(57)【要約】【課題】抗原提示経路の改変を目的とした細胞におけるＩｉ発現の阻害に関連する組成物および方法を提供する。また、ｓｉＲＮＡ、およびＩｉ発現を阻害するのに有効なｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む発現構築物、かかるＤＮＡ構築物またはｓｉＲＮＡを含む細胞、ならびにその使用方法を提供する。【解決手段】ヒトの癌細胞でのＩｉ発現を有効に阻害するヒトＩｉ−ＲＮＡｉ構築物を作製した。Ｉｉ  ｍＲＮＡの異なる位置を標的化する異なるＩｉ−ＲＮＡｉ構築物の組合せは、Ｉｉ阻害に対して相乗効果を有する。さらに、Ｉｉ−ＲＮＡｉ発現を駆動するための特異的プロモーターは、種々の細胞型におけるＩｉ−ＲＮＡｉの活性に不可欠である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される任意の２種類の異なるｓｉＲＮＡを投与する工程を含む、細胞内でＩｉを抑制する方法。
【請求項２】
請求項１において、選択される２種類の異なるｓｉＲＮＡが、配列番号：１４および１７である方法。
【請求項３】
配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される２種類の異なるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含む発現可能な構築物を投与する工程を含む、細胞内でＩｉを抑制する方法。
【請求項４】
請求項３において、該ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結されている方法。
【請求項５】
請求項４において、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、ＣＭＶまたはＥＦ−１αである方法。
【請求項６】
請求項１または３において、細胞が癌細胞である方法。
【請求項７】
請求項５において、細胞が癌細胞であり、プロモーターがＣＭＶであり、癌がＡＭＬ、前立腺癌またはＢ細胞リンパ腫である方法。
【請求項８】
請求項５において、細胞が癌細胞であり、プロモーターがＥＦ−１αであり、癌がＡＭＬまたは前立腺癌である方法。
【請求項９】
配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される任意の２種類の異なるｓｉＲＮＡを投与する工程を含む、癌の処置方法。
【請求項１０】
配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される２種類の異なるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含む発現可能な構築物を投与する工程を含む、癌の処置方法。
【請求項１１】
請求項３または１０において、該ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）が、カチオン性デンドリマー、脂質、リポソーム、金粒子、ポリラクチドコグリコリド粒子、およびポリアルキルオキシドコポリマーからなる群より選択される媒介物質を用いる方法によって細胞内に導入される方法。
【請求項１２】
Ｉｉ発現を阻害するのに有効なｓｉＲＮＡの組合せを含む組成物であって、前記組合せが、配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される任意の２種類の異なるｓｉＲＮＡで構成されたものである組成物。
【請求項１３】
請求項１２において、該２種類の異なるｓｉＲＮＡが、配列番号：１４および１７である組成物。
【請求項１４】
配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される２種類の異なるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含む組成物であって、該ｓｉＲＮＡがＩｉ発現を阻害するのに有効である組成物。
【請求項１５】
請求項１４において、該ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに作動可能に連結されている組成物。
【請求項１６】
請求項１５において、該プロモーターが、ＣＭＶまたはＥＦ−１αプロモーターである組成物。
【請求項１７】
配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される任意の２種類の異なるｓｉＲＮＡを含む哺乳動物細胞。
【請求項１８】
配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される２種類の異なるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含む発現可能な構築物を含む哺乳動物細胞。
【請求項１９】
請求項１７または１８において、癌細胞である哺乳動物細胞。
【請求項２０】
免疫応答のために個体の細胞型を標的化するための方法であって、該細胞型が１種類以上の確認済または未知の抗原の発現を特徴とし、
ａ）  培養物中に、抗原提示細胞を含む個体の末梢血単核細胞を準備する工程；ならびに
ｂ）  工程ａ）の培養物の抗原提示細胞内に、配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される２種類の異なるｓｉＲＮＡを導入し、該ｓｉＲＮＡは直接または間接的に該細胞内に導入されることによりＩｉの発現が阻害される工程、
を含む方法。
【請求項２１】
請求項２０において、さらに、治療効果のために個体に工程ｂ）の細胞を再導入することを含む方法。
【請求項２２】
請求項２０または２１において、標的化される細胞型が、癌細胞である方法。
【請求項２３】
請求項１４において、該ＤＮＡ配列（１つまたは複数）が、プラスミドベクター内に存在する組成物。
【請求項２４】
請求項１４において、該ＤＮＡ配列（１つまたは複数）が、ウイルスベクター内に存在する組成物。
【請求項２５】
請求項１８において、該ＤＮＡ配列（１つまたは複数）が、プラスミドベクター内に存在する哺乳動物細胞。
【請求項２６】
請求項１８において、該ＤＮＡ配列（１つまたは複数）が、ウイルスベクター内に存在する哺乳動物細胞。
【請求項２７】
請求項２４において、ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザ、およびレトロウイルスからなる群より選択される組成物。
【請求項２８】
請求項２６において、ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザ、およびレトロウイルスからなる群より選択される哺乳動物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原提示経路の改変を目的とした細胞におけるＩｉ発現の阻害に関連する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
特異的抗原に対する免疫応答は、Ｔリンパ球による該抗原のペプチド断片の認識によって調節される。抗原提示細胞内では、プロセシングされた抗原のペプチド断片が、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の抗原ペプチド結合部位内に結合された状態になる。このようなペプチド−ＭＨＣ複合体は、次いで、細胞表面に輸送され、ヘルパーまたは細胞傷害性Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体によって（外来ペプチドと、提示しているＭＨＣ分子の隣接表面の両方が）認識される。ペプチドを送達するＭＨＣ分子には２つのクラス、すなわちＭＨＣクラスＩとＭＨＣクラスＩＩがある。
【０００３】
ＭＨＣクラスＩ分子は、抗原をＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｔキラー細胞）に提示する。すると、Ｔリンパ球は、活性化状態となり、抗原提示細胞を直接死滅させることができる。ＭＨＣクラスＩ分子は、内因的に合成されたタンパク質（感染性ウイルスなど）に由来するペプチドをその合成中に、小胞体内で独占的に受け取る。
【０００４】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、抗原をＣＤ４陽性ヘルパーＴリンパ球（Ｔヘルパー細胞）に提示する。活性化されると、Ｔヘルパー細胞は、物理的接触およびサイトカイン放出によって細胞傷害性Ｔリンパ球とＢリンパ球の活性化に寄与する。ＭＨＣクラスＩ分子とは異なり、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、非特異的または特異的エンドサイトーシスによってインターナリゼーションされた外因性抗原に結合する。ＭＨＣクラスＩＩと会合したインバリアント鎖タンパク質（Ｉｉ）は、通常、内因性ペプチドのプロセシングを遮断し、ＭＨＣへの結合および抗原提示を妨げる。
【０００５】
Ｉｉタンパク質の別の主要な機能は、ＭＨＣクラスＩＩ分子への外因性ペプチドの負荷を強化することである（Xu, M.ら、Mol Immunol 31: 723-731 (1994)；Daibata, M.ら、Mol Immunol 31: 255-260 (1994)；Reyes, V.E.ら、Ann N Y Acad Sci 730: 338-341 (1994)）。Ｉｉタンパク質は、通常、合成時に小胞体内でＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、ＭＨＣクラスＩＩ分子上のエピトープ結合部位を、小胞体内で内部由来のエピトープに結合すること（これは、通常、ＭＨＣクラスＩ分子の場合に起こる）から保護する(Bertolino, P.およびRabourdin-Combe、C., Crit Rev Immunol 16: 359-379 (1996)；Bodmer, H.ら、Science 263: 1284-1286 (1994)）。このようなＭＨＣクラスＩＩ−Ｉｉタンパク質複合体は、小胞体から抗原ペプチド結合区画であるポストゴルジ（ｐｏｓｔ−Ｇｏｌｇｉ）に輸送され、そこでＩｉがタンパク質分解によって放出され、外因性抗原ペプチドが結合する（Daibataら、Molecular Immunology 31: 255-260 (1994)；Xuら、Molecular Immunology 31: 723-731 (1994)；Bakke, O.およびDobberstein B., Cell 63: 707-716(1990)；Lamb, C.A.およびCresswell, P., J Immunol 148: 3478-3482 (1992)；Blum, J.S.およびCresswell, P., Proc Natl Acad Sci USA 85: 3975-3979 (1988)）。かかる区画内では、Ｉｉがプロテアーゼによって切断され、外来エピトープの負荷が許容される。エピトープが負荷されると、ＭＨＣクラスＩＩ／エピトープ複合体は、ＣＤ４＋  Ｔｈ細胞への提示のために細胞表面に移動する（Nguyen, Q.Vら、Hum Immunol 24: 153-163 (1989)；Shi, G.P.ら、J Exp Med 191: 1177-1186 (2000)；Riese, R. J.ら、Immunity 4: 357-366 (1996)；Hiltbold, E.M.およびRoche, P.A., Curr Opin Immunol 14: 30-35 (2002)）。
【０００６】
通常の条件下では、内因性ペプチド（自己免疫疾患に至る可能性のある自己決定基を有する）は、Ｉｉタンパク質が常に発生期のＭＨＣクラスＩＩ分子と同時合成されるため、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合しない。自己決定基ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子とを含む複合体は、身体の免疫監視機構系では決して見られないため、このような決定基に対する耐容性は発現されない。これが発現される個体においてＭＨＣクラスＩＩ分子がＩｉによって阻害されない場合、内因性自己決定基がＭＨＣクラスＩＩ分子に提示された状態となり、該内因性抗原に対する自己免疫応答が起始される。これは、ある種の自己免疫疾患における場合である。悪性細胞においてかかる効果を操作することにより、腫瘍の内因性抗原に対する「自己免疫応答」が、増殖を制止させるために、または腫瘍細胞を排除するために、治療的に使用され得る。
【０００７】
腫瘍細胞株およびラット腫瘍モデルにおけるＩｉタンパク質の抑制により、腫瘍抗原提示が誘導され、抗原特異的な腫瘍細胞の死滅が増強されることが示されている。Ｉｉタンパク質が同時に増加することなくＭＨＣクラスＩＩ分子発現が増大するという治療効果が、ＭＨＣクラスＩＩ陰性Ｉｉ陰性腫瘍で示されている(Ostrand-Rosenbergら、Journal of Immunol.144: 4068-4071 (1990)；Clementsら、Journal of Immunol.149: 2391-2396 (1992)；Baskarら、Cell. Immunol. 155: 123-133 (1994)；Baskarら、J. Exp.Med.181: 619-629 (1995)；およびArmstrongら、Proc. Natl.Acad.Sci. USA 94: 6886-6891 (1997)）。これらの研究では、ＭＨＣクラスＩＩ陰性マウス肉腫へのＭＨＣクラスＩＩ分子の遺伝子のトランスフェクションにより、ＭＨＣクラスＩＩ陽性だがＩｉ陰性の腫瘍細胞株が生じた。この細胞をＭＨＣ適合性宿主に注射すると、親腫瘍の増殖遅延がもたらされた。Ｉｉタンパク質の遺伝子を肉腫細胞株内にＭＨＣクラスＩＩ遺伝子とともにコトランスフェクションすると、Ｉｉ鎖によって内因性腫瘍抗原の提示が遮断されたため、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の腫瘍治療効果が阻害された。同等の結果がマウス黒色腫で得られている(ChenおよびAnanthaswamy, Journal of Immunology 151: 244-255 (1993))。
【０００８】
