(57)【要約】  本発明は、セリンプロテアーゼ カリクレイン７の結晶構造および創薬における該結晶構造の使用に関する。本発明はまた、カリクレイン７のこの活性部位に特異的に結合する化合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表３の構造座標により特徴付けられる３次元構造を有する結合ポケットを含む、ヒトカリクレイン７の結晶。
【請求項２】
共結晶化リガンドをさらに含む、請求項１記載の結晶。
【請求項３】
請求項１または２記載の結晶の構造座標を含むコンピューター可読データでコード化されたデータ記憶材料を含む、コンピューター可読媒体。
【請求項４】
結晶構造データの作成のための、請求項１または２記載の結晶の使用。
【請求項５】
カリクレイン７に結合するリガンドの同定方法であって、
（ｉ）請求項４で作成された３次元構造データを用いて、カリクレイン７に結合する可能性のあるリガンドを選択および／または設計する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）で選択された可能性のあるリガンドのうち、インビトロ、インビボまたは細胞ベースのアッセイにおいてカリクレイン７に結合するリガンドを同定する工程
を含む、方法。
【請求項６】
表３の構造座標により特徴付けられる３次元構造を有する結合ポケットにおいて結合することを特徴とする、カリクレイン７のモジュレーター。
【請求項７】
式：
【化１】
2010532162.tif 000148
［式中、
Ｒ１は、水素、シアノ、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ２−８）アルケニル、（Ｃ２−８）アルキニル、ハロゲン、（Ｃ１−８）アルキルアミノ、（Ｃ１−８）アルキルアミノ（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルコキシ、またはハロ（Ｃ１−８）アルキルであり、
Ｘは、ＣＨ＝ＣＨ、ＮＨ、Ｎ＝ＣＨ、ＯまたはＳであり、
Ｙは、式
【化２】
2010532162.tif 000149
｛式中、
−Ｎ含有環系は、所望により、（Ｃ３−８）シクロアルキル、（Ｃ６−１８）アリールまたは５ないし６環員およびＮ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルと環形成（annelated）していてよく、
−ｎは、１、２または３であり、
−Ｒ２は、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルキルアミノ、（Ｃ１−８）アルキルアミノ（Ｃ１−８）アルキル、ジ（Ｃ１−８）アルキルアミノ（Ｃ１−８）アルキル、ハロ（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルコキシ、（Ｃ１−８）アルコキシ（Ｃ１−８）アルキル、または基（ＣＨ２）ｍ−Ｚ（ここで、Ｚは、非置換または置換の、（Ｃ３−８）シクロアルキル、（Ｃ６−１８）アリールまたは５ないし６環員およびＮ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルであり、ｍは、０、１または２である）であり、
−Ｒ３は、水素、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルコキシ、（Ｃ６−１８）アリールまたは５ないし６環員およびＮ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルである｝の基である］
で示される化合物であることを特徴とする、請求項６記載のカリクレイン７のモジュレーター。
【請求項８】
Ｒ１が、水素、エチニル、クロロまたはブロモであり、
Ｘが、ＣＨ＝ＣＨまたはＳであり、
Ｙが、式（ＩＩ）｛式中、
−Ｎ含有環系が、所望より、シクロプロピル、シクロペンチルまたはフェニルと環形成（annealed）していてよく、
−ｎが、１または２であり、
−Ｒ２が、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−４）アルキルアミノ（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルコキシ、（Ｃ１−４）アルコキシ（Ｃ１−４）アルキルまたは基（ＣＨ２）ｍ−Ｚ（ここで、Ｚが、非置換シクロヘキシル、非置換フェニル、（Ｃ１−４）アルコキシで置換されたフェニル、６環員およびＮ、Ｏから選択される１または２個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルで置換されたフェニル、または６環員およびＮ、Ｏから選択される１または２個のヘテロ原子を有する非置換もしくは置換ヘテロシクリルであり；
−ｍが、１または２であり、
−Ｒ３が、水素または（Ｃ１−４）アルコキシである｝の基である、
請求項７記載の化合物。
【請求項９】
Ｙが、式（ＩＩ）｛式中、
−Ｎ含有環系が、所望により、シクロプロピル、シクロペンチルまたはフェニルと環形成（annealed）していてよく、
−Ｒ２が、メチル、ジメチルアミノエチル、メトキシエチル、または基（ＣＨ２）ｍ−Ｚ（ここで、Ｚは、非置換シクロヘキシル；非置換フェニル；メトキシ、ピペラジニルもしくはモルホリニルで置換されたフェニル；ピリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロフラニル、非置換ピペラジニルまたはメチルもしくはフェニルで置換されたピペラジニルである）であり、
そして、ｍ、ｎ、Ｒ１、Ｒ３およびＸは、請求項７または８に定義の通りである。｝の基である、
請求項７または８記載の化合物。
【請求項１０】
塩形態の、請求項７または９記載の化合物。
【請求項１１】
医薬として用いるための、請求項７ないし１０のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１２】
少なくとも１個の薬学的賦形剤と共に請求項７ないし１０のいずれか一項記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
カリクレイン−７活性により仲介される障害の処置方法であって、有効量の請求項７ないし１０のいずれか一項記載の化合物を、かかる処置を必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
カリクレイン−７活性により仲介される障害の処置のための医薬の製造を目的とした、請求項７ないし１０のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１５】
カリクレイン−７活性により仲介される障害が、ケロイド、肥厚性瘢痕、アクネ、アトピー性皮膚炎、乾癬、膿疱性乾癬、酒さ、ネザートン症候群のような炎症性および／または過増殖性および掻痒性皮膚疾患、または結節性痒疹、高齢者の詳細不明の掻痒のような他の掻痒性皮膚病、ならびに老齢皮膚、炎症性腸疾患およびクローン疾患のような上皮性バリア機能障害を含む他の疾患、ならびに膵炎、または癌、特に卵巣癌からなる群から選択される、請求項１４記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、セリンプロテアーゼ カリクレイン７の結晶構造、および創薬におけるこの結晶構造の使用に関する。本発明はまた、カリクレイン７のこの活性部位に特異的に結合する化合物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
カリクレイン７は、キモトリプシン様活性を示すカリクレイン遺伝子ファミリーのＳ１セリンプロテアーゼである。ヒトカリクレイン７（ｈＫ７、ＫＬＫ７または角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）、Swissprot P49862）は、主に皮膚で発現され、皮膚生理学において重要な役割を果たすと考えられている（１、２、３）。ｈＫ７は、落屑過程において、角化扁平上皮細胞の細胞間粘着構造の分解に関与する。落屑過程は、よく制御され、角質のデノボ産生で微妙な均衡を保ち、角質層の一定の厚さを維持している。この観点において、ｈＫ７は、角質デスモソームタンパク質である角質デスモシンおよびデスモコリン１を切断し得ることが報告されている（４、５、６）。さらに、近年、２種の脂質プロセシング酵素であるβ−グルコセレブロシダーゼおよび酸性スフィンゴミエリナーゼがｈＫ７により分解され得ることが示された（７）。両脂質プロセシング酵素は、それらの基質であるグルコシルセラミドおよびスフィンゴミエリンと共に分泌され、これらの極性脂質前駆体をそれらのより非極性の産物、例えばセラミドに変化させ、それはその後、細胞外層膜に挿入される。該層膜構造は、機能的皮膚バリアに重要である。最後に、ｈＫ７は、炎症性サイトカイン プロ−インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）を活性化すること（８）、および多様な微生物病原体に対する感染を予防するための重要な防御機構を制御するカセリシジン（cathelicidine）（ｈＣＡＰ１８）を活性化（不活性化）すること（３４）が示されている。
【０００３】
最近の研究が、ｈＫ７の増大活性と、アトピー性皮膚炎、乾癬またはネザートン症候群のような炎症性皮膚疾患を関連付ける。増大したｈＫ７活性は、制御を失った落屑をもたらす角質デスモソームの無制御の分解、破壊された層膜構造または炎症性サイトカインＩＬ−１βもしくはカセリシジンｈＣＡＰ１８の無制御の活性化（不活性化）をもたらす脂質プロセシング酵素の増強された分解を導き得る。最終的には、損傷した皮膚バリア機能および炎症が導かれ得る（ＷＯ−Ａ−２００４／１０８１３９も参照）。
【０００４】
ｈＫ７活性は、いくつかのレベルで制御される。種々の因子が、炎症性皮膚疾患における増大したｈＫ７活性に関与し得る。第一に、発現されるプロテアーゼの量は、遺伝因子によって影響を受け得る。かかる遺伝的つながりであるｈＫ７遺伝子の３’−ＵＴＲにおける多形が近年報告された（９）。当該著者は、カリクレイン７遺伝子の３’−ＵＴＲに記載の４塩基対の挿入が、ｈＫ７ ｍＲＮＡを安定化し、その結果ｈＫ７の過剰発現をもたらすと仮定している。第二に、ｈＫ７は、層状体経由で角質層細胞外スペースへ酵素前駆体として分泌され、それが自己活性化し得ないために、別のプロテアーゼ、例えばカリクレイン５によって活性化される必要がある（５）。かかる活性化酵素の無制御の活性は、ｈＫ７の過剰発現をもたらし得る。第三に、活性化ｈＫ７は、ＬＥＫＴＩ、ＡＬＰまたはエラフィンのような天然の阻害剤により阻害され得る（１０、１１）。かかる阻害剤の減少した発現または欠失は、ｈＫ７の増強した活性をもたらし得る。近年、ＬＥＫＴＩをコード化するspink5遺伝子における変異が、ネザートン症候群の原因となること（１２）、および当該遺伝子における単一点変異が、アトピー性皮膚炎に関与すること（１３、１４）が見出された。最後に、ｈＫ７の活性を制御する別のレベルは、ｐＨである。ｈＫ７は、中性ないしわずかにアルカリ性の至適ｐＨを有し（２）、皮膚の最内層から最外層までは中性ないし酸性のｐＨ勾配がある。石けんのような環境因子は、角質層の最外層でｈＫ７の至適ｐＨの方へｐＨを増大させ、故にｈＫ７活性を増大し得る。
【０００５】
増大したｈＫ７の活性が炎症性皮膚疾患に関与するという仮定は、以下の研究により支持される：第一に、ネザートン症候群患者は、セリンプロテアーゼ活性の表現型依存的増大、角質デスモソームの減少、脂質プロセシング酵素β−グルコセレブロシダーゼおよび酸性スフィンゴミエリナーゼの減少、および損傷したバリア機能を示す（１５、１６）。第二に、ヒト カリクレイン７を過剰発現するトランスジェニックマウスは、アトピー性皮膚炎を有する患者で見られるのと同様の皮膚表現型を示す（１７、１８、１９）。第三に、アトピー性皮膚炎および乾癬患者の皮膚において、ｈＫ７の増大したレベルが既報であった（１７、２０）。
【０００６】
故に、ｈＫ７は、アトピー性皮膚炎、乾癬またはネザートン症候群のような炎症性皮膚疾患の処置のための可能性のある標的であると考えられ、その特異的モジュレーター（アゴニストまたは阻害剤）が必要とされている。
【０００７】
この必要性を満たすために、本発明者らは、ｈＫ７のクローニング、発現、精製および結晶化の方法を開発し、初めて、ヒト カリクレイン７の構造を非常に高解像度で得ることに成功した。
【０００８】
このヒト カリクレイン７の高解像度の構造は、当該酵素の活性部位の同定、およびカリクレイン７の該活性部位に特異的に結合する化合物の同定を可能にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
文献
1  Skytt A., Stromqvist M. and Egelrud T. (1995) Primary substrate specificity of recombinant human stratum corneum chymotryptic enzyme. Biochem Biophys Res Commun 211, 586−589.
2  Egelrud T. (1993) Purification and preliminary characterization of stratum corneum chymotryptic enzyme: a proteinase that may be involved in desquamation. J. Invest. Dermatol. 101, 200−204.
3  Yousef G.M., Scorilas A., Magklara A., Soosaipillai A. and Diamandis E.P. (2000) The KLK7 (PRSS6) gene, encoding for the stratum corneum chymotryptic enzyme is a new member of the human kallikrein gene family−genomic characterization, mapping, tissue expression and hormonal regulation. Gene 254, 119−128.
4  Simon M., Jonca N., Guerrin M., Haftek M., Bernard D., Caubet C., Egelrud T., Schmidt R. and Serre G. (2001) Refined characterization of corneodesmosin proteolysis during terminal differentiation of human epidermis and its relationship to desquamation. J. Biol. Chem. 276(23), 20292−20299.
5  Caubet C., Jonca N., Brattsand M., Guerrin M., Bernard D., Schmidt R., Egelrud T., Simon M. and Serre G. (2004) Degradation of corneodesmosome proteins by two serine proteases of the kallikrein family, SCTE／KLK5／hK5 and SCCE／KLK7／hK7. J. Invest. Dermatol. 122, 1235−1244.
6  Brattsand M., Stefansson K., Lundh C., Haasum Y. and Egelrud T. (2005) A proteolytic cascade of kallikreins in the stratum corneum. J. Invest. Dermatol. 124(1),198−203.
7  Hachem J.P., Man M.Q., Crumrine D., Uchida Y., Brown B.E., Rogiers V., Roseeuw D., Feingold K.R. and Elias P.M. (2005) Sustained serine proteases activity by prolonged increase in pH leads to degradation of lipid processing enzymes and profound alterations of barrier function and stratum corneum integrity. J. Invest. Dermatol. 125(3),510−520.
8  Nylander−Lundqvist E. and Egelrud T. (1997) Formation of active IL−1β from pro−IL−1β catalyzed by stratum corneum chymotryptic enzyme in vitro. Acta Derm. Venereol. 77(3), 203−206.
9  Vasilopoulos Y., Cork M.J., Murphy R., Williams H.C., Robinson D.A., Duff G.W., Ward S.J. and Tazi−Ahnini R. (2004) Genetic association between an AACC insertion in the 3'UTR of the stratum corneum chymotryptic enzyme gene and atopic dermatitis. J. Invest. Dermatol. 123, 62−66.
【００１０】
10  Schechter N.M., Choi E.J., Wang Z.M., Hanakawa Y., Stanley J.R., Kang Y., Clayman G.L. and Jayakumar A. (2005) Inhibition of human kallikreins 5 and 7 by the serine protease inhibitor lympho−epithelial Kazal−type inhibitor (LEKTI). Biol. Chem. 386, 1173−1184.
11  Franzke C.W., Baici A., Bartels J., Christophers E. and Wiedow O. (1996) Antileukoprotease inhibits stratum corneum chymotryptic enzyme−Evidence for a regulative function in desquamation. J. Biol. Chem. 271, 21886−21890.
12  Descargues P., Deraison C., Bonnart C., Kreft M., Kishibe M., Ishida−Yamamoto A., Elias P., Barrandon Y., Zambruno G., Sonnenberg A. and Hovnanian A. (2005) Spink5−deficient mice mimic Netherton syndrome through degradation of desmoglein 1 by epidermal protease hyperactivity. Nat. Genet. 37(1), 56−65.
13  Walley A.J., Chavanas S., Moffatt M.F., Esnouf R.M., Ubhi B., Lawrence R., Wong K., Abecasis G.R., Jones E.Y., Harper J.I., Hovnanian A. and Cookson W.O. (2001) Gene polymorphism in Netherton and common atopic disease. Nat. Genet. 29(2), 175−178.
14  Nishio Y., Noguchi E., Shibasaki M., Kamioka M., Ichikawa E., Ichikawa K., Umebayashi Y., Otsuka F. and Arinami T. (2003) Association between polymorphisms in the SPINK5 gene and atopic dermatitis in the Japanese. Genes Immun. 4(7), 515−517.
15  Descargues P., Deraison C., Prost C., Fraitag S., Mazereeuw−Hautier J., D'Alessio M., Ishida−Yamamoto A., Bodemer C., Zambruno G. and Hovnanian A. (2006) Corneodesmosomal cadherins are preferential targets of stratum corneum trypsin− and chymotrypsin−like hyperactivity in Netherton syndrome. J. Invest. Dermatol. 126(7), 1622−1632.
