句「他の分子」としては、例えば、タンパク質、他のポリマー、および低分子が挙げられる。さらなる、または別の実施形態では、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンを含んでいる分子リンカーは、全ての末端に同じかまたは同等の基を含んでいる。これによれば、該１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンを含んでいる分子リンカーを１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドと反応させることによって、ホモ多量体化した非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドが得られる。さらなる実施形態では、ホモ多量体化は、ホモ二量体化である。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸の側鎖は、非天然アミノ酸がアルデヒドで置換されたリンカー分子と選択的に反応することができるという、天然に生じるアミノ酸の化学的性質に対して直交な化学的性質を有している。本段落に記載の実施形態に関するさらなる態様では、連結された修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、リンカー分子と非天然アミノ酸のポリペプチドとの反応から生じるものである。さらなる実施形態には、すでに連結された修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドが、さらに任意に修飾されたものが含まれる。
【００１１】
他の様態は、キノキサリン連結またはフェナジン連結を介して化学的に誘導体化されるペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質へ組み込まれる非天然アミノ酸の化学合成方法ある。さらなる、または別の実施形態は、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンの側鎖、保護またはマスキングされた１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンの側鎖、１，２−ジカルボニルの側鎖の同等物、または１，２−ジカルボニルの側鎖の保護またはマスキングされた同等物を有するアミノ酸から選択される非天然アミノ酸の化学合成方法である。
【００１２】
他の態様は、１，２−アリールジアミンまたは１，２−ジカルボニルで置換されたポリペプチドまたはタンパク質をそれぞれ誘導体化するための（いずれの場合においても、フェナジン連結またはキノキサリン連結が形成される。）、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンで置換された分子を化学合成する方法であり、一実施形態では、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンで置換された分子は、ペプチド、他のポリマー（分枝状または非分枝状ポリマー）、および低分子を含んでいてもよい。さらなるまたは別の実施形態では、非天然アミノ酸は、インビボでのタンパク質の翻訳中に部位特異的に組み込まれる。さらなる、または別の実施形態では、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンで置換された分子は、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸を、部位特異的にキノキサリンまたはフェナジンで誘導体化されたポリペプチドを介して、部位特異的に誘導体化できるものである。特定の実施形態では、１，２−ジカルボニルで置換された分子は、１，２−アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸を、部位特異的にキノキサリンまたはフェナジンで誘導体化されたポリペプチドを介して、部位特異的に誘導体化できるものである。もしくは、特定の実施形態では、１，２−アリールジアミンで置換された分子は、１，２−ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸を、部位特異的にキノキサリンまたはフェナジンで誘導体化されたポリペプチドを介して、部位特異的に誘導体化できるものである。さらなる、または別の実施形態では、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンで置換された分子を調製する方法は、部位特異的に誘導体化された多種多様なポリペプチドを、入手する手段を提供する。さらなる、または別の実施形態は、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンで官能基化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を合成する方法である。
【００１３】
他の態様は、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドまたはタンパク質の調製方法である。一実施形態では、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドまたはタンパク質は、生合成的に製造される。他の実施形態では、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドまたはタンパク質は、化学的に製造される。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドまたはタンパク質は、生合成的方法と化学的方法との組合せによって製造される。さらなる、または別の実施形態は、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミン非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドまたはタンパク質の調製方法である。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸はインビボにおけるタンパク質の翻訳中に部位特異的に組み込まれる。さらなる、または別の実施形態では、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミン非天然アミノ酸は、インビボにおけるタンパク質の翻訳中に部位特異的に組み込まれる。
【００１４】
一態様は、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンの反応物質の反応によってキノキサリンまたはフェナジンを基本とする生成物を生成し、タンパク質を誘導体化する方法である。この態様には、キノキサリンまたはフェナジンで誘導体化されたタンパク質付加物を生成するための、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミン反応物質の反応に基づく、タンパク質を誘導体化する方法が包含される。さらなる、または別の実施形態は、１，２−アリールジアミンで官能基化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を用いた、１，２−ジカルボニルを含んでいるタンパク質を誘導体化する方法である。さらなる、または別の実施形態では、１，２−ジカルボニルで官能基化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を用いた、１，２−アリールジアミンを含んでいるタンパク質を誘導体化する方法である。もう１つのさらなる、または別の実施形態では、１，２−ジカルボニルで置換された分子および１，２−アリールジアミンで置換された分子は、タンパク質、他のポリマー、および低分子を含んでいてもよい。
【００１５】
他の態様は、１，２−アリールジアミンまたは１，２−ジカルボニルを含んでいる二官能性リンカーをそれぞれ用いた、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンで置換された非天然アミノ酸のポリペプチドを化学的に誘導体化する方法である。一実施形態では、キノキサリン連結またはフェナジン連結を生成して、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンで置換されたリンカーを１，２−アリールジアミンまたは１，２−ジカルボニルで置換されたタンパク質にそれぞれ付着させる方法である。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンを含んでいる二官能性リンカーを用いて、部位特異的におよび／または３次元構造を正確に制御することによって誘導体化される。一実施形態では、上記方法は、分子リンカー（特に限定されないが、一官能性分子リンカー、二官能性分子リンカー、および多官能性分子リンカーが挙げられる。）を１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドに付着させるために用いられる方法である。該リンカーの末端の少なくとも１つは、キノキサリン連結またはフェナジン連結を形成して、１，２−アリールジアミンまたは１，２−ジカルボニルの非天然アミノ酸のポリペプチドにそれぞれ連結する１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミン基を含んでいる（明確に述べると、いずれの組み合わせの連結であってもキノキサリン連結またはフェナジン連結を形成する）。さらなる、または別の実施形態では、上記リンカーは、１，２−ジカルボニルまたは１，２−アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを他の分子に接続するために用いられる。なお、他の分子としては、例えば、タンパク質、他のポリマー（分枝状または非分枝状ポリマー）、および低分子が挙げられる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、水溶性ポリマーと連結している。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはポリエチレングリコール部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール分子は、二官能性ポリマーである。いくつかの実施形態では、二官能性ポリマーは、第２ポリペプチドと連結している。いくつかの実施形態では、第２ポリペプチドは、第１ポリペプチドと同一であり、他の実施形態では、第２ポリペプチドは、第１ポリペプチドと異なるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、ポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる水溶性ポリマーと連結している、少なくとも２つのアミノ酸を含んでいる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、受容体に対する非天然アミノ酸のポリペプチドの親和性を増加させる、置換、付加または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、非天然アミノ酸のポリペプチドの安定性を増加させる、置換、付加、または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、非天然アミノ酸のポリペプチドの水溶性を増加させる、置換、付加、または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、宿主細胞において製造された非天然アミノ酸のポリペプチドの溶解度を増加させる、置換、付加、または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、置換、付加、または欠失が無いときのアミノ酸のポリペプチドと比べて、プロテアーゼ耐性、血中半減期、免疫原性、および／あるいは発現が調節されている、置換、付加、または欠失を含んでいる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、またはインバースアゴニストである。いくつかの実施形態では、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、またはインバースアゴニストは、水溶性ポリマーと連結している非天然アミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態では、水ポリマーは、ポリエチレングリコール部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーと連結している非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、対応する受容体の二量体化を阻害する。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーと連結している非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、該ポリペプチドの結合パートナー、リガンド、または受容体に対する結合を調節する。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーと連結している非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、該ポリペプチドの１つ以上の性質または活性を調節する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然コドン、５塩基コドンおよび４塩基コドンから成る群より選択される。
【００２０】
また、本明細書には、水溶性ポリマーと連結している非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する方法も記載されている。いくつかの実施形態では、上記方法は、非天然アミノ酸を含んでいる単離されたポリペプチドと、該非天然アミノ酸と反応する部分を含んでいる水溶性ポリマーとを接触させる工程を含んでいる。いくつかの実施形態では、組み込まれた非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーと反応性であるが、２０の一般アミノ酸の何れとも非反応性である。いくつかの実施形態では、水ポリマーは、ポリエチレングリコール部分を含んでいる。ポリマーの分子量は、広範囲（例としては、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａまたはそれ以上の間が挙げられるが、これらに限定されない）である。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約９００Ｄａ、約８００Ｄａ、約７００Ｄａ、約６００Ｄａ、約５００Ｄａ、約４００Ｄａ、約３００Ｄａ、約２００Ｄａ、および約１００Ｄａが含まれるが、これらに限定されない）である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。他の実施形態では、ポリマーの分子量は、約５，００００Ｄａから約３０，０００Ｄａの間である。他の実施形態では、ポリマーの分子量は、約３０，０００Ｄａのである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール分子は、分枝状ポリマーである。枝分かれＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間（約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、および約１，０００Ｄａが含まれるが、これらに限定されない）である。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａである。他の実施形態では、ポリマーの分子量は、約５，００００Ｄａから約３０，０００Ｄａである。他の実施形態では、ポリマーの分子量は、約３０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約２０，０００Ｄａである。
【００２１】
また、本明細書には、本明細書に記載の非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含んでいる組成物も記載されている。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は水溶性ポリマーと連結している。また、本明細書には、薬学的に許容可能な担体と、少なくとも１つのアミノ酸が非天然アミノ酸で置換されたポリペプチドとを含んでいる薬学的組成物も記載されている。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸はサッカライド部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはサッカライド部分を介してポリペプチドと連結している。また、本明細書には、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドのプロドラッグが記載されており、さらには、上記プロドラッグと薬学的に許容可能な担体とを含む組成物も記載されている。また、本明細書には、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの代謝物も記載されている。いくつかの実施形態では、代謝物は、所望の活性を有し、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの活性を補足するか、もしくは上記活性に相乗作用を与える。また、本明細書には、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを利用し、所望の代謝物を生物に提供することが記載されている。上記生物は、上記代謝物を必要とする患者を含む。
【００２２】
また、本明細書には、セレクターコドンを含んでいるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞も記載されている。いくつかの実施形態では、上記細胞は、非天然アミノ酸をポリペプチドに置換するための、直交な（orthogonal）ＲＮＡシンテターゼおよび／または直交なｔＲＮＡを含んでいる。いくつかの実施形態では、細胞は細胞培養物であり、別の実施形態では、両生類、爬虫類、鳥類および哺乳類を含む多細胞生物の一部である。細胞の実施形態の何れにおいても、さらなる実施形態は、非天然アミノ酸のポリペプチドを製造するための、ポリヌクレオチドの発現を含んでいる。他の実施形態では、生物は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を利用して、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを含む、非天然アミノ酸のポリペプチドを製造する。他の実施形態では、生物は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および／または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを含む。上記生物は、両生類、爬虫類、鳥類および哺乳類を含む、単細胞および多細胞生物である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、インビトロにおいて製造される。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、細胞ライセートにおいて製造される。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、リボソームにおける翻訳によって製造される。
【００２３】
また、本明細書には、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを作製する方法が記載されている。いくつかの実施形態では、上記方法は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、直交なＲＮＡシンテターゼ、および／または直交なｔＲＮＡを含んでいる細胞を、ポリペプチドが発現できる条件下において培養する工程と、上記細胞および／または培地から上記ポリヌクレオチドを精製する工程とを含んでいる。
【００２４】
また、本明細書には、本明細書に記載の非天然アミノ酸のライブラリー、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドのライブラリー、または、本明細書に記載の修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドのライブラリー、あるいは、それらを組み合わせたライブラリーが記載されている。また、本明細書には、少なくとも１つの非天然アミノ酸、少なくとも１つの非天然アミノ酸のポリペプチド、および／または、少なくとも１つの修飾された非天然アミノ酸を含んでいるアレイが記載されている。また、本明細書には、セレクターコドンを含んでおり、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを少なくとも１つ含んでいるアレイが記載されている。ある実施形態では、本明細書に記載のアレイは、生物における非天然アミノ酸のポリペプチドの製造をスクリーニングするために用いられ得る（このスクリーニングは、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を検出するか、または該ポリペプチドの翻訳を検出することによって実施される）。
【００２５】
また、本明細書には、本明細書に記載のライブラリーを、所望の活性についてスクリーニングする方法、あるいは、本明細書に記載のアレイを用いて、本明細書に記載のライブラリーをスクリーニングする方法、あるいは、化合物および／またはポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの他のライブラリーを、所望の活性についてスクリーニングする方法が記載されている。また、本明細書には、新規治療剤を開発および発見するためのライブラリーのスクリーニングから得られた上記活性のデータの使用、ならびに、上記治療剤自体が記載されている。
【００２６】
また、本明細書には、非天然アミノ酸または非天然アミノ酸のポリペプチドの蛍光検出方法が記載されている。いくつかの実施形態では、上記方法は、フェナジン部分および／またはキノキサリン部分を少なくとも１つ含むアミノ酸側鎖の使用を含む。いくつかの実施形態では、上記フェナジン部分および／またはキノキサリン部分は、非天然アミノ酸の翻訳後修飾によって形成される。さらなる実施形態では、このような非天然アミノ酸は、ジカルボニル側鎖、アリールジアミン側鎖、またはヒドロキシルアミン側鎖を有する。さらなる実施形態では、フェナジン部分および／またはキノキサリン部分は、インビボにおいて形成され、他の実施形態では、フェナジン部分および／またはキノキサリン部分は、インビトロにおいて形成される。
【００２７】
また、本明細書には、ポリペプチドの治療半減期、血中半減期、または循環時間を増加させる方法が記載されている。いくつかの実施形態では、上記方法は、天然に生じるポリペプチド中の１つ以上の任意のアミノ酸を少なくとも１つの非天然アミノ酸と置換する工程、および／または、該ポリペプチドに水溶性ポリマーを連結する工程を含んでいる。
【００２８】
また、本明細書には、効果的な量の薬学的組成物を用いて、処置を必要とする患者を処置する方法が記載されている。該薬学的組成物は、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーと連結している。
【００２９】
さらなる、または代替の実施形態は、障害、病気または疾病を処置する方法であって、上記方法は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量投与する工程を含む。上記非天然アミノ酸は、１，２−ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸、１，２−アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸、キノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸、およびフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸から成る群より選択される。さらなる、または代替的な実施形態では、上記非天然アミノ酸のポリペプチドは、一般式Ｉ〜ＸＩおよび一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩで示されるアミノ酸から選択される非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいる。他の実施形態では、上記非天然アミノ酸のポリペプチドは、化合物１〜１２のアミノ酸から選択される天然アミノ酸の少なくとも１つを含む。
【００３０】
さらなる、または代替の実施形態は、障害、病気または疾病を処置する方法であって、上記方法は、キノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量投与する工程を含んでおり、生じたキノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる。
【００３１】
さらなる、または代替の実施形態は、障害、病気または疾病を処置する方法であって、上記方法は、キノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量投与する工程を含んでおり、生じたキノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドの安全プロフィールを増加させる。
【００３２】
さらなる、または代替の実施形態は、障害、病気または疾病を処置する方法であって、上記方法は、キノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量投与する工程を含んでおり、生じたキノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドの水溶性を増加させる。
【００３３】
さらなる、または代替の実施形態は、障害、病気または疾病を処置する方法であって、上記方法は、キノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量投与する工程を含んでおり、生じたキノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドの治療半減期を増加させる。
【００３４】
さらなる、または代替の実施形態は、障害、病気または疾病を処置する方法であって、上記方法は、キノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量投与する工程を含んでおり、生じたキノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドの血中半減期を増加させる。
【００３５】
さらなる、または代替の実施形態は、障害、病気または疾病を処置する方法であって、上記方法は、キノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量投与する工程を含んでおり、生じたキノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドの循環時間を延長する。
【００３６】
さらなる、または代替の実施形態は、障害、病気または疾病を処置する方法であって、上記方法は、キノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量投与する工程を含んでおり、生じたキノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドの生物学的な活性を調節する。
【００３７】
さらなる、または代替の実施形態は、障害、病気または疾病を処置する方法であって、上記方法は、キノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量投与する工程を含んでおり、生じたキノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドの免疫原生を調節する。
【００３８】
本明細書に記載の方法および組成物は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、細胞株、コンストラクト、および試薬に限定されるものではなく、変更され得ることを理解されたい。また、本明細書で用いられている専門用語は、特定の実施形態のみを記載するために用いられているのであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本明細書に記載の方法および組成物の範囲の限定を意図していないことを理解されたい。
【００３９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形の形態は、内容から明らかに分かるものを除いて、複数形の形態も含んでいる。
【００４０】
特に定義されない限り、本明細書で用いられた全ての技術用語および科学用語は、本明細書に記載の本発明が属する技術における当業者の一人によって一般的に理解される意味と同じ意味を有している。本明細書に記載の方法、装置、および材料と、同等または類似の任意のものを、本明細書に記載の発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料を記載する。
【００４１】
本明細書において検討された出版物は、本出願の出願日よりも前の開示のみを提供するものである。本明細書では、先行発明の長所または他の如何なる理由によって、本発明らが、上記開示よりも先行している資格を与えられないことを、承認していると解釈されることはない。
【００４２】
本明細書で用いられるような用語「親和性標識」は、可逆的もしくは不可逆的に別の分子と結合して、これを修飾もしくは破壊するか、またはこれと一緒に化合物を形成する標識のことをいう。例えば、親和性標識としては、酵素およびその基質、または抗体およびその抗原が挙げられる。
【００４３】
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ(またはチオアルコキシ)」は、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子に連結するアルキル基のことをいう。
【００４４】
用語「アルキル」は、それ自体または別の分子の一部である場合に、特に明記しない限り、炭素原子の数が指定され（即ち、Ｃ１−Ｃ１０は、１−１０の炭素を意味する。）、必要に応じて完全飽和、一不飽和、または多不飽和である、直鎖状の、分枝状の、または環状の炭化水素基、あるいはそれらの組合せを意味する。このような炭化水素基は、二価の基および多価の基を包含する。飽和炭化水素基としては、例えば特に限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、およびシクロプロピルメチル、ならびに例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、およびｎ−オクチルなどの同族体および異性体が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つ以上の２重結合または３重結合を有しているものである。不飽和アルキル基としては、例えば特に限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタンジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに、高級同族体および異性体などが挙げられる。また、用語「アルキル」は、特に断りの無い限り、下記においてより詳細に定義されるアルキルの誘導体（「ヘテロアルキル」、「ハロアルキル」および「ホモアルキル」など）を包含することを意味する。
【００４５】
用語「アルキレン」は、それ自体または別の分子の一部である場合に、アルカンから誘導された二価の基を意味し、典型的なものとして、（−ＣＨ２−）ｎ（ｎは、１〜約２４である。）が挙げられる。そのような基としては、例えば特に限定されないが、−ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−という構造のような１０以下の炭素原子を有する基が挙げられる。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般的に、８以下の炭素原子を有する、より鎖の短いアルキル基またはアルキレン基のことをいう。また、用語「アルキレン」は、特に断りの無い限り、「ヘテロアルキレン」として本明細書に記載された基を包含することを意味する。
【００４６】
用語「アミノ酸」は、天然に生じるアミノ酸、および非天然アミノ酸、ならびに、天然に生じるアミノ酸と同じように機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模擬体のことをいう。天然にコードされたアミノ酸は、２０の一般アミノ酸、ピロリジン、およびセレノシステインである。２０の一般アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンである。アミノ酸類似体は、天然に生じるアミノ酸と基本的な化学構造（例えば、α炭素が、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合している構造）が同じである化合物のことをいう。このような類似体では、必要に応じてＲ基が修飾されているか（ノルロイシンなど）、またはペプチド骨格が修飾されているとしても、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造が保たれている。アミノ酸類似体としては、例えば特に限定されないが、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどが挙げられる。
【００４７】
本明細書においてアミノ酸の名称を示すときは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生物化学命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）が推薦する公知の３文字表記または１文字表記のどちらかを用いる。また、ヌクレオチドを示すときは、一般的に受け入れられている１文字コードを用いる。
【００４８】
「アミノ末端修飾基」は、末端アミン基に付着することができる任意の分子のことをいう。例えば、このような末端アミン基は、必要に応じて高分子の末端に存在する。高分子としては、特に限定されないが、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびポリサッカライドが挙げられる。末端修飾基としては、特に限定されないが、様々な水溶性ポリマー、ペプチド、またはタンパク質が挙げられる。例えば、末端修飾基としては、ポリエチレングリコール、または血清アルブミンが挙げられる。末端修飾基は、高分子の治療特性を修飾するために使用される。治療特性の修飾としては、例えば特に限定されないが、ペプチドの血中半減期を増加させることが挙げられる。
【００４９】
「抗体断片」は、全長の形態以外の任意の形態の抗体を意味する。本明細書に記載の抗体断片としては、全長の抗体内に存在するより小さい構成要素である抗体、および操作された抗体が挙げられる。抗体断片としては、特に限定されないが、、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、二機能性のハイブリッド抗体、ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、各ＣＤＲの組合せ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、重鎖、軽鎖、可変領域、ならびに、代替的な骨格を有する非抗体分子、二特異性抗体などが挙げられる(「Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76」; 「Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402」)。別の機能的な部分構造体（substructure）は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。一本鎖Ｆｖは、ペプチドリンカーによって共有的に接続された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域から構成されているものである(「S-z Huら, 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061」)。これらの低分子タンパク質（Ｍｒ２５，０００）は、通常、１つのポリペプチド内の抗原に対する特異性と親和性とを保持しており、抗原に特異的なより大きい分子を構成するための有用な基礎的要素となる。特に断りの無い限り、用語「抗体」が用いられている記載および請求項は、明らかに「抗体断片」を含んでいる。
【００５０】
本明細書で用いられるような用語「芳香族」または「アリール」は、共役π電子系を有する環を少なくとも１つ有する閉環構造体のことをいい、炭素環式アリール基および複素環式アリール基（あるいは「ヘテロアリール基」または「複素環式芳香族基」）を包含する。炭素環式芳香族基または複素環式芳香族基は、必要に応じて５〜２０の環原子を含んでいる。用語「芳香族」または「アリール」としては、共有結合によって連結した単環式の基、または融合した多環式の基（すなわち、隣接する何組もの炭素原子を共有する環）が挙げられる。芳香族基は、必要に応じて置換されているか、または置換されていない。「芳香族基」または「アリール基」としては、例えば特に限定されないが、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、アントラセニル、およびフェナントラセニルが挙げられる。上記各アリール環系および各ヘテロアリール環系のための置換基は、本明細書に記載された許容可能な置換基の群より選択される。
【００５１】
他の用語と組み合わせて用いられるときの、略された用語「芳香族」または「アリール」（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アラルキルが挙げられるが、これらに限定されない）としては、上記で定義したようなアリール環およびヘテロアリール環が挙げられる。したがって、用語「アラルキル」または「アルカリル」は、アリール基がアルキル基に付着している基を包含することを意味し、例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。なお、上記アルキル基（メチレン基が含まれるが、これに限定されない）には、炭素原子がヘテロ原子（酸素原子など）で置換されたアルキル基が含まれる。上記アリール基としては、例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で使用されるような用語「アリーレン」は、二価のアリール基のことをいう。「アリーレン」としては、例えば特に限定されないが、フェニレン、ピリジニレン、ピリミジニレンおよびチオフェニレンが挙げられる。アリーレン基のための置換基は、本明細書に記載の許容可能な置換基の群より選択される。
【００５３】
用語「少なくとも１つのアミノ酸」は、１つのアミノ酸、多数のアミノ酸、オリゴペプチド、アミノ酸の二量体、アミノ酸の三量体、アミノ酸の四量体、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはアミノ酸の任意の他の連結した鎖のことをいう。
【００５４】
用語「少なくとも１つの糖類（sugar group）」は、１つの糖類、多数の糖類、オリゴサッカライド、サッカライドの二量体、サッカライドの三量体、サッカライドの四量体、ポリサッカライド、または糖類の任意の他の連結した鎖のことをいう。
【００５５】
用語「少なくとも１つのヌクレオチド」は、１つのヌクレオチド、多数のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドの二量体、ヌクレオチドの三量体、ヌクレオチドの四量体、ポリヌクレオチド、核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはヌクレオチドの任意の他の連結した鎖のことをいう。
【００５６】
「二官能性リンカー」とも称される「二官能性ポリマー」は、他の部分と特異的に反応して、共有結合または非共有結合を形成することができる２つの官能基を含んでいるポリマーのことをいう。このような部分としては、特に限定されないが、天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸の側鎖の基、または天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸を含んでいるペプチドの側鎖の基が挙げられる。例えば、二官能性リンカーは、第１ペプチドの基と反応する官能基と、第２ペプチドの基と反応する別の官能基とを有している。これによれば、第１ペプチド、二官能性リンカーおよび第２ペプチドを含む接合体が形成される。様々な化合物をペプチドに付着させる多くの手法およびリンカー分子は知られている。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号明細書、米国特許第４，６７１，９５８号明細書、米国特許第４，６５９，８３９号明細書、米国特許第４，４１４，１４８号明細書、米国特許第４，６９９，７８４号明細書、米国特許第４，６８０，３３８号明細書、および米国特許第４，５６９，７８９号明細書を参照のこと。また、「多官能性リンカー」とも称される「多官能性ポリマー」は、他の部分と反応することができる２つ以上の官能基を含んでいるポリマーのことをいう。このような部分としては、共有結合あるいは非共有結合を形成するための、天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸の側鎖の基、または天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸を含んでいるペプチドの側鎖の基（特に限定されないが、アミノ酸の側鎖の基が挙げられる。）が挙げられるが、これらに限定されない。二官能性ポリマーまたは多官能性ポリマーは、任意の所望の長さまたは分子量を必要に応じて有しており、化合物に連結している１つ以上の分子と、該化合物もしくはそれが結合している分子との間に特定の所望の空間または立体構造をもたらすように、必要に応じて選択される。
【００５７】
本明細書で用いられるような用語「バイオアベイラビリティ」は、基質またはその活性部分が薬剤の形態として送達されたときに、作用部位または全身循環において利用可能になる割合および程度のことをいう。バイオアベイラビリティの増加は、基質またはその活性部分が、薬剤の形態として送達されたときに、作用部位または全身循環において利用可能になる割合および程度の増加のことをいう。例えば、バイオアベイラビリティの増加は、他の基質または活性部分と比べたときの基質またはその活性部分の血中濃度の増加として示される。バイオアベイラビリティの増加を評価する方法の非限定的な例を、実施例２２〜２６に示す。この方法は必要に応じて、任意のポリペプチドのバイオアベイラビリティを評価するために使用される。
【００５８】
本明細書で用いられるときの用語「生物学的に活性な分子」、「生物学的に活性な部分」、または「生物学的に活性な剤」は、生物に関する生物学的な系、経路、分子、または相互作用における任意の物理性質もしくは生物化学性質に影響を与える任意の物質を意味する。生物としては、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。特に、本明細書で用いられるような生物学的に活性な分子としては、ヒトまたは他の動物における疾病の診断、回復、鎮静、処置、または予防を意図した任意の物質、あるいは、ヒトまたは動物の身体的もしくは精神的な健康状態を増強するための任意の物質が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的に活性な分子としては、例えば、ペプチド、タンパク質、酵素、低分子薬物、ハードドラッグ、ソフトドラッグ、炭水化物、無機原子または無機分子、色素、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、およびミセルが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法および組成物と一緒に使用するために適切な生物学的に活性な剤の種類としては、薬物、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心・血管作動薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤、および細菌由来の毒素などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
「生物学的な活性の調節」は、ポリペプチドの反応性の増加または低下、ポリペプチドの選択性の変更、ポリペプチドの基質選択性の増強または低減を意味する。調節された生物学的な活性の分析は、必要に応じて、非天然のポリペプチドの生物学的な活性を天然のポリペプチドの生物学的な活性と比較することによって実施する。
【００６０】
本明細書で用いられるような用語「生体材料」は、生物学的に得られた材料のことをいい、例えば特に限定されないが、、バイオリアクターならびに／または組換え方法および組換え技術によって得られた材料が挙げられる。
【００６１】
本明細書で用いられるような用語「生物物理的プローブ」は、分子の構造変化を検出または監視するプローブのことをいう。このような分子には、タンパク質が含まれるが、これに限定されない。また、「生物物理的プローブ」は、必要に応じてタンパク質と他の巨大分子との相互作用を検出もしくは監視するために用いられてもよい。生物物理的プローブとしては、例えば特に限定されないが、スピン標識、蛍光団、および光によって活性化可能な基が挙げられる。
【００６２】
本明細書で用いられるような用語「生合成」は、翻訳系（細胞性の翻訳系または非細胞性の翻訳系）を利用し、以下の成分の少なくとも１つを使用する工程を含む任意の方法のことをいう：ポリヌクレオチド、古ドン、ｔＲＮＡ、リボソーム。例えば、非天然アミノ酸は、本明細書の「非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドのインビボにおける生成」という項に記載の方法および手法を用いて、非天然アミノ酸のポリペプチドに「生合成的に組み込まれる」。
【００６３】
本明細書で用いられるような「ビオチンの模擬体」とも称される用語「ビオチンの類似体」は、アビジンおよび／またはストレプトアビジンに対して高い親和性で結合する、ビオチン以外の任意の分子のことである。
【００６４】
本明細書で用いられるような用語「カルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、および−Ｃ（Ｓ）−から成る群より選択される部分を含んでいる基のことをいい、特に限定されないが、少なくとも１つのケトン基、および／または少なくとも１つのアルデヒド基、および／または少なくとも１つのエステル基、および／または少なくとも１つのカルボン酸基、および／または少なくとも１つのチオエステル基が挙げられる。このようなカルボニル基としては、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、およびチオエステルが挙げられる。さらに、このような基は必要に応じて線状の分子、枝分かれした分子、または環状の分子の一部である。
【００６５】
用語「カルボキシ末端修飾基」は、末端カルボキシ基に付着する任意の分子のことをいう。例えば、このような末端カルボキシ基は、必要に応じて高分子の末端に存在する。高分子といては、特に限定されないが、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびポリサッカライドが挙げられる。末端修飾基としては、特に限定されないが、様々な水溶性ポリマー、ペプチド、またはタンパク質が挙げられる。例えば、末端修飾基としては、ポリエチレングリコール、または血清アルブミンが挙げられる。末端修飾基は、高分子の治療特性を修飾するために使用され得る。治療特性の修飾としては、特に限定されないが、ペプチドの血中半減期の増加が挙げられる。
【００６６】
本明細書で用いられるような「化学的に不安定な基」としても称される用語「化学的に切断可能な基」は、酸、塩基、酸化剤、還元剤、化学的開始剤、またはラジカル開始剤に暴露されることによって、破壊または切断される基のことをいう。
【００６７】
本明細書で用いられるような用語「化学発光性の基」は、加熱を伴わない化学反応の結果、発光する基のことをいう。例えば、ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）を、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）などの酸化剤と、塩基および金属触媒の存在下において反応させることによって、励起状態の産物（３−アミノフタラート（３−ＡＰＡ））が生成される。
【００６８】
本明細書で用いられるような用語「発色団」は、可視領域の波長、紫外領域の波長、赤外領域の波長の光を吸収する分子のことをいう。
【００６９】
本明細書で用いられるような用語「補助因子」は、大分子の作用に必須の原子または分子のことをいう。補助因子としては、特に限定されないが、無機イオン、補酵素、タンパク質または酵素の活性に必要な他の因子が挙げられる。例えば、補助因子としては、ヘモグロビン中にあるヘム、クロロフィル中にあるマグネシウム、およびタンパク質にとっての金属イオンが挙げられる。
【００７０】
本明細書で用いられるような「共フォールディング」は、互いに相互作用する少なくとも２つの分子を用いて、折りたたまれていないか、または不適切に折りたたまれた分子を、適切に折りたたまれた分子へ変形させる、リフォールディングの処理、反応または方法のことをいう。例えば、「共フォールディング」は、互いに相互作用する少なくとも２つのポリペプチドを用いて、折りたたまれていないか、または不適切に折りたたまれたポリペプチドを本来の適切に折りたたまれたポリペプチドへ変形させるものである。このようなポリペプチドは、必要に応じて天然アミノ酸および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる。
【００７１】
本明細書で用いられるような「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に、同数の連続した位置の参照配列と、配列を比較するために用いられる連続した位置の何れか１つの区分のことをいう。このような連続した位置としては、特に限定されないが、約２０〜約６００の配列ユニット（特に限定されないが、約５０〜約２００の配列ユニットおよび約１００〜約１５０の配列ユニットが挙げられる。）から成る群が挙げられる。このような配列としては、例えば、配列ユニットを有する、ポリペプチドおよび非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドが挙げられる。配列ユニットとしては、特に限定されないが、天然アミノ酸および非天然アミノ酸が挙げられる。また、例えば、このような配列としては、対応する配列ユニットであるヌクレオチドを有するポリヌクレオチドが挙げられる。比較のために配列を整列させる方法としては、特に限定されないが、例えば「Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c」の局所相同性アルゴリズム、「Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443」の相同性アラインメントアルゴリズム、「Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444」の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（computerizeジmplementation）、（「Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Maジson, WI」のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動によって整列させて、目視によって検査すること（例えば「Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)」参照）が挙げられる。
【００７２】
例えば、配列同一性および配列類似性の百分率を決定するために使用されるアルゴリズムは、例えば、「Altschulら. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402」および「Altschulら. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410」に、それぞれ記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）から公的に利用可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターであるＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムは、語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラムは、語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（「Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915」参照）のアライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、ならびに両鎖の比較をデフォルトとして使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、通常、「低い複雑性」のためのフィルタを使用することなく実施される。
【００７３】
また、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えば「Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787」参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによってもたらされる類似性の尺度の１つは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸と比較した場合の最小合計確率が約０．２未満、約０．０１未満、または約０．００１未満であるときに、核酸は参照核酸と類似しているとみなす。
【００７４】
用語「保存的に修飾されたバリアント」は、天然アミノ酸配列、非天然のアミノ酸配列、天然核酸配列、非天然核酸配列、およびそれらの組合せに適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」は、同一または本質的に同一な天然および非天然のアミノ酸配列をコードする天然および非天然の核酸のことか、または天然および非天然の核酸が、天然および非天然のアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列のことをいう。例えば、遺伝コードが縮重しているため、多くの機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコードしている。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵのコドンは、全てアラニンのアミノ酸をコードしている。このため、コドンによってアラニンが特定される全ての位置では、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載された対応するコドンの何れかへコドンを必要に応じて変化させることができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の１種である。このため、例えば、天然または非天然のポリペプチドをコードする本明細書に記載の全ての天然または非天然の核酸配列は、該天然または非天然の核酸のサイレント変異として可能性のある全てのものを表している。必要に応じて、機能的に同一の分子が得られるように、天然または非天然の核酸における各コドンは修飾される（なお、メチオニンに対する通常唯一のコドンであるＡＵＧ、およびトリプトファンに対する通常唯一のコドンＴＧＧは除く。）。したがって、天然および非天然のポリペプチドをコードする天然および非天然の核酸の各サイレント変異は、記載された各配列に潜在的に含まれる。
【００７５】
アミノ酸配列に関していえば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対して、コードされた配列中の１個の天然および非天然のアミノ酸または数％の天然および非天然のアミノ酸を変更、付加、または欠失する個々の置換、欠失、または付加する場合に、そのような変更によって、アミノ酸が欠失されるか、アミノ酸が付加されるか、または天然および非天然のアミノ酸が化学的に類似のアミノ酸で置換されるときに、「保存的に修飾されたバリアント」が得られる。機能的に類似する天然アミノ酸を示す保存置換表は科学論文から入手することができる。このような保存的に修飾されたバリアントは、本明細書に記載の方法および組成物における多様なバリアント（polymorphic variant）、種間のホモログ（interspecies homologs）、および対立遺伝子に加えられるとともに、それらを排除するものではない。
【００７６】
以下の８群のそれぞれは、互いに保存的な置換となるアミノ酸を含んでいる（例えば、「Creighton, Proteins:Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd eジtion (December 1993)」参照）：
（１）アラニン（Ａ），グリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ），グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ），グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ），リジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ），ロイシン（Ｌ），メチオニン（Ｍ），バリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ），チロシン（Ｙ），トリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ），トレオニン（Ｔ）；および、
（８）システイン（Ｃ），メチオニン（Ｍ）。
【００７７】
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それら自体または他の用語との組み合わられた場合に、特に断らない限りは、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」が環化したものを表す。このため、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルには、飽和した環の結合、部分的に不飽和した環の結合、および完全に不飽和した環の結合が含まれる。さらに、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子を、例えばヘテロ環が分子の残部に付着する位置に配置している。ヘテロ原子としては、特に限定されないが、酸素、窒素、または硫黄が挙げられる。シクロアルキルとしては、例えば特に限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、およびシクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルとしては、例えば特に限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、および２−ピペラジニルなどが挙げられる。また、上記用語は、２環構造および３環構造などの多環構造を包含する。同様に、用語「ヘテロシクロアルキレン」は、それ自体または他の分子の一部であっても、ヘテロシクロアルキルから誘導された二価の基を意味し、用語「シクロアルキレン」は、それ自体または別の分子の一部であっても、シクロアルキルから誘導された二価の基を意味する。
【００７８】
本明細書で用いられるような用語「シクロデキストリン」は、少なくとも６〜８の環状のグルコース分子から成る環状の炭水化物のことをいう。環の外側の部分は、水溶性の基を含んでおり、環の中心に、低分子を収容することができる比較的に非極性の空洞が形成されている。
【００７９】
本明細書で用いられるような用語「細胞毒性」は、細胞に悪影響を与える化合物のことをいう。
【００８０】
本明細書で用いられるような「変性剤」は、ポリマーの可逆的なアンフォールディングを引き起こすであろう任意の化合物または物質のことをいう。例えば、「変性剤」は、タンパク質の可逆的なアンフォールディングを引き起こす。変性剤の強さは、特定の変性剤の性質と濃度との両方に基づいて決定される。変性剤としては、例えば特に限定されないが、カオトロピック性物質、界面活性剤、有機溶媒、水混和性溶媒、リン脂質、またはそれらの組合せが挙げられる。適切なカオトロピック性物質としては、例えば特に限定されないが、尿素、グアニジン、およびチオシアン酸ナトリウムが挙げられる。界面活性剤としては、例えば特に限定されないが、強い界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンエーテル（ＴｗｅｅｎまたはＴｒｉｔｏｎといった界面活性剤など）、またはサルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）など）、非イオン性の弱い界面活性剤（ジギトニンなど）、陽イオン性の弱い界面活性剤（Ｎ−＞２，３−（ジオレイオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムなど）、イオン性の弱い界面活性剤（コール酸ナトリウム、またはデオキシコール酸ナトリウムなど）、あるいは、両性イオン性の界面活性剤（特に限定されないが、スルホベタイン（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンサルフェート（ＣＨＡＰＳ）、および３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）など）が挙げられる。変性剤として用いられる有機溶媒および水混和性溶媒としては、例えば特に限定されないが、アセトニトリル、低級アルカノール（特にＣ２−Ｃ４アルカノール（エタノールまたはイソプロパノールなど））、または低級アルカンジオール（特に、Ｃ２−Ｃ４アルカンジオール（エチレングリコールなど）が挙げられる。リン脂質としては、例えば特に限定されないが、天然に生じるリン脂質（ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルイノシトールなど）、または合成リン脂質の誘導体もしくはバリアント（ジヘキサノイルホスファチジルコリンまたはジヘプタノイルホスファチジルコリンなど）が挙げられる。
【００８１】
本明細書に用いられるような用語「検出可能な標識」は、分析技術を用いて必要に応じて観察可能である標識のことをいう。分析技術としては、特に限定されないが、蛍光、化学発光、電子スピン共鳴、紫外／可視吸収分光法、質量分析、核磁気共鳴、磁気共鳴、および電気化学的方法が挙げられる。
【００８２】
本明細書に用いられるような用語「ジカルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、および−Ｃ（Ｓ）−から成る群より選択される少なくとも２つの部分を含んでいる基のことをいう。ジカルボニルとしては、特に限定されないが、１，２−ジカルボニル基、１，３−ジカルボニル基、および１，４−ジカルボニル基、ならびに、少なくとも１つのケトン基、および／または少なくとも１つのアルデヒド基、および／または少なくとも１つのエステル基、および／または少なくとも１つのカルボン酸基、および／または少なくとも１つのチオエステル基が挙げられるが、これらに限定されない。このようなジカルボニル基としては、ジケトン、ケトアルデヒド、ケト酸、ケトエステル、およびケトチオエステルが挙げられる。また、上記基は、必要に応じて線状の分子、枝分かれした分子、または環状の分子の一部である。ジカルボニル基の２つの部分は、同一であるか、または異なっており、必要に応じて、例えばエステル、ケトン、アルデヒド、チオエステル、またはアミドを２つの部分のどちらかに生じさせる置換基を含んでいる。
【００８３】
本明細書で用られるような用語「1,2-ジカルボニルの同等物」または「1,2-ジカルボニルと同等物」は、１，２の置換パターンで位置している少なくとも２つの部分を含んでいる基のことをいう。これら部分の１つおよび両方は、カルボニル基以外の基で置換されていたとしても、１，２−アリールジアミンと反応して、キノキサリン基またはフェナジンを形成する。1,2-ジカルボニルの同等物としては、例えば１，１−ジブロモ−２−オキソ基が挙げられる。
【００８４】
本明細書で用いられるような用語「薬物」は、疾病または病気の予防、診断、緩和、処置、または回復に用いられる任意の物質のことをいう。
【００８５】
本明細書で用いられるような用語「色素」は、発色団を含んでいる、可溶性で着色性の物質のことをいう。
【００８６】
本明細書で用いられるような用語「効果的な量」は、投与される化合物または剤の量であって、処置される疾病または病気の１つ以上の症状をある程度軽減するために十分な量のことをいう。この結果、疾病の兆候、症状もしくは原因の軽減および／または緩和、あるいは生物学的な系の他の任意の所望の変化がもたらされる。投与される剤または化合物としては、特に限定されないが、天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドが挙げられる。予防的処置、増強するための処置、および／または治療的処置のために、このような天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを含んでいる組成物を必要に応じて投与する。任意の個々の場合における適した「効果的な」量を、用量増加試験などの技術を用いて決定する。
【００８７】
本明細書で用いられるような用語「電子密度の高い基」は、電子ビームが照射されたときに、電子を散乱する基のことをいう。このような基としては、特に限定されないが、モリブデン酸アンモニウム、次硝酸ビスマスヨウ化カドミウム、９９％、カルボヒドラジド、塩化第二鉄六水和物、ヘキサメチレンテトラミン、９８．５％、無水インジウム三塩化物、硝酸ランタン、酢酸鉛三水和物、クエン酸鉛三水和物、硝酸鉛、過ヨウ素酸、リンモリブデン酸、リンタングステン酸、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、ルテニウムレッド、硝酸銀、プロテイン銀“ストロング”（Ａｇ含有量：８．０−８．５％）、シルバーテトラフェニルポリフィリン（Ｓ−ＴＰＰＳ）、塩化金酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム、硝酸タリウム、チオセミカルバジド（ＴＳＣ）、酢酸ウラニル、硝酸ウラニル、および硫酸バナジルが挙げられる。
【００８８】
本明細書で用いられるような「エネルギー伝達剤」は、別の分子からエネルギーを受容、または別の分子へエネルギーを寄与する分子のことをいう。例えば、蛍光共鳴エネルギー移転（ＦＲＥＴ）は、蛍光ドナー分子の励起状態のエネルギーが、非励起状態のアクセプター分子に非放射的に移転された後、該アクセプター分子が、寄与されたエネルギーをより長波長の蛍光として放出するという、双極子間のカップリング作用である。
【００８９】
用語「増強する」または「増強」は、所望の効果を効力または持続時間について、増加もしくは延長することを意味する。例えば、治療剤の効果を「増強すること」は、疾病、障害または病気の処置の間に、治療剤の効果を効力または持続時間について増加もしくは延長できることをいう。本明細書で用いられるような「増強するために効果的な量」は、疾病、障害または病気を処置するときに、治療剤の効果を増強するために十分な量のことをいう。患者に使用される場合に、この使用のための効果的な量は、疾病、障害または病気の重症度および治療単位（ｃｏｕｒｓｅ）、薬歴、患者の健康状態、および薬物に対する反応性、ならびに治療を担当する医師の判断に依存する。
【００９０】
本明細書で用いられるような用語「真核生物」は、系統学的なドメイン（phylogenetic domain）の真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物のことをいう。真核生物としては、特に限定されないが、動物（特に限定されないが、哺乳類、昆虫、爬虫類、鳥類が挙げられる）、繊毛虫類、植物（特に限定されないが、単子葉植物、双子葉植物および藻類が挙げられる）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫目、および原生生物が挙げられる。
【００９１】
本明細書で用いられるような用語「脂肪酸」は、約Ｃ６以上の長さの炭化水素の側鎖を有するカルボン酸のことをいう。
【００９２】
本明細書で用いられるような用語「蛍光団」は、励起されて光子を放出することによって、蛍光を放つ分子のことをいう。
【００９３】
本明細書で用いられるような用語「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応部位」、「化学反応基」、および「化学反応部分」は、化学反応が起こる分子の一部またはユニットのことをいう。これらの用語はある程度同義であり、ある機能または活性を行使するとともに、他の分子と反応する分子の一部を示すために本明細書において用いられる。
【００９４】
用語「ハロゲン」としては、フッ素、塩素、ヨウ素、および臭素が挙げられる。
【００９５】
本明細書で用いられるような用語「ハロアシル」は、ハロゲン部分を含んでいるアシル基のことをいう。ハロアシルとしては、特に限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３，−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３，−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などが挙げられる。
【００９６】
本明細書で用いられるような用語「ハロアルキル」は、ハロゲン部分を含んでいるアルキル基のことをいう。ハロアルキルとしては、特に限定されないが、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３などが挙げられる。
【００９７】
本明細書で用いられるような用語「ヘテロアルキル」は、アルキル基および少なくとも１つのヘテロ原子から成る直鎖状、分枝状または環状の炭化水素基、あるいはそれらの組合せのことをいう。ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、ＳｉおよびＳから成る群より選択される原子である。窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化されており、ヘテロ原子である窒素原子は、必要に応じて４級化されていている。ヘテロ原子であるＯ、Ｎ、ＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の内部の任意の位置、または、アルキル基が分子の残部に付着する位置に必要に応じて配置されている。ヘテロアルキルとしては、例えば特に限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。さらに、２以下のヘテロ原子は、例えば−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３などのように必要に応じて隣接している。
【００９８】
本明細書で用いられるような用語「ヘテロアルキレン」は、ヘテロアルキルから誘導された二価の基のことをいう。ヘテロアルキレンとしては、例えば特に限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が挙げられる。ヘテロアルキレン基は、同一のまたは異なるヘテロ原子を、鎖の末端の一方または両方に必要に応じて配置している（特に限定されないが、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、およびアミノオキシアルキレンが挙げられる）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレンの結合基では、結合基の配向性は、結合基の一般式が書かれた方向に従って示されているわけではない。例えば、一般式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
【００９９】
本明細書で用いられるような用語「ヘテロアリール」または「複素環式芳香族」は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子を少なくとも１つ含んでいるアリール基のことをいう。窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化されており、窒素原子は必要に応じて４級化されている。ヘテロアリール基は、置換されていているか、または置換されていない。ヘテロアリール基は、必要に応じて、ヘテロ原子を介して分子の残部に付着している。ヘテロアリール基としては、例えば特に限定されないが、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル（ｐｕｒｉｎｙｌ）、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。
【０１００】
本明細書で用いられるような用語「ホモアルキル」は、炭化水素基であるアルキル基のことをいう。
【０１０１】
本明細書で用いられるような用語「同一」は、２つ以上の配列またはサブ配列が同じであることをいう。また、本明細書で用いられるような用語「実質的に同一」は、２つ以上の配列またはサブ配列を比較ウィンドウまたは指定された領域に対して最大限に対応するように対比および整列させ、比較アルゴリズムを使用して測定するか、または手動で整列させて目視によって検査して測定した場合に、２つ以上の配列またはサブ配列が所定の百分率で同じである配列ユニットを有することをいう。例えば、配列ユニットが、指定の領域に渡って約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一である場合に、２つ以上の配列は「実質的に同一」である。このような百分率は、２つ以上の配列の「同一性の百分率」を記載するものである。配列の同一性は、長さが少なくとも約７５〜約１００の配列ユニットである領域に渡って、または長さが約５０の配列ユニットである領域に渡って、あるいは指定されない場合は、配列全体に渡って存在し得る。また、この定義は、試験配列の相補体にも関する。例えば、２つ以上のポリペプチド配列は、アミノ酸残基が同じであるときに同一であり、また、２つ以上のポリペプチド配列は、アミノ酸残基が指定の領域に渡って約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一である場合に「実質的に同一」である。同一性は、長さが少なくとも約７５〜約１００アミノ酸である領域に渡って、または長さが約５０アミノ酸である領域に渡って、あるいは、指定されない場合は、ポリペプチド配列の配列全体に渡って存在し得る。また、例えば、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、核酸残基が同じであるとき同一であり、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、核酸残基が、指定領域に渡って、約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一である場合に「実質的に同一」である。同一性は、長さが少なくとも約７５〜約１００の核酸である領域に渡って、または長さが約５０の核酸である領域に渡って、あるいは、指定されない場合は、ポリヌクレオチド配列の配列全体に渡って存在し得る。
【０１０２】
配列比較を行う際には、一般に一方の配列を参照配列として、これを試験配列と比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列とをコンピューターに入力し、サブ配列の座標を指定し、必要に応じて配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。プログラムのデフォルトのパラメーターを必要に応じて用いるか、または代わりのパラメーターを設定する。その後、配列比較アルゴリズムはプログラムのパラメーターに基づいて参照配列に対する試験配列の配列同一性の百分率を計算する。
【０１０３】
本明細書で用いられるような用語「免疫原性」は、治療薬の投与に対する抗体応答のことをいう。治療用の非天然アミノ酸のポリペプチドに対する免疫原性は、生体液中の抗非天然アミノ酸のポリペプチド抗体を検出するための、定量的アッセイおよび定性的アッセイを用いることによって得られる。このようなアッセイとしては、特に限定されないが、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、および蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）が挙げられる。治療用の非天然アミノ酸のポリペプチドに対する免疫原性の分析は、治療用の非天然アミノ酸のポリペプチドを投与したときの抗体応答を、治療用の天然アミノ酸のポリペプチドを投与したときの抗体応答と比較する工程を含んでいる。
【０１０４】
本明細書で用いられるような「インターカレートする基」とも称される用語「インターカレート剤」は、分子の分子内空間、または分子間の分子内空間に、インターカレートする化学物質のことをいう。例えば、インターカレート剤またはインターカレートする基は、ＤＮＡの２重螺旋の積層された塩基へインターカレートする分子である。
【０１０５】
本明細書で用いられるような用語「単離」は、興味のある成分の興味の無い成分からの分離または除去のことをいう。単離された物質は、乾燥状態もしくは半乾燥状態のどちらか、または溶液（水溶液など）に対して溶解した状態である。単離された成分は均質な状態であるか、あるいは単離された成分は、薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤をさらに含んでいる薬学的組成物の一部である。純度および均質性は、必要に応じて化学的技術を用いて決定される。該化学的技術としては、特に限定されないが、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられる。また、興味のある成分が単離され、調製物に優勢種として存在するとき、該成分は、実質的に精製されているとして本明細書に記載される。本明細書で用いられるような用語「精製」は、興味のある成分の純度が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ以上であることをいう。例えば、核酸またはタンパク質が天然の状態において結合している細胞の成分の少なくともいくつかから遊離しているとき、あるいは核酸もしくはタンパク質がそれらのインビボまたはインビトロの産物の濃度よりも高く濃縮されているとき、該核酸またはタンパク質は単離されているといえる。また、例えば、遺伝子は、該遺伝子に隣接し、興味のある遺伝子以外のタンパク質をコードする翻訳領域から分離されているとき、単離されているといえる。
【０１０６】
本明細書で用いられるような用語「標識」は、化合物の物理的分布を必要に応じて検出および／または監視するために、化合物に組み込まれ、容易に検出される物質のことをいう。
【０１０７】
本明細書で用いられるような用語「連結」は、リンカーの官能基と別の分子との間の化学反応によって形成された、結合または化学部分のことをいう。このような結合としては、特に限定されないが、共有結合および非共有結合が挙げられる。また、このような化学部分としては、特に限定されないが、エステル、カーボネート、イミン、リン酸エステル、ヒドラゾン、アセタール、オルソエステル、ペプチド連結、およびオリゴヌクレオチド連結が挙げられる。加水分解に安定な連結は、連結が実質的に水中において安定であり、（特に限定されないが、長期間、ことによると無期限の生理的条件下を含む）有用なｐＨ値において水と反応しないことを意味する。加水分解に不安定または分解性の連結は、連結が水中または水溶液中（例えば血液中）において分解可能であることを意味する。酵素に不安定または分解性の連結は、連結が１つ以上の酵素によって分解されることを意味する。例えば、ＰＥＧおよびそれに関連するポリマーは、分解性の連結をポリマーの骨格、またはポリマーの骨格と該ポリマー分子の末端の官能基の１つ以上との間のリンカー基に含んでいる。このような分解性の連結としては、特に限定されないが、ＰＥＧカルボン酸または活性型ＰＥＧカルボン酸と生物学的に活性な剤のアルコール基との反応によって形成されるエステル連結が挙げられる。このようなエステル基は、一般的に、生理条件下において加水分解され、生物学的に活性な剤を放出するものである。他の加水分解可能な連結としては、特に限定されないが、カーボネート連結、アミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン連結、アルコールとリン酸基との反応によって形成されるリン酸エステル連結、ヒドラジドとアルデヒドとの反応生成物であるヒドラゾン連結、アルデヒドとアルコールとの反応生成物であるアセタール連結、ギ酸塩とアルコールとの反応生成物であるオルソエステル連結、（例えば、ＰＥＧなどのポリマーの末端における）アミン基とペプチドのカルボキシル基とによって形成されるペプチド連結、および（例えばポリマーの末端における）ホスホラミジーテ（phosphoramidite）基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とによって形成されるオリゴヌクレオチド連結が挙げられる。
【０１０８】
本明細書で用いられるような「培養基」は、細胞ならびに／あるいはこのような細胞から発現および／または分泌された生成物の、増殖または収集に用いられる任意の培養基のことをいう。このような「培養基」としては、特に限定されないが、任意の宿主細胞を支持するか、または含む溶液、固体、半固体、または剛性の支持体が挙げられる。宿主細胞としては、例えば、細菌の宿主細胞、酵母の宿主細胞、昆虫の宿主細胞、植物の宿主細胞、真核生物の宿主細胞、哺乳類の宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核生物の宿主細胞、E. coliまたはPseudomonasの宿主細胞、および細胞含有物が挙げられる。このような「培養基」としては、特に限定されないが、宿主細胞が増殖し、ポリペプチドが分泌された培養基が挙げられる。さらに、このような培養基は、増幅工程の前もしくは後の培養基を包含する。また、このような「培養基」としては、特に限定されないが、宿主細胞のライセートを含むバッファまたは試薬が挙げられる。例えば、細胞内に製造されたポリペプチドおよび宿主細胞は、該ポリペプチドが放出されるために、溶解または破壊される。
【０１０９】
本明細書で用いられるような用語「代謝産物」は、天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドなどの化合物が代謝されたときに形成される、天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドなどの化合物の誘導体のことをいう。用語「薬学的に活性のある代謝産物」または「活性のある代謝産物」は、天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドなどの化合物が代謝されたときに形成される、天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドなどの化合物の生物学的に活性な誘導体のことをいう。
【０１１０】
本明細書で用いられるような用語「代謝」は、生物が特定の物質を変化させるための処理の総体のことをいう。このような処理としては、特に限定されないが、加水分解反応、および酵素によって触媒される反応が挙げられる。代謝についてのさらなる情報は、「The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Eジtion, McGraw-Hill (1996)」から入手される。例えば、（１）天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを宿主に投与して、宿主からの組織試料を分析することによって、あるいは（２）天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを、インビトロにおいて肝細胞と一緒にインキュベートして、生じた化合物を分析することによって、天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの代謝産物を同定する。
【０１１１】
本明細書で用いられるような用語「金属キレート剤」は、金属と一緒に金属錯体を形成する分子のことをいう。例えば、このような分子は、中心の金属イオンと２以上の配位結合を形成し、必要に応じて環構造を形成する。
【０１１２】
本明細書で用いられるような用語「金属含有部分」は、金属イオン、金属原子または金属粒子を含む基のことをいう。このような部分には、シスプラチン、キレートされる金属イオン（ニッケル、鉄およびプラチナなど）、および金属ナノ粒子（ニッケル、鉄、およびプラチナなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
本明細書で用いられるような用語「重原子を組み込んでいる部分」は、通常は、炭素よりも重い原子のイオンを組み込んでいる基のことをいう。このようなイオンまたは原子には、シリコン、タングステン、金、鉛、およびウランが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１４】
