(57)【要約】  疎水コアおよび親水シェルを有する高分子ナノ粒子は、１）モル比が約５０％から約９０％、および好ましくは特定の経口または非経口などの送達経路では６０％のＮ‐イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡＭ）；モル比が約１０％から約３０％のビニルピロリドン（ＶＰ）もしくはビニルアセタート（ＶＡ）などの水溶性ビニル誘導体、またはメチルメタクリラート（ＭＭＡ）もしくはスチレン（ＳＴ）などの水不溶性ビニル誘導体；モル比が約１０％から約３０％のアクリル酸（ＡＡ）によって形成される。形成されたナノ粒子は、必要であれば、治療、診断および撮像を目的とした、ＡＡに含まれる反応性基を用いた表面官能化が可能であり、該表面官能化は、ＰＥＧ化、または化学療法剤、造影剤、抗体、放射性核種、リガンドおよび糖などの部分の結合を含む。高分子ナノ粒子は水溶液に分散することが好ましい。高分子ナノ粒子は疎水コアに１種以上の薬品または生物活性剤を組み込み、時により、薬品または生物活性剤は反応性官能基を介してナノ粒子表面に結合する。高分子ナノ粒子は経口、非経口または局所的経路を通じて前記薬品または生物活性剤を送達することができる。高分子ナノ粒子は水溶性の低い薬品もしくは生物活性剤、または経口生物学的利用率の低いもの、の水溶液中での製剤を可能とし、体循環への送達を容易にする。
2010505877.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性流体に、
Ｎ‐イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡＭ）、
アクリル酸（ＡＡ）、
ならびにビニルアセタート、４−ビニル安息香酸、メチルメタクリラート、ビニルメタクリラート、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルピペリドン、Ｎ−ビニルカプロラクツム、Ｎ−ビニルカルバゾールおよびスチレンのうちの少なくとも１つのモノマーを溶解しミセルを形成する工程と、
前記ミセルを重合させる工程と、
未反応材料を前記溶液から除去する工程と、
１以上の生物活性剤を前記溶液に添加して、前記１以上の生物活性剤を前記溶液中の重合したミセルに閉じ込めるか、または、前記溶液中の前記重合したミセルの表面に結合させる工程と、
前記溶液を凍結乾燥または乾燥して、閉じ込められた生物活性剤を有する重合したミセルの再分散可能な乾燥粉末を生成する工程とを含む高分子ナノ粒子の調製方法。
【請求項２】
前記重合させる工程が架橋剤、活性化剤および開始剤の１以上を添加する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記重合させる工程が前記溶液に架橋剤を添加する工程を含み、前記架橋剤は二官能性ビニル誘導体である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記二官能性ビニル誘導体がＮ，Ｎ’メチレンビスアクリルアミドである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記重合させる工程がアンモニウム、カリウムまたはナトリウムのペル二硫酸塩である開始剤を添加することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記重合させる工程がテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤ）、第一鉄アンモニウムスルファートおよびそれらの混合物から成る群から選択される活性化剤を添加することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記重合させる工程が不活性ガスの存在下で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記不活性ガスがアルゴンおよび窒素から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項９】
前記重合させる工程が２０〜８０℃の範囲の温度で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記温度が３０〜４０℃の範囲である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記高分子ナノ粒子が５０〜１００ｎｍ以下の粒径を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
共重合体ミセルを形成するとして挙げられた３つのモノマーが５０〜７０：１０〜３０：３０〜１０のモル比で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１以上の生物活性剤の少なくとも１つが前記ミセルに閉じ込められている請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記１以上の生物活性剤の少なくとも１つが薬剤である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
水溶性の低い生物活性剤の少なくとも１つが抗腫瘍剤、ステロイド系化合物、フラボノイド、クルクミノイド、フィトケミカル、抗かび剤、抗ウィルス剤、抗菌剤、抗結核剤および抗炎症剤から成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記１以上の生物活性剤の少なくとも１つが、パクリタクセル、ドセタキセル、ラパマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、カペシタビン、マイトマイシンＣ、アムサクリン、ブスルファン、トレチノイン、エトポシド、クロラムブシル、クロルメチン、メルファラン、ゲムシタビン、５‐フルオロウラシル、（５−ＦＵ）、ベンジルフェニル尿素（ＢＰＵ）化合物、クルクミン、クルクミノイド、シクロパミン、アシクロビル、インジナビル、ラミブジン、スタブジン、ネビラピン、リトナビル、ガンシクロビル、サキナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、アンホテリシンＢ、グリセオフルビン、シプロフロキサシン、モキシフロキサシン、オフロキサシン、メトキシフロキサシン、ぺフロキサシン、ノルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、シノキサシン、クロキサシリン、ベンジルペニシリン、フェニルメトキシペニシリン、エリスロマイシン、リファンピシン、リファペンチン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダクから成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、前記重合させる工程の後に、前記重合したミセル中のＡＡをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）アミンで官能化することによる粒子の表面修飾という省略可能な工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記官能化する工程が、前記重合したミセル上のＡＡの表面カルボキシ基とＰＥＧまたはＰＥＧの誘導体の末端アミン基との架橋剤を用いた化学結合により行われる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＥＧが５０〜８０００Ｄの範囲の鎖長を有する請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＥＧアミンがメトキシＰＥＧアミンから得られる請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＥＧアミンがポリエチレングリコール鎖の他方の末端に官能基を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記高分子ミセルのカルボキシ基を結合部分のアミン基と化学結合することによる粒子の表面修飾という省略可能な工