(57)【要約】  本発明は、ＩｇＥに対する結合要素、特に抗体分子に関する。これらの結合要素はとりわけ、アレルギーおよび喘息を含むＩｇＥにより媒介される障害の処置に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンＥとの結合に関して抗体３３と競合する、免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素。
【請求項２】
ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞中２５ｎｇ／ｍｌのＩｇＥにより誘発されるカルシウムシグナル伝達阻害のＩＣ５０幾何平均が１ｎＭ未満である、請求項１に記載の単離された結合要素。
【請求項３】
カルシウムシグナル伝達阻害のＩＣ５０幾何平均が０.２ｎＭ未満である、請求項２に記載の単離された結合要素。
【請求項４】
ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のセットを含み、該ＣＤＲセットが参照ＣＤＲセットから８以下のアミノ酸置換を有し、
ＨＣＤＲ１が配列番号２７９のアミノ酸配列を有し；
ＨＣＤＲ２が配列番号２８０のアミノ酸配列を有し；
ＨＣＤＲ３が配列番号２８１のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ１が配列番号２８４のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ２が配列番号２８５のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ３が配列番号２８６のアミノ酸配列を有する、
ヒト免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素。
【請求項５】
前記アミノ酸置換が５以下のアミノ酸置換である、請求項５に記載のヒト免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素。
【請求項６】
ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のセットを含み、ＨＣＤＲ３が配列番号２８１のアミノ酸配列を含む、単離された結合要素。
【請求項７】
ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のセットを含み、該ＣＤＲセットにおいて、
ＨＣＤＲ１が配列番号２７９のアミノ酸配列を有し；
ＨＣＤＲ２が配列番号２８０のアミノ酸配列を有し；
ＨＣＤＲ３が配列番号２８１のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ１が配列番号２８４のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ２が配列番号２８５のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ３が配列番号２８６のアミノ酸配列を有する、
請求項５に記載の単離された結合要素。
【請求項８】
以下の置換：
Ｈ、ＬまたはＳで置換されたＫａｂａｔ残基９５；
Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＦで置換されたＫａｂａｔ残基９６；
Ａ、ＹまたはＦで置換されたＫａｂａｔ残基９７；
Ｖ、ＰまたはＦで置換されたＫａｂａｔ残基９８；
ＡまたはＹで置換されたＫａｂａｔ残基９９；
Ｇ、ＩまたはＳで置換されたＫａｂａｔ残基１００
の１以上を有する抗体１  ＨＣＤＲ３(配列番号５)を含む、単離された結合要素またはＶＨドメイン。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の結合要素。
【請求項１０】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された結合要素をコードする単離された核酸分子。
【請求項１１】
請求項１１に記載の核酸分子で形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された結合要素を生産する方法であって、請求項１２に記載の宿主細胞を該結合要素の生産のための条件下で培養することを含む、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された結合要素と薬学上許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
薬剤として用いるための、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１５】
ＩｇＥに関連する障害を処置するための、請求項１４の組成物の使用。
【請求項１６】
前記障害がアレルギー、喘息または気管支炎の１以上である、請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
前記障害がアレルギー性鼻炎、アレルギー性接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー反応、食物アレルギー、蕁麻疹、炎症性腸疾患、好酸球性胃腸炎、薬剤性発疹、アレルギー性眼症、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、気道過敏症、化粧品アレルギー、薬剤性アレルギー、薬剤性過敏性症候群、金属アレルギー、職業性過敏性肺炎、慢性過敏性肺炎、寒冷過敏症、蠕虫感染誘発性過敏症、ラテックスアレルギーおよび枯草熱の１以上である、請求項１４に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＥに対する結合要素、特に抗体分子に関する。この結合要素は、とりわけ、アレルギーおよび喘息を含むＩｇＥにより媒介される障害の処置に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＥは免疫グロブリンファミリーの一員であり、喘息、食物アレルギー、１型過敏症および副鼻腔炎症などのアレルギー性反応を媒介する。
【０００３】
ＩｇＥは、Ｂ細胞により分泌され、Ｂ細胞の表面で発現する。要するに、ＩｇＥは、短い膜結合領域を介して成熟ＩｇＥ分子に連結された膜貫通ドメインによってＢ細胞膜に固定されている。ＩｇＥはまた、そのＦｃ領域により、低親和性ＩｇＥ受容体(ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ２３としても知られる)を介してＢ細胞、単球、好酸球および血小板と結合し得る。アレルゲンに曝された際、アレルゲン特異的ＩｇＥを産生するＢ細胞がクローン的に増幅される。その後、Ｂ細胞によりアレルゲン特異的ＩｇＥが循環中へ放出され、そこでＦｃεＲＩＩを介してＢ細胞が結合するとともに、高親和性受容体(ＦｃεＲＩ)を通じて肥満細胞および好塩基球が結合する。それにより、このような肥満細胞および好塩基球はアレルゲンに感作される。次にそのアレルゲンに曝されると、肥満細胞および好塩基球上のＦｃεＲＩが架橋され、それによりヒスタミンならびに臨床的過敏症およびアナフィラキシーの一因となる他の因子の放出が活性化される。
【０００４】
ＦｃＥＲＩＩの同時阻害を伴って、または伴わずにＦｃＥＲＩとの結合およびＦｃＥＲＩを介した機能活性を阻害する結合要素は、アレルギーおよび喘息などのＩｇＥ介在疾患の阻害に有用である。
【０００５】
一般に、ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩはＩｇＥ定常(Ｆｃ)ドメイン内の認識部位と結合すると理解されている。これらの認識部位を同定するために種々の研究が行われてきた。例えば、ＩｇＥ分子の特定の部分に相当するペプチドがＩｇＥ−受容体結合の競合的阻害剤として(Burt et al., Eur. J. Immun, 17:437-440 [1987]; Helm et al., Nature, 331:180-183 [1988]; Helm et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:9465-9469 [1989]; Vercelli et al., Nature, 338:649-651 [1989]; Nio et al., Peptide Chemistry, 203-208 [1990])またはＩｇＥ−受容体相互作用を遮断し得る抗ＩｇＥ抗体を惹起するために(Burt et al., Molec. Immun. 24:379-389 [1987]; Robertson et al., Molec. Immun., 25:103-113 [1988]; Baniyash et al., Molec. Immun. 25:705-711 [1988])用いられている。
【０００６】
より最近では、Xolair(登録商標)(オマリズマブ(Omalizumab))が生産され、喘息患者の処置のために市販されている。Xolair(登録商標)は、ヒトＩｇＥと選択的に結合し、それによりＩｇＥと、肥満細胞および好塩基球の表面上の少なくともＦｃεＲＩとの結合を減らすヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ＦｃεＲＩ担持細胞上での表面結合ＩｇＥを減らすことにより、Xolair(登録商標)はアレルギー性反応のメディエーターの放出の程度をいくらか減らす。Xolair(登録商標)は国際特許出願公報：ＷＯ９３／０４１７３およびＷＯ９７／０４８０７に開示されている。
【０００７】
しかしながら、この有望な治療戦略を改良するためには、Xolair(登録商標)よりも高い親和性および／または効力を有するものなど、ＩｇＥに対する他の結合要素が必要である。
【発明の概要】
【０００８】
適切に設計された選択技術およびアッセイを用いることで、本発明者らは、肥満細胞上に存在する高親和性ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩとの結合を阻害するＩｇＥｂに対する結合要素を開発した。
【０００９】
本発明の結合要素はＩｇＥとＦｃεＲＩの結合を阻害する。結合の阻害は、例えばＩｇＥを中和するなどの直接的阻害によるものであり得る。本発明の結合要素は一般に、ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナル伝達アッセイによって測定したときに約１０ｎＭ未満のＩＣ５０で、別の実施態様では、ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナル伝達アッセイによって測定したときに約３.０ｎＭまたは約１ｎＭ未満または約０.５ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＩｇＥを中和する。
【００１０】
本発明の別の実施態様では、免疫グロブリンＥに特異的な単離された結合要素が提供され、該結合要素はＲＢＬ−ＥＲ５１細胞において２５ｎｇ／ｍｌのＩｇＥにより誘導されたカルシウムシグナル伝達の阻害に対して１ｎＭ未満、あるいはまた０.６ｎＭ未満、０.５ｎＭ未満、０.４ｎＭ未満、０.３ｎＭ未満、０.２５ｎＭ未満または０.２ｎＭ未満のＩＣ５０幾何平均を有する。
【００１１】
本発明の結合要素はまた、非ヒトＩｇＥ(ヒト以外の種において天然に存在するＩｇＥ相同分子種を意味する)と結合し、それを中和することもできる。
【００１２】
本発明の結合要素は通常、他の免疫グロブリンよりもＩｇＥに特異的であり、従って、ＩｇＥと選択的に結合する。このような選択性は、例えば標準的な競合アッセイで判定または証明することができる。
【００１３】
これらの結合要素は、ＩｇＥにより媒介される障害、特にアレルギーおよび喘息を処置および／または予防するのに有用である。
【００１４】
これらの結合要素は、哺乳類において循環遊離ＩｇＥを減らすのに有用であり、また、in vivoまたはin vitroのいずれかでアレルゲンにより誘発される肥満細胞の脱顆粒を阻害するのに有用である。
【００１５】
これらの結合要素はさらにin vivoまたはin vitroのいずれかで、ＦｃＥＲＩＩの同時阻害を伴って、または伴わずに、ＦｃεＲ１により媒介される生物学的応答を阻害するために有用である。
【００１６】
本発明の結合要素はまた、喘息またはアレルギー性患者由来のサンプルなどの目的のサンプルにおいてＩｇＥの存在もしくは量、またはアレルゲン特異的ＩｇＥの存在もしくは量を検出するためなどに診断有用性を有する。
【００１７】
本発明の結合要素はXolair(登録商標)のものとは異なるＩｇＥのエピトープと結合する。よって、Xolair(登録商標)と比較した場合、本発明の結合要素は、ＩｇＥとの結合に関して他の抗ＩｇＥ抗体と競合する能力が異なる。
【００１８】
結合要素により結合される残基の配列を決定するためには、いずれの好適な方法を用いてもよい。例えば、本明細書の他所に詳細に記載されているＰＥＰＳＣＡＮに基づく酵素結合免疫アッセイ(ＥＬＩＳＡ)などのペプチド結合スキャンを用いてもよい。ＰＥＰＳＣＡＮ  Ｓｙｓｔｅｍｓにより提供されている種類のものなどのペプチド結合スキャンでは、抗原に由来する短い重複ペプチドが結合要素との結合に関して体系的にスクリーニングされる。これらのペプチドは支持体表面と共有結合させてペプチドアレイを形成してもよい。ペプチドは直鎖であっても、または拘束コンフォメーションであってもよい。拘束コンフォメーションはペプチド配列の各末端に末端Ｃｙｓ残基を有するペプチドを用いて製造することができる。Ｃｙｓ残基は、そのペプチドがループ型コンフォメーションで保持されるように支持体表面に直接的または間接的に共有結合させることができる。よって、本方法に用いられるペプチドは、抗原のフラグメントに相当するペプチド配列の各末端に付加されたＣｙｓ残基を有し得る。また、ダブルループ型ペプチドを用いてもよく、この場合にはＣｙｓ残基はペプチド配列の中央または中央付近に付加的に配置される。これらのＣｙｓ残基は、中央のＣｙｓ残基の各側に１つのループを有するダブルループ型コンフォメーションを形成するように支持体表面に直接的または間接的に共有結合させることができる。ペプチドは合成によって作り出すこともでき、従って、Ｃｙｓ残基は、ＩｇＥ配列には天然に存在しないにもかかわらず、所望の位置に操作することができる。所望により、直鎖および拘束ペプチドは双方ともペプチド結合アッセイでスクリーニングすることができる。ペプチド結合スキャンは、結合要素が結合するペプチドのセットを同定すること(例えば、ＥＬＩＳＡを使用)(ここで、これらのペプチドはＩｇＥのフラグメント(ＩｇＥの約５、１０または１５の連続する残基のペプチド)に相当するアミノ酸配列を有する)、および結合要素により結合される残基のフットプリント(このフットプリントは重複ペプチドに共通する残基を含む)を決定するためにペプチドをアラインすることを含み得る。
【００１９】
代わりに、または加えて、ペプチド結合スキャン法は、結合要素が結合するペプチドを、少なくとも所定のシグナル：ノイズ比で同定することを含み得る。結合を測定するのに好適なペプチド結合スキャンの詳細は当技術分野で公知である。当技術分野で周知の、抗体により結合された残基を決定するため、および／またはペプチド結合スキャン結果を確認するために使用可能な他の方法としては、部位特異的突然変異誘発、水素重水素交換、質量分析、ＮＭＲおよびＸ線結晶学が含まれる。
【００２０】
本発明の結合要素はＩｇＥ変異体と結合し、および／またはそれを中和してもしなくてもよい。よって、本発明の結合要素は、ＩｇＥ変異体とＦｃＥＲＩＩの結合の同時阻害を伴って、または伴わずに、ＩｇＥ変異体とＦｃεＲ１の結合を阻害してもしなくてもよい。
【００２１】
ＩｇＥの直鎖エピトープ配列は、例えば、単離されたペプチドフラグメントまたはそれを含むポリペプチドとして、本発明の結合要素を同定、製造、単離および／または試験するために使用可能である。
【００２２】
以下にさらに詳細に記載されるように、本発明の結合要素は高い効力でＩｇＥを中和することが示されている。中和とは、ＩｇＥの生物活性の阻害を意味する。本発明の結合要素はＩｇＥの１以上の生物活性を中和するが、一般に、ＩｇＥとＦｃεＲ１の結合を阻害する。
【００２３】
ＩｇＥとＦｃＥＲＩＩの結合の同時中和を伴った、または伴わないＩｇＥとＦｃεＲ１の結合の中和は、所望により、アレルゲンにより誘発される肥満細胞の脱顆粒などのその受容体の生物活性の関数として測定可能である。
【００２４】
本発明の結合要素によりＩｇＥの中和を測定するのに好適なアッセイとしては、リガンド受容体生化学アッセイおよび表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)、例えばＢＩＡＣＯＲＥが含まれる。
【００２５】
生物活性の阻害は部分的であってもまたは完全なものであってもよい。結合要素は、ＩｇＥ生物活性、このような受容体結合または肥満細胞の脱顆粒を、結合要素の不在下での活性の１００％、あるいはまた少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害し得る。
【００２６】
結合要素の中和効力は、通常、特に断りのない限り、ＩＣ５０値(ｎＭ)で表される。機能アッセイでは、ＩＣ５０は、生物学的応答をその最大の５０％低下させる結合要素の濃度である。リガンド結合研究では、ＩＣ５０は、受容体結合を最大特異的結合レベルの５０％低下させる濃度である。ＩＣ５０は、最大生物学的応答の％を結合要素濃度のｌｏｇの関数としてプロットし、Ｐｒｉｓｍ(GraphPad)などのソフトウエアプログラムを用い、そのデータにシグモイド関数を当てはめてＩＣ５０値を求めることにより計算することができる。効力は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書に記載もしくは言及されているような１種以上のアッセイを用いて決定または測定することができる。
【００２７】
結合要素の中和効力は幾何平均として表すことができる。本明細書において幾何平均(geomean)(幾何平均(geometric mean)としても知られる)は、１０を底として変換し直したデータセットの対数値の平均を意味する。これには、例えば少なくとも２回、好ましくは少なくとも５回、より好ましくは少なくとも１０回の反復など、少なくとも２回の測定である必要がある。当業者ならば、反復数が多いほど幾何平均値が確固としたものになることが分かるであろう。反復数の選択は当業者の裁量に任される。
【００２８】
本明細書に記載のアッセイにおける結合要素によるＩｇＥ活性の中和は、その結合要素がＩｇＥと結合し、それを中和することを示す。結合要素とＩｇＥの結合を決定するために用い得る他の方法としては、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィーおよび生化学アッセイが含まれる。
【００２９】
２種のＩｇＥに対する結合要素の交差反応性の程度を評価するためには、第一の種(例えば、ヒト)由来のＩｇＥを用いたアッセイにおいて算出された結合要素の中和効力を、第二の種(例えば、カニクイザル)由来のＩｇＥを用いた、同様の条件下での同様のアッセイにおける結合要素の中和効力と比較すればよい。あるいは、交差反応性は、本明細書の他所により詳細に記載されているように競合結合アッセイで評価することもできる。
【００３０】
本発明の結合要素は、ヒトＩｇＥ結合または生物学的アッセイの方がヒト以外の種に由来するＩｇＥを用いた同様のアッセイよりも大きな中和効力を持ち得る。よって、ヒトＩｇＥを用いたアッセイにおける結合要素の中和効力は、ヒト以外の種に由来するＩｇＥを用いた同様のアッセイの場合よりも大きいものであり得る。ヒトＩｇＥ結合または生物学的アッセイでの効力は、例えば、カニクイザルのＩｇＥを用いた同様のアッセイよりも約１０倍大きく、または他の実施態様では、約２５倍または約１２５倍大きい。より具体的には、ヒトＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナル伝達アッセイでの効力は、２５ｎｇ／ｍｌ濃度のヒトＩｇＥに関して決定し、他の点では同様の条件下で１００ｎｇ／ｍｌのカニクイザルＩｇＥを用いた場合の抗力と比較すればよい。ヒトＩｇＥとカニクイザルＩｇＥを用いた同様のＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナル伝達アッセイで得られたデータの例を表５ｂに示す。
【００３１】
本発明の結合要素は、他種のＩｇＥよりもヒトＩｇＥに対して強い親和性を持ち得る。ヒトＩｇＥに対する結合要素の親和性は、例えば、カニクイザルＩｇＥに対するよりも約５倍強く、他の実施態様では、約１０倍強いものであり得る。
【００３２】
本発明の結合要素は、２５ｎｇ／ｍｌ濃度のヒトＩｇＥで、ＩｇＥ中和効力または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を持ち得る。あるいは、ＩＣ５０は約３ｎＭ未満である。他の実施態様では、ＩＣ５０は約１ｎＭ未満、または約０.５ｎＭ未満、または約０.２ｎＭ未満である。
【００３３】
ヒトＩｇＥに対するＩｇＥ結合要素の結合動態および親和性(平衡解離定数ＫＤとして表される)は、例えば、表面プラズモン共鳴(ＢＩＡＣＯＲＥ)を用いて決定することができる。本発明の結合要素のヒトＩｇＥに対する親和性(ＫＤ)は通常約８０ｎＭ未満であり、いくつかの実施態様では、ＫＤは約１０ｎＭ未満であり、他の実施態様では５ｎＭ未満であり、他の実施態様では２ｎＭ未であり、他の実施態様では１ｎＭ未満である。カニクイザルＩｇＥに対する親和性は通常、約１５ｎＭ未満である。
【００３４】
in vivoにおいて内因性ＩｇＥはグリコシル化可能であり、したがって、グリコシル化されたヒトＩｇＥはヒトの療法のための治療標的となる。細菌に由来し、グリコシル化され得ない組換えヒトＩｇＥも本明細書に記載のアッセイにおいて使用可能であるが、本発明の結合要素は、Ｕ２６６.Ｂ１などの骨髄腫細胞系統により生産されたＩｇＥなど、グリコシル化されたヒトＩｇＥと結合し得る。グリコシル化ヒトＩｇＥはin vivoヒト適用の標的抗原であることから、これは本発明の結合要素の大きな利点となる。
【００３５】
本発明の結合要素は抗体分子、好ましくはヒト抗体分子またはヒト化抗体分子を含み得る。本発明の一態様において、抗体分子はモノクローナル抗体である。
【００３６】
抗原結合部位は一般に重鎖可変(ＶＨ)および軽鎖可変(ＶＬ)免疫グロブリンドメインによって形成され、相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる６つの表面ポリペプチドループによって形成された抗原結合インターフェースを伴う。ＶＨ(ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３)およびＶＬ(ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３)にはそれぞれ３つのＣＤＲが存在し、フレームワーク領域(ＦＲ)が伴う。
【００３７】
本発明の結合要素は通常、抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。本発明のＶＨドメインはＨＣＤＲセットを含み、ＶＬドメインはＬＣＤＲセットを含む。抗体分子はＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とフレームワークを含む抗体ＶＨドメインを含み得る。それは、その代わりにまたはそれに加えて、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とフレームワーク抗体を含むＶＬドメインも含み得る。本発明の抗体ＶＨドメイン(配列番号：２、２９８、３３８、３１８、３２８、１１８、３０９、２８、６８、８、４８、２８８、１５８、２６８、１６８、３８、１２８、７８、１３８、１８８、１９８、９８、１８、８８、５８、１０８、２１８、２４８、２２８、２３８、１７８、２０８、２７８、１４８、４２６、２７８および２５８)とＶＬドメイン(配列番号：３５３、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６、４０８、４１０、４１２、４１４、４１６、４１８、４２０、４２２、４３１および４２４)とＣＤＲ(配列番号：３−５、９−１１、１４−１６、１９−２１、２４−２６、２９−３１、３４−３６、３９−４１、４４−４６、４９−５１、５４−５６、５９−６１、６４−６６、６９−７１、７４−７６、７９−８１、８４−８６、８９−９１、９４−９６、９９−１０１、１０４−１０６、１０９−１１１、１１４−１１６、１１９−１２１、１２４−１２６、１２９−１３１、１３４−１３６、１３９−１４１、１４４−１４６、１４９−１５１、１５４−１５６、１５９−１６１、１６４−１６６、１６９−１７１、１７４−１７６、１７９−１８１、１８４−１８６、１８９−１９１、１９４−１９６、１９９−２０１、２０４−２０６、２０９−２１１、２１４−２１６、２１９−２２１、２２４−２２６、２２９−２３１、２３４−２３６、２３９−２４１、２４４−２４６、２４９−２５１、２５４−２５６、２５９−２６１、２６４−２６６、２６９−２７１、２７４−２７６、２７９−２８１、２８４−２８６、２８９−２９１、２９４−２９６、２９９−３０１、３０４−３０６、３０９−３１１、３１４−３１６、３１９−３２１、３２４−３２６、３２９−３３１、３３４−３３６、３３９−３４１、３４４−３４６、３５０−３５２、３５４−３５６および４２７−４２９)の例は本開示の位置をなす添付の配列表に挙げられている通りである。さらなるＣＤＲは下記および表１に開示されている。本明細書に開示されているＶＨおよびＶＬ配列、ＣＤＲ配列、ＣＤＲセットおよびＨＣＤＲセットおよびＬＣＤＲセットは全て本発明の態様および実施態様を表す。
【００３８】
本明細書に記載されている、「ＣＤＲセット」はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。よって、ＨＣＤＲセットはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を表し、ＬＣＤＲセットはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を表す。特に断りのない限り、「ＣＤＲセット」はＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを含む。
【００３９】
あるいは、本発明の結合要素は非抗体分子内に抗原結合部位を含んでもよく、通常、１以上のＣＤＲ、例えば、非抗体タンパク質スキャフォールド内のＣＤＲセットによって提供される。
【００４０】
本明細書に記載されている、親抗体分子としては、表１に示されるようなＣＤＲ配列セットを有するものが単離された(表１の抗体１を参照)。至適化の過程を通じて、本発明者らは、親ＣＤＲ配列に由来し、表１に示されている位置に修飾を有するＣＤＲ配列番号を有する抗体クローン２〜３６番のパネルを作製した。よって、例えば、表１から、抗体２が親ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３配列を有し、Ｋａｂａｔ残基５６がＲで置換された親ＨＣＤＲ２配列、Ｋａｂａｔ残基３１がＴで置換された親ＬＣＤＲ１、およびＫａｂａｔ残基５３がＲで置換されたＬＣＤＲ２を有することが分かる。
【００４１】
本明細書には、ＨＣＤＲ１が配列番号３(Ｋａｂａｔ残基３１〜３５)であり、ＨＣＤＲ２が配列番号４(Ｋａｂａｔ残基５０〜６５)であり、ＨＣＤＲ３が配列番号５(Ｋａｂａｔ残基９５〜１０２)であり、ＬＣＤＲ１が配列番号３５４(Ｋａｂａｔ残基２４〜３４)であり、ＬＣＤＲ２が配列番号３５５(Ｋａｂａｔ残基５０〜５６)であり、ＬＣＤＲ３が配列番号３５６(Ｋａｂａｔ残基８９〜９７)である、表１(抗体１)に示されるような親ＣＤＲセットを含む結合要素が記載される。本発明の結合要素はまた、１以上のＣＤＲが１以上のアミノ酸付加、置換、欠失および／または挿入を有する、表１に示されるような親結合要素であってもよい。一実施態様では、結合要素は８個までのアミノ酸付加、置換、欠失および／または挿入を有する。
【００４２】
本発明の結合要素は、本明細書に記載されているとおりＣＤＲの１つまたは組合せを含み得る。
【００４３】
例えば、本発明の結合要素またはＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ残基３１がＧで置換されているか、またはＫａｂａｔ残基３３がＰで置換されているか、またはＫａｂａｔ残基３４がＶで置換されている親ＨＣＤＲ１を含み得る(表１参照)。
【００４４】
本発明の結合要素またはＶＨドメインは以下の修飾：
Ｋａｂａｔ残基５１がＶで置換されている；
ＧがＫａｂａｔ残基５２Ｂにある；
Ｋａｂａｔ残基５３がＧで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基５６がＲで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基６３がＡで置換されている
の１以上を有する親ＨＣＤＲ２を含み得る。
【００４５】
ある特定の実施態様では、結合要素は親ＨＣＤＲ２のＫａｂａｔ残基５２ＢにＧ、そしてＫａｂａｔ残基５６を有し、これらの結合要素はＩｇＥに対して低いＫＤおよび／またはＩｇＥにより媒介される生物活性の阻害に関して高い効力を示す傾向がある。親ＨＣＤＲ２のＫａｂａｔ残基５２ＢにＧ、そしてＫａｂａｔ残基５６にＲを有するいくつかの抗体を示す表１を参照。
【００４６】
本発明の結合要素またはＶＨドメインは以下の置換：
ＬまたはＳで置換されたＫａｂａｔ残基９５；
Ｓ、Ｔ、ＷまたはＦで置換されたＫａｂａｔ残基９６；
ＹまたはＦで置換されたＫａｂａｔ残基９７；
ＰまたはＦで置換されたＫａｂａｔ残基９８；
Ｙで置換されたＫａｂａｔ残基９９；
