(57)【要約】  本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでニューロン分化を誘導するためのＣＤ９５Ｌ／ＣＤ９５系の活性化と、分化をもたらすためのＣＤ９５Ｌ組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロン傷害の治療用薬物の製造のための、ＣＤ９５−リガンド（ＣＤ９５Ｌ）／ＣＤ９５−受容体（ＣＤ９５）系の活性化因子を含む組成物の使用。
【請求項２】
前記活性化因子が、
（ｉ）ＣＤ９５Ｌ、および
（ｉｉ）ＣＤ９５受容体に対する活性化抗体から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ニューロン傷害が、パーキンソン病、アルツハイマー病などの神経変性疾患である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記ニューロン傷害が、脳卒中または脊髄損傷である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
前記治療が、前記疾病または傷害の亜急性期においてである、請求項１から４までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記治療が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでニューロン分化を誘導するためである、請求項１から５までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記治療が、
（ｉ）ニューロン幹細胞に前記活性化因子を投与すること、および
（ｉｉ）ニューロン疾患または傷害の部位に前記治療済みの幹細胞を導入または遊走させることを含む、請求項１から６までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
ニューロン疾病またはニューロン傷害の治療用薬物の製造のための、ＣＤ９５Ｌをコードするポリヌクレオチドを含む組成物の使用。
【請求項９】
前記治療が、
（ｉ）ニューロン幹細胞に前記ポリヌクレオチドを投与すること、および
（ｉｉ）ニューロン疾患または傷害の部位に前記治療済みの幹細胞を導入または遊走させることを含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
（ｉ）前記ＣＤ９５−リガンド（ＣＤ９５Ｌ）、ＣＤ９５−受容体（ＣＤ９５）系の活性化因子で幹細胞を治療することと、
（ｉｉ）ニューロン傷害の部位にそれらの治療済み幹細胞を導入することであり、前記治療済み幹細胞が前記傷害部位で新しいニューロン細胞に分化することを含む、傷害を受けたニューロン組織を治療する方法。
【請求項１１】
前記活性化因子がＣＤ９５ＬまたはＣＤ９５に対する活性化因子抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ニューロン組織が哺乳動物のニューロン組織である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物が、パーキンソン病を有するか、または脳卒中または脊髄損傷などのニューロン傷害を患ったヒト患者である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記傷害を受けたニューロン組織が、前記哺乳動物の脳または前記哺乳動物の中枢神経系の他所にある、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）ＣＤ９５Ｌをコードするポリヌクレオチドを発現するように幹細胞を遺伝子操作することと、
（ｉｉ）被検体にその遺伝子操作された幹細胞を導入することであり、
（ｉ）前記幹細胞が前記傷害部位に遊走し、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドが、好ましくは傷害を受けた組織でのみ活性がある調節エレメントに作用可能に連結されていることを含む、傷害を受けたニューロン組織を治療するための方法。
【請求項１６】
被検体にウイルスベクターを導入することであり、前記ベクターが、ＣＤ９５Ｌをコードするポリヌクレオチドを含み、好ましくは傷害を受けた組織でのみ活性がある調節エレメントに作用可能に連結されていることを含む、傷害を受けたニューロン組織を治療するための方法。
【請求項１７】
前記ベクターがアデノウイルスまたはレンチウイルスベクターである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤ９５Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターであり、前記ポリヌクレオチドが、
（ｉ）好ましくはニューロン組織においてのみ活性のあるプロモーターと、
（ｉｉ）ニューロン組織の機能的なターミネーターに作用可能に連結されているベクター。
【請求項１９】
前記ＣＤ９５Ｌタンパク質が配列番号３に示されている配列を含む、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
ＣＤ９５Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む非天然性のポリヌクレオチドをそのゲノムに含み、前記ポリヌクレオチドが、
（ｉ）好ましくはニューロン組織においてのみ活性のあるプロモーターと、
（ｉｉ）ニューロン組織の機能的なターミネーターに作用可能に連結されている幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでニューロン分化を誘導するためのＣＤ９５Ｌ／ＣＤ９５系の活性化と、分化をもたらすための方法および組成物とに関する。
【０００２】
発明の背景
神経発生は、多数の異なる転写因子および遺伝子を伴う多段階の過程である。幹細胞研究の中心的問題の１つは、特に生体組織が傷害または損傷を受けた際に神経幹細胞の維持および分化を媒介する遺伝子プログラムを理解することであり続けている。典型的には、中枢神経系（ＣＮＳ）に対する傷害は、神経幹細胞（ＮＳＣ）の産生を刺激する。これらの新しい細胞は、傷害を受けた細胞を置換するために損傷区域へ遊走する。しかしながら、これらの細胞のほとんどは、第１週中に死滅する。さらに、残存する少数の細胞は、もし存在するならば、ニューロン分化およびニューロン統合を起こす。
【０００３】
成体の脳では、神経幹細胞は、神経組織発生領域、すなわち側脳室の脳室下帯（ＳＶＺ）および海馬歯状回（ＤＧ）の顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）に存在する4。これらの細胞の様々な神経前駆体への分化は、これらの細胞が存在する特化した微小環境、つまり神経組織発生「ニッチ」により調節される5。非神経組織発生性の成体皮質では、皮質ニューロンの標的アポトーシス性変性は、視床に向かって軸索を伸長する新しい皮質ニューロンの形成に繋がった6。
【０００４】
同様に、脳卒中または脊髄損傷などの病理学的状態はＮＳＣの産生を増加させ、ＮＳＣは、高い死滅率およびニューロン分化の不良のため、最終的には傷害を受けた成熟ニューロンのごく一部分だけ（およそ約０．２％）を置換する。要約すると、アポトーシスだけが起こる状態は、ＮＳＣに神経組織発生環境を供給する。そのような状態では、神経栄養因子およびアポトーシス促進分子も上方調節される8-11。
【０００５】
これらのアポトーシス促進分子の１つは、ＣＤ９５Ｌである。ＣＤ９５(ＡＰＯ−１またはＦａｓ)／ＣＤ９５Ｌ系は、アポトーシスの誘発因子として免疫系において広範囲に研究されてきた12。三量体化したＣＤ９５ＬによるＣＤ９５のライゲーションは、その後、アダプタータンパク質Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ、ＭＯＲＴ１）およびカスパーゼ８をＣＤ９５受容体に動員することに繋がる。これは、細胞死誘導性シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）の形成に帰着する。ＤＩＳＣにおけるプロカスパーゼ−８は、自己切断を介して活性化され、下流のエフェクターカスパーゼの活性化により細胞をアポトーシスに委ねる12。
【０００６】
未熟ニューロンでは、ＣＤ９５Ｌは樹状突起の分岐を促進する15。ＣＤ９５またはＣＤ９５Ｌ欠損マウス（それぞれ、ｌｐｒおよびｇｌｄマウス）は、海馬ニューロンでの樹状突起分枝の減少を示す。Ｄｅｓｂａｒａｔｓらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ９５の刺激が後根神経節細胞の増殖に帰着することを観察した16。著者らは、ｌｐｒおよびｇｌｄマウスが、パーキンソン様疾病モデルにおけるニューロン変性に高い感受性があることをさらに実証した17。
【０００７】
ＣＤ９５Ｌの発現は、脳卒中によるなど脳に対する傷害の際に誘導される9,28。脳卒中の場合、典型的には、傷害を受けた脳の領域へと遊走し統合するＮＳＣの増殖がある。しかしながら、新生ニューロンは、ほぼ全てが５週後に死滅する1。
【０００８】
対照的に、非神経組織発生領域に位置する選択されたニューロンに標的アポトーシスを誘導することは、成体神経幹細胞の増殖、遊走および統合に帰着する6。それと一致して、Ｅ１７ニューロンは、アポトーシス性皮質へ移植されると、統合して機能的な成熟ニューロンへと分化するが、壊死性皮質へ移植される場合はそうはならない29。
【０００９】
Ｍａｇａｖｉらは、皮質ニューロンの選択的アポトーシス性変性が、移植された内因性神経前駆体のニューロン分化を誘導することを示した6,29。アポトーシスがニューロン分化を制御する因子の発現を誘導することが機序として考えられると著者らは主張する。論じられた候補分子は、ニューロトロフィン、例えばＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４／−５である11。示唆された別の機序は、アポトーシスが、初期新皮質分化を許可および／または指示する神経可塑性プログラムの抑制を解放することである。
【００１０】
神経幹細胞の生存および分化の最適化は、今日、幹細胞生物学の主要な目標の１つである。本発明は、神経発生を制御する機序に対するさらなる洞察を明らかにすることにより、この目標を達成する。
【００１１】
発明の概要
本発明の態様は、ニューロン傷害の治療用薬物の製造のための、ＣＤ９５−リガンド（ＣＤ９５Ｌ）／ＣＤ９５−受容体（ＣＤ９５）系の活性化因子を含む組成物の使用である。
【００１２】
一実施態様においては、活性化因子はＣＤ９５Ｌであり得る。別の実施態様においては、活性化因子は、ＣＤ９５に対する活性化抗体であり得る。
【００１３】
ニューロン傷害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、もしくは脳卒中または脊髄損傷などの神経変成疾患であり得る。治療は、好ましくは傷害の亜急性期においてである。治療は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでニューロン分化を誘導できる。さらに、治療は、（ｉ）神経幹細胞、好ましくは成体神経幹細胞、より好ましくはヒト成体神経幹細胞に対する活性化因子を投与すること、および（ｉｉ）ニューロン傷害部位に治療済み幹細胞を導入または遊走させることを含むことができる。
【００１４】
本発明の別の態様は、ニューロン傷害の治療用薬物の製造のための、ＣＤ９５Ｌをコードするポリヌクレオチドを含む組成物の使用である。
【００１５】
一実施態様においては、治療は、（ｉ）ニューロン幹細胞に当該ポリヌクレオチドを投与すること、および（ｉｉ）ニューロン傷害部位に治療済み幹細胞を導入または遊走させることを含む。
【００１６】
本発明の別の態様は、（ｉ）ＣＤ９５Ｌ／ＣＤ９５Ｌ活性化因子で幹細胞を治療することと、（ｉｉ）ニューロン傷害部位にそれらの治療済み幹細胞を導入することであり、治療済み幹細胞が傷害部位で新しいニューロン細胞に分化することとを含む、傷害を受けたニューロン組織を治療する方法である。
【００１７】
一実施態様においては、ニューロン組織は哺乳動物にある。別の実施態様において、哺乳動物は、ニューロン障害、例えばパーキンソン病を有するか、またはニューロン傷害、脳卒中もしくは脊髄損傷を被ったヒト患者である。
【００１８】
別の実施態様において、傷害を受けたニューロン組織は、哺乳動物の脳または哺乳動物の中枢神経系の他所にある。
【００１９】
