(57)【要約】  画像空間を有する高密度且つ高解像度マイクロアレイスキャン画像において、角にプローブがない場合でも、マイクロアレイチップの角及びプローブを自動的に識別する方法であり、この方法は、（ａ）入力マイクロアレイ画像にラドン変換を適用し、直線の方向を見つけることが可能である角度及び距離空間に画像を投影するステップと、（ｂ）投影画像の最適傾斜角度を見つけるように（ａ）で投影された画像に高速フーリエ変換を適用するステップと、（ｃ）最適傾斜角度の最適な最初及び最後の極大を決定するステップと、（ｄ）画像の最初及び最後の列の第１近似を見つけるため、決定された最初及び最後の極大を画像空間に逆投影するステップと、（ｅ）画像の上部及び下部の行の第１近似を見つけるため、画像を回転させ、ステップ（ａ）乃至（ｄ）を繰り返すステップと、（ｆ）行及び列の線の交差から画像の四隅の第１近似を決定するステップと、（ｇ）ステップ（ｆ）の第１近似が十分であるかどうかを決定するように発見的手法を適用するステップと、（ｈ）オプションとして四隅の第１近似の周りのスキャンされた画像をトリミングし、ステップ（ａ）乃至（ｆ）を繰り返すステップとを含むマルチパス角発見アルゴリズムを画像に適用することにより、スキャンプロセスにおいて生じる画像のエラー歪曲を最小化する。
2010511244.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
画像空間を有する高密度且つ高解像度のマイクロアレイスキャン画像のマイクロアレイチップ角及びプローブを自動的に識別する方法であって、
（ａ）入力マイクロアレイ画像にラドン変換を適用し、直線の方向を見つけることが可能である角度及び距離空間に前記画像を投影するステップと、
（ｂ）（ａ）で投影された画像に高速フーリエ変換を適用し、前記投影画像の最適傾斜角度を見つけるように発見的手法を適用するステップと、
（ｃ）前記最適傾斜角度の最適な最初及び最後の極大を決定するように発見的手法を適用するステップと、
（ｄ）前記画像の最初及び最後の列の第１近似を見つけるため、前記決定された最初及び最後の極大を画像空間に逆投影するステップと、
（ｅ）前記画像の上部及び下部の行の第１近似を見つけるため、前記画像を回転させ、ステップ（ａ）乃至（ｄ）を繰り返すステップと、
（ｆ）前記行及び列の線の交差から前記画像の四隅の第１近似を決定するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の前記第１近似が十分であるかどうかを決定するように発見的手法を適用するステップと、
（ｈ）オプションとして前記四隅の前記第１近似の周りの前記スキャンされた画像をトリミングし、ステップ（ａ）乃至（ｆ）を繰り返すステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記マイクロアレイスキャン画像が、表示オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析、遺伝子発現アレイ、単一ヌクレオチド多型アレイ、ＣｇＰアイランド配列、プロモータマイクロアレイ、及びタンパク質ＤＮＡ相互作用アレイからなるグループから選択される要素から生じる画像である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記画像のエラー歪曲がキーストーニング効果を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記画像のエラー歪曲が直線ではなく、正弦波又はカーブのプローブ位置線を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記スキャン画像の解像度が、１、２又は５マイクロメートルである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記スキャン画像が、Ｃｙ３及びＣｙ５フルオロフォアを使用してスキャンされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記スキャン画像が、約８５，０００本のプローブ乃至約４００，０００本のプローブを含むチップから生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１又はそれより多くのプローブの位置を推定するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
