(57)【要約】単量体アントラニル酸合成酵素に作動可能に連結された葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）をコードする新規な発現ベクターおよび構築物が提供される。さらに、単量体アントラニル酸合成酵素をコードする新規なポリヌクレオチド配列が提供される。発現ベクターおよび構築物を含有するトランスジェニック植物において遊離トリプトファンのレベルを増加させるための方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単量体アントラニル酸合成酵素に融合した葉緑体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターであって、
ａ）葉緑体輸送ペプチドは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３３、もしくは配列番号３６のポリペプチド配列を含み、または
ｂ）葉緑体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、配列番号２、配列番号３、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、もしくは配列番号１７を含み、
前記葉緑体輸送ペプチドが、ＣＴＰ１による前記アントラニル酸合成酵素の標的化と比較した場合、植物細胞の葉緑体への前記単量体アントラニル酸合成酵素の標的化の増強を供し、前記ポリヌクレオチド分子が、同一遺伝子型ではあるが前記ポリヌクレオチド分子を欠く植物細胞と比較した場合、前記ポリヌクレオチド分子を含むトランスジェニック植物細胞において少なくとも１個のアミノ酸のレベルの増強を供する発現ベクター。
【請求項２】
前記単量体アントラニル酸合成酵素がトリプトファンに対してフィードバック非感受性である、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記単量体アントラニル酸合成酵素が、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、および配列番号２１２を含む群から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項４】
配列番号２１３または配列番号２１４の核酸配列を含むと定義される、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項５】
単量体アントラニル酸合成酵素に融合した葉緑体輸送ペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された、植物において機能的なプロモーターをさらに含む、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記プロモーターが、構成的、誘導性、種子特異的、または組織選択的プロモーターである、請求項５記載の発現ベクター。
【請求項７】
葉緑体輸送ペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号９を含み、単量体アントラニル酸合成酵素をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０７を含む、請求項５記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項１記載の発現ベクターで形質転換されたトランスジェニック細胞。
【請求項９】
植物細胞として定義される、請求項８記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１０】
単子葉植物細胞として定義される、請求項９記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項１１】
双子葉植物細胞として定義される、請求項９記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項１２】
前記単量体アントラニル酸合成酵素が、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、および配列番号２１２よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項９記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項１３】
単量体アントラニル酸合成酵素に融合した葉緑体輸送ペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項９記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項１４】
前記プロモーターが、構成的、誘導性、種子特異的、および組織選択的プロモーターよりなる群から選択される請求項９記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項１５】
前記トランスジェニック植物細胞がトウモロコシ細胞である、請求項９記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項１６】
葉緑体輸送ペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号９を含み、単量体アントラニル酸合成酵素をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０７を含む、請求項９記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項１７】
単子葉植物の種子における遊離トリプトファンのレベルを増加させる方法であって、請求項１記載の発現ベクターを植物細胞で発現させることを含み、前記葉緑体輸送ペプチドが前記単量体アントラニル酸合成酵素を前記植物細胞の色素体に区分できることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１記載の発現ベクターで形質転換されたトランスジェニック植物。
【請求項１９】
種子が前記発現ベクターを含む、請求項１８記載の植物の種子。
【請求項２０】
請求項１９記載の種子をミール、タンパク質または油に加工することを含む、栄養的に増強されたトウモロコシ飼料生成物を製造する方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法により製造される飼料生成物。
【請求項２２】
配列番号２１、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３６よりなる群から選択されるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド分子を含有する、請求項２１記載の飼料生成物。
【請求項２３】
ＤＮＡ増幅法において試験される場合、請求項１記載の発現ベクターに特徴的な単位複製配列を産生する核酸を含む、請求項２１記載の飼料生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年８月１１日付けで出願された米国特許仮出願第６０,８３７,２００号の優先権を主張する。ここに出典明示してこの文献の全開示を本明細書の一部とみなす。
【０００２】
本発明は、植物細胞におけるアントラニル酸合成酵素の発現および局在化のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
トウモロコシにおいて、アントラニル酸合成酵素は、葉緑体において芳香族アミノ酸経路からトリプトファンの生合成へと分岐する最初の反応を触媒する２つのサブユニット酵素として存在する。アントラニル酸合成酵素は、植物におけるトリプトファン生成の調節において重要な酵素であることが明らかにされている。Ａｎｄｅｒｓｏｎら（米国特許第６１１８０４７号）は、トウモロコシからのアントラニル合成酵素のトリプトファン非感受性α−サブユニットの過剰発現によりトランスジェニックトウモロコシ植物においてトリプトファンのレベルが増加することを示した。最近、原核生物供給源由来の単量体型のアントラニル酸合成酵素は、トランスジェニックダイズおよびトウモロコシにおいてトリプトファンレベルを増加させることができることが明らかにされた（米国特許第７２１７８６５号として公表された米国特許出願第１０／３８９２７号および米国特許出願公開第２００３／０２１３０１０号として公開された米国特許出願第１０／４３００１１号）。
【０００４】
葉緑体内部で生合成経路に関与する大半のタンパク質は、核コードされており、細胞質ゾルで合成される。したがって、色素体へのこれらのタンパク質の正確な標的化はその生合成機能には不可欠である。ほとんどの場合、この標的化は、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）または色素体輸送ペプチドと呼ばれるＮ末端伸長の存在により実現される。細菌供給源由来の導入遺伝子は、発現されたポリペプチドが葉緑体に区分されるためには、ＣＴＰ配列をコードする配列が、発現されるポリペプチドをコードする配列に融合されていなければならない。したがって、外来性ポリペプチドの葉緑体への輸送は、外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’領域に、ＣＴＰ配列をコードするポリヌクレオチド配列を作動可能に連結させることによって実現される。
【０００５】
単量体アントラニル酸合成酵素を有する植物細胞の操作および形質転換での多くの目的のためには、植物細胞に導入される遺伝子が、色素体に移動され色素体で機能する産物をもたらすことが望ましいであろう。しかしながら、ＣＴＰすべてが等しく効果的にこの移動を実現できるわけではない。単子葉植物、および特にトウモロコシ植物におけるアントラニル酸合成酵素の発現および局在化を成功させるための効率的で効果的なＣＴＰの同定が当該技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、植物細胞におけるアントラニル酸合成酵素の発現および局在化のための方法および組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、単量体アントラニル酸合成酵素（ＡＳ）に融合した葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、前記葉緑体輸送ペプチドは、アントラニル酸合成酵素を植物細胞の色素体画分に区分できる。そのようなアントラニル酸合成酵素核酸がトランスジェニック植物で発現されると、植物の細胞内でトリプトファンレベルの上昇を実現できる。本発明の一実施形態では、これらのポリヌクレオチドを含有する発現ベクターおよび構築物が提供される。そのような発現ベクターおよび構築物を含有する組換え植物細胞も本発明の一部である。本発明の配列、構築物および方法を用いるタンパク質の発現により得られるトランスジェニック植物細胞、種子および飼料生成物もさらに本発明の一部と見なされる。
【０００８】
別の態様では、本発明は、単子葉植物における遊離トリプトファン含有量を増加させるための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、単量体アントラニル酸合成酵素に融合した葉緑体輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで単子葉植物を形質転換することを含み、前記葉緑体輸送ペプチドは、機能してアントラニル酸合成酵素活性を植物細胞の色素体に局在化または区分する。
【０００９】
さらに別の態様では、本発明は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）およびシノリゾビウム（Sinorhizobium）供給源由来の単量体アントラニル酸合成酵素をコードする新規な単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の一実施態様では、これらの新規ポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。さらに他の実施形態では、これらの発現ベクターを含む宿主細胞、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物由来の種子および得られる飼料生成物も本発明の一部と見なされる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】プラスミドｐＭＯＮ６６５６０の制限地図である。
【図２】植物形質転換ベクターｐＭＯＮ６６５６０を含有するトランスジェニックトウモロコシ細胞の色素体画分のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図３】プラスミドｐＭＯＮ７８８２４の制限地図である。
【図４】プラスミドｐＭＯＮ７８８３２の制限地図である。
【図５】プラスミドｐＭＯＮ６９７６５の制限地図である。
【図６】プラスミドｐＭＯＮ６９７５５の制限地図である。
【図７】プラスミドｐＭＯＮ８２５６１の制限地図である。
【図８】プラスミドｐＭＯＮ７８１５２の制限地図である。
【図９】プラスミドｐＭＯＮ７８１５３の制限地図である。
【図１０】プラスミドｐＭＯＮ８２５６０の制限地図である。
【図１１】プラスミドｐＭＯＮ６９７７９の制限地図である。
【図１２】プラスミドｐＭＯＮ７８１３７の制限地図である。
【図１３】プラスミドｐＭＯＮ７８１４０の制限地図である。
【図１４】プラスミドｐＭＯＮ７８１４３の制限地図である。
【図１５】プラスミドｐＭＯＮ７８１４２の制限地図である。
【図１６】プラスミドｐＭＯＮ７８１３９の制限地図である。
【図１７】プラスミドｐＭＯＮ６９７７４の制限地図である。
【図１８】プラスミドｐＭＯＮ６９７７５の制限地図である。
【図１９】プラスミドｐＭＯＮ６９７７７の制限地図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明によれば、単量体アントラニル酸合成酵素を発現し植物細胞の色素体に輸送するための組成物が提供される。本発明は、特に、形質転換された植物の細胞中で遊離トリプトファン含有量を増加させることに用途を見出すことになる新規なポリヌクレオチド配列を提供する。さらに、アグロバクテリウムおよびシノリゾビウム由来の単量体アントラニル酸合成酵素ポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチドが提供される。
【００１２】
本発明は、単量体アントラニル酸合成酵素（ＡＳ）に融合した葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、前記葉緑体輸送ペプチドは、植物細胞の色素体画分にアントラニル酸合成酵素を区分できる。そのようなアントラニル酸合成酵素核酸がトランスジェニック植物で発現されると、植物の細胞内でトリプトファンレベルの上昇を実現できる。本発明の一態様では、これらのポリヌクレオチドを含有する発現ベクターおよび構築物が提供される。そのような発現ベクターおよび構築物を含有する組換え植物細胞も本発明の一部である。本発明の配列、構築物および方法を用いるタンパク質の発現により得られるトランスジェニック植物細胞、種子および飼料生成物も本発明の一部であると見なされる。
【００１３】
本発明のさらに別の態様では、単子葉植物における遊離トリプトファン含有量を増加させる方法が提供される。一実施形態では、この方法は、単量体アントラニル酸合成酵素に融合した葉緑体輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで単子葉植物を形質転換することを含み、前記葉緑体輸送ペプチドは、アントラニル酸合成酵素活性を植物細胞の色素体に区分できる。
【００１４】
本発明は、アグロバクテリウムおよびシノリゾビウム供給源由来の単量体アントラニル酸合成酵素をコードする新規な単離されたポリヌクレオチドをさらに対象とする。本発明の一態様では、これらの新規ポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。さらに他の実施形態では、これらの発現ベクターを含有する宿主細胞、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物由来の種子および得られる飼料生成物も本発明の一部と見なされる。
【００１５】
