(57)【要約】イソキサゾール誘導体を含む再狭窄の予防及び治療のための医薬組成物が提供される。該医薬組成物は、式１で表されるイソキサゾール誘導体の又は医薬品として許容可能なその塩の治療上有効量を含む。該医薬組成物は、抗再発狭窄症活性を示しそして内皮細胞再生を促進するため、該医薬組成物は、血管狭窄症の予防及び治療に有用であり得る。【選択図】図１４
2010532344.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式
【化１】
2010532344.tif 000026
（式中、
Ｒ1は、
非置換又はアシル基、アミノ基、カルボアルコキシ基、カルボキシ基、カルボキシアミノ基、−Ｏ−カルバモイル基（−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ2）、シアノ基、ハロゲン原子、水
酸基、ニトロ基、チオ基、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、スルホニル基及びグアニド基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基により置換された、フェニル基、フラニル基又はチエニル基を表し、
ｍは２又は３を表し、
Ａは結合、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、又はＳ（＝Ｏ）2を表し、そして
Ｒ2は、非置換又はアシル基、アミノ基、カルボアルコキシ基、カルボキシ基、カルボキ
シアミノ基、−Ｏ−カルバモイル基（−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ2）、シアノ基、ハロゲン
原子、水酸基、ニトロ基、チオ基、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、スルホニル基及びグアニド基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基により置換された、イミダゾリル基、ピラゾリル基、トリアゾルイル基、テトラゾリル基又はピリジニル基を表す。）
により表されるイソキサゾール誘導体、又はその医薬品として許容される塩、の治療上有効量を含む、再狭窄の予防及び治療のための医薬組成物。
【請求項２】
前記イソキサゾール誘導体が下記化合物（１）乃至（７０）：
（１）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（２）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピリジン−２−イル−エチル）−アミド
（３）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピリジン−３−イル−エチル）−アミド
（４）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−アミド
（５）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピリジン−４−イル−エチル）−アミド
（６）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［２−（２−メチル−イミダゾール−１−イル）−エチル］−アミド
（７）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［２−（５−メチル−イミダゾール−１−イル）−エチル］−アミド
（８）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［２−（４−メチル−イミダゾール−１−イル）−エチル］−アミド
（９）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
（１０）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピラゾール−１−イル−エチル）−アミド
（１１）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
（１２）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，３
］トリアゾール−２−イル−エチル）−アミド
（１３）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−テトラゾール−２−イル−エチル）−アミド
（１４）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−テトラゾール−１−イル−エチル）−アミド
（１５）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［３−（２−メチル−イミダゾール−１−イル）−プロピル］−アミド
（１６）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−ピラゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（１７）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（１８）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，３］トリアゾール−２−イル−プロピル）−アミド
（１９）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（２０）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−テトラゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（２１）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−テトラゾール−２−イル−プロピル）−アミド
（２２）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［３−（４−メチル−イミダゾール−１−イル）−プロピル］−アミド
（２３）：５−フェニル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（２４）：５−フェニル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−アミド
（２５）：５−ｏ−トリル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（２６）：５−ｍ−トリル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（２７）：５−ｐ−トリル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（２８）：５−（２−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（２９）：５−（３−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（３０）：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（３１）：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（３２）：５−（２−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−アミド
（３３）：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−アミド
（３４）：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピラゾール−１−イル−エチル）−アミド
（３５）：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
（３６）：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，３］トリアゾール−２−イル−エチル）−アミド
（３７）：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［
１，２，３］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
（３８）：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−テトラゾール−２−イル−エチル）−アミド
（３９）：５−（４−クロロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（４０）：５−（４−クロロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
（４１）：５−（４−クロロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（４２）：５−（２−メトキシ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（４３）：５−（３−メトキシ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（４４）：５−（４−メトキシ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（４５）：５−（３−ニトロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（４６）：５−（４−ニトロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（４７）：５−（３−アミノ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（４８）：５−（４−アミノ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（４９）：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（５０）：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（５１）：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−アミド
（５２）：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピラゾール−１−イル−エチル）−アミド
（５３）：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
（５４）：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，３］トリアゾール−２−イル−エチル）−アミド
（５５）：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
（５６）：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピリジン−３−イル−エチル）−アミド