本発明の別の態様は、（ｉ）ＣＤ９５Ｌをコードするポリヌクレオチド、またはそのようなポリヌクレオチドの誘導体を発現するように幹細胞を遺伝子操作することと、（ｉｉ）被検体にその遺伝子操作された幹細胞を導入することであり、幹細胞は傷害部位に遊走し、ポリヌクレオチドは、好ましくは傷害を受けた組織でのみ活性がある調節エレメントに作用可能に連結されていることとを含む、傷害を受けたニューロン組織を治療するための方法である。
【００２０】
本発明の別の態様は、被検体にウイルスベクターを導入することであり、ベクターは、ＣＤ９５Ｌをコードするポリヌクレオチド、またはそのようなポリヌクレオチドの誘導体を含み、好ましくは傷害を受けた組織でのみ活性がある調節エレメントに作用可能に連結されていることを含む、傷害を受けたニューロン組織を治療するための方法である。一実施態様においては、ベクターはアデノウイルス関連ベクターまたはレンチウイルスベクターである。
【００２１】
別の態様は、ＣＤ９５Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはそのようなポリヌクレオチドの誘導体を含むベクターであり、ポリヌクレオチドは、（ｉ）好ましくはニューロン組織においてのみ活性のあるプロモーターおよび（ｉｉ）ニューロン組織の機能的なターミネーターに作用可能に連結されている。一実施態様においては、ＣＤ９５Ｌタンパク質は、配列番号３で示された配列を含む。別の実施態様において、タンパク質は、配列番号１のｍＲＮＡ配列によりコードされるか、または配列番号２で示された遺伝子転写物配列である。
【００２２】
別の態様では、本発明は、ＣＤ９５Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはそのようなポリヌクレオチドの誘導体を含む非天然性のポリヌクレオチドをそのゲノムに含み、ポリヌクレオチドが、（ｉ）好ましくはニューロン組織でのみ活性のあるプロモーターおよび（ｉｉ）ニューロン組織の機能的なターミネーターに作用可能に連結されている、幹細胞、好ましくは成体幹細胞、より好ましくはヒト成体幹細胞を指す。
【００２３】
前述した概要および以下の図面の簡単な説明の両方および詳細な説明は、例示的で説明のためであり、特許請求された発明のさらなる説明を提供するためと意図される。他の目的、利点、および新規な特徴は、当業者であれば、以下の発明の詳細な説明から容易に明白になろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＣＤ９５刺激は、マウスおよびヒトの神経前駆細胞の神経発生を誘導する。（ａ）マウス神経前駆細胞の治療計画。（ｂ）ＣＤ９５Ｌ−ＬＺまたはαＣＤ９５ＡＢを介するＣＤ９５刺激は、ＳＶＺ  ＮＳＣのニューロンマーカーβ−ＩＩＩ−チューブリンに対して陽性の細胞を産生した（薄い灰色：イソタイプ、濃い灰色：対照イソタイプで刺激された細胞）。（ｃ）ＣＤ９５刺激と同様にＲＡ治療は、β−ＩＩＩ−チューブリン陽性海馬ＮＳＣの量を増加させた（薄い灰色（Ｉｇ）：未染色細胞、濃い灰色（ｄｇ）：対照上清で刺激された細胞）。（ｄ）ヒト神経前駆細胞の治療計画。（ｅ）ＣＤ９５Ｌ−ＬＺまたはＣＤ９５（αＡｐｏ１）に対するアゴニスト抗体でのヒト神経前駆体の治療は、増殖因子除去後のβ−ＩＩＩ−チューブリン陽性細胞の産生増加に繋がった。グラフは、増殖因子を除去した４日後および７日後のヒト神経前駆細胞におけるβ−ＩＩＩ−チューブリン陽性細胞の増加の定量化を示す。データは、５つの表示窓の平均±標準偏差として表される（スチューデントｔ−検定、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２】ＣＤ９５Ｌに誘導された神経発生の特徴づけ。（ａ〜ｆ）細胞は図１ａで示されたように治療した。αＣＤ９５ＡＢで４８時間治療されたマウスの成体ＳＶＺ  ＮＳＣの遺伝子発現は、定量的リアルタイムＰＣＲにより分析した。対照細胞：黒色バー；ＣＤ９５に刺激された細胞：灰色バー。
【図３ａ】ＣＤ９５Ｌ配列−ｍＲＮＡ（配列番号１）。配列の下線部分は交互するエキソン構造を表す。
【図３ｂ】ＣＤ９５Ｌ配列−ＤＮＡ（配列番号２）。配列の下線部分は交互するエキソン構造を表す。
【図３ｃ】ＣＤ９５Ｌ配列−ＣＤ９５Ｌのタンパク質配列（配列番号３）。配列の下線部分は交互するエキソン構造を表し、強調したグリシン残基は、重複したスプライス部位を表す。
【図４ａ】ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の構築、開発、および特性。逆平行β−ストランドを形成する、ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ内のＮ−およびＣ−末端アミノ酸の局在化ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ構造の拡大図（Ｎ−末端：緑色；Ｃ−末端：赤色）。
【図４ｂ】ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の構築、開発、および特性。ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ構造内のＮ−およびＣ−末端の位置。上段列：ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤの中心軸の側面図。下段列：ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤの中心軸の上面図。左から右に：単量体、二量体、および三量体。
【図４ｃ】ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の構築、開発、および特性。ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４のアミノ酸配列。シグナルペプチドには下線が引かれている（Ｍｅｔ１〜Ｇｌｙ２０）。Ｅ１４０でのプロセシングを可能にするためにマウスＣＤ９５Ｌ−ＲＢＤに導入されたＰ１４１Ｌ点突然変異には、アスタリスクで印をつけてある。ｍｍＣＤ９５Ｌ−ＲＢＤのＮ−末端アミノ酸（緑色の矢印）およびＣ−末端アミノ酸（赤色の矢印）は、逆平行β−ストランドを形成することが提唱されている。Ｔ４−フォルドン配列は青色（イタリック体）で印字してある。
【図４ｄ】ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の構築、開発、および特性。ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４のアフィニティー精製：ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４は、ストレプタクチンアフィニティー精製により、一時的に形質移入されたＨｅｋ２９３Ｔ細胞から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により分析した。ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の位置が示されている。ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４は、およそ３０ｋＤａの見掛けの分子量を示す。
【図４ｅ】ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の構築、開発、および特性。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による三量体ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の精製：アフィニティー精製されたｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の画分Ｅ２〜Ｅ４は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用したＳＥＣにより分離した。グラフは、ストレプタクチンで精製されたｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の溶出特性（ＯＤ２８０ｎｍ）を示す。１３．８８ｍｌの主要ピークは、三量体ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の滞留容積を示す。ＳＥＣから回収した画分Ａ１〜Ｂ１（Ｂを参照）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により分析した。
【図４ｆ】ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の構築、開発、および特性。推定的三量体ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４を含有する画分Ａ１１〜Ａ１５（Ｂ）を貯留、濃縮し、その後ＳＥＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色により分析した。分析により、１３．７４ｍｌの滞留容積を有する三量体ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４が示され、タンパク質の著しい凝集は示されない。
【図４ｇ】ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の構築、開発、および特性。ＴＲＡＩＬ−Ｔ４−ＤＲ５複合体のモデル。上段列：ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ（濃青色）の上に配置されたＴ４−フォルドン（薄青色）とのＴＲＡＩＬ−ＤＲ５共複合体の側面図。ＤＲ５鎖は暗赤色に着色されている。ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤおよびＴ４−フォルドンのＮ−末端アミノ酸は緑色に着色され、Ｃ−末端アミノ酸は赤色に着色されている。上段列：ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤの中心軸の側面図。下段列：ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤの中心軸の上面図。左：リボンモデル。右：表面モデル。
【図４ｈ】ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の構築、開発、および特性。ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４は、用量依存的な様式でジャーカット細胞のアポトーシスを誘導する。
【図４ｉ】ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の構築、開発、および特性。ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４は、用量依存的な様式でＰ８１５細胞のアポトーシスを誘導する。
【００２５】
詳細な説明
本発明は、ＣＤ９５（ＡＰＯ−１／Ｆａｓ）、すなわちＣＤ９５Ｌ、のリガンドがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでニューロン分化を誘導するという開示と、分化をもたらすためのＣＤ９５Ｌ組成物の使用とに関する。本発明は、ＣＤ９５の活性化が、ニューロン損傷または傷害の区域で神経幹細胞（ＮＳＣ）の神経発生を促進できることを実証する。中枢神経系は、傷害を受けると、損傷を受けた場所に幹細胞を誘引する種々の化学誘引物質を産生することが知られている。その後、それらの幹細胞は、部分的にはＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌの相互作用のため、神経幹細胞へと、引き続いてニューロンへと分化する。参考として本明細書中で援用されるＺｕｌｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，（２００６）１３，３１−４０（２００５年７月８日にオンラインで公開）を参照されたい。
【００２６】
実際、成体神経幹細胞は表面にＣＤ９５を発現するが、それらの細胞はＣＤ９５Ｌで治療された後はアポトーシスを起こさないことが本明細書中で示されている。代りに、マウスおよびヒトＮＳＣのＣＤ９５を刺激すると、ニューロン分化が誘導されることが判明した。全虚血を被ったマウスの線条体に、ＣＤ９５欠損マウス（ｌｐｒ）または野生型マウス由来のＧＦＰ標識化ＮＳＣを注射した。これらのマウスでは、海馬ＣＡ１領域の単離ニューロンは、ＣＤ９５Ｌにより死滅する3。虚血性ＣＡ１領域内のニューロン分化および統合は、ｗｔＮＳＣの場合にのみ観察された。ＬｐｒのＮＳＣは、神経組織発生領域、歯状回では検出されたが、虚血性ＣＡ１領域では検出されなかった。
