(57)【要約】  本発明は、高コレステロール血症および心血管疾患に関連した障害を治療するためのペプチド模倣体に関する。特に、本発明は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡＩ）の活性を模倣するペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然アミノ酸への少なくとも１つのアミノ酸の突然変異によりＡｐｏＡ−１コンセンサスペプチドの配列から誘導されたＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体。
【請求項２】
該非天然アミノ酸がイソ酪酸側鎖、ジカルボン酸側鎖、炭化水素側鎖またはアルキル側鎖を有する、請求項１記載の模倣体。
【請求項３】
該ペプチド模倣体がＡＢＣＡ１依存性コレステロール排出に関して１０〜０．４μＭのＥＣ５０を示す、請求項１記載の模倣体。
【請求項４】
【化１】
2010530433.tif 000016
2010530433.tif 000017
2010530433.tif 000018
よりなる群から選ばれる、請求項１記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号２〜７２よりなる群から選ばれる、請求項１記載のペプチド模倣体。
【請求項６】
請求項１記載のペプチドを含んでなる医薬組成物。
【請求項７】
請求項１記載のペプチドの治療的有効量を患者に投与する工程を含んでなる、患者における逆コレステロール排出（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ）を増加させるための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願において引用されている参考文献は、特許請求されている本発明の先行技術であると自認されるものではない。
【０００３】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に結合したコレステロールの濃度は心血管疾患のリスクと逆相関する（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｊ．およびＭｉｌｌｅｒ，Ｎ．Ｅ．，Ｌａｎｃｅｔ  １（１９７５）１６−２５）。ＨＤＬ代謝の障害を有する患者および遺伝的に改変された動物における研究は低ＨＤＬとアテローム硬化性血管疾患との関連性を支持している。ＨＤＬの有益な作用は、コレステロールが末梢組織から、コレステロールの排除の場となる肝臓へと輸送（逆コレステロール輸送、ＲＣＴ）されるのを媒介するその役割に関連している。ＲＣＴは、コレステロールが合成され又は食物から抽出される場である肝臓から体内の末梢組織へコレステロールを運搬する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の作用に抗する。
【０００４】
ＨＤＬの主要タンパク質成分であるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−１）はＲＣＴ過程において中心的な役割を果たしている。ＲＣＴのメカニズムは、動脈壁内のマクロファージを含む末梢組織から遊離コレステロールを取り出す第１段階を含む。ついで遊離コレステロールはレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の作用によりエステル化され、低密度リポタンパク質と交換され、肝臓へ輸送され、最終的に胆汁中に分泌される。
【０００５】
ＡｐｏＡ−１の活性はＡＴＰ結合カセット輸送体Ａ１（ＡＢＣＡ１）とのその相互作用を要する。ＡＢＣＡ１は、ＲＣＴ経路の初期段階としての、アポリポタンパク質アクセプターへのリン脂質およびコレステロールの排出を媒介する。いくつかの研究はＡｐｏＡ−１  −ＡＢＣＡ１相互作用の重要性を浮き彫りにしている。例えば、ＡＢＣＡ１の欠損はタンジール病の原因となり（Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗｉｌｓｏｎ，Ａ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２（１９９９）３３６−３４４；  Ｂｏｄｚｉｏｃｈ，Ｍ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２（１９９９）３４７−３５１）、ＡＢＣＡ１における突然変異は、細胞からのリン脂質およびコレステロールの排出を媒介するＡｐｏＡ−１の能力を損なって、早発性アテローム性動脈硬化症を引き起こす（Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗｉｌｓｏｎ，Ａ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２（１９９９）３３６−３４４；  Ｂｏｄｚｉｏｃｈ，Ｍ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２（１９９９）３４７−３５１；  Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｇ．Ａ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．９６（１９９５）７８−８７；  Ｒｅｍａｌｅｙ，Ａ．Ｔ．ら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１７（１９９７）１８１３−１８２１）。
【０００６】
ＨＤＬの他の有益な効果には、酸化に対するＬＤＬの保護、血小板凝集の軽減、ならびに脂質異常症またはアテローム性動脈硬化症により誘発される内皮機能不全および血管サイトカイン活性化のモジュレーションが含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ．Ｅ．，Ｌａｎｃｅｔ  １（１９７５）１６−２５
【非特許文献２】Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗｉｌｓｏｎ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２（１９９９）３３６−３４４
【非特許文献３】Ｂｏｄｚｉｏｃｈ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２（１９９９）３４７−３５１
【非特許文献４】Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｇ．Ａ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．９６（１９９５）７８−８７
【非特許文献５】Ｒｅｍａｌｅｙ，Ａ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１７（１９９７）１８１３−１８２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体を提供する。ＨＤＬにおけるＡｐｏＡ−１の活性を模倣するよう、より詳しくは、ＡＢＣＡ−１依存性経路による脂質結合特性およびコレステロール排出特性に関してそれを模倣するよう、ペプチドを設計した。これらのペプチド模倣体は、イソ酪酸側鎖、ジカルボン酸側鎖または炭化水素置換側鎖を含む非天然アミノ酸への少なくとも１つのアミノ酸の突然変異により、ＡｐｏＡ−１コンセンサスペプチドの配列から誘導される。好ましい実施形態には、本明細書に記載されているアッセイにおいてＡＢＣＡ−１依存性コレステロール排出に関して１０〜０．４μＭのＥＣ５０を示すＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体が含まれる。
【０００９】
本発明の幾つかの態様はペプチド模倣体および脂質の組成物である。該ペプチド模倣体は、イソ酪酸側鎖、ジカルボン酸側鎖または炭化水素置換側鎖を含有する非天然アミノ酸への少なくとも１つのアミノ酸の突然変異により、ＡｐｏＡ−１コンセンサスペプチドの配列から誘導される。ペプチド模倣体および脂質の該組成物はＨＤＬ型粒子を模倣したものでありうる。
【００１０】
本発明の幾つかの態様は、医薬上許容される担体溶液中にペプチド模倣体および場合によっては１以上の脂質を含む医薬組成物である。そのような組成物は、例えば、アテローム性動脈硬化症病変の急性および慢性治療に適しているはずである。
【００１１】
本発明の幾つかの態様は、ペプチド模倣体の治療的有効量を患者に投与することを含む、患者における逆コレステロール排出（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ）を増加させるための方法である。
【００１２】
本発明の幾つかの態様は、治療的有効量のペプチド模倣体および脂質を患者に投与することを含む、患者における逆コレステロール排出を増加させるための方法である。
【００１３】
「含む」のような非限定的用語は追加的な要素または工程を許容する。場合によっては、追加的な要素または工程の可能性を強調するために、「１以上」のような表現が、非限定的用語を伴って又は伴わないで用いられる。
【００１４】
明示的に示されていない限り、単数形表現は単数に限定されるものではない。例えば、「細胞」は複数の細胞を除外しない。場合によっては、複数の存在の可能性を強調するために、１以上のような表現が用いられる。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、非天然アミノ酸を有するＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体を含む。該ペプチドは逆コレステロール輸送を促進し、高コレステロール血症の治療において有用でありうる。
【００１６】
各ＨＤＬ粒子はＡｐｏＡ−１の２〜４コピーを含有する。ＡｐｏＡ−１は、しばしばプロリンであるリンカー部分により隔てられた６〜８個の異なる２２アミノ酸反復から主になる２４３アミノ酸のタンパク質である。ＡｐｏＡ−１の生物活性は、クラスＡ両親媒性αヘリックスと称される特有の二次構造要素を示すこれらの複数の反復の存在によるものであると考えられている（Ｓｅｇｒｅｓｔ，Ｊ．Ｐ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８（１９７４）２４７−２５３）。クラスＡ両親媒性ヘリックスは親水性／疎水性境界における正荷電アミノ酸残基の存在により特徴づけられ、一方、負荷電残基は親水性相の中心部に塊化している。