ＩまたはＳで置換されたＫａｂａｔ残基１００
の１以上を有する親ＨＣＤＲ３を含み得る。
【００４７】
本発明の結合要素またはＶＨドメインは以下の置換：
Ｈ、ＬまたはＳで置換されたＫａｂａｔ残基９５；
Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＦで置換されたＫａｂａｔ残基９６；
Ａ、ＹまたはＦで置換されたＫａｂａｔ残基９７；
Ｖ、ＰまたはＦで置換されたＫａｂａｔ残基９８；
ＡまたはＹで置換されたＫａｂａｔ残基９９；
Ｇ、ＩまたはＳで置換されたＫａｂａｔ残基１００
の１以上を有する親ＨＣＤＲ３(配列番号５)を含み得る。
【００４８】
結合要素またはそのＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ残基３１および／またはＫａｂａｔ残基３３がＴで置換されている親ＬＣＤＲ１を含み得る。例えば、ＬＣＤＲ１のＫａｂａｔ残基３１がＴである結合要素はＩｇＥに対して高い親和性および／またはＩｇＥにより媒介される生物活性の阻害において高い効力を示す傾向があった。表１に示されるように、抗体２〜９、１１〜１９、２２〜３０および３２〜３６は全てＬＣＤＲ１のＫａｂａｔ残基３１にＴを有する。他の抗体またはＬＣＤＲ１配列も、例えば部位特異的突然変異誘発を用い、この残基にＴを有するように操作することができる。
【００４９】
結合要素またはそのＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ残基５３がＲで置換され、かつ／またはＫａｂａｔ残基５６がＰで置換されている親ＬＣＤＲ２を含み得る。
【００５０】
結合要素またはそのＶＬドメインはまた、１〜５置換など、１以上のアミノ酸付加、置換、欠失および／または挿入を有する親ＬＣＤＲ３も含み得る。
【００５１】
別の実施態様では、本発明は、ＨＣＤＲ１が配列番号２７９のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２が配列番号２８０のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３が配列番号２８１のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ１が配列番号２８４のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２が配列番号２８５のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３が配列番号２８６のアミノ酸配列を有する結合要素である。例えば、表１の抗体３３参照。本発明のさらに他の実施態様は、ヒトＩｇＥとの結合に関して表１の抗体３３と競合し得る抗体分子などの結合要素である。
【００５２】
本発明は、抗体１〜３６のいずれかのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／もしくはＨＣＤＲ３および／または抗体１〜３６のいずれかのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／もしくはＬＣＤＲ３、例えば、表１に示されている抗体１〜３６のいずれかのＣＤＲセットを含む結合要素を提供する。この結合要素はこれらの抗体の１つのＶＨ  ＣＤＲセットを含み得る。所望によりそれはまた、これらの抗体の１つのＶＬ  ＣＤＲを含んでもよく、このＶＬ  ＣＤＲはＶＨ  ＣＤＲと同じ抗体に由来するものでも、または異なる抗体に由来するものでもよい。抗体１〜３６のいずれかのＨＣＤＲセットを含むＶＨドメインおよび／または抗体１〜３６のいずれかのＬＣＤＲセットを含むＶＬドメインも本発明により提供される。
【００５３】
一般に、ＶＨドメインをＶＬドメインと対合して抗体抗原結合部位を提供するが、以下にさらに述べるとおりＶＨまたはＶＬドメイン単独を、抗原と結合させるのに用いてもよい。抗体１  ＶＨドメイン(表３参照)を抗体１  ＶＬドメイン(表２参照)と対合すると、抗体１  ＶＨドメインとＶＬドメインの双方を含む抗体抗原結合部位が形成される。本明細書に開示されている他のＶＨおよびＶＬドメインにも類似の実施態様が提供される。他の実施態様では、抗体１  ＶＨを抗体１  ＶＬ以外のＶＬドメインと対合する。軽鎖の無差別性は当技術分野で十分確立されている。ここでもまた、本発明により、本明細書に開示されている他のＶＨおよびＶＬドメインに類似の実施態様が提供される。よって、親の、または抗体２〜３６のいずれかのＶＨを、親の、または抗体２〜３６のいずれかのＶＬと対合することができる。
【００５４】
結合要素は、開示されているＨおよび／またはＬ  ＣＤＲセット内に２０、１６、１０、９といった多くの、またはそれより少ない、例えば、１、２、３、４または５つのアミノ酸付加、置換、欠失および／または挿入を有する親抗体の、または抗体２〜３６のいずれかのＨおよび／またはＬ  ＣＤＲセットを含み得る。あるいは、結合要素は、開示されているＨおよび／またはＬ  ＣＤＲセット内に２０、１６、１０、９といった多くの、またはそれより少ない、例えば、１、２、３、４または５つのアミノ酸置換を有する親抗体の、または抗体２〜３６のいずれかのＨおよび／またはＬ  ＣＤＲセットを含み得る。このような修飾は潜在的にこれらのＣＤＲセット内のいずれの残基で行ってもよい。例えば、修飾は、表１に示されるように、抗体２〜３６のいずれかにおいて改変された位置で行うことができる。よって、これら１以上の置換が、以下の残基：ＨＣＤＲのＫａｂａｔ残基３１、３３、３４、５１、５２Ｂ、５３、５６、６３、９５、９６、９７、９８、９９および１００、ならびにＬＣＤＲのＫａｂａｔ残基３１、３３、５３および５６における１以上の置換を含み得る。
【００５５】
結合要素は抗体フレームワーク内に１以上のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲセットを有する抗体分子を含み得る。例えば、抗体分子を得るには、抗体の１以上のＣＤＲまたはＣＤＲセットをフレームワーク(例えば、ヒトフレームワーク)にグラフトすればよい。これらのフレームワーク領域はヒト生殖細胞系遺伝子配列のものであってもよいし、または非生殖細胞系のものでもよい。例えば、フレームワークは生殖系列化されてもよく、フレームワーク内の１以上の残基が、最も類似性の高いヒト生殖細胞系フレームワークの等しい位置の残基と一致するように変更される。よって、本発明の結合要素は、ヒト生殖細胞系フレームワーク、例えば、ヒト生殖細胞系ＩｇＧ  ＶＨフレームワークにＨＣＤＲセットを含むＶＨドメインを有する単離されたヒト抗体分子であり得る。通常、結合要素はまた、例えば、ヒト生殖細胞系ＩｇＧ  ＶＬフレームワークにＬＣＤＲセットを含むＶＬドメインも有する。
【００５６】
ＶＨおよび／またはＶＬフレームワーク残基は、本明細書に記述および例示されているとおり、例えば部位特異的突然変異誘発を用いて改変することができる。
【００５７】
本発明のＶＨドメインまたはこのようなＶＨドメインを含む結合要素は、表３の抗体１〜３６番のいずれかのＶＨドメインを有していてもよい。例えば、本発明のＶＨドメインは以下の修飾：
Ｋａｂａｔ残基１９がＳで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基２５がＰで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基２６がＥで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基２７がＬで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基２９がＬで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基３０がＧで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基６８がＡで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基６９がＶで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基７１がＫで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基７７がＭで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基８２ＢがＧで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基８２ＣがＰで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基１０７がＡで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基１０８がＦで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基１１０がＡで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基１１１がＩで置換されている；および／または
Ｋａｂａｔ残基１１２がＰで置換されている
の１以上を有する親フレームワークを含み得る(表３の抗体１)。
【００５８】
ある特定の実施態様では、Ｋａｂａｔ残基１９がＳで置換され、Ｋａｂａｔ残基２５がＰで置換され、Ｋａｂａｔ残基５２ＢがＧで置換され、Ｋａｂａｔ残基５６がＲで置換され、Ｋａｂａｔ残基７１がＫで置換されている。
【００５９】
一般に、本発明の結合要素またはＶＨドメインは、ＶＨフレームワーク領域に１〜１０個の置換を有する表３の抗体１〜３６のいずれかのＶＨフレームワークを含み得る。
【００６０】
別の実施態様では、本発明の結合要素またはＶＨドメインは、ＶＨ領域に１〜７個の置換を有する表３の抗体１のＶＨフレームワークを含み得る。
【００６１】
別の実施態様では、本発明の結合要素またはＶＨドメインは、ＶＨ領域に１〜１０個の置換を有する表３の抗体３３のＶＨフレームワークを含み得る。
【００６２】
本発明のＶＬドメインまたはこのようなＶＬドメインを含む結合要素は、表２の抗体１〜３６番のいずれかのＶＬドメインを有していてもよい。例えば、抗体ＶＬドメインはフレームワーク領域に以下の修飾：
Ｋａｂａｔ残基２がＦで置換されていてもよい；
Ｋａｂａｔ残基３がＭまたはＥで置換されていてもよい；
Ｋａｂａｔ残基５がＳで置換されていてもよい；
Ｋａｂａｔ残基１３がＡで置換されていてもよい；
Ｋａｂａｔ残基２２がＡで置換されていてもよい；
Ｋａｂａｔ残基３７がＱで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基３９がＫで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基４０がＰで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基４２がＬで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基４５がＡで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基５８がＶで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基６９がＤで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基７０がＡで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基７６がＧまたはＲで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基７７がＲで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基７９がＱまたはＲで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基８０がＡで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基１０３がＥで置換されている；
Ｋａｂａｔ残基１０５がＳで置換されている；および／または
Ｋａｂａｔ残基１０６がＡで置換されている
の１以上を有する表２の抗体の配列を有し得る。
【００６３】
ある特定の実施態様では、Ｋａｂａｔ残基４２がＬで置換され、Ｋａｂａｔ残基４５がＡで置換されている。
【００６４】
一般に、本発明の結合要素またはＶＬドメインは、ＶＬフレームワーク領域に１〜１０個の置換を有する表２の抗体１〜３６のいずれかのＶＬフレームワークを含み得る。
【００６５】
一般に、本発明の結合要素またはＶＬドメインは、ＶＬ領域に１〜９個の置換を有する表２の抗体１のいずれかのＶＬフレームワークを含み得る。
【００６６】
一般に、本発明の結合要素またはＶＬドメインは、ＶＬ領域に１〜６個の置換を有する表２の抗体３３のいずれかのＶＬフレームワークを含み得る。
【００６７】
生殖系列化されていない抗体分子は生殖系列化されている抗体分子と比べると、同じＣＤＲを有するが、フレームワークは異なる。生殖系列化されている抗体は、これらの抗体に関して本明細書で示されているＶＨおよびＶＬドメイン配列のフレームワーク領域を生殖系列化することによって製造し得る。
【００６８】
本発明の結合要素は、ＩｇＥとの結合に関して本発明の他のいずれかの結合要素と競合するものであり得る。このような結合要素は競合的にＩｇＥと結合すると言われ、同じエピトープと結合する。結合要素間の競合は、例えばＥＬＩＳＡの使用および／または１以上の他のタグ無し結合要素の存在下で検出可能な１つの結合要素に特異的リポーター分子をタグ付けし、それにより、同じエピトープと結合する結合要素ならびに重複エピトープと結合する結合要素の検出を可能とすることにより、in vitroで容易にアッセイすることができる。このような方法は当業者には容易に分かり、本明細書にさらに詳細に記載される。よって、本発明のさらなる態様は、抗体分子、例えば特に、ＩｇＥとの結合に関して、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ＣＤＲ、例えば、ＨＣＤＲ３または親抗体もしくは抗体１〜３６のいずれかのＣＤＲセットを含む抗体分子と競合するヒト抗体抗原結合部位を含む結合要素を提供する。一実施態様では、本発明の結合要素は表２および３の抗体３３と競合する。
【００６９】
さらなる態様において、本発明は、ＩｇＥとの結合に関して抗体抗原結合部位と競合するヒト抗体抗原結合部位を含む結合要素を提供し、この抗体抗原結合部位はＶＨドメインとＶＬドメインからなり、このＶＨおよびＶＬドメインは本明細書に開示されているような親抗体または抗体１〜３６のいずれかのＣＤＲセットを含む。
【００７０】
さらなる態様において、本発明は、本発明の結合要素、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする配列を含む単離された核酸を提供する。本発明のＶＨドメインをコードする例示的核酸は添付の配列表の配列番号：１、７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、１２７、１３７、１４７、１５７、１６７、１７７、１８７、１９７、２０７、２１７、２２７、２３７、２４７、２５７、２６７、２７７、２８７、２９７、３０７、３１７、３２７、３３７および４２５である。本発明のＶＬドメインをコードする例示的核酸は添付の配列表の配列番号：６、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４３０および４２３である。本発明はまた、本発明の結合要素、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを作製する方法も含み、それは該結合要素、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの生産を行うための条件下で該核酸を発現させること、およびその結合要素を単離または精製することによりそれを回収することを含む。
【００７１】
本発明の別の態様は、本明細書に開示されているＶＨ  ＣＤＲまたはＶＬ  ＣＤＲ配列をコードする、一般に単離された核酸を提供する。
【００７２】
さらなる態様は、本発明の核酸を含む、または本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を提供する。
【００７３】
本発明のさらなる態様は、本発明の結合要素を含有する組成物、および治療によるヒトまたは動物の処置方法を含む、ＩｇＥを阻害および／または中和する方法における使用を提供する。
【００７４】
例えば、本発明の結合要素は、ヒトもしくは動物身体(例えば、ヒト患者)またはin vitroにおける生物学的応答、疾病、障害または症状の処置および／または予防方法に使用可能であり、あるいは診断方法に使用可能である。
【００７５】
この治療および／または予防方法は、該患者に本発明の結合要素を、ＩｇＥを測定可能に中和するのに十分な量で投与することを含み得る。本発明に従って処置可能な症状としては、アレルギーおよび喘息など、ＩｇＥが役割を果たすいずれのものも含まれる。
【００７６】
本発明のこれら、およびその他の態様を以下にさらに詳細に記載する。
ここで、本明細書で用いられる「および／または」は、他を伴って、または伴わずに２つの明示された特徴または成分の各々の具体的開示と考えるべきであることを指摘しておくのが適切である。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、本明細書にそれぞれ個々に示されているかのように、それぞれ(ｉ)Ａ、(ii)Ｂおよび(iii)ＡとＢの具体的開示と考えるべきである。
【００７７】
ＩｇＥは免疫グロブリンＥである。ヒトＩｇＥ定常領域のアミノ酸配列は公的に入手可能である。いくつかの実施態様では、ＩｇＥはヒトまたはカニクイザルＩｇＥである。本明細書の他所に記載されているように、ＩｇＥは組換え型であってもよいし、かつ／またはグリコシル化型もしくは非グリコシル化型であってもよい。ＩｇＥはin vivoにおいて天然に、グリコシル化型で発現される。グリコシル化ＩｇＥはまた、例えばＵ２６６.Ｂ１細胞を用い、組換え系で発現させることも可能である。
【００７８】
結合要素は一般に、互いに結合する分子対の一方の要素をいう。結合対の要素は天然由来のものであってもよいし、あるいは完全にまたは部分的に合成することもできる。分子対の一方の要素は、その分子対のもう一方の要素と結合し、従って、その特定の空間的および極性的構成に相補的な、その表面上の面積またはキャビティーを有する。結合対のタイプの例としては、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質がある。本発明は一般に抗原−抗体型反応と関連する。
【００７９】
結合要素は通常、抗原結合部位を有する分子を含む。例えば、結合要素は、抗原結合部位を含む抗体分子または非抗体タンパク質であり得る。
【００８０】
抗原結合部位は、フィブロネクチンまたはシトクロムＢなどの非抗体タンパク質スキャフォールド上でのＣＤＲの配置によるか[１、２、３]、または所望の標的に対する結合特異性を付与するためにタンパク質スキャフォールド内のループのアミノ酸残基を無作為化または突然変異させることにより提供し得る。タンパク質において新規な結合部位を操作するためのスキャフォールドはNygren et al.[３]により詳細に検証されている。抗体ミミックスのためのタンパク質スキャフォールドがＷＯ／００３４７８４(出典明示によりその全内容が本明細書の一部とされる)に開示されており、ここで発明者らは、少なくとも１つの無作為化ループを有するＩＩＩ型フィブロネクチンドメインを含むタンパク質(抗体ミミックス)を記載している。１以上のＣＤＲ、例えばＨＣＤＲセットをグラフトするのに好適なスキャフォールドは免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのいずれのドメイン要素によって提供されてもよい。このスキャフォールドはヒトまたは非ヒトタンパク質であり得る。非抗体タンパク質スキャフォールドの利点は、少なくともいくつかの抗体分子よりも小さく、および／または製造が容易なスキャフォールド分子において抗原結合部位を提供し得ることである。小型の結合要素は細胞に入る、組織に深く浸透する、または標的を他の構造内へ到達させる能力、あるいは標的抗原のタンパク質キャビティー内で結合する能力など、有用な生理学的特性を付与し得る。非抗体タンパク質スキャフォールドにおける抗原結合部位の使用はWess, 2004[４]で検証されている。安定な主鎖と１以上の可変ループを有し、標的抗原と結合する抗原結合部位を製造するためにそのループのアミノ酸配列が特異的または無作為に突然変異されているタンパク質が典型である。このようなタンパク質としては、黄色ブドウ球菌(S. aureus)由来のＡタンパク質のＩｇＧ結合ドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン(例えば、第１０番フィブロネクチンIII型ドメイン)、リポカリンならびにγ−クリスタリンおよび他のアフィリン(Affikin)(商標)スキャフォールド(Scil Proteins)が含まれる。他のアプローチの例としては、サイクロチドに基づく合成「マイクロボディー」(分子内ジスルフィド結合を有する小タンパク質)、マイクロプロテイン(Versabodies(商標)、Amunix)およびアンキリンリピートタンパク質(DARPins、Molecular Partners)が挙げられる。
【００８１】
抗体配列および／または抗原結合部位の他、本発明の結合要素は、例えば、折りたたまれたドメインのようなペプチドまたはポリペプチドを形成する、あるいはその分子に抗原結合能に加えて別の機能的特徴を与えるための他のアミノ酸を含んでもよい。本発明の結合要素は検出可能な標識を有してもよく、あるいは毒素または標的化部分または酵素とコンジュゲートさせてもよい(例えば、ペプチジル結合またはリンカーを介して)。例えば、結合要素は、触媒部位(例えば、酵素ドメイン内)ならびに抗原結合部位を含んでもよく、この抗原結合部位は抗原と結合するので、この触媒部位を抗原へ向ける。触媒部位は、例えば切断によって抗原の生物学的機能を阻害し得る。
【００８２】
述べたようにＣＤＲは非抗体スキャフォールドによって保持させることができるが、本発明のＣＤＲまたはＣＤＲセットを担持するための構造は一般に、そのＣＤＲまたはＣＤＲセットが、再配列された免疫グロブリン遺伝子によってコードされている天然ＶＨおよびＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲまたはＣＤＲセットに相当する位置に置かれている抗体重鎖もしくは軽鎖配列またはその実質的部分である。これらの免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は任意のインターネット検索エンジンを用いて「Kabat」で見つけられるKabat, et al., 1987[５]の参照文献およびその更新版により決定することができる。
【００８３】
ＣＤＲ領域またはＣＤＲとは、Kabat et al. 1991[６]およびその後続版により定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すものとする。抗体は一般に３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲを含む。本明細書においてＣＤＲとは、この場合、抗体が認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性による結合に関与する主要なアミノ酸残基を含む、これらの領域１つ、またはこれらの領域のいくつか、またはさらには全部を示すために用いる。
【００８４】
６つの短いＣＤＲ配列のうち、重鎖の３番目のＣＤＲ(ＨＣＤＲ３)は大きなサイズ変動を持つ(大きな多様性は本質的に、それを生じる遺伝子の再配列機構によるものである)。それは短ければアミノ酸２個である場合もあるが、知られている最長サイズは２６である。ＣＤＲの長さはまた、基礎にある特定のフレームワークによって適合可能な長さに応じて多様であり得る。機能上、ＨＣＤＲ３は、１つには抗体の特異性の決定に役割を果たす[参照文献７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４参照]。
【００８５】
抗体分子は天然であれ、部分的もしくは完全合成生産されたものであれ、免疫グロブリンを指す。この用語はまた、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質も包含する。ここで、本発明は天然型の抗体に関するのではなく、すなわち、その天然環境にはなく、天然源からの精製によって単離または入手されたものであるか、または非天然アミノ酸による修飾を含む、遺伝子組換えもしくは化学合成によって得られたものであることを理解しなければならない。抗体抗原結合部位を含む抗体フラグメントとしては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂおよびＦｄなどの分子が含まれる。例えば、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディーおよびミニボディーを含む、１以上の抗体抗原結合部位を含む他の様々な抗体分子が加工されている。抗体分子およびそれらの構築のための方法および使用は[１５]に記載されている。
【００８６】
モノクローナルおよびその他の抗体を採用すること、ならびに標的抗原と結合する他の抗体またはキメラ分子を作製するために組換えＤＮＡ技術を使用することが可能である。このような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域またはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域およびフレームワーク領域へ導入することを含み得る。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４００、およびそれに続く相当数の文献を参照。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞に対して、遺伝子突然変異または他の変異を起こさせることもでき、これらは産生される抗体の結合特異性を変化させるものでも変化させないものでもよい。
【００８７】
抗体は多くの方法で修飾することができるので、「抗体分子」とは、必要な特異性および／または抗原結合性を備えた抗体抗原結合部位を有するいずれの結合要素または物質も包含すると考えるべきである。よって、この用語は、天然型のものであれ、完全もしくは部分合成のものであれ、抗体抗原結合部位を含むポリペプチドを含む抗体フラグメントおよび誘導体を包含する。従って、抗体抗原結合部位を含むキメラ分子、または別のポリペプチド(例えば、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属するもの)と融合された等価物も含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３、ならびに相当数の後続文献に記載されている。
【００８８】
抗体工学分野に利用可能なさらなる技術は、ヒトおよびヒト化抗体の単離も可能としてきた。例えば、ヒトハイブリドーマをKontermann & Dubel[１６]が記載しているように作製することができる。結合要素を作り出すための別の確立された技術であるファージディスプレーが、Kontermann & Dubel[１６]およびＷＯ９２／０１０４７(下記でさらに記載)、および米国特許第５,９６９,１０８号、同第５,５６５,３３２号、同第５,７３３,７４３号、同第５,８５８,６５７号、同第５,８７１,９０７号、同第５,８７２,２１５号、同第５,８８５,７９３号、同第５,９６２,２５５号、同第６,１４０,４７１号、同第６,１７２,１９７号、同第６,２２５,４４７号、同第６,２９１,６５０号、同第６,４９２,１６０号、同第６,５２１,４０４号などの多くの刊行物に詳細に記載されている。
【００８９】
ヒト抗体を単離するには、マウス免疫系の他の成分はそのままに、マウス抗体遺伝子が不活性化され、機能的にヒト抗体遺伝子に置き換えられているトランスジェニックマウスが使用可能である[１７]。ヒト化抗体は、例えばＷＯ９１／０９９６７、米国特許第５,５８５,０８９号、ＥＰ５９２１０６、米国特許第５,５６５,３３２号およびＷＯ９３／１７１０５に開示されているものなど、当技術分野で公知の技術を用いて作製することができる。さらに、ＷＯ２００４／００６９５５には、非ヒト抗体の可変領域のＣＤＲ配列に関してカノニカル(canonical)なＣＤＲ構造タイプとヒト抗体配列、例えば、生殖細胞系抗体遺伝子セグメントのライブラリーに由来する対応するＣＤＲに関するカノニカルなＣＤＲ構造タイプを比較することによる、ヒト抗体遺伝子からの可変領域フレームワーク配列の選択に基づき、抗体をヒト化する方法が記載されている。非ヒトＣＤＲと類似のカノニカルなＣＤＲ構造タイプを有するヒト抗体可変領域は、ヒトフレームワーク配列を選択するためのヒト抗体配列の要素のサブセットを形成する。これらのサブセット要素は、ヒトおよび非ヒトＣＤＲ配列の間のアミノ酸類似性によってさらにランク付けすることができる。ＷＯ２００４／００６９５５の方法では、選択されたサブセット要素のヒトフレームワークを用い、ヒトＣＤＲ配列が非ヒトＣＤＲ相手に機能的に置き換わっているキメラ抗体を構築するためのフレームワーク配列を提供するためにトップランクのヒト配列が選択され、それにより、非ヒト抗体とヒト抗体の間でフレームワーク配列を比較する必要なく、高親和性かつ低免疫原性のヒト化抗体が提供される。この方法に従って作製されたキメラ抗体も開示されている。