所望の形質、例えば、本発明の増加したトリプトファンレベルを示すトランスジェニック植物または種子は、所望の形質を付与するトランスジェニック植物のゲノムに挿入された特定の外来性ＤＮＡを含む。この形質は、対照植物、例えば、その特定の外来性ＤＮＡを欠く実質的に同一の遺伝子型の植物または種子において天然に存在する形質からの測定可能な変化である。増強された所望の形質は、増強された所望の形質に関連する特定の外来性ＤＮＡを有するトランスジェニック植物または種子の形質を、対照植物または種子の形質と比較することにより測定してよい。したがって、「高トリプトファントウモロコシ」とは、任意の植物部分、好ましくは種子においてトリプトファンレベルが増加しているトウモロコシ植物のことであり、前記種子は本明細書では、カーネルまたはグレインと呼ぶこともある。
【００１６】
アントラニル酸合成酵素（ＡＳ；ＥＣ４．１．３．２７）は、植物、真菌、および細菌において芳香族アミノ酸経路からトリプトファンの生合成へ分岐する最初の反応を触媒する。植物では、トリプトファンの生合成のための化学過程は葉緑体に区分されている。アントラニル酸合成酵素は、細胞質ゾルにおいて合成される核コードされたタンパク質であるために、トリプトファンの生合成に関与するにはいくつかの手段により葉緑体中に輸送されなければならない。さらに、野生型または非トランスジェニック植物原産の内在性アントラニル酸合成酵素は、生合成過程中のトリプトファンの蓄積によるフィードバック抑制に感受性である。このように、非トランスジェニック植物細胞のトリプトファン含有量は比較的低レベルに制限されている。例えば、非トランスジェニックトウモロコシでは、トリプトファンレベルは、典型的には植物の種子において１００万分の２５（ｐｐｍ）未満であり、通常は８から１０ｐｐｍ範囲である。本発明は、アントラニル酸合成酵素を色素体に標的化できる葉緑体輸送ペプチドに融合されている、アグロバクテリウムおよびシノリゾビウム由来のフィードバック非感受性単量体アントラニル酸合成酵素ポリペプチドをコードしている新規なポリヌクレオチドを提供する。本発明は、ＤＮＡ構築物、およびそのゲノムに本発明のＤＮＡ構築物の植物発現カセットのうちの少なくとも１つを含有し、前記構築物を含有しない種子よりも高いトリプトファン含有量を有する種子を提供する。
【００１７】
増加したトリプトファンは、カーネル中のアミノ酸の増加量の蓄積（２５ｐｐｍを超える）により植物細胞中で示される場合もあり、適切に抽出された組織の質量分光光度分析または高性能液体クロマトグラフィーの方法などの任意の適切な方法により測定してもよい。トリプトファンが増加した本発明のトランスジェニックトウモロコシカーネルは、特に飼料もしくは食品、ミールもしくはミール生成物、またはタンパク質生成物、または類似の種類の非トランスジェニックカーネルよりも高いトリプトファン含有量を含有するカーネルから加工された他の生成物の供給源として有用である。
【００１８】
本発明の植物またはその部分のいずれでも加工して、飼料（例えば、サイレージ）、ミール、タンパク質または油性調製物を生産してもよい。この目的のための特に好ましい植物部分は種子である。好ましい実施形態では、飼料、ミール、タンパク質または油性調製物は家畜を飼う用途のために設計される。飼料、ミール、タンパク質および油性調製物を生産するための方法は当該技術分野では公知であり、例えば、米国特許第４９５７７４８号、米国特許第５１００６７９号、米国特許第５２１９５９６号、米国特許第５９３６０６９号、米国特許第６００５０７６号、米国特許第６１４６６６９号、および米国特許第６１５６２２７号があり、ここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす。好ましい実施形態では、タンパク質調製物は高タンパク質調製物である。高タンパク質調製物は好ましくは、５％ｗ／ｖを超える、さらに好ましくは１０％ｗ／ｖ超える、さらに好ましくは１５％ｗ／ｖを超えるタンパク質含有量を有する。
【００１９】
単離したポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明は、一実施形態では、単量体アントラニル酸合成酵素に融合した葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ；色素体輸送ペプチド）をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。用語「色素体」は、原色素体、白色体、アミロプラスト、有色体、および葉緑体を含む一種の植物細胞小器官を意味する。本発明の文脈では、語句「輸送ペプチド」は、核コードタンパク質の輸送を色素体に導くポリペプチドを意味する。典型的には、ＣＴＰまたは輸送ペプチド配列はポリペプチドのＮ末端に位置している。
【００２０】
単量体アントラニル酸合成酵素をコードするポリヌクレオチド、およびＣＴＰまたは色素体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、核酸が天然に存在する生物の細胞において核酸が通常会合している他の核酸配列、すなわち他の染色体または染色体外ＤＮＡから前記ポリヌクレオチドは実質的に分離しているまたは精製されている点で「単離」している。前記用語は、混入している核酸および他の細胞成分を実質的に除去するように生化学的に精製されている核酸を包含する。前記用語は、組換え核酸および化学的に合成された核酸も包含する。用語「実質的に精製された」とは、本明細書で使用するように、天然の状態では通常、分子に会合している他の分子から分離している分子のことである。さらに好ましくは、実質的に精製された分子は、調製物中に存在する支配的な化学種である。実質的に精製された分子は、天然の混合物中に存在するその他の分子（溶媒を除く）から６０％より多く遊離している、好ましくは７５％遊離している、さらに好ましくは９０％遊離していてよい。用語「実質的に精製された」は、天然の状態で存在する分子を包含することを企図してはいない。そのような単離されたポリヌクレオチドは、外来性ポリヌクレオチドと組み合わされている点で「組換え」であってもよい。例えば、組換えＤＮＡ分子は、外来性プロモーター、または宿主細胞にとって内在性のプロモーターに作動可能に連結されている単離されたポリヌクレオチドであってよい。
【００２１】
本明細書で使用するように、「外来性」ポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入されている、および好ましくは天然の非形質転換状態の細胞中に存在するいずれのＤＮＡ配列とも同一ではないＤＮＡ配列である。「内在性の」または「天然の」ポリヌクレオチドは、宿主細胞または生物に天然に存在するＤＮＡ配列である。同様に、「外来性」ポリペプチドは、宿主細胞に導入されている、および好ましくは天然の非形質転換状態の細胞中に存在するいずれのＤＮＡ配列とも同一ではない単離されたＤＮＡによりコードされているタンパク質配列である。「内在性の」または「天然の」ポリペプチドは、宿主細胞または生物に天然に存在するタンパク質である。
【００２２】
特に興味深いのは、形質転換された植物細胞の色素体に単量体アントラニル酸合成酵素ポリペプチドを正しく区分できる、本発明のＣＴＰ配列を代表するポリペプチドである。ＣＴＰ配列は、トウモロコシ由来の、または、ルタ・グラヴェオレンス（Ruta graveolens）、オリザサティバ（Oryza sativa）、およびアラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）を含むが、これらに限定されることはない他の植物種由来の色素体標的タンパク質をコードする遺伝子に由来していてよい。葉緑体輸送ペプチド配列は、当該技術分野では公知であり、アラビドプシスサリアナ（Arabidopsis thaliana）リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ（ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット１（Ａｔ−ＣＴＰ１；Ｓｉｌｖａ−Ｆｉｌｈｏら（１９９６）；Ｓｃｈｎｅｌｌら（１９９１）；アラビドプシス・サリアナ５−（エノールピルビル）シキミ酸−３−リン酸合成酵素（Ａｔ−ＣＴＰ２；Ａｒｃｈｅｒら（１９９０）；ゼアマイズ（Zea mays）アントラニル酸合成酵素−アルファ１（Ｚｍ−ＡＳＡ１−ＣＴＰ）およびアルファ２（Ｚｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ）サブユニット；ゼアマイズジヒドロジピコリン酸合成酵素（Ｚｍ−ＤＨＤＰＳ−ＣＴＰ）；オリザサティバＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（Ｏｓ−Ｗａｘｙ（Ｏｓ−Ｗｘ）−ＣＴＰ）；ならびにルタグラヴェオレンスアントラニル酸合成酵素アルファサブユニット（Ｒｇ−ＡＳＡ短−ＣＴＰおよびＲｇ−ＡＳＡ長−ＣＴＰ）の標的化配列が挙げられる。葉緑体輸送ペプチドの使用法の説明は、米国特許第５１８８６４２号および米国特許第５７２８９２５号を参照されたい。その双方をここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【００２３】
本発明の葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）をコードする例となる単離されたポリヌクレオチドには、以下のヌクレオチド配列番号を含むＤＮＡが挙げられる。
配列番号１：改変された切断部位（Ｃ／Ｍ）を有するＡｔ−ＣＴＰ２（Ｃ／Ｍ）（アラビドプシス・サリアナ５−（エノールピルビル）シキミ酸−３−リン酸合成酵素）をコードする核酸配列；
配列番号２：天然の切断部位（Ｅ／Ｋ）を有するＡｔ−ＣＴＰ２（Ｅ／Ｋ）をコードする核酸配列；
配列番号３：Ａｔ−ＣＴＰ２（Ｅ／Ｋ）＋成熟アラビドプシスＥＰＳＰＳ合成酵素由来の１０アミノ酸をコードする核酸配列；
配列番号４：Ａｔ−ＣＴＰ２（Ｅ／Ｋ）＋成熟アラビドプシスＥＰＳＰＳ合成酵素由来の５アミノ酸をコードする核酸配列；
配列番号５：Ｚｍ−ＡＳＡ１−ＣＴＰ（ゼアマイズアントラニル酸合成酵素α１サブユニット）をコードする核酸配列；
配列番号６：Ｚｍ−ＡＳＡ１−ＣＴＰ＋成熟ゼアマイズアントラニル酸合成酵素α１サブユニット由来の２０アミノ酸をコードする核酸配列；
配列番号７：Ｚｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ（ゼアマイズアントラニル酸合成酵素α２サブユニット）をコードする核酸配列；
配列番号８：Ｚｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ＋成熟ゼアマイズアントラニル酸合成酵素α２サブユニット由来の５アミノ酸；
配列番号９：Ｚｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ＋成熟ゼアマイズアントラニル酸合成酵素α２サブユニット由来の１８アミノ酸をコードする核酸配列；
配列番号１０：Ｏｓ−Ｗｘ−ＣＴＰ（オリザサティバＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ）をコードする核酸配列；
配列番号１１：Ｏｓ−Ｗｘ−ＣＴＰ＋成熟オリザサティバＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ由来の５アミノ酸をコードする核酸配列；
配列番号１２：Ｏｓ−Ｗｘ−ＣＴＰ＋成熟オリザサティバＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ由来の２０アミノ酸をコードする核酸配列；
配列番号１３：Ｒｇ−ＡＳ短−ＣＴＰ（ルタグラヴェオレンスアントラニル酸合成酵素αサブユニット；Ｍｅｔ１からＳｅｒ７２）をコードする核酸配列；
配列番号１４：Ｒｇ−ＡＳ長−ＣＴＰ（ルタグラヴェオレンスアントラニル酸合成酵素αサブユニット；Ｍｅｔ１からＳｅｒ９２）をコードする核酸配列；
配列番号１５：Ｚｍ−ＤＨＤＰＳ−ＣＴＰ（ゼアマイズジヒドロジピコリン酸合成酵素）をコードする核酸配列；
配列番号１６：Ｚｍ−ＤＨＤＰＳ−ＣＴＰ＋成熟ゼアマイズジヒドロジピコリン酸合成酵素由来の９アミノ酸；
配列番号１７：Ｚｍ−ＤＨＤＰＳ−ＣＴＰ＋成熟ゼアマイズジヒドロジピコリン酸合成酵素由来の２０アミノ酸をコードする核酸配列；
配列番号１８：Ｚｍ−ＤＨＤＰＳ−ＣＴＰ＋成熟ゼアマイズジヒドロジピコリン酸合成酵素由来の３アミノ酸をコードする核酸配列；
配列番号１９：アラビドプシスサリアナルビスコ小サブユニット遺伝子葉緑体輸送ペプチド、ＣＴＰ１をコードする核酸配列
【００２４】
本発明は、例えば、以下のアミノ酸配列のいずれか１つを含む葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）をコードするあらゆる単離された核酸も企図している。
配列番号２０：改変された切断部位（Ｃ／Ｍ）を有するＡｔ−ＣＴＰ２（Ｃ／Ｍ）（アラビドプシス・サリアナ５−（エノールピルビル）シキミ酸−３−リン酸合成酵素）；
配列番号２１：天然の切断部位（Ｅ／Ｋ）を有するＡｔ−ＣＴＰ２（Ｅ／Ｋ）；
配列番号２２：Ａｔ−ＣＴＰ２（Ｅ／Ｋ）＋成熟アラビドプシスＥＰＳＰＳ合成酵素由来の１０アミノ酸；
配列番号２３：Ａｔ−ＣＴＰ２（Ｅ／Ｋ）＋成熟アラビドプシスＥＰＳＰＳ合成酵素由来の５アミノ酸；
配列番号２４：Ｚｍ−ＡＳＡ１−ＣＴＰ（ゼアマイズアントラニル酸合成酵素α１サブユニット）；
配列番号２５：Ｚｍ−ＡＳＡ１−ＣＴＰ＋成熟ゼアマイズアントラニル酸合成酵素α１サブユニット由来の２０アミノ酸；
配列番号２６：Ｚｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ（ゼアマイズアントラニル酸合成酵素α２サブユニット）；
配列番号２７：Ｚｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ＋成熟ゼアマイズアントラニル酸合成酵素α２サブユニット由来の５アミノ酸；
配列番号２８：Ｚｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ＋成熟ゼアマイズアントラニル酸合成酵素α２サブユニット由来の１８アミノ酸；
配列番号２９：Ｏｓ−Ｗｘ−ＣＴＰ（オリザサティバＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ）；
配列番号３０：Ｏｓ−Ｗｘ−ＣＴＰ＋成熟オリザサティバＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ由来の５アミノ酸；
配列番号３１：Ｏｓ−Ｗｘ−ＣＴＰ＋成熟オリザサティバＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ由来の２０アミノ酸；
配列番号３２：Ｒｇ−ＡＳ短−ＣＴＰ（ルタグラヴェオレンスアントラニル酸合成酵素αサブユニット；Ｍｅｔ１からＳｅｒ７２）；
配列番号３３：Ｒｇ−ＡＳ長−ＣＴＰ（ルタグラヴェオレンスアントラニル酸合成酵素αサブユニット；Ｍｅｔ１からＳｅｒ９２）；
配列番号３４：Ｚｍ−ＤＨＤＰＳ−ＣＴＰ（ゼアマイズジヒドロジピコリン酸合成酵素）；
配列番号３５：Ｚｍ−ＤＨＤＰＳ−ＣＴＰ＋成熟ゼアマイズジヒドロジピコリン酸合成酵素由来の９アミノ酸；
配列番号３６：Ｚｍ−ＤＨＤＰＳ−ＣＴＰ＋成熟ゼアマイズジヒドロジピコリン酸合成酵素由来の２０アミノ酸；
配列番号３７：Ｚｍ−ＤＨＤＰＳ−ＣＴＰ＋成熟ゼアマイズジヒドロジピコリン酸合成酵素由来の３アミノ酸；
配列番号３８：アラビドプシスサリアナルビスコ小サブユニット遺伝子、ＣＴＰ１
【００２５】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に、アントラニル酸合成酵素に、またはＧＦＰに融合したアントラニル酸合成酵素に融合している本発明の葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）をコードする単離されたポリヌクレオチドには、以下のヌクレオチド配列番号を含むＤＮＡが挙げられる。
配列番号３９：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したＡｔ−ＣＴＰ２をコードする核酸配列；
配列番号４０：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したＺｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰをコードする核酸配列；
配列番号４１：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したＯｓ−Ｗｘ−ＣＴＰをコードする核酸配列；
配列番号４２：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したＲｓ−ＡＳ短−ＣＴＰをコードする核酸配列；
