(57)【要約】本発明は、再ミエリン化またはミエリン修復に関連するマーカー遺伝子の神経細胞特異的発現を示す動物モデルの産生に関連する。本発明において例示された組成物および方法は、脱髄疾患の薬剤スクリーニングおよび／または治療のために、特に再ミエリン化を促進または阻害する化合物の同定において、特に有用である。グリア細胞の亜集団は、成熟または前駆オリゴデンドロサイトである。さらに、その細胞の亜集団は、再ミエリン化および／またはミエリン化し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱髄傷害の際に先在ミエリン化細胞を再ミエリン化細胞から区別するための方法であって、
（ａ）神経細胞集団に複数の導入遺伝子を導入する工程であって、少なくとも第１の導入遺伝子は第１のマーカータンパク質をコードし、第２の導入遺伝子は第２のマーカータンパク質をコードし、ここで該第１のマーカータンパク質と第２のマーカータンパク質とは異なる検出可能な波長を放出し；該第１の導入遺伝子の発現は、脱髄の誘導前の先在するミエリン化細胞を示し、該第２の導入遺伝子は再ミエリン化細胞を示す、工程；
（ｂ）該神経細胞の集団を脱髄傷害に供する工程；
（ｃ）該第１のマーカータンパク質または第２のマーカータンパク質を発現する細胞を同定し、それによって、該先在するミエリン化細胞を該再ミエリン化細胞から区別する、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記第１の導入遺伝子および前記第２の導入遺伝子は、ミエリン化細胞に特異的な調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の導入遺伝子の発現は、前記脱髄傷害の際に再ミエリン化する能力を示す前駆細胞において発現される第３の導入遺伝子によって時間的に調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の導入遺伝子は、前記第１の導入遺伝子が抑制されているときに発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の導入遺伝子の発現は、発現オペロンから該第１の導入遺伝子を切り出すことによって抑制される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
神経損傷の際に先在するニューロンから再生したニューロンを区別するための方法であって、
（ａ）神経細胞集団に複数の導入遺伝子を導入する工程であって、少なくとも第１の導入遺伝子は第１のマーカータンパク質をコードし、第２の導入遺伝子は第２のマーカータンパク質をコードし、ここで該第１のマーカータンパク質と第２のマーカータンパク質とは異なる検出可能な波長を放出し；該第１の導入遺伝子の発現は、神経損傷前の先在するミエリン化細胞を示し、該第２の導入遺伝子は再ミエリン化細胞を示す、工程；
（ｂ）該神経細胞の集団を神経損傷に供する工程；
（ｃ）該第１のマーカータンパク質または第２のマーカータンパク質を発現する細胞を同定し、それによって、該先在するミエリン化細胞を該再ミエリン化細胞から区別する、工程
を包含する、方法。
【請求項７】
前記第２の導入遺伝子は、前記第１の導入遺伝子が抑制されているときに発現される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の導入遺伝子の発現は第３の導入遺伝子によって調節され、該第３の導入遺伝子は、軸索の損傷の際に誘導される調節エレメントに作動可能に連結されており、そして該第３の導入遺伝子の発現のときに、前記第１の導入遺伝子の発現は抑制される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ベクターであって、
（ａ）第１のマーカータンパク質をコードする第１の導入遺伝子であって、該第１の導入遺伝子の発現は、グリア細胞特異的調節エレメントのコントロール下にある、第１の導入遺伝子；および
（ｂ）第２のマーカータンパク質をコードする第２の導入遺伝子であって、該第２のマーカータンパク質は、該第１のマーカータンパク質が抑制されているときに発現され、該第１のマーカータンパク質と該第２のマーカータンパク質とは異なるタンパク質である、第２の導入遺伝子、
を含む、ベクター。
【請求項１０】
前記第１のマーカータンパク質および第２のマーカータンパク質は蛍光であり、それぞれ異なる検出可能な波長を放出する、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１２】
前記細胞は神経細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
第１の蛍光マーカータンパク質をコードする第１の導入遺伝子および第２の蛍光マーカータンパク質をコードする第２の導入遺伝子を含むトランスジェニック動物であって、該第２のマーカータンパク質は該第１のマーカータンパク質と区別可能であり、該第１のマーカータンパク質おとび第２のマーカータンパク質は外因性の物質によって時間的にコントロールされ、該発現はグリア細胞の亜集団において生じる、トランスジェニック動物。
【請求項１４】
グリア細胞の前記亜集団は成熟オリゴデンドロサイトである、請求項１３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５】
グリア細胞の前記亜集団は再ミエリン化オリゴデンドロサイトである、請求項１３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
前記外因性の物質は、前記第１のマーカータンパク質および第２のマーカータンパク質の発現を時間的に調節するように、グリア細胞の前記亜集団における第３の導入遺伝子の発現を誘導する、請求項１３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１７】
前記第１のマーカータンパク質の発現は前記外因性の物質による誘導の前に存在していたミエリン化細胞において起こり、前記第２の蛍光マーカータンパク質の発現は、該外因性の物質による誘導の際の再ミエリン化グリア細胞において起こる、請求項１６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１８】
前記グリア細胞は、星状細胞、オリゴデンドロサイト、およびシュワン細胞からなる群より選択される、請求項１３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１９】
請求項１３に記載のトランスジェニック動物の細胞。
【請求項２０】
動物において再ミエリン化が起こったか否かを決定するための方法であって、
（ａ）請求項１７に記載のトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）前記外因性の物質を投与し、前記第３の導入遺伝子の発現を誘導する工程；
（ｃ）該動物を脱髄傷害に供する工程；および
（ｄ）前記第１のマーカータンパク質および／または前記第２のマーカータンパク質の発現を検出し、それによって再ミエリン化が起こったか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
候補物質が再ミエリン化を調節するか否かを決定するための方法であって、
（ａ）請求項１７に記載のトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）外因性の物質を投与し、前記第３の導入遺伝子の発現を誘導する工程；
（ｃ）該動物を脱髄傷害に供する工程；
（ｄ）該動物を該候補物質に曝露する工程；および
（ｅ）コントロールと比較して前記第１のマーカータンパク質および／または前記第２のマーカータンパク質からの蛍光シグナルを検出する工程であって、該候補物質への曝露後の該第２のマーカータンパク質の該蛍光シグナルにおける減少は該物質が再ミエリン化を阻害することを示し；該蛍光シグナルにおける増加は該候補物質が再ミエリン化を促進することを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
再ミエリン化を促進するための候補物質を同定するための方法であって、
（ａ）複数のグリア細胞を提供する工程であって、該複数のうちの少なくとも１つのメンバーは、第１の蛍光マーカータンパク質をコードする第１の導入遺伝子および第２の蛍光マーカータンパク質をコードする第２の導入遺伝子を含み、該第２のマーカータンパク質は該第１のマーカータンパク質から区別可能であり、該第１のマーカータンパク質および該第２のマーカータンパク質の発現は、外因性の物質による誘導の前から存在していたミエリン化グリア細胞において該第１のマーカータンパク質の発現が起こるように、該外因性の物質によって時間的に調節され、該第２のマーカータンパク質の発現は該外因性の物質による誘導の再の再ミエリン化グリア細胞において起こる、工程；
（ｂ）該外因性の物質を投与する工程；
（ｃ）該細胞を脱髄傷害に供する工程；
（ｄ）該細胞を候補物質に曝露する工程；
（ｅ）コントロールと比較して、該第１のマーカータンパク質および／または該第２のマーカータンパク質からの蛍光シグナルを検出する工程であって、該候補物質への曝露後の該第２のマーカータンパク質の該蛍光シグナルにおける減少は、該物質が再ミエリン化を阻害することを示し；該蛍光シグナルにおける増加は、該候補物質が再ミエリン化を促進することを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
再ミエリン化を検出および定量するための動物モデルであって、先祖オリゴデンドロサイトにおいて発現されるリコンビナーゼを時間的に発現することができるダブルトランスジェニック動物を含み、それによって該リコンビナーゼの発現が蛍光マーカータンパク質の発現をもたらし、該蛍光マーカータンパク質の発現が該先祖オリゴデンドロサイトによる再ミエリン化に対応し、該発現が発現のレベルの測定を提供し、それによって再ミエリン化の検出および定量の両方のためのシステムを提供する、動物モデル。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ニューロンの脱髄は、神経系のミエリンの減少によって特徴付けられる有害な状態である。ミエリンは、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）の重要な構成成分であり、ニューロンの軸索を包み、そしてミエリン鞘と呼ばれる絶縁層を形成する。ミエリン鞘の存在は、軸索を伝播する電位の形式の神経シグナルの速度および完全性を増強する。ミエリン鞘の喪失は、神経シグナルがその標的に到達するのがあまりに遅い、非同期的（例えば神経におけるある軸索が他のものより早く伝導する）、間欠的（例えば伝導が高周波でのみ損傷される）、または全く到達しないので、感覚、運動および他の型の機能に有意な障害を生じる。
【０００２】
神経組織は、ニューロンおよび支持細胞またはグリア細胞を含む。グリア細胞は、哺乳類脳において、約１０対１でニューロンより数が多い。グリア細胞を、４つの型：星状細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、およびミクログリア細胞に分類し得る。ミエリン鞘は、ある型のグリア細胞、すなわちＣＮＳにおいてはオリゴデンドロサイト、およびＰＮＳにおいてはシュワン細胞の細胞膜または原形質膜によって形成される。ミエリン形成の活発な時期の間、ＣＮＳ中の各オリゴデンドロサイトは、１日あたり約５０００μｍ２のミエリン表面領域を、そして１分あたり約１０５のミエリンタンパク質分子を産生しなければならない（Ｐｆｅｉｆｆｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：１９１−１９７（１９９３））。ミエリン化オリゴデンドロサイトが脱髄病変において同定され、脱髄した軸索を、新規に合成されたミエリンで修復し得ることを示唆する。
【０００３】
ニューロンの脱髄は、ＣＮＳおよびＰＮＳの多数の遺伝性および後天性の疾患において現れる。これらの疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ疾患、白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アレキサンダー病、カナバン病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ペリツェウス・メルツバッハー病、レフサム病、コケイン症候群、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｎａｐｐ症候群、およびツェルウェガー症候群、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、および多巣性運動ニューロパシー（ＭＭＮ）を含む。これらの疾患の大部分に関して、治癒はなく、そして有効な治療はほとんどない。
【０００４】
多発性硬化症は、最もよくある中枢神経系の脱髄性疾患であり、世界で約６，０００，０００人、および米国において２５０，０００から３５０，０００人が冒されている。その疾患は、再発および寛解によって臨床的に特徴付けられ、最終的には慢性の能力障害を引き起こす。多発性硬化症の初期は、ミエリン鞘に対する自己免疫炎症性攻撃によって特徴付けられ、麻痺、協調の欠如、感覚の障害、および視力障害を引き起こす。続く疾患の慢性進行期は、典型的にはミエリン鞘の活発な変性および脱髄病変の不適切な再ミエリン化のためである（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００５】
オリゴデンドロサイトが脱髄疾患の主な標的細胞であり、そしてこれらの疾患からの回復は、オリゴデンドロサイトによる正常なミエリンの修復を必要とすることが公知である。しかし、再ミエリン化は多くの場合非効率的な過程であり、有意な能力障害および／または死を引き起こす。再ミエリン化の主要な細胞メカニズムは、発生のミエリン形成とは異なり得るという証拠が蓄積されつつある（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。従って、再ミエリン化を理解することが、ミエリン修復の原因、効果および寛解オプションを同定することの重要な局面の１つである。実際、ＭＳ研究における大きなチャレンジは、再ミエリン化の失敗の原因を理解すること、およびその結果を軽減する方法を考案することである。近年、いくつかの証拠が、ＭＳにおける脱髄病変が、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を欠損しておらず、むしろ再ミエリン化の失敗はオリゴデンドロサイトの不十分な再増殖と関連することを示唆した（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）
現在、再ミエリン化された軸索を同定する能力は、そのような軸索のミエリン鞘は、より薄い傾向があるという前提に基づき、それは同定のために電子顕微鏡（ＥＭ）分析を必要とする。ＥＭ分析は、インビボにおける再ミエリン化の日常的な分析のためには、特に脱髄と再ミエリン化が１つの特定の部位に正確に位置していないかもしれない実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）のような状況においては、非常に困難および高価である。従って、ニューロンの再ミエリン化の分子的基礎の同定および解明を促進し得る方法および組成物に対する大きな必要性が依然として存在する。再ミエリン化を促進するために有効な生物学的に活性な薬剤を開発すること、および再ミエリン化を阻害し得る薬剤を同定することの差し迫った必要性も存在する。同じことがニューロンの損傷にあてはまる。
【０００６】
ニューロンの損傷は、神経系の多くの有害な状態の原因である。ＣＮＳのニューロンは、低い再生能力しか有さず、そして従って、ＣＮＳに対する損傷は、多くの場合機能的な障害を引き起こし、それはほとんど不可逆的である。脳卒中、外傷、または他の原因によって起こる損傷は、認知、感覚、および運動機能、およびさらに生命機能の維持における一生の喪失を引き起こし得る。アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、頭部および脊髄の外傷のような多くの疾患は、全てＣＮＳに対する損傷と関連し、それは多くの場合重症であり、長く続き、または永続的でさえある。
【０００７】
失われたニューロン細胞は、通常置換されず、そして残ったものは一般的に切断された連結を再生することはできないが、制限された量の局所のシナプス再編成が、損傷部位の近くで起こり得る。ＣＮＳにおける再生失敗は、多くの因子に起因し、それらは軸索の成長を抑制するグリア細胞の表面における阻害分子の存在、成長を育成するラミニンのような適当な基質分子の欠如、および細胞の生存および分化に必要な遺伝子発現のプログラムを活性化するために必要な、適当な栄養因子の欠如を含む。
【０００８】
ＰＮＳのニューロンは、比較的高い再生能力を有する。例えば、非特許文献１３を参照のこと。損傷した神経線維は、長い距離を越えて再び成長し、最終的には非常によく機能を回復する。その再生能力の違いは、内因性の違いのためではないことが報告され、例えばもし移植されたＰＮＳの部分を通って成長する機会があれば、ＣＮＳのニューロンは遠い距離を越えてその軸索を延長する（例えば坐骨神経）。従って、ＣＮＳのニューロンは、細胞外環境から再成長を促進するシグナルを受け取れば、成長する能力を保持すると考えられる。損傷後に軸索を再生するニューロンの能力は、損傷したニューロンの内因性の因子および周囲の環境によって決定されると考えられる。広範な研究努力にも関わらず、ニューロンの再生に関わる正確な分子メカニズムの解明の進歩は、ニューロンの再生を確認および定量するための簡便な研究ツールおよびモデルがないことによって妨害されてきた。そのようであるので、ニューロンの再生の検出および定量を助ける方法および組成物に対する大きな必要性が依然として存在する。
【０００９】
本発明は、これらの必要性を満たし、そして関連する利点も提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：７０５−７１４（２００２）
【非特許文献２】Ｂｒｕｃｋら、Ｊ．Ｎｕｅｒｏｌ．Ｓｃｉ．２０６：１８１−１８５（２００３）
【非特許文献３】Ｃｏｍｐｓｔｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：１２２１−１２３１（２００２）
【非特許文献４】Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：７０５−７１４（２００２）
【非特許文献５】Ｂａｌａｂａｎｏｖら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：２６２−２６４（２００５）
【非特許文献６】Ｆａｒｈａｄｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：１０２１４−１０２２３（２００３）
【非特許文献７】Ｒｕｆｆｉｎｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：２１６７−２１７５（２００４）
【非特許文献８】Ａｒｎｅｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６：２１１１−２１１５（２００４）
【非特許文献９】Ｓｔｉｄｗｏｒｈｔｙら、Ｂｒａｉｎ  １２７：１９２８−１９４１（２００４）
【非特許文献１０】Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：６４０４−６４１２（２０００）
【非特許文献１１】Ｌｕｃｃｈｉｎｅｔｔｉら、Ｂｒａｉｎ  １２２：２２７９−２２９５（１９９９）
【非特許文献１２】Ｍａｅｄａら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４９：７７６−７８５（２００１）
