(57)【要約】  本発明は生体系における血管新生の抑制方法に関する。この方法は、生体系に有効量のステロイドサポニンを投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体系に有効量のステロイドサポニンを投与することを含む、生体系における血管新生の抑制方法。
【請求項２】
ステロイドサポニンがステロイドサポニンのサポゲニン成分の1つの位置に結合している糖類を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糖類がサポゲニンのC-3位に結合している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
糖類がＤ-グルコース(Glc)、Ｌ-ラムノース(Rha)、Ｄ-ガラクトース(Gal)、Ｄ-グルクロン酸(GlcＡ)、Ｄ-キシロース(Xyl)、Ｌ-アラビノース(Ara)、Ｄ-フコース(Fuc)、Ｄ-ガラクツロン酸(GalＡ)から選択される１つ以上の単糖単位を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ステロイドサポニンのサポゲニン成分がジオスゲニン、ヤモゲニン(ネオジオスゲニン)、ユッカゲニン、サルササポゲニン、チゴゲニン、スミラゲニン、ヘコゲニン、ギトゲニン、コンバラマロゲニン、ネオルスコゲニン及びソラゲニンを含めたスピロスタノール;プロトジオスゲニン、シュードプロトジオスゲニン、メチルプロトジオスゲニン、プロトヤモゲニン及びメチルプロトヤモゲニンを含めたフロスタノールからなる群から選択されるサポゲニンをベースとする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ステロイドサポニンがカコトリオシド-ステロイドサポニンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステロイドサポニンがソラトリオシド-ステロイドサポニンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
カコトリオシド-ステロイドサポニンがC-3位を介してカコトリオースに連結しているジオスゲニン、C-3位を介して別のカコトリオシドに連結しているジオスゲニン、C-3位を介してカコトリオシドに連結しているチゴゲニン、C-3位を介してカコトリオシドに連結しているサルササポゲニン、C-3位を介してカコトリオシドに連結しているスミラゲニン、C-3位を介してカコトリオシドに連結しているユッカゲニン、及びC-3位を介してカコトリオシドに連結しているヤモゲニンからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ソラトリオシド-ステロイドサポニンがグラシリン、デルトニン、ジオスゲニンソラトリオース、C-3位を介して別のソラトリオシドに連結しているジオスゲニン、C-3位を介してソラトリオシドに連結しているチゴゲニン、C-3位を介してソラトリオシドに連結しているサルササポゲニン、C-3位を介してソラトリオシドに連結しているスミラゲニン、C-3位を介してソラトリオシドに連結しているユッカゲニン、及びC-3位を介してソラトリオシドに連結しているヤモゲニンからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ステロイドサポニンが化学式:
【化１】
2010500287.tif 000015
[式中、
R1、R2、R4、R6、R7、R11、R12、R14、R15及びR17は独立してH、OH、=O、薬理学的に許容されるエステル基または薬理学的に許容されるエーテル基であり;
R5はC-5,C-6が単結合のときにはHであり、C-5,C-6が二重結合のときには存在せず;
BがCH2のときにはAはOであり、またはAがCH2のときにはBはOであり;
R27BがCH3のときにはR27AはHであり、またはR27BがHのときにはR27AはCH3であり;
R3は酸素原子を介してステロイドサポゲニンにC-3で連結しているグリコシル基を含む]
を有する化合物、或いはその製薬上許容される塩または誘導体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステロイドサポニンが化学式:
【化２】
2010500287.tif 000016
[式中、
R1、R2、R4、R6、R7、R11、R12、R14、R15及びR17は独立してH、OH、=O、薬理学的に許容されるエステル基または薬理学的に許容されるエーテル基であり;
R5はC-5,C-6が単結合のときにはHであり、C-5,C-6が二重結合のときには存在せず;
R22はC-20,C-22が単結合のときにはヒドロキシルまたはアルコキシ基であり、C-20,C-22が二重結合のときには存在せず;
R27BがCH3のときにはR27AはHであり、またはR27BがHのときにはR27AはCH3であり;
R28はHまたは糖類、或いはその製薬上許容される塩または誘導体であり;
R3は酸素原子を介してステロイドサポゲニンにC-3で連結しているグリコシル基を含む]
を有する化合物、或いはその製薬上許容される塩または誘導体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステロイドサポニンがC-3位を介して糖類に連結しているジオスゲニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステロイドサポニンがC-3位を介して糖類に連結しているチゴゲニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステロイドサポニンがC-3位を介して糖類に連結しているサルササポゲニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ステロイドサポニンがC-3位を介して糖類に連結しているスミラゲニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステロイドサポニンがC-3位を介して糖類に連結しているユッカゲニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ステロイドサポニンがC-3位を介して糖類に連結しているヤモゲニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステロイドサポニンがデルトニン(ジオスゲニンRha 2,[Glc 4],Glc)、ジオスシン(ジオスゲニンRha 2,[Rha 4],Glc)、プロサポゲニンA(ジオスゲニンRha 2,Glc)及びアスペリン(ジオスゲニン[Rha 4,Rha 4],Rha 2,Glc)からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
更に生体系に抗血管新生剤を投与することを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
抗血管新生剤がヒト化及び/またはキメラ抗体を含めた抗-VEGF抗体、抗-VEGFアプタマー、VEGFアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン1、インターロイキン12、レチノイン酸、並びにメタロプロテイナーゼ-2及び-9の組織インヒビターからなる群から選択される1つ以上の物質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
生体系がヒトまたは動物被験者である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
生体系における血管新生が充実性腫瘍の形成または拡大、血管線維腫、角膜血管新生、網膜/脈絡膜血管新生、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、動静脈奇形、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、乾せん性関節炎、狼そう、結合組織病、オスラー・ウェバー症候群、動脈硬化プラーク、乾せん、化膿性肉芽腫、後水晶体線維増殖症、強皮症、肉芽化、血管腫、トラコーマ、血友病性関節、血管接着、肥厚性瘢痕、急性または慢性炎症を伴う疾患または状態、喘息を含めた肺の慢性炎症を伴う疾患または状態、サルコイドーシス、炎症性腸疾患、クローン病または潰瘍性大腸炎に関連する血管新生である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
生体系における血管新生の抑制用薬剤の製造におけるステロイドサポニンの使用。
【請求項２４】
ステロイドサポニン及び抗血管新生剤を含む組成物。
【請求項２５】
生体系に有効量のステロイドサポニンを投与することを含む、所望レベルの血管新生抑制を達成するために生体系に投与される抗血管新生剤の量の低減方法。
【請求項２６】
生体系に有効量のステロイドサポニンを投与することを含む、生体系における内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制方法。
【請求項２７】
有効量のステロイドサポニンを含む、生体系における内皮細胞増殖及び/または遊走を抑制するために使用される組成物。
【請求項２８】
生体系における内皮細胞増殖及び/または遊走血管新生の抑制用薬剤の製造におけるステロイドサポニンの使用。
【請求項２９】
生体系に有効量のステロイドサポニンを投与することを含む、所望レベルの内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制を達成するために生体系に投与される抗血管新生剤の量の減量方法。
【請求項３０】
ステロイドサポニン及び抗血管新生剤を含み、そのステロイドサポニン及び抗血管新生剤が被験者に共投与する形態または被験者に別々に投与する形態で提供されている、組合せ剤。
【請求項３１】
デルトニンを含む医薬組成物。
【請求項３２】
薬剤の製造におけるデルトニンの使用。
【請求項３３】
薬剤が、血管新生の抑制;内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制;被験者の癌の予防及び/または治療;原発性及び/または続発性腫瘍の増殖の防止;転移の抑制及び/または予防;並びに所望レベルの血管新生抑制を達成するために生体系に投与される抗血管新生剤の量の減量;の１つ以上のために使用される、請求項３２に記載のデルトニンの使用。
【請求項３４】
プロサポゲニンAを含む医薬組成物。
【請求項３５】
薬剤の製造におけるプロサポゲニンAの使用。
【請求項３６】
薬剤が、血管新生の抑制;内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制;被験者の癌の予防及び/または治療;原発性及び/または続発性腫瘍の増殖の防止;転移の抑制及び/または予防;並びに所望レベルの血管新生抑制を達成するために生体系に投与される抗血管新生剤の減量;の1つ以上のために使用される、請求項３５に記載のプロサポゲニンAの使用。
【請求項３７】
