(57)【要約】  本発明は、細胞培養表面用コーティングに関する。さらに具体的には、本発明は、天然ガム類、植物ガム類、ガラクトマンナンガム類またはそれらの誘導体などのガム類に由来するか、またはそれらを含有する細胞培養表面用コーティングに関する。本発明はまた、このようなコーティングを有する製品（例えば、細胞培養槽および実験器具）、これらのコーティングを細胞培養表面に適用する方法、およびコーティングされた細胞培養槽を用いる方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のガラクトマンナンガムを含み、１ｍｍ未満の厚さであることを特徴とする細胞培養表面用コーティング。
【請求項２】
前記少なくとも１種のガラクトマンナンガムが、ローカストビーンガム、グアーガム、カッシアガム、タラガム、メスキートガム、およびコロハガムからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のコーティング。
【請求項３】
ローカストビーンガム、グアーガム、カッシアガム、トラガカントゴム、タラガム、カラヤゴム、アカシアゴム、ガティガム、チェリーガム、アンズガム、タマリンドガム、メスキートガム、カラマツガム、オオバコ、コロハガム、キサンタンガム、海草ガム、ジェランガム、アガーガム、カシューガム、カラゲナンおよびカードランからなる群から選択される少なくとも２種のガムを含み、１ｍｍ未満の厚さであることを特徴とする細胞培養表面用コーティング。
【請求項４】
（ａ）基体と；
（ｂ）少なくとも１種のガラクトマンナンガムを含み、１ｍｍ未満の厚さである前記基体上のコーティングと、
を含むことを特徴とする接着細胞培養用の細胞培養槽。
【請求項５】
前記細胞培養槽が、肝細胞の培養を目的とすることを特徴とする請求項４に記載の細胞培養槽。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、参照として本明細書に援用されている２００７年３月９日に出願され、標題が「Ｃｏａｔｉｎｇｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ」である米国仮特許出願第６０／９０６，１６８号明細書の利益を主張する。本出願は、＿＿＿に出願され、標題が「Ｔｈｒｅｅ  Ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｇｕｍ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ」である特許出願第＿＿＿号明細書に関する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、細胞培養表面用コーティングに関する。さらに具体的には、本発明は、天然ガム類、植物ガム類、ガラクトマンナンガム類またはそれらの誘導体などのガム類に由来するか、またはそれらを含有する細胞培養表面用コーティングに関する。本発明はまた、このようなコーティングを有する製品（例えば、細胞培養槽および実験器具）、これらのコーティングを細胞培養表面に適用する方法、およびコーティングされた細胞培養槽を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞のインビトロ培養は、細胞生物学研究に必要な材料を提供し、薬理学、生理学および毒物学の分野を進歩させるための多くの基礎を提供する。しかしながら、細胞培養培地に浸された培養槽中のインキュベーターに生存する単離培養真核細胞は、インビボでの個々の細胞と比較して、極めて異なった特性を有することが多い。真核細胞の一次および二次培養物に対して実施された実験から得られた情報は、培養された細胞が無処置細胞と同じ特性を有する範囲でのみ薬理学者、生理学者および毒物学者に対して有益な情報となる。
【０００４】
細胞は、細胞培養槽の表面で増殖することができる。例えば、液体培地中の細胞を、細胞培養フラスコまたは多ウェル細胞培養プレートなどの細胞培養槽に導入し、この細胞培養槽をインキュベーターなどの好適な環境に置き、細胞を細胞培養槽の表面上に置き、そこでそれらを付着、増殖、および分裂させることができる。しかしながら、なかには、平板状表面で増殖させると、他よりも機能の良好な細胞がある。より自然的な表現型を維持するために、また、最適なインビトロデータを提供するために異なった表面を必要とする細胞もある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞培養の条件は、培養中の細胞の特性に影響を及ぼし、したがって培養中の細胞から得られたデータ値に影響を及ぼす。当業界において、インビボ細胞挙動との関連性がより高いデータを提供する細胞培養表面および条件を提供することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、天然ガム類、植物ガム類、ガラクトマンナンガム類またはそれらの誘導体など、少なくとも１種のガム材料から製造された細胞培養表面用コーティングに関する。一実施形態において、本発明は、少なくとも１種のガラクトマンナンガムから製造された細胞培養表面用コーティングに関する。ガラクトマンナンガム類としては、ローカストビーンガム（イナゴマメビーンガム、イナゴマメ種子ガム、イナゴマメガムとしても知られている）、グアーガム、カッシアガム、タラガム、メスキートガム、コロハガムおよびそれらの誘導体が挙げられる。複数の実施形態において、ガム材料は、加工し、精製し、化学的に修飾し、処理し、または加熱または凍結融解サイクルに供することができる。複数の実施形態において、ガムコーティングは、ゲルコーティング、ヒドロゲルコーティング、フィルムコーティングまたはヒドロフィルムコーティングの形態であり得る。さらなる実施形態において、細胞培養表面コーティングは調整可能である。さらなる実施形態において、ガムコーティングは、生物活性化合物をさらに含むことができる。
【０００７】
さらに別の実施形態において、本発明の細胞培養表面用コーティングは、２種以上のガム材料から製造することができる。組合されたガム材料としては、ローカストビーンガム（イナゴマメビーンガム、イナゴマメ種子ガム、イナゴマメガムとしても知られている）、グアーガム、カッシアガム、トラガカントゴム、タラガム、カラヤゴム、アカシアゴム（アラビアゴム）、ガティガム、チェリーガム、アンズガム、タマリンドガム、メスキートガム、カラマツガム、オオバコ、コロハガム、キサンタンガム、海草ガム、ジェランガム、アガーガム、カシューガム、カラゲナンおよびカードランを挙げることができる。
【０００８】
一実施形態において、本発明はまた、基体およびマトリックスが少なくとも１種のガラクトマンノースガムを含む、基体へのコーティングを含む真核細胞培養用細胞培養槽を含む。本発明の一実施形態において、細胞培養槽は、プラスチックまたはガラスであり得る。さらに本発明の実施形態において、細胞培養槽は実験器具であり得る。
【０００９】
なお別の実施形態において、本発明はまた、ガラクトマンナンガム溶液を調製するステップと、このガラクトマンナンガム溶液を細胞培養槽表面に適用するステップとを含む細胞培養槽を作製する方法を含む。さらなる実施形態において、本発明の細胞培養槽を作製する方法はまた、細胞培養槽を加熱するステップまたは細胞培養槽を凍結／融解サイクルに供するステップを含む。さらなる実施形態において、本発明は、本発明のコーティングされた細胞培養槽を用いて細胞を培養する方法を含む。
【００１０】
本発明は、添付の図面を読み取り、以下の詳細な説明によって最もよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の細胞培養コーティングの一実施形態を示す図である。
【図２】本発明のローカストビーンガムでコーティングされた表面の実施形態で培養９日後のＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の明視野（図２Ａ）、生存染色（図２Ｂ）および死亡染色（図２Ｃ）の修正顕微鏡写真を示す図である。
【図３】異なった表面上で培養９日後のテキサスレッド−ファロイジンによるＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞のアクチンフィラメント染色の修正顕微鏡写真を示す図である。
【図４】本発明のコーティングされた細胞培養表面の実施形態で増殖したＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の明視野（図３Ａ）、および生存／死亡染色（図３Ｂと３Ｃ）後の修正顕微鏡写真の画像を示す図である。
【図５】本発明の細胞培養コーティングの実施形態で増殖したＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を図示する、倍率を増加させて示した明視野顕微鏡写真を示す図である。
【図６】非コーティングＴＣＴ培養プレートと比較して、本発明のコーティング細胞培養表面上での肝細胞培養後の細胞増殖のチャートを示す図である。
【図７】Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、コラーゲンＩ、およびＴＣＴと比較して、本発明のローカストビーンガムコーティング実施形態で増殖したＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞に対して実施したアルブミンアッセイ結果のチャートを示す図である。
【図８】対照としてＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）、コラーゲンコーティング皿およびＴＣＴによる異なった基体上で培養したＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞のアルブミン産生評価のチャートを示す図である。
