(57)【要約】（Ｓ）エナンチオマーが少なくとも８０％  ｅｅまで濃縮された３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステルの調製、又は（Ｒ）エナンチオマーが少なくとも８０％エナンチオマー過剰（ｅｅ）まで濃縮された３−アミノ−３−アリールプロピオン酸の調製の方法が開示される。前記方法は、３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステルのエナンチオマー混合物を、エナンチオマー選択的に加水分解すること；および、加水分解されない光学的活性エステル（Ｓ）−（１）を回収すること、を含む。アスペルギルス属から得られるエステル加水分解酵素の使用もまた開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｓ）エナンチオマーが少なくとも８０％  エナンチオマー過剰（ｅｅ）まで濃縮された３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステルの調製方法であって：式（Ｓ）−（１）および（Ｒ）−（１）：
【化１】
2010505417.tif 000009
式中、Ａｒは、Ｃ4-30の無置換または置換の芳香族基であり、Ｒは、Ｃ1-10直鎖または分枝鎖アルキル基である、
で表される、３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステルのエナンチオマー混合物を、エステル加水分解酵素の存在下でエナンチオマー選択的に加水分解すること；および、加水分解されない光学的活性エステル（Ｓ）−（１）を回収することを含む方法。
【請求項２】
Ａｒが、フェニル、または置換フェニルである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、またはｓｅｃ−ブチルである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
濃縮される３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステルが（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステルである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
調製される（Ｓ）−エステルのエナンチオマー過剰が９０％より大きい請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
エステル加水分解酵素が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属から得られる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
エステル加水分解酵素が、アスペルギルス・フラバス  コルムナリス変種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ｖａｒ．ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）由来である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酵素が、水溶液中にあるか、まるごとの細胞中にあるか、凍結乾燥細胞中にあるか、固相支持体上に固定されているか、膜バイオリアクター内に保持されているか、又はそれらの組み合わせであるかである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
アスペルギルス・フラバス  コルムナリス変種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ｖａｒ．ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）の酵素が単離精製された形態である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
加水分解が４から１０のｐＨで起こる請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
加水分解が６から８のｐＨで起こる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
加水分解が＋５℃から＋１００℃の温度で起こる請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
加水分解が＋１５℃から＋４０℃の温度で起こる請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
（Ｓ）エナンチオマーが少なくとも８０％  ｅｅまで濃縮された３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステル調製のための、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）から得られるエステル加水分解酵素の使用。
【請求項１５】
（Ｓ）エナンチオマーが少なくとも８０％  ｅｅまで濃縮された３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステル調製のための、アスペルギルス・フラバス  コルムナリス変種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ｖａｒ．ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）由来のエステル加水分解酵素の使用。
【請求項１６】
（Ｒ）エナンチオマーが少なくとも８０％エナンチオマー過剰（ｅｅ）まで濃縮された３−アミノ−３−アリールプロピオン酸の調製方法であって：式（Ｓ）−（１）および（Ｒ）−（１）：
【化２】
2010505417.tif 000010
式中、Ａｒは、Ｃ4-30の無置換または置換の芳香族基であり、Ｒは、Ｃ1-10直鎖または分枝鎖アルキル基である、
で表される、３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステルのエナンチオマー混合物を、エステル加水分解酵素の存在下でエナンチオマー選択的に加水分解すること；および、加水分解産物である、光学的活性酸（Ｒ）−（２）を回収することを含む方法。
【化３】
2010505417.tif 000011
