(57)【要約】本発明は一般的に、癌原遺伝子を発現している動物において抗体生産細胞及び抗体を生産するための方法に関する。本発明はまた、自己寛容などの免疫束縛を通常受けている抗原に特異的な抗体の効率的な生産のための方法に関する。本発明はさらに、従来行われている抗体生産Ｂ細胞の骨髄腫融合パートナーとの融合を必要としない、抗体生産細胞及び抗体の生産に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＭＹＣを誘導性に過剰発現する動物を、前記動物においてＭＹＣが過剰発現されない条件下で抗原に導き；ｂ）前記動物からＢ細胞を回収し；及びｃ）ＭＹＣが過剰発現される条件下で前記Ｂ細胞を培養する工程を含む、抗体生産細胞を生産するための方法。
【請求項２】
前記動物を前記抗原に導く工程の後に、前記動物においてＭＹＣが過剰発現される条件下に前記動物を維持する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記動物は、主に前記動物の前記Ｂ細胞においてＭＹＣを誘導性に過剰発現する、請求項に記載の方法。
【請求項４】
前記動物は、ＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ａ）前記マウスは、前記動物を前記抗原に導く工程の間、ＭＹＣ発現を抑止する抗生物質上に維持され；及びｂ）前記Ｂ細胞を培養する工程は、前記抗生物質の非存在下で行って抗体生産細胞を生産する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記マウスを前記抗原に導く工程の後に、前記抗生物質への曝露から前記動物を外す工程をさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記抗生物質はドキシサイクリンである、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記動物を前記抗原に導く工程は、前記抗原をコード化しているＤＮＡを、前記動物に遺伝的に移入する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記抗原は自己抗原を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記動物はさらに前記抗原を発現する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原はＨＩＶ蛋白質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原はｇｐ１２０又はｇｐ４１を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原はインフルエンザウイルス由来の抗原を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原は血球凝集素である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ａ）ＭＹＣを誘導性に過剰発現する動物を、前記動物においてＭＹＣが過剰発現されない条件下で抗原に導き；ｂ）前記動物からＢ細胞を回収し；ｃ）ＭＹＣが過剰発現される条件下で前記Ｂ細胞を培養し；及びｄ）前記Ｂ細胞培養物から抗体を回収する工程を含む、抗体を生産するための方法。
【請求項１６】
前記動物を前記抗原に導く工程の後に、前記動物においてＭＹＣが過剰発現される条件下に前記動物を維持する工程をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記動物は主に前記動物の前記Ｂ細胞においてＭＹＣを誘導性に過剰発現する、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記動物はＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスである、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記動物を前記抗原に導く工程は、前記抗原をコード化しているＤＮＡを、前記動物に遺伝的に移入する工程を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記抗原は自己抗原を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記動物はさらに前記抗原を発現する、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
前記抗原はＨＩＶ蛋白質を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原はｇｐ１２０又はｇｐ４１を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
前記抗原はインフルエンザウイルス由来の抗原を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
前記抗原は血球凝集素である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体はヒト化抗体である、請求項１５記載の方法。
【請求項２７】
ａ）Ｂ細胞の重鎖又は軽鎖遺伝子のＶＤＪ連結領域をコード化している核酸分子を、ＭＹＣを誘導性に過剰発現し且つ前記Ｂ細胞の生産を防止する遺伝的修飾を含む動物からの骨髄由来の幹細胞に導入し；ｂ）前記骨髄由来の幹細胞をレシピエント動物に移入し；ｃ）前記レシピエント動物からＢ細胞を回収し；ｄ）ＭＹＣが過剰発現される条件下で前記Ｂ細胞を培養し、及びｅ）前記Ｂ細胞培養物から抗体を回収する工程を含む、抗体を生産するための方法。
【請求項２８】
ＭＹＣが前記レシピエント動物において過剰発現される条件下に前記レシピエント動物を維持する工程を、前記骨髄由来の幹細胞を前記レシピエント動物に移入する工程の後にさらに含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ＭＹＣが前記レシピエント動物において過剰発現されない条件下に前記レシピエント動物を維持する工程を、前記骨髄由来の幹細胞を前記レシピエント動物に移入する工程の後にさらに含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記工程（ａ）からの前記Ｂ細胞はヒトＢ細胞である、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｂ細胞はヒトから単離される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒトは、抗体が媒介する自己免疫疾患に罹患している、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記工程（ａ）は、前記骨髄由来の幹細胞に、ＶＤＪ連結領域をコード化している前記核酸分子をレトロウイルスにより形質導入する工程を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
前記ＶＤＪ連結領域をコード化している前記核酸分子は、目的の抗原に選択的に結合する単離ヒトＢ細胞からクローニングされる、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記ＶＤＪ連結領域をコード化している前記核酸分子は、ヒトドナーから得たＢ細胞に認められるＩｇＨ及びＩｇＬ配列より再配置したＶＤＪ領域のＰＣＲ増幅断片である、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記ヒトドナーは、健常ドナー、及び抗体が媒介する自己免疫疾患の患者からなる群より選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記骨髄由来の幹細胞はさらに、ヒトＩｇＨをコード化している核酸分子、及びヒトＩｇＬをコード化している核酸分子で形質導入される、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
前記ヒトＩｇＨをコード化している前記核酸分子と前記ヒトＩｇＬをコード化している前記核酸分子は、同じ核酸分子である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ヒトＩｇＨと前記ヒトＩｇＬをコード化している核酸分子の一方又は両方は、前記ＶＤＪ領域をコード化する同じ核酸分子である、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記骨髄由来の幹細胞はヒトからのものである、請求項２７記載の方法。
【請求項４１】
前記骨髄由来の幹細胞はマウスからのものである、請求項２７記載の方法。
【請求項４２】
前記マウスは、Ｒａｇ−２−／−、ＳＣＩＤ、ＤＮＡ−ＰＫ−／−、Ｋｕ７０−／−、Ｋｕ８０−／−、ＸＲＣＣ４−／−及びμＭＴ−／−からなるリストより選択される遺伝的修飾を含む、ＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスである、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記レシピエント動物は致死的に照射されたマウスである、請求項２７記載の方法。
【請求項４４】
前記レシピエント動物はＳＣＩＤマウスである、請求項２７記載の方法。
【請求項４５】
前記動物は、前記ＶＤＪ領域に選択的に結合する抗原にインビボで導かれる、請求項２７記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体のイソタイプはＩｇＡである、請求項２７記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体のイソタイプはＩｇＧである、請求項２７記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体のＦｃ領域を遺伝的に修飾して、前記抗体が自己免疫反応及び関連免疫複合体沈着問題を誘発する能力を最小にしている、請求項２７記載の方法。
【請求項４９】
ａ）細胞の生存及び増殖を促進する癌原遺伝子を誘導性に過剰発現する動物を、前記癌原遺伝子が前記動物において過剰発現されない条件下で抗原に導き；ｂ）前記動物からＢ細胞を回収し；及びｃ）前記癌原遺伝子が過剰発現される条件下で前記Ｂ細胞を培養する工程を含む、抗体生産細胞を生産するための方法。
【請求項５０】
ａ）細胞の生存及び増殖を促進する癌原遺伝子を誘導性に過剰発現する動物を、前記癌原遺伝子が前記動物において過剰発現されない条件下で抗原に導き；ｂ）前記動物からＢ細胞を回収し、；ｃ）前記癌原遺伝子が過剰発現される条件下で前記Ｂ細胞を培養し；及びｄ）前記Ｂ細胞培養物から抗体を回収する工程を含む、抗体を生産するための方法。
【請求項５１】
ａ）抗原をコード化している核酸分子を、細胞の生存及び増殖を促進する癌原遺伝子を誘導性に過剰発現する動物からの骨髄由来の幹細胞に導入し；ｂ）前記骨髄由来の幹細胞をレシピエント動物に移入し；ｃ）前記癌原遺伝子が前記動物において過剰発現される条件下に前記レシピエント動物を維持し；ｄ）前記レシピエント動物からＢ細胞を回収し；ｅ）前記癌原遺伝子が過剰発現される条件下で前記Ｂ細胞を培養し；及びｆ）前記Ｂ細胞培養物から抗体を回収する工程を含む、抗体を生産するための方法。
【請求項５２】
ａ）細胞の生存及び増殖を促進する癌原遺伝子をコード化している核酸分子を、動物からの骨髄由来の幹細胞に導入し；ｂ）前記骨髄由来の幹細胞をレシピエント動物に移入し；ｃ）前記レシピエント動物からＢ細胞を回収し；ｄ）抗原をコード化している核酸分子を前記Ｂ細胞に導入し；ｅ）前記癌原遺伝子が過剰発現される条件下で前記Ｂ細胞を培養し；及びｆ）前記Ｂ細胞培養物から抗体を回収する工程を含む、抗体を生産するための方法。
【請求項５３】
ａ）細胞の生存及び増殖を促進する癌原遺伝子をコード化している核酸分子を、動物からの骨髄由来の幹細胞に導入し；ｂ）前記骨髄由来の幹細胞を第１レシピエント動物に移入し；ｃ）前記第１レシピエント動物からＢ細胞を回収し；ｄ）抗原をコード化している核酸分子を前記Ｂ細胞に導入し；ｅ）前記Ｂ細胞を第２レシピエント動物に移入し；ｆ）前記動物において前記癌原遺伝子が過剰発現される条件下に前記第２レシピエント動物を維持し；ｇ）前記第２レシピエント動物からＢ細胞を回収し；ｈ）前記癌原遺伝子が過剰発現される条件下で前記Ｂ細胞を培養し；及びｉ）前記Ｂ細胞培養物から抗体を回収する工程を含む、抗体を生産するための方法。
【請求項５４】
前記癌原遺伝子はＭＹＣである、請求項５１記載の方法。
【請求項５５】
前記骨髄由来の幹細胞は、抗アポトーシス蛋白質をコード化している核酸分子で形質導入されている、請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
前記抗アポトーシス蛋白質はＢｃｌ−２である、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記核酸分子は、レトロウイルスにより導入される、請求項５２記載の方法。
【請求項５８】
前記骨髄由来の幹細胞はヒトからのものである、請求項５２記載の方法。
【請求項５９】
前記骨髄由来の幹細胞は、条件付きで不死化された長寿命の造血幹細胞である、請求項５２記載の方法。
【請求項６０】
前記レシピエント動物は、亜致死的に照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスである、請求項５１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６１】
前記動物は、ヒトＩｇ座位をコード化している核酸分子に対して遺伝子導入されている、請求項１５のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、癌原遺伝子を発現している動物において抗体生産細胞及び抗体を生産するための方法に関する。本発明はまた、自己寛容などの免疫束縛を通常受けている抗原に特異的な抗体の効率的な生産のための方法に関する。本発明はさらに、従来行われている抗体生産Ｂ細胞の骨髄腫融合パートナーとの融合を必要としない、抗体生産細胞及び抗体の生産に関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００７年３月１３日に出願せる米国仮出願第６０／８９４６５４号、及び２００７年５月１８日に出願せる米国仮出願第６０／９３９０４２号の米国特許法第１１９条（ｅ）を相互参照する。各出願の開示全体を、引用することによりあらゆる目的で本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
