(57)【要約】  毒性の無い量の硝酸塩及び／又は亜硝酸塩を哺乳類に投与することにより、運動中の酸素摂取量（ＶＯ２）の減少を示す前記哺乳類の運動能力を向上させることができる。スポーツ飲料などの、液体、半固体、及び固体のスナック及び食品及び栄養補助食品を提供する。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の運動能力を向上させるための組成物を製造するための無機硝酸塩及び／又は亜硝酸塩の使用。
【請求項２】
前記運動能力向上の効果が運動中のＶＯ2減少の形で示される、
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記運動能力向上の効果が、運動中のＶＯ2減少及び筋効率の著しい増大の両方の形で示される、
ことを特徴とする請求項１及び請求項２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４】
前記組成物が、硝酸塩及び亜硝酸塩を約５：１から約１００：１（硝酸：亜硝酸）の間の用量比で含む、
ことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記組成物が、液体、ペースト、バー、ケーキ、粉末、顆粒、発砲錠、錠剤、カプセル、薬用キャンデー、チューイングガム、速溶性錠剤又はウェハース、舌下錠、又はスプレーの形をとる、
ことを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記組成物が、スポーツ飲料、エネルギー飲料、スポーツバー、又はエネルギーバーの形で市場に出される、
ことを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記無機硝酸塩の供給源が、硝酸塩含有野菜の濃縮物、抽出物又はジュース、或いは無機硝酸塩の塩の中から選択される、
ことを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記無機硝酸塩の供給源が無機硝酸塩の塩である、
ことを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記無機硝酸塩が、ポリフェノールと組み合わせて使用される、
ことを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記無機硝酸塩が、硝酸塩又は亜硝酸塩の還元を促進できる生細菌と組み合わせて使用される、
ことを特徴とする請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記無機硝酸塩が、約５％（ｖ／ｖ）エタノールと組み合わせて使用される、
ことを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
哺乳類が摂取した場合、運動中の酸素摂取量（ＶＯ2）の減少を示す運動能力を向上させることができる組成物であって、無機硝酸塩及び／又は亜硝酸塩及びポリフェノールを含む、
ことを特徴とする組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、硝酸塩及び亜硝酸塩を約５：１から約１００：１（硝酸：亜硝酸）の間の用量比で含む、
ことを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、液体、ペースト、バー、ケーキ、粉末、顆粒、発砲錠、錠剤、カプセル、薬用キャンデー、チューイングガム、速溶性錠剤又はウェハース、舌下錠、又はスプレーの形をとる、
ことを特徴とする請求項１２及び請求項１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、液体、ペースト、バー、ケーキ、粉末、又は顆粒などの食品の形をとるか、或いはこの一部を構成する、
ことを特徴とする請求項１２から請求項１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記無機硝酸塩の供給源が、硝酸塩含有野菜の濃縮物、ジュース又は抽出物の中から選択される、
ことを特徴とする請求項１２から請求項１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記無機硝酸塩の供給源が無機硝酸塩の塩である、
ことを特徴とする請求項１２から請求項１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、硝酸塩又は亜硝酸塩の還元を促進できる生細菌を含む、
ことを特徴とする請求項１２から請求項１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が抗菌化合物を含む、
ことを特徴とする請求項１２から請求項１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、約５％（ｖ／ｖ）濃度のエタノールを含む、
ことを特徴とする請求項１２から請求項１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
哺乳類の運動能力を非治療的に向上させる方法であって、前記哺乳類に無機硝酸塩及び／又は亜硝酸塩を投与する、
ことを特徴とする方法。
【請求項２２】
硝酸塩及び亜硝酸塩が、約５：１〜約１００：１（硝酸：亜硝酸）の間の用量比で投与される、
ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記硝酸塩の用量が、約１〜１０００μｍｏｌ硝酸ナトリウム／ｋｇ体重／日の間で投与される、
ことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記亜硝酸塩の用量が、約０．１〜１００μｍｏｌ／ｋｇ体重／日の間で投与される、
ことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
硝酸塩がポリフェノールと共に投与される、
ことを特徴とする請求項２１から請求項２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳類が、ヒト、ウマ、又はイヌの中から選択される、
ことを特徴とする請求項２１から請求項２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳類がヒトである、
ことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スポーツドリンク、エネルギードリンク、エネルギーバーなどの運動能力向上栄養食品及び栄養補助食品、液体及び固体食料品の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在では、いわゆるスポーツドリンクを摂取することにより運動能力の向上が得られると考えられている。通常、これらは非炭酸であるとともに果糖又はその他の糖分及び複合糖質を含むことが多く、これらの糖質が容易に身体に吸収され、エネルギーの利用性を促進し、及び／又は軽度の脱水症状を予防又は治療するように設計されている。スポーツドリンクはまた、電解質（主にナトリウム及びカリウム塩）及び栄養素（タンパク質およびアミノ酸）も含む。スポーツドリンク、エネルギードリンク、及びその他の液体、半固体及び固体製品は運動選手向けに販売されているが、運動選手以外にも追加のエネルギー及び持久力が求められる場合にスナックとして消費される。
【０００３】
時に、スポーツドリンクとエネルギードリンクとは区別されることがあり、前者はより等張性のものとされる傾向があり、後者は糖分をより多く含み、カフェインを含むこともある。本明細書ではこのような区別は意図しておらず、以下でさらに詳細に説明するように、「運動能力向上食品及び栄養補助食品」という用語は、スポーツドリンク及びエネルギードリンク以外にも、エネルギーバー、錠剤などのその他の液体、半固体、又は固体を含む。
【０００４】
しかしながら、運動への生理的適応には、心臓血管及び代謝の大きな変化が伴う。活動筋では酸素消費量が劇的に増加し、これと平行に筋血流量も増加する。これらの過程では内因性のガスである一酸化窒素（ＮＯ）が重要な調節の役割を果たす。ＮＯは、筋肉への血流を増加させ、筋収縮及びグルコースの取り込みを調節する（ＳＴＡＭＬＥＲ，Ｊ  Ｓらの「骨格筋における一酸化窒素の生理学」Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．２００１年第８１巻第１号２０９−３７頁参照）。
【０００５】
さらに、ＮＯはミトコンドリア呼吸鎖の酵素との相互作用を通じて細胞呼吸の制御にも関与する（ＭＯＮＣＡＤＡ，Ｓらの「一酸化窒素はミトコンドリアのエネルギー生成及びアポトーシスを調節するか？」Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００２年第３巻第３号２１４−２０頁参照）。
【０００６】
１９９０年代に発表されたインビトロ研究では、ＮＯが、チトクロムｃオキシダーゼを可逆的に阻害することにより、ミトコンドリア呼吸の調節因子となることが示されている（ＣＡＲＲ，Ｇ  Ｊらの「亜硝酸還元酵素であるパラコッカスデニトリフィカンによって形成される一酸化窒素は、チトクロムオキシダーゼ活性を阻害するほど十分に安定したものであるとともに好気状態下で還元酵素により還元される」Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９０年５月１５日第１０１７巻第１号５７〜６２頁；ＢＯＬＡＮＯＳ，Ｊ  Ｐらの「培養星状細胞におけるミトコンドリア呼吸鎖の一酸化窒素仲介による阻害」Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ１９９４年第６３巻第２号９１０〜６頁；ＢＲＯＷＮ，Ｇ  Ｃらの「チトクロムオキシダーゼにおいて酸素と競合することによりシナプトソーム呼吸を可逆的に阻害する一酸化窒素のナノモル濃度」ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９４年１２月１９日第３５６巻第２〜３号２９５〜８頁；ＣＬＥＥＴＥＲ，Ｍ  Ｗらの「ミトコンドリア呼吸鎖の末梢酵素であるチトクロムＣオキシダーゼの一酸化窒素による可逆的阻害  神経変性疾患の暗示」ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９４年５月２３日第３４５巻第１号５０〜４頁；及びＳＣＨＷＥＩＺＥＲ，Ｍらの「一酸化窒素が低酸素圧でミトコンドリアを強力かつ可逆的に除勢する」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ．１９９４年第２０４号１６９〜７５頁参照）。
【０００７】
ＮＯはまた、ミトコンドリア呼吸鎖の他の部位及びクレブス回路においても相互作用することができる（上述のＭｏｎｃａｄａの論文参照）。細胞培養においては、ＮＯのこの重要な作用は極めて良好に特徴付けられるが、インビボでのその生理的関連性及び運動中の細胞呼吸に対するＮＯの影響についてはあまり知られていない。Ｓｈｅｎ及びその同僚らは、最大下運動中の犬にＮＯＳ阻害剤をインビボ投与すると酸素消費量が増加することを示し（ＳＨＥＮ，Ｗらの「覚醒中のイヌの酸素消費量の調節におけるＮＯの役割」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．１９９９年第８４号８４０〜５頁参照）、ラセルダ及びその同僚らはラットにおいて同様の結果を示した（ＬＡＣＥＲＤＡ，Ａ  Ｃ  Ｒらの「脳内一酸化窒素阻害が運動の代謝コストを増加させ、ラットの走る能力を低下させる証拠」Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００６年第３９３号２６０〜３頁参照）。研究の大部分はＮＯＳ阻害剤を使用して行われてきたが、外因性ＮＯの投与が運動に及ぼす影響についてはほとんど知られていない。また、健康なヒトにおける研究は少ない。
