(57)【要約】  輸送体は、非常に大きな可能性を有する新たな標的ファミリーであり、経済的および科学的機会を提供する。ナトリウム／カルシウム交換体は、種々の細胞からＣａ2+を排出する重要な機構である。心臓において、前記ナトリウム／カルシウム交換体は、収縮の開始のためにＣａ2+チャネルを通して入っているＣａ2+を押し出すと同時にＮａ+を心臓細胞に入れる。ナトリウム−カルシウム交換体の活性化を調節する化合物をつきとめることはかなりの関心事である。本発明は、「順モード」でＮＣＸを調節する化合物を検出するための蛍光ベースのアッセイに関する。本発明は、さらにＮＣＸを発現する細胞を含むパーツセットおよびＮＣＸのアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性について化合物を試験する前記パーツセットの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＣＸタンパク質の活性を測定するためのアッセイであって、以下：
ｅ）ＮＣＸを発現する細胞を提供すること；
ｆ）細胞内カルシウムを測定するための着色物質を提供すること；
ｇ）細胞をＮＣＸ活性化剤と接触させること；および
ｈ）上記着色物質からのルミネセンス発光シグナルのカルシウム仲介性変化を対照の実験で生じたルミネセンス発光シグナルと比較すること；
を含む、アッセイ。
【請求項２】
ＮＣＸタンパク質が以下のリスト：ＮＣＸ１、ＮＣＸ２、ＮＣＸ３のＮＣＸタンパク質である、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
ＮＣＸタンパク質が、哺乳動物由来、好ましくはラット、マウス、イヌ、ウシ、ブタ、類人猿またはヒト由来のものである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
細胞が、以下：ＣＨＯ、ＨＥＫ、ＣＯＳ７およびＪＵＲＫＡＴ細胞からなる群から選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記着色物質が、細胞に入り、そして色素に加水分解され得る色素前駆体として細胞に添加され、これにより該細胞中のカルシウムと色素が複合体化し、そしてルミネセンス発光シグナルをもたらす、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記ルミネセンス発光シグナルが蛍光であり、そしてモニター工程ｃ）はＦＬＩＰＲデバイスを使用する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記色素前駆体がアセトキシメチルエステル誘導体である、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記色素がカルシウム感受性蛍光色素ｆｌｕｏ−４である、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記ＮＣＸ活性化剤がイオノマイシンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１０】
ＮＣＸのアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性について化合物を試験するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアッセイの使用。
【請求項１１】
ＮＣＸの変化した発現に関連する疾患を診断するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアッセイの使用。
【請求項１２】
化合物の添加に反応した、ＮＣＸタンパク質の活性を測定するためのアッセイであって、以下：
ａ）ＮＣＸを発現する（ｅｘｐｒｉｍｉｎｇ）細胞を提供すること；
ｂ）細胞内カルシウムを測定するための着色物質を提供すること；
ｃ）細胞を化合物と接触させること、ここで、該細胞は、該化合物で処理される前に、ＮＣＸ活性化剤で処理されている；および
ｄ）上記着色物質からのルミネセンス発光シグナルのカルシウム仲介性変化を対照の実験で生じたルミネセンス発光シグナルと比較すること；
を含む、アッセイ。
【請求項１３】
ＮＣＸタンパク質が以下のリスト：ＮＣＸ１、ＮＣＸ２、ＮＣＸ３のＮＣＸタンパク質である、請求項１２に記載のアッセイ。
【請求項１４】
ＮＣＸタンパク質が、哺乳動物由来、好ましくはラット、マウス、イヌ、ウシ、ブタ、類人猿またはヒト由来のものである、請求項１２に記載のアッセイ。
【請求項１５】
細胞が、以下：ＣＨＯ、ＨＥＫ、ＣＯＳ７およびＪＵＲＫＡＴ細胞からなる群から選択される、請求項１２に記載のアッセイ。
【請求項１６】
前記着色物質が、細胞に入り、そして色素に加水分解され得る色素前駆体として細胞に添加され、これにより該細胞中のカルシウムと色素が複合体化し、そしてルミネセンス発光シグナルをもたらす、請求項１２に記載のアッセイ。
【請求項１７】
前記ルミネセンス発光シグナルが蛍光性であり、そしてモニター工程ｃ）はＦＬＩＰＲデバイスを使用する、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１８】
前記色素前駆体がアセトキシメチルエステル誘導体である、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項１９】
前記色素がカルシウム感受性蛍光色素ｆｌｕｏ−４である、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項２０】
前記化合物がＮＣＸアンタゴニストである、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項２１】
前記ＮＣＸ活性化剤がイオノマイシンである、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項２２】
以下：
ａ）ＮＣＸタンパク質を発現する（ｅｘｐｒｉｍｉｎｇ）凍結乾燥した細胞；
ｂ）着色物質；
ｃ）化合物緩衝液；および
ｄ）着色物質緩衝液を含むキットオブパーツ。
【請求項２３】
前記着色物質がカルシウム感受性蛍光色素ｆｌｕｏ−４である、請求項２２に記載のキットオブパーツ。
【請求項２４】
ＮＣＸタンパク質が以下のリスト：ＮＣＸ１、ＮＣＸ２、ＮＣＸ３のＮＣＸタンパク質である、請求項２２および２３に記載のキットオブパーツ。
【請求項２５】
ＮＣＸタンパク質が、哺乳動物由来、好ましくはラット、マウス、イヌ、ウシ、ブタ、類人猿またはヒト由来のものである、請求項２２および２３に記載のキットオブパーツ。
