(57)【要約】  ヒトまたは哺乳動物の対象において、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(ＮＧＡＬ)の血漿または血清中の濃度に対する尿中の濃度の比を決定することによって、急性腎不全を引き起こす急性腎傷害を診断するおよびモニターする方法を提供する。
2010521694.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において、急性腎不全を引き起こすまたはすぐに急性腎不全を発症するリスクを示す腎傷害の存在を診断するまたはモニターする方法であって、
i) 該哺乳動物より得た尿のサンプル中のＮＧＡＬ濃度を決定すること；
ii) 尿のサンプルを集める直前、集めている間または集めた直後に、同じ哺乳動物より得た血液のサンプルからの血漿または血清中のＮＧＡＬ濃度を決定すること；
iii) 血漿または血清中のＮＧＡＬ濃度に対する尿中のＮＧＡＬ濃度の比を計算し、カットオフ値より大きい値が腎傷害が起こっていることを示すように腎傷害の徴候を有するおよび有しない同種の哺乳動物において観察された比の範囲から決定されるカットオフ値と、得られた比を比較すること；
の段階を含む方法。
【請求項２】
尿中のＮＧＡＬ濃度に対する血漿または血清中のＮＧＡＬ濃度の比を計算し、カットオフ値より小さい値が腎傷害が起こっていることを示すように腎傷害の徴候を有するおよび有しない同種の哺乳動物において観察された比の範囲から決定されるカットオフ値と、得られた比を比較する、請求項１に記載された方法。
【請求項３】
血漿のＮＧＡＬ濃度に対する尿のＮＧＡＬ濃度の比のカットオフ値が、好ましくは、０.３０以上であり、例えば０.３３であるか、またはそれより高い値、例えば０.３３以上０.７３以下の何れかの値であるか、またはそれより高い値、例えば０.７３以上１.１４以下の何れかの値であるか、またはそれより高い値、例えば１.１４より高い何れかの値である、請求項１に記載された方法。
【請求項４】
尿のＮＧＡＬ濃度に対する血漿または血清のＮＧＡＬ濃度の比のカットオフ値が、好ましくは、３.３３以下であり、例えば３.０であるか、またはそれより低い値、例えば１.３７以上３.０以下の何れかの値であるか、またはそれより低い値、例えば０.８８以上１.３７以下、またはそれより低い値、例えば０.８８から０の何れかの値であり、これらの値は、請求項３の対応する値の逆数に近い値である、請求項２に記載された方法。
【請求項５】
さらに、請求項１に記載された段階i)、ii)およびiii)を、１回以上繰り返す段階を含む、請求項１から４の何れか１項に記載されたモニターする方法。
【請求項６】
さらに、請求項１に記載された段階i)、ii)およびiii)を、２４時間以内、例えば１２時間以内、例えば６時間以内、例えば３時間以内、例えば１時間以内、例えば３０分以内で繰り返す段階を含む、請求項１から５の何れか１項に記載されたモニターする方法。
【請求項７】
急性腎不全の処置を開始したまたは完了した後に、さらに、請求項１に記載された段階i)、ii)およびiii)を繰り返す段階を含む、請求項１から６の何れか１項に記載されたモニターする方法。
【請求項８】
急性腎不全を発症するリスクが、虚血性腎傷害によるものである、請求項１から７の何れか１項に記載された方法。
【請求項９】
急性腎不全を発症するリスクが、炎症性、感染性または腫瘍性疾患の合併症によるものである、請求項１から８の何れか１項に記載された方法。
【請求項１０】
急性腎不全を発症するリスクが、集中治療を必要とする何れかの原因の重篤な病気によるものである、請求項１から９の何れか１項に記載された方法。
【請求項１１】
急性腎不全を発症するリスクが、外科的処置によるものである、請求項１から１０の何れか１項に記載された方法。
【請求項１２】
急性腎不全を発症するリスクが、腎毒性薬物の投与によるものである、請求項１から１１の何れか１項に記載された方法。
【請求項１３】
該哺乳動物がヒトである、請求項１から１２の何れか１項に記載された方法。
【請求項１４】
方法が適応される哺乳動物の種のＮＧＡＬに特異的に結合する分子によって、ＮＧＡＬが測定される、請求項１から１３の何れか１項に記載された方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、米国仮特許出願第60/919,277号(2007年3月21日出願)に基づく非仮特許出願であり、これに基づく優先権を主張している。また、これは、言及することによって、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、哺乳動物において、腎臓に影響を及ぼし急性腎不全(ＡＲＦ)(以下では同義語的に急性腎機能不全(ＡＲＤ)とも言う)を引き起こし得る、最近起こったまたは進行している傷害性のプロセスの診断およびモニタリングに関する。そして、本発明は、内科に、特に救命医療医学または集中治療医学に関連しており、また、腎臓を傷つけ得る手順を行う手術、腫瘍、画像診断に関連している。本発明はまた、獣医学および手術に、および実験動物における腎臓の病態生理学の研究および腎臓への有害な影響の試験に関連している。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
