(57)【要約】【解決手段】  この発明は異なる粘弾性を有する溶液中の生体を分離する方法に関係し、高い粘弾性を有する生体は薄膜を通過させ、低い粘弾性の生体を薄膜の上に保持するろ過ステップと、分離された粘弾性の低い生体を薄膜の上部または上面で回収し、及び／又は分離された粘弾性の高い生体をろ液で回収するステップを有する方法に関係する。好適には生体は細胞である。より好適には、回収される細胞は生存細胞である。１つの好適な実施例においては、それらの細胞は腫瘍細胞である。他の好適な実施例では、それらの細胞は胎児細胞であり、この方法は出生前診断に適用されるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中の複数の天然の生体を分離する方法であって、前記天然の生体は少なくとも天然の低粘弾性の生体タイプと天然の高粘弾性の生体のタイプとを含み、前記天然の低粘弾性の生体は前記天然の高粘弾性の生体より低い粘弾性を有し、前記天然の低粘弾性の生体は循環胎児細胞、腫瘍又はがん細胞からなるグループの少なくとも１つであり、前記方法は、
薄膜には孔が空いており、該孔の直径は前記天然の低粘弾性の生体の直径よりも小さくかつ前記天然の高粘弾性の生体の一部の直径よりも小さく、前記天然の高粘弾性の生体は前記薄膜を通過させるとともに前記天然の低粘弾性の生体を前記薄膜の上部に保持し、
制御力が加えられ、該制御力は、前記天然の低粘弾性の生体が前記薄膜を通過するのに必要な所定の力より小さく、かつ前記天然の高粘弾性の生体が前記孔を通過するのに必要な所定の力以上である、
前記溶液のろ過ステップと、
分離された前記天然の低粘弾性の生体を前記薄膜の上部又は上面で回収し、及び／又は分離された前記天然の高粘弾性の生体をろ液で回収する回収ステップと、
を含む天然の生体を分離する方法。
【請求項２】
前記制御力は、20 から190 k Pascal 、望ましくは40 から 60 k Pascal、より望ましくは 45から 55 k Pascalである差圧によりもたらされる力に対応し、 前記孔の平均直径は3 μm から15 μm、好ましくは8 μm から10 μmであり、前記天然の低粘弾性の生体を前記薄膜の上部又は上面で回収する請求項1に記載の天然の生体を分離する方法。
【請求項３】
前記複数の天然の生体は少なくとも２つの細胞タイプである請求項１又は２に記載の天然の生体を分離する方法。
【請求項４】
回収される前記細胞タイプは生存細胞である請求項３に記載の天然の生体を分離する方法。
【請求項５】
前記細胞タイプを含む前記溶液は血液サンプルの遠心分離ステップからもたらされた、単核細胞分画を含む請求項３または４に記載の天然の生体を分離する方法。
【請求項６】
前記細胞タイプの１つが胎児細胞タイプである請求項３乃至５のいずれかに記載の天然の生体を分離する方法。
【請求項７】
前記胎児細胞は母性血液中に存在する胎児細胞である請求項６に記載の天然の生体を分離する方法。
【請求項８】
前記ろ過ステップにおいて、温度は20℃から40℃の間である請求項１乃至７項のいずれかに記載の天然の生体を分離する方法。
【請求項９】
前記薄膜はポリカーボネイト薄膜である請求項１乃至８のいずれかに記載の天然の生体を分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は異なる粘弾性を有する溶液中の生体を分離する方法に関係し、高い粘弾性を有する生体は薄膜を通過させ、低い粘弾性の生体を薄膜の上に保持するろ過ステップと、分離された粘弾性の低い生体を薄膜の上部または上面で回収し、及び／又は分離された粘弾性の高い生体をろ液で回収するステップを有する方法に関係する。好適には生体は細胞である。より好適には、回収される細胞は生存細胞である。１つの好適な実施例においては、それらの細胞は腫瘍細胞である。他の好適な実施例では、それらの細胞は胎児細胞であり、この方法は出生前診断に適用されるものである。
【背景技術】
【０００２】
異常や病気の兆候を見つけるのに、生体サンプルや生物資料の検査が望ましい場合がよくある。
【０００３】
例として、血液や髄液サンプル中の細胞ががん検査に必要とされる場合がある。これらのサンプルには数百万の細胞が含まれるので、大部分の不要な細胞や液体を分離して必要とする細胞を濃縮することが非常に重要となる。
【０００４】
血液や髄液サンプルでは、血漿、赤血球細胞、白血球細胞を除去し、通常は存在しない、がんのような異常の兆候を示す少数の細胞を濃縮することが望ましい。白血球細胞は多くの場合検査対象の細胞に非常に似ているので、ロスを無くして白血球細胞を除去するのは困難がある。結果として濃縮された必要細胞は以後の分析に使われる。
【０００５】
現在利用できる細胞種類を分離する方法は、サイズによる分離、遠心分離（密度／比重）による分離、及び化学的または生化学的性質に基づく分離がある。
【０００６】
遠心分離による分離法は、白血球細胞と赤血球細胞の分離例のように2つの細胞のタイプが非常に異なる場合に有効である。しかし、白血球細胞とがん細胞のように2つの細胞が似たような密度およびサイズを持つ場合には遠心分離は役立たない。遠心分離による細胞の分離は、死細胞でさえもそれらの周囲や環境条件に反応するため、細胞の密度が一定ではないというさらなる制限がある。
【０００７】
抗体が表面抗原（磁気ビーズにそれらは吸着する）に細胞を結合させることによる、免疫化学を用いる（生）化学的性質に基づく分離は、高価で多くの手間と時間がかかる。この分離法では多くのステップにより細胞が失われ、分離効率が落ちる。さらにマッチングする抗原がない場合、及び／又は抗原が他の血液成分により不明瞭にある場合には細胞が失われる。血漿タンパクが循環血液中の細胞の外皮をつくり（がん細胞が免疫システムから逃れるために取り得る方法）、これにより抗体が細胞を認識できない場合がある。この方法により分離された細胞はしばしば分離した結果を目視で検査するのが困難な形状になる場合がある。
【０００８】
サイズによる分離は通常フィルタまたは特定のサイズの孔を持つ1つ以上の中空のチューブ配列を用いたろ過により行われる。その孔より大きな細胞はフィルタの一方側に留まり、小さな細胞はフィルタを通過してフィルタの他方側に集められる。この分離法では、細胞膜を安定させるためにホルムアルデヒドのような固定剤が使われる。しかし固定剤の作用の後では、細胞はもはや生存能力を失い、培養することができない。さらに、2つのタイプの細胞のうち一方のタイプの細胞が他方のタイプの細胞に比べてある部分が大きく、他の部分が小さい（サイズ重複分布）場合には、フィルタはこれら2つのタイプの細胞を有効に分離できない。その結果必要とする細胞の一部が失われ、分離効率が低下する。
【０００９】
結果的には、上記の分離法による分離は細胞を生化学的にも物理的にも損傷し、これにより細胞形態を変えて以後の処理、分析を妨げる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、同一サイズのまたは重複サイズの分布となり得る異なる生体を分離でき、好適には、細胞を分離する場合には分離された細胞が生存能力がありさらに培養できるように、生体を変性させることがない方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者達はそのニーズに応える新しい分離方法を考案した。この方法によれば、たとえそのサイズが同等あるいは重複していても、異なる生物学的特性に基づいて生体が分離される。さらに、この方法によれば回収する生体を好適に培養することができる。
【００１２】
従って、この発明は異なるタイプの生体がサイズ、形、及び密度で十分に分離できない場合（白血球細胞とある種のがん細胞が2つの重要な細胞例である）、生体のタイプにより生体を分離する方法に関する。さらにこの方法は、必要とする生体の損失リスクを抑えて、サイズの小さいサンプルを使うことができる、高い分離効率を提供する。さらにこの方法は必要とする生体を生化学的にも形態学的にも損なうことがなく、その後の処理や分析を妨げることがない。そして分離された生体はその本来の形態を維持できる。必要とする生体の化学的／生化学的な調整は行われない（知られているそのような全ての調整それ自体が生体の生化学的、及び／又は生物物理学的、及び／又は形態学的特性を変えるものとなる）。分離された生体はその後病理学者による好適な手順で容易にスライドにセットされるか、自動視覚システムで読み取られるか、あるいは以後の処理に備えて溶液中に保存される。
【００１３】