アスペリンを含む医薬組成物。
【請求項３８】
薬剤の製造におけるアスペリンの使用。
【請求項３９】
薬剤が血管新生の抑制;内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制;被験者の癌の予防及び/または治療;原発性及び/または続発性腫瘍の増殖の防止;転移の抑制及び/または予防;並びに所望レベルの血管新生抑制を達成するために生体系に投与される抗血管新生剤の減量;の1つ以上のために使用される、請求項３８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生(angiogenesis)を抑制するための方法及び組成物に関する。
【０００２】
本発明はまた、内皮細胞増殖及び/または遊走を抑制するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
血管新生は、“発芽”と称されるプロセスでの内皮細胞の増殖及び遊走により既存の血管から新しい血管が形成されるプロセスである。
【０００４】
内皮細胞の増殖は血管新生プロセスにおける決定的なステップである。臓器は、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質(主に、ラミニン)、タイプIVコラーゲン及びプロトグリカンの組織から構成される基底膜と称される周囲の無細胞構造物により規定される明確な境界を有している。血管新生は、血管の内腔の内側を覆う内皮細胞を取り囲む基底膜が浸食されることから始まる。基底膜の浸食は、内皮細胞及び白血球により放出される酵素によりトリガーされる。その後、血管新生刺激因子により誘導されると、内皮細胞は浸食された基底膜を介して遊走する。遊走している細胞は親血管の芽を形成する。遊走している内皮細胞は増殖し、芽はまとまって毛細管ループを形成し、こうして新しい血管が形成される。
【０００５】
血管新生のコントロールは、多数の血管新生刺激因子及び抑制因子の作用を伴う高度に調節されるプロセスである。コントロールされた血管新生とコントロールされない血管新生の両方が同様に進むと考えられている。
【０００６】
正常な生理条件下では、ヒト及び動物は非常に特殊な限られた状況でしか血管新生を受けない。例えば、血管新生は通常創傷治癒、胎児及び胚発生、並びに黄体、子宮内膜及び胎盤の形成においてしか観察されない。
【０００７】
しかしながら、コントロールされないまたは望ましくない血管新生は多くの疾患及び状態に関連している。血管新生の誘導は、腫瘍細胞の身体中への拡散により特徴づけられる癌の特徴である。腫瘍細胞が原発部位から続発性部位に遊走するプロセスは“転移”と称されており、この転移は良性及び悪性増殖の基本的な差であり、癌の重要な臨床問題となる。残念ながら、充実性腫瘍の50%以上が診断時に転移している。
【０００８】
腫瘍増殖における血管新生の役割についての証拠は多数あり、充実性腫瘍の増殖は決定的にこのプロセスに依存していると通常容認されている。血管新生は腫瘍発生の2つの段階で決定的な役割を発揮する。第1に、腫瘍塊が数mmのサイズ以上に増殖するには血管新生が必要である。新しい血管系が形成されなければ、腫瘍塊中の細胞にはこの小さいサイズ以上に発達するのに十分な血液が供給されないであろう。しかしながら、腫瘍の血管新生(vascularization)が始まると、腫瘍塊は拡大する恐れがある。
【０００９】
腫瘍の血管新生は続発性腫瘍の発生においても有意な役割を発揮する。腫瘍が血管新生されると、腫瘍細胞が血流に入り、身体中に循環する。腫瘍細胞が原発部位を離れて、続発性(転移)部位に定着すると、更なる血管新生により続発性腫瘍塊が成長し、拡大する。従って、血管新生を防止すると原発部位での腫瘍増殖が減少するだけでなく、血管新生を防止すると腫瘍細胞の原発部位から身体の他の部分への遊走(転移)を抑えたり減らすこともできる。
【００１０】
腫瘍の形成に加えて、血管新生により誘導されたり、コントロールされないまたは望ましくない血管新生に関連する疾患及び状態も多種多様である。これらには、糖尿病性網膜症、後水晶体線維増殖症、血管新生性緑内障、乾せん、血管線維腫、(関節リウマチを含めた)免疫及び非免疫炎症、動脈硬化プラークにおける毛細管の増殖、血管腫及びカポジ肉腫が含まれる。血管新生はリウマチ様関節でも起こり得、白血球を流入させ、その後炎症メディエーターが放出されることによる関節破壊が早まる。
【００１１】
血管新生は、特定の眼疾患(例えば、眼血管新生疾患)を患っている患者の角膜及び網膜においても重要な役割を発揮する。この疾患の特徴は、新しい血管が眼の組織(例えば、網膜及び角膜)に浸入することである。これが失明の最も一般的な原因であり、多数の眼疾患に関連している。加齢黄斑変性では、関連する視覚の問題は、網膜色素上皮のすぐ下の血管結合組織の増殖を伴ってブルッフ膜の欠陥を介して脈絡膜毛細管が内へ成長することにより生ずる。
【００１２】
慢性炎症も病的血管新生を伴うことがあり得る。潰瘍性大腸炎やクローン病のような病的状態は、新しい血管の炎症組織内への成長を伴う組織学的変化を示す。血管新生に関連する別の病理学的役割はアテローム性動脈硬化症で見られる。血管の内腔内で形成されたプラークが血管新生刺激活性を有することが判明している。
【００１３】
血管新生は再生及び創傷治癒にも関与している。再生では、血管新生は排卵及び受精後の胞胚の着床における重要なステップである。血管新生の防止は、無月経を誘導し、排卵を阻止し、または胞胚による着床を防止するために使用され得る。創傷治癒では、過度の修復または線維増殖は外科手順の有害な副作用であり得、血管新生を起こしたり悪化させる恐れがある。癒着は手術でしばしば起こる合併症であり、小腸閉塞のような問題が生ずる。
【００１４】
コントロールされないまたは望ましくない血管新生を伴う疾患の現在の治療法は不十分である。従って、コントロールされないまたは望ましくない血管新生を抑制する新しい方法及び組成物が要望されている。
【００１５】
本発明は、ステロイドサポニンが抗血管新生能を有しているという知見に基づき、血管新生を抑制するための方法及び組成物に関する。
【００１６】
本明細書中の従来技術として挙げられている特許文献等に対する言及は、本出願の優先日にこれらの文献等が公知であったり、そこに含まれている情報が共通の一般常識の一部であったとする容認として受け取るべきでない。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、ステロイドサポニンが血管新生を抑制する能力についての研究に基づいている。特に、ステロイドサポニンが多数のインビボ及びエキソビボモデル系において血管新生を抑制する能力を有していることが知見された。この知見は、ステロイドサポニンが高い抗血管新生能を有していることを指摘している。
【００１８】
従って、本発明は、生体系に有効量のステロイドサポニンを投与することを含む生体系における血管新生の抑制方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、有効量のステロイドサポニンを含む生体系において血管新生を抑制するために使用される組成物を提供する。
【００２０】
本発明はまた、生体系における血管新生の抑制用薬剤の製造におけるステロイドサポニンの使用を提供する。
【００２１】
本発明はまた、ステロイドサポニン及び抗血管新生剤を含む組成物を提供する。
【００２２】
本発明はまた、生体系に有効量のステロイドサポニンを投与することを含む所望レベルの血管新生抑制を達成するために生体系に投与される抗血管新生剤の量の減量方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、生体系に有効量のステロイドサポニンを投与することを含む生体系における内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制方法を提供する。
【００２４】
本発明はまた、有効量のステロイドサポニンを含む生体系における内皮細胞増殖及び/または遊走を抑制するために使用される組成物を提供する。
【００２５】
本発明はまた、生体系における内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制用薬剤の製造におけるステロイドサポニンの使用を提供する。
【００２６】
本発明はまた、生体系に有効量のステロイドサポニンを投与することを含む所望レベルの内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制を達成するために生体系に投与される抗血管新生剤の量の減量方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、ステロイドサポニン及び抗血管新生剤を含み、そのステロイドサポニン及び抗血管新生剤が被験者に共投与するための形態または被験者に別々に投与するための形態で提供されている、組合せ剤(combination product)を提供する。
【００２８】
本発明は、デルトニンを含む医薬組成物をも提供する。
【００２９】
本発明は、薬剤の製造におけるデルトニンの使用をも提供する。
【００３０】
本発明は、プロサポゲニンAを含む医薬組成物をも提供する。
【００３１】
本発明は、薬剤の製造におけるプロサポゲニンAの使用をも提供する。
【００３２】
本発明は、アスペリンを含む医薬組成物をも提供する。
【００３３】
本発明は、薬剤の製造におけるアスペリンの使用をも提供する。
【００３４】
本明細書を通じて使用されている各種用語は当業者が理解している意味を有している。しかしながら、容易に参照できるようにこれらの用語の幾つかをここで定義する。
【００３５】
本明細書を通じて使用されている用語「グリコシド」は、トリテルペン、ステロイドまたはステロイドアルカロイドのアグリコン(非糖類)成分に連結して糖類(糖)部分(単糖、二糖または多糖)を含む化合物を意味すると理解される。多くの場合、糖類(糖)部分はアグリコンのC-3位に連結されているが、他の連結も本発明の範囲に含まれる。例えば、C-26位に結合している糖類を含むフロスタノールグリコシド及びスピロスタノールグリコシドの両方がステロイドサポニンのサブクラスである。
【００３６】
本明細書を通じて使用されている用語「サポニン」は、通常アグリコンのC-3位を介してアグリコンに結合している糖類(糖)を含むグリコシドを意味すると理解される。
【００３７】
本明細書を通じて使用されている用語「ステロイドサポニン」は、窒素原子非含有アグリコンに結合した(1つ以上の単糖、二糖または多糖単位を含めた)1つ以上の糖類単位を含むグリコシドを意味すると理解される。
【００３８】
これに関して、用語「ステロイドサポニン」は抗癌治療の活性を高める能力の点で機能的に均等である化合物の塩または他の誘導体もその範囲に含むと理解される。
【００３９】
ステロイド「アグリコン」は「ゲニン」または「サポゲニン」とも称され、これらの用語は明細書を通じて互換可能に使用され、いずれもサポニン分子の非糖類部分を意味すると理解される。
【００４０】
本明細書を通じて使用されている用語「糖類A-(1→n)-糖類B」は、糖類AがC-1により糖類BのC-n(ここで、nは整数である)に連結していることを意味すると理解される。