【請求項２６】
ＮＣＸのアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性について化合物を試験するための、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載のキットオブパーツの使用。
【請求項２７】
ＮＣＸの変化した発現に関連する疾患を診断するための、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載のキットオブパーツの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナトリウム−カルシウム交換体（ＮＣＸ）およびその活性を測定するための方法に関する。より具体的には、本発明はＮＣＸ「順モード」調節化合物を検出するための蛍光ベースのアッセイに関する。本発明は、さらにＮＣＸをエクスプライムする（ｅｘｐｒｉｍｉｎｇ）細胞を含むキットオブパーツおよびキットオブパーツの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命の基本的な要件は、生体膜を用いたコンパートメント化であり、生体膜はこの原理を実現するための自然界のツールである。しかし、脂質二重層−細胞膜の基本的な構造−は、細胞および生命体において生体機能を維持するために輸送が必須であるほとんどのイオンおよび化合物に対して不透過性である。このパラドックスに対する答えは、細胞膜の半透性の性質にあり、膜を通過する必要がある溶質は特定の膜タンパク質によって輸送される。これらの輸送体は、イオン勾配の生成および維持、栄養素の摂取、代謝産物の輸送、シグナル伝達分子の再取込みならびに毒性化合物および排泄化合物の処理に関与する。従って、これに関連して、輸送体は、疾患関連の異常に直接的な影響を及ぼし得る潜在的な薬物標的である。
【０００３】
ナトリウム／カルシウム交換体は、種々の細胞からＣａ2+を排出するための重要な機構である。心臓において、この交換体は、Ｃａ2+チャネルを通して流入しているＣａ2+を押し出し、収縮を起こすと同時にＮａ+を心臓細胞に流入させる。心疾患におけるこの交換体の関連性は、例えば非特許文献１に説明されている。従って、製薬産業は、例えば非特許文献２に記載されるようなＮＣＸを阻害する化合物を開発している。例えば非特許文献３で電気生理学的な手段によって明らかにされているように、Ｎａ+／Ｃａ2+交換体は、逆方向に動くＣａ2+１個毎に３〜４個のＮａ+を起電的に輸送する。ＮＣＸは、細胞質のＣａ2+濃度（［Ｃａ2+］流入）を、細胞外のＣａ2+濃度（［Ｃａ2+］排出）に３〜４桁満たない規模で維持することができる。それにもかかわらず、正味のＣａ2+輸送の方向は、Ｎａ+の電気化学的な勾配に依存する。Ｎａ+およびＣａ2+の移送（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）について、同時の、および連続した輸送モデルが示唆されており、そして証拠の大部分が後者を支持している。
【０００４】
輸送体は、科学的および経済的機会を提供する非常に大きな可能性を有する新たな標的ファミリーである。他方では、輸送体は、創薬技術に関して難しい標的の部類である。
【０００５】
例えば、カルシウムの流れを遮断し、そして／またはカルシウムチャネルの活性化を阻害することにより、チャネル活性化を調節する化合物を同定することは相当興味深い。これを行うための１つの標準的な方法が、パッチクランプ実験の利用である。これらの実験では、高度な技術を有するオペレータが、膜電位変化および／または試験化合物の適用に反応して細胞膜を通過するカルシウム電流を測定することにより、細胞を個々にそして順に評価しなければならない。イヌの心室乳頭筋におけるＳｅａ０４００、ＮＣＸの新規な特異的阻害剤の活動電位に対する作用が研究され、発表されている（非特許文献４および非特許文献５）。巨大なパッチ中イオン流束を定量するためのイオン選択性電極法を使用して、心臓のＮａ+／Ｃａ2+交換体は、多数の輸送モードを有することが明らかにされた（非特許文献６）。
【０００６】
これらの実験は、有効かつ有益であるが、非常に時間がかかり、カルシウムイオンチャネル活性を調節する化合物のハイスループットアッセイに応用できない。
【０００７】
電気生理学の標準方法に代わる手段として種々の技術が開発されている。例えば、放射性流束アッセイ（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｆｌｕｘ  ａｓｓａｙ）が使用されており、ここで細胞を放射性トレーサー（例えば、45Ｃａ）に暴露し、そして放射標識Ｃａの流束をモニターする。トレーサーをローディングしている細胞を化合物に暴露し、そしてトレーサーの流出を増強させるかまたは減少させるいずれかのこれら化合物を、細胞膜のイオンチャネルの可能性ある活性化剤または阻害剤として同定している。特定の例は非特許文献７に含まれている。特許文献１には、筋小胞体（ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）を使用してＮａ+／Ｃａ2+交換体の活性を測定する方法が記載されており、45Ｃａ放射能を測定することにより、筋小胞体のＣａ2+取込みの濃度を決定している。
【０００８】
多くに放射能イオン輸送体アッセイは、感度が限られていて、従ってデータの質が不十分である。さらに、放射能スクリーニング技術に関連する費用および安全性の問題は、広範囲の適用を妨げるハードルである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＥＰ１０３１５５６
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈｏｂａｉ，ＪＡ  ＆  Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ，Ｂ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，１３，６５３〜６６４
【非特許文献２】Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９，７５４４〜７５５３
【非特許文献３】Ｈｉｎａｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５４５，４５３〜４６１
