(57)【要約】  作動可能な機能的遺伝子を欠如するように改変されたゲノムを含むビフィドバクテリウム属菌が開示される。そのような細胞を作製するための方法も開示される。本方法を使用すると、ｔｅｔＷなどのある種の機能的な抗生物質耐性遺伝子を欠如し、テトラサイクリンなどの抗生物質に感受性のあるビフィドバクテリウム属菌細胞が作製される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
作動可能な機能的遺伝子を欠如するように改変されたゲノムを含むビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム・アニマリス細胞である、請求項１に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス細胞である、請求項２に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ９０３４株である、請求項１に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項５】
前記機能的遺伝子が抗生物質耐性をもたらす、請求項１に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項６】
前記機能的遺伝子がｔｅｔＷである、請求項５に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項７】
作動可能なｔｅｔＷ遺伝子を含有する相当する細胞より、テトラサイクリンに対して少なくとも５倍の感受性がある、請求項６に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項８】
作動可能なｔｅｔＷ遺伝子を含有する相当する細胞より、テトラサイクリンに対して少なくとも１０倍の感受性がある、請求項７に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項９】
ディスク拡散アッセイを使用して決定される、１ミリリットル当たり約０．３マイクログラムを超えたテトラサイクリン濃度に感受性がある、請求項８に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項１０】
ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ９０３４株である、請求項９に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項１１】
前記ｔｅｔＷ遺伝子の核配列を実質的に欠如している、請求項１に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項１２】
そのゲノムの残部に実質的な変化がない、請求項１に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の細胞を含むビフィドバクテリウム・アニマリスの培養物。
【請求項１４】
作動可能な所定の機能的遺伝子を欠如するビフィドバクテリウム属菌細胞を産生するための方法であって、
ビフィドバクテリウム属菌から所定の機能的遺伝子の上流及び下流配列を取得するステップと、
前記機能的遺伝子の上流及び下流隣接配列と、選択マーカーをコードする遺伝子とを含む、ビフィドバクテリウム属菌中では複製しないプラスミドで、ビフィドバクテリウム属菌細胞の集団を形質転換するステップと、
プラスミド中の選択マーカーをコードする遺伝子を含有する細胞の増殖は可能であるが、選択マーカーをコードする遺伝子を有しないその細胞の増殖は可能ではない条件下で前記ビフィドバクテリウム属菌細胞を増殖させ、それにより、組込みプラスミドを含有する形質転換体を選択するステップと、
前記細胞の増殖を可能にするが、前記組込みプラスミドの喪失を許容する非選択的条件下で前記形質転換体を増殖させるステップと、
選択圧を有するプレート及び選択圧を有しないプレート上にコロニーをレプリカ法でプレーティングすることにより、前記組込みプラスミドを喪失した細胞を選択し、選択圧に感受性のあるそのコロニーを選択するステップと、
前記選択圧に感受性のある細胞が前記機能的遺伝子の機能をもはや有しないことを確認し、それにより作動可能な所定の機能的遺伝子を欠如するビフィドバクテリウム属菌細胞を産生するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
前記所定の機能的遺伝子が欠失されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記機能的遺伝子が抗生物質に対する耐性の増加を付与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗生物質がテトラサイクリンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記機能的遺伝子がｔｅｔＷである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記選択圧が抗生物質の存在である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗生物質がスペクチノマイシンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記プラスミドが相同組換えにより前記ゲノムに組み込まれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記組込みプラスミドが、第２の相同組換えを介して失われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
欠失された又は作動不能にされた唯一の機能的遺伝子が、前記所定の機能的遺伝子である、請求項１５又は請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記形質転換体が、非選択的な条件下で少なくとも約１００世代増殖される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記ビフィドバクテリウム属菌細胞がＢ．アニマリス細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ビフィドバクテリウム属菌細胞がＢ．アニマリス亜種ラクティス細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ビフィドバクテリウム属菌細胞がＢ．アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ２８１８であり、得られる細胞がＢ．アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ９０３４である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ビフィドバクテリウム属菌細胞がＢ．ロンガム細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２９】
ディスク拡散アッセイを使用して決定される、１ミリリットル当たり約０．３マイクログラムを超えたテトラサイクリン濃度に感受性のあるビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス細胞。
【請求項３０】
