(57)【要約】  ＩＳＦ３５または類似構造物の投与による癌の治療方法。この治療は化学療法剤との治療に対する感受性を高めることができる。【選択図】図１ａ及び図１ｂ【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療方法であって、患者に対する効果量の化学療法剤の投与に先立って前記患者に対して効果量のＩＳＦ３５を投与することで、ＩＳＦ３５を前記患者に投与する前よりも癌の前記化学療法剤に対する感受性を高めることを特徴とする癌の治療方法。
【請求項２】
癌は耐性癌であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＩＳＦ３５は化学療法剤の投与に先立って投与されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＩＳＦ３５は化学療法剤と略同時的に投与されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
化学療法に対する患者の癌の感受性を高める方法であって、化学療法を前記患者に対して適用する前にＩＳＦ３５を前記患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項６】
ＩＳＦ３５は化学療法剤の投与後に投与されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
放射線治療に対する感受性を高める方法であって、患者に対して放射線治療を適用する前にＩＳＦ３５を前記患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項８】
ＩＳＦ３５は略１×１０5から略１×１０12のウィルス粒子の投与量で投与されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
癌は、胸部癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、皮膚癌、膀胱癌、リンパ腫、口腔癌、咽頭癌、白血病、腎臓癌、すい臓癌、食道癌、直腸癌、気管支癌、胃癌で成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
化学療法剤は、フダラビン、アレムツジマブ、クロラムブシルおよびリツキシマブで成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
放射線も患者に適用されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
患者の癌治療方法であって、前記患者に対して効果量の化学療法剤の投与に先立って前記患者に対して効果量のキメラＣＤ１５４ポリペプチドまたはそれをエンコードする核酸を投与することで、キメラＣＤ１５４ポリペプチドを前記患者に投与する前よりも癌の前記化学療法剤に対する感受性を高めることを特徴とする方法。
【請求項１３】
患者の癌の治療方法であって、前記患者に効果量の化学療法剤を投与する前にキメラＣＤ１５４ポリペプチドまたはそれをエンコードする核酸を前記患者に投与することで、該患者に対してキメラＣＤ１５４ポリペプチドを投与する前よりも癌の前記化学療法剤に対する感受性を高めることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌およびその治療法の分野に関する。特に、本発明はキメラタンパク質をエンコードする核酸の投与による癌治療に関する。
【０００２】
（援用文献）
本明細書中にて言及されている全文献の全内容を本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
免疫応答は典型的にはその表面に、クラス１１の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子が関与する抗原由来ペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有したＴ細胞によって開始する。このＴ細胞はその表面に様々なポリペプチドを発現する。これらポリペプチドは“リガンド”と呼ばれる。なぜならそれらは以下でさらに詳細に解説するように免疫介在応答が関与する細胞上で受容体に結合するからである。Ｔ細胞受容体が癌細胞由来の抗原のごときＭＨＣ関与抗原に結合するとＴ細胞は活性化され、その表面にリガンドを発現する。このリガンドは細胞表面に短時間存在するだけであり、細胞表面から除去されるとＴ細胞の受容体保持細胞結合能力は失われる。このようなリガンドの１例はＣＤ１５４と呼ばれるものである。
【０００４】
ＣＤ１５４は集団的にＴＮＦスーパーファミリーと呼ばれるリガンドの大ファミリーの構成員である（Gruss et al., Cytokines Mol Ther., 1:75-105, 1995 and Locksley et al, Cell, 104:487-501, 2001）。ＴＮＦスーパーファミリーの構成員にはＦａｓリガンド(FasL)、ＴＮＦα、ＬＴα、リンフォトキシン（ＴＮＦβ）、ＣＤ１５４、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、ＡＰＲＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＬＩＧＨＴ、ＡＩＴＲリガンド、エクトジスプラシン、ＢＬＹＳ、ＶＥＧＩおよびＯＸ４０リガンドが存在する。ＴＮＦスーパーファミリー構成員は次の４種のドメインを含む保存される二次構造物を共有する。すなわちドメインＩである細胞内ドメインと、ドメインＩＩである細胞膜を架橋し、膜透過ドメインとして知られるドメインと、ドメインＩＩＩである細胞膜に最も接近した細胞外アミノ酸で成るドメインと、ドメインＩＶである遠位細胞外ドメインである（キップス他のＷＯ９８/２６０６１、１９９８年６月１８日発行）。典型的には少なくともドメインＩＶの一部は親分子から開裂できる。この開裂断片はしばしば完全リガンドと同じ生物活性を示し、便宜的にＴＮＦファミリー構成員の“可溶形態物”と呼ばれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は癌治療のためのキメラＣＤ１５４ポリペプチドと、それらをエンコードする核酸とに関する。このキメラＤ１５４はＢ細胞を含む多様な細胞タイプでの発現能力を有している。実施例によっては、キメラＣＤ１５４はタンパク質分解開裂に対する抵抗性が弱く、細胞膜での発現時に安定性が高い。さらにキメラＣＤ１５４はヒトＣＤ１５４の受容体結合能力を維持することができるため、ヒトにおける類似タイプの免疫応答を誘引する。
【０００６】
キメラＴＮＦまたは非ヒト由来分子と組み合わされたヒト分子由来の部分で作成されたＣＤ１５４分子が本発明で利用できる。この有用なキメラ分子はヒト由来または非ヒト由来の複数部分を含むであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特に本発明の実施例によっては、本発明の方法はキメラＣＤ１５４配列ＩＳＦ３５に関し、あるいはその利用に関する。これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と図２および図３で示すマウス/ヒトキメラ配列である。
【０００８】