サブサンプリング又は切り取られた態様で、前記画像を処理するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記画像データを生体活動の度合に変換するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、画像データが生体活動の度合に変換され得るように、マイクロアレイ画像上のプローブ点の位置を自動的に決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、最近急速に発達している。現在では、これは、グローバルな遺伝子発現プログラム、マイクロアレイを使用した遺伝子機能の推定、遺伝子コピー数の多型性の測定、及びゲノム全体のＤＮＡタンパク質相互作用の系統的研究において広く使用される。マイクロアレイ画像からのデータの抽出には、多くの固有の課題がある。不均一なハイブリッド化は、結果として一様でないプローブ強度及び形状となる。チップをスキャナに設置しても固定されず、これは、チップの角がどこにでもなり得ることを意味する。スキャナは、しばしば結果として生じる画像を歪め、こうすることは、これらの画像を必要とされるデータに変換することに対する問題を生じさせる。基準は、多くの異なる設計パターンが共存するような多くの異なる組合せで配置され得る。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイは、一本鎖のＤＮＡ分子が化学的に結合される固体の表面から成る。マイクロアレイは、生物学的プロセスによって遺伝子の活動を関連付け、遺伝子を相互に接続された活動のネットワークにグループ化するため、遺伝子発現を調査するために広く使用される。これらが並列且つ半自動化された態様で何千もの遺伝子の発現を測定することを可能にするので、非常に有利である。機能的なゲノミクスにおいて、少し例を挙げるだけでも、遺伝子発現配列、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）配列、遺伝子プロモータ配列、比較ゲノムハイブリッド化配列、ＣｐＧアイランド配列を含む異なるタイプのマイクロアレイが存在する。これらのタイプの配列の全てに対して、スキャンされた画像は、マイクロアレイデータを回復するために処理されることを必要とする。
【０００４】
表示オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析（ＲＯＭＡ）は、比較ゲノムハイブリッド化法［６］の例として、コールドスプリングハーバー研究所（ＣＳＨＬ）で開発された。この技術は、ヒトゲノムのコピー数多型（ＣＮＰ）を検査することで利用可能な解像度における重要な前進である。小さい（６つの塩基対）認識部位を有する酵素を有するゲノムを消化することによって、ゲノム全体に多少一様に分散される多数の断片が、生成されるであろう。各断片内において、ユニークなプローブは、マイクロアレイ上の１つの点で識別及び堆積される。８５，０００本のプローブを有するチップが現在使用され、約４００，０００本のプローブを有するチップは、テストされている。サンプル組織細胞から抽出されるＤＮＡは、チップでラベリングされ、ハイブリッド化される。強度のバリエーションは、サンプルの断片のコピー数に比例する。この方法論を用いて、正常なヒトゲノムの間だけでなく、癌と正常なゲノムの間のバリエーションを識別することが可能である。
【０００５】