ＮＣＣ９０３４株である、請求項３０に記載の前記Ｂ．アニマリス亜種ラクティス細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は乳酸菌の抗生物質感受性に関する。より詳しくは、本発明は、ビフィドバクテリウム属菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）種のテトラサイクリン耐性遺伝子の除去、及びビフィドバクテリウム属菌の遺伝子を除去するための方法又は無能力化するための方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
利用可能な抗生物質に対する菌耐性の増加に関する懸念が、近年、広範に高まっている。その懸念の多くは、医師による広域抗生物質の広範な使用に少なくとも部分的には起因する獲得耐性に関するが、抗生物質耐性遺伝子を獲得した細菌を食料及び農業目的のために使用することから生じる抗生物質耐性に関する懸念も幾つかある。例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子の存在及び分布は、環境、動物及び子供を含むヒトから単離された微生物において一般的である。ある場合には、抗生物質耐性は、例えば特定の細胞膜特性のため、特定の種では内在的であり得る。抗生物質耐性は、細菌遺伝子の突然変異を介して獲得されることもあり、環境中の耐性菌から遺伝子移入（ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）により獲得されることもある。
【０００３】
食品加工又は農業生産において抗生物質耐性を有する又は獲得した任意の細菌を使用すると、食品中の他の細菌、食品摂取後のヒト又は動物の消化管（ＧＩＴ）、又は摂取前又は摂取後のある時点での環境に、耐性を促進する遺伝子が導入されるという潜在的で理論上のリスクがもたらされる。そのようなバクテリアの例は、ビフィドバクテリウム属菌、例えばビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）（ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス新亜種とも呼ばれ、以前はビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）と見なされ、本明細書ではそのように呼ばれることもある）などのビフィドバクテリウム・アニマリスの中に見出すことができる。そのような菌株の１つであるＢ．アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ２８１８株、ＣＮＣＭ  Ｉ−３４４６は市販されており、食品への添加剤として２０年を超えて使用され、一般的に安全であると見なされている。この細菌は、ヒト及び動物由来のある種の他のグラム（−）細菌及びグラム（＋）細菌と同様に、テトラサイクリン耐性遺伝子であるｔｅｔＷを存在させていることが近年発見された。テトラサイクリン耐性転移は理論上は可能であるが、実験室条件の下でさえこれを実証することはこれまで可能ではなかった。しかしながら、この菌株に由来するｔｅｔＷは、グラム（−）細菌では活性がないが、グラム（＋）細菌では活性があることが、クローニング実験から分かっている。
【０００４】
しかしながら、この遺伝子が意図せずに導入されるあらゆるリスクを排除するために、この菌株からこの遺伝子を除去するための方法が必要とされている。テトラサイクリンに対する耐性が低減されたこの菌株の変異体も必要とされている。
【０００５】
［発明の概要］
本発明の一態様は、作動可能な機能的遺伝子を欠如するように改変されたゲノムを含むビフィドバクテリウム属菌細胞を特徴とする。ある実施形態では、ビフィドバクテリウム属菌細胞はビフィドバクテリウム・アニマリス細胞であり、より具体的には、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス細胞である。ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ９０３４株は、本明細書中で例示される。
【０００６】
ある実施形態では、機能的遺伝子は抗生物質耐性をもたらし、例えば、機能的遺伝子はｔｅｔＷであり、テトラサイクリンに対する耐性を付与する。種々の実施形態では、作動可能なｔｅｔＷ遺伝子を欠如するように改変されたビフィドバクテリウム属菌細胞は、作動可能なｔｅｔＷ遺伝子を含有する相当する細胞より、テトラサイクリンに対して少なくとも５〜１０倍の感受性がある。他の実施形態では、この細胞は、ディスク拡散アッセイを使用して決定されるように、１ミリリットル当たり約０．３マイクログラムを超えたテトラサイクリン濃度に感受性がある。典型的な実施形態は、ＣＮＣＭ  Ｉ−３６６４として寄託されているビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ９０３４株を特徴とする。改変されたビフィドバクテリウム属菌細胞は、ｔｅｔＷ遺伝子の核配列を実質的に欠如していてよい。一実施形態では、改変された細胞は、残りのゲノムに実質的な変化はない。
【０００７】
本発明の別の態様は、上述の細胞を含むビフィドバクテリウム・アニマリスの培養物を特徴とする。
【０００８】
本発明の別の態様は、作動可能な所定の機能的遺伝子を欠如するビフィドバクテリウム属菌細胞を産生するための方法を特徴とする。この方法は、（１）ビフィドバクテリウム属菌から所定の機能的遺伝子の上流及び下流配列を取得するステップと、（２）機能的遺伝子の上流及び下流隣接配列と、選択マーカーをコードする遺伝子とを含む、ビフィドバクテリウム属菌中では複製しないプラスミドで、ビフィドバクテリウム属菌細胞の集団を形質転換するステップと、（３）選択マーカーをコードする遺伝子をプラスミド中に含有する細胞の増殖は可能であるが、選択マーカーをコードする遺伝子を有しないその細胞の増殖は可能ではない条件下でビフィドバクテリウム属菌細胞を増殖させ、それにより、組込みプラスミドを含有する形質転換体を選択するステップと、（４）細胞の増殖を可能にするが、組込みプラスミドの喪失を許容する非選択的条件下で形質転換体を増殖させるステップと、（５）選択圧を有するプレート及び選択圧を有しないプレート上にコロニーをレプリカ法でプレーティングすることにより、組込みプラスミドを喪失した細胞を選択し、選択圧に感受性のあるそのコロニーを選択するステップと、（６）選択圧に感受性のある細胞が機能的遺伝子の機能をもはや有しないことを確認し、それにより作動可能な所定の機能的遺伝子を欠如するビフィドバクテリウム属菌細胞を産生するステップとを含む。
【０００９】
ある実施形態では、所定の機能的遺伝子が欠失されている。機能的遺伝子は、抗生物質に対する耐性の増加を付与する遺伝子であってよく、例えばｔｅｔＷ遺伝子はテトラサイクリンに対する耐性を付与する。
【００１０】
本明細書中に記載したある実施形態では、欠失された又は作動不能にされた唯一の機能的遺伝子は、所定の機能的遺伝子である。
【００１１】
種々の実施形態では、選択圧はスペクチノマイシンなどの抗生物質の存在である。
【００１２】
ある実施形態では、プラスミドは相同組換えによりゲノムに組み込まれる。組込みプラスミドは、第２の相同組換えを介して喪失され得る。
【００１３】
前述した方法の種々の実施形態では、形質転換体は、非選択的な条件下で少なくとも約１００世代増殖される。
【００１４】
