(57)【要約】【課題】ボツリヌス毒素の安定性が改善された薬学的液状組成物が開示される。【解決手段】本発明の薬学的液状組成物は、ボツリヌス毒素、ポリソルベート２０、およびメチオニンを含み、任意でイソロイシンを含んでなる。本発明の薬学的液状組成物は、ボツリヌス毒素の安定化剤として、動物由来のタンパク質であるアルブミンまたはゼラチンの代わりにメチオニンまたはメチオニンとイソロイシンの組み合わせからなるアミノ酸を使用し、界面活性剤としてポリソルベート２０を使用するため、ボツリヌス毒素薬剤学的組成物の投与を受ける患者が血液由来病原菌または伝染性微生物に感染する潜在的な危険性を減らすことができ、人体に対する安全性を増大させることができる。また、本発明の薬学的液状組成物は、液状形態であるため、患者に注射剤として投与する場合に使用者が便利に使用することができる。しかも、本発明の薬学的液状組成物は、界面活性剤またはアミノ酸のみを単独で使用する場合より液状状態における保管安定性が著しく、冷蔵条件だけでなく２５〜３７℃の室温でも長期間ボツリヌス毒素の活性が維持されるので、冷蔵条件を維持することができない非常時でも保存安定性を持つことができる。本発明の薬学的液状組成物は、界面活性剤とアミノ酸の組成を用いてボツリヌス毒素を安定化させるので、凍結乾燥過程なしで容易に製造できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリヌス毒素、ポリソルベート２０、およびメチオニンを含む薬学的液状組成物。
【請求項２】
前記メチオニンが、ボツリヌス毒素１００ユニット当り０．５〜１００μｍｏＬ存在する、請求項１に記載の薬学的液状組成物。
【請求項３】
前記メチオニンの濃度は０．５〜１００ｍＭの範囲である、請求項２に記載の薬学的液状組成物。
【請求項４】
前記メチオニンの濃度は２５〜７５ｍＭである、請求項３に記載の薬学的液状組成物。
【請求項５】
前記ポリソルベート２０が、ボツリヌス毒素１００ユニット当り０．０１〜５０ｍｇ存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬学的液状組成物。
【請求項６】
前記ポリソルベート２０の濃度は０．０１〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲である、請求項５に記載の薬学的液状組成物。
【請求項７】
前記ポリソルベート２０の濃度は０．１〜２．５ｍｇ／ｍＬの範囲である、請求項６に記載の薬学的液状組成物。
【請求項８】
前記ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧよりなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬学的液状組成物。
【請求項９】
前記ボツリヌス毒素は複合体化タンパク質を含有しない形態、または複合体化タンパク質を含有する複合体形態である、請求項８に記載の薬学的液状組成物。
【請求項１０】
前記薬剤学的組成物のｐＨは５．５〜７．０の範囲である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬学的液状組成物。
【請求項１１】
前記薬学的液状組成物はイソロイシンをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬学的液状組成物。
【請求項１２】
前記ボツリヌス毒素の濃度は５０〜５，０００ユニット／ｍＬである、請求項１または２に記載の薬学的液状組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、より安定なボツリヌス毒素の薬学的液状組成物に係り、より詳しくは、ボツリヌス毒素、ポリソルベート２０、およびメチオニンを含み、任意でイソロイシンを含んでなる薬学的液状組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ボツリヌス毒素は、バクテリア類のボツリヌス菌(Clostridium botulinum)によって生成される神経毒タンパク質である。この毒素は、神経筋接合部で神経伝達物質アセチルコリンのシナプス前放出を遮断することにより、哺乳類に筋肉の弛緩性麻痺を引き起こす。この毒素は、最近、斜視、特発性眼瞼けいれん、および片側顔面けいれんの治療に効果的であることが証明された。また、この毒素は、例えば痙性斜頸、顎口腔ジストニアおよびけいれん性発声困難などの不随意筋運動障害を緩和させることが証明された。また、ボツリヌス毒素は、顔面上の中度から重度の皺の一時的な改善のために、および多汗症（過多発汗）の非外科的治療のために使用できるようにＦＤＡの許可を受けている。