配列番号４３：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したＺｍ−ＤＨＤＰＳ−ＣＴＰをコードする核酸配列；
配列番号４４：Ｚｍ−ＤＨＤＰＳ−ＣＴＰ＋ＧＦＰに融合した成熟ゼアマイズジヒドロジピコリン酸合成酵素由来の５アミノ酸をコードする核酸配列；
配列番号４５：リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）アントラニル酸合成酵素に融合した、天然の切断部位Ｅ／Ｋを有するＡｔ−ＣＴＰ２をコードする核酸配列；
配列番号４６：Ａｔ−ＣＴＰ２＋リゾビウム・メリロティアントラニル酸合成酵素に融合した成熟アラビドプシス（Arabidopsis）ＥＰＳＰＳ合成酵素由来の１０アミノ酸をコードする核酸配列；
配列番号４７：リゾビウム・メリロティアントラニル酸合成酵素に融合したＺｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰをコードする核酸配列；
配列番号４８：Ｚｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ＋リゾビウム・メリロティアントラニル酸合成酵素に融合した成熟ゼアマイズアントラニル合成酵素α２サブユニット由来の１８アミノ酸をコードする核酸配列；
配列番号４９：Ｚｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ＋緑色蛍光タンパク質に融合したアグロバクテリウム・ツメファシエンス単量体アントラニル酸合成酵素に融合した成熟ゼアマイズアントラニル合成酵素α２サブユニット（Ｚｍ−ＡＳＡ２遺伝子にコードされた最初の６５アミノ酸）由来の１８アミノ酸をコードする核酸配列
【００２６】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはアントラニル酸合成酵素に融合した本発明の葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）を代表する配列には、以下のポリペプチド配列番号を含むアミノ酸が挙げられる。
配列番号５０：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したＡｔ−ＣＴＰ２；
配列番号５１：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したＺｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ；
配列番号５２：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したＯｓ−Ｗｘ−ＣＴＰ；
配列番号５３：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したＲｓ−ＡＳ短−ＣＴＰ；
配列番号５４：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したＺｍ−ＤＨＤＰＳ−ＣＴＰ；
配列番号５５：Ｚｍ−ＤＨＤＰＳ−ＣＴＰ＋ＧＦＰに融合した成熟ゼアマイズジヒドロジピコリン酸合成酵素由来の５アミノ酸；
配列番号５６：リゾビウム・メリロティアントラニル酸合成酵素に融合した、天然の切断部位Ｅ／Ｋを有するＡｔ−ＣＴＰ２；
配列番号５７：Ａｔ−ＣＴＰ２＋リゾビウム・メリロティアントラニル酸合成酵素に融合した成熟アラビドプシスＥＰＳＰＳ合成酵素由来の１０アミノ酸；
配列番号５８：リゾビウム・メリロティアントラニル酸合成酵素に融合したＺｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ；
配列番号５９：Ｚｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ＋リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）アントラニル酸合成酵素に融合した成熟ゼアマイズアントラニル合成酵素α２サブユニット由来の１８アミノ酸；
配列番号６０：Ｚｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ＋緑色蛍光タンパク質に融合したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）単量体アントラニル酸合成酵素に融合した成熟ゼアマイズアントラニル合成酵素α２サブユニット（Ｚｍ−ＡＳＡ２遺伝子にコードされた最初の６５アミノ酸）由来の１８アミノ酸
【００２７】
ある種のオリゴヌクレオチドも本発明の実施のために有用であり、例えば、配列番号６１〜１９８を含むオリゴヌクレオチドは一過性プロトプラストアッセイ用のトランスフェクションベクターの構築に有用であり、配列番号２２６〜２３１を含むオリゴヌクレオチドはＰＣＲプライマーとして有用である。
【００２８】
本発明の別の態様は、単離された単量体アントラニル酸合成酵素（ＡＳ）およびそのフラグメント、ならびに上昇したレベルの遊離Ｌ−トリプトファンを生成する植物を獲得するための方法におけるその使用に関する。そのようなポリペプチドを含有するトランスジェニック植物における遊離Ｌ−トリプトファンの過剰生成は、アントラニル酸合成酵素またはそのドメインをコードする核酸の導入および発現により生じる。そのようなアントラニル酸合成酵素核酸には、野生型もしくは突然変異α−ドメイン、または単量体型のアントラニル酸合成酵素が挙げられる。単量体型のアントラニル酸合成酵素は、単一ポリペプチド鎖の少なくとも２つのアントラニル酸合成酵素ドメイン、例えば、β−ドメインに連結しているα−ドメインを含む。
【００２９】
天然の植物アントラニル酸合成酵素は通常、Ｌ−トリプトファンおよびその類似物によるフィードバック抑制にかなり感受性である。そのような抑制は、トリプトファン合成経路を調節するための重要な機構を構成する。したがって、高度に活性で比較的効率的な、またはトリプトファンもしくはその類似物により抑制される程度が比較的少ないアントラニル酸合成酵素もしくはそのドメインは、おそらく上昇したレベルのトリプトファンを生成するであろう。本発明によれば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスおよびシノリゾビウム・メリロティ由来のアントラニル酸合成酵素は、高レベルのトリプトファンを生成するのに特に有用である。本発明の単離された単量体アントラニル酸合成酵素には、さらに非制御（deregulated）形態およびそのフラグメントが挙げられる。そのような非制御形態には、本明細書に記載するシノリゾビウムのＳ５１Ｃ対立遺伝子；米国特許出願公開第２００３０９７６７７号に記載のアグロバクテリウムアントラニル酸合成酵素のＦ２９８Ｗ、Ｖ４８Ｆ、Ｖ４８Ｙ、Ｓ５１ＦおよびＳ５１Ｃ対立遺伝子；ならびに「高トリプトファン・トウモロコシ」という表題の米国特許出願第１１／５０３５３２号に記載のコドン最適化型のアグロバクテリウムアントラニル酸合成酵素Ｓ５１Ｃ対立遺伝子がある。それらの文献の各々をここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす。これらの対立遺伝子は、トリプトファンからのフィードバック抑制につき非制御である。
【００３０】
植物または選択された宿主細胞において高レベルのトリプトファンを生成するためには、選択されたアントラニル酸合成酵素核酸を単離して、植物細胞または他の細胞型における遺伝子発現のために必要な調節シグナルを含むようにインビトロで操作してもよい。植物におけるトリプトファン生合成経路は色素体内部に存在すると報告されているために、外来性アントラニル酸合成酵素核酸は、色素体に導入するか、またはアミノ末端色素体輸送ペプチドをコードする核酸セグメントを付加することにより改変される。そのような色素体輸送ペプチドは、アントラニル酸合成酵素遺伝子産物を色素体に導くことができる。
【００３１】
トリプトファンの生合成を改変するためには、アントラニル酸合成酵素活性をコードする核酸を植物細胞または他の宿主細胞に導入しなければならず、これらの形質転換された細胞は、直接的にまたは間接的に同定しなければならない。アントラニル酸合成酵素全体またはその有用な部分もしくはドメインを利用できる。アントラニル酸合成酵素は植物細胞ゲノムに安定的に組み込まれている。アントラニル酸合成酵素の発現を制御している転写シグナルは、植物細胞または他の宿主細胞により認識され、その内部で機能的でなければならない。すなわち、アントラニル酸合成酵素は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写されなければならず、ｍＲＮＡは植物細胞核で安定的であり、翻訳のために細胞質に無傷で輸送されなければならない。アントラニル酸合成酵素ｍＲＮＡは、植物細胞リボソームに認識され、正しく翻訳されるには適切な翻訳シグナルを有していなければならない。ポリペプチド遺伝子産物は、細胞質でのタンパク質分解攻撃を実質的に免れ、正確な細胞区画（例えば、色素体）に輸送され、酵素活性を与えることになる三次元立体構造を帯びることができなければならない。アントラニル酸合成酵素は、さらに、トリプトファンおよびその誘導体の生合成において機能することができなければならない、すなわち、要求される基質を獲得し適切な産物を伝えるために生合成において（おそらく、色素体において）フランキング工程を触媒する天然の植物酵素近傍に位置しなければならない。
【００３２】
こうした条件すべてが満たされたとしても、トリプトファンの成功した過剰生成は予想可能な事象ではない。一部の導入遺伝子の発現は近隣の染色体エレメントによって負の影響を受けることがある。フィードバック抑制を減少させる突然変異により高度なレベルのトリプトファンが実現されるのであれば、アントラニル酸合成酵素工程で減少した調節を補う他の制御機構が存在している可能性がある。蓄積したアミノ酸の分解速度を高める機構が存在する可能性がある。トリプトファンおよび関連するアミノ酸も、植物に有害ではないレベルで過剰に生成されなければならない。最後に、導入された形質は、商業的開発および使用を可能にするためには安定的で遺伝性でなければならない。
【００３３】
アントラニル酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドの単離および同定は、米国特許出願公開第２００３００９７６７７号として公開され、米国特許第７２１７８６５号として公表された米国特許出願第１０／３８９２７号、および米国特許出願公開第２００３０２１３０１０号として公開された米国特許出願第１０／４３００１１号に記載されている。これらの特許文献をここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす。
【００３４】
本発明のアントラニル酸合成酵素をコードする例となる単離されたＤＮＡには、以下のヌクレオチド配列番号、
配列番号１９９：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）野生型アントラニル酸合成酵素；
配列番号２０１：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＦ２９８Ｗ突然変異対立遺伝子；
配列番号２０３：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＳ５１Ｆ突然変異対立遺伝子；
配列番号２０５：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＳ５１Ｃ突然変異対立遺伝子；
配列番号２０７：アグロバクテリウム・ツメファシエンスコドン最適化Ｓ５１Ｃ突然変異対立遺伝子；
配列番号２０９：シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）アントラニル酸合成酵素野生型；および
配列番号２１１：シノリゾビウム・メリロティアントラニル酸合成酵素Ｓ５１Ｃ突然変異対立遺伝子
を含むＤＮＡが挙げられる。
【００３５】
本発明は、例えば、以下のアミノ酸配列、
配列番号２００：アグロバクテリウム・ツメファシエンス野生型アントラニル酸合成酵素；
配列番号２０２：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＦ２９８Ｗ突然変異体；
配列番号２０４：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＳ５１Ｆ突然変異体；
配列番号２０６：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＳ５１Ｃ突然変異体；
配列番号２０８：アグロバクテリウム・ツメファシエンスコドン最適化Ｓ５１Ｃ突然変異体；
配列番号２１０：シノリゾビウム・メリロティアントラニル酸合成酵素野生型；
配列番号２１２：シノリゾビウム・メリロティアントラニル酸合成酵素Ｓ５１Ｃ突然変異体
のうちのいずれか１つを含むアントラニル酸合成酵素をコードするあらゆる単離された核酸も企図している。
【００３６】
アントラニル酸合成酵素に関して本明細書で使用するように、用語「単量体の」は、２またはそれを超えるアントラニル酸合成酵素ドメインが、単一ポリペプチド鎖に機能的な形で組み込まれていることを意味する。単量体アントラニル酸合成酵素は、インビトロで二量体型に組み立てられてもよい。単量体アントラニル酸合成酵素ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アナベナ（Anabaena）Ｍ２２９８３、アゾスピリルム・ブラシレンセ（Azospirillum brasilense）、ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、ノストック（Nostoc）ｓｐ．ＰＣＣ７１２０またはリゾビウム・メリロティ（シノリゾビウム・メリロティ）などの種々の生物から単離できる。代わりに、単量体アントラニル酸合成酵素核酸およびポリペプチドは、都合のよい単量体または多量体アントラニル酸合成酵素遺伝子のどれからでも選択されるドメインの組合せから構築できる。そのような生物には、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アナベナＭ２２９８３、アラビドプシス・サリアナ、アゾスピリルム・ブラシレンセ、ブルセラ・メリテンシス、メソリゾビウム・ロティ、ノストックｓｐ．ＰＣＣ７１２０、リゾビウム・メリロティ（シノリゾビウム・メリロティ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ルタ・グラヴェオレンス（Ruta graveolens）、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、ダイズ、イネ、ワタ、トウモロコシ、またはアントラニル酸合成酵素のサブユニットもしくはドメインをコードするあらゆる遺伝子が挙げられる。選択されたドメインをコードする核酸は、組換え的に連結できる。例えば、α−ドメインのＣ末端をコードする核酸を、リン酸ジエステル結合を形成することにより、β−ドメインのＮ末端をコードする核酸に連結することができ、逆もまた同じである。代案として、そのような単一ドメインポリペプチドは化学的に連結できる。例えば、α−ドメインを、ペプチド結合を形成することにより、そのＣ末端を介して、β−ドメインのＮ末端に連結することができ、逆もまた同じである。
【００３７】
本明細書で使用するように、「トリプトファンによるフィードバック抑制に対して非制御の」アントラニル酸合成酵素とは、非制御および「野生型」アントラニル酸合成酵素を当量のトリプトファンまたはトリプトファンのアミノ酸類似物に曝露したときに、対応する「野生型」または天然の感受性アントラニル酸合成酵素に比べ約１０％よりも大きな活性を保持するアントラニル酸合成酵素である。好ましくは、非制御のアントラニル酸合成酵素は、対応する「野生型」または天然の感受性アントラニル酸合成酵素に比べ約２０％よりも大きな活性を保持する。
【００３８】
ポリペプチドのフラグメントおよび変異体も、本発明の一部であると見なされる。フラグメントは、前述のポリペプチドのアミノ酸配列の一部とまったく同じであるが、そのすべてとは同じではないアミノ酸配列を有する変異ポリペプチドである。前記フラグメントは、「独立」しているまたは、それが一部をまたは一領域を形成しているより大きなポリペプチド内に、もっとも好ましくは単一連続領域として含まれていてよい。好ましいフラグメントは、類似の活性もしくは改良された活性を有するまたは減少した活性を有するフラグメントを含む、本発明のポリペプチドの活性を媒介するフラグメントである生物活性フラグメントである。検出方法、例えば、酵素連結免疫吸着アッセイにおいて有用な抗体を作製するための、動物において抗原性のまたは免疫原性のフラグメントも含まれる。