上述の方法は、Ｂ．アニマリス種、より詳しくはＢ．アニマリス亜種ラクティス、さらにより詳しくはＢ．アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ２８１８株のビフィドバクテリウム属菌細胞に実施できる。この方法をＮＣＣ２８１８株に実施することから生じる細胞は、Ｂ．アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ９０３４株により例示される。
【００１５】
上述の方法は、Ｂ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）種のビフィドバクテリウム属菌細胞に実施してもよい。
【００１６】
本発明の別の態様は、ディスク拡散アッセイを使用して決定されるように、１ミリリットル当たり約０．３マイクログラムを超えたテトラサイクリン濃度に感受性のあるビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス細胞を特徴とする。典型的な実施形態では、Ｂ．アニマリス亜種ラクティス細胞はＮＣＣ９０３４株である。
【００１７】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、図面、及び実施例を参照することにより理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】スペクチノマイシン（ｓｐｅｃ）及びアンピシリン（Ａｍｐ）耐性マーカーの位置を示す、ｐＭＤＹ２８の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の地図である。ｔｅｔＷ隣接配列は、ＡｐａＩ部位（塩基６５９位）と６８４０位のＨｉｎｄＩＩＩとの間に挿入される。このプラスミドは、ビフィドバクテリウム属菌中で複製するための作動可能なｏｒｉを含有していない。
【図２】上段パネルは、２つの独立した変異体（Ａ及びＢと指定されたレーン）から得られたゲノムＤＮＡのＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、及びＮｏｔＩ制限断片のサザンブロット分析を示す図である。レーンＣは、変異体を作製するために使用した野生型株（ＮＣＣ２８１８）から得られた相当する破片を含む。下段パネルは、野生型株で取得された断片と対して、変異体（Ａ及びＢ）で取得されたサザンブロットに認められた断片のサイズを示す。
【図３】最小阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するためにＥテストで決定された、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ３６２株（野生型）（左パネル、およそ１６μｇ／ｍｌのテトラサイクリン）及びＮＣＣ９０３４株（右パネル、およそ０．３μｇ／ｍｌのテトラサイクリン）の抗生物質テトラサイクリンへの耐性を示す図である。
【図４】ＮＣＣ３６２株（上段パネル）及びＮＣＣ９０３４株（下段パネル）のｔｅｔ遺伝子座の地図であり、後者の菌株にｔｅｔＷ遺伝子が存在しないことを示す図である。ノックアウト変異体を作製するために使用されたｔｅｔＷ隣接配列は、両パネルでは網掛けバーで示されている。
【図５】クロラムフェニコール（Ｃｍ）及びアンピシリン（Ａｍｐ）耐性マーカーの位置を示す、ｐＭＤＹ２４の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の地図である。Ｂｌ０１０８隣接配列は、ＥｃｏＲＩ部位（塩基１位）と５７６６位のＳａｌＩとの間に挿入される。このプラスミドは、ビフィドバクテリウム属菌中で複製するための作動可能なｏｒｉを含有していない。
【図６】ＮＣＣ２７０５株（上段パネル）及びＮＣＣ９０３５株（下段パネル）のＢｌ０１０８遺伝子座の地図であり、後者の菌株にＢｌ０１０８遺伝子が存在しないことを示す図である。ノックアウト変異体を作製するために使用されたＢｌ０１０８隣接配列は、両パネルでは網掛けバーで示されている。
【図７】パネルＡは、ＢＬ０１０８欠失手順の最終ステップにおけるプラスミドの第２の組換え事象及び消散の後に取得されたクロラムフェニコール感受性コロニーのＰＣＲ分析を示す図である。２個のコロニー（レーン１及び２）のＰＣＲ断片サイズは、Ｂｌ０１０８（３８８５ｂｐ）の欠失を示すが、他の１０個のコロニーのＰＣＲ断片サイズは、Ｂｌ０１０８遺伝子座の野生型配置を示す。パネルＢは、２つの独立した変異体（レーン１及び２）から採取されたゲノムＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ制限断片のサザンブロット分析を示す。レーン３は、変異体を作製するために使用した野生型株（ＮＣＣ２７０５）から取得された相当する断片を含有する。最下段のパネルは、野生型株で取得されたサザンブロットに認められた断片（３）に対して、変異体（１及び２）で取得された断片のサイズを示す。
【図８】ビフィドバクテリウム属菌細胞から機能的遺伝子を欠失させるための、一般化された戦略の模式図である。この戦略は、本明細書中に記載した方法及び実施例で使用された戦略の一例である。手短かに言えば、所望の変異領域（この例では、変異ｔｅｔＷ遺伝子座）は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）プラスミドにクローニングされ（Ａ）、ビフィドバクテリウム属菌細胞に形質転換される（Ｂ）。ビフィドバクテリウム属菌のゲノムに対するプラスミドの組込みは相同組換えにより得られ、適切な抗生物質、この例ではスペクチノマイシンを含有する増殖培地に細胞をプレーティングすることにより選択される（Ｃ）。細胞を抗生物質選択なしで複製させて、プラスミドの消散（Ｄ）、及びパネルＡに描かれているプラスミドと同じ配置に変異した染色体領域をもたらす第２の相同性複製事象を可能にする。対立遺伝子交換後にその領域の野生型遺伝子座を宿すプラスミドは、ビフィドバクテリウム属菌中では複製できず、抗生物質選択をせずに培地上で増殖した細胞の複製中に除去される（Ｅ）。最終的な変異細胞は、ＰＣＲ又はサザンブロット分析などの適切な分子生物学的技術で確認される。
【００１９】
［具体的な実施形態の詳細な説明］
（細胞及び培養物）
本発明は、その幾つかの態様の第１では、作動可能な所定の機能的遺伝子を欠如、又は実質的に欠如するように改変されたゲノムを含む、Ｂ．アニマリス又はＢ．ロンガムに由来する細胞などのビフィドバクテリウム属菌細胞を提供する。いかなる特定の所定遺伝子の指定破壊又は欠失も、ビフィドバクテリウム属菌では達成されていない。
【００２０】
一実施形態では、ビフィドバクテリウム属菌は、食品加工若しくは飼料加工、又は栄養補助食品若しくは医薬品補助剤に使用される菌株に由来する細胞である。好適なビフィドバクテリウム属菌株には、Ｂ．アニマリス株及びＢ．ロンガム株が含まれるが、それらに制限されない。食品若しくは飼料製品に意図的に添加される、又は食品若しくは飼料製品に大量に見出される、分類されている又はされていない他のビフィズス菌も好適である。他の有用なビフィドバクテリウム属菌には、食料若しくは飼料の製造若しくは生産の結果として、又は他の商業的加工を介して、又はヒト若しくは動物によるそのような産物の摂取を介して、直接的に又は間接的に環境中へと放出される任意の細胞が含まれる。ビフィドバクテリウム属菌は、例えば下痢などの胃腸状態を治療するための、又は健康な腸ミクロフローラを増進するための、ヒト幼児及び仔動物を含むヒト又は動物のいずれかのための栄養補助剤として意図された種々の形態でも利用可能である。一実施形態では、細胞は、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス細胞である。