この治療アプローチの好成績には、樹状細胞の天然の活性が関与していると考えられる。樹状細胞は、外来抗原をペプチドにプロセシングしてＭＨＣ抗原由来のＴリンパ球の細胞表面に提示するプロフェッショナルスカベンジャーである。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩとクラスＩＩ分子の両方によって抗原を提示し、両ＭＨＣ分子がＴヘルパーとＴキラー細胞の両方を活性化させるのを可能にする能力を有する。強力なＴキラー細胞応答を惹起するには有効なＴヘルパー細胞応答が必要とされ、樹状細胞によってもたらされた複合活性化により、抗腫瘍応答の増大がもたらされると考えられる（Ridgeら、Nature 193: 474-477 (1998)；Schoenbergerら、Nature 193: 480-483 (1998)）。マクロファージ系の樹状細胞は、腫瘍細胞を発見すると、腫瘍特異的抗原と腫瘍関連抗原の両方を貪食し、プロセシングする。次いで、該樹状細胞はリンパ節（これは、腫瘍部位を排出する）に遊走し、リンパ節内の皮質付近に留まる。該皮質では新たなＴ細胞が発生する。リンパ節皮質では、樹状細胞上の腫瘍決定基を認識する休止Ｔキラー細胞が活性化状態となって増殖し、続いて、循環系内にコンピテントな抗腫瘍キラーＴ細胞として放出される。
【０００９】
Ｔヘルパー細胞との相互作用により、樹状細胞が活性化、あるいはＭＨＣクラスＩ分子による抗原提示が「ライセンス許可（ｌｉｃｅｎｓｅ）」され、したがってＴキラー細胞が活性化されるが、Ｔヘルパー細胞とＴキラー細胞との同時相互作用は必要ではない。活性化された樹状細胞は、Ｔヘルパー細胞が媒介する活性化後しばらくの間、Ｔキラー細胞を刺激する能力を維持している。ＭＨＣクラスＩＩまたはＭＨＣクラスＩのいずれかの決定基に提示された状態となったそれぞれの抗原ペプチドは、１種類の抗原タンパク質に由来するものである必要はなく、悪性細胞由来の２種類以上の抗原が樹状細胞によってプロセシングされ、提示されることがあり得る。したがって、１つの決定基に対するライセンス許可は、ある場合には腫瘍特異的でなく、他に対してＴキラー細胞の活性化をライセンス許可する力を有し、ある場合には腫瘍特異的決定基である。かかる「マイナー」または「潜在性」決定基は、種々の治療目的に使用されている（Mougdilら、J. Immunol. 159: 2574-2579 (1997)）。
【００１０】
ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示の実験的な改変は、免疫応答をこのようなマイナー決定基まで拡張すると考えられる。通常はＭＨＣクラスＩＩ分子への負荷に利用可能でないこの一連のペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ提示のための種々のペプチドの豊富な供給源を提供する。この一連の決定基の利用（exploitation）により、応答性Ｔヘルパー細胞集団の拡張がもたらされる。かかる拡張集団によって樹状細胞のライセンス許可を誘発することができ、その一部は、腫瘍特異的決定基および腫瘍関連決定基に対するものである。正常細胞も腫瘍細胞決定基を共有している可能性があるが、正常細胞に対して起こる細胞損傷は軽微なものにすぎない。これは、抗腫瘍応答の多重エフェクター応答（大量のキラーＴ細胞、周囲活性化サイトカイン、食作用マクロファージおよびこれらの産物など）が正常細胞に対して指向されないためである。
【００１１】
正常なＭＨＣクラスＩＩ抗原提示は、ＭＨＣクラスＩＩ分子とＩｉタンパク質との相互作用を阻害することにより改変され得る。これは、Ｉｉタンパク質の総量を減少させること（例えば、発現を減少させること）、あるいはＩｉの免疫調節機能に干渉することによってなされる。Ｉｉ発現の阻害は、種々のアンチセンス手法を用いてなされている。Ｉｉタンパク質のｍＲＮＡのＡＵＧ部位と相互作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、外因性抗原のＭＨＣクラスＩＩ提示を減少させると報告されている（Bertolinoら、Internat. Immunology 3: 435-443 (1991)）。しかしながら、Ｉｉタンパク質の発現およびＭＨＣクラスＩＩ分子による内因性抗原の提示に対する効果は検討されなかった。最近になって、Humphreysらにより、米国特許第5,726,020号(1998)において、３種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞内に導入されるとＩｉタンパク質発現を有効に抑制する逆遺伝子構築物が確認された。この機構によってＩｉ抑制された腫瘍細胞を接種したマウスは、未処理親腫瘍細胞を接種したマウスよりも有意に長い期間生存することが示された。この観察結果は、Ｉｉタンパク質の抑制によって抗原決定基の提示範囲の増大が生じ、したがって、腫瘍細胞に対してより有効な免疫応答が誘発されたことを示す。
【００１２】
肉腫細胞（Ｓａｌ１）腫瘍モデルにおいて、このＩｉアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した腫瘍細胞は、親腫瘍による攻撃に対する強力なワクチンである。臨床的に有用なインビボ治療用アンチセンス試薬として、発現可能なＩｉアンチセンス逆遺伝子構築物（Ｉｉ−ＲＧＣ）が創製された（米国特許出願第10/127,347号）。これは、種々のＩｉ遺伝子断片を、発現可能なプラスミドまたはアデノウイルス内に逆向きにクローニングし、多数の腫瘍細胞投与方法を評価することにより構築された(Hillmanら、Gene Ther. 10, 1512-8 (2003)；Hillmanら、Human Gene Therapy 14, 763-775 (2003)）。Ｉｉ−ＲＧＣ遺伝子はＤＮＡトランスフェクションによって、いくつかのマウス腫瘍細胞株、例えば、Ａ２０リンパ腫細胞、ＭＣ−３８結腸腺癌細胞、Ｒｅｎｃａ腎腺癌細胞、Ｂ１６黒色腫細胞、およびＲＭ−９前立腺癌細胞において評価された。最も活性の高いＩｉ−ＲＧＣ（−９２，９７）（ＡＵＧ開始コドンのＡが１位である）が、インビボ研究に使用された。
【００１３】
試験された細胞株のうち、Ａ２０は既にＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ＋である。Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２，９７）は、この構築物を脂質または遺伝子銃によるトランスフェクション法によって送達すると、Ｉｉ発現を有意に阻害した。試験されたその他の腫瘍株は、ＭＨＣクラスＩＩ−／Ｉｉ−である。この細胞株は、インビトロでＩｉ−ＲＧＣ（−９２，９７）およびＣＩＩＴＡもしくはＩＦＮ−γのいずれかまたは両方とともにコトランスフェクトされ、ＭＨＣクラスＩＩ陽性／Ｉｉ抑制表現型が生じた（Luら、Cancer Immunol Immunother 48, 492-8 (2003)；Hillmanら、Gene Ther. 10, 1512-8 (2003)；Hillmanら Human Gene Therapy 14, 763-775 (2003)）。また、ＭＨＣクラスＩＩ陽性／Ｉｉ抑制表現型のインビボ誘導は、脂質を伴うＩｉ−ＲＧＣおよびＣＩＩＴＡプラスミドの腫瘍内注射によって生じたり（Luら、Cancer Immunol Immunother 48, 492-8 (2003)；Hillmanら、Human Gene Therapy 14, 763-775 (2003))またはＩｉ−ＲＧＣ（−９２，９７）、ＣＩＩＴＡおよびＩＦＮ−γを含有する組換えアデノウイルスベクターの腫瘍内注射によっても生じた(Hillmanら、Gene Ther. 10, 1512-8 (2003))。
【００１４】
これらの治療用構築物のインビボ活性は、２つの腫瘍モデル、すなわちＲｅｎｃａ腎癌およびＲＭ−９前立腺癌を使用し、定着した皮下腫瘍内への腫瘍内注射によって試験された。両方の腫瘍モデルにおいて、定着した腫瘍の完全な退縮が達成された。Ｒｅｎｃａモデルでは、最適より少ない用量のＩＬ−２プラスミドと一緒に４日間にわたってＣＩＩＴＡおよびＩｉ−ＲＧＣプラスミド構築物の４回の腫瘍内注射を行なった後、マウスの約５０％において腫瘍退縮が観察された（Luら、Cancer Immunol Immunother 48, 492-8 (2003)）。ＣＩＩＴＡ、ＩＦＮ−γ、Ｉｉ−ＲＧＣ構築物およびＩＬ−２遺伝子を含有する組換えアデノウイルスを、定着したＲｅｎｃａ腫瘍内に腫瘍内注射すると、マウスの約６０〜７０％において完全な腫瘍退縮が誘導され、Ｒｅｎｃａ腫瘍再抗原刺激に対する保護が誘導された(Hillmanら、Gene Ther. 10, 1512-8 (2003)）。侵攻性で免疫原性が不充分なＲＭ−９前立腺腫瘍モデルでは、放射線により、最適より少ない用量のＩＬ−２の効果が増大し、マウスの５０％において完全な腫瘍退縮をもたらすＭＨＣクラスＩＩ陽性／Ｉｉ抑制表現型が増大した(Hillmanら、Human Gene Therapy 14, 763-775, 2003)。定着したＲＭ−９皮下腫瘍に選択的に放射線照射し、１日後、腫瘍内プラスミド遺伝子療法により、プラスミドｐＣＩＩＴＡ、ｐＩＦＮ−γ、ｐＩＬ−２およびｐＩｉ−ＲＧＣを用いて連続４日間処置した。４種類のすべてのプラスミドで腫瘍内処置すると、遺伝子療法の１日前に腫瘍放射線照射を行なった場合にのみ、５０％を超えるマウスで完全な腫瘍退縮が誘導された。放射線と腫瘍内遺伝子療法によって無腫瘍状態にし、第６４日目に再抗原刺激したマウスは、ＲＭ−９抗原刺激から保護されたが、同系ＥＬ４抗原刺激からは保護されなかった。この所見により、ＲＭ−９モデルでは、腫瘍特異的免疫応答のインサイチュ誘導のための腫瘍内遺伝子療法の治療有効性が放射線によって向上したことが示された。
【００１５】
最適な治療効果を得るためには、ＭＨＣクラスＩＩおよびＩｉがＣＩＩＴＡによって誘導されなければならず、ＲｅｎｃａおよびＲＭ−９の両方の腫瘍モデルにおいてＩｉがＩｉ−ＲＧＣによって阻害される必要がある（Luら、Cancer Immunol Immunother 48, 492-8 (2003)；Hillmanら、Human Gene Therapy 14, 763-775, 2003）。この結果は、マウス肺癌モデルにおいて、ＣＩＩＴＡによるＭＨＣクラスＩＩの誘導では効率的な腫瘍細胞ワクチンが作製されないことを示したMartinら（J Immunol 162, 6663-70 (1999)）の結果と整合する。この研究により、Ｉｉも誘導するトランスフェクトＣＩＩＴＡによるＭＨＣクラスＩＩの誘導は、治療効果に不充分であるという所見が確認される。ＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−の治療性表現型はまた、Ｉｉタンパク質を抑制することによっても得られるはずである。Ｉｉタンパク質の最適な抑制について試験するため、治療用構築物ＣＩＩＴＡおよびＩｉ−ＲＧＣを種々の比で使用した。良好なＩｉの阻害を確実にするには、少なくとも１：４の比（ＣＩＩＴＡ：Ｉｉ−ＲＧＣ）が必要であった。ＩＦＮ−γは、ＲＭ−９前立腺腫瘍において、親細胞では発現されないＭＨＣクラスＩ分子を誘導するために使用される。Ｒｅｎｃａ細胞はＭＨＣクラスＩ陽性細胞であり、ＩＦＮ−γは、ＭＨＣクラスＩ分子を誘導するのに必要とされないが、それらの分子のさらなる発現を上方調節する。両腫瘍モデルにおいて、免疫応答を促進するために必要とされるＩＬ−２プラスミドは、治療量以下の用量である。
【００１６】
このようにマウスで定着した腫瘍の治癒における有効性が明白に示されたこと、および最適な処置プロトコルを決定するために前臨床研究が着実に進行していることから、ヒトの癌を処置するための試薬が創製された。マウスの研究で使用されたＣＩＩＴＡ遺伝子はヒト由来であり、その産物は、ＭＨＣクラスＩＩおよびＩｉ遺伝子のマウスプロモーターに対して良好に機能を果たす（Tingら、Cell 109, 521-33 (1999)）。ヒトＢリンパ芽球様細胞株およびＨｅＬａ細胞株においてＩｉ発現を阻害するいくつかのヒトＩｉ−ＲＧＣが作出された。ＣＩＩＴＡ構築物で細胞に形質導入すると、細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子および細胞内Ｉｉの上方調節が誘導されたが、ＣＩＩＴＡとｈＩｉ−ＲＧＣの両方で細胞に形質導入すると、ＭＨＣクラスＩＩ発現の増強に影響が及ぶことなくＩｉの抑制が引き起こされた。このデータは、ヒトＢリンパ腫細胞株Ｒａｊｉおよびヒト黒色腫細胞株などのさらなるヒト腫瘍細胞株で再現された。
【００１７】
米国特許第10/999,208号（２００４年１１月２９日出願、引用により本明細書に組み込まれる）では、このような方法が、新たに設計されたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）遺伝子構築物および合成オリゴヌクレオチドを用いて適用された。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、哺乳動物細胞でのＲＮＡｉによる標的遺伝子発現の選択的阻害に使用され得る。アンチセンスとは異なり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称されるヌクレアーゼ複合体内への二本鎖ＲＮＡの組込みによって媒介され、続いて、該複合体が標的ＲＮＡを切断する。２５ヌクレオチド長未満の二本鎖ＲＮＡは、ウイルス感染に特徴的なＲＮＡ応答を活性化しないことが示されている。ＲＮＡ配列は、標的遺伝子ＲＮＡの任意の領域（一般的には、コード領域内）に基づいたものであり得る。合成ＲＮＡｉを使用する場合、細胞は培養物中で、ナノモル濃度のＲＮＡｉの送達のためにカチオン性脂質を用いて処理される。また、活性なＲＮＡｉは、操作により発現構築物とされ得る。標的配列に相補的でないＲＮＡｉが、対照として使用される。遺伝子発現の阻害は、ＲＮＡｉ処理の１２〜７２時間後に、ウエスタン、ＦＡＣＳおよび／または表現型分類アッセイを用いて測定される。
【００１８】
ＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡが、その相補配列を有する遺伝子の発現を特異的に抑制するプロセスである（Moss, Curr. Biol. 11: R772-5 (2001)；Elbashir, Genes Dev. 15: 188-200 (2001)）。いくつかの遺伝子産物、例えば、ＤＩＣＥＲがこのプロセスに関与しており、これは、プロセシングにより長鎖ｄｓＲＮＡを２１〜２５ヌクレオチド長の二本鎖断片に切断するＲｎアーゼである。このような断片は、当該技術分野において短鎖干渉または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られている（Elbashirら、2001)。
【００１９】
ショウジョウバエでの研究により、ＤＩＣＥＲは長鎖ｄｓＲＮＡを、２つの２１ｎｔ鎖で構成されたｓｉＲＮＡにプロセシングすることが示されており、ここで、該２１ｎｔ鎖は各々、他方に正確に相補的な１９ｎｔ領域を含み、２ｎｔ−３’突出端にフランキングされた１９ｎｔ二本鎖領域が得られる（WO01/75164；Bernsteinら、Nature 409: 363， 2001）。次いで、ｓｉＲＮＡにより、標的ｍＲＮＡを認識して切断するタンパク質複合体の形成が誘導される。ＤＩＣＥＲ酵素のホモログは、大腸菌からヒトにわたる種において確認されており（Sharp, 2001；Zamore, Nat. Struct. Biol. 8: 746, 2001)、このことは、ｓｉＲＮＡが多くの異なる細胞型（哺乳動物細胞およびヒト細胞など）において遺伝子発現のサイレンシングを行なう能力を有することを示唆する。
【００２０】
続いて、ＲＮＡｉは哺乳動物細胞において、合成２１ヌクレオチド長ｓｉＲＮＡ二本鎖を導入することにより誘発され得ることが見出された（Elbashirら、2001)。哺乳動物細胞培養物では、ＲＮＡｉは、トランスフェクションなどの手法によって細胞内に導入された合成ｓｉＲＮＡにより、多種多様な異なる細胞型において成功裡に再生成されてきた（Elbashirら、2001)。２１ヌクレオチド長ｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞においてインターフェロン応答を誘導するには短かすぎる（KumarおよびCarmichael, 1998）が、標的化対象遺伝子の配列特異的阻害をもたらすには充分長いため、研究ツールおよび治療剤としての大きな可能性を有する。
【００２１】
ＩｉのＲＮＡｉ阻害の頑健な性質は、内因的に合成された抗原の提示によって生じる免疫刺激に理想的に好適なものである。免疫刺激を得るためにＩｉに必要とされることは、細胞の一画分において短期間にわたって抑制されることだけである。これは、事実上全細胞における連続的阻害を必要とする癌細胞増殖関連の他の特異的標的とは全く対照的である。
【００２２】
本出願人は、以前に、免疫応答を調節する目的のためのＩｉ阻害を開示する複数の特許出願を出願し、審査手続継続中である。これらの出願には、阻害性コポリマー（これは、細胞内に導入され、Ｉｉ  ｍＲＮＡに結合することによりＩｉ合成を直接阻害する）、ならびに逆遺伝子構築物（これは、細胞内に核酸構築物として導入され、続いて該核酸構築物がＲＮＡ分子に転写され、該ＲＮＡ分子は、特異的ハイブリダイゼーション後にＩｉ発現を阻害する）を具体的に開示している。このような先に出願された特許出願としては、米国特許出願第08/661,627号、同第09/205,995号、同第10/054,387号および同第10/127,347号（その開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。米国特許出願第08/661,627号および同第09/205,995号は、それぞれ、米国特許第5,726,020号および同第6,368,855号として発行済である。米国特許第10/054,387号は放棄されている。
【００２３】
上記で簡単に示したように米国特許第09/205,995号は、約１０〜約５０のヌクレオチド塩基を含む化学合成されたコポリマーに関する広範な開示内容を含む。このようなコポリマーは、ＲＮＡ分子の標的化対象（あるいはアンチセンス配列として既知）部分に相補的なヌクレオチド塩基配列を含む。かかるコポリマーの例としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡが挙げられる。アンチセンスコポリマーは、２つの機構によってＲＮＡからのタンパク質の翻訳を阻害する。第１の方法は、リボソーム、スプライセオソームまたはＲＮＡの成熟もしくは翻訳に必須の他の因子と、該ＲＮＡが相互作用すべき部分への到達を遮断することである。第２の方法は、ＤＮＡにハイブリダイズされたＲＮＡの配列を切断する酵素であるリボヌクレアーゼＨの相乗作用を伴うものである。したがって、ＤＮＡまたはＤＮＡ様コポリマーがＲＮＡ内の対応するセグメントに結合することにより、コポリマー結合部位での該ＲＮＡの切断がもたらされる。
【００２４】
かかるオリゴヌクレオチド修飾およびそれによりもたらされる特徴は、当業者に容易に利用可能である。例示的な修飾は、米国特許第4,469,863号(1984)；米国特許第5,216,141号(1993)；米国特許第5,264,564号(1993)；米国特許第5,514,786号(1996)；米国特許第5,587,300号(1996)；米国特許第5,587,469号(1996)；米国特許第5,602,240号(1997)；米国特許第5,610,289号(1997)；米国特許第5,614,617号(1997)；米国特許第5,623,065号(1997)；米国特許第5,623,070号(1997)；米国特許第5,700,922号(1997)；および米国特許第5,726,297号(1998)（その開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる）に示されている。
【００２５】
ＨＬＡ−ＤＲ関連インバリアント鎖（Ｉｉ）は、抗原提示に関与しており、抗原提示細胞上で発現される。また、Ｉｉは癌細胞によっても発現されるが、その発現は正常組織内に限定される。この観察結果により、Ｉｉは、癌の処置のための価値ある治療標的となる。
【００２６】
免疫療法用腫瘍細胞ワクチンの有効性を向上させるため、本出願人は、腫瘍細胞においてＭＨＣクラスＩＩ関連インバリアント鎖（Ｉｉタンパク質）の発現を抑制するための方法を開発した。このタンパク質は、通常、合成直後にＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位を遮断する。Ｉｉタンパク質の阻害により、ＭＨＣクラスＩとＩＩの両分子による腫瘍抗原の同時提示がもたらされ、ＣＤ４＋とＣＤ８＋の両方のＴ細胞の活性化がもたらされ、したがって頑健で長期間持続する抗腫瘍免疫応答が生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
（概要）
本発明は、抗原提示経路の改変を目的とした細胞におけるＩｉ発現の阻害に関連する組成物および方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明は、一態様において、Ｉｉ発現を阻害するのに有効なｓｉＲＮＡに関する。本発明の方法および組成物において使用されるｓｉＲＮＡは、各々、単一の分子内に、Ｉｉのセンス配列、前記センス配列の逆相補鎖、および該センス配列と逆相補鎖配列間の二本鎖形成を可能にする介在配列を含む。別の態様において、本発明は、Ｉｉ発現を阻害するのに有効なｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、かかるＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む細胞、およびその使用方法を提供する。
【００２９】
一態様において、本発明は、細胞内でＩｉの発現を阻害するための方法に関する。この方法は、２種類の異なるｓｉＲＮＡをＩｉ発現細胞内に導入することを含み、該ｓｉＲＮＡは、直接または間接的に該細胞内に導入される。その後、該ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体を形成し、それにより該細胞でのＩｉの発現が阻害される。
【００３０】
ヒトＲａｊｉ（Ｂ細胞リンパ腫）、ＡＭＬ、前立腺癌、およびヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）−２９３腎臓細胞においてＩｉ発現を有効に阻害するヒトＩｉ−ＲＮＡｉ構築物が作製されている。本出願書類は、ある種の単独のｓｉＲＮＡを用いた種々のヒトの癌細胞でのＩｉの抑制を初めて報告するものである。また、このようなｓｉＲＮＡを組合せで使用した場合のＩｉの抑制における有意に大きな効果を開示する。Ｉｉ  ｍＲＮＡの異なる位置を標的化する異なるＩｉ−ＲＮＡｉ構築物の組合せは、Ｉｉ阻害に対して相乗効果を有する。Ｉｉが阻害された細胞の割合は、Ｉｉ−ＲＮＡｉ構築物の組合せを用いた場合には６５％であったのに対し、同等量の単独のＩｉ−ＲＮＡｉ構築物を用いた場合には３５％であった。
【００３１】
別の態様において、本発明は、免疫応答のために動物の細胞型を標的化するための方法であって、該細胞型が１種類以上の既知または未知の抗原の発現を特徴とする方法に関する。この方法では、個体由来の末梢血単核細胞の培養物を準備し、該培養物は抗原提示細胞を含む。Ｉｉ発現の１種類または好ましくは２種類の異なるｓｉＲＮＡインヒビターが、直接または間接的に該培養物の抗原提示細胞内に（ｓｉＲＮＡをコードする１種類以上の発現可能な核酸配列などによって、発現に適切な条件下で培養物の細胞内に）導入される。
【００３２】
さらに、Ｉｉ−ＲＮＡｉ発現を駆動するための特異的プロモーターは、種々の細胞型におけるＩｉ−ＲＮＡｉの活性に不可欠である。活性なＩｉ−ＲＮＡｉ配列を、Ｉｉ−ＲＮＡｉ配列がＥＦ−１αプロモーターによって駆動されるｐＢｕｄＣＥ４．１プラスミド内にクローニングした。ヒト骨髄性白血病細胞株ＫＧ−１の前駆細胞をｐＢｕｄＣＥ４．１／Ｉｉ−ＲＮＡｉ構築物でトランスフェクションすると、ＫＧ−１細胞において、ＥＦ−１αプロモーターがＣＭＶプロモーターよりも活性であること（これは、Ｉｉ阻害がより大きいことによって示される）が示される。
【発明の効果】
【００３３】
臨床用途のためのこのストラテジーの実用上の利点は、Ｉｉ遺伝子の単形性の性質である。種々のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を有するすべての患者に対して、１種類のＩｉ−ＲＮＡｉ構築物で充分である。癌細胞においてＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−表現型が良好に生じることにより、ＡＭＬ、前立腺癌およびＢ細胞リンパ腫を有する患者においてＩｉ抑制癌細胞を使用する治験に対する道が開かれた。いくつかの関連する態様を、以下のセクションで詳細に記載する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
Ｉｉ発現の抑制は、抗原提示経路を改変することが意図される。より詳しくは、Ｉｉ発現の阻害は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に、通常この状況では提示され得ない抗原エピトープが負荷されるのを促進することが意図される。主題の発明は、抗原提示経路の改変を目的とした細胞におけるＩｉ発現の阻害に関連する組成物および方法に関する。
【００３５】
本開示内容のすべての態様に関連する必須要素は、細胞でのＩｉ合成の阻害である。用語「阻害」または「抑制」は、下方調節、またはＩｉの活性もしくはＩｉ  ＲＮＡのレベルを本発明のインヒビターまたはサプレッサーの非存在下で観察されるレベルより下に低下させる行為を意味することが意図される。発明の背景のセクションで記載のように、Ｉｉは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と同時調節されるタンパク質である。ＩｉはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、それにより、内因的に合成された抗原（すなわち、ＭＨＣクラスＩＩ分子発現細胞内で合成された抗原）のＭＨＣクラスＩＩ分子への到達が遮断される。ＭＨＣクラスＩＩ分子／Ｉｉ複合体は、小胞体からポストゴルジ区画に輸送され、そこでＩｉが段階的切断プロセスによって放出され、これにより外因性抗原（すなわち、抗原提示細胞内で合成されたものではなく、食作用、オプソニン作用、細胞表面抗体認識、補体受容体認識およびＦｃ受容体認識などの機構による抗原提示細胞内への取込みのために選択された抗原）の負荷が可能になる。
【００３６】
複合体化されたＩｉタンパク質の存在により小胞体内でのＭＨＣクラスＩＩ分子への結合から排除された抗原は、内因的に合成された抗原と称することがあり得る。かかる抗原は、プロテオソームによって消化され、抗原ペプチド輸送体（ＴＡＰ）によって小胞体内にペプチドとして輸送された一群の細胞質タンパク質を含む。かかる内因的に合成された抗原は、通常、小胞体内でＭＨＣクラスＩ分子に結合される。かかる抗原断片は、通常、小胞体内でＭＨＣクラスＩＩ分子には結合されない。それは、Ｉｉタンパク質がその抗原ペプチド結合部位を遮断するからである。
【００３７】
Ｉｉタンパク質の発現を抑制することにより、ＭＨＣクラスＩ分子と結合した後ＣＤ８＋  Ｔリンパ球に提示されるために小胞体内に輸送されたこの膨大なペプチドレパートリーが、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合され得、続いてＣＤ４＋  Ｔ免疫調節細胞に提示され、該細胞が活性化される。ＣＤ４＋  Ｔ免疫調節細胞は、免疫応答の種々の経路の組織化において、ヘルパー機能またはサプレッサー機能のいずれかを有し得る。該細胞は、物理的接触ならびにサイトカイン放出によって、細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｔキラー細胞）、Ｂリンパ球および樹状細胞などの他の細胞の活性化に寄与する。
【００３８】
用語「目的の抗原エピトープ」は、本明細書で用いる場合、抗原提示が行なわれる細胞内で産生されたタンパク質由来のペプチド内に存在する抗原エピトープをいう。該用語は、本明細書で用いる場合、既知または未知の抗原エピトープを包含することを意図する。したがって、修飾語句「目的の」は、エピトープが所定のものであることを示すのではない。抗原エピトープは、単に、提示が行なわれる細胞の細胞質内で合成されたタンパク質内に含まれているという理由で「目的の」ものである。