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記結合部分が造影剤に付随するものである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記造影剤がキレート金属錯体である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記結合部分が抗体である請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記結合部分が細胞表面の受容体に対するリガンドである請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞表面の受容体のリガンドがペプチド、糖またはグルコサミンなどの炭水化物誘導体である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記結合部分が蛍光体、染料または放射性核種である請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記結合部分が味遮蔽剤である請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記結合部分がゲムシタビンなどの水溶性薬剤である請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
水溶液中で、アクリル酸（ＡＡ）に加えて、ビニルアセタート、４−ビニル安息香酸、メチルメタクリラート、ビニルメタクリラート、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルピペリドン、Ｎ−ビニルカプロラクツム、Ｎ−ビニルカルバゾールおよびスチレンのうちの少なくとも１つのモノマーと重合されたＮ‐イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡＭ）から成る高分子ミセルを再構成する工程を含むミセル組成物の調製方法。
【請求項３２】
さらに、鎖長５０〜８０００ＤのＰＥＧアミンによる、または造影剤、抗体、細胞表面受容体リガンド、蛍光体、染料、放射性核種、味遮蔽剤もしくは水溶性薬剤による、水溶液中の前記重合したミセルの省略可能な表面の官能化を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
さらに、前記水溶液中の前記高分子ミセルに１以上の生物活性剤を添加することにより１以上の生物活性剤を前記重合したミセル内に閉じ込める請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
さらに、前記溶液を凍結乾燥して、閉じ込められた生物活性剤を有する重合したミセルの再分散可能な乾燥粉末を生成する工程を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
Ｎ‐イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡＭ）、
アクリル酸（ＡＡ）、ならびに
ビニルアセタート、４−ビニル安息香酸、メチルメタクリラート、ビニルメタクリラート、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルピペリドン、Ｎ−ビニルカプロラクツム、Ｎ−ビニルカルバゾールおよびスチレンのうちの少なくとも１つのモノマー
の各モノマーの共重合体から成る再構成可能な、高分子ミセル。
【請求項３６】
少なくとも１つの生物活性剤、
液状媒体、および
前記液状媒体に分散された複数の高分子ナノ粒子を含むナノ粒子の、生物活性な高分子組成物であって、前記高分子ナノ粒子は、
モル比の範囲が５０〜７０のＮ‐イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡＭ）、
モル比の範囲が１０〜３０のアクリル酸（ＡＡ）、ならびに
モル比の範囲が１０〜３０の、ビニルアセタート、４−ビニル安息香酸、メチルメタクリラート、ビニルメタクリラート、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルピペリドン、Ｎ−ビニルカプロラクツム、Ｎ−ビニルカルバゾールおよびスチレンのうちの少なくとも１つのモノマーから成る共重合体であり、
少なくとも１つの生物活性剤が前記高分子ナノ粒子に付随している組成物。
【請求項３７】
前記生物活性剤は水溶性が低い請求項３６に記載の生物活性な高分子組成物。
【請求項３８】
前記水溶性の低い生物活性剤が水中で１０μｇ／ｍＬ未満の可溶性を有する請求項３７に記載の生物活性な高分子組成物。
【請求項３９】
前記生物活性剤が水中で可溶であり、化学反応性官能基を有する請求項３６に記載の生物活性な高分子組成物。
【請求項４０】
前記水溶性生物活性剤が化学結合によって粒子表面に付着している請求項３９に記載の生物活性な高分子組成物。
【請求項４１】
前記生物活性剤が抗腫瘍剤、ステロイド系化合物、フラボノイド（flavinoid）、クルクミノイド、フィトケミカル、抗かび剤、抗ウィルス剤、抗菌剤、抗結核剤および抗炎症剤から成る群から選択される請求項３６に記載の生物活性な高分子組成物。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの生物活性剤が、パクリタクセル、ドセタキセル、ラパマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、カペシタビン、マイトマイシンＣ、アムサクリン、ブスルファン、トレチノイン、エトポシド、クロラムブシル、クロルメチン、メルファラン、ゲムシタビン、５‐フルオロウラシル、（５−ＦＵ）、ベンジルフェニル尿素（ＢＰＵ）化合物、クルクミン、クルクミノイド、シクロパミン、アシクロビル、インジナビル、ラミブジン、スタブジン、ネビラピン、リトナビル、ガンシクロビル、サキナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、アンホテリシンＢ、グリセオフルビン、シプロフロキサシン、モキシフロキサシン、オフロキサシン、メトキシフロキサシン、ぺフロキサシン、ノルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、シノキサシン、クロキサシリン、ベンジルペニシリン、フェニルメトキシペニシリン、エリスロマイシン、リファンピシン、リファペンチン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカムおよびスリンダクから成る群から選択される請求項３６に記載の生物活性な高分子組成物。
【請求項４３】
前記複数の高分子ナノ粒子が１種以上の薬剤を閉じ込めるか、または結合する請求項３６に記載の生物活性な高分子ナノ粒子組成物。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの生物活性剤が前記高分子ミセルに閉じ込められている請求項４３に記載の生物活性な高分子組成物。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの生物活性剤が前記高分子ミセルの表面に結合している請求項４３に記載の生物活性な高分子組成物。
【請求項４６】
さらに、前記高分子ナノ粒子に付随する少なくとも１つの表面結合部分を含む請求項４３に記載の生物活性な高分子組成物。
【請求項４７】
患者に薬剤を提供する方法であって、液状媒体中の前記薬剤を含む組成物を前記患者に投与する工程を含み、前記薬剤が前記液状媒体中に分散した高分子ナノ粒子に付随したものである方法。
【請求項４８】
前記投与する工程が経口で行われる請求項４７の方法。
【請求項４９】
前記投与する工程が非経口または局所のいずれかで行われる請求項４７の方法。
【請求項５０】
１以上の薬剤または生物活性剤を、
モル比の範囲が５０〜７０のＮＩＰＡＡＭ、モル比の範囲が１０〜３０のアクリル酸（ＡＡ）、ならびに、モル比の範囲が１０〜３０の、ビニルアセタート、４−ビニル安息香酸、メチルメタクリラート、ビニルメタクリラート、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルピペリドン、Ｎ−ビニルカプロラクツム、Ｎ−ビニルカルバゾールおよびスチレンのうちの少なくとも１つのモノマーから成る高分子ナノ粒子に組み込む工程と、
