(57)【要約】  本発明は、フィーダー細胞を用いた幹細胞の共培養方法に関し、さらに具体的には、フィーダー細胞と幹細胞を、多数のポアを有するポリマー膜によって分離させて培養する幹細胞培養方法に関する。本発明によれば、幹細胞とフィーダー細胞を、必須な物質を選択的に透過させながら独立した空間で別々に培養する、最適化した幹細胞の培養条件が提供される。本発明で製造された幹細胞は、継代培養が必要な時点まで未分化を維持し、フィーダー細胞によって支持され続ける。また、放射線照射またはマイトマイシンなどの細胞増殖抑制剤で前処理を施す必要がないため、治療用として用いられる幹細胞も、何の汚染なしで得ることができる。よって、本発明の膜を用いた幹細胞共培養方法は、臨床適用の際に幅広く活用できる。【選択図】図４
2010500878.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィーダー細胞を用いて幹細胞を培養する方法であって、幹細胞とフィーダー細胞とを、多数のポアを有するポリマー膜によって分離された２つの空間で培養することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記ポリマー膜がポリエステルからなることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞の培養方法。
【請求項３】
前記ポアの直径が０．２μｍ〜０．５μｍであることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞の培養方法。
【請求項４】
前記ポリマー膜の多孔性が２．０ Ｅ＋０６〜６．０ Ｅ＋０６であることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞の培養方法。
【請求項５】
前記ポリマー膜の下に前記フィーダー細胞を培養し、前記ポリマー膜の上に前記幹細胞を培養することを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞の培養方法。
【請求項６】
前記幹細胞が胚性幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞の培養方法。
【請求項７】
前記フィーダー細胞を血清含有培地で培養し、前記幹細胞を無血清培地もしくは血清代替物培地で培養することを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞の培養方法。
【請求項８】
前記フィーダー細胞が細胞増殖抑制剤で前処理されていないことを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞の培養方法。
【請求項９】
前記ポリマー膜によって分離された空間で前記幹細胞を継代培養した後、フィーダー細胞上に移すことを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィーダー細胞を用いて幹細胞を培養する方法に係り、さらに具体的には、フィーダー細胞と幹細胞を、多数のポアを有するポリマー膜によって分離させて培養する幹細胞培養方法に関する。本発明によれば、２種の細胞を、必須な物質を選択的に透過させながら独立した空間で別々に培養する、最適化した幹細胞の培養条件が提供される。
【背景技術】
【０００２】
１９８１年に最初にマウスの胚性幹細胞を試験管で培養することが可能になり、１９８８年にはマウス胚性幹細胞の試験管培養方法を遺伝子ターゲッティング技術と組み合わせて最初に遺伝子ターゲッティングされた形質転換マウスが作られることになった。遺伝子ターゲッティングマウス技術は、以後、遺伝子の機能研究およびヒトの疾患モデルの樹立になくてはならない重要な役割を果たし、さらに生命科学／医学発達の牽引車の役割を果たしてきた(Smith AG, Annu Rev Cell Dev Biol 17:435-62, 2001)。ヒト胚性幹細胞の試験管培養が可能になったのはマウスに比べて１７年も遅れた１９９８年であって、ウィスコンシン大学のトムソン博士がヒト胚性幹細胞株を最初に樹立した(Thomson JA, Science 282(5391):1145-7, 1998)。マウス胚性幹細胞に比べて、ヒト胚性幹細胞は、培養や操作がさらに難しく、遺伝子操作或いは試験管操作することにより治療剤を開発する必要があっても、大量培養するには不適である。したがって、幹細胞の大量培養が可能で細胞の品質管理が容易な培養技術を樹立することが非常に切実である。
【０００３】
一般に用いられる胚性幹細胞の培養法は、トムソン博士が樹立した方法を基礎としている。正確には、基本培養法は、マイトマイシンを処理し或いは放射線を照射して成長を抑制させたマウス由来胎児線維芽細胞をまず接種し、これらの線維芽細胞から胚性幹細胞の成長に必要な細胞外基質およびサイトカインを発現させ、これらの細胞をフィーダー細胞として用い、その上にヒト胚性幹細胞を接種して培養する方法である。しかし、胚性幹細胞とフィーダー細胞の最適培地組成は互いに異なる。すなわち、胚性幹細胞の培地組成は基本培地に血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）を２０％添加するのに対し、フィーダー細胞の培地組成は基本培地に牛胎児血清を２０％添加する。
【０００４】
幹細胞培養はいろいろの欠点がある。線維芽細胞の生存に牛胎児血清は非常に重要な役割を果たすので、牛胎児血清の代わりに血清代替物で培養されると、線維芽細胞はフィーダー細胞としての役割を果たさない。この他にも、現在の胚性幹細胞培養法の他の問題点は、フィーダー細胞にマイトマイシンを処理しまたは放射線を照射するので、フィーダー細胞の生存が５〜７日程度に制限されるという点である。詳細にいえば、幹細胞を最初に樹立する場合、または幹細胞の成長が遅い場合でも、不可避に未だ継代時期に至らない幹細胞を継代培養しなければならない。また、マイトマイシンで処理する場合、フィーダー細胞は安全性に問題があり得る。別の問題点は、幹細胞とフィーダー細胞が同一の培養皿で培養されるため、幹細胞の継代培養の際にフィーダー細胞が混ぜ込まれることを回避することができない。特に、臨床適用の際に、フィーダー細胞の汚染は深刻な問題を引き起こす。
