(57)【要約】  本発明は、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）ポリペプチドに対する抗体（ＨＭＰＶ−Ｆタンパク質に免疫特異的に結合する抗体を含む）を産生させるための方法を開示する。本発明は、ＨＭＰＶ感染に随伴する症状を予防、治療または改善するための方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）融合糖タンパク質（Ｆタンパク質）に特異的に結合する、単離されたヒト抗体。
【請求項２】
前記Ｆタンパク質が、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、および配列番号３６に記載のアミノ酸配列から成る群より選択される、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、または配列番号２８に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項４】
ＨＭＰＶジェノグループＡ１、Ａ２、Ｂ１およびＢ２を中和する、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項５】
ＨＭＰＶジェノグループＡ２を中和する、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項６】
配列番号１２に記載のＨＣＲＤ３アミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離された抗体。
【請求項７】
検出可能な標識をさらに含む、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項８】
ヒト化抗体である、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項９】
ＣＤＲ移植抗体である、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項１０】
抗体フラグメントである、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項１１】
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｃフラグメントである、請求項１０に記載の単離された抗体。
【請求項１２】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項１３】
ｉ）組換え、未成熟および成熟形態の融合タンパク質（Ｆタンパク質）に対する抗体のパネルを作成するステップと、
ｉｉ）競合分析によりそれぞれの形態のＦタンパク質に対する抗体の結合を比較するステップと、
ｉｉｉ）それぞれの形態のＦタンパク質に対するパネル内のそれぞれの抗体についてのＫｄを決定する段階と、
ｉｖ）組換えまたは未成熟形態のＦタンパク質のＫｄが成熟形態のＦタンパク質より１桁以上高い１つ以上の抗体をパネル内で同定するステップと、
ｖ）ステップ（ｉｖ）において同定された１つ以上の抗体の中和効率を決定するステップと
を含み、
中和抗体は、非中和抗体より低い、成熟形態のＦタンパク質に対する結合定数を有する、中和抗体の同定方法。
【請求項１４】
前記Ｆタンパク質が、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、および配列番号３６に記載のアミノ酸配列から成る群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、ＨＭＰＶジェノグループＡ２を中和する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、ＨＭＰＶジェノグループＡ１またはＢ１を中和する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＭＰＶを中和する抗体を被験者に投与することを含む、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）感染によって引き起こされる被験者の呼吸状態を治療する方法。
【請求項１８】
前記抗体が、ＨＭＰＶジェノグループＡ１、Ａ２、Ｂ１およびＢ２を中和する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体が、ＨＭＰＶジェノグループＡ２を中和する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、配列番号１２に記載のＨＣＲＤ３アミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験者が、哺乳動物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）融合糖タンパク質（Ｆタンパク質）に特異的に結合する１つ以上のヒト抗体を含むワクチン。
【請求項２４】
前記１つ以上の抗体が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、または配列番号２８に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
ａ）１つ以上のＨＭＰＶ融合糖タンパク質（Ｆタンパク質）に特異的に結合する１つ以上のヒト抗体と生体サンプルを、１つ以上の抗体と１つ以上のＨＭＰＶ−Ｆタンパク質との複合体の形成を可能にする条件下で接触させるための装置と、
ｂ）複合体を形成していない抗体を除去する１つ以上の試薬と、
ｃ）抗体を認識する１つ以上の試薬と、
ｄ）抗体および試薬の使用に関する手順を提供する指示書と、
ｅ）１つ以上の抗体、試薬および指示書を収容する容器と
を含む、サンプル中のヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）の存在を判定するための診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には抗体、より具体的には、ヒトメタニューモウイルス（ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ：ＨＭＰＶ）に特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメント、ならびにＨＭＰＶ感染に随伴する症状を予防、治療または改善するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）は、最近発見された呼吸器病原体であり、今では幼児、老人および免疫不全の個体における重症呼吸器疾患の世界的主因であることがわかっている。臨床的に、ＨＭＰＶ呼吸器疾患は、ヒト呼吸器合包体ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ：ＨＲＳＶ）によって引き起こされるものに非常に類似し、これら２つの病原体は近縁である。
【０００３】
ヒトメタニューモウイルスは、病因不明の急性呼吸器疾患の症状を呈している小児から単離され、２００１年に初めて記載された。アーカイブ患者サンプルでのオランダにおける血清学的研究は、このウイルスが、少なくとも５０年前からヒトの間で流行してきたことを示している。さらに、血清有病率分析は、２歳までの乳児の５０％より多くがこのウイルスに感染し、ほぼすべての子供が５歳の年齢になる前に１回以上このウイルスに感染することを示している。その発見以来、徹底した研究により、世界中の患者サンプルにおいてＨＭＰＶが検出され、この病原体が幼児および成人における急性呼吸器疾患の（ＨＲＳＶに次ぐ）主因として同定された。ＨＲＳＶでの場合と同様に、ＨＭＰＶ感染率は、温帯気候では季節によって異なり、初冬から冬半ばの月の間にピークに達し、早春まで続く。
【０００４】
ＨＭＰＶ感染によって発現される疾患負荷の完全な範囲はまだ正式に決定されていないが、ＨＭＰＶが入院幼児における呼吸器疾患のおよそ５％から１５％を占めると推定される。この群の中で、２歳未満の年齢の小児は、ＨＭＰＶ感染後の重症疾患の危険度が最も高いようである。成人集団では、ＨＭＰＶ感染後、老人および免疫不全の人に、特に問題が起こりやすい。例えば、ＨＭＰＶは、他の既知病原体がない状態の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する老人個体において見つかった。ＨＭＰＶは、血液学的悪性病変を有する成人および小児において重症および時として致死性の呼吸器疾患を引き起こすことも明らかになった。ＨＭＰＶ感染が喘息状態を招くまたは悪化させることがあるという証拠もある。さらに、ＨＭＰＶは、ＳＡＲＳコロナウイルスによって引き起こされる重症急性呼吸器症候群のサブセットにおいて共通病原体（ｃｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎ）として、および致死性脳炎の症例では病因の補助因子として提案されている。
【０００５】
一般に、ＨＭＰＶは、ＨＲＳＶ感染に伴って観察されるものに非常に類似した疾病スペクトルを呈する患者を感染させるが、もたらされる症状の観察頻度は、個々のＨＭＰＶ患者集団間で異なる。小児の下気道と上気道の両方のＨＭＰＶ感染は、発病率１２から５０％の随伴性中耳炎も伴う。著しく重症の呼吸器疾患に至る悪化は、ＨＭＰＶとＨＲＳＶに同時感染している一部の小児において観察されたが、他ではされなかった。したがって、ＨＭＰＶとＨＲＳＶへの同時感染は、それらの有病率およびオーバーラップする冬季流行からして珍しいことではなさそうだが、これら２つのウイルス間で相互依存的な病理が発生し得るか否かは、今のところ、不明のままである。重要なこととして、急性ＨＭＰＶ感染症のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく診断により、このウイルスは、呼吸器疾患を示す症状を有さない乳児または成人には滅多に存在しないと判定された。これは、これら２つの群における無症候性または非顕性ＨＭＰＶ感染症の不在を示唆している。
【０００６】
ＨＭＰＶは、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）目、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科、ニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎｉａｅ）亜科のメタニューモウイルス（Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）属に割り当てられている。このウイルスは、シチメンチョウにおける重症鼻気管炎の原因因子であるがニワトリおよびキジも感染させるトリメタニューモウイルス（ＡＭＰＶ）（メタニューモウイルス属の唯一の他の構成員）、および肺炎ウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）属（ニューモウイルス科の他の属）に割り当てられているＨＲＳＶと、最も近縁である。
【０００７】
他のニューモウイルスと同じように、Ｇタンパク質およびＦタンパク質が感染プロセスを支配する。ＩＩ型ムチン様分子の特徴を有するが、そのＨＲＳＶおよびＡＭＰＶ相同体において見出されるシステイン残基のクラスターがないＧタンパク質は、ターゲット細胞受容体のウイルス付着を媒介するのに役立ち、Ｆ糖タンパク質は、ウイルスエンベロープ膜と宿主細胞膜の融合を促進し、したがって、ウイルスＲＮＡのターゲット細胞原形質への到達を助長する。しかし、Ｇタンパク質および表面タンパク質遺伝子（ＳＨ）タンパク質のないＨＭＰＶは、アフリカミドリザル（非ヒト霊長類宿主）において首尾よく複製する。これは、そのウイルス付着機能が、最終的には別のウイルスタンパク質によって遂行され得ることを示唆している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）Ｆタンパク質は、ＨＭＰＶ感染症に対する有効な中和および防御を媒介する主要な抗原決定基であると考えられる。ＨＭＰＶ−Ｆタンパク質は、系統を超えた広範な中和および防御を媒介できる主要な抗原決定子である。ＨＭＰＶ−Ｆタンパク質に対するＭＡｂの生産は、診断技術の開発、ワクチン研究、およびウイルス病原性に関する研究にとって重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）Ｆタンパク質抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの開発に基づく。
【００１０】
１つの実施形態において、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）融合糖タンパク質（Ｆタンパク質）に特異的に結合する、単離されたヒト抗体を開示する。１つの態様において、前記Ｆタンパク質は、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、および配列番号３６に記載のアミノ酸配列から成る群より選択される。関連態様において、前記抗体は、ＨＭＰＶジェノグループＡ１、Ａ２、Ｂ１およびＢ２を中和する。
【００１１】
もう１つの態様において、前記抗体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、または配列番号２８に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【００１２】
もう１つの実施形態において、中和抗体の同定方法を開示し、この方法は、組換、未成熟および成熟形態の融合タンパク質（Ｆタンパク質）に対する抗体のパネルを作成するステップと、競合分析によりそれぞれの形態のＦタンパク質への抗体の結合を比較するステップと、それぞれの形態のＦタンパク質に対するパネル内のそれぞれの抗体についてのＫｄを決定するステップと、組換または未成熟形態のＦタンパク質のＫｄが成熟形態のＦタンパク質より１桁以上高い１つ以上の抗体をパネル内で同定するステップと、同定された１つ以上の抗体の中和効率を決定するステップとを含む（この場合、中和抗体は、非中和抗体より低い、成熟形態のＦタンパク質に対する結合定数を有する）。関連態様において、前記方法は、マイクロ中和アッセイによって同定された１つ以上の抗体の分析を含む。１つの実施形態において、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）感染によって引き起こされる呼吸状態を被験者において治療する方法を開示し、この方法は、ＨＭＰＶを中和する抗体を被験者に投与することを含む。
【００１３】
もう１つの実施形態において、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）融合糖タンパク質（Ｆタンパク質）に特異的に結合する１つ以上のヒト抗体を含むワクチンを開示する。関連態様において、前記ワクチンは、ＨＭＰＶジェノグループＡ１、Ａ２、Ｂ１およびＢ２を中和する。
【００１４】
１つの実施形態において、メタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）感染を診断する方法を開示し、この方法は、被験者からのサンプルと、ＨＭＰＶ融合糖タンパク質（Ｆタンパク質）に特異的に結合するヒト抗体とを、抗体／Ｆタンパク質複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップと、そのサンプルと、その抗体と相互作用する試薬とを接触させるステップと、その試薬とその抗体の相互作用を検出するステップとを含み、この場合、その試薬−抗体相互作用が、被験者におけるＨＭＰＶ感染の存在を示す。関連態様において、前記被験者は、ヒトである。もう１つの関連態様において、前記試薬は、ＨＭＰＶ−Ｆタンパク質に特異的に結合するヒト抗体に対する抗体である。