【非特許文献１３】ＨｏｍｅｒおよびＧａｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：９６３−９７０（２０００）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、脱髄の傷害時に、先在するミエリン化細胞と再ミエリン化細胞を区別する方法を提供する。その方法は、（ａ）神経細胞の集団に、複数の導入遺伝子を導入することであって、ここで少なくとも第１の導入遺伝子は第１の蛍光マーカータンパク質をコードし、そして第２の導入遺伝子は第２の蛍光マーカータンパク質をコードし、ここで当該第１のマーカータンパク質および当該第２のマーカータンパク質は、異なる検出可能な波長を放出し；そして当該第１の導入遺伝子の発現は、脱髄の誘導前に先在するミエリン化細胞を示し、そして当該第２の導入遺伝子の発現は、再ミエリン化細胞を示す；（ｂ）当該神経細胞の集団を、脱髄傷害に供すること；および（ｃ）当該第１のマーカーまたは当該第２のマーカータンパク質を発現する細胞を同定し、それによって当該先在ミエリン化細胞を当該再ミエリン化細胞から区別する工程を含む。本発明の方法はさらに、第２のマーカータンパク質を発現する細胞の数を計測することによって、再ミエリン化の程度を定量することを含み得る。１つの局面において、第１の導入遺伝子および第２の導入遺伝子を、ミエリン化細胞に特異的な調節エレメントと作動可能に連結するよう設計する。好ましい局面において、第２の導入遺伝子は、脱髄傷害時に再ミエリン化する能力を示す前駆細胞において発現される第３の導入遺伝子によって時間的に調節される。さらに好ましい局面において、第２の導入遺伝子は、当該第１の導入遺伝子の発現が抑制されているときに発現し、それを第１の導入遺伝子を発現オペロンから切り出すことによって行い得る。
【００１２】
本発明はまた、神経損傷時に、先在ニューロンを再生ニューロンから区別する方法を提供する。その方法は、（ａ）ニューロン細胞の集団に、複数の導入遺伝子を導入することであって、ここで少なくとも第１の導入遺伝子は第１の蛍光マーカータンパク質をコードし、そして第２の導入遺伝子は第２の蛍光マーカータンパク質をコードし、ここで当該第１のマーカータンパク質および当該第２のマーカータンパク質は、異なる検出可能な波長を放出し；そして当該第１の導入遺伝子の発現は、神経損傷前の先在するニューロンを示し、そして当該第２の導入遺伝子の発現は再生ニューロンを示す；（ｂ）当該ニューロン細胞の集団を、神経損傷に供すること；および（ｃ）当該第１のまたは当該第２のマーカータンパク質を発現するニューロン細胞を同定し、それによって当該先在ニューロンを当該再生ニューロンから区別することを含む。１つの局面において、第２の導入遺伝子は、第１の導入遺伝子の発現が抑制される場合に発現する。別の局面において、第２の導入遺伝子の発現は、第３の導入遺伝子によって時間的に調節され、ここで第３の導入遺伝子は、軸索の損傷時に誘導される調節エレメントに作動可能に連結されており、そしてここで第３の導入遺伝子の発現時に、第１の導入遺伝子の発現は抑制される。
【００１３】
本発明は、再ミエリン化を検出および定量するためのモデル系を提供するために設計された組成物および方法を提供する。１つの局面において、本発明は、その発現は外因性の薬剤によって誘導可能であるマーカータンパク質をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニック動物を提供し、それによって、発現はグリア細胞において異なって発現する遺伝子由来の調節エレメントによって調節され、そしてここでこのマーカータンパク質の発現は、特定のグリア細胞の亜集団において異なって起こる。
【００１４】
グリア細胞の亜集団は、成熟または前駆オリゴデンドロサイトである。さらに、その細胞の亜集団は、再ミエリン化および／またはミエリン化し得る。それに加えて、調節エレメントを、グリア細胞、特にミエリン化または再ミエリン化に関与するグリア細胞において異なって発現するあらゆる遺伝子から選択する。他の実施態様において、そのグリア細胞の亜集団は、シュワン細胞、星状細胞、ニューロンまたは軸索である；その細胞は成熟または前駆細胞であり得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、２つまたはそれ以上のマーカータンパク質をコードする少なくとも２つの導入遺伝子を含むトランスジェニック動物を提供し、ここで１つまたはそれ以上のマーカータンパク質の発現は、外因性の物質によって時間的に調節され、ここで発現はグリア細胞の２つの異なる亜集団において異なって起こる。１つの例において、そのマーカータンパク質は蛍光マーカータンパク質であり、それぞれ異なる検出可能な波長を放出する。さらに、異なるマーカータンパク質の検出は、その動物の神経系における、再ミエリン化神経細胞の存在または欠如を示す。
【００１６】
それに加えて、本発明は、本発明のトランスジェニック動物から得られる細胞を提供し、その細胞を細胞培養法のようなインビトロまたはインビボの方法において利用する。それに加えて、本発明は、細胞培養またはトランスジェニックの使用におけるような、インビボおよびインビトロの使用に適当であるベクターを提供する。
【００１７】
本発明のそのトランスジェニック動物、細胞およびベクターは、ミエリン化を再ミエリン化から検出する、または検出および定量する、および区別するモデル系を提供する。そのモデル系は、２つのトランスジェニック動物を設計することを含み、それを続いて組み合わせてダブルトランスジェニック動物を産生する、その過程の概観を図２および３で説明する。
【００１８】
本発明の１つの局面において、第１のトランスジェニック動物を、細胞特異的な方式で作用する遺伝子配列由来の転写調節領域を利用する、同族リコンビナーゼタンパク質を発現するよう設計する。それに加えて、そのリコンビナーゼを、例えば外因性の物質によって誘導された場合にのみ活性であるように遺伝子操作する。
【００１９】
本発明の別の局面において、第２のトランスジェニック動物を、細胞特異的な方式で作用する遺伝子配列由来の転写調節領域を利用するレポーター遺伝子／産物を発現するよう設計する。１つの実施態様において、導入されるその遺伝子構築物は、２つの目的の遺伝子を、１つの転写ユニット由来のプロモーター／エンハンサーエレメントと組み合わせて含む。しかし、目的の第１の遺伝子は、転写終了シグナル（例えばストップコドン）を含み、そしてさらにその遺伝子は、同族のリコンビナーゼタンパク質（例えばＣｒｅ）によって認識され得る配列に隣接される。さらに、もし第１の目的の遺伝子が切除されたときのみ発現する、第２の目的の遺伝子をこの遺伝子に作動可能に連結し、ここでそのような切除は、同族の隣接配列を認識するリコンビナーゼタンパク質の存在下で媒介され得る。それに加えて、発現が、目的のタンパク質を望ましい細胞膜に局在化させる細胞局在化シグナルを含むように、目的のタンパク質を設計する。従って、できたトランスジェニック動物は、第１のまたは第２の望ましい遺伝子産物を、それぞれ細胞特異的な方式で産生することができ、そしてここで第２の目的の遺伝子の発現は、第１の目的の遺伝子の部位特異的組換え切除に依存する。
【００２０】
本発明のさらなる局面において、上記で記載した第１および第２のトランスジェニック動物を組み合わせて（すなわち交配して）、そして第１および第２の動物の導入遺伝子、誘導性のリコンビナーゼおよびレポーター遺伝子を含む子孫を選択する。本発明の子孫トランスジェニック動物は、再ミエリン化を同定および定量するためのシステムを提供する。１つの実施態様において、細胞特異的な方式でリコンビナーゼタンパク質を機能的に活性化するために分子をトランスジェニック動物に投与する。さらに、機能的なリコンビナーゼの発現は、第１の目的の遺伝子の切除を可能にし、そして従って第２の目的の遺伝子の細胞特異的な方式での発現を可能にする。従って、子孫トランスジェニック動物は、細胞特異的な方式でリコンビナーゼタンパク質の誘導性の形式を発現する。そのリコンビナーゼは、第１のレポーター遺伝子を切除し得、それによって第２の目的の遺伝子の、細胞特異的な方式での発現を可能にする。好ましい実施態様において、第１および第２の目的の遺伝子は、本明細書中でさらに記載されるように、蛍光タンパク質をコードする。
【００２１】
好ましい実施態様において、選択された子孫トランスジェニック動物は、１つの細胞型において第１の目的の遺伝子を、そして第２の細胞型において第２の目的の遺伝子を発現する。従って、目的の遺伝子の発現のモニタリングにおいて、そのモデル系は、目的の特定の遺伝子の細胞特異的発現の同定および／または定量を可能にし、そしてそのような発現が、ミエリン化に対して再ミエリン化に相関するかどうかを区別することを可能にする。リコンビナーゼが調節可能に発現し、そして第１の目的の遺伝子が続いて切除される、そのトランスジェニック動物において、そのモデル系は、再ミエリン化に関連し得る、第２の目的の遺伝子の特異的検出および定量を可能にする。
【００２２】
１つの実施態様において、第１のトランスジェニック動物を得るために使用する遺伝的構築物は、リコンビナーゼ遺伝子に作動可能に連結した、血小板由来成長因子α（ＰＤＧＦα）受容体遺伝子をコードし、ここでそのリコンビナーゼは、ＣｒｅＥＲｔ２のような外因性の物質によって、機能的に調節（誘導）される。そのプロモーターは、内因性ＰＤＧＦα受容体遺伝子からとる。そのリコンビナーゼは、合成ステロイドホルモン（タモキシフェン）の投与後に限っては誘導性であり、ＣｒｅＥＲｔ２タンパク質は、それが機能的である核内に移動する。それに加えて、第２の遺伝的動物を得るために、第２の遺伝的構築物を使用し、ここでその構築物は、「フロックス（ｆｌｏｘｅｄ）」第１のマーカー遺伝子および、第１のマーカー遺伝子の下流に第２のマーカー遺伝子をコードし、ここで両方の遺伝子は、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）プロモーターエレメントのコントロール下にある。できたトランスジェニック動物を続いて交配し、そして子孫の遺伝子型を同定して、第１および第２の遺伝子構築物を有する動物を同定する。そのようであるので、本発明のアッセイに使用される好ましい子孫は、ダブルトランスジェニック（Ｆ１）である。
【００２３】
よって、本発明の１つの局面において、再ミエリン化をアッセイするために、組織培養の人工産物を含まない、トランスジェニック動物モデル系が提供される。さらに、本発明のある局面において、トランスジェニック動物の神経系に、侵襲性または非侵襲性の手順によって、物理的および神経毒性の負荷をかけ、ここでそのようなトランスジェニック動物を含むモデル系はまた、神経学的修復または毒性の検出の手段を提供する。さらに、そのモデル系は、トランスジェニック動物において、ある期間における、負荷の効果または生物学的に活性な薬剤の投与の効果をモニターすることを可能にする。さらに、そのような効果のモニタリングは、同じ動物において１回以上の機会であり得る。
【００２４】
別の局面において、本発明は、（ａ）当該動物のゲノムに安定に組み込まれた、１つまたはそれ以上のレポーター遺伝子またはレポータータンパク質をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列；および（ｂ）動物においてそれぞれ細胞特異的に発現する、当該１つまたはそれ以上のレポーター遺伝子またはレポータータンパク質の神経細胞特異的発現を提供する能力を有する、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
【００２５】
それに加えて、本発明は、トランスジェニック動物由来の細胞を含む。さらに、そのような細胞を、生化学的、生物学的製剤、またはミエリン形成機構現象を研究するための、細胞培養技術および細胞に基づくアッセイにおいて使用するために、さらに遺伝的に改変し得る。
【００２６】
本発明はまた、再ミエリン化を促進する生物学的薬剤の候補を同定するためのシステムを提供するトランスジェニック動物を産生する方法を提供する。その方法は、（ａ）レポータータンパク質をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物を異なって発現し得る遺伝子構築物を構築すること；（ｂ）当該遺伝子構築物を、１匹またはそれ以上の動物に導入すること；（ｃ）当該１つまたはそれ以上のレポータータンパク質の発現または発現の調節を検出すること；および（ｄ）１つまたはそれ以上のレポータータンパク質の発現に基づいて、当該薬剤の投与に反応してニューロンのミエリン化および／または再ミエリン化が起こるかどうかを決定することを含む。
【００２７】
関連するが別の実施態様において、本発明は、動物において再ミエリン化が起こるかどうかを決定する方法を提供する。その方法は、（ａ）トランスジェニック動物を提供する；（ｂ）当該外因性物質を投与して、当該第３の導入遺伝子の発現を誘導する；（ｃ）当該動物を脱髄傷害に供する；および（ｄ）当該第１のおよび／または当該第２のマーカータンパク質の発現を検出し、それによって再ミエリン化が起こったかどうかを決定する工程を含む。
【００２８】
本発明はまた、コントロール動物（すなわち薬剤が投与されない）と比較して、マーカー遺伝子／遺伝子産物の異なった細胞特異的発現を比較するために、生物学的に活性な薬剤を１匹の動物（すなわち試験動物）に投与するアッセイを提供し、ここでそのマーカー遺伝子産物を検出／定量して、薬剤の投与が再ミエリン化の調節を引き起こしたかどうかを決定する。
【００２９】
本発明はさらに、細胞培養アッセイを利用して、ニューロンの再ミエリン化を促進する生物学的に活性な薬剤を開発する方法を提供する。その方法は、（ａ）本明細書中で記載された方法によって産生されたトランスジェニック動物から神経細胞を得て、そして培養すること；（ｂ）生物学的に活性な薬剤の候補を、対象の脱髄病変由来のミエリン化細胞と接触させること；および（ｃ）コントロール細胞と比較して、１つまたはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の変化した発現、または当該１つまたはそれ以上の遺伝子産物の変化した活性を検出すること、当該１つまたはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物は、ミエリン形成および／または再ミエリン化と相関する；および（ｄ）当該遺伝子または遺伝子産物の発現レベル、または当該遺伝子産物の活性レベルが、当該コントロール細胞と比較して調節されるなら、当該薬剤を候補として選択することを含む。
【００３０】
関連するが別の実施態様において、本発明は、再ミエリン化を促進する物質の候補を同定する方法を提供する。その方法は、（ａ）複数のグリア細胞を提供すること、複数のうち少なくとも１つは第１の蛍光マーカータンパク質をコードする第１の導入遺伝子を、そして第２の蛍光マーカータンパク質をコードする第２の導入遺伝子を含み、ここで当該第２のマーカータンパク質は、当該第１のマーカータンパク質と区別でき、ここで当該第１のおよび当該第２のマーカータンパク質の発現は、外因性の物質によって時間的に調節されて、当該第１のマーカータンパク質の発現は、当該外因性物質による誘導の前に存在するミエリン化グリア細胞において起こり、そしてここで当該第２のマーカータンパク質の発現は、当該外因性物質による誘導時に再ミエリン化グリア細胞において起こる；（ｂ）当該外因性物質を投与する；（ｃ）当該細胞を脱髄傷害に供する；（ｄ）当該細胞を、候補物質と接触させる；および（ｅ）コントロールと比較して当該第１のおよび／または当該第２のマーカータンパク質からの蛍光シグナルを検出する工程を含み、ここで当該候補物質との接触後の当該第２のマーカータンパク質の当該蛍光シグナルの減少は、当該物質が再ミエリン化を阻害することを示す；そしてここで当該蛍光シグナルの増加は、当該候補物質が再ミエリン化を促進することを示す。
【００３１】
本発明は、脱髄疾患に関連する現象を調節する生物学的に活性な薬剤に関して試験するための別の方法を提供する。その方法は、（ａ）本明細書中で記載された方法によって産生された試験トランスジェニック動物に、生物学的に活性な薬剤の候補を投与する；（ｂ）当該試験動物においてニューロンの脱髄を誘導する、および（ｃ）当該試験動物を、脱髄の誘導から十分な時間回復させ、脱髄病変の再ミエリン化が示され、それによって再ミエリン化を、１つまたはそれ以上のレポーター遺伝子産物の発現の同定によって検出する；および（ｄ）脱髄疾患に関連する現象に対する当該薬剤の効果を決定する工程を含み、ここで当該１つまたはそれ以上のレポーター遺伝子産物の発現の減少または増加は、当該生物学的に活性な薬剤が再ミエリン化を調節することを示す。
【００３２】
再ミエリン化に関連する現象は、中枢神経系のニューロン細胞において特徴付けられる。さらに、再ミエリン化に関連する現象は、中枢神経系または末梢神経系におけるミエリン化軸索の増加によって特徴付けられる。
【００３３】
関連するが別の実施態様において、本発明は、候補物質が再ミエリン化を調節するかどうかを決定するための方法を提供する。その方法は、（ａ）トランスジェニック動物を提供する；（ｂ）当該外因性物質を投与して当該第３の導入遺伝子の発現を誘導する；（ｃ）当該動物を脱髄傷害に供する；（ｄ）当該動物を、当該候補物質に接触させる；および（ｅ）コントロールと比較して、当該第１のおよび／または当該第２のマーカータンパク質からの蛍光シグナルを検出する工程を含み、ここで当該候補物質への接触後の、当該第２のマーカータンパク質の当該蛍光シグナルの減少は、当該物質が再ミエリン化を阻害することを示す；およびここで当該蛍光シグナルの増加は、当該候補物質が再ミエリン化を促進することを示す。
【００３４】
トランスジェニック動物およびその細胞を産生するために有用なベクターも、本発明においてさらに提供される。そのベクターは、（ａ）第１のマーカータンパク質をコードする第１の導入遺伝子（ここで当該第１の導入遺伝子の発現は、グリア細胞特異的調節エレメントのコントロール下にある）；および（ｂ）第２のマーカータンパク質をコードする第２の導入遺伝子を含み、ここで当該第２のマーカータンパク質は、当該第１のマーカータンパク質の発現が抑制された場合に発現し、およびここで当該第１のおよび第２のマーカータンパク質は、異なるタンパク質である。望ましい場合、そのベクターは第１および第２のマーカータンパク質をコードし、それらはそれぞれ蛍光であり、そして異なる検出可能な波長を放出する。本発明はまた、ベクターを含む細胞を提供する。１つの局面において、その細胞は、限定されないが、ニューロンおよびグリア細胞を含む神経細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明によるミエリン化および再ミエリン化のシナリオを説明する。
【図２】ミエリン化および再ミエリン化シナリオの対応する構築物を説明する。
【図３】ＰＤＧＦα／ＣｒｅＥＲＴ２およびＰＬＰ−ＴＣＲ／ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｆ／ＥＧＦＰ−Ｆの概略図を説明する；タモキシフェンなしで、その構築物は赤色の標識（ｍＣｈｅｒｒｙ）を発現し、一方タモキシフェンありで、Ｃｒｅが誘導され、そしてｍＣｈｅｒｒｙを切除し、そして緑色の標識（ＥＧＦＰ）が発現する。
【図４】血小板由来成長因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲ−α）をコードしてＰＤＧＦＲ−α／ＣｒｅＥＲＴ２マウスを産生する、マウス遺伝子に対するＣｒｅＥＲＴ２ノックインターゲティング構築物の概略図を示す。
【図５】ＣｒｅＥＲＴ２ノックインターゲティング構築物のプライマーの配列決定を示す。
【図６】陽性ＣｒｅＥＲＴ２ノックインリコンビナントＥＳクローンを同定するためのＰＣＲスクリーニング戦略およびプライマーを示す。
【図７】図６のＰＣＲスクリーニング戦略由来のＰＣＲ産物を示す。
【図８】ＰＬＰをコードしてＰＬＰ／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰマウスを産生する、マウス遺伝子に対するｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＧＦＰノックインターゲティング構築物の概略図を示す。
【図９】ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｆプラスミドのベクターマップを示す。
【図１０】ＥＧＦＰ−Ｆプラスミドのベクターマップを示す。
【図１１】ｐＢＳ２４６プラスミドのベクターマップを示す。
【図１２】ＰＬＰプロモーターカセットのダイアグラムを示す。
【図１３】ＳＰＲＲ１／ＣｒｅおよびＴａｕ／ｍＣｈｅｒｒｙ／ＥＧＦＰの概略図を説明する；損傷なしで、その構築物は赤色の標識（ｍＣｈｅｒｒｙ）を発現し、一方損傷ありで、Ｃｒｅが誘導され、そしてｍＣｈｅｒｒｙを切除し、そして緑色の標識（ＥＧＦＰ）を発現する。
