(57)【要約】本発明は、癌の治療に有用な、および、化学療法によって誘発される細胞ストレス反応の改善に有用な、組成物および方法に関する。１つの態様において、本発明は、細胞における細胞ストレス反応を改善する方法を提供し、この方法は、該細胞、好ましくは癌細胞、さらに好ましくは前立腺癌腫瘍細胞と、該細胞におけるＲＡ１ｃの発現または活性を減少させるまたは阻止する化合物とを接触させることを含む。１つの実施形態において、前記細胞ストレス反応は、化学療法薬によって誘導される。好ましくは、前記化合物は、前記細胞の前記化学療法薬に対する感受性を増大させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞と、該細胞におけるＲＡ１ｃ発現または活性を減少させる、または、阻止する化合物と、を接触させることを含む、細胞における細胞ストレス反応を改善する方法。
【請求項２】
前記細胞が、癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌細胞が、前立腺腫瘍細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞ストレス反応が、化学療法薬によって誘導される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記化学療法薬が、ｍＴｏｒ阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記化学療法薬が、ラパマイシン、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７３、ＸＬ７Ｆ６５およびＴＡＦＡ９３、ならびにそれらの活性誘導体または類似体からなる群より選択されるｍＴｏｒ阻害剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記化学療法薬が、ＧＳＫ６９０６９３、ペリホシンおよびＸＬ４１８、ならびにそれらの誘導体または類似体からなる群より選択されるＡｋｔ１／２阻害剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、ＲＡ１ｃアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＡ１ｃアンタゴニストが、抗体、抗体フラグメント、抗体コンジュゲート、アプタマー、小分子およびオリゴペプチドからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＡ１ｃアンタゴニストが、ＲＡ１ｃ活性を特異的に阻止する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、ＲＡ１ｃの発現を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、ＲＡ１ｃの発現を阻止する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、アンチセンスポリヌクレオチド、サイレンシングＲＮＡ分子、触媒ＲＮＡ分子およびＲＮＡ−ＤＮＡキメラからなる群より選択される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が、前記細胞の前記化学療法薬に対する感受性を増大させる、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前立腺癌腫瘍細胞における細胞ストレス反応を改善する方法であって、該腫瘍細胞とＲＡ１ｃの発現または活性を減少させるまたは阻止する化合物とを接触させることを含む方法。
【請求項１６】
前記腫瘍細胞が、細胞ストレス反応を誘導する化学療法薬での化学療法を受けている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化学療法薬が、ｍＴｏｒ阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記化学療法薬が、ラパマイシン、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７３、ＸＬ７Ｆ６５およびＴＡＦＡ９３、ならびにそれらの活性誘導体または類似体からなる群より選択されるｍＴｏｒ阻害剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記化学療法薬が、ＧＳＫ６９０６９３、ペリホシンおよびＸＬ４１８、ならびにそれらの誘導体または類似体からなる群より選択されるＡｋｔ１／２阻害剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物が、ＲＡ１ｃアンタゴニストである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＡ１ｃアンタゴニストが、抗体、抗体フラグメント、抗体コンジュゲート、アプタマー、小分子およびオリゴペプチドからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＡ１ｃアンタゴニストが、ＲＡ１ｃ活性を特異的に阻止する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物が、ＲＡ１ｃの発現を減少させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が、ＲＡ１ｃの発現を阻止する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物が、アンチセンスポリヌクレオチド、サイレンシングＲＮＡ分子、触媒ＲＮＡ分子およびＲＮＡ−ＤＮＡキメラからなる群より選択される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物が、前記腫瘍細胞の前記化学療法薬に対する感受性を増大させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍細胞が、前記化合物と接触していない細胞より高い率でアポトーシスを起こす、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍細胞が、前記化合物と接触していない細胞より高い率で成長停止を起こす、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ＲＡ１ｃの発現または活性を減少させるまたは阻止する化合物の有効量を患者に投与することを含む、患者の細胞における細胞ストレス反応を改善する方法。
【請求項３０】
前記患者が、癌患者である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、前立腺癌腫瘍細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍細胞が、細胞ストレス反応を誘導する化学療法薬での化学療法を受けている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記化学療法薬が、ｍＴｏｒ阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤からなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記化学療法薬が、ラパマイシン、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７３、ＸＬ７Ｆ６５およびＴＡＦＡ９３、ならびにそれらの活性誘導体または類似体からなる群より選択されるｍＴｏｒ阻害剤である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記化学療法薬が、ＧＳＫ６９０６９３、ペリホシンおよびＸＬ４１８、ならびにそれらの誘導体または類似体からなる群より選択されるＡｋｔ１／２阻害剤である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物が、ＲＡ１ｃアンタゴニストである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＲＡ１ｃアンタゴニストが、抗体、抗体フラグメント、抗体コンジュゲート、アプタマー、小分子およびオリゴペプチドからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＲＡ１ｃアンタゴニストが、ＲＡ１ｃ活性を特異的に阻止する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記化合物が、ＲＡ１ｃの発現を減少させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記化合物が、ＲＡ１ｃの発現を阻止する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記化合物が、アンチセンスポリヌクレオチド、サイレンシングＲＮＡ分子、触媒ＲＮＡ分子およびＲＮＡ−ＤＮＡキメラからなる群より選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記化合物が、前記腫瘍細胞の前記化学療法薬に対する感受性を増大させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記腫瘍細胞が、前記化合物と接触していない細胞より高い率でアポトーシスを起こす、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍細胞が、前記化合物と接触していない細胞より高い率で成長停止を起こす、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ＲＡ１ｃアンタゴニストとＲＡ１ｃの発現を増加する化合物とを含み、医薬的に許容される担体を場合によってはさらに含む組成物。
【請求項４６】
前記化合物が、ラパマイシン、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７３、ＸＬ７Ｆ６５、ＴＡＦＡ９３、ＳＫ６９０６９３、ペリホシンおよびＸＬ４１８ならびにそれらの活性誘導体または類似体からなる群より選択される、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ＲＡ１ｃアンタゴニストが、抗体であり、前記化合物が、ラパマイシン、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７３、ＸＬ７Ｆ６５、ＴＡＦＡ９３、ＳＫ６９０６９３、ペリホシンおよびＸＬ４１８ならびにそれらの活性誘導体または類似体からなる群より選択される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
化学療法薬が癌細胞において細胞ストレス反応を誘導するかどうかを判定する方法であって、該方法は：
ａ）該癌細胞と該化学療法薬とを接触させること；
ｂ）該癌細胞におけるＲＡ１ｃ発現レベルを判定すること；
ｃ）該癌細胞におけるＲＡ１ｃ発現レベルと、
１）該化学療法薬と接触させる前の該癌細胞におけるＲＡ１ｃ発現レベル、または
２）対照細胞におけるＲＡ１ｃ発現レベル
とを比較すること
を含み、ここで、ＲＡ１ｃ発現の増加は、細胞ストレス反応の誘導を示す、方法。
【請求項４９】
前記癌細胞が、前立腺癌細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記前立腺癌細胞が、ＬＮＣａＰ細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記化学療法薬が、ｍＴｏｒ阻害剤およびＡｋｔ１／２阻害剤からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
併用療法で癌を治療する方法であって、該方法は：
ａ）癌細胞とＲＡ１ｃの発現を増加させる化学療法薬とを接触させること；および
ｂ）ＲＡ１ｃポリペプチドに特異的に結合する化合物の有効量と該癌細胞を接触させること
を含み、それによって、該化学療法薬と該化合物の併用の癌治療効果が、該化学療法薬または該化合物いずれかのみの効果を超えて相乗的である、
方法。
【請求項５３】
前記化学療法薬が、ｍＴＯＲまたはＡｋｔ１／２阻害剤である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記化合物が、抗ＲＡ１ｃ抗体である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗ＲＡ１ｃ抗体を細胞傷害剤にコンジュゲートさせる、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００７年３月２日に出願された米国仮出願第６０／８９２，８０６号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権およびその利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、哺乳動物における癌の治療に有用な組成物、およびそれらの組成物を癌の治療に使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
悪性腫瘍（癌）は、米国において心疾患に次ぐ第二の主要死因である（非特許文献１）。増殖して腫瘍塊を形成する正常組織に由来する異常、すなわち新生、細胞の数の増加、これらの新生腫瘍細胞による隣接組織の浸潤、ならびに、最終的には血液またはリンパ系によって領域リンパ節におよび遠隔部位に、転移と呼ばれるプロセスによって広がる悪性細胞の発生、を癌は特徴とする。癌性状態では、正常細胞は成長しない条件下で細胞が増殖する。癌は、それ自体、異なる浸潤度および攻撃度を特徴とする多種多様な形態として現れる。
【０００４】
癌療法のために有効な細胞ターゲットを発見しようと、研究者たちは、１つ以上の正常非癌性細胞と比較して１つ以上の特定のタイプの癌細胞の表面で特異的に発現する膜貫通型のまたは別様に膜と会合しているポリペプチドを同定しようと努めてきた。多くの場合、そのような膜会合ポリペプチドは、非癌性細胞の表面と比較して癌細胞の表面でのほうが豊富に発現される。そのような腫瘍関連細胞表面抗原ポリペプチドの同定が、抗体ベースの治療法によって特異的に癌細胞を破壊のターゲットにできるもとになった。これに関しては、抗体ベースの療法が一定の癌の治療に非常に有効であると証明されたことを特筆する。例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（両方とも、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコのＧｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．からのもの）は、それぞれ乳癌および非ホジキンリンパ腫を治療するための使用に成功した抗体である。より具体的には、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）癌原遺伝子の細胞外ドメインに選択的に結合する組換えＤＮＡ由来ヒト化モノクローナル抗体である。原発性乳癌の２５〜３０％にＨＥＲ２タンパク質の過発現が認められる。ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）は、正常および悪性Ｂリンパ球の表面で見つけられるＣＤ２０抗原に対して産生させた遺伝子組換えキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。これらの抗体は、両方とも、ＣＨＯ細胞において組換え生産される。
【０００５】
癌療法のために有効な細胞ターゲットを発見するための別の試みでは、研究者たちは、（１）１つ以上の特定のタイプの非癌性正常細胞によるのと比較して１つ以上の特定のタイプの癌細胞によって特異的に生産される非膜会合ポリペプチド、（２）１つ以上の正常な非癌性細胞のものより有意に高い発現レベルで癌細胞によって生産されるポリペプチド、または（３）癌性状態と非癌性状態（例えば、正常な前立腺組織と前立腺腫瘍組織）の両方において単一の（または非常に限られた数の異なる）組織タイプのみにその発現が有意に限定されるポリペプチドを同定しようと努めてきた。そのようなポリペプチドは、細胞内に在るままである場合もあり、または癌細胞によって分泌される場合もある。さらに、そのようなポリペプチドは、癌細胞それ自体によってではなく、癌細胞に対して強化作用または成長増進作用を及ぼすポリペプチドを産生または分泌する細胞によって発現されることがある。そのような分泌ポリペプチドは、癌細胞の成長または生存を正常な細胞より有利にするタンパク質であることが多く、例えば、血管新生因子、細胞接着因子、成長因子などのような物を含む。そのような非膜会合ポリペプチドのアンタゴニストの同定は、そのような癌の治療のために有効な治療薬としての役立つと予想されよう。さらに、そのようなポリペプチドの発現パターンの同定は、哺乳動物における特定の癌の診断に有用であろう。哺乳動物の癌療法に関する上記利点にもかかわらず、哺乳動物において腫瘍の存在を検出することができるさらなる治療薬、および新生細胞の、特に前立腺癌における成長または生存それぞれの有効な抑制が大いに必要とされている。
【０００６】
前立腺癌は、米国の男性の間の癌死亡率の主な原因であり、この集団における最も一般的な悪性疾患である（非特許文献２）。この癌類の初期段階は、一般に、アンドロゲン依存性腫瘍細胞を特徴とし、アンドロゲン枯渇によって治療される。癌が進行するにつれて、一般に、アンドロゲン治療抵抗性となり、有効な特異的療法は未だ得られていない。
【０００７】
化学療法を用いる伝統的な癌治療は、治療の成功を妨げるような、意図とは異なる結果となることが多い。特に重要なのは、一定の化学療法薬の投与による細胞ストレス反応の誘発である。細胞ストレス反応は、化学療法の対象となる癌細胞の生存を有利にする場合がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｏｒｉｎｇら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｌ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．（１９９３）４３：７
【非特許文献２】Ｌａｎｄｉｓら，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．（１９９９）４９：８−３１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、癌性細胞のストレス反応におけるＲＡ１ｃの役割に関する。１つの態様において、本発明は、細胞における細胞ストレス反応を改善する方法を提供し、この方法は、該細胞、好ましくは癌細胞、さらに好ましくは前立腺癌腫瘍細胞と、該細胞におけるＲＡ１ｃの発現または活性を減少させるまたは阻止する化合物とを接触させることを含む。１つの実施形態において、前記細胞ストレス反応は、化学療法薬によって誘導される。好ましくは、前記化合物は、前記細胞の前記化学療法薬に対する感受性を増大させる。
【００１０】
本発明のもう１つの態様は、前立腺癌腫瘍細胞における細胞ストレス反応を改善する方法を提供し、この方法は、該腫瘍細胞とＲＡ１ｃの発現または活性を減少させるまたは阻止する化合物とを接触させることを含む。１つの実施形態において、前記腫瘍細胞は、細胞ストレス反応を誘導する化学療法薬での化学療法を受けている。好ましくは、前記化合物は、前記腫瘍細胞の前記化学療法薬に対する感受性を増大させる。前記化学療法薬に対して感受性である腫瘍細胞は、例えば、前記化合物と接触させていない細胞より高い率でアポトーシスを起こし得、または前記化合物と接触させていない細胞より高い率で成長停止を起こし得る。
【００１１】
さらにもう１つの態様は、患者の細胞における細胞ストレス反応を改善する方法を提供する。この方法は、ＲＡ１ｃの発現または活性を減少させるまたは阻止する化合物の有効量をその患者に投与することを含む。１つの実施形態において、前記患者は、癌患者である。もう１つの実施形態において、前記細胞は、前立腺癌腫瘍細胞である。さらにもう１つの実施形態において、前記腫瘍細胞は、細胞ストレス反応を誘導する化学療法薬での化学療法を受けている。好ましくは、前記化合物は、前記腫瘍細胞の前記化学療法薬に対する感受性を増大させる。前記化学療法薬に対して感受性である腫瘍細胞は、例えば、前記化合物と接触させていない細胞より高い率でアポトーシスを起こし得、または前記化合物と接触させていない細胞より高い率で成長停止を起こし得る。
【００１２】
本発明のこれらの態様において、前記化学療法薬は、好ましくは、ｍＴｏｒ阻害剤またはＡｋｔ１／２阻害剤である。適するｍＴｏｒ阻害剤の例としては、ラパマイシン、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７３、ＸＬ７Ｆ６５およびＴＡＦＡ９３、ならびにそれらの活性誘導体または類似体が挙げられる。適するＡｋｔ１／２阻害剤の例としては、ＧＳＫ６９０６９３、ペリホシンおよびＸＬ４１８、ならびにそれらの誘導体または類似体が挙げられる。
【００１３】
本発明の様々な態様の一部の実施形態において使用する化合物は、ＲＡ１ｃアンタゴニスト、例えば、抗体、抗体フラグメント、抗体コンジュゲート、アプタマー、小分子、またはオリゴペプチドである。好ましくは、前記ＲＡ１ｃアンタゴニストは、ＲＡ１ｃ活性を特異的に阻止する。他の実施形態において、前記化合物は、ＲＡ１ｃの発現を減少させる。さらに他の実施形態において、前記化合物は、ＲＡ１ｃの発現を阻止する。ＲＡ１ｃの発現の減少または阻止に有用な化合物としては、アンチセンスポリヌクレオチド、サイレンシングＲＮＡ分子、触媒ＲＮＡ分子、およびＲＮＡ−ＤＮＡキメラが挙げられる。
【００１４】
本発明のもう１つの態様は、ＲＡ１ｃアンタゴニスト、例えば、抗ＲＡ１ｃ抗体およびＲＡ１ｃの発現を増加させる化合物（例えば、ラパマイシン、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７３、ＸＬ７Ｆ６５、ＴＡＦＡ９３、ＳＫ６９０６９３、ペリホシンおよびＸＬ４１８、またはそれらの活性誘導体もしくは類似体）を含み、医薬的に許容される担体を場合によってはさらに含む組成物を提供する。
【００１５】
本発明のもう１つの態様は、化学療法薬が、癌細胞、好ましくは前立腺癌細胞、さらに好ましくはＬＮＣａＰ細胞において細胞ストレス反応を誘導するかどうかを判定する方法を提供する。この方法は、前記癌細胞と前記化学療法薬とを接触させること、およびその癌細胞におけるＲＡ１ｃ発現レベルを判定することを含む。対照細胞を超える、または前記化学療法薬と接触させる前の前記癌細胞におけるＲＡ１ｃ発現レベルを超える、ＲＡ１ｃ発現の増加は、細胞ストレス反応の誘導を示す。前記化学療法薬は、好ましくは、ｍＴｏｒ阻害剤またはＡｋｔ１／２阻害剤、およびそれらの活性誘導体または類似体である。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、併用療法で癌を治療する方法を提供する。この方法は、癌細胞とＲＡ１ｃの発現を増加させる化学療法薬とを接触させる段階、および該癌細胞をＲＡ１ｃポリペプチドに特異的に結合する化合物、例えば抗ＲＡ１ｃ抗体、の有効量と接触させる段階を含む。好ましくは、前記抗体を細胞傷害剤にコンジュゲートさせる。前記化学療法薬と前記化合物の併用の癌治療効果は、前記化学療法薬または化合物いずれかのみの効果を超えて相乗的である。一実施形態においては、該化学療法薬は、ｍＴＯＲまたはＡｋｔ１／２阻害剤である。
【００１７】
本発明の尚、さらなる実施形態は、本明細書を読めば当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂでは、実施例１において説明するように、ＲＡ１ｃの組織および細胞系列発現のオリゴアレイ解析の結果を図示する。図１Ａにおいて、正常組織は、それぞれの組織サンプルについての最も左の結果であり、癌／他の疾病は、それぞれの組織サンプルについての最も右の結果である。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂでは、実施例１において説明するように、ＲＡ１ｃの組織および細胞系列発現のオリゴアレイ解析の結果を図示する。図１Ａにおいて、正常組織は、それぞれの組織サンプルについての最も左の結果であり、癌／他の疾病は、それぞれの組織サンプルについての最も右の結果である。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、実施例２において説明するように、一定のサイトカインによる刺激に反応した、ＬＮＣａＰ細胞におけるＲＡ１ｃ発現についての定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）分析の結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、実施例２において説明するように、一定のサイトカインによる刺激に反応した、ＬＮＣａＰ細胞におけるＲＡ１ｃ発現についての定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）分析の結果を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、実施例２において説明するように、一定のサイトカインによる刺激に反応した、ＬＮＣａＰ細胞におけるＲＡ１ｃ発現についての定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）分析の結果を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｂは、実施例２において説明するように、ＩＬ−６が不在または存在する状態でのＬＮＣａＰ細胞におけるＲＡ１ｃ発現に対する血清枯渇の効果を検査する実験の結果を示す。図３Ａは、実施例２（ｂ）において説明するように、Ｑ−ＰＣＲデータを図示するものである。図３Ｂは、実施例２（ｃ）において説明するように、処理したまたは未処理のＬＮＣａＰ細胞の細胞周期状態のＦＡＣＳ分析を図示するものである。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｂは、実施例２において説明するように、ＩＬ−６が不在または存在する状態でのＬＮＣａＰ細胞におけるＲＡ１ｃ発現に対する血清枯渇の効果を検査する実験の結果を示す。図３Ａは、実施例２（ｂ）において説明するように、Ｑ−ＰＣＲデータを図示するものである。図３Ｂは、実施例２（ｃ）において説明するように、処理したまたは未処理のＬＮＣａＰ細胞の細胞周期状態のＦＡＣＳ分析を図示するものである。
【図４】図４Ａ〜４は、実施例２（ｄ）において説明するように、ＬｕＣａＰ７７エクスビボ細胞およびＬＮＣａＰ細胞におけるＲＡ１ｃ発現のＱ−ＰＣＲ分析の結果を示す。
【図５】実施例３ａにおいて説明するように、リン酸化細胞内シグナル伝達経路要素の存在を検出するウエスタンブロットを図示する。
【図６】ＩＬ−６処理ＬＮＣａＰ細胞へのＰＩ３Ｋ阻害剤の添加の効果を評定するためのＱ−ＰＣＲデータを図示する。
【図７】ＩＬ−６処理ＬＮＣａＰ細胞へのｐ３８阻害剤の添加の効果を評定するためのＱ−ＰＣＲデータを図示する。
【図８】ＩＬ−６処理または血清枯渇によって活性化されると予想される主要シグナル伝達経路の略図である。
【図９】ＩＬ−６処理ＬＮＣａＰ細胞へのｍＴｏｒ阻害剤の添加の効果を示すＱ−ＰＣＲデータを図示する。
【図１０】ＩＬ−６処理ＬＮＣａＰ細胞へのＡｋｔ１／２阻害剤の添加の効果を示すＱ−ＰＣＲデータを図示する。
【図１１】予測ＳＴＡＴ３結合部位を有する構築物の発現およびＳＴＡＴ３部位の突然変異の効果を示すアッセイを図示する。
【図１２】ＳＴＡＴ３部位の突然変異誘発を図示する。
【図１３】ＩＬ−６処理ＬＮＣａＰ細胞へのＪＡＫ阻害剤の添加の効果を示すデータを図示する。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｂは、実施例４において説明するように、ＬＮＣａＰ細胞におけるＲＡ１ｃのＩＬ−６誘導または血清枯渇誘導発現に対するＤＨＴの効果を評定するためのＱ−ＰＣＲ試験の結果を示す。図１４Ｃは、本明細書に記載するデータに基づく、ＬＮＣａＰ細胞における細胞内ＲＡ１ｃ発現調節のための１つの可能性のある計画を示す図を表す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｂは、実施例４において説明するように、ＬＮＣａＰ細胞におけるＲＡ１ｃのＩＬ−６誘導または血清枯渇誘導発現に対するＤＨＴの効果を評定するためのＱ−ＰＣＲ試験の結果を示す。図１４Ｃは、本明細書に記載するデータに基づく、ＬＮＣａＰ細胞における細胞内ＲＡ１ｃ発現調節のための１つの可能性のある計画を示す図を表す。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｂは、実施例４において説明するように、ＬＮＣａＰ細胞におけるＲＡ１ｃのＩＬ−６誘導または血清枯渇誘導発現に対するＤＨＴの効果を評定するためのＱ−ＰＣＲ試験の結果を示す。図１４Ｃは、本明細書に記載するデータに基づく、ＬＮＣａＰ細胞における細胞内ＲＡ１ｃ発現調節のための１つの可能性のある計画を示す図を表す。
【図１５】実施例５において説明するように、２９３Ｓ細胞におけるＲＡ１ｃ細胞表面発現のＦＡＣＳ分析を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
Ｉ．定義
本明細書において用いる場合、用語「ＲＡ１ｃポリペプチド」および「ＲＡ１ｃタンパク質」は、天然配列ポリペプチド、ポリペプチド変異体、ならびに天然配列ポリペプチドおよびポリペプチド変異体のフラグメント（これらは、本明細書においてさらに定義する）を包含する。本明細書に記載するＲＡ１ｃポリペプチドは、様々な源から、例えば、ヒト組織タイプからもしくは別の源から単離されるものであってもよいし、または組換えもしくは合成法によって作製されるものであってもよい。用語「ＲＡ１ｃポリペプチド」および「ＲＡ１ｃタンパク質」は、本明細書に開示するようなＲＡ１ｃポリペプチドの変異体も包含する。
【００２０】
「天然配列ＲＡ１ｃポリペプチド」は、自然から得られる対応するＲＡ１ｃポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。１つの実施形態において、天然配列ＲＡ１ｃポリペプチドは、配列番号２：
【００２１】
【化１】
2010521425.tif 000002
のアミノ酸配列を含む。もう１つの実施形態において、天然配列ＲＡ１ｃポリペプチドは、天然タンパク質配列を含み、さらにシグナルペプチド、例えば、配列番号３：
【００２２】
【化２】
2010521425.tif 000003
を含むアミノ酸配列を含む。もう１つの実施形態において、天然配列ＲＡ１ｃポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３０７７４に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされる。もう１つの実施形態において、天然配列ＲＡ１ｃポリペプチドは、シグナルペプチドのないアミノ酸配列を含む。さらにもう１つの実施形態において、天然配列ＲＡ１ｃポリペプチドは、プロタンパク質転換酵素での配列番号：２の配列の酵素的開裂の結果として生じるアミノ酸配列を含む。そのような天然配列ＲＡ１ｃポリペプチドは、自然から単離することができ、または組換えもしくは合成手段によって生産することができる。用語「天然配列ＲＡ１ｃポリペプチド」は、特定のＲＡ１ｃポリペプチドの自然発生トランケートまたは分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、該ポリペプチドの自然発生変異形態（例えば、選択的スプライス形態）および自然発生対立遺伝子変異体を特に包含する。天然配列ＲＡ１ｃは、Ｘｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６５６８−６５７２（２０００）、Ｙｕａｎら，Ｇｅｎｅ  ２７８：４１−５１（２００１）、Ｘｉａら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０：５９０３−５９０７（２００１）、および米国特許第６，３７２，８９１号にも報告されている。
【００２３】
「ＲＡ１ｃポリペプチド変異体」は、本明細書に開示するような天然配列ＲＡ１ｃポリペプチド配列のいずれかとの少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、本明細書において定義するとおりのＲＡ１ｃポリペプチド、好ましくは活性ＲＡ１ｃポリペプチドを意味する。そのようなＲＡ１ｃポリペプチド変異体としては、例えば、天然アミノ酸配列のＮまたはＣ末端における１つ以上のアミノ酸残基が付加されているまたは欠失しているＲＡ１ｃポリペプチドが挙げられる。通常、ＲＡ１ポリペプチド変異体は、本明細書に開示するような天然配列ＲＡ１ｃポリペプチド配列との少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。通常、ＲＡ１ｃ変異体ポリペプチドは、長さが少なくとも約１０アミノ酸であり、あるいは、長さが少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０アミノ酸であるかそれより長い。場合によっては、ＲＡ１ｃ変異体ポリペプチドは、天然ＲＡ１ｃポリペプチド配列と比較して１つより多くの保存的アミノ酸置換を有しない、あるいは、天然ＲＡ１ｃポリペプチド配列と比較して２、３、４、５、６、７、８、９または１０より多くの保存的アミノ酸置換を有しないであろう。
【００２４】
本明細書において確認されるＲＡ１ｃポリペプチド配列に関して「アミノ酸配列同一率（％）」は、配列をアラインし、必要な場合には最大配列同一率を達成するためにギャップを導入した後の、配列同一性の一部として保存的置換を一切考えていない、特定のＲＡ１ｃポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率と定義する。アミノ酸配列同一率を決定するためのアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内の様々な方法で、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較する配列の完全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、アラインメントを測定するために適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のために、アミノ酸配列同一％値は、配列比較コンピュータプログラムを使用して生成される。非限定的な例として、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が著作権を有するＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムがあり、これについてのソースコードは、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９の米国著作権庁（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ）にユーザーマニュアルと共に出願されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコのＧｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．を通して公的に利用することができ、または非常に多数の出版物のいずれかに、例えば、米国特許第７，０８７，７３８号に提供されているソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムを、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄで使用するためにコンパイルすべきである。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化しない。
【００２５】
ＡＬＩＧＮ−２をアミノ酸配列比較に利用する環境では、所与のアミノ酸配列Ｂへの、該Ｂとの、または該Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａ（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、該Ｂとの、または該Ｂに対する一定のアミノ酸配列同一％を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと言うことができる）のアミノ酸配列同一％は、次のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
（式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によってＡとＢについてのそのプログラムのアラインメント中に同一マッチとしてスコアされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂの中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢへのアミノ酸配列同一％がＢのＡへのアミノ酸配列同一％と等しくならないことは理解されるであろう。
【００２６】
「ＲＡ１ｃ変異体ポリヌクレオチド」または「ＲＡ１ｃ変異体核酸配列」は、本明細書において定義するとおりのＲＡ１ｃポリペプチド、好ましくは活性ＲＡ１ｃポリペプチド、をコードし、且つ、本明細書に開示するような天然配列ＲＡ１ｃポリペプチド配列をコードするヌクレオチド酸配列との少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する、核酸分子を意味する。通常、ＲＡ１ｃ変異体ポリヌクレオチドは、本明細書に開示するような天然配列ＲＡ１ｃポリペプチド配列をコードする核酸配列との少なくとも８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の核酸配列同一性を有するであろう。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
【００２７】
通常、ＲＡ１ｃ変異体ポリヌクレオチドは、長さが少なくとも約５ヌクレオチドであり、あるいは長さが少なくとも約
【００２８】
【化３】
2010521425.tif 000004
ヌクレオチドであり、この文脈において、用語「約」は、言及したヌクレオチド配列長プラスまたはマイナスその言及した長さの１０％を意味する。
【００２９】
（天然配列ＲＡ１ｃポリペプチドをコードする）ＲＡ１ｃ核酸配列、例えば、ＲＡ１ｃコード領域を含む配列番号１：
【００３０】
【化４】
2010521425.tif 000005
の核酸配列に関して、「核酸配列同一率（％）」は、配列をアラインし、必要な場合には最大配列同一率を達成するためにギャップを導入した後の、対象となるＲＡ１ｃ核酸配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドの百分率と定義する。核酸配列同一率を決定するためのアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内の様々な方法で、例えば、公的に利用できるコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、達成することができる。しかし、ここでの目的のために、核酸配列同一％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２（上で説明したもの）を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が著作権を有するものであり、それについてのソースコードは、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９の米国著作権庁にユーザーマニュアルと共に出願されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコのＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．を通して公的に利用することができ、または非常に多数の出版物のいずれかに、例えば、米国特許第７，０８７，７３８号に提供されているソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムを、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄで使用するためにコンパイルすべきである。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化しない。
【００３１】
ＡＬＩＧＮ−２を核酸配列比較に利用する環境では、所与の核酸配列Ｄへの、該Ｄとの、または該Ｄに対する所与の核酸配列Ｃ（あるいは、所与の核酸配列Ｄへの、該Ｄとの、または該Ｄに対する一定の核酸配列同一％を有するまたは含む所与の核酸配列Ｃと言うことができる）の核酸配列同一％は、次のように計算される：
１００×分数Ｗ／Ｚ
（式中、Ｗは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によってＣとＤについてのそのプログラムのアラインメント中に同一マッチとしてスコアされたヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄの中のヌクレオチドの総数である）。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと等しくない場合、ＣのＤへの核酸配列同一％がＤのＣへの核酸配列同一％と等しくならないことは理解されるであろう。核酸配列同一％計算の例として、表３および４は、「ＲＡ１ｃ  ＤＮＡ」と称する核酸配列への「比較ＤＮＡ」と称する核酸配列の核酸配列同一％を計算する方法を明らかにするものであり、この場合、「ＲＡ１ｃ  ＤＮＡ」は、対象となる仮説ＲＡ１ｃ核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」は、対象となる「ＲＡ１ｃ  ＤＮＡ」核酸分子を比較している核酸分子のヌクレオチド配列を表し、ならびに「Ｎ」、「Ｌ」および「Ｖ」は、それぞれ、異なる仮説ヌクレオチドを表す。特に別の言明がない限り、本明細書において用いるすべての核酸配列同一％値は、直ぐ前の段落で説明したように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【００３２】
他の実施形態において、ＲＡ１ｃ変異体ポリヌクレオチドは、ＲＡ１ｃポリペプチドをコードし、且つ、本明細書に開示するようなＲＡ１ｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、ハイブリダイズすることができる、核酸分子である。ＲＡ１ｃ変異体ポリペプチドは、ＲＡ１ｃ変異体ポリヌクレオチドによってコードされているものである場合もある。
【００３３】
「単離された」は、その天然の環境の成分から同定され、分離され、および／または回収された、分子／化合物（例えば、ポリペプチド）を意味する。その天然環境の不純物成分は、その分子／化合物（例えば、ポリペプチド）についての治療的使用に一般に干渉するであろう物質であり、それらとしては、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質様または非タンパク質様溶質を挙げることができる。一部の実施形態において、ポリペプチドまたはオリゴペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の残基の少なくとも１０〜１５個を得るために十分な程度に、または（２）ゲル電気泳動法、例えば、非還元条件もしくは還元条件下での、例えばクマシンブルーもしくは銀染色剤を使用する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質に、精製されるであろう。単離されたポリペプチドは、組換え細胞内でのインサイチューのポリペプチドを含む。ＲＡ１ｃポリペプチド天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないだろうからである。しかし、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製段階によって作製されるであろう。
【００３４】
「単離された」ポリヌクレオチドは、そのポリペプチドまたはオリゴペプチドコード核酸の天然源において通常は会合している少なくとも１つの不純物核酸分子から同定され、分離される、ポリペプチドまたはオリゴペプチドコード核酸分子である。単離されたポリペプチドまたはオリゴペプチドコード核酸分子は、自然の中で見つけられる形態または設定のもの以外のものである。従って、単離されたポリペプチドまたはオリゴペプチドコード核酸分子は、天然細胞中に存在するような特定のポリペプチドまたはオリゴペプチドコード核酸分子とは区別される。しかし、単離されたポリペプチドまたはオリゴペプチドコード核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なる染色体または染色体外位置にある、ポリペプチドまたはオリゴペプチドを通常は発現する細胞に含まれているポリペプチドまたはオリゴペプチドコード核酸分子を含む。
【００３５】
用語「制御配列」は、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコーディング配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適する制御配列は、例えば、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞がプロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することは公知である。
【００３６】
核酸は、それが別の核酸配列と共に機能できる関係に置かれている場合、「動作可能に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドについてのＤＮＡに動作可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、それがその配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に動作可能に連結されており；またはリボソーム結合部位は、それが転写を助長するような位置にある場合、コーディング配列に動作可能に連結されている。一般に、「動作可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が、隣接していること、ならびに分泌リーダーの場合には隣接しており、且つ、読取り状態にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の慣例に従って使用される。
【００３７】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当該技術分野における通常の技術の１つによって容易に決定でき、一般に、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、プローブが長いほど、妥当なアニーリングに必要な温度は高く、そしてプローブが短いほど必要な温度は低い。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖がそれらの融解温度より低温の環境に存在するときに再びアニーリングする変性ＤＮＡの能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列の間の所望相同度が高いほど、使用することができる相対温度は高い。結果として、相対温度が高いほど、反応条件がストリンジェントになる傾向があり、そして温度が低いほどそうならないということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照のこと。
【００３８】
本明細書において用いる場合、「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）低いイオン強度および高い洗浄温度、例えば、５０℃で０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを利用するもの；（２）ハイブリダイゼーション中に変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液と７５０ｍＭ  塩化ナトリウム、７５ｍＭ  クエン酸ナトリウムを利用するもの；または（３）４２℃で５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを用いる溶液中での一晩のハイブリダイゼーションと、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、４２℃で１０分の洗浄、それに続く５５℃でのＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＣＣから成る１０分の高ストリンジェンシー洗浄、によって識別することができる。
【００３９】
「中等度ストリンジェント条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって記載されているように識別することができ、上で説明したものほどはストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中等度ストリンジェント条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＣＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍＬ  変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃での一晩のインキュベーション、続いての、１×ＳＳＣ中、約３７〜５０℃でのフィルターの洗浄、である。当業者には、プローブ長などのような因子を適応させるために必要な場合にどのようにして温度、イオン強度などを調整するかがわかるであろう。