【００２７】
したがって、本発明によると、ＣＤ９５Ｌ／ＣＤ９５系の活性化因子またはＣＤ９５Ｌをコードするポリヌクレオチドは、ニューロン傷害の治療のために使用できる。好ましい実施形態では、活性化因子は、ＣＤ９５Ｌ、特に、配列番号２で示される核酸配列、もしくは例えば、５５℃、好ましくは６０℃、より好ましくは６５℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ緩衝液を用いて洗浄した後にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、またはその断片および誘導体によりコードされたヒトＣＤ９５Ｌである。上述されたような少なくとも１つのＣＤ９５Ｌドメインと、好ましくはヒト免疫グロブリンＦｃドメイン、例えばヒトＩｇＧ１Ｆｃなどの免疫グロブリンＦｃドメインに対する異種性ポリペプチドドメインとを含む融合タンパク質も好ましい。複数の、例えば３つのＣＤ９５Ｌドメインを含む融合タンパク質、またはＣＤ９５Ｌドメインと、多量体化ドメイン、例えばバクテリオファージＴ４由来のフォルドンドメインなどの３量体化ドメインとを含む融合タンパク質がさらに好ましい。
【００２８】
さらに好ましい実施形態では、活性化因子は、ＣＤ９５受容体に対する活性化抗体である。活性化抗体は、ＣＤ９５受容体に結合し、それにより受容体活性化を誘導できる。抗体は、モノクローナル、キメラ、もしくはヒト化抗体ヒト抗体または抗原結合性断片あるいはその誘導体、例えば単鎖抗体または抗体断片であってよい。
【００２９】
活性作用物質は、ニューロン傷害、例えばニューロン疾病、特に神経変性疾病、または脳もしくは脊髄などのＣＮＳの傷害の治療に使用できる。治療は、疾病または傷害の亜急性期、特にＣＤ９５の発現が傷害を受けた組織に実質的に存在しない段階において、好ましく実行される。
【００３０】
例えば、ＣＤ９５ＬまたはＣＤ９５に対する活性化抗体を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚性幹細胞からニューロンを生成してもよく、当該胚性幹細胞はその後損傷した組織部位に導入できる。または、ＣＤ９５リガンドをコードするポリヌクレオチドを幹細胞が過剰発現し、その後それらの細胞を患者に注射できるように、幹細胞を遺伝子操作してもよい。細胞は、いったん注射されると、傷害部位へ遊走してＣＤ９５Ｌを発現し、それによりｉｎ  ｖｉｖｏで神経発生を誘導する。同様の文脈で、患者には、ＣＤ９５Ｌをコードするポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作されたアデノウイルスまたはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを注射してもよい。そのような構築体では、ポリヌクレオチドは、好ましくは、傷害部位がその内部にある組織においてのみ活性のある調節エレメントに作用可能に連結する。したがって、ＣＤ９５Ｌの発現は、傷害を受けた組織の外では生じない。したがって、神経発生は傷害部位で生じる。
【００３１】
ＣＤ９５Ｌがその最高発現を示す時、つまり急性傷害期において、アポトーシスは、ほとんどの場合、壊死、炎症、および活性酸素種産生の大規模な誘導を伴う。この状況では、ＣＤ９５Ｌにより誘導される神経組織発生プログラムは、変更されるか、または存在さえしないことがある。したがって、虚血後の神経幹細胞の死滅は、能動的な機序ではなく、単に神経組織発生の合図が存在しないことの結果であり得る。
【００３２】
下記に記載したデータは、ＣＤ９５Ｌが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＳＣのニューロン分化を誘導するための有用なツールであることとは別に、傷害を受けたＣＮＳを内因的に修復するためにｉｎ  ｖｉｖｏで使用できることを示唆する。
【００３３】
定義
以下、および本出願の全体にわたって示したように、本発明は、幾つかの定義を使用して本明細書中に記載される。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「約」は、当業者であれば理解し、使用される文脈に依存してある程度変動する。使用される文脈を与えられても当業者にとって明瞭でないこの用語の使用がある場合、「約」とは、その特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「治療有効量」という語句は、そのような治療を必要とする有意数の被検体に薬物がそのために投与される特定の薬学的応答を提供するその薬物用量を意味するものとする。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「患者」とは、治療を必要としている被検体、好ましくはヒトを指す。
【００３７】
「組換えタンパク質またはポリペプチド」とは、組換えＤＮＡ技術により産生された、つまり、所望のタンパク質またはポリペプチドをコードする外来性の組換えＤＮＡ発現構築体により形質転換された微生物または哺乳類の細胞から産生されたタンパク質またはポリペプチドを指す。ほとんどの細菌培養で発現されたタンパク質またはポリペプチドは、典型的にはグリカンを有しない。酵母で発現されたタンパク質またはポリペプチドは、哺乳動物細胞で発現されたタンパク質とは異なるグリコシル化パターンを有することがある。
【００３８】
「天然の」または「天然に生じる」タンパク質またはポリペプチドとは、自然界で生じる供給体から回収されたタンパク質またはポリペプチドを指す。「天然」または「天然に生じる」という用語には、天然のまたは天然に生じるポリペプチド、およびその断片が含まれ、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、アシル化、および切断を含むがそれらに限定されない、そのようなポリペプチドおよびその断片の翻訳後修飾が含まれる。
【００３９】
ＤＮＡまたはポリヌクレオチドの「コード配列」とは、適切な調節配列の支配下に置かれた際に、宿主細胞中でｍＲＮＡへ転写されポリペプチドに翻訳されるＤＮＡまたはポリヌクレオチドの配列である。コード配列の境界は、５’Ｎ−末端の開始コドンおよび３’Ｃ−末端の翻訳終止コドンである。コード配列には、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が含まれ得る。転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’側に位置する。
【００４０】
「ＤＮＡまたはポリヌクレオチド配列」とは、デオキシリボヌクレオチド（塩基はアデニン、グアニン、チミン、シトシン）のヘテロポリマーである。本発明のタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡまたはポリヌクレオチド配列は、合成ｃＤＮＡ由来ＤＮＡ断片および短鎖オリゴヌクレオチドリンカーから構築でき、組換えＤＮＡ発現ベクターで発現可能な合成遺伝子を提供する。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について述べる場合、配列は、ｃＤＮＡの非転写鎖に沿って５’から３’の方向の配列のみを提供する通常の習慣に従って、本明細書中に記載されることがある。
【００４１】
「組換え発現ベクターまたはプラスミド」とは、本発明のタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡの増幅または発現のいずれかのために使用される、複製可能なＤＮＡベクターまたはプラスミド構築体である。発現ベクターまたはプラスミドは、ＤＮＡ制御配列およびコード配列を含有する。ＤＮＡ制御配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節領域、およびエンハンサーが含まれる。本明細書中で定義されたような組換え発現系は、調節エレメントの誘導の際に、本発明のタンパク質またはポリペプチドを発現する。
【００４２】
「形質転換された宿主細胞」とは、外来性ＤＮＡで形質転換および形質移入された細胞を指す。外来性ＤＮＡは、宿主細胞のゲノムを形成する染色体ＤＮＡに組み込まれて（つまり、共有結合で連結されて）いてもよく、いなくてもよい。原核生物および酵母では、例えば、外来性ＤＮＡはプラスミドなどのエピゾームエレメント上で維持されてもよく、または安定的に染色体ＤＮＡへ組み込まれてもよい。真核細胞に関しては、安定的に形質転換された細胞とは、外来性ＤＮＡが染色体に組み込まれている細胞である。この安定性は、真核細胞株またはクローンが、外来性ＤＮＡを含有する娘細胞の個体群を複製を介して産生する能力により実証される。
【００４３】
本発明のポリペプチドを参照する場合、「類似体」、「断片」、「誘導体」、および「変異体」という用語は、本明細書中に記載されたような本発明のポリペプチドと実質的に類似した機能的活性または実質的に同一の生物学的機能または活性を保持する、そのようなポリペプチドの類似体、断片、誘導体、および変異体を意味する。
【００４４】
「類似体」には、本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列をその内に含む前駆ポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏの過程で自然に、または当技術分野で公知の手順、例えば酵素による切断または化学的切断などにより、前駆ポリペプチド分子を成り立たせている追加的なアミノ酸から切断できる。
【００４５】
「断片」とは、本発明のポリペプチドと実質的に類似した機能的活性または実質的に同一の生物学的機能または活性を保持する、本発明のポリペプチドの一部である。
【００４６】
「誘導体」には、本明細書中で開示した機能を実質的に保存する本発明のポリペプチドが含まれ、追加的な構造および付随的な機能、例えば、より長い半減期を有するペグ化ポリペプチドが含まれる。
【００４７】
「変異体」には、本発明の独創的な改良型ポリペプチドのアミノ酸配列に十分に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。「十分に類似した」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能的活性を有するように、第２のアミノ酸配列と比べて同一または等価である十分な数のまたは最小数のアミノ酸残基を含有する第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が同一である共通の構造ドメインを含有するアミノ酸配列が、本明細書中では十分に類似していると定義される。変異体には、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはその相補鎖によりコードされたポリペプチドの変異体が含まれる。そのような変異体は、一般的に本発明のポリペプチドの機能的活性を保持する。変異体には、突然変異誘発によりアミノ酸配列が異なるポリペプチドが含まれる。
【００４８】
「実質的に類似した機能的活性」および「実質的に同一の生物学的機能または活性」とは各々、各ポリペプチドの生物学的活性が同一の手順またはアッセイにより決定される場合に、生物学的活性の程度が比較されるポリペプチドにより実証されたその生物学的活性の約５０％から約１００％内以上、好ましくは約８０％から約１００％内以上、およびより好ましくは約９０％から約１００％内以上であることを意味する。
【００４９】
２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。１つのポリペプチドのアミノ酸は、同一であるかまたは保存的なアミノ酸置換である場合、第２のポリペプチドの対応するアミノ酸に類似している。保存的な置換には、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｄ．，Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８），およびＡｒｇｏｓ，Ｐ．（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７７９−７８５に記載されているものが含まれる。例えば、以下の群のうちの１つに属するアミノ酸は保存的な変更または置換を表す：