【００３９】
治療的介入の機会を提供する有意な生物学的影響は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるペプチドの結合から得られ、小胞体内に輸送されたペプチドレパートリーは、そこでＭＨＣクラスＩ分子により結合される。多くの場合、Ｉｉ抑制下でＭＨＣクラスＩＩ分子に結合されるエピトープは、「潜在性」（cryptic）エピトープであり、それは、かかるエピトープが抗原提示の古典的経路によってＭＨＣクラスＩＩ分子と会合された状態で免疫系に、他の形では提示されないためである。潜在性エピトープは、試験抗原のアミノ酸配列のオーバーラップ合成ペプチドのライブラリーを解析することにより、実験によって明らかとなり得る。試験抗原で免疫処置したあるマウス系統の動物では、ライブラリーの一組のペプチドに対する応答が見られ得る（「優性エピトープ」）。しかしながら、他の点では同一のマウスを該ライブラリーの単一のペプチドで免疫処置した場合、事前に未確認のサブセット（免疫処置用ペプチド内の任意の優性エピトープに加えて）が、免疫学的エピトープを含むことがわかる。このような事前に未確認のエピトープは、一組の潜在性エピトープを含む。
【００４０】
本発明の方法は、優性エピトープと潜在性エピトープの両方に対する免疫性を促進するが、一部の臨床状況では、潜在性エピトープに対する免疫応答の増強は、治療効果において特別な役割を果たす。例えば、癌関連抗原エピトープに対する治療応答を追加刺激すると、サプレッサーＴ細胞応答が起こったことのない潜在性エピトープに対するＴヘルパー細胞応答により、有効な樹状細胞ライセンス許可がもたらされる可能性が高くなり、それにより頑健な細胞傷害性Ｔリンパ球抗腫瘍応答が生じる。癌関連抗原の優性エピトープに対するＴ細胞応答の抑制の発現は、腫瘍微小転移巣の増殖にある役割を果たすことが示されている。したがって、本発明の大きな有用性は、推定潜在性癌関連決定基に対するＴヘルパー細胞応答の促進である。
【００４１】
「内因的に合成された」類型に包含されるさまざまな抗原（これは、通常、ＭＨＣクラスＩＩ分子提示から排除される）は、ある種の病状に特異的に関連している。例えば、腫瘍細胞または他の悪性細胞と考えられたい。かかる細胞は、癌特異的および癌関連タンパク質を合成し、該タンパク質は、治療上有用なＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。しかしながら、このようなタンパク質は抗原提示細胞内で合成されるため、かかるタンパク質の抗原エピトープは、同細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子との会合による提示から排除される。事象の通常の過程を改変し、それにより、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合した病態特異的抗原を提示できることにより、新規なＭＨＣクラスＩＩ抗原エピトープによって起始される応答の増強がもたらされる。
【００４２】
数々の治療モダリティが、本発明の範囲に含まれる。特許性のある組成物は、このような治療モダリティの多くに関連したものである。治療アプローチには、インビボとエキソビボの実施形態が包含される。本発明の目的は、Ｉｉ発現を阻害するのに有効な１種類以上のｓｉＲＮＡを含む組成物を提供すること、また、かかる組成物を含むベクターおよび細胞ならびにその使用方法を提供することである。
【００４３】
二本鎖ｓｉＲＮＡ、およびこのような分子をコードする遺伝子は、ＲＮＡ干渉によりＩｉを阻害するために使用され得る。用語「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」は、本明細書で用いる場合、ｄｓＲＮＡが、その相補配列を有する遺伝子の発現を特異的に抑制するプロセスをいう（Moss, Curr. Biol. 11(19): R772-5 (2001)；Elbashir, Genes Dev. 15(2): 188-200 (2001)）。理論に拘束されることを望まないが、ＲＮＡｉは、４つの主な段階：ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によるｓｉＲＮＡの集合、ＲＩＳＣの活性化、標的認識、および標的切断を特徴とする多重ＲＮＡ−タンパク質相互作用を伴う機構によって起こると理解されたい。用語「短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」は、本明細書で用いる場合、ＲＮＡｉまたは遺伝子サイレンシングの媒介能を有する任意の核酸分子をいうものとする。用語ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ機能を有する種々の天然に生成される化合物または合成化合物を包含するものとする。かかる化合物としては、限定されないが、２または３塩基対の末端重複部を有する約２１〜２３塩基対の二本鎖合成オリゴヌクレオチド；センスでありハイブリダイズする相補セグメントであって、約３〜５塩基対のループと連接された約２１〜２３塩基対のセグメントを有する１つのオリゴヌクレオチド鎖のヘアピン構造；および前述の構造体または機能的同等物の発現をもたらす種々の遺伝子構築物が挙げられる。かかる遺伝子構築物は、通常、インビトロで調製され、試験系内に導入されるが、宿主細胞または動物のゲノムにコードされた天然に存在するｓｉＲＮＡ前駆体由来のｓｉＲＮＡを含むものであってもよい。
【００４４】
本発明のｓｉＲＮＡがＲＮＡのみで構成されたものであることは、必要条件ではない。本発明のｓｉＲＮＡは、１つ以上の化学修飾および／またはヌクレオチド類縁体を含むものであってもよい。該修飾および／または類縁体は、それぞれ、ｓｉＲＮＡがＩｉ発現を阻害する能力に負の影響を及ぼさない任意の修飾および／または類縁体であり得る。ｓｉＲＮＡ内に１つ以上の化学修飾および／またはヌクレオチド類縁体が含まれることは、ヌクレアーゼ消化を抑制または遅滞させ、それによって実用向けにより安定なｓｉＲＮＡを創製するために好ましい場合があり得る。ＲＮＡを安定化させる化学修飾および／またはヌクレオチド類縁体は、当該技術分野で知られている。ホスホロチオエート誘導体は、非橋絡ホスホロイル酸素原子がイオウ原子で置き換えられたものであり、これは、ヌクレアーゼ消化に対する抵抗性の増大を示す類縁体の一例である。化学修飾の対象となり得るｓｉＲＮＡの部位としては、ヘアピン構造のループ領域、ヘアピン構造の５’および３’末端（例えば、キャップ構造）、二本鎖の線状ｓｉＲＮＡの３’突出領域、線状ｓｉＲＮＡのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’または３’末端、ならびに該センスおよび／またはアンチセンス鎖の１つ以上のヌクレオチドが挙げられる。本明細書で用いる場合、用語ｓｉＲＮＡは、当該技術分野において、配列特異的ＲＮＡｉの媒介能を有する分子と定義される任意の用語に相当するものであることが意図される。かかる相当語句としては、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、および転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）が挙げられる。
【００４５】
理論に拘束されることを望まないが、一般的に、ＲＮＡｉではｄｓＲＮＡは２１〜２３塩基対の断片にプロセシングされ、該断片が相補ｍＲＮＡに結合し、その分解をもたらすと理解されたい（Bernstein, Nature 409(6818): 363-6 (2001)、および国際特許公開公報番号WO0175164）。このようなｓｉＲＮＡは、配列特異的翻訳後遺伝子サイレンシングを誘導する。かかる分子は、国際特許公開公報番号WO0175164および種々の特許、特許出願ならびに研究論文に記載されているように、治療目的または予防目的で遺伝子発現を抑制するために細胞内に導入され得る。引用により本明細書に組み込まれ、ＲＮＡｉ手法が記載された刊行物としては、限定されないが、下記のもの：米国特許第6,686,463号、米国特許第6,673,611号、米国特許第6,623,962号、米国特許第6,506,559号、米国特許第6,573,099号、および米国特許第6,531,644号；国際特許公開公報番号WO04061081；WO04052093；WO04048596；WO04048594；WO04048581；WO04048566；WO04046320；WO04044537；WO04043406；WO04033620；WO04030660；WO04028471；WO0175164が挙げられる。このような化合物の最適な使用のための方法および概念が記載された研究論文としては、限定されないが、下記のもの：Brummelkamp Science 296: 550-553 (2002)；Caplen Expert Opin. Biol. Ther. 3: 575-86 (2003)；Brummelkamp, Sciencexpress 21 Mar. 3 1-6 (2003)；Yu Proc Natl Acad Sci USA 99: 6047-52 (2002)；Paul Nature Biotechnology 29: 505-8 (2002)；Paddison Proc Natl Acad Sci USA 99: 1443-8 (2002)；Brummelkamp Nature 424: 797-801 (2003)；Brummelkamp, Science 296: -550-3 (2003)；Sui Proc Natl Acad Sci USA 99: 5515-20 (2002)；Paddison, Genes and Development 16: 948-58 (2002)が挙げられる。
【００４６】
本発明との関連において、Ｉｉ発現を阻害するのに有効なｓｉＲＮＡを含む組成物は、Ｉｉのセンス配列を含むＲＮＡ二本鎖を含むものであり得る。この実施形態では、該ＲＮＡ二本鎖は、Ｉｉのセンス配列を含む第１の鎖と、該Ｉｉのセンス配列の逆相補鎖を含む第２の鎖とを含む。
【００４７】
別の実施形態において、Ｉｉ発現を阻害するのに有効なｓｉＲＮＡを含む組成物は、単一の分子内に、Ｉｉのセンス配列、Ｉｉのセンス配列の逆相補鎖、および該センス配列と逆相補鎖配列間の二本鎖形成を可能にする介在配列を含むものであり得る。本発明のｓｉＲＮＡは、配列番号：１４、配列番号：１６および配列番号：１７からなる群より選択される配列のＲＮＡを含むものであり得る。
【００４８】
本発明のｓｉＲＮＡは、互いに対して、またはＩｉの標的化対象領域に対して、完全相補に満たないＩｉのセンス配列またはＩｉのセンス配列の逆相補鎖を含むものであってもよいことは、当業者には容易にわかるであろう。換言すると、ｓｉＲＮＡは、該センス配列または逆相補鎖配列内にミスマッチまたはバルジ配列（ｂｕｌｇｅ）を含むものであり得る。一態様において、該センス配列またはその逆相補鎖は、完全に連続的でないものであり得る。該配列（１つまたは複数）は、１つ以上の置換、欠失および／または挿入を含むものであり得る。本発明の唯一の必要条件は、ｓｉＲＮＡセンス配列が、その逆相補鎖に対して、およびＩｉの標的化対象領域に対してＲＮＡｉ活性を可能にするのに充分な相補性を有することである。したがって、本発明の目的は、本発明のｓｉＲＮＡの配列修飾であって、ＲＮＡｉ活性を可能にするのに充分な相補性が保持される配列修飾を提供することである。当業者には、本発明の修飾ｓｉＲＮＡ組成物が、Ｉｉの相補配列および標的化対象領域の修飾配列の結合自由エネルギーの計算値に基づいて奏効することが予測され得よう。核酸の結合自由エネルギーの計算および鎖ハイブリダイゼーションに対するかかる値の影響は、当該技術分野で知られている。
【００４９】
米国特許出願第10/999,208号には、Ｉｉ発現を阻害するのに有効な単独のＩｉ  ｓｉＲＮＡの使用、およびＩｉ発現を阻害するのに有効な単独のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の使用による抗原提示経路の改変が記載されている。この阻害は、非癌性細胞であるＨＥＫ−２９３において示された。かかる単独のｓｉＲＮＡまたはそれをコードするＤＮＡを含む細胞およびその使用方法もまた、報告されている。
【００５０】
本発明は、一つには、このようなｓｉＲＮＡのうち３種類がヒトの癌細胞内でＩｉを阻害するという知見、さらに、これらのｓｉＲＮＡのいずれかを組合せて使用すると、単独のｓｉＲＮＡによってもたらされる効果と比べてＩｉの阻害が大きく増大するという知見に基づいている。実施例のセクションの実施例１に示すように、配列番号：１４、１６および１７の単独のｓｉＲＮＡは、対照と比べてＩｉを２７〜３２．５％阻害した。これは、単独または組合せのｓｉＲＮＡによる癌（Ｒａｊｉ）細胞でのＩｉの阻害を初めて示すものである。
【００５１】
一実施形態において、本発明は、配列番号：１４、１６および１７からなる群の任意の２種類の異なるｓｉＲＮＡを投与することを含む、細胞内でＩｉを抑制する方法を含む。本発明の方法は、これらの３つのｓｉＲＮＡ配列の任意の２つ、特に、配列番号：１４と１７との組合せ（この組合せで、Ｒａｊｉ細胞内でのＩｉの阻害において最も大きな効果が得られた（表３）ため）を投与することを含むものである。
【００５２】
実施例のセクションで詳述するように、Ｉｉは、Ｒａｊｉ（Ｂ細胞リンパ腫）細胞、ＡＭＬ細胞、および前立腺癌細胞において、本発明の方法および組成物により阻害された。背景のセクションでは、Ｉｉ抑制が癌免疫療法の標的であること、およびＩｉの抑制によって、腫瘍細胞に対するより有効な免疫応答が誘発され得ることを論考している。したがって、一実施形態において、本発明は、配列番号：１４、１６および１７からなる群の任意の２種類の異なるｓｉＲＮＡを投与することを含む、癌の処置方法を含む。細胞が癌細胞である上記のＩｉの抑制方法も含む。
【００５３】
関連する実施形態において、本発明は、Ｉｉ発現を阻害するのに有効なｓｉＲＮＡの組合せを含む組成物であって、該組合せが配列番号：１４、１６および１７から選択される任意の２種類の異なるｓｉＲＮＡで構成されたものである組成物を含む。すべての組合せが単独のｓｉＲＮＡよりも有意に有効であったため、この有効な組成物は、この群の任意の２種類の異なるｓｉＲＮＡで構成されたものであり得る。本発明の組成物は、最も有効であることが示された配列番号：１４と１７との組合せを含むものである。