以上より、この発明の要旨は溶液中にある複数の天然に存在する生体を分離する方法であり、その複数の生体は少なくとも天然の低粘弾性生体と、天然の高粘弾性生体を含み、天然の低粘弾性生体は、天然の高粘弾性生体よりも低い粘弾性を有し、天然の低粘弾性生体は少なくとも循環する胎児細胞及び腫瘍又はがん細胞のグループの1つであり、その方法は、前記薄膜には孔が空いており、その孔の直径は天然の低粘弾性生体の直径よりも小さくかつ天然の高粘弾性生体の一部の直径よりも小さく、天然の高粘弾性生体は薄膜を通過させるとともに天然の低粘弾性生体を薄膜の上部に保持し、制御力が加えられ、その制御力は天然の低粘弾性生体が薄膜を通過するのに必要な所定の力よりは小さく、かつ天然の高粘弾性生体が前記孔を通過するのに必要な所定の力以上である、溶液のろ過ステップと、分離された前記天然の低粘弾性生体を前記薄膜の上部又は上面で回収し、及び／又は分離された前記天然の高粘弾性生体をろ液で回収する回収ステップとを備える。
【００１４】
明細書を通して使用される用語“天然”は、この発明にかかる方法において、サンプリングと回収のステップ間で化学的／生化学的に変更されない物体や性質を修飾する用語であることを理解すべきである。
【００１５】
生体は、細胞、バクテリア、ウィルス、イースト等どんなタイプであっても良い。そのようなリストには際限がない。溶液中の生体はあらゆる生体サンプルから採取できる。生体サンプルは血液、髄液、尿、いかなる生検組織、及び生検腫瘍のような体液であっても良い。この方法は液体生体サンプルに限定されない。一例として、固体の生検組織が前処理され、組織を個々の細胞に分解する。細胞はその後保存液で懸濁される。それはまた、水と土壌サンプル、植物組織と液体等であっても良い。
【００１６】
好ましくは、複数の生体は少なくとも2つの細胞タイプである。
【００１７】
分離される細胞はどんなタイプであっても良い。これらは、血液中に自然に存在する。例えば、巨核球、単球、マクロファージ、樹枝状細胞、好中性顆粒球、好酸性顆粒球、好塩基性顆粒球、マスト細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、細胞傷害性T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、網状赤血球、幹細胞及び血液と免疫システムのための前駆細胞がある。分離される細胞は他の起源にも属する。それらは、上皮細胞（角化上皮細胞、湿潤層状バリア上皮細胞、外分泌上皮細胞）、内臓細胞、外分泌腺及び尿生殖路、内皮細胞、代謝貯蔵細胞（肝細胞、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、肝脂肪細胞）、バリア機能細胞（肺、内臓、外分泌腺および尿生殖路）、密閉された内部体腔をライニングする外皮細胞、細胞外基質分泌細胞、収縮性細胞、知覚変換器細胞、自律神経ニューロン細胞、感覚器官及び末梢ニューロン支持細胞、中枢神経系ニューロン及びグリア細胞、水晶体細胞、色素細胞、胚細胞、ナース細胞がある。
【００１８】
分離される細胞は異常細胞、例えば突然変異細胞、ウィルス感染細胞又は腫瘍細胞であっても良く、上記の細胞タイプのいずれに属していてもよい。
【００１９】
好ましい実施例においては、回収される細胞タイプは培養液中でさらに分割、拡大した後、生物学的、遺伝子学的、免疫組織化学的及び生化学的な手法により分析されることになる。従って回収される細胞は好適には生存細胞であり、ろ過ステップで使用する溶液は分離された細胞を殺すいかなる試薬も含んでいない。
【００２０】
他の実施例において、回収される細胞タイプは、培養液中でさらに拡大、分割することなく生物学的、遺伝子学的、免疫組織化学的及び生化学的な手法によりさらに分析するために処理される。
【００２１】
他の実施例において、薄膜の上にターゲット細胞を回収した後、その核酸物質がさらなる分析のため抽出される。核酸（DNA, RNA）によりターゲット細胞に具体的に表れる遺伝子異常や遺伝子を特定できる。
【００２２】
細胞骨格は真核細胞の細胞質に及ぶ3次元高分子足場である。このネットワークは、アクチンフィラメント、微小管、中間径フィラメント、及び付属タンパク質を含む。それは細胞構造を与え、粘弾性とともに細胞運動性に影響を与える。細胞粘弾性は、物理的な力が加わったときの細胞の変形度を決定づける。そして、結果として細胞構造や機能に影響を与える。生存細胞の粘弾性の決定には、生理的条件のもとで細胞の力対歪みの関係を定量化することが必要である。粘弾性の決定に使うことができる技術についてはいくつかの論文があり、当業者に良く知られている。
【００２３】
細胞のレオロジー/粘弾性を測定するために数多くのシステムが記述され、マイクロピペット吸引も含まれる(Evans E. and Yeung A., Biophys. J. (1989), 56, 151-160.), 薄膜マイクロホールの通過 (Frank R.S., Tsai M.A. J Biomech Eng. (1990); 112, 277-82), 光ピンセット (Ashkin A. and Dziedzic j.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989), 86, 7914-7918), 原子間力顕微鏡法 (Benoit M. et al., Nature Cell Biol. (2000), 2, 313-317).  これらの技術は適切なレオロジーモデルに結合することができる。
【００２４】
マイクロピペット吸引技術は細胞の粘弾性を測定するのに良く使われる方法である。この技術は溶液中、及び生理的環境の下で細胞の粘弾性を測定する特徴がある。例として、肝細胞及び肝細胞がん(HCC) の細胞の両方の粘弾性がマイクロピペット吸引技術により測定された (Wu ZZ and al., Biorheology. 2000, 37.279-290)。
【００２５】
この発明によれば、プロセスの第1ステップの間で、その天然の粘弾性に従って適切なサイズの孔を含む薄膜を通すろ過ステップにより選別される。好ましくは、制御力がろ過ステップで加えられ、それは天然の低粘弾性の生体が薄膜を通過するのに必要な所定の力より小さく抑えられ、天然の高粘弾性の生体が薄膜を通過するのに必要な所定の力よりは大きく維持される。
【００２６】
この発明によれば、“制御力”の表現は、ろ過ステップの間に加えられ、天然の低粘弾性の生体を保持し、分離のため完全な状態で保存するとともに、天然の高粘弾性の生体が適当なサイズの孔を有する薄膜を通過させる力を表わすのに使われる。
【００２７】
この印加される力は、ろ過膜の両側間に生じる差圧によりもたらされ、力＝（差圧）×（生体面積）となる。この発明の他の実施例により、この印加力は遠心力により加えられた加速度によりもたらされる。例えば、生体により、力＝加速度×（生体質量）となる。
【００２８】
この発明によれば、末梢血サンプルから始まる循環する必要細胞の分離は、白血球細胞と循環する必要細胞間の粘弾性の相違に基づいている。具体的な実施例において、天然の低粘弾性細胞は腫瘍、がん細胞、もしくは胎児細胞である。
【００２９】
この発明で使われる薄膜は、疎水性の性質を示し、大部分は不活性であり強靭である。結果として圧力を受けても孔のサイズは一定となる。この発明で使われる薄膜は、例えば、ポリカーボネイト薄膜である。ポリカーボネイト薄膜は上記のような性質を有し、分離されその生物学的性質として使われる細胞に対して、薄膜からガラススライドへの効率の高い細胞転送速度を有する。
【００３０】
ある具体的実施例においては、天然の低粘弾性細胞は腫瘍細胞やがん細胞である。他の具体的実施例においては、天然の低粘弾性細胞は胎児細胞である。好適には、その胎児細胞は母性血液の中で循環する胎児細胞である。
【００３１】
好適には、ろ過ステップで加えられる制御力は20 kPascalsから190 kPascals, 望ましくは40 kPascalsから60 kPascals, さらに望ましくは45 kPascalsから55 kPascalsの差圧によりもたらされる力に対応し、孔の平均的な直径は、3 μmから15 μm、望ましくは6 μmから 10 μm, さらに望ましくは8 μmから 10 μm からなる、このようにして腫瘍細胞や胎児細胞を薄膜上部やその上に回収する。孔のサイズと印加制御力間で調和がとれていることが望ましい。さらに、ろ過ステップは20℃から40℃で実施される。
【００３２】