−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ：
−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；
−Ｖａｌ、ｌｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；
−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；
−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および
−Ａｓｐ、Ｇｌｕ
「哺乳動物」には、ヒト、ならびにネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、およびウサギなどの家畜化された動物が含まれる。
【００５０】
本明細書中で使用された他の全ての専門用語は、本発明が属する当業者により一般的に使用されるのと同一の意味を有する。
【００５１】
実施例は説明の目的のためだけであり、以下の特許請求の範囲により定義されたような本発明の趣旨および範囲を制限すると解釈すべきでないことが理解されるべきである。米国特許を含め、本明細書中で特定した全ての文献は、参考として本明細書中で明示的に援用される。
【００５２】
実施例
材料および方法
全虚血。手短に言えば、１０週齢の雌のＣ５７ＢＬ６マウスに麻酔をかけ、総頚動脈を露出させた。微小クランプ（Ｆｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ）を使用して両頚動脈を閉塞した。１０分後にクランプを取り除き、創傷を閉じた。全虚血を誘導した４８時間後に、マウスに麻酔をかけた。レンチウイルスベクターｐＥＩＧＷを用いて、５のＭＯＩでＮＳＣを感染させた。レンチウイルスは全て、過去に記述された方法を使用して増殖した。ｅＧＦＰの発現は、フローサイトメトリー解析により感染細胞中で確認した。ＮＳＣは、ＰＢＳで三回すすぎ、洗浄し、１μｌの培地当たり２５００００個の細胞濃度で再懸濁された。２μｌの細胞懸濁液を、Ｆｌｅｘｉ充填注射器（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）およびマイクロ４注射器ポンプコントローラー（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、２００ｎｌ／分の速さで、線条体に注射した。組織学的検査、ＦＡＣＳ解析、またはリアルタイムＰＣＲについては、１群当たり３匹のマウスを使用し、行動試験ついては、１群当たり１３匹のマウスを使用した。
【００５３】
リアルタイム定量的ＰＣＲ。細胞をプレーティングした２４時間後の細胞を、１活性化単位のＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で刺激した。４８時間後、ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。リアルタイム定量的ＰＣＲは、Ｓｙｂｒグリーンコアキット（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）およびウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を使用して実施した。全虚血後のＣＤ９５Ｌ誘導を決定するために、海馬を解剖して取り出し、ＲＮＡｌａｔｅｒ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）中に保存した。ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。リアルタイム定量的ＰＣＲは、Ｓｙｂｒグリーンコアキット（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）およびウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を使用して実施した。定量的リアルタイムＰＣＲ用に使用されたプライマーは、プライマー３ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｆｏｋｋｅｒ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３  ｗｗｗ．ｃｇｉ）を使用して設計した。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
レンチウイルスの感染。ＳＶＺ  ＮＳＣを、レンチウイルスベクターｐＥＩＧＷおよびｐＥＩＧＷ−ＧＳＫ３βＳ９Ａを用いて、５の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。プラスミドは、ｐＷＰＴＳ−ｅＧＦＰのＥＦ１αプロモーターとＷＰＲＥエレメントとの間のｅＧＦＰ配列を、ｐｌＲＥＳ２−ｅＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ドイツ国）由来のＩＲＥＳ−ｅＧＦＰカセットに置換することにより構築した。組換えレンチウイルスベクターｐＥＩＧＷ−ＧＳＫ３βＳ９Ａは、ｐｃＤＮＡ３  ＨＡ−ＧＳＫ３βＳ９Ａを使用して構築した。このベクターは、９位の残基においてセリンからアラニンへの置換を含有する、構成的に活性なＧＳＫ３β変異体（ＧＳＫ３βＳ９Ａ）をコードする。全ての導入遺伝子の発現は、ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析により感染細胞中で確認した。感染細胞のパーセンテージは７０〜９０％であった。
【００５６】
免疫染色。免疫組織化学法および免疫細胞化学法を過去に記述されたように実施した。使用した一次抗体は、抗ＧＦＰ（ニワトリ）（Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ）１：１０００、抗ＮｅｕＮ（マウス）、（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）１：２００、抗β−ＩＩＩ−チューブリン（マウス）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  １：２００）、抗ＧＦＡＰ（マウス）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  １：２００）、活性−β−カテニン（マウス）（Ｐ−Ｓｅｒ３７またはＰ−Ｔｈｒ４１；１：８００）（Ｕｐｓｔａｔｅ）、リン酸化ＧＳＫ３β（Ｐ−Ｓｅｒ９−ＧＳＫ３β、１：１０００）であった。Ａ．Ｋａｗａｋａｍｉにより開発されたマウスＰａｘ６抗体は、ＮＩＣＨＤの後援により開発され、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ、ＩＡ  ５２２４２により維持されているＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋから取得した。使用した二次抗体は、ヤギ抗ウサギアレクサ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）１：５００、ヤギ抗マウスローダミンＸ（Ｄｉａｎｏｖａ）１：２００、Ｄａｐｉ（Ｓｉｇｍａ）１：３０００、ロバ抗ニワトリＦＩＴＣ（Ｄｉａｎｏｖａ）１：２００であった。
【００５７】
ウェスタンブロット。リン酸化ＧＳＫ３β（Ｐ−Ｓｅｒ９−ＧＳＫ３β、１：１０００）、リン酸化ＡＫＴ（Ｐ−Ｓｅｒ４７３−ＫＴ、１：１０００）、トータルＡＫＴ（Ｔ−ＡＫＴ、１：１０００）、Ｓｒｃファミリーキナーゼ（Ｓｒｃ、１：１０００）、切断カスパーゼ３（１：２５０）、トータルβ−カテニン（１：１０００）およびリン酸化ｓｒｃ（Ｔｙｒ４１６）は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ／Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ｐｐ６０（ｃ−Ｓｒｃ）抗体はＵｐｓｔａｔｅｓから購入した。トータルＧＳＫ３β（Ｔ−ＧＳＫ３β、１：１０００）に対する抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから購入した。ＰＩ３Ｋ阻害剤Ｌｙ２９００５９（２５μＭ）およびＳｒｃファミリーキナーゼ阻害剤ＰＰ２（２０μＭ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。細胞は、治療に先立って３０分間（Ｌｙ２９４００２）および１時間（ＰＰ２）、阻害剤で事前インキュベートした。細胞を、さらなる生化学解析のために溶解した。タンパク質抽出およびイムノブロッティングを過去に記述されたように実施した。
【００５８】
ＰＩ３キナーゼ活性アッセイ。ＰＩ３Ｋ活性アッセイは、Ｅｃｈｅｌｏｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した（Ｋ−１０００）。ＰＩ３Ｋ活性は、メーカーの説明書に従って測定した。免疫沈降については、ｐ８５に対する抗体（２，５μｇ＋３０μｌのビーズ）および５０μｇのタンパク質を使用した。
【００５９】
免疫沈降。２×１０７細胞は、１活性化単位（ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４のバッチに依存して５〜４０ｎｇ／ｍｌ）のまたは５０００ｎｇ／ｍｌＣＤ９５Ｌ−Ｔ４のいずれかで、３７℃で１分間および５分間（そうでないと指定しないかぎり）処理したか、または未処理のままであり、ＰＢＳ＋ホスファターゼ阻害剤（ＮａＦ、ＮａＮ３、ｐＮＰＰ、ＮａＰＰｉ、β−グリセリンリン酸、各１０ｍＭおよび２ｍＭのオルトバナジン酸塩）で２回洗浄し、その後緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）、１％のトリトンＸ−１００（Ｓｅｒｖａ、ドイツ国ハイデルベルグ）、１０％のグリセロール、およびホスファターゼ阻害剤（ＮａＦ、ＮａＮ３、ｐＮＰＰ、ＮａＰＰｉ、β−グリセリンリン酸、各１０ｍＭおよび２ｍＭのオルトバナジン酸塩））で溶解したか（刺激性条件）、または処理せずに溶解した（非刺激性条件）。タンパク濃度は、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定した。１ｍｇのタンパク質を、５μｇの抗ＣＤ９５  ＡＢ  Ｊｏ２または５μｇの抗ホスホチロシン抗体（ｐＴｙｒ４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ））および３０μｌのプロテイン−Ａセファロースのいずれかで終夜免疫沈降した。ビーズは、２０容積分の溶解緩衝液で５回洗浄した。免疫沈降物を６０μｌのレムリ緩衝液と混合し、３０μｌを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは７，５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥのいずれかで分析した。続いて、ゲルを、Ｈｙｂｏｎｄニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ国フライブルク）に移し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中で２％のＢＳＡを用いて１時間ブロッキングし、２％のＢＳＡ  ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で一次抗体と共に４℃で終夜インキュベートした。ブロットは、メーカーのプロトコル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ国ロドガウ）に従い化学発光方法で現像した。
【００６０】
ｓｉＲＮＡ。ＳＶＺ  ＮＳＣは、ｐｐ６０−ｓｒｃ  ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）および非標的ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用し、メーカーの説明書に従って形質移入した。手短に言えば、細胞を、抗生物質を有しない通常培地で培養した。形質移入の前に、細胞を、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＡ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して２回洗浄した。形質移入混合物をメーカーの説明書に従って調製した。形質移入の６時間後に、細胞に通常培地を与えた。４８時間後、ｐｐ６０ｓｒｃノックダウンをウェスタンブロットで評価した。同時に、細胞をＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で刺激し、４８時間後にβ−ＩＩＩ−チューブリン陽性細胞について分析した。