【図９】ＴＣＴ、本発明のローカストビーンガムコーティングの実施形態、本発明のグアーガムとカラゲナンのブレンドコーティングの実施形態、ならびに本発明のグアーガムとカードランのブレンドコーティング細胞培養表面の実施形態に関して、３つの異なった期間（７日間、１０日間および１４日間）の培養でのアルブミン産生評価を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の実施形態は、細胞増殖および細胞生理にとって都合のよい細胞培養環境を与える細胞培養コーティングを提供する。複数の実施形態において、本発明は、天然分枝状ガラクトースベースの多糖類から作製された細胞培養表面コーティングを提供する。これらの天然分枝状ガラクトースベースの多糖類としては、ローカストビーンガム（イナゴマメビーンガム、イナゴマメ種子ガム、イナゴマメガムとしても知られている）、グアーガム、カッシアガム、トラガカントゴム、タラガム、カラヤゴム、アカシアゴム（アラビアゴム）、ガティガム、チェリーガム、アンズガム、タマリンドガム、メスキートガム、カラマツガム、オオバコ、コロハガム、キサンタンガム、海草ガム、ジェランガム、アガーガム、カシューガム、カラゲナンおよびカードランが挙げられる。さらなる態様において、好ましい細胞培養条件を提供するために、本発明は、本発明の細胞培養表面コーティングを製造する方法、および細胞培養槽および容器中でこれらの細胞培養表面コーティングを使用する方法を含む。
【００１３】
説明を目的とし、限定ではない以下の詳細な説明において本発明の完全な理解を提供するために、具体的な詳細を開示する例示的な実施形態を示す。しかしながら、本発明は、本明細書に開示された具体的な詳細から外れた他の実施形態で実施し得ることは、当業者にとって明らかとなろう。他の事例において、本発明の説明を不明瞭にさせないために周知の装置および方法の詳細な説明を省く場合もある。この細胞培養環境は、一次細胞、継代細胞系、細胞群、培養組織、接着細胞、懸濁された細胞、胚葉体などの群の中で増殖する細胞、真核細胞、原核細胞、または任意の他の細胞型などの培養物中の任意の細胞型にとって適切であり得る。
【００１４】
多くの細胞は、培養において特殊な要件を有する。これらの細胞培養の要件または優先的措置は、培養における種々の細胞形態を呈し、新生特性を変え、代謝および分泌の特性を変える細胞によって示される。例えば、胚性幹細胞は、所望の細胞型に分化させることができる化学的および／または物理的シグナルに曝露させるまで細胞が未分化状態で増殖および成長させる細胞培養条件を必要とする。例えば、適切なインビトロ環境で増殖させた心細胞は、隣接細胞と一致するように拍動する。インビボでの特性に関連したインビトロ特性を有するような培養で増殖している細胞では、細胞培養条件を慎重に調節する必要がある。
【００１５】
例えば、肝細胞は、重要なインビボ特性をインビトロで維持するために極めて特殊な細胞培養要件を有するようである。肝細胞は、肝臓の一次機能細胞であり、非常に多くの代謝、内分泌および分泌機能を実施する。肝細胞は、肝臓の６０〜８０％の細胞質質量を構成する。肝細胞は、移出用のタンパク質、コレステロール、胆汁酸塩およびリン脂質の合成において非常に活性であり、タンパク質の貯蔵および炭水化物の変換に関与する。インビボでの肝細胞は、身体からの外因性および内因性物質の解毒、または改変および排泄を担っている。
【００１６】
肝臓の再生および分化の機序を研究するために、ならびに培養における肝細胞の特性に影響を及ぼす因子を理解するために、肝細胞の一次および二次培養物が、薬理学、毒物学および生理学研究に用いられている。今まで一次肝細胞の培養では、限定された複製寿命を示していた。さらに培養で分裂させるように刺激すると、それらは、アルブミンおよびトランスフェリンを合成し、分泌させる能力などの分化機能を一般に失う。適切に培養されると、培養された肝細胞は、肝臓特異的機能を増強させる球状構造に自己組織化する。適切に培養されないと、肝細胞は平板状細胞または細胞凝集物を形成する。アルブミン分泌およびＰ４５０活性などの肝臓特異的活性のレベルは、球状よりも平板状細胞または細胞凝集物の方が低い。
【００１７】
任意の細胞型の細胞を培養する場合、好ましい細胞培養環境により、インビトロでの望ましい細胞特性が促進される。再現性があって安価な様式で提供できるような環境が望ましい。さらに、これらの望ましい環境を組み込んだ細胞培養槽を必要とする。さらに望ましい細胞培養環境を組み込んでいる細胞培養槽を製造する方法および使用する方法が必要である。
【００１８】
本発明の実施形態は、細胞培養表面、容器または槽に対するコーティングを含む。本発明の一実施形態において、このコーティングは少なくとも１種のガムに由来する。本明細書においてガムを検討する場合、用語の「ガム」は、天然の植物ガム源、組換え源、合成源、または天然源、組換え源および合成源の組合せから得られる植物ガム類または植物種子ガム類を含有する任意の組成物を含むことを、当業者は理解するであろう。さらに「ガム」は、異なる供給源からの種々のガム類ならびにさらなる成分を含有するガム組成物の混合物を含む。さらに、これらのガム類を酵素的または化学的操作により修飾して所望の化学的特性を増強させることができる。
【００１９】
天然ガム類は天然産物に見られる。植物に由来する天然ガム類の例としては、グアーガム、ローカストビーンガム（イナゴマメビーンガム、イナゴマメ種子ガム、イナゴマメガムとしても知られている）、カッシアガム、トラガカントゴム、タラガム、カラヤゴム、アカシアゴム（アラビアゴムとしても知られている）、ガティガム、チェリーガム、アンズガム、タマリンドガム、メスキートガム、カラマツガム、オオバコ、およびコロハガムが挙げられる。細菌源および藻類源に由来するガム類としては、キサンタンガム、海草ガム、ジェランガム、アガーガム、カシューガム、カラゲナンおよびカードランが挙げられる。天然ガム類には、天然ガム類と異なる供給源からの種々のガム類との混合物、ならびに本発明の実施形態において好適なコーティングを形成するために、天然供給源から採集されてから、化学的に精製、処理、修飾、調整および／または他の成分と混合したガム類が含まれることを当業者は理解するであろう。
【００２０】
天然ガム類は、植物が傷つけられた後、植物によって産生し得る植物の浸出液として生じ得る。傷つけられたガム産生植物は、傷（ガムの裂傷）に応答して浸出液を産生する。
【００２１】
この種の植物浸出液は、植物または植物種子を傷つけ、浸出液を取り出すことによって採取することができる。次いでこれらの浸出液を、塵埃、きょう雑物および他の不純物を除去して清浄にすることができる。浸出液は、乾燥し、粉末化し、液体中に懸濁させることができる。さらなる処理ステップとしては、酵素処理、ろ過、遠心分離、加水分解および他の化学修飾を挙げることができる。
【００２２】
植物ガム類は、植物種子由来でもよい。種子由来ガム類としては、グアー（キアモプシス・テトラゴノロバ（Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａ））、ローカストビーンまたはイナゴマメビーン（セラトニア・シリクア（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ））、タラ（カエサルピニア・スピノザ（Ｃａｅｓａｌｐｉｎｉａ  ｓｐｉｎｏｓａ））、コロハ（トリゴネラ フォエヌム・グラエクム（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ  ｆｏｅｎｕｍ−ｇｒａｅｃｏｍ））、メスキートガム（プロソピス属（Ｐｒｏｓｏｐｉｓ  ｓｐｐ））およびカッシアガム（カッシア・トーア（Ｃａｓｓｉａ  ｔｏｒａ））が挙げられる。これらは一般に亜熱帯植物である。
【００２３】
ガム類は、一般に種子の胚乳に由来する。種子の殻および胚芽の除去後、胚乳を粉砕する。得られた粉体（粉末）は、水および／または他の成分と混合した際に液体ガム物質を形成し得る高多糖含量を含有することができる。粉末ガムと液体とを混合した際に形成される懸濁液は、セルロース、他の植物物質、および種々の化学不純物などの不純物を含有し得る。この懸濁液を処理してガム懸濁液の純度を増大させることができる。例えば、この液体に、遠心分離、ろ過、加熱、凍結融解サイクルを実行して不純物を除去することができる。本発明の一実施形態は、これらのステップの１つによって、または当該技術分野において公知の他の手段によって精製されたガムを含む。本発明の一実施形態は、精製されたガムを含む。本発明のさらなる複数の実施形態は、精製された植物ガム類、天然ガム類およびガラクトマンナンガム類を含む。
【００２４】
粉末ガムの原材料はまた、粒径に従って精製またはろ過することができる。例えば、粒径に従って粉末ガム材料を分離するために、篩いを用いることができる。２５０μｍ、１０６μｍ、５３μｍ、３８μｍおよび２５μｍの粒径篩い目を用いて粉末ガム材料を分離し、１０６μｍと２５０μｍとの間、５３μｍと１０６μｍとの間、３８μｍと５３μｍとの間、２５μｍと３８μｍとの間の粒子のろ過された粒径混合物を作製することができる。これらの分離された粒径、またはこれらの粒径の混合物を用いて本発明の細胞培養コーティングの実施形態を得ることができる。
【００２５】
植物ガム類は、何世紀もの間使用されてきた。古代エジプト人は、ミイラの包装を結合させるためにローカストビーンガムを用いた。植物ガム類は、増粘、冷凍食品における氷晶の形成防止、パリパリ感の保持、水分の保持、温度許容性およびｐＨ許容性など、優れた性質のために食品添加物として広く商業的に使用されている。植物ガム類は、増粘剤、水和剤、および乳化剤また泡安定剤として化粧品産業に使用されている。幾つかのガム類、例えば、ガラクトマンナンガム類は非イオン性であり、したがって、イオン強度またはｐＨによって影響を受けない。ガム類は、極端なｐＨおよび温度で分解する。一般にこれらの条件は細胞培養中に存在せず、したがって細胞培養適用時での懸念とはならない。
【００２６】