【図１４】Ｎｅｓｔｉｎ／ＣｒｅＥＲＴ２およびＴＩＭＰ１／ｍＣｈｅｒｒｙ／ＥＧＦＰの概略図を説明する：タモキシフェンなしで、その構築物は赤色の標識（ｍＣｈｅｒｒｙ）を発現し、一方タモキシフェンありで、Ｃｒｅが誘導され、そしてｍＣｈｅｒｒｙを切除し、そして緑色の標識（ＥＧＦＰ）を発現する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
この開示を通して、様々な出版物、特許および公開された特許明細書が、引用を同定することによって参照される。これらの出版物、特許および公開された特許明細書の開示は、これによって本開示の参考文献に組み込まれて、本発明が属する最新技術をより完全に記載する。
【００３７】
一般的な技術
本発明の実施は、他に示さなければ、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム科学および組換えＤＮＡの従来の技術を採用し、それらは当該分野の技術の範囲内である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７））；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、およびＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））を参照のこと。
【００３８】
定義
明細書および請求において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さなければ、複数の言及を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含む、複数の細胞を含む。
【００３９】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用される。それらは、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形式を指し、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはそのアナログである。ポリヌクレオチドは、あらゆる３次元構造を有し得、そして公知または未知の、あらゆる機能を行い得る。以下は、ポリヌクレオチドの制限しない例である：遺伝子または遺伝子断片のコーディングまたはノンコーディング領域、連鎖解析から規定された遺伝子座（ローカス）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離ＤＮＡ、あらゆる配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログのような、修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合には、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの構築の前または後になされる。ヌクレオチドの配列に、非ヌクレオチド構成成分を介在させ得る。重合の後、標識成分との結合のように、ポリヌクレオチドをさらに修飾し得る。
【００４０】
「ヌクレオチドプローブ」または「プローブ」は、ハイブリダイゼーション反応において、その対応する標的ポリヌクレオチドを検出または同定するために使用するポリヌクレオチドを指す。
【００４１】
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化した複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、フーグスティーン結合、またはあらゆる他の配列特異的な方式で起こり得る。その複合体は、２本鎖構造を形成する２本の鎖、複数鎖の複合体を形成する３本またはそれ以上の鎖、１本の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらのあらゆる組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のような、より広範囲の過程の工程を構成し得る。
【００４２】
ポリヌクレオチドに適用される「ハイブリダイズした」という用語は、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化した複合体を形成する、ポリヌクレオチドの能力を指す。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、フーグスティーン結合、またはあらゆる他の配列特異的な方式で起こり得る。その複合体は、２本鎖構造を形成する２本の鎖、複数鎖の複合体を形成する３本またはそれ以上の鎖、１本の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらのあらゆる組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のような、より広範囲の過程の工程を構成し得る。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程、および／または転写されたｍＲＮＡ（「転写物」とも呼ばれる）が続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程を指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と呼ばれる。もしポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ由来であるなら、真核細胞において発現はｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００４４】
対象におけるヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に適用される「異なって発現した」は、コントロールにおいて検出されるものと比較した場合に、その配列の過剰発現または低発現を指す。低発現はまた、コントロールと比較した場合に、試験対象における検出可能な発現の欠如によって証明されるように、特定の配列の発現の欠如も含む。
【００４５】
「ポリペプチド」「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書中で交換可能に使用されて、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを指す。そのポリマーは直鎖または分岐であり得、それは修飾アミノ酸を含み得、そしてそれは非アミノ酸によって中断され得る。その用語はまた、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えばジスルフィド結合形成、糖鎖付加、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合のようなあらゆる他の操作も含み得る。本明細書中で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方、およびアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸を指す。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「ミエリン化細胞」は、神経系において軸索を絶縁するミエリンを産生し得る細胞を指す。代表的なミエリン化細胞は、中枢神経系においてミエリンの産生を司るオリゴデンドロサイト、および末梢神経系においてミエリンの産生を司るシュワン細胞である。
【００４７】
「再ミエリン化する」または「再ミエリン化」という用語は、例えば脱髄傷害に対して反応した、ミエリンの再生を指す。
【００４８】
「対象」、「個体」または「患者」は、本明細書中で交換可能に使用され、それは脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指す。哺乳類は、マウス、サル、ヒト、農耕動物、競技用動物、およびペットを含むがこれに限らない。インビボで得られた、またはインビトロで培養された、生物学的実体の組織、細胞、およびその子孫も含まれる。
【００４９】
本明細書中で記載された動物モデルまたは細胞培養アッセイにおいて採用される、「生物学的に活性な薬剤」を、単純または複雑な有機または無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質（例えば抗体）、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、またはポリヌクレオチド（例えばアンチセンス）のような、生物学的または化学的化合物からなる群から選択し得る。さらに、そのような薬剤は複雑な有機または無機分子を含み、粗製または精製植物抽出物のような、不均一な化合物の混合物を含み得る。
【００５０】
「プロモーターエレメント」は、そのような配列に連結した遺伝子の転写を促進する調節性配列である。調節性配列は、エンハンサー配列またはその機能的な部分を含み得る。
【００５１】
「コントロール」は、比較の目的のための実験において使用される代わりの対象、細胞またはサンプルである。
【００５２】
「フロックス」遺伝子は、２つのｌｏｘ部位によって隣接された遺伝子を指し、そしてここでその遺伝子は転写ターミネーター（例えば停止シグナル）を含む。
【００５３】
「ストップライト構築物」は、フロックスの第１の遺伝子を含む遺伝子構築物を指し、それはさらに第２の遺伝子と作動可能に連結している。従って、もし第１のフロックスの遺伝子をリコンビナーゼ（例えばＣｒｅ）による組換えによって除去すれば、第２の遺伝子が発現する（例えば図３）。「ストップライト構築物」はまた、「ストップライトカセット」とも呼ばれ、そして任意でプロモーター配列に作動可能に連結し得る。
【００５４】
ベクター：
本発明の１つの局面は、導入遺伝子の神経細胞特異的発現を有するトランスジェニック動物を産生するために使用する、ベクター、またはターゲティングベクター／構築物である。本発明の別の局面は、宿主細胞におけるベクターの使用、例えば細胞に基づくアッセイのための、本発明のベクターによる細胞のトランスフェクションである。
【００５５】
１つの局面において、本発明のベクターは、以下のものを含む：（ａ）第１のマーカータンパク質をコードする第１の導入遺伝子（ここで当該第１の導入遺伝子の発現は、グリア細胞特異的調節エレメントのコントロール下にある）、および（ｂ）第２のマーカータンパク質をコードする第２の導入遺伝子、ここで当該第２のマーカータンパク質は、当該第１のマーカータンパク質の発現が抑制された場合に発現し、そしてここで当該第１のおよび第２のマーカータンパク質は異なるタンパク質である。望ましい場合、そのベクターは第１および第２のマーカータンパク質をコードし、それらはそれぞれ蛍光であり、そして異なる検出可能な波長を放出する。
【００５６】
好ましい実施態様において、ターゲティングベクターまたは構築物を使用して、神経細胞特異的プロモーター配列に作動可能に連結したトランスジェニックヌクレオチド配列を有するトランスジェニック動物を産生し、ここで当該ヌクレオチド配列はリコンビナーゼをコードする。好ましい実施態様において、第１のターゲティングベクターまたは構築物は、同族のリコンビナーゼタンパク質の発現が、細胞特異的な方式で作用する遺伝子配列由来の転写調節領域を利用するよう設計される。好ましい実施態様において、そのリコンビナーゼは、例えば外因性の物質によって誘導された場合にのみ活性であるよう遺伝子操作される。
【００５７】
別の局面において、第２のターゲティングベクターまたは構築物を、細胞特異的な方式で作用する遺伝子配列由来の転写調節領域を利用するレポーター遺伝子／産物を発現する、第２のトランスジェニック動物を産生するために設計する。１つの実施態様において、導入される遺伝子構築物は、２つの目的の遺伝子を、１つの転写ユニット由来のプロモーター／エンハンサーエレメントと組み合わせて含む。好ましい実施態様において、第１の目的の遺伝子は、転写終了シグナル（例えばストップコドン）を含み、そして同族のリコンビナーゼタンパク質（例えば第１のターゲティング構築物によってコードされるリコンビナーゼ）によって認識され得る配列に隣接される。さらに、第１の目的の遺伝子が切除された場合にのみ発現する、第２の目的の遺伝子が、この遺伝子に作動可能に連結し、ここでそのような切除は、同族の隣接配列を認識するリコンビナーゼタンパク質の存在下で媒介され得る。さらなる実施態様において、第１および第２の導入遺伝子は、普通の動物（例えば、記載された動物を交配し、そして両方の導入遺伝子を発現する子孫を選択する）、または宿主細胞（例えば両方のベクター、または導入遺伝子を含む宿主細胞）に存在し、ここでリコンビナーゼの誘導性の発現が、グリア細胞の特定の亜集団におけるマーカータンパク質の異なった発現を可能にする。好ましい実施態様において、異なる亜集団におけるマーカータンパク質の発現は、発生的なミエリン化細胞および再ミエリン化細胞の間の区別を可能にする。
【００５８】
好ましい実施態様において、そのゲノムに安定に組み込まれた第１のトランスジェニック動物を産生するために使用する第１の標的構築物は、リコンビナーゼをコードし、ここでそのリコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、それは同族認識配列のｌｏｘＰ配列（すなわちｌｏｘＰ部位）を認識する。認識配列は当該分野で公知であり、そしてタンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡ分子（例えば制限エンドヌクレアーゼ、修飾メチラーゼ、またはリコンビナーゼ）が認識および結合する特定のＤＮＡ配列を意味する。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列は、ｌｏｘＰであり、それは８塩基対のコア配列に隣接される２つの１３塩基対の反転リピート（リコンビナーゼ結合部位として作用する）から成る、３４塩基対の配列である。（Ｓａｕｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：５２１−５２７（１９９４）を参照のこと）。認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼによって認識される、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列である。ａｔｔＢは、２つの９塩基対のコアタイプＩｎｔ結合部位および７塩基対のオーバーラップ領域を含む、約２５塩基対の配列である。ａｔｔＰは、コアタイプのＩｎｔ結合部位およびアームタイプのＩｎｔ結合部位および、補助タンパク質ＩＨＦ、ＦＩＳ、およびＸｉｓのための部位を含む、約２４０塩基対の配列である。Ｌａｎｄｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：６９９−７０７（１９９３）を参照のこと。そのような部位を本発明によって遺伝子操作して、Ｈａｒｔｌｅｙら、米国特許出願公開第２００６００３５２６９号による開示において開示されたような、当該分野で公知である方法および産物を利用した組換えを増強し得る。
【００５９】
Ｃｒｅリコンビナーゼは、野生型または野生型の変異体であり得る。好ましい実施態様において、Ｃｒｅリコンビナーゼはトランスジェニック動物（またはトランスジェニック細胞）において誘導可能である。変異Ｃｒｅリコンビナーゼは、組換えの部位に対して広範な特異性を有する。具体的には、その変異体は、ｌｏｘＰ配列および野生型Ｃｒｅリコンビナーゼが活性である他のｌｏｘ部位配列以外の配列の間の組換えを媒介する。一般的に、開示されたＣｒｅ変異体は、野生型Ｃｒｅが作用し得るｌｏｘ部位（野生型ｌｏｘ部位と呼ばれる）間、野生型Ｃｒｅによって効率的に利用されない変異ｌｏｘ部位（変異ｌｏｘ部位と呼ばれる）間、および野生型ｌｏｘ部位および変異ｌｏｘ部位間の効率的な組換えを媒介する。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ（またはＦＬＰのような他の、類似のリコンビナーゼ）を使用し得るあらゆる方法または技術において、Ｃｒｅ変異体を使用し得る。それに加えて、Ｃｒｅ変異体は、野生型ｌｏｘ部位および変異ｌｏｘ部位間のはるかにより効率的な組換えを可能にするので、Ｃｒｅ変異体は、異なる別の組換えを行うことを可能にする。そのような他の組換えのコントロールを、より洗練された連続的組換えを達成するために使用して、野生型Ｃｒｅリコンビナーゼでは不可能な結果を達成し得る。変異Ｃｒｅリコンビナーゼは、米国特許第６，８９０，７２６号の開示において開示されるように、当該分野で公知である。Ｃｒｅ活性の誘導能を、Ｃｒｅタンパク質の局在化によってコントロールし得る。例えば、Ｃｒｅタンパク質は、Ｃｒｅリコンビナーゼとエストロゲン受容体の変異体の融合であり得、Ｃｒｅ融合物、ＣｒｅＥＲｔ２を生じる。リガンドの非存在下で、ＣｒｅＥＲｔ２は細胞質内にある。しかし、合成ステロイドホルモン（タモキシフェン）の投与後、ＣｒｅＥＲｔ２タンパク質は核に移動し、そこで機能的になる（すなわちタモキシフェン誘導性）。
【００６０】
本発明の別の局面において、第２のターゲティングベクターは、神経細胞特異的プロモーター配列に作動可能に連結したヌクレオチド配列を含み、ここで当該ヌクレオチド配列はマーカータンパク質をコードする２つまたはそれ以上の遺伝子を含む。１つの実施態様において、その２つまたはそれ以上の遺伝子はそれぞれフルオロフォアまたは蛍光タンパク質をコードする。別の実施態様において、そのトランスジェニックヌクレオチド配列は、第１および第２の遺伝子を直列で、そして神経細胞特異的プロモーターに作動可能に連結して含み、ここで第１の遺伝子はターミネーターまたはストップコドンをコードし、従ってもし第１の遺伝子が発現する場合には第２の遺伝子は発現しない。またさらなる実施態様において、第１の遺伝子はまた、終了／停止配列を含む第１の遺伝子を除去するための手段を提供する認識配列に隣接される。そのような除去または切除は、例えば当該認識配列を認識するリコンビナーゼタンパク質による酵素的なものであり得る。
【００６１】
１つの局面において、第２のターゲティングベクターは、ストップライトカセット（例えば図３）を含み、ここでそのストップライトカセットは、プロモーター／エンハンサーエレメントまたは調節性配列のコントロール下にある。ストップライトカセットは、それぞれ異なる蛍光タンパク質をコードする、第１および第２の遺伝子を含み、ここで第１の遺伝子は停止シグナルを含み、そしてさらにリコンビナーゼ酵素のための認識配列に隣接される。従って、第１の遺伝子が発現したら、第２の遺伝子は発現から除外される。本発明において使用し得るマーカー遺伝子の独占的でない例は、サンゴ礁蛍光タンパク質（ＲＣＦＰｓ）、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ１、クラゲ蛍光タンパク質（ＦＰ）変異体、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ変異体Ｈ９、ＧＦＰ  Ｈ９−４０、ＥＧＦＰ、テトラメチルローダミン、リサミン、テキサスレッド、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、シトリン、Ｋａｅｄｅ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｉｄｏｒｉ  Ｃｙａｎ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、およびナフトフルオレセイン、またはその機能増強変異体を含む。フルオロフォアタンパク質マーカーをコードする多くの遺伝子が当該分野で公知であり、そのマーカーを本発明で使用し得る。ウェブサイト：＜ｃｇｒ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｔｈｏｒｎｌａｂ／ｇｆｐｓ．ｈｔｍ＞を参照のこと。より高い強度の光を放出する、または波長シフトを示す蛍光タンパク質の変異バージョンも、本発明の組成物および方法において利用し得る；そのような変異体は当該分野で公知であり、そして市販で入手可能である。（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、２００５を参照のこと）。さらに別の実施態様において、蛍光標識が膜結合であるように、蛍光標識をそれぞれファルネシル化する。好ましい実施態様において、ストップライトカセットは、第１のマーカー／標識として赤色蛍光標識（例えばｌｏｘＰ部位に隣接するｍＣｈｅｒｒｙ）、および第２の蛍光標識としてＥＧＦＰをコードする（図３ストップライト）。例えばＹａｎｇおよびＨｕｇｈｅｓ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３１：１０３６−４１（２００１）を参照のこと（ＨＥＫ２９３細胞におけるＣｒｅ発現の赤色／緑色レポーターを教示）。
