(57)【要約】  月経血幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物、ならびにそのための方法、プロセスおよびシステムを、本発明によって提供する。ＭＳＣは月経の間に収集された月経流出物から処理される。ＭＳＣは、凍結保存するか、凍結保存のための調製における様々な培養工程および選択工程を介して処理するか、または治療用もしくは薬用化粧品用の使用のために処理することができる。凍結保存したＭＳＣは、治療用および薬用化粧品用の使用のための調製において解凍できる。ＭＳＣは、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＨＬＡクラスＩを発現し、ＣＤ３およびＨＬＡクラスＩＩを低く発現するかまたは発現しない。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
月経血幹細胞を得る方法であって、
ａ）月経流出物から月経血幹細胞を単離する工程と；
ｂ）月経流出物から単離された月経血幹細胞を処理する工程と
を含む方法。
【請求項２】
月経流出物から月経血幹細胞を単離する前記工程が、遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の少なくとも１つにより月経流出物を処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
月経流出物から単離された月経血幹細胞を処理する前記工程が、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＨＬＡクラスＩを含む、少なくとも１つの細胞マーカーについて月経血幹細胞を選択することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
月経血幹細胞を処理する前記工程が、月経血幹細胞を培養するさらなる工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
月経血幹細胞を処理する前記工程が、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＨＬＡクラスＩを含む、少なくとも１つの細胞マーカーについて月経血幹細胞を選択するさらなる工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
月経血幹細胞を処理する前記工程が、月経血幹細胞を培養するさらなる工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
月経流出物から単離された月経血幹細胞を処理する前記工程が、月経血幹細胞を培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
月経血幹細胞を処理する前記工程が、月経血幹細胞を選択するさらなる工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
月経血幹細胞を処理する前記工程が、月経血幹細胞を培養するさらなる工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
月経血幹細胞を処理する前記工程が、細胞マーカーについて月経血幹細胞を選択するさらなる工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が月経血幹細胞を凍結保存するさらなる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、凍結保存した月経血幹細胞を解凍し、解凍された月経血幹細胞を処理するさらなる工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、月経血幹細胞および月経血幹細胞の生存率を維持する細胞培地を含む治療用組成物を調製するさらなる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、月経血幹細胞および薬用化粧品用調製物を含む薬用化粧品用組成物を調製するさらなる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
月経流出物から月経血幹細胞を収集するプロセスであって、
ａ）月経周期の間に月経流出物を獲得することと；
ｂ）処理施設に月経流出物を輸送することと；
ｃ）細胞調製物へと月経流出物から月経血幹細胞を単離することと；
ｄ）月経血幹細胞の細胞調製物を処理することと
を含むプロセス。
【請求項１６】
月経流出物から月経血幹細胞を収集するためのシステムであって、
ａ）月経血幹細胞単離装置が月経流出物から月経血幹細胞を分離する、月経血幹細胞単離装置と；
ｂ）月経血幹細胞収集装置が月経血幹細胞を収集する、月経血幹細胞収集装置と；
ｃ）月経血幹細胞処理装置が治療用使用または凍結保存のために月経血幹細胞を調製する、月経血幹細胞処理装置と
を含むシステム。
【請求項１７】
月経血幹細胞を凍結保存する方法であって、
ａ）月経の間に収集された月経流出物から月経血幹細胞を単離する工程と；
ｂ）月経流出物から単離された月経血幹細胞を収集する工程と；
ｃ）月経流出物から単離された月経血幹細胞を凍結保存する工程と
を含む方法。
【請求項１８】
月経流出物から月経血幹細胞を単離する前記工程が、遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の少なくとも１つによって月経流出物を処理することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
月経流出物から単離された月経血幹細胞を収集する前記工程が、細胞マーカーについて月経血幹細胞を選択する少なくとも１つの工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
月経流出物から単離された月経血幹細胞を収集する前記工程が、選択された月経血幹細胞を培養する少なくとも１つの工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
月経流出物から単離された月経血幹細胞を収集する前記工程が、月経血幹細胞を培養する少なくとも１つの工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
月経流出物から単離された月経血幹細胞を収集する前記工程が、細胞培養から月経血幹細胞を選択する少なくとも１つの工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
月経血幹細胞の集団であって、
ａ）月経の間に収集された月経流出物から月経血幹細胞を単離することと；
ｂ）月経流出物から単離された月経血幹細胞を収集することと
を含むプロセスによって得られる月経血幹細胞の集団。
【請求項２４】
月経流出物から収集された月経血幹細胞の集団を濃縮するプロセスであって、
ａ）月経の間に収集された月経流出物から月経血幹細胞を単離する工程と；
ｂ）月経流出物から単離された月経血幹細胞を収集すること工程と
を含むプロセス。
【請求項２５】
前記プロセスが、細胞マーカーのＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＨＬＡクラスＩの少なくとも１つについて月経血幹細胞を選択する少なくとも１つの工程を含む、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記プロセスが、月経血幹細胞を培養する少なくとも１つの工程を含む、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記プロセスが、月経血幹細胞を選択する少なくとも１つの工程、および選択された月経血幹細胞を培養する少なくとも１つの工程を含む、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記プロセスが、月経血幹細胞を培養する少なくとも１つの工程、および細胞培養から月経血幹細胞を選択する少なくとも１つの工程を含む、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２９】
ＣＤ１１７を発現する月経血幹細胞の集団を濃縮するプロセスであって、
ａ）月経流出物から月経血幹細胞を単離する工程と、
ｂ）月経流出物から単離された月経血幹細胞を収集する工程と；
ｃ）ＣＤ１１７を発現する月経血幹細胞を選択する工程と
を含むプロセス。
【請求項３０】
ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＨＬＡクラスＩを含む細胞マーカーの少なくとも１つを含む、月経血幹細胞の集団。
【請求項３１】
月経血幹細胞を含む細胞が濃縮された集団であって、
ａ）ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＨＬＡクラスＩを含む細胞マーカーの少なくとも１つを発現し；
ｂ）ＣＤ３およびＨＬＡクラスＩＩを含む細胞マーカーの少なくとも１つを低く発現するかまたは発現しない、
集団。
【請求項３２】
少なくとも１つの月経血幹細胞および凍結保存剤を含む組成物。
【請求項３３】
少なくとも１つの月経血幹細胞および細胞培地を含む組成物。
【請求項３４】
少なくとも１つの月経血幹細胞および薬用化粧品用薬剤を含む組成物。
【請求項３５】
少なくとも１つの月経血幹細胞および細胞生存率を維持する保存剤を含む組成物。
【請求項３６】
少なくとも１つの月経血幹細胞、および少なくとも１つの月経血幹細胞の治療用使用のための調製物における容器中の細胞培地を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、各々「子宮内膜細胞／月経血細胞の獲得、単離および凍結保存」と題する、２００７年３月１日に出願された米国仮特許出願第６０／９０４，８３６号、２００７年３月２０日に出願された第６０／９１８，９６１号、２００７年９月１７日に出願された第６０／９９４，１６６号、２００７年１０月９日に出願された第６０／９９８，２５５号、２００８年１月２２日に出願された第６１／０１１，８８１号、および２００８年２月２９日に出願された第６１／０６７，８４９号についての優先権を主張するものであり、その全体を参照することによって本明細書に組み入れる。
【０００２】
本発明は、一般的に、月経血幹細胞（menstrual stem cell）（ＭＳＣ）を得るための方法、プロセスおよびシステムに関する。本発明は、具体的には、凍結保存できるか、または凍結保存のためのまたは治療用もしくは薬用化粧品用の使用のための調製においてMSCを得る様々な培養工程および選択工程を介してさらに処理できる、月経血幹細胞の集団を単離および収集するために、月経の間に得られる血液、体液および組織の獲得および処理のための方法、プロセスおよびシステムに関する。本発明は、少なくとも１つの月経血幹細胞を含む物質の組成物にもまた関する。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞は、細胞間接触および内因性シグナルの制御を経由してインビボの細胞分裂および細胞分化を行う能力を先天的に有する。幹細胞は、局所的な環境要因をともなう刺激により細胞接触および内因性シグナルを制御することによって、分裂し、様々な細胞へとインビトロで分化できることが示されている。骨髄およびさらに胚組織などの様々な成体組織を含むいくつかのソースから幹細胞を得られることが認められる。
【０００４】
特定の幹細胞は、ｃ−ｋｉｔ受容体、スチール因子受容体および幹細胞因子受容体として公知の抗原因子ＣＤ１１７を発現する。ｃ−ｋｉｔの遺伝子は、マスト細胞増殖因子としてもまた公知の、造血、メラニン形成および生殖能のために必須の幹細胞因子（ＳＣＦ）に対するチロシンキナーゼ増殖因子受容体をコードする。造血幹細胞、マスト細胞、生殖細胞、メラノサイト、特定の基底上皮細胞、乳房の内腔上皮および胃腸管のカハール介在細胞においてＣＤ１１７が発現すことが認められる。ＣＤ１１７は、生殖細胞の確立、維持および機能において重大な役割を与える。研究は、胚の生殖腺において、ＣＤ１１７およびその対応するリガンドＳＣＦは始原生殖細胞の生存および増殖のために必須であることを示す。さらに、研究は、ＣＤ１１７およびその対応するリガンドＳＣＦが生殖腺刺激ホルモンに応答して配偶子を産生するために必須であることを示す。言いかえれば、ＣＤ１１７は、リガンドＳＣＦとの組合せにおいて精巣の生殖細胞（精原細胞）の生存および増殖、および卵母細胞の増殖および成熟のために必要である。研究は、さらにＣＤ１１７が原始造血細胞のインビトロでの増殖のための強力な増殖因子であることを示す。
【０００５】
幹細胞の治療用適用は、骨髄の初期の実験から始まった。およそ１世紀前に、医師は貧血患者および白血病患者に対して経口で骨髄を投与した。かかる治療法は不成功であったが、実験研究者は、他のマウスから取られた骨髄を血流の中へ注入することにより骨髄欠損マウスが健康に回復できることを最終的には実証した。このことは、あるヒトから他のヒトに対して骨髄を移すことが実行可能かどうかを医師に推測させた（同種間移植）。骨髄および臍帯からの幹細胞は、様々な疾患を治療するために主として造血系移植において広く使用されている。骨髄を利用した最初の幹細胞移植から、幹細胞のための他のソースは羊水、胎盤、臍帯、臍帯内皮、ウォートンジェリー、脂肪および上皮細胞を含むことが確認されている。
【０００６】
ヒト免疫系の効果（感染および異物から防御する身体の先天的なメカニズム）は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）として後に特性が明らかにされる身体の細胞の拒絶から生じる、研究者が遭遇する病気および／または致死として、初期の移植における重大な問題となった。ヒト組織適合抗原とヒト免疫系との間の関係が見出だされる後まで、ヒトにおける骨髄移植の大規模な実行は試みられなかった。身体の中の大部分の細胞の表面上で見出されるこれらのタンパク質は、ヒト白血球抗原またはＨＬＡ抗原と呼ばれる。身体の免疫系は、どの細胞が身体に属し、どの細胞が属しないかを同定するためにこれらのＨＬＡ抗原を使用する。免疫系が細胞上の抗原を認識しない場合は常に、抗体および他の物質を生成して細胞を破壊する。身体が探索および破壊する対象は、感染症を引き起こす細菌、ウイルス、腫瘍細胞、および表在性異物などの外来物である。このように、免疫系は、身体に侵入して害を引き起こしうる物から身体を守る。治療のための標的とする病状に依存して、個体自身の幹細胞を利用する自家移植は、厳密にＨＬＡ一致するという利益から生じる一定の長所の可能性がある。ドナーおよびレシピエントのＨＬＡ抗原が一致するほど、提供された骨髄のＴ細胞（免疫系細胞）が患者の身体に対して反応しない。
【０００７】
骨髄に由来する成体幹細胞の移植は、ファンコーニ貧血、再生不良性貧血、急性白血病および慢性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、リンパ増殖性障害、ならびに他の悪性腫瘍などのヒト疾患の治療においてうまく使用されてきた。骨髄成体幹細胞の代わりとなるソースは、末梢血前駆細胞、臍帯血、およびこれらのソースから採取された間葉系幹細胞を含む。しかしながら、成体幹細胞の治療用使用に関連するいくつかの欠点がある。成体幹細胞は、培養での数回の継代後に、増殖が遅いことおよび多分化能が消失することなどの、限定的な有効性を有することが示されている。
【０００８】
胚性幹細胞は、細胞療法のためにふさわしい増殖能を示した。しかしながら、ヒト胚性幹細胞は奇形腫を産生することが示された。さらに、胚からの幹細胞の採取は、採取プロセスにおける成長胚の破壊に部分的に起因する倫理的な問題を提起する。
【０００９】
成体幹細胞および胚性幹細胞に関連する問題の少なくともいくつかを克服する、幹細胞の他のソースが同定された。
【００１０】
１つのソースはヒト成体幹細胞を含む臍帯血である。いくつかの理由で、臍帯血は生存幹細胞のソースであるということが証明されている。臍帯血は、子供の分娩の間での獲得および凍結保存のための処理が比較的容易である。臍帯血は、細胞分裂可能であり様々な細胞タイプへと分化可能な幹細胞の適切なソースを提供する。いくつかの公知のヒトの障害および疾患を治療するために、骨髄に対する代替物として臍帯血に由来する幹細胞を臨床設定において使用してきた。特に、臍帯血に由来する幹細胞は、造血系移植、造血系再構成および脊椎損傷の治療において好結果であった。さらに、臍帯血に由来する幹細胞は、卒中および心筋梗塞の影響を回復させることが動物モデルにおいて示されている。
【００１１】
子宮内膜幹細胞／月経血幹細胞（ＭＳＣ）が胚性幹細胞に類似する培養における増殖能を示すことは示されている。ＭＳＣは、インビトロおよびインビボの多能性能力の可能性を示す特定の間葉系幹細胞マーカーおよび特定の胚性幹細胞マーカーもまた提示する。幹細胞のソースとしてのＭＳＣの使用はいくつかの理由のために有用である。第一に、ＭＳＣは、特異的細胞系譜へと分化する能力を示す。第二に、任意の倫理的な配慮または問題は、収集されなければ廃棄物と判断されるＭＳＣを収集することによって解決される。最後に、月経周期の間にＭＳＣを獲得するプロセスは比較的ドナーにリスクを与えない。
【００１２】
ＭＳＣの収集および適切なサンプル量のＭＳＣの獲得を対象とする公知の方法論、ならびにＭＳＣによって発現される他の細胞表面因子の中で特定の間葉系幹細胞マーカーおよび／または特定の胚様抗原因子を発現する生存ＭＳＣの最大の収率を得るために有用な関連する処理および細胞収集の方法論はないと考えられている。
【００１３】
従って、ＭＳＣを単離および凍結保存または処理するために月経の体液、血液および組織を処理する実験室への発送準備のための調製において、月経の間に脱落した体液、血液および組織中に存在する適切な量のＭＳＣを収集する方法の当面の必要性がある。月経の血液、体液および組織に由来するＭＳＣの細胞調製物を得るために、月経の体液、血液および組織を処理する方法の当面の必要性もまたある。例えばＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＨＬＡクラスＩを含む細胞表面マーカーまたは細胞内マーカーの少なくとも１つを発現できるが、細胞マーカーのＣＤ３およびＨＬＡクラスＩＩの少なくとも１つを低レベルで発現するかまたは発現しない細胞などを、凍結保存、さらなる処理または治療用使用のための調製において、月経流出物（menstrual flow）からＭＳＣを単離、選択および／または培養するさらなる必要性もまたある。他の細胞マーカー特性は、本発明の実施形態の実践の結果と共に提供されている。月経の血液、体液および組織から得られ収集されたＭＳＣの集団または特異的ＭＳＣを凍結保存するさらなる必要性がなおある。
【発明の概要】
【００１４】
収集、処理、および凍結保存が容易であり、治療用、薬用化粧品用、または他の使用のための可能性を示す幹細胞のソースの当面の必要性がある。この必要性は、本発明の方法、プロセスおよび組成物によって満たされる。
【００１５】
本発明は、月経血幹細胞を得る方法を提供する。１つの実施形態において、本方法は、月経の間に収集された月経流出物から月経血幹細胞を単離する工程を含む。月経流出物から月経血幹細胞を単離する工程は、遠心分離、密度勾配遠心法、濾過または沈降の少なくとも１つの工程により月経流出物を処理することを含む。月経血幹細胞を単離する工程は、少なくとも１つの抗生物質を含む溶液による月経血幹細胞の汚染除去もまた任意で含みうる。この実施形態において、本方法は、月経流出物から単離された月経血幹細胞を処理する追加の工程を含む。月経流出物サンプルから単離された月経血幹細胞を処理する工程は、特定の細胞表面マーカーについて月経血幹細胞を選択する工程、または処理後サンプル、選択サンプルもしくは月経血幹細胞の解凍したサンプルから月経血幹細胞を培養する工程の少なくとも１つの工程を含みうる。
【００１６】
１つの実施形態において、月経流出物から単離された月経血幹細胞を処理する工程は、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＨＬＡクラスＩを含む少なくとも１つの細胞マーカーについて月経血幹細胞を選択する工程を含む。選択された細胞は、月経血幹細胞の培養によってさらに処理できる。次に、培養した月経血幹細胞は、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＨＬＡクラスＩを含む少なくとも１つの細胞マーカーについて、月経血幹細胞を選択するさらなる工程を行なうことができる。選択された月経血幹細胞は、月経血幹細胞を培養するさらなる工程にかけることができる。月経血幹細胞を選択または培養する工程後の任意の時点で、月経血幹細胞は、凍結保存または治療用もしくは薬用化粧品用の使用のために月経血幹細胞を調製する工程を行なうことができる。次に、凍結保存のために調製された月経血幹細胞は使用のために凍結保存され、後に解凍できる。
【００１７】
他の実施形態において、月経流出物から単離された月経血幹細胞を処理する工程は、月経血幹細胞の培養を含む。次に、培養した月経血幹細胞は、特定の細胞表面マーカーについて月経血幹細胞を選択する工程を行なうことができる。次に、選択された月経血幹細胞は、月経血幹細胞を培養するさらなる工程を行なうことができる。次に、さらに培養した月経血幹細胞は、細胞マーカーについて月経血幹細胞を選択する追加の工程を行なうことができる。月経血幹細胞を選択または培養する工程後の任意の時点で、月経血幹細胞は、凍結保存または治療用もしくは薬用化粧品用の使用のために月経血幹細胞を調製する工程を行なうことができる。次に、凍結保存のために調製された月経血幹細胞は使用のために凍結保存され、後に解凍できる。
【００１８】
他のさらなる実施形態において、月経流出物から単離された月経血幹細胞を処理する工程は、月経血幹細胞を凍結保存する工程を含む。
【００１９】
なお他の実施形態において、月経血幹細胞を処理する工程は、月経血幹細胞、および月経血幹細胞の生存度を維持する細胞培地を含む組成物を調製するさらなる工程を含む。
【００２０】
よりさらなる実施形態において、月経血幹細胞を処理する工程は、月経血幹細胞および薬用化粧品用調製物を含む組成物を調製するさらなる工程を含む。
【００２１】
さらなる実施形態において、凍結保存した月経血幹細胞は、月経血幹細胞を培養する工程または選択する工程のいずれかの少なくとも１つの工程を含むさらなる処理のための調製において解凍できる。あるいは、凍結保存した月経血幹細胞は、治療用または薬用化粧品用の使用のための調製において解凍できる。
【００２２】