【００４１】
例えば、一般名が「カコトリオース」の多糖はα-L-ラムノピラノシル-(1→2)-[α-L-ラムノピラノシル-(1→4)]-β-D-グルコピラノシドである。本明細書中で使用されているIUPAC推奨に従う命名法では、Rha 2,[Rha 4],Glcと略記される。
【００４２】
本明細書を通じて使用されている用語「被験者」はヒトまたは動物被験者を意味すると理解される。これに関して、本発明はその範囲に獣医学的用途を含むと理解される。例えば、動物被験者は哺乳動物、霊長類、家畜動物(例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタまたはヤギ)、愛玩動物(例えば、イヌ、ネコ)、実験動物(例えば、マウス、ラット、モルモット、鳥)、獣医学的に重要な動物または経済的に重要な動物であり得る。
【００４３】
本明細書を通じて使用されている用語「治療する」及びその変形は、有効量のステロイドサポニンを用いる治療介入を意味すると理解される。例えば、この用語はその範囲に以下のアウトカム:(i)切除後の原発性腫瘍の増殖の縮小を含めた被験者における原発性腫瘍の増殖の抑制または予防;(ii)被験者における1つ以上の続発性腫瘍の増殖及び形成の抑制または防止;(iii)被験者における血管新生の抑制または防止;(iv)被験者における内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制;(v)非治療状態と比べた被験者の平均寿命の改善;及び(vi)非治療状態と比べた被験者の生活の質の改善;の1つ以上を有する治療介入が含まれる。
【００４４】
本明細書を通じて使用されている用語「抑制する」は、プロセスの開始、速度、確率、継続または停止の1つ以上を含めたプロセスの進行の低下を意味すると理解される。
【００４５】
本明細書を通じて使用されている用語「血管新生(angiogenesis)」は、例えば組織または臓器への新しい血管の生成(“血管新生(vascularization)”)を意味すると理解される。
【００４６】
本明細書を通じて使用されている用語「生体系」は任意の多細胞系を意味すると理解され、分離された細胞群から全生物までが含まれる。例えば、生体系は組織培養物中の細胞、組織または臓器、或いは望ましくないまたはコントロールされない血管新生の影響、或いは望ましくないまたはコントロールされない血管新生に関連する疾患または状態を有しているヒト被験者のようなヒト被験者全体であり得る。
【００４７】
本明細書を通じて使用されている用語「抗血管新生剤」は、生体系において血管新生を抑制する能力を有している物質を意味すると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】大動脈外植片からの血管成長に対する漸増濃度のデルトニンの影響を示す。
【図２】光学顕微鏡検査またはFitc-BS-1レクチン染色を用いた大動脈外植片に対するDMSO単独の影響の代表例を示す。
【図３】光学顕微鏡検査またはFitc-BS-1レクチン染色を用いた大動脈外植片に対する10μM デルトニンの影響の代表例を示す。
【図４】ジオスシン、デルトニン、トリリン、プロサポゲニンA及びソラフェニブの誘導された血管の平均数に対する影響の指標として、これらの化合物のアンジオスポンジ(angiosponge)中の血管のCD31染色に対する影響を示す。
【図５】ジオスシン、デルトニン、トリリン、プロサポゲニンA及びソラフェニブのアンジオスポンジにおけるbFGFによる血管新生の誘導%に対する影響を示す。
【図６】ジオスシン、デルトニン、トリリン、プロサポゲニンA及びソラフェニブのアンジオチャンバにおける血管容量に対する影響を示す。
【図７】ジオスシン、デルトニン、トリリン、プロサポゲニンA及びソラフェニブのアンジオチャンバ(angiochamber)におけるbFGFによる血管新生の誘導に対する影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
上記したように、1つの実施形態で、本発明は、生体系に有効量のステロイドサポニンを投与するステップを含む生体系における血管新生の抑制方法を提供する。
【００５０】
各種実施形態における生体系は任意の多細胞系であり、分離された細胞群から全生物までが含まれる。例えば、生体系は組織培養物中の細胞、組織または臓器、或いは望ましくないまたはコントロールされない血管新生の影響、或いは望ましくないまたはコントロールされない血管新生に関連する疾患または状態を有しているヒト被験者全体であり得る。
【００５１】
この点で、生体系は血管新生が起こっているかまたは血管新生が起こり得る生体系であると考えられる。
【００５２】
1つの実施形態では、生体系はヒトまたは動物被験者である。1つの具体的実施形態では、生体系は、血管新生が望ましくないまたはコントロールされない血管新生に起因する疾患または状態に関連しているヒトまたは動物被験者である。
【００５３】
例えば、生体系は、充実性腫瘍の形成または拡大、血管線維腫、角膜血管新生、網膜/脈絡膜血管新生、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、動静脈奇形、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、乾せん性関節炎、狼そう、結合組織病、オスラー・ウェバー症候群、動脈硬化プラーク、乾せん、化膿性肉芽腫、後水晶体線維増殖症、強皮症、肉芽化、血管腫、トラコーマ、血友病性関節、血管接着、肥厚性瘢痕、急性または慢性炎症を伴う疾患または状態、喘息を含めた肺の慢性炎症を伴う疾患または状態、サルコイドーシス、炎症性腸疾患、クローン病または潰瘍性大腸炎に関連する血管新生を患っているかまたは前記血管新生に感受性のヒトまたは動物被験者であり得る。
【００５４】
1つの実施形態では、本発明は被験者の癌を予防及び/または治療するために使用され得る。
【００５５】
別の実施形態では、本発明は原発性及び/または続発性腫瘍の増殖を防止するため、並びに転移を抑制及び/または防止するために使用され得る。
【００５６】
癌の例には、癌腫、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、大腸癌(結腸、直腸、肛門及び虫垂の癌を含む)、食道癌、ホジキン病、腎臓癌、喉頭癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、母斑及び異形成母斑、多発性骨髄腫、筋肉癌、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、奇形腫、甲状腺癌及び子宮癌が含まれる。
【００５７】
本発明の各種実施形態における被験者はヒトまたは動物被験者であり得る。例えば、動物被験者は哺乳動物、霊長類、家畜動物(例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタまたはヤギ)、愛玩動物(例えば、イヌ、ネコ)、実験動物(例えば、マウス、ラット、モルモット、鳥)、獣医学的に重要な動物または経済的に重要な動物であり得る。
【００５８】
1つの実施形態で、被験者はヒト被験者である。
【００５９】
サポニンは、通常(i)トリテルペングリコシド、(ii)ステロイドグリコシド、及び(iii)ステロイドアルカロイドグリコシドの３つの主要クラスに分類される。サポニンのすべてで共通して1つ以上の糖単位がアグリコンに、通常C-3位に結合している。ステロイドサポニンはHostettmann K及びMarston A(2005),Chemistry & pharmacology of natural products:Saponins,ケンブリッジ大学出版に一般的に記載されている通りである。
【００６０】
本明細書中で先に検討したように、ステロイドサポニンはアグリコン部中に窒素原子を含有していない。
【００６１】
本発明の各種実施形態でのステロイドサポニンは天然に存在するステロイドサポニン及び天然に存在しないステロイドサポニン(すなわち、化学合成されるステロイドサポニン)を含むと考えられる。加えて、本発明の各種実施形態でのステロイドサポニンはステロイドサポニンのプロドラッグ、ステロイドサポニンの誘導体(例えば、エステル、ケトン、カルボン酸、塩、置換形態、ハロゲン化形態または他のヘテロ原子含有形態、不飽和形態または他の官能誘導体を含む)をも含むと考えられる。
【００６２】
本発明の各種実施形態でのステロイドサポニンの糖類部分は1つ以上の糖類単位、例えば単糖、二糖単位または多糖単位を含み得る。
【００６３】
本発明の各種実施形態でのステロイドサポニンは、糖類がアグリコン部分の1つ以上の位置で結合しているアグリコンをも含み得る。
【００６４】
1つの実施形態では、ステロイドサポニンはステロイドサポニンのサポゲニン成分の1つの位置に糖類が結合しているものを含む。
【００６５】
上で検討したように、糖類単位は単糖、二糖または多糖であり得る。糖類は適当な単糖、例えばD-グルコース(Glc)、L-ラムノース(Rha)、D-ガラクトース(Gal)、D-グルクロン酸(GlcA)、D-キシロース(Xyl)、L-アラビノース(Ara)、D-フコース(Fuc)、D-ガラクツロン酸(GalA)から構成され得る。糖類単位が置換糖、例えばアミノ糖、硫酸化糖、アシル化糖、N-アシル化糖、及び前記した単糖の官能誘導体であってもよい。
【００６６】
同様に、二糖は上記した単糖の2つの組合せであり得る。
【００６７】
本発明の各種実施形態での多糖は線状でも分岐状であってもよく、本明細書中に上記した単糖を含めた単糖の2つ以上の組合せであり得る。
【００６８】
1つの実施形態では、多糖は1〜6個の単糖単位から構成されている。
【００６９】
これに関連して、また本明細書中に上記したように、多糖は成分単糖の配置に関して一般的に記載されている。
【００７０】
1つの実施形態では、ステロイドサポニンの糖類は1つの単糖単位から構成されている。単糖の例はグルコースであり、その化学名はβ-D-グルコピラノシドであり、C-3位を介してアグリコンジオスゲニンに結合すると“トリリン”という一般名を有する。
【００７１】
別の実施形態では、ステロイドサポニンの糖類は2つの単糖単位(すなわち、二糖)から構成されている。二糖の例はRha 2,Glcであり、その化学名はα-L-ラムノピラノシル(1→2)-β-D-グルコピラノシドであり、C-3位を介してアグリコンジオスゲニンに結合すると“プロサポゲニンA”という一般名を有する。
【００７２】
別の実施形態では、多糖類は3つの糖類単位(すなわち、三糖)から構成されている。カコトリオシドが三糖単位の一般例であり、3つの糖類のグリコシル基はグルコース単位に連結して2つのラムノース単位を有し、前記グルコース単位はグリコシド結合を介してサポゲニンのC-3位に連結している。カコトリオースはα-L-ラムノピラノシル-(1→2)-[α-L-ラムノピラノシル-(1→4)]-β-D-グルコピラノシドである。本明細書中で使用されているIUPAC推奨に従う命名法ではRha 2,[Rha 4],Glcと略記される。
【００７３】