【０００８】
ＮＯの生成を行う古典的な手段にＬ−アルギニン経路があり、この場合、ＮＯはＮＯ合成酵素という特殊な酵素により合成される。ＮＯを生成する全く異なる別の方法がつい最近示された（ＬＵＮＤＢＥＲＧ，Ｊ  Ｏらの「ヒトにおける胃内一酸化窒素生成：排気内測定」Ｇｕｔ．１９９４年第３５巻第１１号１５４３〜６頁；ＢＥＮＪＡＭＩＮ，Ｎらの「胃内ＮＯ合成」Ｎａｔｕｒｅ．１９９４年４月７日第３６８巻第６４７１号５０２頁；ＺＷＥＩＥＲ，Ｊ  Ｌらの「生物組織における一酸化窒素の酵素非依存的形成」Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９５年第１巻第８号８０４〜９頁；及びＷＥＩＴＺＢＥＲＧ，Ｅらの「ヒトにおける非酵素的一酸化窒素生成」ＮＯ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８年第２号１〜７頁参照）。このＮＯＳ非依存性の経路では、無機陰イオンである硝酸塩（ＮＯ3-）及び亜硝酸塩（ＮＯ2-）がインビボで還元されてＮＯを形成する。（主に緑色葉野菜に含まれる）食事中の硝酸塩（ＭＣＫＮＩＧＨＴ，Ｇ  Ｍの「ヒトの胃内における食事中の硝酸塩からの一酸化窒素の化学的合成」Ｇｕｔ．１９９７年第４０号２１１〜２１４頁；及びＷｅｉｔｚｂｅｒｇの１９９８年の上述論文参照）は、唾液腺による循環から吸収され、唾液中に分泌され、一部は硝酸還元細菌によって口腔内で亜硝酸塩に変換される。飲み込んだ亜硝酸塩はその後体循環に入ることができる。実際、最近の研究で、硝酸塩を摂取すると循環亜硝酸塩量が持続的に増加することが示されている（ＬＵＮＤＢＥＲＧ，Ｊ  Ｏらの「無機硝酸塩は、一酸化窒素を全身に発生させる有力源である」Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ  Ｂｉｏ  Ｍｅｄ．２００４年第３７巻第３号３９５〜４００頁参照）。酸性又は還元環境において、硝酸塩の生物活性ＮＯへのさらなる還元は自然発生的に行われ得る（Ｂｅｎｊａｍｉｎら、１９９４年、上述論文、Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９４年、上述論文）が、同様に様々なタンパク質及び酵素によっても大いに促進され、これらは血中デオキシヘモグロビン（ＣＯＳＢＹ，Ｋらの「デオキシヘモグロビンにより亜硝酸塩が一酸化窒素に還元されるとヒト循環系を血管拡張させる」Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００３年第９巻第１２号１４９８〜５０５頁）、デオキシミオグロビン（ＳＨＩＶＡ，Ｓらの「デオキシヘモグロビンは、一酸化窒素を生成し、ミトコンドリア呼吸を調節する亜硝酸還元酵素である」Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００７年２月９日）、キサンチン酸化酵素（ＭＩＬＬＡＲ，Ｔ  Ｍらの「キサンチン酸化還元酵素は低酸素状態下で硝酸塩及び亜硝酸塩の一酸化窒素への還元に触媒作用を及ぼす」ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、１９９８年５月８日第４２７巻第２号２２５〜８頁）を含み、場合によってはミトコンドリア呼吸鎖の酵素によっても促進される（ＬＵＮＤＢＥＲＧ，Ｊ  Ｏらの「硝酸塩、細菌及びヒトの健康」Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４年第２巻第７号５９３〜６０２頁；ＬＵＮＤＢＥＲＧ，Ｊ  Ｏらの「亜硝酸塩からのＮＯ生成及びその血管制御における役割」Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ．２００５年第２５巻第５号９１５〜２２頁；及びＧＬＡＤＷＩＮ，Ｍ  Ｔらの「亜硝酸陰イオンの新興生物学」Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００５年第１巻第６号３０８〜１��頁）。特に酸素利用性が低く、ＮＯ合成酵素が十分に機能しない虚血及びアシドーシス中に、ＮＯＳ非依存性のＮＯ生成が内因性ＮＯ生成を補足するように思われる（Ｚｗｅｉｅｒら、１９９５年、上述論文；Ｗｅｉｔｚｂｅｒｇら、１９９８年、上述論文；ＤＵＲＡＮＳＫＩ，Ｍ  Ｒらの「心臓及び肝臓のインビボ虚血−再灌流中における亜硝酸塩の細胞保護作用」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００５年第１１５巻第５号１２３２〜４０頁；Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、２００４年、上述論文）。運動中にも組織アシドーシス及び相対低酸素が存在し、この代謝状態において亜硝酸塩の生物活性化が促進されると考えられる。
【０００９】
健常被験者及び特に作業及び運動中の運動選手におけるＮＯの役割に関する入手可能な情報は十分でないとともに矛盾するものでもある。興味深いことに、現在入手可能な栄養補助食品の運動選手及びボディービルダーに対するマーケティングは、ＮＯの血管拡張作用に触れている。１つの例に「ＮＯＸ２」（Ｂｏｄｙｏｎｉｃｓ社、米国）があり、この製品はαケトグルタル酸アルギニン（Ａ−ＡＫＧ）及びケトイソカプロン酸アルギニン（Ａ−ＫＩＣ）を含むと謳っており、短期一酸化窒素量を上昇させることができるということである。他の製品は、ＮＯＳ酵素によってＮＯを合成する元となるＬ−アルギニンを含み、ＮＯの有益な効果を謳っていることが多いが、さらに詳細な説明は提供していない。
【００１０】
異なる体力レベルの被験者から得たピーク作業量時の血漿及び尿中の硝酸塩レベルと、安静時の血漿及び尿中の硝酸塩レベルとの間の関係が研究されてきた（Ｊｕｎｇｅｒｓｔｅｎらの「体力及び急な運動の両方が健常者における一酸化窒素形成を調整する」Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ第８２巻７６０〜７６４頁、１９９７年）。体力と安静時の一酸化窒素の生成との間の建設的な関係が判明し、この建設的な関係が、運動が心臓血管の健康に及ぼす有益な影響についての説明に役立つのではないかという仮説が立てられた。Ｊｕｎｇｅｒｓｔｅｎｓの研究では、硝酸塩は専らＮＯ生成のマーカとして使用され、著者らは、硝酸塩はＮＯの安定した不活性な最終生成物であり生物学的に不活性であると何度も述べている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ＳＴＡＭＬＥＲ，Ｊ  Ｓらの「骨格筋における一酸化窒素の生理学」Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．２００１年第８１巻第１号２０９−３７頁
【非特許文献２】ＭＯＮＣＡＤＡ，Ｓらの「一酸化窒素はミトコンドリアのエネルギー生成及びアポトーシスを調節するか？」Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００２年第３巻第３号２１４−２０頁
【非特許文献３】ＣＡＲＲ，Ｇ  Ｊらの「亜硝酸還元酵素であるパラコッカスデニトリフィカンによって形成される一酸化窒素は、チトクロムオキシダーゼ活性を阻害するほど十分に安定したものであるとともに好気状態下で還元酵素により還元される」Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９０年５月１５日第１０１７巻第１号５７〜６２頁
【非特許文献４】ＢＯＬＡＮＯＳ，Ｊ  Ｐらの「培養星状細胞におけるミトコンドリア呼吸鎖の一酸化窒素仲介による阻害」Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ１９９４年第６３巻第２号９１０〜６頁
【非特許文献５】ＢＲＯＷＮ，Ｇ  Ｃらの「チトクロムオキシダーゼにおいて酸素と競合することによりシナプトソーム呼吸を可逆的に阻害する一酸化窒素のナノモル濃度」ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９４年１２月１９日第３５６巻第２〜３号２９５〜８頁
【非特許文献６】ＣＬＥＥＴＥＲ，Ｍ  Ｗらの「ミトコンドリア呼吸鎖の末梢酵素であるチトクロムＣオキシダーゼの一酸化窒素による可逆的阻害  神経変性疾患の暗示」ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９４年５月２３日第３４５巻第１号５０〜４頁
【非特許文献７】ＣＨＷＥＩＺＥＲ，Ｍらの「一酸化窒素が低酸素圧でミトコンドリアを強力かつ可逆的に除勢する」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ．１９９４年第２０４号１６９〜７５頁
【非特許文献８】ＳＨＥＮ，Ｗらの「覚醒中のイヌの酸素消費量の調節におけるＮＯの役割」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．１９９９年第８４号８４０〜５頁
【非特許文献９】ＬＡＣＥＲＤＡ，Ａ  Ｃ  Ｒらの「脳内一酸化窒素阻害が運動の代謝コストを増加させ、ラットの走る能力を低下させる証拠」Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００６年第３９３号２６０〜３頁
【非特許文献１０】ＬＵＮＤＢＥＲＧ，Ｊ  Ｏらの「ヒトにおける胃内一酸化窒素生成：排気内測定」Ｇｕｔ．１９９４年第３５巻第１１号１５４３〜６頁
【非特許文献１１】ＢＥＮＪＡＭＩＮ，Ｎらの「胃内ＮＯ合成」Ｎａｔｕｒｅ．１９９４年４月７日第３６８巻第６４７１号５０２頁
【非特許文献１２】ＺＷＥＩＥＲ，Ｊ  Ｌらの「生物組織における一酸化窒素の酵素非依存的形成」Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９５年第１巻第８号８０４〜９頁
【非特許文献１３】ＷＥＩＴＺＢＥＲＧ，Ｅらの「ヒトにおける非酵素的一酸化窒素生成」ＮＯ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８年第２号１〜７頁
【非特許文献１４】ＭＣＫＮＩＧＨＴ，Ｇ  Ｍの「ヒトの胃内における食事中の硝酸塩からの一酸化窒素の化学的合成」Ｇｕｔ．１９９７年第４０号２１１〜２１４頁
【非特許文献１５】ＬＵＮＤＢＥＲＧ，Ｊ  Ｏらの「無機硝酸塩は、一酸化窒素を全身に発生させる有力源である」Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ  Ｂｉｏ  Ｍｅｄ．２００４年第３７巻第３号３９５〜４００頁
【非特許文献１６】ＣＯＳＢＹ，Ｋらの「デオキシヘモグロビンにより亜硝酸塩が一酸化窒素に還元されるとヒト循環系を血管拡張させる」Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００３年第９巻第１２号１４９８〜５０５頁