【００４０】
用語「アプタマー」は、ポリペプチドなどのターゲット分子に結合することができる核酸分子を指す。例えば、本発明のアプタマーは、ＲＡ１ｃポリペプチドに、またはＲＡ１ｃの発現を調節するシグナル伝達経路内の分子に特異的に結合することができる。アプタマーの生成および治療的使用は、当該技術分野において十分に確立されている。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、およびｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）（Ｅｙｅｔｅｃｈ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎを参照のこと。
【００４１】
本明細書において用いるとき、用語「エピトープタグ付の」は、「タグポリペプチド」に融合したＲＡ１ｃポリペプチドまたは抗ＲＡ１ｃ抗体を含むキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、それが融合するポリペプチドの活性に干渉しないような十分な短さのものであるが、抗体を作ることができるエピトープを生じさせるために十分な残基を有する。タグポリペプチドは、好ましくは、その抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように相当独特でもある。適するタグポリペプチドは、一般には少なくとも６アミノ酸残基、通常は約８と５０の間のアミノ酸残基（好ましくは、約１０と２０の間のアミノ酸残基）を有する。タグポリペプチドの非限定的な例としては、検出可能なマーカー、例えばポリヒスチジンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼが挙げられる。
【００４２】
ここでの目的のために「活性な」または「活性」は、天然または自然発生ＲＡ１ｃポリペプチドの生物活性および／または免疫活性を保持するＲＡ１ｃポリペプチドの形態（単数または複数）を指し、この場合、「生物」活性は、天然または自然発生ＲＡ１ｃポリペプチドが有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の天然または自然発生ＲＡ１ｃポリペプチドが生じさせる生物学的機能（阻害機能または刺激機能のいずれか）を指し、「免疫」活性は、天然または自然発生ＲＡ１ｃポリペプチドが有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力を指す。
【００４３】
用語「アンタゴニスト」は、最も広い意味で用いており、本明細書に開示する天然ＲＡ１ｃポリペプチドの生物活性を減少させる、部分的にもしくは完全に阻止する、阻害する、または中和する任意の分子を含む。適するアンタゴニスト分子としては、特に、アンタゴニスト抗体もしくは抗体フラグメント、天然ＲＡ１ｃポリペプチドのフラグメントもしくはアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子または無機小分子などが挙げられる。ＲＡ１ｃポリペプチドのアンタゴニストを同定するための方法は、ＲＡ１ｃポリペプチドと候補アンタゴニスト分子を接触させること、およびＲＡ１ｃポリペプチドに通常随伴する１つ以上の生物活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。
【００４４】
「治療すること」または「治療」または「緩和」は、治療的処置と予防的または防止的処置との両方を指し、その目的は、ターゲットとなる病的状態または疾患を予防または減速させる（減少させる）ことである。治療が必要な者としては、既にその疾患を有する者ならびにその疾患に罹患しやすい者またはその疾患を予防すべき者が挙げられる。被験者または哺乳動物は、少なくとも１つのＲＡ１ｃアンタゴニスト、もしくはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、またはそうした化合物のうちの１つ以上の組み合わせの有効量を本発明の方法に従って受けた後、その患者が、次のうちの１つ以上の観察可能な、および／もしくは、測定可能な減少または不在を示した場合、癌について首尾よく「治療される」：癌細胞の数の減少または癌細胞の不在；腫瘍サイズの減少；軟組織および骨への癌の拡大をはじめとする末梢器官への癌細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度の阻害；および／または特定の癌に随伴する症状のうちの１つ以上のある程度の軽減；罹病率および死亡率減少；ならびに生活の質の問題の改善。ＲＡ１ｃアンタゴニストは、既存の癌細胞の成長を防止できる、および／または、それらを死滅させることができる程度に、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。これらの徴候の減少は、患者にも感じることができる。
【００４５】
疾病に関する治療および改善の成功を評定するための上のパラメータは、医師によく知られている通例的手順によって容易に測定することができる。癌療法については、例えば、疾病が進行するまでの時間（ＴＴＰ）の評定および／または応答速度（ＲＲ）の判定によって有効度を測定することができる。転移は病期決定テストによって判定することができ、ならびに骨への拡大を判定するために骨のスキャンならびにカルシウムレベルおよび他の酵素についての検査によって転移を判定することができる。ＣＴスキャンを行って、骨盤およびその領域内のリンパ節への拡大を捜すこともできる。肺および肝臓への転移を捜すには、それぞれ、胸部Ｘ線と公知の方法による肝臓酵素レベルの測定とが用いられる。疾病をモニターするための他の通例的方法としては、経直腸的超音波断層法（ＴＲＵＳ）および経直腸針生検（ＴＲＮＢ）が挙げられる。
【００４６】
「慢性」投与は、長期間にわたって初期治療効果（活性）を維持するために、急性モードとは対照的に連続モードで薬剤（単数または複数）を投与することを指す。「間欠投与」は、中断せずに連続的に行う治療ではなく、実際にはどちらかと言えば周期的である治療である。
【００４７】
癌の治療、癌の症状の緩和のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜、農場動物、および動物園、競技用またはペット動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどをはじめとする哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、前記哺乳動物は、ヒトである。
【００４８】
「患者」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトを指す。
【００４９】
１つ以上のさらなる治療薬「と併用での」投与は、同時（並行）投与および任意の順序での逐次投与を含む。
【００５０】
本明細書において用いる場合、「担体」は、医薬的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含み、これらは、利用される投薬量および濃度でそれらに暴露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である。多くの場合、生理的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理的に許容される担体の例としては、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸をはじめとする抗酸化物質；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン；グルコース、マンノースもしくはデキストリンをはじめとする単糖類、二糖類および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）が挙げられる。
【００５１】
「固相」または「固体支持体」は、抗体、本発明のＲＡ１ｃポリペプチド結合オリゴペプチドまたはＲＡ１ｃポリペプチド結合有機もしくは無機小分子が付着または結合できる非水性マトリックスを意味する。ここに包含される固相の例としては、ガラス（例えば、細孔制御ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンから部分的にまたは完全に成るものが挙げられる。一定の実施形態では、その状況に依存して、固相は、アッセイプレートのウエルを含むことがあり；他の場合、それは、精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語は、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されているものなどの個別粒子の不連続固相も含む。
【００５２】
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えば、ＲＡ１ｃポリペプチド、それに対する抗体、またはＲＡ１ｃポリペプチド結合オリゴペプチド）の送達に有用である、様々なタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から成る小胞である。リポソームの成分は、生体膜の脂質配列に類似した二重層構成で一般に配列される。
【００５３】
「小」分子または「小さな」有機小分子は、約５００ダルトン未満の分子量を有すると本明細書では定義する。
【００５４】
ＲＡ１ｃアンタゴニストもしくはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、またはそのような化合物のうちの１つ以上の組み合わせの「有効量」は、具体的に述べられている目的を遂行するために十分な量である。「有効量」は、述べられている目的に関連して、経験的におよび通例的な手法で決定することができる。
【００５５】
用語「治療有効量」は、被験者または哺乳動物における疾病または疾患を「治療する」ために有効な、ＲＡ１ｃアンタゴニストもしくはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、またはそのような化合物のうちの１つ以上の組み合わせの量を指す。癌の場合、ＲＡ１ｃアンタゴニストもしくはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、またはそのような化合物のうちの１つ以上の組み合わせの治療有効量は、癌細胞の数を減少させることができ；腫瘍サイズを減少させることができ；末梢器官への癌細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度減速させる、好ましくは停止させる）ことができ；腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度減速させる、好ましくは停止させる）ことができ；腫瘍成長を、ある程度、阻害することができ；および／または癌に随伴する症状のうちの１つ以上をある程度軽減することができる。「治療すること」についての本明細書における定義を参照のこと。ＲＡ１ｃアンタゴニスト、ＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、細胞ストレスを調節する化合物、またはそのような化合物のうちの１つ以上の組み合わせは、成長を防止するおよび／または既存の癌細胞を死滅させる程度に、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。
【００５６】
ＲＡ１ｃアンタゴニストもしくはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、またはそのような化合物のうちの１つ以上の組み合わせの「成長阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞、の成長をインビトロまたはインビボいずれかで阻害することができる量である。新生細胞成長を阻害するための、ＲＡ１ｃアンタゴニストもしくはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、またはそのような化合物のうちの１つ以上の組み合わせの「成長阻害量」は、経験的に、および通例的な手法で決定することができる。
【００５７】
ＲＡ１ｃアンタゴニストもしくはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、またはそのような化合物のうちの１つ以上の組み合わせの「細胞傷害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞、の破壊をインビトロまたはインビボいずれかで生じさせることができる量である。新生細胞成長を阻害するための、ＲＡ１ｃアンタゴニストもしくはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、またはそのような化合物のうちの１つ以上の組み合わせの「細胞傷害量」は、経験的におよび通例的な手法で決定することができる。
【００５８】
用語「抗体」は、最も広い意味で用いており、具体的には、例えば、単一抗ＲＡ１ｃポリペプチドモノクローナル抗体（アンタゴニスト、結合および／または中和抗体を含む）、多エピトープ特異性を有する抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体組成物、ポリクローナル抗体、一本鎖抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体、ならびに抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体のフラグメント（下記参照）を、それらが所望の生物活性または免疫活性を示すという条件で、包含する。本明細書では用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）を抗体と同義で用いている。
【００５９】
本発明の方法に有用な抗体は、その天然環境の成分から同定され、分離され、および／または回収されたものである。その天然環境の不純物成分は、抗体についての治療的使用に干渉するであろう物質であり、それらとしては、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様溶質を挙げることができる。好ましい実施形態において、前記抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって判定して抗体９５重量％より高度に、最も好ましくは９９重量％より高度に、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によりＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の残基の少なくとも１５個を得るために十分な程度に、または（３）例えばクマシンブルーもしくは銀染色剤を使用して、還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥなどのゲル電気泳動法により均質に、精製されるであろう。
【００６０】
基本の４本鎖抗体ユニットは、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から成るヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、その基本へテロ四量体ユニットに加えてＪ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドの５つから成り、従って、１０の抗原結合部位を有し、一方、分泌ＩｇＡ抗体は、重合して、２〜５の基本４本鎖ユニットに加えてＪ鎖を含む多価集合体を形成することができる）。ＩｇＧの場合、その４本鎖ユニットは、一般に、約１５０，０００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結されており、一方、２本のＨ鎖は、そのＨ鎖のアイソタイプに依存して１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結されている。ＨおよびＬ鎖それぞれが、規則正しい間隔の鎖間ジスルフィド架橋も有する。それぞれのＨ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＨ）、続いてαおよびγ鎖のそれぞれについては３つの定常ドメイン（ＣＨ）ならびにμおよびεアイソタイプについては４つのＣＨドメインを有する。それぞれのＬ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＬ）、続いてその反対側の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬは、ＶＨと並んで配置されており、ＣＬは、重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）と並んで配置されている。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬ、互いの対合が、単一抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，ｐａｇｅ  ７１  ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照のこと。
【００６１】
いずれの脊椎動物種からのＬ鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの明確に異なるタイプの一つに割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つのクラスがある：α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる重鎖をそれぞれ有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ。γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能の比較的小さな差に基づきサブクラスにさらに分けることができる。例えば、ヒトは、次のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。
【００６２】
用語「可変」は、抗体の間で可変ドメインの一定のセグメントが配列の点で大幅に異なることを指す。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかし、可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸範囲すべてにわたって均等に分配されてはいない。それよりむしろ、Ｖ領域は、それぞれが９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる超可変性のより短い領域によって隔てられた１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の範囲から成る。天然重および軽鎖それぞれの可変ドメインは、３つの超可変領域によって接続された、主としてβ−シート構造をとる４つのＦＲを含み、それらの超可変領域は、そのβシート構造を接続する、および場合によってはその一部を構成する、ループを構成する。それぞれの鎖内の超可変領域は、それらのＦＲによって極めて近接して互いに保持され、他の鎖からの超可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への抗体の関与を示す。
【００６３】
本明細書において用いるとき、用語「超可変領域」は、抗原結合に責任を負う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬにおける約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）辺りの残基、ならびにＶＨにおける約１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）辺り；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））および／または「超可変ループ」からの残基（例えば、ＶＬにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびにＶＨにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。
【００６４】
本明細書において用いる場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量存在することがある、起こりうる自然発生突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成できる点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、いずれかの特定の方法による抗体の生産を要求するものと解釈すべきでない。例えば、本発明に有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５（１９７５）が最初に説明したハイブリドーマ方法論によって作製することができ、または細菌細胞、真核細胞、動物細胞もしくは植物細胞において組換えＤＮＡ法を用いて作ることができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００６５】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であるが、その（それらの）鎖の残部は、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびにそのような抗体のフラグメントを、所望の生物活性を示すという条件で含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）参照）。ここで対象となるキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が挙げられる。
【００６６】
「インタクト」抗体は、抗原結合部位はもちろん、ＣＬならびに少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。前記定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）である場合もあり、またはそれらのアミノ酸配列変異体である場合もある。好ましくは、インタクト抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有する。
【００６７】
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部分、好ましくは、インタクト抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディー；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］参照）；一本鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特性抗体が挙げられる。
【００６８】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、および残余の「Ｆｃ」領域、容易に結晶化する能力を反映している呼称、を生じさせる。Ｆａｂフラグメントは、Ｌ鎖全体に加えてＨ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）および１本の重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）から成る。それぞれのＦａｂフラグメントは、抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、単一の大きなＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じさせ、このフラグメントは、二価抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂフラグメントにおおよそ対応し、且つ、依然として抗原を架橋させることができる。Ｆａｂ’フラグメントは、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインをはじめとする幾つかの追加の残基を有することでＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、その定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書における呼称である。本来、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、それらの間にヒンジシステインを有する、対のＦａｂ’フラグメントとして生産される。抗体フラグメントの他の化学カップリングも公知である。
【００６９】
Ｆｃフラグメントは、ジスルフィドによって互いに保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列によって決まり、この領域は、一定のタイプの細胞上で見つけられるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
【００７０】
「Ｆｖ」は、完全抗原認識部位および完全抗原結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。このフラグメントは、しっかりと非共有結合で会合している１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体から成る。これらの２つのドメインの保持から６つの超可変ループ（ＨおよびＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が生じ、それらがアミノ酸残基を抗原結合に供し、抗体への抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含む、Ｆｖの半分）であっても、該結合部位全体より低い親和性でではあるが、抗原を認識するおよび抗原に結合する能力を有する。
【００７１】
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」と略称もされる「一本鎖Ｆｖ」は、連結して単一のポリペプチド鎖になるＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む、抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、そのｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインの間にさらに含む。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  １９９５，下記を参照のこと。
【００７２】
用語「ダイアボティー」は、Ｖドメインの鎖内対合ではなく鎖間対合を達成するようにＶＨドメインとＶＬドメインの間に短いリンカー（約５〜１０残基）を有するｓＦｖフラグメント（前の段落参照）を構築し、その結果、二価フラグメント、すなわち２つの抗原結合部位を有するフラグメント、を生じさせることによって作製される、小さな抗体フラグメントを指す。二重特異性ダイアボディーは、２つの抗体のＶＨおよびＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する、２つの「交差」ｓＦｖフラグメントのヘテロ二量体である。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、さらに十分に説明されている。
【００７３】
非ヒト（例えば、齧歯動物）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。たいていは、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の抗体特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にまたはドナー抗体中では見つからない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのものに対応する超可変ループのすべてまたは実質的にすべておよびＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つおよび典型には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、一般にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も場合によっては含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００７４】
「種依存性抗体」、例えば哺乳動物抗ヒトＩｇＥ抗体、は、第一の哺乳動物種からの抗原に対して、第二の哺乳動物種からのその抗原の相同体に対して有するより強い結合親和性を有する抗体である。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原に「特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８以下、および最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、第二の非ヒト哺乳動物種からの抗原の相同体に対して、ヒト抗原に対するその結合親和性より少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い結合親和性を有する。前記種依存性抗体は、上で定義したような抗体の様々なタイプのいずれかのものであり得るが、好ましくはヒト化またはヒト抗体である。
【００７５】
「ＲＡ１ｃポリペプチド結合オリゴペプチド」は、本明細書に記載するようなＲＡ１ｃポリペプチドに結合する、好ましくは特異的に結合する、オリゴペプチドである。ＲＡ１ｃポリペプチド結合オリゴペプチドは、公知のオリゴペプチド合成方法論を用いて化学合成することができ、または組換え技術を用いて作製および精製することができる。ＲＡ１ｃポリペプチド結合オリゴペプチドは、通常、長さが少なくとも約５アミノ酸、あるいは、長さが少なくとも約
【００７６】
【化５】
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アミノ酸であるかそれより長く、そのようなオリゴペプチドは、本明細書に記載するようなＲＡ１ｃポリペプチドに結合する、好ましくは、特異的に結合することができる。ＲＡ１ｃポリペプチド結合オリゴペプチドは、過度の実験を伴わずに周知の技術を用いて同定することができる。これに関して、ポリペプチドターゲットに特異的に結合することができるオリゴペプチドについてオリゴペプチドライブラリをスクリーニングするための技術は当該技術分野において周知であることを特筆する（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、同第５，７５０，３７３号、同第４，７０８，８７１号、同第４，８３３，０９２号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６８９号、同第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ公開番号  ＷＯ  ８４／０３５０６およびＷＯ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：３９９８−４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１７８−１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎら，ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１３０−１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：６１１−６１６（１９８８）；Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３；およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８参照）。
【００７７】
「ＲＡ１ｃポリペプチド結合有機または無機小分子」は、本明細書に記載するようなＲＡ１ｃポリペプチドに結合する、好ましくは特異的に結合する、本明細書において定義するとおりのオリゴペプチドまたは抗体以外の有機または無機小分子である。小分子ＲＡ１ｃアンタゴニストは、好ましくは、有機小分子である。ＲＡ１ｃポリペプチド結合有機物は、公知の方法論を用いて同定および化学合成することができる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ００／００８２３およびＷＯ  ００／３９５８５参照）。ＲＡ１ｃポリペプチド結合有機小分子は、通常、サイズが約２０００ダルトン未満であり、あるいはサイズが約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満であり、また、本明細書に記載するようなＲＡ１ｃポリペプチドに結合する、好ましくは特異的に結合することができるような有機小分子は、過度の実験を伴わずに周知の技術を用いて同定することができる。これに関して、ポリペプチドターゲットに結合することができる分子について有機小分子ライブラリをスクリーニングするための技術は当該技術分野において周知であることを特筆する（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ００／００８２３およびＷＯ  ００／３９５８５参照）。
【００７８】
対象となる抗原、例えばＲＡ１ｃポリペプチド、に「結合する」、抗体、オリゴペプチドまたは他の有機もしくは無機小分子は、その抗体、オリゴペプチドまたは他の有機もしくは無機小分子が、その抗原を発現する細胞または組織のターゲッティングに治療薬として有用であり、他のタンパク質と有意に交差反応しないような十分な親和性でその抗原に結合するものである。そのような実施形態において、「非ターゲット」タンパク質への、抗体、オリゴペプチドまたは他の有機もしくは無機小分子の結合の程度は、蛍光励起細胞分別（ＦＡＣＳ）分析または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって判定して、その特定のターゲットタンパク質への、抗体、オリゴペプチドまたは他の有機もしくは無機小分子の結合の約１０％未満であろう。ターゲット分子への抗体、オリゴペプチドまたは他の有機もしくは無機小分子の結合に関して、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドターゲット上のエピトープ「への特異的結合」または「に特異的に結合する」または「に特異的である」という用語は、非特異的相互作用とははっきりと異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般には結合活性を有しない類似した構造の分子である対照分子の結合と比較して分子の結合を判定することにより、測定することができる。例えば、特異的結合は、ターゲットに類似した対照分子、例えば過剰な非標識ターゲット、との競合によって判定することができる。この場合、標識ターゲットのプローブへの結合が、過剰な非標識ターゲットによって競合的に阻害されるならば、特異的結合を指す。本明細書において用いる場合、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドターゲット上のエピトープ「への特異的結合」または「に特異的に結合する」または「に特異的である」という用語は、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍの、またはそれより大きい、ターゲットに対するＫｄを有する分子によって示されるものであり得る。１つの実施形態において、用語「特異的結合」は、分子が、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合し、いずれの他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープにも実質的に結合しない結合を指す。
【００７９】
「ＲＡ１ｃポリペプチドを発現する腫瘍細胞の成長を阻害する」、抗体、オリゴペプチド、または他の有機もしくは無機小分子、他のＲＡ１ｃアンタゴニスト、ＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、またはそのような化合物のうちの１つ以上の組み合わせ、あるいは「成長阻害性」抗体、オリゴペプチド、または他の有機もしくは無機小分子、他のＲＡ１ｃアンタゴニスト、ＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、細胞ストレスを調節する化合物、またはそのような化合物のうちの１つ以上の組み合わせは、ＲＡ１ｃポリペプチドを発現するまたは過発現する前立腺癌細胞の測定可能な成長阻害を生じさせるものである。ＲＡ１ｃポリペプチドは、細胞の表面に結合している場合もあり、または細胞外環境にある場合もある。一定の実施形態において、成長阻害性抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体、オリゴペプチド、有機もしくは無機小分子、他のＲＡ１ｃアンタゴニスト、ＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、またはそうした化合物のうちの１つ以上の組み合わせは、適切な対照と比較して、約２０％より大きく、あるいは約２０％から約５０％、あるいは５０％より大きく（例えば、約５０％から約１００％）ＲＡ１ｃポリペプチド発現性腫瘍細胞の成長を阻害する。一般に、前記対照は、試験する抗体、オリゴペプチド、他の有機もしくは無機小分子、他のＲＡ１ｃアンタゴニスト、ＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、細胞ストレスを調節する化合物、またはそのような化合物の１つまたはそれ以上の組み合わせ、で処置していない腫瘍細胞である。１つの実施形態では、抗体に対する腫瘍細胞の暴露の１〜１０日後に成長阻害を測定した場合、細胞培養物において約０．１から３０μｇ／ｍＬまたは約０．５ｎＭから２００ｎＭの抗体濃度で成長阻害を測定することができる。前記抗体は、約１μｇ／（体重ｋｇ）から約１００ｍ／ｋｇでのその抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体の投与が、その抗体の初回投与から約５日から３ヶ月以内に、または約５から３０日以内に腫瘍サイズまたは腫瘍細胞増殖の減少を生じさせた場合、インビボで成長阻害性である。
【００８０】
「細胞ストレス反応を誘導する」ことは、通常の細胞の状態および恒常性からの急性または慢性シフトによって誘発され、発作の阻止、傷害の修復および細胞の保護を目的とする少なくとも１つの細胞プロセス、例えばシグナル伝達経路またはカスケードを細胞に開始させることを意味する。
【００８１】
「細胞ストレス反応を改善する」ことは、細胞ストレス反応に随伴するまたは細胞ストレス反応によって引き起こされる任意の生理状態の任意の低減、阻害または予防を意味する。１つの実施形態では、細胞ストレス反応の改善によって、細胞が細胞ストレス反応を誘導する化学療法薬に対してより感受性になる結果となる。化学療法薬に対する感受性の増加は、例えば、細胞をその薬剤と接触したとき、細胞ストレス反応の改善前のアポトーシス率と比較してアポトーシス率が増加されたかどうかを判定することにより、モニターすることができる。アポトーシス、すなわちプログラム細胞死は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡのフラグメント化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞フラグメント化、および／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成をモニターすることによって判定することができる。アポトーシスの誘導は、サンプル細胞集団のＦＡＣＳ分析によって判定することもできる。前記細胞は、通常、ＲＡ１ｃポリペプチドを過発現するものである。好ましくは、前記細胞は、前立腺癌の腫瘍細胞である。アポトーシスに関連した細胞事象を評価するために様々な方法を利用することができる。例えば、アネキシン結合によってホスファチジルセリン（ＰＳ）転座を測定することができ；ＤＮＡラダリングによってＤＮＡフラグメント化を評価することができ；および低二倍体細胞の任意の増加によって、ＤＮＡフラグメント化と共に核／クロマチン濃縮を評価することができる。アポトーシスの増加は、アネキシン結合アッセイにおいて未処理細胞で観察されるものを基準にして、アネキシン結合の約２から５０倍、あるいは約５から５０倍、あるいは約１０から５０倍、またはそれより大きい誘導を結果として生じさせることである。化学療法薬に対する感受性の増加も、細胞をその薬剤と接触させたとき、細胞ストレス反応の改善前のそれらの細胞の成長停止と比較して、成長停止、例えばＧ０／Ｇ１停止、が増大されるかどうかを判定することによって、モニターすることができる。Ｇ０／Ｇ１停止を判定するための方法は、実施例２において見られる。成長停止の増大は、未処理細胞において観察されるものを基準にして、細胞におけるＧ０／Ｇ１停止の約２から５０倍、あるいは約５から５０倍、あるいは約１０から５０倍の、またはそれより大きな増大を結果として生じさせることである。
【００８２】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因し、且つ、その抗体のアイソタイプによって変わる生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；およびＢ細胞活性化が挙げられる。
【００８３】
「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」は、一定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原担持ターゲット細胞に特異的に結合させ、その結果としてそのターゲット細胞を細胞毒で死滅させることができる、細胞傷害性の一形態を指す。前記抗体は、細胞傷害性細胞「の活動準備を整え」、そのような死滅に絶対に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介するための主な細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩしか発現しないが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評定するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されているものなどのインビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、対象となる分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているものなどの動物モデルにおいて、評定することができる。
【００８４】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を述べるものである。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＩＩＩサブクラス受容体（これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライス形態を含む）を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、これらは、主としてそれらの細胞質ドメインに違いのある、類似したアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（総説  Ｍ．ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）参照）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に総説されている。将来同定されるであろうものを含めて他のＦｃＲは、本明細書では用語「ＦｃＲ」に包含される。この用語は、母系ＩｇＧの胎児への移入に責任を負う新生児受容体、ＦｃＲｎ（Ｇｕｙｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））も含む。
【００８５】
「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、これらの細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。これらのエフェクター細胞は、天然源から、例えば、血液から単離することができる。
【００８６】
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体が存在する状態でのターゲット細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、それらの同源抗原に結合する（適切なサブクラスの）抗体への補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。補体活性化を評定するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されているような、ＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００８７】
用語「癌」および「癌性の」は、細胞増殖の異常な増加、細胞死の異常な減少または細胞増殖の量と細胞死の量の不均衡に起因し得る、細胞数の無秩序な増加（本明細書では、一般に、細胞成長と呼ぶ）を一般に特徴とする、哺乳動物における生理状態を指す、または、述べる。癌の例としては、前立腺癌が挙げられるが、これに限定されない。前立腺癌の例としては、前立腺腫瘍、腺癌、および前立腺上皮内新生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
用語「細胞増殖性疾患」および「増殖性疾患」は、ある程度の異常細胞増殖を随伴する疾患を指す。１つの実施形態において、細胞増殖性疾患は、癌である。
【００８９】
本明細書において用いる場合、「腫瘍」は、悪性であろうと、良性であろうと、すべての新生細胞成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性細胞および組織を指す。用語「癌」、「癌性の」、「癌増殖性疾患」、「増殖性疾患」および「腫瘍」は、本明細書において言及する場合、互いに排他的ではない。
【００９０】
「細胞死を誘導する」、ＲＡ１ｃアンタゴニスト、もしくはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、またはそうした化合物のうちの１つ以上の組み合わせは、生細胞が生存不能になる原因となるものである。前記細胞は、ＲＡ１ｃポリペプチドを発現するものであり、また、ＲＡ１ｃポリペプチドを特異的に発現するまたは過発現する細胞タイプのものである。前記細胞は、特定の細胞タイプの癌性または正常細胞であり得る。前記ＲＡ１ｃポリペプチドは、癌細胞の表面で発現される膜貫通型ポリペプチドである場合もあり、または癌細胞によって生産され、分泌されるポリペプチドである場合もある。前記細胞は、癌細胞、例えば、前立腺癌細胞であり得る。インビトロでの細胞死を補体および免疫エフェクター細胞が不在の状態で判定して、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によって誘導される細胞死と区別することができる。従って、細胞死についてのアッセイは、熱不活性化血清を使用して（すなわち、補体が不在の状態で）、および免疫エフェクター細胞が不在の状態で行うことができる。抗体、オリゴペプチドもしくは他の有機小分子、他のＲＡ１ｃアンタゴニスト、ＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、細胞ストレスを調節する化合物、またはそうした化合物のうちの１つ以上の組み合わせが、細胞死を誘導できるかどうかを判定するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅら．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１−１１（１９９５）参照）または７ＡＡＤの取込みによって評価されるような膜完全性の喪失を、未処理細胞を基準にして評定することができる。好ましい細胞死誘導性抗体、オリゴペプチドもしくは他の小分子、他のＲＡ１ｃアンタゴニスト、ＲＡ１ｃ発現を調節する化合物、またはそうした化合物のうちの１つ以上の組み合わせは、ＰＩ取込みアッセイで、前立腺癌細胞モデルの非限定的な例ではＬＮＣａＰ細胞において、ＰＩ取込みを誘導するものである。
【００９１】