【００６１】
フローサイトメトリー。表面マーカーの染色については、細胞を、トリプシンを使用して回収し、５％のＦＣＳを含有するＰＢＳで洗浄し、螢光色素標識抗体またはマッチングイソタイプと共に氷上で３０分間インキュベートした。使用した抗体は、抗マウスＣＤ９５ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）１：１００、抗マウスＣＤ９５Ｌ  ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）１：５０、イソタイプハムスターＰＥ（Ｃａｌｔａｇ）１：２０、α−Ａｐｏ１（１００μｇ／ｍｌ）、ヤギ抗マウスＰＥ  １：３３（Ｄｉａｎｏｖａ）であった。
【００６２】
細胞内マーカーの染色については、細胞を回収し、４％のＰＦＡで１０分間氷上で固定し、１０％のＦＣＳを有するＰＢＳ中の０，１％のサポニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＳＡＰ）を使用して洗浄および透過処理をした。細胞を、一次抗体またはイソタイプと共に３０分間氷上でインキュベートした。細胞をＳＡＰで３回洗浄し、二次抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＳＡＰで再び３回洗浄して分析した。使用した抗体は、抗β−ＩＩＩ−チューブリン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）１：１００、坑ＧＦＡＰ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）１：１００、およびイソタイプマウスＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）１：２０であった。二次抗体は、ヤギ抗マウスＰＥ  １：１００（Ｄｉａｎｏｖａ）であった。ＤＮＡ切断化を定量化するために、トリプシンで分離された細胞を遠心分離にかけ、７０％のエタノールで１時間−２０℃で洗浄および固定した。固定された細胞を、５０ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含有する低張性溶解緩衝液（０．１％のクエン酸ナトリウムおよび０．１％のトリトンＸ−１００）に再懸濁し、４℃で終夜インキュベートした。最後の洗浄後、試料は全て、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。
【００６３】
全虚血後のＣＤ９５Ｌ誘導を決定する場合は、海馬を解剖して取り出し、炎で研磨したパスツールピペット使用して、組織をトリプシン処理およびホモジネートした。その後、細胞を、抗マウスＣＤ９５Ｌ  ＰＥ（ＭＦＬ３）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）１：５０およびイソタイプハムスターＰＥ（Ｃａｌｔａｇ）１：２０と共に氷上で３０分間インキュベートした。洗浄後、試料は、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。実施された全てＦＡＣＳ解析では、少なくとも１０００００イベントをカウントした。
【００６４】
行動試験。全ての行動試験は、過去に記述したように実施した。改変型オープンフィールド検査は、４日間の馴化期間後ＮＳＣをマウスに注射した３週間後に実施した。ＮＳＣ注射の５週間後に自発的交替を検査した。自発的交替は、わずかに改変させた本質的にはＴ字迷路でのように実施した。１日当たり１セッションだけを行い、１セッションは４回の試行からなっていた。合計では、１匹のマウス当たり２回の試行を行った。食餌報酬は与えられず、マウスは食餌を奪われなかった。空間作業記憶を評価するＴ字迷路検査をＮＳＣ注射の３，５週後に行い、その後Ｙ字迷路検査（空間記憶）を行った。
【００６５】
カスパーゼ活性アッセイ。Ａｐｏｓｔａｔ細胞内カスパーゼ検出カスパーゼ活性アッセイは、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓから購入した。アッセイは、メーカーの説明書に従って実施し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。
【００６６】
統計分析。ｎ＜５の試料については、独立スチューデントｔ検定を使用して統計解析を実施した。ｎ＞５の試料については、クラスカル−ワリス解析を使用して統計分析を実施した。
【００６７】
マウス成体神経幹細胞培養。ＮＳＣを以前に記述されているように単離した30。手短に言えば、６週齢の雌のＣ５７ＢＬ６マウスを犠牲にして、海馬、ＳＶＺ、および脊髄由来組織を解剖して取り出した。組織は、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、グルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ヘパリン（２μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）および増殖因子ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）ならびにｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）で補完されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ドイツ国カールスルーエ）中で消化、洗浄、および培養した。培養７日後に、神経球体を遠心分離により回収し、トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して分離させ、再プレーティングした。細胞を毎週１回から2回継代した。実験に使用した細胞は、１０から１５代の間継代した。細胞を、１０μＭのレチノイン酸または１活性化単位のＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で刺激した。１活性化単位とは、ＧＳＫ３βのリン酸化を増加させるのに必要なＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の量と定義した。活性化単位は、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の各バッチについてその都度定義し、５〜４０ｎｇ／ｍｌで変動した。
【００６８】
ヒト神経前駆体産生および培養。ヒトＥＳ細胞株Ｈ９．２は、２０％のノックアウト血清代替物、１％の可欠アミノ酸、１ｍＭのｌ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（全てＧｉｂｃｏ）、および４ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中の、有糸分裂期に不活性化されたマウスの胚の線維芽細胞（ＭＥＦ）上で培養した。細胞は、１００単位のコラゲナーゼＩＶ（Ｇｉｂｃｏ）で１時間処理することにより、４日毎に定常的に継代した。ニューロン分化については、７日齢の胚様体を、ポリオルニチンでコーティングした組織培養プレートに移動させ、２５μｇ／ｍｌのインスリン、１００μｇ／ｍｌのトランスフェリン、３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ドイツ国ダイゼンホッフェン）、２．５μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ国ヴィースバーデン）および２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２で補完されたＤＭＥＭ：Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた。１０日以内に、神経管様構造が胚様体伸長において発生した。これらの構造体を機械的に単離し、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を含有するＮ２培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２、１ｘＮ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、２μｇ／ｍｌのヘパリン）中で、ペトリ皿内の浮遊神経球体として２週間振とう機上で増殖させた。神経前駆細胞は、トリプシン消化により単離細胞に分離し、ポリオルニチン／ラミニンがコーティングされた組織培養プレート上に、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２および１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下でプレーティングした。細胞は、１μｇ／ｍｌのαＡｐｏ１または０，５Ｕ／ｍｌのＣＤ９５Ｌ−ＬＺで、図示したように処理した15。
【００６９】
Ｅ１５初代ニューロン培養。初代ニューロンはＥ１５胚に由来し、記述されているように培養した15。手短に言えば、胚生期１５日目（Ｅ１５）のマウスの海馬を解剖し、トリプシン処理し、物理的に分離した。細胞をＨＢＳＳで洗浄し、４５００００個の海馬細胞または皮質細胞を、最小必須培地（ＭＥＭ）および１０％の加熱不活性化ウマ血清を含有する３ｃｍの組織皿にプレーティングした。細胞を３６．５℃で５％のＣＯ2中に保った。４時間後、培地を、Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）を有するＭＥＭ−Ｎ２培地を含有する培地と交換した。培養２日後に、ニューロンを、組換えＣＤ９５リガンド２００ｎｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）で５分間刺激した。
【００７０】
局所虚血の動物モデル。年齢（平均１００日）および体重（平均２４ｇ）に全て合致した野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、局所脳虚血を、以前に記述されたように中大脳動脈（ＭＣＡ）の閉塞により誘導した28。手術用ナイロン糸を頚動脈の管腔から前大脳動脈まで進めて、ＭＣＡの起始箇所を９０分間閉鎖した。ＭＣＡの血流は、ナイロン糸を引き抜くことにより回復させた。ケタミンおよびロムプン（各１５０ｍｇ／ｋｇ体重）により、深い麻酔に到達させた。動物は麻酔をかけたまま維持し、直腸温を、両外科的処置の間中およびＭＣＡ閉塞期間中から動物が麻酔から回復する時まで、加熱灯で３７℃またはその付近に調節した。６時間の再潅流期間後、動物を深く麻酔にかけ、断頭によって死亡させた。その後、虚血性および非虚血性（対側性）脳半球の異なった領域を、タンパク質生化学検査のためにホモジネートした。
【００７１】
ハツカネズミＣＤ９５−リガンド−Ｔ４（ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４）の遺伝子操作。ＴＮＦ−α構造体と同様にＴＲＡＩＬ／ＤＲ５複合体を、ハツカネズミＣＤ９５Ｌ−受容体結合ドメイン（ｍｍＣＤ９５Ｌ−ＲＢＤ）の発現戦略を開発するためのモデルとして使用した。三量体ｍｍＣＤ９５Ｌ−ＲＢＤの構造が、ＴＮＦ−α−またはＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ−構造（ＰＤＢエントリ：それぞれ、１ＴＮＦおよび１Ｄ０Ｇ／１ＤＵ３）に基本的に類似するならば31-33、ＴＲＡＩＬおよびＴＮＦ−α由来のＲＢＤのＮ−およびＣ−末端アミノ酸は逆平行β−ストランドを形成するという観察が説明される。このβ−ストランドの末端アミノ酸は、ＴＲＡＩＬ−ＲＢＤ三量体の中心軸付近のその分子の同一部位で互いに隣接して配置されている（図４）。これは、同一分子のＮ−およびＣ−末端をタンパク質ドメインの融合用（例えば、安定化モチーフまたはタグを付加するため）に使用することが、立体的な理由で相互に排他的であることを意味する。理想的な安定化モチーフは、リガンド／受容体相互作用部位と干渉するリスクを最小限にするために、ＣＤ９５Ｌ−三量体の中心軸付近でそのＮ−およびＣ−末端が安定化モチーフの反対側の部位にあるように配置される、小型の十分に定義された三量体であるべきである。これらの基準を満たす適切な三量体タンパク質ドメインは、バクテリオファージＴ４のフィブリチン由来のＴ４−フォルドンモチーフである34,35。