しかしながら、これらの高密度チップは、チップ読取部を利用可能にする課題を提示する。ステッパモータ及びレーザスキャナを用いて、励起状態のハイブリッド化プローブは、画像（すなわちピクセルアレイ）に変換される。モータは一度にスキャナを数μｍ移動させ、読み出される新たな行が得られる。このようにマイクロアレイチップは、モータがとるステップのサイズに応じて、１、２又は５μｍの様々な解像度でデジタル化される。画像内のプローブのアレイは、スキャナの機械的及び光学的動作によって、未知の量だけ並進及び回転する。更に、キーストーニング効果（すなわち、アレイが長方形ではなく台形になる）及び／又はプローブ位置における小さな正弦摂動（すなわち、プローブが直線ではなく実際に正弦波曲線上に整列される）があり得る。高密度のマイクロアレイで高いスループット調査のために必要とされることは、プローブ位置を自動的に（すなわち人間の介入なしで）識別するソフトウェアであり、この強度は、プローブ強度に変換されるべきである。
【０００６】
現在チップ上のプローブパターンが、調べられるが、最高密度は、チェッカーボードパターンで達成される。すなわち、チップ領域の半分は、現在の画像処理ソフトウェアが適切にプローブを分解することができないので、無駄にされなければならない。改良されたソフトウェアが生成され得る場合、ＲＯＭＡチップ上の情報密度を２倍にすることが達成され得る。
【０００７】
文字通り、自動化されたマイクロアレイ画像分析を実行しようと試みる他のアルゴリズムがある。Brandleらによる研究［参照１］並びにUehara及びKakadaiarisによる研究［参照６］のどちらも、画像を所望の数値に変換するために必要とされる関数全体のスペクトルに対する手法を提示し、どちらもラドン変換（下記を参照）の使用を主張するが、我々が知る限り、マイクロアレイ画像のキーストーニング問題を補正する手法は、まだ提案されていない。ソフトウェアツールＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｉｍａｇｅｎｅ  ７．０は、複数のアレイに対してバッチモード処理においてさえ、自動化された点の発見及びグリッド配置を主張するが、アルゴリズムは、現在のところ公開されていない（http://www.biodiscovery.com/index/imagene-cgh）。Ｋｈｏｊａｓｔｅｈらによる研究［参照２］は、マルチスケールエッジ検出アルゴリズム［２］を通じてアレイのＣＧＨデータから自動的にＤＮＡコピー数の増減した領域を識別するアルゴリズムを提案する。
【０００８】
このような問題は、マイクロアレイスキャンされた画像から角及びプローブを自動的に識別する、ここで開示された方法によって解決される。テスト画像は、ＲＯＭＡマイクロアレイ技術によるものであるが、上記方法は、他のタイプのマイクロアレイ画像で機能するのに十分に一般的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明によれば、画像空間を有する高密度及び高解像度マイクロアレイスキャン画像のマイクロアレイチップ角及びプローブを自動的に識別する方法が開示され、ここで、方法は、マルチパス角発見アルゴリズムを画像に適用することにより、スキャンプロセスにおいて生じる画像のエラー歪曲を最小化する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
具体的には、本発明の目的は、画像空間を有する高密度及び高解像度マイクロアレイスキャン画像において、自身の角にプローブがない場合でさえ、マイクロアレイチップ角及びプローブを自動的に識別する方法を提供することであり、ここで上記方法は、マルチパス角発見アルゴリズムを画像に適用することにより、スキャンプロセスにおいて生じる画像のエラー歪曲を最小化し、前記アルゴリズムは、
（ａ）ラドン変換を入力マイクロアレイ画像に適用し、直線の方向を見つけることを可能にする角度及び距離空間に画像を投影するステップと、
（ｂ）投影された画像の最適傾斜角度を見つけるため、高速フーリエ変換を（ａ）の投影された画像に適用するステップと、
（ｃ）最適傾斜角度に対する最適な極大の最初及び最後を決定するステップと、
（ｄ）画像の最初及び最後の列の第１近似を見つけるため、決定された極大の最初及び最後を画像空間に逆投影するステップと、
（ｅ）画像の上部及び下部の行の第１近似を見つけるため、画像を回転させ、（ａ）乃至（ｄ）のステップを繰り返すステップと、
