(57)【要約】  天然ヒトインターフェロン−βにしたがって番号付けされた２５位でアスパラギンが組換えによりアスパラギン酸残基で置き換えられたヒトインターフェロン−βタンパク質類似体はＩＦＮ−β  １ｂと比較して増大したレベルでヒトインターフェロン−β（例えばＩＦＮ−β  １ｂ）の生物学的活性を呈する。これらの類似体はＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βをコードする遺伝子を細胞に導入し、そして組換えタンパク質を発現させることにより得られる。得られたＩＦＮ−βタンパク質類似体は多発性硬化症を含む疾患を処置するためのＨＡ含有またはＨＡ不含治療に組み入れるための大規模な製造に適当である。酵素消化、続いてＲＰ−ＨＰＬＣを用いてタンパク質に関するフィンガープリントプロフィールを生み出す還元型Ｌｙｓエンドプロテイナーゼ−Ｃペプチドマップ技術はＩＦＮ−βタンパク質類似体生成物に関する確認試験として品質管理においても有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｓｎ２５不含Ａｓｐ２５ヒトインターフェロン−βを含むヒトインターフェロン−βタンパク質類似体。
【請求項２】
該タンパク質類似体が天然ヒトインターフェロン−βの生物学的活性を呈する請求項１に記載のタンパク質類似体。
【請求項３】
（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のタンパク質類似体。
【請求項４】
天然インターフェロン−βにしたがって番号付けされた１７位でシステインが欠失しているかまたは中性アミノ酸により置き換えられている請求項１に記載のタンパク質類似体。
【請求項５】
該システイン残基がセリン残基により置き換えられている請求項４に記載のタンパク質類似体。
【請求項６】
２５位で残基がイソアスパラギン酸および環状イミドからなる群から選択されるヒトインターフェロン−βをさらに含む請求項５に記載のタンパク質類似体。
【請求項７】
タンパク質類似体がグリコシル化されていない請求項５に記載のタンパク質類似体。
【請求項８】
タンパク質類似体がＮ末端メチオニン欠失を有する請求項７に記載のタンパク質類似体。
【請求項９】
タンパク質類似体がＩＦＮ−β  １ｂよりも大きな生物学的活性を有する請求項２に記載の合成タンパク質類似体。
【請求項１０】
タンパク質類似体がＨＡ不含ＩＦＮ−β  １ｂよりも少なくとも約１.６倍大きい生物学的活性を有する請求項９に記載のタンパク質類似体。
【請求項１１】
タンパク質類似体がＨＡ添加ＩＦＮ−β  １ｂよりも少なくとも約１.７倍大きい生物学的活性を有する請求項９に記載のタンパク質類似体。
【請求項１２】
薬学的に許容される担体溶媒と混合された治療有効量の請求項１に記載のタンパク質類似体を含むＩＦＮ−β活性を有する治療用組成物。
【請求項１３】
組成物がＨＡ不含である請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
組成物がＨＡを伴って製剤化されている請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
Ａｓｐ２５インターフェロン−βコード化配列で細胞を形質転換し；そして
形質転換された細胞を培養してＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体を発現させること；
を含むＩＦＮ−βタンパク質類似体を製造する方法。
【請求項１６】
該Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体を単離し、そして精製すること；
をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法にしたがって製造されたＡｓｎ不含Ａｓｐ２５ヒトインターフェロン−βタンパク質類似体。
【請求項１８】
有効量の請求項１２に記載の組成物を患者に投与することを含む患者を処置する方法。
【請求項１９】
処置が患者の多発性硬化症のためのものであり、そして有効量が組成物の治療有効量である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該多発性硬化症が再発−寛解型である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｌｙｓエンドプロテイナーゼ−Ｃを含有する緩衝溶液中少なくとも６.５のｐＨでタンパク質試料をインキュベートし；
Ｌｙｓエンドプロテイナーゼ−Ｃにタンパク質試料を消化させ；
消化されたタンパク質試料を還元剤で還元し；そして
液体クロマトグラフィーにより消化されたタンパク質試料のペプチドフラグメントを解析すること；
を含むペプチドマッピング方法。
【請求項２２】
還元剤がジチオスレイトール（ＤＴＴ）である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質試料がヒトＩＦＮ−βタンパク質類似体である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
液体クロマトグラフィーがＲＰ−ＨＰＬＣである請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
インキュベーションが約７のｐＨで行われる請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
緩衝溶液が安定剤をも含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
安定剤がアルキルベタイン両性界面活性剤である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ａｓｐ２５ヒトインターフェロン−βをコードするＤＮＡ配列を有する微生物。
【請求項２９】
Ａｓｐ２５ヒトインターフェロン−βをコードし、そして（配列番号：５）に示される配列を含むＤＮＡ配列。
【請求項３０】
Ａｓｐ２５ヒトインターフェロン−βの発現に用いられるプロモーター配列、（配列番号：６）に示される配列を含むコード化およびプロモーター配列をさらに含む請求項２９に記載の配列。
【請求項３１】
医薬的利用に許容される純度を有する請求項１に記載のヒトインターフェロン−β類似体。
【請求項３２】
形質転換される細胞が微生物細胞、ＣＨＯ細胞および昆虫細胞からなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項３３】
形質転換される細胞が大腸菌細胞である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
形質転換される細胞が真核細胞である請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１  技術分野
本発明は生物学的活性タンパク質化学の一般的な分野に入る。さらに具体的にはシステイン、アスパラギンおよびその他の残基の置換、欠失または修飾により天然のタンパク質とは異なる、変異により改変されたインターフェロン−β類似体に関する。
【背景技術】
【０００２】
２  背景技術
インターフェロン−βはヒト疾患の処置、とりわけ多発性硬化症において有用であることが分かっている。多発性硬化症（ＭＳ）は神経線維を取り囲む保護鞘が破損したときに生じる中枢神経系の、慢性のしばしば身体障害をもたらす疾患である。ＭＳ患者の約３０％が、病徴が再燃後に全体的または部分的に消失し、そして数か月または数年持続し得る安定期が続く疾患の再発−寛解形態を被る。ベータインターフェロン（インターフェロン−βまたはＩＦＮ−β）の投与はＭＳの再発−寛解形態の処置のためにＦＤＡにより承認されている。現在では、ＭＳ治療のために市販されている三つのインターフェロン−β生成物、Betaseron（登録商標）、Avonex（登録商標）およびRebif（登録商標）の売上高は合わせて年間３０億ドルを超える。さらに有効なＩＦＮ−β生成物およびそれらを製造するためのさらに効率的な方法が継続的に必要とされている。
【０００３】