16  Hachem J.P., Wagberg F., Schmuth M., Crumrine D., Lissens W., Jayakumar A., Houben E., Mauro T.M., Leonardsson G., Brattsand M., Egelrud T., Roseeuw D., Clayman G.L., Feingold K.R., Williams M.L., Elias P.M. (2006) Serine protease activity and residual LEKTI expression determine phenotype in Netherton syndrome. J. Invest. Dermatol. 126(7), 1609−1621.
17  Hansson L., Baeckman A., Ny A., Edlund M., Ekholm E., Hammarstroem B.E., Toernell J., Wallbrandt P., Wennbo H.,  and Egelrud T. (2002) Epidermal Overexpression of Stratum Corneum Chymotryptic Enzyme in Mice: A Model for Chronic Itchy Dermatitis, J. Invest. Dermatol. 118, 444−449.
18  Ny A. and Egelrud T. (2003) Transgenic mice over−expressing a serine protease in the skin: evidence of interferon gamma−independent MHC II expression by epidermal keratinocytes. Acta Derm. Venereol. 83, 322−327.
19  Ny A. and Egelrud T. (2004) Epidermal hyperproliferation and decreased skin barrier function in mice overexpressing stratum corneum chymotryptic enzyme. Acta Derm. Venereol. 84, 18−22.
20  Ekholm E. and Egelrud T. (1999) Stratum corneum chymotryptic enzyme in psoriasis. Arch. Dermatol. Res. 291(4), 195−200.
21  Otwinowski, Z. and Minor, W. (1997) Processing of X−ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology, 276, C.W. Carter, Jr. and R.M. Sweet, Eds., Academic Press.
22  Kabsch W. (1993) Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. App. Cryst. 26, 795−800.
【００１１】
23  Kroemer M., Dreyer M.K. and Wendt K.U. (2004) APRV−a program for automated data processing, refinement and visualization. Acta Cryst. D60, 1679−82.
24  Vagin A., and Teplyakov A. (1997) MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022−1025.
25  Laxmikanthan G., Blaber S.I., Bernett M.J., Scarisbrick I.A., Juliano M.A. and Blaber M. (2005) 1.70 Å X−ray structure of human apo kallikrein 1: structural changes upon peptide inhibitor／substrate binding. Proteins 58(4), 802−814.
26  Bruenger A.T., Adams P.D., Clore G.M., DeLano W.L., Gros P., Grosse−Kunstleve R.W., Jiang J.−S., Kuszewski J., Nigles M., Pannu N.S., Read R.J., Rice L.M., Simonson T. and Warren G.L. (1998) Crystallography ＆ NMR System: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Cryst., D54, 905−921.
27  Johns T.A., Zou J.Y., Cowan S.W. and Kjeldgaard M. (1991) Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Cryst., A47, 110−119.
28  Engh R.A. and Huber R. (1991) Accurate bond and angle parameters for X−ray protein structure refinement. Acta Cryst. A47, 392−400.
29  Laskowski R.A., MacArthur M.W., Moss D.S. and Thornton J.M. (1993) PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst. 26, 238−291.
30  Birktoft J.J., Kraut J. and Freer S.T. (1976) A detailed structural comparison between the charge relay system in chymotrypsinogen and in alpha−chymotrypsin. Biochemistry 15(20), 4481−5.
31  Bernett M.J., Blaber S.I., Scarisbrick I.A., Dhanarajan P., Thompson S.M. and Blaber M. (2002) Crystal structure and biochemical characterization of human kallikrein 6 reveals that a trypsin−like kallikrein is expressed in the central nervous system. J. Biol. Chem. 277(27), 24562−24570.
32  Kishi T.,  Kato M.,  Shimizu T.,  Kato K.,  Matsumoto K.,  Yoshida S.,  Shiosaka S.,  Hakoshima T.  (1999) Crystal structure of neuropsin, a hippocampal protease involved in kindling epileptogenesis.  J. Biol. Chem.  274, 4220−4224.
33  Debela M., Magdolen V., Schechter N., Valachova M., Lottspeich F., Craik C.S., Choe Y., Bode W. and Goettig P. (2006) Specificity profiling of seven human tissue kallikreins reveals individual subsite preferences. J. Biol. Chem. E−PUB.
34  Yamasaki K., Schauber J., Coda A., Lin H., Dorschner R.A., Schechter N.M., Bonnart C., Descargues P., Hovnanian A. and Gallo R.L. (2006) Kallikrein−mediated proteolysis regulates the antimicrobial effects of cathelicidins in skin. FASEB J. 2006 Oct;20(12):2068−80.
【発明の概要】
【００１２】
発明の概要
上記の必要性を満たすために、本発明者らは、ｈＫ７のクローニング、発現、精製および結晶化の方法を開発し、初めて、ヒト カリクレイン７の構造を非常に高解像度で得ることに成功した。
【００１３】
得られたヒト カリクレイン７の高解像度の構造は、当該酵素の活性部位の同定、およびカリクレイン７の該活性部位に特異的に結合する化合物の同定を可能にする。本発明者らはさらに、これらの化合物が、カリクレイン７に対してモジュレーター作用を有することを確認することができた。
【００１４】
故に、本発明は、以下の表３の構造座標により特徴付けられる３次元構造を有する結合ポケットを含むヒト カリクレイン７の結晶に関する。この結晶はまた、共結晶化リガンドを含み得る。
【００１５】
本発明はまた、本発明の結晶の構造座標を含むコンピューター可読データでコード化されたデータ記憶材料を含むコンピューター可読媒体、ならびに結晶構造データの作成のためのこの結晶の使用に関する。
【００１６】
本発明の別の態様は、カリクレイン７に結合するリガンドの同定方法であって、本方法は、（ｉ）本発明で作成した３次元構造データを用いて、カリクレイン７に結合する可能性のあるリガンドを選択および／または設計する工程、および（ｉｉ）工程（ｉ）で選択された可能性のあるリガンドのうち、インビトロ、インビボまたは細胞ベースのアッセイにおいてカリクレイン７に結合するリガンドを同定する工程を含む。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、表３の構造座標により特徴付けられる３次元構造を有する結合ポケットに結合することを特徴とするカリクレイン７のモジュレーターに関する。このカリクレイン７のモジュレーターは、式
【化１】
2010532162.tif 000002
［式中、
Ｒ１は、水素、シアノ、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ２−８）アルケニル、（Ｃ２−８）アルキニル、ハロゲン、（Ｃ１−８）アルキルアミノ、（Ｃ１−８）アルキルアミノ（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルコキシ、またはハロ（Ｃ１−８）アルキルであり、
Ｘは、ＣＨ＝ＣＨ、ＮＨ、Ｎ＝ＣＨ、ＯまたはＳであり、
【００１８】
Ｙは、式
【化２】
2010532162.tif 000003
｛式中、
−Ｎ含有環系は、所望により、（Ｃ３−８）シクロアルキル、（Ｃ６−１８）アリールまたは５ないし６環員およびＮ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルと環形成（annelated）していてよく、
−ｎは、１、２または３であり、
−Ｒ２は、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルキルアミノ、（Ｃ１−８）アルキルアミノ（Ｃ１−８）アルキル、ジ（Ｃ１−８）アルキルアミノ（Ｃ１−８）アルキル、ハロ（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルコキシ、（Ｃ１−８）アルコキシ（Ｃ１−８）アルキル、または基（ＣＨ２）ｍ−Ｚ（ここで、Ｚは、非置換または置換の、（Ｃ３−８）シクロアルキル、（Ｃ６−１８）アリールまたは５ないし６環員およびＮ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルであり、ｍは、０、１または２である）であり、
−Ｒ３は、水素、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルコキシ、（Ｃ６−１８）アリールまたは５ないし６環員およびＮ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルである｝の基である］
で示される化合物であり得る。
【００１９】
特に、このモジュレーターは、
Ｒ１が、水素、エチニル、クロロまたはブロモであり、
Ｘが、ＣＨ＝ＣＨまたはＳであり、
Ｙが、式（ＩＩ）の基｛式中、
−Ｎ含有環系が、所望により、シクロプロピル、シクロペンチルまたはフェニルと環形成（annelated）していてよく、
−ｎが１または２であり、
−Ｒ２が、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−４）アルキルアミノ（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルコキシ、（Ｃ１−４）アルコキシ（Ｃ１−４）アルキルまたは基（ＣＨ２）ｍ−Ｚ（ここで、Ｚは、非置換シクロヘキシル、非置換フェニル、（Ｃ１−４）アルコキシにより置換されたフェニル、６環員およびＮ、Ｏから選択される１もしくは２個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルにより置換されたフェニル、または非置換もしくは置換の、６環員およびＮ、Ｏから選択される１もしくは２個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルであり、ｍが１または２である）であり、
−Ｒ３が、水素または（Ｃ１−４）アルコキシである｝
である化合物であり得る。
【００２０】
かかるモジュレーターの別の態様において、Ｙは、式（ＩＩ）｛式中、
−Ｎ含有環系が、所望によりシクロプロピル、シクロペンチルまたはフェニルと環形成（annelated）していてよく、
−Ｒ２が、メチル、ジメチルアミノエチル、メトキシエチルまたは基（ＣＨ２）ｍ−Ｚ（ここで、Ｚは、非置換シクロヘキシル、非置換フェニル、メトキシ、ピペラジニルもしくはモルホリニルにより置換されたフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロフラニル、非置換ピペラジニルまたはメチルもしくはフェニルにより置換されたピペラジニルであり、そしてｍ、ｎ、Ｒ１、Ｒ３およびＸは、上記に定義の通りである｝
の基であり得る。
【００２１】
本発明の化合物は、塩形態であってよく、そして／または医薬としての使用のためのものであり得る。故に、本発明はまた、少なくとも１種の薬学的賦形剤と共に上記の化合物を含む医薬組成物、およびカリクレイン−７活性により仲介される障害の処置方法であって、有効量の本発明の化合物をかかる処置を必要とする対象に投与することを含む方法にも関する。
【００２２】
本発明によれば、カリクレイン−７活性により仲介される障害は、ケロイド、肥厚性瘢痕、アクネ、アトピー性皮膚炎、乾癬、膿疱性乾癬、酒さ、ネザートン症候群のような炎症性および／または過増殖性および掻痒性皮膚疾患、または結節性痒疹、高齢者の詳細不明の掻痒のような他の掻痒性皮膚病、ならびに老齢皮膚、炎症性腸疾患およびクローン疾患のような上皮性バリア機能障害を含む他の疾患、ならびに膵炎、または癌、特に卵巣癌からなる群から選択され得る。
【００２３】
発明の詳細な説明
【表１】
2010532162.tif 000004
【００２４】
カリクレイン７は、キモトリプシン様活性を提示するカリクレイン遺伝子ファミリーのＳ１セリンプロテアーゼである。ヒト カリクレイン７（ｈＫ７、ＫＬＫ７または角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）、Swissprot P49862）は、皮膚生理学において重要な役割を果たす（１、２、３）。
【００２５】
本発明は、以下の表３の構造座標により特徴付けられる３次元構造を有する結合ポケットを含むヒト カリクレイン７の結晶を提供する。本発明はまた、本発明の結晶の構造座標を含むコンピューター可読データでコード化されているデータ記憶材料を含むコンピューター可読媒体、および結晶構造データの作成のためのこの結晶の使用を提供する。さらに、本発明は、カリクレイン７に結合するリガンドの同定方法であって、（ｉ）本発明で作成した３次元構造データを用いて、カリクレイン７に結合する可能性のあるリガンドを選択および／または設計する工程、および（ｉｉ）工程（ｉ）で選択された可能性あるリガンドのうち、インビトロ、インビボまたは細胞ベースのアッセイにおいて、カリクレイン７に結合するリガンドを同定する工程を含む方法を提供する。本発明のカリクレイン７のモジュレーターは、表３の構造座標により特徴付けられる３次元構造を有する結合ポケットに結合することを特徴とし、式
【化３】
2010532162.tif 000005
［式中、
Ｒ１は、水素、シアノ、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ２−８）アルケニル、（Ｃ２−８）アルキニル、ハロゲン、（Ｃ１−８）アルキルアミノ、（Ｃ１−８）アルキルアミノ（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルコキシ、またはハロ（Ｃ１−８）アルキルであり、
Ｘは、ＣＨ＝ＣＨ、ＮＨ、Ｎ＝ＣＨ、ＯまたはＳであり、
【００２６】
Ｙは、式
【化４】
2010532162.tif 000006
｛式中、
−Ｎ含有環系は、所望により、（Ｃ３−８）シクロアルキル、（Ｃ６−１８）アリール、または５ないし６環員およびＮ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルと環形成（annelated）していてよく、
−ｎは、１、２または３であり、
−Ｒ２は、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルキルアミノ、（Ｃ１−８）アルキルアミノ（Ｃ１−８）アルキル、ジ（Ｃ１−８）アルキルアミノ（Ｃ１−８）アルキル、ハロ（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルコキシ、（Ｃ１−８）アルコキシ（Ｃ１−８）アルキル、または基（ＣＨ２）ｍ−Ｚ（ここで、Ｚは、非置換または置換の、（Ｃ３−８）シクロアルキル、（Ｃ６−１８）アリールまたは５ないし６環員およびＮ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルであり、ｍは、０、１または２である）であり、
−Ｒ３は、水素、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルコキシ、（Ｃ６−１８）アリールまたは５ないし６環員およびＮ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルである｝の基である］
の化合物であり得る。
【００２７】
本発明の結晶は、好ましくは斜方晶系空間群Ｐ２１２１２１（三斜晶系）に属する。該結晶は、非対称ユニット当たり１分子を有する。
【００２８】
結晶化に用いられる条件によって、単位格子を特徴付けるパラメーターは、制限された範囲内で、少なくとも解像度の範囲内で変化し得る。Ｘ線結晶学の解像度は、典型的に≦５Åであり、本明細書に記載の精製手段により、≦２Åの解像度が達成され得るような高い内部秩序を有する結晶を提供することが可能である。
【００２９】
用語“単位格子”は、基本形ブロックを意味する。結晶の全体積は、かかるブロックの規則的集合により構成され得る。各単位格子は、結晶を構成する単位の繰り返しであるパターン単位の完全な表現を含む。
【００３０】
本発明の用語“空間群”は、結晶の対称要素の配列を意味する。
【００３１】
用語“構造座標”または“原子座標”は、ｈＫ７を含む結晶の原子によるＸ線の単色ビームの回折により得られたパターン（散乱中心）と関係する数学的方程式から導かれる数学的座標を意味する。回折データは、結晶の繰り返し単位の電子密度マップを計算するために用いられる。電子密度マップは、結晶の単位格子内の個々の原子の位置を確立するために用いられる。ｈＫ７の構造座標は、表３に見出され得る。
【００３２】
カリクレイン７の“断片”は、カリクレイン７の配列の５０％を上回って連続したアミノ酸配列を含む。
【００３３】
本明細書で用いる、その配列の“相同体”は、最適アライメントを行うとき、対応する配列と少なくとも７０％同一性、好ましくは８０％同一性、より好ましくは９０％同一性、さらにより好ましくは９５％同一性を共有する。比較ウインドウを決定するための配列の最適アライメントは、Smith and Waterman（J. Theor. Biol., 91 (2) pgs. 370−380 (1981)）の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch（J. Miol. Biol., 48(3) pgs. 443−453 (1972)）の相同性アライメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman（PNAS, USA, 85(5) pgs. 2444−2448 (1988)）の方法による類似性の探索により、またはこれらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetic Computer Group, 575, Science Drive, Madison, WisconsinのGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）のコンピューターによる実行により、実行され得る。
【００３４】
種々の方法により作成される最良のアライメント（すなわち、比較ウインドウを超える同一性のより高い割合をもたらす）は、同一性割合の決定のために選択される。
【００３５】
本明細書中ほぼ同じ意味で用いられる用語“リガンド”または“モジュレーター”は、カリクレイン７の１個以上の特定部位に結合する１分子または分子群を意味する。本発明のリガンドは、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。さらに、本発明のリガンドは、好ましくは低分子量分子である。
【００３６】
本発明の用語“低分子量分子”は、好ましくは、一般的に約１０００未満、より好ましくは約５００未満の分子量を有する有機化合物を意味する。
【００３７】
より好ましくは、該リガンドは、カリクレイン７生物学的活性を阻害する。化合物は、０．００１ｎＭないし１．０μＭの範囲のＩＣ５０を有するとき、カリクレイン７阻害剤と考えられる。
【００３８】
好ましいモジュレーターは、例えばカリクレイン−７活性のアンタゴニストである有機化合物、例えば、例えばピロリジンのようなＮ含有環系の１，２−ジカルボン酸アミドである。
