(57)【要約】  ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールへの生合成経路の活性の改良、およびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性の減弱によって特徴づけられる、炭素源からの１，２−プロパンジオールの製造に有用な微生物。本発明はまた、本発明の微生物を用いた発酵により１，２−プロパンジオールを製造する方法に関する。
2010521190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源からの１，２−プロパンジオールの製造に有用な微生物であって、
・ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールへの生合成経路の活性の増強、および
・グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性の減弱
によって特徴づけられる、微生物。
【請求項２】
ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールへの生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素の活性を増強するように遺伝子操作されている、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
少なくとも１つの酵素の活性の増強が、該酵素をコードする遺伝子の発現を増強することにより得られる、請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
ｍｇｓＡ、ｙａｆＢ、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺ、ｙｑｈＥ、ｙｑｈＤ、ｙｄｈＦ、ｙｃｄＷ、ｙａｊＯ、ｙｄｊＧ、ｙｄｂＣ、ｔａｓ、ｇｌｄＡおよびｆｕｃＯからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が増強されている、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
３つの遺伝子：ｍｇｓＡ、ｙｑｈＤおよびｇｌｄＡの発現が増強されている、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
Entner-Doudoroff経路に関与する少なくとも１つの酵素の活性が減弱されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項７】
次の遺伝子：ｅｄｄ、ｅｄａの少なくとも１つの発現が減弱されている、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
メチルグリオキサールから乳酸への変換に関与する少なくとも１つの酵素の活性が減弱されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項９】
次の遺伝子：ｇｌｏＡ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢの少なくとも１つの発現が減弱されている、請求項８に記載の微生物。
【請求項１０】
乳酸、ギ酸またはエタノールの合成に関与する少なくとも１つの酵素の活性が減弱されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
次の遺伝子：ｌｄｈＡ、ｐｆｌＡ、ｐｆｌＢ、ａｄｈＥの少なくとも１つの発現が減弱されている、請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
酢酸の合成に関与する少なくとも１つの酵素の活性が減弱されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１３】
次の遺伝子：ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢの少なくとも１つの発現が減弱されている、請求項１２に記載の微生物。
【請求項１４】
糖移入の効率が高められている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１５】
ホスホエノールピルビン酸とは独立の糖移入系が用いられる、請求項１４に記載の微生物。
【請求項１６】
ｇａｌＰおよびｇｌｋから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が増強されている、請求項１５に記載の微生物。
【請求項１７】
糖ホスホトランスフェラーゼ系の効率が、代謝産物ホスホエノールピルビン酸のアベラビリティーを高めることによって増強されている、請求項１４に記載の微生物。
【請求項１８】
少なくとも１つのピルビン酸キナーゼの活性が減弱されている、請求項１７に記載の微生物。
【請求項１９】
ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱されている、請求項１８に記載の微生物。
【請求項２０】
ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性が増強されている、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２１】
ｐｐｓＡ遺伝子の発現が増強されている、請求項２０に記載の微生物。
【請求項２２】
ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの代謝に有利な酵素が、非修飾酵素よりもＮＡＤＨによる阻害に対して低い感受性を有する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２３】
遺伝子ｌｐｄが、アラニン５５のバリンでの置換をもたらす点突然変異を有する、請求項２２に記載の微生物。
【請求項２４】
ａｒｃＡおよびｎｄｈから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱されている、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２５】
細菌、酵母および真菌からなる群から選択される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２６】
内細菌科、バチルス科、クロストリジウム科、ストレプトミセス科およびコリネバクテリア科からなる群から選択される、請求項２５に記載の微生物。
【請求項２７】
大腸菌またはクロストリジウム・アセトブチリカムのいずれかである、請求項２６に記載の微生物。
【請求項２８】
１，２−プロパンジオールを製造するための方法であって、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の微生物が炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖され、生成した１，２−プロパンジオールが回収される、方法。
【請求項２９】
微生物が大腸菌(Escherichia coli)であり、炭素源が単純炭素源である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
微生物がクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)であり、炭素源が複合炭素源である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
回収された１，２−プロパンジオールがさらに精製される、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は１，２−プロパンジオールの製造のための代謝的に操作された微生物およびその使用に関する。
【０００２】
Ｃ３ジアルコールである１，２−プロパンジオールすなわちプロピレングリコールは、広く用いられている化学物質である。これは、不飽和ポリエステル樹脂、液体洗剤、冷却剤、不凍剤および航空機の徐氷液の成分である。プロピレングリコールは、プロピレン誘導体より有毒であると認識されているエチレン誘導体の代わりとして１９９３〜１９９４年以来、使用が増えてきた。
【０００３】
１，２−プロパンジオールは現在、大量の水を消費するプロピレンオキシド水和法を用いた化学的手段により製造されている。プロピレンオキシドは、一方はエピクロロヒドリンを用い、他方はヒドロペルオキシドを用いる２つの方法のいずれかよって製造することができる。両経路とも、毒性が強い物質を用いる。さらに、ヒドロペルオキシド経路は、ｔｅｒｔ−ブタノールおよび１−フェニルエタノールなどの副生成物を生じる。プロピレンの産生を有利にするためには、これらの副生成物の用途を見出さなければならない。この化学的経路は一般的にラセミ１，２−プロパンジオールを生成するが、２つの立体異性体（Ｒ）１，２−プロパンジオールおよび（Ｓ）１，２−プロパンジオールはそれぞれ、ある特定の適用に関して注目されるものである。
