(57)【要約】  本発明は、特にがんを処置する方法、がんを処置するための組成物、そしてがんを診断および／または検出するための方法および組成物に関する。特に本発明は、ＦＸＹＤ５過剰発現に関連したがんを処置し、診断し、そして検出するための組成物および方法を提供する。
2010526029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置を必要とする患者におけるがんまたはがん症状を処置する方法であって、当該患者に治療上有効量のＦＸＹＤ５調節剤と、１種以上の薬学的に許容される担体を投与することを含む方法。
【請求項２】
調節を必要とする患者におけるＦＸＹＤ５活性を調節する方法であって、当該患者に、ＦＸＹＤ５活性の調節に有効量のＦＸＹＤ５調節剤と、１種以上の薬学的に許容される担体を投与することを含む方法。
【請求項３】
ＦＸＹＤ５を発現するがんの増殖を阻害する方法であって、該がん細胞に、該細胞の増殖を対照と比較して少なくとも２０％阻害するのに有効量のＦＸＹＤ５調節剤と、１種以上の薬学的に許容される担体を投与することを含む方法。
【請求項４】
阻害を必要とする患者における患者のがん表現型を阻害する方法であって、当該患者に、治療上有効量のＦＸＹＤ５調節剤と１種以上の薬学的に許容される担体を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項５】
ＦＸＹＤ５を発現するがん細胞の１種以上の活性を調節する方法であって、該がん細胞に、１種以上の活性の調節に有効量のＦＸＹＤ５調節剤と１種以上の薬学的に許容される担体を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項６】
がん細胞におけるＦＸＹＤ５とＦＸＹＤ５リガンドの相互作用を阻害する方法であって、該がん細胞に、ＦＸＹＤ５リガンドの存在下で有効量のＦＸＹＤ５調節剤を投与し、それによって該細胞のＦＸＹＤ５とＦＸＹＤ５リガンドの相互作用を阻害することを含む方法。
【請求項７】
ＦＸＹＤ５を発現するがん細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、該がん細胞に、有効量のＦＸＹＤ５調節剤と１種以上の薬学的に許容される担体を投与することを含む方法。
【請求項８】
患者または細胞にさらにメトトレキサートまたはドキソルビシンを投与することを含む、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
ＦＸＹＤ５調節剤が
(a) ＦＸＹＤ５の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープと結合する抗体；
(b) 配列番号：１、８、９または１２〜２６の何れかに記載の配列の少なくとも１９連続ヌクレオチド、またはその全長相補鎖を含む第１ヌクレオチド鎖と、該第１鎖と実質的に相補的な配列を含む第２ヌクレオチド鎖を含んでなる単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、８９０ヌクレオチド長未満であるｄｓＲＮＡ分子；
(c) 配列番号：１、８、９および１２〜２６から選択される配列と少なくとも９０％同一性を有する配列の少なくとも１０連続ヌクレオチド、またはその全長相補鎖を含む単離核酸分子；
(d) 低分子；
(e) 模倣物；
(f) 可溶性受容体；および
(g) デコイ
から選択される、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
ＦＸＹＤ５調節剤が、細胞増殖またはアポトーシスを測定するインビトロアッセイにおいて、ＦＸＹＤ５を発現するがん細胞の増殖を少なくとも２５％阻害する、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
ＦＸＹＤ５調節剤が、対照と比較してＦＸＹＤ５発現を少なくとも５０％阻害する、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
ＦＸＹＤ５調節剤が配列番号：１２〜２６から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
ＦＸＹＤ５調節剤がモノクローナル抗体である、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
モノクローナル抗体が配列番号：２の１個以上のエピトープと結合し、該１個以上のエピトープはそれぞれ配列番号：２の約６〜２０連続アミノ酸からなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
がんが結腸がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、皮膚がん、食道がん、肝臓がん、膵臓がん、子宮がん、子宮頸がん、肺がん、膀胱がん、多発性骨髄腫および黒色腫から選択される、請求項１、３または４の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
がんが結腸腺がんまたは扁平上皮がんである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
がんが腺管がん、小葉腺がんおよび転移性腺がんから選択される乳がんである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
がん細胞が乳がん細胞、皮膚がん細胞、食道がん細胞、肝臓がん細胞、膵臓がん細胞、前立腺がん細胞、子宮がん細胞、子宮頸がん細胞、肺がん細胞、膀胱がん細胞、卵巣がん細胞、多発性骨髄腫細胞および黒色腫細胞から選択される、請求項３、５、６または７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
さらに１種以上の化学療法、放射線療法または外科手術によって患者を処置することを含む、請求項１、２または４の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
がん症状が乳房のしこり、乳頭の変化、乳房嚢胞、乳房疼痛、死亡、体重減少,衰弱、疲労過多、摂食障害、食欲喪失、慢性咳,息切れの悪化、喀血、血尿、血便、吐き気、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、むくみ、腹腔内貯水、膣出血、便秘症、腹部膨満感、結腸穿孔、急性腹膜炎、疼痛、吐血、大量の発汗、熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、目眩、寒気、筋痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、ならびに嚥下困難から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ＦＸＹＤ５治療に受容性の患者を同定する方法であって：
(a) 患者サンプルのＦＸＹＤ５差次的発現の有無を検出し、ここで該サンプルのＦＸＹＤ５差次的発現の存在がＦＸＹＤ５治療の候補である患者の指標であり、該サンプルのＦＸＹＤ５差次的発現の非存在がＦＸＹＤ５治療の候補ではない患者の指標である；
(b) 患者がＦＸＹＤ５治療の候補であるとき、該患者に治療上有効量の請求項１に記載の組成物を投与し；そして
(c) 患者がＦＸＹＤ５治療の候補ではないとき、該患者に常套のがん治療剤を投与すること
を含む方法。
【請求項２２】
サンプルにおけるＦＸＹＤ５を発現する１種以上のがん細胞を検出する方法であって、イメージング剤と結合したＦＸＹＤ５調節剤を含む組成物と該サンプルを接触させて、該サンプル中のイメージング剤の局在を検出することを含む方法。
【請求項２３】
組成物がイメージング剤と複合化したＦＸＹＤ５抗体を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
イメージング剤が１８Ｆ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７７Ｂｒ、８７ＭＳｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、９９ＭＴｅ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂまたは２０６Ｂｉである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞において１種以上のＦＸＹＤ５関連生物学的活性を阻害する抗ＦＸＹＤ５抗体を発現する方法であって、前記ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞において抗ＦＸＹＤ５抗体をコードする核酸を発現することを含む方法。
【請求項２６】
対照と比較してＦＸＹＤ５の過剰発現によって特徴付けられるがんの阻害剤を同定する方法であって、ＦＸＹＤ５を発現する細胞と、候補化合物およびＦＸＹＤ５リガンドを接触させて、ＦＸＹＤ５の下流マーカーが調節されるかを測定することを含む方法、ここで、下流マーカーの調節ががんの阻害剤の指標である。
【請求項２７】
下流マーカーがＥ−カドヘリンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
患者のＦＸＹＤ５調節剤受容性を測定する方法であって、該患者サンプルのＦＸＹＤ５の差次的発現のエビデンスを検出することを含む方法、ここで、ＦＸＹＤ５の差次的発現のエビデンスが患者のＦＸＹＤ５調節剤受容性の指標である。
【請求項２９】
ＦＸＹＤ５調節剤と１種以上の薬学的に許容される担体を含む組成物であって、該ＦＸＹＤ５調節剤が：
(a) ＦＸＹＤ５の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープと結合する抗体；
(b) 配列番号：１、８、９または１２〜２６の何れかに記載の配列の少なくとも１９連続ヌクレオチド、またはその全長相補鎖を含む第１ヌクレオチド鎖と、該第１鎖と実質的に相補的な配列を含む第２ヌクレオチド鎖を含んでなる単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、８９０ヌクレオチド長未満であるｄｓＲＮＡ分子；
(c) 配列番号：１、８、９および１２〜２６から選択される配列と少なくとも９０％同一性を有する配列の少なくとも１０連続ヌクレオチド、またはその全長相補鎖を含む単離核酸分子；
(d) 低分子；
(e) 模倣物；
(f) 可溶性受容体；および
(g) デコイ
を含む、組成物。
【請求項３０】
さらに化学療法剤を含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
化学療法剤がメトトレキセートまたはドキソルビシンである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
ＦＸＹＤ５調節剤ががん細胞成長、がん細胞生存、腫瘍形成およびがん細胞増殖を対照と比較して少なくとも５０％阻害する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３３】
組成物が滅菌注射液である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３４】
単離核酸分子がｄｓＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３５】
ＦＸＹＤ５調節剤が、ＦＸＹＤ５ポリペプチドと少なくとも１×１０８Ｋａの親和性で特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３６】
ＦＸＹＤ５ポリペプチドが配列番号：２と少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
ＦＸＹＤ５ポリペプチドが配列番号：２の配列を有する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
ＦＸＹＤ５ポリペプチドが、配列番号：１および配列番号：９から選択される配列と少なくとも９５％同一の配列を含む核酸によってコードされる、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
モノクローナル抗体がキメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体またはＦａｂフラグメントである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４０】
モノクローナル抗体が配列番号：２の１個以上のエピトープと結合する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４１】
モノクローナル抗体が配列番号：２の２２−１４５アミノ酸の１個以上のエピトープと特異的に結合する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４２】
請求項３５に記載の抗体を生産する単離細胞。
【請求項４３】
請求項３５に記載の抗体を生産するハイブリドーマ。
【請求項４４】
請求項３５に記載の抗体を生産する非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４５】
配列番号：２の１個以上のエピトープを含む、エピトープ含有単離ポリペプチド。
【請求項４６】
請求項４５に記載のエピトープ含有単離ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４７】
１個以上のエピトープのそれぞれが配列番号：２の約６〜約２０連続アミノ酸からなる、請求項４５に記載のエピトープ含有単離ポリペプチド。
【請求項４８】
１個以上のエピトープのそれぞれが配列番号：２の約１０〜約２０連続アミノ酸からなる、請求項４５に記載のエピトープ含有単離ポリペプチド。
【請求項４９】
１個以上のエピトープの少なくとも１個が配列番号：２の少なくとも２１連続アミノ酸からなる、請求項４５に記載のエピトープ含有単離ポリペプチド。
【請求項５０】
配列番号：２の少なくとも２個のエピトープを含み、ここで該エピトープがそれぞれ配列番号：２の約６〜約２０連続アミノ酸からなる、請求項４５に記載のエピトープ含有単離ポリペプチド。
【請求項５１】
請求項４５に記載のエピトープ含有単離ポリペプチドで対象を免疫化して得られる、単離ＦＸＹＤ５抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は一般に、腫瘍学の分野に関する。より具体的には、本発明は、がんを処置する方法、がんを処置するための組成物、そしてがんを診断および／または検出するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
がんは、米国で死亡原因の第２位である。「がん」は多様なタイプのがん、すなわち乳がん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん等を記述するために使用されるが、それぞれのがんのタイプは表現型レベルと遺伝子レベルのいずれにおいても異なる。変異のために１個以上の遺伝子の発現が制御不能となったときがんの特徴である無制御増殖が生じ、細胞増殖は最早制御することができない。
【０００３】
がん転移は、細胞間接着を制御する分子の発現の変化を必要とする。カドヘリンは細胞間接着を仲介する膜貫通糖タンパク質であり、その脱制御が転移に関連している。例えば、上皮細胞の主たる接着細胞であるＥ−カドヘリンの発現の減少は、侵襲性表現型への細胞遷移に関連している（Perl et al. (1998) Nature 392, 190 - 193)。Ｅ−カドヘリンの活性の発現を制御する分子もがん転移に関与している。これらの分子の例には、Ｅ−カドヘリンを細胞骨格に結合させるカテニン、およびＥ−カドヘリン発現の転写リプレッサー、例えばＳｎａｉｌおよびＳｉｐ−１が含まれる（Batlle et al., (2000) Nat. Cell. Biol. 2, 84-89; Comijn et al., (2001) 7. 1267- 1278）。
【０００４】
Ｄｙｓａｄｈｅｒｉｎとも知られるＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送レギュレーター５（ＦＸＹＤ５）は、Ｅ−カドヘリン発現を制御することが提案されている（Ino et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(1), 365-370）。ＦＸＹＤ５は保存的３５アミノ酸コア配列を有するスモールタイプＩ膜タンパク質群に属す。ＦＸＹＤタンパク質群は胎児発生の初期に発現され、通常、液体および溶質の輸送に関与する組織（例えば腎臓、結腸、乳房／乳腺、膵臓、前立腺、肝臓、肺および胎盤）ならびに電気的に興奮し得る組織（例えば神経系、筋肉）に関連する。ＦＸＹＤタンパク質群は、イオン輸送の制御に関与すると考えられている。多様なＦＸＹＤタンパク質がＮａ，Ｋ  ＡＴＰアーゼと相互作用し、ポンプ活性を調節することが示されている。他のＦＸＹＤタンパク質群と比較して、ＦＸＹＤ５は長い細胞外ドメインと、短い細胞内ドメインを有する。
【０００５】
しかし今日まで、がんにおけるＦＸＹＤ５の役割は、十分に明らかにされていなかった。ＦＸＹＤ５を調節する組成物および方法を同定することが必要とされている。本発明は、これらおよび他の重要な必要に関する。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
ある局面において、本発明は、ＦＸＹＤ５調節剤と１種以上の薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は配列番号：１に記載の配列、または配列番号：１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列の少なくとも１０連続ヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチドである。ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤はＦＸＹＤ５の細胞外ドメインのエピトープと結合する抗体である。ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤はｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０００７】
ある局面において、本発明は、それを必要とする患者におけるがんまたはがんの症状を処置する方法であって、該患者に治療上有効量のＦＸＹＤ５調節剤（例えばＦＸＹＤ５阻害剤）を投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
ある局面において、本発明は、患者におけるＦＸＹＤ５関連生物学的活性を調節する方法であって、該患者にＦＸＹＤ５関連生物学的活性の調節に有効量のＦＸＹＤ５調節剤を投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
ある局面において、本発明は、ＦＸＹＤ５治療に受容性の患者を同定する方法であって、患者サンプルのＦＸＹＤ５差次的発現の有無を検出し、患者がＦＸＹＤ５治療の候補であるとき、該患者に治療上有効量のＦＸＹＤ５調節剤を投与し、そして患者がＦＸＹＤ５治療の候補ではないとき、該患者に常套のがん治療剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
ある局面において、本発明は、ＦＸＹＤ５を発現しているがん細胞の増殖を阻害する方法であって、該細胞と、細胞増殖の阻害に有効量のＦＸＹＤ５調節剤を接触させることを含む方法を提供する。
【００１１】
ある局面において、本発明は、ＦＸＹＤ５を発現している細胞集団のがん細胞表現型を阻害する方法であって、該細胞集団にがん細胞表現型の阻害に有効量のＦＸＹＤ５調節剤（例えばＦＸＹＤ５阻害剤）を投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
ある局面において、本発明は、サンプルにおけるＦＸＹＤ５を発現している１個以上のがん細胞を検出する方法であって、イメージング剤と結合したＦＸＹＤ５調節剤を含む組成物と該サンプルとを接触させて、サンプル中のイメージング剤の局在を検出することを含む方法を提供する。
【００１３】
ある局面において、本発明は、少なくとも一方の細胞がＦＸＹＤ５を発現している２個以上の細胞の相互作用を上昇させる方法であって、該細胞を含むサンプルに、有効量のＦＸＹＤ５調節剤を投与することを含む方法を提供する。多様な態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は、細胞−間細胞相互作用を直接または間接的に調節することによって２個以上の細胞の相互作用を上昇させるＦＸＹＤ５アンタゴニストである。細胞間（例えば新生物細胞と他の体細胞間の）相互作用を上昇させることによって、該調節剤は新生物細胞の転移性向を低下させることができる。
【００１４】
ある局面において、本発明は、ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞において抗ＦＸＹＤ５抗体を発現させる方法を提供する。ある態様において、抗ＦＸＹＤ５抗体は１種以上のＦＸＹＤ５関連生物学的活性を阻害する。ある態様において、該方法は、ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞において抗ＦＸＹＤ５抗体をコードする核酸を発現させることを含む。
【００１５】
ある局面において、本発明は、がんの阻害剤を同定する方法であって、ＦＸＹＤ５を発現している細胞と候補化合物およびＦＸＹＤ５リガンドを接触させて、ＦＸＹＤ５関連活性が阻害されるかを測定することを含む方法を提供する。ある態様において、ＦＸＹＤ５関連活性の阻害ががんの阻害剤の指標である。
【００１６】
ある局面において、本発明は、がんの阻害剤を同定する方法であって、ＦＸＹＤ５を発現している細胞と候補化合物およびＦＸＹＤ５リガンドを接触させて、ＦＸＹＤ５の下流マーカーが阻害されるかを測定することを含む方法を提供する。ある態様において、下流マーカーの阻害ががんの阻害剤の指標である。
【００１７】
ある局面において、本発明は、患者のＦＸＹＤ５調節剤受容性を測定する方法であって、該患者のがんサンプルにおけるＦＸＹＤ５の差次的発現のエビデンスを検出することを含む方法を提供する。ある態様において、ＦＸＹＤ５の差次的発現のエビデンスが患者のＦＸＹＤ５調節剤受容性の指標である。
【００１８】
ある局面において、本発明は、ＦＸＹＤ５タンパク質を含むサンプルからＦＸＹＤ５タンパク質を精製する方法であって、固体支持体と結合したＦＸＹＤ５抗体を含むアフィニティーマトリックスを得て、前記サンプルと該マトリックスを接触させてアフィニティーマトリックス−ＦＸＹＤ５タンパク質複合体を形成させ；残留サンプルからアフィニティーマトリックス−ＦＸＹＤ５タンパク質複合体を分離し；アフィニティーマトリックスからＦＸＹＤ５タンパク質を遊離させることを含む方法を提供する。
【００１９】
ある局面において、本発明は、ＦＸＹＤ５を発現している１個以上の細胞に細胞傷害剤または診断剤を送達する方法であって、ＦＸＹＤ５抗体またはそのフラグメントと複合化した細胞傷害剤または診断剤を得て、該抗体−薬剤複合体またはフラグメント−薬剤複合体に前記細胞を曝露することを含む方法を提供する。
【００２０】
ある局面において、本発明は、がん患者の予後を測定する方法であって、患者サンプル中の細胞の細胞膜に結合したＦＸＹＤ５の有無を検出することを含む方法を提供する。ある態様において、患者サンプル中の細胞の細胞膜に結合したＦＸＹＤ５の非存在が、患者の良好な予後の指標である。
【００２１】
本発明のこれらおよび他の局面は、下記本発明の詳細な説明において説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、Affymetrix Gene Chip（登録商標）によって得た結腸がん、乳がんおよび前立腺がん組織、ならびに対応する正常結腸、乳房および前立腺組織のＦＸＹＤ５遺伝子発現データを示す。
【図２】図２は、正常ヒト組織におけるＦＸＹＤ５遺伝子発現データを示す。
【図３】図３は、正常ヒト組織におけるＦＸＹＤ５遺伝子発現データを示す。
【図４】図４は、がん様組織および正常組織におけるＦＸＹＤ５  ｍＲＮＡ発現のオリゴヌクレオチドアレイ分析を示す。
【図５】図５は、正常ヒト組織におけるＦＸＹＤ５遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図６】図６は、細胞系におけるＦＸＹＤ５遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図７】図７は、正常組織および結腸がんにおけるＦＸＹＤ５遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図８】図８は、正常組織、乳がんおよび結腸がんにおけるＦＸＹＤ５遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図９】図９は、転移性結腸がんにおけるＦＸＹＤ５群の遺伝子発現を示す。
【図１０】図１０は、がん細胞系におけるＦＸＹＤ５の細胞表面発現のＦＡＣＳ分析を示す。
【図１１】図１１は、ＨＴ２９細胞の足場非依存性増殖に対するＦＸＹＤ５アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果の分析を示す。
【図１２】図１２は、ＨＴ２９細胞の足場非依存性増殖に対するＦＸＹＤ５アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果の分析を示す。
【図１３】図１３は、ＰＣ３細胞の足場非依存性増殖に対するＦＸＹＤ５  ｓｉＲＮＡの効果の分析を示す。
【図１４】図１４は、ＰＣ３細胞の足場非依存性増殖に対するＦＸＹＤ５アンチセンスＲＮＡの効果の分析を示す。
【図１５】図１５は、ＨＣＴ１１６細胞におけるＦＸＹＤ５  ｓｉＲＮＡの細胞傷害性分析を示す。