ガム材料は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｌｕｋａ、ＴＩＣ−Ｇｕｍｓ  Ｉｎｃ．（メリーランド州ベルキャンプ）、Ｇｕｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＨｅｒｃｕｌｅｓ（旧Ａｑｕａｌｏｎ  Ｉｎｃ．（デラウェア州ウィルミントン））などの化学製品供給会社から購入できる。これらのガム類は、食品添加物として、ならびに工業的応用のために使用されているので、これらの材料は、実験室使用に必要とされ得るよりも純度の低い形態で提供され得る。したがって、さらなる精製ステップならびにさらなる処理が必要とされ得る。精製ステップとしては、例えば、水よりも極性の低い溶媒、例えば、エタノール中の抽出を挙げることができる。しかしながら、下記の実施例において、精製および非精製双方の材料を利用して好都合な結果が得られた。
【００２７】
ローカストビーンガムは、以下の式：
式１
【化１】
2010520765.tif 000003
【００２８】
のガラクトマンナン多糖である。
【００２９】
ローカストビーンガム（ＬＢＧ）は、α−Ｄ−ガラクトース残基に結合した６位からの枝分かれ部位を有するマンノピラノース主鎖からなるガラクトマンナン多糖である。ローカストビーンガムは、ガラクトース残基ごとに約４つのマンノース残基（マンノース／ガラクトース比が約４）を有する。ガラクトマンナンガム類としては、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、グアーガム、カッシアガム、タラガム、メスキートガム、およびコロハガムが挙げられる。グアーガムはまた、マンノピラノース主鎖からなるガラクトマンナン多糖である。しかしながら、グアーガムは、ローカストビーンガムよりもガラクトース枝分かれ部位が多い。グアーガムは、約２のマンノース／ガラクトース比を有する。マンノース／ガラクトース比は、メスキートガムおよびコロハガムに関しては約１：１、タラガムに関しては約３：１およびカッシアガムに関しては約５：１である。この構造における相違により、グアーガムはローカストビーンガムよりも高い粘性を有し、より可溶性となる。すなわち、ローカストビーンガムは、ガラクトース置換の低いガラクトマンナン化合物であり、したがって「硬さが低い」。マンノース／ガラクトース比が大きくなるにつれて、ガムの粘性および溶解性が低くなる。したがって、マンノース／ガラクトース比がより高いガム類は剛性がより少なく、より可撓性であり、一方、マンノース／ガラクトース比がより低いガム類は、より良好に溶解、分散および乳化に供される。ローカストビーンガムは、グアーガムよりも大きな可撓性（低い弾性率）を有する。これらガム類のより高いガラクトース置換により、可溶性、分散性および乳化の改善がガム類に与えられる。より高いガラクトース置換により、ガラクトマンナン多糖類はより硬くなる。より高い置換により、より高い粘性およびより高い可溶性のガム特性が与えられる。
【００３０】
ガラクトマンナンガム類は、ガラクトマンナン多糖類である天然源、または組換えもしくは合成源に由来し得るガム類である。また、ガラクトマンナンガム類は、酵素的処理、ろ過、遠心分離、加水分解、凍結融解サイクル、加熱および化学的処理または修飾を含み得る工程によって精製または処理あるいは修飾されるガム類、ガラクトマンナンガム類と他のガラクトマンナンガム類または非ガラクトマンナンガム類との混合物、ならびにガラクトマンナンガム類と本発明のコーティングの実施形態において細胞培養特性を最適化する他の成分との混合物を含む。
【００３１】
ガラクトマンナンガム類などのガム類は、組換え源または合成源由来であり得る。例えば、ガラクトマンノースは、酵素マンナンシンターゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼによってＧＤＰ−マンノースとＵＤＰ−ガラクトースとからインビボで合成することができる。これらのタンパク質をコードするＤＮＡは単離され、特性化されており（参照として米国特許出願公開第２００４／０１４３８７１号明細書）、これらの酵素で形質転換された組換え植物は、レベルの上昇したガラクトマンナンを発現させることが示されている。さらに、マンノピラノース主鎖のガラクトシル化の程度は、インビボでのアルファ−ガラクトシダーゼの存在（または不在）によって影響を及ぼし得る（Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（２００４）１３４：１１５３−１１６２頁を参照）。アルファ−ガラクトシダーゼは、マンノピラノース主鎖からガラクトース残基を除去する。例えば、より低い程度のガラクトシル化を有するガラクトマンナン類を天然に発現する種子は、これら植物種においてマンノピラノース主鎖からガラクトース部分を除去するアルファ−ガラクトシダーゼを発現し得る（またはより多く発現し得る）。アルファ−ガラクトシダーゼ酵素を使用すると、天然ガラクトマンノースガムの特性に関する実験室操作において、天然ガラクトマンノースガム類のマンノピラノース主鎖上のガラクトースの存在を減じさせることができる。本発明の実施形態は、マンノピラノース主鎖上のガラクトースの存在を減じさせるアルファ−ガラクトシダーゼで処理された天然ガム類およびガラクトマンノースガム類などのガム類を含む。本発明の実施形態は、細胞培養表面用のコーティングとして所望の特性をガムに提供するようにガム類を「調整」するために、アルファ−ガラクトシダーゼまたは他の酵素あるいは化学的処理により処理されたガム類を含む。
【００３２】
いずれの特定の理論にも拘束されないが、マンノース主鎖およびガラクトース側鎖を有するガラクトマンナンガム類は、ガラクトース部分を培養細胞に提示する細胞培養用表面コーティングを提供すると本発明者らは考えた。幾つかの細胞型に対して、これらのガラクトース部分は、培養中の細胞増殖を促進させる表面または増殖ベッドを提供することができる。
【００３３】
培養肝細胞は、培養時のガラクトースの存在に対して都合よく応答することができる。ガラクトース部分の密度と配向性により、細胞培養基体に対する肝細胞などの細胞の付着を制御することができ、インビトロでの細胞機能を改善することができる。これは、インテグリンのクラスター形成阻害および／または細胞−基体および細胞間相互作用の制御によって生じ得る。肝細胞の表面上のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に対する特異的なリガンドとしての多価ガラクトースの結合は、広く研究されており、生存度を維持しながら肝細胞の接着を改善することが示されている。ＡＳＧＰＲは、接着受容体として生理学的に機能しないが、基体への一次肝細胞の選択的接着を誘導するためにガラクトース含有ポリマー類が使用されている（Ｗｅｉｇｅｌ，ＰＨ．「Ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｖｉａ  ａ  ｐａｔｃｈ  ｏｆ  ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８０年；８７；８５５−６１頁；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ａら、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈｅｓ  ｃｏａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌａｃｔｏｓｅ−ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｓｔｙｒｅｎｅ  ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ」。Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９８６年；７：６４５−５０頁およびＧｕｔｓｃｈｅ  ＡＴら「Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：３Ｔ３  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ａｎｄ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ  １９９４年；４３：８０１−９頁）。
【００３４】
肝細胞の細胞間相互作用は、培養中の肝細胞の球状凝集物の形成促進をもたらす可能性があり、次に胆細管の形成、ギャップ結合、密着結合、およびＥ−カドヘリンを促進させて、肝細胞機能の増強、および肝細胞培養性能の改善をもたらすことができる。
【００３５】
本発明の実施形態は、ガム化合物から作製された細胞培養コーティングの物理的および化学的特性を最適化するために修飾できるガム化合物を含む。本発明の細胞培養コーティングの物理的および化学的特性は、ガム材料を化学的に修飾することによって「調整する」ことができる。本明細書に用いられる「調整する」または「調整できる」とは、所望の細胞培養環境を促進する細胞培養基体を提供するために、材料の物理的または化学的特性を調整して、天然または合成的に得られたガム材料を物理的また化学的に修飾できることを意味する。この細胞培養基体は、特定の目的のために特定のタイプの細胞培養培地中で増殖する特定の細胞型用の好ましい細胞培養環境を提供するために調整することができる。コーティング材料の多孔性を変え、コーティングの弾性率を変え、電荷密度と分布、表面エネルギー、トポロジーおよび多孔性を変えることによって、またはマトリックスの他の物理的特性を変えることによって、材料の物理的特性を変えることができる。材料中に化学架橋剤を与え、特定のマトリックス材料から化学基を添加または除去し、異なるガム物質を一緒に混合し、細胞培養環境に存在する受容体リガンドのタイプと密度を変えることによって、または他の化学修飾によって、材料の化学的特性を変えることができる。本発明の実施形態において、化学修飾により物理的特性を変えることができ、物理修飾は化学修飾を含むことができる。本発明の細胞培養表面コーティングの実施形態は、例えば：天然または合成材料の弾性率を変えることにより、マトリックスを提供するために用いられる凍結融解条件を変えることにより、材料の多孔性を変えることにより、多糖化合物を架橋することにより、複数のガム化合物を一緒に混合することにより、コーティング材料中のガム材料にさらなる化合物を添加することにより、コーティング中の多糖ガム材料の主鎖上に存在する側鎖の数または性質を変えることにより、側鎖を置換することにより、材料の化学的性質を変えるための酵素処理することによって、または任意の他の方法によって調整することができる。本発明の実施形態は、調整可能な細胞培養コーティングを含む。本発明のコーティング材料の実施形態を「調整する」ことができるかまたは「調整可能」である。