抗体、特にモノクローナル抗体の使用は、ルーチンの診断法のみならず基礎及び臨床研究の様々な分野に変革をもたらしている。モノクローナル抗体の臨床応用は、癌治療用の薬物の主たる新たな供給源として浮上してきた。例えば、ＣＤ２０と称される表面蛋白質に対する抗体は、ＮＨＬ患者や、さらには抗体が媒介する自己免疫疾患の患者の予後を劇的に改善している。
【０００４】
高力価の中和抗体の発生は、多くのウイルス感染を患者が撃退する能力に関連している。最近の東南アジアでの鳥インフルエンザ（フル）の伝播は、感染しても生き存えた個体が、有効なＢ細胞抗体依存性の中和応答を惹起できる人々でもあることを示した。同様の知見が、その前年にＳＡＲＳ生存者の場合で示された。インフルエンザが原因となる米国での年間死亡者数は、年間３０，０００〜５０，０００名にのぼると見られる。インフルエンザによる全世界の死亡者数は、米国だけでの数字の２０〜３０倍高いと見られる。特に脆弱な２集団は、幼児と高齢者である。受動的に供給でき可能性のある中和抗体の開発は、インフルエンザ又はＨＩＶなどの他のウイルスが原因となる死亡率を劇的に減少させるはずである。
【０００５】
２００５年５月の時点で、米国市場に１８種の治療用モノクローナル抗体製品があった。世界的には、ほぼすべての消耗性疾患を処置するために２００社より多くが開発中の、推定で５００種のモノクローナル抗体製品があった。これらのモノクローナル抗体製品のうちおよそ８０種が、臨床試験中である。モノクローナル抗体に対する世界市場は、２００８年に１６７億ドルに増加すると見積もられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
モノクローナル抗体を生成するための従来からのアプローチは、マウス、又は最適な他の動物の超免疫化に基づいている。脾臓由来の抗体生産細胞はその後、収集して骨髄腫細胞融合パートナーに融合される。それらの抗体生産遺伝子を保持する細胞の選択は、順式及び逆式選択（ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）手順により成し遂げられる。これは、非常に強力な技術であることがわかってはいるものの、基礎生物学により課される制限のため、得ることができたはずの可能な特異性全体の９０％より多くを逸する結果を招きやすい。それらの制限のいくつかに、「自己寛容」と称される機構や、抗体生産細胞と骨髄腫融合パートナーとの間の融合を成功裡に達成するのに必要な特定の要件が包含される。従って、上に挙げた制限に関連する問題を解決し、且つ目的の抗体を同定するのに必要な合計時間を短縮する、改善された抗体の生成方法が、当該技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、ＭＹＣを誘導性に過剰発現する動物を、その動物においてＭＹＣが過剰発現されない条件下で抗原に導き、その動物からＢ細胞を回収し、そしてＭＹＣが過剰発現される条件下でそのＢ細胞を培養することによって、抗体生産細胞を生産するための方法に関する。
【０００８】
いくつかの実施形態で、方法はさらに、動物を抗原に導く工程の後に、その動物においてＭＹＣが過剰発現される条件下に動物を維持する工程を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態で、動物は、主にその動物のＢ細胞においてＭＹＣを誘導性に過剰発現する。
【００１０】
いくつかの実施形態で、動物は、ＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスである。いくつかの実施形態で、動物を抗原に導く工程は、抗原をコード化しているＤＮＡを、その動物に遺伝的に移入することを含む。いくつかの実施形態で、抗原は自己抗原を含む。いくつかの実施形態で、動物はさらに、抗原を発現する。いくつかの実施形態で、抗原はｇｐ１２０又はｇｐ４１などのＨＩＶ蛋白質を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態で、抗原は血球凝集素などのインフルエンザウイルス由来の抗原を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態で、マウスは、その動物を抗原に導く工程の間、ＭＹＣ発現を抑止する抗生物質上に維持され、Ｂ細胞を培養する工程は、抗生物質非存在下に行なって抗体生産細胞を生産する。
【００１３】
いくつかの実施形態で、方法はさらに、マウスを抗原に導く工程の後に、抗生物質への曝露からその動物を外す工程を含む。いくつかの実施形態で、抗生物質はドキシサイクリンである。
【００１４】
本発明の別の態様は、ＭＹＣを誘導性に過剰発現する動物を、その動物においてＭＹＣが過剰発現されない条件下で抗原に導き、その動物からＢ細胞を回収し、ＭＹＣが過剰発現される条件下でそのＢ細胞を培養し、そしてＢ細胞培養物から抗体を回収することによって抗体を生産するための方法に関する。
【００１５】
いくつかの実施形態で、方法はさらに、動物を抗原に導く工程の後に、その動物においてＭＹＣが過剰発現される条件下に動物を維持する工程を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態で、動物は主にその動物のＢ細胞においてＭＹＣを誘導性に過剰発現する。
【００１７】
いくつかの実施形態で、動物はＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスである。いくつかの実施形態で、動物を抗原に導く工程は、抗原をコード化しているＤＮＡを、その動物に遺伝的に移入することを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態で、抗原は自己抗原を含む。いくつかの実施形態で、動物はさらに、抗原を発現する。
【００１９】
いくつかの実施形態で、抗原はｇｐ１２０又はｇｐ４１などのＨＩＶ蛋白質を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態で、抗原は血球凝集素などのインフルエンザウイルス由来の抗原を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態で、抗体はヒト化抗体である。
【００２２】
本発明の別の態様は、Ｂ細胞の重鎖又は軽鎖遺伝子のＶＤＪ連結領域をコード化している核酸分子を、ＭＹＣを誘導性に過剰発現し且つＢ細胞の生産を防止する遺伝的修飾を含む動物からの骨髄由来の幹細胞に導入し、その骨髄由来の幹細胞をレシピエント動物に移入し、そのレシピエント動物からＢ細胞を回収し、ＭＹＣが過剰発現される条件下でそのＢ細胞を培養し、そしてＢ細胞培養物から抗体を回収することによって抗体を生産するための方法に関する。
【００２３】
いくつかの実施形態で、方法はさらに、ＭＹＣがレシピエント動物において過剰発現される条件下にレシピエント動物を維持する工程を、その骨髄由来の幹細胞をレシピエント動物に移入する工程の後に含む。
【００２４】
いくつかの実施形態で、方法はさらに、ＭＹＣがレシピエント動物において過剰発現されない条件下にレシピエント動物を維持する工程を、その骨髄由来の幹細胞をレシピエント動物に移入する工程の後に含む。
【００２５】
いくつかの実施形態で、第１工程からのＢ細胞はヒトＢ細胞である。
【００２６】
いくつかの実施形態で、Ｂ細胞はヒトから単離される。
【００２７】
いくつかの実施形態で、ヒトは、抗体が媒介する自己免疫疾患に罹患している。
【００２８】
いくつかの実施形態で、第１工程は、骨髄由来の幹細胞に、ＶＤＪ連結領域をコード化している核酸分子をレトロウイルスにより形質導入することを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態で、ＶＤＪ連結領域をコード化している核酸分子は、目的の抗原に選択的に結合する単離ヒトＢ細胞からクローニングされる。
【００３０】
いくつかの実施形態で、ＶＤＪ連結領域をコード化している核酸分子は、ヒトドナーから得たＢ細胞に認められるＩｇＨ及びＩｇＬ配列より再配置したＶＤＪ領域のＰＣＲ増幅断片である。
【００３１】
いくつかの実施形態で、ヒトドナーは、健常ドナー、及び抗体が媒介する自己免疫疾患の患者からなる群より選択される。
【００３２】
いくつかの実施形態で、骨髄由来の幹細胞はさらに、ヒトＩｇＨをコード化している核酸分子、及びヒトＩｇＬをコード化している核酸分子で形質導入される。
【００３３】
いくつかの実施形態で、ヒトＩｇＨをコード化している核酸分子とヒトＩｇＬをコード化している核酸分子は、同じ核酸分子である。
【００３４】
いくつかの実施形態で、ヒトＩｇＨとヒトＩｇＬをコード化している核酸分子の一方又は両方は、ＶＤＪ領域をコード化する同じ核酸分子である。
【００３５】
いくつかの実施形態で、骨髄由来の幹細胞は、ヒト又はマウスからのものである。
【００３６】
いくつかの実施形態で、マウスは、Ｒａｇ−２−／−、ＳＣＩＤ、ＤＮＡ−ＰＫ−／−、Ｋｕ７０−／−、Ｋｕ８０−／−、ＸＲＣＣ４−／−及びμＭＴ−／−からなるリストより選択される遺伝的修飾を含む、ＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスである。
【００３７】
いくつかの実施形態で、レシピエント動物は致死的に照射されたマウスである。
【００３８】
いくつかの実施形態で、レシピエント動物はＳＣＩＤマウスである。
【００３９】
いくつかの実施形態で、動物は、ＶＤＪ領域に選択的に結合する抗原にインビボで導かれる。
【００４０】
いくつかの実施形態で、抗体イソタイプは、ＩｇＡ又はＩｇＧである。
【００４１】
いくつかの実施形態で、抗体のＦｃ領域を遺伝的に修飾して、抗体が自己免疫反応及び関連免疫複合体沈着の問題を誘発する能力を最小にしている。
【００４２】
本発明の別の態様は、細胞の生存及び増殖を促進する癌原遺伝子を誘導性に過剰発現する動物を、その癌原遺伝子がその動物において過剰発現されない条件下で抗原に導き、その動物からＢ細胞を回収し、そして癌原遺伝子が過剰発現される条件下でそのＢ細胞を培養することを含む、抗体生産細胞を生産するための方法に関する。
【００４３】
本発明の別の態様は、細胞の生存及び増殖を促進する癌原遺伝子を誘導性に過剰発現する動物を、その癌原遺伝子がその動物において過剰発現されない条件下で抗原に導き、その動物からＢ細胞を回収し、癌原遺伝子が過剰発現される条件下でそのＢ細胞を培養し、そしてそのＢ細胞培養物から抗体を回収することによる、抗体を生産するための方法に関する。
【００４４】
本発明の別の態様は、抗原をコード化している核酸分子を、細胞の生存及び増殖を促進する癌原遺伝子を誘導性に過剰発現する動物からの骨髄由来の幹細胞に導入し、その骨髄由来の幹細胞をレシピエント動物に移入し、癌原遺伝子がその動物において過剰発現される条件下にレシピエント動物を維持し、そのレシピエント動物からＢ細胞を回収し、癌原遺伝子が過剰発現される条件下でそのＢ細胞を培養し、そしてＢ細胞培養物から抗体を回収することによる、抗体を生産するための方法に関する。
【００４５】
本発明の別の態様は、細胞の生存及び増殖を促進する癌原遺伝子をコード化している核酸分子を、動物からの骨髄由来の幹細胞に導入し、その骨髄由来の幹細胞をレシピエント動物に移入し、そのレシピエント動物からＢ細胞を回収し、抗原をコード化している核酸分子をそのＢ細胞に導入し、癌原遺伝子が過剰発現される条件下でそのＢ細胞を培養し、そしてＢ細胞培養物から抗体を回収することによる、抗体を生産するための方法に関する。
【００４６】
本発明の別の態様は、細胞の生存及び増殖を促進する癌原遺伝子をコード化している核酸分子を、動物からの骨髄由来の幹細胞に導入し、その骨髄由来の幹細胞を第１レシピエント動物に移入して、その第１レシピエント動物からＢ細胞を回収し、抗原をコード化している核酸分子をそのＢ細胞に導入し、そのＢ細胞を第２レシピエント動物に移入し、その動物において癌原遺伝子が過剰発現される条件下に第２レシピエント動物を維持し、その第２レシピエント動物からＢ細胞を回収し、癌原遺伝子が過剰発現される条件下でそのＢ細胞を培養し、そしてＢ細胞培養物から抗体を回収することによる、抗体を生産するための方法に関する。
【００４７】
いくつかの実施形態で、癌原遺伝子はＭＹＣである。
【００４８】
いくつかの実施形態で、骨髄由来の幹細胞は、抗アポトーシス蛋白質をコード化している核酸分子で形質導入されている。
【００４９】
いくつかの実施形態で、抗アポトーシス蛋白質は、Ｂｃｌ−２である。
【００５０】
いくつかの実施形態で、核酸分子は、レトロウイルスにより導入される。
【００５１】
いくつかの実施形態で、骨髄由来の幹細胞は、ヒトからのものである。
【００５２】
いくつかの実施形態で、骨髄由来の幹細胞は、条件付きで不死化された長寿命の造血幹細胞である。
【００５３】
いくつかの実施形態で、レシピエント動物は、亜致死的に照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスである。
【００５４】
いくつかの実施形態で、動物は、ヒトＩｇ座位をコード化している核酸分子に対して遺伝子導入されている。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、ＴＢＬＫ６及びＴＢＬＫ７細胞系の表面上での、ＣＤ１３８（Ｙ軸）及びＣＤ４０（Ｘ軸）の発現を（上部パネル）、そしてＴＢＬＫ６及びＴＢＬＫ７細胞系からのＩｇＭ分泌の分析を（下部パネル）示す。
【図２】図２は、Ｅμ−ＭＹＣ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬ遺伝子導入マウスで生じる腫瘍及び細胞系の表面表現型を（上部パネル）、そしてＥμ−ＭＹＣ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬマウスで生じる腫瘍及び細胞系における免疫グロブリン生産（Ａ）及びＨＥＬ特異的力価（Ｂ）を（下部パネル）示す。