【０００３】
現在、ボツリヌス毒素タンパク質のうち、血清型(serotype)ＡとＢは、眼瞼けいれん、斜頸、多汗症などの治療だけでなく、顔面の皺除去のための用途として薬剤化がなされているが、このようなボツリヌス毒素などのタンパク質製剤の場合、薬剤化過程に多くの問題点が発生する。これはタンパク質の不安定性に起因し、例えばボツリヌス毒素のように、極めて低い濃度で薬剤化がなされているタンパク質製剤の場合、その問題が深刻である。
【０００４】
ボツリヌス毒素タンパク質は、固体の表面に接着する特性を持つので、容器に注入される場合、タンパク質の一部が容器の内壁に接着して活性成分の損失をもたらす。また、タンパク質は容易に酸化し或いは小さい断片に分解され得るので、これを防止することが可能な物質として安定化剤を添加する必要がある。
【０００５】
ボツリヌス毒素タンパク質の薬剤化過程において、安定化剤として主にアルブミンが多く用いられる。アルブミンは、薬剤学的組成物においてタンパク質活性成分を安定化することができるうえ、ヒト患者に注射される場合、免疫原性が無視できる程度であるという利点がある。ところが、アルブミンなどの血液製品は、患者が血液由来病原菌または伝染性微生物に感染する潜在的な危険性をもたらすおそれがあり、特にウイルス性疾患またはクロイツフェルトヤコブ病などの疾病の媒介を完全に排除することができない。
【０００６】
アルブミンを代替するためにゼラチンを用いる場合もある。ところが、このゼラチンは動物から得られるタンパク質なので、アルブミンと同様に疾病を媒介するおそれがあって、薬剤化過程で使用しないことが勧められる。
【０００７】
ボツリヌス毒素タンパク質の薬剤化過程において、動物源に由来しない安定化剤を用いる技術として、特許文献１（韓国登録特許公報第１０−０７９９４００号）には、酵母から生産される組み換えアルブミン（ｒＳＡ）を薬剤化に用いる方法が開示されているが、この方法は、組み換えアルブミン（ｒＳＡ）の生産および分離回収過程で新規の抗原性構造のネオエピトープ(Neoepitope)が発生して薬剤の受容者に免疫反応を誘発する可能性を完全に排除することができない。また、特許文献２（韓国登録特許公報第１０−０６６５４６９号）には、ボツリヌス毒素、多糖類（ヒドロキシエチル澱粉を含む）、および例えばリシン、グリシン、ヒスチジンまたはアルギニンなどのアミノ酸を含む薬剤学的組成物が開示されている。ところが、前記特許の薬剤学的組成物は、凍結乾燥形態の剤形のための組成物であり、保管条件も冷凍または冷蔵に限定されている。凍結乾燥形態のボツリヌス毒素は、使用直前に、凍結した剤形を溶解または希釈する過程が必要であり、この過程で誤差が発生するおそれがある。しかも、凍結乾燥形態のボツリヌス毒素は、使用上の不便さを伴い、プレフィルドシリンジ形態(pre-filled syringe type)に開発することが不可能であるという問題点が存在する。
【０００８】
一方、ボツリヌス毒素を安定化させるための組成物に関連し、特許文献３（米国公開特許公報第２００７−０１３４１９９号）には、好ましくは、ポリソルベートを含む非イオン性界面活性剤、およびグルタミンとグルタミン酸の組み合わせ或いはアスパラギンとアスパラギン酸の組み合わせを含んでなる組成物が開示されている。前記特許の希釈ボツリヌス毒素を含む液状組成物を冷蔵条件の４℃で保管する場合には８ヶ月が経っても安定していたが、室温の３７℃で保管する場合には１ヶ月以内に活性が減少する結果を示すため、室温でボツリヌス毒素を含む薬学的液状組成物を安定化させるには限界がある。これは本発明者らの見解によれば、液状組成物に使用されるアミノ酸が全て極性を帯びており、特にグルタミン酸とアスパラギン酸は酸性を帯びているためであると判断される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国登録特許公報第１０−０７９９４００号