【図１６】図１６は、ＭＲＣ９細胞におけるＦＸＹＤ５  ｓｉＲＮＡの細胞傷害性分析を示す。
【図１７】図１７は、ＬｎＣａｐ細胞におけるＦＸＹＤ５  ｓｉＲＮＡと化学療法剤の組合せの細胞傷害性分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
詳細な説明
本発明は、がんの処置、診断およびイメージング、特にＦＸＹＤ５関連がんの処置、診断およびイメージングのための方法および組成物を提供する。
【００２４】
本発明者らは特に、結腸がん、乳がん、前立腺がんおよび卵巣がんを含む多様ながんにおいてＦＸＹＤ５が過剰発現しており、正常組織において発現が制限されていることを見出した。驚くべきことに、ＦＸＹＤ５の阻害は、がん細胞の細胞傷害を誘導するが、ＦＸＹＤ５を発現する正常細胞では細胞傷害を誘導しない。ＦＸＹＤ５の阻害はまた、がん細胞の足場非依存性増殖能も阻害する。さらにまたある態様において、本発明者らは、ＦＸＹＤ５の阻害とがんの化学療法処置の組合せが、細胞に対する相加的細胞傷害効果を発揮することを見出した。本発明のこれらおよび他の局面が本明細書において提供される。
【００２５】
定義
本明細書において多様な定義が使用される。多くの用語は当業者に理解されるとおりの意味を有する。次または本明細書のいずこかに具体的に定義されている用語は、全体として本明細書の文脈において与えられる意味を有し、そして典型的には当業者によって理解されるとおりの意味を有する。
【００２６】
本発明の実施には、特に定めのない限り、技術常識に含まれる化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬学の定法を用いる。かかる技術は文献に十分に説明されている。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)； Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); and Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); および Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)を参照されたい。
【００２７】
本明細書において使用するとき、単数表現“a”、“an”および“the”は、文脈が明確に異なることを示していない限り、複数表現を含む。従って、例えば“an antibody”という表現は、２個以上のかかる抗体の混合物を含む。
【００２８】
本明細書において使用するとき、用語「約」は、記載の数値の＋／−１０％の範囲、または数値の＋／−５％の範囲を意味する。
【００２９】
本明細書において使用するとき、用語「ＦＸＹＤ５」は、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送レギュレーター５およびＤｙｓａｄｈｅｒｉｎとしても知られているタンパク質、ならびに該タンパク質をコードする核酸を意味する（例えば、GenBank（登録商標） Ref. No. NM_014164.4、GI No. 47778936、およびGenBank（登録商標）Ref. No. NM_144779.1、GI No. 47778937、ヌクレオチド配列; GenBank（登録商標）Ref. No. NP_054883.3, GI No. 21618361、アミノ酸配列参照）。例示的ＦＸＹＤ５配列は、配列番号：１および９（ヌクレオチド配列）ならびに配列番号：２（アミノ酸配列）を含む。配列番号：１のヌクレオチド８７−６２３に対応するＦＸＹＤ５のコード配列の例は、配列番号：８として記載している。配列番号：２のアミノ酸１−１４５に対応するＦＸＹＤ５細胞外ドメインアミノ酸配列の例は、配列番号：１０として記載している。配列番号：２のアミノ酸１−２１に対応するＦＸＹＤ５シグナルペプチド配列の例は、配列番号：１１として記載している。
【００３０】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、相互交換可能に使用し、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を意味する。これはコードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導化したアミノ酸、ならびに修飾ペプチド主鎖を有するポリペプチドを含んでいてよい。該用語は、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、Ｎ−末端メチオニン残基を有するかまたは有さない異種および同種リーダー配列との融合体を含むがこれらに限定されない融合タンパク質；免疫標識化タンパク質等を含む。
【００３１】
用語「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」は相互交換可能に使用し、診断、処置または治療が望まれる何れかの対象、特にヒトを意味する。他の対象は、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ等を含んでいてもよい。ある態様において、対象はヒトである。
【００３２】
本明細書において使用するとき、「がん」は、原発性または転移性がんを意味する。用語「がん細胞」は、形質転換している細胞を意味する。この細胞は、がんを有する患者から単離することができ、あるいはインビトロでがん様になるように形質転換された細胞であってもよい。がん細胞は何れかの組織または細胞培養系を含む広範なタイプのサンプルに由来し得る。ある態様において、がん細胞は過形成細胞、腫瘍細胞または新生物である。ある態様において、がん細胞は、乳がん、皮膚がん、食道がん、肝臓がん、膵臓がん、前立腺がん、子宮がん、子宮頸がん、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、多発性骨髄腫および黒色腫から単離する。ある態様において、がん細胞は一般に入手可能な確立された細胞系から入手する。ある態様において、がん細胞は既に存在する患者サンプルから、またはがん細胞を含むライブラリーから単離する。ある態様において、がん細胞は、単離し、次いで別の宿主に移植、例えば異種移植する。ある態様においてがん細胞は、ＳＣＩＤマウスモデルに移植して使用する。ある態様において、がんは結腸がんである。ある態様において、がんは乳がんである。ある態様において、がんは卵巣がんまたは前立腺がんである。
【００３３】
本明細書において使用するとき、用語「形質転換」は、子孫に安定的に遺伝する細胞の特徴における何らかの変化を意味する。ある態様において、「形質転換」は正常な細胞のがん様細胞、例えば腫瘍を引き起こし得るものへの変化を意味する。ある態様において、形質転換細胞は不死化されている。形質転換は広範な要因、例えば受容体リン酸化の非存在下での受容体の過剰発現、ウイルス感染、発がん遺伝子および／または腫瘍抑制遺伝子の変異、および／または細胞の増殖および／または不死化特性を変化させる何れかの他の技術によって引き起こされ得る。
【００３４】
「がん様表現型」は、一般に、がん様細胞の特徴である多様な生物学的現象の何れかを意味し、かかる現象はがんのタイプによって変化し得る。がん様表現型は、一般に、例えば細胞成長または増殖（例えば無制御成長または増殖）、細胞サイクルの制御、細胞移動性、細胞間相互作用または転移等における異常によって同定される。
【００３５】
本明細書において使用するとき、用語「転移」は、がんの起源から、例えば原発性腫瘍から離れた場所に拡がったがんを意味する。転移部位は、骨、リンパ節、肺、肝臓および脳を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書において使用するとき、用語「血管形成」は、患者の血管の発達を意味する。
【００３７】
本明細書において使用するとき、用語「臨床的エンドポイント」は、がんの指標である測定可能なイベントを意味する。臨床的エンドポイントは、最初の転移の時間、続く転移の時間、転移サイズおよび／または数、腫瘍の位置、腫瘍の侵襲性、生活の質、疼痛等を含むが、これらに限定されない。当業者は臨床的エンドポイントを決定し、測定する能力を有すると考えられる。臨床的エンドポイントを測定する方法は当業者に既知である。
【００３８】
本明細書において使用するとき、用語「サンプル」は、患者由来の生物学的物質を意味する。本発明によってアッセイされるサンプルは、何れかの具体的なタイプに限定されない。サンプルは、非限定的な例として、１個の細胞、複数の細胞、組織、腫瘍、生物学的液体、生物学的分子または上記の何れかの上清または抽出物を含む。例には、生検のために単離した組織、切除術によって採取した組織、血液、尿、リンパ組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜および糞便サンプルが含まれる。使用するサンプルは、アッセイ形式、検出方法およびアッセイする腫瘍、組織、細胞または抽出物の性質によって変化する。サンプルの調製方法は当該技術分野において周知であり、使用する方法に適合するサンプルを得るために容易に適合させることができる。
【００３９】
本明細書において使用するとき、用語「生物学的分子」は、ポリペプチド、核酸および糖を含むが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書において使用するとき、用語「調節」は、細胞内、外または表面上に存在する遺伝子、タンパク質または何れかの分子の性質または量の変化を意味する。変化は、分子の発現またはレベルの上昇または低下であり得る。用語「調節」はまた、細胞増殖、増殖、接着、細胞生存、アポトーシス、細胞内シグナル伝達、細胞から細胞へのシグナル伝達等を含むがこれらに限定されない生物学的機能／活性の性質または量の変化を含む。
【００４１】
本明細書において使用するとき、用語「調節剤」は、がんに関連した１種以上の生理学的または生化学的イベントを調節する組成物を意味する。ある態様において、調節剤は、がんに関連した１種以上の生物学的活性を阻害する。ある態様において、調節剤は低分子、抗体、模倣物、デコイまたはオリゴヌクレオチドである。ある態様において、調節剤は、リガンド結合を阻止するか、またはリガンド結合部位と競合することによって作用する。ある態様において、調節剤はリガンド結合とは独立して作用する。ある態様において、調節剤はリガンド結合部位と競合しない。ある態様において、調節剤はがんに関与する遺伝子産物の発現を阻止する。ある態様において、調節剤はがんに関与する２種以上の生物分子の物理的相互作用を阻止する。ある態様において、本発明の調節剤は、がん細胞成長、腫瘍形成、がん細胞増殖、がん細胞生存、がん細胞転移、細胞移動、血管形成、ＦＸＹＤ５シグナル伝達、細胞間接着のＦＸＹＤ５介在性阻害、細胞間相互作用、ＦＸＹＤ５介在性細胞−細胞膜間相互作用、ＦＸＹＤ５介在性細胞−細胞外マトリックス間相互作用、インテグリン介在性活性、ＦＸＹＤ５表面発現、ＦＸＹＤ５介在性細胞−細胞外マトリックス分解から選択される、１種以上のＦＸＹＤ５生物学的活性を阻害する。ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤はＦＸＹＤ５発現を阻害する。
【００４２】
「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現されるかまたは作製されるバイオポリマー生成物である。遺伝子産物は例えば、非スプライシングＲＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライシング変異ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後修飾されたポリペプチド、スプライシング変異ポリペプチド等であってよい。また、ＲＮＡ遺伝子産物をテンプレートとして用いて製造するバイオポリマー生成物（すなわちＲＮＡのｃＤＮＡ）も、この用語に含まれる。遺伝子産物は酵素、組換え、化学によって、または遺伝子が起源とする細胞内で製造することができる。ある態様において、遺伝子産物がタンパク質性であるとき、これは生物学的活性を示す。ある態様において、遺伝子産物が核酸であるとき、これは生物学的活性を示すタンパク質性遺伝子産物に翻訳することができる。
【００４３】
「ＦＸＹＤ５活性の調節」は、本明細書において使用するとき、薬剤とＦＸＹＤ５ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相互作用、ＦＸＹＤ５転写および／または翻訳の阻害（例えば、ＦＸＹＤ５遺伝子またはＦＸＹＤ５転写産物と相互作用するアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡによる、ＦＸＹＤ５発現を促進する転写因子の調節による）等の結果であり得るＦＸＹＤ５活性の上昇または低下を意味する。例えば、生物学的活性の調節は、生物学的活性の上昇または生物学的活性の低下を意味する。ＦＸＹＤ５活性の低下をもたらすＦＸＹＤ５活性の調節は、本発明において特に興味深い。特に、細胞接着のＦＸＹＤ５介在性阻害を測定することによって、ＦＸＹＤ５活性は評価することができる。ＦＸＹＤ５活性はまた、ＦＸＹＤ５ポリペプチドレベルを評価するＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性をアッセイすること、またはＦＸＹＤ５転写レベルを評価することを含むがこれらに限定されない手段によって評価してもよい。ＦＸＹＤ５活性の比較はまた、ＦＸＹＤ５下流マーカーのレベルの測定、ＦＸＹＤ５シグナル伝達阻害の測定、ＦＸＹＤ５介在性がん細胞アポトーシスの活性化の測定、がん細胞増殖阻害の測定および腫瘍形成阻害の測定によって実施してもよい。
【００４４】
本明細書において使用するとき、用語「阻害」は、活性または量の減少、低下、不活性化または下方制御を意味する。例えば、本発明の文脈において、ＦＸＹＤ５調節剤は、がん細胞成長、腫瘍形成、がん細胞増殖、がん細胞生存、がん細胞転移、細胞移動、血管形成、ＦＸＹＤ５シグナル伝達、細胞間接着のＦＸＹＤ５介在性阻害、細胞間相互作用、ＦＸＹＤ５介在性細胞−細胞膜間相互作用、ＦＸＹＤ５介在性細胞−細胞外マトリックス間相互作用、インテグリン介在性活性、カドヘリン介在性活性、ＦＸＹＤ５表面発現およびＦＸＹＤ５発現の１種以上を阻害し得る。阻害は対照と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％であり得る。
【００４５】
本明細書において使用するとき、用語「がん細胞における差次的発現」および「がん細胞において差次的に発現しているポリヌクレオチド」は、本明細書において、相互交換可能に使用され、がん様細胞において、がん様でない同じ細胞型の細胞と比較したとき差次的に発現されている、例えばｍＲＮＡが少なくとも約２５％、少なくとも約５０％〜約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または少なくとも約５０倍以上のレベル差（例えばより高いまたは低い）を示す遺伝子を意味するか、またはそれに対応するポリヌクレオチドを意味する。例えばインサイチュハイブリダイゼーションまたは組織の細胞型をある程度区別することができる別のアッセイ法を用いるとき、該比較は組織中で実施することができる。さらに、あるいは上記とは別に、その組織源から取り出した細胞間で、または一方の細胞をインサイチュで、そして第２の細胞をその組織源から取り出して比較を実施することもできる。ある態様において、ＦＸＹＤ５は、正常細胞と比較してがん細胞で上方制御されている。
【００４６】
ＦＸＹＤ５関連がんは、少なくとも１つのがんの症状が寛解、終了、遅延または予防されたとき、「阻害」されている。本明細書において使用するとき、ＦＸＹＤ５関連がんは、がんの再発または転移が減少、鈍化、遅延または予防されたとき、「阻害」されている。
【００４７】
本明細書において使用するとき、用語「細胞接着のＦＸＹＤ５介在性阻害の調節」は、少なくとも一方の細胞がＦＸＹＤ５を差次的に発現している細胞間接着の、ＦＸＹＤ５阻害剤の存在下での調節（例えば増加）を意味する。この文脈において、細胞接着のＦＸＹＤ５介在性阻害はＦＸＹＤ５阻害剤によって、ＦＸＹＤ５阻害剤の非存在下での細胞接着のＦＸＹＤ５介在性阻害と比較して少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで減少し得る。細胞接着の比較は、例えば目的の細胞を標識し、それを基質と接着している未標識細胞群とインキュベートし、洗浄して非接着群から接着物を分離して、実施することができる。この方法では、細胞接着は、基質に保持された標識の量を測定して、測定することができる。アッセイ系の例は、カルセインＡＭ、ＣＦＭＤＡ（５−クロロメチルフルオレセインジアセテート）、５（６）−ＣＦＤＡ−ＳＥ［５−（および−６）−カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル］のような蛍光プローブで標識して、蛍光プレートリーダーまたはフローサイトメトリーで蛍光を測定することを含むが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書において使用するとき、用語「増殖を阻害」は、ＦＸＹＤ５介在性増殖の低下または阻止を意味し、当業者に既知の広範な方法で測定することができる。細胞増殖アッセイは、ＭＴＴアッセイ（例えば、Vybrant（登録商標）ＭＴＴ細胞増殖アッセイキット(Invitrogen)）；ＢｒｄＵ取り込みアッセイ（例えば、Absolute-S SBIPアッセイ(Invitrogen)）；細胞内ＡＴＰレベル測定（該アッセイの商品版には、ATPLite（商標）-M、1,000アッセイキット(PerkinElmer)およびＡＴＰ細胞生存アッセイキット(Bio Vision)を含む）；ＤｉＯｃ１８アッセイ、膜透過性染色(Invitrogen)；グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性アッセイ（例えば、Vibrant細胞傷害アッセイ(Invitrogen)）、細胞ＬＤＨ活性測定、ならびに３Ｈ−チミジン取り込みおよびCell Titer Glo アッセイ(Promega)を含むがこれらに限定されない。
【００４９】
本明細書において使用するとき、用語「血管形成を阻害」は、ＦＸＹＤ５介在性血管形成の減少または阻止を意味する。血管形成は、当業者に既知の広範な方法で検出することができ、例えばＳＣＩＤマウス、ヌードマウスまたはＣ５７ＢＬマウスにおける、細胞増殖アッセイ、細胞移動アッセイ、細胞分化アッセイ、臓器培養（エクスビボ）アッセイ、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ、角膜血管形成アッセイ、Matrigelプラグアッセイおよび腫瘍体積アッセイを含むがこれらに限定されない。
【００５０】
細胞移動アッセイは、ブラインドウェル走化性チャンバー、例えば修飾BoydenチャンバーおよびPhagokineticトラックアッセイを含むが、これらに限定されない。細胞分化アッセイは、コラーゲン、フィブリン塊またはMatrigelにおける管形成、次いで電子顕微鏡観察を含むが、これらに限定されない。臓器培養（エクスビボ）アッセイは、ラット大動脈輪アッセイおよびニワトリ大動脈弓アッセイを含むが、これらに限定されない。
【００５１】
本明細書において使用するとき、用語「細胞サイクル進行を阻害」は、細胞分裂の遅延または停止を意味する。細胞サイクル進行は、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）取り込みによってアッセイすることができる。かかるアッセイは、新たに合成されるＤＮＡへのＢＲＤＵの取り込みによるＤＮＡ合成を実施している細胞群を同定する。新たに合成されたＤＮＡは、抗ＢＲＤＵ抗体を用いて（Hoshino et al., 1986, int. J. Cancer 38, 369, Campana et al., 1988, J Immunol Meth 107, 79)、または他の手段によって検出することができる。細胞増殖はまた、ヒストンＨ３のリン酸化によって有糸分列を実施している細胞群を同定するリン−ヒストンＨ３染色によってアッセイしてもよい。セリン１０でのヒストンＨ３のリン酸化は、ヒストンＨ３のセリン１０残基のリン酸化形態に特異的な抗体を用いて検出する（Chadlee, D. N. 1995, J. Biol. Chem. 270: 20098-105）。細胞増殖はまた、［３Ｈ］−チミジン取り込みを用いて試験してもよい（Chen, J., 1996, Oncogene 13:1395-403; Jeoung, J., 1995, J. Biol. Chem. 270:18367-73）。このアッセイは、ＤＮＡ合成Ｓ期の定量的特徴付けが可能である。このアッセイにおいて、ＤＮＡを合成している細胞は、新たに合成したＤＮＡに［３Ｈ］−チミジンを取り込む。次いで取り込みは、シンチレーションカウンター（例えば、Beckman L S 3800 Liquid Scintillation Counter）でラジオアイソトープを計測するような標準的な技術によって測定することができる。別の増殖アッセイは、生存細胞で還元されたときに蛍光を発光して、細胞数の間接的測定が得られるAlamar Blue染色（Biosource Internationalから入手可能）を用いる（Voytik-Harbin S L et al., 1998, In Vitro Cell Dev Biol Anim 34:239-46）。さらに別の増殖アッセイであるＭＴＳアッセイは、工業化学物質のインビトロ細胞傷害評価を利用しており、可溶性テトラゾリウム塩、ＭＴＳを用いる。ＭＴＳアッセイは商業的に入手可能であり、Promega CellTiter 96(登録商標) AQueous 非放射活性細胞増殖アッセイ（Cat.# G5421）を含む。細胞増殖はまた、軟寒天でのコロニー形成によってアッセイしてもよい（Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989)）。細胞増殖はまた、代謝的に活性な細胞の指標としてＡＴＰレベルを測定してアッセイしてもよい。かかるアッセイは商業的に入手可能であり、Cell Titer-Glo(商標)(Promega)を含む。細胞サイクル増殖はまた、フローサイトメトリーでアッセイしてもよい（Gray J W et al. (1986) Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med 49:237-55）。ヨウ化プロピジウムで細胞を染色して、細胞サイクルの段階毎に細胞の集積を測定するフローサイトメトリーで評価してもよい。
【００５２】
本明細書において使用するとき、用語「がん細胞アポトーシスの増加」は、ＦＸＹＤ５を差次的に発現するがん細胞の、ＦＸＹＤ５阻害剤の存在下でのアポトーシスの増加を意味する。本明細書において、がん細胞アポトーシスは、ＦＸＹＤ５阻害剤の非存在下でのがん細胞アポトーシスと比較して少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで、ＦＸＹＤ５阻害剤によって増加し得る。がん細胞アポトーシスの比較は、例えばＤＮＡ断片化、カスパーゼ活性、ミトコンドリア膜電位の減少、活性酸素種（ＲＯＳ）の生産増加、細胞内酸性化、クロマチン凝縮、細胞表面のホスファチジルセリン（ＰＳ）レベル、および細胞膜透過性の上昇を測定することによって実施することができる。
【００５３】
ＤＮＡ断片化は、例えばＴＵＮＥＬアッセイ（末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識化）によって測定することができる。該アッセイの製品版は、例えばAPO-BrdU（商標）TUNELアッセイキット(Invitrogen)、APO-DIRECT（商標）キット(BD Biosciences Pharmingen)およびApoAlert（商標）ＤＮＡ断片化アッセイキット(Clontech、Takara Bio Company)として広範に入手可能である。
【００５４】
カスパーゼ活性は、特定のカスパーゼに特異的な蛍光基質、発色基質および発光基質によってモニターすることができる。少なくともカスパーゼ１、２、３、６、７、８および９について、市販のアッセイキットが入手可能である（例えば、Invitrogen、Chemicon、CalBiochem、BioSouroe International、Biovision参照)。
【００５５】
ミトコンドリア膜電位の減少は、健常な活性ミトコンドリアにおいて差次的に蓄積する蛍光色素によって測定することができる。１つの非限定的な例は、InvitrogenのMitoTracker Redシステムである。
【００５６】
活性酸素種（ＲＯＳ）の生産は、例えばH2DCFDA(Invitrogen)を含む蛍光色素によって測定することができる。
【００５７】
細胞内酸性化は、蛍光色素または発色色素によって測定することができる。
【００５８】
クロマチン凝縮は、例えばHoechst 33342を含む蛍光色素によって測定することができる。
【００５９】
ホスファチジルセリン（ＰＳ）レベルは、細胞表面で測定することができる。例えば、アネキシンＶはＰＳに高い親和性を有する。標識化アネキシンＶと細胞の結合をモニターするために、多様な商業的に入手可能なアッセイが好適である。
【００６０】
細胞膜透過性は、アポトーシス細胞には侵入するが、壊死細胞には侵入し得ない蛍光色素、YO-PRO-1(Invitrogen)のような染色剤を用いて測定することができる。
【００６１】
本明細書において使用するとき、用語「がん細胞の成長を阻害」は、ＦＸＹＤ５阻害剤の存在下で、ＦＸＹＤ５を差次的に発現するがん細胞の成長の阻害または阻止を意味する。この文脈において、がん細胞成長は、ＦＸＹＤ５阻害剤の非存在下でのがん細胞成長と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％までＦＸＹＤ５阻害剤によって低下させることができる。がん細胞成長の比較は、例えばＭＴＴアッセイ（例えば、Vybrant(登録商標)ＭＴＴ細胞増殖アッセイキット(Invitrogen)）；ＢｒｄＵ取り込み（例えば、Absolute-S SBIPアッセイ(Invitrogen)）、細胞内ＡＴＰレベル測定（例えば、ATPLite(商標)-M、1,000アッセイキット(PerkinElmer)またはＡＴＰ細胞生存アッセイキット(Bio Vision)を用いる）、ＤｉＯｃ１８アッセイ、膜透過性染色 (Invitrogen)、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性アッセイ（例えば、Vibrant細胞傷害アッセイ(Invitrogen)）または細胞ＬＤＨ活性測定を用いて実施することができる。