本発明は、さらに月経流出物から月経血幹細胞を収集するためのプロセスを提供する。１つの実施形態において、このプロセスは、月経周期の間に月経流出物を獲得すること、処理施設に月経流出物を輸送すること、月経流出物から細胞調製物へと月経血幹細胞を単離すること、および月経血幹細胞の細胞調製物を処理することを含む。
【００２３】
本発明は、月経流出物から月経血幹細胞を収集するためのシステムもまた提供する。１つの実施形態において、このシステムは、月経血幹細胞単離装置が月経流出物から月経血幹細胞を分離する月経血幹細胞単離装置、月経血幹細胞収集装置が月経血幹細胞を収集する月経血幹細胞収集装置、および月経血幹細胞処理装置が治療用使用または凍結保存のために月経血幹細胞を調製する月経血幹細胞処理装置を含む。
【００２４】
本発明は、月経血幹細胞を凍結保存する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、月経の間に収集された月経流出物から月経血幹細胞を単離する工程、月経流出物から単離された月経血幹細胞を収集取する工程、および月経流出物から単離された月経血幹細胞を凍結保存する工程を含む。
【００２５】
月経流出物から月経血幹細胞を単離する工程を含む月経血幹細胞を凍結保存する方法は、遠心分離、密度勾配遠心法、濾過または沈降の少なくとも１つの工程によって月経流出物を処理することを含む。月経血幹細胞を単離する工程は、少なくとも１つの抗生物質を含む溶液により月経血幹細胞を汚染除去することもまた任意で含みうる。この方法は、少なくとも凍結保存またはさらなる細胞培養の工程の前に、細胞マーカーについて月経血幹細胞を選択する少なくとも１つの工程を含みうる。この方法は、選択された月経血幹細胞を培養する少なくとも１つのさらなる工程を含みうる。
【００２６】
月経流出物から単離された月経血幹細胞を収集する工程を含む月経血幹細胞を凍結保存する方法は、月経血幹細胞を培養する少なくとも１つの工程を含む。この方法は、細胞培養から月経血幹細胞を選択する少なくとも１つの工程を含みうる。
【００２７】
本発明は、月経の間に収集された月経流出物から月経血幹細胞を単離する工程および月経流出物から単離された月経血幹細胞を収集する工程を含むプロセスによって得られる月経血幹細胞の集団を提供する。
【００２８】
本発明は、月経流出物から収集された月経血幹細胞の集団を濃縮するプロセスを提供する。１つの実施形態において、このプロセスは、月経の間に収集された月経流出物から月経血幹細胞を単離する工程および月経流出物から単離された月経血幹細胞を収集する工程を含む。本プロセスは、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＨＬＡクラスＩを含む群の少なくとも１つの細胞マーカーについて月経血幹細胞を選択する少なくとも１つの工程を含む。本プロセスは、月経血幹細胞を培養する少なくとも１つの工程を含みうる。本プロセスは、月経血幹細胞を選択する少なくとも１つの工程および選択された月経血幹細胞を培養する少なくとも１つの工程を含みうる。月経血幹細胞を単離する工程は、少なくとも１つの抗生物質を含む溶液により月経血幹細胞を汚染除去することもまた任意で含みうる。別の方法では、本プロセスは、月経血幹細胞を培養する少なくとも１つの工程、および細胞培養から月経血幹細胞を選択する少なくとも１つの工程を含みうる。
【００２９】
本発明は、月経血幹細胞の集団を濃縮するプロセスを提供する。１つの実施形態において、このプロセスは、月経流出物から月経血幹細胞を単離する工程、月経流出物から単離された月経血幹細胞を収集する工程、およびＭＳＣに関連した細胞マーカーを発現する月経血幹細胞を選択する工程を含む。
【００３０】
本発明は、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＨＬＡクラスＩを含む細胞マーカーの少なくとも１つを含む月経血幹細胞の集団を提供する。
【００３１】
本発明は、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＨＬＡクラスＩを含む細胞マーカーの少なくとも１つを発現し、細胞マーカーのＣＤ３およびＨＬＡクラスＩＩの少なくとも１つを含む細胞マーカーを低く発現するかまたは発現しない月経血幹細胞を含む細胞が濃縮された集団を提供する。
【００３２】
本発明は、少なくとも１つの月経血幹細胞および凍結保存剤を含む組成物を提供する。
【００３３】
本発明は、少なくとも１つの月経血幹細胞および細胞培地を含む組成物を提供する。
【００３４】
本発明は、少なくとも１つの月経血幹細胞および薬用化粧品用薬剤を含む組成物を提供する。
【００３５】
本発明は、少なくとも１つの月経血幹細胞および細胞生存度を維持する保存剤を含む組成物を提供する。
【００３６】
本発明は、少なくとも１つの月経血幹細胞、および少なくとも１つの月経血幹細胞の治療用使用のための調製における容器中の細胞培地を含む組成物を提供する。
【００３７】
本発明に従って収集された細胞は、治療用、薬用化粧品用もしくは再生医療用または他の適切な適用において使用できる。
【００３８】
本発明は、月経の血液、体液および細胞および組織を含む月経流出物の少なくとも１つのサンプルを収集するための、収集培地と月経流出物サンプルを組み合わせることによって輸送のために月経流出物を調製するための、および凍結保存または治療用もしくは薬用化粧品用の使用のためのＭＳＣを単離、収集、および処理するために月経流出物サンプルが処理される処理施設に月経流出物サンプルを輸送するための、方法およびプロセスを提供する。
【００３９】
本発明は、高収率の生存ＭＳＣを産生する様式で、ＭＳＣを単離、収集、および凝縮するための方法およびプロセスもまた提供する。
【００４０】
１つの実施形態において、月経血幹細胞を選択する工程は、月経血幹細胞に存在する細胞マーカーの少なくとも１つを発現する細胞をポジティブに選択することを含みうる。別の方法では、月経血幹細胞を選択する工程は、月経血幹細胞に存在しない細胞マーカーを発現する不要な細胞を除去することによって、細胞をネガティブに選択することを含みうる。ネガティブ選択は、例えばＣＤ４５または月経血幹細胞上に存在しない他の細胞表面マーカーを発現する細胞を選択することを含みうる。
【００４１】
さらなる実施形態において、月経血幹細胞を選択する工程は、例えばステム・セル・テクノロジーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社からの、ロゼットセップ（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ）、イージーセップ（ＥａｓｙＳｅｐ）、ロボセップ（ＲｏｂｏＳｅｐ）、ステムセップ（ＳｔｅｍＳｅｐ）またはスピンセップ（ＳｐｉｎＳｅｐ）などの、市販で入手可能な枯渇または凝縮のキットを使用することを含みうる。
【００４２】
なおさらなる実施形態において、月経血幹細胞を選択する工程は、ＭＳＣを選択し、完全な形の細胞膜のない死んだ細胞および／または死にかけの細胞を除去するためにアルデフルオロ（ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ）（登録商標）（アルダゲン（Ａｌｄａｇｅｎ）社）を使用して、月経血幹細胞を選択することを含みうる。アルデフルオロ（登録商標）キットは、月経血幹細胞、系譜抗原陰性（Ｌｉｎ−）細胞、コロニー形成細胞、長期培養開始細胞およびＮＯＤ／ＳＣＩＤ再構築細胞に存在する表面マーカーについて陽性のＡＬＤＨｂｒ細胞を選択するために使用できる。
【００４３】
なおよりさらなる実施形態において、月経血幹細胞を選択する工程は、関係のあるＭＳＣマーカーを発現するＭＳＣを凝縮するために、月経血幹細胞に対して、約２週間〜約４週間の間の血清枯渇を行うことを含みうる。一旦細胞が採取および培養されれば、造血幹細胞は取り出されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の一般的に全体的な方法およびプロセスを図示するフローチャートである。
【図２】月経血幹細胞の収集および凍結保存ための本発明の実施形態を示すフローチャートである。
【図３】月経血幹細胞の収集および凍結保存ための本発明の他の実施形態を示すフローチャートである。
【図４】月経血幹細胞の収集および凍結保存ための本発明のなお他の実施形態を示すフローチャートである。
【図５】月経血幹細胞の収集および凍結保存ための本発明のさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図６】月経血幹細胞の収集および凍結保存ための本発明のなおさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図７】月経血幹細胞の収集および凍結保存ための本発明のよりさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図８】月経血幹細胞の収集および凍結保存ための本発明のなおよりさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図９】月経血幹細胞の収集および凍結保存ための本発明の追加の実施形態を示すフローチャートである。
【図１０】月経血幹細胞の収集および凍結保存ための本発明のさらなる追加の実施形態を示すフローチャートである。
【図１１】治療用使用のための月経血幹細胞の収集および月経血幹細胞の調製のための本発明の実施形態を示すフローチャートである。
【図１２】治療用使用のための月経血幹細胞の収集および月経血幹細胞の調製のための本発明のさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図１３】治療用使用のための月経血幹細胞の収集および月経血幹細胞の調製のための本発明のなおさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図１４】治療用使用のための月経血幹細胞の収集および月経血幹細胞の調製のための本発明のよりさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図１５】治療用使用のための月経血幹細胞の収集および月経血幹細胞の調製のための本発明のなおよりさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図１６】治療用使用のための月経血幹細胞の収集および月経血幹細胞の調製のための本発明の追加の実施形態を示すフローチャートである。
【図１７】治療用使用のための月経血幹細胞の収集および月経血幹細胞の調製のための本発明の追加のさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図１８】治療用使用のための月経血幹細胞の収集および月経血幹細胞の調製のための本発明のさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図１９】治療用使用のための月経血幹細胞の収集および月経血幹細胞の調製のための本発明の他の実施形態を示すフローチャートである。
【図２０】治療用使用のための調製において凍結保存した月経血幹細胞を解凍するための本発明の実施形態を示すフローチャートである。
【図２１】治療用使用のために凍結保存した月経血幹細胞を調製するための本発明の他の実施形態を示すフローチャートである。
【図２２】治療用使用のために凍結保存した月経血幹細胞を調製するための本発明のなお他の実施形態を示すフローチャートである。
【図２３】治療用使用のために凍結保存した月経血幹細胞を調製するための本発明のなおさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図２４】治療用使用のために凍結保存した月経血幹細胞を調製するための本発明のよりさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図２５】治療用使用のために凍結保存した月経血幹細胞を調製するための本発明のさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図２６】治療用使用のために凍結保存した月経血幹細胞を調製するための本発明のなおよりさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図２７】治療用使用のために凍結保存した月経血幹細胞を調製するための本発明の他の実施形態を示すフローチャートである。
【図２８】治療用使用のために凍結保存した月経血幹細胞を調製するための本発明の他のさらなる実施形態を示すフローチャートである。
【図２９ａ−ｊ】以下に記載されるようなＭ２−０１に関して、処理後サンプルおよびアイソタイプについてのフローサイトメトリー分析の結果を示した図である。処理後サンプルは約１ｍｌの細胞懸濁としてＭ２−０１から収集し、フローサイトメトリー分析のための分析チューブ中に置いた。この結果は、ＴＮＣ集団のＣＤ１１７＋細胞の濃度が０．４％、ＴＮＣ集団のＣＤ４４＋細胞の濃度が１７．７％、ＴＮＣ集団のＣＤ１６６＋細胞の濃度が３．６％、ＴＮＣ集団のＣＤ１０５＋細胞の濃度が８．０％、ＴＮＣ集団のＣＤ９０＋細胞の濃度が６．８％、ＴＮＣ集団のＣＤ２９＋細胞の濃度が０．１％、ＴＮＣ集団のＣＤ３４＋細胞の濃度が０．１％、および７ＡＡＤによって測定されるような細胞生存度が９５．４％であることを示す。
【図３０ａ−ｅ】本発明のＣＤ１１７選択方法によって得られる陽性画分中の細胞に関するフローサイトメトリー分析の結果を示した図である。ＣＤ１１７選択後、約１ｍｌの細胞懸濁を収集し、フローサイトメトリー分析のための分析チューブ中に置いた。この結果は、ＴＮＣ集団のＣＤ１１７＋細胞の濃度が７．２％、ＴＮＣ集団のＣＤ４４＋細胞の濃度が９３．６％および７ＡＡＤによって測定されるような細胞生存度が９５．８％であることを示す。この結果は、本発明のフローサイトメトリー分析に従って処理サンプルを流すことおよびＩｇＧ抗体のアイソタイプと共に流された処理後サンプルにより得られたバックグラウンド計算を引くことによって計算された。
【図３１ａ−ｃｃ】以下に記載されるようなＭ２−０２Ｃに関して、処理後サンプルおよびアイソタイプについてのフローサイトメトリー分析の結果を図示した図である。処理後サンプルは約１ｍｌの細胞懸濁として収集し、フローサイトメトリー分析のための分析チューブ中に置いた。この結果は、ＴＮＣ集団のＣＤ１１７＋細胞の濃度が０．２％、ＴＮＣ集団のＣＤ４４＋細胞の濃度が１．８％、ＴＮＣ集団のＣＤ１６６＋細胞の濃度が０．１％、ＴＮＣ集団のＣＤ１０５＋細胞の濃度が１．１％、ＴＮＣ集団のＣＤ９０＋細胞の濃度が０．４％、ＴＮＣ集団のＣＤ２９＋細胞の濃度が０．５％、ＴＮＣ集団のＣＤ３４＋細胞の濃度が０．０％、および７ＡＡＤによって測定されるような細胞生存度が９９．５％であることを示す。
【図３２ａ−ｃｃ】本発明のＣＤ１１７選択方法によって得られる陽性画分中の細胞に関するフローサイトメトリー分析の結果を図示した図である。陽性画分は約１ｍｌの細胞懸濁として収集し、フローサイトメトリー分析のための分析チューブ中に置いた。この結果は、ＴＮＣ集団のＣＤ１１７＋細胞の濃度が１８．４０％、ＴＮＣ集団のＣＤ４４＋細胞の濃度が９３．０％、ＴＮＣ集団のＣＤ１６６＋細胞の濃度が８９．２％、ＴＮＣ集団のＣＤ１０５＋細胞の濃度が８１．４％、ＴＮＣ集団のＣＤ９０＋細胞の濃度が７８．１％、ＴＮＣ集団のＣＤ２９＋細胞の濃度が７３．６％、ＴＮＣ集団のＣＤ３４＋細胞の濃度０．１％、および７ＡＡＤによって測定されるような細胞生存度が９１．９％であることを示す。この結果は、本発明のフローサイトメトリー分析に従って処理サンプルを流すことおよびＩｇＧ抗体のアイソタイプと共に流された処理後サンプルにより得られたバックグラウンド計算を引くことによって計算された。
【図３３】さらに詳細に本明細書において記述されるような培養における数回の継代、凍結保存、解凍および解凍後継代の後の、Ｍ２−０３Ｅに関する細胞のフローサイトメトリー分析の結果を図示した図である。フローサイトメトリー結果は、ここで示されるように、細胞がＭＨＣ  Ｉ、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ１０５、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ９、ＣＤ１６６、ＣＤ１６６およびＣＸＣＲ４を発現し、ＣＤ１３３、ＭＨＣ  ＩＩ、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ３８を低く発現するかまたは発現しないことを示した。
【図３４ａ】月経血幹細胞Ｍ２−０３ＥがＣＤ１１７について陽性に染色されたことを示した図である。
【図３４ｂ】陰性対照はＣＤ１１７について陽性に染色されないことを示した図である。
【図３４ｃ】月経血幹細胞Ｍ２−０３ＥがＳＳＥＡ−４について陽性に染色されたことを示した図である。
【図３４ｄ】陰性対照はＳＳＥＡ−４について陽性に染色されないことを示した図である。
【図３４ｅ】月経血幹細胞Ｍ２−０３ＥではさらにＣＤ１１７およびＳＳＥＡ−４が共局在することを示した図である。
【図３４ｆ】陰性対照ではＣＤ１１７およびＳＳＥＡ−４の共局在について陽性に染色されないことを示した図である。
【図３５ａ】月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅが急速に増殖することを示した図である。約２４時間〜約３６時間の倍加時間で凍結保存前の培養において月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅが急速に増殖することを示す。急速な増殖により、８回の倍化で５０，０００細胞〜４８００万細胞の増加が可能になった。
【図３５ｂ】月経血幹細胞（Ｍ２−０３Ｅ）が多能性マーカーを発現することを示した図である。月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅは、ＲＴ−ＰＣＲによって決定されるように、培養において約１２継代までＲＮＡレベルでＯｃｔ−４を発現することを示す。Ｌ、ラダー；水；ＥＳＣ、胚性幹細胞；Ｐ１２、継代１２。
【図３６ａ−ｃ】月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅが神経組織へと分化したことを示した図である。月経血幹細胞を０４およびＧａｌＣを発現する希突起神経膠細胞へと分化するように神経誘導した。
【図３６ｄ】月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅが神経組織へと分化したことを示した図である。月経血幹細胞はＭａｐ−２もまた発現した。
【図３６ｅ】月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅが神経組織へと分化したことを示した図である。月経血幹細胞はＴｕｂ−３もまた発現した。
【図３６ｆ】月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅが神経組織へと分化したことを示した図である。月経血幹細胞はビメンチンもまた発現した。
【図３６ｇ】月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅが神経組織へと分化したことを示した図である。分化した細胞のＲＴ−ＰＣＲの結果は神経系細胞に典型的なＲＮＡレベル発現を示す。ＲＴ−ＰＣＲ：Ｌ、ラダー；Ｗ、水；Ｂ、脳対照；神経誘導した月経血幹細胞。
【図３７ａ】心臓組織へと分化した月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅを示した図である。月経血幹細胞は８ｕＭのアザ（Ａｚａ）により処理された。トロポニン発現は８００ｕＭのＳＮＡＰによる細胞の処理によって刺激された。
【図３７ｂ】心臓組織へと分化した月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅを示した図である。月経血幹細胞は８ｕＭアザにより処理され、免疫細胞化学によって表わされるアクチンの強い発現を示した。
【図３７ｃ】心臓組織へと分化した月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅを示した図である。月経血幹細胞は８ｕＭのアザにより処理された。コネキシン４３発現は８００ｕＭのＳＮＡＰによる細胞の処理によって刺激された。
【図３７ｄ】心臓組織へと分化した月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅを示した図である。ＲＴ−ＰＣＲにより心臓分化が確認された。ＲＴ−ＰＣＲ：Ｌ、ラダー；Ｗ、水；Ｈ、心臓対照；心臓誘導した。
【図３８ａ−ｂ】月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅが中胚葉タイプ組織へと分化したこと示した図である。図３８ａで示されるような対照に比較して、図３８ｂにおいて示されるように、細胞の脂肪空胞はオイルレッドＯにより染色され、脂肪組織への分化が誘導されたことを示す。
【図３８ｃ−ｄ】月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅが中胚葉タイプ組織へと分化したこと示した図である。図３８ｃで示されるような対照に比較して、図３８ｄで示されるように、細胞はアルシアンブルーにより染色され、誘導されたときの軟骨形成組織への分化を示す。
【図３８ｅ−ｆ】月経血幹細胞Ｍ２−０３Ｅが中胚葉タイプ組織へと分化したこと示した図である。図３８ｅと比較して、図３８ｆで示されるように、細胞はアリザリンレッドＳにより染色され、カルシウム沈着の存在を示す。
【図３９】Ｍ２−０３Ｅ月経血幹細胞が、解凍後培養の継代１２でテロメラーゼ活性を発現することを示すグラフである。ｈＥＳＣ、ヒト胚性幹細胞；ＭＥＦ、マウス胎児線維芽細胞；ＭｅｎＳＣｓ  Ｐ１２。
【図４０】３つの群へと分割され、本発明の月経血幹細胞収集方法に関連した変数を解析するために、事前に設定された条件下で収集された１６１サンプルで実行した研究の結果を示すグラフである。この研究は、抗生物質含有および抗生物質不含有の収集培地を使用すること、および氷ありおよび氷なしで月経流出物サンプルを送る効果を測定するために実行した。図４０は、全有核細胞カウント分析が、３つの群について収集されたすべてのサンプルにわたって、収集されたサンプルあたり平均約７９０万細胞となることを示す。
【図４１】図４０中で参照された研究の結果を示すグラフである。図４１は、処理後サンプルにおいて細胞生存度が３つの群について収集されたすべてのサンプルにわたって、平均約７４％の生存度となることを示す。
【図４２】図４０中で参照された研究の結果を示すグラフである。図４２は、３つの群について収集されたすべてのサンプルについて平均温度が平均約１５℃となることを示す。
【図４３】図４０中で参照された研究の結果を示すグラフである。図４３は、３つの群について収集されたすべてのサンプルの平均試料体積が、約１ｍｌの月経流出物サンプルおよび約１０ｍｌの収集培地を含んで、平均約１１ｍｌとなることを示す。