【図３】図３は、ＭＹＣの急激な過剰発現後の活性化Ｂ細胞の外観を（上部パネル）、そしてＭＹＣの連続的な過剰発現の間での活性化Ｂ細胞の蓄積を（下部パネル）示す。
【図４】図４は、ＭＹＣの過剰発現後の血清中の自己抗体の蓄積を（上部パネル）、そしてＭＹＣの過剰発現後の腎臓における自己抗体及び免疫複合体の蓄積を（下部パネル）示す。
【図５】図５は、ＨＥＬを発現するＰＲＶ変異体の致死的攻撃からの、新規ＨＥＬ特異抗体でのマウスの保護を示す。
【図６】図６は、レトロウイルスによるキメラマウスで発生するＢ細胞腫瘍の表面表現型を示す。
【図７】図７は、レトロウイルスによるキメラマウスから得た血清と、ＨＡを発現している細胞溶解液との反応性を実証するウエスタンブロット分析を示す。
【図８】図８は、レトロウイルスによるキメラマウスから得た、マウス血清の血球凝集阻害分析を示す。
【図９】図９は、ＭＹＣを過剰発現しているマウスの使用により得られる抗体特異性をヒト化する、レトロウイルスのベクターによる２種のアプローチを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明は、従来の抗体生産に伴う問題の多くを克服する、抗体生産細胞及び抗体を生産するための新規方法を提供する。一般的に、本発明は、癌原遺伝子を発現している動物、例えば、ＭＹＣ又はＡｋｔ（特に好ましくはＭＹＣ）を過剰発現する動物において、抗体生産細胞及び抗体を迅速に生産するための方法に関する。本明細書に開示する方法によって、抗体生産Ｂ細胞を骨髄腫融合パートナーと融合させる必要なしに、モノクローナル抗体を生産することが可能になり、抗体を生産するのに必要な時間が短縮される。本明細書に開示する方法はさらに、免疫化されたマウスからのＢ細胞が骨髄腫パートナーと首尾良く融合するために、従来の抗体生産技術に必要とされるような細胞周期の特定段階にあることの必要性を排除する。本発明はまた、自己寛容などの免疫束縛を通常受けている抗原に特異的な抗体の効率的な生産も可能にする。例えば、本方法は、自己抗原に対するモノクローナル抗体を生産するために使用してもよい。
【００５７】
本発明者らは、ＭＹＣの過多が、可溶性抗原に対するＢ細胞寛容を破壊できることを実証している。例えば、ＭＹＣを過剰発現している、ＢＣＲＨＥＬ遺伝子導入Ｂ細胞は、ｓＨＥＬに対する活発な応答を惹起し、悪性化が始まる前にポリクローナル自己免疫性リンパ球増殖性疾患を発症させる（図３及び４参照）。自己反応性Ｂ細胞におけるＭＹＣの過剰発現は、ＭＹＣが増殖及び生存シグナルをもたらす能力によって、Ｂ細胞をＴ細胞の援助に対して非依存性とすることができる。ＭＹＣを過剰発現している、自己反応性Ｂ細胞の増殖した集団は、その同族抗原への連続曝露と、ＭＹＣの過剰発現との双方に伴い、依存性のままであるＢ細胞リンパ腫を発生する。腫瘍担持マウスからのリンパ節、脾臓及び骨髄より収集したＢ細胞を用いて、ＢＣＲＨＥＬ導入遺伝子を発現し、且つ抗ＨＥＬ  ＩｇＭを分泌する多くの細胞系を、初代細胞の骨髄腫融合パートナーへの融合を行うことなく樹立できる（図２参照）。本プロトコルは、以下に記載の通り、事実上任意の抗原に容易に適用できる。
【００５８】
同様の結果が、２つのさらなる動物でのプロトコルを用いて得られている。一例は、Ａｒｓ．ＡｌマウスとΕμ−ＭＹＣ株との間の交雑種に由来するマウスである。それらのマウスでは、バーキット様リンパ腫の発生が平均して３６日齢に起こる。この腫瘍は成熟した活性化Ｂ細胞で構成されている。それらの細胞は、表面にＩｇＭを発現する。このように、本発明者らは、ＭＹＣ過剰発現が、低親和性の抗ＤＮＡ抗体という面において自己反応性Ｂ細胞に対する寛容を破壊できることを実証している。第２の例では、食餌からのドキシサイクリン排除後に、Ｂ細胞特異的で一時的に調節されるＭＹＣの過剰発現を可能とする、ＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスを利用する。ドキシサイクリン含有食餌を４月齢でマウスから離すと、マウスは活性化された末梢Ｂ細胞、抗核抗体を血清に、免疫複合体沈着物を腎臓に蓄積し、また６週以内（平均的な例では、４２日）にＢ細胞リンパ腫を発生した。重要なのは、骨髄腫パートナー細胞への融合を行わずに、腫瘍から細胞系を樹立できていることである。
【００５９】
本発明は、少なくとも三態様のシステムの生物学に基づき、現今のアプローチよりも効力が有意に高められた、既知の特異性を有する抗体を生産する新規のアプローチを提供する。第一は、自己寛容の機構により課されるバリアの存在で、このシステムにより免疫束縛なしに抗体を生成できるようになる。このアプローチで、標準的な（当該技術分野の水準で）免疫化手順によって達成できない抗体特異性の生成が可能になる。さらに、標準的免疫化プロトコルで自己寛容を破壊する簡単な手段はない。第二は、目的の同族抗原が、Ｂ細胞異常増殖をインビボで推進し、リンパ腫を発生しうる抗体生産細胞と、得られるモノクローナル抗体生産細胞系の選択を可能とする。これにより、得られるモノクローナル抗体のスクリーニングを直接的に行うことができるため、開発のための時間が加速される。第三は、これらのマウスで生じる腫瘍から抗体生産細胞系を生成してクローン増殖する能力により、抗体生産脾臓Ｂ細胞を骨髄腫融合パートナーに融合させる必要性が排除される。従来の融合プロセスは、かなり非効率的で、免疫化後に増殖するＢ細胞の画分の不死化が可能になるにすぎず、このため、モノクローナル抗体の形態で誘導しうる特異性の数が限定されてしまう。この非効率性の理由は多くあり、例えば、細胞周期のＳ期にあるＢ細胞の必要性、細胞に保持される必要のあるＢ細胞と骨髄腫融合パートナーとに由来する染色体の適切な数及び組み合わせ、ＨＡＴ及び６−ＴＧ選択で生存する必要性、等である。まとめると、モノクローナル抗体の生成のための本発明の新規なアプローチは、従来のアプローチよりも随分短い時間枠にて、より多くの抗体を提供する。現在利用できるツールを用いた、そのアプローチへのいくつかの変更があり、選択されるその実施形態を以下にまとめる。
【００６０】
本発明の一実施形態で、抗体を生産するために使用される好適なヒト以外の動物には、抗体を生産でき、且つ細胞の生存及び増殖を促進する少なくとも１種の癌原遺伝子を（例えば、遺伝的修飾、又は天然、若しくは定方向突然変異の結果として）過剰発現する、ヒト以外の任意の動物が挙げられる。本発明の方法で用いられるヒト以外の動物によって過剰発現されるべき好ましい癌原遺伝子としては、限定しないが、ＭＹＣ又はＡｋｔ（ミリスチル化物）が挙げられ、ＭＹＣが特に好ましい。一例として、ＭＹＣを過剰発現しているマウスを本明細書で詳説するが、他の好適な癌原遺伝子及び他の動物の使用を含む本プロトコルの改変や、プロトコルを実施する際の技術的詳細の改変は、本明細書の開示に基づいて企図されるはずであり、それらが本発明に包含されることは理解されるべきである。
【００６１】
ＭＹＣを過剰発現している任意の動物を、本発明に使用してもよい。このような動物には、好ましくはヒト以外の哺乳動物が含まれ、より好ましくは齧歯類、さらにより好ましくはマウスが挙げられる。特に有用な動物は、ＭＹＣを主にＢ細胞集団に過剰発現しており、その例としてΕμ−ＭＹＣマウス株などが挙げられる。好ましい動物にはまた、誘導可能な態様でＭＹＣを過剰発現するものも含まれる。これらの動物では、ＭＹＣ過剰発現は、一時的な態様で調節でき、例えば、抗体の生産が開始するまで抑制できる。例えば、ＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウス株に、ドキシサイクリン又はテトラサイクリンを誕生から目的の抗体を生産するための使用時までの間、投与してもよく、これにより自然発症リンパ増殖性疾患の形成が最小化される。ＭＹＣ過剰発現は、マウスの食餌からドキシサイクリン又はテトラサイクリンを除去することによって開始させることができる。本発明での使用に好適な、多くのさらなる誘導可能な遺伝子発現／抑制システムが、当該技術分野で知られている。好適なマウスは、レトロウイルスの形質導入及び養子移入技術によって作り出してもよい。例えば、ＴＲＥ−ＭＹＣマウスからの骨髄細胞又は精製Ｂ細胞を、レトロウイルスによりｒｔＴＡで形質導入し、レシピエントマウスに移入するか、又はインビトロで培養してもよい。得られる細胞は、移入又は培養の前に、さらに（例えば、目的の抗原で）形質導入してもよい。
【００６２】
本発明の特定の実施形態で、ＭＹＣを過剰発現している細胞を保有している動物を、インビボで抗原に導き（例えば、暴露し）、抗原に対する免疫応答を惹起させてもよい。例えば、一態様で、当該技術分野で周知の、動物に外来抗原を導入する従来の経路によって（例えば、免疫化と類似の技術を用いて）、目的の抗原に動物を暴露してもよい。
【００６３】
或いは、好ましい実施形態で、ＭＹＣを誘導性に発現する細胞を保有する動物を、当該技術分野で一般的な技術により目的の抗原を発現するように設計してもよく、又は目的の抗原を発現している細胞を動物に導入してもよい。例として、骨髄造血幹細胞の、レトロウイルスが媒介する形質導入；遺伝子導入動物の作製、若しくはＭＹＣを過剰発現している動物と、抗原を発現する既存の遺伝子導入動物との交雑；又は動物への遺伝子送達のための他の任意の方法が挙げられる。いくつかの実施形態で、抗体の生産が望まれるまでＭＹＣが過剰発現されない条件下に動物を維持する。動物は次いで、ＭＹＣが過剰発現されて目的の抗原に対して特異的な抗体を生産するＢ細胞を生成する条件下に維持してもよい。本発明者らは、抗原に対して特異的なＢ細胞は、ＭＹＣ過剰発現がなければ抗原に対して寛容化されることになると考えている。いったんＭＹＣの過剰発現が誘導されれば、Ｂ細胞は新自己抗原に対する寛容を破壊でき、抗原に対して特異的な抗体を生成することができる。
【００６４】
正常ＡＮ−Ｉ細胞集団（Ｂ細胞発生時にＴ３としても知られる集団、自己抗原結合に際して骨髄において反応不顕性となったＢ細胞と考えられるもの）由来の細胞系を、複数のアプローチによって作製してもよく、そのうちのいくつかを以下に記載及び例証する。一実施形態で、ＡＮ−Ｉ集団は、受胎以降ドキシサイクリンにて維持されたＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウス由来ものである。本発明の方法によれば、それらのマウスは、目的の特異抗原も発現すべきである。前記のとおり、これは骨髄造血幹細胞の、レトロウイルスが媒介する形質導入、標準的遺伝子導入のアプローチ、又はマウスへの遺伝子送達のためのその他の任意の方法によって容易に成し遂げることができる。細胞は、およそ６週齡のマウスや、或いは野生型マウス、又は導入遺伝子の１つを保因するのみのマウスのいずれかの脾臓から単離できる。細胞は、インビトロで、好適なリンパ球培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血清、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｌ−グルタミン、２−βメルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、Ｈｅｐｅｓ及び非必須アミノ酸）において、ドキシサイクリン（５０ｎＭ）の存在下又は非存在下に蒔くことができる。細胞は例えば、２４穴プレートにおいて、およそ２ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で蒔かれるが、これらの工程は当業者によって容易に至適化又は改変できる。培地は通常、週１回交換する。このアプローチは、細胞の供給源及び状態（すなわち腫瘍性又は正常細胞、臓器等）によって、１０〜７０％の効率で細胞系を提供できる。細胞はクローン性の増殖について視覚的に調べてもよい。約１４〜２８日に増殖し始めるいずれのクローンでも、６穴プレートにおいて、最終的に組織培養フラスコにまで、ゆっくりと増殖させることができる。全てのマルチクローン性細胞系を、以前報告され、当該技術分野で公知の通りに、分析の前に限界希釈法によって単一細胞クローニングに付してもよい。
【００６５】
別の実施形態で、目的の抗体を生産できるＢ細胞系の形質転換は、インビボで起こさせてもよい。例としては、受胎以降、ドキシサイクリン含有食餌にて維持されていたＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスのコホート（ｃＤＮＡをコード化しているプラスミドから目的抗原も発現するもの）を、６週齢で正常マウス固形飼料に切り替える。このマウスは、Ｂ細胞リンパ腫の発生に関わる臨床徴候（毛皮汚損、外見的に明白なリンパ節腫脹、脱水、不活発、後肢麻痺−上行性等）について毎日検査できる。さらに、マウスは定期的に供血でき、目的の抗原への反応性について調べることができる。一旦マウスが腫瘍を発生すれば、そのリンパ節、脾臓、骨髄、及び血清を採取する。こうして得られる細胞懸濁液は、ＦＡＣＳ分析に使用してもよく、細胞を蒔いて前記のように細胞系を生成し、そして生存可能な初代腫瘍組織が継続的に得られるようにするため、残余の細胞を１０％ＤＭＳＯ中で凍結する。血清は、目的の抗原を発現する細胞を染色するのに使用して、また特異的抗原に対するものであるウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡアッセイ用に使用してもよい。コントロールマウスには通常、野生型、及び単独に遺伝子導入したマウスが含まれる。
【００６６】
別の実施形態で、ＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウス（前記同様、受胎以降ドキシサイクリン含有食餌にて維持されているもの）からの精製Ｂ細胞を、選択抗原を発現するようにインビトロで形質導入できる。形質導入した細胞はその後、ドキシサイクリン（移入後のＢ細胞においてＭＹＣの過剰発現を誘導するもの）にて維持されていないレシピエントマウス（例えば、野生型マウス）に養子移入する。マウスは次いで、前記のように生成された細胞系、及びＢ細胞リンパ腫の発生に伴う臨床徴候について毎日試験することができる。
【００６７】