【０００５】
そこで、本発明者らは、前述した問題点を克服するために、ポリマー膜を用いて幹細胞とフィーダー細胞を共培養し、その際２種の細胞を、独立空間で、必須な物質を選択的に透過させつつ培養するよう試みた。その結果、幹細胞とフィーダー細胞はそれぞれ最適の条件で培養されるので、幹細胞の最適化した培養方法を提供できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、幹細胞を未分化状態に維持するうえ、フィーダー細胞を最適の条件で培養できる、幹細胞とフィーダー細胞の共培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的を達成するために、フィーダー細胞を用いて幹細胞を培養する方法において、フィーダー細胞と幹細胞を、多数のポアを有するポリマー膜によって分離された別個の空間で培養することを特徴とする、幹細胞の培養方法を提供する。
また、前記ポリマー膜がポリエステル材料からなっていることを特徴とする幹細胞の培養方法を提供する。
また、前記ポアの直径が０．２μｍ〜０．５μｍであることを特徴とする幹細胞の培養方法を提供する。
また、前記ポリマー膜の多孔性が２．０ Ｅ＋０６〜６．０ Ｅ＋０６であることを特徴とする幹細胞の培養方法を提供する。
また、前記ポリマー膜の下に前記フィーダー細胞を培養し、前記ポリマー膜の上に前記幹細胞を培養することを特徴とする幹細胞の培養方法を提供する。
また、前記幹細胞が胚性幹細胞であることを特徴とする幹細胞の培養方法を提供する。
また、前記フィーダー細胞を血清含有培地で培養し、前記幹細胞を無血清培地もしくは血清代替物培地で培養することを特徴とする幹細胞の培養方法を提供する。
また、前記フィーダー細胞が細胞増殖抑制剤で前処理されていないことを特徴とする幹細胞の培養方法を提供する。
また、前記ポリマー膜によって分離された空間に幹細胞を継代培養した後、前記継代培養された幹細胞をフィーダー細胞上に移すことを特徴とする幹細胞の培養方法を提供する。
【０００８】
本発明の前記および他の目的、特徴並びに他の利点は、添付図面を参照する次の詳細な説明からさらに明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−ａ】図１−ａは半透膜を用いた幹細胞共培養の模式図である。
【図１−ｂ】図１−ｂは半透膜を用いた幹細胞共培養の模式図である。
【図２】図２は培養条件による胚性幹細胞ＨＡＦ６（７２継代、５日培養）のコロニーの形態を示す位相差顕微鏡写真である（倍率は４０倍、スケールバーは０．５ｍｍ）。
【図３】図３は、培養条件による胚性幹細胞ＨＡＦ６（７２継代、５日培養）の未分化の程度を示す、アルカリ性ホスファターゼ染色結果である（倍率は４０倍、スケールバーは０．５ｍｍ）。
【図４】図４は、培養条件による胚性幹細胞ＨＡＦ６（７２継代、５日培養）の未分化マーカーであるＮａｎｏｇのＲＮＡ転写産物発現を示すリアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応の結果である。
【図５】図５は、培養条件による、ハウスキーピング遺伝子であるβ−ａｃｔｉｎ、胚性幹細胞ＨＡＦ６（７２継代、５日培養）の未分化マーカーであるＮａｎｏｇ、内胚葉マーカーであるα−フェトプロテイン（ａＦＰ）、中胚葉マーカーであるＫＤＲ、外胚葉マーカーであるＮＣＡＭのＲＮＡ転写産物発現を示す、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応およびアガロースゲル電気泳動の結果である。
【図６】図６は、培養条件による、胚性幹細胞ＨＡＦ６（７２継代、５日培養）の増殖を識別するゲノムＤＮＡ量を示す。
【図７】図７は、胚性幹細胞ＨＡＦ６（７２継代、５日培養）の未分化マーカーであるＮａｎｏｇのＲＮＡ転写産物発現を示すリアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応の結果である。
【図８】図８は、培養条件による、レチノイン酸で処理した胚性幹細胞ＨＡＦ６（７２継代、５日培養）の、アルカリ性ホスファターゼ染色結果である（倍率は４０倍、スケールバーは０．５ｍｍ）。
【図９】図９は、１００倍に拡大した、未分化マーカーであるＳＳＥＡ４の蛍光染色結果である(倍率は１００倍、スケールバーは１０μｍ)。
【図１０】図１０は、１００倍に拡大した、別の未分化マーカーであるＴｒａｌ−６０の蛍光染色結果である（倍率は１００倍、スケールバーは１０μｍ）。
【図１１】図１１は、培養条件による未分化マーカーであるＴｒａｌ−６０の表面発現を、ＦＡＣＳを用いて分析した結果である。
【図１２】図１２はＴｒａｌ−６０の表面発現の変化をＦＡＣＳで分析した結果である。
【図１３】図１３は長期培養する間のＴｒａｌ−６０の表面発現の変化をＦＡＣＳで分析した結果である。
【図１４】図１４はＤＡＰＩ染色とトリパンブルー染色を用いて細胞数を計数した結果である。
【図１５】図１５は、ポリマー上で培養した胚性幹細胞の核型を、染色体異常をモニタリングして分析（最少２５ケースを対象とする）した結果である。
【図１６】図１６はＦＡＣＳ分析を行って検出されたＣＤ３０形質転換マーカーを示す。
【図１７】図１７は３胚葉分化能を調べるための胚様体(EB)の形成を示す。
【図１８】図１８は、３胚葉分化能を確認する、内胚葉マーカーであるα−フェトプロテイン（ａＦＰ）、中胚葉マーカーである平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、外胚葉マーカーであるＮＣＡＭを、蛍光染色によって確認した結果である。