【図４４】図４０中で参照された研究の結果を示すグラフである。図４４は、収集から処理施設での受領より計算される平均試料齢が、約５時間未満〜１４０時間以上にわたることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明の理解は、付随の説明および図中で記述されるような特定の例示的な実施形態と併用して、援用される本発明の実施形態の以下の詳細な説明の考察によって容易になる。本発明の明瞭な理解に適切な要素を図示するために本発明の図および説明は単純化されていることが、理解されるべきである。
【００４６】
ここで図１〜４４を参照して、本発明は、月経の間に脱落した血液、細胞、体液、および組織（この開示の本明細書において「月経流出物」とも呼ばれる）から単離され、本発明の方法、プロセスおよびシステムに従って収集された月経血幹細胞の獲得に関連した方法、プロセス、システムおよび組成物を提供する。本発明の開示の全体にわたって使用されるように、語句「子宮内膜細胞／月経血細胞」、「子宮内膜幹細胞／月経血幹細胞」、「月経血幹細胞」および「月経血細胞」、ならびに用語「ＭＳＣ」および「細胞」は、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６およびＨＬＡクラスＩを含むが、これらに限定されない細胞マーカーまたは細胞内マーカーの少なくとも１つを発現するが、ＣＤ３およびＭＨＣ  ＩＩを低レベルで発現するかまたは発現しない、月経流出物から収集された任意の１つまたは複数の細胞に関して、全体にわたって一般的に使用される。用語「細胞」は単数の意味で使用されるが、本発明の１つ以上の細胞を指す複数の意味でもまた使用できる。細胞の前述の特性は例示的な特性として提供されているが、月経血幹細胞の追加の細胞表面特性は、任意の表および図の上で本明細書に提供される特性を含むがこれらに限定されずに、本発明の開示の全体にわたって本明細書において提供され、本発明の月経血幹細胞に関するさらなる開示を提供する。
【００４７】
ここで特に図３６〜３８を参照して、いくつかの幹細胞が多数の別個の細胞タイプへと分化する細胞の能力により多能性の性質であることが認識される。多能性細胞は、多数の異なる哺乳類の細胞タイプへと分化を行う能力を有する。特に、図３６〜３８中で図示されるように、本発明のＭＳＣは、例えば神経細胞系譜、心臓形成系譜、軟骨形成系譜、脂肪細胞形成系譜および骨形成系譜などの様々な別個の細胞系譜へと分化する能力もまた示す。
【００４８】
本発明のＭＳＣは、身体中で２６０の体細胞のいかなるものへと分化することができると考えられる。例えば、細胞は、少なくとも肝細胞、膵細胞、筋原細胞、骨形成細胞、軟骨形成細胞、脂肪細胞、上皮細胞、神経細胞、角化細胞および心筋細胞へと分化できる。共培養系において見られるように、細胞は、肝細胞、膵細胞、筋原細胞、骨形成細胞、軟骨形成細胞、脂肪細胞、上皮細胞、神経細胞、角化細胞および心筋細胞などの他の分化しやすい細胞と共に培養しときに分化する能力もまた保ちうる。分化から得られた細胞および共培養から得られた細胞は、置換療法または再生療法、他の治療用適用、薬用化粧品、器官拒絶の治療法および他の適用のための処理で使用される可能性もまた有する。
【００４９】
特に、治療用、薬用化粧品用、および他の適用におけるＭＳＣの可能な使用は、ＭＳＣが（ａ）使用しなければ生物学的廃棄物と見なされる、問題とならないソースから容易に得られ、（ｂ）医学的訓練の必要性なしにドナーによって有効に収集され、（ｃ）高度に増殖し、（ｄ）所望される細胞タイプへと分化が可能であり、（ｅ）自己適用が可能であり、（ｆ）同種異系適用が可能であり、（ｇ）複数の治療法の可能なソースとして使用できる単一の細胞株を提供でき、（ｈ）他の正常細胞と潜在的に共培養が可能であり、（ｉ）カスタマイズされた再生医療のソリューションのためのソースとして使用でき、（ｊ）数十年間にわたる規則的な周期で即座に複数の収集が可能であるという多数の理由のために有用である。
【００５０】
他のソースから得られた幹細胞の利用は、再生医学の様々な形態で以下の状況に使用されている：糖尿病、心筋梗塞、弁／動脈置換、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＭＳ、卒中治療法、インスリン再生、アンチエイジング血清、熱傷／創傷治癒包帯、にきび管理、白斑、毛髪置換、歯再生、乳房置換／増大、肝硬変、陰茎増大、スポーツ療法、貧血、白血病、リンパ腫、肺線維症、鎌状赤血球貧血、骨置換、骨粗鬆症、脊柱側弯症、関節リウマチ、脊髄損傷、膝／腰／肘置換、ホルモン補充療法、ＰＭＳ／鬱管理、自閉症、生殖不能治療法、視覚再生、レンズ置換。
【００５１】
一般的に、および１つの実施形態において、本発明は、月経流出物からＭＳＣを得て収集する方法を提供する。他の実施形態において、本発明は月経流出物からＭＳＣを収集するためのシステムを提供する。なお他の実施形態において、本発明は、月経流出物から収集されたＭＳＣを凍結保存する方法を提供する。なおさらなる実施形態において、ＭＳＣの集団を含む生産物は、月経流出物からＭＳＣを得て単離する様々なプロセスによって収集できる。なおよりさらなる実施形態において、本発明は、濃縮されたＭＳＣの集団および月経流出物から得られたＭＳＣの集団を濃縮するプロセスを提供する。よりさらなる実施形態において、本発明は、例えば、ＭＳＣおよび凍結保存剤を含む組成物、ＭＳＣおよび少なくとも１つの薬用化粧品用薬剤を含む組成物、ならびにＭＳＣおよび保存剤を含む組成物などの、ＭＳＣおよび他の薬剤を含む様々な組成物を提供する。本発明のこれらの様々な実施形態は、さらに詳細に以下に記述される。
【００５２】
本発明の全体的な方法およびプロセスの例示的な概略図を図１中に示す。一般的に、様々な工程は、月経流出物を獲得し、特定の使用のためにさらに処理できるＭＳＣを得るように月経流出物を処理するために使用できる。特に、ＭＳＣは、凍結保存でき、細胞の選択または培養の単一工程または複数工程を介して濃縮でき、および／または治療用もしくは薬用化粧品用の使用のために調製できる。本発明の実行の全体にわたって、ＭＳＣおよび周辺環境は、例えば収集されたＭＳＣの特性を評価するフローサイトメトリー、およびサンプルの任意の混入の可能性を同定する微生物分析などの、方法およびプロセスによる品質管理分析を行なうことができる。
【００５３】
図１で図示された本発明の様々な実施形態は、本発明の実動する実施例の明文化された説明と共に図２〜２８でさらに詳述される。
【００５４】
ここで図２を参照して、本発明はＭＳＣの凍結保存ための方法およびプロセスを提供する。図２に従って、月経流出物は収集プロセスにより収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣをさらに処理し、凍結保存のための調製において凍結保存剤と組み合わせることができ、次に凍結保存する。次に凍結保存したＭＳＣは、後に使用のために解凍できる。
【００５５】
ここで図３を参照して、本発明はＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図３に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣは、例えばＭＳＣに関連した任意の１つまたは複数の細胞マーカーのような特定の細胞マーカーを発現するＭＳＣを選択することによってさらに濃縮または凝縮できる。選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣでさえも処理され、凍結保存のための調製において凍結保存剤と組み合わせ、次に凍結保存できる。次に凍結保存したＭＳＣは、後に使用のために解凍できる。
【００５６】
ここで図４を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図４に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣは、例えばＭＳＣに関連した任意の１つまたは複数の細胞マーカーのような特定の細胞マーカーを発現するＭＳＣを選択することによってさらに濃縮または凝縮できる。次に選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣでさえも、ＭＳＣを増やすように培養できる。次に培養したＭＳＣは凍結保存のための調製において凍結保存剤と組み合わせ、次に凍結保存できる。次に凍結保存したＭＳＣは、後に使用のために解凍できる。
【００５７】
ここで図５を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図５に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物がＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣは、例えばＭＳＣに関連した任意の１つまたは複数の細胞マーカーのような特定の細胞マーカーを発現するＭＳＣを選択することによってさらに濃縮または収集できる。次に選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣでさえも、ＭＳＣを増やすように培養できる。次に培養したＭＳＣは、特異的ＭＳＣを濃縮または収集するために特異的細胞表面マーカーについてさらに選択できる。選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣでさえも、凍結保存のための調製において凍結保存剤と組み合わせ、次に凍結保存できる。次に凍結保存したＭＳＣは、後に使用のために解凍できる。
【００５８】
ここで図６を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図６に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣは、例えばＭＳＣに関連した任意の１つまた複数の細胞マーカーのような特定の細胞マーカーを発現するＭＳＣを選択することによってさらに濃縮または収集できる。次に選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣでさえも、ＭＳＣを増やすように培養できる。次に培養したＭＳＣは、特異的ＭＳＣを濃縮または収集するために特異的細胞表面マーカーについてさらに選択できる。次に選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣでさえも、ＭＳＣ数を増やすようにさらに培養できる。次にＭＳＣは凍結保存のための調製において凍結保存剤と組み合わせ、次に凍結保存できる。次に凍結保存したＭＳＣは、後に使用のために解凍できる。
【００５９】
ここで図７を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図７に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣはＭＳＣ数を増やすように培養できる。培養したＭＳＣは処理され、凍結保存のための調製において凍結保存剤と組み合わせ、次に凍結保存できる。次に凍結保存したＭＳＣは、後に使用のために解凍できる。
【００６０】
ここで図８を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図８に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣはＭＳＣ数を増やすように培養できる。培養したＭＳＣは、例えばＭＳＣに関連した任意の１つまたは複数の細胞マーカーのような特定の細胞マーカーを発現するＭＳＣを選択することによって濃縮または凝縮できる。次に選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣでさえも、個別に凍結保存のための調製において凍結保存剤と組み合わせて、次に凍結保存できる。次に凍結保存したＭＳＣは、後に使用のために解凍できる。
【００６１】
ここで図９を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図９に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣはＭＳＣ数を増やすように培養できる。培養したＭＳＣは、例えばＭＳＣに関連した任意の１つまたは複数の細胞マーカーのような特定の細胞マーカーを発現するＭＳＣを選択することよって濃縮および凝縮できる。次に選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣでさえも、ＭＳＣを増やすように培養できる。選択されたＭＳＣの培養および未選択のＭＳＣの培養でさえ、個別に凍結保存のための調製において凍結保存剤と組み合わせて、次に凍結保存できる。次に凍結保存したＭＳＣは、後に使用のために解凍できる。
【００６２】
ここで図１０を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図１０に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣはＭＳＣ数を増やすように培養できる。培養したＭＳＣは、例えばＭＳＣに関連した任意の１つまたは複数の細胞マーカーのような特定の細胞マーカーを発現するＭＳＣを選択することによって濃縮または凝縮できる。次に選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣでさえも、ＭＳＣを増やすように培養できる。選択されたＭＳＣの培養および未選択のＭＳＣの培養でさえ、特異的細胞マーカーについてさらに選択できる。次に選択された細胞および未選択の細胞は、個別に凍結保存のための調製において凍結保存剤と組み合わせ、次に凍結保存できる。次に凍結保存したＭＳＣは、後に治療用使用のために解凍できる。本発明の実施形態のすべての説明の全体にわたって、語句「治療用使用」は、任意のタイプの幹細胞治療法のためのＭＳＣの使用を含み、薬用化粧品用使用もまた含む。
【００６３】
ここで図１１を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図１１に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣを処理し、治療用使用のための調製において細胞生存度を維持するための細胞培地と組み合わせることができる。
【００６４】
ここで図１２を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図１２に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理でききる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣはＭＳＣ数を増やすように培養できる。培養後、ＭＳＣを処理し、治療用使用のための調製において細胞生存度を維持するための細胞培地と組み合わせることができる。
【００６５】
ここで図１３を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図１３に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣはＭＳＣ数を増やすように培養できる。次に培養したＭＳＣは特定の細胞マーカーについて選択できる。次に治療用使用のための調製において細胞生存度を維持するために、選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣは細胞培地と個別に組み合わせることができる。
【００６６】
ここで図１４を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図１４に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣはＭＳＣ数を増やすように培養できる。次に培養したＭＳＣは特定の細胞マーカーについて選択できる。次に選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣは、細胞数を増やすように個別に培養できる。次に治療用使用のための調製において細胞生存度を維持するために、培養したＭＳＣは細胞培地と個別に組み合わせることができる。
【００６７】
ここで図１５を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図１５に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣはＭＳＣ数を増やすように培養できる。次に培養したＭＳＣは特定の細胞マーカーについて選択できる。次に選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣは、細胞数を増やすように個別に培養できる。次に個別に培養したＭＳＣは、特定の細胞表面マーカーについて再び選択できる。次に治療用使用のための調製において細胞生存度を維持するために、選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣは細胞培地と個別に組み合わせることができる。
【００６８】
ここで図１６を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図１６に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣは、例えばＭＳＣに関連した任意の１つまたは複数の細胞マーカーのような特定の細胞マーカーを発現するＭＳＣを選択することによって濃縮または凝縮できる。次に選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣでさえも、治療用使用のための調製において細胞生存度を維持するために、細胞培地と個別に組み合わせることができる。
【００６９】
ここで図１７を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図１７に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣは、例えばＭＳＣに関連した任意の１つまたは複数の細胞マーカーのような特定の細胞マーカーを発現するＭＳＣを選択することによって濃縮または凝縮できる。次に選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣでさえも、ＭＳＣ数を増やすように個別に培養できる。次に治療用使用のための調製において細胞生存度を維持するために、培養されたＭＳＣは細胞培地と組み合わせることができる。
【００７０】
ここで図１８を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図１８に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣは、例えばＭＳＣに関連した任意の１つまたは複数の細胞マーカーのような特定の細胞マーカーを発現するＭＳＣを選択することによって濃縮または凝縮できる。次に選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣでさえも、ＭＳＣ数を増やすように個別に培養できる。次に培養したＭＳＣは特異的細胞マーカーについて選択できる。次に治療用使用のための調製において細胞生存度を維持するために、選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣは細胞培地と組み合わせることができる。
【００７１】
ここで図１９を参照して、本発明は、ＭＳＣを凍結保存する方法およびプロセスを提供する。図１９に従って、月経流出物は収集され、次に月経流出物はＭＳＣを単離および収集するために処理できる処理施設に移送できる。月経流出物からのＭＳＣの単離および収集は、収集されるＭＳＣ数を最大にするために使用する遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過または沈降の方法論によって行なうことができる。一旦収集されたならば、ＭＳＣは、例えばＭＳＣに関連した任意の１つまたは複数の細胞マーカーのような特定の細胞マーカーを発現するＭＳＣを選択することによって濃縮または凝縮できる。次に選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣでさえも、ＭＳＣ数を増やすように個別に培養できる。次に培養したＭＳＣは特異的細胞マーカーについて選択できる。次に選択されたＭＳＣおよび未選択のＭＳＣは、ＭＳＣ数を増やすようにさらに培養できる。次に治療用使用のための調製において細胞生存度を維持するために、培養したＭＳＣは細胞培地と組み合わせることができる。
【００７２】
本発明のさらなる実施形態が提供され、図２０〜２８で記述される。さらなる実施形態は、ＭＳＣが本発明の以前に記述された実施形態のいずれか、または他の細胞収集および／または凍結保存の方法またはプロセスに従って収集および凍結保存された後の、ＭＳＣの処理を含む。
【００７３】
ここで図２０を参照して、本発明は、以前に記述された方法もしくはプロセスのいずれかまたは他の細胞収集および／もしくは凍結保存の方法もしくはプロセスに従って収集および凍結保存したＭＳＣの調製のための方法およびプロセスを提供する。図２０に従って、凍結保存したＭＳＣは解凍され、次に治療用使用のための細胞培地と組み合わせる。
【００７４】
ここで図２１を参照して、本発明は、以前に記述された方法もしくはプロセスもしくはプロセスのいずれかまたは他の細胞収集および／もしくは凍結保存の方法もしくはプロセスに従って収集および凍結保存したＭＳＣの調製のための方法およびプロセスを提供する。図２１に従って、凍結保存したＭＳＣは解凍され、次に特定のＭＳＣ細胞表面マーカーについて選択される。次に選択された細胞および未選択の細胞は、治療用使用のための細胞培地と組み合わせることができる。
【００７５】
ここで図２２を参照して、本発明は、以前に記述された方法もしくはプロセスもしくはプロセスのいずれかまたは他の細胞収集および／もしくは凍結保存の方法もしくはプロセスに従って収集および凍結保存したＭＳＣの調製のための方法およびプロセスを提供する。図２２に従って、凍結保存したＭＳＣは解凍され、次に特定のＭＳＣ細胞表面マーカーについて選択される。次に選択された細胞および未選択の細胞は、ＭＳＣ数を増やすように培養できる。次に培養したＭＳＣは治療用使用のための細胞培地と組み合わせることができる。
【００７６】