【００３９】
一局面において、本発明は、式
【化５】
2010532162.tif 000007
［式中、
Ｒ１は、水素、シアノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、アルコキシまたはハロアルキルであり、
Ｘは、ＣＨ＝ＣＨ、ＮＨ、Ｎ＝ＣＨ、ＯまたはＳであり、
Ｙは、式
【化６】
2010532162.tif 000008
｛式中
−Ｎ含有環系は、所望により、シクロアルキル、アリールまたは５ないし６環員およびＮ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルと環形成（annelated）していてよく、
−ｎは、１、２または３であり、
−Ｒ２は、アルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキルまたは基（ＣＨ２）ｍ−Ｚ（ここで、Ｚは、非置換または置換の、シクロアルキル、アリールまたは５ないし６環員およびＮ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルであり、ｍは、０、１または２である）であり、
−Ｒ３は、水素、アルキル、アルコキシ、アリールまたは５ないし６環員およびＮ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルである｝の基である］
の化合物である。
【００４０】
本明細書に記載の全ての基（置換基）は、１ないし１８個の炭素原子を含んでいてよく、例えば、
−例えば、（Ｃ１−４）アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシルのような（Ｃ１−１２）アルキルを含む、アルキル；
−例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イル、アルカジエンなどのような（Ｃ２−１２）アルケニルを含む、アルケニル；
−例えば、エチニルのような（Ｃ２−１２）アルキニルを含む、アルキニル；
−例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルのような（Ｃ３−１２）シクロアルキルを含む、シクロアルキル；
−例えば、メトキシ、エトキシのような（Ｃ１−１２）アルコキシを含む、アルコキシ；
−（Ｃ６−１８）アリール、例えばフェニル、ナフチルを含む、アリール；
−脂肪族ヘテロシクリルおよび芳香族ヘテロシクリル；
−Ｎ、Ｏから選択される１ないし２個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルのような
例えば、
ピリジニル、例えばピリジン−３−イル、ピリジン−４−イル；
ピペリジニル、例えばピペリジン−４−イル；
ピペラジニル、例えばピペラジン−１−イル；
モルホリニル、例えばモルホリン−４−イル；
テトラヒドロフラニル、例えばテトラヒドロフラン−２−イルを含む、Ｎ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリル；
−クロロ、ブロモのようなＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉを含むハロゲン。
【００４１】
本明細書に記載の全ての基は、非置換か、または例えば１箇所以上を置換されていてよい。
置換基は、例えばメチル、メトキシ、エチニル、クロロ、ブロモを含む。
アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびヘテロシクリルは、非置換か、または例えば有機化学で常用される基により置換された、置換アルキル、アリールまたはヘテロシクリルを含む。
【００４２】
一局面において、本発明は、上記の式（Ｉ）、
［式中、
Ｒ１は、水素、シアノ、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ２−８）アルケニル、（Ｃ２−８）アルキニルまたはハロゲンであり、
Ｘは、ＣＨ＝ＣＨ、ＮＨ、Ｎ＝ＣＨ、ＯまたはＳであり、
Ｙは、式
【化７】
2010532162.tif 000009
｛式中、
−Ｎ含有環系は、所望により、（Ｃ３−８）シクロアルキル、（Ｃ６−１８）アリールまたは５ないし６環員およびＮ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし２個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルと環形成（annelated）していてよく、
−ｎは、１、２または３であり、
−Ｒ２は、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルキルアミノ、（Ｃ１−８）アルキルアミノ（Ｃ１−８）アルキル、ジ（Ｃ１−８）アルキルアミノ（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルコキシ、（Ｃ１−８）アルコキシ（Ｃ１−８）アルキル、または基（ＣＨ２）ｍ−Ｚ（ここで、Ｚは、非置換または置換の、（Ｃ３−８）シクロアルキル、（Ｃ６−１８）アリールまたは５ないし６環員およびＮ、Ｏ、Ｓから選択される１ないし２個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルであり、ｍは、１または２である）であり、
−Ｒ３は、水素、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−８）アルコキシである｝の基である］
の化合物である。
【００４３】
一局面において、本発明は、
Ｒ１が、水素、エチニル、クロロまたはブロモであり、
Ｘが、ＣＨ＝ＣＨまたはＳであり、
Ｙが、式（ＩＩ）｛式中、
−Ｎ含有環系が、所望により、シクロプロピル、シクロペンチルまたはフェニルと環形成（annelated）していてよく、
−ｎは、１または２であり、
−Ｒ２が、（Ｃ１−８）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−４）アルキルアミノ（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルコキシ、（Ｃ１−４）アルコキシ（Ｃ１−４）アルキルまたは基（ＣＨ２）ｍ−Ｚ（ここで、Ｚが、非置換シクロヘキシル、非置換フェニル、（Ｃ１−４）アルコキシにより置換されたフェニル、６環員およびＮ、Ｏから選択される１または２個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルにより置換されたフェニル、または非置換もしくは置換の、６環員およびＮ、Ｏから選択される１または２個のヘテロ原子を有するヘテロシクリルであり、ｍが、１または２である）であり、
−Ｒ３が水素または（Ｃ１−４）アルコキシである｝の基である、式（Ｉ）の化合物である。
【００４４】
一局面において、本発明は、Ｙは、式（ＩＩ）｛式中、
−Ｎ含有環系が、所望によりシクロプロピル、シクロペンチルまたはフェニルと環形成（annelated）していてよく、
−Ｒ２が、メチル、ジメチルアミノエチル、メトキシエチルまたは基（ＣＨ２）ｍ−Ｚ（ここで、Ｚが、非置換シクロヘキシル、非置換フェニル、メトキシ、ピペラジニルもしくはモルホリニルにより置換されたフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロフラニル、非置換ピペラジニル、またはメチルもしくはフェニルにより置換されたピペラジニルである）であり、
ｍ、ｎ、Ｒ１、Ｒ３およびＸは、上記の通りである｝の基である、式（Ｉ）の化合物である。
【００４５】
一局面において、本発明は、
Ｘが、ＣＨ＝ＣＨであり、
Ｒ１が、エチニルまたはクロロであり、
Ｙが、式（ＩＩ）｛式中、
ｎが１であり、
Ｒ３が水素であり、
Ｒ２が、メチル、メトキシエチル、ジメチルアミノエチル、ピリジン−３−イルメチル、ピリジン−４−イルメチル、ピリジン−３−イル−エチル、ピリジン−４−イル−エチル、６−メトキシ−ピリジン−３−イルメチル、（４−メトキシ−フェニル）−エチル、（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−エチル、（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−エチル、４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンジル、１−メチル−ピペリジン−４−イルメチル、２−（４−モルホリン−４−イルメチル）−ベンジルである｝の基である、式（Ｉ）の化合物である。
【００４６】
一局面において、本発明は、
Ｘが、ＣＨ＝ＣＨであり、
Ｒ１が水素であり、
Ｙが、式（ＩＩ）｛式中、
Ｎ含有環系が、所望によりフェニルと環形成（annelated）していてよく、
Ｒ３が、水素またはフェニルであり、
ｎが、１または２であり、
Ｒ２が、ベンジル、フェネチル、シクロヘキシルメチル、（４−メトキシ−フェニル）−エチル、３−メチル−ブチル、テトラヒドロフラン−２−イルメチルである｝の基である、式（Ｉ）の化合物である。
【００４７】
一局面において、本発明は、
ＸがＣＨ＝ＣＨであり、
Ｒ１がエチニルであり、
Ｙが式（ＩＩ）｛式中、
Ｎ含有環系が、所望によりシクロプロピル、シクロペンチル、フェニルと環形成（annelated）していてよく、
Ｒ３が水素であり、
ｎが１であり、
Ｒ２が、ピリジン−３−イルメチルである｝の基である、式（Ｉ）の化合物である。
【００４８】
一局面において、本発明は、
Ｘが、ＣＨ＝ＣＨであり、
Ｒ１がエチニルであり、
Ｙが、式（ＩＩ）｛式中、
Ｒ３がメトキシであり、
ｎが１であり、
Ｒ２がピリジン−３−イルメチルである｝の基である、式（Ｉ）の化合物である。
【００４９】
一局面において、本発明は、式（Ｉ）［式中、
ＸがＣＨ＝ＣＨであり、
Ｒ１がエチニルであり、
Ｙが、式（ＩＩ）｛式中、
Ｒ３が水素であり、
ｎが２であり、
Ｒ２がピリジン−３−イルメチルである｝の基である］
の化合物である。
【００５０】
一局面において、本発明は、式（Ｉ）［
ＸがＳであり
Ｒ１が、クロロまたはブロモであり、
Ｙが式（ＩＩ）｛式中、
Ｒ３が水素であり、
ｎが１であり、
Ｒ２が、（４−メトキシ−フェニル）−エチルである｝の基である］
の化合物である。
【００５１】
式Ｉの化合物において、各一定義された置換基は、例えば定義されたそれぞれ他の置換基と独立して、好ましい置換基であり得る。
【００５２】
別の局面において、本発明は、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（２−ピリジン−３−イル−エチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−［（２−ジメチルアミノ−エチル）−アミド］１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（２−ピリジン−４−イル−エチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（６−メトキシ−ピリジン−３−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（１−メチル−ピペリジン−４−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンジルアミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンジルアミド）、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−メチルアミド、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−｛［２−（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−エチル］−アミド｝１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（２−メトキシ−エチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−４−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−エチル］−アミド｝、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（６−クロロ−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−クロロ−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（５−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝、
【００５３】
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（５−クロロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝、
−（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ヘキサヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−１，２−ジカルボン酸２−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］１−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−２，３−ジヒドロ−インドール−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−１，３−ジヒドロ−イソインドール−１，２−ジカルボン酸２−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］１−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］、
−（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，３−ジカルボン酸３−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］、
−（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，３−ジカルボン酸３−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−（フェネチル−アミド）、
−（２Ｓ，４Ｓ）−４−フェニル−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−（フェネチル−アミド）、
−（２Ｓ，４Ｒ）−４−フェニル−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−（フェネチル−アミド）、
【００５４】
−（Ｓ）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−２，３−ジカルボン酸２−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］３−（フェネチル−アミド）、
−（Ｓ）−ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−（フェネチル−アミド）、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−ベンジルアミド−１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−シクロヘキシルメチル−アミド−１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−［（３−メチル−ブチル）−アミド］１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］、
−（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（テトラヒドロ−フラン−２−イルメチル）−アミド］、
−（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，３−ジカルボン酸３−［（７−クロロ−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］、および
−（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，３−ジカルボン酸３−［（７−クロロ−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝、
からなる群から選択される、式Ｉの化合物を提供する。
【００５５】
本明細書に記載の本発明の化合物の化合物名は、ＩＳＩＳ、バージョン２．５（AutoNom 2000 Name）から写し取られる。
【００５６】
本発明により提供される化合物を、以下に“本発明の化合物（複数可）”と称する。本発明の化合物には、何らかの形態の化合物、例えば遊離形、塩形態、溶媒和物形態、ならびに塩および溶媒和物の形態が含まれる。
【００５７】
別の局面において、本発明は、塩形態の本発明の化合物を提供する。
かかる塩類には、好ましくは薬学的に許容される塩類が含まれるが、薬学的に許容されない塩類には、例えば製造／単離／精製目的のものが含まれる。
【００５８】
遊離形の本発明の化合物は、対応する塩形態の化合物に変換され得る；また、その逆も可能である。遊離形または塩形態および溶媒和物形態の本発明の化合物は、遊離形または塩形態および非溶媒和物形態の対応する化合物に変換され得る；また、その逆も可能である。
【００５９】
本発明の化合物は、異性体形態およびその混合物；例えば、光学異性体、ジアステレオ異性体、シス／トランス配座異性体として存在し得る。本発明の化合物は、例えば不斉炭素原子を含んでいてよく、故に、エナンチオマーまたはジアステレオ異性体の形態、およびその混合物、例えばラセミ体として存在していてよい。本発明の化合物は、本発明の化合物の特定の位置に関して、（Ｒ）−、（Ｓ）−または（Ｒ，Ｓ）−配置、好ましくは（Ｒ）−または（Ｓ）−配置で存在していてよい。
【００６０】
本発明により提供される化合物は、（Ｒ）−および（Ｓ）−配置の、例えばその混合物を含む、式Ｉの化合物であってよく、好ましくは（Ｒ）−または（Ｓ）−配置である。
【００６１】
異性体混合物は、適当に、例えば常套法に従い、例えば常套法と同様に単離され、純粋な異性体を得ることができる。本発明は、何れかの異性体形態および何れかの異性体形態混合物の本発明の化合物を含む。
【００６２】
本発明はまた、互変異性体が存在し得るとき、本発明の化合物の互変異性体を含む。
【００６３】
別の局面において、本発明は、以下の工程を含む本発明の化合物、例えば式Ｉの化合物の製造方法を提供する。
Ａ）式
【化８】
2010532162.tif 000010
（式中、Ｒ１およびＲ３は、上記に定義の通りである）の化合物を、式
Ｒ２−ＮＨ２    （ＩＶ）
（式中、Ｒ２は上記に定義の通りである）の化合物と、適当な条件下で、例えばＮ−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−Ｎ−カルボジイミド−ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＣＨ２Ｃｌ２、トリフルオロ酢酸、アセトニトリルの存在下、適当な温度、例えば室温で、適当な時間、例えば一晩、反応させる工程；
または
Ｂ）式
【化９】
2010532162.tif 000011
（式中、Ｒ２、Ｒ３およびｎは、上記に定義の通りである）の化合物を、式
【化１０】
2010532162.tif 000012
（式中、Ｒ１およびＸは、上記に定義の通りである）の化合物と、適当な条件下で、例えばクロロギ酸４−ニトロフェニル、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＣＨ２Ｃｌ２の存在下、適当な温度、例えば室温で、適当な時間、例えば一晩、反応させる工程；
ならびに、反応混合物から得られた式Ｉの化合物を単離する工程。
【００６４】
式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）（出発物質）の中間体において、存在するとき、官能基は、所望により、保護形態、または塩形成基が存在するとき塩形態であってよい。所望により存在していてよい保護基は、適当な段階で、例えば常套法に従い、例えば常套法と同様に、除去され得る。
【００６５】
このようにして得られた式Ｉの化合物は、別の式Ｉの化合物に変換されてよいか、例えば遊離形で得られた式Ｉの化合物は、式Ｉの化合物の塩に変換されてよく、その逆も可能である。
【００６６】
式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の中間体（出発物質）は、公知であるか、または常套法に従い、例えば常套法と同様に、または本明細書に記載の通りに製造され得る。
【００６７】
本明細書に記載の全ての化合物、例えば本発明の化合物および式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の中間体は、適当に、例えば常套法に従い、例えば常套法と同様に、または例えば本明細書に記載の通りに、製造され得る。
【００６８】
例えば式Ｉの化合物を含む本発明の化合物は、薬理学的活性を示し、故に、医薬として有用である。例えば本発明の化合物は、カリクレイン−７活性を阻害することが見出される。
本発明の化合物は、例えば以下のアッセイで決定される、１ｎＭないし１０μＭのＩＣ５０値を有する。
【００６９】
材料および緩衝液
蛍光−消光基質Ａｃ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（ＥＤＡＮＳ）−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ＾Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）−Ｇｌｕ−ＮＨ２（ここで、＾は、ＭＳ分析により同定される、切れやすい結合（scissile bond）を示す）を、Biosyntan（Berlin, Germany）から購入し、ＤＭＳＯ中５ｍＭ貯蔵溶液として２０℃にて貯蔵した。全ての他の化合物は、分析等級のものである。
酵素反応を、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ５．６で行う。
【００７０】
溶液を含む全てのタンパク質およびペプチドを、シリコンチューブ（Life Systems Design, Merenschwand, Switzerland）で取り扱う。化合物溶液ならびに酵素および基質溶液を、CyBi−Well ９６−チャネル分注器（CyBio AG, Jena, Germany）により３８４ウェルプレート（black Cliniplate; cat. no. 95040020 Labsystems Oy, Finland）に移す。