本明細書で用いられるような用語「修飾された」は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドに変更が存在することをいう。天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドを合成後に修飾することによって、あるいは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドを翻訳後に修飾するか、または翻訳と同時に修飾することによって、このような変更または修飾が得られる。「修飾されたまたは修飾されていない」という形態は、検討されている天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドが、必要に応じて修飾されていること、つまり、検討されている天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドが、必要に応じて修飾されているか、または修飾されていないということを意味する。
【０１１５】
本明細書で用いられるような用語「調節された血中半減期」は、未修飾の形態と比べたときの、修飾された生物学的に活性な分子の循環半減期における正の変化または負の変化のことをいう。例えば、修飾された生物学的に活性な分子としては、特に限定されないが、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドが挙げられる。例えば、血中半減期は、生物学的に活性な分子または修飾された生物学的に活性な分子を投与した後の様々な時点の血液試料を採取して、各試料における生物学的に活性な分子または修飾された生物学的に活性な分子の濃度を決定することによって測定される。血清中の濃度と時間との相互関係に基づいて血中半減期を計算することができる。例えば、血中半減期を調節して、投与計画の改善を可能にするか、または毒性効果を避けるように、血中半減期を増加させる。血清におけるこのような増加は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍である。この方法は、任意のポリペプチドの血中半減期を評価するために必要に応じて使用される。
【０１１６】
本明細書で用いられるような用語「調節された治療半減期」は、未修飾の形態と比べたときの、修飾された生物学的に活性な分子の治療に効果的な量の半減期の正の変化または負の変化のことをいう。例えば、修飾された生物学的に活性な分子としては、特に限定されないが、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドが挙げられる。例えば、治療半減期は、投与後の様々な時点における上記分子の薬物動態学的性質および／または薬力学的性質を測定することによって測定される。治療半減期が増加すると、特定の有利な投与計画もしくは特定の有利な総用量を利用すること、または望ましくない効果を避けることができる。例えば、治療半減期の増加は、効力の増加、標的に対する修飾された分子の結合の増加もしくは減少、修飾されていない分子の作用に関する別のパラメーターまたは機構の増加もしくは減少、または酵素（プロテアーゼなど）による分子の破壊の増加もしくは減少に起因する。この方法は、任意のポリペプチドの治療半減期を評価するために必要に応じて使用される。
【０１１７】
本明細書で用いられるような用語「ナノ粒子」は、粒径が約５００ｎｍ〜約１ｎｍである粒子のことをいう。
【０１１８】
本明細書で用いられるような用語「ほぼ化学量論的」は、化学反応に参加している各化合物のモル比が、約０．７５〜約１．５であることをいう。
【０１１９】
本明細書で用いられるような用語「非真核生物」は、真核生物ではない生物のことをいう。例えば、非真核生物は、系統学的なドメインの真正細菌（特に限定されないが、Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, またはPseudomonas putidaなどが挙げられる。）、または系統学的なドメインの古細菌(特に限定されないが、Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, またはHalobacterium（Haloferax volcaniiおよびHalobacteriumの種のNRC-1など）が挙げられる。)に属している。
【０１２０】
「非天然アミノ酸」は、２０の一般アミノ酸、セレノシステイン、もしくはピロリジンの１つではないアミノ酸のことをいう。用語「非天然アミノ酸」と同義的に用いてもよい他の用語は、「天然にコードされていないアミノ酸」、「天然ではないアミノ酸」、「天然に生じないアミノ酸」、およびそれらの様々にハイフンで繋げられたもの、およびハイフンで繋げられていないものである。用語「非天然アミノ酸」としては、特に限定されないが、天然にコードされたアミノ酸（特に限定されないが、２０の一般アミノ酸、またはピロリジンおよびセレノシステインなどが挙げられる）の修飾（例えば翻訳後修飾）によって天然に生じるが、それ自体は翻訳複合体によって成長中のポリペプチド鎖に組み込まれないアミノ酸が挙げられる。天然にコードされていない天然に生じるアミノ酸としては、例えば特に限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニン、およびＯ−ホスホチロシンなどが挙げられる。さらに、用語「非天然アミノ酸」としては、特に限定されないが、天然に生じないが、合成によって入手されるか、もしくは非天然アミノ酸の修飾によって入手されるアミノ酸が挙げられる。
【０１２１】
本明細書で用いられる用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、およびそれらの一本鎖または２本鎖の形態のポリマーのことをいう。例えば、このような核酸および核酸のポリマーとしては、（ｉ）参照核酸と同様の結合性質を有し、かつ天然に生じるヌクレオチドと同じように代謝される天然ヌクレオチドの類似体、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドの類似体（ＰＮＡ；ペプチド核酸（peptidonucleic acid））、アンチセンス技術に用いられるＤＮＡの類似体（ホスホチオエート、およびホスホロアミデートなど）（ｉｉｉ）それらの保存的に修飾されたバリアント（特に限定されないが、縮重コドンの置換体が挙げられる。）、相補的配列、および明確に示された配列、が挙げられる。例えば、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置を、混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって、縮重コドンの置換体が得られる（「Batzerら, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)」; 「Ohtsukaら, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);およびRossoliniら, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)」）。
【０１２２】
本明細書で用いられるような用語「酸化剤」は、酸化される化合物から電子を除去することができる、化合物または物質のことをいう。酸化剤としては、例えば特に限定されないが、酸化型グルタチオン、システイン、シスタミン、酸化型ジチオスレイトール、酸化型エリスリトール（oxidized erythreitol）、および酸素が挙げられる。多種多様な酸化剤が、本明細書に記載の方法および組成物における使用に適切である。
【０１２３】
本明細書で用いられるような用語「薬学的に許容可能な」は、物質（特に限定されないが、塩、担体、または希釈剤が挙げられる。）が、化合物の生物学的な活性または性質を抑制せず、比較的無毒性であることをいう。すなわち、該物質は個体に投与されたとしても、望まれない生物学的な効果を引き起こさないか、または物質が含まれている組成物の任意の成分と有害な影響を与えるように相互作用しない。
【０１２４】
本明細書で用いられるような用語「光親和性標識」は、露光されることによって標識が親和性を有する分子と連結を形成する基を有する標識のことをいう。例えば、このような連結は共有結合であってもよいし、非共有結合であってもよい。
【０１２５】
本明細書で用いられるような用語「フォトケージド（photocaged）部分」は、ある波長光が照射されることによって、他のイオンまたは分子と共有結合または非共有結合する基のことをいう。
【０１２６】
本明細書で用いられるような用語「光切断可能な基」は、露光されることによって破壊される基のことをいう。
【０１２７】
本明細書で用いられるような用語「光架橋剤」は、露光されることによって、２つ以上の単量体分子または多量体分子と反応して共有連結または非共有連結を形成する、２つ以上の官能基を含んでいる化合物のことをいう。
【０１２８】
本明細書で用いられるような用語「光異性体化可能な部分」は、光の照射によってある異性体から別の異性体へ変化する基のことをいう。
【０１２９】
本明細書で用いられるような用語「ポリアルキレングリコール」は、線状のまたは枝分かれしたポリエーテルポリオールのポリマー（polymeric polyether polyol）のことをいう。このようなポリアルキレングリコールとしては、特に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびそれらの誘導体が挙げられる。他の典型的な実施形態は、例えば、商業的な供給業者のカタログ（Shearwater Corporationのカタログ「“Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications”(2001)」など）に記載されている。例えば、上記ポリエーテルポリオールのポリマーの平均分子量は、約０．１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである。このようなポリエーテルポリオールのポリマーとしては、例えば特に限定されないが、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ以上のものが挙げられる。該ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであり、特に限定されないが、約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約９００Ｄａ、約８００Ｄａ、約７００Ｄａ、約６００Ｄａ、約５００Ｄａ、約４００Ｄａ、約３００Ｄａ、約２００Ｄａおよび約１００Ｄａが挙げられる。ある実施形態では、該ポリマーの分子量は約１００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。ある実施形態では、該ポリマーの分子量は約１００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。他の実施形態では、該ポリマーの分子量は約５，００００Ｄａ〜約３０，０００Ｄａである。他の実施形態では、該ポリマーの分子量は約３０，０００である。ある実施形態では、該ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。ある実施形態では、該ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。ある実施形態では、該ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。ある実施形態では、ポリエチレングリコール分子は、枝分かれポリマーである。枝分かれＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａであり、特に限定されないが、約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、および約１，０００Ｄａが挙げられる。ある実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。他の実施形態では、該ポリマーの分子量は約５，  ００００Ｄａ〜約３０，０００Ｄａである。他の実施形態では、該ポリマーの分子量は約３０，０００である。ある実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。ある実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。ある実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａである。
【０１３０】
本明細書で用いられるような用語「ポリマー」は、繰返しサブユニットから構成される分子のことをいう。このような分子としては、特に限定されないが、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリサッカライド、またはポリアルキレングリコールが挙げられる。
【０１３１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーのことをいう。すなわち、ポリペプチドに対する記述は、ペプチドの記載およびタンパク質の記載に等しく適用され、また、その逆の場合もあり得る。これらの用語は、天然に生じるアミノ酸のポリマーだけでなく、１つ以上のアミノ酸残基が非天然アミノ酸であるアミノ酸のポリマーにも適用される。また、上記「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」には、アミノ酸残基がペプチド共有結合によって連結されている、アミノ酸鎖の長さが任意のもの（例えば全長のタンパク質）が包含される。
【０１３２】
用語「翻訳後修飾」は、天然または非天然のアミノ酸が翻訳によってペプチド鎖に組み込まれた後に生じる、天然または非天然アミノ酸の任意の修飾のことをいう。このような修飾としては、特に限定されないが、インビボの同時翻訳修飾、インビトロの同時翻訳修飾（無細胞翻訳系での同時翻訳修飾など）、インビボの翻訳後修飾、およびインビトロの翻訳後修飾が挙げられる。
【０１３３】
本明細書で用いられるような用語「プロドラッグ」または「薬学的に許容可能なプロドラッグ」は、インビボまたはインビトロにおいて親薬物へ変換される剤のことをいう。このような剤は、薬物の生物学的な活性または性質を抑制せず、比較的無毒性である。剤は個体に投与されたとしても、望まれない生物学的な効果を引き起こさないか、または剤が含まれている組成物の任意の成分と有害な影響を与えるように相互作用しない。プロドラッグは一般に、被験体に投与され、吸収された後に、いくつかの処理（例えば代謝経路）を経て活性な種またはより活性な種へ変換される薬物の前躯体である。ある種のプロドラッグは、より活性を低くする、および／または薬物を可溶性にするか、もしくは薬物に他の性質を与える化学基をプロドラッグ上に有している。化学基がプロドラッグから切断されるおよび／または修飾されると、活性な薬物が生成される。プロドラッグは、酵素反応または非酵素反応によって体内で活性な薬物へ変換される。プロドラッグは、例えば改善された生理化学的性質（例えばプロドラッグの溶解度の向上）、強化された送達特性（例えば、特定の細胞、組織、臓器、またはリガンドを特異的に標的とすること）、および改善された薬物の治療的価値（therapeutic value）を備えている。このようなプロドラッグの利点としては、特に限定されないが、（ｉ）親薬物と比べて投与が容易であること、（ｉｉ）プロドラッグは、経口投与されることによって、生物的に利用可能であるが、親薬物はそうではないこと、および（ｉｉｉ）プロドラッグは、親薬物と比べて、薬学的組成物における溶解度が改善されていることが挙げられる。プロドラッグとしては、活性な薬物の薬理学的に不活性な誘導体、または活性な薬物の活性が減少している誘導体が挙げられる。生理化学的性質、生物薬剤学的性質、または薬物動態学的性質などの薬物の性質を操作することによって、所望の作用部位に到達する薬物または生物学的に活性な分子の量が調節されるように、プロドラッグは設計される。プロドラッグとしては、例えば特に限定されないが、エステル体として投与される非天然アミノ酸のポリペプチド挙げられる。このエステル体の非天然アミノ酸のポリペプチドは、水溶性であることが移動するために不利となる細胞膜を容易に通過し、水溶性が有利となる細胞内にあるときに、代謝によってカルボン酸である活性体へ加水分解される。また、プロドラッグは、薬物の部位特異的な組織への輸送を向上させる調節剤として使用されるための可逆的な薬物の誘導体として設計される。
【０１３４】
本明細書で用いられるような用語「予防に効果的な量」は、処置される疾病、病気または障害の症状の１つ以上をある程度軽減するであろう、少なくとも１つの非天然アミノ酸のポリペプチド、または少なくとも１つの修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを含んでいる組成物の患者に予防的に適用される量のことをいう。このような予防的な適用では、このような量は、患者の健康状態および体重などに依存する。例えば、予防に効果的な量は用量を増加させる臨床試験などの方法によって決定される。
【０１３５】
本明細書で用いられるような用語「保護された」は、「保護基」、すなわちある反応条件下において化学的に反応性の官能基の反応を抑制する部分が存在することをいう。保護される化学的に反応性の基の種類に依存して保護基は変更される。例えば、（ｉ）化学的に反応性の基がアミンまたはヒドラジドである場合に、保護基はｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）から選択され、（ｉｉ）化学的に反応性の基がチオールである場合に、保護基はオルソピリジルジスルフィドであり、（ｉｉｉ）化学的に反応性の基がカルボン酸（ブタン酸またはプロピオン酸など）またはヒドロキシル基である場合に、保護基はベンジル基またはアルキル基（メチル、エチル、またはｔｅｒｔ−ブチルなど）である。
【０１３６】
例えば、ブロック基／保護基は、以下の化合物から選択される。
【０１３７】
【化１】
2010514808.tif 000003
【０１３８】
また、保護基としては、特に限定されないが、感光性基（ＮｖｏｃおよびＭｅＮｖｏｃなど）、およびGreene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999に記載の他の保護基が挙げられる。
【０１３９】
本明細書で用いられるような用語「放射性部分」は、自発的に放射線を放つ核を有する基のことをいう。放射線は、アルファ粒子、ベータ粒子またはガンマ粒子などである。アルファ粒子はヘリウムの核であり、ベータ粒子は電子であり、ガンマ粒子は高エネルギーの光子である。
【０１４０】
本明細書で用いられるような用語「反応性化合物」は、適切な条件下において、別の原子、分子または化合物と反応性である化合物のことをいう。
【０１４１】
「宿主細胞」とも称される用語「組換え宿主細胞」は、外因性のポリヌクレオチドを含んでいる細胞のことをいう。外因性のポリヌクレオチドを細胞に挿入するために用いられる方法としては、特に限定されないが、直接的な取込、形質導入、ｆ−交配、または組換え宿主細胞を作製する他の方法が挙げられる。例えば、このような外因性のポリヌクレオチドは、非組込み型のベクター（特に限定されないが、プラスミドが挙げられる。）であるか、または宿主のゲノムに組み込まれるものである。
【０１４２】
本明細書で用いられるような「酸化還元活性化剤」は、別の分子を酸化または還元する分子のことをいう。なお、別の分子を酸化または還元することによって、酸化還元活性化剤は還元または酸化される。酸化還元活性化剤としては、例えば特に限定されないが、フェロセン、キノン、Ｒｕ２＋／３＋錯体、Ｃｏ２＋／３＋錯体、およびＯｓ２＋／３＋錯体が挙げられる。
【０１４３】
本明細書で用いられるような用語「還元剤」は、還元される化合物に電子を追加することができる化合物もしくは物質のことをいう。還元剤としては、例えば特に限定されないが、、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン（２−アミノエタンチオール）、および還元型グルタチオンが挙げられる。例えば、スルヒドリル基を還元状態に維持し、分子内または分子間のジスルフィド結合を減少させるために、このような還元剤を用いる。
【０１４４】
本明細書で用いられるような「リフォールディング」は、不適切に折りたたまれた状態、あるいは折りたたまれていない状態から、本来の立体構造もしくは適切に折りたたまれた立体構造へ変形させる任意の処理、反応または方法のことを記述するものである。例えば、リフォールディングによって、ジスルフィド結合を含有するポリペプチドは、ジスルフィド結合に関して、不適切に折りたたまれた状態、あるいは折りたたまれていない状態から、本来の立体構造もしくは適切に折りたたまれた立体構造に変形させられる。このようなジスルフィド結合を含有するポリペプチドは、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドである。
【０１４５】
本明細書で用いられるような用語「樹脂」は、高分子量で不溶性のポリマービーズのことをいう。例えば、このようなビーズを、固相ペプチド合成の支持体として、あるいは精製前に分子が付着する部位として用いる。
【０１４６】
本明細書で用いられるような用語「サッカライド」は、一連の炭水化物のことをいう。サッカライドとしては、例えば特に限定されないが、糖、モノサッカライド、オリゴサッカライド、およびポリサッカライドが挙げられる。
【０１４７】
本明細書で用いられるような用語「安全性」または「安全性プロフィール」は、投与された薬物の回数に対する薬物の投与に関する副作用のことをいう。例えば、何度も投与されたが、ごく軽度の副作用をもたらすか、または副作用をもたらさない薬物は優れた安全性プロフィールを有する。この方法は、例えば任意のポリペプチドの安全性プロフィールを評価するために使用される。
【０１４８】
本明細書で用いられるような語句「〜に対する選択的なハイブリダイズ」または「〜に対する特異的なハイブリダイズ」は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物（全細胞、ＤＮＡライブラリー、またはＲＮＡライブラリーなど）に存在するときに、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下において、特定のヌクレオチド配列にのみ分子が結合すること、２本鎖を形成すること、またはハイブリダイズすることをいう。
【０１４９】
本明細書で用いられる用語「スピン標識」は、電子スピン共鳴分光法によって検出され、別の分子に付着する不対の電子スピンを示す原子または原子の基（すなわち安定な常磁性の基）を含んでいる分子のことをいう。このようなスピン標識分子としては、特に限定されないが、ニトリル基および窒素酸化物が挙げられる。また、スピン標識はシングルスピン標識またはダブルスピン標識を包含する。
【０１５０】
本明細書で用いられるような用語「化学量論的」は、化学反応に参加している化合物のモル比が、約０．９〜約１．１であることをいう。
【０１５１】
本明細書で用いられるような用語「化学量論様」は、反応条件の変化または添加物の存在の変化に応じて、化学量論的またはほぼ化学量論的になる化学反応のことをいう。このような反応条件の変化としては、特に限定されないが、温度の上昇、またはｐＨの変化が挙げられる。上記添加剤としては、特に限定されないが、促進剤が挙げられる。
【０１５２】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件」は、低イオン強度および高温度の条件下における、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または他の核酸模擬体、あるいはそれらの組合せの配列のハイブリダイゼーションのことをいう。例えは、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸の複合混合物（全細胞、ＤＮＡライブラリー、またはＲＮＡライブラリーなど）中のプローブが標的とするサブ配列とハイブリダイズするが、該複合混合物中の他の配列とはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、配列に依存する。また、環境が異なれば、ストリンジェントな条件も異なる。例えば、配列が長くなるほど、特異的にハイブリダイズするための温度は高くなる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、特に限定されないが、（ｉ）既定のイオン強度とｐＨとにおいて、特異的な配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低いこと、（ｉｉ）ｐＨが約７．０〜約８．３であるときに、塩濃度が約０．０１Ｍ〜約１．０Ｍであり、温度が、短いプローブ（例えば約１０〜約５０ヌクレオチドのプローブ）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば約５０ヌクレオチドよりも長いプローブ）については少なくとも約６０℃であること、（ｉｉｉ）ホルムアミドなどの不安定化剤の添加、（ｉｖ）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳにおいて、４２℃でインキュベーションするか、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳにおいて６５℃でインキュベーションし、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中において６５℃で約５分〜約１２０分洗浄することが挙げられる。例えば特に限定されないが、バックグラウンドに対して陽性シグナルが少なくとも約２倍であるとき、選択的または特異的なハイブリダイゼーションが検出されたといえる。核酸のハイブリダイゼーションの豊富な指針は、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993)に見られる。
【０１５３】
本明細書で用いられるような用語「被験体」は、処置、観察または実験の対象である動物のことをいう。被験体としては、例えば特に限定されないが、哺乳類が挙げられる。哺乳類としては、特に限定されないが、ヒトが挙げられる。
【０１５４】
本明細書で用いられるような用語「実質的な精製」は、普通は精製前の興味のある成分と付いているか、または相互作用している他の成分から、興味のある成分が実質的もしくは本質的に遊離していることをいう。例えば、興味のある成分の調製物が、（乾燥重量で）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の不純な成分を含んでいるとき、「実質的に精製されている」。したがって、「実質的に精製された」興味のある成分は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上の純度を有している。例えば、組換え技術によって製造される天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドの場合に、天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドは、自然の細胞または宿主細胞から精製される。天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドは、調製物が（乾燥重量で）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満の不純物を含んでいるとき、「実質的に精製されている」。例えば、天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドは、組み換え技術に基づいて宿主細胞によって製造されるとき、天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドは、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％またはそれ以下で存在している。例えば、天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドは、組み換え技術に基づいて宿主細胞によって製造されるとき、天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドは、培地に、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌまたはそれ以下で存在している。例えば、「実質的に精製された」天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドは、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、またはそれ以上の純度を有している。このような純度は、特に限定されないが、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピラリー電気泳動などの適切な方法によって決定される。
【０１５５】
「不干渉性置換基」とも称される用語「置換基」は、分子上の別の基を置き換えるために必要に応じて用いられる。このような基としては、特に限定されないが、ハロゲン（ｈａｌｏ）、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル、Ｃ２−Ｃ１０のアルケニル、Ｃ２−Ｃ１０のアルキニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ、Ｃ５−Ｃ１２のアラルキル、Ｃ３−Ｃ１２のシクロアルキル、Ｃ４−Ｃ１２のシクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２のアルコキシアルキル、Ｃ５−Ｃ１２のアルコキシアリール、Ｃ５−Ｃ１２のアリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２のオキシアリール、Ｃ１−Ｃ６のアルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルキルスルホニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）（ｍは１〜８である。）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、複素環基、置換複素環基、ニトロアルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、Ｃ２−Ｃ１０のアルキルチオアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、−ＯＨ、−ＳＯ２、＝Ｓ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ２、カルボニル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−（Ｃ１−Ｃ１０のアリール）−Ｓ−（Ｃ６−Ｃ１０のアリール）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６−Ｃ１０のアリール）、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）（各ｍは１〜８である。）、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−ＳＯ２ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、およびそれらの塩などが挙げられる。上述した各Ｒ基としては、特に限定されないが、Ｈ、アルキルまたは置換アルキル、アリールまたは置換アリール、あるいはアルカリルが挙げられる。置換基が、左から右へ書くという従来の化学式に基づいて記載されている場合に、該置換基は、右から左へ書かれた構造に由来する化学的に同一の置換基を等しく包含する。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は−ＯＣＨ２−と同等である。
【０１５６】
アルキル基およびヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと称される基を包含する。）のための置換基としては、例えば特に限定されないが、−ＯＲ、＝Ｏ、＝ＮＲ、＝Ｎ−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＳＲ、−ハロゲン、−ＳｉＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲ（Ｏ）２Ｒ、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ２）＝ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−ＮＲＳＯ２Ｒ、−ＣＮ、および−ＮＯ２が挙げられる。上述した各Ｒとしては、特に限定されないが、水素、置換または非置換のヘテロアルキル基、置換または非置換のアリール基（特に限定されないが、１〜３のハロゲンで置換されたアリール基）、置換または非置換のアルキル基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、あるいはアラルキル基が挙げられる。２つのＲ基が、同じ窒素原子に付着している場合に、それらは必要に応じて窒素原子と結合して、５員環、６員環、または７員環を形成する。例えば、−ＮＲ２は、特に限定されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを包含することを意味する。
【０１５７】
アリール基およびヘテロアリール基のための置換基としては、例えば特に限定されないが、−ＯＲ、＝Ｏ、＝ＮＲ、＝Ｎ−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＳＲ、−ハロゲン、−ＳｉＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲ（Ｏ）２Ｒ、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ２）＝ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−ＮＲＳＯ２Ｒ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルが挙げられる。上記置換基の数は、０〜芳香環系の開放原子価の総数である。上述した各Ｒとしては、特に限定されないが、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、およびヘテロアリールが挙げられる。
【０１５８】
本明細書で用いられるような用語「治療に効果的な量」は、疾病、病気もしくは障害にすでに罹患している患者に投与される、少なくとも１つの非天然アミノ酸のポリペプチド、および／または少なくとも１つの修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを含んでいる組成物の量であって、処置される上記疾病、病気もしくは障害の症状の１つ以上を回復するか、該症状の１つ以上の進行を少なくとも部分的に停止するか、あるいは該症状の１つ以上をある程度緩和するために十分な量のことをいう。このような組成物の有効性は、状態（特に限定されないが、疾病、病気、または障害の重症度および治療単位、薬歴、患者の健康状態、および薬物への反応性が挙げられる。）および治療を担当する医師の判断に依存する。例えば、治療に効果的な量は、用量を増加する臨床試験などの方法によって決定される。
【０１５９】
本明細書で用いられるような用語「チオアルコキシ」は、酸素原子を介して分子に連結する硫黄を含むアルキル基のことをいう。
【０１６０】
用語「熱融解温度」またはＴｍは、（既定のイオン強度、ｐＨ、および核酸の濃度において）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。
【０１６１】
本明細書で用いられるような用語「毒性部分」は、被験体に対して危害をもたらす化合物のことをいう。
【０１６２】
本明細書で用いられるような用語「処置する」、「処置すること」、または「処置」は、疾病または病気の症状の軽減、柔和もしくは改善、さらなる症状の予防、症状の根本的な代謝の原因の改善もしくは予防、疾病もしくは病気の抑制（例えば、疾病もしくは病気の発症の停止）、疾病もしくは病気の緩和、疾病もしくは病気の回復の誘導、疾病もしくは病気によって引き起こされた状態の緩和、または疾病もしくは病気の症状の停止が含まれる。用語「処置する」、「処置すること」、または「処置」は、予防的処置および／または治療的処置を包含する。
【０１６３】
本明細書で用いられるような用語「水溶性ポリマー」は、水溶性の溶媒に可溶性である任意のポリマーのことをいう。このような水溶性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポチエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそれらのＣ１−Ｃ１０のモノアルコキシもしくはモノアリールオキシ誘導体（これらは、このような水溶性ポリマーを開示するために、参照によって本明細書に援用される米国特許第５，２５２，７１４号明細書に記載されている。）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体（デキストラン  サルフェートなど）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、ヘパリン、ヘパリンの断片、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、グリカン、セルロースおよびセルロース誘導体（メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースなど）、血清アルブミン、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、およびアルファ−ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド（aspartamide）など、ならびに、それらの混合物が挙げられる。例えば、このような水溶性ポリマーを天然アミノ酸のポリペプチドもしくは非天然アミノ酸のポリペプチドに連結させることによって、例えば、以下のような変化が生じる。すなわち、未修飾の形態のものと比べたときの、水溶性の増加、血中半減期の増加もしくは調節、または治療半減期の増加もしくは調節、バイオアベイラビリティの増加、生物学的な活性の調節、循環時間の延長、免疫原性の調節、物理的会合特性（凝集および多量体形成など）の調節、受容体結合性の変更、１つ以上の結合パートナーに対する結合性の変更、および、受容体の二量体化および多量体化の変更など。また、上記水溶性ポリマーは、必要に応じてそれ自体生物学的な活性を有ている。
【０１６４】
特に断りのない限り、質量分析法、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生物化学、組換えＤＮＡ技術、および薬理学の従来方法が用いられる。
【０１６５】
本明細書に示された化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびに上記化合物を製造するための試薬が挙げられる）としては、同位体で標識された化合物が挙げられる。この同位体で標識された化合物は、１つ以上の原子が、天然に一般的に発見される原子量または質量数と異なる原子量または質量数を有する原子で置換されていることを除いて、本明細書に示された様々な式および構造にて詳述されている化合物と同一の化合物である。本化合物に組み込まれ得る同位体としては、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素、および塩素の同位体が挙げられ、例えば、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌなどである。本明細書に記載の特定の同位体で標識された化合物（例えば、３Ｈおよび１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれた化合物）は、組織分布アッセイの基質および／または薬物に有用である。さらに、重水素（つまり２Ｈ）などの同位体で置換することによって、インビボの半減期の増加もしくは必要な用量の減少などの代謝安定性が向上し、これによって、特定の治療上の利点を得ることができる。
【０１６６】
本明細書に記載の化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびに上記化合物を製造するための試薬が含まれる）のいくつかは、不斉炭素を有しているため、エナンチオマーまたはジアステレオマーとして存在する。ジアステレオマーの混合物は、特に限定されないが、クロマトグラフィーおよび／または分別結晶などの方法によって、物理化学的な違いに基づいて、それぞれのジアステレオマーに分けられる。エナンチオマーの混合物を適切な光活性化合物（アルコールなど）と反応させて、該混合物をジアステレオマーの混合物に変換し、ジアステレオマーを分けてから、それぞれのジアステレオマーを対応する純粋なエナンチオマーに変換する（例えば加水分解する）ことによって、エナンチオマーは分けられる。全ての上記異性体（ジアステレオマー、エナンチオマー、およびそれらの混合物など）は本明細書に記載の組成物の一部として考慮される。
【０１６７】
別のまたはさらなる実施形態では、本明細書に記載の化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびに上記化合物を製造するための試薬が挙げられる。）は、プロドラッグの形態で用いられる。別のまたはさらなる実施形態では、本明細書に記載の化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびに上記化合物を製造するための試薬が含まれる）は、所望の効果（所望の治療効果など）を引き起こすために使用される代謝産物を製造する必要がある生物に投与されることによって代謝される。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸および“修飾されたまたは修飾されていない”非天然アミノ酸のポリペプチドの活性のある代謝産物である。
【０１６８】
本明細書に記載の方法および製剤には、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドのＮ酸化物、結晶形態（多形としても知られている）、または薬学的に許容可能な塩の使用が含まれる。ある実施形態では、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドは、互変異性体として存在する。全ての互変異性体は、本明細書に示された非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの範囲に含まれる。さらに、特定の実施形態では、本明細書に示された非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドは、薬学的に許容可能な溶媒（水およびエタノールなど）と一緒になった溶媒和物の形態で存在しているだけでなく、非溶媒和の形態でも存在している。また、本明細書に示された非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの溶媒和物の形態も、本明細書に開示されていると考慮される。
【０１６９】
特定の実施形態では、本明細書に記載の上記化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびに上記化合物を製造するための試薬が挙げられる。）のいくつかは、互変異性体のいくつかの形態にて存在する。このような互変異性体の全ては、本明細書に記載の組成物の一部として考慮される。また、例えば、本明細書における任意の化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびに上記化合物を製造するための試薬が含まれる）のエノール−ケトの形態も、本明細書に開示の組成物の一部として考慮される。
【０１７０】
特定の実施形態では、本明細書における化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびに上記化合物のどれか１つを製造するための試薬が挙げられる。）のいくつかは、酸性であり、薬学的に許容可能な陽イオンと塩を形成する。他の実施形態では、本明細書における上記化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびに上記化合物を製造するための試薬が挙げられる。）のいくつかは、塩基性であり、このため、薬学的許容可能な陰イオンと塩を形成する。二塩などの全ての塩が、本明細書に記載の組成物の範囲に含まれる。また当該塩は立証された方法によって調製される。例えば、酸性物質と塩基性物質とを、水性の媒体、非水性の媒体、または部分的に水性の媒体において、接触させることによって、塩が調製される。また、塩は、（ろ過する、非溶媒によって沈殿させた後にろ過する、溶媒を蒸発させる、あるいは、水溶液の場合に凍結乾燥するという）技術の少なくとも１つを用いて、回収される。
【０１７１】
本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドの薬学的に許容可能な塩は、親の非天然アミノ酸のポリペプチドに存在する酸性のプロトンが、金属イオン（例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、またはアルミニウムイオン）によって置換されるか、または有機塩基と配位結合するときに、必要に応じて形成される。また、開示された非天然アミノ酸のポリペプチドの塩の形態は、出発物質または中間体の塩を用いて必要に応じて調製される。本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドは、遊離塩基の形態である本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドを、薬学的に許容可能な無機酸または有機酸と反応させることによって、薬学的に許容可能な酸付加塩（薬学的に許容可能な塩の一種である。）として必要に応じて調製される。また、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドは、遊離酸の形態の本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドを、薬学的に許容可能な無機塩基または有機塩基と反応させることによって、薬学的に許容可能な塩基付加塩（base addition salt）（薬学的に許容可能な塩の一種である。）として必要に応じて調製される。
【０１７２】
薬学的に許容可能な塩の種類としては、特に限定されないが、（１）無機酸または有機酸と一緒に形成された酸付加塩、（２）親化合物に存在する酸性のプロトンが、金属イオンで置換されたとき、または有機塩基と配位結合するときに形成するときに形成される塩が挙げられる。無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸などが挙げられる。有機酸としては、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、エチレンコハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−メチルビシクロ−［２．２．２］オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトニック酸（glucoheptonic acid）、４，４′−メチレンビス（３−ヒドロキシ２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第３級ブチル酢酸（tertiary butylacetic acid）、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、およびムコン酸などが挙げられる。金属イオンとしては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、またはアルミニウムイオンなどが挙げられる。許容可能な有機塩基としては、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、およびＮ−メチルグルカミンなどが挙げられる。許容可能な無機塩基としては、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、および水酸化ナトリウムなどが挙げられる。
【０１７３】
非天然アミノ酸のポリペプチドの薬学的に許容可能な塩の対応する対イオンは、様々な方法を用いて必要に応じて分析および同定される。様々な方法としては、特に限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、誘導結合プラズマ、原子吸光分光分析、質量分析、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。さらに、このような非天然アミノ酸のポリペプチドの薬学的に許容可能な塩の治療活性は、実施例２２〜２６に記載の技術および方法を用いて試験される。
【０１７４】
塩を参照するとき、当該塩には、溶媒が付加された形態または結晶形態（特に、溶媒和物または多形）が包含される。溶媒和物は、化学量論的または非化学量論的な量の溶媒を含んでいる。また、溶媒和物は多くの場合に、水およびエタノールなどの薬学的に許容可能な溶媒と結晶する過程の間に形成される。水和物は、溶媒が水のときに形成され、アルコラートは、溶媒がアルコールのときに形成される。多形には、化合物の基本的な組成は同じであるが、結晶の凝集の構成が異なるものが包含される。各多形では、一般的に、Ｘ線回折パターン、赤外スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学特性、電気的特性、安定性、および可溶性が異なっている。様々な要因（再結晶溶媒、結晶化速度、および保存温度など）によって、単結晶が優先的に形成されると期待される。
【０１７５】
非天然アミノ酸のポリペプチドの薬学的に許容可能な塩、多形、および／または溶媒和物のスクリーニングと特徴付けとは、様々な技術を用いて実施される。様々な技術としては、特に限定されないが、熱分析、Ｘ線回折、分光法、蒸気収着、および顕微鏡検査が挙げられる。熱分析法は、多形転移などの熱化学的な分解、または熱物理学的な分解を調べるものである。熱分析法は、多形同士の関係を分析するか、重量の減少を決定するか、ガラス転移温度を見つけるか、または賦形剤の適合性試験を行うために使用される。このような熱分析法としては、特に限定されないが、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、調節された示差走査熱量測定（ＭＤＣＳ）、熱重量分析（ＴＧＡ）、および熱重量と赤外との分析（Thermogravimetric anジnfrared analysis(TG/IR)）が挙げられる。Ｘ線回折法としては、特に限定されないが、単結晶回折法、粉末回折法、シンクロトロン放射源（synchrotron source）が挙げられる。使用される様々な分光技術としては、特に限定されないが、ラマン分光法、ＦＴＩＲ、ＵＶＩＳ、およびＮＭＲ（液体および固体）が挙げられる。様々な顕微鏡検査技術としては、特に限定されないが、偏光顕微鏡検査、エネルギー分散型Ｘ線分析装置（ＥＤＸ）を有する走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、ＥＤＸを有する環境制御型走査電子顕微鏡（ガス雰囲気または水蒸気雰囲気）、ＩＲ顕微鏡検査、およびラマン顕微鏡検査が挙げられる。
【０１７６】
以下の詳細な説明では、我々の方法、組成物、装置および器具の原理を利用した実施形態が説明のために記載されており、詳細な説明と添付の図面とを参照することによって、本方法および本組成物の特徴および利点がより理解される。
【０１７７】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、本明細書に記載の方法、組成物、方策、および技術の特定の態様の関係を示す非限定的な概略図である。
【０１７８】
図２は、本明細書に記載のキノキサリンの誘導体およびフェナジンの誘導体を作製するために使用される合成方法の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。生体適合性の条件下において、１，２−アリールジアミンの化合物と１，２−ジカルボニルの化合物とによって、キノキサリンおよびフェナジンが形成されることが説明されている。
【０１７９】
図３は、本明細書に記載のキノキサリンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、２−オキソ−２−フェニルアセトアルデヒドとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、２−フェニルキノキサリンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャート（high-performance liquid chromatography trace）を示す図である。
【０１８０】
図４は、本明細書に記載のキノキサリンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、ペンタン−２，３−ジオンとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、２−エチル−３−メチルキノキサリンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【０１８１】
図５は、本明細書に記載のキノキサリンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、１−フェニルプロパン−１，２−ジオンとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、２−メチル−３−フェニルキノキサリンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【０１８２】
図６は、本明細書に記載のキノキサリンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、ベンジルとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、２，３−ジフェニルキノキサリンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【０１８３】
図７は、本明細書に記載のキノキサリンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、１，２−ジ（ピリジン−２−イル）エタン−１，２−ジオンとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、２，３−ジ（ピリジン−２−イル）キノキサリンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【０１８４】
図８は、本明細書に記載のフェナジンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、ナフタレン−１，２−ジオンとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、ベンゾ［ａ］フェナジンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【０１８５】
図９は、本明細書に記載のフェナジンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、５−スルホニル−ナフタレン−１，２−ジオンとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、４−スルホニルベンゾ［ａ］フェナジンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【０１８６】
図１０は、本明細書に記載のフェナジンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、強い蛍光性のジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【０１８７】
図１１は、本明細書に記載のフェナジンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、フェナントレン−９，１０−ジオンとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、強い蛍光性のジベンゾ［ａ，ｃ］フェナジンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【０１８８】
図１２は、本明細書に記載の１，２−ジカルボニル基を含んでいる非天然アミノ酸、および１，２−アリールジアミン基を含んでいる非天然アミノ酸の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。このような非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。このようなアミノ酸は、必要におじて、任意の非天然アミノ酸のポリペプチドに必要に応じて組み込まれる。非天然アミノ酸のポリペプチドとしては、ウロテンシン（ＵＴ−ＩＩ）、ＸＴ−８、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（granulocyte cell stimulating factor）（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンが挙げられる。
【０１８９】
図１３は、Ｚ基を含んでいる出発物質およびＷ基を含んでいる出発物質から、誘導体化剤である［Ｚ−Ｌ］ｎ−Ｌ１−Ｗ−Ｒおよび［Ｚ−Ｌ］ｎ−Ｌ１−Ｗ’−Ｒを調製するための説明に役立つ非限定的な例を示す図である。このような誘導体化剤は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０１９０】
図１４は、ＰＥＧ試薬を合成するための説明に役立つ非限定的な図である。このようなＰＥＧ試薬は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。任意のポリアルキレングリコールは、必要に応じてこのような合成方法に使用される。本図では、説明のためにｍ−ＰＥＧ３０ｋが示されている。
【０１９１】
図１５は、Ｚ基を含んでいる出発物質およびＷ基を含んでいる出発物質から、誘導体化剤である［Ｚ−Ｌ］ｎ−Ｌ１−Ｗ−Ｒおよび［Ｚ−Ｌ］ｎ−Ｌ１−Ｗ’−Ｒを調製することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。このような誘導体化剤は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０１９２】
図１６は、ジケトンを含んでいる試薬を用いて、ジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを誘導体化することによって、修飾されたキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾されたフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。ジアミンを含んでいるウロテンシン（ＵＴ−ＩＩ）の誘導体化が示されているが、ジアミンを含んでいる任意の非天然アミノ酸のポリペプチドがこのような反応に使用される。このような非天然アミノ酸のポリペプチドとしては、ＸＴ−８、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンが挙げられる。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０１９３】
図１７は、ジアミンを含んでいる試薬を用いて、ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸の保護されていないペプチドを誘導体化することによって、修飾されたキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾されたフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。ジカルボニルを含んでいるＸＴ−８の誘導体化が示されているが、ジカルボニルを含んでいる任意の非天然アミノ酸のポリペプチドがこのような反応に使用される。このような非天然アミノ酸のポリペプチドとしては、ウロテンシン（ＵＴ−ＩＩ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンが挙げられる。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０１９４】
図１８は、ジアミンの試薬およびジカルボニルの試薬をそれぞれ用いて、ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のタンパク質またはポリペプチド、およびジアミンを含んでいるアミノ酸のタンパク質またはポリペプチドを翻訳後修飾することによって、キノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、およびフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。灰色の形状の物体は、ウロテンシン（ＵＴ−ＩＩ）、ＸＴ−８、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンなどのポリペプチドまたはタンパク質を示す。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０１９５】
図１９Ａは、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドまたはタンパク質をジアミンおよびジカルボニルで修飾して、新しい化学官能基を導入することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。灰色の形状の物体は、ウロテンシン（ＵＴ−ＩＩ）、ＸＴ−８、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンなどのポリペプチドまたはタンパク質を示す。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０１９６】
図１９Ｂは、官能基を含んでいるポリペプチドまたはタンパク質とＰＥＧ誘導体との反応の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。灰色の形状の物体は、ウロテンシン（ＵＴ−ＩＩ）、ＸＴ−８、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンなどのポリペプチドまたはタンパク質を示す。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０１９７】
図２０は、ジアミンおよびジカルボニルで、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドまたはタンパク質を修飾して、新しい化学官能基を導入することを説明に役立つ非限定的な例を示す図、ならびに説明に役立つ官能基とＰＥＧ誘導体との反応の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。灰色の形状の物体は、ウロテンシン（ＵＴ−ＩＩ）、ＸＴ−８、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンなどのポリペプチドまたはタンパク質を示す。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０１９８】
図２１は、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド上にフェナジンが部位特異的に形成されることの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。楕円はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を示し、楕円へのアセトフェノンの付着は、ｈＧＨのアミノ酸３５における修飾を示す。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０１９９】
図２２は、タンパク質を標識するために、連続的に接合することによってキノキサリン部分およびフェナジン部分を形成することを説明する非限定的な例を示す図である。楕円形の物体は、抗体、ポリペプチドまたはタンパク質を示す。このようなポリペプチドまたはタンパク質としては、ウロテンシン（ＵＴ−ＩＩ）、ＸＴ−８、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンが挙げられる。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０２００】
図２３は、二官能性リンカー基を使用して、フェナジン部分を形成することによって非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質またはポリペプチドをＰＥＧ誘導体と連結することの説明に役立つ非限定的な図である。灰色の形状の物体は、ウロテンシン（ＵＴ−ＩＩ）、ＸＴ−８、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンなどのポリペプチドまたはタンパク質を示す。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０２０１】
図２４は、アリールジアミンを両方の末端に含んでいる二官能性リンカー基の合成の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【０２０２】
図２５は、２つの非天然アミノ酸のポリペプチドを一緒に連結する二官能性リンカーを用いて、ホモ二量体を形成するという合成の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。灰色の形状の物体は、ウロテンシン（ＵＴ−ＩＩ）、ＸＴ−８、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンなどのポリペプチドまたはタンパク質を示す。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０２０３】
図２６は、枝分かれＰＥＧを含んでいる試薬と、ジカルボニルの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドとの反応によって、キノキサリンで修飾されたポリペプチド、およびフェナジンで修飾されたポリペプチドを形成することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。灰色の形状の物体は、ウロテンシン（ＵＴ−ＩＩ）、ＸＴ−８、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンなどのポリペプチドまたはタンパク質を示す。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０２０４】
図２７は、枝分かれＰＥＧを含んでいる試薬と、ジアミンの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドとの反応によって、キノキサリンで修飾されたポリペプチドの異性体を形成することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。灰色の形状の物体は、ウロテンシン（ＵＴ−ＩＩ）、ＸＴ−８、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンなどのポリペプチドまたはタンパク質を示す。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０２０５】
図２８は、分岐したＰＥＧを含んでいる試薬と、置換されたジアミンの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドとの反応によって、フェナジンで修飾されたポリペプチドの異性体を形成することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。灰色の形状の物体は、ウロテンシン（ＵＴ−ＩＩ）、ＸＴ−８、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンなどのポリペプチドまたはタンパク質を示す。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０２０６】
図２９は、（Ａ）〜（Ｄ）は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれるリンカーの合成の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【０２０７】
図３０は、アリールジアミン基を含んでいるＰＥＧ誘導体およびジカルボニル基を含んでいるＰＥＧ誘導体の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【０２０８】
図３１は、ＰＥＧを含んでいる試薬と非天然アミノ酸を含んでいる化合物との、２ステップの接合および１ステップの接合の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。灰色の形状の物体は、ウロテンシン（ＵＴ−ＩＩ）、ＸＴ−８、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エリスロポエチン、上皮成長因子、顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、およびコルチコステロンなどのポリペプチドまたはタンパク質を示す。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれる。
【０２０９】
〔発明の詳細な説明〕
＜Ｉ．序論＞
近年、タンパク質の部位特異的修飾に関連する制限の多くを克服する見込みのある、タンパク質科学におけるまったく新しい技術が報告されている。具体的には、原核生物であるEschrichia coli（E. coli）（例えば、L.Wangら(2001),Science 292:498-500）および真核生物であるSacchromyces cerevisiae（S. cerevisiae）（例えば、J.Chinら, Science 301: 964-7(2003)）のタンパク質生合成機構に新規の構成要素が加えられた。これによって、インビボにおいて非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むことが可能になった。この手法によって、これまでにない化学的性質、物理的性質または生物学的性質を有する多数の新たなアミノ酸が、アンバーコドンＴＡＧと反応して、Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母においてタンパク質へ高い忠実性でもって効率的に組み込まれた。例えば、J.W.Chinら, (2002) Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027（その全体が参照することによって援用される）、J.W.Chin,& P.G.Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11):1135-1137（その全体が参照することによって援用される）、J.W.Chinら, (2002), PNAS United States of America 99(17):11020-11024（その全体が参照することによって援用される）、および、L. Wang,& P.G.Schultz, (2002), Chem. Comm.,1-11（その全体が参照することによって援用される）を参照のこと。なお、新たなアミノ酸としては、例えば、光親和性標識されたアミノ酸、光異性化性（photoisomerizable）アミノ酸、ケトアミノ酸、およびグリコシル化アミノ酸が挙げられる。これらの研究では、（１）タンパク質中に存在せず、（２）２０の遺伝的にコードされた一般アミノ酸において存在する全ての官能基に対して化学的に不活性であり、（３）使用したときに、選択的かつ効率よく反応して安定な共有連結を必要に応じて形成する化学官能基を選択的且つ定石通りに導入できることが証明された。
【０２１０】
＜ＩＩ．概要＞
図１は、本明細書に記載の組成物、方法および技術の概要を示す図である。ある水準において、１，２−ジカルボニル基、１，２−アリールジアミン基、キノキサリン基、またはフェナジン基を有する非天然アミノ酸もしくは修飾された非天然アミノ酸を少なくとも１つ有するポリペプチドを製造および使用するための道具（方法、組成物、技術）が、本明細書に記載されている。上記非天然アミノ酸は、以下の官能基（functionality）を必要に応じてさらに含んでいる。このような官能基としては、例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体；抗体または抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団；金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分（photocaged moiety）；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギー伝達剤；生物学的に活性な剤（この場合、生物学的に活性な剤は治療活性を有し、非天然アミノ酸のポリペプチドまたは修飾された非天然アミノ酸は付着された治療剤とともに共治療剤（cotherapeutic agent）として機能するか、付着された治療剤を生物内の所望の部位に送達する手段として機能する）；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤（activated complex activator）、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。なお、上記に様々な官能基を示したが、１つの官能基のメンバーが別の官能基のメンバーとして分類されないということではない。実際に、特定の状況下では重複することもある。例えば、水溶性ポリマーはポリエチレングリコールの誘導体と範囲が重複する。しかし、この重複は完全ではないため、上記で両方の官能基を挙げた。
【０２１１】
図１に示すように、一態様では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の方法、組成物および技術を用いて修飾されるポリペプチドを選択および設計する方法である。新規ポリペプチドは、例えば必要に応じて、ハイスループットスクリーニング過程の一部として、または研究者の興味に基づいて、新規に（de novo）設計される。新規ポリペプチドが、ハイスループットスクリーニング過程の一部として新規に設計される場合は、非常に多数のポリペプチドが必要に応じて設計、合成、特徴付けおよび／または試験される。また、新規ポリペプチドは、公知のポリペプチドまたは部分的に特徴付けられているポリペプチドの構造に基づいて必要に応じて設計される。例えば、科学界は、後述する成長ホルモン遺伝子のスーパーファミリーを精力的に研究してきたが、ある実施形態では、新規ポリペプチドは、この遺伝子のスーパーファミリーのメンバーの構造に基づいて必要に応じて設計される。本明細書には、どのアミノ酸を置換および／または修飾するかを選択する原理が別々に記載されている。また、本明細書には、どの修飾を採用するかという選択についても記載されており、この選択は、実験者または最終使用者の要求に合うように用いることができる。このような要求としては、必要に応じて特に限定されないが、ポリペプチドの治療有効性の操作、ポリペプチドの安全性プロフィールの改善、ポリペプチドの薬物動態学的性質、薬理学的性質および／または薬力学的性質の調節（例えば、水溶性の増加、バイオアベイラビリティ、血中半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調節、生物学的な活性の調節、または循環時間の延長）が挙げられる。また、上記修飾としては、例えば、ポリペプチドへのさらなる官能基の提供、ポリペプチドへのタグ、標識、または検出可能なシグナルの組み込み、ポリペプチドの単離性質の緩和、およびこれらの修飾の任意の組合せが挙げられる。
【０２１２】
また、本明細書には、１，２−ジカルボニル基、１，２−アリールジアミン基、キノキサリン基、またはフェナジン基を有しているか、あるいはそれらを含むように必要に応じて修飾される非天然アミノ酸が記載されている。この態様には、上記非天然アミノ酸を製造、精製、特徴付け、および使用するための方法が含まれる。また、図３、４、５、６、７、８、９、１０および１１に示すようなキノキサリンの誘導体およびフェナジンの誘導体の合成、およびこれら誘導体を非天然アミノ酸のポリペプチドに組み込むことも含まれる。本明細書に記載の別の態様では、上記非天然アミノ酸を少なくとも１つポリペプチドに組み込むための方法、方策および技術が記載されている。また、この態様には、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを、少なくとも部分的に、製造するために必要に応じて用いられるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）を製造、精製、特徴付け、および使用するための組成物および方法が含まれる。また、この態様には、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを、少なくとも部分的に、製造するために必要に応じて用いられる上記オリゴヌクレオチドを発現することができる細胞を製造、精製、特徴付け、および使用するための組成物および方法が記載されている。
【０２１３】
したがって、本明細書には、１，２−ジカルボニル基、１，２−アリールジアミン基、キノキサリン基、またはフェナジン基を有する非天然アミノ酸もしくは修飾された非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドが提供および記載されている。特定の実施形態では、１，２−ジカルボニル基、１，２−アリールジアミン基、キノキサリン基、またはフェナジン基を有する非天然アミノ酸もしくは修飾された非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドは、該ポリペプチドにおけるある位置に、翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでいる。いくつかの実施形態では、翻訳と同時の修飾（co-translational modification）および翻訳後修飾は、細胞機構を介して生じるものであり、例えば、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、および糖脂質が連結する修飾などが挙げられる。多くの場合に、上記細胞機構に基づく、翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾は、ポリペプチドの天然に生じるアミノ酸の部位において生じるが、ある実施形態では、上記細胞機構に基づく、翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾は、ポリペプチドの非天然アミノ酸の部位において生じる。
【０２１４】
他の実施形態では、翻訳後修飾は細胞機構を利用しないが、その代わり、本明細書に記載の化学的方法または特定の反応基に適したその他の方法を使用して、第２反応基を含んでいる以下の分子を、第１反応基を含んでいる少なくとも１つの非天然アミノ酸（ケトン、アルデヒド、アセタール、ヘミアセタール、オキシム、またはヒドロキシルアミンの官能基を含んでいる非天然アミノ酸など）に結合させることにより、官能基が提供される。上記分子としては、例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギー伝達剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾は、真核細胞または非真核細胞においてインビボで作製される。特定の実施形態では、翻訳後修飾は細胞機構を利用せずにインビトロで作製される。また、この態様には、上記翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾された非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいる上記ポリペプチドを製造、精製、特徴付け、および使用するための方法が含まれる。
【０２１５】
また、本明細書に記載の方法、組成物、方策および技術の範囲には、上記翻訳後修飾の何れかを作製するために、ポリペプチドの一部である非天然アミノ酸と反応することができる試薬が含まれる。上記非天然アミノ酸は、１，２−ジカルボニル基、１，２−アリールジアミン基、もしくはそれらのマスキングされた、保護された、または同等の形態のものを含んでいる。一般的に、翻訳後修飾された非天然アミノ酸が生じた場合、この非天然アミノ酸はキノキサリン基またはフェナジン基を少なくとも１つ含んでおり、この生じたキノキサリンまたはフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸は、さらなる修飾反応を必要に応じて受ける。また、この態様には、上記非天然アミノ酸に対して上記翻訳後修飾をすることができる上記試薬を製造、精製、特徴付け、および使用する方法が含まれる。
【０２１６】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、ある宿主細胞によってインビボで作製された翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでいる。翻訳後修飾は、通常は別の宿主細胞によって作製されないものである。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ある真核細胞によってインビボで作製された翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでいる。当該翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾は、通常は非真核細胞によって作製されないものである。翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、および糖脂質が連結する修飾などが挙げられる。一実施形態では、翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン連結を介した、アスパラギンに対するオリゴサッカライドの結合を含んでいる（例えば、オリゴサッカライドが、（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃなどを含んでいる場合）。別の実施形態では、当該翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン連結、ＧａｌＮＡｃ−トレオニン連結、ＧｌｃＮＡｃ−セリン連結、またはＧｌｃＮＡｃ−トレオニン連結を介した、セリンまたはトレオニンに対するオリゴサッカライドの結合を含んでいる（例えば、当該オリゴサッカライドとしては、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどが含まれる）。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは必要に応じて、分泌または局在化の配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、および／またはＧＳＴ融合などを含んでいる。また、この態様には、上記翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでいる上記ポリペプチドを製造、精製、特徴付け、および使用するための方法が含まれる。他の実施形態では、グリコシル化された非天然アミノ酸のポリペプチドは、グリコシル化されていない形態のものから製造される。グリコシル化される非天然アミノ酸のポリペプチドのための上記グリコシル化されていない形態のものは、必要に応じて以下の方法によって製造される。すなわち、（１）単離された、実質的に精製された、または精製されていないグリコシル化された非天然アミノ酸のポリペプチドからオリゴサッカライド基を化学的もしくは酵素的に除去する工程を含んでいる方法、（２）非天然アミノ酸のポリペプチドをグリコシル化させない宿主において非天然アミノ酸のポリペプチドを製造する工程を含んでいる方法（このような宿主としては、原核生物、ポリペプチドをグリコシル化しないように操作されているか、あるいは突然変異させられた真核細胞が挙げられる）、（３）ポリペプチドをグリコシル化する真核細胞によって上記非天然アミノ酸のポリペプチドが通常は製造される細胞培養液に、グリコシル化阻害剤を導入する工程を含んでいる方法、あるいは（４）上記方法の任意の組合せ。また、本明細書には、標準的にグリコシル化される非天然アミノ酸のポリペプチドのための上記グリコシル化されていない形態のものが含まれる。ここで、「標準的なグリコシル化」は、天然に生じるポリペプチドがグリコシル化される条件下にて製造されるときの、ポリペプチドのグリコシル化を意味する。勿論、標準的にグリコシル化される非天然アミノ酸のポリペプチドのための上記グリコシル化されていない形態のもの（または、本明細書に記載のどのポリペプチド）は、未精製の形態のものであるか、実質的に精製された形態のものであるか、または単離された形態のものである。
【０２１７】
特定の実施形態では、非天然アミノ酸ペプチドは、翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでいる。当該翻訳後修飾は、化学量論的、化学量論様、またはほぼ化学量論的である。
【０２１８】
別の実施形態では、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、１，２−ジカルボニル基、１，２−アリールジアミン基、キノキサリン基、フェナジン基、またはそれらの保護された形態のものもしくは同等の形態のものの何れかを有する非天然アミノ酸を、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、あるいは１０以上含んでいる。非天然アミノ酸は、同一であるか、または異なっており、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含んでいる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の異なる場所が、タンパク質に存在する。特定の実施形態では、天然に発生するタンパク質に存在する特定のアミノ酸の少なくとも１つ（ただし、全てではない）が非天然アミノ酸で置換されている。
【０２１９】