【非特許文献４】Ｋ．Ａｃｓａｉ，「ＥＳＣ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ２００４」（表題：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｏｄｉｕｍ−ｃａｌｃｉｕｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｓｅａ０４００  ｏｎ  ｔｈｅ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｄｏｇ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｆｉｂｅｒ）, Ｍｕｎｉｃｈ  ｏｎ  Ｐｏｓｔｅｒ  Ｎｒ．２８８６
【非特許文献５】Ｃ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；Ｖｏｌ．３１１：７４８−７５７，２００４；表題：Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ＳＥＡ０４００［２−［４−［（２，５−Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｏｘｙ］−５−ｅｔｈｏｘｙａｎｉｌｉｎｅ］ａｓｓｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉａｃ  Ｎａ+／Ｃａ2+  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ，ＮＣＸ１．１
【非特許文献６】Ｔｏｎｇ  Ｍｏｏｋ  Ｋａｎｇ  ＆  Ｄｏｎａｌｄ  Ｗ．Ｈｉｌｇｅｍａｎｎ；Ｎａｔｕｒｅ；Ｖｏｌ．４２７，５  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００４；表題：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｍｏｄｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉａｃ  Ｎａ+／Ｃａ2+  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ
【非特許文献７】Ｔ．Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；１２（２００４）５０３９−５０５６；表題：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｅｓ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｄｉｕｍ−ｃａｌｃｉｕｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の創薬技術の中で、イオンチャネルおよびイオン輸送体の活性を調節する化合物を同定するための放射性流束アッセイの使用は、細胞からのＣａ2+の流束をモニターすることにより、試験化合物を可能性ある活性化剤または阻害剤として同定し得る技術なので、本発明に最も近い先行技術である。その放射性アッセイについての多くの問題は、１秒当り約１〜１０００分子−ほとんどのイオンチャネルの１０4分の１−のイオン輸送体の限られた代謝回転の検出困難性に基づく。従って、最先端にある技術から生じる問題は、ＮＣＸモジュレーターのハイスループットスクリーニングおよびプロファイリングにとって非常に良好な感度および有用性を有するロブストアッセイをつきとめることである。この課題の解決が本発明により提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
本発明の１つの主題は、ＮＣＸタンパク質の活性を検出するためのアッセイであって、ここで
ａ）ＮＣＸを発現する細胞を提供し；
ｂ）細胞内カルシウムを測定するための着色物質を提供し；
ｃ）細胞をＮＣＸ活性化剤と接触させ；そして
ｄ）上記着色物質からのルミネセンス発光シグナルのカルシウム仲介性変化を、対照の実験で生じたルミネセンス発光シグナルと比較する、
アッセイに関する。
【００１３】
本発明の別の主題は、化合物の添加に反応した、ＮＣＸタンパク質の活性を測定するためのアッセイであって、ここで：
ａ）ＮＣＸを発現する（ｅｘｐｒｉｍｉｎｇ）細胞を提供し；
ｂ）細胞内カルシウムを測定するための着色物質を提供し；
ｃ）細胞を化合物と接触させ、ここで、該細胞は、該化合物で処理される前に、ＮＣＸ活性化剤で処理され；そして
ｄ）上記着色物質からのルミネセンス発光シグナルのカルシウム仲介性変化を、対照の実験で生じたルミネセンス発光シグナルと比較する、
アッセイに関する。
【００１４】
一般的に、使用されるＮＣＸタンパク質は、哺乳動物由来、特にヒト由来のものであった。ＮＣＸタンパク質は、ＮＣＸ１、ＮＣＸ２、ＮＣＸ３、ＮＣＸ４、ＮＣＸ５、ＮＣＸ６および／またはＮＣＸ７、特にＮＣＸ１、ＮＣＸ２および／またはＮＣＸ３から選択される。
【００１５】
一般的に、本発明のアッセイに使用される細胞は、任意の真核生物から誘導され得る。好ましい実施形態において、細胞は哺乳動物の細胞である。より好ましい実施形態において、細胞は、ＣＨＯ（ＣＣＬ−６１）、ＨＥＫ（ＣＣＬ−１５７３）、ＣＯＳ７（ＣＲＬ−１６５１）および／またはＪＵＲＫＡＴ（ＣＲＬ−１９９０）細胞である。
【００１６】
特に、本発明のアッセイに使用されるＮＣＸ活性化剤は、イオノマイシンである。
好ましい実施形態において、前記着色物質は、細胞に入って、色素に加水分解され得る色素前駆体として細胞に添加され、これにより該細胞中のカルシウムと色素が複合体化し、そしてルミネセンス発光シグナルをもたらす。さらに、前記色素前駆体は、好ましくはアセトキシメチルエステル誘導体であり得、そして該色素は、好ましくはカルシウム感受性蛍光色素ｆｌｕｏ−４であり得る。より好ましい実施形態において、前記ルミネセンス発光シグナルは蛍光であり、そして前記モニター工程ｃ）はＦＬＩＰＲデバイスを使用する。
【００１７】
本発明は、さらに、前に述べたように、ＮＣＸのアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性について化合物を試験するためのアッセイの使用に関する。別の好ましい実施形態において、本発明は、前に述べたように、ＮＣＸの変化した発現に関連する疾患を診断するためのアッセイの使用に関する。
【００１８】
本発明は、さらに、
ａ）ＮＣＸタンパク質を発現する（ｅｘｐｒｉｍｉｎｇ）凍結乾燥した細胞；
ｂ）着色物質；
ｃ）化合物緩衝液；および
ｄ）着色物質緩衝液；
を含むキットオブパーツに関する。
【００１９】