【００１７】
ヒトＡｐｏＡ−１のヘリックスの配列に基づく２２アミノ酸残基を含有するコンセンサスペプチドは科学文献に開示されている（Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈ，Ｇ．Ｍ．ら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １０（１９９０）９５）。ヒトＡｐｏ  ＡＩのヘリックスドメインの各位置における最も優勢な残基を特定することにより、コンセンサスペプチド（Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓ）の配列を設計した。得られたペプチドはクラスＡ両親媒性ヘリックスの特徴を示している。Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓのヘリックス円形表示を図１に示す。
【００１８】
しかし、Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓを、リポソーム濁度を消失させマウスマクロファージ細胞からのインビトロコレステロール排出を促進するその能力に関して試験したところ（該アッセイの実施例を参照されたい）、それはどちらのアッセイにおいても不活性であることが判明した。
【００１９】
所望の特性を有するペプチド模倣体を設計する場合には、ＡＢＣＡ１非依存性メカニズムによりもたらされるコレステロール排出が細胞毒性を引き起こしうることを特に考慮して、ＡＢＣＡ１輸送体によるコレステロール排出に対するペプチド特異性の特有の特徴が好ましい。
【００２０】
本発明のペプチドは、Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓ配列の種々の位置に単一または複数の突然変異を導入することにより設計される。ペプチドは、増強された膜結合アフィニティに関してスクリーニングされる。活性に必須である該ペプチドのクラスＡ  α−ヘリックスコンホメーションの維持または更なる安定化も望ましい。
【００２１】
導入された突然変異は、α−ヘリックス二次構造を安定化することが知られているアミノ酸であるα−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）を含む非天然アミノ酸に基づくものであった。しかし、Ａｉｂの場合、１３位における１つのＡｉｂ残基の置換は、コレステロール排出能の大きな改善を得るのに十分でない可能性があり、これは、突然変異の位置によっては１３位および１６位にＡｉｂを含有する二重突然変異体にも当てはまりうることである。
【００２２】
アスパラギン酸および／またはグルタミン酸に比べて側鎖に余分のカルボン酸を含有するアミノ酸であるγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）の導入とＡｉｂ突然変異が組合された場合に、改善されたコレステロール排出活性が観察されうる。Ｇｌａ上の二重負電荷は該ペプチド内の局所負電荷密度を有効に増加させる。例えば、二重突然変異Ｇｌａ８／Ａｉｂ１３およびＧｌａ１５／Ａｉｂ１３はコレステロール排出アッセイにおいて、それぞれ、ＥＣ５０＝４４および４１μＭを示す。該活性はＧｌａおよびＡｉｂの両方の残基に依存している。同じ位置における対応するＧｌａ／Ａｌａ二重突然変異体は、コレステロール排出アッセイにおいて、それほど強力ではない。例えば、Ｇｌａ８／Ａｌａ１３およびＧｌａ１５／Ａｌａ１３は、それぞれ、ＥＣ５０＝１４２および２３４μＭを示す。
【００２３】
種々の長さの炭化水素置換側鎖を含有するアミノ酸［Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｃ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２（２０００）５８９１に既に記載されている、Ｒ（またはＤ）およびＳ（またはＬ）立体化学の両方のＳ７Ｈ３、Ｓ８Ｈ３およびＳ１２Ｈ３（図２も参照されたい）］が本発明に含まれる。特に、本発明は、限定的なものではないが（２Ｓ）−２−アミノノン−８−エン酸（Ｓ７Ｈ）；（２Ｒ）−２−アミノノン−８−エン酸（Ｒ７Ｈ）；（２Ｓ）−２−アミノオクタ−７−エン酸（Ｓ６Ｈ）；（２Ｒ）−２−アミノオクタ−７−エン酸（Ｒ６Ｈ）；（２Ｓ）−２−アミノノナン酸（Ｓ７Ｈ３）のような好ましいアミノ酸を含み、α−、α−ジ置換アミノ酸、例えば（２Ｒ）−２−メチルヘプタ−６−エン酸（Ｒ５Ｍｅ）がＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体内に組込まれうる。
【００２４】
該ペプチドの疎水性特性を増強する他の突然変異には、フェニル部分とα炭素との間にアルケニルリンカーを有する、フェニルアラニンの優れた類似体であるスチリル−アラニン（ＳｔｙｒＡ）、およびフッ素化アミノ酸、例えばヘキサフルオロイシンが含まれる。
【００２５】
Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓ内に単一または複数の炭化水素置換アミノ酸を導入する目的は２つある。第１に、長いアルケニル鎖を付与することにより、そのようなアミノ酸は該ペプチドの疎水性特性を増強する。第２に、ある場合には、該ペプチド配列のｉ、ｉ＋４位またはｉ、ｉ＋７位における２つの炭化水素置換アミノ酸の閉環メタセシスによりヘリックスコンホメーションを安定化すると同時に、活性を維持することが可能である。炭化水素置換アミノ酸のルテニウム触媒閉環メタセシス（ＲＣＭ）によるペプチドの共有的ヘリックス安定化が報告されている（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｈ．Ｅ．およびＧｒｕｂｂｓ，Ｒ．Ｈ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７（１９９８）３２８１−３２８４）。ヘリックス架橋をもたらす、全炭化水素置換置換アミノ酸に基づく架橋も報告されている（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｃ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２（２０００）５８９１；Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｌ．Ｄ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５（２００４）１４６６；Ｂｅｒｎａｌ，Ｆ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９（２００７）２４５６）。
【００２６】
極性である（例えば、ラクタム架橋）または薬理学的に不安定である（例えば、ジスルフィド）、ペプチドに関して記載されているその他の架橋とは異なり、ペプチドα−ヘリックス構造を安定化するための化学的に強固な全炭化水素置換架橋の利点はその疎水性にある。したがって、それは、脂質膜への結合のための高度な疎水性およびαヘリックス構造の両方を維持することが重要な本発明に特に適している。
【００２７】
炭化水素置換アミノ酸は、Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓの単一の位置または複数の位置、より詳しくは２つの位置に導入されうる。２つの位置を突然変異させた場合、該炭化水素置換アミノ酸は両方の位置において同一である、あるいは各位置において異なるものであることが可能であった。いくつかの典型的なペプチドを以下に説明する。
【００２８】
炭化水素置換アミノ酸Ｒ５ＨをＡｐｏ  ＡＩｃｏｎｓの２つの異なる位置（Ｋ９およびＥ１３）に導入し、炭化水素置換架橋の形成を伴うそれらの２つのＲ５Ｈ基のメタセシスの後、このペプチドのもう１つの形態を設計した。どちらのペプチドもＡＢＣＡ１依存性メカニズムによるコレステロール排出を促進し、リポソーム可溶化アッセイにおいて活性である。第１のペプチドはコレステロール排出アッセイにおいてＥＣ５０＝４６μＭを、そしてリポソーム可溶化アッセイにおいてＩＣ５０＝９１μＭを示した。９および１３位（ｉ、ｉ＋４）における側鎖を連結する炭化水素置換架橋を伴う第２のペプチドはより強力であり、コレステロール排除アッセイにおいてＥＣ５０＝１０μＭを、そしてリポソーム可溶化アッセイにおいてＩＣ５０＝６０μＭを示した。この場合、該炭化水素置換架橋の形成は活性の増加を招いた。
【００２９】
興味深いことに、同じ位置（Ｋ９およびＥ１３）をＳ５Ｈ［すなわち、Ｒ５Ｈと同じ側鎖長を有するがＲ（Ｄ）ではなくその逆のＳ（Ｌ）の立体科学を有する炭化水素置換アミノ酸（図２）］へと突然変異させた場合には、得られたペプチド（９／１３  Ｓ５Ｈ側鎖のメタセシス後、１つは開形態、そして１つは閉形態）は、良好な脂質結合にもかかわらず、コレステロール排除アッセイにおいて非常に低い活性を示した、あるいは活性を全く示さなかった。
【００３０】
これらのデータは、Ｃ５炭化水素置換アミノ酸でのＫ９およびＥ１３位における突然変異の場合、該ペプチドの開形態および閉形態のどちらに関してもＬ−立体配置（Ｓ５Ｈ）よりもＤ立体配置（Ｒ５Ｈ）のほうが好ましいことを示している。
【００３１】
同じ位置（Ｋ９およびＥ１３）をＲ５ｍｅ［すなわち、Ｒ５Ｈと同じ側鎖長および同じＤ立体配置を有するα，α−ジ−置換アミノ酸（図２）］へと突然変異させた場合、予想されることは、αヘリックス構造の安定化および疎水性の増加が、より高い効力に変換されうることである。これは実現しなかった。なぜなら、９／１３  Ｒ５ｍｅ側鎖のメタセシスの後の開形態および閉形態はどちらも、良好な脂質結合にもかかわらずコレステロール排出アッセイにおいて非常に低い活性を示した、あるいは活性を全く示さなかったからである。
【００３２】