実施例によっては、患者の癌の治療方法は、その患者に対する化学療法剤の効果量の投与に先立って患者に対して効果量のＩＳＦ３５および類似構造物を投与し、ＩＳＦ３５または類似構造物を患者に投与する前よりも癌の化学療法剤に対する感受性を高めることによって提供される。ＩＳＦ３５または類似構造物は化学療法剤の投与に先立って投与できる。ＩＳＦ３５または類似構造物は化学療法剤の投与前、同時または投与後に投与できる。ここで使用するＩＳＦ３５の“類似構造物”とは本発明による別キメラＣＤ１５４分子のことである。さらに、および加えて、類似構造物はＩＳＦ３５に対して実質的相同性を有する構造物を含む。実施例によっては、これはＩＳＦ３５と少なくとも９８％の相同性を有するものを含む。別実施例ではこれは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、または９９％以上のＩＳＦ３５との相同性を有するものを含む。
【０００９】
別実施例では、患者の耐性癌の治療法は患者に対する効果量の化学療法剤の投与に先立って患者に対して効果量のＩＳＦ３５あるいは類似構造物を投与し、ＩＳＦ３５または類似構造物を患者に投与する前よりも耐性癌の化学療法剤に対する感受性を高めることによって提供される。ＩＳＦ３５または類似構造物は化学療法剤の投与に先立って投与できる。ＩＳＦ３５またはその類似構造物は化学療法剤の投与前、同時または投与後に投与できる。
【００１０】
実施例によっては、患者の癌の化学療法に対する感受性を高める方法は化学療法を患者に対して適用する前にＩＳＦ３５または類似構造物を患者に投与することで提供される。
【００１１】
実施例によっては、例えば癌の治療のために放射線治療に対する感受性を高める方法は患者に対して放射線治療を適用する前にＩＳＦ３５または類似構造物を患者に投与することで提供される。
【００１２】
別実施例においては、ここで解説する本発明の一部の実施例ではＩＳＦ３５または類似構造物は約１Ｘ１０5から約１Ｘ１０12のウィルス粒子の投与量が投与できる。
【００１３】
本発明を利用する治療対象の癌は、例えば胸部癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、皮膚癌、膀胱癌、リンパ腫、口腔癌、咽頭癌、白血病、腎臓癌、すい臓癌、食道癌、直腸癌、気管支癌、胃癌から選択できる。
【００１４】
化学療法剤は、例えばフルダラビン、アレムツジマブ、クロラムブシルおよびリツキシマブから選択できる。
【００１５】
実施例によっては放射線も同時的に患者に適用される。
【００１６】
さらに別実施例では、患者の癌治療方法は、患者に対して効果量の化学療法剤の投与に先立って患者に対して効果量のキメラＣＤ１５４ポリペプチドまたはそれをエンコードする核酸を投与し、キメラＣＤ１５４ポリペプチドを患者に投与する前よりも癌の化学療法剤に対する感受性を高めることによって提供される。
【００１７】
さらに別実施例では、患者に効果量の化学療法剤を投与する前にキメラＣＤ１５４ポリペプチドまたはそれをエンコードする核酸を患者に投与することで、患者に対してキメラＣＤ１５４ポリペプチドを投与する前よりも癌の化学療法剤に対する感受性を高めることで提供される。
【００１８】
実施例によっては、患者の癌の治療方法はＣＤ４０タンパク質に結合する効果量の分子を患者に投与することで提供される。
【００１９】
別実施例では、患者の癌の治療方法はＣＤ４０タンパク質に結合する効果量の抗体を患者に投与することで提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１ａ】図１ａは様々なキメラＣＤ１５４配列をエンコードするポリヌクレオチドを示す概略図であり、キメラＣＤ１５４の特性が関与するサブドメインの位置を示す。ネズミＣＤ１５４由来のドメインまたはサブドメインは斜線で示されている。
【図１ｂ】図１ｂは様々なキメラＣＤ１５４配列をエンコードするポリヌクレオチドを示す概略図であり、キメラＣＤ１５４の特性が関与するサブドメインの位置を示す。ネズミＣＤ１５４由来のドメインまたはサブドメインは斜線で示されている。ＩＳＦ３５キメラは図１ｂで示されている。
【図２】図２はヒトＣＤ１５４に対して整合配列されたＩＳＦ３５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１］である。ヒトＣＤ１５４に相同する領域は太文字で示されている。
【図３】図３はネズミＣＤ１５４に対して整合配列されたＩＳＦ３５のヌクレオチド配列［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１］である。ＩＳＦ３５ヌクレオチド配列はその整合配列の上方配列であり、ヒトまたはマウスＣＤ１５４のヌクレオチド配列は下方配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明はキメラＣＤ１５４タンパク質をエンコードする核酸で患者を治療することによって患者の癌を治療する方法を提供する。好適な核酸はＩＳＦ３５であり、代表的には図１で示すキメラマウス/ヒト配列であり、特には図２と図３で示す配列である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。ＩＳＦ３５とヒトＣＤ１５４配列との比較は図２で示す。ＩＳＦ３５とネズミＣＤ１５４配列との比較は図１と図２で示されている。ＩＳＦ３５は化学療法剤と組み合わせて投与できる。ＩＳＦ３５は化学療法剤の投与前、同時あるいは投与後に投与できる。
【００２２】
本発明の特徴は特に本明細書中および「請求の範囲」で記載されている。この開示の特徴と利点のさらなる理解は、本発明の特徴を具現化したいくつかの実施例を解説する以下の詳細な説明で得られるであろう。
【００２３】
ここで解説する方法と組成物の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかとなろう。しかしながら本発明の詳細な説明および特定の実施例は本発明の説明のみを目的としており、本発明の開示の精神と範囲内での内容の様々な変更および改良は専門家には明らかであろう。
（定義）
【００２４】
開示されている組成物が治療効果量で患者に投与される。ここで使用する“治療効果量”および“治療効果投与量”とは患者に望む結果をもたらすために必要な、例えばＩＳＦ３５である活性剤の投与量のことである。その結果とは、例えば治療を必要とする患者の症状の緩和または改善（完全または部分的）、その他の患者の症状、病気または状態の望ましい改善、または癌の予防または癌症状の開始を遅らせることである。
【００２５】
ここで使用する“対応する”とは別種のＣＤ１５４のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に相同する種のＣＤ１５４のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列のことである。この相同性は異なる種のＣＤ１５４中のドメイン境界位置等である二次構造物における類似性に基づくものである。
【００２６】