本発明は、ヒトまたは哺乳動物において、腎尿細管細胞傷害を含む(これに限定されない)、著しい腎傷害(以後、腎臓を構成する細胞における傷害の意味で用いる)の存在を検出するための、血液および尿の双方で見られる腎臓の病状のための新規マーカー分子の診断的使用に関する。マーカー分子は、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(ＮＧＡＬ)(好中球リポカリン(ＮＬ；ヒト好中球リポカリンの場合はＨＮＬ)としても知られる)、リポカリン２(ＬＣＮ２)、２５kDa α２−ミクログロブリン関連蛋白質(ラットにおける)、または、２４Ｐ３(マウスにおける)である。ラットにおいて、その遺伝子は、ｎｅｕ(HER2/c-erbB-2)発癌遺伝子によって開始される乳癌において過剰発現されるため、それは、ｎｅｕ関連リポカリン(ＮＲＬ)とも言われる(Stoesz and Gould, 1995)。ＮＧＡＬは、好中球多形核白血球の顆粒球から最初に単離された２５kDaの糖蛋白質である(Triebel et al., 1992; Kjeldsen et al., 1993)。それは、ジスルフィド架橋を含み、一定割合の二量体およびより少ない割合の三量体を形成する。分泌された全ＮＧＡＬの一部は、見かけ上１１５kDaの複合体を形成するＮＧＡＬモノマー(Monier et al., 2000; Yan et al., 2001)、または、見かけ上１２５kDaの複合体を形成するＮＧＡＬ二量体(Yan et al., 2001)の何れかとして、９２kDaのヒト好中球IV型コラゲナーゼ(マトリックスメタロプロテイナーゼ９(ＭＭＰ−９)またはゼラチナーゼＢとも呼ばれる)と関連している。これらの複合体は、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌および乳癌を含む種々の癌を有する患者の尿中で確認されている。
【０００４】
ＮＧＡＬは、当初、微生物、特に化膿菌の侵入が好中球の脱顆粒および顆粒蛋白質の開口分泌を引き起こした際に血中に放出される、好中球活性化のマーカーとして開示された。そのため、ヒトの血清サンプル中のＮＧＡＬ濃度上昇の測定は、個人が炎症プロセス、特に微生物感染によって引き起こされる炎症プロセスを患っていることを示すと考えられる(米国特許第6,136,526号；ＰＣＴ出願WO95/29404)。これに関係しているが、しかしその主張された好中球からの特定の由来と対照的に、ＮＧＡＬ(24P3)は、マウスにおいて、１型急性期蛋白質として同定され、その発現は、急性期応答の間、主に肝臓に位置する(Liu and Nilsen-Hamilton, 1995)。
【０００５】
米国特許出願第2004/0219603号は、腎尿細管細胞傷害の早期発症を検出するための尿バイオマーカーとしてのＮＧＡＬの使用を開示している。米国特許出願第2005/0272101号は、同じ目的のための血清中のＮＧＡＬの使用を開示している。しかしながら、何れの開示も、どのようにして、ＮＧＡＬ濃度上昇の原因として、腎尿細管細胞傷害を、全身の炎症、または微生物感染、または癌と区別できるか記載していない。本発明者らは、以前にＰＣＴ出願WO 2006/066587を出願しており、当該出願は、尿中または血漿または血清中のＮＧＡＬ濃度が、ＮＧＡＬ測定においてＡＲＦまたはＡＲＤを引き起こす腎傷害の診断となるＮＧＡＬ測定値となるためには超えなければならないこれらの体液中のＮＧＡＬカットオフ濃度を定義することによって、どのようにして腎障害の診断とならない少しの上昇と、より高い上昇に分け得るかを開示している。WO2006/066587(言及することによって本明細書にその全体が組み込まれる)は、体液中のＮＧＡＬ濃度はまた、炎症、感染および特定の癌において上昇し得るが通常ＡＲＦまたはＡＲＤを引き起こす腎傷害に関連する値より低い値までしか上昇しないという事実を考慮している。しかし、重度の感染および／または癌を有する少数の患者は、たとえ入院時に腎傷害に罹患していなくとも、腎傷害を診断するために用いられるカットオフ濃度より高いＮＧＡＬ濃度を示し得る。一方、少数の患者は、たとえそのＮＧＡＬ濃度がカットオフ値を超えていなくとも、軽度のＡＲＤに罹患している。カットオフ濃度を用いるとき、これらの２つのタイプの境界ケースは、それぞれ腎傷害の偽陽性診断、または、腎傷害の偽陰性診断を引き起こし得る。
【０００６】
体液中のＮＧＡＬ濃度のカットオフ値の使用に頼ることなく、腎傷害による体液中のＮＧＡＬ濃度上昇と、腎臓によらないものとを区別する確かな手段を提供することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の概要
本発明は、腎傷害によって生じるＮＧＡＬが尿に分泌され、血漿中の濃度よりも尿中の濃度を高くするという我々の観察によるものである。逆に、腎臓以外、例えば感染時に好中球多形核白血球から、または特定の腺癌において、血中に分泌されたＮＧＡＬは、典型的に、尿中よりも血漿中で高い濃度となる。
【０００８】
腎臓によるＮＧＡＬの発現および分泌は基底状態では低く、健康なヒトの対象の尿中のＮＧＡＬ基底濃度中央値は約５ng/mlである。ＮＧＡＬはまた、好中球によって、および場合により他の組織によって、血中に放出され、血漿中の基底濃度中央値は約６０ng/mlである。このことは、尿中対血漿中のＮＧＡＬ濃度の中央値の比率が約０.０８であることを意味する。我々による観察では、健康なヒトの対象では、ＮＧＡＬ濃度の尿：血漿比は０.３を超えることはなかった。
【０００９】
腎傷害において、ＮＧＡＬは、血中よりも多く尿中に分泌される。これは、健康な対象で見られる比よりもＮＧＡＬ濃度の尿：血漿比を増大させる。従って、本発明は、以下によって、腎傷害を診断することを含む：
i) 哺乳動物より得た尿のサンプル中のＮＧＡＬ濃度を決定すること；
ii) 尿のサンプルを集める直前、集めている間または集めた直後に、同じ哺乳動物より得た血液のサンプルからの血漿または血清中のＮＧＡＬ濃度を決定すること；