【００１５】
もう１つの実施形態において、サンプル中のヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）の存在を判定するための診断用キットを開示し、このキットは、１つ以上のＨＭＰＶ融合糖タンパク質（Ｆタンパク質）に特異的に結合する１つ以上のヒト抗体と生体サンプルを、１つ以上の抗体と１つ以上のＨＭＰＶ−Ｆタンパク質との複合体の形成を可能にする条件下で接触させるための装置と、複合体を形成していない抗体を除去する１つ以上の試薬と、抗体を認識する１つ以上の試薬と、抗体および試薬の使用に関する手順を提供する指示書と、１つ以上の抗体、試薬および指示書を収容する容器とを含む。
【００１６】
上述の実施形態の様々な組み合わせが本発明により考えられ、下に列挙する他の態様を含む実施形態もまた考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＨＭＰＶ−ＦΔＴＭタンパク質に対するＦａｂ産生ファージディスプレイを用いて染色したＨＭＰＶ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層の免疫蛍光画像を示す。ヤギ抗ヒトＦａｂを用いて二次検出を遂行する。左のパネル、倍率１０倍。右のパネル、倍率２０倍（２つの合包体を示す）。
【図２】ヒト抗ＨＭＰＶ−Ｆ−ＦａｂおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８−ヤギ抗ヒトＩｇＧを用いて染色したＨＭＰＶ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層の光学顕微鏡画像および免疫蛍光画像を示す。（Ａ）、（Ｂ）はＦａｂ  ＡＣＮ０４４。（Ｃ）、（Ｄ）はＦａｂ  ＤＳλ７。倍率２０倍。
【図３】ＤＳλ７−Ｆａｂの表面プラズモン共鳴分析を示す。（Ａ）は固定化ＨＭＰＶ  ＦΔＴＭタンパク質に対する漸減濃度のＤＳλ７の会合／解離曲線。パリビツマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）（ＲＳＶ−Ｆ−特異的ＭＡｂ）を無関係対照として使用した。（Ｂ）は固定化ＨＭＰＶ−ＦΔＴＭタンパク質およびＲＳＶ−ＦΔＴＭタンパク質に対する１００ｎＭ濃度でのＤＳλ７の会合／解離曲線。
【図４】試験した動物系統および種から感染４日後に排出された鼻のＨＭＰＶ力価（上）、および試験した動物系統および種から感染４日後に排出された肺のＨＭＰＶ力価（下）をグラフで示す。（Ａ）モルモット、（Ｂ）Ｃ３Ｈマウス、（Ｃ）ＣＢＡマウス、（Ｄ）Ｃ５７ＢＩ／１０マウス、（Ｅ）ＳＪＬマウス、（Ｆ）ＢＡＬＢ／ｃマウス、（Ｇ）１２９マウス、（Ｈ）ＡＫＲマウス、（Ｉ）ＤＢＡ／１マウス、（Ｊ）ＤＢＡ／２マウス、（Ｋ）シリアゴールデンハムスター、および（Ｌ）コットンラット。
【図５】コットンラットにおけるＨＭＰＶ排出をグラフで示す。動物を鼻腔内感染させ、感染後２、４、６、８、１０および１４日目に犠牲にした。黒丸は鼻、白丸は肺を示す。
【図６】コットンラットの肺におけるＨＭＰＶ感染の組織病変を示す。（Ａ）：より低倍率では、対照肺は、間質浸潤がなく、正常な気道を有する（Ｈ＆Ｅ、３５倍）。（Ｂ）：ＨＭＰＶに感染した肺の間質は、単核細胞によって拡大される（Ｈ＆Ｅ、２５倍）。（Ｃ）感染していない肺のより高倍率の拡大図は、間質浸潤および細気管支周囲の炎症を示さない（Ｈ＆Ｅ、６２．５倍）。（Ｄ）：ＨＭＰＶに感染した肺のより高倍率の拡大図は、上皮細胞の過分泌変化および細気管支周囲の単核細胞浸潤を示す（Ｈ＆Ｅ、１２５倍）。
【図７】コットンラットの肺におけるＨＭＰＶの免疫組織化学を示す。（Ａ）：対照肺は、ＨＭＰＶ抗原について陰性であり、最小限のバックグラウンドを有する（ｘ２５０）。（Ｂ）：ＨＭＰＶに感染した肺。ＨＭＰＶ抗原は、線毛細胞の内腔表面において不連続パターンで検出される（矢印）。その内腔における混合炎症細胞に注目（Ｌ）。（ｘ２５０）。
【図８】初接種後２１日目にチャレンジした後のＨＭＰＶ感染動物についての前の模擬感染の鼻および肺ＨＭＰＶ力価（左）、および初接種後２１日目にチャレンジした後のＨＭＰＶ感染動物についての前の模擬感染の血清ＨＭＰＶ中和抗体力価（右）をグラフで示す。
【図９】鼻（Ａ）および肺（Ｂ）のＨＭＰＶ力価を示す。群は、実施例の項目において定義する。組織ウイルス力価は、統計解析のためにｌｏｇ（１０）変換した。ウィルコクソン順位和検定を用いて、群間比較を行った。水平の線は、幾何平均を表し、点線は、検出限界（５ＰＦＵ／ｇ）を示す。
【図１０】ＤＳλ７の用量応答関係を示す。（Ａ）鼻のＨＭＰＶ力価。（Ｂ）肺のＨＭＰＶ力価。群は、本文中で定義する。線形回帰を用いて、Ｆａｂ−ＤＳλ７と、実施例の項目において説明されるｌｏｇ（１０）変換ウイルス力価との用量−応答関係を調査した。点線は、検出限界（５ＰＦＵ／ｇ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本組成物および方法を記載する前に、記載する特定の組成物、方法および実験条件に本発明が限定されないことを理解しなければならない。そのような組成物、方法および条件は、変わることがあるからである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において用いる専門用語は、特定の実施形態の説明のみを目的とし、限定するためのものでないことも理解しなければならない。
【００１９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、その文脈が明確に別様に示していない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「その（ｔｈｅ）方法」への言及は、本開示などを読むことによって当業者に明らかとなる、ここに記載するタイプの１つ以上の方法および／またはステップを含む。
【００２０】
別様に定義されていない限り、ここで用いるすべての技術用語および科学用語は、当分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。ここに記載するものと同様のまたは等価の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、ここでは例示的な方法および材料を記載する。
【００２１】
「１本鎖抗原結合タンパク質」は、ＶＬ配列のカルボキシル末端をＶＨ配列のアミノ末端に連結させるペプチドによって免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列（ＶＨ）につなぎ留められた免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列（ＶＬ）からなるポリペプチドを指す。
【００２２】
「１本鎖抗原結合タンパク質コード化遺伝子」は、１本鎖抗原結合タンパク質をコードする組換遺伝子を指す。
【００２３】
「ポリペプチドおよびペプチド」は、隣接残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基の間のペプチド結合によって互いに接続しているアミノ酸残基の線形配列を指す。
【００２４】
「タンパク質」は、ポリペプチドの場合のような互いに接続された約５０個より多くのアミノ酸残基の線形配列を指す。
【００２５】
「免疫グロブリン産物」は、免疫グロブリン重鎖の少なくとも免疫活性部分を含有し、したがって、抗原と特異的に化合することができる、ポリペプチド、タンパク質または多量体タンパク質を指す。例示的免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン分子、実質的にインタクトの免疫グロブリン分子、ならびにパラトープを含有する免疫グロブリンの任意の部分（Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ２’フラグメントおよびＦｖフラグメントとして当該技術分野において公知の部分を含む）である。
【００２６】
「免疫グロブリン分子」は、互いに共有結合し、抗原と特異的に化合することができる免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の免疫活性部分を含有する、多量体タンパク質を指す。
【００２７】
「Ｆａｂフラグメント」は、互いに共有結合し、抗原と特異的に化合することができる免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の免疫活性部分を含有する免疫グロブリン分子の一部からなる多量体タンパク質を指す。Ｆａｂフラグメントは、一般に、当分野において周知の方法を用いて、実質的に無損傷の免疫グロブリン分子をパパインで加水分解消化することによって作製される。しかし、Ｆａｂフラグメントは、当分野において周知の方法を用いて、適する宿主細胞において免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の所望の部分を発現させることによって作製することもできる。
【００２８】
「Ｆｖフラグメント」は、互いに共有結合し、抗原と特異的に化合することができる免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫活性部分からなる多量体タンパク質を指す。Ｆｖフラグメントは、一般に、当分野において周知の方法を用いて、適する宿主細胞において免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の所望の部分を発現させることによって作製される。
【００２９】
「免疫グロブリンスーパーファミリー分子」は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン関連ドメインに有意に類似しているドメインサイズおよびアミノ酸残基配列を有する分子を指す。類似性の有意性は、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５２４−５４５（１９８３）によって記載されたアラインプログラムなどのコンピュータプログラムを用いて統計学的に決定される。３未満の代表的なアラインスコアは、試験した分子が免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであることを示す。
【００３０】
「エピトープ」は、免疫グロブリン産物によって特異的に認識される分子の部分を指す。決定基または抗原決定基と呼ばれることもある。
【００３１】
「中和する」は、ウイルスの感染性または毒素分子の毒性を阻害することができる抗体の活性を指す。
【００３２】
「ジェノグループ」は、同じまたは類似したタンパク質をコードする１セットの近縁遺伝子を含む、ウイルスの株を指す。
【００３３】
ＨＲＳＶおよびＡＭＰＶと同様に、ＨＭＰＶは、マイナス鎖ＲＮＡからなる約１３キロ塩基のゲノムを含有するエンベロープウイルスである。機構はコンパクトであり、そのゲノムの約９５％が、予測されるオープンリーディングフレーム内に表される。３’から５’の方向の以下の順序で発生する８つの遺伝子があると考えられる。ヌクレオカプシドＲＮＡ結合タンパク質遺伝子（（Ｎ）、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号８４１２１０；ＤＱ８４１２０９；ＤＱ８４１２０８；ＤＱ８４１２０７；ＤＱ８３４３７６）、ヌクレオカプシドリンタンパク質遺伝子（（Ｐ）：例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＤＱ１１２３１９；ＤＱ１１２３１８；ＤＱ１１２３１７；ＤＱ１１２３１６；ＤＱ１１２３１５；ＤＱ１１２３１４）、非グリコシル化マトリックスタンパク質遺伝子（（Ｍ）：例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＤＱ４３９９６１；ＤＱ４３９９６０；ＤＱ４３９９５９；ＤＱ４３９９５８；ＤＱ４３９９５７）、融合糖タンパク質遺伝子（（Ｆ）：例えば、配列番号３０；配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６が挙げられるが、これらに限定されない）、転写延長因子遺伝子（（Ｍ２−１）：例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ２２１２６；ＡＡＳ２２０８６；ＡＡＳ２２１１８；ＡＡＳ２２１１０；ＡＡＳ２２１０２）、小型疎水性表面タンパク質遺伝子（（ＳＨ）：例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ２２０８８；ＡＡＳ２２１２８；ＡＡ２２１２０；ＡＡＳ２２１１２；ＡＡＳ２２１０４）、大型付着タンパク質遺伝子（（Ｇ）：例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ２２１２９；ＡＡＳ２２１２１；ＡＡＳ２２１１３；ＡＡＳ２２１０５；ＡＡＳ２２０９７）、および大型ポリメラーゼサブユニット遺伝子（（Ｌ）：例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ５５０１７３；ＡＹ５５０１７２；ＡＹ５５０１７１；ＡＹ５５０１７０；ＡＹ５５０１６９）である。９番目のタンパク質、ＲＮＡ合成調節因子（（Ｍ２−２）、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ２２０９５；ＡＡＳ２２１０３；ＡＡＳ２２１１１；ＡＡＳ２２１１９；ＡＡＳ２２１２７）は、ＨＲＳＶの場合のようにＭ２遺伝子配列内の第二オーバーラッピングオープンリーディングフレームから生じると予測される（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ（２００１）７：７１９−７２４）。ＩＩ型糖タンパク質であると予想されるＳＨ分子も、そのアミノ末端の近くに位置する疎水性シグナルアンカー配列によって、ウイルスエンベロープに挿入される。
【００３４】
広い地理および温度分布を有する単離された多数のＨＭＰＶからのＦ−、Ｇ−、ＳＨ−、Ｎ−、Ｐ−、Ｍ−、Ｍ−２−およびＬ−遺伝子のうちの１つ以上についての部分または完全配列の系統発生的精査が行われた（Ｂａｓｔｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００４）４２：３５３２−３５３７；Ｂｉａｃｃｈｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ（２００３）３１５：１−９；Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００４）４２：３４０６−３４１４）。これらの分析からのデータセットによって、２つのＨＭＰＶ遺伝子系統が矛盾なく同定され、これらはＡおよびＢと呼ばれている（これは、ＨＲＳＶの分離集団についてのグループ分けに類似している）。グループＡおよびＢ内のＨＭＰＶ遺伝子配列は、グループごとにさらに２つのクレードに分けることができ、これらは、Ａ１およびＡ２、ならびにＢ１およびＢ２と表される。これら４つのＨＭＰＶサブタイプが、同じ地理領域内で同時に循環し得ること、およびそれぞれのサブタイプの相対比率が、季節によって変わり得ることは、明らかである。グループＡまたはグループＢに割り当てられたＨＭＰＶ分離集団間で予測アミノ酸配列を比較すると、Ｇ−およびＳＨ−タンパク質は、低いアミノ酸同一性（それぞれ、３３％および５８％の同一性）を有した。対照的に、他のＨＭＰＶ遺伝子産物は、高度に保存された次のもの、すなわち、Ｆタンパク質：９４〜９５％のアミノ酸同一性、Ｎタンパク質：９５〜９６％の同一性、Ｐタンパク質：８５％の同一性、Ｍタンパク質：９７％の同一性、Ｍ２−１：９５〜９６％の同一性、Ｍ２−２タンパク質：８９〜９０％の同一性、およびＬタンパク質：９４％の同一性である。Ｆおよび非エンベロープウイルスタンパク質についてのより多くの保存配列のＨＭＰＶグループ間のこの明らかなパターン、ならびにＧ−およびＳＨ−タンパク質のより大きな多様性は、一般に、ＨＲＳＶにおける同等の分析で見られるものとよく似ている。Ｍ２−２タンパク質は例外であり、これは、ＨＲＳＶ株間よりＨＭＰＶ株間のほうが著しく保存される。さらに、アミノ酸レベルでは、ＨＭＰＶのＦタンパク質は、ＨＲＳＶ−Ｆタンパク質より系統発生グループ間での違いが６％少なかった。