【００６２】
第１および第２のターゲティング構築物は、好ましくはプロモーターまたは調節性配列、特に中枢神経系における導入遺伝子の発現に利用可能なもののコントロール下でその導入遺伝子を発現する。その調節性配列は、中枢神経系、特に神経細胞、具体的にはオリゴデンドロサイト、シュワン細胞、星状細胞またはミューラー細胞における、導入遺伝子の異所性の発現を可能にし得る。神経細胞特異的プロモーターの例は、米国特許出願公開第２００３／０１１０５２４号において開示されるように、当該分野で公知である；ウェブサイト＜ｃｈｉｎｏｏｋ．ｕｏｒｅｇｏｎ．ｅｄｕ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．ｈｔｍｌ＞も参照のこと。代表的な転写調節配列は、以下のタンパク質をコードする遺伝子から選択される転写調節配列を含む：ＰＤＧＦα受容体、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、グリア線維性酸性遺伝子（ＧＦＡＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、および微小管結合タンパク質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）、Ｔｈｙ１．２、ＣＣ１、セラミドガラクトース転移酵素（ＣＧＴ）、ミエリン結合糖タンパク質（ＭＡＧ）、オリゴデンドロサイト−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、ＢＳＦ１、ドパミン３−ヒドロキシラーゼ、セロトニン２受容体、コリンアセチルトランスフェラーゼ、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、およびスルファチド。
【００６３】
いくつかの実施態様において、調節性配列を改変または修飾して、発現を増強し得る（すなわち、プロモーターの強度を増加させる）。例えば、エンハンサー機能を含むイントロン配列を利用して、プロモーター機能を増加させ得る。ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子は、エンハンサーエレメントとして機能するイントロン配列を含む。この調節エレメント／領域ＡＳＥ（アンチサイレンサー（ａｎｔｉｓｉｌｅｎｃｅｒ）／エンハンサー）は、エキソン１ＤＮＡの約１ｋｂ下流に位置し、そしてほぼ１００ｂｐを含む。Ｍｅｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．８２：３４６−３５６（２００５）。
【００６４】
さらに、特定の細胞内位置における導入遺伝子の発現が望ましい場合、その導入遺伝子を、当該分野で広く実施されている組換えＤＮＡ技術によって、対応する細胞内局在化配列と作動可能に連結し得る。代表的な細胞内局在化配列は、（ａ）遺伝子産物の細胞の外への分泌を指示するシグナル配列；（ｂ）タンパク質の、細胞膜または細胞の他の膜性区画への結合を可能にする膜固定ドメイン；（ｃ）コードされたタンパク質の核への転座を媒介する核局在化配列；（ｄ）コードされたタンパク質を主にＥＲに閉じ込める、小胞体保持配列（例えばＫＤＥＬ配列）；（ｅ）タンパク質が細胞膜と結合するようにタンパク質をファルネシル化されるよう設計し得る；または（ｆ）コードされたタンパク質産物の、異なる細胞内分布に役割を果たすあらゆる他の配列を含むがこれに限らない。
【００６５】
好ましい実施態様において、第１のベクターは、内因性ＰＤＧＦα受容体遺伝子から取られたプロモーターを含み、ここでＰＤＧＦαはオリゴデンドロサイト前駆細胞では発現するが、成熟オリゴデンドロサイトでは発現しない。ＰＤＧＦαを、ベクターにおいてＣｒｅＥＲＴ２をコードする配列と作動可能に連結し（図４）、そしてトランスジェニック動物を産生するために使用し得、ここでその動物は、好ましくはマウスである。得られたトランスジェニックマウスは、ＰＤＧＦα／ＣｒｅＥＲＴ２である。さらなる実施態様において、第２のターゲティング構築物は、ＰＬＰの調節性配列、ミエリン化オリゴデンドロサイトに特異的なプロモーター配列、および細胞内局在化配列と共にコードされたマーカー遺伝子を含み、特にそのマーカータンパク質はファルネシル化されるよう設計する。好ましい実施態様において、そのベクターはｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰの発現をコントロールするＰＬＰプロモーターを含み、それらはどちらも発現するときファルネシル化される。ＰＬＰ／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰマウスを産生するためのターゲティング構築物を、図８に図示する。
【００６６】
さらに別の実施態様において、第１のベクターは、神経の発生の間と比較して、軸索切断後のニューロンにおいて優先的に発現する遺伝子由来のプロモーターを含む。１つの例はＳＰＲＲ１遺伝子である（Ｗａｎｇら、Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７  印刷中（２００７））。図１３に示す説明的な概略図において、ＳＰＲＲ１プロモーターを、ベクターにおいてＣｒｅをコードする配列と作動可能に連結し、そしてトランスジェニック動物を産生するために使用し得、ここでその動物は、好ましくはマウスである。得られたトランスジェニックマウスは、ＳＰＲＲ１／Ｃｒｅである。第２のターゲティング構築物は調節性配列を含み、ここでその調節性配列はＴａｕのプロモーターである。Ｔａｕはニューロンにおいて豊富なタンパク質であり、そして他の実施態様において、ニューロンにおいて豊富に発現する他のタンパク質由来の調節性配列を使用し得る。Ｔａｕプロモーターを、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰをコードする配列と作動可能に連結し、トランスジェニックマウスＴａｕ／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰを生じる。ダブルトランスジェニックマウスを、ＳＰＲＲ１／ＣｒｅおよびＴａｕ／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰマウスから産生し得、損傷前のニューロンは赤色の蛍光を発し（ｍＣｈｅｒｒｙ）、一方軸索切断後再生したニューロンは緑色の蛍光を発する（ＥＧＦＰ）（図１３）。
【００６７】
別の実施態様において、第１のベクターは、ニューロン前駆細胞において発現する細胞遺伝子由来のプロモーターを含む。１つの例は、内因性Ｎｅｓｔｉｎ遺伝子である。図１４に示す説明的な概略図において、Ｎｅｓｔｉｎプロモーターを、ベクターにおいて誘導性ＣｒｅＥＲＴ２をコードする配列と作動可能に連結し、そしてトランスジェニック動物を産生するために使用し得、ここでその動物は、好ましくはマウスである。できたトランスジェニックマウスはＮｅｓｔｉｎ／ＣｒｅＥＲＴ２である。第２のターゲティング構築物は調節性配列を含み、ここでその調節性配列はＴＩＭＰ１のプロモーターである。ＴＩＭＰ１の発現は、ニューロンの発生およびニューロンの再生の間に増加する（Ｗａｎｇら、Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７  印刷中（２００７））。他の実施態様において、ニューロンの発生およびニューロンの再生の間に発現が増加する、他の遺伝子の調節性配列を使用し得る。ＴＩＭＰ１プロモーターを、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰをコードする配列と作動可能に連結し、トランスジェニックマウスＴＩＭＰ１／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰを生じる。ダブルトランスジェニックマウスを、Ｎｅｓｔｉｎ／ＣｒｅＥＲＴ２およびＴＩＭＰ１／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰマウスから産生し得、そしてタモキシフェンで誘導しない場合はニューロンは赤色の蛍光を発し（ｍＣｈｅｒｒｙ）、そしてタモキシフェンで処理すると緑色の蛍光を発する（ＥＧＦＰ）（図１４）。
【００６８】
本発明に適当な多数の遺伝的媒体が当該分野で利用可能である。それらは、ウイルスおよび非ウイルス発現ベクターを両方含む。制限されない代表的なウイルス発現ベクターは、レトロウイルスのようなＲＮＡウイルス、およびアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスのようなＤＮＡウイルス由来のベクターである。非ウイルス発現ベクターは、プラスミド、コスミド、およびＤＮＡ／リポソーム複合体を含むがこれに限らない。その遺伝的媒体を、その中に有する外因性遺伝子の組織特異的、細胞特異的、または細胞小器官特異的でさえある発現を指示する調節性配列を有するように、遺伝子操作し得る。
【００６９】
本発明の１つまたはそれ以上の組成物または方法で利用し得るベクターは、ＳＶ−４０の誘導体、アデノウイルス、レトロウイルス由来ＤＮＡ配列、および機能的な哺乳類ベクターおよび機能的なプラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせ由来のシャトルベクターを含む。例えばＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２）；Ｓｕｂｒａｍｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４（１９８１）、ＫａｕｆｍａｎｎおよびＳｈａｒｐ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１（１９８２）；Ｓｃａｈｉｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４６５４−４６５９（１９８３）およびＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０（１９８０）によって記載されるもののような、真核生物の発現ベクターが周知であり、それらは本明細書中に参考として援用される。本発明の方法において使用するベクターは、ウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクターであり得る。複製欠損アデノウイルスが好ましい。例えば、レトロウイルスの構造遺伝子が、単一の目的の遺伝子で置換された「単一遺伝子ベクター」、例えば、参考として本明細書中に援用されるＥｇｌｉｔｉｓおよびＡｎｄｅｒｓｅｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８−６１４（１９８８）によって記載されたような、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕｌＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびマウス骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭｕＭＰＳＶ）、および細網内皮症ウイルス（Ｒｅｖ）のような鳥類レトロウイルス、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）を、末端反復配列に含まれるウイルス調節性配列のコントロール下で使用し得る。
【００７０】
望ましいなら、その遺伝的媒体を、当該分野で公知のあらゆる方法によって、宿主細胞（例えばオリゴデンドロサイトまたはシュワン細胞のようなミエリン化細胞）に挿入し得る。適当な方法は、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、または微量注入を用いたトランスフェクションを含み得る。
【００７１】
トランスジェニック動物
本発明の１つの局面は、マーカー遺伝子／産物の時間調節された、かつ細胞特異的な発現を提供し、従って発生的なまたは先在的なミエリンと比較して、新規に形成されたミエリンまたは再ミエリン化の同定を可能にする、ダブルトランスジェニック動物を利用する組成物および方法を含む。
【００７２】
１つの実施態様において、その本発明のトランスジェニック動物は、第１の蛍光マーカータンパク質をコードする第１の導入遺伝子、および第２の蛍光マーカータンパク質をコードする第２の導入遺伝子を含み、ここで当該第２のマーカータンパク質は、当該第１のマーカータンパク質と区別でき、そしてここで当該第１および当該第２のマーカータンパク質の発現は、外因性物質によって時間的に調節され、そして当該発現はグリア細胞の亜集団において起こる。１つの局面において、そのグリア細胞の亜集団は、成熟オリゴデンドロサイトである。別の局面において、そのグリア細胞の亜集団は、再ミエリン化オリゴデンドロサイトである。さらに別の局面において、その外因性物質は、当該グリア細胞の亜集団において第３の導入遺伝子の発現を誘導して、当該第１および当該第２のマーカータンパク質の発現を時間的に調節する。いくつかの例において、当該第１のマーカータンパク質の発現は、当該外因性物質による誘導の前に存在するミエリン化グリア細胞において起こり、そしてここで当該第２の蛍光マーカータンパク質の発現は、当該外因性物質による誘導時に、再ミエリン化グリア細胞において起こる。
【００７３】
別の実施態様において、そのトランスジェニック動物は、１）プロモーターのコントロール下の誘導性リコンビナーゼと共に、特定の神経細胞の亜集団において発現する神経特異的プロモーター、および２）別の神経細胞の亜集団の、別の神経特異的プロモーターの発現下の、２つのマーカー遺伝子のストップライトカセットを含む。好ましい実施態様において、第１のプロモーターは前駆細胞において特異的に発現し、そして第２のプロモーターは成熟細胞において特異的に発現する。
【００７４】
本発明の別の局面は、その発現が再ミエリン化特異的であるため発現の検出／定量は再ミエリン化と相関する、マーカー遺伝子／産物を含むストップライト構築物である。またさらなる局面において、そのような発現における増加または減少は、再ミエリン化の増加または減少と相関する。上記で記載したベクターを使用して、本発明のトランスジェニック動物を産生し得る。
【００７５】
好ましい実施態様において、そのトランスジェニック動物、好ましくはマウスは、導入遺伝子ＣｒｅＥＲＴ２およびｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰを含み、ここでＣｒｅＥＲＴ２は内因性ＰＤＧＦαプロモーターのコントロール下にあり、そしてｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰはＰＬＰプロモーターのコントロール下にある。ＰＤＧＦα／ＣｒｅＥＲＴ２マウスを、ＰＬＰ／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰマウスと交配することによって、そのトランスジェニックマウスを産生し得る。図４および８において図示したターゲティング戦略およびベクターを使用することによって、ＰＤＧＦα／ＣｒｅＥＲＴ２マウスおよびＰＬＰ／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰマウスを産生し得る。
【００７６】
さらに別の実施態様において、そのトランスジェニック動物、好ましくはマウスは、導入遺伝子ＣｒｅおよびｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰを含み、ここでＣｒｅはＳＰＲＲ１プロモータのコントロール下にあり、そしてｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰはＴａｕプロモーターのコントロール下にある。ＳＰＲＲ１／ＣｒｅマウスおよびＴａｕ／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰマウスを交配することによって、そのトランスジェニックマウスを産生し得る。別の実施態様において、そのトランスジェニック動物、好ましくはマウスは、Ｎｅｓｔｉｎプロモーターのコントロール下のＣｒｅＥＲＴ２導入遺伝子およびＴＩＭＰ１プロモーターのコントロール下のｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰを含む。Ｎｅｓｔｉｎ／ＣｒｅＥＲＴ２およびＴＩＭＰ１／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰマウスを交配することによって、そのトランスジェニックマウスを産生し得る。
【００７７】
上記トランスジェニック動物を、当該分野で公知の遺伝子ターゲティング技術を利用して設計する。遺伝子ターゲティングは、標的となる内因性配列と相同性の外因性ＤＮＡ配列による相同的組換えによる、染色体遺伝子座の指向性の改変を意味する。遺伝子ターゲティングの異なる型の間で、区別がなされる。従って遺伝子ターゲティングを用いて、１つまたはいくつかの内因性遺伝子の発現を改変、および通常は増加させ得る、または内因性遺伝子を外因性遺伝子で置換し得る、または活性なままである特定の内因性遺伝子の遺伝子発現を制御するエレメントのコントロール下に外因性遺伝子を配し得る。この場合、遺伝子ターゲティングは、「ノックイン」（ＫＩ）と呼ばれる。あるいは、遺伝子ターゲティングを使用して、１つまたはいくつかの遺伝子の発現を抑制または排除し得、そしてこの型の遺伝子ターゲティングは「ノックアウト」（ＫＯ）と呼ばれる（例えばＢｏｌｋｅｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２３：１９９−２２５（１９８９）を参照のこと）。
【００７８】
本発明によるトランスジェニック細胞を産生する方法は、当業者に周知である。哺乳類細胞にトランスフェクションするための様々な技術が記載された（Ｇｏｒｄｏｎ、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９））。任意で本発明による導入遺伝子を、直線化または非直線化ベクターに含んで、またはベクター断片の形式で、例えば核への微量注入（米国特許第４，８７３，１９１号）、リン酸カルシウムによる沈殿によるトランスフェクション、リポフェクチン、エレクトロポレーション（Ｌｏ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））、熱ショック、カチオンポリマーによる形質転換（ＰＥＧ、ポリブレン、ＤＥＡＥ−デキストラン等）、ウイルス感染（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、または精子（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ  ５７：７１７−７２３（１９８９））のような、標準的な方法によって宿主細胞に導入し得る。
【００７９】
遺伝的構築物を、哺乳類接合体の前核（好ましくはオス前核）に挿入することによって、トランスジェニック動物を遺伝子操作し、そして安定なゲノム組込みが自然に起こることを可能にする。次いでその接合体を、受容性の子宮に移し、そして分娩日まで発達させる。マウスが好ましい種であるが、ラットおよびウサギも前核挿入の可能性のある候補である。接合体をトランスジェニックにする遺伝的構築物は、利用する内因性遺伝子（例えばＰＤＧＦα受容体遺伝子）を標的とする遺伝子構築物を含み、その遺伝子を、望ましいエレメント（例えば外因性プロモーター／エンハンサーエレメントおよび／または目的の遺伝子）を含むように変異および／またはさらに改変し得る。
【００８０】
胚の顕微操作に関する技術の進歩は、今や異種ＤＮＡの哺乳類受精卵への導入も可能にする。例えば、全能性または多能性幹細胞を、微量注入、リン酸カルシウムによる沈殿、リポソームの融合、レトロウイルス感染、または他の手段によって形質転換し得る。形質転換した細胞を、次いで胚に導入し、そしてその胚は次いでトランスジェニック動物に発達する。好ましい実施態様において、発達中の胚に、望ましい導入遺伝子を含むウイルスベクターを感染させて、導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物を感染した胚から産生し得る。別の好ましい実施態様において、望ましい導入遺伝子を、胚の前核または細胞質に、好ましくは単一細胞段階で、同時注入し、そしてその胚を成熟トランスジェニック動物に発達させる。トランスジェニック動物を産生するこれらおよび他の変種の方法が、当該分野でよく確立されており、そして従って本明細書中で詳述しない。例えば米国特許第５，１７５，３８５および同第５，１７５，３８４号を参照のこと。