「ＲＡ１ｃポリペプチド発現性細胞」は、内因性のまたはトランスフェクトされたＲＡ１ｃポリペプチドを例えば分泌形態で発現する細胞である。ＲＡ１ｃポリペプチド発現は、検出または診断アッセイにおいて（例えば、ＲＡ１ｃポリペプチドをコードする単離された核酸から組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる単離されたＲＡ１ｃポリペプチドに対して作製された抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体を用いる免疫組織化学アッセイ；ＦＡＣＳ分析などにより）細胞中におよび／もしくは細胞表面に存在する、ならびに／または細胞によって分泌されるＲＡ１ｃタンパク質のレベルを評価することによって判定することができる。あるいは、または加えて、例えば、ＲＡ１ｃポリペプチドをコードする核酸またはその補体に対応する核酸ベースのプローブを使用する蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開されたＷＯ９８／４５４７９参照）、サザンブロット法、ノーザンブロット法、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えば実時間定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ＲＡ１ｃポリペプチドをコードする核酸またはｍＲＮＡの細胞内レベルを測定することができる。例えば抗体ベースアッセイを用いて、血清などの生体液中のｓｈｅｄ抗原を測定することによってＲＡ１ｃポリペプチド発現を研究することもできる（例えば、１９９０年６月１２日発行の米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日発行のＷＯ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日発行の米国特許第５，４０１，６３８号；およびＳｉａｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３２：７３−８０（１９９０）も参照のこと）。上のアッセイのほかにも様々なインビボアッセイを当業者は利用することができる。例えば、検出可能な標識、例えば放射性同位元素、で場合によっては標識されている抗体に患者の体内の細胞を暴露することができ、ならびに放射活性の体外式スキャンによって、または以前にその抗体に暴露された患者から採取した生検材料を分析することによって、患者の細胞へのその抗体の結合を評価することができる。
【００９２】
本明細書において用いる場合、用語「免疫付着因子」は、異種タンパク質の結合特異性（「付着因子」）と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を兼ね備えている抗体様分子を意味する。構造的には、免疫付着因子は、抗体の抗原認識および結合部位以外の所望の結合特異性を有する（すなわち非相同の）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。免疫付着因子分子の付着部分は、一般に、受容体またはリガンドの結合部位を少なくとも含む隣接アミノ酸配列である。免疫付着因子内の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３もしくはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができる。
【００９３】
本明細書において用いるときの「標識」という語は、抗体、オリゴペプチドまたは他の有機もしくは無機小分子に直接または間接的にコンジュゲートして「標識」抗体、オリゴペプチドまたは他の有機もしくは無機小分子を生成する、検出可能な化合物または組成物を指す。この標識は、それだけで検出可能であり得（例えば、放射性同位元素標識もしくは蛍光標識）、または酵素的標識の場合、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学的改変を触媒することができる。
【００９４】
本明細書において用いる場合、用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害もしくは防止する、および／または細胞の破壊を生じさせる物質を指す。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法薬、例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤、酵素およびそれらのフラグメント、例えば核溶解酵素、抗生物質、および毒素、例えば小分子毒素または細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性毒素（それらのフラグメントおよび／もしくは変異体を含む）、ならびに下に開示する様々な抗腫瘍または抗癌剤を含むと解釈する。他の細胞傷害剤は、下で説明する。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を生じさせる。
【００９５】
「化学療法薬」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法薬の具体的な例としては、ラパマイシン／シロリムス、ＣＣＩ−７７９／テムシロリムス（Ｗｙｅｔｈ）、ＲＡＤ００１／エベロリムス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＰ２３５７３（Ａｒｉａｄ）、ＸＬ７Ｆ６５、ＴＡＦＡ９３（Ｉｓｏｔｅｃｈｎｉｋａ）、ＧＳＫ６９０６９３（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ペリホシン（ＡＥｔｅｒｎａ  Ｚｅｎｔａｒｉｓ）、およびＸＬ４１８（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ならびにこれらの活性誘導体および類似体をはじめとする（しかし、それらに限定）、ｍＴｏｒまたはＡＫＴ経路を阻害する薬剤が挙げられる。
【００９６】
化学療法薬のさらなる例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパおよびウレドパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロロメラミンをはじめとする、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）参照）；ダイネマイシンＡをはじめとするダイネマイシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、���トフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトリキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタラビン、フルオキシウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デホファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（オレゴン州、ユージーンのＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリクロテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（ニュージャージー州、プリンストンのＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、パクリタキセルのＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ不含、アルブミン操作ナノ粒子製剤（イリノイ州、ショームバーグのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（フランス、アントニーのＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノル��シン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチン酸；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記のもののいずれかの医薬的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに上記のもののうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンの併用療法についての略記）およびＦＯＬＯＦＯＸ（オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を５−ＦＵおよびロイコボビンと併用する治療レジメンについての略記）が挙げられる。
【００９７】
癌の成長を促進することがあり、多くの場合、全身治療、すなわち体全体の治療の形態である、ホルモンの作用を調節、低減、阻止または阻害するように作用する抗ホルモン薬も、この定義に含まれる。それらはホルモン自体である場合もある。例としては、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェンをはじめとする、抗エストロゲン薬および選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）；抗プロゲステロン薬；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）；卵巣を抑制または閉鎖するように機能する薬剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えば、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリンおよびトリプテレリン；他の抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド；ならびに副腎におけるエストロゲン生産を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン（ｈｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなどが挙げられる。加えて、化学療法薬の上記の定義は、ビスホスホネート、例えば、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）もしくはＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ドレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート、またはＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネート；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）など；ワクチン、例えば、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチンおよびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ラパチニブジトシレート（ＧＷ５７２０１６としても知られている、ＥｒｂＢ−２およびＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）；ならびに上記のもののうちのいずれかの医薬的に許容される塩、酸または誘導体を包含する。
【００９８】
本明細書において用いるとき、「成長抑制剤」は、ＲＡ１ｃポリペプチド発現性癌性細胞をインビトロまたはインビボいずれかで阻害する化合物または組成物を指す。従って、成長抑制剤は、Ｓ期におけるＲＡ１ｃポリペプチド発現性細胞の百分率を有意に減少させるものであり得る。成長抑制剤の例としては、（Ｓ期以外の場所で）細胞周期進行を阻止する物質、例えば、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤が挙げられる。古典的Ｍ期ブロッカーとしては、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシドおよびブレオマイシンが挙げられる。Ｇ１を停止させる薬剤、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシルおよびａｒａ−Ｃは、Ｓ期にも影響を及ぼす。さらなる情報は、Ｍｕｒａｋａｍｉらによる「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」と題する、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒｅａｌ  ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｒａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）、特に、ｐ．１３において見つけることができる。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、抗癌薬であり、両方ともイチイ属の木から採取される。ヨーロッパイチイから採取されるドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似体である。パクリタキセルおよびドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管の組み立てを促進し、解重合を防止することによって微小管を安定させ、その結果として細胞における有糸分裂を抑制する。
【００９９】
「ドキソルビシン」は、アントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全化学名は、（８Ｓ−ｃｉｓ）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リクソ−ヘキサピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオンである。
【０１００】
用語「サイトカイン」は、ある細胞集団によって放出され、別の細胞に対しては細胞間伝達物質として作用するタンパク質についての一般用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパクホルモン、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β；抗ミュラー管抑制物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板成長因子；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球―ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子は、サイトカインの中に含まれる。本明細書において用いる場合、用語サイトカインは、天然源からの、または、組換え細胞培養からのタンパク質、および天然配列サイトカインの生物活性等価物を包含する。
【０１０１】
用語「添付文書」は、治療製品の商用パッケージ内に慣例上含まれている、適応症、使用法、用量、投与、濃度および／またはそのような治療製品の使用に関する警告についての情報を含む使用説明書を指すために用いる。
【０１０２】
ＩＩ．本発明の組成物および方法
本明細書に記載するように、そして、例えば、米国公開特許出願第２００５０１０６６４４号、Ｘｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６５６８−６５７２（２０００）、Ｙｕａｎら，Ｇｅｎｅ  ２７８：４１−５１（２００１）、Ｘｉａら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０：５９０３−５９０７（２００１）、および米国特許第６，３７２，８９１号に記載されているように、ＲＡ１ｃは、前立腺癌細胞において高度に発現され、大部分の他の一般に試験される正常および罹病組織においては実質的に発現されない。ＲＡ１ｃは、７回膜貫通型Ｇタンパク質結合受容体タンパク質のファミリーとの配列相同性を有する。
【０１０３】
本明細書において、初めて、ＲＡ１ｃが前立腺癌細胞の細胞外膜上に位置すること、および従って、前立腺癌の同定および治療のターゲットとして利用できることを明らにする。
【０１０４】
前立腺癌細胞モデルにおけるＲＡ１ｃ発現がＩＬ−６処理または血清枯渇に反応してアップレギュレーションされること（これは、ＲＡ１ｃ発現が細胞ストレスの増加によって刺激されることを示唆する）も本明細書において明らかにする。細胞ストレス反応は、進化上、すべての生物に保存されており、ストレスを受けた生物が順応するのか、生き残るのか、または死ぬのかを示す分子的応答を生じさせる。この細胞反応は、代謝における特定の細胞順応段階、膜、細胞骨格に対してならびに他の細胞要素および機能のものに対して備える、多数の特異的シグナル伝達事象を含む。Ｓｚａｌａｙら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８１（１９）：３６７５−３６８０（２００７）。ストレスに対するこれらの分子的反応は、生物にとってたいていは有益である。しかし、細胞ストレス反応が癌細胞において誘導されると、化学療法薬での治療の有効性の妨げになることがある。Ｈｅｒｒ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｄｅｂａｔｉｎ，Ｋ−Ｍ，Ｂｌｏｏｄ，９８：２６０３−２６１４（２００１）；Ｔｉｌｉｇａｄａ，Ｅ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ，１３：Ｓ１１５−Ｓ１２４（２００６）。一般に、化学療法薬は、感受性腫瘍細胞において細胞成長を抑制し、および／またはアポトーシスを誘導する。これらの薬剤は、細胞の恒常性の不均衡を生じさせ、結果として細胞ストレスを生じさせる。それに応じて、細胞は、その細胞を前の状態に戻そうとして、細胞ストレス反応を起こす。細胞という状況の中でストレスのタイプおよび量がその細胞反応の結果を左右するようである。細胞ストレス反応は、細胞が化学療法薬での処理に対して感受性であるのか、または耐性であるのかを左右し得る。Ｂｌｏｏｄ，９８：２６０３−２６１４。
【０１０５】
ＩＬ−６または本明細書において説明する細胞ストレス反応に関係すると考えられる一定の細胞内シグナル伝達経路の阻害に関する研究により、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼの阻害またはＰＩ３Ｋの阻害が結果として処理細胞におけるＲＡ１ｃ発現を減少させることが立証された。しかし、構成的活性ｍＴＯＲおよびＡｋｔ１／２の阻害は、ＲＡ１ｃ発現を刺激するという反対の効果を有し、この効果は、ＩＬ−６のみについて観察された効果に少なくとも相加的であった。
【０１０６】
本明細書中の実施例に提示するデータは、ＲＡ１ｃが、癌細胞に生存有利性を与え得るストレス誘導遺伝子であることを示している。図１４Ｃ。正常な充実した成長条件下ではＲＡ１ｃ発現は抑制されるが、ＲＡ１ｃ発現は、細胞ストレスを助長する条件（ＩＬ６処理または血清枯渇）に反応してアップレギュレートされる。さらに、細胞ストレスに反応してのＲＡ１ｃ発現亢進を成長促進経路活性化（ＤＨＴ）によって逆転または減弱することができ、また、成長促進経路をさらに阻害（ラパマイシン）すると、増幅させることができる。
【０１０７】
Ａｋｔ１／２またはｍＴＯＲの阻害がＩＬ−６と少なくとも相加的であるという観察は、これらの阻害剤と抗ＲＡ１ｃ分子の併用が、癌の治療に治療的恩恵を有し得ることを示唆している。ｍＴＯＲをターゲットにする幾つかの薬剤、例えば、ラパマイシン／シロリムス、ＣＣＩ−７７９／テムシロリムス、ＲＡＤ００１／エベロリムス、ＡＰ２３５７３、ＸＬ７Ｆ６５およびＴＡＦＡ９３、ならびにこれらの活性化誘導体または類似体は、臨床評価中である。ＧＳＫ６９０６９３、ペリホシンおよびＸＬ４１８、ならびにこれらの活性化誘導体または類似体をはじめとするＡｋｔの阻害剤も、最近、臨床開発に入った。
【０１０８】
従って、本発明は、特に前立腺癌細胞において、それらの細胞におけるＲＡ１ｃ発現またはＲＡ１ｃ活性化を減少させるまたは阻止することにより、細胞ストレス反応を改善する方法を提供する。前記細胞におけるＲＡ１ｃ発現または活性化を減少させるまたは阻止する化合物としては、ＲＡ１ｃアンタゴニストおよびＲＡ１ｃ発現を調節する化合物が挙げられる。前記細胞におけるＲＡ１ｃ発現または活性化を減少させるまたは阻止する化合物の例としては、抗体、抗体フラグメント、抗体コンジュゲート、アプタマー、小分子、オリゴペプチド、アンチセンスポリヌクレオチド、サイレンシングＲＮＡ分子、触媒ＲＮＡ分子、およびＲＮＡ−ＤＮＡキメラが挙げられるが、これらに限定されず、それらを本明細書においてさらに説明する。
【０１０９】
細胞ストレス反応は、様々な要因（単数または複数）によって誘導され得る。例えば、血清枯渇条件下に細胞を置くことによって細胞ストレス反応を誘導することができる。細胞をＩＬ−６に暴露することによっても細胞ストレス反応を誘導することができる。化学療法薬は、その薬剤がターゲットにする細胞において細胞ストレス反応を誘導することが多い。細胞ストレス反応は、細胞を化学療法薬での処理にもかかわらず生き延びさせることに成功することがある。結果として、細胞はその薬剤に対してあまり感受性でなくなり、その化学療法での処理の有効性に悪影響を与える。細胞ストレス反応の改善は、化学療法薬での処理に対する細胞の感受性を増大させる。１つの実施形態において、細胞ストレス反応が改善された細胞は、化学療法薬と接触すると、該化合物と接触していない細胞より高い率でアポトーシスを起こす。もう１つの実施形態において、細胞ストレス反応が改善された細胞は、化学療法薬と接触すると、該化合物と接触していない細胞より高い率で成長停止を起こす。
【０１１０】
本発明の１つの態様は、細胞ストレス反応を誘導する化学療法薬での化学療法を受けている癌患者における細胞ストレス反応を改善する方法を提供し、この方法は、ＲＡ１ｃの発現または活性を減少させるまたは阻止する少なくとも１つの化合物をその患者に投与することを含む。特定の実施形態において、前記癌患者は、前立腺癌に罹患している。この治療方法を受けている患者は、化学療法での治療に対してより感受性である癌細胞を有する。
【０１１１】
細胞ストレス反応を誘導する化学療法薬としては、ｍＴＯＲまたはＡｋｔ１／２経路の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本発明は、癌を治療するための併用療法をさらに提供する。１つの実施形態において、この併用療法は、ＲＡ１ｃ発現を増加させる化学療法薬およびＲＡ１ｃポリペプチドに特異的に結合する化合物と癌細胞とを接触させることを含む。ＲＡ１ｃの発現を増加させる化学療法薬の例としては、細胞ストレス反応を誘導する薬剤が挙げられる。ＲＡ１ｃ発現を増加させる化学療法薬の具体的な例としては、ｍＴＯＲまたはＡｋｔ１／２経路の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＡ１ｃポリペプチドに特異的に結合する化合物としては、抗ＲＡ１ｃ抗体またはそれらのフラグメント、ＲＡ１ｃ結合オリゴペプチド、ＲＡ１ｃに特異的に結合する小分子、および他のＲＡ１ｃアンタゴニスト、例えばアプタマーが挙げられるが、それらに限定されない。ＲＡ１ｃポリペプチド発現の増加は、ＲＡ１ｃを認識し、ＲＡ１ｃに結合する化合物にアップレギュレートされたターゲットを与える。好ましくは、ＲＡ１ｃポリペプチドに特異的に結合する化合物を細胞傷害剤にコンジュゲートさせる。化学療法薬とＲＡ１ｃに特異的に結合する化合物との併用治療は相乗効果を生じさせ、その結果、癌治療を向上させる。特定の実施形態において、前記癌細胞は、前立腺癌細胞である。
【０１１３】
もう１つの実施形態において、前記併用療法は、ＲＡ１ｃ発現を増加させる化学療法薬およびＲＡ１ｃ発現または活性を減少させるまたは阻止する化合物と癌細胞を接触させることを含む。ＲＡ１ｃの発現を増加させる化学療法薬の例としては、細胞ストレス反応を誘導する薬剤が挙げられる。ＲＡ１ｃの発現を増加させる化学療法薬の具体的な例としては、ｍＴＯＲまたはＡｋｔ１／２経路の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＡ１ｃ発現の増加は、ＲＡ１ｃを認識する化合物にアップレギュレートされたターゲットを与える。化学療法薬とＲＡ１ｃ発現または活性を減少させるまたは阻止する化合物との併用治療は相乗効果を生じさせ、その結果、癌治療を向上させる。特定の実施形態において、前記癌細胞は、前立腺癌細胞である。
【０１１４】
癌患者の治療の関連での併用療法は、ＲＡ１ｃ発現を増加させる化学療法薬と、ＲＡ１ｃ発現もしくは活性を減少させるまたは阻止するおよび／またはＲＡ１ｃポリペプチドに特異的に結合する化合物とを癌患者に投与することを含む。
【０１１５】
本発明は、本明細書においてさらに説明するように、単独と併用の両方で上記化合物を含む組成物も提供する。
【０１１６】
癌を診断するおよび病期決定する方法も本発明によって提供する。ＲＡ１ｃは細胞表面で利用することができ、また、ＲＡ１ｃは前立腺細胞、特に癌性前立腺細胞についての特異的マーカーであるため、本発明のＲＡ１ｃ結合分子（抗ＲＡ１ｃ抗体またはそれらのフラグメント、ＲＡ１ｃ結合オリゴペプチド、ＲＡ１ｃ抗体コンジュゲート、ＲＡ１ｃに特異的に結合する無機または有機小分子、および他のＲＡ１ｃアンタゴニスト、例えばアプタマーを含むが、これらに限定されない）のいずれかの使用は、ＲＡ１ｃを発現する細胞のインビボまたはインビトロでの同定を可能にするはずである。１つ以上の適切な標識（放射性標識、蛍光標識、酵素的標識、比色標識、スピン標識、および当該技術分野において周知であるような任意の他の適切な標識を含むが、それらに限定されない）をＲＡ１ｃ結合分子に取り付けて視覚化することができる。
【０１１７】
本発明のもう１つの態様は、化学療法薬が癌細胞において細胞ストレス反応を生じさせるかどうかを判定する方法に関する。そのような方法は、化学療法を受けている患者を、ＲＡ１ｃの発現または活性を減少させるまたは阻止する化合物で治療する必要性の判定に有用である。
【０１１８】
従って、本発明は、化学療法薬が癌細胞において細胞ストレス反応を誘導するかどうかを判定する方法を提供し、この方法は、癌細胞と化学療法薬を接触させること、およびその癌細胞におけるＲＡ１ｃ発現のレベルを判定することを含む。対照細胞を超える、またはその化学療法薬と接触させる前のその癌細胞におけるＲＡ１ｃ発現レベルを超える、ＲＡ１ｃ発現レベルの増加は、細胞ストレス反応の誘導を示す。適する対照細胞としては、アッセイする癌細胞と同じ種類の未処理癌細胞が挙げられる。このアッセイにおいて使用する癌細胞は、好ましくは、前立腺細胞、例えばＬＮＣａＰ細胞である。
【０１１９】
これらの方法においてアッセイする化学療法薬は、細胞ストレス反応を生じさせることができると推測される任意の薬剤である。１つの実施形態において、前記化学療法薬は、ｍＴｏｒ阻害剤である。もう１つの実施形態において、前記化学療法薬は、Ａｋｔ１／２阻害剤である。
【０１２０】
本明細書においてさらに説明するように、本発明は、キットおよび製品も提供する。
【０１２１】
これらの方法および組成物ならびにそれらの特定の態様を後続のセクションでより詳細に説明する。
【０１２２】
Ａ．抗ＲＡ１ｃ抗体
１つの実施形態において、本発明は、治療薬または診断薬としてここで使用することができる抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体を提供する。抗体の例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体が挙げられる。
【０１２３】
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、動物において適切な抗原およびアジュバントの多回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により産生させる。免疫処置を施す種において免疫原性であるタンパク質に適切な抗原（特に、合成ペプチドを使用するとき）をコンジュゲートさせることが有用である。例えば、二官能性または誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によるコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基によるコンジュゲーション）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（この場合のＲおよびＲ１は、異なるアルキル基である）を使用して、抗原をキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤にコンジュゲートさせることができる。一定の実施形態において、抗体を産生するために使用する動物は、トランスジェニック動物であり得る。一定のそのような実施形態において、前記動物を、それらがＲＡ１ｃ発現を有しないように、それらがＲＡ１ｃをコードするポリヌクレオチドの完全不在を示すように遺伝子操作することができる（「ノックアウト」動物と呼ばれる）。そのような動物を生じさせる方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓｎｏｕｗａｅｒｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１０８３，１９９２；Ｌｏｗｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：７４０−４２，１９９３；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２，１９８９を参照のこと。特定のタンパク質またはペプチドに対する抗体をそのタンパク質またはペプチドに関するノックアウト動物において産生させることは、有利であり得る。当該技術分野において周知であるように、この動物では抗体の生産または収量を減少させ得る抗自己反応が発生しないだろうからである。
【０１２４】
例えば（ウサギまたはマウスについては、それぞれ）１００μｇまたは５μｇのタンパク質またはコンジュゲートを３容量のフロイント完全アジュバントと併せ、その溶液を多数の部位に皮内注射することによって、動物に抗原、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対する免疫処置を施す。１ヶ月後、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの原量の１／５または１／１０を多数の部位に皮下注射することによって、それらの動物に追加免疫を施す。７から１４日後、それらの動物から採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。その力価がプラトーに達するまで動物に追加免疫を施す。コンジュゲートを組換え細胞培養でタンパク質融合体として作ることもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤を適切に使用して、免疫反応を強化する。
【０１２５】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）が最初に記載したハイブリドーマ法を用いて作ることができ、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作ることができる。
【０１２６】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターに上で説明したように免疫処置を施して、その免疫処置に使用するタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を生産するまたは生産できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球にインビトロで免疫処置を施してもよい。免疫処置後、リンパ球を単離し、その後、適する融合剤、例えばポリエチレングリコール、を使用して骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１２７】
このようにして作製したハイブリドーマ細胞を、適する培養基に播種し、成長させる。この培地は、好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞（融合パートナーとも呼ばれる）の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する。例えば、前記親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、前記ハイブリドーマのための選択培養基は、一般に、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠乏細胞の成長を防止する）を含むであろう（ＨＡＴ培地）。
【０１２８】
好ましい融合パートナー骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生産細胞による安定した高い抗体生産レベルを支持し、且つ、融合していない親細胞に対して選択する選択培地に感受性であるものである。好ましい骨髄腫細胞系列は、マウス骨髄腫系列、例えば、米国、カリフォルニア州、サンディエゴのＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、ならびにＳＰ−２および誘導体、例えば、米国、バージニア州、マナッサの米国微生物系統保存機関（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手できるＸ６３−Ａｇ８−６５３である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫細胞系列もヒトモノクローナル抗体の生産について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；およびＢｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１２９】
ハイブリドーマ細胞が成長している培養基を、その抗原に対するモノクローナル抗体の生産についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降法によって、またはインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって判定する。
【０１３０】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）に記載されているＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって判定することができる。
【０１３１】
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞を同定したら、それらのクローンを限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な手順によって成長させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。このために適する培養基としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、それらのハイブリドーマ細胞を、動物において、例えばマウスへのそれらの細胞の注射によって、腹水腫瘍としてインビボで成長させることができる。
【０１３２】
それらのサブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、従来の抗体精製手順、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ａタンパク質もしくはＧタンパク質−セファロースを使用）またはイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析などによって、培養基、腹水または血清から適切に分離する。
【０１３３】
それらのモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離し、配列決定する。それらのハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい源として役立つ。単離したら、そのＤＮＡを発現ベクターの中に据えることができ、その後、それらを宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別の方法では抗体タンパク質を生産しない骨髄腫細胞に、トランスフェクトして、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を達成する。それらの抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する総説論文としては、Ｓｋｅｒｒａら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１−１８８（１９９２）が挙げられる。
【０１３４】
さらなる実施形態では、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載されている技術を用いて、モノクローナル抗体または抗体フラグメントを抗体ファージライブラリから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）には、ファージライブラリを用いるマウスおよびヒト抗体の単離がそれぞれ記載されている。その後の出版物には、鎖のシャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の生産（Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに非常に大きなファージライブラリを構築するための戦略として組換え感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））が記載されている。このように、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代案である。
【０１３５】
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメイン（ＣＨおよびＣＬ）配列で相同マウス配列を置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））によって、または免疫グロブリンコーディング配列を非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）についてのコーディング配列のすべてもしくは一部と融合させることによって、キメラまたは融合抗体ポリペプチドを生産するように修飾することができる。前記非免疫グロブリンポリペプチド配列で抗体の定常領域を置換することができ、またはそれらで抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを置換して、ある抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有するもう１つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作る。
【０１３６】
３．ヒトおよびヒト化抗体
本発明の抗ＲＡ１ｃ抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含むことができる。ヒト化形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗原結合配列）である。ヒト化抗体としては、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見つからない残基を含む場合がある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的には２つ、の可変ドメインの実質的にすべてを含むであろう。この場合、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。前記ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのもの、の少なくとも一部分も含むであろう［Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
【０１３７】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒトでない源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と呼ばれ、これらは、典型的に、「移入」可変ドメインから取り出される。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法［Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］に従って、齧歯動物ＣＤＲ（複数または単数）配列でヒト化抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる。従って、そのような「ヒト化」抗体は、実質的に全長に満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、概して、一部のＣＤＲ残基およびことによると一部のＦＲ残基が、齧歯動物抗体における類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１３８】
ヒト化抗体を作るために使用されるヒト可変ドメイン（軽と重の両方）の選択は、その抗体がヒトの治療に使用するためのものである場合、抗原性およびＨＡＭＡ応答（ヒト抗マウス抗体）を低下させるために、非常に重要である。いわゆる「最も合う」方法に従って、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。齧歯動物のものに最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、その中のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒト化抗体に受容される（Ｓｉｍｓら，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら，  Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７））。もう１つの方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを、幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３））。
【０１３９】
抗原に対する高い結合親和性および他の好適な生物学的性質を保持しながら抗体をヒト化させることが、さらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法に従って、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用する親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析のプロセスによりヒト化抗体を作製する。三次元免疫グロブリンモデルを一般に利用することができ、それらは当分野の技術者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元高次構造を図解および表示するコンピュータプログラムを利用することができる。これらの表示を検分することによって、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基の有望な役割を分析することができ、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合する能力に影響を及ぼす残基を分析することができる。このように、所望の抗体の特徴、例えばターゲット抗原（単数または複数）に対する親和性の増大、が達成されるようにレシピエント配列および移入配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、高可変領域残基は、抗原結合への影響に直接、且つ、最も大きく関与する。
【０１４０】
様々な形態のヒト化抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体が考えられる。例えば、ヒト化抗体は、イムノコンジュゲートを生ずるように１つ以上の細胞傷害剤と場合によってはコンジュゲートされる抗体フラグメント、例えばＦａｂであり得る。あるいは、ヒト化抗体は、インタクト抗体、例えばインタクトＩｇＧ１抗体であり得る。
【０１４１】
ヒト化に代わるものとして、ヒト抗体を産生させることができる。例えば、内因性免疫グロブリン生産が無い状態で免疫処置によってヒト抗体の完全レパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を今では生産することができる。例えば、キメラおよび生殖細胞系列突然変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体生産を完全に抑制する結果となると記載されている。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイのそうした生殖細胞系列突然変異マウスへの移入は、抗原を負荷するとヒト抗体を生産する結果となる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５９１，６６９号（すべてＧｅｎＰｈａｒｍ）；同第５，５４５，８０７号；およびＷＯ  ９７／１７８５２参照。
【０１４２】
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３［１９９０］）を用いて、免疫処置を施していないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体および抗体フラグメントを生産することができる。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子を、糸状バクテリオファージの主働コートタンパク質遺伝子または微働コートタンパク質遺伝子、例えばＭ１３またはｆｄ、のいずれかにインフレームでクローニングし、そのファージ粒子の表面に機能性抗体フラグメントとして表示する。前記糸状粒子はそのファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能特性に基づいて選択すると、結果的に、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子を選択することとなる。それ故、前記ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、様々な形式で行うことができ、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）に総説されている。Ｖ遺伝子セグメントの幾つかの源をファージディスプレイに用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫処置を施したマウスの脾臓から採取したＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリから抗オキサゾロン抗体の様々なアレイを単離した。Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）によって説明された技術に本質的に従って、免疫処置を施していないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、様々なおびただしい数の抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号も参照。
【０１４３】
上で論じたように、ヒト抗体をインビトロ活性化Ｂ細胞によって産生させることもできる（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号参照）。
【０１４４】
４．抗体フラグメント
一定の状況では、完全抗体ではなく抗体フラグメントの使用が有利である。これらのフラグメントのより小さなサイズが急速なクリアランスを可能にし、充実性腫瘍への接近を増進させる結果となり得る。
【０１４５】
抗体フラグメントを生産するために様々な技術が開発された。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクト抗体のタンパク質溶解性消化によって誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）。しかし、これらのフラグメントは、今では組換え宿主細胞から直接生産することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体フラグメントは、すべて、大腸菌において発現させることおよび大腸菌から分泌させることができ、従って、大量のこれらのフラグメントを容易に生産することができる。上で論じた抗体ファージライブラリから抗体フラグメントを単離することもできる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌から直接回収し、化学的に連結させてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。もう１つのアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が増大されたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントが米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体フラグメントの生産のための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の実施形態において選ばれる抗体は、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ  ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号参照。ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域が全くないインタクト連結部位を有する唯一の種類であり、従って、それらは、インビボでの使用中の非特異的結合の減少に適する。ｓＦｖ融合タンパク質を構築して、ｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合体を生じさせることができる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，上記文献を参照のこと。抗体フラグメントは、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「線状抗体」である場合もある。そのような線状抗体フラグメントは、単一特異性である場合もあり、または二重特異性である場合もある。