【００３５】
１つの実施形態において、コットンラットにおいて高免疫原性であり、中和抗体を誘導する可溶性形態のＨＭＰＶＦタンパク質（ＦΔＴＭ）を産生させるための哺乳動物タンパク質発現方法を開示する。この構築物を使用して、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリから完全ヒトＭａｂを選択した。１つの態様において、このアプローチは、ＨＭＰＶ感染細胞に結合する非常に多数のヒトＦａｂを単離する際に有効である。もう１つの態様において、前記ＦΔＴＭタンパク質は、天然Ｆタンパク質上に存在する中和エピトープを保持する。
【００３６】
個々のＨＭＰＶ株、特に、３つのエンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子、の間の遺伝的変異度は、感染した宿主における抗原の多様性に直接影響を及ぼす。ＨＲＳＶに類似して、ＨＭＰＶのＦタンパク質に対する抗体応答は、系統発生グループＡとＢの間で交差反応性および交差防御性であるが、Ｇタンパク質に対する免疫応答は、特異的であり、一般に、クレードを超えた中和および防御をもたらすことができない。理論に拘束されないが、ＨＭＰＶ単離集団の系統学的研究から、グループＡおよびグループＢのウイルス分離集団は異なる抗原分類をも示すことができ、遺伝的多様性のような抗原多様性の大部分がＧタンパク質およびＳＨタンパク質から生じ得ると結論付けるのが妥当であると考えられる。
【００３７】
ヒトにおいて、パラミクソウイルス（ＨＭＰＶを含む）による再感染は、遺伝子的に同種のウイルスによっても、生涯を通じて発生する。したがって、これらの環境下で、ＨＭＰＶにおける遺伝的多様性および抗原多様性の最も有意な帰結、すなわち、１つの遺伝子グループのウイルスが、異種株ではなく、同種株による感染に対してより大きな免疫防御を誘導するかどうか、を有意義に決定することは難しい。しかし、ＨＭＰＶサブグループ間および内のＧタンパク質の高い分岐度は、Ｇタンパク質に対する制限された交差中和および交差防御抗体応答の一因となり、したがって、インバリアントＦタンパク質は、当然、ＨＭＰＶ中和抗体の主要オペレーションターゲットとしての意味をもつ。
【００３８】
１つの実施形態において、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）融合糖タンパク質（Ｆタンパク質）に特異的に結合する、単離された抗体を開示する。１つの態様において、前記Ｆタンパク質は、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、および配列番号３６に記載のアミノ酸配列から成る群より選択される。関連態様において、前記抗体は、ＨＭＰＶジェノグループＡ１、Ａ２、Ｂ１およびＢ２を中和する。
【００３９】
抗原多様性は、病原体に対する戦術上の利点をもたらす。ＨＭＰＶの系統発生グループ間でＧタンパク質について観察される配列多様性は、分子の細胞外部分に主として限定される。これは、ＨＲＳＶのＧタンパク質における類似の変化について仮定されるように、この現象が免疫学的圧力に対する進化の応答であることを示唆している。この特性は、１つのＨＭＰＶサブグループのＧタンパク質に対する抗体が他のサブグループに属するウイルスを交差中和する確率を、低下させる可能性が高いだろう。併せると、これらの要因のため、Ｇタンパク質は、ＨＭＰＶ感染の抗体予防においてターゲットにするには魅力のない分子となる。これは、Ｆタンパク質にはありそうもないケースである。
【００４０】
Ｆタンパク質はＨＭＰＶ分離集団全体にわたって高度に保存され、経時的な抗原変異の徴候は殆どなく、これは、ことによると、Ｇタンパク質におけるよりこの分子におけるほうが大きな機能的および構造的制約がアミノ酸置換にかかることを表している。ＨＲＳＶに言及して、Ｆタンパク質は、株間交差中和および防御抗体についての主要ターゲットである。したがって、ＨＭＰＶのＦタンパク質は、抗体予防のための非常に好適なターゲットと言え、候補ワクチンの成分とも言える。
【００４１】
前記Ｆタンパク質は、最初は不活性単量体前駆体Ｆ０として合成され、該タンパク質は、ジスルフィド結合によって共有結合で連結される２つのサブユニット（Ｆ１およびＦ２）に分割される。前記Ｆ１−Ｆ２分子の４個が、Ｆ１サブユニットを介して相互作用して、成熟ウイルス粒子スパイクを形成する。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明は、ＨＭＰＶのＦタンパク質に対する中和抗体を同定するための方法を開示し、この方法は、組換え、未成熟および成熟形態の融合タンパク質（Ｆタンパク質）に対する抗体のパネルを作成するステップと、競合分析によりそれぞれの形態のＦタンパク質への抗体の結合を比較するステップと、それぞれの形態のＦタンパク質に対するパネル内のそれぞれの抗体についてのＫｄを決定するステップと、組換えまたは未成熟形態のＦタンパク質のＫｄが成熟形態のＦタンパク質より１桁以上高い１つ以上の抗体をパネル内で同定するステップと、同定された１つ以上の抗体の中和効率を決定するステップとを含む（この場合、中和抗体は、非中和抗体より低い、成熟形態のＦタンパク質に対する結合定数を有する）。関連態様において、前記Ｆタンパク質は、オリゴマー形態のものである。
【００４３】
「オリゴマー」は、繰り返される共有結合性または非共有結合性連鎖の中に少数の、典型的には２から約１０の、構造ユニットを含有する分子からなる任意の物質または物質の種類を指し、前記ユニットは、１種類のユニットである場合もあり、１つより多くの種類のユニットである場合もある。
【００４４】
機能性ポリペプチド（機能性タンパク質複合体を含む）を生産するための本発明の方法の有用性を、本明細書では、機能性抗体の生産によって例示する。用語「抗体」は、本明細書では、抗原のエピトープに特異的に結合することができるポリペプチドまたはタンパク質複合体を指すために広く用いている。一般に、抗体は、重鎖可変領域ドメインおよび軽鎖可変領域ドメイン、特に超可変領域、の会合によって形成される、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含有する。
【００４５】
糸状バクテリオファージの表面で発現される抗体分子のフラグメントのライブラリの構築、および抗原への結合によるファージ抗体の選択は、研究および臨床用途のための新たなツールを生じさせる強力な手段とみなされている。しかし、この技術は、固相依存性選択手順に十分な量で利用することができる精製抗原に特異的なファージ抗体を産生させるために主として用いられている。生化学的および機能性アッセイにおけるそのようなファージ抗体の有効性はまちまちであり、一般に、選択に用いられる手順によってそれらの有用性が決まる。
【００４６】
一般に、対象となる多数の抗原を純粋な形態で非常に大量に入手することはできない。このことは、研究および臨床用途のためにそのような抗原材料と結合させるにあたりファージ抗体の有用性を制限し得る。さらに、そのような用途におけるファージ抗体の有用性は、抗原の純度、および単離されたファージ抗体の特異性を評価するための精製法に正比例する。天然細胞表面構造に結合するヒトモノクローナル抗体は、治療および診断手順に関する幅広い用途を有すると予想される。ファージ抗体ディスプレイ技術の重要な拡張は、異種混合物中に存在する細胞の亜集団の表面で発現される抗原に対する特異的抗体を直接選択する戦略である。そのような抗体は、単一の高多様性ディスプレイライブラリから誘導することができる（例えば、米国特許第６，２６５，１５０号を参照のこと。この特許は、本明細書に参照することによって取り入れられている）。
【００４７】
ディスプレイライブラリ（すなわち、バクテリオファージ、特に糸状ファージ、および具体的には、ファージＭ１３、ＦｄおよびＦ１からのもの）は、融合タンパク質を形成するこれらのファージのｇＩＩＩまたはｇＶＩＩＩのいずれかに提示されるポリペプチドをコードする挿入ライブラリを含む。例えば、Ｄｏｗｅｒ、ＷＯ  ９１／１９８１８；Ｄｅｖｌｉｎ、ＷＯ  ９１／１８９８９；ＭａｃＣａｆｆｅｒｔｙ、ＷＯ  ９２／０１０４７（遺伝子ＩＩＩ）；Ｈｕｓｅ、ＷＯ  ９２／０６２０４；Ｋａｎｇ、ＷＯ  ９２／１８６１９（遺伝子ＶＩＩＩ）を参照のこと。そのような融合タンパク質は、通常はファージコートタンパク質以外の分泌タンパク質、提示されるポリペプチド、および遺伝子ＩＩＩもしくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかまたはそれらのフラグメントからの、シグナル配列を含む。外因性コード化配列は、多くの場合、遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのＮ末端またはその付近に挿入されるが、他の挿入部位も可能である。幾つかの糸状ファージベクターが、遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかの二次コピーを生産するように遺伝子操作された。そのようなベクターでは、外因性配列が２つのコピーのうちの一方にしか挿入されない。他方のコピーは、ファージ粒子に組み込まれる融合タンパク質の比率を有効に薄め、ならびにファージ増殖に有害なポリペプチドに対する選択を減少させる点で有利であり得る。もう１つの変形では、ファージコートタンパク質およびファージパッケージング配列をコードするが、複製することができないファージミドベクターに、外因性ポリペプチド配列がクローニングされる。ファージミドは、細胞にトランスフェクトされ、ヘルパーファージでの感染によってパッケージングされる。ファージミド系の使用は、コートタンパク質とヘルパー細胞から発現されるコートタンパク質の野生型コピーを有する提示されるポリペプチドからなる融合タンパク質を希釈する効果も有する。例えば、Ｇａｒｒａｒｄ、ＷＯ  ９２／０９６９０を参照のこと。真核細胞を使用して、類似の方法でポリペプチドを提示することができる。
【００４８】
胞子もディスプレイパッケージとして使用することができる。この場合、ポリペプチドは、胞子の外面から提示される。例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からの胞子が好適であると報告されている。これらの胞子のコートタンパク質の配列は、当分野において公知である。細胞もディスプレイパッケージとして使用することができる。提示されるポリペプチドは、細胞表面で発現される細胞タンパク質をコードする遺伝子に挿入される。細菌細胞としては、鼠チフス菌、枯草菌、緑膿菌、ビブリオコレラ、クレブシエラ肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、淋菌、髄膜炎菌、バクテロイデス・ノドサス、牛モラクセラ菌および大腸菌が挙げられるが、これらに限定されない。他の外面タンパク質の詳細は、当分野において周知である（例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５７１，６９８号を参照のこと）。例えば、大腸菌のｌａｍＢタンパク質が好適である。
【００４９】
抗体鎖は、１本鎖形で提示される場合もあり、または２本鎖形で提示される場合もある。１本鎖抗体ライブラリは、抗体の重鎖または軽鎖を単独で含む場合もあり、またはそれらの可変ドメインを含む場合もある。しかし、より一般的には、１本鎖抗体ライブラリの構成員は、単一の隣接タンパク質中のペプチドスペーサーによって隔てられた重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの融合体から形成される。例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ８８／０６６３０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ９２／０１０４７を参照のこと。２本鎖抗体は、重鎖と軽鎖またはそれらの結合フラグメントの非共有結合性会合によって形成される。２本鎖抗体は、２つの１本鎖抗体（それぞれの１本鎖抗体は、重鎖可変ドメイン、リンカーおよび軽鎖可変ドメインを含む）の会合によっても形成される。ダイアボディーとして公知である、そのような抗体では、１本鎖抗体の重鎖は他方の軽鎖に結合し、軽鎖は他方の重鎖に結合し、このようにして、２つの全く同じ抗原結合部位を形成する。したがって、１本鎖抗体を提示するファージは、ダイアボディーとしての２つの１本鎖抗体の会合により、ダイアボディーを形成することができる。
【００５０】
抗体ライブラリの多様性は、免疫処置を受けたまたは受けていないＢ細胞のモノクローナル集団などの天然源から抗体コード配列を得ることから生ずる。あるいは、または加えて、多様性は、ディスプレイベクターへの導入前または後、抗体鎖をコードする核酸の人工的突然変異誘発によって導入することができる。そのような突然変異誘発は、ＰＣＲの過程で行うことができ、またはＰＣＲ前もしくは後に誘導することもできる。
【００５１】
場合によってはスペーサーに隣接して提示される抗体鎖をコードする核酸を、標準的な組換えＤＮＡ技術（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照のこと。これは、本明細書に参照によって取り入れられている）によって、上で論じたようなファージのゲノムに挿入する。最終的に、核酸を（スペーサーまたはフレームワーク残基を有するまたは有さない）抗体鎖として発現させる。ファージ、細菌および胞子ベクターにおいて、複製可能なパッケージの外表面タンパク質のすべてまたは一部に抗体鎖を融合させる。ライブラリは、多くの場合、構成員数約１０３、１０４、１０６、１０７、１０８のまたはそれより大きいサイズを有する。
【００５２】
用語「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」または「核酸分子」は、本明細書では、ホスホジエステル結合によって互いに連結されている２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を意味するために広く用いている。したがって、これらの用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡ（これらは、遺伝子またはその一部、ｃＤＮＡ、合成ポリデオキシリボ核酸配列などである場合があり、および１本鎖である場合もあり、または２本鎖である場合もある）、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを包含する。さらに、これらの用語は、本明細書において用いる場合、細胞から単離することができる天然核酸分子、ならびに例えば化学合成法によってまたは酵素的方法よって（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって）作製することができる合成ポリヌクレオチドを包含する。
【００５３】