【００７１】
ＦＩ測定のための装置
蛍光強度（ＦＩ）測定のために、Ultra Evolution reader（TECAN, Maennedorf, Switzerland）を用いる。該装置は、それぞれ蛍光励起および放射捕捉のための、３５０ｎｍ（２０ｎｍ帯域幅）および５００ｎｍ（２５ｎｍ帯域幅）バンドパスフィルターを組み合わせて装備している。シグナル：バックグラウンド比を増大するため、適当な干渉ミラーを用いる。光学フィルターおよび干渉ミラーを、ＴＥＣＡＮから購入する。各ウェル中のフルオロフォアを、測定毎に３フラッシュにより励起する。
【００７２】
ＩＣ５０値の決定
ＩＣ５０値を決定するために、アッセイを３８４ウェルプレートで室温にて行う。全ての最終アッセイ量は３０μｌであった。試験化合物を、９０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ／水中に溶解し、水（０．０５％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳを含む）で３倍の所望のアッセイ濃度に希釈する。１１種の最終化合物濃度は、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭおよび３０μＭである。各アッセイ用に、１０μｌ水／ＣＨＡＰＳ（±試験化合物）を１ウェル当たり添加し、次いで１０μｌプロテアーゼ溶液（１．５×アッセイ緩衝液）を添加する。最終アッセイ溶液中のプロテアーゼ濃度は、０．２ｎＭ（Bradford法により決定された酵素濃度に従い）である。室温で１時間インキュベート後、反応を、１０μｌ基質溶液（１．５×アッセイ緩衝液中に希釈した基質、終濃度は２μＭであった）の添加により開始する。酵素活性に対する化合物の効果は、線形プログレス曲線から得られ、第一の測定値を基質の添加後すぐに得て、第二の測定値を１時間後に得る、２個の測定値から決定される。ＩＣ５０値は、非線形回帰分析ソフトウェア（XLfit, Vers. 4.0; ID Business Solution Ltd., Guildford, Surrey, UK）を用いて、阻害割合 対 阻害剤濃度のプロットから計算する。
【００７３】
本発明の化合物は、そのアッセイにおいて活性を示し、故に、カリクレイン−７活性により仲介される障害（疾患）の処置に用いられる。
本発明の化合物のＩＣ５０値は、１０μＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下の範囲であり、例えば実施例３６の化合物は、３ｎＭのＩＣ５０値を有する。
【００７４】
例えば、カリクレイン−７活性により仲介され、カリクレイン−７アンタゴニスト、例えばアセトニトリルで成功裏に処置されやすい疾患を含む障害には、カリクレイン−７の活性が、因果的役割を果たすか、または一因である障害、例えばアトピー性皮膚炎、乾癬、ネザートン症候群のような炎症性および／または過増殖性および掻痒性皮膚疾患、または結節性痒疹、詳細不明の掻痒のような他の掻痒性皮膚病、ならびに炎症性腸疾患またはクローン疾患のような上皮性バリア機能障害を含む他の疾患のような上皮性機能障害を伴う疾患である障害が含まれる。
【００７５】
別の局面において、本発明は、
例えばカリクレイン−７活性により仲介される障害の処置のための、
−医薬としての使用のための本発明の化合物、
−医薬としての本発明の化合物の使用、
−医薬の製造のための本発明の化合物の使用、を提供する。
【００７６】
薬学的使用のため、１個以上の本発明の化合物を用いることができ、例えば１個、または２個以上の本発明の化合物の組み合わせ、好ましくは１個の本発明の化合物を用いる。
本発明の化合物は、医薬組成物の形態で医薬として用いられ得る。
【００７７】
別の局面において、本発明は、少なくとも１個の薬学的に許容される賦形剤、例えば適当な担体および／または希釈剤、例えば充填剤、結合剤、崩壊剤、流動調整剤、滑剤、糖類もしくは甘味剤、香料、防腐剤、安定化剤、湿潤剤および／または乳化剤、可溶化剤、浸透圧調節のための塩類および／または緩衝液を含むものと共に、本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００７８】
別の局面において、本発明は、
−カリクレイン−７活性により仲介される障害の処置における使用のための本発明の医薬組成物
−カリクレイン−７活性により仲介される障害を処置するための本発明の医薬組成物の使用、を提供する。
【００７９】
さらなる局面において、本発明は、例えば上記の障害を含む、カリクレイン−７活性により仲介される障害の処置方法であって、有効量の、例えば医薬組成物形態の本発明の化合物を、かかる処置を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００８０】
別の局面において、本発明は、
−医薬の製造のための本発明の化合物、
−例えばカリクレイン−７活性により仲介される障害の処置のための、例えばアトピー性皮膚炎、乾癬、ネザートン症候群のような皮膚疾患または結節性痒疹、詳細不明の掻痒のような他の掻痒性皮膚病の処置のための、医薬、例えば医薬組成物、の製造のための本発明の化合物の使用、を提供する。
【００８１】
処置には、処置および予防（予防）が含まれる。処置は、例えばクリーム、軟膏または坐薬のような局所または全身適用により、またはそれぞれ経口、皮下もしくは点滴適用により可能である。
【００８２】
かかる処置のための適当な投与量は、もちろん、例えば用いる本発明の化合物の化学的性質および薬理動力学的データ、個々の宿主、投与方法、ならびに処置される状態の性質および重症度によって変わり得る。しかしながら、一般的に、大型哺乳動物、例えばヒトに満足いく結果をもたらすために、示される一日投与量は、例えば、１日４回までの分割用量で投与される、
−約０．００１ｇないし約１．５ｇ、例えば０．００１ｇないし１．５ｇ；
−約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重ないし約２０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ体重ないし２０ｍｇ／ｋｇ体重、の範囲を含む。
【００８３】
本発明の化合物は、大型哺乳動物、例えばヒトに、カリクレイン−７活性の他のメディエーター、例えば低分子量阻害剤に通常使用されるのと同様の投与方法で投与され得る。
【００８４】
本発明の化合物は、何れかの常套経路、例えば経鼻、口腔、経直腸、経口を含む、例えば経腸投与；例えば静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、皮下、骨内注入、経皮（無傷の皮膚を介する拡散）、経粘膜（粘膜を介する拡散）、吸入を含む、非経腸投与；例えば経皮、経鼻、気管内を含む、局所投与；腹腔内投与（腹腔への注入または注射）；硬膜外投与（peridural）（硬膜空間への注入または注射）；髄腔内投与（脊髄液への注入または注射）；硝子体内投与（眼を介する投与）；例えば被覆または非被覆錠剤、カプセル剤、（注入可能）溶液、注射溶液、固体溶液、懸濁液、分散液、固体分散液形態；例えばアンプル、バイアル形態、クリーム、ゲル、ペースト、吸入粉末、泡状物、チンキ剤、口紅、ドロップ、スプレー形態、または坐剤形態で投与され得る。好ましくは、本発明の化合物は、局所適用される。
【００８５】
例えば眼への投与を含む局所使用について、満足のいく結果は、１日数回、例えば１日２ないし５回の、０．５−１０％、例えば１−３％濃度の活性物質の局所投与で得られ得る。
【００８６】
本発明の化合物は、薬学的に許容される塩形態、または遊離形；所望により、溶媒和物形態で投与され得る。塩形態および／または溶媒和物形態の本発明の化合物は、遊離形の本発明の化合物と同程度の活性を示す。
【００８７】
本発明の化合物は、単独で、または１個以上、少なくとも１個の他の第二薬物と共に、何れかの方法に、または本明細書に記載の通りに使用され得る。
【００８８】
別の局面において、本発明は、
−本発明の化合物と少なくとも１個の第二薬物の組合せ剤；
−本発明の化合物を少なくとも１個の第二薬物と共に含む薬学的組合せ剤；
−本発明の化合物を少なくとも１個の第二薬物および１個以上の薬学的に許容される賦形剤と共に含む医薬組成物；
−本明細書に記載の何れかの方法に用いるための、例えば薬学的組合せ剤または医薬組成物形態の、少なくとも１個の第二薬物と組み合わせる本発明の化合物、例えば
−医薬としての使用のための、本発明の化合物および少なくとも１個の第二薬物を含む、組合せ剤、薬学的組合せ剤または医薬組成物；
−例えば薬学的組合せ剤または医薬組成物形態の、少なくとも１個の第二薬物と組み合わせる本発明の化合物の医薬としての使用；
−第二薬物と共に使用するための、医薬の製造のための本発明の化合物の使用
−対象におけるカリクレイン−７活性により仲介される障害の処置方法であって、それを必要とする対象に、例えば薬学的組合せ剤または医薬組成物形態の、治療的有効量の本発明の化合物および少なくとも１個の第二薬物を共投与、同時投与または連続投与することを含む方法；
−カリクレイン−７活性により仲介される障害において使用するための、医薬の製造に使用するための、例えば薬学的組合せ剤または医薬組成物形態の、少なくとも１個の第二薬物と組み合わせる本発明の化合物、を提供する。
【００８９】
組合せ剤は、本発明の化合物および少なくとも１個の第二薬物が同じ剤形中にある固定した組合せ剤；別個の剤形の本発明の化合物および少なくとも１個の第二薬物が、例えば共投与のための指示と共に同じパッケージで提供される、キット；ならびに、本発明の化合物および少なくとも１個の第二薬物が別個にパッケージングされるが、同時または連続投与のための指示書が提供される、自由な組合せ剤、を含む。
【００９０】
別の局面において、本発明は、
−本発明の化合物である第一薬物および少なくとも１個の第二薬物を、併用投与のための指示書と共に含む、医薬パッケージ；
−本発明の化合物を、少なくとも１個の第二薬物と併用投与するための指示書と共に含む、医薬パッケージ；
−少なくとも１個の第二薬物を、本発明の化合物と併用投与するための指示書と共に含む、医薬パッケージ、を提供する。
【００９１】
本発明の組合せ剤での処置は、単剤処置と比較して改善を提供し得る。
【００９２】
別の局面において、本発明は、
−一定量の本発明の化合物および一定量の第二薬物を含む薬学的組合せ剤（ここで、該量は、相乗的治療効果を生じるのに適当である）；
−治療的有効量の本発明の化合物および第二薬物を、共投与、例えば同時投与または連続投与することを含む、本発明の化合物の治療的有用性を改善するための方法
−治療的有効量の本発明の化合物および第二薬物を共投与、例えば同時投与または連続投与することを含む、第二薬物の治療的有用性を改善するための方法、を提供する。
【００９３】
本発明の組合せ剤および組み合わせパートナーとしての第二薬物は、例えば、本発明の化合物について上記の通り、何れかの常套法により投与され得る。第二薬物は、適当な投与量で、例えば単剤処置に用いられるのと同様の投与量範囲で、または例えば相乗的なとき、通常の投与量範囲以下でも投与され得る。
【００９４】
本発明の医薬組成物は、常套法に従い、例えば常套法と同様に、例えば混合、造粒、コーティング、溶解または凍結乾燥処理により製造され得る。単位投与量形態は、例えば約０．１ｍｇないし約１５００ｍｇ、例えば１ｍｇないし約１０００ｍｇ含み得る。
【００９５】
本発明の組合せ剤を含む医薬組成および本明細書に記載の第二薬物を含む医薬組成物は、適当に、例えば常套法に従い、例えば常套法と同様に、または本発明の医薬組成物について記載の通りに、提供され得る。
【００９６】
用語“第二薬物”は、抗炎症剤、免疫調節剤、抗癌剤、麻酔剤または化学療法剤を意味する。“第二薬物”は、カリクレイン−７活性を有するが、本発明の化合物ではない化合物であり得る。
【００９７】
本発明の化合物を他の薬物と併用投与するとき、共投与した第二薬物の投与量はもちろん、本発明の化合物の場合、用いる共薬物の種類、用いる特定の薬物、処置されるべき状態によって変化し得る。一般的に、第二薬物供給者により供されるのと類似の投与量が適当であり得る。
【００９８】
以下の実施例において、全ての表示の温度は、摂氏（℃）である。
【００９９】
以下の略語もまた、用いる：
【表２】
2010532162.tif 000013
【０１００】
カリクレイン７阻害剤は、“ペプチド”または“ペプチド誘導体”とも称されてよく、それらの用語は、カリクレイン７の結合ポケットの３次元構造と合致するか、または本発明で提供されるカリクレイン７の３次元結合ポケットと結合するための改善された物理的もしくは化学的特性を有するように設計され得る“ペプチド模倣物”または“ペプチド類似体”を包含することが意図される。
【０１０１】
用語“変異体”は、かかる変異体配列が、最適アライメントを行うとき、対応する断片配列徒少なくとも９０％同一性、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９９％同一性を共有するように、１個以上の選択したアミノ酸の欠失、挿入、または好ましくは置換により変異した配列を意味する。
【０１０２】
タンパク質変異体の製造方法は、当技術分野で公知である。例えば、カリクレイン７変異体は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によりそのコーディング領域において予め改変されたカリクレイン７ＤＮＡの発現により製造され得る。
【０１０３】
本明細書で用いる用語“結合ポケット”は、その形状および物理化学的特性の結果として、別の化学物質または化合物と都合よく結合し、表３の座標により定義されるカリクレイン７のある領域を意味する。
【０１０４】
結晶化に用いられるカリクレイン７タンパク質は、生物学的に活性または不活性であってよい。かかる能力は、当技術分野で公知の形態学的、生化学的または生存率分析により決定され得る。
【０１０５】
組み換えカリクレイン７またはその断片の発現は、真核もしくは原核系またはインビトロ発現系で達成され得る。
好ましい態様によれば、カリクレイン７は、結晶化前のいずれかの段階で少なくとも１個のリガンドと結合する。
【０１０６】
カリクレイン７は、融合タンパク質、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはヒスチジン標識融合タンパク質として発現され得る。要すれば、融合パートナーは、結晶化前に除かれる。
【０１０７】
結晶製造方法の結晶化段階を実行するために、当技術分野で公知の方法である蒸気拡散、透析または回分晶析(batch crystallization)を含む種々の方法が用いられ得る（“Crystallization of Biological Macromolecules”, A. McPherson, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA）。
【０１０８】
蒸気拡散結晶化において、少量（すなわち、数マイクロリットル）のタンパク質溶液を、沈殿剤を含む溶液と混合する。この混合した容量を、少量、すなわち約１ｍｌの沈殿剤を含む１ウェルに懸濁する。液滴から該ウェルへの蒸気拡散は、該液滴中での結晶形成をもたらし得る。
【０１０９】
結晶の透析方法は、タンパク質を保持するが、小分子（すなわち緩衝液および沈殿剤）をその中または外に拡散させる半透性のサイズ排除膜を利用する。透析において、蒸発によりタンパク質および沈殿剤を濃縮するよりも、沈殿剤は、膜を通ってゆっくり拡散し、一定のタンパク質濃度を維持しながらタンパク質濃度を減少させ得る。
【０１１０】
一般的にバッチ法は、溶液がちょうど懸濁した状態になるまで、タンパク質水溶液への沈殿剤のゆっくりとした添加を伴い、この時点で容器を密閉し、結晶化が起こるまでの時間放置してよい。バッチ技術において、沈殿剤および標的分子溶液を単純に混合する。過飽和は、拡散法よりむしろ直接的に達成される。しばしば、バッチ技術は、油状物下で行われる。該油状物は、蒸発を防ぎ、非常に少量の液滴を用い得る。このため、用語“マイクロバッチ”が用いられる。この技術の変法は、ゆっくりとした蒸発を可能にするため、パラフィン油状物（蒸発を完全に防ぐ）を用いるのではなく、シリコン油状物またはシリコンおよびパラフィン油状物の混合物を用いる。
【０１１１】
本発明は、何れかおよび全ての結晶化方法を包含し得る。当業者は、かかる方法の何れかを選択でき、選択した方法が所望の結晶をもたらすようにパラメーターを変更可能である。
【０１１２】
カリクレイン７の結晶化の１つの好ましい方法は、カリクレイン７溶液と“リザーバー緩衝液”を混合することを伴う。結晶形成のために、例えば滴定により、例えば沈殿剤を添加するか、または結晶化緩衝液とリザーバー緩衝液（必ずしも元のリザーバー緩衝液と同じでなくてよい）の拡散により均衡を取ることにより、混合物中の沈殿剤の濃度を増大させる。適当な条件下、かかる沈殿剤の拡散は、例えばより高濃度の沈殿剤を含むリザーバー緩衝液から低濃度の沈殿剤を含む結晶化緩衝液への、沈殿剤の勾配に沿って起こる。拡散は、例えば、通常の気相への水の拡散を可能にする蒸気拡散技術により、達成され得る。公知の技術は、例えば“ハンギング・ドロップ（hanging drop）”法または“シッティング・ドロップ（sitting drop)”法のような蒸気拡散法である。蒸気拡散法において、タンパク質を含む結晶化緩衝液の液滴を、より大貯蔵量のリザーバー緩衝液にハンギングまたはシッティングする。あるいは、沈殿剤の均衡は、結晶化緩衝液とリザーバー緩衝液を分け、リザーバー緩衝液へのタンパク質の拡散を防ぐ半透性膜を介して達成され得る。
【０１１３】
カリクレイン７の形成は、以下のパラメーター：ｐＨ、塩類および添加剤の存在、沈殿剤、タンパク質濃度および温度により基本的に決定される種々の条件下で達成され得る。ｐＨは、例えば約４．０ないし９．０の範囲であり得る。
【０１１４】
別の好ましい態様において、本発明は、リガンドと複合したカリクレイン７の共結晶の製造方法に関する。
【０１１５】
カリクレイン７結晶の結晶形態はまた、例えば化合物の最適化、または断片ベースのスクリーニング法における新規骨格化合物の発見のために、興味のある化合物を浸漬させることによりリガンドを交換するために用いられ得る。
【０１１６】
本発明の結晶組成物の構造座標は、３次元形状を示すため、またはそれらが定義する構造座標または３次元構造のコンピューター補助操作、またはそれに基づく計算を伴う他の使用のために、機械可読記憶媒体、例えばコンピューターハードドライブ、ディスケット、ＤＡＴテープなどに機械可読形態で格納され得る。例えば、カリクレインファミリーのタンパク質の３次元構造、またはかかるタンパク質の構造的に類似する相同性部分を定義するデータは、機械可読記憶媒体に格納されてよく、通常、該格納媒体からデータを読み出し得るコンピューターを用いて、かかるデータから表示を作成するための指示で操作し、タンパク質構造の図的３次元表示として示し得る。
【０１１７】
本発明によって、３次元カリクレイン７モデルが、カリクレイン７、その断片または相同体を含むカリクレイン７結晶から得られ得る。
【０１１８】
本発明はまた、カリクレイン７結晶構造のモデルを格納するコンピューター可読媒体に関する。好ましい態様において、該モデルは、Ｘ線回折データから導かれる表３の原子座標の、全て、または選択された部分から構築される。
【０１１９】
“選択された部分”は、表３に示される少なくとも１０個の連続アミノ酸、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１００個の連続アミノ酸の構造座標を意味する。
【０１２０】
カリクレイン７の３次元モデルから得られる知識は、種々の方法に用いられ得る。例えば、それは、化学要素、例えばカリクレイン７に結合し、好ましくはカリクレイン７により仲介されるか、またはそれと関係する過程もしくは事象を阻止または阻害するか、またはカリクレイン７アゴニストとして作用する、ペプチド模倣体および合成有機分子のような有機小分子および有機生体分子を同定するために用いられ得る。さらに、この情報は、カリクレイン７変異体、例えば変化した触媒活性を有する変異体を設計し、製造するため、３次元構造をモデル化するため、ならびに例えば分子置換または相同性モデリングを伴う、カリクレイン７相同体、カリクレイン７変異体またはカリクレイン７共複合体のようなタンパク質の結晶構造を解くために用いられ得る。
【０１２１】
用語“分子置換”は、未知の結晶の観察される回折パターンをより詳しく説明するために、未知の結晶の単位格子内に、構造座標が既知の分子を、例えばカリクレイン７配置を方向付け、そして位置付けることにより、構造座標が未知の結晶の予備的構造モデルを作成することを伴う方法を意味する。次に、配座が未知の構造の近似的フーリエ合成を行うために、位相をこのモデルから計算し、観測された振幅と組み合わせ得る。これは順に、未知の結晶の最終的な正確な構造を提供するために、いくつかの改良のいずれかを受け得る。本発明により提供される構造座標を用いて、分子置換は、結晶共複合体、未知のリガンド、変異体もしくは相同体の、またはカリクレイン７の異なる結晶形態の構造座標を決定するために用いられ得る。さらに、特許請求された結晶およびその配置は、カリクレイン７と関係する化学物質の構造座標を決定するために用いられ得る。
【０１２２】
本発明の“相同性モデリング”は、カリクレイン７のような１種以上の関連タンパク質、タンパク質ドメインおよび／または１個のサブドメインの構造座標を用いて未知の構造モデルを構築することを含む。相同性モデリングは、その３次元構造を解析されるべきタンパク質またはペプチドの共通部位または相同性部位を構造的に相同の物質の３次元構造に合わせることにより行われ得る。相同性モデリングは、解析されるべき関連構造のアミノ酸または他の成分による該アミノ酸または他の成分の置換によって、３次元構造の一部または全てを再構築することを含み得る。
【０１２３】
本発明で提供されるカリクレイン７の３次元構造に基づき、そして表３の原子座標、またはその選択した部分を用いて、部位特異的変異の効果を予測することができる。より具体的には、本発明で供される構造情報は、アミノ酸修飾、特に置換、挿入または欠失変異体をもたらすアミノ酸変異に望ましい部位の同定を可能にする。かかる変異体は、特定の特性、特に、変化した触媒活性のような、野生型カリクレイン７とは異なる特性を有するように設計され得る。置換、欠失および挿入は、望ましい変異体に達するように組み合わせられ得る。かかる変異体は、例えば野生型カリクレイン７から出発するか、デノボで合成されることにより、当技術分野で公知の方法により製造され得る。
【０１２４】
本発明で供されるカリクレイン７構造情報は、カリクレイン７と選択的に結合し得るが、カリクレイン７以外の他のプロテアーゼと結合しないリガンドの設計に有用であり、故に、特に、カリクレイン７の生物学的活性を調節するが、他のカリクレイン７プロテアーゼの活性を調節しない。
【０１２５】