【非特許文献１７】ＳＨＩＶＡ，Ｓらの「デオキシヘモグロビンは、一酸化窒素を生成し、ミトコンドリア呼吸を調節する亜硝酸還元酵素である」Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００７年２月９日
【非特許文献１８】ＭＩＬＬＡＲ，Ｔ  Ｍらの「キサンチン酸化還元酵素は低酸素状態下で硝酸塩及び亜硝酸塩の一酸化窒素への還元に触媒作用を及ぼす」ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、１９９８年５月８日第４２７巻第２号２２５〜８頁
【非特許文献１９】ＬＵＮＤＢＥＲＧ，Ｊ  Ｏらの「硝酸塩、細菌及びヒトの健康」Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４年第２巻第７号５９３〜６０２頁
【非特許文献２０】ＬＵＮＤＢＥＲＧ，Ｊ  Ｏらの「亜硝酸塩からのＮＯ生成及びその血管制御における役割」Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ．２００５年第２５巻第５号９１５〜２２頁
【非特許文献２１】ＧＬＡＤＷＩＮ，Ｍ  Ｔらの「亜硝酸陰イオンの新興生物学」Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００５年第１巻第６号３０８〜１４頁
【非特許文献２２】ＤＵＲＡＮＳＫＩ，Ｍ  Ｒらの「心臓及び肝臓のインビボ虚血−再灌流中における亜硝酸塩の細胞保護作用」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００５年第１１５巻第５号１２３２〜４０頁
【非特許文献２３】Ｊｕｎｇｅｒｓｔｅｎらの「体力及び急な運動の両方が健常者における一酸化窒素形成を調整する」Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ第８２巻７６０〜７６４頁、１９９７年
【非特許文献２４】Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ＆  Ｇｏｖｏｎｉ、２００４年、ＬＡＲＳＥＮ，Ｆ  Ｊら「健常ボランティアの血圧に対する食事中の硝酸塩の作用」Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００６年第２５５巻第２６号２７９２〜３頁
【非特許文献２５】ＢＲＹＡＮ，ＮＳ，ら「亜硝酸塩はシグナル伝達分子であるとともに哺乳類組織における遺伝子発現の調整剤である」Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００６年第１巻第５号２９０〜７頁
【非特許文献２６】ＳＨＥＮ，Ｗら「一酸化窒素  酸素消費量の調節における血管内皮細胞と実質細胞との間の重要なシグナル伝達メカニズム」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９５年１２月１５日第９２巻第１２号３５０５〜１２頁
【非特許文献２７】ＩＳＨＩＢＡＳＨＩ，Ｙら「運動中の冠動脈拡張はＡＴＰ感受性Ｋ＋チャネル、アデノシン及びＮＯ介在機構が主な原因である」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．１９９８年第８２号３４６〜３５９頁
【非特許文献２８】ＢＯＨＵＳＬＡＶＳＫＹＩ，Ａ，ら「疲労時に動作する骨格筋によって酸素消費効率に及ぼされる一酸化窒素の影響」Ｆｉｚｉｏｌ  Ｚｈ．２００５年第５１巻第１号３３〜４２頁
【非特許文献２９】ＮＡＶＥＴ，Ｒ，ら「ラット骨格筋ミトコンドリアにおいてインビトロ酸素欠乏／再酸素化中に生成される活性酸素種により誘発されるプロトン漏出」Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２００６年第３８巻第１号２３〜３２頁
【非特許文献３０】ＷＡＮＧ，Ｇ，ら「一酸化窒素供与体がミトコンドリア透過性遷移の調整を通じてマウス心筋を梗塞から守る」Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００５年第２８８巻第３号１２９０〜５頁
【非特許文献３１】ＲＥＣＣＨＩＡ，Ｆ  Ａ，ら「一酸化窒素が覚醒中のイヌの心臓基質の利用を制御する」Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．１９９９年第４４号３２５〜３２頁
【非特許文献３２】ＬＯＫＥ，Ｋ  Ｅ，ら「一酸化窒素がヒト心不全時にミトコンドリア呼吸を調整する」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９９年９月２１日第１００巻第１２号１２９１〜７頁
【非特許文献３３】ＮＵＮＥＺ，Ｃ，ら「ミトコンドリア酸素消費量、血管作用、及びＮＯの放出におけるニトログリセリンとＮＯ放出薬物との間の相違」Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００５年１１月１１日第９７巻第１０号１０６３〜９頁
【非特許文献３４】ＤＥ  ＢＡＣＫＥＲ，Ｄ，ら「健常ボランティアにおける酸素消費量と酸素送達量との関係に及ぼすドブタミンの作用：ニトロプルシドナトリウムとの比較」Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｌｏｎｄ）．１９９６年第９０巻第２号１０５〜１１頁
【非特許文献３５】ＫＯＺＬＯＶ，Ａ  Ｖら「亜硝酸塩還元酵素活性は、哺乳類ミトコンドリアの新たな機能である」ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９９年７月２日第４５４巻第１〜２号１２７〜３０頁
【非特許文献３６】ＭＯＤＩＮ，Ａら「亜硝酸由来一酸化窒素：「酸性代謝性」血管拡張の介在物質候補」Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ．２００１年第１７１巻第１号９〜１６頁
【非特許文献３７】ＣＯＳＢＹ，Ｋ，ら「デオキシヘモグロビンによる亜硝酸塩の一酸化窒素への還元がヒトの血液循環を血管拡張する」Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００３年第９巻第１２号１４９８〜５０５頁
【非特許文献３８】ＣＯＹＬＥ，Ｅ  Ｆら「サイクリング効率はＩ型筋線維の割合に関連する」Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．１９９２年第２４巻第７号７８２〜８頁
【非特許文献３９】ＭＯＧＥＮＳＥＮ，Ｍら「ヒトのサイクリング効率は低ＵＣＰ３含有量及びＩ型筋線維に関連するが、ミトコンドリア効率には関連しない」Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００６年第５７１巻第３号６６９〜６８１頁
【非特許文献４０】ＷＩＬＬＩＡＭＳ，Ｋ  Ｒ．「力学的エネルギー推定と生理的エネルギー推定との関係」Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．１９８５年第１７号３１７〜２５頁
【非特許文献４１】ＭＡＲＣＨＥＡＬ，Ｇら「骨格筋収縮に及ぼす一酸化窒素の影響」Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．１９９９年第５５号１０８８〜１１０２頁
【非特許文献４２】ＢＯＲＧ，Ｇ．「身体ストレスの指標としての主観的運動」Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｅｈａｂｉｌ  Ｍｅｄ．１９７０年第２巻第２号９２〜８頁
【非特許文献４３】ＡＳＴＲＡＮＤ，Ｐ  Ｏら、「作業生理機能のテキスト」ニューヨークＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９７０年６１９頁
【非特許文献４４】ＢＲＯＵＷＥＲ，Ｅ．「ガス交換（酸素摂取及び炭酸排出）及び尿−Ｎから熱消費量及びヒト及び動物の代謝で酸化された炭水化物及び脂肪の量を計算するための単純な公式について」Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｎｅｅｒｌ．１９５７年第６号７９５〜８０２頁
【非特許文献４５】ＧＡＥＳＳＥＲ，ＧＡら「定常運動中の筋効率：速度及び作業量の影響」Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９７５年第３８号１１３２〜１１３９頁
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、硝酸塩の食事投与が全身の亜硝酸塩の貯蔵プールを増大させるかどうか、及びこの食事計画が運動中に様々な生理学的及び生化学的パラメータに影響を与えるかどうかについて検証を試みた。
【００１３】
驚くべきことに、本発明者らは、毒性の無い量の硝酸塩及び／又は亜硝酸塩を哺乳類に投与することにより、運動中の酸素摂取量（ＶＯ2）の減少を示す前記哺乳類の運動能力が向上することを発見した。この知見に基づき、本発明者らは、引用により本明細書に組み入れられる特許請求の範囲で定義されるような使用、組成物、及び方法を提供する。
【００１４】
添付図面を参照しながら、以下の説明、実施例、限定的でない特許請求の範囲において本発明についてさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】硝酸塩とポリフェノールとの組み合わせが相乗的に作用して、一酸化窒素の生体利用性を高めると同時に、酸素ラジカル及びニトロソアミンなどの有害な化合物の形成を減少させる数多くの方法を示すグラフである。詳細な説明は本文を参照されたい。
【図２】９人の健常男性ボランティアにおける硝酸ナトリウム又は塩化ナトリウム（プラセボ）を含む食事補給の、安静時及び運動直後に測定した亜硝酸塩の血漿濃度に対する効果を示す図である。
【図３】硝酸ナトリウム（０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、ＮＩＴ）又は等量の塩化ナトリウム（ＣＯＮ）を３日間食事補給した後に６つの異なる作業量で測定した酸素消費量（ＶＯ2）及び心拍数（ＨＲ）を示す図である。この調査は、試験間の休薬期間が少なくとも１０日の無作為化二重盲検クロスオーバー法で行った。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【図４】９人の健常男性ボランティアにおけるＶＯ2peakが８０％での酸素消費量を示す図である。測定は、硝酸塩（０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ／日）又は等量の塩化ナトリウム（プラセボ）を３日間食事補給した後に行った。硝酸塩期間とプラセボ期間との差は顕著であった（ｐ＜０．０１）。
【図５】硝酸ナトリウム（０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ／日を３日間、塗りつぶした棒）又は等量の塩化ナトリウム（プラセボ、白い棒）を食事補給した後に６つの異なる作業量で測定した血漿乳酸塩濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明について説明する前に、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びその同等物によってのみ限定されるものであるため、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的でのみ使用され、本発明を限定することを意図したものではないことを理解されたい。