【０００４】
これら１，２−プロパンジオールの製造のための化学法の欠点は、生合成を魅力的な選択肢とする。微生物による糖からの１，２−プロパンジオールの天然生産に関して２つの経路が同定されている。
【０００５】
１つ目の経路では、６−デオキシ糖（例えば、Ｌ−ラムノースまたはＬ−フコース）がジヒドロキシアセトンリン酸および（Ｓ）−ラクトアルデヒドに開裂され、さらに（Ｓ）−１，２−プロパンジオールへと還元することができる(Badia et al, 1985)。この経路は大腸菌(E. coli)で機能するものの、デオキシヘキソースのコストが高いために経済上実現可能な方法をもたらすことはできない。
【０００６】
２つ目の経路は、解糖経路、次いでメチルグリオキサール経路を介した汎用糖（例えば、グルコースまたはキシロース）の代謝である。ジヒドロキシアセトンリン酸はメチルグリオキサールへ変換され、これがラクトアルデヒドまたはアセトールのいずれかへ還元することができる。その後、これら２つの化合物は２回目の還元を受け、１，２−プロパンジオールを生じ得る。この経路は、クロストリジウム・スフェノイデス(Clostridium sphenoides)およびサーモアナエロバクター・サーモサッカロリチカム(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)などの天然（Ｒ）−１，２−プロパンジオール生産株によって用いられている。クロストリジウム・スフェノイデスは、リン酸制限条件下、１．５８ｇ／ｌの力価で１，２−プロパンジオールを産生するために用いられている(Tran Din and Gottschalk, 1985)。また、サーモアナエロバクター・サーモサッカロリチカムも、１，２−プロパンジオールの生産に関して検討されてきた(Cameron and Cooney, 1986, Sanchez-Rivera et al, 1987)。得られた最高性能は力価９ｇ／ｌであり、０．２ｇ／ｇのグルコースからの収率であった。しかしながら、これらの生物で得られる性能の改良は、利用可能な遺伝的手段が不足しているために限られていると思われる。
【０００７】
先行技術
Cameron et al (1998)は、糖の１，２−プロパンジオールへの変換に関して代謝操作するためのプラットフォームとしての使用を検討した。彼らの理論分析は、現実的な生成物収率の上限（質量バランスと増殖のためのエネルギーの生産を考慮）は培養条件によって著しく異なる。嫌気性条件下では、減少した補因子を再循環させるために副生成物として酢酸が生成され、最良の収率はグルコース１モル当たり１，２−プロパンジオール１モル（０．４２ｇ／ｇ）に限定されるはずである。好気性条件下では、補因子の再循環は末端電子受容体として酸素を用いる呼吸鎖によって確保されるはずであり、副生成物を生じずに１，２−プロパンジオールを生産することが可能となる。これらの条件下では、収率は良くて１．４２ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．６ｇ／ｇ）に達し得る。Cameron et alは、１，２−プロパンジオールの最大力価を考慮して、生成物および副生成物の毒性へのその依存を考察した。１，２−プロパンジオールは１，３−プロパンジオールよりも著しく毒性が低く、大腸菌(E. coli)は１００ｇ／ｌ  １，２−プロパンジオールで、０．５／時の増殖速度の残存を示す。この増殖の阻害は、増殖阻害性が高いことが知られている副生成物の酢酸によるものである可能性が高い。高い力価および収率で１，２−プロパンジオールを製造するための嫌気性プロセスの開発では、この酢酸の問題に取り組まなければならない。酢酸の、阻害性がより低く、in situで容易に除去できるアセトンへの変換が提案されている（ＷＯ２００５／０７３３６４）。
【０００８】
単純炭素源を用いて１，２−プロパンジオール生産株を得るための大腸菌の遺伝的改変に関するいくつかの検討がCameronのグループ(Cameron et al, 1998, Altaras and Cameron, 1999, Altaras and Cameron, 2000)およびBennettのグループ(Huang et al, 1999, Berrios-Rivera et al, 2003)によって行われた。これらの研究は、一方では、ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールへの経路における１つ、またはいくつかの酵素活性に頼り、他方では、宿主株におけるＮＡＤＨおよび炭素消費経路の除去に頼るものである。Cameronのグループによって得られた最良の結果は、嫌気的フラスコ培養における１．４ｇ／ｌの１，２−プロパンジオールの生産であり、グルコース消費１ｇ当たり０．２ｇの収率であった。嫌気性流加発酵槽に外挿すると、生産量は１，２−プロパンジオール４．５ｇ／ｌであり、グルコース１ｇ当たり０．１９ｇの収率であり、それらの理論的期待値からかけ離れていた。これらの性能は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）を欠いた株における、大腸菌のメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子（ｍｇｓ）、大腸菌のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｌｄＡ）および大腸菌の１，２−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子（ｆｕｃＯ）の過剰発現を用いて得られたものである。力価および収率は低いが、同じアプローチを用いて得られた結果が米国特許第６，０８７，１４０号、同第６，３０３，３５２号およびＷＯ９８／３７２０４にも記載されている。
【０００９】
Bennettのグループも、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)由来のｍｇｓ遺伝子および大腸菌由来のｇｌｄＡ遺伝子の過剰発現のためにｌｄｈＡ欠損大腸菌宿主株を用いた。嫌気条件下でのフラスコ培養では力価１．３ｇ／ｌおよび収率０．１２ｇ／ｇであったが、微好気培養では力価１．４ｇ／ｌであり、収率は０．１３ｇ／ｇであった。
【００１０】
この段階では、これらの結果は全て、Ｔ．サーモサッカロリチカム種で得られたものほど良くはない。
【００１１】
大腸菌(E. coli)における解糖経路を介したグルコースの異化作用は、フルクトース１，６ビスリン酸の開裂後に、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）とグリセルアルデヒド３リン酸の２種類のトリオースリン酸分子をもたらす。これら２種類のトリオースリン酸分子はトリオースリン酸イソメラーゼ活性によって相互変換され得る。一般に、ＤＨＡＰはＧＡ３Ｐへ変換され、グルコースに起源するこの２つのＧＡ３Ｐがさらに異化されると認識されている。
【００１２】
グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨとも呼ばれる）は、グルコースの、ピルビン酸への解糖変換に関与する重要な酵素の１つである。ＧＡＰＤＨは次の反応を触媒する：
グリセルアルデヒド３−リン酸＋リン酸＋ＮＡＤ＋→１，３−ビスホスホグリセレート＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋。
【００１３】
この酵素をコードする遺伝子は１９８３年に大腸菌でクローニングされており(Branlant et al., Gene., 1983)、「ｇａｐ」と命名された。その後、同じ酵素活性を有する生成物をコードする別の遺伝子が同定され、ｇａｐＢと命名された(Alefounder et al., Microbiol., 1987)。ｇａｐＡおよびｇａｐＢ遺伝子を欠いた大腸菌株を特性決定したところ、ｇａｐＡは解糖に不可欠であるが、ｇａｐＢは無くてもよいことが示された(Seta et al., J. Bacter., 1997)。特許出願ＷＯ２００４／０３３６４６では、発酵によるグルコースからの１，３−プロパンジオールの生産に関して、ｇａｐＡ遺伝子がダウンレギュレートされた微生物が報告されている。
【００１４】
本発明者らは、１，２−プロパンジオール収量の増大を得るには、
・１，２−プロパンジオールの生合成経路の活性化の増強と