【００５４】
多種多様な送達系が、インビトロおよびインビボでの標的細胞への本発明のｓｉＲＮＡの送達における使用に利用可能である。本発明のｓｉＲＮＡは、直接または間接的に、Ｉｉ阻害が所望される細胞内に導入され得る。ｓｉＲＮＡは、直接細胞内に、例えば注射によって導入され得る。したがって、本発明の目的は、Ｉｉを阻害するのに有効なｓｉＲＮＡを含む組成物を、注射用単位投薬形態で提供することである。本発明のｓｉＲＮＡは、本発明の方法および組成物と関連する治療用途のため、一例として静脈内または皮下注射され得る。かかる処置としては、所望の組織内でＩｉ発現を阻害するのに治療的に有効なレベルが達成されるまでの、間欠または連続投与が挙げられる。
【００５５】
間接的には、該ｓｉＲＮＡをコードする発現可能なＤＮＡ配列（１つまたは複数）を細胞内に導入すると、その後、ｓｉＲＮＡが該ＤＮＡ配列（１つまたは複数）から転写され得る。したがって、本発明の目的は、Ｉｉ発現を阻害するのに有効な１種類以上のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含む組成物を提供することである。発現可能なｓｉＲＮＡ構築物は、以下の理由で、合成オリゴヌクレオチドであることが好ましいものであり得る。１）ＲＮＡオリゴヌクレオチドでの細胞のトランスフェクションは、ＤＮＡ発現構築物でのトランスフェクションよりも困難なことがあり得る。２）合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの大規模合成は、ＤＮＡプラスミドまたは他のベクターの調製よりも高価である。３）構築物の発現（したがって、Ｉｉ抑制活性）は、組織特異的プロモーターを用いて、特定の器官または組織に標的化され得る。４）ｓｉＲＮＡ（合成のもの、または遺伝子ベクターから発現されたもののいずれの場合も）の活性は、一般に、逆遺伝子構築物の活性よりもずっと高い。これらの理由で、発現可能なｓｉＲＮＡ構築物は、インビボ使用に対してより一層大きな潜在的有益性を有する。
【００５６】
本発明のＤＮＡ組成物は、Ｉｉのセンス配列を含む第１のＲＮＡ配列をコードする第１のＤＮＡ配列と、Ｉｉのセンス配列の逆相補鎖を含む第２のＲＮＡ配列をコードする第２のＤＮＡ配列とを含む。第１および第２のＲＮＡ配列は、ハイブリダイズさせると、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体の形成能を有するｓｉＲＮＡ二本鎖を形成し、このＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体は、Ｉｉ発現の阻害能を有する。第１および第２のＤＮＡ配列は、化学合成されたもの、またはＩｉに適切なプライマーを用いてＰＣＲによって合成されたものであり得る。あるいはまた、該ＤＮＡ配列は、当該技術分野でよく知られたクローニング手法を用いて組換え操作によって得られたものであってもよい。得られたら、ＤＮＡ配列は精製され、合わされ、次いでＩｉ阻害が所望される細胞内に導入され得る。あるいはまた、該配列を単一のベクターまたは別々のベクター内に含め、該ベクターを、Ｉｉ阻害が所望される細胞内に導入してもよい。
【００５７】
別の実施形態において、本発明は、配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される２種類の異なるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含む発現可能な構築物を投与する工程を含む、細胞内でＩｉを抑制する方法を含む。該構築物は、該群の２種類の異なるｓｉＲＮＡを一緒にコードする１つ以上のＤＮＡ配列で構成されたものであってもよい。上記のｓｉＲＮＡを用いたＩｉの直接的な抑制方法と同様、この実施形態の方法は、Ｉｉが抑制される細胞が癌細胞である方法を含む。さらに、本発明は、配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される２種類の異なるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含む発現可能な構築物を投与する工程を含む、癌の処置方法を含む。本発明に含まれる別の実施形態は、配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される２種類の異なるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含む組成物であって、該ｓｉＲＮＡがＩｉ発現を阻害するのに有効である組成物である。
【００５８】
標的細胞への本発明のＤＮＡ組成物の送達するために使用可能な送達系としては、例えば、ウイルス系および非ウイルス系が挙げられる。適当なウイルス系の例としては、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルスベクター、ワクシニア、単純疱疹ウイルス、ＨＩＶ、マウス微小ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスが挙げられる。また、非ウイルス送達系も使用され得、例えば、非複合体型ＤＮＡ、ＤＮＡ−リポソーム複合体、ＤＮＡ−タンパク質複合体およびＤＮＡコート金粒子、細菌ベクター（サルモネラなど）、ならびに他の手法、例えば、ＶＰ２２輸送タンパク質、Ｃｏ−Ｘ−Ｇｅｎｅおよびレプリコンベクターを伴うものが使用される。
【００５９】
本発明の組成物は、配列番号：１４、１６および１７から選択される任意の２種類の異なるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含み、該ＤＮＡ配列（１つまたは複数）は、プラスミドまたはウイルスベクター内に存在する。実施例のセクションで投与した組成物は、pSuppressorAdenoまたはpBudCE4.1プラスミド内にクローニングしたＤＮＡ配列とした。
【００６０】
動物細胞で目的の核酸配列を発現させるための選択肢の１つは、アデノウイルス系である。以下の実施例のセクションでは、アデノウイルス系の使用を具体的に開示する。アデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、宿主細胞の分裂とは独立して複製される。アデノウイルスベクターは、細胞内に発現可能な構築物を導入する別の方法と比べ、さまざまな利点をもたらす。例えば、アデノウイルスベクターは、広範なヒト組織への形質導入能を有し、高レベルの遺伝子発現が分裂細胞および非分裂細胞において得られ得る。アデノウイルスベクターは、免疫系によるクリアランスおよび標的細胞分裂中の希釈性減損のため、比較的短時間での導入遺伝子発現を特徴とする。いくつかの投与経路、例えば、静脈内、胆管内、腹腔内、小胞内、頭蓋内および髄腔内注射、ならびに標的器官または組織の直接注射が使用され得る。したがって、当該技術分野では、解剖学的境界部（ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ｂｏｕｎｄａｒｙ）に基づく標的化が達成可能であると認識されている。
【００６１】
アデノウイルスゲノムは、約１５種類のタンパク質をコードしており、感染は、細胞表面受容体に結合する線維タンパク質を伴う。この受容体相互作用により、該ウイルスのインターナリゼーションがもたらされる。ウイルスＤＮＡは、感染細胞の核内に侵入し、細胞分裂の非存在下で転写が開始される。発現および複製は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の制御下にある（Horwitz, M. S., In Virology,第2版,1990, pp. 1723-1740参照）。Ｅ１遺伝子の除去により、ウイルス複製能がなくなる。アデノウイルス血清型の２型および５型は、ベクターの構築に広く使用されてきた。Beftら（Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91: 8802-8806 (1994))は、Ｅ１およびＥ３アデノウイルス遺伝子を欠失させたアデノウイルス５型ベクター系を使用した。
【００６２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）(Kotin, R. M., Hum. Gene Ther. 5: 793-801 (1994))は、単鎖ＤＮＡであり、非常に広い宿主範囲の非分裂細胞のゲノム内に組み込まれ得る非自律性パルボウイルスである。ＡＡＶがヒト疾患と関連していることは示されておらず、免疫応答を惹起しない。ＡＡＶは、２つの相違する生活環相を有する。野生型ウイルスは、宿主細胞に感染し、組み込まれるが、潜在状態のままである。アデノウイルスの存在下では、ウイルスの溶菌相が誘導され、この相はアデノウイルス初期遺伝子の発現に依存し、活発なウイルス複製をもたらす。ＡＡＶゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列にフランキングされた２つのオープンリーディングフレーム（ｒｅｐおよびｃａｐと呼ばれる）で構成されている。ｒｅｐ領域は、宿主ゲノムへの組込みに使用されるＡＡＶ複製、ウイルスＤＮＡ転写、およびエンドヌクレアーゼ機能を媒介する４種類のタンパク質をコードしている。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルス複製に必要とされる唯一のＡＡＶ配列である。ｃａｐ配列は、ウイルスのキャプシドを形成する構造タンパク質をコードしている。ＩＴＲは、ウイルスの複製起点を含み、キャプシド形成シグナルを提供し、ウイルスＤＮＡの組込みに関与する。遺伝子療法のために開発された組換え複製欠損ウイルスは、ｒｅｐおよびｃａｐ配列を欠いたものである。複製欠損ＡＡＶは、ＡＡＶ複製に必要な別々のエレメントを許容細胞株内にコトランスフェクションすることにより作製され得る。米国特許第4,797,368号には関連する開示内容が含まれ、かかる開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
レトロウイルスベクターは、分裂細胞の感染に有用であり、宿主細胞膜およびウイルスタンパク質由来のエンベロープ内にパッケージングされるＲＮＡゲノムで構成されている。レトロウイルス遺伝子の発現は、その陽性鎖ＲＮＡゲノムが二本鎖ＤＮＡ合成を指示するための鋳型として使用される逆転写工程を伴い、次いで、該ＤＮＡが宿主細胞ＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたプロウイルスは、宿主細胞の遺伝子発現機構を利用する能力を有する。
【００６４】
マウス白血病ウイルスは、一般に用いられているレトロウイルス種である（Millerら、Methods Enzymol. 217: 581-599 (1993)）。レトロウイルスベクターは、典型的には、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の欠失によって構築される。これらの配列の欠失により、目的の核酸配列の挿入のための能力がもたらされ、該ウイルスの複製機能が排除される。多くの場合、選択手段として、抗生物質耐性をコードする遺伝子が含められる。また、例えば、インビボ投与後に組織特異的発現をもたらすため、プロモーター機能およびエンハンサー機能を含めてもよい。また、長い末端反復配列内にプロモーター機能およびエンハンサー機能を含めたものも使用され得る。
【００６５】
かかるウイルス、および目的の外因性核酸配列を有するかかるウイルスの修飾体は、ウイルスパッケージング細胞株においてのみ生成され得る。パッケージング細胞株は、欠失ウイルス遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を安定的に細胞内に挿入することにより、構築され得る。そして、それにより組換えを防ぐため該遺伝子が異なる染色体上に存在することになる。パッケージング細胞株を用いて、組換えプロウイルスＤＮＡを挿入することによって目的の核酸配列を含む複製欠損レトロウイルスを生成させるプロデューサー細胞株が構築される。キャプシド形成配列を含むｇａｇ遺伝子の小部分にフランキングする長い末端反復配列と目的の遺伝子とを含むプラスミドＤＮＡを、パッケージング細胞株内に、ＤＮＡ導入および取込みのための標準的な手法（エレクトロポレーション、カルシウム沈殿など）を用いてトランスフェクトする。複製能を有するウイルスが生成する可能性を低下させるため、このアプローチの変形型が使用されている（Jolly， D.， Cancer Gene Therapy 1: 51-64 (1994)）。ウイルスの宿主細胞範囲は、エンベロープ遺伝子（ｅｎｖ）によって決定され、種々の細胞特異性を有するｅｎｖ遺伝子の置換が採用され得る。また、エンベロープタンパク質内への適切なリガンドの組込みも、標的化に使用され得る。
【００６６】
組換えレトロウイルスベクターの投与は、任意の適当な手法によってなされ得る。かかる手法としては、例えば、患者の細胞のエキソビボ形質導入、組織内へのウイルスの直接注射、およびレトロウイルスプロデューサー細胞の投与が挙げられる。エキソビボアプローチには、単離と、患者細胞の組織培養物中での維持が必要とされる。この状況では、標的細胞に対するウイルス粒子の高比率が達成でき、したがって、形質導入効率が改善される（例えば、米国特許第5,399,346号（その開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと)。米国特許第4,650,764号には、レトロウイルス発現系の使用に関連する開示内容が含まれ、この参照特許の開示内容もまた、引用により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
場合によっては、インビボでのウイルスの直接導入が必要であるか、または好ましい。
レトロウイルスは、脳腫瘍を処置するために使用されており、この場合、レトロウイルスが分裂細胞（腫瘍細胞）のみに感染する能力が、特に好都合であり得る。
【００６８】