【００２１】
破壊又は欠失される遺伝子は、任意の機能的遺伝子（例えば、細胞の機能をコードする任意の遺伝子）であってよいが、現時点で好ましい一実施形態では、機能的遺伝子は抗生物質耐性をもたらす。特定の実施形態では、遺伝子は獲得した抗生物質耐性遺伝子であり、つまり遺伝子は、ビフィドバクテリウム属菌細胞に内在的であるとは見なされず、現在はその中に見出されるが、むしろ外来性と見なされ、例えば環境又は別の生物に由来する。別の実施形態では、機能的遺伝子は、酵素又は酵素阻害剤、例えば食品加工又は生物の他の望ましい特性（例えば、健康な腸ミクロフローラの増進）に負の影響を与え得る阻害剤をコードする。当業者であれば、そのような様々な阻害剤は、１つ又は複数の遺伝子によりコードされてよいことを認識しよう。一実施形態では、阻害剤はプロテアーゼ阻害剤である。
【００２２】
特定の実施形態では、遺伝子産物は、テトラサイクリンに対する耐性を付与する。一実施形態では、機能的遺伝子はｔｅｔＷである。ｔｅｔＷ遺伝子は、比較的幅広く分布することが知られている。一実施形態では、欠失させるｔｅｔＷ遺伝子を含有する細胞の供給源として、ビフィドバクテリウム・アニマリス種ラクティスＮＣＣ２８１８株が、現時点では好ましい。ｔｅｔＷ遺伝子座の配列は、配列番号１として示されている。
【００２３】
ある実施形態では、野生型細胞は、本発明の細胞、つまり遺伝子が欠失した細胞より、高濃度の抗生物質に耐性がある。特定の抗生物質に対する微生物細胞の感受性は、任意の様々な方法で測定できる。抗生物質感受性を測定するための１つの便利な手段は、ディスク拡散アッセイ、例えばＥテスト（ＡＢ  ＢＩＯＤＩＳＫ社により商業的に製造されている）を使用することである。Ｅテストシステムは、プラスチックストリップ上のあらかじめ定められた抗生物質濃度勾配を使用し、特定の生物について抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を正確に決定するために使用できる。
【００２４】
現時点で好ましい実施形態では、本発明のビフィドバクテリウム属菌細胞は、ｔｅｔＷ遺伝子を破壊されているが、他の機能的遺伝子は失われておらず、その細胞は、作動可能なｔｅｔＷ遺伝子を含有する相当する野生型細胞より、テトラサイクリンに対して少なくとも５倍の感受性がある。別の実施形態では、作動不能なｔｅｔＷ遺伝子を有するビフィドバクテリウム属菌細胞は、作動可能なｔｅｔＷ遺伝子を含有する相当する細胞より、テトラサイクリンに対して少なくとも１０倍の感受性がある。
【００２５】
一実施形態では、作動不能なｔｅｔＷ遺伝子を有するビフィドバクテリウム属菌細胞は、ディスク拡散アッセイを使用して決定されるように、１ミリリットル当たり約０．３マイクログラムを超えたテトラサイクリン濃度に感受性がある。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、ゲノムに関して「改変された」という用語は、ゲノムが人為的に操作又は修飾されたことを示す。ある実施形態では、ゲノムは特定の遺伝子の遺伝子座全体を欠失させることにより改変される。他の改変されたゲノムでは、制御配列の欠失又は制御配列における変異は、所定遺伝子の機能性の完全な又は少なくとも実質的な喪失をもたらすことができる。遺伝子座全体、遺伝子全体、又はさらにはコード配列全体を喪失するように操作されたそれらのゲノムに加えて、改変されたゲノムには、機能的遺伝子の機能の喪失又は実質的な喪失に帰着する点変異又はフレームシフト変異などの軽微な変更（挿入又は欠失を含む）のみを有するゲノムが含まれる。
【００２７】
改変が作動可能性の完全な喪失に帰着することが好ましいが、必ずしも容易に達成されないこともあり、時にはそのような活性の実質的な喪失が有用なこともあろう。本明細書中で使用される場合、「実質的な喪失」とは、機能的な活性が半分を超えて失われることを示し、つまり改変されたゲノムを有する細胞は、所定の機能的遺伝子が寄与する機能的特性の半分未満を示す。例えば、酵素に関して改変されたゲノムを有する細胞は、それが由来する親細胞と比較した際に、その酵素活性の５０％未満を有しよう。或いは、改変されたゲノムを有する細胞は、所定の機能的遺伝子に関連する遺伝子産物の５０％未満を産生できる。当業者であれば、ある種の機能的な活性に対処する際に、特定の機能的遺伝子の遺伝子産物の５０％未満を有する細胞が、細胞中で測定可能な活性の５０％を必ずしも喪失しないことがあると理解しよう。
【００２８】
好ましくは、改変されたゲノムにおいて、コード配列自体に少なくとも１つの点変異又はフレームシフト変異があり、完全な機能的遺伝子が、改変されたゲノムを有する細胞に近接している他の細胞、又は改変されたゲノムを有する細胞の環境中の他の細胞に導入されることを防止する。したがって、本明細書中で使用される場合、「改変される」には、そのような操作が、所定の機能的遺伝子の作動可能性の喪失又は実質的な喪失に関するゲノムの操作があることが必要である。
【００２９】
したがって、一実施形態では、機能的遺伝子は全て欠失、又は少なくとも実質的に欠失される。この実施形態は、環境、他の腸微生物、又は環境中の他の生物に機能的な抗生物質耐性遺伝子が不用意に導入され得ないことを保証し、また破壊された遺伝子が導入され得るのは、下流事象を介して回復されることによってのみであることも保証する。したがって、好ましい実施形態では、本発明のこの態様によるビフィドバクテリウム属菌細胞は、ｔｅｔＷ遺伝子の核配列を実質的に欠如している。一実施形態では、コード配列は少なくとも実質的に欠失される。或いは、所定の機能的遺伝子と関係する１つ又は複数の非コード配列も欠失されてよい。例えば、細胞において他の機能を果たさない機能的遺伝子の結合配列又は制御配列は欠失されてよい。他の実施形態では、改変されたゲノムを有する細胞は、よりわずかな変更、例えば所定の遺伝子の機能性の喪失又は実質的な喪失に帰着する点変異又はフレームシフト変異を有し、例えば改変されたゲノムは、機能的遺伝子の作動可能性の低減を示す。
【００３０】
また、好ましい実施形態では、ビフィドバクテリウム属菌細胞は、そのゲノムの残りに実質的な変化はない。言い換えれば、ビフィドバクテリウム属菌細胞は、機能的遺伝子の作動可能性の喪失及び好ましくは細胞からのその完全な又は少なくとも実質的な欠失を除くと、それが由来する細胞（例えば親細胞）と同一、又はほとんど同一である。菌株又は培養物が長期間にわたって適応し、例えば、乳製品の発酵、例えばヨーグルトなどのような食品加工に有用な望ましい特性を提供した場合に、これは特に有用である。例えば、下記でより詳細に説明する一実施形態では、Ｂ．アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ２８１８が開始（親）細胞であり、ｔｅｔＷが所定の機能的遺伝子であるが、結果として生じる細胞は、Ｂ．アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ９０３４であり、その改変されたゲノムは、所定のｔｅｔＷ遺伝子を欠如する点でのみ親と異なる。予想通りに、ＮＣＣ９０３４細胞により示されたテトラサイクリンに対する感受性の増加を除いて、その細胞も表現型的に類似している。前述の実施形態は、臨床症状の治療を支援するために使用される菌株にも有用であり、特にそれらの菌株が選択又は改良されて、腸内での迅速な世代時間又は滞留時間の延長などの望ましい機能を有する場合にも有用である。