【００６２】
本明細書において使用するとき、用語「腫瘍形成を阻害」は、ＦＸＹＤ５を差次的に発現する細胞を含む腫瘍の形成の、ＦＸＹＤ５阻害剤の存在下での阻害または阻止を意味する。この文脈において、腫瘍形成は、ＦＸＹＤ５阻害剤の非存在下での腫瘍形成と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで、ＦＸＹＤ５阻害剤によって低下させることができる。腫瘍形成の比較は、例えば細胞利用アッセイ（例えば、軟寒天中でのコロニー形成）；典型的には目的細胞を動物に注射することによる腫瘍形成インビボモデル（例えば、無胸腺マウスまたはラット、放射線照射マウスまたはラット；脳、頬袋または目のような免疫特権組織への接種；同系動物の接種）、および所定の期間後の塊サイズのモニタリングを用いて実施することができる。
【００６３】
本明細書において使用するとき、用語「がん細胞生存を阻害」は、ＦＸＹＤ５を発現するがん細胞の生存を阻害することを意味する。ある態様において、該用語は、ＦＸＹＤ５を発現するがん細胞のアポトーシスをもたらすことを意味する。この文脈において、ＦＸＹＤ５発現がん細胞の生存は、ＦＸＹＤ５阻害剤の非存在下または通常細胞のがん細胞生存と比較して少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで、阻害剤によって減少させることができる。
【００６４】
本明細書において使用するとき、用語「細胞間相互作用のＦＸＹＤ５阻害を調節」は、ＦＸＹＤ５を発現する２個以上の細胞間の相互作用の増加を意味する。ある態様において、該細胞間相互作用は、細胞シグナル伝達を導く。細胞間相互作用は、例えばＰＫＨ２６とＰＫＨ６７(Sigma)を含む別の蛍光膜染色剤で標識化した共培養、プレ標識化細胞間での膜交換の観察を含むが、これに限定されない当業者に既知の広範な方法によって検出することができる。
【００６５】
「ＦＸＹＤ５下流マーカー」は、本明細書において使用するとき、正常または健常組織における遺伝子または活性による発現レベルと比較して、がん組織またはがん細胞で変化した発現レベルを示す遺伝子または活性、あるいはＦＸＹＤ５調節剤の存在下で変化した特性（例えば細胞接着）である。ある態様において、下流マーカーは、ＦＸＹＤ５が本発明のＦＸＹＤ５調節剤で影響されているとき、変化した発現レベルを示す。多様な態様において、Ｅ−カドヘリン活性および／またはβ−カテニン局在がＦＸＹＤ５活性の下流マーカーとして使用される。例えば、低下したＥ−カドヘリン活性または発現は、上昇したＦＸＹＤ５発現または活性の指標であり得る。β−カテニンの上昇した核局在はまた、上昇したＦＸＹＤ５発現または活性の指標であってもよい。
【００６６】
本明細書において使用するとき、用語「上方制御」は、活性または量の増加、活性化または刺激を意味する。上方制御は、対照と比較して少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも４００％または少なくとも５００％であり得る。
【００６７】
本明細書において使用するとき、用語「Ｎ末端」は、タンパク質の最初の１０アミノ酸を意味する。
【００６８】
本明細書において使用するとき、用語「Ｃ末端」は、タンパク質の最後の１０アミノ酸を意味する。
【００６９】
用語「ドメイン」は、本明細書において使用するとき、生体分子の既知または予期される機能に寄与する生体分子の構造部分を意味する。ドメインは領域またはその部分と同延であってよく、特定の領域とは異なる生体分子の一部を、該領域の全体または部分に加えて、含んでいてもよい。
【００７０】
本明細書において使用するとき、用語「細胞外ドメイン」は、細胞の外側または外部に存在する分子の一部を意味する。本発明の文脈において、Ｎ末端細胞外ドメインは、最初の膜貫通ドメインの直前までの該分子のＮ末端に存在する細胞外ドメインを意味する。
【００７１】
本明細書において使用するとき、用語「リガンド結合ドメイン」は、ＦＸＹＤ５の対応する天然配列の少なくとも１個の定性的結合活性を保持した受容体の何れかの部分または領域を意味する。
【００７２】
用語「領域」は、生体分子の１次構造の物理的に連続した部分を意味する。タンパク質の場合、領域は該タンパク質のアミノ酸配列の連続部分によって定義される。ある態様において、「領域」は生体分子の機能に関連している。
【００７３】
用語「フラグメント」は、本明細書において使用するとき、生体分子の１次構造の物理的に連続した部分を意味する。タンパク質の場合、部分は該タンパク質のアミノ酸配列の連続部分によって定義され、少なくとも３〜５アミノ酸、少なくとも８〜１０アミノ酸、少なくとも１１〜１５アミノ酸、少なくとも１７〜２４アミノ酸、少なくとも２５〜３０アミノ酸、そして少なくとも３０〜４５アミノ酸を意味する。オリゴヌクレオチドの場合、部分は該オリゴヌクレオチドの核酸配列の連続部分によって定義され、少なくとも９〜１５ヌクレオチド、少なくとも１８〜３０ヌクレオチド、少なくとも３３〜４５ヌクレオチド、少なくとも４８〜７２ヌクレオチド、少なくとも７５〜９０ヌクレオチド、そして少なくとも９０〜１３０ヌクレオチドを意味する。ある態様において、生体分子の部分は生物学的活性を有する。本発明の文脈において、ＦＸＹＤ５ポリペプチドフラグメントは、ＦＸＹＤ５ポリペプチド配列全体を含まない。ある態様において、ＦＸＹＤ５フラグメントは天然、全長ＦＸＹＤ５の１個以上の活性を保持する。
【００７４】
本明細書において使用するとき、用語「ＦＸＹＤ５関連細胞／腫瘍／サンプル」等は、非がん様および／または非転移性細胞、サンプル、腫瘍または他の病変と比較してＦＸＹＤ５の差次的発現によって特徴付けられる細胞、サンプル、腫瘍または他の病変を意味する。ある態様において、ＦＸＹＤ５関連細胞、サンプル、腫瘍または他の病変は、非転移性細胞、サンプル、腫瘍または他の病変と比較して、上昇したＦＸＹＤ５発現のエビデンスによって特徴付けられる。
【００７５】
本明細書において使用するとき、用語「抗体」は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、二重機能／二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および標的タンパク質またはそのフラグメントに特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体を意味する。さらに用語「抗体」は、インビボでの治療的抗体遺伝子導入を含む。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦｖを含む抗体フラグメントも本発明によって提供される。
【００７６】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において使用するとき、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体を意味し、すなわち当該集団に含まれるそれぞれの抗体は少量存在する可能性がある天然の変異を除き同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位に指向されている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体製品とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対して指向されている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに生成されるという利点を有する。修飾語「モノクローナル」は、実質的に同種集団の抗体から得られた抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造法を要すると解釈されてはならない。例えば、本発明に使用するモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 [1975]によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって製造されてもよく、また組換えＤＮＡ法によって製造されてもよい（例えば米国特許第4,816,567号参照）。「モノクローナル抗体」はまた、ファージ抗体ライブラリーから、例えばClackson et al.,Nature,352:624628[1991]および Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載の技術を用いて単離することができる。
【００７７】
モノクローナル抗体は本明細書において特に、「キメラ抗体」を含む。これは、所望の生物学的活性を発揮する限り、軽鎖および／または重鎖の一部が特定の種に由来するかまたは特定の抗体集団または亜集団に属する抗体の対応する配列と同一または類似するが、鎖の残りの部分が別の種に由来する抗体または別の抗体集団または亜集団に属する抗体の対応する配列と同一または類似する（米国特許第4,816,567号；および Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）。本発明のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば旧世界猿、類人猿等）に由来する可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む、「霊長類化」抗体を含む。
【００７８】
「抗体フラグメント」は、インタクト（intact）抗体の一部、ある態様においてその抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；リニアー抗体（Zapata et al., Protein Eng.,8(10):1057-1062 (1995)）；一本鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成した多重特異性抗体が含まれる。
【００７９】
「インタクト」抗体は、抗原結合性可変領域と、軽鎖定常領域（ＣＬ）および重鎖定常領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン（例えばヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、インタクト抗体は１種以上のエフェクター機能を有する。
【００８０】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御を含むがこれらに限定されない。
【００８１】
「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に分泌Ｉｇが結合して、これらの細胞傷害エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合して細胞毒素で標的細胞を実質的に殺すことができるようになる、細胞傷害の形態を意味する。抗体は細胞傷害細胞を「武装させ」、そしてかかる殺傷のために必須である。ＡＤＣＣを介在する１次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet、Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)の４６４ページ、表３に要約されている。目的分子のＡＤＣＣ活性を評価するため、米国特許第5,500,362号または第5,821,337号に記載されているもののようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施してもよい。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。これとは別に、またはこれに加えて、目的分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、例えばClynes et al. (USA) 95:652-656 (1998)に記載されているもののような動物モデルで評価してもよい。
【００８２】
「ヒトエフェクター細胞」は、１種以上のＦｃＲを発現し、そしてエフェクター機能を発揮する白血球である。好ましくは、該細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、かつＡＤＣＣエフェクター機能を発揮する。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球を含み；ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞はその天然源、例えば血液またはＰＢＭＣから、本明細書に記載のとおりに単離することができる。
【００８３】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を記述するために使用する。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合するもの（ガンマ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体、ならびにこれらの受容体の対立遺伝子多型および別のスプライシング形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、細胞質ドメインが第１に異なる類似アミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（M. in Daron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)の概説を参照されたい）。ＦｃＲはRavetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)； Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；および de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330- 41 (1995)に概説されている。将来に同定されるものを含む他のＦｃＲが、本明細書において、「ＦｃＲ」に包含される。該用語はまた、母体のＩｇＧの胎児への移動に関与する新生児受容体、ＦｃＲｎも含む（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) および Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）。
【００８４】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を意味する。補体活性化経路は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）と、同種抗原と複合化した分子（例えば抗体）の結合によって開始する。補体活性化を評価するため、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のとおりに実施してもよい。
【００８５】
本明細書において使用するとき、用語「エピトープ」は、ポリペプチドの抗原性決定部分を意味する。ある態様において、エピトープは該エピトープに固有の空間配置に３個以上のアミノ酸を含み得る。ある態様において、エピトープは直線または立体構造エピトープである。一般に、エピトープは少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、そして少なくとも１２個のアミノ酸からなり、より通常、少なくとも８〜１０個のアミノ酸からなる。アミノ酸の空間配置を決定する方法は当該技術分野において既知であり、例えばＸ線結晶学および２次元核磁気共鳴を含む。
【００８６】
用語「アンタゴニスト」は、最も広範な意味で使用され、本明細書に記載の腫瘍細胞抗原の生物学的活性を部分的または完全に阻止し、阻害し、または中和するあらゆる分子を含む。同様に、用語「アゴニスト」は、最も広範な意味で使用され、本明細書に記載の腫瘍細胞抗原の生物学的活性を模倣するあらゆる分子を含む。好適なアゴニスト分子またはアンタゴニスト分子は特に、アゴニストまたはアンタゴニスト抗体または抗体フラグメント、腫瘍細胞抗原のフラグメントまたはアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子有機分子等を含む。腫瘍細胞抗原のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法は、目的の抗原を発現する腫瘍細胞と候補アゴニストまたはアンタゴニスト分子を接触させて、通常は腫瘍細胞抗原に関連する、１種以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定することからなり得る。アンタゴニストはまた、合理的設計またはファージディスプレイによって生産したペプチドであってもよい（例えば、１９９８年８月１３日公開のWO98/35036参照）。１つの態様において、選択分子は「ＣＤＲ模倣物」または抗体のＣＤＲに基づいて設計した抗体アナログであってよい。かかるペプチドはそれ自体アゴニストであってよいが、該ペプチドは所望により、細胞傷害剤と融合させてペプチドのアンタゴニスト特性を追加または向上させてもよい。
【００８７】
本明細書において使用するとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の結合したヌクレオチド残基を意味する。オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチドはＤＮＡ配列の一部を含み、少なくとも約１０ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド以下を有する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは化学的に合成してもよく、またプローブとして使用してもよい。ある態様において、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。ある態様において、オリゴヌクレオチドは二本鎖の少なくとも一部を含む。ある態様において、オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。ある態様において、オリゴヌクレオチドはＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド（ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）である。
【００８８】
本明細書において使用するとき、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、ＦＸＹＤ５の転写または翻訳に関連するポリヌクレオチド配列（例えばＦＸＹＤ５ポリヌクレオチドのプロモーター）を含む、ＦＸＹＤ５ポリヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有する非修飾または修飾核酸を意味し、該アンチセンスポリヌクレオチドは、ＦＸＹＤ５ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる。特に興味のあるものは、インビトロまたはインビボでＦＸＹＤ５ポリペプチドコードポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を阻害することができるアンチセンスポリヌクレオチドである。
【００８９】
本明細書において使用するとき、用語「ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド」、「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」、「低分子干渉ＲＮＡ」、または「ｓｉＲＮＡ」は、相互交換可能に使用され、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とも知られる転写後遺伝子サイレンシングに関与するオリゴヌクレオチドを意味する。該用語は、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」が可能な分子を意味する（Kreutzer et al., WO 00/44895；Zernicka-Goetz et al. WO 01/36646；Fire、WO 99/32619；Mello and Fire、WO 01/29058参照)。ｓｉＲＮＡ分子は一般にＲＮＡ分子であるが、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに含む。ｓｉＲＮＡ遺伝子ターゲッティング実験は、細胞への一時的ｓｉＲＮＡ移入によって実施する（リポソーム介在トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションのような常套の方法で実施する）。ｓｉＲＮＡ分子は、通常はＲＮＡｉを開始する長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のＲＮアーゼＩＩＩプロセッシング生成物に類似した、特徴的な２〜３ヌクレオチド３’オーバーハング末端を有する２１〜２３ヌクレオチドＲＮＡである。
【００９０】
本明細書において使用するとき、用語「治療上有効量」は、治療上有効量の医薬を個体に投与したとき、該個体の１種以上の臨床的エンドポイント、がん細胞の増殖および／または生存またはがん細胞の転移の減少または逆転として観察される薬効が生じる医薬の量を意味する。治療上有効量は、典型的には、有効成分を含まない組成物を同じ状況の個体に投与したとき観察される効果と比較した効果によって決定される。ある対象についての正確な有効量は、対象のサイズ、健康、状態の性質および程度、ならびに投与に選択した治療剤または治療剤の組合せに依存する。しかし、ある状況についての有効量は、平常の実験によって決定され、臨床医の判断の範囲内である。
【００９１】
本明細書において使用するとき、用語「組合せ」または「組み合わせる」は、他の治療レジメンと共に本発明のＦＸＹＤ５調節剤を投与することを意味する。
【００９２】
本明細書において使用するとき、用語「受容性」は、ＦＸＹＤ５治療が受け入れられる処置方法である患者、すなわち陽性に応答する可能性がある患者を意味する。ＦＸＹＤ５治療に受容性であるがん患者は、ＦＸＹＤ５治療に受容性でない患者と比較して、高レベルのＦＸＹＤ５を発現する。ＦＸＹＤ５治療に良好な候補ではないがん患者は、がん細胞中またはがん細胞上においてＦＸＹＤ５レベルを欠くか、またはそれが低い腫瘍サンプルを有するがん患者を含む。
【００９３】
本明細書において使用するとき、用語「検出」は、活性（例えば遺伝子発現）または生体分子（例えばポリペプチド）のエビデンスを確立し、発見し、または確認することを意味する。
【００９４】
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するものである。かかる天然配列ポリペプチドは、自然界から単離することができるか、または組換えもしくは合成的手法によって作成することができる。したがって、天然配列ポリペプチドは、天然に生じるヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、または何れか他の生物種由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。
【００９５】
用語「アミノ酸配列変異体」は、天然配列ポリペプチドとある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。通常、アミノ酸配列変異体は、天然リガンドの少なくとも１個の受容体結合ドメインまたは天然受容体の少なくとも１個のリガンド結合ドメインと少なくとも約７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％相同性を有する。アミノ酸配列変異体は、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列中のある位置に置換、欠失および／または挿入を有する。
【００９６】
本明細書において使用するとき、用語「相同ヌクレオチド配列」もしくは「相同アミノ酸配列」またはそれらの変形は、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルで、少なくとも特定のパーセンテージの相同性によって特徴付けられる配列を意味し、「配列同一性」と相互交換可能に使用される。相同ヌクレオチド配列は、タンパク質のアイソフォームをコードする配列を含む。かかるアイソフォームは、例えば別のＲＮＡスプライシングによって、同じ生物種の異なる組織で発現し得る。あるいは、アイソフォームは別の遺伝子によってコードされていてもよい。相同ヌクレオチド配列は、哺乳類を含むがこれに限定されないヒト以外の種のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９７】