ここで使用する“発現ベクター”とは、組み換えヌクレオチド配列の発現またはその発現をもたらし、細胞に感染し、自身を内部で複製することができる核酸のことである。典型的なこの発現ベクターは組み換えＤＮＡ技術で利用されるプラスミドや、バクテリアまたは動物細胞内で複製をすることができる様々なウィルス等を含む。いくつかの発現ベクターは次の文献で解説されている。Cantwell et al., Blood, In(1996) entitled “Adenovirus Vector Infection of Chronic Lymphocytic Leukemia B Cells;" Woll, P.J. and I.R. Hart, Ann. Oncol., 6 Suppl 1:73(1995); Smith, K.T., A.J. Shepherd, J.E. Boyd, and G.M. Lees, Gene Ther., 3:190(1996); Cooper, M.J., Semin. Oncol., 23:172(1996); Shaughnessy, E., D. Lu, S. Chatterjee, and K.K. Wong, Semin. Oncol., 23:159(1996); Glorioso, J.C., N.A. Deluca, and D.J. Fink, Annu. Rev. Microbiol., 49:675(1995); Flotte, T.R. and B.J. Carter, Gene Ther., 2:357(1995); Randrianarison-Jewtoukoff, V. and M. Perricaudet, Biologicals., 23:145(1995); Kohn, D.B., Curr. Opin. Pediatr., 7:56(1995); Vile, R.G. and S.J. Rissel, Br. Med. Bull., 51:12(1995); Russel, S.J., Semin. Cancer Biol., 5-437(1994); and Ali, M., N.R. Lemoine, and C.J. Ring, Gene Ther., 1:367(1994)
【００２７】
ここで使用される“治療法”またはその類似表現とは個別患者の状態に関連して症状の改善、予防または治癒及び/又は効果をもたらす行為のことである。
【００２８】
ここで使用する“治療効果量”とは患者の症状、病気または状態の改善をもたらすＩＳＦ３５のごとき活性剤または治療効果物質の投与量であって、この活性剤を投与しなければ殆ど、あるいは全く改善されないような投与量をも表す。典型的には治療効果物質は望む治療効果を達成するために十分な期間その投与が継続される。“治療効果量”とはＩＳＦ３５のごとき活性剤または治療効果物質の量のことでもあり、この活性剤を投与しなければ殆ど、あるいは全く改善されないような症状、病気または状態の改善または均衡状態をもたらす投与量のことである。
【００２９】
ＩＳＦ３５または類似構造物の治療効果および治療効果量は標準的な薬理学的試験法に従って決定できる。このような試験法ではその投与量の決定に動物実験を活用することができる。
【００３０】
ＩＳＦ３５または類似構造物の投与レジメンは様々な要因を考慮して選択できる。それら要因とはタイプ、種、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、症状程度、投与経路、および利用される組成物または調剤の特徴等である。
【００３１】
一般的にＩＳＦ３５または類似構造物の配列を含むＩＳＦ３５または類似構造物、あるいはその組み換え構造物の治療量は約１×１０7から約１×１０12のウィルス粒子の範囲である。ウィルス調剤の密度は約５×１０3から約５×１０12のウィルス粒子/ｍｌである。この投与レジメンは最良治療反応を得るために変更できる。
【００３２】
この組成物は単独または他の薬剤と組み合わせて投与できる。
（ＣＬＬ）
【００３３】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）は末梢血液とリンパ節のクローン成熟Ｂリンパ球の蓄積をもたらす病気である。当初、この病気は主として老人病であり、治癒が遅い病気であると考えられていた。その結果、早期の治療は不要であると考えられ、患者は治療が必要となる前にＣＬＬとは無関係な要因で死亡するであろうと告げられていた。
【００３４】
ＣＬＬの診断のための臨床検査の近年の発達と、改善されたパラダイムはこの病気の良性である性質に関する旧来の概念が間違っていたことを示している。現在、ＣＬＬ患者は特に感染病や自己免疫症に罹患しやすく、二次的悪性疾患のリスクが高いことが知られている。この病気の初期の予後診断に反して、早期に診断された病気のＣＬＬ患者の５０％は急速に進行し、これらの患者の生存期間は数ヶ月程度である。
【００３５】
この病気の悪性度のため、いくつかの治療パラダイムが開発された。この病気の治療法は確立されていないが、ＣＬＬ患者はまずアルキル化剤であるクロランブシルとシクロホスファミドまたはプリン類似体であるフルダラビン、ペントスタチンおよびクラドラビンを単独または組み合わせて投与されるのが普通である。フルダラビンはＣＬＬの主要な第１選択治療薬であり、全体的な有効率は７０％に近い。アルキル化剤に対するＣＬＬ患者の全体的な有効率（２％から１０％）はフルダラビンよりも低いが、いずれのレジメンで治療された患者からも明確な生存率の向上は観察されていない。
【００３６】
生存率を高めるために、ＣＬＬに関する新しいプロトコルが“カクテル”法を活用して開発された。この方法では化学療法剤（フルダラビンまたはペントスタチンおよびシクロホスファミド）はＣＤ１９の標的化学免疫療法剤（リツキサン）と組み合わせられ、それぞれ９０％と６０％に近い有効率と完全消失率が得られた。これら治療プロトコルに対する向上した有効率にも拘わらず多くの患者において病気は再発し、さらなる治療が必要になる。その後の治療の必要性はこれら薬剤に対する耐性を招く。このような場合、悪性Ｂ細胞上のＣＤ５２を標的にする別な化学免疫療法アレムリツキサン（Campath：登録商標）が延命治療のために使用可能である。
【００３７】
ＣＬＬに加えてＢ細胞介在白血病やリンパ腫の治療に利用される他の治療法が存在する。これらには固体腫瘍癌の治療に単独薬剤または組み合わせ薬剤として使用される多くの化学治療法が含まれる。Ｂ細胞悪性腫瘍に利用されるこれら薬剤にはシスプラチン、アスパラギナーゼ、ダカルバジン、メクロレタミン、メファラン、シタラビン、エトポシド、カルムスチン、プロカルバジン、ロムスチン、ダクチノスマイシン、プリカマイシン、メトトレキサート、カルボプラチン、ドキソルビシンおよびダウノルビシ等々が含まれる。
【００３８】
確立されている化学療法と共に利用されるとメシル酸イマチニブ（グリベック：登録商標）とダサチニブ等の新規な抗白血病剤が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者に特に効果的である。これら薬剤に加えて白血病関与抗原ＣＤ２２、ＣＤ４０またはＣ２００等を標的にした多数のモノクロナール抗体が開発されている。
（ＣＤ１５４）
【００３９】
典型的には免疫応答は表面上に、クラスＩＩの主組織適合複合（ＭＨＣ）分子が関与する抗原由来ペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有したＴリンパ球（Ｔ細胞）によって開始する。このＴ細胞はその表面上に様々なポリペプチドも発現する。これらは“リガンド”と呼ばれる。なぜならそれらは以下でさらに詳細に解説するように免疫介在反応が関与する細胞上で受容体に結合するからである。Ｔ細胞受容体が悪性腫瘍細胞由来抗原のごときＭＨＣ関与抗原に結合すると活性化され、その表面にリガンドを発現する。このリガンドは短時間だけ細胞表面上に存在する。細胞表面から除去されるとＴ細胞の受容体保持細胞への結合能力は消失する。そのようなリガンドの１例にはＣＤ１５４と呼ばれるものが存在する。
【００４０】