iii) 血漿または血清中のＮＧＡＬ濃度に対する尿中のＮＧＡＬ濃度の比を計算し、カットオフ値より大きい値が腎傷害が起こっていることを示すように、腎傷害の徴候を有するおよび有しない同種の哺乳動物において観察された比の範囲から決定されたカットオフ値と、得られた比を比較すること。
【００１０】
逆の比、すなわち血漿または血清中のＮＧＡＬ濃度を尿中の濃度によって割ったものもまた計算され、このような逆の比について同様に決定されたカットオフ値と比較され得る。この場合において、全ての用いられる比は、上記のiii)で述べた比の逆数であり、このとき、“逆の”カットオフ値より低い逆の比の値が、腎傷害が起こっていることを示す以外は、本発明の実施に違いはない。
【００１１】
記載された方法は、尿および血漿または血清中のＮＧＡＬの絶対濃度と無関係であり、その結果、これらの間の比率が腎傷害の診断となるために、これらが特定の絶対濃度のカットオフ値を超える必要はないという利点を有する。このことは、尿および血漿または血清中のＮＧＡＬ濃度がこれらの体液の絶対濃度について定められた、記載された非腎臓障害で観察され得るＮＧＡＬの濃度上昇の大部分を除外するために高く設定されているカットオフ値を超える程度まで腎傷害が進行する前に、腎傷害を診断することを可能とする。
【００１２】
本発明の方法は、集中治療または救命医療部門に入った患者で特に有用であり、また、重篤な病でなくとも、例えば腎臓の虚血性傷害を引き起こし得る手術などの明確な傷害を受けた患者や、例えば化学療法剤または抗菌剤または画像診断のために静脈内投与された造影剤などの腎毒性薬物に曝露された患者に有用である。これらの場合において、該処置によって腎臓が影響を受けた患者、およびその結果ＡＲＦのリスクがある患者の早期発見が、ＡＲＦの発症を予防するためのより早期のより集中的な介入を可能とする。該方法はまた、獣医学の医薬、実験動物における腎臓の病態生理学の調査、および実験動物における候補治療薬または診断薬の腎毒性についての試験に有用である。
【００１３】
体液中のＮＧＡＬ濃度は、好ましくは、ＮＧＡＬに対する１種以上のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用する免疫化学的方法を含む、対象の種のＮＧＡＬに特異的に結合する１種以上の分子によって決定される。このような方法の例は、サンドイッチＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着測定法)、ラテラルフロー・イムノクロマト法(lateral flow immunochromatographic method)、抗体被覆尿試験紙、または抗体被覆微粒子をベースとする自動化免疫化学法を含み、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】病院で集中治療に入った９０人の成人患者由来の尿および血漿の４５８組のサンプルにおいて、急性腎不全を引き起こす腎傷害の診断に関する、尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比についての、受診者動作特性(ＲＯＣ)曲線。
【図２】軽度の腎傷害を発症している患者における、尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比の時間経過(図２ａ)および尿と血漿のＮＧＡＬ濃度(図２ｂ)。５日目で、尿：血漿のＮＧＡＬ濃度は、約１であったが、その翌日に２より上まで上がった。その比のカットオフ値は０.７３と示されている(図２ａ)。尿中および血漿中のＮＧＡＬの絶対濃度は、試験した患者について、これらの体液の何れにおいてもＮＧＡＬ濃度についてのＡＲＦの指標である３５５ng/mlのカットオフ値を超えていなかった(図２ｂ)。血漿クレアチニン(示さず)は、５日目および６日目で正常値の上限を超え、８日目、すなわち尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比のピーク後４８時間でピークとなった。
【図３】ＡＲＦに罹患していない患者における、尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比(図３ａ)および尿と血漿のＮＧＡＬ濃度(図３ｂ)。併発状態(腸穿孔および腹膜炎)は、３５５ng/mlのカットオフ値よりかなり高い血漿ＮＧＡＬ濃度を与え(図３ｂ)、それにより、この患者群は独立してＡＲＦとの診断になり得るが、尿：血漿のＮＧＡＬ比は、０.７３の比についてのカットオフ値より低いままである(図３ａ)という事実により、ＮＧＡＬが腎臓由来ではないことが実証された。血漿クレアチニン(示さず)は低く、正常範囲内であった。
【図４】敗血症による腎傷害の典型的なエピソードを有する患者における、尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比の時間経過(図４ａ)および尿と血漿のＮＧＡＬ濃度(図４ｂ)。尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比は、１日目から３日目の正常値から、４日目でカットオフ値０.７３を超え(図４ａ)、５日目でピークとなったが、血漿クレアチニン(示さず)は６日目でピークとなった。尿のＮＧＡＬ濃度が独立してＡＲＦと診断されるに至ったが、血漿のＮＧＡＬ濃度は、試験された患者群について決定された３５５ng/mlのカットオフ値を超えず、独立してＡＲＦと診断されなかった(図４ｂ)。
