(57)【要約】化学合成の間に成長するペプチド鎖を固相支持体にアンカーする新規方法が発明された。新規のアミノ酸誘導体およびペプチド誘導体（固相支持体に非結合および結合の両方）も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式の化合物から開始するペプチド合成のための方法であって、
【化１−１】
2010505781.tif 000007
式中のAは固相支持体または固相支持体に移植されたリンカーであり; nはゼロおよび十の間の整数であり; Xは、C1-6 アルコキシ, アリール置換された C1-6 アルコキシ, アリールオキシ, アリルオキシ, 任意で保護されたアミノ酸残基, 任意で保護されたペプチド残基またはNR1R2であり（ここで、R1およびR2は、独立に水素またはC1-10 アルキルである）；およびYはAおよびアミノ官能基の結合とオルソゴナルな保護基であり；並びに以下の工程を備える方法：
(a)  Ｎ末端のα-アミノ官能基（α-amino function）を脱保護すること、
(b)  少なくとも自由な又は活性化したカルボン酸官能基（carboxylic acid function）を有しているN-末端が保護されたアミノ酸またはペプチドを、工程 (a)の脱保護されたα-アミノ官能基とカップリングし、式 Iの化合物を伸長すること、
(c)  任意で、少なくとも一度工程(a) および (b)を繰り返すこと〔少なくともN-末端が保護されたアミノ酸またはペプチドは、先行する工程 (b)のものと同一である又は異なる〕、
(d)  Aから生じるペプチドを切断すること、
(e)  任意で、工程 (d)の後で残る全ての保護基を除去すること、
(f)  得られたペプチドを単離すること及び任意で精製すること。
【請求項２】
請求項1に記載の方法であって、Yは、Fmoc, Boc, Cbz, Npys および Allocからなる群から選択されるオルソゴナルな保護基（但し、Xがアリルオキシである場合、YはAllocではない）である方法。
【請求項３】
請求項1または2に記載の方法であって、nはゼロおよび四の間の整数であり；R1およびR2は独立に水素, メチルまたはエチルである方法。
【請求項４】
請求項1〜3の何れか一項に記載の方法であって、nは一であり；XはNR1R2（式中のR1 および R2 の双方は水素である）であり；YはFmocまたはAllocである方法。
【請求項５】
請求項1〜4の何れか一項に記載の方法であって、工程 (b)のN-末端が保護されたアミノ酸はN-末端が保護されたArgまたはHarである；または工程 (b)のN-末端が保護されたペプチドはArgまたはHarをC-末端残基として含む方法。
【請求項６】
請求項1〜5の何れか一項に記載の方法であって、YはFmocまたはAllocであり、工程(b) および (c)のN-末端が保護されたアミノ酸またはペプチドはFmoc-保護された方法。
【請求項７】
請求項6に記載の方法であって、少なくとも最後に繰り返される工程 (c)のN-末端が保護されたアミノ酸またはペプチドは、Fmocとオルソゴナルな保護基で保護される方法。
【請求項８】
オルソゴナルな保護基がBocである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
請求項1〜8の何れか一項に記載の方法であって、Aは、2-クロロトリチル クロリド ポリスチレン樹脂, ブロモ-(4-メチルフェニル)-メチル ポリスチレン樹脂 および ブロモ-(4-メトキシフェニル)-メチル ポリスチレン樹脂からなる群から選択される活性化され移植されたリンカー樹脂複合体である方法。
【請求項１０】
請求項1〜9の何れか一項に記載の方法であって、工程(f)で得られるペプチドは、Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2である方法。
【請求項１１】
請求項1〜9の何れか一項に記載の方法であって、工程(f)で得られるペプチドは、Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2である方法。
【請求項１２】
請求項1〜9の何れか一項に記載の方法であって、工程(f)で得られるペプチドは、Trp-Arg-Arg-Lys-NH2である方法。
【請求項１３】
以下の式の化合物：
【化１−２】
2010505781.tif 000008