モノクローナル抗体生産細胞の樹立を成し遂げるためのさらなるアプローチは、細胞の生存及び増殖を促進する（そして好ましくは、調節可能（誘導可能、制御可能）である）癌原遺伝子と、アポトーシスを阻害する蛋白質をコード化している核酸分子との選択された組み合わせを発現するマウスからの、骨髄レトロウイルスのキメラの使用を含む。本実施形態で、組み合わせの例として、限定しないが、ＭＹＣ−ＥＲ及びＢｃｌ−２が挙げられる。この後者のアプローチは、発現されるＭＹＣを活性にするために４−ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）を添加することを含む。本発明者らは、長寿命の造血幹細胞の条件付き不死化に関する実験においてＭＹＣ機能を首尾良く調節するような構築体を使用している。この場合、骨髄キメラマウスのコホートは、以下のように５ＦＵ富化骨髄由来幹細胞を用いて生成してもよい。骨髄由来造血幹細胞の場合、長寿命のＨＳＣを富化するために、そしてそれらのインビボ増殖を誘導するために、５ｍｇ／マウスの５−フルオロウラシル（５ＦＵ）を静脈内に投与する。骨髄細胞は、５日後に大腿骨及び脛側から収集する。低張溶解バッファーを用いて、赤血球細胞を溶解する。残る細胞を、培地で２回洗浄して、１５％熱不活性化ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、組換えヒトＩＬ−３、ＩＬ−６及び幹細胞因子（ＳＣＦ）を補充したＤＭＥＭ培地を含む２４穴プレートに２ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で蒔く。前記の通り、骨髄細胞は選択抗原を発現するように、インビトロで形質導入してもよい。細胞を第１スピン感染の前に２４時間培養して、２４時間毎に３回、この手順に付す。
【００６８】
最後のスピン感染の翌日に、細胞をフローサイトメトリーによって分析する。例として、レンチウイルスにより形質導入した骨髄に由来するＨＳＣを用いて、致死的に照射されたマウスを再構成してもよく、１２週後のリンパ系器官におけるレポーター遺伝子ＧＦＰの発現を用いて細胞を追跡できる。この場合、マウスは正常末梢リンパ系区画（骨髄移植後８〜１２週）を再構成してもよい。脾臓、ＧＦＰ＋ＡＮ−１／Ｔ３細胞は次いで、それらマウスから単離し、前記のようにインビトロ不死化プロトコルに用いてもよい。重要な相違は、システムからドキシサイクリンを排除する代わりに、４ＯＨＴを培地に添加することである。或いは、ｌｍｇ／マウスの４ＯＨＴで週１回腹腔内に処置した野生型レシピエントマウスのコホートに、ソートされたＧＦＰ＋ＡＮ−１／Ｔ３細胞を養子移入できる。マウスは、Ｂ細胞リンパ腫又は白血病の発生に伴う臨床徴候の出現につき毎日モニターする。得られる腫瘍を収集し、ＭＹＣ機能のレギュレーターとしてドキシサイクリンの代わりに４ＯＨＴを用い、本節に既に記載したようにＢ細胞系を生成するために使用できる。
【００６９】
別の実施形態で、条件付きで不死化した骨髄由来の幹細胞系を、前記方法における５ＦＵ富化骨髄由来幹細胞の代わりに使用してもよい。いくつかの実施形態で、細胞の生存及び増殖を促進する（そして好ましくは調節可能（誘導可能、制御可能）である）癌原遺伝子と、アポトーシスを阻害する蛋白質をコード化している核酸分子との前記組み合わせ（ＭＹＣ−ＥＲとＢｃｌ−２との組み合わせが例示される）を発現する細胞系を使用してもよい。条件付きで不死化した骨髄由来の幹細胞系及びそれらの作製の詳細な説明及び例は、国際公開第ＷＯ２００７／０４７５８３号パンフレットに記載されており、その内容を引用することにより本明細書に援用する。ＷＯ２００７／０４７５８３号パンフレットは、癌原遺伝子と抗アポトーシス遺伝子及び本発明で使用してもよいそれらの誘導体とのさらなる組み合わせの詳細な説明を提供する。特定の実施形態で、細胞系は、選択抗原をそれらが発現するように、インビトロで形質導入してもよい。
【００７０】
目的の抗原に対して特異的な抗体のポリクローナル集団や、さらにはそれらの抗体を生産する細胞は、動物の組織（脾臓、リンパ節等）又は血清から直接、単離してもよい。別の実施形態で、抗体生産細胞のモノクローナル集団を、標準的手順により単離してもよく、またモノクローナル抗体を培養培地から回収してもよい。
【００７１】
本発明の方法はまた、ヒト抗体を生産する細胞系を作製するのに使用してもよい。本実施形態を成し遂げるための２種の例示的技術として、（１）ヒト免疫グロブリン座位（ＩｇＨ及びＩｇＬ）をコード化している遺伝子導入ＢＡＣ構築体を保因するマウス株の、Ｅμ−ＭＹＣ株若しくはＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣ導入遺伝子を含むマウスのいずれかへの交雑（繁殖による）、又は（２）ＭＹＣ−ＥＲ（又は別の好適な誘導可能癌原遺伝子）に対するｃＤＮＡを含む、レトロウイルスの骨髄キメラの使用が挙げられる。この後者のアプローチで、目的の同族抗原は、レトロウイルスによりコード化されるｃＤＮＡから新自己抗原として、従来の導入遺伝子から、又は遺伝子及び蛋白質送達の他の手段によって発現される。前記のものに比較した場合、本実施形態における重要な相違は、本設定にて生産される抗体がヒト蛋白質になるはずであるということである。
【００７２】
ヒト抗体を生産する細胞系を作製する第２の方法は、所定の目的蛋白質に対する血清抗体価を有するヒトから得られる末梢血Ｂ細胞の単離に基づいている。Ｂ細胞は、標準的アプローチを用いて精製する。精製Ｂ細胞は、目的の特異性を備えたようなＢ細胞に対して富化するために、目的の蛋白質を被覆したプラスチックプレート上にパニングすることができる。或いは、目的の蛋白質は、磁気ビーズに接合させ、次いで目的の特異性を備えたＢ細胞を単離するのに使用できる。それらの細胞は、その後、単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ用のＴｅｒａｓａｋｉプレートに単一細胞ソートすることができる。単離したＢ細胞の各々に対するＩｇＨ及びＩｇＬ遺伝子に対するＶＤＪ連結領域につき、ｃＤＮＡを生成する。それらのｃＤＮＡ断片は次いで、ヒトＩｇＨ及び／又はＩｇＬをコード化し、且つ多重クローニング部位をそれらの分子が普通はそれら自体のＶＤＪ配列を有するはずである位置に含む、レトロウイルスベクター（ＬＴＲ−ＩｇＨ−ＩＲＥＳ−ＩｇＬ−ＬＴＲをコード化するレトロウイルスのベクター、又はＩｇＬに対するもの、ＩｇＨのいずれか１つ）へとクローニングできる。得られるレトロウイルスを配列決定して、ＭＹＣを過剰発現し、且つＢ細胞の生産を防止する遺伝的修飾を含む、マウス由来の５ＦＵ富化骨髄由来ＨＳＣを形質導入するのに使用できる。例として、ＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣ／Ｒａｇ−１−／−マウス、Ｅμ−ＭＹＣ／Ｒａｇ−１−／−マウス、又はＩｇＨ／ＩｇＬレトロウイルス及びＭＹＣ−ＥＲに対するもので同時感染したＲａｇ−１−／−骨髄が挙げられる。さらなる例として、Ｒａｇ−２−／−、ＳＣＩＤ、ＤＮＡ−ＰＫ−／−、Ｋｕ７０−／−、Ｋｕ８０−／−、ＸＲＣＣ４−／−、μＭＴ−／−等の座位の遺伝的除去を含むマウスと交雑した、前記のＭＹＣを過剰発現しているマウスの、任意のものが挙げられる。それらの細胞は次いで、前記のプロトコル（レトロウイルスの骨髄キメラマウス用）を用いて致死的に照射されたマウスを再構成するのに使用できる。特異的抗原をコード化している核酸をマウスに形質導入するのに、任意の手段（遺伝子銃、裸（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ免疫化、遺伝子導入マウス、レンチウイルスでの「遺伝子導入」マウス、組換え蛋白質の直接注射、その遺伝子に対するｃＤＮＡをコード化するワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換え酵母、又は哺乳動物細胞、ｔａｔ−融合蛋白質等）を使用できる。
【００７３】
本アプローチより得られる細胞系は、目的の蛋白質に特異的なヒト免疫グロブリン配列をコード化することになる。これは、ウイルス感染、腫瘍、細菌及び真菌等を含む様々な病原及び疾患に対する阻害抗体のカクテルの生成のための強力な新規アプローチである。本発明はまた、ＭＭＴＶ−ｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスを使用することで得られる抗体特異性をヒト化する方法も含んでいる。この場合、ＩｇＬ座位にあるマウスＩｇＨ及びＶＪ領域より由来する、再配置したＶＤＪ連結配列をＰＣＲ増幅する。それらの配列は、ＭＭＴＶ−ｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスより発生し、目的の抗原に対する抗体を生産することが既に示されているクローン細胞系から得ることができる。ＰＣＲ増幅断片は、その中にＰＣＲ断片がクローニングされる多重クローニング部位を含むヒトＩｇＨ及びＩｇＬ配列をコード化するレトロウイルスのプラスミドへとクローニングできる（図９参照）。ＩｇＨ及びＩｇＬ配列は、両方のｃＤＮＡが同じウイルスベクターから発現されるように、ＩＲＥＳエレメントによって離間されている。異なるウイルスベクターの使用により、所定の特異性を備えた、異なる抗体イソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びその異なるサブグループ）の生成が可能になる。さらに、Ｆｃ領域をコード化している配列をさらに修飾して、得られる抗体が自己免疫反応及び関連免疫複合体沈着の問題を誘発する能力を最小にしてもよい。得られるレトロウイルスは、Ｒａｇ−１−／−／ＭＭＴＶ−ｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスから得られる骨髄由来造血幹細胞を形質導入するのに使用される。形質導入した細胞は、致死的に照射されたＣ５７／ＢＬ６野生型マウスのコホートに移植できる。この結果得られるマウスは、一抗原に対して単一特異性であり、ヒト化抗体の追加された特徴のすべてを備えたモノクローナル抗体生産細胞を生成できる。
【００７４】
別の実施形態で、目的の抗原に対するモノクローナルヒト抗体は、以下の方法によって生産できる。所定の細胞系に見られるＩｇＨ及びＩｇＬからの特異的ＶＤＪ連結配列を増幅する代わりに、抗体が媒介する自己免疫疾患（例えば、シェーグレン症候群、ハシモト甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、ワルデンストロームマクログロブリン血症等）に罹患している患者や、非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、濾胞様リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、ＭＧＵＳ及び複数の骨髄腫）に罹患している患者、又は健常ドナーのいずれかから得たＢ細胞に見られるＩｇＨ及びＩｇＬ配列から再配置したＶＤＪに対するＰＣＲ増幅断片を単離できる。ＰＣＲ断片は、前記レトロウイルス構築体にクローニングされる（これらのライブラリーの生成を円滑にするよう、２つの異なるレトロウイルスの構築体としても調製できる）。次いで、レトロウイルスのライブラリーを使用して、前記のように骨髄キメラマウスを生成するために、Ｒａｇ−−／−／ＭＭＴＶ−ｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスから得られた骨髄由来造血幹細胞（ＨＳＣ）を形質導入できる。骨髄キメラマウスは、ヒト免疫グロブリンを発現するＢ細胞のみを作り、免疫化の準備が整うまで（ＭＹＣ過剰発現を抑制するために）ドキシサイクリン含有食餌にて維持できる。これらのマウスは、（それらのＢ細胞でのＭＹＣ過剰発現を果たすため）ドキシサイクリンの非存在下に免疫化できる。反応性の抗原特異的Ｂ細胞は、特異的抗原に対するパニングによってインビトロで単離及び濃縮できる。この細胞は、それらを不死化して、ヒト抗体を生産するモノクローナル細胞系を作るために、ＭＹＣ過剰発現下に成長させることができる。
【００７５】
前記の通り、このアプローチを使用して、例えば、特異的抗原に対するヒトＩｇＡ抗体を含め、異なるイソタイプを有するヒト抗体を特異的に単離できる。ＩｇＡ抗体は、予防用に後で強く求められるが、ＩｇＡ生産を意図的に誘導するために従来の抗体生産方法を用いてどのように動物を免疫化するかは不明なままである。本発明を用いて、この問題が解決される。さらに、本明細書で定義するいずれの特異性も、前記の通り別のＦｃ骨格に容易に移入できる。
【００７６】
得られる細胞系は、多量の抗体を至適に生産しない可能性がある。これは、ＩｇＨ及びＩｇＬをコード化するｃＤＮＡをＰＣＲに基づき増幅することによって解消できる。それらｃＤＮＡの発現ベクターへのクローニングは、次いで骨髄腫細胞系（又は他のＢ細胞リンパ腫細胞系）を形質導入して抗体生産を増大させるのに使用できる。
【００７７】
第３のアプローチは、レトロウイルスにより目的の抗原でヒトｃｔｌｔ−ＨＳＣ細胞系を形質導入して、亜致死的に照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、それらの形質導入ｃｔｌｔ−ＨＳＣ細胞系を用いて移植することである。マウスに４ＯＨＴを注射し、得られる白血病／リンパ腫を培養してヒトモノクローナル抗体生産細胞系を作製できる。その利点は、モノクローナル抗体全体がヒト遺伝子によりコード化され、インビボで成熟できることである。第４の可能性は、亜致死的に照射され、且つヒトｃｔｌｔ−ＨＳＣ細胞系で再構成されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに由来する脾臓成熟ヒトＢ細胞を単離することである。ＭＹＣ過剰発現なしに発生した成熟Ｂ細胞を、目的の抗原でレトロウイルスにより形質導入できる。細胞は、亜致死的に照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに戻し移植してそれらのマウスに４ＯＨＴを注射することによりインビボで形質転換させるか、又は４ＯＨＴの存在下にインビトロ培養で維持することができる。これにより、目的の抗原の核酸配列のみで開始して２〜３週で、新規ヒトモノクローナル抗体の発生が可能になりうる。ＭＹＣが自己抗原に対するＢ細胞寛容を破壊する能力は、Ｔ細胞免疫優性エピトープに関わらず多くの特異性に対する抗体の発生をもたらすかもしれない。ＭＹＣがＢ細胞寛容を破壊する機構は、自己反応性Ｂ細胞をＴ細胞の援助に非依存的なものとすることに関わり、よってそれらを蛋白質配列の特定部分に応答する束縛から開放することもできる。本アプローチは、自己蛋白質を模倣し、免疫系によって通常は無視され、従って寛容機構が概して、それらの残基に対する良好な応答を妨げる、ウイルスによりコード化されたエピトープを明らかにすることができるかもしれない。本発明は従って、それらの共通ドメインを良好なワクチン候補とする新規の方法を提供する。