【００３６】
本発明の実施形態において、多糖細胞培養表面コーティングにおけるガラクトース側鎖の数と性質を変えることができる。この修飾は、ガラクトースが存在する多糖ベースのマトリックスの性質に影響を及ぼす。例えば、本発明の複数の実施形態において、ガラクトマンナン多糖ガム細胞培養表面コーティングからガラクトース多糖側鎖を添加および除去することによって、ガラクトマンノース多糖中の１ガラクトース当りのマンノース基の数を変えることによって、および／またはこれらの側鎖の性質を変えることによって、ガラクトマンナン多糖コーティングを含む多糖細胞培養表面コーティングを調整可能である。
【００３７】
別の実施形態において、細胞培養表面コーティングを処理するかまたは調整して物理的に架橋された系を作製している。架橋されたガムは、ゲル、ヒドロゲル、フィルムまたはヒドロフィルムであり得る物理的ゲルである。ヒドロフィルムは、薄く透明またはほぼ透明なコーティングである。物理的および化学的処理により、細胞培養表面コーティングを架橋させることができる。物理的処理は、加熱、冷却および凍結融解の加熱と冷却のサイクルなど、特定の温度範囲への曝露を含む。ローカストビーンガムの溶液は、低温処理（凍結融解サイクル）下でゲル化する。これらの凍結融解サイクルにより、物理的ゲルまたは物理的に架橋されたネットワークが作製される。室温に維持された場合、ローカストビーンガムの溶液は、流体のままである。長期（２〜３ヵ月）貯蔵後、この溶液は弱い物理的ゲルを形成する。本発明の実施形態は、物理的なゲルを形成するために処理または調整されたガム溶液を含む。
【００３８】
本発明の実施形態は、細胞培養表面の弾性率を変えることができる化学的架橋化学を用いて、ポリマーコーティングの弾性率を変えるために調整されている細胞培養表面コーティングを含む。架橋方法としては、ＵＶ誘導架橋、および化学的架橋が挙げられる。ホウ砂（水素化ホウ素ナトリウム）、グルタルアルデヒド、エポキシ誘導体などの化学薬品、および当該技術分野において知られた他の方法を使用することができる。ゲル化または架橋反応を開始させるために、ガムまたはガム類のブレンドに化学的に結合させた光開始剤をガムに用いることができるＵＶ架橋方法もまた使用できる。本発明の調整されたガム類の実施形態は、処理ガムから作製された細胞培養表面コーティングの細胞培養特性を改善するために、遠心分離、ろ過、加熱、凍結、凍結融解、化学的または酵素的処理、露光あるいは他の様式で変化させたガム類である。本発明の調整されたガム類はまた、ゲル、ヒドロゲル、フィルムまたはヒドロフィルム形態にあるガム類を含む。さらに、本発明の調整されたガム類は、遠心分離、ろ過、加熱、凍結、凍結融解、化学的または酵素的処理、露光あるいは他の様式で変化させたガラクトマンナンガム類、ならびに細胞培養用コーティングとして使用するためのゲル、ヒドロゲル、フィルムまたはヒドロフィルム形態にあるガラクトマンナンガム類を含む。さらに、本発明の実施形態は、滑らかではないが、細胞培養表面上にガム材料の「バンプ」または「ペレット」であるコーティングを含む。
【００３９】
本発明の実施形態は、ガム類の混合物を含む。ガム類の混合物は、架橋ゲル組成物を形成することができる。例えば、寒天またはカードランのようなゲル化反応を有するキサンタンガムまたはカラゲナンまたは中性多糖類などの荷電多糖類は、室温でゲルを形成するブレンドを形成するためにガラクトマンナンガム類と混合することができる。
【００４０】
本発明の実施形態はまた、コーティングの荷電特性を変えるように調整された細胞培養表面コーティングを含み、これはコーティング中の線状または分枝状荷電多糖類をブレンドして荷電を変えることによって達成できる。キサンタンガムまたはカラゲナンのような荷電多糖類を天然ガム（類）と混合してブレンドを形成する。ガラクトマンナンガム類とカラゲナンおよびキサンタンガム（荷電多糖類）などの他のガム類との組合せは、相乗的相互作用が可能である。ローカストビーンガムと組み合わせたこれらのガム類は、冷却（凍結融解）処理なしで熱可逆性軟弾性ゲルを形成する。室温ゲル化のために最適な相乗作用には、ローカストビーンガム（５０：５０）と比較して、グアーガムをより大きな割合（８０：２０）にすることが必要である。複数の実施形態において、本発明は、７０：３０から９０：１０の範囲のグアーガム；荷電多糖の混合物、および４０：６０から６０：４０の範囲のローカストビーンガム；荷電多糖の混合物を提供する。
【００４１】
別の実施形態において、細胞培養親和的コーティングを形成するために、少なくとも２つのタイプのガム多糖類混合物（またはブレンド）を、基体表面をコーティングするために使用することができる。これらのガム多糖材料を個々にまたはこれら多糖類の任意の組合せの混合物で基体をコーティングすることにより、ガラクトースまたは他の多糖部分の様々な量を提供するマトリックスを得ることができる。少なくとも２種のガムの混合物またはブレンドとしては、例えば、以下の：グアーガム、ローカストビーンガム（イナゴマメビーンガム、イナゴマメ種子ガム、イナゴマメガムとしても知られている）、カッシアガム、トラガカントゴム、タラガム、カラヤゴム、アカシアゴム（アラビアゴムとしても知られている）、ガティガム、チェリーガム、アンズガム、タマリンドガム、メスキートガム、カラマツガム、オオバコ、およびコロハガムなど、任意の２種以上のガム類混合物を挙げることができる。細菌源および藻類源由来のガム類としては、キサンタンガム、海草ガム、ジェランガム、アガーガム、カラゲナンおよびカードランが挙げられる。
【００４２】
代わりの実施形態において、本発明は、多糖ガムマトリックスの物理的性質をさらに調整する方法を提供する。一実施形態において、従来の架橋方法を使用して弾性および表面エネルギー（すなわち、親水性）を変えた多糖マトリックスを製造する。架橋方法としては、物理的架橋、ＵＶ誘導架橋、および化学的架橋が挙げられる。別の実施形態において、キサンタンガムまたはカラゲナンのような荷電多糖類を天然ガム（類）と混合してブレンドを形成する。生じたブレンドを用いて、肝細胞培養などの細胞培養のために電荷密度を制御したマトリックスを形成する。別の実施形態において、寒天またはカードランなどのゲル化反応を有する線状中性多糖類を、天然分枝状多糖（類）と混合してブレンドを形成する。生じたブレンドを用いて、長期細胞培養のための弾性率および安定性などの材料特質を有するマトリックスを形成する。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態は、ゲル、ヒドロゲル、フィルムまたはヒドロフィルムである材料を含む。この材料は不透明から透明であり得る。不純物を含有する未処理および／またはより高濃度のガム材料は、細胞培養表面上で不透明なコーティングを形成し得るが、より加工された材料および／またはより低濃度の（すなわち、遠心分離、ろ過、または化学的に精製された）材料は、より透明なコーティングを形成し得る。細胞培養槽への溶液の適用前のガム材料の溶液中の濃度により、材料がゲルか、ヒドロゲルか、フィルムかまたはヒドロフィルムかどうかが決まる。ヒドロゲルまたはヒドロフィルムは、構造中に水分がより多くあるゲルまたはフィルムであり得る。
【００４４】
複数の実施形態において、本発明の細胞培養コーティングは、薄いコーティングである。すなわち、このコーティングは、厚さが２ｍｍ未満、１ｍｍ未満、０．５ｍｍ未満、０．２５ｍｍ未満、０．１ｍｍ未満、または０．０５ｍｍ未満であり得る。例えば、ローカストビーンガムの７．５ｍｇ／ｍｌ溶液（０．７５％溶液）から作製されたコーティングは、湿潤時は約４０μｍの厚さ、また、乾燥時は約２０μｍの厚さが測定された。これらの測定値は、多部位から採取された平均測定値であり得る。本発明の細胞培養コーティングは、材料の厚い層から見分けられる薄いコーティングである。開示されたものよりも厚いコーティングは、基体に粘着できない厚さの範囲である。すなわち、水性媒体が本発明の細胞培養コーティングの実施形態を含有する細胞培養槽に導入されると、より厚いコーティングは基体から離層して浮遊する可能性がある。さらに、本発明の複数の実施形態において、細胞培養コーティングは、細胞培養槽の増殖表面にわたる連続コーティングである。すなわち、細胞培養コーティングは、細胞培養槽の壁から壁へと延在し得る。本発明の細胞培養コーティングの実施形態は、溝または中空を有してはならない。図１は、底面１０１、壁１０４を有する細胞培養槽１００、および本発明の細胞培養表面コーティング１０２の実施形態を示す図である。本発明の細胞培養表面コーティング１０２は、細胞が定置および増殖できる細胞培養表面１０３を有する。複数の実施形態において、この細胞培養表面コーティング１０２は、肝細胞などの接着細胞の増殖に好適である表面１０３を提供する。これらの細胞培養表面コーティング１０２が、何らかの表面トポロジーを有することができるが、複数の実施形態において、これらの表面は比較的平坦であり得る。
【００４５】