【特許文献２】韓国登録特許公報第１０−０６６５４６９号
【特許文献３】米国公開特許公報第２００７−０１３４１９９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明は、上述した従来の技術の問題点を解決するためのもので、その目的は、冷蔵条件でだけでなく室温でも長時間保管するときにボツリヌス毒素の活性を維持すると同時に、使用上の不便さを解消するための製剤形態として、凍結乾燥形態ではなく液状形態の組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、ボツリヌス毒素の安定化剤として、アルブミンまたはゼラチンなどの動物由来のタンパク質を使用せず、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸などの極性または酸性のアミノ酸を含有しないうえ、冷蔵および室温の保管条件でボツリヌス毒素の安定性が改善された薬学的液状組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明者は、多くの界面活性剤およびアミノ酸で、鋭意徹底的に研究し、ボツリヌス毒素の安定化のために室温におけるボツリヌス毒素薬剤学的組成物の安定性実験を行ったところ、界面活性剤中のポリソルベート２０およびアミノ酸中のメチオニンまたはメチオニンとイソロイシンを同時に含む液状組成物がボツリヌス毒素の安定性を改善させることに優れた効果があることを確認し、本発明を完成した。
【００１３】
本発明のある観点によれば、ボツリヌス毒素、ポリソルベート２０、およびメチオニンを含んでなる薬学的液状組成物を提供する。
【００１４】
本発明の他の観点によれば、ボツリヌス毒素、ポリソルベート２０、メチオニン、およびイソロイシンを含んでなる薬学的液状組成物を提供する。
【００１５】
本発明の薬学的液状組成物は、メチオニンの含量がボツリヌス毒素１００ユニット当たり０．５〜１００μｍｏＬであり、好ましくはメチオニンの濃度が０．５〜１００ｍＭであり、さらに好ましくはメチオニンの濃度が２５〜７５ｍＭである。
【００１６】
本発明の薬学的液状組成物は、ポリソルベート２０の含量がボツリヌス毒素１００ユニット当り０．０１〜５０ｍｇであり、好ましくはポリソルベート２０の濃度が０．０１〜５０ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくはポリソルベート２０の濃度が０．１〜２．５ｍｇ／ｍＬである。
【００１７】
本発明の薬学的液状組成物は、ボツリヌス毒素が血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧよりなる群から選択されることを特徴とし、複合体化タンパク質を含有しない形態または複合体化タンパク質を含有する複合体形態を全て含むことができる。ボツリヌス毒素の濃度は、５０〜５，０００ユニット／ｍＬであることが好ましい。
【００１８】
本発明の薬学的液状組成物は、ｐＨが５．５〜７．０であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の薬学的液状組成物は、ボツリヌス毒性の安定化剤として、動物由来のタンパク質であるアルブミンまたはゼラチンの代わりに、ポリソルベート２０およびメチオニンまたはメチオニンとイソロイシンとの組み合わせを使用するため、ボツリヌス毒素薬剤学的組成物の投与を受ける患者が血清由来病原菌または微生物に感染する危険性を減らすことができ、安全に投与することができる。
【００２０】
また、本発明の薬学的液状組成物は、液状形態であるため、患者に注射剤として投与するために便利に使用することができる。しかも、本発明の薬学的液状組成物は、界面活性剤またはアミノ酸のみを単独で使用する場合より液状状態での保管安定性が著しく、冷蔵条件でだけでなく２５〜３７℃の室温でも長期間ボツリヌス毒素の活性が維持されるので、冷蔵条件を維持することができない非常時でも保存安定性を持つことができるという利点がある。