・ＧＡＰＤＨ活性の減弱
の、２つの因子の組合せが必要であることを示した。
【００１５】
発明者らはまた、細胞内ホスホエノールピルビン酸濃度の増加または選択的糖輸送系の使用が、微生物の発酵による１，２−プロパンジオール生産をさらに押し上げることがきできることを示す。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、炭素源からの１，２−プロパンジオールの製造に有用な微生物に関し、該微生物は、
ａ）ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールへの生合成経路の活性の増強、および
ｂ）グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性の減弱
によって特徴づけられる。
【００１７】
ＤＨＡＰから１，２−プロパンジオールへの生合成経路の活性の向上は、該生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素の活性を増強することによって得られる。これは、該酵素をコードする遺伝子の発現、特に、ｍｇｓＡ、ｙｑｈＤ、ｙａｆＢ、ｙｃｄＷ、ｙｑｈＥ、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺ、ｙａｊＯ、ｔａｓ、ｙｄｊＧ、ｙｄｂＣ、ｇｌｄＡおよびｆｕｃＯから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増強することによって得ることができる。好ましくは、３つの遺伝子ｍｇｓＡ、ｙｑｈＤおよびｇｌｄＡの発現が増強される。
【００１８】
本発明のさらなる態様において、Entner-Doudoroff経路がｅｄｄ遺伝子またはｅｄａ遺伝子のいずれか、または双方を欠失させることによって削除される。さらに、メチルグリオキサールからの乳酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ｇｌｏＡ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢなど）、ピルビン酸からの乳酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ギ酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ｐｆｌＡ、ｐｆｌＢ）、エタノールの合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ａｄｈＥ）および酢酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ）を欠失させることにより不要な副生成物の合成が減弱される。
【００１９】
利用可能なグリセルアルデヒド３リン酸の一部を酵素トリオースリン酸イソメラーゼの作用を介して１，２−プロパンジオールの合成へ向け直すためには、グリセルアルデヒド３リン酸活性が減弱される。そして、グルコースに対する１，２−プロパンジオールの収量は、１モル／モルより高くなり得る。しかしながら、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の生産の低減のために、ＰＥＰ依存性糖移入系は負の影響を受ける。従って、本発明の一態様では、ｇａｌＰによりコードされているもののようなＰＥＰとは独立の糖移入を用いるか、または糖ホスホトランスフェラーゼ系に、より多くのＰＥＰを供給するかのいずれかによって、糖移入効率が高められる。これは、ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ遺伝子によりコードされている）のようなＰＥＰを消費する経路を除去することにより、かつ／または例えばＰＥＰシンターゼをコードするｐｐｓＡ遺伝子を過剰発現させることによるなど、ＰＥＰの合成を促進することにより得られる。
【００２０】
さらに、ピルビン酸をアセチル−ｃｏＡに変換する酵素が、嫌気性条件下で見られる高濃度のＮＡＤＨに耐性があることも有用である。これはｌｐｄ遺伝子の特異的突然変異により得ることができる。最後に、アセトールの１，２−プロパンジオールへの還元のためのＮＡＤＨを節約するために、ａｒｃＡ遺伝子およびｎｄｈ遺伝子を欠失させることができる。
【００２１】
１，２−プロパンジオールの製造に用いる微生物は細菌、酵母および真菌から選択されるが、好ましくは、大腸菌またはクロストリジウム・アセトブチリカム種に由来する。
【００２２】
本発明の目的はまた、適切な増殖培地で改変微生物を培養すること、および生成した１，２−プロパンジオールを回収および精製することによる１，２−プロパンジオールの製造方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす添付図面は本発明を例示し、その説明とともに本発明の原理を説明にするのに役立つ。
【００２４】
【図１】炭水化物からの１，２−プロパンジオール生産系の開発における中枢代謝の遺伝子工学を示す。
【発明の具体的説明】
【００２５】
本明細書において、特許請求の範囲および明細書の解釈に以下の用語を用いることができる。
【００２６】
本発明によれば、「培養」、「増殖」および「発酵」とは、単純炭素源を含有する適切な増殖培地での細菌の増殖を表すために互換的に用いられる。
【００２７】
本発明において「炭素源」とは、微生物の正常な増殖を支えるために当業者が使用可能ないずれの炭素源も表し、ヘキソース、ペントース、単糖類、二糖類、オリゴ糖、デンプンまたはその誘導体、ヘミセルロース、グリセロールおよびそれらの組合せであり得る。
【００２８】
「１，２−プロパンジオールの製造に有用な」とは、その微生物が目的の生成物を、好ましくは発酵により生産することを表す。発酵は、好気性、微好気性または嫌気性条件下で実施可能な従来のプロセスである。
【００２９】
「酵素の活性の減弱」とは、改変前の始原株の活性に比べた、改変株での目的酵素の活性の低下を指す。当業者ならば、この結果を得るための多数の手段を知っている。可能性のある例としては、
・その遺伝子への、この遺伝子の発現レベルまたはコードされているタンパク質の活性のレベルを低下させる突然変異の導入、
・その遺伝子の天然プロモーターの、より低い発現をもたらす強度の低いプロモーターでの置換、
・対応するメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質を脱安定化するエレメントの使用、
・発現が全く望まれないならば、その遺伝子の欠失
が挙げられる。
【００３０】
「発現」とは、その遺伝子の産物である、対応するタンパク質の生成をもたらす遺伝子配列の転写および翻訳を指す。
【００３１】
有利には、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性は、同じ条件下で非改変株で見られる活性の３０％未満、より好ましくは１０％未満である。
【００３２】
「ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールへの生合成経路の活性の増強」とは、この経路に含まれる少なくとも１つの酵素活性が増強されることを意味する（下記参照）。
【００３３】
有利には、本発明の微生物は、ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールへの生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素の活性を増強するように遺伝子操作される。
【００３４】
好ましくは、酵素の活性の増強は、該酵素をコードする遺伝子の発現を増強することにより得られる。
【００３５】
目的遺伝子の過剰発現を得るためには、当業者であれば、
・内因性プロモーターの、より強力なプロモーターでの置換
・微生物への、目的遺伝子を運ぶ発現ベクターの導入
・目的遺伝子の付加的コピーの、染色体への導入
などの種々の方法を知っている。
【００３６】
現在、いくつかの技術が細菌株にＤＮＡを導入するために用いられている。好ましい技術はエレクトロポレーションであり、当業者のよく知られている。
【００３７】
有利には、ｍｇｓＡ、ｙａｆＢ、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺ、ｙｑｈＥ、ｙｑｈＤ、ｙｄｈＦ、ｙｃｄＷ、ｙａｊＯ、ｙｄｊＧ、ｙｄｂＣ、ｔａｓ、ｇｌｄＡおよびｆｕｃＯから選択される少なくとも１つの目的遺伝子が過剰発現される。
【００３８】