インターフェロン−β基盤の医薬品の大規模製造を促進するために組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術が開発されている。組換えＤＮＡ分子は、自然のまたは合成のＤＮＡセグメントを、生存細胞において複製できるＤＮＡ分子に結合させることにより生存細胞の外で構築されたＤＮＡ分子、またはその複製の結果である分子である。組換えＤＮＡ技術により天然のまたは変異により改変されたタンパク質の大規模製造が可能になる。とりわけこれらの技術により対処される必要のある一つの問題は、そのアミノ酸配列が図１（配列番号：１）で提供されるヒトβインターフェロンが１７、３１および１４１位でシステイン残基を含有し（Gene(1980) 10:11-15およびNature(1980) 285:542-547）、それらは製造工程のいくつかの間に分子間または分子内連結を形成することができるという点であった。これらの連結は変性ＩＦＮ−βの復元の間に形成され、望ましくないミスフォールディングされた構造および凝集物を導き得る。ｒＤＮＡ技術によるＩＦＮ−βの微生物調製の過程で、高濃度のＩＦＮ−βを含有する抽出物中でこの分子間連結のためにＩＦＮ−βの二量体およびオリゴマーが形成されることが観察されている。この多量体形成のためにＩＦＮ−βの精製および単離は非常に骨の折れる、そして時間のかかるものになり、そして精製および単離手順、例えば精製の間にタンパク質を還元すること、およびそれをその元来の立体配置に回復するためにそれを再度酸化することのいくつかのさらなる工程が必要とされ、それにより誤ったジスルフィド結合形成の可能性が増大する。加えてこの多量体形成は特異性の低い生物学的活性に関連している。
【０００４】
これらの問題点に対処するために、微生物により製造された生物学的に活性なＩＦＮ−βタンパク質類似体を、その活性に有害な影響を及ぼさないが、タンパク質に望ましくない三次元構造（例えばタンパク質の活性を低減させる立体配置）を取らせる分子間架橋または分子内結合を形成するその能力を低減させるか、または排除する型に改変するために、改良ｒＤＮＡ技術が開発されている。定方向変異誘発技術は、その親タンパク質の望ましい活性を保持するが、分子間連結または望ましくない分子内ジスルフィド結合を形成する能力を欠く、変異により改変された生物学的に活性なタンパク質類似体（本明細書では「タンパク質類似体」とは一つ以上のアミノ酸が遺伝的および／または化学的および／または熱的に修飾され、そして親タンパク質の生物学的活性を保持する合成タンパク質を指す）を形成するために成功裏に用いられている。１７位で欠失された、または別のアミノ酸により置き換えられたシステイン残基を有するＩＦＮ−β生物学的活性タンパク質の合成タンパク質類似体は望ましい活性および特徴を有することが見出されている。
【０００５】
とりわけＩＦＮ−βの合成組換えタンパク質類似体であるインターフェロン−β  １ｂ（ＩＦＮ−β  １ｂ）は１７位のシステイン残基がセリン残基により置き換えられている生物学的活性タンパク質である。微生物により生成されたタンパク質であるため、ＩＦＮ−β  １ｂはグリコシル化されていない。それはＮ末端メチオニン欠失をも有する。ＩＦＮ−β  １ｂはBetaseron（登録商標）として市販されている医薬品への製剤化に成功しており、それはＭＳの処置および管理に有効であることが示されている。このタンパク質類似体、その製造のための物質および技術、治療薬としてのその製剤化ならびにＭＳを処置するためのその使用は１９８６年５月１３日発行の特許第４５８８５８５号；１９８８年４月１２日発行の特許第４７３７４６２号；および１９９０年９月２５日発行の第４９５９３１４号（その各々はこれらの特色の開示に関して出典明示により本明細書の一部とする）を含む多くの米国特許および出願において記載され、そして権利が主張される。
【０００６】
医薬用のＩＦＮ−βの大規模製造はまた哺乳動物起源、とりわけチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からも行われる。ＩＦＮ−β  １ａと称されるこのＩＦＮ−β類似体はＩＦＮ−β  １ｂのＳｅｒ１７変異を欠き、そしてグリコシル化されている。ＩＦＮ−β  １ａはAvonex（登録商標）およびRebif（登録商標）として市販されている治療用生成物に製剤化される。
たいていの治療薬と同様、さらに強力な生物学的に活性な薬剤の同定および製造が継続的に望まれている。ＩＦＮ−β基盤の医薬品の場合、生物学的活性が増大されたＩＦＮ−β類似体が望ましい。
【０００７】
加えて、Betaseron（登録商標）を含むいくつかのＩＦＮ−β医薬製剤は一般的なタンパク質安定剤であるヒトアルブミン（ＨＡまたはＨＳＡ）を含有する。ＨＡはヒト血液生成物であり、そして供給が漸減している。したがってさらに最近では、ＨＡ不含薬物製剤が望まれており、そして安定な、および有効なＨＡ不含ＩＦＮ−β製剤が望まれている。
一般に、ＨＡを伴って、または伴わずに製剤化できる、生物学的活性が増大したＩＦＮ−β組成物およびかかる組成物を製造する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は天然のインターフェロン−βにしたがって番号付けされた２５位のアスパラギンが変異を介してアスパラギン酸残基により置き換えられているＩＦＮ−βを含有する精製および単離された組換えヒトインターフェロン−βタンパク質類似体を提供することによりこれらの必要性に対処する。ｒＤＮＡ技術を用いてＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βをコードする遺伝子を提供することにより、およびこの遺伝子を微生物細胞または真核細胞（例えばＣＨＯ細胞または昆虫細胞）のような細胞に導入して、これらの細胞においてＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体を発現させることによりＡｓｎ２５Ａｓｐ変異を導入する。いくつかの実施態様では、細胞の形質転換に用いられるｒＤＮＡはまたプロモーター配列をも含む。組換えインターフェロン−βタンパク質類似体は天然のＡｓｎ２５  ＩＦＮ−βを含まず、そしてＩＦＮ−β  １ｂと比較して増大したレベルでＩＦＮ−β（例えばＩＦＮ−β  １ｂ）の生物学的活性を呈する。このタンパク質類似体はＨＡ不在下で安定であり、そしてＨＡ不含またはＨＡ含有治療用組成物に製剤化できる。
【０００９】
組換えインターフェロン−βタンパク質類似体はＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体に加えて、図２で示されるイソａｓｐ２５およびイミド２５タンパク質変異体のようなその分解生成物をも含有し得る。
具体的な実施態様では、組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βは、天然のインターフェロン−βにしたがって番号付けされた１７位でシステインが欠失されているか、または中性アミノ酸、とりわけセリンにより置き換えられており、そして２５位のアスパラギンが組換えによりアスパラギン酸と交換されている合成ヒトインターフェロン−β  １ｂタンパク質類似体である。この実施態様では、Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−βはＮ末端メチオニン欠失を有し、そしてグリコシル化されていない。具体的には、Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−βは図３（配列番号：２）で示される一次アミノ酸配列を有し得る。
【００１０】
少なくとも約６.５、好ましくは約６.９から約７.１の範囲のｐＨで、および最も好ましくは約７のｐＨで実施される還元型Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼアッセイを用いてヒトインターフェロン−βタンパク質類似体を特徴付けすることができる。このｐＨ範囲で実施されるＬｙｓ−Ｃ消化は試料中の分解生成物の相対量を改変することなく、特異的部位でタンパク質を切断する。消化で得られたペプチドフラグメントを逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣによりさらに分離し、そしてエドマンシークエンシングにより同定することができる。
