(57)【要約】  抗生物質と共有結合している多糖類の複合体を含む抗微生物剤組成物。ゲンタマイシンと共有結合している酸化再生セルロースの複合体を含む、抗微生物剤組成物を有する医療用具。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の抗生物質製剤と共有結合している多糖類の複合体を含む、抗微生物剤組成物。
【請求項２】
前記多糖類がセルロースである、請求項１に記載の抗微生物剤組成物。
【請求項３】
前記セルロースが酸化再生セルロースである、請求項２に記載の抗微生物剤組成物。
【請求項４】
前記抗生物質製剤がゲンタマイシンである、請求項１に記載の抗微生物剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、一般的に、共有結合している抗生物質製剤を有するポリマーを含む抗微生物剤組成物及び医療用具を製造するためのその使用に関する。より具体的には、本発明は、共有結合している抗生物質製剤を有する多糖類を含む抗微生物剤組成物に関する。更に、本発明は、共有結合しているゲンタマイシンを有する酸化再生セルロース（ＯＲＣ）を含む抗微生物剤組成物に関し、抗微生物剤組成物は単独で用いてもよく又は医療機器と併用してもよい。本発明はまた、共有結合している抗生物質製剤を有するこのようなポリマーを利用する医療機器に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
外科設備で医療用具を用いる場合はいつでも、感染のリスクが生じる。感染のリスクは、静脈内カテーテル、動脈グラフト、くも膜下腔内又は大脳内シャント、及び人工器官のような侵襲的又は移植可能な医療用具で劇的に増加し、これらの医療用具は体組織及び体液に密接に接触している間、病原体の侵入路をつくる。手術部位感染の発生は、医療用具上でコロニー形成する細菌に関連することが多い。例えば、外科的処置中、周囲大気から細菌が手術部位に入り、医療用具に付着する場合がある。細菌は、周囲の組織への経路として、移植された医療用具を用いる場合がある。このような医療用具上での細菌のコロニー形成は、患者に感染並びに罹患及び死亡をもたらす場合がある。
【０００３】
抗微生物剤を医療用具に組み込む、侵襲的又は移植可能な医療用具に関連する感染のリスクを減らす、多数の方法が開発されている。このような用具は、望ましくは、用具が用いられている間、有効量の抗微生物剤を提供する。例えば、医療用具は、β−ラクタム抗生物質、ポリペプチド及びキノロンのような抗生物質を含有してよい。しかしながら、抗生物質を含有している医療用具は、抗菌物質が徐々に放出され、及びそれに続いてかかる抗生物質が致死量以下の濃度を生じるために、有効性を損なう場合がある。この、抗生物質の致死量以下の濃度は、抗生物質耐性細菌を選別する。例えば、β−ラクタム抗生物質は、手術感染の最も一般的な原因であると考えられる細菌種である、黄色ブドウ球菌（S. aureus）に対して有効であることが知られているが、これらの抗生物質はＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）及びＭＲＳＥ（メチシリン耐性表皮ブドウ球菌）のような抗生物質耐性細菌に対しては効果がない。
【０００４】
この問題の１つの潜在的な解決策は、抗生物質とポリマー基材とを併用して、抗生物質を固定化することである。特に、ポリマー基材が抗生物質製剤と共有結合している場合、有益である。
【０００５】
米国特許出願公開第２００５０１９２５４７（Ａ１）号には、抗生物質と消毒剤との混合溶液で、医療物品を処理することにより抗感染性ポリマー含有医療物品を調製するアプローチが開示されている。抗微生物活性は、阻止帯（ＺＯＩ（zoneof inhibition））実験により示されている。種々の抗生物質及び消毒剤の併用により、広範囲の細菌の阻害が実現可能である。しかしながら、開示されているアプローチは、医療物品上への剤の物理的吸収又は沈着にのみ基づいている。用具と抗生物質との間に共有結合が存在しないため、もたらされる活性が短期間であることは明らかである。また、このアプローチは、抗生物質耐性細菌を選別する潜在的リスクを提示する場合がある。