【００１７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、「１つの（英文不定冠詞）」及び「その（英文定冠詞）」という単数形は、文脈において単数であることをはっきりと示していない限り複数形の意味をも含むことに留意されたい。
【００１８】
「約」という用語は、適用可能な場合、所定の値の±２％、好ましくは数値の±５％、最も好ましくは＋／−１０％の偏差を示すのに使用される。
【００１９】
本文脈における「食用の」という用語は、毒性が無い及び摂取可能であることを意味するが、飲んだり、噛んだり、例えばスプレーやエアロゾルなどの様々な形で口腔に入れたりなどの特定の摂取方式に限定されるものではない。
【００２０】
「機能性食品」という用語は、栄養素の補給という基本的な栄養機能を超える健康促進特性及び／又は疾患予防特性を有すると主張されるあらゆる生鮮食品又は加工食品に関する。機能性食品は栄養補給食品と呼ばれることもある。この一般的なカテゴリーには、機能性食品の原料で作られた、或いは「ビタミン強化」製品のような健康促進添加物で栄養強化された加工食品が含まれ、また特定の宣伝文句が添えられた（野菜などの）生鮮食品も含まれる。また、生きた培養菌を含む発酵食品もプロバイオテックな利点を有する機能性食品とみなされることが多い。
【００２１】
本発明者らは、無機硝酸塩を食事補給した結果、運動中のＶＯ2が減少し、筋効率が著しく増大することを示した。これらの効果は、血漿乳酸塩を増加させることなく生じた。
【００２２】
これらの知見に基づき、本発明者らは、哺乳類が摂取した場合、運動中の酸素摂取量（ＶＯ2）の減少を示す運動能力を向上させることができる、無機硝酸塩及び／又は亜硝酸塩を含む組成物、好ましくは食用組成物を提供し、詳細には、運動中の酸素摂取量（ＶＯ2）の減少及び筋効率の著しい増大の形で運動能力の向上が示されるような組成物を提供する。
【００２３】
１つの実施形態によれば、硝酸塩及び亜硝酸塩が、約５：１〜約１００：１（硝酸塩：亜硝酸塩）の間の用量比で、例えば５：１ 、１０：１ 、３０：１ 、５０：１ 、７０：１及び１００：１で与えられる。用量比は約１０：１であることが好ましい。
【００２４】
特定の実施形態によれば、前記組成物は亜硝酸塩を単独で含み、硝酸塩を含まない。
【００２５】
別の実施形態によれば、前記組成物は、硝酸塩及び／又は亜硝酸塩に加えアルギニンも含む。
【００２６】
本発明の別の実施形態によれば、以下で説明するように、硝酸塩及び／又は亜硝酸塩を含む組成物、又は硝酸塩／亜硝酸塩に富む加工物とポリフェノールに富む加工物とのブレンドを含む組成物に非病原性細菌が加えられる。この目的は、ＮＯ、ニトロソ付加物又は化学的に関連する化合物などの生物活性化合物の生成をさらに強化することにある。この強化は、硝酸塩及び亜硝酸塩のＮＯ及びその他の生物活性酸化窒素への細菌依存した還元を通じて、ＧＩ（胃腸）管においても局所的に行われる。また、形成された化合物は全身的に吸収され、例えば、血圧を低下させる上で、及びアテローム性動脈硬化症、癌、又は上述のようなＮＯ放出の促進に関するあらゆる他の作用を予防する上で持続的な生物学的効果を有することができる。細菌を加えた組成物は、ジュースなどの飲料、ヨーグルト、牛乳ベースの飲料又は他のあらゆる発酵食品の形をとることができる。この細菌を加えた組成物を異なる種類の機能性食品に含めることもできる。適当な細菌はいわゆるプロバイオテック細菌であり、以下に限定されるわけではないが、（例えばアシドフィルス菌、デルブリュッキ菌、ヘルベティカス菌、サリバリウス菌、カゼイ菌、カルバタス菌、プランタラム菌、サケイ菌、ブレビス菌、ブフネリ菌、ファーメンタム菌、ロイテリ菌などの）ラクトバチルス属と、例えば以下に限定されるわけではないが、ブレベ菌、ビフィダム菌及びラクティス菌などのビフィドバクテリウム属と、サッカロマイセスボウラディなどのプロバイオテック酵母菌とを含む。適当な非病原性細菌には、例えば以下に限定されるわけではないが、ブドウ球菌属、放線菌属及びロチア属が含まれる。また、これらの微生物を「乾燥型」の、例えば錠剤、カプセル、バーなどに含めることもできる。
【００２７】
本発明の１つの実施形態によれば、無機硝酸塩及び亜硝酸塩の供給源は、硝酸塩又は亜硝酸塩を含む植物、野菜、又は果物の濃縮物又は抽出物、或いは無機硝酸塩の塩の中から選択される。硝酸塩及び亜硝酸塩の塩の例として、以下に限定されるわけではないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛、アルギニン及びアンモニウムが挙げられる。ナトリウム塩及びカリウム塩が現在のところ最も好ましい。亜硝酸塩及び硝酸塩の塩は、合成起源のものであってもよいが、自然源から単離することもできる。硝酸塩が豊富な野菜の例として、緑色葉野菜、ホウレンソウ、ビートルート、フェンネル、レタス、キャベツ、白菜などが挙げられる。このような野菜のジュース、ペースト、濃縮物等は硝酸塩の適当な供給源であることが企図される。１つの実施形態によれば、本発明の組成物中の硝酸塩はビートルートに由来する。
【００２８】
多くの野菜及び果物はポリフェノールに富む。ポリフェノールは、植物に見られる化学物質の群であり、１分子あたり２以上のフェノール基が存在することを特徴とする。ポリフェノールは、一般に、グルコース及びその他の糖質の没食子酸エステルである加水分解型タンニンと、リグニン、フラボノイド及び縮合型タンニンなどのフェニルプロパノイドとにさらに再分割される。このようにして、本発明の１つの実施形態では、硝酸塩及び／又は亜硝酸塩含有組成物が、高レベルのポリフェノールを含む化合物と混合される。硝酸塩含有組成物：高ポリフェノール化合物の比率は、硝酸塩が十分に供給されるように選択すべきである。従って、硝酸塩及び／又は亜硝酸塩含有組成物を、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、さらに好ましくは少なくとも約４０％及び最も好ましくは少なくとも約５０％又はさらにそれ以上にすべきである。この組み合わせ製品が、ＮＯの生体利用性の相乗作用を通じて健康促進効果を得るようになることが企図される。ポリフェノールは、図１で強調しているいくつかの別個のメカニズムによりＮＯの生成を促進する。第１に、このような物質は、ＮＯシンターゼ酵素（図１の１）から内生的ＮＯ形成に直接刺激を与えることができる。第２に、フェノール環に還元ＯＨ基が存在するため（図１の２）、これらの化合物が亜硝酸塩の生物活性ＮＯへの還元を促進することが企図される。第３に、超酸化物のようなフリーラジカルのスカベンジャーとして機能することにより、これらのラジカルがＮＯと相互作用（及び破壊）しないようにすることによって、ＮＯをさらに長寿命にする（図１の３）。これに加えて、亜硝酸塩又はその反応生成物がポリフェノール自体と相互作用し、ニトロ化又はニトロソ化反応を通じてポリフェノールを化学的に修飾することができる（図１の４ａ）。結果として得られる化合物は、長寿命ＮＯ供与体（図１の４ｂ）として機能することができる。追加の効果として、ポリフェノールの存在により、発癌性の疑いがあるニトロソアミンが形成されないように化学反応が変化する（図１の５）。硝酸塩反応生成物である亜硝酸塩は、アミンと反応してニトロソアミンを形成することができるが、ポリフェノールは、二重のメカニズムによってこの反応を阻害する。第１に、ポリフェノールは、ＨＮＯ2を急速に直接ＮＯに還元することにより、ニトロソ化種（Ｎ2Ｏ3、ＨＮＯ2）の形成を最低限に抑えるのに役立つ。第２に、ポリフェノールは、自身がニトロソ化されることにより、アミンのニトロソ化と直接争うことができる。
【００２９】
ポリフェノールが豊富な果物又は果物ジュースの例として、以下に限定されるわけではないが、リンゴ、ナシ、ブドウ、レモン、オレンジ、ライム、モモ、ザクロ、グレープフルーツ、キウィ、ショウガ及びパイナップルが挙げられる。また、以下に限定されるわけではないが、ブラックベリー、ブラックラズベリー、ブルーベリー、クランベリー、レッドラズベリー、チェリー、クロマメノキ、コケモモ、ブラックエルダーベリー、ブラックチョコベリー、ブラックカラント、ブルーベリー、クラウドベリー及びストロベリーを含むベリー類及びベリー類から得たジュースも使用可能である。その他のポリフェノールの自然源としては、以下に限定されるわけではないが、ニンジン、チリ、ルバーブ、タマネギなどの野菜が挙げられる。また、カカオ製品（フラボノールが豊富）、グリーン又はブラックティー、ナッツ、イエルバマテ及びコーヒーは全てポリフェノールが豊富である。硝酸塩と上述したような高ポリフェノール製品との組み合わせが相乗的に作用して、ニトロソアミンのような有害化合物を犠牲にして体内におけるＮＯ形成を促進することが企図される。この作用の有益な効果として、血圧の低下が挙げられる。１つの好ましい実施形態では、本発明の組成物における硝酸塩は、１又はいくつかのポリフェノールに富む化合物又は製品とブレンドしたビートルート（例えばビートルートジュース）に由来する。ビートルートジュース：高ポリフェノール化合物の比率は、硝酸塩が十分に供給されるように選択すべきであり、従って、ビートルートジュース側を、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、さらに好ましくは少なくとも約４０％及び最も好ましくは少なくとも約５０％にすべきである。
【００３０】
別の実施形態では、本発明の組成物に低濃度エタノールを加える。驚くべきことに、極めて低濃度のエタノールでも、生理量の亜硝酸塩と反応させることにより強力な血管拡張性エチル亜硝酸塩を生成できることが判明している。この反応は、胃管腔内のような酸性の状態で促進される。硝酸塩の摂取により唾液中に亜硝酸塩が蓄積し、亜硝酸塩が胃内のエタノールと反応することによりエチル亜硝酸塩を形成することが企図される。例えば、本発明の組成物が液体の形である場合、エタノール含有量を、約５％（ｖ／ｖ）未満、さらに好ましくは約２％（ｖ／ｖ）未満、最も好ましくは約０．５〜１％（ｖ／ｖ）の間にすべきである。
【００３１】
本発明のさらに別の実施形態では、硝酸塩又は亜硝酸塩の塩（例えば硝酸カリウム又は硝酸アンモニウム）及び乾燥粉末野菜を含む天然の硝酸源が、例えばソルティーリコリス（塩化アンモニウム）などのリコリスキャンデーの形でリコリスと組み合わせられる。この組み合わせにポリフェノールを加えることも好ましい。リコリスは血圧を上昇させる効果があることがよく知られており、硝酸塩／亜硝酸塩を単独で又はポリフェノールと組み合わせて加えることにより、これらの化合物のＮＯ媒介による血圧を低下させる効果を通じてリコリスの上記効果を相殺することが企図される。特に、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、又は硝酸アンモニウムなどの塩を、リコリス製品に含有される（塩化ナトリウム又は塩化アンモニウムなどの）塩の一部又は全てと置き換えて使用することができる。
【００３２】