ここで図２３を参照して、本発明は、以前に記述された方法もしくはプロセスもしくはプロセスのいずれかまたは他の細胞収集および／もしくは凍結保存の方法もしくはプロセスに従って収集および凍結保存したＭＳＣの調製のための方法およびプロセスを提供する。図２３に従って、凍結保存したＭＳＣは解凍され、次に特定のＭＳＣ細胞表面マーカーについて選択される。次に選択された細胞および未選択の細胞は、ＭＳＣ数を増やすように培養できる。次に培養したＭＳＣは特定のＭＳＣ細胞マーカーについて選択できる。次に選択された細胞および未選択の細胞は、治療用使用のための細胞培地と組み合わせることができる。
【００７７】
ここで図２４を参照して、本発明は、以前に記述された方法もしくはプロセスもしくはプロセスのいずれかまたは他の細胞収集および／もしくは凍結保存の方法もしくはプロセスに従って収集および凍結保存したＭＳＣの調製のための方法およびプロセスを提供する。図２４に従って、凍結保存したＭＳＣは解凍され、次に特定のＭＳＣ細胞表面マーカーについて選択できる。次に選択された細胞および未選択の細胞は、ＭＳＣ数を増やすように培養できる。次に培養したＭＳＣは特定のＭＳＣ細胞マーカーについて選択できる。次に選択された細胞および未選択の細胞は、ＭＳＣ数を増やすように培養できる。次に培養したＭＳＣは治療用使用のための細胞培地と組み合わせることができる。
【００７８】
ここで図２５を参照して、本発明は、以前に記述された方法もしくはプロセスもしくはプロセスのいずれかまたは他の細胞収集および／もしくは凍結保存の方法もしくはプロセスに従って収集および凍結保存したＭＳＣの調製のための方法およびプロセスを提供した。図２５に従って、凍結保存したＭＳＣは解凍され、次にＭＳＣ数を増やすように培養できる。次に培養したＭＳＣは治療用使用のための細胞培地と組み合わせることができる。
【００７９】
ここで図２６を参照して、本発明は、以前に記述された方法もしくはプロセスもしくはプロセスのいずれかまたは他の細胞収集および／もしくは凍結保存の方法もしくはプロセスに従って収集および凍結保存したＭＳＣの調製のための方法およびプロセスを提供した。図２６に従って、凍結保存したＭＳＣは解凍され、次にＭＳＣ数を増やすように培養できる。次に培養したＭＳＣは特定の細胞マーカーについて選択できる。次に選択された細胞および未選択のＭＳＣは、個別に治療用使用のための細胞培地と組み合わせることができる。
【００８０】
ここで図２７を参照して、本発明は、以前に記述された方法もしくはプロセスもしくはプロセスのいずれかまたは他の細胞収集および／もしくは凍結保存の方法もしくはプロセスに従って収集および凍結保存したＭＳＣの調製のための方法およびプロセスを提供した。図２７に従って、凍結保存したＭＳＣは解凍され、次にＭＳＣ数を増やすように培養できる。次に培養したＭＳＣは特定の細胞マーカーについて選択できる。次に選択された細胞および未選択のＭＳＣは、ＭＳＣの数を増やすように個別に培養できる。次に培養したＭＳＣは治療用使用のための細胞培地と組み合わせることができる。
【００８１】
ここで図２８を参照して、本発明は、以前に記述された方法もしくはプロセスもしくはプロセスのいずれかまたは他の細胞収集および／もしくは凍結保存の方法もしくはプロセスに従って収集および凍結保存したＭＳＣの調製のための方法およびプロセスを提供した。図２８に従って、凍結保存したＭＳＣは解凍され、次にＭＳＣ数を増やすように培養できる。次に培養したＭＳＣは特定の細胞マーカーについて選択できる。次に選択された細胞および未選択のＭＳＣは、ＭＳＣ数を増やすように個別に培養できる。次に培養したＭＳＣは特定の細胞表面マーカーについて選択できる。次に選択された細胞および未選択のＭＳＣは、治療用使用のための細胞培地と組み合わせることができる。
【００８２】
図１〜２８で参照されるような本発明の前述の実施形態は、以下に提供および記載されるようにさらに詳述される。本発明に従って、月経血幹細胞、および例えば凍結保存剤、細胞培地または薬用化粧品用薬剤のような他の薬剤を含む組成物もまた以下に提供および記載される。
【００８３】
月経血幹細胞の収集および輸送
【００８４】
本発明の方法およびプロセスに従って、月経血幹細胞は、月経の間の、収集キットと共に提供される収集器具を使用して、月経流出物（それは月経血幹細胞を含んでいる）を収集することによって最初に得られる。月経流出物は、月経期の重い日、中程度の日または軽い日を含むが、これらに限定されていない、月経の任意の時の間に収集することができる。任意で、末梢血のサンプルは、比較で感染症分析のためにドナーから収集できる。
【００８５】
収集キットは、月経血幹細胞を処理するために月経流出物の少なくとも１つのサンプルを収集する目的のためにドナーに提供できる。例えば、月経血幹細胞収集キットは、発送のための月経流出物の少なくとも１つのサンプルを収集、処理、およびパッケージングするために提供できる。収集キットは、ボックス、バッグ、または月経流出物の少なくとも１つのサンプルを任意で低温で送るために適切な他の容器のような輸送容器（例えばナノクール（Ｎａｎｏｃｏｏｌ）、スタイロフォームまたは断熱コンテナ）；例えばムーンカップ（Ｍｏｏｎｃｕｐ）、ディヴァカップ（Ｄｉｖａｃｕｐ）、インステッドカップ（Ｉｎｓｔｅａｄ  ｃｕｐ）、または月経流出物の少なくとも１つのサンプルの収集のために適切な他のサニタリー収集器具のような収集器具；例えば５０ｍｌのチューブまたは他の適切なサイズにしたチューブのような適切なサイズの少なくとも１つの滅菌済み収集容器；少なくとも１つの月経流出物サンプルの懸濁ための収集培地；少なくとも１つのプラスチックのチャックつきバッグ；少なくとも１枚の吸収性のタオル；少なくとも１つのバイオハザードバッグ；滅菌済み４×４ガーゼ；少なくとも１つの収集容器を包むためのパラフィルム；ならびに消毒済み浄化用濡れナプキンまたはワイプ、を含みうる。月経血幹細胞を含む少なくとも１つの月経流出物サンプルの収集の前に、ドナーの識別には、ドナーによって収集された任意のサンプルを同定するために本発明の実行を通して使用できるアクセッション番号を割り当てることができる。
【００８６】
収集キットのための収集培地は、ＤＰＢＳおよびヘパリンの混合物を含みうる。必要なｐＨの適切な同等の組織培養培地をＤＰＢＳの代わりに使用できる。例えば、ヘパリンは１ｍｌあたり約１０００単位の濃度で提供できる。１つの実施形態において、収集培地は、１ｍｌあたり約１０００単位の濃度のヘパリンを２００単位で有する約１０ｍｌのＤＰＢＳを含みうる。収集キットのための培地は、約１０ｍｌのＤＰＢＳに、１ｍｌあたり１０００単位の濃度の約０．２０ｍｌのヘパリンを追加することによって調製できる。サンプルが収集される前に、滅菌済み収集容器中にこの体積を置くことができる。他の実施形態において、収集培地は、カルシウム、マグネシウムまたはフェノールレッド不含有のダルベッコのリン酸緩衝液生理食塩水（ＤＰＢＳ）（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）社または適切な置換培地の他の製造者）；ペニシリン（１ミリリットルあたり約１００単位）、ストレプトマイオシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｏｃｉｎ）（１ミリリットルあたり約１００マイクログラム）、アンフォテリシンＢ、および／または他の適切な抗生物質を含みうる抗生物質；ならびにＤＰＢＳ培地１ｍｌあたり約１０単位〜約２０単位の範囲の防腐剤不含有ヘパリンまたは例えばＡＣＤ、ＣＰＤ、ＣＰＤＡもしくはＣＰＤＡ−１のような適切な抗凝血剤、を含みうる。収集培地は無菌技術を使用して調製できる。
【００８７】
膣領域は、月経血幹細胞を含む少なくとも１つの月経流出物サンプルの収集のための調製において消毒剤により浄化できる。１つの実施形態において、消毒剤を濡れナプキン上に提供することができる。次に、ドナーは、収集器具の使用のための説明書に従って膣内に、収集器具（それはあらかじめ石鹸および水により洗浄してもよい）を置くことができる。収集器具は、月経流出物の少なくとも１つのサンプルを収集するためにドナーの月経期の間に膣内に置かなくてはいけない。１つの実施形態において、収集器具は月経の重い日の間に膣内に置くことができる。他の実施形態において、収集器具は月経の中程度の日または軽い日の間に膣内に置くことができる。
【００８８】
収集器具は、月経流出物の少なくとも１つのサンプルを収集する時間量で膣内に維持されるべきである。例えば、収集器具は約３時間またはそれ以下の間膣内に維持できる。サンプルを収集する追加の時間は必要でありうる。約３時間膣内に維持された後に、次に月経流出物サンプルを含む収集器具は取り出すことができる。月経流出物サンプルは、約０．１ｍｌ〜約５ｍｌの体積の月経血血液、組織、体液および月経血幹細胞を含みうる。次に月経流出物サンプルは、滅菌済み収集チューブ中の収集培地に移すことができる。滅菌済み容器への月経流出物サンプルの移行は、処理施設への月経流出物サンプルの発送のための調製において収集器具から月経流出物サンプルを容器中の培地へと注ぐことによって行なうことができる。月経流出物サンプルおよび収集培地の溶液の漏出を防止するために、容器にキャップをするかそうでなければシールすべきである。シールは、収集容器の内部への空気の侵入もまた防止するべきである。１つの実施形態において、堅く閉まる対応するふたを備えた容器をパラフィルムにより包み、輸送のためにパッケージングできる。
【００８９】
１つ以上の月経流出物サンプルを収集し、容器に移し、処理施設への発送のために調製できる。１つ以上の月経流出物サンプルが収集されるならば、最後のサンプルが収集されるまで、収集チューブの中の収集培地中に収集された各サンプルは、冷蔵庫中に保存できる。一旦すべての月経流出物サンプルが収集されたならば、次にサンプルは発送のためにパッケージングできる。
【００９０】
１つの実施形態において、月経血幹細胞は、子宮内膜領域または頸部領域において行われるパパニコロー試験または任意の生検によって獲得できる。
【００９１】
月経血幹細胞を含む月経流出物の少なくとも１つのサンプルは、発送および処理施設での処理を通して獲得後に低温で維持できる。月経流出物および培地の溶液を保持する任意のシール容器は、処理施設への発送の間に約１℃〜約２５℃の範囲内の温度で発送するために各サンプルを維持するようにパッケージングできる。１つの実施形態において、サンプルは各、処理施設への発送の間に約１℃〜約１５℃の温度領域で維持できる。他の実施形態において、収集された月経流出物サンプルは、獲得後に、および発送の全体にわたって室温または周囲温度で維持できる。
【００９２】
月経血幹細胞および収集培地を含む月経流出物サンプルを含む各収集容器は、バッグのチャック機能によりシールされる大きなプラスチックのチャック付きバッグ中に収集容器を置くことによって、輸送のためにパッケージングできる。封入された滅菌容器をともなう大きなプラスチックバッグは、第２の大きなチャック付きバッグ中に置かれ、さらにシールできる。吸収性の２枚のタオルを輸送容器の底部に置くことができる。ナノクール器具が使用されているならば、追加の氷は必要ではない。レンガ状の発泡スチロールまたは他の器具は月経流出物サンプルを保有する輸送容器を冷やすために使用できる。濡れた氷で満たされたバッグは吸収性のタオルの上に置くことができる。シールバッグ中の滅菌された容器は、氷嚢の下に置くことができる。残りの吸収性のタオルは、氷のバッグの上に置くことができる。輸送容器は閉じられ、確実にされ、シールされる。
【００９３】
容器が発送の間に約１℃〜約２５℃の間の温度で月経血幹細胞を含む月経流出物サンプルを維持する限り、他の適切な容器は容器の輸送のために使用できる。例えば、他の適切な容器は、セラパック（Ｔｈｅｒａｐａｋ）株式会社によって販売される冷却断熱発送容器、任意のタイプの断熱コンテナまたは発送のためにデザインされたスタイロフォームボックスを含むが、これらに限定されない。
【００９４】
収集培地に少なくとも１つの月経流出物サンプルを含む輸送容器を集荷するために、輸送会社は、発送の少なくとも２時間以内に連絡をとることができる。輸送会社は、エアネット（ＡｉｒＮｅｔ）社または生物学的物質の輸送のために適切な他の好ましい宅配便業者、またはフェデックスまたはＵＰＳのような他の発送会社でありうる。輸送容器は、収集後約５時間〜約１２５時間以内に処理施設に到着すべきである。１つの実施形態において、輸送容器は、収集後約２４時間〜約７２時間の間に処理施設に到着しうる。他の実施形態において、輸送容器は、約２４時間〜約４８時間の間に処理施設に到着しうる。輸送容器は高温環境において保存されるべきでない。
【００９５】
処理施設は、輸送容器およびカタログ（月経血幹細胞を含む月経流出物サンプルの処理の全体にわたる使用のための各ドナーサンプルについての識別情報）を受け取る。適切なバリアおよび個人保護手段を、処理施設での月経血幹細胞を含む月経流出物の任意のサンプルの扱いの全体にわたって使用できる。一旦輸送容器が処理施設で受け取られたならば、月経流出物サンプルをともなう各容器を、輸送容器から取り出し、アイスパン中の（または冷蔵庫中の）氷の上に置き、そして月経流出物からの月経血幹細胞の単離、月経血幹細胞の収集ならびに後の使用および／または凍結保存のための処理のために生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）中のクリーンルームへと移すことができる。
【００９６】
処理施設での月経流出物の処理
月経流出物サンプルは処理施設によって受け取られ、処理施設システムへと記録される。一旦月経流出物サンプルが処理施設で受け取られたならば、それは、処理の全体にわたって約１℃〜約２５℃の温度で維持できる。各月経流出物サンプルはＢＳＣ中で処理し、無菌技術を使用して遠心分離できる。ＢＳＣで作業するときに７０％のＩＰＡによりグローブを頻繁に拭く。レッドトップチューブ、針、シリンジ、レッドトップチューブのためのラック、ＢａｃＴボトル、アルコールパッド、５０ｍｌのコニカル、５０ｍｌのコニカルのためのラック、および月経流出物サンプルの処理の前のピペッターを含むが、これらに限定されていない、ＢＳＣ中で処理するために必要な他のすべての資材を無菌的に置く。ＢＳＣを消毒した後に、すべての滅菌済み供給品を置く。このプロセスのために使用される滅菌済み供給品はすべて、パンまたは滅菌済みドレープ中に置くことができる。滅菌済み供給品は、針、シリンジ、ならびにレッドトップチューブ、レッドトップチューブのためのラック、血液培養ボトル、アルコールパッド、５０ｍｌの収集用のコニカルチューブ、５０ｍｌの収集用のコニカルチューブのためのラック、ピペットおよびアイスパンを含むＢＳＣ中に置かれた他の資材を含みうる。培地および試薬はすべて、好ましくは氷上に置かれ、約１℃〜約１５℃の間で保存されるが、製造者の使用説明書に基づいて約２℃〜約８℃でもまたありうる。
【００９７】
緩衝生理食塩水培地（ＤＰＢＳ）または適切な置換物は、月経血幹細胞単離プロセスの全体にわたって使用できる。ＤＰＢＳ培地は、約５ｍｌ〜約１０ｍｌのヘパリン（ヘパリンナトリウム１，０００ＵＳＰ単位／ｍｌ−アメリカン・ファーマシューティカル・パートナーズ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ）社）を含有する約１００ミリリットルのＤＰＢＳを含む。
【００９８】
月経流出物サンプルを処理施設で受け取る最初の日に、月経血幹細胞を含む月経流出物の各標本は、ステージ１処理を行なうことができる。最初に、月経流出物サンプルを保持する収集容器の外部は、遠心分離の前に消毒できる。収集容器中の月経流出物サンプルは、遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過、および／またはデンプン沈降を行なうことができる。
【００９９】
遠心分離
１つの実施形態において、月経流出物サンプルの遠心分離は約４℃で約７分間約２０００ｒｐｍで行なうことができる。遠心分離後に、次に月経流出物サンプルの各標本を遠心分離機から取り出すことができる。上清を吸引するために収集チューブをＢＳＣへ移す前に、収集容器の外部を消毒することができる。沈殿を約１０ｍｌのＤＰＢＳ（または同等の置換物）中に再懸濁し、次にステージ２処理を行なうことができる。沈殿は本明細書において記述されるような任意の汚染除去工程に従って処理することもまたできる。
【０１００】
密度勾配遠心分離
他の実施形態において、月経流出物サンプルの遠心分離は密度勾配を使用して行なうことができる。例えば、密度勾配は、リンパ球分離培地（約２０℃で密度１．０７７〜１．０８３ｇ／ｍｌ−セルグロー（Ｃｅｌｌｇｒｏ））、またはより高密度もしくはより低密度を有する他の適切な勾配でありえる。月経流出物サンプル、収集培地および密度勾配を含む収集用のコニカルチューブを、遠心分離にかける。例えば、収集用のコニカルチューブは、約１５℃〜約３０℃の間で（好ましくは約２０℃で）、および遠心分離機を減速させるために適用されるブレーキなしで、約３０分間約１４，０００ｒｐｍで遠心分離できる。
【０１０１】
密度勾配遠心分離の結果として、バフィーコート層は上清と密度勾配との間の境界面で形成される。バフィーコート層は、月経流出物サンプルから得られた月経血幹細胞を含む所望される細胞集団を含む。バフィーコート層の上の上清は、バフィーコート層の約５ｍｌ上で吸引して、廃棄する。バフィーコート層は、穏やかにバフィーコート層を旋回させ、１０ｍｌのピペットによりバフィーコート層でコニカルチューブの側面をすくうことによって取り出される。可能なかぎり最少量の体積の密度勾配をバフィーコート層と共に収集すべきである。残りの密度勾配および赤血球を含む沈殿は廃棄できる。密度勾配分離は室温の試薬および細胞により実行できる。細胞が冷却されるならば、分離された細胞の回復は至適でない。
【０１０２】
収集されたバフィーコート層を、５０ｍｌの収集用のコニカルチューブ中に置くことができ、体積は洗浄溶液により約３０ｍｌまでにする。次に、細胞懸濁は約１５℃〜約３０℃の間で約７分間約２０００ｒｐｍで遠心分離することができる。
【０１０３】
遠心分離後に、次に標本を遠心分離機から取り出すことができ、上清を吸引するために収集チューブをＢＳＣへ移す前に収集容器の外部は消毒できる。沈殿を約１０ｍｌのＤＰＢＳ中に再懸濁し、次にステージ２処理を行なうことができる。沈殿は本明細書において記述されるような任意の汚染除去工程に従って処理することもまたできる。
【０１０４】
濾過
なおさらなる実施形態において、月経流出物サンプルを滅菌済みフィルターで濾過することができる。滅菌済みフィルターは、約４０ミクロン、約７０ミクロン、または約１００ミクロンでありえる。濾過は、月経血幹細胞を含む月経流出物サンプルを約１℃〜約３０℃の間で約７分間約２０００ｒｐｍで遠心分離することを含むことができる。
【０１０５】
遠心分離後に、次に標本を遠心分離機から取り出すことができ、上清を吸引するために収集チューブをＢＳＣへ移す前に収集容器の外部は消毒できる。沈殿を約１０ｍｌのＤＰＢＳ中に再懸濁し、次にステージ２処理を行なうことができる。沈殿は本明細書において記述された任意の汚染除去工程に従って処理することもまたできる。
【０１０６】
デンプン沈降
さらなる実施形態において、月経流出物サンプルはデンプン沈降によって処理できる。１つの実施形態において、ヒドロキシエチルデンプンは１対５の比率、すなわち、約１ｍｌのデンプン対約５ｍｌの月経流出物サンプルで使用できる。各月経流出物サンプルは前述の比率に従って混合できる。混合物は、沈降を補助するために約６分間約５０ｇで遠心分離できる。前述の遠心分離工程ありまたはなしで、混合物を約３０分間または最大約２時間沈降できる。沈降後、月経血幹細胞を含むバフィーコートを取り出し、月経血幹細胞を遠心分離して凝縮した。遠心分離は、ＤＰＢＳ中に懸濁した月経血幹細胞を、約１℃〜約３０℃の間で約７分間約２０００ｒｐｍで遠心分離することを含む。
【０１０７】
遠心分離後に、次に標本を遠心分離機から取り出すことができ、上清を吸引するために収集チューブをＢＳＣへ移す前に収集容器の外部は消毒される。沈殿を約１０ｍｌのＤＰＢＳ中に再懸濁し、次にステージ２処理を行なうことができる。沈殿は本明細書において記述された任意の汚染除去工程に従って処理することもまたできる。
【０１０８】
汚染除去
遠心分離、密度勾配遠心分離、濾過またはデンプン沈降の前述の工程の任意の１つに従って収集されるような、収集された月経血幹細胞のサンプルは、任意の汚染除去プロセスを行なうことができる。沈殿についての過剰の液体は、サンプルの全体積を最初に計算した後に除去できる。沈殿は約５ｍｌの汚染除去培地中で再懸濁できる。
【０１０９】
汚染除去培地は月経流出物サンプルを汚染除去するために使用できる。汚染除去培地は、適切な培地中に少なくとも１つの抗生物質を含む。非限定例によって、抗生物質は、バンコマイシン、クラフォラン、アミカシン、ゲンタマイシンおよびアンフォテリシンＢの少なくとも１つを含みうる。適切な培地はハンク平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）または他の培地を含みうる。もし乾燥形態で提供されるならば、抗生物質は再構成を必要としうる。
【０１１０】
１つの実施形態において、汚染除去培地は、以下の濃度の抗生物質、５０ｕｇ／ｍｌのバンコマイシン、２５０ｕｇ／ｍｌクラフォラン、１００ｕｇ／ｍｌアミカシン、１２０ｕｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび２．７ｕｇ／ｍｌアンフォテリシンＢを含みうる。抗生物質の他の濃度レベルも適切でありうる。例えば汚染除去培地は、約１００ｍｇ／ｍｌの濃度を得るように、バンコマイシンの約１ｇのバイアルに約１０ｍｌのＨＢＳＳを追加することによって作製できる。約１ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌの濃度のバンコマイシンを、約１９９ｍｌのＨＢＳＳに追加して、約５００ｕｇ／ｍｌの濃度を得る。約１ｍｌの約５００ｕｇ／ｍｌの濃度のバンコマイシンを、汚染除去培地の調製のために最終バイアルに追加する。約２ｍｌのＨＢＳＳを約５００ｍｇ／バイアルのクラフォランに追加し、約２５０ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。約１ｍｌの約２５０ｍｇ／ｍｌのクラフォラン溶液を、約９９ｍｌのＨＢＳＳに追加し、約２５００ｕｇ／ｍｌのクラフォランの濃度を得る。約１ｍｌの約２５００ｕｇ／ｍｌ濃度のクラフォランを、汚染除去培地のための最終バイアルに追加する。約１０ｍｌのＨＢＳＳを約１ｇのアミカシンのバイアルに追加し、約１００ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。約１ｍｌの約１００ｍｇ／バイアルの濃度のアミカシンを約９９ｍｌのＨＢＳＳに追加し、約１０００ｕｇ／ｍｌ得る。約１ｍｌのアミカシンを最終バイアルに追加して汚染除去培地を調製する。約１０ｍｌのＨＢＳＳをゲンタマイシンの約１ｇのバイアルに追加して、約１００ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。約１ｍｌの約１００ｍｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシンを約９９ｍｌのＨＢＳＳに追加して約１０００ｕｇ／ｍｌ濃度を得る。約１．２ｍｌのゲンタマイシンの約１０００ｕｇ／ｍｌ溶液を最終バイアルに追加して汚染除去培地を調製する。約２ｍｌのアンフォテリシンＢを約８ｍｌの滅菌水に追加して１ｍｌあたり約５０ｕｇの濃度のアンフォテリシンＢを調製する。約０．５４０ｍｌのアンフォテリシンＢ（２７ｕｇ）によりアンフォテリシンＢの最終濃度を調製する。