【０００６】
国際公開第２００５０１６９７２（Ａ１）号は、カルボキシル基を介して正荷電部分に結合するポリマーを含む抗微生物ポリマー材料及びこのような抗微生物化合物の生成プロセス及びその使用について記載している。この場合も、抗生物質の放出は、共有結合を有しないため、固定化されない。
【０００７】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
共有結合した抗生物質製剤を有する多糖類の組み合わせの使用に関するデータは報告されていない。それ故、持続的にかつ長期間抗微生物効果を示す共有結合した抗生物質製剤を有する多糖類が必要とされている。
【０００８】
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、少なくとも１種の抗生物質製剤と共有結合した多糖類の複合体を含む抗微生物剤組成物を目的とする。
【０００９】
より具体的には、本明細書には、少なくとも１種の抗生物質製剤と共有結合した多糖類の複合体を含む抗微生物剤組成物であって、多糖類が酸化再生セルロースであり、かかる抗生物質製剤がゲンタマイシンである組成物が記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ゲンタマイシンの構造。
【図２】ゲンタマイシンのＯＲＣへの共有結合。
【図３】未処理並びに処理ＯＲＣ及びゲンタマイシンのＦＴ−ＩＲの比較。
【図４】ＯＮＡＭＥＲ（登録商標）ＭのＯＲＣへの共有結合。
【図５】ＯＮＡＭＥＲ（登録商標）Ｍを有する未処理及び処理ＯＲＣのＦＴ−ＩＲの比較。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、少なくとも１種の抗生物質製剤と共有結合している多糖類の複合体を含む抗微生物剤組成物を提供する。１つの実施形態では、抗微生物剤組成物は、少なくとも１種の抗生物質製剤と共有結合している多糖類の複合体を含み、かかる多糖類は酸化再生セルロース（ＯＲＣ）である。複合体は、典型的には、約０．１重量％〜約２０重量％の抗生物質製剤を含む。
【００１２】
本発明は、医療物品上での微生物のコロニー形成を防ぐために、抗生物質を固定化するのに効果的な方法を提供する。共有結合で固定化したゲンタマイシンを有するＯＲＣの場合、極めて殺菌性の高い材料を調製することができる。
【００１３】
用語「複合体」は、本明細書で使用するとき、好ましくは抗生物質製剤と多糖類との間にイオン結合又は共有結合を有する、分子レベルでの均質混合物を指す。多糖類は、好ましくは、カルボキシル基含有多糖類を含む。好ましい多糖類は、カルボキシル基含有セルロース、加工デンプン、酸化再生セルロース、キトサン、グアーガム、グリカン、ガラクタン、グルカン、キサンタンガム、アルギン酸、ポリマンヌロン酸（polymannuric acid）、ヒアルロン酸、ポリグリコスロン酸（polyglycosuronic acid）及びポリグルコン酸、マンナン、デキストリン、シクロデキストリン及びこれらの混合物、並びに直鎖であってもよく、分岐鎖であってもよい、他の合成カルボキシル化又は天然由来のカルボキシル化多糖類からなる群から選択される。多糖類は、タンパク質、脂質又は他の分子と結合しているフラノサン（furanosan）又はピラノサン（pyranosan）であってよく、藻類、植物、細菌及びムコ多糖類、グリコーゲン、ペクチン、糖タンパク質、並びに糖脂質を挙げることができる。ヒアルロン酸、ジェラン、キサンタン、サクシノグリカン、ペクチン、酸化再生セルロース、コンドロイチン硫酸（chondroitan sulphate）、ヘパラン硫酸、デルマタンが、好ましいカルボキシル化多糖類の例である。酸化再生セルロースが最も好ましい。
【００１４】