実際、通常細胞、胎児循環細胞、がん循環細胞は異なる粘弾性を示す。科学文献によれば、多くの白血球の細胞タイプは折りたたまれた細胞膜を持つ。折りたたまれた白血球細胞を開くことで白血球細胞に粘弾性を与え、それにより、圧力を加えた場合に細胞が伸長し、マイクロピペットのチップを、チップのサイズが白血球細胞の直径の1/4以下の場合であっても通過する（E Evans and A Yeung, (1989).  Biophysical Journal 56: 151-160）。
【００３３】
好中球、その直径は10 μmから12μmであるが、3μm の孔を通過できる。詳細には、白血球細胞には以下の異なるタイプがある。
＊小型白血球細胞
‐白血球細胞の20-25 % を占める。直径は6-8 μm、 核スフェロイドか卵形細胞、高密度塊状クロマチン、薄青に着色した少ない細胞質を有する。
＊中型白血球細胞
‐白血球細胞の1.5-2.0 % を占める。直径は8-12 μm、 核スフェロイドか卵形細胞、低密度のクロマチン、細胞質は多く、より多くの核を囲む傾向にある。
＊好中球
‐白血球細胞の60-70 % を占める。直径は10-12 μm、2-8ローブの核、高密度の粗い塊状クロマチンを有し、細胞質は好中性顆粒と女性の好中球の3 %にあるローブ上の“ドラムスティック”を有し、好酸性である。
‐好中球の1-2 %は馬蹄形状の核を有し、細胞質は顆粒を有している。
＊単球
‐白血球細胞の3-8 % を占め最大の白血球細胞である。直径は20 μm、 核はジグザグ形状、青白い豊富な細胞質を有する。高密度塊状クロマチン、薄青に着色した豊富な好塩基性の細胞質を有する。一様でない（泡状）の外観を示し、少量の細かいアズール性顆粒を含む細胞質を有する。
＊好酸球
‐白血球細胞の5 % までを占め直径は12-15 μm、 核はローブが少ない。通常は双丘のローブのみである。クロマチンは塊状だが好中球の様に高密度ではない。細胞質は淡いピンクに着色された多数の大型の好酸性顆粒で満たされている。
＊好塩基球
‐白血球細胞の1 %以下を占め直径は14 μm、 核は大きく双丘のローブである。クロマチンはよりきめが細かく、核は青白く着色し、細胞質はダークブルーに着色された多数の大型の好塩基性顆粒で満たされて、それによりブラックベリーの外観を有する核を見え難くしている。
【００３４】
他のタイプの細胞はこの折りたたまれた細胞膜を有してなく、それ故に細胞の直径よりも小さい孔を通過するのが困難である。白血球細胞のサイズに対し薄膜の孔のサイズが小さければ小さいほど、白血球細胞に対し孔を通過させるのにより大きな差圧が必要となる。例えば、細胞の形態が通常細胞からがん細胞へ発達するにつれて細胞膜はある場合は厚く、またある場合は薄くなる(Gang Zhang et al. 2002, World J Gastroenterol; 8(2), 243-246)。
【００３５】
細胞膜が薄くなれば、それはその分損傷（ダメージ）や溶解を受けやすくなる。必要とする細胞を損傷させない限界値が、その細胞が損傷を受けることなく薄膜の両面に加えることができる差圧に対し上限値を与えることになる。このように、悪性細胞への変容が粘弾性を減少させると考えられる。
【００３６】
この発明の方法は、異なる細胞間の粘弾性の相違に基づいて細胞のタイプを有効に分離する方法である。
【００３７】
例えば、血液サンプル中の循環する細胞の分離を粘弾性に基づいて行う場合、孔サイズが控えめにみて8 μmのポリカーボネイト薄膜（8 μmのWhatman polycarbonate Nuclopore filtersから必要分カット）を使い、20℃- 40℃で40-60 kPascalの差圧を加える。
【００３８】
これは、その粘弾性のために、細胞の75 %のサイズが8 μm以上であるにもかかわらず白血球細胞の大多数が通過するのに十分な条件である。一方他の細胞は、すなわち白血球細胞ではない8 μm以上の直径の細胞は（薄膜により）ブロックされることになる。
【００３９】
直径8 μm以下の他の細胞から白血球細胞を分離するには、4 μmの小さい薄膜を用い、その細胞を損傷しないように必要に応じた圧力を加えるあるいは必要な細胞が薄膜を通過できる圧力を加える。ポリカーボネイトの薄膜は、それらが疎水性であり、通常不活性であり、弾性が低く強靭である理由で使われる。このため、例え圧力を加えられても孔のサイズは一定に保たれる。さらにポリカーボネイトの薄膜は、薄膜からガラススライドへの細胞の転送について高い転送効率を有する。
【００４０】
好ましくは、その細胞タイプを含む溶液は、血液サンプルの遠心分離ステップによりもたらされた単核細胞部分である。具体的実施例において、低粘弾性細胞は循環腫瘍細胞である。
【００４１】
他の実施例において、少なくとも1つの細胞タイプは胎児細胞である。望ましくは、その胎児細胞は母性血液中を循環する胎児細胞である。
【００４２】
胎児細胞は母性血液循環の中に存在する。母性血液から胎児細胞を分離できれば、本来母親と胎児への危険が伴う侵襲的出産前診断 (絨毛膜標本採取又は羊水穿刺) に代えて、胎児細胞の遺伝子分析 (FISH, PCR, sequencing) に従った非侵襲的方法による診断を行うことができる。3つの異なる胎児細胞の、トロホブラスト、胎児白血球細胞、胎児赤血球細胞（Bianchi, British Journal of Haematology, 1999 参照）が母性血液中を循環する。
【００４３】
絨毛の外側 (extravillous) に存在する胎児トロホブラストは妊娠初期3カ月間に胎盤ベッドの母体組織へ移動する。この侵入のプロセスはトロホブラスト細胞に特異的であり、母体脊髄動脈の血管適応をもたらす。結果的に、トロホブラスト細胞の特定の一部がよく起きることとして母体血液中に現れる(Oudejans et al. 2003, Prenatal Diagnosis)。初期3カ月の中ごろに第1の波のピークがあり、その最後に第2の波のピークがある。
【００４４】
この発明の2つ目の特徴は、この発明の方法に従った体外での出産前診断である。その中で、2つの細胞タイプの少なくとも1つが上記の胎児細胞タイプである。1 mlの血液中に700万の白血球細胞があることを考るならば、異なるタイプの白血球細胞の数とサイズは以下のようになる。
‐小型白血球細胞：サイズ6-8 μm , 1,575,000 /ml, 白血球細胞の全体数の22.5 %を占める。
‐中型白血球細胞：サイズ8-12 μm , 1,225 /ml, 白血球細胞の全体数の0.02 %を占める。
‐好中球細胞：サイズ10-12 μm , 4,620,000 /ml, 白血球細胞の全体数の66 %を占める。
‐単球細胞：サイズ20 μm , 385,000 /ml, 白血球細胞の全体数の5.5 %を占める。
‐好酸球細胞：サイズ12-15 μm , 350,000 /ml, 白血球細胞の全体数の5 %を占める。
‐好塩基球細胞：サイズ14 μm , 70,000 /ml, 白血球細胞の全体数の1 %を占める。
‐胎児細胞：サイズ約12 μm , 5 /ml, 白血球細胞の全体数の0.00007 %を占める。
【００４５】
この発明に基づく方法が母体血液中を循環する胎児細胞の分離に非常に適合することが付属例から理解できる。
【００４６】
上記説明には多くの実例を含んでいるが、これらは発明の範囲を制限するものとして解釈すべきではなく、好適な実施例の例示として解釈すべきである。この発明の範囲には多くの他の分岐やバリエーションを含むことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図1a, 1b, 1c, 1dは、 差圧又は遠心力により小さな孔に細胞を通過させる概念図である。
【図２ａ】重複サイズの2のタイプの細胞集団が分布する様子を表す概略図である。細胞集団Aは平均サイズが細胞集団Bより大きい。一方、細胞集団Aは細胞集団Bに比べ粘弾性が高い。
【図２ｂ】細胞集団Aと細胞集団Bの混合液に対して薄膜のろ過を従来サイズで行う、従来の分離処理を示す。ここでは、薄膜上部又は上に残る細胞の分布を示す。フィルタの孔よりサイズの小さい細胞が薄膜上部又は上に留まることを示している。ろ過後、2つの集団が大量に重複して留まることに注目すべきである。より小さな孔サイズで、タイプBの集団とともに大半のタイプAの集団が留まる。結果として必要とする細胞（タイプB）濃度が減少する。逆に、大きいサイズの孔の場合は、タイプBの細胞（必要とする細胞）の多くが失われ、結果として、タイプBの細胞に対する全体の感度が低下する。さらに、分布曲線の位置、形は患者によっても変わる。この分布の重複やバリエーションにより、従来のサイズによるろ過が2つの細胞タイプを分離するうえでうまく機能しない。