【図５】ＡＲＦを発症しなかった患者における、尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比の時間経過(図５ａ)および尿と血漿のＮＧＡＬ濃度(図５ｂ)。該患者には、肺炎および脱水症状が認められ、その結果、０日目での血漿のＮＧＡＬ濃度が予め決定されたカットオフ値３５５ng/mlよりも高く、この患者群は独立して実際にまたは直近にＡＲＦと診断されていた。しかし、尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比はカットオフ値０.７３よりも低かったことによって、この診断は否定された(図５ａ)。血漿クレアチニン(示さず)は、０日目で正常値の上限よりも低く、その後も低い基底値であった。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
一連の集中治療に入った危篤状態の患者において、我々は、腎傷害に起因するＮＧＡＬが尿に分泌され、尿中で、血漿または血清中よりも高い濃度となることを観察した。逆に、ＮＧＡＬは、腎臓以外の源から、例えば感染における好中球多核白血球から、または、特定の腺癌から、血中に分泌され、典型的に、血漿または血清中で、尿中よりも高い濃度となる。
【００１６】
血中の遊離のＮＧＡＬは、腎糸球体によって濾過され、糸球体濾過物から遠位の曲尿細管によって一部再吸収される。従って、血中のＮＧＡＬ濃度の増加は、尿中のＮＧＡＬ濃度の僅かな増加に、比較的弱くではあるが、反映される。傷害を受けた近位の尿細管または他の細胞によって、ＮＧＡＬが糸球体濾過物に直接放出されれば、これらは血中よりも尿中に高濃度で現れ、幾らかのＮＧＡＬが、遠位の曲尿細管における再吸収によって、および／または傷害を受けた細胞からの血液への拡散によって血中に入る。腎尿細管の傷害は、ＮＧＡＬおよび幾らかの他の小蛋白質分子の再吸収の減少と関連しており、このことは、さらに、腎障害において、尿中のＮＧＡＬ濃度が血漿または血清中よりも高くなる理由である。
【００１７】
腎臓によるＮＧＡＬの発現および分泌は基底状態では低いため、健康なヒトの尿中の基底濃度の中央値は約５ng/mlである。糸球体によって濾過される血中の遊離のＮＧＡＬの大部分は尿細管によって再吸収され、その結果、尿の低い基底ＮＧＡＬ濃度が維持される。ＮＧＡＬは、通常、血漿または血清中で、より高い濃度で存在しており、約６０ng/mlの基底濃度中央値に相当する。これは、好中球による、場合により僅かな程度で他の組織による血液へのＮＧＡＬの放出に起因する。血漿中のＮＧＡＬ濃度に対する尿中のＮＧＡＬ濃度の比の中央値は、従って、約０.０８である。我々が観察したところによると、健康なヒトでは、０.３を超えるＮＧＡＬの尿：血漿の比を有することはない。
【００１８】
本明細書で定義した腎傷害において、ＮＧＡＬは、血液に分泌されるより多く尿に分泌される。同時に、ＮＧＡＬの腎尿細管での再吸収も損なわれる。両方の現象が、尿：(血漿または血清)のＮＧＡＬ濃度比を、健康な対象および腎傷害を有さない患者で見られる比よりも上昇させるのに寄与する。
【００１９】
腎傷害後の尿：(血漿または血清)のＮＧＡＬ濃度比の増大は、ヒトのみならず、ヒトと類似の腎臓構造および機能を有する何れの哺乳動物でも適用されることが明らかである。従って、本発明は、次に示すことによって、腎傷害を診断することを含む：
i) 哺乳動物より得た尿のサンプル中のＮＧＡＬ濃度を決定すること；
ii) 尿のサンプルを集める直前、集めている間または集めた直後に、同じ哺乳動物より得た血液のサンプルからの血漿または血清中のＮＧＡＬ濃度を決定すること；
iii) 血漿または血清中のＮＧＡＬ濃度に対する尿中のＮＧＡＬ濃度の比を計算し、カットオフ値より大きい値が腎傷害が起こっていることを示すように、腎傷害の徴候を有するおよび有しない同種の哺乳動物において観察された比の範囲から決定されるカットオフ値と、得られた比を比較すること。
【００２０】
逆の比、すなわち血漿または血清中のＮＧＡＬ濃度を尿中の濃度によって割ったものもまた計算され、このような逆の比について同様に決定されたカットオフ値と比較され得る。この場合において、全ての用いられる比は、上記のiii)で述べた比の逆数であり、このとき、“逆の”カットオフ値より低い逆の比の値が、腎傷害が起こったことを示す以外は、本発明の実施に違いはない。
【００２１】
記載された方法は、尿および血漿または血清中のＮＧＡＬの絶対濃度と無関係であり、その結果、これらの間の比率によって腎傷害の診断となるために、これらが特定の絶対濃度のカットオフ値を超える必要はないという利点を有する。このことは、尿および血漿または血清中のＮＧＡＬ絶対濃度がこれらの体液についての、非腎臓障害で観察されるＮＧＡＬの濃度上昇の大部分を除外するために高く設定されているカットオフ値を超える程度まで腎傷害が進行する前に、腎傷害を診断することを可能とする。
【００２２】
本発明の段階ii)は、血漿または血清の何れかのＮＧＡＬ濃度を測定することによって、行うことができ、本発明の好ましい具体的態様において、凝固した血液由来の血清中よりむしろ、抗凝固剤処理した全血由来の血漿中で、ＮＧＡＬを測定する。ＮＧＡＬ濃度は、分析前に血液のサンプルから分離した血漿中、または、適応されるサンプルが抗凝固剤処理した全血である自動化または半自動化分析手順の必須の部分として血液から分離した血漿中の何れかで測定される。血清中よりむしろ血漿中のＮＧＡＬの測定は、血液から血餅と血清を形成し得る時間が経過することなく、血液のサンプルを集めた直後に分析を行うことが可能であるという利点を有する。それは、血清調製の幾つかの手順の間に起こり得る凝固過程の間に、血液のサンプル中の好中球からＮＧＡＬが血清に放出される危険を避けられるという、さらなる利点を有する。
【００２３】