【００７８】
本明細書に開示の技術は、癌及び自己免疫などの感染症及び慢性疾病を明らかにする、検出及び処置用の診断及び治療用抗体の迅速な開発のための新しいストラテジーを提供する。抗体生産のための既存の手順に比べて、本発明の速度及び効率のために、新しい感染作用物質が現れた後すぐに、これらの抗体を生成することができる。例えば、疾患の突然の激増（例えば、パンデミックインフルエンザ（フル））の原因になるウイルスに特異的な抗体を、現行法により生成されるものよりもずっと短期間で治療剤としての使用に備えるものとしうる。本発明の方法を用いて生産される抗体は、あらゆる型及びクラスの抗体を初めとして、抗体結合断片及び抗体の誘導体を含んでもよい。さらに詳細には、本発明の方法により生産される抗体は、かかる抗体を含有する血清、又は様々な程度に精製されている抗体を含むことができる。本発明の全抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルでありうる。或いは、全抗体の機能性等価物、例えば、１種以上の抗体ドメインが切欠されたか又は存在しない抗原結合断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’，又はＦ（ａｂ）２断片）、さらには、単鎖抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（前記）、１種より多くのエピトープに結合できる抗体（例えば、二重特異性抗体）、若しくは１種以上の異なる抗原に結合できる抗体（例えば、二重又は多重特異性抗体）を含む遺伝的に操作した抗体又はその抗原結合断片なども、本発明の方法によって生産されうる。
【００７９】
多種多様な抗原に選択的に結合することができる抗体を、本発明の方法によって生産できる。一般的に、動物に導入すると免疫応答を誘導できる任意の抗原が、本発明での使用に好適である。さらに、自己抗原などの、正常動物では通常自己寛容機構を受けているはずの抗原も、本発明で使用してもよい。例えば、抗原としては、限定しないが、ウイルス抗原、真菌抗原、細菌抗原、蠕虫抗原、寄生虫抗原、外寄生生物抗原、原生動物抗原、又は他の任意の感染作用物質からの抗原を含め、病原に関わる任意の抗原を挙げることができる。抗原としてはまた、病原性又は細胞性のいずれの出所からのものであれ、特定の疾患又は状態に関連する任意の抗原も挙げることができ、これらには限定しないが、癌（腫瘍）抗原、自己免疫疾患に関わる抗原（例えば、糖尿病抗原）、アレルギー抗原（アレルゲン）、１種以上の変異アミノ酸を内包している哺乳動物細胞分子、哺乳動物細胞によって通常は出生前又は新生児期に発現される蛋白質、疫学的作用物質（例えばウイルス）の挿入により発現が誘導される蛋白質、遺伝子転座により発現が誘導される蛋白質、及び調節配列の突然変異により発現が誘導される蛋白質が含まれる。これらの抗原は、天然抗原又は遺伝操作された抗原で、なんらかの方法によって修飾されているもの（例えば、配列変化又は融合蛋白質の生成）であることができる。
【００８０】
一態様で、抗原は、アデノウイルス、アレナウイルス、ブニアウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、フラビウイルス、ヘパドナウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ミクソウイルス、発癌ウイルス、オルソミクソウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、パラインフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、風疹ウイルス、トガウイルス、及び水痘ウイルスなどのウイルス由来のものであるが、これらに限定されることはない。他のウイルスとして、Ｔ−リンパ増殖性ウイルス、例えば、ヒトＴ細胞リンパ増殖性ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩなどのＨＴＬＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶＳ）及びネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）が挙げられる。レンチウイルスとしては、限定しないが、ヒト（ＨＩＶ−Ｉ又はＨＩＶ−２を含むＨＩＶ）、サル（ＳＩＶ）、ネコ（ＦＩＶ）及びイヌ（ＣＩＶ）免疫不全ウイルスが挙げられよう。
【００８１】
本発明の新規の手順によるモノクローナル抗体の生成により、ＨＩＶ変異体のクレード全体を中和する潜在的能力のある新規特異性の発生をもたらすことができる。これは、例えば、ウイルスのエンベロープ蛋白質の構造上の必須構成要素の標的化、又は代わりに、宿主コレセプター蛋白質のいずれかによって達成できよう。
【００８２】
好ましい一実施形態で、本発明の方法は、血球凝集素（ＨＡ）蛋白質又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）蛋白質などのインフルエンザウイルス蛋白質に特異的な抗体を生成するのに使用してもよい。いくつかの実施形態で、ＨＡ蛋白質は、Ｈｌ、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及びＨ１６から選択される。一態様で、ＨＡ蛋白質はＨ５である。一態様で、ＮＡ蛋白質は、Ｎｌ、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８及びＮ９から選択される。一態様で、ＮＡ蛋白質はＮ５である。特定の実施形態で、抗体はＨＡ蛋白質のサブユニットに対して特異的である。
【００８３】
別の態様で、抗原は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ、Ｂｒｕｇｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｈ１ａｍｙｄｉａ、Ｃｏｃｃｉｄｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ、Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ  Ｙｅｒｓｉｎｉａからなる属より選択される感染作用物質由来のものである。一態様で、感染作用物質は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（熱帯熱マラリア原虫）  ｏｘ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ（三日熱マラリア原虫）から選択される。
【００８４】
一態様で、抗原は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、及びＲｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅより選択されるファミリー由来の細菌からのものである。一態様で、細菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、及びＹｅｒｓｉｎｉａから選択される属のものである。一態様で、細菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｌｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａから選択される種由来である。
【００８５】
好適な抗原として、ウイルスが結合する細胞性レセプター（例えば、ＣＤ４等）も挙げられる。
【００８６】
本発明によれば、「〜に選択的に結合する」の用語は、抗体又はその抗原結合断片が、特定の蛋白質又は他の抗原に優先的に結合する能力を意味する。さらに具体的には、「選択的に結合する」の用語は、ある蛋白質と別のものとの特異的結合（例えば、抗原に対する、抗体又はその抗原結合断片）であって、結合のレベルが、任意の標準的アッセイ（例えば、イムノアッセイ）によって測定して、そのアッセイに対するバックグラウンコントロールよりも統計的に有意に高いことを意味する。例えば、イムノアッセイを実施する場合、コントロールは通常、抗体又は抗原結合断片を単独で含む（すなわち、抗原の非存在下の）反応ウェル／チューブであり、抗原非存在下での抗体又はその抗原結合断片による反応性の量（例えば、ウェルへの非特異的結合）が、バックグラウンドと考えられる。結合は、酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、イムノブロットアッセイ等を含む、当該技術分野の水準にある様々な方法を用いて測定できる。
【００８７】
本発明によれば、本発明での使用に好適な抗原として、同じ抗原由来の２種以上の免疫原性ドメイン若しくはエピトープ；同じ細胞、組織若しくは生物由来の２種以上の抗原、免疫原性ドメイン、若しくはエピトープ；及び／又は異なる細胞、組織若しくは生物由来の２種以上の異なる抗原、免疫原性ドメイン、若しくはエピトープを挙げることができる。実際、本発明は、１度の免疫化後に多重特異性のモノクローナル抗体を生成するための方法を提供する。例えば、本明細書に記載のマウス（例えば、ＭＭＴＶ−ｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウス）を、細菌又は酵母にて組換え蛋白質として生成され、ＧＳＴ−融合蛋白質として作製された抗原などの２種以上の免疫原性ドメイン、エピトープ、又は他の抗原で、標準的な免疫化技術を用いて免疫化してもよい。免疫化されたマウスからのＢ細胞は次いで、例えば、精製蛋白質抗原で被覆されたプレート上にパニングすることによって単離してもよい。単離された抗原特異的Ｂ細胞は、ＭＹＣ過剰発現を活性化し、継続的抗原の存在下にＢ細胞をインビトロで形質転換するために、抗生物質（例えば、ドキシサイクリン）の非存在下に培養してもよい。得られる細胞系はその後、抗体生産及び特異性についてスクリーニングしてもよい。このアプローチで、一度に２００もの抗原に特異的なモノクローナル抗体を迅速に生産できるようになり、多くの蛋白質に対するモノクローナル抗体の供給を豊富にすることによって、プロテオミクスの分野での主な障壁を解消しうる。
【００８８】
前記の方法は、１つの抗原又は複数の抗原の、多くの又はすべてのエピトープを認識する中和抗体組成物を生成するのに使用してもよい。例えば、１つのウイルスのいくつかの抗原で、又はいくつかの関連ウイルス株からの特定の抗原の複数の変異体でマウスを免疫化してもよい。単離された抗原特異的Ｂ細胞は、次いで抗原の特定のエピトープに対して特異的な抗体を生産する細胞についてパニングしてもよい。これらはその後、合わせて、ウイルス、又はウイルス株のパネルからの特異的抗原の全ての変異体の、殆ど又は全てのエピトープに結合する抗体組成物を生産してもよい。同様に、類似のエピトープとの交差反応性なしに、１つの特定の抗原又はエピトープへ結合することにつき、同様の方法によって抗体を選択してもよい。
【００８９】
本発明によって生産される、予防又は治療剤として有用な抗体は、通常は組成物（製剤）の形態で提供される。本発明の一実施形態で、医薬組成物又は製剤は、有効な量の抗体又はその抗原結合断片、及び薬理学的に許容できる担体から調製される。薬理学的に許容できる担体は、当業者に周知である。本発明によれば、「薬理学的に許容できる担体」には、薬理学的に許容できる賦形剤及び／又は薬理学的に許容できる送達媒体で、好適なインビボの部位に製剤又は組成物を投与するための使用に好適なものが含まれる。薬理学的に許容できる担体は、抗体が患者の標的部位に到達すれば、その抗体が作用でき、好ましくはその患者に治療的恩恵をもたらすことのできる形態の製剤において、使用される抗体を維持できるものでもよい。従って、本発明はさらに、本発明によって生産される抗体又は誘導体の１種以上を用いて個体を処置する方法も包含する。本発明は、一実施形態で、病原による感染（例えば、コロナウイルス感染）若しくはそれに起因する疾患を含む、状態若しくは疾患を有するか、又はそれを発生する危険のある動物を処置する（その状態又は疾患の予防及び／又は治療的処置を含む）方法を包含する。この方法は、その状態若しくは疾患を有するか、又はそれを発生する危険のある動物に、本明細書に記載の通り本発明によって生産される１種以上の抗体又はその機能性誘導体を投与して、その疾患又は状態に起因する少なくとも１つの症状をその動物において予防又は低減することを含め、疾患又は状態を低減又は予防する工程を含む。本発明はマウスを用いて例証されているが、当該技術分野で知られている抗体生産用の任意の実験動物を使用してもよいことは当業者に理解されるであろう。本発明の方法は、細胞又はその組織を含め、抗体生産に好適な任意の生物で使用できる。好ましい動物として、脊椎動物綱の任意の動物、制限なく霊長類、齧歯類、家畜及び家庭用ペットを含む哺乳類（すなわち、哺乳動物）が挙げられる。一般的に、抗体の生産において、例えば、限定しないが、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、マウス、ラット又はニワトリなどの好適な実験動物が、それに対する抗体を所望される抗原に暴露される。好ましい実施形態で、動物は「ヒト化」動物、例えば、ヒト抗体を生じるヒトｃｔｌｔ−ＨＳＣ細胞系及びヒトモノクローナル生産細胞系で再構成されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスである。
【００９０】
（一般定義）