（５７）：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピリジン−４−イル−エチル）−アミド
（５８）：５−（５−ブロモ−チオフェン−２−イル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（５９）：５−フラン−３−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（６０）：５−フラン−３−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（６１）：５−フラン−３−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
（６２）：５−チオフェン−３−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２
，４］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（６３）：５−チオフェン−３−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
（６４）：５−チオフェン−３−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−アミド
（６５）：５−チオフェン−３−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
（６６）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［２−（ピリジン−２−イル−オキシ）−エチル］−アミド
（６７）：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［２−（ピリジン−２−イル−オキシ）−エチル］−アミド
（６８）：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［２−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル−スルファニル）−エチル］−アミド
（６９）：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［３−（４Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イル−スルファニル）−プロピル］−アミド
（７０）：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［２−（４−メチル−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−スルホニル）−エチル］−アミド
からなる群より選ばれる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）又はパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記組成物が、経皮的冠動脈血管形成術（ＰＴＣＡ）後の冠動脈再狭窄、脳血管及び末梢血管の経皮的インターベンション後の再狭窄、種々の血管手術後の血管狭窄症、バイパス手術及び動静脈瘻血管形成術後の血管狭窄症、自己血管及び人工血管移植後の狭窄症、及び動脈硬化からなる群より選ばれる疾患の予防及び治療に用いられる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
経口製剤、非経口製剤、注射製剤又は経皮製剤に形成されるものとして好適な、医薬品として許容できる担体をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記組成物が、ステントコーティング剤の形態において典型的に非経口的に投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１に定義された医薬組成物を患者に投与することにより、抗動脈再狭窄活性をもたらしそして内皮細胞再生を促進する、遅発性ステント血栓症を予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再狭窄の予防及び治療のための医薬組成物に関し、そしてより詳細には、有効成分としてのイソキサゾール誘導体又はそれらの医薬品として許容される塩を含む再狭窄の予防又は治療のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
狭心症又は心筋梗塞によって代表される虚血性疾患を治療する方法のひとつとして、経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）が、バイパス手術の代わりに、最近広く用いられている。この場合、ＰＴＣＡは、その先端部に取り付けられたバルーンを有する特別なカテーテルを末梢動脈から冠動脈の狭窄部位へ経皮的に挿入し、バルーンを拡張することにより狭窄部位を拡張することにより行われる。このバルーンカテーテルを使用した冠動脈血管形成術は、狭心症の比較的高い改善率及び心筋梗塞の発病の誘発に対する低いリスクを有するため、優れた治療法として評価されてきた。しかし、バルーンカテーテルを使用した冠動脈形成術後に、同じ部位の再狭窄が４０乃至５０％の頻度で発生する。この場合は、ＰＴＣＡ又はバイパス手術を再び行わなければならない。
【０００３】
上記問題を解決するために、ステントを使用した方法が、ステンレススチール製の金属ステントを狭窄した血管内に挿入しそして狭窄した血管を血管の本来のサイズに拡張させることにより、狭窄した血管を治療しそして正常な血流を維持するために使用されてきた。この冠動脈ステント挿入は約１０％まで再狭窄率を低下させることが報告された。しかし、ステントを使用する該方法はまた、再狭窄が高頻度で再発する問題を有し、そしてまたステントは柔軟性に欠けるため曲がった血管へステントを適用することは困難である。
【０００４】
ステント内再狭窄の発生に対する機構は、上記問題を解決するために研究された。結果として、バルーンを使用した治療介入における機構とは別に、ステント挿入術後の再狭窄の機構は、血管壁の気圧障害及び異物による連続的な刺激に起因する内膜の過形成に起因し、そして血管がステント挿入術中に十分に拡張されなかった場合に、見せかけのステント内狭窄が生じ得ることが報告された（Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｒ等，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９４：１２４７−１２５４頁、１９６６年：Ｄｕｓｓａｉｎｌｌａｎｔ  ＧＲ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，２６：７２０−７２４頁，１９９５年参照）。最近では、内皮細胞の損傷に対する過形成反応がアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子多型と関連付けられることが知られている。この場合、Ｄ／Ｄ遺伝形質が、８０%のびま
ん性ステント内再狭窄病変において観測され、そして、３６％の病巣部位において認められ、このことは、遺伝形質は再狭窄に影響を及ぼす１つのファクターであることを示している（Ｒｉｂｉｃｈｉｎｉ  Ｆ等、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９７;１４１−１５４頁、
１９９８年参照）。また、血管の中膜中の血管平滑筋細胞の増殖及び内膜への血管平滑筋の移動に起因する新生内膜形成は、再狭窄の機構における最も重要な役割を果たすことが期待されていた。これらの研究結果から、血管再狭窄は、治療介入後の損傷を受けた血管内の血管平滑筋細胞の増殖、成長因子及び細胞質基質に起因する新生内膜の過形成、血管内の動的変化への血管壁の反応による血管の再構築、等に起因すると最近では考えられている（Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＳＥ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．，２３：１２７８−１２８８頁、１９９４年；Ｇｌａｇｏｖ  Ｓ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８９:
２８８８８−２８８９１頁、１９９４年参照）。
【０００５】
正常な血管平滑筋細胞は増大しないが、血管平滑筋細胞の分裂、移動及び増殖は、内皮細胞の中膜がステント挿入手術等により損傷を受けた場合に、シグナル変換カスケードを通じて誘因される。血管平滑筋細胞の増殖の機構は、増殖阻害因子の除去、正常内皮細胞
の損傷による増殖因子の活性化、血管平滑筋細胞の細胞表面上の受容体を介する増殖促進シグナルの変換、そして血管平滑筋細胞の核へ変換された増殖促進シグナルによる細胞周期の変化、等を含む。正常な内皮細胞は、血管平滑筋細胞の増殖を阻害する因子を分泌するが、しかし、内皮細胞が損傷を受けた場合、これらの因子の分泌が阻害され、そして、平滑筋細胞の増殖は、トロンビン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及び活性化血小板から分泌される血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、及び細胞損傷により発生する酸素フリーラジカルにより誘発されることが報告されている（Ｐａｌｍｅｒ  ＲＭＪ等，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：５２４−５２６頁，１９８７年；Ｋｉｎｓｅｌｌａ  ＭＧ，Ｗｉｇｈｔ  ＴＮ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０２：６７８−６８２頁、１９８６年：ＭｃＮａｍａｒａ  ＣＡ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，９１:９４−９８頁，１９９３年参照）
。
【０００６】
レーザー血管形成術、高速回転アテローム切除術及びカッティングバルーンを使用した冠動脈血管形成術のような新しいＰＴＣＡ機器が、再狭窄を予防するために導入され、そして、抗血小板薬、抗血栓剤、血管拡張剤、細胞増殖抑制剤等のような薬剤を使用して冠動脈血管形成術後の再狭窄を予防する試みもまた行われてきた。それらのなかでも、表面がラパマイシン又はパクリタキセルのような細胞増殖抑制剤でコートされた薬剤溶出性ステントが最も効果的であることが証明されている。これらの薬剤は、再狭窄の原因である血管中の血管平滑筋細胞の分裂、移動及び増殖を強力に阻害する。この２種の薬剤溶出性ステントは、再狭窄を防止するというすばらしい効果を持っていたため、薬剤溶出性ステントが２００４年に米国によって着手されてから２年以内に米国冠動脈血管形成市場の９０％以上を該薬剤溶出性ステントが占めるに至るほどのものとして認められてきていた。
【０００７】