【００３９】
ポリペプチドの変異体には、配列表に示される配列とは保存されたアミノ酸置換、すなわち特徴が類似する別の残基による残基の置換、だけ異なるポリペプチドも挙げられる。一般に、そのような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕとＩｌｅ間；ＳｅｒとＴｈｒ間、ＡｓｐとＧｌｕ間、ＡｓｎとＧｌｎ間、ＬｙｓとＡｒｇ間、またはＰｈｅとＴｙｒ間である。特に好ましいのは、５から１０；１から５；１から３または１アミノ酸が任意の組合せで置換されている、欠失している、または付加されている変異体である。
【００４０】
本明細書にはっきりと記載するＤＮＡ配列およびアミノ酸配列に対して８０％、さらに好ましくは８５％、はるかに好ましくは９０％から９５％、もっとも好ましくは９６％から９９％の配列同一性を示す機能的アントラニル酸合成酵素ＤＮＡ配列および機能的アントラニル酸合成酵素ポリペプチドも本発明の範囲内である。例えば、８５％アミノ酸同一性とは、２つの配列を最大適合で整列させた場合、アミノ酸の８５％が同一であることを意味する。適合を最大にする際に（適合される２つの配列のいずれにおいても）ギャップは許容され、５またはそれ未満のギャップ長が好ましく、２またはそれ未満がさらに好ましい。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本明細書においてさらに考察するように、植物宿主細胞の形質転換のために有用な組換え発現ベクターの構築に利用できる。
【００４２】
植物形質転換ベクター
本発明において興味深いのは、植物宿主細胞において、ＣＴＰに融合された単量体ＡＳをコードするポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を指示する組換え発現ベクターにおけるポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチドの使用である。
【００４３】
本明細書で使用するように、「組換え」は、異種核酸配列の導入により改変された、もしくは細胞がそのように改変された細胞由来である細胞またはベクターへの言及を含む。したがって、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）型の細胞内で同一の形では見出されることのない遺伝子を発現する、または、計画的なヒトの介入の結果として、そうでなければ異常に発現される、低発現される、もしくはまったく発現されない天然の遺伝子を発現する。
【００４４】
用語「作動可能に連結される」とは、プロモーターが第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始させ媒介する、プロモーターと第２の配列間の機能的な連結のことである。本明細書で使用するように、「作動可能に連結される」とは、連結されている核酸配列が近接しており、必要な場合には、近接しており同一読み枠内の２つのタンパク質コード領域を結合させることになるような２またはそれを超える別々のヌクレオチド配列間の機能的連結のことでもある。例えば、ＣＴＰコード配列を、単量体アントラニル酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結するには、アミノ末端輸送配列のより良好な認識を可能にすることもある都合のよい制限部位またはリンカー配列などの、１つまたは複数のＤＮＡ配列の操作が必要になる可能性がある。
【００４５】
標準的ＰＣＲ増幅技法に従って、鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、そのようなポリヌクレオチドを増幅させることができる。代わりに、ポリヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置などの標準的合成技法を用いて合成できる。
【００４６】
発現ベクターは、最小限、宿主細胞で発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。典型的には、発現ベクターは、プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーを含むある種の調節エレメントの制御の下に置かれる。そのような発現ベクターは、調節エレメントに「作動可能に連結される」と言われる。
【００４７】
本発明の発現ベクターは、通常、本発明の葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）に融合したアントラニル酸合成酵素をコードする核酸配列に作動可能に連結した、植物細胞で機能的なプロモーター、および植物宿主細胞において機能的な転写終結領域を含む。
【００４８】
本発明の例となる発現ベクターには、以下の配列番号、
配列番号２１３：ｐＭＯＮ６８０６５、すなわちＺｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ＋１８：：アグロＡＳ（Ｓ５１Ｃ）非最適化突然変異対立遺伝子のための発現ベクターをコードする核酸配列；
配列番号２１４：ｐＭＯＮ６８０６６、すなわちＺｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ＋１８：：アグロＡＳ（Ｓ５１Ｃ）非天然最適化（ｎｎｏ）突然変異対立遺伝子のための発現ベクターをコードする核酸配列；
配列番号２１５：ｐＭＯＮ６９７５７、すなわちアグロＡＳ（Ｆ２９８Ｗ）突然変異対立遺伝子を含有する構築物のための発現ベクターをコードする核酸配列；
配列番号２１６：ｐＭＯＮ６９７７０、すなわち代替３’ＵＴＲを有するアグロＡＳ（Ｓ５１Ｃ）非最適化突然変異対立遺伝子を含有する構築物のための発現ベクターをコードする核酸配列；
配列番号２１７：ｐＭＯＮ６９７６８、すなわちアグロＡＳ（Ｓ５１Ｆ）突然変異対立遺伝子を含有する構築物のための発現ベクターをコードする核酸配列；
配列番号２１８：ｐＭＯＮ７８８５０、すなわちリゾビウム・メリロティアントラニル酸合成酵素野生型対立遺伝子を含有する構築物のための発現ベクターをコードする核酸配列；
配列番号２１９：ｐＭＯＮ７８８５１、すなわちリゾビウム・メリロティアントラニル酸合成酵素Ｓ５１Ｃ対立遺伝子を含有する構築物のための発現ベクターをコードする核酸配列
を有するＤＮＡが挙げられる。
【００４９】
「宿主細胞」により、ベクターを含有し発現構築物の複製、および／もしくは転写または転写および翻訳（発現）を支持する細胞を意味する。本発明において使用するための宿主細胞は、単子葉植物細胞でもよく細菌細胞でもよい。本発明の細菌宿主細胞の例はアグロバクテリウムである。好ましい実施形態では、宿主細胞はトウモロコシ細胞である。
【００５０】
本明細書で使用するように、「トランスジェニック植物」は、そのゲノムに安定的に導入された外来性ポリヌクレオチド、例えば、別の生物由来の核または色素体ポリヌクレオチドを有する植物である。
【００５１】
用語「種子」および「カーネル」は意味において等価であると理解されている。用語カーネルは、トウモロコシまたはイネ植物の種子を記述する際に頻繁に使用される。あらゆる植物で、種子は、種皮、胚、糊粉、および胚乳からなる成熟胚珠である。
【００５２】
特に興味深いのは、宿主植物細胞においてＣＴＰと融合した単量体ＡＳをコードし、ＣＴＰが植物宿主細胞の色素体画分へのＡＳの局在化を導く、組換え発現ベクターを調製するための本発明のポリヌクレオチドの使用である。植物発現構築物は、通常、本発明の核酸配列に作動可能に連結し、植物宿主細胞において機能的なプロモーターおよび植物宿主細胞において機能的な転写終結領域を含む。
【００５３】
本明細書で使用するように、「プロモーター」は、ＤＮＡからのＲＮＡの転写の開始に不可欠なＤＮＡ配列の領域を意味する。プロモーターは、転写されることになるＤＮＡの上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位として機能する領域を有し、ＲＮＡ転写を促進する他の因子と共に働く領域を有する。さらに具体的には、植物中の基本プロモーターは、転写の開始と関連する、ＣＡＡＴおよびＴＡＴＡボックスなどの基準領域を含む。本発明では、好ましいプロモーター分子および５’ＵＴＲ分子は、植物の他の細胞および組織よりも大きな速度またはレベルでの種子細胞または組織における転写を可能にする。当業者であれば、植物細胞において機能的であり、文献にすでに記載されている構成的で組織特異的なプロモーターが数多く存在することを認識するであろう。例えば、プロモーターは、米国特許第６４３７２１７号（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；米国特許第５６４１８７６号（イネアクチンプロモーター）；米国特許第６４２６４４６号（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）；米国特許第６４２９３６２号（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）；米国特許第６２３２５２６号（トウモロコシＡ３プロモーター）；米国特許第６１７７６１１号（構成的トウモロコシプロモーター）；米国特許第５３２２９３８号、米国特許第５３５２６０５号、米国特許第５３５９１４２号および米国特許第５５３０１９６号（３５Ｓプロモーター）；米国特許第６４３３２５２号（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター、Ｐ−Ｚｍ．Ｌ３）；米国特許第６４２９３５７号（イネアクチン２プロモーターならびにイネアクチン２イントロン）；米国特許第５８３７８４８号（根特異的プロモーター）；米国特許第６２９４７１４号（光誘発性プロモーター）；米国特許第６１４００７８号（塩誘発性プロモーター）；米国特許第６２５２１３８号（病原体誘発性プロモーター）；米国特許第６１７５０６０号（リン欠損誘発性プロモーター）；米国特許第６６３５８０６号（ガンマ−コイクシンプロモーター、Ｐ−Ｃｌ．Ｇｃｘ）；米国特許出願第１０／７３２７２１号（トウモロコシ胚特異的プロモーターＺｍＥＭ；ｅｍｂ５）；米国特許第７１５１２０４号（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）；配列番号２２０（オオムギＰｅｒ１プロモーター）；配列番号２２１（トウモロコシＢ３２プロモーター）；配列番号２２２（トウモロコシＺ２７プロモーター）；配列番号２２３（トウモロコシグロブリン１プロモーター、Ｂｅｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｒｉｚ，１９９１）；および配列番号２２４（コイクシンＬ−３プロモーター）に記載されている。これらの特許文献および配列番号を参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【００５４】
カリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（米国特許第５８５８７４１号および米国特許第５３２２９３８号）またはゴマノハグサモザイクウイルス由来ＦＭＶ３５Ｓプロモーター（米国特許第５３７８６１９号）などの構成的プロモーターは、大半の植物器官において高レベルの発現をもたらす。増強されたまたは複製されたバージョンのＣａＭＶ３５ＳおよびＦＭＶ３５Ｓプロモーターは、本発明の実施において有用であり、例えば増強されたＣａＭＶ３５Ｓ（ｅ３５Ｓ）（Ｏｄｅｌｌら、１９８５）；米国特許第５３７８６１９号）。さらに、葉、茎、根、塊茎、種子胚乳、種子胚、果実等などの植物の特定の組織において対象のタンパク質の発現をもたらすのも好ましく、選ばれたプロモーターは所望の組織および発生特異性を有するほうがよい。
【００５５】
調節転写物終結領域を、本発明の植物発現ベクター中に同様に提供してよい。転写物終結領域は、内在性アントラニル酸合成酵素の遺伝子配列または異なる遺伝子供給源由来の都合のよい転写物終結領域により提供してもよい。これらの転写物終結領域は一般に、３’非翻訳領域または３’ＵＴＲと呼ばれる。３’ＵＴＲ領域の例には、ノパリン合成酵素３’領域（ｎｏｓ３’；Ｆｒａｌｅｙら、１９８３）、コムギ熱ショックタンパク質、ｈｓｐ１７（Ｔ−Ｔａ．Ｈｓｐ１７）、オリザサティバのグルテリン遺伝子の３’領域（Ｏｓ−ｇｔ１；配列番号２２５）、Ｚ２７  ３’ＵＴＲなどのゼイン遺伝子由来の３’ＵＴＲ（Ｌｏｐｅｓら、１９９５）、トウモロコシグロブリン１（Ｔ−Ｚｍ．Ｇｌｂ１）、およびＴ−Ｐｓ．ＲｂｃＳ２：Ｅ９（エンドウ豆ルビスコ小サブユニット）、国際公開第００／１１２００Ａ２号で開示された３’ＵＴＲおよび試験し、葉緑体輸送ペプチドに融合されたアントラニル酸合成酵素コード領域と組み合わせて用いることができる当該技術分野で公知の他の３’ＵＴＲがある。当業者であれば、単子葉植物細胞において転写を終結できるあらゆる都合のよい転写物終結領域を本発明の構築物において用いてよいことを認識するであろう。
【００５６】
さらに、転写エンハンサーまたはエンハンサーの複製物を用いて、特定のプロモーターからの発現を増加させることができる。そのようなエンハンサーの例には、トウモロコシｈｓｐ７０イントロン（Ｚｍ．Ｄｎａｋとも呼ばれる）（米国特許第５４２４４１２号  Ｂｒｏｗｎら）、Ａｄｈイントロン１（Ｃａｌｌｉｓら、１９８７）、イネアクチンイントロン（ＭｃＥｌｒｏｙら、１９９１；米国特許第５６４１８７６号）、ショ糖合成酵素イントロン（Ｖａｓｉｌら、１９８９）、ＴＭＶオメガエレメント（Ｇａｌｌｉｅら、１９９９）、およびＣａＭＶ３５Ｓエンハンサーまたはオクトピン合成酵素エンハンサー（米国特許第５２９０９２４号）が挙げられるが、これらに限定されることはない。転写開始部位とコード配列の先頭間のＤＮＡ配列、すなわち、非翻訳リーダー配列は、遺伝子発現に影響を与えることができるので、特定のリーダー配列を用いることを望んでもよい。当業者が入手できるいかなるリーダー配列でも用いてよい。好ましいリーダー配列は、例えば、ｍＲＮＡ安定性を高めるもしくは維持することによっておよび／または翻訳の不適切な開始を防ぐことによって、結合した遺伝子の発現の最適水準を導く（Ｊｏｓｈｉ、１９８７）。そのような配列の選択は、当業者の自由裁量による。単子葉植物において、特にトウモロコシおよびイネにおいて高度に発現される遺伝子由来の配列が企図されている。
【００５７】
本発明の単離ＣＴＰ配列が対象のタンパク質を色素体に標的する効率を判定するためのアッセイ法は当該技術分野では公知である。一例として、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーター遺伝子をＣＴＰ配列に作動可能に連結してよい。この遺伝子融合は、適切なプロモーターの制御外に置かれ、形質転換ベクターにライゲートされ、植物細胞に形質転換される。発現および色素体への局在化のための十分な時間に続いて、色素体画分を抽出し、レポーター活性をアッセイする。このようにして、レポータータンパク質を色素体に標的し送達する単離ＣＴＰ配列の能力を評価し、他の既知のＣＴＰ配列と比較する。Ｓｉｌｖａ−Ｆｉｌｈｏら、（１９９６）を参照されたい。
【００５８】
植物細胞形質転換
本発明の組換え発現ベクターを導入している植物細胞、組織、器官、または植物は、形質転換された、トランスフェクトされた、またはトランスジェニックであると見なされる。トランスジェニックもしくは形質転換された植物細胞または植物には、前記植物細胞または植物の子孫および交雑しており導入された核酸配列の存在から生じる改変表現型を示す親などのトランスジェニック植物を用いる育種計画から作製される子孫も含まれる。
【００５９】
核酸配列を細胞に挿入するという文脈における用語「導入された」は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、核酸配列を真核または原核細胞に組み込み、そこで前記核酸配列は細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ、自律レプリコンに変換され、または一過性に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）ことへの言及を含む。
【００６０】
本明細書で使用するように、用語「植物」は、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、根等）、種子、および植物細胞ならびにその子孫への言及を含む。本明細書で使用される植物細胞には、制限なく、種子懸濁培養物、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子が挙げられる。本発明の方法において使用できる植物の種類は、通常、単子葉植物である。本発明の好ましい植物はトウモロコシである。