前記組み込む工程の後に高分子ナノ粒子を回収する工程とを含む高分子ナノ粒子組成物の調製プロセス。
【請求項５１】
さらに、前記高分子ナノ粒子を表面修飾する工程を含む請求項５０に記載のプロセス。
【請求項５２】
さらに、前記高分子ナノ粒子を水溶液に分散する工程を含む請求項５０に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性の低い薬品を含めた薬品を可溶化し、かつ被包するナノ粒子組成物に係る。特に、本発明は、組織的な標的化のための粘膜付着性、経口生物学的利用率および多機能性などの「スマート」な特性を有する組成物に係る。
【背景技術】
【０００２】
この２０年間、疎水性で水溶性の低い薬品用に数多くの薬物送達システムが開発された。これらのシステムは、薬物の利用率の低さおよびそれに伴う、この種の分子に内在する、非効果的な治療の改善を主な目的とする。
【０００３】
水溶性の低い薬品に関わる上記問題を解決するために、特許文献１および特許文献２は、担体が生体適合性油および担体を生体内に投与した際に該油を分散させる薬剤学的に許容可能な界面活性剤成分を含むことを特徴とする、疎水性薬物および該薬物を主成分とする医薬品組成物のための担体の調製方法を開示している。適用された両親媒性界面活性剤成分は生体内での油の脂肪分解（リポリシス）を実質的に阻むものではない。この種の製剤は多種の疎水性薬物の担体系として適用可能であり、結果として、該疎水性薬物の生物学的利用率が時折、既存の製剤に比べて高くなる。しかし、これらの製剤は生体内で安定しておらず、乳濁液から薬物が漏出して身体に不必要な副作用が生じる可能性がある。また、用いられた界面活性剤が生体膜を破壊して細胞障害を引き起こし得る。さらに、かかる乳濁液系によって薬物を標的化することはできない。
【０００４】
上記以外にも、高分子ミセルまたは超分子集合体を形成する両親媒性ブロック共重合体で、疎水性部がコアを形成し親水性部がシェルを形成する共重合体などの薬物担体が用いられた。特許文献３は、親水性部分および疎水性部分がミセルを形成し、物理的な方法で疎水性薬物を閉じ込めるブロック共重合体を記載している。親水性部分は好ましくはポリ（酸化エチレン）であり、疎水性部分は好ましくはポリ（ε‐ベンジル‐Ｌ‐アスパルタート）であり、好ましい薬物はアドリアマイシンである。
【０００５】
近年、高分子ミセルが非経口投与における薬物送達担体として広く用いられている。ミセル状の薬物送達担体は生体適合性、コア内の疎水性薬物の可溶化、炎症部位における管外遊出を促進するナノメートル範囲のサイズ、部位特異的な送達などを含む複数の利点を有する。たとえば、特許文献４は薬剤学的製剤を含有するミセル中でポリ（ビニル‐Ｎ‐ヘテロサイクル）‐ｂ‐ポリ（酸化アルキレン）を用いることを記載している。これらの共重合体は環境中のｐＨの変化に反応するもので、より低いｐＨ値で治療用化合物を送達するために使用し得る。これら高分子ミセルは生理学的なｐＨでは変化せず、腫瘍組織などｐＨがより低い環境にさらされると含有物を放出する。
【０００６】
ノニオン性および／または荷電された疎水性部分および親水性部分を有し、ミセルを形成する多くの両親媒性共重合体が文献で報告されている。たとえば、特許文献５は、アクリルモノマー（すなわち、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドンおよびＰＥＧ化マレイン酸のモノエステル）から成る架橋高分子ミセルの注射可能な製剤を開示している。これらの高分子ナノ粒子はパクリタクセルを溶解させ、薬物を非経口投与によって腫瘍組織に送達したと報告されている。しかし、これらの粒子は静脈路を介した送達に適すとしか報告されていない。なお、共重合体ミセルの一成分としてアルキルシアノアクリラートを使用することが報告されているが、これは製剤に毒性を付与し、製剤を生体内への適用に不向きなものとする。
【０００７】
ある特許、特許文献６は疎水性薬物をβ‐シクロデキストリンなどのデキストリンと組み合わせてミクロ流体化または湿式微粉化する処理を開示した。この特許の述べるところによれば、前記の処理は、可溶性が低くても透過性が高い薬物の平均粒径の縮小を促し、平滑なラテックス状のミクロ懸濁剤を生成するものである。膨張可能なポリマーおよび不溶性・疎水性の賦形剤の混合物はミクロ懸濁剤とともに粒状化されてマトリックスを形成し、該マトリックスは圧縮後、２４時間にわたって均一に侵食される。しかし、このミクロ流体化系に関わる問題として、薬物の一分子につき一分子のβ‐シクロデキストリンが必要であり、その結果、薬物とともに大量のβ‐シクロデキストリン化合物が体内に投与される点があげられる。さらに、β‐シクロデキストリンからの薬物の漏出およびβ‐シクロデキストリン‐薬物複合体の生物学的利用率の低さは副作用を引き起こしかねない。最後に、粒子の５００ｎｍ以下の直径が、その薬物送達における有用性を制限する要因であろう。
【０００８】
別の特許、特許文献７はＮ‐イソプロピルアクリルアミド、アクリル酸およびＮ‐ビニルピロリドンから成る、ＰＥＧ化されていない、ｐＨ感受性および温度感受性を有する架橋高分子ミセルの製剤を開示している。これらの粒子には極めて限定的な適用方法しかなく、眼球面での局所的送達という特定の目的にしか使用することができない。というのも、この粒子のＬＣＳＴ（ｌｏｗｅｒ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；下部臨界完溶温度）は周囲体温より低く、粒子は生体内で疎水性の塊に凝集するからである。したがって、該粒子は経口送達を含む体循環および標的化に適さない。その他、類似の特許に特許文献８および特許文献９がある。
【０００９】
別の特許、特許文献１０はポリ（酸化エチレン）から形成される親水性部分と少なくとも１種の付属カルボキシ基を含むビニルモノマーから成る疎水性部分とから成る製剤を記載している。より具体的には、ポリマーに含まれるビニルモノマーは、付属カルボキシ基（pendant carboxyl group）を有するアクリル酸およびメタクリル酸ならびにブチル部分が直鎖または分枝鎖であるブチル（アルキル）アクリラートである。したがって、疎水性部分はノニオン性ブチル（アルキル）アクリラートおよびイオン性（アルキル）アクリル酸の混合物であり、該混合物がポリマーの疎水性を制御する。粒子の表面に向かって伸びた、ポリマーのイオン性カルボキシ基がｐＨ感受性を左右すると報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，６４５,８５６号
【特許文献２】米国特許第６，０９６，３３８号
【特許文献３】米国特許第５，５１０，１０３号
【特許文献４】米国特許第５，９５５，５０９号
【特許文献５】米国特許第６，３２２，８１７号
【特許文献６】米国特許第６，５５５，１３９号
【特許文献７】米国特許第６，５７９，５１９号
【特許文献８】米国特許第６，７４６，６３５号
【特許文献９】米国特許第６，８２４，７９１号
【特許文献１０】米国特許第７，０９４，８１０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述されたポリマーの大部分は生物活性剤の注射可能なまたは局所的な送達に利用し得るものだが、現在欠けているのは、ナノ粒子径および粘膜付着性によって経口送達に適用可能な多機能両親媒性ポリマーである。かかる「スマート」なナノ粒子の表面反応性官能基は、必要であれば、全身の標的化を目的としてＰＥＧ化、リガンド付着または蛍光標識によって修飾され得るので、診断、治療および撮像での並行した生物学的適用に有益である。本願では、経口生物学的利用能を有するスマートな高分子ナノ粒子系について説明する。
【００１２】
本発明は水溶性の低い薬品などの１以上の生物活性剤を含んでもよく、経口送達に特に適しているが、注射可能なまたは局所的な製剤を含む他の適用形態にもなじむ架橋高分子ナノ粒子に係る。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、水溶性の低い薬物を、単独または他の生物活性剤との組み合わせで、最大限まで閉じ込め得る高分子ナノ粒子の調製プロセスを提供することである。高分子ナノ粒子は１種以上の薬剤を閉じ込めることが好ましい。高分子ナノ粒子の好ましい平均粒径は５０〜１００ｎｍ以下であり、粒径が２００ｎｍを上回る高分子ナノ粒子は５％未満である。