本発明の実施形態には、細胞培養基体または表面または槽あるいは容器を形成するプラスチックまたはポリマー基体が含まれ、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリオレフィン、環式ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリメチルペンテン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリスチレンコポリマー類（例えば、ＳＡＮおよびＡＢＳ）、ポリプロピレンコポリマー類、エチレン／ビニルアセテートコポリマー、ポリアミド類、フルオロポリマー類、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン類、およびシリコーン、炭化水素などのエラストマー類、フッ化炭素エラストマー類または任意の他の好適な表面を含むかまたはそれらから構成されるものを含む。さらなる実施形態には、例えば、プラズマで処理されたプラスチックまたはポリマー基体が含まれる。
【００４６】
本発明の実施形態は、細胞培養の表面または槽または容器を形成する無機基体を含み、金属、半導体材料、ガラスおよびセラミック材料などの無機材料を含むか、またはそれらから構成されたものを含む。表面または基体の材料として使用することのできる金属の例としては、金、白金、ニッケル、パラジウム、アルミニウム、クロム、鋼鉄およびガリウム砒素の酸化物が挙げられる。基体または表面の材料に使用される半導体材料としては、シリコンおよびゲルマニウムを挙げることができる。表面または基体の材料に使用できるガラスおよびセラミックの材料としては、石英、ガラス、陶材、アルカリ土類金属アルミノホウケイ酸ガラス、および他の混合酸化物を挙げることができる。無機基体材料のさらなる例としては、黒鉛、セレン化亜鉛、雲母、シリカ、ニオブ酸リチウム、および無機単結晶材料が挙げられる。
【００４７】
本発明の実施形態には、実験器具または細胞培養槽の任意の部分が、本発明の細胞培養コーティングでコーティングされている、基体または基体の組合せから作製された実験器具または細胞培養槽が含まれる。実験器具としては、スライド、細胞培養プレート、多ウェルプレート、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、１３６ウェルプレート、フラスコ、多層フラスコ、バイオリアクター、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄにより製造されたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）などの細胞培養挿入器具、および細胞培養に有用な他の表面または容器または槽が挙げられる。
【００４８】
本発明の代替実施形態としては、限定はしないが、幹細胞、委任幹細胞、分化細胞、および腫瘍細胞などの細胞の培養に用いられるガムまたは天然ガムまたはガラクトマンナンガムでコーティングされた細胞培養表面が挙げられる。幹細胞の例としては、限定はしないが、胚性幹細胞、骨髄幹細胞および臍帯幹細胞が挙げられる。種々の実施形態に用いられる細胞の他の例としては、限定はしないが、筋芽細胞、神経芽細胞、線維芽細胞、グリア芽細胞、生殖細胞、肝細胞、軟骨細胞、ケラチノサイト、平滑筋細胞、心筋細胞、結合組織細胞、グリア細胞、上皮細胞、内皮細胞、ホルモン分泌細胞、免疫系の細胞、およびニューロンが挙げられる。一態様において、破骨細胞、骨細胞および造骨細胞などの骨の細胞は、本明細書において作製されたコーティング基体と共に培養することができる。
【００４９】
本明細書において有用な細胞は、インビトロで培養できるか、天然源由来であり得るか、遺伝子工学的に、または他の任意の手段により作製できる。任意の出所源の細胞が使用できる。腫瘍細胞などの非典型的な、または異常な細胞もまた本明細書において使用することができる。本明細書に記載されたコーティング基体上で培養される腫瘍細胞は、薬物治療の評価のために、体内の固有な腫瘍環境のより正確な提示を提供できる。本明細書に記載された基体上での腫瘍細胞の増殖により、インビボ様環境における遺伝子発現、受容体発現、およびポリペプチド産生など、生化学的経路および腫瘍の活性の特性化を促進することができ、腫瘍を特異的に標的化する薬物の開発を可能にする。
【００５０】
遺伝子操作された細胞もまた使用することができる。操作には、1つ又は複数の遺伝子を発現させる、1つ又は複数の遺伝子を抑制する、または双方のために、細胞をプログラミングすることを含む。遺伝子操作は、例えば、細胞へ、または細胞からの遺伝子材料の付加または除去、既存の遺伝子材料の変更、または双方を含むことができる。ある遺伝子を発現させるために細胞にトランスフェクトするか、または他の操作を行う実施形態では、一時的にまたは永久的にトランスフェクトした遺伝子、または双方を使用することができる。遺伝子配列は、完全長でも部分長でもよく、クローン化したものでも天然のものでもよい。
【００５１】
肝細胞は本明細書において例示的な細胞型として示されている。肝細胞を示しているが、他の任意の細胞または細胞型を、本発明の実施形態を用いて培養液中で増殖させることができる。一次および二次肝細胞の長期の細胞培養は一般に、経時的にそれらの生理学的な特徴を失う細胞を生じさせるため、肝細胞は重要な細胞培養上の問題を表す。一次肝細胞は、付着依存性の細胞であり、インビトロで維持することがきわめて難しく、単層または懸濁液中で培養すると、それらの成体肝臓形態および分化機能を失う。複雑な肝細胞微小環境に基づいていくつかの細胞培養モデルが現在研究されている。これらには、細胞外マトリックス中の種々の成分の試験、低濃度のホルモン、副腎皮質ステロイド、サイトカイン類、ビタミン類、またはアミノ酸の添加による培地の修飾、およびホモタイプ（肝細胞−肝細胞）とヘテロタイプ（肝細胞−非実質性細胞）双方の細胞間相互作用の理解が含まれる。これら全てにより、肝細胞の機能およびインビトロ増殖は細胞間および細胞−マトリックスの相互作用を介する細胞付着、細胞形状および細胞拡散により調節されること、ならびにインビトロでの肝細胞の挙動は培養培地および細胞培養の基体によって改変できることが示されている。肝細胞のような培養することが困難な細胞に、非動物由来の材料および好適な培養培地の使用によって達成される、一次および二次培養において細胞がインビボ特異的な機能（肝細胞の場合は肝特異的機能）を維持することを可能にする環境を提供する細胞培養条件を開発することが望ましい。例えば、組織培養処置（ＴＣＴ）ポリスチレンなどの未処置の通常ポリスチレン２Ｄ表面上では、肝細胞は平板状形態、高い増殖速度および低い肝細胞特異的機能を示す。それと比較して、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｏｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上では、培養肝細胞は、球状構造、中等度／低度の増殖速度および高い肝細胞特異的機能を示す（データは示していない）。
【００５２】
例えば、本発明の細胞培養表面コーティングの実施形態を調整して、肝細胞または他の細胞型による球状形態またはコロニーの細胞培養物の形成を促進し、より機能性のインビボ様細胞の培養物を誘導する条件を作出することができる。これらの調整された細胞培養表面コーティングは、肝細胞において細胞間相互作用（例えば、胆細管の形成、細胞骨格の配置）および肝特異的細胞機能（例えば、アルブミン産生）の維持を促進できる。例えば、種々のガラクトース置換を用いることによって、得られるマトリックスの固さおよび溶解性を制御または調整することができる。置換の程度が高いほど、より固くなり、溶解性、分散性および乳化がより良好になる（すなわち、可撓性が低下）。本発明の実施形態により、生存の延長する（分化状態で）よりインビボ様の肝細胞培養のための多糖マトリックスが提供される。
【００５３】
本発明の実施形態は、少なくとも１つの生体活性分子を含む細胞培養表面コーティングを含む。生体活性分子の包含により、細胞の接着、増殖または生存を促進することができる。あるいは、生体活性分子の包含により、培養中の細胞の機能を改善させ得る。生体活性分子としては、ヒトまたは家畜の治療薬、栄養剤、ビタミン類、塩類、電解質、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、多糖類、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、成長因子、分化因子、ホルモン、神経伝達物質、フェロモン、カローン、プロスタグランジン、免疫グロブリン、モノカインおよび他のサイトカイン、湿潤剤、ミネラル、電気的または磁気的に反応性の物質、感光性の物質、抗酸化剤、細胞エネルギー源として代謝できる分子、抗原、および細胞応答または生理学的応答を生じさせることのできる任意の分子が挙げられる。分子の任意の組合せ、ならびにこれらの分子のアゴニストまたはアンタゴニストを用いることができる。グリコアミノグリカンとしては、糖タンパク質、プロテオグリカン、およびヒアルロナンが挙げられる。多糖類としては、セルロース、澱粉、アルギン酸、キトサン、またはヒアルロナンが挙げられる。サイトカインとしては、限定はしないが、カルジオトロフィン、間質細胞由来因子、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、黒色腫成長刺激活性（ＭＧＳＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ−１アルファ）、２、３アルファ、３ベータ、４および５、インターロイキン（ＩＬ）１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＮＦアルファ、およびＴＮＦベータが挙げられる。本明細書に有用な免疫グロブリンとしては、限定はしないが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびこれらの混合物が挙げられる。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、このような分子の任意のサイズおよび複雑性を有する任意のタイプ、ならびにこのような分子の組合せを含み得る。例としては、限定はしないが、構造タンパク質、酵素、およびペプチドホルモンが挙げられる。これらの化合物は、調製される際にガム化合物と混合するか、または細胞培養表面に適用した後に細胞培養コーティングの表面に付加することができる。