ＨＡ不含およびＨＡ含有製剤を含む治療用組成物中の活性タンパク質類似体化合物の製剤、ならびに製造および使用の方法もまた提供される。
本発明のこれらのおよびその他の目的および特色は以下の本発明の詳細な説明を添付の図面と組み合わせて読めばさらに十分に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒトＩＦＮ−βのアミノ酸配列（配列番号：１）の図である。
【図２】天然のＩＦＮ−βにしたがって番号付けされた２５位のアスパラギン酸残基を示すＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β減成経路を説明する図である。
【図３】本発明によるＡｓｎ２５Ａｓｐ変異の部位およびＬｙｓ−Ｃ切断部位を示すＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂのアミノ酸配列（配列番号：２）の図である。
【図４Ａ】Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂおよびＡｓｎ２５  ＩＦＮ−β  １ｂの還元型Ｌｙｓ−Ｃペプチドマップを示す。
【図４Ｂ】図４Ａのマップの一部の拡大図を示す。
【図５Ａ】Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂおよびＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ高温処理試料の還元型Ｌｙｓ−Ｃペプチドマップを示す。
【図５Ｂ】図５Ａのマップの一部の拡大図を示す。
【図６】Ａｓｎ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ、Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂおよびＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ高ｐＨ処理試料のＭｏｎｏ−Ｓカチオン交換（ＣＥＸ）ＨＰＬＣを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
今回、本発明の化合物、組成物、原料ならびに関連する技術および使用をいくつかの実施態様に関連して記載する。記載された実施態様の重要な特性および特徴を文章の形で説明する。本発明はこれらの実施態様に関連して記載されるが、本発明はこれらの実施態様に限定されると意図されるわけではないということを理解すべきである。対照的に、代替え、改良および均等物を包含することが意図され、特許請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲内に含まれ得る。以下の記載では、本発明の完全な理解を提供するために非常に多くの具体的な詳細を示す。これらの具体的な詳細のいくつかまたは全てを伴わずとも本発明を実行することができる。その他の例では、本発明を不必要に不明瞭にしないために、周知の処理操作は詳細には記載されていない。
【００１３】
序文
本発明はＩＦＮ−β  １ｂと比較して増大したレベルでヒトインターフェロン−β（例えばＩＦＮ−β  １ｂ）の生物学的活性を呈する、組換えにより製造されたインターフェロン−βタンパク質類似体を提供する。ＨＡを伴って、または伴わずにタンパク質類似体を製剤化できるが、タンパク質安定化にＨＡは必要としない。具体的には、インターフェロン−βタンパク質類似体は、天然のインターフェロン−βにしたがって番号付けされた２５位でアスパラギンがアスパラギン酸残基により組換えにより置き換えられたヒトインターフェロン−β類似体を含有する。このインターフェロン−βタンパク質類似体は天然のＡｓｎ２５  ＩＦＮ−βを含まない。
【００１４】
一つの実施態様では、組換えにより製造されたインターフェロン−βタンパク質類似体はまた図２で示される生成物のようなＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βの分解生成物をも含有し得る。Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−βの主な分解経路を記載する図２のスキームを参照して、Ａｓｐ２５残基２０１を、スクシンイミド中間体２０５（イミド２５）を介してイソアスパラギン酸残基２０３（イソａｓｐ２５）に変換することができる。かかる変換は、例えば高温または高ｐＨ条件への暴露時に生じ得る。イソアスパラギン酸またはスクシンイミドにより２５位で置換されたインターフェロン−β類似体は組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β類似体の生物学的活性を有意に低下させず、そしてＩＦＮ−β類似体生成物およびその治療用製剤中に存在し得る。ｒＤＮＡ技術を用いてＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βをコードする遺伝子を提供することにより、およびこの遺伝子を微生物細胞または真核細胞（例えばＣＨＯ細胞または昆虫細胞）のような細胞に導入して、これらの細胞においてＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体を発現させることによりＡｓｎ２５Ａｓｐ変異を導入する。いくつかの実施態様では、細胞の形質転換に用いられるｒＤＮＡはまたプロモーター配列をも含む。
【００１５】
少なくとも６.５、好ましくは約７のｐＨで実施される還元型Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼアッセイを用いてＩＦＮ−βタンパク質類似体を特徴付けすることができる。このｐＨで実施されるＬｙｓ−Ｃ消化は試料中の分解生成物の相対量を改変することなく、特異的部位でタンパク質を切断する。消化で得られたペプチドフラグメントをＲＰ  ＨＰＬＣによりさらに分離し、収集し、そしてエドマンシークエンシングにより同定することができる。
治療用組成物中の活性タンパク質類似体化合物の製剤、ならびに製造および使用の方法もまた提供される。
【００１６】
「タンパク質類似体」とは本明細書では、一つまたはそれより多いアミノ酸が遺伝的および／または化学的に修飾されており、そして細胞の細胞変性効果または抗増殖活性のような親タンパク質の生物学的活性を保持する合成タンパク質を指す。具体的な実施態様では、組換えヒトインターフェロン−βタンパク質類似体は、天然のインターフェロン−βにしたがって番号付けされた１７位でシステインが欠失されているか、または中性アミノ酸、とりわけセリンにより置き換えられており、そして２５位のアスパラギンが組換えによりアスパラギン酸により置き換えられているヒトインターフェロン−β  １ｂタンパク質類似体（例えばＩＦＮ−βｓｅｒ１７，ａｓｐ２５）を含有する。その他の実施態様では、Ａｓｐ２５はさらにイソアスパラギン酸またはスクシンイミド残基に化学的に修飾される（例えば各々eＩＦＮ−βｓｅｒ１７，イソａｓｐ２５２５またはＩＦＮ−βｓｅｒ１７，スクシンイミド２５）。Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体はＩＦＮ−β  １ｂに比較して増大したレベルでヒトインターフェロン−βの生物学的活性を呈する。加えてこのタンパク質類似体のＨＡ不含製剤では、強化された生物学的活性が観察され、ＨＡ不含ＩＦＮ−β  １ｂ治療を可能にする。
【００１７】
Ａｓｎ２５のＡｓｐ２５への置き換え