同様に、ソラトリオシドは、各々が第３の糖類単位に連結している1つのラムノース単位及び非ラムノース糖類単位を含む3つの糖類のグリコシル基であり、第３の糖類単位はグリコシド結合を介してサポゲニンのC-3位に連結している。
【００７４】
四糖の例は[Rha 4,Rha 4],Rha 2,Glcであり、その化学名は[α-L-ラムノピラノシル(1→4)-α-L-ラムノピラノシル(1→4)]-α-L-ラムノピラノシル(1→4)-β-D-グルコピラノシドであり、C-3位を介してアグリコンジオスゲニンに結合すると“アスペリン”という一般名を有する。
【００７５】
四糖の別の例はGlc 4,[Xyl 3],Rha 2,Araであり、その化学名はβ-D-グルコピラノシル(1→4)-[β-D-キシロピラノシル-(1→3)]-α-L-ラムノピラノシル(1→2)-α-L-アラビノシドである。
【００７６】
本明細書中で先に検討したように、ステロイドサポニンはアグリコン部分中に窒素原子を含有していない。
【００７７】
1つの実施形態では、本発明の各種実施形態でのステロイドサポニンは以下の化学式IまたはIIを有するサポゲニン、或いはその製薬上許容される塩または誘導体をベースとする:
【化１】
2010500287.tif 000002
【００７８】
[式中、
R1、R2、R4、R6、R7、R11、R12、R14、R15及びR17は独立してH、OH、=O、薬理学的に許容されるエステル基または薬理学的に許容されるエーテル基であり;
R5はC-5,C-6が単結合のときにはHであり、C-5,C-6が二重結合のときには存在せず;
BがCH2のときにはAはOであり、またはAがCH2のときにはBはOであり;
R27BがCH3のときにはR27AはHであり、またはR27BがHのときにはR27AはCH3であり;
R3は酸素原子を介してステロイドサポゲニンにC-3で連結しているグリコシル基を含む]
【化２】
2010500287.tif 000003
【００７９】
[式中、
R1、R2、R4、R6、R7、R11、R12、R14、R15及びR17は独立してH、OH、=O、薬理学的に許容されるエステル基または薬理学的に許容されるエーテル基であり;
R5はC-5,C-6が単結合のときにはHであり、C-5,C-6が二重結合のときには存在せず;
R22はC-20,C-22が単結合のときにはヒドロキシルまたはアルコキシ基であり、C-20,C-22が二重結合のときには存在せず;
R27BがCH3のときにはR27AはHであり、またはR27BがHのときにはR27AはCH3であり;
R28はHまたは糖類、或いはその製薬上許容される塩または誘導体であり;
R3は酸素原子を介してステロイドサポゲニンにC-3で連結しているグリコシル基を含む]。
【００８０】
ステロイドサポゲニンの例には、スピロスタノールアグリコン、例えばジオスゲニン、ヤモゲニン(ネオジオスゲニン)、ユッカゲニン、サルササポゲニン、チゴゲニン、スミラゲニン、ヘコゲニン、ギトゲニン、コンバラマロゲニン、ネオルスコゲニン及びソラゲニン;及びフロスタノールアグリコン、例えばプロトジオスゲニン、シュードプロトジオスゲニン、メチルプロトジオスゲニン、プロトヤモゲニン及びメチルプロトヤモゲニンが含まれる。
【００８１】
1つの実施形態では、ステロイドサポニンはカコトリオシド-ステロイドサポニンである。別の実施形態では、ステロイドサポニンはソラトリオシド-ステロイドサポニンである。
【００８２】
カコトリオシド-ステロイドサポニンの例には、C-3位を介してカコトリオースに連結しているサポゲニン“ジオスゲニン”、C-3位を介して別のカコトリオシドに連結しているジオスゲニン、C-3位を介してカコトリオシドに連結しているチゴゲニン、C-3位を介してカコトリオシドに連結しているサルササポゲニン、C-3位を介してカコトリオシドに連結しているスミラゲニン、C-3位を介してカコトリオシドに連結しているユッカゲニン、及びC-3位を介してカコトリオシドに連結しているヤモゲニンから構成される“ジオスシン”が含まれる。
【００８３】
ソラトリオシドステロイドサポニンの例には、C-3位を介してソラトリオシド(Rha 2,[Glc 3],Glc)に連結しているジオスゲニンである“グラシリン”、“デルトニン”(C-3位を介してソラトリオシドRha 2,[Glc 4],Glcに連結しているジオスゲニン)、C-3位を介してソラトリオース(Rha 2,[Glc 3],Gal)に連結しているジオスゲニン[これに関連して、(Rha 2,[Glc 3],Gal)に連結しているジオスゲニンは「ジオスゲニンソラトリオース」と称される]、C-3位を介して別のソラトリオシドに連結しているジオスゲニン、C-3位を介してソラトリオシドに連結しているチゴゲニン、C-3位を介してソラトリオシドに連結しているサルササポゲニン、C-3位を介してソラトリオシドに連結しているスミラゲニン、C-3位を介してソラトリオシドに連結しているユッカゲニン、及びC-3位を介してソラトリオシドに連結しいるヤモゲニンが含まれる。
【００８４】
単純な単糖ステロイドサポニンは植物界に広く存在している。単糖は通常C-3位を介してアグリコンに連結しており、その例にはC-3位を介してグルコースに連結しているジオスゲニンである“トリリン”が含まれる。C-3位を介してグルコースに連結している他のサポゲニンには、サルササポゲニン、ロデアサポゲニン及びヤモゲニンが含まれる。幾つかのサポゲニンはC-3位を介して別の単糖(例えば、アラビノース)に連結しており、例えばヨノゲニン及びコンバラゲニンはC-3位を介してガラクトース等に連結している。
【００８５】
二糖ステロイドサポニンの例には、C-3位を介して例えば(Xyl 2,Gal 3);(Glc 2,Glc 3);(Glc 3,Glc 3)に連結しているサルササポゲニン、C-3位を介して(Glc 2,Glc 3);(Glc 2,Gal 3)に連結しているスミラゲニン、C-3位を介して(Rha 2,Glc 3)に連結しているサモゲニン、チゴゲニン、ギトゲニン、アリオゲニン、ルスコゲニン、ペンノゲニン、セパゲニン及びジオスゲニンが含まれる。
【００８６】
ヤムイモ(Dioscorea)種由来のジオスゲニングリコシドはステロイドホルモンの出発物質として商業上非常に興味深いものである。ジオスゲニン及びそのC-25異性体ヤモゲニンのグリコシドは最も頻繁に記載されているスピロスタノールサポニンである。
【００８７】
B環中にC-5,C-6二重結合を有する天然に存在するステロイドスピロスタノールサポゲニンの例を表1にリストする。
【化３】
2010500287.tif 000004
【表１】
2010500287.tif 000005
【００８８】
B環中にC-5,C-6単結合を有する天然に存在するステロイドスピロスタノールサポゲニンの例を表２にリストする。
【化４】
2010500287.tif 000006
【表２】
2010500287.tif 000007
【００８９】
B環中にC-5,C-6二重結合及びＥ環中にC-20,C-22単結合を有するプロトスピロスタンタイプの天然に存在するステロイドフロスタノールサポゲニンの例を表３にリストする。
【化５】
2010500287.tif 000008
【表３】
2010500287.tif 000009
【００９０】
B環中にC-5,C-6単結合及びＥ環中にC-20,C-22単結合を有するプロトスピロスタンタイプの天然に存在するステロイドフロスタノールサポゲニンの例はプロトチゴゲニンである。
【００９１】
B環中にC-5,C-6二重結合及びＥ環中にC-20,C-22二重結合を有するシュードスピロスタンタイプの天然に存在するステロイドフロスタノールサポゲニンの例はシュードジオスゲニンである。
【００９２】
B環中にC-5,C-6二重結合及びＥ環中にC-20,C-22二重結合を有するシュードプロトスピロスタンタイプの天然に存在するステロイドフロスタノールサポゲニンの例はシュードプロトジオスゲニンである。
【００９３】
1つの実施形態では、ステロイドサポニンはC-3位を介して糖類単位に連結しているサポゲニンジオスゲニンである。
【００９４】
別の実施形態では、ステロイドサポニンはジオスシンまたはグラシリンであり、ジオスシンはC-3位を介してカコトリオース(Rha 2,[Rha 4],Glc)に連結しているサポゲニンジオスゲニンであり、グラシリンはC-3位を介してソラトリオシド(Rha 2,[Glc 3],Glc)に連結しているジオスゲニンである。
【００９５】
別の実施形態では、ステロイドサポニンは、デルトニンがC-3位を介してRha 2,[Glc 4],Glcに連結しているサポゲニンジオスゲニンであるデルトニンである。
【００９６】
別の実施形態では、ステロイドサポニンはC-3位を介してソラトリオース(Rha 2,[Glc 3],Gal)に連結しているサポゲニンジオスゲニンである。これに関連して、(Rha 2,[Glc 3],Gal)に連結しているジオスゲニンは「ジオスゲニンソラトリオース」と称されている。
【００９７】
別の実施形態では、ステロイドサポニンはC-3位を介して糖類に連結しているサポゲニンジオスゲニンである。
【００９８】
別の実施形態では、ステロイドサポニンはC-3位を介して糖類に連結しているサポゲニンチゴゲニンである。
【００９９】
別の実施形態では、ステロイドサポニンはC-3位を介して糖類に連結しているサポゲニンサルササポゲニンである。
【０１００】
別の実施形態では、ステロイドサポニンはC-3位を介して糖類に連結しているサポゲニンスミラゲニンである。
【０１０１】
別の実施形態では、ステロイドサポニンはC-3位を介して糖類に連結しているサポゲニンユッカゲニンである。
【０１０２】
別の実施形態では、ステロイドサポニンはC-3位を介して糖類に連結しているサポゲニンヤモゲニンである。
【０１０３】
別の実施形態では、ステロイドサポニンはコンバラマロシドを除くフロスタノールをベースとするステロイドサポニンである。
【０１０４】
1つの具体的実施形態では、ステロイドサポニンはデルトニン(ジオスゲニンRha 2,[Glc 4],Glc)、ジオスシン(ジオスゲニンRha 2,[Rha 4],Glc)、プロサポゲニンA(ジオスゲニンRha 2,Glc)及びアスペリン(ジオスゲニン[Rha 4,Rha 4],Rha 2,Glc)からなる群から選択される。
【０１０５】
デルトニン、プロサポゲニンA及びアスペリンの場合、これらのステロイドサポニンのいずれか1つが医薬組成物中で製造され得る。
【０１０６】
従って、これらのステロイドサポニンは薬剤の製造において使用され得る。
【０１０７】
前記薬剤は、例えば癌細胞の増殖を抑制する;原発性及び/または続発性腫瘍の形成及び/または増殖を抑制する;癌を予防及び/または治療する;血管新生を抑制する;内皮細胞増殖及び/または遊走を抑制する;転移を抑制及び/または防止する;並びに所望レベルの血管新生抑制を達成するために生体系に投与される抗血管新生剤の量を減量する;の1つ以上のために使用され得る。
【０１０８】
本明細書中で先に検討したように、本発明の各種実施形態でのステロイドサポニンは天然源から入手され得、合成方法から製造され、または天然に存在する化合物または中間体に適用される部分合成または修飾として製造され得る。
【０１０９】