酸化セルロースは、例えば、四酸化二窒素によるセルロースの酸化により生成される。このプロセスは、糖類残基の一級アルコール基をカルボン酸基に変換し、セルロース鎖内でウロン酸残基を形成する。好ましい酸化セルロースは、レーヨンのような再生セルロースの酸化により調製される酸化再生セルロース（ＯＲＣ）である。以前から、ＯＲＣは止血特性を有することが知られていた。ＯＲＣは、１９５０年からＳＵＲＧＩＣＥＬ（ジョンソン・アンド・ジョンソン・メディカル社（Johnson & Johnson Medical, Inc.）の登録商標）と呼ばれる止血製品として入手可能である。この製品は、編まれたレーヨン材料の酸化により製造される。
【００１５】
本発明により、抗生物質は、図２に示すような明確に定義された方法で抗微生物活性を実現するために、用具上での共有化学結合により固定化されるべきである。
【００１６】
抗生物質の共有結合は、化学結合にもかかわらずこれらの剤の抗微生物活性が効果的に維持される方法で行われる。このアプローチの効果は、酸化再生セルロース（ＯＲＣ）上にゲンタマイシンを共有結合させることにより立証された。このような変性ＯＲＣの抗微生物活性が確認された。抗生物質の共有結合的固定化は、剤に対する細菌耐性を最低限に抑え、その遊離型と比較して活性を長持ちさせる方法を提供する。
【００１７】
ゲンタマイシンのような共有結合した抗生物質を有するＯＲＣは、広範な細菌に対する細菌耐性が著しく向上することが示されている。ゲンタマイシンは、カルボジイミドカップリング反応により、ＯＲＣのカルボン酸に共有結合していた。このように処理された抗微生物活性は化学反応することなく、ゲンタマイシン溶液のみで処理したＯＲＣと比較して、活性がより高く、及び長持ちすることが観察された。
【００１８】
ゲンタマイシンは、カルボジイミドカップリング反応を通してＯＲＣに共有結合した。生成物を、抗微生物活性試験に供する前に、全面的に洗浄した。ＯＲＣ上へのゲンタマイシン負荷は〜１２％と推定された。処理したＯＲＣは、カルボン酸官能基の喪失及びＦＴ−ＩＲ分析により証明されたようにアミド官能基の新たな形成を示した。
【００１９】
新たに形成された、共有結合的に固定化されたＯＲＣ−ゲンタマイシン（ＯＲＣ−ＧＭ−ＣＶＢ）は、インビトロで著しい抗微生物効果を示す。以下の実施例で記載するように、ｌｏｇ減少アッセイは、２〜５桁の規模で細胞数の低下を示した。未処理ＯＲＣは、同一条件下で細胞数の低下を示さなかった。
【００２０】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載された抗微生物剤組成物を含む医療用具である製品を含む。１つの実施形態では、抗微生物剤組成物を用いて、例えば、紡績、成型、鋳造又は押出成形により、物品又は物品の一部を形成することができる。
【００２１】
抗微生物剤組成物を利用して、繊維、メッシュ、粉末、微粒子、フレーク、スポンジ、
発泡体、布地、不織布、織布マット、フィルム、縫合アンカー装置、縫合糸、止め金、手術用鋲、クリップ、板及びねじ、薬物送達装置、癒着防止バリア並びに組織接着剤が挙げられるが、これらに限定されない、医療用具を製造することができる。
【００２２】
医療用具は、単独で、又は他のポリマー成分と併用して、１種又はそれ以上の本発明の抗微生物剤組成物から構成してよい。
【００２３】
以下の実施例は本発明の特定の実施形態を示すが、それらは本発明の範囲を限定するものとしてではなく、発明を十分に説明するのに寄与するものとして解釈すべきである。
【実施例】
【００２４】
実施例１（発明）ＯＲＣ−ゲンタマイシン（ＯＲＣ−ＧＭ−ＣＶＢ）化合物の調製
材料
全ての材料はシグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）から購入し、インターシード（Interceed）（登録商標）という商品名でエチコン社（Ethicon, Inc.）から入手可能である、酸化再生セルロース（ＯＲＣ）の布地を除いて、購入したままの状態で使用した。ゲンタマイシンは、図１に示すような類似体の混合物としてシグマ−アルドリッチから硫酸塩形で得た。
【００２５】
手順
合成を図２に概説する。
【００２６】