また、レトロウイルスプロデューサー細胞株を直接、患者の脳腫瘍内に投与することも提案されている（例えば、Oldfieldら、Hum. Gene Ther. 4: 39-69 (1993)参照）。かかるプロデューサー細胞は、脳腫瘍内で数日間生存し得、脳腫瘍の周囲で形質導入する能力を有するレトロウイルスを分泌し得る。
【００６９】
ポックスウイルスを主体とする発現系が報告されている(MossおよびFlexner, Annu. Rev. Immunol 5: 305-324 (1987)；Moss, B., In Virology, 1990, pp. 2079-2111)。例えば、ワクシニアは、エンベロープを有する大型のＤＮＡウイルスであり、感染細胞の細胞質内で複製される。多くの種々の組織の非分裂細胞および分裂細胞が感染し、組み込まれていないゲノムからの遺伝子発現が観察される。組換えウイルスは、導入遺伝子をワクシニア由来プラスミド内に挿入し、このＤＮＡでワクシニア感染細胞をトランスフェクトすると、感染細胞で相同組換えによりウイルス産生がもたらされることにより、作製され得る。大きな不都合点は、１５０〜２００種類のウイルスコードタンパク質に対する宿主免疫応答が惹起され、反復投与が問題となることである。
【００７０】
単純疱疹ウイルスは、二本鎖ＤＮＡの大型ウイルスであり、感染細胞の核内で複製される。このウイルスは、外因性核酸配列と関連する使用に適合可能である（KennedyおよびSteiner, Q. J. Med. 86: 697-702 (1993)参照）。利点としては、広い宿主細胞範囲、分裂細胞および非分裂細胞の感染、ならびに大きな配列の外来ＤＮＡが相同組換えによって該ウイルスゲノム内に挿入され得ることが挙げられる。不都合点は、ウイルス調製物を、複製能を有するウイルスや強力な免疫応答がないものにすることが困難なことである。ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の欠失によって、ウイルスは細胞内で複製欠損となり、チミジンキナーゼレベルが低くなる。活発な細胞分裂を行なっている細胞（例えば、腫瘍細胞）は、複製を可能にするのに充分なチミジンキナーゼ活性を有する。
【００７１】
さまざまな他のウイルス、例えば、ＨＩＶ、マウス微小ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびインフルエンザウイルスが、遺伝子導入のためのベクターとして開示されている（Jolly, D., Cancer Gene Therapy 1: 51-64 (1994)参照)。
【００７２】
本発明の組成物は、Ｉｉ発現を阻害するのに有効なものであって、配列番号：１４、１６および１７からの２種類の異なるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含み、該ＤＮＡ配列（１つまたは複数）がウイルスベクター内に存在するものを包含する。ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザ、およびレトロウイルスからなる群より選択され得る。
【００７３】
非ウイルスＤＮＡ送達ストラテジーもまた適用可能である。このようなＤＮＡ送達ストラテジーは、非複合体型プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ−脂質複合体、ＤＮＡ−リポソーム複合体、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡコート金粒子、およびＤＮＡコートポリラクチドコグリコリド粒子に関する。精製核酸は直接、組織内に注射され得、例えば、筋肉組織内で一過性の遺伝子発現をもたらし、筋肉の再生に特に有効である（Wolffら、Science 247: 1465-1468 (1990)）。Davisら（Hum. Gene Ther. 4: 733-740 (1993))により、成熟筋肉（骨格筋が一般に好ましい）内へのＤＮＡの直接注射が発表されている。
【００７４】
金粒子上のプラスミドＤＮＡは、遺伝子銃を用いて、細胞（例えば、表皮または黒色腫）内に「発射」され得る。ＤＮＡは、金粒子上に共沈殿させられ、次いで、電気スパークまたは噴射剤としての加圧ガスを用いて発射される（Fynanら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 11478-11482 (1993)）。エレクトロポレーションも、充実性腫瘍内へのＤＮＡ導入を可能にするために使用されており、マルチニードルアレイとパルス型で回転式の電界を用いたエレクトロポレーションプローブが使用される（Nishiら、Cancer Res. 56: 1050-1055 (1996)）。皮下腫瘍への高効率遺伝子導入について、有意な細胞トランスフェクションの増強と、腫瘍内注射手順よりも良好な分布特性が主張されている。
【００７５】
脂質媒介型トランスフェクションは、インビトロトランスフェクションとインビボトランスフェクションの両方に好ましい（Hortonら、J. Immunology 162: 6378 (1999)）。脂質−ＤＮＡ複合体は、市販の脂質（ＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬など）を用いて、注射の１〜５分前にＤＮＡと脂質とを混合することにより形成される。
【００７６】
リポソームは、親水性分子を疎水性分子で囲み、細胞侵入を助長することにより作用する。リポソームは、脂質から作製された単層(unilamellar)または多層(multilamellar)の球体である。脂質の組成および製造プロセスは、リポソーム構造に影響を及ぼす。他の分子が脂質膜に組み込まれることがあり得る。リポソームは、アニオン性またはカチオン性であり得る。Nicolauら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1068-1072 (1983))は、ラットに注射されたアニオン性リポソームからのインスリン発現に関する研究を発表した。アニオン性リポソームは、他に特に標的化されるものがない限り、主に肝臓の網内系細胞を標的化する。分子はリポソームの表面内に組み込まれ得、その挙動、例えば細胞選択的送達が改変され得る（WuおよびWu， J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987))。
【００７７】
Feignerら（Proc. Nat Acad. Sci. U.S.A. 84: 7413-7417 (1987))は、カチオン性リポソームに関する研究を発表し、静電気的相互作用による核酸との結合を示し、細胞侵入を示した。カチオン性リポソームの静脈内注射により、ほとんどの臓器において、臓器への求心性血液供給中に注射されると、導入遺伝子の発現がもたらされる。肺上皮を標的化するためには、カチオン性リポソームは、エーロゾルによって投与され得る（Brighamら、Am. J. Med. Sci. 298: 278-281 (1989))。カチオン性リポソーム導入遺伝子送達によるインビボ試験が、発表されている(例えば、Nabelら、Rev. Hum. Gene Ther. 5: 79-92 (1994)；Hydeら、Nature 362: 250-255 (1993)および；Conaryら、J. Clin. Invest 93: 1834-1840 (1994)参照)。
【００７８】
微粒子は、食作用性細胞へのＤＮＡの送達系として研究されている。かかるアプローチは、Pangaea Pharmaceuticalsによって報告された。かかるＤＮＡマイクロカプセル封入送達系は、ミクロスフェアを貪食する食作用性細胞（マクロファージなど）のより効率的な形質導入を行なうために使用されている。ミクロスフェアは、潜在的に免疫原性のペプチドをコードするプラスミドＤＮＡをカプセル封入するものであり、該ペプチドは、発現されると、ＭＨＣ分子による細胞表面上へのペプチドディスプレイをもたらすものであり、これにより、かかるペプチドおよび同じエピトープを含むタンパク質配列に対する免疫応答が刺激され得る。このアプローチは、現在、抗腫瘍／病原体ワクチンの開発における潜在的役割に対して意図されたものであるが、他の遺伝子療法適用の可能性も有し得る。
【００７９】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）への均質な自己集合能力を有する天然のウイルスコートタンパク質もまた、送達用ＤＮＡのパッケージングに使用されている。ヒトポリオーマウイルスの主な構造コートタンパク質（ＶＰ１）は、組換えタンパク質として発現され得、ＶＬＰへの自己集合の際にプラスミドＤＮＡをパッケージングする能力を有する。得られた粒子は、続いて、種々の細胞株に形質導入するために使用され得る。
【００８０】
また、ＤＮＡベクターにおける改善も行なわれており、おそらく非ウイルス送達系の多くに適用可能である。このようなものとしては、スーパーコイルミニサークル（これは、細菌の複製起点も抗生物質耐性遺伝子も有さず、したがって高レベルの生物学的封入を示すため、潜在的に安全である）、エピソーム発現ベクター（プラスミドが核内で増幅されるが染色体外では増幅されず、したがってゲノム組込み事象が回避される複製性エピソーム発現系）、およびＴ７系（厳密には、ベクター自体がファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現し、治療用遺伝子が、第１のプロモーターによって生成されたポリメラーゼを用いて第２のＴ７プロモーターから駆動される細胞質発現ベクター）の使用が挙げられる。ＤＮＡベクター技術に対する他のより一般的な改善点としては、高レベルの発現をもたらすためのシス作用性エレメント、細胞周期１回あたり１回の複製をもたらすためのアルフォイド（ａｌｐｈｏｉｄ）反復配列ＤＮＡ由来の配列および核内標的化配列の使用が挙げられる。
【００８１】
２種類の異なるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含む発現可能な構築物を投与することによりＩｉを阻害および／または癌を処置する本発明の方法は、該ＤＮＡ配列（１つまたは複数）が、カチオン性デンドリマー、脂質、リポソーム、金粒子、ポリラクチドコグリコリド粒子、およびポリアルキルオキシドコポリマーからなる群より選択される媒介物質を用いる方法によって細胞内に導入される実施形態を包含する。実施例のセクションの実施例１に、どのようにしてＤＮＡ配列を金粒子上の細胞に送達したかを詳細に記載する。
【００８２】
本発明のすべての実施形態において、１種類以上のｓｉＲＮＡを単一の分子構築物として提供することが可能である（例えば、両方のｓｉＲＮＡをコードする核酸を受容するのに充分な能力を有するウイルスベクター送達系を用いて）。この単一の分子構築物には、さらなる配列が含まれることがあり得る。あるいはまた、別々の発現構築物を用いて各ｓｉＲＮＡを担持させてもよい。独立した様式で送達される別々の構築物の場合、単一の抗原提示細胞が２種類の各構築物を取り込む可能性は、統計的確率上の問題である。さらに、単一のウイルス粒子内に２種類以上の構築物をパッケージングすることは、有害な免疫応答が生じるウイルスタンパク質の合成に対して治療上有効なＩｉ抑制の誘導を最大限にするという有用性を有する。かかる抗ウイルス免疫応答により、例えば、かかる治療的介入がなされ得る頻度を制限することができる。
【００８３】
非ウイルス送達系による導入にも、同様に具体的な考慮が必要とされる。非ウイルス送達系を使用することにより、非複合体型ＤＮＡ、ＤＮＡ−リポソーム複合体、ＤＮＡ−タンパク質複合体、およびＤＮＡコート金粒子が細胞内に送達され得る。このような方法は各々、利点と不都合点を有し、これらによって、具体的な病状に対する選択が支配される。複合体化されたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ−リポソーム複合体、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡコート金粒子、およびポリラクチドコグリコリド粒子内のマイクロカプセル封入体）の使用は、Ｉｉ発現のインヒビターをコードする両方の核酸配列が単一の細胞に送達されることを確実にする傾向があり得る。相違する分子種にコードされている場合であっても、これらは、「パッケージング」されている（例えば、リポソーム内にカプセル封入されているか、または金粒子上にコーティングされている）ため、両方の種が単一の細胞に送達される傾向があり得る。
【００８４】
ＤＮＡコート金粒子は、一般的には、いわゆる「遺伝子銃」技術を用いて弾動法によって送達される。この手法を用いて、金粒子が皮膚または筋肉組織内に発射され得、細胞への浸透に使用され得る。この浸透細胞は、この様式で導入された核酸配列を発現することが示されている。樹状細胞は、天然に存在する抗原提示細胞であり、この手法を用いて有効にトランスフェクトされ得る。かかる発現構築物は、例えば、単一の樹状細胞内に導入されると、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合した抗原提示細胞の表面上への目的抗原エピトープのディスプレイをもたらす。抗原提示細胞の表面上へのエピトープ／ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体のディスプレイにより、さらなる免疫細胞が刺激され、免疫応答の増強がもたらされる。
【００８５】
あるいはまた、画定された解剖学的位置を有する病状（例えば、原発腫瘍または新生物性疾患の一部の転移巣）に対処する場合、画定された解剖学的部位内への直接注射が指示され得る。かかる部位は、抗原提示細胞（樹状細胞など）が富化されている傾向にある。腫瘍は、かかる局所導入部位の一例である。Ｉｉ発現を阻害する構築物が、病態を示す細胞（例えば、腫瘍細胞）によって取り込まれた場合、該細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合したその細胞表面上に病態特異的エピトープをディスプレイする。このような細胞もまた、Ｔヘルパー細胞およびＢリンパ球を刺激するだろう。
【００８６】