【００３１】
その幾つかの態様の別の態様では、本発明は、機能的遺伝子が欠失された細胞、又は機能的遺伝子が少なくとも作動不能な細胞を含むビフィドバクテリウム属菌の培養物を提供する。当業者であれば認識されることであるので、そのような培養物の使用について詳細に考察する必要はない。一実施形態では、培養物は、公知の培養物、望ましくない機能的遺伝子をそのゲノムに有することが発見された又は決定された公知の培養物に由来する細胞を含む。一実施形態では、遺伝子は、抗生物質耐性をコードする遺伝子などの、外来的に獲得された遺伝子である。一実施形態では、遺伝子はテトラサイクリン耐性遺伝子である。特定的な実施形態では、遺伝子はｔｅｔＷ遺伝子であり、特定の実施形態では、適切なｔｅｔＷ遺伝子配列は、配列番号１に提供される配列である。
【００３２】
（細胞及び培養物を作製するための方法）
本発明の別の態様では、本発明は、作動可能な所定の機能的遺伝子を欠如するビフィドバクテリウム属菌細胞を産生するための方法を提供する。この方法は、
ビフィドバクテリウム属菌から所定の機能的遺伝子の上流及び下流配列を取得するステップと、
機能的遺伝子の上流及び下流隣接配列、並びに選択マーカーをコードする遺伝子を含む、ビフィドバクテリウム属菌中では複製しないプラスミドで、ビフィドバクテリウム属菌細胞の集団を形質転換するステップと、
選択マーカーをコードする遺伝子をプラスミド中に含有する細胞のみが増殖可能になる条件下でビフィドバクテリウム属菌細胞を増殖させ、それにより、プラスミドが染色体上の機能的遺伝子の遺伝子座に組み込まれた形質転換体を選択するステップと、
細胞の増殖は可能にするが、組込みプラスミドの喪失を許容する非選択的条件下で形質転換体を増殖させるステップと、
選択マーカーをコードする遺伝子に選択圧を有するプレート及び選択圧を有しないプレート上にコロニーをレプリカ法でプレーティングすることにより、組込みプラスミドを喪失した細胞を選択し、選択圧に感受性のあるそのコロニーを選択するステップと、
選択圧に感受性のある細胞が機能的遺伝子の機能をもはや有しないことを確認し、それにより作動可能な所定の機能的遺伝子を欠如するビフィドバクテリウム属菌細胞を産生するステップと
を含む。
【００３３】
上記で細胞及び培養物について説明したように、ビフィドバクテリウム属菌細胞は、好ましくは、Ｂ．アニマリス又はＢ．ロンガムなどの食品加工又は飼料加工で使用される菌株に由来する細胞である。他のビジフィドバクテリア（Ｂｉｄｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、ヒト又は動物の臨床治療に使用される、又はヒト又は動物の臨床治療で予防的に使用されるものなどが、本明細書中での使用に企図される。一実施形態では、開始細胞として使用される細胞は、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスである。本明細書中で例示されたある実施形態では、Ｂ．アニマリス亜種ラクティス細胞は、ＮＣＣ２８１８株である（Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ社から「ＢＢ１２」として市販されている）。
【００３４】
欠失させる遺伝子は、任意の機能的遺伝子（例えば、細胞の機能をコードする任意の遺伝子）であってよいが、現時点で好ましい一実施形態では、機能的遺伝子は抗生物質耐性をもたらす。特定の実施形態では、遺伝子は獲得した抗生物質耐性遺伝子であり、つまり遺伝子は、ビフィドバクテリウム属菌細胞に内在的であるとは見なされず、現在はその中に見出されるが、むしろ外来性と見なされ、例えば環境又は別の生物に由来する。
【００３５】
一実施形態では、作動不能にされる又は欠失される遺伝子は、テトラサイクリンに対する耐性をコードする。一実施形態では、機能的遺伝子はｔｅｔＷである。一実施形態では、ｔｅｔＷ遺伝子は配列番号１として提供される配列を有し、Ｂ．アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ２８１８のｔｅｔＷ遺伝子座全体を表わす。一実施形態では、開始細胞はビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス細胞ＮＣＣ２８１８株である。これらの細胞の試料は、ブダペスト条約の条項に従ってパスツール研究所の特許寄託所に寄託されている。Ｂ．アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ２８１８が開始細胞であり、ｔｅｔＷが所定の機能的遺伝子である場合、結果として生じる細胞はＢ．アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ９０３４であり、それらの試料も、ブダペスト条約の条項に従ってパスツール研究所の特許寄託所に寄託されている。
【００３６】
ある実施形態では、野生型の細胞は、提供された方法から生じた細胞より高濃度の抗生物質に耐性がある。Ｅテスト（ＡＢ  ＢＩＯＤＩＳＫ社）などのディスク拡散アッセイ及び関連する感受性テストは、抗生物質に対する細胞の感受性を測定するための好ましい方法である。特定の生物に対する抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、どのように決定されたとしても、相対的感受性を比較するための便利な方法である。
【００３７】
現時点で好ましい実施形態では、本発明のビフィドバクテリウム属菌細胞は、ｔｅｔＷ遺伝子を破壊されているか又は欠失されているが、他の機能的遺伝子はそれらの機能の点で欠如又は破壊されていない。一実施形態において、本方法により産生された細胞は、作動可能なｔｅｔＷ遺伝子を含有する相当する野生型細胞より、テトラサイクリンに対して少なくとも５倍の感受性がある。より具体的には、結果として生じるビフィドバクテリウム属菌細胞は、作動可能なｔｅｔＷ遺伝子を含有する相当する細胞より、テトラサイクリンに対して少なくとも１０倍の感受性がある。他の実施形態では、細胞は、ｔｅｔＷ遺伝子を保持する相当する細胞より、２０倍、３０倍、４０倍、又はさらに５０倍又はそれを超えた感受性がある。特定の実施形態では、結果として生じるビフィドバクテリウム属菌細胞は、ディスク拡散アッセイ又はＥテストを使用して決定されるように、１ミリリットル当たり約０．３マイクログラムを超えたテトラサイクリン濃度に感受性がある。
【００３８】
上述のように細胞及び培養物について、一実施形態では、機能的な抗生物質耐性遺伝子が不用意に環境、他の腸微生物、又は環境中の他の生物に導入できないように、機能的遺伝子は全て欠失、又は少なくとも実質的に欠失されている。同様に、実質的にその配列の全てが生物から失われたため、破壊された遺伝子でさえ導入され得ない。したがってそのような実施形態では、本方法により作製された、結果として生じたビフィドバクテリウム属菌細胞は、実質的にｔｅｔＷ遺伝子の核酸配列を欠如している。種々の実施形態では、コード配列は少なくとも実質的に欠失され、所定の機能的遺伝子と関係する非コード配列でさえも欠失されている。
【００３９】