本発明のキットオブパーツの好ましい実施形態において、前記着色物質は、カルシウム感受性蛍光色素ｆｌｕｏ−４である。別の好ましい実施形態において、使用されるＮＣＸタンパク質は、哺乳動物由来、特にヒト由来のものであった。ＮＣＸタンパク質は、ＮＣＸ１、ＮＣＸ２、ＮＣＸ３、ＮＣＸ４、ＮＣＸ５、ＮＣＸ６および／またはＮＣＸ７、特にＮＣＸ１、ＮＣＸ２および／またはＮＣＸ３から選択される。
本発明は、さらに、前に述べたように、ＮＣＸのアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性について化合物を試験するためのキットの使用に関する。別の好ましい実施形態において、本発明は、前に述べたように、ＮＣＸの変化した発現に関連する疾患を診断するためのキットオブパーツの使用に関する。
【００２０】
発明の詳細な説明
用語「アッセイ」とは、系または物の特性を測定する手順をいう。アッセイは、生物学的アッセイについて一般に用いられる略語であり、そしてインビトロ実験の一種である。アッセイは、典型的に、生体に対する物質の効果を測定するために行われる。アッセイは、定性的でもまたは定量的でもよく、新薬の開発に必須である。
ＮＣＸタンパク質の活性を測定し得るように、本発明のアッセイは広ダイナミックレンジを提供する。特に、本発明は、ＮＣＸタンパク質と特異的に相互作用し、そしてＮＣＸタンパク質の活性を調節する薬学的に有効な化合物をスクリーニングおよびプロファイリングするための迅速で、効果的なアッセイを利用可能とする。
【００２１】
本発明の文脈における用語「ＮＣＸタンパク質」または「ＮＣＸ」は、単独のまたは互いに組み合わせた以下のリストのＮａ+／Ｃａ2+交換体タンパク質のいずれか一つを意味するものとする：ＮＣＸ１、ＮＣＸ２、ＮＣＸ３、ＮＣＸ４、ＮＣＸ５、ＮＣＸ６、ＮＣＸ７。アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号３に対応するＮＣＸ１、ＮＣＸ２および／またはＮＣＸ３が特に好ましい。
【００２２】
このようなＮＣＸタンパク質は、任意の脊椎動物、特に哺乳動物種（例えば、イヌ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ニワトリ、類人猿、ヒトなど）から誘導され得る。ＮＣＸは、このような脊椎動物生命体の組織プローブから単離され得るか、またはＮＣＸタンパク質を発現し得る組換え生物学的材料により製造され得る。
【００２３】
用語「ＮＣＸタンパク質」とは、ポリペプチド、多型変異体、突然変異体、および配列番号１、配列番号２および配列番号３に含まれる核酸配列によりコード化されるアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、もしくは５００またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたり約８０％より大きいアミノ酸配列同一性、８５％
、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する種間のホモログをいう。
【００２４】
用語「生物材料」とは、遺伝情報を含み、それ自己増殖可能であるか、または生物系において増殖可能な任意の材料を意味する。組換え生物材料は、当業者によく知られた組換え技術によって生産されたか、変えられているか、または修飾されたあらゆる生物材料である。
【００２５】
以下の参考文献は、特定のＮＣＸタンパク質のクローニングの例である：イヌのＮａ+／Ｃａ2+交換体ＮＣＸ１は、Ｎｉｃｏｌｌ，ＤＡ．ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５０（４９８０）：５６２〜５，１９９０；表題：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ  Ｎａ（＋）−Ｃａ２＋ｅｘｃｈａｎｇｅｒ．）によりクローニングされている。ヒトＮａ+／Ｃａ2+交換体ＮＣＸ１は、Ｋｏｍｕｒｏ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（１０），４７６９〜４７７３，１９９２；表題：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  Ｎａ+／Ｃａ2+ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ｃＤＮＡ）およびＫｏｆｕｊｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６３（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３２）：Ｃ１２４１−Ｃ１２４９，１９９２；表題：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａ−Ｃａ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ｉｎ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ：ａ  ｓｔｕｄｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｌｏｎｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  Ｎａ−Ｃａ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）によりクローニングされている。ヒトＮａ+／Ｃａ2+交換体ＮＣＸ２は、Ｌｉ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（２６）：１７４３４〜９，１９９４；表題：Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＣＸ２  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｎａ（＋）−Ｃａ２＋ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）によりクローニングされている。ラットＮａ+／Ｃａ2+交換体ＮＣＸ３は、Ｎｉｃｏｌｌ，ＤＡ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４０）：２４９１４〜２１．１９９６；表題：Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｔｈｉｒｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｎａ+／Ｃａ2+ｅｘｃｈａｎｇｅｒ，ＮＣＸ３）によりクローニングされている。ヒトＮａ+／Ｃａ2+交換体ＮＣＸ３は、Ｇａｂｅｌｌｉｎｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ．２９８：１〜７，２００２；表題：Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＳＬＣ８Ａ３  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｎａ+／Ｃａ2+ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ３  ｉｓｏｆｏｒｍｓ）によりクローニングされている。