しかし、細胞増殖抑制剤を使用した薬剤溶出性ステントは、ステント挿入手術の１ヶ月以上後に患者の遅発性ステント血栓症の発症を増加させるリスクを有することが報告された（２００６年、バルセロナにおける世界心臓病学会）。したがって、ＦＤＡは、患者は、ステント挿入手術後の少なくとも１年間は、抗血栓剤を選ぶようにと推奨しており、そして、遅発性ステント血栓症のリスクを調査して追跡している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｏｈｒｍｓ／ｄｏｃｋｅｔｓ／ａｃ／０６／ｂｒｉｅｆｉｎｇ／２００６−４２５３ｂ１＿０１．ｐｄｆ参照）。薬剤溶出性ステントのこれらの副作用には種々の原因があり得るが、最も重要な原因のひとつは、ステント操作中におけるステント側の血管壁の創傷が治癒しないか又はその治癒が遅延していることである（Ｒｅｎｕ  Ｖｉｒｍａｎｉ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００５年；１１２；２７０−２７８頁参照）。薬剤それ自身は、血管壁における創傷治癒の遅延の原因として考えられている。最近使用された薬剤の全てが細胞増殖抑制剤であり、そしてこれらの細胞増殖抑制剤は、血管壁の内皮細胞再生に作用する血管内皮細胞の分裂、移動及び増殖を阻害し、並びに、再狭窄の原因である血管平滑筋細胞の分裂、移動及び増殖を阻害する。即ち、これらの薬剤は、平滑筋細胞への選択性を有さず、その結果、再狭窄を阻害する作用を有し、また、この薬剤は細胞に対する特定の選択性を有さないため血管壁の創傷治癒を遅延させる副作用も有する。（Ｓａｒｅｍｂｏｃｋ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ：Ｄｉｓ  Ｍｅｃｈ（２００７年）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｄｍｅｃ．２００７．１０．００７）。したがって、再狭窄を予防し、そして血管壁の創傷治癒を阻害する如何なる副作用も有しない、医薬用品の開発に対する緊急の需要が存在する。
【０００８】
一方、「Ｗｎｔ」タンパクは、約４０ｋＤａの分子量を有しそして、システインに富む分泌性糖タンパクであり、そして細胞増殖及び分化を含む種々の成長過程及び細胞極性に関連付けられることが知られている（Ｍｏｏｎ  ＲＴ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年；Ｒｅｙａ  Ｔ及びＣｌｅｖｅｒｓ  Ｈ，Ｎａｔｕｒｅ，２００５年）。１９のＷｎｔタンパクがヒトにおいて同定されたこと、そして、Ｗｎｔ受容体として作用する１０のフリズル（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）タンパク及び２の共受容体（ＬＲＰ５及び６）もまたヒトに存在
することが報告された（ＨｅＸＣ等、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２００４年；Ｔａｍａｉ  Ｋ等，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，２００４年；Ｔａｍａｉ  Ｋ等，Ｎａｔｕｒｅ，２０００年）。
【０００９】
最近では、Ｗｎｔシグナル変換経路が、幹細胞の維持及び分化及び成長促進における重要な役割を果たすことが報告され（Ｒｅｙａ  Ｔ等、Ｎａｔｕｒｅ，２００３年；Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ  ＪＪ等，Ｎａｔｕｅｒ  Ｍｅｄ．，２００６年）、それゆえ、組織の再生、抜け毛の防止、造血、及び幹細胞の成長促進、維持及び分化のための基質としてのＷｎｔタンパクを開発する多くの試みがある。
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を試み、そして、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル変換を調節（アゴナイズ）する効果を有するアゴニストとして作用するイソキサゾール誘導体及びその医薬品として許容できる塩が、再狭窄を予防及び治療するために有効であることを見出したものである。ゆえに、本発明は、上記事実に基づき完成された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｒ等，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９４：１２４７−１２５４頁、１９６６年
【非特許文献２】Ｄｕｓｓａｉｎｌｌａｎｔ  ＧＲ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，２６：７２０−７２４頁，１９９５年
【非特許文献３】Ｒｉｂｉｃｈｉｎｉ  Ｆ等、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９７;１４１−１５４頁、１９９８年
【非特許文献４】Ｅｐｓｔｅｉｎ  ＳＥ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．，２３：１２７８−１２８８頁、１９９４年
【非特許文献５】Ｇｌａｇｏｖ  Ｓ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８９:２８８８８−２８８９１頁、１９９４年
【非特許文献６】Ｐａｌｍｅｒ  ＲＭＪ等，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：５２４−５２６頁，１９８７年
【非特許文献７】Ｋｉｎｓｅｌｌａ  ＭＧ，Ｗｉｇｈｔ  ＴＮ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０２：６７８−６８２頁、１９８６年
【非特許文献８】ＭｃＮａｍａｒａ  ＣＡ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，９１:９４−９８頁，１９９３年
【非特許文献９】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｏｈｒｍｓ／ｄｏｃｋｅｔｓ／ａｃ／０６／ｂｒｉｅｆｉｎｇ／２００６−４２５３ｂ１＿０１．ｐｄｆ
【非特許文献１０】Ｒｅｎｕ  Ｖｉｒｍａｎｉ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００５年；１１２；２７０−２７８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、先行技術の問題を解決することを目的とし、そしてしたがって、該医薬組成物は有効成分としてのイソキサゾール誘導体又はそれらの医薬品として許容できる塩を含むため、本発明の目的は、再狭窄の予防及び治療に効果を有する医薬組成物を提供することにある。
【００１３】
また、本発明のその他の目的は、活性成分としてイソキサゾール誘導体又はそれらの医薬品として許容できる塩を採用することにより、血管内皮細胞における創傷治癒に起因する遅発性ステント血栓症の如何なる副作用もなしに、抗再狭窄活性を付与しそして内皮細胞再生を促進する、血管再狭窄の予防又は治療の方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
技術的解決
本発明のこの明細書の詳細な説明に先立ち、本発明中で使用される用語を以下に定義する。
【００１５】
ａ）アルキル基：直鎖又は分枝、飽和又は不飽和の１乃至１０個の炭素原子を含む炭化水素であり、１つ又はそれ以上の水素原子が、１種又はそれ以上の、アシル基、アミノ基、カルボアルコキシ基、カルボキシ基、カルボキシアミノ基、−Ｏ−カルバモイル基（−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ2）、シアノ基、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、チオ基、アルキ
ル基、シクロアルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、スルホキシ基及びグアニド基から選ばれる基で、最大限に可能な数まで、順番及びその種類にかかわりなく、置換され得るものを指す。
【００１６】
ｂ）シクロアルキル基：飽和又は部分的に飽和されるか、０乃至５個の酸素、硫黄、窒素等のようなヘテロ原子と構成される３乃至１２員からなる、非芳香族、単環式又は多環式環状炭化水素化合物を指す。それは、３乃至１２員の単環化合物又は結合した環化合物であり、１つ又はそれ以上の水素原子が、アシル基、アミノ基、カルボアルコキシ基、カルボキシ基、カルボキシアミノ基、−Ｏ−カルバモイル基（−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ2）、
シアノ基、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、チオ基、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、スルホキシ基、グアニド基から選ばれる基で、１種又はそれ以上の、最大限に可能な数まで、順番及びその種類にかかわりなく、置換され得るものであり得る。
【００１７】
シクロアルキル基の具体例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、モルホリニル基、ホモモルホリニル基、チオモルホリニル基、ホモチオモルホリニル基、チオモルホリニル  Ｓ−オキシド、チオモルホリニル  Ｓ，Ｓ−ジオキシド、ピペリジニル基、ホモピペリジニル基、ピペラジニル基、ホモピペラジニル基、ピロリジニル基、ピロリニル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロフラニル基、テトラヒドロチエニル基、オキサゾリジノニル基、ジヒドロピラゾリル基、ジヒドロピロリル基、ジヒドロピラジニル基、ジヒドロピリジニル基、ジヒドロピリミジニル基、ジヒドロフリル基及びジヒドロピラニル基を含むがこれらに限定されない。
【００１８】
ｃ）アリール基： ５乃至１５員環及び１乃至５個の酸素、硫黄又は窒素のようなヘテロ
原子との複素環からなる、芳香族単環又は結合環炭化水素を含む芳香族環であり、１つ又はそれ以上の水素原子が、アシル基、アミノ基、カルボアルコキシ基、カルボキシ基、カルボキシアミノ基、−Ｏ−カルバモイル基（−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ2）、シアノ基、ハ
ロゲン原子、水酸基、ニトロ基、チオ基、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、スルホキシ基及びグアニド基から選ばれる基で、１種又はそれ以上の、最大限に可能な数まで、順番及びその種類にかかわりなく、置換され得るものを指す。
【００１９】
アリール基の具体例としては、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、ピリジニル基、ピリミジニル基、キノリニル基、ベンゾチエニル基、インドリル基、ピラジニル基、イソインドリル基、イソキノリル基、キナゾリニル基、キノキサリニル基、フタラジニル基、イミダゾリニル基、イソキサゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、インドリジニル基、インダゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ベンズイミダゾリル基、ベンゾフラニル基、チエニル基、ピロリル基、オキサジアゾリル基、チアジアゾリル基、チアゾリル基、テトラゾリル基、オキサゾロピリジニル基、イミダゾピリジニル基、イソチアゾリル基、シンノリニル基、カルバゾリル基、イソクロマニル基、クロマニル基