【００２１】
また、本発明の薬学的液状組成物は、界面活性剤とアミノ酸の組成を用いて凍結乾燥なしでボツリヌス毒素を安定化させるので、容易に製造できる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ボツリヌス毒素の安定性が改善された薬学的液状組成物を提供する。特に、薬学的液状組成物は、ボツリヌス毒素、ポリソルベート２０およびメチオニンを含み、任意でイソロイシンを含んでなる。
【００２３】
ボツリヌス毒素を含む薬学的液状組成物は、ボツリヌス毒素、ポリソルベート２０、およびメチオニンを含んでなり、或いはボツリヌス毒素、ポリソルベート２０、メチオニンおよびイソロイシンを含んでなる。
【００２４】
本発明では、ボツリヌス毒素の安定化剤として、アルブミンまたはゼラチンなどの動物由来タンパク質を使用せず、ポリソルベート２０、メチオニンまたはイソロイシンを使用するため、ボツリヌス毒素薬剤学的組成物の投与を受ける患者が血液由来病院菌または伝染性微生物に感染する潜在的な危険性を減らすことができ、人体に対する安全性を増大させることができる。また、本発明は、ボツリヌス毒素の安定化剤としてポリソルベート２０およびメチオニンの組み合わせ、或いはポリソルベート２０、メチオニンおよびイソロイシンの組み合わせを使用するため、界面活性剤またはアミノ酸のみを単独で使用する場合より２５〜２７℃の室温条件でボツリヌス毒素の活性をより安定的に維持させることができる。
【００２５】
本発明の薬学的液状組成物の一構成要素であるボツリヌス毒素は、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧよりなる群から任意で選択できる。ボツリヌス毒素は、嫌気性バクテリアのClostridium botulinumにより産生される毒素のファミリーを含み、免疫学的な区別法によって血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧに区別でき、それぞれの血清型に応じて、作用する動物種および麻痺の程度、持続時間などが異なるものと知られている。また、全ての血清型のボツリヌス毒素は、神経筋接合部で信号伝達物質アセチルコリンの分泌を阻害することにより、神経麻痺効果を発生するものと知られている。
【００２６】
本発明の薬学的液状組成物において、ボツリヌス毒素は、複合体化タンパク質を含有しない形態、または複合体化タンパク質を含有する複合体形態を全て含むことができる。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)に由来するボツリヌス毒素タンパク質のみの分子量は約１５０ＫＤａである。しかし、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)バクテリアによって毒素タンパク質が生産されるとき、ボツリヌス毒素タンパク質は、ボツリヌス毒素タンパク質の作用を補助および保護する多様なヘマグルチニン(Hemagglutinin)タンパク質および非ヘマグルチニンタンパク質と多様な複合体を形成することにより生産される。自然に形成するボツリヌス毒素血清型Ａは約９００ｋＤａ、５００ｋＤａまたは３００ｋＤａの分子量を有し、血清型ＢとＣは約５００ｋＤａの分子量を有する複合体形態であり、血清型Ｄは約３００ｋＤａまたは５００ｋＤａの分子量を有する複合体形態であり、血清型ＥとＦは約３００ｋＤａの分子量を有する複合体形態である。
【００２７】
本発明の薬学的液状組成物において、ボツリヌス毒素の濃度は大きく制限されないが、ボツリヌス毒素の一般な用途と通常の使用量を考慮するとき、５０〜５，０００ユニット／ｍＬであることが好ましい。
【００２８】
本発明の薬学的液状組成物の一構成要素であるメチオニンは、その含量がボツリヌス毒素１００ユニット当り０．５〜１００μｍｏＬであることを特徴とし、好ましくはメチオニンの濃度が０．５〜１００ｍＭであり、さらに好ましくはメチオニンの濃度が２５〜７５ｍＭであることを特徴とする。
【００２９】