【００２６】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書中で変換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーをいう。これらの用語は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）であるアミノ酸ポリマー、さらに天然のアミノ酸ポリマーおよび非天然のアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００２７】
用語「ＮＣＸタンパク質の活性」とは、細胞から細胞内Ｃａ2+を排出する機構をいう。心臓において、これは、Ｃａ2+チャネルを通して流入しているＣａ2+を押し出し、収縮を起こと同時にＮａ+を心臓細胞に入れる。心疾患におけるこの関連性は、例えば、Ｈｏｂａｉ，ＪＡ  ＆  Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ，Ｂ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，１３，６５３−６６４に説明されている。従って、製薬産業は、例えばＩｗａｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９，７５４４−７５５３に記載されるようなＮＣＸを阻害する化合物が開発している。例えば、Ｈｉｎａｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５４５，４５３−４６１中の電気生理学的手段により示されているようにＮａ+／Ｃａ2+交換体は、逆方向に動くＣａ2+１個毎に３〜４個のＮａ+を起電的に輸送する。ＮＣＸは、細胞質のＣａ2+濃度（［Ｃａ2+］流入）を、細胞外のＣａ2+濃度（［Ｃａ2+］排出）に３〜４桁満たない規模で維持することができる。それにもかかわらず、正味のＣａ2+輸送の方向は、Ｎａ+の電気化学的な勾配に依存する。Ｎａ+およびＣａ2+の移送（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）について、同時のおよび連続した輸送モデルが示唆されており、そして証拠の大部分が後者を支持している。ＮＣＸタンパク質の活性は、カルシウムと複合体化する適切な着色物質によりもたらされる増強蛍光を測定することにより決定される。
【００２８】
用語「ＮＣＸを発現する細胞」とは、関心ある交換体を内因的に（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ）発現する細胞または組み換え細胞をいう。例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、用語「組み換え」は、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種核酸もしくはタンパク質の導入、または野生型核酸もしくはタンパク質の変化により修飾されていること、または細胞がこのように修飾された細胞から誘導されることを意味する。従って、例えば、組み換え細胞は、細胞の野生型（非組み換え）内で見出されない遺伝子を発現するか、または別の方法で異常に発現されるか、少し発現されるか、または全く発現されない野生型遺伝子を発現する。本発明において、組み換え細胞は、典型的には、ＮＣＸタンパク質をコード化する核酸配列でトランスフェクトされている細胞をいう。本アッセイは適切な培地を有する適切な容器中で細胞を増殖させることにより、簡単に行なわれる。細胞がアッセイの間生命を維持し得、そして倍地中で望ましく増殖し得さえすれば、細胞は、天然の細胞、野生型細胞、樹立細胞株、市販される細胞、遺伝子操作された細胞などであってよい。
【００２９】
本主題のアッセイを作成するための適切な細胞としては、原核生物、酵母、または高等真核細胞、特に哺乳動物細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性菌およびグラム陽性菌が挙げられる。細胞は、通常、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、チャイニーズハムスター細胞などのような哺乳動物細胞である。便利であることが見い出されている細胞としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ７、ＪＵＲＫＡＴ、ＨｅＬａ、ＨＥＫｓ、ＭＤＣＫおよびＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。細胞は周知の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，ＩＳＢＮ：０４７１２４１０５９）で調製しても、または購入してもよい（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。
【００３０】
用語「着色物質」とは、特に、カルシウム感受性蛍光色素をいう。色素前駆体は、アッセイの条件下ではルミネセンス発光性でなく、細胞に入ることができ、そしてルミネセンス発光性のオキシ化合物に細胞内で加水分解されるエステルであり、そしてカルシウムと複合体化すると増強したルミネセンス発光をもたらすことを特徴とする。細胞内加水分解酵素により加水分解を受けやすいエステルが選択される。