ｍｇｓＡ遺伝子は、ＤＨＡＰのメチルグリオキサールへの変換を触媒するメチルグリオキサールシンターゼをコードしている。遺伝子ｙａｆＢ、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺ、ｙｑｈＥ、ｙｑｈＤ、ｙｄｈＦ、ｙｃｄＷ、ｙａｊＯ、ｙｄｊＧ、ｙｄｂＣ、ｔａｓは、メチルグリオキサールをアセトールへ変換可能な酵素活性をコードしている。ｇｌｄＡ遺伝子は、アセトールの１，２−プロパンジオールへの変換を触媒するグリセロールデヒドロゲナーゼをコードしている。ｆｕｃＯ遺伝子は、ラクトアルデヒドの１，２−プロパンジオールへの変換を触媒する１，２−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードしている。
【００３９】
好ましい微生物は、特に注目される３つの遺伝子：ｍｇｓＡ、ｙｑｈＤおよびｇｌｄＡの過剰発現をもたらす改変を有する。
【００４０】
好ましくは、本発明の微生物において、Entner-Doudoroff経路に関与する少なくとも１つの遺伝子が減弱される。Entner-Doudoroff経路は、解糖の他に、グルコースをグリセルアルデヒド３リン酸とピルビン酸に分解する別の方法を提供する。Entner-Doudoroff経路の減弱は、ほとんどの、または良ければ全てのグルコースが解糖により分解され、１，２−プロパンジオールの製造に利用されることを保証する。
【００４１】
特に、この経路の２つの遺伝子ｅｄｄまたはｅｄａの少なくとも１つが減弱される。
【００４２】
本発明において「遺伝子の発現の減弱」とは、遺伝子の発現の部分的なまたは完全な抑制を表し、その後、それは「減弱された」と言われる。この発現の抑制は、その遺伝子の活性化機構の抑制、その遺伝子の発現の阻害、その遺伝子発現に必要なプロモーター領域の全てもしくは一部の欠失、またはその遺伝子のコード領域の欠失のいずれかであり得る。好ましくは、遺伝子の減弱は本質的にその遺伝子の完全な欠失であり、その遺伝子は、本発明の株の同定、単離および精製を助ける選択マーカー遺伝子で置換することができる。遺伝子は、Datsenko, K.A. & Wanner, B. L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K- 12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645に記載されているように、好ましくは、相同組換えの技術によって不活性化される。
【００４３】
好ましくは、本発明の微生物では、メチルグリオキサールの乳酸への変換に関与する少なくとも１つの酵素が減弱される。この減弱の目的は、利用可能なメチルグリオキサールが本質的に１，２−プロパンジオールの合成のために細胞機構によって用いられるというものである（図１参照）。
【００４４】
メチルグリオキサールの乳酸への変換に関与する遺伝子は、特に、
・メチルグリオキサールからのラクトイルグルタチオンの合成を触媒するグリオキサラーゼＩをコードするｇｌｏＡ遺伝子などの、グリオキサラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子、
・ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（（Ｓ）ラクトアルデヒドからの（Ｓ）乳酸の合成を触媒する）をコードするａｌｄＡおよびａｌｄＢ遺伝子
である。
【００４５】
これらの１以上の遺伝子の発現が始原株において減弱されることが有利である。好ましくは、ｇｌｏＡ遺伝子が完全に欠失される。
【００４６】
本発明の微生物において、乳酸、エタノールおよびギ酸などの副生成物の合成に関与する少なくとも１つの酵素が減弱されることが好ましい。
【００４７】
特に、ピルビン酸からの乳酸の合成を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｌｄｈＡ、およびアセチル−ＣｏＡからのエタノールの合成を触媒するアルコール−アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ａｄｈＥを減弱することが有利である。
【００４８】
同様に、アセチル−ＣｏＡとギ酸の代わりに、ピルビン酸から、アセチル−ＣｏＡ  ＣＯ２とＮＡＤＨを生産するために微生物にピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を使用させることもできる。これは、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子ｐｆｌＡおよびｐｆｌＢを減弱することによって達成することができる。
【００４９】
本発明の別の特定の実施態様では、副生成物である酢酸の合成が、その合成に関与する少なくとも１つの酵素を減弱することにより妨げられる。１，２−プロパンジオールの生産を至適化するためにはこのような酢酸合成を回避することが好ましい。
【００５０】
酢酸の生産を妨げるためには、ａｃｋＡ、ｐｔａおよびｐｏｘＢから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を減弱するのが有利である。これらの遺伝子は全て、異なる酢酸生合成経路（図１参照）に関与する酵素をコードしている。
【００５１】
好ましくは、本発明の微生物において、糖移入の効率が高められる。ｇａｐＡ遺伝子発現の強い減弱はＧＡＰＤＨ反応において５０％を超える炭素フラックスの低下をもたらし、この結果、移入グルコース１モル当たり１モル未満のホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）が合成される。移入はグルコース６リン酸を生じるＰＥＰからグルコースへのホスホ転移と結びついていることから、ＰＥＰは、細胞への単純糖の移入に通常用いられる糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）により必要とされる。よって、ＰＥＰ量を減らすと、糖移入に負の影響が及ぶ。
【００５２】
本発明の特定の実施態様では、糖はホスホエノールピルビン酸とは独立の糖移入系によって微生物に移入され得る。リン酸化を含まない遺伝子ｇａｌＰによりコードされているガラクターゼ−プロトン共輸送体が利用可能である。この場合、移入したグルコースは、ｇｌｋ遺伝子によりコードされているグルコースキナーゼ活性によってリン酸化されなければならない。この経路を促進するために、ｇａｌＰおよびｇｌｋから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が増強される。結果として、ＰＴＳは分配可能となり、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩまたはｃｒｒから選択される少なくとも１つの遺伝子を減弱することによって排除することができる。
【００５３】
本発明の別の特定の実施態様では、糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の効率が、代謝産物ホスホエノールピルビン酸のアベラビリティーを高めることによって増強される。ｇａｐＡ活性の減弱およびピルビン酸へ向かう炭素フラックスのために、本発明の改変株におけるＰＥＰの量は限定され、細胞へ輸送されるグルコースの量が少なくなり得る。
【００５４】
微生物株においてＰＥＰのアベラビリティーを高めるために使用可能な様々な手段がある。特に、ＰＥＰ→ピルビン酸の反応を減弱する手段がある。好ましくは、この結果を得るために前記の株においてピルビン酸キナーゼ酵素をコードするｐｙｋＡおよびｐｙｋＦから選択される少なくとも１つの遺伝子が減弱される。ＰＥＰのアベラビリティーを高める別法は、この酵素の活性を高めることによってホスホエノールピルビン酸シンターゼにより触媒されるピルビン酸→ＰＥＰの反応に有利になるようにすることである。この酵素はｐｐｓＡ遺伝子によりコードされている。よって、好ましくは、この微生物において、ｐｐｓＡ遺伝子の発現が好ましくは増強される。両改変が微生物に同時に存在してもよい。
【００５５】
特に嫌気性または微好気性条件下で、ピルビン酸をアセチル−ｃｏＡへ変換するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）がＮＡＤＨによる阻害に対して低い感受性を有することが有利である。より低い感受性とは、非改変酵素の感受性に対して定義される。このような特徴は、酵素のタンパク質配列においてアラニン５５のバリン残基による置換をもたらす、ｌｐｄ遺伝子（ＰＤＣのサブユニットリポアミドデヒドロゲナーゼをコードする）に特異的突然変異を導入することによって得ることができる。
【００５６】