（ｆ）列及び行の交差から画像の四隅の第１近似を決定するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の第１近似が充分かどうかの決定に発見的手法（heuristic）を適用するステップと、
（ｈ）オプションとして四隅の第1近似周辺をトリミングし、ステップ（ａ）乃至（ｆ）を繰り返すステップと
を含む。
【００１１】
他の目的は、マイクロアレイスキャン画像が、表示オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析、遺伝子発現配列、単一ヌクレオチド多型配列、ＣｇＰアイランド配列、プロモータマイクロアレイ、及びタンパク質ＤＮＡ相互作用配列からなるグループから選択された要素の結果として生じる画像である方法を提供することである。
【００１２】
他の目的は、画像のエラー歪曲がキーストーニング効果を含む方法を提供することである。
【００１３】
他の目的は、画像のエラー歪曲が直線の位置線ではなく、正弦波又はカーブするプローブ位置線を含む方法を提供することである。
【００１４】
他の目的は、スキャン画像の解像度が１、２又は５μｍである方法を提供することである。
【００１５】
他の目的は、スキャン画像がＣｙ３及びＣｙ５フルオロフォアを使用してスキャンされる方法を提供することである。
【００１６】
他の目的は、スキャン画像が約８５，０００乃至約４００，０００本のプローブを含むチップからの結果として生じたものである方法を提供することである。
【００１７】
他の目的は、１又はそれより多くのプローブの位置を推定するステップを更に含む、請求項１に記載の方法を更に含む方法を提供することである。
【００１８】
他の目的は、サブサンプリング、又は切り取られる態様で画像を処理するステップを更に含む、請求項１に記載の方法を更に含む方法を提供することである。
【００１９】
他の目的は、画像データを生体活動の度合に変換するステップを更に含む請求項１に記載の方法を更に含む方法を提供することである。
【００２０】
本発明のこれら及び他の態様は、以下の実施例及び図面を参照して更に詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、２μｍの解像度でスキャンされる８５０００本のプローブを有するＲＯＭＡ画像である（画像サイズは、１５０ＭＢである）。
【図２】図２は、プログラムの画像軸系である。
【図３】図３は、Ｆｉｎｄ＿ｃｏｒｎｅｒｓ（画像）アルゴリズムに対する疑似的なコードである。
【図４】図４は、画像空間投影に対するラドン空間である。
【図５】図５は、最適な角度に対するサンプルのラドン変換である。
【図６】図６は、画像投影のサンプルＦＦＴである。
【図７】図７は、基準を有する画像に対するラドン変換の実施例である。
【図８】図８は、図７からの投影のズームインである。
【図９】図９は、ＲＯＭＡ画像の推定された線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ここにおける開示は、画像を数字に復号することを支援するマイクロアレイ画像の角の発見、及び内部プローブのグリッド化又は発見をする自動化された方法を提示する。我々は、マイクロアレイの角及びプローブの正確な位置を見つけるため、ラドン変換、高速フーリエ変換、及びいくつかの発見的手法のような画像処理方法を使用した。我々の技術に基づいて、角自体にプローブのないレイアウトに対してさえ、２、３ピクセル以内に角を識別することが可能である。
【００２３】
高密度マイクロアレイ画像（我々の場合ではＲＯＭＡ画像において）の一例は、図１に示される。様々なプローブ設計配置方法が存在する。これまで検査されたプローブは、間に２μｍの通路（alley）を有する一辺１６μｍの正方形である。画像は、５μｍ、２μｍ又は１μｍでスキャンされ得るか、又はマイクロメートルよりも更に小さい解像度で、プローブ当たり３，８，９ピクセル、及び通路当たり０、１、２ピクセルの画像を得ることが考慮される。
【００２４】