【図１９】図１９は、膜のポアの密度による幹細胞の未分化の程度を、アルカリ性ホスファターゼ染色を用いて調べた結果である。
【図２０】図２０はポリエステル膜のポアの密度による幹細胞の未分化の程度を、蛍光染色を用いて調べた結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を次の通りにさらに明確に説明する。
本発明は、幹細胞とフィーダー細胞の効率的な共培養方法を提供する。
本発明の一様態によれば、本発明は、フィーダー細胞を用いて幹細胞を培養する方法において、フィーダー細胞と幹細胞を、多数のポアを有するポリマー膜によって分離された２つの空間内で培養することを特徴とする、幹細胞の培養方法を提供する。
【００１１】
本発明において、前記フィーダー細胞は、幹細胞の自己複製に必要な各種栄養分およびサイトカインを供給し、幹細胞の特定の細胞への分化を抑制する役割を果たす細胞である。広く使用されてきたいずれのフィーダー細胞も選択でき、例えばマウスなどの動物由来の線維芽細胞およびヒト由来の線維芽細胞のどちらも利用することができる。一般に、マウスフィーダー細胞は、ヒト幹細胞を汚染させるなどの問題点がある。本発明によれば、フィーダー細胞と幹細胞がポリマー膜によって分離されるので、動物細胞を除外させながら純粋なヒト幹細胞を得ることができる。
【００１２】
本発明において、前記ポリマー膜は、共培養中の細胞に毒性があってはならない。膜として成形性を有するいずれの生体適合性高分子でもこのような用途に選択できる。好ましくは、前記高分子材料は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリエステル、ポリカーボネートなどよりなる群から選択できるが、これに限定されない。より好ましくは、前記高分子材料は、ポリエステル、ポリカーボネートおよびポリテトラフルオロエチレンよりなる群から選択できる。最も好ましくは、前記高分子材料はポリエステルを主成分とする高分子材料であり得る。また、前記高分子材料は、合成ポリマーのみからなるか、或いはゼラチンまたはコラーゲンなどがコートされている。
【００１３】
本発明において、ポリマー膜のポアは、フィーダー細胞および幹細胞は通過できないが、フィーダー細胞から分泌される幹細胞増殖因子および分化抑制因子などの生理活性分子は通過することができなければならない。好ましくは、前記ポアの直径は０．１μｍ〜１μｍである。より好ましくは、前記ポアの直径は０．２μｍ〜０．５μｍである。
前記ポアサイズの範囲では、フィーダー細胞から分泌されるバイオ分子は通過できるが、培地を構成する巨大分子は通過できない。よって、幹細胞とフィーダー細胞が混合されないため、培養培地による汚染を防止することができる。本発明では、前述したポリマー膜を、全細胞体を透過させる完全透過性の膜とは区別する意味で半透膜(semi-permeable membrane)と称する。
【００１４】
前記ポリマー膜の多孔性は、フィーダー細胞から分泌される幹細胞増殖因子や分化抑制因子などの生理活性分子を効果的に通過させることが可能な範囲でなければならない。好ましくは、前記ポリマー膜の多孔性は、ポリエステルに相応する２．０ Ｅ＋０６〜６．０ Ｅ＋０６の範囲である。多孔性が増大すれば、胚性幹細胞が正常に成長できず胚様体を形成する傾向がある。逆に、多孔性が減少すれば、胚性幹細胞は自然分化する傾向が高い。ここで、多孔性（ポア密度）は単位平方メートル当りのポアの数を意味する。
【００１５】
本発明のポリマー膜は、培養皿を２つの隔てられた空間に区分することができる。フィーダー細胞と幹細胞は、前記ポリマー膜を境界としていずれの位置に別々に置かれてもよい。好ましくは、培養皿の空間を上下に分けた場合、ポリマー膜の下でフィーダー細胞を培養し、ポリマー膜上で幹細胞を培養する。この場合、幹細胞はさらに活発に増殖し、分化もさらに効果的に抑制される。
【００１６】
本発明において、前記幹細胞は、共培養の間フィーダー細胞を必要とする限り、胚性幹細胞、成体幹細胞および治療用のクローン化幹細胞を含む任意の種類の幹細胞から選択できる。好ましくは、前記幹細胞はクローン化幹細胞を含む胚性幹細胞であり得る。本発明の幹細胞培養方法は幹細胞の樹立(derivation)段階を含む。
【００１７】
幹細胞の培養方法において、好ましくは、前記フィーダー細胞は血清含有培地を用いて培養し、前記幹細胞は無血清培地もしくは血清代替物培地を用いて培養する。培養プレートのそれぞれの空間は細胞の種類によってそれぞれの培地で充填される。血清は通常幹細胞の分化を誘発するので、幹細胞とフィーダー細胞の両方を、無血清培地を使用して培養するしかなかった。よって、フィーダー細胞は不適な条件下で増殖せざるを得ない。本発明によれば、各培養条件はポリマー膜によって区分されるので、それらをそれぞれ最適化することができる。幹細胞の培養空間は幹細胞の分化を防止するように無血清培地もしくは血清代替物培地で充填される。逆に、フィーダー細胞の培養空間は血清含有培地で充填され、フィーダー細胞に最適の環境を造成する。
【００１８】
本発明の幹細胞の培養方法において、前記フィーダー細胞は細胞増殖抑制剤で前処理されていない。従来の培養法では、フィーダー細胞にマイトマイシン或いは放射線照射の処理を施すので、フィーダー細胞の生存期間が短くなり、幹細胞の正常な増殖を妨害する可能性がある。本発明によれば、培養皿がポリマー膜によってあらかじめ区分され、フィーダー細胞が幹細胞を妨害する可能性がない。よって、フィーダー細胞を細胞増殖抑制剤で前処理する必要性がなく、フィーダー細胞の細胞数を高く維持して培養することができる。また、フィーダー細胞の生存期間を長期間にすることができる。よって、幹細胞をコンフルエントに達する前に継代する必要がない。最初に樹立した際は、５〜７日ではなく２週間連続して、幹細胞を培養することができる。
【００１９】