ボツリヌス毒素１ユニットは、体重１８〜２０ｇの雌ＳＷマウス(Swiss Webster Mice)に腹腔内注射を行ったときのＬＤ５０と定義することができる。マウスにおいて、ボツリヌス毒素ＡのＬＤ５０は約５０ピコグラムである。
【００３０】
本発明の薬学的液状組成物において、メチオニン含量がボツリヌス毒素１００ユニット当り０．５μｍｏＬ未満であれば、室温で長期間保管するときにメチオニンによるボツリヌス毒素の安定化効果が所望の水準を達成できず、一方、１００μｍｏｌ超過であれば、超過による上昇効果がそれ以上現れず、メチオニンの過多使用により経済性に難しさを与えるおそれがある。本発明の薬学的液状組成物において、ボツリヌス毒素の濃度が１００ユニット／ｍＬのとき、メチオニンの適正濃度は０．５〜１００ｍＭである。ポリソルベート２０の濃度範囲を同時に考慮する場合、メチオニンの適正濃度は２５〜７５ｍＭである。本発明の薬学的液状組成物において、メチオニンの濃度が２５ｍＭ未満であれば、室温で長期間保管するときにポリソルベート２０の特定の濃度範囲でメチオニンによるボツリヌス毒素の安定化効果が所望の水準を達成できず、メチオニンの濃度が７５ｍＭ超過であれば、超過による上昇効果がそれ以上現れない。
【００３１】
本発明の薬学的液状組成物の一構成要素であるポリソルベート２０は、その含量がボツリヌス毒素１００ユニット当り０．０１〜５０ｍｇであり、好ましくはポリソルベート２０の濃度が０．０１〜５０ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくはポリソルベート２０の濃度は０．１〜２．５ｍｇ／ｍＬである。
【００３２】
ポリソルベートは、非イオン性界面活性剤として製薬または食品分野で乳化剤として主に使用される。特に化粧品分野ではエッセンシャルオイルを水中に乳化させる水中油型の製品に主に使用される。ポリソルベートの種類としてはオキシエチレングループの全体数を基準としてポリソルベート２０、４０、６０または８０がある。本発明の薬学的液状組成物は、ポリソルベート２０（商品名はツイン２０）をボツリヌス毒素の安定化剤として使用する。
【００３３】
本発明の薬学的液状組成物において、ポリソルベート２０の含量がボツリヌス毒素１００ユニット当り０．０１ｍｇ未満であれば、室温で長期間保管するときにポリソルベート２０によるボツリヌス毒素の安定化効果が所望の水準を達成できず、一方、５０ｍｇ超過であれば、安定化効果がそれ以上与えられず、ポリソルベート２０の過多使用により経済性に難しさを与えるおそれがある。本発明の薬学的液状組成物においてボツリヌス毒素の濃度が１００ユニット／ｍＬのとき、ポリソルベート２０の適正濃度は０．０１〜５０ｍｇ／ｍＬであり、メチオニンの濃度範囲を同時に考慮する場合、ポリソルベート２０の適正濃度は０．１〜２．５ｍｇ／ｍＬである。本発明の薬学的液状組成物において、ポリソルベートの濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ未満であれば、室温で長期間保管するときにメチオニンの特定濃度範囲でポリソルベート２０によるボツリヌス毒素の安定化効果が所望の水準を達成できず、ポリソルベート２０の濃度が２．５ｍｇ／ｍＬ超過であれば、超過による上昇効果がそれ以上現れない。
【００３４】
また、本発明の薬学的液状組成物は、ｐＨが５．５〜７．０であることを特徴とする。本発明の薬学的液状組成物は、ｐＨが５．５〜７．０の場合、室温（特に４０℃の温度）で長期間保管するときにボツリヌス毒素の活性が安定的に維持される。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の権利範囲を限定するものではない。
【００３６】
１．実験方法
（１）ボツリヌス毒素液状組成物の製造
安定化剤溶液を用いてボツリヌス毒素液を希釈し、最終的にボツリヌス毒素液の濃度を１００ユニット／ｍＬとなるようにボツリヌス毒素液状組成物を製造した。
【００３７】
（２）ボツリヌス毒素の安定性実験