本発明の合成タンパク質類似体では、システイン１７残基が欠失されるか、またはセリン、スレオニン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンもしくはメチオニンにより置き換えられてよい。具体的な実施態様では、置換はセリン１７である。アスパラギン２５残基はｒＤＮＡ技術を用いてアスパラギン酸残基により置き換えられる。図３を参照して、本発明によるＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体の一次（アミノ酸配列（配列番号：２））および二次（フォールディング、架橋）構造を説明する。２５位では天然のＡｓｎ残基は組換えにより導入されたＡｓｐ残基で置き換えられる。例えばＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β類似体を高温または高ｐＨのような異性化誘起条件に暴露することによりＡｓｐ２５残基を部分的に、または実質的にスクシンイミドおよび／またはイソアスパラギン酸に変換することができる。これらの条件はアスパラギン酸のＬ体からＤ体への光学異性化を誘起することもできる。本発明はＡｓｐ２５、イソａｓｐ２５およびイミド２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体のＬおよびＤ体双方を包含する。
【００１８】
タンパク質類似体を組換え合成技術により製造し、場合によってはそれに発現後化学的修飾を追加することができる。Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ合成タンパク質類似体を組換えＤＮＡ定方向変異誘発技術により製造する。Ｃｙｓ１７Ｓｅｒ交換は前記で本出願の背景技術のセクションにて参照された特許に記載されている。定方向変異誘発技術は周知であり、そしてLather, R. F. and Lecoq, J. P. in Genetic Engineering Academic Press(1983)pp 31-50により概説されている。オリゴヌクレオチド−特異的変異誘発は具体的にはSmith, M. and Gillaun, S. in Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press(1981)3:1-32により概説されている。Ａｓｎ２５Ａｓｐ変異を本明細書にてさらに詳細に記載する。以下の変異誘発の記載は例としてのみ提供され、そしていかなるようにも本発明を限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明はまた当業者に明白であろう以下のプロトコールの修飾をも包含する。
【００１９】
鋳型として提供されるＩＦＮ−β生成プラスミド（ｐＳＹ２５０１）でＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）方法により変異を導入する。Quik−Change変異誘発キット（Stratagene kit #200516, Stratagene, La Jolla, CA）を使用することができる。ＰＣＲにおいて合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる。Ａｓｎ２５Ａｓｐ変異誘発に使用されるプライマーを以下に示す：
Ａｓｐ２５フォワードプライマーＢＳＮ２５ＤＦ（配列番号：３）：
【化１】
2010500024.tif 000002
Ａｓｐ２５リバースプライマーＢＳＮ２５ＤＲ（配列番号：４）：
【化２】
2010500024.tif 000003
【００２０】
フォワードプライマー（配列番号：３）はヌクレオチドＧＡＴをコードするアスパラギン酸を含有する。リバースプライマー（配列番号：４）はフォワードプライマーに相補的である。二つのプライマーは逆の配向であるが、同一の位置でプラスミドＤＮＡの異なる鎖に結合する。全プラスミドはＰＣＲにより複製され、そして次にＤｐｎＩ酵素により消化される。ＤｐｎＩはメチル化された細菌性鋳型ＤＮＡ鎖のみを消化するが、メチル化されていないＰＣＲ複製プラスミドをそのまま残す。次いでＤｐｎＩ処理反応混合物をXL Goldウルトラコンピテント細胞（Stratagene）に加えて、変異担持プラスミドで細胞を形質転換させる。カルベニシリンおよびトリプトファンの存在下、Luria寒天培地中で細胞コロニーを増殖させる。次いでいくつかのコロニーを取り、そしてカルベニシリンおよびトリプトファンの存在下、Luria培地中で培養する。各培養物からプラスミドＤＮＡを抽出し、そしてプラスミドのＩＦＮ−β挿入をシークエンシングすることにより分析する。ＩＦＮ−β挿入のシークエンシングによりＡｓｎ２５からＡｓｐ２５への変異を確認する。プラスミドの残りの徹底した制限消化をも実施する。ＩＦＮ−β挿入はプロモーター、直に続いてＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂタンパク質をコードする遺伝子を含有する。Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂコード化遺伝子（配列番号：５）およびＩＦＮ−β挿入（遺伝子およびプロモーター、配列番号：６）に関するヌクレオチド配列を以下に提供する。アスパラギン酸コード化コドンＧＡＴおよび停止コドンＴＧＡに下線を付している。
【００２１】
Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂコード化遺伝子配列（配列番号：５）
【化３】
2010500024.tif 000004
【００２２】
Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂの発現のために用いられるプロモーターおよび遺伝子配列（配列番号：６）
【化４】
2010500024.tif 000005
【００２３】
標準的なタンパク質発現技術を用いて細菌細胞においてＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βを発現させた。トリプトファンレプレッサーを発現する大腸菌細胞をＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ遺伝子を担持するプラスミドで形質転換した。細胞を培養してＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂを発現させ、そして発現されたタンパク質を単離し、そして精製した。
【００２４】
哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ−Ｋ）、バキュロウイルス／昆虫細胞、または酵母系のようなその他の発現系を使用できることは当業者には理解されよう。これらの系のいくつかで（例えば真核細胞において）実施された発現は末端Ｍｅｔ欠失を伴わないＡｓｐ２５  ＩＦＮタンパク質またはグリコシル化タンパク質に至り得て、そしてこれらは本発明の範囲内である。
【００２５】
Ａｓｐ２５変異体タンパク質の同一性をペプチドフラグメントのエドマンシークエンシングにより確認し、それはタンパク質をｐＨ７で還元型Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼマッピング消化に供することにより得られた。組換えにより製造されたＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂは多量のＡｓｐ２５種および少量の二つの分解生成物、イソａｓｐ２５およびイミド２５  ＩＦＮ−β  １ｂ類似体を含有することが決定された。これらの生成物は図２で説明される分解経路を介して組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βから形成される。化学的手段または熱処理によりイソａｓｐ２５およびイミド２５種の量を改変することができる。例えばＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βを高温処理に供したとき、イソａｓｐ２５種の画分を増加させることができる。混合物のｐＨを変えることによりＩＦＮ−βタンパク質類似体中のＡｓｐ２５、イソａｓｐ２５およびイミド２５種の相対比率を変化させることもできる。例えばイミド２５画分の相対量は９.２５のような高ｐＨで減少する。「ヒトＩＦＮ−βタンパク質類似体」なる用語は組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βならびにイソａｓｐ２５およびイミド２５のようなその分解生成物を包含する。組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体はＡｓｎ２５  ＩＦＮ−βを全く含まないことを理解すべきである。米国特許出願第１１／２７１５１６号に記載されるように、アスパラギン残基の化学的脱アミド化を介して２５位で脱アミド化されたインターフェロン類似体を得ることは可能であるが、化学的に脱アミド化されたインターフェロン生成物は一般的に未反応の天然のＡｓｎ２５タンパク質を含有する。Ａｓｎ２５インターフェロンはＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体よりも低い生物学的活性を呈し、そしてそれ故にＡｓｎ２５不含であるインターフェロン類似体を得ることは有利である。