【００５４】
生体活性分子という用語には、線維性タンパク質、接着タンパク質、接着性化合物、脱接着性化合物、およびターゲティング化合物もまた含まれる。線維性タンパク質にはコラーゲンおよびエラスチンが含まれる。接着／脱接着化合物には、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンジンおよびテナシンＣが含まれる。接着性タンパク質には、アクチン、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、セレクチン、細胞内接着分子１、２、および３、ならびに限定はしないが、α５β１、α６β１、α７β１、α４β２、α２β３、およびα６β４などのインテグリンを含む細胞マトリックス接着受容体が含まれる。
【００５５】
生体活性分子という用語にはまた、レプチン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ＲＧＤペプチド、腫瘍壊死因子アルファおよびベータ、エンドスタチン、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、骨形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質２および７、オステオネクチン、ソマトメジン様ペプチド、オステオカルシン、インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファＡ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロン１アルファ、ならびにインターロイキン２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７および１８も含まれる。
【００５６】
本明細書に用いられる「成長因子」という用語は、細胞または組織の増殖を促進する生体活性分子を意味する。本明細書に有用な成長因子としては、限定はしないが、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦアルファ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦベータ）、ＡＡ、ＡＢおよびＢＢイソ型を含む血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽成長因子（ＦＧＦ）酸性イソ型１および２、ＦＧＦ塩基性型２、ならびにＦＧＦ４、８、９および１０を含む線維芽成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）２．５ｓ、ＮＧＦ７．０ｓ、およびベータＮＧＦを含む神経成長因子（ＮＧＦ）およびニューロトロフィン類、脳由来神経栄養因子、軟骨由来因子、骨成長因子（ＢＧＦ）、塩基性線維芽成長因子、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、毛管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＥＧ−ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ関連タンパク質、Ｂｖ８、ＶＥＧＦ−Ｅ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）ＩおよびＩＩ、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、グリア神経栄養成長因子（ＧＤＮＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）アルファ、ベータ、ベータ１、ベータ２およびベータ３を含む形質転換成長因子（ＴＧＦ）、骨格成長因子、骨マトリックス由来成長因子および骨由来成長因子ならびにそれらの混合物が挙げられる。いくつかの成長因子は、細胞または組織の分化を促進することもできる。例えばＴＧＦは、細胞または組織の成長および／または分化を促進することができる。いくつかの好ましい成長因子としては、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＦＧＦｂ、ＦＧＦａ、ＨＧＦ、およびＢＧＦが挙げられる。
【００５７】
本明細書に用いられる用語「分化因子」とは、細胞または組織の分化を促進する生体活性分子を意味する。この用語には、限定はしないが、ニューロトロフィン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、または形質転換成長因子が含まれる。ＣＳＦには、顆粒球−ＣＳＦ、マクロファージ−ＣＳＦ、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、およびＩＬ−３が含まれる。いくつかの分化因子は、細胞または組織の増殖を促進することもできる。例えば、ＴＧＦおよびＩＬ−３は、細胞の分化および／または増殖を促進できる。
【００５８】
本明細書に用いられる用語「接着性化合物」は、線維表面への細胞または組織の付加を促進する、接着性化合物を含む生体活性分子を意味する。接着性化合物の例としては、限定はしないが、フィブロネクチン、ビトロネクチン、およびラミニンが挙げられる。
【００５９】
本明細書に用いられる用語「脱接着性化合物」とは、線維からの細胞または組織の脱離を促進する、脱接着性化合物を含む生体活性分子を意味する。脱接着性化合物の例としては、限定はしないが、トロンボスポンジンおよびテナシンＣが挙げられる。
【００６０】
本明細書に用いられる用語「ターゲティング化合物」とは、線維への細胞または組織の動員および／または付加を誘導するシグナル伝達分子として機能する、ターゲティング化合物を含む生体活性分子を意味する。ターゲティング化合物およびそれらの同族受容体の例としては、フィブロネクチンおよびインテグリン由来のＲＧＤペプチドなどの付加ペプチド、ＥＧＦおよびＥＧＦ受容体などの成長因子、ならびにインスリンおよびインスリン受容体などのホルモンが挙げられる。
【００６１】
別の態様において、細胞または細胞系と因子または薬物との間の相互作用を判定する方法を本明細書に記載しており、本方法は（ａ）本明細書に記載されたコーティング基体上に細胞を堆積させること；（ｂ）堆積細胞と因子とを接触させること；および（ｃ）因子と接触させた際の堆積細胞によって生じた応答を特定すること、を含む。
【００６２】
薬物が固定化された細胞と相互作用する場合、コーティングされた基体上に固定化された既知の細胞系によって、幾つかの薬物の活性をスクリーンすることは可能である。試験される細胞と薬物に依り、種々の技法を用いて、細胞―薬物相互作用を検出し、測定することができる。例えば、細胞は、薬物を代謝して容易に検出できる代謝物を産生することができる。あるいは、薬物は、細胞を誘導してタンパク質または他の生体分子を産生させることができる。本明細書に記載された基体は、生体外環境における細胞のインビボの性質をより密に模倣するような環境を細胞に提供する。
【００６３】
薬剤／細胞相互作用を分析するために、基体はハイスループット適用で用いることができる。ハイスループット適用に用いられるマルチウェルプレート内の本発明のコーティングにおいて、細胞を増殖させることができる。次いで、細胞を薬剤に曝露し、これらのハイスループット培養液から培地を取り出し、取り出した培地を代謝物、タンパク質または他の生体分子の存在に関して分析することができる。１ウェル当たりの細胞集団を増加すること、または培養液中の細胞のインビボ様性質を増大させることは、これらの技法によって測定されるシグナル価値の増大に役立ち得る。
【００６４】
本発明の実施形態はまた、化合物の毒性評価、化合物の代謝、およびタンパク質合成に使用するための生体−人工肝臓として使用できる肝細胞培養物も含む。肝細胞は、薬剤および殺虫剤などの外因性化合物、ならびにステロイドなどの内因性化合物を代謝、解毒、および不活性化する能力を有する。ホメオスタシスを維持し、摂取された毒素に対して身体を防御するために、肝臓内への腸静脈血の排液には、様々な吸収された物質の効率的な解毒が必要である。肝細胞の解毒機能の１つは、排泄に関してアンモニアを尿素に改変することである。
【００６５】
別の態様において、（ａ）本明細書に記載されたコーティング基体上に親細胞のセットを堆積させること、および（ｂ）細胞増殖を促進させるために堆積細胞を有するコーティング基体を培養すること、を含む細胞または組織を増殖させる方法が記載されている。さらなる態様において、（ａ）細胞を細胞培養槽に導入するステップと；（ｂ）細胞培養培地を添加するステップと；（ｃ）細胞をインキュベートするステップと；を含む細胞培養コーティング槽を用いる方法が本明細書に記載されている。本明細書で製造されたコーティング基体上に生存細胞を堆積させ、組織増殖を促進させる条件下で培養できることが考慮されている。本明細書で製造されたコーティング基体により、上記の任意の細胞から増殖された（すなわち、操作された）組織が考慮されている。これらのコーティングされた基体は、種々の多くの前駆体細胞を支持することができ、これらの基体は、新たな組織の発現を誘導することができる。組織の生成は、創傷治癒に多数の適用を有する。組織の増殖はインビボまたはエクスビボで実施することができる。
【００６６】