現時点で好ましい実施形態では、結果として生じるビフィドバクテリウム属菌細胞ゲノムは、欠失又は作動不能にされたことを除くと、実質的に変化していない。好ましくは、結果として生じるビフィドバクテリウム属菌細胞のゲノムは、作動不能にされた又は欠失された機能的遺伝子以外は、それが由来する細胞（例えば親細胞）と同一、又はほとんど同一である。したがって、本方法により産生された細胞は、それらが由来する親株、野生型株、又は原型株と、実質的に同じ又はさらに全く同じ機能性及び特性（栄養所要量、酵素特性、増殖特徴、風味産生、及び酸産生など）を有しよう。したがって、そのように産生された細胞を使用すると、機能的遺伝子が欠失された細胞又は機能的遺伝子が少なくとも作動不能な細胞を含むビフィドバクテリウム属菌の有用な培養物を作り出すことができる。細胞が公知の培養物に由来し、その公知の培養物が、獲得した抗生物質耐性遺伝子、例えばテトラサイクリン耐性遺伝子、特にｔｅｔＷ遺伝子などの望ましくない機能的遺伝子をそのゲノムに有することが発見された場合、これは特に当てはまる。
【００４０】
本方法の一実施形態では、プラスミドは、付加的な選択マーカーをコードする。ある実施形態では、選択マーカーは抗生物質耐性を付与する。そのような実施形態では、組込みプラスミドについて形質転換体をスクリーニングするための選択条件には、耐性マーカーに対応した抗生物質という形態の選択圧が含まれる。一実施形態では、抗生物質はスペクチノマイシンであり、別の実施形態ではクロラムフェニコールである。
【００４１】
ある実施形態では、プラスミドは、好ましくは上流及び／又は下流の隣接配列部位で、相同組換えによりゲノムに組み込まれ、円形プラスミドがビフィドバクテリウム属菌ゲノムに組み込まれた状態になることを可能にするクロスオーバー事象が生じる。別の実施形態では、組込みプラスミドは、第２の相同組換え事象を介して失われ、好ましくは、所定の機能的遺伝子、例えばｔｅｔＷ遺伝子座又は他の遺伝子標的の全ての又は実質的に全てが同時に失われる。
【００４２】
上述したように、好ましい実施形態では、欠失された又は作動不能にされた唯一の機能的遺伝子は、所定の機能的遺伝子である。
【００４３】
一実施形態では、十分な世代数の間、形質転換体を非選択的条件下で増殖させ、所定の機能的遺伝子を含む不必要な配列の喪失を可能にする。一実施形態では、少なくとも約１００世代の増殖は、そのような喪失を容易にしよう。
【００４４】
以下の実施例は、本発明のこれらの又は追加的な態様をさらに例示するために提供されるが、例示されるものに本発明を制限するようには解釈すべきではない。
【００４５】
［実施例]
（複製しないプラスミドの構築）
ｔｅｔＷの開始コドンの上流にｔｅｔＷと隣接するおよそ３ｋｂのＤＮＡ断片と、ｔｅｔＷの終止コドンの下流にｔｅｔＷと隣接するおよそ３ｋｂのＤＮＡ断片とを以下のプライマー対で増幅した。
ｍｄｙ１００：５’−ＣＧＣＡＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＴＣＡＣＧＣＡＡＡＣＴＣＴＡＣＧ−３’（配列番号２）；
ｍｄｙ９８：５’−ＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＡＴＴＧＴＣＣＴＣＣＣＴＴＴＡ−３’（配列番号３）及び
ｍｄｙ９９：５’−ＡＧＧＡＣＡＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＡＴＡＣＡＣＣＡＣＡＧＣＧＡＧＧ−３’（配列番号４）
ｍｄｙ８９：５’−ＣＣＧＴＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＡＴＣＧＣＧＡＧＡＴＡＡＴＣＡＧＣ−３’）（配列番号５）。
【００４６】
その結果生じる増幅産物をテンプレートとして使用し、ｍｄｙ１００プライマー及びｍｄｙ８９プライマーで融合ＰＣＲ（ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ）を実施し、ｔｅｔＷの開始コドン及び終止コドンを介して連結されたｔｅｔＷの上流領域及び下流領域を含有したＤＮＡ断片がその結果として生じた。
【００４７】
ＤＮＡ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａ１でその末端を消化され、ＨｉｎｄＩＩＩとＡｐａＩとの間でｐＪＬ７４（Ｌｅｄｅａｕｘ及びＧｒｏｓｓｍａｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５年１月；１７７巻（１号）：１６６〜７５頁）にクローニングした。結果として生じるプラスミドは、ｐＭＤＹ２８（配列番号６）と名付けた。制限エンドヌクレアーゼ部位の詳細な地図は図１として提供する。ｐＭＤＹ２８を形成するためにｐＪＬ７４に挿入されたＤＮＡ断片の配列を確認し、Ｂ．アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ２８１８の染色体に由来する配列と同一であることが示された。これにより、ＰＣＲを介したＤＮＡ増幅中にもその後のＤＮＡ操作中にも突然変異が導入されなかったことが示された。
【００４８】
（Ｂ．アニマリスの形質転換及び対立遺伝子交換）
プラスミドｐＭＤＹ２８は、Ａｒｇｎａｎｉら１９９６年（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；１４２巻：１０９〜１４頁）により記述された方法を使用して、Ｂ．アニマリス細胞中に導入し形質転換を行った。細胞は１リットル当たり１００ｍｇのスペクチノマイシンを含有するＭＲＳプレート上に配置した。その結果生じるｓｐｅｃＲ形質転換体を嫌気的に選択した。プラスミドｐＭＤＹ２８はＢ．アニマリス中で複製できないため、ｓｐｅｃＲのコロニーは、プラスミドが単一のクロスオーバー事象を介した相同組換えによりＢ．アニマリスゲノムに組み込まれたことから生じた可能性が最も高い。複製しないプラスミドをビフィドバクテリウム属菌細胞へと形質転換することに成功したのは、過去に報告がない。
【００４９】
プラスミドの喪失を可能にするために、およそ１００世代、抗生物質選択をせずにｓｐｅｃＲ形質転換体をＭＲＳブロス中で培養し、個々のコロニーをＭＲＳ寒天培地上にプレーティングした。プラスミドがＢ．アニマリスのゲノムから取り除かれたことを保証するため、個々のコロニーは、スペクチノマイシンが添加されたＭＲＳ寒天及びスペクチノマイシンが添加されなかったＭＲＳ寒天上にレプリカ法でプレーティングすることにより、スペクチノマイシン耐性の喪失を検査した。
【００５０】
検査した７５０個のコロニーのうち、１６３個のコロニーはスペクチノマイシン感受性であり（２１％）、プラスミドが、第２のクロスオーバー事象の発生を介してＢ．アニマリスの染色体から切除されたことを示した。
【００５１】
第２のそのような事象は、
ｉ）野生型細胞と同一のｔｅｔＷ遺伝子座を有する野生型配置への復帰変異、
ｉｉ）ｔｅｔＷの欠失
という２つのゲノムの配置に帰着し得る。
【００５２】
これらの２つの可能性を識別するため、上述したスペクチノマイシン感受性コロニー１６３個のうち１３５個を、ｔｅｔＷの喪失について、以下のプライマー対を用いた直接コロニーＰＣＲ（ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲ）で検査した。
ｍｄｙ９４：５’−ＧＡＧＣＡＴＧＴＡＴＴＣＧＧＴＧＴＣＧ−３’（配列番号７）及び
ｍｄｙ９５：５’−ＧＡＴＴＴＧＣＣＣＴＡＴＣＧＡＣＴＧ−３’（配列番号８）。
【００５３】
検査した１３５個のコロニーのうち、２個は、ｔｅｔＷの欠失を示す１０３４ｂｐのＤＮＡバンドを生じさせたが、他は、野生型細胞で取得された断片に類似したより高分子量（２９４９）の断片を生じさせた（図２、パネルＢを参照）。
【００５４】