【００１４】
本発明の別の目的は、ナノ粒子内に閉じ込められた被包薬品の放出を制御できるよう、相互架橋ポリマー鎖を有するナノ粒子の調製プロセスを提供することである。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、薬品を、単体または組み合わせによって、組み込んだナノ粒子の調製プロセスを提供することであり、必要であれば、異なる鎖長（５０〜８０００Ｄ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を、形成されたナノ粒子の表面上の反応性分子と該ナノ粒子の外面上で化学結合させることができる。ＰＥＧ鎖は、粒子が全身に投与されてから比較的長時間、血管内を循環するよう補助する。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、水溶性でありながら現在経口送達という選択肢を持たない薬物の送達を、薬物またはその組み合わせをナノ粒子の表面に化学結合させることによって可能とすることであり、該ナノ粒子は経口経路から吸収するための賦形剤として働き、薬物の生物学的利用率を高める。
【００１７】
本発明の別の目的は、アクリル化合物のカルボン酸、アミンもしくはアルデヒド誘導体または似たようなビニル誘導体を、単独または組み合わせで、重合におけるモノマーとして用いてナノ粒子に多機能を付与し、ナノ粒子を「スマート」ナノ粒子とすることである。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、非反応モノマーなどの不要かつ有毒な材料が除去された状態で、水溶液中に分散する、水溶性の低い薬品またはその組み合わせを組み込んだ高分子ナノ粒子の調製プロセスを提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、生体内実験において、疾患部位に最大限の薬品を標的化し、他の組織には微量しか標的化しないという目的のために利用可能な、水溶性の低い薬品または薬品の組み合わせを含む高分子ナノ粒子の調製プロセスを提供することであり、該方法は従来技術に付随する問題点を回避するものである。たとえば、本願で検討する重合したミセル複合体は、高分子ミセルに付随したＰＥＧ鎖との化学結合を通じて、蛍光体、染料、造影剤、抗原、抗体、アミノ酸またはグルコサミンなどの糖もしくは関連する炭水化物誘導体などの標的化部分によって官能化することができ、該複合体は、上述された経口製剤だけでなく、特定種類の細胞または組織への標的化された送達を必要とする医学的な治療、診断および撮像への適用においても利用可能である。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、味修飾剤をミセルの表面に化学結合させて、高分子ミセルに組み込まれた特定の薬剤の天然の味を遮蔽することによって、経口摂取するときの製剤の味をよりよくすることである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、本発明の調製プロセスに基づいて調製された、水溶性の低い薬品またはその組み合わせを組み込んだ高分子ナノ粒子を、望ましくない病原性または解剖学的な状態から生じる症状を治療するために使用する方法を提供することである。
【００２２】
本発明に基づき、好ましくは平均粒径が１００ｎｍ未満で、少なくとも１つの水溶性の低い疎水性の薬品を単独でまたは１以上の付加的な薬品と組み合わせて閉じ込めた高分子ナノ粒子を含む医薬用組成物を調製する。これらの両親媒性ナノ粒子は、主に、特定のモル比でモノマーとして添加される以下の３成分から構成される架橋ポリマーから形成することができる。その３成分とは、（１）Ｎ‐イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡＭ）、および（２）粒子のシェルの親水性を増すための、ビニルアセタート（ＶＡ）もしくはビニルピロリドン（ＶＰ）のような水溶性ビニル化合物、または粒子のコアの疎水性を増すための、スチレン（ＳＴ）もしくはメチルメタクリラート（ＭＭＡ）などの水不溶性ビニル誘導体のいずれか、および（３）表面反応性官能基を提供するアクリル酸（ＡＡ）である。ナノ粒子の表面は、必要であれば、血液中で長く循環するためにＰＥＧ化することを含み、ＡＡの提供する反応性官能基を用いるか、または、治療、診断および撮像に適用するために生体内の組織の標的化に利用可能な他の表面反応性基を付加することによって、官能化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、疎水コア（１０）が薬品（１１）を閉じ込めるポリマーの疎水性部分から成り、親水性部分が水性媒質に向かって位置する親水シェル（１２）を形成する高分子ナノ粒子を示す。ナノ粒子は１００ｎｍ未満の寸法を有し、薬剤またはその他の生物活性剤の分子を１つ以上含む。
【図２】図２は、水溶性が低く、本発明で具体的に示された高分子ナノ粒子に閉じ込められることで可溶化が可能となった３種の薬物を例示する。遊離パクリタクセル（タキソール）（Ａ）、遊離ラパマイシン（Ｃ）および遊離リファンピシン（Ｅ）は基本的に水不溶性であり、それは、溶液の濁度および各薬物の目に見える浮遊粒子から明らかである。反対に、当量のナノ粒子被包パクリタクセル（Ｂ）、ナノ粒子被包ラパマイシン（Ｄ）およびナノ粒子被包リファンピシン（Ｆ）は水中に透明な溶液を形成する。
【図３】図３は、下部臨界完溶温度（ＬＣＳＴ）を、成分の質量比（％）、特にナノ粒子中のＮＩＰＡＡＭのモル比の関数として表す。図示例は高分子ナノ粒子に含まれるＮＩＰＡＡＭ（ＮＰ）、ビニルピロリドン（ＶＰ）およびアクリル酸（ＡＡ）のモル比がそれぞれ異なる、異なる３種のナノ粒子組成物を表す。ナノ粒子の平均寸法（ｎｍ）は動的光分散法および他の方法で測定される。ＮＩＰＡＡＭのモル比が９０％の組成物は、体温より低いＬＣＳＴを有するのに対し、ＮＩＰＡＡＭのモル比が６０％の組成物は、体温より高いＬＣＳＴを有する。
【図４】図４ａは、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）による、平均粒径が５０ｎｍ以下（右下に１００ｎｍの目盛が図示されている）のＮＩＰＡＡＭ／ＶＰ／ＡＡ高分子ナノ粒子（モル比６０：２０：２０）の顕微鏡写真である。図４ｂは、ＴＥＭによる、平均粒径が５０ｎｍ以下（右下に５００ｎｍの目盛が図示されている）のＮＩＰＡＡＭ／ＭＭＡ／ＡＡ高分子ナノ粒子（モル比６０：２０：２０）の顕微鏡写真である。最低限の多分散性が見受けられる。
【図５】図５ａ〜ｃは、経口送達された空の（「中空」）高分子ナノ粒子に、実証可能な生体内の毒性がないことを示す。経口送達された中空ナノ粒子を２種類用いた。モル比が６０：２０：２０のＮＩＰＡＡＭ／ＶＰ／ＡＡ（ＮＶＡ６２２と呼称される）とモル比が６０：２０：２０のＮＩＰＡＡＭ／ＭＭＡ／ＡＡ（ＮＭＡ６２２と呼称される）である。４匹のＣＤ１野生型マウス（オス２匹、メス２匹）から成る各群れに、水５００μＬ中に５００ｍｇ／ｋｇの中空ＮＶＡ６２２または中空ＮＭＡ６２２ナノ粒子が含まれたものを、２週間に渡って各週連続５日間、投与した。中空ナノ粒子を投与している間、またはその最高点で、体重の減少も、行動異常も、その他の異常な特徴も見られなかった。中空ＮＶＡ６２２ナノ粒子を受容したマウスにも中空ＮＭＡ６２２ナノ粒子を受容したマウスにも肉眼で見える（巨視的）毒性は確認されなかった。