ＣＤ１５４は集団的にＴＮＦスーパーファミリーと呼ばれるリガンドの大ファミリーの構成員である（Gruss et al., Cytokines Mol Ther., 1:75-105, 1995 and Locksley et al, Cell, 104:487-501, 2001）。ＴＮＦスーパーファミリーの構成員にはＦａｓリガンド(FasL)、ＴＮＦα、ＬＴα、リンフォトキシン（ＴＮＦβ）、ＣＤ１５４、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、ＡＰＲＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＬＩＧＨＴ、ＡＩＴＲリガンド、エクトジスプラシン、ＢＬＹＳ、ＶＥＧＩおよびＯＸ４０リガンドが存在する。ＴＮＦスーパーファミリー構成員は次の４種のドメインを含む保存される二次構造物を共有する。すなわちドメインＩである細胞内ドメインと、ドメインＩＩである細胞膜を架橋し、膜透過ドメインとして知られるドメインと、ドメインＩＩＩである細胞膜に最も接近した細胞外アミノ酸で成るドメインと、ドメインＩＶである遠位細胞外ドメインである（キップス他のＷＯ９８/２６０６１、１９９８年６月１８日発行）。典型的には少なくともドメインＩＶの一部は親分子から開裂できる。この開裂断片はしばしば完全リガンドと同じ生物活性を示し、便宜的にＴＮＦファミリー構成員の“可溶形態物”と呼ばれる。
（ＣＤ１５４の生物活性）
【００４１】
ＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンドとしても知られる）と、その同属受容体ＣＤ４０との間の反応は免疫認識のためには非常に重要である。（Banchereau J. et al., Annu. Rev. Immunol. 12.881-992, 1994; Laman J.D. et al., Crit. Rev. Immunol., 16:59-108, 1996）。
ＭＨＣクラスＩＩ分子を介した抗原提供細胞によるＴ細胞受容体の関与に続きＣＤ１５４はＣＤ４sup+Ｔ細胞で一時的に発現される。（Roy M. et al., J. immunol., 151:2497-2510, 1993; Hepmann P. et al., Eur. J. Imkmunol., 23:961-967, 1993; Castle B.E. et al., J. Immunol., 151:1777-1788, 1991; Cabtwell M. et al., Nat. Med., 3:987-989, 1997）。その代わりに、これはＣＤ４０発現抗原提供細胞（ＡＰＣ）を活性化する。この細胞にはＢ細胞、デントリティック細胞、単核細胞およびマクロファージが含まれる。（Ranheim E.A. et al., J. Exp. Med., 177:925-935, 1993; Ranheim E.A. et al., Cell. Immunol., 161:226-235, 1995）。このようなＣＤ４０活性細胞は免疫活性イベントのカスケードを起こし、ウィルスや腫瘍のごとき異物に対する特殊で効果的な免疫応答をもたらす。ＣＤ４０とＣＤ１５４との間の反応の重要性はＣＤ４０のためのリガンドの欠陥を遺伝した個人が強力な免疫欠陥を有するという発見によって強調される。（Korthauer J. et al., Nature, 361:539-541, 1993; Aruffo A. et al., Cell., 72:291-300, 1993）。このような患者は欠陥胚中心形成、欠陥アイソタイプ切替および様々なバクテリア並びにウィルス病原菌に対する罹患性が関与する免疫欠陥症候群を有する。
【００４２】
免疫抑制においては、ＣＤ１５４は非常に重要な分子であるため、いくつかのメカニズムがヒトＣＤ１５４発現を制御する。まず膜発現性ＣＤ１５４は開裂され、ＣＤ１５４受容体であるＣＤ４０に結合できるＣＤ１５４の細胞外部分は可溶性分子として放出される。タンパク質分解酵素はヒトＣＤ１５４をリガンドに沿って異なる部位で開裂し、ＣＤ４０に結合でき、免疫応答を刺激することができるＣＤ１５４の可溶性形態物を放出することが示された。（Pietravalle F. et al., J. Biol. Chem., 271:5965-5967, 1996; Pietravalle F. et al., Eur. J. Immunol., 26:725-723, 1996）。例えば１研究では、ＣＤ１５４はＰｈｅ１１１とＡｌａ１２３の間で開裂されることが示され（Pietravalle F. et al., Eur. J. Immunol., 26:725-728, 1996）、開裂はＭｅｔ１１３でも報告されている。次に、ＣＤ１５４の類似受容体との反応はＣＤ１５４の表面発現の急速なダウンモジュレーションを誘起する。（Cantwell M. et al., Nat. Med., 3:984-989, 1997）。次にＣＤ１５４遺伝子転写は厳密に抑制される。最大リガンド発現はＴＣＲ連結の４から６時間後であり、ＣＤ１５４ＲＮＡとタンパク質合成は急速に減少する（Ｉｄ）。共に、これら抑制メカニズムは特定抗原に対する免疫応答の特殊性を確実にする。ＣＤ１５４発現の厳密な制御を維持することの重要性は全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）を患う患者で解説されている。これら患者は過剰にＣＤ１５４発現するように見え、リンパ漿内で高レベルの可溶性ＣＤ１５４を有し、非制御ＣＤ１５４発現がＳＬＥ症活性に貢献することを暗示しているように思われる。（Kato K. et al., J. Clin. Invest., 101:1133-1141, 1998; Vakkalanka R.K., Arthritis Rheum., 42871-881, 1999）。
【００４３】
Ｂ細胞および他の腫瘍を処理する研究は、ＣＬＬとＢ細胞リンパ腫の場合と同様に腫瘍細胞自体の抗原提供を増強するか、あるいはＣＤ４０非介在腫瘍の場合のように抗腫瘍免疫応答を励起することができるデントリティック細胞のごときバイスタンダー抗原提供細胞を活性化させることで機能する。しかしながら追加の研究ではＣＤ１５４は一定種の腫瘍、特に胸部癌に対して直接成長抑制効果を有することが暗示されている（Tong A.W. et al., Clin. Cancer Des., 7:691-703, 2001; Hirano A., Blood, 93:2999-3007, 1999）。さらに、ある種のリンパ腫の成長はＣＤ４０の連結反応によって直接的に抑制されるという証拠が存在する。（Wilsey J.A. et al., J. Immunol., 158:2932-2938, 1997）。よって幅広い範囲の腫瘍にＣＤ１５４免疫治療が効果を発揮する。
【００４４】
ヒト、マウスおよびウシのごとき異なる種のＣＤ１５４分子をエンコードしているヌクレオチド配列における類似性に鑑み、１つの種由来のＣＤ１５４のドメインまたはサブドメインをエンコードするヌクレオチド配列は別種由来のＣＤ１５４の対応するヌクレオチド配列と互換性があり、キメラＣＤ１５４をエンコードするハイブリッドポリヌクレオチド配列となる。そのようなキメラ分子の１例はＩＳＦ３５であり、図１代表的な手法および図２と図３の特定配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）で示されるマウス/ヒトＣＤ１５４キメラである。
【００４５】