本発明の組成物は、液体、ペースト、バー、ケーキ、粉末、顆粒、発泡錠、チューインガム、錠剤、カプセル、薬用キャンデー、速溶性の錠剤又はウェハース、舌下錠、又はスプレーの形をとることが好ましい。別の組成物として、ニコチンを含まない無煙タバコ及び／又は濡れ嗅ぎタバコがある。このような製品は、飲食料品業界又は製薬業界で実施される従来の方法で製造することができる。
【００３３】
前記組成物は、液体、ペースト、バー、ケーキ、粉末、又は顆粒などの食品の形をとるか、或いはこの一部を構成することがさらに好ましい。
【００３４】
好ましい実施形態によれば、本発明による組成物は、硝酸塩又は亜硝酸塩の還元を促進することができる生細菌に加えて硝酸塩及び／又は亜硝酸塩の供給源を含むヨーグルト又は同様の乳製品又は非乳製品などの発酵食品として調製される。
【００３５】
本発明者らは、この組成物をスポーツドリンク、エネルギードリンク、スポーツバー、又はエネルギーバーの形で市場に出すことを考えている。
【００３６】
エネルギーバーは様々な形をとることができる。便宜上、エネルギー食品は、箱型、四角形、円筒形、糸状、パイ状、球状、三角形、又は包装、輸送、取り扱い及び摂食に適したその他の形状であることが好ましい。
【００３７】
別の実施形態によれば、この組成物は機能性食品として市場に出される。
【００３８】
本発明の組成物を含む製品は、食品、菓子及び飲料業界又は製薬業界の従事者が容易に製造でき、既存の組成物に、硝酸塩、亜硝酸塩及び本明細書で説明するその他の組み合わせを本発明に準じた量で追加することができる。
【００３９】
例えば、本発明によるエネルギーバーは、硝酸塩及び任意に亜硝酸塩に加えて、例えばナッツ、クリスプ、果物片、チョコレート、種子などの様々な他の成分を含むことができる。好ましいナッツは、アーモンド、ピーナッツ、ヘーゼルナッツ、カシュー、クルミ、ペカン、ブラジルナッツなどである。クリスプの成分としては、ライスクリスプ、コーンクリスプ、オーツ、小麦フレークなどが挙げられる。チョコレートは、例えばチョコレートチップス、チャンク、フレークなどの様々な形のあらゆる種類のチョコレート又はチョコレート状食用成分であってもよい。限定的でない種子の例として、ゴマ、ヒマワリ、ケシ、キャラウェイ、フェンネルなどが挙げられる。
【００４０】
本発明の１つの実施形態では、フラバノールに富むダークチョコレートなどのカカオ製品を硝酸塩／亜硝酸塩に富む天然化合物と飲料又はチョコレートバーの形で組み合わせる。この実施形態における硝酸塩に富む１つの好ましい化合物はルバーブである。この場合も、上述するとともに図１に示すようにＮＯ形成を促進することにより、硝酸塩がフラバノールの効果を高めることになる。
【００４１】
また、香料などの従来の食品原料を含めることもできる。例えば、追加材料として、天然及び人工の香料、甘味料、塩、香味増強剤、着色添加物、乳化剤、安定剤、脂肪、保存料などを挙げることができる。
【００４２】
硝酸塩／亜硝酸塩含有食品又は飲料が不要な細菌で汚染されると、硝酸塩還元細菌酵素が原因で亜硝酸塩が大量に蓄積する可能性がある。高レベルの亜硝酸塩の摂取は、重篤なメトヘモグロビン血症を引き起こすことがある。１つの実施形態では、硝酸塩に富む組成物が、不要な細菌の繁殖を阻害する化合物と混合される。このような化合物は、製品の風味に悪影響を及ぼさないように選択すべきである。理想的には、このような化合物は、風味を向上させると同時に製品の生物活性も増加させるべきである。１つの選択肢としては、最終的なｐＨが約５未満、最も好ましくはｐＨ約２〜４の間になるように本発明の組成物を酸性にすることである。これにより、細菌の繁殖が阻害及び／又は根絶される。適当な酸性化剤は、ｐＨを低下させるとともに、人工化合物のほかに、以下に限定されるわけではないが、レモン又はライム、アスコルビン酸、酢酸又は（リンゴ、ブドウ又は他の果物由来の）食酢などから得た天然ジュースを含むあらゆる薬剤であってもよい。天然製品を使用することにより、二重の効果が得られることが企図される。抗菌作用を有することに加え、これらがポリフェノールに富むことにより、野菜飲料中の硝酸塩／亜硝酸塩から生物活性ＮＯの生成が促進される。１つの特定の実施形態では、（ビートルートジュースなどの）硝酸塩に富む野菜ジュースが、細菌の繁殖を阻害する化合物と混合される。
【００４３】
本発明はまた、無機硝酸塩／亜硝酸塩の第２の非医療的使用、即ち、運動能力の向上という効果が運動中のＶＯ2減少の形で示される哺乳類の運動能力を向上させるための組成物を製造するための使用も提供する。
【００４４】
運動能力の向上効果は、運動中のＶＯ2減少及び筋効率の著しい増大の両方の形で示されることが好ましい。
【００４５】
上記使用の１つの実施形態によれば、硝酸塩及び亜硝酸塩は、約５：１〜約１００：１（硝酸塩：亜硝酸塩）の間の用量比で、例えば５：１ 、１０：１ 、３０：１ 、５０：１ 、７０：１及び１００：１で使用される。用量比は約１０：１であることが好ましい。
【００４６】
特定の実施形態によれば、前記無機亜硝酸塩が単独で使用され、硝酸塩を含まない。
【００４７】
本発明の１つの実施形態によれば、無機硝酸塩／亜硝酸塩の供給源は、硝酸塩含有野菜の濃縮物又は抽出物、又は無機硝酸塩又は亜硝酸塩の塩の中から選択される。硝酸塩及び亜硝酸塩の塩の例として、以下に限定されるわけではないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛、アルギニン及びアンモニウムが挙げられる。硝酸が豊富な野菜の例として、緑色葉野菜、ホウレンソウ、ビートルート、フェンネル、レタス、キャベツなどが挙げられる。このような野菜のジュース、ペースト、濃縮物等は硝酸塩の適当な供給源であることが企図される。
【００４８】
また、硝酸塩の塩と亜硝酸塩の塩との組み合わせを使用することもできる。１つの実施形態によれば、硝酸塩及び亜硝酸塩は、約５：１〜約１００：１（硝酸塩：亜硝酸塩）の間の用量比で、例えば５：１ 、１０：１ 、３０：１ 、５０：１ 、７０：１及び１００：１で経口的に与えられる。用量比は約１０：１であることが好ましい。この用量比により、亜硝酸塩が吸収されてからすぐの急性効果が与えられ、その後、亜硝酸塩に生物変換された後の硝酸塩の持続作用が生じるようになる。
【００４９】
さらに別の実施形態によれば、無機亜硝酸塩及び／又は硝酸塩がポリフェノールと共に使用される。ポリフェノールの特徴及び健康促進効果については上述した。無機硝酸塩及び／又は亜硝酸塩組成物：高ポリフェノール化合物の比率は、硝酸塩／亜硝酸塩が十分に供給されるように選択すべきである。従って、亜硝酸塩／硝酸塩含有組成物を、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、さらに好ましくは少なくとも約４０％及び最も好ましくは少なくとも約５０％又はそれ以上にすべきである。
【００５０】
使用できるポリフェノールが豊富な果物又は果物ジュースの例として、限定ではないが、リンゴ、ナシ、ブドウ、レモン、オレンジ、ライム、モモ、ザクロ、グレープフルーツ、キウィ、ショウガ及びパイナップルが挙げられる。また、以下に限定されるわけではないが、ブラックベリー、ブラックラズベリー、ブルーベリー、クランベリー、レッドラズベリー、チェリー、クロマメノキ、コケモモ、ブラックエルダーベリー、ブラックチョコベリー、ブラックカラント、ブルーベリー、クラウドベリー及びストロベリーなどのベリー類及びベリー類から得たジュースも使用可能である。その他のポリフェノールの自然源としては、以下に限定されるわけではないが、ニンジン、チリ、ルバーブ、タマネギなどの野菜が挙げられる。また、カカオ製品（フラボノールが豊富）、グリーン又はブラックティー、ナッツ、イエルバマテ及びコーヒーは全てポリフェノールが豊富である。１つの好ましい実施形態では、（ビートルートジュースなどの）ビートルートが、１又は複数の高ポリフェノール製品と共に無機硝酸塩の供給源として使用される。ビートルートジュース：高ポリフェノール化合物の比率は、硝酸塩が十分に供給されるように選択すべきであり、従って、ビートルートジュース側を、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、さらに好ましくは少なくとも約４０％及び最も好ましくは少なくとも約５０％にすべきである。
【００５１】
本発明の別の実施形態によれば、硝酸塩及び／又は亜硝酸塩、又は無機硝酸塩及び／又は亜硝酸塩とポリフェノールに富む化合物とのブレンドを含む組成物と組み合わせて非病原性細菌が使用される。細菌との組み合わせは、ジュースなどの飲料、ヨーグルト、牛乳ベースの飲料又は他のあらゆる発酵食品の形をとることができる。細菌との組み合わせを異なる種類の機能性食品に含めることもできる。適当な細菌はいわゆるプロバイオテック細菌であり、以下に限定されるわけではないが、（例えばアシドフィルス菌、デルブリュッキ菌、ヘルベティカス菌、サリバリウス菌、カゼイ菌、カルバタス菌、プランタラム菌、サケイ菌、ブレビス菌、ブフネリ菌、ファーメンタム菌、ロイテリ菌などの）ラクトバチルス属と、例えば以下に限定されるわけではないが、ブレベ菌、ビフィダム菌及びラクティス菌などのビフィドバクテリウム属と、サッカロマイセスボウラディなどのプロバイオテック酵母菌とを含む。適当な非病原性細菌には、例えば以下に限定されるわけではないが、ブドウ球菌属、放線菌属及びロチア属が含まれる。また、これらの微生物を「乾燥型」の形で使用することもできる。
【００５２】
硝酸塩含有食品又は飲料が細菌で汚染されると、硝酸塩還元細菌酵素が原因で亜硝酸塩が大量に蓄積する可能性がある。高レベルの亜硝酸塩の摂取は、重篤なメトヘモグロビン血症を引き起こすことがある。１つの実施形態では、硝酸塩に富む組成物が、不要な細菌の繁殖を阻害する化合物と混合される。このような化合物は、製品の風味に悪影響を及ぼさないように選択すべきである。理想的には、このような化合物は、風味を向上させると同時に製品の生物活性も増加させるべきである。１つの選択肢としては、最終的なｐＨが約５未満、最も好ましくはｐＨ約２〜４の間になるようにジュースを酸性にすることである。これにより、細菌の繁殖が阻害及び／又は根絶される。適当な酸性化剤は、ｐＨを低下させるとともに、人工化合物のほかに、以下に限定されるわけではないが、レモン又はライム、アスコルビン酸、酢酸又は（リンゴ、ブドウ又は他の果物由来の）食酢などから得た天然ジュースを含むあらゆる薬剤であってもよい。天然製品を使用することにより、二重の効果が得られることが企図される。抗菌作用を有することに加え、これらがポリフェノールに富むことにより、野菜飲料中の硝酸塩／亜硝酸塩から生物活性ＮＯの生成が促進される。１つの特定の実施形態では、（ビートルートジュースなどの）硝酸塩に富む野菜ジュースが、細菌の繁殖を阻害する化合物とともに使用される。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、無機硝酸塩及び／又は亜硝酸塩とともに低濃度のエタノールが使用される。例えば、本発明の組成物が液体の形である場合、エタノール含有量を、約５％（ｖ／ｖ）未満、さらに好ましくは約２％（ｖ／ｖ）未満、最も好ましくは約０．５〜１％（ｖ／ｖ）の間にすべきである。
【００５４】
本発明のさらに別の実施形態では、硝酸塩及び／又は亜硝酸塩の塩（例えば硝酸カリウム又は硝酸アンモニウム）及び乾燥粉末野菜を含む天然の硝酸源が、例えばソルティーリコリス（塩化アンモニウム）などのリコリスと組み合わせて使用される。この組み合わせにポリフェノールを加えることも好ましい。特に、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、又は硝酸アンモニウムなどの塩を、リコリス製品に含有される（塩化ナトリウム又は塩化アンモニウムなどの）塩の一部又は全てと置き換えて使用することができる。