【００２６】
細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）アッセイおよびＨｓ２９４Ｔ抗増殖アッセイを実施することにより、組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体生成物の生物学的活性を研究した。Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂのＣＰＥ活性は５.８２×１０７ＩＵ／ｍｇであり、それはＨＡ不含Ａｓｎ２５  ＩＦＮ−β  １ｂのＣＰＥ活性よりも１.６倍高く、そしてＨＡ添加ＩＦＮ−β  １ｂ（Betaseron（登録商標））のＣＰＥ活性よりも１.７倍高い。Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂのＨｓ２９４Ｔ抗増殖生物学的活性は５.７２×１０７ＩＵ／ｍｇであり、それはＨＡ不含Ａｓｎ２５  ＩＦＮ−β  １ｂのＨｓ２９４Ｔ抗増殖活性よりも１.３倍高く、そしてＨＡ添加ＩＦＮ−βｓｅｒ１７の対応する活性よりも１.７倍高い。
【００２７】
Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体は高ｐＨおよび高温条件を含む多くの条件下で、ＨＡ不在下でその生物学的活性を保持する。それ故にＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βを含有する治療用生成物の生物学的活性を維持するために、ＨＡを伴う製剤化は必要とされない。高ｐＨまたは高温処理されたＨＡ不含Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ試料の特徴付けを、タンパク質そのまま、またはＬｙｓ−Ｃ消化により得られたペプチド混合物のいずれかで実施できるＲＰ  ＨＰＬＣおよびＣＥＸ  ＨＰＬＣにより行った。予期されないタンパク質減成を示し得る予期されないピークが、高ｐＨ（例えばｐＨ９.２５）に供された試料および高温（例えば３７℃）処理に供された試料の双方において観察された。Ａｓｐ２５、イソａｓｐ２５およびイミド２５種の存在が全ての試料に関して確認された。試料を３７℃に１８日間暴露することにより、ＩＦＮ−βタンパク質類似体中のイソａｓｐ２５画分の量の増加を導く。試料をｐＨ９.２５に４時間暴露することにより、イミド２５種画分の減少およびＡｓｐまたはイソａｓｐ画分の増加を招く。
【００２８】
組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体ＩＦＮ−βの生物学的活性は、Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−βが高温に暴露されたときに増大することも観察された。３７℃で１８日間インキュベートされたＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ試料のＣＰＥ活性は、ＨＡ添加ＩＦＮ−β  １ｂと比較して２.９倍の増大、およびＨＡ不含ＩＦＮ−β  １ｂと比較して２.７倍の増大を呈し、そして９.６×１０７ＩＵ／ｍｇに達する。生物学的活性の増大はＩＦＮ−βタンパク質類似体中のイソａｓｐ２５またはイミド２５種の比率がより高いことに起因し得る。
【００２９】
一般的に、組換えにより製造されたＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体中のイソａｓｐ２５またはイミド２５類似体の量の増加を導き得る多くの可能な技術がある。これらの技術は大規模の医薬品の製造に適用するのに有効および適当であり得て、そして天然の生物学的活性、好ましくは増大した生物学的活性を維持しながらＡｓｐ２５、イソａｓｐ２５およびイミド２５の相対量を変化させる任意の技術を用いることができる。概して中から高温（例えば約２５−６０℃）および種々のｐＨ、低（例えば約０−４）、中（例えば約４−１０）から高（例えば約１０−１４）ｐＨで、条件に依存して約１分から約９０日以上の反応時間でのインキュベーションにより、Ａｓｐ２５、イソａｓｐ２５およびイミド２５  ＩＦＮ−β類似体の相対量を変えることができる。例えばＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β（例えばＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ａまたはＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ）の６０℃まで；または約２５℃から４０℃、例えば約３７℃で少なくとも２４時間、例えば１８日間、または４０日までのインキュベーションにより、生物学的活性が増大したＩＦＮ−βタンパク質類似体を得ることができる。
【００３０】
組換えヒトＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体を製造するための技術はＡｓｎ２５種を含有しない生成物を製造する。Ａｓｐ２５、イソａｓｐ２５およびイミド２５の相対量は組換えタンパク質生成の条件および続く高温または高ｐＨへの暴露のような化学的処理に依存して変わり得る。例えば少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または約１００％のＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βを含有するＩＦＮ−βタンパク質類似体を得ることができる。ＩＦＮ−βタンパク質類似体混合物の個々の種を精製および単離することが望ましいかもしれない場合もある。例えば以下の条件を用いてカチオン交換（ＣＥＸ）ＨＰＬＣによりこの精製および単離を達成することができる；
クロマトグラフィー固定相：Pharmacia Mono Ｓ  ＨＲ  ５／５、または均等物；
溶離バッファー：０.５％  Empigen ＢＢ（ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシン（アルキルベタインラウリルジメチルベタイン、両性界面活性剤））を含む２０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７.０；
グラジエント：溶離バッファー中２００ｍＭまで、またはそれより高いＮａＣｌ直線グラジエント。
製造用にこの技術を大規模に行うことができる。
【００３１】
一つの実施態様では、合成タンパク質類似体が微生物により生成されたとき、それはグリコシル化されない。またタンパク質類似体はＮ末端メチオニン欠失を有する。その他の実施態様では、タンパク質類似体は哺乳動物細胞において生成され、そして故にグリコシル化され得る。
【００３２】
以下でさらに詳細に記載されるように、種々の活性アッセイにより、組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体はその親Ａｓｎ２５  ＩＦＮ−β  １ｂタンパク質と比較して増大した生物活性を有することが実証される。ＨＡ不含試料で安定性結果が得られており、それは本発明の組換えＩＦＮ−βタンパク質類似体が治療薬としてのＨＡ不含製剤に適当であることを示している。治療用組成物を形成するために、前記されたように部分的または実質的に純粋であるタンパク質類似体を、この型の治療用生成物用に周知であるような薬学的に許容される担体溶媒と混合することができる。
【００３３】