嫌気性または微好気性条件下で、前駆体の、１，２−プロパンジオールへの還元に関するＮＡＤＨのアベラビリティーが高められることが有利である。これは、グローバルレギュレーターＡｒｃＡ（ａｒｃＡ遺伝子によりコードされている）により媒介されるトリカルボン酸サイクルに対する抑制を軽減することにより得られる。細胞のＮＡＤＨ濃度はまた、遺伝子ｎｄｈによりコードされているＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを不活性化することにより増強され得る。よって、好ましくは、ａｒｃＡおよびｎｄｈから選択される少なくとも１つの遺伝子が減弱される。
【００５７】
好ましくは、本発明の微生物は細菌、酵母または真菌から選択される。より好ましくは、微生物は腸内細菌科、バチルス科、クロストリジウム科、ストレプトミセス科およびコリネバクテリア科からなる群から選択される。いっそうより好ましくは、微生物は大腸菌またはクロストリジウム・アセトブチリカムのいずれかである。
【００５８】
本発明のもう１つの目的は、これまでに記載したものなどの微生物が単純炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖され、その後、生成された１，２−プロパンジオールが回収される、１，２−プロパンジオールを製造するための方法である。１，２−プロパンジオールの製造は好気性、微好気性または嫌気性条件下で行われる。
【００５９】
発酵プロセスの培養条件は、当業者ならば容易に定義することができる。特に、細菌は２０℃〜５５℃の間、好ましくは２５℃〜４０℃の間の温度、好ましくは、Ｃ．アセトブチリカムでは約３５℃、大腸菌では約３７℃で発酵される。
【００６０】
この工程は回分法、流加法または連続法のいずれかで行うことができる。
【００６１】
「好気性条件下」とは、酸素が、液体相に気体を溶解させることにより培養物に供給されることを意味する。これは、（１）酸素を含有する気体（例えば、空気）を液体相に散布すること、または（２）培養培地を含有する容器を振盪して、上部空間に含まれている酸素を液体相に送ることにより得ることができる。嫌気性条件下ではなく好気性条件下での発酵の利点は、電子受容体としての酸素の存在が、その株の、細胞プロセスのためにより多くのエネルギーをＡＴＰ形態で生産する能力を改良するということである。従って、その株はその全般的代謝が改良されている。
【００６２】
微好気性条件は、低パーセンテージの酸素（例えば、０．１〜１０％の間の酸素を含み、窒素で１００％とした混合物を用いる）が液体相に溶解される培養条件として定義される。
【００６３】
嫌気性条件は、培養培地に酸素が供給されない培養条件として定義される。厳密な嫌気性条件は、他の気体の痕跡を除去するために培養培地に窒素のような不活性ガスを散布することにより得られる。硝酸を電子受容体として用い、株によるＡＴＰ生産を改良し、その代謝を改良することができる。
【００６４】
本発明において「適切な増殖培地」とは、微生物の増殖に適合した既知のモル構成の培地を表す。例えば、少なくとも１つの炭素源を含有し、使用する細菌に適合した既知の設定構成の無機培養培地である。従って、大腸菌用の無機増殖培地は、特に、Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) と同一もしくは類似の組成のもの、またはSchaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)により定義されているものなどの培地、および下記のＭＰＧと呼ばれる最小培養培地であり得る。
【００６５】
【表１】
2010521190.tif 000003
【００６６】
本発明の特定の実施態様では、この方法は、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、スクロースまたはキシロースであり得る単純炭素源を含有する培地で増殖させた大腸菌株を用いて行われる。
【００６７】
本発明の別の特定の実施態様では、この方法は、単純炭素源または複合炭素源を含有する培地で増殖させたＣ．アセトブチリカム株を用いて行われる。
【００６８】
従って、増殖培地は、クロストリジウム増殖培地(CGM, Wiesenborn et al., Appl. Environm. Microbiol., 54: 2717-2722)またはMonot et al. (Appl. Environm. Microbiol., 44: 1318-1324)もしくはVasconcelos et al. (J. Bacterid., 176: 1443-1450)により示されているような無機増殖培地と同一もしくは類似の組成のものであり得る。
【００６９】
Ｃ．アセトブチリカムの培養に用いられる炭素源は単純炭素または複合炭素のいずれかである。単純炭素源はアラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、スクロースまたはキシロースであり得る。特に好ましい単純炭素源はグルコースである。複合炭素源はデンプンまたはヘミセルロースであり得る。特に好ましい複合炭素源はデンプンである。
【００７０】
有利には、回収された１，２−プロパンジオールはさらに精製される。当業者ならば、１，２−プロパンジオールを回収および精製するための様々な手段を知っている。
【００７１】
本発明は上記、下記および大腸菌に関して実施例に記載されている。よって、本発明の始原株および進化株に関して減弱、欠失または過剰発現可能な遺伝子は、主として大腸菌由来の遺伝子の名称を用いて定義される。しかしながら、この名称は本発明によればより一般的な意味を持ち、他の微生物において対応する遺伝子も包含する。当業者ならば、大腸菌由来の遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ参照番号を用いて、大腸菌以外の生物における等価な遺伝子を同定することができる。
【００７２】
相同配列の同定の手段およびそれらの相同性％は当業者によく知られており、特に、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で、このウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに使用することができるＢＬＡＳＴプログラムを含む。得られた配列は、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)を、これらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いて利用（アライン）することができる。
【００７３】
ＰＦＡＭデータベース（protein families database of alignments and Hidden Markov Models http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列アライメントの大きなコレクションである。各ＰＦＡＭは、複数のアライメントの可視化、タンパク質ドメインの観測、生物間での分布の評価、他のデータベースへのアクセスの確保および既知のタンパク質構造の可視化を可能とする。
【００７４】
ＣＯＧ（Clusters of Orthologous Groups of protein http://www.ncbi.nlm.nih. gov/COG/）は、４４の主要な系統発生論的系統を表す６６の完全に配列決定された単細胞ゲノムに由来するタンパク質配列を比較することにより得られる。各ＣＯＧは少なくとも３つの系統から定義され、古くから保存されていたドメインの同定が可能となる。
【００７５】
参照文献（本明細書に引用されている順）
【表２】
2010521190.tif 000004
2010521190.tif 000005
【実施例】
【００７６】
実施例１：改変大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ：：ｃｍ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ）、大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ：：ｃｍ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙａｆＢ−−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ）および大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ：：ｃｍ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ）の構築
１，２−プロパンジオールの生産を高めるために、ｔｒｃプロモーターを用い、遺伝子の種々の組合せをプラスミドｐＭＥ１０１ＶＢ０１から発現させた。
【００７７】