【００７２】
上記の言及を考慮して、Ｔ４−フォルドンを、ｍｍＣＤ９５Ｌ−ＲＢＤ（ｍｍＣＤ９５ＬのＧｌｕ１４０〜Ｌｅｕ２７９）のＣ−末端に融合させた。ＣＤ９５Ｌ−ＲＢＤとＴ４−フォルドンとの間に、可動性リンカーエレメント（ＧＳＳＧＳＳＧＳＳＧＳ）を設置し、ヘキサヒスチジンタグおよびストレプタグ−II（ＨＨＨＨＨＨＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ）をＣ−末端に付加した。このアフィニティータグを、可動性リンカーエレメント（ＳＧＰＳＳＳＳＳ）でＴ４−フォルドンに連結した。分泌に基づく発現を可能にするために、ヒトＩｇκ由来のシグナルペプチドをＮ−末端（Ｇｌｕ１４０）に融合した。ＩｇκリーダーがｍｍＣＤ９５Ｌ−ＲＢＤに融合されることにより形成されたシグナルペプチド切断の提唱部位は、ｍｍＣＤ９５ＬのＧｌｕ１４０に対応するグルタミンがＮ−末端に配置された最終産物を放出すると予期される。正確なプロセシングを確実にするために、プロセシング部位付近に単一のアミノ酸交換を導入した。すなわちＰｒｏ１４１をＬｅｕに変異させた（Ｐ１４０Ｌ）。図４に示したｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４−構築体のアミノ酸配列を逆翻訳し、そのコドン利用頻度を哺乳動物細胞に基づく発現のために最適化した。遺伝子合成は、ＥＮＴＥＬＥＣＨＯＮ  ＧｍｂＨ（ドイツ国レーゲンスブルク）により行われた。最終発現カセットは、プラスミドの固有なＨｉｎｄ−ＩＩＩ−部位およびＮｏｔ−Ｉ−部位を使用して、ｐＣＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘ−骨格にサブクローニングした。上述した特徴を全て含む模式図的な要約は、ＴＲＡＩＬ−Ｔ４−ＤＲ５−複合体について例示的に示されている（図４）。
【００７３】
マウスＣＤ９５−Ｔ４リガンド（ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４）の発現および精製。１０％のＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補完されたＤＭＥＭ＋グルタマックス（ＧｉｂＣｏ）で増殖されたＨｅｋ２９３Ｔ細胞を、ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４をコードするプラスミドで形質移入した。組換えｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４を含有する細胞培養上清を、形質移入３日後に回収し、３００ｇで遠心分離することにより清澄化し、その後０．２２μｍの滅菌フィルターでろ過した。アフィニティー精製の場合、１ｍｌのストレプタクチンセファロース（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ、ドイツ国ゲッティンゲン）をカラムに充填し、１５ｍｌの緩衝液Ｗ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ８．０）で平衡化した。細胞培養上清を４ｍｌ／分の流速でカラムにアプライした。続いて、カラムを緩衝液Ｗで洗浄し、緩衝液Ｅ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのデスチオビオチン、ｐＨ８．０）で、結合したｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４を溶出した。溶出画分のタンパク質含有は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により分析した。続いて、画分Ｅ２〜Ｅ４を限外ろ過により濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりさらに精製した。
【００７４】
ＳＥＣは、リン酸緩衝食塩水で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施し、ストレプタクチンで精製された濃縮ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４（Ｅ２〜Ｅ４）を、０．５ｍｌ／分の流速でＳＥＣカラムに負荷した。ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の溶出は、２８０ｎｍの吸光度によりモニターした。定義された三量体ｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４を精製するために、ＳＥＣの画分Ａ１１〜Ａ１５を貯留して濃縮し、貯留したタンパク質の少量を再びＳＥＣで分析した。
【００７５】
最終的に精製されたｍｍＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の見掛けの分子量は、ゲルろ過標準タンパク質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧｍｂＨ、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムの較正に基づいて決定した。
【００７６】
ＮＳＣを用いた実験の場合、活性化単位を定義した。１活性化単位（１Ｕ）とは、５分間でＡＫＴをリン酸化するのに必要なＣＤ９５Ｌ−Ｔ４の用量であった。活性化単位は、５〜４０ｎｇ／ｍｌとバッチ間で変動した。
【００７７】
実施例１
まず、神経前駆細胞を成体マウスのＳＶＺ、ＨＣ、または脊髄から単離した。全３領域に由来する神経前駆細胞は、表面にＣＤ９５を発現した（データ非表示）。他者により既に報告されているように13,14、これらの細胞は、ＣＤ９５媒介性ポトーシスに抵抗性を示した（データ非表示）。その後、代替的な非アポトーシスシグナル伝達がＣＤ９５の下流に存在し得るかどうかを検討した。最近、ＣＤ９５が、神経系で非アポトーシスシグナル伝達に関与する分子として注目されるようになった。
【００７８】
ＣＤ９５Ｌが神経前駆体の非アポトーシス機能も有するかどうかを研究するために、ＣＤ９５Ｌ刺激に際して増殖が変化するかどうかを決定した。ＣＤ９５Ｌまたは抗ＣＤ９５刺激抗体で神経前駆細胞を処理しても、未処理細胞と比較した際に増殖速度の著しい変化には繋がらなかった（データ非表示）。
【００７９】
実施例２
神経前駆細胞は、自己再生する能力および種々の神経系列に分化する能力により特徴づけられる。ＣＤ９５Ｌが後者に影響を及ぼすかどうかを判断するために、ニューロンマーカーβ−ＩＩＩ−チューブリンおよび神経膠マーカーＧＦＡＰを検査した。
【００８０】
神経ＳＶＺ前駆体では、増殖因子の存在下でＣＤ９５が誘発されると、β−ＩＩＩ−チューブリンの発現が著しく増加した（図１ｂ）。この効果は、ＣＤ９５Ｌおよび抗ＣＤ９５刺激抗体の両方で見られた。さらに、ＣＤ９５Ｌ誘導性神経発生は、ＣＤ９５Ｌ（Ｎｏｋ１）に対する中和抗体で阻止できた（データ非表示）。レチノイン酸（ＲＡ）は、ＤＧにおける成体神経発生の重要な調整因子であり、成体神経幹細胞を含む多数の異なる幹細胞をニューロンへと分化させるために一般的に使用される18。それと一致して、ＨＣから単離された神経前駆体をレチノイン酸およびＣＤ９５Ｌで処理した際に、β−ＩＩＩ−チューブリンの発現増加が認められた（図１ｃ）。
【００８１】
ＣＤ９５Ｌがニューロン分化の誘導だけでなく神経膠分化の誘導にも関わっているかどうかを評価するために、ＧＦＡＰの発現を検査した。ＣＮＴＦを星状細胞分化の誘発因子として使用した。ＣＮＴＦは、ＧＦＡＰを発現する星状細胞への迅速で効率的な神経幹細胞の分化を誘導することが示されている。ＣＮＴＦで神経前駆細胞を処理すると、ＧＦＡＰの発現増強に繋がる。ＣＤ９５ＬまたはＲＡ処理は、ＧＦＡＰ発現を変化させなかった（データ非表示）。
【００８２】
これらの結果は、ＣＤ９５Ｌが神経膠分化の誘導に関与しないことを示す。次に、ｌｐｒマウスから単離されたＳＶＺ幹細胞を使用した。Ｌｐｒマウスは、１９番染色体上のＴｎｆｒｓｆ６（ＣＤ９５）遺伝子に、初期転移因子ＥＴｎの挿入により引き起された自然突然変異を保有する20。したがって、ｌｐｒマウスは、細胞表面のＣＤ９５発現レベルの低減（＜１０％）を示す（データ非表示）。
【００８３】
これらの細胞で、発明者らは、ＲＡでのみβ−ＩＩＩ−チューブリンの発現増加を認めたが、抗ＣＤ９５ＡＢでは認められなかった。これは、これらの細胞自体は分化障害を示さないことを示す（データ非表示）。Ｅ１１胚の脳から単離された細胞は、ＣＤ９５レベルの低減を示し、β−ＩＩＩ−チューブリンレベルの発現増加を示さなかった（データ非表示）。これは、ＣＤ９５Ｌを媒介とした非アポトーシスシグナル伝達が、Ｅ１１神経幹細胞においては作用しないことを示唆する。対照的に、後期胚形成期、すなわちＥ１５から単離された細胞もまた、ＣＤ９５刺激に際してβ−ＩＩＩ−チューブリンの発現増加を示した（データ非表示）。
【００８４】
実施例３
ＣＤ９５Ｌがヒトニューロン幹細胞（ＮＳＣ）においてもニューロン分化を誘導できるかどうかを検討するために、胚性幹細胞由来のヒト神経前駆体を使用した。ヒト神経前駆細胞は、マウスＮＳＣと比較して、同様のレベルでＣＤ９５を発現した（データ非表示）。ＣＤ９５の誘発は、ヒト神経前駆細胞においてアポトーシスを誘導しなかった（データ非表示）。これらのデータにより、ヒト神経前駆細胞は、ＣＤ９５Ｌにより誘導されるアポトーシスに対しても感受性のないことが確認された。
【００８５】
したがって、この集団の系列分化を評価した（図１ｄ）。神経前駆細胞の分化は、一般的に、自己再生および増殖を支援する増殖因子の除去へと続く。それと一致して、増殖因子除去の４日後、β−ＩＩＩ−チューブリンの発現により評価されたように、幹細胞は自然とニューロンを生じさせた。ＣＤ９５ＬとＣＤ９５（α−Ａｐｏ１）に対するアゴニストＡＢとの両方で処理すると、ニューロン数の著しい増加に帰着した（図１ｄ）。図１ｃに示したニューロンマーカーβ−ＩＩＩ−チューブリンの相対的蛍光の増加は、ＣＤ９５Ｌにより媒介されることが知られている効果である神経突起の分岐増加によるものではなく、実際にニューロン数が増加したことによるものであった（データ非表示）。増殖因子除去の７日後および２１日後にも、発明者らは、ニューロン数の増加を観察できた（図１ｃ）。これらの知見は、ＣＤ９５Ｌが、ヒト神経幹細胞においても神経発生を誘導することを示す。
【００８６】
実施例４
神経発生は、多数の異なる転写因子および遺伝子を伴う多段階の過程である。幹細胞研究での中心的問題の１つは、神経幹細胞の維持および分化を媒介する遺伝子プログラムを理解することであり続けている。ＣＤ９５の誘発によりニューロンへの分化決定に繋がる事象をさらに特徴づけるために、発明者らは、幹細胞の維持および分化に関与することが知られている因子のｍＲＮＡレベルを決定した。ニューロン分化および神経膠分化の誘発因子を、比較のために使用した。刺激した４８時間後に、ｍＲＮＡレベルを分析した。抗ＣＤ９５抗体で処理された細胞は、ネスチンおよびサイクリンＤ２の発現を強く減少させた（図２）。ネスチンとは、よく研究された神経幹細胞マーカーである21。サイクリンとは、細胞周期調節の主要な関与物質である22。データは、ＣＤ９５刺激が幹細胞特性の喪失に帰着し、神経前駆細胞において、分化の前提条件である細胞周期からの離脱を促進することを実証する。したがって、同様の効果はＲＡ処理で見られた。これらのデータにより、ＣＤ９５Ｌは、選択されたニューロンマーカー（例えば、β−ＩＩＩ−チューブリン）の発現を前駆細胞において促進しないが、実際にはニューロン分化の過程を誘導することも示唆される。
【００８７】
抗ＣＤ９５ＡＢで処理された細胞においては、Ｎｏｔｃｈリガンドジャグ１の顕著な下方調節も認められた。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、ニューロン分化を阻害することが知られており、神経幹細胞増殖において重要な役割を有する。Ｎｏｔｃｈリガンドの下方調節は、神経幹細胞がＮｏｔｃｈシグナル伝達を回避し、幹細胞増殖から分化への移行を起こすことを可能にするための手段であり得る。ジャグ１ｍＲＮＡレベルも、ＣＮＴＦでの刺激では減少したが、ＲＡでは減少しなかった。これらの結果は、神経幹細胞におけるＣＤ９５刺激が、幹細胞の維持および増殖に関与する機序の下方調節に繋がることを示す。
【００８８】