一般に、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、天然デオキシリボヌクレオチド、例えば、２’デオキシリボースに連結されたアデニン、シトシン、グアニンもしくはチミン、またはリボヌクレオチド、例えば、リボースに連結されたアデニン、シトシン、グアニンもしくはウラシルである。しかし、用途に依存して、ポリヌクレオチドは、非天然合成ヌクレオチドまたは修飾天然ヌクレオチドをはじめとする、核酸類似体も含有することがある。ヌクレオチド類似体は、当分野において周知であり、市販され（例えば、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．；Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）、そのようなヌクレオチド類似体を含有するポリヌクレオチドも同様である。ポリヌクレオチドのヌクレオチドを連結する共有結合は、一般に、ホスホジエステル結合である。しかし、そのポリヌクレオチドを使用することとなる目的に依存して、この二重結合は、チオジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ペプチド様結合または当業者に合成ポリヌクレオチドを生成するためのヌクレオチドの連結に有用であると知られている任意の他の結合をはじめとする、他の種々の結合のいずれであってもよい。
【００５４】
天然ヌクレオチドおよびホスホジエステル結合を含むポリヌクレオチドは、化学合成することができ、または組換えＤＮＡ法を用い、適切なポリヌクレオチドをテンプレートとして使用して生成することができる。一方、ヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチド、またはホスホジエステル結合以外の共有結合は、一般に化学合成されるが、Ｔ７ポリメラーゼなどの酵素は、一定のタイプのヌクレオチド類似体をポリヌクレオチドに組み込むことができ、したがって、そのようなポリヌクレオチドを適切なテンプレートから組換え生産するために使用することができる。
【００５５】
用語「組換え核酸分子」は、本明細書では、人間の介入によって操作されるポリヌクレオチドを指すために用いている。組換え核酸分子は、その生成物が細胞内のどこにも存在しないような様式で連結されている、２つ以上のヌクレオチド配列を含有し得る。特に、それら２つ以上のヌクレオチド配列は、動作可能に連結させることができ、ならびに例えば、融合ポリペプチドをコードすることができ、またはコードヌクレオチド配列および調節要素を含むことができる。組換え核酸分子はまた、天然ポリヌクレオチドに基づくが、天然ポリヌクレオチドとは異なるように操作されている場合もあり、例えば、第一コドン（これは、通常、ポリヌクレオチドにおいて見出される）または対象となる配列（例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位またはスプライス部位、プロモーター、ＤＮＡ複製起点など）がポリヌクレオチドに導入されるような１つ以上のヌクレオチド変化を有する、ポリヌクレオチドである場合もある。
【００５６】
本明細書において用いる場合、用語「動作可能に連結される」は、２つ以上の分子が、それらが単一ユニットとして動作し、一方もしくは両方の分子またはそれらの組み合わせに帰する機能を果たすように、互いに対して配置されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写または翻訳調節要素に動作可能に連結させることができ、この場合、その要素は、その調節要素が、細胞内で通常それが会合しているポリヌクレオチド配列に作用するのと同様に、ポリヌクレオチドに対してその調節効果をもたらす。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドは、第一クローニング部位および第二クローニング部位に隣接させることができ、したがって、第二ポリヌクレオチドに容易に挿入または連結することができるカセットをもたらすことができる。そのような隣接する第一および第二クローニング部位は、同じ場合もあり、または異なる場合もあり、ならびに一方または両方が、独立して、複数のクローニング部位、すなわち多数のクローニング部位、のうちの１つである場合もある。本発明のベクターは、そのベクターに望ましい特性を付与する１つ以上の追加のヌクレオチド配列、例えばそのベクターの操作を助長する配列、を含有する場合もある。したがって、前記ベクターは、例えば、１つ以上のクローニング部位、例えば、異種ポリヌクレオチドをそのベクターに挿入し、第一プロモーターに動作可能に連結させることができるような位置にあるクローニング部位（多数のクローニング部位であってもよい）、を含有する場合がある。前記ベクターは、原核細胞の複製起点（ｏｒｉ）、例えば、大腸菌ｏｒｉまたはコスミドｏｒｉも含有する場合があり、したがって、ＤＮＡ増幅のために原核宿主細胞において継代することができるベクターを提供することができる。
【００５８】
２本鎖抗ディスプレイライブラリは、上で論じたディスプレイライブラリの一種を意味する。そのようなライブラリの生産は、当分野において周知である。例えば、２本鎖抗体ファージディスプレイライブラリでは、１本鎖ライブラリの場合と同様に、１本の抗体鎖がファージコートタンパク質に融合する。そのパートナー抗体鎖は、第一抗体鎖と複合しているが、そのパートナーは、ファージコートタンパク質に直接連結していない。重鎖または軽鎖のいずれかが、コートタンパク質に融合した鎖であり得る。コートタンパク質に融合していないもう一方の鎖が、パートナー鎖である。この配置は、一般に、１つの抗体鎖遺伝子をコードする核酸セグメントをファージディスプレイベクターのｇＩＩＩまたはｇＶＩＩＩに組み込んで、シグナル配列と抗体鎖とファージコートタンパク質とを含む融合タンパク質を形成することによって達成される。パートナー抗体鎖をコードする核酸セグメントは、第一抗体鎖をコードするものと同じベクターに挿入することができる。場合によっては、重鎖および軽鎖を、同じプロモーターに連結された同じディスプレイベクターに挿入し、ポリシストロン性メッセンジャーとして転写することができる。あるいは、パートナー抗体鎖をコードする核酸を別のベクター（ファージベクターであってもよいし、またはなくてもよい）に挿入することができる。この場合、それら２つのベクターを同じ細胞において発現させる（ＷＯ  ９２／２０７９１参照）。パートナー鎖をコードする配列は、そのパートナー鎖をシグナル配列に連結するが、ファージコートタンパク質には融合しないように、挿入する。両方の抗体鎖を発現させ、細胞のペリプラズムにエクスポートし、そこでそれらは集合し、ファージ粒子に組み込まれる。
【００５９】
前記ディスプレイベクターは、重鎖および軽鎖定常領域またはそれらのフラグメントを、挿入配列から発現される重鎖および軽鎖可変領域と共にインフレームで発現するように、設計することができる。一般に、前記定常領域は、天然ヒト定常領域であり、少数の保存的置換は許容され得る。Ｆａｂフラグメントでは、通常、重鎖定常領域は、ＣＨ１領域、および場合によっては、ヒンジ領域の一部またはすべてを含み、ならびに軽鎖定常領域は、無損傷軽鎖定常領域、例えば、ＣκまたはＣλである。定常領域アイソタイプの選択は、補体依存性細胞毒性を最終的に必要するかどうかに、一部、依存する。例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ４は、そのような細胞毒性を支持するが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３は支持しない。あるいは、前記ディスプレイベクターは、非ヒト定常領域を生じさせることができる。そのような状況では、一般に、その後、抗体鎖の可変領域のみをディスプレイベクターからサブクローニングし、ヒト定常領域は、挿入された抗体配列と共にインフレームで発現ベクターによって生じさせる。
【００６０】
抗体コード配列は、ヒトのリンパ細胞から得ることができる（下の実施例を参照のこと）。本発明の方法の実施に有用なポリヌクレオチドは、対象となる抗体を生産する細胞、例えば、免疫処置された被験者から、または特定の抗原に暴露された個体からのＢ細胞から単離することができ、周知のポリヌクレオチド合成法を用いて新たに合成することができ、または組換え生産することができる。１つの態様において、本発明の抗体ライブラリは、生涯の中で少なくとも１回はＨＭＰＶに暴露またはＨＭＰＶに感染したことがある、異なる成人ドナーの骨髄リンパ球から作製さる。もう１つの態様では、免疫されたヒトのリンパ球をエプスタイン−バールウイルスの感染により不死化して、モノクローナル抗体分泌性培養物を作製することができる。
【００６１】
再配列された免疫グロブリン遺伝子をゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡからクローニングすることができる。後者の場合、ｍＲＮＡは、細胞から抽出し、ｃＤＮＡは、逆転写およびポリｄＴオリゴヌクレオチドプライマーを用いて作製する。そのような配列をコードする抗体をクローニングするためのプライマーは、当分野において周知である。
【００６２】
増幅させたＶＨおよびＶＬ配列を幾つかの方法で互いに結合させることによって、抗体フラグメントのレパートリーが構築された。軽鎖および重鎖を異なるベクターに挿入し、それらのベクターをインビトロまたはインビボで結合させることができる。あるいは、軽鎖および重鎖を同じベクターに逐次的にクローニングすることができ、またはＰＣＲによって一緒に組み立て、その後、ベクターに挿入することができる。重鎖のレパートリーを単一の軽鎖と化合させることもでき、または軽鎖のレパートリーを単一の重鎖と結合させることもできる。
【００６３】
一般に、抗体重鎖および軽鎖をコードするセグメントを重鎖および軽鎖の別個の集団からサブクローニングし、その結果、それぞれのベクターにおいて前記集団から重鎖と軽鎖のペアをランダムに会合させる。したがって、修飾されたベクターは、一般に、天然抗体では見出すことができない重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせを含有する。これらの組み合わせの一部は、一般に、選択プロセスを生き残り、ポリクローナルライブラリの中にも存在する。
【００６４】
重鎖および軽鎖コード配列の集団をクローニングするための一部の例示的ベクターおよび手順は、Ｈｕｓｅ（ＷＯ  ９２／０６２０４）によって記載されている。Ｈｃポリペプチドをコードする配列の多様な集団をＭ１３ＩＸ３０にクローニングし、Ｌｃポリペプチドをコードする配列をＭ１３ＩＸ１１にクローニングする。それらの集団は、Ｍ１３ＩＸ３０の場合はＸｈｏＩ−ＳｅｅＩまたはＳｔｕＩ制限酵素部位間、およびＭ１３ＩＸ１１の場合はＳａｃＩ−ＸｂａＩまたはＥｃｏＲＶ部位間に挿入される（それぞれ、Ｈｕｓｅの図１ＡおよびＢ）。両方のベクターは、ＨｃおよびＬｃコード配列とそれらの関連ベクター配列を互いに連結させるために、ＭｌｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位の２つのペア（Ｈｕｓｅの図１ＡおよびＢ）を含有する。これら２つのペアは、発現させる配列を含有するベクタータンパク質のみが単一のベクターに正確に結合するように、クローニング部位を中心に対称に配向している。
【００６５】
抗体鎖を糸状ファージにクローニングするための他の例示的ベクターおよび手順は、米国特許第６，７９４，１３２号（本明細書に参照によって取り入れられている）に記載されている。一般に、本発明のベクターは、環状ベクターであってもよいし、または第一末端と第二末端を有する線状ベクターであってもよい。本発明の線状ベクターは、一方の末端または両末端に１つ以上のクローニング部位を有することができ、したがって、そのベクターを環状にする手段、またはそのベクターを第二のポリヌクレオチド（これは、本発明のベクターと同じまたは異なる第二のベクターであり得る）に連結させる手段を提供する。前記クローニング部位としては、制限エンドヌクレアーゼ認識部位（もしくはその分解産物）、リコンビナーゼ部位、またはそのような部位の組み合わせを挙げることができる。
【００６６】
前記ベクターは、１つ以上の発現制御要素、例えば、転写調節要素、追加の翻訳要素などをさらに含有することがある。１つの実施形態において、前記ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを開始ＡＴＧコドンに隣接して動作可能に連結させることができるように、プロモーターをコードする配列に動作可能に連結された開始ＡＴＧコドンを含有する。したがって、前記ベクターは、そのようなＡＴＧコドンに少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを動作可能に連結させることができるような位置にあるクローニング部位も含有することがある。本発明のベクターは、第一のプロモーターに作動可能に連結された第一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含有することがあり、この場合、コードするヌクレオチド配列は、例えばＡＴＧコドンの上流およびその付近、ＡＴＧコドンの下流およびその付近、ならびに／またはコードされるポリペプチドのＣ末端またはその付近をはじめとする、１つ以上のクローニング部位を含有するように修飾される。そのようなベクターは、第一ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の置換により、または第一および第二ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現することができるようなコードされたポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端付近での動作可能な連結で、第二ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をその中に挿入するための適便な手段を提供する。
【００６７】
抗体生産のために組換え発現系を使用する最も有用な側面としては、分子工学によって抗体を作製することができる容易さがある。これによって、抗体フラグメントおよび１本鎖分子の生産、ならびに完全長抗体の操作が可能となる。例えば、機能性組換え型抗体フラグメントのサイドレンジ、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、一本鎖および単一ドメイン抗体を作製することができる。これは、個々のドメインを遺伝子レベルで「切断し、スプライスする」ことができる、免疫グロブリン鎖のドメイン構造によって容易になる。
【００６８】
ヒト化モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、マウス免疫グロブリン遺伝子の可変重鎖および可変軽鎖由来のマウス相補性決定領域をコードするヌクレオチド配列をヒト可変ドメイン遺伝子に移入し、その後、マウス相対物のフレームワーク領域内のヒト残基を置換することによって、得ることができる。マウス免疫グロブリン可変ドメインの一般的なクローニング技術は、当分野において公知である。
【００６９】
本発明の方法は、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリから単離されたヒト抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを使用して実施することもできる。ヒト免疫グロブリンファージライブラリを生産するために有用であるクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）から入手することができる。