【０１１１】
汚染除去培地は、５０ｍｌの滅菌チューブ中に、抗生物質の溶液の、約１ｍｌの５００ｕｇ／ｍｌバンコマイシン、約１ｍｌの２５００ｕｇ／ｍｌのクラフォラン、約１ｍｌの１０００ｕｇ／ｍｌのアミカシン、約１．２ｍｌの１０００ｕｇ／ｍｌのゲンタマイシン、および約０．５４０ｍｌ（２７ｕｇ）のアンフォテリシンＢを追加して約４．７４ｍｌの培地を作製することによって、調整できる。約０．２００ｍｌの１ｍｌあたり１０００単位ヘパリンを抗生物質溶液に追加し、約５．０６ｍｌのＨＢＳＳを抗生物質溶液に追加して、最終体積１０ｍｌの汚染除去培地を作成する。培地は使用まで約２℃〜約８℃で保存できる。
【０１１２】
沈殿は約５ｍｌの汚染除去培地中に再懸濁できる。血餅または他の高分子が存在するならば、細胞は濾過が必要でありうる。再懸濁した細胞が、血餅のためにまたは他の理由のために濾過を必要とするならば、サンプルは１００ミクロンのフィルターを使用して濾過できる。濾過のために、懸濁は、懸濁中の血餅サイズに依存して１００ミクロンのフィルターまたはより小さなもの、および滅菌済み５０ｍｌのコニカルチューブを使用して濾過できる。一旦懸濁がフィルターを介して通過すれば、フィルターは追加の抗生物質培地を使用して洗浄できる。
【０１１３】
汚染除去培地中の濾過された細胞または濾過されない細胞は、汚染除去のためにインキュベートできる。１つの実施形態において、汚染除去培地中の濾過された細胞または濾過されない細胞は、クリーンルーム中の冷蔵庫において約２℃〜約８℃で約２０時間〜約３０時間インキュベートできる。インキュベーションの間、細胞はローテーターに置かれるか、またはインキュベーションの最初の５時間に毎時約１回で転倒させることができる。汚染除去プロセスの終わりに、次に月経血幹細胞を含む細胞懸濁はステージ２処理を行なうことができる。
【０１１４】
月経血幹細胞を含む細胞懸濁は、汚染除去プロセスありまたはなしで、ステージ２処理に従って処理できる。ステージ２処理は、ＤＰＢＳまたは汚染除去培地のどちらかの中で月経血幹細胞を含む細胞懸濁を遠心分離することを含む。１つの実施形態において、細胞懸濁の遠心分離は約４℃で約７分間約２０００ｒｐｍで行うことができる。月経血幹細胞を保持するチューブの外部は、遠心分離後におよびＢＳＣに移す前に消毒できる。一旦ＢＳＣの中にあれば、チューブの底の細胞の沈殿を残して、上清を除去することができる。細胞は約１０ｍｌのＤＰＢＳにより再懸濁し、混合し、約４℃で約７分間約２０００ｒｐｍで遠心分離できる。遠心分離後、容器はＢＳＣに移す前に汚染除去できる。
【０１１５】
月経血幹細胞の細菌学的分析は、処理中のこの時点の間に行うことができる。ＢＳＣの中で、および無菌技術を使用して、月経血幹細胞を含む沈殿の上の約５ｍｌの上清は滅菌済みシリンジを使用して取り出すことができる。約４ｍｌの上清を嫌気性血液培養ボトル中に置き、約１ｍｌの上清を好気性血液培養ボトル中に置くことができる。ボトルはＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔシステムにおける使用のために構成できる。次にボトルは、製造者の使用説明書に従ってＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔシステムを使用してインキュベートできる。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴの血液培養ボトルおよびシステムは、本発明の実行のために適切な試験システムの実施例として提供される。２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション６１０．１２またはこのＣＦＲセクションに類似するパフォーマンスが認証されたものを遵守する限り、他の適切な自動または手動の血液培養標本ボトルおよびシステムが使用できる。
【０１１６】
残りの上清は沈殿の上から取り出すことができる。細胞を含む沈殿は、約５．１ｍｌまでのＤＰＢＳ中で再懸濁し、混合することができる。約１００μｌの細胞は処理後試験のためにチューブに小分けにし、細胞カウントおよび生存率を得ることができる。細胞カウントは自動または手動の血球計数器を使用して実行できる。細胞生存率はトリパンブルーまたは他の方法を使用して実行できる。
【０１１７】
ＤＰＢＳ中で懸濁した残りの細胞は、凍結保存、細胞培養、細胞選択、または治療用もしくは薬用化粧品用の使用のために調製できる。
【０１１８】
凍結保存
凍結保存のために、ＤＰＢＳ中で懸濁した残りの細胞は、凍結保存のための調製において少なくとも約１５分間氷上に置くことができる。調製は、月経血幹細胞に凍結保存培地を追加すること、および速度制御フリーザーまたは他の適切なフリーザーシステム（モニタリングダンプフリーズまたはフリーズコンテナー（ナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）社））を利用して、約−９０℃の最終温度まで月経血幹細胞の温度を低下させるいくつかの温度低下工程を混合物に対して行うことを含むことができる。適切な速度制御フリーザーは、クリオメド・サーモ・フォーマ・コントロールド・レート・フリーザー（Ｃｒｙｏｍｅｄ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｏｒｍａ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒａｔｅ  Ｆｒｅｅｚｅｒ）７４５４（サーモ・エレクトロン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）社）、プラナー・コントロールド・レート・フリーザー・クリオ（Ｐｌａｎａｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒａｔｅ  Ｆｒｅｅｚｅｒ  Ｋｒｙｏ）１０／１６（ＴＳサイエンティフィック（ＴＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社）、ゴーディナー（Ｇｏｒｄｉｎｉｅｒ）、バイオ−クール−ＦＴＳシステムズ（Ｂｉｏ−Ｃｏｏｌ−ＦＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびアシンプトート（Ａｓｙｍｐｔｏｔｅ）ＥＦ６００、バイオストア（ＢＩＯＳＴＯＲ）ＣＢＳ  ２１００シリーズを含むが、これらに限定されない。
【０１１９】
凍結保存培地は、培地およびＤＭＳＯを含んで調製できる。約３ｍｌのＤＰＢＳを例えば５０ｍｌのコニカルチューブなどの容器に追加できる。約１ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を約３ｍｌのＤＰＢＳに追加し、次に氷上で約１０分間冷却することができる。約１ｍｌの冷却９９％ＤＭＳＯをＨＳＡおよびＤＰＢＳに追加し、最終的な凍結保存培地を調製する。次に、凍結保存培地を細胞サンプルに追加する前に、凍結保存培地および細胞サンプルを約１５分間氷上に置くことができる。細胞サンプルの中への凍結保存培地の小分けのために、バッチ処理を使用できる。例えば、細胞懸濁の約１００ｕｌの単一の小分けは、約３ｍｌのＤＰＢＳ、１ｍｌのＨＳＡ、および約１ｍｌの９９％ＤＭＳＯと組み合わせることができる。細胞懸濁の約２００ｕｌの約２つの小分けは、約６ｍｌのＤＰＢＳ、２ｍｌのＨＳＡ、および約２ｍｌの９９％ＤＭＳＯと組み合わせることができる。細胞サンプルの約５つの小分けは、約１５ｍｌのＤＰＢＳ、約５ｍｌのＨＳＡ、および約５ｍｌの９９％ＤＭＳＯと組み合わせることができる。細胞サンプルの約１０の小分けは、約３０ｍｌのＤＰＢＳ、約１０ｍｌのＨＳＡ、および約１０ｍｌの９９％ＤＭＳＯと組み合わせることができる。
【０１２０】
他の実施形態において、他の凍結保存培地を使用することができる。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地は、例えばクリオストア（ＣｒｙｏＳｔｏｒ）Ｓ１０もしくはＣＳ５（バイオライフ（Ｂｉｏｌｉｆｅ）社）、プロパンジオールおよびスクロースを追加した胚の凍結保存培地（ビトロライフ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）社）、またはＳＡＧＥ培地（クーパー・サージカル（Ｃｏｏｐｅｒ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ）社）のような、解凍後の高細胞生存率の転帰を維持するために使用できる。グリセロールは他の凍結保存剤（ＤＭＳＯなどの）と共に使用できるか、または適切なタンパク質を含む培地中で約１０％の濃度で単独で使用できる。
【０１２１】
凍結保存培地は細胞サンプルに追加できる。懸濁した月経血幹細胞および凍結保存培地の全混合物の体積が凍結保存細胞混合物の最終的な所望される体積になるまで、凍結保存培地をＤＰＢＳ中に懸濁した月経血幹細胞に一滴ずつ追加できる。最終的な凍結保存細胞培地は、５ｍｌのバイアルのキャップ中に保存されたＱＣサンプルを備えた２×５ｍｌ  バーコード付きのクリオクオート（ｃｒｙｏｑｕａｔ）の中への移すことができる。サンプルの約２００μｌ小分けを取り出すため、およびＱＣキャップの中へ小分けするためにピペッターを使用する。キャップが満たされた後、５ｍｌのバイアルの中への残りの４．８ｍｌの標本を追加する。サンプルは感染症および他の分析のために送付するべきである。クリオバイアルをクリオメドフリーザー中に置き、約−８５℃またはそれ以下で温度まで制御された速度による温度低下を行なう。凍結保存した標本は、−１５０℃またはそれ以下の液体窒素の蒸気中の保存のための貯蔵庫に移すべきである。感染症について陽性のテスト結果の任意のサンプルは隔離されるべきである。感染症について陰性のテスト結果の任意のサンプルは異なる永久保存に移すことができる。
【０１２２】
以下の温度低下工程は、最初に凍結保存剤および月経血幹細胞の混合物を低下させて、速度制御フリーザーにおいてプログラムできる。凍結保存剤と組み合わせた月経血幹細胞は、フリーザー中での最終的な保存のための調製において速度制御した温度低下を行なうことができる。速度制御した低下は、細胞生存率を維持するようにデザインできる。クリオ−メド（Ｃｒｙｏ−Ｍｅｄ）フリーザー（サーモ・エレクトロン社）、液体窒素シリンダーおよびポータブルクリオ−メドフリーザーを、フリーザー中での最終保存のための調製における速度制御した低下のために使用できる。約−９０℃の温度に到達するまで、クリオバイアルまたはクリオバッグ（ｃｒｙｏｂａｇ）中で、細胞は速度制御した低下を行うことができる。
【０１２３】
クリオバッグ中に収集された月経血幹細胞のサンプルについて、以下の速度制御した低下プロフィールを細胞に対して行うことができる：約４℃で待機、−６．０℃まで１分につき１．０℃（サンプル）、−５０．０℃まで１分につき２５．０℃（チャンバー）、−１４．０℃まで１分につき１０．０℃（チャンバー）、−４５．０℃まで１分につき１．０℃（チャンバー）、−９０．０℃まで１分につき１０．０℃（チャンバー）、および終了（サンプルは−８５．０℃またはそれ以下で）。
【０１２４】
クリオバイアル中に収集された月経血幹細胞のサンプルについて、以下の速度制御した低下プロフィールを細胞に対して行うことができる：４．０℃で待機、−３．０℃まで１分につき１．０℃（チャンバー）、−２０．０℃まで１分につき１０．０℃（チャンバー）、−４０．０℃まで１分につき１．０℃（チャンバー）、−９０．０℃まで１分につき１０．０℃（チャンバー）および終了。
【０１２５】
一旦凍結保存剤および月経血幹細胞の混合物が約−８５℃またはそれ以下になれば、凍結保存バイアルは低温保存ユニットに移され、約−１３５℃またはそれ以下の温度で液体窒素の蒸気中に保存されるか、またはあるいはバイアルは液体窒素の液相中で保存できる。例えば適切な低温保存ユニットは、ＬＮ２フリーザーＭＶＥ  １８３０（チャート・インダストリーズ）を含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
フローサイトメトリー分析
月経血幹細胞の任意の収集されたサンプルは、全細胞カウントおよび色素排除を介するトリパンブルーによる細胞生存率について試験できる。月経血幹細胞のサンプルは、細胞マーカーを発現する細胞の存在についてもまた解析できる。
【０１２７】
処理前の細胞、処理後の細胞、および任意の他のサンプルの細胞の全細胞カウントおよび細胞生存率は、血球計数器による手動カウント、フローサイトメーター、または例えばバイセル（ＶｉＣｅｌｌ）（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）社）もしくは顕微鏡画像に表示された細胞をカウントするのに適切なソフトウェアなどの、細胞カウントを得るのに適切な他の手段によって定量できる。
【０１２８】
処理前の細胞は、フローサイトメトリーによって解析できる。赤血球が存在するならば、１×ＮＨ４ＣＬ溶解溶液（ステムキット（ＳｔｅｍＫｉｔ））を、５０ｍｌのチューブ中へ約３６ｍｌの蒸留水および約４ｍｌの１０×溶解溶液を追加することによって調製できる。１クライアントあたり約１００ｕｌの処理前のサンプルを２本のチューブに追加して、分析を実行することができる。１本のチューブはＣＤ３４＋／生存率の分析のためのものであり、２本目のチューブはアイソクロニック対照のためのものである。約２０ｕｌのＣＤ４５−ＦＩＴＣ／ＣＤ３４−ＰＥを各チューブの底に追加できる。約２０ｕｌの７−ＡＡＤ生存率用色素（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ）をチューブの中へ追加すべきである。混合物をボルテックスにより撹拌し、次に遮光して、約１５℃〜約３０℃で少なくとも２０分間インキュベートした。次に約１ｍｌの１×ＮＨ４ＣＬ溶解溶液を各チューブに追加し、ボルテックスにより撹拌できる。混合物を約１５℃〜約３０℃で約２０分間インキュベートできる。約１００ｕＬのステム−カウント・フルオロスフェア（Ｓｔｅｍ−Ｃｏｕｎｔ  Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅ）を各チューブに追加し、ボルテックスにより撹拌できる。次にサンプルを分析のためにフローサイトメーター上に流すべきである。
【０１２９】
処理後の細胞はフローサイトメトリーによって分析することができる。１×ＮＨ４ＣＬ溶解溶液を、５０ｍｌのチューブの中へ約３６ｍｌの蒸留水および４ｍｌの１０×溶解溶液を追加することによってステムキットから調製できる。１クライアントあたり約５０ｕｌの処理後のサンプルを２本のチューブに追加して、分析を実行することができる。１本のチューブはＣＤ３４＋／生存率の分析のためのものであり、２本目のチューブはアイソクロニック対照のためのものである。約１０μＬの７−ＡＡＤ生存率用色素を各チューブに追加できる。約１０μＬのＣＤ４５−ＦＩＴＣ／ＣＤ３４−ＰＥを第１のチューブに追加できる。約１０μＬのＣＤ４５−ＦＩＴＣ／ＣＴＲＬ−ＰＥを第２のチューブに追加できる。混合物をボルテックスにより撹拌し、次に遮光して、約１５℃〜約３０℃で少なくとも２０分間インキュベートした。次に約１ｍｌの１×ＮＨ４ＣＬ溶解溶液を各チューブに追加し、ボルテックスにより撹拌した。混合物は約１５℃〜約３０℃で約２０分間インキュベートできる。約１００ｕＬのステム−カウント・フルオロスフェアを各チューブに追加し、ボルテックスにより撹拌できる。次にサンプルを分析のためにフローサイトメーター上に流すべきである。
【０１３０】
細胞表面マーカー、細胞生存率、および他の細胞特性を解析するために、月経血幹細胞の新鮮なサンプルおよび以前に凍結保存した月経血幹細胞の解凍したサンプルも、フローサイトメトリーによって解析されてもよい。新鮮なサンプルは細胞溶解後に以下のプロトコールに従ってもまた解析されてもよい。
【０１３１】
凍結保存した月経血幹細胞は、本明細書において記述された解凍プロセスに従って解凍されなくてはならない。細胞サンプルが解凍されなくてはならない場合において、細胞は、解凍後直ちに、または細胞を培養して特定の細胞継代を評価した後に、フローサイトメトリー分析を必要としうる。凍結保存したサンプルは、細胞を完全に解凍させずに、３７℃水浴中で撹拌してもよい。細胞は約１ｍｌの冷却した洗浄培地の中へ移され、転倒により混合できる。サンプルは約７分間約２０００ｒｐｍで遠心分離できる。上清を除去し、約１００ｕｌの洗浄培地（２５％ＨＳＡ、ＤＮＡｓｅ、ヘパリンならびにＣａ＋およびＭｇ＋含有ＨＢＳＳ）中に細胞を再懸濁する。次に再懸濁した細胞は、約１分間ブラッド・バンク・セロフュージ（Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ  Ｓｅｒｏｆｕｇｅ）中で遠心分離できる。上清はデカントすることができ、細胞を約１．２ｍｌのシース液中で再懸濁し、ボルテックスにより撹拌した。
【０１３２】
シース液中の細胞は多数の細胞表面マーカーについて解析できる。限定するのではなく例として、表Ａにおいて記述されているように、約１００ｕｌのシース液中の細胞のサンプルを、各チューブ中に１つの試薬あたり１０ｕｌまたは２０ｕｌ体積のどちらかで以下の試薬を含む各チューブに追加し、次にチューブをボルテックスにより撹拌して試薬およびサンプルを混合する。
【０１３３】
【表１】
2010530214.tif 000003
【０１３４】
２０分間室温（１５〜３０℃）でインキュベートする。遮光する。ＲＢＣを含む新鮮なサンプルで実行するならば、５００μｌの溶解溶液を追加し、さらに１０分間室温でインキュベートし、遮光する。密度勾配または解凍したサンプルで実行する場合は、溶解しない。サンプルを溶解しなかった場合は、２０分のインキュベーション後に１ｍｌの洗浄培地により洗浄する。１分間遠心分離し、次に上清をデカントする。サンプルを溶解した場合は、１分間サンプルを遠心分離し、溶解物をデカントする。１ｍｌの洗浄培地を追加し、ボルテックスにより撹拌し、再び遠心分離し、次に再びデカントする。各チューブに５００ｕＬのシース液を追加し、ボルテックスにより撹拌し、ＦＣ５００フローサイトメーターを実行する。
【０１３５】
細胞マーカー分析の前に、全細胞カウントを新鮮な細胞サンプルまたは解凍したサンプルで実行できる。多数の陽性対照は、カスミ（Ｋａｓｕｍｉ）−３対照細胞または他の対照細胞を使用して、フローサイトメトリー分析のために設定できる。
【０１３６】
細胞カウントならびに細胞生存率分析のための資材は、フローサイトメーター、イソフロー・シース液（Ｉｓｏｆｌｏｗ  Ｓｈｅａｔｈ  Ｆｌｕｉｄ）、コールター・クレンズ洗浄剤（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｌｅｎｚ  Ｃｌｅａｎｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ）、ならびにＣＤ４５−ＦＩＴＣ／ＣＤ３４−ＰＥ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ／アイソクロニック対照ＰＥ、７−ＡＡＤ生存率用色素、ステム−カウント・フルオロスフェア、塩化アンモニウム（ＮＨ４ＣＬ）溶解溶液１０×濃縮および２２％のウシアルブミン溶液を含むが、これらに限定されない試薬を含むが、これらに限定されない。ステムキット（Ｓｔｅｍ  Ｋｉｔ）（商標）ＣＤ３４＋ＨＰＣエニュメレーション・キット（Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）添付文書−バージョン０３（ＰＮＩＭ２３９０）；ベックマン・コールター製品是正処置、ＣＸＰ  ２．０＆２．１パネルインタラプション−３／１０／０６、ＰＣＡＭ−Ｄ−１０１３；１４．３  ステムラボ（ＳｔｅｍＬａｂ）、ビルド番号、バージョン３．２．１  ２００７０６２６０８５６を参照。フローサイトメトリーのための資材もまた、イソフロー・シース液；コールター・クレンズ洗浄剤；および以下の試薬（使用の前に約２０〜２５℃）：ＣＤ１１７−ＰＥ、ＣＤ２９−ＦＩＴＣ、ＣＤ３４−ＥＣＤ、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＥＣＤ、ＣＤ９０−ＰＣ５、ＣＤ１０５−ＰＥ、ＣＤ１６６−ＰＥ、ＩｇＧＦＩＴＣ、ＩｇＧ−ＰＥ、ＩｇＧ−ＥＣＤ、ＩｇＧ１−ＰＣ５、ＨＬＡ−Ｉ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１３３−ＰＥ、ＨＬＡ−ＩＩ  ＥＣＤ、ＣＤ９−ＦＩＴＣ、ＣＤ５４−ＰＥ、ＣＤ１０−ＰＣ５、ＣＤ５９−ＦＩＴＣ、ＣＤ６３−ＰＥ、ＣＤ１３−ＰＣ５、ＣＤ４９ｅ−ＦＩＴＣ、ＣＤ８１−ＰＥ、ＣＤ４９ｆ−ＰＣ５、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ、ＣＤ３８−ＰＣ５、ＣＤ２９−ＦＩＴＣ、ＣＤ１０５−ＰＥ、ＣＤ４１−ＥＣＤ、ＣＤ３−ＰＣ５、ＣＤ１９−ＦＩＴＣ、ＮＡＮＯＧ−ＦＩＴＣ、ＳＳＥＡ３−ＰＥ、ＳＳＥＡ４−ＰＥ、ＣＤ１４−ＦＩＴＣ、ＣＤ５６−ＰＥ、７−ＡＡＤ生存率用色素、塩化アンモニウム（ＮＨ４ＣＬ）溶解溶液１０×濃縮、洗浄培地（ＨＢＳＳ（Ｃａ＋およびＭｇ＋含有ハンクス）５００ｍｌ、ヘパリン５ｍｌ、２５％ヒト血清アルブミン５０ｍｌ、ＤＮＡＳＥを１アンプル含む）、カスミ−３細胞株（ＣＤ１１７＋細胞）、タイマーおよびボルテックスミキサーを含むが、これらに限定されない。
【０１３７】
他の実施形態において、対照の使用、および月経血幹細胞の新鮮なサンプル、処理前のサンプル、処理後のサンプル、または解凍したサンプルを調製する方法を含む、以前に記述されたフローサイトメトリー法に類似する代わりとなるフローサイトメトリー法によって、細胞を解析できる。細胞マーカーもまた免疫組織化学的分析によって評価できる。
【０１３８】
各サンプルについての全細胞カウントはフローサイトメトリーの前に解析できる。サンプルが＞＝３．５×１０6細胞を含んでいるならば、全パネルを評価できる。サンプルが＜３．５×１０6細胞を含んでいるならば、より少ないチューブが必要でありえる。
【０１３９】