相同ヌクレオチド配列は、天然に生じる対立遺伝子変異型および本明細書に記載のヌクレオチド配列の突然変異型も含むが、これらに限定されない。相同アミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列、および該ポリペプチドが同じ結合および／または活性を有するものを含む。ある態様において、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、野生型配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有しているとき、相同である。ある態様において、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０または５０−６０個のヌクレオチド／アミノ酸置換、付加または欠失を有するとき、相同である。ある態様において、相同アミノ酸配列は５個以下（例えば５個またはそれ未満）、または３個以下（例えば３個またはそれ未満）の保存的アミノ酸置換を有する。相同アミノ酸配列はまた、保存的アミノ酸置換を含み、かつ該ポリペプチドが天然ＦＸＹＤ５と同じ結合および／または活性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＦＸＹＤ５ホモログの変化した発現レベルはがんの指標である。
【００９８】
相同率または同一性率は、例えばSmith and Watermanのアルゴリズム(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489)を用いるＧａｐプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNDC, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI)で、初期設定を用いて測定することができる。ある態様において、プローブと標的間の相同性は、約７０％〜約８０％である。ある態様において、核酸は配列番号：１またはその一部と約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％および約１００％の相同性であるヌクレオチドを有する。
【００９９】
相同性はまた、ポリペプチドレベルであってもよい。ある態様において、ポリペプチドは配列番号：２またはその一部と約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％および約１００％相同である。
【０１００】
本明細書において使用するとき、用語「プローブ」は、多様な長さの核酸配列を意味する。ある態様において、プローブは少なくとも約１０ヌクレオチド、約６，０００ヌクレオチド以下を含む。ある態様において、プローブは少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０または少なくとも７５連続ヌクレオチドを含む。プローブは、同一、類似または相補的核酸配列の検出に使用する。より長いプローブは、通常天然または組換え源から得られ、標的配列に高度に特異的であり、そしてオリゴマーよりもゆっくりと標的にハイブリダイズする。プローブは一本鎖または二本鎖であってよく、ＰＣＲ、膜利用ハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するように設計する。
【０１０１】
本明細書において使用するとき、用語「混合」は、１個以上の化合物、細胞、分子等を同じ領域で混合するプロセスを意味する。これは例えば、試験管、ペトリ皿または１個以上の化合物、細胞または分子を混合することができるあらゆる容器中で実施することができる。
【０１０２】
本明細書において使用するとき、用語「単離」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体が天然に生じる環境とは別の環境に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体または宿主細胞を意味する。細胞を単離する方法は当業者に周知である。単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体は、一般に、実質的に精製されている。
【０１０３】
本明細書において使用するとき、用語「実質的に精製」は、天然環境から採取された化合物（例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは抗体）を意味し、本来関連している他の成分を少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％含まない。
【０１０４】
本明細書において使用するとき、用語「結合」は、２個以上の生体分子または化合物間の物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン性、非イオン性、水素結合、ファンデルワールス、疎水性相互作用等を含む。結合は直接または間接であってよく、間接結合は他の生体分子または化合物を介するか、またはその影響のためである。直接結合は他の分子または化合物を介さず、またはその影響のためではなく生じる相互作用を意味するが、他の実質的な化学中間体を含まない。
【０１０５】
本明細書において使用するとき、用語「接触」は、ある分子を第２の分子に物理的に、直接または間接的に近づけることを意味する。該分子はバッファー、塩、溶液等の何れかの中に存在していてもよい。「接触」は、例えば核酸分子を含むビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ等にポリヌクレオチドを入れることを含む。接触はまた、例えばポリペプチドを含むビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ等に抗体を入れることを含む。接触は、インビボ、エクスビボまたはインビトロで実施してよい。
【０１０６】
本明細書において使用するとき、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが標的配列に結合するが、他の配列にはほとんど結合しない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存し、状況が変われば異なる。より長い配列はより高温でその適切な相補鎖に特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択する。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列と平衡状態でハイブリダイズする温度である（所定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍで５０％のプローブが、平衡状態でその相補鎖にハイブリダイズする。典型的に、ストリンジェントな条件は、塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０Ｍ、ｐＨ７．０〜８．３であり、温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば１０〜５０オリゴヌクレオチド）について少なくとも約３０℃、長いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドについて少なくとも約６０℃であるものである。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような脱安定化剤を加えて得ることもできる。
【０１０７】
本明細書において使用するとき、用語「緩やかなストリンジェンシー条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列には限られた数がハイブリダイズする条件を意味する。緩やかな条件は配列に依存し、状況が変われば異なる。緩やかな条件は当該技術分野において周知であり、特にManitatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 2nd Edition (December 1989))に記載されている。
【０１０８】
本明細書に記載の核酸組成物は、例えば、生物学的サンプル（例えばヒト細胞抽出物）のｍＲＮＡまたはかかるサンプルから生産されたｃＤＮＡの検出用プローブとしてのポリペプチドを作成するため、該ポリヌクレオチドのさらなるコピーを作成するため、リボザイムまたはオリゴヌクレオチド（一本鎖または二本鎖）を作成するため、そして一本鎖ＤＮＡプローブまたは三本鎖形成オリゴヌクレオチドとして使用することができる。本明細書に記載のプローブは、例えばサンプル中の本明細書に記載のポリペプチドの有無を測定するために使用することができる。該ポリペプチドは、がんに関連したポリペプチドに特異的な抗体を作成するために使用することができ、したがって該抗体は本明細書に詳細に記載されるように、診断方法、予後診断方法等に有用である。ポリペプチドはまた、本明細書により詳細に記載されるように、治療的介入のための標的として有用である。本発明の抗体はまた、例えば、インビトロおよびインビボ診断方法および治療方法の両方を含め、本発明のポリペプチドを精製し、検出し、そして標的とするために使用することができる。例えば、該抗体は、生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおいて有用である。例えば、Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)を参照されたい。これらおよび他の使用は、以下により詳細に記載されている。
【０１０９】
本明細書において使用するとき、用語「イメージング剤」は、本発明の抗体、低分子またはプローブに結合し、当該技術分野において既知の技術を用いて検出可能である組成物を意味する。本明細書において使用するとき、用語「遺伝子発現のエビデンス」は、遺伝子が発現していることを示す何れかの測定可能な指標を意味する。
【０１１０】
用語「薬学的に許容される担体」は、抗体またはポリペプチド、遺伝子および他の治療剤のような治療剤を投与するための担体を意味する。該用語は、それ自体が組成物を投与された個体に有害な抗体の生産を誘導することなく、過度の毒性なく投与することができる何れかの医薬担体を意味する。好適な担体は、大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳糖、ポリグリコール酸、ポリマー状アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体、および不活性ウイルス粒子であり得る。かかる担体は当業者に周知である。治療用組成物の薬学的に許容される担体は、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含んでいてもよい。湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質等の補助物質も、かかるビークルに存在していてよい。
【０１１１】
本発明の方法および組成物によって処置することができるがんの具体的な例は、ＦＸＹＤ５に関連したがんを含むが、これらに限定されない。本明細書において使用するとき、「ＦＸＹＤ５に関連したがん」は、非がん様細胞と比較してＦＸＹＤ５を差次的に発現する細胞によって特徴付けられるがんを意味する。本発明はまた、ＦＸＹＤ５ががん細胞成長、腫瘍形成、がん細胞増殖、がん細胞転移、細胞移動、血管形成、ＦＸＹＤ５シグナル伝達、細胞間接着、細胞間相互作用、ＦＸＹＤ５介在性細胞−細胞膜間相互作用、ＦＸＹＤ５介在性細胞−細胞外マトリックス間相互作用、インテグリン介在性活性、ＦＸＹＤ５表面発現およびＦＸＹＤ５発現に関与する何れかの腫瘍細胞型に適用することができる。ある態様において、がんは結腸がん、乳がん、皮膚がん、食道がん、肝臓がん、膵臓がん、前立腺がん、子宮がん、子宮頸がん、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、多発性骨髄および黒色腫である。ある態様において、がんはＥＲ陽性乳がんである。ある態様において、がんはＥＲ−陰性乳がんである。ある態様において、かかるがんは、対照と比較して少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％または少なくとも約３００％のＦＸＹＤ５の差次的発現を示す。
【０１１２】
本発明は、ＦＸＹＤ５過剰発現に関連した疾患および障害の処置、阻害および管理、ならびにかかる疾患および障害の症状の処置、阻害および管理を提供する方法および組成物を提供する。本発明のいくつかの態様は、がん転移、がん細胞増殖、がん細胞成長およびがん細胞侵襲を含むがこれらに限定されないがんを処置し、阻害しまたは管理する方法および組成物に関する。
【０１１３】
本発明はさらに、本発明のＦＸＹＤ５調節剤と組み合わせた他の有効成分を含む方法を提供する。ある態様において、該方法はさらに、患者に１種以上の常套のがん治療剤を投与することを含む。ある態様において、本発明の方法はさらに、患者を１種以上の化学療法、放射線療法または外科手術で処置することを含む。例えば、ある態様において、本発明は、ＦＸＹＤ５調節剤と組合せて、メトトレキセートおよび／またはドキソルビシンで患者を処置する。
【０１１４】
本発明はまた、外科手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法および生物学的治療のような現行または標準のがん処置に部分的または完全に難治性になったがんまたは他の過増殖性細胞障害または疾患の処置、阻害または管理のための方法および組成物を提供する。
【０１１５】
本発明はまた、本発明のＦＸＹＤ５調節剤、特にＦＸＹＤ５抗体を用いてがんを診断し、および／またはがんの進行を予測する診断方法および／またはイメージング方法を提供する。ある態様において、本発明は、腫瘍および／または転移をイメージングおよび局在化する方法、ならびに診断方法および予後診断方法を提供する。ある態様において、本発明は、ＦＸＹＤ５関連治療の妥当性を評価する方法を提供する。
【０１１６】
ＦＸＹＤ５調節剤
本発明は、特にがんの処置、診断、検出またはイメージングのためのＦＸＹＤ５調節剤を提供する。ＦＸＹＤ５調節剤はまた、がんの処置用医薬の製造にも有用である。
【０１１７】
ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤はオリゴヌクレオチド、低分子、模倣物、デコイ、または抗体である。ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は、対照と比較して少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％ＦＸＹＤ５生物学的活性を阻害する。ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は対照と比較して少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％ＦＸＹＤ５発現を阻害する。
【０１１８】
抗体
ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、またはＦａｂフラグメントである。抗体は例えば酵素、ラジオアイソトープまたは蛍光色素で標識されていてもよい。ある態様において、抗体はＦＸＹＤ５以外のポリペプチドに対して約１×１０５Ｋａ未満の結合親和性を有する。ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は少なくとも１×１０８Ｋａの親和性でＦＸＹＤ５と結合するモノクローナル抗体である。
【０１１９】
本発明はまた、例えばイムノアッセイを用いた競合的結合を検出するための何れかの既知の方法によって測定したとき、抗体と本発明のエピトープの結合を競合的に阻害する抗体を提供する。ある態様において、該抗体はエピトープとの結合を少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％または少なくとも５０％阻害する。
【０１２０】
ある態様において、抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は多様な方法、例えば以下の方法によって得ることができる：（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワークおよび定常領域に移植すること（当該技術分野で「ヒト化」と呼ばれる工程）または、（２）非ヒト変異ドメイン全体を移植するが、それをヒト様表面で表面残基を置換して「覆う」(cloaking）こと（当該技術分野で「貼合せ」と呼ばれる工程）。本発明において、ヒト化抗体は「ヒト化」および「貼合せ」抗体のいずれをも含む。同様に、ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えばマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入して製造することができる。チャレンジによって、ヒト抗体製造が観察され、これは遺伝子配置、集合および抗体レパートリーを含むあらゆる点でヒトに見られるものと極めて類似している。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号および次の科学文献：Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)；Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A., 81:6851-6855 (1984)；Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)；Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988)；Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991)；Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169-217 (1994)；およびKettleborough, CA. et al., Protein Eng. 4(7):773-83 (1991)に記載されている（各々参照により本明細書に引用する）。
【０１２１】
本発明の抗体は、多様なメカニズムで機能し得る。ある態様において、抗体は、抗体標的細胞に対する溶解攻撃である抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を惹起する。ある態様において、抗体は例えば、抗原結合、アポトーシス誘導、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含む複数の治療機能を有する。
【０１２２】
ある態様において、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。例えばある態様において、本発明は、ＦＸＹＤ５とリガンド間の相互作用を部分的または完全に阻止する抗体を提供する。ある態様において、本発明の抗体は、本明細書に記載のエピトープまたはその一部と結合する。ある態様において、抗体の非存在下での活性と比較して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％または少なくとも５０％リガンド活性または受容体活性を調節する抗体を提供する。
【０１２３】
ある態様において、ＦＸＹＤ５抗体は次の活性の１種以上を仲介する：Ｅ−カドヘリン発現または活性の上方制御、Ｎａ／ＡＴＰアーゼ活性の調節、がん細胞成長の阻害、腫瘍形成の阻害、がん細胞生存の阻害、がん細胞増殖の阻害、がん細胞転移の阻害、細胞移動の阻害、ＦＸＹＤ５介在性シグナル伝達の阻害、細胞間接着の増加、アクチンの調節、ＦＸＹＤ５リガンドと結合するＦＸＹＤ５の阻害、血管形成の阻害、細胞外マトリックスとの細胞相互作用の阻害、およびがん細胞アポトーシスの上方制御。
【０１２４】
ある態様において、本発明は、中和抗体を提供する。ある態様において、中和抗体は、受容体アンタゴニストとして作用し、すなわちリガンド介在性受容体活性化の生物学的活性の全てまたはサブセットを阻害する。ある態様において、該抗体は、本明細書に記載の本発明のペプチドの特定の生物学的活性を含む、生物学的活性のアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして特定され得る。
【０１２５】
本発明の抗体は、単独で、または化学療法剤のような他の組成物との組合せで使用することができる。抗体はさらに、異種ポリペプチドとＮまたはＣ末端で組換え的に融合しているか、またはポリペプチドまたは他の組成物と化学的に複合化（共有コンジュゲートおよび非共有コンジュゲートを含む）されていてもよい。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおいて標識として有用な分子、および異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種または毒物のようなエフェクター分子と組換え的に融合または複合化していてよい。例えば、ＰＣＴ公報WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624、米国特許第5,314,995号、および EP 396,387を参照されたい。
【０１２６】
キメラ抗体およびヒト化抗体に加えて、完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウス（例えば、米国特許第6,075,181号、第6,091,001号および第6,114,598号参照、全て参照により本明細書に引用する）またはヒト免疫グロブリン遺伝子のファージディスプレイライブラリー（例えば、McCafferty et al., Nature, 348 552-554 (1990)、 Clackson et al., Nature, 352 624-628 (1991)および Marks et al., J. Mol. Biol., 222 581-597 (1991) 参照）に由来し得る。ある態様において、抗体はｓｃＦｖ−ファージディスプレイライブラリーによって作成および同定することができる。抗体ファージディスプレイ技術は、商業的起源、例えばＸｏｍａ(Berkeley、CA)から入手することができる。
【０１２７】
モノクローナル抗体は、Kohler et al (1975) Nature 256 495-496の方法またはその変法を用いて作成することができる。典型的には、抗原を含む溶液でマウスを免疫化する。免疫化は、食塩水、好ましくはアジュバント、例えばフロイント完全アジュバント中に抗原含有溶液を混合または乳化し、該混合物またはエマルジョンを非経腸的に注射して実施することができる。当該技術分野において既知の何れかの免疫化方法を用いて、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。動物を免疫化した後、脾臓（および所望により多様な大きさのリンパ節）を採取して、１種類の細胞に単離する。目的の抗原でコーティングしたプレートまたはウェルに細胞懸濁液を適用して脾臓細胞をスクリーニングしてもよい。抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞はプレートと結合し、濯ぎ流されない。得られたＢ細胞または全単離脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成し、選択培地で培養する。得られた細胞を連続希釈または限定希釈によって播種し、目的の抗原と特異的に結合する（そして無関係の抗原には結合しない）抗体の生産についてアッセイする。選択したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌するハイブリドーマは、次いでインビトロ（例えば、組織培養ボトルまたは中空糸反応器）またはインビボ（マウスの腹水として）で培養する。
【０１２８】
発現のためのハイブリドーマの使用とは別の方法として、抗体は、米国特許第5,545,403号、第5,545,405号および第5,998,144号（各々参照により本明細書に引用する）に記載のように、ＣＨＯまたは骨髄腫細胞系のような細胞系で作製することができる。簡潔には、軽鎖と重鎖を発現することができるベクターをそれぞれ細胞系にトランスフェクトする。別のベクター上の２種のタンパク質をトランスフェクトすると、キメラ抗体が作成され得る。Immunol. 147 8, Banchereau et al. (1991) Clin. Immunol. Spectrum 3:8、およびBanchereau et al. (1991) Science 251: 70（これらは全て、参照により本明細書に引用する）。
【０１２９】
ヒト抗体はまた、当該技術分野において既知の技術、例えばファージディスプレイライブラリー[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]を用いて作成してもよい。ヒトモノクローナル抗体の製造には、Cole et al.およびBoerner et al.の技術も利用可能である[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) および Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86 95 (1991)]。ヒト化抗体は、例えば（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワークおよび定常領域に移植すること（当該技術分野で「ヒト化」と呼ばれる工程）または、（２）非ヒト変異ドメイン全体を移植するが、それをヒト様表面で表面残基を置換して「覆う」(cloaking）こと（当該技術分野で「貼合せ」と呼ばれる工程）を含む多様な方法で得てもよい。本発明において、ヒト化抗体は「ヒト化」および「貼合せ」抗体のいずれをも含む。同様に、ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えばマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入して製造することができる。チャレンジによって、ヒト抗体製造が観察され、これは遺伝子配置、集合および抗体レパートリーを含むあらゆる点でヒトに見られるものと極めて類似している。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号および次の科学文献：Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)；Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A., 81:6851-6855 (1984)；Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)；Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988)；Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991)；Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169-217 (1994)；およびKettleborough, CA. et al., Protein Eng. 4(7):773-83 (1991)に記載されている（各々参照により本明細書に引用する）。完全ヒト化抗体は、Morphosys (Martinsried/Planegg, Germany)のような商品を用いたスクリーニングアッセイにおいて同定することができる。