本明細書に記載および提供されている方法と組成物とは、１，２−ジカルボニル基、１，２−アリールジアミン基、またはそれらの保護された形態のもの、マスキングされた形態のもの、もしくは同等の形態のもの、あるいはキノキサリン基、またはフェナジン基を含んでいる、非天然アミノ酸を少なくとも１つ含有しているポリペプチドを含んでいる。少なくとも１つの上記非天然アミノ酸をポリペプチドに導入することによって、例えば、２０の一般的に生じるアミノ酸とは反応しないが１以上の非天然アミノ酸と反応するという特異的な化学反応に関与する接合化学反応を活用することができる。天然に生じないアミノ酸の側鎖が組み込まれた後で、本明細書に記載の化学的方法または天然にコードされたアミノ酸に存在する特定の官能基または置換基に適した化学的方法を利用して、天然に生じないアミノ酸の側鎖を修飾することができる。
【０２２０】
本明細書に記載の非天然アミノ酸に関する方法および組成物は、多種多様な官能基、置換基または部分を有する物質と、以下の他の物質との接合体を提供する。すなわち、他の物質としては、例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギー伝達剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２１】
特定の実施形態では、一般式Ｉ〜ＸＩで示される化合物、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩで示される化合物、および化合物１〜６を含んでいる本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、リンカー、および試薬は、弱酸性の環境下で水溶液において安定である。弱酸性の環境としては、特に限定されないが、約２〜約１０のｐＨが挙げられ、さらに約３〜約８のｐＨ；約４〜約１０のｐＨ；約４〜約８のｐＨ；約４．５〜約７．５のｐＨ；約４〜約７のｐＨ；約３〜約４のｐＨ；約７〜約８のｐＨ；約４〜約６のｐＨ；約４のｐＨ；約６のｐＨが挙げられる。他の実施形態では、上記の化合物は弱酸性の環境化で少なくとも１ヶ月間安定である。他の実施形態では、上記の化合物は弱酸性の環境下で少なくとも約２週間安定である。他の実施形態では、上記の化合物は弱酸性の環境下で少なくとも約５日間安定である。
【０２２２】
本明細書に記載の組成物、方法、技術、および方策の別の態様は、上述した「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチドの何れかを、研究または使用するための方法である。この態様には、例えば、「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチドもしくはタンパク質を含むポリペプチドから利益を受ける、治療上の使用、診断上の使用、アッセイに基づく使用、産業上の使用、美容的使用、植物生物学的使用、環境への使用、エネルギー生産への使用、消費者製品への使用、および／または軍事上の使用が含まれる。
【０２２３】
＜ＩＩＩ．ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の場所＞
本明細書に記載の方法および組成物は、１つ以上の非天然アミノ酸のポリペプチドへの組み込みを含んでいる。ある実施形態では、１つ以上の非天然アミノ酸は、ポリペプチドの活性を阻害しない１つ以上の特定の位置に組み込まれる。これは、「保存的」置換をすること、および／または活性に必須ではない箇所に非天然アミノ酸を挿入することによって必要に応じて達成される。「保存的」置換とは、例えば、疎水性アミノ酸の非天然もしくは天然の疎水性アミノ酸での置換、かさ高いアミノ酸の非天然もしくは天然のかさ高いアミノ酸での置換、親水性アミノ酸の非天然もしくは天然の親水性アミノ酸での置換などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２４】
様々な生化学的および構造的手法が、ポリペプチド内における非天然アミノ酸で置換するための所望の部位の選択に採用される。ポリペプチド鎖の任意の部位は、非天然アミノ酸を組み込むための選択に好適であり、かつ選択は、必要に応じて合理的な設計に基づいているか、または任意の目的または特に所望ではない目的に応じた無作為の選択によってなされる。所望の部位の選択は、任意の所望の性質または活性を有する非天然アミノ酸のポリペプチド（さらに必要に応じて修飾されいるか、非修飾のままである）の製造に基づいている。このような任意の所望の性質または活性としては、例えば、アゴニスト、スーパーアゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニスト、受容体との結合を調節する物質、受容体の活性を調節する物質、結合パートナーに対する結合を調節する物質、結合パートナーの活性を調節する物質、結合パートナーの構造を調節する物質、二量体もしくは多量体の形成、本来の分子と比較して活性もしくは性質に対して変化がないこと、またはポリペプチドの物理的性質もしくは化学的性質（例えば、可溶性、凝集、または安定性）を操作することなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ポリペプチドの生物学的な活性に必要なポリペプチド内の位置は、点変異分析、アラニン走査、または相同物スキャニング法を用いて必要に応じて同定される。アラニン走査突然変異誘発または相同物スキャニング突然変異誘発によって生物学的な活性に重要であると同定されたもの以外の残基は、ポリペプチドに求められる所望の活性次第ではあるが、非天然アミノ酸で置換される良い候補である。また、生物学的な活性に重要であると同定された部位は、この場合もやはりポリペプチドに求められる所望の活性次第ではあるが、非天然アミノ酸で置換される良い候補である。その他にも、ポリペプチド鎖の各位置において非天然アミノ酸で連続的に置換し、ポリペプチドの活性に対する影響を観察する。非天然アミノ酸を用いた任意のポリペプチドへの置換の位置を選択する任意の手段、技術、または方法が、本明細書に記載の方法、技術および組成物に好適に使用される。
【０２２５】
また、欠失を含むポリペプチドの天然に生じる突然変異体の構造および活性を調査して、非天然アミノ酸による置換に対して耐性があると思われるタンパク質の領域を決定することもできる。非天然アミノ酸による置換に対して耐性がないと思われる残基が排除されると、残りの位置のそれぞれにおいて計画される置換の影響を、例えば、関連するポリペプチドならびに任意の会合するリガンドまたは結合タンパク質の３次元構造から調査することができる。多くのポリペプチドのＸ線結晶学的かつＮＭＲの構造は、タンパク質および核酸の大分子の３次元構造データを含む集中データベースであるProtein Data Bank （PDB、www.rcsb.org）において利用可能であり、これを使用することによっても非天然アミノ酸と（所望した通りに）必要に応じて置換されるアミノ酸位置が同定される。また、３次元構造データが利用できない場合には、モデルは、ポリペプチドの２次構造および３次構造の調査に基づいて必要に応じて作製される。このようにして、非天然アミノ酸で置換され得るアミノ酸位置の同定は、容易に行われる。
【０２２６】
非天然アミノ酸の組み込みの例示的な部位としては、例えば、（１）受容体と結合する可能性のある領域または結合タンパク質もしくはリガンドと結合する領域以外の部位、（２）完全にもしくは部分的に溶媒に露出する部位、（３）近くの残基との水素結合相互作用がない部位もしくは最小である部位、（４）近くの反応性残基に最小限で露出される部位、および／あるいは（５）特定のポリペプチドとその会合受容体、リガンドもしくは結合タンパク質との３次元結晶構造に基づいて予想したときに、柔軟性が高い領域内である部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２７】
多種多様の非天然アミノ酸は、必要に応じてポリペプチドにおける所定の位置に対して、置換または組み込まれる。例えば、特定の非天然アミノ酸は、ポリペプチドおよびその会合するリガンド、受容体、ならびに／または結合タンパク質との３次元結晶構造の調査に基づいて、組み込みのために選択される。
【０２２８】
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、ポリペプチドへ第１反応基を含む非天然アミノ酸を組み込む工程と、第２反応基を含む以下の分子と当該ポリペプチドとを接触させる工程とをさらに包含する。ここで、上記分子としては、例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギー伝達剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、第１反応基は１，２−ジカルボニル部分であり、第２反応基は１，２−アリールジアミン部分であり、これによってキノキサリン連結が形成される。ある実施形態では、第１反応基は１，２−ジカルボニル部分であり、第２反応基は１，２−アリールジアミン部分であり、これによってフェナジン連結が形成される。ある実施形態では、第１反応基は１，２−アリールジアミン部分であり、第２反応基は１，２−ジカルボニル部分であり、これによってキノキサリン結合が形成される。ある実施形態では、第１反応基は１，２−アリールジアミン部分であり、第２反応基は１，２−ジカルボニル部分であり、これによってフェナジン連結が形成される。
【０２２９】
場合によっては、非天然アミノ酸の置換または組み込みは、他の化学的特徴、物理的特徴、薬理学的特徴、および／または生物学的特徴に影響を与えるために、ポリペプチド内における他の付加、置換または欠失と組み合わせられる。場合によっては、他の付加、置換または欠失は、必要に応じて、ポリペプチドの安定性（例としては、タンパク質の分解に対する耐性が挙げられるが、これに限定されない）を増強するか、あるいは適切な受容体、リガンドおよび／または結合タンパク質に対するポリペプチドの親和性を増強する。場合によっては、当該他の付加、置換または欠失は、必要に応じて、Ｅ．  ｃｏｌｉまたは他の宿主細胞において発現されるときに（例として挙げられるが、これに限定されない）、ポリペプチドの可溶性を増強する。ある実施形態では、Ｅ．  ｃｏｌｉまたは他の組み換え宿主細胞において発現した後にポリペプチドの可溶性を増強するために非天然アミノ酸を組み込む部位を選択することに加えて、天然にコードされるアミノ酸または非天然アミノ酸で置換する別の部位が選択される。ある実施形態では、ポリペプチドは、会合するリガンド、結合タンパク質および／または受容体に対する親和性を調節するか、受容体の二量体化を調節（増強または低減が挙げられるが、これらに限定されない）するか、受容体の二量体を安定化するか、循環半減期を調節するか、放出またはバイオアベイラビリティを調節するか、精製を容易にするか、または投与の特定の経路を改善または変更するかの何れかである、他の付加、置換または欠失を含んでいる。同様に、非天然アミノ酸のポリペプチドは、検出（ＧＦＰが挙げられるが、これに限定されない）、精製、組織もしくは細胞膜を介する輸送、プロドラッグの放出もしくは活性化、サイズの低減、またはポリペプチドの他の特徴の何れかを改善する、化学的もしくは酵素的な切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧまたはポリ−Ｈｉｓが挙げられるが、これらに限定されない）、あるいは他の親和性に基づく配列（例としては、ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなどが挙げられるが、これらに限定されない）または親和性に基づく結合分子（ビオチンが挙げられるが、これに限定されない）を必要に応じて含んでいる。
【０２３０】
＜ＩＶ．例としての成長ホルモンスーパーファミリー＞
本明細書に記載の方法、組成物、方策および技術は、特定の種類、分類またはファミリーのポリペプチドまたはタンパク質に限定されない。実際に、ほとんどあらゆるポリペプチドが、本明細書に記載されている「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸を少なくとも１つ含むように必要に応じて設計または修飾される。単なる一例として、当該ポリペプチドは、必要に応じて以下の物質から成る群より選択される治療タンパク質と相同である：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、抗体断片、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質（four-helical bundle protein）、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン（neurturin）、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン（paracitonin）、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン（pleiotropin）、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、試験ステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロン。
【０２３１】
従って、成長ホルモン（ＧＨ）スーパーファミリーについての以下の記述は、説明を目的として単なる一例として提供されるものであり、かつ本明細書に記載の方法、組成物、方策および技術の範囲を制限するようなものではない。さらに、本出願における「ＧＨポリペプチド」とは、ＧＨスーパーファミリーのメンバーの例を示す総称として使用される。従って、ＧＨポリペプチドまたはタンパク質に関する本明細書に記載の修飾および化学反応は、必要に応じてＧＨスーパーファミリーの任意のメンバー（本明細書に具体的に記載されているものを含む）に等しく適用される。
【０２３２】
以下のタンパク質：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチン  Ｍ、繊毛状の神経栄養因子、白血病抑制因子、アルファ  インターフェロン、ベータ  インターフェロン、イプシロン  インターフェロン、ガンマ  インターフェロン、オメガ  インターフェロン、タウ  インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、およびカージオトロフィン−１（cardiotrophin-1）（ＣＴ−１）（「ＧＨスーパーファミリー」）は、成長ホルモン（ＧＨ）スーパーファミリーの遺伝子によってコードされるタンパク質を含む（「Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1990)」;「Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992)」;「Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)」；「Silvennoinen, O. and Ihle, J. N., SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996)」）。今後、遺伝子のクローニングおよび配列決定によって、当該遺伝子ファミリーの更なるメンバーが同定されることが予想される。ＧＨスーパーファミリーの各メンバーは、それらのアミノ酸またはＤＮＡ配列の同一性が通常限られているにもかかわらず、類似した二次構造および三次構造を有する。共通の構造的特徴によって、当該遺伝子ファミリーの新しいメンバーを迅速に同定することができる。また、本明細書に記載の非天然アミノ酸に関する方法および組成物に、当該共通の構造的特徴を同様に適用可能である。
【０２３３】
多くのサイトカイン（例としては、Ｇ−ＣＳＦ（「Zinkら, FEBS Lett.314:435 (1992)」;「Zinkら, Biochemistry 33:8453 (1994)」;「Hillら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5167 (1993)」）、ＧＭ−ＣＳＦ（「Diederichs, K.,ら Science 154: 1779-1782 (1991)」;「Walterら, J. MoI. Biol. 224:1075-1085 (1992)」）、ＩＬ−２（「Bazan, J. F. and McKay, D. B. Science 257: 410-413 (1992)」）、ＩＬ−４（「Redfieldら, Biochemistry 30: 11029-11035 (1991)」;「Powersら, Science 256:1673-1677 (1992)」）、およびＩＬ−５（「Milburnら, Nature 363: 172-176 (1993)」）が挙げられる）の構造はＸ線回折およびＮＭＲ調査によって測定されている。そして、そのサイトカインの構造は、有意な一次配列の相同性がないにもかかわらず、ＧＨ構造が顕著に保存されていることを示している。インターフェロンは、モデリングおよび他の研究（「Leeら, J. Interferon Cytokine Res. 15:341 (1995)」;「Murgoloら, Proteins 17:62 (1993)」;「Radhakrishnanら, Structure 4:1453 (1996)」;「Klausら, J. MoI. Biol. 274:661 (1997)」）に基づいて当該ファミリーのメンバーであると考えられる。インターフェロン（ＩＮＦ）（例えば、アルファ、ベータ、オメガ、タウ、イプシロン、およびガンマ  インターフェロン）だけでなく、多数の更なるサイトカインおよび成長因子（例としては、繊毛状の神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、オンコスタチン  Ｍ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が挙げられる）は、当該ファミリーに属する（「Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)」;「Silvennoinen and Ihle (1996) SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS」において概説されている）。現在、上記のサイトカインおよび成長因子のすべては、一つの大きい遺伝子ファミリーを構成すると考えられている。
【０２３４】
類似する二次構造および三次構造を共有する他に、当該ファミリーのメンバーは、細胞内シグナル伝達経路を活性化するために細胞表面受容体をオリゴマー化する必要があるという性質を共有している。ＧＨファミリーのメンバーの中には（ＧＨおよびＥＰＯが挙げられるが、これらに限定されない）、一種類の受容体に結合し、該受容体にホモ二量体を形成させるものもある。ファミリーの他のメンバーの中には（ＩＬ−２、ＩＬ４、およびＩＬ−６が挙げられるが、これらに限定されない）、一種類より多くの受容体に結合し、該受容体にヘテロ二量体またはより高次の集合体を形成させるものもある（「Davisら, (1993) Science 260: 1805-1808」;「Paonessaら, (1995) EMBO J. 14: 1942-1951」;「Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)」）。突然変異誘導法の研究は、ＧＨのように、これらの他のサイトカインおよび成長因子が、複数の、通常２つの受容体結合部位を含み、かつそれらの同種の受容体に連続的に結合することを示している（「Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)」;「Matthewsら, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9471-9476」）。ＧＨのように、ファミリーのこれら他のメンバーにとって主要な受容体結合部位は、主として４つのアルファヘリックスおよびＡ−Ｂループに存在する。受容体結合に関与する、ヘリカルバンドルにおける特定のアミノ酸は、当該ファミリーのメンバーの間で異なる。ＧＨスーパーファミリーのメンバーと相互作用する細胞表面受容体のほとんどは、構造的に関連し、かつ第２の大きな複数の遺伝子によるファミリーを構成する。例えば、参照によって上記ＧＨスーパーファミリーの説明に援用される米国特許出願第６，６０８，１８３号明細書を参照のこと。
【０２３５】
ＧＨスーパーファミリーの様々なメンバーの変異に関する研究から、通常、アルファヘリックスに結合したループは受容体結合に関与しない傾向にあるという一般的な結論が得られた。特に、短いＢ−Ｃループは、すべてではないがほとんどのファミリーのメンバーにおいて、受容体結合に必須ではないと思われる。従って、ＧＨスーパーファミリーのメンバーにおいて、該Ｂ−Ｃループは、必要に応じて本明細書に記載されているような非天然アミノ酸で置換される。また、Ａ−Ｂループ、Ｃ−Ｄループ（およびＧＨスーパーファミリーのインターフェロン／ＩＬ−１０のようなメンバーのＤ−Ｅループ）は、必要に応じて非天然アミノ酸で置換される。また、ヘリックスＡに近接したアミノ酸および最後のヘリックスに遠位のアミノ酸も受容体結合に関与しない傾向があるので、必要に応じて非天然アミノ酸を導入するための部位である。いくつかの実施形態では、ループ構造内の任意の場所（特に限定されないが、上記Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ、またはＤ−Ｅループの最初の１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のアミノ酸が挙げられる）が、非天然アミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、上記Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ、またはＤ−Ｅループの最後の１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のアミノ酸が、非天然アミノ酸で置換される。
【０２３６】
ＥＰＯ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、およびベータ  インターフェロンなどを含むＧＨファミリーの特定のメンバーは、Ｎ−結合型の糖および／またはＯ−結合型の糖を含む。このようなタンパク質においてグリコシル化部位は、ほぼ例外なくループ領域に生じ、かつアルファヘリックスバンドルには生じない。ループ部位は、一般的に受容体との結合に関与せず、かつこの部位は糖基と共有結合するための部位であるので、該部位は、非天然アミノ酸の置換を上記タンパク質に導入するための有用な部位である。タンパク質においてＮ−結合型のグリコシル化部位およびＯ−結合型のグリコシル化部位を含んでいるアミノ酸は、タンパク質の表面に露出しているので、非天然アミノ酸置換のための任意の部位となる。このように、天然のタンパク質は、これらの部位において該タンパク質に付着する嵩高い糖基を許容することができ、グリコシル化部位は、受容体結合部位から離れて位置する傾向がある。
【０２３７】
今後、おそらくＧＨ遺伝子ファミリーのメンバーがさらに発見されるであろう。ＧＨスーパーファミリーの新しいメンバーの同定は、例えば、予想されるタンパク質配列に対するコンピューターを使った二次構造および三次構造の解析に基づいて、また特定の対象に結合する分子を同定する選択技術によって行われる。ＧＨスーパーファミリーのメンバーは、通常、非螺旋形のアミノ酸（ループ部位）によって結合される両親媒性のヘリックスを４つまたは５つ有する。このようなタンパク質は、細胞からの分泌を促進するために、タンパク質のＮ末端に疎水性のシグナル配列を含んでいる。上記のような後日発見されたＧＨスーパーファミリーのメンバーも、本明細書に記載の方法および組成物の中に含まれる。
【０２３８】
＜Ｖ．非天然アミノ酸＞
本明細書に記載の方法および組成物に使用される非天然アミノ酸は、以下の４つの性質のうち少なくとも１つを有する：
（１）非天然アミノ酸の側鎖上における少なくとも１つの官能基が、遺伝的にコードされた２０の一般アミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）の化学反応性に対して直交な、または、少なくとも、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドに存在する天然に生じるアミノ酸の化学反応性に対して直交な特性および／または活性および／または反応性の少なくとも１つを有する；
（２）導入された非天然アミノ酸が、上記遺伝的にコードされた２０の一般アミノ酸に対して実質的に化学的に不活性である；
（３）上記非天然アミノ酸が、天然に生じるアミノ酸に相応する安定性をもって、もしくは通常の生理的条件下において、ポリペプチドに安定的に組み込まれており、そのような組み込みが必要に応じてインビボの系を介して生じる；ならびに、
（４）非天然アミノ酸は、試薬との反応によってキノキサリン基またはフェナジン基に変換される官能基を含んでおり、上記変換が、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドの生物学的性質を破壊しない条件において起こるか（当然、そのような生物学的性質の破壊が修飾／変換の目的である場合を除く）、または、上記変換が、必要に応じて約２〜約１０のｐＨ（約３〜約８のｐＨ、約４〜約１０のｐＨ、約４〜約８のｐＨ、約４．５〜約７．５のｐＨ、約４〜約７のｐＨ、約３〜約４のｐＨ、約７〜約８のｐＨ、約４〜約６のｐＨ、約４のｐＨ、および約６のｐＨを含む）における水性条件で生じる。
【０２３９】
本明細書に記載の組成物および方法で使用される非天然アミノ酸に関する上記４つの性質を満たすアミノ酸の例示的かつ非限定的な例が、図１２に示されている。任意の数の非天然アミノ酸が必要に応じてポリペプチドに導入される。ある実施形態では、保護またはマスキングされたキノキサリンまたはフェナジンが非天然アミノ酸に含まれる。これらの基は、保護された基の脱保護またはマスキングされた基のデマスキングの後にキノキサリン基またはフェナジン基に変換される。他の実施形態では、保護またはマスキングされた１，２−ジカルボニル基が非天然アミノ酸に含まれる。これらの基は、保護された基の脱保護またはマスキングされた基のデマスキングの後に１，２−ジカルボニル基に変換され、その結果１，２−アリールジアミンとの反応によってキノキサリン基またはフェナジン基を形成することに利用することができる。他の実施形態では、保護またはマスキングされた１，２−アリールジアミン基が非天然アミノ酸に含まれる。これらの基は、保護された基の脱保護またはマスキングされた基のデマスキングの後に１，２−アリールジアミン基に変換され、その結果１，２−ジカルボニルとの反応によってキノキサリン基またはフェナジン基を形成することに利用することができる。
【０２４０】
本明細書に記載の方法および組成物に必要に応じて使用される非天然アミノ酸の例としては、光活性化可能な架橋剤を含んでいるアミノ酸、スピン標識したアミノ酸、蛍光性アミノ酸、金属と結合しているアミノ酸、金属を含んでいるアミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用するアミノ酸、フォトケージドアミノ酸および／または光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチンの類似体を含んでいるアミノ酸、糖鎖付加アミノ酸（例えば、糖で置換されたセリン）、他の炭水化物を用いて修飾したアミノ酸、ケトを含んでいるアミノ酸、アルデヒドを含んでいるアミノ酸、ポリエチレングリコールまたは他のポリエーテルを含んでいるアミノ酸、重原子で置換されたアミノ酸、化学切断可能なおよび／または光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比べて伸長した側鎖を有するアミノ酸（ポリエーテルまたは長鎖炭化水素（約５以上のまたは１０以上の炭素が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）、炭素連結した糖を含んでいるアミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸を含んでいるアミノ酸、ならびに１つ以上の毒性部分を含んでいるアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸はサッカライド部分を含んでいる。そのようなアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン、およびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。また、そのようなアミノ酸の例としては、アミノ酸とサッカライドとの間における天然に生じるＮ−またはＯ−連結が、通常には天然に見られない共有連結（アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドが挙げられるが、これに限定されない）によって置き換えられている例が挙げられる。また、そのようなアミノ酸の例は、天然に生じるタンパク質に通常は見られないサッカライド（例えば、２−デオキシ−グルコース、および２−デオキシガラクトースなど）を含んでいる。
【０２４２】
非天然アミノ酸のポリペプチドへの組込みを介して当該ポリペプチドに組み込まれる化学部分は、多様な利点およびポリペプチドの操作を提供する。例えば、１，２−ジカルボニル官能基および１，２−アリールジアミン官能基に固有の反応性によって、インビボとインビトロの両方でタンパク質の選択的修飾が可能となる。ある実施例では、重原子の非天然アミノ酸は、例えば、Ｘ線構造データの位相調整に有用である。また、非天然アミノ酸を用いて重原子を部位特異的に組み込むことによって、重原子用の位置を選択する際の選択性および柔軟性が与えられる。光反応性非天然アミノ酸（ベンゾフェノンおよびアリールアジド（フェニルアジドが挙げられるが、これに限定されない）側鎖を有するアミノ酸が挙げられるが、これに限定されない）は、例えば、インビボおよびインビトロにおけるポリペプチドの効率的な光架橋を可能にする。光反応性非天然アミノ酸としては、ｐ−アジド−フェニルアラニンおよびｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。また、光反応性非天然アミノ酸を有するタンパク質は、必要に応じて光反応性基が供給する（photoreactive group-providing）一時的な制御の励起によって、自由自在に架橋される。１例を挙げると、非天然アミノ酸のメチル基は、核磁気共鳴および振動分光法（例として挙げられるが、これらに限定されない）を利用した局所的な構造および動態のプローブとしての同位体標識されたメチル基（例として挙げられるが、これに限定されない）で置換される。
【０２４３】
‐Ａ．１，２−ジカルボニル基、保護された１，２−ジカルボニル基、マスキングされた１，２−ジカルボニル基、および１，２−ジカルボニルのような基‐
１，２−ジカルボニル基官能基を有するアミノ酸は、１，２−アリールジアミンと反応し、更に他の分子と必要に応じて結合するキノキサリンまたはフェナジンを形成する。１，２−ジカルボニル官能基を含有する非天然アミノ酸は、様々な１，２−アリールジアミン基との反応を可能にし、キノキサリン連結またはフェナジン連結を介して接合体（ＰＥＧまたはその他の水溶性ポリマーとの接合体が挙げられるが、これらに限定されない）を形成する。１，２−ジカルボニル官能基としては、１，２−ジカルボニルのような基（１，２−ジカルボニル基と構造的に類似しており、１，２−ジカルボニル基と同様に１，２−アリールジアミンと反応する）、マスキングされた１，２−ジカルボニル基（容易に１，２−ジカルボニル基に必要に応じて変換される）、または保護された１，２−ジカルボニル基（脱保護により１，２−ジカルボニル基と同様の反応性を有する）を含む。このようなアミノ酸は、一般式（Ｉ）：
【０２４４】
【化２】
2010514808.tif 000004
【０２４５】
で示される構造を有するアミノ酸を含んでいる。ここで、
Ａは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−（ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーであり；
Ｊは、
【０２４６】
【化３】
2010514808.tif 000005
【０２４７】
（ＸはＣＨ２、ＮＲ”、Ｏ、またはＳであり、ｎは０、１、２、または３である。また、Ｒ”は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）であり：
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキル；シクロアルキル（cloalkyl）であり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、あるいはＲ３およびＲ４は一緒にまたは２つのＲ３基は一緒に、必要に応じてシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
または、−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ−基は、１，２−ジカルボニル基、保護された１，２−ジカルボニル基、もしくはマスキングされた１，２−ジカルボニル基を有する二環または三環のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
または、−Ｊ−Ｒ基は、１，２−ジカルボニル基、保護された１，２−ジカルボニル基、もしくはマスキングされた１，２−ジカルボニル基を有する単環または二環のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成する。なお、ＪはＢおよびＲのどの位置にも必要に応じて結合される。例えば、これに特に限定されるものではないが、Ｊがシクロヘキサ−３，５−ジエン−１，２−ジオン誘導体の場合、以下に示すように、ＢおよびＪは必要に応じて環の３，４−、３，５−、３，６−、または４，５−に配置される：
【０２４８】
【化４】
2010514808.tif 000006
【０２４９】
また、さらに、ある実施形態では、当該環は必要に応じて置換される。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ必要に応じて翻訳後修飾される。
【０２５０】
ある実施形態では、一般式（Ｉ）で示される化合物は、水溶液において弱酸性の環境下で少なくとも１ヶ月間安定である。ある実施形態では、一般式（Ｉ）で示される化合物は、弱酸性の環境下で少なくとも２週間安定である。ある実施形態では、一般式（Ｉ）で示される化合物は、弱酸性の環境下で少なくとも５日間安定である。ある実施例では、このような弱酸性の環境とは約２〜約１０のｐＨであり、約３〜約８のｐＨ；約４〜約１０のｐＨ；約４〜約８のｐＨ；約４．５〜約７．５のｐＨ；約４〜約７のｐＨ；約３〜約４のｐＨ；約７〜約８のｐＨ；約４〜約６のｐＨ；約４のｐＨ；約６のｐＨを含む。
【０２５１】
一般式（Ｉ）で示される化合物のある実施形態では、Ｂは任意に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−（ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーである。一般式（Ｉ）で示される化合物のある実施例では、Ｒは、Ｃ１−６アルキルまたはシクロアルキルである。一般式（Ｉ）で示される化合物のある実施例では、Ｒは、−ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、もしくはシクロプロピルである。一般式（Ｉ）で示される化合物のある実施例では、Ｒ１は、Ｈ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、Ｎ−アセチル、テトラフルオレアセチル（ＴＦＡ）、もしくはベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。一般式（Ｉ）で示される化合物のある実施例では、Ｒ１は、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、もしくはポリヌクレオチドである。一般式（Ｉ）で示される化合物のある実施例では、Ｒ２は、ＯＨ、Ｏ−メチル、Ｏ−エチル、またはＯ−ｔ−ブチルである。一般式（Ｉ）で示される化合物のある実施例では、Ｒ２は、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、もしくはポリヌクレオチドである。一般式（Ｉ）で示される化合物のある実施例では、Ｒ２はポリヌクレオチドである。一般式（Ｉ）で示される化合物のある実施例では、Ｒ２はリボヌクレオチド酸（ＲＮＡ）である。一般式（Ｉ）で示される化合物のある実施例では、Ｒ２はｔＲＮＡである。一般式（Ｉ）で示される化合物のある実施例では、該ｔＲＮＡは、具体的には、セレクターコドンを認識する。一般式（Ｉ）で示される化合物のある実施例では、該セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然コドン、５塩基コドン、および４塩基コドンから成る群より選択される。一般式（Ｉ）で示される化合物のある実施例では、Ｒ２は、サプレッサーｔＲＮＡである。
【０２５２】
一般式（Ｉ）で示される化合物のある実施例では、−Ａ−Ｂ−は、次の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群から選択される：
（ｉ）Ａは、置換低級アルキレン、Ｃ４−アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、もしくは置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−（ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーである；
（ｉｉ）Ａは任意に、置換低級アルキレン、Ｃ４−アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、もしくは置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−（ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーである；
（ｉｉｉ）Ａは低級アルキレンであり；
Ｂは任意に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−（ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーである；および、
（ｉｖ）Ａはフェニレンであり；
Ｂは任意に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−（ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーである。
【０２５３】
さらに、一般式（ＩＩ）
【０２５４】
【化５】
2010514808.tif 000007
【０２５５】
の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。ここで、
Ａは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−  （ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドである。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、または非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ必要に応じて翻訳後修飾される。
【０２５６】
さらに、一般式（ＩＩＩ）：
【０２５７】
【化６】
2010514808.tif 000008
【０２５８】
の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。ここで、
Ｂは任意に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−（ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーであり；
Ｒ’は、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択される。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、または非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ必要に応じて翻訳後修飾される。
【０２５９】
さらに、以下のアミノ酸
【０２６０】
【化７】
2010514808.tif 000009
【０２６１】
が含まれる。ここで、このような化合物は、必要に応じてアミノ基が保護されているか、カルボキシル基が保護されているか、またはそれらの塩である。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、または非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２６２】
さらに、一般式（ＩＶ）：
【０２６３】
【化８】
2010514808.tif 000010
【０２６４】
の構造を有するアミノ酸が含まれる。ここで、
Ｂは任意に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−（ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択され；
ｎは０〜８である。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、または非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２６５】
さらに、以下のアミノ酸
【０２６６】
【化９】
2010514808.tif 000011
【０２６７】
が含まれる。ここで、このような化合物は、必要に応じてアミノ基が保護されているか、カルボキシル基が保護されているか、またはそれらの塩である。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、または非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２６８】
１，２−ジカルボニル官能基は、水溶液中において、弱酸性の環境下で、試薬を含む１，２−アリールジアミンと選択的に反応し、生理学的条件下において安定である対応するキノキサリン連結またはフェナジン連結を形成する。さらに、ジカルボニル基に特有の反応性によって、他のアミノ酸側鎖の存在下で、選択的な修飾が可能となる。例えば、「Cornish,V.W.,ら, J.Am.Chem.Soc., 118:8150-8151 (1996)」、「Geoghegan,K.F. & J.G., Bioconjug.Chem. 3:138-146 (1992)」、「Mahal,L.K.,ら, Science 276:1125-1128 (1997)」を参照のこと。
【０２６９】
ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンとｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成が、「Zhang, Z.ら, Biochemistry. 42:6735-6746 (2003)」に記載されており、これは参照によって本明細書の合成方法に組み込まれる。他のカルボニルを含んでいるアミノ酸またはジカルボニルを含んでいるアミノ酸も同様に所望した通りに作製される。また、本明細書に含まれる非天然アミノ酸の合成の一例（これに限られない）が、実施例１および１６に記載されている。
【０２７０】
‐Ｂ．１，２−アリールジアミン基、保護された１，２−アリールジアミン基、およびマスキングされた１，２−アリールジアミン基‐
１，２−アリールジアミン基を有する非天然アミノ酸によって、様々な１，２−ジカルボニル基または１，２−ジカルボニルと同等の基と反応し、キノキサリン連結またはフェナジン連結を介して接合体（ＰＥＧまたはその他の水溶性ポリマーとの接合体が挙げられるが、これらに限定されない）を形成することができる。このように、本明細書に記載のある実施例では、１，２−アリールジアミン基、１，２−アリールジアミンのような基（１，２−アリールジアミン基と構造的に類似しており、１，２−アリールジアミンと同様に１，２−ジカルボニルと反応する）、マスキングされた１，２−アリールジアミン基（容易に１，２−アリールジアミン基に必要に応じて変換される）、または保護された１，２−アリールジアミン基（脱保護によって１，２−アリールジアミン基と同様の反応性を有する）を含む。このようなアミノ酸は、一般式（Ｖ）：
【０２７１】
【化１０】
2010514808.tif 000012
【０２７２】
で示される構造を有するアミノ酸を含んでいる。ここで、
Ａは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−（ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーであり；
Ｊは、
【０２７３】
【化１１】
2010514808.tif 000013
【０２７４】
であり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４は一緒にもしくは２つのＲ３基は一緒に、必要に応じてシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
または、−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ−基は、１，２−アリールジアミン基、保護された１，２−アリールジアミン基、もしくはマスキングされた１，２−アリールジアミン基を有する二環または三環のシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールを形成し；
または、−Ｊ−Ｒ基は、１，２−アリールジアミン基、保護された１，２−アリールジアミン基、もしくはマスキングされた１，２−アリールジアミン基を有する単環または二環のシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールを形成する。なお、Ｊは必要に応じてＢおよびＲのどの位置にも結合される。例えば、これに特に限定されるものではないが、Ｊが１，２−ジアミノフェニル誘導体の場合、以下に示すように、ＢおよびＪは必要に応じて環の３，４−、３，５−、３，６−、または４，５−に配置される：
【０２７５】
【化１２】
2010514808.tif 000014
【０２７６】
また、当該環は必要に応じて置換される。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、または非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２７７】
さらに、一般式（ＶＩ）：
【０２７８】
【化１３】
2010514808.tif 000015
【０２７９】
の構造を有するアミノ酸が含まれる。ここで、
Ｂは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２、または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、＝Ｎ−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり；Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択される。
【０２８０】
さらに、一般式（ＶＩＩ）：
【０２８１】
【化１４】
2010514808.tif 000016
【０２８２】
の構造を有するアミノ酸が含まれる。ここで、
Ａは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−（ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４は一緒にもしくは２つのＲ３基は一緒に、必要に応じてシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択される。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、または非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２８３】
さらに、一般式（ＶＩＩＩ）：
【０２８４】
【化１５】
2010514808.tif 000017
【０２８５】
の構造を有するアミノ酸が含まれる。ここで、
Ｂは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＳＯｋ−（ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−；−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−；（Ｒ’は独立してＨ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択される。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、または非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２８６】
さらに、以下のアミノ酸
【０２８７】
【化１６】
2010514808.tif 000018
【０２８８】
が含まれる。ここで、このような化合物は、必要に応じてアミノ基が保護されているか、カルボキシル基が保護されているか、またはそれらの塩である。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、または非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２８９】
さらに、一般式（ＩＸ）：
【０２９０】
【化１７】
2010514808.tif 000019
【０２９１】
で示される構造を有するアミノ酸を含む。ここで、
Ｂは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−ＳＯｋ−（ｋは１、２、または３である）、−ＳＯｋ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−；−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−；（Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、Ｒ’−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択され；
ｎは０〜８である。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、または非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２９２】
さらに、以下のアミノ酸
【０２９３】
【化１８】
2010514808.tif 000020
【０２９４】
が含まれる。ここで、このような化合物は、必要に応じてアミノ基が保護されているか、カルボキシル基が保護されているか、またはそれらの塩である。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、または非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２９５】
さらに、一般式（Ｘ）：
【０２９６】
【化１９】
2010514808.tif 000021
【０２９７】
の構造を有するアミノ酸が含まれる。ここで、
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択される。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、または非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２９８】
‐Ｃ．キノキサリン基およびフェナジン基‐
キノキサリン基またはフェナジン基を含む非天然アミノ酸は、１，２−アリールジアミンを含む非天然アミノ酸と１，２−ジカルボニルを含む試薬との反応、または１，２−ジカルボニルを含む非天然アミノ酸と１，２−アリールジアミンを含む試薬との反応によって生成される。該試薬は、さらに、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団；金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギー伝達剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；およびこれらの任意の組合せから成る群より選択される分子に必要に応じて連結される。ある実施例では、上記非天然アミノ酸はポリペプチドに組み込まれ、適当な試薬との反応後、キノキサリン連結またはフェナジン連結を介して、該ポリペプチドと興味のある分子との間に接合体を形成する。
【０２９９】
このようなアミノ酸は、一般式（ＸＩ）：
【０３００】
【化２０】
2010514808.tif 000022
【０３０１】
の構造を有するアミノ酸を含む。ここで、
Ａは任意に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、一方の末端においてフェナジンを含んでいる部分またはキノキサリンを含んでいる部分と連結するリンカーであり、該リンカーは、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−（ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択され；
Ｊは、
【０３０２】
【化２１】
2010514808.tif 000023
【０３０３】
であり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４もしくは２つのＲ３基は、必要に応じてシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキサイド、置換ポリアルキレンオキサイド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、ＣＮ、ＮＯ２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２であり（ここで、Ｒ”はそれぞれ水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、Ｌ−Ｙ、または、Ｒ”基が１つより多く存在する場合は、２つのＲ”が任意にヘテロシクロアルキルを形成する）；
Ｒ５基が１つより多く存在する場合は、２つのＲ５がヘテロシクロアルキルまたは芳香族ヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｙは、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補助因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、核酸、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分（photocaged moiety）、光異性化可能な部分、ビオチン、ビオチンの類似体、重原子を組み込んでいる部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、伸長した側鎖、炭素連結した糖、酸化還元活性化剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識されている部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、インターカレートする基、発色団、エネルギー伝達剤、生物学的に活性な剤、検出可能な標識、薬物を送達する剤、電子伝達剤、ホルモン、ステロイド、酵素、ビタミン、栄養素、栄養補給物、免疫グロブリン、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、ヌクレアーゼ、インスリン、腫瘍抑制因子、血中タンパク質、ホルモンまたはホルモンの類似体、ワクチン、抗原、血液凝固因子、成長因子、リボザイム、およびこれらの任意の組合せから成る群より選択され；
Ｌは任意に、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ｋは１、２、または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、もしくは置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーであり；
または、−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ−基は、少なくとも１つのキノキサリン基またはフェナジン基を有する二環または三環のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
または、−Ｊ−Ｒ基は、少なくとも１つのキノキサリン基またはフェナジン基を有する単環または二環のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成する。
【０３０４】
ある実施形態では、Ｙは、水溶性ポリマー；ポリアルキレンオキサイド；ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；少なくとも１つのアミノ酸；少なくとも１つの糖基；少なくとも１つのヌクレオチド；少なくとも１つのヌクレオシド；リガンド；ビオチン；ビオチンの類似体；検出可能な標識；およびこれらの任意の組合せから選択される。
【０３０５】
一態様では、本発明は、構造１〜６：
【０３０６】
【化２２】
2010514808.tif 000024
【０３０７】
を有する化合物、または、その薬学的に許容可能な塩、活性のある代謝産物、プロドラッグ、溶媒和物、多形、互変異性体、またはエナンチオマーである。ここで、
Ａは任意に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、一方の末端においてフェナジンを含んでいる部分またはキノキサリンを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、該リンカーは、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−（ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択され；
Ｘは、−Ｃ（Ｒ５）（Ｒ５）−、−ＮＲ５−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり；
Ｙは、−ＣＲ５−または−Ｎ−であり；
ｎは０、１、２、３、または４であり；ｍは０、１、２、３、または４であり；ただし、ｍ＋ｎは１、２、３、または４であること；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４もしくは２つのＲ３基は、必要に応じてシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキサイド、置換ポリアルキレンオキサイド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ”、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２、または−Ｌ−Ｚであるか；あるいは、
２つのＲ５基は、必要に応じて一緒になって、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールを形成し；
Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、保護基、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルであり、２つ以上のＲ”基が存在する場合は、２つのＲ”が必要に応じてヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールを形成し；
Ｚは、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補助因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、核酸、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分、光異性化可能な部分、ビオチン、ビオチンの類似体、重原子を組み込んでいる部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、伸長した側鎖、炭素連結した糖、酸化還元活性化剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識されている部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、インターカレートする基、発色団、エネルギー伝達剤、生物学的に活性な剤、検出可能な標識、薬物を送達する剤、電子伝達剤、ホルモン、ステロイド、酵素、ビタミン、栄養素、栄養補給物、免疫グロブリン、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、ヌクレアーゼ、インスリン、腫瘍抑制因子、血中タンパク質、ホルモンまたはホルモンの類似体、ワクチン、抗原、血液凝固因子、成長因子、リボザイム、およびこれらの任意の組合せから成る群より選択され；
Ｌは任意に、結合、アルキレン、置換アルキレン、シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、置換アラルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＳ−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＳ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’）−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、または−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−であり；
ここで、ｋは０、１、または２であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
または、−Ａ−Ｂ−フェナジンまたはキノキサリンを含んでいる部分の基は、少なくとも１つのキノキサリン基またはフェナジン基を有する、置換されたまたは置換されていない二環または三環の、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールを形成し；
または、−Ｂ−フェナジンまたはキノキサリンを含んでいる部分の基は、少なくとも１つのキノキサリン基またはフェナジン基を有する、置換されたまたは置換されていない単環または二環の、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールを形成する。
【０３０８】
ある実施形態では、Ｚは、水溶性ポリマー；ポリアルキレンオキサイド；ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；少なくとも１つのアミノ酸；少なくとも１つの糖基；少なくとも１つのヌクレオチド；少なくとも１つのヌクレオシド；リガンド；ビオチン；ビオチンの類似体；検出可能な標識；およびこれらの任意の組合せから選択される。
【０３０９】
さらなる実施形態では、化合物は、構造７〜１２：
【０３１０】
【化２３】
2010514808.tif 000025
【０３１１】
を含む。ここで、Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３であり、Ｒ’はＨ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択される。
【０３１２】
他の実施形態では、化合物は、一般式（ＸＩ−Ａ）：
【０３１３】
【化２４】
2010514808.tif 000026
【０３１４】
に相当する。
【０３１５】
別の実施形態では、化合物は、一般式（ＸＩ−Ｂ）：
【０３１６】
【化２５】
2010514808.tif 000027
【０３１７】
に相当する。ここで、Ｒａはそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり；ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり；Ｂは−ＣＨ２−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり；Ｒ’はＨ、アルキル、または置換アルキルであり；ｎは０、１、２、３、４、５、または６である。
【０３１８】
さらなる実施例では、化合物は、一般式（ＸＩ−Ｃ）：
【０３１９】
【化２６】
2010514808.tif 000028
【０３２０】
に相当する。ここで、Ｂは−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｎ（Ｒ’）−であり、Ｒ’はＨ、アルキル、または置換アルキルである。
【０３２１】
さらに別の実施例では、化合物は、一般式（ＸＩ−Ｄ）：
【０３２２】
【化２７】
2010514808.tif 000029
【０３２３】
に相当する。ここで、Ｒａは、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２、または３であり、Ｒ’はＨ、アルキル、または置換アルキルであり）から成る群より選択される。
【０３２４】
別の実施形態では、化合物は、一般式（ＸＩ−Ｅ）：
【０３２５】
【化２８】
2010514808.tif 000030
【０３２６】
に相当する。
【０３２７】
このようなアミノ酸の例として（これらに限定されない）、以下の構造を有するアミノ酸が含まれる。
【０３２８】
【化２９】
2010514808.tif 000031
【０３２９】
このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、または非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドに組み込まれ、かつ必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３３０】
‐Ｄ．非天然アミノ酸の細胞の取り込み‐
真核細胞による非天然アミノ酸の取り込みは、タンパク質への取り込みを目的として（例として挙げられるが、これに限定されない）、非天然アミノ酸を設計および選択するときに考慮される１つの課題である。例えば、α−アミノ酸の高い電荷密度は、これらの化合物が細胞透過性ではないかもしれないことを示唆する。天然アミノ酸は、タンパク質に基づく輸送系の集まりを介して真核細胞に取り込まれる。高速スクリーニングが行われ、どの非天然アミノ酸が細胞に取り込まれたか（もしあれば）を評価する（本明細書に記載の実施例１６では、非天然アミノ酸に対して必要に応じて行われる試験の例（これに限定されない）が記載されている）。例えば、参照によってその全体が本明細書に援用される、「Protein Arrays」と題された米国特許出願公開第２００４／１９８６３７号明細書、および「Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785」における、例えば、毒性アッセイを参照のこと。取り込みは様々なアッセイを用いて容易に分析されるが、細胞の取り込み経路に受け容れられる非天然アミノ酸の設計に代わるものは、インビボにおいてアミノ酸を作り出す生合成経路を提供することである。
【０３３１】
通常は、本明細書に記載されているような細胞取り込みを介して産生される非天然アミノ酸は、タンパク質の効果的な生合成に十分な濃度で産生される。該濃度とは、例えば、これに限定されないが、天然の細胞における量が挙げられ、他のアミノ酸の濃度に影響を与えたり、細胞資源を使い果たしたりする程度ではない。このように調製される通常の濃度は、約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。
【０３３２】
‐Ｅ．非天然アミノ酸の生合成‐
多くの生合成経路が、アミノ酸および他の化合物を産生するために細胞にすでに存在している。特定の非天然アミノ酸用の生合成方法は、天然（例としては、細胞内が挙げられるが、これに限定されない）には存在し得ないが、本明細書に記載の方法および組成物は、そのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸用の生合成経路は、新しい酵素の添加または既存の宿主細胞経路の修飾によって、宿主細胞において必要に応じて生成される。追加の新しい酵素としては、天然に生じる酵素または人工的に発展させた酵素が挙げられる。例えば、ｐ‐アミノフェニルアラニンの生合成（「In vivo incorporation of unnatural amino acids」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号における一例に示されているような）は、他の生物に由来する公知の酵素を組み合わせて添加することを基にしている。これらの酵素に関する遺伝子は、当該遺伝子を含んでいるプラスミドを用いた細胞の形質転換によって真核細胞に必要に応じて導入される。該遺伝子は、細胞において発現すると、所望の化合物を合成する酵素経路を提供する。必要に応じて添加される酵素の種類の例は、本明細書に記載されている。追加の酵素の配列は、例えば、ジーンバンクで見出される。また、人工的に発展させた酵素は、同様の方法で細胞の中に必要に応じて加えられる。このように、細胞性機構および細胞資源が、非天然アミノ酸を産生するために操作される。
【０３３３】
種々の方法が、生合成経路に使用される新規な酵素、または既存の経路を発展させるための新規な酵素の産生に利用可能である。例えば、Maxygen, Inc.（ワールドワイドウェブのwww.maxigen.comで参照できる）によって開発されたような（例として挙げられるが、これに限定されない）反復的な組み換えは、新規の酵素および経路の開発に使用できる。例えば、「Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391」、および「Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751」を参照のこと。同様に、Genencor（ワールドワイドウェブのgenencor.comで参照できる）によって開発されたDesignPath（登録商標）は、代謝経路設計（例としては、細胞において非天然アミノ酸を作り出す経路の設計が挙げられるが、これに限定されない）に必要に応じて使用される。この技術は、新しい遺伝子（機能的なゲノミクス、分子進化、および分子設計によって同定される遺伝子が挙げられるが、これに限定されない）の組み合わせを用いて、宿主生物に存在する経路を再コンストラクションする。また、Diversa Corporation（ワールドワイドウェブのdiversa.comで参照できる）は、非天然アミノ酸を生合成的に産生するための新しい経路を作り出すための（例として挙げられるが、これに限定されない）、遺伝子および遺伝子経路のライブラリーを高速スクリーニングする技術を提供する。
【０３３４】
通常は、本明細書に記載されているような、設計された生合成経路を用いて産生される非天然アミノ酸は、タンパク質の効率的な生合成に十分な濃度で産生される。該濃度としては、例えば特に限定されないが、天然の細胞における量が挙げられ、他のアミノ酸の濃度に影響を与えたり、細胞資源を使い果たしたりする程ではない。インビボにおいてこのように調製される通常の濃度は、約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定の経路に所望される酵素の生成に使用される遺伝子を含むプラスミドを用いて細胞が形質転換され、非天然アミノ酸が生成されると、インビボでの選択が必要に応じて使用され、リボソームタンパク質の合成および細胞の増殖ために非天然アミノ酸の産生をさらに最適化する。
【０３３５】
‐Ｆ．その他の合成方法論‐
本明細書に記載の非天然アミノ酸は、当該技術について説明されている方法論を用いて、または本明細書に記載の技術を用いて、またはこれらの組合せによって必要に応じて合成される。補足として、以下の表に、所望の官能基を作り出すために必要に応じて組み合わせられる、多様な出発物質となる求電子試薬および求核試薬を示す。なお、ここに示す情報は例示的であり、本明細書に記載の合成技術に限定するものではない。
【０３３６】
【表１】
2010514808.tif 000032
【０３３７】
一般的に、炭素求電子試薬は、補完的な求核試薬（例としては、炭素求核試薬が挙げられる）による作用に影響を受けやすい。ここで、作用する求核試薬は、求核試薬と炭素求電子試薬との間に新しい結合を形成するために、炭素求電子試薬に対して電子対をもたらすものである。
【０３３８】
炭素求核試薬の例としては、アルキル、アルケニル、アリールおよびアルキニルのグリニャール（Grignard）試薬、有機リチウム試薬、有機亜鉛試薬、アルキル−、アルケニル−、アリール−およびアルキニル−スズ試薬（有機スズ化合物（organostannanes））、アルキル−、アルケニル−、アリール−およびアルキニル−ボラン試薬（有機ホウ素化合物および有機ボロネート（organoboronate））が挙げられるが、これに限定されない。これらの炭素求核試薬は、水または極性有機溶媒において動力学的に安定であるという利点を有する。他の炭素求核試薬の例としては、リンイリド試薬、エノール試薬、エノラート試薬が挙げられるが、これらに限定されない。これらの炭素求核試薬は、前駆体から比較的に容易に生成されるという利点を有する。炭素求核試薬は、炭素求電子試薬とともに使用されると、炭素求核試薬と炭素求電子試薬との間に新たな炭素−炭素結合を生み出す。
【０３３９】
炭素求電子試薬に対するカップリングに好適な非炭素求核試薬の例としては、１級アミンおよび２級アミン、チオール、チオレート（thiolate）およびチオエーテル、アルコール、アルコキシド、アジド、ならびにセミカルバジドなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの非炭素求核試薬は、炭素求電子試薬とともに使用されると、通常、異種原子連結（Ｃ−Ｘ−Ｃ）を生じる（Ｘは、酸素、硫黄、または窒素（これらに限定されない）などの異種原子である）。
【０３４０】
＜ＶＩ．非天然アミノ酸を有するポリペプチド＞
便宜上、本セクションに記載される化合物の形態、特性、およびその他の特徴は、代表的なものおよび／または具体例をもって説明されている。しかし、本セクションに記載の形態、特性、およびその他の特徴は、本セクションに記載の代表的な説明や具体例に限定されるものではない。本セクションに記載の形態、特性、およびその他の特徴は、本明細書の説明、特許請求の範囲、および図面に記載された一般式Ｉ〜ＸＩで示される化合物、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩで示される化合物および化合物１〜６の範囲に含まれるすべての化合物（一般式Ｉ〜ＸＩで示される化合物、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩで示される化合物および化合物１〜６の範囲に含まれるすべての下位の一般式（subformula）で示される化合物または特定の化合物を含む。）に等しくに適用される。
【０３４１】
本明細書に記載の組成物および方法は、少なくとも１つの非天然アミノ酸のポリペプチドへの組み込みを提供する。非天然アミノ酸は、ポリペプチドにおける任意の位置（ポリペプチドの任意の末端、または任意の内部が挙げられる）に必要に応じて存在する。ポリペプチドに非天然アミノ酸を組み込む目的の１つがポリペプチドの活性および／または三次元構造の破壊でない限り、非天然アミノ酸は、相同な天然に生じるアミノ酸のポリペプチドの活性および／または三次元構造と比較して、ポリペプチドの活性および／または三次構造を破壊しないことが好ましい。さらに、非天然アミノ酸をポリペプチドに組み込むことによって、ポリペプチドの活性および／またはポリペプチドの三次構造は、完全に破壊されることなく、相同な天然に生じるアミノ酸のポリペプチドと比較して、ある程度まで修飾され得る。ポリペプチドの活性の修飾には、例えば、ポリペプチドの治療有効性の操作、ポリペプチドの安全性プロフィールの改善、ポリペプチドの薬物動態学的性質、薬理学的性質および／または薬力学的性質の調節（例えば、水溶性の増加、バイオアベイラビリティ、血中半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調節、生物学的な活性の調節、または循環時間の延長）、ポリペプチドへのさらなる官能基の付与、ポリペプチドへのタグ、標識または検出可能なシグナルの組込み、ポリペプチドの単離性質の緩和、ならびに上述した修飾の任意の組合せが挙げられる。非天然アミノ酸のポリペプチドへの組み込みによって、相同な天然に生じるアミノ酸のポリペプチドと比較して、ポリペプチドの活性および／または三次構造はほとんど影響されなくてもよいが、上記のような活性および／または三次構造の修飾は、しばしば組み込みを行うことの目的の１つである。そのため、非天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチドを含む組成物、当該ポリペプチドおよびポリペプチド組成物を作製する方法、当該ポリペプチドおよびポリペプチド組成物を精製、単離、および特徴付ける方法、ならびに当該ポリペプチドおよびポリペプチド組成物を使用する方法は、本開示内容の範囲に含まれるとみなされる。さらに、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドは、他のポリペプチド（単なる一例として、非天然アミノ酸のポリペプチドまたは天然に生じるアミノ酸のポリペプチドが挙げられる）と必要に応じて連結される。
【０３４２】
本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドは、必要に応じて生合成的または非生合成的に産生される。生合成的に産出する方法とは、翻訳系（細胞の翻訳系または無細胞翻訳系）を利用した任意の方法（例としては、以下の構成要素：ポリヌクレオチド、コドン、ｔＲＮＡ、およびリボソームの少なくとも１つの使用が挙げられる）を意図している。非生合成的に産出する方法とは、翻訳系を利用しない任意の方法を意図しており、この方法は、固体ペプチド合成方法（solid state synthetic method）、固相ペプチド合成方法、少なくとも１つの酵素を利用する方法、および少なくとも１つの酵素を利用しない方法にさらに分類されてもよい。また、あらゆるこの小区分は重複していてもよく、かつ多くの方法はこれらの小区分の組み合わせを利用し得る。
【０３４３】
本明細書に記載の方法、組成物、方策、および技術は、特定の種類、分類またはファミリーのポリペプチドまたはタンパク質に限定されない。実際に、本明細書に記載の非天然アミノ酸を少なくとも１つ含むほとんどあらゆるポリペプチドが、本明細書に記載の組成物の範囲内に含まれる。単なる一例として、ポリペプチドは、必要に応じて以下から成る群より選択される治療タンパク質と相同である：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質（four-helical bundle protein）、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン（neurturin）、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン（paracitonin）、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン（pleiotropin）、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、試験ステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロン。関連する実施形態またはさらなる実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、必要に応じて成長ホルモンスーパーファミリーのあらゆるポリペプチドメンバーと相同である。
【０３４４】
非天然アミノ酸のポリペプチドは、本開示内容の他の場所に記載されているように、必要に応じてさらに修飾される。または、非天然アミノ酸のポリペプチドは、必要に応じてさらなる修飾なしでも使用される。非天然アミノ酸のポリペプチドへの組み込みは、必要に応じて、様々な目的（例としては、タンパク質構造および／または機能の変化の調整、大きさの変更、酸性度の変更、求核性の変更、水素結合の変更、疎水性の変更、プロテアーゼ標的部位の接触性の変更、部分（ポリペプチドアレイ用の部分が挙げられるが、これに限定されない）に対する標的化の変更などが挙げられるが、これらに限定されない）のためになされる。非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、増強された、もしくは全く新しい触媒性または生物物理学的性質をも有する。単なる一例として、以下の性質がポリペプチドの非天然アミノ酸の包含によって必要に応じて修飾される：毒性、体内分布、構造的性質、分光の性質、化学的および／または光化学的性質、触媒能、半減期（例としては、血清中半減期が挙げられるが、これに限定されない）、ならびに他の分子との共有結合的なまたは非共有結合的な（例として挙げられるが、これらに限定されない）反応性など。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを有する組成物は、新規の治療、診断、触媒酵素、工業的触媒、結合タンパク質（抗体が挙げられるが、これに限定されない）、ならびにタンパク質の構造および機能（例として挙げられるが、これに限定されない）の研究に有用である（例として挙げられるが、これらに限定されない）。例えば、「Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4:645-652」を参照のこと。
【０３４５】
さらに、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分の側鎖は、ポリペプチドに対して広範な付加的な官能基を提供する。限定されるようなものではなく単なる一例として、ポリペプチドの非天然アミノ酸部分の側鎖は、必要に応じて以下の何れかを含んでいる：標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団；金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分（photocaged moiety）；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギー伝達剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤（activated complex activator）、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せ。
【０３４６】
一態様において、組成物は、少なくとも１（例としては、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれ以上が挙げられるが、これらに限定されない）の非天然アミノ酸を有する少なくとも１つのポリペプチドを含んでいる。上記非天然アミノ酸は、必要に応じて同じあるか、または異なっている。また、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸または同じ非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の異なる場所が必要に応じて存在する。他の態様において、組成物は、非天然アミノ酸で置換されているポリペプチドに存在する少なくとも１つ（ただし、全てではない）の特定のアミノ酸を有するポリペプチドを含んでいる。２以上の非天然アミノ酸を有する所定のポリペプチドにおいて、当該非天然アミノ酸は同一でもよいし、異なっていてもよい（例えば、当該ポリペプチドは異なる２種類以上の非天然アミノ酸を含んでもよいし、２の同じ非天然アミノ酸を含んでもよいが、これに限定されない）。３以上の非天然アミノ酸を有する所定のポリペプチドにおいて、当該非天然アミノ酸は同じでもよいし、異なっていてもよいし、また、同種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１の異なる非天然アミノ酸とを組み合わせたものであってもよい。
【０３４７】
本明細書に記載されている非天然アミノ酸のポリペプチドの実施形態は、必要に応じて固相ペプチド合成方法を介して（例えば、固体樹脂上において）、液相ペプチド合成方法によって、および／または酵素の補助なしで、化学的に合成されるが、本明細書に記載されている非天然アミノ酸のポリペプチドの他の実施形態では、細胞膜、細胞抽出物、もしくはライセートの系を介した、またはインビボの系を介した（例えば、原核細胞または真核細胞の細胞機構を用いた）合成が可能である。さらなる実施形態または付加的な実施形態では、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドの重要な特徴の１つは、それらがリボソームを利用して合成されることである。本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドのさらなる実施形態または付加的な実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、次の方法の組み合わせによって合成される：固体樹脂の組み合わせによる方法、酵素の補助なしの方法、リボソームの補助を介した方法、および／またはインビボの系を介した方法（ただし、これらに限定されない）。
【０３４８】