【００９０】
合成抗体分子は、例えば、Knappik et al.[１８]またはKrebs et al.[１９]により記載されているように、合成され、好適な発現ベクター内にアセンブルされたオリゴヌクレオチドの手段によって作製された遺伝子からの発現により製造することができる。
【００９１】
完全抗体のフラグメントは抗原と結合する機能を遂行できることが示されている。結合フラグメントの例としては、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；(ii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；(iii)単鎖抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；(iv)ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂフラグメント[２０、２１、２２]；(ｖ)単離されたＣＤＲ領域；(vi)連結した２本のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ’)フラグメント；(vii)ＶＨドメインとＶＬドメインが、これら２つのドメインを結合させて抗原結合部位を形成可能とするペプチドリンカーによって連結されている単鎖Ｆｖ分子(ｓｃＦｖ)[２３、２４]；(viii)二重特異性単鎖Ｆｖ二量体(ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５)および(ix)遺伝子融合によって構築された多価または多重特異性フラグメントである「ダイアボディー」(ＷＯ９４／１３８０４；[２５])がある。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディー分子はＶＨドメインとＶＬドメインを連結するジスルフィド橋の組み込みによって安定化させることができる[２６]。ＣＨ３ドメインと連結されたｓｃＦｖを含むミニボディーもまた作製可能である[２７]。結合フラグメントの他の例としては、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端において、抗体ヒンジ領域に由来する１以上のシステインを含む数個の残基が付加されていることでＦａｂフラグメントとは異なるＦａｂ’、および定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持っているＦａｂ’フラグメントであるＦａｂ’−ＳＨがある。
【００９２】
本発明の抗体フラグメントは親抗体分子または抗体分子１〜３６のいずれかから出発し、例えばペプシンまたはパパインなどの酵素による消化、および／または化学的還元によるジスルフィド橋の切断などの方法によって得ることができる。別法では、本発明に含まれる抗体フラグメントは、当業者に周知の遺伝子組換え技術によるか、あるいはまた、例えば、Applied Biosystemsなどによって供給されているような自動ペプチド合成装置の手段によるペプチド合成、または核酸の合成および発現によって得ることができる。
【００９３】
本発明の機能的抗体フラグメントとしては、化学修飾、特にペグ化により、またはリポソームへの封入によりその半減期が延長されたいずれの機能的フラグメントも含む。
【００９４】
ｄＡｂ(ドメイン抗体)は、抗体の小さな単量体型抗原結合フラグメント、すなわち、抗体重鎖または軽鎖の可変領域である[２２]。ＶＨ  ｄＡｂはラクダ科動物(例えば、ラクダ、ラマ)に天然に存在し、ラクダ科動物に標的抗原を感作させ、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、個々のＢ細胞からのｄＡｂ遺伝子をそのままクローニングすることによって生産することができる。また、ｄＡｂは細胞培養でも生産可能である。それらの小さなサイズ、良好な溶解度および温度安定性は、それらを特に生理学上有用かつ選択および親和性成熟に好適なものとする。ラクダ科動物のＶＨ  ｄＡｂは「ナノボディー(商標)」の名称で治療用に開発中である。本発明の結合要素は、実質的に本明細書に示されているようなＶＨまたはＶＬドメインを含むｄＡｂ、あるいは実質的に本明細書に示されているようなＣＤＲセットを含むＶＨまたはＶＬドメインであり得る。
【００９５】
二重特異性または二機能性抗体は、同じ分子内で２つの異なる可変領域が合わされた第二世代のモノクローナル抗体をなす[２８]。それらの使用は、診断分野および治療分野の双方で、それらの新しいエフェクター機能を補充する能力または腫瘍細胞の表面のいくつかの分子を標的とする能力から実証されている。二重特異性抗体が用いられる場合、これらは種々の方法で作成可能な、例えば、化学的にまたはハイブリッドハイブリドーマから作製することができる便宜な二重特異性抗体であってもよいし、あるいは上述の二重特異性抗体フラグメントのいずれであってもよい。これらの抗体は化学的方法[３０、３１]または体細胞的方法[３２、３３]によって得ることができるが、同様に好ましくは、ヘテロ二量体形成を課し、従って、求める抗体の精製過程を助けることを可能とする遺伝子工学的技術によって得ることもできる[３４]。二重特異性抗体の例としては、特異性の異なる２つの抗体の結合ドメインを用い、短い柔軟なペプチドを介して直接連結させることができるＢｉＴＥ(商標)技術のものが含まれる。これは短い単鎖ポリペプチド上に２つの抗体を合わせる。ダイアボディーおよびｓｃＦｖは、Ｆｃ領域を含まずに、可変ドメインだけを用いて構築することができ、潜在的に抗イディオタイプ反応の影響を軽減する。
【００９６】
二重特異性抗体は全ＩｇＧとして、二重特異性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、ダイアボディーとして、あるいはまた二重特異性ｓｃＦｖとして構築することができる。さらに、当技術分野で公知の方法を用いて２つの二重特異性抗体を連結し、四価抗体を形成することができる。
【００９７】
二重特異性完全抗体に対して二重特異性ダイアボディーも、容易に構築でき、大腸菌(E. coli)で発現させることができるので特に有用であり得る。好適な結合特異性のダイアボディー(および抗体フラグメントなどの他の多くのポリペプチド)は、ファージディスプレー(ＷＯ９４／１３８０４)を用いてライブラリーから容易に選択することができる。ダイアボディーの一方の腕を、例えばＩｇＥに対して特異性を持ったまま維持すべきである場合、他方の腕が多様なライブラリーを作製し、適当な特異性の抗体を選択することができる。二重特異性完全抗体は、Ridgeway et al., 1996[３５]に記載されているような択一的加工法により作製することができる。
【００９８】
当技術分野において、ＩｇＥに対する抗体を得るには種々の方法を利用することができる。これらの抗体は特にヒト、マウス、キメラまたはヒト化起源のモノクローナル抗体であってよく、当業者に周知の標準的な方法に従って得ることができる。
【００９９】
一般に、特にネズミ起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントの作製のためには、特に手引き書「Antibodies」[３６]またはKohler and Milstein[３７]により記載されているハイブリドーマから作製する技術を参照することができる。
【０１００】
モノクローナル抗体は例えば、ＩｇＥに感作した動物細胞または該モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含むそのフラグメントの１つから得ることができる。好適なフラグメントおよびそれらを含むペプチドまたはポリペプチドが本明細書に記載され、ＩｇＥに対する抗体を生成するため動物に感作させるのに使用することができる。該ＩｇＥまたはそのフラグメントの１つは、特に、ＩｇＥまたはそのフラグメントをコードするｃＤＮＡ配列に含まれる核酸配列で出発する遺伝子組換えによる、ＩｇＥおよび／またはそのフラグメントのペプチド配列に含まれるアミノ酸配列から出発するペプチド合成によるなど、通常の操作法に従って作製することができる。
【０１０１】
モノクローナル抗体は、例えば、そのモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含むＩｇＥまたはそのフラグメントの１つが予め固定されているアフィニティーカラムで精製することができる。より詳しくは、これらのモノクローナル抗体はＡタンパク質および／またはＧタンパク質上でのクロマトグラフィーによって精製することができ、その後に本質的に残留タンパク質夾雑物ならびにＤＮＡおよびＬＰＳを排除する目的のイオン交換クロマトグラフィーを行って行わなくてもよく、その後に二量体または他の多量体の存在による凝集の可能性を排除するためにセファロースゲルでの排除クロマトグラフィーを行っても行わなくてもよい。一実施態様では、これらの技術を全て同時または順次に使用することができる。
【０１０２】
抗原結合部位は、標的抗原と結合し、標的抗原の全てまたは一部と相補的である分子の部分である。抗体分子においては、それは抗体抗原結合部位を指し、標的抗原と結合し、標的抗原の全てまたは一部と相補的である抗体の部分を含む。抗原が大きい場合には、抗体は抗原の特定の部分とだけ結合することができ、この部分はエピトープと呼ばれる。抗体抗原結合部位は１以上の抗体可変ドメインによって提供され得る。抗体抗原結合部位は抗体軽鎖可変領域(ＶＬ)と抗体重鎖可変領域(ＶＨ)を含み得る。
【０１０３】
単離されたとは、本発明の結合要素またはこのような結合要素をコードする核酸は一般に本発明に従うものであることを示す。よって、本発明の、結合要素、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ならびにコード核酸分子およびベクターは、例えば、それらの天然環境から、実質的に純粋または均質な形態で、または核酸の場合には、必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸または遺伝子を含まない、または実質的に含まない形態で単離および／または精製されたものが提供され得る。単離された要素および単離された核酸は、それらの天然環境、またはこのような生成がin vitroまたはin vivoにおいて実施される組換えＤＮＡ技術によるものである場合には、それらが生成される環境(例えば、細胞培養)で、一緒に見られる他のポリペプチドまたは核酸など、それらが天然に会合している材料を含まない、または実質的に含まない。要素および核酸は希釈剤またはアジュバントとともに処方されてもよく、さらに実施目的では単離されてもよく、例えば、免疫アッセイで使用するためのマイクロタイタープレートをコーティングするために用いるときには、これらの要素は通常ゼラチンまたは他の担体と混合され、あるいは診断または治療で用いる場合には、薬学上許容される担体または希釈剤と混合される。結合要素は自然に、または異種真核細胞(例えば、ＣＨＯまたはＮＳ０(ＥＣＡＣＣ  ８５１１０５０３)細胞)系によってグリコシル化されてもよく、あるいはそれらは非グリコシル化型であってもよい(例えば、原核細胞での発現によって生産される場合)。
【０１０４】
抗ＩｇＥ抗体分子を含む異種調製物も本発明の一部をなす。例えば、このような調製物は、種々の程度のグリコシル化を有し、かつ／またはピログルタミン酸残基を形成するためのＮ末端グルタミン酸の環化など、誘導体化されたアミノ酸を有する、抗体と全長重鎖およびＣ末端リシンを欠いた重鎖との混合物であり得る。
【０１０５】
本明細書において「示されているように実質的に」とは、本明細書に記載の結合要素のＶＨまたはＶＬドメインの関連のＣＤＲの特徴が、その配列が本明細書に示されている特定の領域と同一であるか、または類似性が高いことを指す。本明細書に記載されているとおり、１以上の可変ドメインの特定の領域に関して「類似性が高い」とは、ＣＤＲおよび／またはＶＨまたはＶＬドメイン内に１〜約５、例えば１〜４(１〜３、あるいは１または２、あるいは３または４を含む)のアミノ酸置換が製造可能であることを意図する。
【０１０６】
詳細な説明
上述のように、本発明の結合要素はＩｇＥの生物活性を調節および中和し得る。本明細書に記載されているように、本発明のＩｇＥ結合要素は中和効力に関して至適化することができる。一般に、効力の至適化は、選択された結合要素の配列(通常、抗体の可変ドメイン配列)を突然変異させて結合要素のライブラリーを作製し、その後これを効力に関してアッセイし、より効力のある結合要素を選択することを含む。このようにして選択された「効力が至適化された」結合要素は、そのライブラリーが作製された結合要素よりも高い効力を有する傾向がある。しかしながらやはり、効力の高い結合要素はまた至適化を行わずに得てもよく、例えば、効力の高い結合要素は最初のスクリーニング、例えば生化学中和アッセイから直接得ることもできる。「効力が至適化された」結合要素とは、特定の活性または下流機能の中和の効力が至適化された結合要素を指す。アッセイおよび効力については、本明細書の他所により詳細に記載されている。本発明は、効力が至適化された結合要素と至適化されていない結合要素の双方、ならびに選択された結合要素からの効力の至適化のための方法を提供する。よって、本発明は、当業者に高い効力を有する結合要素を製造させる。
【０１０７】
与えられた結合要素からより高い効力の結合要素を製造するために効力の至適化を用いることができるが、効力の至適化を用いなくても高い効力の結合要素が得られることも述べておく。
【０１０８】
さらなる態様において、本発明は、抗原と結合し得る１以上の結合要素を得る方法を提供し、その方法は、本発明の結合要素のライブラリーと抗原を接触させ、該抗原と結合し得るライブラリーの１以上の結合要素を選択することを含む。
【０１０９】
このライブラリーは粒子または分子複合体、例えば酵母、細菌またはバクテリオファージ(例えば、Ｔ７)粒子、ウイルス、細胞または共有結合性、リボゾーム性もしくはその他のin vitroディスプレー系などの複製可能な遺伝子パッケージ上にディスプレーすることができ、各粒子または分子複合体は、その上にディスプレーされた、抗体ＶＨ可変ドメインをコードする核酸を含み、および所望により存在する場合には、ディスプレーされたＶＬドメインも含む。ファージディスプレーはＷＯ９２／０１０４７、例えば、米国特許第５,９６９,１０８号、同第５,５６５,３３２号、同第５,７３３,７４３号、同第５,８５８,６５７号、同第５,８７１,９０７号、同第５,８７２,２１５号、同第５,８８５,７９３号、同第５,９６２,２５５号、同第６,１４０,４７１号、同第６,１７２,１９７号、同第６,２２５,４４７号、同第６,２９１,６５０号、同第６,４９２,１６０号および同第６,５２１,４０４号(それぞれ出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる)に記載されている。
【０１１０】
抗原と結合し、バクテリオファージまたは粒子もしくは分子複合体の他のライブラリー上にディスプレーされ得る結合要素を選択した後、選択された結合要素をディスプレーするバクテリオファージまたは他の粒子もしくは分子複合体から核酸を採取することができる。このような核酸は次に、該選択された結合要素をディスプレーするバクテリオファージまたは粒子もしくは分子複合体から採取された核酸の配列を有する核酸から発現させることによる、結合要素または抗体ＶＨもしくはＶＬ可変ドメインの産生に使用可能である。
【０１１１】
該選択された結合要素の抗体ＶＨ可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体ＶＨ可変ドメインは、このようなＶＨドメインを含む結合要素と同様に、単離形態で提供することができる。
【０１１２】
さらにＩｇＥと結合する能力、また、ＩｇＥとの結合に関して親抗体分子または抗体分子１〜３６(例えば、ｓｃＦｖ形式および／またはＩｇＧ形式、例えば、ＩｇＧ１)と競合する能力を試験することができる。ＩｇＥを中和する能力は、本明細書の他所でさらに述べられているように試験することができる。
【０１１３】
本発明の結合要素は、親抗体もしくは他の抗体分子、例えばｓｃＦｖ、または抗体１〜３６の１つ、例えばＩｇＧ１の親和性で、あるいはより良好な親和性でＩｇＥと結合し得る。
【０１１４】
本発明の結合要素は、親抗体もしくは他の抗体分子、抗体１〜３６の１つ、例えばｓｃＦｖまたはＩｇＧ１の効力で、あるいはより良好な効力でＩｇＥの生物活性を中和し得る。
【０１１５】
異なる結合要素の結合親和性および中和効力を適当な条件下で比較することができる。
【０１１６】
アミノ酸配列が本明細書に示されているもの、およびＩｇＥに対する結合要素に使用可能なものを含む、本発明のＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの変異体は、配列変更または突然変異の方法および所望の特徴を有する抗原結合要素のスクリーニングによって得ることができる。所望の特徴の例としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。
・その抗原に特異的な既知の抗体に比べて増強された抗原に対する結合親和性
・活性が既知であれば、その抗原に特異的な既知の抗体に比べて増強された抗原活性の中和
・その抗原に対する既知の抗体またはリガンドとの特定のモル比における特定の競合能
・複合体を免疫沈降させる能力
・特定のエピトープと結合する能力
・直鎖および／または拘束コンフォメーションにおいてスクリーニングされたペプチドを用い、本明細書に記載されているようなペプチド結合スキャンを用いて同定された直鎖エピトープ、例えば、ペプチド配列
・非連続残基により形成されたコンフォメーションエピトープ
・ＩｇＥまたは下流分子の新規な生物活性を調節する能力
このような方法も本明細書で提供される。
【０１１７】
本明細書に開示されている抗体分子の変異体は本発明において作製および使用可能である。構造／特性−活性関係に多変量データ解析技術の適用においてコンピューター化学を導入[３８]した後、抗体の定量的活性−特性関係を、統計学的回帰、パターン認識および分類などの周知の数学的技術を用いて導くことができる[３９、４０、４１、４２、４３、４４]。抗体の特性は抗体配列、機能および三次元構造の経験的および理論的モデル(例えば、可能性のある接触残基の分析または算出された物理化学的特性)から導くことができ、これらの特性は単独で、また組み合わせて考慮することができる。
【０１１８】
ＶＨドメインおよびＶＬドメインからなる抗体抗原結合部位は一般に、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)由来の３つと重鎖可変ドメイン(ＶＨ)由来の３つの、６つのループのポリペプチドにより形成される。原子構造が既知の抗体の分析は、抗体結合部位の配列と三次元構造の間の関係が解明された[４５、４６]。これらの関係は、ＶＨドメインの三番目の領域(ループ)を除き、結合部位ループは少数の主鎖コンフォメーション：カノニカルな構造の１つを有することを意味する。特定のループにおいて形成されたカノニカルな構造は、その大きさならびに両ループおよびフレームワーク領域の鍵となる部位における特定の残基の存在によって決定されることが示されている[４５、４６]。
【０１１９】
この配列−構造関係の研究は、既知配列の抗体における残基の推定に使用できるが、そのＣＤＲループの三次元構造の維持に重要であり、従って結合特異性を維持する未知の三次元構造における残基の推定には使用できない。これらの推定は、その推定と主要な至適化実験からの出力との比較によってバックアップすることができる。構造アプローチでは、ＷＡＭ[４８]など、いずれかの無料利用可能なまたは市販のパッケージを用い、抗体分子のモデルを製造することができる[４８]。次に、Insight II (Accelrys, Inc.)またはDeep View[４９]などのタンパク質可視化および分析ソフトウエアパッケージを用いて、ＣＤＲの各位置に存在し得る置換を評価することができる。次に、この情報を用い、活性に対して最小のまたは有益な作用を持ち得る置換を作り出すことができる。
【０１２０】
当技術分野において、一般に、ＣＤＲ、抗体ＶＨまたはＶＬドメインおよび結合要素のアミノ酸配列内に置換を作り出すために必要な技術は利用可能である。活性に対して最小のまたは有益な作用を持つと推定され得る、または推定されない置換を有する変異体配列を作り出し、ＩｇＥと結合し、かつ／またはそれを中和する能力、および／または他のいずれかの所望の特性に関して試験することができる。
【０１２１】
その配列が本明細書に具体的に開示されているＶＨおよびＶＬドメインのいずれかの可変ドメインアミノ酸配列変異体は、述べられているように、本発明に従って使用することができる。
【０１２２】
本発明のさらなる態様は、表３および添付の配列表に示されている抗体１〜３６のいずれかのＶＨドメインと、または表１に示されているＨＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２またはＨＣＤＲ３)と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含む抗体分子である。この抗体分子はまた所望により、抗体１〜３６のいずれかのＶＬドメインと、または表２に示されているＬＣＤＲ(例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２またはＬＣＤＲ３)と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインも含む。２つのアミノ酸配列の同一性％を算出するために使用可能なアルゴリズムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ[５０]、ＦＡＳＴＡ[５１]またはSmith-Watermanアルゴリズム[５２](例えば、デフォルトパラメーターを用いる)が含まれる。
【０１２３】
特定の変異体は、１以上のアミノ酸配列変異(アミノ酸残基の付加、欠失、置換および／または挿入)を含み得る。ある特定の実施態様では、これらの変異体は約２０未満のこのような変異を有する。
【０１２４】
変異は１以上のフレームワーク領域および／または１以上のＣＤＲで作り出すことができる。変異は通常、機能欠損を招かず、従って、このように変異したアミノ酸配列を含む結合要素はＩｇＥと結合し、かつ／またはそれを中和する能力を保持し得る。それは、例えば本明細書に記載のアッセイで測定した場合、変異が起こっていない結合要素と同量の結合および／または中和能を保持し得る。このように変異したアミノ酸配列を含む結合要素はＩｇＥと結合し、かつ／またはそれを中和する能力の向上を示す場合もある。
【０１２５】
変異は、１以上のアミノ酸残基の非天然または非標準アミノ酸での置換、１以上のアミノ酸残基の非天然または非標準的型への改変、またはその配列への１以上の非天然または非標準アミノ酸の挿入を含み得る。本発明の配列における変異の数および位置の例は本明細書の他所に記載されている。天然アミノ酸としては、標準的な一文字コードでＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅとして表される２０の「標準」Ｌ−アミノ酸が含まれる。非標準アミノ酸としては、ポリペプチド主鎖に組み込み可能な、または既存のアミノ酸残基の修飾から生じ得る他のいずれの残基も含まれる。非標準アミノ酸は天然に存在する場合も天然に存在しない場合もある。４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、３−メチルヒスチジン、Ｎ−アセチルセリンなど、いくつかの天然型非標準アミノ酸が当技術分野で知られている[５３]。そのＮ−α位で誘導体化されたアミノ酸残基はアミノ酸配列のＮ末端にしか存在しない。通常、本発明では、アミノ酸はＬ−アミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸であってもよい。従って、変異はＬ−アミノ酸のＤ−アミノ酸への修飾、またはＬ−アミノ酸のＤ−アミノ酸での置換を含み得る。メチル化、アセチル化および／またはリン酸化型のアミノ酸も知られており、本発明のアミノ酸はこのような修飾を受け得る。
【０１２６】
本発明の抗体ドメインおよび結合要素のアミノ酸配列は、上記の非天然または非標準アミノ酸を含み得る。非標準アミノ酸(例えば、Ｄ−アミノ酸)は合成の際に、またはアミノ酸配列の合成の後に「元の」標準アミノ酸を修飾または置換することによって、アミノ酸配列へ組み込むことができる。
【０１２７】
非標準的および／または非天然アミノ酸の使用は構造および機能の多様性を高め、従って、本発明の結合要素において所望のＩｇＥ結合および中和特性を達成する可能性を高め得る。さらに、Ｄ−アミノ酸および類似体は、動物、例えばヒトに投与した後に、Ｌ−アミノ酸を有するポリペプチドのin vivo分解のために、標準的なＬ−アミノ酸と比べて良好な薬物動態特性を有することが示されている。
【０１２８】
本発明のＣＤＲ由来配列を含む新規なＶＨまたはＶＬ領域は、全長可変ドメイン内に突然変異を作り出すための１以上の選択ＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発を用いて作製することができる。このような技術は、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲを用いたGram et al.[５４]によって記載されている。いくつかの実施態様では、全長可変ドメインまたはＣＤＲセット内に１または２つのアミノ酸置換が製造される。
【０１２９】
使用可能な別法として、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対する突然変異誘発を指定するものがある。このような技術はBarbas et al.[５５]およびSchier et al.[５６]に記載されている。
【０１３０】
上記の技術は全てそれ自体当技術分野で既知であり、当業者ならばこのような技術を用い、当技術分野で慣例の方法を用いて本発明の結合要素を提供することができる。
【０１３１】
本発明のさらなる態様は、ＩｇＥに対する抗体抗原結合部位を得るための方法を提供し、その方法は、本明細書に示されるＶＨドメインのアミノ酸配列における、１以上のアミノ酸を付加、欠失、置換または挿入によってＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを準備すること、所望により、このように準備されたＶＨドメインと１以上のＶＬドメインを組み合わせること、および所望により１以上の所望の特性、例えばＩｇＥ活性中和能を有する、ＩｇＥに対する結合要素または抗体抗原結合部位を同定するためにこのＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの組合せを試験することを含む。該ＶＬドメインは本明細書に実質的に示されているアミノ酸配列を持ち得る。本明細書に開示されているＶＬドメインの１以上の配列変異体を１以上のＶＨドメインと組み合わせる類似の方法も使用可能である。
【０１３２】
上述のとおり、実質的に本明細書に示されているＣＤＲアミノ酸配列は、ヒト抗体可変ドメインまたはその実質的一部にＣＤＲとして保持され得る。実質的に本明細書に示されているようなＨＣＤＲ３配列は本発明の実施態様に相当し、これらはそれぞれヒト重鎖可変ドメインまたはその実質的一部にＨＣＤＲ３として保持され得る。
【０１３３】
本発明で用いられる可変ドメインは、いずれの生殖細胞系または再配列ヒト可変ドメインから取得される、または由来してもよく、あるいは既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列または実際の配列に基づく合成可変ドメインであってもよい。可変ドメインは非ヒト抗体に由来してもよい。本発明のＣＤＲ配列(例えば、ＣＤＲ３)は、組換えＤＮＡ技術を用い、ＣＤＲ(例えば、ＣＤＲ３)を欠いた可変ドメインのレパートリーに導入してもよい。例えば、Marks et al.[５７]は、ＣＤＲ３を欠いたＶＨ可変ドメイン可変ドメインのレパートリーを提供するために、領域の５’末端に、またはそれに隣接して指定されたコンセンサスプライマーが、ヒトＶＨ遺伝子の３番目のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーとともに用いられる、抗体可変ドメインレパートリー作製法を記載している。Marks et al.はさらに、このレパートリーを特定の抗体のＣＤＲ３といかに組み合わせればよいかも記載している。類似の技術を用い、本発明のＣＤＲ３由来配列を、ＣＤＲ３を欠いたＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフルし、シャッフルされた完全ＶＨまたはＶＬドメインをコグネイトＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて本発明の結合要素を提供することができる。次に、このレパートリーを、出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされるＷＯ９２／０１０４７、またはKay, Winter & McCafferty[５８]をはじめとする相当数の後続文献のファージディスプレー系など、好適な宿主系でディスプレーし、このようにして好適な結合要素を選択することができる。レパートリーは１０４以上、例えば、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９または少なくとも１０１０またはそれを超える個々の要素のいずれかからなり得る。他の好適な宿主系としては、限定されるものではないが、酵母ディスプレー、細菌ディスプレー、Ｔ７ディスプレー、ウイルスディスプレー、細胞ディスプレー、リボソームディスプレーおよび共有結合ディスプレーが含まれる。