【００５５】
食品、菓子、製薬業界で実施される従来の方法を使用して、本発明の組成物を、液体、ペースト、バー、ケーキ、粉末、顆粒、発泡錠、錠剤、カプセル、薬用キャンデー、チューインガム、速溶性の錠剤又はウェハース、舌下錠、又はスプレーなどの形に製造することができる。
【００５６】
さらに、この組成物を、液体、ペースト、バー、ケーキ、粉末、又は顆粒などの食品の形に、或いはこの一部として製造することができる。例えば、上述したような発酵食品、機能性食品、又はスポーツドリンクなどであってもよい。
【００５７】
本発明の１つの実施形態では、無機硝酸塩及び／又は亜硝酸塩が、フラバノールに富むダークチョコレートなどのカカオ製品と組み合わせて使用される。この実施形態における硝酸塩に富む１つの好ましい化合物はルバーブである。
【００５８】
さらに別の実施形態によれば、無機硝酸塩及び／又は亜硝酸塩が、細菌の繁殖を阻害する化合物と組み合わせて使用される。１つの選択肢としては、最終的なｐＨが約５未満、最も好ましくはｐＨ約２〜４の間になるようにジュースを酸性にすることである。これにより、細菌の繁殖が阻害及び／又は根絶される。適当な酸性化剤は、ｐＨを低下させるとともに、人工化合物のほかに、以下に限定されるわけではないが、レモン又はライム、アスコルビン酸、酢酸又は（リンゴ、ブドウ又は他の果物由来の）食酢などから得た天然ジュースを含むあらゆる薬剤であってもよい。天然製品を使用することにより、二重の効果が得られることが企図される。１つの特定の実施形態では、（ビートルートジュースなどの）硝酸塩に富む野菜ジュースが、細菌の繁殖を阻害する化合物と組み合わせて使用される。
【００５９】
本発明者らはまた、哺乳類の運動能力を非治療的に向上させる方法も提供し、この方法では無機硝酸及び／又は亜硝酸が前記哺乳類に投与される。前記哺乳類は、ヒト、ウマ、又はイヌから選択されるが、ヒトが好ましい。硝酸塩の用量は、１〜１０００μｍｏｌ／ｋｇ体重／日であることが好ましい。これに対応して、亜硝酸塩の用量は、０．１〜１００μｍｏｌ／ｋｇ体重／日であることが好ましい。
【００６０】
より具体的には、硝酸塩を経口で使用する場合、現在のところ約０．０１〜１００ｍｍｏｌ／ｋｇ／２４ｈの用量が好まれており、約０．０１〜１０ｍｍｏｌ／ｋｇ／２４ｈの用量がより好ましく、０．１〜１ｍｍｏｌ／ｋｇ／２４ｈがさらに好ましい。これに対応して、亜硝酸塩の用量は約０．００１〜１０ｍｍｏｌ／ｋｇ／２４時であり、約０．００１〜１ｍｍｏｌ／ｋｇ／２４時であることが好ましく、約０．０００１〜０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ／２４時であることがさらに好ましい。
【００６１】
本発明の１つの実施形態によれば、硝酸塩及び亜硝酸塩は、約５：１〜約１００：１（硝酸塩：亜硝酸塩）の間の用量比で、例えば５：１ 、１０：１ 、３０：１ 、５０：１ 、７０：１及び１００：１で投与される。用量比は約１０：１であることが好ましい。
【００６２】
特定の１つの実施形態によれば、亜硝酸塩のみが投与される。
【００６３】
本発明の方法のさらに別の実施形態では、無機硝酸塩及び／又は亜硝酸塩がポリフェノールと共に投与される。ポリフェノールの特徴及び健康促進効果については上述した。無機硝酸塩及び／又は亜硝酸塩組成物：高ポリフェノール化合物の比率は、硝酸塩が十分に供給されるように選択すべきである。従って、亜硝酸塩／硝酸塩含有組成物を、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、さらに好ましくは少なくとも約４０％及び最も好ましくは少なくとも約５０％又はそれ以上にすべきである。投与できる高ポリフェノール製品の例については上述した。
【００６４】
本発明の別の実施形態によれば、硝酸塩及び／又は亜硝酸塩、又は無機硝酸塩及び／又は亜硝酸塩とポリフェノールに富む化合物とのブレンドを含む組成物と組み合わせて非病原性細菌が投与される。投与に適した限定的でない細菌の例については上述した。
【００６５】
本発明の方法の別の実施形態では、無機硝酸塩及び／又は亜硝酸塩が低濃度のエタノールと共に投与される。例えば、本発明の無機硝酸塩／亜硝酸塩が液体の形をとる場合、エタノール含有量を、約５％（ｖ／ｖ）未満、さらに好ましくは約２％（ｖ／ｖ）未満、最も好ましくは約０．５〜１％（ｖ／ｖ）の間にすべきである。
【００６６】
本発明のさらに別の実施形態では、硝酸塩又は亜硝酸塩の塩（例えば硝酸カリウム又は硝酸アンモニウム）及び乾燥粉末野菜を含む天然の硝酸源が、例えばソルティーリコリス（塩化アンモニウム）などのリコリスと組み合わせて投与される。この組み合わせにポリフェノールを投与することも好ましい。特に、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、又は硝酸アンモニウムなどの塩を、リコリス製品に含有される（塩化ナトリウム又は塩化アンモニウムなどの）塩の一部又は全てと置き換えて使用することができる。
【００６７】
本発明の１つの実施形態では、無機硝酸塩及び／又は亜硝酸塩が、フラバノールに富むダークチョコレートなどのカカオ製品と組み合わせて投与される。この実施形態における硝酸塩に富む１つの好ましい化合物はルバーブである。
【００６８】
観察される硝酸塩が身体的運動能力に与える効果は、硝酸から亜硝酸への最初の還元に関連するものであると確信するには理由がある。硝酸塩自体は生物学的に不活性であると考えられており、哺乳類細胞はこれを代謝することができない。しかしながら、摂取後に唾液線を介して硝酸塩が再び口に入ると、共生細菌によって効果的に還元されることにより亜硝酸塩が形成される。硝酸塩とは対照的に、亜硝酸イオンは幅広い生物活性を有することが近年示されている。
【００６９】
本発明者らは、硝酸塩治療期間後に血漿亜硝酸塩が増加することに気付き、この結果、前述したように硝酸塩がインビボで還元されることを確認した（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ＆  Ｇｏｖｏｎｉ、２００４年、ＬＡＲＳＥＮ，Ｆ  Ｊら「健常ボランティアの血圧に対する食事中の硝酸塩の作用」Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００６年第２５５巻第２６号２７９２〜３頁）。亜硝酸塩が生物活性であることを支持する別の知見は、血漿硝酸塩のレベルが変化しないのとは対照的に、運動中に亜硝酸塩が効果的に消費されることであった。結局、亜硝酸塩の生物活性は、それがさらにＮＯに還元されること、及び場合によっては他の密接に関連する窒素媒介物に関連があるようである。また、細胞の情報伝達経路に亜硝酸塩自身が直接影響を及ぼす可能性があることが近年示唆されている（ＢＲＹＡＮ，ＮＳ，ら「亜硝酸塩はシグナル伝達分子であるとともに哺乳類組織における遺伝子発現の調整剤である」Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００６年第１巻第５号２９０〜７頁）。可能性は低いが、この初期段階では、硝酸イオン自体の作用を除外することはできない。酸化窒素の生物学的作用を伝えることができるいくつかの原理的方法が存在し、これには、ニトロシル化／ニトロ化によるタンパク質機能の変性、又はＮＯによるグアニリルシクラーゼの原型活性化におけるもののようなタンパク質ヘム成分への直接結合が含まれる。
【００７０】
ＮＯＳ阻害剤を使用して内因性ＮＯ生成を阻害する以前の研究にいくつかの指摘がある。ＮＯＳ阻害により、血流の減少とは無関係に、運動中のイヌの最大下ＶＯ2が増加することが示されている。（ＳＨＥＮ，Ｗら「一酸化窒素  酸素消費量の調節における血管内皮細胞と実質細胞との間の重要なシグナル伝達メカニズム」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９５年１２月１５日第９２巻第１２号３５０５〜１２頁、ＩＳＨＩＢＡＳＨＩ，Ｙら「運動中の冠動脈拡張はＡＴＰ感受性Ｋ＋チャネル、アデノシン及びＮＯ介在機構が主な原因である」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．１９９８年第８２号３４６〜３５９頁；Ｓｈｅｎら、１９９９年、上述論文）。ＮＯＳ阻害中におけるこのＶＯ2の増加は、呼吸酵素チトクロームＣオキシダーゼの可逆阻害により、ＮＯが組織呼吸に影響を及ぼすという事実により説明されてきた（Ｃａｒｒ  ＆  Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、１９９０年、上述論文；Ｂｏｌａｎｏｓら、１９９４年、上述論文；Ｂｒｏｗｎ  ＆  Ｃｏｏｐｅｒ、１９９４年、Ｃｌｅｅｔｅｒら、１９９４年、Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ  ＆  Ｒｉｃｈｔｅｒ、１９９４年）。ＮＯＳ阻害中におけるＶＯ2の増加を、ミトコンドリア内膜へのプロトンの漏れに対するＮＯの阻害効果と関連付ける者もいる（ＢＯＨＵＳＬＡＶＳＫＹＩ，Ａ，ら「疲労時に動作する骨格筋によって酸素消費効率に及ぼされる一酸化窒素の影響」Ｆｉｚｉｏｌ  Ｚｈ．２００５年第５１巻第１号３３〜４２頁；ＮＡＶＥＴ，Ｒ，ら「ラット骨格筋ミトコンドリアにおいてインビトロ酸素欠乏／再酸素化中に生成される活性酸素種により誘発されるプロトン漏出」Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２００６年第３８巻第１号２３〜３２頁；ＷＡＮＧ，Ｇ，ら「一酸化窒素供与体がミトコンドリア透過性遷移の調整を通じてマウス心筋を梗塞から守る」Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００５年第２８８巻第３号１２９０〜５頁）。硝酸塩の作用が、チトクロームＣオキシダーゼの阻害のみによるものであるとすれば、運動中の嫌気的代謝の増加、及び乳酸塩の大量蓄積が予測される。しかしながら、結果から判断すると、硝酸塩の補給後も血漿乳酸塩濃度がプラセボと比較してほぼ同じであったため、これは当てはまらない。本発明者らは、このことを大変驚くべきことと考える。
【００７１】
上述のＮＯＳ阻害剤を使用した研究は、すべて内因性ＮＯが酸素消費量の調節に関与することを意味するが、外因性ＮＯ送達の作用を研究する試みはほとんど無かった。ニトロプルシド及びニトログリセリンなどのＮＯ供与体による研究では、いくつかのケースではＶＯ2が減少し（ＲＥＣＣＨＩＡ，Ｆ  Ａ，ら「一酸化窒素が覚醒中のイヌの心臓基質の利用を制御する」Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．１９９９年第４４号３２５〜３２頁；ＬＯＫＥ，Ｋ  Ｅ，ら「一酸化窒素がヒト心不全時にミトコンドリア呼吸を調整する」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９９年９月２１日第１００巻第１２号１２９１〜７頁）、１つの研究では影響がなく（ＮＵＮＥＺ，Ｃ，ら「ミトコンドリア酸素消費量、血管作用、及びＮＯの放出におけるニトログリセリンとＮＯ放出薬物との間の相違」Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００５年１１月１１日第９７巻第１０号１０６３〜９頁）、他の設定では増加する（ＤＥ  ＢＡＣＫＥＲ，Ｄ，ら「健常ボランティアにおける酸素消費量と酸素送達量との関係に及ぼすドブタミンの作用：ニトロプルシドナトリウムとの比較」Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｌｏｎｄ）．１９９６年第９０巻第２号１０５〜１１頁）という若干異なる結果が示されてきた。