肝細胞と同様に、培養物中の他の細胞型も、好ましくてよりインビボ様の細胞培養状態として、球状の細胞形態をとる。したがって、本発明の細胞培養表面コーティングの実施形態は多くの細胞型に使用できる。本発明は、肝細胞により示された「球状」形態を、自身の機能様式として好む細胞型および他の細胞型に用いることもできる。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例は、本発明の実施形態を実際に示すために含めたもので、本発明の範囲を限定する意図は決してない。以下の実施例に開示された技法は、本発明の実施において十分に役立つ本発明者によって用いられた技法を表すことが当業者には当然理解されるはずである。しかし、本開示に鑑みて、開示されている特定の実施形態において多くの変更をなし得、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく類似の、または同様な結果が得られることもまた当然理解されるはずである。
【００６８】
実施例１：コーティング調製
実施例１ａ．ローカストビーンガム
秤量した量のローカストビーンガム（ＬＢＧ）粉末（白色〜ベージュ色）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ０７５３、ロット番号１２５Ｋ００９１またはカタログ番号６２６３１、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ロット番号１３０１４５２、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄからも入手可能、Ａｑｕａｌｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（デラウェア州ウィルミントン）を脱イオン水に分散させ、０．１〜５重量％の溶液ならびに１〜２重量％の溶液を形成しｐＨを７に調整した（しかしながらｐＨ７に調整してもしなくても、これらの表面を作製できる）。この溶液を約５分間の音波処理により脱気した。この容器を密封し、不均一な溶液を最初は室温で攪拌し、次いで温度を１００〜１２０℃に上げ、その温度で１５〜６０分間攪拌を続けた。０．１〜０．５重量％の溶液はこの状態で不溶性のフラクションを含有し、溶液は粘稠性の低いままであった。１〜２重量％の溶液はより粘稠性で不透明であり、不溶性のフラクションを含有した。
【００６９】
細菌による劣化を防ぐために、この溶液に安息香酸ナトリウムを添加した。ローカストビーンガムの秤量した粉末をさらに、例えば、Ｐａｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ４９（２００２）２０７−２１６頁に開示されているステップにおいて用いられているとおり、例えば、遠心分離、化学的精製および／またはろ過により処理した。不純物を分離するために、遠心分離は、例えば、４０００ｒｐｍで２０分間、ローカストビーンガム溶液を遠心分離することにより達成できる。次いでローカストビーンガムポリマーを含有する上澄み液を、主に不純物を含有するペレットから分離した。
【００７０】
ローカストビーンガムはまた、遠心分離ステップを伴う、または伴わないエタノール抽出により化学的に精製することもできる。このローカストビーンガム溶液を過剰のエタノールに注ぎ入れ、ローカストビーンガムを沈殿させることができる。次いで沈殿物を凍結乾燥することができる（室温で２４時間）。得られた粉末を、沈殿物の粉砕などの機械的手段によってさらに処理して微細粉末を形成することができる。
【００７１】
実施例１ｂ．グアーガム
Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＴＩＣ−Ｇｕｍｓ  Ｉｎｃ．から入手できる秤量した量のグアーガム粉末（白色〜ベージュ色）を脱イオン水中、０．０５重量％から２重量％の範囲の濃度に調製し、ｐＨを７に調整した。この溶液を上記のように処理した。
【００７２】
実施例１ｃ．グアーガムおよびキサンタンガム
ある量のグアーを上記のとおり調製した。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能な秤量したキサンタンガム粉末（白色〜ベージュ色）を脱イオン水中、１〜２重量％に調製し、ｐＨは調整しなかった。この溶液を温めるとキサンタンガムは溶液に溶解した。グアーガム（ＧＧ）溶液とキサンタンガム（ＸＧ）溶液を１：４および１：１の割合で混合した。ＧＧ／ＸＧ混合物を基体に適用する前に６０℃に加熱し攪拌した。
【００７３】
実施例１ｄ．グアーガム−カラゲナン混合物
グアーガムおよびカラゲナンを１〜２重量％の溶液に調製した。これらの溶液を上記のとおり混合した。グアーガム−カードラン混合物もまた上記のとおり調製し混合した。
【００７４】
実施例２：コーティング細胞培養表面の調製
上記のとおり調製した溶液を、ピペットを用いて基体に適用した。溶液を典型的には２４ウェルＴＣＴプレートに添加し（０．５〜２重量％、０．５ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌまたは３ｍｌ）、プレート上のコーティングが乾燥したと思われるまで、６０℃で１２〜２４時間保持した。次いで、脱イオン水の添加により基体を再水和し、表面を水で３回すすぎ、６０℃で１２時間保持した。使用するまでプレートを４℃で保持し、ＵＶランプ（３６６ｎｍ）を用いて、培養前に１時間滅菌した。得られた細胞培養表面コーティングは、乾燥時は１ｍｍ未満の薄さの不透明なフィルムであり、湿潤時は１ｍｍ超の薄さの不透明なヒドロフィルムであった。
【００７５】
溶液を上記のとおり調製し、ピペットを用いて基体に適用した。コーティング基体を６０℃で０．５時間保持してから、４℃または室温で一晩保持した。この手順を用いて、ＧＧ／ＸＧコーティング混合物に関する好適な結果を得た。
【００７６】
実施例３：凍結融解ゲル化
粘稠溶液（ＬＢＧ、ＧＧ、ＧＧ／ＸＧの１〜２重量％溶液）をＴＣＴプレートに添加し（２４ウェル：１ｍｌ、２ｍｌまたは３ｍｌならびに６ウェル：６ｍｌ）、−１５℃で２４時間保持した。この手順で、コーティング基体は６０℃で１２〜２４時間保持せず、再水和した。コーティング基体を４℃（１２時間）に融解し、再び冷凍庫に２４時間保持した。これを２回繰り返した。使用前にプレートを４℃に保持し、ピペットを用いて過剰の溶媒を取り除いた。培養前に、ＵＶランプ（３６６ｎｍ）を用いて１時間滅菌した。この凍結融解処理により、ガム溶液から物理的ゲルの形成が生じた。この方法によりゲルまたはヒドロゲルが生じる。
【００７７】
実施例４：室温ゲル化
混合物として調製されたガム溶液を６０℃で攪拌し、ピペットを用いて２４ウェルプレートに注いだ。典型的な容量は０．５〜２ｍｌの範囲である。ゲル化させるために２４時間室温に保持した。ＧＧ（グアーガム）／ＸＧ（キサンタンガム）およびＣＧ（カッシアガム）／ＸＧ（キサンタンガム）コーティング混合物でこの手順を用いた。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｏｎｓｏｎにより提供されたプロトコルに従ってＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）コーティング細胞培養基体を作製した。当業界に知られた方法に従ってコラーゲンＩコーティング細胞培養基体を作製した。
【００７８】
実施例５：細胞培養
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）からＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を入手した。凍結細胞を融解し、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＣｅｌｌＢｉｎｄ表面上、イーグルミニマムエッセンシャル培地（ＥＭＥＭ）中で培養し、５％のＣＯ２、３７℃でインキュベーターに保持した。１０％のＦＢＳおよび１％の抗生物質を含有するＥＭＥＭ中、ガムコーティング、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎから購入したカタログ番号３５４２３４の製品仕様書に従ってコーティングした基体）、コラーゲンＩでコーティングした基体またはＴＣＴプレート上に細胞を塗布し、５％のＣＯ２、３７℃で増殖させた。
【００７９】
実施例６：細胞増殖および機能の特性化
図２は、１重量％のローカストビーンガムコーティング表面上での培養９日後、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の生存／死亡染色を示している。細胞を、生存／死亡染色試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した生存／死亡−生存度／細胞毒性キット、カタログ番号Ｌ−３２２４）で染色し、供給されたプロトコルに従って使用した。通常このキットにより、蛍光緑色（生存）および蛍光赤色（死亡）細胞染色が提供される。本開示を目的とした黒白色図を提供するために、元の図で緑色染色か赤色染色が示されている場所を白色で示すようにこれらの図を改変した。図２は、１００〜１５０μｍの球状構造を示し、ほぼ全ての細胞が生存したままである。図２Ａは光学顕微鏡の画像であり；図２Ｂは、生存細胞を示すＦＩＴＣにおける蛍光画像（元は緑色蛍光に染色されていた白色の点）チャネルであり；図２Ｃは、死細胞を示すＣｙ３における蛍光画像（元の染色は赤色）チャネルを示す。明るい蛍光死細胞が見えていないことに注意されたい。図２Ｂで見ることのできる白色の点は、生存細胞が生きて機能していることを示す。マトリックスは１重量／容量％のローカストビーンガムを用いて形成した。光学顕微鏡と蛍光画像は双方とも、このマトリックス上に多数の肝細胞球状クラスターが存在することを示している。ほぼ全ての細胞が、培養１４日後に生存している（データは示していない）。図２は、これらのローカストビーンガムマトリックス上で肝機能を保持して肝細胞培養物を生じさせる、長期間の肝細胞増殖培養を示している。
【００８０】