実施例によっては、種間で対応する配列と交換されるヌクレオチド配列は機能的要因によって選択される。なぜなら選択された配列は望む機能を提供あるいは改質するか、または標的リガンド遺伝子の望まない機能を排除するドメインまたはサブドメインをエンコードしているからである。
【００４６】
本技術分野では少なくともヒトＣＤ１５４の一部が親分子から開裂され、可溶性分子となると考えられている。本発明によれば可溶形態は一般的に不都合である。よって本発明の実施例によっては、タンパク質分解酵素により認識された開裂部位を含むヒトＣＤ１５４のアミノ酸またはアミノ酸配列を、この開裂部位を含まない非ヒトＣＤ１５４のアミノ酸またはアミノ酸配列と交換することは少なくとも部分的にこの問題を解決することができる。好適には非ヒトＣＤ１５４はネズミＣＤ１５４である。
【００４７】
本発明の実施例によっては、ヒトＣＤ１５４の細胞外ドメインは少なくとも１つのアミノ酸またはアミノ酸配列を認識され、開裂プロテアーゼによって開裂されたドメインＩＩＩとドメインＩＶの境界に、あるいはその近辺に含む。本発明の実施例によっては、少なくとも１つのそのような開裂部位はヒトＣＤ１５４のヌクレオチド３２２から３４８であるアミノ酸１０８から１１６に存在する。
【００４８】
さらに本発明の実施例によっては、ヒトＣＤ１５４の細胞外ドメインはヒトＣＤ１５４受容体（例：ＣＤ４０）に結合する少なくとも１つのアミノ酸またはアミノ酸配列を含むことができる。この理由で実施例によっては、ＣＤ１５４の可溶性形態であっても抗原提供細胞でＣＤ１５４受容体に結合でき、免疫応答に積極的に関与できる。よって実施例によってはヒトＣＤ１５４のこの細胞外領域は天然ＣＤ１５４受容体結合を維持するために保存される。
【００４９】
従って本発明の１好適実施例はキメラＣＤ１５４ポリヌクレオチド配列であり、ヒトＣＤ１５４の開裂部位に対応して交換する非ヒトＣＤ１５４の細胞外サブドメインをエンコードする第１ヌクレオチド配列を含む。本発明の実施例によっては、ＣＤ１５４開裂部位を含むヒトＣＤ１５４のサブドメインを、非ヒトＣＤ５４の対応するサブドメインと交換するとヒトＣＤ１５４よりも開裂の影響を比較的受けにくい、あるいは大幅に受けにくいキメラＣＤ１５４となる。
【００５０】
本発明の実施例によっては、第１ヌクレオチド配列は、ＣＤ４０リガンドのごときヒトＣＤ１５４受容体への結合に関与するＣＤ１５４の細胞外サブドメインをエンコードする第２ヌクレオチド配列に機能的に連結できる。このようにして本発明の実施例によっては、ポリヌクレオチド配列はＣＤ１５４受容体を発現するヒト細胞に結合するキメラＣＤ１５４をエンコードすることができる。
【００５１】
さらに本発明の実施例によっては、ネズミとヒトのＣＤ１５４の細胞外ドメインはネズミおよびヒトの細胞膜に分子を発現させる少なくとも１つのアミノ酸またはアミノ酸配列を含むことができる。例えば、ネズミとヒトのＣＤ１５４は両方ともＨｅＬａ細胞で発現される。しかしネズミＣＤ１５４はさらに多様な種類の細胞で発現される。これにはヒト細胞が含まれる。事実、典型的にはＣＤ１５４は、特にＣＬＬ細胞であるヒトＣＤ４０＋細胞のごときヒトＣＤ１５４を発現しないヒト細胞にて発現できる。ヒトとネズミのＣＤ１５４との間のこの差別的発現は解説されている。よって本発明の実施例によっては、ヒト分子の発現に関与するヒトＣＤ１５４のアミノ酸またアミノ酸配列を、非ヒト分子の発現に関与するネズミＣＤ１５４のアミノ酸またはアミノ酸配列と置換することは少なくとも部分的にこの問題に対処することができる。
【００５２】
従って本発明の１好適実施例においては、キメラＣＤ１５４ポリヌクレオチド配列は、ネズミおよびヒトの細胞によるネズミＣＤ１５４分子の発現に重要なネズミのＣＤ１５４の細胞外サブドメインをさらにエンコードする第１ヌクレオチド配列を含む。このように本発明の実施例によっては提供されるポリヌクレオチド配列は、典型的にはヒトＣＤ１５４を発現しないヒトＣＤ４０＋細胞を含む様々な細胞タイプで発現できるキメラＣＤ１５４をエンコードすることができる。この実施例はネズミＣＤ１５４の利用が関与するが、本発明の実施例によってはヒト細胞で発現できる非ヒトＣＤ１５４が利用できる。
【００５３】
さらに本発明の実施例によっては、ネズミＣＤ１５４の細胞外ドメインはキメラＣＤ１５４の発現の検出に関与するアミノ酸またはアミノ酸配列を含むことができる。なぜならそれはネズミＣＤ１５４限定抗体に結合するからである。このようにキメラＣＤ１５４ポリヌクレオチド配列の発言が、典型的にはＦＡＣＳまたは免疫組織化学によって検出可能であり、天然ヒトＣＤ１５４の発現とは区別される。
【００５４】
従って本発明の１好適実施例ではキメラＣＤ１５４ポリヌクレオチド配列は、抗ネズミＣＤ１５４抗体に結合することでキメラＣＤ１５４の発現を検出する非ヒトＣＤ１５４の細胞外サブドメインをさらにエンコードする第１ヌクレオチド配列を含む。
【００５５】
本発明の１好適実施例ではこの第１ヌクレオチド配列は、好適にはネズミである非ヒトＣＤ１５４のドメインＩＶのサブドメインをエンコードできる。他の配列も単独または組み合わせて利用できる。ネズミＣＤ１５４のサブドメインＩＶはヒトＣＤ１５４の開裂部位を置換し、ネズミおよびヒト細胞によるネズミ分子の発現に重要であると考えられ、本発明の実施例によってはキメラＣＤ１５４の検出に関与するアミノ酸配列を含む。さらに本発明の実施例によっては、この第１ヌクレオチド配列はドメインＩＩＩとドメインＩＶの境界に、または隣接して非ヒトＣＤ１５４のドメインＩＩＩのサブドメインをエンコードできる。本発明の実施例によっては、このサブドメインはヒトＣＤ１５４の開裂部位の一部を含む。
【００５６】
好適には実施例によっては、第１ヌクレオチド配列はさらにネズミＣＤ１５４のドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩをエンコードできる。なぜならこの構造はヒト細胞によるキメラＣＤ１５４の改善された発現をもたらすと考えられているからである。本発明の実施例によっては、第１ヌクレオチド配列はネズミＣＤ１５４のドメインＩＩＩまたはサブドメイン及び/又はネズミＣＤ１５４のドメインＩＩまたはサブドメイン及び/又はネズミＣＤ１５４のドメインＩまたはサブドメインをエンコードできる。
【００５７】
ＣＤ１５４および特殊ＣＤ１５４キメラＩＳＦ３５核酸およびタンパク質配列の作製法は知られており、米国特許願２００３/０２２０４７３（プルサク）および米国特許願２００５/００４８４７６にて解説されている。これらの内容を本明細書で援用する。
【００５８】
さらに本発明の実施例によっては、ＩＳＦ３５の細胞外ドメインは抗ＣＤ１５４抗体に結合し、そのリガンドの免疫活性効果を中和あるいは部分中和する少なくとも１つのアミノ酸またはアミノ酸配列を含むことができる。実施例によってはこのアミノ酸またはアミノ酸配列は好適には、ＣＤ４０であるＣＤ１５４の同属受容体に結合するＣＤ１５４の三次構造の領域と同一であるか実質的に類似する。ネズミＣＤ１５４は抗ＣＤ１５４抗体産生の観点では高い反応性を誘引すると考えられている。よってそれはヒトＣＤ１５４よりも抗Ｃ１５４抗体での結合または中和に対してさらに感受性が高く、ヒトにおけるネズミＣＤ１５４の反復投与に関わる長く続く問題を引き起こす。
【００５９】
１実施例では抗ＣＤ１５４抗体が結合する細胞外サブドメインをさらにエンコードするヒトＣＤ１５４の第２ヌクレオチド配列を含むＩＳＦ３５ポリヌクレオチド配列または類似構造物が提供される。このように本発明で提供されたポリヌクレオチド配列はヒトに投与すると免疫原性ではないタンパク質をエンコードする。
【００６０】