本発明の各種実施形態でのステロイドサポニンの抽出、単離及び同定は当業界で公知の方法によりなされ得る。
【０１１０】
例えば、幾つかのステロイドサポニンは植物源から産生され得る。ステロイドサポニンの他の源は、例えばHostettmann K及びMarston A(2005),Chemistry & pharmacology of natural products:Saponins,ケンブリッジ大学出版,1〜3章及び6章に記載されているように文献から容易に得られ得る。ステロイドサポニンの一般名は上記文献及びDictionary of Natural Products,Chapman and Hall,CRC(2004)に従って使用されている。
【０１１１】
本発明の各種実施形態において生体系に投与されるステロイドサポニンの量は特に限定されず、通常標的が0.1〜20μMの範囲の濃度のステロイドサポニンにさらされるような範囲である。
【０１１２】
ステロイドサポニンは、物質が所望の作用部位に到達し、血管新生の抑制のような所望の効果を有するのに適した形態及び濃度でデリバリーされ得る。
【０１１３】
ステロイドサポニンの投与は、所望効果を生ずるのに適した時間内であり得る。ヒトまたは動物被験者では、ステロイドサポニンは例えば経口、非経口、局所または他の適当な手段により投与され得、従って物質の通過時間を考慮しなければならない。
【０１１４】
例えば、本発明の各種実施形態においてステロイドサポニンは被験者に対して血管新生の開始前及び/または血管新生が起こっている間に投与され得る。例えば、充実性癌に関連する血管新生を抑制する場合、ステロイドサポニンは腫瘍(原発性及び/または続発性腫瘍)の増殖の前及び/またはその間、及び/または腫瘍(原発性及び/または続発性腫瘍)の切除前またはその後に投与され得る。
【０１１５】
本発明の各種実施形態においてステロイドサポニンは被験者に対して適当な形態で投与され得る。
【０１１６】
1つの実施形態では、ステロイドサポニンは血管新生を抑制するのに適した組成物の形態にある。
【０１１７】
従って、別の実施形態で、本発明は有効量のステロイドサポニンを含む生体系における血管新生を抑制するために使用される組成物を提供する。
【０１１８】
生体系(例えば、被験者)に投与しようとするステロイドサポニンの有効量は、通常有用なまたは治療効果を発揮する量及び形態の範囲である限り特に限定されない。用語「治療有効量」は、治療を要する被験者に投与したとき被験者の予後及び/または状態を改善する量である。被験者に投与しようとする量は、抑制しようとする血管新生の具体的特徴、治療対象の癌、投与モード、及び被験者の特徴(例えば、全身健康状態、他の疾患、年齢、性別、遺伝子型及び体重)に依存する。当業者はこれらの要因及び他の要因に応じて適切な量を決定することができる。
【０１１９】
従って、別の実施形態で、本発明は生体系における血管新生の抑制用薬剤の製造におけるステロイドサポニンの使用を提供する。
【０１２０】
本明細書中で先に検討したように、ステロイドサポニンの投与及びデリバリーは、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経口または局所ルートにより、或いは所望の作用部位への直接注射によりなされ得る。投与モード及びルートは多くの場合治療対象の疾患または状態のタイプに依存する。
【０１２１】
投与形態、投与頻度及び投与量は投与モード及びルートに依存する。典型的には、注射可能な組成物は5〜500mg/m2、通常10〜200mg/m2の量で投与される。典型的には、経口投与される組成物は5mg〜5g、好ましくは50mg〜1gの量で投与される。
【０１２２】
例えば、ステロイドサポニンの有効量は、典型的には約0.1〜約1000mg/kg体重/日の範囲であり、1つの形態では1〜100mg/kg体重/日の範囲である。
【０１２３】
上記したように、ステロイドサポニンを含む組成物の投与は、投与しようとするステロイドサポニンの具体的な物理的、微生物学的及び化学的特性を考慮して、1つ以上の製薬上許容される添加剤(製薬上許容される塩、アミノ酸、ポリペプチド、ポリマー、溶媒、バッファー、賦形剤、保存剤及び増量剤を含む)の使用をも含み得る。
【０１２４】
例えば、ステロイドサポニンは、各種の製薬上許容される組成物中に水溶液、油性調製物、脂肪エマルション、エマルション、再構成用凍結乾燥粉末等のような形態で製造され得、発熱物質非含有の滅菌筋肉内または皮下注射剤として、臓器への注射剤として、包埋製剤として、または鼻腔、直腸、子宮、膣、肺等への経粘膜製剤として投与され得る。組成物は経口製剤(例えば、錠剤、カプレット剤、カプセル剤、顆粒剤または散剤のような固体製剤;シロップ剤、エマルション剤、分散液剤または懸濁液剤のような液体製剤)の形態で投与され得る。
【０１２５】
ステロイドサポニンを含有する組成物が1つ以上の製薬上許容される保存剤、バッファー剤、希釈剤、安定化剤、キレート化剤、増粘剤、分散剤、pH調節剤、溶解度調整剤または等張剤を含んでいてもよい。これらの賦形剤は当業者に十分知られている。
【０１２６】
適当な保存剤の例はp-ヒドロキシ安息香酸、フェノール、フェニルエチルアルコールまたはベンジルアルコールの安息香酸エステルである。適当なバッファーの例はリン酸ナトリウム塩、クエン酸、酒石酸等である。適当な安定化剤の例は抗酸化剤、例えばα-トコフェロールアセテート、α-チオグリセリン、重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、アセチルシステイン、8-ヒドロキシキノリン;及びキレート化剤、例えばエデト酸ジナトリウムである。適当な増粘剤、懸濁、可溶化または分散剤の例は置換セルロースエーテル、置換セルロースエステル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、カルボマー、ポリオキシプロピレングリコール、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレエート、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油60である。
【０１２７】
適当なpH調節剤の例には塩酸、水酸化ナトリウム、バッファー等が含まれる。適当な等張剤の例はグルコース、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムである。
【０１２８】
ステロイドサポニンは、投与しようとするステロイドサポニンの物理的、化学的及び微生物学的特性を考慮して、製薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤、懸濁剤、滑沢剤、佐剤、ビヒクル、デリバリーシステム、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、流動促進剤、抗付着剤、結合剤、着香料または甘味料を含有する組成物の形態でも投与され得る。
【０１２９】
上記した目的で、組成物は経口、非経口、吸入スプレー、吸収、吸着により、局所、経腸、鼻腔内、口腔内、膣内、心室内、慣用されている非毒性の製薬上許容される担体を含有する剤形の移植レザーバーを介して、または他の慣用されている剤形により投与され得る。本明細書中で使用されている用語「非経口」は皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、くも膜下、心室内、胸骨内、及び頭蓋内注射または注入技術を含む。
【０１３０】
非経口投与する場合、組成物は通常発熱物質非含有の滅菌注射可能形態(使用直前に再構成され得る溶液、懸濁液またはエマルション剤であってもよい)の単位形態であり、通常レシピエントの血液と製薬上許容される担体は等張性である。滅菌注射可能形態の例は滅菌の注射可能な水性または油性懸濁液である。これらの懸濁液剤は適当なビヒクル、分散または湿潤剤、複合化剤、ポリマー、可溶化助剤及び懸濁剤を用いて当業界で公知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射可能な形態が非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能な溶液または懸濁液(例えば、1,3-ブタンジオール中溶液)であってもよい。使用され得る製薬上許容されるビヒクル及び溶媒の中には、水、エタノール、グリセロール、生理食塩液、ジメチルスルホキシド、N-メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド、リンガー液、デキストロース溶液、等張性塩化ナトリウム溶液及びハンクス溶液がある。加えて、滅菌固定油が溶媒または懸濁媒体として慣用されている。この目的で、合成モノ-またはジグリセリド、コーン油、綿実油、落花生油及びゴマ油を含めた無刺激性固定油が使用され得る。オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル及びオレイン酸のような脂肪酸、並びにオリーブ油やヒマシ油を含めたそのグリセリド誘導体、特にそのポリオキシエチル化物が注射剤の製造において有用である。この油性溶液及び懸濁液は長鎖アルコール希釈剤または分散剤をも含み得る。
【０１３１】
担体は、溶解度、等張性及び化学的安定性を高める物質のような添加剤、例えば抗酸化剤、バッファー及び保存剤を含み得る。
【０１３２】
加えて、ステロイドサポニンを含有する組成物は投与前に再構成される形態であってもよい。その例には、投与前に製薬上許容される溶媒を用いて再構成するのに適した固体形態を生ずるような凍結乾燥、噴霧乾燥等が含まれる。
【０１３３】
組成物は1つ以上のバッファー、増量剤、等張剤、凍害保護剤及び凍結保護剤を含み得る。賦形剤の例にはリン酸塩、クエン酸、非還元糖(例えば、スクロースまたはトレハロース)、ポリヒドロキシアルコール、アミノ酸、メチルアミンが含まれ、リオトロピック塩はマルトースまたはラクトースのような還元糖に対して好ましい。
【０１３４】
経口投与する場合、ステロイドサポニンは通常当業界で公知の一般的な装置及び技術を用いて単位投与形態(例えば、錠剤、カプレット剤、カシェ剤、散剤、顆粒剤、ビーズ、チューアブル口内錠、カプセル剤、液剤、水性懸濁液剤または溶液剤、或いは類似の投与形態)に製剤化される。前記製剤は、典型的には固体、半固体または液体担体を含んでいる。担体の例には賦形剤、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カリシウム、鉱油、カカオバター、カカオ脂、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、シロップ、置換セルロースエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム等が含まれる。
【０１３５】
錠剤は、場合により1つ以上の補助成分と一緒にステロイドサポニンを圧縮または成形することにより製造され得る。圧縮錠は、適当な機械において自由流動性形態(例えば、粉末または顆粒状)の活性成分を場合により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、表面活性または分散剤と混合して圧縮することにより製造され得る。成形錠は、適当な機械において粉末状活性成分と不活性液体希釈剤で湿らせた適当な担体との混合物を成形することにより製造され得る。