集中治療に入った任意抽出の成人患者の試験において、我々は、同時に集められた血漿のサンプルにおけるＮＧＡＬ濃度に対する尿のサンプルにおけるＮＧＡＬ濃度の比が、その患者がＡＲＦまたはＡＲＤを起こしたまたは後日ＡＲＦまたはＡＲＤを起こすであろう腎障害にかかっているかどうかの非常に良好な指標を提供することを見出した。この指標は、尿中または血漿中のＮＧＡＬの絶対濃度に独立である。にもかかわらず、尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比の上昇は、血漿のＮＧＡＬ濃度の正常範囲未満への低下が非常にまれに観察されるが、尿のＮＧＡＬ濃度が健康な個人の正常範囲より高いことをほぼ示唆している。尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比は、ＡＲＦを有する患者または次の２４時間以内にＡＲＦを発症するであろう患者において、著しく上昇する。一方、たとえＮＧＡＬ絶対濃度が尿および血漿中の双方で正常値よりも上昇していても、その間でＡＲＤを発症していない患者では、この比は正常範囲をめったに超えない。
【００２４】
i) 患者の多様性および集中治療に入る原因となる多くの異なる疾患および状態、ii) 集中治療の状況下でのサンプル回収のタイミングの偶発的輸送の困難性、および、iii) ＡＲＦおよびＡＲＤの臨床診断および血清クレアチニン由来のＡＲＤの生化学的診断における不正確さのために、尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比の解釈は、その比と、ＡＲＦまたはＡＲＤを起こす腎障害を示すより高い比と腎障害を起こしていないもののより低い比の間で最も良好な区別を得るために経験的に決定されたカットオフ値との比較が必要である。
【００２５】
臨床試験からのデータを実施例１に示す。４５８組の尿および血漿のサンプルを同時に、他のデータからサンプリング時またはそれから２４時間の間にＡＲＦまたはＡＲＤが発症しているまたは発症していないと分類され得る９０人の患者から得た。これらのサンプルについてのデータの受診者動作特性(ＲＯＣ)分析により、尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比が０.７３のカットオフ値を用いて、１組の試験について、ＡＲＦ／ＡＲＤと非ＡＲＦ／ＡＲＤの間で、総合的に良好な区別が得られることが示された。０.７３より高い比は、実際にＡＲＦ／ＡＲＤであるまたは直ぐにそれを発症しそうであることを予測し、その陽性予測値は９６.３％であった。０.７３より低い比は、実際にＡＲＦ／ＡＲＤがないまたはそれを直ぐには発症しそうにないことを予測し、その陰性予測値は９７.４％であった。診断感受性および診断特異性は、それぞれ９６.３％および９７.４％であった。カットオフ値０.７３は、ＡＲＦ／ＡＲＤを有さない個々の患者で観察された全ての比の中央値の最大値(０.７４)にも近かった。
【００２６】
他の特許文献における同様の試験で得られたカットオフ値の範囲は、ＡＲＦまたはＡＲＤを有する個々の患者で観察された比の最小値（０.３３）およびＡＲＦまたはＡＲＦを有さない患者で観察された比の最大値（１.１４）から概算した。この結果において、カットオフ値０.３３からは、陽性予測値７５.９％、陰性予測値１００％、診断感受性１００％、および診断特異性７７.１％が得られた。カットオフ値１.１４からは、陽性予測値１００％、陰性予測値９２.７％、診断感受性８９.１％、および診断特異性１００％が得られた。
【００２７】
従って、それより高い尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比であればＡＲＦまたはＡＲＦと予測されるカットオフ値は、好ましくは、０.３０以上であり、例えば０.３３であるか、または０.３３以上０.７３以下の何れかの値であり、後者の値では、診断感受性、診断特異性、陽性予測値および陰性予測値が、全て９５％より高い。あるいは、該カットオフ値は、０.７３以上１.１４以下の何れかの値であり、この値では、陽性予測値が１００％である。あるいは、該カットオフ値は、１.１４より高い何れかの値であり、その全ての値で、陽性予測値が１００％である。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、該方法が、疾患の推移を通じて、または、ＡＲＦを引き起こすリスクを有する診断または治療介入後の種々の時間で、患者をモニターするために用いられ得ることである。測定された尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比のカットオフ値との比較は、患者が腎傷害に罹患していたときに、そしてＡＲＦ発症のリスクがあるときに決定する。モニタリング用体液サンプルを採取する間隔は短くてもよく、その結果、可能な限り早く腎傷害兆候を提供し、そして、予防的または治療的手段を短時間に設定することを可能とする。この目的のために、尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比のモニタリングは、例えば腎傷害が起こることが知られているならば、例えば手術または医学的処置の間、好ましくは２４時間以下、より好ましくは提案された時間よりも短い時間、すなわち３時間以下、またはさらに短い時間、例えば３０分間または１時間の間隔で行われる。
【００２９】
本発明のさらなる利点は、１つの分析方法によって決定された尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比についてのカットオフ値が、異なる分析法によって得られた結果に適用可能であることである。これは、常に、分析法が満足な線形性を示し、そして、ＮＧＡＬ濃度に違いがない尿、血漿または血清の組成の違いに影響されないとの条件付で、絶対濃度値とは異なり、得られた濃度比は、用いられた分析方法およびその較正の潜在的な違いに無関係であるからである。