特に、本発明の、フィーダー細胞を用いて幹細胞を共培養する方法は、以下の段階：ポリマー膜によって分けられた２つの空間で幹細胞を１〜１０継代の間継代培養する段階と、次いで、前記幹細胞をフィーダー細胞上に移してさらに一般的な培養方法で培養する段階とを含む。ポリマー膜を用いて継代培養した後、さらに一般的な培養方法で培養した場合、幹細胞は、対照群より高く、未分化マーカーであるＮａｎｏｇ ＲＮＡ転写産物を発現する。また、幹細胞は、コロニーの形態を含む未分化細胞の特性をさらによく維持することができる。
幹細胞の未分化維持を確認するために、ヒト胚性幹細胞を位相差顕微鏡写真で観察する（図２）。それぞれ、幹細胞を既存の培養方法或いは新規の共培養法で培養する。また、ヒト胚性幹細胞をアルカリ性ホスファターゼ染色を用いてモニタリングし（図３）、ＳＳＥＡ４マーカーについて蛍光染色（図９）で、Ｔｒａｌ−６０マーカーについて蛍光染色（図１０）でモニタリングし、Ｔｒａｌ−６０についてフローサイトメトリー分析（図１１〜図１３）、Ｎａｏｎｏｇ ＲＮＡ転写産物についてリアルタイムＰＣＲ（図４）、３胚葉分化マーカーについてＰＣＲ（図５）を行うことによって分析し、細胞増殖を評価するためのゲノムＤＮＡ総量（図６）および幹細胞数（図１４）について比較し、染色体異常について細胞遺伝学的解析（図１５）によって、細胞の形質転換検出のためのＣＤ３０マーカーについてフローサイトメトリー分析（図１６）によって、レチノイン酸処理後の幹細胞について細胞の分化能を識別するためのアルカリ性ホスファターゼ染色（図８）によって、胚様体（ＥＢ）の形成について（図１７）および３胚葉マーカーについて蛍光染色（図１８）によって試験する。新規の共培養法で培養した後、既存の培養法でさらに培養する場合は、ヒト胚性幹細胞をＮａｏｎｏｇ ＲＮＡ転写産物についてリアルタイムＰＣＲ（図８）を行って分析する。共培養用膜は、ポリエステル、ポリカーボネートおよびポリテトラフルオロエチレンの３種が選択される。
【実施例】
【００２０】
本発明の実用的かつ現在好ましい態様を、下記の実施例に示す通り説明する。
ところが、当業者であれば、これらの開示を考慮の上、本発明の精神および範囲内において変形および改良することができる。
【００２１】
実施例１：対照群の胚性幹細胞培養
妊娠１３．５日目のマウス（ＣＦ１、Ｃ５７ＢＬ６）からマウス胎児線維芽細胞を抽出して１次培養した。得られた細胞をフィーダー細胞として使用するために、細胞増殖抑制剤としてマイトマイシン（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ−４２８７）を１０μｇ／ｍＬの濃度で１時間３０分処理した後、４×１０４／ｃｍ２の細胞密度で接種し、翌日に胚性幹細胞（ＨＳＦ６）を接種した。培地の組成は、基礎ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２５００−０６２）に３．０６９ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ５７６１）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ８５４０）、１％ペニシリン（５０Ｕ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ４６８７）／ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ１２７７）、２０％ノックアウト血清代替物（ＳＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０８２８−０２８）、４ｎｇ／ｍＬ 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１３２５６−０２９）を添加したものである。前記幹細胞を３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。培地交換は毎日行った。
【００２２】
実施例２：半透膜を用いた胚性幹細胞の共培養
共培養は、一般的なポリスチレン培養皿とコーニング社から購入した市販のｔｒａｎｓｗｅｌｌを用いて行った。まず、マウス胎児線維芽細胞をフィーダー細胞として使用するために、細胞増殖抑制剤としてマイトマイシン（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ−４２８７）を１０μｇ／ｍＬの濃度で１時間３０分処理し、或いはマイトマイシンを処理していないままで、前記線維芽細胞を５×１０３／ｃｍ２の細胞密度で接種した。翌日に上部空間に新鮮な胚性幹細胞用培地を添加して平衡化した。上部と下部間の培地の平衡がなされたかを確認した後、膜上に胚性幹細胞（ＨＳＦ６）を接種した。培地の組成は、ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．）に３．７ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ５７６１）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ８５４０）、ペニシリン（５０μ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ４６８７）／ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ１２７７）および１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＨ３００７０．０３）が混合されたものであり、この培地を２４ウェル培養皿に１．５ｍＬ添加した。２４ウェルに挿入するポリマー膜上には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２５００−０６２）に２．