式中のAは固相支持体または固相支持体に移植されたリンカーであり; nはゼロおよび十の間の整数であり; Xは、C1-6 アルコキシ, アリール置換された C1-6 アルコキシ, アリールオキシ, アリルオキシ, 任意で保護されたアミノ酸残基, 任意で保護されたペプチド残基またはNR1R2であり、R1およびR2は独立に水素またはC1-10 アルキルであり;YはAおよびアミノ官能基の結合とオルソゴナルな保護基、または任意でさらに保護されたα-アミノ保護または無保護のアミノ酸またはペプチド残基である。
【請求項１４】
請求項13に記載の化合物であって、Yは、Fmoc, Boc, Cbz, Npys および Allocからなる群から選択されるオルソゴナルな保護基（但し、Xがアリルオキシである場合、YはAllocではない）である化合物。
【請求項１５】
請求項13または14に記載の化合物であって、nはゼロ および 十の間の整数である化合物。
【請求項１６】
請求項13〜15の何れか一項に記載の化合物であって、XはNR1R2であり、R1 および R2は独立に水素またはC1-10 アルキルであり;YはFmoc, Boc, Cbz, NpysまたはAllocである化合物。
【請求項１７】
請求項13〜16の何れか一項に記載の化合物であって、Yはα-アミノ保護または無保護のアミノ酸残基またはY'-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg, Y'-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg, Y'-Trp-Arg-Arg, Y'-Arg-ArgおよびY'-Argからなる群から選択される任意で更に保護されたペプチド残基（配列中のY'は水素または適切な保護基であり、前記アミノ酸残基は任意でその側鎖で適切な保護基で保護される）である化合物。
【請求項１８】
以下の式の化合物：
【化２】
2010505781.tif 000009
式中のnはゼロ および 十の間の整数であり；XはC1-6 アルコキシ, アリール置換された C1-6 アルコキシ, アリールオキシ, アリルオキシまたはNR1R2であり（ここで、R1およびR2は、独立に水素またはC1-10 アルキルである）; Yは、Fmoc, Boc, Cbz, Npys, Alloc, α-アミノ保護または無保護のアミノ酸残基または任意でさらに保護されたペプチド残基である（但し、Xがアリルオキシである場合、YはAllocではない）。
【発明の詳細な説明】
【発明の記載】
【０００１】
本発明は、固相ペプチド合成の分野に関する。特に、保護アミノ酸（例えば、Fmoc-アミノ酸）を固相合成において成長しているペプチドの自由なN-末端に付着させることによってペプチド鎖を構築する方法の改善に関する。
【０００２】
バルキー（bulky）なアミノ酸、特にアルギニン, ホモ-およびノルアルギニンは、他のアミノ酸よりも成長しているペプチド鎖にカップリングさせることが困難であることが知られている。問題は最も一般的に使用されるカップリング試薬で発生し、その問題は付加的な空間的な拘束が樹脂表面で生じるだろう固相合成においてさらにより重要である。一般に、この問題は、標準量よりも多い結合されるアミノ酸またはオリゴペプチド（および特にカップリングサイクルの繰り返し）を用いて克服されると考えられる。もちろん、幾つかの試薬を過剰に用いるアプローチは、価値ある試薬を顕著に消耗する。
【０００３】
Di Bello 等(Semisynth. Pept. Proteins, Pap. Int. Meet. Protein Semisynth., meeting date 1977, "coupling of arginine peptides", 1978, 373-379)は、この問題を標準のN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド (DCC) カップリング化学を用いて試験し、実験データを詳細に検討し、Merrifieldポリスチレン樹脂に付着させる保護された五または九量体のN-末端にジペプチド Z-Phe-Arg-OHまたはBoc-Glu(OBzl)-Arg-OHの何れかをカップリングするための異なるカップリング添加物を試験した。全てのカップリングは、室温で行なわれた。最高の結果はカップリング試薬 DCC および 添加物1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)の混合物を用いて得られ、定量的に産物が生じた。不利な点として、この方法は、N,N-ジメチルホルムアミド中で5:1モル比のジペプチドおよびオリゴマーでのカップリングサイクルの繰り返しを必要とする。
【０００４】