【図２ｃ】細胞集団Aと細胞集団Bの混合液を本発明の原理に従い制御された差圧を使って処理し、回収と濃縮を向上することを示す。細胞集団Aはそれらが薄膜の孔のサイズより大きい場合であっても、細胞集団Bに比べて粘弾性が高いので、薄膜を通過する。細胞集団Bはそのサイズが薄膜の孔のサイズより小さいか、あるいは同等に近くなければ、薄膜の孔を通過できない。図2cは本発明の原理に従って薄膜の上部もしくは上残留する細胞の分布を表している。図2bに比べ、図2cは高い分離効率を示すことに注目すべきである。
【図３】この発明方法を使ってMCF7細胞が蒔かれ光を遮断したサンプルから回収されたMCF7細胞を示す。
【図４】ろ過装置（付記Aの6参照）
【図５】薄膜からの細胞の回収（付記Aの10参照）
【発明を実施するための形態】
【００４８】
図1a,1b,1c,1dは遠心力の差圧により小さな孔から押し出される細胞の概念図である。
a)            孔を通過する流体により細胞が孔に吸い寄せられる(上部に圧力、遠心力が加えられる)。 図1a。
b)            差圧又は遠心力が細胞を変形させ孔に押し込む。 図1b。
c)            差圧又は遠心力により細胞が孔を通過する。 図1c。
d)            孔を通過する流体により細胞が孔から放出される。 図1d。
【００４９】
小さな孔を通過させるのに必要な差圧又は遠心力は、細胞のサイズと粘弾性により決定される。生体の粘弾性は生体が容易に折曲、屈曲して弾性変形し生体より小さな孔を通過することができる性質である。文献は白血球細胞が比較的高い粘弾性を有することを記述している。すなわち、粘弾性により、白血球細胞が狭い経路を通過して体内の微細な血管を通って組織に到達することを可能にしている。
【００５０】
母性血液中の腫瘍又はがん細胞、及び胎児細胞は白血球細胞と類似するサイズとなりうる。しかし、腫瘍又はがん細胞、及び胎児細胞は天然の粘弾性が相当に低いことが分かっている。従って腫瘍又はがん細胞、及び胎児細胞は、それを小さい孔に押し込んで通過させるためには、同じサイズの白血球細胞に比べると相当に大きな力を必要とする。腫瘍や胎児細胞は小さいサイズの孔にひっかかり、第1a図のポイントを通過できないであろう。2つのタイプのこの粘弾性の相違を利用して、タイプによって細胞を分離することができる。この性質を利用した分別は他に見られない方法であり、この発明のベースとなる。
【００５１】
実施例
A-            例1：腫瘍又はがん細胞
以下に示すプロトコルは、ヒトの血液サンプルからがん細胞を分離する方法を記述する。患者の内因性循環腫瘍細胞を分離する目的で、サンプルはがん患者から採取される。あるいは、この発明の有効性を示す実験的モデルとして、培養された腫瘍細胞を健康なボランティアの血液サンプルにシーディングする。この後者の設定では、分離プロセスの収率と感度を評価するのが目的である。母性血液から胎児細胞を精製するために、同様なプロトコルが用いられる。
【００５２】
1.            装備と試薬
＊培養されたがん細胞
＊Becton-Dickinson Vacutainer tube (4ml) with purple top (EDTA 抗凝血剤)
＊人体からの血液採取を安全に行う瀉血療法の専門家
＊洗浄された瓶中のエタノール(40 % と60 %)
＊コーティングされた又はされていないClean Glass顕微鏡スライド(使用していないErie Scientific Superfrost Plus スライドを推奨。スライドの開放ボックス保管については製造者のガイドラインに従うこと)。
＊Ficoll-Paque 分画遠心法媒体(Amersham Bioscience #17-1440-02) 常温使用。
＊12mL以上保持可能な遠心分離管（15mLのFalcon conical bottom tubeを推奨）
＊末梢血から単核細胞分画の分離に使用するFicoll-Paque製品使用のために特定されたスピードに到達可能なSwinging-bucket 遠心分離機。
＊薄膜をハンドリングするための先端が正確な曲線のギザギザのないピンセット。
＊5mL注射器 ×2 slip tip without tips (BD-ref 301603)
以下に示すアイテムは頻繁な洗浄に必要。（何度も使用するので市販のものを推奨する）。それぞれに2ピース入っている。
製造者Kimble-Kontes
953701-0000 Glass Funnel top, 25 mm, 15 mL
953702-0001 Fritted Glass Support Base (装置の将来バージョンはガラス製品は使い捨てになると予測される)
＊消耗キット＃1は以下を含む：
薄膜（8 μmのWhatman polycarbonate Nuclopore filtersから必要分カット）；スポンジ（Lendell社製親水性ポリウレタン気泡ゴムのシートから必要分カット）；10 cm  シリコン管注射器チップ；12 cm  シリコン管注射器チップ（チップの長さは使用する遠心分離管の形、長さで決まる。チップの材料として、硬化プラスチック、ステンレス鋼も使うことができる）。
＊サンプル固定剤 (95 %以上のエタノールを推奨する)
＊免疫染色試薬及び装置
＊発明の他のバージョンとして、ガラス製品は1回使用の使い捨てプラスチック製品に置換可能。その場合洗浄工程は不要となる。
【００５３】
2．シーディング方法
培養されたがん細胞（好ましくは過度に凝集していない細胞株）が通常の細胞生物学的処理に従って集菌される。例えば、細胞容器は洗浄され、適当な長さの時間トリプシン処理で分離され、遠心分離機で集菌される。
集めた細胞は再懸濁され、90 % の培地/10 %の血清溶液（溶液A）で洗浄する。その後集菌のため再度遠心分離される。
細胞密度（cells/volume）は十分に分散した細胞株から周知の分量を採取した株に対し血球計を用いて決められる。
健康なボランティアの末梢循環から4 mLの全血検体を採取する。その血液は、抗凝血剤のEDTAとともに市販のVacutainer（登録商標）の中に集められる。
その後、培養されたがん細胞は分散細胞株に対する連続希釈法により周知の規定量その血液サンプルに加えられる。溶液Aは連続希釈を通して希釈媒体として用いる。連続希釈の各ステップで、及びシーディングされた最終の血液サンプルにおいて、前述の菅は細胞分散のために緩やかに混入される。
前記規定量はサンプルにシーディングするおよその細胞数を表す。正確な数の細胞数は連続希釈法では得られない。細胞の混合体の不均一による。正確な数量のシーディングは（特に細胞数が少ない場合において）マイクロマニピュレーションや、フローサイトメトリーを推奨する。
【００５４】
3.  濃縮方法
＊血液は採取菅から適切な遠心分離管へ移される。
＊5 mLの注射器、12 cmのチップを使って常温で遠心分離菅の底から3.0 mL のFicoll-Paque勾配遠心分離媒体をゆっくり注入する。
＊血液サンプルを操作最終に一部ブレーキ又はノーブレーキで、400g /30 分のスピードで遠心分離する。バッチサイズは遠心分離時間を除く30分のバッチプロセスタイム全体で決める。バッチの最大サイズは4から6サイズと予測される。
＊単核細胞分画（又は軟膜）を、10 cmのシリコン管チップアッタチメントを取り付けた5 mLの注射器のチップを軟膜の液面レベルより下側に浸すことによって、遠心分離管から吸引する。少量の血清が吸引されるまで着実に吸引する。チップを少し下にずらせて、再度少量の血清を吸引するまで吸引を続ける。
＊約10 mLの40 %エタノールを装置上部のチャンバーに残留させた状態で吸引された軟膜を40 %のエタノールで前処理された薄膜の上に直接添加する。この液の一部を注射器に吸引し排出することにより、注射器を洗浄する。  
＊中味を上部チャンバーに残る約3 mLにろ過させる。10 mLの40 % エタノールを加えてサンプルを洗浄し、薄膜をバックフラッシュする。ろ過が完了するまで（ろ液がクリアーとなり、流量が一定になるまで）必要回数これを繰り返す。サンプルにより薄膜を通る流量は非常に緩やかになり、中味が3 mLに到達する前にバックフラッシュを必要とする。
＊1mLのマークまでろ過しその後ゆっくり薄膜上部に液が無くなるまで中味をろ過する。薄膜の水分が抜けきらないようする。