カリクレイン７の結合ポケットの接触可能表面を模倣する表面を有する化学物質は、当業者により構築され得る。一例として、当業者は、化合物の３次元構造データベースをスクリーニングして、同様の３次元構造配列に適当な官能基を位置づける化合物を同定し、次いで、かかる化学物質の周りにコンビナトリアル化学ライブラリーを構築して、カリクレイン７の結合ポケットに高い親和性を有する化合物を同定することができる。
【０１２６】
発明の特定の態様において、細胞ベースのアッセイは、カリクレイン７の生物学的活性を阻害するリガンドを同定するように設計されている。
【０１２７】
低分子量化合物のようなリガンドは、化合物データベースまたはライブラリーをスクリーニングすること、およびカリクレイン７上の結合部位に対する適合操作を構成するためにコンピューター手段を用いることにより、同定され得る。表３の構造座標またはその選択される一部により本発明で供されるカリクレイン７の３次元構造は、種々のドッキングプログラムと共に用いられ得る。
【０１２８】
カリクレイン７に対する化学物質の可能性のある阻害または結合作用は、その実際の合成前に分析され得て、コンピューターモデリング技術の使用により試験される。特定の化学物質の理論的構造が、それとカリクレイン７との不十分な相互作用および結合を示すとき、該化学物質の合成および試験の必要性がなくなる。しかしながら、コンピューターモデリングが強い相互作用を示すとき、次に該分子は、カリクレイン７に結合する可能性について合成され、試験され得る。従って、作用しない化合物の効果かつ手間のかかる合成が避けられ得る。
【０１２９】
この“コンピューター内での（in silico）”分析は、例えば、表３の構造座標の全体または一部に基づくコンピュータースクリーン上の結合ポケットの視覚的検査により開始され得る。その後、選択された断片または化学物質は、種々の方向に位置づけられるか、またはカリクレイン７の結合ポケット内に“ドッキング”され得る。ドッキングは、ＱｕａｎｔａおよびＳＹＢＹＬのようなソフトウェアを用いて、次いで、エネルギー最小化、ならびにＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲのような標準的分子力学力場を含む分子動力学を用いて行われ得る。特化されたコンピュータープログラムは、興味のある断片または化学物質の選択のために用いられ得る。これらのプログラムは、例えばOxford University, Oxford, UKから市販されるGRID; Molecular Simulations, Burlington, MAから市販される5 MCSSまたはCATALYST; Scripps Research Institute, La Jolla, CAから市販されるAUTODOCK; University of California, San Francisco, CAから市販されるDOCK、ならびにUniversity College of London, UKから市販されるXSITEを含む。
【０１３０】
カリクレイン７の基質結合部位または何れかの他の結合部位で相互作用するカリクレイン７阻害剤の設計方法が、好ましい。本発明により使用可能な一方法は、カリクレイン７に結合するか、またはそれと関係する化学物質を設計し、異なる方法で該化学物質の物理的特性を改変するために、カリクレイン７の構造座標を用いる。故に、例えば溶解性、親和性、特異性、有効性、オン／オフ速度、または他の結合特性のような特性は、全て、改変および／または最大化され得る。候補化学物質とカリクレイン７との相互作用に最適な部位を決定するために、異なる物質のライブラリーと共に本発明の結合ポケットを含むカリクレイン７をプローブ化することにより所望の化学物質が設計され得る。例えば、溶媒で飽和した結晶から収集した高解像度Ｘ線回折データは、それぞれの溶媒分子の各タイプがどこに付着するかを決定可能である。従って、それらの部位に強く結合する小分子は、設計され、所望の活性について試験され得る。所望の活性が得られると、分子は、望ましい特性を最大化するためにさらに改変され得る。
【０１３１】
化合物が、上記の方法で設計されるか、または選択されると、化合物がカリクレイン７に結合し得る効率は、コンピューターによるか、または実験的評価を用いて最大の所望特性を試験および修飾され得る。種々のパラメーターが、所望の結果によって最大化され得る。これらには、特異性、親和性、オン／オフ速度、疎水性、溶解性、および当業者により容易に同定され得る他の特性が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
好ましい態様において、カリクレイン７の表３の構造座標は、上記のコンピューターベースの設計工程で用いられる。
【０１３３】
本発明はさらに、カリクレイン７に結合するリガンドの選択方法に関係し、以下：
ａ．適当な条件下で、候補化合物または化合物の混合物とカリクレイン７を共結晶化またはインキュベートし、
ｂ．Ｘ線またはＮＭＲ法により、候補化合物と相互作用するカリクレイン７のアミノ酸を決定し、
ｃ．結合ポケットの少なくとも１個以上のアミノ酸と相互作用する化合物を選択すること、
を含む。
【０１３４】
工程ｂの実行のため、リガンドの結合部位のマッピングを、通常、候補化合物の有無でのＮＭＲスペクトルの記録、およびリガンド結合により影響を受けるタンパク質の共鳴の同定により行う。これは、分析前のタンパク質共鳴の割り当て、または公知の結合部位を有するリガンドの結合により起こる化学シフト変化のパターンの比較を要する。あるいは、公知の結合部位を有する該リガンドを用いる競合実験は、相当する情報を得ることができる。
【０１３５】
本発明がさらに、断片連結法を用いる、カリクレイン７の新規リガンドの設計方法を提供する。カリクレイン７の異なる結合領域に結合する化合物が、まず初めに選択される。該リガンドは、設計した新規化合物が２個の結合部位内に合うように、空間的定位を基に互いに連結される。
【０１３６】
故に、本発明は、カリクレイン７に対するリガンドの設計方法に関し、該方法は、以下：
ａ．カリクレイン７の第一結合領域の１個以上のアミノ酸に結合する第一リガンドを提供し、
ｂ．カリクレイン７の第二結合領域の１個以上のアミノ酸に結合する第二リガンドを提供し、そして、
ｃ．該第一リガンドと該第二リガンドを連結させ、カリクレイン７の第一および第二結合ポケットに結合するリガンドを設計すること、
を含む。
【０１３７】
適当な連結基の選択は、有機化学分野で公知の結合角および結合距離の情報の原則を基に、互いに、かつカリクレイン７に対するリガンドの空間的定位を維持することにより行われる。
【０１３８】
さらに、カリクレイン７のアンタゴニストは、患者を処置するため、またはケロイド、肥厚性瘢痕、アクネ、アトピー性皮膚炎、乾癬、膿疱性乾癬、酒さ、ネザートン症候群のような炎症性および／または過増殖性および掻痒性皮膚疾患、または結節性痒疹、高齢者の詳細不明の掻痒のような他の掻痒性皮膚病、ならびに老齢皮膚、炎症性腸疾患およびクローン疾患のような上皮性バリア機能障害を含む他の疾患、ならびに膵炎、または癌、特に卵巣癌の処置のための医薬の製造を目的として、用いられ得る。
【０１３９】
以下の実施例は、本発明を説明するものであり、本発明を限定するために構成されるべきではない。本発明は特に、これらの実施例に記載の特定の態様に関係する。
【実施例】
【０１４０】
実施例
クローニング
ｈＫ７の自己開裂を防ぐために、Ｔｙｒ１８０（Swiss−Prot 登録番号 P49862に従い番号付けした）での自己開裂部位を、テンプレートとしてｐＥＴ２４＿Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−ＥＫ−ＫＬＫ７（ａａ３７−２５３）を用いる標準プロトコールに従い部位特異的変異誘導によりＡｒｇに変異させた（QuickChange 部位特異的変位導入キット； Stratagene；変異誘発プライマー：５’ GACTGCACGAAGGTTCGCAAGGACTTACTGGAAAATTCCATGC）。ベクターｐＥＴ２４＿Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−ＥＫ−ＫＬＫ７（ａａ３７−２５３）のクローニングは、当技術分野で常用の方法で行った。最終ベクターをｐＥＴ２４ｃ−Ｈｉｓ−ＰｒｏＫＬＫ７−Ｅｎｔｅｒｏｋ−ＫＬＫ７（ａａ３７−２５３）＿Ｙ１８０Ｒと称した。
【０１４１】
発現および精製
ｐｒｏ−ｈＫ７の発現プラスミドを含む大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地中、３７℃で培養した。変異導入を、１．０のＯＤ６００で、３７℃で４時間、０．４ｍＭ ＩＰＴＧで開始した。次いで、細胞を遠心により集めた。他に特記する場合を除き、全ての精製工程を４℃で行った。１０リットルの大腸菌細胞培養からの細胞（２５ｇ細胞ペレット）を、１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む２００ｍｌの５０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中に懸濁し、−２０℃で一晩貯蔵した。解凍後、１μｌのBenzonase（ROCHE）を添加し、サンプルを３７℃で１０分間インキュベートした。細胞をソニケーション（７０％振幅で２０秒を４回； Branson Digital Sonifier W−450D）により破壊し、ホモジネートを７０００ｇで１５分間遠心した。ペレットを含む封入体を、２５％スクロース、１％トライトン１００および１μｌ Benzonaseを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０で３回洗浄し、最終的に１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＨ２Ｏで２回洗浄した。該封入体を、逆相カラムを用いるＨＰＬＣによりさらに精製した。このため、該封入体を、６Ｍ ＧｕＨＣｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）および１００ｍＭ ＤＴＴ中に溶解し、０．１％ＴＦＡおよび１０％アセトニトリルで平衡化したGE Source RPCカラム（Fine line 35S）に用いた。タンパク質を１０−１００％の漸増アセトニトリル濃度により溶出した。プロテアーゼを含む画分を集め、凍結乾燥させた。乾燥タンパク質を、２Ｍウレア、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．２５ｍＭ ＧＳＨおよび０．５ｍＭ ＧＳＳＧを含む、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０（１０℃冷却）に終濃度５０μｇ／ｍｌまで希釈した。次いで、サンプルを、１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０に対して透析し、Ｑ−セファロースカラム上に充填した（５０ｍｌ）。タンパク質を、０−０．５Ｍ ＮａＣｌの漸増塩濃度で溶出し、ｐｒｏ−ｈＫ７を含む画分を集め、約５ｍｌに濃縮した。次いで、サンプルを、８℃で２４時間のエンテロキナーゼ（１：１００）の添加により活性化した。最後に、ｈＫ７を、５０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８で平衡化したサイズ排除クロマトグラフィーカラム（Superdex 75, HiLoad 26／60, Amersham）に、２．５ｍｌ／分の流速で適用した。結晶化実験のために、タンパク質緩衝液を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６および１００ｍＭ塩化ナトリウムに対して透析することにより交換し、該タンパク質を４℃で貯蔵した。
【０１４２】
結晶化
ｈＫ７を、２４．６ｍｇ／ｍｌに濃縮し、ハンギング・ドロップ蒸気拡散法により２０℃で結晶化させた。５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ阻害剤および１．８％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む０．５μｌのタンパク質溶液を、３５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０、２００ｍＭ塩化カルシウムおよび１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８を含む０．５μｌリザーバー溶液と混合した。液滴を、１ｍｌのリザーバー溶液に対して平衡化した。結晶品質の回折は、１−３日間以内に明らかとなった。
【０１４３】
データ収集
Ｘ線データ収集のために、結晶を、さらなる抗凍結剤なしに液体窒素中で急速凍結した。Ｘ線回折データを、ｈＫ７−阻害剤複合体の単結晶から、０．９７９９Åの波長でＭＡＲ２２５モザイクＣＣＤ検出器を有するSwiss Light Sourceのビームライン×１０ＳＡで、９５Ｋにて集めた。阻害剤と結合したｈＫ７の結晶について、２９９または３００画像を各０．５°振幅で集めた。露光時間は、１画像当たり０．５秒ないし１秒であった。結晶と検出器の距離は、１００ｍｍないし１２０ｍｍであった。未加工の回折データを、APRV （２３）界面を用いるHKL program suite version 1.98.0 （２１）またはXDS／XSCALE （２２）で処理し、縮尺した。結晶データおよびデータ収集統計値を表１にまとめる。
【０１４４】
【表３】
2010532162.tif 000014
Ｒｍｅｒｇｅ＝Σ|Ｉｏ−＜Ｉ＞|／Σ＜Ｉ＞
【０１４５】
構造決定および構造微細化
化合物１との複合体のｈＫ７構造は、ヒトカリクレイン１の座標（pdb code 1SPJ、１．７Å解像度まで精密化（２５））を探索モデルとして用いて、プログラムMOLREP version 9.2.10 （２４）を用いて分子置換することにより解析された。４．０Åの高解像度データカットオフ値で、明確な解が、非対称ユニット中に１個のタンパク質−モジュレーター複合体を含む空間群Ｐ２１２１２１中に見出された（相関係数０．３４、Ｒ因子０．４８）。最初の精密化サイクルを、プログラム CNX version 2005（２６）のrigid-body、simulated-annealingおよびbindividual精密化プロトコールおよび高１．５Åの解像度データカットオフ値を用いて行った。ｈＫ７構造を、プログラム O version 9（２７）を用いるマニュアルモデル（再）構築ならびにプログラムCNX version 2005のminimizeおよびbindividualプロトコールを用いる自動化精密化を交互に行うことにより構築および精密化した。次いで、解像度を１．２Åまで拡張し、２０９水分子をプログラムCNX version 2005の吸水プロトコールを用いて添加し、最後にモジュレーターを添加した。異方性置換パラメーターは、CNX 2005のａｄｐプロトコールを用いる１．２Å解像度での最終精密化サイクルを含んだ。精密化標的は、振幅を用いるEngh and Huber（２８）により既報のパラメーターを含む最大尤度関数であった。精密化から排除された反射（reflection）の９．８％を用いて、相互検証を精密化過程を通して用いた。最終モデルの質を、プログラム CNX 2005およびPROCHECK（２９）で評価した。精密化統計値を表２にまとめる。
【０１４６】
【表４】
2010532162.tif 000015
Ｒｃｒｙｓｔ＝Σ｜Ｆｏ−Ｆｃ｜／ΣＦｏ
【０１４７】
２２４個のアミノ酸のうち２１９個が、高品質電子密度マップ中にトレースされ得た。アミノ酸１６６ＲＫＤＬＬ１７０（キモトリプシノーゲン番号付けスキーム（３０）によるアミノ酸番号付けが、他に記載されない限り、本明細書を通して用いられる）は、電子密度を欠き、最終構造に包含されなかった。この破壊されたループのアルギニン残基は、結晶化に用いられる構築物において変異している（Swiss−Pro番号付け番号Ｐ４９８６２に従い、この残基は、Ｔｙｒ１８０である）。野生型チロシン残基は、自己触媒的切断を起こしやすく、それは、アルギニン変異の場合以外は、ＭＳ分析により証明された。
【０１４８】
予想通り、６つのジスルフィド結合が、残基Ｃｙｓ２２−Ｃｙｓ１５７、Ｃｙｓ４２−Ｃｙｓ５８、Ｃｙｓ１２９−Ｃｙｓ２３２、Ｃｙｓ１３６−Ｃｙｓ２０１、Ｃｙｓ１６８−Ｃｙｓ１８２およびＣｙｓ１９１−Ｃｙｓ２２０間で見出され、そしてｃｉｓ−ペプチド結合が、アミノ酸Ｐｒｏ１４７およびＰｒｏ２１９で構築されていた。構造の高解像度により、アミノ酸３０、３８、３９、４９、５０、８４、９０、１１０、１３８、１５３、１６１、１６４、１８７、１９２および２００の側鎖は、２つの構造を構築していた。
【０１４９】
ｈＫ７の構造
ｈＫ７の構造は、ｈＫ１、ｈＫ６およびｈＫ８（２５、３１、３２）の全体構造に類似し、２つのβ−バレルおよびＣ末端α−ヘリックスを含む古典的キモトリプシン様折りたたみを有する。Ｈｉｓ５７、Ａｓｐ１０２およびＳｅｒ１９５からなる触媒３残基（catalytic triad）を含む活性部位は、２個のβ−バレルの界面に位置する。
【０１５０】
ｈＫ５およびｈＫ６と同様に、かつｈＫ１と対照的に、ｈＫ７は、いわゆるカリクレインループを欠く。カリクレインループは、カリクレイン、とりわけ古典的カリクレインのいくつかに特徴的なＴｈｒ９６とＧｌｎ９７の間の１１個までのアミノ酸残基の挿入である。それは、ｌｉｄのような非第一結合部位から突出する。ｈＫ７は、この領域にアミノ酸挿入がなく、トリプシンまたはキモトリプシンと比較して長さが区別できない。
【０１５１】
他のカリクレインと同様の全体構造にもかかわらず、ｈＫ７のＳ１ポケットは、極性Ａｓｎ１８９をポケットの底部で負荷電Ａｓｐと置換し、そして疎水性Ａｌａ１９０を極性Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基と置換することで、例えばｈＫ１、ｈＫ５、ｈＫ６およびｈＫ８のチロシン様特異性とは異なる。Ｓ１ポケットのこれらの特異的構造特性は、中性ないし極性ｔｉｐを含む大きなＳ１残基に好ましいｈＫ７の観察されるキモトリプシン様特異性と一致する。ｈＫ７は、Ｐ１においてＡｌａ、ＭｅｔおよびＰｈｅよりもＴｙｒに好ましい特異性を有する（１、３３）。
【０１５２】
破壊されたループは、Ｓ３／Ｓ４基質結合ポケットの遠端部に位置する。Ｓ１ないしＳ３と結合する阻害剤と複合体形成した他のＳ１セリンプロテアーゼにおいて、相同性ループは、Ｓ３／Ｓ４結合ポケットの骨格形成部分を順序立て、折りたたみ、それにより、阻害剤結合に寄与する。故に、カリクレイン７構造のこの部分は、Ｓ３／Ｓ４ポケットを占有する阻害剤の結合により順序立てられることが可能であり得る。さらに、精製中のこのループのチロシン残基後の自己切断のために、このチロシンはアルギニン残基により置換され、それはまたこのループの構造に影響し得る。
【０１５３】
本発明者らのモジュレーターは、Ｓ１から第一結合部位への予期されない結合モードを採用するカリクレイン７の活性部位に結合する。
【０１５４】
化合物１に関して、ナフチルおよびメトキシフェニル基は、それぞれＳ１およびＳ２’ポケットに結合する。中心のピロリジン環は、Ｓ１’ポケットに結合し、Ｈｉｓ５７側鎖の構造変化を誘導し、それにより、Ｈｉｓ５７、Ａｓｐ１０２およびＳｅｒ１９５からなる触媒３残基を妨げる。阻害剤結合により、Ｈｉｓ５７側鎖の揺れ（swing）はＳ２ポケットに向き（ｈＫ６ ｐｄｂコード１Ｌ２Ｅの構造と比較して、ｃｈｉ１の周りを１２０°回転し、ｃｈｉ２の周りを９０°回転する）、そしてＣｙｓ４２とＣｙｓ５８の間のジスルフィド結合と一体となって、阻害剤のピロリジン環により占有される疎水性ポケットを形成する。阻害剤のウレア部分のカルボニル酸素原子は、オキシアニオンホールを占有し、Ｇｌｙ１９３およびＳｅｒ１９５の骨格窒素原子までのＨ結合距離である。１個のウレア窒素原子は、Ｈｉｓ５７の側鎖およびＳｅｒ２１４の骨格カルボニル基への水仲介相互作用を構成する。阻害剤アミド窒素原子は、Ｈｉｓ４１の骨格カルボニル酸素原子と相互作用する。メトキシフェニル部分は、Ｐｈｅ１５１の側鎖へのedge−to−face相互作用を構成するフェニル環とのＶａｌ１４９およびＰｈｅ１５１までのファンデルワールス距離である。
【０１５５】
結晶環境内で、対称関連ｈＫ７分子は、ｈＫ７の活性部位に近接近で詰まる。上記の通り、モジュレーター結合は、触媒のＨｉｓ５７側鎖の移動を引き起こす。この転位したＨｉｓ５７側鎖の１個の窒素原子は、対称関係分子のＰｈｅ１５１の骨格カルボニル基までのＨ結合距離である。さらに、モジュレーターの第一部位部分は、同じ対称関連分子のＰｒｏ２１およびＡｓｐ１５４の側鎖と接触している。故に、結晶接点によるモジュレーターの結合モードに対する影響は、完全には排除され得ない。しかしながら、結晶接点は、異なる第一部位ポケットへの異なる第一部位骨格の結合を阻害しない。
【０１５６】
【表５】
2010532162.tif 000016
【表６】
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【表７】
2010532162.tif 000018
【０１５７】
【表８】
2010532162.tif 000019
【表９】
2010532162.tif 000020
【表１０】
2010532162.tif 000021
【０１５８】
【表１１】
2010532162.tif 000022
【表１２】
2010532162.tif 000023
【表１３】
2010532162.tif 000024
【０１５９】
【表１４】
2010532162.tif 000025
【表１５】
2010532162.tif 000026
【表１６】
2010532162.tif 000027
【０１６０】
【表１７】
2010532162.tif 000028
【表１８】
2010532162.tif 000029
【表１９】
2010532162.tif 000030
【０１６１】
【表２０】
2010532162.tif 000031
【表２１】
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【表２２】
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【０１６２】
【表２３】
2010532162.tif 000034
【表２４】
2010532162.tif 000035
【表２５】
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【０１６３】
【表２６】
2010532162.tif 000037
【表２７】
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【表２８】
2010532162.tif 000039
【０１６４】
【表２９】
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【表３０】
2010532162.tif 000041
【表３１】
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【０１６５】
【表３２】
2010532162.tif 000043