【０１３４】
ＩｇＥ抗原に対する結合要素を作製する方法が提供され、その方法は、
(ａ)置換されるＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３コード領域を欠いたＶＨドメインをコードする核酸の出発レパートリーを準備し、
(ｂ)ドナー核酸がレパートリーのＣＤＲ３領域に挿入されて、ＶＨドメインをコードする核酸の生成物レパートリーが得られるように、該レパートリーを、ＶＨ  ＣＤＲ３に関して実質的に本明細書に示されているアミノ酸配をコードするドナー核酸と合わせ、
(ｃ)該生成物レパートリーの核酸を発現させ、
(ｄ)ＩｇＥに対する結合要素を選択し、そして
(ｅ)該結合要素またはそれをコードする核酸を回収する
ことを含む。
【０１３５】
また、本発明のＶＬ  ＣＤＲ３を、置換されるＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３コード領域を欠いたＶＬドメインをコードする核酸のレパートリーと合わせる類似の方法も使用可能である。
【０１３６】
同様に、３つのＣＤＲの１以上または全てをＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーのグラフトした後、ＩｇＥに対する結合要素をスクリーニングしてもよい。
【０１３７】
例えば、親抗体もしくは抗体１〜３６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の１以上、または親抗体もしくは抗体１〜３６のＨＣＤＲセットが使用可能であり、かつ／または親抗体もしくは抗体１〜３６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の１以上、または親抗体もしくは抗体１〜３６のＬＣＤＲセットが使用可能である。
【０１３８】
同様に、本明細書に開示されている他のＶＨおよびＶＬドメイン、ＣＤＲセットおよびＨＣＤＲセット、ならびに／またはＬＣＤＲセットも使用可能である。
【０１３９】
免疫グロブリン可変ドメインの実質的一部は、少なくとも３つのＣＤＲ領域を、それらの介在フレームワーク領域とともに含み得る。この部分はまた、１番目と４番目のフレームワーク領域のいずれかまたは双方の少なくとも約５０％を含んでもよく、この５０％は１番目のフレームワーク領域のＣ末端５０％、そして４番目のフレームワーク領域のＮ末端５０％である。この可変ドメインの実質的一部のＮ末端またはＣ末端における付加的残基は、天然可変ドメイン領域とは通常会合していないものであり得る。例えば、組換えＤＮＡ技術によって行われる本発明の結合要素の構築は、クローニングまたは他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによってコードされているＮ末端またはＣ末端残基の導入をもたらし得る。他の操作工程には、本発明の可変ドメインと、本明細書の多少により詳細に記載されているように、抗体定常領域、その他の可変ドメイン(例えば、ダイアボディーの作製の場合)または検出可能な／機能的標識を含むさらなるタンパク質配列とを連結するためのリンカーの導入が含まれる。
【０１４０】
本発明のいくつかの態様では、結合要素は１対のＶＨドメインとＶＬドメインを含むが、ＶＨドメインまたはＶＬドメイン配列のいずれかに基づく単鎖結合ドメインも本発明のさらなる態様をなす。単鎖免疫グロブリンドメイン、特に、ＶＨドメインは、特異的な様式で標的抗原と結合し得る。例えば、上記のｄＡｂの考察を参照。
【０１４１】
これらいずれかの単鎖結合ドメインの場合、これらのドメインは、ＩｇＥと結合し得る２ドメイン結合要素を形成し得る相補的ドメインをスクリーニングするために使用可能である。これは、出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされるＷＯ９２／０１０４７に開示されているように、Ｈ鎖またはＬ鎖クローンのいずれかを含む個々のコロニーを用いて、他方の鎖(ＬまたはＨ)をコードするクローンの完全ライブラリーに感染させ、結果として得られる２鎖結合要素を、その参照文献に記載されているものなどのファージディスプレー技術に従って選択する、いわゆる階層的デュアルコンビナトリアルアプローチを用いたファージディスプレースクリーニング方によって果たすことができる。この技術はMarks et al.(同書)にも開示されている。
【０１４２】
本発明の結合要素は、抗体定常領域またはその一部、例えば、ヒト抗体定常領域またはその一部を含み得る。例えば、ＶＬドメインは、ヒトＣκまたはＣγ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインのＣ末端に結合させ得る。同様に、ＶＨドメインに基づく結合要素は、抗体イソ型、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭのいずれか、また、イソ型サブクラス、特に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２のいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部(例えば、ＣＨ１ドメイン)のＣ末端に結合させ得る。ＩｇＧ１が、製造が容易で安定な(例えば半減期)ために有利である。これらの特性を有し、かつ、可変領域を安定化させる、任意の合成または他の定常領域変異体も本発明において有用であり得る。
【０１４３】
本発明の結合要素は検出可能なまたは機能的標識で標識し得る。よって、結合要素または抗体分子は、検出可能なおよび／または定量可能なシグナルを得るための免疫複合体の形態で存在させ得る。免疫複合体は、検出可能なまたは機能的標識とコンジュゲートされた本発明の抗体分子を含み得る。標識はシグナルを生成するまたはシグナル生成を誘発し得るいずれの分子でもよく、限定されるものではないが、蛍光剤、放射性標識、酵素、化学発光剤または光増感剤が含まれる。よって、結合は、蛍光または化学発光、放射能、酵素活性または吸光度を検出することによって検出および／または測定可能である。
【０１４４】
好適な標識としては、限定されるものではないが例を挙げれば、下記の通りである。
・アルカリ性ホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ(「Ｇ６ＰＤＨ」)、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼ、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素；
・色素；
・フルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミン化合物および誘導体、ＧＦＰ(ＧＦＰは「緑色蛍光タンパク質」)、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、ならびにフルオレスカミンなどの蛍光標識または蛍光剤；ランタニドクリプテートなどの蛍光団およびユウロピウム(Perkin Elmer and Cis Biointernational)などのキレート剤；
・イソルミノール、ルミノールおよびジオキセタンなどの化学発光標識または化学発光剤；
・ルシフェラーゼおよびルシフェリンなどの生物発光標識；
・増感剤；
・補酵素；
・酵素基質；
・限定されるものではないが、臭素７７、炭素１４、コバルト５７、フッ素８、ガリウム６７、ガリウム６８、水素３(トリチウム)、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ヨウ素１２３ｍ、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３１、ヨウ素１３３、水銀１０７、水銀２０３、リン３２、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、スカンジウム４７、セレン７５、硫黄３５、テクネチウム９９、テクネチウム９９ｍ、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、イットリウム１９９および本明細書に記載の他の放射性標識を含む、放射性標識；
・ラテックスまたは炭素粒子などの粒子；金属ゾル；クリスタライト；リポソーム；細胞など(色素、触媒または他の検出可能な基でさらに標識してもよい)；
・ビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモデオキシウリジンなどの分子；
・例えば、シュードモナス外毒素(ＰＥまたはその細胞傷害性フラグメントもしくは変異株)、ジフテリア毒またはその細胞傷害性フラグメントもしくは変異株、ボツリヌス菌毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦ、リシンまたはその細胞傷害性フラグメント、例えば、リシンＡ、アブリンまたはその細胞傷害性フラグメント、サポリンまたはその細胞傷害性フラグメント、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細胞傷害性フラグメント、ならびにボリョジン(bryodin)１またはその細胞傷害性フラグメントの群から選択される毒素部分などの毒素部分。
【０１４５】
好適な酵素および補酵素はLitman, et al.の米国特許第４,２７５,１４９号およびBoguslaski, et al.の米国特許第４,３１８,９８０号(それぞれ出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる)に開示されている。好適な蛍光剤および化学発光剤はLitman, et al.の米国特許第４２７５１４９号(出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる)に開示されている。標識はさらに、例えば標識アビジンまたはストレプトアビジンなど、特異的コグネイト検出部分との結合を介して検出可能なビオチンのような化学部分をさらに含む。検出可能な標識は、当技術分野で公知の慣例の化学法を用いて本発明の抗体と結合させることができる。
【０１４６】
免疫複合体またはそれらの機能的フラグメントは、当業者に公知の方法によって作製することができる。それらは酵素または蛍光標識に直接またはグルタルアルデヒドのようなポリアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ジエチレン−トリアミン五酢酸(ＤＰＴＡ)などのスペーサー基または架橋基の介在により、または治療用コンジュゲートに関して上述したものなどのカップリング剤の存在下で結合させることができる。フルオレセインタイプの標識を含むコンジュゲートは、イソチオシアネートと反応させることにより作製することができる。
【０１４７】
治療用放射性同位元素と抗体を直接、または上述のＥＤＴＡ、ＤＴＰＡなどのキレート剤を介して結合させるための当業者に公知の既存の方法が、診断に用い得る放射性元素に対しても使用可能である。同様に、クロラミンＴ法[５９]によるナトリウム１２５での標識、あるいはまたCrockford et al.(出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第４,４２４,２００号)の技術によるテクネチウム９９ｍでの標識を行うか、あるいはHnatowich(出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第４,４７９,９３０号)により記載されているようにＤＴＰＡを介して結合させることができる。
【０１４８】
標識が外的手段、例えば、目視検査、電磁放射線、熱および化学試薬によって検出可能なシグナルを生成し得る多くの方法がある。標識はまた、本発明の抗体または支持体と結合する別の結合要素と結合させることもできる。
【０１４９】
標識は直接シグナルを生成することができ、従って、シグナル生成のために他の成分は必要としない。多くの有機分子、例えば、蛍光剤は紫外線および可視光を吸収することができ、この光の吸収がこれらの分子にエネルギーを移し、それらを励起されたエネルギー状態にまで引き上げる。この吸収されたエネルギーは次に、第二の波長における発光によって放散される。この第二の波長の放出も標識されたアクセプター分子にエネルギーを移すことができ、生じたエネルギーは、発光、例えば蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)によってアクセプター分子から放散される。直接シグナルを生じる他の標識としては、放射性同位元素および色素が含まれる。
【０１５０】
あるいは、標識はシグナルを生成するために他の成分を必要とする場合もあり、このシグナル生成系は測定可能なシグナルを生成するために必要な全ての成分を含み、基質、補酵素、エンハンサー、付加的酵素、酵素生成物と反応する物質、触媒、アクチベーター、補因子、阻害剤、スカベンジャー、金属イオン、およびシグナル生成物質の結合に必要な特定の結合物質を含み得る。好適なシグナル生成系の詳細な考察は、出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされるUllman et al.の米国特許第５,１８５,２４３号に見出せる。
【０１５１】
本発明は、本明細書で提供される結合要素とＩｇＥの結合を生じさせるまたは可能とすることを含む方法を提供する。述べたように、このような結合はin vivoにおいて、例えば、結合要素またはコード核酸をヒトまたは動物(例えば、哺乳類)に投与した後に起こり得るか、あるいはin vitro、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、および生化学または細胞に基づくアッセイにおいて起こり得る。
【０１５２】
一般に、本発明の結合要素とＩｇＥの間の複合体はとりわけ、酵素結合免疫アッセイ、ラジオアッセイ、免疫沈降、蛍光免疫アッセイ、化学発光アッセイ、免疫ブロットアッセイ、ラテラルフローアッセイ、凝集アッセイおよび粒子に基づくアッセイによって検出可能である。
【０１５３】
本発明はまた、例えばバイオセンサー系において本発明の結合要素を使用することにより抗原のレベルを直接測定するために提供される。例えば、本発明は、ＩｇＥとの結合を検出および／または測定する方法を含み、その方法は、(ｉ)該結合要素をＩｇＥに曝すこと、および(ii)該結合要素とＩｇＥの結合を検出すること(結合は本明細書に記載のいずれかの方法または検出可能な標識を用いて検出される)を含む。この結合検出法および本明細書に記載の他のいずれかの結合検出法は、当業者によれば、例えば検出可能な標識を目視により観察することによる方法を行うことと直接解釈できる。あるいは、この方法または本明細書に記載の他のいずれかの結合検出法は、オートラジオグラフ、写真、コンピューターのプリントアウト、フローサイトメトリーレポート、グラフ、チャート、結果を含む試験管もしくは容器もしくはウェル、または本方法の結果の他の視覚的もしくは物理的提示の形態のレポートを作成し得る。
【０１５４】
結合要素とＩｇＥの結合量も測定可能である。定量は、診断対象であり得る試験サンプル中の抗原の量に関するものであり得る。ＩｇＥ結合に関するスクリーニングおよび／またはその定量は、例えば、本明細書で言及されている疾病もしくは障害、および／または異常なＩｇＥの産生、発現および／または活性を含む他のいずれかの疾病もしくは障害に関して患者をスクリーニングする上で有用であり得る。
【０１５５】
本発明の診断方法は、(ｉ)被験体から組織または液体サンプルを得ること、(ｉｉ)この組織または液体サンプルを１以上の本発明の結合要素に曝すこと、および(ｉｉｉ)結合したＩｇＥを対照サンプルと比較して検出し、対照と比較した際のＩｇＥ結合量の増加がＩｇＥの産生、発現または活性の異常なレベルを示し得ることを含む。供試組織または液体サンプルとしては、血液、血清、尿、生検材料、腫瘍または異常なＩｇＥレベルを含むと思われるいずれの組織も含まれる。異常なＩｇＥレベルまたは活性に関して陽性と判定された被験体もまた、本明細書の以降で開示される処置方法から利益が得られる。
【０１５６】
本発明の診断方法は、結合要素とＩｇＥの複合体を固定された抗原によって捕捉することをさらに含み得る。例えば、対象サンプル中の抗原特異的ＩｇＥを捕捉するため、ラテラルストリップアッセイ上に抗原を固定すればよい。
【０１５７】
当業者ならば、本明細書に開示されている方法に照らして、それらの優先性と全般知識に従って結合要素と抗原の結合を測定する好適な様式を選択することができる。
【０１５８】
サンプル中の結合要素の反応性は適当ないずれかの方法によって測定することができる。ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)が１つの可能性である。放射性標識抗原を非標識抗原(試験サンプル)と混合し、結合要素と結合させる。結合した抗原を結合しなかった抗原から物理的に分離し、結合要素と結合した放射性抗原の量を測定する。試験サンプル中に存在する抗原が多いほど、結合要素と結合する放射性抗原は少なくなる。また、リポーター分子に結合させた抗原または類似体を用い、非放射性抗原との競合的結合アッセイを用いてもよい。リポーター分子は、スペクトル的に独立した吸収または発光特性を有する蛍光色素、燐光体またはレーザー色素であり得る。好適な蛍光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッド、ならびにランタニドキレートまたはクリプテートが挙げられる。好適な発色色素としては、ジアミノベンジジンがある。
【０１５９】
他のリポーターとしては、高分子コロイド粒子または粒状物質(有色、磁性または常磁性であるラテックスビーズなど)、および検出可能なシグナルを直接または間接的に、視覚により観察させ得るか、または電気的に検出させ得るか、またはたの方法で記録させ得る生物学的または化学的に活性な薬剤が含まれる。これらの分子は、例えば発色または変色または電気的特性を変化させ得る反応を触媒する酵素であってもよい。それらは、エネルギー状態間の電気的遷移が特徴的なスペクトル吸収または発光をもたらすように分子的に励起可能であり得る。それらは、バイオセンサーと併用される化学存在を含み得る。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリ性ホスファターゼ検出系が使用可能である。
【０１６０】
個々の結合要素−リポーターコンジュゲートにより生成されたシグナルは、サンプル(正常および試験)において関連のある結合要素の結合の定量可能な絶対的または相対的データを導くために使用することができる。
【０１６１】
また、本発明のいずれかの態様または実施態様の結合要素を含むキットも、本発明の一態様として提供される。このキットにおいて、結合要素は、例えばさらに以下に記載されるように、サンプル中のその反応性を測定可能とするよう標識することができる。さらに、結合要素は固相支持体に結合させても結合させなくてもよい。キットの成分は一般に無菌であり、密閉バイアルまたはその他の容器内にある。キットは診断分析または結合要素が有用な他の方法で使用可能である。キットは、例えば本発明の方法などの方法においてこれらの成分の使用説明書を含み得る。このような方法の実施を助けるまたは可能とする補助材料が本発明のキットに含まれてよい。補助材料としては、第一の結合要素と結合し、検出可能な標識(例えば、蛍光標識、放射性同位元素または酵素)とコンジュゲートされる第二の、異なる結合要素を含む。抗体に基づくキットはまた、免疫沈降を行うためのビーズも含み得る。キットの各成分は一般にその固有の好適な容器内にある。よって、これらのキットは一般に、各結合要素に好適な別個の容器を含む。さらに、これらのキットは、アッセイおよびアッセイの実行から得られるデータを解釈および分析するための方法を実行するための説明書を含み得る。
【０１６２】
本発明はまた、競合アッセイにおいて抗原レベルを測定するための上記結合要素の使用、すなわち、競合アッセイにおいて本発明により提供される結合要素を利用することによってサンプル中の抗原のレベルを測定する方法を提供する。これは非結合抗原から結合抗原を物理的に分離する必要のない方法であり得る。結合の際に物理的または光学的変化が生じるようなリポーター分子と結合要素の連結が１つの可能性である。このリポーター分子は直接または間接的に、定量可能である検出可能なシグナルを生成し得る。このリポーター分子の連結は直接的または間接的、共有結合的(例えば、ペプチド結合を介する)または非共有結合的であり得る。ペプチド結合を介した連結は、抗体およびリポーター分子をコードする遺伝子融合物の組換え発現の結果としてのものであり得る。
【０１６３】
種々の態様および実施態様において、本発明は、ＩｇＥとの結合に関して本明細書で定義されたいずれかの結合要素、例えば、親抗体または抗体１〜３６のいずれか、例えば、ＩｇＧ１形式のものと競合する結合要素に及ぶ。結合要素間の競合は、同じエピトープまたは重複するエピトープと結合する結合要素の同定を可能とするため、in vitroにおいて、例えば、検出可能な特異的リポーター分子をある結合要素に、他のタグ無しの結合要素の存在下でタグ付けすることにより、容易にアッセイすることができる。競合は例えば、ＩｇＥがプレートに固定され、第一のタグ付きまたは標識結合要素が１以上の他のタグ無しまたは非標識結合要素とともにプレートに添加されるＥＬＩＳＡを用いて判定することができる。タグ付き結合要素と競合するタグ無し結合要素の存在は、タグ付き結合要素によって発せられるシグナルの低下によって観察される。
【０１６４】
例えば、本発明は、ＩｇＥ結合化合物を同定する方法を含み、その方法は、(ｉ)ＩｇＥを支持体に固定すること、(ii)該固定化ＩｇＥを同時にまたは段階的に本発明の少なくとも１つのタグ付きまたは標識結合要素および１以上のタグ無しまたは非標識試験結合化合物と接触させること、および(iii)タグ付き結合要素に由来する結合タグの量の低下を観察することによって新規なＩｇＥ結合化合物を同定することを含む。このような方法はマルチウェルまたはアレイ形式を用い、ハイスループット様式で行うことができる。このようなアッセイはまた溶液中でも行うことができる。例えば、出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第５,８１４,４６８号参照。上記のように、結合の検出は、例えば、検出可能な標識またはその存在の低下を視覚的に観察することによるなど、本方法の実施者が直接解釈することが可能である。あるいは、本発明の結合方法はオートラジオグラフ、写真、コンピューターのプリントアウト、フローサイトメトリーレポート、グラフ、チャート、結果を含む試験管もしくは容器もしくはウェル、または本方法の結果の他の視覚的もしくは物理的提示の形態のレポートを作成し得る。
【０１６５】
競合アッセイはまた、エピトープマッピングにも使用できる。１つの事例では、エピトープマッピングは、所望により、至適化された中和および／または調節特性を持ち得るＩｇＥ結合要素によって結合されるエピトープを同定するために使用可能である。このようなエピトープは直鎖であってもコンフォメーション型であってもよい。コンフォメーショナルエピトープは少なくとも２つの異なるＩｇＥフラグメントを含むことができ、該フラグメントは、ＩｇＥがその三次元または四次元構造に折りたたまれて、ＩｇＥ結合要素などのＩｇＥの阻害剤により認識されるコンフォメーショナルエピトープを形成する場合には、互いに近接して配置される。競合の試験では、抗原のペプチドフラグメント、特に対象エピトープを含む、または本質的に対象エピトープからなるペプチドを使用することができる。いずれかの末端にエピトープ配列と１以上のアミノ酸を有するペプチドが使用可能である。本発明の結合要素は、抗原に対するそれらの結合が与えられた配列番号を有する、または含むペプチドによって阻害されるようなものであり得る。
【０１６６】
本発明はさらに本発明の結合要素をコードする単離された核酸を提供する。核酸はＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み得る。１つには、本発明は、上記で定義されたような本発明のＣＤＲまたはＣＤＲセットまたはＶＨドメインまたはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位または抗体分子、例えばｓｃＦｖまたはＩｇＧ１をコードする核酸を提供する。
【０１６７】
本発明はまた、上記のような少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物を提供する。
【０１６８】
本発明はまた、上記のような１以上の構築物を含む組換え宿主細胞を提供する。提供されるようなＣＤＲまたはＣＤＲセットまたはＶＨドメインまたはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位または抗体分子、例えばｓｃＦｖまたはＩｇＧ１のいずれかをコードする核酸はそれ自体、コードされる産物の生産方法(この方法はそのコード核酸からの発現を含む)と同様に本発明の態様をなす。発現は便宜には、核酸を含む組換え宿主細胞を適当な条件下で培養することによって達成され得る。発現による生産の後、ＶＨもしくはＶＬドメインまたは結合要素は、いずれかの好適な技術を用いて単離および／または精製した後、適宜使用することができる。
【０１６９】
本発明の核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含んでよく、完全または部分合成品であってもよい。本明細書に示されているようにヌクレオチド配列という場合には、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、文脈から他の解釈が必要ではない限り、ＵがＴに置き換えられている特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【０１７０】
なおさらなる態様は抗体ＶＨ可変ドメインの生産方法を提供し、その方法はコード核酸から発現させることを含む。このような方法は、宿主細胞を該抗体ＶＨ可変ドメインの生産のための条件下で培養することを含み得る。
【０１７１】
ＶＨおよび／またはＶＬドメインを含むＶＬ可変ドメインおよび結合要素の生産のための類似の方法が、本発明のさらなる態様として提供される。
【０１７２】
生産方法は、生成物の単離および／または精製の工程を含み得る。生産方法は、生成物を薬学上許容される賦形剤などの少なくとも１つの付加的成分を含む組成物に処方することを含み得る。
【０１７３】
多様な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳類細胞、植物細胞、微細線維真菌、酵母およびバキュロウイルス系ならびにトランスジェニック植物および動物が含まれる。原核細胞における抗体および抗体フラグメントの発現は当技術分野で十分確立されている。総説としては、例えば、Pluckthun[６０]参照。一般的な細菌宿主は大腸菌である。
【０１７４】
培養真核細胞における発現も、結合要素の生産のための選択肢として当業者に利用可能である[６１、６２、６３]。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野で利用可能な哺乳類細胞系統としては、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胚腎臓細胞、ヒト胚網膜細胞その他多数が含まれる。
【０１７５】
好適なベクターとしては、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適当であればその他の配列を含む適当な調節配列を含むものが選択または構築可能である。ベクターは、適当であれば、プラスミド、例えばファージミド、またはウイルス、例えばファージであり得る[６４]。例えば、核酸構築物の作製、突然変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの既知の技術およびプロトコールがAusubel et al.[６５]に詳細に記載されている。
【０１７６】
本発明のさらなる態様は、本明細書に開示されるような核酸を含む宿主細胞を提供する。このような宿主細胞はin vitroであってもよいし、培養系であってもよい。このような宿主細胞はin vivoであってもよい。in vivoにおける宿主細胞の存在は、「イントラボディー」または細胞内抗体としての本発明の結合要素の細胞内発現を可能とする。イントラボディーは遺伝子療法に使用可能である。
【０１７７】
なおさらなる態様は、本発明の核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。この導入には利用可能ないずれの技術を用いてもよい。真核細胞のためには、好適な技術として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクションおよびレトロウイルスもしくは他のウイルス(例えば、ワクシニア)または昆虫細胞にはバキュロウイルスを用いた形質導入が含まれる。宿主細胞、特に真核細胞における核酸の導入には、ウイルスまたはプラスミドに基づく系を用い得る。プラスミド系はエピソームによって維持されてもよいし、あるいは宿主細胞または人工染色体へ組み込まれてもよい。組込みは単一または複数の遺伝子座における１以上のコピーの無作為または標的化された組込みのいずれかによるものであってよい。細菌細胞のためには、好適な技術として、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを用いたトランスフェクションが含まれる。
【０１７８】