ここで開示される方法論によると、発見的手法は、高密度チップ（すなわち、８５，０００乃至４００，０００本のプローブ）に対して１）水平及び垂直方向に画像をサブサンプリングする（例えば２ピクセル毎、又は４ピクセル毎に取る）ことにより使用され得る。また、第１近似で開始するために妥当な画像サイズを生成するため、画像の左上４分の１の部分、画像の右上４分の１の部分、画像の左下の部分、及び画像の右下の部分をとり得る。これは、プリントパターン及び基準のマークにも基づき得る。
【００２５】
更にチップは、（非常に明るいプローブとして見える）様々な基準のマークパターンでプリントされる。全ての画像は、２色周波数（通常Ｃｙ３及びＣｙ５フルオロフォア）でスキャンされる。角発見アルゴリズムの最善の画像処理結果は、全体の強度画像（すなわち２色周波数の合計）を分析することから予測される。自動マイクロアレイ画像復号化は、角の点を見つけ、グリッドか、及びマイクロアレイデータへの復号化を実行するために必要とされる。このプロセスにおいて、知的な画像処理アルゴリズムは、化学反応（すなわち正規化）及びスキャンプロセスにより生成されるアーチファクトを修正するために必要とされる。
【００２６】
開発され、以下に記載されるソフトウェアの目的は、自動的にプローブアレイの４つの角をピクセル座標に位置させることであった。この情報を用いて、正弦波摂動がないことを仮定して、プローブ重心を位置させるために双一次変換が使用され得る。高密度アレイに対するＲＯＭＡ技術は、新たな手法であり、現在これらの画像を処理するのに十分な方法は、存在しない。
【００２７】
マイクロアレイ画像において角の点を見つけることは、画像におけるプローブの位置を見つけるためのグリッド化、及びマイクロアレイデータへの復号化を実行するために必要とされる第１ステップである。画像化プロセスは、アーチファクトを導く及び画像を歪曲する。スキャンプロセスにより生成されるアーチファクトを検出し、補償することは、重要である。我々は、高解像度及び高密度マイクロアレイ画像の角の点を検出するためのマルチパスアルゴリズムを設計した。アルゴリズムは、外部及び内部のループから成る。外部ループは、キーストーニングがなければ（すなわちプローブアレイが依然として長方形であれば）正確である角の発見において、初回通過をする。適合度の基準が計算され、満足である場合、アルゴリズムは、この結果を報告し、停止するであろう。この試験が失敗する場合、キーストーニングを修正することを試みる内部のループが実行される。再び、適合度の基準が計算され、受け入れられる場合、結果が報告され、そうでなければ、アルゴリズムは失敗を報告し、停止する。結果は、図２に示されるピクセルのプローブアレイの角のｘ及びｙ座標から成る。
【００２８】
アルゴリズムは、ラドン変換［５］を利用する。異なる角度から果樹園を見ることに類似することとして、ラドン変換を考えるかもしれない。正しい角度で見る場合、全ての木々及び行の間の通路が明らかに見えるであろう。画像のピクセルがこの角度で合計される場合、強度の明確且つ規則的な振動が結果として生じるであろう（図７及び８を参照）。ラドン変換のフーリエ変換〔４〕が計算され、発見的基準は、最適角度を識別するために使用される。
【００２９】
この発見的手法は、水平及び垂直方向の回転で最適な角度を得るように適用される。最適回転角度を選択すると、プローブアレイのエッジは、この角度に対するラドン変換の極大の最初及び最後を選択することによって識別される。この動作は、画像全体に対して最初に実行される。それから、適合度の基準が、画像はキーストーンされることを示す場合、全体のプロセスは、非平行なエッジのみを検査するために切り取られるサブ画像で水平及び／又は垂直方向において繰り返される。アルゴリズムの疑似的なコードは、図３に示される。
【００３０】
画像の右端及び左端に沿って線を発見するアルゴリズム（ｆｉｎｄＬｉｎｅｓ）は、以下の通りである。
【００３１】
我々は、入力マイクロアレイ画像にラドン変換を適用する。ラドン変換は、画像を極座標空間、すなわち角度及び距離空間（θ及びρ）に投影し、ここで直線の方向を見つけることが可能になる。
2010511244.tif 000003
ここで、ｇ（ｘ，ｙ）は、デカルト座標における強度の配列としての元の画像であり、ｇ（ρ，θ）が、ラドン変換された画像であり、θは、回転角度であり、ρが、軸系の原点から最も短い距離であり、δ（）は、ディラックのデルタ関数である。