【００６１】
本明細書で使用するように、「トランスジェニック植物」は、そのゲノム内に異種ポリヌクレオチドを含む植物への言及を含む。通常、異種ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドが継続世代に伝えられるように、ゲノム内に安定的に組み込まれている。異種ポリヌクレオチドは、ゲノムのみに組み込まれていてもよく、組換え発現ベクターの一部として組み込まれていてもよい。「トランスジェニック」は、本明細書では、その遺伝子型が、最初にそのように改変されたトランスジェニックならびに最初のトランスジェニックからの性交雑または無性繁殖により作製されたトランスジェニックを含む異種核酸の存在により改変されている、いずれの細胞、株化細胞、カルス、組織、植物部分または植物も含むように使用される。
【００６２】
したがって、その細胞内部に異種ポリヌクレオチドを有する植物は、本明細書ではトランスジェニック植物と呼ばれる。異種ポリヌクレオチドは、ゲノムに安定的に組み込まれていてもよく、染色体外でもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドが継続世代に伝えられるようにゲノムに安定的に組み込まれている。前記ポリヌクレオチドは、ゲノムのみに組み込まれている、または組換え発現ベクターの一部として組み込まれている。
【００６３】
本明細書で使用するように、核酸に関する「異種」は、外来種起源の、または、同一種由来の場合には、計画的なヒトの介入により、組成および／もしくはゲノム遺伝子座がその天然型から実質的に改変されている核酸である。例えば、異種構造遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、前記構造遺伝子が由来した種とは異なる種由来である、または、同一種由来の場合には、１つもしくは双方がその原型から実質的に改変されている。異種タンパク質は、外来種起源でもよく、または、同一種由来の場合には、計画的なヒトの介入により、その原型から実質的に改変されている。
【００６４】
宿主植物細胞の形質転換のために使用される特定の方法は、本発明にとって決定的ではない。植物の形質転換は、好ましくは永久的である、すなわち、導入された構築物が継続植物世代に伝えられるように、導入された発現構築物の宿主植物ゲノムへの組み込みによる。当業者であれば、幅広い種類の形質転換技法が当該技術分野には存在することを認識するであろう。標的宿主植物に適したいかなる技法も本発明の範囲内で用いることができる。例えば、前記構築物は、ＤＮＡ鎖として、プラスミドで、または人工染色体で、を含むが、これらに限定されることはない種々の形で導入できる。標的植物細胞への構築物の導入は、カルシウム−リン酸−ＤＮＡ共沈澱、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム感染、リポソームまたは微粒子銃形質転換（すなわち、遺伝子銃）を含むが、これらに限定されることはない種々の技法によって実現できる。
【００６５】
微粒子銃（米国特許第５５５０３１８号、米国特許第５５３８８８０号、および米国特許第５６１００４２号。ここに出典明示してそれらの全てを具体的に本明細書の一部とみなす）に関して、粒子はポリヌクレオチドをコーティングされ、推進力により細胞内に送達される。例となる粒子には、タングステン、プラチナ、および好ましくは金からなる粒子が挙げられる。粒子加速によりＤＮＡを植物細胞内に送達するための有用な方法は、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ（登録商標）Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア）であり、これを使えば、ＤＮＡまたは細胞をコーティングした粒子を、ステンレス鋼もしくはＮＹＴＥＸスクリーンなどのスクリーンを通して、懸濁状態で培養した単子葉植物細胞で覆われているフィルター表面に推進できる。微粒子銃法は広く適用可能であり、ほとんどどんな植物種でも形質転換するのに用いてよい。微粒子銃により形質転換された種の例には、トウモロコシ（ＰＣＴ国際公開第９５／０６１２８号）、オオムギ、コムギ（米国特許第５５６３０５５号、ここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす）、イネ、カラスムギ、ライムギ、サトウキビ、およびモロコシなどの単子葉植物種、ならびに、タバコ、ダイズ（米国特許第５３２２７８３号、ここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす）、ヒマワリ、ピーナッツ、ワタ、トマト、およびマメ科植物全般（米国特許第５５６３０５５号、ここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす）を含む数多くの双子葉植物が挙げられる。当業者ならば、詳細は文献を参照し、本発明の方法における使用に適した技法を選択できる。
【００６６】
通常、本発明の発現ベクターと共に含まれるのが、宿主における発現に必要な調節領域を有し、形質転換細胞の選択を提供する構造遺伝子であろう。前記遺伝子は、細胞毒性物質、例えば、抗体、重金属、毒素等に対する抵抗性、栄養要求性宿主に原栄養性を提供する相補性、ウイルス免疫または同様のものを提供する可能性がある。発現構築物またはその成分が導入される異なる宿主種の数次第で、１つまたは複数のマーカーを用いてもよく、その場合異なる宿主に対して選択のための異なる条件が用いられる。
【００６７】
植物細胞形質転換のためにアグロバクテリウムが用いられる場合、アグロバクテリウム宿主に存在するＴ−ＤＮＡまたはＴｉ−もしくはＲｉ−プラスミドとの相同組換えのためにアグロバクテリウム宿主に導入してよいベクターを使用してもよい。ｖｉｒ遺伝子が形質転換されたアグロバクテリウム宿主に存在する限り、組換えのためにＴ−ＤＮＡを含有するＴｉ−またはＲｉ−プラスミドを備えていてもよく（こぶ形成を引き起こすことができる）、解除してもよく（こぶ形成を引き起こすことができない）、後者は許容できる。前記の備えたプラスミドは、正常植物細胞とこぶの混合物を与えることができる。
【００６８】
アグロバクテリウムが宿主植物細胞を形質転換するための媒体として使用されるいくつかの例では、Ｔ−ＤＮＡ境界領域と境を接する発現または転写構築物が、イー・コリおよびアグロバクテリウムにおいて複製可能な広宿主域ベクターに挿入されることになり、広宿主域ベクターは文献に記載されている。ｐＲＫ２またはその誘導体が広く使われている。例えば、ここに出典明示して本明細書の一部とみなすＤｉｔｔａら、（１９８０）および欧州特許出願公開第０１２０５１５号を参照されたい。あるいは、植物細胞で発現されることになる配列を、一方がイー・コリでベクターを安定化させ、他方がアグロバクテリウムでベクターを安定化させる別々の複製配列を含有するベクターに挿入してもよい。例えば、ｐＲｉＨＲＩ（Ｊｏｕａｎｉｎら、１９８５）複製起点が利用され、宿主アグロバクテリウム細胞において植物発現ベクターの追加の安定性を提供する、ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ（１９９０）を参照されたい。
【００６９】
発現構築物およびＴ−ＤＮＡと一緒に含まれるのは、形質転換されたアグロバクテリウムおよび形質転換された植物細胞の選択を可能にする１つまたは複数のマーカーであろう。植物細胞で使用するために、クロラムフェニコール、カナマイシン、アミノグリコシドＧ４１８、ハイグロマイシンまたは同種のものに対する耐性など数多くのマーカーが開発されている。用いる特定のマーカーは本発明に不可欠ではなく、特定の宿主および構築方法により、１つまたは別のマーカーが好まれる。
【００７０】
アグロバクテリウムを用いる植物細胞の形質転換のために、外植体は、形質転換に十分な時間形質転換されたアグロバクテリウムと組み合わせてインキュベートし、細菌を死滅させ、植物細胞を適切な選択培地で培養してよい。カルスが形成されると、既知の方法に従って適切な植物ホルモンを用いることにより苗条形成を促進することができ、前記苗条は植物の再生のために発根培地に移される。次に、前記植物を種子ができるように生育し、前記種子を用いて反復性世代を樹立してもよい。
【００７１】
複数の発現ベクターを含有する本発明の植物細胞を得るための可能な方法がいくつかある。本発明のベクターまたはポリヌクレオチド配列、および別個の酵素をコードする別のポリヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの他のベクターを含む植物を生産するためのいかなる手段も本発明に包含される。例えば、本発明の発現ベクターを用いて、単一の植物形質転換ベクター（プラスミド）に双方の発現ベクターを含ませることにより、またはそれぞれが所望の遺伝子を発現する別個の植物形質転換ベクターを用いることにより、第２の構築物と同時に植物を形質転換できる。第２のベクターは、第１の発現ベクターですでに形質転換されている植物に導入できる、または、別法として、一方が第１の構築物を有し、一方が第２の構築物を有する形質転換された植物を、標準的育種技法を用いて交雑させて、同一植物で前記構築物を１つにまとめることができる。
【００７２】
方法
本発明は、トランスジェニック植物の種子において遊離トリプトファンレベルを増加させる方法を提供する。一実施形態では、トリプトファンを増加させる方法は、単量体アントラニル酸合成酵素を植物細胞の葉緑体に標的しまたは局在化できるＣＴＰに作動可能に連結された単量体アントラニル酸合成酵素をコードする核酸配列を、植物細胞に導入することを含む。本発明の単量体アントラニル酸合成酵素は、トリプトファンによるフィードバック抑制に非感受性の非制御形態の酵素である。
【００７３】
本明細書で使用するように、植物細胞、植物組織、植物部分または植物内の遊離トリプトファンの「増加した」または「上昇した」レベルは、非形質転換植物細胞、植物組織、植物部分または植物、すなわち、ゲノムが単量体アントラニル酸合成酵素に融合された葉緑体輸送ペプチドをコードするポリペプチドの存在により改変されていない植物細胞、植物組織、植物部分または植物において見出されるレベルの約２から２００倍、好ましくは約５から１５０倍、さらに好ましくは約１０から１００倍のレベルである。例えば、形質転換された植物種子における遊離Ｌ−トリプトファンのレベルは、非形質転換植物種子（「出発原料」）の遊離Ｌ−トリプトファンのレベルと比較される。
【００７４】
本発明の追加の態様は、単量体ＡＳを植物細胞の色素体に正しく区分するＣＴＰの能力を予測するための比較的に高処理方法を提供することである。本発明は、種々の単量体ＡＳおよび種々のＣＴＰと融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の、トウモロコシプロトプラストまたはトウモロコシの発生中の胚における一過性発現を利用する視覚化法を提供する。ＧＦＰは、緑色蛍光を生成し、ＵＶ中ピークが３９５ｎｍの青色域まで吸収し、ピークが５１０ｎｍの緑色域で発光できる。この方法は、ＡＳ：：ＧＦＰポリペプチドの局在化の視覚化を可能にする。５０％を超える局在化が色素体中である結果は、単量体ＡＳをうまく区分するＣＴＰの能力のポジティブな予測因子であると考えられる。
【００７５】
本発明は、本発明のトウモロコシ植物の種子を穀粉、タンパク質または油に加工することを含む栄養的に増強されたトウモロコシ飼料生成物を作製する方法をさらに提供する。
【００７６】
さらに、本発明は、トランスジェニック植物細胞、またはそのようなトランスジェニック植物細胞由来の飼料もしくはミール生成物において、本明細書に記載するＣＴＰ：：ＡＳ配列組合せのいずれかに属する独自のＤＮＡ配列を検出するための方法を提供する。そのようなトランスジェニック植物細胞、またはそのようなトランスジェニック植物細胞由来の飼料もしくはミール生成物のゲノムは、そのようなトランスジェニック植物細胞、またはそのようなトランスジェニック植物細胞由来の飼料もしくはミール生成物から抽出したＤＮＡからＤＮＡ分子を増幅するＤＮＡ増幅法で試験するとき、独自のＣＴＰ：：ＡＳ  ＤＮＡ配列のいずれかを含有する発現ベクターに特徴的な単位複製配列を生成する。本明細書で使用するように、「単位複製配列」は、ＰＣＲまたはＬＣＲなどの増幅技法を用いて合成されたＤＮＡの断片である。「単位複製配列」は、一般的な用法ではＰＣＲ産物でもあると理解されている。
【００７７】
本発明は、今や一般的に説明されているので、例証のために含まれ本発明を限定することを目的としない以下の実施例を参照することによりさらに容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００７８】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。次に続く実施例で開示される技法は、本発明の実施においてうまく機能することが本発明者により発見された技法を代表し、したがって、その実施のために好ましい方法を構成すると見なすことができることを当業者なら認識するべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態において多くの変更が可能であり、それでも本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく同様のまたは類似の結果を得ることを認識すべきである。さらに具体的には、化学的にも物理的にも関連するある種の薬剤を本明細書に記載する薬剤の代わりに用いてもよいが、同一のまたは類似の結果が得られることが明らかになるであろう。当業者にとり明らかなそのような類似の代用物および改変物はすべて、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲および概念の内であると見なされる。
【実施例１】
【００７９】
ＣＴＰ１葉緑体輸送ペプチドを含むアントラニル酸合成酵素の局在化
本実施例は、アグロバクテリウムアントラニル酸合成酵素対立遺伝子のアミノ末端に融合したＣＴＰ１葉緑体輸送ペプチドをコードする導入遺伝子のタンパク質産物は、トランスジェニックトウモロコシの胚色素体に効率的に標的されないことを実証する。
【００８０】
植物形質転換ベクターｐＭＯＮ６６５６０（図１）は、アラビドプシスルビスコ小サブユニット遺伝子由来の葉緑体輸送ペプチド配列、すなわちアグロＡＳ（Ｆ２９８Ｗ（配列番号２０１によりコードされる）のアミノ末端に融合しているＣＴＰ１（配列番号１９によりコードされている）を含む融合タンパク質をコードしており、トウモロコシ胚特異的プロモーター（ＺｍＥＭ）により駆動される。
【００８１】
トランスジェニックトウモロコシ植物由来未熟カーネルの胚から色素体画分を単離するために、受粉後（ＤＡＰ）２５〜２７日目でいくつかの穂を収穫した。ホモ接合Ｆ３トランスジェニックトウモロコシ植物は、植物形質転換ベクターｐＭＯＮ６６５６０（図１）を含有していた。
【００８２】
約２．５ｇの胚は、それをカーネルから切り取るとすぐに氷上に置いた。次に、胚は、冷却減菌水で３回すすぎ、続いて冷却ＰＩＭ緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、０．５Ｍソルビトール、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．４）ですすいだ。胚およびそれに続く画分は、すべての単離工程中冷却保存した。
【００８３】
次に、胚は５ｍｌ  ＰＩＭを含有するペトリ皿に移し、切り刻んだ胚の粘調度が砂に似てくるまで片刃カミソリを用いて細かく切り刻んだ。切り刻んだ胚は一層のＭｉｒａｃｌｏｔｈ（商標）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、ラホーヤ、カリフォルニア）を通して５０ｍｌ円錐管にろ過し、ＰＩＭで全容量を２０ｍｌにした。小分量のこのろ過したホモジネート（画分Ｈと命名）は分析に先立って−８０℃で保存した。次に、ろ過したホモジネートは５分間７５０×ｇで遠心分離して色素体をペレット状にした。上澄みは捨て、小分量（Ｓ１と命名）を−８０℃で保存した。次に、２．５ｍｌのＰＩＭの一定分量をペレット状色素体に添加し、ペレットは小型の柔毛絵筆を用いて再懸濁させた。小分量を取り出し凍結した（Ｐ１と命名した画分）のち、２．５ｍｌの再懸濁したペレットを２つの不連続パーコール勾配のそれぞれの上に層状に重ねた。勾配管は、３ｍｌ  ７５％パーコール／ＰＩＭ上に層状に重ねた６ｍｌ  ３５％パーコール／ＰＩＭからなっていた。次に、勾配管は、８分間１０００×ｇで遠心分離した。３５％／７５％界面で得られた色素体バンドを回収し、別の１５ｍｌ管に移し、５ｍｌ  １Ｘ  ＰＩＭをそれぞれの管に添加した。７５０×ｇで５分間遠心分離したのち、上澄みを除去し、両ペレットを０．２５ｍｌ  ＰＩＭに再懸濁した。精製した色素体を含有する再懸濁ペレット画分はＰ２と命名し、分析に先立って−８０℃で保存した。