Ｅ１３をＳ７Ｈ（図２）へと突然変異させたもう１つのペプチドを、Ｅ１３をＲ７Ｈ（図２）へと突然変異させたペプチドと比較した。どちらのペプチドもＡＢＣＡ１依存性メカニズムによるコレステロール排出を促進し、リポソーム可溶化アッセイにおいて活性を示した。Ｅ１３にＳ７Ｈアミノ酸を有するペプチドはコレステロール排出アッセイにおいてＥＣ５０＝２．８μＭを、そしてリポソーム可溶化アッセイにおいてＩＣ５０＝１１μＭを示し、一方、Ｅ１３にＲ７Ｈアミノ酸を有するペプチドはコレステロール排出アッセイにおいてＥＣ５０＝７．２μＭを、そしてリポソーム可溶化アッセイにおいてＩＣ５０＝５００μＭを示した。
【００３３】
Ｅ１３をＳ６Ｈへと突然変異させたもう１つのペプチドを、Ｅ１３をＲ６Ｈへと突然変異させたペプチドと比較した。どちらのペプチドもＡＢＣＡ１依存性メカニズムによるコレステロール排出を促進し、リポソーム可溶化アッセイにおいて活性を示した。Ｅ１３にＳ６Ｈアミノ酸を有するペプチドはコレステロール排出アッセイにおいてＥＣ５０＝１．４μＭを、そしてリポソーム可溶化アッセイにおいてＩＣ５０＝５００μＭを示し、一方、Ｅ１３にＲ６Ｈアミノ酸を有するペプチドはコレステロール排出アッセイにおいてＥＣ５０＝１８μＭを、そしてリポソーム可溶化アッセイにおいてＩＣ５０＝３２μＭを示した。
【００３４】
Ｆ６およびＥ１３（ｉ、ｉ＋７位）をそれぞれＲ６ＨおよびＳ７Ｈへと突然変異させたペプチドを、炭化水素置換架橋の形成を伴うＲ６ＨおよびＳ７Ｈ側鎖のメタセシス後の同じペプチドと比較した。どちらのペプチドもＡＢＣＡ１依存性メカニズムによるコレステロール排出を促進し、リポソーム可溶化アッセイにおいて活性を示した。Ｆ６にＲ６Ｈアミノ酸を及びＥ１３にＳ７Ｈアミノ酸を有するペプチドはコレステロール排除アッセイにおいてＥＣ５０＝０．４μＭを、そしてリポソーム可溶化アッセイにおいてＩＣ５０＝２５μＭを示した。６位および１３位（ｉ、ｉ＋７）における側鎖を連結する炭化水素置換架橋を含有する対応ペプチドはコレステロール排出（ＡＢＣＡ１依存性）においてＥＣ５０＝２．０μＭを、そしてリポソーム可溶化アッセイにおいてＩＣ５０＝４３μＭを示した。Ｒ５Ｈ（ｉ、ｉ＋４）ペプチドで観察された結果とは異なり、この場合には、炭化水素置換架橋の形成は活性の減少を招く。
【００３５】
炭化水素置換アミノ酸Ｒ６ＨおよびＳ７Ｈの位置の逆転、すなわち、Ｓ７ＨがＦ６位に存在しＲ６ＨがＥ１３に存在するペプチドの産生は、２〜３倍低い活性を有するペプチドを与え、このペプチドはＡＢＣＡ１依存性メカニズムによるコレステロール排出アッセイにおいてはＥＣ５０＝１．２μＭを、そしてリポソーム可溶化アッセイにおいてはＩＣ５０＝４４μＭを示す。
【００３６】
したがって、突然変異体炭化水素置換アミノ酸の特定の位置、特定の化学的性質および特定のキラリティーを最適化することにより（これらはすべて、同時に最適化される必要がある）、所望の特性を有するＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体、すなわち、低いマイクロモル範囲のＥＣ５０で細胞からの専らＡＢＣＡ１依存性メカニズムによりコレステロール排除を促進しうる、またはマイクロモル範囲のＥＣ５０で脂質可溶化を促進しうるＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体を得ることが可能である。さらに、炭化水素置換アミノ酸側鎖のＲＣＭにより得られる全炭化水素置換架橋の該分子内の存在が有益なこともあれば、有益でないこともある。したがって、該架橋の形成も、場合に応じて最適化される必要がある。
【００３７】
該置換に最適に適合する非天然アミノ酸の長さ及び立体科学を更に検討するために、該αヘリックスの疎水性面の周囲の構造−活性関係（ＳＡＲ）を単点突然変異により調べた。種々の長さ（Ｃ５〜Ｃ１２）および異なる立体化学（ＬまたはＤ）の炭化水素置換側鎖アミノ酸を、図３に矢印で示されている位置（これらはＡｐｏ  ＡＩｃｏｎｓ配列の２、３、６、９、１０、１３、１４、１７、２０および２１位である）に導入した。
【００３８】
Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓ配列の２、３、６、９、１０、１３、１４、１７、２０および２１位にＲ６Ｈが導入される単点突然変異により一連の類似体を合成した。該類似体をインビトロ逆コレステロール輸送アッセイにおいて試験した。１３位の突然変異体のみがＥＣ５０＝１８μＭのマイクロモル範囲の活性を示した。
【００３９】
Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓ配列の２、６、９、１０、１３、１４、１７、２０、２１位における、より優れたＲ６Ｈ類似体であるＲ７Ｈでの単点突然変異により、一連の類似体を合成した。この場合、３つの突然変異体がインビトロＲＣＴアッセイにおいて活性を示した。２位にＲ７Ｈを有する突然変異体および２０位にＲ７Ｈを有する突然変異体の２つの突然変異体は僅かに活性であるに過ぎなかったが、１３位にＲ７Ｈを有する突然変異体はマイクロモル範囲の良好な効力（ＥＣ５０＝７．２μＭ）を示した。この突然変異体はＲ６Ｈより１桁強力であった。
【００４０】
要約すると、一連のＤ立体配置の炭化水素置換アミノ酸（Ｒ６Ｈ、Ｒ７Ｈ）を単点突然変異体として導入した場合、ＲＣＴインビトロの活性に影響を及ぼす３つの鍵位置、すなわち、１３、２および２０位が特定された。興味深いことに、これらの３つの位置は該αヘリックスの同一面上に存在し、疎水性残基と正荷電残基との間の界面に隣接するヘリックス軸に沿った小さな回廊を占拠する（図３）。
【００４１】
また、６位および１３位へのＲ５Ｈの導入により、２つの単点突然変異体を得た。該ペプチドをインビトロＲＣＴアッセイにおいて試験したところ、該ペプチドは活性を全く示さないか又は僅かな活性しか示さず（１００μＭにおいてＥＣ５０＝６．２％）、このことは、インビトロＲＣＴにおける活性のためには、５より長い炭素鎖を有するアミノ酸が必要であることを示唆している。
【００４２】
また、６炭素鎖のＳ６Ｈから１２炭素鎖のＳ１２Ｈ３までのＬ−立体配置の炭化水素置換側鎖を使用して、ＳＡＲを調べた。Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓ配列の２、３、６、９、１０、１３、１４、１７、２０および２１位におけるＳ６Ｈ（図２）での単点突然変異により、一連の類似体を合成した。該ペプチドをインビトロＲＣＴアッセイにおいて試験した。２位における単点突然変異体および２０位における単点突然変異体は僅かに活性であるに過ぎなかった。１３位におけるＳ６Ｈでの突然変異体は、そのＲ６Ｈ類似体より優れたマイクロモル範囲の効力（ＥＣ５０＝１．４μＭ）を示した。この知見は、１３位における置換がＡｐｏ  ＡＩｃｏｎｓからの活性の付与に非常に重要であること、および該Ｌ−立体配置が好ましいことを示している。
【００４３】
Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓの６、９、１０、１３、１４、１７位における、より優れたＳ６ＨホモログであるＳ７Ｈ（図２）での単点突然変異により、別の一連の類似体を合成した。該ペプチドをインビトロＲＣＴアッセイにおいて試験した。６位にＳ７Ｈを含有する突然変異体は１００μＭにおいてＥＣ５０＝４．０％を示し、一方、１３位にＳ７Ｈを含有する突然変異体はより強力であり、ＥＣ５０＝２．０μＭを示した。これらのデータは更に、７炭素鎖であるＳ７Ｈのような長いアルケニル鎖の、１３位への導入が、インビトロＲＣＴアッセイにおいて、活性の増加における大きな影響を及ぼすという知見を証明している。
【００４４】
ついで１３位における更なる突然変異を調べた。より優れたＳ７ＨホモログであるＳ８ＨをＡｐｏ  ＡＩｃｏｎｓの１３位に含有するペプチドを合成した。該ペプチドはＲＣＴインビトロアッセイにおいてＥＣ５０＝０．６μＭを示し、このことは、７炭素から８炭素へのアルケニル鎖の伸長が活性の増加をもたらすという見解を支持している。
【００４５】
要約すると、一連のＬ−立体配置の炭化水素置換アミノ酸（Ｓ６Ｈ、Ｓ７Ｈ、Ｓ８Ｈ）を単点突然変異体としてＡｐｏ  ＡＩｃｏｎｓ上に導入した場合、４つの鍵位置、すなわち、１３、６、２および２０位がＲＣＴインビトロアッセイにおける活性に影響を及ぼすことが特定された。興味深いことに、これらの４つの位置は、Ｄ−立体配置の炭化水素置換アミノ酸で行ったＳＡＲ研究で判明したとおり、α−ヘリックスの同一表面上に存在し、疎水性残基と正荷電残基との間の界面に隣接するヘリックス軸に沿った小さい回廊を占拠している（図３）。
【００４６】
炭化水素置換非天然アミノ酸の導入に加え、ＬおよびＤの両方の立体配置のアルキル側鎖アミノ酸をも使用して、Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓのα−ヘリックスの疎水性面の周囲のＳＡＲを調べた。Ｓ７Ｈ３、Ｓ８Ｈ３、Ｓ１２Ｈ３またはＲ１２Ｈ３（図２）をＡｐｏ  ＡＩｃｏｎｓ配列の６位または１３位のいずれかに導入した場合に、単点突然変異体を得た。Ｓ７Ｈ３およびＳ８Ｈ３を１３位に導入した場合に得られた突然変異体は、それぞれＥＣ５０＝０．６μＭおよびＥＣ５０＝０．３μＭの、ＲＣＴインビトロアッセイにおける非常に良好な効力を示した。該データにより示されているとおり、これらの２つの飽和類似体は、対応する不飽和ペプチドより幾分活性であった。より長いアルキル側鎖である（ＲＳ）１２Ｈ３を６位または１３位に導入した場合、対応する単点突然変異体はＥＣ５０＝０．１〜０．４μＭまたはＥＣ５０＝０．２〜０．４μＭを示した。
【００４７】
したがって、１３位の場合には、８炭素鎖から１２炭素鎖への伸長は大きな活性増加をもたらさず、一方、６位の場合には、７炭素アルケニル鎖（Ｓ７Ｈ３）から１２炭素アルキル鎖（ＲＳ１２Ｈ３）へと、相当な活性増加が達成されることが明らかである。
【００４８】
フェニル部分とα炭素との間にアルケニルリンカーを有する、より優れたフェニルアラニン類似体であるスチリル−アラニン（ＳｔｙｒＡ）で、ＳＡＲを更に調べた。スチリル−アラニンは更に、該ペプチドの疎水性特性を増強する。（Ｄ）−ＳｔｙｒＡおよび（Ｌ）−ＳｔｙｒＡを１３位に導入して得られた単一突然変異体は、ＲＣＴインビトロアッセイにおいて、それぞれ、ＥＣ５０＝２２μＭおよびＥＣ５０＝１μＭを示した。このことは、１３位への疎水性／芳香族アミノ酸の導入がインビトロＲＣＴアッセイにおける活性増加に非常に有益であること、およびＬ−立体配置が好ましいことを示唆した。（Ｄ）−ＳｔｙｒＡおよび（Ｌ）−ＳｔｙｒＡを６位に導入して得られた単一突然変異体はＲＣＴインビトロアッセイにおいて不活性であった。