ａ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５（ｐＭΕ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ）、ＭＧ１６５５（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙａｆＢ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ）およびＭＧ１６５５（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ）の構築
プラスミドｐＭＥ１０１ＶＢ０１の構築
プラスミドｐＭＥ１０１ＶＢ０１はプラスミドｐＭＥ１０１に由来し、希少な制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＰａｃＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＳａｃＩＩおよびＡｇｅＩに特異的な認識部位配列とその後にクロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４のａｄｃ転写ターミネーターを含む多重クローニング部位を担持している。
【００７８】
低コピーベクターからの発現のために、プラスミドｐＭＥ１０１を次のように構築した。プラスミドｐＣＬ１９２０(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631 - GenBank AX085428)を、オリゴヌクレオチドＰＭＥ１０１ＦおよびＰＭＥ１０１ＲならびにｌａｃＩ遺伝子を担持するベクターｐＴｒｃ９９Ａ(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)由来のＢｓｔＺ１７Ｉ−ＸｍｎＩ断片を用いてＰＣＲ増幅し、増幅されたベクターにｔｒｃプロモーターを挿入した。
【００７９】
ＰＭＥ１０１Ｆ（配列番号１）：
ccgacagtaagacgggtaagcctg
ＰＭＥ１０１Ｒ（配列番号２）：
agcttagtaaagccctcgctag
【００８０】
多重クローニング部位とａｄｃ転写ターミネーターを含む合成二本鎖核酸リンカーを用いてｐＭＥ１０１ＶＢ０１を作製した。ＮｃｏＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化された制限部位によってフランキングされた、相補的な２つの１００塩基のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。この１００塩基対の産物をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＭＥ１０１にサブクローニングしてｐＭＥ１０１ＶＢ０１を作製した。
【００８１】
ｐＭＥ１０１ＶＢ０１  １は、１００塩基（配列番号３）：
catgggctagctacgtattaattaaagatctcctaggagctcaccggtTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTAggcgcgcca
からなり、
ｐＭＥ１０１ＶＢ０１  ２は、１００塩基（配列番号４）：
agcttggcgcgccTAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAaccggtgagctccctagagatctttaattaatacgtagctagcc
からなり、
・多重クローニング部位に対応する領域（下線の小文字）
・クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ  ８２４ｐＳＯＬ１（ＮＣ＿００１９８８）のａｄｃ転写ターミネーター（配列１７９８４７〜１７９８１４）に相当する領域（大文字）を含む。
【００８２】
１，２−プロパンジオールの生合成経路の遺伝子の種々の組合せを発現させるためのプラスミドの構築（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ、ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙａｆＢ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡおよびｐＭＥ１０１ＹＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ）
表１に示されたオリゴヌクレオチドを用い、大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡから種々の遺伝子をＰＣＲ増幅した。
【００８３】
【表３】
2010521190.tif 000006
【００８４】
ＰＣＲ増幅した断片を表１に示される制限酵素で切断し、プラスミドｐＭＥ１０１ＶＢ０１の制限部位へクローニングした。次のプラスミドを構築した：ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ、ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｆβ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡおよびｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ。
【００８５】
次に、これらのプラスミドを大腸菌ＭＧ１６５５株に導入した。
【００８６】
ｂ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ：：ｃｍの構築
大腸菌ＭＧ１６５５株における天然ｇａｐＡプロモーターの、合成ショートＰｔｒｃ１６プロモーター（配列番号６９：gagctgttgacgattaatcatccggctcgaataatgtgtgg）での置換は、２２５ｐｂの上流ｇａｐＡ配列をＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴおよび操作プロモーターで置換することにより行う。用いた技術は、Datsenko, K.A. & Wanner, BX. (2000)により記載されている。
【００８７】
プロトコール１に従い、天然ｇａｐＡプロモーターを置換するのに用いた２つのオリゴヌクレオチドを表２に示す。
【００８８】
プロトコール１：組換えのためのＰＣＲ産物の導入および組換え体の選択
遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択され、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用い、プラスミドｐＫＤ３由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドｐＫＤ４由来のカナマイシン耐性カセットを増幅した(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000))。次に、得られたＰＣＲ産物を、そこで発現したＲｅｄ（ｅｘｏ）系が相同組換えに極めて有利である、プラスミドｐＫＤ４６を担持するレシピエント株にエレクトロポレーションにより導入した。その後、抗生物質耐性形質転換体を選択し、その耐性カセットの挿入を、表３に示された適切なオリゴヌクレオチドを用いた分析により確認した。
【００８９】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ：：ｃｍと命名した。
【００９０】
３つのプラスミドをそれぞれ大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ：：ｃｍに導入した。
【００９１】
【表４】
2010521190.tif 000007
【００９２】
【表５】
2010521190.tif 000008
【００９３】
実施例２：１，２−プロパンジオールを高収量で生産し得る改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ），（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）、大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｆＢ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ），（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）および大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ），（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）の構築