【請求項１７】
Ａｒが、フェニル、または置換フェニルである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
濃縮される３−アミノ−３−アリールプロピオン酸が（Ｒ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸である請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
調製される（Ｒ）−酸のエナンチオマー過剰が９０％より大きい請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
エステル加水分解酵素が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属から得られる請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
エステル加水分解酵素が、アスペルギルス・フラバス  コルムナリス変種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ｖａｒ．ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）由来である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
酵素が、水溶液中にあるか、まるごとの細胞中にあるか、凍結乾燥細胞中にあるか、固相支持体上に固定されているか、膜バイオリアクター内に保持されているか、又はそれらの組み合わせであるかである請求項１６〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
アスペルギルス・フラバス  コルムナリス変種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ｖａｒ．ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）の酵素が単離精製された形態である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
加水分解が４から１０のｐＨで起こる請求項１６〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
加水分解が６から８のｐＨで起こる請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
加水分解が＋５℃から＋１００℃の温度で起こる請求項１６〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
加水分解が＋１５℃から＋４０℃の温度で起こる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（Ｒ）エナンチオマーが少なくとも８０％  ｅｅまで濃縮された３−アミノ−３−アリールプロピオン酸調製のための、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）から得られるエステル加水分解酵素の使用。
【請求項２９】
（Ｒ）エナンチオマーが少なくとも８０％  ｅｅまで濃縮された３−アミノ−３−アリールプロピオン酸調製のための、アスペルギルス・フラバス  コルムナリス変種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ｖａｒ．ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）由来のエステル加水分解酵素の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エステル加水分解酵素存在下における生物学的分割（ｂｉｏｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）による、（Ｓ）エナンチオマー濃縮アミノ酸エステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベータ・アミノ酸およびエステル、例えば、３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステルは、合成中間体として、特に、医薬製剤の製造において、広く多様な、有用な用途を有する。これらの分子はキラルであり、単一エナンチオマー（鏡像異性体）形として、または、少なくともエナンチオマー濃縮形として入手可能であることが好ましい。
【０００３】
このような分子のエナンチオマー濃縮形、および対応するカルボン酸は、化学的技法によって調製することができる。例えば、特許文献１には、３−アミノ基の保護を含む、複数の工程を必要とする古典的分割法を用いて、３Ｓ−アミノ−３−アリールプロピオン酸（例えば、アリール＝３−ピリジル）およびその誘導体を作製する方法が記載されている。
【０００４】
エナンチオマー濃縮ベータ・アミノ酸およびエステルの調製のために、より経済的で、より生態学的に有利な代替方法として、生物触媒法が記述されている。例えば、（Ｓ）−酸を与えるリパーゼＰＳ酵素の使用が、特許文献２のほか、非特許文献１にも記載されている。
【０００５】
エナンチオマー高純度のベータ・アミノ酸および／またはベータ・アミノ酸エステルを調製するための生物触媒法を記載する他の参考文献としては、例えば、特許文献３が挙げられる。ただし、この文献は、それらの分子の記述を含むが、エナンチオマー濃縮化合物の合成法の記述を含まない。非特許文献２および３には、ジイソプロピルエーテルにおいて、ラセミ基質のアミノ基と、２，２，２−トリフルオロエチルエステルの間においてエナンチオマー選択的アミド形成を触媒するためにカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｔｃｔｉｃａ）リパーゼを使用することが記載されている。したがって、これらの参考文献によって記載される方法では、活性化エステルの使用によってのみ、アミノ基のアシル化が（Ｒ）中心に優先的に起こり、これが、（Ｓ）−無反応基質の濃縮、および、（Ｒ）濃縮アミドの形成をもたらす。同様に、非特許文献４には、非特許文献３と同様のルートではあるが、エナンチオマー高純度の３−アミノブチル酸を生産するルートが記載されている。
【０００６】