リボソームおよび／またはインビボの系を介した非天然アミノ酸のポリペプチドの合成は、固体樹脂上または酵素の補助なしで合成された非天然アミノ酸のポリペプチドとは異なる利点および特性を有する。これらの利点または特性としては、不純物プロファイルの違いが含まれる。リボソームを利用した系および／またはインビボの系は、利用した生物系に由来する不純物（宿主細胞タンパク質、膜部分および脂質が挙げられるが、これらに限定されない）を有することに対し、固体樹脂を利用した系および／または酵素の補助がない系からの不純物プロファイルは、合成手法に使用された有機溶媒、保護基、樹脂材料、カップリング試薬および他の化学物質を含んでいる。さらに、リボソームおよび／またはインビボの系の使用を介して合成された非天然アミノ酸のポリペプチドの同位体の型は、細胞に利用される供給原料の同位体の型を正確に反映することに対し、固体樹脂上においておよび／または酵素の補助なしで合成された非天然アミノ酸のポリペプチドの同位体の型は、合成に使用されたアミノ酸の同位体の型を正確に反映する。さらに、リボソームおよび／またはインビボの系の使用を介して合成された非天然アミノ酸のポリペプチドは、一般的に、アミノ酸のＤ−異性体が実質的になく、および／またはポリペプチドの構造に内部システインアミノ酸を容易に組み込むことができ、および／または内部アミノ酸欠失ポリペプチドを提供することはまれである。これに対し、固体樹脂を介しておよび／または酵素の補助なしで合成された非天然アミノ酸のポリペプチドは、一般的に、アミノ酸のＤ−異性体の含有量が高く、および／または内部システインアミノ酸の含有量が低く、および／または内部アミノ酸欠失ポリペプチドを高い割合で有する。さらに、当業者は、リボソームおよび／またはインビボの系を使用して合成された非天然アミノ酸のポリペプチドと、固体樹脂を介しておよび／または酵素の補助なしで合成された非天然アミノ酸のポリペプチドとを区別することができる。
【０３４９】
＜ＶＩＩ．核酸およびオリゴヌクレオチドを含む組成物および方法＞
‐Ａ．本明細書における使用のための一般的な組み換え核酸に関する方法‐
本明細書に記載の方法および組成物の多くの実施形態では、興味のあるポリペプチド（単なる一例として、ＧＨポリペプチドが挙げられる）をコードする核酸は、単離され、クローニングされ、組み換え法を用いてしばしば変更される。このような実施形態は、例えば、特に限定されないが、タンパク質の発現のために、またはバリアント、誘導体、発現カセット、もしくはポリペプチドに由来する他の配列の生成時に使用される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする配列は、異種のプロモーターに発現可能に連結される。
【０３５０】
非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、例えば、親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて合成し、関連のあるアミノ酸残基を導入（例えば、組み込みまたは置換）または除去（例えば、欠失または置換）するために該ヌクレオチド配列を変更する。ヌクレオチド配列は従来の方法による部位特異的突然変異誘発法によって必要に応じて簡便に修飾される。また、ヌクレオチド配列は、必要に応じて化学合成によって調製される。このような化学合成としては、例えば特に限定されないが、オリゴヌクレオチド合成機を用いる化学合成が挙げられる。オリゴヌクレオチドは所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される。オリゴヌクレオチドの設計の際には、組換えポリペプチドが産生される宿主細胞に有利に働くコドンを選択することが好ましい。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さいオリゴヌクレオチドは、合成され、かつＰＣＲ、ライゲーションまたはライゲーション連鎖反応によって必要に応じて集められる。例えば、参照によって上記開示内容に援用される「Baranyら, Proc. Natl. Acad. Sci 88: 189-193 (1991)」；米国特許第６，５２１，４２７号明細書を参照のこと。
【０３５１】
本明細書に記載の非天然アミノ酸に関する方法および組成物は、組み換え遺伝学の分野で使用されている技術を利用する。本明細書に記載の非天然アミノ酸に関する方法および組成物に使用する一般的な方法を開示する基本的なテキストの例としては、「Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)」；「Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)」；および「Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら, eds., 1994)」が挙げられる。
【０３５２】
分子生物学的技術について説明するテキストの例としては、「Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzvmology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)」「Sambrookら, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.). Vol. 1-3. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (「Sambrook」)」、「Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら, eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) (「Ausubel」)」が挙げられる。これらのテキストは、突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター、および多くの他の関連する話題（例としては、非天然アミノ酸、直交なｔＲＮＡ、直交なシンテターゼ、およびこれらの対を含むタンパク質の産生のためのセレクターコドンを含む遺伝子またはポリヌクレオチドの生成が挙げられるが、これらに限定されない）について述べている。
【０３５３】
様々な種類の突然変異誘発法が、様々な目的（特に限定されないが、新規なシンテターゼまたはｔＲＮＡを産生するため、ｔＲＮＡ分子を突然変異させるため、シンテターゼをコードするポリヌクレオチドを突然変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを産生するため、シンテターゼのライブラリーを産生するため、セレクターコドンを産生するため、興味のあるタンパク質またはポリペプチドに非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを挿入するためが挙げられる。）のために、本明細書に記載の非天然アミノ酸に関する方法および組成物において使用される。突然変異誘導法の例としては、部位特異的突然変異誘発法、ランダム点突然変異誘発法、相同性組換え、ＤＮＡシャッフリングもしくは他の反復的な突然変異誘発法方法、キメラのコンストラクション、ウラシルを含む鋳型を用いた突然変異誘発法、オリゴヌクレオチドの定方向突然変異誘発法、ホスホロチオネートで修飾されたＤＮＡの突然変異誘発法、またはギャップドデュプレックスＤＮＡ（gapped duplex DNA）を用いた突然変異誘発法など、またはこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。さらに他の適切な方法の例としては、ポイントミスマッチ修復、修復欠損のある宿主株を用いた突然変異誘発法、制限選択および制限精製、欠失突然変異誘発法、全体の遺伝子合成を用いた突然変異誘発法、および二本鎖破壊修復などが挙げられる。また、キメラコンストラクションに関与する（例として挙げられるが、これに限定されない）突然変異誘発法も、本明細書に記載の非天然アミノ酸に関する方法および組成物に含まれる。一実施形態では、突然変異誘発法は、天然に生じる分子、または変更もしくは突然変異された天然に生じる分子の公知の情報（例としては、配列比較、物理的な性質、または結晶構造などが挙げられるが、これらに限定されない）によって誘導され得る。
【０３５４】
本明細書に挙げられるテキストおよび実施例を用いて、これらのおよびその他の関連する手法が説明されている。以下の出版物および参考文献において、付加的な情報が参照できる：「Lingら, Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2):157-178 (1997)」；「Daleら, Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996) 」；「Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462(1985)」；「Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985)」；「Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986)」;「Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J, eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)」；「Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)」；「Kunkelら, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)」；「Bassら, Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988)」；「Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)」；「Methods in Enzymol. 154：329-350 (1987)」；「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982)」；「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)」；「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987)」;「Taylorら, The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985)」；「Taylorら, The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985)」；「Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Net I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14:9679-9698 (1986)」；「Sayersら, 5’-3’ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988) 」;「Sayersら, Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814」；「Kramerら, The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984) 」;「Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987)」；「Kramerら, Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988) 」；「Fritzら, Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988) 」；「Kramerら, Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Carterら, Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) 」；「Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)」；「Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986) 」；「Wellsら, Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986)」；「Nambiarら, Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984)」；「Sakmar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunil of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988) 」；「Wellsら, Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985) 」；「Grundstroemら, Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun’ gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985) 」；「Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:7177-7181 (1986)」；「Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993)」；「Sieberら, Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001). W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994) 」および「I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995) 」。上述した多くの方法についての付加的な詳細は、「Methods in Enzymology Volume 154」（多様な突然変異誘発法方法における異常処理の問題に対する有用な制御についても説明している）で参照できる。
【０３５５】
また、本明細書に記載の方法および組成物は、直交なｔＲＮＡ／ＲＳ対を介した非天然アミノ酸のインビボにおける組み込みのための真核宿主細胞、非真核宿主細胞、および生物の使用を包含する。宿主細胞は、本明細書に記載のポリペプチドに対応するポリヌクレオチド、または本明細書に記載のポリペプチドに対応するポリヌクレオチドを含むコンストラクト（必要に応じて例えば、本明細書に記載のポリペプチドに対応するベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターである）が挙げられるが、これに限定されない）を用いて、遺伝子組み換えされる。上記遺伝子組換えの例としては、形質転換、形質導入またはトランスフェクトが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、直交な（orthogonal）ｔＲＮＡ、直交なｔＲＮＡシンテターゼ、および誘導体化されるタンパク質のコーディング領域は、所望の宿主細胞内で機能する遺伝子発現制御エレメントと動作可能に連結される。ベクターは、必要に応じて例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、または接合されたポリヌクレオチドの形態である。ベクターは、標準的な方法（例としては、エレクトロポレーション（「Frommら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)」）、ウイルスベクターによる感染、小さいビーズもしくは粒子の中または表面における核酸を用いた低分子による高速弾丸侵入（high velocity ballistic penetratrion）（「Kleinら, Nature 327.70-73 (1987)」）等）によって細胞および／または微生物に導入される。
【０３５６】
操作された宿主細胞は、スクリーニング段階、プロモーターの活性化、または形質転換体の選択といった活動に適するように修飾された、従来の培養液において必要に応じて培養される。また、これらの細胞は、必要に応じてトランスジェニック生物の中において培養される。（例えば、その後に核酸を単離するための）細胞の単離および培養などに関する他の有用な文献の例としては、「Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York」、およびこれらに引用されている参考文献「Payneら (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY」、「Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell. Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)」、ならびに「Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL」が挙げられる。
【０３５７】
標的の核酸を細胞に導入する様々な方法が利用可能であり、これらの方法のいずれも、本明細書に記載の方法および組成物に使用することができる。これら方法の例としては、ＤＮＡを含む細菌の原形質体と受容細胞の融合、エレクトロポレーション、粒子衝撃法（projectile bombardment）、およびウイルスベクターを用いた感染（以下にさらに詳しく述べる）などが挙げられる。細菌の細胞は、本明細書に記載のポリペプチドに対応するＤＮＡコンストラクトを含むプラスミドの数を増幅するために必要に応じて使用される。細菌は対数増殖期まで成長され、当該細菌内のプラスミドは様々な方法によって単離される（例えば、Sambrookを参照のこと）。また、細菌からプラスミドを精製するためのキットがたくさん市販されている（例えば、EasyPrep（登録商標）、FlexiPrep（登録商標）（いずれもPharmacia Biotechが提供している）；StrataClean（登録商標）（Stratageneが提供している）；およびQIAprep（登録商標）（Qiagenが提供している）を参照のこと）。単離および精製されたプラスミドは、他のプラスミドを産生するためにさらに操作されるか、細胞のトランスフェクトに使用されるか、または生体に感染させるために関連するベクターに組み込まれる。典型的なベクターは、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、転写開始配列および翻訳開始配列、ならびに特定の標的核酸の発現を制御するために有用なプロモーターを含んでいる。ベクターは、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物または原核生物またはその両方（例としては、シャトルベクターが挙げられるが、これに限定されない）においてカセットの複製を許容する配列、ならびに原核生物および真核細胞の両方の系にとっての選択マーカーを含む一般的な発現カセットを必要に応じて含んでいる。ベクターは、原核生物、真核生物、または好ましくはその両方における複製および組み込みに好適である。「Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979)」；「Robertsら, Nature. 328:731 (1987)」；「Schneider, E.ら, Protein Expr. Purif. 6(l)-10-14 (1995)」；（すべて上述した）「Ausubel」、「Sambrook」、「Berger」を参照のこと。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージの一覧表が、例えば、ＡＴＣＣによって公開されている（「The ATCC Catalogue of bacteria and bacteriophage (1992) Ghernaら (eds)、ATCC発行」）。また、配列決定、クローニング、ならびに分子生物学の他の態様、および基礎をなす理論的な考察のためのその他の基本的手法は、「Watsonら (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY」で参照できる。また、原則的にどの核酸（および標準的か非標準的かは問わず、ほぼほとんどの標識された核酸）も、様々な商業的供給源（例えば、the Midland Certified Reagent Company(Midland, TX mcrc.com)、The Great American Gene Company(Ramona、CA、ワールドワイドウェブのgenco.comで参照できる)、ExpressGen Inc.（Chicago,IL,ワールドワイドウェブのexpressgen.comで参照できる）、Operon Technologies Inc.（Alameda, CA）、その他多数）に特別注文または通常注文できる。
【０３５８】
‐Ｂ．セレクターコドン‐
本明細書に記載の方法および組成物に包含されるセレクターコドンは、タンパク質の生合成機構の遺伝学的なコドンの枠組みを拡張する。セレクターコドンの例としては、固有の３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えば、終止コドン（例としては、アンバーコドン（ＵＡＧ）、オパールコドン（ＵＧＡ）が挙げられるが、これらに限定されない））、非天然コドン、４塩基以上のコドン、またはレアコドン（rare codon）などが挙げられるが、これらに限定されない。所望の遺伝子またはポリヌクレオチドに必要に応じて導入されるセレクターコドンの数は広範である（例としては、所望のポリペプチドの少なくとも一部をコードする単一のポリヌクレオチドにおいて１以上、２以上、３以上、４、５、６、７、８、９、１０以上が挙げられるが、これらに限定されない）。
【０３５９】
一実施形態では、本方法は、インビボにおいて１つ以上の非天然アミノ酸を組み込むための終止コドンであるセレクターコドンの使用を含んでいる。例えば、終止コドン（例としては、ＵＡＧが挙げられるが、これに限定されない）を認識するＯ−ｔＲＮＡが産生され、当該Ｏ−ｔＲＮＡは所望の非天然アミノ酸でＯ−ＲＳによってアミノアシル化される。このＯ−ｔＲＮＡは、天然に生じる宿主のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによって認識されないものである。部位特異的な突然変異誘発法は、終止コドン（例としては、ＵＡＧが挙げられるが、これに限定されない）を、興味のあるポリペプチドにおける興味のある部位に導入するために必要に応じて使用される。例えば、「Sayers, J.R.,ら (1988), 5’,3’ Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 16:791-802」を参照のこと。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、ならびに興味のあるポリペプチドをコードする核酸がインビボにおいて組み合わせられると、非天然アミノ酸はＵＡＧコドンに応じて組み込まれ、その結果、所定の位置に非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドが生じる。
【０３６０】
インビボにおける非天然アミノ酸の組込みは、必要に応じて、真核宿主細胞を有意に乱すことなくなされる。例えば、ＵＡＧコドンに関する抑圧効率は、Ｏ−ｔＲＮＡと真核細胞の放出因子との間の競合に依存するので、抑圧効率は、必要に応じて例えば、特に限定されないがＯ−ｔＲＮＡおよび／またはサプレッサーｔＲＮＡの増加によって修飾される。なお、上記Ｏ−ｔＲＮＡとしては、アンバーサプレッサーｔＲＮＡが挙げられるが、これに限定されない。また、上記放出因子は、終止コドンと結合し、成長しているペプチドのリボソームからの放出を開始するものであり、例としては、ｅＲＦが挙げられるが、これに限定されない。
【０３６１】
また、セレクターコドンは、延長されたコドン（延長コドン）（４塩基以上のコドン（例えば、４塩基、５塩基、６塩基以上のコドン）が挙げられるが、これらに限定されない。）を含んでいる。４塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、およびＣＣＣＵなどが挙げられるが、これらに限定されない。５塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、およびＵＡＧＧＣなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法および組成物の特徴には、フレームシフト抑圧に基づく延長コドンの使用が含まれる。４塩基以上のコドンは、同じタンパク質に１つまたは複数の非天然アミノ酸（例として挙げられるが、これらに限定されない）を挿入することができる。例えば、アンチコドンループ（少なくとも８−１０ｎｔのアンチコドンループなど）を有する突然変異されたＯ−ｔＲＮＡ（特別なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡが挙げられるが、これに限定されない。）の存在下において、４塩基以上のコドンが単一のアミノ酸として読まれる。他の実施形態では、アンチコドンループは、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、または少なくとも６塩基コドン（例として挙げられるが、これらに限定されない。）以上を解読できる。２５６の４塩基コドンが可能なので、４塩基以上のコドンを用いて、複数の非天然アミノ酸を同じ細胞にコードできる。「Andersonら, (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology. 9:237-244」；「Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of ‘Shifty’ Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307:755-769」を参照のこと。
【０３６２】
例えば、４塩基コドンは、インビトロ生合成方法を用いたタンパク質への非天然アミノ酸の組み込みに使用されている。例えば、「Maら, (1993) Biochemistry. 32:7939-7945」、および「Hohsakaら, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:34-40」を参照のこと。ＣＧＧＧおよびＡＧＧＵは、化学的にアシル化された２つのフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて、インビトロにおいて、ストレプトアビジンに２−ナフチルアラニンおよびリジンＮＢＤ誘導体を同時に組み込むために使用された。例えば、「Hohsakaら, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:12194-12195」を参照のこと。Ｍｏｏｒらは、インビトロの研究にて、ＵＡＧＮコドンを抑圧するというＮＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕ誘導体の能力を調べた（Ｎは必要に応じてＵ、Ａ、ＧまたはＣである。）。そして、ＵＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕによって、４塩基のＵＡＧＡが、０または−１フレームにおける解読がほとんどなく、１３〜２６％の効率で解読され得ることを発見した。「Mooreら, (2000) J. Mol. Biol., 298:195-205」を参照のこと。一実施形態では、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づく延長コドンは、本明細書に記載の方法および組成物に必要に応じて使用される。これによれば、他の望ましくない部位におけるミスセンスのリードスルーと、フレームシフト抑圧とを減少することができる。
【０３６３】
また、所定の系に関して、内在性の系が天然塩基コドンを使用しない（または稀にしか使用しない）場合に、セレクターコドンは天然の３塩基コドンの１つを含むことができる。この例としては、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡが欠如している系、および／または３塩基コドンがレアコドンである系が挙げられる。
【０３６４】
セレクターコドンは、必要に応じて非天然塩基対を含んでいる。これらの非天然塩基対は、存在する遺伝アルファベットをさらに拡張する。塩基対を１つ追加することによって、３塩基コドンの数が６４から１２５まで増加する。第３の塩基対の性質の例としては、安定かつ選択的な塩基対形成、ポリメラーゼによる高い忠実度を伴ったＤＮＡへの効率的な酵素的組み込み、および新生の非天然塩基対の合成後における効率的な連続するプライマー伸張が挙げられる。本方法および本組成物に必要に応じて適合する非天然塩基対の記述の例としては、例えば、「Hiraoら, (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182」が挙げられ、かつまた、「Wu, Y.,ら(2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630」を参照のこと。他の関連する発行物は以下に載せられている。
【０３６５】
インビボにおける使用法に関して、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、かつリン酸化されて対応する３リン酸塩を形成する。また、増加した遺伝情報は安定であり、かつ細胞性の酵素によって破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒ他は、これまでの試みで、基準のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対（もっとも注目すべき例はイソ−Ｃ：イソ−Ｇ対である）における水素結合様式とは異なる水素結合様式を巧く活用した。例えば、「Switzerら, (1989) J. Am. Chem. Soc, 111:8322-8322」;「Piccirilliら, (1990) Nature, 343:33-37」；「Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602-608」を参照のこと。これらの塩基は、通常、ある程度に天然塩基と誤対合し、かつ酵素的に修復され得ない。Ｋｏｏｌおよび共同研究者は、塩基間の疎水性パッキング相互作用が水素結合と入れ替わって、塩基対の形成を生じることができることを証明した。例えば、「Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602-608」、および「Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36(24);2825-2828」を参照のこと。上述した条件のすべてを満たす非天然塩基対を開発する試みにおいて、Schultz、Romesbergおよび共同研究者は、一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、かつ研究している。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は、天然塩基対より安定であることが見出されており、かつEscherichia coliのＤＮＡポリメラーゼ  Ｉのクレノー断片（ＫＦ）によって、ＤＮＡに効率的に組み込まれ得る。例えば、「McMinnら, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:11585-11586」；および「Ogawaら, (2000) J. Am. Chem. Soc. 122:3274-3278」を参照のこと。３ＭＮ：３ＭＮ自己対は、生物学的機能に対して十分な効率性および選択性を伴って、ＫＦによって合成され得る。例えば、「Ogawaら, (2000) J Am. Chem. Soc, 122:8803-8804」を参照のこと。しかし、両方の塩基は、さらなる複製に対して鎖ターミネーターとして作用する。近年、ＰＩＣＳ自己対の複製に使用され得る突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが発展されている。また、７ＡＩ自己対は複製され得る。例えば、「Taeら, (2001) J. Am. Chem. Soc. 123:7439-7440」を参照のこと。また、Ｃｕ（ＩＩ）との結合によって安定な対を形成する新規な金属塩基対であるＤｉｐｉｃ：Ｐｙも開発されている。「Meggersら, (2000) J. Am. Chem. Soc 122:10714-10715」を参照のこと。延長コドンおよび非天然コドンは、天然コドンに対して本来的に直交であるので、本明細書に記載の非天然アミノ酸に関する方法は、この性質を活かして非天然アミノ酸用の直交なｔＲＮＡを生成し得る。
【０３６６】
また、翻訳回避系（translational bypassing system）が、所望のポリペプチドにおける非天然アミノ酸の組み込みに使用され得る。翻訳回避系において、大きな配列が遺伝子に組み込まれるが、この配列はタンパク質に翻訳されない。当該配列は、リボソームに当該配列を跳び越させ、かつ挿入部位の下流で翻訳を再開させる合図として機能する構造を含んでいる。
【０３６７】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法および／または組成物における興味のあるタンパク質またはポリペプチド（またはこれらの一部）は、核酸によってコードされている。通常、核酸は、少なくとも１のセレクターコドン、少なくとも２のセレクターコドン、少なくとも３のセレクターコドン、少なくとも４のセレクターコドン、少なくとも５のセレクターコドン、少なくとも６のセレクターコドン、少なくとも７のセレクターコドン、少なくとも８のセレクターコドン、少なくとも９のセレクターコドン、１０以上のセレクターコドンを含んでいる。
【０３６８】
興味のあるタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば、非天然アミノ酸を組み込むためのセレクターコドンを１以上含めるために、当業者に公知の方法、および本明細書の「突然変異誘発法および他の分子生物学技術」の項目に記載されている方法を用いて、必要に応じて突然変異誘発される。例えば、興味のあるタンパク質に関する核酸は、１以上のセレクターコドンを含むように突然変異誘発され、その結果、１以上の非天然アミノ酸の組み込みを提供する。本明細書に記載の方法および組成物は、任意の変形（例としては、例えば、少なくとも１の非天然アミノ酸を含む任意のタンパク質の突然変異体型が挙げられるが、これらに限定されない）を包含する。同様に、本明細書に記載の方法および組成物は、対応する核酸（すなわち、１以上の非天然アミノ酸のインビボにおける組み込みをコードする、または可能にする１以上のセレクターコドンを有する核酸）を包含する。
【０３６９】
興味のあるポリペプチド（単なる一例として、ＧＨポリペプチドが挙げられる）をコードする核酸分子は、ポリペプチドの任意の所望の位置にシステインを導入するために容易に突然変異される。システインは、反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質、または多種多様な他の分子を、興味のあるタンパク質に導入するために、広く使用される。ポリペプチドの所望の位置にシステインを組み込むのに好適な方法としては、参照によって本明細書に援用される米国特許第６，６０８，１８３号明細書に記載の方法およびその他の突然変異誘発技術が含まれる。このようなシステインを導入する技術および利用する技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を導入する技術および利用する技術と必要に応じて併用される。
【０３７０】
＜ＶＩＩＩ．非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドのインビボにおける生成＞
便宜上、この項に記載された非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドのインビボにおける生成は、一般的に、および／または特定の例について記載されている。しかし、この項に記載された非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドのインビボにおける生成は、一般的な記載、またはこの項で提供された特定の例に限るべきではなく、むしろ、この項に記載された非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドのインビボにおける生成は、本発明の明細書、特許請求の範囲、および図面に記載された一般式Ｉ〜ＸＩで示される化合物、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩで示される化合物および化合物１〜６の範囲に含まれるすべての化合物（一般式Ｉ〜ＸＩで示される化合物、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩで示される化合物および化合物１〜６の範囲に含まれるすべての下位の一般式で示される化合物または特定の化合物を含む。）に等しくに適用される。
【０３７１】
本明細書に記載されているポリペプチドは、天然に生じる系にコードされないアミノ酸を追加または置換する、修飾されたｔＲＮＡおよび修飾されたｔＲＮＡシンテターゼを用いて、インビボにおいて必要に応じて生成される。
【０３７２】
天然に生じる系においてコードされないアミノ酸を使用するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡ合成酵素を生成するための方法は、例えば引用によって組み入れられる米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（シリアル番号１０／１２６，９２７）および第２００３／０１０８８８５号（シリアル番号１０／１２６，９３１）明細書に記載されている。これらの方法は、翻訳の系に対して内在性の合成酵素、および内在性のｔＲＮＡと独立して機能する翻訳機構を生み出すことを含む（従って時々「直交な」として表される）。一実施形態では、翻訳系はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、対応するＤＮＡから転写されたｍＲＮＡか、またはＲＮＡウイルスベクターから必要に応じて生じるｍＲＮＡであり得る。さらに、ポリヌクレオチドは、非天然アミノ酸のために予め設計された組み込み部位に関連するセレクターコドンを含む。翻訳系は、非天然アミノ酸を好適に含むときもｔＲＮＡをさらに含む。ここで、ｔＲＮＡは、前述のセレクターコドンに特有であり／前述のセレクターコドンを特に認識する。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸はアミノアシル化されている。非天然アミノ酸は、本明細書に記載の一般式Ｉ〜ＸＩ、および一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩ、ならびに化合物１〜６のうちのいずれか１つの構造を有するそれらを含む。さらなる、または付加的な実施形態において、翻訳系は、ｔＲＮＡに対して特異的なアミノアシル合成酵素を含む。また、他のさらなる実施形態では、翻訳系は、直交なｔＲＮＡ、および直交なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を含む。さらなる、または付加的な実施形態において、翻訳系は、前述のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡの形態など）を含むプラスミド、前述のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡの形態など）を含むゲノムＤＮＡ、または前述のポリヌクレオチドを組み入れたゲノムＤＮＡ（さらなる実施形態では、組み入れは安定した組み入れである）の少なくとも１つを含む。翻訳系のさらなる付加的な実施形態において、セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然のコドン、５塩基コドン、および４塩基コドンから成る群より選択される。さらなる付加的な実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドはリボソームによって合成される。
【０３７３】
さらなるまたは付加的な実施形態では、翻訳系は、直交なｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含んでいる。典型的に、Ｏ−ＲＳは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを、翻訳系において好ましくアミノアシル化し、かつＯ−ｔＲＮＡは、当該系において他のｔＲＮＡによって認識されない少なくとも１つのセレクターコドンを認識する。従って、翻訳系は、当該系において産生されるポリペプチドに非天然アミノ酸を、コードされるセレクターコドンに応じて挿入して、コードされるポリペプチドにおける位置にアミノ酸を「置換する」。
【０３７４】
広範な直交なｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、ポリペプチドに特定の合成アミノ酸を挿入することについて、当該技術分野において説明されており、かつ一般的に本明細書に記載されている非天然アミノ酸のポリペプチドを産生する、本明細書に記載されている方法に好適である。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、「Wang, L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(1):56-61 (2003) 」、および「Zhang, Z.ら, Biochem. 42(22):6735-6746 (2003)」に記載されている。例示的なＯ−ＲＳまたはこれらの一部は、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書（それぞれ、参照によって本明細書に援用される。）に開示されている、ポリヌクレオチド配列にコードされており、かつアミノ酸配列を含む。また、Ｏ−ＲＳとともに使用するための対応するＯ−ｔＲＮＡ分子は、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（シリアル番号１０／１２６，９２７）および第２００３／０１０８８８５号（シリアル番号１０／１２６，９３１）明細書に記載されている。その上に、その全体が参照することによって援用される「Mehlら in J. Am. Chem. Soc. 2003; 125:935-939」、および「Santoroら Nature Biotechnology 2002 Oct; 20:1044-1048」には、ポリペプチドへのｐ−アミノフェニルアラニンの組み込みのための、スクリーニング方法、およびアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、およびｔＲＮＡ分子について議論している。
【０３７５】
本明細書に記載されている方法に使用する、例示的なＯ−ｔＲＮＡの例としては、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９３１）に開示されているような配列番号１−３のヌクレオチド配列が挙げられる。特定の非天然アミノ酸に対して特異的な、例示的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮシンテターゼ対は、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９２７）に記載されている。S.cerevisiaeにおいてケト含有アミノ酸およびアジド含有アミノ酸の両方を組み込む、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡは「Chin, J. W.ら, Science 301: 964-967 (2003) 」に記載されている。
【０３７６】
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの使用は、非天然アミノ酸をコードする特定のコドンの選択に関与する。あらゆるコドンが使用され得るが、一般的にＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが発現されている細胞においてまれにしか使用されないか、または決して使用されないコドンを選択することが好ましい。例えば、例示的なコドンとしては、ナンセンスコドン（例えば、終止コドン（アンバー、オーカー、およびオパール）、４塩基コドンまたは５塩基コドン、ならびにまれにしか使用されないか、または使用されない他の天然の３塩基コドン）が挙げられる。
【０３７７】
特定のセレクターコドンは、当該分野に公知の突然変異誘発法（例としては、部位特異的突然変異誘発法、カセット突然変異誘発法、制限選択突然変異誘発法などが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、配列をコードするポリヌクレオチドにおける適切な位置に組み込まれ得る。
【０３７８】
非天然アミノ酸の組み込みに用いることができる、タンパク質生合成機構の構成要素（Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、および直交なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対など）を生成する方法は、「Wang, L.ら, Science 292: 498-500 (2001)」、「Chin, J. W.ら, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002)」、および「Zhang, Z.ら, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)」に記載されている。非天然アミノ酸をインビボにおいて組み込むための方法と組成物とは、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書（シリアル番号１０／１２６，９２７）に記載されている（なお上記特許文献は、参照によって本明細書に援用される）。また、生物のインビボでの翻訳系に使用される直交なｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼの対を選択する方法も、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（シリアル番号１０／１２６，９２７）および第２００３／０１０８８８５号（シリアル番号１０／１２６，９３１）明細書に記載されている。その上に、その全体が参照によって本明細書に援用される、「Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into proteins」と題された国際公開第０４／０３５７４３号パンフレットには、ケトアミノ酸の組み込み用の直交なＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載されている。参照によって本明細書に援用される、「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」と題された国際公開第０４／０９４５９３号パンフレットには、真核宿主細胞における非天然にコードされたアミノ酸の組み込み用の直交なＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載されている。
【０３７９】
少なくとも１つの組み換え直交なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を製造する方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを生成する工程、（ｂ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、直交なｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーについて、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを選択（および／またはスクリーニング）して、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールを提供する工程、および／または（ｃ）非天然にコードされたアミノ酸の非存在下において、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性型ＲＳ（ＲＳの突然変異体の活性型など）のプールを選択して、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを提供する工程を含んでおり、上記少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳは、非天然にコードされたアミノ酸を用いてＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する、方法である。上記第１生物は、例えば、原核生物（Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, またはT. thermophilusなど）、あるいは、真核生物である。上記（ｃ）工程では、必要に応じて、陰性選択によって、活性型ＲＳ（ＲＳの突然変異体の活性型など）のプールを選択してもよい。
【０３８０】
一実施形態では、ＲＳは、不活性型ＲＳである。活性型ＲＳを突然変異させることによって、不活性型ＲＳを生成することができる。例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、または少なくとも１０、あるいはそれ以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸（アラニンなど）に突然変異させることによって、不活性型ＲＳを生成することができる。
【０３８１】
技術的に公知の様々な技術を用いて、ＲＳの突然変異体のライブラリーを生成することができる。そのような技術として、例えば、ＲＳについてのタンパク質の３次元構造に基づく合理的設計、または無作為的技術もしくは合理的設計技術におけるＲＳヌクレオチドの突然変異誘発法が挙げられる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ランダム突然変異誘発法、多様性を生成する組み換え突然変異誘発法、キメラコンストラクト、合理的設計、および本明細書に記載の方法によって、ＲＳの突然変異体を生成することができる。
【０３８２】
一実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、活性型メンバー（例えば、直交なｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性型メンバー）について、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを選択（および／またはスクリーニング）する工程は、（ｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陽性選択マーカーまたはスクリーニングマーカーと、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーとを複数の細胞へ導入する段階、（ｉｉ）選択剤の存在下において、複数の細胞を成長させる段階、ならびに（ｉｉｉ）選択剤および／またはスクリーニング剤の存在下において、陽性選択マーカーまたはスクリーニングマーカーにおける少なくとも１つのセレクターコドンを抑圧することによって、生存する（または特定の反応を示す）細胞を同定して、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールを含んでいる陽性選択された細胞の一部（ｓｕｂｓｅｔ）を提供する段階を含んでいる。上記陽性選択マーカーおよび／またはスクリーニングマーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子である。上記セレクターコドンは、例えば、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然コドン、５塩基コドンおよび４塩基コドンである。また、必要に応じて、選択剤および／またはスクリーニング剤の濃度を、変更することができる。
【０３８３】
一態様では、陽性選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、セレクターコドンは、該ＣＡＴ遺伝子におけるアンバー終止コドンである。必要に応じて、陽性選択マーカーは、β−ラクタマーゼ遺伝子であり、セレクターコドンは、該β−ラクタマーゼ遺伝子におけるアンバー終止コドンである。別の態様では、陽性スクリーニングマーカーとしては、蛍光スクリーニングマーカー、発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカー（細胞表面マーカーなど）が挙げられる。
【０３８４】
一実施形態では、非天然アミノ酸の非存在下において、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）について、上記プールを陰性選択またはスクリーニングする工程は、（ｉ）陽性選択またはスクリーニングからの活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールと一緒に、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陰性選択マーカーまたはスクリーニングマーカーを、第２生物の複数の細胞に導入する段階、ならびに（ｉｉ）非天然アミノ酸とスクリーニング剤または選択剤とが補充された第１培養基では、生存するか、もしくは特定のスクリーニング反応を示すが、非天然アミノ酸と選択剤またはスクリーニング剤とが補充されていない第２培養基では、生存しないか、もしくは特定のスクリーニング反応を示さない、細胞を同定して、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを有する生存細胞またはスクリーニングされた細胞を提供する段階を含んでいる。上記陰性選択マーカーおよび／またはスクリーニングマーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子など）である。例えば、ＣＡＴ同定のプロトコールは、必要に応じて、適切なＯ−ＲＳ組換え体の決定における陽性選択および／または陰性スクリーニングとしての役割を果たす。例えば、必要に応じて、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいるＣＡＴを含み、かつ１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいる成長プレート上か、または１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいない成長プレート上のどちらかにおいて、クローンのプールは複製される。したがって、非天然アミノ酸を含んでいるプレートにおいて、排他的に成長するコロニーは、組換えＯ−ＲＳを含んでいると見なされる。一態様では、選択（および／またはスクリーニング）剤の濃度は、変更される。いくつかの態様では、第１生物と第２生物とは、異なっている。よって、第１生物および／または第２生物は、原核生物、真核生物、哺乳類、Escherichia coli、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などを、必要に応じて含んでいる。他の実施形態では、スクリーニングマーカーとしては、蛍光スクリーニングマーカー、発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカーが挙げられる。
【０３８５】
別の実施形態では、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）について、プールをスクリーニングまたは選択する工程（陰性選択する工程など）は、（ｉ）陽性選択の工程（ｂ）からの、ＲＳの突然変異体の活性型のプールを単離する段階、（ｉｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陰性選択マーカーまたはスクリーニングマーカーと、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールとを、第２生物の複数の細胞へ導入する段階、ならびに（ｉｉｉ）非天然アミノ酸が補充されていない第一培養基では、生存するか、もしくは特定のスクリーニング反応を示すが、上記非天然アミノ酸が補充されている第二培養基では、生存しないか、もしくは特定のスクリーニング反応を示さない細胞を同定して、上記非天然アミノ酸に特異的な組換えＯ−ＲＳを少なくとも１つ有する生存細胞またはスクリーニングされた細胞を提供する段階を含んでいる。上記少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陰性選択またはスクリーニングマーカーは、例えば、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる毒性マーカー遺伝子（リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子など）である。一態様では、少なくとも１つのセレクターコドンは、約２つ以上のセレクターコドンを含んでいる。そのような実施形態は、必要に応じて、少なくとも１つのセレクターコドンが２つ以上のセレクターコドンを含んでおり、第１生物と第２生物とが異なっているということを含んでいてもよい。第１生物と第２生物とは、それぞれ、原核生物、真核生物、哺乳類、Escherichia coli、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などを、必要に応じて含んでいる。また、いくつかの態様では、陰性選択マーカーは、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子（該遺伝子は少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる）を含んでいる。他の態様では、スクリーニングマーカーとしては、必要に応じて蛍光スクリーニングマーカー、発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカーが挙げられる。本明細書における実施形態では、スクリーニングおよび／または選択は、必要に応じて、スクリーニングおよび／または選択のストリンジェンシーが変更されることを含んでいる。
【０３８６】
別の実施形態では、少なくとも１つの組み換え直交なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を製造する方法は、（ｄ）少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを単離する工程、（ｅ）少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳに由来するＯ−ＲＳ（必要に応じてＯ−ＲＳの突然変異体）の第２組を生成する工程、ならびに（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する能力を含んでいるＯ−ＲＳの突然変異体が得られるまで、上記（ｂ）工程と（ｃ）工程とを繰り返す工程を、さらに含んでいてもよい。必要に応じて、（ｄ）工程〜（ｆ）工程は、繰り返される（例えば少なくとも約２回）。一態様では、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳに由来するＯ−ＲＳの突然変異体の第２組は、突然変異誘発法によって生成されてもよい。該突然変異誘発法としては、例えば、ランダム突然変異誘発法、部位特異的突然変異誘発法、組換え、またはそれらの組合せが挙げられる。
【０３８７】
上記方法における、陽性選択／スクリーニングの（ｂ）工程、陰性選択／スクリーニングの（ｃ）工程、または陽性および陰性選択／スクリーニングの（ｂ）工程と（ｃ）工程との両方などを含んでいる選択／スクリーニング工程のストリンジェンシーは、必要に応じて、選択／スクリーニングのストリンジェンシーを変更する段階を含んでいる。別の実施形態では、陽性選択／スクリーニングの（ｂ）工程、陰性選択／スクリーニングの（ｃ）工程、または陽性および陰性選択／スクリーニングの（ｂ）工程と（ｃ）工程との両方は、レポーターを使用する段階を含んでおり、該レポーターは、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって検出されるか、または発光によって検出されるものである。必要に応じて、上記レポーターは、ファージディスプレイ、または細胞表面などに提示される。また、上記レポーターは、非天然アミノ酸またはその類似体に関する親和性または触媒活性に基づいて選択される。一実施形態では、シンテターゼの突然変異体は、ファージディスプレイ、または細胞表面に提示される。
【０３８８】
組み換え直交なｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を製造する方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡ（サプレッサーｔＲＮＡなど）に由来するｔＲＮＡの突然変異体のライブラリーを生成する工程、（ｂ）第１生物からのＲＳの非存在下において、第２生物からのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によって、アミノアシル化されるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、上記ライブラリーをスクリーニングまたは選択（陰性選択など）して、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを提供する工程、ならびに（ｃ）導入された直交なＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを提供する工程を含んでおり、上記少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識するとともに、第２生物からのＲＳによって効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳによって優先的にアミノアシル化される、方法である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡであり、ならびに／あるいは、天然のユニークな３塩基コドン、および／もしくは非天然塩基を含んでいるか、またはナンセンスコドン、レアコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基を含んでいるコドン、アンバーコドン、オーカーコドン、もしくはオパール終止コドンである。一実施形態では、組換えＯ−ｔＲＮＡの直交性は、改善されている。いくつかの実施形態では、Ｏ−ｔＲＮＡが、修飾の必要なく、第２生物から第１生物へ必要に応じて移入されることが好ましい。様々な実施形態では、第１生物と第２生物とは、同じであるか、異なっている。さらに、第１生物と第２生物とは、必要に応じて、原核生物（Methanococcus jannaschii, Methanobacteium thermoautotrophicum, Escherichia coli, Halobacteriumなど）、真核生物、哺乳類、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などから選択される。さらに、組み換えｔＲＮＡは、必要に応じて、非天然アミノ酸によってアミノアシル化されるものであり、該非天然アミノ酸は、天然にまたは遺伝子操作によって、インビボにおいて生合成されるものである。非天然アミノ酸は、少なくとも第１生物または第２生物の成長培養基に、必要に応じて加えられる。
【０３８９】
一態様では、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによってアミノアシル化される、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、上記ライブラリーをスクリーニングまたは選択（陰性選択など）する工程（（ｂ）工程）は、（ｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる毒性マーカー遺伝子と、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のライブラリーとを、第２生物からの複数の細胞へ導入する段階、ならびに（ｉｉ）少なくとも１つの直交なｔＲＮＡまたは非機能的なｔＲＮＡを含んでいるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを含有している生存細胞を選択する段階を含んでいる。また、上記毒性マーカー遺伝子の代わりに、毒物もしくは静止剤の産生を引き起こす遺伝子、または生物にとって必須の遺伝子を用いてもよい（ただし、これらマーカー遺伝子は、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる）。例えば、細胞密度比の比較アッセイを用いて、生存細胞を選択することができる。
【０３９０】
別の態様では、毒性マーカー遺伝子は、２つ以上のセレクターコドンを含んでいてもよい。上記方法の別の実施形態では、毒性マーカー遺伝子は、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子であり、該リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子は、少なくとも１つのアンバーコドンを含んでいる。必要に応じて、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子は、２つ以上のアンバーコドンを含んでいてもよい。
【０３９１】
一実施形態では、導入された直交なＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によって、アミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングする工程は、Ｏ−ＲＳと一緒に陽性選択またはスクリーニングマーカー遺伝子と、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールとを、第２細胞からの複数の細胞へ導入する段階、ならびに抗生物質などの選択剤またはスクリーニング剤の存在下において成長した生存細胞、またはスクリーニングされた細胞を同定して、少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡを有する細胞のプールを提供する段階を含んでいてもよい。前述の少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡは、Ｏ−ＲＳによってアミノアシル化され、かつ陽性マーカー遺伝子によってコードされた翻訳産物へ、少なくとも１つのセレクターコドンに応じて、アミノ酸を挿入する。上記陽性選択マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、生物に必須の遺伝子、または毒物の解毒を導く遺伝子を含んでいる。上記薬剤耐性遺伝子としては、例えば、少なくとも１つのセレクターコドン（少なくとも１つのアンバー終止コドンなど）を含んでいるβ−ラクタマーゼ遺伝子が挙げられる。別の実施形態では、選択剤および／またはスクリーニング剤の濃度が変更される。
【０３９２】
特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対を生成する方法が提供される。該方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡに由来するｔＲＮＡの突然変異体のライブラリーを生成する工程、（ｂ）第１生物からＲＳの非存在下において、第２生物からのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によって、アミノアシル化されるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、上記ライブラリーを陰性選択またはスクリーニングして、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを提供する工程、ならびに（ｃ）導入された直交なＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを提供する工程を含んでいる。少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第２生物からのＲＳによって効率的に認識されず、そして、Ｏ−ＲＳによって優先的にアミノアシル化される。また、上記方法は、（ｄ）第３生物からの少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを生成する工程、（ｅ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーについて、ＲＳの突然変異体のライブラリーを選択またはスクリーニングして、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールを提供する工程、ならびに（ｆ）非天然アミノ酸の非存在下において、少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）について、上記プールを陰性選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対を提供する工程を含んでおり、上記少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対は、非天然アミノ酸に対して少なくとも１つの特異的な組換えＯ−ＲＳと、少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡとを含んでいる、方法である。本方法によって製造される特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対が含まれる。特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対には、例えば、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳの対（ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳの対など）、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳの対、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳの対、またはｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳの対などが含まれる。さらに、上記方法は、第１生物および第３生物が、同じであること（例えばMethanococcus jannaschiiであること）を含んでいる。
【０３９３】
また、本明細書に記載の方法には、第２生物のインビボの翻訳系に使用するための直交なｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼの対を選択する方法が含まれる。この方法は、第１生物から単離されたか、または第１生物に由来するマーカー遺伝子と、ｔＲＮＡと、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）とを、第２生物からの細胞の第１組に導入する工程、上記マーカー遺伝子とｔＲＮＡとを、第２生物からの複製した細胞の組に導入する工程、ならびに上記複製した細胞の組では生存できないが、上記第１組では生存する細胞について選択するか、上記複製した細胞の組では特定のスクリーニング反応を示さないが、上記第１組では特定のスクリーニング反応を示す細胞をスクリーニングする工程を含んでおり、上記第１組と複製した細胞の組とは、選択剤またはスクリーニング剤の存在下において成長させられ、生存細胞またはスクリーニングされた細胞は、第２生物のインビボの翻訳系に使用するための直交なｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼの対を含んでいる、方法である。一実施形態では、比較および選択またはスクリーニングする工程は、インビボでの相補性試験（complementation assay）を含んでいる。選択剤またはスクリーニング剤の濃度は、変更可能である。
【０３９４】
本明細書に記載の生物は、様々な生物および様々な組み合わせを含んでいる。一実施形態では、上記生物は、必要に応じて、原核生物である。該原核生物としては、例えば、Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, またはT. thermophilusなどが挙げられる。代わりに、上記生物は、必要に応じて真核生物を含んでいる。該真核生物としては、例えば、植物（例えば、単子葉植物または双子葉植物などの複雑な生物）、藻類、原生生物、菌類（酵母など）、または動物（例えば哺乳類、昆虫、節足動物）などが挙げられる。
【０３９５】
‐Ａ．非真核生物および真核生物における発現‐
この項に開示される技術は、本明細書に記載される非天然アミノ酸のポリペプチドの非真核生物および真核生物における発現に対して適用され得る。
【０３９６】
クローン化されたポリヌクレオチドの高水準な発現量を得るために、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写を導く強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、さらにタンパク質をコードする核酸用であれば、翻訳開始に関するリボソーム結合部位を含んでいる、発現ベクターにサブクローニングする。適切な細菌性プロモーターは、例えば「Sambrookら」および「Ausubelら」に記載されている。
【０３９７】
ポリペプチド発現のための細菌性発現系は、例えば、E.coli、Bacillus sp. 、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putida、およびSalmonellaにおいて利用できる(「Palvaら Gene 22:229-235(1983)」、「Mosbachら Nature 302:543-545(1983)」)。当該発現系のためのキットは市販されている。哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系も同様に市販されている。直交なｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（本明細書の別の項に記載される）がポリペプチドを発現するために利用される場合、発現のための宿主細胞は、該宿主細胞の直交型の構成要素を使用する能力に基づいて選択される。典型的な宿主細胞としては、グラム陽性細菌（B. brevisまたはB. subtilis、もしくはStreptomycesが挙げられるが、これらに限定されない）、およびグラム陰性細菌（E.coli、またはPseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putidaが挙げられるが、これらに限定されない）、ならびに酵母およびその他の真核細胞が挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含んでいる細胞は、本明細書に記載されているように用いることができる。
【０３９８】
本明細書に記載されているように真核宿主細胞または非真核宿主細胞は、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを、有用かつ大量に合成する能力を提供する。ある態様において組成物は、例えば少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム、またはそれ以上の非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを任意に含有しているか、あるいはインビボにおけるポリペプチド製造方法（組換えタンパク質の製造および精製の詳細については本明細書において提供する）によって得られる量を含有している。別の態様において、タンパク質は、例えば、特に限定されないが、細胞ライセート、緩衝液、薬理学的な緩衝液、またはその他の液体懸濁液（特に限定されないが、約１ｎｌから約１００Ｌまで、またはそれ以上のどの量も含む）中に、特に限定されないが、少なくとも１０μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも５０μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも７５μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも１００μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも２００μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも２５０μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも５００μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも１ｍｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも１０ｍｇ／Ｌまたはそれ以上の濃度で、組成物に任意に存在する。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる真核細胞において、タンパク質の大量生産（例えば、インビトロにおける翻訳のような、その他の方法によって一般的に生産される量よりも多い量）は、本明細書に記載される方法、技術、および組成物の特徴である。
【０３９９】
本明細書に記載されているような真核宿主細胞または非真核宿主細胞は、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質を、有用かつ大量に生合成する能力を提供する。例えば、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、特に限定されないが、細胞抽出物、細胞ライセート、細胞培地、および／または緩衝液などにおいて、少なくとも約１０μｇ／Ｌ、少なくとも約５０μｇ／Ｌ、少なくとも約７５μｇ／Ｌ、少なくとも約１００μｇ／Ｌ、少なくとも約２００μｇ／Ｌ、少なくとも約２５０μｇ／Ｌ、少なくとも約５００μｇ／Ｌ、少なくとも約１ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６ｍｇ／Ｌ、少なくとも約７ｍｇ／Ｌ、少なくとも約８ｍｇ／Ｌ、少なくとも約９ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００ｍｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、またはそれ以上のポリペプチド濃度で製造することができる。
【０４００】
１．発現系、培養、および単離
この項に開示される技術は、本明細書に記載される非天然アミノ酸のポリペプチドの発現系、培養、および単離に適用できる。非天然アミノ酸のポリペプチドは、いくつかの適切な発現系において発現されればよい。そのような発現系としては、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞、および細菌が挙げられるが、これらに限定されない。主な発現系の詳細については、本明細書において提供する。
【０４０１】
（酵母）
本明細書で用いられる用語「酵母」は、非天然アミノ酸のポリペプチドをコードする遺伝子を発現する能力がある種々の酵母を含むことを意図している。当該酵母としては、例えば、ascosporogenous酵母（Endomycetales）、basidiosporogenous酵母、およびFungi imperfecti （Blastomycetes）の群に属する酵母が挙げられる。ascosporogenous酵母は、SpermophthoraceaeおよびSaccharomycetaceaeという２つのファミリーに分けられる。後者は４つのサブファミリーから成っており、Schizosaccharomycoideae （例えば、Schizosaccharomyces属）、Nadsonioideae、Lipomycoideae、およびSaccharomycoideae（例えば、Pichia属、Kluyveromyces属、およびSaccharomyces属）である。basidiosporogenous酵母としては、Leucosporidium属、Rhodosporidium属、Sporidiobolus属、Filobasidium属、およびFilobasidiella属を含む。Fungi imperfecti（Blastomycetes）の群に属する酵母としては、Sporobolomycetaceae（例えば、Sporobolomyces属およびBullera属）、ならびにCryptococcaceae（例えば、Candida属）という２つのファミリーに分けられる。
【０４０２】
いくつかの実施形態では、Pichia属、Kluyveromyces属、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Hansenula属、Torulopsis属、およびCandida属内の種としては、特に限定されないが、P. pastoris、P. guillerimondii、S. cerevisiae、S. carlsbergensis、S. diastaticus、S. douglasii、S. kluyveri、S, norbensis、S. oviformis、K. lactis、K. fragilis、C. albicans、C. maltosa、およびH. polymorphaが挙げられる。これらは、本明細書に記載される方法、技術、および組成物に用いられる。
【０４０３】
発現のための酵母宿主を選択するとき、適切な宿主としては、例えば、良好な分泌能、低いタンパク質分解活性、および総合的な強健さが認められるものであればよい。酵母は、一般的に様々な供給源から入手可能であり、例えば、Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics University of California (Berkeley, CA)、およびThe American Type Culture Collection(「ATCC」)(Manassas,VA) などから入手できる。
【０４０４】
用語「酵母宿主」または「酵母宿主細胞」は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡの受容体として使用し得るか、または使用されている酵母を含む。この用語は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡを受け容れている、元々の酵母宿主細胞の子孫を含んでいる。１つの親細胞の子孫は、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの相補体において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致しなくてもよいことを理解されたい。関連する性質（例えば、非天然アミノ酸のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）によって特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義に基づいて意図される子孫に含まれる。
【０４０５】
発現ベクターおよび形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターなど）は、多くの酵母宿主中への形質転換するために開発された。例えば、発現ベクターは、S.cerevisiae（「Sikorskiら, Genetics(1998)122:19」、「Itoら, J. Bacteriol. (1983) 153:163」、「Hinnenら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:1929」）、C.albicans（「Kurtzら, Mol.Cell.Biol.(1986)6:142」）、C.maltosa（「Kunzeら, J.Basic Microbiol.(1985)25:141」）、H.polymorpha（「Gleesonら, J.Gen.Microbiok. (1986)132:3459」、「Roggenkampら, Mol.Gen.Genet. (1986)202:302」）、K.fragilis（「Dasら, J.Bacteriol. (1984)158:1165」）、K.lactis（「De Louvencourtら, J.Bacteriol(1983)154:737」、「Van den Bergら, Bio/Technology(1990)8:135」）、P.guillerimondii（「Kunzeら, J.Basic Microbiol.(1985)25:141」）、P.pastoris（米国特許出願第５，３２４，６３９号明細書、米国特許出願第４，９２９，５５５号明細書、および米国特許出願第４，８３７，１４８号明細書、「Creggら, Mol.Cell.Biol. (1985)5:3376」）、Schizosaccharomyces pombe(「Beachら,Nature(1981)300:706」)、Y.lipolytica（「Davidowら., Curr.Genet. (1985)10:380 (1985)」、「Gaillardinら.,Curr. Genet. (1985)10:49」）、A.nidulans（「Ballanceら, Biochem.Biophy.Res.Commum. (1983)112:284-89」、「TiburnらGene(1983)26:205-221」、および「YeltonらProc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:1470-74」）、A.niger（Kelly and Hynes,EMBO J. (1985)4:475-479)、T.reesia（欧州特許出願公開第０２４４２３４号明細書）、および糸状菌（例えば、Neurospora、Penicillium、Tolypocladium（国際公開第９１／００３５７号パンフレット）など）に対して開発された。なお、各文献は引用によって本明細書に援用される。
【０４０６】