【００４９】
Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓ配列のα−ヘリックスコンホメーションを安定化させつつ疎水性特性を増強するために導入した疎水性アミノ酸であるＬ−ヘキサフルオロ−ロイシン（ｈＦ−Ｌ−Ｌｅｕ）（図２）はマイクロモル範囲の効力を示した。ｈＦ−Ｌ−Ｌｅｕを１３位に導入して得られた単点突然変異体はＲＣＴインビトロアッセイにおいてＥＣ５０＝１．１μＭを示した。この知見は、該インビトロアッセイにおけるＲＣＴを増強するためには１３位の該疎水性アミノ酸が有益であることを証明している。
【００５０】
種々の長さ（Ｃ５〜Ｃ１２）のＤ−立体配置およびＬ−立体配置の両方の炭化水素置換アミノ酸を含有する単点突然変異体で行ったＳＡＲ分析を要約すると、３つの主要知見は以下のとおりである：２、６、１３および２０位における置換は不活性Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓ配列からの効力の獲得をもたらした；１３位はそれらの４つのうちで最も重要なものとして特定された；およびＬ−立体配置が好ましかった。
【００５１】
これらの知見に基づいて、突然変異の組合せを用いてＳＡＲを調べること、および同じペプチド配列内に二重または多重突然変異を導入することに決定した。Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓの２つの位置または複数（５つまで）の位置に炭化水素置換側鎖アミノ酸を導入した。２以上の位置を同時に突然変異させた場合、該炭化水素置換側鎖アミノ酸は、すべての位置において同じである、または各位置において異なることが可能であった。
【００５２】
Ｓ７Ｈを２位および１３位に有する二重突然変異体（ＥＣ５０＝０．３μＭ）ならびにＳ７Ｈを６位および１３位に有する二重突然変異体（ＥＣ５０＝０．３μＭ）ならびにＳ７Ｈを１３位および２０位に有する二重突然変異体（ＥＣ５０＝０．６μＭ）または６位の（Ｌ）−ＳｔｙｒＡと１３位のＳ７Ｈとの組合せとしての二重突然変異体（ＥＣ５０＝０．２μＭ）を設計し、それにより、鍵位置における２つの突然変異の組合せがＲＣＴインビトロアッセイにおける効力に対して相加効果をもたらすことが示された。
【００５３】
さらに、２つの他の突然変異体、すなわち、Ｓ７Ｈを１３位に含有する突然変異体、および側鎖に追加的カルボン酸を有するアミノ酸であるγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）を８位または１５位のいずれかに有する突然変異体を設計した。該ペプチド内の局所負電荷密度を増加させるために、Ｇｌａを導入した。２つの二重突然変異体Ｇｌａ８／Ｓ７Ｈ１３およびＳ７Ｈ１３／Ｇｌａ１５は、ＲＣＴインビトロアッセイにおいて、それぞれ、ＥＣ５０＝０．９μＭおよび０．７μＭを示した。該活性はＧｌａおよびＳ７Ｈ残基の両方に左右される。なぜなら、対応するＧｌａ８＆１５／Ｓ７Ｈ１３突然変異体（ＥＣ５０＝１．６μＭ）はそれほど強力ではなく、このことは、２つの突然変異の適切な組合せが効力に対して相加効果をもたらしたことを証明しているからである。
【００５４】
Ｓ８Ｈを６位および１３位に導入した場合（ＥＣ５０＝０．４μＭ）、該ペプチドは、単一突然変異体で観察された場合（ＥＣ５０＝０．６μＭ）より優れた効力を示した。この効力は、Ｓ７Ｈを含有する二重突然変異体の場合（ＥＣ５０＝０．３μＭ）に類似しており、このことは、炭素鎖アミノ酸の伸長（＞Ｓ７Ｈ）が二重突然変異体（６位および１３位）にとってＲＣＴインビトロ活性に、もはや有益ではないことを証明している。
【００５５】
また、アルキル側鎖アミノ酸の導入により、二重突然変異体も設計した。Ｓ７Ｈ３を６位および１３位に導入した場合、該ペプチドは対応単一突然変異体より有効であり、ＥＣ５０＝０．３μＭを有していた。Ｓ８Ｈ３を含有する二重突然変異体はＥＣ５０＝０．６μＭを示し、このことは、より長い炭素鎖アミノ酸（Ｃ８）を有する二重突然変異体ペプチドが、Ｃ７アミノ酸を有する二重突然変異体と比べてＲＣＴアッセイにおける活性の増強を示さないことを証明している。
【００５６】
前記と同じペプチド配列内に複数の突然変異を導入して該ＳＡＲを更に分析したところ、効力の更なる改善は得られなかった（７．７μＭ〜０．１μＭのＥＣ５０）。
【００５７】
アミノ酸置換を行うことに加えて、所望の特性（すなわち、ＡＢＣＡ１輸送体によるコレステロール排出）を有するペプチドを得るために他の方法を用いた。例えば、スペーサーを含有しない二量体ペプチド（ＥＣ５０＝４１μＭ）、または１以上のアミノ酸置換を伴うジスルフィド架橋形成による二量体ペプチド（ＥＣ５０＝１．５μＭ）を形成させるための配列の伸長を行った。
【００５８】
さらに他のアプローチには、例えば、ＲＣＴインビトロアッセイにおける活性の減少をを伴うことなくペプチドの化学合成または安定性を改善するための、７位におけるＬｙｓ残基でのＡｒｇの置換、またはそれぞれＧｌｕおよびＧｌｎでのＡｓｐおよびＡｓｎ残基の置換が含まれた。
【００５９】
さらに、ペプチドの薬物動態学的特性、例えば半減期、クリアランス、曝露、排泄プロファイルを改善するための他の試みには、以下のものが含まれる：
（ｉ）ＰＥＧ部分を含有するペプチドの設計、
（ｉｉ）コレステロールを含有するペプチドの設計、
（ｉｉｉ）該配列における同じＤ−アミノ酸でのＬ−アミノ酸の置換、および
（ｉｖ）リン脂質での製剤化。
【００６０】
表１および２におけるペプチド（それらのうちの幾つかはＡＢＣＡ１依存性コレステロール排出に関して僅か〜０．１μＭのＥＣ５０を示している）は、従来技術からは導き出し得ない設計による新規ＡｐｏＡ−１模倣体を代表するものである。
【００６１】
【表１】
2010530433.tif 000002
2010530433.tif 000003
2010530433.tif 000004
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【００６２】
【表２】
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2010530433.tif 000008
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【００６３】
本発明のＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体は、高コレステロール血症および心血管疾患に関連した障害の治療に対するものとして提示される。特に、これらのペプチドは、ＡｐｏＡ−１の活性、より詳しくは、ＡＢＣＡ−１依存性経路によるその脂質結合およびコレステロール排出能を模倣したものであり、したがって、アテローム性動脈硬化性病変の急性および慢性治療に適しているはずである。
【００６４】
本発明のＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体は、当技術分野で公知のいずれかの技術を用いて合成または製造されうる。該ペプチドは、当技術分野で一般に用いられている方法により、Ｎ末端アセチルおよび／またはＣ末端カルボキシアミドキャッピング基のようなキャップ化末端を有する形態で製造されうる。該ペプチドは医薬上許容される塩として製造されることが可能であり、本明細書においては酢酸塩が例示されている。該ＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体は任意の簡便な量での凍結乾燥による安定化形態で保存されうる。該ＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体は、患者への投与の前に無菌水または適当な無菌緩衝溶液で再水和させることにより還元（再構成）されうる。該ＡｐｏＡ−１模倣体は、医薬上適当な賦形剤を使用して製剤化されうる。
【００６５】
ある実施形態においては、ＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体をペプチド−脂質複合体として製剤化し投与することが好ましいかもしれない。脂質を使用する、本発明のＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体の製剤化は、例えば、該模倣体を脂質と共に同時凍結乾燥して、無菌ペプチド模倣体／脂質複合体に還元（再構成）されうる混合物を形成させることにより行われうる。典型的な技術は当業者によく知られている。任意の適当な脂質が使用されうるが、好ましい実施形態は１−パルミトイル−２−リノレオイルホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）である。
【００６６】
脂質でのペプチド模倣体の製剤化は幾つかの利点を有する。なぜなら、ＨＤＬクラスのタンパク質（特にプレ−ベータＨＤＬ集団）に類似したサイズおよび密度を該複合体が有する場合に特に、該複合体は、増加した循環半減期を有するからである。ＨＤＬクラスのリポタンパク質は、サイズ、密度および電気泳動移動度のような特性に基づいて幾つかのサブクラスに分けられうる。幾つかの具体例としては、サイズが増加する順に列挙すると、直径５０〜６０オングストロームのミセルプレ−ベータＨＤＬ、中間的サイズ、すなわち、６５ｋＤａの質量（約７０オングストローム）を有する円盤状ＨＤＬ、直径９０〜１２０オングストロームの球状ＨＤＬ３またはＨＤＬ２が挙げられる（Ｊ．Ｋａｎｅ，１９９６，Ｖ．Ｆｕｓｔｅｒ，Ｒ．ＲｏｓｓおよびＥ．Ｔｏｐｏｌ［編］Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ｐ．９９；Ａ．ＴａｌｌおよびＪ．Ｂｒｅｓｌｏｗ，同誌，ｐ．１０６；Ｂａｒｒａｎｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａｌ３００，ｐ．７３−８５；ならびにＦｉｅｌｄｉｎｇら，１９９５，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ３６，ｐ．２１１−２２８）。しかし、ＨＤＬより小さい又は大きいサイズのペプチド模倣体−脂質複合体も本発明のペプチド模倣体により形成されうる。
【００６７】