、テトラヒドロイソキノリニル基、イソインドリニル基、イソベンゾテトラヒドロフラニル基、イソベンゾテトラヒドロチエニル基、イソベンゾチエニル基、ベンゾキサゾリル基、ピリドピリジニル基、ベンゾテトラヒドロフラニル基、ベンゾテトラヒドロチエニル基、プリニル基、ベンゾジオキソリル基、トリアジニル基、フェノキサジニル基、フェノチアジニル基、プテリジニル基、ベンゾチアゾリル基、イミダゾピリジニル基、イミダゾチアゾリル基、ジヒドロベンズイソキサジニル基、ベンズイソキサジニル基、ベンゾキサジニル基、ジヒドロベンズイソチオピラニル基、ベンゾピラニル基、ベンゾチオピラニル基、クマリニル基、イソクマリニル基、クロモニル基、クロマノニル基、ピリジニル−Ｎ−オキシド、テトラヒドロキノリニル−Ｎ−オキシド、ジヒドロキノリニル基、ジヒドロキノリノニル基、ジヒドロイソキノリノニル基、ジヒドロクマリニル基、ジヒドロイソクマリニル基、イソインドリノニル基、ベンゾジオキサニル基、ベンゾオキサゾリノニル基、ピロリル−Ｎ−オキシド、ピリミジニル−Ｎ−オキシド、ピラジニル−Ｎ−オキシド、キノリニル−Ｎ−オキシド、インドリル−Ｎ−オキシド、インドリニル−Ｎ−オキシド、ピラジニル−Ｎ−オキシド、イソキノリル−Ｎ−オキシド、キナゾリニル−Ｎ−オキシド、キノキサリニル−Ｎ−オキシド、フタラジニル−Ｎ−オキシド、イミダゾリニル−Ｎ−オキシド、イソキサゾリル−Ｎ−オキシド、オキサゾリル−Ｎ−オキシド、チアゾリル−Ｎ−オキシド、インドリジニル−Ｎ−オキシド、イミダゾリル−Ｎ−オキシド、ベンゾチアゾリル−Ｎ−オキシド、ベンズイミダゾリル−Ｎ−オキシド、ピロリル−Ｎ−オキシド、オキサジアゾリル−Ｎ−オキシド、チアジアゾリル−Ｎ−オキシド、トリアゾリル−Ｎ−オキシド及びテトラゾリル−Ｎ−オキシドを含むがこれらに限定されない。
【００２０】
ｄ）ハロ：一般的にフルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードと呼ぶ。
【００２１】
説明の便宜のため、本発明で用いられる用語は、以下に定義した省略された形で用いられる。
−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド：ＤＭＦ
−テトラヒドロフラン：ＴＨＦ
−１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド：ＥＤＣ
−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物：ＨＯＢｔ
−１，１'−カルボニルジイミダゾール：ＣＤＩ
−ジフェニルホスホリルアジド：ＤＰＰＡ
−トリエチルアミン：ＴＥＡ
−メチル：Ｍｅ
−エチル：Ｅｔ
【００２２】
以下に典型的な本発明の実施態様をより詳細に説明する。
本発明の特徴によれば、下記式
【化１】
2010532344.tif 000003
（式中、
Ｒ1は、
非置換又はアシル基、アミノ基、カルボアルコキシ基、カルボキシ基、カルボキシアミノ基、−Ｏ−カルバモイル基（−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ2）、シアノ基、ハロゲン原子、水
酸基、ニトロ基、チオ基、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、スルホニル基及びグアニド基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基により置換された、フェニル基、フラニル基又はチエニル基を表し、
ｍは２又は３を表し、
Ａは結合、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、又はＳ（＝Ｏ）2を表し、そして
Ｒ2は、非置換又はアシル基、アミノ基、カルボアルコキシ基、カルボキシ基、カルボキ
シアミノ基、−Ｏ−カルバモイル基（−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ2）、シアノ基、ハロゲン
原子、水酸基、ニトロ基、チオ基、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、スルホニル基及びグアニド基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基により置換された、イミダゾリル基、ピラゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基又はピリジニル基を表す。）
により表されるイソキサゾール誘導体、又はその医薬品として許容される塩、の治療上有効量を含む、再狭窄の予防及び治療のための医薬組成物、が提供される。
【００２３】
化学式１により表される化合物に加え、医薬品として許容できる酸又は塩基添加物塩及びその立体化学的な異性体は、本発明のイソキサゾール誘導体の範囲内である。該化合物が投与される対象においてそれが好ましくない効果をもたらさずにその親化合物の活性が維持される限り、如何なる塩も本発明の範囲内であり、そして如何なる特別な限定もそれに付与されるものではない。該塩は無機又は有機塩であり得る。好ましくは、酢酸、硝酸、アスパラギン酸、スルホン酸、硫酸、マレイン酸、グルタミン酸、蟻酸、コハク酸、リン酸、フタル酸、タンニン酸、酒石酸、臭化水素酸、プロピオン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ステアリン酸、エシル酸（ｅｓｙｌ）、乳酸、重炭酸、重硫酸、酒石酸水素塩、シュウ酸、酪酸、エデト酸カルシウム、カムシル酸、炭酸、クロロ安息香酸、クエン酸、エデト酸、トルエンスルホン酸、エデシル酸（ｅｄｉｓｙｌｉｃ）、エシル酸、フマル酸、グルセプト酸、パモン酸、グルコン酸、グリコリルアルサニル酸、メチル硝酸、ポリガラクトウロン酸、ヘキシルレゾルシン酸、マロン酸、ヒドラバミック酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸、マンデル酸、エストリック酸、メチル硫酸、ムチン酸、ナプシル酸、ムコン酸、ｐ−ニトロメタンスルホン酸、ヘキサミン酸、パントテン酸、リン酸一水素、リン酸二水素、サリチル酸、スルファミン酸、スルファニル酸、メタンスルホン酸、又はテオクル酸の塩である。
【００２４】
また、塩基性塩の形態は、例えば、アンモニウム塩、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウム塩のようなアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、ベザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ヒドラバミン塩、及びアルギニン及びリジンのようなアミノ酸のような有機塩基性塩を含み得る。
【００２５】
一方、塩の形態は、好適な塩基又は酸で処理することにより遊離型に変換され得る。
【００２６】
ここで用いられる用語「付加塩」は、化学式１の化合物又はその塩が形成し得る溶媒和物を含む塩を意味する。該溶媒和物は、水和物及びアルコラートにより例示され得る。
【００２７】
ここで用いられるように、「化学式１で表される化合物の立体化学的な異性体」という用語は、化学式１で表される化合物が有し得る全ての可能な形態を指す。特に特定又は言及のない限り、化学式１で表される化合物の化学名は、基本分子構造の全てのジアステレオマー及びエナンチオマーを含む、全ての可能な立体化学的な異性体の混合物を示す。
【００２８】
特に、それぞれのキラル中心は、Ｒ又はＳ−配置の両方を有し得、そして二価の環状（部分的に）飽和ラジカル上の置換基は、シス−又はトランス−配置を有し得る。二重結合を有する化合物がもし存在する場合には、Ｅ−又はＺ−立体化学を有し得る。全ての化学式１で表される化合物の立体化学的な異性体は、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【００２９】
本発明の典型的な実施態様によるイソキサゾール化合物の中で、より好ましいイソキサゾール誘導体の例は、以下の誘導体（１）乃至（７０）であるがこれらに特に限定される
ものではない。
【００３０】
誘導体１：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体２：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピリジン−２−イル−エチル）−アミド
誘導体３：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピリジン−３−イル−エチル）−アミド
誘導体４：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体５：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピリジン−４−イル−エチル）−アミド
誘導体６：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［２−（２−メチル−イミダゾール−１−イル）−エチル］−アミド
誘導体７：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［２−（５−メチル−イミダゾール−１−イル）−エチル］−アミド
誘導体８：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［２−（４−メチル−イミダゾール−１−イル）−エチル］−アミド
誘導体９：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体１０：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピラゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体１１：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体１２：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，３］トリアゾール−２−イル−エチル）−アミド
誘導体１３：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−テトラゾール−２−イル−エチル）−アミド
誘導体１４：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−テトラゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体１５：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［３−（２−メチル−イミダゾール−１−イル）−プロピル］−アミド
誘導体１６：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−ピラゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体１７：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体１８：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，３］トリアゾール−２−イル−プロピル）−アミド
誘導体１９：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体２０：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−テトラゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体２１：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−テトラゾール−２−イル−プロピル）−アミド