本発明の実施には、特に断らない限り、当業者に周知の、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の常用の技術を利用しうる。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ，２００１），（本明細書では併せて「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」として引用する）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７，２００１年までの追補も含む）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら、編、１９９４）；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（本明細書では併せて「Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ」として引用する），Ｂｅａｕｃａｇｅら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）；並びにＶａｃｃｉｎｅｓ，Ｓ．Ｐｌｏｔｋｉｎ及びＷ．Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，編、第３版（１９９９）などの文献において充分に説明されている。
【００９１】
本発明によれば、本明細書で一般的に用いられる用語「抗原」は、自然発生的に、若しくは合成により得られる蛋白質（ペプチド、部分蛋白質、全長蛋白質）のあらゆる部分、細胞性組成物（全細胞、細胞溶解液又は破壊細胞）、生物（生物全体、溶解液、若しくは破壊細胞）、又は炭水化物（癌細胞で発現されているものなど）や他の分子若しくはその一部を意味する。抗原は、その抗原が投与される個体の細胞及び組織内で遭遇する同一若しくは類似の抗原に対する、抗原特異的な免疫応答（例えば、体液性免疫応答及び／又は細胞媒介性免疫応答）を誘発する。或いは、抗原は免疫寛容原として作用できる。免疫応答の刺激を言う場合、「抗原」の用語は、「免疫原」の用語と互換的に用ることができる。抗原は、単一エピトープほどに小さくてもよいし、又はより大きくてもよく、また複数のエピトープを含むことができる。従って、抗原のサイズは、約５〜１２アミノ酸（例えば、ペプチド）と小さくてよいし、全長蛋白質ほどの大きさでもよく、これには多量体、及び融合蛋白質、キメラ蛋白質、全細胞、微生物全体、又はその一部（例えば、全細胞の溶解液や、微生物の抽出物）が含まれる。さらに、抗原には炭水化物が含まれうる。
【００９２】
所定抗原の「免疫原性ドメイン」は、動物に投与された場合に免疫原として作用する少なくとも１つのエピトープを含む、抗原の任意の部分、断片又はエピトープ（例えば、ペプチド断片、サブユニット、抗体エピトープ又は他のコンホメーションに基づくエピトープ）でありうる。例えば、単一蛋白質が、複数の異なる免疫原性ドメインを含みうる。免疫原性ドメインは、体液性免疫応答の場合のように蛋白質内で線状の配列である必要はない。
【００９３】
エピトープは、本明細書で、所定抗原内の、免疫応答を誘発するのに充分な単一免疫原性部位、又は所定抗原内の、免疫応答を抑制、削除若しくは不活性化させるのに充分な、単一免疫寛容原性部位と定義する。当業者は、Ｔ細胞エピトープのサイズ及び組成がＢ細胞エピトープと異なること、並びにクラスＩ  ＭＨＣ経路を通じて提示されるエピトープは、クラスＩＩ  ＭＨＣ経路を通じて提示されるエピトープと異なることを認識するであろう。エピトープは、線状配列であっても、又はコンホメーションに基づくエピトープ（保存結合領域）であってもよい。「ワクチン接種」又は「免疫化」は、単独又はアジュバントと共に抗原を投与することの結果としての、抗原又はその部分に対する免疫応答の誘発（誘導）を意味する。免疫化の概念は、当該技術分野で周知である。抗原の投与により誘発される免疫応答は、抗原を投与しないときと比較した場合の、免疫応答の任意の様相（例えば、細胞媒介性応答、体液性応答、サイトカイン生産）の検出可能な任意の変化でありうる。
【００９４】
本発明によれば、抗体は免疫グロブリンドメインを含むことを特徴とし、よって、それらは蛋白質の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。一般的には、抗体分子は２種の鎖を含んでいる。鎖の１方の型は、重鎖又はＨ鎖と称され、もう一方の型は軽鎖又はＬ鎖と称される。２つの鎖は、等モル比で存在し、各抗体分子は通常、２つのＨ鎖と２つのＬ鎖とを有している。２つのＨ鎖はジスルフィド結合によって連結され、Ｈ鎖の各々はジスルフィド結合によってＬ鎖に連結されている。Ｌ鎖は、ラムダ（λ）及びカッパ（κ）鎖と称される２種のみである。これに対し、Ｈ鎖の主要クラスは５つあり、イソタイプと称される。その５つのクラスには、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ又はμ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ又はδ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ又はλ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ又はα）、及び免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ又はε）が含まれる。このようなイソタイプ間の弁別的特性は、免疫グロブリンの定常ドメインによって定義付けられ、それらを以下に詳説する。ヒト免疫グロブリン分子は、９つのイソタイプ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１（γｌ）、ＩｇＧ２（γ２）、ＩｇＧ３（γ３）及びＩｇＧ４（γ４）を含むＩｇＧの４つのサブクラス、並びにＩｇＡｌ（αｌ）及びＩｇＡ２（α２）を含むＩｇＡの２つのサブクラスを含む。ヒトにおいて、ＩｇＧサブクラス３及びＩｇＭは、最も強力な補体活性化因子（古典的補体系）であるが、ＩｇＧサブクラス１と、ずっと程度は低いがＩｇＧサブクラス２は、古典的補体系の中度から低度の活性化因子である。ＩｇＧ４サブクラスは補体系（古典的又は副補体系）を活性化しない。副補体系を活性化することが知られている唯一のヒト免疫グロブリンイソタイプは、ＩｇＡである。マウスでは、ＩｇＧサブクラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３である。マウスＩｇＧ１は補体を活性化しないが、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３は補体活性化因子である。
【００９５】
免疫グロブリン分子の各々のＨ又はＬ鎖は、Ｌ鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）及びＬ鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）、並びにＨ鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）及びＨ鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン）と称される２つの領域を含む。完全なＣＨドメインは、３つのサブドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、及びヒンジ領域を含む。合わせて、１つのＨ鎖と１つのＬ鎖が、免疫グロブリン可変領域を有する免疫グロブリン分子の腕を形成できる。完全な免疫グロブリン分子は、２つの会合した（例えば、ジスルフィド結合した）腕を含んでいる。よって、免疫グロブリン全体の各々の腕は、ＶＨ＋Ｌ領域、及びＣＨ＋Ｌ領域を含んでいる。本願明細書で用いる「可変領域」又は「Ｖ領域」という用語は、ＶＨ＋Ｌ領域（Ｆｖ断片としても知られている）、ＶＬ領域又はＶＨ領域を意味する。本願明細書で用いる「定常領域」又は「Ｃ領域」という用語もやはり、ＣＨ＋Ｌ領域、ＣＬ領域又はＣＨ領域を意味する。
【００９６】
プロテアーゼを用いた免疫グロブリンの限定消化で、２つの断片を生産してもよい。抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２断片と称される。抗原への結合能力を欠く断片は、Ｆｃ断片と称される。Ｆａｂ断片は、ＶＨ領域及びＣＨ領域の一部（ＣＨ１ドメイン）と対合するＬ鎖（ＶＬ＋ＣＬドメイン）を有する、免疫グロブリン分子の一方の腕を含んでいる。Ｆａｂ’断片は、Ｆａｂ断片に対応しており、ヒンジ領域の一部がＣＨ１ドメインに付着している。Ｆ（ａｂ’）２断片は、典型的にはヒンジ領域において、ジスルフィド結合を介して通常互いに共有結合している２つのＦａｂ’断片に対応する。
【００９７】
ＣＨドメインは免疫グロブリンのイソタイプを決定付け、そのイソタイプに応じて異なる機能的特性が与えられる。例えば、μ定常領域は、ＩｇＭ分子の五量体の凝集体形成を可能とし、α定常領域は二量体の形成を可能とする。
【００９８】
免疫グロブリン分子の抗原特異性は、可変、すなわちＶ領域のアミノ酸配列によって与えられる。このように、異なる免疫グロブリン分子のＶ領域は、それらの抗原特異性に応じて有意に変動しうる。Ｖ領域の特定の部分は、他の部分よりも保存されており、フレームワーク領域（ＦＷ領域）と称される。これに対し、Ｖ領域の特定の部分は、可変性が高く、超可変領域と命名されている。ＶＬとＶＨドメインが免疫グロブリン分子内で対合すると、各ドメイン由来の超可変領域が会合して、抗原結合部位を形成する超可変ループを創出する。よって、超可変ループが免疫グロブリンの特異性を決定し、それらの表面が抗原に対して相補的であるので、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名されている。
【００９９】
Ｖ領域のさらなる可変性は、免疫グロブリンＶ領域をコード化する遺伝子セグメントの組み合わせの可変性によって与えられる。免疫グロブリン遺伝子は、体細胞性に再配置して免疫グロブリン分子をコード化する再配置免疫グロブリン遺伝子を形成する、複数の生殖系遺伝子セグメントを含む。ＶＬ領域は、Ｌ鎖Ｖ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメント（連結セグメント）によってコード化される。ＶＨ領域は、Ｈ鎖Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント（多様性セグメント）及びＪ遺伝子セグメント（連結セグメント）によってコード化される。
【０１００】
Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ遺伝子セグメントの両者とも、実質的なアミノ酸配列可変性の３つの領域を有している。かかる領域は、それぞれＬ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにＨ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と称される。Ｌ鎖ＣＤＲ１の長さは、異なるＶＬ領域間で実質的に変動しうる。例えば、ＣＤＲ１の長さは、約７アミノ酸から約１７アミノ酸までで変動しうる。これに対し、Ｌ鎖ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の長さは、通常は異なるＶＬ領域間で変動しない。Ｈ鎖ＣＤＲ３の長さは、異なるＶＨ領域間で実質的に変動しうる。例えば、ＣＤＲ３の長さは、約１アミノ酸から約２０アミノ酸までで変動しうる。各Ｈ及びＬ鎖ＣＤＲ領域には、ＦＷ領域が隣接している。
【０１０１】
免疫グロブリン分子の他の機能面として、免疫グロブリン分子の価数、免疫グロブリン分子の親和性、及び免疫グロブリン分子の結合力が挙げられる。本願明細書で用いる「親和性」は、免疫グロブリン分子上の単一部位で免疫グロブリン分子が抗原に結合する（すなわち、一価抗原に結合する一価Ｆａｂ断片結合）強度を意味する。親和性は、免疫グロブリンが抗原に結合する強度の合計を意味する結合力とは異なっている。免疫グロブリン結合親和性は、当該技術分野で標準的な技術を使用して測定でき、この例として競合的結合技術、平衡透析法又はＢＩＡコア法が挙げられる。本願明細書で用いる「価数」とは、免疫グロブリン分子あたりの異なる抗原結合部位の数（すなわち、抗原結合断片の抗体分子１つあたりの抗原結合部位の数）を意味する。例えば、一価免疫グロブリン分子は、一度に１つの抗原にしか結合できないが、二価免疫グロブリン分子は、一度に２種以上の抗原に結合できる、等々である。
【０１０２】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物としては、限定しないが、家畜、競技用動物、ペット、霊長類、マウス及びラットが挙げられる。「個体」の用語は、「動物」、「被検者」又は「患者」の用語と互換的に使用できる。
【０１０３】
本発明の様々な態様は、以下の実験に記載されている。これらの実験結果は、例示目的のみで、本発明の範囲を限定することは意図しない。
【実施例】
【０１０４】
（実施例１）
以下の実施例は、ＭＭＴＶ−ｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスに由来するＢ細胞系の生産を示す。
【０１０５】
Ｂ細胞特異的に誘導性にＭＹＣを過剰発現できるマウスのＡＮ１／Ｔ３集団からＢ細胞系を生成するために、生後８週間、ＭＭＴＶ−ｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスをドキシサイクリンにて維持し、その後正常食餌に切り替えた。そのマウスで、外見的に顕著なリンパ節腫脹及び脾腫大が発生し、リンパ系異常増殖に伴い一貫して認められる多くの臨床徴候（毛皮汚損、弯曲姿勢、努力性呼吸、貧血、臓器肥大等）を表した。マウスを安楽死させて、それらのリンパ節及び脾臓を分析用に集めた。リンパ節のいくつか及び脾臓の一部から、単一細胞懸濁液を生成した。それらの細胞をフローサイトメトリー分析に使用した。腫瘍を初期に特徴付けすることで、活性化Ｂ細胞の高い有病率が実証された。同じ細胞のいくつかを用いて、培養物を播種し、Ｂ細胞系を生成させた。これらの細胞は、リンパ球培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及び２−β−メルカプトエタノール）で培養した。およそ１４〜２１日後に、ウェルのいくつかが細胞系のクローン増殖を呈し始めた。細胞が大きなフラスコでの成長に適応し、細胞の一部は凍結保存するまで、注意深く増殖させた。