導入の後に、例えば宿主細胞を遺伝子の発現のための条件下で培養することにより、核酸からの発現を引き起こすまたは可能とすることができる。発現産物の精製は当業者に公知の方法によって達成することができる。
【０１７９】
本発明の核酸は宿主細胞のゲノム(例えば、染色体)に組み込まれ得る。組込みは、標準的な技術に従い、ゲノムとの組換えを促進する配列の包含により促進することができる。
【０１８０】
本発明はまた、上記のような結合要素またはポリペプチドを発現させるために、発現系において上述の構築物を用いることを含む方法を提供する。
【０１８１】
本発明の結合要素はヒトまたは動物対象、特にヒトにおける診断または処置の方法に使用可能である。ＩｇＥに対する結合要素はＩｇＥにより媒介される生物作用を特徴とする障害、特にアレルギーおよび喘息を処置するために使用可能である。例えば、本発明の結合要素は、アレルギー性鼻炎、アレルギー性接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー反応、食物アレルギー、蕁麻疹、炎症性腸疾患、好酸球性胃腸炎、薬剤性発疹、アレルギー性眼症、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、気道過敏症、化粧品アレルギー、薬剤性アレルギー、薬剤性過敏性症候群、金属アレルギー、職業性過敏性肺炎、慢性過敏性肺炎、寒冷過敏症、蠕虫感染誘発性過敏症、ラテックスアレルギーまたは枯草熱の処置に使用可能である。
【０１８２】
ＩｇＥに対する結合要素は、in vivoまたはin vitroでアレルゲンにより誘発される肥満細胞の脱顆粒を阻害するため、in vivoまたはin vitroでＦｃεＲ１により媒介される生物学的応答を軽減するため、ならびにヒトまたは動物患者において循環ＩｇＥを低減するために使用可能である。
【０１８３】
よって、本発明は、哺乳類においてアレルゲンにより誘発される肥満細胞の脱顆粒を阻害するための方法を提供し、その方法は、該哺乳類に本発明の結合要素、抗体、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを、ＩｇＥを中和するのに十分な量で投与することを含む。
【０１８４】
本発明はさらに、ＦｃεＲ１により媒介される生物学的応答を軽減するための方法を提供し、その方法は、ＦｃεＲ１を発現する細胞をＩｇＥの存在下で本発明の結合要素、抗体、ＶＨドメインまたはＶＬとドメインと接触させることを含む。
【０１８５】
試験細胞がin vitroにおいて本発明の結合要素と接触される場合、対照細胞はまた陽性対照(例えば、結合要素を含まない反応)および／または陰性対照(例えば、ＩｇＥおよび／または抗原を含まない反応)としても使用可能である。
【０１８６】
細胞が、本発明の結合要素を、ＦｃεＲ１により媒介される生物学的応答を示す哺乳類に投与することにより、in vivoにおいて結合要素により接触される場合、本発明の結合要素はＩｇＥを中和するのに十分な量で投与される。
【０１８７】
なおさらに、本発明は、ヒトなどの哺乳類において循環ＩｇＥを低減するための方法を提供し、その方法は、本発明の結合要素、抗体、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを、循環中の遊離ＩｇＥを中和し、低減するのに十分な量で投与することを含む。
【０１８８】
本発明の結合要素は、限定されるものではないが、アレルギー性鼻炎、アレルギー性接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー反応、食物アレルギー、蕁麻疹、炎症性腸疾患、好酸球性胃腸炎、薬剤性発疹、アレルギー性眼症、鼻結膜炎およびアレルギー性結膜炎のいずれか１以上を含む疾病または障害の診断または処置に使用可能である。
【０１８９】
上記の障害におけるＩｇＥの関与の証拠は当技術分野で公知である。
【０１９０】
よって、ＩｇＥの結合および中和に関して本明細書に示されたデータは、本発明の結合要素がこのような障害の重篤度の軽減を含む、該障害を治療または予防するために使用可能である。よって、本発明は、本明細書に述べられているいずれかの障害の少なくとも１つの症状を処置またはその重篤度を軽減する方法を提供し、その方法は、それを必要とする患者に、有効量の１以上の本発明の結合要素を単独で、または上記障害のいずれかの少なくとも１つの症状の重篤度が軽減されるように、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の別の適当な薬剤との併用治療計画で投与することを含む。
【０１９１】
本発明の結合要素は適当な動物および動物疾病モデル、特にサルで使用可能である。
【０１９２】
よって、本発明の結合要素は、ＩｇＥ、例えば、ＩｇＥの産生、発現および／または活性、特に異常な産生、発現または活性を含む疾病または障害の処置において治療薬として有用である。処置方法は有効量の本発明の結合要素を、それを必要とする患者に投与することを含み、それにより、ＩｇＥの異常な産生、発現および／または活性は低減される。処置方法は、(ｉ)例えば上記の診断方法を用いて異常なＩｇＥレベルまたは活性を示す患者を特定すること、および(ｉｉ)その患者に有効量の本発明の結合要素を投与し、ＩｇＥの異常な産生、発現および／または活性が低減されることを含む。本発明有効量は、ＩｇＥの異常な産生、発現および／または活性を低減させ、その結果、処置される特定の疾病または症状の少なくとも１つの症状の重篤度を低減または減らすが、必ずしもその疾病または障害を治癒させるものではない量である。
【０１９３】
本発明はまた、ＩｇＥの少なくとも１つの作用に拮抗作用を及ぼす方法も提供し、有効量の本発明の１以上の結合要素と接触させるか、またはそれを投与し、その結果、ＩｇＥの少なくとも１つの作用が拮抗作用を受けることを含む。本発明の方法により拮抗作用を受け得るＩｇＥの作用としては、ＦｃεＲ１により媒介される生物学的応答、およびこれらの結合反応の結果として生じるいずれの下流作用も含む。
【０１９４】
よって、本発明のさらなる態様は、本明細書に述べるＩｇＥと関連する、またはＩｇＥとにより媒介される障害を処置するための薬剤の製造を目的とする本発明の単離された結合要素、抗体、ＶＨドメインまたはＶＬドメインの使用を提供する。薬剤または医薬組成物のこのような使用または製造方法は、結合要素を薬学上許容される賦形剤とともに処方することを含む。
【０１９５】
薬学上許容される賦形剤は、二次反応を引き起こさず、例えば、有効化合物の投与の助長、その寿命および／または身体におけるその有効性の増大、溶液中でのその溶解度の増大、あるいはまたその変換の改良を可能とする医薬組成物に入った化合物または化合物の組合せであり得る。これらの薬学上許容されるビヒクルは周知のものであり、当業者により、選択された有効化合物の性質および投与様式の関数として適合される。
【０１９６】
本発明の結合要素は通常、結合要素に加えて少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。よって、本発明の、本発明に従って用いられる医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学上許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤または当業者に周知の他の材料を含み得る。このような材料は無毒であるべきであり、有効成分の有効性を妨げてはならない。担体または他の材料の厳密な性質は、下記に述べられるように、経口、吸入、気管内、局所的、小胞内または注射であり得る投与経路によって異なる。
【０１９７】
本発明では、例えば単鎖ドメイン抗体分子(例えば、「ナノボディー(商標))などのような経口投与用の医薬組成物も考えられる。このような経口製剤は錠剤、カプセル剤、散剤、液剤または半固体状であり得る。錠剤はゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含み得る。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油もしくは合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースまたは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれ得る。
【０１９８】
静脈内注射または罹患部位における注射では、有効成分は、発熱物質不含であり、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者ならば、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル液注射液などの等張ビヒクルを用い、好適な溶液を調製することが十分できる。必要であれば、リン酸、クエン酸およびその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンなどの酸化防止剤；保存剤(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど)；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類およびその他の炭水化物(グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む)；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体)；および／またはＴＷＥＥＮ(商標)、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(商標)またはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)などの非イオン性界面活性剤を含む、保存剤、安定剤、バッファー、酸化防止剤および／またはその他の添加剤が使用可能である。
【０１９９】
本発明の結合要素は、その分子の物理化学的特性および送達経路によって、液体、半固体または固体形態で処方され得る。製剤は賦形剤、または賦形剤の組合せ、例えば、糖類、アミノ酸および界面活性剤を含み得る。液体製剤は広範囲の抗体濃度およびｐＨを含み得る。固体製剤は例えば凍結乾燥、噴霧乾燥または超臨界流体技術による乾燥によって製造され得る。抗ＩｇＥ製剤は意図する送達経路によって異なり、例えば、肺送達用の製剤は、吸入の際に肺深部への浸透を確保する物理的特性を有する粒子からなってよく；局所用製剤(例えば、瘢痕、例えば皮膚瘢痕の処置のため)は、薬剤がその作用部位に留まる時間を延長する粘度改質剤を含み得る。結合要素は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル送達系を含む徐放性製剤など、結合要素を即時放出から保護する担体を用いて調製してもよい。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用可能である。このような製剤を調製するための多くの方法が当業者に公知である[６６]。
【０２００】
抗ＩｇＥ処置は経口(例えば、単鎖ドメイン抗体分子(例えば、「ナノボディー(商標)」)、注射(例えば、皮下、関節内、静脈内、腹腔内、動脈内または筋肉内)、吸入、気管内、小胞内経路(膀胱への点滴)、または局所的(例えば、眼内、鼻腔内、直腸、創傷内、皮膚上)により与えることができる。処置は、パルス注入により、特に結合要素の用量を引き下げながら投与することができる。投与経路は処置の物理化学的特徴、疾病の特殊な考慮または、有効性を至適化するため、もしくは副作用を最小化するための要件によって決定され得る。１つの特定の投与経路は静脈内である。本発明の医薬組成物を投与するもう１つの経路は皮下である。抗ＩｇＥ処置は診療所での使用に限定されないと考えられる。よって、無針デバイスを用いた皮下注射も有利である。
【０２０１】
組成物は処置される症状に応じて単独でまたは他の処置と組み合わせて、同時または逐次に投与され得る。
【０２０２】
ＩｇＥに対する結合要素は、併用療法の一部として、付加的な医薬成分とともに使用することができる。併用処置、特に、抗ＩｇＥ結合要素と１以上の他の薬剤との組合せは、有意な相乗作用を得るために用い得る。ＩｇＥに対する結合要素は、本明細書に挙げられている１以上の症状の処置のために同時または逐次に、あるいは別の治療薬との組合せ製剤として投与し得る。
【０２０３】
本発明の結合要素は、喘息およびアレルギー性障害、またはＩｇＥ介在作用を含む他の障害のためのその他の利用可能な処置と組み合わせて処方および／または使用し得る。
【０２０４】
本発明の結合要素は、以下の薬剤の１以上と組み合わせて、またはそれらを加えて提供することができる：
・サイトカインまたはサイトカイン機能のアゴニストもしくはアンタゴニスト(例えば、サイトカインシグナル伝達経路に作用する薬剤、例えばＳＯＣＳ系のモジュレーター)、例えば、α−、β−および／またはγ−インターフェロン；インスリン様増殖因子Ｉ型(ＩＧＦ−１)、その受容体および関連の結合タンパク質；インターロイキン(ＩＬ)、例えば、１以上のＩＬ−１〜３３および／またはインターロイキンアンタゴニストまたは阻害剤、例えば、アナキンラ；インターロイキンファミリー要素の受容体の阻害剤またはこのような受容体の特異的サブユニットの阻害剤、腫瘍壊死因子α(ＴＮＦ−α)阻害剤、例えば、抗ＴＮＦモノクローナル抗体(例えば、インフリキシマブ(infliximab)、アダリムマブ(adalimumab)および／またはＣＤＰ−８７０)および／またはＴＮＦ受容体アンタゴニスト、例えば、免疫グロブリン分子(エタネルセプト(etanercept)など)および／またはペントキシフィリンなどの低分子量薬剤；
・Ｂ細胞のモジュレーター、例えば、Ｂリンパ球を標的とするモノクローナル抗体(ＣＤ２０(リツキシマブ)またはＭＲＡ−ａＩＬｌ６Ｒなど)またはＴリンパ球(例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＨｕＭａｘ  Ｉｌ−１５またはアバタセプト(Abatacept))；
・破骨細胞活性を阻害するモジュレーター、例えば、ＲＡＮＫＬに対する抗体；
・ケモカインまたはケモカイン受容体機能のモジュレーター、例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ２Ａ、ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０およびＣＣＲ１１(Ｃ−Ｃファミリーに対する)；ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５およびＣＸＣＲ６(Ｃ−Ｘ−Ｃファミリーに対する)ならびにＣ−Ｘ３−Ｃファミリーに対するＣＸ３ＣＲ１のアンタゴニスト；
・マトリックスメタロプロテアーゼ(ＭＭＰ)の阻害剤、すなわち、１以上のストロメライシン、コラゲナーゼおよびゼラチナーゼ、ならびにアグレカナーゼ、特にコラゲナーゼ−１(ＭＭＰ−１)、コラゲナーゼ−２(ＭＭＰ−８)、コラゲナーゼ−３(ＭＭＰ−１３)、ストロメライシン−１(ＭＭＰ−３)、ストロメライシン−２(ＭＭＰ−１０)および／またはストロメライシン−３(ＭＭＰ−１１)および／またはＭＭＰ−９および／またはＭＭＰ−１２、例えば、ドキシサイクリンなどの薬剤；
・ロイコトリエン生合成阻害剤、５−リポキシゲナーゼ(５−ＬＯ)阻害剤または５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ＦＬＡＰ)アンタゴニスト、例えばジレウトン；ＡＢＴ−７６１；フェンレウトン(fenleuton)；テポキサリン(tepoxalin)；Ａｂｂｏｔｔ−７９１７５；Ａｂｂｏｔｔ−８５７６１；Ｎ−(５−置換)−チオフェン−２−アルキルスルホンアミド；２,６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノールヒドラゾン；メトキシテトラヒドロピラン、例えばＺｅｎｅｃａ  ＺＤ−２１３８；化合物ＳＢ−２１０６６１；ピリジニル−置換２−シアノナフタレン化合物、例えば、Ｌ−７３９,０１０；２−シアノキノリン化合物、例えば、Ｌ−７４６,５３０；インドールおよび／またはキノリン化合物、例えば、ＭＫ−５９１、ＭＫ−８８６および／またはＢＡＹ  ｘ  １００５；
・Ｌ−６５１,３９２などのフェノチアジン−３−１；ＣＧＳ−２５０１９ｃなどのアミジノ化合物；オンタゾラスト(ontazolast)などのベンゾキサラミン；ＢＩＩＬ  ２８４／２６０などのベンゼンカルボキシイミドアミド；ならびにザフィルルカスト(zafirlukast)、アブルカスト(ablukast))、モンテルカスト(montelukast)、プランルカスト(pranlukast)、ベルルカスト(verlukast)(ＭＫ−６７９)、ＲＧ−１２５２５、Ｒｏ−２４５９１３、イラルカスト(iralukast)(ＣＧＰ  ４５７１５Ａ)およびＢＡＹ  ｘ  ７１９５などの化合物からなる群から選択されるロイコトリエン(ＬＴ)Ｂ４、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４の受容体アンタゴニスト；
・メチルキサンタニン、例えば、テオフィリンおよび／またはアミノフィリン；および／または選択性ＰＤＥイソ酵素阻害剤、例えば、ＰＤＥ４阻害剤および／またはイソ型ＰＤＥ４Ｄの阻害剤および／またはＰＤＥ５の阻害剤などのホスホジエステラーゼ(ＰＤＥ)阻害剤；
・ヒスタミン１型受容体アンタゴニスト、例えば、セチリジン(cetirizine)、ロラタジン(loratadine)、デスロラタジン(desloratadine)、フェキソフェナジン(fexofenadine)、アクリバスチン(acrivastine)、テルフェナジン(terfenadine)、アステミゾール(astemizole)、アゼラスチン(azelastine)、レボカバスチン(levocabastine)、クロロフェニラミン(chlorpheniramime)、プロメタジン(promethazine)、サイクリジン(cyclizine)および／またはミゾラスチン(mizolastine)(一般に経口、局所または非経口適用される)；
・プロトンポンプ阻害剤(例えば、オメプラゾール)または胃保護ヒスタミン２型受容体アンタゴニスト；
・ヒスタミン４型受容体のアンタゴニスト；
・プロピルヘキセドリン、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、エフェドリン、シュードエフェドリン、塩酸ナファゾリン、塩酸オキシメタゾリン、塩酸テトラヒドロゾリン、塩酸キシロメタゾリン、塩酸トラマゾリンおよび塩酸エチルノルエピネフリンなどのα−１／α−２アドレノセプターアゴニスト血管収縮交感神経作用薬；
・抗コリン作用薬、例えば、ムスカリン性受容体(Ｍ１、Ｍ２およびＭ３)アンタゴニスト、例えば、アトロピン、ヒヨスチン、グリコピロレート、臭化イプラトロピウム、臭化チオトロピウム、臭化オキシトロピウム、ピレンゼピンおよびテレンゼピン；
・β−アドレノセプターアゴニスト(β受容体サブタイプ１〜４)を含む、例えば、イソプレナリン、サルブタモール、フォルモテロール、サルメテロール、テルブタリン、オルシプレナリン、メシル酸ビトルテロールおよび／またはピルブテロール、例えば、そのキラル鏡像異性体；
・クロモン、例えば、クロモグリク酸ナトリウムおよび／またはネドクロミルナトリウム；
・グルココルチコイド、例えば、フルニソリド、トリアムシノロンアセトニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、シクレソニドおよび／またはフロ酸モメタゾン；
・核ホルモン受容体を調節する薬剤、例えば、ＰＰＡＲ；
・Ｉｇ機能を調節する免疫グロブリン(Ｉｇ)またはＩｇ製剤またはアンタゴニストまたは抗体、例えば、本発明の結合要素と同じまたは異なるエピトープと結合する抗ＩｇＥ；
・その他の全身適用または局所適用抗炎症薬、例えば、サリドマイドまたはその誘導体、レチノイド、ジトラノールおよび／またはカルシポトリオール；
・アミノサリチレートとスルファピリジン(例えば、スルファサラジン、メサラジン、バルサラジドおよびオルサラジン)との；免疫調節薬、例えば、チオプリンとの；コルチコステロイド、例えば、ブデソニドとの組合せ；
・抗菌薬、例えば、ペニシリン誘導体、テトラサイクリン、マクロライド、β−ラクタム、フルオロキノロン、メトロニダゾールおよび／または吸入アミノグリコシド；および／または抗ウイルス薬、例えば、アシクロビル(acyclovir)、ファムシクロビル(famciclovir)、バラシクロビル(valaciclovir)、ガンシクロビル(ganciclovir)、シドフォビル(cidofovir)；アマンタジン(amantadine)、リマンタジン(rimantadine)；リバビリン(ribavirin)；ザナマビル(zanamavir)および／またはオセルタマビル(oseltamavir)；プロテアーゼ阻害剤、例えば、インジナビル(indinavir)、ネルフィナビル(nelfinavir)、リトナビル(ritonavir)および／またはサキナビル(saquinavir)；ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えば、ジダノシン(didanosine)、ラミブジン(lamivudine)、スタブジン(stavudine)、ザルシタビン(zalcitabine)、ジドブジン(zidovudine)；非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えば、ネビラピン(nevirapine)、エファビレンズ(efavirenz)；
・心血管薬、例えば、カルシウムチャネル遮断薬、β−アドレノセプター遮断薬、アンギオテンシン変換酵素(ＡＣＥ)阻害剤、アンギオテンシン−２受容体アンタゴニスト；脂質降下薬、例えば、スタチンおよび／またはフィブラート；血液細胞形態のモジュレーター、例えば、ペントキシフィリン；血栓溶解薬および／または抗凝固薬、例えば、血小板凝集阻害剤；
・ＣＮＳ薬、例えば、抗鬱薬(例えば、セルトラリン)、抗パーキンソン病薬(例えば、デプレニル、Ｌ−ドーパ、ロピニロール(ropinirole)、プラニペキソール(pramipexole)；ＭＡＯＢ阻害剤、例えば、セレジン(selegine)およびラサギリン(rasagiline)；ｃｏｍＰ阻害剤、例えば、タスマール(tasmar)；Ａ−２阻害剤、ドーパミン再取り込み阻害剤、ＮＭＤＡアンタゴニスト、ニコチンアゴニスト、ドーパミンアゴニストおよび／またはニューロン一酸化窒素合成酵素阻害剤)および抗アルツハイマー病薬、例えば、ドネペジル(donepezil)、リバスチグミン(rivastigmine)、タクリン(tacrine)、ＣＯＸ−２阻害剤、プロペントフィリン(propentofyllin)またはメトリフォネート(metrifonate)；
・急性および慢性疼痛の処置のための薬剤、例えば、中枢または末梢作用性鎮痛薬、例えば、オピオイド類似体または誘導体、カルバマゼピン(carmazepine)、フェニトイン(phenytoin)、バルプロ酸ナトリウム、アミトリプチリン(amitryptiline)または他の抗鬱薬、パラセタモール(paracetamol)または非ステロイド系抗炎症薬；
・非経口適用または局所適用(吸入を含む)局部麻酔薬、例えば、リグノカインまたはその類似体；
・抗骨粗鬆症薬、例えば、ホルモン剤、例えば、ラロキシフェン(raloxifene)、またはビホスホネート、例えば、アレンドロネート(alendronate)；
・(ｉ)トリプターゼ阻害剤；(ii)血小板活性化因子(ＰＡＦ)アンタゴニスト；(iii)インターロイキン変換酵素(ＩＣＥ)阻害剤；(iv)ＩＭＰＤＨ阻害剤；(ｖ)ＶＬＡ−４アンタゴニストを含む接着分子阻害剤；(vi)カテプシン；(vii)キナーゼ阻害剤、例えば、チロシンキナーゼの阻害剤(例えば、Ｂｔｋ、Ｉｔｋ、Ｊａｋ３  ＭＡＰの阻害剤の例としては、ゲフィチニブ、メシル酸イマチニブが含まれる)、セリン／トレオニンキナーゼの阻害剤(例えば、ＭＡＰキナーゼ、例えば、ｐ３８、ＪＮＫ、プロテインキナーゼＡ、ＢおよびＣ、ならびにＩＫＫの阻害剤)または細胞周期の調節に関与するキナーゼ(例えば、サイクリン依存性キナーゼ(cylin dependent kinase)の阻害剤；(viii)グルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤；(ix)キニン−Ｂ１−および／またはＢ２−受容体アンタゴニスト；(ｘ)抗痛風薬、例えば、コルヒチン；(xi)キサンチンオキシダーゼ阻害剤、例えば、アロプリノール(allopurinol)；(xii)尿酸排泄薬、例えば、プロベネシド(probenecid)、スルフィンピラゾン(sulfinpyrazone)および／またはベンズブロマロン(benzbromarone)；(xiii)成長ホルモン分泌促進薬；(xiv)トランスフォーミング増殖因子(ＴＧＦβ)；(xv)血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)；(xvi)繊維芽細胞増殖因子、例えば、塩基性繊維芽細胞増殖因子(ｂＦＧＦ)；(xvii)顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)；(xviii)カプサイシンクリーム；(xix)タキキニンＮＫ１および／またはＮＫ３受容体アンタゴニスト、例えば、ＮＫＰ−６０８Ｃ、ＳＢ−２３３４１２(タルネタント(talnetant))および／またはＤ−４４１８；(xx)エラスターゼ阻害剤、例えば、ＵＴ−７７および／またはＺＤ−０８９２；(xxi)ＴＮＦ−α変換酵素阻害剤(ＴＡＣＥ)；(xxii)誘発性一酸化窒素シンターゼ(ｉＮＯＳ)阻害剤または(xxiii)ＴＨ２細胞上で発現される化学遊走物質受容体ホモ分子(ＣＲＴＨ２アンタゴニスト)；(xxiv)Ｐ３８の阻害剤、(xxv)Ｔｏｌｌ様受容体(ＴＬＲ)の機能を調節する薬剤および(xxvi)プリン受容体の活性を調節する薬剤、例えば、Ｐ２Ｘ７；(xxvii)転写因子活性化の阻害剤、例えば、ＮＦｋＢ、ＡＰＩおよび／またはＳＴＡＴＳ。
【０２０５】
阻害剤は特異的であっても、または混合型阻害剤、例えば、上述の１を超える(例えば、受容体)または分子種を標的とする阻害剤であり得る。
【０２０６】
結合要素はまた、同時投与で、または免疫複合体も形態で化学療法薬または別のチロシンキナーゼ阻害剤と併用可能である。該抗体のフラグメントもまた、組換え機構または生化学的カップリングおよびその後の上記抗体の特異性と、ＩｇＥが関連する活性に関与する他の分子を認識し得る他の抗体の特異性との関連づけによって得られる二重特異性抗体において使用可能である。
【０２０７】
炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、骨関節炎、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)または乾癬の処置のためには、本発明の結合要素を、局所適用であれ全身適用であれ非選択性シクロオキシゲナーゼ(ＣＯＸ)−１／ＣＯＸ−２阻害剤(例えば、ピロキシカム(piroxicam)、ジクロフェナク(diclofenac)、プロピオン酸(例えば、ナプロキセン(naproxen)、フルビプロフェン(flurbiprofen)、フェノプロフェン(fenoprofen)、ケトプロフェン(ketoprofen)およびイブプロフェン(ibuprofen)、フェナム酸(例えば、メフェナム酸、インドメタシン(indomethacin)、スリンダック(sulindac)、アザプロパゾン(azapropazone))、ピラゾロン(例えば、フェニルブタゾン)、サリチレート(例えば、アスピリン)；選択性ＣＯＸ−２阻害剤(例えば、メロキシカム(meloxicam)、セレコキシブ(celecoxib)、ロフェコキシブ(rofecoxib)、バルデコキシブ(valdecoxib)、ルマロコキシブ(lumarocoxib)、パレコシキブ(parecoxib)およびエトリコキシブ(etoricoxib))；一酸化窒素供与体阻害シクロオキシゲナーゼ(ＣＩＮＯＤ)；グルココルチコステロイド(局所投与されるものであれ、経口投与されるものであれ、筋肉内投与されるものであれ、静脈内投与されるものであれ、あるいは関節内経路により投与されるものであれ)；メトトレキサート(methotrexate)、レフルノミド(leflunomide)；ヒドロキシクロロキン(hydroxychloroquine)、ｄ−ペニシラミン(de-penicillamine)、オーラノフィン(auranofin)またはその他の非経口または経口金製剤；鎮痛薬；ジアセレイン(diacerein)；関節内治療薬(例えば、ヒアルロン酸誘導体)；および栄養サプリメント(例えば、グルコサミン)を含む非ステロイド系抗炎症薬(以下、ＮＳＡＩＤ)などの１以上の薬剤と組み合わせればよい。
【０２０８】
本発明の結合要素と１以上の上記の付加的医薬成分は薬剤の製造において使用可能である。この薬剤は個々への個別投与または組合せ投与のためのものであってよく、従って、結合要素および付加的成分を組合せ製剤または個別製剤として含み得る。個別製剤は個別投与および逐次または同時投与するために使用可能であり、例えば経口投与および非経口投与などの種々の経路によるこれら成分の投与を可能とする。
【０２０９】