【００３２】
計算の労力を最小化するため、アルゴリズムは、０．１度のステップで‐１から＋１までθを変化させることにより始める階層的なラドン変換を実行する。１台のスキャナからの画像での我々の経験は、この範囲がこのスキャナに適切であることを示す。より回転可変性を有する他のスキャナは、この範囲を拡張することを必要とし得る。ラドン変換は、θ∈｛−１，−０．９，−０．８，…,１｝であるθ全てに対して漸進的に適用される。図５は、特定のθに対するラドン変換のサンプル投影を示す。
【００３３】
我々は、画像の傾斜角度を見つけるため、θカーブの各々に高速フーリエ変換を適用する。選択された傾斜角度θｋは、単一の周波数において最も高いエネルギーをＦＦＴが含む角度である。図６は、図５の投影のＦＦＴを示す。
【００３４】
我々は、θｋを選び、今回はサイズ０．０１のステップでθｋ‐０．１からθｋ＋０．１までラドン変換を適用し、ステップ３に行く。再び、これらのパラメータ選択は、異なるスキャナ―画像セットに対して変化されなければならないであろう。θの特定の値のラドン変換の各適用に対して、ρ空間における画像の垂直投影を得る。各θ（θ１，…,θ２１）に対して別個のカーブを取得し、これらのカーブから、最もよい回転角になるように高速フーリエ変換の単一の周波数の最も高いエネルギーを有するものが選択される。
【００３５】
我々は、最もよい角度のラドン変換の極大を見出す。以下、図７は、単一の周波数において最も高いエネルギーを有する角度に対するラドン変換を示す。星形は、極大を示す。
【００３６】
我々は、全体における最大の少なくとも２０％である極大の最初及び最後を見つける。図７の最初及び最後の小さな円は、選択された極大の最初及び最後を示す。代替として、平均信号レベルより非常に高いピークを見つける場合、我々はこれを我々の最初／最後の極大と認め、これらの極大の周辺の他のピークを無視する（図７）。これは、通常、プローブ周辺全ての基準マーカを有するデザインに対して生じる。投影及び選択された極大のズームインは、図８に示される。最初及び最後の列は、ある基準を満たす極大の最初及び最後によって推定される。これらは、アレイ画像が実際に始まる前に、雑音を選び取ることを回避するのに必要である。我々は、この処理をするため、最初及び最後の３分の１の画像のみを取扱う。我々は、局所平均勾配が２０％より低い極大のサブセットを選択する。それから、我々は、高さが画像の真ん中の３分の１の平均強度の少なくとも２５％である第１の最大点を見つける。これは、通常、アレイの端を占める。それから基準点が存在する場合、我々は、画像の最初（又は最後）の３分の１における最大値が、最初（又は最後）の３分の１の平均の２倍より大きいかどうかを調べる。このような点を得る場合、我々は、これらを以前に見つけたものの代わりに最初及び最後の有意な最大として指定する。図７の始めと終わりの小円は、選択された最初及び最後の極大を示す。投影及び選択された極大のズームインは、図８に示される。
【００３７】
我々は、画像の最初及び最後の列を通過する線の第１近似を見つけるため、対応する最初及び最後の極大を画像空間に逆投影する。この点において、我々は、逆投影から見つけた角度及び点によって規定される線を有する。これらは、最も左及び最も右の列を通過する線である。以下の式は、ラドン空間のρを画像空間にマッピングする。図４は、実行されることを必要とする推定をグラフィックで表す。
2010511244.tif 000004
【００３８】
ラドン変換の各々は、ラドン変換が可能である最大可能サイズの長さであるラドンサイズを有する。これは、
2010511244.tif 000005
によって与えられる。
【００３９】
全ての他の角度に対するラドン変換は、ラドンサイズのアレイの一部のみをカバーする。これは、
実際のラドンサイズ＝幅＊ｃｏｓ（θ）＋高さ＊ｓｉｎ（θ）
によって与えられる。
【００４０】
ラドン変換における各所望の点に対して、画像空間へのこの逆投影は、
2010511244.tif 000006
によって与えられる。
【００４１】