しかしながら、HOBtを使用しても、比較的高いレベルのラセミ化がカルボジイミドカップリング試薬の重大な欠点として残っており、Jiang等（Jiang et al., Tetrahedron 1998, 54, 14233-14254）の総説に記載されたとおり、後にO-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸(HBTU)またはベンゾトリアゾール-1-イルオキシ-トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロリン酸(BOP)系列などの全体的に異なるカップリング試薬の開発が導かれた。
【０００５】
Nishimura等（Nishimura et al., Chem. Pharm. Bull. 1976, 24, 1568-1575）によると、バルキーなアルギニンまたはホモアルギニンのカップリングの問題は、立体配置的な要求性が低いオルニチンをペプチド鎖に結合させる共役すること及び後（即ち、最後のカップリング工程の後、全体的な脱保護の前）に該オルニチンをグアニジン化（guanidation）でアルギニンに変換することなどによって解決できる。
【０００６】
不利な点として、このアプローチには、不純物のレベルが上昇する付加的な化学反応工程が関与する。別のネガティブな影響は、挑戦的な保護の戦略が必要であることである（というのも、オルニチンは、引き続くグアニジン化に必要な特異的に切断することができるオルソゴナルな保護基によりブロックされなければならないからである）。最終的に、グアニジン化は、樹脂からの切断の後に行われる。しかしながら、伝統的なポリスチレンベースの樹脂（例えば、Wang樹脂またはRink樹脂）は通常厳格な切断条件を必要とし、ペプチドの望まれない部分的な又は完全な脱保護へと導かれる。
【０００７】
結果的に、そのような挑戦的な配列モチーフを含んでいるペプチドを商業スケールで達成しえるバルキーなアミノ酸をリジン残基又はそのホモログと結合する方法が非常に必要とされている。所望のペプチドの一つは、抗感染性な、抗菌および抗細菌性の活性を示す陽イオン性の「インドリシジン（indolicidin）」Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2である。通常、このような陽イオン性（抗感染性のペプチド）は、C-末端がアミド化された形態でさらに活性である。US-A1-2003/0219854は、病原性微生物に対抗する標準の抗生物質に対する多剤耐性の急速な伝播との戦いを援助するだろう広域スペクトルの抗菌物質の新しいクラスとしてのインドリシジン及びその更なる誘導体を開示している。二つのアルギニン残基を続いて最初のリジンに共役させなければならないインドリシジンの配列によって、許容されるカップリング収率を達成するための現実的な挑戦が提示される。
【０００８】
特にアルギニン又はそのホモログを立体的に同等に要求されるリジンまたはリジンホモログにカップリングする場合に、固相ペプチド合成におけるアルギニン残基等でのカップリング問題を克服するための方法を発明することが本発明の課題である。本発明によると、低いカップリング効率の問題は、驚くことに側鎖をアンカーする戦略を適用することによって解決される。本発明によって、カップリング収率が非常に改善され、固相合成における望まれない早期の鎖の終結が回避される。
【０００９】
上記の課題は、請求項1に記載の方法によって達成された。請求項1に記載の方法を適用する際に誘導された化合物も、本発明の課題である。  
出願人は、次の式の化合物から開始するペプチド合成のための方法を見出した：
【００１０】
【化１−１】
2010505781.tif 000002
【００１１】
式中で
Aは、固相支持体または固相支持体に移植されたリンカーであり；
nは、ゼロおよび十の間の整数であり；
Xは、C1-6のアルコキシ, アリール-置換されたC1-6のアルコキシ, アリールオキシ, アリルオキシ, 任意で保護アミノ酸残基, 任意で保護ペプチド残基またはNR1R2であり（ここで、R1およびR2は、独立に水素またはC1-10 アルキルである）；および
Yは、Aおよびアミノ官能基の間の結合にオルソゴナル（orthogonal）である保護基であり；および
該方法は次の工程を含んでいる、
(a)  Ｎ末端のα-アミノ官能基（α-amino function）を脱保護すること、
(b)  少なくとも自由な又は活性化したカルボン酸官能基（carboxylic acid function）を有しているN-末端が保護されたアミノ酸またはペプチドを、工程 (a)の脱保護されたα-アミノ官能基とカップリングし、式 Iの化合物を伸長すること、