【００３０】
本発明の方法は、特に、集中治療または救急医療部門に入った患者に、または、それ自体でまたはその合併症としてＡＲＦまたはＡＲＤを引き起こす腎傷害を起こすリスクの高い重篤な炎症性、感染性または腫瘍性疾患または障害に罹患している全ての患者に有用である。この状況において、炎症性、感染性または腫瘍性障害は、それ自体、何れかの腎傷害が起こる前に、ＮＧＡＬ濃度を上昇させ得る。この上昇は、通常、尿中よりも血漿中で著しく、また、血漿の濃度は、特定の状況で、血漿中のＮＧＡＬ濃度が通常ＡＲＤを引き起こす腎傷害と診断されるカットオフ濃度を超え得る。本発明の方法では、尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比がその比について決定された診断カットオフ値よりも高い比となるほど尿のＮＧＡＬ濃度が上昇するまで、このような患者はＡＲＤを引き起こす腎傷害を有すると診断されない。その結果、本発明の方法は、これらの患者において、ＡＲＤを引き起こす腎傷害について、血漿または尿のＮＧＡＬ濃度が別個に提供し得る診断特異性よりも高い診断特異性を提供する。
【００３１】
本発明の方法はまた、重篤でなくとも、例えば腎臓の虚血性傷害を引き起こし得る手術などの明確な傷害を受けた患者、または例えば化学療法剤または抗微生物剤または静脈内投与される画像診断用造影剤などの腎毒性薬物に曝露された患者において有用である。これらの場合において、該手順によって腎臓が影響を受けた患者、およびその結果ＡＲＦのリスクがある患者の早期発見が、ＡＲＦの発症を予防するためのより早期のより集中的な介入を可能とし得る。
【００３２】
本発明の方法はまた、獣医学の医薬、実験動物における腎臓の病態生理学の調査、および実験動物における候補治療薬または診断薬の腎毒性についての試験に有用である。
【００３３】
体液のサンプル中の、例えば尿、血漿または血清のサンプル中のＮＧＡＬの測定は、満足のいく分析学的特異性、感受性および精度を提供する何れかの方法によって行われ得る。好ましい方法は、ＮＧＡＬに特異的であってサンプルを得た哺乳動物種由来のＮＧＡＬに結合し得る１種以上の結合分子を用いる結合アッセイである。該結合分子は、ＮＧＡＬに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、または他の方法によって作製した特異的ＮＧＡＬ結合性分子を含み、これらに限定されない。
【００３４】
好ましい方法において、分析される哺乳動物種由来の組み換えＮＧＡＬに対するモノクローナル抗体が用いられる。サンプル、例えば尿のサンプル、血漿または血清のサンプルから、ＮＧＡＬを捕捉する固体支持体に結合される抗体もある。他方、発色団、色素複合体、フルオロフォア、電気化学的または化学発光マーカー、またはビオチンまたは酵素を含む(これらに限定されない)、当業者に既知の多くの方法の何れかによって検出され得るマーカー物質または化学的部分の少なくとも１つで標識された抗体もある。固体支持体は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)のためのポリスチレンまたはポリ塩化ビニル表面、または、ラテックス(ポリスチレン)粒子、または、圧縮ポリエチレン粒子からなる濾過フリット、または、多孔性ニトロセルロール・マトリックスであってもよく、実際、免疫化学分析に用いられる何れの適切な支持体であってもよい。ＮＧＡＬに特異的に結合する分子で被覆された粒子はまた、手動または自動化された方法によって行われる粒子増強比濁法または比濁分析法によって、サンプル中でＮＧＡＬ濃度を決定するために用いられ得る。
【００３５】
本発明によって、尿または血液のサンプル中のＮＧＡＬを測定するのに好ましい手段は、尿試験紙、ラテラルフロー(イムノクロマト法)、またはミニカラム試験、または、高速時間分解免疫蛍光定量法、または、二光子励起微粒子ベースのイムノアッセイ(two-photon excitation microparticle-based immunoassay)を含み、これらの方法は全てサンプルの素早い対象の近くでの分析を可能としている。しかしながら、本明細書を読んだ当業者に理解されるように、ＮＧＡＬを測定する他の方法を用いることも可能であり、緊急分析のためにサンプルをランダムアクセスすることが可能な装置での中央検査室における自動化された方法を含む。
【００３６】
好ましい具体的態様において、本発明の方法は、ヒトの体に実施される手術の、治療の、または診断の段階を含まない。
下記の非制限的実施例は、さらに、本発明を説明するために提供される。
【実施例】
【００３７】
実施例１：病院で集中治療に入った９０人の成人患者由来の４５８組の尿および血漿のサンプルにおいて、尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比の、ＡＲＦまたはＡＲＤに関する診断能力
病院で集中治療に入った総数９０人の患者から毎朝集めた４５８組の尿および血漿のサンプルにおいて、ＮＧＡＬを決定した(実施例５に記載したサンドイッチＥＬＩＳＡを提供するＮＧＡＬ  ＥＬＩＳＡキットによって)。入院経過要録および通常の血液検査の結果に基づいて、入院中にＡＲＦまたはＡＲＤの発症が１回以上あった患者(３７人, サンプリング時またはその後の２４時間でＡＲＦまたはＡＲＤの発症を伴った１９２組のサンプル)、および、ＡＲＦまたはＡＲＤを発症しなかった患者(５３人, ２６６組のサンプル)に患者を分類した(ＮＧＡＬデータに関して盲検的に)。ＡＲＦまたはＡＲＤの発症を伴った組のサンプルでは、尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比の中央値は、３.１８であった(０.３３から４０.０２の範囲)が、ＡＲＦまたはＡＲＤを伴わなかった組のサンプルでは、０.２０であった(０.０１から１.１４の範囲)。