該ペプチド模倣体−脂質複合体は、後記の同時凍結乾燥により、長い貯蔵寿命を有する安定な製剤として簡便に製造されうる。該凍結乾燥ペプチド模倣体−脂質複合体は、医薬再製剤化のためのバルク薬物質を製造するために、あるいは患者に投与する前に無菌水または適当な緩衝溶液で再水和させることにより還元（再構成）されうる個々のアリコートまたは投与単位を製造するために使用されうる。
【００６８】
ＨＤＬに類似した特性を有するペプチド−（リン）脂質複合体を製造するための簡便な方法は、各成分を同時安定化する溶媒系中で該ペプチド模倣体と脂質とを一緒にすることを含む。該溶媒ペアは、該ペプチド模倣体と該脂質との両方の同時溶解性が保証されるよう注意深く選択されなければならない。１つの典型的な方法においては、該粒子内に取り込ませるペプチド模倣体を水性もしくは有機溶媒または溶媒の混合物（溶媒１）に溶解させることが可能である。該（リン）脂質成分を、溶媒１と混和性である水性もしくは有機溶媒または溶媒の混合物（溶媒２）に溶解させ、それらの２つの溶液を一緒にする。あるいは、もう１つの典型的な方法においては、該（リン）脂質成分を該ペプチド模倣体溶液に直接的に溶解させる。あるいは、該ペプチド模倣体および脂質を共溶媒系（すなわち、該混和性溶媒の混合物）内に取り込ませることが可能である。該ペプチド模倣体の脂質結合特性に応じて、増強された又は更には完全な可溶化（および／または増強された混合）が凍結乾燥前に必要となる可能性があり、それに応じて溶媒が選択されうる、と当業者は認識するであろう。
【００６９】
この方法においては、得られる複合体が適当な物理的および化学的特性を有するよう、まず、脂質に対するペプチド模倣体の適当な比率を実験的に決定する。適当な特性には、通常（しかし、常にそうであるわけではない）、サイズにおけるＨＤＬ２またはＨＤＬ３に対する類似性が含まれうる。脂質とペプチド模倣体とのモル比は、複合体の所望のタイプに応じて、約２〜約２００、好ましくは５〜５０の範囲となるべきである。そのようなサイズのクラスのペプチド模倣体−脂質複合体の具体例には、ミセルまたは円盤状粒子（通常はＨＤＬ３またはＨＤＬ２より小さい）、ＨＤＬ２またはＨＤＬ３に類似したサイズの球状粒子、およびＨＤＬ２より大きい、より大きな複合体が含まれるが、これらに限定されるものではない［命名規則に関しては、Ｂａｋｏｇｉａｎｎｉら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．２００１  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；１５（５）：２６５−９を参照されたい］。
【００７０】
脂質とペプチド模倣体との複合体のサイズを評価するために、ゲル濾過クロマトグラフィーが用いられうる。例えば、以下のカラムが使用可能であろう：Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ  Ｓ  ２０００  ＨＰＬＣ。溶離液は、適切には、適当なバッファー中に１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する。典型的なサンプル体積は、０．５ｍＭ  ｍｇペプチド模倣体を含有する複合体１０〜２００マイクロリットルである。カラム流量は、適切には、０．３ｍｌ／分でありうる。既知分子量およびストークス径の一連のタンパク質およびヒトＨＤＬを、カラムの校正のための標準として使用する。該タンパク質およびリポタンパク質複合体を波長２２０または２８０ｎｍの光の散乱または吸光度によりモニターする。クロマトグラフィー中の標準として使用されうるＨＤＬの一例として、成熟ＨＤＬ２粒子が挙げられる。プレ−β１  ＨＤＬはアポリポタンパク質および少数の分子のリン脂質のミセル複合体である。プレ−β２  ＨＤＬはアポリポタンパク質およびリン脂質の分子の円盤状複合体である。取り込まれる脂質（トリグリセリド、コレステロール、リン脂質）が多くなればなるほど、ＨＤＬは大きくなり、その形状が修飾される（プレ−β  ＨＤＬ（ミセル複合体）→プレ−β２  ＨＤＬ（円盤状複合体）→ＨＤＬ３（球状複合体）→ＨＤＬ２（球状複合体））。
【００７１】
溶媒を選択し、該ペプチド模倣体および脂質が取り込まれたら、生じた混合物を凍結乾燥する。所望により、凍結乾燥を促進するために、該混合物に追加的な溶媒を加えることが可能である。該凍結乾燥産物は長期間保存可能であり、安定なままである。
【００７２】
該ペプチド模倣体−脂質複合体の溶液または懸濁液を得るために、該凍結乾燥複合体を還元（再構成）することが可能である。この目的には、該凍結乾燥粉末を適当な体積（しばしば、静脈内注射に簡便な約５ｍｇペプチド／ｍｌ）まで水溶液で水和させる。典型的な実施形態においては、該凍結乾燥粉末をリン酸緩衝食塩水または生理食塩水で再水和させる。該混合物は、再水和を促すために攪拌を要するかもしれない。還元（再構成）は、典型的には、該複合体の脂質成分の相転移温度（Ｔｍ）と同じ又はそれより高い温度で行われる。数分以内に、還元された脂質−ペプチド模倣体複合体の溶液が生じる。該複合体が小さい場合、該溶液は透明でありうる。
【００７３】
使用されうる溶媒には、無極性、極性、非プロトン性およびプロトン性有機溶媒など、例えばエタノール、メタノール、シクロヘキサン、１−ブタノール、イソプロピルアルコール、キシレン、ＴＨＦ、エーテル、塩化メチレン、ベンゼンおよびクロロホルムが含まれるが、これらに限定されるものではない。単一の溶媒だけでなく溶媒混合物も使用可能である。さらに、使用前に、該有機溶媒は、水を除去するために乾燥されうる。しかし、ある脂質またはペプチド模倣体では、水和溶媒または水が使用されうる。水が適当な溶媒でありうる。あるいは水和溶媒または有機溶媒／水混合物が使用されうる。しかし、水を使用する場合には、それは界面活性剤を含有しないものでなければならない。該溶媒は、好ましくは、最も純粋な品質のものであり、該溶媒は塩を含有せず、粒子を含有しないものであるべきである。しかし、該溶媒は無菌である必要はない。なぜなら、得られる産物は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ａｎｄ  １８ｔｈ  Ｅｄｓ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０  ａｎｄ  １９９０）（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）およびＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ／ＮＦ）  ＸＶＩＩ（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているような薬学分野における公知技術により、凍結乾燥の前、途中または後に滅菌されうるからである。
【００７４】
使用されうる脂質には、天然の及び合成された（合成）脂質およびリン脂質、例えば、小さなアルキル鎖リン脂質、卵ホスファチジルコリン、ダイズホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン  ジオレオホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルグリセロール  ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン  スフィンゴ脂質、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール  ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジン酸  ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン、脳スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、ジラウリルホスファチジルコリン、（１，３）−Ｄ−マンノシル−（１，３）ジグリセリド、アミノフェニルグリコシド、３−コレステリル−６’−（グリコシルチオ）ヘキシルエテール糖脂質ならびにコレステロールおよびその誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
前記の医薬組成物の、それを要する患者への投与は、所望の効果（これは一般に、アテローム性動脈硬化症の１以上の症状の改善および／またはアテローム性動脈硬化症の１以上の症状の発生の可能性の有意な減少であると考えられる）をもたらすのに有効な投与量および期間にて、公知方法を用いて行われうる。本発明の医薬組成物の有効量は、患者に固有の要因、例えば、個体の年齢、性別および体重に応じて変動するであろう。本発明の医薬組成物は、治療剤を投与するための当技術分野で公知のいずれかの投与経路（例えば、経口投与、粘膜内投与、腹腔内注射、血管内注射、皮下注射、経皮投与または筋肉内投与）により投与されうる。本発明のペプチド模倣体が適切に保護される場合、それは、例えば不活性希釈剤または同化可能な可食性担体と共に経口投与されうる。また、該ペプチドおよび他の成分は硬または軟殻ゼラチンカプセル内に封入され、錠剤に圧縮され、あるいは個体の食事に直接添加されうる。経口治療用投与の場合、該活性化合物は賦形剤と共に含まれることが可能であり、経口摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、溶液剤（水剤）、ゲル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエファーなどの形態で使用されうる。そのような組成物および製剤は少なくとも１重量％の活性化合物を含有するべきである。該組成物および製剤の百分率は勿論、様々なものとなることが可能であり、簡便には、該単位の重量の約５〜８０％でありうる。そのような治療的に有用な組成物における活性化合物の量は、適当な投与量が得られる量である。また、該活性化合物は徐放製剤またはコントロールリリース製剤中に含有されうる。
【００７６】
ペプチド模倣体の濃度は、約０．１または１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、時にはそれより高い投与量を与えるよう選択されうるが、典型的にはそのように選択されるであろう。そのような投与量は、個々の対象または対象の群における治療計画を最適化するために様々に変更されうると理解されるであろう。