【表３３】
2010532162.tif 000044
【表３４】
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【０１６６】
【表３５】
2010532162.tif 000046
【表３６】
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【表３７】
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【０１６７】
【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【０１６８】
【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【０１６９】
【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【０１７０】
【表４７】
2010532162.tif 000058
【表４８】
2010532162.tif 000059
【表４９】
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【０１７１】
【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【０１７２】
【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【０１７３】
【表５６】
2010532162.tif 000067
【表５７】
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【表５８】
2010532162.tif 000069
【０１７４】
【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【０１７５】
【表６２】
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【表６３】
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【表６４】
2010532162.tif 000075
【０１７６】
【表６５】
2010532162.tif 000076
【表６６】
2010532162.tif 000077
【表６７】
2010532162.tif 000078
【０１７７】
【表６８】
2010532162.tif 000079
【表６９】
2010532162.tif 000080
【表７０】
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【０１７８】
【表７１】
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【表７２】
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【表７３】
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【０１７９】
【表７４】
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【表７５】
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【表７６】
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【０１８０】
【表７７】
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【表７８】
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【表７９】
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【０１８１】
【表８０】
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【表８１】
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【表８２】
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【表８３】
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【０１８２】
【表８４】
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【表８５】
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【表８６】
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【０１８３】
【表８７】
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【表８８】
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【表８９】
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【０１８４】
【表９０】
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【表９１】
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【表９２】
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【０１８５】
【表９３】
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【表９４】
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【表９５】
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【０１８６】
【表９６】
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【表９７】
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【表９８】
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【０１８７】
【表９９】
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【表１００】
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【表１０１】
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【０１８８】
【表１０２】
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【表１０３】
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【表１０４】
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【０１８９】
【表１０５】
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【表１０６】
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【表１０７】
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【０１９０】
【表１０８】
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【表１０９】
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【表１１０】
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【０１９１】
【表１１１】
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【表１１２】
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【表１１３】
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【０１９２】
【表１１４】
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【表１１５】
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【表１１６】
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【０１９３】
【表１１７】
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【表１１８】
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【表１１９】
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【０１９４】
【表１２０】
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【表１２１】
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【表１２２】
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【０１９５】
【表１２３】
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【表１２４】
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【０１９６】
実施例１：
（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（２−ピリジン−３−イル−エチル）−アミド］
Ａ）７−クロロ−ナフタレン−１−カルボン酸メチルエステル
５０ｍｌのメチル ２−フロエートおよび４００ｍｌのクロロベンゼンの混合物を、０℃で３０分間、室温で１．５時間、および１００℃で１６時間撹拌する。１２１ｇの無水ＡｌＣｌ３を０℃で分割して添加する。得られた溶液を冷却し、氷浴中に注ぎ、そして３０分間撹拌し、その後水層をエーテルで抽出する。得られた有機層を１０％ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄し、乾燥させ、溶媒を蒸発させる。得られた残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（溶離剤：シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ ９９／１ないし９５／５）により精製して、表題化合物を得る。
【０１９７】
Ｂ）（７−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メタノール
ＣＨ２Ｃｌ２中、０．７Ｍ水素化ジイソブチルアルミニウム溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２中、２２ｇの７−クロロ−ナフタレン−１−カルボン酸メチルエステルに−７８℃で滴下する。−７８℃で１時間撹拌後、得られた混合物を０℃まで温め、１０％酒石酸ナトリウム水溶液でクエンチし、さらに数分間撹拌する。得られた有機層を分離し、塩水で洗浄し、乾燥させ、溶媒を蒸発させる。得られた残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（溶離剤：シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ ８／１ないし４／１）により精製して、表題化合物を得る。
ＭＳ：１７５［Ｍ−Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ ３／１）＝０．３
【０１９８】
Ｃ）１−アジドメチル−７−クロロ−ナフタレン
１．５２ｍｌのジフェニルホスホリルアジドおよび１．１０ｍｌの１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エンを、１８ｍｌのトルエン中、１．３ｇの（７−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メタノールに添加する。得られた混合物を室温で１時間撹拌し、塩水で洗浄し、有機層を乾燥させ、溶媒を蒸発させる。得られた残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（溶離剤：シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ ９９／１）により精製して、表題化合物を得る。
ＴＬＣ、Ｒｆ（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ ９９／１）＝０．３３３
【０１９９】
Ｄ）塩酸Ｃ−（７−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メチルアミン
１．２４ｇのトリフェニルホスフィンおよび４１０μｌのＨ２Ｏを、２０ｍｌのＴＨＦ中、９９８ｍｇの１−アジドメチル−７−クロロ−ナフタレンに添加する。得られた混合物を５０℃で５時間撹拌し、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を１Ｎ ＨＣｌ水溶液で酸性化し、ＥｔＯＡｃで抽出する。得られた水層を１０％ＮａＨＣＯ３水溶液で塩基性化し、ＥｔＯＡｃで抽出する。得られた有機層を乾燥させ、溶媒を蒸発させる。表題化合物を遊離アミン化合物として得て、ジオキサン中、４Ｍ ＨＣｌ溶液の添加により塩酸塩に変換する。溶媒を蒸発させ、得られた残渣をエーテルで撹拌し、得られた混合物を濾過し、そして得られた濾液を乾燥させて表題化合物を得る。
ＭＳ：１９２［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９５／５／０．０１）＝０．２５
【０２００】
Ｅ）Ｃ−（７−トリエチルシラニルエチニル−ナフタレン−１−イル）−メチルアミン
７．５ｍｌのアセトニトリル中、５００ｍｇの塩酸Ｃ−（７−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メチルアミン、５．４ｍｇの塩化ビス（アセトニトリル）パラジウム（ＩＩ）、２９．８ｍｇの２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニルおよび１．７ｇの炭酸セシウムの溶液を、室温で２５分間撹拌する。４９５μｌの（トリエチルシリル）アセチレンを添加後、得られた混合物を９０℃で２時間撹拌し、Ｈ２Ｏでクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出する。得られた有機層を塩水で洗浄し、乾燥させて、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９９／１／０．０１ないし９５／５／０．０１）により精製し、表題化合物を得る。
ＭＳ：２７９［Ｍ−ＮＨ３＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９８／２／０．０１）＝０．２２
【０２０１】
Ｆ）（Ｓ）−１−［（７−トリエチルシラニルエチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−カルバモイル］−ピロリジン−２−カルボン酸
８ｍｌのトルエン中、２０％ホスゲン溶液を、４０ｍｌのトルエン中、５００ｍｇのＣ−（７−トリエチルシラニルエチニル−ナフタレン−１−イル）−メチルアミンおよび４７９μｌのジイソプロピルエチルアミンに添加する。得られた溶液を還流温度で３時間撹拌し、別の８ｍｌのトルエン中、２０％ホスゲン溶液を添加し、還流温度でさらに１時間撹拌する。溶媒を蒸発させる。蒸発により得られた残渣に、４０ｍｌのＴＨＦ中、５５９μｌのジイソプロピルエチルアミンおよび２１３ｍｇの（Ｓ）−ピロリジン−２−カルボン酸を添加する。得られた混合物を１時間撹拌し、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を分取ＨＰＬＣ（Waters Sun Fire C18 カラム、水／アセトニトリル勾配 ９５／５ないし０／１００）により精製して、表題化合物を得る。
ＭＳ：４３７［Ｍ＋Ｈ］＋
ＨＰＬＣ（方法Ｂ）：４．３６６分
【０２０２】
Ｇ）（Ｓ）−１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−カルバモイル］−ピロリジン−２−カルボン酸
１４ｍｌのＴＨＦ中、２５０ｍｇの（Ｓ）−１−［（７−トリエチルシラニルエチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−カルバモイル］−ピロリジン−２−カルボン酸の溶液を、室温で１時間撹拌する。溶媒を蒸発させ、得られた残渣を分取ＨＰＬＣ（Waters Sun Fire C18 カラム、水／アセトニトリル勾配 ９５／５ないし０／１００）により精製して、表題化合物を得る。
ＭＳ：３２３［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ／ＡｃＯＨ ５０／１）＝０．１６
【０２０３】
Ｈ）（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（２−ピリジン−３−イル−エチル）−アミド］
１１．６ｍｇの３−（２−アミノエチル）ピリジン、４．０５μｌのジイソプロピルエチルアミン、１３．１ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび１８．８ｍｇの塩酸Ｎ−（エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを、１ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中、２０ｍｇの（Ｓ）−１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−カルバモイル］−ピロリジン−２−カルボン酸に添加する。得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌し、溶媒を蒸発させ、得られた残渣を分取ＨＰＬＣ（Waters Sun Fire C18 カラム、水／アセトニトリル勾配 ９５／５ないし０／１００）により精製して、表題化合物を得る。
ＭＳ：４２７［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９５／５／０．０１）＝０．３７．
【０２０４】
実施例２：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−［（２−ジメチルアミノ−エチル）−アミド］１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、３−（２−アミノエチル）ピリジンの代わりにＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミンを用いて、実施例１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：３９３［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９５／５／０．０１）＝０．０７
【０２０５】
実施例３：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（２−ピリジン−４−イル−エチル）−アミド］
表題化合物を、３−（２−アミノエチル）ピリジンの代わりに４−（２−アミノエチル）ピリジンを用いて、実施例１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４２７［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９５／５／０．０１）＝０．１０
【０２０６】
実施例４：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（６−メトキシ−ピリジン−３−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、３−（２−アミノエチル）ピリジンの代わりにＣ−（６−メトキシ−ピリジン−３−イル）−メチルアミンを用いて、実施例１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４４３［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９５／５／０．０１）＝０．２７５
【０２０７】
実施例５：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（１−メチル−ピペリジン−４−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、３−（２−アミノエチル）ピリジンの代わりに１−（メチルピペリジン−４−イル）メチルアミンを用いて、実施例１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４３３［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９５／５／０．０１）＝０．０７２
【０２０８】
実施例６：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンジルアミド］
表題化合物を、３−（２−アミノエチル）ピリジンの代わりに４−（４−メチルピペラジノ）ベンジルアミンを用いて、実施例１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：５１０［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９５／５／０．０１）＝０．１
【０２０９】
実施例７：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンジルアミド）
表題化合物を、３−（２−アミノエチル）ピリジンの代わりに４−（モルホリノメチル）ベンジルアミンを用いて、実施例１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：５１１［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９８／２／０．０１）＝０．２６