【００３８】
個々の患者について、それぞれ、中央値、最大値、および最小値の比を記録し、ＡＲＦまたはＡＲＤを有するおよび有さない全ての患者について、これらの値の中央値と範囲を決定した。ＡＲＦまたはＡＲＤを有する患者において、中央値の比の中央値は３.１７であり（１.５３から５.７３の範囲）、最小値の比の中央値は１.１８であり（０.３３から１.７２の範囲）、最大値の比の中央値は１６.４５であった（１６.４５から４０.０２の範囲）。ＡＲＦまたはＡＲＤを有さない患者においては、中央値の比の中央値は０.１９であり（０.１０から０.３４の範囲）、最小値の比の中央値は０.０５であり（０.０１から０.０７の範囲）、最大値の比の中央値は０.７４であった（０.６０から１.１４の範囲）。
【００３９】
尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比に関する診断能力は、図１に示したＲＯＣ曲線をプロットすることによって決定した。曲線下面積は０.９９１であり、カットオフ値、すなわちそれより高い尿：血漿のＮＧＡＬ濃度比であれば実際にＡＲＦまたはＡＲＦであるまたはそれを直ぐに発症しそうであると診断される値は、最も良好な総合的診断能特性で、０.７３であると決定された。このカットオフ値では、診断感受性は９６.３％であり、診断特異性は、９７.４％であり、陽性予測値は９６.３％であり、陰性予測値は９７.４％であった。しかし、他を犠牲にして特定の診断性能特性を改善するために、他のカットオフ値を選択することも可能である。例えば、カットオフ値０.３３、すなわちＡＲＦまたはＡＲＤを有する患者で観察された最小値の比では、１００％の診断感受性および陰性予測値が得られるが、診断特異性は全てで７７.１％に低下し、陽性予測値は７５.９％に低下した。カットオフ値１.１４、すなわちＡＲＦまたはＡＲＤを有さない患者で観察された最大値の比では、１００％の陽性予測値および診断特異性が得られるが、陰性予測値は９２.７％であり、診断感受性は８９.１％であった。
【００４０】
実施例２：ＮＧＡＬ尿試験紙試験
ポリスチレン表面を含む尿試験紙の分析領域は、ヒトＮＧＡＬに対する捕捉抗体で被覆されている。遠心分離し希釈したサンプルのアリコートを、尿試験紙を浸す第１管中のＮＧＡＬに対する酵素標識検出抗体の溶液に加える。酵素標識検出抗体のＮＧＡＬとの複合体は、尿試験紙に結合し、次いでそれを水道水で洗浄して、第２管中の発色基質溶液に入れる。所定の時間内で発色基質溶液中で展開した色を、眼で尿のサンプル中のＮＧＡＬ濃度を示す色強度チャートと比較して測定するか、または例えばＮＧＡＬ濃度を直接示すようプログラムされた簡単な比色計で測定する。
【００４１】
実施例３：ＮＧＡＬラテラルフロー装置
毛管力によって液体の移動が促進され得るチャネルを有する多孔性ニトロセルロースまたは他の物質の小片からなるラテラルフロー装置は、その遠位の末端近くで、横のバンドとして適用されるＮＧＡＬに対する捕捉抗体で被覆されている。検出抗体が由来する種の抗体に対する抗体のさらなる横のバンドは、捕捉抗体バンドに対して遠くに置かれ、小片の機能のコントロールとして提供される。小片の近位の末端は、標識されたポリスチレン粒子または色素複合体の粒子に吸着したまたは結合したＮＧＡＬに対する検出抗体を含む。遠心分離または濾過されたサンプルのアリコートを小片の近位の末端に適用し、検出抗体に結合した標識粒子は、毛管力によって小片に沿って移動する。捕捉抗体のバンドに到達したとき、サンプル中のＮＧＡＬに結合した粒子のみが保持され、検出可能なバンドを生じた。検出抗体に対する抗体のコントロールのバンドに到達した粒子は、ＮＧＡＬが結合していようといまいと検出可能なバンドを生じる。標識されたバンドの強度は、色のついた粒子の場合は眼で、または用いた標識に対して適切な検出装置によって測定され得る。陽性の結果は、双方のバンド中の標識の色の展開または累積によって示され、一方、陰性の結果は、コントロールのバンドのみでの色の展開または他の標識によって示される。コントロールのバンドの色の展開または他の標識の失敗は、小片の機能が不適当なことを示す。該試験の感受性は、適用されるサンプルの希釈によって制御され、決定されたカットオフ値より高いＮＧＡＬ濃度でのみ陽性の結果を与えるように調節される。該試験の感受性はまた、標識されたおよび標識されていない粒子の混合物に検出抗体を結合させることによっても調節され得る。小片のバッチは、予め較正され、検出装置によって測定され得る較正コードを備えていてもよく、その結果、定量的または半定量的な結果が該装置によって測定され得る。このラテラルフロー法の当業者に既知の個別の態様の多くのバリエーションが可能である。
【００４２】
実施例４：ＮＧＡＬミニカラム試験
ミニカラムは、液体および細胞が通過可能な圧縮ポリエチレン粒子から作られたフリット(frit)を含む。該フリットは、ヒトＮＧＡＬに対する捕捉抗体で被覆されている。該ミニカラムは、自動化された液体の操作によって、希釈サンプルを固定された流速で固定された容積で適用し、次に色素と複合体化した検出抗体を適用することが可能である装置に組み込まれている。洗浄溶液を通じた後、フリットの色の強度を光拡散測光によって測定する。フリットのバッチを予め較正して、ミニカラムは、標準物質で予め較正する必要なしに、定量的な結果が装置によって得られるように、該装置によって測定され得る較正コードを備えていてもよい。
【００４３】
実施例５：ＮＧＡＬサンドイッチＥＬＩＳＡ