製造されたボツリヌス毒素液状組成物を特定の温度で保管しながら一定期間ごとに１ｍＬサンプリングを行った。サンプリングされた液状組成物１ｍＬに注射用水９ｍＬを入れて１０倍に希釈し、希釈されたサンプルを４週齢ＩＣＲ(Institute of Cancer Research、ＵＳＡ)雌マウス５匹に腹腔注射した（１匹当り０．３ｍＬずつ、すなわち３ユニット／マウス）。腹腔注射後３日間観察しながら、死亡したマウスの数およびそれによる死亡率を確認した。マウスの死亡率が５０％以上であれば、ボツリヌス毒素の活性が維持されるものと評価できる。
【００３８】
２．ボツリヌス毒素安定化剤の選別
多様なボツリヌス毒素安定化剤候補を含むボツリヌス毒素液状組成物を製造し、２５℃または３７℃の温度で保管しながら、保管期間によるボツリヌス毒素液状組成物の安定性を測定した。ボツリヌス毒素安定化剤の選別実験による２５℃での安定性実験結果を表１に示し、３７℃での安定性実験結果を表２に示した。表１および表２において、ＨＳＡはヒト血清アルブミン(Human Serum Albumin)を意味し、ＰＥＧ８０００はポリエチレングリコール８０００を意味する。
【００３９】
表１に示すように、２５℃では、Ｌ−メチオニン（２０ｍＭ）＋ポリソルベート２０（２ｍｇ／ｍＬ）＋ボツリヌス毒素（１００ユニット／ｍＬ）、ＨＳＡ（５ｍｇ／ｍＬ）＋ポリソルベート２０（２ｍｇ／ｍＬ）＋ボツリヌス毒素（１００ユニット／ｍＬ）、Ｌ−イソロイシン（５０ｍＭ）＋ポリソルベート２０（２ｍｇ／ｍＬ）＋ボツリヌス毒素（１００ユニット／ｍＬ）、ヒドロキシエチル澱粉（１０ｍｇ／ｍＬ）＋ポリソルベート２０（２ｍｇ／ｍＬ）＋ボツリヌス毒素（１００ユニット／ｍＬ）からなる液状組成物においてボツリヌス毒素の活性が長期間維持された。また、表２に示すように、３７℃では、Ｌ−メチオニン（２０ｍＭ）＋ポリソルベート２０（２ｍｇ／ｍＬ）＋ボツリヌス毒素（１００ユニット／ｍＬ）、ＨＳＡ（５ｍｇ／ｍＬ）＋ポリソルベート２０（２ｍｇ／ｍＬ）＋ボツリヌス毒素（１００ユニット／ｍＬ）を含む液状組成物においてボツリヌス毒素の活性が長期間維持された。
【００４０】
前述した結果より、メチオニンとポリソルベート２０との組み合わせは、ＨＡＳとポリソルベート２０との組み合わせまたはヒドロキシエチル澱粉とポリソルベート２０との組み合わせを代替することが可能な安定化剤として評価される。また、イソロイシンとポリソルベート２０との組み合わせも、従来の安定化剤を代替することが可能な可能性があるものと見られる。
【００４１】
【表１】
2010532784.tif 000002
【００４２】
【表２】
2010532784.tif 000003
【００４３】
３．メチオニンの濃度変化によるボツリヌス毒素の安定性
ボツリヌス毒素の安定化剤として様々な濃度のメチオニンとポリソルベート２０を含む液状ボツリヌス毒素組成物の安定性実験を３７℃の保管条件で実施した。以下の表３にはメチオニンの濃度変化によるボツリヌス毒素の安定性実験結果を示した。
【００４４】
【表３】
2010532784.tif 000004
表３に示すように、メチオニンの濃度が０．５〜２０ｍＭの場合には５６日までボツリヌス毒素の活性が維持され、５０〜１００ｍＭの場合には７０日までボツリヌス毒素の活性が維持された。ポリソルベート２０のみをボツリヌス毒素の安定化剤として使用した場合と比較するとき、メチオニンおよびポリソルベート２０の両方を採用した組成物は、ボツリヌス毒素の安定性が大幅向上した。
【００４５】
４．ポリソルベート２０の濃度変化によるボツリヌス毒素の安定性
ボツリヌス毒素の安定化剤としてメチオニンと様々な濃度のポリソルベート２０を含む液状ボツリヌス毒素組成物の安定性実験を３７℃の保管条件で行った。ポリソルベート２０の濃度変化によるボツリヌス毒素の安定性実験結果は表４に示した。
【００４６】
【表４】
2010532784.tif 000005
表４に示すように、ポリソルベート２０の濃度が０．５〜２．０ｍｇ／ｍＬの場合には２０２日までボツリヌス毒素の活性が維持され、ポリソルベート２０の濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬの場合にはそれぞれ１６７日、１２０日までボツリヌス毒素の活性が維持された。メチオニンのみをボツリヌス毒素の安定化剤として使用した場合と比較するとき、メチオニンとポリソルベート２０の両方を採用した組成物では、ボツリヌス毒素の安定性が大幅向上したことが分かる。