【０１０６】
最初に２種の細胞系を選び、ＴＢＬＫ６及びＴＢＬＫ７と命名した。両細胞系の試料をＣＤ１３８（Ｙ軸）及びＣＤ４０（Ｘ軸）に特異的な抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図１（上部パネル）に示す通り、２種の細胞系は、異なるレベルのＣＤ１３８発現を示し、ＣＤ４０発現はほとんど乃至は全く示さなかった。播種後の組織培養培地への免疫グロブリン分泌のレベルも測定した。各細胞系由来の細胞の規定数（１０５細胞）を、１ｍｌの成長培地単独、又はＩＬ−４、ＩＬ−６若しくは両者のいずれかを補充した培地を含む２４穴プレートのウェルに播種した。培養開始後、１、３又は４日に上清の試料を採取した。その後、抗ＩｇＭ捕獲ＥＬＩＳＡ用に上清を使用した。図１（下部パネル）に表す結果より、両細胞系は自発的に免疫グロブリンをそれらの生育培地に分泌するが、最初の接種物にＩＬ−４及びＩＬ−６を添加することによって分泌のレベルを増加できることが示される。次いで、ＴＢＬＫ６及びＴＢＬＫ７両者により分泌される免疫グロブリンはＩｇＭであることを実証した。真のモノクローナル集団を生成し続けるために、それらの細胞系の両方を単一細胞にクローン化できる。さらに、セルソーティングによってＡＮ１／Ｔ３集団を単離するために使用できるＭＭＴＶ−ｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣバイジェニックマウスのコホートを、現在生成している。
【０１０７】
（実施例２）
以下の実施例は、Ｅμ−ＭＹＣ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬ遺伝子導入マウスで生じる腫瘍及び細胞系の表面表現型とＨＥＬ特異的抗体生産を実証する。
【０１０８】
野生型マウス（塗りつぶしたヒストグラム）、ＢＣＲＨＥＬ遺伝子導入マウス（明灰色実線）、ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬマウス（網点灰色線）、及びＥμ−ＭＹＣ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬ三重遺伝子導入マウス（黒実線）から得た細胞を、表示の表面マーカーに対して特異的な抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図２（上部パネル）に示すデータは、Ｂ２２０＋脾臓細胞上の表示マーカーの発現を表す。
【０１０９】
細胞系ＴＢＬ−Ｉ、ＴＢＬ−８、ＴＢＬ−１４及びＴＴＬＮ９（全て、Ｅμ−ＭＹＣ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬマウスで生じる腫瘍由来）の１０５細胞を、２４穴プレートに、サイトカインを全く追加しない１ｍｌの生育培地中へ播種した。４日後に上清の試料を採取して、総ＩｇＭの濃度（Ａ）、さらにＨＥＬ特異的ＩｇＭの力価（Ｂ）についてアッセイした。様々なコントロールマウスからの血清も含めて、細胞系における抗体生産を比較する手段を提供する。これらのマウスには、野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ＷＴ）、ＢＣＲＨＥＬ遺伝子導入マウス（ＢＣＲ−ｔｇ）、ｓＨＥＬ遺伝子導入マウス（Ａｇ−ｔｇ）、ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬ二重遺伝子導入マウス（ＢＣＲ／Ａｇ−ｔｇ）、Ｅμ−ＭＹＣマウス及び腫瘍担持Ｅμ−ＭＹＣ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬ三重遺伝子導入マウス（ＢＬ）が含まれた。図２（下部パネル）に示す結果は、Ｅμ−ＭＹＣ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬマウスで生じる腫瘍及び細胞系におけるＨＥＬ特異的力価を示す。
【０１１０】
（実施例３）
以下の実施例は、ＭＹＣがＢ細胞寛容を破壊して、抗原誘発、ＭＹＣ−依存性Ｂ細胞リンパ腫を起こすことができることを実証する。
【０１１１】
寛容を破壊することによって、ＭＹＣはＢ及びＴ細胞を自己抗原による持続的刺激に曝して、細胞増殖、及び確実になるゲノムの障害を助長できる力をもたらすのかもしれない。ＭＹＣを過剰発現しているＢ細胞の新生物発生前状態の検討は、Ｂ細胞寛容の調節におけるＭＹＣの新規な役割の解明につながる。
【０１１２】
フローサイトメトリー分析を、野生型マウス（塗りつぶしたヒストグラム）、ずっとドキシサイクリンにて維持しておいたＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−Ｍ７Ｃ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬマウス（明灰色線）、及び安楽死の１週間前にドキシサイクリンから離脱させておいたＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬマウス（暗灰色線）から得たリンパ節細胞について実施した。図３（上部パネル）は、Ｂ細胞、ＣＤ６９（Ａ）、及びＢ７−２（ＣＤ８６）（Ｂ）の抗原依存性活性化後に上方調節される２種の分子に対する抗体で細胞を染色した場合の結果を示す。ＣＤ６９及びＢ７−２の示唆レベルは、細胞のＢ２２０＋画分で表れ、フローサイトメトリーによりチトクロムＣ染色細胞上でゲート開閉することによって確認される。結果は、ＭＹＣの急激な過剰発現後に活性化Ｂ細胞が出現することを示唆している。
【０１１３】
図３（下部パネル）は、活性化Ｂ細胞の蓄積に、ＭＹＣの連続的な過剰発現が必要であることを示す。グラフの各データポイントは、個々のマウスのリンパ節で検出された活性化Ｂ細胞の数を表す。４匹のマウスのコホートを、各時間のポイントに用いた。この図は、誘導されたＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−Ｍ７Ｃ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬマウスでの活性化Ｂ細胞の蓄積の惹起及び維持におけるＭＹＣの必要性を示す。
【０１１４】
野生型マウス（１）、ＢＣＲＨＥＬマウス（２）、ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬマウス（３）、顕性腫瘍の発生前のＥμ−ＭＹＣ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬマウス（４）、ずっとドキシサイクリンにて維持しておいたＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−Ｍ７Ｃ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬマウス（５）、及び血清採取前２８日にドキシサイクリンから離脱しておいたＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−Ｍ７Ｃ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬマウス（６）から血清を得て、ＨＥＬ（Ａ）、又は総血清免疫グロブリン（Ｂ）に対するＥＬＩＳＡによって三重でアッセイした。図４（上部パネル）に表す結果は、ＭＹＣの過剰発現後の血清中の自己抗体の蓄積を示す。
【０１１５】
ＭＹＣの過剰発現後の腎臓における自己抗体及び免疫複合体の蓄積を調べるために、野生型マウス（Ａ）又はＥμ−ＭＹＣ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬマウス（Ｂ）から組織学的検討用の腎臓を得た。組織を切片としてヘマトキシリン及びエオシンで染色し、顕微鏡画像を得た。倍率は１００倍であった。免疫蛍光のために、野生型マウス（Ｃ）又はＥμ−ＭＹＣ／ＢＣＲＨＥＬ／ｓＨＥＬマウス（Ｄ）から腎臓を得た。凍結組織を切片化し、ＩｇＭに対するローダミン接合抗体で染色した。倍率は５倍であった。図４（下部パネル）に表す結果は、ＭＹＣの過剰発現後の腎臓における自己抗体及び免疫複合体の蓄積を示す。
【０１１６】
そうでなければ遺伝子導入自己抗原に対して免疫寛容のマウスが、Ｂ細胞系統中でＭＹＣが単独で発現されれると、抗原に対する免疫応答を開始することを観察している。応答性Ｂ細胞は、活性化表現型に変換し、腎臓の免疫複合体病を引き起こす自己抗体を生産した。寛容の断絶の確立及び維持の双方に、ＭＹＣは必要であった。これらのマウスは、リンパ腫も発生し、それはＢＣＲ及びＭＹＣに由来するシグナル間の協働の結果である可能性が最も高かった。これらの効果は、ＭＹＣがサイトカインの代替として働く能力に起因するかもしれない。ＭＹＣがＢ細胞増殖及び生存の双方に対するサイトカインの効果を模倣でき、実際にそれらの効果が必要とされることを見出した。我々のデータは、ＭＹＣ過剰発現が、免疫学的寛容の断絶の確立及び維持に必要であることを示唆している。抗原依存的にＭＹＣを過剰発現する自己反応性Ｂ細胞を不死化する能力によって、寛容Ｂ細胞の短い寿命によって限定されることは最早なく、また反応不顕性Ｂ細胞が骨髄腫細胞系と生産的に融合する周期に入ることを最早必要としないことから、ハイブリドーマ細胞系の生成のための従来からのアプローチよりもさらに多くの特異性の安定化が可能になる。
【０１１７】
（実施例４）
以下の実施例は、Ｂ細胞特異的な、Ｄｏｘで調節されるＭＹＣを過剰発現しているマウスを使用した、自己反応性バックグラウンドからのＢ細胞系の生成を実証している
【０１１８】
前記の結果は、ＭＹＣの過多が、可溶性自己抗原に対するＢ細胞寛容を破壊できることを示している。それらの研究では、ＭＹＣを過剰発現している、ＢＣＲＨＥＬ遺伝子導入Ｂ細胞は、ＨＥＬに対する活発な応答を惹起し、悪性化が始まる前にポリクローナル自己免疫性リンパ球増殖性疾患を発症させることができた（図３及び４）。自己反応性Ｂ細胞におけるＭＹＣの過剰発現は、ＭＹＣの増殖及び生存シグナルを提供する能力によって、Ｂ細胞をＴ細胞の援助に対して非依存性とすることができることが、我々の研究により示唆された。ＭＹＣを過剰発現している、自己反応性Ｂ細胞の増殖した集団は、その同族抗原への連続曝露と、ＭＹＣの過剰発現との双方に伴い、依存性のままのＢ細胞リンパ腫を生成し始めた。腫瘍担持マウスからのリンパ節、脾臓及び骨髄よりＢ細胞を収集でき、そしてＢＣＲＨＥＬ導入遺伝子を発現し、且つ抗ＨＥＬ  ＩｇＭを分泌する多くの細胞系を、初代細胞の骨髄腫融合パートナーへの融合を行うことなく樹立できた。
【０１１９】
２つのさらなる環境を使用して、同様の結果を得ることができている。一例では、Ａｒｓ／ＡｌマウスをΕμ−ＭＹＣ株に交雑した。それらのマウス（ｎ＝９マウス）は、平均して第３６日齢でバーキット様リンパ腫を発生した。腫瘍は、成熟した活性化Ｂ細胞で構成されていた。それらの細胞は、表面にＩｇＭを発現していた。それらの結果は、ＭＹＣ過剰発現が、低親和性の抗ＤＮＡ抗体という面において、自己反応性Ｂ細胞に対する寛容を破壊する能力を示している。第２例では、ＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスを用いた。それらのマウスは、食餌からのドキシサイクリンの排除後に、Ｂ細胞特異的で一時的に調節されたＭＹＣの過剰発現を可能とする。ドキシサイクリン含有食餌を４月齢でマウスから離すと、活性化された末梢Ｂ細胞、抗核抗体を血清に、免疫複合体沈着物を腎臓に蓄積し、また６週以内にＢ細胞リンパ腫を発生した（平均的な例は、４２日）。骨髄腫パートナー細胞への融合を行わずに、腫瘍から細胞系を樹立できている。これらの結果は、自己反応性Ｂ細胞レセプターを発現するＢ細胞系を生成する、新規アプローチとしての本システムの使用を示唆している。
【０１２０】
（実施例５）
以下の実施例は、ＭＹＣを過剰発現しているマウスで生産される抗体が、インビボで機能することを実証する。
【０１２１】
ＭＭＴＶ−ｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスにて生成したＨＥＬ特異抗体がインビボで機能しうるかどうかを調べるために、致死的なウイルス感染のモデルを使用することにした。ブタ狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）は、静脈内投与後にマウスで致死的となることがこれまでに示されている、アルファ−ヘルペスウイルスのメンバーである。ＰＲＶの変異体を２種構築した。一例では、ＵＳ−９と称される遺伝子に対する配列の１つをＧＦＰに融合させた。この構築体により、異なる設定にてウイルスで感染した細胞、及びウイルスの追跡が可能になる。重要なこととして、ＵＳ−９蛋白質は、なお生産されており、その機能を保持している。ウイルスはその付加的な遺伝的カーゴにもかかわらず完全に病原性がある。ＨＥＬに対する読み取り枠をコード化するＰＲＶの変異体も生成した。感染細胞のウエスタンブロット分析によって、本ウイルス変異体がＨＥＬを発現することが示された（データは示さず）。
【０１２２】
ＧＦＰを発現しているウイルス又はＨＥＬを発現しているウイルス接種液（１０９ＰＦＵの力価を有するウイルス上清２００μｌ）を、１：５００に希釈したＨＥＬ特異抗体と氷上で１時間インキュベートした。混合液は次いで、４匹のマウスのコホートに静脈注射した。その後マウスは、ウイルス及び抗体混合液の投与後４日間モニターし、ＰＲＶ感染に関わる重篤な神経学的臨床徴候を呈したら安楽死させた。図５に示す通り、ＧＦＰを発現しているウイルス（実線）は、ＨＥＬ特異抗体の存在による影響を受けなかった。そのコホートでの死亡の動態は、野生型ＰＲＶ株を用いて以前に発明者が得たものに類似していた。これに対し、ＨＥＬを発現しているウイルス（破線）を与えたマウスでの死亡の動態は、有意に遅延し、そのマウスのコホートは、ＧＦＰを発現しているウイルスを注射したマウスのほぼ２倍も生き延びた。これらの実験に使用したウイルスは、ＵＳ−９融合蛋白質を一過性に発現するのみであった。細胞への侵入後、それらは野生型ＰＲＶを生産した。死亡の遅延は、抗体がウイルス感染を阻害する能力を示唆している。
【０１２３】
（実施例６）
以下の実施例は、表現型としてＨ５Ｎ１を用いて、感染作用物質に対する新規抗体の発生を実証する。
【０１２４】