【００８４】
４つの単離された画分（Ｈ、Ｓ１、Ｐ１およびＰ２）中のＡＳタンパク質の存在は、当該技術分野で公知の方法を用いて、ウェスタンブロット分析により分析した。略言すると、タンパク質画分は、１８μｇタンパク質／レーンを負荷して、４〜１２％Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ研究所、ハーキュリーズ、カリフォルニア）上ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動に続いて、タンパク質はニトロセルロースに移し、二重ブロットは、ブロッキング、一次抗体インキュベーション（下に記載する一次抗体）、洗浄、二次抗体インキュベーション（西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた）、洗浄、および化学発光検出を含むウェスタンブロット法の標準プロトコールにかけた。ブロット分析において用いる一次抗体は、（ａ）トウモロコシ由来のアントラニル酸合成酵素α−２サブユニット、既知の色素体局在化タンパク質；（ｂ）エンドウマメグルタミン合成酵素１（ＧＳ１）、細胞質ゾル型のグルタミン合成酵素（ＧＳ）（Ｔｉｎｇｅｙら、１９８７）；および（ｃ）アグロバクテリウムアントラニル酸合成酵素に対してヤギ中で産生した。それぞれ抗トウモロコシＡＳα、抗エンドウマメＧＳ１および抗アグロＡＳと名付けた抗体は、当該技術分野で公知の標準技術を用いて調製した。
【００８５】
その結果（図２）は、抗トウモロコシＡＳα抗体は、４つの画分すべてにおいてトウモロコシアントラニル酸合成酵素α−２サブユニットに対応するバンドを認識するが、色素体画分Ｐ１およびＰ２において富化されたことを実証している。これとは対照的に、抗エンドウマメＧＳ１抗体は、画分ＨおよびＳ１における予測されるサイズのタンパク質、粗製Ｐ１色素体画分におけるさらに少量のタンパク質、および精製された色素体、Ｐ２画分におけるかろうじて検出可能な量に対応するバンドを認識した。このパターンのグルタミン合成酵素の分割は、細胞質ゾルへのその局在化と一致している。抗アグロＡＳ抗体は、４画分すべてにおいて細胞質ゾルマーカーＧＳ１に似ているパターンを示す予想されるサイズのタンパク質を認識し、コード配列にはＣＴＰ１配列が含まれるという事実にもかかわらず、そのタンパク質も主に細胞質ゾルに局在化していることを示していた。その結果は、ＣＴＰ１は、トウモロコシ胚細胞の色素体にタンパク質を区分するための発現ベクターには有用ではないと考えられることを示している。さらに、その結果は、すべての葉緑体輸送ペプチドが単量体ＡＳをトウモロコシ細胞の色素体に首尾よく局在化する能力を有するわけではないことを示唆している。
【実施例２】
【００８６】
アントラニル酸合成酵素の局在化のための追加の輸送ペプチド配列
本実施例は、トウモロコシアントラニル酸合成酵素−緑色蛍光タンパク質（Ｚｍ−ＡＳ：：ＧＦＰ）融合物および実施例３で詳述される対照：：ＧＦＰ融合物を含有するプロトプラストトランスフェクションベクターの構築に組み込まれ、実施例４で説明される一過性発現アッセイシステムで評価された種々のＣＴＰ配列の設計を説明する。
【００８７】
【表１】
2010500035.tif 000002
【実施例３】
【００８８】
形質転換ベクターの構築
本実施例は、トウモロコシアントラニル酸合成酵素：：緑色蛍光タンパク質（Ｚｍ−ＡＳ：：ＧＦＰ）融合物および実施例４で説明される一過性プロトプラストおよび胚アッセイにおいて使用された対照：：ＧＦＰ融合物を含有するプロトプラストトランスフェクションベクターの構築を説明する。２つの一般的戦略を用いてこれらのベクターを構築した。
【００８９】
第１の戦略は、ＧＦＰコード配列の付加を促進するための制限部位の導入と共に、ＣＴＰ−ＡＳコード配列のＰＣＲ増幅を含んでいた。第１の戦略はｐＭＯＮ７８８２４（図３）の構築により例証される。プラスミドｐＭＯＮ７８８２４は、プラスミドｐＭＯＮ６６５７４を鋳型として用いて、Ｚｍ−ＡＳＡ２  ＣＴＰ−コード配列を含有するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅により構築した。ＢａｍＨＩ制限部位をプライマーＡＳ２５およびＡＳ３’（それぞれ配列番号６３および６１）に組み込んで、ＧＦＰコード配列がプラスミドｐＭＯＮ３００９８に含有されているフレームへの前記フラグメントの挿入を可能にした。ＰＣＲ産物は、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に含まれる製造者の使用説明書に従って、ｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア）にクローン化し、プラスミドｐＭＯＮ８２５５３を得た。配列完全性は、当該技術分野で公知の方法を用いて、ＤＮＡ塩基配列決定法により確証した。
【００９０】
次に、Ｚｍ−ＡＳＡ２  ＣＴＰ−フラグメントを、ＢａｍＨＩを用いてｐＭＯＮ８２５５３から切り取り、プラスミドｐＭＯＮ３００９８のＢａｍＨＩ部位に挿入して、ｐＭＯＮ７８８２４を作製した。得られたプラスミドｐＭＯＮ７８８２４は、ａ）Ｚｍ−ＡＳＡ２遺伝子によりコードされた最初の６５アミノ酸；ｂ）アグロバクテリウム・ツメファンシス単量体アントラニル酸合成酵素；およびｃ）ＧＦＰコード領域を含む融合タンパク質（配列番号６０）をコードしており、すべてがｅ３５Ｓプロモーターの制御下にあった。
【００９１】
種々のＧＦＰ翻訳融合物を含有する追加のプロトプラスト形質転換ベクターは、当該技術分野で公知の標準ＰＣＲおよびクローニング法を用いて類似の方法で構築した。トランスフェクションベクターＩＤ（ｐＭＯＮ番号）、トランスフェクションベクターに含まれる融合タンパク質の概要、使用したＰＣＲプライマー、およびＰＣＲ鋳型は表２に要約されている。
【００９２】
【表２】
2010500035.tif 000003
【００９３】
プロトプラスト形質転換ベクター構築のために用いられる第２の戦略は、種々のＣＴＰに対応する配列の組立て、およびこれらの配列をアグロＡＳ（Ｆ２９８Ｗ）（配列番号２０１）のＮ末端コード配列に融合することを含んでいた。ＣＴＰコード配列は、Ｗｉｔｈｅｒｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら（１９９９）の方法に基づいたＰＣＲベース組立て反応において一連の重複プライマーを用いて作製した。この第２の戦略の例は、Ａｔ−ＣＴＰ２：：アグロＡＳ（Ｆ２９８Ｗ）：：ＧＦＰ融合タンパク質をコードする発現ベクターを含有するプラスミドｐＭＯＮ７８８３２（図４）の作製である。
【００９４】
この第２の戦略の第１工程は、種々のＣＴＰのそのＮ末端へのおよびＧＦＰのそのＣ末端へのインフレーム融合物のために改変されたアグロＡＳ（Ｆ２９８Ｗ）コード配列を含有するシャトルベクターを合成することである。この目的のために、当該技術分野で公知の方法を使い、鋳型としてｐＭＯＮ７９９６１を、ならびにオリゴヌクレオチドプライマーＡＳ５Ａ（配列番号８４）およびＡＳ３’（配列番号６３）を用いてＰＣＲ増幅反応を行った。アグロＡＳ（Ｆ２９８Ｗ）コード配列を含有する得られた２．２ｋｂＰＣＲ−産物は、アガロースゲル精製し、ｐＣＲＩＩベクターにライゲートし、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてコンピテントイー・コリ細胞に形質転換した。得られた中間プラスミドはＷＤＲＡＰＰ０１．０００５と命名し、塩基配列を決定して、２．２ｋｂＰＣＲ産物の存在を確認した。次に、２．２ｋｂ挿入物を、ＢａｍＨＩを用いてプラスミドＷＤＲＡＰＰ０１．０００５から切り取り、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋中のＢａｍＨＩ部位にクローン化して、プラスミドｐＭＯＮ８２５５４を作製した。
【００９５】
この第２の戦略の第２工程は、Ａｔ−ＣＴＰ２−アグロＡＳ（Ｆ２９８Ｗ）Ｎ末端コード配列の合成を含んでいた。この目的のために、表３に収載する以下の１４オリゴヌクレオチドプライマーを調製した。
【００９６】
【表３】
2010500035.tif 000004
【００９７】
蒸留水に必要量を溶解させることにより、表５に記載する１４オリゴヌクレオチドそれぞれに対して保存液（１００μモル／Ｌ）を作製した。次に、オリゴヌクレオチド混合物（Ａｔ−ＣＴＰ２  Ｎ１オリゴミックス）を、５μｌの各個別のオリゴヌクレオチド溶液を組み合わせることによって調製した。ＰＣＲ増幅は以下の条件を用いて実施した。
一次ＰＣＲ
ミックス１：
１マイクロリットルＣＴＰ２  Ｎ１オリゴミックス
１マイクロリットル４ｄＮＴＰミックス（Ｒｏｃｈｅ社製、１０ミリモル各）
２３マイクロリットル水
ミックス２
６マイクロリットル  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５マイクロリットルＰＣＲ緩衝液（ｗ／ｏｕｔ  ＭｇＣｌ２）
０．７５マイクロリットルＥｘｐａｎｄ  Ｈｉ−Ｆｉ酵素ミックス（Ｒｏｃｈｅ社製）
１３．２５マイクロリットル水
ミックス１およびミックス２は薄壁ＰＣＲ管中で組み合わせ、ＰＣＲ反応は以下のように実施した：
１）９４℃／２分
２）９４℃／３０秒
３）４５℃／３０秒
４）７２℃／３０秒
５）さらに４回、工程２へ進む
６）７２℃／２分
７）４℃／保持
二次ＰＣＲ
ミックス３
１マイクロリットルの一次ＰＣＲ反応物
１．５マイクロリットルＮ１−１オリゴ（１０ピコモル／マイクロリットル）
１．５マイクロリットルＮ１−１４オリゴ（１０ピコモル／マイクロリットル）
１マイクロリットルｄＮＴＰミックス
２０マイクロリットル水
ミックス４
６マイクロリットル  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５マイクロリットルＰＣＲ緩衝液（ｗ／ｏｕｔ  ＭｇＣｌ２）
０．７５マイクロリットルＥｘｐａｎｄ  Ｈｉ−Ｆｉ酵素ミックス（Ｒｏｃｈｅ社製）
１３．２５マイクロリットル水
ミックス１およびミックス２は薄壁ＰＣＲ管中で組み合わせ、ＰＣＲ反応は以下のように実施した：
ミックス３およびミックス４は薄壁ＰＣＲ管中で組み合わせ、ＰＣＲ反応は以下のように実施した：
１）９４℃／２分
２）９４℃／３０秒
３）５５℃／３０秒
４）７２℃／３０秒
５）さらに２４回、工程２へ進む
６）７２℃／２分
７）４℃／保持
【００９８】
上記のように、妥当なサイズ（〜０．３ｋｂ）の得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲル精製し、ｐＣＲＩＩベクター（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲートした。その配列を確認したのち、プラスミドはＮｃｏＩおよびＢｓｉＷＩで消化し、ｐＭＯＮ８２５５４にクローン化し、ＮｃｏＩおよびＢｓｉＷＩ部位で以前取り除かれていたフラグメントを置き換えた。次に、得られた中間プラスミドはＢａｍＨＩで消化し、その後ｐＭＯＮ３００９８にクローン化するフラグメントを作製した。この得られたプラスミドベクターは、ｅ３５Ｓプロモーター：：ｈｓｐ７０イントロン：：Ａｔ−ＣＴＰ２：アグロＡＳ（Ｆ２９８Ｗ）：：ＧＦＰ：：ｎｏｓ３’ＵＴＲ遺伝子エレメント（ｐＭＯＮ７８８３２；図４）を含んでいた。
【００９９】
各ＣＴＰのいくつかの変異体を、ＣＴＰの３’末端の３から２０アミノ酸をコードする対応する成熟タンパク質のＤＮＡ配列を付加することによって上記の方法で構築した。ＣＴＰ変異体を含有するｐＣＲＩＩベクターごとに、ｐＣＲＩＩベクターのＮｃｏＩとＢＳｉＷＩ制限部位間のフラグメントを続いてベクターから取り除き、上記のｐＭＯＮ８２５５４シャトルベクターのＮｃｏＩとＢｓｉＷＩ間にクローン化した。これらのベクターはそれぞれ、続いてＢａｍＨＩで消化して、次に上記のｐＭＯＮ３００９８のＢａｍＨＩ部位にクローン化するフラグメントを作製し、最終プラスミドベクターの残りの遺伝子エレメントを提供した。ＧＦＰに融合させたこれらのＣＴＰ変異体およびベクターの残りの遺伝子エレメントを含有する最終プラスミドベクターは、その構築で使用したプライマーと一緒に表４に収載する。
【０１００】
【表４−１】
2010500035.tif 000005
【０１０１】
【表４−２】
2010500035.tif 000006
【０１０２】
【表４−３】
2010500035.tif 000007
【０１０３】
【表４−４】
2010500035.tif 000008
【０１０４】
【表４−５】
2010500035.tif 000009
【０１０５】
【表４−６】
2010500035.tif 000010
【実施例４】
【０１０６】
アグロＡＳおよび変異体の色素体への局在化
本実施例は、ＡＳ：：ＧＦＰ融合タンパク質の色素体標的における異なる葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）の能力を予測するのに用いる２つの一過性発現アッセイシステムを説明する。これらのアッセイは、アントラニル酸合成酵素−緑色蛍光タンパク質（ＡＳ：：ＧＦＰ）融合物および実施例３に記載した融合物を含有するプロトプラストトランスフェクションベクターを利用する。
【０１０７】
２つの一過性発現アッセイ法は、トウモロコシ細胞におけるＡＳ：：ＧＦＰ融合タンパク質の局在化を予測するために開発された。中間スループットトウモロコシプロトプラストシステムを用いて、ＡＳ：：ＧＦＰ融合タンパク質を黄化したトウモロコシ葉細胞の色素体へ標的するその能力を求めて多くの異なったＣＴＰをスクリーニングした。発生中のトウモロコシ胚中でタンパク質を発現する低スループットシステムを用いて、プロトプラストシステムにおいて見られる色素体局在化パターンを確証した。次に、これらの２つのアッセイからのデータを用いて、トランスジェニックトウモロコシ胚におけるアグロバクテリウムおよびシノリゾビウムＡＳタンパク質の局在化を導く際の種々のＣＴＰの能力を予測した。
【０１０８】
一過性アッセイシステムで試験した構築物はすべて、ｅ３５Ｓプロモーター、ｈｓｐ７０（ＤｎａＫ）イントロンおよびｎｏｓ３’ＵＴＲを用いて各遺伝子を発現する共通のベクター骨格中の同一遺伝子エレメントで構築した。
【０１０９】
一過性アッセイシステムが正しく機能していることを保証するため、対照プラスミドを構築した。細胞質ゾル局在化用の対照は、ＣＴＰのないＧＦＰ融合物（ｐＭＯＮ３００９８；表２および５）、ＧＦＰへのアグロＡＳ融合物（ＣＴＰ付加なし）（ｐＭＯＮ７８８１８；表２および５）、ならびにＺｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰを欠く切断されたＺｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ：：ＧＦＰ融合物（ｐＭＯＮ７８８２２、表２および５）を含有するベクターであった。色素体局在化のために用いられる対照は、ＧＦＰに融合したトウモロコシＡＳＡ２（ｐＭＯＮ７８８２０、表２および５）ならびにＧＦＰに融合したＡｔ−ＣＴＰ２（ｐＭＯＮ５３１７３、表５）であった。２つの追加の対照、すなわちＣＴＰ１：：ＧＦＰ（ｐＭＯＮ７９９６０、表２および５）ならびにＣＴＰ１：：アグロＡＳ（Ｆ２９８Ｗ）：：ＧＦＰ（ｐＭＯＮ７９９６１、表２および５）を用いて、トランスジェニック植物からのデータを確かめた。これらのベクターそれぞれ由来のＧＦＰまたはＧＦＰ融合タンパク質の局在化パターンは表５に報告している。前記データは、実施例１に記載する細胞分画結果も確証しており、ＣＴＰ１：：アグロＡＳ（Ｆ２９８Ｗ）：：ＧＦＰ融合タンパク質の細胞質ゾル局在化、およびＣＴＰ１がアグロＡＳ（Ｆ２９８Ｗ）を色素体へ標的することができないことを示していた。
【０１１０】
実験の大半において、追加の対照は、試験するＣＴＰごとに構築した。これらの対照は、ＧＦＰに直接融合している試験されたＣＴＰからなっていた。例えば、Ｚｍ−ＡＳＡ２：：アグロＡＳ：：ＧＦＰ融合物を試験するためのＧＦＰに融合したＺｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ（ｐＭＯＮ６９７７１）である。試験したベクターすべての構築のための方法は実施例３に詳説している。
【０１１１】