本発明はＩＳＦ３５または類似構造物を標的細胞内で発現できる本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターまたは他の遺伝構造物を想定する。
【００６１】
本発明で利用できる発現ベクターは、適した転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に機能的に連結するＩＳＦ３５または類似構造物をエンコードする、哺乳動物、微生物、ウィルスまたは昆虫の遺伝子由来のごときポリヌクレオチド配列を含む。このような調節配列は転写促進物質またはエンハンサのごとき遺伝子発現において調節の役割を担う配列と、転写を制御する機能配列と、メッセンジャＲＮＡ内でリボゾーム結合部位をエンコードする配列、および転写、翻訳開始または転写終了を制御する好適配列を有した配列を含む。
【００６２】
特に有用な調節配列には様々な哺乳動物、ウィルス、微生物および昆虫の遺伝子由来の促進物質領域が含まれる。この促進物質領域は本発明のＩＳＦ３５または類似構造物をエンコードするポリヌクレオチド配列を介在および含ませて転写の開始を指示する。有効な促進物質領域にはラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）エンハンサ/促進物質領域、ｌａｃ促進物質、アデノウィルス由来単離促進物質、および、真核生物、原核生物、ウィルスまたは微生物細胞で遺伝子発現に有効であることが知られる他の促進物質が含まれる。真核生物細胞内で遺伝子およびたんぱく質の発現に特に有効である他の促進物質には、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガウィルス、等々由来の哺乳動物細胞促進物質配列およびエンハンサ配列が含まれる。特に有効なものはウィルスの初期および後期促進物質であり、典型的にはＳＶ４０のごときウィルスでの複製のウィルス源に隣接して発見されるものである。当業者であれば理解しようが、特に有効な促進物質は、正確な細胞ラインと、特定細胞ライン内でポリヌクレオチド配列を発現するのに使用される遺伝構造物の他の様々なパラメータを考慮して選択される。
【００６３】
よって本発明が想定する特定の遺伝構造物は促進物質配列または促進物質とエンハンサ配列のいずれかに機能的に連結し、メッセンジャＲＮＡの終結とポリアデニル化を指示するポリアデニル化配列に機能的に連結するポリヌクレオチド配列を含む。好適にはこのポリヌクレオチド配列はＣＭＶ促進物質とウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を利用して構築されている。
（ＩＳＦ３５をエンコードする核酸または類似構造物の投与による癌治療）
【００６４】
癌の進行を治療または遅らせるためにＩＳＦ３５核酸（およびこれらの類似構造物）を癌患者に投与することができる。ポリヌクレオチド配列を生体内または対象者の身体内の特定細胞に導入するための方法はよく知られており、発現ベクターの使用と対象者への様々な遺伝構造物の直接注入が含まれる。典型的な利用形態では、本発明のポリヌクレオチド配列を含んだ発現ベクターを対象者の血液循環系または局部位に導入してベクターを所望細胞に選択的に感染させる。他の好適実施例ではベクターは、本発明のポリヌクレオチド配列が導入される細胞の少なくとも一部を含む対象者内の腫瘍床に直接注入される。
【００６５】
本発明は、ＩＳＦ３５をエンコードするポリヌクレオチド配列を含んだ遺伝構造物または類似構造物を動物またはヒトに直接注入する方法も想定し、含んでおり、追加的に促進物質およびポリアデニル化配列を含むこともできる。これら有用な方法については解説されている(Vile et al, Ann Oncol,5:59-65,1994)。遺伝構造物は動物またはヒトの筋肉または他の部位に直接注入されるか、あるいは対象者の腫瘍または腫瘍床に直接注入することもできる。
【００６６】
本発明は、エンコードされたＩＳＦ３５または類似構造物が腫瘍細胞の表面上で発現させるべく、腫瘍細胞に本発明のポリヌクレオチド配列を挿入するステップを含む腫瘍の治療方法にも関する。本発明は生体内および生体外両方でのヒト腫瘍の治療を想定している。
【００６７】
腫瘍治療の１好適方法において、本方法は先ず対象者から腫瘍細胞を採取するステップと、ＩＳＦ３５または類似構造物が腫瘍細胞の表面で発現させるべくそこに本発明のポリヌクレオチド配列を挿入するステップと、それら細胞を対象者に再投入するステップとをさらに含んでいる。当業者であれば理解しようが、対象者への変形腫瘍細胞の再投入には数々の方法が利用できる。
【００６８】
ＩＳＦ３５または類似構造物を利用して多くのタイプの癌を治療することができる。例示的な癌には、胸部癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、皮膚癌、膀胱癌、リンパ腫、口腔癌、咽頭癌、白血病、腎臓癌、すい臓癌、食道癌、直腸癌、気管支癌、胃癌があるがこれらに限られない。
【００６９】
ＩＳＦ３５または類似構造物を利用して治療できるさらに別の例示的癌のタイプには、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、星状膠細胞腫、基底細胞腫瘍、胆管癌、膀胱癌、骨肉腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、胸部癌、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、上皮癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、子宮頸癌、慢性リンパ球白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄性障害、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮体癌、上衣腫、食道癌、性腺外生殖細胞腫瘍、眼瞼扁平上皮癌、眼球内黒色腫、眼瞼扁平上皮癌、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、胃腸管腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍（頭蓋外）、生殖細胞腫瘍（性腺外）、生殖細胞腫瘍（卵巣性）、栄養膜腫瘍、グリオーマ、ヘアリー・セル白血病、頭頚部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路グリオーマ、眼球内メラノーマ、島細胞腫瘍（内分泌膵臓）、カポシ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（急性リンパ性）、白血病（急性骨髄性）、白血病（慢性リンパ性）、白血病（慢性骨髄性）、口唇および口腔癌、肝臓癌、肺癌（非小細胞）、肺癌（小細胞）、リンパ腫、（皮膚Ｔ細胞）、リンパ腫（非ホジキン）、骨の悪性腺維性組織球症/骨肉腫、神経髄芽細胞腫、メラノーマ、メルケル細胞癌、中皮腫、潜在原発性転移性扁平頚部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発骨髄腫/形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成/骨髄増多症、骨髄性白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖症候群、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫/骨の悪性腺