(57)【要約】  感染性疾患、特にヘリコバクターにより引き起こされる疾患の治療用薬剤組成物の製造のための一般化学構造式（Ｉ）の化合物またはその塩の利用が開示されている。式中、ＹはＮＯ２、ＣＯＯＨまたはＳＯ３Ｈであり、ＺはＯ、ＮまたはＳであり、Ｘ１とＸ２はハロゲンであり、同一または異なるものであり、ｍとｎは０から３であり、同一または異なるものである。【選択図】化１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性疾患の治療用薬剤組成物の製造のための下記の一般化学構造式（Ｉ）の化合物またはその塩の利用であって、
【化１】
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ＹはＮＯ２、ＣＯＯＨまたはＳＯ３Ｈであり、
ＺはＯ、ＮまたはＳであり、
Ｘ１とＸ２はハロゲンであり、同一または異なるものであり、
ｍとｎは０から３であり、同一または異なるものである、
ことを特徴とする化合物またはその塩の利用。
【請求項２】
ＺはＯであり、Ｘ１とＸ２は同一または異なっており、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩであるハロゲン原子で成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の利用。
【請求項３】
Ｘ１とＸ２は同一または異なっており、ＦとＣｌであるハロゲン原子から選択されることを特徴とする請求項２記載の利用。
【請求項４】
ｍは２であり、ｎは１であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の利用。
【請求項５】
Ｘ１はＦであり、Ｘ２はＣｌであり、ｎは１であり、ｍは２であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の利用。
【請求項６】
化合物は一般化学構造式（ＩＩ）を有することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の利用。
【化２】
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【請求項７】
感染性疾患はヘリコバクターによって引き起こされるものであることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の利用。
【請求項８】
感染性疾患はヘリコバクターピロリによって引き起こされるものであることを特徴とする請求項７記載の利用。
【請求項９】
感染性疾患は胃炎、胃十二指腸潰瘍、リンパ腫または胃ガンであることを特徴とする請求項８記載の利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染症または伝染性疾患（以降“疾患”）の治療、特にヘリコバクターによって引き起こされる疾患の治療のためにフラボドキシンを阻害する能力を備えた一般化学（構造）式（Ｉ）で示される化合物の利用に関する。
【０００２】
【化１】
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【背景技術】
【０００３】
ヘリコバクターピロリにより疾患は今日の最も一般的である慢性疾患の１つである。事実、このバクテリアは５０％以上の人の胃粘膜にコロニーを形成していることが知られている。
【０００４】
ヘリコバクターピロリは慢性胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を引き起こし、ＭＡＬＴリンパ腫および腺ガン（最も一般的で致命的な種類のガン）を引き起こす危険因子であるグラム陰性バシラス菌である。
【０００５】
ヘリコバクターピロリ疾患を根絶するのに利用される従来の治療法は２つの広範なスペクトル抗体とプロトンポンプ阻害剤を利用する。従って、治療成功率が８０％を超えるような、この疾患に対する特定治療法も、非常に効果的な治療法も存在しない。さらに、従来型抗体に対する抵抗性の増加に伴う突然変異的な変質によって従来治療法の効果は低下している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は感染症または伝染性疾患（“疾患”）、特にヘリコバクターピロリによって引き起こされる疾患を治療することができる新規な化合物に関する。
【０００７】
よって、本発明の第１の特徴は、疾患の治療のための薬剤化合物の生成に供する一般化学（構造）式（Ｉ）で表される化合物（以降“本発明の化合物”）またはその塩の使用に関する。
【０００８】
【化２】
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式中、Ｙ、Ｚ、Ｘ１、Ｘ２、ｍおよびｎは以下のものである。
【０００９】