大腸菌ＭＧ１６５５株において、プロトコール１に記載の技術を表２に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ｅｄｄ−ｅｄａ遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ：：ｋｍと命名した。
【００９４】
この欠失を、プロトコール２に従い、大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ：：ｃｍに導入した。
【００９５】
プロトコール２：遺伝子欠失のためのファージＰ１を用いた形質導入
レシピエント大腸菌における、その遺伝子を耐性カセット（カナマイシンまたはクロラムフェニコール）で置換することによる選択された遺伝子の欠失は、ファージＰ１を用いた形質導入技術によって行った。プロトコールは、（ｉ）単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株でのファージ溶解液の作製、および（ｉｉ）このファージ溶解液によるレシピエント株の形質導入の二段階であった。
【００９６】
ファージ溶解液の作製
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｃｍ  ３０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２  ５ｍＭでの、単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株の一晩培養物１００μｌを播種する。
・振盪しながら３７℃で３０分インキュベーション。
・野生株ＭＧ１６５５で作製したファージＰ１溶解液１００μｌ（およそ１×１０９ファージ／ｍｌ）を加える。
・３７℃で３時間、全ての細胞が溶解するまで振盪する。
・２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける・
・４５００ｇで１０分の遠心分離を行い、細胞残渣を除去する。
・上清を無菌試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを加える。
・この溶解液を４℃で保存する。
形質導入
・ＬＢ培地中、大腸菌レシピエント株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分遠心分離する。
・この細胞ペレットを２．５ｍｌのＭｇＳＯ４  １０ｍＭ、ＣａＣｌ２  ５ｍＭ中に懸濁させる。
・対照試験管：細胞１００μｌ
単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株のファージＰ１  １００μｌ
・試験管試験：細胞１００μｌ＋単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株のファージＰ１  １００μｌ
・振盪せずに３０℃で３０分インキュベーション。
・各試験管に１Ｍクエン酸ナトリウム１００μｌを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍｌのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベーション。
・試験管を７０００ｒｐｍで３分遠心分離した後、ディッシュ上、ＬＢ＋Ｃｍ３０μｇ／ｍｌでプレーティング。
・３７℃で一晩インキュベーション。
【００９７】
次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、欠失の挿入を、適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【００９８】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ：：ｃｍ、Δｅｄｄ−ｅｄａ：：ｋｍと命名した。
【００９９】
次に、プロトコール３に従い、抗生物質耐性カセットを除去した。
【０１００】
プロトコール３：耐性カセットの除去
クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットを以下の技術に従って除去した。クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位にＦＬＰレコンビナーゼ作用を有するプラスミドｐＣＰ２０をエレクトロポレーションによりこの組換え株へ導入した。４２℃で連続培養した後、これらの抗生物質耐性カセットの欠損を、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【０１０１】
プロトコール１に従い、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用いてＭＧ１６５５  ΔｇｌｏＡ：：ｃｍ株を構築し、この欠失を、プロトコール２に従って予め構築した株に導入した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ：：ｃｍと命名した。
【０１０２】
先の株において、プロトコール１に従い、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入することにより、ｐｙｋＡ遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ：：ｃｍ，ΔｐｙｋＡ：：ｋｍと命名した。
【０１０３】
次に、プロトコール３に従い、抗生物質耐性カセットを除去した。
【０１０４】
プロトコール１に従い、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用い、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入することにより、ｐｙｋＦ遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ：：ｃｍと命名した。
【０１０５】
次に、プロトコール３に従い、抗生物質耐性カセットを除去した。
【０１０６】
各段階で、それまでに構築された全ての欠失の存在を、表３に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１０７】
ホスホエノールピルビン酸の生産を高めるために、ｐｐｓＡ遺伝子を、ｇａｐＡプロモーターを用いてプラスミドｐＪＢ１３７から発現させた。プラスミドｐＪＢ１３７−Ｐ  ｇａｐＡ−ｐｐｓＡの構築のため、ｐｐｓＡ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０１０８】
１．ｇａｐＡ−ｐｐｓＡＦは、６５塩基（配列番号６４）：
ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC
からなり、
・ウェブサイト（http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の参照配列であるｐｐｓＡ遺伝子（１７８５１３６〜１７８２７５８）の配列（１７８５１０６〜１７８５１３６）と相同な領域（大文字）
・ｇａｐＡプロモーター（１８６０７９４〜１８６０７６１）と相同な領域（小文字）
を含む。
【０１０９】
２．ｐｐｓＡＲは、４３塩基（配列番号６５）：
aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC
からなり、
・ｐｐｓＡ遺伝子の領域（１７８５１３６〜１７８２７５８）の配列（１７８２７５８〜１７８２７８０）と相同な領域（小文字）
・制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ（下線の文字）
を含む。
【０１１０】
同時に、大腸菌ｇａｐＡ遺伝子のｇａｐＡプロモーター領域を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
【０１１１】
１．ｇａｐＡ−ｐｐｓＡＲは、６５塩基（配列番号６６）：
GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtgaataaaagg
からなり、
・ｐｐｓＡ遺伝子（１７８５１３６〜１７８２７５８）の配列（１７８５１０６〜１７８５１３６）と相同な領域（大文字）および
・ｇａｐＡプロモーター（１８６０７９４〜１８６０７６１）と相同な領域（小文字）
を含む。
【０１１２】
２．ｇａｐＡＦは、３３塩基（配列番号６７）：
ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc
からなり、
・ｇａｐＡプロモーター（１８６０６３９〜１８６０６６１）と相同な領域（小文字）