抗ＣＤ９５抗体で神経幹細胞を処理すると、ダブルコルチン様キナーゼ１（ＤＣＬＫ）の発現減少、およびニューロゲニン（Ｎｇｎ１）の顕著な上方調節にさらに帰着した（図２およびデータ非表示）。神経前駆細胞では、ｂＨＬＨ転写因子Ｎｇｎ１は神経発生を促進し、同時にグリア新生を阻害する。ＤＣＬＫは新皮質の活性神経発生領域で発現され、ＤＣＬＫ機能のｉｎ  ｖｉｖｏ喪失は、ＳＶＺにおける神経前駆細胞のニューロン分化をもたらす。データは、ＣＤ９５刺激が前神経遺伝子発現プログラムを活性化することを実証する。それと一致して、ＲＡでの処理は同様の効果を示したが、Ｎｇｎ１発現の程度は、ＲＡで処理した細胞と比較してＣＤ９５Ｌにおいて遥かに高かった。これは、ＣＤ９５Ｌがより強力な神経発生誘発因子であることを示す。対照的に、ＣＮＴＦ処理はＤＣＬＫ発現に影響を与えず、Ｎｇｎ１ｍＲＮＡのほとんど完全な喪失に帰着し、ＣＤ９５Ｌはニューロン分化を促進するが神経膠分化は促進しないことをさらに示唆した。
【００８９】
抗ＣＤ９５抗体で神経前駆細胞を処理した後、脳由来神経因子（ＢＤＮＦ）の強い誘導が認められた（図２）。ＢＤＮＦ発現も、ＲＡではなくＣＮＴＦでの処理で誘導された。ＢＤＮＦとは、ニューロン細胞の細胞生存および分化を促進する、よく研究されたニューロトロフィンである。ＢＤＮＦは、それ自体では成体神経幹細胞の培養にほとんど影響を与えないが、ＲＡと協働して神経発生を調節する。ＲＡは、ニューロンの発生運命の探知を容易にし、Ｔｒｋ受容体の誘導により細胞をＢＤＮＦに対して感作する。その後、ＢＤＮＦは、未熟なニューロンの成熟を促進する。ＣＤ９５刺激によるＢＤＮＦの誘導は、発明者らの実験で見られたように、神経前駆細胞がさらなる成熟ニューロンへとさらに分化することを説明できる。ＣＤ９５刺激は、２重の役割を有すると仮定される。すなわちＣＤ９５刺激は、ＲＡと同様の方法で神経前駆細胞を予備刺激し、ＢＤＮＦを介して、新しく産生されたニューロンのさらなる成熟に繋がる。本実験系では、外来性ＢＤＮＦで神経幹細胞を処理しただけでは、β−ＩＩＩ−チューブリンの発現は増加しなかった（データ非表示）。
【００９０】
実施例５
神経発生の別の重要な調節因子は、転写因子Ｐａｘ６である。培養された神経球体では、Ｐａｘ６は、ニューロン系列へと向かう神経前駆細胞の進行を促進する。上衣下帯（ＳＥＺ）由来の前駆細胞が吻側細胞移動路（ＲＭＳ）に沿って遊走する際に、Ｐａｘ６のｉｎ  ｖｉｖｏ発現が最初に検出される。いったんＰａｘ６が発現されると、細胞は不可逆的にニューロン系列に分化を決定すると考えられる。
【００９１】
Ｐａｘ６ｍＲＮＡレベルを分析した際、発明者らは、細胞を抗ＣＤ９５ＡＢで処理した３時間後にＰａｘ６の誘導を検出した（データ非表示）。したがって、ＣＤ９５刺激の３時間後に、Ｐａｘ６の核内トランスロケーションおよび核内蓄積が認められた（データ非表示）。Ｐａｘ６の核内蓄積は、刺激の５時間後にヒト神経幹細胞でも見出された（データ非表示）。核内のＰａｘ６は、前神経遺伝子の転写因子として機能する。これらの結果は、ＣＤ９５Ｌ処理が、Ｐａｘ６の発現および核内トランスロケーションを誘導し、したがって、神経幹細胞のニューロン系列への分化決定をもたらすことを示す。
【００９２】
要約すると、結果は、ＣＤ９５Ｌが神経発生の強力な誘発因子であることを示す。神経幹細胞におけるＣＤ９５刺激は、幹細胞マーカーの喪失、細胞周期からの離脱、幹細胞増殖に関与するシグナル伝達の抑制、および神経組織発生シグナル伝達の誘導に帰着した。
【００９３】
実施例６
ＣＤ９５Ｌの発現は、例えば脳卒中における脳に対する傷害の際に誘導される。脳卒中は、その後遊走して傷害を受けた脳領域に統合するＮＳＣの増殖を伴う。しかしながら、新生ニューロンは、ほぼ全てが５週後に死滅する。対照的に、非神経組織発生領域に位置する選択されたニューロンに標的アポトーシスを誘導すると、成体神経幹細胞の増殖、遊走および統合に帰着する6。それと一致して、Ｅ１７ニューロンは、アポトーシス性皮質へ移植される場合、統合して機能的な成熟ニューロンへと分化するが、壊死性皮質へ移植される場合はそうはならない。
【００９４】
内因性ＣＤ９５Ｌがｉｎ  ｖｉｖｏで神経発生を誘導できるかどうかを試すために、さらなる組織損傷、壊死、および炎症が最小限であるが、海馬ＣＡ１領域のニューロンがごく少数しかアポトーシスを起こさないという事実によって特徴づけられる、全虚血の動物モデルを使用した。このモデルでは、ＣＡ１領域におけるＣＤ９５およびＣＤ９５Ｌ発現の著しい増加が認められる。全虚血の誘導４８時間後に、ｗｔまたはｌｐｒマウスのＳＶＺ由来のＧＦＰ発現神経幹細胞を、ｗｔマウスの線条体に注射した。幹細胞注射の７日後、ｗｔまたはｌｐｒ神経前駆細胞のいずれかを受容したマウスの両群において、海馬に多数のＧＦＰ陽性細胞を検出できた。ＤＧおよびＣＡ１領域の門部における細胞数の分析は、群間の相異を明らかにしなかった（データ非表示）。ＧＦＰおよびニューロンマーカーＮｅｕＮに対して二重に陽性である細胞の数に、相異は検出されなかった。ＧＦＰ＋／ＮｅｕＮ＋細胞は、マウスのＣＡ１領域および門部でかろうじて見出された（データ非表示）。
【００９５】
特筆すべきことには、注射の２１日または１０週後に、２群のマウス間でＣＡ１領域における著しい相異が観察され、ｗｔ細胞を受容したマウスでは、ＧＦＰ＋細胞がＣＡ１領域で検出された。それらはニューロンの表現型（ＮｅｕＮ＋）を獲得し、軸索が細胞層から突出した典型的なニューロンの形態およびＣＡ１領域の細胞性の改善を示した（データ非表示）。
【００９６】
これに反して、ｌｐｒ細胞を受容したマウスでは、発明者らはかろうじてＧＦＰ＋細胞を見出し、ＧＦＰ＋／ＮｅｕＮ＋陽性細胞はＣＡ１領域において検出できなかった。（データ非表示）。２群のマウスの門部を検査した際、有意な相異は検出されなかった（データ非表示）。これは、ＣＡ１領域における細胞数の減少がｌｐｒ細胞の生存率不良のためのではなかったことを示唆する。
【００９７】
実施例７
細胞生存、遊走および神経発生に関与するシグナル伝達経路は、ＰＩ３Ｋ経路である。ＰＩ３ＫはＡＫＴ／ＰＫＢを活性化し、それは次いでＧＳＫ３βをリン酸化し、それによりそれを不活化できる。これにより、β−カテニンは、分解を回避し核内の転写因子として作用することが可能になる。ＰＩ３Ｋシグナル伝達が、β−カテニンの遺伝子発現および核内へのトランスロケーションの観察された変化に関与し得るかどうかを調べるために、発明者らは、ＧＳＫ３βおよびＡＫＴのリン酸化を測定した。ＣＤ９５刺激は、ＡＫＴのリン酸化、したがって活性化に帰着した（データ非表示）。ＡＫＴのリン酸化は、近接した用量範囲でのみ検出された。活性化用量を超えた用量は、ＡＫＴのリン酸化に帰着せず、したがって釣鐘形の活性化キネティクスを記述した。ＡＫＴのリン酸化は、５分および１５分でピークを示す２つの波を示した。また、その下流の標的ＧＳＫ３βの９位セリン残基におけるリン酸化が検出された。優性活性型のＧＳＫ３βを発現する細胞は、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４処理に際しβ−ＩＩＩ−チューブリンの発現を増加させなかった（４，６０％±０，２５対４，７９％±０，１９）。これは、ＧＳＫ３βのリン酸化が、ＣＤ９５Ｌを介するニューロン分化の誘導に必要であることを示す。
【００９８】
ＧＳＫ３βのリン酸化は、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２で細胞を処理することにより阻止できた。したがって、１ＵのＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で細胞を処理した１分後および５分後に、ＰＩ３Ｋ活性が増加した（１対１，３８％±０，１２および１対１，５３％±０，１８）。ＣＤ９５は受容体型チロシンキナーゼでないため、ＣＤ９５をＰＩ３Ｋに結び付ける有力な候補は、Ｓｒｃファミリーキナーゼの非受容体型チロシンキナーゼであり得る。ＣＤ９５に誘導されるＰＩ３Ｋの活性化が、Ｓｒｃファミリーのアダプター分子の１つにより媒介され得るかどうかを調べるために、発明者らはＳｒｃ−ファミリーキナーゼ阻害剤ＰＰ２を使用した。ＮＳＣをＰＰ２で処理すると、ＣＤ９５Ｌにより誘導されたＧＳＫ３βおよびＡＫＴのリン酸化が阻害された。
【００９９】
実施例８
ＣＤ９５がどのようにしてＰＩ３Ｋシグナル伝達を活性化し得るのかをさらに検討するために、発明者らは、免疫共沈降実験を実施した（データ非表示）。発明者らは、ＣＤ９５に対する抗体を用いて、Ｓｒｃファミリーメンバーｐｐ６０と同様にＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニットを共免疫共沈降させることができた。ＣＤ９５へのｐｐ６０およびｐ８５の結合は、１ＵのＣＤ９５Ｌ−Ｔ４でＮＳＣを刺激した１分後および５分後に増加した。ｐｐ６０−ｓｒｃは、活性化ループにあるチロシン残基（Ｙ４１６）のリン酸化により活性化される。したがって、発明者らは、リン酸化チロシン残基に対する抗体を用いて免疫沈降実験を実施した。次にＹ４１６を特異的に認識する抗体で免疫沈降物を探索した。リン酸化され、それにより活性化されたｓｒｃの増加が、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４で刺激した５分後に観察された。１０００倍のより高用量のＣＤ９５Ｌ−Ｔ４（５μｇ／ｍｌ）を使用しても、リン酸化されたｓｒｃの増加はなかった。これは、ＣＤ９５Ｌ非アポトーシスシグナル伝達が、低用量範囲で作用することを示す。ｐｐ６０−ｓｒｃが、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の活性化およびニューロン分化の誘導に必要かどうかを検討するために、ｐｐ６０−ｓｒｃに対するｓｉＲＮＡでＮＳＣを形質移入した。４８時間で、効率的なノックダウンをウェスタンブロットおよびＦＡＣＳ分析により確認した。形質移入用試薬だけを含有する細胞または対照ｓｉＲＮＡで形質移入された細胞では、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４での刺激は、β−ＩＩＩ−チューブリン陽性細胞の細胞数の増加に帰着した（それぞれ、４，８９％±１，６１対１７，１５％±０，６５および４，６９％±０，１６対１８，０７％±４，０９）。この増加は、ｐｐ６０−ｓｒｃ  ｓｉＲＮＡで形質移入された細胞では阻止された（４，３１％±０，４３対５，２３％±０，７９）。これは、ｐｐ６０−ｓｒｃが、ＣＤ９５刺激後に観察されたニューロン分化表現型に必要であることを示す。
【０１００】
実施例９
発明者らは、ＮＳＣがＣＤ９５Ｌで刺激された際にアポトーシスを検出できなかったため、ＤＩＳＣ構成要素がこれらの細胞で効率的に動員されたかどうかを検討した。成体の脳において、ＣＤ９５へのＦＡＤＤ動員は、９０分間の中大脳動脈閉塞および６時間の虚血半球の再潅流後に容易に検出できた（データ非表示）。初代Ｅ１５ニューロンまたはＮＳＣ上でＣＤ９５を刺激した際、発明者らは、ＦＡＤＤの効率的な動員を検出できなかった。この結果は、Ｅ１５ニューロンまたはＮＳＣのような未熟な発生系では、ＣＤ９５の刺激が効率的なＦＡＤＤ動員に帰着しないことを示す。この線に沿って、発明者らは、ＮＳＣ上でＣＤ９５を刺激した際、細胞死執行カスパーゼ−３の切断を見出さなかった。さらに、ＣＤ９５Ｌ−Ｔ４またはＣＤ９５に対する抗体でＮＳＣを刺激した際、発明者らは、活性カスパーゼに陽性の細胞をかろうじて検出できた。
【０１０１】
これらの細胞は全くＣＡ１分子層に統合せず、発明者らは、ＧＦＰおよびＮｅｕＮに対して二重の陽性の示す細胞を検出しなかった。この観察がｌｐｒ細胞の生存率不良のためであることを除外するために、発明者らは、２群のマウスの歯状回の門部を検査した。両群のマウスで、ＧＦＰ陽性細胞は、同程度の傷害の１０週後に歯状回に統合した。これは、ＣＡ１領域での細胞数の減少が、ｌｐｒ細胞の生存率不良のためではなかったことを示す。要約すると、これらの知見は、ＣＤ９５シグナルが、ニューロンへの分化決定および脳修復のために新たに産生されたＮＳＣのさらなる成熟を誘導することを実証した。
【０１０２】
実施例１０