維性組織球症、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞腫瘍、低悪性度卵巣腫瘍、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、松果体芽細胞腫および天幕上原始神経胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞新生物/多発骨髄腫、芽細胞腫、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、横紋筋腫、唾液腺癌、肉腫（カポシ）、肉腫（子宮）、セザール症候群、皮膚癌（非メラノーマ）、皮膚癌（メラノーマ）、皮膚癌（メルケル細胞）、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平細胞癌、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、睾丸癌、胸腺腫、甲状腺癌、栄養膜腫瘍、妊娠性、尿道癌、子宮癌、子宮内、子宮肉腫、膣癌、視覚路および視床下部グリオーマ、外陰癌、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、腎芽細胞腫、等が含まれるがこれらに限られない。
【００７０】
“化学療法剤”とは癌治療に有用な化合物である。“化学療法剤”としても解説される多様な化合物は、ＤＮＡ損傷を誘発するように機能する。これら全ての化合物はここで開示されている組み合わされた治療方法で利用されることが意図されている。
【００７１】
従って、ＩＳＦ３５治療を化学療法剤の投与と組み合わせることができる。例示的な化学療法治療には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５‐フロロウラシル、サイトシンアラビノサイド（“Ara-C”）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド、例：パクリタキセル（タキソール、ブリストルマイヤーズスクイブオンコロジー社、ニュージャージー州  プリンストン）、およびドセタキセル（タキソテール、ローヌプーランローラ社、フランス、アンソニー）、トキソテール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシンズ、エスペラミシンズ、メルファラン、アレムツジマブ、フルダラビン、クロラムブシル、リツキサン、等が含まれるがこれらに限られない。
【００７２】
化学療法剤の投与形態はその特定組成、治療される癌の種類、患者の状態およびその他の要素に基づく。一般的に投与物は経口、静脈内、または必要に応じてその他の方法で投与される。典型的な投与量は薬剤のタイプ、純度およびその他前述の要素に基づいて、約０．０１ｍｇ/ｍ2、０．１ｍｇ/ｍ2、１ｍｇ/ｍ2、５ｍｇ/ｍ2、１０ｍｇ/ｍ2、１００ｍｇ/ｍ2から約５００ｍｇ/ｍ2である。
【００７３】
フルダラビンの場合、注入のための典型的な投与量は約２５ｍｇ/ｍ2であり、５日連続で毎日約３０分間静脈内に投与される。治療の各５日間コースは約２８日毎に開始されるべきである。投与量は血液学的または非血液学的毒性の有無に基づいて減少または遅らせることができる。
【００７４】
アレムツジマブ治療は毎日２時間のＩＶ注入投与として、１投与量約３ｍｇで開始できる。毎日のアレムツジマブの３ｍｇ投与が耐えられれば（例：注入関連毒性は£グレード２）、毎日の投与量を約１０ｍｇに増量させることができ、限界まで継続する。１０ｍｇの投与量に耐えられれば、アレムツジマブ３０ｍｇの定量投与を開始できる。アレムツジマブの定量投与は典型的には約３０ｍｇ/日、一日おきに週３回投与し（すなわち月、水、金）、最長約１２週間である。ほとんどの患者では約３０ｍｇへの増量は約３日から７日で達成できる。週３回の約３０ｍｇの推薦定量投与への増量が多くの場合必要とされる。典型的には約３０ｍｇを超える量のアレムツジマブの単独投与、または週約９０ｍｇよりも多量の累積投与量は投与されない。多量の投与は汎血球減少症の発生率を増加させるからである。
【００７５】
化学療法剤クロラムブシルの投与は典型的には経口投与である。通常の経口投与量は毎日０．１ｍｇから０．２ｍｇ/ｋｇ体重であり、必要に応じて３週間から６週間である。平均的な患者ではこれは通常毎日４ｍｇから１０ｍｇである。１日の投与量を１回で投与することができる。
【００７６】
化学療法剤リツキシマブの典型的投与量は約３７５ｍｇ/ｍ2であり、ＩＶ注入により週１回、約４回から８回の投与である。この範囲は約５ｍｇ/ｍ2から約５００ｍｇ/ｍ2でよい。
【００７７】
別実施例ではＩＳＦ３５は、放射線治療及び/又は放射線治療と化学療法の組み合わせに対する癌感受性を増加させる。
【００７８】
本発明を以下の実施例でさらに詳細に解説する。これらの実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７９】
（アデノウィルス合成）
キメラＩＳＦ３５プラスミドは制限酵素ＮｒｕｌおよびＳｍａＩで消化され、ｐＣＤＮＡ３からのＣＭＶ促進物質、ＩＳＦ３５遺伝子およびｐＣＤＮＡ３からのポリアデニル化信号を含んだＤＮＡ断片を放出した。１％アガロースゲル上での消化されたＤＮＡの分離によるこの断片のゲル精製に続き、ＤＮＡ断片はアデノウィルスシャトルベクターＭＣＳ（ＳＫ）ｐＸＣＸ２のＥｃｏＲＶ部位へと連結された。このプラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔポリリンカー配列がＥｌ領域へとクローン化されているようにするためのプラスミドｐＸＣＸ２の変形である（J.R.Tozer, UCSD,未発行データ、１９９３年９月）。製造者の指示に従い、キメラＩＳＦ−ＭＣＳ（ＳＫ）ｐＸＣＸ２プラスミドの精製に引き続き、プロメガの燐酸カルシウムプロフェクションキットを用いて、５μｇのシャトルプラスミドが５μｇのＪＭ１７プラスミドと２９３ＡＣ２細胞に同時導入された。この導入に続き、相同組み換えとウィルス合成をもたらすようにそれら細胞を５日間培養した。全細胞と上澄みはその後採取され、３度凍結融解されて細胞関連アデノウィルスを放出した。
【００８０】
当初のウィルス生成に続き、プラーク精製によってウィルスのクローン単離物を得た。凍結融解されたウィルス上澄みは、テーブルトップ遠心分離機内で５分間、１０００ｒｐｍの遠心分離処理によって残骸を取り除かれた。６ウェル型組織培養プレート内で飽和密度を増加させた２９３ＡＣ２細胞をその後１時間から２時間、ウィルス上澄みの連続的希釈によって感染させた。この感染に続いて培地を吸引し、５６℃に維持された４％ウシ胎児血清と０．６５％アガロースを含んだＤＭＥＭ培地に細胞を塗布した。４日間から６日間の培養後、単離プラークを１ｍｌの培地に移して引き続きウィルス増殖のために利用した。
【００８１】
増加させた２９３ＡＣ２を連続感染させて大規模アデノウィルス生成を行なった。精製アデノウィルスをその後塩化セシウム濃度勾配工程で精製した。この方法では濃度勾配工程を介してウィルス粒子を濃縮させるために塩化セシウム濃度勾配を利用し、濃度は１．４５ｇ/ｃｍ3と１．２０ｇ/ｃｍ3であり、２９３ＡＣ２拡散ウィルスサンプルはＳＷ４０ロータ（ベックマン社、カリフォルニア州  ブレア）内で４℃、２５０００ｒｐｍで２時間遠心分離処理される。このウィルスバンドを２７ゲージ針と注射器で単離し、Ｇ−２５ＤＮＡグレードカラム（ファルマシア社、ニュージャージー州  ピスカタウェイ）を用いて脱塩処理した。このウィルスを、１０％グリセロールを含むリン酸塩緩衝生理食塩水で脱塩処理し、−７０℃で保管した。ウィルスの最終ウィルス価をアニオン交換ＨＰＬＣで決定した。