(c)  任意で、少なくとも一度工程(a) および (b)を繰り返すこと〔ここで、少なくともN-末端が保護されたアミノ酸またはペプチドは、先行する工程 (b)のものと同一である又は異なる〕、
(d)  生じるペプチドをAから切断すること、
(e)  任意で、工程 (d)の後で残る全ての保護基を除去すること、
(f)  得られたペプチドを単離すること及び任意で精製すること。
【００１２】
以下の「C1-n アルキル」の用語は、1〜nの炭素原子を含んでいる任意の直鎖状または分枝状アルキル基を意味することが理解される。例えば、「C1-6 アルキル」の用語は、例えば、メチル, エチル, プロピル, イソプロピル, ブチル, イソブチル, sec-ブチル, tert-ブチル, ペンチル, イソペンチル (3-メチルブチル), ネオペンチル(2,2-ジメチルプロピル), ヘキシル, イソヘキシル(4-メチルペンチル)などの基を含む。  
従って、「C1-n アルコキシ」の用語は、単一の共有結合で連結された上記で規定されたC1-n アルキル基および酸素原子から構成される基を意味する。
【００１３】
「アリール置換されたC1-n アルキル（aryl-substituted C1-n alkyl）」の用語は、直鎖状または分枝状の炭素鎖の任意のポジションで、少なくとも一つのフェニル基で置換される上記で規定されたC1-n アルキル基から構成される基を意味することが理解される。フェニル基は、任意でヒドロキシル, C1-2 アルコキシ および ハロゲンからなる群から選択される少なくとも一置換基で置換されてもよい。アリール置換された C1-n アルキル基の例は、ベンジル, 1-(3-ヒドロキシフェニル)プロパン-2-イルまたは1-(3-メトキシフェニル)プロパン-2-イルである。
【００１４】
以下、「アリルオキシ（allyloxy）」の用語は、任意でC1-3 アルキルまたはハロゲンで置換されえるアリル基を意味することが理解される。  
本発明の方法の好適な態様において、式 Iの化合物のYは、Fmoc, Boc, Cbz, Npys および Allocからなる群から選択されるオルソゴナルな保護基である（但し、Xがアリルオキシである場合、YはAllocではない）。
【００１５】
以下、「Fmoc」はフルオレン-9-イルメトキシカルボニルの略語, 「Boc」はtert-ブチルオキシカルボニルの略語, 「Cbz」はベンジルオキシカルボニルの略語, 「Npys」は3-ニトロ-2-ピリデンスルフェニルの略語および「Alloc」はアリルオキシカルボニルの略語である。
【００１６】
以下、二つの異なる保護基に関する「オルソゴナル（orthogonal）」の用語は、一の保護基が除去可能であり、他の保護基が同じ反応条件下で安定なままであることを意味すると理解される。
【００１７】
従って、保護基およびリジン側鎖又はそのホモログのアミノ官能基および固相支持体または固相支持体Aに移植されたリンカーの間の結合に関する「オルソゴナル」の用語は、保護基が除去可能であり、前記結合が同じ反応条件下で安定なままであることを意味すると理解される。
【００１８】
本発明によるペプチドは、任意の天然または非天然のアミノ酸およびキラルの場合にそのLまたはD型で又はラセミ体として含んでいるペプチドであってもよい。非天然のアミノ酸の例は、ホモシステイン, ホモアルギニン, シクロヘキシルアラニン, ペニシリンアミド (Pen)またはオルニチン (Orn)である。
【００１９】
「ペプチドバックボーン（peptide backbone）」、「主鎖（main chain）」、「側鎖（side chain）」および、接頭語「ノル（nor）」および、「ホモ（homo）」の用語は、本発明においてIUPAC-IUBの定義（Joint IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, "Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides", Pure Appl. Chem. 1984, 56, 595-624）と一致すると解釈される。
【００２０】
広い意味で、「ホモ」は、リジン側鎖に直鎖状（linear）に添加される九つまでの追加的なメチレン基を意味すると理解される。狭い意味および好適な意味で、「ホモ」は、前記側鎖におけるちょうど一つの追加的なメチレン基に対応する。「ノル」は、常に本発明において一の量で断続的（intermittent）なメチレン基が天然のε-リジンの側鎖から排除されることと解釈される。
【００２１】
本発明において、アミノ酸側鎖の「ω-アミノ基」は、炭素鎖長と無関係に側鎖の「末端（terminal）」アミノ基を意味すると理解される。
【００２２】