本発明の組成物がＨＡ不含安定性を呈することは、それの有利な特性であるが、Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体をＨＡ含有製剤に利用することもでき、そしてこれらは本発明の範囲から排除されるものではない。加えて、本発明は主にＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体に関して本明細書にて記載されるが、本発明はまたＩＦＮ−β  １ａ類似体およびＩＦＮ−βタンパク質のその他の機能的変異体を含むその他のＩＦＮ−β類似体にも適用可能である。
【００３４】
本発明のＩＦＮ−βタンパク質類似体および組成物は、患者における細胞増殖を調節すること、およびウイルス疾患の患者を処置することを含む多くの適応での治療薬における有用性を示唆する生物学的活性を呈する。本発明による治療薬は患者の多発性硬化症、とりわけ再発−寛解型のＭＳの処置に有用であることが証明できる。
【実施例】
【００３５】
実施例
以下の実施例は本発明の態様を説明するものであるが、いかなるときも本発明を限定することを意図するものではない。
【００３６】
実施例１  組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂの製造
ＰＣＲ混合物の代表的な組成および組換えにより脱アミド化されたＩＦＮ−β  １ｂの製造のための代表的なＰＣＲプロトコールを各々表１および表２において説明する。
【００３７】
表１
ＰＣＲ混合物の組成
【表１】
2010500024.tif 000006
【００３８】
表２
代表的なＰＣＲプロトコール
【表２】
2010500024.tif 000007
【００３９】
ＰＣＲの完了時に、ＤｐｎＩ（２μｌ）を各反応混合物が入った試験管に加え、そしてその試験管を３７℃で１時間インキュベートした。次いでＤｐｎＩ含有混合物（２μｌ）をXL Goldウルトラコンピテント細胞（細胞４５μｌおよびβ−メルカプトエタノール２μｌ）に加えた。得られた混合物を３０分間０℃に保ち、次いで４５秒間４２℃に保ち、そしてＳＯＣ培養培地（５００μｌ）の添加時に２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。Luria−Ｂ／Ｌ−カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびトリプトファン（５０μｇ／ｍｌ）プレートに細胞を撒いた。コロニーを３７℃で２４時間成長させた。６個のコロニーを取り、そして各々を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびトリプトファン（５０μｇ／ｍｌ）含有Luria Broth培地（２ｍｌ）の入った別個の試験管に移した。細菌を３７℃で２４時間増殖させた。標準的なQiagenプロトコールにしたがって細胞培養物からＤＮＡを得た。慣用的なシークエンシングによりＤＮＡの同一性を決定した。次いで大腸菌ＭＭ２９４−１細胞をＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ挿入含有プラスミドＤＮＡで形質転換した。トリプトファンを補充した培地中に細胞を接種した。細胞を３７℃でおよそ２１時間培養し、そしてトリプトファンが枯渇した後に収集した。標準的な生化学的技術を用いて発現されたＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂタンパク質を単離し、そして精製した。
【００４０】
実施例２  組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂにおける能力増大
ＣＰＥおよびＨｓ２９４Ｔ抗増殖生物活性アッセイの結果を各々表３および表４にまとめる。表３はＨＡ添加（Betaseron（登録商標））およびＨＡ不含Ａｓｎ２５  ＩＦＮ−β  １ｂのＣＰＥ活性と比較したＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ、熱処理および高ｐＨ処理Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂのＣＰＥ活性を提示する。
【００４１】
表３
ＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体のＣＰＥ生物活性
【表３】
2010500024.tif 000008
【００４２】
表４はＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂのＨｓ２９４Ｔ抗増殖生物活性をＨＡ添加（Betaseron（登録商標））およびＨＡ不含Ａｓｎ２５  ＩＦＮ−β  １ｂの対応する活性と比較して提示する。
【００４３】
表４
ＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体のＨｓ２９４Ｔ抗増殖生物活性
【表４】
2010500024.tif 000009
【００４４】
２．１．ＣＰＥバイオアッセイ
ＩＦＮ−βは哺乳動物細胞において、いくつかのウイルス型が複製を阻止され、そして細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）を引き起こす抗ウイルス状態を誘起する。Ａ５４９ヒト肺癌細胞およびネズミ脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルスを用いてＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂおよびその高温（３７℃で約１８日間）および高ｐＨ（ｐＨ９.２５で４時間）処理試料の生物学的活性を評価した。
【００４５】
９６ウェルプレートでＩＦＮ−β試験試料の連続希釈を実施した。組織培養培地でＡ５４９細胞を調製し、そしてアッセイプレートに加えた。一晩インキュベートした後、ＥＭＣウイルスをアッセイプレートに加え、続いてさらに一晩インキュベートしてウイルス複製を可能にする。十分なＩＦＮ−β  １ｂで処理された細胞はウイルスの攻撃から保護され、そして生き残った。保護されなかった細胞は細胞変性変化を被り、そして死んだ。ホスファターゼ（ｐＮＰＰ）染色技術を用いてインターフェロン用量依存性ＣＰＥを定量化し、そして細胞生存性（光学密度測定値）対ＩＦＮ−β濃度のプロットから用量応答曲線を準備した。試験試料およびＷＨＯ補正参照基準のＥＤ５０（細胞保護の最大半量のための必要濃度）の比率からＩＦＮ−β活性を計算した。
【００４６】
表３で示されるように、ＨＡ不含Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂのＣＰＥ活性はＨＡ添加ＩＦＮ−β  １ｂ（１.７倍増大）およびＨＡ不含Ａｓｎ  ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ（１.６倍）よりも有意に高い。熱処理されたＨＡ不含  Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂのＣＰＥ活性はさらに高い（ＨＡ添加ＩＦＮ−β  １ｂと比較して２.９倍、およびＨＡ不含Ａｓｎ  ２５  ＩＦＮ−β  １ｂと比較して２.６倍増大）。高ｐＨ処理されたＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂは、ＩＦＮ−β  １ｂおよびＨＡ不含Ａｓｎ  ２５  ＩＦＮ−β  １ｂのＣＰＥ活性よりも各々１.８および１.６倍高いその高活性を保持する。
【００４７】
２．２．抗増殖活性
ＩＦＮ−βはヒト腫瘍から確立された多くの細胞系に対して抗増殖活性を示す。ヒトメラノーマ細胞系（Ｈｓ２９４Ｔ）を使用してＨＡ不含Ａｓｎ２５  ＩＦＮ−β  １ｂおよびＨＡ不含Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ試料の生物学的活性を評価した。
【００４８】
９６ウェルプレートでＩＦＮ−β試験試料の連続希釈を実施した。組織培養培地で応答細胞を製造し、そしてアッセイプレートに加えた。３日間インキュベートした後、細胞をｐＮＰＰ（ホスファターゼ染色）で染色して成長応答を測定した。用量依存的な様式でＩＦＮ−βに応答して細胞成長が阻止された。細胞数（光学密度測定値）対ＩＦＮ−β濃度のプロットから用量応答曲線を準備した。試験試料およびＷＨＯ補正参照基準のＥＤ５０（細胞成長応答の最大半量のための必要濃度）の比率からＩＦＮ−β活性を計算した。