特許文献４は、Ｎ−ベンジル−Ｌ−アゼチジンカルボン酸塩の調製に使用される、（Ｓ）酸を与えるアスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）エステラーゼＡＴＣＣ  １１４９２を記載するが、これらの酵素を、ベータ・アミノ酸またはベータ・アミノエステルの調製において使用することについてはこれまで記載されていない。
【０００７】
上に特定した従来技術に記載されている生物触媒ルートは、ベータ・アミノ酸エステルの生物触媒的加水分解を含むが、全て加水分解の産物として、（Ｓ）−酸を与える。次に、対応する（Ｓ）−エステルが、所望の産物として要求されるならば、改めて、この（Ｓ）−酸の−通常、化学的方法による−再エステル化が必要とされることになる。その結果、この生物触媒ルートは、多数の方法工程を要し、そのため、比較的時間がかかり、高価となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，６７３，９２６  Ｂ２号
【特許文献２】米国特許公報２００４／００２９２３６  Ａ１
【特許文献３】ＷＯ  ０１／１６０９０Ａ１
【特許文献４】ＥＰ  １  ０５７  ８９４  Ａ２，Ａ３
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆａｕｌｃｏｎｂｒｉｄｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ａｒｏｍａｔｉｃ  β−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｖｉａ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（酵素分割による、エナンチオマー濃縮芳香族β−アミノ酸の調製），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１（２０００）  ２６７９−２６８１．
【非特許文献２】Ｍ．Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  β−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（β−アミノ酸の立体選択的合成における最近の進歩），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５８（２００２）７９９１−８０３５．
【非特許文献３】Ｇｅｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｎａｎｔｉｏｐｕｒｅ  β−ａｍｉｎｏ  ｅｓｔｅｒｓ  ｂｙ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  ｌｉｐａｓｅ  Ａ．（カンジダ・アンタルクチカ  リパーゼＡによる、エナンチオマー高純度β−アミノエステルの調製），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  １０  （１９９９）２５７３−２５８１．
【非特許文献４】Ｖ．Ｓａｎｃｈｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｔｃｔｉｃａ  ｌｉｐａｓｅ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｔｈｙｌ（±）−３−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ（エチル（±）−３−アミノブチル酸塩の、カンジダ・アンタルクチカ  リパーゼ触媒による分割），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１，ｐｐ．３７−４０，１９９７．
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、改良された、アミノ酸の酵素的調製方法を提供する。
【００１１】
一局面において、本発明は、（Ｓ）エナンチオマーが少なくとも８０％  ｅｅまで濃縮された３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステルの調製方法であって：式（Ｓ）−（１）および（Ｒ）−（１）：
【００１２】
【化１】
2010505417.tif 000002
式中、Ａｒは、Ｃ4-30の無置換または置換の芳香族基であり、Ｒは、Ｃ1-10直鎖または分枝鎖アルキル基である、
【００１３】
で表される、３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステルのエナンチオマー混合物を、エステル加水分解酵素の存在下でエナンチオマー選択的に加水分解すること；および、加水分解されない光学的活性エステル（Ｓ）−（１）を回収することを含む方法を提供する。
【００１４】
第二局面では、本発明は、（Ｓ）エナンチオマーが少なくとも８０％  ｅｅまで濃縮された３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステル調製のための、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）から得られるエステル加水分解酵素の使用である。
【００１５】
第三局面において、本発明は、（Ｒ）エナンチオマーが少なくとも８０％エナンチオマー過剰（ｅｅ）まで濃縮された３−アミノ−３−アリールプロピオン酸の調製方法であって：式（Ｓ）−（１）および（Ｒ）−（１）：
【００１６】
【化２】
2010505417.tif 000003
式中、Ａｒは、Ｃ4-30の無置換または置換の芳香族基であり、Ｒは、Ｃ1-10直鎖または分枝鎖アルキル基である、
【００１７】
で表される、３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステルのエナンチオマー混合物を、エステル加水分解酵素の存在下でエナンチオマー選択的に加水分解すること；および、加水分解産物である、光学的活性酸（Ｒ）−（２）を回収すること、を含む方法を提供する。
【００１８】
【化３】
2010505417.tif 000004
【００１９】
第四局面では、本発明は、（Ｒ）エナンチオマーが少なくとも８０％  ｅｅまで濃縮された３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステル調製のための、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓから得られるエステル加水分解酵素の使用である。
【００２０】