本発明の方法の好適な態様において、式 Iの化合物のnはゼロ, 一, 二, 三, 四, 五, 六, 七 八, 九, 十であり; 好ましくはnはゼロ, 一, 二, 三, 四であり; そのアミノ側鎖（amino side chain）をとおしてアンカーされるアミノ酸残基はε-リジル, ω-ホモリシル（ω-homolysyl）またはω-ノルリシル（ω-homolysyl）である。
【００２３】
本発明の方法の好適な態様において、式 Iの化合物のR1およびR2は、独立に水素, メチル, エチル, プロピルおよびブチル; 好ましくは 水素, メチルおよびエチル;および最も好ましくは水素である。
【００２４】
好適な態様において、工程 (b)のN-末端が保護されたアミノ酸は、N-末端が保護されたアルギニン(Arg)またはホモアルギニン(Har)である。好適な態様において、工程 (b)のN-末端が保護されたペプチドは、Ｃ末端残基としてArgまたはHarを含む。
【００２５】
ArgまたはHarのグアニジノ基は、保護または無保護であってもよい。当業者に知られている任意の種類の適切なグアニジノ保護基を使用してもよく、例えば、Cbz, 2,3,6-トリメチル-4-メトキシベンゼンスルホニル (Mtr), ニトロ, トシル, 5-スルホニル-2,2,4,6,7-ペンタメチルベンゾフラン (Pbf), 2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル (Pmc), アダマンチルオキシカルボニル, tert-ブチルオキシカルボニル(Boc)またはトリチル(Trt)を使用してもよい。
【００２６】
より好適な態様において、ArgまたはHar側鎖は、Pbfで保護される。
【００２７】
本発明によると、ArgまたはHarを（好ましくはFmoc-ArgまたはFmoc-Harとして使用される際に）共有結合性に付着したグアニジノ保護基なしで、非共有結合性の保護化学を適用して、カップリングすることは別の好適な態様である。これは次の反応を確かに行なうことによって達成される：  つまり、個々のArgまたはHar残基のカップリング後にグアニジノ基が任意の更なるカップリング反応の前に定量的にプロトン化され、有機溶媒においてプロトンドナーと安定なイオン対が形成されることである。実施において、樹脂結合したペプチドは、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt), ベンゾトリアジン誘導体またはアザベンゾトリアジンなどの酸性カップリング添加物で過剰に処理されてもよく、芳香族コア（aromatic core）で更に置換されてもよい。グアニジウム基の電荷を除去する別の可能性は、US 4,954,616に記載されたようにテトラフェニルボラートを対イオンとしてプロトン化されたFmoc-保護Harなどに使用することである。
【００２８】
固相合成において、アミノ酸側鎖における殆どの又は好ましくは全ての官能基が、ペプチド鎖を組立てる間に用いられる反応条件によって影響されない永続的な保護基でマスクされなければならないことは当該技術で周知である。カップリングする各アミノ酸のα-アミノ基は、好ましくは側鎖の保護基にオルソゴナルである保護基で一時的に保護され〔側鎖の保護基と同じデブロッキング化学（deblocking chemistry）を用いて除去できる最後にカップリングするアミノ酸を除く〕。本発明に記載される最初のアミノ酸の側鎖の固着後、一時的なα-アミノ保護基が除去される。
【００２９】
当該技術分野において既知の全ての適切な保護基は、本発明の工程(b) および (c)に使用されるアミノ酸またはペプチドの側鎖官能基およびα-アミノ基の双方を保護するために使用されえる。適切な保護基には、フルオレン-9-イルメトキシカルボニル (Fmoc), ベンジルオキシカルボニル (Cbz), tert-ブチルオキシカルボニル (Boc), 2-(4-ビフェニリル)-イソプロピルオキシカルボニル (Bpoc), アセトアミドメチル (Acm), アセチル (Ac), アリル (All), アリルオキシカルボニル (Alloc), ベンゾイル (Bz), ベンジル (Bzl), 3-カルボキシプロパノイル (Suc), 5-スルホニル-2,2,4,6,7-ペンタメチルベンゾフラン (Pbf) および トリチル (Trt)が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明の方法の好適な態様において、式 Iの化合物のYはFmocであり、工程(b)および (c)のN-末端が保護されたアミノ酸またはペプチドはFmoc保護される、但し最後に繰り返される工程 (c)のN-末端が保護されたアミノ酸またはペプチドを除く、これはFmocにオルソゴナルな保護基（好ましくはBoc）で保護される。