【０２１０】
実施例８：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−メチルアミド
表題化合物を、３−（２−アミノエチル）ピリジンの代わりに塩酸メチルアミンを用いて、実施例１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：３３６［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（酢酸エチル）＝０．１
【０２１１】
実施例９：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−｛［２−（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−エチル］−アミド｝１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、３−（２−アミノエチル）ピリジンの代わりに２−（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−エチルアミンを用いて、実施例１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：５２４［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９５／５／０．０１）＝０．３２
【０２１２】
実施例１０：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（２−メトキシ−エチル）−アミド］
表題化合物を、３−（２−アミノエチル）ピリジンの代わりに２−メトキシエチルアミンを用いて、実施例１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：３８０［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９５／５／０．０１）＝０．２７６
【０２１３】
実施例１１：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、３−（２−アミノエチル）ピリジンの代わりに３−ピコリルアミンを用いて、実施例１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４１３［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９５／５／０．０１）＝０．１７
【０２１４】
実施例１２：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−４−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、３−（２−アミノエチル）ピリジンの代わりに４−ピコリルアミンを用いて、実施例１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４１３［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９５／５／０．０１）＝０．２１５
【０２１５】
実施例１３：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−エチル］−アミド｝
表題化合物を、３−（２−アミノエチル）ピリジンの代わりに１−（２−アミノエチル）４−メチルピペラジンを用いて、実施例１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４４８［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９５／５／０．０１）＝０．０８８
【０２１６】
実施例１４：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（６−クロロ−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝
Ａ）Ｃ−（６−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メチルアミントリフルオロ酢酸塩
表題化合物を、（７−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メタノールの代わりに（６−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メタノールを用いて、実施例１工程ＣおよびＤに記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：１７５［Ｍ−ＮＨ３＋Ｈ］＋
ＨＰＬＣ（方法）：１．９３５分
【０２１７】
Ｂ）（Ｓ）−２−［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチルカルバモイル］−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
１８．９ｇの塩酸Ｎ−（エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを、２５０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中、２０．０４ｇの（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、１４．９ｇの４−メトキシフェネチルアミン、１６．９ｍｌのジイソプロピルエチルアミンおよび１３．２ｇの１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールの冷却溶液に添加する。得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌し、反応を２Ｎ ＨＣｌ水溶液でクエンチし、そして得られた水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。合わせた、得られた有機層を２Ｎ ＨＣｌ水溶液、塩水および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、乾燥させ、溶媒を蒸発させる。得られた残渣をＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１／３）で再結晶により精製して、表題化合物を得る。
ＭＳ：３４９［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（酢酸エチル／ヘキサン １／１）＝０．２１
【０２１８】
Ｃ）（Ｓ）−ピロリジン−２−カルボン酸［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド
４１ｍｌのジオキサン中、４Ｎ ＨＣｌ溶液を、４０ｍｌのジオキサン中、１６．７８ｇの（Ｓ）−２−［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチルカルバモイル］−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの微細懸濁液に添加する。氷浴にて弱冷下で２．５時間撹拌後、溶媒を蒸発させ、得られた残渣を０℃で一晩冷却し、得られた結晶を１５０ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルと共に撹拌し、濾過し、乾燥させて、表題化合物を得る。
ＭＳ：２４９［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９０／９／１）＝０．３５
【０２１９】
Ｄ）（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（６−クロロ−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝
３ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中、３３ｍｇのＣ−（６−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メチルアミントリフルオロ酢酸塩、２２ｍｇのクロロギ酸４−ニトロフェニルおよび２５μｌのピリジンの溶液を、室温で１時間撹拌する。３０ｍｇの（Ｓ）−ピロリジン−２−カルボン酸［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミドおよび３７μｌのジイソプロピルエチルアミンを添加する。得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌し、溶媒を蒸発させ、得られた残渣を分取ＨＰＬＣ（Waters Sun Fire C18 カラム、水／アセトニトリル勾配 ９５／５ないし０／１００）により精製して、表題化合物を得る。
ＭＳ：４６６［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ）＝０．３６３
【０２２０】
実施例１５：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−クロロ−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝
表題化合物を、Ｃ−（６−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メチルアミントリフルオロ酢酸塩の代わりに、Ｃ−（７−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メチルアミントリフルオロ酢酸塩を用いて、実施例１４に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４６６［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ）＝０．４５
【０２２１】
実施例１６：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（５−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝
表題化合物を、Ｃ−（６−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メチルアミントリフルオロ酢酸塩の代わりに、Ｃ−（５−ブロモ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−メチルアミンを用いて、実施例１４に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：５１８［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン ２／１）＝０．１
【０２２２】
実施例１７：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（５−クロロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝
表題化合物を、Ｃ−（６−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メチルアミントリフルオロ酢酸塩の代わりに、塩酸Ｃ−（５−クロロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−メチルアミンを用いて、実施例１４に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４７２［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン ２／１）＝０．２０９
【０２２３】
実施例１８：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝
Ａ）（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝１−［（７−トリエチルシラニルエチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、Ｃ−（６−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メチルアミントリフルオロ酢酸塩の代わりにＣ−（７−トリエチルシラニルエチニル−ナフタレン−１−イル）−メチルアミンを用いて、実施例１４に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：５７０［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２２４】
Ｂ）（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝
表題化合物を、（Ｓ）−１−［（７−トリエチルシラニルエチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−カルバモイル］−ピロリジン−２−カルボン酸の代わりに（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝１−［（７−トリエチルシラニルエチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］を用いて、実施例１の工程Ｇに記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４５６［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン ２／１）＝０．１５
【０２２５】
実施例１９：（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］
Ａ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ−２−［（ピリジン−３−イルメチル）−カルバモイル］−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
表題化合物を、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの代わりに（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用い、そして４−メトキシフェネチルアミンの代わりに３−ピコリルアミンを用いて、実施例１４の工程Ｂに記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：３３６［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９０／９／１）＝０．３６
【０２２６】
Ｂ）（（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ−ピロリジン−２−カルボン酸（ピリジン−３−イルメチル）−アミド
表題化合物を、（Ｓ）−２−［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチルカルバモイル］−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの代わりに、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ−２−［（ピリジン−３−イルメチル）−カルバモイル］−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いて、実施例１４の工程Ｃに記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：２３６［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９０／９／１）＝０．３１
【０２２７】
Ｃ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］１−［（７−トリエチルシラニルエチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、（Ｓ）−ピロリジン−２−カルボン酸の代わりに、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ−ピロリジン−２−カルボン酸（ピリジン−３−イルメチル）−アミドを用いて、実施例１の工程Ｆに記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：５５７［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９０／９／１）＝０．４４
【０２２８】
Ｄ）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝１−［（７−トリエチルシラニルエチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］の代わりに、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］１−［（７−トリエチルシラニルエチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］を用いて、実施例１８の工程Ｂに記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４４３［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９０／９／１）＝０．２３
【０２２９】
実施例２０：（Ｓ）−ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの代わりに、（Ｓ）−ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いて、実施例１９に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４２７［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９０／９／１）＝０．３６
【０２３０】
実施例２１：（Ｓ）−ヘキサヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−１，２−ジカルボン酸２−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］１−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］
Ａ）（Ｓ）−ヘキサヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−１，２−ジカルボン酸２−ｔｅｒｔ−ブチルエステル１−エチルエステル
２，３６ｇの二炭酸ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）を、２０ｍｌのジオキサンおよび１０ｍｌのＨ２Ｏ中、１．６５ｇの（Ｓ）−オクタヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボン酸エチルエステルおよび１．４５ｇのＮａＣＯ３の混合物に、３回で添加する。得られた反応混合物を、室温で４時間撹拌し、反応を塩水でクエンチし、得られた残渣をＥｔＯＡｃで抽出する。得られた有機層を塩水で洗浄し、乾燥させ、溶媒を蒸発させて、その後、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（溶離剤：シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ ９／１）を行い、表題化合物を得る。
ＭＳ：２２８［Ｍ−イソブテン＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ ４／１）＝０．３５３
【０２３１】
Ｂ）（Ｓ）−ヘキサヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−１，２−ジカルボン酸２−ｔｅｒｔ−ブチルエステル
３０ｍｌのＴＨＦおよび１０ｍｌのＨ２Ｏ中、２ｇの（Ｓ）−ヘキサヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−１，２−ジカルボン酸２−ｔｅｒｔ−ブチルエステル１−エチルエステルおよび４４９ｍｇのＬｉＯＨの混合物を、室温で１６時間撹拌する。反応を塩水でクエンチし、２Ｎ ＨＣｌ水溶液でｐＨ２に酸性化し、ＥｔＯＡｃで抽出する。合わせた得られた有機層を塩水で洗浄し、乾燥させ、溶媒を蒸発させて、表題化合物を得る。
ＭＳ：２００［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＡｃＯＨ ３／６／１）＝０．７１
【０２３２】
Ｃ）（Ｓ）−１−［（ピリジン−３−イルメチル）−カルバモイル］−ヘキサヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
６５０μｌのＤＭＦ中、５０％プロピルホスホン酸無水物溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２中、２００ｍｇの（Ｓ）−ヘキサヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−１，２−ジカルボン酸２−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、７．４２ｍｇの４−ジメチルアミノピリジンおよび６５０μｌのジイソプロピルエチルアミンの溶液に添加する。室温で１６時間撹拌後、反応を２Ｎ ＮａＯＨ水溶液でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２と共にChem Elut extractionを通して溶出し、そして溶媒を蒸発させて、その後分取ＨＰＬＣによる精製（Waters Sun Fire C18 カラム、水／アセトニトリル勾配 ９５／５ないし０／１００）を行い、表題化合物を得る。
ＭＳ：３４６［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９０／９／１）＝０．４２
【０２３３】