【００７０】
ヒトモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を生産するように遺伝子操作されたトランスジェニックマウスから得ることもできる。この技法では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の要素を、外因性重鎖および軽鎖遺伝子座の部位特異的破壊（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を含む胚性幹細胞系統から採取したマウス株に導入する。そのトランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、そのマウスを使用して、ヒト抗体分泌性ハイブリドーマを生産することができ、そこから、本発明の方法を実施するために有用なポリヌクレオチドを得ることができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、当分野において公知である。
【００７１】
前記ポリヌクレオチドは、抗体の抗原結合フラグメントをコードするものである場合もある。例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ＦｃおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む、抗原結合抗体フラグメントは、当分野において周知であり、当初、抗体のタンパク質加水分解によって同定された。例えば、抗体フラグメントは、従来の方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。ペプシンでの抗体の酵素的開裂によって生成された抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２を示す５Ｓフラグメントを生じさせる。このフラグメントは、チオール還元剤を使用して、および場合によってはスルフヒドリル基のためのブロッキング基を使用して（ジスルフィド結合を開裂させる結果となる）さらに開裂させて、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価フラグメントを生成することができる。あるいは、ぺプチンを使用する酵素的開裂により、直接、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントと１つのＦｃフラグメントが生成される（例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，０３６，９４５号および米国特許第４，３３１，６４７号を参照のこと。前記特許のそれぞれは参照により取り入れられている）。
【００７２】
抗体フラグメントのもう１つの形態は、単一相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチドは、対象となる抗体のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することにより、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体生産細胞のＲＮＡから可変領域を合成することにより、得ることができる（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６，１９９１を参照のこと。これは、本明細書に参照として取り入れられている）。そのような抗体フラグメント（そのようなフラグメントのサブユニットを含む）と例えば重鎖可変領域および軽鎖可変領域を連結させるペプチドリンカーとをコードするポリヌクレオチドは、化学合成法によって、または上で説明したようにして得ることができる完全長重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドではじめる常用の組換えＤＮＡ法（ファージディスプレイを含む）を用いて、作製することができる。１つの態様において、本発明の抗体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、または配列番号２８に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【００７３】
１つの実施形態において、多量体タンパク質は、免疫グロブリン重鎖の一部および免疫グロブリン軽鎖の一部からなるＦａｂフラグメントである。前記免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、互いに会合し、ならびに予め選択されたまたは予め決められた抗原に特異的な抗原結合部位を有する配座を呈する。Ｆａｂフラグメント上の抗原結合部位は、免疫グロブリン分子上の抗原結合部位に類似した結合親和性またはアビディティーを有する。
【００７４】
本発明の実施に有用な遺伝子としては、免疫グロブリン生成物、免疫グロブリン分子、ＦａｂフラグメントおよびＦｖフラグメントに含まれているポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。これらは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含む。一般に、予め選択された抗原に結合することができる免疫グロブリンの免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする遺伝子を使用する。
【００７５】
これらの遺伝子は、活性が求められる抗原性リガンド（抗原）すなわち予め選択された抗原により免疫された哺乳動物（１つの態様ではヒト）から得た細胞から単離する。免疫処置は、従来どおり行うことができ、ならびに非ヒト動物における抗体力価をモニターして、所望の親和性またはアビディティーに対応する所望の免疫処置段階を決定することができる。軽度免疫非ヒト動物は、１回の免疫処置しか受けず、応答検出直後にそこから細胞を回収する。完全免疫非ヒト動物はピーク力価を提示し、これは、宿主非ヒト動物への抗原の注射を、１回以上、通常は２または３週間間隔で、繰り返すことで達成される。
【００７６】
ＶＨおよびＶＬポリペプチドをコードする遺伝子は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭを生産する細胞から採取することができる。免疫グロブリン可変領域遺伝子をクローニングすることができるゲノムＤＮＡのフラグメントの作製方法は、当分野において周知である。
【００７７】
本明細書において用いる場合、用語「特異的に会合する」または「特異的に相互作用する」または「特異的に結合する」は、生理条件下で比較的安定である複合体を形成する２つ以上のポリペプチドを指す。これらの用語は、本明細書では、例えば、機能性タンパク質複合体を形成するための第一ポリペプチドサブユニットと第二ポリペプチドサブユニットの相互作用をはじめとする様々な相互作用、ならびに抗体とその抗原の相互作用に関して用いている。特異的相互作用は、少なくとも約１×１０−６Ｍ、一般には少なくとも約１×１０−７Ｍ、通常は少なくとも約１×１０−８Ｍ、および特に、少なくとも約１×１０−９Ｍ、または約１×１０−１０Ｍ以上の解離定数によって特徴付けることができる。特異的相互作用は、一般に、例えば、生きている被験者（脊椎動物であってもよいし、または非脊椎動物であってもよい）の細胞または細胞内コンパートメントにおいて発生する条件ならびに細胞培養の際に発生する条件、例えば生物の細胞または組織を維持するために用いられる条件、をはじめとする生理条件下で安定である。２つの分子が特異的に相互作用するかどうかを判定する方法は周知であり、それらとしては、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、ゲルシフト分析などが挙げられる。
【００７８】
１つの態様では、インビボで惹起される抗体を発展させて、インビトロでの抗体親和性を強化することができる。例えば、オーバーラッピングＰＣＲおよびＮＮＫドーピング戦略を用いてサチュレーション変異誘発により抗体重鎖および軽鎖の個々のまたは多数のＣＤＲ領域を逐次的にランダム化するＣＤＲウォーキングを用いてもよい。このようにして作ったＦａｂ抗体配列変異体のライブラリを、ファージ表面に提示させ、最高親和性Ｆａｂクローンを確実に回収するためにストリンジェントな競合パンニング環境を用いて対象となる抗原（例えば、ＨＭＰＶのＦタンパク質）に関して再び選択する。その後、当分野において公知のアプローチ（例えば、平衡ディスプレイ、表面プラズモン共鳴、ゲルシフト分析などを含むが、これらに限定されない）によってその親和性を判定することができる。この方法を用いて、Ｋｄ値を１０倍、１００倍または１０００倍強化することができる。
【００７９】
１つの実施形態では、ＨＭＰＶ−Ｆタンパク質に対して産生させた抗体のパネルを用いて、様々な形態のＦタンパク質抗原に対する抗体の中和特性を判定する。理論に拘束されないが、概念上、Ｆタンパク質は、多数の抗原および免疫原形態で発生し得る。未成熟および成熟形態のＦタンパク質のそれぞれが、自然感染中に宿主免疫系にもたらされる可能性は高く、異なる抗体プロフィールを惹起し得ること、オーバーラップする交差反応性の幾分かがそれらの様々な形態のうちの１つより多くに共通する抗原決定基に由来する可能性が高いことは、非現実的なことではない。
【００８０】
関連態様では、バキュロウイルス系を含む（しかし、これに限定されない）様々な系において発現させることができるＨＭＰＶ−Ｆタンパク質の組換え融合体に関するスクリーニングによって回収された中和抗体をはじめとするＨＭＰＶ特異的抗体のパネルの抗原結合部分を調査した。さらなる関連態様では、ファージ抗体ライブラリをはじめとする（しかし、これに限定されない）様々な源から得られた他の非中和Ｆａｂが、前記パネルを構成し得る。前記非中和抗体を、適切な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において発現された精製組換えＨＭＰＶ−Ｆタンパク質に関して選択することができる。１つの態様において、前記抗体は、インビトロで中和活性を示す。
【００８１】
例えば、上の選択アッセイ行った後、ＨＲＳＶに対する抗体（すなわち、ＲＳＶ１９）を使用する競合試験は、非中和抗体が、ＲＳＶ１９抗体によって認識されるもの以外のエピトープに結合することを示した。より顕著なこととして、前記中和抗体は、前記非中和抗体より、組換えＨＲＳＶ−Ｆタンパク質に約１０００倍よく結合した（Ｋｄ＝６ｎＭ）。しかし、ウイルス粒子上のスパイクへと組み立てられたＦタンパク質に対する抗体の結合に先行しなければならないメカニズムを介してＲＳＲＶ１９がインビトロでウイルスを中和した効率（４ｎＭで５０％プラーク減）は、成熟状態のＦタンパク質についての全結合定数が、組換えタンパク質についてのものより３桁高いことを暗示している。実際、ＲＳＶ１９は、非中和抗体パネルよりはるかに効率的に、ＨＲＳＶ感染細胞表面に結合した（この場合、前記タンパク質は、出芽ウイルス粒子のエンベロープにいつでも組み込める状態の成熟したオリゴマー構造に配列される可能性が高い）。重ねて、理論に拘束されないが、これらのデータは、この特定の中和抗体は、未成熟形態より成熟形態のＦタンパク質に良好に結合するが、非中和抗体では反対の結合パターンが観察されるという仮説を支持している。
【００８２】
１つの実施形態において、本発明のＨＭＰＶ−Ｆ−特異的Ｆａｂは、ＶＨおよびＶＬ遺伝子セグメントの様々な使用量を表す。１つの態様において、抗体可変抗体遺伝子セグメントは、ランダムに選択された成熟Ｂ細胞のレパートリーの中で共通していないセグメントである。例えば、１つ以上の中和クローンには異なる軽鎖が利用されるが、ほぼ同一の重鎖が利用される。理論に拘束されないが、これは、そのようなクローンの場合、重鎖がＦΔＴＭ結合についての主決定子を媒介することを示唆している。もう１つの態様において、最大インビトロ中和活性には、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで異なるＶＨおよびＪＨセグメントが利用される（この場合、そのようなＦａｂは、異なるドナーから採取したものであり得る）。関連態様において、ＨＣＤＲ３ループは、重要な決定子抗原結合部位である。
【００８３】
本発明の方法の実施に有用なポリヌクレオチドは、対象となる抗体を生産する細胞、例えば、免疫された被験者もしくは特定の抗原に暴露された個体からのＢ細胞から単離することができ、周知のポリヌクレオチド合成法を用いて新たに合成することができ、組換え生産することができ、または例えば、可変重鎖および可変軽鎖をコードするポリヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって、得ることができる。例えばキメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植、一本鎖および二機能性抗体をコードするポリヌクレオチドのこれらおよび他の作製方法は、当業者に公知である。
【００８４】
当業者に公知の技法（例えば、米国特許第６，８１８，２１６号を参照のこと。前記特許は、本明細書に参照によって取り入れられている）を用いて、本発明の抗体またはそれらのフラグメントを、ＨＭＰＶ複製を阻害するまたはダウンレギュレートするそれらの能力について、アッセイすることもできる。例えば、ＨＭＰＶ複製は、プラークアッセイによってアッセイすることができる。本発明の抗体またはそれらのフラグメントを、ＨＭＰＶポリペプチドの発現を阻害するまたはダウンレギュレートするそれらの能力について、アッセイすることもできる。ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析、ノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲをはじめとする（しかし、これらに限定されない）当業者に公知の技法を用いて、ＨＭＰＶポリペプチドの発現を直接または間接的に測定することもできる。さらに、本発明の抗体またはそれらのフラグメントを、抱合体の形成を防止するそれらの能力についてアッセイすることができる。
【００８５】
本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、ヒトにおいて使用する前に、インビトロで試験し、その後、所望の治療または予防活性についてインビボで試験する。例えば、本発明の特異的抗体または組成物の投与を指示するかどうか決定するために用いることができるインビトロアッセイとしては、被験者組織サンプルを培養で増殖させ、本発明の抗体または組成物に暴露するか、本発明の抗体または組成物を別様に投与し、その組織サンプルに対する本発明のそのような抗体または組成物の効果を観察する、インビトロ細胞培養アッセイが挙げられる。様々な実施形態において、ＨＭＰＶ感染に関与する細胞タイプの代表的な細胞（例えば、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞）を用いてインビトロアッセイを行って、本発明の抗体または組成物が、ＨＭＰＶに対して所望の効果を有するかどうかを判定することができる。１つの態様では、ヒトに投与する前に、本発明の抗体または組成物をインビトロアッセイおよび動物モデル系においても試験する。具体的な実施形態では、コットンラットに本発明の抗体もしくはそのフラグメント、または本発明の組成物を投与し、１０５ｐｆｕのＨＭＰＶでチャレンジし、４日以上後にそれらのラットを犠牲にし、ＨＭＰＶ力価および抗ＨＭＰＶ抗体血清力価を判定する。さらに、この実施形態に従って、それらの犠牲にしたラットからの組織（例えば、肺組織）を組織変化について検査することができる。
【００８６】