【０１４６】
５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。具体例としての二重特異性抗体は、本明細書に記載するようなＲＡ１ｃポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合することができる。他のそのような抗体は、ＲＡ１ｃポリペプチド結合部位と別のポリペプチドのための結合部位を併せ持つことができる。あるいは、抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体アームを、白血球上の誘発分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ３）、またはＩｇＧのためのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと組み合わせて、細胞防御メカニズムをＲＡ１ｃポリペプチド発現および／または結合細胞に集中および局在させることができる。二重特異性抗体は、ＲＡ１ｃポリペプチドを発現および／または結合する細胞に細胞傷害剤を局在させるために使用することもできる。これらの抗体は、ＲＡ１ｃポリペプチド結合アームと、細胞毒性剤（例えば、サポニン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位元素ヘプテン）に結合するアームとを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として作製することができる。
【０１４７】
ＷＯ  ９６／１６６７３には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５，８３７，２３４号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は、ＷＯ９８／０２４６３に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示している。
【０１４８】
二重特異性抗体を作る方法は、当該技術分野において公知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な生産は、２本の鎖が異なる特異性を有する、２本の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重および軽鎖のランダムな組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クォドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、それらの分子のうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有する。アフィニティークロマトグラフィー段階によって通常は行われるその正しい分子の生成は相当厄介であり、産物の収率は低い。同様の手順が、ＷＯ  ９３／０８８２９に、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１４９】
別のアプローチによると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原連結部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。好ましくは、この融合は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含むＩｇ重鎖定常ドメインとの融合である。それらの融合体の少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体および所望される場合には免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適する宿主細胞にコ・トランスフェクトする。これは、その構築物に用いられる３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の至適収量をもたらす実施形態において、それら３つのポリペプチドフラグメントの相互比率を調節する際の自由度をより大きくする手だてとなる。しかし、少なくとも２本のポリペプチド鎖の同じ比率での発現が高い収量を生じさせる結果となる場合、または前記比率が、所望の鎖の組み合わせの収量に有意な影響を及ぼさない場合、２本のまたは３本すべてのポリペプチド鎖についてのコーディング配列を単一の発現ベクターに挿入することができる。
【０１５０】
このアプローチの好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、一方のアームの中の第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームの中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性をもたらす）とで構成される。この非対称構造は、所望の二重特異性化合物と望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせとの分離を助長することが判明した。二重特異性分子の半分だけに免疫グロブリン軽鎖が存在することが分離方法を容易にする手だてとなるからである。このアプローチは、ＷＯ  ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の作製のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１５１】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載されているもう１つのアプローチによると、一対の抗体分子間の界面を、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の百分率を最大にするように遺伝子工学で作り変えることができる。好ましい界面は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第一の抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換する。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって、その（それらの）大きな側鎖と同じまたは類似したサイズの代償「空洞」を第二の抗体分子の界面に作る。これが、そのヘテロ二量体の収量をホモ二量体などの他の望ましくない最終生成物より増すためのメカニズムをもたらす。
【０１５２】
二重特異性抗体としては、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の１つをアビジンに、他のものをビオチンに連結させることができる。例えば、免疫系細胞の望ましくない細胞へのターゲッティングに（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染症の治療に（ＷＯ  ９１／００３６０、ＷＯ  ９２／２００３７３およびＥＰ  ０３０８９）、そのような抗体が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の従来の架橋方法を用いて作ることができる。適する架橋剤は、当該技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に多数の架橋技術と共に開示されている。
【０１５３】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を産生させるための技術も文献に記載されている。例えば、化学的連結を用いて二重特異性抗体を作製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）には、インタクト抗体をタンパク質溶解により分解してＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する手順が記載されている。これらのフラグメントを、ジチオール複合体形成剤、亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、近接ジチオールを安定させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。その後、それらの生成されたＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に転化させる。その後、それらのＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つをメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再び転化させ、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための作用物質として使用することができる。
【０１５４】
最近の進歩によって大腸菌からのＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接回収が容易になり、それらを化学的にカップリングさせて二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）には、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生産が記載されている。それぞれのＦａｂ’フラグメントを大腸菌から別々に分泌させ、インビトロでの定方向化学的カップリングに付して二重特異性抗体を形成した。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳腺腫瘍ターゲットに対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。組換え細胞培養から二重特異性抗体フラグメントを直接作り、単離する様々な技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体が生産された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させた。それらの抗体ホモ二量体のヒンジ領域を還元して単量体を形成し、その後、再び酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の生産にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記載された「ダイアボディー」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作るための代替メカニズムをもたらした。これらのフラグメントは、同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーによってＶＬに連結されたＶＨを含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的ＶＬおよびＶＨドメインと対合することを余儀なくされ、その結果、２つの抗原結合部位が形成される。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体フラグメントを作る別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）参照。
【０１５５】
二価より大きい価を有する抗体が考えられる。例えば、三重特異性抗体を作製することができる。Ｔｕｔｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１５６】
６．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体も本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合で連結された２つの抗体で構成される。例えば、免疫系細胞の望ましくない細胞へのターゲッティングに［米国特許第４，６７６，９８０号］、およびＨＩＶ感染症の治療に［ＷＯ  ９１／００３６０；ＷＯ  ９２／２００３７３；ＥＰ  ０３０８９］そのような抗体が提案されている。これらの抗体は、架橋剤を必要とするものをはじめとする合成タンパク質化学に関する公知の方法を用いてインビトロで作製することができる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構築することができる。このために適する試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが挙げられる。
【０１５７】
７．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって二価抗体より速く内在化する（および／または異化する）ことができる。本発明の抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に生産することができる、３つ以上の抗原結合部位を有する（ＩｇＭクラス以外である）多価抗体（例えば、四価抗体）である場合がある。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３つ以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（または、から成る）。このシナリオでの抗体は、Ｆｃ領域およびそのＦｃ領域に対してアミノ末端の３つ以上の抗原結合部位を含むであろう。ここで好ましい多価抗体は、３つから約８つ、しかし好ましくは４つ、の抗原結合部位を含む（または、から成る）。多価抗体は、少なくとも１本のポリペプチド鎖（および好ましくは２本のポリペプチド鎖）を含み、その（それらの）ポリペプチド鎖は、２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、その（それらの）ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含み、この場合のＶＤ１は、第一可変ドメインであり、ＶＤ２は、第二可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１本のポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、ならびにｎは、０または１である。例えば、その（それらの）ポリペプチド鎖は、ＶＨ−ＣＨ１−フレキシブルリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含むことがある。ここでの多価抗体は、好ましくは、少なくとも２つ（および好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。ここでの多価抗体は、例えば、約２から約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含むことがある。ここで考えられる軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、場合によってはＣＬドメインをさらに含む。
【０１５８】
８．エフェクター機能工学
本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾すること、例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を強化すること、が望ましい場合がある。これは、抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成することができる。あるいはまたは加えて、システイン残基（単数または複数）をＦｃ領域に導入することができ、それによってこの領域に鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。このようにして産生されたホモ二量体抗体は、向上された内在化能力ならびに／または増大された補体媒介細胞致死および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有することができる。Ｃａｒｏｎら，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）参照。Ｗｏｌｆｆら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて、抗腫瘍活性が強化されたホモ二量体抗体も作製することができる。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、その結果、強化された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる抗体を遺伝子工学で作ることができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）参照。抗体の血清半減期を増加させるために、例えば米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているようにサルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に、抗体フラグメント）に組み込んでもよい。本明細書において用いる場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」は、そのＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因となる、ＩｇＧ分子のＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のエピトープを指す。
【０１５９】
９．イムノコンジュゲート
本発明は、細胞傷害剤、例えば化学療法薬、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性毒素、またはそれらのフラグメント）、または放射性同位元素（すなわち、ラジオコンジュゲート）にコンジュゲートさせた抗体を含む、抗体コンジュゲートまたは抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）としても知られている、イムノコンジュゲートにも関する。
【０１６０】
細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤、すなわち、癌の治療の際に腫瘍細胞を死滅させるまたは抑制する薬物の局所送達のための抗体−薬物コンジュゲートの使用（Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２；米国特許第４，９７５，２７８号）は、理論的には腫瘍への薬物部分のターゲット設定送達およびそこでの細胞内蓄積を可能にするが、この場合、これらの非コンジュゲート型薬剤の全身投与は、排除しようとする腫瘍細胞ばかりでなく正常な細胞にとっても許容できないレベルの毒性をもたらす結果となり得る（Ｂａｌｄｗｉｎら，（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ  ｐｐ．（Ｍａｒ．１５，１９８６）：６０３−０５；Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａら（ｅｄ．ｓ），ｐｐ．４７５−５０６）。その結果、最小の毒性で最大の効能が求められる。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方がこれらの戦略に有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄら，（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３−８７）。これらの方法に使用される薬物としては、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサートおよびビンデシンが挙げられる（Ｒｏｗｌａｎｄら，上記）。抗体−毒素コンジュゲートに使用される毒素としては、細菌毒素、例えばジフテリア毒素、植物毒素、例えばリシン、小分子毒素、例えばゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｊｏｕｒ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、メイタンシノイド（ＥＰ  １３９１２１３；Ｌｉｕら，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３）、およびカリケアマイシン（Ｌｏｄｅら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）が挙げられる。これらの毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害をはじめとするメカニズムによってそれらの細胞傷害効果および細胞増殖抑制効果を果たすことができる。一部の細胞傷害剤は、大きな抗体またはタンパク質受容体リガンドにコンジュゲートさせると不活性になる、またはあまり活性でなくなる傾向がある。
【０１６１】
ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）は、正常および悪性Ｂリンパ球の表面で見つけられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体と、チオウレアリンカー−キレーターによって結合された１１１Ｉｎまたは９０Ｙ放射性同位元素とで構成された、抗体−放射性同位元素コンジュゲートである（Ｗｉｓｅｍａｎら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２７（７）：７６６−７７；Ｗｉｓｅｍａｎら（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９（１２）：４３３６−４２；Ｗｉｔｚｉｇら（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：２４５３−６３；Ｗｉｔｚｉｇら（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１５）：３２６２−６９）。ＺＥＶＡＬＩＮは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対する活性を有するが、投与は、大部分の患者に重度で長期の血球減少症を生じさせる。ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、カリケアマイシンに連結されたｈｕＣＤ３３抗体から成る抗体薬物コンジュゲート、は、２０００年に注射による急性骨髄性白血病の治療用に認可された（Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ（２０００）２５（７）：６８６；米国特許第４９７０１９８号；同第５０７９２３３号；同第５５８５０８９号；同第５６０６０４０号；同第５６９３７６２号；同第５７３９１１６号；同第５７６７２８５号；同第５７７３００１号）。カンツズマブメルタンシン（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ）、ジスルフィドリンカーＳＰＰによってメイタンシノイド薬物部分、ＤＭ１、に連結されたｈｕＣ２４２抗体から成る抗体薬物コンジュゲート、は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例えば大腸癌、膵臓癌、胃癌および他の癌、の治療についての第ＩＩ相試験に進んでいる。ＭＬＮ−２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．、ＢＺＬ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、メイタンシノイド薬物部分、ＤＭ１、に連結された抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体から成る抗体薬物コンジュゲート、は、可能な前立腺腫瘍治療について開発中である。オーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）、ドラスタチンの合成類似体、がキメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌腫上のＬｅｗｉｓ  Ｙに特異的）およびｃＡＣ１０（血液学的悪性病変上のＣＤ３０に特異的）にコンジュゲートされた（Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−７８４）。これは、治療開発中である。
【０１６２】
このようなイムノコンジュゲートの産生に有用な化学療法薬は上に記載した。使用することができる酵素活性毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシャヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｎｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが挙げられる。様々な放射性核種をラジオコンジュゲート型抗体の生産に利用できる。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジピミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）へキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作られる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように、リシン免疫毒素を作製することができる。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体へのラジオヌクレオチドのコンジュゲーションのための具体例としてのキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６参照。
【０１６３】
ここでは抗体と１つ以上の小分子毒素（例えば、カリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコテセンおよびＣＣ１０６５、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体）とのコンジュゲートも考えられる。
【０１６４】
メイタンシンおよびメイタンシノイド
１つの実施形態では、本発明の抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体（完全長またはフラグメント）を１つ以上のメイタンシノイド分子にコンジュゲートさせる。
【０１６５】
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂（ｍｉｔｏｔｏｔｉｃ）阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカ低木マイテヌス・セルラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）から単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、一定の微生物もメイタンシノイド、例えば、メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルを生産することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノールならびにその誘導体および類似体は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；同第４，２４８，８７０号；同第４，２５６，７４６号；同第４，２６０，６０８号；同第４，２６５，８１４号；同第４，２９４，７５７号；同第４，３０７，０１６号；同第４，３０８，２６８号；同第４，３０８，２６９号；同第４，３０９，４２８号；同第４，３１３，９４６号；同第４，３１５，９２９号；同第４，３１７，８２１号；同第４，３２２，３４８号；同第４，３３１，５９８号；同第４，３６１，６５０号；同第４，３６４，８６６号；同第４，４２４，２１９号；同第４，４５０，２５４号；同第４，３６２，６６３号；および同第４，３７１，５３３号に開示されており、これらの開示は参照により本明細書に特に取り入れられている。
【０１６６】
メイタンシノイド−抗体コンジュゲート
それらの治療係数を向上させる試みの中で、メイタンシンおよびメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体にコンジュゲートされた。メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲートおよびそれらの治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号および欧州特許ＥＰ  ０  ４２５  ２３５  Ｂ１に開示されており、これらの開示は参照により本明細書に特に取り入れられている。Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３（１９９６）には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結されたＤＭ１と呼ばれるメイタンシノイドを含むイムノコンジュゲートが記載されている。このコンジュゲートは、培養大腸癌細胞に対して非常に細胞傷害性であることが判明し、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Ｃｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）には、メイタンシノイドをヒト大腸癌細胞系列上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子を結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１にジスルフィドリンカーによってコンジュゲートさせたイムノコンジュゲートが記載されている。細胞１個あたり３×１０５個のＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞系列ＳＫ−ＢＲ−３を用いて、ＴＡ．１−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞傷害性がインビトロで検査された。この薬物コンジュゲートは、遊離メイタンシノイド薬に類似した細胞傷害度を達成し、これは、抗体分子１個あたりのメイタンシノイド分子の数を増加させることによって増加させることができた。Ａ７−メイタンシノイドコンジュゲートは、マウスにおいて低い全身細胞傷害性を示した。
【０１６７】
抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体−メイタンシノイドコンジュゲート（イムノコンジュゲート）
抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体をメイタンシノイド分子に化学的に連結させることにより、その抗体またはメイタンシノイド分子のいずれの生物活性も有意に減少させることなく、抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを作製する。抗体分子１個あたり平均３〜４個のメイタンシノイド分子は、抗体の機能または溶解度に負の影響を及ぼすことなくターゲット細胞の細胞傷害性の強化に有効性を示したが、１個の毒素分子／抗体であっても裸抗体の使用より細胞傷害性を強化すると予想された。メイタンシノイドは当該技術分野において周知であり、また、公知の技術によって合成することができ、または天然源から単離することができる。適するメイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号に、ならびに上で言及した他の特許および非特許文献に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、およびメイタンシノール分子の芳香族環または他の位置が修飾されているメイタンシノール類似体、例えば様々なメイタンシノールエステルである。
【０１６８】
例えば、米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許０  ４２５  ２３５  Ｂ１、およびＣｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示されているものをはじめとする、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを製造するための多くの連結基が当該技術分野において公知である。それらの連結基としては、上で確認した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性の基、光不安定性の基、ペプチダーゼ不安定性の基またはエステラーゼ不安定性の基が挙げられ、ジスルフィドおよびチオエーテル基が好ましい。
【０１６９】
様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジピミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性化エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）へキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して、抗体とメイタンシノイドのコンジュゲートを作ることができる。特に好ましいカップリング剤としては、ジスルフィド結合に備えてＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７［１９７８］）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が挙げられる。
【０１７０】
前記リンカーは、その連結のタイプに依存して、メイタンシノイド分子の様々な位置に付けることができる。例えば、エステル結合は、従来のカップリング技術を用いてヒドロキシル基との反応により形成することができる。この反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されているＣ−１４位置、ヒドロキシル基で修飾されているＣ−１５位置、およびヒドロキシル基を有するＣ−２０位置で発生し得る。好ましい実施形態において、前記結合は、メイタンシノールまたはメイタンシノール類似体のＣ−３位置に形成される。
【０１７１】
カリケアマイシン
対象となるもう１つのイムノコンジュゲートは、１つ以上のカリケアマイシン分子にコンジュゲートさせた抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体を含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、サブピコモル濃度で２本鎖ＤＮＡ切断を生じさせることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの作製については、米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、同第５，８７７，２９６号（すべて、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙのもの）を参照のこと。使用することができるカリケアマイシンの構造類似体としては、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチルγ１Ｉ、ＰＳＡＧおよびθＩ１（Ｈｉｎｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）、およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄの上述の米国特許）が挙げられるが、それらに限定されない。抗体をコンジュゲートすることができるもう１つの抗腫瘍薬は、葉酸代謝拮抗物質であるＱＦＡである。カリケアマイシンとＱＦＡの両方が、細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易に横断しない。従って、抗体媒介内在化によるこれらの薬剤の細胞への取込みは、それらの細胞傷害効果を大いに強化する。
【０１７２】
他の細胞傷害剤
本発明の抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体にコンジュゲートさせることができる他の抗腫瘍薬としては、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、同第５，７７０，７１０号に記載されている総称してＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として知られているファミリーの薬剤、ならびにエスペラマイシン（米国特許第５，８７７，２９６号）が挙げられる。
【０１７３】
使用することができる酵素活性毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシャヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日に発行されたＷＯ  ９３／２１２３２を参照のこと。
【０１７４】
本発明は、抗体と核酸溶解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）とで形成されたイムノコンジュゲートをさらに考えている。
【０１７５】
腫瘍の選択的破壊のために、前記抗体は、高放射性原子を含む場合がある。様々な放射性同位元素をラジオコンジュゲート型抗ＲＡ１ｃ抗体の生産に利用することができる。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位元素が挙げられる。検出のためにコンジュゲートを使用する場合、それは、シンチグラフィー研究のために放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３を含むことがあり、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）撮像（磁気共鳴撮像、ｍｒｉ、としても知られている）のためにスピンラベル、例えば、再びヨウ素−１２３、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄を含むことがある。
【０１７６】
放射性または他の標識は、公知の方法で前記コンジュゲートに組み込むことができる。例えば、前記ペプチドを生合成することもでき、または例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む、適するアミノ酸前駆体を使用する化学的アミノ酸合成によって合成することもできる。前記ペプチド内のシステイン残基によって、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１などの標識を付けることができる。イットリウム−９０は、リシン残基によって付けることができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｎｋｅｒら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）を用いて、ヨウ素−１２３を組み込むことができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）に他の方法が詳細に記載されている。
【０１７７】
様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジピミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）へキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して、抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートを作ることができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように作製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体へのラジオヌクレオチドのコンジュゲーションのための具体例としてのキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６参照。そのリンカーは、細胞内での細胞傷害薬の放出を助長する「切断可能」リンカーであり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
【０１７８】
本発明の化合物は、（例えば、米国、イリノイ州、ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から）市販されている架橋剤：ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を用いて作製されたＡＤＣを特に容認するが、これに限定されない。４６７−４９８頁、２００３−２００４  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ参照。
【０１７９】
抗体薬物コンジュゲートの作製
本発明の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）では、抗体（Ａｂ）をリンカー（Ｌ）によって１つ以上の薬物部分（Ｄ）、例えば、抗体１つあたり約１から約２０の薬物部分にコンジュゲートさせる。式ＩのＡＤＣは、（１）共有結合によってＡｂ−Ｌを形成するための抗体の求核基と二価リンカー試薬の反応、続いて、薬物部分Ｄとの反応；および（２）共有結合によってＤ−Ｌを形成するための薬物部分の求核基と二価リンカー試薬の反応、続いて、抗体の求核基との反応を含む、当業者に公知の有機化学反応、条件および試薬を利用して幾つかの経路によって作製することができる。
【０１８０】
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ
抗体上の求核基としては、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、および（ｉｖ）その抗体がグリコシル化されている場合、糖ヒドロキシルまたはアミノ基が挙げられるが、それらに限定されない。アミン、チオールおよびヒドロキシル基は、求核性であり、ならびに（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸エステルおよび酸ハロゲン化物；（ｉｉ）ハロゲン化アルキルおよびベンジル、例えば、ハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基をはじめとするリンカー部分およびリンカー試薬の求電子基と共有結合を形成するように反応することができる。一定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有する。リンカー試薬とのコンジュゲーションのために、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤での処理によって、抗体を反応性にすることができる。従って、それぞれのシステイン架橋は、理論的には、２つの活性チオール求核試薬を形成することとなる。アミンのチオールへの転化を生じさせる結果となるリシンと２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）の反応によって、追加の求核基を抗体に導入することができる。
【０１８１】
本発明の抗体薬物コンジュゲートは、リンカー試薬または薬物の求核置換基と反応することができる求電子部分を導入する抗体の修飾によって生産することもできる。グリコシル化抗体の糖を、例えば過ヨウ素酸酸化試薬で酸化してアルデヒドまたはケトン基を形成することができ、それらをリンカー試薬または薬物部分のアミン基と反応させることができる。結果として生ずるイミンＳｃｈｉｆｆ塩基基は、安定な結合を形成することができ、または例えばホウ化水素試薬によって、それらを還元して安定なアミン結合を形成することができる。１つの実施形態において、グリコシル化抗体の炭水化物部分とガラクトースオキシダーゼまたはメタ−過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの反応は、該タンパク質中に該薬物の適切な基と反応することができるカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基を生じさせることができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。もう１つの実施形態において、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含有するタンパク質はメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応することができ、その結果、最初のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成することができる（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ＆  Ｓｔｒｏｈ，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６；ＵＳ  ５３６２８５２）。そのようなアルデヒドを薬物部分またはリンカー求核試薬と反応させることができる。
【０１８２】
同様に、薬物部分の求核基としては、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸エステルおよび酸ハロゲン化物；（ｉｉ）ハロゲン化アルキルおよびベンジル、例えば、ハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基をはじめとするリンカー部分またはリンカー試薬の求電子基と反応して共有結合を形成することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレートおよびアリールヒドラジド基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
あるいは、例えば組換え技術またはペプチド合成によって、抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体および細胞傷害剤を含む融合タンパク質を作ることができる。ＤＮＡ長は、互いに隣接している、またはそのコンジュゲートの所望の特性を壊さないリンカーペプチドをコードする領域によって隔てられている、コンジュゲートの２つの部分をコードするそれぞれの領域を含む場合がある。
【０１８４】
さらにもう１つの実施形態において、抗体−受容体コンジュゲートを患者に投与する腫瘍プレターゲッティングに利用するために（ストレプタビジンのような）「受容体」に抗体をコンジュゲートさせ、その後、洗浄剤を使用して循環から未結合コンジュゲートを除去し、その後、細胞傷害剤（例えば、ラジオヌクレオチド）にコンジュゲートしている「リガンド」（例えば、アビジン）を投与することができる。
【０１８５】
１０．イムノリポソーム
本明細書に開示する抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体は、イムノリポソームとして調合することもできる。「リポソーム」は、動物への薬物の送達に有用である様々タイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から成る小胞である。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質配列に類似した二層構造で配列される。抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびに１９９７年１０月２３日に発行されたＷＯ９７／３８７３１に記載されているものなどの当該技術分野において公知の方法によって作製される。循環時間が増したリポソームは、米国特許第５，０１３，５６号に開示されている。
【０１８６】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって作製することができる。所定の孔径のフィルターを通してリポソームを押し出して、所望の直径を有するリポソームを生じさせる。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントを、ジスルフィド交換反応により、Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されているようなリポソームにコンジュゲートさせることができる。場合によっては、化学療法薬をリポソーム内に含める。Ｇａｂｉｚｏｎら，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４（１９８９）参照。
【０１８７】
Ｂ．ＲＡ１ｃポリペプチド結合オリゴペプチド