解凍の必要のある凍結サンプルでフロー試験を実行する必要がある場合は、細胞を完全に解凍させずに、３７℃水浴中でバイアルを撹拌する。解凍したサンプルは、以前に論じられたフローサイトメトリー分析法のための方法に従って処理し、以下の表Ｂに従う細胞数に依存して多数のチューブに追加した。
【０１４０】
【表２】
2010530214.tif 000004
【０１４１】
各チューブは約１５℃〜約３０℃で約２０分間インキュベートできる。遮光する。ＲＢＣを含む新鮮なサンプルで実行するならば、５００μｌの溶解溶液を追加し、約１０分間同じ温度でインキュベートし、遮光する。密度勾配または解凍したサンプルで実行する場合は、溶解しない。サンプルを溶解しなかった場合は、約２０分のインキュベーション後に１ｍｌの洗浄培地により洗浄し、約１分間遠心分離し、次に上清をデカントするサンプルを溶解した場合は、約１分間サンプルを遠心分離し、溶解物をデカントする。約１ｍｌの洗浄培地を追加する、ボルテックスにより撹拌し、遠心分離し、次に再びデカントする。約１ｍｌのシース液を追加して、ボルテックスにより撹拌して、ＦＣ５００または適切な代わりのフローサイトメーターで実行する。  
【０１４２】
細胞選択
細胞は、本明細書において記述されるような月経血幹細胞のための細胞マーカーの少なくとも１つについて選択できる。細胞は、所望されない細胞を除去するネガティブ選択工程もまた行なうことができる。細胞選択プロセスの全体にわたって、無菌技術を使用できる。細胞選択は、新鮮な細胞、処理後の細胞、あらかじめ凍結保存した解凍した細胞、および培養中の細胞について使用できる。細胞選択は、２５０万細胞〜１０００万細胞で実行できる。細胞は、２５０万未満の細胞を含むサンプルまたは１０００万以上の細胞を含むサンプルからもまた選択できる。
【０１４３】
細胞選択についての資材は、ＤＮａｓｅ、パルモザイム（ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社）−１アンプル、ネガティブまたはポジティブに選択される任意の抗細胞の表面マーク、例えば抗ＣＤ１１７抗体（サンタクルズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）社の１０４Ｄ２、またはＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社のＹＢ５．５８）、ヤギ抗マウスＩｇＧマイクロビーズ、および磁石体を含むが、これらに限定されない。
【０１４４】
新鮮なサンプル、処理後サンプル、解凍したサンプルまたは月経血幹細胞の培養したサンプルから得られた月経血幹細胞を含む細胞懸濁は、約４℃で約１０分間約３００ｇで遠心分離できる。上清は細胞沈殿を乱さずに取り出すことができる。沈殿は、約１００ｕｌのワーキングバッファーおよび約２０ｕｌの抗細胞表面抗体により再懸濁できる。１つの実施形態において、抗細胞表面抗体は抗ＣＤ１１７抗体である。溶液中の細胞は約２０分〜約２５分間氷上でインキュベートできる。インキュベーション後に、約２ｍｌのワーキングバッファーを細胞に追加し、穏やかに混合することができる。混合物は約４℃で約１０分間約３００ｇで遠心分離できる。遠心分離後に、上清は沈殿を乱さずに吸引できる。沈殿は約８０ｕｌのワーキングバッファー中に再懸濁できる。約２０ｕｌのヤギ抗マウスＩｇＧを細胞懸濁に追加し、穏やかに混合することができる。混合物を氷上で約３０分間インキュベートすることができる。インキュベーション後、細胞を約２ｍｌのワーキングバッファーの追加によって洗浄し、次に溶液を混合することができる。細胞を約４℃で約１０分間約３００ｇで遠心分離できる。
【０１４５】
カラムは選択されない細胞から選択された細胞を分離するために使用できる。カラムは約５００ｕｌのワーキングバッファー中で湿らせることによって調製できる。遠心分離後に、上清は沈殿を乱さずに吸引できる。沈殿は約５００ｕｌのワーキングバッファー中で再懸濁できる。細胞接着を回避するために、追加のＤＮａｓｅを細胞に追加できる。細胞懸濁はピペットを使用して、カラムに追加できる。抗体に標識された細胞（陽性画分）は、マックス（ＭＡＣＳ）セパレーターによって提供される磁石体にさらされるカラムに結合する。未標識細胞（陰性画分）はカラムを通って流出したものであり、収集すべきである。
【０１４６】
細胞懸濁をカラムを通して流出させ、陰性画分として収集した後、カラムは１洗浄あたり５００ｕｌのワーキングバッファーを使用して、少なくとも３回洗浄することができる。各洗浄は、次の洗浄の前にカラムを通して完全に流出させることができる。各洗浄は陰性画分と共に収集できる。約１００ｕｌの陰性画分を分析のために取り出すことができる。血球計を使用する細胞カウント、およびトリパンブルーまたは他の方法を使用する生存率を実行できる。表現型分析は、以前に論じられたようなフローサイトメトリーを使用して、または他のフローサイトメトリー法を使用して、行なうことができる。陰性画分は凍結保存のために調製できるか、またはさらなる細胞増殖および増加ならびに後の処理のための培養を行なうことができる。
【０１４７】
陰性画分を収集し、カラムを洗浄した後に、別のチューブを陽性画分を収集するためにカラム下に置くことができる。約１ｍｌのワーキングバッファーをカラムに追加し、カラムから磁石体を取り除くことができる。ワーキングバッファーおよび陽性画分が収集されるべきである。陽性画分についてのカラムから可能な限り多くの標識細胞を取り出すために、プランジャーを使用することができる。トリパンブルーまたはフローサイトメトリーを使用する細胞カウントおよび生存率を含むが、これらに限定されない分析のために、約１００ｕｌの陽性画分を取り出すことができる。陽性画分は凍結保存するか、培養するか、または治療用もしくは薬用化粧品用の使用のために調製できる。
【０１４８】
ＭＳＣ細胞マーカーを発現する月経血幹細胞を選択する工程は、図３〜６、８〜１０、１３〜１９、２１〜２４および２６〜２８中で示されるような本発明の実施形態のいずれかに従って行なうことができる。特に、選択は、（ａ）凍結保存の前に、（ｂ）少なくとも１つの細胞培養の工程の前および／または後に、または（ｃ）凍結保存した細胞を解凍した後に、行なうことができる。特定の細胞マーカーを発現する月経血幹細胞を選択する工程は、選択された細胞マーカーを発現する濃縮された細胞の集団を提供し、それは、本発明の方法論に従って、さらなる細胞培養、凍結保存、または治療用もしくは薬用化粧品用の使用のために使用できる。
【０１４９】
１つの実施形態において、細胞の集団からＣＤ１１７を発現する月経血幹細胞を選択する工程は、抗ヒトＣＤ１１７抗体により月経血幹細胞を標識すること、および次に抗ヒトＣＤ１１７抗体に結合が可能な磁気標識抗体によりＣＤ１１７幹細胞−抗ヒトＣＤ１１７抗体複合体を標識することを含む。さらに、この方法は、ＣＤ１１７を発現する任意の細胞を抗ヒトＣＤ１１７抗体により標識すること、および次に抗ヒトＣＤ１１７抗体に結合が可能な磁気標識抗体によりＣＤ１１７細胞−抗ヒトＣＤ１１７抗体複合体を標識することを含む。ＣＤ１１７を発現する月経血幹細胞を選択する方法は、本発明の方法論のいずれかに従って収集されるＣＤ１１７を発現する任意の細胞を選択することを含むことができる。月経血幹細胞を単離する工程は、カラムに複合体の磁気標識抗体およびその他のものを引き付けるために、ＣＤ１１７細胞、抗ヒトＣＤ１１７抗体および磁気標識抗体を含む複合体を磁石体に暴露すること、および分析のためのカラムを通して他のすべてのＣＤ１１７陰性細胞を洗浄することを含む。
【０１５０】
ＣＤ１１７を発現する月経血幹細胞を選択する工程の全体にわたって、細胞の細胞懸濁およびワーキングバッファー（Ｄｎａｓｅ含有マックス分離（登録商標）ランニングバッファー、ミルテニー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）社）は、低温で維持できる。他の磁気分離キットは使用のために適切でありうる（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）社）。ＣＤ１１７を発現する子宮内膜細胞／月経血細胞を選択する工程が、（ａ）凍結保存の前に、（ｂ）少なくとも１つの細胞培養の工程の前におよび／または後に、または（ｃ）本発明の実施形態の全体にわたって示されるような凍結保存した細胞を解凍した後に、行なわれる場合に、細胞懸濁は洗浄溶液中に懸濁された細胞の集団を含むことができる。
【０１５１】
細胞懸濁は約１０分間約３００ｇで遠心分離できる。沈殿は抗ヒトＣＤ１１７抗体を含むワーキングバッファー中に懸濁できる。例えば、ワーキングバッファーは、例えばＰＢＳ（約ｐＨ７．２）、ウシ血清アルブミン、ＥＤＴＡおよび約０．０９％のアジ化物（または適切な溶液）（ＢＤバイオサイエンス社）を含むことができる。沈殿は、例えば約１００ｕｌのワーキングバッファーおよび約５ｕｇのヒトＣＤ１１７に親和性を有する精製抗体の中に懸濁できる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルでありうる。抗体は、ヒトＣＤ１１７に結合が可能な精製されたＩｇＧまたは他の抗体でありうる。抗体はマウス抗ＣＤ１１７抗体でありうる。例えば、抗体は、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１１７抗体（サンタクルズ社からの１０４Ｄ２またはＢＤバイオサイエンス社からのＹＢ５．５８として入手可能）でありえる。
【０１５２】
細胞、ワーキングバッファーおよび抗ＣＤ１１７の抗体を含む溶液を、インキュベーション期間の間インキュベートする。例えば、インキュベーション期間は氷上で約２０分〜約２５分の間を含みうる。あるいはインキュベーション期間は、温度が少なくとも約２℃〜約８℃である場合は約２０分未満、または少なくとも室温である場合は約５分〜約１０分に短縮できる。インキュベーション期間後、細胞を含む溶液を、未結合抗体を除去するためにワーキングバッファーにより洗浄し、次に遠心分離できる。例えば遠心分離は約１０分間約３００ｇで行なうことができる。遠心分離後、上清を吸引し、分析のために保存でき、沈殿をワーキングバッファー中で懸濁する。例えばワーキングバッファーの体積は約８０ｕｌでありえる。
【０１５３】
添付されるマイクロビーズを有し、抗ヒトＣＤ１１７抗体に親和性を有する第２バッチの抗体に、沈殿を懸濁するために使用するワーキングバッファーを追加した。マイクロビーズは例えば酸化鉄および多糖類を含むことができる。マイクロビーズは生物分解性でありえる。マイクロビーズはミルテニー・バイオテク社を介して入手可能である。例えば、抗体の第２バッチは、ヒトＣＤ１１７に対して親和性を有する抗体に特異的であり、例えばヤギ抗マウスＩｇＧ抗体などである。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルでありえる。抗体は、マウス抗体の軽鎖および／または重鎖に結合することが可能でありえる。抗体は、例えば製品１３０−０４８−４０１としてミルテニー・バイオテク社を介して入手可能なヤギ抗マウスＩｇＧマイクロビーズコンジュゲートでありえる。前述のヤギ抗マウスＩｇＧの２ｍｌのバイアルを、およそ１．０×１０9の全未分離細胞のために使用できる。
【０１５４】
細胞懸濁を、第２のインキュベーション期間の間インキュベートする。例えばインキュベーション期間は、約３０分〜約３５分の範囲でありえる。あるいはインキュベーション期間は、インキュベーションが約２℃〜約８℃で行なわれる場合は約３０分未満、またはインキュベーションがおよそ室温で行なわれる場合は約５〜約１０分でありえる。インキュベーション期間が完了した後に、細胞を例えば約２ｍｌのワーキングバッファーのようなワーキングバッファーにより洗浄し、次に細胞を遠心分離する。例えば遠心分離は約１０分間約３００ｇで行なうことができる。上清を吸引し、分析のために保存でき、細胞を含む沈殿を、例えば約５００ｕｌのワーキングバッファーのなどのワーキングバッファー中に懸濁する。
【０１５５】
細胞分離
ＣＤ１１７幹細胞は、ＣＤ１１７幹細胞を分離するためにＭＳカラムを使用して、ワーキングバッファー中の細胞懸濁から分離できる。例えば、ＭＳカラム（ミルテニー・バイオテク社）または他の適切なカラムを使用できる。あるいは、分離細胞に対して他の適切な方法を使用できる。ユニット、マルチスタンド、ＭＳカラムおよびマイクロビーズを含む、ミルテニー・バイオテク社を介して入手可能なミニマックス（ＭｉｎｉＭＡＣＳ）キットは、ＣＤ１１７細胞選択のために使用できる。ＭＳカラムは、ワーキングバッファーによるリンスによって調製できる。例えば、カラムをリンスするために使用するワーキングバッファーの体積は約５００ｕｌでありえる。カラムを、ミルテニー・バイオテク社を介して入手可能なマックスセパレーターの磁石体または磁石体を提供する適切なセパレーター中に置く。
【０１５６】
ワーキングバッファー中の細胞懸濁を、ピペットまたはある体積の液体を移すことができる他の器具によりカラムに追加する。抗ヒトＣＤ１１７抗体により標識されたＣＤ１１７細胞（それはマイクロビーズが付着した抗体に結合される）は、マックスセパレーターの磁石体のためにカラム中で保持される。任意の未標識細胞は、ワーキングバッファーと一緒にカラムを通って流出するべきであり、細胞の表現型決定および細胞カウントのために滅菌済みチューブ中に収集できる。カラムを通って流出する未標識細胞を陰性画分として同定できる。カラムは細胞懸濁の追加後にワーキングバッファーにより洗浄できる。例えばカラムは、少なくとも３回、またはすべてもしくは実質的にすべての未標識細胞がカラムを通って通過する任意の量の時間で洗浄できる。洗浄工程からの排出物は、細胞の表現型決定およびカウントのために収集できる。排出物は陰性画分としても同定できる。
【０１５７】
カラムを洗浄した後に、標識されたＣＤ１１７幹細胞をカラムから収集できる。標識されたＣＤ１１７細胞は、滅菌済みチューブをカラム下に置き、カラムを磁石体から取り出すことによって収集される。一旦カラムが磁石体から取り出されれば、標識されたＣＤ１１７細胞はカラムを通って通過し、滅菌済みチューブの中へ入る。カラム中の残りの標識されたＣＤ１１７幹細胞は、カラムにワーキングバッファーを追加してカラムを通して細胞を洗浄することによって、および任意でプランジャーによりカラムを剥がして細胞を放出することによって、洗い出すことができる。収集した標識されたＣＤ１１７細胞は、陽性画分として同定できる。標識されたＣＤ１１７細胞のより精製された集団を得るために、陽性画分は、任意で、以前に開示された洗浄手順に従ってカラムを通すことを少なくとも１回以上実行できる。陽性画分を約１０分間約３００ｇで遠心分離し、上清を吸引することができる。沈殿を約５ｍｌのワーキングバッファー中に懸濁できる。
【０１５８】
陽性画分および陰性画分を血球計数器により解析し、全生存細胞のカウントを得る。陰性画分を表現型決定のためのフローサイトメトリーによって解析する。任意で、陽性画分は表現型決定のためのフローサイトメトリーによって解析できる。
【０１５９】
例えばＣＤ１１７または他の細胞マーカーのようなＭＳＣ細胞マーカーを発現する幹細胞を含む陽性画分は、本発明の方法に従って凍結保存のために調製でき、本明細書においてさらに詳述される。約１ｍｌのヒト血清アルブミン、約３ｍｌＤＰＢＳおよび約１ｍｌのＤＭＳＯを、約５ｍｌの陽性画分に追加した。あるいは、例えば完全培地、ウシ血清アルブミン、ウシ胎仔血清、ウシ胎仔血清、タンパク質血漿画分または自己血清のような他の培養培地は、凍結保存のために細胞を調製する工程において使用できる。ＭＳＣを含む溶液を混合し、約１０分間氷上で冷却する。約１ｍｌのＤＭＳＯを、凍結保存剤として追加する。あるいは、約６％ＨＥＳヒドロキシエチルデンプンおよび約５％ＤＭＳＯの約１ｍｌの混合物を凍結保存剤として使用できる。結果として生じる溶液をクリオバイアルの中へ小分けにする。あるいは、結果として生じる溶液を例えば凍結保存バッグなどの凍結保存のために適切な任意の容器の中へ小分けすることができる。次にクリオバイアルは、本明細書においてさらに詳述されるような本発明の速度制御フリーザープロトコールに従って、速度制御フリーザー（クリオメド）中で凍結保存する。一旦ＭＳＣを含む溶液が約−９０℃の目標温度に到達すれば、クリオバイアルを長期間保存用フリーザーの中へ移し、約−１３５℃またはそれ以下で保存する。あるいは、クリオバイアルまたは他の適切な凍結保存容器を、モニタリングダンプフリーズへと置き、約−８０℃に凍結し、次に約−１３５℃またはそれ以下で長期間保存用フリーザー中の液体窒素の蒸気相の中へ移すことができる。
【０１６０】
あるいは、陽性画分は培養フラスコに播種し、本発明の方法に従って細胞を培養するために使用できる。次にＭＳＣを細胞培養から選択し、本発明の方法に従って凍結保存できる。
【０１６１】
本発明に従って得られた細胞は、ＣＤ１１７選択が用いられる本発明の実行における任意の時点で、他の適切なプロセスおよび方法によって選択または単離できる。例えば、本明細書において記述されるＣＤ１１７選択プロセスおよび方法を使用するのではなく、本発明の細胞（凍結保存前、解凍後、または細胞培養から得られたかにかかわらず）は、培養において血清枯渇培地を約２週間〜約４週間または他の適切な期間の間使用して、適切な温度および条件での血清枯渇によって凝縮することができる。血清枯渇培地はＥＳ−ＦＢＳありまたはなしで使用できる。
【０１６２】
細胞培養のための調製
本発明の方法論に従って収集された月経血幹細胞を含む細胞懸濁は、さらなる選択工程、凍結保存、または治療用もしくは薬用化粧品用の使用のための調製においてさらに培養できる。月経血幹細胞を含む細胞懸濁は、本発明に従う凝縮後に、または凍結保存および解凍後に、細胞培養のために調製できる。適用可能な場合、解凍工程は、解凍する予定の約５ｍｌの凍結保存した細胞を含む各バイアルのために、ヒストパック（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社）として入手可能な約１５ｍｌの密度勾配培地または他の適切な培地の小分けをおよそ室温で調製すること、および次に解凍する予定の約５ｍｌの凍結保存した細胞を含む各バイアルのために、チャン（Ｃｈａｎｇ）完全培地、ＤＭＥＭ完全培地もしくはＩＭＤＭ完全培地または他の適切な培地の約２５ｍｌの小分けを調製することを含む。本明細書において記述されたように、処理後、密度勾配、および細胞選択からの新鮮な細胞サンプルもまた培養において播種することができる。
【０１６３】
チャン完全培地は約３２５ｍｌのＭＥＭアルファ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社）（製品１２５７１−０６３として）を含み、約９０ｍｌのチャンＢ（基本）Ｃ１１０（１８％ｖ／ｖ）（アーバイン・サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社）、約１０ｍｌのサプリメントＣ１０６からのチャン培地Ｃ（２％ｖ／ｖ）（アーバイン・サイエンティフィック社）、約５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（０．８５％の生理食塩水（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社−１５１４０−１２２）中の１０，０００単位／ｍｌペニシリンＧナトリウムおよび１０，０００ｕｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンにより調製された液体）約５ｍｌのＬ−グルタミン２００ｍＭ（１００×）（ギブコ社−２５０３０−０８１）、および約７５ｍｌのＥＳウシ胎仔血清（１５％ｖ／ｖ）（ギブコ社−１０４３９−０２４）を含むように２０％のチャン培地を追加する。チャン培地は完全培地（アーバイン・サイエンティフィック社）として購入することができる。
【０１６４】
凍結保存した細胞は、完全培地、ＤＮＡｓｅ（ジェネンテック社＃５０２４２−１００−４０）、トリプＬＥ（ＴｒｙｐＬＥ）（商標）エクスプレス（ギブコ社、＃１２６０５−０１０）、およびＤＰＢＳ（メディアテック社、ＭＴ２１−０３１  ＣＶ）を含むが、これらに限定されていない資材を使用して解凍できる。
【０１６５】
凍結保存した細胞を液体窒素の蒸気中の保存から取り出し、３７℃水浴中に置かなくてはならない。細胞を水浴中で攪拌し、完全に解凍させないこともできる。部分的に解凍した細胞は、ＤＮＡｓｅ含有冷却したチャン完全培地に移され、転倒によって混合できる。ＤＮＡｓｅは１００ｍｌのチャン培地あたり約１０滴で追加できる。約５ｍｌの各細胞調製物を、約２５ｍｌの冷却したチャン培地に追加した。懸濁は約５分間約１２０ｇで遠心分離できる。上清を吸引でき、細胞培養のための調製において適切な培地中で細胞を再懸濁される。
【０１６６】
あるいは、および、解凍が必要でない場合（例えば月経血幹細胞を含む細胞懸濁が凍結保存の工程なしで培養された場合など）、パルモザイムとして入手可能な約１ｍｇのＤＮＡｓｅを含む約２５ｍｌの冷却したチャン完全培地の小分けの中へ、細胞懸濁の約５ｍｌの小分けを置くことによって希釈できる。
【０１６７】
希釈する細胞懸濁は転倒によって混合できる。懸濁は約７分間約８４０ｇで遠心分離する。上清は沈殿を乱さずに吸引する。沈殿は、チャン完全培地で全体積を約３０ｍｌまでにする。少量の細胞懸濁を、血球計数器による細胞カウントおよびトリパンブルーを使用する生存率試験または他の適切な生存率試験法を含む分析のために取り出す。約３０ｍｌの懸濁をヒストパック（シグマ−アルドリッチ社）または他の適切な培地として入手可能な密度勾配溶液上に重層し、ブレーキなしで約３０分間約４２０ｇで遠心分離する。バフィーコートを破壊しないように、チューブを遠心分離機から取り出す。上清は吸引し、バフィーコートを収集する。バフィーコートをチャン完全培地により約２０ｍｌまでにし、約７分間約８４０ｇで洗浄する。上清を吸引し、沈殿をチャン完全培地中で約１０ｍｌまでにして懸濁するが、約２０ｍｌもしくは約３０ｍｌまでにすることも、または約１０ｍｌ未満でさえもすることができる。例えば約１００ｕｌなどの懸濁の小分けを、細胞カウントおよび生存率分析を実行するために取り出す。
【０１６８】
凍結保存した細胞の培養
細胞は、約４８時間の継代期間で、１ｃｍ2あたり約２０００細胞でプレーティングできる。細胞がより高い濃度で使用される場合、継代は約２４時間の間隔で行なうことができる。組織培養用の処理をしていないＴ７５フラスコを、約１５ｍｌの完全培地中で約１５０，０００細胞をプレーティングするのに使用できる。約８０％でサブコンフルエントになるまで、プレーティングした細胞を５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートできる。
【０１６９】