【実施例２】
【００８２】
（ＣＬＬ細胞とＨｅＬａ細胞内のキメラアクセサリ分子リガンド遺伝子の発現および機能）
ＨｅＬａへの効果的な遺伝子移転をもたらすリポゾームベーストランスフェクション試薬であるリポフェクタミン２０００（Ｇｉｂｃｏ‐ＢＲＬ）を用いてＩＳＦ−ｐｃＤＮＡ３プラスミドが過渡的に導入された。この導入に続いて２日間、細胞はフローサイトメトリーによるＩＳＦ３５の細胞表面発現のために分析された。培地を吸引し、分離溶液（１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ８）を追加することで付着細胞をウェルから分離した。この分離溶液を、トリプシン感応部位でのＩＳＦ３５の非特定開裂を防止するために普通のトリプシン化バッファの代わりに使用することで、発現の偽陰性評価を導くことが可能である。細胞をプレートから分離した後に、それら細胞をＦＡＣＳ染色バッファ（３％ＦＣＳおよび０．０５％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ組成物）内で１回洗浄し、ＦＡＣＳバッファ内で約１０．ｓｕｐ.７細胞/ｍｌへと再懸濁し、５×１０5（５０μｌ）細胞を９６ウェル型ｕ底プラスチックマイクロウェルプレート内で培養した。ＣＤ１５４のためのＰＥ結合抗体（抗体クローンＭＲ‐１、ファーミンゲン社）を４℃で３０分間追加した。その後細胞をＦＡＣＳバッファで２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファ内で再懸濁させ、データ取得のためにＦＡＣＳ管へ移動した。非特定抗体結合制御のため、全サンプルを適切なアイソトープコントロール抗体で染色した。さらに、ｌｏｎｇ/ｍｌヨウ化プロビジウムを全染色反応物へ追加して死滅細胞と残骸を分析物から排除した。ＦＡＣＳカリバーフローサイメトメトリー（ベクトン  ディッキンソン社）を用いてフローサイトメトリーによりＩＳＦ３５発現のために細胞を分析した。結果として、ＩＳＦ３５はＣＤ１５４特定抗体とで検出できる細胞表面リガンドとして発現され、全タンパク質三次構造が維持されたことを示している。
【実施例３】
【００８３】
（ＩＳＦ３５による胸部癌患者の治療）
胸部癌の患者を特定する。毎週患者に３×１０11ＩＳＦ３５ウィルス粒子を結節注入する。患者を月２回モニターする。この方法によって胸部癌の進行が遅延される。
【実施例４】
【００８４】
（化学療法剤との組み合わせによる、ＩＳＦ３５による肺癌患者の治療）
肺癌の患者を特定する。患者に１回の投与量２×１０10ＩＳＦ３５ウィルス粒子を鼻孔内エアゾール投与する。３日後、患者に２５ｍｇ/ｍ2のフルダラ注入物を１日３０分間、５日間静脈内投与する。５日間のフルダラ治療を２８日毎に繰り返す。患者を月２回モニターする。この方法によって肺癌の進行が遅延される。
【実施例５】
【００８５】
（化学療法剤リツキシマブとの組み合わせによる、ＩＳＦ３５による前立腺癌患者の治療）
前立腺癌の患者を特定する。患者に投与量１０×１０11ＩＳＦ３５ウィルス粒子を月１回注入する。１週間後、患者に週１回８回投与分のリツキサン注入物を３７５ｍｇ/ｍ2ＩＶ注入する。患者を毎週モニターする。この方法によって前立腺癌の進行が遅延される。
【実施例６】
【００８６】
（化学療法剤クロラムブシルとの組み合わせによる、ＩＳＦ３５によるＣＬＬ患者の治療）
ＣＬＬの患者を特定する。患者に投与量３×１０11ＩＳＦ３５ウィルス粒子を月１回注入する。１週間後、患者にクロラムブシル１０ｍｇ体重を毎日５週間、経口投与する。患者を毎週モニターする。この方法によってＣＬＬの進行が遅延される。
【００８７】
本発明をその好適実施例に関連して説明した。当業者であれば理解しようが、添付の「請求の範囲」に包含される本発明の範囲から逸脱せずにそれらの形態や細部を変更することができる。
【図１ａ】
2010511731.tif 000002
【図１ｂ】
2010511731.tif 000003
【図２−１】
2010511731.tif 000004
【図２−２】
2010511731.tif 000005
【図３−１】
2010511731.tif 000006
【図３−２】
2010511731.tif 000007
【配列表】
2010511731000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月10日(2009.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
効果量の化学療法剤の投与に先立って投与するための効果量のＩＳＦ３５を含有する治療剤であって、ＩＳＦ３５を投与する前よりも癌の前記化学療法剤に対する感受性を高めることを特徴とする治療剤。
【請求項２】
癌は耐性癌であることを特徴とする請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
ＩＳＦ３５は化学療法剤の投与に先立って投与されることを特徴とする請求項１記載の治療剤。
【請求項４】
ＩＳＦ３５は化学療法剤と略同時的に投与されることを特徴とする請求項１記載の治療剤。
【請求項５】
化学療法に対する患者の癌の感受性を高める方法であって、化学療法を前記患者に対して適用する前にＩＳＦ３５を前記患者に投与することを特徴とする治療剤。
【請求項６】
ＩＳＦ３５は化学療法剤の投与後に投与されることを特徴とする請求項１記載の治療剤。
【請求項７】
放射線治療に対する感受性を高めるための効果量のＩＳＦ３５を含有する治療剤であって治療剤であって、患者に対して放射線治療を適用する前にＩＳＦ３５を前記患者に投与することを特徴とする治療剤。
【請求項８】
ＩＳＦ３５は略１×１０5から略１×１０12のウィルス粒子の投与量で投与されることを特徴とする請求項１記載の治療剤。
【請求項９】
癌は、胸部癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、皮膚癌、膀胱癌、リンパ腫、口腔癌、咽頭癌、白血病、腎臓癌、すい臓癌、食道癌、直腸癌、気管支癌、胃癌で成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の治療剤。
【請求項１０】
化学療法剤は、フダラビン、アレムツジマブ、クロラムブシルおよびリツキシマブで成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の治療剤。
【請求項１１】
放射線も患者に適用されることを特徴とする請求項１記載の治療剤。
【請求項１２】
癌患者の治療剤であって、前記患者に対して効果量の化学療法剤の投与に先立って前記患者に対して効果量のキメラＣＤ１５４ポリペプチドまたはそれをエンコードする核酸を含有する治療剤を投与することで、キメラＣＤ１５４ポリペプチドを前記患者に投与する前よりも癌の前記化学療法剤に対する感受性を高めることを特徴とする治療剤。
【請求項１３】
癌患者の治療剤であって、前記患者に効果量の化学療法剤を投与する前にキメラＣＤ１５４ポリペプチドまたはそれをエンコードする核酸を含有する治療剤を投与することで、該患者に対してキメラＣＤ１５４ポリペプチドを投与する前よりも癌の前記化学療法剤に対する感受性を高めることを特徴とする治療剤。
【国際調査報告】
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