我々は、画像のこの点を通過する線の方程式を計算することを必要とする。
ｙ＝ｍｘ＋ｃ
【００４２】
傾斜角度は、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を実行した後、単一周波数において最も高い値を有するとして選択されるθによって与えられる。方程式の定数ｃの値を見積もるため、我々は、ラドン変換の逆投影された点に対するｙ＝０の点を有する。従って、
ｃ＝−ｍ＊Ｘｂｐ
である。
【００４３】
我々は、次に上及び下の行を通過する線を見積もるため、画像を回転させるステップ２乃至７を実行する。
【００４４】
角の第１近似を見つけるため、我々は、４本の線（上、下、左、及び右）の交差点を見つける。上記ステップから、我々は、４本の線の方程式を得、４つの角の点を見積もるために４つの方程式を解く。
【００４５】
次に、見積もられた角の適合性を調べる。この目的のために、我々は、ラドン変換を再び使用する。選択されたθ（θｉ）のラドン変換のＦＦＴに対して、全体の最大エネルギー周波数自身の周囲のエネルギーの総和と比較した全体の最大値の比率（ｒｉ）を算出する。これは、
［ｍａｘＥｎｅｒｇｙ  ｉ］＝ｍａｘ（ｆｆｔ）
ｍａｘＥｎｅｒｇｙＳｕｍ＝ｓｕｍ（ｆｆｔ（ｉ―１０：ｉ＋１０））
ｒｉ＝ｍａｘＥｎｅｒｇｙＳｕｍ／ｍａｘＥｎｅｒｇｙ
のように計算される。
【００４６】
この比率ｒｉが、選択された閾値（発見的手法で多くの実験に基づいて０．４が選択され、何がよく機能するかを見積もる）より低い場合、我々は第１近似周辺の画像をトリミングし、ラドン変換を再び適用する。上記のプロセスは、繰り返され、２回においてもこの比率が選択された閾値より低い場合、失敗が返される。
【００４７】
我々は、アルゴリズムをテストするため、様々な解像度のテスト画像を使用した。様々なテスト画像及びこれらの解像度は、表１において提供される。多くの場合において、Ｃｙ５及びＣｙ３は、１つのｔｉｆｆファイルにバンドルされる２つの画像だった。全体で、１４枚の画像が、テストされた。
【表１】
2010511244.tif 000007
【００４８】
表２は、表１に記載の１４枚の画像のうちの１２枚の角のグランドトルース位置を示す。表１において２μｍでスキャンされた２＊として示される２枚の画像は、アルゴリズムが失敗を返したので、以下の計算には考慮されなかった。画像が不鮮明であり、アルゴリズムは回転の角度をうまく見積もることができず、切り取られた画像のラドン変換を実行した後にステップ９において失敗が示されたグランドトルースは、ＭＡＴＬＡＢ図の画像に注目し、右上のプローブを中心にすることにより、手動で見積もられる。プローブが存在しない場合、線は描画され、角の点はこれらの線の交差点として決定された。画像１１に対して、ＲＯＭＡチップのハイブリッド化は、あまり機能せず、角は不鮮明であり、手動で見積もられることはできなかった。（「なし」と表にマークされている）。このような場合に対して、自動化された方法を有することは、人間のオペレータが角を見つけることができないので、非常に貴重である。正確な計算のための画像１１のグランドトルースは、Ｃｙ３フルオロフォアに対するスキャンである画像１０と同様であるとみなされた。
【表２】
2010511244.tif 000008
【００４９】
表３は、表２の各画像に対するグランドトルース値と、アルゴリズムによるコーナー推定値との間の総絶対差（ＴＡＤ）及び推定された角を示す。例えば、画像１では、表３のＴＡＤは、表２及び表３のｘ１（又は１０５．３―１０５＝０．３）ｘ２（８０―８０＝０）
ｘ３（２６９０．３―２６９０＝０．３）ｘ４（２６６５―２６６５＝０）ｙ１（５０．４―５０＝０．４）ｙ２（３５０４．４−３００４＝０．４）ｙ３（６４．６―６４．１＝０．５）及びｙ４（３５１９．５―３５１９＝０．５）の絶対差の総和を取って計算される。それゆえ、絶対差を加えることにより、ＴＡＤは、画像１では２．４である。図９は、ＲＯＭＡ画像において推定された線及び角の一例を示す。これは、見積もられた線及び角を実際のＲＯＭＡアレイに重ねてみることができるプログラムの視覚的出力である。
【表３】
2010511244.tif 000009
【００５０】