酵母ベクターの制御配列は、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州特許出願公開第０２８４０４４号明細書）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許出願公開第０３２９２０３号明細書）などの遺伝子から得られるプロモーター領域が挙げられるが、これに限定されない。また、酸性ホスファターゼをコードしている酵母のＰＨＯ５遺伝子は、有用なプロモーター配列を提供し得る（「Miyanoharaら,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1983)80:1」）。酵母宿主と共に用いるために適切な他のプロモーター配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（「Hitzemanら, J. BIOL. CHEM. (1980)255(4):12073-12080」）、および他の解糖系の酵素（例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、およびグルコースリン酸イソメラーゼ（「Hollandら,BIOCHEMISTRY(1978)17(23):4900-4907」、「Hessら,J.ADV.ENZYME REG.(1969)7:149-167」））が含まれ得る。増殖条件によって転写が制御されるという付加的な利点を有する、酵母の誘導性プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素にとってのプロモーター領域を含んでもよい。酵母発現のための使用に適切なベクターおよびプロモーターは、欧州特許出願公開第００７３６５７号明細書にさらに記載されている。
【０４０７】
また、酵母エンハンサーを、酵母プロモーターと共に用いてもよい。さらに、合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能してもよい。例えば、酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）を別の酵母プロモーターの転写活性化領域につなぎ、合成混成プロモーターを作製してもよい。上記混成プロモーターとしては、例えば、ＧＡＰの転写活性領域に連結されたＡＤＨ調節配列が挙げられる。米国特許出願第４，８８０，７３４号明細書および米国特許出願第４，８７６，１９７号明細書を参照すればよく、これらの文献は引用によって本明細書に援用される。混成プロモーターの他の例としては、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子の調節配列から成るプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターは、例えば、ＧＡＰまたはＰｙＫのような解糖系の酵素遺伝子の転写活性領域と組み合わされる。欧州特許出願公開第０１６４５５６号明細書を参照のこと。さらに、酵母プロモーターは、酵母のＲＮＡポリメラーゼとの結合能、および転写開始能を有する、非酵母系の天然に存在するプロモーターを含んでいてもよい。
【０４０８】
酵母発現ベクターの一部を構成し得る他の制御要素はとしては、例えばＧＡＰＤＨまたはエノラーゼ遺伝子に由来するターミネーター（「HollandらJ.BIOL.CHEM.(1981)256:1385」を参照のこと）が挙げられる。さらに、２μプラスミドの起点に由来する複製起点は、酵母に適している。酵母中で使用するために適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドに存在するｔｒｐｌ遺伝子である。「Tschumperら, GENE(1980)10:157」、「Kingsmanら, GENE(1979)7:141」を参照のこと。ｔｒｐｌ遺伝子は、トリプトファンにおいて増殖能を欠如している酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。同様にＬｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドによって補完される。
【０４０９】
外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は、例えば、アルカリイオンによって処理された無傷の酵母宿主細胞またはスフェロプラストのいずれかの形質転換が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、酵母の形質転換は、「Hsiaoら, PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1979)76:3829」および「Van Solingenら, J.BACT. (1977)130:946」に記載の方法にしたがって、実施され得る。しかし、例えば、核注入、エレクトロポレーション、または原形質融合によってＤＮＡを細胞に導入する他の方法も、「SAMBROOKら, MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)」に通常に記載されているように、使用され得る。その後、酵母宿主細胞を当業者に公知の標準技術を用いて培養してもよい。
【０４１０】
酵母宿主細胞中において異種タンパク質を発現させる他の方法は、当業者に公知の技術である。一般的に、米国特許出願公開第２００２／００５５１６９号明細書、米国特許出願第６，３６１，９６９号明細書、米国特許出願第６，３１２，９２３号明細書、米国特許出願第６，１８３，９８５号明細書、米国特許出願第６，０８３，７２３号明細書、米国特許出願第６，０１７，７３１号明細書、米国特許出願第５，６７４，７０６号明細書、米国特許出願第５，６２９，２０３号明細書、米国特許出願第５，６０２，０３４号明細書、および米国特許出願第５，０８９，３９８号明細書、米国再発行特許発明第ＲＥ３７，３４３号明細書、および米国再発行特許発明第ＲＥ３５，７４９号明細書、国際公開第９９／０７８６２号パンフレット、国際公開第９８／３７２０８号パンフレット、国際公開第９８／２６０８０号パンフレット、欧州特許出願公開第０９４６７３６号明細書、欧州特許出願公開第０７３２４０３号明細書、欧州特許出願公開第０４８０４８０号明細書、国際公開第９０／１０２７７号パンフレット、欧州特許出願公開第４６００７１号明細書、欧州特許出願公開第０３４０９８６号明細書、欧州特許出願公開第０３２９２０３号明細書、欧州特許出願公開第０３２４２７４号明細書、および欧州特許出願公開第０１６４５５６号明細書を参照のこと。また、「Gellissenら, ANTONIE VAN LEEUWENHOEK(1992)62(1-2):79-93」、「Romanosら, YEAST(1992)8(6):423-488」、「Goeddel,METHODS IN ENZYMOLOGY(1990)185:3-7」を参照のこと。上記文献は引用によって本明細書に援用される。
【０４１１】
標準の供給バッチ発酵方法（standard feed batch fermentation method）を用いて、増幅段階の間に酵母宿主株を発酵槽において成長させてもよい。この発酵方法は、特定の酵母宿主の炭素利用経路または発現制御の様式の差異を説明するために適用されてもよい。例えば、Saccharomyces酵母宿主の発酵は、１つのグルコース飼料、複合的な窒素源（カゼイン加水分解物など）および複数のビタミン補助物を必要としてもよい。これに対し、メチル栄養性（methylotrophic）酵母であるP.pastorisは、グリセロール、メタノール、および微量ミネラル試料を必要としてもよく、最適な成長および発現については単純なアンモニウム（窒素）塩だけを必要とする。例えば、米国特許出願第５，３２４，６３９号明細書、「Elliottら,J.PROTEIN CHEM.(1990)9:95」、および「Fieschkoら, BIOTECH.BIOENG.(1987)29:1113」を参照のこと。なお、これら文献は引用によって本明細書に援用される。
【０４１２】
しかし、上記発酵方法は、使用される酵母宿主株とは無関係な特定の共通の特徴を有していてもよい。例えば、成長限界栄養素（通常は炭素）を、増幅段階の間に発酵槽に添加して、最大限の成長を可能にしてもよい。さらに、発酵方法は、一般的に、十分な量の炭素、窒素、基本塩、リン、および他の微量栄養素（ビタミン、微量無機物、および塩など）を含むように調製された発酵培地を用いてもよい。例えば、Pichiaと共に用いるのに適した発酵培地は米国特許出願第５，３２４，６３９号明細書および米国特許出願第５，２３１，１７８号明細書に記載されており、これら文献は、引用によって本明細書に援用される。
【０４１３】
（バキュロウイルス感染昆虫細胞）
用語「昆虫宿主」または「昆虫宿主細胞」は、組み換えベクターまたはトランスファーＤＮＡの受容体として用いることができるか、または用いられている昆虫のことをいう。この用語は、トランスフェクトされた元々の昆虫宿主細胞の子孫を含む。形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの相補体において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致していなくてもよいことを理解されたい。関連する性質（例えば、非天然アミノ酸のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の存在）によって特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義に基づいて意図される子孫に含まれる。
【０４１４】
ポリペプチド発現にとって適した昆虫細胞の選択は当業者に公知である。いくつかの昆虫種は、当該分野において十分に説明されており、かつAedes asgypti、Bombyx mori、Drosophia melanogaster、Spodoptera frugiperdaおよびTrichoplusia niなどが市販されている。発現用の昆虫宿主の選択において、適切な宿主としては、特に、良好な分泌能、低いタンパク質分解活性、および総合的な強健さを有することが示されている宿主であってもよい。昆虫は、Insect Genetic Stock Center、Department of biophysics and Medical Physics,University of California(Berkeley,CA)およびthe American Type Cuture Collection(「ATCC」)(Manassas,VA) を含む、様々な供給源から入手することができるが、これらに限定されない。
【０４１５】
一般的に、バキュロウイルスに感染した昆虫の発現系の構成要素は、バキュロウイルスのゲノム断片、および発現される異種遺伝子の挿入に便利な制限酵素認識部位の両方を含んでいるトランスファーベクター（通常は細菌性プラスミド）、当該トランスファーベクターにおけるバキュロウイルスに特異的な断片に対して、相同な配列を有する（これにより、バキュロウイルスゲノムに対する異種遺伝子の相同組換えが可能になる）野生型バキュロウイルス、ならびに適切な昆虫宿主細胞および成長培養基を含んでいる。ベクターのコンストラクション、細胞のトランスフェクション、プラークの選択、または培養における細胞の成長などに用いられる材料、方法および技術は本明細書に記載されており、かつこれらの技術が記載されている手引書が利用可能である。
【０４１６】
異種遺伝子をトランスファーベクターに挿入した後に、該ベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、当該ベクターと当該ウイルスゲノムとが組み換えを起こす昆虫宿主細胞に、トランスフェクションする。パッケージングされた組み換えウイルスが発現され、かつ組み換え体プラークが同定および精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系にとっての材料および方法は、例えば、Invitrogen(Carlsbad,CA) が提供している、キットの様式において市販されている。これらの技術は、「SUMMERS AND SMITH,TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No.1555(1987)」において記載されており、引用によって本明細書に援用される。また、「RICHARDSON,39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY:BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS(1995)」、「AUSUBELら, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11(1994)」、「KING AND POSSEE,THE BACULOVIRUS SYSTEM:A LABORATORY GUIDE(1992)」および「O’REILLYら, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:A LABORATORY MANUAL(1992)」を参照のこと。
【０４１７】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いた、様々な異種タンパク質の製造は、以下の参考文献に記載されており、当該技術は本明細書に記載されている非天然アミノ酸のポリペプチドを製造するために適用され得る。例えば、米国特許出願第６，３６８，８２５号明細書、米国特許出願第６，３４２，２１６号明細書、米国特許出願第６，３３８，８４６号明細書、米国特許出願第６，２６１，８０５号明細書、米国特許出願第６，２４５，５２８号明細書、米国特許出願第６，２２５，０６０号明細書、米国特許出願第６，１８３，９８７号明細書、米国特許出願第６，１６８，９３２号明細書、米国特許出願第６，１２６，９４４号明細書、米国特許出願第６，０９６，３０４号明細書、米国特許出願第６，０１３，４３３号明細書、米国特許出願第５，９６５，３９３号明細書、米国特許出願第５，９３９，２８５号明細書、米国特許出願第５，８９１，６７６号明細書、米国特許出願第５，８７１，９８６号明細書、米国特許出願第５，８６１，２７９号明細書、米国特許出願第５，８５８，３６８号明細書、米国特許出願第５，８４３，７３３号明細書、米国特許出願第５，７６２，９３９号明細書、米国特許出願第５，７５３，２２０号明細書、米国特許出願第５，６０５，８２７号明細書、米国特許出願第５，５８３，０２３号明細書、米国特許出願第５，５７１，７０９号明細書、米国特許出願第５，５１６，６５７号明細書、米国特許出願第５，２９０，６８６号明細書、国際公開第０２／０６３０５号パンフレット、国際公開第０１／９０３９０号パンフレット、国際公開第０１／２７３０１号パンフレット、国際公開第０１／０５９５６号パンフレット、国際公開第００／５５３４５号パンフレット、国際公開第００／２００３２号パンフレット、国際公開第９９／５１７２１号パンフレット、国際公開第９９／４５１３０号パンフレット、国際公開第９９／３１２５７号パンフレット、国際公開第９９／１０５１５号パンフレット、国際公開第９９／０９１９３号パンフレット、国際公開第９７／２６３３２号パンフレット、国際公開第９６／２９４００号パンフレット、国際公開第９６／２５４９６号パンフレット、国際公開第９６／０６１６１号パンフレット、国際公開第９５／２０６７２号パンフレット、国際公開第９３／０３１７３号パンフレット、国際公開第９２／１６６１９号パンフレット、国際公開第９２／０３６２８号パンフレット、国際公開第９２／０１８０１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２８号パンフレット、国際公開第９０／１００７８号パンフレット、国際公開第９０／０２５６６号パンフレット、国際公開第９０／０２１８６号パンフレット、国際公開第９０／０１５５６号パンフレット、国際公開第８９／０１０３８号パンフレット、国際公開第８９／０１０３７号パンフレット、国際公開第８８／０７０８２号パンフレットを参照すればよく、各文献は、引用によって本明細書に援用される。
【０４１８】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に有用なベクターは公知であり、例えば、バキュロウイルスのAutographacalifornica核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する、ヘルパー非依存性のウイルス発現ベクターである昆虫の発現およびトランスファーベクターを含む。この系に由来するウイルス発現ベクターは、一般的に、異種遺伝子の発現を誘導するために、ウイルスの強力なポリヘドリン（polyhedrin）遺伝子プロモーターを利用する。一般的には、「Reillyら, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:A LABORATORY MANUAL(1992)」を参照のこと。
【０４１９】
外来の遺伝子をバキュロウイルスのゲノムに挿入する前に、上記構成要素（プロモーター、リーダー（必要に応じて）、関連のあるコード配列、および転写終結配列を含んでいる）は、中間トランス配列コンストラクト（intermediate transplacement construct）（トランスファーベクター）に集められる。中間トランス配列コンストラクトは、レプリコンにおいてしばしば維持される。このレプリコンは、例えば、細菌などの宿主において安定な維持が可能な染色体外エレメント（例えば、プラスミド）といったものである。レプリコンは複製系を有し、このため、クローニングおよび増幅に適切な宿主における当該レプリコンの維持を可能にする。より具体的には、プラスミドは、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル（「Millerら,ANN.REV.MICROBIOL.(1988)42:177)」およびE.coliにおける選択および増殖に関する、原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子と複製起点とを含有する。
【０４２０】
ＡｃＮＰＶへ外来遺伝子を導入するために一般的に使用されるトランスファーベクターの１つは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知である他の多くのベクターもまた設計されており、例えば、ｐＶＬ９８５が挙げられる。このベクターでは、ポリヘドリン開始コドンがＡＴＧからＡＴＴに変えられ、ＡＴＴの下流の３２塩基対にＢａｍＨＩクローニング部位が導入されている（「Luckow and Summers, VIROLOGY 170:31-39(1989)」を参照のこと）。他の市販されているベクターとしては、例えば、ＰＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）が挙げられる。
【０４２１】
異種遺伝子を挿入した後に、トランスファーベクターおよび野生型バキュロウイルスのゲノムを、昆虫細胞宿主に同時トランスフェクションする。異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入するための具体的な方法は、「SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)」、「Smithら, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156」、「Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 170:31-39」を参照のこと。２重交差型相同組換えによって、ポリへドリン遺伝子などの遺伝子に、挿入してもよい。また、所望のバキュロウイルス遺伝子中に設けられた、制限酵素認識部位に挿入してもよい。例えば、「Millerら, BIOESSAYS (1989) 11(4):91」を参照のこと。
【０４２２】
トランスフェクションを、エレクトロポレーションによって達成してもよい。「TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)」、「Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501」を参照のこと。また、その代わりに、リポソームを用いて、昆虫細胞に組み換え発現ベクターとバキュロウイルスとをトランスフェクションしてもよい。例えば、「Liebmanら., BIOTECHNIQUES (1999) 26(1):36」、「Gravesら, BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050」、「Nomuraら, J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570」、「Schmidtら, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323」、「Siffertら, NATURE GENETICS (1998) 18:45」、「TILKINSら, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998) 」、「Caiら, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263」、「Dolphinら, NATURE GENETICS (1997) 17:491」、「Kostら, GENE (1997) 190:139」、「Jakobssonら, J. BlOL. CHEM. (1996) 271:22203」、「Rowlesら, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37): 22376」、「Revereyら, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39) :23607- 10」、「Stanleyら, J. BlOL. CHEM. (1995) 270:4121」、「Siskら, J. VlROL. (1994) 68(2):766」、および「Pengら, BIOTECHNIQUES (1993) 14(2):274」を参照のこと。市販されているリポソームとしては、例えば、セルフェクチン（Cellfectin（登録商標））、およびリポフェクチン（Lipofectin（登録商標））（Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA）が挙げられる。また、リン酸カルシウムトランスフェクションを用いてもよい。「TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)」、「Kitts, NAR (1990) 18(19):5667」、および「Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501」を参照のこと。
【０４２３】
バキュロウイルス発現ベクターは、大抵は、バキュロウイルスプロモーターを含んでいる。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスのＲＮＡポリメラーゼが結合でき、コード配列（例えば、構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）へ転写開始する任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、たいていはコード配列の５’末端近傍に配置される転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含んでいる。また、バキュロウイルスのプロモーターは、エンハンサーと呼ばれる２次ドメインを有していてもよい。この２次ドメインは、存在する場合は、構造遺伝子から遠位に存在する。また、発現は、調節されてもよいし、恒常的であってもよい。
【０４２４】
感染サイクルの後期に多量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。有用なプロモーター配列の例としては、ウイルスポリヘドリンタンパク質をコードする遺伝子由来の配列（「FRIESENら, The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)」、欧州特許出願公開第０１２７８３９号明細書、および欧州特許出願公開第０１５５４７６号明細書）、およびｐ１０タンパク質をコードする遺伝子由来の配列（「Vlakら, J. GEN. VlROL. (1988) 69:765」）が挙げられる。
【０４２５】
新しく形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、感染性の組み換えバキュロウイルスにパッケージングされる。その後、成長したプラークが当業者に公知の方法によって精製されてもよい。「Millerら, BIOESSAYS (1989) 4:91」、「SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)」を参照のこと。
【０４２６】
組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞へ感染させるために開発されている。例えば、とりわけAedes aegypti（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１２５）、Bombyx mori（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８９１０）、Drosophila melanogaster（ＡＴＣＣ番号１９６３）、Spodoptera frugiperda、およびTriclioplusia niのための組み換えバキュロウイルスが開発されている。上記組み換えバキュロウイルス発現ベクターについては、国際公開第８９／０４６，６９９号パンフレットを参照のこと。「Wright, NATURE (1986) 321:718」、「Carbonellら, J. VlROL. (1985) 56:153」、「Smithら, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156」を参照のこと。一般的には、「Fraserら, IN VITRO CELL. DEV. BIOL (1989) 25:225」を参照のこと。より具体的には、バキュロウイルス発現ベクターの系に用いられる細胞株としては、通常、Sf9(Spodoptera frugiperda)（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７１１）、Sf21(Spodoptera frugiperda)(Invitrogen Corp.,カタログ番号11497-013 (Carlsbad, CA))、Tri-368(Trichopulsia ni)、およびHigh-Five(登録商標)BTI-TN-5B1-4(Trichopulsia ni)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４２７】
バキュロウイルス／発現における異種ポリペプチドの直接発現と融合発現とのための細胞および培地は、市販されている。
【０４２８】
（細菌）
細菌宿主における使用を目的とした様々なベクターが利用可能である。上記ベクターは、１コピーベクター、またはコピー数が少ない多コピーベクター（低多コピーベクター）、もしくはコピー数が多い多コピーベクター（高多コピーベクター）であってもよい。ベクターは、クローニングおよび／または発現に役立ち得る。上記ベクターは、通常は選択を可能にするマーカーを含んでいる。上記マーカーは、細胞毒性剤への耐性、原栄養性、または免疫を提供し得る。異なる特徴を提供する複数のマーカーが、高頻度に存在する。
【０４２９】
細菌プロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼが結合でき、コード配列（例えば、構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）へ転写開始できる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、大抵はコード配列の５’末端近傍に配置される転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含んでいる。また、細菌プロモーターは、オペレーターと呼ばれる２次ドメインを有していてもよい。この２次ドメインは、ＲＮＡ合成が始まる隣接したＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複してもよい。オペレーターは、負に調節される（誘導性の）転写を可能にする。すなわち、遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結合することによって、特定の遺伝子の転写を阻害してもよい。さらに、正の調節が、遺伝子アクチベータータンパク質の結合配列によってもたらされてもよい。該結合配列は、存在する場合は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列よりも（５’）近位に存在する。遺伝子アクチベータータンパク質としては、例えば、代謝活性化タンパク質（ＣＡＰ）が挙げられる。このＣＡＰは、Escherichia coli(E. coli)のｌａｃオペロンの転写開始を助ける（「Raibaudら, ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173」）。したがって、制御された発現は、正または負のいずれかであってもよく、これによって転写を増強または減少させてもよい。
【０４３０】
代謝経路の酵素をコードしている配列は、特に有用なプロモーターを提供する。この配列としては、例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（「Changら, NATURE (1977) 198:1056」）、およびマルトースなどの糖代謝酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。別の例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）などの生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる（「Goeddelら, Nuc. ACIDS RES. (1980) 8:4057」、「Yelvertonら, NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731」、米国特許第４，７３８，９２１号明細書、欧州公開第０３６７７６号明細書、欧州公開第１２１７７５号明細書）。なお、これら文献は、引用によって本明細書に援用される。また、β‐ガラクトシダーゼ（ｂｌａ）のプロモーター系（「Weissmann (1981) “The cloning of interferon and other mistakes.” In Interferon 3 (Ed. I. Gresser) 」）、バクテリオファージ・ラムダのＰＬ（「Shimatakeら, NATURE (1981) 292:128」）、およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号明細書）のプロモーター系も、有用なプロモーター配列を提供する（なお、これら文献は、引用によって本明細書に援用される）。本明細書に記載の好ましい方法は、例えばポリペプチド生成物を高レベルに誘導するためのＴ７プロモーターなどの強力なプロモーターを利用する。そのようなベクターの例は、特に限定されないが、ｐＥＴ２９のシリーズ（Novagen）、および国際公開第９９／０５２９７号明細書に記載のｐＰＯＰベクターなどが挙げられる（なお、上記文献は、引用によって本明細書に援用される）。そのような発現系は、宿主細胞の生存能力または成長パラメーターに支障をきたすことなく、宿主において、ポリペプチドを高レベルに産生する。
【０４３１】
さらに、天然に生じることのない合成プロモーターは、細菌プロモーターとして機能する。例えば、１つの細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、他の細菌プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列とつないで、合成混成プロモーターを形成してもよい（米国特許出願第４，５５１，４３３号明細書）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターとｌａｃオペロン配列とから成る、混成ｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである。なお、混成ｔｒｐ−ｌａｃプロモーターはリプレッサーによって調節される（「Amannら, GENE(1983)25:167」、「de Boerら, PROC.NATL.ACAD.SCI.(1983)80:21」）。さらに、細菌プロモーターは天然に生じる非細菌由来のプロモーターが含まれ得る。非細菌由来のプロモーターは細菌ＲＮＡポリメラーゼとの結合能を有しており、転写を開始することができる。天然に生じる非細菌由来のプロモーターは、原核生物においていくつかの遺伝子の高レベルな発現を産出するために、共通ＲＮＡポリメラーゼと結合させることができる。バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合プロモーター系の一例である（「Studierら, J.MOL.BIOL(1986)189:113」、「TaborらProc Natl.Acad.Sci.(1985)82:1074」）。さらに、混成プロモーターは、バクテリオファージプロモーターと、E. coliのオペレーター領域とを含んでいてもよい（欧州公開第２６７８５１号明細書）。
【０４３２】
また、機能性プロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位が、外来遺伝子を原核細胞において発現させるために有効である。E.coliにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン‐ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）と、該開始コドンから３〜１１ヌクレオチド上流に位置した、長さ３〜９ヌクレオチドの配列とを含んでいる（「Shineら, NATURE (1975) 254:34」）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とE. coliの１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’との間で塩基対を形成することによって、ｍＲＮＡとリボソームとの結合を促進すると考えられている（「Steitzら “Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA”, In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979) 」）。真核性遺伝子および原核性遺伝子を、弱いリボソーム結合部位によって発現すること（「Sambrookら “Expression of cloned genes in Escherichia coli”, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989」）。
【０４３３】
用語「細菌宿主」または「細菌宿主細胞」は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡにとっての受容物として使用されてもよい、または使用されている細菌のことをいう。この用語は、トランスフェクションされている元々の細菌宿主細胞の子孫を含む。１つの親細胞の子孫は、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの相補体において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致していなくてもよいことを理解されたい。関連する性質（例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）によって特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義に基づいて意図される子孫に含まれる。
【０４３４】
所望のポリペプチドの発現に関する細菌宿主の選択において、適切な宿主は、とりわけ、良好な封入体形成能、低いタンパク質分解活性、良好な分泌能力、良好な溶解性タンパク質生成能力、および全体的に強健さといった特性の少なくとも１つ、および好ましくは少なくとも２つを含む。細菌宿主は、一般的に、様々な供給源から入手可能であり、例えば、「Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA)」、および「the American Type Culture Collection (「ATCC」) (Manassas, VA)」から入手することができるが、これらに限定されない。Ｋ株に由来する細菌（Ｗ３１１０など）、またはＢ株に由来する細菌（ＢＬ２１など）が、一般的に産業的／製薬的な発酵に用いられる。これらの株は、成長パラメーターが強健であるから特に有用である。さらに、これらの株は非病原性であるから、安全性と環境の観点から商業的に重要である。本明細書に記載の方法の一実施形態では、E. coli宿主としては、例えば、ＢＬ２１、ＤＨ１０Ｂ、またはその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法の別の実施形態では、E. coli宿主は、プロテアーゼが欠失した株（ＯＭＰ−、およびＬＯＮ−など）である。別の実施形態では、細菌宿主はPseudomonas種（P.fluorescens、P.aeruginosaおよびP.putida）である。Pseudomonas発現株としては、例えば、P.fluorescens次亜種Ｉ、ＭＢ１０１株（Dow Chemical）が挙げられる。
【０４３５】
組み換え宿主細胞株が、確立されれば（すなわち、発現コンストラクトが、宿主細胞に導入され、適切な発現コンストラクトを有する宿主細胞が単離されれば）、当該組み換え宿主細胞株がポリペプチドの産生に適切な条件下において培養される。宿主細胞株の培養方法は、利用される天然の発現コンストラクトと宿主細胞の性質とに依存する。組み換え宿主株は、通常、技術的に公知の方法を用いて培養される。組み換え宿主細胞は、通常、炭素、窒素および無機塩の吸収可能な供給源を含む液体培養基にて培養される。さらに、該液体培養基は、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸、成長因子、および技術的に公知の他のタンパク質性の培養補助物を含んでいてもよい。また、宿主細胞の培養のための液体培養基は、望ましくない微生物の成長を阻害するための抗生物質、もしくは抗真菌剤、および／または発現ベクターを含む宿主細胞を選択するための抗生物質などの化合物を、任意に含んでいてもよい。
【０４３６】
組み換え宿主細胞は、バッチ式または連続式で培養され得る。目的のポリペプチドが細胞内に蓄積する場合、細胞は収集されるか、またはバッチ式もしくは連続式において培養液上清が収集される。いくつかの実施形態においては、原核生物の宿主細胞での製造には、バッチ式培養および細胞収集が用いられる。
【０４３７】
一実施形態では、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドは組み換え系における発現の後に、精製される。ポリペプチドは、技術的に公知の様々な方法によって、宿主細胞または細胞培地から精製されてもよい。通常、細菌宿主細胞中に産生された多くのポリペプチドは、難溶性であっても不溶性（封入体の形態において）であってもよい。一実施形態では、アミノ酸の置換はポリペプチドにおいて容易に行われ得る。このアミノ酸の置換は、本明細書に記載の方法を利用して、組換えによって製造されたポリペプチドの溶解度の増加を目的として選択される。不溶性のポリペプチドの場合、当該ポリペプチドは宿主細胞ライセートから遠心分離またはろ過によって回収されればよく、続いて、細胞のホモジナイゼーションが行われてもよい。難溶性ポリペプチドの場合、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などを含む組成物は、部分的に可溶性のポリペプチドの沈殿を引き起こすために加えられてもよい。その後、沈殿したタンパク質は、遠心分離またはろ過によって好都合に回収されてもよい。組み換え宿主細胞は、当該分野において公知の様々な方法によって、細胞内部から封入体を放出させるために、分離またはホモジナイズされてもよい。宿主細胞の分離またはホモジナイゼーションは公知の技術を用いて実施されればよく、例えば、酵素的細胞崩壊、超音波処理、ダウンス型ホモジナイゼーション、または高圧放出崩壊を含むが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法の一実施形態では、高圧放出技術を、E.coli宿主細胞の崩壊に使用することによって、ポリペプチドの封入体を放出させてもよい。ホモジナイズの間にE.coli宿主細胞の継代を一回のみとすることで、封入体の形態での不溶性ポリペプチドの収量が増加することが明らかとなっている。ポリペプチドの封入体を取り扱うときに、繰り返しのホモジナイゼーション時間を最小化することが好都合である。これにより、可溶化、機械的なせん断またはタンパク質分解などの要因による損失を無くし、封入体の収量が最大になる。
【０４３８】
それから、不溶性のまたは沈殿したポリペプチドは、当該技術にとって公知の、多くの適切な可溶化試薬のいずれかを用いて可溶化されてもよい。例えば、ポリペプチドは尿素またはグアニジン塩酸塩を用いて可溶化される。都合よく扱いやすい大きさのバッチを用いて、大規模なバッチが産生され得るように、可溶化されたポリペプチドの容積は、最小化されるべきである。組み換え宿主細胞が一度に数千リットルの容積であるバッチで成長させられる場合、この要因は、大規模な工業的設定において重要である。また、特にヒトへの製薬利用のために大規模な工業的設定においてポリペプチドを製造するとき、機械および容器か、タンパク質産物自体かのいずれかを損傷するおそれのある、きつい化学物質の回避は、可能であれば、避けられるべきである。穏やかな変性試薬である尿素を、きつい変性試薬であるグアニジン塩酸塩の代わりに、ポリペプチド封入体の可溶化に使用できることが、本明細書に記載および包含される方法に示されている。尿素の使用は、ポリペプチドの製造過程および精製過程に利用されるステンレス鋼の設備に対する損傷の危険度を有為に低減すると同時に、ポリペプチドの封入体を効率的に可溶化する。
【０４３９】
可溶性ポリペプチドの場合、ペプチドは細胞膜周辺腔に、または培地に分泌され得る。また、可溶性ペプチドは宿主細胞の細胞質に存在し得る。精製段階を実施する前に、可溶性ペプチドを濃縮することが望ましいことがある。本明細書に記載されるような標準的な技術は、細胞ライセートまたは培地などからの可溶性ペプチドの濃縮に使用され得る。また、当業者に公知の標準的な技術は、宿主細胞の崩壊、および宿主細胞の細胞質もしくは細胞膜周辺腔からの可溶性ペプチドの放出に使用されてもよい。
【０４４０】
ポリペプチドが融合タンパク質として産生されるとき、融合配列は、好ましく除去される。融合配列の除去は、例えば、酵素的切断または化学的切断によって果たされ得るが、これらに限定されない。融合配列の酵素的除去は、当該分野において公知の方法を用いて果たされ得る。融合配列の除去にふさわしい酵素の選択は、融合の個性によって決定され、かつ反応条件は、当業者にとって明らかなような酵素の選択によって特定される。化学的切断は、例えば、臭化シアン、ＴＥＶプロテアーゼ、および他の試薬などの試薬を用いて果たされ得る。切断されたポリペプチドは、よく知られた方法によって、切断された融合配列から必要に応じて精製される。そのような方法は、融合配列およびポリペプチドの個性および性質によって決定される。精製方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換グラフィー、もしくは透析、またはこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４１】
また、ポリペプチドは、タンパク質溶液からＤＮＡを除去するために、精製されることが好ましい。ＤＮＡは、当業者に公知のあらゆる適切な方法（例えば、沈殿またはイオン交換クロマトグラフィー）によって除去され得る。一実施形態では、ＤＮＡは核酸沈殿剤（例えば、硫酸プロタミンであるが、これに限定されない）を用いた沈殿によって除去される。ポリペプチドは標準的な公知の方法（例えば、遠心分離またはろ過が挙げられるが、これらに限定されない。）を用いて、沈殿されたＤＮＡから分離され得る。ポリペプチドがヒトの治療に用いられ、かつ本明細書に記載の方法が薬学的に許容可能なレベルまで宿主細胞のＤＮＡを低減するという設定において、宿主核酸分子の除去は重要な要素となる。
【０４４２】
また、小規模または大規模な発酵方法は、タンパク質発現（例としては、発酵槽、振とうフラスコ、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル培養系、および攪拌タンクバイオリアクター系が挙げられるが、これらに限定されない）に使用され得る。これらの方法のそれぞれは、バッチ処理、給飼バッチ処理、連続様式処理において実施され得る。
【０４４３】
本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドのヒト様式は、当該分野における標準的な方法を用いて、通常に回収され得る。例えば、培地または細胞ライセートは、細胞破片を除去するために遠心分離またはろ過され得る。上清は、所望の容積まで濃縮または希釈されてもよいし、またはさらなる精製用の調製物を適当な状態にする適切な緩衝液の中に透析されてもよい。本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドのさらなる精製は、ジアミド化され、かつ短縮されたポリペプチド変異体を対応する原型の形態から分離することを含む。
【０４４４】
以下に示す方法のいずれかは、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチド精製に採用され得る。そのような方法としては、例えばアフィニティークロマトグラフィー；陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー（例としては、DEAE SEPHAROSEを用いたものが挙げられるが、これに限定されない）；シリカ上におけるクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（特に限定されないが、SEPHADEX G-75を用いたものが挙げられる）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；クロマト分画；置換クロマトグラフィー；電気泳動法（特に限定されないが、例えば調整用の等電点電気泳動法を含む）；差別的可溶性（differential solubility）（例としては、硫酸アンモニウム沈殿が挙げられるが、これに限定されない）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抽出、またはそれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。
【０４４５】
本明細書に記載の方法および組成物の範囲にあるポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドに対する抗体、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドに対する結合パートナーなどが挙げられるが、これらに限定されない）は、当業者に知られ、かつ使用される標準的な手法に従って、部分的または実質的に均質に精製される。したがって、本明細書に記載のポリペプチドは、当該分野においてよく知られた多くの方法（例としては、硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出もしくは塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などを含んでいてもよく、またそれらのいずれかの組み合わせであってもよいが、これらに限定されない）によって、修復および精製され得る。タンパク質をリフォールディングする工程は、必要に応じて、正確に折りたたまれた成熟タンパク質を作製するときに、使用され得る。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、または他の適切な方法は、高い純度が所望される最終的な精製工程において採用され得る。一実施形態では、非天然アミノ酸（または非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド）に対して作製された抗体は、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドの親和性に基づく精製などのための精製試薬として使用される。所望のように、部分的にまたは均質になるまで精製されると、ポリペプチドは、多種多様な有用物（例えば、これらに限定されないが、アッセイの構成要素、治療法、予防法、診断法、研究試薬、および／または抗体製造用の抗原を含む）として、必要に応じて使用される。
【０４４６】
本明細書に言及されている他の参考文献に加えて、様々な精製／タンパク質折りたたみ方法は、当該分野においてよく知られている（例えば、「R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)」、「Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification. Academic Press, Inc. N.Y. (1990) 」、「Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.」、「Bollagら (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY」、「Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England」、「Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England」、「Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY」、「Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY」、および「Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ」ならびにこれらに引用されている参考文献に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない）。
【０４４７】
真核生物宿主細胞または非真核生物宿主細胞において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを産生することの１つの利点は、通常、ポリペプチドがそれらの本来の立体構造に折りたたまれることである。しかしながら、本明細書に記載の方法および組成物のいくつかの実施形態では、合成、発現および／または精製の後に、ポリペプチドが関連するポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有することがある。本明細書に記載の方法および組成物の一態様では、発現タンパク質は必要に応じて変性され、かつその後復元される。この随意的な変性および復元は、当該分野において公知の方法によって成し遂げられるものであり、特に限定されないが、関連するポリペプチドに対するシャペロニンの添加によって、およびカオトロピック剤（特に限定されないが、例えば塩酸グアニジン）においてタンパク質を可溶化することによって、ならびにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを用いることによって成し遂げられる。
【０４４８】
加えて、発現したポリペプチドを変性および還元して、その後に、ポリペプチドを好ましい立体構造へリフォールディングさせることが可能である。例えば、このリフォールディングは、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥおよび／またはシャペロニンを目的の翻訳産物に添加することによって成し遂げられ得る。タンパク質の還元、変性および復元の方法は、当業者によく知られている（上述した参考文献、「Debinskiら(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070」、「Kreitman an Pastan(1993)Bioconjug.Chem.,4:581-585」、および「Bucherら(1992)Anal.Biochem.,205:263-270」を参照のこと）。Debinskiらは、例えば、グアニジン−ＤＴＥにおける封入体タンパク質の変性および還元について記載している。タンパク質は、還元剤（例としては、酸化型グルタチオンおよびＬ−アルギニンを含有する還元剤が挙げられるが、これらに限定されない）においてリフォールディングされ得る。リフォールディング剤は、流されてもよいし、またはそうでなければ、１つ以上のポリペプチドもしくは他の発現産物と接触するように移動させられてもよい。また、他の実施形態では、１つ以上のポリペプチド、または他の発現産物は、流されてもよいし、またはそうでなければリフォールディング剤と接触するように移動させられる。
【０４４９】
非天然アミノ酸のポリペプチドを原核生物において産生する場合、そのように産生されるポリペプチドは、誤って折りたたまれることがある。このため、ポリペプチドの生物学的な活性が、欠如または低減されていることがあり得る。タンパク質の生物学的な活性は、「リフォールディング」によって回復され得る。一実施形態では、誤って折りたたまれたポリペプチドは、例えば、１つ以上のカオトロピック剤（例えば、尿素および／またはグアニジン）ならびにジスルフィド結合を還元可能な還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または２メルカプトエタノール（２−ＭＥ））を用いて、ポリペプチド鎖を可溶化（ポリペプチドも不溶性である場合に）、アンフォールディング、ならびに還元することによってリフォールディングされる。穏やかなカオトロープ濃度において、ジスルフィド結合の再構築を可能にする、酸化剤（例えば、酸素、クリスチン（crystine）またはクリスタミン（crystamine））が続いて添加される。折りたたまれていない、または誤って折りたたまれたポリペプチドは、例えば、それぞれ引用によって本明細書に援用される米国特許出願第４，５１１，５０２号明細書、米国特許出願第４，５１１，５０３号明細書、および米国特許出願第４，５１２，９２２号明細書に開示されたリフォールディング方法のような方法を用いてリフォールディングされ得る。また、ポリペプチドは、他のタンパク質と共同して折りたたまれて、ヘテロ二量体またはヘテロ多量体を形成し得る。リフォールディングまたは共同折りたたみの後に、ポリペプチドは、さらに精製されてもよい。
【０４５０】
非天然アミノ酸のポリペプチドの精製は、本明細書に記載された様々な技術（例として、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられ、またそれらのいずれかの組み合わせであってもよいが、これら技術に限定されない）を用いて達成され得る。また、さらなる精製は、精製されたタンパク質の乾燥工程または沈殿工程を含んでいてもよい。
【０４５１】
精製の後、非天然アミノ酸のポリペプチドは、当該分野において公知の、様々な方法（例として、ダイアフィルトレーションおよび透析が挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかによって異なる緩衝液の中で交換されてもよく、および／または濃縮されてもよい。いくつかの実施形態では、１つの精製されたタンパク質として提供されるｈＧＨは、凝集しやすく、かつ沈殿しやすくてもよい。いくつかの実施形態では、精製された非天然アミノ酸のポリペプチドは少なくとも約９０％の純度であればよい（逆相高速液体クロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰＬＣ、またはドデシル硫酸−ポリアクリルアミドナトリウムゲル電気泳動，ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される）。別のいくつかの実施形態では、精製された非天然アミノ酸のポリペプチドは少なくとも約９５％の純度、少なくとも約９８％の純度、少なくとも約９９％の純度またはそれ以上の純度であればよい。非天然アミノ酸のポリペプチドの純度の正確な数値にかかわらず、非天然アミノ酸のポリペプチドは、医薬品として利用するために十分な純度であるか、またはさらなる処理（例えば、ＰＥＧのような水溶性ポリマーとの結合）にとって十分な純度である。
【０４５２】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチド分子は、他の活性成分またはタンパク質（賦形剤、担体および安定剤、血清アルブミンなど）が存在していない治療剤として用いられ得る。また、いくつかの実施形態では非天然アミノ酸のポリペプチド分子は他のポリペプチドまたはポリマーと複合されてもよい。
【０４５３】
２．非天然アミノ酸のポリペプチドの精製
（一般的な精製方法）
この項に開示されている技術は、本明細書に記載された非天然アミノ酸のポリペプチドの一般的な精製に適用できる。
【０４５４】
様々な単離工程のうちのいずれか１つは、所望のポリペプチドを含んでいる細胞ライセート抽出、培地、封入体、宿主細胞の周辺孔、宿主細胞の細胞質、または所望のポリペプチドを含む他の材料であるか、またはいずれかの単離工程から得られるポリペプチドの混合物について実施され得る。この単離工程としては、特に限定されないが、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）、発泡床吸収（expanded bed absorption）が挙げられる。これらは、いずれかの方法の組み合わせおよび／またはいずれかの方法の繰り返しであってもよく、いずれかの適切な順序において行われればよい。
【０４５５】
本明細書に記載されている技術の実施に使用される設備、および他の必要な材料は、市販されている。ポンプ、フラクションコレクター、モニター、記録器、および全体のシステムは、Applied Biosystems(Foster City, CA)、Bio-Rad Laboratories, Inc.(Hercules, CA)、およびAmersham Biosciences, Inc.(Piscataway, NJ)から市販されている。クロマトグラフィーの材料（例としては、交換基質材料、溶剤および緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない）は、そのような企業から入手可能である。
【０４５６】
本明細書に記載されているカラムクロマトグラフィー処理における平衡および他の工程（例えば、洗浄および溶出）は、特殊な設備（例えば、ポンプ）を用いてより速く実施され得る。市販のポンプの例としては、ハイロードポンプＰ−５０（HILOAD（登録商標） Pump P−50）、ペリスタルティックポンプＰ−１（Peristaltic Pump P-1）、ポンプＰ−９０１（Pump P-901）、およびポンプＰ−９０３（Pump P-903)(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５７】
フラクションコレクターとしては、例えばレディフラック  フラクションコレクター（REDIFRAC Fraction Collector）、ＦＲＡＣ−１００およびＦＲＡＣ−２００フラクションコレクター、ならびにスーパーフラック  フラクションコレクター（SUPERFRAC(登録商標) Fraction Collector)(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられるが、これらに限定されない。また、ミキサーはｐＨまたは直線濃度勾配を形成するために利用可能である。工業的に利用可能なミキサーとしては、勾配ミキサーＧＭ−１およびＩＮ−Ｌｉｎｅミキサー（Amersham Biosciences,Piscataway,NJ）が挙げられる。
【０４５８】
クロマトグラフィー処理は、あらゆる市販のモニターを用いて観察され得る。当該モニターは、ＵＶ、蛍光、ｐＨ、および導電率のような情報を集めるために用いればよい。検出器の例としては、モニターＵＶ−１（Monitor UV-1）、ユニコードＳ  ＩＩ（UVICORD(登録商標) S II）、モニターＵＶ−Ｍ  ＩＩ（Monitor UV-M II）、モニターＵＶ−９００（Monitor UV-900）、モニターＵＰＣ−９００（Monitor UPC-900）、モニターｐＨ／Ｃ−９００（Monitor pH/C-900）、およびコンダクティビティーモニター（Conductivity Monitor）（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられる。実際に、全体のシステムは、市販されており、例えばアクタシステムズ（AKTA(登録商標) systems）などは、Amersham Biosciences(Piscataway, NJ)から市販されている。
【０４５９】
本明細書に記載の方法および組成物の一実施形態では、例えばポリペプチドを、得られた精製ポリペプチドを尿素中で第１変性させることによって、還元および変性させ、続いて、適切なｐＨにおいて還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含むＴＲＩＳ緩衝液に希釈させてもよい。別の実施形態では、ポリペプチドを約２Ｍから約９Ｍの範囲の濃度の尿素中において変性させ、続いて、ｐＨ約５．０〜約８．０の範囲のＴＲＩＳ緩衝液において希釈する。その後、この実施形態のリフォールディング混合物を、インキュベートする。一実施形態では、リフォールディング混合物を、室温で４時間〜２４時間、インキュベートする。還元され、かつ変性されたポリペプチド混合物を、その後さらに単離または精製してもよい。
【０４６０】
本明細書に述べられているように、第１のペプチド混合物のｐＨは、次のあらゆる単離工程を実施する前に調節されればよい。また、第１のペプチド混合物、またはあらゆるその後の混合物は、濃縮されてもよい。さらに、第１のポリペプチド混合物、またはあらゆるその後の混合物を含む溶出緩衝液は、次の単離工程に好適な緩衝液に交換され得る。
【０４６１】
（イオン交換クロマトグラフィー）
この項に開示されている技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドのイオン交換クロマトグラフィーに適用できる。
【０４６２】
一実施形態では、必要に応じて工程を追加するのであれば、イオン交換クロマトグラフィーは第１のポリペプチド混合物について実施されればよい。一般的に、「ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY:PRINCIPLES AND METHODS(カタログ番号18-1114-21, Amersham Biosciences(Piscataway,NJ))」を参照のこと。市販のイオン交換カラムとしては、ハイトラップ（HITRAP（登録商標））カラム、ハイプレップ（HIPREP（登録商標））カラム、およびハイロード（HILOAD（登録商標））カラム（Amersham Biosciences,Piscataway,NJ）が挙げられる。そのようなカラムは、強い陰イオン交換体（例えば、Ｑセファロースファーストフロウ（Q SEPHAROSE(登録商標) Fast Flow），Ｑセファロースハイパフォーマンス（Q SEPHAROSE(登録商標) High Performance）、およびＱセファロースＸＬ（Q SEPHAROSE(登録商標) XL））；強い陽イオン交換体（例えば、ＳＰセファロースハイパフォーマンス（SP SEPHAROSE(登録商標) High Performance），ＳＰセファロースファーストフロウ（SP SEPHAROSE(登録商標) Fast Flow）、およびＳＰセファロースＸＬ（SP SEPHAROSE(登録商標) XL））；弱い陰イオン交換体（例えば、デアエセファロースファーストフロウ（DEAE SEPHAROSE(登録商標) Fast Flow））；および弱い陽イオン交換体（例えば、ＣＭセファロースファーストフロウ（CM SEPHAROSE(登録商標) Fast Flow））（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を利用している。陰イオン交換カラムクロマトグラフィーまたは陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、実質的に精製されたポリペプチドを単離するために、精製過程のあらゆる工程において、ポリペプチドに対して実施されてもよい。陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、任意の適切な陽イオン交換基質を用いて実施され得る。陽イオン交換基質としては、例えば、繊維質の、多孔質の、非多孔質の、微小粒状の、ビーズ状の、または架橋された陽イオン交換基質材料が挙げられるが、これらに限定されない。陽イオン交換基質の材料としては、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル、または上記材料のうちのいずれかの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。陽イオン交換基質への当該ポリペプチドの吸着に続いて、実質的に精製されたポリペプチドは、基質からポリペプチドを取り除くために十分高いｐＨ、またはイオン強度を有する緩衝液と接触することによって溶出されてもよい。実質的に精製されたポリペプチドの高いｐＨ溶出に用いるために適した緩衝液としては、特に限定されないが、少なくとも約５ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度範囲のクエン酸塩、リン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、およびＭＥＳ緩衝液が挙げられる。
【０４６３】
（逆相クロマトグラフィー）
この項において開示されている技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドの逆相クロマトグラフィーに適用できる。
【０４６４】
ＲＰ−ＨＰＬＣは当業者に公知の適切な手順に従って、タンパク質を精製するために実施されてもよい。例えば、「Pearsonら, ANAL BIOCHEM.(1982)124:217-230(1982)」、「Riverら, J.CHROM.(1983)268:112-119」、「Kunitaniら, J.CHROM.(1986)359:391-402」を参照のこと。ＲＰ−ＨＰＬＣは実質的に精製されたポリペプチドを単離するために、ポリペプチドに対して実施されてよい。この点に関して、多種多様な長さ（例としては、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ３０まで、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ２０まで、または少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ１８までの長さが挙げられるが、これらに限定されない）を有するアルキル官能基を用いたシリカ誘導体化樹脂が使用され得る。また、ポリマー化樹脂が使用され得る。例えば、スチレンポリマー樹脂である、TosoHaas Amberchrome CG1000sd樹脂が使用され得る。また、多種多様なアルキル鎖を有するシアノ樹脂またはポリマー樹脂が使用され得る。さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムは、溶媒（例えば、エタノール）を用いて洗浄され得る。イオン対化剤および有機緩和剤（例えば、メタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、またはエタノール）を含む適切な溶出緩衝液が、ポリペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣカラムから溶出するために使用され得る。最も一般的に使用されるイオン対化剤（ion pairing agents）の例としては、酢酸、蟻酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロブチル酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。溶出は、分離時間を短縮するため、およびピーク幅を縮小するために好ましい勾配条件を有する、１つ以上の勾配条件または定組成条件を用いて実施され得る。他の方法は、異なる溶媒濃度範囲を有する２つの勾配の使用に関する。本明細書における使用に適した溶出緩衝液の例としては、酢酸アンモニウム溶液およびアセトニトリル溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６５】
（疎水性相互作用クロマトグラフィー精製技術）
この項において開示されている技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドの疎水性相互作用クロマトグラフィー精製に適用できる。
【０４６６】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、本明細書に記載のポリペプチドを精製するために実施されてもよい。そのような技術は、引用によって本明細書に援用される「HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK:PRINCIPLES AND METHODS(カタログ番号18-1020-90,Amersham Biosciences(Piscataway,NJ))」を参照すればよい。適切なＨＩＣ基質の例としては、特に限定されないが、アルキル置換基質、またはアリール置換基質が挙げられる。そのような基質としては、例えば、アガロース、架橋型アガロース、セファロース、セルロース、シリカ、デキストラン、ポリスチレン、ポリ（メタクリレート）充填剤を含む置換ブチル基、置換ヘキシル基、置換オクチル基、または置換フェニル基質（例として、アガロース基質、架橋アガロース基質、セファロース基質、セルロース基質、シリカ基質、デキストラン基質、ポリスチレン基質、ポリ（メタクリレート）基質が挙げられる））、および混合形態の樹脂が挙げられる。混合形態の樹脂としては、例えば、ポリエチレンアミン樹脂、または置換ブチル基もしくは置換フェニル基ポリ（メタクリレート）充填剤が挙げられるが、これらに限定されない。疎水性相互作用クロマトグラフィーに関する市販されている原料の例としては、ハイトラップ（HITRAP（登録商標））、ハイプレップ（HIPREP（登録商標））、およびハイロード(HILOAD(登録商標))カラム（Amersham Biosciences Piscataway,NJ）が含まれるが、これに限定されない。簡単に説明すると、装填の前に、ＨＩＣカラムは、緩衝液（例えば、酢酸溶液／塩化ナトリウム溶液、または硫酸アンモニウムを含むＨＥＰＥＳ）を用いて平衡化されてもよい。硫酸アンモニウムは、ＨＩＣカラムに装填するための緩衝液として用いられてもよい。ポリペプチドの装填の後に、カラムは不要な物質を取り除くための緩衝液を用いて洗浄され得るが、ポリペプチドはＨＩＣカラムに保持されている。ポリペプチドはカラム容積の約３倍から約１０倍の緩衝液（例えば、特に、ＥＤＴＡと平衡化緩衝液より低濃度の硫酸アンモニウムとを含むＨＥＰＥＳ緩衝液、または酢酸／塩化ナトリウム緩衝液）を用いて溶出され得る。例えば、リン酸カリウムを用いた減少直線塩勾配は、ポリペプチド分子の溶出に使用され得る。その後、この溶出物は、例えばダイアフィルトレーション、または限外ろ過といったろ過によって濃縮されてもよい。ダイアフィルトレーションは、ポリペプチドを溶出するために使用される塩を除くために利用され得る。
【０４６７】
（他の精製技術）
この項に開示されている技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドの他の精製技術に適用できる。
【０４６８】
本発明に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドは、ゲルろ過を用いて精製されてもよい。そのような技術は、引用によって本明細書に援用される「GEL FILTRATION:PRINCIPLES AND METHODS(カタログ番号18-1022-18,Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,)」に記載されている。本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用して精製されてもよい。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの好適な基質の例としては特に限定されないが、例えばＨＡウルトロゲルハイリゾリューション（HA-Ultrogel High Resolution(Calbiochem)）、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト（CHT Ceramic Hydroxyapatite(BioRad)）、バイオ−ゲルＨＴＰヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HTP Hydroxyapatite(BioRad)）が挙げられる。また、ＨＰＬＣ、発泡床吸着、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥などは、あらゆる過剰の塩を除去するため、および次の単離工程にとって、もしくは最終的な製剤の剤形にとって好適な緩衝液と交換するために、第一のポリペプチド混合物について、またはその後のそれらのあらゆる混合物について実施されてもよい。実質的に精製されたポリペプチドを含むポリペプチドの収率は、本明細書に記載されるような多種多様な技術を用いて、本明細書に記載されている各工程において観察されてもよい。また、そのような技術は、最後の単離工程の後に、実質的に精製されたポリペプチドの収率を評価するために使用され得る。例えば、ポリペプチドの収率は、様々なアルキル鎖長（例えば、シアノＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ）を有する様々な逆相高圧液体クロマトグラフィーだけでなく、陽イオン交換ＨＰＬＣおよびゲルろ過ＨＰＬＣのいずれかを用いて観察されてもよい。
【０４６９】
純度は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのような技術によって、またはウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイによるポリペプチドの測定によって決定されてもよい。例えば、陰性コントロールの酵母発酵から単離され、続いて陽イオン交換によって回収されたタンパク質に対して、ポリクローナル抗体が生成され得る。抗体は、混入している宿主細胞タンパク質の存在に対するプローブとして使用され得る。
【０４７０】
いくつかの実施形態では、各精製工程の後におけるポリペプチドの収率は、各精製工程の開始物質におけるポリペプチドの、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、または少なくとも約９９．９９％である。
【０４７１】
ＲＰ−ＨＰＬＣ材料であるＶｙｄａｃ  Ｃ４（Vydac）はシリカゲル粒子からなり、その表面はＣ４−アルキル鎖を持つ。タンパク質性の不純物からの非天然アミノ酸のポリペプチドの分離は、疎水性相互作用の強度の差異に基づいている。溶出は、希釈されたトリフルオロ酢酸におけるアセトニトリル勾配によって行われる。調製用のＨＰＬＣは、ステンレススチールカラム（２．８リットルから３．２リットルのＶｙｄａｃ  Ｃ４ゲルで充填されている）によって行われる。ヒドロキシアパタイトウルトロゲル（Hydroxyapatite Ultrogel）溶出物は、添加するトリフルオロ酢酸によって酸性にされ、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４カラムに装填される。トリフルオロ酢酸で希釈されたアセトニトリル勾配が、洗浄および溶出するために用いられる。画分は集められ、直ちにリン酸緩衝液によって中和される。ＩＰＣ制限内のポリペプチド画分はプールされる。
【０４７２】
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基からなるデアエセファロース（DEAE Sepharose(Pharmacia)）基質は、セファロースビーズの表面に共有結合される。ＤＥＡＥ基に対するポリペプチドの結合は、イオン相互作用によって媒介される。アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸は、保持されることなくカラムを通過する。これらの物質が洗い流された後に、残存する不純物は低いｐＨの酢酸緩衝液を用いてカラムを洗浄することによって除去される。その後、カラムは中性のリン酸緩衝液を用いて洗浄され、ポリペプチドは増加したイオン強度を有する緩衝液を用いて溶出される。カラムには、デアエセファロースファーストフロウ（DEAE Sepharose fast flow）が充填されている。カラム容積は、約３ｍｇ〜約１０ｍｇのポリペプチド／ｍｌのゲルの範囲におけるポリペプチドの装填を確実にするために調節される。カラムは、水および平衡化された緩衝液（リン酸ナトリウム／カリウム）によって洗浄される。ＨＰＬＣ溶出物のプールされた画分は装填され、カラムは平衡化された緩衝液を用いて洗浄される。その後、カラムは平衡化された緩衝液による洗浄に続いて、洗浄用の緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）によって洗浄される。続いて、ポリペプチドは溶出用の緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）を用いてカラムから溶出され、主要な溶出プロファイルに従って１つの画分に集められる。デアエセファロース（DEAE Sepharose）カラムの溶出物は、特定の伝導性に調節される。その結果得られる製剤は、テフロン（登録商標）（Teflon）ボトル内に無菌的にろ過され、−７０℃で保存される。
【０４７３】
１つ以上の非天然アミノ酸を有するポリペプチドの収量、および精製度を評価するために多種多様な方法、および手段を使用し得る。そのような方法および手段には、ブラフォードアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシー染色）、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦなど）、およびタンパク質を特徴付けるその他の方法が含まれる。
【０４７４】
付加的な方法としては、特に限定されないが、例えばエンドトキシンを除去する工程が挙げられる。エンドトキシンは、グラム陰性の宿主細胞（例えば、Escherichia coli）の外膜上に位置するリポポリサッカライド（ＬＰＳ）である。エンドトキシンレベルを低減させる方法は、特に限定されないが、シリカ支持体、ガラス粉末、またはヒドロキシアパタイトを用いた精製技術、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびこれらの方法の組み合わせなどが挙げられる。修飾または付加的な方法は、混入物質（例えば、目的のポリペプチドから共に得られるタンパク質）を除去するために必要とされ得る。エンドトキシンレベルを測定する方法は、例えば、リムルスアメーバリセート（Limulus Amebocyte Lysate）（ＬＡＬ）アッセイが挙げられるがこれに限定されない。
【０４７５】
さらなる方法および手順は、例えば、タンパク質染色法と一体となったＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫ブロッティング、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析、調製用等電点電気泳動（isoelectric focusing）、分析陰イオン交換、等電点電気泳動（chromatofocusing）、および円偏光二色性が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７６】
いくつかの実施形態では、一般式Ｉ〜ＸＩで示される化合物、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩで示される化合物および化合物１〜６の範囲に含まれるすべての化合物（一般式Ｉ〜ＸＩで示される化合物、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩで示される化合物および化合物１〜６の範囲に含まれるすべての下位の一般式（subformula）で示される化合物または特定の化合物を含む。）のアミノ酸は、ポリペプチドに組み込まれ、これによって非天然アミノ酸のポリペプチドが作製される。別の実施形態では、当該アミノ酸はポリペプチド内の特定部位に組み込まれる。別の実施形態では、当該アミノ酸は翻訳系によってポリペプチドに組み込まれる。別の実施形態では、当該翻訳系は：（ｉ）上記ポリペプチドをコードし、上記アミノ酸が組み込まれるために予め設計された部位に対応するセレクターコドンを含んでいるポリヌクレオチドと、（ｉｉ）上記アミノ酸を含み、上記セレクターコドンに対して特異的であるｔＲＮＡとを含んでいる。当該翻訳系の別の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは翻訳系において産生されるｍＲＮＡである。当該翻訳系の別の実施形態では、翻訳系は、上記ポリヌクレオチドを含んでいるプラスミドまたはファージを含む。当該翻訳系の別の実施形態では、翻訳系は、上記ポリヌクレオチドを含んでいるゲノムＤＮＡを含む。当該翻訳系の別の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに安定的に組み込まれている。当該翻訳系の別の実施形態では、翻訳系は、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然のコドン、５塩基コドン、および４塩基コドンから成る群より選択されるセレクターコドンに対して特異的なｔＲＮＡを含んでいる。当該翻訳系の別の実施形態では、ｔＲＮＡはサプレッサーｔＲＮＡである。当該翻訳系の別の実施形態では、翻訳系は、上記アミノ酸によってアミノアシル化されたｔＲＮＡを含む。当該翻訳系の別の実施形態では、翻訳系には、ｔＲＮＡに対して特異的なアミノアシルシンテターゼを含む。当該翻訳系の別の実施形態では、翻訳系には直交なｔＲＮＡおよび直交なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む。当該翻訳系の他の実施形態では、ポリペプチドはリボソームによって合成され、さらなる実施形態では翻訳系は、細菌の細胞、古細菌の細胞、および真核細胞から成る群より選択される細胞を含んでいる、インビボの翻訳系である。別の実施形態では、細胞はEscherichia coli細胞、酵母細胞、Pseudomonas種由来の細胞、哺乳類細胞、植物細胞、または昆虫細胞である。当該翻訳系の他の実施形態では、翻訳系は、細菌の細胞、古細菌の細胞、または真核細胞由来の細胞抽出物を含んでいる、インビトロの翻訳系である。他の実施形態では、細胞抽出物は、Escherichia coli細胞、Pseudomonas種由来の細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、植物細胞、または昆虫細胞に由来する。他の実施形態では、少なくとも一部のポリペプチドは、固相ペプチド合成または液相ペプチド合成、もしくはそれらの組み合わせによって合成される。一方、他の実施形態では、ポリペプチドと別のポリペプチドとの連結反応をさらに含む。他の実施形態では、一般式Ｉ〜ＸＩで示される化合物、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩで��される化合物および化合物１〜６の範囲に含まれるすべての化合物（一般式Ｉ〜ＸＩで示される化合物、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩで示される化合物および化合物１〜６の範囲に含まれるすべての下位の一般式で示される化合物または特定の化合物を含む。）のアミノ酸は、ポリペプチドに組み込まれる。上記ポリペプチドは、以下の治療用のタンパク質と相同なタンパク質である：すなわち、治療用のタンパク質は、アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、試験ステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンから成る群より選択される。
【０４７７】
Ｂ．インビボにおける翻訳後修飾
真核細胞において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する目的のポリペプチドを製造した場合、当該ポリペプチドは真核細胞の翻訳後修飾を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含み、かつ少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。なお、翻訳後修飾は、原核細胞によってなされず、真核細胞によってインビボにおいてなされる。例えば、翻訳後修飾としては、特に限定されないが、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質が連結する修飾、グリコシル化などが挙げられる。一態様において、翻訳後修飾には、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン連結による、オリゴサッカライド（例えば、（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃが挙げられるが、これに限定されない）とアスパラギンとの結合を含む。真核細胞のタンパク質にＮ−連結したオリゴサッカライドについて、いくつかの例を記載した表１を参照のこと（別の残基も存在し得るが、示されていない）。別の態様において、翻訳後修飾には、ＧａｌＮＡｃセリン連結、もしくはＧａｌＮＡｃトレオニン連結、またはＧｌｃＮＡｃセリン連結、もしくはＧｌｃＮＡｃトレオニン連結による、オリゴサッカライドのセリン、またはトレオニンへの結合を含む。上記オリゴサッカライドには、限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどが挙げられる。
【０４７８】
【表２】
2010514808.tif 000033
【０４７９】