試験したＣＴＰごとにいくつかの変異体を作製した。天然宿主タンパク質のＣＴＰに付加したＮ末端アミノ酸の数を変えることにより、これらの変異体を識別した（表１）。例えば、Ｚｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰシリーズにおいて、ＧＦＰに直接融合された実験的に決定されたＣＴＰ、ならびにＣＴＰに隣接する成熟トウモロコシアントラニル酸合成酵素α２サブユニットのアミノ末端の領域から単離した、Ｚｍ−ＡＳＡ２のＮ末端由来の５および１８アミノ酸を含む２つの追加のバージョンを使用した。前記構築物は、表１ではＺｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ＋５（配列番号８）およびＺｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ＋１８（配列番号９）と命名している。
【０１１２】
一次試験として、表１に記載のＣＴＰ構築物は、黄化プロトプラストシステムにおいて評価した。葉葉肉プロトプラストは、当該技術分野で公知の方法を用いて黄化トウモロコシ実生から調製した（例えば、Ｓｈｅｅｎ、１９９３を参照されたい）。
【０１１３】
異なるベクターを当該技術分野では公知の方法を用いてプロトプラストにエレクトロポレートした。ほぼ１８から２４時間後、プロトプラスト細胞は、共焦点顕微鏡を用いてＧＦＰ蛍光を計測した。略言すると、アルゴンイオンレーザー、緑色および赤色ヘリウム−ネオンレーザー、およびカメレオンダイオード励起レーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ社レーザー部門、サンタクララ、カリフォルニア）を装備したＺｅｉｓｓレーザー走査型顕微鏡ＬＳＭ５１０  ＭＥＴＡ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ社、トルンウッド、ニューヨーク）を用いて、顕微鏡観察を実施した。画像収集および解析は、ＬＳＭ５画像エグザミナー、バージョン３．２．０．７０（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ社、トルンウッド、ニューヨーク）を用いて実施した。画像処理はＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ、バージョン８．０（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、サンノゼ、カリフォルニア）を用いて実施した。ａ）色素体のみ、ｂ）細胞質ゾルのみ、およびｃ）色素体と細胞質ゾルの双方においてＧＦＰ蛍光を有することに関して、構築物ごとに少なくとも５０細胞をスコア化した。
【０１１４】
二次試験として、発生中のトウモロコシ胚組織において発現されるように設計した構築物を評価するために特定の一過性アッセイシステムを開発した。プロトプラストシステムにおいて、色素体のみ局在化を含有する形質転換された細胞の５０％またはそれを超える点数を有することに基づいて、この試験により評価された構築物を選択した。上に詳説するように、追加の対照構築物も試験した。
【０１１５】
胚は、受粉後（ＤＡＰ）のほぼ１４日目に、トウモロコシ、例えば、ＨｉＩＩまたは自植親由来表面無菌化穂から単離した。約２０〜３０胚を０．２Ｍソルビトールおよび０．２Ｍマンニトールを補充したＮ６培養液を含有するペトリ皿に置いた（Ｃｈｕ、１９７８）。室温での４時間のインキュベーションに続いて、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（商標）ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、胚にＤＮＡをコーティングした０．６μｍ金粒子を照射した。前記プレートには、破裂圧力１１００ｐｓｉおよび間隙距離１ｃｍで、停止スクリーンから標的棚まで９ｃｍで２度照射した。照射に続いて、上述のように、多光子共焦点顕微鏡により分析する前に、胚は暗所において一晩２８℃でインキュベートした。プロトプラストシステムについて上記したように、試料につき少なくとも５０細胞を計測し、スコア化した。
【０１１６】
局在化アッセイの結果は表５に示している。結果は、視覚化に基づいて、以下の６つのＣＴＰ、すなわちＺｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ＋１８（配列番号９；ｐＭＯＮ７８８２４のＣＴＰ成分）、Ｒｇ−ＡＳ長−ＣＴＰ（配列番号１４；ｐＭＯＮ７８１４２のＣＴＰ成分）、Ｒｇ−ＡＳ短−ＣＴＰ（配列番号１３；ｐＭＯＮ７８１４３およびｐＭＯＮ７８１３９のＣＴＰ成分）、Ａｔ−ＣＴＰ２（Ｅ／Ｋ）（配列番号２；ｐＭＯＮ７８８３３のＣＴＰ成分）、Ａｔ−ＣＴＰ２（Ｅ／Ｋ）＋１０（配列番号３；ｐＭＯＮ７８８３４のＣＴＰ成分）、およびＺｍ−ＤＨＤＰＳ−ＣＴＰ＋２０（配列番号１７；ｐＭＯＮ６９７６５のＣＴＰ成分）がアグロＡＳをトウモロコシ胚細胞に効果的に標的することを示している。結果は、プロトプラスト一過性発現アッセイでも胚一過性発現アッセイでも、アッセイされた種々のＣＴＰがすべて、ＡＳ：：ＧＦＰを局在化する能力がポジティブであったわけではないことも示している。これらの結果は、実施例１に記載する結果を実証しており、単子葉植物の葉緑体に単量体ＡＳタンパク質を首尾よく局在化し、したがって、上昇したトリプトファンレベルを生み出すために有用なＣＴＰを同定する必要性を示している。
【０１１７】
【表５−１】
2010500035.tif 000011
【０１１８】
【表５−２】
2010500035.tif 000012
【実施例５】
【０１１９】
形質転換ベクターおよびトウモロコシ形質転換
本実施例は、種々の葉緑体輸送タンパク質と組み合わせた、野生型（ｗｔ）および突然変異対立遺伝子のアグロバクテリウム・ツメファンシスおよびリゾビウム・メリロティアントラニル酸合成酵素（ＡＳ）双方をコードする核酸配列を含有する形質転換ベクターの構築を説明する。本実施例は、本明細書に記載する形質転換ベクターを用いるトウモロコシの形質転換のためのプロトコールも提供する。
【０１２０】
野生型アグロバクテリウム・ツメファンシスＡＳを含有する形質転換ベクターの構築のために、ＡＳコード配列を、ＸｈｏＩで消化することによりプラスミドｐＭＯＮ６６５８０から切り出し、マングビーンヌクレアーゼを用いて末端を平滑末端化し、次にＢｇｌＩＩで切断して、最初のフラグメントを単離した。トウモロコシオレオシンプロモーター、ｈｓｐ７０イントロン、およびＴｒ７−３’−ＵＴＲを含有する第２のフラグメントを単離するために、プラスミドｐＭＯＮ６９７５３をＢｇｌＩＩおよびＳｍａＩで切断した。これら２つのフラグメントをライゲートしてｐＭＯＮ６９７５４を作製した。Ｚｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰを含有する最終形質転換ベクターを構築するために、ｐＭＯＮ６９７５４をＸｈｏＩで消化し、トウモロコシオレオシンプロモーター、ｈｓｐ７０イントロン、ｗｔに融合したＺｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ、およびＴｒ７−３’ＵＴＲを含有する精製したフラグメントを単離した。次に、このフラグメントは、同じくＸｈｏＩで消化していたベクターｐＭＯＮ７８８０８にライゲートし、最終形質転換ベクターｐＭＯＮ６９７５５を作製した（図６）。
【０１２１】
アグロＡＳ（Ｆ２９８Ｗ）突然変異対立遺伝子を含有する形質転換ベクターの構築のために、ｐＭＯＮ６６８６９をＳｔｕＩおよびＲｓｒＩＩで消化して、アグロＡＳ（Ｆ２９８Ｗ）コード領域の一部を含有するフラグメントを単離した。同様に、ｐＭＯＮ６９７５４もＳｔｕＩおよびＲｓｒＩＩで消化して、トウモロコシオレオシンプロモーター、ｈｓｐ７０イントロン、コード領域の一部およびＴｒ７  ３’−ＵＴＲを含有する第２のフラグメントを単離した。得られたフラグメントをライゲートし、ｐＭＯＮ６９７５６を作製した。最終形質転換ベクターを構築するために、ｐＭＯＮ６９７５６をＸｈｏＩで消化し、トウモロコシオレオシンプロモーター、ｈｓｐ７０イントロン、アグロＡＳ（Ｆ２９８Ｗ）に融合したＺｍ−ＡＳＡ２−ＣＴＰ、およびＴｒ７−３’ＵＴＲを含有するフラグメントを精製した。次に、このフラグメントをｐＭＯＮ７８８０８のＸｈｏＩ部位にライゲートし、ｐＭＯＮ６９７５７；配列番号２１５）を作製した。
【０１２２】
アグロＡＳ（Ｓ５１Ｆ）コード領域（配列番号２０３）を含有する形質転換ベクターも同様に構築した。例えば、上記のプラスミドｐＭＯＮ６９７５４は、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化してアグロＡＳコード領域を取り除いた。プラスミドｐＭＯＮ５８１２１もＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化して、アグロＡＳ（Ｓ５１Ｆ）突然変異対立遺伝子を単離した。次に、得られたフラグメントをライゲートして中間プラスミドｐＭＯＮ６９７６７を作製した。最終形質転換ベクターのｐＭＯＮ６９７６８は、ｐＭＯＮ６９７６７をＸｈｏＩで消化し、ｐＭＯＮ７８８０８のＸｈｏＩ部位で前記フラグメントをライゲートすることにより、上記のように構築した。
【０１２３】
アグロＡＳ（Ｓ５１Ｃ）対立遺伝子を含有する形質転換ベクターの構築の例はｐＭＯＮ６８０６５である。ｐＭＯＮ６８０６３はＸｈｏＩ制限酵素で消化し、１．０％アガロースゲル上で分離し、Ｚｍｈｓｐ７０（Ｚｍ．ＤＮＡＫ）イントロンに融合したトウモロコシオレオシンプロモーター、アグロＡＳ（Ｓ５１Ｃ）対立遺伝子およびＯｓ−ｇｔ１−３’ＵＴＲに対応する４５６９ｂｐＤＮＡフラグメントを前記ゲルより単離した。
【０１２４】
ｐＭＯＮ７８８０８ＤＮＡもＸｈｏＩ制限酵素で切断し、アルカリホスファターゼ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて脱リン酸化し、前記ＤＮＡはＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。ｐＭＯＮ７８８０８のＸｈｏＩ消化ＤＮＡおよびｐＭＯＮ６８０６３の４５６９ｂｐＸｈｏＩ消化ＤＮＡフラグメントを互いにライゲートして、ｐＭＯＮ６８０６５を作製した。
【０１２５】
アグロＡＳ（Ｓ５１Ｃ）コドン最適化（アグロＡＳ（Ｓ５１Ｃ）−ｎｎｏ）対立遺伝子を含有する形質転換ベクターの構築の例は、ｐＭＯＮ６８０６６である。アグロＡＳ（Ｓ５１Ｃ）突然変異対立遺伝子のコドン最適化は、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許出願第１１／５０３５３２号に記載のとおりに実施した。コドン最適化アグロＡＳ（Ｓ５１Ｃ）−ｎｎｏＤＮＡは、ＢＬＵＥ  ＨＥＲＯＮ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹグループ（ボセル、ワシントン州、米国）が合成した。次に、前記合成ＤＮＡは、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、１．０％アガロースゲル上で分離し、アグロＡＳ（Ｓ５１Ｃ）−ｎｎｏに対応する２１９３ｂｐＤＮＡフラグメントを前記ゲルから切り出し、上記のように精製した。ｐＭＯＮ６８０６３のＤＮＡもＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で切断し、１．０％アガロースゲル上で分離した。単離した５２４４ｂｐＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡフラグメントは、アグロＡＳ（Ｓ５１Ｃ）突然変異対立遺伝子を除いて、ｐＭＯＮ６８０６３に記載するすべての遺伝子エレメントを含有する。ライゲーション反応は、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化アグロＡＳ（Ｓ５１Ｃ）−ｎｎｏＤＮＡ（２１９３ｂｐフラグメント）とｐＭＯＮ６８０６３（５２４４ｂｐＤＮＡフラグメント）のＤＮＡを混合することにより実施して、ｐＭＯＮ６８０６４を作製した。次に、ｐＭＯＮ６８０６４をＸｈｏＩ制限酵素で消化し、１．０％アガロースゲル上で分離し、ｈｓｐ７０（Ｚｍ．ＤＮＡＫ）イントロンに融合したトウモロコシオレオシンプロモーター、アグロＡＳ（Ｓ５１Ｃ）−ｎｎｏおよびＯｓ−ｇｔ１−３’ＵＴＲを含有する４５３２ｂｐＤＮＡフラグメントを上記のように精製した。ｐＭＯＮ７８８０８ＤＮＡのＤＮＡもＸｈｏＩ制限酵素で切断し、アルカリホスファターゼ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製、ベヴァリー、マサチューセッツ）を用いて脱リン酸化し、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社、ヴァレンシア、カリフォルニア）を用いて精製した。ライゲーション反応は、脱リン酸化ＸｈｏＩ切断ｐＭＯＮ７８８０８ＤＮＡとｐＭＯＮ６８０６４の４５３２ｂｐＤＮＡフラグメントを混合することにより実施して、ｐＭＯＮ６８０６６を作製した。
【０１２６】
プラスミドｐＭＯＮ６９７６９を基本ベクターとして使い、類似のクローニング戦略を用いて、ｐＭＯＮ８２５６１（図７）、ｐＭＯＮ７８１５２（図８）、ｐＭＯＮ７８１５３（図９）、ｐＭＯＮ８２５６０（図１０）、ｐＭＯＮ６９７７９（図１１）、ｐＭＯＮ７８８４６、ｐＭＯＮ７８８５０、ｐＭＯＮ７８８５１、ｐＭＯＮ６８０６５、ｐＭＯＮ６９７８１、ｐＭＯＮ９４５４８、ｐＭＯＮ９４５４９、ｐＭＯＮ９７７０１、ｐＭＯＮ９７７０３およびｐＭＯＮ９７７０５を含む種々の他の形質転換ベクターを作製した。
【０１２７】
トウモロコシの形質転換
上記の形質転換ベクターは、基本的に米国特許出願公開第２００５／０００５３２７号に記載のとおりにトウモロコシに形質転換した。この特許文献は参照によりその全体を本明細書に組み込んでいるものとする。略言すると、未熟胚を含有する穂は受粉のほぼ１０日後に収穫し、使用まで４℃で冷蔵した（収穫後最長５日間）。形質転換のこの方法に好ましい胚のサイズは〜１．５〜２．０ｍｍである。このサイズには通常、平均温度８７°Ｆ、ＧＥ１０００ワット高圧ナトリウムランプにより供給される補助照明付きで日照時間１４時間の生育条件付きの温室内で受粉の１０日後に到達する。
【０１２８】
未熟胚は表面無菌化穂から単離し、１．５ｍＬ微量遠心分離管内の調製したアグロバクテリウム細胞懸濁液に直接落とす。単離はほぼ５から６０分間連続して持続する。代わりに、胚は５〜６０分間で、播種培養液（アグロバクテリウムおよびアセトシリンゴンなし）に直接切り取り、続いて５〜３０分間アグロバクテリウム細胞懸濁液を播種する。アグロバクテリウム細胞懸濁液を、先の細い無菌ホールピペットを用いて取り除いた後、未熟胚は、ｃｒｎ３９８共培養培地上に移す（表６）。次に、胚盤側を上に向けて、胚を培地上に置く。胚はほぼ１４〜４８時間暗インキュベーター（２３℃）中で培養する。
【０１２９】
次に、胚は、ペトリ皿（１００ｍｍ×２５ｍｍ）でアグロバクテリウムを阻害するために０．１ｍＭグリフォセートおよび５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有するカルス誘導培地（ｃｒｎ３３６、表６）上に移す。培養物は、暗培養室／インキュベーターにおいて３０℃で２週間、続いてさらに１週間、暗培養室／インキュベーターにおいて２７℃でインキュベートする。次に、カルス片はすべて、０．１ｍＭグリフォセートおよび２５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有する第１再生培地（ｃｒｎ３３５、表６）上に個別に移す。培養物は、７から１０日間、１６時間明／８時間暗の光周期で２７℃培養室において、この培地上で培養する。次に、ほぼ２から３週間、１６時間明の２７℃でペトリ皿（１００ｍｍ×２５ｍｍ）の第２再生培地（ｃｒｎ３３３、表６）に移す。次に、再生苗条と生体組織を有するカルス片はすべて、土壌に移すのに先立ってさらに培養するために、新たなｃｒｎ３３３プレートもしくはｃｒｎ３３４ＰＨＹＴＡＴＲＡＹ（表６）のいずれかに移す、または、発根培地（ｃｒｎ３６６、表６）を含有するサンデーカップに直接移す（ほぼ１から３週間）。再生培地（ｃｒｎ３３５、ｃｒｎ３３３およびｃｒｎ３３４）はすべて、２５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンおよび０．１ｍＭグリフォセートを含有する。
【０１３０】
次に、小植物を土壌に移し、ほぼ１から２週間、２７℃、８０％湿度、および低強度光で栽培箱において慣れさせ、その後、温室に移して、標準温室条件の下で生育する。得られたカーネルを収集し、下記のように分析する。
【０１３１】
【表６】