４４ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ５７６１）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ８５４０）、ぺニシリン（５０μ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ４６８７）／ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ１２７７）、２０％ノックアウト血清代替物（ＳＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０８２８−０２８）および４ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１３２５６−０２９）が混合された胚性幹細胞用培地を０．５ｍＬずつ添加した。場合によってはフィーダー細胞と胚性幹細胞の接種位置を変えたりもした。培地は毎日新鮮なものに交換した。図１は半透膜を用いた幹細胞共培養の模式図である。「対照群」はフィーダー細胞と胚性幹細胞を単に共培養したものである。「ポリスチレン」はポリスチレン培養皿上に胚性幹細胞を広げ、ポリエステル半透膜上にフィーダー細胞を重層して共培養したものである。「ポリエステル」はポリスチレン培養皿上にフィーダー細胞を広げ、ポリエステル半透膜上に胚性幹細胞を重層して共培養したものである。「ポリカーボネート」はポリスチレン培養皿上にフィーダー細胞を広げ、ポリカーボネート半透膜上に胚性幹細胞を重層して共培養したものである。「コラーゲンコートポリテトラフルオロエチレン」はポリスチレン培養皿上にフィーダー細胞を広げ、コラーゲンコートポリテトラフルオロエチレン半透膜上に胚性幹細胞を重層して共培養したものである。
【００２３】
実施例３：アルカリ性ホスファターゼ染色
ヒト胚性幹細胞をアルカリ性ホスファターゼ染色によって選択した。染色される幹細胞コロニーは未分化維持コロニーとして計数した。染色されない明瞭なコロニーは分化コロニーとして計数した。アルカリ性ホスファターゼ染色はｐＨ９．５のＴｒｉｓ−ＣｌにＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１ ６８１ ４５１）溶液を９９：１の割合で添加して反応させた後、発色反応を確認した（図３、図８、実験結果１、２を参照）。
【００２４】
実施例４：ＳＳＥＡ４の蛍光染色
胚性幹細胞をｐ−ホルムアルデヒドで固定した後、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を用いて浸透性を良くした。次いで、得られた細胞と、１次抗体であるＳｔａｇｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ４（ＳＳＥＡ４、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＵＳＡ）を４℃で３時間以上反応させた後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を混ぜた溶液によってよく洗浄した。その後、結果物と２次抗体であるＦＩＴＣ−コンジュゲートされた抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）を１時間反応させ、ＤＡＰＩで約５分間処理して核を染色した。図９は、未分化マーカーであるＳＳＥＡ４の蛍光染色データである。倍率は１００倍、スケールバーは１０μｍである。このデータは、胚性幹細胞がポリマー膜上でも未分化を維持しているか否かの情報を与える。結果として、他の膜上に接種した胚性幹細胞よりポリエステル上に接種した幹細胞がＳＳＥＡ４マーカーをよく発現したことが分かる。
【００２５】
実施例５：Ｔｒａｌ−６０の蛍光染色
Ｔｕｍｏｒ−Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ−６０（Ｔｒａｌ−６０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＵＳＡ）の蛍光染色は、１次抗体としてＴｒａｌ−６０を使用し、２次抗体としてＦＩＴＣ−コンジュゲートされた抗マウス抗体を使用し、実施例４に記載した方法と同様の過程で行った。図１０は別の未分化マーカーであるＴｒａｌ−６０の蛍光染色データである。倍率は１００倍、スケールバーは１０μｍである。このデータは、胚性幹細胞が未分化を維持しているか否かの情報を与える。結果として、ポリエステル膜上に接種した幹細胞がＴｒａｌ−６０マーカーも最も安定的によく発現したことが分かる。
【００２６】
実施例６：Ｔｒａｌ−６０のフローサイトメトリー
胚性幹細胞を懸濁して単一細胞に分離させた後、１次抗体であるＴｒａｌ−６０と低温で３時間以上反応させ、２次抗体で約１時間処理した後、ｐ−ホルムアルデヒドで固定させた。結果物をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を行って分析した。図１１は、Ｔｒａｌ−６０マーカーの細胞表面発現をＦＡＣＳを用いて分析した結果である。この結果は、種々の培養条件での胚性幹細胞の未分化維持がどの程度かの情報を与える。表１は図１１で計測されたＴｒａｌ−６０の細胞表面発現（％）を表として示したものである。その結果、未分化マーカーの細胞表面発現は、ポリエステル膜の場合に最も高かった。この事実はポリエステル膜上における細胞培養が未分化を維持することに最適であるということを示す。フィーダー細胞上に接種した対照群の場合、Ｔｒａｌ−６０マーカーの表面発現は非常に低いが、その理由は分化した細胞が混ぜられているためか、不活性化されたフィーダー細胞が混ぜられたためかもしれない。図１２はＴｒａｌ−６０の細胞表面発現の変化をフローサイトメトリーで分析した結果である。この結果はポリエステル膜で培養された胚性幹細胞をフィーダー細胞上に移したとき、未分化マーカーの表面発現がどのように変わるかを示す。その結果、ポリエステル膜上で培養した胚性幹細胞は、未分化マーカーの発現が高いが、３継代より多く培養した後でフィーダー細胞上に移すと、標識されない細胞数が増加した。これは細胞を収集するときにフィーダー細胞が混ぜられるためであると予想される。図１３は長期培養の間のＴｒａｌ−６０の表面発現の変化をフローサイトメトリーで分析した結果である。この結果はポリエステル膜上で胚性幹細胞を長期培養する場合、胚性幹細胞が未分化を維持していることを示す。結果として、ポリエステル膜上で長期培養した後にも、胚性幹細胞は正常に未分化マーカーを発現した。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