（ｔｅｔＷ欠失変異体のサザンブロット分析）
ｔｅｔＷの欠失は、ＰＣＲ分析により特定された２つの変異体候補から抽出したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ及びサザンブロット分析により確認した（図２、パネルＡ及びＢを参照）。制限酵素（ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、又はＮｏｔＩ）で、染色体ＤＮＡの試料を消化した。サザンブロットは、ｐＭＤＹ２８に由来するＤＮＡとハイブリダイズさせた。サザン分析により、両変異体候補のゲノムからｔｅｔＷが欠失されていることが確認された（レーンＡ及びＢ）。１つの株だけを保持し、それ以降はその株をＮＣＣ９０３４と指定した。
【００５５】
（Ｂ．アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ９０３４株対ＮＣＣ２８１８株の抗生物質感受性試験）
Ｂ．アニマリス亜種ラクティス野生型株ＮＣＣ２８１８のテトラサイクリン感受性と、実質的に全てのｔｅｔＷ遺伝子の欠失が示された派生株ＮＣＣ９０３４のテトラサイクリン感受性とを比較した。市販のＥテスト（ＡＢ  ＢＩＯＤＩＳＫ社）を使用して、テトラサイクリンについての各株のＭＩＣを決定した。
【００５６】
結果は図３に示す。ＮＣＣ２８１８株は１６μｇ／ｍｌのＭＩＣを示したが、ＮＣＣ９０３４はテトラサイクリンにより感受性があり、わずかに約０．３μｇ／ｍｌのＭＩＣを示した。したがって、ＮＣＣ９０３４は、その親である野生型株ＮＣＣ２８１８より、テトラサイクリンに対して約５０倍感受性が強かった。この感受性表現型は、ｔｅｔＷ遺伝子の機能性喪失と完全に一致している。これは、上記のサザン分析で見られたように、遺伝子分析により裏付けられる。
【００５７】
プロテアーゼ阻害タンパク質をコードするＢ．ロンガム遺伝子（Ｂｌ０１０８）の欠失
（複製しないプラスミドの構築）
Ｂｌ０１０８と隣接するおよそ３ｋｂのＤＮＡ断片を、以下のプライマー対で増幅した。
ｍｄｙ８２：５’−ＣＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＧＣＡＴＣＡＴＴＧＣ−３’（配列番号９）；
ｍｄｙ８３：５’−ＧＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＴＣＡＡＴＡＣＣ−３’（配列番号１０）及び
ｍｄｙ８４：５’−ＣＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＴＣＣＧＴＣＡＡＴＴＡＧＧＧＴＧ−３’（配列番号１１）
ｍｄｙ８５：５’−ＣＧＴＴＧＣＴＧＡＣＧＴＴＧＣＧＧＴＴＣ−３’）（配列番号１２）。
【００５８】
ｍｄｙ８２及びｍｄｙ８３を用いて取得されたＰＣＲ産物は、ＥｃｏｒＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ｍｄｙ８４及びｍｄｙ８５を用いて取得されたＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで消化した。
【００５９】
増幅されたＤＮＡ断片をそれらに共通したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を介して連結し、３点ライゲーション（ｔｈｒｅｅ  ｗａｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）により、ｐＪＨ１０１（Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｆ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３年）１５４巻：１５１３〜１５１５頁）のＥｃｏＲＩとＳａｌＩとの間にクローニングした。結果として生じるプラスミドは、ｐＭＤＹ２４（配列番号１３）と名付けた。ｐＭＤＹ２４の制限エンドヌクレアーゼ部位の詳細な地図は、図５として提供する。
【００６０】
（Ｂ．ロンガムの形質転換及び対立遺伝子交換）
プラスミドｐＭＤＹ２４は、スクロースが増殖培地から除外された以外は、Ａｒｇｎａｎｉら１９９６年（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；１４２巻：１０９〜１４頁）により記述された方法によって、Ｂ．ロンガムＮＣＣ２７０５細胞に形質転換された。細胞は、１リットル当たり３．５ｍｇのクロラムフェニコールを含有するＭＲＳプレート上に播種した。その結果生じるｃｍＲ形質転換体を嫌気的に選択した。プラスミドｐＭＤＹ２４はＢ．ロンガム中で複製できないため、ｃｍＲのコロニーは、プラスミドが単一のクロスオーバー事象を介した相同組換えによりＢ．ロンガムに組み込まれたことから生じた可能性が最も高い。
【００６１】
個々のコロニーをＭＲＳ寒天培地上にプレーティングする前に、プラスミドの喪失を可能にするためにおよそ１００世代、抗生物質選択をせずにｃｍＲ形質転換体を培養した。プラスミドがＢ．ロンガムのゲノムから取り除かれたことを保証するため、個々のコロニーは、クロラムフェニコールが添加されたＭＲＳ寒天及びクロラムフェニコールを添加しなかったＭＲＳ寒天上にレプリカ法でプレーティングすることにより、クロラムフェニコール耐性の喪失を検査した。
【００６２】
検査した２００個のコロニーのうち、２２個のコロニーはクロラムフェニコール感受性であり（１１％）、プラスミドが、第２のクロスオーバー事象の発生を介してＢ．ロンガムの染色体から切除されたことを示した。
【００６３】
第２のクロスオーバー事象は、
ｉ）野生型細胞と同一のＢｌ０１０８遺伝子座を有する野生型配置への復帰変異、又は
ｉｉ）Ｂｌ０１０８の欠失
という２つのゲノムの配置に帰着し得た。
【００６４】
これらの２つの可能性を識別するために、２２個のクロラムフェニコール感受性コロニーのうち１２個から染色体ＤＮＡを抽出した。以下のプライマー対を用いたＰＣＲで、Ｂｌ０１０８の喪失について染色体ＤＮＡを検査した。
ｍｄｙ２７：５’−ＴＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡＣＧＡＧＴＴＣＧＣ−３’（配列番号１４）及び
ｍｄｙ３９：５’−ＴＡＧＴＡＣＴＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１５）。
【００６５】
検査した１２個のコロニーのうち、２個が、Ｂｌ０１０８の欠失を示す３８８５ｂｐのＰＣＲ断片を示した（図７、パネルＡ、レーン１〜２）。検査した他の１０個のコロニーは、野生型細胞で取得された断片に類似した５３１１ｂｐのより大きいサイズのＰＣＲ断片を生じさせた（図７、パネルＡ、レーン３〜１２）。
【００６６】
（Ｂｌ０１０８欠失変異体のサザンブロット分析）
Ｂｌ０１０８の欠失は、上述のようにＰＣＲ分析により特定された２つの変異体候補から抽出したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ及びサザンブロット分析により確認し、図７に示した。制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）で、染色体ＤＮＡ試料を消化した。サザンブロットは、ｐＭＤＹ２４に由来するＤＮＡとハイブリダイズさせた。サザン分析により、両変異体候補のゲノムからＢＬ０１０８遺伝子が欠失されていることが確認された（図７、レーンＡ及びＢ）。１つの株だけを保持し、それ以降はその株をＮＣＣ９０３５と指定した。