本発明のＲＡ１ｃポリペプチド結合オリゴペプチドは、本明細書に記載するとおりのＲＡ１ｃポリペプチドに結合する、好ましくは、特異的に結合するオリゴペプチドである。ＲＡ１ｃポリペプチド結合オリゴペプチドは、公知のオリゴペプチド合成方法論を用いて化学合成することができ、または組換え技術を用いて作製および精製することができる。ＲＡ１ｃポリペプチド結合オリゴペプチドは、本明細書に記載するようなＲＡ１ｃポリペプチドに結合、好ましくは特異的に結合できるようなオリゴペプチドの場合、通常、長さが少なくとも約５アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約
【０１８８】
【化６】
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アミノ酸であるかそれより長い。ＲＡ１ｃポリペプチド結合オリゴペプチドは、過度の実験を伴わずに周知の技術を用いて同定することができる。これに関して、ポリペプチドターゲットに特異的に結合することができるオリゴペプチドについてオリゴペプチドライブラリをスクリーニングする技術は、当該技術分野において周知であることを特筆する（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、同第５，７５０，３７３号、同第４，７０８，８７１号、同第４，８３３，０９２号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６８９号、同第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ８４／０３５０６およびＷＯ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：３９９８−４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１７８−１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎら，ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１３０−１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：６１１−６１６（１９８８），Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３、およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８参照）。
【０１８９】
これに関して、バクテリオファージ（ファージ）ティスプレーは、大きなオリゴペプチドライブラリをスクリーニングして、ポリペプチドターゲットに特異的に結合できるそれらのライブラリのメンバー（単数または複数）を同定することができる１つの周知の技術である。ファージディスプレイは、バクテリオファージ粒子の表面のコートタンパク質への融合タンパク質として変異体ポリペプチドを表示する技術である（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６）。ファージディスプレイの有用性は、選択的に無作為化したタンパク質変異体（または無作為にクローニングしたＤＮＡ）の大きなライブラリを高い親和性でターゲット分子に結合する配列について迅速且つ効率的に選別できることにある。ファージ上でのペプチド（Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８）またはタンパク質（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３）ライブラリの表示は、何百万ものポリペプチドまたはオリゴペプチドを特定の結合特性を有するものについてスクリーニングするために使用されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８）。ランダム突然変異体のファージライブラリの選別は、多数変異体を構築して増殖するための戦略、ターゲット受容体を使用するアフィニティー精製手順、および結合強化の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６８９号および同第５，６６３，１４３号。
【０１９０】
大部分のファージディスプレイ法は、糸状ファージを使用しているが、ラムドイドファージディスプレイ系（ＷＯ  ９５／３４６８３；Ｕ．Ｓ．５，６２７，０２４）、Ｔ４ファージディスプレイ系（Ｒｅｎら，Ｇｅｎｅ，２１５：４３９（１９９８）；Ｚｈｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｊｉａｎｇら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６５（１１）：４７７０−４７７７（１９９７）；Ｒｅｎら，Ｇｅｎｅ，１９５（２）：３０３−３１１（１９９７）；Ｒｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，５：１８３３（１９９６）；Ｅｆｉｍｏｖら，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，１０：１７３（１９９５））およびＴ７ファージディスプレイ系（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７：２２８−２５７（１９９３）；Ｕ．Ｓ．５，７６６，９０５）も公知である。
【０１９１】
基本ファージディスプレイ概念の多くの他の改善形態および変形形態が、今では開発されている。これらの改善形態は、ペプチドライブラリを選択ターゲット分子に結合する能力についてスクリーニングするディスプレイ系の能力、および所望の特性についてスクリーニングする可能性のある機能性タンパク質を表示するディスプレイ系の能力を高める。ファージディスプレイ反応のためのコンビナトリアル反応装置が開発され（ＷＯ  ９８／１４２７７）、ファージディスプレイライブラリは、二分子相互作用（ＷＯ  ９８／２０１６９；ＷＯ  ９８／２０１５９）および拘束ヘリカルペプチドの特性（ＷＯ  ９８／２００３６）を分析および制御するために使用されている。ＷＯ  ９７／３５１９６には、アフィニティーリガンドの単離方法が記載されており、この方法では、そのリガンドがターゲット分子に結合するであろう１つの溶液およびそのアフィニティーリガンドがターゲット分子に結合しないであろう第二の溶液とファージディスプレイライブラリを接触させて、結合リガンドを選択的に単離する。ＷＯ  ９７／４６２５１には、抗体の親和精製、次に結合ファージの単離、その後、マイクロプレートウエルを使用して高親和性結合ファージを単離するマイクロパンニングプロセスを用いる、ランダムファージディスプレイライブラリのバイオパンニング方法が記載されている。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｌｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）タンパク質Ａの親和性タグとしての使用も報告されている（Ｌｉら（１９９８）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：１８７）。ＷＯ  ９７／４７３１４には、ファージディスプレイライブラリであり得るコンビナトリアルライブラリを使用して酵素特異性を区別するための基質差分ライブラリの使用が記載されている。ファージディスプレイを使用して界面活性剤中での使用に適する酵素を選択するための方法がＷＯ  ９７／０９４４６に記載されている。特異的結合タンパク質を選択する追加の方法は、米国特許第５，４９８，５３８号、同第５，４３２，０１８号およびＷＯ  ９８／１５８３３に記載されている。
【０１９２】
ペプチドライブラリの作製方法およびこれらのライブラリのスクリーニング方法も、米国特許第５，７２３，２８６号、同第５，４３２，０１８号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，４９８，５３０号、同第５，７７０，４３４号、同第５，７３４，０１８号、同第５，６９８，４２６号、同第５，７６３，１９２号、および同第５，７２３，３２３号に開示されている。
【０１９３】
Ｃ．ＲＡ１ｃポリペプチド結合小分子
ＲＡ１ｃポリペプチド結合小分子は、好ましくは、本明細書に記載するようなＲＡ１ｃポリペプチドに結合する、好ましくは特異的に結合する、本明細書において定義するとおりのオリゴペプチドまたは抗体以外の有機分子である。ＲＡ１ｃポリペプチド結合有機小分子は、公知の方法論（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ００／００８２３およびＷＯ  ００／３９５８５参照）を用いて同定および化学合成することができる。ＲＡ１ｃポリペプチド結合有機小分子は、通常、サイズが約２０００ダルトン未満であり、あるいはサイズが約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満であり、本明細書に記載するようなＲＡ１ｃポリペプチドに結合、好ましくは特異的に結合できるそのような有機小分子は、過度の実験を伴わず周知の技術を用いて同定することができる。これに関して、ポリペプチドターゲットに結合できる分子について有機小分子ライブラリをスクリーニングするための技術は当該技術分野において周知であることを特筆する（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ００／００８２３およびＷＯ  ００／３９５８５参照）。ＲＡ１ｃポリペプチド結合有機小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、第一アミン、第二アミン、三級アミン、Ｎ−置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、ウレア、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、スルホン酸アリール、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、酸塩化物などであり得る。
【０１９４】
Ｄ．ＲＡ１ｃ発現を調節する化合物
本発明のＲＡ１ｃ発現を調節する化合物は、アンチセンスポリヌクレオチド、サイレンシングＲＮＡ分子、触媒ＲＮＡ分子、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、アプタマー、抗体、オリゴペプチド、無機もしくは有機小分子、または本明細書に記載するような細胞におけるＲＡ１ｃポリペプチドの発現を調節する他の化合物である。一定のそのような化合物は、ＲＡ１ｃポリヌクレオチドの転写を活性化または増加させる。一定のそのような化合物は、ＲＡ１ｃポリヌクレオチドの翻訳を活性化または増加させる。一定のそのような化合物は、ＲＡ１ｃポリペプチドの発現を活性化または増加させる。一定のそのような化合物は、ＲＡ１ｃポリヌクレオチドの転写を減少または阻止する。一定のそのような化合物は、ＲＡ１ｃポリヌクレオチドの翻訳を減少または阻止する。一定のそのような化合物は、ＲＡ１ｃポリペプチド発現を減少または阻止する。ＲＡ１ｃ発現を調節する化合物は、ＲＡ１ｃ発現に関与する１つ以上の細胞内シグナル伝達経路に対して作用することができる。例えば、ＲＡ１ｃ発現を調節する化合物は、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路を調節することができる。もう１つの例では、ＲＡ１ｃ発現を調節する化合物は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を調節することができる。もう１つの例では、ＲＡ１ｃ発現を調節する化合物は、ＩＬ−６によって通常活性化されるシグナル伝達経路を調節することができる。
【０１９５】
本発明のＲＡ１ｃ発現を調節する化合物は、その化合物の性質に適する手法で作製することができる。ＲＡ１ｃ発現を調節する抗体または抗体フラグメントは、抗ＲＡ１ｃ抗体またはそれらのフラグメントを作製するために本明細書に記載する同じ技術を用いて作製することができる。もう１つの例では、ＲＡ１ｃ発現を調節するオリゴペプチドは、ＲＡ１ｃポリペプチド結合オリゴペプチドを作製するために本明細書に記載するものと同じ技術を用いて作製することができる。もう１つの例において、ＲＡ１ｃ発現を調節する有機小分子は、ＲＡ１ｃポリペプチド結合小分子を作製するために本明細書に記載する同じ技術を用いて作製することができる。もう１つの例において、ＲＡ１ｃ発現を調節するアプタマーは、ＲＡ１ｃ結合アプタマーを作製するために本明細書に記載するものと同じ技術を用いて作製することができる。
【０１９６】
Ｅ．ＲＡ１ｃアンタゴニストおよびＲＡ１ｃ発現を調節する化合物についてのスクリーニング
ＲＡＩｃアンタゴニスト、例えば、ＲＡ１ｃポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドおよび小分子、ならびにＲＡ１ｃ発現を調節する化合物を生成する技術は、上で説明した。所望される場合には、一定の生物学的特徴を有する、ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物をさらに選択することができる。
【０１９７】
本発明のＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物の成長阻害効果は、当該技術分野において公知の方法によって、例えば、ＲＡ１ｃポリペプチドを内因的に発現するまたはＲＡ１ｃポリペプチド遺伝子でのトランスフェクション後に発現する細胞を使用して、評価することができる。例えば、適切な腫瘍細胞系列およびＲＡ１ｃポリペプチドでトランスフェクトされた細胞を、様々な濃度のＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物で数日（例えば、２〜７日）間処理し、クリスタルバイオレットもしくはＭＴＴで染色する、または何らかの他の比色アッセイによって分析することができる。増殖を測定するもう１つの方法は、ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物が存在するまたは不在の状態で細胞を処理することによって３Ｈ−チミジン取込みを比較することによる方法であろう。処理後、それらの細胞を回収し、ＤＮＡに組み込まれた放射活性の量をシンチレーションカウンタで定量する。適切な陽性対照としては、選択された細胞系列をその細胞系列の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体で処理することが挙げられる。インビボでの腫瘍細胞の成長阻害は、当該技術分野において公知の様々な方法で判定することができる。前記腫瘍細胞は、ＲＡ１ｃポリペプチドを過発現するものであり得る。ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物は、約０．５から３０μｇ／ｍＬの抗体濃度で、１つの実施形態ではインビトロまたはインビボでのＲＡ１ｃポリペプチド発現性腫瘍細胞の細胞増殖を、未処理の腫瘍細胞と比較して約２５〜１００％、さらに好ましくは約３０〜１００％、およびさらにいっそう好ましくは約５０〜１００％または７０〜１００％阻害するであろう。一定の実施形態において、抗体に対する腫瘍細胞の暴露の１〜１０日後に成長阻害を判定する場合、細胞培養物中、約０．５から３０μｇ／ｍＬまたは約０．５ｎＭから２００ｎＭの抗体濃度で成長阻害を測定することができる。一定の実施形態において、約１μｇ／（体重ｋｇ）から約１００ｍｇ／（体重ｋｇ）での抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体の投与が、その抗体の初回投与から約５日から３ヶ月以内、好ましくは約５から３０日以内に腫瘍サイズを減少させるまたは腫瘍細胞増殖を減少させる結果となれば、その抗体は成長阻害性である。
【０１９８】
細胞死（アポトーシス）を誘導するＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物について選択するために、例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルーまたは７ＡＡＤ取込みによって示されるような膜完全性の喪失を、対照を基準にして評価することができる。ＰＩ取込みアッセイは、補体および免疫エフェクター細胞が不在の状態で行うことができる。ＲＡ１ｃポリペプチド発現性腫瘍細胞を培地のみと共に、または適切なＲＡ１ｃポリペプチド抗体（例えば、約１０μｇ／ｍＬで）、ＲＡ１ｃポリペプチド結合オリゴペプチド、ＲＡ１ｃポリペプチド結合有機小分子、他のＲＡ１ｃアンタゴニスト、またはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物と共にインキュベートする。それらの細胞を３日の期間にわたってインキュベートする。それぞれの処理後、細胞を洗浄し、細胞集塊を除去するために３５ｍｍのストレーナーキャップ付き１２×７５チューブに分取する（チューブ１本あたり１ｍＬ、１処理群あたり３本のチューブ）。その後、チューブにＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）を入れる。非限定的な例ではＦＡＣＳＣＡＮ（登録商標）フローサイトメータおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（登録商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してサンプルを分析することができる。ＰＩ取込みによって判定して統計学的に有意な細胞死レベルを誘導するＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物を、細胞死誘導性のＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物として選択することができる。
【０１９９】
抗体、オリゴペプチドもしくは他の有機小分子、または対象となる抗体が結合するＲＡ１ｃポリペプチド上のエピトープに結合する他のＲＡ１ｃアンタゴニストをスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているものなどの通例的交差遮断アッセイを行うことができる。このアッセイは、試験抗体、オリゴペプチド、他の有機小分子または他のＲＡ１ｃアンタゴニストが、既知抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体と同じ部位またはエピトープに結合するかどうかを判定するために用いることができる。あるいは、または加えて、当該技術分野において公知の方法によってエピトープマッピングを行うことができる。例えば、アラニンスキャンなどによって抗体配列に突然変異を起こさせて、接触残基を同定することができる。突然変異抗体は、正しいフォールディングを保障するために、最初にポリクローナル抗体との結合について試験する。別の方法では、ＲＡ１ｃポリペプチドの異なる領域に対応するペプチドを、試験抗体との競合アッセイにおいて、または試験抗体および特性付けされたもしくは既知のエピトープを有する抗体との競合アッセイにおいて使用することができる。
【０２００】
Ｆ．抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）
本発明の抗体は、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法薬、ＷＯ  ８１／０１１４５参照）を活性抗癌薬に転化させるプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることによってＡＤＥＰＴで使用することもできる。例えば、ＷＯ  ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号参照。
【０２０１】
ＡＤＥＰＴに有用なイムノコンジュゲートの酵素成分としては、プロドラッグをそのより活性な細胞傷害形態に転化させるようにプロドラッグに対して作用することができる任意の酵素が挙げられる。
【０２０２】
本発明の方法に有用な酵素としては、ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬物に転化させるために有用なアルカリフォスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離薬物に転化させるために有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬、５−フルオロウラシルに転化させるために有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に転化させるために有用であるプロテアーゼ、例えば、セルラチアプロテアーゼ、サーモライシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例えば、カテプシンＢおよびＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを転化させるために有用な、Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に転化させるために有用な炭水化物開裂酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ；β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に転化させるために有用なβ−ラクタマーゼ；ならびにアミン窒素がそれぞれフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基で誘導体化された薬物を遊離薬物に転化させるために有用なペニシリンアミダーゼ、例えば、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、当該技術分野において「アブザイム」としても知られている酵素活性を有する抗体を使用して、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に転化させることができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）参照）。腫瘍細胞集団へのアブザイムの送達のために本明細書において説明するように抗体−アブザイムコンジュゲートを作製することができる。
【０２０３】
本発明の酵素は、当該技術分野において周知の技術、例えば、上で論じたヘテロ二官能性架橋試薬の使用によって、抗ＲＡ１ｃ抗体に共有結合させることができる。あるいは、本発明の酵素の少なくとも１つの機能活性部分に連結させた本発明の抗体の抗原結合部位を少なくとも含む融合タンパク質を、当該技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）参照）を用いて構築することができる。
【０２０４】
Ｇ．抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体変異体
本明細書に記載する抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体に加えて、抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体変異体を作製できると考えられる。抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体変異体は、適切なヌクレオチド変更をコーディングＤＮＡに導入することによって、または所望の抗体の合成によって作製することができる。アミノ酸変更が、抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体の翻訳後プロセスを改変し得ること、例えば、グリコシル化部位の数もしくは位置を変えるまたは膜アンカー特性を改変することは、当業者には理解されるであろう。
【０２０５】
例えば米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的および非保存的突然変異についての任意の技術およびガイドラインを例えば用いて、本明細書に記載する抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体の変型を作ることができる。変型は、天然配列抗体またはポリペプチドと比較してアミノ酸配列に変更を生じさせる結果となる、抗体をコードする１つ以上のコドンの置換、欠失または挿入であり得る。場合によっては、変型は、抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体の１つ以上のドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸の任意の他のアミノ酸での置換によるものである。所望の活性に悪影響を及ぼすことなく、どのアミノ酸残基を挿入する、置換するまたは欠失させることができるかを決めるガイドラインは、抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体と既知相同タンパク質分子のものとを比較し、高相同性領域において成されるアミノ酸配列変更数を最小にすることによって見つけることができる。アミノ酸置換は、あるアミノ酸の類似の構造および化学特性を有する別のアミノ酸での置換、例えば、ロイシンのセリンでの置換、すなわち保存的アミノ酸置換の結果であり得る。挿入または欠失は、場合により、アミノ酸の約１から５個の範囲の挿入または欠失であり得る。許される変型は、その配列において挿入、欠失または置換を系統的に行い、結果として生じた変異体を親配列が示す活性について検査することによって決定することができる。
【０２０６】
抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体およびＲＡ１ｃポリペプチドフラグメントを本明細書において提供する。そのようなフラグメントは、例えば、完全長天然抗体またはタンパク質と比較したとき、Ｎ末端もしくはＣ末端がトランケートされている場合があり、または内部残基を欠く場合がある。一定のフラグメントは、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドの所望の生物活性に必須でないアミノ酸残基を欠く。
【０２０７】
抗ＲＡ１ｃ抗体およびＲＡ１ｃポリペプチドフラグメントは、多数の従来技術のいずれかよって作製することができる。所望のペプチドフラグメントを化学合成することができる。代替アプローチは、酵素的消化による、例えば、特定のアミノ酸残基によって規定される部位でタンパク質を開裂させることが知られている酵素でタンパク質を処理することによる、または適する制限酵素でＤＮＡを消化し、所望のフラグメントを単離することによる、抗体またはポリペプチドフラグメントの生成を含む。さらにもう１つの適する技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、所望の抗体またはポリペプチドフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントの単離および増幅を含む。ＰＣＲでは、ＤＮＡフラグメントの所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドを５’および３’プライマーで利用する。好ましくは、抗ＲＡ１ｃ抗体およびＲＡ１ｃポリペプチドフラグメントは、本明細書に開示する天然抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドと、少なくとも１つの生物または免疫活性を共有する。
【０２０８】
特定の実施形態において、対象となる保存的置換を表１の好ましい置換という項目の下に示す。そのような置換が生物活性を変化させる結果となる場合には、表１では例示的置換と称する、またはアミノ酸クラスに関して下でさらに説明する、より実質的な変化を導入し、それらの生成物をスクリーニングする。
【０２０９】
【表１】
2010521425.tif 000008
抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドの機能または免疫学的同一性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造を、例えばシートもしくはらせん形配座として、（ｂ）ターゲット部位での分子の電荷もしくは疎水性を、または（ｃ）側鎖のバルクを、維持することに対するそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって遂行される。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従ってグループ分けすることができる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５）では）：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０２１０】
あるいは、自然発生残基を共通の側鎖特性に基づいて分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２１１】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必然的に伴うであろう。そのような置換残基を保存的置換部位に、またはさらに好ましくは、残りの（非保存）部位に導入することもできる。
【０２１２】
当該技術分野において公知の方法、例えば、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャン法およびＰＣＲ突然変異誘発を用いて、変型を作ることができる。部位特異的突然変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）］、カセット突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓら，Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５）］、制限選択突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓら，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６）］または他の公知の技術をクローニングしたＤＮＡに対して行って、抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体またはＲＡ１ｃポリペプチド変異ＤＮＡを生産することができる。
【０２１３】
アミノ酸スキャン分析を利用して、隣接配列に沿って１つ以上のアミノ酸を同定することもできる。好ましいスキャン用アミノ酸には、比較的小さい中性アミノ酸がある。そのようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリンおよびシステインが挙げられる。アラニンは、ベータ−炭素を超える側鎖を無くすため、および変異体の主鎖配座を改変する可能性が低いため、一般に、このグループの中で好ましいスキャン用アミノ酸である［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）］。アラニンは、また、最も一般的なアミノ酸であるため、一般に好ましい。さらに、それは、多くの場合、埋まっている状態と露出している状態の両方で見つけられる［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１  （１９７６）］。アラニン置換が妥当な量の変異体を生じない場合、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を使用することができる。
【０２１４】
抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドの正しい配座の維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般にはセリンで置換して、その分子の酸化安定性を改善することおよび異所架橋を防止することもできる。逆に言えば、システイン結合（単数または複数）を抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドに加えてその安定性を改善することができる（特に、前記抗体が、Ｆｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。
【０２１５】
特に好ましいタイプの置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。一般に、さらなる開発のために選択される、得られた変異体（単数または複数）は、それらを生じさせる親抗体に比べて改善された生物学的特性を有するであろう。そのような置換変異体を生じさせるための都合の良い方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟を含む。簡単に言うと、幾つかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させて、それぞれの部位にすべての可能なアミノ置換を生じさせる。このようにして生じさせた抗体変異体は、糸状ファージ粒子から、それぞれの粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合体として、一価様式で表示する。その後、それらのファージディスプレイ変異体を、本明細書に開示するようにそれらの生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を特定するために、アラニンスキャン型突然変異誘発を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を特定することができる。あるいは、または加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトＲＡ１ｃポリペプチドとの接触点を特定することは有益であり得る。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書において詳しく述べる技術による置換の候補である。そのような変異体を生じさせたら、それらの変異体のパネルを本明細書に記載するようにスクリーニングし、１つ以上の適切なアッセイにおいて優れた特性を有した抗体をさらなる開発のために選択することができる。
【０２１６】
抗ＲＡ１ｃ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野において公知の様々な方法によって作製することができる。これらの方法としては、天然源からの単離（自然発生アミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および抗ＲＡ１ｃ抗体のより容易に作製される変異体もしくは非変異体バージョンのカセット突然変異誘発による作成が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１７】
Ｈ．抗ＲＡ１ｃ抗体およびＲＡ１ｃポリペプチドの修飾
抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体およびＲＡ１ｃポリペプチドの共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合修飾の１つのタイプは、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドのターゲットとなるアミノ酸残基と、その抗ＲＡ１ｃポリペプチド抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドの選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤とを反応させることを含む。二官能性薬剤での誘導体化は、例えば、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドを、抗ＲＡ１ｃ抗体を精製する方法で使用するための水不溶性支持マトリックスまたは表面に、またその逆に、架橋するために有用である。一般に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン；グルタルアルデヒド；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル；３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含む、ホモ二官能性イミドエステル；二官能性マレイミド、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン；およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオネートなどの薬剤が挙げられる。
【０２１８】
他の修飾としては、グルタミニルおよびアスパラギニル残基のそれぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシ基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）］、Ｎ−末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０２１９】
本発明の範囲内に含まれる抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドの共有結合修飾のもう１つのタイプは、該抗体またはポリペプチドの天然グリコシル化パターンの改変を含む。「天然グリコシル化パターンの改変」は、ここでの目的のために、天然配列抗ＲＡ１ｃ抗体もしくはＲＡ１ｃポリペプチド中で見つけられる１つ以上の炭水化物部分の（基礎グリコシル化部位の除去、または化学的もしくは酵素的手段によるグリコシル化の欠失、いずれかによる）欠失、または天然配列抗ＲＡ１ｃ抗体もしくはＲＡ１ｃポリペプチド中には存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加を意味すると解釈する。加えて、このフレーズは、存在する様々な炭水化物部分の性質および特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化の質的変化を含む。
【０２２０】
抗体および他のポリペプチドのグリコシル化は、一般に、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の連結を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（この場合のＸは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的連結のための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在によって、潜在的グリコシル化部位が作られる。Ｏ−結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸（５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも用いられるが、最も一般的にはセリンまたはトレオニン）への糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの連結を指す。
【０２２１】
抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、上で説明したトリペプチド配列の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって容易に遂行される（Ｎ−結合型グリコシル化部位について）。この改変は、もとの抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドの配列への１つ以上のセリンまたはトレオニン残基、の付加または該残基による置換によって行うこともできる（Ｏ−結合型グリコシル部位について）。場合によっては、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変更により、特に、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドをコードするＤＮＡを、所望のアミノ酸に翻訳するであろうコドンが生成されるように前もって選択した塩基で突然変異させることによって、改変することができる。
【０２２２】
抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させるもう１つの手段は、そのポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。そのような方法は、当該技術分野において、例えば、１９８７年９月１１に発行されたＷＯ  ８７／０５３３０に、およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。
【０２２３】
抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的にもしくは酵素的に、またはグリコシル化のためのターゲットとして役立つアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異性置換によって、遂行することができる。化学的脱グリコシル化技術は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）によって、および、Ｅｄｇｅら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０（１９８７）によって記載されているような様々なエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用によって達成することができる。
【０２２４】
抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドの共有結合修飾のもう１つのタイプは、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に記載されている手法で、様々な非タンパク質様ポリマーの１つ、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンに、該抗体またはポリペプチドを結合させることを含む。例えばコアセルベーション技術によってもしくは界面重合によって作製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）の中に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）の中に、またはマイクロエマルジョンの中に前記抗体またはポリペプチドを捕捉することができる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。
【０２２５】
本発明の抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドは、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合した抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドを含むキメラ分子を形成するように修飾することもできる。
【０２２６】
１つの実施形態において、そのようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合するエピトープを提供するタグポリペプチドと抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドの融合体を含む。前記エピトープタグは、一般に、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に配置される。そのようなエピトープタグの付いた形態の抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドの存在は、そのタグペプチドに対する抗体を使用して検出することができる。また、エピトープタグの提供により、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドは、エピトープタグに結合する抗タグ抗体または別のタイプの親和性マトリックスを使用する親和性精製によって容易に精製できるようになる。様々なタグポリペプチドおよびそれらそれぞれの抗体が当該技術分野において周知である。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグならびにそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５）］；ならびに単純疱疹ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０）］が挙げられる。他のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇ−ペプチド［Ｈｏｐｐら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１）］；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０）］が挙げられる。
【０２２７】
代替実施形態において、前記キメラ分子は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域と抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドの融合体を含む。二価形態のキメラ分子（「免疫付着因子」とも呼ばれる）についてのそのような融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域へのものであり得る。前記Ｉｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の場所での可溶性（膜貫通ドメイン欠失または不活性化）形態の抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドの置換を含む。特定の好ましい実施形態において、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の生産については、１９９５年６月２７日に発行された米国特許第５，４２８，１３０号も参照のこと。
【０２２８】
Ｉ．抗ＲＡ１ｃ抗体およびＲＡ１ｃポリペプチドの作製
下の説明は、抗ＲＡ１ｃ抗体およびＲＡ１ｃポリペプチドをコードする核酸を含有するベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を培養することによる、抗ＲＡ１ｃ抗体およびＲＡ１ｃポリペプチドの生産に主として関する。勿論、当該技術分野において周知である代替方法を利用して抗ＲＡ１ｃ抗体およびＲＡ１ｃポリペプチドを作製することもできる。例えば、適切なアミノ酸配列またはその一部を、固相技術を用いる直接ペプチド合成によって生産することができる［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ  （１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）参照］。手動または自動化によってインビトロタンパク質合成を行うこともできる。自動合成は、例えば、製造業者の使用説明書を用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（カリフォルニア州、フォスター・シティー）を使用して、遂行することができる。化学的または酵素的方法を別々に用いてまたは併用して抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドの様々な部分を化学合成して、所望の抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドを生産することができる。
【０２２９】
１．抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドをコードするＤＮＡは、その抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドｍＲＮＡを有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられている組織から作製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒト抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドＤＮＡは、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリから都合よく得ることができる。ゲノムライブラリからまたは公知の合成手順（例えば、自動核酸合成）によって、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドをコードする遺伝子も得ることができる。
【０２３０】
対象となる遺伝子およびそれがコードしているタンパク質を同定するように設計されたプローブ（例えば、少なくとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド）を用いてライブラリをスクリーニングすることができる。選択されたプローブでのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているものなどの標準的な手順を用いて行うことができる。抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドをコードする遺伝子を単離するための代替手段は、ＰＣＲ方法論を用いるものである［Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記；  Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５）］。