上記のように、本発明は、さまざまな動物細胞型における、インビボまたはエキソビボのいずれかでのＩｉの阻害に関する。本発明の別の実施形態は、配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される任意の２種類の異なるｓｉＲＮＡを含む哺乳動物細胞を含む。本発明の別の実施形態は、配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される２種類の異なるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含む発現可能な構築物を含む哺乳動物細胞を含む。前述の２つの実施形態のいずれにおいても、哺乳動物細胞は癌細胞であり得る。ｓｉＲＮＡの組合せを含むか、または前記組合せをコードする発現可能なＤＮＡ構築物を含む３つの型の癌細胞を、実施例のセクションの実施例１〜４において作製した。本発明の哺乳動物細胞としては、該ＤＮＡ配列（１つまたは複数）がプラスミドまたはウイルスベクター内に存在しているものが挙げられる。哺乳動物細胞内のウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザ、およびレトロウイルスからなる群より選択され得る。
【００８７】
天然に存在する抗原提示細胞について、インビボ適用およびエキソビボ適用が包含される。本開示において、用語「標的化すること」は、場合によっては、抗原タンパク質または抗原タンパク質内の特定の抗原エピトープに対する免疫応答を指令することを示すために用いる。この免疫応答は、一つには、該応答の状況に応じて可変的にＴｈ１またはＴｈ２またはＴｈ３細胞であり得るＴ免疫調節細胞（Ｔヘルパー細胞またはＴサプレッサー細胞など）の活性化を特徴とする。例えば、Ｔｈ１応答は、腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答の発生に関してヘルパー応答であり、該応答によって腫瘍細胞の死滅がもたらされる。しかしながら、アレルゲンに対するＴｈ１応答は、機能的には、アレルゲンに対する応答のＴｈ２応答からの免疫的逸脱（ｉｍｍｕｎｏｄｅｖｉａｔｉｎｇ）に関して抑制応答であり得、該応答によって病原性のＩｇＥ抗体の産生がもたらされる。また、標的化の概念は、新規であるかまたは量が増加したＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープの提示によって刺激される免疫応答の最初の部分だけでなく、Ｔ免疫調節細胞に対する初期作用によって誘導または調節される下流のエフェクター応答も含む。したがって、例えば、標的化は、本明細書に教示した標的化方法によって開始され得るＣＴＬの抗癌応答または免疫グロブリン抗ウイルス応答を含む。
【００８８】
標的化は、抗原が、特定されたものであるか未知のものであるか、さらには必要以上の実験を行なわずに確認可能であるかを問わず、免疫応答が抗原に対するものであっるという概念を含む。例えば、標的化は、各々が免疫応答の発生に寄与し得る多数の抗原を発現し得る細胞に対するものであり得る。細胞内のどの特定の抗原が免疫応答に関与するかは、個体の遺伝子構成に応じて人によって異なり得る。遺伝因子に対する免疫応答の感受性は、充分報告されている。そのため、有用な治療目的または診断目的のための標的化方法の使用において、細胞の特異的抗原成分を特定する必要はなく、多くの場合、特定され得ない。
【００８９】
標的化のプロセスは、インビボまたはインビトロいずれかで行なわれるプロセスを含む。インビボでは、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞（これは、腫瘍細胞または樹状細胞のいずれかである）によって提示された抗原に対する免疫調節Ｔ細胞の活性化は、腫瘍でない位置または浸潤性腫瘍のいずれかで行なわれ得る。免疫応答のエフェクター部分の拡張も、同様に、インビボまたはインビトロのいずれかで行なわれ得る。インビトロ応答の場合、製剤が作製され得、これがその個体または選択された別の個体に再導入され、治療応答がもたらされ得る。かかる製剤の例としては、樹状細胞調製物、細胞傷害性Ｔ細胞調製物、および抗体（これは、インビトロ標的化対象培養物などからのＢ細胞クローニング後（例えば、Ｂ細胞ハイブリドーマの作製後）に生成されたものであってもよい）が挙げられる。
【００９０】
この目的のため、末梢血単核細胞を採取した個体への導入に所望される治療用製剤に応じて、元の培養物を分画して所望の細胞集団（例えば、樹状細胞またはＴリンパ球）を富化させることがあり得る。また、本明細書に教示した標的化プロセスを行なった後の培養物を、所望の細胞集団（例えば、樹状細胞またはＴリンパ球）について分画してもよい。単離直後であって本発明の標的化プロセスの前に、または該標的化プロセスを行なった後に、個体から採取した細胞の分画のための確立された方法が利用可能である。さらに、かかる製剤を、末梢血単核細胞を最初に採取した個体に導入するための確立された手順が利用可能である。この目的のため、本発明の方法は、標的化に関して、末梢血単核細胞に限定されず、個体から採取され得るあらゆる細胞の調製物（例えば、口腔咽頭部または他の領域由来の粘膜細胞、気管支または胃の洗浄後に得られた細胞、生検または任意の器官（例えば、肝臓、膵臓、前立腺、骨格筋、脂肪または皮膚由来の腫瘍組織または正常組織など）からの切除によって得られた細胞の細胞調製物）を包含する。
【００９１】
別の実施形態において、本発明は、免疫応答のために個体の細胞型を標的化するための方法であって、該細胞型が１種類以上の確認済または未知の抗原の発現を特徴とする方法を含む。該方法は、培養物中に、抗原提示細胞を含む個体の末梢血単核細胞を準備する工程と、ならびに該抗原提示細胞内に、配列番号：１４、１６および１７からなる群より選択される２種類の異なるｓｉＲＮＡを導入する工程とを含む。該ｓｉＲＮＡは、直接または間接的に該細胞内に導入され得、いずれの場合もＩｉの発現が阻害される。本発明の別の実施形態は、上記の細胞型を標的化するための方法であって、さらに、ｓｉＲＮＡを含む抗原提示細胞を治療効果のために個体に再導入することを含む方法を含む。本発明の方法は、標的化対象細胞が癌細胞である実施形態を含む。
【００９２】
エキソビボ適用に関して、腫瘍細胞は個体から単離され、エキソビボ培養物が確立される。かかる培養物は、個体から採取された悪性細胞（付随する正常細胞から分離したもの、または分離していないもの）の非選択集団から確立されたものであってもよく、あるいは細胞は、細胞株またはかかる細胞株のクローンとして得られたものであってもよい。あるいはまた、かかる細胞は、非親族の患者の確立された悪性細胞株から得られたもの、または新鮮悪性組織（例えば、結腸癌もしくは卵巣癌）の外植片として得られたものである。
【００９３】
ＩｉサプレッサーｓｉＲＮＡを培養細胞内に導入すると、腫瘍特異的または腫瘍関連抗原エピトープの所望のＭＨＣクラスＩＩ分子関連提示がもたらされる。このようにして処理された細胞は、複製不能状態にされ（例えば、放射線照射または固定によって）、慣用的な免疫処置プロトコル（例えば、皮下、静脈内、腹腔内または筋肉内免疫処置）に使用される。完全体細胞の製剤に加え、その誘導体である他のものも免疫処置製剤に使用され得る。
【００９４】
多くの腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子およびＩｉに陰性であるが、一部の腫瘍（例えば、ある種のリンパ腫、黒色腫および腺癌（例えば、乳房、肺および結腸を冒すもの））は、ＭＨＣクラスＩＩ分子陽性かつＩｉ陽性であることは、よく知られている。ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するこのサブセットでは、所望の免疫刺激を得るのに、Ｉｉサプレッサーのみの導入で充分なはずである。かかる細胞内にＭＨＣクラスＩＩ分子の誘導物質を含めることは、ＭＨＣクラスＩＩ分子関連抗原とのＴヘルパー細胞相互作用の可能性を増大させることにより、所望の刺激を増強し得ることが認識されよう。
【００９５】
ＤＮＡワクチンウイルスおよびＲＮＡワクチンウイルスはともに、感染細胞におけるＩｉタンパク質発現の抑制をもたらすｓｉＲＮＡの発現のための構築物を含むものであり得る。ＤＮＡウイルス（ワクシニアなど）の場合、該遺伝子は、古典的な哺乳動物プロモーター（ＣＭＶ、ＲＳＶ、Ｕｂｃ、ＥＦ−１αおよびＵ６など）の制御下にある。ＲＮＡウイルス、例えばインフルエンザの場合は、挿入された構築物のＲＮＡからの翻訳は、ＲＮＡの転写と翻訳の機構を媒介するインフルエンザウイルス酵素によって発現される。ワクチンウイルスは、感染細胞内でのＩｉタンパク質の発現を抑制する能力により、Ｉｉタンパク質およびＭＨＣクラスＩＩ分子を既に内因的に発現している細胞型に標的化される。かかる細胞型としては、皮膚のランゲルハンス細胞、皮膚内または気道もしくは腸の粘膜表面内の他の樹状細胞、あるいは骨髄から分離された可能性があるもの、あるいは骨髄または脾臓から採取されたもの、末梢血または他の体液（腹腔、胸膜腔、心膜腔もしくは他の体腔において生起もしくは誘導された滲出液もしくは漏出液など）のマクロファージが挙げられる。さらなる細胞型としては、Ｂ細胞、Ｂ細胞系白血病およびリンパ腫、ならびに活性化によってＭＨＣクラスＩＩ分子およびＩｉタンパク質を発現するようになった細胞（一部のＴ細胞サブセットおよび形質転換された悪性または正常細胞など）が挙げられる。
【００９６】
これらのＤＮＡまたはＲＮＡウイルスの例の構築は、標準的な分子生物学的手法によりなされ得る。Ｉｉ特異的ｓｉＲＮＡをコードするｃＤＮＡは、標準的な分子クローニング法を用いて、ワクシニア、カナリア痘または他のＤＮＡウイルスをコードするプラスミドに導入され得る（Panicali D. Proc Natl Acad Sci USA. 1982；16: 4927-31)。インタクトなワクシニアウイルスＤＮＡならびにＩｉ特異的ｓｉＲＮＡ発現カセットは、ウイルス配列によりフランキングされたベクター内にクローニングされ得る。クローニングされたＩｉ特異的ｓｉＲＮＡ発現カセット間の相同組換えが起こることがあり得、新規なウイルスは、適切な条件下で選択され得る（Panicali D. Proc Natl Acad Sci USA. 1982；16: 4927-31；Marti W R. Cell Immunol. 1997: 179: 146-52；Bertley F M N. J. Immunol. 2004；172: 3745-57)。組換えRNAウイルスも同様に、ウイルスｃＤＮＡをコードするプラスミドを用いて構築され得る。Ａ型インフルエンザウイルスのためのプラスミド系逆遺伝子解析系が開発されている（Pleschka S. J Virol 1996；70: 4188-92)。この系では、ウイルスＲＮＡを発現させる切断型ヒトポリメラーゼＩプロモーターを含むプラスミドが使用される。Ｉｉ特異的ｓｉＲＮＡ発現カセットは、インフルエンザＨＡまたはＮＡ遺伝子をコードするプラスミド内にクローニングされ得る。該ウイルスゲノムの全８セグメントをコードするプラスミドが、組織培養細胞内にコトランスフェクトされ得、感染性の組換えウイルスを回収し、これがワクチン接種の目的に使用され得る。あるいはまた、Ｉｉ特異的ｓｉＲＮＡをコードする組換えプラスミドが、インフルエンザヘルパーウイルスを用いて感染させた細胞株内にトランスフェクトされ得る。ある選択方法を使用し、遺伝子操作されたトランスフェクタントウイルスを含むウイルスが、単離され得る（Palese P. J. Virol. 1996；93: 11354-8)。このような種々の構築物の設計および調製、ならびにワクチンとしての該構築物の適用は、下記の米国特許の材料および方法により行なわれ得る。米国特許第5,976,552号、米国特許第5,292,506号、米国特許第4,826,687号、米国特許第6,740,325号、米国特許第6,651,655号、米国特許第5,948,410号、米国特許第5,824,536号、米国特許第4,029,763号、米国特許第4,009,258号、米国特許第668,463号、米国特許第667,611号、米国特許第6,623,962号、および米国特許第6,506,559号。
【００９７】
本発明の別の実施形態は、２種類の異なるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含む発現可能な構築物を投与することにより、細胞内でＩｉを抑制する方法であって、ｓｉＲＮＡをコードする該ＤＮＡ配列（１つまたは複数）が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結されている方法を含む。該方法は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、ＣＭＶまたはＥＦ−１αである実施形態を含む。Ｉｉ発現を抑制したｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、実施例１〜４ではＣＭＶプロモーターに連結させたものであり、実施例３〜４ではＥＦ−１αプロモーターに連結させたものであった（以下の実施例のセクションに詳述）。発現可能な構築物は、ＣＭＶプロモーターによって駆動させた場合、試験したすべての型の癌で、Ｉｉの阻害において好成績であった。本発明の方法は、発現可能なＤＮＡ構築物によりＩｉを抑制するものであって、細胞が癌細胞であり、プロモーターがＣＭＶであり、癌がＡＭＬ、前立腺癌またはＢ細胞リンパ腫であるものを含む。発現可能な構築物に連結させたプロモーターをＥＦ−１αとした場合、Ｉｉは、ＡＭＬおよび前立腺癌において好成績で抑制された。本発明の方法は、Ｉｉを抑制するものであって、細胞が癌細胞であり、プロモーターがＥＦ−１αであり、癌がＡＭＬまたは前立腺癌であるものを含む。また、本発明は、Ｉｉ発現を阻害するのに有効な２種類の異なるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含む組成物であって、該ＤＮＡ配列（１つまたは複数）がＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えば、ＣＭＶまたはＥＦ−１αプロモーターに作動可能に連結されている組成物を含む。
【実施例】
【００９８】
［ｓｉＲＮＡプラスミドによるヒト細胞におけるＩｉの阻害］