【００７７】
【表３】
2010530433.tif 000010
2010530433.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】Ａｐｏ  Ａ−Ｉコンセンサス配列（Ａｐｏ  ＡＩｃｏｎｓ）の構造およびヘリックス円形を表示する。
【図２】非天然アミノ酸の代表的側鎖を示す。
【図３】構造−活性関係（ＳＡＲ）法のヘリックス円形を表示する。
【図４】磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）により測定した、ＡｐｏＥ欠損マウスにおけるアテローム体積に対する代表的ペプチドの効果を示す。
【実施例】
【００７９】
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例を含む本明細書に記載の追加的説明から明らかである。記載されている実施例は、本発明の実施において有用な種々の成分および方法を例示している。該実施例は、特許請求されている本発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を特定し使用することが可能である。
【００８０】
（実施例１）
ＡｐｏＡ−１模倣体ペプチドを設計するための炭化水素置換基の合成
Ｆｍｏｃ−Ｒ５Ｈ−ＯＨ：（２Ｒ）−２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘプタ−６−エン酸の合成
工程１：５−ヨードペンタ−１−エン
アセトン中の５−ブロモ−１−ペンテン（１当量）およびＮａＩ（３当量）の混合物を６０℃で２時間加熱した。該混合物を室温に冷却し、水で希釈し、ペンタンで抽出した。ペンタン層を合わせ、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、５−ヨード−１−ペンテン（９６％）を得た：１Ｈ  ＮＭＲ  ５．７５（ｄｄｔ，１，Ｊ）１７．２，１０．４，６．８），５．０８（ｄｄ，１，Ｊ）１７．２，１．６），５．０２（ｄｄ，１，Ｊ）１０．４，１．６），３．１９（ｔ，２，Ｊ）７．０），２．１７（ｄｔ，２，Ｊ）６．８，７．０），１．９１（ｔｔ，２，Ｊ）７．０，７．０）。
【００８１】
工程２：（２Ｓ，５Ｒ）−２−イソプロピル−３，６−ジメトキシ−５−ペンタ−４−エン−１−イル−２，５−ジヒドロピラジン
ブチルリチウムの溶液（ヘキサン中の１．６Ｎ溶液、１．０当量）を、−７０℃で、乾燥テトラヒドロフラン中の（２Ｓ）−２−イソプロピル−３，６−ジメトキシ−２，５−ジヒドロピラジン（１．０当量）の攪拌溶液にシリンジにより加え、攪拌を１５分間継続した。ついで、乾燥テトラヒドロフラン中の５−ヨードペンタ−１−エン（１．０当量）の予め冷却された溶液を加え、−７０℃で２〜４時間、攪拌を継続した。ついで該反応混合物を一晩室温で加温した。該反応を飽和水性塩化アンモニウムの添加によりクエンチし、該混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で蒸発させた。該最終粗混合物を、石油エーテル中の１０％  ＥｔＯＡｃで溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００８２】
工程３：メチル（２Ｒ）−２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘプタ−６−エノアート
ＵＰＬＣ／ＭＳにより加水分解の完了が確認されるまで、水性希塩酸（１Ｎ，６．０当量）とＴＨＦ（０．２５Ｍ）との混合物中の（２Ｓ，５Ｒ）−２−イソプロピル−３，６−ジメトキシ−５−ペンタ−４−エン−１−イル−２，５−ジヒドロピラジンの溶液を室温で攪拌した。該反応を２Ｎ  ＮａＯＨの添加により中性状態にまでクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で蒸発させて、（２Ｒ）−２−アミノヘプタ−６−エノアートとメチルＬ−バリナートとの混合物を得た。残渣を、更に精製することなく次工程において直接使用した。Ｆｍｏｃ−Ｒ５Ｈ−Ｏｍｅ（メチル（２Ｒ）−２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘプタ−６−エノアート）を得るために、該基質をＤＣＭ中の１．２当量のＦｍｏｃ−Ｏｓｕで室温で一晩処理した。該混合物を水で洗浄し該産物をＤＣＭ中で抽出することにより、該反応をクエンチした。有機物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で蒸発させた。得られた粗混合物（Ｆｍｏｃ−Ｒ６Ｈ−ＯｍｅおよびＦｍｏｃ−Ｓ−Ｖａｌ−Ｏｍｅ）を、１％〜３０％  ＭｅＯＨで溶出するシリカ上のカラムに付し、これは一定の度合で該産物を精製した（約３：１，産物：バリン−Ｏｍｅ）。
【００８３】
工程４：（２Ｒ）−２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘプタ−６−エン酸（Ｆｍｏｃ−Ｒ５Ｈ−ＯＨ）
該メチル（２Ｒ）−２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘプタ−６−エノアート混合物をＨ２Ｏ／ジオキサン（１：１）に０．３Ｍの最終濃度で溶解し、最終混合物を一晩還流した。最終的な（２Ｒ）−２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘプタ−６−エン酸をＥｔＯＡｃ中に抽出し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。最終粗製物を、Ｈ２Ｏ中の５％〜８０％  ＣＨ３ＣＮで溶出する、ＫＰ−Ｃ１８−ＨＳ  ６５Ｓｉ（３７−７０ｍｍ  ３００オングストローム）上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の最終的なＦｍｏｃ−Ｒ５Ｈ−ＯＨを得た。
【００８４】
（実施例２）
ＡｐｏＡ−１模倣体ペプチドの合成
本発明のＡｐｏＡ−１模倣体ペプチド（表１を参照されたい）を、ペプチド合成装置ＳＹＭＰＨＯＮＹ（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＴＥＣＮＯＬＯＧＩＥＳ，ＩＮＣ）上のＦｍｏｃ／ｔＢｕ化学法を用いる固相により合成した。各ペプチドに関して、Ｆｍｏｃ−リンカーＡＭ−ＰＳに基づく樹脂、１％  架橋体（ＢＩＯＳＥＡＲＣＨ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，Ｉｎｃ．）およびＰＥＧ−ＰＳに基づく樹脂［修飾Ｒｉｎｋリンカーｐ−［（Ｒ，Ｓ）−α−［９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸（Ｒｉｎｋ，Ｈ．，１９８７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２８：３７８７−３７８９；Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ，Ｍ．Ｓ．ら，１９８９，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３０：４６４５−４６６７）で誘導体化されたもの］を使用した。該アシル化反応は全て、該合成装置上のペプチド構築の終了の後、樹脂非含有アミノ基に対して６倍過剰の活性化アミノ酸を使用して６０分間にわたって行った。側鎖保護基は以下のものであった：ＡｓｐおよびＧｌｕにはｔｅｒｔ−ブチル；Ｌｙｓにはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ＡｓｎおよびＧｌｎにはトリチル；Ａｒｇには２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル。ＤＭＦ中、カップリング試薬としてＨＢＴＵ／ＤＩＥＡを使用することにより、Ａｃ−プロリン−ＯＨとしてＮ末端のプロリンを導入した。活性化物質としてＨＢＴＵ／ＤＩＥＡを使用することにより、炭化水素置換非天然アミノ酸（Ｒ７Ｈ，Ｓ７Ｈ，Ｒ８Ｈ，Ｓ８Ｈ，Ｓ７Ｈ３，Ｒ７Ｈ３，Ｓ８Ｈ３，Ｒ８Ｈ３）を手動でカップリングさせ、必要に応じて、該カップリングを繰返した。該カップリングの後、該合成の残りを、前記のとおりに自動で行った。
【００８５】
あるいは、ペプチド合成装置ＡＢＩ４３３Ａ（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）上でＦｍｏｃ／ｔＢｕ化学法を用いる固相により、ＡｐｏＡ−１模倣体ペプチドを合成した。各ペプチドに関して、Ｆｍｏｃ−リンカーＡＭ−ＰＳに基づく樹脂、１％  架橋体（ＢＩＯＳＥＡＲＣＨ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，Ｉｎｃ．）を使用した。該アシル化反応は、樹脂非含有アミノ基に対して４倍過剰の活性化アミノ酸を使用して６０分間にわたって行った。ＤＭＦ中の等モル量のＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）および２倍モル過剰のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）を使用して、該アミノ酸を活性化させた。ＤＭＦ中、カップリング試薬としてＨＢＴＵ／ＤＩＥＡを使用することにより、Ａｃ−プロリン−ＯＨとしてＮ末端のプロリンを導入した。
【００８６】
該合成の終了時に、該乾燥ペプチド−樹脂を個々に切断混合物（８８％  ＴＦＡ、５％  フェノール、２％  トリイソプロピルシランおよび５％  水）（Ｓｏｌｅ，Ｎ．Ａ．およびＧ．Ｂａｒａｎｙ，１９９２，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：５３９９−５４０３）で室温で１．５時間処理した。オレフィン性側鎖アミノ酸を含有するペプチドの場合、該切断混合物は９５％  ＴＦＡおよび５％  水から構成されるものであった。各樹脂を濾過し、該ペプチドを沈殿させるために、該溶液を冷メチル−ｔ−ブチルエーテルに加えた。遠心分離後、ペプチドペレットを新鮮な冷メチル−ｔ−ブチルエーテルで洗浄して該有機スカベンジャーを除去した。この過程を２回繰返した。最終ペレットを乾燥させ、Ｈ２Ｏ、２０％  アセトニトリルに再懸濁させ、凍結乾燥した。
【００８７】