【００８１】
本明細書中で開示された本発明の１つまたはそれ以上の局面において、望ましい導入遺伝子を、単一のコピーとして、または例えばヘッドトゥヘッドの直列、またはヘッドトゥテイルの直列の、コンカテマーで組込み得る。望ましい導入遺伝子を、特定の組織または細胞型、好ましくは中枢神経系の細胞に、選択的に導入および活性化し得る。そのような細胞型特異的活性化に必要な調節性配列は、特定の目的の細胞型に依存し、そして当業者に明らかである。好ましくは、標的となる細胞型は、中枢および末梢神経系を含む神経系に存在する。
【００８２】
上記で述べたように、トランスジェニック動物を、２つの型：「ノックアウト」および「ノックイン」に大きく分類することができる。「ノックアウト」は、標的遺伝子の機能の減少を引き起こす、トランスジェニック配列の導入による標的遺伝子の変化を有し、好ましくは標的遺伝子の発現はわずかであるかまたは検出できない。「ノックイン」は、例えばさらなる標的遺伝子のコピーの導入によって、または標的遺伝子の内因性コピーの発現の増強を提供する調節性配列を作動可能に挿入することによって、標的遺伝子の発現の増強を引き起こす、宿主細胞ゲノムの変化を有するトランスジェニック動物である。ノックインまたはノックアウトトランスジェニック動物は、標的遺伝子に関して、ヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。ノックアウトおよびノックインはどちらも、「バイジェニック」であり得る。バイジェニック動物は、少なくとも２つの宿主細胞遺伝子が変化している。好ましいバイジェニック動物は、神経細胞特異的リコンビナーゼをコードする導入遺伝子および神経細胞特異的マーカー遺伝子をコードする別のトランスジェニック配列を有する。本発明のトランスジェニック動物は、広く「ノックイン」として分類し得る。
【００８３】
本発明において、トランスジェニック動物を、再ミエリン化を同定および定量するためのモデル系を提供するために設計する。そのような定量は、脱髄傷害の前または後を含む、動物の一生の間のあらゆる時間に起こり得る。そのトランスジェニックモデル系を、ニューロンの再ミエリン化を促進するか、またはそのために有利な生物学的に活性な薬剤の開発にも使用され得る。さらに、そのモデル系を、例えば脱髄傷害後に、試験薬剤が有害な影響を与えるか、または再ミエリン化を抑制するかどうかをアッセイするために利用し得る（図１および２）。さらに、エキソビボ技術を含む、細胞に基づく、または細胞培養の環境で行われるさらなる研究またはアッセイのために、神経細胞を、本発明のトランスジェニック動物から単離し得る。
【００８４】
本発明の動物モデルは、中枢神経系および末梢神経系を含む、その動物の神経系におけるニューロン脱髄状態を生じる手順を受け入れられるあらゆる非ヒト脊椎動物を含む。好ましいモデル生物は、哺乳類、霊長類、およびげっ歯類を含むがこれに限らない。好ましいモデルの制限しない例は、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウサギ、ブタ、チンパンジー、およびサルである。その試験動物は、野生型またはトランスジェニックであり得る。１つの実施態様において、その動物はげっ歯類である。さらに別の実施態様において、その動物はマウスである。別の実施態様において、その動物はサル種由来である。さらに別の実施態様において、その動物はマーモセットであり、そのサルを、神経学的疾患を調査するために利用する（例えばＥｓｌａｍｂｏｉ、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．６８：１４０−１４９（２００５）；Ｋｉｒｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：２８８４−２８８９（２００４）））。
【００８５】
よって、本発明は、細胞特異的な方式で再ミエリン化を検出および定量するための動物モデルを使用する方法を提供する。そのような実施態様において、その方法は、（ａ）本発明のトランスジェニック動物において脱髄傷害を誘導する；（ｂ）ミエリン修復が起こる時間を与える；（ｃ）細胞特異的マーカー遺伝子の発現を検出および／または定量する；（ｄ）再ミエリン化が起こったかどうか、およびどのくらい起こったかを決定する工程を含む。
【００８６】
本発明の別の局面において、本発明は、再ミエリン化調節活性に関して、生物学的に活性な薬剤を試験する方法を提供する。その方法は、（ａ）本発明のトランスジェニック動物において脱髄傷害を誘導する；（ｂ）ミエリン修復が起こる時間を与える；（ｃ）試験薬剤を動物に投与する；（ｄ）工程（ｃ）の前および後に、細胞特異的マーカー遺伝子の発現を検出および／または定量する；（ｅ）工程（ｄ）において再ミエリン化が起こったかどうか、およびどれくらい起こったかを検出する；（ｆ）もし再ミエリン化特異的マーカータンパク質が、試験薬剤の投与に反応してアップまたはダウンレギュレートされるなら、その試験薬剤は再ミエリン化調節活性を有すると決定する工程を含む。いくつかの実施態様において、様々な時点で検出を行い、そして試験薬剤の投与を、アッセイの過程の間反復し得る、および異なる投与レジメを用いる。
【００８７】
本発明のさらに別の局面において、本発明は、再ミエリン化誘導またはプロモーター活性に関して、候補薬剤を試験する方法を提供する。その方法は、（ａ）本発明のトランスジェニック動物において脱髄傷害を誘導する；（ｂ）ミエリン修復が起こる時間を与える；（ｃ）試験薬剤を動物に投与する；（ｄ）工程（ｃ）の前および後に、細胞特異的マーカー遺伝子の発現を検出および／または定量する；（ｅ）工程（ｄ）において再ミエリン化が起こったかどうか、およびどれくらい起こったかを検出する；（ｆ）もし細胞特異的マーカータンパク質の発現が、試験薬剤の投与に反応して増加するなら、その試験薬剤は再ミエリン化誘導またはプロモーター活性を有すると決定する工程を含む。いくつかの実施態様において、試験動物における細胞特異的マーカータンパク質の発現を、コントロールまたは参照動物と比較し得る。他の実施態様において、試験動物における細胞特異的マーカータンパク質の発現を、同じ動物において様々な時点で行った測定と比較し、ここで初期の時点を参照またはコントロール時点として使用し得る。さらに他の実施態様において、細胞特異的マーカータンパク質の発現を、多くの試験動物において測定し、ここで試験動物の様々な時点で測定をし、そして対応するコントロール動物と比較し得る。その細胞特異的マーカーは、好ましくは再ミエリン化特異的マーカーである。
【００８８】
本発明のさらなる局面において、本発明は、再ミエリン化阻害または抑制活性に関して、候補薬剤を試験する方法を提供する。その方法は、（ａ）本発明のトランスジェニック動物において脱髄傷害を誘導する；（ｂ）ミエリン修復が起こる時間を与える；（ｃ）細胞特異的マーカー遺伝子の発現を検出および／または定量する；（ｄ）再ミエリン化を検出および定量する；（ｅ）候補薬剤を動物に投与する；（ｆ）工程（ｅ）の前および後で、再ミエリン化が起こったかどうか、およびどのくらい起こったかを検出および定量する；および（ｇ）もし細胞特異的マーカータンパク質の発現が試験薬剤の投与に反応して減少するなら、その試験薬剤は再ミエリン化阻害または抑制活性を有すると決定する工程を含む。いくつかの実施態様において、試験動物における細胞特異的マーカータンパク質の発現を、コントロールまたは参照動物と比較し得る。他の実施態様において、試験動物における細胞特異的マーカータンパク質の発現を、同じ動物において異なる時点で行った測定を比較し、ここで初期の時点を参照またはコントロール時点として使用し得る。他の実施態様において、細胞特異的マーカータンパク質の発現を、多くの試験動物で測定し、ここで試験動物の様々な時点で測定を行い、そして対応するコントロール動物と比較し得る。さらに他の実施態様において、候補薬剤が再ミエリン化阻害または抑制活性を有するかどうかの決定において、細胞特異的マーカー、好ましくは再ミエリン化特異的マーカータンパク質の発現を、試験動物およびコントロールまたは参照動物において測定する。そのような薬剤を、再ミエリン化阻害剤または再ミエリン化毒素と分類し得る。
【００８９】
本発明の１つの局面において、目的のタンパク質をコードする遺伝子と作動可能に連結した神経細胞特異的遺伝子をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列をゲノムに安定に組込んだトランスジェニック動物を産生し、ここで細胞特異的遺伝子は、目的のタンパク質と同時に細胞特異的な方式で発現し、そしてここで当該遺伝子は誘導性プロモーターのコントロール下にある。いくつかの実施態様において、細胞特異性は、神経細胞、好ましくはグリア細胞、より好ましくは星状細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、またはミューラー細胞に対するものである。別の実施態様において、目的のタンパク質をコードする遺伝子は、リコンビナーゼタンパク質をコードする。
【００９０】
本発明のさらに別の局面において、本発明の方法は、ダブルトランスジェニック（Ｆ１）動物を含み、ここでそのトランスジェニック動物は、本明細書中の上記で記載した単一のトランスジェニック動物の子孫を意味する。Ｆ１動物は、細胞特異的リコンビナーゼの誘導性発現、および蛍光標識をコードする第１または第２の遺伝子の細胞特異的発現の特徴を有する表現型を示し、ここでその細胞特異的な異なる発現は、再ミエリン化と相関し、従って再ミエリン化の検出および定量を可能にする。従って、（Ｆ１）動物は、異なる方式で、オリゴデンドロサイトによる蛍光標識の時間調節および細胞特異的発現を示す。好ましい実施態様において、そのトランスジェニック動物はマウスである。
【００９１】
従って、本発明の１つの実施態様において、タモキシフェンを（Ｆ１）動物に投与して、Ｃｒｅリコンビナーゼ（例えばＣｒｅＥＲＴ２遺伝子）の発現を誘導し、好ましくは第１のマーカータンパク質または標識をコードする、「フロックス」トランスジェニックヌクレオチド配列の、Ｃｒｅ依存性部位特異的組換えを可能にする。好ましい実施態様において、ＣｒｅＥＲＴ２遺伝子は、ＰＤＧＦα受容体遺伝子のコントロール下にあり、従ってオリゴデンドロサイト前駆細胞において、細胞特異的な方式で発現する。Ｃｒｅ依存性組換えの発生の結果として、ｍＣｈｅｒｒｙをコードする配列が切除され、従って第２のトランスジェニックヌクレオチド配列によるＥＧＦＰの発現を可能にする。前述の前駆細胞由来のオリゴデンドロサイトにおいて、再ミエリン化を検出し得る。従って新規に形成されたミエリン（すなわち再ミエリン化）は緑色の蛍光を発し（すなわちＥＧＦＰ）、一方先在のまたは発生上のミエリンは赤色の蛍光を発する（すなわちｍＣｈｅｒｒｙ）。さらに、Ｃｒｅの発現は誘導性であるので、ＥＧＦＰの発現を、時間を調節した方式、および細胞特異的な方式で行って、再ミエリン化特異的ミエリン増殖を検出し得る。好ましい実施態様において、そのダブルトランスジェニック動物はマウスであり、そして二重の導入遺伝子は、それぞれＰＤＧＦα受容体／ＣｒｅＥＲＴ２およびＰＬＰ／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰである。
【００９２】
従って、本発明のトランスジェニック動物は、再ミエリン化をアッセイするためのモデル系を産生するために利用し得る組成物および方法を提供する。そのようなモデル系は、再ミエリン化のメカニズムの解明に対する洞察、および再ミエリン化を促進する治療的戦略の開発を提供する。さらに、再ミエリン化特異的マーカータンパク質の発現を、当該分野で公知の技術を利用して容易に検出および定量する。
【００９３】
脱髄の誘導および再ミエリン化の評価：
本発明は、再ミエリン化のメカニズムの解明におけるモデル系、および再ミエリン化を促進する治療的戦略の開発を提供する。好ましい実施態様において、そのトランスジェニック動物は、例えばＰＤＧＦα受容体／ＣｒｅＥＲＴ２マウスとＰＬＰ／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰの交配から生じた、ダブルトランスジェニックＰＤＧＦα受容体／ＣｒｅＥＲＴ２  ＰＬＰ／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰマウスである（Ｌｉｎら、（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１００７４−１００８３；ダブルトランスジェニック動物を産生するための当該分野で公知の方法を教示）。
【００９４】
このダブルトランスジェニックマウスは、ＰＤＧＦα受容体遺伝子の利用に基づいて、前駆体オリゴデンドロサイトではあるが成熟オリゴデンドロサイトではないような、ＣｒｅＥＲＴ２の時間的な発現が可能である。マーカー遺伝子は、ＰＬＰプロモーターのコントロール下にあり、そしてミエリン化オリゴデンドロサイトにおいて発現する。Ｃｒｅリコンビナーゼの誘導なしで、そのマウスはミエリン化オリゴデンドロサイトにおいて第１のマーカータンパク質（例えばｍＣｈｅｒｒｙ）を発現する。そのマウスを、Ｃｒｅ活性を誘導するタモキシフェンで処置し得る。Ｃｒｅ活性は、第２のマーカータンパク質（例えばＥＧＦＰ）の発現を引き起こし得る。
【００９５】
このシステムを用いて、脱髄傷害の前にマウスをタモキシフェンで処置し、そして次いで第１および第２のマーカータンパク質の発現を検出することによって、発生的ミエリン化および再ミエリン化オリゴデンドロサイトを区別し得る。上記で議論したように、タモキシフェン処置は、別々の蛍光マーカータンパク質（例えばｍＣｈｅｒｒｙ）をコードする２つの遺伝子のうち第１のものに隣接するＬｏｘ認識部位を認識し、そしてそれに作用するＣｒｅリコンビナーゼを誘導する。この第１のマーカー遺伝子は、終了または停止シグナルを含み、従って当該第１の遺伝子がＣｒｅによる組換えをうけた場合、その遺伝子および停止シグナルの両方が切除され、それによって生じる導入遺伝子は第２の蛍光マーカー（例えばＥＧＦＰ）に作動可能に連結し、そしてその発現を行うＰＬＰプロモーターエレメントを含む。脱髄傷害後、Ｃｒｅ構築物を含むオリゴデンドロサイト前駆細胞は、第２の蛍光マーカーの発現を可能にする。結果として、これらの動物において、発生的ミエリンは、第１のマーカータンパク質によって蛍光を発し（例えば、もしｍＣｈｅｒｒｙが第１のマーカー遺伝子なら赤色）、そして「再ミエリン」は第２の蛍光タンパク質によって蛍光を発する（例えば、もしＥＧＦＰが第２のマーカー遺伝子なら緑色）。あるいは、脱髄傷害後あらゆる時点でタモキシフェンをマウスに投与し得、それはＣｒｅＥＲＴ２リコンビナーゼを活性化する。
【００９６】
試験動物において脱髄を誘導する多くの方法が確立されている。例えば、ニューロンの脱髄を、病原体または物理的損傷、試験動物において炎症および／または自己免疫反応を誘導する物質によって与え得る。好ましい方法は、ＩＦＮ−γクプリゾン（ビス−シクロヘキサノンオキサルジヒドラゾン）、リゾレシチン、またはエチジウムブロマイドを含むがこれに限らない脱髄誘導物質を採用する。クプリゾン誘導脱髄モデルは、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａら、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１１：１０７−１１６（２００１）において記載されている。この方法において、典型的には試験動物にクプリゾンを含む食餌を、約１から約１０週の範囲で数週間与える。当業者は、この点で、末梢または中枢神経系において脱髄を誘導するための、当該分野で公知のあらゆる方法を、脱髄傷害を誘導する手段として置き換え得ることを認識する。
【００９７】
試験動物における脱髄状態は、一般的に神経系（例えば中枢または末梢神経系）におけるミエリン化軸索の減少、またはオリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞のようなミエリン化細胞のマーカーのレベルにおける減少を指す。望ましいなら、当該分野で公知の方法によって、脱髄を特徴付けし得る。形態学的に、ニューロンの脱髄を、中枢神経系におけるオリゴデンドロサイト、または末梢神経系ににおけるシュワン細胞の喪失によって特徴付けし得る。それをまた、神経系におけるミエリン化軸索の減少、またはオリゴデンドロサイトまたはシュワン細胞マーカーのレベルの減少によって決定し得る。オリゴデンドロサイトまたはシュワン細胞の代表的なマーカータンパク質は、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトース転移酵素（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、オリゴデンドロサイト−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）を含むがこれに限らない。そのようであるので、本発明の方法によって同定された候補薬剤は、ニューロンの脱髄の有害な形態学的特徴を阻害し得る物質を含む。
【００９８】
適当な方法による脱髄状態の誘導後、その動物を十分な時間回復させ、以前に脱髄した病変における、またはその付近の再ミエリン化を可能にする。再ミエリン化軸索の発達に必要な時間は、異なる動物の間で異なるが、それは一般的に少なくとも約１週間、より多くの場合少なくとも約２から１０週間、そしてさらにより多くの場合約４から約１０週間を必要とする。
【００９９】
上記で記載したような第２のマーカータンパク質（例えばＥＧＦＰ）の発現によるように、マーカー遺伝子／遺伝子産物の細胞特異的発現の増加を観察することによって（例えば中枢神経または末梢神経系における）、再ミエリン化を確認し得る。本明細書中の１つまたはそれ以上の方法において、脱髄またはミエリン形成を同定しようとする場合、様々なマーカーが当該分野において利用可能である。ミエリン化細胞を同定する代表的なマーカーは、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトース転移酵素（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、オリゴデンドロサイト−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）を含むがこれに限らない。
【０１００】
傷害に続いて、および再ミエリン化が起こるのに十分な時間の後、マーカータンパク質の蛍光を、小動物における蛍光の検出に関して当該分野で公知のインビトロまたはインビボの方法を用いて検出し得る。インビボにおける蛍光を、関連する分野において利用可能な装置を利用して検出および／または定量し得る。例えば、視覚化システムと組み合わせた、パルスレーザーダイオードおよび時間相関単一光子計数検出システムを用いて、組織からの蛍光発光のレベルを検出し得る。（Ｇａｌｌａｎｔら、Ａｎｎｕａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（２００４）；Ｃｏｎｔａｇら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：５９３−６０３（１９９５）；Ｓｃｈｉｎｄｅｈｕｔｔｅら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３：１０−１５（２００５））。組織−空気界面における後方反射光子からの大きなシグナルを避けるために、検出ポイントは光源点の右３ｍｍに位置する。レーザーおよびフィルター両方の波長の選択は、選択した蛍光マーカーに依存する。生物学的組織の吸収が低い場合、大きな組織深度（例えばレーザー出力に依存して２、３から数センチメートル）からの蛍光シグナルをインビボイメージングのために検出し得る。
【０１０１】
イメージングするマウスを、イソフルラン／酸素で麻酔し、そしてイメージングステージに置き得る。腹側および背側の画像を、関連する分野において利用可能なイメージングシステムを用いて、様々な時点で採取し得る（例えばＩＶＩＳイメージングシステム、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）。様々な標的組織からの蛍光をイメージングおよび定量し得る。例えば、シグナル強度を、平均＋／−平均についての標準誤差として、文字または図で示し得る。蛍光シグナルを、ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔ検定による分散分析によって分析して、０時および続く各時点における、所定のマーカーに関する蛍光シグナル間の違いを評価し得る。