ＹはＮＯ２、ＣＯＯＨおよびＳＯ３Ｈから選択される基であり、ＺはＯ、ＮまたはＳの原子であり、好適には酸素原子であり、Ｘ１とＸ２はハロゲン原子であり、それらは同一であっても異なっていてもよく、好適にはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択されるものであり、さらに好適にはＦまたはＣｌであり、ｍとｎは対応する芳香族環の置換基数を表し、同一であっても異なっていてもよく、０から３であり、好適には１または２であり、さらに好適にはｍは２であり、ｎは１である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の好適実施例はＺがＯであり、Ｘ１がＦであり、Ｘ２がＣｌであり、ｎが１であり、ｍが２である本発明の化合物の利用に関する。
【００１１】
さらに好適な実施例では本発明の化合物は以下の化学（構造）式（ＩＩ）のものである。
【００１２】
【化３】
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【００１３】
幾種かの疾患はヘリコバクターバクテリアの場合と同様にグラム陰性バクテリアによって引き起こされる。
【００１４】
これら特定タイプの疾患の治療のための効果的な治療標的はフラボドキシンであり、α／β構造を有する酸化還元タンパク質であり、その機能は多様な代謝経路による電子の移動である。ヘリコバクターピロリにおいては、酵素のピルビン酸塩であるピルビン酸塩酸化脱炭酸経路のフラボドキシンオキシドリダクターゼ（ＰＦＯＲ）から電子を受領し、ピルビン酸塩をアセチルＣｏＡに変換する。電子媒介物としてこの機能を実行するためにフラボドキシンはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）分子結合した非共有結合を具備する。フラボドキシンに対する他の種の構造的類似性にも拘わらず、ヘリコバクターピロリの構造はＦＭＮ結合部位で非常に大きく異なっている。そこではアラニンの残基が他のフラボドキシンの特性であるトリプトファンを置換する。この理由で、それは補助因子の結合部位に隣接した脆弱部を有する。この脆弱部はその生物活性の可能な阻害物である分子の結合のための適した部位である。なぜなら、それら阻害物はＰＦＯＲへの電子移動を阻害するＦＭＮ酸化還元能力を変更するからである。または、それら阻害物は単に２つのタンパク質の結合を妨害するからである。ピルビン酸塩酸化経路を妨害するとバクテリアは確実に死滅する。
【００１５】
従って、フラボドキシンはバクテリアの生存には必須であり、人体には存在せず、前述のごとく感染に関連する疾患の根絶のための治療に適した標的を構成する。
【００１６】
本発明の化合物は、ヘリコバクターピロリフラボドキシンが関与するピルビン酸塩の酸化を阻害することによってミクロモルレベルの濃度範囲のヘリコバクターピロリ菌を完全に阻害することが証明された（実施例参照）。
【００１７】
従って、本発明の好適実施例は、好適にはヘリコバクターピロリであるヘリコバクター属のバクテリアにより引き起こされる疾患の治療のための一般化学（構造）式（Ｉ）で示される化合物の利用を含む。
【００１８】
よって、これら化合物はそれら疾患の治療のための医薬物または薬剤組成物の製造に使用できる。これら化合物に加えて、この薬剤組成物は薬学的に利用できる賦形剤、添加剤、等々も含むことができる。
【００１９】
従って、フラボドキシンを阻害するこれら化合物は感染性疾患、特にヘリコバクターピロリ等のヘリコバクターにより引き起こされる疾患の治療に非常に優れた代替物を提供する。
【００２０】
本発明の一般化学（構造）式（Ｉ）の化合物の利用は、これら化合物がフラボドキシンタンパク質に特に有効に作用する阻害物質であるため、この病原菌に対する有効治療法の欠如を補うであろう。また、人体での相同タンパク質の不在は、宿主生物に対する副作用がない、あるいは弱いこれら阻害物質を特に有効な分子治療剤にする。
【００２１】
ヘリコバクターピロリにより引き起こされる疾患は、慢性胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍、リンパ腫および胃ガン等の胃腸の病気に関係する。従って、さらに好適な実施例は、慢性胃炎、胃潰瘍及び／又は十二指腸潰瘍、リンパ腫および胃ガン等の疾患治療のための本発明化合物の利用を含む。
【００２２】
明細書と“請求項”を通じて、用語“含む”およびその変形は他の技術的特徴、追加物、成分または方法のステップを排除するものではない。当該分野の専門家であれば、本発明の他の目的、利点および特徴は本発明の説明から明らかであろう。以下の実施例と添付図面は本発明の説明のためのみを目的として提供されており、それらによる本発明の限定は意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は５０μＭの濃度の一般化学（構造）式（ＩＩ）の化合物の存在下、または不在下でのヘリコバクターピロリの反応を示すそれぞれのプロダクト生成曲線を比較するグラフを示す。時間（ｔ）（秒）に対する３４０ｎｍでの吸収度（Ａ）（ＡＵは吸収度の単位）の測定値。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は発明者によって実施された試験に沿って説明される。この試験ではフラボドキシン阻害剤の特異性と効果が示される。