細胞は多数の継代を行なうことができる。細胞をフラスコから解離する準備ができている場合、培地をフラスコから吸引できる。次にフラスコを、約５ｍｌのカルシウムまたはマグネシウム不含有のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）によりリンスすることができる。次に接着細胞を１回洗浄した後に、ＰＢＳを除去することができる。約２ｍｌのトリプシン様酵素または他の適切な酵素的溶液を、約３７℃であらかじめ暖めて、Ｔ７５フラスコに追加した（Ｔ２５フラスコあたり１ｍｌ）。フラスコを撹拌して、酵素様溶液で細胞を覆うことができる。酵素様溶液を入れたフラスコはインキュベーター中で約３７℃で約５分間インキュベートできる。インキュベーション後に、フラスコを固体表面の上でタッピングして、細胞を外すことができる。フラスコの内容物を約２ｍｌの完全培地により希釈して、リンスし、反応を停止することができる。細胞を約２ｍｌ〜約５ｍｌのＤＰＢＳにより洗浄し、洗浄のための５０ｍｌの遠心分離チューブに移すことができる。チューブは約５分間約１２０ｇで遠心分離できる。上清は遠心分離後に廃棄でき、採取した細胞をチャン完全培地中に懸濁できる。約７ｍｌの細胞懸濁をＴ２５フラスコ中での培養のために、および約１５ｍｌをＴ７５フラスコのために使用することができる。
【０１７０】
細胞培養のためのチャン完全培地は約３２５ｍｌのＭＥＭアルファ培地（ギブコ社＃１２５７１−０６３）、約９０ｍｌのチャンＢ（基本培地）（１８％ｖ／ｖ）（アーバイン・サイエンティフィック社、Ｃ１１０）、約１０ｍｌのチャンＣ（２％ｖ／ｖ）（アーバイン・サイエンティフィック社、サプリメントＣ１０６）、約５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００単位／ｍｌペニシリンＧナトリウムおよび１０，０００ｕｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン（ギブコ社＃１５１４０−１２２））、約５ｍｌのＬ−グルタミン２００ｍＭ（１００×）（ギブコ社、＃２５０３０−０８１）および約７５ｍｌのＥＳウシ胎仔血清（１５％ｖ／ｖ）（ギブコ社＃１０４３９−０２４）を含む。
【０１７１】
解凍および培養方法の他の実施形態。
細胞を液体窒素の蒸気から取り出した後に、細胞を完全に解凍させずに、クリオバイアルを３７℃水浴中で撹拌する。部分的に解凍した細胞をＤＮＡｓｅ含有冷却したチャン培地に移し、転倒によって穏やかに混合できる。各５ｍｌの細胞懸濁のために、約２５ｍｌの冷却したチャンの培地を使用できる。１００ｍｌの冷却したチャンの培地に対して約１０滴のＤＮＡｓｅをチャン培地に追加できる。細胞懸濁は約５分間約１２０ｇで遠心分離できる。上清は吸引でき、細胞を以前に説明した抗生物質培地中に置くことができる。約３７℃での少なくとも約１２時間のインキュベーション後に、チャン完全培地を使用して細胞を洗浄できる。
【０１７２】
次に洗浄した細胞を細胞培養のために播種できる。１つの実施形態において、解凍した細胞は、１ｃｍ2あたり約４０，０００細胞、またはＴ−２５あたり１００万細胞でプレーティングできる。細胞は、４８時間の継代期間で、１ｃｍ2あたり２０００細胞でプレーティングできる。より多くの細胞をプレーティングする場合、継代は約２４時間の間隔内で行なうことができる。組織培養用の処理をしていないＴ７５フラスコを、約１５ｍｌの完全培地中で約１５０，０００細胞をプレーティングするのに使用できる。８０％でサブコンフルエントになるまで、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートできる。細胞をフラスコから解離する準備ができている場合、培地をフラスコから吸引できる。次にフラスコを、約５ｍｌのカルシウムまたはマグネシウム不含有リン酸塩緩衝液によりリンスすることができる。接着細胞を少なくとも１回洗浄した後に、ＰＢＳを除去することができる。約２ｍｌのトリプシン様酵素を、約３７℃であらかじめ暖めて、Ｔ７５フラスコに追加し（Ｔ２５フラスコについては１ｍｌ）、フラスコを撹拌して、酵素で細胞を覆うことができる。酵素を入れたフラスコはインキュベーター中で約３７℃で約５分間インキュベートできる。インキュベーション後に、フラスコを固体表面の上で穏やかにタッピングして、細胞を外すことができる。フラスコの内容物を約２ｍｌの完全培地により希釈して、リンスし、反応を停止することができる。細胞を約２ｍｌ〜約５ｍｌのＤＰＢＳにより洗浄し、洗浄のために５０ｍｌの遠心分離チューブに再懸濁した細胞を移す。チューブは約５分間約１２０ｇで遠心分離できる。上清は遠心分離後に廃棄でき、採取した細胞をチャン完全培地中に懸濁し、次の継代のために使用できる。約７ｍｌをＴ２５フラスコのために、および約１５ｍｌをＴ７５フラスコのために使用することができる。
【０１７３】
他の細胞培養方法
懸濁中の細胞は、チャン完全培地、ＤＭＥＭ完全培地（高グルコースまたは低グルコース含有）または他の適切な培地中に、無処理の培養フラスコの中へ１ｃｍ2あたり約４０，０００細胞で播種できる。フラスコは、約３７℃の温度で、ＣＯ2インキュベーター（サーモ・エレクトロン社またはバイオサイエンス・テクノロジーズ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）、または他の適切なインキュベーターシステム中で約５％ＣＯ2でインキュベートできる。細胞培養は濁度およびｐＨ変化についてモニタリングされる。ｐＨが高い場合、培地の約５０％を交換すべきである。
【０１７４】
フラスコは、最初に約７日間、または培地が培地中のフェノールレッド指示薬の色によって示されるように著しく範囲外になるまで、インキュベートする。約７日後にｐＨが安定したままである場合、培地は、新鮮培地（本明細書において「処女培地」とも呼ばれる）と必要に応じて交換する。培地はほとんどすべて交換する。７日目での培地交換後に、細胞は８日目〜２１日目までにコンフルエントになりうる。いったん約７０〜８０％のコンフルエンスに達すると、細胞は継代培養できる。細胞培養は、本発明に従って細胞選択を実行するのに十分な細胞を提供するために、トリプＬＥ（商標）エクスプレス（ギブコ社）のようなトリプシン様酵素または他の適切な酵素を使用して継代培養する。例えば細胞選択は、約１０００万の細胞により行なうことができる。細胞選択は、約１０００万以上のまたはそれ未満の細胞により行なうこともまたできる。
【０１７５】
本発明に従って、細胞は適切な時期の細胞培養から収集できる。細胞を収集するために、接着細胞はフラスコから解離するべきである。フラスコから細胞を解離するために、培地は自動ピペットを介して吸引する。次にフラスコを、約５ｍｌのカルシウムまたはマグネシウム不含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によりリンスする。次に接着細胞を少なくとも１回洗浄してＰＢＳをフラスコから除去する。トリプＬＥ（商標）エクスプレス  （または他の適切な酵素）（ギブコ）のような約１ｍｌのトリプシン様組換え酵素を、好ましくは約３７℃であらかじめ暖めて、フラスコ中の細胞培養に追加するべきである。フラスコを撹拌して、酵素で細胞を覆う。酵素の入ったフラスコを約３７℃で約５分間インキュベートすべきである。インキュベーション後に、フラスコを固体表面に穏やかにタッピングして、細胞を外すべきである。フラスコを約２ｍｌのチャン完全培地で希釈するべきであり、細胞をチャン完全培地、ＤＭＥＭ完全培地（高グルコースまたは低グルコース含有）または他の適切な培地による洗浄のために１５ｍｌの遠心分離チューブに移す。チューブは約１００ｇで約７分間遠心分離すべきである。上清を吸引し廃棄する。沈殿を、チャン完全培地、ＤＭＥＭ完全培地（高グルコースまたは低グルコース含有）または他の適切な培地の適切な体積中に懸濁する。
【０１７６】
この時点で、細胞は本発明の細胞選択の方法論に従って細胞培養から選択できる。一旦選択されたならば、細胞はペトリ皿上にプレーティングするか、培養フラスコの中へ播種するか、または本発明に従って凍結保存できる。
【０１７７】
細胞は、チャン完全培地（約１５％ＦＢＳ）を使用して、９ｃｍ2ペトリ皿中にプレーティングできる。あるいは、細胞は通気口付きキャップを備えた培養フラスコ中に置くことができる。培地のｐＨが高くなる場合、細胞をチャン完全培地により洗浄することができる。適切な増殖後に必要な場合は、細胞はトリプシン様酵素を使用して、ペトリ皿または培養フラスコから解離でき。次にチャン完全培地を使用して無処理の培養フラスコ中に置いた。適切な増殖後、細胞はトリプＬＥ（商標）エクスプレス（ギブコ）のようなトリプシン様酵素を使用して解離でき、次に新鮮な無処理の培養フラスコ中に播種した。このプロセスは所望される細胞増殖を維持するために繰り返すことができる。細胞は新鮮培地により洗浄できるか、または培地のｐＨが高い場合、培地の約５０％もしくは他の適切な量を新鮮な培地と置換することができる。この時点で、本発明の細胞選択の方法論に従って、細胞を細胞培養から選択できる。選択された細胞は、ペトリ皿上にプレーティングするか、培養フラスコの中へ播種するか、または本発明に従って凍結保存することができる。
【０１７８】
本発明の実行の全体にわたって、連邦施行規則集中の、米国食品医薬品局によって制定された最新の医薬品最適製造基準（ｃＧＭＰ）規格および最新の優良組織実施基準（Ｇｏｏｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）（ｃＧＴＰ）に従う。
【０１７９】
本発明のプロセス、方法およびシステムの前述の工程は、あるいは、図２〜２８によって図示されるように具体化できる。
【０１８０】
Ｍ２−０１細胞
実施例において、本発明の実行に従って、月経血幹細胞を収集した。特に、Ｍ２−０１として本明細書において呼ばれて参照される約０．４ｍｌの月経流出物サンプルは、月経周期の間にドナーによって収集された。滅菌された収集器具を、月経流出物のサンプルを収集するのに十分な時間の間ドナーの膣内に置いた。約０．４ｍｌの月経流出物サンプルを、収集器具から収集チューブ中の約１０ｍｌの収集培地へと注いだ。収集培地は、カルシウム、マグネシウムまたはフェノールレッド不含有ＤＰＢＳ（メディアテック社）、ＤＰＢＳ１ミリリットルあたり約１００単位のペニシリン、ＤＰＢＳ１ミリリットルあたり約１００マイクログラムのストレプトマイシン、およびＤＰＢＳ１ミリリットルあたり約１０単位〜約２０単位の範囲の防腐剤不含有ヘパリンを含んでいた。月経流出物サンプルおよび収集培地を、収集チューブ中にシールし、収集容器中で氷の上にパックし、発送して処理施設へ輸送した。
【０１８１】
月経流出物サンプルは、収集後約２４時間以内に処理施設に到着した。抗生物質含有収集培地中に約１０．０ｍｌの月経流出物サンプルを含む収集容器を、処理施設への到着と同時に消毒し、クリーンルームへと移し、氷上に置いた。収集容器を約１８℃の温度で約７分間約２０００ｒｐｍで遠心分離し、次に消毒した。約５ｍｌの上清のサンプルを吸引し、２本のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ血液培養ボトル（好気培養ボトルの中へ約４ｍｌおよび嫌気培養ボトルの中へ約１ｍｌ）を接種のために使用した。培養ボトルを、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴシステムにおいて約３７℃で約１４日間インキュベートした。結果は、好気性微生物および嫌気性微生物について陰性であった。
【０１８２】
残りの上清を吸引して廃棄した。沈殿を約２ｍｌのＤＰＢＳ中に懸濁した。約１ｍｌの細胞懸濁を処理後サンプルとして収集し、細胞カウント、フロー分析および生存率によって解析した。血球計数器を使用して実行された全細胞カウントは、約７５０万細胞が処理後サンプル中に収集されることを示した。フローサイトメトリー分析はＦＣ５００フローサイトメーターを使用して本発明の方法に従って実行して、処理後サンプル中の月経血幹細胞上に存在する特定の細胞表面マーカーを同定した。図２９ａ〜２９ｊにおいて示されるように、この結果は、細胞集団の約０．４％の濃度でＣＤ１１７＋細胞が収集されたことを示す。さらに、この結果は細胞集団の約５８％の濃度でＣＤ４５陰性細胞が収集されることを示した。この結果は、細胞集団の約１７％の濃度でＣＤ４４＋細胞が収集され、細胞集団の約３％の濃度でＣＤ１６６＋細胞が収集され、細胞集団の約８．０％の濃度でＣＤ１０５＋細胞が収集され、細胞集団の約６．８％の濃度でＣＤ９０＋細胞が収集され、細胞集団の約０．１％の濃度でＣＤ２９＋細胞が収集されることを示し、この結果は、細胞集団の約０．１％の濃度でＣＤ３４＋細胞が収集されることを示した。フローサイトメトリー分析は７ＡＡＤもまた使用して実行し、細胞生存率を評価した。この結果は、月経血幹細胞の約９５％が生存していることを示す。
【０１８３】
残りの細胞懸濁を、本発明の方法に従って培養した。特に、細胞懸濁の一部を、１．０８３ｇ／ｍｌの１５ｍｌの密度勾配溶液（ヒストパック、シグマ−アルドリッチ社）上に重層した。細胞懸濁を、ブレーキなしで約３０分間約４２０ｇで遠心分離した。上清を吸引し、バフィーコートを取り出し、チューブ中に置いた。チャン完全培地をバフィーコートへ追加して、全体積を約３０ｍｌまでにした。溶液を約７分間約８４０ｇで２回洗浄した。第２の洗浄に対する遠心分離後に、上清は沈殿を残して取り出し、約１５ｍｌのチャン完全培地をチューブに追加して沈殿を懸濁した。約１００ｕＬの懸濁を取り出して、血球計数器による細胞カウント分析およびトリパンブルーを使用する生存率分析を実行する。
【０１８４】
１日目に、約１００万細胞を、無処理のＴ２５培養フラスコの中へ１ｃｍ2あたり約４０，０００細胞でチャン培地中に播種した。フラスコは約３７℃の温度で約５％ＣＯ2中でインキュベートした。８日目に、細胞は１回目の継代を行い、培地を交換した。
【０１８５】
この開示の全体にわたって使用されるように、継代は一般的に自動ピペットによる培地の吸引によってフラスコから細胞を解離することを含んでいた。フラスコを、約５ｍｌのカルシウムまたはマグネシウム不含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によりリンスした。次に付着した細胞が入ったフラスコをいったん洗浄した後、ＰＢＳを除去した。約３７℃であらかじめ暖めた約１ｍｌのトリプシン様酵素（トリプＬＥ（商標）エクスプレス−ギブコ社）をフラスコへ追加し、フラスコを撹拌して酵素で細胞を覆った。酵素を入れたフラスコはインキュベーター中で約３７℃で約５分間インキュベートした。インキュベーション後に、フラスコを固体表面の上で穏やかにタッピングして、細胞を外した。フラスコの内容物を約２ｍｌの完全培地により希釈して、細胞を洗浄のために１５ｍｌの遠心分離チューブへ移した。チューブを約１００ｇで約７分間遠心分離した。上清を遠心分離後に廃棄し、採取した細胞をチャン完全培地中で懸濁し、少なくとも１つの新しいＴ２５またはＴ７５の無処理の細胞培養フラスコの中へ置いた。
【０１８６】
細胞培養の追加の継代を、１０、１４、１９、２１、２４、２６、２９、３２および３５日目に行なった。８日目に、約１６５，０００細胞を採取し、本発明の培養方法に従って、無処理の組織培養フラスコ中のチャン培地中に播種した。１０日目に、約２７０，０００細胞を採取し、無処理の組織培養フラスコ中のチャン培地中に播種した。１４日目に、約８４０，０００細胞を採取し、無処理の組織培養フラスコ中のチャン培地中に播種した。１９日目に、約２２０万細胞を採取し、無処理の組織培養フラスコ中のチャン培地中に播種した。２１日目に、約５００万細胞を採取し、そのうちの約３５０万細胞を細胞表現型のために使用した。２４日目に、約３００万細胞を採取し、無処理の組織培養フラスコ中のチャン培地中に播種した。２６日目に、約４９０万細胞を採取し、無処理の組織培養フラスコ中のチャン培地中に播種した。２９日目に、約１４８０万細胞を採取し、約１１１０万細胞をＣＤ１１７発現細胞のポジティブ選択のために使用し、約３５０万細胞を表現型分析のために使用するように、無処理の組織培養フラスコ中のチャン培地中に播種し、約２００，０００細胞を培養用に播種した。３２日目に、約１３０万を採取し、そのうちの約１００万細胞をフローの表現型のために使用し、約３００，０００細胞を無処理の組織培養フラスコ中のチャン培地中に播種した。
【０１８７】
２９日目に、およびあらかじめ検討されたように、培養から採取された細胞は、本明細書において記述されるような本発明の選択の方法論に従って、ＣＤ１１７選択を行なった。ＣＤ１１７幹細胞選択の前に、各細胞培養の小分けを、表Ｃにおいて示される結果の分析のために取り出す。
【０１８８】
特に、採取した細胞をマウス抗ヒトＣＤ−１１７抗体により標識した。約１０００万の採取した細胞を遠心分離し、上清を吸引した。沈殿を、約５ｕｇの製品１０４Ｄ２（サンタクルズ社）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ１１７モノクローナル抗体（ＩｇＧ１）を含む約１００ｕｌのワーキングバッファー中に懸濁した。ＢＤバイオサイエンス社を介して入手可能なワーキングバッファーは、ｐＨ約７．２のＰＢＳ、ウシ血清アルブミン、ＥＤＴＡおよび約０．０９％アジ化物を含む。細胞および抗体を含む溶液を、氷上に約２０分〜約２５分間インキュベートした。細胞をワーキングバッファーにより洗浄して未結合抗体を除去し、細胞および抗体を含む溶液を約１０分間約３００ｇで遠心分離した。遠心分離後に、上清を吸引して廃棄し、沈殿を約８０ｕｌのワーキングバッファー中に懸濁した。
【０１８９】
ＣＤ１１７幹細胞−抗体複合体を、マウスＩｇＧの重鎖および／または軽鎖に結合可能なヤギ抗マウス抗体により標識した。磁石のマイクロビーズがヤギ抗マウス抗体に付着されている。ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体をワーキングバッファー中で懸濁された沈殿に追加し、約３０分〜約３５分間氷上でインキュベートした。インキュベーション後に、細胞を約２ｍｌのワーキングバッファーにより洗浄し、約１０分間約３００ｇで遠心分離した。上清を吸引し、最終的な細胞を約５００ｕｌのワーキングバッファー中に懸濁した。
【０１９０】
ワーキングバッファーを含む、採取された幹細胞および溶液を含む細胞懸濁を、実験の全体にわたって冷たく保ち、細胞の非特異的標識を防止した。
【０１９１】
ＭＳカラム（ミルテニー・バイオテク社）を、カラムを通して約５００ｕｌのワーキングバッファーでリンスすることによって調製した。ミルテニー・バイオテク社を介して入手可能なミニマックスをＣＤ１１７幹細胞選択のために使用した。ミルテニー・バイオテク社を介して入手可能なマックスセパレーターの磁石体中にカラムを置いた。細胞懸濁をピペットを介してカラムに追加した。未標識細胞およびワーキング溶液はカラムを通して流し、表現型決定および細胞カウント分析のために滅菌済みチューブ中に収集した。収集された流出物を有するチューブを、ＣＤ１１７陰性細胞画分として標識した。カラムは、細胞懸濁の追加後に、ワーキングバッファーにより３時間洗浄した。陽性画分がカラムを通って、滅菌済みチューブの中へと通過できるように、カラムを磁石体から取り出して、滅菌済みチューブをカラム下に置いた。約１ｍｌのワーキングバッファーをカラムに追加し、プランジャーをカラムを通して押し出して細胞の陽性画分を放出した。収集された流出物を有するチューブを、ＣＤ１１７陽性細胞画分として標識した。
【０１９２】
陽性画分および陰性画分を血球計数器により解析して、生存細胞の総数を得た。陰性画分をフローサイトメトリーによって解析した。Ｍ２−０１細胞を、処理および培養の全体にわたる様々な工程で解析し、図３０ａ〜３０ｅ中に結果を示して、以下の表Ｃに要約した。
【０１９３】
【表３】
2010530214.tif 000005
【０１９４】
Ｍ２−０２Ｃ細胞
他の実施例において、本発明の実行に従って、月経血幹細胞を収集した。特に、Ｍ２−０２Ｃとして本明細書において呼ばれて参照される約１．０ｍｌ未満の月経流出物サンプルは、月経周期の間にドナーによって収集された。滅菌された収集器具を、月経流出物のサンプルを収集するのに十分な時間の間ドナーの膣内に置いた。月経流出物サンプルを、収集器具から収集チューブ中の約１０ｍｌの収集培地へと注いだ。収集培地は、カルシウム、マグネシウムまたはフェノールレッド不含有ＤＰＢＳ（メディアテック社）、ＤＰＢＳ培地１ミリリットルあたり約１００単位のペニシリン、ＤＰＢＳ培地１ミリリットルあたり約１００マイクログラムのストレプトマイシン、およびＤＰＢＳ培地１ミリリットルあたり約１０単位〜約２０単位の範囲の防腐剤不含有ヘパリンを含んでいた。月経流出物サンプルおよび収集培地を、収集チューブ中にシールし、収集容器中で氷の上にパックし、発送して処理施設に輸送した。
【０１９５】
月経流出物サンプルは、収集後に約２４時間未満以内に処理施設に到着した。約１０．０ｍｌの月経流出物サンプルおよび抗生物質含有収集培地を含む収集容器を、処理施設への到着と同時に消毒し、クリーンルームへと移し、氷上に置いた。収集容器を約１８℃の温度で約７分間約２０００ｒｐｍで遠心分離し、次に消毒した。約５ｍｌの上清のサンプルを吸引し、２本のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ血液培養ボトル（好気培養ボトルの中へ約４ｍｌおよび嫌気培養ボトルの中へ約１ｍｌ）を接種のために使用した。培養ボトルを、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴシステムにおいて約３７℃で約１４日間インキュベートした。結果は、好気性微生物および嫌気性微生物について陰性であった。
【０１９６】
残りの上清を吸引して廃棄した。沈殿を約２ｍｌの緩衝生理食塩水中に懸濁した。約１ｍｌの細胞懸濁を処理後サンプルとして収集し、フローサイトメトリー分析によって解析して、細胞カウント、フロー分析および生存率を得た。
【０１９７】
処理サンプルの全細胞カウントを血球計数器を使用して実行した。約１９７０万細胞が処理サンプル中に収集された。フローサイトメトリー分析はＦＣ５００フローサイトメーターを使用して実行して、細胞表面マーカーを同定した。図３１ａ〜３１ｉｉｉにおいて示されるように、この結果は、細胞集団の約０．２％の濃度でＣＤ１１７＋細胞が収集されることを示した。さらに、この結果は細胞集団の約９７％の濃度でＣＤ４５陰性細胞が収集されることを示した。この結果は、細胞集団の約１％の濃度でＣＤ４４＋細胞が収集され、細胞集団の約０．１％の濃度でＣＤ１６６＋細胞が収集され、細胞集団の約１％の濃度でＣＤ１０５＋細胞が収集され、細胞集団の約０．４％の濃度でＣＤ９０＋細胞が収集され、細胞集団の約０．５％の濃度でＣＤ２９＋細胞が収集されることを示し、この結果は、細胞集団の約０％の濃度でＣＤ３４＋細胞が収集されることを示した。この結果は、７ＡＡＤによって決定されるように、収集された細胞の約９９％が生存していることもまた示す。
【０１９８】