【０１３６】
ステロイドサポニン剤を徐放テクノロジーを用いて投与してもよい。
【０１３７】
局所投与の場合、組成物は溶液、スプレー、ローション、クリーム(例えば、非イオン性クリーム)、ゲル、ペーストまたは軟膏の形態をとり得る。或いは、組成物をリポソーム、ナノソーム、リボソームまたは栄養拡散ビヒクルを用いてデリバリーしてもよい。
【０１３８】
本明細書中で先に検討したように、投与しようとするステロイドサポニンの有効量は、通常薬理学的に有用なまたは治療効果を発揮するような量及び形態の範囲内である限り特に限定されない。
【０１３９】
ステロイドサポニンの投与は、更にヒト化及びキメラ抗体を含めた抗-VEGF抗体、抗-VEGFアプタマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン1、インターロイキン12、レチノイン酸、並びにメタロプロテイナーゼ-2及び-9の組織インヒビターを含めた抗血管新生剤の投与を含み得る。
【０１４０】
抗血管新生剤の投与ルート、用量及び治療レジメは当業者により決定され得る。抗血管新生剤及びその使用は、“Biotherapy:A comprehensive Overview”(2001),第2版,Paula Trahan Rieger編,Jones and Bartlett Publishers Internationalに一般的に記載されている。
【０１４１】
生体系における血管新生の抑制は、新生血管構造の遅れた出現、新生血管構造の遅い発生、新生血管構造の少ない発生、血管新生依存性病的作用のゆっくりしたまたは小さい重症、停止した血管新生成長、または既存の血管新生成長の退行のような当業界で公知の適当な方法により調べられ得る。
【０１４２】
ステロイドサポニンが血管新生を抑制する能力は、当業界で公知の血管新生を測定する適当なアッセイにより調べられ得る。例えば、マウスの大動脈外植片モデルが使用され得る。
【０１４３】
或いは、トリ漿尿膜(CAM)アッセイまたは角膜血管新生モデルが実施され得る。ステロイドサポニンの血管新生を抑制する能力はトリ胚中の血管新生の抑制の程度または角膜血管新生モデルにおける血管新生の抑制の程度により調べられ得る。
【０１４４】
例えば、ステロイドサポニンがトリ漿尿膜アッセイにおいて血管新生を抑制する能力は、漿尿膜をメチルセルロースディスクに適用したステロイドサポニンと接触させることにより試験され得る。角膜血管新生モデルの場合、ステロイドサポニンをステロイドサポニンを含有する局所組成物として角膜に適用し、角膜をひっかき、血管新生を誘導する物質を接種する。
【０１４５】
血管新生を研究する別の方法は、動物への各種の人工スポンジ(すなわち、ポリビニルアルコール、ゼラチン)の皮下移植である。評価しようとするステロイドサポニンを動物中に置いたスポンジに直接注射し得る。スポンジの血管新生を組織学的に、形態測定により(血管密度)、生化学的に(ヘモグロビン含量)、またはスポンジの血管系中の血流量を放射性トレーサーを用いて測定することにより評価される。
【０１４６】
試験化合物の抗血管新生活性を試験するために多数の動物腫瘍モデルも開発されている。多くの場合、腫瘍細胞を皮下に移植し、腫瘍サイズを定期的に測定する。頻繁に使用されている腫瘍細胞にはC6ラットグリオーム、B16BL6メラノーマLLC及びWalker 256癌腫が含まれる。
【０１４７】
本発明のステロイドサポニンが生体系に投与される抗血管新生剤の量を減量すべく使用するために適しているとも考えられる。
【０１４８】
従って、別の実施形態では、本発明は、生体系に有効量のステロイドサポニンを投与するステップを含む所望レベルの血管新生抑制を達成するために生体系に投与される抗血管新生剤の量の減量方法も提供する。
【０１４９】
投与しようとするステロイドサポニンの有効量は、通常生体系において所望レベルの血管新生抑制を達成するのに必要な抗血管新生剤の量を減量するために薬理学的に有効な効果を発揮する量の範囲である限り特に限定されない。
【０１５０】
ステロイドサポニンは、生体系において所望レベルの血管新生抑制を達成するのに必要な生体系に投与される抗血管新生剤の量を減量するという所望の効果を生じさせるのに適当な時期に投与され得る。本明細書中で先に検討したように、ヒトまたは動物被験者では、ステロイドサポニンは例えば経口、非経口、局所または他の適当な手段により投与され得、従って薬物の通過時間を考慮しなければならない。
【０１５１】
本明細書中で先に検討したように、抗血管新生剤の例にはヒト化及びキメラ抗体を含めた抗-VEGF抗体、抗-VEGFアプタマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン1、インターロイキン12、レチノイン酸、並びにメタロプロテイナーゼ-2及び-9の組織インヒビターが含まれる。
【０１５２】
これに関して、所望レベルの血管新生抑制を達成するために必要な抗血管新生剤の量は当業界で公知の方法を用いて実験的に決定され、抑制しようとする血管新生の所望レベル、被験者の年齢及び体重、並びに投与頻度に依存する。
【０１５３】
抗血管新生剤は、血管新生を所望レベルまで抑制するという所望効果を生じさせるのに適当な形態で適当な時間内に投与される。抗血管新生剤を処方及び投与する方法は当業界で公知である。
【０１５４】
ステロイドサポニンの投与は、抗血管新生剤の投与と同時または同一方法でなされ得る。或いは、ステロイドサポニンの投与は抗血管新生剤の投与とは別に、抗血管新生剤の投与またはその後の薬理学的に適当な時期になされ得る。
【０１５５】
本発明は、血管新生を抑制するために被験者に対してステロイドサポニン及び抗血管新生剤を別々にまたは共投与するための組合せ剤も提供する。この場合、組合せ剤は適当な形態で被験者に別々に投与するため、または適当な形態で被験者に共投与するためにステロイドサポニンを含む。
【０１５６】
従って、別の実施形態で、本発明は、ステロイドサポニン及び抗血管新生剤を含み、そのステロイドサポニン及び抗血管新生剤が被験者に共投与するための形態または被験者に別々に投与するための形態で提供されている、組合せ剤を提供する。
【０１５７】
組合せ剤の成分は、適当に滅菌した容器(例えば、アンプル、ボトルまたはバイアル)中に複数回投与形態または単位投与形態で別々にまたは一緒に包装され得る。容器は典型的には密閉されている。成分を包装する方法は当業界で公知である。
【０１５８】
本明細書中で先に検討したように、共投与は逐次または同時であり得、通常両薬物が具体的時間間隔中に被験者に存在していることを意味する。典型的には、第2薬物を第1薬物の半減期内に投与されるならば、両薬物は共投与されたと見なされる。
【０１５９】
本発明は、内皮細胞増殖及び/または遊走を抑制するためにも使用され得る。
【０１６０】
従って、別の実施態様で、本発明は、生体系に有効量のステロイドサポニンを投与するステップを含む生体系における内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制方法を提供する。
【０１６１】
これに関して、生体系は、内皮細胞増殖及び/または遊走が起こっているかまたは起こる恐れがある生体系であると考えられる。
【０１６２】
1つの実施形態では、生体系はヒトまたは動物被験者である。
【０１６３】
更なる実施形態で、生体系は、内皮細胞増殖及び/または遊走が望ましくないまたはコントロールされない内皮細胞増殖及び/または遊走に起因する疾患または状態に関連しているヒトまたは動物被験者である。
【０１６４】
例えば、生体系は、充実性腫瘍の形成または拡大、血管線維腫、角膜血管新生、網膜/脈絡膜血管新生、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、動静脈奇形、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、乾せん性関節炎、狼そう、結合組織病、オスラー・ウェバー症候群、動脈硬化プラーク、乾せん、化膿性肉芽腫、後水晶体線維増殖症、強皮症、肉芽化、血管腫、トラコーマ、血友病性関節、血管接着、肥厚性瘢痕、急性または慢性炎症を伴う疾患または状態、喘息を含めた肺の慢性炎症を伴う疾患または状態、サルコイドーシス、炎症性腸疾患、クローン病または潰瘍性大腸炎に関連する内皮細胞増殖及び/または遊走を患っているかまたは内皮細胞増殖及び/または遊走に感受性のヒトまたは動物被験者であり得る。
【０１６５】
内皮細胞は増殖及び/または遊走を受けている内皮細胞であり、この中には生体系における1つ以上の血管新生刺激に応答して増殖を受けている内皮細胞または1つ以上の血管新生刺激に応答して増殖を受ける能力を有する内皮細胞が含まれる。1つの実施形態では、内皮細胞増殖及び/または遊走は生体系におけるコントロールされないまたは望ましくない血管新生に関連している。
【０１６６】
1つの実施形態では、本発明は、内皮細胞増殖及び/または遊走を抑制することにより被験者の癌を予防及び/または治療するために使用され得る。
【０１６７】
癌の例には、癌腫、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、大腸癌(結腸、直腸、肛門及び虫垂の癌を含む)、食道癌、ホジキン病、腎臓癌、喉頭癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、母斑及び異形成母斑、多発性骨髄腫、筋肉癌、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、奇形腫、甲状腺癌及び子宮癌が含まれる。
【０１６８】
生体系に投与されるステロイドサポニンの量は特に限定されず、通常標的内皮細胞が0.1〜20μMのステロイドサポニンにさらされるような範囲である。
【０１６９】
ステロイドサポニンは、物質が所望の作用部位に到達し、内皮細胞増殖及び/または遊走を抑制させる効果を有するのに適した形態及び濃度でデリバリーされ得る。
【０１７０】
ステロイドサポニンは、内皮細胞増殖及び/または遊走を抑制するという所望効果を生じさせるのに適した時間内に投与され得る。ヒトまたは動物被験者では、ステロイドサポニンは例えば経口、非経口、局所または他の適当な手段により投与され得、従って物質の通過時間を考慮しなければならない。
【０１７１】
例えば、本発明の各種実施形態においてステロイドサポニンは、内皮細胞増殖及び/または遊走の開始前、及び/または内皮細胞増殖及び/または遊走が生じている間に投与され得る。
【０１７２】
本明細書中で先に検討したように、ステロイドサポニンは被験者に対して適当な形態及び適当な方法で処方、投与され得る。
【０１７３】
1つの実施形態では、ステロイドサポニンは血管新生を抑制するために使用するのに適した組成物の形態であり得る。
【０１７４】
従って、別の実施形態で、本発明は、有効量のステロイドサポニンを含む生体系における内皮細胞増殖及び/または遊走を抑制するために使用される組成物を提供する。
【０１７５】