【０１３０】
用語「相補性決定領域」は、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を共に定義するアミノ酸配列を意味する。例えばChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)； Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services NIH Publication No. 91-3242 (1991)参照。用語「定常領域」は、エフェクター機能を与える抗体分子の部分を意味する。本発明において、マウス定常領域はヒト定常領域によって置換される。対象ヒト化抗体の定常領域はヒト免疫グロブリン由来である。重鎖定常領域は５つのアイソタイプ：アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマまたはミューから選択され得る。抗体をヒト化する一つの方法は、非ヒト重鎖および軽鎖配列をヒト重鎖および軽鎖配列と整列させ、選択し、そしてかかるアラインメント、ヒト化配列のコンホメーションを予測する分子モデリングおよび親抗体のコンホメーションとの比較に基づき、非ヒトフレームワークをヒトフレームワークで置換することを含む。このプロセスの後、ヒト化配列モデルの予測コンホメーションが親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲのコンホメーションとほぼ近似するまで、ＣＤＲの構造を障害するＣＤＲ領域の残基の復帰変異を反復する。かかるヒト化抗体はさらに誘導化して、例えばAshwell受容体による取り込みおよびクリアランスを促進することができる。例えば米国特許第5,530,101号および第5,585,089号（参照により本明細書に引用する）参照。
【０１３１】
ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作するトランスジェニック動物を用いて製造することができる。例えば、WO 98/24893はヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物であって、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の不活性化のために機能的内因性免疫グロブリンを生産しない動物を開示している。WO 91/10741はまた、免疫原に対する免疫応答を付加することができるトランスジェニック非霊長類哺乳類宿主であって、抗体が霊長類定常領域および／または可変領域を有しており、そして内因性免疫グロブリンコード化遺伝子座が置換または不活性化されている宿主を開示している。WO 96/30498は、哺乳類における免疫グロブリン遺伝子座を修飾するための、例えば定常または可変領域の全てまたは一部を置換して修飾抗体分子を形成するためのCre/Loxシステムの使用を開示している。WO 94/02602は、不活性化された内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳類宿主を開示している。米国特許第5,939,598号は、マウスが内因性重鎖を欠いており、１個以上の異種定常領域を含む異種免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを製造する方法を開示している。本発明の抗体はまた、米国特許第5,766,886号に記載されているようなヒト化操作技術を用いて作成してもよい（参照により本明細書に引用する）。
【０１３２】
上記トランスジェニック動物を用いて、免疫応答を作成して抗原分子を選択することができ、そして抗体産生細胞を動物から除去してヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを製造するために使用することができる。免疫化プロトコル、アジュバント等は当業者に既知であり、例えばWO 96/33735に記載のトランスジェニックマウスの免疫化に用いる。モノクローナル抗体は対応するタンパク質の生物学的活性を阻害または中和する能力について試験することができる。
【０１３３】
本発明の抗体は、Fang et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23, 584-590に記載のように、インビボ治療抗体遺伝子トランスファーによって対象に投与することができる。例えば組換えベクターを作成して、ＭＡｂ重鎖と軽鎖コーディング配列間に位置するポリペプチドの酵素非依存性共翻訳的自己切断を仲介するペプチドからなる、多シストロン発現カセットを送達することができる。発現は化学量論量の両方のＭＡｂ鎖を与える。酵素非依存性共翻訳的自己切断を仲介するペプチドの好ましい例は、口蹄疫由来２Ａペプチドである。
【０１３４】
全長抗体の所望の親和性を保持している限り、抗体のフラグメントは、本発明の方法での使用に好適である。したがって、抗ＦＸＹＤ５抗体のフラグメントは、ＦＸＹＤ５との結合能を保持している。かかるフラグメントは、対応する全長抗ＦＸＹＤ５抗体と類似の特性によって特徴付けられ、すなわち該フラグメントはヒト細胞表面で発現するヒトＦＸＹＤ５抗原と特異的に結合する。
【０１３５】
ある態様において、本抗体はＦＸＹＤ５の細胞外ドメインの１個以上のエピトープと結合する。ある態様において、本抗体は、ＦＸＹＤ５関連生物学的活性の１種以上を調節する。ある態様において、本抗体はがん細胞成長、腫瘍形成およびがん細胞増殖の１種以上を阻害する。
【０１３６】
ある態様において、本抗体はＦＸＹＤ５の細胞外ドメインの１個以上のエピトープと結合するモノクローナル抗体である。
【０１３７】
本発明の好適な抗体は、直線エピトープまたは立体配置エピトープ、またはそれらの組合せを認識し得る。
【０１３８】
本発明の抗体が結合し得る他の潜在的エピトープを予測する方法は、当該技術分野において周知であり、Kyte-Doolittle 分析(Kyte, J. and Dolittle, R.F., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132)、Hopp and Woods分析 (Hopp, T.P. and Woods, K.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:3824-3828; Hopp, T.J. and Woods, K.R., Mol. Immunol. (1983) 20-483-489; Hopp, T.J., J. Immunol. Methods (1986) 88:1-18.)、Jameson-Wolf 分析 (Jameson, B.A. and Wolf, H., Comput. Appl. Biosci. (1988) 4:181-186.)、およびEmini 分析(Emini, E.A., Schlief, W.A., Colonno, RJ. and Wimmer, E., Virology (1985) 140:13-20)を含むが、これらに限定されない。
【０１３９】
ある態様において、潜在的エピトープは理論上の細胞ドメインによって同定する。TMpred (K. Hofinann & W. Stoffel (1993) TMbase - A database of membrane spanning proteins segments Biol. Chem. Hoppe- Seyler 374, 166参照) またはTMHMM (A. Krogh, B. Larsson, G. von Heijne, and E. L. L. Sonnhammer. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model- Application to complete genomes. Journal of Molecular Biology, 305(3):567-580, January 2001)のような分析アルゴリズムを用いて、かかる予測を実施してもよい。SignalP 3.0 (Bednsten et al., (2004) J. Mol. Biol. 2004 Jul 16;340(4):783-95)のような他のアルゴリズムを用いて、シグナルペプチドの存在を予測し、該ペプチドが全長タンパク質のどこから切断されるかを予測することができる。細胞の外側に存在するタンパク質の部分は、抗体相互作用の標的として使用してもよい。
【０１４０】
１）抗体が結合活性の閾値レベルを示し、そして／または２）抗体が既知の関連ポリペプチド分子と顕著に交叉反応しないとき、該抗体は「特異的に結合する」と定義される。抗体の結合親和性は当業者によって、例えばScatchard分析(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949)によって容易に測定することができる。ある態様において本発明の抗体は、標的がん関連ポリペプチドの標的エピトープまたは模倣デコイと少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍またはそれ以上結合する。
【０１４１】
ある態様において、本抗体は、１０−４Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−９Ｍ以下の高い親和性、またはサブナノモルの親和性（０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｎＭまたはそれ未満）で結合する。ある態様において、ＦＸＹＤ５に対する本抗体の結合親和性は、少なくとも１×１０６Ｋａである。ある態様において、ＦＸＹＤ５に対する本抗体の結合親和性は、少なくとも１×１０６Ｋａ、少なくとも１×１０７Ｋａ、少なくとも２×１０７Ｋａ、少なくとも１×１０８Ｋａまたはそれ以上である。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに対する結合親和性の点で記載または特定してもよい。ある態様において、結合親和性は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、１０−１５Ｍ未満、またはそれ未満のＫｄを有するものを含む。
【０１４２】
ある態様において、本発明の抗体は、例えば標準的なウェスタンブロット分析（Ausubel et al.）を用いてＦＸＹＤ５ポリペプチドと結合するが、既知の関連ポリペプチド（例えば他のＦＸＹＤ群ポリペプチド）と結合しないとき、既知の関連ポリペプチド分子と結合しない。
【０１４３】
ある態様において、本発明の抗体は、ＦＸＹＤ５のオルソログ、ホモログ、パラログまたは変異体、またはその組合せおよび下位組合せと結合する。ある態様において、本発明の抗体は、ＦＸＹＤ５のオルソログ、ホモログ、パラログまたは変異体、またはその組合せおよび下位組合せと結合しない。
【０１４４】
ある態様において、抗体は既知の関連ポリペプチドに対してスクリーニングして、ＦＸＹＤ５ポリペプチドと特異的に結合する抗体群を単離してもよい。例えば、ヒトＦＸＹＤ５ポリペプチドに特異的な抗体は、適切なバッファー条件下で不溶性マトリックスと接着するＦＸＹＤタンパク質（ＦＸＹＤ５を除く）を含むカラムを流れる。かかるスクリーニングによって、密接に関連したポリペプチドと非交叉反応性のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を単離することができる（Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995）。特異的抗体のスクリーニングおよび単離は、当該技術分野において周知である（Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J. W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984参照）。かかるアッセイの代表例は、同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、放射性免疫沈降法、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットまたはウェスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイおよびサンドイッチアッセイを含む。
【０１４５】
ある態様において、本発明の抗体は、Ｔｈｒ１９−Ａｌａ３３（配列番号：３）、Ｌｅｕ５４−Ａｓｐ８２（配列番号：４）、Ｐｒｏ８９−Ａｌａ９７（配列番号：５）、Ｐｒｏ１００−Ｌｙｓ１２５（配列番号：６）、Ｓｅｒ１２７−Ｐｈｅ１３５（配列番号：７）から選択されるＦＸＹＤ５のエピトープと特異的に結合しない。ある態様において、本抗体は、Shimamura et al., J. Clin. Oncol., 21:659, 2003に記載のｍＡｂｓ  ＮＣＣ−３Ｇ１０またはＮＣＣ−Ｍ５３によって結合するエピトープ以外のＦＸＹＤ５のエピトープと結合する。
【０１４６】
本発明はまた、標的タンパク質に特異的なＳＭＩＰまたは結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体を提供する。これらの構築物は、抗体エフェクター機能を実施するために必要な免疫グロブリンドメインと融合した抗原結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドを含む。例えば、WO03/041600、米国特許公報20030133939および米国特許公報20030118592参照。
【０１４７】
ある態様において、本発明の抗体は中和抗体である。ある態様において、抗体はターゲッティング抗体である。ある態様において、抗体は標的との結合によって内部化された（internalized）抗体である。ある態様において、抗体は標的との結合によって内部化されず、表面に残る。
【０１４８】
本発明の抗体は、問題の腫瘍細胞抗原との結合によって速やかに内部化する能力について、または結合後細胞表面に残る能力についてスクリーニングしてもよい。ある態様において、例えばあるタイプの免疫複合体の構成において、毒性部分の放出に内部化が必要であるとき、抗体の内部化能力が望まれ得る。あるいは、抗体がＡＤＣＣまたはＣＤＣを促進するために使用されるとき、細胞表面に残ることがより望まれ得る。スクリーニング方法は、これらのタイプの行動を分類するために使用することができる。例えば、腫瘍細胞抗原を有する細胞は、濃度約１μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ１（対照抗体）または本発明の抗体の１種と、氷上（内部化を阻止するために０．１％ナトリウムアジドと共に）または３７℃（ナトリウムアジドの非存在下）で３時間、該細胞をインキュベートしたとき、使用することができる。該細胞を次いで、冷染色バッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％ナトリウムアジド）で洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣで３０分間、氷上で染色する。幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）をFACS Caliburで記録する。氷上、ナトリウムアジドの存在下で本発明の抗体とインキュベートした細胞と、ナトリウムアジドの非存在下、３７℃でインキュベートした細胞間でＭＦＩに差が見られないとき、該抗体は内部化されずに、細胞表面に結合したままであるものであると推測される。しかし、３７℃、ナトリウムアジドの非存在下で細胞をインキュベートしたとき、表面の染色され得る抗体の減少が観察されるならば、該抗体は内部化し得るものと推測される。
【０１４９】
抗体複合体
ある態様において、本発明の抗体は複合化することができる。ある態様において、複合化抗体はがん治療、がんの診断またはがん様細胞のイメージングに有用である。
【０１５０】
診断適用のために、本抗体は典型的に、検出可能なもので標識化する。多様な標識が利用可能であり、一般に次のカテゴリーに分類することができる：
(a) 次に記載のもののような放射性核種。抗体は例えば、Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2、Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N. Y., Pubs. (1991)に記載の技術を用いてラジオアイソトープで標識することができる。例えば放射活性はシンチレーションカウンティングを用いて測定することができる。
(b) 希土類キレート（ユーロピウムキレート）または蛍光色素およびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリンおよびTexas Redのような蛍光標識を用いることができる。蛍光ラベルは、例えば上記Current Protocols in Immunologyに記載の技術を用いて抗体と複合化することができる。蛍光は蛍光光度計を用いて定量することができる。
(c) 多様な酵素−基質標識が利用可能であり、米国特許第4,275,149号はこれらのいくつかの概説を提供する。酵素は一般に、多様な技術を用いて測定可能な発色基質の化学的変化を触媒する。例えば、酵素は基質の色の変化を触媒することがあり、これは分光光度計で測定することができる。あるいは、酵素は基質の蛍光または化学発光を変化させることもある。蛍光の変化を定量するための技術は上記している。化学発光基質は化学反応によって電気的に励起し、測定可能な（例えば化学発光計を用いて）光を放出するか、または蛍光アクセプターにエネルギーを供与する。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（例えばホタルルシフェラーゼまたは細菌ルシフェラーゼ; 米国特許第4,737,456号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸エステルデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばホースラディッシュ ペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ヘテロ環オキシダーゼ（例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等を含む。酵素と抗体を複合化する技術は、O’Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme- Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay、Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。
【０１５１】
抗体はまた、インビボ診断アッセイのために使用してもよい。ある態様において、免疫シンチグラフィーを用いて腫瘍が局在化され得るように、抗体は放射性核種で標識されている。便宜のために、本発明の抗体は、キット、すなわち所定量の薬剤と診断アッセイを実施するための指示書の同梱組合せ物で提供してもよい。抗体が酵素で標識されているとき、該キットは酵素が必要とする基質および補因子（例えば、検出可能な蛍光または発色を提供する基質前駆体）を含んでいてもよい。さらに、他の添加剤、例えば安定化剤、バッファー（例えばブロックバッファーまたは溶解バッファー）等を含んでいてもよい。多様な薬剤の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する薬剤溶液の濃度を得るため、広範に変化してよい。特に、薬剤は、溶解したときに最適な濃度を有する薬剤溶液が得られる賦形剤を含む、乾燥粉末、通常凍結乾燥粉末として提供してもよい。
【０１５２】
ある態様において、抗体は１個以上のマイタンシン分子（例えば約１〜約１０個／抗体分子のマイタンシン分子）と複合化している。マイタンシンは例えば、Ｍａｙ−ＳＨ３に還元され、修飾抗体と反応して(Chan et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992))マイタンシノイド抗体免疫複合体を生じ得るＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換してもよい。ある態様において、複合体は、約１０〜１１ＭのＩＣ５０を有する（Payne (2003) Cancer Cell 3:207- 212参照）極めて強力なマイタンシン誘導体ＤＭ１（Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−ｌ−オキソプロピル）−マイタンシン）（例えば２００２年１２月１２日公開、WO02/098883参照）、またはＤＭ４（Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−ｌ−オキソペンチル）−マイタンシン）（例えば２００４年１２月２日公開、WO2004/103272参照）であってよい。
【０１５３】
ある態様において、抗体複合体は、１個以上のカリケアマイシン分子と複合化した抗腫瘍細胞抗原抗体を含む。カリケアマイシン群の抗生物質は、サブピコモル濃度で二本鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。使用することができるカリケアマイシンの構造アナログは、ガンマ１Ｉ、アルファ２Ｉ、アルファ３Ｉ、Ｎ−アセチルガンマ１Ｉ、ＰＳＡＧおよびシータＩ１を含むが、これらに限定されない（Hinman et al., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993)および Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)）。また、米国特許第5,714,586号；第5,712,374号；第5,264,586号；および第5,773,001号も参照されたい（各々参照により本明細書に明示的に引用する）。
【０１５４】
ある態様において、本抗体は、多くのがんで過剰生産される酵素によって活性形態で放出され得るプロドラッグと複合化している。例えば、抗体複合体は、活性成分がプラスミンによって複合体から放出される、ドキソルビシンのプロドラッグ形態と製造することができる。プラスミンは多くのがん様組織で過剰生産されることが知られている（Decy et al., (2004) FASEB Journal 18(3):565-567参照）。
【０１５５】
ある態様において、本抗体は酵素的に活性な毒素またはそのフラグメントと複合化する。ある態様において、毒素は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、シュードモナス属内毒素、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ）、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシンおよびトリコテセンを含むが、これらに限定されない。例えば、１９９３年１０月２８日公開、WO 93/21232を参照されたい。ある態様において、毒素は低い内因性免疫原性を有し、がん様細胞が該毒素に抵抗性となる機会を減少させる作用メカニズム（例えば細胞傷害メカニズム対細胞増殖抑制メカニズム）を有する。
【０１５６】
ある態様において、複合体は本発明の抗体と免疫調節剤間で製造する。例えば、ある態様において、免疫賦活オリゴヌクレオチドを使用してもよい。これらの分子は抗原特異的抗体応答を導き得る強力な免疫原である（Datta et al., (2003) Ann. N.Y. Acad. Sci 1002: 105-111）。さらなる免疫調節化合物は、幹細胞増殖因子、例えば「Ｓ１因子」、リンホトキシン、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、造血因子、例えばインターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、例えばインターフェロンアルファ、ベータまたはガンマ、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンを含み得る。
【０１５７】
ある態様において、放射性核種複合抗体が提供される。ある態様において、かかる抗体は、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｈ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、５８Ｃｏ、６７Ｇａ、８０ｍＢｒ、９９ｍＴｃ、１０３ｍＲｈ、１０９Ｐｔ、１６１Ｈｏ、１８９ｍＯｓ、１９２Ｉｒ、１５２Ｄｙ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２２３Ｒａ、２１９Ｒｎ、２１５Ｐｏ、２１１Ｂｉ、２２５Ａｃ、２２１Ｆｒ、２１７Ａｔ、２１３Ｂｉ、２５５Ｆｍおよびそれらの組合せおよび下位組合せを用いて製造することができる。ある態様において、ホウ素、ガドリニウムまたはウラン原子が該抗体と複合化する。ある態様において、ホウ素原子が１０Ｂであり、ガドリニウム原子が１５７Ｇｄであり、ウラン原子が２３５Ｕである。