新自己抗原としてシステムに導入することによりＭＭＴＶ−ｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスが目的の抗原に対する新規抗体を生成する能力を試験するために、レトロウイルスの骨髄キメラマウスの生成に依存するアプローチを用いた。ｐＭＩＳＣＶ−Ｈ５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ｐＭＩＧ−Ｈ５）を生成するために、Ａ／Ｔｙ／Ｏｎｔ／７７３２／６６（Ｈ５Ｎ９）単離物からのヘマグルチニン（ＨＡ）のコーディング領域（ｃＤＮＡのＯＲＦをコード化している部分−クローンに非翻訳部分が存在していた）を、ｐＭＩＧにサブクローニングした。５−ＦＵで処置したＴＲＥ−ＭＹＣマウスからの骨髄を、ｐＭＩＧ−Ｈ５及びｐＭＩＧ−ｔＴＡで形質導入した。ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析により定量すると、およそ６０％の細胞が形質導入されていた。３日後に、致死的に照射された（８００／４００Ｒ）マウス（Ｂｌ／６レシピエント）のコホートに細胞を移植した。骨髄キメラマウスをＳＥＰＴＲＡ上に維持し、血液学的悪性疾患の外見的に顕著な臨床徴候を毎日観察した。再構成後６週で、数匹のマウスが、弯曲姿勢、毛皮汚損、外的に触知可能な腫瘍（脾腫大及びリンパ節腫脹）及び呼吸促迫を含む腫瘍発生の臨床徴候を示し始めた。再構成後７〜８週の間で、１００％のマウスが腫瘍発生の徴候を呈した。マウスを屠殺し、ＧＦＰ発現の証左のための蛍光顕微鏡によって分析した。屠殺されたマウスの１００％に脾腫大、並びにリンパ節、骨髄及び脾臓にＧＦＰ発現があった。
【０１２５】
リンパ節及び脾臓を採取して、２４穴プレートに蒔く単一細胞懸濁液を生成するのに使用した。残存細胞を培養して細胞系を生成させ始めるか、又はその後の分析用に凍結保存した。細胞をＢ細胞マーカーＢ２２０及びＩｇＭに対して特異的な抗体を用いて染色し、その発現につきフローサイトメトリーによって分析した。図６は、ＧＦＰ陽性細胞は、Ｂ細胞マーカーＢ２２０及びＩｇＭの双方を発現することを示している。腫瘍は、成熟した活性化Ｂ細胞で構成される、ＭＹＣ誘発性の抗原依存性腫瘍を生じる、成熟した活性化（ブラスティング）Ｂ細胞（バーキットリンパ腫のマウスモデルで観察されたものと同様）で構成されていた。これらの細胞を培養系に入れて、クローン増殖させた集団を、最初の接種後８日に開始して継代した。これは、モノクローナル抗体生産への現今のアプローチで通常成し遂げられるものより有意に速いタイムラインである。さらに、この新規アプローチで血球凝集素に対する新規抗体を生成できるようになる加速された時間フレームが、このアプローチを、新しく新生の感染症及び他の生物学的脅威に対する新規の中和抗体の発生のための迅速な応答プラットフォームとするはずである。骨髄細胞は、さらに特異性を導き、又は追加の抗原を加えるべく、今後マウスの大きなコホートを再構成するためにも凍結できる。マウスからその器官を収集した時間に血清を採取して、−２０℃で保管した。腫瘍がＨ５  ＨＡ蛋白質に対する抗体を生成しているかどうかを確かめるために、血清を１：５０００の希釈にてウエスタンブロット分析で使用した。ｐＭＩＧ−ＨＡをトランスフェクトした２９３細胞由来の蛋白質溶解液（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００系溶解バッファー）、Ａ／Ｔｙ／Ｏｎｔ／７７３２／６６単離物由来の、ＨＡを発現しているプラスミド、又は陽性コントロールプラスミドｐＣＤＮＡ３−Ｈ５を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ゲル）によって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写して、その膜を希釈血清でプローブ探査し、その後ＨＲＰを接合した二次抗体とインキュベーションした。図７は、腫瘍担持マウス由来の血清は、ｐＭＩＧ−ＨＡ（中央のレーン）又は陽性コントロールプラスミドｐＣＤＮＡ３−Ｈ５（右のレーン）のいずれかを発現している２９３細胞由来のＨＡと反応するが、トランスフェクトしていない２９３細胞由来の溶解液又はｐＭＩＧベクターのみをトランスフェクトした細胞由来の溶解液（左のレーン）とは反応しなかったことを示している。
【０１２６】
ＨＡ蛋白質は、およそ３８〜４０ｋＤのバンドとして現れる。低分子量のバンド（１９Ｋｄ）は、非特異的であるらしく、良好なローディングコントロールとして働く。展開されたバンド形成パターンは、Ｈ５、及び細胞におけるその正常な成熟及び処理の間に発生する切断産物と一致している。成熟ＨＡは、２つのサブユニット（ＨＡ１及びＨＡ２）で構成される。ＨＡ１サブユニット（〜４０ｋＤａ）は、分子の球状頭部を形成し、表面糖蛋白質及び糖脂質上の宿主細胞シアル酸レセプターへの結合を担う。ＨＡ２サブユニット（〜２０ｋＤａ）サブユニットは、侵入の間、宿主細胞のエンドソーム膜とのウイルスエンベロープの融合を担う。プロテアーゼ切断部位は、これらの２つのサブユニットを分かち、宿主プロテアーゼによる切断が、宿主細胞への侵入に必要である。ウイルスを中和するエピトープの大部分がＨＡ１サブユニットに認められ、ウイルス−レセプター相互作用を阻害する。
【０１２７】
血清がウイルス−レセプター相互作用を遮断する能力を試験するために、Ｈ５Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、及びＨ６Ｎ８サブタイプを含む多様なインフルエンザＡ単離物を用いた血球凝集阻害及びウイルス中和アッセイを使用した（図８）。３匹のマウス（１〜３）から、Ｈ５／ｔＴＡ  ＢＭ形質導入後６〜８週に単離した血清、又はリン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｃ１）を、マイクロタイタープレートの二重のウェルに沿って連続希釈した。連続希釈後に、インフルエンザＡウイルスＡ／Ｍａｌ／ＷＩ／９４４／８２（Ｈ５Ｎ２）、Ａ／ＮＹ／１４６９／０２（Ｈ１Ｎ１）、又はＰＢＳ（ウイルスなし）の４種の凝集単位を各ウェルに添加して、３０分間インキュベートした。次に、シチメンチョウ赤血球細胞を添加して３０分間インキュベートし、血球凝集活性を検出した。第１カラムは、１：２０の最終血清濃度を含有する。
【０１２８】
これらのデータは、Ｈ５Ｎ１に対して生成した新規抗体は、異なるクレード（Ｈ１Ｎ１）からのウイルスも中和できたことを示している。これは、ＭＹＣの過剰発現を用いる新しいアプローチが、ウイルスによりコード化されるエピトープで、自己蛋白質をおそらく模倣し、寛容機構がそれらの残基に対する良好な応答を妨げるために通常は無視されるものを明らかにできることを示唆している。これにより、特定のタイプ（インフルエンザ、又は他のタイプ）の異なるウイルス間の共通の残基を同定して、治療用に開発することができるようになるかもしれない。
【０１２９】
リンパ節及び脾臓細胞由来の細胞系を作製でき、その上清をＨＡとの反応性について試験して、ＨＡ蛋白質に対する抗体を生産する細胞系を生成できることを立証することができる。これらの上清及び／又は血清は、Ｈ５を含むインフルエンザウイルスを中和する能力についても試験できる。中和アッセイには、ある抗体が、インフルエンザ（フル）ウイルス及びヒツジ赤血球細胞を用いる凝集アッセイや、上皮性細胞のインビトロ、又はマウスのインビボの有効な感染を阻害できるかどうかの判定を含みうる。本発明のさらなる開示及び実施形態を、添付の原稿に見出すことができ、これを本願に引用してその全体を援用する。
【０１３０】
本発明の様々な実施形態を本明細書に詳細に記載しているが、それらの実施形態の改変及び適応が当業者に想起されるであろうことは明らかである。しかし、このような改変及び適応は添付の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲に含まれることは特に理解されるべきである。
【図１】
2010521170.tif 000002
【図２】
2010521170.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2010521170.tif 000009
【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年11月16日(2009.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＭＹＣを誘導性に過剰発現する動物に抗原を接種し、
ｂ）ＭＹＣの過剰発現またはＭＹＣの過活性を誘導性にし、
ｃ）前記動物からＢ細胞を回収し、及び
ｄ）ＭＹＣが過剰発現され、抗原に晒される条件下で前記Ｂ細胞を培養し、
ｅ）前記Ｂ細胞の培養から抗体を回収する工程を含む、
抗体を生産するための方法。
【請求項２】
ＭＹＣの過剰発現またはＭＹＣの活性は抗体の生成が望まれるまで抑止される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗原は自己抗原である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記抗原は、アデノウイルス、アレナウイスルス、ブニアウイスル、コロナウイスル、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイスル、エプスタインバーウイルス、フラビウイルス、ヘパドナウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ミクソウイルス、発癌ウイルス、オルソミクソウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、パラインフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、風疹ウイルス、トガウイルス、水痘ウイルス、Ｔ−リンパ増殖性ウイルス、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、百日咳（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、またはこれらの組合せから由来する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記動物は前記抗原をコード化している核酸配列を含んでおり、この抗原をコード化している前記核酸配列が発現される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記動物はＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＭＹＣの過剰発現を可能にする工程は、ドキシサイクリン源またはテトラサイクリン源から前記マウスを隔離することを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記Ｂ細胞は脾臓またはリンパ節から回収される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ａ）ＭＹＣを誘導性に過剰発現する幹細胞であって動物内に抗原をコード化している核酸分子を含む肝細胞を移動し、
ｂ）ＭＹＣの過剰発現またはＭＹＣの過活性を誘導にし、
ｃ）前記動物からＢ細胞を回収し、及び
ｄ）ＭＹＣが過剰発現され、誘導性に活性化され、抗原に晒される条件下で前記Ｂ細胞を培養し、
ｅ）前記Ｂ細胞の培養から前記抗体を回収する工程を含む、
抗体を生産するための方法。
【請求項１０】
前記抗原をコード化している前記核酸配列は前記動物内で発現される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＭＹＣの過剰発現は、抗原の生産が望まれるまで抑止される、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原は自己抗原である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原は、アデノウイルス、アレナウイスルス、ブニアウイスル、コロナウイスル、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイスル、エプスタインバーウイルス、フラビウイルス、ヘパドナウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ミクソウイルス、発癌ウイルス、オルソミクソウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、パラインフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、風疹ウイルス、トガウイルス、水痘ウイルス、Ｔ−リンパ増殖性ウイルス、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エスケリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、またはこれらの組合せから由来する、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞はヒト幹細胞またはマウス幹細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞は骨髄、臍帯血、またはこれらの組合せから由来する、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
前記動物はＭＭＴＶ−ｒｔＴＡ／ＴＲＥ−ＭＹＣマウスである、請求項９記載の方法。
【請求項１７】
ＭＹＣの過剰発現を可能にする工程は、ドキシサイクリン源またはテトラサイクリン源から前記マウスを隔離することを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記動物は致死的に放射線を照射されたかまたは亜致死的に放射線を照射された、請求項９記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｂ細胞は脾臓またはリンパ節から回収される、請求項９記載の方法。
【国際調査報告】
2010521170.tif 000011
2010521170.tif 000012