【実施例１】
【００２５】
組み換えフラボドキシンのための遺伝子クローニング
ヘリコバクターピロリのゲノムＤＮＡがＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抗原陽性患者から単離された。
【００２６】
フラボドキシンをコード化しているＤＮＡ配列は制限酵素Ｎｃｏ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）と制限酵素ＢａｍＨＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｄｇｅｎ）を使用してＰＣＲによって増幅された。
【００２７】
増幅後に、６００程度のヌクレオチドの断片はフラボドキシン遺伝子の断片に対応して検出された（６１３個のヌクレオチド）。
【００２８】
これら断片は標準技術を利用して純化され、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクターのＮｃｏｌ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化された。遺伝子の挿入およびその方向性並びに一体性は、バクテリオファージＴ７プロモータを使用して、プラスミドのＤＮＡ配列でチェックされた。
【実施例２】
【００２９】
ヘリコバクターピロリ組み換えフラボドキシンの発現および純化
Ｅ．コリＢＬ２１のコンピテント細胞はインサートを含むｐＥＴ２８ａプラスミドで変性され、３７℃のカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）の存在下、１０ｍｌのＬＢ培地内で培養された。
【００３０】
培養液は同一条件で１０倍に薄められ、６００ｎｍで光学密度が０．８になるまで成長が継続された。それらはＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）で誘導され、細胞は３〜４時間成長が継続された。
【００３１】
その後に、培養液は遠心分離処理され、細胞が得られた。それらは０．１５ＭのＮａＣｌで洗浄された。
【００３２】
遠心分離後に細胞は５０ｍＭのトリスＨＣｌバッファ（ｐＨ８）、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＰＭＳＦで再縣濁された。
【００３３】
これら細胞は超音波処理サイクルで破壊され、細胞断片は遠心分離（４℃、１８０００ｒｐｍ、４５分間）によって除去された。
【００３４】
得られた未処理の抽出物は６５％の飽和硫酸アンモニウムで沈降処理され、遠心分離された。上澄み液は６５％の硫酸アンモニウムによる５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）で平衡化されたＤＥＡＥ  ＤＥ−５２セルロースカラム上に供給された。
【００３５】
タンパク質は６５から０％の（ＮＨ４）２ＳＯ４飽和の逆勾配で溶離された。
【００３６】
５０ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファ（ｐＨ８）でのタンパク質の透析後、同一バッファ内で均衡された別ＤＥＡＥ  ＤＥ−５２セルロースカラム上に供給された。
【００３７】
タンパク質は０から１ＭのＮａＣｌの勾配で溶離された。タンパク質のアポ形態（補助因子無し）とホロ形態（補助因子有り）とを分離するには、サンプルをＦＰＬＣシステムのＭｏｎｏＱ  １０／１０カラムを通過させることが必要であるが、純粋なタンパク質はこのカラム後に得られた。
【００３８】
タンパク質は−２０℃で保存された。
【実施例３】
【００３９】
阻害試験
ピルビン酸塩の酸化脱炭酸からエネルギーを得るためにフラボドキシンは基礎反応に関与するため、フラボドキシンはヘリコバクターピロリの生存には必須なタンパク質である。この反応において、ＰＦＯＲ酵素とＦｑｒＢ酵素との間でフラボドキシンは電子を移動させる。これでＮＡＤＰ＋に電子が放出される。
【００４０】
以下の例では、ｐＢＳ（ＫＳ）ベクターに挿入されたＰＦＯＲ酵素の遺伝子と、ｐＥＴ２９ｂベクターに挿入されたＦｑｒＢ酵素の遺伝子に対応するｃＤＮＡが使用された。
【００４１】
両方の組み換え酵素は、溶解性部分であるリダクターゼ（ｎｓｆＡとｎｆｓＢ）が欠落しているＥ．ｃｏｌｉ  ＪＶＱ２コンピテント細胞内のＰＦＯＲおよびＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞内のＦｑｒＢとして発現される。
【００４２】
細胞は３７℃のＬＢ培地内で成長し、ＪＶＱ２の場合にはアンピシリンに対する抵抗性で、ＢＬ２１の場合にはカナマイシンに対する抵抗性によって選択される。
【００４３】
その後に、それらはＩＰＴＧにより誘導され、誘導の３時間後（光学密度は約０．８）に−８０℃で保存された。
【００４４】