【０２３１】
ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための技術は、当該技術分野において周知である。プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、偽陽性を最小にする十分な長さおよび十分に明白なものでなければならない。前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡにハイブリダイズしたときにそれを検出できるように標識される。標識方法は当該技術分野において周知であり、３２Ｐ−標識ＡＴＰのような放射性標識、ビオチニル化または酵素標識の使用を含む。中等度ストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーをはじめとするハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｃｋらの上記文献に提供されている。
【０２３２】
そのようなライブラリスクリーニング方法で同定された配列を、ＧｅｎＢａｎｋなどの公共データベースまたは他の私有配列データベースに寄託されている利用可能な他の既知配列と比較することおよびそれらにアラインすることができる。当該技術分野において公知の方法および本明細書に記載するような方法を用いて、分子の所定領域内でのまたは完全長配列全域での（アミノ酸またはヌクレオチドレベルいずれかでの）配列同一性を決定することができる。
【０２３３】
タンパク質コーディング配列を有する核酸は、本明細書に開示する演繹アミノ酸配列を最初に使用し、必要な場合には、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの上記文献に記載されているような従来のプライマー延長手順を用いて、選択されたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリをスクリーニングして前駆体を検出すること、およびｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの中間体を処理することによって、得ることができる。
【０２３４】
２．宿主細胞の選択および形質転換
抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチド生産のための本明細書に記載する発現またはクローニングベクターで宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために、適宜、変性させた従来の栄養培地においてそれらを培養する。当業者は、過度の実験を伴わずに培養条件、例えば、培地、温度、ｐＨなどを選択することができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコルおよび実用技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，ｅｄ．（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら，上記文献において見つけることができる。
【０２３５】
真核細胞トランスフェクション方法および原核細胞形質転換方法、例えば、ＣａＣｌ２法、ＣａＰＯ４法、リポソーム媒介法およびエレクトロポレーション法は、通常の当業者に公知である。使用する宿主細胞に依存して、そのような細胞に適する標準的な技術を用いて形質転換を行う。原核細胞には、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの上記文献に記載されているような塩化カルシウムを利用するカルシウム処理、またはエレクトロポレーションが一般に用いられる。Ｓｈａｗら，Ｇｅｎｅ，２３：３１５（１９８３）および１９８９年６月２９日に発行されたＷＯ  ８９／０５８５９に記載されているように、一定の植物細胞の形質転換にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）での感染が用いられる。そのような細胞壁のない哺乳動物細胞には、Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈降法を利用することができる。哺乳動物細胞宿主系トランスフェクションの一般的態様は、米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母への形質転換は、一般に、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎら，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１３０：９４６（１９７７）およびＨｓｉａｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７６：３８２９（１９７９）の方法に従って行われる。しかし、ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクト細胞との細菌プロトプラスト融合、または多価カチオン、例えばポリブレン、ポリオルチニンによるものも用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するための様々な技術については、Ｋｅｏｗｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７（１９９０）およびＭａｎｓｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照のこと。
【０２３６】
ここでのベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に適する宿主細胞としては、原核細胞、酵母、または高等真核細胞が挙げられる。適する原核細胞としては、真性細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの腸内細菌科細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）が挙げられるが、それらに限定されない。様々な大腸菌株、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）およびＫ５  ７７２（ＡＴＣＣ  ５３，６３５）を公的に利用することができる。他の適する原核宿主細胞としては、腸内細菌科細菌、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クエブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、および赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ならびに杆菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバシラス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日に発行されたＤＤ  ２６６，７１０に開示されているバシラス・リケニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。これらの例は、限定ではなく実例となるものである。Ｗ３１１０株は、組換えＤＮＡ産物発酵のための一般的な宿主株であるため、１つの特に好ましい宿主または親宿主である。好ましくは、宿主細胞は、最少量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、Ｗ３１１０株は、宿主に内在するタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子突然変異に作用するように修飾することができ、そのような宿主の例としては、完全遺伝子型ｔｏｎＡを有する、大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する、大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎｒを有する、大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎｒを有する、大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失突然変異を有する株３７Ｄ６である、大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ３；および１９９０年８月７日に発行された米国特許第４，９４６，７８３号に開示されている突然変異ペリプラスムプロテアーゼを有する大腸菌株が挙げられる。あるいは、インビトロクローニング法、例えば、ＰＣＲまたは他の核酸ポリメラーゼ反応が適する。
【０２３７】
完全長抗体、抗体フラグメント、および抗体融合タンパク質は、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能を必要としないとき、例えば、治療用抗体を細胞傷害剤（例えば、毒素）にコンジュゲートさせ、そのイムノコンジュゲートそれ自体が腫瘍細胞破壊に有効性を示すとき、細菌において生産することができる。完全長抗体は、循環においてより長い半減期を有する。大腸菌の生産は、より速く、より経済的である。細菌における抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７（Ｃａｒｔｅｒら）、米国特許第５，７８９，１９９（Ｊｏｌｙら）、ならびに発現および分泌を最適にするための翻訳開始領域（ＴＩＲ）およびシグナル配列を記載している米国特許第５，８４０，５２３（Ｓｉｍｍｏｎｓら）を参照のこと。これらの特許は、参照により本明細書に取り入れられている。発現後、可溶性画分中の大腸菌細胞ペーストから抗体を単離し、例えばそのアイソタイプに依存してプロテインＡまたはＧカラムにより精製することができる。例えばＣＨＯ細胞において発現された抗体を精製するためのプロセスに類似した最終精製を行うことができる。
【０２３８】
原核細胞に加えて、真核微生物、例えば、糸状菌または酵母は、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドをコードするベクターのための適するクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、一般に使用される下等真核宿主微生物である。他のものとしては、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０［１９８１］；１９８５年５月２日に発行されたＥＰ  １３９，３８３）；クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））、例えば、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４（２）：７３７−７４２［１９８３］）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリカス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウィッカーアミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ  ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０））、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）およびＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）など；ヤロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ  ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ  １８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら，Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：２６５−２７８［１９８８］）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レッシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ  ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（Ｃａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３［１９７９］）；シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワニオマイセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（１９９０年１０月３１日に発行されたＥＰ  ３９４，５３８）；ならびに糸状菌、例えば、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラディウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（１９９１年１月１０に発行されたＷＯ  ９１／００３５７）、およびコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、為巣性こうじ菌（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｂａｌｌａｎｃｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎら，Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１４７０−１４７４［１９８４］）および黒色こうじ菌（Ａ．ｎｉｇｅｒ）（��ｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：４７５−４７９［１９８５］）などが挙げられる。メチロトローフ酵母は、ここでは好適であり、それらとしては、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）およびロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）から成る属から選択される、メタノールを用いて成長させることができる酵母が挙げられるが、これらに限定されない。このクラスの酵母の具体的な例である特定の種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）において見つけることができる。
【０２３９】
グリコシル化抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドの発現に適する宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９、ならびに植物細胞、例えば、綿、トウモロコシ、馬鈴薯、大豆、ツクバネアサガオ、トマトおよびタバコの細胞培養物が挙げられる。ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの宿主からの非常の多数のバキュロウイルス株および変異体ならびに対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株を、公的に利用でき、そのようなウイルスを、本発明に従ってここでのウイルスとして、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、使用することができる。
【０２４０】
しかし、脊椎動物細胞への関心が最も高く、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖が通例的手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系列（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎臓系列（２９３細胞または懸濁培養で成長させるためにサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；サル乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌系列（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２４１】
抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチド生産のために上に記載した発現またはクローニングベクターで宿主細胞を形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために、適宜、変性させた従来の栄養培地においてそれらを培養する。
【０２４２】
３．複製可能なベクターの選択および使用
抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を、クローニング（ＤＮＡの増幅）のためにまたは発現のために、複製可能なベクターに挿入することができる。様々なベクターを公的に利用することができる。前記ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子またはファージの形態であり得る。適切な核酸配列を様々な手順によってベクターに挿入することができる。一般に、当該技術分野において公知の技術を用いて適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）にＤＮＡを挿入する。ベクター成分としては、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。これらの成分の１つ以上を含有する、適するベクターの構築は、当業者に公知である標準的なライゲーション技術を利用する。
【０２４３】
ＲＡ１ｃポリペプチドを、直接、組換え生産できるばかりでなく、ポリペプチドと異種ポリペプチド（これは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特定の開裂部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドであり得る）の融合体としても生産することができる。一般に、前記シグナル配列は、ベクターの成分であってもよいし、またはそのベクターに挿入される、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドをコードするＤＮＡの一部であってもよい。前記シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターセ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される、原核生物シグナル配列であってもよい。酵母分泌のためのシグナル配列は、例えば、酵母転化酵素リーダー、アルファ因子リーダー（サッカロマイセス属およびクルイベロマイセス属α−因子リーダー、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日に発行されたＥＰ  ３６２，１７９）、または１９９０年１１月１５日に発行されたＷＯ  ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列を使用して、タンパク質、例えば、同じまたは同族の種の分泌ポリペプチドからのシグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダーの分泌を指示することができる。
【０２４４】
発現ベクターとクローニングベクターは両方とも、１つ以上の選択された宿主細胞においてそのベクターを複製できる核酸配列を含有する。様々な細菌、酵母およびウイルスについてのそのような配列が周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、大部分のグラム陰性菌に適し、２μプラスミド起点は酵母に適し、および様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が哺乳動物におけるベクターのクローニングに有用である。
【０２４５】
発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を典型的に含有する。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求体欠失を補足する、または（ｃ）複合培地から入手できない重要な栄養分、例えば、杆菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）のためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子、を供給する、タンパク質をコードする。
【０２４６】
哺乳動物細胞に適する選択可能マーカーの例は、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドをコードする核酸を取り込む能力がある細胞の同定を可能にするもの、例えば、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼである。野生型ＤＨＦＲを利用するときの適切な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６  （１９８０）によって記載されているように作製および増殖させた、ＤＨＦＲ活性を欠くＣＨＯ細胞である。酵母での使用に適する選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０）］。このｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１［Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）］のための選択マーカーをもたらす。
【０２４７】
発現およびクローニングベクターは、ｍＲＮＡ合成を指示するために、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを通常は含有する。様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモーターが周知である。原核生物宿主と共に使用するために適するプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプローモータ系［Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９）］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；ＥＰ  ３６，７７６］、およびハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーター［ｄｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３）］が挙げられる。細菌系において使用するためのプロモーターは、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有するであろう。
【０２４８】
酵母宿主と共に使用するために適する促進配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３（１９８０）］または他の糖分解酵素［Ｈｅｓｓら，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．，７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００（１９７８）］、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼおよびグルコキナーゼのためのプロモーターが挙げられる。
【０２４９】
成長条件によって制御される転写の追加の利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用の責任を負う酵素のためのプロモーター領域である。酵母発現の際に使用するための適するベクターおよびプロモーターは、ＥＰ  ７３，６５７にさらに記載されている。
【０２５０】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウイルス、例えば、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日発行のＵＫ  ２，２１１，５０４）、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、および異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、および熱ショックプロモーターから得られるプロモーター（但し、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする）によって制御される。
【０２５１】
高等真核生物による抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をそのベクターに挿入することによって増加させることができる。エンハンサーは、プロモーターに対して作用してその転写を増加させるＤＮＡのシス−作用性要素、通常は約１０から３００ｂｐ、である。今では多くのエンハンサー配列が、哺乳動物遺伝子からわかっている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）。しかし、一般には真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ  １００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。前記エンハンサーを、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドコーディング配列に対して５’または３’位置で前記ベクターにスプライスすることができるが、好ましくはそのプロモーターから５’部位に配置する。
【０２５２】
真核宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または他の多細胞生物からの有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結におよびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。そのような配列は、一般に、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および時として３’、非翻訳領域から得ることができる。これらの領域は、抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。
【０２５３】
組換え脊椎動物細胞培養での抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドの合成への適応に適するさらに他の方法、ベクターおよび宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６（１９７９）；ＥＰ  １１７，０６０；およびＥＰ  １１７，０５８に記載されている。
【０２５４】
４．宿主細胞の培養
本発明の抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドを生産するために使用される宿主細胞は、様々な培地において培養することができる。市販の培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ変性イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）は、宿主細胞の培養に適する。加えて、Ｈａｍら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ  ９０／０３４３０；ＷＯ  ８７／００１９５；または米国特許第再発行番号３０，９８５に記載されているいずれの培地も、宿主細胞用の培養基として使用することができる。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモンまたは他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬）、微量元素（通常はマイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義する）、およびグルコースまたは等価のエネルギー源を補足することができる。任意の他の必要な補足物も当業者に公知であろう適切な濃度で含めることができる。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選択される宿主に関して以前に用いられたものであり、通常の当業者には明らかであろう。
【０２５５】
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子増幅または発現は、本明細書に提供する配列に基づき、適切に標識されたプローブを使用して、例えば、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０）］、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、またはインサイチューハイブリダイゼーションによって、直接サンプルにおいて測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖をはじめとする特定の二重鎖を認識することができる抗体を利用することができる。そしてまた、それらの抗体に標識付けすることができ、アッセイを行うことができ、この場合、二重鎖が表面に結合してその表面に二重鎖が形成されると、その二重鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【０２５６】
あるいは、免疫学的方法、例えば、細胞または組織切片の免疫組織化学染色および細胞培養液または体液のアッセイによって遺伝子発現を測定して、遺伝子産物の発現を直接定量することができる。サンプル液の免疫組織化学染色またはアッセイに有用な抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよく、および任意の哺乳動物において該抗体を作製することができる。好都合なことに、天然配列ＲＡ１ｃポリペプチドに対する抗体、または本明細書に提供するＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対する抗体、またはＲＡ１ｃポリペプチドＤＮＡに融合しており、特定の抗体エピトープをコードする外因性配列に対する抗体を作製することができる。
【０２５７】
６．抗ＲＡ１ｃ抗体およびＲＡ１ｃポリペプチドの精製
抗ＲＡ１ｃ抗体およびＲＡ１ｃポリペプチドの形態を培養基からまたは宿主細胞溶解産物から回収することができる。膜に結合している場合、適する界面活性剤溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を使用して、または酵素的開裂によって、それを膜から放出させることができる。抗ＲＡ１ｃ抗体およびＲＡ１ｃポリペプチドの発現の際に利用される細胞は、様々な物理的または化学的手段、例えば、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤によって、分解することができる。
【０２５８】
組換え細胞タンパク質またはポリペプチドから抗ＲＡ１ｃ抗体およびＲＡ１ｃポリペプチドを精製することが望まれる場合もある。以下の手順は、適する精製手順の具体例である：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿法；逆相ＨＰＬＣ；シリカでのまたはカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥでのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿法；例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用する、ゲル濾過；ＩｇＧなどの不純物を除去するためのプロテインＡセファロースカラム；ならびにエピトープタグ付き形態の抗ＲＡ１ｃ抗体およびＲＡ１ｃポリペプチドを結合するための金属キレートカラム。様々なタンパク質精製方法を利用することができ、そのような方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載されている。選択される精製段階（単数または複数）は、例えば、使用される生産プロセスの性質、および生産される個々の抗ＲＡ１ｃ抗体またはＲＡ１ｃポリペプチドに依存するであろう。
【０２５９】
組換え技術を用いるとき、抗体をペリプラスム間隙において細胞内生産することができ、または培地に直接分泌させることができる。抗体を細胞内生産する場合、第一段階として、粒子状破壊片（宿主細胞または溶解フラグメントのいずれか）を、例えば遠心分離または限外濾過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）には、大腸菌のペリプラスム間隙に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。簡単に言うと、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）が存在する状態で約３０分、解凍する。細胞破壊片は、遠心分離によって除去することができる。抗体を培地に分泌させる場合、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、そのような発現系からの上清を、先ず、濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上述の段階のいずれかに含めてタンパク質分解を抑制することができ、抗生物質を含めて偶発性汚染菌の成長を防止することができる。
【０２６０】
それらの細胞から作製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、好ましい精製技術は、アフィニティークロマトグラフィーである。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプにおよびヒトγ３に組み換えられる（Ｇｕｓｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドを連結させるマトリックスは、最も多くの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用できる。機械的に安定なマトリックス、例えば、気孔制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンによって、アガロースで達成することができるものより速い流速および短い処理時間が可能となる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）レジン（ニュージャージー州、フィリップスバーグのＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）が精製に有用である。回収すべき抗体に依存して、他のタンパク質精製技術、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびに硫酸アンモニウム沈殿法も利用できる。
【０２６１】
任意の予備精製段階（単数または複数）後、対象となる抗体および不純物を含む混合物を、約２．５〜４．５の間のｐＨの溶離緩衝液を使用する、好ましくは低い塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに付すことができる。
【０２６２】
Ｊ．ＲＡ１ｃペプチドおよびＲＡ１ｃポリペプチドをコードする核酸−特定の形態および用途
ＲＡ１ｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（またはそれらの補体）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、染色体および遺伝子マッピングにおける使用ならびにアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡプローブの生成における使用を含めて、分子生物学の技術分野において様々な用途を有する。ＲＡ１ｃポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記載する組換え技術によるＲＡ１ｃポリペプチドの作製にも有用でもあろう。この場合、それらのＲＡ１ｃポリペプチドは、例えば、本明細書に記載するような抗ＲＡ１ｃ抗体の作製に使用することができる。
【０２６３】
完全長天然配列ＲＡ１ｃポリペプチド遺伝子またはその一部をｃＤＮＡライブラリのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用して、本明細書に開示する天然ＲＡ１ｃポリペプチド配列との望ましい配列同一性を有する他のｃＤＮＡ（例えば、ＲＡ１ｃポリペプチドの自然発生変異体または他の種からのＲＡ１ｃポリペプチドをコードするもの）を単離することができる。場合により、前記プローブの長さは、約２０から約５０塩基であろう。前記ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的には完全長天然ヌクレオチド配列の新規領域（これらの領域は、過度の実験を伴わずに決定することができる）に由来する場合もあり、または天然配列ＲＡ１ｃポリペプチドのプロモーター、エンハンサー要素およびイントロンを含むゲノム配列に由来する場合もある。例として、あるスクリーニング法は、約４０塩基の選択されたプローブを合成するために既知ＤＮＡ配列を使用してＲＡ１ｃポリペプチドのコーディング領域を単離することを含むであろう。ハイブリダイゼーションプローブは、ラジオヌクレオチド、例えば３２Ｐもしくは３５Ｓ、または酵素的標識、例えば、アビジン／ビオチンカップリング系によって該プローブにカップリングされるアルカリホスファターゼをはじめとする様々な標識によって標識付けすることができる。本発明のＲＡ１ｃポリペプチド遺伝子のものに相補的な配列を有する標識プローブを使用してヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリをスクリーニングして、該プローブがハイブリダイズするのはそのようなライブラリのどのメンバーかを決定することができる。ハイブリダイゼーション技術を、下の実施例でさらに詳細に説明する。本出願に開示する任意のＥＳＴ配列は、本明細書に開示する方法を用いてプローブとして同様に利用することができる。
【０２６４】
ＲＡ１ｃポリペプチドをコードする核酸の他の有用なフラグメントとしては、ターゲットＲＡ１ｃポリペプチドｍＲＮＡ（センス）またはＲＡ１ｃポリペプチドＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明によるアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＡ１ｃ  ＤＮＡのコーディング領域のフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、一般に、少なくとも約１４のヌクレオチド、好ましくは、約１４から３０のヌクレオチドを含む。所与のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを得ることができることは、例えば、Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８）およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，１９８８）に記載されている。
【０２６５】
ターゲット核酸配列へのアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合は、二重鎖の分解増進、転写もしくは翻訳の時期尚早の終結をはじめとする幾つかの手段のうちの１つによってまたは他の手段によってターゲット配列の転写または翻訳を阻止する二重鎖を形成する結果となる。そのような方法は、本発明に包含される。従って、それらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、Ｒａ１ｃタンパク質（該Ｒａ１ｃタンパク質は、哺乳動物における癌の誘導に１つの役割を果たし得る）の発現を阻止することができる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖ホスホジエステル骨格（または他の糖連鎖、例えば、ＷＯ  ９１／０６６２９に開示されているもの）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、この場合、そのような糖連鎖は内因性ヌクレアーゼに対して耐性である。耐性糖連鎖を有するそのようなオリゴヌクレオチドは、インビボで安定である（すなわち、酵素的分解に耐えることができる）が、ターゲットヌクレオチド配列に結合することができる配列特異性を保っている。
【０２６６】
アンチセンス結合のために好ましい遺伝子内部位としては、その遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始／スタートコドン（５’−ＡＵＧ／５’−ＡＴＧ）または終結／停止コドン（５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５−ＵＧＡ／５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡ）が挙げられる。これらの領域は、翻訳開始または終結コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）に約２５から約５０の隣接するヌクレオチドを含むｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を指す。アンチセンス結合のための他の好ましい領域としては、イントロン；エキソン；イントロン−エキソン接合部；翻訳開始コドンと翻訳終結コドンの間の領域である、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コーディング領域」；ｍＲＮＡの５’キャップ（５’−５’三リン酸結合によってｍＲＮＡの最も５’側の残基に連結されたＮ７−メチル化グアノシン残基を含み、５’キャップ構造それ自体ばかりでなくそのキャップに隣接する最初の５０のヌクレオチドを含む）；５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの一部、従って、ｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンの間のヌクレオチドまたはその遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む）；および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（翻訳終結コドンから３’方向のｍＲＮＡの一部、従って、翻訳終結コドンとｍＲＮＡの３’末端の間のヌクレオチドまたはその遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む）が挙げられる。
【０２６７】
ＲＡ１ｃポリペプチドの発現の阻害に有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例としては、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドは、その骨格にリン原子を保有するものおよびその骨格にリン原子を有しないものを含む。本明細書のために、および当該技術分野において時として参照されるように、ヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであると見なすことができる。好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリ−エステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含む）、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常な３’−５’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノ−ホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、ならびに１つ以上のヌクレオチド間結合が３’から３’、５’から５’または２’から２’への結合である逆極性を有するものを含む。逆の極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間結合に単一の３’から３’結合、すなわち、無塩基であり得る（核酸塩基が欠落している、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）単一の転化ヌクレオシド残基、を含む。様々な塩、混合塩および遊離形態も含まれる。リン含有結合の作製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第
【０２６８】
【化７】
2010521425.tif 000009
が挙げられるが、これらに限定されず、これらのそれぞれが参照により本明細書に取り入れられている。
【０２６９】
それらの中にリン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキル混合型ヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部分がヌクレオシドの糖部分から成る）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混成Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分パーツを有する他のものが挙げられる。そのようなオリゴヌクレオシドの作製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第
【０２７０】
【化８】
2010521425.tif 000010
が挙げられるが、これらに限定されず、これらのそれぞれが参照により本明細書に取り入れられている。
【０２７１】
他の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間結合、すなわち骨格、の両方が新たな基で置換される。これらの塩基単位は、適切な核酸ターゲット化合物でのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物（優れたハイブリダイゼーション特性を有することが証明されたオリゴヌクレオチド模擬体）は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖−骨格が、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置換される。これらの核酸塩基は保持され、その骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の作製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されず、これらのそれぞれが参照により本明細書に取り入れられている。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００において見つけることができる。
【０２７２】
好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドには、ホスホロチオエート骨格またはヘテロ原子骨格、および特に、上で参照した米国特許第５，４８９，６７７号に記載されている−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［この場合、天然ホスホジエステル骨格は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２と表される］、ならびに上で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格が組み込まれている。上で参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドも好ましい。
【０２７３】