ＯＲＣ布地を重量０．２５ｇの１”のストリップに切断した。切断したＯＲＣストリップを、室温で真空下にて一晩乾燥させた。乾燥させたＯＲＣストリップを、２０ｍＬのバイアル瓶のゲンタマイシン溶液（５ｍＬ）中に入れた。０．０８０ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）を添加し、反応用バイアル瓶をＮ2雰囲気下で密封した。反応用バイアル瓶を、室温で一晩振盪器上に放置した。
【００２７】
ＯＲＣ布地を反応混合物から回収し、大量の流脱イオン（ＤＩ）水ですすぎ、振盪器上で５０ｍＬのＤＩ水に３０分間、５０ｍＬのメタノールに３０分間浸漬した。処理したＯＲＣ布地を真空下で２時間乾燥させた。０．２８ｇのわずかに黄色であるＯＲＣ布地を得た。ＦＴ−ＩＲを用いて、処理及び未処理ＯＲＣサンプルを比較した。
【００２８】
図３で、未処理ＯＲＣの３３８３ｃｍ-1（カルボン酸プロトン）及び１７２８ｃｍ-1（カルボン酸カルボニル）におけるＦＴ−ＩＲシグナルは、遊離カルボン酸官能基の存在を示した。ＯＲＣとゲンタマイシンとの化学反応後、３３８３ｃｍ-1及び１７２８ｃｍ-1でのシグナルは消失し、一方で１５９５ｃｍ-1において、ＯＲＣカルボン酸官能基とゲンタマイシンのアミン官能基との間に新たに形成されたアミド結合の指標である、新たなシグナルが現れた。
【００２９】
上記観察結果は、ゲンタマイシンがＯＲＣにうまく共有結合したことを立証した。
【００３０】
実施例２（発明）
以下の研究は、共有結合したゲンタマイシンが抗微生物効果を維持していることを示すために実施した（表１）。
【００３１】
以下のような２つのサンプルを研究に用いた：
１．未処理ＯＲＣ布地
２．ＯＲＣ−ＧＭ−ＣＶＢ：実施例１に従って調製したゲンタマイシンと共有結合しているＯＲＣ布地。
【００３２】
表１の結果は、ｌｏｇ減少アッセイにより、試験物品のインビトロでの効果を試験して得た。共有結合ＧＭの効果を示すために、試験物品を生理食塩水中で抽出して、使用前に遊離ゲンタマイシンを取り除いた。試験物品は約４．０ｍｇ／片の正方形であり、４０ｍＬ／物品の無菌生理食塩水中で、３７℃で１時間振盪（１００ｒｍｐ）しながら、連続して２回にわたって抽出した。抽出後、試験物品の効果をｌｏｇ減少アッセイにより評価した。
【００３３】
ｌｏｇ減少アッセイでは、試験物品を、１時間試験物品の表面上で約１−２×１０ｅ４ＣＦＵの細菌に曝露した。共有結合ゲンタマイシンによる試験物品の表面上での効果の試験を容易にするために、接種菌液を１０μＬ／物品送達し、接種菌液が試験物品の表面上に局在するように、試験物品に試験物品に対して少容量の接種菌液を完全に吸収させる。接種菌液は、２０×リン酸カリウム緩衝液中で調製し、これは試験物品のｐＨを中性の近くで維持した。中性ｐＨにおけるＯＲＣの抗微生物効果は最低限に抑えられるため、その結果、ｌｏｇ減少はＯＲＣではなくゲンタマイシンの抗微生物効果を示すことになる。曝露後、試験物品を振盪しながら生理食塩水に浸漬し、生存細菌を取り除き、生存細菌を平板計数により測定した。平板計数はトリプチカーゼ大豆寒天中で実施し、３７℃で２４時間培養した。
【００３４】
表１のデータは、共有結合したゲンタマイシンを有するＯＲＣ（ＯＲＣ−ＧＭ−ＣＶＢ）が、２回の連続した抽出後にインビトロで２．８ｌｏｇ減少という良好な効果を示した一方で、未処理ＯＲＣ布地は同一試験条件下でｌｏｇ減少を示さなかったことを示す。この結果は、ゲンタマイシンがＯＲＣ布地に共有結合し、その抗微生物効果を維持していることを示した。
【００３５】
【表１】
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*ｌｏｇ減少＝ｌｏｇ  ＣＦＵ接種菌液−ｌｏｇ  ＣＦＵ処理サンプル
【００３６】
実施例３（比較）ＯＮＡＭＥＲ（登録商標）ＭのＯＲＣへの共有結合
材料