【図６】図６は、高分子ナノ粒子被包パクリタクセル（ナノパクリタクセル）を用いて実施された生体外細胞生存度（３−（４，５−ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウム臭化物、またはＭＴＴ）アッセイ、および遊離パクリタクセルとの比較を示す。図示例では、モル比６０：２０：２０のＮＩＰＡＡＭ／ＶＰ／ＡＡ高分子ナノ粒子がパクリタクセルの被包に用いられた。濃度の漸増する（１、１０、２０、５０および１００ｎｍ）遊離パクリタクセル（黒棒）または当量のナノパクリタクセル（グレー棒）のいずれかを用いて３種のヒト膵臓がん細胞系（ＸＰＡ−１、ＢｘＰＣ３およびＰＡＮＣ−１）を４８時間培養した。また各条件における対照標準として、前記適用量のナノパクリタクセルを被包するのに必要な量と当量の中空高分子ナノ粒子（白棒）および前記適用量の遊離パクリタクセルを溶解するのに必要な量と当量の溶媒（ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］，青棒）も含めた。遊離パクリタクセル（黒棒）と比較すると、ナノパクリタクセル（グレー棒）の生体外での細胞毒性は３種の細胞系全てにおいて遊離パクリタクセルのものと同程度である。したがって、薬物のナノ被包は薬物の作用を損なうものではない。それに対して、予測されたように、中空ポリマーのみでの処置は細胞の制御成長の基線（０ｎｍ条件）との比較において際立った細胞毒性効果を示さない。全てのアッセイは３通りの方法で実施され、エラー棒は標準偏差を表わしている。
【図７】図７は、高分子ナノ粒子で被包されたパクリタクセル（ナノパクリタクセル）と高分子ナノ粒子で被包されたクルクミン（ナノクルクミン）との相乗効果を実証するために実施された生体外細胞生存度（ＭＴＴ）アッセイを示す。濃度の漸増する（１、２、４、６、８および１０ｎｍ）遊離パクリタクセル（黒棒）または当量のナノパクリタクセル（白棒）のいずれかを用いて３種のヒト膵臓がん細胞系（ＸＰＡ−１、ＢｘＰＣ３およびＰＡＮＣ−１）を４８時間培養した。治療におけるクルクミンとの相乗作用を確認するために、遊離パクリタクセルを加えた遊離クルクミン（１５μＭ）（グレー棒）、またはナノパクリタクセルを加えた当量のナノクルクミン（１５μＭ）（青棒）を用いて細胞を培養した。図示したように、ナノパクリタクセルとナノクルクミンとの組み合わせは、どの適用量においても、遊離パクリタクセルまたはナノパクリタクセルのいずれか単独よりも大きい細胞毒性を示す。留意すべきは、特に細胞系の２種（ＸＰＡ−１およびＰＡＮＣ−１）で低適用量を用いた場合、ナノパクリタクセルとナノクルクミンとの組み合わせは遊離パクリタクセルと遊離クルクミンとの組み合わせより有効性があることで、ナノ被包化合物の細胞内摂取が増加したことが理由だろう。高適用量では、遊離薬物の組み合わせ治療もナノ被包薬物の組み合わせ治療も同程度の効果を持つようである。
【図８】図８は、ナノ粒子被包リファンピシンおよび遊離リファンピシンのマイコバクテリウム‐ツベルクローシス（ＭＴＢ）に対する殺菌効果を示す。この実験では、ＭＴＢはいかなる処置もない、ナノ被包リファンピシン、遊離リファンピシンおよび中空ナノ粒子の各条件下で２週間培養された。ＭＴＢは処置のない試験管および中空ナノ粒子の試験管内で活発に成長し、後者の成長はポリマー自体の毒性のなさと一致していた。反対に、ナノ被包リファンピシンの試験管および遊離リファンピシンの試験管ではＭＴＢの成長が完全に抑制されていた。
【図９】図９は、高分子ナノ粒子のアクリル酸（ＡＡ）表面反応性官能基に結合した水溶性薬物ゲムシタビンを用いて実施された生体外細胞生存度（ＭＴＴアッセイ）を示す。ナノ粒子内に被包された水溶性の低い薬物と違って、ゲムシタビンなどの水溶性薬物はナノ粒子の表面に結合することができ、その化合物は経口送達になじむものとなる。ヒト膵臓がん細胞系ＢｘＰＣ３を、適用量の漸増する遊離ゲムシタビン（黒棒）、ナノゲムシタビン（白棒）、中空ポリマー（グレー棒）またはＰＢＳ溶媒（模様入り棒）のいずれかの中で培養した。ＵＴ＝非処置。９６時間時点で、遊離ゲムシタビンとナノゲムシタビンとは同程度の作用を示した。全てのアッセイは３通りの方法で実施され、平均および標準偏差が記入された。
【図１０】図１０は、高分子ナノ粒子を経口送達した後のラパマイシンの血中濃度を示す。ラパマイシンを、共重合体組成物におけるアクリル酸（ＡＡ）の割合（％）を順次増加させたナノ粒子で被包した。ナノ粒子をそのまま、あるいは表面をＰＥＧ化した後に投与した。比較したのは、対照標準Ａ（水中に懸濁したラパマイシン）、ＮＩＰＡＡＭ：ＶＰ：ＡＡの比率が６０：３０：１０のラパマイシンナノ粒子（ＮＶＡ６３１と呼称される）、ＮＩＰＡＡＭ：ＶＰ：ＡＡの比率が６０：２０：２０のラパマイシンナノ粒子（ＮＶＡ６２２と呼称される）、ＮＩＰＡＡＭ：ＶＰ：ＡＡの比率が６０：１０：３０のラパマイシンナノ粒子（ＮＶＡ６１３と呼称される）、およびＮＩＰＡＡＭ：ＭＭＡ：ＡＡの比率が６０：２０：２０のラパマイシンナノ粒子（ＮＭＡ６２２と呼称される）である。対応するＰＥＧ化された、ラパマイシンを被包するナノ粒子（ＰＥＧ−ＮＶＡ−６３１、ＰＥＧ−ＮＶＡ−６２２、ＰＥＧ−ＮＶＡ−６１３およびＰＥＧ−ＮＭＡ−６２２）は斜線の入った棒で表す。ラパマイシンは、水中に分散した遊離薬物（１５ｍｇ／ｋｇ）または対応する、当量の適用量を有する、高分子ナノ粒子製剤中のナノ被包ラパマイシンとして投与された。この調査の各部分（アーム、arm）で６匹の野生型Ｃ５７／Ｂ６マウスを用いた。ＨＰＬＣによって血中濃度を測定するのに、経口送達の２時間後に得たサンプルを用いた。経口送達後のラパマイシンの血中濃度が最も高かったのは、それぞれ含まれるＡＡのモル比が２０％の２種類のナノ粒子（ＮＶＡ６２２およびＮＭＡ６２２）だった。
【図１１】図１１は、マウスに経口送達されたナノ被包ラパマイシンの２４時間にわたる薬物動態学（ＰＫ）データを示す。この調査のために投与後２時間での血中濃度が最も高い２種の高分子ナノ粒子製剤（図１０）を選択した。その２種とは、それぞれ６０：２０：２０のＮＩＰＡＡＭ／ＶＰ／ＡＡおよびＮＩＰＡＡＭ／ＭＭＡ／ＡＡを含むＮＶＡ６２２およびＮＭＡ６２２である。この調査の各部分（arm）で６匹の野生型Ｃ５７／Ｂ６マウスを用いた。１回分の適用量（薬物１５ｍｇ／ｋｇに相当する）のナノ被包ラパマイシンを、ゼロ時間に投与し、経口送達から３０分後、２、４、８および２４時間後に静脈穿刺によって顔面静脈から血液を得た。マウスプラズマのＨＰＬＣによってラパマイシンの量を測定した。各ナノ粒子製剤について、各時点での平均および標準偏差（エラー棒）を記入した。ＮＭＡ６２２ナノ粒子はＮＶＡ６２２ナノ粒子に比べて濃度曲線下面積（ＡＵＣ）が大きい（それぞれ平均ＡＵＣ２６，９４９対１１，６８４）。
【図１２】図１２は、ナノ粒子被包ラパマイシンを経口経路で投与してから２時間後の中心静脈循環および末梢静脈循環におけるラパマイシンの量を示す。ラパマイシンを被包したＮＶＡ６２２粒子を経口経路で３匹のマウスに投与し（適用量１５ｍｇ／ｋｇ）、２時間後に中心静脈循環および末梢静脈循環（顔面静脈）でラパマイシンの量を測定した。２部位間の独立した３つの測定で得られた量は全て同一であり、経口送達されたナノ粒子被包ラパマイシンが血液循環において全身に等しく行き渡ることと一致する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
高分子ナノ粒子に閉じ込められた、単独の、または２種以上の薬品と組み合わせられた水溶性の低い薬物の医薬用組成物について以下に記載する。また、高分子ナノ粒子の表面に結合したゲムシタビンなどの水溶性薬品の医薬用組成物についても、以下に記載する。形成後のナノ粒子は略球状であり、好ましくは平均粒径５０〜１００ｎｍ以下のサイズを有する。ナノ粒子は、両親媒性で架橋結合したポリマーのミセル集合体のナノメートルサイズの粒子だと言える。
【００２５】
本発明において、高分子ミセルのナノ粒子は、
（ｉ）  ＮＩＰＡＡＭおよびＡＡを水に溶解させてミセルを形成し、
（ｉｉ）  水溶性であっても水不溶性であってもよいが、いずれの場合も前記ミセルに可溶でありラジカル重合によって重合可能なビニル誘導体の化合物を少なくとも１種添加し、
（ｉｉｉ）  適量の活性化剤および開始剤、例えばテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤ）および第一鉄アンモニウムスルファートを活性剤として添加しアンモニウムペルジスルファートを活性化剤として添加し、
（ｉｖ）  前記ミセル溶液に架橋剤、好ましくはＮ，Ｎ’メチレンビスアクリルアミドを添加し、
（ｖ）  モノマーを、例えば窒素などの不活性ガスの存在下で３０〜４０℃の温度で反応完了間近まで２４時間重合させて共重合体とし、
（ｖｉ）  共重合体ミセルのナノ粒子を３時間の透析で浄化し、有毒モノマーおよび他の未反応物質を除去すること、
（ｖｉｉ）  異なる鎖長（５０〜８０００Ｄ）のＰＥＧアミンまたは他の結合された部分をナノ粒子表面の反応性官能基に化学結合させることによる、省略可能なナノ粒子の表面修飾、