＊分散するがん細胞を濃縮後、装置から薄膜を取り外し、フィルタ（薄膜）を細胞を上にして60 %のエタノールを最小限浸透させたスポンジの上に載せることにより細胞をスライドの上に沈着させる。薄膜をガラススライドとスポンジの間に挟み、細胞が圧力により薄膜からスライドへ押し出されるように、顕微鏡スライドをスポンジの上に押し込む。
あるいは、フィルタの上の細胞は遠心分離ステップで再懸濁することもできる。フィルタを通過する細胞も使用されることに留意すべきである。
＊顕微鏡スライドに移された細胞を損なわないように、薄膜を注意深く剥ぎ取る。
＊必要とする抗体による免疫着色分析のような生物学的分析を後で行うため、スライドは固定剤に浸ける。
【００５５】
４．代替の濃縮方法
以下の手順により、回収された細胞を培養、拡大するための濃縮方法について述べる。この代替の濃縮方法では、40 % のエタノール溶液は等張緩衝液に置き換わる。
＊血液は回収菅から適切な遠心分離管へ移される。
＊血液回収菅は少量のリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄され、遠心分離管へ加えられても良い。
＊5 mLの注射器、12 cmのチップを使って常温で遠心分離管の底から3.0 mL のFicoll-Paque勾配遠心分離媒体をゆっくり注入する。
＊血液サンプルを操作最終に一部ブレーキ又はノーブレーキで、400g /30 分のスピードで遠心分離する。バッチサイズは遠心分離時間を除く30分のバッチプロセスタイム全体で決める。バッチの最大サイズは4から6サンプルと予測される。
＊単核細胞分画（又は軟膜）を、10 cmのシリコン管チップアッタチメントを取り付けた5 mLの注射器のチップを軟膜の液面レベルより下側に浸すことによって、遠心分離管から吸引する。少量の血清が吸引されるまで着実に吸引する。チップを少し下にずらせて、再度少量の血清を吸引するまで吸引を続ける。
＊吸引された軟膜は細胞の完全性、生存能力を維持する液で前処理を施した薄膜の上に直接添加する。この液（Culture Bufferと呼ぶ）は容積10 %の血清を含む等張緩衝液であってもよい。単核細胞分画を加えるまえに、この約10 mLのCulture Bufferを装置上部のチャンバーに残留させる。この液の一部を注射器に吸引し排出することにより、注射器を洗浄する。
＊中味を上部チャンバーに残る約3 mLにろ過させる。10 mLのCulture Bufferを加えてサンプルを洗浄し、薄膜をバックフラッシュする。ろ過が完了するまで（ろ液がクリアーとなり、流量が一定になるまで）必要回数これを繰り返す。サンプルにより薄膜を通る流量は非常に緩やかになり、中味が3 mLに到達する前にバックフラッシュを必要とする。
＊この時点で、濃縮された分画は少なくとも2つの代替方法により細胞の培養に使われる。
方法1：
‐約3mLの濃縮された分画がろ過された後、ろ過室の中味は再懸濁される。
‐この再懸濁された分画は、その後吸引され、細胞の培養に適した容器に移される。
方法2：
‐約3mLの濃縮された分画がろ過された後、薄膜の上の液が無くなるまでゆっくりろ過室の残留液をろ過する。薄膜の水分が抜けきらないようする。
‐薄膜自体は装置から外し、細胞培養のために細胞培養媒体を含む容器へ直接入れる。
結果
外因性腫瘍細胞を使った血液細胞へのシーディング
この実験では、光を遮断したサンプルに4から120の細胞がシーディングされる。免疫組織化学検出による分析では、それぞれのサンプルのシーディングされた細胞の80 %以上が回収されたことを示した（図３参照）。
【００５６】
5. 付記
付記 A: シーディングされた濃縮サンプルの詳細な操作手順
1.10cm, 12 cmのシリコン管を2本の5 mL注射器へ取り付ける。
2.採取菅から適切な遠心分離管へ血液を移す。
3．血液採取菅は少量のリン酸緩衝食塩水(PBS) < 1 mLで洗浄し、遠心分離管へ加えられる。
4.常温で3.0 mL のFicoll-Paque勾配遠心分離媒体を注射器に満たす。12 cmのシリコン管チップを遠心分離菅の底に取り付ける。その菅の底へ3.0 mL のFicoll-Paqueをゆっくり注入する。
5．血液サンプルを操作最終に一部ブレーキ又はノーブレーキで、400g /30 minのスピードで遠心分離する（遠心分離機は水平揺動バケットを備える）。バッチサイズは遠心分離時間を除く30分のバッチプロセスタイム全体で決める。バッチの最大サイズはオペレータのスピードに依存し、30分毎4から6サンプルと予測される。
6．新しい薄膜を装置に装着する（図４参照）。
薄膜の下部から空気を抜く処理
1) 40 %エタノール10 mLで上部を満たす。
2)  約5mLを吸引する(F)。
3) バックフラッシュ(BK)
4) 約2 mLを吸引する(F)。
5) バックフラッシュ(BK)
6) 約1mLを吸引する(F)。
7) 40 %のエタノールで10 mLになるまで補給する。
システム内に空気が漏れ込まないようにする。
注）(F) 及び(BK)は測定器制御を表す。
7．単核細胞分画（又は軟膜）を、10 cmのシリコン管チップアッタチメントを取り付けた5 mLの注射器のチップを軟膜の液面レベルより下側に浸すことによって、遠心分離管から吸引する。少量の血清が吸引されるまで着実に吸引する。チップを少し下にずらせて、再度少量の血清を吸引するまで吸引を続ける。菅を手で支える代わりに、スタンドで支えても良い。
約10 mLの40 %エタノールとともに吸引された軟膜を薄膜の上に直接添加する。液の一部を注射器に吸引し排出することにより、注射器を洗浄する。
8．中味を上部チャンバーに残る約3 mLにろ過させる(F)。10 mLの40 % エタノールを加えてサンプルを洗浄し、薄膜をバックフラッシュする(BK)。ろ過が完了するまで（ろ液がクリアーとなり、流量が一定になるまで）必要回数これを繰り返す。サンプルにより薄膜を通る流量は非常に緩やかになり、中味が3 mLに到達する前にバックフラッシュを必要とする。
9．1mLのマークまでろ過しその後ゆっくり薄膜上部に液が無くなるまで中味をろ過する(S)。薄膜の水分が抜けきらないようする。
10.分散するがん細胞を濃縮後、装置から薄膜を取り外すことにより細胞をスライドの上に沈着させる。薄膜を顕微鏡ガラススライドとスポンジの間に挟み、顕微鏡スライドをスポンジの上に押し込む。その結果、細胞が薄膜からスライドへ圧力により押し出されて移される。締め具を外し、まっすぐに上に持ち上げることにより、ろ過装置の上部を取り外す。細胞を含む中央部分を触らないように注意して小型で精巧なピンセットを使って薄膜を取り除く。
場合によっては、薄膜が薄膜装置の上部に張り付くことがある。そんな場合には、ピンセットを使ってゆっくり薄膜を上部から引き剥がす。薄膜が上部に接触して細胞層が損傷されないよう薄膜が上部を擦らないように特に注意を払う必要がある。
薄膜を細胞層を上にして60 %のエタノールを含有し用意された治具にセットされたスポンジの上に置く。
薄膜が４本の柱の間に収まり、かつ2本の短柱の上に当接するように位置決めする。薄膜の長軸はスライドをまたぐことになる。写真に示すように、スライドをラベルを下面にして薄膜の上に載せる。
スポンジ中央の上の顕微鏡スライドを約5 から8秒間ゆっくり押さえる。圧力を解く（図５ 参照）。
スライドをスポンジから持ち上げる（薄膜はスライドに付着する）。スライドを反転させラベル側を上面にする。スライドの上に移った細胞を損傷しないように、注意深く薄膜を剥がす。
11．必要とする抗体による免疫着色分析を後で行うため、スライドは固定剤に浸ける（固定剤として95 %エタノールを使うことを推奨する）。
12．数秒間(F)制御を押して薄膜支持の底部からろ液の残留物を除去する。
【００５７】
付記B-装置の制御と接続
装置は数分間廃瓶に真空ポンプを作動させ空気抜きを行う。
真空ポンプの作動を止めて、洗浄の前に廃瓶を大気圧にする。
ボタン(F)を押してろ液を吸引する。
ボタン(BK)を押してバックフラッシュする。空気をシステム内に入れないように、このボタンの押圧は1秒以内とする。薄膜の上に液がある場合、及び(F) ボタンが数秒間使用された後にのみバックフラッシュする。
装置はさらにボタン(S)を有し、システムからろ液をゆっくり取り外すのに使われる。
【００５８】
実施例
B-  例#2: 胎児細胞