さらに別の態様において、翻訳後修飾は、前躯体（例えば、これらに限定されないが、カルシトニン前躯体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前躯体、プレプロパラチロイドホルモン、プレプロインスリン、プロインスリン、プレプロ−オピオメラノコルチン（prepro-opiomelanocortin）、プロ−オピオメラノコルチン（pro-opiomelanocortin）など）のタンパク質分解プロセシング、マルチサブユニットタンパク質への集合または高分子集合、細胞内の別の部位への翻訳（例えば、小胞体、ゴルジ体、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞小器官、または分泌経路を経由することもあるが、これらに限定されない）を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、分泌配列、もしくは局在性配列、エピトープ標識、ＦＬＡＧ標識、ポリヒスチジン標識、またはＧＳＴ融合などを含む。
【０４８０】
非天然アミノ酸の利点の１つは、非天然アミノ酸には付加分子を付加するために用いられ得る、付加的な化学部分が存在することである。これらの修飾は、真核細胞、または非真核細胞のインビボにおいて、またはインビトロにおいて行われ得る。このように、いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は非天然アミノ酸を介して生じる。例えば、翻訳後修飾は求核−求電子反応によってなされる。多くの反応は、一般に求核反応パートナーと求電子反応パートナーとの間の共有結合形成（特に限定されないが、α−ケモカインと、ヒスチジン側鎖またはシステイン側鎖との反応）を含むタンパク質の選択的修飾のために利用される。これらの場合における選択性は、タンパク質における求核性の残基の数、および近接性によって決定される。本明細書に記載のポリペプチド、または本明細書に記載の方法を用いて作製されたポリペプチドにおいて、より選択的な他の反応を用いることができる。そのような反応としては、特に限定されないが、インビトロ、およびインビボにおける、非天然ケトアミノ酸と、ヒドラジドまたはアミノオキシ化合物との反応が挙げられる。例えば、「Cornishら, (1996)J.Am.Chem.Soc.,118:8150-8151」、「Mahalら, (1997)Science,276:1125-1128」、「Wangら(2001) Science,292:498-500」、「Chinら, (2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027」、「Chinら, (2002)Proc.Natl.Acad.Sci.,99:11020-11024」、「Wangら, (2003)Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61」、「Zhangら, (2003)Biochemistry42:6735-6746」、および「Chinら, (2003) Science,301:964-967」を参照のこと。これによれば、多くの試薬（蛍光団、架橋剤、サッカライド誘導体、および細胞毒性分子など）によって、実質的にあらゆるタンパク質を選択的に標識することができる。また、「Glycoprotein synthesis」と題された米国特許出願第１０／６８６，９４４号明細書（２００３年１月１６日出願）も参照のこと（なお、上記特許文献は参照によって本明細書に援用される）。また、翻訳後修飾（アジドアミノ酸を介した翻訳後修飾など）を、シュタウディンガーライゲーションによって（例えば、トリアリールホスフィン試薬を用いて）作製することができる。例えば、「Kiickら, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99(1):19-24」を参照のこと。
【０４８１】
＜ＩＸ．非天然アミノ酸のポリペプチドを製造するための代替系＞
いくつかの方策が、非組み換え宿主細胞、突然変異を起こした宿主細胞、または無細胞系においてタンパク質に非天然アミノ酸を組み込むために採用されている。この項に開示されている代替系は、本明細書中に記載の非天然アミノ酸の製造に任意に適用することができる。一例として、例えば、Ｌｙｓ、ＣｙｓおよびＴｙｒなどの反応性側鎖を有するアミノ酸を誘導体化することによって、リジンがＮ２−アセチル−リジンに変化する。また、化学合成は、非天然アミノ酸を組み込むための簡易な方法を提供する。酵素ライゲーションおよびペプチド断片の天然の化学ライゲーションにおける近年の発展によれば、より大きなタンパク質を作ることが可能である。例えば、「P.E.Dawson and S.B.H.Kent,Annu.Rev.Biochem.,69:923(2000)」を参照のこと。化学的ペプチドライゲーションおよび天然の化学ライゲーションは、米国特許出願６，１８４，３４４号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１３８４１２号明細書、米国特許出願公開第２００３／０２０８０４６号明細書、国際公開第０２／０９８９０２号パンフレットおよび国際公開第０３／０４２２３５号パンフレットに記載されており、これらは本明細書において参照によって援用される。所望の非天然アミノ酸によって化学的にアセチル化されるサプレッサーｔＲＮＡが、タンパク質合成を補助することが可能な抽出物に、インビトロにおいて付加されるような、一般的なインビトロにおける生合成方法は、実質的にあらゆるサイズの様々なタンパク質に１００を超える非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むために利用されている。例えば、「V.W.Cornish,D.Mendel and P.G.Schultz,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,1995,34:621-633(1995)」、「C.J.Noren,S.J.Anthony-Cahill,M.C.Griffith,P.G.Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244 182-188(1989)」および「J.D.Bain,C.G.Glabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide,J.Am.Chem.Soc.111 8013-8014(1989)」を参照のこと。広範囲の官能基が、タンパク質の安定性、タンパク質の折りたたみ、酵素機序、およびシグナル伝達の研究用のタンパク質に導入される。
【０４８２】
選択圧力組込み（selective pressure incorporation）と呼ばれるインビボにおける方法は、野生型シンテターゼの無差別さを利用するために開発された。例えば、「N.Budisa,C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger,F.M.Dong,L.Moroder and R.Huber,FASEB J.,13:41-51(1999)」を参照のこと。細胞に特定の天然アミノ酸を供給する適切な代謝経路が断たれている栄養要求性株は、制限された濃度の天然アミノ酸を含む最少培地において培養されると同時に、標的遺伝子の転写が抑制されている。安定した増殖期の開始において、天然アミノ酸が使い果たされて、非天然アミノ酸の類似体と置き換えられる。組換えタンパク質の発現誘導は、結果として、非天然の類似体を含むタンパク質の蓄積を生じる。例えば、この方策を用いて、ｏ、ｍ、およびｐ−フルオロフェニルアラニンが、タンパク質に組み込まれ、容易に同定され得るＵＶスペクトルにおける２の特徴的な肩を示し（例えば、「C.Minks,R.Huber,L.Moroder and N.Budisa,Anal.Biochem.,284:29-34(2000)」を参照のこと）、トリフルオロメチオニンは、１９Ｆ  ＮＭＲによってチトオリゴサッカライドリガンドとの相互作用を研究するためのバクテリオファージＴ４リソザイムにおいて、メチオニンとの置き換えに使用され（例えば、「H. Duewel,E. Daub,V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404-3416(1997) 」を参照のこと）、トリフルオロロイシンがロイシンの代わりに組み込まれた結果として、ロイシンジッパータンパク質の向上した熱安定性および化学安定性を生じる（例えば、「Y. Tang,G. Ghirlanda,W. A. Petka,T. Nakajima,W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 40(8):1494-1496(2001) 」を参照のこと）。さらに、セレノメチオニンおよびテルロメチオニンは、様々な組換えタンパク質に組み込まれて、Ｘ線結晶学における相の溶解を容易にする。例えば、「W.A.Hendrickson,J.R.Horton and D.M.Lemaster,EMBO J,9(5):1665-1672(1990)」、「J.O.Boles,K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom,B.Dunlap,L.Lebioda and M.Hatada,Nat.Struct.Biol.,1:283-284(1994)」、「N.Budisa,B.Steipe,P.Demange,C.Eckerskorn,J.Kellermann and R.Huber,Eur.J.Biochem.,230:788-796(1995)」、および「N.Budisa,W.Kambrock,S.Steinbacher,A.Humm,L.Prade,T.Neuefeind,L.Moroder and R.Huber,J.Mol.Biol.,270:616-623(1997)」を参照のこと。また、アルケンまたはアルキン官能基を有するメチオニン類似体は効率的に取り込まれ、化学的方法によってタンパク質のさらなる修飾を可能にする。例えば、「J.C.M.vanHest and D.A.Tirrell,FEBS Lett.,428:68-70(1998)」、「J.C.M.van Hest,K.L.Kiick and D.A.Tirrell,J.Am.Chem.Soc.,122:1282-1288(2000)」および「K.L.Kiick and D.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487-9493(2000)」、米国特許出願第６，５８６，２０７号明細書、米国特許出願公開第２００２／００４２０９７号明細書を参照のこと（なお、これらは引用によって本明細書に援用される）。
【０４８３】
この方法の成功は、通常、タンパク質翻訳の忠実度を保障するために高い選択性を要求するアミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼによる、非天然アミノ酸類似体の認識に依存する。この方法の範囲を拡張する１つの方法は、アミノアシル‐ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性を緩和することであるが、このことが達成された事例の数は限られていた。例えば、Escherichia coliのフェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）におけるＡｌａ２９４をＧｌｙで置き換えることによって、基質結合ポケットの大きさが向上し、その結果、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によってｔＲＮＡＰｈｅがアシル化されることになる。「M.Ibba,P.Kast and H.Henecke,Biochemistry,33:7107-7112(1994)」を参照のこと。この突然変異体ＰｈｅＲＳを含むEscherichia coli株は、フェニルアラニンの代わりにｐ−Ｃｌ−フェニルアラニンまたはｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンの組み込みを可能にする。例えば、「M.Ibba and H.Hennecke,FEBS Lett.,364:272-275(1995)」および「N.Sharma,R.Furter,P.Kast and D.A.Tirrell,FEBS Lett.,467:37-40(2000)」を参照のこと。同様に、Escherichia coliのチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位に近い、Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒの点突然変異体は、チロシンよりもアザチロシンが高効率に組み込まれることを可能にする。「F.Hamano-Takaku,T.Iwama,S.Saito-Yano,K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.Soll and S.Nishimura,J.Biol.Chem.,275(51):40324-40328(2000)」を参照のこと。
【０４８４】
インビボにおいて非天然アミノ酸をタンパク質に組み込む他の方策は、校正機構を有するシンテターゼを改変することである。これらのシンテターゼは、識別が不可能なので、同種の天然アミノ酸と構造的に類似しているアミノ酸を活性化する。この誤りは、タンパク質翻訳の忠実度を維持するために、ｔＲＮＡから間違って入ったアミノ酸を脱アシル化する別の部位において補正される。シンテターゼの校正活性が無効であれば、誤って活性化される構造的な類似体は、校正機能を逃れて組み込まれ得る。この方法は、近年、ｖａｌｙｌ−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶａｌＲＳ）を用いて証明されている。例えば、「V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle,T.L.Hendrickson,V.de Crecy-Lagard,P.Schimmel and P.Marliere,Science,292:501-504(2001)」を参照のこと。ＶａｌＲＳは、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、またはアミノブチレート（Ａｂｕ）を用いてｔＲＮＡｖａｌを誤ってアミノアシル化し、これらの非同種のアミノ酸は、続いて校正領域によって加水分解される。Escherichia coli染色体のランダム変異誘発の後に、ＶａｌＲＳの校正部位に突然変異を有するEscherichia coli突然変異株が、選択される。この校正に欠損のあるＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡＶａｌにＣｙｓを間違って入れる。Ａｂｕは構造的にＣｙｓ（Ａｂｕでは、Ｃｙｓの‐ＳＨ基が‐ＣＨ３と置換されている）と似ているので、ＶａｌＲＳ突然変異体はまた、この突然変異体がＡｂｕ存在下において増殖されるとき、タンパク質にＡｂｕを組み込む。質量分析によって、約２４％のバリンが本来のタンパク質におけるバリンの位置おいて、Ａｂｕによって置換されていることが示された。
【０４８５】
また、固相合成法および半合成法は、新規のアミノ酸を含む数多くのタンパク質の合成を可能にする。例えば、以下の刊行物：「Crick,F.J.C,Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin,R.General nature of the genetic code for proteins.Nature,192(4809):1227-1232(1961)」、「Hofmann,K.,Bohn,H.Studies on polypeptides XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment,J.Am Chem.,88(24):5914-5919(1996)」、「Kaiser,E.T.Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins includeing enzymes,Acc Chem Res,22(2):47-54(1989)」、「Nakatsuka,T.,Sasaki,T.,Kaiser,E.T.Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin,J Am Chem Soc,109:3808-3810(1987)」、「Schnolzer,M.,Kent,S B H.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides:backbone-engineered HIV protease,Sience,256,221-225(1992)」、「Chaiken,I.M.Semisynthetic peptides and proteins,CRC Crit Rev Biochem,225-301(1981)」、「Offord,R.E.Protein engineering by chemical means? Protein Eng.,1(3):151-157(1987)」、および「Jackson,D.Y.,Burnier,J.,Quan,C.,Stanley,M.,Tom,J.,Wells,J.A.A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues,Science,266,243-247(1994)」、および上記刊行物で引用されている参考文献を参照のこと。
【０４８６】
化学的な修飾は、補助因子、スピン標識、およびオリゴヌクレオチドを含む様々な非天然の側鎖を、インビトロにおいてタンパク質に導入するために使用される。例えば、「Corey,D.R.,Schulz,P.G.Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease,Science,238:1401-1403(1987)」、「Kaiser,E.T.,Lawrence D.S.,Rokita,S.E.The chemical modificaion of enzymatic specificity,Annu.Rev Biochem,54:565-595(1985)」、「Kaiser,E.T., Lawrence D.S.Chemical mutation of enzyme active sites,Science,226,505-511(1984)」、「Neet,K.E.,Nanci A,Koshland,D.E.Properties of thiol-subtilisin,J Biol.Chem,243(24):6392-6401(1968)」、「Polger,L.B.,M.L.A new enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc,88(13):3153-3154(1966)」、および「Pollack,S.J.,Nakayama,G.Schultz,P.G.Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites,Science,l(242):1038-1040(1988)」を参照のこと。
【０４８７】
また、化学修飾されたアミノアシル−ｔＲＮＡｓを利用する生物合成方法は、インビトロにおいて合成されたタンパク質に、いくつかの生物物理的プローブを組み込むために用いられている。以下の刊行物：「Brunner, J.New Photolabeling and crosslinking methods,Annu.Rev Biochem,483-514(1993)」、および「Krieg,U.C.,Walter,P.,Hohnson,A.E.Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle,Proc.Natl.Acad.Sci,83,8604-8608(1986)」、および該刊行物において引用されている参考文献を参照のこと。
【０４８８】
これまで、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを、所望のアンバーナンセンス突然変異を含む遺伝子を用いてプログラムされたタンパク質合成反応に加えることによって、非天然アミノ酸が、インビトロにおいてタンパク質に、部位特異的に組み込まれ得ることが示されている。これらの試みによって、２０の一般アミノ酸の多くを、構造的に近縁な相同物に置換することができる（例えば、特定のアミノ酸について栄養要求性の株を用いて、フェニルアラニンをフルオロフェニルアラニンに置換することができる）。例えば、「Noren,C.J.,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.,Schultz,P.G.A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244: 182-188(1989) 」、「M.W.NowakらScience268:439-42(1995)」、「Bain,J.D.,Glabe,C.G.,Dix,T.A.,Chamberlin,A.R.,Diala,E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide,J.Am Chem Soc,111:8013-8014(1989)」、「N.BudisaらFASEB J.13:41-51(1999)」、「Ellman,J.A.,Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.,Noren,C.J.,Schultz,P.G.Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins,Methods in Enz.,202,301-336(1992)」、および「Mendel,D.,Cornish,V.W.& Schultz,P.G.Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code,Annu Rev Biophys.Biomol Struct.24,435-62(1995)」を参照のこと。
【０４８９】
例えば、終止コドン（ＵＡＧ）を認識するサプレッサーｔＲＮＡが調製されて、該サプレッサーｔＲＮＡが、非天然アミノ酸によって化学的にアミノアシル化された。従来の部位特異的突然変異誘発法は、終止コドン（ＴＡＧ）を、タンパク質の遺伝子における興味部位に導入するために使用される。例えば、「Sayers, J.R.,Schmidt,W.Eckstein, F. 5’3’ Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3):791-802 (1988)」を参照のこと。アシル化されたサプレッサーｔＲＮＡと突然変異遺伝子とが、インビトロにおける転写／翻訳系に組み合わせられたとき、非天然アミノ酸は、特定位置にそのアミノ酸を含んでいるタンパク質を生じさせるＵＡＧコドンに応じて組み込まれた。〔３Ｈ〕−Ｐｈｅを用いた実験、およびα−ヒドロキシ酸による実験は、望ましいアミノ酸のみがＵＡＧコドンによって特定された部位で取り込まれ、このアミノ酸がタンパク質中のどの別の部位でも取り込まれることはないことを実証した。例えば、「上記Ｎｏｒｅｎら」、「Kobayashiら(2003)Nature Structural Biology 10(6):425-432」、および「Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.G.Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins,Science,255,197-200(1992)」を参照のこと。
【０４９０】
マイクロインジェクション技術は、タンパク質への非天然アミノ酸の組み込みに用いられている。例えば、「M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks,C.G.Labarca,S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz,D.A.Dougherty and H.A.Lester,Science,268:439-442(1995)」、および「D.A.Dougherty,Curr.Opin.Chem.Biol.,4:645(2000)」を参照のこと。ゼノプスの卵母細胞は、インビトロにおいて作製された２種類のＲＮＡとともに取り込まれた。そのようなＲＮＡとは、興味のあるアミノ酸位置にＵＡＧ終止コドンを有する標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および所望の非天然アミノ酸によってアミノアシル化されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡである。卵母細胞の翻訳機構は、ＵＡＧによって特定される位置に非天然アミノ酸を挿入する。この方法によって、インビトロ発現系では通常には受け容れられない、膜タンパク質全体のインビボにおける構造的−機能的研究が可能になる。例えば、限定されないが、蛍光共鳴エネルギー移動によって距離を測るための、タキキニン  ニューロキニン−２受容体に対する蛍光性アミノ酸の組み込み（例えば、「G.Turcatti,K.Nemeth,M.D.Edgerton,U.Meseth,F.Talabot,M.Peitsch,J.Knowles,H.Vogel and A.Chollet,J.Biol.Chem.,271(33):19991-19998(1996)」を参照のこと）、イオンチャンネルにおける表面露出残基を同定するためのビオチニル化アミノ酸の組み込み（例えば、「J.P.Gallivan,H.A.Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4(10):739-749(1997)」を参照のこと）、実時間におけるイオンチャンネルの立体構造変化を観察するための、ケージ化チロシン類似体の利用（例えば、「J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty and H.A.Lester,Neuron,20:619-624(1998)」を参照のこと）、および、ゲート開閉機序の精査のために、イオンチャネル骨格を変化させるための、アルファヒドロキシアミノ酸の使用（例えば、「P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96:89-98 (1999) 」、および「T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci., 4(3):239-246 (2001)」を参照のこと）が挙げられる。
【０４９１】
インビボにおいて、非天然アミノ酸をタンパク質へ直接組み込むための能力は、高収量の変異体タンパク質、技術的な簡便性、細胞もしくは可能であるのなら生物の細胞における突然変異タンパク質を研究するための能力、および薬物治療におけるこれら突然変異タンパク質の利用といった様々な利点を提供する。様々な大きさ、酸性度、求核性、疎水性、および他の性質を有する非天然アミノ酸をタンパク質に含める能力は、タンパク質の機能を精査し、且つ新規な性質を有する新しいタンパク質または組織を作り出すような、タンパク質の構造を合理的かつ体系的に操作する能力を、著しく拡大することができる。
【０４９２】
パラ−Ｆ−Ｐｈｅを部位特異的に組み込むための１つの試みでは、酵母のアンバーサプレッサーｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ対が、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ耐性、Ｐｈｅ栄養要求株であるEscherichia coli株に用いられた。例えば、「R.Furter,Protein Sci.,7:419-426(1998)」を参照のこと。
【０４９３】
また、無細胞（インビトロにおいて）翻訳系を用いて、所望のポリヌクレオチドの発現を得ることが可能であってもよい。鋳型としてｍＲＮＡ（インビトロ翻訳）、または鋳型としてＤＮＡ（インビトロ転写とインビトロ翻訳との組み合わせ）のいずれかを含むことができるこれらの系において、インビトロ合成はリボソームによって管理される。相当な労力が無細胞タンパク質発現系の開発に注がれている。例えば、引用によって本明細書に援用される、「Kim,D.-M.and J.R.Swartz,Biotechnology and Bioengineering,74(4):309-316(2001)」、「Kim,D.-M.and J.R.Swartz,Biotechnology Letters,22,1537-1542,(2000)」、「Kim,D.-M.and J.R.Swartz,Biotechnology Progress,16,385-390,(2000)」、「Kim,D.-M.and J.R.Swartz,Biotechnology and Bioengineering,66(3):180-188,(1999)」、および「Patnaik,R.and J.R.Swartz,Biotechniques 24(5):862-868,(1998)」、米国特許第６，３３７，１９１号明細書、米国特許出願公開第２００２／００８１６６０号明細書、国際公開第００／５５３５３号パンフレット、国際公開第９０／０５７８５号パンフレットを参照のこと。非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド発現に適用され得る別のアプローチは、限定されないが、ｍＲＮＡ−ペプチド融合技術を含む。例えば、「R.Roberts and J.Szostak,Proc.Natl Acad.Sci.(USA)94 12297-12302(1997)」、「A.FrankelらChemistry&Biology 10,1043-1050(2003)」を参照のこと。このアプローチにおいて、ピューロマイシンと連結するｍＲＮＡの鋳型は、リボソーム上のペプチドへ翻訳される。例えば、１つ以上のｔＲＮＡ分子が修飾されている場合、非天然アミノ酸もまたペプチドに組み込まれ得る。最後のｍＲＮＡコドンが読み取られた後に、ピューロマイシンは当該ペプチドのＣ−末端を捕捉する。例えば、生じたｍＲＮＡ−ペプチド接合体が、インビトロアッセイにおいて関連する性質を有することが見られるとき、その個性はｍＲＮＡ配列から容易に明らかにされ得る。このようにして、所望の性質を有するポリペプチドを同定するために、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドのライブラリーをスクリーニングしてもよい。つい最近、精製成分を用いたインビトロリボソーム翻訳が、非天然アミノ酸で置換されたペプチドの合成を可能にすることが報告されている。例えば、「A.ForsterらProc.Natl Acad.Sci.(USA)100(11):6353-6357(2003)」を参照のこと。
【０４９４】
＜Ｘ．ポリペプチドの非天然アミノ酸成分の翻訳後修飾＞
便宜上、本項に記載するポリペプチドの非天然アミノ酸成分の翻訳後修飾を、一般的におよび／または具体例を用いて説明する。ただし、本項に記載するポリペプチドの非天然アミノ酸成分の翻訳後修飾は、本項中の一般的な記載または具体例のみに限定されず、本明細書、請求項、および図面中に記載された一般式Ｉ〜Ｘで示される化合物、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶで示される化合物、一般式ＸＸＸＶＩＩで示される化合物、および構造１〜６を有する化合物の範囲に含まれるすべての化合物（一般式Ｉ〜Ｘで示される化合物、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶで示される化合物、一般式ＸＸＸＶＩＩで示される化合物、および構造１〜６を有する化合物の範囲に含まれるすべての下位の一般式で示される化合物または特定の化合物を含む。）に対しても同様に行うことができる。
【０４９５】
方法、組成物、技術および方策は、インビボにおけるタンパク質の翻訳中に、非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むために開発されている。天然アミノ酸の側鎖の化学的性質に対して直交する化学的性質の側鎖を有する非天然アミノ酸を組み込むことによって、この技術は、組換えタンパク質の部位特異的な誘導体化を可能にさせる。結果として、本明細書に記載の方法、組成物、技術および方策の主な利点としては、誘導体化されたタンパク質が、規定された均質な生成物として、調製され得ることである。しかしながら、本明細書に記載の方法、組成物、反応混合物、技術および方策は、インビボにおけるタンパク質翻訳技術によって形成される非天然アミノ酸のポリペプチドに限定されず、例えば、発現したタンパク質のライゲーション、化学合成、リボザイムを基本とする技術（例えば、本明細書の「代替系における発現」と表題される項を参照のこと）などの、いかなる技術によって形成される非天然アミノ酸のポリペプチドをも含む。
【０４９６】
組換えタンパク質へ非天然アミノ酸を組み込むことができることは、インビトロ、またはインビボどちらかにおいて起こる翻訳後の誘導体化のために実施される化学反応を、多様化する。
【０４９７】
より具体的には、ポリペプチド内の非天然アミノ酸の部位において、フェナジン連結またはキノキサリン連結を形成する、１，２−ジカルボニルと１，２−アリールジアミンとの反応を利用した、ポリペプチドの誘導体化は、いくつかの利点を提供する。まず第１に、天然に生じるアミノ酸は、（ａ）１，２−アリールジアミン基と反応することによってフェナジンあるいはキノキサリン連結を形成することができる１，２−ジカルボニル基を含まない。また、（ｂ）１，２−ジカルボニル基と反応することによってフェナジン連結またはキノキサリン連結を形成することができる１，２−アリールジアミン基を含まない。したがって、このような連結を形成するように作られた試薬は、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分と部位特異的に反応することがある（言うまでもなく、非天然アミノ酸および対応する試薬は、こうした連結を形成するように作られていることを想定する）。よって、タンパク質を部位特異的に誘導体化する能力は、既知の方法によって製造された、誘導体化されたタンパク質の混合物とは対照的に、単一の均質製品を提供することができる。第２に、このようなフェナジン連結またはキノキサリン連結は、生物学的環境下で安定である。これは、このような連結によって誘導体化されたタンパク質が、治療への応用にとって有効な候補であるということを示唆している。第３に、得られたフェナジン連結またはキノキサリン連結の安定性は、当該連結が形成された非天然アミノ酸の固有性（例えば、官能基および／または構造）に基づいて操作することができる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドに生じたフェナジン連結またはキノキサリン連結の分解半減期は、１時間未満であり、別の実施形態では１日未満であり、別の実施形態では２日未満であり、別の実施形態では１週間未満であり、別の実施形態では１週間よりも長い。さらに別の実施形態では、生じたフェナジン連結またはキノキサリン連結は、弱酸性の環境下で少なくとも２週間安定している。さらに別の実施形態では、生じたフェナジン連結またはキノキサリン連結は、弱酸性の環境下で少なくとも５日間安定している。別の実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは約２〜約８のｐＨにおいて少なくとも１日間安定しており、別の実施形態では、約２〜約６のｐＨで少なくとも１日間安定しており、別の実施形態では、約２〜約４のｐＨにおいて、少なくとも１日間安定している。別の実施形態では、本明細書に記載の方策、方法、組成物および技術を用いた、非天然アミノ酸のポリペプチドへのフェナジン連結またはキノキサリン連結の合成において、分解半減期を、例えば、治療上の使用（例えば、持続放出）、診断上の使用、産業上の使用、または軍事上の使用などの状況によって、変更してもよい。
【０４９８】
上述した非天然アミノ酸のポリペプチドは、特に限定されないが、新規治療、診断、触媒酵素、工業用酵素、および結合タンパク質（抗体および抗体断片が挙げられるが、これに限定されない）に有用であるとともに、タンパク質の構造や機能の研究などに有用である。例えば、「Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4:645-652」を参照のこと。上述した非天然アミノ酸のポリペプチドに関する別の使用としては、アッセイに基づく使用、化粧品への使用、植物生物学的使用、環境への使用、エネルギー生産への使用および／または軍事上の使用が挙げられる。また一方、上述した非天然アミノ酸のポリペプチドは、新たな、または修飾された官能基を組み込むために、さらなる修飾を受けることができる。この官能基としては、ポリペプチドの治療有効性の操作、ポリペプチドの安全プロフィールの改善、ポリペプチドの薬物動態学的性質、薬理学的性質および／または薬力学的性質の調節（例えば、水溶性の増加、バイオアベイラビリティ、血中半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調節、生物学的な活性の調節、または循環時間の延長）、ポリペプチドへのさらなる官能基の提供、ポリペプチドへのタグ、標識、または検出可能なシグナルの組み込み、ポリペプチドの単離性質の緩和、および上述した修飾のいずれかの組み合わせが挙げられる。
【０４９９】
ある実施形態では、ポリペプチドの単離性質を緩和する方法は、フェナジンを含んでいる非天然アミノ酸、キノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸、ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸、およびアリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸から成る群より選択される非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいる、相同的に生合成された非天然アミノ酸のポリペプチドを利用する工程を含んでいる。他の実施形態では、このような非天然アミノ酸は、本明細書に記載されているように、生合成的にポリペプチドへ組み込まれる。さらなる、あるいは他の実施形態では、このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、一般式Ｉ〜ＸＩおよび一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩで示されるアミノ酸および化合物１〜６のアミノ酸から選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる。
【０５００】
本明細書に記載の方法、組成物、方策および技術は、ポリペプチドの、特定のタイプ、クラス、あるいはファミリーに限定されるものではない。実際に、事実上すべてのポリペプチドが、本明細書に記載の少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでもよい。単なる一例として、ポリペプチドは：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スー���ーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、試験ステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンから成る群より選択される治療タンパク質と相同であり得る。また、非天然アミノ酸のポリペプチドは、成長ホルモン超遺伝子族の任意のポリペプチドのメンバーと相同であってもよい。
【０５０１】
上記修飾には、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分へのさらなる官能基の組込みを含んでいる。このような官能基としては、例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギー伝達剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５０２】
さらに、非天然アミノ酸のポリペプチドは、他の官能基へ変換可能な部分を含んでいてもよい。このような官能基としては、例えば、カルボニル、ジカルボニル、ヒドロキシルアミン、またはアリールジアミンが挙げられる。図１９は、非天然アミノ酸のポリペプチドから、ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドおよびアリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドへの化学変換を示している。得られたジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドおよびアリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを製造、精製、特徴づけ、および利用するためのすべての方法、組成物、技術、および方策に利用されるか、または組み込まれる。化学部位の他の官能基（一例として、ジカルボニルまたはアリールジアミンが挙げられる）への化学変換は、既知の方法によって行うことができる。既知の方法として、例えば、「ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 5th Ed.,(Wiley 2001)」や「Carey and Sundberg, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4th Ed., Vols.A and B(Plenum 2000,2001)」が挙げられる。
【０５０３】
さらに、アリールジアミンを含んでいる試薬を用いた、ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドの化学修飾は、適当な励起状態下において、強蛍光性フェナジンおよびキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを精製するのに利用することができる。また、ジカルボニルを含んでいる試薬と反応させたアリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドも、適当な励起状態下において、強傾向性フェナジンおよびキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを精製するのに利用することができる。
【０５０４】
本明細書に記載の方法および組成物の一態様では、組成物は、翻訳後修飾されている非天然アミノ酸を、特に限定されないが、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０つ、またはそれ以上を有するポリペプチドを少なくとも１つ含んでいる。翻訳後修飾された非天然アミノ酸は、同一であっても異なっていてもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の異なる翻訳後修飾された非天然アミノ酸を含んでいる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の異なる場所が、ポリペプチドに存在し得る。別の態様では、組成物は、ポリペプチドに存在する特定のアミノ酸の少なくとも１つ（ただし、全てではない）が、翻訳後修飾された非天然アミノ酸と置き換えられているポリペプチドを含んでいる。翻訳後修飾された非天然アミノ酸を１つ以上有する、特定のポリペプチドに関しては、翻訳後修飾された非天然アミノ酸は、全く同一であてもよいし、または異なっていてもよい（ポリペプチドが、２つ以上の異なる種類の翻訳後修飾された非天然アミノ酸を含んでいてもよいし、また、２つ以上の同一の翻訳後修飾された非天然アミノ酸を含んでいてもよい）。２つ以上の翻訳後修飾された非天然アミノ酸を有する特定のポリペプチドに関しては、翻訳後修飾された非天然アミノ酸は同一であってもよいし、異なっていてもよいし、または、同じ種類の複数の翻訳後修飾された非天然アミノ酸と、少なくとも１つの異なる翻訳後修飾された非天然アミノ酸との組み合わせであってもよい。
‐Ａ．非天然アミノ酸のポリペプチドを翻訳後修飾する方法：フェナジンおよびキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドの合成‐
キノキサリンまたはフェナジン基を有する非天然アミノ酸は、１，２−アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸と１，２−ジカルボニルを含んでいる試薬との反応、または１，２−ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸と１，２−アリールジアミンを含んでいる試薬との反応のいずれかによって生成される。これらの試薬はさらに分子に結合していてもよく、この分子は、以下に示すものから成る群より選択される：標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギー伝達剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；およびこれらの任意の組合せ。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸はポリペプチドに組み込まれており、この場合、適当な試薬との反応後に、ポリペプチドと関連分子との間に、キノキサリン連結またはフェナジン連結を介して接合体が形成される。
【０５０５】
一態様は、構造１〜６を有する少なくとも１つのアミノ酸を含んでいるポリペプチドを製造する方法である。
【０５０６】
【化３０】
2010514808.tif 000034
【０５０７】
上記方法は、上記構造１〜６を有する少なくとも１つのアミノ酸を、上記ポリペプチドの末端または内部に組み込む工程を含んでおり、
Ａは任意に、存在する場合に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、一方の末端においてフェナジンを含んでいる部分またはキノキサリンを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
該リンカーは、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−から成る群より選択され、ｋは１、２、または３であり、Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｘは−Ｃ（Ｒ５）（Ｒ５）−、−ＮＲ５−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり；
Ｙは−ＣＲ５−または−Ｎ−であり；
ｎは０、１、２、３、または４であり；
ｍは０、１、２、３、または４であり；ｍ＋ｎは１、２、３、または４であり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、または置換低級アルキルであるか、あるいはＲ３およびＲ４または２つのＲ３基は、必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ”、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２、または−Ｌ−Ｚであるか；あるいは、
２つのＲ５基は、必要に応じて一緒になって、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールを形成し；
Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、保護基、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、（または）置換アラルキルであるか、あるいは２つ以上のＲ”が存在する場合に、２つのＲ”は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールを形成し；
Ｚは、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補助因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、核酸、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分、光異性化可能な部分、ビオチン、ビオチンの類似体、重原子を組み込んでいる部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、伸長した側鎖、炭素連結した糖、酸化還元活性化剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識されている部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、インターカレートする基、発色団、エネルギー伝達剤、生物学的に活性な剤、検出可能な標識、薬物伝達剤、電子伝達剤、ホルモン、ステロイド、酵素、ビタミン、栄養剤、栄養補助剤、免疫グロブリン、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、ヌクレアーゼ、インスリン、腫瘍抑制因子、血漿タンパク質、ホルモンもしくはホルモン類似体、ワクチン、抗原、血液凝集因子、成長因子、リボザイム、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択され；
Ｌは任意に、結合、アルキレン、置換アルキレン、シクロアルキレン、置換シクロアルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、ヘテロアルキレン、置換へテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、置換アラルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＳ−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＳ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ’）−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、または−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−であり；
ｋは０、１または２であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであるか；
あるいは、−Ａ−Ｂ−フェナジンまたはキノキサリンを含んでいる部分の基は一緒になって、少なくとも１つのキノキサリン基またはフェナジン基を含んでいる、置換されているかまたは置換されていない、二環または三環の、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールを形成するか；
あるいは、−Ｂ−フェナジンまたはキノキサリンを含んでいる部分の基は一緒になって、少なくとも１つのキノキサリン基またはフェナジン基を含んでいる、置換されているかまたは置換されていない、単環または二環の、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールを形成する。
【０５０８】
一実施形態では、Ｚは、水溶性ポリマー；ポリアルキレンオキシド；ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；少なくとも１つのアミノ酸；少なくとも１つの糖類；少なくとも１つのヌクレオチド；少なくとも１つのヌクレオシド；リガンド；ビオチン；ビオチンの類似体；検出可能な標識；およびそれらの任意の組合せから選択される。
【０５０９】
一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸を含んでいるポリペプチドを製造する方法である。構造１〜６は構造７〜１２に相当する。
【０５１０】
【化３１】
2010514808.tif 000035
【０５１１】
上記方法は、上記構造１〜６を有する少なくとも１つのアミノ酸を、上記ポリペプチドの末端あるいは内部に組み込む工程を含んでおり、Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群より選択され（ｋは１、２または３である）、Ｒ’はＨ、アルキル、または置換アルキルである。
【０５１２】
一実施形態は、構造７を有する少なくとも１つのアミノ酸を含んでいるポリペプチドを製造する方法である。この方法は、構造７を有する少なくとも１つのアミノ酸を、上記ポリペプチドの末端または内部に組み込む工程を含んでいる。構造７は一般式（ＸＩ−Ａ）または（ＸＩ−Ｃ）：
【０５１３】
【化３２】
2010514808.tif 000036
【０５１４】
で示される構造に相当する。
【０５１５】
一実施形態は、構造１を有する少なくとも１つのアミノ酸を含んでいるポリペプチドを製造する方法である。この方法は、上記少なくとも１つのアミノ酸を組み込む工程を含んでいる。構造１は一般式（ＸＩ−Ｂ）：
【０５１６】
【化３３】
2010514808.tif 000037
【０５１７】
で示される構造に相当する。
【０５１８】
一実施形態は、構造６を有する少なくとも１つのアミノ酸を含んでいるポリペプチドを製造する方法である。この方法は、上記少なくとも１つのアミノ酸を組み込む工程を含んでいる。構造６は一般式（ＸＩ−Ｄ）：
【０５１９】
【化３４】
2010514808.tif 000038
【０５２０】
で示される構造に相当し；
Ｒａはそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、または―Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり；Ｂは、−ＣＨ２−、−Ｎ（Ｒ’）―、−Ｏ−，または−Ｓ−であり；Ｒ’は、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；ｎは０、１、２、３、４、５、または６である。
【０５２１】
一実施形態は、一般式（ＸＩ−Ａ−Ｄ）：
【０５２２】
【化３５】
2010514808.tif 000039
【０５２３】
で示される構造を有する少なくとも１つのアミノ酸を含んでいるポリペプチドを製造する方法である。この方法は、一般式（ＸＩ−Ａ−Ｄ）で示される構造を有する少なくとも１つのアミノ酸を組み込む工程を含んでいる。
【０５２４】
一実施形態は、構造１または６を有する少なくとも１つのアミノ酸を含んでいるポリペプチドを製造する方法である。この方法は、上記少なくとも１つのアミノ酸を組み込む工程を含んでいる。このアミノ酸は、翻訳系によって上記ポリペプチドの特定の部位に組み込まれる。翻訳系は：
（ｉ）上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、構造１〜６を有するアミノ酸が組み込まれる所定の部位に一致するセレクターコドンを含むポリヌクレオチド；および、
（ｉｉ）上記アミノ酸を含み、上記セレクターコドンに特異的なｔＲＮＡ、を含んでいる。
【０５２５】
一実施形態は、構造１または６を有する少なくとも１つのアミノ酸を含んでいるポリペプチドを製造する方法である。この方法は、上記少なくとも１つのアミノ酸を組み込む工程を含んでいる。翻訳系は、構造１〜６を有するアミノ酸でアミノアシル化されるｔＲＮＡを含んでいる。
【０５２６】
一実施形態は、構造１または６を有する少なくとも１つのアミノ酸を含んでいるポリペプチドを製造する方法である。この方法は、上記少なくとも１つのアミノ酸を組み込む工程を含んでいる。翻訳系は、細菌の細胞、古細菌の細胞、および真核細胞から成る群より選択される細胞を含んでいる、インビボの翻訳系である。
【０５２７】
一様態は、構造３または６を有する化合物を製造する方法である。この方法は、一般式（ＶＩＩ）：
【０５２８】
【化３６】
2010514808.tif 000040
【０５２９】
で示される構造を有する非天然アミノ酸と、１，２−ジカルボニルを含んでいる化合物とを反応させる工程を含んでいる。ここで、
Ａは任意に、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、一方の末端においてフェナジンを含んでいる部分またはキノキサリンを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
該リンカーは、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｎ（Ｒ”）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−から成る群より選択され、ｋは１、２、または３であり、Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、または置換低級アルキルであるか、あるいはＲ３およびＲ４または２つのＲ３基は、必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、保護基、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルであるか、あるいは２つ以上のＲ”が存在する場合に、２つのＲ”は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールを形成し；
Ｒａはそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、または―Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり；Ｒ’は、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである。
【０５３０】
一実施形態は、構造３または６を有する化合物を製造する方法である。この方法は、一般式（ＶＩＩ）で示される構造を有する非天然アミノ酸と、１，２−ジカルボニルを含んでいる化合物とを反応させる工程を含んでいる。一般式（ＶＩＩ）で示される構造は、一般式（ＶＩ）：
【０５３１】
【化３７】
2010514808.tif 000041
【０５３２】
に相当する。
【０５３３】
一実施形態は、構造３または６を有する化合物を製造する方法である。この方法は、一般式（ＶＩＩ）で示される構造を有する非天然アミノ酸と、１，２−ジカルボニルを含んでいる化合物とを反応させる工程を含んでいる。一般式（ＶＩＩ）で示される構造は、一般式（ＶＩＩＩ）：
【０５３４】
【化３８】
2010514808.tif 000042
【０５３５】
に相当する。
【０５３６】
一実施形態は、構造３または６を有する化合物を製造する方法である。この方法は、一般式（ＶＩＩ）で示される構造を有する非天然アミノ酸と、１，２−ジカルボニルを含んでいる化合物とを反応させる工程を含んでいる。一般式（ＶＩＩ）で示される構造は、
【０５３７】
【化３９】
2010514808.tif 000043
【０５３８】
から成る群より選択される。
【０５３９】
一実施形態は、構造３または６を有する化合物を製造する方法である。この方法は、一般式（ＶＩＩ）で示される構造を有する非天然アミノ酸と、１，２−ジカルボニルを含んでいる化合物とを反応させる工程を含んでいる。一般式（ＶＩＩ）で示される構造は、一般式（ＩＸ）：
【０５４０】
【化４０】
2010514808.tif 000044
【０５４１】
に相当する。
【０５４２】
一実施形態は、構造３または６を有する化合物を製造する方法である。この方法は、一般式（ＩＸ）で示される構造を有する非天然アミノ酸と、１，２−ジカルボニルを含んでいる化合物とを反応させる工程を含んでいる、一般式（ＩＸ）で示される構造は、
【０５４３】
【化４１】
2010514808.tif 000045
【０５４４】
から成る群より選択される。
【０５４５】
一様態は、構造１〜６を有する化合物を製造する方法である。この方法は、一般式（Ｉ）：
【０５４６】
【化４２】
2010514808.tif 000046
【０５４７】
で示される構造を有する非天然アミノ酸と、１，２−ジカルボニルを含んでいる化合物とを反応させる工程を含んでおり、
Ａは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換へテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（ｋは１、２、または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）から成る群より選択されるリンカーであり；
Ｊは、
【０５４８】
【化４３】
2010514808.tif 000047
【０５４９】
であり；
Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり；
Ｙは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり；
ｎは、０、１、２、３、または４であり；
ｍは、０、１、２、３、または４であり；ｍ＋ｎは１、２、３、または４であり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキル、置換へテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換へテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、または少なくとも１つのヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、または置換低級アルキルであるか、あるいはＲ３およびＲ４または２つのＲ３基は一緒になって、必要に応じてシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成するか；
あるいは、−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ基は一緒になって、１，２−ジカルボニル基、保護された１，２−ジカルボニル基、マスキングされた１，２−ジカルボニル基を含んでいる、置換されたまたは置換されていない、二環または三環の、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールを形成するか；
あるいは、−Ｊ−Ｒ基は一緒になって、１，２−ジカルボニル基、保護された１，２−ジカルボニル基、マスキングされた１，２−ジカルボニル基を含んでいる、置換されたまたは置換されていない、二環または三環の、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールを形成する。
【０５５０】
一実施形態は、構造１または６を有する化合物を製造する方法である。この方法は、一般式（ＩＩ）：
【０５５１】
【化４４】
2010514808.tif 000048
【０５５２】
で示される構造を有する非天然アミノ酸と、１，２−ジアリールアミン含有化合物とを反応させる工程を含んでいる。
【０５５３】
一実施形態は、構造１または６を有する化合物を製造する方法である。この方法は、一般式（ＩＩＩ）：
【０５５４】
【化４５】
2010514808.tif 000049
【０５５５】
で示される構造を有する非天然アミノ酸と、１，２−ジアリールアミン含有化合物とを反応させる工程を含んでおり、Ｒａはそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、または―Ｃ（Ｏ）ＯＲ’（Ｒ’は、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）である。
【０５５６】
一実施形態は、構造１または６を有する化合物を製造する方法である。この方法は、一般式（ＩＩＩ）で示される構造を有する非天然アミノ酸と、１，２−ジアリールアミン含有化合物とを反応させる工程を含んでおり、一般式（ＩＩＩ）で示される構造は、
【０５５７】
【化４６】
2010514808.tif 000050
【０５５８】
から成る群（Ｘは、−ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｏ−，または−Ｓ−である。）から選択される。
【０５５９】
一実施形態は、構造３または６を有する化合物を製造する方法である。この方法は、一般式（Ｉ）で示される構造を有する非天然アミノ酸と、１，２−ジアリールアミン含有化合物とを反応させる工程を含んでいる。一般式（Ｉ）で示される構造は、
【０５６０】
【化４７】
2010514808.tif 000051
【０５６１】
から成る群より選択され；
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、または―Ｃ（Ｏ）ＯＲ’（Ｒ’は、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）である。
【０５６２】
一実施形態は、構造１、３、または６を有する化合物を製造する方法である。この方法は、一般式（Ｉ）で示される構造を有する非天然アミノ酸と、１，２−ジアリールアミン含有化合物とを反応させる工程を含んでおり、一般式（Ｉ）で示される構造は、
【０５６３】
【化４８】
2010514808.tif 000052
【０５６４】
であり；
Ｒａはそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、または―Ｃ（Ｏ）ＯＲ’であり；
Ｂは、−ＣＨ２−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり；
Ｒ’は、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
ｎは、０、１、２、３、４、５、または６である。
【０５６５】
置換１，２−カルボニルおよび置換１，２−アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸をポリペプチドに組み込むことによって、フェナジン連結またはキノキサリン連結を介して、部位特異的な誘導体化が得られる。誘導体化する方法および／またはさらに修飾する方法は、誘導体化工程の以前または以後に精製されたポリペプチドを用いて行われてもよい。また、誘導体化する方法および／またはさらに修飾する方法は、このような修飾の以前または以後に精製された、合成ポリマー、ポリサッカライド、またはポリヌクレオチドを用いて行われてもよい。さらに、誘導体化工程は、例えば約２〜約１０のｐＨの、弱酸性から少し塩基性の環境下で効率的に行われる。約２〜約１０のｐＨには、約３〜約８のｐＨ、約４〜約１０のｐＨ、約４〜約８のｐＨ、約４．５〜約７．５のｐＨ、約４〜約７のｐＨ、約３〜約４のｐＨ、約７〜約８のｐＨ、約４〜約６のｐＨ、約４のｐＨ、および約６のｐＨが含まれる。
【０５６６】
さらに、特定のフェナジン連結またはキノキサリン連結を形成することによって、様々な検出法で用いることができる蛍光性非天然アミノ酸のポリペプチドが形成される。図２〜１１は、フェナジンの誘導体およびキノキサリンの誘導体を生成する、１，２−ジカルボニルの試薬と１，２−アリールジアミンの試薬との反応の例（これらに限定されない）を示す図である。１，２−ジカルボニルの試薬と１，２−アリールジアミンの試薬のいずれかが、非天然アミノ酸（非天然アミノ酸のポリペプチドを含む）の側鎖を表している。一例として、以下に示す非天然アミノ酸が、フェナジンを含んでいる非天然ポリペプチド、およびキノキサリンを含んでいる非天然ポリペプチドの生成に用いられる、ジカルボニルを含んでいるアミノ酸およびアリールジアミンを含んでいるアミノ酸の種類である。フェナジンを含んでいる非天然ポリペプチドおよびキノキサリンを含んでいる非天然ポリペプチドを形成するこのような反応は、広範なｐＨにおいて、非常に迅速かつ効率的に起こる。また、このようなフェナジンおよびキノキサリンの形成は、フェナジンを含んでいる非天然ポリペプチドおよびキノキサリンを含んでいる非天然ポリペプチドへのライゲーション／接合に使用されたり、またはフェナジンを含んでいる非天然ポリペプチドおよびキノキサリンを含んでいる非天然ポリペプチドの検出に使用されたりする。
【０５６７】
１，２−ジカルボニル官能基を含んでいるアミノ酸は、１，２−アリールジアミンと反応し、キノキサリンまたはフェナジン（さらに他の分子と結合していてもよい）を形成する。１，２−ジカルボニル官能基は、１，２−ジカルボニル様の基（１，２−ジカルボニル基と構造的に類似しており、１，２−ジカルボニル基と同様に１，２−アリールジアミンと反応する）、マスキングされた１，２−ジカルボニル基（１，２−ジカルボニル基へ容易に変換される）、または保護された１，２−ジカルボニル基（脱保護された状態で、１，２−ジカルボニル基と類似した反応性を持つ）を包含する。このようなアミノ酸としては、上述の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
【０５６８】
１，２−アリールジアミン基を含んでいる非天然アミノ酸は、様々な１，２−ジカルボニル基または１，２−ジカルボニルと同等の基と反応し、キノキサリン連結またはフェナジン連結を介して、接合体（特に限定されないが、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーとの接合体が挙げられる。）を形成する。よって、本明細書中に記載するある実施形態は、１，２−アリールジアミン基、１，２−アリールジアミン様の基（１，２−アリールジアミン基と構造的に類似しており、１，２−アリールジアミン基と同様に１，２−ジカルボニル基と反応する）、マスキングされた１，２−アリールジアミン基（１，２−アリールジアミン基へ容易に変換される）、または保護された１，２−アリールジアミン基（脱保護された状態で、１，２−アリールジアミン基と類似した反応性を持つ）を含んでいる側鎖を有する非天然アミノ酸である。このようなアミノ酸としては、上述の一般式（Ｖ）の構造を有するアミノ酸、一般式（ＶＩ）の構造を有するアミノ酸、一般式（ＶＩＩ）の構造を有するアミノ酸、一般式（ＶＩＩＩ）の構造を有するアミノ酸、一般式（ＩＸ）の構造を有するアミノ酸、および一般式（Ｘ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
【０５６９】
一実施形態では、生じたジカルボニルまたはアリールジアミンを含んでいるポリペプチドはさらに修飾され、例えば一般式（ＸＶＩＩ）：
【０５７０】
【化４９】
2010514808.tif 000053
【０５７１】
で示される試薬を用いて、フェナジン−またはキノキサリン−含有ポリペプチドを形成してもよい。
【０５７２】
Ｘはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換へテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールもしくは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２（Ｒ”はそれぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキル）であるか；
または、Ｘはそれぞれ独立して、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギー伝達剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せから成る群より選択され；
Ｌはそれぞれ独立して、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２、または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択され；
Ｌ１は任意に、−Ｃ（Ｒ’）ｐ−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）（ｐは０、１、または２）であり；
Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｗは、
【０５７３】
【化５０】
2010514808.tif 000054
【０５７４】
であって、ＲはＨ、アルキル、または置換アルキルであり、ｎは１〜３であり；
ただし、Ｌ−Ｌ１−Ｗは一緒になって、非天然アミノ酸または“修飾されたまたは修飾されていない”非天然アミノ酸のポリペプチド上でアリールジアミン基またはカルボニル（ジカルボニルを含む）基とそれぞれ反応可能な、少なくとも１つのジカルボニル基またはアリールジアミン基を提供する。
【０５７５】
一実施形態では、Ｘは、水溶性ポリマー；ポリアルキレンオキシド；ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；少なくとも１つのアミノ酸；少なくとも１つの糖類；少なくとも１つのヌクレオチド；少なくとも１つのヌクレオシド；リガンド；ビオチン；ビオチン類似体；検出可能な標識；およびこれらの任意の組合せの中から選択される。
【０５７６】
一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、Ｘは、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換へテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルを含むポリマーである。一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、Ｘは、[（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｏ−（水素、アルキル、または置換アルキル）]ｘ（ｘは約２０〜約１０，０００）である。一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、Ｘは、約２から約４０ｋＤａまでの範囲の分子量を有するｍ−ＰＥＧである。一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、Ｘは、ペプチド、タンパク質、酵素、抗体、薬物、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、およびミセルから成る群より選択される生物学的に活性な物質である。一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、Ｘは、抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心・血管作動薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、およびステロイド剤から成る群より選択される薬物である。一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、Ｘは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼから成る群より選択される酵素である。一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、Ｘは、蛍光性部分、燐光性部分、化学発光性部分、キレート化部分、電子密度の高い部分、磁性部分、インターカレートする部分、放射性部分、発色性部分、およびエネルギーを伝達する部分から成る群より選択される検出可能な標識である。一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、Ｘは、ジカルボニルを含んでいる部分およびアリールジアミンを含んでいる部分から成る群より選択される反応基である。一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、Ｘは、フェナジンまたはキノキサリンの誘導体基である。一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、Ｌは、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、および−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−から成る群より選択される。
【０５７７】
一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、化合物は、一般式（ＸＶＩＩＩ）：
【０５７８】
【化５１】
2010514808.tif 000055
【０５７９】
で示される構造を有し；
Ｗは、
【０５８０】
【化５２】
2010514808.tif 000056
【０５８１】
であって、Ｒは、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである。
【０５８２】
一般式（ＸＶＩＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、化合物は、一般式（ＸＩＸ）：
【０５８３】
【化５３】
2010514808.tif 000057
【０５８４】
で示される構造を有し；
他の実施形態では、このようなｍ−ＰＥＧまたはＰＥＧ基は、約５から約３０ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。
【０５８５】
一般式（ＸＶＩＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、化合物は、一般式（ＸＸ）：
【０５８６】
【化５４】
2010514808.tif 000058
【０５８７】
で示される構造を有し；
Ｗは、
【０５８８】
【化５５】
2010514808.tif 000059
【０５８９】
であって、Ｒは、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｙは、存在するときは、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｌは、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−である。一般式（ＸＶＩＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、化合物は、一般式（ＸＸＩ）：
【０５９０】
【化５６】
2010514808.tif 000060
【０５９１】
で示される構造を有し；
一般式（ＸＸＩ）で示される化合物の他の実施形態では、このようなｍ−ＰＥＧ基は、約５から約３０ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。
【０５９２】
一般式（ＸＶＩＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、化合物は、一般式（ＸＸＩＩ）：
【０５９３】
【化５７】
2010514808.tif 000061
【０５９４】
で示される構造を有し；
Ｗは、
【０５９５】
【化５８】
2010514808.tif 000062
【０５９６】
であって、Ｒは、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｙは、存在するときは、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｌは、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−である。一般式（ＸＸＩ）で示される化合物のある実施形態では、化合物は、一般式（ＸＸＩＩＩ）：
【０５９７】
【化５９】
2010514808.tif 000063
【０５９８】
で示される構造を有し；
一般式（ＸＸＩＩＩ）で示される化合物の他の実施形態では、このようなｍ−ＰＥＧ基は、約５から約３０ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。
【０５９９】
ある実施形態では、一般式（ＸＶＩＩＩ）で示されるリンカーは、水溶液中で、弱酸性の条件下において、ジカルボニルまたはアリールジアミン含有ポリペプチドと反応する。ある実施形態では、このような酸性条件は、約２〜約１０のｐＨであり、約３〜約８のｐＨ；約４〜約１０のｐＨ；約４〜約８のｐＨ；約４．５〜約７．５のｐＨ；約４〜約７のｐＨ；約３〜約４のｐＨ；約７〜約８のｐＨ；約４〜約６のｐＨ；約４のｐＨ；および約６のｐＨを含む。
【０６００】
一般式（ＸＶＩＩＩ）で示される化合物のある実施形態では、化合物は、一般式（ＸＸＩＶ）：
【０６０１】
【化６０】
2010514808.tif 000064
【０６０２】
で示される構造を有し；
Ｚは、ＯまたはＮＨであって、ｎは１、２、３、および４であり；
Ｗは、
【０６０３】
【化６１】
2010514808.tif 000065
【０６０４】
であって、Ｒは、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである。
【０６０５】
一般式（ＸＸＩＶ）で示される化合物のある実施形態では、化合物は、一般式（ＸＸＶ）：
【０６０６】
【化６２】
2010514808.tif 000066
【０６０７】
で示される構造を有する。
【０６０８】
一般式（ＸＸＩＶ）で示される化合物の他の実施形態では、化合物は、一般式（ＸＸＶＩ）：
【０６０９】
【化６３】
2010514808.tif 000067
【０６１０】
で示される構造を有する。
【０６１１】
ある実施形態は、一般式Ｉ〜Ｘ、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶ、および一般式ＸＸＸＶＩＩで示されるアミノ酸（一般式Ｉ〜Ｘ、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶ、および一般式ＸＸＸＶＩＩに包含される任意の下位の一般式で示される化合物または特定の化合物を包む。）を含んでいるポリペプチドを誘導体化する方法である。この方法は、一般式Ｉ〜Ｘ、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶ、および一般式ＸＸＸＶＩＩで示されるアミノ酸を少なくとも１つ含んでいる上記ポリペプチドと、一般式（ＸＶＩＩ）で示される試薬とを接触させる工程を含んでいる。ある実施形態では、上記ポリペプチドは、一般式（ＸＶＩＩ）で示される上記試薬との接触の以前または以後に精製される。他の実施形態では、生じたポリペプチドは、少なくとも１つのジカルボニルまたはアリールジアミンを含んでいる、一般式Ｉ〜Ｘ、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶ、および一般式ＸＸＸＶＩＩで示されるアミノ酸を含む。他の実施形態では、生じたポリペプチドは、一般式Ｉ〜Ｘ、ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶ、およびＸＸＸＶＩＩの化合物と、一般式（ＸＶＩＩ）で示される試薬とのカップリングから生成される、少なくとも１つのフェナジンまたはキノキサリンを含んでいるポリペプチドを含んでいる。
【０６１２】
図１８は、ＰＥＧ基が付加した、フェナジンまたはキノキサリン含有ポリペプチドを形成するための、一般式（ＸＩＸ）で示される試薬を用いた、ジカルボニルまたはアリールジアミンの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドの翻訳後修飾を示す概略図である。図２４は、一般式（ＸＸＶ）で示される二官能性リンカーの合成を例示している。このように、本明細書中に記載の方法は、両端にアミン基またはヒドロキシル基を有するスペーサー試薬と、Ｂｏｃで保護されたアリールジアミンを含んでいる酸とのカップリングを含む。Ｂｏｃ基を切断することによって、一般式（ＸＸＶ）で示されるリンカーが得られる。
【０６１３】
ある実施形態は、フェナジン連結またはキノキサリン連結を介して、ポリペプチドの二量体を製造する方法である。この方法は、一般式（ＸＸＩＶ）で示されるリンカーと、ジカルボニルまたはアリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドとの反応から成る。図２３は、ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドと一般式（ＸＸＶ）で示されるリンカーとの縮合を利用した、上記のような二量体の形成の代表例を示す。一実施形態では、一般式（ＸＸＶ）で示されるリンカーは、末端基としてのジカルボニル部分またはアリールジアミン部分と、さらに修飾されることによって他方の末端に異なる分子が導入される官能基とを含んでいる。
【０６１４】
ある実施形態は、二官能性リンカーを用いた、フェナジンを含んでいるポリペプチドおよびキノキサリンを含んでいるポリペプチドを調製する方法である。この方法は；
（ｉ）二官能性リンカーを用いて、一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸を含んでいる第１のポリペプチドを誘導体化する工程；および、
（ｉｉ）工程（ｉ）によって生じた誘導体化されたタンパク質と、誘導体化されたＰＥＧなどの第２の試薬とを接触させる工程を含んでいる。ある実施形態では、上記ポリペプチドは、上記二官能性リンカーとの接触の以前または以後に精製される。
【０６１５】
図２３は、このような二官能性リンカーおよび、フェナジンまたはキノキサリンを含有し、かつＰＥＧ基が付加されたポリペプチドを製造するための二官能性リンカーの使用を例示している。
【０６１６】
一例として以下に示すのは、一般式（ＸＸＶＩＩ）：
【０６１７】
【化６４】
2010514808.tif 000068
【０６１８】
で示される二官能性リンカーの代表例であって；
Ｗは、
【０６１９】
【化６５】
2010514808.tif 000069
【０６２０】
であり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである。
【０６２１】
一実施形態では、複数のリンカー化学物質は、ジカルボニルで置換された非天然アミノ酸のポリペプチドまたはアリールジアミンの非天然アミノ酸のポリペプチドと、部位特異的に反応する。一実施形態では、本明細書に記載のリンカーを用いた方法は、少なくとも１つのリンカー（一官能性リンカー、二官能性リンカー、または多官能性リンカー）の末端において、アリールジアミン官能基を含んでいるリンカーを使用する。ジカルボニルで置換されたタンパク質とアリールジアミンで誘導体化されたリンカーとの縮合は、フェナジンまたはキノキサリンで置換された非天然タンパク質を生成する。他の実施形態では、本明細書に記載されるリンカーを用いた方法は、少なくとも１つのリンカー（一官能性リンカー、二官能性リンカー、または多官能性リンカー）の末端において、ジカルボニル官能基を含んでいるリンカーを使用する。アリールジアミンで置換されたタンパク質とジカルボニルで誘導体化されたリンカーとの縮合は、フェナジンまたはキノキサリンで置換された非天然ポリペプチドを生成する。
【０６２２】
ヒドロキシルアミンを含んでいるフェナジンまたはキノキサリンで置換された非天然タンパク質をカップリングする方法の説明に役立つ実施形態が図２０に示される。この実施形態では、カルボニルで誘導体化された試薬が、ヒドロキシルアミンを含んでいるフェナジンまたはキノキサリンで置換された非天然タンパク質の緩衝液（約４〜約７のｐＨ）に加えられる。反応は、室温で、数時間〜数日進行する。