【００３１】
本発明の方法の好適な態様において、式 Iの化合物のYはAllocであり、工程(b)および (c)のN-末端が保護されたアミノ酸またはペプチドはFmoc保護される、但し最後に繰り返される工程 (c)のN-末端が保護されたアミノ酸またはペプチドを除く、これはFmocにオルソゴナルな保護基（好ましくはBoc）で保護される。
【００３２】
カップリング試薬, カップリング添加物および非プロトン性の, 極性の溶媒（例えば、ジメチルホルムアミドまたはN-メチルピロリドン,又はその混合物）は、当該技術分野において周知であり、Bodanszky（Bodanszky , "Principles of Peptide Synthesis", 2nd ed., Springer Verlag, 1993）などに記載されている。カップリング試薬の例は、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC), 1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド (DCC), N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド (EDC), ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸 (PyBOB), O-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム テトラフルオロボラート (HBTU) および O-(1H-6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム テトラフルオロボラート (TCTU)である。カップリング添加物の例は、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt), 6-クロロ-N-ヒドロキシベンゾトリアゾール (6-クロロ-HOBt), N-ヒドロキシスクシンイミド および N-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン (HOOBt)である。
【００３３】
DICまたはTCTUをカップリング試薬として、HOBtまたは6-クロロ-HOBtをカップリング添加物として適用することが好適である。
【００３４】
本発明によると、工程 (b) および (c)に使用される各アミノ酸またはペプチドの量は、1 および 3の間の均等な量である。好ましくは、N-末端が保護された ArgまたはHarは、1.5 および 2.5の間の均等な量で使用される。
【００３５】
固相支持体は、任意の一般に用いられる固相樹脂、好ましくは活性化ハロゲン, ヒドロキシまたはカルボキシル官能化樹脂（functionalized resin）または移植されたリンカー樹脂複合体の活性化誘導体であってもよい。樹脂のポリマーマトリックスは、例えば、ポリスチレン, ポリエチレングリコール (PEG), クロスリンクしたPEG, ポリアミド, ポリビニルアルコール(PVA) またはポリオキシアルキレンであってもよい。また、純粋な又は混合性の樹脂でもよく、これには内側ポリスチレンマトリックスに移植されたブロック-コポリマーまたは移植された樹脂、例えば、PEG樹脂に移植されたPVA, PEG移植したポリスチレン-ジビニルベンゼン(PS-DVB)樹脂, ポリオキシエチレン樹脂が含まれる（ここで、カップリングのための官能性を持たせた官能基は、ポリオキシエチレン分枝に暴露される）。
【００３６】
通常の例は、2-クロロトリチル クロリド ポリスチレン (2-CTC) 樹脂, ブロモ-(4-メチルフェニル)-メチル ポリスチレン 樹脂, ブロモ-(4-メトキシフェニル)-メチル ポリスチレン 樹脂, Merrifield樹脂またはWang樹脂である。
【００３７】
本発明の好適な態様において、Aは、2-クロロトリチル クロリド ポリスチレン樹脂, ブロモ-(4-メチルフェニル)-メチル ポリスチレン樹脂, ブロモ-(4-メトキシフェニル)-メチル ポリスチレン樹脂および活性化ヒドロキシ-(4-メチルフェニル)-メチル ポリスチレン樹脂からなる群から選択される活性化され移植されたリンカー樹脂複合体から形成される。
【００３８】