（ｖｉｉｉ）  形成された高分子ナノ粒子内に閉じ込めるための１種以上の生物活性剤の水溶液中への添加、または将来の使用に備えて空の高分子ナノ粒子を乾燥粉末に凍結乾燥させること、
（ｉｘ）  空の高分子ナノ粒子の乾燥粉末を水溶液中で再構成すること、および前記高分子ナノ粒子に閉じ込めるための１種以上の生物活性剤の添加、
（ｘ）  薬物を挿入した高分子ナノ粒子を凍結乾燥すること、および
（ｘｉ）  薬物を挿入した高分子ナノ粒子を経口、注射可能または局所的な送達のために水溶液中で再構成することによって調製される。
ＮＩＰＡＡＭおよびＡＡを除くビニルモノマーは、ビニルアセタート、４−ビニル安息香酸、Ｎ−ビニルピロリドン（ＶＰ）およびＮ−ビニルピペリドンなどの水溶性ビニル化合物から選択される一方、水不溶性両親媒性ビニル化合物はメチルメタクリラート（ＭＭＡ）、ビニルメタクリラート、Ｎ−ビニルカプロラクツム、Ｎ−ビニルカルバゾールおよびスチレンを含む。
【００２６】
一実施形態では、反応混合物中の諸モノマーを重合させてナノ粒子を形成する。組成のモル比は、ＮＩＰＡＡＭが約５０％から約９０％であり、経口または非経口など特定の送達経路に関しては６０％が好ましく、水溶性ＶＰまたは水不溶性ＭＭＡなどのビニルモノマーが約１０％から約３０％であり、ＡＡが約１０％から約３０％である。モノマーを水に溶解させ、そこにアンモニウムペルジスルファートＴＥＭＥＤおよび第一鉄アンモニウムスルファートを添加する。ポリマーを架橋するためにＮ，Ｎ’メチレンビスアクリルアミドも添加する。前記混合物を、好ましくは不活性ガス（例えば窒素、アルゴン等）の存在下で、好ましくは２０〜８０℃、より好ましくは３０〜４０℃の温度で重合させ、重合反応が完了するまで続ける。重合反応の完了は、反応混合物からモノマーが減少したことをビニルプロトンのＨＰＬＣまたは１ＨＮＭＲを用いて確認する。溶液を、例えば２〜４時間、透析して浄化し、有毒なモノマーまたは他の未反応種を除去する。実施例１では、ポリマー中のＡＡの比率を変えることで経口送達された胃腸管中の粘膜付着性を潜在的に変調させるべく、モル比６０：３０：１０、６０：２０：２０および６０：１０：３０のＮＩＰＡＡＭ、ＶＰおよびＡＡを用いて共重合体を調製した。実施例２では、ＶＰをＭＭＡに置き換えて同様の共重合体ナノ粒子を調製し、その具体例ではモル比６０：２０：２０のＮＩＰＡＡＭ、ＭＭＡおよびＡＡをそれぞれ用いた。下記するように、利用した諸モノマーの比率は体温でのナノ粒子の安定性にも影響する。
【００２７】
図１は本発明の一実施形態を示す。この図は、ナノ粒子が薬品（符号１１）を閉じ込めたポリマーの疎水性部分から成る疎水コア（符号１０）を有する一方、親水シェル（符号１２）を形成する親水性部分は水性媒質に向けて配向することを示す。
【００２８】
共重合体製剤中にＮＩＰＡＡＭが存在するので、ナノ粒子シェルは下部臨界完溶温度（ＬＣＳＴ）で親水性物質から疎水性物質に転じる。該下部臨界完溶温度は、図３から明らかなように、用いたモノマーの比率におけるＮＩＰＡＡＭの量を変更することで変調できる。これらのナノ粒子を体循環に適合させるには、ナノ粒子のＬＣＳＴが人間の体温（〜３７℃）より高くなければならない。ナノ粒子が高温度のＬＣＳＴ（すなわち、４０〜５０℃の範囲）を得て、体温で薬品の全身送達およびナノ粒子の安定性を実現するには、ＮＩＰＡＡＭ成分の使用を最適モル比５０〜７０％とし、他の２種のモノマーで１００％の残りを構成する必要がある。上述のとおり、それ以外のモノマーまたは官能性部分を含めてもよく、それらのモノマーまたは官能性部分はＬＣＳＴに影響しない。
【００２９】
本実施形態で記載したナノ粒子を、そのまま薬物送達に使用してもよいし、必要であれば、ナノ粒子の表面を、異なる鎖長（５０〜８０００Ｄ）のＰＥＧアミン鎖を付着させるために、またはリガンド、抗体、放射性核種、蛍光体および造影剤などの標的化部分の化学結合のために、またはアスパルテームなどの味遮蔽剤を付加するためにＡＡが提供した反応性表面基（ＣＯＯ−）を官能化することで修飾してもよい。ＰＥＧアミン鎖の付加は、図１０から明らかなように、観察された薬物被包ナノ粒子の経口生物学的利用率を妨げない。図１０では、ラパマイシンを被包した独立した４種のナノ粒子製剤（ＮＶＡ６３１、ＮＶＡ６２２、ＮＶＡ６１３およびＮＭＡ６２２）を経口経路でマウスに投与し、体循環における２時間時点での薬物レベルを、対応するＰＥＧ化ナノ粒子に被包されたラパマイシン（ＰＥＧ−ＮＶＡ６１３、ＰＥＧ−ＮＶＡ６２２、ＰＥＧ−ＮＶＡ６１３およびＰＥＧ−ＮＭＡ６２２）と比較した。見たとおり、非ＰＥＧ化ナノ粒子もＰＥＧ化ナノ粒子も経口送達後のラパマイシンの血中濃度は大差ない。当業者は、ナノ粒子をＰＥＧ化することが、ナノ粒子に生体固有の細網内皮組織（ＲＥＳ）を回避させてナノ粒子の長い循環を実現すること、および本発明で実施される「ＲＥＳ回避」ナノ粒子の作製が、ナノ粒子の経口生物学的利用率を妨げないことを認識していたであろう。
【００３０】
本実施形態で開示される高分子ナノ粒子は、薬品または他の生物活性剤が最大限挿入されることが好ましい。該薬品または生物活性剤は、水溶性が低いまたは水不溶性だが有機溶媒に易溶な有機化合物でもよい。該薬品または生物活性剤は、クロロホルム、エタノールまたはエーテルの各溶媒に対する該薬物の可溶性に応じて、乾燥粉末または溶液のいずれかの形態で添加され、光学的に透明な溶液を形成する。かかる薬品の例には、パクリタクセル、ドセタキセル、ラパマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、カペシタビン、マイトマイシンＣ、アムサクリン、ブスルファン、トレチノイン、エトポシド、クロラムブシル、クロルメチン、メルファランおよびベンジルフェニル尿素（ＢＰＵ）化合物などの抗腫瘍剤、クルクミン、クルクミノイドおよび他のフラボノイド（flavinoids）などの植物化学（フィトケミカル）および他の天然化合物、天然ステロイドおよび合成ステロイドなどのステロイド系化合物ならびにシクロパミンなどのステロイド誘導体、アシクロビル、インジナビル、ラミブジン、スタブジン、ネビラピン、リトナビル、ガンシクロビル、サキナビル、ロピナビル、ネルフィナビルなどの抗ウィルス剤、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、アンホテリシンＢおよびグリセオフルビンなどの抗かび剤、シプロフロキサシン、オフロキサシン、モキシフロキサシン、メトキシフロキサシン、ぺフロキサシン、ノルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、シノキサシンを含むキノロン剤などの抗菌剤、クロキサシリン、ベンジルペニシリン、フェニルメトキシペニシリンを含むペニシリンなどの抗菌剤、エリスロマイシンおよび他のマクロライドを含むアミノグリコシドなどの抗菌剤、リファンピシンおよびリファペンチンなどの抗結核剤、およびイブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダクなどの抗炎症剤が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、組成物に挿入された薬品はポリマーの１〜２０％（ｗ／ｗ）で変化するが、適用形態によって挿入物の比率はずっと高いだろう。
【００３１】
一般的に、生物学的な効果をもたらす他の薬剤を含む、水性媒質への可溶性が低い薬品などの１以上の生物活性剤が、エタノールまたはクロロホルムなどの適切な溶媒に溶解され、ナノ粒子溶液に添加される。この添加工程は、ナノ粒子形成前に行っても形成後に行ってもよい。薬品または生物活性剤とナノ粒子溶液との組み合わせは、結果的に、該薬品または生物活性剤をナノ粒子の疎水コア（内部）に閉じ込める。閉じ込められた薬品または生物活性剤を含むナノ粒子は、必要であれば、凍結乾燥または他の方法で粉末形状にして、将来適切な液状媒体中で再構成し、人間または哺乳動物へ投与してもよい。後述の図１０、１１および１２を組み込んだ実施例５において、高分子ナノ粒子に被包されたラパマイシンの生体内での経口生物学的利用率が実証される。
【００３２】