本発明によると、本発明の抗体またはそれらのフラグメントの予防的および／または治療的有効度を立証するために、ヒト被験者での臨床試験を行う必要がない。抗体またはそれらのフラグメントを使用するインビトロおよび動物モデル研究をヒトにあてはめることができ、それらは、前記抗体またはそれらのフラグメントの予防的および／または治療的有用性を立証するために十分である。
【００８７】
治療に使用するための本発明の抗体または組成物は、ラット、マウス、ウシ、サルおよびウサギをはじめとする（しかし、これらに限定されない）好適な動物モデル系において、それらの毒性について試験することができる。抗体または組成物の毒性のインビボ試験には、当分野において公知の任意の動物モデル系を使用することができる。
【００８８】
ウイルス感染の治療または予防の有効度は、ウイルスの複製を阻害する、伝染を抑制するまたはウイルスのその宿主における樹立を予防する、ＨＭＰＶ感染の発生率を低下させる、またはＨＭＰＶ感染に随伴する１つ以上の症状を予防、改善もしくは軽減する本発明の抗体または組成物の能力を検出することによって、立証することができる。前記治療は、例えば、本発明の抗体または組成物の投与後にウイルス量の減少、１つ以上の症状の改善、ＨＭＰＶ感染期間の減少、または死亡率および／もしくは罹患率の減少があった場合、治療とみなす。さらに前記治療は、１つ以上のＨＭＰＶ抗原に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体またはそれらのフラグメントの投与後に免疫応答の増加があった場合、治療とみなす。
【００８９】
本発明の抗体についての好適な標識を以下に提供する。好適な酵素標識の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母−アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
【００９０】
好適な放射性同位元素標識の例としては、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５２Ｅｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７ＳＣ、１０９Ｐｄなどが挙げられる。
【００９１】
好適な非放射性同位元素標識の例としては、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｔｒおよび５６Ｆｅが挙げられる。
【００９２】
好適な蛍光標識の例としては、１５２Ｅｕ標識、フルオロセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルデヒド標識、およびフロレスカミン標識が挙げられる。
【００９３】
好適な毒素標識の例としては、ジフテリア毒素、リシンおよびコレラ毒素が挙げられる。
【００９４】
化学発光標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、  ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識が挙げられる。
【００９５】
核磁気共鳴造影剤の例としては、重金属核、例えば、Ｇｄ、Ｍｎおよび鉄が挙げられる。
【００９６】
上に記載した標識を抗体に連結させるための代表的な技法としては、当分野において公知である、グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、ジマレイミド、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルの使用が挙げられる。
【００９７】
１つの実施形態において、メタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）感染を診断する方法を開示し、この方法は、被験者からのサンプルと、ＨＭＰＶ融合糖タンパク質（Ｆタンパク質）に特異的に結合するヒト抗体とを、抗体／Ｆタンパク質複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップと、そのサンプルと、その抗体／Ｆタンパク質複合体と相互作用する試薬とを接触させるステップと、その試薬とその抗体の相互作用を検出するステップとを含み、この場合、その試薬−抗体相互作用が、被験者におけるＭＨＰＶ感染の存在を示す。１つの態様において、抗体／Ｆタンパク質複合体形成は、抗体−抗原相互作用を指す。もう１つの態様において、試薬相互作用は、ＨＭＰＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合するヒト抗体を認識する抗体の結合を含むが、これに限定されない。試薬相互作用は、抗体に共有結合または非共有結合している部分を認識するリガンドをさらに含む。例えば、抗体をビオチン部分で標識することができ、その後、その試薬は、ストレプトアビジンを含むこととなろう。この目的に有用な他のリガンドは、当分野において公知であり、上で略述したような標識を含む。
【００９８】
もう１つの実施形態において、１つ以上のＨＭＰＶ融合糖タンパク質（Ｆタンパク質）に特異的に結合する１つ以上のヒト抗体と生体サンプルを、１つ以上の抗体と１つ以上のＨＭＰＶ−Ｆタンパク質との複合体の形成を可能にする条件下で接触させるための装置と、複合体を形成していない抗体を除去する１つ以上の試薬と、抗体を認識する１つ以上の試薬と、抗体および試薬の使用に関する手順を提供する指示書と、１つ以上の抗体、試薬および指示書を収容する容器とを含むキットを開示する。１つの態様において、装置としては、ウィック、スワブ、多孔質媒体（例えば、ビーズ、ゲル）、毛管、注射器、ピペットなどが挙げられるが、これらに限定されない。関連態様において、前記装置は、固定相を備えることがあり、これは、サンプルが、そのような装置によって濾過される移動相としての役割を果たす。
【００９９】
１つの態様において、診断キットの種々の構成要素は、用いられる実際の診断方法に依存するであろう。
【０１００】
診断キットの上に挙げた可能な構成要素に加えて、このキットは、陽性参照サンプル、陰性参照サンプル、希釈液、洗浄溶液およびバッファを、適宜、含むことができる。
【０１０１】
１つの態様において、診断は、免疫診断法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を含むことができる。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡの場合、標識としてポリペプチドに連結させる、一般に使用される酵素としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。これらの酵素のそれぞれを、それぞれ、発色剤または試薬（基質）、例えば過酸化水素およびｏ−フェニレンジアミン；ならびにｐ−ニトロフェニルホスフェートと共に使用する。あるいは、ポリペプチドに連結されたビオチンは、ホースラディッシュペルオキシダーゼなどのシグナル手段にそれ自体が連結しているアビジンと併用で、免疫反応体の存在を示すラベルとして使用することができる。
【０１０３】
１つの態様において、Ｆタンパク質は、生体液および組織中に存在するときに本発明の方法によって検出することができる。検出可能な量のそのような抗原を含有する任意の検体を使用することができる。サンプルは、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体である場合もあり、または組織、糞便などの固体もしくは半固体である場合もあり、あるいは組織診断において一般に用いられるものなどの固体組織である場合もある。１つの態様において、前記サンプルは、血清を含む血液である。関連態様において、前記検体は、ヒト血液または血清サンプルである。
【０１０４】
前記抗体および抗原の具体的な濃度、インキュベーション温度および時間、ならびに他のアッセイ条件は、サンプル中の抗原の濃度、サンプルの性質などのような因子に依存して変えることができる。当業者は、常用の実験を用いることによってそれぞれの判定のための効果のある最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。一般に、反応条件の所定のセットについての期間は、そのアッセイを行う前に、周知の方法によって予め決定しておく。
【０１０５】
生物学的アッセイ条件下、その持続期間は、通常、数分から数時間、例えば、３０分から２時間から一晩であるが、これらの期間は様々である。もちろん、特定の状況のために所望されるまたは必要な場合があるような、抗原の洗浄、攪拌、振盪、濾過またはアッセイ前抽出などのような他の段階を、そのアッセイに加えてもよい。その後、形成された複合体を、本明細書に記載する手段によって検出することができる。
【０１０６】
上で述べた診断方法のすべては、当分野において周知であり、当業者は、用いる診断方法に関連して診断キットの有用な構成要素を容易に選択できる。
【０１０７】
本発明の組成物は、生きている被験者、例えば脊椎動物または他の哺乳動物（飼育された動物もしくはペットである場合もあり、またはヒトであってもよい）への投与に適する形態であるように調合することができる。例えば、適する形態は、コードされた抗体、またはその抗原結合部位を含む組成物であり得、この組成物は、ＨＭＰＶに暴露された固体などの被験者の受動免疫に有用であり得る。したがって、本発明は、ＨＭＰＶによって引き起こされたまたは悪化された呼吸器感染などの病的状態の改善に有用な薬物を提供する。
【０１０８】
１つの実施形態では、ＨＭＰＶに対する予防接種をしたときに遭遇する自然免疫応答の予測のつかない変化に依存するのではなく、受動免疫によって一定の防御濃度で抗ウイルス抗体を被験者に送達することができる。関連態様では、特異性の異なる小数の異なる抗体の単回投与によって、幾つかのウイルス呼吸器病原体による感染から被験者を守る。
【０１０９】
１つの実施形態において、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）融合糖タンパク質（Ｆタンパク質）に特異的に結合する１つ以上のヒト抗体を含むワクチンを開示する。
【０１１０】
１つの態様において、前記ワクチンは、アジュバントをさらに含むことがある。そのようなアジュバントは、もちろん、ペットの病気治療のまたは人間用の医薬品に責任を負う管轄官庁によってワクチンでの使用が認可されているアジュバントでなければならない。
【０１１１】
個々の抗体または抗体を含有するワクチン製剤を、診断または治療用の組成物に組み込むことができる。その形態は、指定された投与方式および診断または治療用途に依存する。前記組成物は、所望される調合に依存して、医薬的に許容される非毒性担体または希釈剤（動物またはヒトに投与するための医薬組成物を調合するために一般に使用されるビヒクルとして定義される）も含むことがある。前記希釈液は、その併用物の生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈液の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液、およびハンクス溶液である。加えて、前記医薬組成物または調合物は、他の担体、アジュバントまたは非毒性、非治療用、非免疫原性安定剤なども含むことがある。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）を参照のこと。インビボでの使用を目的とする組成物は、通常、無菌である。非経口投与用の組成物は、無菌であり、実質的に等張性であり、ならびにＧＭＰ条件下で作られる。
【０１１２】
前記調合物は、前記抗体での治療が必要な哺乳動物（ヒトを含む）に、公知の方法に従って、例えば、ボーラスとしての静脈内投与、または一定期間にわたる持続点滴により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下、経口、局所もしくは吸入経路により、投与される。１つの実施形態において、前記調合物は、静脈内投与によって前記哺乳動物に投与される。このような目的のために、前記調合物は、例えば、注射器を使用してまたは静脈ラインによって注射することができる。
【０１１３】
前記抗体の適切な用量（「治療有効量」）は、例えば、治療すべき状態、その状態の重症度および経過、その抗体を予防目的で投与するのか、または治療目的で投与するのか、前治療、その患者の臨床履歴、およびその抗体への応答、使用する抗体のタイプ、ならびに担当医の判断に依存するであろう。前記抗体は、１回でまたは一連の治療にわたって患者に適切に投与し、診断以降、いつまで投与してもよい。前記抗体は、単独治療薬として投与してもよいし、または問題の状態の治療に有用な他の薬物もしくは療法と共に施与してもよい。
【０１１４】
一般的な提案として、投与する抗体の治療有効量は、１回の投与によろうと、それより多くの投与によろうと、約０．１から約５０ｍｇ／（患者の体重１ｋｇ）の範囲であるし、使用する抗体の典型的な範囲は、例えば、１日１回の投与で、約０．３から約２０ｍｇ／ｋｇ、および／または約０．３から約１５ｍｇ／ｋｇであろう。しかし、他の薬剤投与計画が有用である場合もある。この療法の進行は、従来の技術によって容易にモニターすることができる。
【０１１５】
以下の実施例は、本発明の範囲を説明するためのものであり、限定するためのものではない。
【実施例】
【０１１６】
材料および方法
＜哺乳動物細胞におけるＨＭＰＶ−Ｆ細胞外ドメイン発現＞
ＲＴ−ＰＣＲを用いて、推奨命名法（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ（２００１）７：７１９−７２４）によるとＴＮ／９２−４、原型ジェノグループＡ２株、と称する病原性臨床分離株から完全長Ｆ配列を増幅した。その完全ＴＮ／９２−４Ｆ配列は、商品供給業者（Ａｐｔｇｅｎ）によって、哺乳動物ｔＲＮＡの偏りのための最適でないコドン使用量を変え、二次ｍＲＮＡ構造を改善し、ＡＴリッチ領域を除去してｍＲＮＡ安定性を増大させるように最適化された配列であった。次に、膜貫通（ＴＭ）ドメインのないＨＭＰＶ−Ｆ細胞外ドメイン構築物をコードする発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ＦΔＴＭ）を作製した。そのＦ遺伝子の最適化完全長ｃＤＮＡを、プライマー５’−ＧＧＡＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧ−３’および５’−ＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＴＴＣＴＣ−３’でＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を消化し、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ部位（前記プライマー配列において下線を引いた位置に限定）にライゲートした。そのｐｃＤＮＡ３．１−ＦΔＴＭ組換えプラスミドを２９３−Ｆ細胞懸濁液（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。トランスフェクション後９６時間の時点で、細胞を５分間、１００ｘｇで室温で遠心分離し、上清を回収した。上清を０．２μｍフィルターによって濾過した後、精製した。
【０１１７】
＜６ｘＨｉｓ標識Ｆ細胞外ドメインの精製＞