【０６２３】
ある実施形態は、フェナジンまたはキノキサリンの誘導体を形成するための、ジカルボニルまたはアリールジアミンを含んでいる試薬を用いた、ジカルボニルまたはアリールジアミンを含有している非天然ポリペプチドを含んでいる化学合成されたポリペプチドを誘導体化する方法である。
【０６２４】
図１６は、ジカルボニルを含んでいる試薬を用いた、アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド（ウロテンシン）の誘導体化の説明に役立つ例を示す。図１７は、アリールジアミンを用いた、ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド（ＸＴ−８）の誘導体化の説明に役立つ例を示す。
【０６２５】
他の実施形態では、このような誘導体化されたポリペプチドは、水溶液中、弱酸性の環境下で、少なくとも約１ヶ月間安定である。他の実施形態では、このような誘導体化されたポリペプチドは、弱酸性の環境下で、少なくとも約２週間安定である。他の実施形態では、このような誘導体化されたポリペプチドは、弱酸性の環境下で、少なくとも約５日間安定である。他の実施形態では、このような環境は、約２〜約８のｐＨである。ある実施形態では、誘導体化されたポリペプチドの三次構造は維持される。他の実施形態では、このようなポリペプチドの誘導体化は、さらに、誘導体化されたポリペプチドの、別のポリペプチドへのライゲーションを含む。他の実施形態では、このような誘導体化されたポリペプチドは、アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、試験ステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンから成る群より選択される治療タンパク質と相同である。
【０６２６】
‐Ｂ．非天然アミノ酸を翻訳後修飾する方法：カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸とヒドロキシルアミンを含んでいる試薬との反応‐
天然アミノ酸の側鎖は、強い求電子部分が不足している。それゆえ、求電子含有側鎖を有する非天然アミノ酸（例えば、ケトンまたはアルデヒドなどの、カルボニル基またはジカルボニル基を含んでいるアミノ酸）の取込みは、カルボニル基またはジカルボニル基の求核攻撃によって、この側鎖の部位特異的な誘導体化を可能にさせる。求核攻撃がヒドロキシルアミンに対するものである場合、オキシムで誘導体化されたタンパク質（oxime-derivatized protein）が生成される。誘導体化する方法および／またはさらに修飾する方法は、誘導体化工程の前、または誘導体化工程の後に精製されているポリペプチドによって行われればよい。また、誘導体化する方法および／または、さらに修飾する方法は、合成ポリマー、ポリサッカライド、または上記修飾の前あるいは修飾の後に精製されるポリヌクレオチドによって行われてもよい。さらに、誘導体化工程は、弱酸性から弱塩基性の環境下で行う。例えば、ｐＨは約２〜約１０であればよく、ｐＨ約３〜約８、ｐＨ約４〜約１０、ｐＨ約４〜約８、ｐＨ約４．５〜約７．５、ｐＨ約４〜約７、ｐＨ約３〜約４、ｐＨ約７〜約８、ｐＨ約４〜約６、ｐＨ約４およびｐＨ約６を含む。
【０６２７】
カルボニルまたはジカルボニルを含んでいるポリペプチドとヒドロキシルアミンで置換された分子との反応に基づくポリペプチドを誘導体化する方法は、明確な利点を有する。第１に、ヒドロキシルアミンは、オキシム付加体を生成するために、約２〜約８のｐＨ範囲（さらなる実施形態では、約４〜約８のｐＨ範囲；約４〜約７のｐＨ範囲；約７〜約８のｐＨ範囲）でカルボニルを含んでいる化合物またはジカルボニルを含んでいる化合物と縮合する。これらの反応条件において、天然アミノ酸の側鎖は不活性である。第２に、この選択的な化学反応は、組換えタンパク質の部位特異的な誘導体化を可能する。誘導体化されたタンパク質は相同な産物として定義され、直ちに調製することができる。第３に、本明細書に記載のヒドロキシルアミンと、本明細書に記載のカルボニルまたはジカルボニルを含んでいるポリペプチドとを反応させるために必要とされる穏やかな条件は、通常、ポリペプチドの三次構造を不可逆的に破壊しない（当然、反応の目的がそのような三次構造を破壊することである場合は除かれる。）。最後に、ヒドロキシルアミン基のアミノはＥ．ｃｏｌｉによって代謝されているかのように見えるが、ヒドロキシルアミンとカルボニルまたはジカルボニルを含んでいる分子との縮合は、生物学的環境下で安定しているオキシム付加体を生成する。
【０６２８】
ある実施形態では、このような誘導体化において用いられるヒドロキシルアミン試薬は、その側鎖上に、保護されたジカルボニル基またはアリールジアミン基を含んでいる。上記誘導体化によって得られた生成物は、フェナジンまたはキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを調製するための前躯体として用いることができる。図２１は、アリールジアミンを含んでいるヒドロキシルアミン試薬を用いた、キノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを合成する非限定的な例を示す図である。
【０６２９】
一例として、以下のヒドロキシルアミンを含んでいる試薬は、本明細書に記載されるカルボニルまたはジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸と反応するとともに、カルボニルまたはジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のさらなる修飾に使用される、ヒドロキシルアミンを含んでいる試薬の一種である。
【０６３０】
【化６６】
2010514808.tif 000070
【０６３１】
ここで、
Ｘはそれぞれ独立して、ジカルボニルを含んでいる基、アリールジアミンを含んでいる基、フェナジンを含んでいる基、またはキノキサリンを含んでいる基であり、
Ｌはそれぞれ独立して、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択され、
Ｌ１は任意に、−Ｃ（Ｒ’）ｐ−Ｎ（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（ｐは、０、１または２である）であり、
Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり、
Ｗは、−Ｎ（Ｒ８）２（Ｒ８はそれぞれ独立して、Ｈまたはアミノ保護基であり、ｐは、０、１または２である）である。
【０６３２】
ただし、Ｌ−Ｌ１−Ｗは一緒になって、非天然アミノ酸、または「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチド上のカルボニル基（ジカルボニル基を含む）と反応することができるヒドロキシルアミン基を、少なくとも１つ提供する。
【０６３３】
ある実施形態において、一般式（ＸＸＸＩ）に示す化合物は、以下の一般式（ＸＸＸＩＩ）：
【０６３４】
【化６７】
2010514808.tif 000071
【０６３５】
で示される構造を有する化合物である。
【０６３６】
ある実施形態において、一般式（ＸＸＸＩ）に示す化合物は、
【０６３７】
【化６８】
2010514808.tif 000072
【０６３８】
から成る群より選択される化合物である。
【０６３９】
別の実施形態において、二官能性リンカーおよび／または多官能性リンカー（例えば、１つ以上の別の結合性質を有するヒドロキシルアミン）は、ジカルボニル部分またはアリールジアミン部分を含んでいる、異なる分子の部位特異的な結合を可能にする。このリンカー技術、および本明細書に記載されるインビボの翻訳技術を組み合わせて、フェナジンまたはキノキサリンを非天然アミノ酸のポリペプチドと結合させ、異なる誘導体を形成することによって、強い蛍光を発するタンパク質を生成する。
【０６４０】
ヒドロキシルアミンとカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のｈＧＨとを部位特異的に結合する方法の実施形態を、図２１に示す。この実施形態において、アリールジアミンを含んでいるヒドロキシルアミン試薬は、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のｈＧＨの緩衝液（ｐＨ約３〜約４）に加えられる。この反応は、室温で、およそ数時間〜数日間進行する。最終生成物を緩衝液中においてジカルボニル誘導体と反応させることによって、強い蛍光性を有するフェナジン誘導体を含んでいるｈＧＨが生成する。
【０６４１】
一例として、以下に示す非天然アミノ酸は、カルボニルを含んでいるアミノ酸とヒドロキシルアミン試薬との反応によって生じる、ジカルボニルを含んでいるアミノ酸およびアリールジアミンを含んでいるアミノ酸の一種である。
【０６４２】
【化６９】
2010514808.tif 000073
【０６４３】
ここで、
Ａは任意に、アルキレン、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｂは任意に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ”−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（ｋは、１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＮＲ”−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ”）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ”）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ”）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−（Ｒ”はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキル）から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキルまたは置換シクロアルキルであり、
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基または樹脂であり、
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基または樹脂であり、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４または２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｌは、独立して、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択され、
Ｘはそれぞれ独立して、ジカルボニルを含んでいる基、アリールジアミンを含んでいる基、フェナジンを含んでいる基、またはキノキサリンを含んでいる基である。
【０６４４】
さらなる一例として、前述の目的のために、一般式（ＸＸＸＩＩＩ）に示す化合物は、以下の構造を有する化合物を含む。
【０６４５】
【化７０】
2010514808.tif 000074
【０６４６】
ここで、
Ｊは、
【０６４７】
【化７１】
2010514808.tif 000075
【０６４８】
フェナジン部分、またはキノキサリン部分であり、
Ｒは、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり、
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基または樹脂であり、
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基または樹脂であり、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは、１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである）であり、
Ｌは、独立して、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択される。
【０６４９】
さらなる一例として、前述の目的のために、一般式（ＸＸＸＩＩＩ）に示す化合物は、以下の構造：
【０６５０】
【化７２】
2010514808.tif 000076
【０６５１】
を有する化合物を含む。
ここで、
Ｊは、
【０６５２】
【化７３】
2010514808.tif 000077
【０６５３】
、フェナジン部分、またはキノキサリン部分であり、
Ｒは、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり、
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基または樹脂であり、
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基または樹脂であり、
Ｒ３はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキルもしくは置換低級アルキル、または、Ｒ３およびＲ４もしくは２つのＲ３基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｌは、独立して、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは、１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−（アルキレンもしくは置換アルキレン）ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択される。
【０６５４】
ある実施形態では、一般式Ｉ〜Ｘ、一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶおよび一般式ＸＸＸＶＩＩで示されるアミノ酸（一般式Ｉ〜Ｘ、ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶおよびＸＸＸＶＩＩの範囲内に含まれる、あらゆる下位の一般式または特定の化合物を包含する。）を含んでいるポリペプチドを誘導体化する方法である。ここで、当該方法は、一般式Ｉ〜Ｘ、ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶおよびＸＸＸＶＩＩに含まれる少なくとも１つのアミノ酸を含んでいるポリペプチドと、一般式（ＸＸＸＩ）で示される試薬との接触を包含する。ある実施形態では、このポリペプチドは、一般式（ＸＸＸＩ）で示される試薬と接触する前、または後に精製される。別の実施形態では、一般式（ＸＸＸＩＩＩ）に対応するオキシムを含有しているアミノ酸を少なくとも１つ含んでいる誘導体化ポリペプチドを生じる。別の実施形態では、一般式（ＸＸＸＩ）で示される試薬による一般式Ｉ〜Ｘ、ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶおよびＸＸＸＶＩＩのアミノ酸の誘導体化によって生成されたジカルボニルまたはアリールジアミンを含有しているアミノ酸を、少なくとも１つ含んでいるポリペプチドを生じる。別の実施形態では、このような誘導体化されたポリペプチドは、弱酸性環境下の水溶液において少なくとも約１ヶ月間安定である。別の実施形態では、このような誘導体化されたポリペプチドは、弱酸性環境下において少なくとも約２週間安定である。別の実施形態では、このような誘導体化されたポリペプチドは、弱酸性環境下において少なくとも約５日間安定である。別の実施形態において、ｐＨは約２〜約８である。ある実施形態では、誘導体化されたポリペプチドの三次構造は保存される。別の実施形態において、このような誘導体化されたポリペプチドは、誘導体化されたポリペプチドと別のポリペプチドとのライゲーションをさらに含む。別の実施形態において、誘導体化されたポリペプチドは、以下から成る群より選択される治療タンパク質と相同であり得る：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、抗体断片、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、試験ステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロン。
【０６５５】
‐Ｃ．タンパク質標識の連続結合‐
また、本明細書には、アリールジアミンまたはジカルボニルを含んでいる側鎖（ここで、当該側鎖部分の構造は翻訳後に生じる）を有する非天然アミノ酸を含んでいる方法および組成物が記載される。例えば、図２２に示すポリペプチドのように、タンパク質または抗体（すべての天然アミノ酸または少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる）のそれぞれは、アリールジアミン基もしくはカルボキシル基を含んでいる側鎖を少なくとも１つ有するポリペプチドを形成するために、アリールジアミン基もしくはカルボキシル基のいずれかを含んでいる試薬と反応することができる。その後、ポリペプチド上のアリールジアミン部分を、フェナジン（phenzine）基またはキノキサリン基のいずれかを有するアミノ酸側鎖を含有するポリペプチドを形成するために、ジカルボニル部分を含んでいる別の試薬と反応させる。別の方法として、ポリペプチド上のジカルボニル部分を、フェナジン（phenzine）基またはキノキサリン基のいずれかを有するアミノ酸側鎖を含有するポリペプチドを形成するために、アリールジアミン部分を含んでいる別の試薬と反応させる。
【０６５６】
‐Ｄ．官能基を付加する例：非天然アミノ酸のポリペプチドと結合する高分子ポリマー‐
本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドに対する様々な修飾は、本明細書に記載の組成物、方法、技術および方策を用いてもたらされ得る。これらの修飾は、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分へのさらなる官能基の組込みを含んでいる。このような官能基としては、例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギー伝達剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の組成物、方法、技術および方策の非限定的な例として、以下の説明では、高分子ポリマーを非天然アミノ酸のポリペプチドに付加する方法について述べる。しかしながら、本明細書に記載の組成物、方法、技術および方策は、別の官能基を追加すること可能であり、上述した官能基に限定されない。
【０６５７】
多種多様な高分子ポリマーおよび他の分子は、非天然アミノ酸のポリペプチド（または対応する天然アミノ酸のポリペプチド）の生物学的性質を調節するため、および／または非天然アミノ酸のポリペプチド（または対応する天然アミノ酸のポリペプチド）へ新規な生物学的性質を提供するために、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドと結合され得る。これら高分子ポリマーは、非天然アミノ酸、または非天然アミノ酸の任意の官能性の置換基、あるいは、非天然アミノ酸に付加された任意の置換基または官能基によって非天然アミノ酸のポリペプチドと連結することが可能である。
【０６５８】
水溶性ポリマーは、（天然または合成の）ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリサッカライドまたは本明細書に記載の合成ポリマーに組み込まれる非天然アミノ酸と連結され得る。水溶性ポリマーは、ポリペプチドに組み込まれた非天然アミノ酸、または非天然アミノ酸の任意の官能基もしくは置換基、あるいは非天然アミノ酸に付加された任意の官能基または置換基によって連結され得る。ある場合には、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドは、水溶性ポリマーと連結される１つ以上の非天然アミノ酸、および水溶性ポリマーと連結される１つ以上の天然アミノ酸を含んでいる。親水性ポリマーと生物学的に活性な分子との共有結合は、水溶性の向上（例えば、生理的環境において）、バイオアベイラビリティ、血清半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調節、生物学的に活性な分子の調節、または生物学的に活性な分子（例えば、タンパク質、ペプチド、および特定の親水性分子）の循環時間の延長を行うための１つの手段であるといえる。親水性ポリマーのさらに重要な性質には、例えば生体適合性、毒性の欠如、および免疫原性の欠如が含まれてもよい。最終生成物の調製物の治療上の使用に関して、当該ポリマーが薬学的に許容されることが好ましい。
【０６５９】
親水性ポリマーの例としては、特に限定されないが、ポリアルキルエーテルおよびポリアルキルエーテルのアルコキシキャップ類似体（例えば、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレン／プロピレングリコール、および、それらのメトキシキャップまたはエトキシキャップされた類似体が挙げられ、特にポリオキシエチレングリコールが好ましい。また、後者はポリエチレングリコールまたはＰＥＧとして知られている）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルキルエーテル、ポリオキサゾリン、ポリアルキルオキサゾリンおよびポリヒドロキシアルキルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリアルキルアクリルアミド、ならびにポリヒドロキシアルキルアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドおよびその誘導体）、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリシアリック酸およびその類似体、親水性ペプチド配列、ポリサッカライドおよびその誘導体（例えば、デキストラン、およびカルボキシメチルデキストラン、デキストラン硫酸、アミノデキストランなどのデキストラン誘導体）、セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース）、キチンおよびその誘導体（例えば、キトサン、スクシニルキトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン）、ヒアルロン酸およびその誘導体、スターチ、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、アルブミン、プルランおよびカルボキシメチルプルラン、ポリアミノ酸およびその誘導体（例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパルトアミド（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔａｍｉｄｅｓ））、無水マレイン酸共重合体（例えば：スチレン無水マレイン酸共重合体、ジビニルエチルエーテル無水マレイン酸共重合体）、ポリビニルアルコール、それらの共重合体、それらの三元重合体、それらの混合物、およびそれらの誘導体が挙げられる。水溶性ポリマーは、特に限定されないが、直線状、分岐鎖状、または分枝状のいずれかの構造形態であればよい。いくつかの実施形態では、約２から約３００までの末端を有する水溶性ポリマーの骨格が、特に有用である。多官能性ポリマー誘導体は、２つの末端のそれぞれが、同一の官能基、または異なる官能基と結合されている直線状のポリマーを含んでいるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、水性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる。ポリマーの分子量は広い範囲におよぶものであってもよく、特に限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間、またはそれ以上の分子量を含む。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間であればよく、約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約９００Ｄａ、約８００Ｄａ、約７００Ｄａ、約６００Ｄａ、約５００Ｄａ、約４００Ｄａ、約３００Ｄａ、約２００Ｄａおよび約１００Ｄａを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約５０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａから約３０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約３０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール分子は分枝状のポリマーである。枝分かれＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間であればよく、特に限定されないが、約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、および約１，０００Ｄａを含む。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間であり、別の実施形態では、ポリマーの分子量は、約５０，０００Ｄａから約３０，０００Ｄａの間である。別の実施形態では、ポリマーの分子量は、約３０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約２０，０００Ｄａの間である。実質的な水溶性骨格に関する上述した例示は、決して包括的ではなくただの一例にすぎず、また、上記性質を有するすべてのポリマー材料が、本明細書に記載の方法および組成物に利用するために適しているとして予期される。
【０６６０】
上述したように、親水性ポリマーの一例としては、人工移植において、または毒性および免疫原性のない生体適合性が重要となる他の用途において、薬学的に広範囲に亘って用いられている、ＰＥＧと省略されるポリ（エチレングリコール）である。本明細書に記載されている、ポリマー：ポリペプチドの実施形態では、親水性ポリマーの例としてＰＥＧが用いられるが、当該実施形態では他の親水性ポリマーを同様に用いてもよいと理解される。
【０６６１】
ＰＥＧは、市販の水溶性ポリマーであるか、あるいは当該技術分野において公知の方法（例えば、「Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161」を参照のこと）に従って、エチレングリコールの開環重合によって調製することができる。ＰＥＧは、一般的に透明、無色、無臭、水に可溶、熱に対して安定、多くの化学製剤に対して不活性、加水分解または劣化しないものであり、一般的に無毒である。ポリ（エチレングリコール）は生体適合性があるとみなされている。すなわち、ＰＥＧは、害を与えずに生体組織または生物と共存できる。より具体的には、ＰＥＧは実質的に免疫原性がなく、このことは、ＰＥＧが生体において免疫応答を引き起こす傾向にはないことを示す。生体において、いくつかの望ましい機能を有する分子（例えば、生物学的に活性な剤）とＰＥＧとが結合する場合、ＰＥＧは当該生物学的に活性な剤をマスクする傾向にあり、生物が当該生物学的に活性な剤の存在を許容できるように、どの免疫応答も緩和または除去することができる。ＰＥＧ接合体は、実質的に免疫応答を引き起こしたり、凝固または他の望ましくない影響をもたらしたりする傾向はない。
【０６６２】
用語「ＰＥＧ」は、ＰＥＧの大きさあるいは末端における修飾には関係なく、任意のポリエチレングリコール分子を包含するために、幅広く用いられる。非天然アミノ酸のポリペプチドと連結するようなＰＥＧは、一般式：ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙで表わされ得る。上記一般式において、ｎは２から１０，０００であり、ＸはＨまたは末端修飾（特に限定されないが、Ｃ１−４アルキル、保護基、または末端官能基を含む）である。用語「ＰＥＧ」は、特に限定されないが、例えば、二官能性ＰＥＧ、マルチアームドＰＥＧ、誘導体化されたＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、枝分かれＰＥＧ（各鎖の分子量は、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、または約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａである）、垂れ下がった（ｐｅｎｄｅｎｔ）ＰＥＧ（例えば、ポリマー骨格へ垂れ下がっている１つ以上の官能基を有するＰＥＧまたは関連するポリマー）、または分解可能な連結を有するＰＥＧを含んでいる形態のいずれかのポリ（エチレングリコール）を含んでいる。一実施形態では、ｎが約２０〜約２，０００であるＰＥＧは、本明細書に記載の方法および組成物において用いるのに適している。いくつかの実施形態では、水性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間、またはそれ以上の広い範囲におよんでもよく、特に限定されない。ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間であればよく、特に限定されないが、約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約９００Ｄａ、約８００Ｄａ、約７００Ｄａ、約６００Ｄａ、約５００Ｄａ、約４００Ｄａ、約３００Ｄａ、約２００Ｄａおよび約１００Ｄａを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。別の実施形態では、ポリマーの分子量は約５０，０００Ｄａから約３０，０００Ｄａの間である。別の実施形態では、ポリマーの分子量は約３０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝状ポリマーである。枝分かれＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間であればよく、特に限定されないが、約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、および約１，０００Ｄａを含む。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａの間である。別の実施形態では、ポリマーの分子量は約５０，０００Ｄａから約３０，０００Ｄａの間である。別の実施形態では、ポリマーの分子量は約３０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は、約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は、約５，０００Ｄａから約２０，０００Ｄａの間である。多様なＰＥＧの分子は、特に限定されないが、「the Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog」に記載されており、本明細書において参照することによって援用される。
【０６６３】
この文献における末端官能基の具体的な例は、特に限定されないが、Ｎ−スクシニミジル炭酸（N- succinimidyl carbonate）（例えば、米国特許出願第５，２８１，６９８号明細書、米国特許出願第５，４６８，４７８号明細書を参照のこと）、アミン（例えば、「Buckmannら, Makromol. Chern. 182:1379 (1981)」、「Zalipskyら, Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)」を参照のこと）、ヒドラジド（例えば、「Andreszら, Makromol. Chem. 179:301 (1978)」を参照のこと）、スクシニミジルプロピオン酸（succinimidyl propionate）およびスクシニミジルブタン酸（succinimidyl butanoate)(例えば、「Olsonら, in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181 , Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997」、米国特許出願第５，６７２，６６２号明細書を参照のこと）、スクシニミジルコハク酸（例えば、「Abuchowskiら, Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984)」および「Joppichら, Makromol. Chem. 180:1381 (1979)」）、スクシニミジルエステル（例えば、米国特許出願第４，６７０，４１７号明細書を参照のこと）、ベンゾトリアゾール炭酸（benzotriazole carbonate）（例えば、米国特許出願第５，６５０，２３４号明細書を参照のこと）、グリシジルエーテル（例えば、「Pithaら, Eur. J Biochem. 94:11 (1979)」、「Ellingら, Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991)」を参照のこと）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、「Beauchampら, Anal. Biochem. 131 :25 (1983)」、「Tondelliら, J. Controlled Release 1:251 (1985)」を参照のこと）、ｐ−ニトロフェニル炭酸（例えば、「Veroneseら, Appl.Biochem. Biotech., 11 : 141 (1985)」：および「Sartoreら, Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)」を参照のこと）、アルデヒド（例えば、「Harrisら, J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984)」、米国特許出願第５，８２４，７８４号明細書、米国特許出願第５，２５２，７１４号明細書を参照のこと）、マレイミド（例えば、「Goodsonら, Bio/Technology 8:343 (1990)」、「Romaniら, in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)」、および「Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)」を参照のこと）、オルトピリジルジスルフィド（例えば、「Woghirenら, Bioconj. Chem. 4:314(1993)」を参照のこと）、アクリロール（acrylol）（例えば、「Sawhneyら, Macromolecules, 26:581 (1993)」を参照のこと）、ビニルスルフォン（例えば、米国特許出願第５，９００，４６１号明細書を参照のこと）が挙げられる。上記参考文献および特許文献はすべて本明細書中に参考によって組み込まれる。
【０６６４】
ある場合において、ＰＥＧはヒドロキシまたはメトキシを有する末端で区切られる。例えば、ＸがＨあるいはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。別の場合では、ＰＥＧの末端の１つは反応性基を有して終結していてもよい。これによって、二官能性ポリマーを形成する。一般的な反応性基は、（１）２０の一般アミノ酸において見られる官能基（例えば、マレイミド基、活性型炭酸塩（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル）、活性型エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、ｐ−ニトロフェニルエステル）、およびアルデヒド）と反応するために通常用いられる反応性基、ならびに、（２）２０の一般アミノ酸に対して不活性であるが、非天然アミノ酸に存在する相補的な官能基（例えば、芳香族アミン基）と特異的に反応する官能基と反応するために通常用いられる反応性基を含むことができる。
【０６６５】
なお、上記一般式においてＹとして示されるＰＥＧの他方の末端は、非天然アミノ酸によって、ポリペプチド（合成または天然）、ポリヌクレオチド、ポリサッカライド、または合成ポリマーと、直接的または間接的に接着する。Ｙがジカルボニル基である場合、ジカルボニルを含んでいるＰＥＧ試薬は、ポリペプチド内のアリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸と反応して、フェナジン連結またはキノキサリン連結によってポリペプチドと連結されたＰＥＧ基を形成することができる。Ｙがアリールジアミン基である場合、ジカルボニルを含んでいるＰＥＧ試薬は、ポリペプチド内のアリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸と反応して、フェナジン連結またはキノキサリン連結によってポリペプチドと連結されたＰＥＧ基を形成することができる。適切な反応条件、精製方法、および精製試薬としては、例えば、本明細書中および添付の図２９において記載される。図２９は、様々なジカルボニル基またはアリールジアミン基含有ＰＥＧ誘導体の例を示す。
【０６６６】
また、ポリマーの末端にそれぞれ異なる分子を接着させることが望ましい場合、ヘテロ二官能性誘導体が特に有用である。例えば、オメガ−Ｎ−アミノ−Ｎ−アジドＰＥＧは、ＰＥＧの末端の１つに対して、活性型求電子基（例えば、アルデヒド、ケトン、活性型エステル、活性型炭酸塩など）を有する分子の接着を可能にし、ＰＥＧの他方の末端に対して、アセチレン基を有する分子の接着を可能にする。
【０６６７】
このように、いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸を含有するポリペプチドは、非天然アミノ酸の側鎖によって、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））と連結される。本明細書に記載の非天然アミノ酸に関する方法および組成物は、セレクターコドンに対応するタンパク質への非天然アミノ酸（例えば、自然に組み込まれた２０の一般アミノ酸には見られない官能性基または置換基を含有するアミノ酸）の選択的な取り込み、およびその後に、適切な反応性のＰＥＧ誘導体を有する非天然アミノ酸の修飾を含む、ＰＥＧ誘導体を有するタンパク質の選択的修飾のための非常に効果的な方法を提供する。本明細書に記載の多様な化学的手法は、タンパク質内に水溶性ポリマーを取り込むために、本明細書に記載の非天然アミノ酸に関する方法および組成物とともに使用するために適している。
【０６６８】
ポリマー骨格は、直線状または分枝状であってもよい。分枝状ポリマーの骨格は当該分野において一般的に知られている。通常、分枝状ポリマーは分枝の中心となるコア部分、および、当該コア部分と連結される複数個の直線状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、分枝状の形態で用いられる。この形態は、様々なポリオール（例えば、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトールおよびソルビトール）へのエチレンオキシドの付加によって調製することができる。また、この中心鎖部分は、いくつかのアミノ酸（例えばリジン）から生じさせることもできる。例えば、その全体を本明細書において参照することによって援用される、米国特許出願第５，９３２，４６２号明細書、米国特許出願第５，６４３，５７５号明細書、米国特許出願第５，２２９，４９０号明細書、米国特許出願第４，２８９，８７２号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書、国際公開第９６／２１４６９号パンフレット、および国際公開第９３／２１２５９号パンフレットに記載されている、マルチアームドＰＥＧ分子を、ポリマー骨格として用いることが可能である。
【０６６９】
枝分かれＰＥＧは、ＰＥＧ（−ＹＣＨＺ２）ｎで表わされる分岐状ＰＥＧの形態であってもよい。ここで、Ｙは連結基であり、Ｚは規定の長さの原子鎖によってＣＨと連結される、活性化された末端基である。さらに、別の分枝形態であるペンダント型のＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端よりもむしろＰＥＧ骨格に沿って、反応性基（例えば、カルボキシル）を有する。
【０６７０】
また、これらＰＥＧの形態に加えて、弱い連結または分解可能な連結を骨格に有するポリマーを調製することができる。例えば、加水分解の影響を受けるエステル連結をポリマー骨格に有するＰＥＧを調製することができる。以下に示すように、この加水分解の結果、ポリマーが開裂されて、低分子量の断片が生じる：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−  ＋  Ｈ２Ｏ  →  ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ  ＋  ＨＯ−ＰＥＧ−
用語「ポリ（エチレングリコール）」または「ＰＥＧ」は、特に限定されないが、本明細書において開示される技術として知られるすべての形態を表わし、あるいは含んでいる。ポリマーの分子量は、広範囲におよんでいてもよく、特に限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａ、またはそれ以上の分子量を含む。ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａであってもよく、特に限定されないが、約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約９００Ｄａ、約８００Ｄａ、約７００Ｄａ、約６００Ｄａ、約５００Ｄａ、約４００Ｄａ、約３００Ｄａ、約２００Ｄａ、および約１００Ｄａを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。別の実施形態では、ポリマーの分子量は約５０，０００Ｄａから約３０，０００Ｄａである。別の実施形態では、ポリマーの分子量は約３０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。
【０６７１】
ＰＥＧの望ましい特性を最大限にするために、ＰＥＧポリマーまたは生物学的に活性な分子と接着されるポリマーの、全分子量および水和状態は、ＰＥＧポリマー結合と特に関連のある有利な性質（例えば、上昇された水溶性、および増加された循環半減期）を与えるために、十分に高くなければならず、さらにもとの分子の生物学的な活性に悪影響を及ぼすことのない必要がある。
【０６７２】
本明細書に記載の方法および組成物は、実質的に均質なポリマー：タンパク質接合体分子を生成するために使用され得る。ここで用いられる、「実質的に均質」とは、ポリマー：タンパク質接合体分子が、全タンパク質のうち半分よりも多くあるように観察される、ということを意味する。このポリマー：タンパク質接合体は生物学的な活性を有しており、本明細書において提供される、本明細書における「実質的に均質」なＰＥＧ化ポリペプチド調製物は、均質な調製物の利点（例えば、臨床適用の際に、ロット間の薬物動態を容易に予測できること）を十分示すほどに均質なものである。
【０６７３】
また、ポリマー：タンパク質接合体の混合物を調製してもよい。本明細書において提供される利点としては、混合物に包含させるために、モノポリマー：タンパク質接合体の比率が選択され得ることである。このように、必要に応じて、当業者は、様々な数（すなわち２、３、４など）のポリマー部分が接着されている様々なタンパク質の混合物を調製し、上記接合体と本明細書に記載の方法を用いて調製されたモノ−ポリマー：タンパク質接合体とを組み合わせて、モノ−ポリマー：タンパク質接合体を所定の割合で有する混合物を得てもよい。
【０６７４】
ポリエチレングリコール分子とタンパク質分子との比は、反応混合物における濃度のように、変更してもよい。一般的に、最適比（余分な未反応のタンパク質またはポリマーを最小限にする、という反応効率の観点における）は、選択されたポリエチレングリコールの分子量、および利用可能な反応性基の有効な数によって決定すればよい。分子量に関して言えば、一般にポリマーの分子量が大きくなるほど、タンパク質と結合され得るポリマー分子の数は少なくなる。また、これらのパラメーターを最適化させる場合、枝分かれしているポリマーを考慮すべきである。一般的に、分子量が大きくなるにつれ（または、枝分かれが多くなるにつれ）、ポリマー：タンパク質比は大きくなる。
【０６７５】
本明細書において使用されるような、疎水性ポリマー：ポリペプチド／タンパク質接合体を熟慮する場合、「治療に効果的な効量」の項では、患者に対して望ましい効果を与える量についてさらに言及する。この治療に効果的な量は人によって異なり、要因（例えば、患者の全般的な身体条件、および治療される疾病、障害または健康状態の原因）の数に依存する。
【０６７６】
本明細書に記載の「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチドと連結される水溶性ポリマーの数（例えば、ＰＥＧ化またはグリコシル化の及ぶ範囲）は、改変した（例えば増加または減少を含むが限定されない）薬理性、薬物動体性、薬力学性（例えば、インビボにおける半減期）をもたらすように調節すればよい。いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドの半減期を少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０パーセント増加し、非修飾型ポリペプチドの２倍、５倍、１０倍、５０倍、または少なくとも１００倍以上、増加する。
【０６７７】
ある実施形態では、カルボニルまたはジカルボニルを含有している非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、ＰＥＧ骨格と直接連結される末端ヒドロキシルアミン部分を含んでいるＰＥＧ誘導体によって修飾される。
【０６７８】
いくつかの実施形態では、アルデヒド末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造を有する：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００（例えば、平均分子量は約５〜約４０ｋＤａ）である。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの範囲内であればよく、約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約９００Ｄａ、約８００Ｄａ、約７００Ｄａ、約６００Ｄａ、約５００Ｄａ、約４００Ｄａ、約３００Ｄａ、約２００Ｄａ、および約１００Ｄａが含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。別の実施形態では、ポリマーの分子量は約５０，０００Ｄａから約３０，０００Ｄａである。別の実施形態では、ポリマーの分子量は約３０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。
【０６７９】
別の実施形態では、カルボニルまたはジカルボニルを含んでいるアミノ酸を含んでいるポリペプチドは、アミド結合によってＰＥＧ骨格に結合される末端ヒドロキシルアミン部分を含んでいるＰＥＧ誘導体によって修飾される。
【０６８０】
いくつかの実施形態では、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造を有する：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００（例えば、平均分子量は５〜４０ｋＤａ）である。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの範囲内であればよく、約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約９００Ｄａ、約８００Ｄａ、約７００Ｄａ、約６００Ｄａ、約５００Ｄａ、約４００Ｄａ、約３００Ｄａ、約２００Ｄａ、および約１００Ｄａが含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。別の実施形態では、ポリマーの分子量は約５０，０００Ｄａから約３０，０００Ｄａである。別の実施形態では、ポリマーの分子量は約３０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。
【０６８１】
別の実施形態では、カルボニルを含んでいるアミノ酸またはジカルボニルを含んでいるアミノ酸を含有しているポリペプチドは、枝分かれＰＥＧの各鎖におけるＭＷが約１０から約４０ｋＤａの範囲（別の実施形態では、ＭＷが約５から約２０ｋＤａの範囲）である、末端ヒドロキシルアミン部分を含んでいるＰＥＧ誘導体によって修飾される。枝分かれＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａであればよく、約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、および約１，０００Ｄａを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａである。別の実施形態では、ポリマーの分子量は約５０，０００Ｄａから約３０，０００Ｄａである。別の実施形態では、ポリマーの分子量は約３０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、枝分かれＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから約２０，０００Ｄａである。
【０６８２】
別の実施形態において、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、少なくとも１つの分枝鎖型構造を有するＰＥＧ誘導体によって修飾される。いくつかの実施形態では、ヒドロキシルアミン基を含んでいるＰＥＧ誘導体は、次の構造を有する：
[ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２]ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは、任意で、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか、あるいは存在しない。ｍは約２〜約１０であり、ｎは約１００〜約１，０００である。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの範囲内であればよく、約１００，０００Ｄａ、約９５，０００Ｄａ、約９０，０００Ｄａ、約８５，０００Ｄａ、約８０，０００Ｄａ、約７５，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ、約６５，０００Ｄａ、約６０，０００Ｄａ、約５５，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ、約４５，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約３５，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約９，０００Ｄａ、約８，０００Ｄａ、約７，０００Ｄａ、約６，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約９００Ｄａ、約８００Ｄａ、約７００Ｄａ、約６００Ｄａ、約５００Ｄａ、約４００Ｄａ、約３００Ｄａ、約２００Ｄａ、および約１００Ｄａが含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。別の実施形態では、ポリマーの分子量は約５０，０００Ｄａから約３０，０００Ｄａである。別の実施形態では、ポリマーの分子量は約３０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａである。
【０６８３】
ＰＥＧの機能性化およびＰＥＧの接合体について、いくつかの考察およびモノグラフが得られる。例えば、「Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985)」、「Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987)」、「Wongら, Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992)」、「Delgadoら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992)」、「Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995)」を参照のこと。
【０６８４】
また、ポリマーの活性化法は、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許出願第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許出願第５，２１９，５６４号明細書、米国特許出願第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット、米国特許出願第５，２８１，６９８号明細書、および国際公開第９３／１５１８９号パンフレットから入手可能であり、これらは活性化されたポリマーと酵素（特に限定されないが、結合因子ＶＩＩＩ（国際公開第９４／１５６２５号パンフレット）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７号パンフレット）、酸素輸送分子（米国特許出願第４，４１２，９８９号明細書）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（「Veroneseら, App. Biochem. Biotech. 11 : 141-52 (1985)」））との接合に関するものである。これらは、本明細書においてその全体が参照することによって援用される。
【０６８５】
必要であれば、本明細書に記載の、疎水性クロマトグラフィーによって得られるＰＥＧ化非天然アミノ酸のポリペプチドは、当該技術分野における当業者に周知である１つ以上の方法によってさらに精製され得る。そのような手段としては特に限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、DEAE SEPHAROSEを用いる）、シリカ上におけるクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（特に限定されないが、SEPHADEX G-75を用いたものが挙げられる）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；クロマトフォーカシング（chromatofocusing）；置換クロマトグラフィー；電気泳動法（特に限定されないが、例えば調整用の等電点電気泳動法を含む）；差別的可溶性（differential solubility）（例としては、硫酸アンモニウム沈殿が挙げられるが、これに限定されない）、または抽出が挙げられる。見かけの分子量は、ＧＰＣによる、球形タンパク質基準との比較によって算出すればよい（「Preneta AZ, PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.)IRL Press 1989, 293-306」）。非天然アミノ酸のポリペプチド：ＰＥＧ接合体の純度は、タンパク質分解（トリプシン開裂を含むが限定されない）を行った後に、質量分析をすることによって評価できる。「Pepinsky RBら, J. Pharmcol & Exp. Ther. 297(3): 1059-66 (2001)」。
【０６８６】
本明細書に記載されている非天然アミノ酸のポリペプチドと結合される水溶性ポリマーは、さらなる誘導体化または置換されてもよく、限定されない。
【０６８７】
‐Ｅ．血清アルブミンの親和性の増強‐
血清半減期を調節するために、様々な分子が本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドと融合されてもよい。いくつかの実施形態において、動物において内因性血清アルブミンの親和性を高めるために、分子が本明細書に記載の「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチドと連結、あるいは融合させられる。
【０６８８】
例えば、ある場合には、ポリペプチドとアルブミン結合配列との組換え融合体が作製される。一般的なアルブミン結合配列としては、例えば、連鎖球菌タンパク質Ｇから得られるアルブミン結合ドメイン（「Makridesら, J. Pharmacol. Exp. Ther 277(1): 534-542 (1996)」および「Sjolanderら, J, Immunol. Methods 201 :115-123 (1997)」を参照）が挙げられ、またアルブミン結合ペプチドは、例えば、「Dennisら, J. Biol. Chem. 277: 35035- 35043 (2002)」に記載されているペプチドを含む。
【０６８９】
別の実施形態では、本明細書に記載の「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチドは、脂肪酸によってアシル化される。ある場合において、脂肪酸は血清アルブミンへの結合を促進する。例えば、「Kurtzhals, ら, Biochem. J. 312:725-731 (1995) 」を参照のこと。
【０６９０】
別の実施形態では、本明細書に記載の「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチドは、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンを含むが、これに限定されない）と直接融合される。血清アルブミンまたは別の血清要素との結合を調節するために、多種多様な他の分子は、本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていないの非天然アミノ酸のポリペプチドと連結されてもよい。
【０６９１】
‐Ｆ．本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドのグリコシル化‐
本明細書に記載の方法および組成物は、サッカライド残基を有する、１つ以上の非天然アミノ酸を組み込んでいるポリペプチドを含んでいる。サッカライド残基は、天然（Ｎ−アセチルグルコサミンを含むが、限定されない）または非天然（３−フルオロガラクトシダーゼを含むが、限定されない）のどちらであってもよい。サッカライドは、Ｎ−連結されたグリコシド連結、またはＯ−連結されたグリコシド連結（特に限定されないが、Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリン）、あるいは非天然連結（特に限定されないが、複素環（例えば、窒素含有複素環、Ｃ−連結されたグリコシドまたはＳ−連結されたグリコシドの連結、あるいはこれに相当するもの））のどちらかによって非天然アミノ酸のポリペプチドと連結されてもよい。
【０６９２】
サッカライド（例えば、グリコシル）部分は、インビボまたはインビトロのどちらかで非天然アミノ酸のポリペプチドに付加されればよい。いくつかの実施形態では、ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、フェナジン結合またはキノキサリン結合によって連結された、対応グリコシル化ポリペプチドを生成するために、アリールジアミン基により誘導体化されたサッカライドによって修飾される。一度非天然アミノ酸と結合させれば、当該サッカライドは、非天然アミノ酸のポリペプチドとのオリゴサッカライド結合を生成するために、グリコシルトランスフェラーゼおよび別の酵素による処理によってさらに修飾させてもよい。例えば、「H. Liuら. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003) 」を参照のこと。
【０６９３】
‐Ｇ．連結基の使用と、ポリペプチドの二量体および多量体などへの適用‐
非天然アミノ酸のポリペプチドへ直接的に官能基を付加することに加えて、ポリペプチドの非天然アミノ酸部分は、まず多官能性（例えば、二官能性、三官能性、四官能性）リンカー分子によって修飾されればよく、それから、さらに修飾される。すなわち、少なくとも１つの多官能性リンカー分子の末端は、ポリペプチドにおいて少なくとも１つの非天然アミノ酸と反応性を示し、少なくとも１つの多官能性リンカーの他方の末端は、さらなる機能性化に利用できる。多官能性リンカーのすべての末端が同一であるならば、結果として、非天然アミノ酸のポリペプチドのホモ多量体が形成される（化学量論条件に依存している）。多官能性リンカーの末端が異なる化学反応性を有するのであれば、結果として、少なくとも１つの多官能性リンカー基の末端は、非天然アミノ酸のポリペプチドと結合し、当該リンカー基の他方の末端は、以下の異なる官能基と続けて反応し得る：例えば、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結した糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギー伝達剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。
【０６９４】
図２３は、多段階合成において、１つ以上のＰＥＧ基を非天然アミノ酸のポリペプチドに結合するための、二官能性リンカーの使用の例を示す概略図であるが、これに限定されない。第１の工程において、アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、修飾されたフェナジンまたはキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成するために、ジカルボニルを含んでいる二官能性リンカーと反応する。しかしながら、当該二官能性リンカーは、修飾されたフェナジンまたはキノキサリンの官能基を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成するために、適切な反応性を有する試薬と反応することが可能な官能基を保持したままである。一例において、このような官能基はＰＥＧ基であるが、上述した官能基のいずれか、または三官能性または四官能性リンカーでは、１種類以上の官能基あるいは同一種の官能基を複数含んでいてもよい。このように、本明細書に記載のリンカー基は、部位選択的な方法で非天然アミノ酸のポリペプチドをさらに修飾するための付加手段を提供する。
【０６９５】
また、本明細書に記載の方法および組成物は、ポリペプチドの組合わせ（例えば、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体、またはヘテロ多量体（例えば、三量体、四量体など））を提供する。一例として、以下の説明では、ＧＨスーパーファミリーメンバーを中心に進める。しかしながら、この項に記載される方法、技術および組成物は、二量体および多量体の形態において利益をもたらし得る、他の任意のポリペプチドにも、事実上適用され得る。なお、他の任意のポリペプチドとしては、例えば：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン���ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、試験ステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンが挙げられる。
【０６９６】
したがって、本明細書に記載の方法、技術、および組成物に包含されるものは、ポリペプチド骨格と直接的に、またはリンカーを介して、別のＧＨスーパーファミリーメンバーまたはそのバリアント、あるいは非ＧＨスーパーファミリーメンバーである他のポリペプチドまたはそのバリアントと結合する、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチドである。モノマーと比較して分子量が増加するために、ＧＨスーパーファミリーメンバーの二量体である接合体または多量体である接合体は、新規な、あるいは望ましい性質を示す。当該性質としては、例えば、モノマーのＧＨスーパーファミリーと比べて、異なる薬理学的性質、薬物動態学的性質、または薬力学的性質、あるいは、調節された治療半減期、または調節された血しょう半減期が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、ＧＨスーパーファミリーメンバーの二量体は、ＧＨスーパーファミリーメンバー受容体の二量体化を調節する。別の実施形態では、本明細書に記載されているＧＨスーパーファミリーメンバーの二量体または多量体は、ＧＨスーパーファミリーメンバー受容体アンタゴニスト、アゴニスト、あるいは調節因子として作用し得る。
【０６９７】
いくつかの実施形態では、ＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチドは、例えば、Ａｓｎ−Ｌｙｓアミド連結またはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド連結を介して、直接的に連結される。いくつかの実施形態では、連結されたＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチド、および／または、連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーは、二量体を促進するために、異なる非天然アミノ酸を含んでいる。例えば、特に限定されないが、ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドである、第１のＧＨスーパーファミリーメンバー、および／または、連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーは、アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドである、第２のＧＨスーパーファミリーメンバーと接合されており、これらポリペプチドは、対応するフェナジンまたはキノキサリンの構造によって反応させる。
【０６９８】
別の方法では、２つのＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチド、および／または連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーは、リンカーを介して連結される。ヘテロ二官能性リンカーまたはホモ二官能性リンカーは、同一の一次配列または異なる一次配列を有し得る、２つのＧＨスーパーファミリーメンバー、および／または連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバー２つのＧＨスーパーファミリーメンバー、および／または連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーのポリペプチドを連結するために用いることができる。ある場合において、ＧＨスーパーファミリーメンバー、および／または連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーのポリペプチドをつなぐために用いられているリンカーは、二官能性ＰＥＧ試薬であってもよい。
【０６９９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、アレイ型構造を有する水溶性の二官能性リンカーを提供するものである。当該アレイ型構造は：ａ）ポリマー骨格の少なくとも第１の末端に、アジド、アルキン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、カルボニル、またはジカルボニルを含んでいる部分、および、ｂ）ポリマー骨格の第２の末端に少なくとも第２の官能基を含んでいる。第２の官能基は、第１の官能基と同一であってもよいし、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、第２の官能基は第１の官能基と反応しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、少なくとも１つの枝を有する分枝状分子構造を含んでいる水溶性組成物である。例えば、分枝状分子構造は、樹状である可能性もある。
【０７００】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、以下の構造を有する水溶性活性化ポリマーとの反応によって形成される、１つ以上のＧＨスーパーファミリーメンバー含んでいる多量体を提供する：
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ
ここで、ｎは約５〜約３，０００であり、ｍは２〜１０、Ｘはアジド、アルキン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシルアミン、アセチル、または、カルボニル、またはジカルボニルを含んでいる部分であり、Ｒはキャッピング基、官能基、あるいは脱離基であり、Ｘのように同一であってもよいし、または異なっていてもよい。Ｒは、例えば、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、１−ベンゾトリアゾールエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカルボン酸、１−ベンゾトリアゾールカルボン酸、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリル酸、メタクリル樹脂、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン（ｄｉｏｎｅｓ）、メシレート、トシレート、およびトレシレート、アルケン、ならびにケトンから成る群より選択される官能基である。
【０７０１】
‐Ｈ．官能基を付加する例：ポリペプチドの単離性質の緩和‐
天然または非天然アミノ酸のポリペプチドは、多くの原因（例えば、ポリペプチドの溶解性または結合性）のために試料から単離することが困難なこともあり得る。例えば、治療に使用するためにポリペプチドを調製するとき、当該ポリペプチドは、ポリペプチドを過剰生産するように設計されている組み換え機構から単離されてもよい。しかしながら、ポリペプチドの溶解性または結合特性のために、望ましい水準の純度に達することは、しばしば困難であると分かる。本明細書に記載されている方法、組成物、技術および方策は、この問題への解決策を提供する。
【０７０２】
本明細書に記載されている方法、組成物、技術および方策を用いて、所望のポリペプチドと相同な、フェナジン含有またはキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを生成し得る。ここで、フェナジン含有またはキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、改良された単離特性を有する。ある実施形態では、同質な非天然アミノ酸のポリペプチドは、生合成的に生成される。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、本明細書に記載されている、１つの非天然アミノ酸の構造に組み込まれている。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は末端または内部に組み込まれ、部位特異的にさらに組み込まれる。
【０７０３】
ある実施形態では、生合成的に生成して得られた非天然アミノ酸は、すでに望ましい改良された単離特性を有する。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、改良された単離特性をもたらす基とのフェナジン連結またはキノキサリン連結を含んでいる。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、修飾されたフェナジン含有または修飾されたキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成するために、さらに修飾される。ここで、当該修飾は改良された単離特性をもたらす基とのフェナジン連結またはキノキサリン連結を提供する。いくつかの実施形態では、当該基は非天然アミノ酸と直接連結し、別の実施形態では当該基は、非天然アミノ酸とリンカー基を介して連結される。ある実施形態では、当該基は１つの化学反応によって非天然のアミノ酸と連結され、別の実施形態では、当該基と非天然アミノ酸とを連結するために、一連の化学反応が必要とされる。ある実施形態では、改良された単離特性をもたらす基は、非天然アミノ酸のポリペプチドにおいて非天然アミノ酸と部位特異的に連結されるものであり、利用される反応条件下において天然アミノ酸とは連結しない。
【０７０４】
さらなるまたは付加的な実施形態では、生じた非天然アミノ酸のポリペプチドは、ＧＨスーパーファミリーメンバーと相同である。しかしながら、この項に記載されている方法、技術および組成物は、改良された単離特性から利益を得ることのできるのであれば、実質的にどのポリペプチドにも適用できる。そのようなポリペプチドとしては、例えば：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３���ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、試験ステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンを含む。
【０７０５】
さらなるまたは付加的な実施形態では、改良された単離特性をもたらす基は、ポリペプチドの水溶性を改良し、別の実施形態では、当該基はポリペプチドの結合特性を改良し、別の実施形態では、当該基はポリペプチドへの新たな結合特性を提供する（一例として、ビオチン基またはビオチン結合基を含むが限定されない）。当該基がポリペプチドの水溶性を改善する実施形態では、この基は本明細書に記載されている水溶性ポリマー（例えば、本明細書に記載されているＰＥＧポリマー群のいずれか）から選択される。
【０７０６】
‐Ｉ．官能基を付加する例：ポリペプチドの存在の検出‐
天然または非天然アミノ酸のポリペプチドは、いくつかの原因（例えば、ポリペプチドと迅速に結合し得る試薬または標識の不足）のために、試料（インビボの試料、およびインビトロの試料を含む）において検出することが難しいこともある。本明細書に記載されている方法、組成物、技術、および方策は、この状況への解決策を提供する。
【０７０７】
本明細書に記載の方法、組成物、技術、および方策を用いて、当業者の１人は、所望のポリペプチドと相同なフェナジン含有またはキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを生成し得る。ここで、フェナジン含有またはキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、インビボの試料、およびインビトロの試料中の上記ポリペプチドの検出が可能である。ある実施形態では、相同な非天然アミノ酸のポリペプチドは、生合成的に生成される。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸は、本明細書に記載されている非天然アミノ酸の１つの構造に組み込まれている。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸は末端または内部に組み込まれ、部位特異的にさらに組み込まれる。
【０７０８】
ある実施形態では、生合成的に生成して得られた非天然アミノ酸のポリペプチドは、すでに望ましい検出特性を有している。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸、アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸、およびフェナジン含有またはキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸からなる群から選択される、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる。別の実施形態では、当該非天然アミノ酸は本明細書に記載されているように、ポリペプチド中に生合成的に組み込まれている。さらなるまたは別の実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、一般式Ｉ〜ＸＩおよび一般式ＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩで示されるアミノ酸から選択される、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる。さらなるまたは別の実施形態では、非天然アミノ酸は、ジカルボニル基またはアリールジアミン基とのオキシム結合を含んでいる。さらなるまたは別の実施形態では、非天然アミノ酸は、修飾されたオキシムを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成するためにさらに修飾される。ここで、この修飾は、改良された検出特性をもたらすフェナジン基またはキノキサリン基とのオキシム結合を提供する。いくつかの実施形態では、当該基は、非天然アミノ酸と直接連結され、また別の実施形態では当該基は、非天然アミノ酸とリンカー基を介して連結される。ある実施形態では、当該基は１つの化学反応によって非天然アミノ酸と連結され、別の実施形態では、一連の化学反応が当該基と非天然アミノ酸とを連結するために必要とされる。好ましくは、改良された検出特性をもたらす基は、非天然アミノ酸のポリペプチドにおいて非天然アミノ酸と部位特異的に連結されるものであり、利用される反応条件下において天然アミノ酸とは連結しない。
【０７０９】
ある実施形態では、一例として、上述したポリペプチドは、以下の一般式
【０７１０】
【化７４】
2010514808.tif 000078
【０７１１】
の構造を有するキノキサリンの誘導体を少なくとも１つ含んでいる。
【０７１２】
ある実施形態では、一般式（ＸＸＸＶＩ）で示される化合物を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドは、特定の疾病のバイオマーカーと特異的に結合する。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、異なる生体媒質におけるバイオマーカーの存在を検出するために用いられてもよい。一例として、一般式（ＸＸＸＶＩ）で示される化合物を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドは、癌のためのバイオマーカーと特異的に結合する。癌は、適切な捕捉基質を有するバイオマーカーを捕捉し、適切な緩衝液の中で一般式（ＸＸＸＶＩ）で示される化合物を含んでいるポリペプチドを付加することによって、血液試料から検出される。洗浄後、得られた複合体を蛍光法（fluorescence method）を用いて分析する。陽性の場合には、バイオマーカーの存在を示す結果になる。別の例によれば、癌は尿試料から検出される。
【０７１３】
別の実施形態では、一般式（ＸＸＸＶＩ）で示される化合物を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドは、インビボでの検体を分析するために用いられる。一例として、一般式（ＸＸＸＶＩ）で示される化合物を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドが動物に投与され、一般式（ＸＸＸＶＩ）で示される化合物を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドの存在、非存在あるいは位置を検出するために、画像検査法（imaging method）が用いられる。
【０７１４】
ある実施形態では、一例として、上述したポリペプチドは、以下の一般式（ＸＸＸＶＩＩ）：
【０７１５】
【化７５】
2010514808.tif 000079
【０７１６】
で示される構造を有するアリールジアミン誘導体を少なくとも１つ含んでいる。
【０７１７】
ある実施形態では、一般式（ＸＸＸＶＩＩ）で示される化合物を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドは、特定の疾病のバイオマーカーと特異的に結合する。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、以下の一般式（ＸＸＸＶＩＩＩ）：
【０７１８】
【化７６】
2010514808.tif 000080
【０７１９】
で示されるジカルボニル試薬の付加後、異なる生体媒質におけるバイオマーカーの存在を検出するために用いられてもよい。
一例として、一般式（ＸＸＸＶＩＩ）で示される化合物を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドは、癌のためのバイオマーカーと特異的に結合する。癌は、適切な捕捉基質を有するバイオマーカーを捕捉し、適切な緩衝液の中で一般式（ＸＸＸＶＩＩ）で示される化合物を含んでいるポリペプチドを付加することによって、血液試料から検出される。洗浄後、得られた複合体を蛍光法を用いて分析する。陽性の場合には、バイオマーカーの存在を示す結果になる。別の例によれば、癌は尿試料から検出される。
【０７２０】
さらなるまたは付加的な実施形態では、生じた非天然アミノ酸のポリペプチドは、ＧＨスーパーファミリーメンバーと相同である。しかしながら、この項に記載されている方法、技術および組成物は、インビボの試料およびインビトロの試料中で検出するために必要とされる、実質的にどのポリペプチドにも適用される。そのようなポリペプチドとしては、例えば：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ���、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、試験ステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンを含む。
【０７２１】
さらなるまたは付加的な実施形態では、改良された検出特性をもたらす基は、例えば、標識；色素；親和性標識；光親和性標識；スピン標識；蛍光団；放射性部分；重原子を組み込んでいる部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；発色団；エネルギー伝達剤；検出可能な標識；およびそれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択される。
【０７２２】
‐Ｊ．官能基を付加する例：ポリペプチドの薬効性の改善‐
天然または非天然アミノ酸のポリペプチドは、特定の障害、疾病または病気を発症している患者に対して、いくらかの治療効果をもたらし得る。この治療効果は、様々な要因に依存し得るものであり、例えば：ポリペプチドの安全プロフィール、ならびにポリペプチドの薬物動態学的性質、薬理学的性質、および／または薬力学的性質（例えば、水溶性、バイオアベイラビリティ、血清半減期、薬学的半減期、免疫原性、生物学的な活性、または循環時間）が挙げられる。さらに、例えばポリペプチドに官能基の付加を提供すること（例えば、細胞毒性化合物または薬剤の結合）は有効であり、また、本明細書に記載されているホモ多量体およびヘテロ多量体を形成するために、さらなるポリペプチドと結合することが望ましいこともある。この修飾は、元のペプチドの活性および／または三次構造を破壊するものではないことが好ましい。本明細書に記載されている方法、組成物、技術および方策は、これらの問題に対する解決策を提供する。
【０７２３】
本明細書に記載の方法、組成物、技術、および方策を用いて、当業者の１人は、所望のポリペプチドと相同な、ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、フェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、キノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドおよびオキシムを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを生成し得る。ここで、当該非天然アミノ酸のポリペプチドは、改良された治療特性を有する。ある実施形態では、同質な非天然アミノ酸のポリペプチドは、生合成的に生成される。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸は、本明細書に記載されている非天然アミノ酸の１つのコンストラクトに組み込まれている。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸は末端または内部において組み込まれ、且つ、部位特異的にさらに組み込まれる。
【０７２４】
ある実施形態では、生合成的に生成して得られた非天然アミノ酸は、すでに望ましい治療特性を有する。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸は改良された治療特性をもたらす基とのオキシム結合、フェナジン結合またはキノキサリン結合を含んでいる。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸は、修飾されたジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾されたアリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾されたフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾されたキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾されたオキシムを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成するためにさらに修飾される。ここで、当該修飾は、改良された治療特性をもたらす基とのオキシム結合、フェナジン結合またはキノキサリン結合を提供する。いくつかの実施形態では、当該基は、非天然アミノ酸と直接連結され、また別の実施形態では当該基は、非天然アミノ酸とリンカー基を介して連結される。ある実施形態では、当該基は１つの化学反応によって非天然アミノ酸と連結され、別の実施形態では、一連の化学反応が当該基と非天然アミノ酸とを連結するために必要とされる。好ましくは、改良された治療特性をもたらす基は、非天然アミノ酸のポリペプチドにおいて非天然アミノ酸と部位特異的に連結されるものであり、利用される反応条件下において天然アミノ酸とは連結しない。
【０７２５】