本発明によれば、提供される組成物は哺乳類に投与し得る。投与は通常「治療上有効な量」であり、これは患者に利益を示すのに十分なものである。このような利益は少なくとも１つの症状の少なくとも改善であり得る。投与される実際の量ならびに投与の頻度およびタイムコースは、処置されるものの性質および重篤度、処置される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、その障害の経過、その組成物の送達部位、結合要素のタイプ、投与方法、投与計画および医師に知られているその他の因子によって異なる。例えば用量の判断などの処置の処方は一般医その他の医師の責任の範囲内であり、症状の重篤度および／または処置される疾病の進行によって異なり得る。抗体の適当な用量は当技術分野で周知であり[６７、６８]。投与される薬剤のタイプに適当であれば、本明細書またはPhysician’s Desk Reference (2003)に示されている特定の用量が使用可能である。本発明の結合要素の治療上有効な量または好適な用量は、そのin vitro活性と動物モデルにおけるそのin vivo活性を比較することによって決定することができる。ヒトに対してマウスおよびその他の試験動物の有効用量を外挿する方法は公知である。厳密な用量は、その抗体が診断用のものであるか、予防用のものであるか、治療用のものであるか、処置される領域の大きさおよび場所、抗体の厳密な性質(例えば、完全抗体かフラグメントかダイアボディーか)および抗体と結合される任意の検出可能な標識またはその他の分子の性質を含む多数の因子に依存する。典型的な抗体用量は全身適用では１００μｇ〜１ｇ、局所適用では１μｇ〜１ｍｇの範囲である。最初により高い導入用量、次いで１以上のより低い用量を投与することができる。一般に、この抗体は完全抗体、例えばＩｇＧ１イソ型である。これは成人患者の単回処置のための用量であり、小児および乳児にも比例的に調整でき、また、他の抗体分子についても分子量と比例して調整可能である。処置は、医師の判断で毎日、毎週または毎月の間隔で反復可能である。処置は、皮下投与では２〜４週間おき、静脈内投与では４〜８週間おきであり得る。処置は周期的であり得、投与間の期間は約２週間またはそれ以上、例えば約３週間またはそれ以上、約４週間またはそれ以上、または約１か月である。処置は術前および／または術後に行ってもよく、かつ／または手術処置の解剖学的部位に直接投与または適用してもよい。
【０２１０】
表および図の簡単な説明
表１ａ−ｆは抗体１〜３６のそれぞれの重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
表２ａ−ｆは抗体１〜３６のそれぞれの軽鎖のアミノ酸配列を示す。
表３ａ−ｈは抗体１〜３６のそれぞれの重鎖のアミノ酸配列を示す。
表４は添付の配列表(配列番号は表４に示されているものに相当)に示されるような本発明の例示的結合要素の配列を示す。
表４ｂは添付の配列表(配列番号は表４ｂに示されているものに相当)に示される仮出願からの本発明の例示的結合要素のＶＬ  ＤＮＡ配列およびＶＬアミノ配列を示す。
表５ａは受容体−リガンド結合ＨＴＲＦ(登録商標)アッセイで試験した場合に、標的化突然変異誘発ライブラリーから同定されたクローンの効力例を示す。
表５ｂはＳＰＲ(BIACORE)を用いた、ヒトＩｇＥおよびカニクイザルＩｇＥに対する本発明の例示的結合要素の結合親和性(ＫＤ)を示す。表５ｂはさらに、ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナル伝達アッセイ(２５ｎｇ／ｍｌヒトまたは１００ｎｇ／ｍｌカニクイザルＩｇＥを用いて４時間)における、本発明の例示的結合要素の効力(ＩＣ５０として表される)を示す。
表６はＢＩＡｃｏｒｅを用いた結合親和性算出の例および生殖系列化された抗体に関するＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナル伝達アッセイを用いた効力測定値を示す。
表７は抗ＩｇＥモノクローナル抗体(ｍＡｂ)の一般的安全性および能力の評価のための試験計画の概要を示す。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】実施例２.６に関し、抗体のモル濃度(ｘ軸で対数として表される)とＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナル伝達アッセイにおけるピークの高さ(ｙ軸)を示す。白い四角は抗体１１、十字は無関連のＩｇＧ１対照抗体、そして白い逆三角は抗ＩｇＥ架橋抗体(Biosource)に関する。この図面では白い四角と十字が互いに重なっていることに着目される。
【図２】カニクイザルＣε３−４  ＦＬＡＧ  Ｈｉｓ１０の配列を示す。
【図３】ヒト抗エストラジオール(oestradiaol)ｓｃＦｖ(Ｄ１２＿ＶＨ)およびカニクイザルＩｇＨＥ遺伝子ハプロタイプの１つ(ｃｙＩｇＨＥ  ＴＱ)をコードする可変重鎖の配列を示す。
【図４】ヒト抗エストラジオール(oestradiaol)ｓｃＦｖ(Ｄ１２＿ＶＨ)およびカニクイザルＩｇＨＥ遺伝子ハプロタイプの１つｃｙＩｇＨＥ  ＭＥをコードする可変重鎖の配列を示す。
【図５】ヒト抗エストラジオールｓｃＦｖ(Ｄ１２＿ＶＬ)およびカニクイザルλ定常領域遺伝子ｃｙＩＧＬＣ  ４の可変軽鎖の配列(配列範囲：１〜７０８)を示す。
【図６】ヒト抗エストラジオールｓｃＦｖ(Ｄ１２＿ＶＬ)およびカニクイザルλ定常領域遺伝子Ｄ１２＿ＶＬ  ｃｙＩＧＬＣ  ７の可変軽鎖の配列を示す。
【図７】実施例４に関し、遮断抗ＩｇＥで処理されてないＢ細胞における最大ＩｇＥ発現の阻害率％を示す。ここで、ｘ軸はヒトインターロイキン４の濃度(ｎｇ／ｍｌ)であり、ｙ軸はＣＤ１９とＩｇＥの双方に陽性の細胞の割合％である。十字は抗体３３が存在しない場合の対照に関し、白丸は、０.５μｇ／ｍｌの抗体３３により誘発されたシフトに関し、白四角は５μｇ／ｍｌの抗体３３により誘発されたシフトに関する。
【図８】実施例５に関し、カニクイザルにおける１ｍｇ／ｋｇ(１日目)、３０ｍｇ／ｋｇ(８日目)および１００ｍｇ／ｋｇ(１６日目とそれ以降)投与後のＥ８５＿５０  ＩｇＧ１、Ｅ８５＿５０  ＩｇＧ２および抗体３３の平均毒物動態学プロファイルを示す。エラーバーは標準偏差を表す。ｙ軸は抗体の血清濃度であり、ｘ軸は最初の投与からの日数である。群１(Ｅ８５＿５０  ＩｇＧ１)は黒丸で示し、群２(Ｅ８５＿５０  ＩｇＧ２)は白三角で示し、群３(抗体３３)は黒四角で示す。
【図９】実施例５に関し、毎週、Ｅ８５＿５０  ＩｇＧ１、Ｅ８５＿５０  ＩｇＧ２および抗体３３(１日目に１ｍｇ／ｋｇ、８日目に３０ｍｇ／ｋｇ、そして１６日目とそれ以降に１００ｍｇ／ｋｇ)の投与を受けたカニクイザルにおける平均遊離ＩｇＥプロファイルを示す。エラーバーは標準偏差である。ｙ軸はＩｇＥ濃度(ｎｇ／ｍｌ)であり、ｘ軸は日数である。群１(Ｅ８５＿５０  ＩｇＧ１)は黒丸で示し、群２(Ｅ８５＿５０  ＩｇＧ２)は白三角で示し、群３(抗体３３)は黒四角で示す。
【図１０】実施例５に関し、群１(抗体３３処理)における動物かの血漿濃度に対する２つの投与前の値の平均からの変化率％として表した血小板数(×１０９／Ｌ)のプロットを示す。このプロットは、血小板に対して有意な作用を示さなかった３つの群の他の１６匹の動物の代表例である。ｘ軸は時間(時間)を示し、左のｙ軸は血小板レベルを処置前の平均レベルからの変化率％として示し、右のｙ軸は抗ＩｇＥ抗体の濃度(ｎｍｏｌ／Ｌ)を示す。閉じた四角は血小板濃度、黒い菱形は抗ＩｇＥ抗体の濃度を示す。閉じた三角は抗ＩｇＥ抗体の用量(ｍｇ／ｋｇ)を示す。
【実施例】
【０２１２】
繊維状ファージＭ１３に基づくファージミドベクターにクローニングされたナイーブヒト単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)ファージディスプレーライブラリーを選択に用いた[６９、７０]。
【０２１３】
組換えヒトＩｇＥに対する一連の選択サイクルを用い、ファージディスプレーライブラリーから抗ＩｇＥ特異的ｓｃＦｖ抗体を単離する。
【０２１４】
選択されたｓｃＦｖ抗体をヒトＩｇＥとの結合および／または効力に関して至適化し、ＩｇＧ抗体として再フォーマットする。
【０２１５】
配列
本発明の例示的結合要素の配列は添付の配列表に示され、それらの配列番号は次のように対応する。
ｉ)抗体番号の後にＧＬが続く場合(例えば３３ＧＬ)、これは１以上の残基が生殖細胞系の構成に復帰突然変異された抗体を指し、一般にＧＬが用いられる場合、感知できる活性の損失無く生殖細胞系に復帰突然変異され得る全ての非生殖細胞系残基が生殖系列化されている。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
2010519194.tif 000018
【０２１６】
仮出願とともに提出された配列表では、ＶＬ  ＤＮＡおよび対応するＶＬアミノ酸(aminio acid)のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に示されている３’ｇｇｔコドンの配列および対応するグリシン残基は、発現されたこの抗体のｓｃＦｖおよびＩｇＧ配列に含まれていた。この配列のＣ末端グリシン残基はＫａｂａｔ残基１０８に相当する。この末端グリシンはＶＬ配列の一部ではなく、表４ａに示されている配列からは除かれている。仮出願のＶＬ  ＤＮＡおよびＶＬアミノ酸の配列は配列表とともに含まれ、下記表４ｂに示されている。この残基の起源およびそのコードするトリプレットｇｇｔは以下に説明する。
【０２１７】
ＩｇＧの軽鎖を発現させるため、ＶＬドメインをコードする第一エキソン、ＣＬドメインをコードする第二エキソンおよび第一エキソンと第二エキソンを隔てるを含む抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を準備した。通常の環境下で、イントロンは細胞ｍＲＮＡプロセシング機構によってスプライシングで除かれ、第一エキソンの３’末端と第二エキソンの５’末端が連結される。よって、該ヌクレオチド配列を有するＤＮＡがＲＮＡとして発現された場合、第一エキソンと第二エキソンはともにスプライシングされた。このスプライシングされたＲＮＡが翻訳されると、ＶＬドメインとＣＬドメインを含むポリペプチドが産生される。スプライシングの後、Ｋａｂａｔ残基１０８のＧｌｙは、ＶＬドメインフレームワーク４配列の最後の塩基(ｇ)とＣＬドメインの最初の２つの塩基(ｇｔ)によりコードされる。
【０２１８】
従って、Ｋａｂａｔ残基１０８のグリシン残基は仮出願のＶＬ配列の配列表に含まれていたが、上記のように、抗体分子のＶＬドメインのＣ末端残基と考えるべきではないので、表４ａの配列表からは削除した。
【表１８】
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【表１９】
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【０２１９】
仮出願の配列表で抗体３５として示されている配列は、表４ａでは抗体３３ＧＬと示されている。抗体３３ＧＬは抗体３３と共通のＶＨドメインを有し、従って、配列番号３４７は仮出願の配列表(sequence lising)では空欄である。結局、３３ＧＬのＶＨドメイン配列は配列番号２７７(ＤＮＡ)および配列番号２７８(タンパク質)である。これについては表４ａで修正されている。
【０２２０】
実施例１. 主要な単離
１.１  選択
繊維状ファージＭ１３に基づくファージミドベクターにクローニングされたナイーブヒト単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)ファージディスプレーライブラリーを選択に用いた(Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996), Hutchings, Antibody Engineering, R.Kontermann and S. Dubel, Editors. 2001, Springer Laboratory Manuals, Berlin. P93)。本質的にVaughan et al (Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996)によって従前に記載されているように、血漿精製ヒトＩｇＥκ(Calbiochem)または血漿精製ヒトＩｇＥλ(Biodesign)のいずれかでの一連の選択サイクルを用い、抗ＩｇＥ特異的ｓｃＦｖ抗体をファージディスプレーライブラリーから単離した。要するに、パンニング選択のため、ＰＢＳ(ダルベッコのＰＢＳ、ｐＨ７.４)中のヒトＩｇＥを４℃で一晩、Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート(Nunc)のウェルに吸着させた。ウェルをＰＢＳで洗浄した後、１時間、ＰＢＳ−Ｍａｒｖｅｌ(３％ｗ／ｖ)でブロッキングした。これらのウェルにＰＢＳ−Ｍａｒｖｅｌ(３％ｗ／ｖ)中の精製ファージを加え、１時間、コーディングされた抗原と結合させた。結合していないファージを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ(０.１％ｖ／ｖ)およびＰＢＳを用いた一連の洗浄サイクルによって除去した。結合しているファージ粒子を溶出させ、細菌に感染させ、次の選択のために救済した(Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996))。κ型とλ型のＩｇＥを用い、交互に選択を行った。
【０２２１】
１.２  未精製ｓｃＦｖによるＩｇＥとＦｃεＲＩの結合の阻害
２回目の選択から得られた典型数の各ｓｃＦｖを９６ウェルプレートで増殖させた。ＳｃＦｖは細菌の縁質で発現され、ヒトＩｇＥ／ヒトＦｃεＲＩ−結合アッセイに基づく均質ＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー移動)で、それらの阻害活性に関してスクリーニングした。このアッセイでは、サンプルは、ユウロピウムキレート(Perkin Elmer 1244-302)で標識されたヒトＩｇＥとの結合に関して(Calbiochem 401152)ヒトＦｃεＲＩ−Ｆｃ(自家生産ＮＳ０細胞)と競合した。詳細なアッセイ方法は材料および方法の節に示されている。
【０２２２】
１.３  精製ｓｃＦｖによるＩｇＥとＦｃεＲＩとの結合の阻害
未精製周縁質抽出物と同様にＩｇＥ：ＦｃεＲＩ相互作用に対して有意な阻害作用を示したＳｃＦｖに対してＤＮＡ配列決定を行った(Osbourn 1996;Immunotechnology. 2, 181-196)。ユニークなｓｃＦｖを細菌で再び発現させ、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した(Bannister et al (2006) Biotechnology and bioengineering, 94. 931-937に記載の通り)。これらのサンプルの効力は、精製調製物の連続希釈液をユウロピウムキレート(Perkin Elmer 1244-302)で標識されたヒトＩｇＥ(Calbiochem 401152)との結合に関してＦｃεＲＩ(自家生産ＮＳ０細胞)と競合させることにより測定した。精製ｓｃＦｖ調製物、例えば、抗体１はＩｇＥ−ＦｃεＲＩ相互作用を阻害することができた。詳細なプロトコールは材料および方法の節に示されている。
【０２２３】
１.４  ｓｃＦｖからＩｇＧへの再フォーマット
ＶＨおよびＶＬドメインを、それぞれ完全抗体重鎖および軽鎖を発現するベクターにサブクローニングすることにより、クローンをｓｃＦｖ形式からＩｇＧ形式へ変換した。ＶＨドメインを、ヒト重鎖定常ドメインと哺乳類細胞で完全ＩｇＧ１またはＩｇＧ２重鎖を発現させるための調節エレメントを含有するベクター(ｐＥＵ１５.１  １またはｐＥＵ９.２)にクローニングした。同様に、ＶＬドメインを、ヒトλ軽鎖定常ドメインを、哺乳類細胞において完全ＩｇＧ軽鎖を発現させるための調節エレメントとともに発現させるため、ベクターｐＥＵ４.４にクローニングした。重鎖および軽鎖の発現のためのベクターはPersic et al. (Persic, L., et al. (1997) Gene 187, 9-18)により最初に記載されたものである。Cambridge Antibody Technologyのベクターが、ＥＢＮＡ１タンパク質との組合せにおいてプラスミドのエピソーム複製を可能とするＥＢＶ  ＯｒｉＰエレメントを含むように操作されている。ＩｇＧを得るため、この重鎖および軽鎖ＩｇＧ発現ベクターをＥＢＮＡ−ＨＥＫ２９３哺乳類細胞にトランスフェクトした。ＩｇＧは発現され、培地中に分泌された。採取物をプールし、精製前に濾過した。このＩｇＧを、Ａタンパク質クロマトグラフィーを用いて精製した。培養上清をセラミックＡタンパク質カラム(BioSepra)にのせ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８.０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した。結合したＩｇＧを、０.１Ｍクエン酸ナトリウム(ｐＨ３.０)を用いてカラムから溶出させ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ９.０)を添加することで中和した。Ｎａｐ１０カラム(Amersham, #17-0854-02)を用い、この溶出材料のバッファーをＰＢＳに交換し、ＩｇＧ濃度を、ＩｇＧのアミノ酸配列に基づく吸光係数を用いて分光光度的に測定した(Mach et al Anal. Biochem. 200(1): 20-26, 1992)。ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用い、また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製ＩｇＧの凝集または分解を分析した。
【０２２４】
１.５  精製ｓｃＦｖおよびＩｇＧによるＲＢＬ−ＥＲ５１細胞におけるカルシウムシグナル伝達の阻害
ＦｃεＲＩにより媒介されるヒトＩｇＥ生活性に対する精製ｓｃＦｖおよびＩｇＧ調製物の中和効力を、ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナル伝達アッセイを用いて評価した。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞(ラット好塩基球細胞系統)をヒトＦｃεＲＩで安定的にトランスフェクトした(ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞)。細胞近傍の遊離のＩｇＥは細胞表面のＦｃεＲＩと結合し、その後の受容体結合ＩｇＥの架橋が、Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR)を用いて検出可能なカルシウムの可動化をもたらす。このプロトコールの詳細な説明は材料および方法の節に示されている。
【０２２５】
抗体１の精製ｓｃＦｖ調製物は、試験した最大濃度で、ＩｇＥにより誘発されるＲＢＬ−ＥＲ５１細胞のカルシウムシグナル伝達を阻害することができた。精製ＩｇＧと同様に試験した際、抗体１のＩＣ５０は２６７ｎＭ(ｎ＝３)と算出された。
【０２２６】
１.６  ＤＥＬＦＩＡ(登録商標)エピトープ競合アッセイにおける抗体の選択性および種交差反応性
ＩｇＥおよび構造的に関連のある分子ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＧに対する抗体の種交差反応性および選択性を、ＤＥＬＦＩＡ(登録商標)エピトープ競合アッセイを用いて確認した。このアッセイは、ビオチニル化ＩｇＥ(血漿精製品、BIODESIGN International)と、それぞれ固定された抗ＩｇＥ抗体との結合の阻害を測定することによって、相対的交差反応性を決定する。
【０２２７】
各アッセイで精製ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＧ(全てCalbiochem)の滴定物を試験し、アッセイにおいてＩＣ５０値により測定される、構造的に関連のある各タンパク質の特異性プロファイルを確立した。
【０２２８】
各アッセイで、カニクイザルＩｇＥ  Ｃε３−Ｃε４ドメイン(自家誘導ＨＥＫ−ＥＢＮＡ)、ヒトＩｇＥ  Ｃε３−Ｃε４ドメイン(自家誘導ＨＥＫ−ＥＢＮＡ)およびヒトＩｇＥλ(BIODESIGN International)を含むＩｇＥ種の滴定物を試験し、これらの抗体の種交差反応性を確認した。全長ヒトＩｇＥλで阻害曲線を作成した。ヒトまたはカニクイザルＩｇＥ  Ｃε３−Ｃε４ドメインで、または構造的に関連のあるタンパク質では阻害は見られなかった。これらのデータは、抗体１はヒトＩｇＥλと結合するが、Ｃε３−Ｃε４ドメインとは結合しないことを示す。さらに、抗体１はＩｇＥと最も関連の強いヒトタンパク質のいずれとも結合しない。プロトコールの詳細は材料および方法の節に示されている。
【０２２９】
１.７  精製ＩｇＧによるＩｇＥとＣＤ２３の結合の阻害
ＩＭ９細胞(ヒトＢ細胞系統)は基本条件下でＣＤ２３を発現するが、ＦｃεＲＩは発現しないことが示されている。ＩｇＥはＩＭ９細胞の表面でＣＤ２３と結合する。ＣＤ２３と結合したＩｇＥはその後、抗ＩｇＥ−フィコエリトリン(Caltag)と結合し、フローサイトメトリー(FACSCalibur, BD Biosciences)により検出することができる。
【０２３０】
抗体をＩｇＥ／ＣＤ２３相互作用の阻害に関して評価した。この手順の詳細なプロトコールは材料および方法の節に示されている。要するに、試験ＩｇＧの滴定物をＩｇＥと混合した後、ＩＭ９細胞とともにインキュベートした。１時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、結合したＩｇＥを抗ＩｇＥ−フィコエリトリン(Caltag)で検出した。抗体１によるＩｇＥ／ＣＤ２３相互作用の検出可能な阻害は見られなかった。
【０２３１】
１.８  ＦｃεＲＩ結合ＩｇＥの架橋
ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナル伝達アッセイを用い、抗体のＦｃεＲＩ結合ＩｇＥ架橋能を評価した。材料および方法に記載されているＲＢＬ−ＥＲ５１細胞にＩｇＥを加えた。抗体をこのＩｇＥ添加細胞とともにインキュベートし、それらのカルシウム応答刺激能を評価した。抗体１は検出可能なカルシウム応答を誘発することができなかった。
【０２３２】
実施例２. 抗体の至適化
２.１  親クローンの至適化
抗体１をＩｇＥに対する親和性を高めるよう至適化した。これは、標的化またはランダム突然変異誘発アプローチのいずれかを用いて行った。標的化突然変異誘発アプローチでは、抗体１から大きなｓｃＦｖ−ファージライブラリーを誘導し、これは、Clackson and Lowman (2204) Phage Display A Practical Approach, 2004. Oxford University Pressにより記載されているような標準的な分子生物学的技術を用い、可変重鎖(ＶＨ)相補性決定領域３(ＣＤＲ３)のオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発により製造した。
【０２３３】
これらのライブラリーに対し、ヒトＩｇＥに対してより高い親和性を有する変異体を選択するため、親和性に基づくファージディスプレー選択を行った。結果として、これらはＩｇＥとその受容体の結合に関して阻害活性の向上を示した。これらの選択は本質的に従前に記載されている通りに行った(Thompson. Journal of Molecular Biology. 256:77-88, 1996)。要するに、ｓｃＦｖファージ粒子を溶液中で組換えビオチニル化ヒトＩｇＥλ(Ｕ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167]で、自家改良したもの)とともにインキュベートした。次に、抗原と結合したＳｃＦｖ−ファージをストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズ(Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(登録商標)Ｍ２８０)上に、製造者の推奨に従って捕捉した。次に、選択されたｓｃＦｖ−ファージ粒子を従前に記載されている通りに(Osbourn, JK. Et al. Immunotechnology, 2(3):181-96, 1996)救済し、この選択工程を漸減濃度(４回で２５０ｎＭから２５０ｐＭへ)のビオチニル化ＩｇＥの存在下で繰り返した。続いて、標準的な分子生物学的技術を用いた部位指定突然変異誘発により、可変重鎖(ＶＨ)相補性決定領域２(ＣＤＲ２)および可変軽鎖(ＶＬ)相補性決定領域１(ＣＤＲ１)にさらなる突然変異を導入した。ランダム突然変異誘発アプローチでは、標準的な分子生物学的技術を用い、可変重鎖(ＶＨ)および軽鎖(ＶＬ)領域のｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲにより主要クローン由来の大きなｓｃＦｖリボソームディスプレーライブラリーを製造した。
【０２３４】
これらのライブラリーに対し、ＩｇＥに対してより高い親和性を有する変異体を選択するため、親和性に基づくリボソームディスプレー選択を行った。結果として、これらはＩｇＥとその受容体の結合に関して阻害活性の向上を示した。これらの選択は本質的に従前に記載されている通りに行った(Hanes et al. 2000. Methods in Enzymology 328, 404)。要するに、ｍＲＮＡ−リボソーム−ｓｃＦｖ複合体(omplexes)組換えビオチニル化ヒトＩｇＥλ(Ｕ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167]で、自家改良したもの)とともにインキュベートした。次に、抗原と結合したｍＲＮＡ−リボソーム−ｓｃＦｖ複合体をストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズ(Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(登録商標)２８０)上に、製造者の推奨に従って捕捉した。次に、選択されたｍＲＮＡ−リボソーム−ｓｃＦｖ複合体を解離させ、ｍＲＮＡを精製し、従前に記載されているように逆転写およびＰＣＲ増幅に用いた(Hanes et al. 2000. Methods in Enzymology 328, 404)。この選択工程を漸減濃度(５回で１００ｎＭから１００ｐＭへ)のビオチニル化ヒトＩｇＥλの存在下で繰り返した。
【０２３５】
２.２  抗体−リガンド生化学アッセイを用いたランダム突然変異誘発からの改良されたクローンの同定
ランダム突然変異誘発選択出力からのＳｃＦｖをｐＣａｎｔａｂ６ベクター(Cambridge Antibody Technology)にサブクローニングした後、細菌の周縁質で発現させ、エピトープ競合ＨＴＲＦ(登録商標)(均質時間分解蛍光)アッセイ形式で、クリプト酸ユウロピウム(CIS bio International 62EUSPEA)で標識されたヒトＩｇＥ(Ｕ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])と、抗ヒトＩｇＥ(実施例１で単離された抗体１)との結合の阻害に関してスクリーニングした。詳細なアッセイ方法は材料および方法の節に示されている。有意な阻害作用を示したｓｃＦｖに対してＤＮＡ配列決定を行い、ユニークなｓｃＦｖを精製調製物として調製した。
【０２３６】
２.３  精製ｓｃＦｖによるＩｇＥとＦｃεＲＩとの結合の阻害
精製ｓｃＦｖを、受容体−リガンド結合ＨＴＲＦ(登録商標)(均質時間分解蛍光)アッセイ形式で、クリプト酸ユウロピウム(CIS bio International 62EUSPEA)で標識されたヒトＩｇＥ(Ｕ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])またはｃｙｎｏ  ＩｇＥ(組換え型、材料および方法を参照)のいずれかと、ヒトＦｃεＲ１−Ｆｃ(自家生産ＮＳ０細胞)の結合の阻害に関して試験した。ｓｃＦｖ効力データの例は表５ａに示す。
【表２０】
2010519194.tif 000021
【０２３７】
２.４  精製ＩｇＧによるＲＢＬ−ＥＲ５１細胞におけるカルシウムシグナル伝達の阻害
ＩｇＧとしての再フォーマットの後、至適化されたクローンの効力を、改良型ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナル伝達アッセイを用いて測定した。このアッセイは、より強力な抗体が検出できるよう感度を改良するために、主要な単離の際に用いられる方法から適合させた。このプロトコールの詳細な説明は材料および方法の節に示されている。ヒトおよびカニクイザルのＩＣ５０効力データを表５ｂに示す。
【表２１】
2010519194.tif 000022
【０２３８】
２.５. 生殖系列化
至適化抗ＩｇＥ抗体のＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を、ＶＢＡＳＥデータベース(Tomlinson 1997; Journal of Molecular biology. 224. 487-499)にて既知のヒト生殖細胞系配列に対してアラインし、配列類似性により最も近い生殖細胞系を同定した。至適化抗体系列のＶＨドメインでは、これはＶｈ３  ＤＰ−４７(３−２３)であった。ＶＬドメインでは、それはＶλ３  ＤＰＬ２３(３ｒ)であった。
【０２３９】
変化せずに残ったＶｅｒｎｉｅｒ残基(Foote & Winter 1992)を考慮しなければ、抗体１のＶＨドメインのフレームワークにおいて、また、ＶＬドメインの６において生殖細胞系との違いはなかった。このＶＬドメインにおける変化は全て、ヒト抗体と等しく合致するように最も近いヒト生殖細胞系配列に復帰させた。これらのアミノ酸残基の生殖系列化は、適当な突然変異誘発プライマーとともに標準的な部位特異的突然変異誘発技術を用いて行った。次に、生殖系列化されたＩｇＧを、効力または親和性が低下されていることを確認するために再評価した。
【０２４０】
生殖系列化された(ＧＬ)抗体の親和性および効力の例を表６に示す。
【表２２】
2010519194.tif 000023