表４で示されるように、Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂの抗増殖活性はＨＡ添加ＩＦＮ−β  １ｂ（１.７倍増大）およびＨＡ不含Ａｓｎ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ（１.３倍）よりも有意に高い。
【００４９】
組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂの特徴付け
組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂは、天然インターフェロンにしたがって番号付けされた２５位でアスパラギン残基が組換えによりアスパラギン酸残基により置き換えられている。それはまたＣｙｓ１７Ｓｅｒ変異をも担持する。Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂの一次配列を図３に示す。図２にて説明される減成経路にしたがって２５位のアスパラギン酸をスクシンイミドおよびイソアスパラギン酸種に変換することができる。本発明の組換えＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体はＡｓｐ２５変異体タンパク質ならびにＡｓｐ２５変異体から誘導されたイミド２５およびイソａｓｐ２５インターフェロンを包含する。本発明の組換えＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体の組成物を以下に記載されるアッセイで研究した。
【００５０】
３．１．還元型Ｌｙｓ−Ｃペプチドマップ
酵素消化、続いてＲＰ−ＨＰＬＣを用いてペプチドマップがタンパク質に関するフィンガープリントプロフィールを生み出す。ＲＰ−ＨＰＬＣにより分離された各々のペプチドフラグメントを単離し、そして質量分析またはエドマンペプチドシークエンシングのようなその他の分析方法によりさらに特徴付けすることができる。一般的にペプチドマッピングを確認試験として品質管理において利用する。クリッピング、変異および酸化または脱アミド化による減成のような事象からのタンパク質における小規模な一次構造修飾をモニタリングすることも強力な手段である。米国特許出願第１１／２７１５１６号に記載される化学的脱アミド化研究により、化学的に脱アミド化されたＩＦＮ−βがアスパラギン酸、スクシンイミドおよびイソアスパラギン酸バリアントを含有し、ここで脱アミド化は２５位でのみ生じることが示された。それ故に組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体を分析するために用いられるペプチドマッピングは試料中のＡｓｐ２５、イミド２５およびイソａｓｐ２５種の配分を改変しない条件下で行われるべきである。高ｐＨで環状イミドは不安定であり、そして人為的にその他の種に変換されることが知られている。一つの態様では、本発明は本質的に中性のｐＨで、少なくとも約６.５で、好ましくは約６.９から約７.１のｐＨで、そしてさらに好ましくは約７のｐＨで実施される独特なエンドプロテイナーゼ消化を提供する。この消化はスクシンイミドの分解を人為的に誘起せず、それ故に、分析される試料中のＡｓｐ２５、イミド２５およびイソａｓｐ２５種の配分に影響しない。タンパク質が指示されたｐＨ範囲で安定性を欠くこれらの場合には、Empigen ＢＢ、アルキルベタイン両性界面活性剤のような安定剤の存在下でこの消化を行うことができる。これらの安定剤はまたＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼと適合する当業者に公知の非イオン性（例えばTween ８０、Sigma−Aldrich, Milwaukee WIから入手可能）、カチオン性、アニオン性または両性界面活性剤を含み得る。この消化を伴うタンパク質マッピングはＩＦＮ−βの分析に特に適当であるが、高ｐＨで不安定であるタンパク質のようなその他のタンパク質の分析に適用することもできる。
【００５１】
組換えＩＦＮ−βタンパク質類似体に存在する種を特徴付けするための、少なくとも約６.５、好ましくは約６.９−７.１のｐＨで、機能的な還元剤と組み合わされた新しい還元型リジンエンドプロテイナーゼ（Ｒ）（Ｌｙｓ−Ｃ）ペプチドマップが開発されている。このアッセイで使用できる適当な還元剤はジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。試料調製物を用いて、約７.０のｐＨでの消化および続く還元を含む組換えＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体のＬｙｓ−Ｃ消化を実施したが、それは約６.９−７.１の最適ｐＨ範囲で実施される。試料中のＡｓｐ２５、イソａｓｐ２５およびイミド２５形態の天然のレベルを保持するため、ならびにタンパク質を効率的に還元および切断するための双方でこの範囲が必要とされる。本明細書で開発されたペプチドマップは中性ｐＨ試料調製物を用いるので、Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−βおよびその減成生成物の天然のレベルの正確なモニタリングが成功裏に達成される。その方法と組み合わせて使用できるその他の適当な還元剤にはトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２−メルカプトエタノール、システイン、還元型グルタチオン、２−メルカプトエチルアミンおよびチオグリコール酸が含まれ得る。
【００５２】
組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂの試料を還元型Ｌｙｓ−Ｃペプチドマップにより試験して２５位でのＡｓｎのＡｓｐへの変異を確認した。２ｍＭアスパラギン酸製剤バッファー中０.２５から０.５ｍｇ／ｍｌの濃度のＩＦＮ試料各０.４ｍｌに１Ｍ  TRIS ＨＣｌ（ｐＨ７.０）２５Oμｌ、３０％  Empigen ＢＢ（Calbiochem, San Diego, CAから入手可能）５μｌおよび０.０１Ｎ  ＨＣｌ  ６２Oμｌを加えた。１ｍｇ／ｍｌ  Ｌｙｓ−Ｃ  ４μｌの添加および３７℃で４時間のインキュベーションで消化を開始した。次いでさらに１ｍｇ／ｍｌ  Ｌｙｓ−Ｃ  ４μｌを加え、そして試料を３７℃で、全部で２４時間インキュベートした。消化をクエンチするために、８Ｍグアニジン１００μｌを加えた。次いで消化された試料を１Ｍ  ＤＴＴ  ８μｌの添加、続いて３７℃で４５分間のインキュベーションにより還元した。溶離バッファーとして０.１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルグラジエントを用いて流速２ｍｌ／分およびカラム温度４０℃でＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Vydac ２１８ＴＰ５４Ｃ１８、２５０×４.６ｍｍ）によりペプチドフラグメントを解析した。Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼは特異的な部位でインターフェロンタンパク質を切断して、１２個の主要なペプチドフラグメントＫｌ−Ｋ１２を導く。一次および二次Ｌｙｓ−Ｃ切断部位および対応するペプチドフラグメントを図３にて説明する。Ｋ２フラグメントは２５位で変異した残基を含有する。残基の性質に依存して、Ｋ２フラグメントはＲＰ−ＨＰＬＣで異なる保持時間で溶離し、Ａｓｐ２５、イソａｓｐ２５およびイミド２５種の間の区別が可能になる。この方法により、脱アミド化された種を天然Ａｓｎ２５  ＩＦＮと識別することも可能になる。
【００５３】