本発明の別の実施例では、水溶性だが経口経路からの生物学的利用率が低い薬物を、ナノ粒子の反応性カルボキシ基と該薬物上のアミン基またはチオール基などの相補的な官能基とが共有結合することによってナノ粒子の表面に付着させる。ナノ粒子との結合によって、かかる薬物は経口生物学的利用能を得る。かかる化合物の例には、ゲムシタビンのような抗腫瘍剤が含まれるが、これに限定されない。
【００３３】
上記のプロセスで調製された、少なくとも１種の薬品または薬品と生物活性剤との組み合わせを含むナノ粒子（例えば、薬品が閉じ込められたナノ粒子または薬品が表面に結合したナノ粒子またはその両方の組み合わせ）は、がん、炎症、感染および神経変性を含むがこれらに限定されない多種の疾患から生じる病理学的な状態の治療に使用することができる。
次に、本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。
【実施例】
【００３４】
（実施例１）
ＮＩＰＡＡＭ、ＶＰ（水溶性ビニル誘導体）およびＡＡの架橋共重合体ミセルの合成
ＮＩＰＡＡＭとＶＰおよびＡＡとの共重合体を、ラジカル重合によって合成した。各水溶性モノマー、ＮＩＰＡＡＭ、ＶＰおよびＡＡを、ＮＶＡ６３１では６０：３０：１０、ＮＶＡ６２２では６０：２０：２０、ＮＶＡ６１３では６０：１０：３０のモル比で水に溶解させた。Ｎ２環境下でアンモニウムペルスルファート（ＡＰＳ）を開始剤として用いて重合を開始した。重合反応を活性化させるとともに、各モノマーを確実に完全に重合させて高収量を得るために、第一鉄アンモニウムスルファート（ＦＡＳ）を添加した。ＮＶＡ６３１を模範例として用いて、典型的な実験計画において、再結晶化したＮＩＰＡＡＭ  ６２．８ｍｇ，新たに蒸留されたＶＰ  ３０．５μｌおよび（新たに蒸留された）ＡＡ  ６．６１μｌを１０ｍｌの水に入れて使用した。ポリマー鎖を架橋するために、モノマーの水溶液に３０μｌ（０．０４９ｇ／ｍｌ）のＭＢＡを添加した。窒素ガスを３０分間流すことによって溶解していた酸素を除去した。次にＦＡＳを２０μｌ（０．５％ｗ／ｖ）、ＡＰＳを３０μｌおよびＴＥＭＥＤを２０μｌ添加して、重合反応を開始させた。該重合反応を３０℃の窒素環境下で２４時間実施した。重合の完了後に、スペクトラポール膜透析バッグ（spectrapore membrane dialysis bag）（１２ｋＤ排除）を使って、全重合体水溶液を一晩透析した。透析した溶液はその後すぐに凍結乾燥させ、将来使用するための、水性緩衝剤中で簡単に再分散する乾燥粉末を得た。高分子ナノ粒子の収量は９０％を超えた。ＶＰをビニルアルコール（ＶＡ）などの他の水溶性ビニル誘導体で置き換えても、調製方法は変わらず、共重合体の性質も変わらない。
【００３５】
（実施例２）
ＮＩＰＡＡＭ、ＭＭＡ（水不溶性ビニル誘導体）およびＡＡの架橋共重合体ミセルの合成
ＮＩＰＡＡＭとＭＭＡおよびＡＡとの共重合体を、ラジカル重合によって合成した。ＮＭＡ６３１では６０：３０：１０、ＮＭＡ６２２では６０：２０：２０、ＮＭＡ６１３では６０：１０：３０のモル比で各水溶性モノマー、ＮＩＰＡＡＭおよびＡＡを水に溶解させ、水不溶性モノマー、ＭＭＡをＮＩＰＡＡＭおよびＡＡのミセル溶液に溶解させた。Ｎ２環境下でアンモニウムペルスルファート（ＡＰＳ）を開始剤として用いて重合を開始した。重合反応を活性化させるとともに各モノマーを確実に完全に重合させて高収量を得るために、第一鉄アンモニウムスルファート（ＦＡＳ）を添加した。ＮＭＡ６２２を模範例として用いて、ＮＭＡ６２２を調製する典型的な実験計画において、再結晶化したＮＩＰＡＡＭ  ６６．６ｍｇ，新たに蒸留したＭＭＡ  １９．４μｌおよび（新たに蒸留した）ＡＡ  １４μｌを１０ｍｌの水に入れて使用した。ポリマー鎖を架橋するために、モノマーの水溶液に３０μｌ（０．０４９ｇ／ｍｌ）のＭＢＡを添加した。窒素ガスを３０分間流すことによって溶解していた酸素を除去した。次にＦＡＳを２０μｌ（０．５％ｗ／ｖ）、ＡＰＳを３０μｌおよびＴＥＭＥＤを２０μｌ添加して、重合反応を開始させた。該重合反応を３０℃の窒素環境下で２４時間実施した。重合完了後に、スペクトラポール膜透析バッグ（１２ｋＤ排除）を使って、重合体の水溶液全量を一晩透析した。透析した溶液はその後すぐに凍結乾燥し、将来使用するための、水性緩衝剤中で簡単に再分散する乾燥粉末を得た。高分子ナノ粒子の収量は９０％を超えた。ＭＭＡをスチレン（ＳＴ）などの他の水不溶性ビニル誘導体で置き換えても、調製方法は変わらず、共重合体の性質も変わらない。
【００３６】
（実施例３）
５ｋＤのＰＥＧ部分によるＮＩＰＡＡＭ／ＶＰ／ＡＡ共重合体ミセルの表面修飾
製剤ＮＶＡ６３１、ＮＶＡ６２２またはＮＶＡ６１３を上に詳述した実験計画に基づいて調製した。共重合後にＡＡと結合させる官能化ＰＥＧ分子の具体例として、メトキシポリエチレングリコールアミン（メトキシＰＥＧアミン；分子量５０００Ｄ）を用いた。メトキシＰＥＧアミンを共重合体内のアクリル酸のカルボキシ基に結合させるために、ＥＤＣＩを架橋剤として用いた。１００ｍｇの凍結乾燥された共重合体粉末を短時間、１０ｍｌのリン酸塩緩衝剤に溶解させた。ここに、５ｍＭの１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ）を添加して３０分間攪拌した。その後、この共重合体溶液に５ｍｇのメトキシＰＥＧアミンを添加して室温で一晩攪拌した。その翌日、１２ｋＤ透析膜を使って、該溶液を２〜４時間透析し、結合していないメトキシＰＥＧアミンを除去した後、次の凍結乾燥を行った。生成されたナノ粒子の呼称をＰＥＧ−ＮＶＡ６３１、ＰＥＧ−ＮＶＡ−６２２およびＰＥＧ−ＮＶＡ６３１とする。ＮＩＰＡＡＭ／ＭＭＡ／ＡＡ製剤でも同一のＰＥＧ化を行うことができ、呼称をそれぞれ、ＰＥＧ−ＮＭＡ６３１、ＰＥＧ−ＮＭＡ６２２およびＰＥＧ−ＮＭＡ６３１とする。
【００３７】
（実施例４）
水溶性が低く、免疫調節剤であり抗がん剤であるラパマイシンを被包した高分子ナノ粒子の調製
免疫調節剤であり抗がん剤であるラパマイシンは、経口経路からの吸収率が低いことで知られている。本発明のナノ粒子を用いてのラパマイシンの送達を調査するために、下記の方法で、ＮＶＡ６３１、ＮＶＡ６２２、ＮＶＡ６１３およびＮＭＡ６２２ナノ粒子またはそれぞれのＰＥＧ化誘導体（ＰＥＧ−ＮＶＡ６３１、ＰＥＧ−ＮＶＡ６２２、ＰＥＧ−ＮＶＡ６１３およびＰＥＧ−ＮＭＡ６２２）にラパマイシンを組み込んだ。すなわち、１０ｍｌの蒸留水中に各ナノ粒子の凍結乾燥された乾燥粉末１００ｍｇを分散させ、十分に攪拌してミセルを再構成した。遊離薬のラパマイシンをクロロホルム（１０ｍｇ／ｍｌ）に溶解させ、ＣＨＣｌ３に含有される薬物溶液を一定の渦運動および穏やかな超音波処理の下でゆっくりと重合体溶液に加えた。ラパマイシンはミセルの疎水コアに直接挿入された。次に、薬物が挿入されたミセルを将来使用するための乾燥粉末に凍結乾燥した。各共重合体ミセル（ＮＶＡ６３１、ＮＶＡ６２２、ＮＶＡ６１３およびＮＭＡ６２２ならびにそれぞれのＰＥＧ化誘導体）で、ミセル粉末１００ｍｇに３ｍｇ以下のラパマイシンが閉じ込められ、薬物挿入ナノ粒子溶液を形成し、挿入物は総じてポリマーの３％（ｗ／ｗ）となった。
本実施例は、水溶性の低い薬物が簡単かつ効率的に本発明のナノ粒子に挿入されることを示すものである。
【００３８】
（実施例５）
ラパマイシンを被包した高分子ナノ粒子の生体内への経口投与