表４は、推定ピクセル当たりの差分（ＤＰＥＰ）値、及びプローブサイズのパーセンテージとしての値を示す。これは、異なるスキャン解像度の各々の全ての絶対差の合計を、８倍された画像の数で割ったものである（我々は、各画像に対して８つの値を推定した）。各プローブは、一辺１６μｍの正方形である。５μｍにおいて、プローブ当たり約３ｘ３ピクセル等が存在する。
ＤＰＥＰ＝ΣＴＡＤ／（画像の総数＊８）
【表４】
2010511244.tif 000010
【００５１】
したがって、ラドン変換を使用することにより、我々は、正確に高密度ＲＯＭＡ画像の角を推定することが可能である。現在のデータセットにおいて、最大差は、プローブサイズの約２０％である。これは、最も適合したグリッドを見つけるために、推定された角のまわりの検索領域が、最高でも２、３ピクセルのオーダーであることを必要とすることをまさに意味している。これは、この技術の高いボリュームでの展開可能にする画像のグリッド点を見つけるため、手動の介入の必要性を排除するであろう。本発明によるここで開示される方法は、高解像度ＲＯＭＡ画像を数に変換する全プロセスを自動化するための多くの見込みを示す。
【００５２】
ＲＯＭＡとともに使用することに加えて、開示された方法が、手動で推定することが非常に困難な、角に「空白」のプローブを有するマイクロアレイを含めて、遺伝子発現アレイ、単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）アレイ、ＣｐＧアイランドアレイ、プロモータマイクロアレイ、タンパク質ＤＮＡ相互作用アレイ、及び他のものを含む、異なる型のアレイとともに使用され得ることも考えられる。更に、ラドン変換に結合される高速フーリエ変換の支援があれば、スキャナが高解像度で動作するときに生じ得る正弦波を発見することは、可能である。更に、我々のアルゴリズムの拡張が、おそらくマイクロアレイの容量を２倍にし、チップ上の実体財産（real  estate）をすべて使用し、プローブが正しく読まれるのを可能にするために現在使用されるようなチェッカーボードパターンを使用しないと、我々は思っている。
【００５３】
ラドン投影が直線のみに対してなされる上記の方法と同様に、正弦波の変形を補償するため、我々は、最も適切な正弦波及び回転角をみつけるため、異なる位相及び異なる振幅で様々な周波数の正弦波に沿って画像を投影し得る。この方法は、様々な正弦波を補償することが可能であり、より良い精度でプローブを位置決めすることが可能である。このような投影が必要とされるという程度は、選択されるラドン変換の極小を見つけ、最小値の合計が閾値内にあるかどうかを知ることであり得る。正弦波のバリエーションがない場合、最小値はゼロに近づくであろう。そうでなければ、実行されるこの正弦波バリエーションの補償ステップを誘発し得る背景雑音よりも少し高い値が存在するであろう。
【００５４】
プローブを推定するため、我々は、最高の角度、周波数、位相、及び振幅に対するラドン変換の極大を見つけ、これらを水平及び垂直方向の両方の画像化空間に逆投影する。これらの線の交差は、プローブの位置を与える。
【００５５】
開示された方法は、１）処理の速度を向上させるためにサブサンプリング又は切り取られた態様で画像を処理する（これは高密度又はバッチ処理において重要になる）２）データへの復号化を処理する、ために使用され得ることも考慮される。１つのオプションは、空間領域における切り取られたマトリクスを復号することである。これは、フーリエ変換データに基づいても実行され得る。
【００５６】
本発明は、本発明の特定の実施例に関して記載されるが、多くの修正例、改善例、及び／又は変更が本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく達成され得ることは、当業者により認識されるであろう。従って、本発明が請求項及びこれと等価の物の範囲のみによって制限されることは、明白に意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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