【００７２】
上述した亜硝酸塩のＮＯへの還元に関して提案されるメカニズムのいくつかは、理論的には運動中も作用し始めることができる。従って、これらの経路は全て、低酸素症の期間中及び運動中の筋肉のようにｐＨが減少した際に大いに強化される。Ｓｈｉｖａ及びその同僚らは、つい最近、ラット心臓のホモジネートにおいて亜硝酸塩のＮＯへのデオキシミオグロビン依存性還元に付随してミトコンドリア呼吸の阻害が起こることを実証した（Ｓｈｉｖａら２００７年、上述論文）。別の考えられる経路としては、ミトコンドリア自身によるＮＯ形成（ＫＯＺＬＯＶ，Ａ  Ｖら「亜硝酸塩還元酵素活性は、哺乳類ミトコンドリアの新たな機能である」ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９９年７月２日第４５４巻第１〜２号１２７〜３０頁）、又は運動筋肉中における亜硝酸塩の単純な酸性還元さえも挙げられる（Ｚｗｅｉｅｒら１９９５年、上述論文、ＭＯＤＩＮ，Ａら「亜硝酸由来一酸化窒素：「酸性代謝性」血管拡張の介在物質候補」Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ．２００１年第１７１巻第１号９〜１６頁）。Ｃｏｓｂｙ及びその同僚らは、循環する亜硝酸イオンの血中デオキシヘモグロビンとの反応から生じるＮＯ形成及び血管拡張について説明した（ＣＯＳＢＹ，Ｋ，ら「デオキシヘモグロビンによる亜硝酸塩の一酸化窒素への還元がヒトの血液循環を血管拡張する」Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００３年第９巻第１２号１４９８〜５０５頁）。後者の経路、及び場合によっては組織の亜硝酸塩還元も、最近記載された硝酸塩誘導性の安静時血圧の低下（Ｌａｒｓｅｎら２００６年）については非常によく説明がつくが、このＮＯが運動筋肉中における酸素消費量をどのようにして減少させるかについては未だ明らかではない。従って、例えばデオキシミオグロビン由来ＮＯによるミトコンドリア呼吸の効果的な阻害の結果、やはり血漿乳酸塩が蓄積するようになると予想されるが、これは事実ではなかった。
【００７３】
筋肉が仕事をする効率は、Ｉ型筋線維（ＣＯＹＬＥ，Ｅ  Ｆら「サイクリング効率はＩ型筋線維の割合に関連する」Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．１９９２年第２４巻第７号７８２〜８頁）、及び筋線維の脱共役蛋白−３（ＵＣＰ３）の含有量の割合に関連付けられてきた（ＭＯＧＥＮＳＥＮ，Ｍら「ヒトのサイクリング効率は低ＵＣＰ３含有量及びＩ型筋線維に関連するが、ミトコンドリア効率には関連しない」Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００６年第５７１巻第３号６６９〜６８１頁）。動作効率に寄与する可能性がある別の因子に、解剖学的、生化学的、及び生体力学的特徴がある（ＷＩＬＬＩＡＭＳ，Ｋ  Ｒ．「力学的エネルギー推定と生理的エネルギー推定との関係」Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．１９８５年第１７号３１７〜２５頁）。このように、特定のＶＯ2におけるエネルギー出力は基質の利用に依存するため、異なる運動量でのＶＯ2の差を単純に測定することは、最適な筋効率の推定にはならない。総効率（ＧＥ）計算は、可能性のある呼吸交換率の変化を含むことにより、基質の利用も考慮に入れたものである。硝酸塩を補充した後にＧＥが改善するのは効率が良くなったことを示すものであるが、たとえそうであっても、この効率の改善は基準エネルギー消費量（ＥＥ）の低下によるものであるということを除外することはできない。デルタ効率（ＤＥ）の計算は基準ＥＥに依存せず、ＧＥ計算のように１つの時期の１つの仕事量に基づくものではなく、ひとまとめにした全ての仕事量に基づくものである。従って、この場合ＤＥが最も正当な筋効率の推定であると予想することがもっともらしい。実際、硝酸塩の補充後、ＤＥまでもが大きく改善した。この硝酸塩による効率の改善が力学的因子からもたらされたものとは考えにくい。この研究の被験者はすべて長年の訓練及び競技を経験してきたサイクリストであった。研究所に二、三度訪れただけでは、被験者のサイクリング中の効率に注目に値する程の変化が生じることはなさそうである。特に、被験者らは、訓練中に慣れたものと同じサイクリングシューズ、クリップ式ペダル、及び同じ座席位置を使用したので、これはなおさら考えにくい。さらに重要なことに、この研究で使用された無作為化手順により、このような差異は排除される。ＭａｒｃｈｅａｌとＧａｉｌｌｙ（ＭＡＲＣＨＥＡＬ，Ｇら「骨格筋収縮に及ぼす一酸化窒素の影響」Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．１９９９年第５５号１０８８〜１１０２頁）は、原位置試験においてＮＯ供与体の投与中に筋線維が急速に弛緩することを実証し、これによりＮＯの神経筋調節作用を示唆した。これがサイクリング中の筋効率を向上させるかどうかはまだ証明されていない。
【００７４】
所定の作業量における酸素パルスが硝酸塩を補給することによって減少するという知見は、その作業量における低い酸素必要量が直接作用したものである。しかしながら、所定の絶対酸素摂取量における酸素パルスには差がない。硝酸塩がＶＥ／ＶＯ2又は酸素パルスに及ぼす影響が存在しないということは、心臓又は肺における中枢適応ではなく筋肉又はミトコンドリア適応に起因して効率が向上したことを示す。
【００７５】
要約すると、この知見は、毒性の無い量の亜硝酸塩を摂取することにより得られる量の硝酸塩を食事補充した後に最大下作業中の酸素消費量が低下することを実証する。この酸素消費量の低下は血漿乳酸塩の増加を伴わずに生じ、エネルギー生成がより効率的になったことを示した。この作用のメカニズム及び主な対象を明らかにする必要があるが、その過程は硝酸塩の亜硝酸塩及びＮＯを含む生物活性酸化窒素物へのインビボ還元に関連があると思われる。
【実施例】
【００７６】
方法
被験者
９人の健康で十分に訓練された（ＶＯ2peak５５＋／−３．７ｍｌ×ｋｇ-1×分-1）男性（２８＋／−６歳）が試験に志願した。全ての被験者は、訓練されたサイクリスト又はトライアスロン選手であり、試験手順にはよく慣れていた。この試験では、最大下運動中にＶＯ2peakが向上したり、或いは機械効率が良くなったりするような、試験から得られる訓練効果を避けるために、十分に訓練された被験者を使用することを選択した。ストックホルムの地域倫理委員会によって手順が承認され、全ての被験者が参加前に承諾書を提出した。
【００７７】
硝酸塩の食事補給
この試験の目的は、硝酸塩摂取量が通常より高いものと、低いものとの２つの異なる食事パターンの効果を調べることであった。試験は、二重盲検プラセボ対照クロスオーバー法で行った。１０日の休薬間隔で分離した２回の３日間の間、硝酸塩含有量が中程度又は高度の食品（全ての野菜、全ての塩漬け肉、いちご、ぶどう、及びお茶）を全て避けるように被験者に指示した。また、被験者にはアルコール及びタバコ製品を控えるように伝えた。その他の点では、被験者は３日間の食事制限中、好きな食品を自由に食べた。被験者は、水に溶解した０．１ｍｍｏｌ硝酸ナトリウム／ｋｇ体重／日、又は等量の塩化ナトリウム（プラセボ）の摂取のいずれかにより、ランダムに試験が開始された。１日の用量を分割し、毎日３回摂取した。味又は外観により異なる溶液を見分けることはできなかった。１日の硝酸塩用量は、ホウレンソウ、レタス又はビートルートなどの硝酸塩が豊富な野菜１５０〜２５０グラムに通常含有される量に相当した（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、２００４年、上述論文）。硝酸塩又はプラセボの最後の用量は、測定日の朝に摂取した（以下の本試験を参照されたい）。硝酸塩補給期間（ＮＩＴ）とプラセボ期間（ＣＯＮ）との間の順序はバランスが保たれた。休薬期間の間、被験者は特定の食事療法には従わなかった。
【００７８】
実験手順
被験者がトレーニングで慣れた競技用サドル及びペダルシステムで改造した電気ブレーキ式自転車エルゴメータ（Ｍｏｎａｒｋ  ８３９Ｅ、ヴァールベリ、スウェーデン）で測定を行った。自転車エルゴメータはコンピュータ制御されており、被験者がペダルを漕ぐのに選択したリズムに関係なく一定の作業量が可能であった。ペダルを漕ぐリズムは、７０〜９０ｒｐｍの範囲で個々に選択したが、試験中は一定に保持されて、筋動員パターンの変化による作業出力の差を最小にした。
【００７９】
被験者の呼吸がマウスピース及びプラスチックチューブを介して通過する流量計に連結されたコンピュータガス分析器（ＡＭＩＳ ２００１ 、オーデンセ、デンマーク）により、肺換気量（ＶE）、酸素摂取量（ＶＯ2）、ＣＯ２排出量（ＶＣＯ2）及び呼吸交換率（ＲＥＲ）を１０秒間隔で測定した。携帯型心拍数モニタ（Ｐｏｌａｒ  Ｓ６１０、Ｐｏｌａｒ、ケンペレ、フィンランド）で試験中連続的に心拍数（ＨＲ）を記録した。毛細血液サンプル（２０μｌ）を指先から収集し、Ｂｉｏｓｅｎ  Ｃ−Ｌｉｎｅ  Ｓｐｏｒｔ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＥＫＦ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、マグデブルク、ドイツ）を使用して乳酸塩（［Ｈｌａ］）を分析した。毛細血液を指先から採ってＨｂ測定装置（Ｈｅｍｏｃｕｅ、エンゲルホルム、スウェーデン）で分析し、安静時ヘモグロビン濃度（［Ｈｂ］）を求めた。毛細血液を１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離することによりヘマトクリット（Ｈｃｔ）を求めた。
【００８０】
予備試験
各被験者は、第１の本試験の前の２週間内に２回実験室を訪れた。被験者に自転車エルゴメータ及び試験手順に慣れてもらうために第１の予備試験を行った。被験者は、各レベルが５分間継続する５つの最大下レベルで予備試験を受けた。異なる最大下レベルの間に休憩はなかった。ＡＭＩＳ  ２００１でＶＯ2を連続的に測定した。各最大下レベルの最後に指先から毛細血液を採り、後に［Ｈｌａ］を分析した。各作業量において、被験者は、ボルグのＲＰＥスケール（ＢＯＲＧ，Ｇ．「身体ストレスの指標としての主観的運動」Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｅｈａｂｉｌ  Ｍｅｄ．１９７０年第２巻第２号９２〜８頁）における主観的運動強度を示し、中枢性及び筋肉性運動強度の両方を示した。８分間の回復時間後、被験者は、個々の計算した最大酸素摂取量に相当する作業量で可能な限り長く自転車を漕ぐように指示された（ＡＳＴＲＡＮＤ，Ｐ−Ｏら、「作業生理機能のテキスト」、ニューヨーク  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、１９７０年ＩＳＢＮ  ００７００２４０６５、６１９頁）。この試験中、被験者の実際のＶＯ2peakを測定し、被験者が７分よりも長く漕げる場合には、疲労するまで毎分２０〜３０ワットの追加出力を加えた。最大試験の１分後及び３分後に指先から毛細血液を採取し、［Ｈｌａ］を分析した。