【０１５８】
ある態様において、放射性核種複合体は、２０〜１０，０００ｋｅＶのエネルギーを有する放射性核種を有する。放射性核種は、１０００ｋｅＶ未満のエネルギーを有するオージェ放射体であるか、２０〜５０００ｋｅＶのエネルギーを有するＰ放射体であるか、または２０００〜１０，０００ｋｅＶのエネルギーを有するアルファまたは“α”放射体であり得る。
【０１５９】
ある態様において、ガンマ、ベータまたはポジトロン放出アイソトープである放射性核種を含む診断用放射性核種複合体が提供される。ある態様において、該放射性核種は、２０〜１０，０００ｋｅＶのエネルギーを有する。ある態様において、該放射性核種は、１８Ｆ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、９７Ｒｕ、９９ｍＴｃ、１１４ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３Ｌｉおよび１９７Ｈｇから選択される。
【０１６０】
ある態様において、本発明の抗体は、光活性剤または造影剤である診断剤と複合化している。光活性化合物は、クロマジェン（chromagen）または染色剤のような化合物を含んでいてもよい。造影剤は、例えば常磁性イオンであってよく、ここで該イオンは、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）から選択される金属を含む。造影剤は、Ｘ線技術またはコンピュータ断層撮影法に使用される放射線を通さない化合物、例えばヨウ素、イリジウム、バリウム、ガリウムおよびタリウム化合物であってもよい。放射線を通さない化合物は、バリウム、ジアトリゾ酸、ヨード化ケシ油エチルエステル、クエン酸ガリウム、イオカルミン酸、イオセタミン酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド（iogulamide）、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノ酸、イオプロセム酸（ioprocemic acid）、イオセファム酸（iosefamic acid）、イオセル酸（ioseric acid）、イオスラミドメグルミン、イオセメチン酸（iosemetic acid）、イオタスル、ヨーテトル酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポダート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドン、および塩化タリウムから選択されてもよい。ある態様において、診断用免疫複合体は、本発明の抗体と複合化したガス充填リポソームのような超音波増強剤を含んでいてもよい。診断用免疫複合体は、手術中、内視鏡的または血管内の腫瘍またはがん診断および検出方法を含むが、これらに限定されない多様な方法のために使用することができる。
【０１６１】
ある態様において抗体複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）のような多様な二官能タンパク質カップリング剤、イミドエステルの二官能誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン（tolyene）２，６−ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて製造する。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238 1098 (1987)の記載に準じて製造することができる。炭素−１４標識された１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体との放射性ヌクレオチドの複合化のための例示的なキレート剤である。WO94/11026を参照されたい。リンカーは、細胞への細胞傷害剤の放出を促進する「切断」リンカーであってよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Chan et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)）を使用することができる。薬剤はさらに、糖基を介して本発明の抗体と結合していてもよい。
【０１６２】
ある態様において、本発明の抗体と細胞傷害剤を含む融合タンパク質は、例えば組換え技術またはペプチド合成によって製造することができる。ある態様において、細胞傷害剤と複合化した抗腫瘍抗原抗体を含むかかる免疫複合体は、患者に投与される。ある態様において、それが結合する免疫複合体および／または腫瘍細胞抗原タンパク質は細胞によって内部化されて、それが結合するがん細胞の殺傷における免疫複合体の治療効果の増進をもたらす。ある態様において、細胞傷害剤は、がん細胞の核酸を標的とし、またはそれに干渉する。かかる細胞傷害剤の例は、マイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
【０１６３】
ある態様において、本抗体は腫瘍プレターゲティングに利用するための「受容体」（例えばストレプトアビジン）と複合化する。該抗体−受容体複合体は患者に投与され、次いで除去剤（clearing agent）を用いて非結合複合体を循環系から除去し、次いで細胞傷害剤（例えば放射性ヌクレオチド）に結合する「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０１６４】
ある態様において、本抗体は標的細胞ライソゾーム内に放出される細胞傷害分子と複合化する。例えば、タンパク質分解ライソゾーム酵素であるカテプシンＢによって切断され、次いで抗体複合体が内部化し得るバリン−シトルリン結合を介して、薬剤モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）が結合する（例えば、２００３年４月３日公開、WO03/026577参照）。ある態様において、ＭＭＡＥは、切断部分としてヒドラゾン官能基を含む酸に不安定なリンカーを用いて抗体と結合し得る（例えば、２００２年１１月１１日公開、WO02/088172参照）。
【０１６５】
抗体依存性酵素介在プロドラッグ治療（ＡＤＥＰＴ）
ある態様において、本発明の抗体は、プロドラッグを活性な抗がん剤に変換するプロドラッグ活性化酵素（例えば、ペプチジル化学療法剤、WO81/01145参照）と複合化することによって、ＡＤＥＰＴに使用することができる。例えば、WO 88/07378および米国特許第4,975,278号を参照されたい。
【０１６６】
ある態様において、ＡＤＥＰＴに有用な免疫複合体の酵素成分は、より活性な、細胞傷害形態に変換するような方法でプロドラッグに対して作用し得る何れかの酵素を含む。
【０１６７】
ＡＤＥＰＴに有用な酵素は、リン酸エステル含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸エステル含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性の５−フルオロシトシンを抗がん剤である５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用なプロテアーゼ、例えばセラチアペプチダーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例えばカテプシンＢおよびＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；糖化プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用な糖切断酵素、例えばβガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ；βラクタムで誘導化した薬剤を遊離薬剤に変換するのに有用なβラクタマーゼ；ならびにフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基でアミン窒素を誘導化した薬剤を遊離薬剤に変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼを含むが、これらに限定されない。ある態様において、本発明のプロドラッグを遊離活性薬剤に変換するために、「アブザイム」としても知られる酵素活性を有する抗体を使用してもよい（例えば、Massey, Nature 328: 457-458 (1987)参照）。抗体−アブザイム複合体は、該アブザイムを腫瘍細胞集団に送達するために本明細書に記載のとおりに製造することができる。
【０１６８】
ある態様において、ＡＤＥＰＴ酵素は、上記ヘテロ２官能性架橋剤の使用のような当該技術分野において周知の技術によって、抗体と共有結合していてもよい。ある態様において、本発明の酵素の少なくとも機能的活性部位と結合した本発明の抗体の抗原結合領域を少なくとも含む融合タンパク質は、当該技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構成することができる（例えば、Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)参照）。
【０１６９】
ある態様において、細胞傷害的方法よりも細胞増殖抑制的方法で作用する抗体の同定は、非処理対照培地と比較して、処理した標的細胞培地の生存率を測定して実施することができる。生存率は、Cell Titer-Blue（登録商標）細胞生存率アッセイまたはCell Titer- Glo（登録商標）Luminescent細胞生存率アッセイ（Promega、それぞれのカタログ番号G8080 と G5750）のような当該技術分野において周知の方法を用いて検出することができる。ある態様において、例えば上記方法によって測定したとき、細胞死の何らかのエビデンスが無く、対照と比較して、処置によって細胞数の減少が生じているとき、抗体は潜在的に細胞増殖抑制性であると考えられる。
【０１７０】
ある態様において、当該技術分野において既知のアッセイを用いたインビボスクリーニングアッセイを実施して、ＡＤＣＣを促進する抗体を同定してもよい。例示的アッセイの１つは、インビトロＡＤＣＣアッセイである。クロム５１標識した標的細胞を作成するため、腫瘍細胞系を組織培養プレート中で増殖させ、滅菌ＰＢＳ中１０ｍＭのＥＤＴＡを用いて採取する。採取した細胞を細胞培養培地で２回洗浄する。３７℃で１時間、時折撹拌しながら、２００μＣｉのクロム５１（New England Nuclear/DuPont）で細胞（５×１０６個）を標識化する。標識した細胞を細胞培養培地で３回洗浄し、次いで濃度１×１０５細胞／ｍＬに再懸濁する。オプソニン化せずに細胞を用いるか、またはアッセイ前に、ＰＢＭＣアッセイ中１００ｎｇ／ｍＬおよび１．２５ｎｇ／ｍＬ、またはＮＫアッセイ中２０ｎｇ／ｍＬおよび１ｎｇ／ｍＬの試験抗体とインキュベーションしてオプソニン化する。末梢血単核細胞は、健常ドナーから血液をヘパリンに採取し、等体積のリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で希釈して調製する。次いで血液をLYMPHOCYTE SEPARATION MEDIUM（登録商標）（LSM Organon Teknika）で層状にして、製造業者の指示書に準じて遠心分離する。単核細胞はＬＳＭ−血漿界面から採取され、ＰＢＳで３回洗浄する。最終濃度１×１０７細胞／ｍＬになるようにエフェクター細胞を細胞培養培地に懸濁する。ＬＳＭで精製後、ＮＫ細胞単離キットおよび磁性カラム（Miltenyi Biotech）を製造業者の指示書の通りに用いる負の選択によって、ＰＢＭＣからナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を単離する。単離ＮＫ細胞を回収し、洗浄し、細胞培養培地に再懸濁して、濃度２×１０６細胞／ｍＬとする。ＮＫ細胞の同一性は、フローサイトメトリー分析によって確認する。多様なエフェクター標的比は、マイクロタイタープレートの列に沿って細胞培養培地で２倍（最終体積１００μＬ）にエフェクター（ＰＢＭＣまたはＮＫ）細胞を連続希釈して調製する。エフェクター細胞濃度は、ＰＢＭＣについて１．０×１０７個／ｍＬ〜２．０×１０４個／ｍＬ、そしてＮＫについて２．０×１０６個／ｍＬ〜３．９×１０３個／ｍＬの範囲である。エフェクター細胞の滴定後、１×１０５個／ｍＬのクロム５１標識した細胞（オプソニン化または非オプソニン化）１００μＬを該プレートの各ウェルに加える。これによって、ＰＢＭＣについて１００：１、そしてＮＫについて２０：１の初期エフェクター標的比となる。全てのアッセイは２連で実施し、各プレートは自発的溶解（エフェクター細胞なし）と全溶解（標的細胞と、１００μＬの１％ドデシル硫酸ナトリウム、１Ｎの水酸化ナトリウム）の両方についての対照を含む。該プレートを３７℃で１８時間インキュベートし、その後、上清回収システム（Skatron Instrument, Inc.）を用いて細胞培養上清を回収し、Minaxi auto-gamma 5000 シリーズガンマカウンター（Packard）で１分間測定する。次の式：細胞傷害率＝（サンプルｃｐｍ−自発的溶解）／（全溶解−自発的溶解）×１００を用いて、細胞傷害のパーセントして結果を表す。
【０１７１】
ＣＤＣを促進する抗体を同定するために、当業者は当該技術分野において既知のアッセイを実施してもよい。例示的アッセイの１つは、インビトロＣＤＣアッセイである。腫瘍細胞抗原を発現する細胞とヒト（または別の起源）補体含有血清を、多様な濃度の試験抗体の存在下または非存在下でインキュベートして、インビトロでＣＤＣ活性を測定することができる。次いで、ALAMAR BLUE（登録商標）を用いて生存細胞を定量することによって、細胞傷害を測定する（Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202 163-171 (1997)）。対照アッセイは抗体の非存在下、および抗体の存在下であるが熱不活性化血清を用い、および／または問題の腫瘍細胞抗原を発現しない細胞を用いて実施する。あるいは、腫瘍抗原または腫瘍抗原由来ペプチドで赤血球をコーティングすることができ、次いで赤血球溶解を観察してＣＤＣをアッセイしてもよい（例えば、Karjalainen and Mantyjarvi, Acta Pathol Microbiol Scand. 1981 Oct; 89(5):315-9参照）。
【０１７２】
細胞死を誘導する抗体を選択するために、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルーまたは７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）取り込みによって示される膜インテグリティの減少を、対照と比較して評価してもよい。例示的アッセイの１つは、腫瘍抗原発現細胞を用いたＰＩ取り込みアッセイである。このアッセイによると、１０％の熱不活性化ＦＢＳ（Hyclone）と２ｍＭのＬ−グルタミンを補ったダルベッコ修飾イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）：ハムＦ−１２（５０：５０）で腫瘍細胞抗原発現細胞を培養する。（従って、該アッセイは補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で実施する）。密度３×１０６個／ディッシュで腫瘍細胞を１００×２０ｍｍディッシュに播種し、一夜接触させる。次いで培地を除去し、新鮮な培地のみ、または適切なモノクローナル抗体を１０μｇ／ｍＬ含む培地で置換する。該細胞を３日間インキュベートする。各処置の後、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理して分離させる。次いで細胞を１２００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、ペレットを３ｍＬの氷冷Ｃａ２＋結合バッファー（１０ｍＭのヘペス、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣＵ）に再懸濁し、細胞塊を除去するために３５ｍｍのストレーナーキャップ付１２×７５チューブに等分する（１ｍＬ／チューブ、１群あたり３チューブ）。次いでチューブにＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）を加える。FACSCAN（商標）フローサイトメーターおよびFACSCONVERT（商標）CellQuest ソフトウェア（Becton Dickinson）を用いてサンプルを分析することができる。ＰＩ取り込みによって測定したとき、統計的に有意なレベルの細胞死を誘導する抗体が、細胞死誘導抗体として選択されてもよい。
【０１７３】
抗体はまた、ＰＥＴイメージング剤としてＦ−アネキシンを用いて、アポトーシス活性についてインビボでスクリーニングしてもよい。この方法では、アネキシンＶを１８Ｆで放射性標識して、研究している抗体の用量に従って試験動物に投与する。アポトーシスプロセスに生じる最も初期の事象の１つは、細胞膜の内側から、アネキシンが接触可能な細胞の外側表面へのホスファチジルセリンの移行である。次いで動物をＰＥＴイメージングに付す（Yagle et al., J Nucl Med. 2005 Apr; 46(4): 658-66参照）。動物はまた、犠牲にして、個々の臓器または腫瘍を採取し、標準的なプロトコルに準じてアポトーシスマーカーについて分析をしてもよい。
【０１７４】
ある態様において、がんは遺伝子発現産物の過剰発現によって特徴付けることができるが、本願はさらに、腫瘍抗原過剰発現がんであるとは考えられていないがんを処置する方法を提供する。がんにおける腫瘍抗原発現を測定するために、多様な診断／予後アッセイが利用可能である。ある態様において、遺伝子発現生成物過剰発現は、免疫組織化学的（ＩＨＣ）に分析することができる。腫瘍生検のパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイに付して、次の腫瘍抗原タンパク質染色強度基準に照らし合わせてよい：
スコア０：染色が観察されないか、腫瘍細胞の１０％未満で膜染色が観察される。
スコア１＋：腫瘍細胞の１０％以上でわずかに／かろうじて認識可能な膜染色が検出される。細胞は膜の一部にのみ染色されている。
スコア２＋：腫瘍細胞の１０％以上で弱〜中度の完全な膜染色が観察される。
スコア３＋：腫瘍細胞の１０％以上で中〜強度の完全な膜染色が観察される。
【０１７５】
腫瘍抗原過剰発現評価において０または１＋のスコアを有する腫瘍は、腫瘍抗原を過剰発現してないと特徴付けることができ、２＋または３＋のスコアを有する腫瘍は、腫瘍抗原を過剰発現していると特徴付けることができる。
【０１７６】
上記方法とは別に、またはそれに加えて、腫瘍における腫瘍抗原過剰発現の程度（もしあれば）を測定するために、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイ、例えばINFORM（商標）（Ventana, Ariz.が販売）またはPATHVISION（商標）（Vysis, III）を実施してもよい。
【０１７７】
さらに、抗体はポリマーとの共有結合によって化学的に修飾して、例えばその循環半減期を低下させることができる。各抗体分子は１個以上（すなわち１、２、３、４、５またはそれ以上）のポリマー分子と結合していてよい。ポリマー分子は好ましくは、リンカー分子によって抗体と結合している。ポリマーは、一般に、合成または天然由来のポリマー、例えば所望により置換された直鎖または分枝鎖ポリアルケン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマー、または分枝鎖または非分枝鎖ポリサッカライド、例えばホモまたはヘテロポリサッカライドであってよい。ある態様において、ポリマーはポリオキシエチレンポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは室温で水溶性であり、一般式Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒ（式中、Ｒは水素またはアルキル基またはアルカノール基のような保護基であってよい）を有する。ある態様において、保護基は１〜８個の炭素を有する。ある態様において、保護基はメチルである。記号ｎは、１〜１０００、または２〜５００の正の整数である。ある態様において、ＰＥＧは平均分子量１０００〜４０，０００、２０００〜２０，０００、または３，０００〜１２，０００を有する。ある態様において、ＰＥＧは少なくとも１個のヒドロキシ基を有する。ある態様において、ヒドロキシは末端ヒドロキシ基である。ある態様において、これは阻害剤の遊離アミノ基と反応して活性化されるヒドロキシ基である。しかし、本発明の共有結合したＰＥＧ／抗体を得るための反応基のタイプおよび量が変化し得ると理解される。好ましいポリマーおよびそれをペプチドと結合する方法は、米国特許第4,766,106号；第4,179,337号；第4,495,285号；および第4,609,546号に示されており、これらを全体について、参照により本明細書に引用する。
【０１７８】
安全性試験
本発明の抗体は、安全性および毒物学的特徴について研究することができる。これらのタイプの研究のガイドラインは、ＵＳＤＡ  ＣＢＥＲ部が発行している文書“Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use”（文書番号 94D-0259、１９９７年２月２８日）に見ることができ、これを参照により本明細書に引用する。一般に、候補抗体は、多数のヒト組織サンプルおよび／または単離ヒト細胞型を用いた前臨床試験においてスクリーニングして、非標的組織結合および交叉反応性について評価するべきである。これらのヒト組織試験の結果が満足のいくものであれば、多様な動物種に由来する組織サンプルまたは単離細胞のパネルをスクリーニングして、一般に毒物学的研究に使用するのに好適な種を同定することができる。交叉反応しない動物種が同定されると、他のタイプのモデルは適切であると見なすことができる。これらの他のモデルは、ヒト腫瘍細胞をげっ歯類宿主に移植する異種移植片モデル、または毒物学的研究で選択した動物種において対応する腫瘍細胞抗原を認識する代替モノクローナル抗体の使用のような研究を含んでいてよい。これらのタイプの代替モデルから得たデータは最初の概算であり、高等種で進めるには注意すべきであると理解されるべきである。
【０１７９】
候補ネイキッド抗体について、単純忍容性を探索する研究を実施してもよい。これらの研究において、候補分子の治療指標は、何れかの用量依存的薬力学的効果を観察することによって特徴付けることができる。広範な用量を用いることができる（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ）。腫瘍細胞抗原数の差、交叉反応性動物標的についての候補抗体の親和性、そして抗体結合後の細胞応答の差は、治療指標を推測するために考慮しなければならない。候補抗体をヒトで試験するときに初期用量設定についての判断を補助するために、適切な動物モデルでの薬力学的試験および薬物動態学的試験も実施しなければならない。
【０１８０】
候補免疫複合体について、複合体の安定性試験をインビボで実施しなければならない。最適には、免疫複合体のそれぞれの成分についての薬力学的研究および薬物動態学的研究を実施して、候補免疫複合体から生じるあらゆる分解生成物の結果を測定するべきである。ギルド初期用量についての判断を補助するために、適切な動物モデルで上記の通り、薬力学的研究および薬物動態学的研究も実施すべきである。薬剤がネイキッド抗体による前処置と組み合わせて投与されるとき、安全性試験を設計するためにさらなる検討を行わなければならない。安全性試験はネイキッド抗体単独で実施しなければならず、試験は、免疫複合体の最大用量がこのタイプの処置レジメンにおいてより低くなる免疫複合体について考慮して設計しなければならない。
【０１８１】
放射性免疫複合体について、生体内分布データを測定するために動物組織分布試験を実施するべきである。さらに、合計用量の投与された放射活性物質の代謝分解の検討を、投与後初期および後の時点の両方で実施すべきである。放射性免疫複合体は、血清または血漿を用いてインビトロ安定性について試験することができ、遊離放射性核種、放射性免疫複合体および標識化非抗体化合物の割合を測定するための方法は、開発されるべきである。
【０１８２】
オリゴヌクレオチド
ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤はオリゴヌクレオチドである。ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は配列番号：１２〜２６から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【０１８３】
ある態様において、オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。ある態様において、オリゴヌクレオチドはＦＸＹＤ５遺伝子または遺伝子発現産物の領域、ドメイン、一部または断片と相補的である。ある態様において、オリゴヌクレオチドは約５〜約１００ヌクレオチド、約１０〜約５０ヌクレオチド、約１２〜約３５ヌクレオチド、および約１８〜約２５ヌクレオチドを含む。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、ＦＸＹＤ５遺伝子または遺伝子発現産物の領域、一部、ドメインまたは断片と少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％相同である。ある態様においてＦＸＹＤ５遺伝子または遺伝子産物の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０または１００連続ヌクレオチドにわたって、実質的な配列相同性が存在する。ある態様において、ＦＸＹＤ５遺伝子または遺伝子発現産物の全長にわたって、実質的な配列相同性が存在する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは緩やかまたはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する核酸分子と結合する。