実施例７：逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応とリアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応
それぞれの実験群からヒト胚性幹細胞を回収した後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。前記幹細胞を、遠心分離機で３０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、上澄み液を捨てた。得られた細胞ペレットをＴｒｉｚｏｌ処理してＲＮＡを分離した。逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）させるために、約５００ｎｇのＲＮＡと、プライマーとしてのランダムヘキサマーを用い、逆転写酵素ＡＭＶ（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０ １０９ １１８ ００１）を用いてｃＤＮＡを作った。作られたｃＤＮＡ１００〜２００ｎｇに対して、センスプライマーとアンチセンスプライマー（ｂ−アクチン、ａ−ＦＰ、ＫＤＲ、ＮＣＡＭ用）、ＰＣＲプレミックス（ＰｅｒＭｉｘ、ＢｉｏＮＥＥＲ、Ｋｏｒｅａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ−２０１６）を加え、蒸留水とともに反応させた。２０〜３０回のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、および７２℃で４５秒であった。ＰＣＲ産物５μＬを１％アガロースゲル上で電気泳動してその結果を分析した（図５、実験結果１を参照）。
リアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うために、前記逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応と同一の方法でＲＮＡを得てｃＤＮＡを作った。ｃＤＮＡ１００〜２００ｎｇ、センスプライマーとアンチセンスプライマー（Ｎａｎｏｇ用）、蛍光ＰＣＲプレミックス（ｉＱＴＭＳＹＢＲ(R)Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、ＢＩＯ−ＲＡＤ、ＣＡ）を蒸留水とともに反応させた。ＢＩＯ−ＲＡＤリアルタイムＰＣＲ機を用いて３０〜４０回のリアルタイムＰＣＲ増幅を行い、その結果を分析した。
【００２９】
実施例８：ゲノムＤＮＡ抽出および定量
それぞれの実験群からヒト胚性幹細胞を回収した後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。得られた細胞を遠心分離機で３０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、上澄み液を捨てた。得られた細胞ペレットをＴｒｉｚｏｌ(Invitrogen, Rockville, Cat. No. 15596-018)処理してゲノムＤＮＡを分離した。次いで、得られたＤＮＡの吸光度を測定して分析した（図６、実験結果２を参照）。
【００３０】
実施例９：細胞数の測定
ヒト胚性幹細胞を懸濁して単一細胞として準備した後、ＤＡＰＩを細胞と３分間反応させた。次いで、細胞核を染色した後、蛍光顕微鏡の下で細胞数を計数した。別の方法として、幹細胞をトリパンブルーで染色して細胞数を測定することもできる。図１４は、ＤＡＰＩ染色と、トリパンブルー染色を用いて細胞数を計数した結果である。細胞増殖の度合いを測定するために、蛍光顕微鏡の下で細胞数を計数した。表２は図１４で計測された細胞数（Ｃｅｌｌ＃／１．１２ｃｍ２）を示した表である。その結果、ＤＡＰＩ染色およびトリパンブルー染色のどちらの場合でも、幹細胞はポリエステル膜を用いると細胞増殖が最も活発であった。この結果は上記ゲノムＤＮＡの測定結果と一致する。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
実施例１０：細胞遺伝学的解析
染色体異常を観察するために、細胞の核型を分析した。まず、ポリエステル膜上で４継代より多く継代培養した胚性幹細胞を十分に成長するまで培養した後、細胞をコルセミド（０．１μｇ／ｍＬ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、これを懸濁して単一細胞に分離した。細胞を固定した後、スライドガラスでＧ−ｂａｎｄを観察した。図１５は胚性幹細胞の核型を分析した結果である。ポリマー膜上で培養した胚性幹細胞を、染色体異常発生の有無を確認するために核型分析を行った。核型分析は少なくとも２５ケースを対象とした。その結果、ポリエステル膜上で４継代より多く培養した場合でさえも、胚性幹細胞の染色体異常がないことが確認された。
【００３３】
実施例１１：ＣＤ３０のフローサイトメトリー