用語「細胞に入ることができる」とは、前駆体が細胞膜を通過し、そして細胞中で加水分解され得ることを意味し、色素前駆体は、ｐＨ、温度などの特異的な条件下、細胞に入るか、異なる速度で細胞に入るか、または特異的な条件下で細胞に入らない。着色物質は、よく知られたプロトコルを使用して細胞に添加される（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，ＩＳＢＮ：０４７１２４１０５９）。着色物質の使用が通常であり、そして市販の試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）や、さらに研究室で合成された試薬も使用され得る。上記の要件を満たす多数の市販の色素が公知である。Ｃａ2+をモニターするための蛍光色素はよく知られており、そしてｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｃａｔａｌｏｇ，第９編の節２０．１〜２０．４に詳細に記載されている。これらは、通常、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、アミノフェニルインドールなどのような蛍光核に結合した２つのビス−カルボキシメチルアミノ基を有する。大部分の化合物は前駆体ではオキシ基が置換され、そしてルミネセンス発光色素ではそれらが非置換である、３，６−ジオキシ置換キサンテンである。通常、フェノールおよび酸を保護するアセトキシメチル基が存在する。例えば、Ｆｌｕｏ３／４、Ｆｕｒａ２／３、カルセイングリーンなどを参照のこと。アセチル基の加水分解は、ルミネセンス発光生成物をもたらす。前駆体は細胞膜を通過し、そして細胞中で加水分解され得る。
【００３１】
用語「ルミネセンス」とは、「冷光」、他のエネルギー源からの光をいい、これは標準温度および低温で起こり得る。ルミネセンスにおいて、あるエネルギー源は、その「基底」（最も低いエネルギー）状態から「励起」（より高いエネルギー）状態に原子の電子を上げる（ｋｉｃｋ）；次いで、電子は光の形態でエネルギーを返すのでその「基底」状態に戻ることができる。エネルギー源が何であるか、またはルミネセンスのトリガーが何であるかということに従って各々命名された、いくつかのルミネセンスが存在する。
【００３２】
用語「蛍光」とは、光子の分子吸収がより長い波長を有する別の光子の発光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）の引き金となる、冷体（ｃｏｌｄ  ｂｏｄｙ）における光学現象として主として見いだされるルミネセンスをいう。吸収される光子と放射される光子との間のエネルギー差は、結局最後には分子振動または分子熱になる。通常、吸収された光子は紫外線領域中にあり、そして放射光は可視領域にあるが、これは吸光度曲線および特定のフルオロフォアのストークスシフトに依存する。蛍光は、しばしばこの現象を示すフッ化カルシウムで構成される鉱物の蛍石にちなんで名付けられている。
【００３３】
インジケーター色素からの蛍光は、発光測定装置または蛍光撮像装置で測定し得る。１つの好ましい検出装置は、蛍光測定画像解析用プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）である。ＦＬＩＰＲは、９６または３８４ウェルのマイクロタイタープレートに同時にピペッティングし得る統合液体ハンドリングと、電荷結合素子イメージングカメラに接続されたアルゴンレーザーを使用する高速動的検出とを組み入れる場合、本発明の方法を使用するハイスループットスクリーニングに十分に適している。
【００３４】
カルシウムインジケーター色素の使用の代替法は、エクオリン系の使用である。エクオリン系は、タンパク質アポエクオリンを使用し、これはエクオリンとして公知である、アポエクオリンとセレンテラジンの組み合わせを形成する脂溶性発色団セレンテラジンに結合する。アポエクオリンは３つのカルシウム結合部位を有しており、カルシウム結合すると、エクオリンのアポエクオリン部分はその立体配座を変化させる。立体配座におけるこの変化が、セレンテラジンの酸化を引き起こし、セレンテラミド、ＣＯ２、および青色光（４６６ｎｍ）の光子となる。この光子を、適切な計測装置を用いて検出し得る。エクオリンの使用の概説について、以下を参照のこと：Ｃｒeｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ４６：３９０−３９７；Ｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９８９６−９９０３；Ｋｎｉｇｈｔ  ＆  Ｋｎｉｇｈｔ，１９９５，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４９：２０１−２１６。アポエクオリンを発現する哺乳動物細胞にセレンテラジン補因子を添加することにより哺乳動物細胞における細胞内カルシウムを測定する方法を記載する米国特許第５，７１４，６６６号もまた興味深い。ＮＣＸポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の「阻害剤」、「活性化剤」および「モジュレーター」は、ＮＣＸポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の細胞ベースのアッセイを使用して同定される活性化分子、阻害分子、または調節分子をいうために使用される。「阻害剤」は、例えば結合して、活性を部分的にまたは完全に遮断する、低減する、妨げる、活性化を遅延させる、不活化する、感受性を低下させる、またはＮＣＸタンパク質の活性または発現を下方制御する化合物、例えばアンタゴニストである。
【００３５】
「活性化剤」は、ＮＣＸタンパク質の活性を増大する、開口する、活性化する、促進する、活性化を増強する、感受性を高める、作動する、または上方制御する化合物である。好ましいＮＣＸ活性化剤は、イオノマイシン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕｓ由来のイオノフォアである。阻害剤、活性化剤、またはモジュレーターはまた、ＮＣＸタンパク質の遺伝子学的に修飾されたバージョン、例えば改変した活性を有するバージョン、さらに天然および合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、ペプチド、環状ペプチド、核酸、抗体、アンチセンス分子、リボザイム、有機低分子などを含む。
【００３６】