ＲＥＰＲＯＳＩＬ−ＰＵＲ  ３００  Ｃ４カラム（２５０×２０ｍｍ，１０μｍ）（ＤＲ．ＭＡＩＳＣＨ  ＧｍｂＨ）またはＲＣＭ  ＤＥＬＴＡ−ＰＡＫ  Ｃ４カートリッジ（４０×２００ｍｍ，１５μｍ）またはＲＣＭ  ＤＥＬＴＡ−ＰＡＫ  Ｃ１８カートリッジ（４０×２００ｍｍ，１５μｍ）またはＡＣＥ  Ｃ１８（２５０×２１ｍｍ，１０μｍ，３００オングストローム）（ＣＰＳ  Ａｎａｌｉｔｉｃａ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）を備えた分取ＷＡＴＥＲＳ  ＰＲＥＰ  ＬＣ  ４０００  ＳｙｓｔｅｍまたはＧＸ−２８１  Ｇｉｌｓｏｎ  Ｔｒｉｌｕｔｉｏｎ  ＬＣを使用し、溶離液（Ａ）水中の０．１％  ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％  ＴＦＡをそれぞれ３０または８０ｍＬ／分の流量で使用する逆相ＨＰＬＣにより、該粗ペプチドを精製した。
【００８８】
ＲＥＰＲＯＳＩＬ−ＰＵＲ  ３００  Ｃ４もしくはＣ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ，３００オングストローム）（ＤＲ．ＭＡＩＳＣＨ  ＧｍｂＨ）またはＡＣＥ  Ｃ４もしくはＣ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ，３μｍ，３００オングストローム）（ＣＰＳ  ａｎａｌｉｔｉｃａ）上、流量１ｍＬ／分、４５℃で、あるいはＡｃｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ（登録商標）Ｃ１８カラム（１００×２．１ｍｍ，１．７μｍ，１３０オングストローム）（Ｗａｔｅｒｓ）上、流速０．４ｍＬ／分、４５℃で、分析用ＨＰＬＣを行った。精製されたペプチドを、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォームおよび／またはＳＱＤ  Ｗａｔｅｒｓおよび／またはＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆマススペクトロメトリー（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）上のエレクトロスプレー質量分析により特徴づけた。
【００８９】
記載されているとおりに（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ  ＣＥ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，５８９１−５８９２）、閉環メタセシスを行った。ただし、この場合、使用した触媒はＧｒｕｂｂｓ（グラブス）ＩＩ触媒であった。触媒であるルテニウム，［１，３−ビス−（２，４，６−トリメチルフェニル）−２−イミダゾリジニリデン］ジクロロ（フェニルメチレン）（トリシクロヘキシルホスフィン）をＭＡＴＥＲＩＡ，Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。
【００９０】
使い捨てフリット化反応容器における固体支持体に尚も結合している２０ｍｇの該ペプチドのＲＣＭに用いた一般的方法は以下のとおりであった。
ａ）反応容器内に直接的にアルゴンを通気しながら、脱気された２００μＬの１，２−ジクロロエタンで該樹脂−ペプチドを膨潤させた。この時点で、Ｇｒｕｂｂｓ  ＩＩ触媒を、１０ｍＭの最終濃度となるよう、該反応混合物に直接加えた。該反応を室温で２時間進行させた。
ｂ）該触媒を濾去した。該樹脂を１，２ジクロロエタンで洗浄し、工程ａに従い該触媒を再び加えた。その遅いメタセシス反応を完了させるために、その２時間のメタセシス反応を１回繰返した。ついで該樹脂結合ペプチドを洗浄し、乾燥させ、試験切断を行うために標準的なＦｍｏｃ切断プロトコールに従い切断して、該ＲＣＭが完了したかどうかを確認した。
【００９１】
該乾燥ペプチド−樹脂を個々に２０ｍＬの切断混合物（９５％  ＴＦＡおよび５％  水）で室温で１．５時間処理した。各樹脂を濾過し、原液ＴＦＡで１回洗浄した。該ペプチド溶液をメチル−ｔ−ブチルエーテルで沈殿させた。遠心分離後、ペプチドペレットを新鮮な冷メチル−ｔ−ブチルエーテルで洗浄して該有機スカベンジャーを除去した。この過程を３回繰返した。最終ペレットを乾燥させ、Ｈ２Ｏ、２０％  アセトニトリルに再懸濁させ、凍結乾燥した。該メタセシス化ペプチドの全ては未メタセシス化出発物質の前に溶出した。
【００９２】
ＲＥＰＲＯＳＩＬ−ＰＵＲ  ３００  Ｃ４カラム（該企業はそれを、Ｃ１８などのようなその他の全てのものと同様に、下付き文字を伴わないＣ４と呼んでいる）カラム（２５０×２０ｍｍ，１０μｍ）（ＤＲ．ＭＡＩＳＣＨ  ＧｍｂＨ）またはＲＣＭ  ＤＥＬＴＡ−ＰＡＫ  Ｃ４カートリッジ（４０×２００ｍｍ，１５μｍ）またはＲＣＭ  ＤＥＬＴＡ−ＰＡＫ  Ｃ１８カートリッジ（４０×２００ｍｍ，１５μｍ）またはＡＣＥ  Ｃ１８（２５０×２１ｍｍ，１０μｍ，３００オングストローム）（ＣＰＳ  ａｎａｌｉｔｉｃａ）を備えた分取ＷＡＴＥＲＳ  ＰＲＥＰ  ＬＣ  ４０００  ＳｙｓｔｅｍまたはＧＸ−２８１  Ｇｉｌｓｏｎ  Ｔｒｉｌｕｔｉｏｎ  ＬＣを使用し、溶離液（Ａ）水中の０．１％  ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％  ＴＦＡをそれぞれ３０または８０ｍＬ／分の流量で使用する逆相ＨＰＬＣにより、粗ペプチド（未メタセシス化体およびメタセシス化体の両方）を精製した。
【００９３】
ＲＥＰＲＯＳＩＬ−ＰＵＲ  ３００  Ｃ４もしくはＣ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ，３００オングストローム）（ＤＲ．ＭＡＩＳＣＨ  ＧｍｂＨ）またはＡＣＥ  Ｃ４もしくはＣ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ，３μｍ，３００オングストローム）（ＣＰＳ  Ａｎａｌｉｔｉｃａ）上、流量１ｍＬ／分、４５℃で、あるいはＡｃｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ（登録商標）Ｃ１８カラム（１００×２．１ｍｍ，１．７μｍ，１３０オングストローム）（Ｗａｔｅｒｓ）上、流速０．４ｍＬ／分、４５℃で、分析用ＨＰＬＣを行った。精製されたペプチドを、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォームおよび／またはＳＱＤ  Ｗａｔｅｒｓおよび／またはＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆマススペクトロメトリー（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）上のエレクトロスプレー質量分析により特徴づけた。
【００９４】
前記のとおりに、ＡｐｏＡ−１コンセンサスペプチド（配列番号１）を８０％の合成収率で合成した。ＷＡＴＥＲＳ  ＲＣＭ  ＤＥＬＴＡ−ＰＡＫ  Ｃ４カートリッジを３０−３０（５分間）−３０−５０（２０分間）％のＢ（Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ中の０．１％  ＴＦＡ）の勾配で使用することにより、ＲＰ−ＨＰＬＣにより該最終ペプチドを精製して、２０％の収率を得た。所望の産物をＬＣ−ＭＳ分析により特徴づけた：ＭＷ  ２７１１．１８，実測値（ＭＨ＋）：２７１２．６８。残りのペプチドも、前記のとおりに、ＡｐｏＡ−１コンセンサスペプチドのように又はＲＣＭにより合成した。
【００９５】
もう１つの典型的なペプチドは配列番号１１であり、これは、２工程のメタセシスおよび切断後の樹脂の適切な最終的洗浄を行う前記のとおりのＲＣＭにより合成した。得られた合成収率は６０％であった。ＲＥＰＲＯＳＩＬ−ＰＵＲ  ３００  Ｃ４カラムを３２−４８％（２５分間）のＢ（Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ中の０．１％  ＴＦＡ）の勾配で使用することにより、ＲＰ−ＨＰＬＣにより該最終ペプチドを精製して、２３％の収率を得た。所望の産物をＬＣ−ＭＳ分析により特徴づけた：２６９２．２４，実測値（ＭＨ＋）：２６９３．６５。
【００９６】
もう１つの典型的なペプチドは、２つの炭化水素置換側鎖アミノ酸を有する配列番号４３であり、７３％の合成収率で、前記のとおりに合成された。ＷＡＴＥＲＳ  ＲＣＭ  ＤＥＬＴＡ−ＰＡＫ  Ｃ４カートリッジを４０−５５％（２５分間）のＢ（Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ中の０．１％  ＴＦＡ）の勾配で使用することにより、ＲＰ−ＨＰＬＣにより該最終ペプチドを精製して、２２％の収率を得た。所望の産物をＬＣ−ＭＳ分析により特徴づけた：ＭＷ  ２７４１，３４；実測値（ＭＨ＋）：２７４２。
【００９７】
（実施例３）
インビトロ機能アッセイ−コレステロール排出
本発明のペプチドを、両親媒性特性、およびリン脂質を可溶化しコレステロール排出を促すそれらの能力に基づいて設計した。ＡｐｏＡ−１ペプチド模倣体の効力の最も直接的な機能尺度は、細胞からのコレステロールの排出を改善するその能力である。ＲＡＷおよびＪ７７４細胞系は、当技術分野においてこの目的に頻繁に使用される信頼しうるマウスマクロファージ細胞系である。これらの細胞系においては、特異的ＡＢＣＡ１刺激排出が、より非特異的なメカニズム（例えば、ＡＢＣＧ１およびＳＲＢ１によるもの）から区別されうるよう、十分に特徴づけられたＡＢＣＡ１コレステロール輸送体タンパク質の発現がｃＡＭＰとのインキュベーションによりアップレギュレーションされうる。以下のアッセイにおいては、ＲＡＷ、Ｊ７７４または比較しうるマクロファージ細胞系が使用されうる。ＲＡＷ細胞系が好ましく、以下の説明において用いられている。
【００９８】