【０２４１】
２.６  精製ＩｇＧによるＩｇＥとＣＤ２３の結合の阻害
これらの至適化抗体のいくつかを、従前に記載されたようなＩＭ９結合アッセイを用い、ＩｇＥ／ＣＤ２３相互作用の阻害に関して評価した。この系において試験した抗体３３は、ＩＣ５０  ８３ｎＭ(ｎ＝２)でＩｇＥ／ＣＤ２３の相互作用を阻害することが分かっている。
【０２４２】
２.７  ＦｃεＲＩ結合ＩｇＥの架橋
至適化抗体を、ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナル伝達アッセイを用い、ＦｃεＲＩ結合ＩｇＥを架橋する能力に関して評価した。材料および方法に記載されているＲＢＬ−ＥＲ５１細胞はＩｇＥ付加が最大であった。至適化抗体をＩｇＥ付加細胞とともにインキュベートし、それらのカルシウム応答刺激能を評価した。シグナル伝達は検出されなかった(図１)。
【０２４３】
２.８. ＤＥＬＦＩＡ(登録商標)エピトープ競合アッセイにおける至適化抗体の選択性および種交差反応性
主要抗体の選択性および種交差反応性を、従前に記載されたようなＤＥＬＦＩＡ(登録商標)エピトープ競合アッセイを用いて再評価した(第１.６節  材料および方法を参照)。
【０２４４】
各アッセイで、このアッセイにおいてＩＣ５０値で測定される、構造的に関連のある各タンパク質に対する特異性プロファイルを確立するため、精製ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＧ(全てCalbiochem)の滴定物を試験した。
【０２４５】
各アッセイにおいて抗体の種交差反応性を確認するため、ヒトＩｇＥλ(Ｕ２６６由来)およびＩｇＥκ(Calbiochem)、カニクイザルＩｇＥ  Ｃε３−Ｃε４ドメイン(自家誘導ＨＥＫ−ＥＢＮＡ)、ヒトＩｇＥ  Ｃε３−Ｃε４ドメイン(自家誘導ＨＥＫ−ＥＢＮＡ)およびカニクイザルＩｇＥ(自家誘導ＨＥＫ−ＥＢＮＡ)を含むＩｇＥ種の滴定物を試験した。全長ヒトＩｇＥλおよびＩｇＥκおよびｃｙｎｏ  ＩｇＥにより阻害曲線を作成した。ヒトまたはカニクイザルＩｇＥ  Ｃε３−Ｃε４ドメインで、または構造的に関連のあるいずれのタンパク質でも阻害は見られなかった。これらのデータは、抗体３３ＧＬは全長ヒトおよびｃｙｎｏ  ＩｇＥと結合するが、Ｃε３−Ｃε４ドメインとは結合しないことを示す。さらに、抗体３３ＧＬはＩｇＥと最も関連の強いヒトタンパク質のいずれとも結合しない。プロトコールの詳細は材料および方法の節に示されている。
【０２４６】
２.９  ＢＩＡｃｏｒｅを用いた至適化クローンに関する親和性データの結合親和性の算出
ヒトおよびカニクイザルＩｇＥに対する典型数のクローンの精製ＩｇＧサンプルの結合親和性を、本質的にKarlsson et al 1991; Journal of Immunological Methods 145 (1-2) 229-240に記載されているようにＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００バイオセンサー(BIAcore AB)を用い、表面プラズモン共鳴により測定した。要するに、精製ヒトまたはカニクイザルＩｇＥを、標準的なアミンカップリング試薬を製造者の説明書に従って用い、表面密度が１００ＲＵとなるようにＣＭ５センサーチップ(BIAcore)の表面に共有結合させた。２５０ｎＭ〜１５.６ｎＭの間の濃度範囲でＨＢＳ−ＥＰバッファー(BIAcore AB)中に調製したＩｇＧサンプルをこのセンサーチップ表面に通した。抗体注入の度にこの表面を、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１.７５を用いて再生した。得られたセンサーグラムを、ＢＩＡ評価３.１ソフトウエアを用いて評価し、二価分析物モデルに当てはめ、相対的結合データを得た。試験したＩｇＧの親和性の例を表５ｂおよび表６に示す。
【０２４７】
実施例１および２の材料および方法
未精製ｓｃＦｖによるＩｇＥとＦｃεＲＩの結合の阻害
選択出力を、受容体−リガンド結合均質ＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー移動)に基づくアッセイ形式で、ユウロピウムキレート(Perkin Elmer 1244-302)で標識されたヒトＩｇＥ(Calbiochem 401152)とヒトＦｃεＲＩ−Ｆｃ(自家生産ＮＳ０細胞)の結合の阻害に関してスクリーニングした。
【０２４８】
主要単離の際の出力を、５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファー  ｐＨ７.４、０.５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０.５Ｍソルビトール中に調製した非精製ｓｃＦｖを含有する非希釈周縁質抽出物としてスクリーニングした。
【０２４９】
１５μｌの未精製ｓｃＦｖサンプルを３８４ウェルアッセイプレート(Perkin Elmer 6006280)に加えた。その後、１５μｌの１１ｎＭヒトＦｃεＲＩ−Ｆｃ(ＭＷ２６０ｋＤａに基づく)、ＸＬ６６５(CIS Bio International 61HFCXLA)で標識された１５μｌの４０ｎＭ抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ、次いで１５μｌの０.７５ｎＭユウロピウム標識ヒトＩｇＥを加えた。非特異的対照結合は、３００ｎＭヒトＩｇＥ(Calbiochem)を用いて定義した。希釈は全て、２５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.８)(アッセイバッファー)で行った。
【０２５０】
次に、アッセイプレートを室温で１.５時間インキュベートした後、ＶＩＣＴＯＲ２プレートリーダー(Perkin Elmer)を用い、発光波長６１５ｎｍおよび６６５ｎｍにて時間分解蛍光を順次読み取った。
【０２５１】
counts per second (CPS)を算出するため、ＶＩＣＴＯＲ２ソフトウエアによりデータをノーマライズした。次に、ＣＰＳ値を用いて、方程式１に記載のように特異的結合％を算出した。
方程式１：
【数１】
2010519194.tif 000024
【０２５２】
精製ｓｃＦｖによるＩｇＥとＦｃεＲＩの結合の阻害
スクリーニングから同定された陽性クローン由来の精製ｓｃＦｖを、受容体−リガンド結合均質ＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー移動)に基づくアッセイ形式で、ユウロピウムキレート(Perkin Elmer 1244-302)で標識されたヒトＩｇＥ(Calbiochem 401152)とヒトＦｃεＲ１−Ｆｃ(自家生産ＮＳ０細胞)の結合の阻害に関して試験した。
【０２５３】
このアッセイにおいてＩＣ５０値により測定されるｓｃＦｖ効力を確立するため、ｓｃＦｖ濃度の滴定を用いた。３８４ウェルアッセイプレート(Perkin Elmer 6006280)に精製ｓｃＦｖサンプルの滴定物１５μｌを加えた。その後、１５μｌの１１ｎＭヒトＦｃεＲＩ−Ｆｃ(ＭＷ２６０ｋＤａに基づく)、ＸＬ６６５(CIS Bio International 61HFCXLA)で標識された１５μｌの４０ｎＭ抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ、次いで、１５μｌの０.７５ｎＭユウロピウム標識ヒトＩｇＥを加えた。非特異的対照結合は３００ｎＭヒトＩｇＥ(Calbiochem)を用いて定義した。希釈は全て、２５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.８)(アッセイバッファー)で行った。
【０２５４】
次に、アッセイプレートを室温で１.５時間インキュベートした後、ＶＩＣＴＯＲ２プレートリーダー(Perkin Elmer)を用い、発光波長６１５ｎｍおよび６６５ｎｍにて時間分解蛍光を順次読み取った。
【０２５５】
counts per second (CPS)を算出するため、ＶＩＣＴＯＲ２ソフトウエアによりデータをノーマライズした。次に、ＣＰＳ値を用いて、方程式１に記載のように特異的結合％を算出した。
方程式１：
【数２】
2010519194.tif 000025
【０２５６】
ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用い、４パラメーターロジスティック方程式(方程式２)を用いた曲線の当てはめにより求めた。
方程式２：
【数３】
2010519194.tif 000026
Ｘは、濃度の対数である。Ｙは、特異的結合であり、Ｙは下限値で始まり、Ｓ字型で上限値に至る。
【０２５７】
ヒトＦｃεＲ１で安定的にトランスフェクトされたＲＢＬ−２Ｈ３細胞(ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞)における精製ｓｃＦｖおよびＩｇＧによるカルシウムシグナル伝達の阻害
ＦｃεＲＩにより媒介されるヒトＩｇＥ生活性に対する精製ｓｃＦｖおよびＩｇＧ調製物の中和効力を、ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナル伝達アッセイを用いて評価した。ヒトＦｃεＲＩをヒト末梢血リンパ球からｐｃＤＮＡ３.１ベクターにクローニングし、標準的なエレクトロポレーション法を用いてＲＢＬ−２Ｈ３細胞(ラット好塩基球細胞系統)にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を制限希釈によりクローニングし、表面ＦｃεＲＩ発現に関して分析した。得られたＲＢＬ−ＥＲ５１細胞を、安定な受容体発現を維持するためにＧ４１８(Invitrogen 10131-027)を含有する培地で維持した。
【０２５８】
細胞近傍の遊離のＩｇＥはＦｃεＲＩと結合し、その後の受容体結合ＩｇＥの架橋が、Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR)を用いて検出可能なカルシウムの可動化をもたらす。
【０２５９】
ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞を、９６ウェルの、壁面が黒く、平底の組織培養処理プレート(Costar)中、培地[９％ｖ／ｖＦＢＳ  Ｎｏｎ−Ｈｅａｔ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ(Invitrogen 10100-147)および４００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８(Invitrogen 10131-027)を含むＤＭＥＭ(Invitrogen 41966)]に５×１０４／１００μｌ／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて１８〜２４時間インキュベートした。その後、細胞単層をそのまま残して培地を吸引し、３７℃、５％ＣＯ２にて１〜２時間、１００μＬ／ウェルのＦＬＵＯ−４ＡＭローディングバッファー[０.１％ＦＢＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２.５ｍＭプロベニシドおよび２μｇ／ｍＬ  ＦＬＵＯ−４ＡＭ(Teff Labs)を含むＤＭＥＭ]に置き換えた。ローディングバッファーを吸引し、細胞を２００μＬ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗液を吸引し、７０μＬ／ウェルのＦＬＩＰＲバッファー[１２５ｍＭ  ＮａＣｌ２、５ｎＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１.５ｍＭ  ＣａＣｌ２、３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２.５ｍＭプロベニシド、５ｍＭグルコース、０.０１％ｖ／ｖＦＣＳ]に置き換えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２にて５〜４５分間インキュベートした。
【０２６０】
精製ｓｃＦｖまたはＩｇＧの試験溶液(二反復)をＶ底プレート(Greiner)でＦＬＩＰＲバッファー中に所望の濃度まで希釈した。ＩｇＥに向けられない無関連の抗体を陰性対照として用いた。ＩｇＥ(CalbiochemまたはＵ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])をＦＬＩＰＲバッファー中に調製し、適当な試験抗体と混合し、総量４０μｌ／ウェルで、ＩｇＥ終濃度３.３３μｇ／ｍＬとした。アッセイに用いたＩｇＥの濃度は、最終アッセイ濃度が最大カルシウム応答のおよそ８０％となるような用量として選択した。全てのサンプルを室温で３０分間インキュベートした後、３０μｌのＩｇＥ／抗体混合物を上記で調製した色素付加細胞に移した。アッセイプレートを３７℃で１０分間インキュベートし、遊離のＩｇＥをＲＢＬ−ＥＲ５１細胞に結合させた。
【０２６１】
架橋抗ＩｇＥを添加した後のカルシウムの可動化を測定するため、製造者の説明書に従って好適な曝露のためにＦＬＩＰＲ(Molecular Devices)を較正した。ＦＬＩＰＲバッファーに希釈した抗ＩｇＥ(Biosource AHI0501)をアッセイプレートに加え、終濃度１０μｇ／ｍＬとした。ＦＬＵＯ−４ＡＭ色素の蛍光を１秒間隔で測定８０回、その後、８秒間隔で測定４０回記録した。各ウェルからのピーク応答をエクスポートした後、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてデータを分析した。
【０２６２】
ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞における抗ＩｇＥ架橋の測定
精製ＩｇＧのＦｃεＲＩ結合ＩｇＥ架橋能を測定するため、ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞を調製し、阻害アッセイに記載のように色素を付加した。細胞を、ＦＬＩＰＲバッファーに希釈した１μｇ／ｍＬのヒトＩｇＥ(CalbiochemまたはＵ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])１００μＬ中で１０分間インキュベートし、ＩｇＥを細胞表面のＦｃεＲＩと結合させた。アッセイに用いたＩｇＥの濃度は、最大カルシウム応答のおよそ８０％となる用量として選択した。架橋抗ＩｇＥを添加した後のカルシウムの可動化を測定するため、製造者の説明書に従って好適な曝露のためにＦＬＩＰＲ(Molecular Devices)を較正した。ＦＬＩＰＲバッファーに適当な濃度となるように希釈した３０μｌの試験抗体を、ＩｇＥを付加したアッセイプレートに加えた。抗ＩｇＥ(Biosource AHI0501)を陽性対照として用いた。ＦＬＵＯ−４ＡＭ色素(Teff Labs)の蛍光を１秒間隔で測定８０回、その後、８秒間隔で測定４０回記録した。各ウェルからのピーク応答をエクスポートした後、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてデータを分析した。
【０２６３】
ＤＥＬＦＩＡ(登録商標)エピトープ競合アッセイにおける抗体の選択性および種交差反応性
精製ＩｇＧをＰＢＳ中、ビオチニル化ヒトＩｇＥがその特定のＩｇＧに対するそのおよその推定ＫＤで加えた際に有意なシグナルをもたらした濃度で９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート(Nunc)に吸収させた。過剰なＩｇＧをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ(０.１％ｖ／ｖ)で洗い流し、これらのウェルをＰＢＳ−Ｍａｒｖｅｌ(３％ｗ／ｖ)で１時間ブロッキングした。ビオチニル化ヒトＩｇＥと個々のＩｇＧ；ヒトＩｇＥλ(BIODESIGN InternationalまたはＵ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])、ヒトＩｇＥκ(Calbiochem)、カニクイザルＩｇＥ(自家誘導ＨＥＫ−ＥＢＮＡ)、ヒトＩｇＥ  Ｃε３−Ｃε４ドメイン(自家誘導ＨＥＫ−ＥＢＮＡ)、カニクイザルＩｇＥ  Ｃε３−Ｃε４ドメイン(自家誘導ＨＥＫ−ＥＢＮＡ)、ヒトＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＤ(全てCalbiochem)の間の相互作用のＫＤ値のおよそ１０００倍の濃度で始め、以下の競合因子のそれぞれの希釈系をＰＢＳで調製した。この系に、等量のビオチニル化ヒトＩｇＥをおよそＫＤの濃度で加えた(競合抗原：ビオチニル化ヒトＩｇＥ比およそ１０００：１で始まる系が得られる)。次に、これらの混合物をブロッキングされたＩｇＧに導入し、１時間平衡化した。非結合抗原をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ(０.１％ｖ／ｖ)で洗浄することにより除去し、一方、残っているビオチニル化ヒトＩｇＥはストレプトアビジン−ユウロピウム３＋コンジュゲート(ＤＥＬＦＩＡ(登録商標)検出、PerkinElmer)により検出した。時間分解蛍光をＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー(PerkinElmer)にて６２０ｎｍで測定した。蛍光データを、Graphpad PrismまたはMicrosoft Excelソフトウエアのいずれかを用いて分析した。
【０２６４】
抗体−リガンド生化学アッセイを用いた改良型クローンの同定
選択出力を、エピトープ競合ＨＴＲＦ(登録商標)(均質時間分解蛍光)アッセイ形式で、クリプト酸ユウロピウム(CIS bio International 62EUSPEA)で標識されたクリプテートヒトＩｇＥ(Ｕ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])と抗ヒトＩｇＥ抗体(抗体１)の結合の阻害に関してスクリーニングした。
【０２６５】
主要な至適化の際、選択出力を、５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファー  ｐＨ７.４、０.５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０.５Ｍソルビトール中に調製された未精製ｓｃＦｖを含有する非希釈または希釈された周縁質抽出物としてスクリーニングした。
【０２６６】
４ｎＭの抗ヒトＩｇＥ抗体を、ＸＬ６６５(CIS Bio International 61HFCXLA)で標識された２０ｎＭの抗ヒトＦｃ  ＩｇＧと予め混合した。１０μｌの未精製ｓｃＦｖサンプルを３８４ウェル低容量アッセイプレート(Costar 3676)に加えた。その後、５μｌの抗ヒトＩｇＥ抗体抗Ｆｃ−ＸＬ６６５混合物を加え、次いで５μｌの１／２４５希釈のクリプテート標識ヒトＩｇＥ(およそ２.３ｎＭのクリプテート標識ヒトＩｇＥ)を加えた。非特異的対照結合は３００ｎＭのヒトＩｇＥ(Ｕ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])を用いて定義した。希釈は全て、０.４Ｍフッ化カリウムおよび０.１％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)(アッセイバッファー)で行った。
【０２６７】
次に、アッセイプレートを室温にて１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、室温で３時間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー(Perkin Elmer)を用い、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ発光波長で時間分解蛍光を読み取った。
【０２６８】
データは各サンプルについてΔＦ％値を算出することにより分析した。ΔＦは方程式１に従って求めた。
方程式１：
【数４】
2010519194.tif 000027
【０２６９】
次に、ΔＦ％値を用いて、方程式２に記載されているように特異的結合％を算出した。
方程式２：
【数５】
2010519194.tif 000028
【０２７０】
改良されたｓｃＦｖ(精製)によるＩｇＥとＦｃεＲＩの結合の阻害
精製ｓｃＦｖを、受容体−リガンド結合ＨＴＲＦ(登録商標)(均質時間分解蛍光)アッセイ形式で、クリプト酸ユウロピウム(CIS bio International 62EUSPEA)で標識されたヒトＩｇＥ(Ｕ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])またはｃｙｎｏ  ＩｇＥ(組換え型、材料および方法を参照)のいずれかとヒトＦｃεＲ１−Ｆｃ(自家生産ＮＳ０細胞)の結合の阻害に関して試験した。
【０２７１】
このアッセイにおいてＩＣ５０値で測定されるｓｃＦｖ効力を確認するため、ｓｃＦｖ濃度の滴定を用いた。１.９ｎＭのヒトＦｃεＲ１−Ｆｃ(ＭＷ２６０ｋＤａに基づく)を、ＸＬ６６５(CIS Bio International 61HFCXLA)で標識された２０ｎＭの抗ヒトＦｃ  ＩｇＧと予め混合した。精製ｓｃＦｖサンプルの滴定物１０μｌを３８４ウェル低容量アッセイプレート(Costar 3676)に加えた。その後、５μｌのＦｃεＲ１−Ｆｃ抗Ｆｃ−ＸＬ６６５混合物を加え、次いで５μｌの１／１９７希釈のクリプテート標識ヒトまたはＣｙｎｏ  ＩｇＥ(およそ２.９ｎＭのクリプテート標識ヒトまたはｃｙｎｏ  ＩｇＥ)を加えた。非特異的対照結合は３００ｎＭのヒトまたはカニクイザルＩｇＥ(自家誘導)を用いて定義した。希釈は全て、０.４Ｍフッ化カリウムおよび０.１％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)(アッセイバッファー)で行った。
【０２７２】
次に、アッセイプレートを室温にて１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、室温で３時間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー(Perkin Elmer)を用い、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ発光波長で時間分解蛍光を読み取った。
【０２７３】
データは、各サンプルでΔＦ％値を算出することにより分析した。ΔＦは方程式１に従って求めた。
方程式１：
【数６】
2010519194.tif 000029
【０２７４】
次に、ΔＦ％値を用い、方程式２に記載のように特異的結合％を算出した。
方程式２：
【数７】
2010519194.tif 000030
【０２７５】
ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用い、４パラメーターロジスティック方程式(方程式３)を用いた曲線の当てはめにより求めた。
方程式３：
【数８】
2010519194.tif 000031
Ｘは、濃度の対数である。Ｙは、特異的結合であり、Ｙは下限値で始まり、Ｓ字型で上限値に至る。
【０２７６】
ＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナル伝達アッセイにおける改良されたクローンの同定
改良された抗体からの精製ＩｇＧ調製物の中和効力を、主要な単離に関して記載された改良型のＲＢＬ−ＥＲ５１カルシウムシグナル伝達アッセイで評価した。
【０２７７】
ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞を、９６ウェルの、壁面が黒く、平底の組織培養処理プレート(Costar)中、培地[９％ｖ／ｖＦＢＳ  Ｎｏｎ−Ｈｅａｔ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ(Invitrogen 10100-147)および４００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８(Invitrogen 10131-027)を含むＤＭＥＭ(Invitrogen 41966)]に５×１０４／１００μｌ／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて１８〜２４時間インキュベートした。その後、培地を吸引し、アッセイ培地[９％ｖ／ｖ  ＦＢＳ  Ｎｏｎ−Ｈｅａｔ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ(Invitrogen 10100-147)、４００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８(Invitrogen 10131-027)および１.６％ペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen 15140-122)を含むＤＭＥＭ(Invitrogen 41966)]中、５０μＬ／ウェルの試験抗体の希釈液(６６.７ｎＭ〜１３.３ｐＭ)に置き換えた後、それぞれ終濃度が２５ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌとなるようにアッセイ培地で希釈したＩｇＥ[ヒト(Ｕ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])またはカニクイザル(組換え型、材料および方法を参照)]を加えた。アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２にて４時間インキュベートした。
【０２７８】
その後、細胞単層をそのまま残して抗体／ＩｇＥ混合物を吸引し、３７℃、５％ＣＯ２にて１〜２時間、１００μＬ／ウェルのＦＬＵＯ−４ＡＭローディングバッファー[０.１％ＦＢＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２.５ｍＭプロベニシドおよび２μｇ／ｍＬ  ＦＬＵＯ−４ＡＭ(Invitrogen)を含むＤＭＥＭ]に置き換えた。ローディングバッファーを吸引し、細胞を２００μＬ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗液を吸引し、１００μＬ／ウェルのＦＬＩＰＲバッファー[１２５ｍＭ  ＮａＣｌ２、５ｎＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１.５ｍＭ  ＣａＣｌ２、３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２.５ｍＭプロベニシド、５ｍＭグルコース、０.０１％ｖ／ｖＦＣＳ]に置き換えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２にて５〜４５分間インキュベートした。
【０２７９】
架橋抗ＩｇＥを添加した後のカルシウムの可動化を測定するため、製造者の説明書に従って好適な曝露のためにＦＬＩＰＲ(Molecular Devices)を較正した。ＦＬＩＰＲバッファーに希釈した抗ＩｇＥ(Biosource AHI0501)をアッセイプレートに加え、終濃度２.３μｇ／ｍＬ(架橋ヒトＩｇＥ)または２０μｇ／ｍＬ(架橋カニクイザルＩｇＥ)とした。ＦＬＵＯ−４ＡＭ色素の蛍光を１秒間隔で測定８０回、その後、３秒間隔で測定４０回記録した。各ウェルからのピーク応答をエクスポートした後、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてデータを分析した。
【０２８０】
至適化抗体によるＦｃεＲＩ結合ＩｇＥの架橋の測定
精製ＩｇＧのＦｃεＲＩ結合ＩｇＥ架橋能を測定するため、改良抗体の評価のための阻害アッセイに記載されているようにＲＢＬ−ＥＲ５１細胞を調製した。ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞を、９６ウェルの、壁面が黒く、平底の組織培養処理プレート(Costar)中、培地[９％ｖ／ｖＦＢＳ  Ｎｏｎ−Ｈｅａｔ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ(Invitrogen 10100-147)および４００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８(Invitrogen 10131-027)を含むＤＭＥＭ(Invitrogen 41966)]に５×１０４／１００μｌ／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて１８〜２４時間インキュベートした。その後、培地を吸引し、アッセイ培地[９％ｖ／ｖ  ＦＢＳ  Ｎｏｎ−Ｈｅａｔ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ(Invitrogen 10100-147)、４００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８(Invitrogen 10131-027)および１.６％ペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen 15140-122)を含むＤＭＥＭ(Invitrogen 41966)]中、１μｇ／ｍＬに希釈した１００μＬ／ウェルのヒトＩｇＥ[(Ｕ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167])に置き換えた。ＩｇＥ濃度は、ＲＢＬ−ＥＲ５１細胞の最大付加となるように選択した。アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２にて４時間インキュベートした。