ヒトの絨毛外トロホブラスト生成細胞株SGHPL-4は初期領域SV 40の妊娠初期3カ月の絨毛外トロホブラストのトランスフェクションにより生成する。SGHPL-4細胞はサイトケラチン-7, BC-1,HLA-G, CD9, hPL, HCG (Choy and Manyonda, 1998; Cartwright et al., 1999, Prefumo et al, 2004b)の発現のような通常の絨毛外トロホブラストの多くの特徴を保持している。そして、初代細胞と同じように行動する(Ganapathy et al. Hum. Reprod. 21 (5): 1295)。
それ故、SGHPL-4細胞株は、血液サンプルから循環胎児細胞を分離する我々の技術のユニークな特徴を実証する最も適した細胞モデルである。ここで、1 mL当たり5個のSGHPL-4細胞を含む血液サンプルからの胎児細胞の回収率が80 ％以上であることを示す。分離される胎児細胞の純度はプロセス前の0.00005 %に比べ5 %となる。
【００５９】
1. 胎児細胞分離のプロトコル
以下の手順は、付記A及びBに示した装置を使って、血液サンプルから胎児細胞を分離する方法を開示する。
-            温度20℃から40℃の間で以下の全てのステップを通し装置の2つの区画間の差圧が40 kPA から60 kPAとなるように調整する。
-            細胞即ちPBS1Xの完全性、生存能力を維持する洗浄液により、システムを予備洗浄する。
-            血液サンプル5 mLを装置上部の部屋（チャンバー）に直接入れる。
-            5 mLの洗浄液を加え、中味をろ過してサンプルを洗浄する。このステップを5回繰り返す。各ステップで薄膜の水分が抜けないようにする。
-            装置から薄膜を取り外し、さらなる処理に備え細胞を上にして適切な（保持）面に置く。
-            分離細胞の固定(免疫蛍光検査法又はFISHの実例)：
フィルタは1 mL, 4 %のパラホルムアルデヒドで10 分処理され、1 mLのPBS1Xで4回洗浄する。
‐  分離細胞の培養：
‐フィルタは適切な培養媒体とともに、細胞培養容器に入れる。
‐あるいは、フィルタに存在する細胞は1 mLの培養媒体により再懸濁され、細胞培養容器に入れる。
この時点で、必要とする細胞、即ち胎児細胞の特定は免疫蛍光検査法、FISH又は遺伝子診断に用いられる他の方法論により実行できる。
【００６０】
2.循環血液サンプルの準備
全血検体は末梢循環から採取する。  血液は抗凝血剤（ヘパリン, EDTA）を含む15 mLのポリプロピレン菅に採取する。
【００６１】
3.SGHPL-4細胞によるスパイキング実験
胎児細胞(VIDE SUPRA)と考えられているSGHPL-4細胞は通常の細胞生物学的手法により、具体的には細胞容器を洗浄し、所定の時間長トリプシン処理により分離し、遠心分離で採取する。採取する細胞は血清を含まない一定容積の媒体で懸濁し、細胞の計数は上部をカバーした計数室を使って実行する。
5 mLの全血検体は健康なボランティアの末梢循環から採取する。血液は抗凝血剤を含む15 mLのポリプロピレン菅に採取する。
SGHPL-4細胞は分散株の連続希釈法により周知の規定分量を血液サンプルに加える。連続希釈法の各ステップで、および最終のシーディングされた血液サンプルで前記菅をゆっくり混ぜて細胞を分散する。
【００６２】
4.薄膜上に分離されたSGHPL-4細胞の免疫蛍光検査法による検出
＊ポイント3に記載するように準備された血液サンプルは胎児細胞分離のプロトコルに記載する手順に従って処理する。処理の最後で薄膜は装置から取り外され、10分間4 %のパラホルムアルデヒド1 mLで処理し、1 mLのPBS1Xで4回洗浄する。
＊以下のステップは全て室温で実行する。
＊薄膜の上に1 mLのPBS1X、0.1 %のトリトンを10分間添加する。
＊薄膜を1 mLのPBS1Xで10分間洗浄する。
＊PBS1X、ゼラチン0.25 %から成る1 mLの溶液で30分間薄膜を処理する。
以下から成る100マイクロリットルの溶液で1時間薄膜を培養する：
PBS1X、anti-SV40 large Tを含むゼラチン0.12 %, small t 抗原単クローン抗体(BD Pharmingen, cat n°554150) 1:200 希釈。
＊薄膜を1 mL のPBS1Xで各5分間、3回洗浄する。
＊薄膜をPBS1X、0.12 %のゼラチンから成る100マイクロリットルの溶液、第2の蛍光抗体（Goat anti-mouse CY3. Jackson）を1:50から1:200の希釈範囲で使用して1時間培養する。
＊薄膜を1 mL のPBS1Xで各5分間、3回洗浄する。
＊蛍光染色液DAPI(4’. 6-doamidino-2-phenylindole, SIGMA)を含む50 mLのanti-fade 溶液（VectaShield, Vector Laboratories 社）を加え、薄膜を適当なスリップ(22 mm × 32 mm)で覆う。
【００６３】
5. 結果
この実験において光を遮断されたサンプルを血液1 mLあたり5個から50個のSGHPL-4細胞でシーディングした。白血球細胞ではなく、SGHPL-4細胞により発現した抗原に対抗する具体的な抗体を使い、免疫蛍光細胞検出のために、薄膜を処理した。説明した実例では、マウスanti-SV40 Large T, small t 抗原単クローン抗体を使用した。プロトコルの最後に、免疫蛍光検出法による分析は各サンプルで80 %を超えるシーディング細胞が回収されたことを示した。
以下の表１は、薄膜上に分離された異なる細胞タイプの数を表している。細胞は適切なフィルタを用い、蛍光顕微鏡で観測して計数した。全ての有核細胞はDAPI 染色フィルタを用い、SGHPL-4細胞はCY 3染色フィルタを用いて計数した。
【表１】
2010530234.tif 000002
胎児細胞の分離等の濃縮は計数された。循環血液1 mL当たりの白血球細胞の合計値は、400万から1000万である。この発明のプロセスをもちいた胎児細胞の濃縮では、105以上となる。これを以下の表２でしめす。
【表２】
2010530234.tif 000003
【００６４】
6.薄膜上に分離されたSGHPL-4のFISH分析
この解析のため健康な女性のボランティアの抹消循環から血液サンプルを採取する。光を遮断するサンプルを1 mL当たり100個のSGHPL4細胞でシーディングした。SGHPL4細胞はXY、女性ボランティアの白血球はXXである。
ポイント3に記載するように準備された血液サンプルは、胎児細胞分離のプロトコルに記載の手順に従って処理する。胎児細胞分離処理の最後で、薄膜を装置から取り外し、1 mLの4 %パラホルムアルデヒドにより10分間処理し、1 mLのPBS1Xで4回洗浄する。
FISHの実験は、キット“2 Color X & Y Probe Panel”, OnCellSystem, Catalog # ASXYのインストラクションマニュアルに従って実行する。蛍光顕微鏡の適切なフィルタを用いた赤色及び緑色シグナルの分析により、XX 細胞からXY細胞をクリアーに分離できる。これらの結果は、薄膜上の分離細胞について多重FISH実験を実行できることを実証している。
【００６５】
7．分離された胎児細胞に対する最適パラメ−タの決定
循環する希少細胞の分離は、白血球が有する自らの直径よりも小さい薄膜の孔を通過できる粘弾性に依存している。この性質（粘弾性）は、2つの区画間の差圧により影響を受けるが、また温度にも影響を受ける。
【００６６】
8．遺伝分析のための薄膜上の分離胎児細胞の検出  
薄膜上に分離した胎児細胞は、白血球細胞によっては発現せず、胎児細胞によって発現するマーカ−に対する具体的抗体により特定できる。トロホブラスト細胞の特定に使われる市販の抗体を以下の表３に記す。
【表３】
2010530234.tif 000004
【００６７】
さらに、以下ように具体的なトロホブラスト細胞に対し、他の抗体が文献に示されている。(PMID: PubMed Identifier)
【００６８】
AC133-2：トロホブラストの全ての亜類型を特性化する明確なマーカーとして、及びトロホブラスト細胞の明確なマーカーとして適用可能。PMID: 11504532
【００６９】
Cdkn1c：IPLと p57(KIP2)/CDKN1C遺伝子は密接にリンクし、協調して刷り込まれる。免疫染色はそれらのタンパク生成物が絨毛細胞栄養芽層の中にともに発現することを示した。PMID: 13129680
【００７０】
Cdx2：トロホブラスト関連の転写ファクターはトロホブラストマーカーである。PMID: 14990861
トロホブラスト幹細胞マーカーPMID: 16433625