ＣＤ３０は、現在まで知られている、胚性幹細胞の形質転換を明らかにする最も一般的なマーカーである。胚性幹細胞を懸濁して単一細胞に分離させた後、１次抗体であるＣＤ３０と低温で３時間以上反応させた。次いで、得られた細胞を２次抗体で１時間程度処理した後、ｐ−ホルムアルデヒドで固定させた。ＣＤ３０の表面発現をＦＡＣＳを行って分析した。図１６は、細胞形質転換マーカーであるＣＤ３０マーカーをＦＡＣＳ分析を行って検出した結果である。幹細胞がポリマー膜上で形質転換するかを観察するために、ＣＤ３０マーカーを追跡した。その結果、ポリエステル膜上で培養した胚性幹細胞は、対照群の細胞と同様にＣＤ３０を発現しない、形質転換されていない正常な細胞であることが分かった。
【００３４】
実施例１２：レチノイン酸を用いた分化の誘導
接種後２日目にヒト胚性幹細胞に分化を誘導した。そのときから、ヒト胚性幹細胞が散らばりコロニーを形成し始めた。全トランスレチノイン酸(all-trans-retinoic acid)をＤＭＳＯ溶液に溶かして最終濃度が１０−６Ｍとなるように培地に滴下した後、３日間毎日前記レチノイン酸溶液を処理し続けた。４日間毎日新鮮な培地で培地交換を行った。対照群は５日間毎日新鮮な培地に交換しながらいかなる溶液でも処理しなかった。
【００３５】
実施例１３：胚様体（ＥＢ）の形成および３胚葉マーカーの蛍光染色
胚性幹細胞のコロニーを適正のサイズに切って細胞が凝集しないように特殊コーティングされたｈｙｄｒｏｃｅｌｌ（日本）上で培養した。このとき、ノックアウト血清代替物１０％、２％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液を用いて、膜を浮遊させてコロニーが胚様体（ＥＢ）を形成するようにした。形成された胚様体をｐ−ホルムアルデヒドを用いて固定し、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で処理して抗体がよく浸透するようにした。次いで、細胞を１次抗体と低温で３時間以上反応させ、よく洗浄した後、２次抗体と１時間反応させ、ＤＡＰＩ染色によって細胞核を染色した。ポリエステル膜上で培養した胚性幹細胞の分化能を確認するために、該細胞から胚様体を作り、内胚葉、中胚葉、外胚葉マーカーを用いて蛍光染色を行った。結果物を蛍光顕微鏡の下で観察して蛍光マーカーの発現を検出した。図１７は胚様体の形成結果である。胚性幹細胞が胚様体を形成するように誘導し、分化能を測定した。図１８は、内胚葉マーカーであるα−フェトプロテイン（ａＦＰ）、中胚葉マーカーである平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、外胚葉マーカーであるＮＣＡＭを示す蛍光染色されたマーカーである。誘導された胚様体を観察して分化能を測定した。その結果、本発明によって培養された胚性幹細胞が胚様体を形成しかつ内胚葉、中胚葉、外胚葉への分化能を有することが分かった。
【００３６】
実施例１４：多孔性による細胞培養特性試験
単位ｃｍ２当りのポアの密度が異なる多くのポリエステル膜を準備し、胚性幹細胞を培養した。幹細胞が未分化を維持しているか否かを観察するために、前述した実験と同様の手順によりアルカリ性ホスファターゼ染色を行い、未分化マーカーを染色した。細胞増殖比率を調べるために、トリパンブルー染色後に細胞数を計数した。図１９は膜のポアの密度による幹細胞の未分化の程度をアルカリ性ホスファターゼ染色で調べたものである。このマーカー（スケールバー：２０μｍ）により幹細胞の未分化維持の有無を検出した。多孔性が増大すれば、胚性幹細胞は正常に成長できず胚様体を形成する傾向が強かった。これに対し、多孔性が低減すれば、胚性幹細胞は自然分化する傾向が高かった。結果として、多孔性は２．０．Ｅ＋０６〜６．０．Ｅ＋０６の範囲で調整することができると判断される。図２０はポリエステル膜のポアの密度による幹細胞の未分化能を調べるために、蛍光染色されたＴｒａｌ−６０マーカーを示す。多孔性が増大すると、胚性幹細胞が未分化を維持する能力が低下した。これに対し、多孔性が低減すると、胚性幹細胞のクローン内にある単一細胞のサイズが大きくなる傾向を示した。図２１はポリエステル膜の多孔性による細胞増殖を、トリパンブルー染色によって調べた結果である。細胞増殖を観察するために、細胞数を直接計数した。表３は図２１で計測された細胞数（Ｃｅｌｌ＃／１．１２ｃｍ２）を表として示したものである。多孔性を高めるほど、細胞増殖は低下した。
【００３７】
【表３】
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【００３８】
実験結果１：半透膜を用いて共培養された幹細胞の未分化維持
半透膜を用いた共培養において、幹細胞が付着する材質の種類によって未分化維持程度に差異を示した。例えば、ポリエステル膜を境界として幹細胞とフィーダー細胞を培養するときに、同一の共培養条件でも、ポリスチレン培養皿上で生育した幹細胞（図１、ポリスチレン）の形態は、反対にポリエステル膜上で培養した幹細胞（図１、ポリエステル）の形態とは非常に異なることが観察された。ポリエステル膜上で培養した幹細胞は増殖が活発であって、コロニーの境界が識別されないだけ膜の表面全体を５日内に覆い被せた（図６）。細胞の大きさも、これは未成熟細胞に特有の性質であるが、幹細胞は核：細胞質の比率が高く過密であった。これに対し、ポリスチレン膜上で培養した幹細胞は、未分化のいかなる特徴も示さず、コロニーが底部に密接に付着していた（図２）。ポリスチレン膜上で培養した対照群では、フィーダー細胞上に胚性幹細胞を接種するので、フィーダー細胞から分泌された細胞外基質がポリスチレンの表面と幹細胞との間に蓄積されていると見られる。半透膜上で培養した幹細胞および対照群のいずれも、アルカリ性ホスファターゼ染色によって未分化状態を維持していることがわかった（図３）。ところが、それらの細胞をより詳細に調べた結果、培養条件による差異が観察された。未分化マーカーであるＮａｎｏｇ ＲＮＡ転写産物の発現をリアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応によって調べた。