【００８１】
第２の予備試験前に、最大下レベルが、ＶＯ2peakの４５、６０、７０、８０及び８５％と一致するように調整した。また、必要に応じて、時間対疲労度が４分と７分の間に維持されるように最大作業量も調整した。
【００８２】
本試験
被験者は、本試験の前３日間は激しい運動を控え、試験前日は全ての運動を避けた。また、試験開始の少なくとも３時間前に最後の軽食を摂るように被験者に伝えた。被験者は、実験室にくるとプラセボ又は硝酸塩のいずれかの最後の投与を受け、試験開始前に６０分間仰向けで休憩することが許された。
【００８３】
全ての被験者は、１００ワットで５分間自転車を漕ぐという標準的なウォームアップ手順を使用し、その後５分間休憩した。異なるレベルの間に休憩を挟むことなく、各々が５分間継続する５つの最大下作業量で第２の予備試験と同じ方法で最大下及び最大試験を行った。２つの本試験中は同じ作業量を使用した。最後の硝酸塩／プラセボ投与を摂取した４５分後の休憩時に静脈血液（９ｍｌ）を採り、ＶＯ2peak試験の直後に再び静脈血液（９ｍｌ）を採った。この血液を氷浴に入れ、１３００ｒｐｍ及び４°Ｃで５分以内の遠心分離を行った。血漿を分離し、前述したような化学発光分析により硝酸塩及び亜硝酸塩濃度が分析されるまで−８０℃に保持した（ＬＵＮＤＢＥＲＧ，２００４年、上記）。
【００８４】
統計及び計算
結果を平均＋／−標準偏差（平均＋／−ＳＤ）の形で表す。対応のあるｔ検定を使用して硝酸塩試験とプラセボ試験との間の差を評価した。有意レベルをｐ＝＜０．０５に設定した。
【００８５】
総効率（ＧＥ）は、作業量を実際のエネルギー消費量（ＥＥ）で割ったものと定義した。次に、Ｂｒｏｕｗｅｒ方程式でＥＥを計算した（ＢＲＯＵＷＥＲ，Ｅ．「ガス交換（酸素摂取及び炭酸排出）及び尿−Ｎから熱消費量及びヒト及び動物の代謝で酸化された炭水化物及び脂肪の量を計算するための単純な公式について」Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｎｅｅｒｌ．１９５７年第６号７９５〜８０２頁）。デルタ効率（ＤＥ）は、作業量の増加をＥＥで割ったものと定義した（ＧＡＥＳＳＥＲ，ＧＡら「定常運動中の筋効率：速度及び作業量の影響」Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９７５年第３８号１１３２〜１１３９頁）。ＤＥは最低から４つの作業量に基づき、線形回帰で分析した。酸素パルスはＶＯ2／ＨＲと定義される。
【００８６】
結果
安静時血圧
硝酸塩補給（１１２＋／−８ｍｍＨｇ）後は、平均安静時最高血圧がプラセボ（１２０＋／−５．９、ｐ＜０．０１）よりも低かった。硝酸塩（６８＋／−５．５ｍｍＨｇ）後は、最低血圧もプラセボ（７４＋／−６．８ｍｍＨｇ、ｐ＜０．０１）より低かった。これらの知見の一部は、別の文書（Ｌａｒｓｅｎら２００６年）として出版されている。
【００８７】
血液値
［Ｈｂ］は安静時（ＮＩＴ  １５２＋／−１１、ＣＯＮ  １５３＋／−１１ｇ ×ｌ-1、ｐ＝０．８７）又はＶＯ2peak試験直後（ＮＩＴ  １６３＋／−１３、ＣＯＮ  １６１＋／−１３ｇ×ｌ-1、ｐ＝０．２７）で変化が観察されなかった。ヘマトクリット値も安静時（ＮＩＴ  ４２＋／−４、ＣＯＮ  ４３＋／−３％、ｐ＝０．１９）又はＶＯ2peak試験後（ＮＩＴ  ４６＋／−４、ＣＯＮ  ４７＋／−４％、ｐ＝０．６）で変化がなかった。
【００８８】
安静時の硝酸塩の血漿レベルはＣＯＮで２７＋／−６．９μＭ、ＮＩＴで１８２＋／−５５（ｐ＝＜０．０１）であった。最大作業試験直後の硝酸塩レベルは、ＣＯＮで２９＋／−６．１、ＮＩＴで１７５＋／−６１μＭ（ｐ＝＜０．０１）であった。血漿硝酸塩は、運動中にＮＩＴでもＣＯＮでも変化しなかった（ｐ＝０．８）。安静時の亜硝酸塩レベルは、ＣＯＮで１２４＋／−２８、ＮＩＴで２２６＋／−８７ｎＭ（ｐ＝＜０．０１）であった。最大作業試験直後では、亜硝酸塩レベルは、ＣＯＮで１１１＋／−２９、ＮＩＴで１３７＋／−４８（ｐ＝０．１７）であった。
運動中の亜硝酸塩濃度の減少は、ＣＯＮよりもＮＩＴの方において顕著であった（図２参照）。
【００８９】
作業パラメータ
硝酸塩投与後、プラセボ期間と比較して、４５〜８０％ＶＯ2peakに相当する５つの作業量の間でＶＯ2が著しく低かった（図３）。ＶＯ2peakの８０％で最も顕著な差が見られた（ＮＩＴ  ３．４４＋／−０．３１ｌ×分-1対ＣＯＮ  ３．６１＋／−０．３１ｌ×分-1、ｐ＝０．００３、図４）。平均すると、ＶＯ2は、５つの最大下作業量にわたるＮＩＴ試験で０．１５ｌ×分-1低かった。ＮＩＴ試験とＣＯＮ試験との間で心拍数（ＨＲ）に差はなかった（図３参照）。酸素パルスは、ＣＯＮ中の２１．０＋／−２．０から２０．３＋／−１．９ｍｌ×心拍数-1に減少する傾向にあった（ｐ＝０．０８）。最大下作業量のいずれの最中にもＮＩＴとＣＯＮとの間で［Ｈｌａ］（図５）、ＶＥ、ＶＥ／ＶＯ2又は呼吸交換率（ＲＥＲ）に差は見られなかった。平均総効率は、ＣＯＮ中の１９．７％からＮＩＴ中の２１．１％まで改善した（ｐ＝０．０２）。デルタ効率（ＤＥ）は、ＮＩＴ中の２２．９＋／−１．９％に比較して、ＣＯＮ中の２２．１＋／−１．６％から著しく増加した（ｐ＝０．０４）。
【００９０】
最大作業量では、ＮＩＴ試験のＶＯ2peak及びＣＯＮ試験のＶＯ2peakは、それぞれ４．４９＋／−０．４４及び４．６１＋／−０．２８ｌ×分-1、ｐ＝０．２９であった。ＶEmax（ＮＩＴ  １８２＋／−２１．４対ＣＯＮ  １８６＋／−２１．７ｌ×分-1、ｐ＝０．５）、ＨＲmax（ＮＩＴ  １８９．８＋／−７．０対ＣＯＮ  １９０．３＋／−７．５拍動×分-1、ｐ＝０．９４）又は最大作業量（ＮＩＴ  ３６０．６＋／−３２．８対ＣＯＮ  ３５８．９＋／−３２．３ワット、ｐ＝０．３５）のいずれにおいても大きな差はみられなかった。あらゆる作業負荷（最大下又は最大）における主観的運動強度（ボルグＲＰＥスケール）ではＮＩＴとＣＯＮとの間に差はなかった。
【００９１】
理解の明瞭化を目的として、説明図及び実施例により上述の発明についてある程度詳細に説明したが、当業者であれば、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の思想又は範囲から逸脱することなく特定の変更及び修正を行うことができることが明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年8月27日(2009.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の運動能力であって、運動中の酸素摂取量（ＶＯ2）の減少として示される運動能力の向上を図る組成物の製造における、無機硝酸塩及び亜硝酸塩の何れか又はそれらの混合物の使用。
【請求項２】
前記運動能力向上の効果が、運動中のＶＯ2減少及び筋効率の著しい増大の両方の形で示される、
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記組成物が、液体、ペースト、バー、ケーキ、粉末、顆粒、発砲錠、錠剤、カプセル、薬用キャンデー、チューイングガム、速溶性錠剤又はウェハース、舌下錠、又はスプレーの形をとる、
ことを特徴とする請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記組成物が、スポーツ飲料、エネルギー飲料、スポーツバー、又はエネルギーバーの形で市場に出される、
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記無機硝酸塩の供給源が、硝酸塩含有野菜の濃縮物、抽出物又はジュース、或いは無機硝酸塩の塩の中から選択される、
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記無機硝酸塩が、ポリフェノールと組み合わせて使用される、
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記無機硝酸塩が、硝酸塩又は亜硝酸塩の還元を促進できる生細菌と組み合わせて使用される、
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記無機硝酸塩が、５％（ｖ／ｖ）未満、好ましくは２％（ｖ／ｖ）未満、より好ましくは０．５〜１％（ｖ／ｖ）の量のエタノールと組み合わせて使用される、
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
哺乳類が摂取すると、運動中の酸素消費量（ＶＯ2）の減少を示す運動能力を向上させることができる組成物であって、ポリフェノールと、無機硝酸塩及び亜硝酸塩の何れか又はそれらの混合物とを含む、
ことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、液体、ペースト、バー、ケーキ、粉末、顆粒、発砲錠、錠剤、カプセル、薬用キャンデー、チューイングガム、速溶性錠剤又はウェハース、舌下錠、又はスプレーの形をとる、
ことを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、液体、ペースト、バー、ケーキ、粉末、又は顆粒などの食品の形をとるか、或いはこの一部を構成する、
ことを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記無機硝酸塩の供給源が、硝酸塩含有野菜の濃縮物、ジュース又は抽出物の中から選択される、
ことを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記無機硝酸塩の供給源が無機硝酸塩の塩である、
ことを特徴とする請求項９〜１１から請求項１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、硝酸塩又は亜硝酸塩の還元を促進できる非病原性生細菌を含む、
ことを特徴とする請求項９〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が抗菌化合物を含む、
ことを特徴とする請求項９〜１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、約５％（ｖ／ｖ）未満の濃度のエタノールを含む、
ことを特徴とする請求項９〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
哺乳類の運動能力を非治療的に向上させる方法であって、運動中の酸素消費量（ＶＯ2）の減少を示す形で運動能力を向上させる方法において、
無機硝酸塩及び亜硝酸塩の何れか又はそれらの混合物が、０．１〜１００μｍｏｌ／ｋｇ体重／日の用量で前記哺乳類に経口投与される
ことを特徴とする方法。
【請求項１８】
硝酸塩及び亜硝酸塩が、約５：１〜約１００：１（硝酸：亜硝酸）の間の用量比で投与される、
ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
硝酸塩がポリフェノールと共に投与される、
ことを特徴とする請求項１７または１８に記載の方法。
【国際調査報告】
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