修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上の置換糖部分も含有する場合がある。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位置に次のもののうちの１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキルもしくはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル（ａｌｋｅｙｎｙｌ）もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニルもしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（この場合のアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１からＣ１０アルキルまたはＣ２からＣ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る）。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（この場合、ｎおよびｍは、１から約１０である）が特に好ましい。他の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’位置に次のもののうちの１つを含む：Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、挿入因子、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、これは、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎら，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。さらに好ましい修飾としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（本明細書において下の実施例に記載するように、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）が挙げられる。
【０２７４】
さらに好ましい修飾としては、２’−ヒドロキシル基が、糖環の３’または４’炭素原子に結合し、それによって二環式糖部分を形成している、ロックト核酸（ＬＮＡ）が挙げられる。前記結合は、好ましくは、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、この場合のｎは、１または２である。ＬＮＡおよびその作製は、ＷＯ  ９８／３９３５２およびＷＯ  ９９／１４２２６に記載されている。
【０２７５】
他の好ましい修飾としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。２’−修飾は、アラビノ（上）位置である場合もあり、リボ（下）位置である場合もある。好ましい２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合オリゴヌクレオチド内の糖の３’位置および５’末端ヌクレオチドの５’位置でも、類似の修飾を行うことができる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに糖模擬体、例えばシクロブチル部分を有する場合もある。そのような修飾糖構造の作製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第
【０２７６】
【化９】
2010521425.tif 000011
【０２７７】
【化１０】
2010521425.tif 000012
が挙げられるが、これらに限定されず、これらのそれぞれはそれら全体が参照により本明細書に取り入れられている。
【０２７８】
オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）修飾または置換も含む場合がある。本明細書において用いる場合、「非修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基としては、他の合成および天然核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、ピリミジン塩基の５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３または−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ）ウラシルおよびシトシンおよび他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミジン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。さらなる修飾核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンズオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンズオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリミドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’；４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンで置換されているものも挙げられる。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈら，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されているものが挙げられる。これらのうちの一定の核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらとしては、���−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）が挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが証明されており（Ｓａｎｇｈｖｉら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、さらにいっそう特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と併さると、好ましい塩基置換である。修飾核酸塩基の作製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第
【０２７９】
【化１１】
2010521425.tif 000013
が挙げられるが、これらに限定されず、これらのそれぞれが参照により本明細書に取り入れられている。
【０２８０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのもう１つの修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを向上させる１つ以上の部分またはコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に連結させることを含む。本発明の化合物は、第一または第二ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含む場合がある。本発明のコンジュゲート基としては、挿入因子、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を向上させる基、およびオリゴマーの薬物動態特性を向上させる基が挙げられる。典型的なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、カチオン脂質、リン脂質、カチオン性リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素が挙げられる。本発明に関連して、薬力学的特性を向上させる基としては、オリゴマー取り込みを増進する基、オリゴマーの耐分解性を強化する基、またはＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。本発明に関連して、薬物動態特性を向上させる基としては、オリゴマー取り込み、分布、代謝または排泄を増進する基が挙げられる。コンジュゲート部分としては、脂質部分、例えば、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、または��クタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられるが、それらに限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドを、活性薬物、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、ホリニン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ薬、抗糖尿病薬、抗菌薬または抗生物質にコンジュゲートさせることもできる。オリゴヌクレオチド−薬物コンジュゲートおよびそれらの作製は、米国特許出願番号０９／３３４，１３０（１９９９年６月１５日出願）ならびに米国特許第
【０２８１】
【化１２】
2010521425.tif 000014
に記載されており、これらのそれぞれが参照により本明細書に取り入れられている。
【０２８２】
所与の化合物におけるすべての位置が均等に修飾される必要はなく、実際、上述の修飾の１つより多くが、たった１つの化合物に組み込みこまれる場合があり、またはオリゴヌクレオチド内のたった１つのヌクレオシドに組み込まれる場合さえある。
【０２８３】
本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。本発明に関連して、「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、２つ以上の化学的に異なる領域を含有し、そのそれぞれが少なくとも１つの単量体単位、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチド、で構成されているアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。典型的に、これらのオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取込みの増大、またはターゲット核酸に対する結合親和性の増大をそのオリゴヌクレオチドにもたらすようにそのオリゴヌクレオチドが修飾される、少なくとも１つの領域を含有する。このオリゴヌクレオチドの追加の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂させることができる酵素のための基質としての役割を果たすことができる。例として、ＲＮａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を開裂させる細胞エンドヌクレアーゼである。従って、ＲＮａｓｅ  Ｈの活性化は、ＲＮＡターゲットの開裂を生じさせることとなり、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率が大きく増される。従って、キメラオリゴヌクレオチドを使用すると、同じターゲット領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して短いオリゴヌクレオチドで、同等の結果を、多くの場合、得ることができる。本発明のキメラアンチセンス化合物を、上で説明したようなオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド模擬体の２つ以上の複合構造として形成することができる。好ましいキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドには、ヌクレアーゼ耐性を付与するために３’末端に少なくとも１つの２’修飾糖（好ましくは、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３）、およびＲＮａｓｅ  Ｈ活性を付与するために少なくとも４つの隣接する２’−Ｈ糖を有する領域が組み込まれている。そのような化合物は、当該技術分野においてハイブリッドまたはギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）とも呼ばれている。好ましいギャップマーは、少なくとも４つの隣接する２’−Ｈ糖を有する少なくとも１つの領域によって隔てられた３’末端および５’末端に２’修飾糖（好ましくは、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３）の領域を有し、好ましくは、ホスホロチオエート骨格結合が組み込まれている。そのようなハイブリッド構造の作製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第５，０１３，８３０号；同第５，１４９，７９７号；同第５，２２０，００７号；同第５，２５６，７７５号；同第５，３６６，８７８号；同第５，４０３，７１１号；同第５，４９１，１３３号；同第５，５６５，３５０号；同第５，６２３，０６５号；同第５，６５２，３５５号；同第５，６５２，３５６号；および同第５，７００，９２２号が挙げられるが、これらに限定されず、これらのそれぞれはそれら全体が参照により本明細書に取り入れられている。
【０２８４】
本発明に従って使用するアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術によって都合よく且つ通例的に作ることができる。そのような合成のための装置は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州、フォスター・シティー）をはじめとする幾つかの供給業者によって販売されている。当該技術分野において公知であるそのような合成の任意の他の手段を追加してまたは代替として利用することができる。ホスホロチオエートなどのオリゴヌクレオチドおよびアルキル化誘導体を作製するために同様の技術を用いることは周知である。取り込み、分布または吸収を助長するために、例えば、リポソーム、受容体をターゲットにする分子、経口、直腸内、局所または他の調合物のような、他の分子、分子構造または化合物の混合物と本発明の化合物を混合する、カプセル封入する、コンジュゲートさせるまたは別様に会合させることもできる。そのような取り込み、分布または吸収助長調合物の作製の教示する代表的な米国特許としては、米国特許第
【０２８５】
【化１３】
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が挙げられるが、これらに限定されず、これらのそれぞれが参照により本明細書に取り入れられている。
【０２８６】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例としては、ＷＯ  ９０／１００４８に記載されているものなどの有機部分に共有結合で連結されているオリゴヌクレオチド、およびポリ−（Ｌ−リシン）などのターゲット核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増大させる他の部分に共有結合で連結されているオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに尚、挿入剤、例えばエリプチシン、およびアルキル化剤または金属錯体をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに連結させて、ターゲットヌクレオチド配列に対するそのアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾することができる。
【０２８７】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションをはじめとする任意の遺伝子移入法によって、またはエプスタイン−バーウイルスなどの遺伝子移入ベクターを使用することによって、ターゲット核酸配列を含有する細胞に導入することができる。好ましい手順では、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを適するレトロウイルスベクターに挿入する。ターゲット核酸を含有する細胞を組換えレトロウイルスベクターとインビボまたはエクスビボのいずれかで接触させる。適するレトロウイルスベクターとしては、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶから得られるレトロウイルス）から得られるもの、またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと呼ばれる二重コピーベクター（ＷＯ  ９０／１３５４１参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８８】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ  ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子とのコンジュゲートを形成することによって、ターゲットヌクレオチド配列を含有する細胞に導入することもできる。適するリガンド結合分子としては、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子のコンジュゲーションは、リガンド結合分子がその対応する分子または受容体に結合する能力に実質的に干渉せず、また、細胞へのセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその対応するコンジュゲートバージョンの侵入を遮断しない。
【０２８９】
あるいは、ＷＯ  ９０／１０４４８に記載されているように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により、ターゲット核酸配列を含有する細胞にセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することができる。好ましくは、前記センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、内因性リパーゼによって細胞内で解離される。
【０２９０】
アンチセンスまたはセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、一般に、長さが少なくとも約５ヌクレオチド、あるいは長さが少なくとも約
【０２９１】
【化１４】
2010521425.tif 000016
ヌクレオチドであり、この文脈での用語「約」は、参照するヌクレオチド配列長プラスまたはマイナスその参照長の１０％を意味する。
【０２９２】
プローブをＰＣＲ法に利用して、近縁ＲＡ１ｃポリペプチドコーディング配列の同定のための配列プールを生成することもできる。
【０２９３】
ＲＡ１ｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を使用して、そのＲＡ１ｃポリペプチドをコードする遺伝子をマッピングするための、および、遺伝障害を有する固体の遺伝分析のための、ハイブリダイゼーションプローブを構築することもできる。本明細書に提供するヌクレオチド配列は、公知の技術、例えば、インサイチューハイブリダイゼーション、既知染色体マーカーに対する結合分析、およびライブラリでのハイブリダイゼーションスクリーニングを用いて、染色体および染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【０２９４】
前記ＲＡ１ｃポリペプチドをアッセイにおいて使用して、そのＲＡ１ｃポリペプチドとの結合性相互作用に関与する他のタンパク質または分子を同定することができる。そのような方法により、受容体／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。そのような結合性相互作用に関与するタンパク質を使用して、その結合性相互作用のペプチドまたは小分子阻害剤についてスクリーニングすることもできる。スクリーニングアッセイは、天然ＲＡ１ｃポリペプチドまたはＲＡ１ｃポリペプチドについての受容体の生物活性を模倣するリード化合物を見つけるように設計することができる。そのようなスクリーニングアッセイは、化学ライブラリのハイスループットスクリーニングに適用できるアッセイを含むこととなり、それがそれらを小分子薬候補の同定に特に適するものにするだろう。考えられる小分子としては、合成有機または無機化合物が挙げられる。タンパク質−タンパク質アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイおよび細胞ベースのアッセイをはじめとする、当該技術分野において十分に特性付けされている様々な形式で、前記アッセイを行うことができる。
【０２９５】
ＲＡ１ｃポリペプチドまたはその修飾形態をコードする核酸を使用して、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物を産生することもでき、そしてまたこれらは治療に有用な試薬の開発およびスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）は、出生前、例えば胚期にその動物またはその動物の祖先に導入されたトランスジーンを含有する細胞を有する動物である。トランスジーンは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡである。１つの実施形態では、ＲＡ１ｃポリペプチドをコードするｃＤＮＡを使用して、ＲＡ１ｃポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを確立された技術に従ってクローニングし、そのゲノム配列を使用して、ＲＡ１ｃポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する細胞を含有するトランスジェニック動物を産生することができる。トランスジェニック動物、特に、マウスまたはラットなどの動物を産生するための方法は、当該技術分野では通例的になっており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号に記載されている。典型的に、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーでのＲＡ１ｃポリペプチドトランスジーン取込みのターゲットにされるであろう。胚期にその動物の生殖細胞系列に導入されたＲＡ１ｃポリペプチドをコードするトランスジーンのコピーを含むトランスジェニック動物を使用して、ＲＡ１ｃポリペプチドをコードするＤＮＡの発現増加の効果を検査することができる。そのような動物は、例えばその過発現に関連した病的状態からの防御をもたらすと考えられる試薬についてのテスター動物として使用することができる。本発明のこの側面に従って、動物をその試薬で治療し、そのトランスジーンを有する未治療動物と比較してその病的状態の発生率低下は、その病的状態に対して可能性のある治療的介入の指標になるだろう。
【０２９６】
あるいは、ＲＡ１ｃポリペプチドの非ヒト相同体を使用して、ＲＡ１ｃポリペプチドをコードする内因性遺伝子と動物の胚性幹細胞に導入されたＲＡ１ｃポリペプチドをコードする改変ゲノムＤＮＡの間の相同組換えの結果として、ＲＡ１ｃポリペプチドをコードする欠失または改変遺伝子を有するＲＡ１ｃ遺伝子「ノックアウト」動物を構築することができる。例えば、確立された技術に従って、ＲＡ１ｃポリペプチドをコードするｃＤＮＡを使用して、ＲＡ１ｃポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡをクローニングすることができる。ＲＡ１ｃポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部分を欠失させることができ、または別の遺伝子、例えば、組み込みをモニターするために使用することができる選択可能マーカーをコードする遺伝子で置換することができる。典型的に、数キロ塩基の未改変隣接ＤＮＡ（５’末端と３’末端の両方で）をベクターに含める［相同組換えベクターの説明については、例えば、Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，５１：５０３（１９８７）を参照のこと］。そのベクターを（例えば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞に導入し、導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡで相同組換えされた細胞を選択する［例えば、Ｌｉら，Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）参照］。その後、それらの選択細胞を動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に注射して凝集キメラを形成する［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５２参照］。その後、キメラ胚を適する偽妊娠雌育成動物に移植し、その胚に「ノックアウト」動物を作らせる。それらの生殖細胞に相同組換えＤＮＡを有する子孫を標準的な技術によって同定し、それらを使用して、その動物のすべての細胞が相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させる。ノックアウト動物を、例えば、一定の病的状態を防ぐそれらの能力について、およびＲＡ１ｃポリペプチドの不在に起因する病的状態の発現について特性付けすることができる。
【０２９７】
ＲＡ１ｃポリペプチドをコードする核酸を遺伝子療法で使用することもできる。遺伝子療法用途では、例えば欠失遺伝子の置換のために、遺伝子を細胞に導入して治療に有効な遺伝産物のインビボ合成を達成する。「遺伝子療法」は、永続効果が単回治療によって達成される従来の遺伝子療法と、治療に有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの１回または反復投与を含む遺伝子療法薬の投与の両方を含む。一定の遺伝子のインビボでの発現を阻止するための治療薬としてアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡを使用することができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に移入することができ、そこでそれらが細胞膜によるそれらの制限された取込みに起因するそれらの低い細胞内濃度にもかかわらず阻害剤として作用することは、既に証明されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４１４３−４１４６［１９８６］）。それらのオリゴヌクレオチドを例えば、負の電荷を有するそれらのホスホジエステルの非荷電基による置換によって、それらの取込みを増進するように修飾することができる。
【０２９８】
核酸を生細胞に導入するために利用できる様々な技術がある。それらの技術は、核酸を培養細胞にインビトロで移入するのか、所期の宿主の細胞にインビボで移入するのかによって変わる。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の移入に適する技術としては、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用が挙げられる。目下好ましいインビボ遺伝子移入技術としては、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでのトランスフェクションおよびコートタンパク質−リポソーム媒介トランスフェクション（Ｄｚａｕら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１，２０５−２１０［１９９３］）が挙げられる。状況によっては、ターゲット細部をターゲットにする薬剤、例えば、細胞表面膜タンパク質またはターゲット細胞に特異的な抗体、ターゲット細胞上の受容体のリガンドなどを核酸源に供給することが望ましい。リポソームを利用する場合、エンドサイトーシスに関連した細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞のほうに向くカプシドタンパク質またはそれらのフラグメント、循環中に内在化されるタンパク質に対する抗体、細胞内局在をターゲットにし、細胞内半減期を増すタンパク質を、ターゲッティングのためにまたは取込みを助長するために使用することができる。受容体媒介エンドサイトーシス技術は、例えば、Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；およびＷａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３４１０−３４１４（１９９０）によって記載されている。遺伝子マーキングおよび遺伝子療法プロトコルの総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，８０８−８１３（１９９２）を参照のこと。
【０２９９】
本明細書に記載するＲＡ１ｃポリペプチドまたはそれらのフラグメントをコードする核酸分子は、染色体同定に有用である。これに関しては、実際の配列データに基づく染色体マーキング試薬は比較的少数しか現在利用できないので、新たな染色体マーカーの同定が必要とされ続けている。本発明の各ＲＡ１ｃ核酸分子は、染色体マーカーとして使用することができる。
【０３００】
ＲＡ１ｃ発現または活性の減少または阻止に有用な他の核酸化合物はリボザイムである。リボザイムは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒することができる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的ターゲットＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、その後のエンドヌクレアーゼでの分解による開裂によって作用する。可能性のあるＲＮＡターゲット内の特異的リボザイム開裂部位を公知の技術によって同定することができる。さらなる詳細については、例えば、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：４６９−４７１（１９９４）、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日発行）を参照のこと。
【０３０１】
Ｋ．組成物および医薬調合物
本発明は、ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物と担体とを含む組成物も提供する。さらなる実施形態において、前記組成物は、ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃ発現を調節する化合物を他の治療薬、例えば、化学療法薬などの細胞傷害または成長阻害剤との組み合わせで含む場合がある。本発明は、ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物と担体とを含む調合物も提供する。１つの実施形態において、前記調合物は、少なくとも１つの医薬的に許容される担体、賦形剤および／または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））を含む、凍結乾燥調合物または水溶液の形態の治療用調合物である。許容される担体、賦形剤または安定剤は、利用される投薬量および濃度で受容者に対して非毒性であり、ならびに緩衝液、例えばアセテート、Ｔｒｉｓ、ホスフェート、シトレートおよび他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンをはじめとする抗酸化物質；保存薬（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン；グルコース、マンノースもしくはデキストリンをはじめとする、単糖類、二糖類および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；等張化剤、例えば、トレハロースおよび塩化ナトリウム；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；界面活性剤、例えば、ポリソルベート；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。前記抗体は、好ましくは、抗体を５〜２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍＬの間の濃度で含む。
【０３０２】
本明細書における調合物は、治療する特定の対応症のために必要な場合には１つより多くの活性化合物、好ましくは、互いに有害に作用しない相補的活性を有するものも含有し得る。例えば、ＲＡ１ｃアンタゴニストもしくはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物、またはそうした化合物のうちの１つ以上の組み合わせに加えて、追加の抗体、例えば、ＲＡ１ｃポリペプチド上の異なるエピトープを結合する第二の抗ＲＡ１ｃ抗体、または特定の癌の成長に影響を及ぼす成長因子などの一部の他のターゲットに対する抗体を１つの調合物中に含むことが望ましい場合がある。あるいは、または加えて、前記組成物は、化学療法薬、細胞傷害剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン薬、または心臓保護物質（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）をさらに含む場合がある。そのような分子は、好適には、所期の目的に有効な量での組み合わせで存在する。
【０３０３】
例えば、コアセルベーションによってまたは界面重合によって作製したマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）内にまたはマクロエマルジョン内に活性薬物を捕捉することもできる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０３０４】
持効性製剤を作製することができる。持効性製剤の適する例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、該マトリックスは、成形品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持効性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから成る注射用マイクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロ酪酸が挙げられる。
【０３０５】
インビボ投与に使用する調合物は、無菌でなければならない。これは、標準的な技術を用いて、例えば滅菌濾過膜による濾過によって、容易に遂行される。
【０３０６】
Ｌ．治療用途
ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物は、細胞ストレス反応、特に、前立腺癌などのＲＡ１ｃ発現性癌における細胞ストレス反応の改善に有用である。癌細胞における細胞ストレス反応の改善は、化学療法薬への細胞の感受性を増大させることにより癌の化学療法治療を向上させる。
【０３０７】
ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物は、特に、ＲＡ１ｃ発現を増加させる化学療法薬と併用したとき、前立腺癌などのＲＡ１ｃ発現性癌を治療する治療法に有用である。ＲＡ１ｃの発現を増加させる化学療法薬の例としては、細胞ストレス反応を誘導する薬剤が挙げられる。ＲＡ１ｃの発現を増加させる化学療法薬の具体的な例としては、ｍＴＯＲまたはＡｋｔ１／２阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、前記併用療法は、ＲＡ１ｃポリペプチドに特異的に結合する化合物、例えば抗ＲＡ１ｃ抗体またはそのフラグメント、ＲＡ１ｃ結合オリゴペプチド、ＲＡ１ｃに特異的に結合する無機または有機小分子、および他のＲＡ１ｃアンタゴニスト、例えばアプタマーを含む。１つの特定の実施形態において、前記化合物は、抗ＲＡ１ｃ抗体である。好ましくは、前記抗ＲＡ１ｃ抗体を細胞傷害剤にコンジュゲートさせる。
【０３０８】
もう１つの実施形態において、前記併用療法は、ＲＡ１ｃの発現または活性を減少させるまたは阻止する化合物を含む。
【０３０９】
ＲＡ１ｃ発現の増加は、抗ＲＡ１ｃ化合物と相互作用するために利用できるＲＡ１ｃの量の増加をもたらす。化学療法薬とＲＡ１ｃ発現または活性を減少させるまたは阻止する化合物との併用治療は相乗効果を生じさせ、結果として癌治療を改善する。
【０３１０】
治療的適用のために、ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物を単独で使用することができ、または例えば、ホルモン、アンチアンジオゲン（ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｓ）もしくは放射性標識化合物との、または外科手術、凍結療法もしくは放射線療法との併用療法で使用することができる。
【０３１１】
ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物は、他の形態の従来の療法と共に（従来の療法と逐次的に、従来の療法の前にまたは後に、のいずれか）施与することができる。化学療法薬、例えば、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（パリクタキセル）、エストラムスチンおよびミトキサントロンは、特に危険度良好（ｇｏｏｄ  ｒｉｓｋ）患者において、癌の治療に使用される。治療的処置の場合、患者にＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物を前記化学療法薬の１つ以上での治療と共に施与することができる。特に、ｍＴＯＲまたはＡｋｔ１／２阻害剤との併用療法が考えられる。ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物は、前記化学療法薬の治療有効用量と共に投与されることとなる。Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）には、様々な癌の治療に使用されたこれらの薬剤の投薬量が開示されている。治療に有効であるこれらの上記化学療法薬の投薬レジメンおよび投薬量は、治療する特定の癌、その疾病の程度、および当該技術分野における技能を有する医師によく知られている他の因子に依存することとなり、医師はそれを決定することができる。
【０３１２】
ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物は、公知の方法に従って、例えば、静脈内投与、例えばボーラスとして、またはある期間にわたって持続注入により、または筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、クモ膜下、経口、局所もしくは吸入経路により、人間の患者に投与される。抗体、オリゴペプチドまたは有機小分子の静脈内または皮下投与が好ましい。
【０３１３】
他の治療レジメンを、ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物の投与と併用することができる。この併用投与は、別個の調合物または単一医薬調合物を使用する同時投与、およびいずれかの順番での逐次投与（この場合、好ましくは、両方（またはすべての）活性成分がそれらの生物活性を同時に発揮する期間がある）を含む。好ましくは、そのような併用療法は、相乗的治療効果を生じさせる結果となる。
【０３１４】
ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物の投与とその特定の癌に関連した別の腫瘍抗原に対する抗体の投与を併用することが望ましい場合もある。
【０３１５】
ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物は、抗ホルモン化合物、例えば、抗エストロゲン化合物、例えばタモキシフェン；抗プロゲステロン、例えばオナプリストン（ＥＰ  ６１６  ８１２参照）；または抗アンドロゲン、例えばフルタミドと、そのような化合物について知られている投薬量で併用することができる。
【０３１６】
時として、心臓保護薬（その治療法に関連した心筋機能不全を予防するもしくは減少させるため）または１つ以上のサイトカインを患者に同時投与することも有益であり得る。上の治療レジメンに加えて、抗体、オリゴペプチドまたは有機／無機小分子療法の前に、該療法と同時にまたは該療法の後に、患者を癌細胞の外科的除去または放射線療法に付す場合もある。上の同時投与剤のうちのいずれについての適する投薬量も、現在用いられているものであり、その薬剤とＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物との総合作用（相乗作用）のためにそれを減少させることができる。
【０３１７】
疾病の予防または治療のための投薬量および投与方式は、医師が公知の基準に従って選択することとなる。ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物の適切な投薬量は、治療すべき疾病のタイプ（上で定義したとおり）、その疾病の重症度および経過、ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物を予防のために投与するのか、治療のために投与するのか、以前の治療、その患者の臨床履歴およびＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物に対する反応、ならびに担当医の自由裁量に依存するであろう。前記化合物は、１回でまたは一連の治療にわたって適切に投与される。好ましくは、ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物は、静脈内注入によってまたは皮下注射によって投与される。
【０３１８】
特定の実施形態において、抗ＲＡ１ｃ抗体の約１μｇ／（体重ｋｇ）から約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ／用量）が、例えば、１回以上の別々の投与によろうと、または持続注入によろうと、患者への投与の初期候補投薬量であり得る。ある投薬レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量、その後、約２ｍｇ／ｋｇの週１回の維持用量の抗ＲＡ１ｃ抗体の投与を含む。しかし、他の投薬レジメンが有用である場合もある。典型的な日用量は、上で述べた因子に依存して、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上にわたるであろう。数日またはそれより長きにわたる反復投与については、その条件に依存して疾病症状の所望の抑制が発生するまで治療を持続させる。この療法の進行は、従来の方法およびアッセイによって、ならびに医師または他の当業者に公知の基準に基づいて、容易にモニターすることができる。
【０３１９】
患者への抗体タンパク質または抗体フラグメントの投与のほかに、本出願は、遺伝子療法による抗体の投与を考えている。抗体をコードする核酸のそのような投与は、「抗体の治療有効量の投与」に包含される。例えば、細胞内抗体を産生させるための遺伝子療法の使用に関する１９９６年３月１４日発行のＷＯ  ９６／０７３２１を参照のこと。
【０３２０】
本発明の抗体の結合ターゲットの位置をその抗体の作製および投与の際に考慮に入れることができる。結合するダーゲットが細胞内分子であるとき（すなわち、ＲＡ１ｃ発現を調節する本発明の化合物について）、本発明の一定の実施形態は、結合するターゲットが位置する細胞に導入される抗体またはその抗原結合フラグメントに備える。１つの実施形態では、本発明の抗体をイントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）として細胞内発現させることができる。本明細書において用いる場合、用語「イントラボディー」は、Ｍａｒａｓｃｏ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１１−１５（１９９７）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４：１６３−１７０（２００４）；米国特許第６，００４，９４０号および同第６，３２９，１７３号；米国特許出願公開第２００３／０１０４４０２号、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２００３／０７７９４５に記載されているように、細胞内発現し、ターゲット分子に選択的に結合することができる、抗体またはその抗原結合部分を指す。イントラボディーの細胞内発現は、所望の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸（その抗体または抗原結合フラグメントをコードする遺伝子に通常随伴する野生型リーダー配列および分泌シグナルを欠くもの）をターゲット細胞に導入することによって果たされる。マイクロインジェクション、バリスティック・インジェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム、ならびに対象となる核酸を担持するレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびワクチンベクターでのトランスフェクションをはじめとする（しかし、これらに限定されない）、細胞に核酸を導入する任意の標準的な方法を用いることができる。シグナル伝達経路成分ポリペプチドに細胞内結合することができ、ＲＡ１ｃの発現または活性に直接または間接的に関与する１つ以上の細胞経路を調節することができる１つ以上のイントラボティーを発現するように、ターゲット細胞に、本発明の化合物のすべてまたは一部分をコードする１つ以上の核酸を送達することができる。
【０３２１】
患者の細胞に核酸（場合によってはベクターに含有されているもの）を入れるもう１つのアプローチは、エクスビボである。エクスビボ処理のために、患者の細胞を除去し、核酸をこれらの単離した細胞に導入し、修飾された細胞を患者に直接投与するか、例えば患者に移植する多孔質膜の中に封入して投与する（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および同第５，２８３，１８７号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用できる様々な技術がある。それらの技術は、その核酸をインビトロで培養細胞に移入するのか、または所期の宿主の細胞にインビボで移入するのかによって異なる。哺乳動物細胞への核酸のインビトロでの移入に適する技術としては、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用が挙げられる。遺伝子のエクスビボ送達に一般に用いられるベクターは、レトロウイルスベクターである。
【０３２２】
もう１つの実施形態では、抗体の内在化を提供する。抗体は、細胞内への抗体の送達を増進する一定の特質を有することができ、またはそのような特質を有するように修飾することができる。これを達成するための技術は、当該技術分野において公知である。例えば、抗体のカチオン化が細胞へのその取込みを助長することは公知である（例えば、米国特許第６，７０３，０１９号参照）。リポフェクションまたはリポソームを使用して、抗体を細胞内に送達することもできる。抗体フラグメントを使用する場合、ターゲットタンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性フラグメントが一般に有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づき、ターゲットタンパク質配列を結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは、化学合成することができ、または組換えＤＮＡ技術によって生産することができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）参照。
【０３２３】
ターゲット細胞への抗体の侵入を当該技術分野において公知の方法によって増進することができる。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔまたはアンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）ホメオドメインタンパク質に由来するものなどの一定の配列は、細胞膜を横断する異種タンパク質の効率的取込みを指図することができる。例えば、Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９），９６：４３２５−４３２９参照。
【０３２４】
Ｍ．診断および非治療的使用
ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物は、様々な非治療用途を有する。例えば、ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物は、（例えば、放射線撮像における）ＲＡ１ｃポリペプチド発現性の癌の病期決定に有用であり得る。ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物を組織タイプ分類のために診断的に使用することができ、この場合、ＲＡ１ｃポリペプチドを１つの組織において別の組織と比較して差別的に発現させることができ、好ましくは、罹病組織において同じ組織タイプの正常組織と比較して差別的に発現させることができる。これらの化合物は、細胞からのＲＡ１ｃポリペプチドの精製または免疫沈降のためにも、インビトロでの、例えばＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットでの、ＲＡ１ｃポリペプチドの検出および定量のためにも、他の細胞の精製における一段階としてＲＡ１ｃポリペプチド発現性細胞を死滅させ、混合細胞の集団から除去するためにも有用である。ＲＡ１ｃ核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析およびウエスタン分析のためのプローブを作製するために使用することができるだろう。
【０３２５】
癌細部におけるＲＡ１ｃポリペプチド発現を判定するために、様々な検出アッセイを利用することができる。１つの実施形態では、免疫組織化学（ＩＨＣ）によってＲＡ１ｃポリペプチド過発現を分析することができる。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイに付し、次のようなＲＡ１ｃポリペプチド染色強度基準を与えることができる：