さらなるまたは付加的な実施形態では、生じた非天然アミノ酸のポリペプチドは、ＧＨスーパーファミリーメンバーと相同である。しかしながら、この項に記載されている方法、技術および組成物は、改良された治療特性から利益を得ることのできるのであれば、実質的にどのポリペプチドにも適用できる。そのようなポリペプチドとしては、例えば：アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成性低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３���ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、試験ステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンが挙げられる。
【０７２６】
さらなるまたは付加的な実施形態では、改良された治療特性をもたらす基は、ポリペプチドの水溶性を向上し、別の実施形態では、当該基はポリペプチドの結合特性を向上し、別の実施形態では、当該基はポリペプチドへの新たな結合特性を提供する（一例として、ビオチン基またはビオチン結合基を含むが限定されない）。当該基がポリペプチドの水溶性を改善する実施形態では、この基は本明細書に記載されている水溶性ポリマー（例えば、本明細書に記載されているＰＥＧポリマー基のいずれか）から選択される。さらなるまたは付加的な実施形態では、当該基は細胞毒性化合物であり、別の実施形態では、当該基は薬剤である。さらなる実施形態では、連結された薬剤または細胞毒性化合物は、目的とする治療位置へ薬剤または細胞毒性化合物を輸送するために、非天然アミノ酸のポリペプチドから開裂され得る。別の実施形態では、この基は、第２のポリペプチドである（例えば、オキシムを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドであり、さらに言えば、例えば第１の非天然アミノ酸のポリペプチドと同一のアミノ酸構造を有するポリペプチドである）。
【０７２７】
さらなるまたは付加的な実施形態では、ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、フェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、キノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、またはオキシムを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、それぞれ、修飾されたジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾されたアリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾されたフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾されたキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾されたオキシムを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドである。さらなるまたは付加的な実施形態では、このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドと比べてポリペプチドのバイオアベイラビリティが向上している。さらなるまたは付加的な実施形態では、このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドと比べてポリペプチドの安全プロフィールが向上している。さらなるまたは付加的な実施形態では、このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドと比べてポリペプチドの水溶性が向上している。さらなるまたは付加的な実施形態では、このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドと比べてポリペプチドの治療半減期が増加している。さらなるまたは付加的な実施形態では、このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドと比べてポリペプチドの血清半減期が増加している。さらなるまたは付加的な実施形態では、このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドと比べてポリペプチドの循環時間が延長している。さらなるまたは付加的な実施形態では、このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドと比べてポリペプチドの活性が調節されている。さらなるまたは付加的な実施形態では、このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドと比べてポリペプチドの免疫原性が調節されている。
【０７２８】
‐ＸＩ．修飾型ポリペプチドの治療上の使用‐
便宜上、この項に記載されている「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチドは、一般的に、および／または特定の例を伴って説明されている。しかしながら、この項に記載されている「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチドは、この項において提供される一般的な説明または特定の例のみに限定されるものではない。むしろこの項に記載の「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチドは、一般式Ｉ〜ＸＩおよびＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩ、ならびに化合物１〜６の範囲内に含まれる少なくとも１つのアミノ酸を含んでいる、すべての「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチドに対して等しく適用される。例えば、一般式Ｉ〜ＸＩおよびＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩ、ならびに化合物１〜６の範囲内に含まれる少なくとも１つのアミノ酸には、本明細書、特許請求の範囲及び図面に記載の一般式Ｉ〜ＸＩおよびＸＸＸＩＩＩ〜ＸＸＸＶＩＩ、ならびに化合物１〜６の範囲内に含まれる、あらゆる下位の一般式または特定の化合物が挙げられる。
【０７２９】
本明細書に記載の「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチド（そのホモ多量体およびヘテロ多量体を含む）は、多様な利用が見出されており、特に限定されないが：治療上の使用、診断上の使用、分析を基本とする使用、産業上の使用、化粧品への使用、植物生物学的使用、環境への使用、エネルギー生産への使用、および／または軍事上の使用を含む。以下に、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドの治療上の使用における例を提供するが、これに限定されない。
【０７３０】
本明細書に記載の「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチドは、障害、疾病または病気という広い範囲の治療に有効である。本明細書に記載の「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチド生成物の投与は、市販のポリペプチド製剤によってヒトにおいて実証されるいずれかの活性が得られる。「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチド生成物の平均量は変えてもよく、特に医師の推奨および指示に従うべきである。「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチド生成物の的確な量は、治療される病気の正確な症例、治療している患者の健康状態、および組成物に含まれる他の含有成分などの要因に、優先的に従う事項である。
【０７３１】
‐Ａ．投与および薬学的組成物‐
本明細書に記載の「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチド（そのホモ多量体およびヘテロ多量体を含む）は、多様な利用が見出されており、特に限定されないが：治療上の使用、診断上の使用、分析を基本とする使用、産業上の使用、化粧品への使用、植物生物学的な使用、環境への使用、エネルギー生産への使用、および／または軍事上の使用を含む。以下に、「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチドの治療上の使用における例を提供するが、これに限定されない。
【０７３２】
本明細書に記載の「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチドは、障害という広い範囲の処置に有効である。本明細書に記載の「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチド生成物の投与は、市販のポリペプチド製剤によってヒトにおいて実証されるいずれかの活性が得られる。「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチド生成物の平均量は変更してもよく、特に医師の推奨および指示に従うべきである。「修飾されたまたは修飾されていない」非天然アミノ酸のポリペプチド生成物の的確な量は、処置される病気の正確な症例、処置している患者の健康状態、および組成物に含まれる他の含有成分などの要因に、優先的に従う事項である。
【０７３３】
本明細書に記載されている修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチド（例えば、シンテターゼ、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質などを含むがこれに限定されない）は、治療上の使用のために、（例えば、適切な薬学的担体との組み合わせて）用いてもよい。例えば、当該組成物は、本明細書に記載の薬学的に効果的な量の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチド、および薬学的に許容可能な担体あるいは賦形剤を含んでいる。当該担体または賦形剤としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、および／または、それらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。製剤は、投与に適した形態に作製される。一般的に、天然アミノ酸タンパク質の投与方法は、本明細書に記載されている修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドの投与に適用できる。
【０７３４】
本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドを１つ以上含んでいる治療組成物は、公知の方法によって有効性および組織代謝を確認するため、ならびに投与量を算出するために、インビボおよび／またはインビトロに適した１つ以上の病態モデルにおいて試験されてもよい。特に、投与量は、例えば適切なアッセイにおける、天然アミノ酸相同物に対する非天然アミノ酸の活性、安定性、またはその他適切な指標（例えば、１つ以上の非天然アミノ酸を含むために修飾されたポリペプチドと、天然アミノ酸のポリペプチドとの比較を含むが、これに限定されない）によって、最初に決定することができる。
【０７３５】
投与は、血液または組織細胞と接触する最終段階に分子を取り込むために通常用いられる、いずれかの投与方法によって行う。本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、いずれかの適切な方法（状況に応じて、１つ以上の薬学的に許容可能な担体とともに）において投与される。本明細書に記載されている修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドの適切な投与方法は、患者に対して利用可能であり、特定の組成物を投与するために１つ以上の投与方法を用いることができるが、特定の投与方法では、しばしば別の投与方法よりも、さらに迅速且つ効果的な活性あるいは反応を提供することができる。
【０７３６】
薬学的に許容可能な担体は、投与されている特定の組成物、および組成物を投与するために用いられる特定の方法によって、部分的に決定される。したがって、本明細書に記載されている薬学的な組成物の適切な製剤は、幅広く存在する。
【０７３７】
本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチド、および当該ポリペプチドを含んでいる組成物は、特に限定されないが、非経口（例えば、皮下注射あるいは静脈注射を含む注射、またはその他の注射あるいは注入の形態を含む）を含む、タンパク質またはポリペプチドに適したいずれかの投与方法によって投与される。ポリペプチド薬学的組成物（本明細書に記載されているあらゆる非天然アミノ酸のポリペプチドを含む）は、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋内内投与、経皮投与、皮下投与、局所投与、舌下投与または直腸投与を含むが、これに限定されない様々な投与方法によって投与することができる。また、本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、リポソームによって投与されることもある。本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドは、単独、あるいは別の適切な組成物（例えば、薬学的担体を含むが限定されない）と組み合わせて用いてもよい。
【０７３８】
また、単独、あるいは別の適切な組成物との組み合わせにおける、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドは、吸入器によって投与されるような噴霧剤（例えば、「霧状」にされ得る）として作製することができる。噴霧剤は、圧縮されて利用可能な高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）に収容される。
【０７３９】
非経口投与（例えば、関節内注射（接合部に）、静脈注射、筋内注射、皮内注射、腹腔内注射、および皮下注射による）に適した製剤は、水性および非水性の等張性無菌注入溶液、および水性および非水性の無菌懸濁液を含んでいる。当該等張性無菌注入溶液は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤投与の対象者の血液と等張の製剤が溶かされた溶剤、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存料を含み得る水性または非水性の滅菌懸濁液を含むことができる。パッケージ化された核酸製剤は、単回投与または多回投与の密閉した容器（例えば、プラスチック容器およびガラス容器）で存在することができる。
【０７４０】
非経口投与および静脈内投与は好ましい投与方法である。特に、現在使用中の製剤とともに、天然アミノ酸の相同物を用いた治療（natural amino acid homologue therapeutics）のためにすでに用いられている投与経路（特に限定されないが、ＥＰＯ、ＩＦＮ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮｓ、インターロイキン、抗体、および／または、その他薬学的に誘導体化されたタンパク質に対して一般的に用いられる方法を含む）は、本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドに好ましい投与経路および製剤を提供する。
【０７４１】
本明細書に記載されている組成物および方法の範囲における、患者に対して投与される投与量は、患者が長期にわたって有益な治療反応を示すのに十分な量である。投与量は、特定の製剤の有効性、使用される修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドの活性、安定性、または血中半減期、および患者の健康状態によって決定されるとともに、処置される患者の体重または体表面積によっても決定される。また、投与量の大小は、特定の患者において、特定の製剤の投与に付随して起こるいかなる有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。
【０７４２】
病気（例えば、ガン、遺伝的障害、糖尿病、ＡＩＤＳなどを含むがこれに限定されない）の治療または予防において投与される製剤の効果的な量の決定において、医師は、血しょうの循環量、製剤の毒性、病気の進行、および／または、関連性がある場合には、抗非天然アミノ酸のポリペプチド抗体の生成を評価する。
【０７４３】
例えば、７０ｋｇの患者に対して投与される投与量は、一般的に、現在使用中の治療組成物の投与量と同様の範囲であるが、関連する組成物の活性または血中半減期の変化によって調節される。本明細書に記載されている薬学的製剤は、周知慣用な治療（例えば、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性製剤の投与、天然アミノ酸のポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、生物応答調節物質など）のいずれかによって、治療条件を補うことができる。
【０７４４】
投与に関して、本明細書に記載されている薬学的組成物は、関連する製剤のＬＤ−５０またはＥＤ−５０によって決定づけられる比率、および／または、各種濃度（例えば、健康な患者の大半および全体に適用されるような濃度を含むが、特に限定されない）において、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドのいずれかの副作用が観察されることによって決定づけられる比率において投与される。投与は、単回投与または多回投与によって達成され得る。
【０７４５】
製剤を投与されている患者が、発熱、悪寒、または筋肉痛の症状を訴える場合、この患者に、アスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン、または他の痛み／熱を調節する製剤を適切に投与する。発熱、筋肉痛、または悪寒などの、製剤投与に対する反応を示す患者は、当該製剤を投与する３０分前に、アスピリン、アセトアミノフェン、または特に限定されないがジフェニドラミンのいずれかを事前に投与される。メペリジンは、解熱剤および抗ヒスタミン剤と即座に反応しないより激しい悪寒および筋肉痛に対して用いられる。細胞注入は、反応の重症度に依存して減速されるか、または中断される。
【０７４６】
本明細書に記載されている修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、被験体となる哺乳動物に直接投与することができる。投与は、被験体にポリペプチドを導入するために通常使用される、いずれかの投与方法によるものである。本明細書に記載されている修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、経口、直腸、局所的、吸入（特に限定されないが噴霧剤を介する）、口腔（下の舌（sub-lingual）を含むが限定されない）、膣筋、非経口（特に限定されないが、皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸腔内、腹腔内、脳内、動脈内または静脈内）、局所的（例えば、皮膚および粘膜表面（気道表面を含む））、および経皮的な投与に適したものを含むが、任意の特定の症状における、最も適切な投与経路は、治療されている病状の性質および重傷度に依存する。投与は、局所的または体系的になされ得る。製剤は、単回投与または多回投与の密閉した容器（例えば、プラスチック容器およびガラス容器）に含まれ得る。本明細書に記載されている修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、薬学的に許容可能な担体を含んでいる、単回投与可能な形態（特に限定されないが、溶剤、懸濁液、または乳化剤を含む）の混合物に生成され得る。また、本明細書に記載されるような、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、持続注入（特に限定されないが、例えば浸透ポンプのような小型ポンプを用いる）、単回ボーラス、または持続放出性薬剤によって投与され得る。
【０７４７】
投与に適した製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を等張にさせる溶液を含み得る、水性および非水性の溶液である等張性無菌溶液、ならびに、懸濁化剤、可溶化剤、濃化剤、安定化剤、および防腐剤を含み得る、水性および非水性の無菌懸濁液を含む。溶液および懸濁液は、無菌粉末、顆粒、および上述した種類の錠剤から生成され得る。
【０７４８】
凍結乾燥法は、関連するタンパク質製剤から水を取り除くことによって、タンパク質を保存している、一般的に使用される技術である。凍結乾燥法（または材料乾燥工程である凍結乾燥）では、まず、材料を氷結させ、それから、氷溶剤または氷結した溶剤が真空環境下における昇華によって取り除かれる。賦形剤は、凍結乾燥工程の間に安定性を高めるため、および／または、貯蔵下において凍結乾燥された生成物の安定性を改良するために、事前に凍結乾燥された製剤に含まれてもよい。「Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) and Arakawa ら. Pharm. Res. 8(3): 285-291 (1991) 」を参照のこと。
【０７４９】
また、薬剤の噴霧乾燥法は、当該技術分野の当業者に周知である。例えば、「Broadhead, J. ら., ‘The Spray Drying of Pharmaceuticals,’ in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)」を参照のこと。低分子薬剤に加えて、様々な生物材料が噴霧乾燥されており、これらは：酵素、血清、血漿、微生物、および酵母を含む。噴霧乾燥法は、１つの工程において、薬学的製剤溶液を、良質な、ほこりのない、また凝固粉末に変えることができるため、有用な技術である。基本的な技術には、以下の４つの工程を含む：ａ）噴霧器中での給水溶液の噴霧化、ｂ）噴霧空気の接触、ｃ）噴霧器の乾燥、およびｄ）乾燥空気から乾燥された生成物の分離。米国特許出願第６，２３５，７１０号明細書、および米国特許出願第６，００１，８００号明細書では、その全体が本明細書において参照として引用されており、噴霧乾燥法による組み換えエリスロポエチンの製造が記載されている。
【０７５０】
本明細書において記載されている薬学的組成物には、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤が含まれてもよい。薬学的に許容可能な担体は、投与されている特定の組成物によって部分的に決定されており、同様に、組成物の投与に用いられる特定の方法によって、部分的に決定される。したがって、本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドのために、薬学的組成物の多種多様な適切な製剤（薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤を任意に含んでいる）が存在する（例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)」、「Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975」、「Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980」、および「Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins, 1999)」を参照のこと）。適した担体としては、コハク酸含有緩衝剤、リン酸、ボラート（ｂｏｒａｔｅ）、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、イミダゾール、酢酸、重炭酸、およびその他の有機酸が挙げられる。他の有機酸としては：酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸）、低分子量ポリペプチド（特に限定されないが、約１０残基未満）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンを含む）、疎水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン、またはヒスチジン誘導体、メチオニン、グルタミン酸、またはリジン）、単糖類、二糖類、およびその他の糖質（例えば、トレハロース、スクロース、グルコース、マンノース、またはデキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡおよびエデンテート２ナトリウム（edentate disodium））、二価金属イオン（例えば、亜鉛、コバルト、または銅）、糖アルコール（例えば、マンニトール、またはソルビトール）、塩形成対イオン（salt-forming counter ions）（例えば、ナトリウム）、および／または非イオン性界面活性剤（特に限定されないが、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）およびＴｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０））、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）および他のプルロニック酸）を含む。また、他のプルロニック酸としては、プルロニック酸Ｆ６８（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８）またはＰＥＧを含む。適切な界面活性剤としては、例えば、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）に基づくポリエーテルを含み、例えば、（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）またはポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）、例えば、（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）またはその組み合わせが挙げられる。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯおよびＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、Ｒ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＴｅｔｒｏｎｉｃｓおよびＲ−Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（いずれも登録商標：ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ社、ワイアンドット、ミシガン州）として、市販されている。これらは米国特許出願第４，８２０，３５２号明細書においてさらに記載されており、本明細書において、その全体が参照によって組み込まれている。他のエチレン／ポリプロピレンブロック重合体は、適切な界面活性剤であってもよい。界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは、ＰＥＧ化された非天然アミノ酸のポリペプチドを、１つ以上の応力（例えば、攪拌によってもたらされる圧力など）に対して安定化するために用いられ得る。上記のいくつかは、「充填剤」と称されることもある。また、いくつかは、「等張化重合調整剤（tonicity modifiers）」と称されることもある。
【０７５１】
本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドには、水溶性ポリマー（例えば、持続放出系によって、または持続放出系の一部によって投与され得るＰＥＧ）と連結される非天然アミノ酸のポリペプチドを含んでいる。持続放出組成物は、加工品の形態（特に限定されないが、フィルムまたはマイクロカプセル）の半透過ポリマー材料を含むが、これに限定されない。持続放出材料は、生体適合性を有する材料から得られるものであり、例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（「Langer ら., J. Biomed. Mater. Res., 15: 267- 277 (1981)」、「Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)」）、エチレンビニル酢酸（上記「Langerら」）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号明細書）、ポリラクチド（ポリラクチック酸）（米国特許出願第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許出願公開第５８，４８１号明細書）、ポリグリコリド（グリコリック酸のポリマー）、ポリラクチド共グリコリド（乳酸およびグリコリック酸の共重合体）ポリアンヒドリド、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（「U. Sidman ら., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)」）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン酸、ポリサッカライド、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン）ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、およびシリコンが挙げられる。また、持続放出組成物は、リポソームに取り込まれる化合物を含む。この化合物を含んでいるリポソームは、公知の方法によって生成される：独国特許出願公開第３，２１８，１２１号明細書、「Epstein ら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)」、「Hwang ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)」、欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書、欧州特許出願公開３６，６７６号明細書、欧州特許出願公開８８，０４６号明細書、欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書、欧州特許出願公開１４２，６４１号明細書、日本特許出願公開（Japanese Pat. Appln.）第８３−１１８００８号明細書、米国特許出願第４，４８５，０４５号明細書、および米国特許出願第４，５４４，５４５号明細書、ならびに欧州特許出願公開第１０２，３２４号明細書を参照のこと。
【０７５２】
リポソームに取り込まれるポリペプチドは、例えば、独国特許出願公開第３，２１８，１２１号明細書、「Epstein ら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)」、「Hwang ら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)」、欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書、欧州特許出願公開第３６，６７６号明細書、欧州特許出願公開第８８，０４６号明細書、欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書、欧州特許出願公開第１４２，６４１号明細書、日本特許出願公開第８３−１１８００８号明細書、米国特許出願第４，４８５，０４５号明細書、および米国特許出願第４，５４４，５４５号明細書、ならびに欧州特許出願公開第１０２，３２４号明細書において記載される方法によって生成することができる。リポソームの組成および大きさは当業者の１人によって経験的に決定され得る。リポソームのいくつかの例は、「Park JWら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995)」、「Lasic D and Papahadjopoulos D (eds)」、「MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998)」、「Drummond DC,ら., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed) : CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002)」、「Park JW,ら., Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002)」、「Nielsen UBら, Biochim. Biophys. Acta 1591(l-3) :109-l18 (2002)」、「Mamot Cら, Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)」に記載されている。
【０７５３】
本明細書に記載されている組成物、製剤および方法の範囲において、患者に対して投与される投与量は、患者に長期にわたって有益な反応をもたらすのに十分であるようにすべきである。一般的に、非経口によって１回当たりに投与される、本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドの全薬学的に効果的な量は、患者の体重当り、約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１００μｇ／ｋｇ、または約０．０５μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲内であるが、この値は治療上の判断に従うものである。また、投与回数は、治療上の判断に従うものであり、その回数は、ヒトへの利用を認可された、市販の生成物よりも多くても少なくてもよい。一般的に、本明細書に記載されるようなポリマー：ポリペプチド接合体（例えば、ＰＥＧ化ポリペプチド）は、上述した投与方法のいずれかによって投与され得る。
【０７５４】
〔実施例〕
（実施例１：２−アミノ−３−（４−（プロピル−１，２−ジオン）フェニル）プロパン酸の塩酸塩の合成）
１，２−ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸は、以下に示す合成方法によって調整された。
【０７５５】
【化７７】
2010514808.tif 000081
【０７５６】
９０℃のベンゼン（３００ｍＬ）に４’−メチルプロピオフェノン（２０ｇ、１２２ｍｍｏｌ）およびＮ−ブロモスクシニミド（ＮＢＳ、２３ｇ、１３０ｍｍｏｌ）が溶かされた溶液に、２，２’−アゾシソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、０．６ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を還流するため、一晩中加熱した。その後、この反応物を室温まで冷却した。続いて、この褐色溶液を水および塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、ろ過し、さらに真空中で濃縮させた。残留物をヘキサンから結晶化させ、生成物（淡黄色溶液）（２７ｇ、８７％）を得た。
【０７５７】
０℃のＥｔＯＨ（４００ｍＬ）にＥｔＯＮａ（１４．５ｇ、２０３ｍｍｏｌ）が溶かされた溶液に、ジエチルアセタミドマロン酸（３９ｇ、１８０ｍｍｏｌ）を加え、続いてＥｔＯＨ（１００ｍＬ）に上記臭化物（２７ｇ、１１９ｍｍｏｌ）が溶かされた溶液を加えた。得られた混合物を、還流させるために１時間加熱し、クエン酸（３０ｇ）で急冷し、さらに水（３００ｍＬ）で希釈した。大半の溶媒が真空中で除去された後、残留物をＥｔＯＡｃで抽出した。続いて、有機相を水および塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、ろ過し、さらに真空中で濃縮させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（flash chromatography）（シリカ、１０：１−３：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、生成物（黄色溶液）（３７ｇ、８８％）を得た。
【０７５８】
０℃のエーテル（１００ｍＬ）にケトン（５ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）が溶かされた溶液に、臭素（Ｂｒ２）（０．８ｍＬ、１５．６ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で３時間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）水溶液で急冷した。この混合物をＥｔ２Ｏで抽出した。続いて、有機相を水および塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、ろ過し、さらに真空中で濃縮させて、さらなる精製を行う次の工程において直接用いられる生成物（黄色溶液）（５．４ｇ、８８％）を得た。
【０７５９】
ＤＭＳＯ（２０ｍＬ）にα−ブロモケトン（５．４ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）（２．０ｇ、１８．９ｍｍｏｌ）が溶かされた溶液に、ヨウ化カリウム（ＫＩ）（２．１ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を９０℃の窒素雰囲気下で２８時間攪拌した。反応物を水で急冷し、ＥｔＯＨｃで希釈した。有機相を分離し、続けて水および塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、ろ過し、さらに真空中で濃縮させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、６：１−１：１０ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、生成物（溶液）（１１．２ｇ、２４％）を得た。
【０７６０】
ＨＣｌ（１０ｍＬ）およびジオキサン（１０ｍＬ）の濃縮物（conc.）にジケトン（１．２ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）が溶かされた溶液を、還流のために一晩加熱した。真空中で溶媒を除去した後、残留物を溶解するためにＭｅＯＨ（３ｍＬ）を加えた。その後、エーテル（３００ｍＬ）を加えて、生成物（淡黄色溶液）（３０２ｍｇ、４２％）を沈殿させた。
【０７６１】
（実施例２：２−アミノ−３−（４−（ブチル−１，２−ジオン）フェニル）プロパン酸の塩酸塩の合成）
１，２−ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸は、以下に示す合成方法によって生成された。
【０７６２】
【化７８】
2010514808.tif 000082
【０７６３】
９０℃のエーテル（２５ｍＬ）にＣ３Ｈ７ＭｇＣｌ（２Ｍ、５０ｍｍｏｌ）が溶かされた溶液に、エーテル（５０ｍＬ）に溶かされたベンズアルデヒド（５ｍＬ、４２．５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を０℃で３０分間攪拌した。その後、この反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌで急冷し、エーテルで希釈した。有機相を分離し、続けて水および塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、ろ過し、さらに真空中で濃縮させて、精製なしで次の反応に直接用いられる粗生成物（７．２ｇ）を得た。
【０７６４】
ＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）に上記アルコール（７．２ｇ、４３．９ｍｍｏｌ）およびピリジン（７ｍＬ、８６．７ｍｍｏｌ）が溶かされた溶液に、デスマーチン（Ｄｅｓｓ−Ｍｅｒｔｉｎ）ペリオジアミン（１９．２ｇ、４５．３ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を一晩攪拌し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液および飽和炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）水溶液（１：１）で急冷した。次に、有機相を水および塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、ろ過し、さらに真空中で濃縮させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、８：１−４：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、生成物（無色油）（６．２８ｇ、２段階の間に９１％）を得た。
【０７６５】
ベンゼン（１５０ｍＬ）に上記ケトン（４．４３ｇ、２７．３ｍｍｏｌ）Ｎ−ブロモスクシニミド（ＮＢＳ、５．５ｇ、３０．９ｍｍｏｌ）が溶かされた溶液に、９０℃の２，２’−アゾビシソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、０．２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を還流のために一晩加熱し、その後室温で冷却した。続いて、褐色溶液を水および塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、ろ過し、さらに真空中で濃縮させた。残留物をヘキサンから結晶化させて、生成物（白色溶液）（６．２１ｇ、９５％）を得た。
【０７６６】
０℃のＥｔＯＨ（２００ｍＬ）にＥｔＯＮａ（２．５ｇ、３４．９ｍｍｏｌ）が溶かされた溶液に、ジエチルアセタミドマロン酸（６．７ｇ、３０．９ｍｍｏｌ）を加え、続いてＥｔＯＨ（１００ｍＬ）に上記臭化物（６．２ｇ、２５．８ｍｍｏｌ）が溶かされた溶液を加えた。得られた混合物を、還流させるために１時間加熱し、クエン酸（９ｇ）で急冷し、さらに水で希釈した。大半の溶媒が真空中で除去された後、残留物をＥｔＯＡｃで抽出した。続いて、有機相を水および塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、ろ過し、さらに真空中で濃縮させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、４：１−２：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、生成物（淡黄色溶液）（８．９２ｇ、９２％）を得た。
【０７６７】
ＨＯＡｃ（５０ｍＬ）に上記ケトン（１．４ｇ、３．７１ｍｍｏｌ）が溶かされた溶液に、臭素（Ｂｒ２）（０．７ｍＬ、１３．６ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で一晩攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）水溶液で急冷した。この混合物をＥｔ２Ｏで抽出した。続いて、有機相を水および塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、ろ過し、さらに真空中で濃縮させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、５：１−３：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、生成物（黄色溶液）（１．２３ｇ、７３％）を得た。
【０７６８】
ＤＭＳＯ（３０ｍＬ）にα−ブロモケトン（１．１２ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）（０．４ｇ、３．７７ｍｍｏｌ）が溶かされた溶液に、ヨウ化カリウム（ＫＩ）（０．４５ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を９０℃で一晩攪拌し、クエン酸（２ｇ）および水（２００ｍＬ）で急冷した。この混合物をＥｔＯＨｃで希釈した。次に、有機相を水および塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、ろ過し、さらに真空中で濃縮させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、６：１−１：１０ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、α−ヒドロキシルケトン（油）（０．６２ｇ、６４％）を得た。
【０７６９】
０℃のＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に上記アルコール（０．６２ｇ、１．５８ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．５ｍＬ、６．１９ｍｍｏｌ）が溶かされた溶液に、Ｄｅｓｓ−Ｍｅｒｔｉｎペリオジアミン（０．９ｇ、２．１２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を一晩攪拌し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液および飽和炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）水溶液（１：１）で急冷した。次に、有機相を水および塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、ろ過し、さらに真空中で濃縮させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、９：１−３：２ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、生成物（黄色油）（２８７ｍｇ、２段階の間に３０％）を得た。
【０７７０】
ＨＣｌ（１０ｍＬ）およびジオキサン（１０ｍＬ）の濃縮物（conc.）にジケトン（２７２ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）が溶かされた混合物を、還流のために一晩加熱した。真空中で溶媒を除去した後、残留物を溶解するためにＭｅＯＨ（３ｍＬ）を加えた。その後、エーテル（２００ｍＬ）を加えて、生成物（黄色溶液）（１６２ｍｇ、８１％）を沈殿させた。
【０７７１】
（実施例３：２−アミノ−３−（３，４−ジオキソシクロヘキサ−１，５−ジエニル）プロパン酸の塩酸塩の合成）
１，２−ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸は、以下に示す合成方法によって生成された。
【０７７２】
【化７９】
2010514808.tif 000083
【０７７３】
（実施例４：２−アミノ−３−（１，２−ジヒドロ−１，２−ジオキソナフタレン−６−イル）プロパン酸の塩酸塩の合成）
１，２−ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸は、以下に示す合成方法によって生成された。
【０７７４】
【化８０】
2010514808.tif 000084
【０７７５】
（実施例５：２−アミノ−３−（３，４−ジアミノフェニル）プロパン酸の塩酸塩の合成）
１，２−アリールジアミンを含んでいる非天然アミノ酸は、以下に示す合成方法によって生成された。
【０７７６】
【化８１】
2010514808.tif 000085
【０７７７】
（実施例６）
２−フェニルキノキサリンは、以下に示す合成方法に沿って合成された。この反応のＨＰＬＣのチャート（HPLC trace）を図３に示す：
【０７７８】
【化８２】
2010514808.tif 000086
【０７７９】
（実施例７）
２−エチル−３−メチルキノキサリンは、以下に示す合成方法に沿って合成された。このＨＰＬＣのチャートを図４に示す：
【０７８０】
【化８３】
2010514808.tif 000087
【０７８１】
（実施例８）
２−メチル−３−フェニルキノキサリンは、以下に示す合成方法に沿って合成された。このＨＰＬＣのチャートを図５に示す：
【０７８２】
【化８４】
2010514808.tif 000088
【０７８３】
（実施例９）
本実施例では、以下に示す合成方法に沿って、２，３−ジフェニルキノキサリンの合成について詳しく述べる。このＨＰＬＣのチャートを図６に示す：
【０７８４】
【化８５】
2010514808.tif 000089
【０７８５】
（実施例１０）
本実施例では、以下に示す合成方法に沿って、２，３−ジ（ピリジン−２−イル）キノキサリンの合成について詳しく述べる。このＨＰＬＣのチャートを図７に示す：
【０７８６】
【化８６】
2010514808.tif 000090
【０７８７】
（実施例１１）
本実施例では、以下に示す合成方法に沿って、ベンゾ（ａ）フェナジンの合成について詳しく述べる。このＨＰＬＣのチャートを図８に示す：
【０７８８】
【化８７】
2010514808.tif 000091
【０７８９】
（実施例１２）
本実施例では、以下に示す合成方法に沿って、４−スルフォニルベンゾ（ａ）フェナジンの合成について詳しく述べる。このＨＰＬＣのチャートを図９に示す：
【０７９０】
【化８８】
2010514808.tif 000092
【０７９１】
（実施例１３）
以下の合成方法に示すように、フェナジンは、１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンと、ｏ−フェニルジアミンとの反応によって合成した。このＨＰＬＣのチャートを図１０に示す：
【０７９２】
【化８９】
2010514808.tif 000093
【０７９３】
（実施例１４）
以下の合成方法に示すように、フェナジンは、フェナントレン−９，１０−ジオンと、ｏ−フェニルジアミンとの反応によって合成した。このＨＰＬＣのチャートを図１１に示す：
【０７９４】
【化９０】
2010514808.tif 000094
【０７９５】
（実施例１５：Ｅ−ｃｏｌｉにおける、修飾型ポリペプチドのクローニングおよび発現）
直交なｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および直交なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含んでいる、導入された翻訳系は、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドの発現に使用される。Ｏ−ＲＳは、非天然アミノ酸によって、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。翻訳系は、コードされるセレクターコドンに応じて、次々にポリペプチドに非天然アミノ酸を挿入する。非天然アミノ酸の取り込みに有用な、Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳのアミノ酸配列ならびにポリヌクレオチド配列が、米国特許出願公開第１０／１２６，９２７号明細書（「非天然アミノ酸のインビボでの取り込み」）、および米国特許出願公開第１０／１２６，９３１号明細書（「直交なｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対の生成に関する方法および組成物」）に記載されている。上記特許文献は本明細書中に参考によって組み込まれる。また、以下のＯ−ＲＳ配列およびＯ−ｔＲＮＡ配列が用いられてもよい：
【０７９６】
【表３】
2010514808.tif 000095
【０７９７】
修飾された遺伝子、および（所望の非天然アミノ酸に対して特異的な）直交なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡの対を含んでいるプラスミドを用いた、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換によって、ポリペプチドへの非天然アミノ酸の部位特異的な組込みが可能になる。形質転換後のＥ．ｃｏｌｉを、０．０１〜１００ｍＭの範囲の特定の非天然アミノ酸を含む培養液において３７℃で成長させると、高い忠実度、および効率で修飾型ポリペプチドを発現する。非天然アミノ酸を含んでいるヒスチジン標識されたポリペプチドは、封入体または凝集体として、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞において生成される。凝集体を可溶化し、６ＭのグアニジンＨＣｌ中で変性状態の下、親和性精製する。５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４０μＭ  ＣｕＳＯ４、および２％（Ｗ／Ｖ）サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）において、一晩４℃で透析することによって、リフォールディング（refolding）を行う。その後、２０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣＩ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣＩ、２ｍＭのＣａＣｌ２に対してポリペプチドを透析し、続いて、ヒスチジン標識を除去した（「Boissel ら., (1993) 268:15983-93」を参照のこと）。ポリペプチドの精製方法は、当該技術分野において公知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット分析、またはエレクトロスプレーイオン化質量分析などによって確認される。
【０７９８】
（実施例１６：非天然アミノ酸試験）
本実施例では、非天然アミノ酸のポリペプチドへの組込みに関する非天然アミノ酸の性質を予測するために役立つように、いくつかの実施例の非天然アミノ酸において実施される４つの試験の結果を提供する。
【０７９９】
【表４】
2010514808.tif 000096
【０８００】
（実施例１７）
本実施例では、化学合成されたＵＴ−ＩＩの誘導体化を図１６に示す。
【０８０１】
【化９１】
2010514808.tif 000097
【０８０２】
（実施例１８）
本実施例では、化学合成されたＸＴの誘導体化を図１６に示す。
【０８０３】
【化９２】
2010514808.tif 000098
【０８０４】
（実施例１９：アドリルジアミン基を有する非天然アミノ酸を含んでいるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のＰＥＧ化）
アミノ酸３５に位置するｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）を有するヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、ｈＧＨのＰＥＧ化をもたらすペンタン−２，３−ジオンを含んでいるｍＰＥＧ３０ｋと、キノキサリン結合を介して反応する。
【０８０５】
（実施例２０：アドリルジアミン基を有する非天然アミノ酸を含んでいるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の蛍光標識）
アミノ酸３５に位置するｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）を有するヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、フェナジン、ベンゾ（ａ）フェナジン、そこに蛍光標識しているｈＧＨの形質転換をもたらすナフタレン−１，２−ジオンと、キノキサリン結合を介して反応される。
【０８０６】
以下の実施例では、治療活性のある修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドのインビトロおよびインビボにおける活性、ならびに治療活性のある天然アミノ酸のポリペプチドのインビトロおよびインビボにおける活性を測定および比較するための方法を記載する。
【０８０７】
（実施例２１：細胞結合アッセイ）
様々な濃度の未標識ＧＨ、ｈＧＨまたはＧＭ−ＣＳＦ（容量：１０μｌ）が存在しない、あるいは存在する場合、ならびに１２５Ｉ−ＧＨ（約１００，０００ｃｐｍあるいは１ｎｇ）が存在する場合に、細胞（３×１０６）はＰＢＳ１％ＢＳＡ（１００μｌ）における複製物において培養される。その後、細胞は再び懸濁され、３５０μｌプラスチック遠心分離管中のよく冷えた２００μｌＦＣＳ上に積層され、遠心分離された（１０００ｇ：１分）。ペレットは、遠心分離管の端を切ることによって採取され、ペレットおよび上清はガンマ計測器（Packard社）において別々に測定された。
【０８０８】
特異的な結合（ｃｐｍ）は、１００倍過剰に存在する未標識のＧＨ（非特異的結合）において、競争的な（複製を意味する）負の結合（ｃｐｍ）が存在しないすべての結合として測定される。この非特異的な結合は、使用されるそれぞれの細胞種について測定される。実施例は、同一の１２５Ｉ−ＧＨ調整液を用いて別々の日に実施するものであり、内部整合性を示すべきである。１２５Ｉ−ＧＨは、ＧＨ受容体産生細胞との結合を示す。この結合は、未標識の天然ＧＨまたはｈＧＨによる容量依存性の方法において抑制されるが、ＧＭ−ＣＳＦあるいは別の負の制御によっては抑制されない。天然１２５Ｉ−ＧＨ（同様に、天然ＧＨ）の結合を得るためのｈＧＨの能力は、受容体が両形態とも非常に等しいと認識されることを示唆する。
【０８０９】
（実施例２２：ＰＥＧ化されたｈＧＨのインビボにおける検討）
ＰＥＧ−ｈＧＨ、非修飾型ｈＧＨおよび緩衝液がマウスあるいはラットに投与される。この結果、本発明のＰＥＧ化されたｈＧＨは、著しく増加した体重によって示されるように、非修飾型のｈＧＨと比較して、より優れた活性および延長された半減期を示す。
【０８１０】
（実施例２３：接合されたｈＧＨおよび接合されていないｈＧＨ、ならびにそれらの変異体のインビボにおける半減期の測定）
すべての動物実験は、ＡＡＡＬＡＣに認定された設備、およびSt. Louis UniversityのInstitutional Animal Care and Use委員会によって認可されたプロトコールに基づき実施される。ラットは、１２時間毎の明／暗サイクルに設定した室内において、個々のケージに収容される。動物は、認可された飼料（Purina rodent chow 5001）および水へのアクセスを提供される。脳下垂体を摘出されたラットには、５％グルコースを含んだ水を与えた。
【０８１１】
（実施例２４：薬物動態の検討）
ＰＥＧ化された各変異ｈＧＨの質は、動物実験開始前に、３つのアッセイを用いて測定される。ＰＥＧ−ｈＧＨの純度は、非還元条件下において、ＭＥＳ  ＳＤＳ移動緩衝液を用いて、４〜１２％のアクリルアミドＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを流動させることによって検査される（Invitrogen社、Carlsbad、CA）。ゲルは、クマシーブルーによって染色される。ＰＥＧ−ｈＧＨの接合体は、デンシトメトリースキャンに基づく、９５％の純度よりも高い。ＰＥＧ−ｈＧＨそれぞれの内毒素の値は、Charles River Laboratories(Wilmington, MA)から入手できるＫＴＡ２キットを用いて、動態ＬＡＬアッセイによって検査されており、これによって、１回の投与につき、当該内毒素は５ＥＵよりも少ないことが分かっている。ＰＥＧ−ｈＧＨの生物学的な活性は、ＩＭ−９  ｐＳＴＡＴ５生物アッセイによって評価され、ＥＣ５０の値は１５ｎＭよりも少ないことが確認された。
【０８１２】
ＰＥＧ修飾型成長ホルモン化合物の薬物動態は、Charles River Laboratoriesから入手した雄のSprague-Dawleyラット（２６１ｇ〜４５１ｇ）において、当該ＰＥＧ修飾型成長ホルモン同士、および、非ＰＥＧ化成長ホルモンと比較された。カテーテルは血液採取のため、頚動脈に外科的に挿入される。カテーテルの挿入に成功した後に、動物は投与前に治療群（１群：３〜６匹）に割り当てられる。動物は、１ｍｇ／ｋｇの化合物を含む０．４１〜０．５５ｍｌ／ｋｇの投与量で、皮下に投与される。血液サンプルは、留置カテーテルを介して各時点において、ＥＤＴＡコートされたマイクロ遠心分離チューブの中に集められる。血しょうは遠心分離後に集められ、分析するまでは−８０℃で貯蔵される。化合物の濃度は、BioSource International(Camarillo, CA)またはDiagnostic Systems Laboratories (Webster, TX)から入手できる抗体サンドイッチ成長ホルモンＥＬＩＺＡキットを用いて測定される。濃度は投与される類似体に対応するスタンダードによって計算される。薬物動態学的パラメーターは、モデル化プログラムWinNonlin(Pharsight社, version 4.1)によって評価される。リンナーアップ／ログダウン（linear-up/log-down）台形積分を用いた非分画分析が使用されており、これによって、濃度データが一律に加重される。
【０８１３】
血しょう濃度はラットに単回皮下投与によって一定期間で得られる。ラット（１グループ当たり３〜６匹）は、１ｍｇ／ｋｇタンパクを単回ボーラス投与によって与えられる。ｈＧＨ野生型タンパク質（ＷＨＯ  ｈＧＨ）、ヒスチジン標識ｈＧＨポリペプチド（ｈｉｓ−ｈＧＨ）または一般式１で示される非天然アミノ酸を含んでいるヒスチジン標識ｈＧＨポリペプチドは、それぞれ６つの異なる位置において３０ｋＤａのＰＥＧと共有結合し、ＷＨＯ  ｈＧＨおよび（ｈｉｓ）−ｈＧＨと比較される。血しょうサンプルは、一定の時間間隔を引き継ぎ、記載されているような化合物を注入するためにアッセイされる。
【０８１４】
（実施例２５：薬力学の検討）
脳下垂体が摘出されたSprague-Dawleyラット(雄)は、Charles River Laboratoriesから入手できる。下垂体は、３〜４週齢で外科的に除去される。動物は３週間馴化飼育され、その間、時体重が測定される。試験開始前に、７日間で０ｇ〜８ｇ以上の体重増加が見られた動物は、治療群に含まれ、無作為に抽出された。ラットは、ボーラス投与量または日用量のいずれかを皮下に投与された。試験を通して、ラットは毎日連続して体重測定、麻酔、採血、および（可能であれば）投与される。血液は、ヘパリン添加毛細血管チューブを用いて、眼窩洞から採取され、ＥＤＴＡコートされたマイクロ遠心分離チューブの中に収められる。血しょうは遠心分離によって単離され、分析まで−８０℃で貯蔵される。平均血しょう濃度（＋／−Ｓ．Ｄ．）は、時間間隔を比較してプロットされた。
【０８１５】
ペプチドＩＧＦ−Ｉは、ソマトメジンまたはインスリン様成長因子ファミリーのメンバーである。ＩＧＦ−Ｉは、成長ホルモンの多くの成長促進因子を媒介する。ＩＧＦ−Ｉ濃度は、提供されたラット／マウスＩＧＦ−Ｉスタンダード（Diagnosic Systems Laboratories）に対して競合して結合する酵素免疫測定法キットを用いて測定された。脳下垂体が摘出されたラット、ラット（１群：５〜７匹）は皮下に単回投与または日用量投与のいずれかを与えられる。動物は、毎日連続して体重測定、麻酔、採血、および（可能であれば）投与される。体重の結果はプラシーボ処理され、野生型ｈＧＨ（ｈＧＨ）、ヒスチジン標識ｈＧＨ（（ｈｉｓ）ｈＧＨ）、および一般式３で示される非天然アミノ酸を含んでいるｈＧＨポリペプチドが、３５および９２の位置で３０ｋＤａのＰＥＧと共有結合される。
【０８１６】
（実施例２６：非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨの安全性、および／または、有効性に関するヒトでの臨床試験）
臨床試験に関する以下の実施例は、子供および成人の成長ホルモンの分泌障害、ターナー症候群、慢性腎不全、プラダーウィリ症候群、子宮内発育遅延を発症している子供、特発性小人症、慢性的なグルココルチコイドの大量投与使用に付随する成長不全、後発的な移植による成長不全、Ｘ連結された低リン酸血症性のくる病、炎症性腸障害、ノーン症候群、骨形成異常、セリアック病に関連する成長不全、筋肉疲労（例えば、後発的な免疫不全症候群に促進される、火傷の回復、肥満体の過度な減量の副作用で促進される）、線維筋通症、慢性疲労症候群および老化に伴う衰弱を治療するため、ならびにその他のヒト成長ホルモンの利用に用いる。
【０８１７】
（目的）
皮下投与される、１つ以上の市販のｈＧＨ産物（例えば、Humatrope（登録商標）（Eh Lilly & Co.社）、Nutropin（登録商標）（Genentech社）、Norditropin（登録商標）（Novo-Nordisk社）、Genotropin（登録商標）（Pfizer社）、およびSaizen/Serostim（登録商標）（Serono社）を含むが限定されない）を有する、一般式１で示される非天然アミノ酸を含んでいるＰＥＧ化された組み換えヒトｈＧＨの安全性および薬物動態を比較する。
【０８１８】
（患者）
この調査に参加した１８人の健康な志願者は、年齢が２０〜４０歳であり、体重が６０〜９０ｋｇである。被験者は、血液学または血清化学、陰性の尿薬物中毒のスクリーニング検査、ＨＩＶスクリーニング検査、およびＨＢｓ抗原に関して、臨床的に重大な異常を示す検査値を有しない。被験者らは、高血圧、主な血液病のいずれかの病歴、重篤な肝臓障害の病歴、腎臓障害、心臓血管障害、胃腸障害、泌尿器障害、代謝障害、または神経障害、貧血または発作性障害の病歴、細菌由来または哺乳動物由来の産物、ＰＥＧ、あるいはヒト血清アルブミンに対する既知の感受性、習慣的且つ過剰なカフェイン含有飲料の消費、本調査を開始する３０日以内に別の臨床試験に参加しているか、または輸血あるいは献血されている、本調査を開始する３ヶ月以内にｈＧＨを曝露されている、本調査を開始する７日以内に病気を発症している、および本調査を開始する１４日以内に、調査前の身体検査または臨床検査値において顕著な異常を有する、というどの兆候も有するべきではない。すべての被験者は、安全性に対する評価が可能であり、薬物動態分析のためのすべての血液採取物は、予定通りに収集される。すべての試験は、制度倫理委員会の承認および患者の同意を得て実施される。
【０８１９】
（研究計画）
フェーズ１は、単一施設において、盲検はなく無作為に選ばれた健康な男性志願者においての２期間にまたがる試験である。１８人の被験者は、無作為に２つの治療順序群のうち１つに割り当てられる（１群に９人）。選択された市販の製品に記載される処方に相当する非天然アミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨの投与量を用いて、大腿上方にボーラス皮下注射として、２回に分けた投与期間に亘って投与される。市販の製品の投与量および投与回数は、包装ラベルに指示されている。さらなる投与、投与回数、あるいは別の条件が求められる場合、さらなる被験者群を追加することによって、当該市販の製品の使用がこの試験に加えられる。各投与期間は、１４日目の洗い流し期間によって隔てられる。被験者は、２回の投与期間それぞれの投与前に少なくとも１２時間、および投与後に７２時間研究施設に拘束されるが、投与期間中は拘束されない。さらなる投与量、投与回数あるいは別の条件が存在する場合、さらなる被験者群が、ＰＥＧ化されたｈＧＨに関して試験するためにも、同様に追加される。ヒトに認可されたＧＨの複数の製剤が、本試験において用いられてもよい。Humatrope(登録商標) (Eli LilIy & Co. 社)、Nutropin(登録商標) (Genentech社)、Norditoropin(登録商標) (Novo-Nordisk社)、Genotropin(登録商標) (Pfizer社)およびSaizen/Serosum(登録商標) (Serono社)が、ヒトに使用可能な市販のＧＨ製品である。
【０８２０】
（血液採取）
ｈＧＨ投与の前後、直接血管を穿刺することによって、連続的に血液が抜き出される。血清ＧＨ濃度測定のための静脈血サンプル（５ｍＬ）は、投与の約３０分前、約２０分前および約１０分前、ならびに投与の約３０分後、１時間後、２時間後、５時間後、８時間後、１２時間後、１５時間後、１８時間後、２４時間後、３０時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後および７０時間後に得た。各血清サンプルを２等分し、すべての血清サンプルを、−２０℃で貯蔵した。血清サンプルはドライアイスの状態で出荷される。空腹時の臨床検査試験（血液学、血清化学、および尿検査）は、１日目に最初に投与される前、４日目の朝、１６日目に投与される前、および１９日目の朝に迅速に実施される。
【０８２１】
（生物分析法）
ＥＬＩＺＡキット法（Diagnostic Systems Laboratory [DSL], Webster TX）が、血清中の濃度の測定に用いられる。
【０８２２】
（安全性の測定）
生命兆候は、各投与前（１日目および１６日目）、ならびに各投与後６時間、２４時間、４８時間および７２時間に速やかに記録される。安全性の測定は、有害事象の発生率および種類、ならびに臨床検査試験における基準値からの変化に基づく。さらに、生命兆候（例えば、血圧）の測定における検査前からの変化、および身体検査の結果が測定される。
【０８２３】
（データ分析）
投与後の血清濃度値は、投与後の血清濃度値からそれぞれ差し引くことによって、投与前のＧＨ基準濃度に対して補正される。平均ＧＨ基準濃度は、投与の３０分前、２０分前および１０分前に採取された３つのサンプルから得られた値を平均化することによって決定される。投与前に採取されたサンプルの血清濃度がアッセイの定量値を下回る場合、投与前の血清ＧＨ濃度は、この平均値の計算に含まれない。薬物動態学的パラメーターは、ＧＨ基準濃度に対して補正された血清濃度データから求められる。薬物動態学的パラメーターは、最新版のＢｌＯＡＶＬソフトウェアを用いて、ＶＡＸ  ８６００コンピュータシステム（Digital Equipment社）上のモデル独立法（model independent methods）によって算出される。このシステムでは、次の薬物動態パラメーターが求められる。すなわち、血清濃度ピーク（Ｃｍａｘ）、血清濃度ピークに達する期間（Ｔｍａｘ）、線形台形法則の利用によって算出される、０時から最終血液採取時（ＡＵＣ０−７２）までの濃度−時間曲線（ＡＵＣ）、および消失速度定数から算出された末端消失半減期（ｔ１／２）である。消失速度定数は、対数−直線濃度−期間プロットの末端直線領域における、連続したデータポイントの直線回帰によって算定される。薬物動態学的パラメーターの標準偏差（ＳＤ）および変動係数（ＣＶ）は、各処理に対して算出されるものを意味する。パラメーター平均値の比（保存された公式／保存されていない公式）が、算出される。
【０８２４】
（安全性の結果）
有害事象発生率は、治療群全体に均等に分散される。臨床検査試験または血圧測定の基準値あるいは調査前の値から、臨床的に著しい変化はみられず、また、身体検査の結果および生命兆候想定において調査前からの注目すべき変化はみられない。２つの治療群に関する安全性は、類似しているであろう。
【０８２５】
（薬物動態の結果）
平均血清ＧＨ濃度−時間プロフィールは、市販のｈＧＨ製品（特に限定されないが、例えば、Humatrope(登録商標) (Eli LilIy & Co. 社)、Nutropin(登録商標) (Genentech社)、Norditoropin(登録商標) (Novo-Nordisk社)、Genotropin(登録商標) (Pfizer社)およびSaizen/Serosum(登録商標) (Serono社)を含む）を１つ以上単回投与された後の１８人の被験者全員において、各時点で測定された、一般式Ｉで示される非天然アミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨと比較される。すべての被験者は、投与前のＧＨ基準濃度が正常な生理的範囲内であるべきである。薬物動態学的パラメーターは、投与前の平均ＧＨ基準濃度に対して補正される血清データから割り出され、ＣｍａｘおよびＴｍａｘが求められる。選択された臨床コンパレータ（Humatrope(登録商標) (Eli LilIy & Co. 社)、Nutropin(登録商標) (Genentech社)、Norditoropin(登録商標) (Novo-Nordisk社)、Genotropin(登録商標) (Pfizer社)およびSaizen/Serosum(登録商標) (Serono社)）に関する平均Ｔｍａｘは、一般式Ｉで示される非天然アミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨに関する平均Ｔｍａｘよりも著しく短い。末端半減期の値は、一般式Ｉで示される非天然アミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨの末端半減期と比較して、試験された市販のｈＧＨ製品は著しく短い。
【０８２６】
本発明は、健康な男性を被験者として実施するが、別の患者集団において、同様の吸収特性および安全プロフィールが予測され得る。別の患者集団としては、例えば、ガンまたは慢性腎不全を発症している男性患者あるいは女性患者、小児腎不全患者、自己貯血式プログラムにおける患者、または選択的手術を予定している患者が挙げられる。
【０８２７】
結論として、皮下投与される一般式Ｉで示される非天然アミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨの１回の投与量は安全であり、健康な男性被験者に許容される。有害事象の比較発症率、臨床検査値、生命兆候、および生理学的試験の結果に基づく、ｈＧＨの市販形態、および一般式Ｉで示される非天然アミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨの安全プロフィールは均等である。一般式Ｉで示される非天然アミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨは、患者および医療提供者に大きな臨床利用性をもたらす可能性がある。
【０８２８】
（実施例２７：ＰＥＧ化されたｈＧＨおよびＰＥＧ化されていないｈＧＨの水溶性の比較）
ｈＧＨ野生型タンパク質（ＷＨＯ  ｈＧＨ）、ヒスチジン標識されたｈＧＨポリペプチド（ｈｉｓ−ｈＧＨ）あるいは３０ｋＤａのＰＥＧとアミノ酸の９２の位置で共有結合された、一般式Ｉで示される非天然アミノ酸を含んでいるヒスチジン標識されたｈＧＨポリペプチドの水溶性は、１００μＬの水に可溶なポリペプチドの量をそれぞれ測定することによって求められる。ＰＥＧ化されたｈＧＨの量はＷＨＯ  ｈＧＨの量よりも多いことから、非天然アミノ酸のポリペプチドのＰＥＧ化されたｈＧＨは、水溶性の上昇を示す。
【０８２９】
（実施例２８：治療活性のある修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドのインビボにおける試験）
前立腺癌腫瘍異種移植片をマウスに移植し、２つの群に分ける。１つの群は、治療活性のある修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを毎日投与し、もう１つの群は、治療活性のある天然アミノ酸のポリペプチドを毎日投与する。腫瘍の大きさを毎日測定したところ、治療活性のある修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドによって処置された群において腫瘍の大きさの縮小が見られるように、治療活性のある修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドは治療効果が改善されている。
【０８３０】
本明細書に記載された実施例および実施形態は説明のみを目的としており、且つそれらの様々な改良および変更は、当業者に示唆されるとともに、本出願の精神および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０８３１】
【図１】本明細書に記載の方法、組成物、方策、および技術の特定の態様の関係を示す非限定的な概略図である。
【図２】本明細書に記載のキノキサリンの誘導体およびフェナジンの誘導体を作製するために使用される合成方法の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図３】本明細書に記載のキノキサリンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、２−オキソ−２−フェニルアセトアルデヒドとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、２−フェニルキノキサリンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【図４】本明細書に記載のキノキサリンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、ペンタン−２，３−ジオンとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、２−エチル−３−メチルキノキサリンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【図５】本明細書に記載のキノキサリンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、１−フェニルプロパン−１，２−ジオンとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、２−メチル−３−フェニルキノキサリンが形成されること、およびこの反応を、この反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【図６】本明細書に記載のキノキサリンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、ベンジルとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、２，３−ジフェニルキノキサリンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【図７】本明細書に記載のキノキサリンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、１，２−ジ（ピリジン−２−イル）エタン−１，２−ジオンとｏ−フェニルジアミン  （ｏＰＤＡ）との反応によって、２，３−ジ（ピリジン−２−イル）キノキサリンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【図８】本明細書に記載のフェナジンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、ナフタレン−１，２−ジオンとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、ベンゾ［ａ］フェナジンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【図９】本明細書に記載のフェナジンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、５−スルホニル−ナフタレン−１，２−ジオンとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、４−スルホニルベンゾ［ａ］フェナジンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【図１０】本明細書に記載のフェナジンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、強い蛍光性のジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【図１１】本明細書に記載のフェナジンの誘導体を形成することの説明に役立つ非限定的な例として、フェナントレン−９，１０−ジオンとｏ−フェニルジアミン（ｏＰＤＡ）との反応によって、強い蛍光性のジベンゾ［ａ，ｃ］フェナジンが形成されること、およびこの反応の高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す図である。
【図１２】本明細書に記載の１，２−ジカルボニル基を含んでいる非天然アミノ酸、および１，２−アリールジアミン基を含んでいる非天然アミノ酸の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図１３】Ｚ基を含んでいる出発物質およびＷ基を含んでいる出発物質から、誘導体化剤である［Ｚ−Ｌ］ｎ−Ｌ１−Ｗ−Ｒおよび［Ｚ−Ｌ］ｎ−Ｌ１−Ｗ’−Ｒを調製するための説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図１４】ＰＥＧ試薬を合成するための説明に役立つ非限定的な図である。
【図１５】Ｚ基を含んでいる出発物質およびＷ基を含んでいる出発物質から、誘導体化剤である［Ｚ−Ｌ］ｎ−Ｌ１−Ｗ−Ｒおよび［Ｚ−Ｌ］ｎ−Ｌ１−Ｗ’−Ｒを調製することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図１６】ジケトンを含んでいる試薬を用いて、ジアミンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを誘導体化することによって、修飾されたキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾されたフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図１７】ジアミンを含んでいる試薬を用いて、ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸の保護されていないペプチドを誘導体化することによって、修飾されたキノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾されたフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図１８】ジアミンの試薬およびジカルボニルの試薬をそれぞれ用いて、ジカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のタンパク質またはポリペプチド、およびジアミンを含んでいるアミノ酸のタンパク質またはポリペプチドを翻訳後修飾することによって、キノキサリンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド、およびフェナジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図１９Ａ】非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドまたはタンパク質をジアミンおよびジカルボニルで修飾して、新しい化学官能基を導入することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図１９Ｂ】官能基を含んでいるポリペプチドまたはタンパク質とＰＥＧ誘導体との反応の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図２０】ジアミンおよびジカルボニルで、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドまたはタンパク質を修飾して、新しい化学官能基を導入することを説明に役立つ非限定的な例を示す図、ならびに説明に役立つ官能基とＰＥＧ誘導体との反応の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図２１】非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド上にフェナジンが部位特異的に形成されることの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図２２】タンパク質を標識するために、連続的に接合することによってキノキサリン部分およびフェナジン部分を形成することを説明する非限定的な例を示す図である。
【図２３】二官能性リンカー基を使用して、フェナジン部分を形成することによって非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質またはポリペプチドをＰＥＧ誘導体と連結することの説明に役立つ非限定的な図である。
【図２４】アリールジアミンを両方の末端に含んでいる二官能性リンカー基の合成の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図２５】２つの非天然アミノ酸のポリペプチドを一緒に連結する二官能性リンカーを用いて、ホモ二量体を形成するという合成の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図２６】枝分かれＰＥＧを含んでいる試薬と、ジカルボニルの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドとの反応によって、キノキサリンで修飾されたポリペプチド、およびフェナジンで修飾されたポリペプチドを形成することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図２７】枝分かれＰＥＧを含んでいる試薬と、ジアミンの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドとの反応によって、キノキサリンで修飾されたポリペプチドの異性体を形成することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図２８】分岐したＰＥＧを含んでいる試薬と、置換されたジアミンの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドとの反応によって、フェナジンで修飾されたポリペプチドの異性体を形成することの説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図２９】（Ａ）〜（Ｄ）は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する、精製する、特徴付ける、および使用するための方法、組成物、技術、ならびに方策の何れかに必要に応じて使用されるか、または組み込まれるリンカーの合成の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図３０】アリールジアミン基を含んでいるＰＥＧ誘導体およびジカルボニル基を含んでいるＰＥＧ誘導体の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図３１】ＰＥＧを含んでいる試薬と非天然アミノ酸を含んでいる化合物との、２ステップの接合および１ステップの接合の説明に役立つ非限定的な例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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