その結果、ポリスチレン上の幹細胞は対照群より著しくレベルが低かった（閾値サイクル数：対照１２．４対ポリスチレン１５、図４）。この際、閾値サイクル数は発現された特定の遺伝子の量に反比例する。このような結果は、幹細胞が接種される材質と半透膜を介して分割された独立した空間の両方が、幹細胞を効率よく培養するのに重要な要因になることを立証する結果である。胚性幹細胞の未分化マーカーであるＮａｎｏｇ ＲＮＡ転写産物を、リアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応によっても調べた。その結果、ポリカーボネートおよびコラーゲンコートポリテトラフルオロメチレン上の幹細胞はいずれも、ポリスチレン上の幹細胞および対照群より高レベルで前記転写産物を発現した（図４）。
【００３９】
【表４】
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【００４０】
ところが、ポリエステル膜上の幹細胞以外は、すべての幹細胞が、内胚葉マーカーとしてのα−フェトプロテイン（ａＦＰ）および外胚葉マーカーとしてのＮＣＡＭにおいて分化し始めた（図５）。したがって、ポリエステル膜上で胚性幹細胞を、フィーダー細胞と共培養する場合、胚性幹細胞の未分化能（図４、図５）が最もよく維持されることが分かった。フィーダー細胞が良い状態であると見られるので、このような共培養方法はフィーダー細胞に最適化した条件を提供するという利点がある。
【００４１】
実験結果２：半透膜を用いて共培養した幹細胞の増殖速度の向上
ポリエステル膜を境界として共培養する場合の、幹細胞の増殖速度をモニタリングした。具体的に、同一の共培養条件でも、ポリスチレン培養皿上で生育させた幹細胞（図１、ポリスチレン）の増殖速度は、その反対にポリエステル膜上で培養した幹細胞（図１、ポリエステル）の増殖速度と非常に異なることが観察された。すなわち、ポリエステル膜上で培養された幹細胞は、増殖が活発であって、コロニーの境界が識別されないだけ膜の表面全体を５日内に覆い被せた（図６）。これに対し、ポリスチレン上で培養された幹細胞はコロニーの大きさの増加がなかった。このような結果はゲノムＤＮＡ量からも確認できる一貫した結果である。詳細には、ポリエステル膜上から得られたＤＮＡ量は１．８倍程度増加し、さらに対照群のＤＮＡの増加より２．７倍程度高く増加した。これにより、ポリエステル膜上で胚性幹細胞を培養し、ポリスチレンプレート上でフィーダー細胞を培養する場合、胚性幹細胞は最もよく増殖できることが分かる（図６）。
【００４２】
実験結果３：半透膜上で共培養した後、一般培養方法で培養した幹細胞の試験
幹細胞を半透膜上で共培養した後、一般培養方法で培養した。得られた幹細胞の未分化維持の増大の有無を確認した。まず、ポリエステル膜を境界として幹細胞とフィーダー細胞を２継代共培養した後、さらに幹細胞をフィーダー細胞上に直接培養する一般的な培養方法で培養した。その結果、リアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応によって、前記幹細胞のＮａｎｏｇ ＲＮＡ転写産物の発現は、却ってポリエステル上の幹細胞または対照群より高かった（図７）。また、幹細胞のコロニーも未分化細胞特性を有していた。よって、半透膜上で共培養する方法を１〜３継代施行した後、さらに一般的な方法で培養しても、幹細胞は顕著に未分化を維持することが分かる。
【００４３】
【表５】
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【００４４】
実験結果４：半透膜上で共培養した幹細胞の分化能試験
培養条件に応じた３つのグループの幹細胞をレチノイン酸１０−６Ｍで処理し、アルカリ性ホスファターゼ染色によって分析した（図８）。３つのグループはポリエステル膜上で培養した幹細胞、ポリエステル膜上で２継代共培養した後で一般的な方法で培養した幹細胞、および対照群からなっていた。その結果、３つのグループのいずれもレチノイン酸処理によって分化が進んでアルカリ性ホスファターゼに対して陰性と観察された。ところが、ポリエステル膜上で培養した幹細胞は、コロニーの外側半分で分化しているが、内側半分では分化せずにアルカリ性ホスファターゼに対して陽性であると認められた（図８）。よって、ポリエステル膜上で培養した幹細胞が分化を相当遅延させていることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
上記にて説明し確認したように、本発明によれば、幹細胞とフィーダー細胞を、必須な物質を選択的に透過させながら独立した空間で別々に培養する、最適化した幹細胞の培養条件が提供される。本発明により共培養した幹細胞は、継代培養が必要になるまで未分化状態を維持しフィーダー細胞により支持され続ける。さらに、放射線照射またはマイトマイシンなどの細胞増殖抑制剤で前処理を施す必要がないので、治療用として用いられる幹細胞でも、汚染なしに取得することができる。したがって、本発明の膜を用いる幹細胞の共培養方法は、臨床適用に広く活用できる。
当業者は、上述した説明に開示された概念および特定の実施態様が、本発明の同一目的を行うための他の実施態様を変更または設計するための基礎として容易に利用され得ると理解するであろう。
また、当業者は、そのような同等な実施態様が添付した請求の範囲に開示された本発明の精神と範囲から逸脱しないことを理解するであろう。
【図１−ａ】
2010500878.tif 000008
【図１−ｂ】
2010500878.tif 000009
【図２】
2010500878.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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