ＵＮＩＣＯＲＮ  ４．１２ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって制御されたＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムを用いて、タンパク質精製を行った。充填済ＨｉｓＴｒａｐ  Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、金属イオン固定化クロマトグラフィーにより、Ｈｉｓ標識Ｆ細胞外ドメインＦΔＴＭを精製した。精製前に、濃縮結合バッファーストックでサンプルを希釈して、ｐＨ、塩およびイミダゾール濃度を調整した。タンパク質は、５．９ｍＬ／分の負荷流量で５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐカラムに負荷し、結合バッファは、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．４）を含有した。溶出段階１において４カラム量の８％溶出バッファを使用して無関係なタンパク質を溶出し、溶出段階２において４カラム量の２５％溶出バッファで６ｘＨｉｓ標識Ｆタンパク質を溶出した。この溶出バッファは、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．４）を含有した。精製されたタンパク質を濃縮し、３０，０００および１００，０００分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心濾過機（ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によりＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対して透析した。
【０１１８】
＜抗体ファージディスプレイライブラリの構築および選択＞
抗体Ｆａｂ免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）（ＫおよびまたはＸ鎖）ファージディスプレイライブラリを、記載されているとおり（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９：１０１６４−１０１６８，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９３）９０：４１４１−４１４５）、１２のドナーの骨髄組織からクローニングした。ライブラリのサイズは、構成員数３×１０３から５×１０７の範囲であった。記載されているようなバイオパンニング手順（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２））を用いて、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）ウェルに結合した組換えＨＭＰＶＦタンパク質に関して、ライブラリを個々に選択した。パンニングの第４または第５ラウンドから回収した選択されたファージを可溶性Ｆａｂ発現系に転換し（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２））、クローンを、組換えＨＭＰＶＦタンパク質選択抗原との反応性について、個々に試験した。選択されたＨＭＰＶＦタンパク質反応性Ｆａｂクローンを免疫アフィニティークロマトグラフィー（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３））によって精製した。ＨＭＰＶ反応性抗体Ｆａｂクローンの軽鎖および重鎖可変領域配列を、記載されているように決定した（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３））。Ｊｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓプログラムを使用し、最近まとめられた（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ（２００６）３４：Ｄ７８１−７８４，Ｒｕｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２０００）２８：２１９−２２１）最新のヒトＩｇ遺伝子名により結果を報告する、インターナショナルＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（フランス、モンペリエのＣｅｎｔｒｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑｕｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｌ’Ｅｎｓｅｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｕｐｅｒｉｅｕｒがホストである）で、ＶＨまたはＶＬ領域の配列を分析した。手作業での点検により、すべてのＶＨおよびＶＬ割当てを再調査し、確認した。連結領域での突然変異を手作業で確認し、残りの領域での突然変異を手作業で採点し、表にした。
【０１１９】
＜免疫蛍光アッセイ＞
ＬＬＣ−ＭＫ２細胞培養単層を１のＭＯＩのＨＭＰＶで感染させた。感染後３４時間の時点で、細胞を１０％緩衝ホルマリンで固定し、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、その後、ＰＢＳ−Ｔ／ミルク中のＦａｂまたは抗ＨＭＰＶ血清（１：５００希釈）のいずれかと共に１時間、３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔでの洗浄後、ＰＢＳ−Ｔ／ミルク中で１：１０００希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５８６コンジュゲート型ヤギ抗モルモットＩｇまたはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５８６コンジュゲート型マウス抗Ｆａｂ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）で、１時間、３７℃で細胞を染色した。Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ倒立顕微鏡で細胞単層を検査し、Ｎｉｋｏｎ  Ｄ１００デジタルカメラで画像を獲得した。画像をデジタル調整および再加工せずに、Ａｄｏｂｅ  ＰｈｏｔｏｓｈｏｐおよびＩｌｌｕｓｒａｔｏｒを使用して画像をトリミングし、図を作成した。
【０１２０】
＜インビトロ中和アッセイ＞
以下の修正を施した、記載されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２００５）７９：１０９４４−１０９５１）ようなプラーク減少アッセイによって、ＨＭＰＶ中和力価を決定した。未希釈で開始する４倍系列希釈でのＦａｂ懸濁液を、２４ウェルプレートにおいて１ウェルにつき５０のプラークを生じるように希釈したＨＭＰＶの作業用ストックと共にインキュベートした。そのＦａｂとウイルスの混合物を１時間、３７℃で回転させながらインキュベートした。その後、Ｆａｂ／ウイルス混合物を２４ウェル培養プレート内のＬＬＣ−ＭＫ２単層の上に三重反復でプレーティングし、室温で１時間、吸着させた。その後、トリプシンを補足したＯｐｔｉＭＥＭ中の０．７５５  メチルセルロースをかぶせ、ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で４日間、インキュベートした。単層をすすぎ、ホルマリン固定し、記載されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５））ようにモルモット抗ＨＭＰＶ血清およびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗モルモットＩｇで染色した。プラークをカウントし、６０％プラーク減少力価を計算した。ＨＭＰＶ陽性ヒト血清を陽性対照として使用した。
【０１２１】
＜表面プラズモン共鳴＞
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００での表面プラズモン共鳴を用いて、ＨＭＰＶ−Ｆ特異的ＭａｂとＨＭＰＶ−Ｆタンパク質の相互作用を遂行した。精製された組換えＨＭＰＶ  ＦまたはＲＳＶＦタンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中、３０μｇ／ｍＬに希釈し、ターゲットＲＵ密度が１２００のＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のデキストランマトリックスに結合しているアミンによって４５℃μＬ／ｍＬで共有結合的に固定化した。未反応活性エステル基を１Ｍのエタノールアミンでブロックした。リファレンスとして用いるために、タンパク質を含有しないブランク表面を、全く同じ固定化条件下で作製した。ＨＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０バッファ（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中５から５００ｎＭの範囲にわたる様々な濃度の精製ＨＭＰＶ−Ｆ抗体およびＲＳＶ特異的ＭＡｂ（パリビツマブ）を、固定化ＨＭＰＶＦタンパク質上、ＲＳＶＦタンパク質上、リファレンス細胞表面に注入した。１８０秒間、３０μＬ／分の流量で抗体結合を測定し、さらに３６０秒間、解離をモニターした。１００μＬ／分で３０秒間、５０ｍＭのＨＣｌをパルシングすることによって、残留結合抗体をセンサーチップから除去した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、結合曲線を全体にわたって１：１ラングミュア結合モデルに合うようにアラインすることにより、Ｋａ、ＫｄおよびＫＤを決定した。
【０１２２】
＜インビボ感染およびＦａｂ治療＞
商業ブリーダー（インディアナ州、インディアナポリスのＨａｒｌａｎ）から週齢５〜６週のコットンラットを購入し、基準食および水を自由に与え、マイクロアイソレーターケージで飼育した。ウイルスまたはＦａｂ接種前にイソフランによって動物に麻酔した。使用したウイルス株は、推奨命名法（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４））によるとｈＭＰＶ株ＴＮ／９４−４９、ジェノグループＡ２ウイルス、と称する、病原性臨床分離株であった。このウイルス株は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層培養物でのプラーク力価測定によって、３．５×１０６ｐｆｕ／ｍＬの力価を有すると判定された。第０日に、５−１の群内のコットンラットに１００μＬの量の３．５×１０５ｐｆｕを鼻腔内接種した。感染後第３日に、Ｆａｂの溶液を鼻腔内滴下した。Ｂ１２と称する無関係の同様に作製したＦａｂを、１または４ｍｇ／（体重１ｋｇ）で使用した。ＨＭＰＶ−Ｆ特異的ＤＳλ７は、０．０６、０．２５、１または４ｍｇ／（体重１ｋｇ）で使用した。より低い濃度のために２２５μＬ量で与えたＢ１２の４ｍｇ／ｋｇ用量を除いて、すべてのＦａｂ濃度を一律１００μＬ量に調整した。感染後第４日（Ｆａｂ投与の２４時間後）に、ＣＯ２窒息によってそれらの動物を犠牲にし、全血を採取した。鼻および肺組織を別々に回収し、それぞれの動物について個々に計量し、直ちにホモジネートした。肺は、氷冷ガラスホモジナイザーで粉砕し、鼻甲介は、冷たい磁製乳鉢の中の無菌砂および乳棒を用いて、３ｍＬの氷冷ハンクス緩衝塩類溶液中で粉砕した。組織ホモジネートを４℃で１０分間、３００ｘｇで遠心分離し、上清を回収し、クリオバイアルに分取し、液体窒素で急速冷凍した。この研究は、Ｔｈｅ  Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された。
【０１２３】
＜統計的分析＞
対照群間のウイルス力価をＫｒｕｓｔａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定で比較した。ウィルコクソン順位和検定を用いて、ＨＭＰＶ−Ｆ特異的Ｆａｂ  ＤＳλ７治療群のそれぞれにおけるウイルス力価を、併せた対照群におけるウイルス量と比較した。線形回帰を用いて、用量−応答分析を考察した。用量をｌｏｇ２変換した。非正規分布の影響を最小にするために用量２−４、２−２、２０、および２２ｍｇ／ｋｇならびに組織ウイルス力価を対数変換したからである。プラークが検出されなかったウイルスアッセイを、ｌｏｇ１０変換前に、５  ＰＦＵ／ｇの検出限界の力価に割り当てた。たった４つの離れた用量レベルでデータに自由に曲がる曲線を適合させるモデルは、データへの過剰適合となり得るという理由から、このモデルでは、データに直線を適合させた。実験群の力価を幾何平均力価として表示した。
【０１２４】
ファージライブラリパンニングによるＨＭＰＶ−Ｆ特異的モノクローナルＦａｂフラグメントの回収。１２のドナーの骨髄組織から作製したファージ抗体Ｆａｂディスプレイライブラリを、ＥＬＩＳＡウェルに結合した組換えＨＭＰＶ−Ｆタンパク質に関して個々に選択した。ファージパンニングの第４または第５ラウンド後に存在した２０または３０の抗体Ｆａｂクローンを、ＥＬＩＳＡで、選択抗原に対する反応性について評価した。抗原特異的クローンを、１２のドナーライブラリのうちの５つから単離した。特異的ＦａｂのＦａｂ軽鎖および重鎖ＤＮＡ配列の分析によって、別個の配列を有する１４の異なるクローンが同定された（表１）。
【０１２５】
分子の膜貫通部分を欠失した（ΔＴＭ）アフィニティー精製Ｆタンパク質（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＪｏｈｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓにより提供されたもの）に関して、ＨＭＰＶについての選択実験を行った。前記選択実験の結果、重鎖の塩基配列決定によって判定して、表１に示すとおりの１４の異なるＨＭＰＶ反応性抗体のパネルを得た。
【０１２６】
【表１】
2010505876.tif 000002
【０１２７】
これらの実験において、６のファージ抗体のうちの１つだけは、１回のパンニング後にＨＭＰＶ特異的抗体を生じることができなかった。可溶性Ｆａｂフラグメントとして、表１に記載した抗体は、ＥＬＩＳＡ形式で組換えＦタンパク質と陽性反応するが、対照抗原とは反応しないことが確認された。
【０１２８】
それらの反応性をさらに調査するために、ＥＬＩＳＡ陽性Ｆａｂ抗体を、免疫組織化学アッセイで、ＨＭＰＶ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞に関して評価した。ＥＬＩＳＡスクリーニングによりＨＭＰＶ−Ｆタンパク質に特異的に結合した１４のＦａｂクローンからの細菌上清を試験した。試験した１４のＦａｂ抗体のうち、２つを除くすべてが、ＨＭＰＶ感染細胞への特異的結合を阻害した（図２Ａ、Ｂ）。幾つかのＦａｂは、インビトロで中和活性を示し、それらを細菌上清から精製した。これらの精製Ｆａｂは、ＨＭＰＶ感染細胞にも結合した（図２Ｃ、Ｄ）。Ｆ特異的Ｆａｂは、抱合体と単個感染細胞の両方からＦタンパク質の予想局在と一致する膜分布パターンで検出された。蛍光パターンは、ポリクローナル血清でのＨＭＰＶ感染細胞またはＨＭＰＶ−ＦのみをコードするｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の染色結果として、以前に観察されたものに類似していた。免疫蛍光法によってＨＭＰＶを検出したＦａｂクローンを、インビトロ中和能力についてさらに試験した。
【０１２９】