本アッセイにおいては、ＲＡＷ細胞を、５μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−コレステロールおよびＤＭＥＭ完全培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮの１０％  ＦＢＳおよびＧＩＢＣＯの１％  ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンを含有する）内で１．５×１０５細胞／２００μｌ／ウェル／４８ウェルプレートにてプレーティングする。５％  ＣＯ２を含有する湿った３７℃の雰囲気中の２４時間のインキュベーションの後、消費された培地を除去し、該細胞を無血清ＤＭＥＭ（ＦＢＳの代わりに０．１％  脂肪酸非含有ウシ血清アルブミンが使用される）で１回洗浄し、新鮮な無血清培地（２００μｌ）を各ウェルに加える。細胞コレステロールプールを平衡化するための無血清培地内での一晩のインキュベーションの後、消費された培地を除去し、ＣＰＴ−ｃＡＭＰ（１５０μＭ）を伴って／伴わずに新鮮な無血清培地を加える。被験ペプチドの８点連続滴定体をこの時点で加える（ｃＡＭＰを含有しない単純な培地内での二重滴定ならびにｃＡＭＰを含有する培地内での二重滴定）。
【００９９】
種々の条件中の２４時間のインキュベーションの後、該培地を各ウェルから集め、５０μｌのアリコートを計数する。ついで５００μｌのＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｔｏｎ細胞溶解バッファーを各ウェルに加えることにより、該細胞を細胞溶解した。凍結および解凍により、１回、該細胞溶解を促進させる。解凍後、該ライセートを十分に混合し、５０μｌのアリコートを計数する。
【０１００】
該培地における総計数を該培地およびライセートにおける総計数の和で割り算することにより、各培地条件（±ｃＡＭＰ）における各ペプチドの排出率を計算する。単純な培地で見出された排出率を、ｃＡＭＰ刺激排出で見出された排出率から引き算して、ＡＢＣＡ１刺激の報告値を得る。ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して、ＥＣ５０値を決定する（表２）。
【０１０１】
（実施例４）
インビトロ機能アッセイ−脂質可溶化
前記のとおり、他方の重要なパラメーターはリン脂質可溶化であった。本発明のペプチドの可溶化能を決定するために、濁度法を用いる。まず、該ペプチドの３倍連続滴定体をポリプロピレンｖ形９６ウェルプレート内で調製する。２００μｌの最終ウェル体積中、５００μＭの出発濃度を得るために、＜１００μｌアリコートにおける光学的に透明な底のアッセイプレートへの添加を可能にする出発濃度から、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．５）またはＤＭＳＯ中で８点連続滴定を行う。ついでＰＢＳを各ウェルに加えて、総体積を１００μｌにする。誤った結果を回避するために、該ウェル内の気泡を分散させなければならない。つぎに、ＰＢＳ中の０．５ｍｇ／ｍｌのジミリストイルホスファチジルコリンの濁っているが均一なエマルションから、１００μｌを該アッセイプレート内の各ウェルに加え、該プレートをＮＥＰＨＥＬＯＳＴＡＲ（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ）内に挿入し、直ちに及び１５分ごとに２時間にわたって読取りを行う。
【０１０２】
リン脂質を含有するがペプチドを含有しないウェルの読取り値を平均することにより、真の０点値を計算する。各ペプチド濃度に関して、対応する３０および１２０分の読取り値から該０点値を引き算し、その０点値で割り算することにより、濁度の減少率を計算する。最終的に、ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して、両方の時点に関するＥＣ５０値を決定する（表２）。
【０１０３】
（実施例５）
赤血球（ＲＢＣ）溶解アッセイ
効力の増加および毒性の減少は共に薬物発見において重要である。本発明のペプチドは、リン脂質、ＡＢＣＡ１コレステロール排出ポンプおよび細胞膜と相互作用しうる両親媒性ペプチドであるため、赤血球（ＲＢＣ）溶解および哺乳類細胞毒性の測定は、該ペプチドの治療ウィンドウを決定するのに有用である。
【０１０４】
ＲＢＣ溶解アッセイは既に記載されている（Ｋｕｒｔｚ，Ｍ．Ｂ．ら，（１９９４）；Ｗａｎｇ，Ｊ．ら，ＰＮＡＳ  １０４（１８），７６１２−７６１６（２００７））。基本的には、ＥＤＴＡを含有するバキュテーナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）チューブ内にヒト献血者からヒト赤血球を集める。２ｍｌの新鮮に採取された全血を６ｍｌの無菌塩類液に加え、穏やかに混合し、ついで２０００ｒｐｍ、５℃で５分間遠心分離する。上清を捨て、ヒト赤血球を６ｍｌの無菌塩類液に再懸濁させ、２０００ｒｐｍ、５℃で５分間、再び遠心分離する。この操作を２回繰返す。０．３ｍｌの該洗浄赤血球を９．７ｍｌの無菌塩類液に加えることにより、該洗浄赤血球の３％  懸濁液を調製する。３．２％  Ｍｅ２ＳＯを含有する１００μｌの無菌塩類液中の１６０〜２．５（または１５０〜２．３）μＭの範囲の最終濃度の試験ペプチドを９６ウェルＭＩＣＲＯＴＥＳＴ  Ｕ底プレート（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ，ＢＤ−３５３２２７）内で調製する。該プレート内の各ウェルへの５μｌの３％  洗浄ヒト赤血球懸濁液の添加により、ＲＢＣ溶解を開始させる。該プレートを室温で一晩インキュベートし、ついで２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、直ちに読取る。赤血球の溶血は、該ウェルの底にＲＢＣペレットを伴わない又は粗（ｒｏｕｇｈ）ＲＢＣペレットを伴う上清の完全または部分的な清澄化（細胞溶解）により示される。溶血の非存在は、該ウェルの底に平滑（ｓｍｏｏｔｈ）ＲＢＣペレットを伴う透明上清により判断される。最小細胞溶解濃度（ＭＬＣ）は、赤血球の完全または部分的な細胞溶解を可視的に引き起こす、試験ペプチドの最低濃度と定義される。陽性対照としてアンホテリシンＢを使用し（ＭＬＣ＝２〜４μｇ／ｍｌ）、陰性対照としてクロラムフェニコールを使用する（ＭＬＣ＝＞６４μｇ／ｍｌ）（表３）。
【０１０５】
（実施例６）
哺乳類細胞毒性アッセイ
いくつかの変更を伴う以外は既に記載されているとおりに（Ｗａｎｇ，Ｊ．ら，（２００３））該アッセイを行う。簡潔に説明すると、ＲＡＷ細胞を集め、フェノールレッドを伴わないＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  ５１２００−３８）で３回洗浄し、同じ培地に再懸濁させる。該細胞（４×１０４個）を９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ  ３９０４）の各ウェル内に播く。ペプチドの系列希釈物を１６０〜２．５μＭの最終濃度で加える。該プレートを、５％  ＣＯ２を含有する湿った３７℃の雰囲気中でインキュベートする。２４時間後、２０μｌのＯＮＥ  ＳＯＬＵＴＩＯＮ  ＲＥＡＧＥＮＴ（ＰＲＯＭＥＧＡ，Ｇ３５８２）を各ウェル内に加え、ついで該プレートを３７℃で１時間インキュベートし、４９０ｎｍで読取る。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、細胞毒性（ＩＣ５０）を計算する（表３）。
【０１０６】
【表４】
2010530433.tif 000012
2010530433.tif 000013
2010530433.tif 000014
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【０１０７】
（実施例７）
アポリポタンパク質Ｅ欠損マウスにおけるアテロームの減少に対するＡｐｏＡ−１模倣体ペプチドの効果
これらの模倣体ペプチドの開発の最終目標はヒト患者におけるアテローム性動脈硬化症病変の急性および慢性治療であった。ＨＤＬ粒子内の主要タンパク質成分アポリポタンパク質Ａ−Ｉの活性突然変異体である組換えアポリポタンパク質Ａ−Ｍｉｌａｎｏは、急性冠状動脈症候群を有する患者における５週間の治療の後にヒト冠状動脈病変の退縮を誘導することが示されている（Ｎｉｓｓｅｎら，２００３）。また、組換えアポリポタンパク質Ａ−ＩＭｉｌａｎｏは、誘発性進行大動脈病変を有するＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅウサギにおいて、脂質に富むアテローム性動脈硬化プラークを減少させること（Ｐａｒｏｌｉｎｉら，２００８；Ｉｂａｎｅｚら，２００８）、ならびに大動脈アテローム性動脈硬化症の進行を防ぎ、アポＥ欠損マウスにおいて重度の高コレステロール血症にもかかわらずプラークの脂質およびマクロファージ含量を減少させること（Ｓｈａｈら，１９９８）が示されている。通常のげっ歯類用食餌が与えられているＡｐｏＥ欠損マウスにＡｐｏＡ−１模倣体ペプチド（Ｃｏｎｓ［Ｓ７Ｈ６，１３］）を２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で１２週間にわたって１日１回皮下投与したところ、５週間の治療の後、ビヒクルで処理されたアポＥ欠損マウスにおける変化と比較して磁気共鳴撮像による評価でアテローム体積の有意な減少が見出された（図１１）。１６週間にわたって１日１回腹腔内投与された類似構造を有する化合物は、アテローム形成性食餌が与えられたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける病変形成の抑制において有効でなかったため（Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈら，２００７）、該結果は、この（Ｃｏｎｓ［Ｓ７Ｈ６，１３］）ペプチドが新規であり、アテローム体積の強力な減少誘導因子であることを示した。
【０１０８】
他の実施形態は以下の特許請求の範囲の範囲内である。いくつかの実施形態が示され記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾が施されうる。
【図１】
2010530433.tif 000019
【図２】
2010530433.tif 000020
【図３】
2010530433.tif 000021
【図４】
2010530433.tif 000022
【配列表】
2010530433000001.app
【国際調査報告】
2010530433.tif 000023
2010530433.tif 000024