【０１０２】
蛍光の視覚化、イメージングまたは検出を、当該分野で公知の、および本明細書中、前述で記載された方法を用いて行い得る。視覚化、イメージングまたは検出を、侵襲的、最小限に侵襲的、または非侵襲的な技術によって行い得る。典型的には、顕微鏡技術を利用して、トランスジェニック動物から得られた細胞／組織からの、生きた細胞からの、またはインビボイメージング技術による蛍光を検出またはイメージングする。前出、「一般的な方法論」。
【０１０３】
発光、蛍光、または生物発光シグナルを、蛍光マルチウェルプレートリーダー、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）およびシグナルの空間分解能を提供する自動化された細胞に基づくイメージングシステムを含む、様々な自動化および／またはハイスループット計測システムのいずれか１つによって容易に検出および定量する。Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＴＴＰ、Ｑ３ＤＭ、Ｅｖｏｔｅｃ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＩｍａｇｉｎｇおよびＺｅｉｓｓによって開発された、自動化蛍光イメージングおよび自動化顕微鏡システムを含む、様々な計測システムが、検出を自動化するために開発された。蛍光退色後回復測定（ＦＲＡＰ）および微速度蛍光顕微鏡も、生きた細胞においてタンパク質の移動度を研究するために使用した。
【０１０４】
動物から得られた細胞／組織サンプルを調査することによって（例えば切片を作り、そして共焦点顕微鏡を用いてイメージングすることによって）、生きた細胞を調査することによって、またはインビボにおける蛍光の検出によって、蛍光の視覚化（例えば蛍光タンパク質をコードするマーカー遺伝子）を、顕微鏡技術によって行い得る。視覚化技術は、当該分野で公知の、共焦点顕微鏡またはフォトオプティカル（ｐｈｏｔｏ−ｏｐｔｉｃａｌ）走査技術の利用を含むがこれに限らない。一般的に、バックグラウンドノイズを増加させる、散乱および自己蛍光が両方とも、波長が増加するにつれて抑制されるので、近赤外線の発光波長を有する蛍光標識が、深部組織イメージングにより適している。Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．１０：４１２０７（２００５）；Ｚｈａｎｇら、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐ．３１：１０５４−１０６４（２００３）；Ｆｌｕｓｂｅｒｇら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．２：９４１−９５０（２００５）；Ｍｅｈｔａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１４：６１７−６２８（２００４）；Ｊｕｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９２：３１２１−３１３３（２００４）；米国特許第６９７７７３３号および同第６８３９５８６号によって開示されるような、インビボイメージングの例が当該分野で公知であり、それらの開示はそれぞれ本明細書中で参考として援用される。
【０１０５】
インビボイメージング過程の１つの例は、インビボイメージング実験の前１週間を含み、脱毛剤（Ｎａｉｒ、Ｃａｒｔｅｒ−Ｗａｌｌａｃｅ  Ｉｎｃ．）を用いて、休止期の背側の毛を脱毛する（約２．５ｃｍ×２．５ｃｍの領域）。イメージング実験の日に、そのマウスを麻酔し、そしてその背側の皮膚を顕微鏡ステージの顕微鏡カバーガラスに置く。表皮の脱毛領域を、５０Ｗ水銀灯で照射し、そして１０倍の対物レンズおよびＬＰ５２０エミッションフィルター（Ｚｅｉｓｓ）を有する倒立レーザー走査共焦点蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０）を用いてスキャンする。アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）のようなレーザーおよび１０倍の対物レンズが、深部組織から表皮細胞に、より有効に蛍光発光をイメージングし得る。増強されたエミッターまたはより長い波長のエミッターを利用することによって、より深部の組織のイメージングの感受性を増強し得る。あるいは、マウスのような小動物を、様々な異なる位置（例えば背側、腹側等）を利用して容易に走査／イメージングし得る。インビボイメージングは、肝臓のような深部組織領域でさえ有効であった（例えばＺｈａｎｇら、前出）。
【０１０６】
ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でマウントした細胞／組織切片を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ蛍光顕微鏡で視覚化し得る。Ｏｐｅｎ  Ｌａｂソフトウェアスイートを用いて、アップルマッキントッシュコンピューターに接続したＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＰＸＬ  ＣＣＤカメラを用いて画像を捕捉し得る。０．０４ｍｍ２の領域に限定された、脳梁の正中における陽性細胞を計測することによって、異なる波長の蛍光を検出および定量する。蛍光または共焦点顕微鏡を利用する、インビトロで組織／細胞からの蛍光のレベルを検出および測定するためのさらなる方法が、当該分野で公知であり、そして上記の本明細書中で開示された１つまたはそれ以上のマーカータンパク質からの蛍光を検出または測定することにおいて利用し得る。
【０１０７】
別の例において、落射蛍光励起および発光経路において、神経細胞を、Ｌｕｄｌフィルターホイールを備えたＡｘｉｏｖｅｒｔ  Ｓ１００  ＴＶ  倒立顕微鏡でイメージングし得る（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）、そして冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｍｉｃｒｏ−ＭＡＸＯ；Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔｒｅｎｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用して画像を採取し得る。２つの異なる蛍光タンパク質のシグナルを単離するために、特異的な励起および発光フィルターおよび共通の二色性エレメントを使用し得る（ＨＱＦＩＴＣおよびテキサスレッド励起および発光フィルター、およびＦＩＴＣ／テキサスレッド  Ｖ３  ダイクロイック；Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ、ＶＴ、ＵＳＡ）。フィルターホイールおよびカメラを、ソフトウェアによってコントロールし得る（例えばＩＰＬａｂｓソフトウェア、Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｆａｉｒｆａｘ、ＶＡ、ＵＳＡ）。赤色および緑色蛍光画像のセットを採取して、赤色または緑色蛍光を有する細胞の相対的パーセンテージを分析し得る。ＩＰＬａｂｓおよびＡｄｏｂｅ  ＩｎＤｅｓｉｇｎソフトウェアによって、画像を分析し、公開のために準備し得る。画像の操作を、赤色および緑色蛍光タンパク質のグレースケール画像を重ね合わせてＲＧＢカラーファイルを作成すること、最終的なプリントアウトの明度／コントラストを調整して顕微鏡で観察されたものに最も近く合わせること、および文字の配置およびスケールバーの追加に限定し得る。蛍光顕微鏡の装置は、当該分野で公知であり、そして市販で入手可能である。例えば、ウェブサイト＜ｃｏｎｆｏｃａｌ−ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．ｃｏｍ／ｗｅｂｓｉｔｅ／ｓｃ＿ｌｌｔ．ｎｓｆ．＞を参照のこと。
【０１０８】
別の実施態様において、蛍光の検出は網膜または角膜から直接的である。網膜部位は、全身性の毒性を研究するための非侵襲的な部位である。角膜は、体に侵入せずに、グリア細胞を含む臓器に対して直接適用された物質の毒性を評価するために、特にふさわしい。従って、マーカータンパク質を異なって発現する神経細胞から放出された蛍光を、レーザービームを望ましい領域に向けて、そして放出された蛍光のレベルを検出することにより、網膜または角膜の共焦点顕微鏡を用いることによって検出し得る。
【０１０９】
さらに、脱髄／再ミエリン化現象を、当該分野で公知の免疫組織化学的手段またはタンパク質分析によって観察し得る。例えば、試験動物の脳の切片を、オリゴデンドロサイトマーカーを特異的に認識する抗体で染色し得る。別の局面において、オリゴデンドロサイトマーカーの発現レベルを、イムノブロッティング、ハイブリダイゼーション手段、および増幅手順、および当該分野でよく確立された他の方法によって定量し得る。例えば、Ｍｕｋｏｕｙａｍａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０３：１５５１−１５５６（２００６）；Ｚｈａｎｇら、前出；Ｇｉｒａｒｄら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：７９２４−７９３３（２００５）；および米国特許第６，９０９，０３１；６，８９１，０８１；６，９０３，２４４；６，９０５，８２３；６，７８１，０２９；および６，７５３，４５６号、それらのそれぞれの開示は、本明細書中で参考文献に組み込まれる。
【０１１０】
別の局面において、中枢または末梢神経系の細胞／組織を切除し、そしてタンパク質に関して処理し得る、例えば組織をホモジナイズし、そしてタンパク質をＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、そして次いでニトロセルロース膜に移してマーカータンパク質を検出する。蛍光タンパク質レベルを、一次抗体／抗血清（例えば特定のマーカータンパク質に対して産生されたヤギポリクローナル（ＢＤ  Ｇｅｎｔｅｓｔ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）およびペルオキシダーゼ結合二次抗体（例えばウサギ抗ヤギＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を利用して検出し得る。当該分野で利用可能な標準的な試薬を用いて化学発光を検出し、そして組織サンプル中の蛍光マーカータンパク質のレベルを決定する。
【０１１１】
従って、候補治療薬／薬剤を、本発明の１つまたはそれ以上の方法においてアッセイするなら、異なる時点で比較して、かつ参照またはコントロールと比較して、薬剤に反応して全体的な差異が存在するかどうかを決定し得る。まとめると、例えば様々なデータを得るために前述の例のトランスジェニック動物を用いて、単一のグリア細胞の亜集団（例えば前駆オリゴデンドロサイト）において異なって発現するマーカーの発現を検出および定量することによって、傷害後に再ミエリン化が起こるかどうか、および候補薬剤がそのような再ミエリン化を調節するかどうか、およびどの程度まで調節するかを決定し得る。もちろん、当業者は、前述のものは、本発明の再ミエリン化モデル系を利用する単なる１つの例であることを認識する。
【０１１２】
細胞に基づくアッセイ：
本発明のいくつかの局面において、本発明のトランスジェニック動物は、細胞／組織培養の供給源であり得る。例えば、本発明の実施は、コントロール細胞と比較した、試験神経細胞（例えばトランスジェニックオリゴデンドロサイトまたはシュワン細胞）における遺伝子または遺伝子産物の発現、または当該遺伝子産物の活性の比較を提供するための、細胞に基づくアッセイを含み得る。本発明で使用する試験神経細胞を、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）から単離し得、そしてトランスジェニック動物の細胞、その子孫、およびその供給源から調製した切片またはスメア、またはＣＮＳまたはＰＮＳのあらゆる他のサンプル、例えばオリゴデンドロサイト、シュワン細胞、またはニューロン；成熟または未成熟細胞由来の細胞培養を含む。望ましい場合、実質的にニューロン、ミクログリア細胞、および星状細胞のような他の神経細胞型を含まない、濃縮細胞培養を使用することを選択し得る。成熟オリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞を単離、産生、または維持する様々な方法が当該分野で公知であり（Ｂａｅｒｗａｌｄら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５２：２３０−２３９（１９９８）；Ｌｅｖｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．６８：２１−２６（１９９８））、そして本明細書中で例示される。
【０１１３】
１つの実施態様において、本発明は、再ミエリン化を調節する生物学的に活性な候補薬剤を同定する方法を提供する。その方法は、（ａ）マーカータンパク質を差示的に発現し得る、本発明のトランスジェニック動物由来の神経細胞を得る、または単離する、およびそのような細胞を培養する工程；（ｂ）候補薬剤を培養神経細胞と接触させる工程；（ｃ）コントロール細胞と比較して、遺伝子または遺伝子産物の発現の変化、または当該遺伝子産物の活性の変化を検出する工程（当該遺伝子または遺伝子産物は、再ミエリン化の調節と関連する）；および（ｄ）当該コントロール細胞と比較して、当該遺伝子または遺伝子産物の発現レベルが調節されたなら、当該薬剤を候補として選択する工程を含む。
【０１１４】
別の実施態様において、本発明は、ニューロンの再ミエリン化を促進する生物学的に活性な薬剤を同定する方法を提供する。その方法は、（ａ）本発明のトランスジェニック動物に存在する脱髄病変から神経細胞を得る、単離する、および培養する工程；（ｂ）生物学的に活性な候補薬剤を、培養神経細胞と接触させる工程；および（ｃ）コントロール細胞と比較して、遺伝子または遺伝子産物の発現の変化、または当該遺伝子産物の活性の変化を検出する工程（当該遺伝子または遺伝子産物は、再ミエリン化と関連する）；および（ｄ）当該コントロール細胞と比較して、当該遺伝子または遺伝子産物の発現レベル、または当該遺伝子産物の活性のレベルが増加したなら、当該薬剤を候補として選択する工程を含む。ある実施態様において、その神経系が活発にミエリン形成を行っている若い対象由来のミエリン化細胞を採用することが好ましくあり得る。他の実施態様において、病原体または物理的損傷を与えられた病変、およびクプリゾンのような毒性薬剤によって引き起こされた病変を含むがこれに限らない、脱髄病変における成人オリゴデンドロサイト前駆体由来の再ミエリン化細胞を使用することが好ましくあり得る。
【０１１５】
あるいは、単一の「ノックイン」遺伝子（例えばＰＤＧＦα／リコンビナーゼまたはＰＬＰ／ストップライト）を含む、本発明のトランスジェニック動物から神経細胞を単離および培養し得る。そのような神経細胞を、遺伝的に改変し得る。例えば、望ましい遺伝子構築物を含む遺伝的媒体を細胞に導入することによって、神経細胞の新しい変異体を産生し得る。例えば、誘導性ＰＤＧＦα／リコンビナーゼ遺伝子構築物を含むトランスジェニック動物から得た神経細胞を、ＰＬＰ／ストップライト構築物を含む遺伝的媒体でトランスフェクトし得る。あるいは、トランスジェニック動物から得た神経細胞を、望ましい産物をコードする誘導性遺伝子、および１つまたはそれ以上のレポーター遺伝子をコードする発現構築物を含むバイシストロニックな遺伝的媒体でトランスフェクトし得る。それに加えて、単離した細胞を、複数の遺伝的媒体で同時トランスフェクトし得る（例えばそれぞれ望ましい産物をコードする遺伝子構築物および１つまたはそれ以上のレポーター遺伝子をコードする遺伝子構築物を含む２つのベクター）。
【０１１６】
適当なコントロール細胞または組織の選択は、第１に選択された試験細胞または組織、および調査中のその表現型または遺伝子型の特徴に依存する。試験再ミエリン化細胞を試験化合物と接触させるのに対して、コントロール細胞または組織は未処理の対応物であり得る。試験再ミエリン化細胞が脱髄後に検出された試験細胞であるのに対して、コントロール細胞は未処理の対応物であり得る。試験細胞およびコントロールを平行して分析することが一般的に好ましい。
【０１１７】
本発明の目的のために、ニューロンの再ミエリン化を調節するのに有効な生物学的に活性な薬剤は、単純な、または複雑な有機または無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質（例えば抗体）、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、またはポリヌクレオチド（例えばアンチセンス）のような、生物学的または化学的化合物を含むよう意図されるが、これに限らない。
【０１１８】
広範な化合物、例えばポリペプチドおよびポリヌクレオチドのようなポリマー、および様々なコア構造に基づく合成有機化合物を合成し得、そしてそれらも本明細書中で企図される。それに加えて、植物または動物抽出物等のような、様々な天然の供給源が、スクリーニングのための化合物を提供し得る。常に明確に述べられるわけではないが、その活性薬剤を単独で、または本発明のスクリーニング法によって同定された薬剤と同じまたは異なる生物学的活性を有する、別の調節剤と組み合わせて使用し得ることが理解される。
【０１１９】
その生物学的に活性な薬剤が、裸のＲＮＡ以外の組成物である場合、その薬剤を細胞培養に直接加え得る、または添加のための培地に加え得る。当業者に明らかであるように、経験的に決定し得る「有効な」量を加えなければならない。その薬剤がポリヌクレオチドである場合、それをトランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって細胞に直接導入し得る。あるいは、遺伝子伝達媒体または上記で記載した他の方法を用いて細胞に挿入し得る。
【０１２０】
タンパク質レベルを検出するために適当な、広く様々な標識が当該分野で公知である。制限しない例は、放射性同位体、酵素、コロイド金属、蛍光化合物、生物発光化合物、および化学発光化合物を含む。
【０１２１】
本発明の方法によって同定された生物学的に活性な候補薬剤を、以下の２つの種類に大きく分類し得る。第１の種類は、細胞または患者に投与された場合、再ミエリン化神経細胞に特異的なマーカー遺伝子の発現または活性のレベルを抑制する薬剤を含む。第２の種類は、再ミエリン化神経細胞に特異的なマーカー遺伝子の発現または活性のレベルを増強する薬剤を含む。
【０１２２】
上記の項で議論したように、これらの細胞は、ニューロン再ミエリン化状態の分子的基礎を解明するための細胞に基づくアッセイを行うために、およびニューロンの脱髄を阻害する、または再ミエリン化を促進するのに有効な薬剤をアッセイするために、特に有用である。
【０１２３】
従って、候補治療薬／薬剤を本発明の１つまたはそれ以上の方法でアッセイするなら、異なる時点と比較して、および参照またはコントロールと比較して、薬剤に反応して全体として差異があるかどうかを決定し得る。まとめると、単一のグリア細胞の亜集団（例えば前駆オリゴデンドロサイト）において異なって発現するマーカーの発現を検出および定量することによって、前述の例のトランスジェニック動物を使用して、再ミエリン化が傷害後起こるかどうか、および候補薬剤がそのような再ミエリン化を調節するかどうか、およびどの程度調節するかを含む、様々なデータを得る。もちろん、当業者は、前述のものは、本発明の再ミエリン化モデル系を利用する単なる１つの例であることを認識する。
【０１２４】
細胞運命マッピング：