・制限部位ＳｍａＩ（下線の文字）
を含む。
【０１１３】
次に、両断片を、オリゴヌクレオチドｐｐｓＡＲおよびｇａｐＡＦ(Horton et al. 1989 Gene 77:61-68)を用いて融合した。ＰＣＲ増幅した断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩで切断し、ベクターｐＪＢ１３７（ＥＭＢＬ受託番号：Ｕ７５３２６）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングし、ベクターｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡを得た。
【０１１４】
種々のｐＭＥ１０１ＶＢ０１プラスミドおよびｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡを大腸菌株ＭＧ１６５５Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦに導入した。得られた株をそれぞれ大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ，ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ（株１）、大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙａｆＢ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ，ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ（株２）および大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ，ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ（株３）と命名した。
【０１１５】
実施例３：１，２−プロパンジオールをグルコース１モル当たり１モルよりも高い収率で生産し得る改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ、ΔａｃｋＡ−ｐｔａ、ΔｐｏｘＢ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ）、（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）、大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙａｆＢ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ）、（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）および大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ）、（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）の構築
プロトコール１に従い、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用い、ＭＧ１６５５  ΔａｌｄＡ：：ｋｍ、ＭＧ１６５５  ΔａｌｄＢ：：ｃｍ、ＭＧ１６５５  ΔｐｆｌＡＢ：：ｋｍ、ＭＧ１６５５  ΔａｄｈＥ：：ｃｍ、ＭＧ１６５５  ΔａｃｋＡ−ｐｔａ：：ｃｍを構築し、これらの欠失を、プロトコール２に従い、これまでに構築した株に導入する。必要があれば、プロトコール３に従い、抗生物質耐性カセットを除去する。
【０１１６】
プロトコール１に従い、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用い、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入することにより、ｌｄｈＡ遺伝子とｐｏｘＢ遺伝子を不活性化する。必要があれば、プロトコール３に従い、抗生物質耐性カセットを除去する。
【０１１７】
各段階で、それまでに構築された全ての欠失の存在を、表３に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１１８】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦと命名した。
【０１１９】
これら種々のｐＭＥ１０１ＶＢ０１プラスミドおよびｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡを大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦに導入した。得られた株をそれぞれ、大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ、ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ，ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ、大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙａｆＢ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ，ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡおよび大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ、ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ，ΔｐｙｋＡ、ΔｐｙｋＦ、ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ、ｐＪＢＭ−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡと命名した。
【０１２０】
実施例４：好気性条件下での１，２−プロパンジオール生産に関する種々の株の比較
実施例２で記載したように得られた株（株１、２および３）および対照株（対照１：ＭＧ１６５５  ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ、対照２：ＭＧ１６５５  ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙａｆＢ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ、対照３：ＭＧ１６５５  ｐＭＥ１０１ＹＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡおよび対照４：ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ）を、エルレンマイヤーフラスコ内、好気性条件下、炭素源としてグルコースを含む最小培地中で培養した。培養は３４℃または３７℃で行い、培養培地をＭＯＰＳで緩衝させることによりｐＨを維持した。培養の終了時に、発酵培養液中の１，２−プロパンジオール、アセトールおよび残留グルコースをＨＰＬＣにより分析し、グルコースに対する１，２−プロパンジオールおよびグルコースに対する１，２−プロパンジオール＋アセトールを算出した。その後、最良の株を発酵槽の流加培養のために選択した。
【０１２１】
【表６】
2010521190.tif 000009
【０１２２】
実施例５：最良の株を用いた流加培養での１，２−プロパンジオールの生産
これまでの実験で選択された最良の株を、流加プロトコールを用い、２１発酵槽で培養する。
【０１２３】
培養物の温度は３７℃に維持し、ｐＨはＮＨ４ＯＨ溶液を用い、常に６．５〜８の間に調整する。振盪速度は回分期には２００〜３００ｒｐｍの間に維持し、流加期の終了時には１０００ｒｐｍまで引き上げる。溶解酸素濃度は、ガスコントローラーを用いて３０〜４０％の間の値に維持する。光学密度が３〜５の間の値に達した際に、流加を初期流速０．３〜０．５ｍｌ／時で開始し、２．５〜３．５ｍｌ／時の間の流速値まで段階的に引き上げる。この時点で２４〜４８時間、流速を一定に維持する。流加培地は３００〜５００ｇ／ｌの間の濃度のグルコースを含有する最小培地に基づく。
【図１】
2010521190.tif 000010
【配列表】
2010521190000001.app
【国際調査報告】
2010521190.tif 000011
2010521190.tif 000012
2010521190.tif 000013
2010521190.tif 000014