【０１８４】
ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を介して働く。ある態様において、ｄｓＲＮＡの一方の鎖は、ＦＸＹＤ５遺伝子の領域、一部、ドメインまたは断片と少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％相同である。ある態様において、ＦＸＹＤ５遺伝子の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００連続ヌクレオチドにわたって、実質的な配列相同性が存在する。ある態様において、ＦＸＹＤ５ヌクレオチド配列またはその相補配列の全長にわたって、実質的または完全な配列相同性が存在する。
【０１８５】
ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用する。この配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づく（またはそれから設計した）ものであってよく、特定の細胞または組織における同一、類似または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅、確認または検出するために使用する。
【０１８６】
低分子
ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は低分子である。本明細書において使用するとき、用語「低分子」は、約１０キロダルトン未満の分子量を有する有機または無機非ポリマー化合物を意味する。低分子の例は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、有機化合物、無機化合物等を含む。ある態様において、低分子は約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または約１キロダルトンの分子量を有する。
【０１８７】
模倣物
ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は模倣物である。本明細書において使用するとき、用語「模倣物」は、あるペプチドの活性を模倣する化合物を意味するものとして使用する。模倣物は非ペプチドであるが、非ペプチド結合で結合したアミノ酸を含んでいてもよい。１９９７年６月１０日に発行された米国特許第5,637,677号およびその親出願（これらを全て、参照により本明細書に引用する）は、模倣物の製造について詳しい説明が含まれている。簡潔には、ＦＸＹＤ５の３次元構造と特異的に相互作用するペプチドの３次元構造は、ペプチドではない分子によって複製される。ある態様において、ＦＸＹＤ５模倣物は、ＦＸＹＤ５の模倣物またはＦＸＹＤ５のリガンドの模倣物である。
【０１８８】
デコイ
ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は、ＦＸＹＤ５ポリペプチドの少なくとも一部を含むデコイである。ある態様において、デコイは、ＦＸＹＤ５リガンドとの結合について、天然ＦＸＹＤ５ポリペプチドと競合する。ある態様において、本デコイは定性、定量および／または可視化を容易にするために標識されている。他の態様において、本デコイはさらに、デコイまたはデコイ−リガンド複合体の単離および／または分離を容易にするための部分を含む。ある態様において、本デコイは抗体または抗体フラグメントと融合したＦＸＹＤ５ポリペプチドの少なくとも一部を含む。
【０１８９】
がんを処置および予防する方法
本発明は、対象のがんまたはがんの症状を処置し、および／または予防する方法であって、該対象に治療上有効量の１種以上の本発明のＦＸＹＤ５調節剤を投与することを含む方法を提供する。ある態様において、がんはＦＸＹＤ５の過剰発現に関連したがんである。ある態様において、がんは、結腸がん、乳がん、皮膚がん、食道がん、肝臓がん、膵臓がん、前立腺がん、子宮がん、子宮頸がん、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、多発性骨髄腫または黒色腫である。ある態様において、がんは非ホルモン制御組織に存在する。ある態様において、乳がんはＥＲ陽性乳がん、ＥＲ陰性乳がんまたは転移性乳がんである。ある態様において、乳がんは導管腺がん、小葉腺がんまたは転移性腺がんである。ある態様において、対象はがんを有すると、またはがんの傾向があると診断されている。
【０１９０】
がんの症状は、当該技術分野において周知であり、そして乳房のしこり、乳頭の変化、乳房嚢胞、乳房疼痛、死亡、体重減少、衰弱、疲労過多、摂食障害、食欲喪失、慢性咳、息切れの悪化、喀血、血尿、血便、吐き気、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、むくみ、腹腔内貯水、膣出血、便秘症、腹部膨満感、結腸穿孔、急性腹膜炎（感染、熱、疼痛）、疼痛,吐血、大量の発汗、熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、目眩、寒気、筋痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移,骨転移、腎臓転移、および膵臓転移、嚥下困難等を含むが、これらに限定されない。
【０１９１】
調節化合物の治療上有効量は、医薬品化学者に周知の方法によって実験的に決定することができ、そして特に、患者の年齢、状態の重症度、および望まれる最終的な医薬製剤に依存する。本発明の調節剤の投与は、例えば、吸入もしくは座薬によって、または粘膜組織に、例えば膣、直腸、尿道、頬側および舌下組織に洗浄することによって、経口的に、局所的に、鼻腔内に、腹腔内に、非経腸的に、静脈内に、リンパ管内に、腫瘍内に、筋肉内に、傷口内に、動脈内に、皮下に、眼内に、滑液内に、経上皮的に、および経皮的に行うことができる。ある態様において、当該阻害剤を洗浄によって、経口的に、または動脈内に投与する。他の好適な導入方法には、再充填可能または生分解性デバイス、および遅延もしくは徐放ポリマーデバイスも含まれ得る。上記の通り、本発明の治療組成物はまた、他の既知の抗がん剤または他の既知の抗骨疾患処置レジメンとのコンビナトリアル治療の一部として投与することができる。
【０１９２】
本発明はさらに、患者のＦＸＹＤ５関連生物学的活性を調節する方法を提供する。該方法は、患者に１種以上のＦＸＹＤ５生物学的活性を調節するのに有効量のＦＸＹＤ５調節剤を投与することを含む。ＦＸＹＤ５生物学的活性を測定するための好適なアッセイは、本明細書に記載されている。
【０１９３】
本発明はまた、それを必要とする患者におけるがん細胞増殖を阻害する方法であって、治療上有効量のＦＸＹＤ５調節剤を患者に投与することを含む方法を提供する。ＦＸＹＤ５関連細胞増殖を測定するための好適なアッセイは、当業者に既知であり、本明細書に記載されている。
【０１９４】
本発明はさらに、それを必要とする患者におけるがんを阻害する方法を提供する。該方法は、本明細書に記載のとおり患者がＦＸＹＤ５治療の候補であるかを決定して、患者がＦＸＹＤ５治療の候補であれば該患者に治療上有効量の１種以上のＦＸＹＤ５調節剤を投与することを含む。患者がＦＸＹＤ５治療の候補でなければ、該患者は常套のがん処置で処置する。
【０１９５】
本発明は、がんを有すると診断された、または有する疑いがある患者においてがんを阻害する方法を提供する。該方法は、患者に治療上有効量の１種以上のＦＸＹＤ５調節剤を投与することを含む。
【０１９６】
本発明はまた、ＦＸＹＤ５を発現している細胞集団にアポトーシスを誘導する方法を提供する。ある態様において、該方法は、細胞集団とＦＸＹＤ５調節剤および化学療法剤を接触させることを含む。ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤はＦＸＹＤ５タンパク質レベルを阻害する。ある態様において、細胞集団とＦＸＹＤ５調節剤および化学療法剤の接触は、相加効果を有する。
【０１９７】
本発明はまた、患者の２個以上の細胞の相互作用を阻害する方法であって、該患者に治療上有効量のＦＸＹＤ５調節剤を投与することを含む方法を提供する。ＦＸＹＤ５関連細胞相互作用を測定するための好適なアッセイは、当業者に既知であり、本明細書に記載されている。
【０１９８】
本発明はまた、患者の１種以上のがんの症状を調節する方法であって、該患者に治療上有効量の本明細書に記載のＦＸＹＤ５組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１９９】
本発明はさらに、それを必要とする患者における細胞増殖を阻害する方法であって、該患者に治療上有効量のＦＸＹＤ５調節剤を投与することを含む方法を提供する。ＦＸＹＤ５関連足場非依存性細胞増殖を測定するための好適なアッセイは、本明細書に記載されている。
【０２００】
本発明はまた、それを必要とする患者におけるがん細胞の移動を阻害する方法であって、該患者に治療上有効量のＦＸＹＤ５調節剤を投与することを含む方法を提供する。ＦＸＹＤ５関連細胞移動を測定するための好適なアッセイは、当業者に既知である。
【０２０１】
本発明はさらに、それを必要とする患者におけるがん細胞の接着を阻害する方法であって、該患者に治療上有効量のＦＸＹＤ５調節剤を投与することを含む方法を提供する。ＦＸＹＤ５関連細胞接着を測定するための好適なアッセイは、当業者に既知である。
【０２０２】
本発明はまた、がん、がん転移を発症する素因を有する患者または転移を有しており、したがって再発または反復しやすい患者を予防的に処置する方法を提供する。該方法は、例えばがんまたは転移性腫瘍の家族歴を有するか、またはがん転移の遺伝的素因を示す高リスク個体において特に有用である。ある態様において、腫瘍はＦＸＹＤ５関連腫瘍である。さらに、該方法は、外科手術による切除または常套のがん処置によってＦＸＹＤ５関連腫瘍を処置した患者の、ＦＸＹＤ５関連腫瘍の再発を予防するために有用である。
【０２０３】
本発明はまた、がん進行の阻害および／またはがんの退縮を引き起こす方法であって、患者に治療上有効量のＦＸＹＤ５調節剤を投与することを含む方法を提供する。
【０２０４】
ある態様において、抗がん処置を必要とする患者は、化学療法および／または放射線療法と共に、本発明のＦＸＹＤ５調節剤で処置される。例えば、ＦＸＹＤ５調節剤の投与後、該患者は治療上有効量の抗がん放射線療法で処置してもよい。ある態様において、化学療法処置（例えばメトトレキセートおよび／またはドキソルビシンによる）は、ＦＸＹＤ５調節剤との組合せによって提供する。ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は、化学療法および放射線療法との組合せで投与する。
【０２０５】
処置方法は、患者に１種以上のＦＸＹＤ５調節剤の単回用量または複数用量を投与することを含む。ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は、滅菌、ピロゲンを含まない、薬学的に許容される担体または希釈剤との組合せにおいてＦＸＹＤ５調節剤を含む注射用医薬組成物として投与する。
【０２０６】
ある態様において、本発明の治療レジメンは、外科手術、放射線療法、ホルモン除去および／または化学療法を含むが、これらに限定されない常套の処置レジメンと共に使用される。本発明のＦＸＹＤ５調節剤の投与は、常套のがん処置の前、同時または後に行うことができる。ある態様において、２種以上の異なるＦＸＹＤ５調節剤を患者に投与する。
【０２０７】
ある態様において、患者に投与するＦＸＹＤ５調節剤の量は、がん細胞成長、腫瘍形成、がん細胞増殖、がん細胞転移、細胞移動、血管形成、ＦＸＹＤ５シグナル伝達、細胞間接着のＦＸＹＤ５介在性阻害、ＦＸＹＤ５介在性細胞−細胞膜間相互作用、ＦＸＹＤ５介在性細胞−細胞外マトリックス間相互作用、インテグリン介在性活性、ＦＸＹＤ５介在性細胞−細胞外マトリックス分解およびＦＸＹＤ５発現の１種以上の阻害に有効である。ある態様において患者に投与するＦＸＹＤ５調節剤の量は、アポトーシスによるがん細胞死を増進するのに有効である。
【０２０８】
組合せ治療
ある態様において、本発明は、がんに対してさらに改善された効果を得るための２種以上のＦＸＹＤ５調節剤を含む組成物を提供する。ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤はモノクローナル抗体である。２種以上のＦＸＹＤ５抗体を含む組成物は、がんを有するか、またはがんを有する素因を有する個人または哺乳類に投与することができる。１種以上の抗体はまた、他の治療剤、例えば細胞傷害罪またはがん化学療法剤と共に投与してもよい。２種以上の治療剤の同時投与は、薬剤がそれらの治療効果を発揮する時間が重複していれば、同じ時点で、または同じ経路で投与する必要はない。異なる日または週に投与される同時または逐次投与が意図される。
【０２０９】
ある態様において、本発明の方法は、異なる抗体の組合せまたは「カクテル」の投与を意図する。かかる抗体カクテルは、異なるエフェクター機構を利用する抗体を含むか、または細胞傷害抗体と免疫エフェクター機能性に依存する抗体とを直接組み合わせる場合と同程度の利点を有することがある。かかる組合せ抗体は、相乗治療効果を示すこともある。
【０２１０】
ある態様において、組合せ治療は向上した処置を提供する。「向上した処置」は、相加、相乗または増強効果の何れかを意味する。例えばＬＮＣａＰにおいて、ＦＸＹＤ５ノックダウンと化学療法剤の組合せは相加効果を有する。ある態様において向上した処置は、１種以上の化学療法剤と共に、１種以上のＦＸＹＤ５調節剤を投与することを含む。
【０２１１】
細胞傷害剤は、細胞の機能を阻害または阻止し、そして／または細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。当該用語は、放射性同位体（例えば１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅ）、化学療法剤、および毒素、例えば酵素的に活性な細菌、真菌、植物もしくは動物起源の毒素または合成毒素、あるいはそのフラグメントを含むことを意図する。非細胞傷害剤は、細胞の機能を阻害または阻止せず、そして／または細胞の破壊を引き起こさない物質を意味する。非細胞傷害剤は、活性化されて細胞傷害性になり得る。非細胞傷害剤はビーズ、リポソーム、マトリックスまたは粒子を含んでいてもよい（例えば、米国特許公開公報2003/0028071および2003/0032995参照、これらを参照により本明細書に引用する）。かかる薬剤は本発明の抗体と複合化、共役、結合または関連し得る。
【０２１２】
ある態様において、常套のがん医薬が本発明の組成物と共に投与される。常套の含意約は：
a) がん化学療法剤；
b) さらなる薬剤；
c) プロドラッグ
を含む。
【０２１３】
がん化学療法剤は、次のものを含むが、これらに限定されない：アルキル化剤、例えばカルボプラチンおよびシスプラチン；窒素マスタードアルキル化剤；ニトロソウレアアルキル化剤、例えばカルムスチン（ＢＣＮＵ）；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート；フォリン酸；プリンアナログ代謝拮抗剤、メルカプトプリン；ピリミジンアナログ代謝拮抗剤、例えばフルオロウラシル（５−ＦＵ）およびゲムシタビン（Gemzar（登録商標））；ホルモン性抗新生物剤、例えばゴセレリン、ロイプロリド、およびタモキシフェン；天然抗新生物剤、例えばアルデスロイキン、インターロイキン−２、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンアルファ、パクリタキセル（Taxol（登録商標））、およびトレチノイン（ＡＴＲＡ）；抗生物質性天然抗新生物剤、例えばブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ダウノマイシンおよびミトマイシン、例えばミトマイシンＣ；およびビンカアルカロイド天然抗新生物剤、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン；ヒドロキシウレア；アセグラトン、アドリアマイシン、イフォスファミド、エノシタビン、エピチオスタノール、アクラルビシン、アンシタビン、ニムスチン、塩酸プロカルバジン、カルボクオン、カルボプラチン、カルモフール、クロモマイシンＡ３、抗腫瘍多糖類、抗腫瘍血小板因子、シクロホスファミド（Cytoxin（登録商標））、シゾフィラン、シタラビン（シトシンアラビノシド）、デカルバジン、チオイノシン、チオテパ、テガフール、ドラスタチン、ドラスタチンアナログ、例えばアウリスタチン、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）、ミトザントロン、ビノレルビン、テニポシド、アミノプテリン、カルミノマイシン、エスペラミシン（例えば米国特許第4,675,187号参照）、ネオカルジノスタチン、ＯＫ−４３２、ブレオマイシン、フルツロン、ブロキシウリジン、ブスルファン、ホンバン、ペプロマイシン、ベスタチン（Ubenimex（登録商標））、インターフェロン−β、メピチオスタン、ミトブロニトール、メルファラン、ラミニンペプチド、レンチナン、カワラタケ（Coriolus versicolor）抽出物、テガフール／ウラシル、エストラムスチン（エストロゲン／メクロレタミン）。
【０２１４】
がん患者の治療に使用することができるさらなる薬剤には、次のものが含まれる：ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ガンシクロビル；抗生物質、ロイプロリド；メペリジン；ジドブジン（ＡＺＴ）；変異体およびアナログを含むインターロイキン１〜１８；インターフェロンまたはサイトカイン、例えばインターフェロンα、β、γ、ホルモン、例えば黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）およびアナログ、ならびにゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）；成長因子、例えば形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子ホモログ因子（ＦＧＦＨＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、およびインシュリン成長因子（ＩＧＦ）；腫瘍壊死因子−αおよびβ（ＴＮＦ−αおよびβ）；侵襲阻害因子−２（ＩＩＦ−２）；骨形成タンパク質１−７（ＢＭＰ１−７）；ソマトスタチン；チモシン−α−１；γ−グロブリン；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；補体因子；抗血管新生因子；抗原物質；およびプロドラッグ。
【０２１５】
プロドラッグは、親薬剤と比較して腫瘍細胞に毒性が低いかまたは存在しない薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態であって、酵素的に活性なまたはより活性な親形態に活性化または変換され得るものを意味する。例えば、Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)およびStella et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)参照。プロドラッグには、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、糖化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、所望により置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンを含むがこれらに限定されず、これらはより活性な細胞毒性遊離薬剤に変換することができる。本発明において使用するためのプロドラッグ形態に誘導化することができる細胞毒性薬剤の例には、上記化学療法剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１６】
臨床的局面
ある態様において、本発明の方法および組成物は、結腸がん、乳がん、皮膚がん、食道がん、肝臓がん、膵臓がん、前立腺がん、子宮がん、子宮頸がん、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、多発性骨髄腫および黒色腫に特に有用である。ある態様において、がんは導管腺がん、小葉腺がんまたは転移性腺がんである。
【０２１７】
医薬組成物
本発明はまた、１種以上の本明細書に記載のＦＸＹＤ５調節剤と薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。ある態様において、当該医薬組成物を注射液として、液体溶液または懸濁液として製造し；注射前に液体ビークル溶液または懸濁液とするのに適した固体形態として製造してもよい。リポソームは薬学的に許容される担体の定義に含まれる。薬学的に許容される塩、例えば鉱酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等；および有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等も、医薬組成物中に存在していてよい。薬学的に許容される賦形剤の全議論は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995) Alfonso Gennaro, Lippincott, Williams, & Wilkinsで入手可能である。
【０２１８】
ＦＸＹＤ５を検出する方法
本発明はまた、ＦＸＹＤ５を検出する方法を提供する。ある態様において、ＦＸＹＤ５は患者または患者サンプル中に存在する。ある態様において、当該方法は、患者に１種以上のＦＸＹＤ５調節剤を含む組成物を投与し、そして患者におけるイメージング剤の局在を検出することを含む。ある態様において、前記患者サンプルはがん細胞を含む。ある態様において、前記ＦＸＹＤ５調節剤はイメージング剤と結合しているか、または検出可能に標識されている。ある態様において、前記ＦＸＹＤ５調節剤はイメージング剤と複合化された抗ＦＸＹＤ５抗体であり、そして患者に投与して１個以上の腫瘍を検出するか、またはＦＸＹＤ５治療に対する患者の受容性を決定する。前記標識化抗体は、細胞上の高密度の受容体と結合し、それによって腫瘍細胞に蓄積する。標準的なイメージング技術を用いて、腫瘍の部位を検出することができる。
【０２１９】
本発明はまた、ＦＸＹＤ５を発現しているかまたは過剰発現している細胞または腫瘍をイメージング／検出する方法であって、ＦＸＹＤ５調節剤を含む組成物をサンプルと接触させ、そしてサンプル中のＦＸＹＤ５調節剤の存在を検出することを含む方法を提供する。ある態様において、前記サンプルは患者サンプルである。ある態様において、患者サンプルはがん細胞を含む。ある態様において、前記ＦＸＹＤ５調節剤はイメージング剤と結合しているか、または検出可能に標識されている。
【０２２０】
本発明はまた、患者、細胞またはサンプル中に存在するＦＸＹＤ５の量を定量する方法を提供する。当該方法は、１種以上の抗体、プローブまたは低分子を患者またはサンプルに投与して、当該サンプル中に存在するＦＸＹＤ５の量を検出することを含む。ある態様において、当該抗体、プローブまたは低分子は、イメージング剤と結合しているか、または検出可能に標識されている。かかる情報は、例えば腫瘍がＦＸＹＤ５に関連しているか、そしてしたがって、特定の処置を使用するべきか避けるべきかを示す。ある態様において、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いて、腫瘍細胞を含むと考えられるサンプルを得て、そして標識化抗体、プローブ、オリゴヌクレオチドおよび低分子と接触させる。未結合の標識化抗体、プローブ、オリゴヌクレオチドまたは低分子を除去した後、前記細胞と結合した標識化抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは模倣物の量を、あるいは未結合として除去された抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは模倣物の量を測定する。当該情報は、存在するＦＸＹＤ５の量と直接関係する。
【０２２１】
イメージングは、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。例えばラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）またはコンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）によってイメージングを行うことができる。イメージング剤に最も一般的に使用される放射性標識は、放射性ヨウ素またはインジウムを含む。ＣＴスキャンによるイメージングは、鉄キレートのような重金属を用いてもよい。ＭＲＩスキャンは、ガドリニウムまたはマンガンのキレートを用いてもよい。さらに、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）は、酸素、窒素、鉄、炭素またはガリウムの陽電子放出を用いてもよい。かかる方法は当業者に既知である。かかる方法の例は、A. Takeda et al, Cancer Research 61, 5065-5069, July 1, 2001; および C. Frederickson, Sci STKE. 2003 May 13;2003(182)（各々その全体を参照により本明細書に引用する）に記載されている。