ＦｑｒＢ酵素は、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーにより純化するために、アミノ酸配列のＮ端末にて６個のヒスチジン残基の末端で発現される。よって、細胞は破砕バッファ（５０ｍＭの燐酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、および１０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８））で再縣濁され、１０秒間の超音波処理サイクル（１分間隔）による破砕された。
【００４５】
細胞の残りは４℃の１０００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離によって除去された。上澄み液は破砕バッファで均衡化されていたニッケルアフィニティカラム（Ｎｉ−ＮＴＡアガロース、Ｑｉａｇｅｎ）上に供給された。２０ｍＭ、４０ｍＭおよび６０ｍＭのイミダゾールで３回の洗浄が実行され、他のタンパク質とのマトリックスの目的外相互作用が排除され、ＦｑｒＢ酵素は２５０ｍＭのイミダゾールの勾配を有したカラムから溶離された。
【００４６】
最後に、酵素は１０％のグリコールによりＰＢＳ保存バッファ内で透析された。酵素テストのためにヒスチジン末端は除去されなかった。活性に影響を及ぼさないからである。
【００４７】
ＰＦＯＲ酵素は空気に曝露することで不活性化される（酸素により不活性化される）。よって、ＰＦＯＲは窒素流が通過しており、接続部が気密化されているシステムによって純化された。
【００４８】
細胞は１ｍＭのＭｇＣｌ、１ｍＭのＤＴＴおよび１０％のグリセロールにより５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７）内で再縣濁され、１分間隔の１０秒間の超音波処理サイクルで音波処理され、細胞破片を除去するために４℃にて１０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離された。その後に、さらに高速で遠心分離され（２４０００ｒｐｍで２時間）、タンパク質の濃度はブラッドフォードアッセイによって決定された。
【００４９】
未処理の抽出物はタンパク質の濃度が２５ｍｇ／ｍｌとなるまで同一バッファで希釈された。タンパク質は０から０．５Ｍの塩化ナトリウムの勾配のＤＥＡＥ  ＤＥ−５２カラムにより部分的に純化された。酵素を含んだ部分は、２５μｌの反応バッファ（５００ｍＭのピルビン酸塩、１０ｍＭのＣｏＡおよび１００ｍＭのベンジルビオロゲン）を５０から１００μｌの部分に加える有酸素条件下で急速アッセイによって所在確認された。酵素を含む部分は透明から青色に変化した。
【００５０】
その後に、酵素を含んだ部分は保存バッファ（細胞の再縣濁に使用されたものと同一）内で透析された。続く純化工程は産量を大幅に減らし、この試験では目的とする酵素活性は不純物によって変性されなかったので酵素は上述のように部分的に純化された。
【００５１】
ピルビン酸塩、ＰＦＯＲ、フラボドキシン、ＦｑｒＢおよびＮＡＤＰ＋（活性アッセイ）間での電子移動の連続的反応に続いて、ＮＡＤＰＨの形成を伴う３４０ｎｍの信号が分光的に確認された。反応混合物はｐＨ７の１００ｍＭの燐酸カリウムと、１０ｍＭのピルビン酸塩と、０．１８ｍＭのＣｏＡと、１ｍＭのＭｇＣｌと、０．３ｍＭのＮＡＤＰ＋と、０．０９ｍｇ／ｍｌのＰＦＯＲと、１０μＭのＦｌｄと、０．１５μＭのＦｑｒＢとを含んでいた。ＣｏＡを除いて混合物は有酸素条件用に特別に設計されたキュベットに入れられた。酸素は真空とアルゴンの交互流による５分間サイクルによって排除された。反応は同一キュベットの内部の小室内に維持されていた０．１８ｍＭのコエンザイムＡ（ＣｏＡ）に追加によって開始された。ＣｏＡ試薬の追加後に反応は１５分で完了した。いかなる反応成分の欠落もＮＡＤＰＨの形成には結びつかなかった。すなわち、ピルビン酸塩とＮＡＤＰ＋との間の電子移動には全成分が必須であり、置換不能であることが示された。
【００５２】
阻害アッセイは前述の活性アッセイと同一条件で実行され、５０ｍＭの一般化学（構造）式（ＩＩ）の本発明化合物が反応キュベットに追加された。
【００５３】
図１で示すように阻害現象はこの濃度ではほぼ完全であった。
【実施例４】
【００５４】
阻害剤の結合エネルギー
ヘクトバクターピロリのフラボドキシンに対する本発明阻害剤の結合は等温適定熱量計（ＩＴＣ）により確認された。この技術は標的タンパク質に対する各化合物の親和度を測定するだけではなく、結合のエンタルピーおよびエントロピー成分の貢献度をも決定する。
【００５５】
結合実験は７％のＤＭＳＯでの５０ｍＭのＥＰＰＳバッファ（ｐＨ９）を使用して実施された。注射器内の阻害剤は３００から５００μＭの濃度であり、測定細胞内のタンパク質の濃度は約２０ｍＭであった。
【００５６】
阻害剤の親和定数は約１μＭであり、これは阻害アッセイで得られた結果に則していた（ミクロモル濃度でピルビン酸塩の脱炭酸化を完全に阻害）。
【００５７】
特に、一般化学（構造）式（ＩＩ）の化合物は１．６（±０．３）μＭのフラボドキシンに対する親和性を有している。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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