特に規定しない限り、全ての材料はシグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）から購入し、購入したままの状態で使用した。ＯＮＡＭＥＲ（登録商標）Ｍ（ポリクアテルニウム（POLYQUATERNIUM）１）は、３２％水溶液としてステファン社（Stephen Company）（ニュージャージー州メイウッド（Maywood）（ロット番号５５７２−ｃ）から入手し、購入したままの状態で使用した。酸化再生セルロース（ＯＲＣ）布地は、エチコン社（Ethicon, Inc.）から商品名インターシード（Interceed）（登録商標）を入手した。
【００３７】
手順
合成を図４に概説した。
【００３８】
ＯＲＣ布地を重量０．２５ｇの１”のストリップに切断した。切断したＯＲＣストリップを、真空下にて室温で一晩乾燥させた。
【００３９】
乾燥させたＯＲＣストリップを、１００ｍＬのＲＢＦのＯＮＡＭＥＲ（登録商標）Ｍ溶液（４０ｍＬ）中に入れた。０．３２ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）を５ｍＬの水と混合し、ガラス製のピペットを通じて反応混合物に滴下した。
【００４０】
反応混合物はＮ2で末端保護をし、室温で一晩振盪器上に放置した。
【００４１】
ＯＲＣ片を反応混合物から回収し、流脱イオン（ＤＩ）水ですすぎ、攪拌しながらビーカー内の１５０ｍＬの水に３０分間、１００ｍＬのメタノールに３０分間浸漬した。処理したＯＲＣ布地を真空下で２時間乾燥させた。
【００４２】
乾燥後、１．０７ｇのわずかに黄色である処理ＯＲＣを得た。ＯＲＣに共有結合していたＯＮＡＭＥＲ（登録商標）Ｍ（ＯＮＭ）の量は約７％である。ＦＴ−ＩＲを用いて、処理及び未処理ＯＲＣサンプルを比較した。
【００４３】
図５では、ＦＴ−ＩＲデータは、１６０３ｃｍ-1におけるシグナルが示すように、ＯＲＣとＯＮＭとの間の共有結合の形成を確認した。
【００４４】
実施例４（比較）
以下の研究は、ＯＲＣに共有結合しているＯＮＡＭＥＲ（登録商標）Ｍ（ＯＮＭ）が抗微生物効果を失っていることを示した（表２）。ｌｏｇ減少アッセイにより、実施例３から得られた、ＯＲＣに共有結合しているＯＮＭのサンプル（ＯＲＣ−ＯＮＭ−ＣＶ）の、インビトロでの効果を試験した。ｌｏｇ減少アッセイでは、試験物品（約４．０ｍｇ／片の正方形）を、試験物品の表面上で約１−２×１０ｅ４ＣＦＵの細菌に１時間曝露した。共有結合ＯＮＭによる試験物品の表面上での効果の試験を容易にするために、接種菌液を１０μＬ／物品送達し、接種菌液が試験物品の表面上に局在するように、試験物品に試験物品に対して少容量の接種菌液を完全に吸収させる。接種菌液は、２０×リン酸カリウム緩衝液中で調製し、これは試験物品のｐＨを中性の近くで維持した。中性ｐＨにおけるＯＲＣの抗微生物効果は最低限に抑えられるため、その結果、ｌｏｇ減少はＯＲＣではなくＯＮＭの抗微生物効果を示すことになる。曝露後、試験物品を振盪しながら生理食塩水に浸漬し、生存細菌を取り除き、生存細菌を平板計数により測定した。平板計数はトリプチカーゼ大豆寒天中で実施し、３７℃で２４時間培養した。ＯＮＭの陽性対照をこのアッセイで培養し、遊離型のＯＮＭが曝露した細菌に対して効果を有していることを示した。
【００４５】
【表２】
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*ｌｏｇ減少＝接種菌液のｌｏｇ  ＣＦＵ−処理ｌｏｇ  ＤＦＵ（接種菌液下で３つのサンプル）
【００４６】
〔実施態様〕
（１）  少なくとも１種の抗生物質製剤と共有結合している多糖類の複合体を含む、抗微生物剤組成物。
（２）  前記多糖類がセルロースである、実施態様１に記載の抗微生物剤組成物。
（３）  前記セルロースが酸化再生セルロースである、実施態様２に記載の抗微生物剤組成物。
（４）  前記抗生物質製剤がゲンタマイシンである、実施態様１に記載の抗微生物剤組成物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2010526092.tif 000009
【国際調査報告】
2010526092.tif 000010
2010526092.tif 000011
2010526092.tif 000012