好適な態様において、本発明の方法によって得られるペプチドは、Trp-Arg-Arg-Lys-NH2, Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2またはIle-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2である。  
本発明の別の課題は、以下の式の化合物を提供することである：
【００３９】
【化１−２】
2010505781.tif 000003
【００４０】
式中のAは固相支持体または固相支持体に移植されたリンカーであり; nはゼロおよび十の間の整数であり; Xは、C1-6 アルコキシ, アリール置換された C1-6 アルコキシ, アリールオキシ（aryloxy）, アリルオキシ, 任意で保護されたアミノ酸残基, 任意で保護されたペプチド残基またはNR1R2であり（ここで、R1およびR2は、独立に水素またはC1-10 アルキルである）；およびYはAおよびアミノ官能基の結合とオルソゴナルな保護基、または任意でさらに保護されたα-アミノ保護または無保護のアミノ酸またはペプチド残基（an optionally further protected α-amino protected or unprotected amino acid or peptide residue）である。
【００４１】
式 Iの化合物は、本発明の方法の中間体（intermediate）として有用である。  
好適な態様において、式 Iの化合物のYは、Fmoc, Boc, Cbz, Npys および Allocからなる群から選択されるオルソゴナルな保護基である（但し、Xがアリルオキシである場合、YはAllocではない）。  
好適なものは、式 Iの化合物であって、式中のnがゼロ および 十の間の整数の化合物である。  
好適な態様において、式 Iの化合物のXはNR1R2であり、R1 および R2は独立に水素またはC1-10 アルキルであり; Yは、Fmoc, Boc, Cbz, NpysまたはAllocである。  
更なる好適な態様は式 Iの化合物であって、式中のYはα-アミノ保護または無保護のアミノ酸残基またはY'-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg, Y'-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg, Y'-Trp-Arg-Arg, Y'-Arg-ArgおよびY'-Argからなる群から選択される任意で更に保護されたペプチド残基である（式中のY'は、水素または適切な保護基であり、前記アミノ酸残基は任意で彼らの側鎖で適切な保護基で保護される）化合物である。  
本発明の別の課題は、以下の式の化合物である：
【００４２】
【化２】
2010505781.tif 000004
【００４３】
式中のnはゼロ および 十の間の整数であり；XはC1-6 アルコキシ, アリール置換された C1-6 アルコキシ, アリールオキシ, アリルオキシまたはNR1R2であり（ここで、R1およびR2は、独立に水素またはC1-10 アルキルである）; Yは、Fmoc, Boc, Cbz, Npys, Alloc, α-アミノ保護または無保護のアミノ酸残基または任意でさらに保護されたペプチド残基である；但し、Xがアリルオキシである場合、YはAllocではない。
【００４４】
実  験
次の例によって、さらに本発明が説明されるが、本発明を限定するものではない。
【００４５】
例 1:  Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2の固相合成
例 1に使用される全てのアミノ酸は、L型であった。33 gのH-Lys(Boc)-NH2 (ジェンザイムから)を、Fmoc-Lys(Boc)-NH2へとジオキサン/水 (1:1)中でFmoc-クロリドおよび10% Na2CO3と反応させることによって転換した。次に、側鎖保護のBoc基を、周囲温度で50% トリフルオロ酢酸 (TFA)でジクロロメタン中で除去した。メチルtert-ブチルエーテルの付加後、Fmoc-Lys-NH2をTFA塩として沈殿させた。前記塩を、回収し、水性の塩基性の媒体に溶解し、抽出し、有機相に溶解させた塩が遊離したFmoc-Lys-NH2をえた。
【００４６】
30 gの2-クロロトリチル クロリド ポリスチレン樹脂(CBL-Patrasから)を、先行する抽出の有機相に添加し、有機塩基（好ましくは、ジイソプロピルエチルアミン）の存在下で撹拌した。εアミノ基と樹脂との反応後、ローディングは約 0.50 mmol/gであり、以下の式の化合物が産出された：
【００４７】
【化３】
2010505781.tif 000005
【００４８】