【００７１】
CHL1：大多数のEVTに発現することが分かった。絨毛外トロホブラストマーカーPMID: 12771237
【００７２】
Cytokeration：絨毛トロホブラストに比べより多くの汎血球ケラチン免疫蛍光が絨毛外細胞栄養芽層細胞に観測される。トロホブラスト系統で最も侵襲的集団（絨毛外トロホブラスト）は健全妊娠と子癇前妊娠を比較するとき、サイトケラチン免疫蛍光の著しい減少を示す。PMID: 15287017
ビトロのトロホブラスト系統細胞に対する信頼できるマーカー、トロホブラストはサイトケラチン8/18に優先してサイトケラチン7の存在下で特定される。PMID: 10527816
サイトケラチンに対する免疫組織化学染色の適用はトロホブラストの特定を可能にした。PMID: 8906606
ヒトの胎盤トロホブラストの異なる集団は、発達、分化、機能的な特異的なパターンでサイトケラチンを発現する。これらの発見は、様々のトロホブラスト集団を弁別し分類するのに役立ち、トロホブラストの病理学的特徴を研究する基盤を提供する。
PMID: 7539466  
【００７３】
Cytokeratin-7 (CK 7)：フローサイトメトリーによるヒトの胎盤絨毛トロホブラスト細胞の純度を評価するのに用いる正確な細胞内マーカー  PMID: 15087219
【００７４】
D1x3：最初は栄養膜錐体細胞と絨毛膜板に発現、後で漿尿膜胎盤の迷路トロホブラストに発現PMID: 9874789
【００７５】
FD0161G：絨毛外トロホブラストマーカー  脱落膜組織の絨毛外トロホブラストの具体的プローブとして使うことができる。PMID: 3301747
【００７６】
Gem1 (glial cells missing 1)：Gem1転写因子を発現する絨毛膜の基底層のトロホブラスト細胞集団PMID: 16916377
分化した迷路トロホブラストのマーカーPMID: 16433625
GCM1タンパク発現の研究が転写ファクターが転写因子としてのその役割に一致して細胞栄養芽層細胞集団の核中に主に存在することを実証した。PMID: 15135239
転写ファクターの符号化、グリア細胞、missing-1(Gem1)、はフラットな絨毯膜板ステージと漿尿膜褶曲および形態形成が始まる拡張部の絨毛膜トロホブラスト細胞の小集団に発現する。PMID: 10888880
【００７７】
H315：合胞体栄養細胞の細胞膜に関連する胎盤型アルカリホスファターゼ（PLAP）に反応するトロホブラストマーカー  PMID: 2590397
トロホブラスト-特異的マーカー  PMID: 3500181
胎児トロホブラスチック細胞表面に存在する特異的抗原に抗して反応するPMID: 3510966
トロホブラスチック細胞表面に存在する特異的抗原を特定し、胎盤絨毛トロホブラスト及び羊膜絨毛膜の細胞栄養芽層の両方を強く染色する。PMID: 6312818
H315, H316は胎盤絨毛合胞体栄養細胞及び細胞栄養芽層に対し同等の染色を示し、さらに脱落膜子宮筋層内の細胞栄養芽層及び血管内トロホブラスト細胞、血管周囲細胞を含み、胎盤ベッドの無絨毛トロホブラスト小集団を識別できた。PMID: 6197884
主に通常胎盤トロホブラスト及びリンパ球細胞、さらに形質転換または新生培養細胞株に反応した。PMID: 7118296
【００７８】
hCG (human chorionic gonadotropin)：トロホブラスト細胞により合成されたホルモンPMID: 15570553
細胞栄養芽層細胞の分化プロセスのマーカー  PMID: 15852231
トロホブラスト細胞の合胞体栄養細胞への分化プロセスのマーカー  PMID: 12942243, PMID: 12820356
胎盤ホルモン及び細胞栄養芽層細胞の合胞体栄養細胞への分化プロセスのマーカー  PMID: 12820352
【００７９】
hCG-beta (human chorionic gonadotropin bata)：トロホブラストマーカー  は、トリプロ核zygotesから生じるヒト8−細胞体胎芽に発現する。PMID: 2460490
【００８０】
HLA-A/HLA-B/HLA-C/HLA-G：異なる妊娠ステージ、異なるトロホブラストでのHLA-Gタンパク 発現はトロホブラストの制御された侵襲に関係する。PMID: 16354612
通常の中間体トロホブラスト(IT)の特異的なマーカーとして表された非古典的MHCクラス1抗原はこれらの病気の鑑別診断の中で有用なマーカーとして機能する。PMID: 12131159
絨毛外トロホブラストのHLA-G発現は胎芽の発達とは独立し自律的に起きる。それは母性免疫システムからの耐性を許容する胎盤の発達には不可分のものである。PMID: 1137214
それはトロホブラストの中に組織に特異的な発現を有する。そこにHLA-A,-B,-C, 古典的遺伝子の精製は無い。PMID: 7583772
HLA-A,-B,-Cは絨毛外細胞栄養芽層(CTs)から中間体トロホブラスト(Its)を識別するために使われた。PMID: 2584815
【００８１】
hPL(human placental lactogen)：トロホブラスト細胞の合胞体トロホブラストへの分化プロセスのためのマーカー  PMID: 12942243
【００８２】
Inhibin A：母性血清インヒビンAレベルは不完全及び完全流産の生存能力のあるトロホブラストのマーカー  である。PMID: 12590643
【００８３】
Integrins：アルファ5インテグリンは、ヒトトロホブラストがフィブロネクチンへ結合する仲介を行い、トロホブラストの細胞移動の制限に関わる。PMID: 15846213
インテグリンアルファ5を介してフィブロネクチンとの相互作用は、ヒト絨毛外トロホブラスト侵襲に重要な役割を行う。PMID: 17027088
インテグリンはヒトの妊娠初期においてトロホブラスト細胞による発現のダイナミックな一時的、空間的パターンを表す。PMID: 15255377
トロホブラストと内皮細胞との直接接触はトロホブラストベータインテグリンの発現を促進する。PMID: 15189562
インテグリンアルファ2ｂベータ3は、マウス移植前後発達の間トロホブラストがフィブロネクチンに接着する重要な役割を行う。生体内でアルファ2bは栄養膜錐体細胞の侵襲的トロホブラスト細胞及びparietal yolk sac.のトロホブラスト巨細胞により高い発現を示す。PMID: 15031111
アルファ7ベータ1インテグリンは、トロホブラスト細胞で発現し、移植中ラミニンのいくつかのイソフォームに対しレセプタとして働く。PMID: 11784026
妊娠初期3カ月間の絨毛トロホブラスト及び満期胎盤は免疫組織化学で観察されるように、インテグリンサブユニットアルファ6及びベータ4を発現する。PMID: 7685095
細胞栄養芽層細胞表面のアルファ5インテグリンサブユニットの発現は、侵襲的表現型の外見と相関性がある。PMID: 8288018
【００８４】
M30：扱い易く、アポトーシスにより特異的であり、より自然に近いという理由から、トロホブラストアポトーシス検出のマーカーとしてTUNEL反応よりも優る。PMID: 11162351, PMID: 16077948, PMID: 12456208
【００８５】
Mash2：海綿芽トロホブラストマーカー  PMID: 16966370, PMID: 15901283
免疫反応性Mash-2タンパクは主にヒト細胞栄養芽層の細胞質に在る。PMID: 12917334
トロホブラスト特異性転写因子PMID: 12842421
低酸素誘導転写因子として作用する。それは合胞体栄養細胞への分化を阻み、低酸素状態で培養されたヒトトロホブラストにアロマターゼが誘導されるのを阻む。PMID: 11043580
Mash-2の発現は移植前発達間に始まるが胚盤胞ステージ以降はトロホブラストに制限される。トロホブラスト系統の中でMash-2転写が栄養膜錐体細胞及び絨毛膜に最初に発現する。しかし末期的に分化されたトロホブラスト巨細胞には発現しない。妊娠8.5日目以後は、Mash-2発現は海綿芽トロホブラスト及び迷路内の病巣部位にさらに限定される。PMID: 9291577
ベーシックへリックスループへリックス転写因子をエンコードし、胚胎外トロホブラスト系統で強く発現するachaete-scuteファミリーの哺乳類メンバーPMID: 8090202
【００８６】
MNF116：トロホブラスト細胞の特定のために、トロホブラストマーカーとなる。PMID: 12848643.