ラパマイシンは水溶性の低い薬物で経口生物学的利用率が低い。この実験の目的は、本発明で実施された高分子ナノ粒子によるラパマイシンのナノ被包が、水性媒質内の遊離ラパマイシンと比較して、経口投与による吸収を向上させ得るのかどうかを判断することだった。独立した９セットのＣ５７Ｂ６野生型マウス（Ｎ＝１セット６匹のマウス）を調査した。ラパマイシンは、水に懸濁した経口遊離ラパマイシン（１５ｍｇ／ｋｇ体重）、またはＮＶＡ６３１、ＮＶＡ６２２、ＮＶＡ６１３およびＮＭＡ６２２に被包された当量のラパマイシン、またはそれぞれの表面修飾ＰＥＧ化誘導体としてマウスに投与された。全ての投与は経口洗浄によりなされた。経口投与から２時間後にマウスの血を抜き、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて血中のラパマイシン濃度を判断した。この調査の結果を図１０に示した。図から明らかなように、実験が成功裏に行われたすべてのナノ粒子は、基本的に検出不能だった水中の遊離ラパマイシンと比べ高濃度のラパマイシンを血流に送った。経口送達後の全身濃度の高さは、担体ポリマーのナノ微粒子的寸法（粒径〜５０ｎｍ）と消化管内での粘膜付着性の向上との両方により、該粘膜付着性の向上は表面上にポリマー内のＡＡ成分からの自由なＣＯＯ−（カルボキシ）基が存在することによる。さらに、ＮＶＡ６２２およびＮＭ６２２の２種のナノ粒子製剤が２時間後に最も高い血中濃度を有したが、これは高分子組成物に含まれる粘膜付着性ＡＡの最適モル比によると考えられる。この調査はまたＡＡの部分的なＰＥＧ化（ＰＥＧ−ＮＶＡ６３１、ＰＥＧ−ＮＶＡ６２２、ＰＥＧ−ＮＶＡ６１３およびＰＥＧ−ＮＭＡ６２２に見られる）がナノ粒子の粘膜付着性を損なわないことを示す。それは、ＰＥＧ化後も粘膜に付着するのに十分な数の自由なＣＯＯ−基が残っているからであろう。したがって、時折長い体循環で必要とされる、省略可能な上記ナノ粒子のＰＥＧ化は経口生物学的利用率を損なわない。図１１の実験ではナノ粒子被包薬物の迅速で活発な接種が確認され、早くて経口投与の３０分後には著しく高い摂取量が観察される。最後に、図１２の実験ではナノ粒子被包薬物が経口送達後の循環において全身に等しく行き渡ることが確認され、中心循環区画および末梢循環区画において略同程度のラパマイシンが観察される。したがって、本実施例は本発明で実施された高分子ナノ粒子が、１種以上の被包された水溶性の低い薬物を、経口経路を介して効果的に体循環に送達することを示す。
【００３９】
（実施例６）
抗がん剤のナノ粒子製剤の生体外成長アッセイ、および独立した２種の抗がん剤のナノ粒子製剤によって成立した組み合わせ治療の一例
パクリタクセルは水溶性の低い抗がん剤で、本願に記載した高分子ナノ粒子を用いて水性媒質に分散させるために可溶化し得るものである。ＮＶＡ６３１粒子に被包されたナノパクリタクセルを３種のヒト膵臓がん細胞系（ＸＰＡ−１、ＢｘＰＣ３およびＰＡＮＣ−１）のパネルで生体外細胞生存度（ＭＴＴ）アッセイとして用いた。この調査の結果を図６に示した。図から明らかなように、ナノパクリタクセルは与えられたパクリタクセルのどの適用量においても遊離薬物と同様の効力を示し、それによって、ナノ被包化処理が親化合物の作用を抑えるものではないことを裏付けた。独立した２種の治療剤（ナノパクリタクセルおよびナノクルクミン）の結果を図７に示した。図から明らかなように、ナノパクリタクセルとナノクルクミンとの組み合わせは、パクリタクセルのどの適用量においても、単体での遊離パクリタクセルまたはナノパクリタクセルよりも大きい細胞毒性を示す。留意すべきは、特に細胞系の２種（ＸＰＡ−１およびＰａｎｃ−１）を低適用量で用いた場合、ナノパクリタクセルとナノクルクミンとの組み合わせは遊離パクリタクセルと遊離クルクミンとの組み合わせより有効性があることで、それはナノ被包化合物の細胞内摂取の増加によるのだろう。高適用量では遊離薬物の組み合わせ治療もナノ被包薬物の組み合わせ治療も同程度の効果を持つようである。
【００４０】
（実施例７）
味遮蔽剤アスパルテームによる高分子ナノ粒子製剤の表面修飾、および表面修飾ナノ粒子による抗かび剤グリセオフルビンの被包
抗かび剤グリセオフルビンは水溶性が低く、経口生物学的利用率が低く、患者の薬剤服用順守に影響し得る苦味を呈する。本実施例では、味遮蔽剤による表面修飾になじみ、修飾されたナノ粒子にグリセオフルビンを組み込む「スマート」な高分子ナノ粒子（実例として組成物ＮＭＡ６２２を挙げる）の効用を示す。１０ｍｌのＮＭＡ６２２ポリマー分散系（１００ｍｇのポリマーを含む）と５００μｌの５ｍＭ  ＥＤＣＩとを攪拌によって混合し、完全に溶解させた。透明な分散系に固形アスパルテームを３０ｍｇ添加した。該溶液を夜通し１５〜２０時間攪拌した。続いて透明溶液を１２ｋＤ排除の透析バッグを通して、外側の水を１時間ごとに交換しながら、４時間透析した。透析された溶液に固形グリセオフルビンを２ｍｇ加え、該溶液を３０分間超音波処理して完全な分散系を形成し、攪拌しながら５０〜６０℃で穏やかに加熱し、透明な溶液を得た。必要に応じて、超音波処理とそれに続く攪拌を伴う穏やかな加熱を、溶液が透明になるまで繰り返した。ナノグリセオフルビンの室温での透明溶液を凍結乾燥して、後で使用するための乾燥粉末にした。
表面にアスパルテームが結合した高分子ナノ粒子からの室温でのグリセオフルビンの放出動力学をさらに調査した。グリセオフルビンが挿入された表面修飾ＮＭＡ６２２高分子ナノ粒子（「ナノグリセオフルビン」と呼称される）の凍結乾燥された粉末１０ｍｇを、渦運動によって１ｍｌの水に溶解させた。次に、ナノグリセオフルビンの透明溶液１０μｌを水１ｍｌに加え、混合物の吸光度を２９２ｎｍで測定した。２時間ごとに、ナノグリセオフルビンの原液を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離機にかけ、液面から遠心分離物１０μｌをピペットで注意深く取り、水１ｍｌに添加した。２９２ｎｍで吸光度を測定した。１０時間経過後、ナノグリセオフルビン原液を一晩置き、２４時間後の２９２ｎｍでの吸光度を上記の方法で測定した。同様に４８時間後および７２時間後の吸光度も測定した。Ｄ０を０時間での吸光度とし、Ｄｔをｔ時間後の吸光度とする等式（Ｄ０−Ｄｔ）／Ｄ０×１００を用いて放出率（％）を算出した。この計算は、ナノ粒子から放出されたグリセオフルビンのほとんど全てが遠心分離機にかけている間に沈下し、水中のグリセオフルビン濃度が実質的にゼロであることを前提としている。
【００４１】
結果
時間            ＯＤ          放出率（％）
０時間          ０．０９３    ０．０
２時間          ０．０８５    ８．６
４時間          ０．０７６    １８．３
６時間          ０．０７２    ２３．０
１０時間        ０．０６１    ３４．４
２４時間        ０．０５３    ４３．０
４８時間        ０．０４８    ４８．４
７２時間        ０．０１８    ８０．６
【００４２】
本実施例はもう１つの水溶性の低い薬物、抗かび剤グリセオフルビンの高分子ナノ粒子による被包、および被包された薬物の生得的な味をナノ粒子表面に結合した味遮蔽剤によって変換する機能を表わすものである。本実施例はまた、７２時間に渡る、ナノ粒子挿入薬物の好ましい放出動力学（「バースト放出」効果の欠如を含む）を示す。
【００４３】
（実施例８）
水溶性抗がん剤ゲムシタビンの高分子ナノ粒子表面への結合および該「ナノゲムシタビン」製剤のヒトがん細胞系における生体内細胞生存度アッセイへの適用
ゲムシタビンは水溶性化合物であり、上述された高分子ナノ粒子の疎水コアに被包された水溶性の低い薬物とは異なる。本実施例において、水溶性薬物の一例として、ゲムシタビンの、高分子ナノ粒子の親水性表面への化学結合を説明する。このような結合は担体として用いられる該高分子ナノ粒子の経口生物学的利用能を利用することによって、ゲムシタビンの経口送達を容易にすると予測される。渦運動によって１０ｍｇのＮＭＡ６２２高分子ナノ粒子を水１０ｍｌ中に分散させた。透明溶液にＥＤＣＩを６．５ｍｇ添加して１０分間攪拌した。その後、攪拌を継続しながら、ゲムシタビン粉末を１０．２ｍｇ添加した。該溶液をさらに１５〜２０時間攪拌した。反対側が水の１２ｋＤ透析膜を通して透明溶液を３時間透析した。続いて該溶液を凍結乾燥して、その後使用するための乾燥粉末を生成した。高分子ナノ粒子に結合したゲムシタビンの抗がん効果が維持されていることを示すために、実施例６に示したように、ヒト膵臓がん細胞系ＢｘＰＣ３を用いて細胞生存度（ＭＴＴ）アッセイを行った。図９はナノゲムシタビンが９６時間時点で遊離ゲムシタビンと同等の効力を有することを裏付ける。
本発明を好ましい実施形態によって説明したが、本発明は添付請求項の精神および範囲において変更して実施することが可能であることを当業者は認めるであろう。
【図１】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図２】
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【図８】
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【国際調査報告】
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