Ｄ）（Ｓ）−ヘキサヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−１，２−ジカルボン酸２−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］１−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシ−２−［（ピリジン−３−イルメチル）−カルバモイル］−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの代わりに（Ｓ）−１−［（ピリジン−３−イルメチル）−カルバモイル］−ヘキサヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いて、実施例１９に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４５３［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９０／９／１）＝０．２９
【０２３４】
実施例２２：（Ｓ）−２，３−ジヒドロ−インドール−１，２−ジカルボン酸１−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、（Ｓ）−ヘキサヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−１，２−ジカルボン酸２−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの代わりに（Ｓ）−２，３−ジヒドロ−インドール−１，２−ジカルボン酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いて、実施例２１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４６１［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９０／９／１）＝０．４２
【０２３５】
実施例２３：（Ｓ）−１，３−ジヒドロ−イソインドール−１，２−ジカルボン酸２−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］１−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、（Ｓ）−ヘキサヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−１，２−ジカルボン酸２−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの代わりに１，３−ジヒドロ−イソインドール−１，２−ジカルボン酸２−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いて、実施例２１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４６１［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９０／９／１）＝０．３４
【０２３６】
実施例２４：（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，３−ジカルボン酸３−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、（Ｓ）−ヘキサヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−１，２−ジカルボン酸２−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの代わりに（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，３−ジカルボン酸３−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いて、実施例２１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４２５［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９０／９／１）＝０．３２
【０２３７】
実施例２５：（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，３−ジカルボン酸３−［（７−エチニル−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、（Ｓ）−ヘキサヒドロ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−１，２−ジカルボン酸２−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの代わりに（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，３−ジカルボン酸３−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用いて、実施例２１に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４２５［Ｍ＋Ｈ］＋
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９０／９／１）＝０．３６
【０２３８】
実施例２６：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−（フェネチル−アミド）
Ａ）（４−ポリスチリルオキシ−２，６−ジメトキシ−ベンジル）−フェネチル−アミン
２５ｇの市販されている２−（３，５−ジメトキシ−４−ホルミルフェノキシ）エトキシメチルポリスチレンを、ＤＣＥおよびＴＭＯＦの１０／３混合物（１５０ｍｌ）で４回洗浄する。得られた樹脂を、ＤＣＥおよびＴＭＯＦの上記１０／３混合物（１５０ｍｌ）中に再び懸濁し、１５．１ｇのフェネチルアミンで処理する。得られたスラリーを、室温で１６時間、オービタルシェーカーで振とうし、得られた樹脂を乾かし、ＤＭＡ、ＴＨＦおよびＣＨ２Ｃｌ２で連続して洗浄する。予め調製した、ＣＨ２Ｃｌ２中、５．１ｍｌのＭｅＯＨ、７．２ｍｌのＡｃＯＨおよび１２５ｍｍｏｌのボラン−ピリジン複合体の溶液を該樹脂に添加し、再び、室温で４時間振とうする。得られた樹脂を乾かし、ＤＭＡ、ＡｃＯＨ／ＤＭＡ（１／１９）、ＤＭＡ、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（９／１）、ＴＨＦ、ＣＨ２Ｃｌ２、ＭｅＯＨ、ＴＨＦ、ＭｅＯＨで連続して洗浄する。表題化合物を、真空下で一定量になるまで完全に乾燥させる。
【０２３９】
Ｂ）（Ｓ）−２−［（４−ポリスチリルオキシ−２，６−ジメトキシ−ベンジル）−フェネチル−カルバモイル］−ピロリジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル
１２２ｍｇの（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル、次いで１２６μｌのＤＩＰＥＡを、１．２０ｍｌのＮＭＰ中、１４０ｍｇのＨＡＴＵの溶液に添加する。得られた溶液を、２００ｍｇの（４−ポリスチリルオキシ−２，６−ジメトキシ−ベンジル）−フェネチル−アミン樹脂（約０．６ｍｍｏｌ／ｇ、０．１２ｍｍｏｌ充填）上に添加し、得られたスラリーを、６０℃で２時間振とうする。得られた樹脂を、ＤＭＡ、ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２で連続して洗浄し、５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中、Ａｃ２Ｏおよび２Ｍ ＤＩＰＥＡの１Ｍ溶液で、室温で１時間処理する。得られた樹脂を乾燥させ、ＤＭＡ、ＭｅＯＨおよびＣＨ２Ｃｌ２の上記溶媒順で連続して３回洗浄する。
【０２４０】
Ｃ）（Ｓ）−ピロリジン−２−カルボン酸（４−ポリスチリルオキシ−２，６−ジメトキシ−ベンジル）−フェネチル−アミド
工程Ｂで得られた樹脂（Ｓ）−２−［（４−ポリスチリルオキシ−２，６−ジメトキシ−ベンジル）−フェネチル−カルバモイル］−ピロリジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（０．１２ｍｍｏｌの結合種）を、ピペリジンおよびＤＭＡの混合物（１／４、３ｍｌ）中に懸濁し、オービタルシェーカーで２０分間振とうし、その後乾燥させ、ＤＭＡ、ＭｅＯＨおよびＣＨ２Ｃｌ２で連続して洗浄する。得られた樹脂を、ピペリジンおよびＤＭＡ溶液にさらに１回、２０分間懸濁し、その後、ＤＭＡ、ＭｅＯＨおよびＣＨ２Ｃｌ２で最終洗浄して、表題化合物を得る。
【０２４１】
Ｄ）（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−［（４−ポリスチリルオキシ−２，６−ジメトキシ−ベンジル）−フェネチル−アミド］１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］
２１０ｍｇの１−（アミノメチル）ナフタレン、次いで２１０μｌのＤＩＰＥＡを、２．６０ｍｌのＤＣＥ中、２４９ｍｇのクロロギ酸４−ニトロフェニルの溶液に注意深く添加する。得られた溶液を、室温で２．５時間撹拌し、工程Ｃで得られた樹脂（０．１２ｍｍｏｌの結合種）に添加する。得られた樹脂のスラリーを、オービタルシェーカーで、室温で１７時間振とうする。得られた樹脂を乾燥させ、ＤＭＡ、ＭｅＯＨおよびＣＨ２Ｃｌ２を連続して用いて３回洗浄し、表題化合物を得る。
【０２４２】
Ｅ）（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−（フェネチル−アミド）
工程Ｄ）の樹脂（０．１２ｍｍｏｌの結合種）を、２ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中、２０％ＴＦＡの溶液で、室温で１時間処理する。得られた樹脂を濾過し、２ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄する。合わせた得られた濾液を濃縮し、得られた残渣をＭｅＯＨ中に溶解し、分取ＨＰＬＣにより精製して、表題化合物を得る。
ＭＳ：４０２［Ｍ＋Ｈ］＋、４２４［Ｍ＋Ｎａ］＋
ＨＰＬＣ：４．４４分、１００％ＵＶ純度
【０２４３】
実施例２７：（２Ｓ，４Ｓ）−４−フェニル−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−（フェネチル−アミド）
表題化合物を、工程Ｂの（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルの代わりに（２Ｓ，４Ｓ）−４−フェニル−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルを用いて、実施例２６に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４７８［Ｍ＋Ｈ］＋、５００［Ｍ＋Ｎａ］＋
ＨＰＬＣ：５．２２分
【０２４４】
実施例２８：（２Ｓ，４Ｒ）−４−フェニル−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−（フェネチル−アミド）
表題化合物を、工程Ｂの（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルの代わりに（２Ｓ，４Ｒ）−４−フェニル−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルを用いて、実施例２６に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４７８［Ｍ＋Ｈ］＋、５００［Ｍ＋Ｎａ］＋
ＨＰＬＣ：５．１３分
【０２４５】
実施例２９：（Ｓ）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−２，３−ジカルボン酸２−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］３−（フェネチル−アミド）
表題化合物を、工程Ｂの（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルの代わりに（Ｓ）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−２，３−ジカルボン酸２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルを用いて、実施例２６に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４６４［Ｍ＋Ｈ］＋、４８６［Ｍ＋Ｎａ］＋
ＨＰＬＣ：５．０４分
【０２４６】
実施例３０：（Ｓ）−ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−（フェネチル−アミド）
表題化合物を、工程Ｂの（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルの代わりに（Ｓ）−ピペリジン−１，２−ジカルボン酸１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステルを用いて、実施例２６に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４３８［Ｍ＋Ｎａ］＋
ＨＰＬＣ：４．７７分
【０２４７】
実施例３１：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、工程Ａのフェネチルアミンの代わりに２−（４−メトキシ−フェニル）−エチルアミンを用いて、実施例２６に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：４３２［Ｍ＋Ｈ］＋、４５４［Ｍ＋Ｎａ］＋
ＨＰＬＣ：４．２３分
【０２４８】
実施例３２：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−ベンジルアミド１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、工程Ａのフェネチルアミンの代わりにベンジルアミンを用いて、実施例２６に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：３８８［Ｍ＋Ｈ］＋、４１０［Ｍ＋Ｎａ］＋
ＨＰＬＣ：４．１１分
【０２４９】
実施例３３：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−シクロヘキシルメチル−アミド１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、工程Ａのフェネチルアミンの代わりにＣ−シクロヘキシル−メチルアミンを用いて、実施例２６に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：３９４［Ｍ＋Ｈ］＋、４１６［Ｍ＋Ｎａ］＋
ＨＰＬＣ：４．６８分
【０２５０】
実施例３４：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−［（３−メチル−ブチル）−アミド］１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、工程Ａのフェネチルアミンの代わりに３−メチル−ブチルアミンを用いて、実施例２６に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：３６８［Ｍ＋Ｈ］＋、３９０［Ｍ＋Ｎａ］＋
ＨＰＬＣ：４．３４分
【０２５１】
実施例３５：（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸１−［（ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（テトラヒドロ−フラン−２−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、工程Ａのフェネチルアミンの代わりにＣ−（テトラヒドロ−フラン−２−イル）−メチルアミンを用いて、実施例２６に記載の方法と類似の方法で製造する。
ＭＳ：３８２［Ｍ＋Ｈ］＋、４０４［Ｍ＋Ｎａ］＋
ＨＰＬＣ：３．４７分
【０２５２】
実施例３６：（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，３−ジカルボン酸３−［（７−クロロ−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−［（ピリジン−３−イルメチル）−アミド］
表題化合物を、（Ｓ）−ピロリジン−２−カルボン酸の代わりに（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸（ピリジン−３−イルメチル）−アミドを、そしてＣ−（７−トリエチルシラニルエチニルナフタレン−１−イル）−メチルアミンの代わりにＣ−（７−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メチルアミンを用いて、実施例１の工程Ｆに記載の方法と類似の方法で製造する。表題化合物をＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、ポリマー結合ベンジルアミンで処理する。
ＭＳ：４３４．９［Ｍ＋Ｈ］＋、４３２．８［Ｍ−Ｈ］−
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９５／５／０．５）＝０．１０
【０２５３】
実施例３７：（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，３−ジカルボン酸３−［（７−クロロ−ナフタレン−１−イルメチル）−アミド］２−｛［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミド｝
表題化合物を、（Ｓ）−ピロリジン−２−カルボン酸の代わりに（１Ｓ，２Ｓ，５Ｒ）−３−アザ−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボン酸［２−（４−メトキシ−フェニル）−エチル］−アミドを、そしてＣ−（７−トリエチルシラニルエチニルナフタレン−１−イル）−メチルアミンの代わりにＣ−（７−クロロ−ナフタレン−１−イル）−メチルアミンを用いて、実施例１の工程ｆに記載の方法と類似の方法で製造する。表題化合物をＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、ポリマー結合ベンジルアミンで処理する。
ＭＳ：４７７．９［Ｍ＋Ｈ］＋、４７５．８［Ｍ−Ｈ］−
ＴＬＣ、Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ ９５／５／０．５）＝０．４０
【０２５４】
表４：
式
【化１１】
2010532162.tif 000136
［式中、Ｒ２は表４に定義の通りである。］
の化合物。
【０２５５】
【化１２】
2010532162.tif 000137
【０２５６】
表５：
式
【化１３】
2010532162.tif 000138
［式中、Ｙは表５に定義の通りである。］
の化合物。
【０２５７】
【化１４】
2010532162.tif 000139
【０２５８】
表６：
式
【化１５】
2010532162.tif 000140
［式中、Ｙは表６に定義の通りである。］
の化合物。
【０２５９】
【化１６】
2010532162.tif 000141
【化１７】
2010532162.tif 000142
【０２６０】
【化１８】
2010532162.tif 000143
【０２６１】
実施例３８：
Ａ）マウスにおける皮膚バリア破壊の回復試験
方法：皮膚バリア破壊は、無毛ＳＫＨ１マウス群において、Ｓ−Ｓｑａｍｅ（登録商標）皮膚サンプリングディスクで皮膚を繰り返し剥離して達成する。該方法は、皮膚水分蒸散量（ＴＥＷＬ）が≧４０ｍｇ／ｃｍ２／時となったとき完了する。ＴＥＷＬをTewameter TM210 (Courage Khazaka, Cologne, DE)で評価する。バリア破壊後直ぐに、３０μｌの実施例３７の化合物（＝試験化合物１）を１０ｍＭ濃度で適用する。対照動物を、溶媒（ＥｔＯＨ／プロピレングリコール、３／７（ｖ／ｖ））のみで同様に処理する。ＴＥＷＬを、バリア破壊前、直後、破壊後３時間に測定する。各動物において、回復率を式：（１−［３時間でのＴＥＷＬ−ベースラインＴＥＷＬ］／［剥離直後のＴＥＷＬ−ベースラインＴＥＷＬ］）×１００％、を用いて計算する。
【０２６２】
表７は、試験化合物１の単独適用が、溶媒のみで処理したマウスの回復と比較してバリア回復を６５−７６％促進することを示す（ｐ＜０．００１）。
【表１２５】
2010532162.tif 000144
【０２６３】
Ｂ）刺激性接触性皮膚炎（ＩＣＤ）のマウスモデルにおける抗炎症活性の試験
方法：Ｃｒｌ：ＮＭＲＩマウスを、右耳の内表面に１０μｌの０．００５％ホルボール １２−ミリステート−１３−アセテート（ＴＰＡ）を接種する。未処理の左耳を正常対照として用い、皮膚炎を、接種後６時間の耳の重量（炎症性肥大の指標として用いる）の相違から評価する。該動物を、接種の３０分前に、１０μｌの試験化合物１または溶媒で局所的に処理する。処理の効果を、ビークルのみで処理した動物と比較して、耳の炎症性肥大の阻害割合として計算する。
【０２６４】
表８は、ＴＰＡ誘導性刺激性皮膚炎が濃度依存的に阻害されることを示す。炎症性肥大は、２０ｍＭ濃度で５４−７３％阻害される；統計学的に有意な阻害は、３ｍＭで観察されなかった。
【表１２６】
2010532162.tif 000145
【０２６５】
Ｃ）アレルギー性接触性皮膚炎（ＡＣＤ）のブタモデルにおける抗炎症活性の試験
ＡＣＤの誘導の８日前に、５００μｌの１０％の２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ、ＤＭＳＯ／アセトン／オリーブ油中に溶解［１／５／３、ｖ／ｖ／ｖ］）を、感作のために、両耳の付け根および両脚の付け根に分割用量（１００μｌ／部位）を皮膚上に適用する。接種反応を、削り取った背側部の反対側の試験部位（各７ｃｍ２サイズ）に１５μｌのＤＮＦＢ（１．０％）で誘発する。処理に関して、実施例１１の化合物（＝試験化合物２）およびプラセボ（溶媒のみ）を、各動物の２個の試験部位に、接種の０．５および６時間後に、反対側に適用する。試験部位を、炎症がピークのとき、摂取後２４時間臨床的に試験する。接種を０ないし４スケールで記録し（表ＸＹ）、指定の部位当たり合わせて１２個の最大スコアを得る。皮膚の発赤を、ａ＊値を用いて反射計量的（reflectometrically）に測定する（表９参照）
【表１２７】
2010532162.tif 000146
【０２６６】
表１０は、ＡＣＤを有する試験部位の処理結果をまとめる：試験化合物２の１％溶液は、臨床的炎症変化を４２％阻害し（ｐ＜０．０１）、皮膚発赤を３２測定した（ｐ＜０．０５）。
【表１２８】
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【国際調査報告】
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