期待通り子宮を通して胎盤ベッド、腺上皮細胞内部で合胞体巨細胞、単核トロホブラストを特定した。しかしさらに、子宮のトロホブラスト巨細胞及び単核トロホブラスト以外の細胞に発現したエピトープに交差反応した。従って、胎盤ベッドに関する組織の診断特性解析にこのような抗体使う場合には注意が必要である。PMID: 8575730
【００８７】
NDOG1/NDOG2：NDOG1 染色された絨毛合胞体栄養細胞であり、絨毛細胞栄養芽層ではない。胎盤ベッドでは、いかなる細胞栄養芽層成分にも反応しなかった。
NDOG2  排卵後早くも13日〜15日目にトロホブラストのこれらの異なる下位個体群を識別した。PMID: 6197884
【００８８】
OKT9：胎盤絨毛膜絨毛トロホブラストにのみ反応し、いかなる非絨毛細胞栄養芽層細胞集団にも反応しなかった。PMID: 6312818
【００８９】
PAI-1(plasminogen activator Inhibitor-1)：侵襲的トロホブラストの免疫細胞化学的マーカー  PMID: 2473276
プラスミノーゲン活性化機能の抑制により繊維素溶解と細胞侵襲の制限に重要な役割を行う。PMID: 12398812
絨毛合胞体栄養細胞に存在し、絨毛膜絨毛の表面のフィブリンタイプフィブリノイドと局部集中する。基盤及び胎盤ベッドの絨毛外間質トロホブラスト及び血管トロホブラストはPAI-1ポジティブであった。PAI-1は母性脱落膜内の特異的絨毛外トロホブラストを限定する。PMID: 11095924
【００９０】
Placental Lactogen (PL-1, PL-2)：トロホブラスト細胞分化マーカー  PMID: 15685636
トロホブラスト巨細胞は体外で2つのタイプのPLsを解放する。すなわち、高分子量ラクトゲンPL-1, 及び低分子量ラクトゲンPL-2 PMID: 3972167
PLP-A/PLP-B/PLP-C/PLP-D/PLP-E/PLP-F/PLP-L/PLP-M/PLP-N
PLP-Aはトロホブラスト巨細胞と海綿芽トロホブラスト細胞の両方に発現した。一方、PLP-Bは脱落膜および海綿芽トロホブラスト細胞に発現した。PMID: 9472921
PLP-L及びPLP-Mは中央胎盤血管の内側を覆う侵襲的トロホブラスト細胞にラットの侵襲的トロホブラストマーカーとして最も多く発現する。PMID: 10906059
PLP-N  mRNAの発現は移動トロホブラスト細胞により制限された。PMID: 14656203
PLP-A, PLP-L, PLP-Mは間質的及び血管内ラットトロホブラスト細胞両方により合成される。PMID: 12885563
PLP-Aは新規な妊娠及びトロホブラスト細胞に特異的なサイトカインである。PMID: 12850282
マウス内で、PLF-RPは妊娠中期漿尿膜及び絨毛膜卵嚢胎盤のトロホブラスト巨細胞層で発現した。さらに妊娠後期でマウス漿尿膜胎盤結合部内のトロホブラスト巨細胞および海綿芽トロホブラスト細胞層において発現した。マウスでは、PLP-Fは海綿芽トロホブラスト細胞層の唯一の生成物である。一方ラットにおいては、トロホブラスト巨細胞がPLP-Fの主な源であり妊娠後期では海綿芽トロホブラスト細胞の貢献は少なかった。PMID: 10657001
PLA−Aは結合ゾーンの巨細胞および海綿芽トロホブラスト細胞に特異的に集中した。PMID: 2667962
PLP-Cは妊娠第2半期の海綿芽トロホブラスト細胞により生成される主な分泌タンパク質である。PMID: 2036977
PLP-C mRNA はラット漿尿膜胎盤結合ゾーン領域の海綿芽トロホブラスト細胞及びいくつかのトロホブラスト巨細胞に特異的に発現した。PMID: 1744098
PLP-A, PLP-B, PLP-Cは明確な細胞パターンおよび一時的特異的パターンで発現し、ラットトロホブラスト細胞の分化状態を観察するのに使うことができる。PMID: 8290493
PLP-D mRNAは胎盤結合ゾーンの海綿芽トロホブラスト細胞及びトロホブラスト巨細胞に特異的に発現した。PMID: 8756556
PLP-Cvはユニークな遺伝子構造であり、転写活性のトロホブラストに特異的なパターンを表す。PMID: 8895375
PLP-Eの発現はトロホブラスト巨細胞に限定される。一方、PLP-Fは海綿芽トロホブラスト細胞の中でのみ合成される。PMID: 9389541
【００９１】
SBU-1：妊娠後期の羊の胎盤から生成し、トロホブラスト単核細胞の優れたマーカーである。PMID: 1692053
【００９２】
SP-1：トロホブラストに特異的なベータ1-糖タンパク質PMID: 2450546, PMID: 3675636, PMID: 2422727
合胞体栄養細胞において、SP-1は通常の妊娠で発現し、自然流産では発現しなかった。PMID: 9589941
HCG 及びSP-1は妊娠初期におけるトロホブラスト機能の連続評価に等しく適している。PMID: 6984404
トロホブラスト機能を評価するのに良い追加のパラメータである。PMID: 94488
TA1/TA2（トロホブラスト抗原）
トロホブラスト細胞膜に発現した。PMID: 6378769, PMID: 3073224    Tfeb
絨毛膜トロホブラストマーカー  PMID: 15987772
胎芽の低レベルに、しかし迷路トロホブラスト細胞の高レベルに発現した。胎盤の通常の血管新生に必要な信号変換プロセスに重要な役割を行う。PMID: 9806910
Troma 1及びCAM5.2
通常妊娠及び絨毛性疾患の組織学的トロホブラストマーカー  PMID: 3009660, PMID: 2433238
Troma 1,ラット単クローン抗体は免疫組織化学的研究のトロホブラストマーカーとして使われた。PMID: 3001198, PMID: 3902998
Troma 1はラット単クローン抗体であり、トロホブラストマーカーとして使用できる。PMID: 2584815, PMID: 6352374
【図３】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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