本発明は、エステルを分割して、未反応の（Ｓ）エステルを後に残すか、または、直接（Ｒ）酸を生産することを含み、そうすることによって、従来技術に記載される方法に比べて、方法工程の数を減らす。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明にしたがって調製される化合物は、式（Ｓ）−（１）で表される、（Ｓ）−エナンチオマー濃縮アミノ酸エステルである。
【００２２】
【化４】
2010505417.tif 000005
【００２３】
このアミノ酸は、式（Ｓ）−（１）および（Ｒ）−（１）によって表される、３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステルのエナンチオマー混合物から調製される：
【００２４】
【化５】
2010505417.tif 000006
式中、Ａｒは、Ｃ4-30の芳香族基であり、Ｒは、Ｃ1-10のアルキル基である、
【００２５】
好適なＡｒ基としては、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、または置換ヘテロアリールが挙げられる。本明細書で用いる場合、別に示さない限り、「アリール」とは、芳香族基、例えば、フェニル、ナフチルなどを示すものとする。アリール基は、無置換でもよいし、または、一つ以上の置換基によって置換されてもよい。アリール基における適切な置換基としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アラルキル、アミノ、アミド、ニトロ、チオ基、カルボキシル、ヒドロキシから成る群から独立に選ばれるものである。本明細書で用いる場合、別に示さない限り、「ヘテロアリール」とは、Ｏ、Ｎ、およびＳから選ばれる少なくとも一つのヘテロ原子を含む、５または６員の、任意の単環構造か、または、ヘテロアリール環が、もう一つのアリール基に縮合する、２環システムを示すものとする。好適なヘテロアリール基の例としては、例えば、ただしこれらに限定されないが、ピロリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、フラニル、ピラニル、イミダゾリル、チオフェニル、オキサゾリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、フラザニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、インダゾリル、プリニル、イソキノリル、キノリル、イソチアゾリルなどが挙げられる。好ましくはＡｒは、フェニル、または置換フェニルであるが、フェニルがもっとも好ましい。
【００２６】
好適なＲ基としては、Ｃ１−１０の直鎖または分枝鎖アルキル基が挙げられる。本明細書で用いる場合、「アルキル」とは、単独で用いる場合であれ、置換基の一部として用いる場合であれ、１から１０個の炭素原子を含む、直鎖および分枝鎖を含むものとする。例えば、アルキルラジカルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが挙げられる。好ましくは、Ｒは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、またはｓｅｃ−ブチルであるが、メチルまたはエチルがもっとも好ましい。
【００２７】
ある特に好ましい実施態様では、（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルが、下式で表される、（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルおよび（Ｒ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルの混合物から調製される。
【００２８】
【化６】
2010505417.tif 000007
【００２９】
本発明の３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステルは、（Ｓ）−エナンチオマーのエナンチオマー過剰、すなわち、「ｅｅ」を有する。「エナンチオマー過剰」または「ｅｅ」とは、一方のエナンチオマーが、他方と比べてどのぐらい過剰に存在するかを示すための尺度であり、下式で表される：
【００３０】
％エナンチオマー過剰＝（大量エナンチオマーのモル数−他方エナンチオマーのモル数／両エナンチオマーの合計モル数）＊１００
【００３１】
好ましくは、本発明の３−アミノ−３−アリールプロピオン酸エステルは、（Ｓ）−エナンチオマーが、少なくとも８０％  ｅｅまで、より好ましくは少なくとも９０％  ｅｅまで、さらに好ましくは少なくとも９５％  ｅｅまで濃縮される。
【００３２】
本発明において使用される酵素は、エステル加水分解酵素である。好ましくは、このエステル加水分解酵素は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属から得られ、より好ましくは、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）種から得られる。さらに好ましくは、このエステル加水分解酵素は、アスペルギルス・フラバス  コルムナリス変種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ｖａｒ．ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）由来のエステル加水分解酵素であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ｖａｒ．ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓのＵＫＮＣＣ  ０９５２５３およびＵＫＮＣＣ  ０１５９５８株がもっとも好ましい。この酵素は、水溶液中にあるか、まるごとの細胞中にあるか、凍結乾燥細胞中にあるか、固相支持体上に固定されているか、膜バイオリアクター内に保持されているか、又はそれらの組み合わせであるかであればよい。
【００３３】
（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチル調製のための、例示の反応スキームは以下の通りである：
【化７】
2010505417.tif 000008
【００３４】
反応パラメータの選択は、大部分常識的であり、適切な条件は、当該技術分野で周知の、通例法を用いて見出すことができる。ガイドラインとして、反応のｐＨ値は、４と１０の間、好ましくは５と９の間、より好ましくは６と８の間とすべきである。ｐＨが高すぎると、エステルの、選択されない化学的加水分解が起こる傾向が生ずる。ｐＨが低すぎると、酵素が分解する可能性がある。