別の局面において、本発明の遺伝子構築物を利用して、細胞／組織系統を追跡または規定し得る。ある細胞系統または組織由来の、規定された細胞集団の単離または同定は、細胞分化および発達を分析するための必要条件である。例えば、系統をトレースすることは、幹細胞由来細胞の分析を必要する適用の設計において重要であり、そのような適用は、選択された胚細胞クローンから細胞分化をトレースすること、または適当なプロモーターを有するストップライト構築物を含むマウスをＣｒｅ発現マウスと交配する場合にインビボで発現を評価することを含む。この後者のシナリオにおいて、Ｃｒｅは発達の間に特定の細胞において条件的に発現し、そしてこの細胞由来の誘導体が検出される（例えばＥＧＦＰによって）。言い換えると、上記で記載したＰＤＧＦα受容体／Ｃｒｅと同様に、例えばＷｎｔ１−Ｃｒｅを用いて神経外胚葉性誘導体を、ＲＡＲβ２−Ｃｒｅを用いて中胚葉性誘導体を、または内分泌においてＰａｘ４−Ｃｒｅを用いて内胚葉性起源の膵臓を追跡するために、組織特異的プロモーターを有するストップライトマウスを、条件的Ｃｒｅマウスと交配し得る。
【０１２５】
従って、いくつかの実施態様において、構築物のためのプロモーターエレメント−ＰＤＧＦα受容体／ＣｒｅＥＲＴ２および／またはＰＬＰ／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ−を、例えば胚性幹細胞および子孫細胞において、「フロックスの」レポーターを発現する構成的プロモーターで置換し得、そして続いてＣｒｅ組換え、例えばストップライト構築物の第２の蛍光マーカーの発現を引き起こすＣｒｅ発現を誘導することによって同定し得る。さらなる実施態様において、ストップライトおよびＣｒｅ構築物を、望ましいあらゆる細胞または組織特異的なプロモーターを含むように改変し得る。そのようなプロモーターは当該分野で公知である。そのようであるので、Ｃｒｅ−ストップライトシステムを利用して、Ｃｒｅの条件的発現および生じた２つの蛍光マーカーのうち１つの異なった発現によって、細胞の系統をトレースし得る。従って、その条件的発現システムは、単一細胞の標識（例えばｍＣｈｅｒｒｙ発現）および続くそのクローン系統のトレースを可能にし、それによってＣｒｅ組換えは幹細胞クローン由来の誘導体細胞の遺伝的標識を可能にする（例えばＥＧＦＰ発現）。
【０１２６】
Ｃｒｅまたはストップライト構築物において利用し得るプロモーターエレメントは、ドパミン作動性、セロトニン作動性、ＧＡＢＡ作動性、コリン作動性、またはペプチド作動性のニューロンおよびその亜集団；神経細胞、特にグリア細胞、より具体的にはオリゴデンドロサイト、星状細胞、およびその亜集団；神経伝達物質特異的受容体、イオンチャネル、イオンチャネルゲーティングに関与する受容体、サイトカイン、成長因子およびホルモンにおいて特異的に活性なプロモーターおよび／またはエンハンサー、および当該分野で公知のもの、またはＰａｔｔｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２３１１１−２３１１８（１９９５）；米国特許第６４７２５２０号、同第７０２２３１９号、同第７０３３５９５号、米国特許出願公開第２００６００５２３２７号、同第２００６００４０３８６号、同第２００６００３４７６７号、同第２００６００３０５４１号の開示において開示されたものを含むがこれに限らず、これらは全て本明細書中で参考文献に組み込まれる。
【０１２７】
他の実施態様において、筋肉、腎臓、肝臓、脾臓、心臓、肺、脳、中枢神経系、末梢神経系、視神経、眼、網膜、リンパ組織、胸腺、甲状腺、副甲状腺、消化管、胃、前立腺、精巣、卵巣、真皮、皮膚、生殖器、内皮細胞または脈管構造を含む、組織／臓器で起こる再生を定義するために異なる前駆細胞を利用して、細胞運命マッピングを行い得る。例えば、本明細書中で記載した、および当該分野で公知の細胞／組織特異的プロモーターを含む、ｌｏｘＰ導入した構築物を利用して、細胞培養またはインビボで起こる細胞／組織再生において観察される細胞系統を定義し得る。言い換えると、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントを、ｌｏｘＰ導入したベクターおよび／またはｌｏｘＰ導入したベクターに存在する隣接配列に特異的なリコンビナーゼを発現するベクターに組込みうる。部位特異的リコンビナーゼの例は当該分野で公知であり、そして本明細書中で記載される。
【０１２８】
従って、いくつかの実施態様において、筋肉、腎臓、肝臓、脾臓、心臓、肺、脳、中枢神経系、末梢神経系、視神経、眼、網膜、リンパ組織、胸腺、甲状腺、副甲状腺、消化管、胃、前立腺、精巣、卵巣、真皮、皮膚、生殖器、内皮細胞または脈管構造を含む、組織／臓器で起こる、細胞／組織の再生を、比色定量顕微鏡によって検出する場合、細胞系統を、観察される異なる検出可能なシグナルに基づいて決定し得る（例えば、ｌｏｘＰ導入された構築物にコードされた検出可能なシグナル）。
【０１２９】
本発明の方法において利用し得るプロモーターの制限しない例は、脱共役タンパク質３、αヒト葉酸受容体、乳清酸性タンパク質の遺伝子由来のプロモーター、前立腺特異的プロモーターおよび米国特許第６，３１３，３７３号で開示されたもの、および遺伝子／活性によって分類された１５，０００以上の異なるプロモーター配列のデータベースである、＜ｂｉｏｂａｓｅ／ｄｅ／ｐａｇｅｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｔｒａｎｓｐｏｒ．ｈｔｍｌ＞でオンラインで開示されているもの；およびＣｈｅｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２００６、３４：Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０４−１０７で開示されているものを含む；ウェブサイト＜ｔｉｐｒｏｄ．ｃｂｉ．ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ：８０８０／ｉｎｄｅｘ＞も参照のこと、これもある細胞／組織に特異的な遺伝子のプロモーターを列挙している。
【０１３０】
本発明の別の局面において、使用するプロモーターは、軸索切断後のニューロンに特異的であり得、従って、損傷後の軸索の修復をモニターし得る。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼは、軸索切断後に誘導される遺伝子のプロモーターのコントロール下にあり得る。そのような遺伝子の例は、レチノイン酸結合タンパク質２、レチノール結合タンパク質１、腫瘍関連糖タンパク質ｐＥ４、内皮単球活性化ポリペプチド、ニューロリシン（メタロペプチダーゼＭ３ファミリー）、ＧＡＤＤ４５、モエシン、ＳＰＲＲ１、スフィンゴシンキナーゼ１、およびガラニンを含む（Ｗａｎｇら、Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７  印刷中（２００７））。Ｃｒｅリコンビナーゼは、Ｃｒｅの発現が前述の遺伝子のプロモーターによって誘導された場合に活性であり得る。ストップライト構築物は、Ｔａｕのもののような、ニューロン特異的プロモーターのコントロール下にあり得る。この例において、第１のマーカータンパク質は、ニューロン細胞に発現し、そして損傷後、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現が誘導され、第１のマーカー遺伝子が切除され（例えばｍＣｈｅｒｒｙ）、そして第２のマーカータンパク質（例えばＥＧＦＰ）が発現する（例えば図１３）。
【０１３１】
あるいは、ＣｒｅＥＲＴ２のような誘導性Ｃｒｅが、Ｎｅｓｔｉｎのようなニューロン前駆細胞プロモーターのコントロール下にあり、そしストップライトカセットが、Ｂｅｓｔ５、ＴＩＭＰ１、メタロチオネイン、ＡＴＦ３、モノグリセリドリパーゼ、ＰＴＰ非受容体５型、ＬＰＳ誘導ＴＮＦ因子、ＦＸＶＤイオン輸送ｒｅｇ７、およびプロリントランスポーターのような、発生の間および軸索の損傷後に発現が増加する遺伝子のプロモーターのコントロール下にある（Ｗａｎｇら、Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７  印刷中（２００７））。従って、第１のマーカータンパク質の発現は、発生中の軸索においてである。Ｃｒｅは、ＣｒｅＥＲＴ２に関するタモキシフェンのような、外因性の物質によって誘導され、そして細胞に損傷を与える。結果として、第１のマーカー遺伝子は切除され、そして再生軸索は第２のマーカータンパク質を発現する（図１４）。
【０１３２】
もちろん、細胞／組織特異的プロモーターの代わりに、またはそれに加えて、当該分野で公知の調節可能なプロモーターも利用し得ることが理解される。例えば、リコンビナーゼタンパク質をコードする構築物を、ｔｅｔ応答性プロモーターのような、調節可能なプロモーターに作動可能に連結し得る。従って、望ましい場所および時に、誘導性物質（例えばテトラサイクリンまたはそのアナログ）を細胞または対象に投与して、リコンビナーゼタンパク質の発現を誘導し得、それは次いでｌｏｘＰ導入した構築物に作用し、それも組織特異的または調節可能なプロモーターを含み得、従って検出可能なシグナルの異なった発現を引き起こす（例えばＥＧＦＰまたはＣｈｅｒｒｙ  Ｒｅｄ）。調節可能なプロモーターの例は、ＭＭＴＶ、熱ショック７０プロモーター、ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０プロモーター、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｅｎ）誘導性プロモーター（例えば銅誘導性ＡＣＥ１）、ホルモン応答エレメント（例えばグルココルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン）、および培養またはインビボで、哺乳類細胞において調節可能なプロモーターとして作用することが当該分野で公知のものを含むがこれに限らない。
【０１３３】
エキソビボにおける適用
本発明のいくつかの局面において、本発明のトランスジェニック動物からトランスジェニック細胞を得て、培養および増殖させ、標的タンパク質をコードする遺伝子で形質導入し、そして供給源の動物または他の動物に移植または再導入し得る。そのようなエキソビボの方法において、そのトランスジェニック細胞を、例えば試験遺伝子／タンパク質をマーカー遺伝子発現／産生の調節に関してアッセイするために、誘導性に産生し得る、生物学的に活性な薬剤をコードする遺伝子（例えば試験産物をコードする遺伝子）でトランスフェクトし得る。そのような調節を、上記の本明細書中で記載されたように、細胞培養においてアッセイし得る。あるいは、形質導入細胞を、対象動物に再導入し、ここでマーカー遺伝子発現をアッセイし、そしてコントロールまたは参照と比較し得る、ここで移植した細胞は形質導入されない、ベクターによる目的の産物を発現しない、目的のベクターによる産物を時間的にコントロールされた方式で発現する（例えば誘導性発現）、または目的の産物を構成的に発現する（例えばＣＭＶプロモーター）。
【０１３４】
例えばグリア細胞（例えばオリゴデンドロサイトまたはシュワン細胞）を、神経生検から得ることができる。細胞を培養中で増殖させ得る（例えば１０％熱不活性化胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含み、抗生物質、組換えＮｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、インスリンおよびフォルスコリン（１μｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭから成る増殖培地を利用する）。さらに、導入遺伝子によって提供される蛍光標識を利用して、非トランスジェニック神経細胞から、細胞を識別し得る（例えばＦＡＣＳ）。形質導入のために、目的の産物を伝達する、当該分野で公知の様々なベクター媒体で、細胞をトランスフェクトし得る。
【０１３５】
本発明の医薬品組成物
本明細書中で開示された発明の１つまたはそれ以上の方法を利用して、生物学的に活性な薬剤を選択し得、それは続いて脱髄の治療において道具となり得る。再ミエリン化の調節に有効な、選択された生物学的に活性な薬剤を、ニューロン脱髄疾患を治療するための薬物の調製に使用し得る。ある実施態様において、本明細書中で言及される脱髄疾患は、多発性硬化症である。他の実施態様において、その脱髄疾患は、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ疾患、白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アレキサンダー病、カナバン病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ペリツェウス・メルツバッハー病、レフサム病、コケイン症候群、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｎａｐｐ症候群、およびツェルウェガー症候群、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、および多巣性運動ニューロパシー（ＭＭＮ）から成る群から選択される。
【０１３６】
１つの局面において、本発明の同定／選択された生物学的に活性な薬剤を、細菌およびウイルスのような病原菌によって引き起こされたニューロンの脱髄を治療するために投与し得る。別の局面において、選択された薬剤を使用して、例えば橋中心髄鞘崩壊症およびビタミン欠乏症におけるような、毒性物質または体内における毒性代謝物の蓄積によって引き起こされたニューロンの脱髄を治療し得る。さらに別の局面において、その薬剤を使用して、脊髄損傷のような、物理的な損傷によって引き起こされた脱髄を治療し得る。さらにまた別の局面において、その薬剤を、白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、変性多系統萎縮症、ビンスワンガー脳症、中枢神経系における腫瘍、および多発性硬化症を含むがこれに限らない、遺伝的特質を有する疾患、遺伝的疾患において顕在化する脱髄を治療するために投与し得る。その薬剤をまた、再ミエリン化に影響を与える疾患、または虚血、脳卒中、またはアルツハイマー病のような、再ミエリン化に影響を与える低酸素状態、または損傷を治療するために投与し得る。
【０１３７】
本発明の同定／選択された生物学的に活性な薬剤を、成長因子、サイトカイン、神経成長因子、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗増殖剤、抗遊走剤、抗線維剤、アポトーシス促進剤、抗体、抗血栓剤、抗血小板剤、ＩＩｂＩＩＩａ薬剤、血管新生因子、抗血管新生薬剤、抗ウイルス剤、ＮＧＦファミリーのタンパク質、ＮＧＦ、ベータＮＧＦ、ニューロトロフィン３前駆体（ＮＴ−３）、ＨＤＮＦ、神経成長因子２（ＮＧＦ−２）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、またはその前駆体および組み合わせから選択し得るがこれに限らない、他の目的の産物と共に、その前に、またはそれに続いて伝達し得る。
【０１３８】
様々な伝達システム、例えばリポソームにおけるカプセル封入、微粒子、マイクロカプセル、組換え細胞による発現、受容体によるエンドサイトーシス（例えばＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての治療的核酸の構築等が公知であり、そして本発明の生物学的に活性な薬剤を投与するために使用し得る。伝達の方法は、動脈内、筋肉内、静脈内、鼻腔内、および経口経路を含むがこれに限らない。特定の実施態様において、本発明の医薬品組成物を、治療の必要がある領域に局所的に投与することが望ましくあり得る；これを、例えば、そして制限のためでなく、術中の局所注入によって、注射によって、またはカテーテルの手段によって達成し得る。ある実施態様において、その薬剤を、患者の神経系、好ましくは中枢神経系に伝達する。別の実施態様において、その薬剤を、再ミエリン化が起こっている神経組織に投与する。
【０１３９】
選択された薬剤の投与を、治療の過程を通して、１回投与で、連続的に、または間欠的に行い得る。最も有効な投与の手段および投与量を決定する方法は、当業者に周知であり、そして治療に使用する組成物、治療の目的、治療する標的細胞、および治療する対象によって変化する。単回または複数回投与を、治療する医師が選択した投与レベルおよびパターンで行い得る。
【０１４０】
本発明の医薬品組成物の調製を、医薬品調製物の調製に関して一般的に許容される手順によって行う。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０）、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ＰＡを参照のこと。意図される使用および投与の方式に依存して、医薬品組成物の調製において活性成分をさらに処理することが望ましくあり得る。適当な処理は、適当な無毒性および非干渉成分との混合、滅菌、投与単位への分割、および送達デバイスへの封入を含み得る。
【０１４１】
経口、鼻腔内、または局所投与のための医薬品組成物を、錠剤、カプセル、粉末、液体、および懸濁液を含む、固体、半固体、または液体形式で供給し得る。注射のための組成物を、液体溶液または懸濁液として、エマルションとして、または注射の前に液体に溶解または懸濁するために適当な固体形式として供給し得る。気道による投与のために、好ましい組成物は、固体、粉末、または適当なエアロゾル化装置と共に使用した場合にエアロゾルを提供するものである。
【０１４２】
液体の薬学的に許容可能な組成物を、例えば、本明細書中で例示されたポリペプチドを、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、またはエタノールのような液体賦形剤に溶解または分散することによって調製し得る。その組成物は、他の医学的薬剤、医薬品、アジュバント、担体、および湿潤剤または乳化剤のような補助物質、およびｐＨ緩衝化物質も含み得る。
【実施例】
【０１４３】
実施例１：血小板由来成長因子受容体−アルファ（ＰＤＧＦＲ−α）をコードするマウス遺伝子へのＣｒｅＥＲＴ２ノックインのための、ターゲティング構築物の産生
ターゲティングベクターを構築するために使用する約１０．２ｋｂの領域を、最初に相同組換えに基づく技術を用いて、陽性と同定されたＣ５７ＢＬ／６ＢＡＣクローンからサブクローニングした。ＮｅｏおよびＣｒｅＥＲＴ２カセットに隣接するＦＬＰリコンビナーゼターゲット（ＦＲＴ）の５’まで、短いホモロジーアーム（ＳＡ）が１．６ｋｂ伸びるように、その領域を設計した。長いホモロジーアーム（ＬＡ）は、ＦＲＴ隣接ＮｅｏおよびＣｒｅＥＲＴ２カセットの３’側で終わり、そして約８．６ｋｂの長さである。この遺伝子のエキソン１を、ＦＲＴ隣接ＮｅｏおよびＣｒｅＥＲＴ２カセットで置換した（図４）。
【０１４４】
各改変工程の後に制限酵素分析によって、およびセレクションカセットからＬＡの３’末端（Ｎ２）およびＳＡの５’末端（Ｎ１）を読むように設計されたプライマーを用いた、またはベクター配列のＰ６およびＴ７にアニーリングし、そしてＢＡＣサブクローンの５’および３’末端まで読むプライマーによる配列決定によって、ターゲティングベクターを確認した（図５）。
【０１４５】
エレクトロポレーションの前に構築物を再形質転換するために、ＢＡＣを、アンピシリンセレクションカセットを含む約２．４ｋｂ  ｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）バックボーンベクターにサブクローニングした。プロジェクト概略図で記載したように、ＦＲＴ隣接ネオマイシンカセットを遺伝子に挿入した（図４）。ＥＳ細胞へのエレクトロポレーションの前に、ターゲティング構築物を、ＮｏｔＩを用いて直線化し得る。ターゲティング構築物（ベクターバックボーンを含む）の全体の大きさは、約１７．６ｋｂである。
【０１４６】
実施例２：エレクトロポレーションおよびＰＤＧＦＲ−α／ＣｒｅＥＲＴ２組換えクローンに関するスクリーニング
実施例１のターゲティングベクター１０μｇを、ＮｏｔＩによって直線化し、そして次いでｉＴＬ  ＩＣ１  Ｃ５７ＢＬ／６胚性幹細胞のエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。Ｇ４１８抗生物質におけるセレクションの後、生き残ったクローンをＰＣＲ分析のために増殖させて組換えＥＳクローンを同定した。ターゲティング構築物を産生するために使用した領域の外側の短いホモロジーアーム（ＳＡ）に対して下流（３’）に、プライマーＡ１、Ａ２およびＡ３を設計した（図６）。Ｎｅｏカセットの５’末端におけるＬＡＮ１プライマーと共に、Ａ１、Ａ２、またはＡ３を用いたＰＣＲ反応は、それぞれ１．９、１．９、および２．０ｋｂの断片を増幅する。ターゲティング構築物を産生するために使用した領域の内側のＳＡの５’末端にある、プライマーペアＡＴ１およびＡＴ２を用いて、コントロールＰＣＲ反応を行った。これは１．５ｋｂのバンドを増幅する。ＰＣＲパラメーターは、９５℃で３０秒、６４℃で３０秒、７２℃で１５０秒を３５サイクルであった。