【０２８１】
その後、細胞単層をそのまま残してＩｇＥ溶液を吸引し、３７℃、５％ＣＯ２にて１〜２時間、１００μＬ／ウェルのＦＬＵＯ−４ＡＭローディングバッファー[０.１％ＦＢＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２.５ｍＭプロベニシドおよび２μｇ／ｍＬ  ＦＬＵＯ−４ＡＭ(Invitrogen)を含むＤＭＥＭ]に置き換えた。ローディングバッファーを吸引し、細胞を２００μＬ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗液を吸引し、１００μＬ／ウェルのＦＬＩＰＲバッファー[１２５ｍＭ  ＮａＣｌ２、５ｎＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１.５ｍＭ  ＣａＣｌ２、３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２.５ｍＭプロベニシド、５ｍＭグルコース、０.０１％ｖ／ｖＦＣＳ]に置き換えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２にて５〜４５分間インキュベートした。
【０２８２】
架橋抗ＩｇＥ(１.５３μＭ〜２.３３ｎＭ)を添加した後のカルシウムの可動化を測定するため、製造者の説明書に従って好適な曝露のためにＦＬＩＰＲ(Molecular Devices)を較正した。ＦＬＩＰＲバッファーに適当な濃度となるように希釈した３０μＬの試験抗体をアッセイプレートに加えた。抗ＩｇＥ(Biosource AHI0501)を陽性対照として用いた。ＦＬＵＯ−４ＡＭ色素(Invitrogen)の蛍光を１秒間隔で測定８０回、その後、３秒間隔で測定４０回記録した。各ウェルからのピーク応答をエクスポートした後、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてデータを分析した。
【０２８３】
精製ＩｇＧによるＩｇＥとＩＭ９細胞上のＣＤ２３の結合の阻害
ＩＭ９細胞結合アッセイを用い、抗体をＩｇＥ／ＣＤ２３相互作用に関して評価した。標準的な組織培養手順を用い、ＩＭ９細胞(ヒトＢ細胞系統)を培養培地[ＲＰＭＩ  １６４０  ｇｌｕｔａｍａｘ(Invitrogen 61870-010)；９％ｖ／ｖ熱不活性化ＦＢＳ(Invitrogen 10100-147)]で維持した。
【０２８４】
至適化ＩｇＧを試験するため、ＣＤ２３発現をアップレギュレートするために、ＩＭ９細胞を３７℃／５％ＣＯ２にて３日間、２５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−４(組換え型、Peprotech 200-04)で前処理した。
【０２８５】
ＩＭ９細胞を採取し、フローバッファー[１％ヤギ血清(Sigma)および０.１％ＢＳＡ画分Ｖ(Sigma)を含むＰＢＳ]に１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。Ｆｃ受容体のブロッキングは、終濃度５μｇ／ｍＬとなるようにＦｃフラグメント(TEBU-bio)を加えることで行った。この細胞懸濁液をＵ底ポリプロピレンプレート(Greiner)に１００μＬ／ウェルでプレーティングし、氷上で３０分間インキュベートした。
【０２８６】
Ｕ底ポリプロピレンプレート(Greiner)で抗体希釈液(６６７ｎＭ〜１ｎＭ)を調製し、室温で３０分間、ＩｇＥ終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにＩｇＥ(Ｕ２６６由来[Ikeyama et. al. 1986. Molecular Immunology 23 (2); p159-167]と混合した。細胞プレートを２０００ｒｐｍで２分間回転させ、細胞ペレットをそのまま残して上清を吸引した。細胞を１００μＬ／ウェルの抗体／ＩｇＥ混合物に再懸濁させ、氷上で１時間インキュベートした。細胞プレートを２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、抗体／ＩｇＥ上清を吸引した。細胞を２００μＬ／ウェルのフローバッファーに再懸濁させ、上記のように遠心分離することで洗浄した。
【０２８７】
細胞表面に結合したＩｇＥは、１／３０ｖ／ｖ希釈した１００μＬ／ウェルの抗ＩｇＥ−フィコエリシン(Caltag)で検出した。アッセイプレートを暗所、氷上で２０分間インキュベートした後、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上記のように２×２００μＬのフローバッファーで洗浄した。細胞を１００μＬのＣｅｌｌ  Ｆｉｘ(BD biosciences)に再懸濁させ、ＦＬ２染色を検出するため、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(BD Biosciences)を用いて分析した。
【０２８８】
データはＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア(BD biosciences)を用いて分析した。ＦＬ２幾何平均蛍光をエクスポートした後、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてデータを分析した。
【０２８９】
Ｃ末端にＦＬＡＧ  Ｈｉｓ１０タグが付けられたヒトＩｇＥ  Ｃｅ３−４の作製
ヒトＩｇＥ  Ｃｅ３−４のフラグメントは、従前にWurzburg et. al. (2000) Structure of the Human IgE-Fc C3-C4 Reveals Conformational Flexibility in the Antibody Effector Domainsに記載されている通りであった。ヌクレオチド２１３５−２８６８(ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００２２２)を含んだｃＤＮＡフラグメントを、ＩＬ１３刺激ヒトＰＢＭＣの全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅した。このＰＣＲ産物をｐＣＲ２.１  ＴＡ(Invitrogen)にクローニングした。
【０２９０】
発現タンパク質を分泌させ、インフレームＣ末端ＦＬＡＧエピトープおよびポリヒスチジンタグ(Ｈｉｓ１０)を組み込んだ配列を作製するため、５’ＢｓｓＨＩＩ部位、ならびに３’ＦＬＡＧエピトープ、ポリヒスチジンタグ(Ｈｉｓ１０)およびＸｂａＩ部位を組み込んだプライマーを用いてＩｇＥ  Ｃｅ３−４フラグメントをＰＣＲ増幅した後、ｐＥＵ８.２ベクターへ挿入した。この改良型ｐＥＵ８.２ベクターはＥＦ−１プロモーター、ネズミＩｇＧ１リーダーペプチドのゲノム配列、ＥＢＮＡ−１遺伝子産物を発現する細胞系統(ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞など)へトランスフェクトした際にエピソームプラスミド複製を可能とするｏｒｉＰ複製起点を含む。
【０２９１】
ＩＭＡＣクロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーを用い、細胞馴化培地からタンパク質を精製した。
【０２９２】
Ｃ末端にＦＬＡＧ  Ｈｉｓ１０タグが付けられたカニクイザルＩｇＥ  Ｃｅ３−４の作製
カニクイザルＩｇＥ定常領域は、ヒトＩｇＨＥ遺伝子座のヌクレオチド１１７４−２９８９(ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００２２２)を包含するプライマーを用い、ゲノムＤＮＡから増幅させたＰＣＲ産物の直接配列決定により判定した。
【０２９３】
エキソンはヒト配列との相同性により同定し、よって、カニクイザルＩｇＥ重鎖定常領域のｃＤＮＡ配列を推定することができた。
【０２９４】
ネズミＩｇＧ１リーダーペプチド、カニクイザルＣｅ３−４ならびにＣ末端ＦＬＡＧエピトープおよびポリヒスチジンタグの配列をコードするｃＤＮＡを合成し(ＤＮＡ２.０)、ｐＤＯＮＲ２２１(Invitrogen)にクローニングした。そして、ＬＲ  Ｇａｔｅｗａｙ(登録商標)反応(Invitrogen)を用い、目的の遺伝子を、ＥＢＮＡ−１遺伝子産物を発現する細胞系統(ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞など)にトランスフェクトした際にエピソームプラスミド複製を可能とするためのｐＣＥＰ４ベクター(Invitrogen)由来のｏｒｉＰ複製起点を挿入することにより改変された発現ベクターｐＤＥＳＴ１２.２(Invitrogen)に導入した。
【０２９５】
ＩＭＡＣクロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーを用い、細胞馴化培地からタンパク質を精製した。
【０２９６】
キメラＤ１２可変領域およびカニクイザルＩｇＥ定常領域の作製
ヒト抗エストラジオールｓｃＦｖ(Ｄ１２＿ＶＨ)および２つの異なるハプロタイプカニクイザルＩｇＨＥ遺伝子(ｃｙＩＧＨＥ  ＴＱおよびｃｙＩＧＨＥ  ＭＥ)のいずれか１つをコードした可変重鎖領域をコードするｃＤＮＡを合成し(ＤＮＡ２.０)、ｐＤＯＮＲ２２１(Invitrogen)にクローニングした。また、可変軽鎖ヒト抗エストラジオールｓｃＦｖ(Ｄ１２＿ＶＬ)および２つのカニクイザルλ定常領域遺伝子(ｃｙＩＧＬＣ４およびｃｙＩＧＬＣ７)のいずれか１つを提供するｃＤＮＡを合成し(ＤＮＡ２.０)、ｐＤＯＮＲ２２１(Invitrogen)にクローニングした。
【０２９７】
そして、ＬＲ  Ｇａｔｅｗａｙ(登録商標)反応(Invitrogen)を用い、目的の遺伝子を、ＥＢＮＡ−１遺伝子産物を発現する細胞系統(ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞など)にトランスフェクトした際にエピソームプラスミド複製を可能とするためのｐＣＥＰ４ベクター(Invitrogen)由来のｏｒｉＰ複製起点を挿入することにより改変された発現ベクターｐＤＥＳＴ１２.２(Invitrogen)に導入した。
【０２９８】
ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞から発現された、カニクイザルＩｇＥ  Ｃｅ１−４と融合されたヒト抗エストラジオールｓｃＦｖの可変重鎖領域(図３および４)と、カニクイザルλ定常領域と融合されたヒト抗エストラジオールｓｃＦｖの可変軽鎖領域(図５および６)を提供する組換えキメラＩｇＥタンパク質を、Ikeyam et. al. (1986) Mol Immunol 23 p159-67に記載されている方法を用いて精製した。
【０２９９】
ヒトＦｃ□ＲＩ−Ｆｃ(自家生産ＮＳ０細胞)
ヌクレオチド６７−７１１(ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２００１)を包含するＦｃｅＲＩを、最初にPersic et al. (1997) Gene 187; 9-18に記載されたｐＥＵ１.２からの場合と同様に、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃのゲノム領域の上流にクローニングした。これをｐｃＤＮＡ３.１  ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩにクローニングした。組換え融合タンパク質ＦｃｅＲＩ＿Ｆｃの発現は、ＮＳ０細胞をｐｃＤＮＡ３.１  ＦｃｅＲＩ＿Ｆｃ構築物で安定的にトランスフェクトすることにより果たした。Ｇ４１８を用いた選択、制限希釈によるクローンの単離および発現レベルの高いクローンの同定によって安定な発現を確立した。次に、Ａタンパク質アフィニティークロマトグラフィー、次いで分取サイズ排除クロマトグラフィーを用い、細胞馴化培地からＦｃｅＲＩ＿Ｆｃ融合タンパク質を精製した。
【０３００】
実施例３  ＩｇＥと精製ＩｇＧの間の複合体形成の測定
精製ヒトＩｇＥと精製抗ＩｇＥ  ＩｇＧ(抗体３３)の間で形成された免疫複合体の特性決定を、高速サイズ排除液体クロマトグラフィーによって行った。さらに、オンライン多角度光散乱(ＭＡＬＳ)を用い、複合体のサイズを評価した。複合体は、１８℃で１時間、ダルベッコのＰＢＳ中、ＩｇＥとＩｇＧを１：１のモル比でともにインキュベートすることにより形成した。サンプル中の各タンパク質の濃度は２.５μＭであった。サンプルを直列配置した２本のＢｉｏ−Ｓｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ  ４０００カラム(３００×７.８ｍｍ)で分析した。これらのカラムを平衡化し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１１００  ＨＰＬＣシステムにて、ダルベッコのＰＢＳ中、流速１ｍｌ／分でサンプルを分析した。ピークはダイオードアレイデテクターを用い、２２０および２８０ｎｍで検出し、また、溶出液をＷｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＤＡＷＮ  ＥＯＳ(ＭＡＬＳ)およびＯｐｔｉｌａｂ  ｒＥＸ(屈折率)にも向けた。
【０３０１】
１：１モル比のサンプルのクロマトグラフィーにより３つのピーク(ＵＶ吸光度により検出)が得られ、これらは完全には分離できず、保持時間１３.３８分、１４.２４分および１５.６４分に相当した。これらの保持時間は、ＩｇＥとＩｇＧの非共有結合的複合体の形成を示す。ＭＡＬＳ分析では、分子量１２３９ｋＤａ(１３.８８分ピーク)、９１４ｋＤａ(１４.２４分ピーク)および５７６ｋＤａ(１５.６４分ピーク)が得られ、これらは全てＩｇＧタンパク質およびＩｇＥタンパク質単独の分子量よりも大きい。ボイド用量に溶出するタンパク質の証拠は見られず、大きな分子量の凝集物(＞２００万Ｄａ)は形成されなかったことを示す。
【０３０２】
実施例４：ヒトＢ細胞−細胞内ＩｇＥの阻害
ヒトヘパリン処理全血から、フィコール−パーク勾配(Pharmacia)での遠心分離により末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を単離した。次に、このＰＢＭＣ集団から、磁気ビーズ(Miltenyi)による陽性抗ＣＤ１９選択を用い、Ｂ細胞を単離した。この磁気カラムに細胞を通すと、陽性Ｂ細胞画分と陰性Ｂ細胞画分の双方が回収された。Ｂ細胞以外の全ＰＢＭＣ細胞を含む陰性Ｂ細胞画分からの細胞をマイトマイシンＣで処理して増殖を妨げた。これらの細胞を５０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣとともに３０分間インキュベートした後、組織培養培地(Ｇｌｕｔａｍａｘ(Gibco)／１０％ＦＣＳ(Gibco)／５０Ｕ／ｍＬペニシリン／５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン(Gibco)を含むＲＰＭＩ  １６４０)で洗浄し、さらにＰＢＳとともに７０分間インキュベートし、その後、最終洗浄を行い、全てのマイトマイシンＣを除去した。Ｂ細胞の分化を誘導するため、４×１０４のＢ細胞および９.２×１０５のＢ細胞陰性画分由来細胞を、３.５μＭのβ−メルカプトエタノール(Sigma)および２０μｇ／ｍＬのトランスフェリン(Chemicon)を添加した組織培養培地中、９６ウェルプレートにプレーティングし、０.００１〜１００ｎＭの抗ＩｇＥ  Ｍａｂまたは対照抗体とともに３０分間プレインキュベートした後、０〜１００ｎｇ／ｍＬのヒトインターロイキン−４(ＩＬ−４)を加えた。次に、これらの細胞を加湿ＣＯ２インキュベーターで１２日間インキュベートした。１２日目に、これらのプレートを軽く回転させ、上清を回収し、細胞を、下記のプロトコールを用いて細胞内ＩｇＥに関して染色した。
【０３０３】
細胞をまず、１％ヒト血清を含むＰＢＳで１０分間インキュベートしてＦｃ受容体結合をブロッキングした。次に、Becton Dickinson製のＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを用い、細胞を氷上で固定し、透過処理を施した。その後、これらの細胞を洗浄した後、１：６最終希釈のポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＥ−ＦＩＴＣ抗体(DAKO)および１０倍希釈のモノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９−ＲＰＥ／Ｃｙ５抗体(DAKO)を加えた。残留する抗ＩｇＥ  ＭＡｂ(モノクローナル抗体)からの干渉を避けるために細胞を十分洗浄することが重要である。３０分インキュベートした後に、細胞を洗浄し、ＨＴＳ  ９６ウェルプレートローダーデバイスを用い、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒにてサンプルを分析した。次に、ＣＤ１９＋集団中の、ＩｇＥを同時発現する細胞のパーセンテージを記録し、細胞内ＩｇＥの発現を、ブロッキング抗ＩｇＥで処理してない細胞における最大ＩｇＥ発現阻害率％として表す。
【０３０４】
細胞内染色を有する抗ＩｇＥ  ＭＡｂの干渉がないことを確認するため、上清を並行して、用いる抗ＩｇＥクローンによる有意な干渉を示さないことが確認されているアッセイ、すなわち、Pharmacia diagnostics(現在、Phadia) ImmunoCapアッセイを用い、ＩｇＥ産生に関して分析した。
【０３０５】
実施例５  若齢カニクイザルにおける抗ＩｇＥ  ｍＡｂの一般的安全性および血小板数低減誘発能の評価
導入
抗ＩｇＥ  ｍＡｂ抗体３３および他の２つの抗ＩｇＥ抗体、Ｅ８５−５０  ＩｇＧ１とＥ８５−５０  ＩｇＧ２の一般的安全性および相対的血小板数低減誘発能を評価するため、若齢カニクイザルにおいて検討(非ＧＬＰ準拠)研究を行った。
【０３０６】
この研究の目的は、１)若齢カニクイザルにおいて、３つの候補抗ＩｇＥ  ｍＡｂの一般的安全性および相対的血小板数／血小板減少症(thrombocyopaenia)(ＴＣＰ)および関連の影響の低減を誘発する能力を決定すること、２)サルにおいてｍＡｂの予備的薬物動態パラメーターを決定すること、３)３つの候補ｍＡｂの遊離ＩｇＥ低減誘発能およびｍＡｂ濃度と遊離ＩｇＥレベルの間の関係(ＰＫ／ＰＤ)を決定することであった。
【０３０７】
実施例５の材料および方法
１８匹の目的を持って繁殖した(purpose-bred)カニクイザル(Macaca fascicularis)をBioculture, Mauritiusから入手した。これらの動物は投与開始時に６３〜６７週齢の間であった。高いＩｇＥレベル(Ｕ／ｍｌ)を持ったサルを予備選択し(１００匹のより大きなプールから)、各雄３匹と雌３匹を含み、Ｅ８５−５０  ＩｇＧ１(群１)、Ｅ８５−５０  ＩｇＧ２(群２)または抗体３３(群３)を受容する３群間でノーマライズした。３種類のｍＡｂをそれぞれ５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５.５中に処方し、２ｍＬ／ｋｇの用量で、速度１ｍＬ／分の緩慢静注(電動シリンジ／注入ポンプを使用)によって動物に投与した。これらの動物に、１、８、１６、２２および２９日目に用量を１ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ(３倍)に引き上げつつ毎週１回投与した(表７)。群１と２にはそれぞれ３７日目に追加量のＥ８５−５０  ＩｇＧ１およびＥ８５−５０  ＩｇＧ２を投与した。最も高い２つの用量レベルは、若齢カニクイザルにおいてXolairを用いてＴＣＰをもたらすことが従前に示されている血清濃度に達するものと推定された。低用量が、遊離ＩｇＥレベルの低減を果たすｍＡｂの能力の決定を可能とすると考えられた。
【表２３】
2010519194.tif 000032
【０３０８】
２８日目の投与後８週間、動物を観察し、毒物学的作用からの回復を調べた。
【０３０９】
全ての動物の病的徴候または明白な毒性を毎日観察し、体重および食物消費を記録した。さらに、各動物に、毎日投与時間中に、また、少なくとも毎週１回は非投与時間中に詳細な身体検査を行った。また、各投与前および投与後０.５、２、６、２４、４８および１６８時間目にも全ての動物を観察した。
【０３１０】
標準的な血液学パラメーター(血小板総数を含む；ＥＤＴＡ中に採取)および凝固パラメーター(クエン酸三ナトリウム中に採取)の分析用の血液サンプルを処置前(２週間前および１週間前)に２回、大腿静脈／動脈から採取した。さらに、血小板総数および標準的な血液学用のサンプルを、各投与(２、７、９、１４、１７、２２、２３、２６、３０および３５日目；３８日目と４３日目は群１および２からのサンプルのみ)後２４時間目および１４４時間目、および８週間の回復期間中は２週間おき(４３、５７、７１および８２日目)に採取した。凝固用サンプルは各投与(７、１４、２２、２６および３５日目)後１４４時間目と回復期間の終了時(８２日目)に採取した。凝固用サンプルはまた、５７日目にも採取した。補体活性化(Ｃ３ａ、Ｃ３ｂおよびＢＢフラグメント)用の血液サンプルは、処置前に１回(１週間前)および処置時間が終了してからおよそ２４時間後に採取した(３０日目)。
【０３１１】
ＴＫ分析用の血清サンプルは、１日目の投与前、投与後０.５、６、１２、２４、４８、１４４時間目、８、１６、２２および２９日目の投与後０.５、２４および１４４時間目、２９日目(群３および４のみ)の投与後３３６、６７２、１００８、１２７２時間目、３７日目(群１および２のみ)の投与後０.５、２４、１４４、４８０、８１６、１０８０時間目に全ての群から採取した。一般的なサンドイッチ免疫アッセイ(ｍＡｂとしてのビオチニル化ヒトＩｇＥ、およびＡｌｅｘａ−６４７標識ネズミ抗ヒトＩｇＧ検出試薬を使用)およびＧｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙプラットフォーム(ストレプトアビジンビーズカラム内蔵)を用い、サンプルのｍＡｂを分析した。ＩｇＥ分析用のさらなる血清サンプルを、１日目の投与前、投与後０.５、６、１２、２４、４８、１４４時間目、８、１６、２２および２９日の投与後０.５、１４４時間目、および試験の終了時(８２日目)の最後の投与後１２７２時間目(群３および４)または１０８０時間目(群１および２)に採取した。ＩｍｍｕｎｏＣａｐシステム(Phadia AB, Uppsala, Sweden)を、遊離ＩｇＥの捕捉のためのヒトＩｇＧ−ＦｃεＲＩａおよび検出のためのウサギ抗ヒトＩｇＥ(ＰＣＳコンジュゲート)とともに用いる免疫アッセイによりサンプルの遊離ＩｇＥを分析した。
【０３１２】
８５日の動物の屠殺の際に、病理学者の全般的管理下で詳細な肉眼的検査を行い、全ての病変を記録した。絶対的臓器重および臓器：体重比を求めた。一定範囲の臓器からの組織を採取し、冷凍保存したが、顕微鏡検査は行わなかった(肉眼的異常または不時の死亡以外、下記参照)。
【０３１３】
実施例５の結果
一般的安全性の観察
３種類のｍＡｂは全て、臨床症状の悪化および体重減少のために計画より早く剖検に送った１匹のＥ８５−ＩｇＧ１受容動物以外は、本試験中に病的な臨床徴候は無く、全般的に十分許容されるものであった。この悪化した動物は十分回復期にあり、この動物(および他の任意のもの)の病理学的または血液学的検証の際に見られる所見が無かったことから、見られた影響はｍＡｂ関連のものであるとは考えられない。全ての群で軟便または水便の発生が見られたが、これらの所見は投与に関連せず、全ての動物に見られたわけではなく、あるいは同じ動物の全ての時点で見られたわけでなく、投与期間中も回復期間中に頻繁に見られたことから、ｍＡｂに関連するとは思えない。平均体重および平均体重増加は、本研究中、各群内の動物でいくらか個体変動を示した。しかしながら、予測されたように、処置期間にわたって全ての動物が体重増を示し(上述の１匹を除く)、群間で明白な差は無かった。どの群でも、絶対的または相対的臓器重に処置に関連する明白な影響は見られなかった。大まかな病理学的検査および顕微的病理学的検査では、限られた範囲の被験組織には、ｍＡｂ処置の影響を示唆する所見は見られなかった。
【０３１４】
毒物動態学およびＩｇＥレベル
本試験ではＴＫにおける性差は見られなかった。一般に、これら３種類のｍＡｂで曝露は同程度であり、１〜１００ｍｇ／ｋｇの用量範囲では、用量に応じた直線性が見られた。Ｅ８５−５０  ＩｇＧ１、Ｅ８５−５０  ＩｇＧ２および抗体３３の平均ＴＫプロファイルを図８に示す。ＴＫに対する明白なＩｇＥシンク効果は、最低用量レベルでさえ見られなかった。カニクイザルにおいてこれら３種類の抗体ＴＫは、ヒトＩｇＧの典型であると思われた。
【０３１５】
最後の１００ｍｇ／ｋｇの投与後に見られた平均最大濃度(Ｃｍａｘ)は、Ｅ８５−５０  ＩｇＧ１、Ｅ８５−５０  ＩｇＧ２および抗体３３でそれぞれ１８７００、１５９００および２４０００ｎＭであった。最後の１００ｍｇ／ｋｇの投与後の平均最終ＴＫ半減期はおよそ１０〜１３日であった。これらの動物では、霊長類抗ヒト抗体の発達の可能性のために、ＴＫ曝露低減の証拠は見られなかった。
【０３１６】
カニクイザルにおいて種々の用量のＥ８５−５０  ＩｇＧ１、Ｅ８５−５０  ＩｇＧ２および抗体３３を毎週投与した後の平均遊離ＩｇＥプロファイルを図９に示す。動物が最初の投与を受ける前の平均ベースラインＩｇＥはは、Ｅ８５−５０  ＩｇＧ１、Ｅ８５−５０  ＩｇＧ２および抗体３３群でそれぞれ５１４、４１４および６９０ｎｇ／ｍＬであった。１日目では、１ｍｇ／ｋｇの投与が、投与後１時間で遊離ＩｇＥに７５〜８０％減をもたらした。１ｍｇ／ｋｇ投与後の曝露は低いために、遊離ＩｇＥは１週間以内にベースラインに戻った。用量が高いと、処置期間中、遊離ＩｇＥの一貫した抑制が起こった。２つのＥ８５−５０群では試験の終了時に遊離ＩｇＥがベースラインに戻ったが、抗体３３群の遊離ＩｇＥは抑制されたままであった。
【０３１７】
血小板に対する影響
２９日目の１時点(３回目の、２８日目の１００ｍｇ／ｋｇ投与後２４時間)で血小板に減少をもたらした(ベースラインから３４.９％減)１匹のＥ８５−ＩｇＧ１受容動物を除いては、３つの候補ｍＡｂ(Ｅ８５−５０  ＩｇＧ１、Ｅ８５−５０  ＩｇＧ２または抗体３３)の中に、いずれの動物のいずれの時点でも平均ベースラインレベルから血小板総数を有意に低下させるものは無かった。４回目の、３７日目のＥ８５−５０  ＩｇＧ１およびＥ８５−５０  ＩｇＧ２投与はこの動物に、またはこれら２群のいずれの動物にもさらなる血小板の減少をもたらさなかった。
【０３１８】
図１０は、群３(抗体３３で処置)の動物からの血漿濃度に対する、２つの投与前値の平均からの変化率％として表した血小板数(×１０９／Ｌ)のプロットを示す。このプロットは、血小板に対して有意な影響を示さなかった３つの群の他の１６匹の動物を代表するものである。
【０３１９】
興味深いことに、２９日目の投与後に血小板数に一次的な低下を示したＥ８５−５０  ＩｇＧ１処置のサルは、この時点で最高のＣｍａｘ値(２９４００ｎｍｏｌ／Ｌ)(曝露無しであるが)を示した。その後、血漿レベルは急に低下し、血小板総数は投与前の値に戻った。このことは、血小板数に低下をもたらすには、もっと高い血漿濃度閾値が必要とされる可能性を暗示している。しかしながら、相当する血小板作用無く同レベル(２８５００ｎｍ／Ｌ)に達したのは抗体３３処置動物１匹だけであった(図８)。
【０３２０】
その他の血液学的影響
血小板総数(以下参照)を除き、血液学的パラメーター(ヘモグロビン濃度、血球容積、平均血球容量、平均血球ヘモグロビン濃度、赤血球分布幅、血小板クリット、血小板分布幅、赤血球細胞総数、平均血球ヘモグロビン、ヘモグロビン分布幅、平均血小板容量、網状赤血球総数、総白血球数および分画白血球数)ならびに血液凝固パラメーター(プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間)の大多数にｍＡｂ処置の一貫した影響は見られなかった。全ての群で網状赤血球数の増加が見られたが、これらの変化は投与／曝露に関連が無く、１つの群内で一貫性が無く(１つの群内の動物で投与前値より高かったり、低かったり、変わらなかったりした)、またはある動物内でも一貫性が無く(動物内の値は曝露とは独立に時点によって上下した)、並行対照群が無いので、この時点では、ｍＡｂ処置との関係は十分に判定できない。このような変化は一般に、回復期間の終了時には戻っていた。補体活性化(Ｃ５ａ、Ｃ３ａまたはＢＢフラグメント)には有意な処置関連の影響は見られなかった。
【０３２１】
考察および結論
本研究は、抗ＩｇＥ  ｍＡｂ  Ｅ８５−５０  ＩｇＧ１、Ｅ８５−５０  ＩｇＧ２および抗体３３が、有意な有害毒物学的作用無く、若齢カニクイザルに高反復用量レベル(１００ｍｇ／ｋｇまで)で投与した際に十分許容されたことを示した。１８匹のうち１匹だけが、１００ｍｇ／ｋｇのＥ８５−５０  ＩｇＧ１を投与した後、ｍＡｂの血漿濃度がほぼ３００００ｎｍｏｌ／Ｌに達した一時点で、平均ベースラインレベルからの血小板数の有意な低下を示した。本研究において３種類のｍＡｂの全てで到達した血漿Ｃｍａｘ濃度は、臨床上達せられるものを遙かに超えていると思われる(例えば、２００ｎｍｏｌ／Ｌ)。
【０３２２】
参考文献
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【表４２】
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【表４３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年10月13日(2009.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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