2010500035.tif 000013
【実施例６】
【０１３２】
トウモロコシカーネルにおけるＡＳの免疫局在性およびトリプトファンの定量化のための方法
本実施例は、実施例５に記載するＣＴＰ−構築物で形質転換したトウモロコシ事象由来のカーネルにおける免疫局在性の研究および遊離トリプトファンレベルの定量化で使用される分析法を説明する。
【０１３３】
異なる構築物を宿すＦ１段階トランスジェニック植物由来のカーネルは、２６ＤＡＰで別々に収穫した。これらの構築物には、ｐＭＯＮ６９７５５（図６）、ｐＭＯＮ６９７７９（図１１）、ｐＭＯＮ８２５６０（図１０）、ｐＭＯＮ８２５６１（図７）、ｐＭＯＮ７８１５３（図９）およびｐＭＯＮ７８１５２（図８）が挙げられた。８から１０胚をこれらの構築物の各遺伝子導入系から単離し、３．７％ホルムアルデヒド溶液に固定し、下記の免疫標識試験により発現されたタンパク質の局在化を調べるために分析されるのに先立って４℃で貯蔵した。
【０１３４】
ゲノムＤＮＡも、ＤＮｅａｓｙ（商標）植物キット（カタログ番号６９１０４、Ｑｉａｇｅｎ社、ウォルサム、マサチューセッツ）を用いてこれらのトランスジェニックカーネルの胚乳から抽出した。ＰＣＲ増幅を実行して、配列表においてそれぞれ配列番号２２６および配列番号２２７と命名されるオリゴヌクレオチドプライマートウモロコシＡＳ２−５’およびトウモロコシＡＳ２−３’を用いてポジティブおよびネガティブのカーネルを同定した。
【０１３５】
上記のトウモロコシ胚は、５００μｌ  ０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で３０分間インキュベートした。胚盤組織切片を、サファイアナイフを備えたＬｅｉｃａＶＴ１０００Ｓ振動刃ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ有限責任会社、ヌスロッホ、独国）を用いて切片２０μｍ厚に薄切りし、次に、１０ｍＭグリシンを含有するＰＢＳ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４および１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）で、洗浄ごとに１０分間、３回洗浄した。
【０１３６】
次に、組織切片を２８℃で４０分間、酵素混合液（４％ペクチナーゼ、２％セルラーゼ）中でインキュベートした。次に、アグロＡＳ検出にはヤギ血清（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ−９０２３；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ社、セントルイス、ミズリー）を、トウモロコシＡＳにはウサギ血清（ＳｉｇｍａＲ−９１３３）を用いて、前記組織を１５分間無希釈血清でブロックした。次に、前記組織切片は、ＰＢＳ緩衝液中１％ウサギ抗−ｈｉｓアグロＡＳまたはヤギ抗トウモロコシＡＳのいずれかで、穏やかに攪拌しながら４℃で一晩インキュベートした。
【０１３７】
一晩インキュベーション後、前記組織は、２０分間１０ｍＭグリシンを含有するＰＢＳ緩衝液で洗浄し、室温で１５分間それぞれの無希釈血清中で再びインキュベートした。次に、組織は室温で２時間、Ａｌｅｘａコンジュゲート二次抗体と共に暗所でインキュベートした。希釈係数は、アグロＡＳタンパク質に対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージン、オレゴン）ヤギ抗ウサギコンジュゲート二次抗体で１：１０００、およびＺｍ  ＡＳタンパク質に対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）ウサギ抗ヤギで１：１０００であった。インキュベーションに続いて、組織は、１０ｍＭグリシンを含有するＰＢＳで、洗浄ごとに１０分間、３回洗浄した。次に、組織は、攪拌しながら暗所で１５分間、細胞壁用カルコフロールホワイト（Ｓｉｇｍａ社製）溶液（ストック中２．５ｍｇ／ｍｌ、蒸留水で１：５０に希釈）および核用Ｈｏｅｃｈｓｔ染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）で対比染色した。次に、染色した組織は、マウンティングに先立って蒸留水で１０分間洗浄した。
【０１３８】
試料を、チャネルを混合して、アグロＡＳ（５４３ｍｍで赤色蛍光）と対照Ｚｍ  ＡＳ抗体（４８８ｍｍで緑色蛍光）の双方で探索すると、黄色の出現により色素体中のタンパク質の共局在化が示唆されたこと（データは示されず）を、結果は示している。
【０１３９】
アミノ酸画分を抽出するため、３０ｍｇの轢いたカーネルを遠心分離用バイアルに入れた。１ミリリットルの５％トリクロロ酢酸を各試料に添加した。試料はボルテックスにより混合し、４℃で一晩置いた。次に、試料は再び混合し、１４０００ｒｐｍで１５分間、微量遠心機で回転させた。次に、上澄みの一部を取り除き、ＨＰＬＣバイアルに入れて密封した。試料は分析に先立って、４℃で保持した。
【０１４０】
アミノ酸分析は、アジレント技術刊行物「Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ−ＡＡＡ  Ｃｏｌｕｍｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ」３月１７日、２０００に記載される通りに実行した。分析では、アミノ酸をｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）で前誘導体化し、次に、逆相クロマトグラフィーによりＯＰＡコンジュゲートを分離する。分離は、ＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢ−Ｃ１８  ５μｍ、４．６×１５０ｍｍカラム、および流速１．２ｍｌ／分で、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、パロアルト、カリフォルニア）を用いて行った。アミノ酸濃度は、蛍光：３４０ｎｍで励起、４５０ｎｍで発光、を用いて測定した。溶出は、表７に従ってＨＰＬＣ緩衝液ＡおよびＢの勾配を使い、ＨＰＬＣ緩衝液Ａは４０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．８およびＨＰＬＣ緩衝液Ｂは９：９：２：：メタノール：アセトニトリル：水であった。
【０１４１】
【表７】
2010500035.tif 000014
【０１４２】
アミノ酸標準は、０から１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で調製または購入した。プロリン分析は、９−フルオレニルメチル−クロロギ酸（ＦＭＯＣ）を用いる追加の誘導体化工程を必要とした。結果は、表８に示すように、ｐｐｍで報告した。
【実施例７】
【０１４３】
トウモロコシにおける遊離トリプトファンレベルの分析
本実施例は、実施例５に記載する発現ベクターで形質転換したトウモロコシ植物における遊離トリプトファンレベルの分析を説明する。
【０１４４】
Ｆ１カーネルは実施例６に記載する遊離トリプトファンを分析した。下の表８に示す一部の形質転換植物からの結果は、一過性発現アッセイにおいてＧＦＰを首尾よく標的する能力を示したＣＴＰ（データは表５に示す）は、形質転換植物においてより高レベルの遊離トリプトファンを有していたことを示している。さらに、色素体にＧＦＰを局在化する能力を示さなかったＣＴＰは、より低レベルの遊離トリプトファンを有していた。これらの結果は、すべてのＣＴＰが、色素体への単量体ＡＳの局在化を導いて、したがって、遊離トリプトファンレベルを高めることができるわけではないことを示している。
【０１４５】
【表８−１】
2010500035.tif 000015
【０１４６】
【表８−２】
2010500035.tif 000016
【０１４７】
【表８−３】
2010500035.tif 000017
【０１４８】
【表８−４】
2010500035.tif 000018
【実施例８】
【０１４９】
ミールおよび飼料生成物の製造
本実施例は、実施例５に記載されている発現ベクターを含有するミールおよび飼料生成物の製造のための方法を説明する。
【０１５０】
本発明の植物またはその部分のどれでも、全トリプトファン含有量の高い飼料、ミール、タンパク質および油調製物を含む飼料、ミール、タンパク質または油調製物を製造するために加工してよい。この目的のために特に好ましい植物部分は種子である。好ましい実施形態では、飼料、ミール、タンパク質または油調製物は、家畜動物もしくは人間、または双方のために設計される。飼料、ミール、タンパク質および油調製物を製造するための方法は当該技術分野では公知である。例えば、米国特許第４９５７７４８号、米国特許第５１００６７９号、米国特許第５２１９５９６号、米国特許第５９３６０６９号、米国特許第６００５０７６号、米国特許第６１４６６６９号、および米国特許第６１５６２２７号を参照されたい。好ましい実施形態では、飼料、ミール、タンパク質または油調製物は、高トリプトファン調製物である。そのような高トリプトファン調製物は、好ましくは約２００〜４００ｐｐｍを超える、さらに好ましくは４００〜６００ｐｐｍを超える、はるかに好ましくは６００〜８００ｐｐｍを超えるトリプトファン含有量を有する。
【実施例９】
【０１５１】
ＣＴＰ：：ＡＳ導入遺伝子を検出するための方法
これは、トランスジェニック植物細胞、またはそのようなトランスジェニック植物細胞由来の飼料もしくはミール生成物における、本明細書に記載するＣＴＰ：：ＡＳ配列組合せのいずれでも含有する構築物に属する独自の配列の存在を検出するために使用してよい方法を説明する。
【０１５２】
ＣＴＰ：：ＡＳ  ＤＮＡのＰＣＲ増幅
トランスジェニック植物細胞由来の、またはそのようなトランスジェニック植物細胞由来の飼料もしくはミール生成物由来のゲノムＤＮＡは、製造元のプロトコールに従って、ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ（商標）植物ミニキット（カタログ番号６９１０４、ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出できる。ＰＣＲ反応混合物は、通常、約１００ｍｇの抽出ゲノムＤＮＡ、１Ｘ  ＰＣＲ反応緩衝液（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号１７３２６４１、Ｒｏｃｈｅ社、ナットレー、ニュージャージー）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、５ピコモルの各プライマー、３．５ユニットのＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑポリメラーゼ酵素、および５０μｌの最終容量になるまでの水を含んでいてよい。例えば、配列番号２２８と配列番号２２９、または配列番号２３０と配列番号２３１のプライマー対を使えば、抽出ＤＮＡを増幅させて、ｐＭＯＮ６８０６６で形質転換した植物細胞のＺｍ−ＡＳＡ２＋１８−ＣＴＰ：：アグロＡＳ構築物由来ＤＮＡに特徴的な単位複製配列を作製できる。反応混合物は、９５℃での変性、６０℃でのアニーリング、および７２℃での伸長を３５サイクル含んでいてよい種々の温度サイクルにかける。３５サイクルのＰＣＲ後、約１０μｌの反応混合物を１．０％アガロースゲル上で分離する。２６４９塩基対フラグメント（プライマー対配列番号２２８と配列番号２２９での）または２７３５塩基対フラグメント（プライマー対配列番号２３０と配列番号２３１での）の存在は、植物細胞、飼料またはミール生成物が、ＡＳ対立遺伝子に融合したＺｍ−ＡＳＡ２＋１８−ＣＴＰを含むことを示している。本明細書に記載する他のＣＴＰ：：ＡＳ配列組合せのいずれでも含有する構築物に属する独自の配列の検出に有用であると考えられる追加のＰＣＲプライマー対を認識し設計するのは、十分に当業者の手段内である。
【０１５３】
ここで開示し特許請求する材料および方法はすべて、上記の開示により教示されるように、過度の実験を行うことなく、作製し使用できる。本発明の材料および方法を、好ましい実施形態および実施例において説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載する材料および方法に改変を適用してよいことは当業者には明らかであろう。当業者には明らかなそのような類似の代替形態および修正形態はすべて、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲および概念内にあると見なされる。
【０１５４】
参考文献
本明細書に記載されたものに補足する例示的手順または他の詳細を提供する範囲まで、以下の参考文献をここに出典明示して特に本明細書の一部とみなす
【０１５５】
米国特許、出願および出願公開：米国出願第０９／７５７,０８９号；米国出願第１０／１３８,９２７号；米国出願第１０／４３０,０１１号；米国出願第１０／７３２,７２１号；米国出願第１１／５０３,５３２号；米国特許第４,９５７,７４８号；米国特許第４,９５７,７４８号；米国特許第５,１００,６７９号；米国特許第５,１００,６７９号；米国特許第５,１８８,６４２号；米国特許第５,２１９,５９６号；米国特許第５,２１９,５９６号；米国特許第５,２９０,９２４号；米国特許第５,３２２,７８３号；米国特許第５,３２２,９３８号；米国特許第５,３２２,９３８号；米国特許第５,３５２,６０５号；米国特許第５,３５９,１４２号；米国特許第５,３７８,６１９号；米国特許第５,３７８,６１９号；米国特許第５,４２４,４１２号；米国特許第５,５３０,１９６号；米国特許第５,５３８,８８０号；米国特許第５,５５０,３１８号；米国特許第５,５６３,０５５号；米国特許第５,６１０,０４２号；米国特許第５,６４１,８７６号；米国特許第５,７２８,９２５号；米国特許第５,８３７,８４８号；米国特許第５,８５８,７４１号；米国特許第５,９３６,０６９号；米国特許第５,９３６,０６９号；米国特許第６,００５,０７６号；米国特許第６,００５,０７６号；米国特許第６,１１８,０４７号；米国特許第６,１４０,０７８号；米国特許第６,１４６,６６９号；米国特許第６,１４６,６６９号；米国特許第６,１５６,２２７号；米国特許第６,１５６,２２７号；米国特許第６,１７５,０６０号；米国特許第６,１７７,６１１号；米国特許第６,２３２,５２６号；米国特許第６,２５２,１３８号；米国特許第６,２９４,７１４号；米国特許第６,４２６,４４６号；米国特許第６,４２９,３５７号；米国特許第６,４２９,３６２号；米国特許第６,４３３,２５２号；米国特許第６,４３７,２１７号；米国特許第６,６３５,８０６号；米国特許第５,６４１,８７６号；米国特許第７,１５１,２０４号；米国特許第７,２１７,８６５号；米国公開第２００３００９７６７７号；米国公開第２００３０２１３０１０号；米国公開第２００５０００５３２７号 
【０１５６】
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【図１】
2010500035.tif 000019
【図３】
2010500035.tif 000020
【図４】
2010500035.tif 000021
【図５】
2010500035.tif 000022
【図６】
2010500035.tif 000023
【図７】
2010500035.tif 000024
【図８】
2010500035.tif 000025
【図９】
2010500035.tif 000026
【図１０】
2010500035.tif 000027
【図１１】
2010500035.tif 000028
【図１２】
2010500035.tif 000029
【図１３】
2010500035.tif 000030
【図１４】
2010500035.tif 000031
【図１５】
2010500035.tif 000032
【図１６】
2010500035.tif 000033
【図１７】
2010500035.tif 000034
【図１８】
2010500035.tif 000035
【図１９】
2010500035.tif 000036
【図２】
2010500035.tif 000037
【配列表】
2010500035000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月2日(2009.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010500035000001.app
【国際調査報告】
2010500035.tif 000038
2010500035.tif 000039
2010500035.tif 000040