【０１４７】
個々のクローンを、Ａ１／ＬＡＮ１プライマーでスクリーニングした。組換えクローンを、１．９ｋｂのＰＣＲ断片によって同定した。陽性のコントロールは、陽性のプールしたサンプルであり、そして（＋）で示した（図７）。ＰＣＲ反応のコントロールを、スクリーニングおよび内部プライマーによって行った。
【０１４８】
組換えクローンを増殖および確認した。陽性クローン由来のＥＳ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃの着床前の胚の胞胚腔に注射した。いくつかのキメラ動物を産生した。これらのマウスを交配して生殖系統の伝達体（ｔｒａｎｓｍｉｔａｎｔ）を同定する。
【０１４９】
実施例３：レポーター遺伝子のターゲティング構築物の産生
レポーター遺伝子のターゲティング構築物を図８に示す。ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｆ（図９）およびｐＥＧＦＰ−Ｆ（図１０）プラスミドの制限酵素部位を、プラスミドをＡｃｃ６５ＩおよびＳｍａＩで消化することによって除去した。次いでＤＮＡをゲル抽出した。平滑末端ライゲーション（クレノウを用いて）を行って、Ａｃｃ６５Ｉ消化部位を埋め、そしてＤＮＡをゲル抽出した。平滑末端のベクターをライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。個々のコロニーに対してプラスミドの単離を行った。正しい切断パターンを有するプラスミド調製物を、プライマーＲＥＲＥＭ−Ｒ、Ｃｈｅｒｒｙ−ＦおよびＥＧＦＰ−Ｆで配列決定して、制限酵素部位の欠失を確認した。そのベクターを、ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｆ−ＲＥＲＥＭおよびｐＥＧＦＰ−Ｆ−ＲＥＲＥＭと名付けた。
【０１５０】
ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｆ−ＲＥＲＥＭおよびＥＧＦＰ−Ｆ−ＲＥＲＥＭを次いでｐＢＳ２４６にクローニングした（図１１）。ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｆ−ＲＥＲＥＭおよびｐＥＧＦＰ−Ｆ−ＲＥＲＥＭをどちらも、ＡｇｅＩおよびＭｌｕＩで消化し、そして約１．１ｋｂのＤＮＡ断片をゲル抽出した。ｐＢＳ２４６をＳｍａＩで消化し、そしてホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。そのＤＮＡをゲル抽出した。消化したｍＣｈｅｒｒｙ−Ｆ−ＲＥＲＥＭおよび消化したｐＢＳ２４６をライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。個々のコロニーについてプラスミド単離を行った。正しい切断パターンを有するプラスミド調製物を、プライマーＣｈｅｒｒｙ−ＦおよびＣｈｅｒｒｙ−Ｌｏｘ−Ｒで配列決定して、ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｆ−ＲＥＲＥＭが、ｐＢＳ２４６のＬｏｘＰ部位の間に正しく挿入されたことを確認した。その３．６ｋｂのベクターをｐＢＳ２４６−ｍＣｈｅｒｒｙと名付けた。ｐＢＳ２４６−ｍＣｈｅｒｒｙを、ＳｐｅＩで消化し、ホスファターゼで処理し、そしてゲル抽出した。消化したＥＧＦＰ−Ｆ−ＲＥＲＥＭを、消化したｐＢＳ２４６−ｍＣｈｅｒｒｙにライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。個々のコロニーについてプラスミド単離を行った。正しい切断パターンを有するプラスミド調製物を、プライマーＣｈｅｒｒｙ−Ｆ、Ｃｈｅｒｒｙ−Ｌｏｘ−Ｒ、ＥＧＦＰ−Ｆ、およびＥＧＦＰ−Ｒで配列決定して、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰがどちらも、ｐＢＳ２４６に正しく挿入されたことを確認した。その４．８ｋｂのベクターを、ｐＢＳ２４６−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＧＦＰと名付けた。
【０１５１】
ＰＣＰプロモーターカセット（図１２）への挿入のために制限酵素部位ＡｓｃＩおよびＰａｃＩを産生するために、ｐＢＳ２４６−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＧＦＰをＳｓｐＩおよびＮｏｔＩで消化し、そして３．７ｋｂのＤＮＡ挿入物をゲル抽出した。ｐＮＥＢ１９３をＳｍａＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてゲル抽出した。Ｌｏｘ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｌｏｘ−ＥＧＦＰ挿入物を、消化したｐＮＥＢ１９３にライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。個々のコロニーについてプラスミド単離を行った。正しい切断パターンを有するプラスミド調製物を、プライマーＣｈｅｒｒｙ−Ｆ、Ｃｈｅｒｒｙ−Ｒ、ＥＧＦＰ−Ｆ、およびＥＧＦＰ−Ｒで配列決定して、Ｌｏｘ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｌｏｘ−ＥＧＦＰが、ｐＮＥＢ１９３に正しく挿入されたことを確認した。その６ｋｂのベクターを、ｐＮＥＢ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＧＦＰと名付けた。ｐＮＥＢ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＧＦＰをＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化し、そしてゲル抽出した。
【０１５２】
ターゲティングベクターのためにＰＬＰ−ｎｅｏ−ＳＣ１０１ｏｒｉを構築するために、ｎｅｏカセット、Ｌｏｘ−ＦＲＴ−ｎｅｏ／Ｋａｎ−Ｌｏｘ−ＦＲＴを、ＢｓｉＷＩで消化し、平滑末端にし、そしてゲル抽出した。ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＶで消化し、そしてホスファターゼで処理した。消化したｎｅｏカセットを、ｐＢＲ３２２にライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。個々のコロニーについてプラスミド単離を行い、そしてｎｅｏカセットを消化によって確認した。その６．２ＫｂのベクターをｐＢＲＧと名付けた。ｎｅｏカセットから３’ＬｏｘＰ部位を除去するために、ｐＢＲＧをＳａｃＩＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、平滑末端にし、そしてゲル抽出し、ライゲーションし、そして形質転換した。個々のコロニーについてプラスミド単離を行った。正しい切断パターンを有するプラスミド調製物を、プライマーＮｅｏ−ＲＥＲＥＭ−ＦおよびＮ１で配列決定して、ｎｅｏカセットからの３’ＬｏｘＰ部位の除去を確認した。そのベクターを、ｐＧＬＯＸＯＵＴと名付けた。ＳＣ１０１ｏｒｉを増幅するためにプライマーを設計した。配列の５’末端にＮｈｅＩ部位を、および３’末端にＮｒｕＩ部位を加えるために、プライマーを遺伝子操作した。ＳＣ１０１ｏｒｉをＰＣＲ増幅し、そしてゲル抽出した。ＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＮｒｕＩで消化し、そしてゲル抽出した。ｐＧＬＯＸＯＵＴをＮｈｅＩおよびＮｒｕＩで消化し、そしてゲル抽出した。ＰＣＲ産物をｐＧＬＯＸＯＵＴにライゲーションし、そして形質転換した。個々のコロニーについてプラスミド単離を行い、そしてＳＣ１０１ｏｒｉの追加を消化によって確認した。そのベクターをｐＧＬＯＸＯＵＴ−ＳＣＯＲＩと名付けた。ｐＧＬＯＸＯＵＴ−ＳＣＯＲＩからｎｅｏカセット＋ＳＣ１０１ｏｒｉを増幅するために、プライマーを設計した。フォワードプライマーは、ｎｅｏカセット（５’ＬｏｘＰ部位の２ｂｐ下流、これはｎｅｏカセットから最後のＬｏｘＰ部位を除去する）に対する２０ｂｐの相同部分、およびＰＬＰカセットに対する６０ｂｐの相同部分を含み、ＳａｃＩＩ制限酵素部位の下流であった。リバースプライマーは、ＳＣ１０１ｏｒｉの３’末端に対する２０ｂｐの相同部分、およびＰＬＰカセットに対する６０ｂｐの相同部分を含み、ＡｐａＩ制限酵素部位の上流であった。続く組換え工程において使用した場合、ｎｅｏＲ−ＳＣ１０１ｏｒｉがＰＬＰカセットのＡｍｐＲおよびｐＵＣｏｒｉを置換する。そのＰＣＲ産物をＧ３Ｏ２と名付けた。個々のコロニーについてプラスミド単離を行ってＰＬＰ−Ｇ３Ｏ２を発見した。正しい切断パターンを有するプラスミド調製物を、プライマーＰＬＰ−ｓｅｑ−Ｒ、ＳＣＯＲＩ−Ｒ、Ｎ１およびＮｅｏ−ＲＥＲＥＭ−Ｆで配列決定して、ｎｅｏカセットが両方の隣接ＦＲＴ部位がそのままで挿入されたこと、および両方のＬｏｘＰ部位が存在しないこと確認し、およびＳＣ１０１ｏｒｉの存在、およびＰＬＰカセットが依然として正しい位置にあることを確認した。その１４．９Ｋｂのベクターを、ＰＬＰ−Ｇ３Ｏ２と名付けた。ＰＬＰ−Ｇ３Ｏ２をＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化し、そしてゲル抽出した。
【０１５３】
ＰＬＰ−Ｇ３Ｏ２を、ＡｓｃＩ／ＰａｃＩ消化ｌｏｘ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＧＦＰ−ｌｏｘ挿入物にライゲーションし、そして形質転換した。個々のコロニーについてプラスミド単離を行った。正しい切断パターンを有するプラスミド調製物を、ＡｐａＩおよびＭｌｕＩで消化して、導入遺伝子を除去した。その１８Ｋｂのベクターを、ＰＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＧＦＰ−ｎｅｏ−ＳＣＯＲＩと名付けた。その１５Ｋｂの導入遺伝子を、ゲル抽出した。ＰＬＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＥＧＦＰ、およびｎｅｏＲの存在を確認するために消化を行った。ゲル抽出したＤＮＡを、プライマーＮｅｏ−ＦＲＴ−Ｒ、ｎｅｏ−ＲＥＲＥＭ−Ｆ、Ｃｈｅｒｒｙ−Ｆ、Ｃｈｅｒｙｙ−Ｌｏｘ−Ｒ、ＥＧＦＰ−Ｆ、ＥＧＦＰ−Ｒ、ＰＬＰ−ｓｅｑ−Ｆ、およびＰＬＰ−ｓｅｑ−Ｒで配列決定して、ＦＲＴ−ｎｅｏ−ＦＲＴ、ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ、ＥＧＦＰ、およびＰＬＰの存在および位置を確認した。
【０１５４】
配列確認したＤＮＡを、ｉＴＬ  ＩＣ１  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションした。Ｇ４１８抗生物質におけるセレクションの後、生き残ったクローンをＰＣＲ分析のために増幅して、組換えＥＳクローンを同定した。
【０１５５】
その構築物はランダムに組み込まれ、そして陽性クローンを、ターゲティング構築物の完全性およびコピー数に関してスクリーニングする。組み込みが１回だけ起こったクローンを同定し、そしてＢＡＬＢ／ｃの着床前の胚の胞胚腔に注射した。
【０１５６】
実施例４：ＰＬＰ／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰマウスにおける脱髄の誘導および再ミエリン化の評価
実施例２で産生されたＰＤＧＦα受容体／ＣｒｅＥＲＴ２マウスを、実施例３で産生されたＰＬＰ／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰマウスと交配して、ダブルトランスジェニックマウスを産生する（ダブルトランスジェニックマウスを産生する方法は当該分野で公知である、例えばＬｉｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１００７４−１００８３（２００４）を参照のこと）。
【０１５７】
そのダブルトランスジェニックマウスのＰＤＧＦα受容体／ＣｒｅＥＲＴ２  ＰＬＰ／ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰは、ミエリン化細胞においてｍＣｈｅｒｒｙを発現する。脱髄傷害の前に、動物をタモキシフェンで処置して、成体オリゴデンドロサイト前駆細胞において、Ｃｒｅリコンビナーゼを誘導し、それはｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子を切り出す（図１−３）。したがって、オリゴデンドロサイト前駆細胞がミエリン化細胞へ成熟した場合に、Ｃｒｅ構築物を含むオリゴデンドロサイト前駆細胞のみが、ＥＧＦＰを発現し得る。
【０１５８】
脱髄を誘導するために、マウスに６週間まで０．２％のクプリゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）を含む製粉したマウス固形飼料の食餌を与える。続いて、３週間までマウスを正常の食餌に戻して、再ミエリン化を起こさせる。
【０１５９】
傷害に続いて、および再ミエリン化が起こるのに十分な時間の後、小動物における蛍光の検出に関して当該分野で公知のインビトロまたはインビボの方法を用いて、蛍光を検出する。イソフルラン／酸素で麻酔したマウスを、画像化ステージに置く。関連分野で利用可能なイメージングシステムを用いて（例えばＩＶＩＳイメージングシステム、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）、腹側および背側の画像を、様々な時点で得る
麻酔したマウスをまた、左心室を通じて、０．１ＭのＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドで灌流する。脳を除去し、パラホルムアルデヒドで固定し、３０％ショ糖中で凍結保存し、ＯＣＴに包埋し、そしてドライアイス上で凍結する。凍結切片を、クリオスタットで１０μｍの厚さに切断する。シドマン切片２４１−２５１に対応する、脳梁の脳弓領域における冠状切片を、使用のために選択し、そして全ての比較分析を、正中脳梁に制限する（Ｓｉｄｍａｎら、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（１９７１））。
【０１６０】
インビボにおける蛍光を、関連分野で利用可能な装置を利用して、検出および／または定量する。視覚化システムと組み合わせたパルスレーザーダイオードおよび時間相関単一光子計測検出システムを使用して、組織からの蛍光の放出のレベルを検出する（Ｇａｌｌａｎｔら、Ａｎｎｕａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（２００４）；Ｃｏｎｔａｇら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：５９３−６０３（１９９５）；Ｓｃｈｉｎｄｅｈｕｔｔｅら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２３：１０−１５（２００５））。組織−空気界面における後方反射光子からの大きなシグナルを避けるために、検出ポイントは光源点の右３ｍｍに位置する。レーザーおよびフィルター両方の波長の選択は、選択した蛍光マーカーに依存する。生物学的組織の吸収が低い場合、大きな組織深度（例えばレーザー出力に依存して２、３から数センチメートル）からの蛍光シグナルをインビボイメージングのために検出し得る。
【０１６１】
様々な標的組織からの蛍光をイメージングおよび定量する。シグナル強度を平均＋／−平均についての標準誤差として文字または図で示す。蛍光シグナルを、０時および続く各時点における、所定のマーカーに関する蛍光シグナル間の違いを評価するために、ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔ検定による分散の分析によって分析する。
【０１６２】
免疫組織化学のために、凍結切片を−２０℃のアセトンで処理し、１０％のＮＧＳおよび０．１％のＴｒｉｒｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで固定し、そして固定溶液で希釈した一次抗体と一晩インキュベートする。適当な蛍光色素または酵素標識した二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を検出のために使用する。細胞／組織切片を、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でマウントし、そしてＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ蛍光顕微鏡で視覚化する。Ｏｐｅｎ  Ｌａｂソフトウェアスイートを用いて、アップルマッキントッシュコンピューターと接続したＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＰＸＬ  ＣＣＤカメラを用いて画像を捕捉する。０．０４ｍｍ２の領域に限定された脳梁の正中において陽性細胞を計測することによって、異なる波長の蛍光を検出および定量する。蛍光または共焦点顕微鏡を利用した、インビトロにおいて組織／細胞からの蛍光レベルを検出および測定するためのさらなる方法が当該分野で公知であり、そして上記の本明細書中で開示された１つまたはそれ以上のマーカータンパク質からの蛍光を検出または測定するのに利用し得る。
【０１６３】
顕微鏡による蛍光の検出に加えて、中枢または末梢神経系からの細胞／組織を切除し、そしてタンパク質に関して処理する、例えば組織をホモジナイズし、そしてタンパク質をＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲルにおいて分離し、そして次いでニトロセルロース膜に移す。蛍光タンパク質レベルを、一次抗体／抗血清（例えば特定のマーカータンパク質に対して産生されたヤギポリクローナル；ＢＤ  Ｇｅｎｔｅｓｔ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）およびペルオキシダーゼ結合二次抗体ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を利用して検出する。当該分野で利用可能な、標準的な試薬を用いて、化学発光を検出して、組織サンプルにおける蛍光マーカータンパク質のレベルを検出および決定する。
【０１６４】
ＥＧＦＰは、再ミエリン化オリゴデンドロサイトにおいて特異的に蛍光または化学発光によって検出される。
【０１６５】
本発明は、上記で記載された実施態様に限定されず、添付の請求の範囲内で改変し得る。当業者は、単なる日常的な実験を用いて、本明細書中で記載された本発明の特定の実施態様の多くの同等物を認識する、またはそれを確認し得る。本発明から離れることなく、今や多くのバリエーション、変化、および置換が当業者に思い浮かぶ。本明細書中で記載された、本発明の実施態様の様々な代案を、本発明の実施において採用し得ることが理解される。以下の請求が本発明の範囲を規定すること、およびこれらの請求の範囲内の方法および構造、およびその同等物が、それによって含まれることが意図される。
【図１】
2010500039.tif 000002
【図２】
2010500039.tif 000003
【図３】
2010500039.tif 000004
【図４】
2010500039.tif 000005
【図５】
2010500039.tif 000006
【図６】
2010500039.tif 000007
【図７】
2010500039.tif 000008
【図８】
2010500039.tif 000009
【図９】
2010500039.tif 000010
【図１０】
2010500039.tif 000011
【図１１】
2010500039.tif 000012
【図１２】
2010500039.tif 000013
【図１３】
2010500039.tif 000014
【図１４】
2010500039.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月15日(2009.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010500039000001.app
【国際調査報告】
2010500039.tif 000016
2010500039.tif 000017
2010500039.tif 000018