１０種類のＩｉ−ｓｉＲＮＡ構築物を作製した。これらは米国特許出願第10/999,208号に記載されている。これらの単独のｓｉＲＮＡ構築物を、非癌性ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株においてＩｉ発現の阻害について試験した。
【００９９】
［ｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）構築物の設計］
１０種類のｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）構築物を設計した。これらの構築に使用したオリゴヌクレオチドを表１に示す。構築物は、ｓｉＲＮＡのクローニングのために特別に設計されたｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＡｄｅｎｏプラスミド（Ｉｍｇｅｎｅｘ．サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて作製した。このプラスミドは、ｓｉＲＮＡ発現に対して最適化されたＣＭＶプロモーターを含み、ｓｉＲＮＡ配列の挿入のための簡便なクローニング部位を提供し、さまざまな細胞への送達を可能にする。さらに、このプラスミドはまた、ｓｉＲＮＡ発現構築物を含む組換えアデノウイルスの構築に対しても使用され得る。これらのｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）構築物の設計では、２つのアプローチに従った。まず、Ｉｍｇｅｎｅｘコンピュータプログラムを用いて５種類の構築物（表１の構築物１１〜１５）を予測した。このプログラムにより、Ｉｉ  ＲＮＡにハイブリダイズしそうな基本組成（すなわち、適切なＧ−Ｃ含量など）を有するＲＮＡ配列が特定される。得られた５種類のｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）構築物は、実際にＩｉ  ｍＲＮＡとハイブリダイズするならば、強力なインヒビターであることが予測される。しかしながら、任意の所与のｍＲＮＡの３次構造を予測することは困難なため、かかるコンピュータ設計ｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）構築物は、実験によってＩｉ  ｍＲＮＡに到達可能でないとされる場合がみられ得る。したがって、さらに５種類の構築物（表１の構築物１６〜２０）の設計において、第２のアプローチもまた使用した。Ｉｉタンパク質の発現を阻害するためのＩｉ−ＲＧＣの使用に関する先のデータにおいて、一部のＩｉアンチセンスオリゴヌクレオチド（Qiu Cancer Imm Immunother. 48: 499-506 (1999)(Xu 米国特許第6,368,855号)およびＩｉ逆遺伝子構築物（RGC；Lu Cancer Immunol Immunother. 52: 592-598 (2003))（米国特許第10/127,347号）は、ヒトＩｉ  ｍＲＮＡの最初の４００ｂｐにハイブリダイズすること、およびその結果としての強力なＩｉタンパク質発現の阻害が示されていた。このデータから、ヒトＩｉ  ｍＲＮＡのこの領域は、ｓｉＲＮＡ構築物に到達する可能性が高いはずであることが推測され得る。さらに、この提案は、翻訳を開始させるＡＵＧ部位を含むｍＲＮＡ領域が、一般に、ｍＲＮＡに結合するアンチセンス構築物に対して感受性の領域であるという文献のデータと整合する。したがって、検討により、さらに５種類のｓｉＲＮＡ構築物を設計してヒトＩｉ  ｍＲＮＡの最初の４００ｂｐ以内のＡＵＧ開始部位近傍のＩｉ  ｍＲＮＡの部分にハイブリダイズさせた。ヒトＩｉ  ｍＲＮＡの最初には２つのＡＵＧが存在し、これらはともに機能性の翻訳開始部位であると思われるため、ｓｉＲＮＡ配列は、これらの両方の部位を標的化するように設計した。具体的には、最初のＡＵＧの近傍に２つのオーバーラップ配列を設計し、第２のＡＵＧの近傍に３つのオーバーラップｓｉＲＮＡ配列を設計した。これらの５種類のｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）配列は、最適なアニーリングパラメータを有するものでない可能性はあるが、Ｉｉ  ＲＮＡとハイブリダイズすることが予測され得る。配列はすべて、発現されたｓｉＲＮＡ配列のヘアピン形成を可能にする短鎖ループ配列を用いて設計した。ヘアピンの形成により、機能性の二本鎖ｓｉＲＮＡが生��る。標的ｍＲＮＡと相互作用し、これを切断するＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の形成における二本鎖ＲＮＡの必要性が、明白に示された（Nature Reviews Genetics 2: 110-119, 2001)。
【０１００】
二本鎖オリゴヌクレオチドは、それぞれ上術するようにセンス鎖と相補鎖のｓｈＲＮＡ（短鎖ヘアピンＲＮＡ）をコードする２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることによって作製される。アニーリングされたオリゴヌクレオチドは、「ｔｃｇａ」（上記）および「ｇａｔｃ」突出端を有し、線状化pSuppressorAdenoベクター内へのクローニングを補助する。下記の表１において、センス配列には一重下線を施している。ループ配列は太字である。逆配列には二重下線を施している。
【０１０１】
【表１】
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【０１０２】
ｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）構築物の作製
１０種類のｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）構築物を、標準的な分子生物学的手法に従い、Ｓａｌ１およびＸｂａ１酵素部位を用いて、上記の配列をｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＡｄｅｎｏプラスミド（Ｉｍｇｅｎｅｘ、サンディエゴ、カリフォルニア州）内にクローニングすることにより作製した。２９３ヒト腎臓細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）の細胞を、これらの各Ｉｉ  ｓｉＲＮＡ構築物（０．８２μｇ）を有するヒトＩｉ  ｃＤＮＡ遺伝子プラスミド（０．１８μｇ）とともにコトランスフェクトした。いくつかの活性なＩｉ  ｓｉＲＮＡ構築物を規定した。
【０１０３】
［腫瘍細胞におけるＩｉ−ＲＮＡｉ関与Ｉｉ抑制］
【０１０４】
（実施例１）  Ｉｉ−ｓｉＲＮＡ構築物によるＲａｊｉ細胞でのＩｉ阻害
本発明では、上記の表１に示した１０種類のＩｉ−ｓｉＲＮＡ構築物を使用し、ヒトリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞をトランスフェクトした。Ｒａｊｉ細胞内へのＩｉ−ｓｉＲＮＡ構築物のトランスフェクションには、遺伝子銃送達法を使用した。Ｉｉ−ｓｉＲＮＡ配列を、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＡｄｅｎｏベクター（Ｉｍｇｅｎｅｘ、サンディエゴ）内にクローニングした（ＣＭＶ／Ｉｉ−ｓｉＲＮＡと称する）。このプラスミドＤＮＡを、金微粒子上に沈降させた。金マイクロキャリア（カートリッジ１つに対して０．５ｍｇの１μｍ金微粒子）を、超音波処理によって１００μｌの０．１Ｍスペルミジン中に懸濁させた。表示した量のプラスミドＤＮＡ（カートリッジの所望数による）を、内毒素無含有水中１ｍｇ／ｍｌの濃度で添加し、超音波処理し、２００μｌの１Ｍ  ＣａＣｌ２を滴下した。この金−ＤＮＡ混合物を１０分間放置した後、１ｍｌの１００％エタノールで３回洗浄した。最後の洗浄後、ペレットを適切な容量（金微粒子の所望量による）の０．０２ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）含有１００％エタノール中に再懸濁させ、１５ｍｌ容チューブに移した。すると、カートリッジ１つあたり０．５ｍｇの金のマイクロキャリア負荷量（ＭＬＱ）および可変ＤＮＡ負荷比（ＤＬＲ）であった。１ｍｌのＤＮＡ／マイクロキャリア懸濁液で、１７個のコーティングされた０．５インチカートリッジが作製され、これらを使用前に、乾燥剤を用いて４℃で一晩保存した。Ｒａｊｉ細胞のトランスフェクションには、１０６Ｒａｊｉ細胞を含む２０μｌの媒体を組織培養皿上の直径約０．８ｃｍの領域に塗布し、次いで、０．５インチカートリッジによる遺伝子銃射撃に供した（３５０〜４００ｐｓｉのヘリウム圧を使用）。トランスフェクション後、細胞をさらに３６〜４８時間培養した。次いで、細胞を収集し、洗浄し、抗ＨＬＡ−ＤＲおよび抗ヒトＩｉモノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析し、ＨＬＡ−ＤＲ＋／Ｉｉ−細胞の割合を求めた。Ｒａｊｉ細胞におけるＩｉ阻害を表２に示す。表２から、Ｉｉ−ｓｉＲＮＡ配列番号１４、番号１６および番号１７は、Ｒａｊｉ細胞におけるＩｉ発現の阻害において活性であることがわかる。この阻害は、ＭＨＣクラスＩＩ分子提示が、これらのＩｉ−ｓｉＲＮＡ構築物によって明らかには影響されていないため、Ｉｉ特異的である。
【０１０５】
【表２】
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【０１０６】
（実施例２）  Ｉｉ−ｓｉＲＮＡ構築物の単独または組合せでの使用によるＲａｊｉ細胞でのＩｉ阻害
別の実験において、活性なＣＭＶ／Ｉｉ−ｓｉＲＮＡ構築物（表２の配列番号１４、番号１６および番号１７を含む）を、さらに、別々に（１μｇ／トランスフェクション）または組合せて（０．５μｇ＋０．５μｇ／トランスフェクション）使用し、Ｒａｊｉ細胞においてＩｉ発現を阻害した。金微粒子上へのプラスミドＤＮＡコーティングおよびトランスフェクションの手順は、表２の実験のものと同じとした。Ｒａｊｉ細胞をトランスフェクションの３６〜４８時間後に収集し、洗浄し、抗ＨＬＡ−ＤＲおよび抗ヒトＩｉ抗体で染色した。結果を表３に示す。表３から、配列番号１４と番号１７を含むプラスミドの組合せの使用で、Ｒａｊｉ細胞における最も著しいＩｉ阻害が得られたことがわかり、これは、Ｉｉ遺伝子の異なる部位に標的化されるＩｉ−ｓｉＲＮＡ配列の組合せの使用によって、単独のＩｉ−ｓｉＲＮＡ構築物の使用よりも有効なＩｉ阻害がもたらされることを示す。配列番号１４と番号１６または配列番号１６と番号１７を含むプラスミドの組合せの使用では、配列番号１４と番号１７を含むプラスミドの組合せの使用と比べて低いＩｉ阻害がもたらされ、これは、後者の組合せが最良の組合せであることを示す。
【０１０７】
【表３】
2010521460.tif 000004
【０１０８】
（実施例３）  ＣＭＶ／Ｉｉ−ｓｉＲＮＡおよびＥＦ−１α／ｓｉＲＮＡ構築物によるＫＧ−１（ＡＭＬ）細胞でのＩｉ阻害
２つの最も活性な（Ｒａｊｉ細胞において）Ｉｉ−ｓｉＲＮＡ配列番号１４と番号１７（表２参照）を、ＥＦ−１αプロモーターによって駆動されるｐＢｕｄＣＥ４．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）内にさらにクローニングした（ＥＦ−１α／Ｉｉ−ｓｉＲＮＡと称する）。これを行なうため、２種類のオリゴヌクレオチド対をまずアニーリングさせてオーバーヘッドＢｇｌ  ＩＩおよびＮｏｔ  Ｉクローニング部位を有する番号１４および番号１７（表２）のＤＮＡ配列に対応する２つの二本鎖ＤＮＡ配列とした。Ｉｉ−ｓｉＲＮＡ配列は、ＥＦ−１αプロモーターによって駆動させた。得られたプラスミドを配列決定によって確認した。ＫＧ−１細胞（ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株）を使用し、ＣＭＶまたはＥＦ−１αいずれかのプロモーターによって駆動される２種類の活性なＩｉ−ｓｉＲＮＡプラスミドの活性を調べた。金微粒子上へのプラスミドコーティングの手順および遺伝子銃関与トランスフェクションの手順は、Ｒａｊｉ細胞のトランスフェクションと同じとした。トランスフェクション後、ＫＧ−１細胞を３６〜４８時間さらに培養し、細胞を収集し、洗浄し、抗ヒトＩｉモノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析し、Ｉｉ陰性細胞の割合を求めた。表４に示されるように、ＣＭＶ／Ｉｉ−ｓｉＲＮＡおよびＥＦ−１α／Ｉｉ−ｓｉＲＮＡ構築物は、ＫＧ−１細胞においてほぼ同程度に活性であった。違いは、コーティングおよびトランスフェクションの差異の反映であり得る。ＣＭＶ駆動プラスミドは、ｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＡｄｅｎｏベクターであり、一方、ＥＦ−１α駆動プラスミドは、ＰＢｕｄＣＥ４．１ベクターであった。
【０１０９】
【表４】
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【０１１０】
（実施例４）  ＣＭＶ／Ｉｉ−ｓｉＲＮＡおよびＥＦ−１α／ｓｉＲＮＡ構築物によるＰＣ−３細胞でのＩｉ阻害
ＣＭＶ／Ｉｉ−ｓｉＲＮＡおよびＥＦ−１α／Ｉｉ−ｓｉＲＮＡ構築物の活性を、前立腺癌細胞においてさらに試験した。ＰＣ−３前立腺癌細胞をＣＭＶ／ｐ７（ｐ７＝配列番号１７）およびＥＦ−１α／Ｐ７プラスミドで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）法により、製造業者の使用説明書に従ってトランスフェクトした。結果（表５）は、ＰＣ−３細胞において、ＣＭＶプロモーターがＥＦ−１αプロモーターよりもずっと活性であることを示す（ＣＭＶ／ｐ７とＥＦ−１α／ｐ７を比較）。この結果は、プロモーターの活性が細胞型特異的であることを示す。この試験のデータ全般は、ＣＭＶプロモーターが、試験したすべての型の細胞において活性なプロモーターであることを示す。また、ＥＦ−１αプロモーターも、試験したすべての型の細胞において活性であるが、前立腺癌細胞でのＥＦ−１αプロモーターの活性は、ＣＭＶプロモーターよりもずっと低い。
【０１１１】
【表５】
2010521460.tif 000006
【配列表】
2010521460000001.app
【国際調査報告】
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