【０２２２】
ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は、ＦＸＹＤ５抗体である。ある態様において、該調節剤はイメージング剤と結合しているか、または検出可能に標識されている。ある態様において、イメージング剤は１８Ｆ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７７Ｂｒ、８７ＭＳｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、９９ＭＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、または２０６Ｂｉである。
【０２２３】
検出方法は当業者に周知である。例えば、ポリヌクレオチドを検出する方法は、ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、ＲＮＡ保護、およびＤＮＡハイブリダイゼーション（インサイチュハイブリダイゼーションを含む）を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドを検出する方法は、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、酵素活性アッセイ、スロットブロッティング、ペプチド質量フィンガープリント、電気泳動、免疫化学および免疫組織化学を含むが、これらに限定されない。検出方法の他の例には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光イムノアッセイ、フルオロイムノアッセイ、時間分解フルオロイムノアッセイ（ＴＲ  ＦＩＡ）、２色蛍光顕微鏡観察、または免疫クロマトグラフアッセイ（ＩＣＡ）（全て当業者に周知である）を含むが、これらに限定されない。本発明のいくつかの好ましい態様において、ポリヌクレオチド発現を、ＰＣＲ方法論を用いて検出し、そしてポリペプチド生産をＥＬＩＳＡ技術を用いて検出する。
【０２２４】
細胞傷害剤または診断剤を細胞に送達する方法
本発明はまた、ＦＸＹＤ５を発現する１個以上の細胞に細胞傷害剤または診断剤を送達する方法を提供する。ある態様において、該方法は、細胞傷害剤または診断剤と複合化した本発明のＦＸＹＤ５調節剤と細胞を接触させることを含む。
【０２２５】
がん患者の予後を測定する方法
ある態様において、ＦＸＹＤ５関連がんを有する患者の予後を測定する方法は、患者サンプル中の細胞の細胞膜に結合したＦＸＹＤ５を検出することを含む。ある態様において、患者サンプル中の細胞の細胞膜に結合したＦＸＹＤ５の検出は、延長された生存および／または本発明のＦＸＹＤ５調節剤および／または常套のがん医薬による処置の成功の良好な予後を示さない。
【０２２６】
ある態様において、ＦＸＹＤ５は配列番号：１の配列を有する核酸によってコードされる。ある態様において、ＦＸＹＤ５は配列番号：２の配列を有する。
【０２２７】
ＦＸＹＤ５治療に対する受容性を測定する方法
本発明はまた、ＦＸＹＤ５治療に対する患者の受容性を測定する方法を提供する。該方法は、患者または患者サンプルにおけるＦＸＹＤ５の差次的発現のエビデンスの有無を検出することを含む。患者またはサンプルにおけるＦＸＹＤ５の差次的発現のエビデンスの存在は、ＦＸＹＤ５治療に受容性の患者の指標である。ある態様において、患者またはサンプルにおけるＦＸＹＤ５の差次的発現のエビデンスの非存在は、ＦＸＹＤ５治療の候補でない患者の指標である。
【０２２８】
ある態様において、本治療方法は、それを必要とする患者にイメージング剤と結合したＦＸＹＤ５調節剤を含む組成物を投与して、該患者における遺伝子または遺伝子産物の有無を検出することを含む、第１にＦＸＹＤ５治療に受容性の患者を同定することを含んでいる。ある態様において、本治療方法はさらに、患者がＦＸＹＤ５治療の候補であるとき該患者に１種以上のＦＸＹＤ５調節剤を投与し、そして患者がＦＸＹＤ５治療の候補でないとき該患者を常套のがん処置で処置することを含む。
【０２２９】
ある治療方法において、患者ががんを有するか、またはがんに罹患しやすいと同定されたとき、該患者に１種以上のＦＸＹＤ５調節剤を単独で、または他の抗がん医薬との組合せで投与する。
【０２３０】
がんの進行を評価する方法
本発明はまた、患者のがんの進行を評価する方法であって、第１の時点での生物学的サンプル中のＦＸＹＤ５の発現生成物のレベルを第２の時点での同じ発現生成物のレベルと比較することを含む方法を提供する。第１の時点と比較して第２の時点での発現生成物のレベルの変化は、がんの進行の指標である。
【０２３１】
スクリーニング方法
本発明はまた、抗がん剤をスクリーニングする方法を提供する。該方法は、ＦＸＹＤ５を発現している細胞と候補化合物を接触させて、ＦＸＹＤ５関連生物学的活性が調節されるかを測定することを含む。ある態様において、がん細胞成長、インテグリン介在性活性、カドヘリン介在性活性、腫瘍形成、がん細胞増殖、がん細胞転移、細胞移動、血管形成、ＦＸＹＤ５シグナル伝達、細胞間接着のＦＸＹＤ５介在性阻害およびＦＸＹＤ５発現の１種以上の阻害は、抗がん剤の指標である。
【０２３２】
本発明はさらに、がんの阻害剤を同定する方法を提供する。該方法は、ＦＸＹＤ５を発現している細胞と候補化合物およびＦＸＹＤ５リガンドを接触させて、ＦＸＹＤ５関連生物学的活性が調節されるかを測定することを含む。ある態様において、がん細胞成長、インテグリン介在性活性、カドヘリン介在性活性、腫瘍形成、がん細胞増殖、がん細胞転移、細胞移動、血管形成、ＦＸＹＤ５シグナル伝達、細胞間接着のＦＸＹＤ５介在性阻害およびＦＸＹＤ５発現の１種以上の阻害は、がん阻害剤の指標である。ある態様において、患者に投与するＦＸＹＤ５調節剤の量は、がん細胞アポトーシスの増進に有効なものである。
【０２３３】
ある態様において、本発明は、例えば下流マーカーの活性またはレベルを調節する能力について推定調節剤をスクリーニングして、抗がん剤、特に抗転移性がん剤をスクリーニングする方法を提供する。
【０２３４】
ＦＸＹＤ５を精製する方法
ある態様において、本発明は、ＦＸＹＤ５を含むサンプルからＦＸＹＤ５タンパク質を精製する方法を提供する。該方法は、固体支持体と結合した本発明のＦＸＹＤ５抗体を含むアフィニティーマトリックスを得て、前記サンプルと該マトリックスを接触させてアフィニティーマトリックス−ＦＸＹＤ５タンパク質複合体を形成させ；残留サンプルからアフィニティーマトリックス−ＦＸＹＤ５タンパク質複合体を分離し；アフィニティーマトリックスからＦＸＹＤ５タンパク質を遊離させることを含む方法を提供する。
【０２３５】
キット
いくつかの態様において、本発明はＦＸＹＤ５過剰発現に関連した遺伝子または遺伝子産物をイメージングおよび／または検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、検出用抗体、低分子、オリゴヌクレオチド、デコイ、模倣物またはプローブならびに本発明の方法を行うための指示書を含む。所望により、キットは次の１個以上を含んでいてもよい：対照（ポジティブおよび／またはネガティブ）、対照のための容器、ポジティブまたはネガティブな結果の代表的な例の写真または描写。
【０２３６】
本明細書に記載の特許、特許出願、受託番号および公報の各々は、その全体について、ここに参照により本明細書に引用する。
【０２３７】
本明細書に記載のものに加えて、上記記載の点から本発明の多様な修飾が当業者に明らかであろう。かかる修飾も添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。本発明はさらに、下記実施例において詳述されるが、これは説明の目的のためであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０２３８】
実施例１：ＦＸＹＤ５遺伝子発現分析
マイクロアレイデータを用いて、多様な原発性腫瘍および正常組織におけるＦＸＹＤ５の発現を測定した。結果は、図１〜４に図示する。これらはＦＸＹＤ５が乳がんおよび結腸がんで有意に上方制御されていることを示す。図１に結果を示している実験において、、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）した結腸がん組織、乳がん組織および前立腺がん組織からｍＲＮＡを単離し、該ｍＲＮＡをそれぞれの正常組織（ＲＳＭ＝参照標準混合物）または各組織サンプル内でがん細胞に隣接する正常細胞のプールと比較した。ｘ軸のＡ項内のサンプルは、原発性乳がん、ＬＣＭに由来し；Ｂ項内のサンプルは正常乳房サンプル、ＲＳＭに由来し；Ｃ項内のサンプルは転移性結腸がん、ＬＣＭに由来し；Ｄ項内のサンプルは正常結腸、ＬＣＭに由来し；Ｅ項内のサンプルは原発性結腸がんに由来し；Ｆ項内のサンプルは正常結腸、ＲＳＭに由来し；Ｇ項内のサンプルは正常前立腺、ＬＣＭに由来し；Ｈ項内のサンプルは原発性前立腺がん、ＬＣＭに由来し；Ｉ項内のサンプルは正常前立腺、ＲＳＭに由来する。サンプルは、Affymetrix（登録商標）GeneChips（登録商標）（Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA）によるオリゴヌクレオチドアレイ分析によって試験した。ＦＸＹＤ５プローブセット１７９８９および２４３２０を用いた正常ヒト組織におけるＦＸＹＤ５  ｍＲＮＡの発現は、それぞれ図２および３に示す。
【０２３９】
Human Genome U133 Plus 2 0 Array（Affymetrix, Inc.）を用いたがん様組織および正常組織におけるＦＸＹＤ５  ｍＲＮＡ発現のオリゴヌクレオチドアレイ分析のグラフ表示は、図４に示す。正常組織タイプおよびがん様組織タイプは、横軸に沿って並べられている。がん様組織は、例えば‘ｃ_’、例えば“c_breast_duct”とラベルしており、これは乳がん組織サンプルを意味し、そして正常組織は‘ｎ_’で示す。組織タイプはさらに、知られていれば、組織のタイプおよびサブタイプでラベルされている。例えば、“c_breast_duct”は乳管に局在した乳がん由来のがん様組織である。サブタイプが外科手術による除去によっても明らかではないかまたは知られていないとき、ラベルは‘特定されていない’という‘ns’と表記する。図４の縦軸の各スポットは、１人の患者由来の組織サンプルを意味し、垂直軸上の各スポットの高さ（直線的）はプローブセットの相対的発現レベルを意味する。分析を行う前に、各プローブセットを大きな、多様なサンプルのセット間でその構成プローブの動態を分析することによってキャリブレーションした。このキャリブレーションによって、各プローブの相対的感受性を決定し、そしてプローブセット応答がプローブ間で直線である強度範囲を決定した。この範囲未満の強度は「検出されず」と称し、上のものは「飽和」と称される。サンプル間でのハイブリダイゼーションおよびラベリング効率の差のため、キャリブレーションの適用後に本発明者らは各チップを正規化した。これによって、サンプル間で異なる遺伝子発現についての範囲の上限および下限が生じた。
【０２４０】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、正常組織サンプルおよびがん組織サンプルにおける相対的ＦＸＹＤ５  ｍＲＮＡレベルも試験した（図５〜８）。多様な正常またはがん組織または細胞系を、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（GeneAmp（登録商標）, Applied Biosystems, Foster City, CA）によって、多様なプライマーセットを用いて比較した。プライマー224252_s_atおよび218084_x_atからのデータを図５に示す。これは、他の試験した正常組織と比較して、胎盤組織においてＦＸＹＤ５発現が上方制御されたことを示している。図６に示すデータは、ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ−ｄ、ＭＤＡ−２３１、１８４Ｂ５、ｈＭＥＣ−Ｑ、ｈＭＥＣ−Ｐｒｏｌ、ＭＳＣ−正常、ＨＴ１０９０およびＭＲＣ９細胞系においてＦＸＹＤ５発現が最も高いことを示している。プライマーセット“ABTP 241-242”由来のデータを図８に示す。これはｍｄａ２３１、Ａ４３１、ｓｋｏｖ３、ＨＭＥＣ、ＰＲＥＣおよびＭＲＣ９細胞系においてＦＸＹＤ５発現が最も高いことを示している。プライマーセット“ABTP 555-556”由来のデータを図７に示す。これは結腸がん組織においてＦＸＹＤ５発現のレベルが高いことを示している。正常結腸組織では、ＦＸＹＤ５発現は低いか、または観察されなかった。
【０２４１】
多様なＦＸＹＤ群（ＦＸＹＤｌ、ＦＸＹＤ２、ＦＸＹＤ３、ＦＸＹＤ５、ＦＸＹＤ６およびＦＸＹＤ７）のｍＲＮＡ発現を、結腸がんサンプルにおいて試験した。図９に示すとおり、結腸がん細胞においてＦＸＹＤ２およびＦＸＹＤ５発現が上方制御されていた。他のＦＸＹＤ群の発現は低いか、または存在しなかった。
【０２４２】
実施例２：ＦＸＹＤ５タンパク質発現分析
ＦＡＣＳフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を用いて、多様ながん細胞系におけるＦＸＹＤ５の細胞表面発現を測定した。抗ＦＸＹＤ５抗体で染色した非透過化ＨＴ１０８０、ＭＤＡ２３１、ＰＣ３およびＬｎＣＡＰ細胞のＦＡＣＳ分析によって、全てのこれらの細胞系が細胞表面でＦＸＹＤ５を発現していることを見出した（図１０、下のパネル）。下のパネルの下隣の平均値は、各細胞系の相対位置を示している。ＭＤＡ２３１細胞は最も高いレベルの細胞表面ＦＸＹＤ５発現を示し、ＨＴ１０８０細胞、ＰＣ３そしてＬｎＣＡＰと続いた。染色の特異性は、ペプチド競合で確認した（図１０、上のパネル）。
【０２４３】
免疫組織化学。抗ＦＸＹＤ５抗体を用いて、免疫組織化学的分析（ＩＨＣ）をヒト組織で実施した。ＩＨＣによって、正常結腸においてＦＸＹＤ５発現が存在しないことが示された。結腸がん、肝臓転移性がんおよび前立腺がん組織は、ＦＸＹＤ５タンパク質発現について陽性であった（データは示さず）。
【０２４４】
実施例３：ＦＸＹＤ５  ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは軟寒天増殖を阻害する。
ＰＣ３およびＨＴ２９細胞をｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトして、足場非依存性増殖に対するＦＸＹＤ５阻害の効果を測定した。
【０２４５】
ｓｉＲＮＡ実験のために、ＰＣ３細胞を次の１つでトランスフェクトした：ＦＸＹＤ５に対するｓｉＲＮＡ、Ｃ２９５−４ｓｉ（CCAGATGCAGTCTACACAGAA；配列番号：２３）；ポジティブコントロールとしてｓｉＲＮＡ  Ｅｇ５ｓｉ；またはネガティブコントロールとしてＰＧＬ３ｓｉ。ＰＧＬ３ｓｉは、無関係の遺伝子配列を標的とする。第４セットの細胞はトランスフェクトしなかった。
【０２４６】
アンチセンス実験のために、ＰＣ３またはＨＴ２９細胞を次のアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つでトランスフェクトした：対照として、Ｅｇ５を標的とするＣ１０９−３；ＦＸＹＤ５を標的とするＣ２９５−３；またはＦＸＹＤ５を標的とするＣ２９５−４。細胞はまた、ネガティブコントロールとして各配列の逆相補体を含むオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。該細胞は０．３５％軟寒天に播種し、培地中での増殖を７日後に、Alamar Blueを用いて定量した。
【０２４７】
該細胞の足場非依存性細胞増殖に対するＦＸＹＤ５遺伝子発現の効果は、軟寒天中のコロニー形成によって測定した。軟寒天アッセイは、まず非組織培養処理プレートをＰｏｌｙ−ＨＥＭＡでコーティングして、細胞とプレートの接着を防止して実施した。非トランスフェクト細胞はトリプシンを用いて収穫し、培地中で２回洗浄した。血球計を用いて細胞を計測し、培地で１０４細胞／ｍｌに再懸濁した。５０μｌのアリコートをｐｏｌｙＨＥＭＡコーティング９６ウェルプレートに入れ、トランスフェクトさせた。各トランスフェクション混合物について、担体分子、好ましくはリピトイドまたはコレステロイドを水中実質濃度０．５ｎＭに調製し、超音波処理して、均一な溶液を得て、０．４５μｍのＰＶＤＦ膜で濾過した。
【０２４８】
アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、または対照オリゴヌクレオチドを滅菌Millipore水中実際実質１００μＭに調製した。オリゴヌクレオチドはさらに、マイクロチューブ中で、OptiMEM（商標）（Gibco/BRL）で２μＭ、またはOptiMEM（商標）で約２０μｇのオリゴ／ｍｌに希釈した。別のマイクロチューブ中で、典型的には１．５〜２ｎｍｏｌリピトイド／μｇオリゴヌクレオチドの量のリピトイドまたはコレステロイドは、オリゴヌクレオチドの希釈で使用したものと同じ体積のOptiMEM（商標）で希釈した。希釈したオリゴヌクレオチドは速やかに希釈したリピトイドに加え、上下にピペッティングして混合した。最終濃度約３００ｎＭとなるように、細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを加えた。最終濃度約６６ｎＭとなるように、ｓｉＲＮＡを加えた。３７℃で約３０分間トランスフェクションした後、最終濃度０．３５％アガロースとなるように、細胞に３％のＧＴＧアガロースを加え、上下にピペッティングした。細胞層アガロースが凝固した後、培地１００μｌを各ウェルの上面に添加した。約７日でコロニーが形成した。増殖の読み出しのために、２０μｌのAlamar Blueを各ウェルに加え、該プレートを約１５分間撹拌した。６〜２４時間インキュベーション後に、蛍光を読み込んだ（励起波長５３０ｎｍ／放出波長５９０ｎｍ）。
【０２４９】
ＰＣ３細胞のアンチセンス実験の結果を図１４に示す；ＰＣ３細胞のｓｉＲＮＡ実験の結果を図１３に示す。ＦＸＹＤ５  ｓｉＲＮＡは、ポジティブコントロールと比較可能なレベルでがん細胞の足場非依存性増殖を阻害した。ＨＴ２９細胞のアンチセンス実験の結果を図１１および１２に示す。ＦＸＹＤ５を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、がん細胞の足場非依存性増殖を阻害した。
【０２５０】
ＦＸＹＤ５調節剤を用いたがん細胞系のコロニー形成の阻害は、ＦＸＹＤ５が転移性表現型の作成および／または維持に関与していることを示している。
【０２５１】
実施例４：ＦＸＹＤ５  ｓｉＲＮＡはがん細胞の細胞傷害を誘導するが、正常細胞では誘導しない
ＦＸＹＤ５  ｓｉＲＮＡでの実験によって、ＦＸＹＤ５の阻害はがん細胞に細胞傷害性であるが、正常細胞にはそうではないことが示された。簡潔には、ＨＣＴ１１６細胞、ＰＣ３細胞、または正常非発がん性繊維芽（ＭＲＣ９）細胞を次のｓｉＲＮＡの１つでトランスフェクトした：Ｅｇ５ｓｉ（ポジティブコントロール）、ＰＧＬ３ｓｉ（ネガティブコントロール）、Ｃ２９５−３（ＦＸＹＤ５  ｓｉＲＮＡ）、またはＣ２９５−４（ＦＸＹＤ５  ｓｉＲＮＡ）。非トランスフェクト細胞の細胞傷害も測定した。トランスフェクションは、上記実施例に記載のとおりに実施した。図１５〜１７について、膜損傷のために培地中に放出されたＬＤＨ酵素の量を測定して、細胞傷害をモニターした。Roche Molecular BiochemicalsのCytotoxicity Detection Kitを用いてＬＤＨ活性を測定した。データは、培地中に放出されたＬＤＨ対同じ時点および処置でウェルに存在する総ＬＤＨの比として得られる（ｒＬＤＨ／ｔＬＤＨ）。
【０２５２】
図１５〜１６に示すとおり、ＦＸＹＤ５  ｓｉＲＮＡは、ＨＣＴ１１６細胞およびＰＣ３細胞において、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡよりもかなりの程度、細胞傷害を誘導した（それぞれ図１５および１６）。３日目までに、ＭＲＣ９細胞におけるＦＸＹＤ５  ｓｉＲＮＡ誘導性細胞傷害の程度は、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡのものと同程度であった（図１６）。したがって、がん細胞は、非がん様細胞と比較して、ＦＸＹＤ５阻害により高い感受性を示す。ＦＸＹＤ５と拮抗する薬剤は、新生物性傷害の処置に好適な治療指標を示し得る。
【０２５３】
実施例５：化学療法剤との組合せにおけるＦＸＹＤ５阻害
細胞の化学療法処置と組み合わせたＦＸＹＤ５阻害を試験した。オリゴヌクレオチドトランスフェクションを実施例３に記載のとおりに実施した。ＬｎＣａＰ細胞は、次のアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つでトランスフェクトした：ＦＸＹＤ５を標的とするＣＨＩＲ２９５−３；ＦＸＹＤ５を標的とするＣＨＩＲ２９５−４；Ｂｃｌ２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド；またはこれらの１つの逆相補体。非トランスフェクト細胞も分析した。細胞のサブセットはまた、多様な濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ）またはドキソルビシン（ＤＯＸＯ）で処理した。上記実施例に記載のとおり、膜損傷のために培地中に放出されたＬＤＨ酵素の量を測定して、細胞傷害を測定した。
【０２５４】
図１７に示すとおり、化学療法剤との組合せ処置は、細胞傷害に対して相加効果を有していた。
【０２５５】
実施例６：ＦＸＹＤ５エピトープ
抗体認識および製造のためのＦＸＹＤ５の直線エピトープを、当該技術分野において既知の多様な方法の何れかによって同定することができる。ある例示的方法は、抗原のアミノ酸配列由来のペプチドの抗体結合能を証明することを含む。結合は、ＢＩＡＣＯＲＥ法またはＥＬＩＳＡ法を用いて評価することができる。他の技術は、平面固体支持体（チップ）上でペプチドライブラリーを抗体に曝露して、固相スクリーニングに使用する多様な方法の何れかで結合を検出することを含む。さらに、ファージディスプレイを用いてペプチドのライブラリーをスクリーニングし、数回バイオパンニングの後、エピトープを選択することができる。
【０２５６】
実施例７：調節剤
ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は：
(a) ＦＸＹＤ５の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープと結合する抗体；
(b) 配列番号：１、８、９または１２〜２６の何れかに記載の配列の少なくとも１９連続ヌクレオチド、またはその全長相補鎖を含む第１ヌクレオチド鎖と、該第１鎖と実質的に相補的な配列を含む第２ヌクレオチド鎖を含んでなる単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、８９０ヌクレオチド長未満であるｄｓＲＮＡ分子；
(c) 配列番号：１、５〜２１、２４および２５から選択される配列と少なくとも９０％同一の配列の少なくとも１０連続ヌクレオチド、またはその全長相補鎖を含む単離核酸分子；
(d) 低分子；
(e) 模倣物；
(f) 可溶性受容体；および
(g) デコイ
から選択される。
【０２５７】
ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤はＦＸＹＤ５ポリペプチドの抗原領域を含むか、またはそれに関する。本発明のある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は、配列番号：２の配列の１種以上を含み、そして／またはそれに特異的に結合する。
【０２５８】
ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は、配列番号：２の１個以上のエピトープと結合するモノクローナル抗体であって、該エピトープは各々、配列番号：２の約６〜２０連続アミノ酸からなるモノクローナル抗体である。ある態様において、該抗体は、Ｔｈｒ１９−Ａｌａ３３（配列番号：３）、Ｌｅｕ５４−Ａｓｐ８２（配列番号：４）、Ｐｒｏ８９−Ａｌａ９７（配列番号：５）、Ｐｒｏ１００−Ｌｙｓ１２５（配列番号：６）およびＳｅｒ１２７−Ｐｈｅ１３５（配列番号：７）から選択されるＦＸＹＤ５のエピトープ以外のＦＸＹＤ５のエピトープと特異的に結合しないモノクローナル抗体である。
【０２５９】
ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤は、配列番号：１、８、９および１２〜２６から選択される配列と少なくとも９０％同一の配列の少なくとも１０連続ヌクレオチド、またはその全長相補鎖を含む単離核酸分子である。ある態様において、ＦＸＹＤ５調節剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、配列番号：１２〜２６から選択される配列を有する。
【０２６０】
ＦＸＹＤ５アンチセンスおよびｓｉＲＮＡオリゴ
【表１】
2010526029.tif 000003
【０２６１】
本発明を特定の態様についての記載によって説明してきたが、様々な変化をつけることができ、均等物が本発明の真の精神および範囲から離れることなく置換され得ることを、当業者によって理解されるべきである。さらに、多くの修正を行って具体的な状況、物質、物質の組成物、方法、方法工程または複数工程を、本発明の対象、精神および範囲に適用することができる。全てのかかる修飾は、本発明の範囲に含まれると意図される。
【図１】
2010526029.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
2010526029000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年12月7日(2009.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010526029000001.app
【国際調査報告】
2010526029.tif 000028
2010526029.tif 000029
2010526029.tif 000030
2010526029.tif 000031
2010526029.tif 000032