【００４７】
５．メチオニンおよびポリソルベート２０の多様な濃度条件におけるボツリヌス毒素の安定性
ボツリヌス毒素の安定化剤として、メチオニンおよびポリソルベート２０の多様な濃度を含む液状ボツリヌス毒素組成物によるボツリヌス毒素の安定性実験を３７℃の保管条件で行った。表５および表６には、３０日および６０日保管時のメチオニンおよびポリソルベート２０の多様な濃度条件（実施例１２）におけるボツリヌス毒素の安定性実験結果（死亡率（％））を示した。前記実験のボツリヌス毒素液状組成物において、ボツリヌス毒素の濃度は１００ユニット／ｍＬであった。
【００４８】
表５と表６の結果を用いて統計分析を行った結果、２５〜７５ｍＭのメチオニンと０．１〜２．５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０との組み合わせがボツリヌス毒素を最も安定化させるものと示唆された。
【００４９】
【表５】
2010532784.tif 000006
【００５０】
【表６】
2010532784.tif 000007
６．ボツリヌス毒素液状組成物の様々なｐＨによるボツリヌス毒素の安定性
ボツリヌス毒素を最も安定化させるメチオニンとポリソルベート２０の濃度範囲においてｐＨ５．５〜７．０のボツリヌス毒素液状組成物（実施例１３）を製造し、ボツリヌス毒素の安定性実験を４０℃の保管条件で行った。ボツリヌス毒素液状組成物のｐＨは塩酸（ＨＣｌ）または水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて調整し、ボツリヌス毒素の濃度は１００ユニット／ｍＬであった。表７にはボツリヌス毒素液状組成物のｐＨによるボツリヌス毒素の安定性実験結果を示した。
【００５１】
図７に示すように、２５〜７５ｍＭのメチオニンと０．２５〜０．７５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０との組み合わせおよびｐＨ５．５〜７．０の範囲を有するボツリヌス毒素液状組成物では、４０℃の保管条件で９０日間ボツリヌス毒素の活性が維持された。
【００５２】
【表７】
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７．メチオニン、イソロイシンおよびポリソルベートの組み合わせを含む薬学的液状組成物中のボツリヌス毒素の安定性
ボツリヌス毒素の安定化剤を選別する過程で、メチオニンとポリソルベート２０の組み合わせだけでなく、イソロイシンとポリソルベート２０の組み合わせもボツリヌス毒素を安定化させる効果を持たと確認されたので、メチオニン、イソロイシンおよびポリソルベート２０の組み合わせによるボツリヌス毒素の安定性実験を３７℃の保管条件で行った。前記実験のボツリヌス毒素液状組成物におけるボツリヌス毒素の濃度は１００ユニット／ｍＬであった。
【００５３】
【表８】
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図８に示すように、メチオニン、イソロイシンおよびポリソルベート２０の組み合わせでは、３７℃の保管条件で長時間（約２００日）ボツリヌス毒素の活性が維持された。これに対し、イソロイシンのみからなり、或いはメチオニンとイソロイシンの組み合わせのみからなり、或いはイソロイシンとポリソルベート２０の組み合わせのみからなる場合、ボツリヌス毒素の活性が３０日経過の前に殆ど無くなることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
上述したように、本発明は、ボツリヌス毒素を含み、ボツリヌス毒素の安定性が改善された薬学的液状組成物であって、ジストニア、こわばった筋肉または神経疾患（例えば、片頭痛、腰痛、頸椎疾患など）の治療に使用できる。また、多汗症および皺除去などの美容目的でも使用できる。特に、本発明の薬学的液状組成物は、冷蔵条件だけでなく２５〜３７℃の室温でも長期間ボツリヌス毒素の活性が維持されるので、流通と販売に好都合である。
【国際調査報告】
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