誘導体２２：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［３−（４−メチル−イミダゾール−１−イル）−プロピル］−アミド
誘導体２３：５−フェニル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体２４：５−フェニル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体２５：５−ｏ−トリル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体２６：５−ｍ−トリル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体２７：５−ｐ−トリル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体２８：５−（２−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体２９：５−（３−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体３０：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体３１：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体３２：５−（２−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体３３：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体３４：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピラゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体３５：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体３６：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，３］トリアゾール−２−イル−エチル）−アミド
誘導体３７：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体３８：５−（４−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−テトラゾール−２−イル−エチル）−アミド
誘導体３９：５−（４−クロロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体４０：５−（４−クロロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体４１：５−（４−クロロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体４２：５−（２−メトキシ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体４３：５−（３−メトキシ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体４４：５−（４−メトキシ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体４５：５−（３−ニトロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体４６：５−（４−ニトロ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体４７：５−（３−アミノ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体４８：５−（４−アミノ−フェニル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体４９：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体５０：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体５１：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体５２：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピラゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体５３：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体５４：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体５５：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，３］トリアゾール−２−イル−エチル）−アミド
誘導体５６：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピリジン−３−イル−エチル）−アミド
誘導体５７：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−ピリジン−４−イル−エチル）−アミド
誘導体５８：５−（５−ブロモ−チオフェン−２−イル）−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体５９：５−フラン−３−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体６０：５−フラン−３−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体６１：５−フラン−３−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体６２：５−チオフェン−３−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体６３：５−チオフェン−３−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド
誘導体６４：５−チオフェン−３−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−イミダゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体６５：５−チオフェン−３−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（２−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−エチル）−アミド
誘導体６６：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［２−（ピリジン−２−イル−オキシ）−エチル］−アミド
誘導体６７：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［２−（ピリジン−２−イル−オキシ）−エチル］−アミド
誘導体６８：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［２−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル−スルファニル）−エチル］−アミド
誘導体６９：５−チオフェン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［３−（４Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イル−スルファニル）−プロピル］−アミド
誘導体７０：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸［２−（４−メチル−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イル−スルホニル）−エチル］−アミド
【００３１】
本発明のその他の特徴によれば、抗再狭窄活性を付与しそして内皮細胞再生を促進するため有効成分として化学式１で表されるイソキサゾール誘導体又はそれらの医薬品として許容される塩を採用することにより、遅発性ステント血栓症の如何なる副作用なしに血管再狭窄の予防及び治療する方法もまた提供される。
【００３２】
血管再狭窄は、経皮的冠動脈血管形成術（ＰＴＣＡ）後の冠動脈再狭窄、脳血管及び末梢血管の経皮的インターベンション後の再狭窄、種々の血管手術後の血管狭窄症、バイパ
ス手術及び動静脈瘻血管形成術後の血管狭窄症、自己血管及び人工血管移植後の狭窄症、及び動脈硬化を含み得るが、これらに特に限定されるものではない。
【００３３】
本発明の一つの典型的な実施態様による化学式１で表されるイソキサゾール誘導体は、既知の化合物、又は、本発明が関連する分野における化合物合成の分野に関する当業者により知られた化合物から容易に製造され得る化合物、から製造され得る。したがって、ここに示されるイソキサゾール誘導体の製造方法の記載は、例証することのみを目的とするためだけの好ましい例であり、そして、単位操作の順番は、必要ならば、選択して変更され得るが、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００３４】
先ず、化学式１で表されるイソキサゾール誘導体の製造方法を以下のスキーム１を参照して詳細に説明する。
【００３５】
［スキーム１］
【化２】
2010532344.tif 000004
【００３６】
市販の出発物質（１）は、好ましくは、無水エタノール中で１．０Ｍナトリウムエトキシドで処理され得、そして、シュウ酸ジエチルと反応させ中間体（２）を得る。次に、中間体（２）は無水エタノール溶液中でヒドロキシルアミンで処理され得、イソキサゾール中間体（３）を得る。次に、中間体（３）は、好ましくはＴＨＦ及びメタノール溶媒の存在下で１Ｎ水酸化リチウム水溶液で処理され得、カルボン酸中間体（４）を合成する。中間体（４）は所望のアミンと反応し得、最終のイソキサゾール化合物（５）（化学式１で表される化合物）を得る。
【００３７】
本発明の典型的な実施態様による化学式１の化合物は、後述する実施例の結果のように、Ｗｎｔ／β―カテニンシグナル変換をアゴナイズ（ａｇｏｎｉｚｅ）する効果を有する。したがって、本発明は、式１で示されるイソキサゾール誘導体、又は医薬品として許容できる塩及び医薬品として許容できるその担体の治療上の有効量を本質的に含む、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル変換をアゴナイズする効果を有する組成物を提供する。
【００３８】
医薬組成物の製造において、担体は、製造される製剤により選択され得、そして製剤は、活性成分、式１で表されるイソキサゾール誘導体と担体を好適な混合比で混合することにより製造され得る。
【００３９】
即ち、活性成分は、所望の使用により経口、非経口、注射剤又は経皮的製剤に製剤化され得、そして、簡易な投与及び投与量の均一性の観点において単位あたりの剤形に製造される。