ＨＭＰＶ特異的Ｆａｂの機能性を判定するために、マイクロ中和プラークアッセイを利用した。まず、可溶性Ｆタンパク質反応性Ｆａｂクローンを含有する粗細菌上清をスクリーニングした。プラーク数の６０％減少を達成するために必要な細菌上清の希釈度を、それぞれの場合に記録した。ＨＩＶ−１を認識する組換えＦａｂおよび高いＨＭＰＶ中和力価を有するヒト血清を、それぞれ、陰性対照および陽性対照としてこの実験に組み入れた。これらの実験は、約４つの個々のＦａｂクローン、ＤＳλ１、ＤＳλ６、ＤＳλ７およびＡＣＮ０４４、が、ＨＭＰＶのＡ２株に関するＨＭＰＶ中和活性を有することを示した。これらの抗体のそれぞれを、非中和ＨＭＰＶ−Ｆタンパク質特異的抗体Ｈａｎκ９、およびＦａｂ  ｂ１２と一緒に、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、前記ＨＭＰＶ中和実験を繰り返した。これらの実験結果を表２に示す。
【０１３０】
【表２】
2010505876.tif 000003
【０１３１】
データは、ＦａｂクローンＤＳλ１、ＤＳλ６、ＤＳλ７およびＡＣＮ０４４が、インビトロでＨＭＰＶのＡ２株を妥当な効率（１．１から３．２μｇ／ｍＬ）で中和することを示している。その後、ＦａｂパネルがＡ２以外のＨＭＰＶの株も中和するか否かを判定した（表３）。Ａ２は、臨床上、最も有力なＨＭＰＶジェノグループであると考えられるが、他のジェノグループ、特にＢ２にも遭遇することがある。
【０１３２】
【表３】
2010505876.tif 000004
【０１３３】
データは、すべての選択抗体がＨＭＰＶ−Ａ２ジェノグループを中和したことを裏付けたが、ＤＳλ７−Ｆａｂクローンだけは、Ａ１およびＢ１ジェノグループに対する中和活性を一切提示しなかった。これらのデータは、Ａ２ジェノグループを代表する組換えＦタンパク質に関する選択によって回収した抗体が、Ａ２ウイルスを中和する抗体の選択に有利であることを示唆している。このタイプのジェノグループ特異的中和は、異なるＨＭＰＶジェノグループと会合しているＦタンパク質間の高いアミノ酸同一性からすると予想外であり、ならびに中和抗体応答によって発揮される選択圧力が、パラミクソウイルス科の中でのエンベロープタンパク質の異質性を形づくる上で重要な役割を果たし得るという主張に重みを付ける。
【０１３４】
下記は、アーカイブ臨床サンプルにおいて遭遇するような、例えば３０（Ａ１）；配列番号３２（Ａ２）；配列番号３４（Ｂ１）および配列番号３６（Ｂ２）によって例示される、４つのＨＭＰＶジェノグループにわたるおよびそれらの中でのＦタンパク質配列の総合的比較である。
【０１３５】
【表４】
2010505876.tif 000005
【０１３６】
ＨＭＰＶ−ＦΔＴＭ特異的Ｆａｂには、多数のＶＨ遺伝子セグメントが用いられていた（表５）。
【０１３７】
【表５】
2010505876.tif 000006
【０１３８】
ＶＨ３−２３は、成熟ランダム循環Ｂ細胞レパートリーにおいて最も一般に用いられているＶＨセグメントであるにもかかわらず、１つのクローンにしか存在しなかった（Ｂｒｅｚｉｎｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９５）１５５：１９０−２０２、Ｃｏｒｂｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ（１９９７）２７０：５８７−５９７、Ｗｅｉｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００３）１７１：４５８０−４６８８）。５％より少ないランダム循環Ｂ細胞に用いられているＶＨ１−０３は、４つのクローンに用いられていた。ＶＨ４−５９は、３つのクローンで用いられ、そのうち２つは１ドナーからのクローン的に関連したものである可能性が高く、１つは別のドナーからのものであった。ウイルス中和活性を有する４つのＦａｂクローンのうち、単一ドナーからの２つ（ＤＳλ１およびＤＳλ６）は、非常に類似したＶＨセグメントおよび全く同じＨＣＤＲ３領域を有する（表１）が、異なる軽鎖を有した。最も高い中和活性を有する２つのクローン（ＡＣＮ０４４およびＤＳλ７）は、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで異なっているＶＨ、ＪＨおよび軽鎖を含むが、非常に類似したＨＣＤＲ３ループを有した（表１）。体細胞突然変異の分析により、Ｆａｂクローンの大部分が高度に突然変異し、フレームワークの突然変異が最も多いことが判明した（表６Ａおよび６Ｂ）。
【０１３９】
【表６】
2010505876.tif 000007
【０１４０】
しかし、突然変異の数と中和活性の明らかな相関はなかった。
【０１４１】
ＳＰＲ研究は、ＨＭＰＶ特異的ＦａｂはＨＭＰＶ−ＦΔＴＭに高い親和性で結合するが、予想どおり、ＲＳＶ−Ｆ特異的ＭＡｂパリビツマブはしないことを示した。５００ｎＭから５ＮＭの範囲にわたる濃度の抗ＨＭＰＶ−Ｆａｂ  ＤＳλ７の結合曲線は、ＨＭＰＶ  ＦΔＴＭへの特異的結合パターンを示した（図３）。対照的に、図３は、パリビツマブが１００ｎＭの濃度の時でさえＨＭＰＶＦΔＴＭに結合しなかったことを示している。本発明者らは、パリビツマブのＲＳＶ−ＦΔＴＭへの結合能力を試験したところ、強い、特異的な結合を示した。これは、ＨＭＰＶ−ＦΔＴＭへの結合の欠如が、特異性の結果であり、抗体の量とは関係ないことを示している。ヒトＦａｂ  ＤＳλ７のＨＭＰＶ−ＦΔＴＭに対する親和性は高く、Ｋａ＝３．５４×１０５（１／ミリ秒）、Ｋｄ＝３．４８×１０−５（１／秒）、およびＫＤ＝９．８４×１０−１０（Ｍ）であった。これらの値は、強い、特異的な抗体−抗原結合を示唆している。結合Ｆａｂ  ＤＳλ７は、ＨＭＰＶ−ＦΔＴＭへの特異的結合を示したが、ＲＳＶ−ＦΔＴＭタンパク質に対する検出可能な親和性は有さなかった（図３）。
【０１４２】
ハムスター、モルモット、コットンラット、および９つのマウス近交系に麻酔下で１０５ｐｆｕのＨＭＰＶを鼻腔内接種した。感染から４日後、それらの動物を犠牲にし、鼻および肺組織のＨＭＰＶ力価をプラーク力価測定によって決定した。パラミクソウイルス感染の齧歯動物モデルでは一般的である呼吸器症候群を示した動物は全くいなかった。マウスにおけるＲＳＶ感染の研究により、１０８ｐｆｕの非常に高い接種量の場合にのみ、マウスは体を丸める（ｈｕｄｄｌｉｎｇ）および毛を逆立たせる（ｒｕｆｆｌｅｄ  ｆｕｒ）などの症状を示すことが証明された。鼻組織に存在したウイルスの量は、４．６×１０２ｐｆｕ／（組織１ｇ）（Ｃ３Ｈマウス）から、１０５ｐｆｕ／（組織１ｇ）より多い（ハムスター）の範囲にわたった（図４、上）。したがって、すべての動物は、鼻甲介におけるＨＭＰＶ複製をやや許容した。肺力価の判定は、相当異なる結果をもたらした（図４、下）。肺組織におけるＨＭＰＶ複製の量は、検出可能未満（＜５ｐｆｕ／ｇ；モルモットおよびＳＪＬマウス）から、平均で１．８×１０５ｐｆｕ／ｇ（コットンラット）の範囲にわたった。
【０１４３】
これらのデータは、試験した齧歯動物の中で、コットンラットがＨＭＰＶ感染を最も高く許容したことを示している。したがって、１０５ｐｆｕのＨＭＰＶで動物を鼻腔内感染させ、感染後２、４、６、８、１０または１４日の時点でそれらを犠牲にすることによって、コットンラットにおけるＨＭＰＶ複製の動態を判定した。図５に示すように、鼻甲介におけるＨＭＰＶ複製は、５．６×１０４ｐｆｕ／ｇの平均力価で第２日にピークに達し、第４日を過ぎると低下し、第６日の後は鼻甲介において検出されなかった。肺組織におけるＨＭＰＶの複製は、１．８×１０５ｐｆｕ／ｇの平均力価で感染後第４日にピークに達し、急速に低下し、第６日の後は肺においてウイルスは検出されなかった。これは、ヒトにおけるＨＭＰＶ排出期間に関するデータ（Ｅｂｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００４）４２：１２６−１３２；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（２００３）１８８：１５７１−１５７７；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（２００６）１９３：３８７−３９５）と類似している。
【０１４４】
次に、感染４日後に回収した未感染および感染動物からの病理検体を検査した。ＨＭＰＶ感染動物の鼻の上皮は、軽度の上皮下リンパ球様浸潤を示した。最も目を引く発見は、感染動物の肺にあった（図６Ｂ、Ｄ）。ＨＭＰＶ感染コットンラットの肺は、気管支周囲のリンパ形質細胞浸潤および気管支粘膜下組織の浮腫性肥厚を示した。加えて、単核細胞浸潤および浮腫に起因して肺胞間質のびまん性で軽度の拡大があった。脱落上皮細胞、好中球、マクロファージおよび無定形の残屑が、気管支腔に見えた。肺病変の分布は多病巣性であり、それらは位置的に広範囲にわたっていた。未感染動物の肺は正常であった（図６Ａ、Ｃ）。いずれの動物においても、脳、心臓、胸腺、肺、脾臓または肝臓における病変は見られなかった。
【０１４５】
未感染動物からの肺をはじめとする組織切片は、抗ＨＭＰＶ血清との反応性を示さなかった（図７Ａ）。ＨＭＰＶ感染コットンラットからの脳、心臓、胸腺、脾臓および肝臓の免疫染色切片は、陰性であった。ＨＭＰＶ感染コットンラットからの切片における呼吸上皮組織では、呼吸上皮細胞の内腔表面でのみ、ＨＭＰＶ抗原が検出された（図７Ｂ）。鼻組織から細気管支の呼吸上皮細胞では、形態学的に正常な上皮細胞と変性した上皮細胞の両方においてＨＭＰＶ抗原染色が観察された。これは、呼吸上皮でのウイルス複製を示している。脱落上皮細胞とマクロファージの両方を含む内腔細胞残屑は、ＨＭＰＶ抗原に対して陽性に染まった。ＣＤ３の免疫組織化学は、Ｔ細胞の実質的流入を示した。これは、細胞性免疫がウイルスのクリアランスに関与することを示唆している。組織病理学データと免疫組織化学データの両方が、気道以外の組織においてＨＭＰＶを確認できなかったヒトおよび霊長類の研究を反映していた。
【０１４６】
防御免疫および抗体応答を判定するために、コットンラットの２つの群に、スクロース（模擬）または１０５ｐｆｕのスクロース精製ＨＭＰＶのいずれかを鼻腔内接種した。両方の群を、２１日後、１０５ｐｆｕのスクロース精製ＨＭＰＶで鼻腔内チャレンジした。４日後、コットンラットを犠牲にし、鼻および肺組織におけるウイルス力価を判定した。前に感染していた動物は、わずかだが有意な鼻での力価減少を示し、ならびに肺での高い防御度を示した（図８、左）。前に感染させたラット６匹のうち４匹は、肺において検出可能なウイルス力価を排出しなかった。これらの動物におけるウイルス複製の不在を免疫組織化学によって確認した。前に感染させた動物は、平均１：１７４（１：１７〜１：２５６の範囲）の有意な血清中和抗体力価も示した（図８、右）。
【０１４７】
これらのデータは、コットンラットが鼻および肺においてＨＭＰＶ複製を許容すること（病理が気管支炎と一致する）が証明されたことを示している。さらに、ＨＭＰＶ感染は、コットンラットにおいて防御免疫を誘発する。したがって、コットンラットは、ＨＭＰＶ感染の丈夫で扱いやすい動物モデルとなる。
【０１４８】
インビボでのＨＭＰＶ特異的Ｆａｂの機能性を判定するために、コットンラットの７つの群（６〜７匹／群、合計４３匹）を選択した。４群に０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび４ｍｇ／ｋｇのＦａｂ  ＤＳλ７を鼻腔内投与した。対照として、２群にそれぞれ４ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇのＦａｂ  ｂ１２（非中和抗体）を鼻腔内投与した。翌日、それらの動物に１０５ｐｆｕのスクロース精製ＨＭＰＶを鼻腔内接種した。４日後、それらの動物を犠牲にし、鼻および肺組織におけるウイルス力価を判定した。試験および対照動物のそれぞれのセットを、ＨＭＰＶのみを受けた動物群と比較した。結果を表７に示す。
【０１４９】
【表７】
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【０１５０】
肺組織について表からわかるように、ＤＳλ７を受けたラットは、試験したすべての濃度のＢ１２と比較して低減されたウイルス力価を示し、力価は、一般に鼻組織におけるより低く、特に、最高濃度のＤＳλ７のときに低かった。これらのデータは、上の防御免疫および抗体応答データ（すなわち、図８）とよく相関している。
【０１５１】
これらのデータは、鼻および肺においてＨＭＰＶ複製を許容する動物を用いてインビボ中和の模擬実験を行うことができることを示し、ならびに開示する方法によって得られるＦａｂクローン（例えば、ＤＳλ７）が、これらの動物の肺におけるウイルス量を減少させることができることを示している。
【０１５２】
もう１つの実験セットにおいて、コットンラットをＨＭＰＶで鼻腔内感染させ、第４日に、ＨＭＰＶ複製のピークより前の日に、Ｆａｂを鼻腔内投与した（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２００５）７９：１０９４４−１０９５１）。第４日に動物を犠牲にして組織を回収し、鼻および肺のウイルス力価を判定した。鼻甲介におけるウイルス力価は、Ｆａｂ  ＤＳλ７治療によってほんのわずかしか減少されなかった（図９Ａ）。対照群間にはウイルス力価の有意な差（ｐ＝０．０２５）があり、未治療対照群は、２つのＦａｂ  Ｂ１２治療対照群よりわずかに高い鼻の幾何平均力価を有した（１．９×１０４ＰＦＵ／ｇ，ＨＭＰＶ；１．２×１０４ＰＦＵ／ｇ，Ｂ１２  ４ｍｇ／ｋｇ；１．７×１０４ＰＦＵ／ｇ，Ｂ１２  １ｍｇ／ｋｇ）。対照群と比較したＤＳλ７治療群のうち、４ｍｇ／ｋｇ  ＤＳλ７用量のみが、鼻のウイルス力価の有意な減少を伴った（４．９×１０３ＰＦＵ／ｇ対１．８  １０４ＰＦＵ／ｇ、ｐ＝０．０００５）（図９）。用量と応答の間には統計学的に有意な関係があった（ｐ＝０．０００２）：用量が４倍になるごとに、期待ウイルス量は、約−０．２０  ｌｏｇ１０−ＰＦＵ／ｇ（−０．２９、−０．１１の９５％ＣＩ）減少した（図１０Ａ）。
【０１５３】
ＤＳλ７は、肺におけるウイルス力価減少に非常に有効であった（図９Ｂ）。対照群（未治療のもの、またはＦａｂ  Ｂ１２で治療したもののいずれか）は、９．６×１０３ＰＦＵ／ｇの肺の平均ウイルス力価を有した。肺のウイルス力価は、３つの対照間で差がなかった（ｐ＝０．３８）。ＤＳλ７治療群のそれぞれは、対照より低い肺のウイルス力価を有した（対照と比較してそれぞれの群について、ｐ＜０．０００２）。ＤＳλ７治療動物の肺における平均ウイルス力価は、１．１×１０２（０．０６ｍｇ／ｋｇ用量）から６．２×１００（４ｍｇ／ｋｇ用量）の範囲にわたった。ＤＳλ７  ４ｍｇ／ｋｇ群における７匹の動物のうちの１匹のみが、肺において検出可能なウイルスを有した。これは、対照と比較して、４ｍｇ／ｋｇ治療コットンマウスにおける１５００倍より大きな減少を表していた。用量が高いほど、肺において低いウイルス力価が得られるという証拠があった（ｐ＝０．０１３；傾き  用量が４倍になるごとに−０．３６  ｌｏｇ１０−ＰＦＵ／ｇ［−０．６２、−０．１０の９５％ＣＩ］）（図１０Ｂ）。しかし、この結果は、４ｍｇ／ｋｇ用量から得たものであった。肺のウイルス力価が０．０６、０．２５および１．０ｍｇ／ｋｇの用量の間で異なることを示唆する証拠はなかった（ｐ＝０．３７）。用量をｌｏｇ２変換しない線形回帰分析も行ったが、鼻組織と肺組織の両方についてのウイルス力価の減少は、尚、有意であった（両方についてｐ＜０．０００１、肺について−０．６２  ｌｏｇ１０−ＰＦＵ／ｇ［−０．８２、−０．４３の９５％ＣＩ］、および鼻甲介について−０．１４  ｌｏｇ１０−ＰＦＵ／ｇ［−０．２０、−０．０９の９５％ＣＩ］。
【０１５４】
上の実施例に関して本発明を説明したが、変更および変形が本発明の精神および範囲に包含されることは理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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