【００３５】
反応は、好ましくは約摂氏１０度よりも高い温度で、より好ましくは少なくとも約１５℃の温度で実施される。反応温度は、好ましくは約１００℃未満、より好ましくは約４０℃である。
【００３６】
本発明の反応は、本目的のために用意されるいずれの反応容器においても、その反応容器が適切なｐＨおよび温度調節を有する限り、実施することができる。例えば、本発明の反応は、通常のバッチリアクター、ループリアクター、または酵素膜リアクターにおいて実施することができる。
【００３７】
反応は、通常、水性条件下で、例えば、水、および／またはバッファー水溶液において実施する。反応物質または反応産物の可溶性が懸案事項である場合、反応はまた、水またはバッファー水溶液に加えて、有機性助溶剤、例えば、疎水性有機溶媒、または親水性有機溶媒の存在下で実施してもよい。この疎水性有機溶媒は、例えば、エーテル、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテル、または、炭化水素、例えば、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、およびイソオクタンであってもよく、一方、親水性有機溶媒は、例えば、アルコール、例えば、ｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、およびｎ−ブタノール、テトラヒドロフランなどのエーテル、ジメチルスルフォキシドなどのスルフォキシド、アセトンなどのケトン、またはアセトニトリルなどのニトリルであってもよい。これら疎水性および親水性溶媒は、それぞれ、単一助溶剤として使用してもよいし、あるいは、互いに組み合わせて使用してもよく、さらに、疎水性溶媒および親水性溶媒の組み合わせも本発明の考慮の対象とされる。
【００３８】
所望の最終産物は、加水分解が起こった後、後に残留するので回収しなければならない。好ましくは、所望産物は、抽出、ろ過、またはそれらの組み合わせによって回収される。
【実施例】
【００３９】
下記の実施例は、本発明のいくつかの実施態様を具体的に例示するが、これらは、例示のみを意図するものであって、限定的であることを意図するものではない。
【００４０】
（例１）
基質液（クエン酸・リン酸ナトリウムバッファー中の、１０．０ｇ／Ｌの３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル）の調製
本基質液は、２０ｍｌのクエン酸／リン酸ナトリウムバッファー（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１９２１，４９，１８３にしたがって調製）に、０．２ｇのエステル（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００２，５８，７４４９にしたがって調製）を加えて調製した。ｐＨは、リン酸によって必要値に調整した。
【００４１】
（例２）
アスペルギルス細胞の調製
アスペルギルス・フラバス  コルムナリス変種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ｖａｒ．ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）は、英国国立カルチャーコレクション（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＵＫＮＣＣ）から、株番号０１５９５８として入手し（元々、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＣＡＢＩ）由来のもの）、グリセロール保存体として−７０℃で保存した。この保存体（２５０μｌ）を用いて、２５０ｍｌの遮蔽円錐フラスコにおいて５０ｍｌの滅菌ジャガイモデキストロースブロスに接種した。培養物は２５℃，２５０ｒｐｍで７２時間育成した。次に、この培養物を用いて、ベンチトップ発酵器において２．０Ｌの滅菌ジャガイモデキストロースブロスに接種し、この培養物を、２５℃，５００ｒｐｍ、１．０Ｌ空気／分、ｐＨ調節無しで７２時間育成した。細胞をろ過によって収集して、３５．７ｇの湿潤細胞を得、これを次に−２０℃で凍結した。この細胞を凍結乾燥して、７．２５ｇの乾燥細胞を得た。
【００４２】
（例３）
生物学的形質転換反応混合物の調製
基質保存液（２０ｍｌ）を、２００ｍｇの凍結乾燥アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）収集細胞と共に２７℃でインキュベートした（ブランクとして、一つの反応系では、細胞をバッファーと置き換えた）。
【００４３】
（例４）
生物学的形質転換のアキラル分析
反応は、アキラル分析のために、１００μｌの生物学的形質転換混合物を、９００μｌのＨＰＬＣ溶媒（２０％アセトニトリル＋１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ３．０）に移して停止させた。
分析：
アキラルＨＰＬＣ分析は、Ｃ１８（ＢＤＳ）カラム（１５０ｘ４．６ｍｍ、またはそれと等価のもの）においてＨＰＬＣ溶媒（２０％アセトニトリル＋１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ３．０）を２ｍｌ／分で用い、吸光度を２１０ｎｍで監視することによって行った。
【００４４】
（例５）
生物学的形質転換のキラル分析
キラル分析のために、１００μｌの生物学的形質転換反応系を、９００μｌのヘプタンに移し、混合し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、有機相をＨＰＬＣによって分析した。
分析：
エステル基質の両異性体を区別するために、キラル分析を行うことができる。移動相として９０％ヘプタン／１０％プロパン−２−オール使用による、Ｄｉａｃｅｌ  Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ−Ｈカラム（２５０ｘ４．６ｍｍ、またはそれと等価のもの）を用いた。１ｍｌ／分の流速、および２１０ｎｍにおける検出を用いた。
【００４５】
結果：
ｐＨ７．０において行われた生物学的形質転換では、１７時間の反応時間から、５０％の転換が得られ（ブランクの転換は７％）、（Ｓ）−エステルの単離純度は、＞９８．５％  ｅｅであった。
【国際調査報告】
2010505417.tif 000012
2010505417.tif 000013