【００４０】
本発明の一つの典型的な実施態様による医薬組成物の投与は、腹腔内、筋肉内及び皮下
投与並びに経口投与を含み得るが、非経口投与が好ましい。例えば、医薬組成物は、浸透圧ポンプをヒトに挿入することにより放出を制御して投与され得、そしてまた、コーティング剤の形態のステントへ非経口で局所的に投与される。また、本発明の一つの典型的な実施態様による医薬組成物を、単独又は従来のその他の薬剤と組み合わせてコーティング剤の形態で局所的に投与するのもまた好ましい。この場合、コーティング方法は、ステントを薬剤でコーティングする従来の方法に従う。コーティング方法としては例えば、ステントをコーティングするために用いられる種々のポリマーと薬剤を混合すること、ドロップ及びスピンのようなコーティング方法を用いて薬剤混合物を用いてステントをコーティングすること、そしてコーティングされたステントを滅菌することを含む方法が使用され得る。
【００４１】
最も好ましくは、本発明の一つの典型的な実施態様による医薬組成物は、ステントコーティング剤の形態で非経口で局所的に投与され得る。
【００４２】
従来の薬学的担体は、経口製剤の製造のために使用され得る。例えば、水、グリコール、オイル、アルコール等がシロップ、エリキシル剤及び溶液のような経口液体製剤の場合の担体として使用され得、そして、デンプン、糖、カオリン、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等が、粉末、ピル、カプセル及びタブレットのような固体製剤の場合に担体として使用され得る。タブレット及びカプセルは、簡便な投与を考慮し最も使い勝手のよい剤形であり、そして、タブレット及びピルを腸溶性製剤の形態で製造することが、より好ましい。
【００４３】
非経口製剤の場合において、滅菌水が担体として一般的に使用される。この場合、非経口製剤はさらに、溶解剤のようなその他の成分を含み得る。
【００４４】
注射製剤、例えば、滅菌された注射用水溶性又は脂溶性懸濁液は、既知の方法による好適な分散剤、湿潤剤及び懸濁化剤を用いて製造され得る。ここに使用される溶媒は、水、リンゲル液及び生理食塩水が含まれ得、そして滅菌固定油もまた溶媒又は懸濁化媒体として一般的に使用される。任意の、モノ−又はジ−グリセリドを含む非刺激性固定油が、この目的のために使用され、そしてオレイン酸のようなその他の脂肪酸が注射用製剤のために使用され得る。
【００４５】
経皮的製剤の場合に、担体としての浸潤プロモーター及び／又は好適な湿潤剤が、皮膚に如何なる炎症ももたらさない好適な添加剤とともに、任意に使用され得る。添加剤が皮膚を介した投与を促進し又は望ましい組成物を製造する一助となる場合、添加剤には特に限定はない。また、経皮製剤は、経皮パッチ、クリーム又は軟膏のような種々の形態で投与され得る。
【００４６】
一方、本発明による活性成分が人体から急速に排除されることを防ぐために、本発明の１つの典型的な実施態様によるイソキサゾール誘導体を含む組成物は、徐放性製剤に製剤化され得る。この場合、ここで使用され得る担体の具体例は、当業者に知られたインプラント、マイクロカプセル化された送達系、生分解性／生体適合性のあるポリマー等を含む。
【００４７】
用語「治療上の有効量」は、治療の必要のある病気の症状の緩和又は軽減に、又は予防の必要のある病気の臨床的指標の兆候又は症状の軽減又は遅延に、効果的な活性成分の量を意味する。治療上の有効量は、実際に治療する病気のためには既知の生体内及び生体外モデル系における、対応する化合物の実験を行うことによる経験から決定され得る。
【００４８】
本発明の１つの典型的な実施態様による組成物中の活性成分、特に化学式１で表されるイソキサゾール誘導体は、臨床目的で投与され、患者に単回又は複数回で投与され得る活
性成分の一日投与量は、体重１ｋｇあたり０．１乃至１００ｍｇの範囲がより好ましいが、特定の患者に対する同等な投与量は、使用される特定の化合物、患者の体重、性別及び健康状態、食餌、薬剤の投与時間、投与経路、排泄速度、薬剤の混合物、病気の重篤度等により変化し得る。
【００４９】
化学式１で表されるイソキサゾール誘導体は、有効な医薬組成物を該誘導体のプロドラッグ形態等へ製剤化するために必要な場合には使用され得る。
【００５０】
また、本発明の1つの典型的な実施態様による組成物は、活性成分の作用を阻害しない
又は助けるその他の成分をさらに含み得、そして、当業者に知られたその他の種々の形態に製剤化され得る。本発明の1つの典型的な実施態様による組成物は、好ましくは、当業
者に知られたラパマイシン又はパクリタキセルのような血管再狭窄阻害剤をさらに含み得る。
【００５１】
有利な効果
上記したように、本発明の１つの典型的な実施態様による医薬組成物は、該医薬組成物が抗再狭窄活性及び内皮細胞再生の促進を示すため、従来の薬剤溶出ステントの副作用の１つである遅発性ステント血栓症の予防に有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、β−カテニン活性におけるイソキサゾール誘導体の効果を測定するために設計された遺伝子構造を図示する略図である。
【図２】図２は、β−カテニン活性におけるイソキサゾール誘導体の効果を評価するために構築された細胞株スクリーニング系を説明する概念図である。
【図３】図３は、図２に示すスクリーニング系の作用がＷｎｔ／β−カテニンシグナル変換のアゴニストである塩化リチウムを用いて測定される結果を説明するグラフである。
【図４】図４は、細胞内に集積したβ−カテニンの量が、ＨＥＫ２９３細胞が種々の濃度のイソキサゾール誘導体で処理される場合のヒトβ−カテニン抗体を用いて、ウエスタンブロット実験により測定される結果を説明する図である。
【図５】図５は、内皮細胞増殖及び平滑筋細胞増殖における、本発明の１つの典型的な実施態様によるイソキサゾール誘導体及び従来の再狭窄阻害剤、パクリタキセル及びラパマイシン、の効果を説明するグラフである。
【図６】図６は、細胞をイソキサゾール誘導体及びラパマイシンを一緒に用いて処理した場合の、内皮細胞増殖及び平滑筋細胞増殖における効果を説明するグラフである。
【図７】図７は、細胞をイソキサゾール誘導体及びパクリタキセルを一緒に用いて処理した場合の、内皮細胞増殖における効果を説明するグラフである。
【図８】図８は、内皮細胞増殖における、本発明の１つの典型的な実施態様による種々のイソキサゾール誘導体の効果を説明するグラフである。
【図９】図９は、内皮細胞増殖における、本発明の１つの典型的な実施態様による種々のイソキサゾール誘導体の効果を説明するグラフである。
【図１０】図１０は、内皮細胞増殖における、本発明の１つの典型的な実施態様による種々のイソキサゾール誘導体の効果を説明するグラフである。
【図１１】図１１は、ラット頸動脈損傷モデルを用いることにより、細胞をイソキサゾール誘導体及びラパマイシンを一緒に用いて処理した場合の再狭窄の阻害における効果を説明する図である。
【図１２】図１２は、ラット頸動脈損傷モデルを用いることにより、本発明の１つの典型的な実施態様によるイソキサゾール誘導体の内皮細胞再生における効果を説明する図である。
【図１３】図１３は、ラット頸動脈損傷モデルを用いることにより、細胞をイソキサゾール誘導体及びラパマイシンを一緒に用いて処理した場合の内皮細胞再生における効果を説明する図である。
【図１４】図１４は、ブタ冠状動脈ステントモデルを用いることにより、本発明の１つの典型的な実施態様によるイソキサゾール誘導体の再狭窄の阻害における効果を説明する図である。
【図１５】図１５は、ブタ冠状動脈ステントモデルを用いることにより、本発明の１つの典型的な実施態様によるイソキサゾール誘導体の内皮細胞再生における効果を説明する図である。
【実施例】
【００５３】
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の典型的な実施態様をより詳細に記載する。しかしながら、ここに提案される記載は、例示のみ提案するための単に好ましい例であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるものである。
【００５４】
製造実施例１：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミドの製造
５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミド（誘導体１）を以下のスキーム２で表される経路を通じて合成した。それぞれの反応系路の工程を以下により詳細に記載する。
【００５５】
［スキーム２］
【化３】
2010532344.tif 000005
【００５６】
１）工程１：４−フラン−２−イル−２，４−ジオキソ−酪酸エチルエステルの製造
無水エタノール（２００ｍＬ）中のナトリウムエトキシド（６．８１ｇ）の溶液へ、０℃において２−アセチルフラン（５．０１ｍＬ）を徐々に添加した。得られた溶液を０℃において２時間攪拌し、そしてシュウ酸ジエチル（９．３０ｍＬ）を該溶液へ徐々に添加した。得られた溶液を１８時間攪拌し、そして反応を１Ｎ塩酸溶液を用いて停止させた。得られた混合物を減圧下で濃縮し、そして次に残渣を塩化メチレンで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そして次に減圧下で濃縮し、１０．０ｇの４−フラン−２−イル−２，４−ジオキソ−酪酸エチルエステルを得た。この濃縮物をさらに精製することなく次の工程に用いた。
1Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−ｄ6，２００ＮＨｚ），ｐｐｍ（δ）：８．０２〜７．９９（ｍ，１Ｈ），７．６２〜７．５５（ｍ，１Ｈ），６．９８〜６．９４（ｍ，１Ｈ），６．８３〜６．７７（ｍ，１Ｈ），４．４０（ｑ，２Ｈ），１．３８（ｔ，３Ｈ）
【００５７】
２）工程２：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸エチルエステルの製造
４−フラン−２−イル−２，４−ジオキソ−酪酸エチルエステル（１０．０ｇ）及びヒドロキシルアミン塩酸塩のエタノールの懸濁液を８５℃において２時間攪拌し、そして得られた混合物を減圧下濃縮した。濃縮物を塩化メチレン及び蒸留水中に溶解し、そして
有機層を分離した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、シリカゲルパッドを通し濾過し、そして次に減圧下濃縮し、８．０１ｇの５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸エチルエステルを得た（収率：７７％）。この濃縮物をさらに精製することなく次の工程に用いた。
1Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−ｄ6、  ２００ＮＨｚ），ｐｐｍ（δ）：７．９０〜７．８６（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｄ，１Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），６．７７〜６．７３（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｑ，２Ｈ），１．４１（ｔ，３Ｈ）
【００５８】
３）工程３：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸の製造