被験者に投与しようとするステロイドサポニンの有効量は、通常有用な効果または治療効果を発揮する量及び形態の範囲である限り特に限定されない。用語「治療有効量」は、治療を要する被験者に投与したとき該被験者の予後及び/または状態を改善する量である。被験者に投与しようとする量は、抑制しようとする内皮細胞増殖及び/または遊走の具体的特徴、投与モード、及び被験者の特徴(例えば、全身健康状態、他の疾患、年齢、性別、遺伝子型及び体重)に依存する。当業者はこれらの要因及び他の要因に応じて適当な用量を決定することができる。
【０１７６】
従って、別の実施態様で、本発明は、生体系における内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制用薬剤の製造におけるステロイドサポニンの使用を提供する。
【０１７７】
本明細書中で先に検討したように、ステロイドサポニンの投与及びデリバリーは、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、経口または局所ルートにより、或いは所望の作用部位への直接注射によりなされ得る。投与モード及びルートは、多くの場合本明細書中で先に検討したように治療対象の疾患または状態のタイプに依存する。
【０１７８】
投与形態、投与頻度及び投与量は投与モード及びルートに依存する。典型的には、注射可能な組成物は5〜500mg/m2、好ましくは10〜200mg/m2の量で投与される。典型的には、経口投与される組成物は5mg〜5g、好ましくは50mg〜1gの量で投与される。
【０１７９】
例えば、ステロイドサポニンの有効量は、典型的には約0.1〜約1000mg/kg体重/日の範囲であり、1つの形態では1〜100mg/kg体重/日の範囲である。
【０１８０】
本明細書中に上記したように、ステロイドサポニンを含む組成物の投与は、投与しようとするステロイドサポニンの具体的な物理的、微生物学的及び化学的特性を考慮して、1つ以上の製薬上許容される添加剤(製薬上許容される塩、アミノ酸、ポリペプチド、ポリマー、溶媒、バッファー、賦形剤、保存剤及び増量剤を含む)の使用をも含み得る。
【０１８１】
本明細書中で先に検討したように、ステロイドサポニンを含む組成物は1つ以上の製薬上許容される保存剤、バッファー剤、希釈剤、安定化剤、キレート化剤、増粘剤、分散剤、pH調節剤または等張剤をも含み得る。これらの賦形剤は当業者に公知である。
【０１８２】
ステロイドサポニンの投与は、更にヒト化及びキメラ抗体を含めた抗-VEGF抗体、抗-VEGFアプタマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン1、インターロイキン12、レチノイン酸、並びにメタロプロテイナーゼ-2及び-9の組織インヒビターを含めた抗血管新生剤の投与を含み得る。
【０１８３】
生体系における内皮細胞の増殖及び/または遊走の抑制は当業界で公知の適当な方法により調べられ得る。
【０１８４】
例えば、細胞増殖の場合、細胞計数、3[H]チミジン取り込み、細胞増殖に対する免疫-組織化学的染色、新生血管構造の遅い出現、新生血管構造のゆっくりした発生、新生血管構造の少ない発生、血管新生依存性病的作用の重症度の遅延または低下、血管新生成長の停止、または以前の血管新生成長の退行のような方法が使用される。
【０１８５】
ステロイドサポニンが内皮細胞の増殖を抑制する能力は、細胞を処理し、内皮細胞増殖を測定する当業界で公知の適当なアッセイにより調べられ得る。例えば、ヒト臍帯血管内皮細胞を適当な培地においてインビトロで培養し、内皮細胞増殖を例えばトリチウム化チミジン摂取により測定し得る。前記アッセイにおいてステロイドサポニンが増殖を抑制する能力は、その後内皮細胞を物質と接触させ、具体的濃度で生ずる増殖の抑制の程度を測定することにより試験され得る。
【０１８６】
内皮細胞遊走の場合、適当なアッセイはBD BioCoat(商標)Angiogenesis System: Endothelial Cell Migrationである。
【０１８７】
本発明のステロイドサポニンが生体系に投与される抗血管新生剤の量を減量するために使用するのに適していると考えられる。
【０１８８】
従って、別の実施形態で、本発明は、生体系に有効量のステロイドサポニンを投与するステップを含む所望レベルの内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制を達成するために生体系に投与される抗血管新生剤の量の減量方法を提供する。
【０１８９】
投与しようとするステロイドサポニンの有効量は、生体系において所望レベルの内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制を達成するのに必要な薬物の量を減量させるために薬理学的に有用な効果を通常発揮する量の範囲である限り特に限定されない。
【０１９０】
ステロイドサポニンは、生体系において所望レベルの内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制を達成するのに必要な生体系に投与される物質の量を減量するという所望効果を生じさせるのに適した時間内で投与され得る。本明細書中で先に検討したように、ヒトまたは動物被験者では、ステロイドサポニンは例えば経口、非経口、局所または他の適当な手段により投与され得、従って薬物の通過時間を考慮しなければならない。
【０１９１】
本明細書中で先に検討したように、抗血管新生剤の例にはヒト化及びキメラ抗体を含めた抗-VEGF抗体、抗-VEGFアプタマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン1、インターロイキン12、レチノイン酸、並びにメタロプロテイナーゼ-2及び-9の組織インヒビターが含まれる。
【０１９２】
これに関して、所望レベルの内皮細胞増殖及び/または遊走の抑制を達成するのに必要な抗血管新生剤の量は当業界で公知の方法により実験的に決定され、抑制しようとする所望レベル、被験者の年齢及び体重、並びに投与頻度に依存する。
【０１９３】
抗血管新生剤は、血管新生を所望レベルまで抑制するという所望効果を生じさせるのに適当な形態で適当な時間内に投与される。抗血管新生剤の処方及び投与方法は当業界で公知である。
【０１９４】
ステロイドサポニンの投与は、抗血管新生剤の投与と同時及び同一方法でなされ得る。或いは、ステロイドサポニンの投与は抗血管新生剤の投与と別であり、抗血管新生剤の投与前またはその後の薬理学的に適切なときになされ得る。
【０１９５】
本発明は、内皮細胞増殖及び/または遊走を抑制するために被験者にステロイドサポニン及び抗血管新生剤を別々にまたは共投与するための組合せ剤をも提供する。この場合、組合せ剤は、適当な形態で被験者に別々に投与するためまたは適当な形態で被験者に共投与するためにステロイドサポニンを含む。
【０１９６】
従って、別の実施形態で、本発明は、ステロイドサポニン及び抗血管新生剤を含み、そのステロイドサポニン及び抗血管新生剤が被験者に共投与するための形態または被験者に別々に投与するための形態で提供されている、組合せ剤を提供する。
【０１９７】
組合せ剤の成分は、適当に滅菌した容器(例えば、アンプル、ボトルまたはバイアル)中に複数回投与形態または単位投与形態で別々にまたは一緒に包装され得る。容器は典型的には密閉されている。成分を包装する方法は当業界で公知である。
【０１９８】
本明細書中で先に検討したように、共投与は逐次または同時であり得、通常薬物が特定の時間間隔中に被験者中に存在していることを意味する。典型的には、第2薬物を第1薬物の半減期以内に投与したなら、2つの薬物は共投与されたと見なされる。
【０１９９】
医薬組成物の製造方法は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,1990,ペンシルバニア州イーストンに所在のMack Publishing Co.,発行;米国薬局方:National Formulary,1984,ペンシルバニア州イーストンに所在のMack Publishing Company出版;及びM.E.Aulton,Pharmaceutics,The Science of Dosage Form Design,第2版,エディンバラに所在のChurchill Livingstone(2002)発行に記載されているように当業界で公知である。
【０２００】
生体分子の治療デリバリーは、Bladon,C.(2002),“Pharmaceutical Chemistry:Therapeutic Aspects of Biomolecules”,JOHn Wiley & Sons Ltd.に概説されている。
【０２０１】
(具体的実施形態の記載)
本発明の先の一般原則を具体化する実験を参照されたい。しかしながら、以下の記載は先の記載の概論を限定しないと理解されたい。
【実施例１】
【０２０２】
材料
ジオスゲニン、ジオスシン(ジオスゲニンRha 2,[Rha 4],Glc)、及びデルトニン(ジオスゲニンRha 2,[Glc 4],Glc)及びトリリン(ジオスゲニン-Glc)はNingbo Hanpharm Biotech Co.Ltdから、グラシリンはChromaDexから、トリリンはAktin Chemicalsから商業的に入手した。プロサポゲニンA:ジオスゲニンRha 2,GlcはLiら,Carbohydr.Res.,(2001),331,1-7に記載されている方法により合成した。ジオスシン及びプロサポゲニンAも七叶一枝葉(Paris polyphylla)から単離した。ソラフェニブは商業的に入手した。
【実施例２】
【０２０３】
大動脈外植片における血管成長に対するデルトニンの効果の評価
３匹の雄C57BL6/Jマウス(9週齢)をCO2窒息により殺し、血液を29ゲージ針を用いる心穿刺により集めた。次いで、大動脈を(大動脈弓から胸膜/腹膜界面まで)切開し、10mM Ｈｅｐｅｓ及びペニシリン/ストレプトマイシンを補充した氷冷DMEM中に置いた。
【０２０４】
大動脈の周りの線維組織及び脂肪組織を顕微鏡切開により除去し、氷冷DMEMを用いて大動脈から血液を流した。次いで、大動脈を縦方向に二等分し、約1平方mmに切断した。個々の大動脈片を24ウェル組織培養プレートのウェルの底部において20μLのコラーゲン溶液液滴中に包埋した。次いで、プレートを37℃/５% CO2下で10分間置いて、コラーゲンをゲルに重合した。DMSOまたはDMSO中デルトニンを含有する培地(0.3mL)のみを各ウェルに添加して、コラーゲンゲルの周りに堀を形成した。
【０２０５】
外植片サンプルウェル間でのガス交換及び蒸発速度の差を避けるために各24ウェルプレートの中央8ウェルのみを外植片培養のために使用した。外側ウェルにはPBSを充填した。
【０２０６】
各々8反復で、9群を試験した:
1. 培地のみ(10ｍＭ Hepes及び2% 正常マウス血清を補充したEBM-2)(I);
2. 培地+1μL/mL DMSO(デルトニンに対する希釈剤対照)(H);
3. 培地+1μＬ/ｍＬ DMSO,10nM デルトニン(G);
4. 培地+1μL/mL DMSO,30nM デルトニン(F);
5. 培地+1μL/mL DMSO,100nM デルトニン(E);