標準物質としておよび較正物質として使用するための精製した組換えヒトＮＧＡＬは、Kjeldsen ら(1996)によって記載された通りに調製した。ＮＧＡＬに対する抗体は、Kjeldsenら(1993; 1996)によって記載されているものとした。ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、０.０５Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液(pH 9.4)中の２μｇ/mLの濃度の抗体２１１−１で、１００μｌ／ウェルでアプライして、４℃で一夜被覆した。ウェルを空にして、０.０５％  Tween 20を含むリン酸緩衝食塩水(pH 7.4)の洗浄緩衝液で３回洗浄し、ブロットした。希釈緩衝液(０.１mg/mlでウシアルブミンを含む洗浄緩衝液)での較正物質とサンプルの希釈液を、ウェルに１００μｌ容積でアプライし、振盪器上で、室温で１時間インキュベートした。次いでウェルを空にし、洗浄し、先の通りブロットした。希釈緩衝液中０.２５μｇ/mlのビオチン化抗体２１１−２を、１００μｌ／ウェルで、それぞれのウェルに加え、振盪器上で、室温で１時間インキュベートした。次いで、ウェルを空にし、洗浄し、先の通りブロットした。希釈緩衝液で１／２０００に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼとストレプトアビジンの複合体(Zymed, CA)を、それぞれのウェルに１００μｌ／ウェルで加え、振盪器上で、室温で１時間インキュベートした。次いでウェルを空にし、洗浄し、先の通りブロットした。次いで、テトラメチルベンジジンおよびペルオキシドを含む基質溶液(TMB-ONE, Kem-En-Tech, Denmark)を、それぞれのウェルに１００μｌ／ウェルでアプライし、暗所で室温で正確に８分間インキュベートし、その後、５０μｌの１Ｍ  硫酸をそれぞれのウェルに添加することによって呈色反応を停止させた。次いで波長４５０nmでウェルの吸光度をＥＬＩＳＡプレート・リーダーで測定し、６５０nmの吸光度を引いた。サンプル中のＮＧＡＬ濃度を既知濃度の較正物質の吸光度測定値から得られた標準曲線から計算した。
【００４４】
該アッセイは、０.０２ng/mlから１ng/mlの範囲で行い、２.４pg/mlの検出限界(ゼロからの拡散の信頼限界９５％)を有し、精製較正物質とサンプルの希釈液の間で平行性を示した。
【００４５】
参考文献
Kjeldsen L, Johnsen AH, Sengelov H, Borregaard N (1993) Isolation and primary structure of NGAL, a novel protein associated with human neutrophil gelatinase. J Biol Chem 268:10425-10432.
Kjeldsen L, Koch C, Arnljots K, Borregaard N (1996) Characterization of two ELISAs for NGAL, a newly described lipocalin in human neutrophils. J Immunol Methods 198:155-164.
Liu Q, Nilsen-Hamilton M (1995) Identification of a new acute phase protein. J Biol Chem 270:22565-22570.
Monier F, Surla A, Guillot M, Morel F (2000) Gelatinase isoforms in urine from bladder cancer patients. Clin Chim Acta 299:11-23.
Stoesz SP, Gould MN (1995) Overexpression of neu-related lipocalin (NRL) in neu-initiated but not ras or chemically initiated rat mammary carcinomas. Oncogene 11:2233-2241.
Triebel S, Blaser J, Reinke H, Tschesche H (1992) A 25 kDa alpha 2-microglobulin-related protein is a component of the 125 kDa form of human gelatinase. FEBS Lett 314:386-388.
Yan L, Borregaard N, Kjeldsen L, Moses MA (2001) The high molecular weight urinary matrix metalloproteinase (MMP) activity is a complex of gelatinase B/MMP-9 and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL). Modulation of MMP-9 activity by NGAL. J Biol Chem 276:37258-37265.
【図１】
2010521694.tif 000003
【図２】
2010521694.tif 000004
【図３】
2010521694.tif 000005
【図４】
2010521694.tif 000006
【図５】
2010521694.tif 000007
【国際調査報告】
2010521694.tif 000008
2010521694.tif 000009
2010521694.tif 000010