５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸エチルエステル（４．１４ｇ）のＴＨＦ（１３０ｍＬ）及びメタノール（２５ｍＬ）の溶液に、１Ｎ水酸化リチウム水溶液（８０ｍＬ）を徐々に添加した。得られた混合物を１５時間攪拌し、そして次に減圧下濃縮した。残渣の溶液を１Ｎ塩酸で酸性にし、固体を形成させた、そしてこの固体を濾取し、蒸留水で洗浄し、乾燥させ、３．２２ｇの５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸を白色固体として得た（収率：９０％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−ｄ6，２００ＮＨｚ），ｐｐｍ（δ）：７．９０〜７．８６（ｍ，１Ｈ），７．１９（ｄ，１Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），６．７７〜６．７３（ｍ，１Ｈ）
【００５９】
４）工程４：５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）アミド（誘導体１）の製造
５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（７ｍｇ）及び３−イミダゾールー１−イル−プロピルアミン（０．００５ｍＬ）のＤＭＦの溶液へＨＯＢｔ（８ｍｇ）、ＥＤＣ（９ｍｇ）及びＴＥＡ（０．０１４ｍＬ）を添加した。得られた溶液を室温において１８時間攪拌し、そして次に減圧下濃縮した。得られた濃縮物を分取用ＨＰＬＣを用いて精製し、４ｍｇの５−フラン−２−イル−イソキサゾール−３−カルボン酸（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−アミドを得た（収率：３５％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（アセトン−ｄ6，２００ＮＨｚ），ｐｐｍ（δ）：８．１６（ｂｓ，１Ｈ），７．８６〜７．８４（ｍ，１Ｈ），７．６５〜７．６１（ｍ，１Ｈ），７．１９〜７．１２（ｍ，２Ｈ），６．９７〜６．８９（ｍ，２Ｈ），６．７８〜６．７１（ｍ，１Ｈ），４．１８（ｔ，２Ｈ），３．４８（ｑ，２Ｈ），２．２４〜２．０７（ｍ，２Ｈ）  正確な質量（計算値）２８６．１１  ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｅ（Ｍ＋１）＋：２８７
【００６０】
以下の誘導体２乃至７０を、適切な出発物質を用いる他はイソキサゾール誘導体１の合成と同様の方法で製造した。
ＮＭＲの結果を下記表１に一覧する。
【００６１】
表１
【表１】
2010532344.tif 000006
【表２】
2010532344.tif 000007
【表３】
2010532344.tif 000008
【表４】
2010532344.tif 000009
【表５】
2010532344.tif 000010
【表６】
2010532344.tif 000011
【表７】
2010532344.tif 000012
【表８】
2010532344.tif 000013
【表９】
2010532344.tif 000014
【表１０】
2010532344.tif 000015
【表１１】
2010532344.tif 000016
【表１２】
2010532344.tif 000017
【表１３】
2010532344.tif 000018
【表１４】
2010532344.tif 000019
【表１５】
2010532344.tif 000020
【００６２】
製造実施例において合成された上記化合物は、以下の再狭窄の阻害における効果を試験した。
【００６３】
実施例１：細胞株を用いたＷｎｔ／β−カテニンシグナル変換に対する活性物質の確認
（１）細胞株を用いたｗｎｔ／β−カテニンシグナル変換のための測定系の構築      
２種のヒト腫瘍細胞株ＨＥＫ２９３及びＳＷ４８０を、本発明の典型的な実施例による化合物の生体外での活性を測定するために使用した。ここで、前者は、Ｗｎｔシグナル変換経路が除かれていない細胞株を表し、そして後者はＷｎｔシグナル変換経路が構造的に制限されていない（ＡＰＣ遺伝子突然変異）細胞株を表す。
それぞれの癌細胞株中のｗｎｔ／β−カテニンシグナル変換の活性を測定するために、本発明者らは、図１に示されるように、β−カテニンが結合するＴｃｆ／Ｌｅｆ転写調節タンパクの結合サイト（５Ｘ  ＴＣＦｓ）を有し、そしてＴｃｆ／Ｌｅｆ転写調節タンパクの活性を測定し得るマーカーとしてホタル蛍光タンパク（ホタルルシフェラーゼ）を有する遺伝子、を細胞中へ導入した。次に、本発明者らは、Ｇ４１８で遺伝子導入された細胞を処理することにより、Ｔｃｆ／Ｌｅｆ転写調節タンパクが遺伝子の導入により連続的に発現する、細胞株の単一クローンを得るために、細胞に基づくＷｎｔアゴニストスクリーニング系を構築した。次に、本発明者らは、図２に示されるように、スクリーニング系を用いて発現した蛍光タンパクの量を測定することにより、β−カテニン活性を間接的に測定する、細胞に基づくスクリーニングを行った。
調製された細胞株が、本発明の一つの典型的な実施態様によるイソキサゾール誘導体のＷｎｔアゴニスト活性を測定する対照としての細胞に基づくＷｎｔアゴニストスクリーニング系中の陽性対照である、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）で処理された場合、蛍光タンパクの発現量が測定され、そして図３に示されるようにグラフ中にプロットされた。
【００６４】
（２）イソキサゾール誘導体のｗｎｔ／β−カテニンシグナル変換活性の測定
細胞に基づいたＷｎｔアゴニストスクリーニング系が構築された細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０（ＳＷ４８０用）又はＤＭＥＭ（ＨＥＫ２９３用）培養媒体（ペニシリニウム属ストレプトマイシン（１００単位／ｍＬ）処理及び熱処理により不活化したウシ胎児血清を含む）中で標準の培養条件（５％ＣＯ2、３７℃、１００％相対湿度（ＲＨ））のもとで
インキュベートした。次に、単個細胞浮遊液をトリプシン処理及びピペッティング法により得た。単個細胞浮遊液を、細胞の数がウェルあたり８，０００個乃至１５，０００個の範囲になるまで同じ培養媒体で希釈し、そして９６−ウェルのマイクロタイタープレートへ移した。２４時間の培養の後、細胞を種々の濃度の製造実施例において製造したイソキ
サゾール誘導体で処理した。２４時間の培養の後、イソキサゾール誘導体の活性を、ルシフェラーゼアッセイキット（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）製、米国）を用いて測定した。評価は、製造者のマニュアルに記載されている方法に基づき行い、そして、製造実施例で製造したイソキサゾール誘導体の活性を以下の表２乃至３に一覧する。Ｗｎｔシグナル変換をアゴナイズする作用を有することで知られる塩化リチウム（ＬｉＣｌ、２０ｍＭ）を対照として使用し、そして塩化リチウムのアゴニスト効果に対する相対値を百分率で表した。
【００６５】
［表２］
ＨＥＫ２９３細胞株中のβ−カテニン活性におけるイソキサゾール誘導体の効果
【表１６】
2010532344.tif 000021
【表１７】
2010532344.tif 000022
【００６６】
［表３］
［表］
ＳＷ４８０細胞株中のβ−カテニン活性におけるイソキサゾール誘導体の効果
【表１８】
2010532344.tif 000023
【表１９】
2010532344.tif 000024
【表２０】
2010532344.tif 000025
【００６７】
実施例２：集積したβ−カテニンの量を測定することによる生体外でのイソキサゾール誘導体のＷｎｔ／β−カテニンシグナル変換活性の確認
ＨＥＫ２９３細胞株を、ＤＭＥＭ培養媒体（ペニシリニウム属ストレプトマイシン（１００単位／ｍＬ）の処理及び熱処理により不活化したウシ胎児血清を含む）中で標準の培養条件（５％ＣＯ2、３７℃、１００％相対湿度（ＲＨ））のもとでインキュベートした
。試験化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解し、そして最後に３０又は６０μＭの濃度において使用した。ＨＥＫ２９３細胞（３×１０7）を、試験化合物含有培
養媒体及び試験化合物のない培養媒体それぞれの中で２４時間インキュベートした。ＨＥＫ２９３細胞から細胞質のみを選択的に遊離させるために、該ＨＥＫ２９３細胞を、高濃度塩溶液でＨＥＫ２９３細胞を処理し、得られた細胞浮遊液を２００ｇ（ｒｐｍ）の回転速度で１０分間遠心分離することにより、溶解させた。次に、細胞核及び膜の沈殿物を除去し、上澄を回収した。
得られた細胞質溶液を１０％ＰＡＧＥゲル中で電気泳動し、そして次にβ−カテニン抗体（アップステートバイオテクノロジー社（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）製）でプローブした。プローブは、化学発光系を用いて行った（ＥＣＬ、アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）製）。アクチンタンパクを対照として使用し、タンパクの当量を比較した。結果を図４に示す。図４に示すように、ウエスタンブロットアッセイから、細胞が化合物で処理された場合、化合物の濃度に依存してβ−カテニンは細胞中に集積することが確認された。
【００６８】
実施例３：イソキサゾール誘導体における内皮細胞増殖及び平滑筋細胞増殖の生体外試験（１）内皮細胞増殖
３乃至１０代継代培養されたＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞、キャンブレックス社（Ｃａｍｂｒｅｘ）製、米国）細胞株を、ＥＧＭ２（内皮増殖媒体、キャンブレックス社
製）培養媒体中で標準の培養条件（Ｏ2９５％、５％ＣＯ2、３７℃、１００％相対湿度（ＲＨ））のもとでインキュベートした。１×１０4の細胞を２４−ウェルプレートに分け
、そして１日培養し細胞が２４−ウェルプレートに固定され得るようにした。細胞が中間期に入るのを可能とするために、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そしてＥＧＭ２培養媒体を、１％ウシ胎児血清及び１％抗生物質抗真菌剤（米国ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）製）を含むＥＢＭ２（内皮基礎媒体、キャンブレックス社製）で置換し、そして細胞を１日インキュベートした。使用した媒体を除去した後、薬剤を補充した１％ウシ胎児血清及び１％抗生物質抗真菌剤（ギブコ社製）を含むＥＢＭ２溶液を細胞に添加し、そして細胞溶液を次に２日間培養した。細胞培養の後、細胞の形態を顕微鏡下で観察した。次に、細胞をトリプシンを用いてプレートから分離し、そして血球計を用いて計測した。生理食塩液中に溶解した０．１％ＤＭＳＯを溶媒対照として使用した。
【００６９】
（２）血管平滑筋細胞増殖の試験
３乃至１０代継代培養されたＳＭＣ（ラット大動脈平滑筋細胞）細胞株を、５％ウシ胎児血清及び１％抗生物質抗真菌剤（ギブコ社製、米国）を含むＳｍＧＭ（平滑筋細胞増殖媒体、キャンブレックス社製）の培養媒体中で標準の培養条件（９５％Ｏ2、５％ＣＯ2、３７℃、１００％相対湿度（ＲＨ））のもとでインキュベートした。２×１０4の細胞を