6. 培地+1μL/mL DMSO,300nM デルトニン(D);
7. 培地+1μL/mL DMSO,1μM デルトニン(C);
8. 培地+1μL/mL DMSO,3μM デルトニン(B);
9. 培地+1μL/mL DMSO,10μM デルトニン(A)。
次いで、外植片を湿潤インキュベーターにおいて37℃/5% CO2で6日間培養した。等容量(0.3mL)のPBS中4% パラホルムアルデヒドを各ウェルに添加することにより外植片を室温で20分間固定した。Hepes緩衝食塩液(HBS,150mM NaCl,10mM Hepes)で3回洗浄した後、外植片をHBS中10μg/ml FITC-BS-1レクチンコンジュゲート(BS-1レクチンはマウス内皮細胞に特異的に結合する)を用いて4℃で一晩染色した。翌日、外植片をHBSで３回洗浄した。外植片からの血管成長を蛍光顕微鏡検査により可視化し、データ分析のために写真を撮影した。各外植片について複数の多焦点蛍光イメージを写真撮影し、写真をデコンボリューションソフトウェアを用いてコンピュータ処理して、各外植片についての全血管成長を調べることができる。各外植片に関連する全細胞増殖も解剖顕微鏡を用いる光学顕微鏡検査により可視化し、写真により文書化した。可視化及び分析を容易とするために、合成反転白黒イメージを各外植片についての血管成長の複数の蛍光イメージから作成した。その後、各外植片について血管芽の数及び血管枝の数を各サンプルの正体を知らない人が計数してカウントした。結果を表４に要約し、図1にグラフで示す。
【表４】
2010500287.tif 000010
【０２０７】
注:グラフ上では明白に減少しているが、0.01μM デルトニンと培養した外植片における血管芽及び枝はDMSO処理対照外植片培養物と有意な差がなかった。
【０２０８】
DMSOの非存在下で培養した大動脈外植片に比してDMSOで処理した大動脈外植片の血管出芽及び血管分枝の有意な減少が観察されたように、デルトニンに対するビヒクルであるDMSO単独の血管新生応答に対する有意な抑制効果があった。
【０２０９】
しかしながら、高濃度のデルトニンは、DMSO処理した対照外植片培養物に比して大動脈外植片からの血管芽(10及び3μMで)及び血管枝(10、3及び1μMで)を有意に抑制した。
【０２１０】
サンプルの代表例を図２及び３に示す。
【実施例３】
【０２１１】
内皮細胞増殖及び遊走のステロイドサポニンによる抑制のAngioSponge(商標)アッセイ法を用いる調査
AngioSponge(商標)アッセイにより、内皮細胞増殖及び遊走を刺激し、血管新生のための組織様マトリックスを与えるアガロース捕捉増殖因子がゆっくり放出され得る。従って、このアッセイは、内皮細胞をCD31免疫組織化学的染色した後血管を計数することにより測定して、血管新生を抑制するように設計した治療効率を評価するために使用され得る(McCartyら,International Journal of Oncology,21:5-10,2002)。
ゲルフォーム(Pharmacia & UpJohn)を滅菌条件下で約7×7×7mmピースにカットし、滅菌リン酸緩衝食塩液に一晩予め浸漬した。次いで、水和したゲルフォームを部分的に乾燥させた。増殖因子(bFGF)を温(37℃)0.4% アガロースで2μg/mLの初期濃度まで希釈した。部分乾燥させたゲルフォームを増殖因子溶液または増殖因子を含有しない温0.4% アガロース中に置いた後、重合及び凝固のために温0.4% アガロース(1:1 希釈,1μg/mLの最終増殖因子濃度)を収容しているペトリ皿に移した。
【０２１２】
70匹の雌C3H/Hejマウスにマイクロチップを付け、体重を計り、体重に基づいて1群10匹のマウスとして７群にランダムに割り当てた。移植のために、ハロタン吸入させてマウスを麻酔した。小チャネルをトロカール針を用いて第3と第4乳腺の間に前進させ、スポンジをチャネルの全長まで挿入し、切開部を傷クリップで閉じた。
【０２１３】
化合物をN-メチルピロリドン(NMP):PEG300:水(1:9:10,v/v)中で調製した。インビトロIC50データ及び予備毒性研究に基づいて用量を設定した。化合物を、表５に示すように10mL/kgの用量で研究期間中1日1回毎日腹腔内注射により投与した。
【表５】
2010500287.tif 000011
【０２１４】
治療はすべての動物が麻酔から完全に回復したときに開始し、10日間続けた。11日目にアンジオスポンジを切開し、凍結切片をCD31染色するためにOCTを含む液体窒素でスナップ凍結した。
【０２１５】
CD31/PECAM-1は内皮細胞上に特異的に存在する抗原であり、従って血管に対するマーカーとして使用され得る。スポンジの凍結サンプルを低温切開し(12μm)、正帯電Plusスライド(Fisher Scientific)上に載せ、30分間風乾した。凍結切片を冷アセトン、アセトン/クロロホルム(1:1,v/v)及びアセトン中で順次それぞれ５分間固定した後、PBS(リン酸緩衝食塩液)で洗浄した。5%正常ウマ血清及び1%正常ヤギ血清を含有するPBSでブロックした後、切片をPECAM-1モノクローラルラット抗-マウスCD31抗体(ブロッキング溶液中1:5000,カリフォルニア州サンジェゴに所在のPharMingen)と室温で4時間インキュベートした。次いで、スライドをPBSで3回洗浄し、適切な二次抗-ラット抗体とインキュベートした。スライドを安定な3,3'-ジアミノベンジジン中で5〜10分間インキュベートすることにより正反応を可視化した。切片を蒸留水で濯ぎ、Gillのヘマトキシリンを用いて1分間対比染色し、Universal Mount(Research Genetics)を用いて載せた。第二抗体のみにさらした対照サンプルは特異的染色を示さなかった。マウス胎盤をポジティブ対照として使用した。定量のために、3つの独立した視野を選択し、ポジディブ染色したスポット、すなわち内腔を有する血管を計数した。
【０２１６】
結果を血管の平均数(CD31カウント)として照合し、表６に要約する。
【表６】
2010500287.tif 000012
【０２１７】
治療に対する誘導%は治療(+bFGF)とビヒクル単独(-bFGF)間のCD31カウンの差であり、bFGF含有ビヒクルとビヒクル単独(-bFGF)間のCD31カウントの差で割って%で表示する。
【０２１８】
治療に対する血管の数及び誘導%を図４及び５にグラフでプロットする。これらの結果から、ステロイドサポニンが血管新生モデル系において血管新生を減少させることが立証される。
【実施例４】
【０２１９】
内皮細胞増殖及び遊走のステロイドサポニンによる抑制のAngioSponge(商標)アッセイ法を用いる測定
AngioSponge(商標)アッセイは、移植したチャンバの周囲に線維被膜形成を促進する創傷治癒の正常な生理学的プロセスを利用している(Woodら,(2000),Cancer Research,60(8):2178-89)。チャンバ中にbFGFを導入すると、線維被膜中に血管発生が誘導される。従って、アッセイは、研究終了時の被膜の湿潤重量により調べられる線維被膜形成及びヘモグロビン含量をアッセイすることによるチャンバに対する血管供給の測定に対する影響を調べることにより治療効果を評価する。線維被膜のヘモグロビン含量はDrabkinアッセイによりアッセイされる血管新生の尺度である。
【０２２０】
アンジオチャンバは、ペルフルオロ-アルコキシ-テフロンからなり、20IU/mL ヘパリン及び場合により1μg/mL ヒトbFGFを含有している0.8%寒天が充填されている多孔質組織チャンバである。チャンバの両端を同一材料からなる着脱可能なキャップで密封した。チャンバに滅菌条件下で20IU/mL ヘパリン及び場合により1μg/mL ヒトbFGFを含有する0.8% 寒天を充填した。チャンバに充填する前はアガロース溶液は37℃で維持した。
【０２２１】
70匹の雌FvBマウスにマイクロチップを付け、体重を計り、体重に基づいて1群10匹のマウスとして７群にランダムに割り当てた。移植のために、ハロタン吸入させてマウスを麻酔した。各マウスの背部の肩甲骨間に約150μLの滅菌濾過空気を皮下注射すると空気ポケットが生じ、ここに小さい切口部を作成し、チャンバを挿入した。創傷を2つの1.4mm傷クリップを用いて閉じた。
【０２２２】
表７に示すように、治療薬はいずれもNMP:PEG300:水(1:9:10,v/v)中で調製し、腹腔内注射により毎日投与した。
【表７】
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【０２２３】
治療はすべての動物が麻酔から完全に回復したときに開始し、5日間続けた。6日目に血管新生化線維チャンバを除去し、各インプラントの湿潤重量を記録した。次いで、各マウスからのチャンバを液体窒素を用いてスナップ凍結し、ヘモグロビン含量を評価するまで-20℃で保存した。
【０２２４】
線維被膜サンプルを解凍し、処置中氷上に保持した。解凍した各サンプルに滅菌水を添加し、サンプルをUltraTouraxを用いて高速でホモジナイズした。相互汚染を避けるために、各サンプルをホモジナイズした後UltraTouraxに蒸留水(5mL)を30秒間フラッシュした。ホモジネートを2mLエッペンドルフ管に移し、氷上で保存した。エッペンドルフ管を4℃、高速(14,000相対遠心力(RCF))で60分間遠心した。1.0〜1.5mLのペレットと脂肪層間の中間水溶液(ホモジネート)を新しい標識した1.5mLエッペンドルフ管に移し、氷上で保存した。50μLの各ホモジネートを96ウェルプレートの別々のウェルに移した。ブランクとして、水(50μL)を2つのウェルに移した。次いで、Drabkin試薬(50μL)を各ウェルに添加し、混合した。室温で15分間インキュベートした後、各サンブルの540nmでの吸光度を測定し、標準曲線から各サンプルの血液量を計算した。
【０２２５】
結果を平均チャンバ重量、(ヘモグロビン含量からの)平均血液含量及び誘導%として照合し、表８に要約する。
【表８】
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【０２２６】
治療に対する誘導%は治療(+bFGF)とビヒクル単独(-bFGF)間の血液含量の差であり、bFGF含有ビヒクルとビヒクル単独(-bFGF)間の血液含量の差で割って%で表示する。
【０２２７】
治療に対するアンジオチャンバの平均血液含量及び誘導%を図６及び７にグラフでプロットする。これらの結果から、ステロイドサポニンがアンジオスポンジモデル系において血管新生を減少させることが立証される。
【０２２８】
最後に、本明細書中に記載されている本発明の方法及び組成物の本発明の範囲及び趣旨を逸脱しない各種修飾及び改変は当業者に自明であると認められる。本発明を具体的実施形態に関連して記載してきたが、特許請求されている発明はこれらの具体的実施形態に不当に限定されるべきではない。実際、本発明を実施するための記載されている方法の各種修飾が本発明の範囲内であると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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