次に、式 IIIの化合物を、20% ピペリジンと反応させることによって脱保護した。Fmoc-Arg(Pbf)-OHの2 均等物, HOBtの1 均等物およびジイソプロピルカルボジイミドの1 均等物の混合物を、N-メチルピロリドン中で調製し、脱保護したアミノ酸樹脂に添加した。60 および 90 分間の期間で周囲温度でカップリングした後に、>99%のカップリング効率がさらに手順を反復することなく達成された。
【００４９】
ジペプチド樹脂をN-メチルピロリドンで洗浄し、さらにアミノ酸を周囲温度でそれぞれのFmoc-アミノ酸（Boc-Ile-OHである最後のアミノ酸は例外）の2 均等物を用いて、ジクロロメタン中で6-クロロ-HOBt, TCTU および ジイソプロピルエチルアミンの1 均等物の存在下で30-60 分間のカップリング時間で連続的に組み立てた。洗浄をN-メチルピロリドンで行った。各カップリング工程を、一度のみ行った（即ち、個々のカップリング工程の反復が生じない）。最後のアミノ酸のカップリング後、ペプチド樹脂Boc-Ile-Leu-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Pro-Trp(Boc)-Trp(Boc)-Pro-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Lys(固相)-NH2が得られ、これはTFA 60%, チオアニソール 5%, フェノール 5%, トリイソプロピルシラン(TIS) 1%, ジチオスレイトール(DTT) 2.5%, 水 5% および ジクロロメタン 21.5%の混合物で処理され、脱保護され、樹脂から除去されて、28.2 gの粗製のIle-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2が白色固形物として産生された(MSで構造を確認)。
【００５０】
例 2:  Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2の固相合成
例 3に使用される全てのアミノ酸は、L型であった。54 gのH-Lys(Boc)-NH2 x HCl(ジェンザイムから)を、Alloc-Lys(Boc)-NH2へとジオキサン中でAlloc-OSu(アリルオキシカルボニルオキシスクシンイミド)およびトリエチルアミンと反応させることによって転換した。次に、側鎖保護のBoc基を、0 °Cで塩化水素ガスでジクロロメタン中で除去した。反応後、Alloc-Lys-NH2を、HCl 塩として沈殿させた。それを濾過し、ジクロロメタンで洗浄した。
【００５１】
50 gのブロモ-(4-メチルフェニル)-メチル ポリスチレン樹脂 (CBL-Patrasから) および 31.7 gのAlloc-Lys-NH2 x HClを、温度を上昇させてN-メチルピロリドン中でジイソプロピルエチルアミンの存在下でカップリングした。εアミノ基と樹脂との反応後、ローディングは約 0.55 mmol/gであり、以下の式の化合物が産出された：
【００５２】
【化４】
2010505781.tif 000006
【００５３】
次に、式 IVの化合物を、N,N-ジメチルホルムアミド中で、p-トルエンスルフィナートナトリウムの存在下でPd[PPh3]4で処理することによって脱保護した。さらなる工程を、例 1と同様に行った（但し、各カップリング工程に対してN-メチルピロリドン中で、HOBtの1 均等物およびジイソプロピルカルボジイミドの1 均等物からなるカップリング混合物を用いる）。産物:  41.3 gのIle-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(構造をMSで確認)。
【００５４】
例 1と同様、Fmoc-Arg(Pbf)を、式 IVの脱保護されたアミノ酸樹脂と一つのカップリング工程のみで>99%の効率で連結した。
【００５５】
比較例 C1:  Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2の固相合成
例 1の手順を繰り返した（但し、最初のアミノ酸残基は、伝統的にC-末端を介して樹脂にアンカーされ、Fmoc-Lys(Boc)-固相が提供される）。Fmoc-Arg(Pbf)との続くカップリングは、十分に長いカップリング時間(8時間)および少なくとも二回のサイクルごとにFmoc-Arg(Pbf)の4 均等物でのカップリング工程の反復が必要とされる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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