２４−ウェルプレートに分け、そして１日培養し細胞が２４−ウェルプレートに固定され得るようにした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そして、５％ウシ胎児血清及び１％抗生物質抗真菌剤（ギブコ社製）を含むＳｍＧＭの溶液へ加え、そして細胞を１日培養した。使用した媒体を除去した後、対応する薬剤を補充した５％ウシ胎児血清溶液を含むＳｍＧＭ溶液を細胞に添加し、そして細胞溶液を次に２日間インキュベートした。細胞培養の後、細胞の形態を顕微鏡下で観察した。次に、細胞をトリプシンを用いてプレートから分離し、そして血球計を用いて計測した。生理食塩液中に溶解した０．１％ＤＭＳＯを溶媒対照として使用した。
【００７０】
（３）結果
結果を図５乃至１０にそれぞれ示す。図５に示すように、従来の抗狭窄剤、パクリタキセル及びラパマイシンは、細胞を抗狭窄剤の濃度を増加して処理した場合に、ＨＵＶＥＣの増殖を阻害したが、本発明の１つの典型的な実施態様による誘導体５はＨＵＶＥＣの増殖を増加又は維持した。また、本発明の１つの典型的な実施態様による誘導体５の濃度を増加させると、５％ウシ胎児血清及び１％抗生物質抗真菌剤（ギブコ社製、米国）を含むＳｍＧＭ（平滑筋細胞媒体、キャンブレックス社製）の培養媒体中での標準の培養条件（９５％Ｏ2、５％ＣＯ2、３７℃、１００％相対湿度（ＲＨ））での血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の細胞数は減少した。また、図６に示すように、内皮細胞の増殖は、化合物が従来の薬剤「ラパマイシン」と一緒に使用される場合に回復し、一方、内皮細胞がラパマイシンのみで処理された場合、内皮細胞の増殖は、阻害されることが示された。また、ラパマイシンを単独で使用した場合よりも、ラパマイシンを該化合物と一緒に使用した場合に、血管平滑筋細胞の増殖は、より有意に阻害されることが観測された。同様に、従来の薬剤「パクリタキセル」を該化合物と一緒に使用した場合に、内皮細胞の増殖が回復し、一方、パクリタキセル単独を使用した場合に、内皮細胞の増殖が阻害されることが、図７に示すように観測された。
誘導体５に加えて、内皮細胞の増殖における誘導体４、１９、２３、３１、３５、５０、６２、６３、６８、６９及び７０の効果もまた測定した。結果として、図８乃至１０に示すように、該化合物は内皮細胞の増殖を阻害又は維持することが示された。したがって、これらの化合物は、平滑筋細胞の増殖を阻害しそして内皮細胞の増殖を増強するので、本発明において使用される化合物は、再狭窄を予防又は治療するために有効である薬剤であることが示された。
【００７１】
実施例４：ラット頸動脈損傷モデルでの再狭窄阻害におけるイソキサゾール誘導体の効果
再狭窄の阻害におけるイソキサゾール誘導体の効果をラット頸動脈損傷モデルを用いて評価した。
３５０乃至４００ｇの体重の白色ラットをケタミン及びキシレンで麻酔し、そしてそれらの手術部位の毛を剃りそしてベタジンで消毒した。頸部の皮膚を約２ｃｍ切開し、そしてラットの頸動脈をモスキート鉗子で見出した。頸動脈及び内頸動脈上に糸を保持し次いで外頸動脈を糸で結ぶことにより、血流を阻止した。２Ｆフォガティーカテーテル（バクスター社（Ｂａｘｔｅｒ）製，米国）を、外頸動脈と頸動脈の間の血管に挿入し、頸動脈部位を３回傷つけた。次に、傷つけた頸動脈部位を糸で結び、頸動脈と内頸動脈を通る血流を可能にし、そして頸動脈と外頸動脈の間の出血を防ぎ、そして手術部位を縫い閉じた。頸部後方の皮膚それぞれを約１ｃｍ切開し、そして薬剤を含む浸透圧ポンプを血管に挿入しそして縫い閉じた。１週間後に内皮細胞を観察するために、そして２週間後に再狭窄を観察するために、全ての血液をそれぞれの対象のラットからかん流を使用して抜き取り、頸動脈をラットより取り出しそしてその組織スライドをそれらの血管の断面を観察するために作成した。誘導体５（ＳＫＬ−２０２０）を、実験群として用い、そして７５％ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）（ＤＭＦ：Ｈ2Ｏ＝３：１）を溶媒対照として使用した。
実験結果を図１１に示す。図１１及び図１３に示すように、誘導体５を投与しなかった場合よりも２００μｇ／ｋｇ／日の誘導体５を２週間にわたり投与した場合に、血管の再狭窄部位はより有為に縮小することが示された。また、単独の化合物で細胞を処理する場合よりも、ラパマイシンと共に化合物で細胞を処理した場合に、該化合物はより有意な再狭窄阻害効果を有するため、本発明の1つの典型的な実施態様による化合物は、化合物を従
来の再狭窄阻害剤と一緒に使用する場合に相乗効果を有すると考えられた。
【００７２】
実施例５：ラット頸動脈損傷モデルでのイソキサゾール誘導体による内皮細胞再生の観測
薬剤による内皮細胞再生レベルを観察するために、血管の組織切片スライドを０．１％の過酸化水素で処理し、内因性ペルオキシダーゼを除去し、マウスの内皮細胞を染色するｖＷＦ（フォンヴィレブランド因子、ダコサイトメーション（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）社製，米国）Ａｂを用いて４℃において反応させた。次に、組織切片をビオチン化抗ラットＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製，米国）で処理し、そしてアビジン−ビオチン錯体（ＡＢＣ）ペルオキシダーゼキット（エリートキット（Ｅｌｉｔｅ  ｋｉｔ）；ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製）を用いて染色した。組織切片スライドを顕微鏡下で観察しそして撮影した。誘導体５を、実験群として用い、そして７５％ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）（ＤＭＦ：Ｈ2Ｏ＝３：
１）を溶媒対照として使用した。実験結果を図１２及び図１３に示す。図１２に示すように、誘導体５を投与しなかった場合よりも２００μｇ／ｋｇ／日の誘導体５を２週間にわたり投与した場合に、損傷した頸動脈の内皮細胞再生はより有意に現れることが示された。図１３に示すように、単独の化合物で細胞を処理する場合よりも、ラパマイシンと共に化合物で細胞を処理した場合に、内皮細胞再生はより有意に増進するため、本発明の1つ
の典型的な実施態様による化合物は、化合物を従来の再狭窄阻害剤と一緒に使用する場合に相乗効果を有すると考えられた。
【００７３】
実施例６：ブタ冠状動脈ステントモデルでの再狭窄の阻害におけるイソキサゾール誘導体の効果
再狭窄の阻害におけるイソキサゾール誘導体の効果をブタ冠状動脈ステントモデルを用いて評価した。
外科手術を受ける全てのブタを、外科手術の１週間前に抗血栓剤「クロピドグレル」（３５ｍｇ／日）及びアスピリン（１００ｍｇ／日）で処理した。３０乃至４０ｋｇの体重のブタをケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ／ＩＭ）及びキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ）で麻酔し、そしてそれらの麻酔を、麻酔状態により耳静脈へ輸液セットを接続し、そしてケタミン／キシラジン溶液（ケタミン５０ｇ＋キシラジン１０ｇ／５００ｍＬ生理食塩液）を
耳静脈へ流入させることにより維持した。ブタの手術部位の毛を剃り、ベタジンで消毒した。頸部の皮膚を約５ｃｍ切開し、そしてブタの頸動脈をモスキート鉗子で見出し、そして１ｍＬのヘパリン（５，０００単位）をブタに投与した。血管心臓造影法をＳＩＲＥＭＯＢＩＬ２４５Ｂ血管心臓造影機（ジーメンス（Ｓｉｅｍｅｎｓ）社より市販されている）を用いて行った。ステント（直径：３．０ｍｍ；長さ：１５ｍｍ）を、ステント：静脈直径の比が１．３：１においてステントを拡張することにより、ＬＡＤ、ＲＡＤ及びＲＣＸにおける外科手術に使用した。静脈径、ステント移植の位置は、イメージング装置を用いて予め測定した。
２８日後、ブタは、ブタに心臓麻痺をひき起こすための従来の麻酔状態下でＫＣｌ（４０ｍｅｑ／Ｌ）を静脈内注射され、そしてブタの心臓を摘出した。ブタ心臓の摘出直後、ブタ心臓血管を、１ｍｌのヘパリン（５０００単位）を希釈することにより得られた５００ｍｌの生理食塩液でかん流し、そしてかん流を通して５００ｍｌの１０％のホルマリン溶液で固定した。次に、ブタの心臓全体を、生理食塩液で緩衝した１０％ホルマリン溶液に浸漬することにより固定した。ステント移植したＬＡＤ、ＲＡＤ及びＲＣＸ血管部位を摘出し、１０％ホルマリン溶液で１日固定し、エタノールで脱水し、そして次にメチルメタクリレートで１ヶ月包埋した。包埋後、ブタ血管をレーザーカッターを用いて１０μｍの長さで切り、サンドペーパーを用いて５乃至７μｍのサイズに擦り、そして次に光学顕微鏡下で観察し再狭窄の存在を判定した。この実験において、薬剤を含まず及びＰＬＧＡポリマーで覆われたステントを陰性対照として用い、そしてＰＬＧＡポリマーに加えてラパマイシンを含むステントを陽性対照として用いた。１８０μｇのラパマイシンと増量した（４５μｇ、９０μｇ及び１８０μｇ）誘導体５の混合物を含むステントを、実験群として使用した。
実験結果を図１４に示す。図１４に示すように、血管の再狭窄部位は、陰性対照と比較して、ラパマイシン処理群においては２．７４ｍｍ2乃至１．８０ｍｍ2有意に縮小したことが示され、そしてまた、ラパマイシン処理群と比較して誘導体５処理群においては、血管のルーメン（ｌｕｍｅｎ）の損失が更に減少したことが確認された。
【００７４】
実施例７：ブタ冠状動脈ステントモデルでのイソキサゾール誘導体による内皮細胞再生の観測
薬剤による内皮細胞再生レベルを観察するために、ブタ血管の組織切片スライドを、マウスの内皮細胞を染色するｖＷＦ（フォンヴィレブランド因子、ダコサイトメーション社製，米国）Ａｂを用いて４℃において反応させた。次に、組織切片をビオチン化抗ヒトＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ製，米国）で処理し、そしてアビジン−ビオチン錯体（ＡＢＣ）ペルオキシダーゼキットを用いて染色した。組織切片スライドを蛍光顕微鏡下で観察しそして撮影した。実験結果を図１５に示す。
図１５に示すように、ステントをポリマーで被覆した場合に、内皮細胞再生度（再生％）は８０．２％であったが、しかし、内皮細胞再生度（再生％）はラパマイシンにより６７．９％に縮小した。誘導体５をブタに投与した４週間後、損傷した頸動脈表面の内皮細胞再生は、細胞をラパマイシンで処理したもののレベルまで、有意に回復した。本発明の１つの典型的な実施態様による化合物を従来の再狭窄阻害剤と一緒に使用する場合、その化合物は、副作用に起因する内皮細胞再生の縮小を阻害することにより、遅発性ステント血栓症を予防する作用を有する。
【図１】
2010532344.tif 000027
【図２】
2010532344.tif 000028
【図３】
2010532344.tif 000029
【図４】
2010532344.tif 000030
【図５】
2010532344.tif 000031
【図６】
2010532344.tif 000032
【図７】
2010532344.tif 000033
【図８】
2010532344.tif 000034
【図９】
2010532344.tif 000035
【図１０】
2010532344.tif 000036
【図１１】
2010532344.tif 000037
【図１２】
2010532344.tif 000038
【図１３】
2010532344.tif 000039
【図１４】
2010532344.tif 000040
【図１５】
2010532344.tif 000041
【国際調査報告】
2010532344.tif 000042
2010532344.tif 000043
2010532344.tif 000044