【００６７】
【図１】
2010500884.tif 000002
【図２】
2010500884.tif 000003
【図３】
2010500884.tif 000004
【図４】
2010500884.tif 000005
【図５】
2010500884.tif 000006
【図６】
2010500884.tif 000007
【図７】
2010500884.tif 000008
【図８】
2010500884.tif 000009
【配列表】
2010500884000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年11月7日(2008.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
作動可能な、抗生物質耐性をもたらす、機能的遺伝子を欠如するように改変されたゲノムを含むビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム・アニマリス細胞である、請求項１に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス細胞である、請求項２に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ９０３４株である、請求項１に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項５】
前記機能的遺伝子がｔｅｔＷである、請求項１に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項６】
作動可能なｔｅｔＷ遺伝子を含有する相当する細胞より、テトラサイクリンに対して少なくとも５倍の感受性がある、請求項５に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項７】
作動可能なｔｅｔＷ遺伝子を含有する相当する細胞より、テトラサイクリンに対して少なくとも１０倍の感受性がある、請求項６に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項８】
ディスク拡散アッセイを使用して決定される、１ミリリットル当たり約０．３マイクログラムを超えたテトラサイクリン濃度に感受性がある、請求項７に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項９】
ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ９０３４株である、請求項８に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項１０】
前記ｔｅｔＷ遺伝子の核配列を実質的に欠如している、請求項１に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項１１】
そのゲノムの残部に実質的な変化がない、請求項１に記載のビフィドバクテリウム属菌細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞を含むビフィドバクテリウム・アニマリスの培養物。
【請求項１３】
作動可能な所定の機能的遺伝子を欠如するビフィドバクテリウム属菌細胞を産生するための方法であって、
ビフィドバクテリウム属菌から所定の機能的遺伝子の上流及び下流配列を取得するステップと、
前記機能的遺伝子の上流及び下流隣接配列と、選択マーカーをコードする遺伝子とを含む、ビフィドバクテリウム属菌中では複製しないプラスミドで、ビフィドバクテリウム属菌細胞の集団を形質転換するステップと、
プラスミド中の選択マーカーをコードする遺伝子を含有する細胞の増殖は可能であるが、選択マーカーをコードする遺伝子を有しないその細胞の増殖は可能ではない条件下で前記ビフィドバクテリウム属菌細胞を増殖させ、それにより、組込みプラスミドを含有する形質転換体を選択するステップと、
前記細胞の増殖を可能にするが、前記組込みプラスミドの喪失を許容する非選択的条件下で前記形質転換体を増殖させるステップと、
選択圧を有するプレート及び選択圧を有しないプレート上にコロニーをレプリカ法でプレーティングすることにより、前記組込みプラスミドを喪失した細胞を選択し、選択圧に感受性のあるそのコロニーを選択するステップと、
前記選択圧に感受性のある細胞が前記機能的遺伝子の機能をもはや有しないことを確認し、それにより作動可能な所定の機能的遺伝子を欠如するビフィドバクテリウム属菌細胞を産生するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
前記所定の機能的遺伝子が欠失されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記機能的遺伝子が抗生物質に対する耐性の増加を付与する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗生物質がテトラサイクリンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記機能的遺伝子がｔｅｔＷである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記選択圧が抗生物質の存在である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗生物質がスペクチノマイシンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記プラスミドが相同組換えにより前記ゲノムに組み込まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記組込みプラスミドが、第２の相同組換えを介して失われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
欠失された又は作動不能にされた唯一の機能的遺伝子が、前記所定の機能的遺伝子である、請求項１４又は請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記形質転換体が、非選択的な条件下で少なくとも約１００世代増殖される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記ビフィドバクテリウム属菌細胞がＢ．アニマリス細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ビフィドバクテリウム属菌細胞がＢ．アニマリス亜種ラクティス細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ビフィドバクテリウム属菌細胞がＢ．アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ２８１８であり、得られる細胞がＢ．アニマリス亜種ラクティスＮＣＣ９０３４である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ビフィドバクテリウム属菌細胞がＢ．ロンガム細胞である、請求項１３に記載の方法。
【国際調査報告】
2010500884.tif 000010
2010500884.tif 000011
2010500884.tif 000012
2010500884.tif 000013