移植されたＮＳＣが機能的であったかどうか調べるために、発明者らは、それらが海馬破壊に関連した行動障害を改善できるかどうかを検討した。Ｔ字迷路に置かれると、ラットまたはマウスは、偶然を超えた有意性でアーム間を交替した。この自発的交替は、海馬破壊を有する動物では減少する。虚血の５週後に、発明者らは、虚血マウスは未処理対照と比較して著しく低減された成功率を示したことを見出した（５５，７６％±３，９対６６，４４％±４，５８）。自発的交替行動におけるこの障害は、ｗｔＮＳＣを注射したマウスで減少した。これは、ｗｔＮＳＣが、脳回路に統合することができ、虚血誘導性障害を改善できることを示す（６４，４２％±２，７７）。対照的に、ｌｐｒＮＳＣを受容したマウスは、食塩水を注射した虚血動物と比較可能な自発的交替率を減少させた（５０，９６％±３，３）。明らかに、ｌｐｒＮＳＣは、損傷を受けたＣＡ１に統合できず、したがって行動障害を回復できなかった。追加セッションで食餌報酬を与えると、全ての群の動物は、同様の方法で課題を学習できた。発明者らは、改変オープンフィールド検査で、これらの動物の探索行動および空間認識をさらに調べた。オープンフィールドおよび物体探索における運動活性では、群間に有意差はなかった。これは、自発的交替で見られた効果が、異なる群のマウスの運動活性または探索行動の変化のためではなかったことを示す。置換えられたかまたは交換された物体に対するマウスの認識を分析すると、ある傾向を観察できた。ｌｐｒＮＳＣを受容したマウスは、ｗｔＮＳＣを受容したマウスまたは対照動物と比較して、置換えられたかまたは交換された物体の探索により少ない時間を費やした。これは、非連想空間記憶の低減を示す。要約すると、発明者らは、ｌｐｒＮＳＣで処理されたマウスが、Ｔ字迷路およびＹ字迷路で見られたように（データ非表示）課題学習は損なわれないものの、Ｔ字迷路およびオープンフィールド検査で観察されたような自発的行動における障害を有したことを見出した。これらの障害は、ｗｔＮＳＣを受容したマウスでは回復された。これは、ＣＤ９５がＮＳＣ由来の新生ニューロンの産生、統合および機能に必要であることを示す。
【０１０３】
考察
いくつかの研究は、ｉｎ  ｖｉｖｏのＳＶＺおよび海馬のＤＧ領域で新しいニューロンを産生するＮＳＣの能力を例証している27。これらの２つの神経組織発生領域外でＮＳＣにより新しいニューロンが産生される第１の証拠は、Ｍａｇａｖｉらにより提供された6。それらは、一重項酸素産生により皮質ニューロンの選択的アポトーシス性変性を誘導した。このアポトーシス死は、移植された神経前駆体および内因性神経前駆体のニューロン分化を誘導した。Ｅ１７ニューロンは、アポトーシス性皮質へ移植される場合、統合して機能的な成熟ニューロンへと分化するが、壊死性皮質へ移植される場合はそうはならない。それと一致して、壊死およびアポトーシスの両方による大規模な細胞死により特徴づけられる中大脳動脈閉塞のモデルでは、ほぼ全ての新生ニューロンは５週後に死滅する。Ｍａｇａｖｉらは、アポトーシスが、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４／−５などの、ニューロン分化を制御する因子の発現を誘導し11、著者が述べるには、「初期の新皮質分化を許可および／または指示する神経塑性のプログラムの抑制」を開放すると推測した。しかし、アポトーシスに繋がる一重項酸素の産生は、ＣＤ９５Ｌの発現を誘導するとも報告されている。したがって、発明者らのデータは、アポトーシス関連神経組織発生シグナルの候補リストに新しい分子を加える。
【０１０４】
これらの観察は、ニューロン発生運命の決定およびサブタイプの特定が、微小環境−ニッチによりもたらされるシグナルにより制御されることを実証する。歯状回の神経組織発生ニッチでは、Ｗｎｔシグナル伝達は成体神経発生を導く重要な調節因子であることが近年特定された31。それと一致して、ＣＤ９５の欠如は、移植されたＮＳＣのＤＧへのホーミングおよび統合を妨げなかった。対照的に、発明者らのデータは、傷害誘導性神経発生にとってＣＤ９５系が不可欠であることを実証する。
【０１０５】
発明者らは、ＣＤ９５ライゲーションが、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の活性化およびβ−カテニンの核内へのトランスロケーションに帰着し、その後前神経の遺伝子発現が続くことを示した。傷害ニッチにおいてＰＩ３Ｋシグナル伝達が主要な役割を果たすことを支持する幾つかの観察がある。つまり脳卒中は、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２により阻止できる、ＮＳＣにおけるＡＫＴのリン酸化を増加させる。さらに、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の阻害は、移植片培養の傷害部位への神経芽細胞の遊走を妨害する。この線に沿って、薬理学的治療、例えばＥＰＯまたはスタチンにより活性化される新脈管形および神経発生は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達により媒介される。発明者らの結果は、今やＣＤ９５系を、「傷害ニッチ」内のＰＩ３Ｋシグナル伝達の主要な調節因子として確立する。興味深いことには、Ｗｎｔ−シグナル伝達およびＰＩ３Ｋシグナル伝達の両方は、ＧＳＫ３βの不活性化に収束する。しかし、ＰＩ３Ｋは、９位セリンのリン酸化によりＧＳＫ３β活性を阻止し、Ｗｎｔは阻止しない。ＧＳＫ３β阻害のこれらの様々な手段が、様々なニューロン発生運命およびサブタイプの特定に関与するかどうかは、これからの研究主題であり続けている。
【０１０６】
発明者らは、ＣＤ９５が、ｐｐ６０−ＳｒｃおよびＰＩ３Ｋを介して神経発生のシグナル伝達をすること提案する。過去において、幾つかの報告は、ＣＤ９５誘導性シグナル伝達におけるチロシンリン酸化のための重要な役割を指摘している。しかしながら、これらの予備報告は、ＣＤ９５誘導性チロシンリン酸化がＣＤ９５媒介性アポトーシスの前提条件であることを示唆した。この線に沿って、ホスファターゼＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、およびＳＨＩＰは、ｓｒｃ−相同性ドメイン２（ＳＨ２）を介して、ＣＤ９５のＤＤのホスホチロシン含有モチーフに結合し、生存因子開始経路に対抗することを見出した。発明者らは、今や、ＣＤ９５に対するｐｐ６０およびｐ８５の新規な結合を記述している。ＣＤ９５のＰＩ３Ｋ活性化複合体において、別のアダプター分子が未だに欠けているかどうかは、よく分かっていない。あるいは、ｐｐ６０およびＰ８５は、ＣＤ５のＤＤにおいて、過去に特定されたホスホチロシン含有モチーフを介してＣＤ９５と直接相互作用し、その後互いに活性化している可能性がある。
【０１０７】
しかし、ＣＤ９５Ｌが疾患脳において神経発生を誘導し上方調節される場合、なぜ傷害後の神経発生がほとんどの場合でそれほど顕著でないのだろうか。考え得る説明は、ＣＤ９５Ｌがその最高発現を示す時、つまり急性傷害期において、アポトーシスには、ほとんどの場合、壊死、炎症、および活性酸素種産生の大規模な誘導を伴うということであり得る。炎症は、神経発生を損なうことが知られている。細菌性リポ多糖体（ＬＰＳ）の輸液による炎症の誘導は、反応性神経膠症に繋がり、約８５％の新生ＤＧ細胞の減少に帰着する。また、ＮＳＣでは、活性酸素種（ＲＯＳ）は、細胞の機能を複雑に調節する手段であると考えられ、細胞密度を増殖状態に結びつける。その一方で、放射線傷害に伴うＲＯＳのレベルが上昇する場合、特にＮＳＣは高い感受性を有する。ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は両方とも、放射線が、これらの細胞でのＲＯＳ上昇を誘導することによりＮＳＣを枯渇させることを示した。
【０１０８】
脳卒中または脊髄損傷に引き続き、ＣＤ９５およびＣＤ９５Ｌは上方調節され細胞死に繋がる。ＣＤ９５Ｌの阻害は、細胞が傷害後にアポトーシスを起こすのを予防し、脊髄損傷の場合には運動機能の回復、または虚血の後では生存率の増加に帰着する。ＣＮＳに対する傷害はＮＳＣの増殖を伴う。ＮＳＣはＣＤ９５受容体を発現するが、本明細書で報告したようにおよび他者により既に報告されたように、ＮＳＣはＣＤ９５媒介性アポトーシスに抵抗性を有する。傷害を受けた成熟ニューロンにおけるＣＤ９５シグナルアポトーシスおよびＮＳＣにおけるＰＩ３Ｋ活性化を引き起こすのは何か。ＮＳＣは、「細胞死誘導シグナル伝達複合体」（ＤＩＳＣ）を誘導するのに必要なアダプター分子を欠如している可能性がある。実際、ＣＤ９５Ｌでの処理は、ＮＳＣのアダプター分子ＦＡＤＤまたは発生中のニューロンの効率的な動員を誘導しなかった。しかしながら、完全に分化したニューロンでは、ＦＡＤＤは虚血後にＣＤ９５へと動員された。
【０１０９】
本明細書において、発明者らは、全虚血後にＣＤ９５Ｌが神経発生を推進し、虚血誘導性行動傷害の回復に繋がることを実証した。ＣＤ９５Ｌは損傷を受けたニューロンを死滅させ、神経前駆細胞による置換を促進し、新しく産生されたニューロンのさらなる成熟を支援さえできる。しかしながら、全虚血後には、新しく産生される内因性ＮＳＣの数が限定要因であると考えられる。それと一致して、ＥＧＦおよびｂＦＧＦ誘導性のＮＳＣ増殖は、虚血誘導性の空間学習障害の部分的な回復に帰着した。対照的に、脳卒中および外傷などの急性神経学的侵襲には、壊死およびアポトーシスが伴う周囲組織の重度な破壊が伴うだけでなく、それらの大部分がニューロンにならないＮＳＣの著しい増殖も伴う。炎症、壊死、およびＲＯＳの存在下でＣＤ９５媒介性神経発生を阻止する因子を明らかにすることは、ＣＤ９５の使用が、内因的に産生されたＮＳＣを利用して傷害を受けたＣＮＳを修復することを可能にする。あるいは、虚血もしくは外傷性ＣＮＳ傷害または神経変性疾病の亜急性期のより許容的と考えられる環境におけるＣＤ９５Ｌの過剰発現は、現在のＮＳＣ由来の神経発生を増加させることによりニューロンの喪失に対抗し得る。この場合、成体ＣＮＳにおいては、ＣＤ９５発現が傷害の急性期でのみ検出されることに留意すべきである。そうでなければ、検出可能なＣＤ９５の発現はなく、成熟ニューロンがＣＤ９５媒介性アポトーシスを起こすリスクはない。したがって、傷害の亜急性期では過剰発現戦略を試みることができる。
【０１１０】
要約すると、発明者らのデータは、ＣＤ９５Ｌ系が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＳＣのニューロン分化を誘導するための有用なツールであることとは別に、ＮＳＣを使用して傷害を受けたＣＮＳを修復するための非常に大きな潜在能力を有し得ることを示唆する。
【０１１１】
結論
本明細書中で提供されたデータは、アポトーシスそれ自体が実際にニューロン分化を制御できるという証拠を提供する。ＣＮＳへの傷害後、ＣＤ９５Ｌは損傷を受けたニューロンを死滅させ、同時に、神経前駆細胞による置換を促進し、新しく産生されたニューロンのさらなる成熟を支援さえできる。
ＣＤ９５Ｌがその最高発現を示す時、つまり急性傷害期において、アポトーシスには、ほとんどの場合、壊死、炎症、および活性酸素種産生の大規模な誘導が伴う。この状況では、ＣＤ９５Ｌにより誘導される神経組織発生プログラムは、変更されるか、または存在さえしないことがある。したがって、虚血後の神経幹細胞の死滅は、能動的な機序ではなく、単に神経組織発生の合図の非存在の結果であり得る。
【０１１２】
上記に記載したデータは、ＣＤ９５ＬまたはＣＤ９５Ｌ／ＣＤ９５系の他の活性化因子が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＳＣのニューロン分化を誘導するための有用なツールであることとは別に、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用して傷害を受けたＣＮＳを内因的に修復できることを示唆する。
【０１１３】
本発明の趣旨または範囲から逸脱せずに、本発明の方法および組成物に種々の改変および変化を成し得ることは、当業者であれば明白であろう。したがって、本発明は、本発明の改変および変化が、添付の特許請求の範囲内およびそれらの等価物の範囲内であれば、それらを包含することが意図される。
【０１１４】
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【０１１５】
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【０１１６】
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【０１１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ｇ】
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【図４ｈ】
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【図４ｉ】
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【国際調査報告】
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