スコア０  −  染色が観察されないまたは腫瘍細胞の１０％未満に膜染色が観察される。
【０３２６】
スコア１＋  −  かすかな／かろうじて認知できる膜染色が腫瘍細胞の１０％より多くで検出される。これらの細胞は、それらの膜の一部分にしか染色されない。
【０３２７】
スコア２＋  −  弱から中等度の完全膜染色が腫瘍細胞の１０％より多くで観察される。
【０３２８】
スコア３＋  −  中等度から強度の完全膜染色が腫瘍細胞の１０％より多くで観察される。
【０３２９】
ＲＡ１ｃポリペプチド発現について０または１＋のスコアを有する腫瘍細胞は、ＲＡ１ｃポリペプチドを過発現していないと特性付けすることができ、これに対して２＋または３＋のスコアを有する腫瘍は、ＲＡ１ｃポリペプチドを過発現すると特性付けすることができる。
【０３３０】
あるいは、または加えて、ＩＮＦＯＲＭ（登録商標）（アリゾナ州のＶｅｎｔａｎａによって販売されている）またはＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）（イリノイ州のＶｙｓｉｓ）などのＦＩＳＨアッセイをホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍組織で行って、腫瘍におけるＲＡ１ｃポリペプチド過発現の程度（もしあれば）を判定することができる。
【０３３１】
ＲＡ１ｃポリペプチドの過発現または増幅は、インビトロ検出アッセイを用いて、例えば、検出すべき分子に結合する分子（例えば、抗体、抗体フラグメント、抗体コンジュゲート、オリゴペプチドまたは有機小分子、またはアプタマー）を投与し、検出可能な標識（例えば、放射性同位元素または蛍光標識）で標識し、その標識の局在について患者を外部からスキャンすることによって、評価することができる。
【０３３２】
本発明は、細胞が細胞ストレス反応を受けているかどうかアッセイする方法も提供する。これらの方法は、特定の化学療法治療が、癌細胞において細胞ストレス反応を誘導しているかどうかの判定に特に使用することができる。細胞ストレス反応の誘導によって、細胞に生存有利性をもたらし、化学療法薬の作用に対して細胞をあまり感受性でなくすこと、または耐性にすることができる。ある化学療法薬がターゲット癌細胞において細胞ストレス反応を誘導すると判明した場合、例えばＲＡ１ｃの発現または活性を減少させるまたは阻止する化合物で、その化学療法薬に対するその細胞の感受性を増大させるようにその細胞ストレス反応を改善することが望ましい。
【０３３３】
細胞ストレス反応の誘導は、化学療法薬で処理した細胞におけるＲＡ１ｃの発現レベルをモニターすることによって判定される。１つの実施形態において、その方法は、癌細胞と化学療法薬を接触させること、およびその癌細胞におけるＲＡ１ｃの発現レベルを判定することを含む。この試験におけるＲＡ１ｃの発現レベルを、その化学療法薬と接触させる前のその試験細胞におけるＲＡ１ｃの発現レベルと比較し、その治療薬と接触させる前のその試験における発現レベルと比較してその治療薬と接触させた後のその試験細胞における発現レベルの増加があれば、その化学療法薬が細胞ストレス反応を誘導することを示す。あるいは、試験細胞におけるＲＡ１ｃの発現レベルを、その試験細胞と同じタイプのものである対照におけるＲＡ１ｃの発現レベルと比較することができる。特定の実施形態において、ＲＡ１ｃ発現の増加は、約５０倍より大きく、あるいは約２から５０倍、あるいは約５から５０倍、あるいは約１０から５０倍大きい。当該技術分野において公知であるように、試験および／または対照細胞における遺伝子の発現レベルを較正する方法としてハウスキーピング遺伝子をモニターするのが有利である。このアッセイにおいて使用する癌細胞は、好ましくは、前立腺癌細胞、例えばＬＮＣａＰ細胞である。
【０３３４】
前記アッセイによって、ＲＡ１ｃ遺伝子の発現レベルまたはＲＡ１ｃポリペプチドの発現レベルをモニターすることができる。
【０３３５】
これらの方法においてアッセイする化学療法薬は、細胞ストレス反応を生じると推測される任意の薬剤である。１つの実施形態において、前記化学療法薬は、ｍＴｏｒ阻害剤である。もう１つの実施形態において、前記化学療法薬は、Ａｋｔ１／２阻害剤である。
【０３３６】
本発明は、ＲＡ１ｃポリペプチドの効果を妨げるもの（アンタゴニスト）を同定するための化合物のスクリーニング方法をさらに包含する。アンタゴニスト薬候補についてのスクリーニングアッセイは、本明細書において確認される遺伝子によってコードされたＲＡ１ｃポリペプチドと結合するもしくは複合体を形成する化合物、またはそれらのコードされたポリペプチドと他の細胞タンパク質の相互作用に別様に干渉する化合物（例えば、細胞からのＲＡ１ｃポリペプチドの発現を阻害するものを含む）を同定するように設計される。そのようなスクリーニングアッセイは、化学物質ライブラリのハイスループットスクリーニングに適用できるアッセイを含むこととなり、それがそれらを小分子薬候補の同定に特に適するものにするだろう。
【０３３７】
前記アッセイは、当該技術分野において十分に特性付けされている、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイおよび細胞ベースのアッセイをはじめとする様々な形式で行うことができる。
【０３３８】
アンタゴニストについてのすべてのアッセイは、薬物候補と本明細書において確認される核酸によってコードされたＲＡ１ｃポリペプチドとを、これら２つの化合物を相互作用させるために十分な条件下で、十分な時間、接触させることを要する点で共通している。
【０３３９】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体を単離するまたは反応混合物中で検出することができる。特定の実施形態では、ＲＡ１ｃポリペプチドまたはその薬物候補を固相上に、例えばマイクロタイタープレート上に共有結合性または非共有結合性連結によって固定させる。非共有結合性連結は、一般に、その固体表面をＲＡ１ｃポリペプチドの溶液で被覆し、乾燥させることによって遂行される。あるいは、固定すべきＲＡ１ｃポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を使用して、それを固体表面に固着させることができる。前記アッセイは、固定されていない成分（これを検出可能な標識によって標識してもよい）を固定された成分、例えば、固着成分を含有する被覆表面、に付加させることによって行われる。反応が完了したら、反応していない成分を、例えば洗浄によって除去し、固体表面に固着された複合体を検出する。当初固定されていない成分が検出可能な標識を有する場合、その表面に固定された標識の検出は、複合体形成が起こったことを示す。当初固定されていない成分が標識を有しない場合、複合体形成は、例えば、固定された複合体に特異的に結合する標識抗体を使用することによって検出することができる。
【０３４０】
候補化合物が、ＲＡ１ｃポリペプチドと相互作用するが、ＲＡ１ｃポリペプチドに結合しない場合、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によってそのポリペプチドとの相互作用をアッセイすることができる。そのようなアッセイは、伝統的なアプローチ、例えば、架橋、共免疫沈降法、および勾配またはクロマトグラフカラムによる共精製などを含む。加えて、タンパク質−タンパク質相互作用は、Ｃｈｅｖｒａｙ  ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５７８９−５７９３（１９９１）によって開示されているようにＦｉｅｌｄｓおよび共同研究者（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３４０：２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８−９５８２（１９９１））によって記載されている酵母ベースの遺伝系を使用することによってモニターすることができる。酵母ＧＡＬ４などの多くの転写活性化因子は、２つの物理的に異なるモジュラードメイン（１つはＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他の１つは転写活性化ドメインとして機能する）から成る。上述の出版物に記載されている酵母発現系（一般に、「ツー・ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性をうまく利用し、２つのハイブリッドタンパク質（そのうちの１つは、ターゲットタンパク質をＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、もう１つは、候補活性化タンパク質を活性化ドメインに融合する）を用いる。ＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下でのＧＡＬ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現は、タンパク質−タンパク質相互作用によるＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含有するコロニーを、β−ガラクトシダーゼのための色素産生基質で検出する。ツー・ハイブリッド技術を用いる２つの特定のタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全キット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（商標））がＣｌｏｎｔｅｃｈから市販されている。このシステムを拡大して、特定のタンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインをマッピングすること、ならびにこれらの相互作用にとって重要なアミノ酸残基を正確に指摘することもできる。
【０３４１】
本明細書において確認されるＲＡ１ｃポリペプチドをコードする遺伝子と他の細胞内または細胞外成分の相互作用に干渉する化合物は、次のように試験することができる：通常、該遺伝子および該細胞内または細胞外成分を、それら２つの成分の相互作用および結合が可能になる条件下および時間、含有する反応混合物を調製する。結合を阻害する候補化合物の能力を試験するために、その反応を試験化合物が不在の状態および存在する状態で実行する。加えて、陽性対照として役立つように、プラシーボを第三の反応混合物に加える。その混合物中に存在する試験化合物と細胞内または細胞外成分の間の結合（複合体形成）を、上で説明したようにモニターする。試験化合物を含有する反応混合物中でではなく対照反応物（単数または複数）中での複合体の形成は、試験化合物が、試験化合物とその反応パートナーの相互作用に干渉することを示す。
【０３４２】
アンタゴニストについてアッセイするために、ＲＡ１ｃポリペプチドをその化合物と共に細胞に添加して特定の活性についてスクリーニングすることができ、化合物がＲＡ１ｃポリペプチドの存在下で対象となる活性を阻害できることは、その化合物がそのＲＡ１ｃポリペプチドに対するアンタゴニストであることを示す。あるいは、ＲＡ１ｃポリペプチドおよび可能性のあるアンタゴニストと膜結合ＲＡ１ｃポリペプチド受容体またはコード化受容体とを競合阻害アッセイに適する条件下で併せることによって、アンタゴニストを検出することができる。受容体に結合したＲＡ１ｃポリペプチド分子の数を用いて前記可能性のあるアンタゴニストの有効性を判定することができるように、ＲＡ１ｃポリペプチドを放射活性などによって標識することができる。その受容体をコードする遺伝子を、当業者に公知の非常に多数の方法、例えば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳ選別によって同定することができる。Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．，１（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ  ５（１９９１）。好ましくは、ＲＡ１ｃポリペプチドに反応する細胞からポリアデニル化ＲＮＡを作製し、このＲＮＡから作ったｃＤＮＡライブラリをプールに分け、それを使用して、ＲＡ１ｃポリペプチドに反応しないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクトする、発現クローニングを用いる。スライドガラス上で成長させているトランスフェクトされた細胞を標識ＲＡ１ｃポリペプチドに暴露する。ＲＡ１ｃポリペプチドは、ヨウ素化または部位特異的プロテインキナーゼのための認識部位の封入をはじめとする様々な手段によって標識することができる。固定およびインキュベーション後、それらのスライドガラスをオートラジオグラフ分析に付す。陽性プールを特定し、サブプールを作製し、相互作用性サブプール作製および再スクリーニングプロセスを用いて再びトランスフェクトし、最終的に、推定受容体をコードする単一のクローンを得る。
【０３４３】
受容体同定のための代替アプローチとして、標識ＲＡ１ｃポリペプチドを細胞膜と光親和性結合させ、受容体分子を発現する調製物を抽出することができる。架橋物質をＰＡＧＥによって分割し、Ｘ線フィルムに暴露する。受容体を含有する標識複合体を摘出し、ペプチドフラグメントに分割し、タンパク質マイクロシークエンシングに付すことができる。このマイクロシークエンシングから得られたアミノ酸配列を使用して、推定受容体をコードする遺伝子を同定するためにｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための１セットの変性オリゴヌクレオチドプローブを設計することとなる。
【０３４４】
アンタゴニストについてのもう１つのアッセイでは、前記受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物を候補化合物の存在下で標識ＲＡ１ｃポリペプチドと共にインキュベートすることとなる。その後、この相互作用を増進させるまたは阻止するその化合物の能力を測定することができる。
【０３４５】
Ｎ．製品およびキット
本発明のもう１つの実施形態は、ＲＡ１ｃポリペプチド発現性の癌、例えば前立腺癌の治療に有用な材料を含有する製品である。この製品は、容器および容器上のまたはその容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。適する容器としては、例えば、ビン、バイアル、注射器などが挙げられる。前記容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から作ることができる。前記容器は、前記癌状態の治療に有効な組成物を保持し、滅菌取り出し口を有し得る（例えば、前記容器は、静注溶液バッグまたは皮下注射針によって穴をあけることができるストッパーを有するバイアルであり得る）。前記組成物中の少なくとも１つの活性成分は、ＲＡ１ｃアンタゴニストまたはＲＡ１ｃの発現を調節する化合物である。前記ラベルまたは添付文書は、その組成物が癌の治療に使用されることを示す。前記ラベルまたは添付文書は、抗体、オリゴペプチドまたは有機／無機小分子組成物を癌患者に投与するための説示をさらに含むであろう。加えて、本製品は、医薬的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二の容器をさらに含む場合がある。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針および注射器を含めて、商業的および使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含む場合もある。
【０３４６】
様々な目的に、例えば、ＲＡ１ｃポリペプチド発現性細胞死滅アッセイに、細胞からのＲＡ１ｃポリペプチドの精製または免疫沈降に、および細胞ストレス反応の誘導を判定するためのアッセイに有用であるキットも提供する。ＲＡ１ｃポリペプチドの単離および精製のために、本キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングさせた、抗ＲＡ１ｃ抗体、抗ＲＡ１ｃ抗体フラグメント、抗ＲＡ１ｃ抗体コンジュゲート、オリゴペプチド、有機／無機小分子または他のＲＡ１ｃ結合アンタゴニストを含有することができる。例えばＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットでの、インビトロでのＲＡ１ｃポリペプチドの検出および定量のための、抗ＲＡ１ｃ抗体、抗ＲＡ１ｃ抗体フラグメント、抗ＲＡ１ｃ抗体コンジュゲート、オリゴペプチド、有機／無機小分子または他のＲＡ１ｃ結合アンタゴニストを含有するキットを提供することができる。製品での場合、そのキットは、容器およびその容器上のまたはその容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。前記容器は、本発明の少なくとも１つの抗ＲＡ１ｃ抗体、抗ＲＡ１ｃ抗体フラグメント、抗ＲＡ１ｃ抗体コンジュゲート、オリゴペプチド、有機／無機小分子または他のＲＡ１ｃアンタゴニストを含む組成物を保持する。例えば、希釈剤および緩衝剤、対照抗体が入っている追加の容器を含めることができる。前記ラベルまたは添付文書は、その組成物の説明ならびに所期のインビトロまたは検出使用のための説示を提供し得る。
【０３４７】
本発明の好ましい実施形態を実証するために以下の実施例を含める。下記の実施例に開示する技術が、本発明の実施の際に十分に機能するように本発明者らが開示する技術の代表であり、従って、その実施に好ましい方式の一部を成すと考えることができることは、当業者には理解されるはずである。しかし、本開示にかんがみて、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示する特定の実施形態に多くの変更を加えて同様または類似の結果をなお得ることができることは、当業者には理解されるはずである。本明細書全体を通して引用するすべての参考文献は、それら全体が参照により本明細書に明白に取り入れられている。
【実施例】
【０３４８】
実施例１：ＲＡ１ｃ発現
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧＵ１３３Ｐオリゴアレイ（ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ）を使用して、幾つかの組織および腫瘍におけるＲＡ１ｃの発現を検査した。ＲＡ１ｃ発現は、以前に説明されている（Ｓｈｅｎ−Ｏｎｇら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３：６３（１２）：３２９６−３３０１）ように、ヒトＲＡ１ｃの３’ＵＴＲ（ＮＭ＿０３０７７４の塩基２３４９〜２７４２）にハイブリダイズするように設計されたプローブを用いてオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（ＨＧ−Ｕ１３３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を問い合わせることにより、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．（メリーランド州、ゲーサーズバーグ）で評価した。結果は、ＲＡ１ｃ発現が試験した他の組織のいずれにおけるより前立腺組織において実質的に高かったことを示している（図１Ａ）。さらに、癌性前立腺組織におけるＲＡ１ｃの発現は、正常前立腺組織における発現より実質的に多かった（図１Ａ）。幾つかの正常および罹病前立腺サンプルにおけるＲＡ１ｃ発現のより精密な検査（図１Ｂ）により、正常前立腺組織および良性前立腺肥大は類似したＲＡ１ｃ発現レベルを有するが、前立腺上皮間新生物サンプルはこれら２つの組織より実質的に低いＲＡ１ｃ発現量を有し、７のＧｌｅａｓｏｎスコアを有する３つの異なる腺癌サンプルはこれら２つの組織より実質的に高いＲＡ１ｃ発現量を有することが明らかになった。
【０３４９】
実施例２：ＲＡ１ｃ発現の調節
（ａ）ＲＡ１ｃ発現に対するサイトカイン効果
様々な研究により、不朽化前立腺細胞系列においてそれらの細胞にインターロイキン６（ＩＬ−６）を投与することによりＲＡ１ｃ発現が増進されることが判明した（Ｗｅｎｇら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９６：１０３４−１０４８（２００５））。従って、ＩＬ−６および他のサイトカインのＬＮＣａＰ細胞、不朽化、アンドロゲン感受性前立腺癌細胞系列、への投与の効果を試験した。ＬＮＣａＰ細胞を６ウエルプレートに等密度（およそ０．５×１０６細胞／ウエル）でプレーティングし、５％ＣＯ２中、３７℃で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２Ｋ培地中で４８時間成長させ、その後、その培地を、指示濃度のＩＬ−６、インスリン、ＥＧＦまたはＩＧＦ−１を含有する完全無フェノールレッド培地または無血清無フェノールレッド培地のいずれかで置換した。ＩＬ−６、ＥＧＦおよびＩＧＦ−１での処理は２４時間であり、一方、インスリンでの処理は７時間であった。処理後、細胞を機械的リフティングによって回収した。回収した細胞から、ＲＮＡｅａｓｙ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）およびＤＮＡｓｅ処理を用いてＲＮＡを単離した。ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍからの試薬およびＱ−ＰＣＲシステム（Ｔａｑｍａｎ（商標）、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の使用説明書に従って使用して、定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を行った。使用したＱ−ＰＣＲプライマーは、フォワード：ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＡＡＡ（配列番号：４）、リバース：ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＡＡ（配列番号：５）であった。使用したプローブは、ＣＣＡ  ＡＡＣ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＧＡＡ  ＣＡＣ  ＧＧＧ  ＴＧＣ  ＴＧ（配列番号：６）であった。式：２ＲＰＬ１９についての平均Ｃｔ値／２ＲＡ１ｃについての平均Ｃｔ値を用いてリボソームタンパク質Ｌ１９（ＲＰＬ１９）との比較により正規化したＲＡ１ｃ値として、結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。
【０３５０】
結果は、以前の報告と一致して、ＩＬ−６処理が完全培地処理細胞におけるＲＡ１ｃ発現が対照レベルより実質的に増すことを示した（図２Ａ参照）。無血清培地における細胞成長に対するＥＧＦおよびＩＧＦ−１処理は、完全培地における対照細胞成長において見られるものと比較して観察されるＲＡ１ｃ発現を増加させたが、その発現は、無血清培地における対照細胞成長において観察されるものと実質的に異ならなかった（図２Ａ参照、ならびに図４Ｂおよび１４Ａと比較）。類似して、インスリン処理は、培地を合わせた対照細胞と比較してＲＡ１ｃ発現に対して有意な効果がなかった（図２Ｂ）。ＲＰＬ１９についてのＣｔ値は、それぞれの実験においてサンプル同士で一致し、完全培地処理細胞と無血清培地処理細胞の間でも一致した。従って、これらの実験は、ＩＬ−６処理が、処理したＬＮＣａＰ細胞におけるＲＡ１ｃ発現を適切な対照細胞と比較して増加させることを明示し、ＩＬ−６処理とは無関係に血清枯渇も細胞におけるＲＡ１ｃ発現を増加させることも示唆した。両方の発見をさらに調査した。
【０３５１】
ＩＬ−６処理によるＲＡ１ｃ発現のアップレギュレーションのタイミングを評定するために、ＬＮＣａＰ細胞において経時試験を行った。細胞を６ウエルプレートに等密度（およそ０．５×１０６細胞／ウエル）でプレーティングし、５％ＣＯ２中、３７℃で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２Ｋ培地中で７２時間成長させ、その後、先ず、ＩＬ−６で処理した（２４時間処理サンプル）。プレーティングから実験終了までの総時間は、９６時間であった。すべてのサンプルが機械的リフティングによって同じ時に回収されるように細胞の時間点処理をずらした。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１回洗浄し、その後、ＲＮＡｅａｓｙ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して溶解およびＲＮＡ単離を行った。ＲＮＡ単離中にすべてのサンプルをＤＮａｓｅで処理した。上で説明したＱ−ＰＣＲシステム、プライマーおよびプローブを使用してＱ−ＰＣＲを行い、上で説明したように結果をＲＰＬ１９に対して正規化した。結果を図２Ｃに示す。ＲＡ１ｃ発現は、４時間の時点でＩＬ−６処理に反応して増加し、８時間の時点でピークに達した。２４時間処理も対照細胞ＲＡ１ｃ発現より高かったが、４時間の時点で観察されたレベルに類似していた。この結果は、ＲＡ１ｃがＬＮＣａＰ細胞におけるＩＬ−６経路の初期ターゲット遺伝子であることを示唆していた。
【０３５２】
（ｂ）ＲＡ１ｃ発現に対する血清枯渇の効果
ＬＮＣａＰ細胞に対する血清枯渇の影響をさらに評定するための実験も行った。細胞を６ウエルプレートに等密度（およそ０．５×１０６細胞／ウエル）でプレーティングし、５％ＣＯ２中、３７℃で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２Ｋ培地中で２４時間放置した。無血清および無フェノールレッド培地（「５０／５０」）を細胞に添加した。指示量のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を一定のサンプルに添加し、１８時間処理を続けた。インキュベーション後、機械的リフティングによって細胞を回収し、ＲＮＡｅａｓｙ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて上で説明したようにＲＮＡを単離し、ＲＮＡ単離中にＤＮａｓｅで処理した。Ｑ−ＰＣＲシステムおよび試薬（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ならびに実施例２（ａ）において説明したプライマーおよびプローブを使用して、実施例２（ａ）において説明したようにＱ−ＰＣＲを行った。上で説明したように、結果をＲＰＬ１９に対して正規化した。５０／５０培地では、血清不在とＲＡ１ｃ発現増加の間に明確な相関関係がある。図３Ａ。細胞に添加したウシ胎仔血清の百分率を増加させるにつれて、ＲＡ１ｃ発現の量は減少した。図３Ａ。従って、ＲＡ１ｃ発現は、正常細胞系にストレスをかける条件、例えば、血清枯渇およびＩＬ−６での処理によって誘導されるようである。別の種類の無血清培地、ＲＰＭＩ、を使用して試験したとき、結果は類似していた。
【０３５３】
さらなる研究は、血清枯渇下でのＲＡ１ｃ  ｍＲＮＡの上昇が、血清担持アンドロゲンの除去のみに起因するものでないことを示した。ウシ胎仔血清を活性炭（ＣＤＳ）で処理してアンドロゲンおよび他の小有機成分、例えば生体活性脂質、を除去した。ＣＤＳを補足した培地中で成長させた二重反復試験ウエル中のＬＮＣａＰ細胞は、完全ウシ胎仔血清を伴う培地中で成長させた細胞と比較して類似したレベルでＲＡ１ｃを発現した。対照的に、無血清培地中で成長させた細胞は、以前に観察されたように、高レベルのＲＡ１ｃを発現した。ＤＨＴ処理は、すべての条件下でＲＡ１ｃ発現を抑制した。
【０３５４】
（ｃ）ＩＬ−６処理ＬＮＣａＰ細胞における細胞周期調節に対する血清枯渇の効果
ＬＮＣａＰ細胞を６ウエルプレートに５×１０６細胞／ウエルの密度でプレーティングし、１日後、ＩＬ−６処理を行った。プレーティングの１日後、培地を新たな完全培地または無血清で無フェノールレッドの培地のいずれかで置換し、一定のウエルを１０または５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６で追加処理した。処理を５％ＣＯ２中、３７℃で４８時間継続し、この時点で、１ｍＬの１×トリプシン／１０ｍＭ  ＥＤＴＡを使用してそのプレートから細胞を除去し、冷ＰＢＳで２回洗浄した。その後、細胞を冷１００％エタノールに入念に再懸濁させ、分析まで４℃で保存した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色のために、細胞を回転沈降させ、その後、１ｍＬのＰＩ染色溶液（０．４％  ＮＰ４０、０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＰＩ、０．０２ｍｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ）に再懸濁させ、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）システム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する蛍光励起細胞選別（ＦＡＣＳ）分析による分析まで、一晩、インキュベートした。中等度捕捉設定で１サンプルにつき２５０００個の細胞を捕捉した。
【０３５５】
図３Ｂにおいてわかるように、完全培地において成長させた対照細胞は、無血清培地において成長させた対照細胞と比較して有意に低い割合の、Ｇ０／Ｇ１停止状態の細胞を有した。血清が、活性細胞成長および分裂を刺激する多数の成長因子およびサイトカインを含有することからして、この結果は予想外ではなかった。ＩＬ−６の濃度の増加に伴って、Ｇ０／Ｇ１停止細胞から離れてアポトーシス細胞へのシフトが観察された。図３Ｂに示すアポトーシス細胞を生じさせるために適用したものよりはるかに短いＩＬ−６暴露によってＲＡ１ｃ発現が上昇された（図２Ｃ）ことに留意しなければならない。これらの結果は、ＲＡ１ｃ発現増加が、成長停止またはアポトーシスを最終的に生じさせることとなる細胞ストレスに対する初期反応であり得ることを示唆している。
【０３５６】
（ｄ）他の前立腺癌モデルにおける血清枯渇の効果
実施例２（ａ）および２（ｂ）においてＬＮＣａＰ細胞で観察された血清枯渇の効果をより幅広く適用できるかどうかを評価するために、他の前立腺腫瘍モデルを使用して実験を繰り返した。１つのそのようなモデルは、ＬＵＣａＰ７７前立腺癌異種移植片モデルである（Ｃｈｅｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６２：１３４９−１３５４（２００３）参照）。ふるいおよびガラス乳棒を使用してＬＵＣａＰ７７腫瘍を均質化し、その後、２０％ＦＢＳを伴う完全培地にプレーティングした。それらの細胞を１０日間放置して成長させ、その後、培地を新たな完全または無血清無フェノールレッド培地と交換した。ＬＮＣａＰ細胞も同じ手法で処理した。ＩＬ−６処理は、機械的リフティングによる回収前の７時間であった。回収した細胞をＰＢＳで１回洗浄した。実施例２（ａ）において説明したように、ＲＮＡｅａｓｙ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して回収細胞からＲＮＡを単離した。そのＲＮＡ単離中にすべてのサンプルをＤＮａｓｅで処理した。実施例２（ａ）において説明した定量的実時間ＰＣＲ試薬、プライマーおよびプローブを使用して、ＱＰＣＲを行った。実施例２（ａ）において説明したように結果をＲＰＬ１９に対して正規化した。それらを図４Ａおよび４Ｂに示す。
【０３５７】
実施例２（ａ）および２（ｂ）において説明したＬＮＣａＰ結果に類似して、ＬＵＣａＰ７７細胞は、血清が存在する状態で成長させたときより血清が不在の状態でのほうが実質的に多くのＲＡ１ｃを発現した。特に、完全培地の状況下でのＩＬ−６での処理は、結果的にこれらの細胞におけるＲＡ１ｃ発現を増加させなかったが、細胞を血清飢餓させたとき、ＩＬ−６濃度の上昇に伴ってＲＡ１ｃ発現のわずかな追加の増加が観察された（図４Ａ参照、グラフの左半分とグラフの右半分を比較）。ＬＵＣａＰ７７エクスビボ細胞におけるＲＡ１ｃおよびＲＰＬ１９発現についての平均Ｃｔ値は、培地のタイプまたはＩＬ−６濃度による影響を受けなかった。ＬＮＣａＰ細胞をＬＵＣａＰ７７細胞と同じ条件下でアッセイした（図４Ｂ参照）。完全培地において成長させた細胞ではＩＬ−６の漸増濃度に応じてＲＡ１ｃ生産の有意な増加は観察されなかったが、無血清培地において成長させた細胞ではＲＡ１ｃ発現の著しい増加が観察され、ＩＬ−６を使用して無血清細胞を処理したとき、さらなる増加が観察された（図４Ｂ）。血清枯渇およびＩＬ−６処理に反応してのＬＮＣａＰ細胞におけるＲＡ１ｃ発現の増加は、ＬＵＣａＰ７７細胞において観察されたものより実質的に大きかったが、両方の細胞タイプが、血清枯渇とＩＬ−６処理の両方に反応して発現増加をはっきりと示した。これらの結果は、ＲＡ１ｃ遺伝子調節の一定の態様（ＩＬ−６処理に反応してのアップレギュレーションおよび血清枯渇に反応してのアップレギュレーション）が前立腺癌のインビトロモデル全体にわたって保存されることを明示している。
【０３５８】
実施例３：ＲＡ１ｃ発現に対するシグナル伝達経路阻害剤の効果
多くのサイトカインと同様に、ＩＬ−６は、幾つかの異なる細胞内シグナル伝達カスケードを刺激し、そしてまた、そのようなシグナル伝達は、他の細胞内因子によって調節され得る。例えば、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼは、ＩＬ−６シグナル伝達の阻害を媒介することが知られており（Ａｈｍｅｄら，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．７２：１５４−１６２（２００２）；Ｃｈａｎｇら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８９：Ｌ４４６−Ｌ４５３（２００５））、ＩＬ−６は、ＬＮＣａＰ細胞において４，５−ホスファチジル−イノシトール  ３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を活性化することが知られている（Ｘｉｅら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６０：６１−６７（２００４））（図８参照）。ＰＩ３Ｋの活性化が、生存促進（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の活性化を含めて、多数の下流の結果を有することは公知であるが、プロテインキナーゼＰＤＫ１も、ｐ７０Ｓ６キナーゼの活性化によって転写を調節する。ＬＮＣａＰ細胞には機能的ＰＴＥＮ（ＰＩ３Ｋの効果に対抗する腫瘍抑制因子）がなく、従って、ＬＮＣａＰ細胞におけるＰＩ３Ｋの下流エフェクターは、構成的に活性であり得る。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３経路もＩＬ−６によって活性化される（Ｈｉｒａｎｏら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：２５４８−２５５６（２０００））。従って、ＩＬ−６誘導ＲＡ１ｃ発現に対する幾つかの異なる公知シグナル伝達経路阻害剤の効果を評価した。
【０３５９】
（ａ）特異的ＰＩ３Ｋおよびｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤の効果
ＬＮＣａＰ細胞を６ウエルプレートに等密度（およそ０．５×１０６細胞／ウエル）でプレーティングし、７２時間放置し、その後、無血清無フェノールレッド培地を添加し、２４時間放置した。細胞を阻害剤なしで培養するか、主要細胞ストレス反応経路を遮断する、ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋに対して特別な効能を有するキナーゼの広い区画の阻害剤）または高特異的ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤ＳＢ２０３５８０で処理した。ＬＹ２９４００２（２μＭおよび４μＭ）を適切なウエルに添加し、１時間インキュベートし、その後、５０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−６をさらに２４時間にわたって添加した。ＳＢ２０３５８０（５μＭおよび１０μＭ）を適切なウエルに添加し、１時間インキュベートし、その後、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６をさらに７時間にわたって添加した。機械的リフティングによって細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄した。実施例２（ａ）において説明したように、ＲＮＡｅａｓｙ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して回収細胞からＲＮＡを単離した。そのＲＮＡ単離中にすべてのサンプルをＤＮａｓｅで処理した。実施例２（ａ）において説明したＱ−ＰＣＲシステム、試薬、プライマーおよびプローブを使用してＱ−ＰＣＲを行った。実施例２（ａ）において説明したように、結果をＲＰＬ１９に対して正規化した。
【０３６０】
ＰＩ３ＫおよびＰ３８  ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路内の一定の分子の、それらの経路を活性化することが知られている成長因子での刺激に基づいてＬＮＣａＰ細胞において正しく活性化される能力も評価した。ＬＮＣａＰ細胞を６ウエルプレートにおよそ０．５×１０６細胞／ウエルの密度でプレーティングした。それらの細胞を７２時間成長させた後、様々な阻害剤で１時間処理し、その後、１０分間、１０ｎＭのＥＧＦで刺激した。細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄した後、β−メルカプトエタノールを含有する冷２×サンプル緩衝液に溶解した。３５マイクロリットルの溶解産物を負荷し、４〜２０％ポリアクリルアミドゲルを用いて実行し、その後、標準的な手順を用いてＰＶＤＦ膜に移した。ＰＩ３Ｋおよびｐ３８  ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の活性化（すなわち、リン酸化）成分の存在を、次の抗体（すべてＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのもの）を使用し標準的な手順を用いるウエスタンブロットによって評価した：ウサギポリクローナル抗リン酸化ＡＫＴ  Ｓｅｒ  ４７３、マウスモノクローナル抗リン酸化ＭＡＰキナーゼｐ４４／４２、マウスモノクローナル抗リン酸化ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、およびマウスモノクローナル抗リン酸化ｍＴＯＲ。抗ベータアクチン抗体をブロット正規化に用いた。結果を図５に示す。結果は、ＬＮＣａＰ細胞におけるそれらそれぞれのシグナル伝達成分のリン酸化形態の存在、およびそのようなリン酸化（すなわち、活性化）タンパク質の集団を調節するための指示阻害剤の有効性を明示している。
【０３６１】
図６に示すように、血清飢餓させＩＬ−６で処理した細胞へのＬＹ２９４００２の添加は、血清飢餓ＬＮＣａＰ細胞をＩＬ−６のみとインキュベートしたときに観察されるＲＡ１ｃの過発現を実質的に減少させた。さらに、血清飢餓細胞へのＬＹ２９４００２の添加も、ＩＬ−６が不在の状態で血清枯渇によって誘導されるＲＡ１ｃの発現を減少させた（図６における最も右の２本の棒と最も左の棒を比較）。リン酸化Ａｋｔレベルは、ＬＹ２９４００２処理によって減少されたが、ＰＩ３Ｋ阻害に関係ない活性もことによるとＬＹ２９４００２の効果の説明となり得る。ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０での処理もＩＬ−６誘導ＲＡ１ｃ発現を阻害した（図７）が、ｐ３８それ自体は、ＩＬ−６によってアップレギュレートされない。
【０３６２】
（ｂ）特異的ｍＴＯＲ阻害剤の効果
ＬＮＣａＰ細胞を６ウエルプレートにおよそ０．５×１０６細胞／ウエルの密度でプレーティングし、２４時間、完全培地中、３７℃および５％ＣＯ２で放置して成長させた。新たな完全培地で培地を交換および置換し、細胞を一晩、３７℃および５％ＣＯ２で成長させた。ラパマイシン（１００ｎＭまたは５００ｎＭ）を適切なウエルに添加し、１時間インキュベートし、その後、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６をさらに７時間にわたって添加した。機械的リフティングによって細胞を回収し、冷ＰＢＳで１回洗浄した。回収し、洗浄した細胞を−８０℃で保管した。−８０℃から取り出した直後に、ＲＮＡｅａｓｙ（商標）キットからのＲＬＴ溶解緩衝液をそれらの細胞ペレットに添加し、細胞を再懸濁させた。凍結細胞ペレットを決して１週間より長くは保管しなかった。再懸濁させた細胞を再びＰＢＳで１回洗浄した。実施例２（ａ）において説明したように、ＲＮＡｅａｓｙ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを回収細胞から単離した。そのＲＮＡ単離中にすべてのサンプルをＤＮａｓｅで処理した。実施例２（ａ）において説明したＱ−ＰＣＲシステム、試薬、プライマーおよびプローブを使用してＱ−ＰＣＲを行った。実施例２（ａ）において説明したように結果をＲＰＬ１９に対して正規化した。
【０３６３】
図９に示すように、ラパマイシン処理のみまたはＩＬ−６処理のみはいずれも、ＬＮＣａＰ細胞においてＲＡ１ｃ発現の測定可能な増加を生じさせた。しかし、ＩＬ−６とラパマイシンの両方一緒での処理は、処理細胞におけるＲＡ１ｃ発現を相乗的に増進させるようであった（図９）。いずれか１つの解釈に限定されないが、ＩＬ−６処理とｍＴＯＲ活性の阻害の組み合わせからの追加の細胞ストレスによって相乗効果が生じ得る。ＩＬ−６は、ＬＮＣａＰにおいて成長停止を生じさせるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路もこれらの細胞において構成的に活性であり、ＬＮＣａＰ細胞成長にとって重要である。従って、ＩＬ−６処理とｍＴＯＲ阻害の複合ストレスは、ＲＡ１ｃ発現の相乗的アップレギュレーションを生じさせ得る。
【０３６４】
（ｃ）ＡＫＴ１／２阻害剤の効果
ＬＮＣａＰ細胞をウエルあたりおよそ０．５×１０６個の細胞の密度でプレーティングし、４８時間成長させた。その後、培地を新鮮な成長培地に交換し、その２４時間後に指示濃度のＡｋｔ１／２阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で処理した。Ａｋｔ１／２阻害剤処理は、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６の添加前に１時間であった。ＩＬ−６処理を７時間進行させた。その後、細胞を機械的リフティングによって回収し、冷１×ＰＢＳで１回洗浄し、その後、液体窒素中で急速凍結させ、−８０℃で一晩保管した。その後、ＱｉａｇｅｎのＲＮＡｅａｓｙキットを使用して細胞ペレットからＲＮＡを単離した。ＲＮＡ単離中、サンプルをＤＮＡｓｅで処理した。Ａｋｔ１／２阻害剤の添加は、ＲＡ１ｃメッセージレベルの上昇を生じさせた（図１０）。さらに有意なことに、ＲＡ１ｃメッセージは、ＡＫＴ阻害剤と外因性ＩＬ−６の併用によってさらに増加された（図１０）。これらの効果は、明らかに相加的であった。上で論じたｍＴＯＲ阻害結果と考え合わせると、この結果は、ＩＬ−６が存在する状態でのＲＡ１ｃ発現の陽性レギュレーターとしてのＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路と相反する。
【０３６５】
（ｄ）ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３阻害の効果
ＪＡＫ／ＳＴＡｔ３経路の役割を評価するために、プロモーター分析を行った。Ｗｅｎｇらは、推定ＲＡ１ｃプロモーターが予測ＳＴＡＴ３結合部位を含有すると報告している（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈ．２００５；９６：１０３４−１０４８）。推定ＲＡ１ｃプロモーターの異なる領域に由来するルシフェラーゼレポーター構築物を遺伝子工学で作製した。予測ＳＴＡＴ３結合部位を有するその構築物は、（ｐＧＬ−３基本ベクターによって表される）対照レベルより大きくルシフェラーゼを発現し、この発現は、外因性ＩＬ−６の添加によってさらに増進された（図１１）。ＳＴＡＴ３部位の突然変異（図１２）は、その構成的活性を激しく低下させ、このプロモーターのＩＬ−６反応を完全になくした（図１１）。また、ＪＡＫ阻害剤ＡＧ４９０は、それ自体ではルシフェラーゼ活性をわずかに強化したが、ＩＬ−６と併用するとルシフェラーゼ活性のさらなる上昇を防止した（図１３）。考え合わせると、これらの結果は、ＩＬ−６に反応して増加されるＲＡ１ｃ発現に責任を負う主要経路が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３経路であることを示唆している。
【０３６６】
実施例４：ＲＡ１ｃ発現に対するＤＨＴの効果
ＬＮＣａＰ細胞はアンドロゲン感受性であり、テストステロンおよび関連分子が存在する状態で成長を刺激する。以前の研究は、ＬＮＣａＰ細胞における神経内分泌系分化のＩＬ−６媒介誘導がこれらの細胞へのアンドロゲン投与によって阻止されることを明らかにした（Ｘｉｅら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６０：６１−６７（２００４））。上に記載した研究は、ＩＬ−６処理がＲＡ１ｃ発現を刺激することを示しているので、ＩＬ−６誘導および血清枯渇誘導ＲＡ１ｃ発現に対するアンドロゲンの効果を調査した。
【０３６７】
ＬＮＣａＰ細胞を等密度でプレーティングし、３日間成長させ、その後、その培地を、５α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を含有する新鮮な完全培地またはＤＨＴを伴う無血清無フェノールレッド培地のいずれかで置換した。ＩＬ−６処理のため、１０ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭおよび１μＭのＤＨＴ用量を、完全および無血清無フェノールレッド培地中、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６と併用した。すべての処理を一晩行い、その後、機械的リフティングによって細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、その後、ＲＮＡｅａｓｙ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを単離した。そのＲＮＡ単離中にすべてのサンプルをＤＮａｓｅで処理した。実施例２（ａ）において説明したＱ−ＰＣＲシステム、試薬、プライマーおよびプローブを使用してＱ−ＰＣＲを行った。実施例２（ａ）において説明したように結果をＲＰＬ１９に対して正規化した。
【０３６８】
ＤＨＴ処理は、ＲＡ１ｃのＩＬ−６誘導発現に対しても、ＲＡ１ｃの血清枯渇誘導発現に対しても、実質的に阻害性であった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。この効果は用量依存性であり、１００ｎＭのＤＨＴが存在する状態で最も顕著であった。ＲＰＬ１９についてのＣｔ値は、ＤＨＴ処理範囲全体にわたって一致していた。これは、細胞生存度の変化が、ＤＨＴ処理によって観察されたＲＡ１ｃ発現減少の原因でなかったことを示す。実施例２および３からの結果と考え合わせると、このデータは、ＲＡ１ｃが、癌細胞に生存有利性をもたらし得るストレス誘導遺伝子であることを示唆している（図１４Ｃ）。正常な充実した成長条件下ではＲＡ１ｃ発現が抑制される。このデータは、考え合わせると、ストレス条件（例えば、ＩＬ−６処理または血清枯渇）下でのＲＡ１ｃ発現の上昇を、成長促進経路活性化（ＤＨＴ）によって逆転させるまたは軽減することができ、成長促進経路をさらに阻害する（ラパマイシン）と増幅させることができることを示唆している。
【０３６９】
実施例５：ＲＡ１ｃの表面発現の実証
ＲＡ１ｃは、７回膜貫通型Ｇ蛋白結合受容体タンパク質のファミリーに対して相同性を有するが、ＲＡ１ｃが細胞内膜上のみに位置するのではなく細胞表面膜上で利用できる証拠は、当該技術分野において以前に提供されていない。ＲＡ１ｃタンパク質の細胞局在を評定するために、ＦｕＧｅｎｅ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）トランスフェクション試薬を使用して、ヒト胚性腎細胞（２９３Ｓ細胞）においてＮ末端ｇＤタグ付ＲＡ１ｃを過発現させた。２９３Ｓ細胞を２×１０６細胞／（１０ｃｍ皿）の密度でプレーティングし、２４時間、完全培地中、３７℃および５％ＣＯ２で放置して成長させ、その後、トランスフェクトした。ＦｕＧｅｎｅ（登録商標）試薬を使用して５．６μｇのＲＡ１ｃ−ｐＲＫ−Ｎ末端ｇＤプラスミドで細胞をトランスフェクトし、４８時間放置し、その後、５ｍＭ  ＥＤＴＡでそれらのプレートをリフティングした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ中１ｍＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄し、その後、４μｇ／ｍＬの抗ｇＤ  ｍＡｂに再懸濁させ、氷上で１時間インキュベートした。その後、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗マウス二次抗体に再懸濁させ（１：５００希釈）、氷上で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、その後、ＦＡＣＳ分析した。
【０３７０】
図１５に示すように、ＦＡＣＳ分析によって、ＰＥ標識抗マウス二次抗体に特異的に結合する大きな細胞集団が検出された。これは、ＲＡ１ｃが２９３Ｓ細胞の表面で利用できることを示している。これらの結果を、ＣＨＯ細胞発現を用いて確認した（結果は示さない）。これは、ＲＡ１ｃの細胞表面発現が異なる生物からの異なる細胞系列で観察されることを示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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