用語「化合物」または「試験化合物」または「試験候補」またはそれらの文法的等価物は、ＮＣＸ活性を調節する能力について試験しようとする天然または合成の任意の分子、例えばタンパク質、オリゴペプチド、有機低分子、多糖、脂質、脂肪酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなどを表わす（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，ＩＳＢＮ：０４７１２５０９６１）。試験化合物は、試験化合物のライブラリー、例えば十分な範囲の多様性を与えるコンビナトリアルライブラリーまたはランダム化ライブラリーの形態であり得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，ＩＳＢＮ：０４７１２５０９３７）。試験化合物は、場合により、融合パートナー、例えば標的化合物、レスキュー化合物、二量化化合物、安定化化合物、アドレス可能な化合物、および他の機能的部分に連結される。従来通り、いくつかの所望の特性または活性（例えば活性を増強する）を有する試験化合物（「リード化合物」と呼ばれる）をつきとめ、そのリード化合物の変形体を創製し、そしてそれら変形体化合物の特性および活性を評価することにより、有用な特性を有する新規化学物質を生み出す。望ましくは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法がこのような分析のため利用される。
【００３７】
前記阻害剤、活性化剤および試験化合物は、細胞が増殖した後、培地に注入することにより細胞に添加してもよく、またはこれらは細胞増殖の前に培地中に存在してもよい（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，ＩＳＢＮ：０４７１２４１０５９）。細胞は、阻害剤、活性化剤および／または試験化合物上で適切な数まで増殖させてもよく、またはその上に配置し、そしてさらに増殖させずに使用してもよい。細胞は、阻害剤、活性化剤および／または試験化合物に結合させてもよく、または細胞をウェル中に配置またはで増殖させる実施形態において、細胞はウェル中の流体に懸濁される懸濁細胞であってもよい。
【００３８】
用語「対照の実験」とは、一緒に行うべき異なる種類の実験をいう。当業者は、本明細書中に記載される方法と一緒に対照を行うことは一般に有益であることを認識する。
例えば、ＮＣＸタンパク質の活性を測定するアッセイについての対照を有することは通常有益であり、この場合、細胞は、これらの細胞が関心あるＮＣＸタンパク質を発現しないことを除いて、好ましくはアッセイに使用される細胞と本質的に同一である。さらに、化合物の添加に反応したＮＣＸタンパク質の活性化を測定するアッセイのための対照を有することは通常有益であり、この場合、これらの細胞が関心あるＮＣＸタンパク質を発現しないことを除いて、好ましくはアッセイに使用される細胞と本質的に同一である細胞に対して、化合物を本発明のアッセイにおいて試験する。このようにして、アッセイにより同定された化合物がある予期していない非特異的な機構を通してよりもむしろ、関心あるＮＣＸタンパク質を通してそれらの効果を実際に発揮していると決定することができる。このような対照細胞についての１つの可能性は、実際の実験細胞が関心あるＮＣＸタンパク質を発現する場合に、非組み換え型親細胞を使用することである。
【００３９】
化合物の添加に反応したＮＣＸタンパク質の活性化を測定するアッセイのための他の対
照は、試験化合物を添加することなくアッセイを行い（低対照）、そして高濃度の試験化合物を添加してアッセイを行う（高対照）。他の種類の対照は、本発明のアッセイにより同定された化合物を関心あるＮＣＸタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとして採用し、及び先行技術の方法で試験した場合にもこれらの化合物がアゴニストまたはアンタゴニストであることを確認するために、先行技術の方法でこれらの化合物を試験することを含むことになる。さらに、当業者は、アッセイ値と標準値と比較することにより、統計分析を行うこともまた望ましいということを理解している。
【００４０】
用語「アゴニスト」および「アンタゴニスト」とは、受容体を介してシグナル伝達を調節する受容体エフェクター分子をいう。受容体エフェクター分子は、受容体に結合し得るにもかかわらず、天然のリガンドの結合部位に必ずしも結合しない。受容体エフェクターは、単独で使用される、すなわち代理（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）リガンドであり得る場合、シグナル伝達を調節し得るか、または天然のリガンドの存在下、シグナル伝達を変え、天然のリガンドによりシグナル伝達を増強または阻害し得る。例えば、「アンタゴニスト」は、受容体のシグナル伝達活性化を遮断するか、または低減させる分子であり、例えばその受容体からのシグナル伝達を競合的に、非競合的に、および／またはアロステリックに阻害し得るのに対して、「アゴニスト」は受容体のシグナル伝達活性を増強、誘導または別の方法で促進する。
【００４１】
用語「ＮＣＸの変化した発現に関連する疾患」とは、拡張型心筋症、冠状動脈性心疾患、不整脈、心不全などをいう。
【００４２】
便利性のために、着色物質およびアッセイの他の成分を、キット中に提供してもよく、ここで着色物質は再構成可能な（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔａｂｌｅ）粉末として、または氷上の冷却溶液として緩衝液中に存在し得る。キットにはまた、緩衝液、活性化剤、阻害剤、試験化合物、ＮＣＸタンパク質を発現する（ｅｘｐｒｉｍｉｎｇ）細胞などが含まれ得る。細胞は凍結乾燥細胞として存在し得る。前記キットオブパーツは、拡張型心筋症、冠状動脈性心臓病、不整脈、心不全などを診断するための診断キットとして使用され得る。
【００４３】
蛍光ベースの細胞ＮＣＸアッセイの典型的な結果を記載する以下の図および実施例によって、本発明をさらに詳細に説明するが、これらは保護範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１ａ】図１ａは、配列番号１で表わされるＮＣＸ１のポリヌクレオチド配列を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、配列番号２で表わされるＮＣＸ２のポリヌクレオチド配列を示す。
【図１ｃ】図１ｃは、配列番号３で表わされるＮＣＸ３のポリヌクレオチド配列を示す。
【図２】図２は、イオノマイシン添加後のＣＨＯ−ＮＣＸ１細胞の蛍光シグナルを示す。細胞質ゾルカルシウムの増加に起因して、ＮＣＸ１の阻害（高対照、３０μＭ  Ａ０００１３５９３３、赤）は蛍光の増加をもたらす。数秒後、活性なＮＣＸ１は、初期カルシウム負荷を確立する（低対照、黒）。
【図３】図３は、生データ：イオノマイシン添加後、種々の濃度のＡ０００１３５９３３についての蛍光変化の動態を示す。５０〜９０秒の蛍光値の合計を使用し、対照と比較して、蛍光変化の割合を計算した。結果を図４に示す。