図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、異なった表面上で培養９日後のテキサスレッド−ファロイジンによるＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞のアクチンフィラメント染色を示す図である。そのように処理されたこれらの画像は赤色染色を示すが、やはり本開示の目的のために、その赤色染色は白色領域で示されている。図３Ａは、ローカストビーンガムコーティング基体を（４０倍の倍率で）示す。図３Ｂは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）基体を（２０倍の倍率で）示す。図３Ｃは、ＴＣＴプレート上で増殖する細胞を（４０倍の倍率で）示す。蛍光画像は、生細胞が、ローカストビーンガムおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）双方の表面上では大部分が球状体であるが、ＴＣＴ表面ではそうではないことを示した。機能的生細胞の形態学的特性である胆細管構造（ＢＣ）は、ローカストビーンガムおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）双方の表面上では示すことができるが、ＴＣＴ表面ではできない。
【００８１】
細胞が平板状であり、アクチンフィラメントが主として伸びているＴＣＴ表面とは異なり、本発明のコーティング表面の実施形態上で増殖している肝細胞は、胆細管構造を有する球体形状であることが図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃにより示されており、これらの肝細胞は、合成されたタンパク質および脂質を分泌でき、機能的であることが示されている。生細胞は、ローカストビーンガムおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）双方の表面上で大部分が球状体である。
【００８２】
図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、ＧＧ／ＸＧ（４：１）の細胞培養コーティング上で増殖した、上記のようにそれぞれ非染色、生存／死亡染色後のＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の顕微鏡写真を示す図である。グアーガム／キサンタンガム（ＧＧ／ＸＧ）（４：１）上で増殖させた細胞は、ローカストビーンガムコーティング、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはＴＣＴ上での培養後に示されたものとは異なる細胞形態を示したが、個々の細胞は、球形凝集細胞構造を示したことを、図４Ａは示している。幾つかの死細胞が見られた。図４Ｃを参照されたい。
【００８３】
図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、グアーガム／カードランの細胞培養コーティング上で増殖したＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を図示する倍率増加（それぞれ５倍、２０倍および４０倍）で示された明視野顕微鏡写真を示す図である。図５は、このコーティング上で増殖した細胞が明らかに球状細胞で見られることを示している。
【００８４】
図６は、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）コーティング細胞培養基体上で培養後１日目および３日目の肝細胞の生存度および増殖アッセイを示す図である。図６は、１重量％および０．５重量％のローカストビーンガム（ＬＢＧ）コーティングＴＣＴ基体および非コーティングＴＣＴ培養プレート上での肝細胞培養後の細胞増殖を示している。Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒアッセイキットを、Ｐｒｏｍｅｇａにより提供された標準的プロトコルに基づいて使用した。結果は図６に図示されるように、肝細胞は、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）でコーティングされた表面上に中等度の増殖が示したが、ＴＣＴほど大きくはなかった（＊は、１５分間加熱された溶液を用いたコーティングを示し、＋は、１時間加熱された溶液を用いたコーティングを示し、ＬＢＧはローカストビーンガムである）。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、ＬＢＧで示されたものと同様に中等度の増殖を示し、ＴＣＴ上で示されたものほど大きくはない（データは示していない）。典型的には球状形態で球形のままである肝細胞は、分化機能の増大と同時に細胞増殖の減少を示す。
【００８５】
図７は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）コラーゲンＩおよびＴＣＴと比較して、ローカストビーンガムコーティング細胞培養表面上で増殖したＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞に対して実施したアルブミンアッセイの結果を示す図である。ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を、７日間、１０日間および１４日間増殖させた。上澄み液／培地を、７日目、１０日目および１４日目に採取し、製造元のプロトコルに従ってＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｅｌｉｓａアッセイ（Ｂｉｏｍｅｄａ  Ｍｉｃｒｏ−Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｅｓｔキット、カタログ番号ＥＵ１０５７）を用いてアルブミンの存在について調べた。アルブミンは、機能的肝細胞（ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞）がインビボで産生する一般的なタンパク質である。図７は、ローカストビーンガム上で増殖した細胞が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上で増殖した細胞によって示されたものと同様の量でアルブミンを排出したことを示している。ＴＣＴ増殖細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはローカストビーンガムコーティング表面よりも少なくアルブミンを排出した。培養時間が増加するにつれて産生アルブミンの全量は増加する。全ての天然多糖コーティング表面上で培養されたＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の産生アルブミンの全量は、ＴＣＴ上でのものよりも多い。
【００８６】
図８は、対照としてＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）、コラーゲンコーティング皿およびＴＣＴによる異なった基体上で培養されたＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞のアルブミン産生評価を示す図である。多糖表面は、３つの異なった期間（８日、１０日および１５日）の培養で０．５重量％のローカストビーンガム、および１重量％のローカストビーンガムである。ここでもまた、結果は、ローカストビーンガムコーティング表面上でアルブミンを産生するＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の能力を示した。全てのビーンガム表面上で培養されたＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞で産生されたアルブミンの全量は、ＴＣＴおよびコラーゲンコーティング皿よりも多く、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）と同等である。定量化が困難なため、細胞数に対する基体の正規化はされていないが、図６に示されているようにＴＣＴにおける細胞増殖は、多糖表面よりも大きい。
【００８７】
図９は、ＴＣＴ、ローカストビーンガム−１（２重量％の２ｍｌを使用）、ローカストビーンガム−３（１重量％の３ｍｌを使用）、グアーガムとカラゲナンとのブレンド、およびグアーガムとカードランとのブレンドのコーティング細胞培養表面に関する３つの異なった期間（７日、１０日および１４日の培養）におけるアルブミン産生評価を示す図である。アルブミンを産生するＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の能力は、全てのガムまたは多糖コーティングの表面上で明確に示されるという結果が示された。培養時間が増加するにつれて産生アルブミンの全量は増加する。全てのガムまたは多糖コーティング表面上で培養されたＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞で産生されたアルブミンの全量は、ＴＣＴ上でのものよりも多い。
【００８８】
本発明およびその実施形態をこのように記載しているが、本開示の利益を有した当業者によってこれらを多くの方法で変更することができる。このような変更は、本発明の趣旨および範囲から逸脱したものとはみなされず、このような改変は、以下の特許請求の範囲および法的等価物の範囲内に含まれるものとする。
【図１】
2010520765.tif 000004
【図２】
2010520765.tif 000005
【図３】
2010520765.tif 000006
【図４】
2010520765.tif 000007
【図５】
2010520765.tif 000008
【図６】
2010520765.tif 000009
【図７】
2010520765.tif 000010
【図８】
2010520765.tif 000011
【図９】
2010520765.tif 000012
【国際調査報告】
2010520765.tif 000013
2010520765.tif 000014
2010520765.tif 000015
2010520765.tif 000016