図４ＡはＬｙｓ−Ｃ消化されたインターフェロンのＲＰ−ＨＰＬＣトレースを示す。トレース４０５は組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体に対応し、トレース４０３は対照Ａｓｎ２５  ＩＦＮ−β  １ｂに対応し、そしてトレース４０１はブランクＬｙｓ−Ｃ酵素試料を表す。Ｋ１およびＫ２フラグメントに対応するピークは３２−４０分の保持時間間隔で現れる。この間隔の拡大図を図４Ｂで示す。組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体の主要なＫ２フラグメントは天然のＡｓｎ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ対照のＫ２フラグメントよりも遅い保持時間で溶離することを示すことができる。組換えにより生成されたＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βにおいてこの主要なフラグメントが単離され、そして質量分析およびエドマンシークエンシング技術によりＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂとして同定された。組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂタンパク質類似体生成物に存在する二つの少量のフラグメントはイミド２５およびイソａｓｐ２５種として同定された。
Ｋ１およびＫ２フラグメントの同一性を確認するエドマンシークエンシングデータを図５に提示する。
【００５４】
表５
エドマンシークエンシングによるＬｙｓ−Ｃペプチドマップフラグメントの同定
【表５】
2010500024.tif 000010
【００５５】
ＨＡ不含組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ生成物の安定性
ＨＡ不含治療用製剤中では組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βを使用するのが望ましいので、ＨＡ不含Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂの生物学的活性に関して安定性を調査した。二つの型の安定性研究を実施した。ＨＡ不含Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂを３７℃に２２日間、および別の実験ではｐＨ９.２５に４時間供することにより、高温に対する安定性および高ｐＨに対する安定性を研究した。
【００５６】
図５Ａは熱処理された前および後の、Ｌｙｓ−Ｃ消化されたＨＡ不含Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂのＲＰ  ＨＰＬＣデータを提示する。トレース５０１はブランクＬｙｓ−Ｃ酵素に関するトレースであり、トレース５０３はＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂに対応し、そしてトレース５０５は３７℃で２２日間インキュベートされたＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂに対応する。この図から見出すことができるとおり、イソａｓｐ２５およびイミド２５  ＩＦＮ−β類似体以外のその他の分解種を示す予期されないピークは高温安定性試料では観察されない。図５Ｂでより詳細にＫ１およびＫ２フラグメントに対応する目的のピークを示す。Ａｓｐ２５、イソａｓｐ２５およびイミド２５種の相対量が熱処理時に変化することを示すことができる。注目すべきことには、イソａｓｐ２５フラグメントの比率が増大する。この実験によりＨＡ不含Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂが、その生物学的活性に悪影響を及ぼす分解種の著しい増加を伴わずに長期間高温暴露に耐えることができ、そしてそれ故にＨＡ不含製剤に適当であることが実証される。
【００５７】
そのままのタンパク質で実施されるＭｏｎｏ−Ｓ  ＣＥＸ  ＨＰＬＣにより高ｐＨでのＨＡ不含Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂ試料の安定性を分析した。高ｐＨ処理の前および後のＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂのクロマトグラムを図６に示す。ＨＡ不含高ｐＨ安定性試料に関して予期されない減成を示すピークは観察されない。トレース６０１はＡｓｎ２５  ＩＦＮ−β  １ｂに対応し、トレース６０３はＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂに対応し、そしてトレース６０５はｐＨ９.２５に４時間暴露されたＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂに対応する。Ａｓｐ２５、イソａｓｐ２５およびイミド２５種の相対量が高ｐＨ処理時に変化することを示すことができる。具体的にはイミド２５フラグメントが有意に減少するが、イソａｓｐ２５種は増加する。この実験により、ＨＡ不含Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂが高ｐＨで予期されない減成生成物を形成しないことが実証される。ＨＡを含む製剤は、典型的には高ｐＨで実施される工程を伴い、そしてそれ故にＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂが高ｐＨ条件下でその生物学的活性を保持し、そしてＨＡ含有治療用生成物に製剤化され得ることは有利である。
【００５８】
Ａｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂはその生物学的活性を維持し、そして高温および高ｐＨ双方の条件下で予期されない減成生成物を何ら形成しないと結論される。多発性硬化症およびその他の疾患の処置のためにＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂをＨＡ不含またはＨＡ含有治療薬に成功裏に製剤化できると結論付けされる。
【００５９】
結論
前記された研究から得られた結果に基づいて、組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−βタンパク質類似体（Ａｓｐ２５、イソａｓｐ２５およびイミド２５  ＩＦＮ−β種を含む）は増大したレベルでＩＦＮ−β（例えばＩＦＮ−β  １ｂ）の生物学的活性を呈する。組換えＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β、例えばＡｓｐ２５  ＩＦＮ−β  １ｂを薬学的に許容される様式で製造し、そして生物学的活性が増大した治療用生成物に製剤化することができる。部位特異的変異誘発技術を用いてＡｓｐ２５変異をヒトＩＦＮ−βに導入することにより本発明の組換えＩＦＮ−βタンパク質類似体を製造することができる。本発明の組換えＩＦＮ−βタンパク質類似体はＨＡ不含およびＨＡ含有ＩＦＮ−β製剤において必要とされる臨床用量を低下させることができる。臨床用量を低下させることにより、有害な免疫反応（例えば中和抗体）を経験する患者の比率が低下する。
【００６０】
理解を明確にする目的で前記の発明をいくらか詳細に記載してきたが、特許請求の範囲内で特定の変化および修飾を実行できることは明らかであろう。本発明の方法および組成物の双方を具現化する多くの代替えの方式が存在することに留意すべきである。したがって本実施態様は説明的であり、制限的ではないとして考えられるべきであり、そして本発明は本明細書に示される詳細に限定されるものではないが、特許請求の範囲の範囲および均等物内で修飾され得る。
本明細書にて引用された全ての文献はその全てにおいて、および全目的のために出典明示により本明細書の一部とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年5月28日(2009.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010500024000001.app
【国際調査報告】
2010500024.tif 000019
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