【図４】図４は、高対照および低対照ならびに種々の濃度のＡ０００１３５９３３を含む９６ウェルプレートについてのアッセイ統計を示す。計算されたシグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）、ｚ’および種々の濃度のＡ０００１３５９３３の５０〜９０秒の蛍光増加を掲記する（図２を参照のこと(ｓ.ａ.)）。この実施例についての計算されたＡ０００１３５９３３のＩＣ50は７．１６μＭ（平均ＩＣ50：５．９  μＭ）であった。
【図５】図５は、Ａ０００１３５９３３の化合物濃度と比較した蛍光増加の割合および対応するフィット曲線を説明する。この実施例についての計算されたＡ０００１３５９３３のＩＣ50は７．１６μＭ（平均ＩＣ50：５．９μＭ）であった。
【図６−１】図６は、ＦＬＩＰＲからの生データのプリントアウトを示す。
【図６−２】続きである。
【図７】図７は、１つの化合物クラスのＮＣＸ１蛍光ベースのＦＬＩＰＲアッセイと電気生理学ベースのＳＵＲＦＥ2Ｒ技術との間の相関を示す。両方の場合において、１０μＭでＮＣＸ１の阻害を測定した。
【実施例】
【００４５】
１．アッセイ手順
１．１．アッセイ試薬
【００４６】
【表１】
2010520759.tif 000002
【００４７】
１．２．アッセイ手順
１］実験の２０〜２４時間前に、抗生物質を含まない増殖培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２（ＨＡＭ）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，５％  ＦＣＳ，Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ）に細胞を懸濁し、そして９６ウェルブラッククリア底（ｂｌａｃｋ  ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ）プレートに播種する（１００μｌ中２５０００細胞／ウェル）。
２］培地を廃棄し、続いて色素ローディング緩衝液（１００μｌ）を添加し、そしてプ
レートをＲＴで７５分間暗所でインキュベートする。
３］アッセイ緩衝液（１００μｌ）で３回洗浄することにより、色素ローディグ緩衝液を除去する。緩衝液を廃棄する。
４］化合物プレートから８０μｌを添加し、そしてプレートを１６℃に３０分間保つ。
５］プレートをＦＬＩＰＲに移し、そして以下のプロトコルを使用してアッセイする（イオノフォアプレートから４０μｌの添加を含む）：
【００４８】
【表２】
2010520759.tif 000003
【００４９】
１．３．データ分析
ＮＣＸ細胞中の試験化合物の阻害活性
阻害の計算
計算は統計エクスポート（ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｅｘｐｏｒｔ）に基づく。生データを、
【数１】
2010520759.tif 000004
に従って阻害に変換する。
【００５０】
平均高対照を、イオノマイシンを含む１０または３０μＭ  Ａ０００１３５９３３の８つのペアサンプルの平均差から算出する。平均低対照をイオノマイシン対照から算出する
。基底蛍光（ｂａｓａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を１．３倍より高くする化合物は破棄する。
【００５１】
２．アッセイ実施例
２．１．高および低対照の応答
イオノマイシン（２μＭ）の添加後の高および低対照の典型的な蛍光応答を図２に示し、そして以下の通りである：ＮＣＸ１が活性である場合（低対照）、イオノマイシン添加後、細胞に入っているカルシウムは細胞外に輸送される。数秒後、細胞の初期カルシウム負荷が回復する。細胞質ゾルカルシウムの増加に起因して、イオノマイシンの添加後、ＮＣＸ１の阻害が蛍光増加をもたらす（高対照、３０μＭ  Ａ０００１３５９３３）。
【００５２】
２．２．ツール物質：Ａ０００１３５９３３
新規なＮＣＸ１阻害剤Ａ０００１３５９３３が、最初のＨＴＳスクリーニングにおいて発見された。図３、４および５は、種々の濃度のＡ０００１３５９３３の典型的な用量依存反応を示す。Ａ０００１３５９３３は、５．９μＭの平均ＩＣ50を有する良好なＮＣＸ１阻害剤であり、そして以後アッセイにおいてツール物質として使用された。この化合物のＩＣ50を、対照として全てのプレートに添加する。この実施例についてのＳ／Ｂ比およびｚ’値は、非常に良好であった。Ａ０００１３５９３３のＩＣ50と一緒に、これらのパラメーターを使用して、全てのプレートについての良好な分析性能を示した：
１．２より大きいＳ／Ｂ
２．０．５〜０．７のｚ’値
３．ツール化合物Ａ０００１３５９３３のＩＣ50は、およそ平均５．９μＭであった。
【００５３】
２．３．ツール物質：アッセイ実施例
４つの化合物のＩＣ50を用いて、アッセイを二連で行った（図６）。４つの化合物は、同じ化合物クラスに由来する。１つの化合物は、良好なＮＣＸ１阻害剤（Ａ０００１３５９３３）であり、２つの化合物は中程度の阻害を示し（Ａ０００１３６６４８、Ａ０００１０４２４３）、そして１つはその濃度範囲で活性ではなかった（Ａ０００１０３７４６）。この実施例は、アッセイがこのようにＮＣＸ１阻害剤をスクリーニングして構造活性関連性を確立するのに適切であることを示す。
【００５４】
２．４．電気生理学との相関関係
直接的な電気生理学的方法（Ｉｏｎｇａｔｅ’ｓ  ＳＵＲＦＥ2Ｒ技術）を用いる蛍光ベースのアッセイから算出されたデータの比較は、このアッセイの性能を見積るのに最良の方法である。これらの２つの大変異なる技術の相関は非常に良好である（図７）。１つの化合物を除いて、ＳＵＲＦＥ2Ｒを用いて測定された阻害は、間接的なＦＬＩＰＲアッセイから算出された阻害よりも高かった（平均１４％）。
【図１ａ】
2010520759.tif 000005
【図１ｂ】
2010520759.tif 000006
【図１ｃ】
2010520759.tif 000007
【図２】
2010520759.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
2010520759.tif 000011
【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【配列表】
2010520759000001.app
【国際調査報告】
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