細胞浮遊液はすべて１本の５０ｍｌの収集用のコニカルチューブに移し、洗浄溶液を使用して、細胞懸濁の体積を約３１ｍｌの全体積までにした。３０ｍｌの細胞懸濁の約半分を密度勾配遠心分離によって凝縮した。細胞を、密度勾配遠心分離および体積減少、凝縮ならびに洗浄を含む方法によって処理した。細胞懸濁を約３０ｍｌまでにし、約１５ｍｌのリンパ球分離培地（約２０℃で密度１．０７７〜１．０８０ｇ／ｍｌ−セルグロー）の密度勾配を下に置いた。細胞懸濁および密度勾配を、約２０℃の温度でブレーキなしで約３０分間約１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。バフィーコート層が形成され、月経血幹細胞集団を含んでいた。バフィーコート層の上の上清を吸引して廃棄した。バフィーコート層を、若干の洗浄溶液および可能な限り少ない体積の密度勾配と共に取り出した。残りの密度勾配および赤血球を含む沈殿を廃棄した。
【０１９９】
バフィーコート層を５０ｍｌの収集用のコニカルチューブ中に置き、体積を洗浄溶液により約３０ｍｌまでにした。細胞懸濁を、約２０℃の室温で約７分間約２０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後に、コニカル収集チューブの上部近くの約１ｍｌの上清を取り出し、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ血液培養ボトルを使用して接種した。血液培養ボトルを、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴシステムにおいて約３７℃で約１４日間インキュベートした。結果は、上清および細胞懸濁が任意の好気性微生物または嫌気性微生物を含まないことを示す。残りの上清は、月経血幹細胞を含む沈殿を注意深く残しながら吸引した。
【０２００】
約１００万細胞を、無処理のＴ２５培養フラスコの中へ１ｃｍ2あたり約４０，０００細胞で１５％のチャン完全培地中に播種した。フラスコは３７℃の温度で約５％ＣＯ2中でインキュベートした。６日目の継代１で細胞は約８０，０００、１１日目に３２４，０００細胞、１７日目に６００，０００細胞、９日目に２９０万（２３０万は細胞表現型のために提供された）、２２日目に１２０万、２４日目に２６０万、２９日目に２６８０万細胞（細胞表現型のために３５０万、ＣＤ１１７選択のために１０００万、１億３１００万を凍結保存、２００，０００細胞を培養のために播種）で採取した。細胞および培地の小分けを、表現型決定および有効性評価のために細胞培養の全体にわたって収集した。表現型決定および有効性評価は、すべての細胞株に関するすべての細胞培養実験について、本明細書において記述された方法に従って実行した。細胞培養の間の細胞カウントは、すべての細胞株に関して血球計数器を使用して実行した。評価から集めたデーターは、細胞株Ｍ２−０２Ｃは、ＣＤ１１７、ＣＤ１６６、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ９０およびＣＤ４４について最初は陽性であり、およびＣＤ４５について陰性であり、高生存率のパーセンテージであることを示した。
【０２０１】
【表４−１】
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【表４−２】
2010530214.tif 000007
【０２０２】
継代４で培養されたＭ２−０２Ｃについてのフローサイトメトリー分析の結果を、図３２ａ〜３２ｉｉｉ中に提供する。培養したサンプルは、本発明に従って播種した約１００万の細胞を含む。この結果は、継代４では細胞集団の約０．０％の濃度でＣＤ１１７＋細胞が収集されることを示した。さらに、この結果は細胞集団の約８２％の濃度でＣＤ４５−細胞が収集されることを示した。この結果は、細胞集団の約９３％の濃度でＣＤ４４＋細胞が収集されることを示した。この結果は、７ＡＡＤによって決定されるように、収集された細胞の約９９％が生存していることもまた示した。この結果は、Ｍ２−０２Ｃの継代８では、細胞集団の約１４％の濃度でＣＤ１１７＋細胞が収集されることを示した。さらに、この結果は細胞集団の約８４％の濃度でＣＤ４５−細胞が収集されることを示した。この結果は、細胞集団の約９３．３％の濃度でＣＤ４４＋細胞が収集され、細胞集団の約９３％の濃度でＣＤ１６６＋細胞が収集され、細胞集団の約９０％の濃度でＣＤ１０５＋細胞が収集され、細胞集団の約８７％の濃度でＣＤ９０＋細胞が収集され、細胞集団の約８５％の濃度でＣＤ２９＋細胞が収集されることを示し、結この果は、細胞集団の約０．２％の濃度でＣＤ３４＋細胞が収集されることを示した。この結果は、７ＡＡＤによって決定されるように、収集された細胞の約９７％が生存していることもまた示す。
【０２０３】
細胞培養中の細胞は本発明の方法論に従い、本明細書において記述されるように、継代４でＣＤ１１７幹細胞選択を行なった。採取した細胞を、マウス抗ヒトＣＤ−１１７抗体により標識した。約１０００万の採取した細胞を遠心分離し、上清を吸引した。沈殿を、約５ｕｇの製品１０４Ｄ２（サンタクルズ社）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ１１７モノクローナル抗体（ＩｇＧ１）を含む約１００ｕｌのワーキングバッファー中に懸濁した。ＢＤバイオサイエンス社を介して入手可能なワーキングバッファーは、ｐＨ約７．２のＰＢＳ、ウシ血清アルブミン、ＥＤＴＡおよび約０．０９％アジ化物を含む。細胞および抗体を含む溶液を、氷上に約２０分〜約２５分間インキュベートした。細胞をワーキングバッファーにより洗浄して未結合抗体を除去し、細胞および抗体を含む溶液を約１０分間約３００ｇで遠心分離した。遠心分離後に、上清を吸引して廃棄し、沈殿を約８０ｕｌのワーキングバッファー中に懸濁した。
【０２０４】
ＣＤ１１７幹細胞−抗体複合体を、マウスＩｇＧの重鎖および／または軽鎖に結合可能なヤギ抗マウス抗体により標識した。磁石のマイクロビーズがヤギ抗マウス抗体に付着されている。ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を追加し、約３０分〜約３５分間氷上でインキュベートした。インキュベーション後に、細胞を約２ｍｌのワーキングバッファーにより洗浄し、約１０分間約３００ｇで遠心分離した。上清を吸引し、最終的な細胞を約５００ｕｌのワーキングバッファー中に懸濁した。
【０２０５】
ワーキングバッファーを含む、採取された幹細胞および溶液を含む細胞懸濁を、実験の全体にわたって冷たく保ち、細胞の非特異的標識を防止した。
【０２０６】
ＭＳカラム（ミルテニー・バイオテク社）を、カラムを通して約５００ｕｌのワーキングバッファーでリンスすることによって調製した。ミルテニー・バイオテク社を介して入手可能なミニマックスをＣＤ１１７幹細胞選択のために使用した。ミルテニー・バイオテク社を介して入手可能なマックスセパレーターの磁石体中にカラムを置いた。細胞懸濁をピペットを介してカラムに追加した。未標識細胞およびワーキング溶液はカラムを通して流し、表現型決定および細胞カウント分析のために滅菌済みチューブ中に収集した。収集された流出物を有するチューブを、ＣＤ１１７陰性細胞画分として標識した。カラムは、細胞懸濁の追加後に、ワーキングバッファーにより３時間洗浄した。陽性画分がカラムを通って、滅菌済みチューブの中へと通過できるように、カラムを磁石体から取り出して、滅菌済みチューブをカラム下に置いた。収集された流出物を有するチューブを、ＣＤ１１７陽性細胞画分として標識した。
【０２０７】
陽性画分および陰性画分を、密度勾配、ＣＤ１１７選択および後続する培養による他の処理の全体にわたる様々な工程で、血球計数器およびフローサイトメトリーにより解析し、表Ｄ中に陽性画分および陰性画分ならびに以下の表Ｅ中に陽性画分について、一般的に結果を示した。
【０２０８】
Ｍ２−０３Ｅ細胞
なお他の実施例において、本発明の実行に従って、月経血幹細胞を収集した。特に、Ｍ２−０３Ｅとして本明細書において呼ばれて参照される月経流出物のサンプルは、月経周期の間にドナーによって収集された。滅菌された収集器具を、月経流出物のサンプルを収集するのに十分な時間の間ドナーの膣内に置いた。月経流出物サンプルを、収集器具から収集チューブ中の約１０ｍｌの収集培地へと注いだ。収集培地は、カルシウム、マグネシウムまたはフェノールレッド不含有ＤＰＢＳ（メディアテック社）、ＤＰＢＳ培地１ミリリットルあたり約１００単位のペニシリン、ＤＰＢＳ培地１ミリリットルあたり約１００マイクログラムのストレプトマイシン、およびＤＰＢＳ培地１ミリリットルあたり約１０単位〜約２０単位の範囲の防腐剤不含有ヘパリンを含んでいた。月経流出物サンプルおよび収集培地を、収集チューブ中にシールし、収集容器中で氷の上にパックし、発送して処理施設に輸送した。
【０２０９】
月経流出物サンプルは、収集後約２４時間未満以内に処理施設に到着した。約１０．０ｍｌの月経流出物サンプルおよび抗生物質含有収集培地を含む収集容器を、処理施設への到着と同時に消毒し、クリーンルームへと移し、氷上に置いた。収集容器を約１８℃の温度で約７分間約２０００ｒｐｍで遠心分離し、次に消毒した。約５ｍｌの上清のサンプルを吸引し、２本のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ血液培養ボトル（好気培養ボトルの中へ約４ｍｌおよび嫌気培養ボトルの中へ約１ｍｌ）を接種のために使用した。培養ボトルを、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴシステムにおいて約３７℃で約１４日間インキュベートした。結果は、好気性微生物および嫌気性微生物について陰性であった。
【０２１０】
残りの上清を吸引して廃棄した。沈殿を約２ｍｌの緩衝生理食塩水中に懸濁した。約１ｍｌの細胞懸濁を処理後サンプルとして収集し、フローサイトメトリー分析によって解析して、細胞カウント、フロー分析および生存率を得た。
【０２１１】
処理サンプルの全細胞カウントは血球計数器を使用して実行した。結果は、約５２０万細胞が本発明に従う処理後サンプル中に収集されることを示した。フローサイトメトリー分析はＦＣ５００フローサイトメーターで実行した。この結果は、細胞集団の約０．５％の濃度でＣＤ１１７＋細胞が収集されることを示した。さらに、この結果は細胞集団の約８８．４％の濃度でＣＤ４５陰性細胞が収集されることを示した。この結果は、細胞集団の約２．１％の濃度でＣＤ４４＋細胞が収集されることを示した。この結果は、７ＡＡＤによって決定されるように、収集された細胞の約９７．０％が生存していることもまた示した。
【０２１２】
約４００万細胞を、０日目に、無処理のＴ７５培養フラスコの中へ１ｃｍ2あたり約４０，０００細胞でチャン培地中に播種した。フラスコは約３７℃温度で約５％ＣＯ2中でインキュベートした。継代１の１０日目に培地を交換した。追加の継代を、１４、１６、１９、２２および２６日目に行なった。継代５の２６日目に、本発明の選択方法に従って、ＣＤ１１７選択のために細胞を採取した。
【０２１３】
採取した細胞を、マウス抗ヒトＣＤ−１１７抗体により標識した。約１０００万の採取した細胞を遠心分離し、上清を吸引した。沈殿を、約５ｕｇの製品１０４Ｄ２（サンタクルズ社）の精製されたマウス抗ヒトＣＤ１１７モノクローナル抗体（ＩｇＧ１）を含む約１００ｕｌのワーキングバッファー中に懸濁した。ＢＤバイオサイエンス社を介して入手可能なワーキングバッファーは、ｐＨ約７．２のＰＢＳ、ウシ血清アルブミン、ＥＤＴＡおよび約０．０９％アジ化物を含む。細胞および抗体を含む溶液は、氷上に約２０分間インキュベートした。細胞をワーキングバッファーにより洗浄して未結合抗体を除去し、細胞および抗体を含む溶液を約１０分間約３００ｇで遠心分離した。遠心分離後に、上清を吸引して廃棄し、沈殿を約８０ｕｌワーキングバッファーの中に懸濁した。
【０２１４】
ＣＤ１１７幹細胞−抗体複合体を、マウスＩｇＧの重鎖および／または軽鎖に結合可能なヤギ抗マウス抗体により標識した。磁石のマイクロビーズがヤギ抗マウス抗体に付着されている。ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を追加し、約３０分間氷上でインキュベートした。インキュベーション後に、細胞を約２ｍｌのワーキングバッファーにより洗浄し、約１０分間約３００ｇで遠心分離した。上清を吸引し、最終的な細胞を約５００ｕｌのワーキングバッファー中に懸濁した。
【０２１５】
ワーキングバッファーを含む、採取された幹細胞および溶液を含む細胞懸濁を、実験の全体にわたって冷たく保ち、細胞の非特異的標識を防止した。
【０２１６】
ＭＳカラム（ミルテニー・バイオテク社）を、カラムを通して約５００ｕｌのワーキングバッファーでリンスすることによって調製した。ミルテニー・バイオテク社を介して入手可能なミニマックスをＣＤ１１７幹細胞選択のために使用した。ミルテニー・バイオテク社を介して入手可能なマックスセパレーターの磁石体中にカラムを置いた。細胞懸濁をピペットを介してカラムに追加した。未標識細胞およびワーキング溶液はカラムを通して流し、表現型決定および細胞カウント分析のために滅菌済みチューブ中に収集した。収集された流出物を有するチューブを、ＣＤ１１７陰性細胞画分として標識した。カラムは、細胞懸濁の追加後に、ワーキングバッファーにより３時間洗浄した。陽性画分がカラムを通って、滅菌済みチューブの中へと通過できるように、カラムを磁石体から取り出して、滅菌済みチューブをカラム下に置いた。約１ｍｌのワーキングバッファーをカラムに追加し、プランジャーをカラムを通して押し出して細胞の陽性画分を放出した。収集された流出物を有するチューブを、ＣＤ１１７陽性細胞画分として標識した。
【０２１７】
陽性画分および陰性画分を血球計数器により解析して、生存細胞の総数を得た。
【０２１８】
陽性画分をチャン培地中で培養した。約９０００億細胞を、０日目に、４−Ｔ２５無処理の培養フラスコの中へ１ｃｍ２あたり約３，０００細胞でチャン培地中に播種した。フラスコは約３７℃温度で約５％ＣＯ2中にインキュベートした。３日目に、細胞は１回目の継代を行い、培地を交換した。追加の継代を、３、６および８日目に行なった。継代３の８日目に、約２４００万細胞を採取し、本発明の凍結保存方法に従って約２０５０万細胞を凍結保存した。ＣＤ１１７陽性で選択された残りの細胞は培養へと播種して、さらに幾つかの継代を行なった。陽性の選択された細胞培養の継代５で、細胞は表Ｅでリストされるような細胞表面マーカーを示した。
【０２１９】
【表５】
2010530214.tif 000008
【０２２０】
凍結保存した細胞を後に解凍し、R. Gonzalez et al.、ヒト妊娠第２期ＭＳＣの多能性マーカー発現および分化（Pluripotent marker expression and differentiation of human second trimester MSC）、Biochem. Biophys, Res. Commun. (2007)において記載された、細胞培養、フローサイトメトリー方法、核型分析、分化方法ならびにＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ方法に従って解析した。
【０２２１】
凍結保存した細胞を解凍し、Ｇｏｎｚａｌｅｚの培養技術に従って１回の継代のために培養した。細胞は、第１の継代でフローサイトメトリー方法、核型方法およびＧｏｎｚａｌｅｚの分化方法によって解析した。図３３において示されるようなフローサイトメトリー結果は、細胞がＣＤ１１７およびＳＳＥＡ−４について陽性であることを示し、特に図３４において示されるように、およびＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｆ、ＭＨＣ  Ｉ、ＣＤ２９およびＣＤ９もまた陽性であり、単離された細胞上で共局在を示した。細胞はＣＸＣＲ４についてもまた陽性であった。細胞は、ＣＤ３８、ＣＤ１３３、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＭＨＣ  ＩＩおよびＬＩＮについて陰性であった。図３５ａにおいて示されるように、細胞は培養中に約２４〜約３６時間の割合で倍化した。さらに図３５ｂにおいて示されるように、最初の細胞培養は５０，０００細胞で始まり、培養２６日目までに４８，０００，０００に増殖した。図３５ｂにおいてもまた示されるように、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、細胞が継代１２でＳＯＸ−２またはＮａｎｏｇは発現せず、多能性マーカーＯｃｔ−４を発現することを示した。
【０２２２】
Ｇｏｎｚａｌｅｚの方法に従う核型分析は、細胞が見かけ上正常な女性核型であり、染色体異常のない状態で維持された二倍体細胞であることを示した。図３９において示されるように、細胞は継代１２で５０％以上のテロメラーゼ活性を示す。
【０２２３】
ＲＴ−ＰＣＲ結果を図３５ｂにおいて示し、細胞は少なくとも多能性マーカーＯｃｔ−４を発現することを示す。
【０２２４】
Ｇｏｎｚａｌｅｚの方法に従う分化分析の結果は、細胞が神経細胞系譜、心臓形成系譜、軟骨形成系譜、骨形成系譜および脂肪細胞形成系譜へと分化する能力を有することを示す。
【０２２５】
神経細胞系譜分化のためのＧｏｎｚａｌｅｚの方法の結果に従って、図３６において示されるように、細胞は、希突起神経膠細胞によって発現されるマーカーのＯ４およびＧａｌＣを発現して、神経組織へと分化する能力を示した。図３６において示されるように、神経細胞誘導した細胞は、神経細胞および神経前駆細胞によって発現されるＴｕｂ３、Ｍａｐ２およびビメンチンもまた発現した。４日間ＦＤＦを含む培地中で、続いて約７日間ＦＧＦ、ＰＤＧＦおよびＥＧＦを追加して培養し、次に５日間ＥＧＦを除いてＦＧＦおよびＰＤＧＦが存在する中で培養した場合、図３６において示されるように、細胞は、Ｏ４およびＧａｌＣ、神経マーカーのＭａｐ−２、ビメンチンならびに星状細胞マーカーのＧＦＡＰを発現した。ＲＴ−ＰＣＲは、細胞がＲＮＡレベルで、ネスチン、ＮＣＡＭおよびＮｕｒｒ−１を含む神経マーカーを発現することを示す。ＲＴ−ＰＣＲデーターは、４５〜５０％の割合で細胞が複数の神経細胞表現型への分化の可能性を有することを示す。
【０２２６】
心臓形成系譜分化のためのＧｏｎｚａｌｅｚ方法の結果に従って、細胞は、心臓形成系譜へと分化する能力を示した。図３７においてもまた示されるように、心臓誘導した細胞は心臓細胞において発現されるアクチンおよびトロポニンを発現した。
【０２２７】
軟骨形成系譜分化のためのＧｏｎｚａｌｅｚの方法の結果に従って、図３８ｃおよび３８ｄにおいて示されるように、細胞は軟骨形成系譜へと分化する能力を示した。軟骨形成分化した細胞は、軟骨形成組織タイプによって発現される硫酸化プロテオグリカン類について、アルシアンブルーにより陽性に染色された。
【０２２８】
脂肪細胞形成系譜分化のためのＧｏｎｚａｌｅｚの方法の結果に従って、図３８ｅおよび３８ｆにおいて示されるように、細胞は脂肪細胞形成系譜へと分化する能力を示した。特に図３８ｆにおいてもまた示されるように、脂肪細胞形成分化した細胞は、脂肪細胞形成組織によって発現される脂肪空胞について、オイルレッドＯにより陽性に染色された。
【０２２９】
骨形成系譜分化のためのＧｏｎｚａｌｅｚの方法の結果に従って、図３８ａおよび３８ｂにおいて示されるように、細胞は造骨組織に典型的なカルシウム沈着について、アリザリンレッドＳによる低染色を示した。
【０２３０】
心臓系譜分化のためのＧｏｎｚａｌｅｚ方法の結果に従って、図３７において示されるように、細胞は心臓系譜へと分化する能力を示した。図３７において示されるように、細胞は、８ｕＭアザまたは８００ｕＭのＳＮＡＰのいずれかを使用する細胞の分化後に、心臓マーカーのアクチン、トロポニンおよびコネキシン４３について陽性に染色された。ＲＴ−ＰＣＲデーターは、細胞が細胞凝集体をともなって過剰に増殖する場合、細胞がＲＮＡレベルで心臓マーカーを発現することを実証する。このデーターは、約５０〜約６０％の割合で細胞レベルおよび分子レベルで細胞が心臓形成マーカーを発現することを示す。
【０２３１】
研究例
月経流出物サンプルの収集の代替方法の結果を解析する研究を実行した。この研究は、収集カップおよび抗生物質含有およびあるいは不含有の収集培地を使用する月経流出物収集方法に従って収集された月経血幹細胞の全有核細胞カウントおよび細胞生存率の決定に注目した。この研究は、月経流出物サンプルが氷上でまたはあるいは室温で輸送された場合、収集後約４時間〜約１１２時間の間の処理施設の到着後の月経流出物サンプルの温度にもまた注目した。収集され、研究に従って解析された全月経流出物サンプルは１６１あった。以下のように、全月経流出物サンプルを処理した。（ａ）４６の月経流出物サンプルは、すべて本発明に従って、収集器具を使用して収集し、抗生物質を含む収集培地中に置き、氷上で輸送した、（ｂ）３４の月経流出物サンプルは、すべて本発明に従って、収集器具を使用して収集し、抗生物質不含有収集培地中に置き、室温で発送した、および（ｃ）８１の月経流出物サンプルは、すべて本発明に従って、収集器具を使用して収集し、抗生物質不含有収集培地中に置き、氷上で輸送した。
【０２３２】
処理施設への到着と同時に各サンプルを解析して、到着での温度および全月経流出物サンプル体積を評価した。血球計数器を使用する全有核細胞カウントおよびトリパンブルー排除色素による細胞生存率を、処理後に評価した。各サンプルは、全有核細胞カウントの評価および細胞生存率分析の前に、ステージ１処理ならびに任意で汚染除去プロセスおよびステージ２処理を行なった。図４０において示されるように、すべてのサンプルについて評価した平均細胞カウントは約７９０万細胞であった。生存率の範囲は、１つのサンプルあたり約６％〜約１００％であった。図４１において示されるように、トリパンブルー色素排除によって決定される収集されたすべてのサンプルについての平均細胞生存率は約７４％だった。月経流出物サンプルの到着時に測定された温度は、研究で解析されたすべてのサンプルについて約５．８℃〜約２５℃にわたった。図４２において示されるように、月経流出物サンプル到着時に測定された平均温度は約１５℃であった。収集培地中の月経流出物サンプルの全体積は、約５ｍｌ〜約３０ｍｌにわたった。図４３において示されるように、収集培地中の月経流出物サンプルの平均体積は約１１ｍｌであった。
【０２３３】
収集器具を使用して収集し、抗生物質を含む収集培地中に置き、氷上で輸送した４６の月経流出物サンプルもまた評価した。月経流出物サンプルは、約６．６℃〜約１６．９℃にわたる温度で処理施設に到着し、このグループについての到着に際しての平均温度は約１０．５℃であった。このグループにおける月経流出物サンプルは、サンプル収集後の約４時間〜約１１２時間の間で処理施設に到着し、このグループについての平均時間は約４７．９時間であった。収集培地中の月経流出物を含む月経流出物サンプル体積は、約５ｍｌ〜約３０ｍｌにわたり、このグループについては平均１１．５ｍｌであった。このグループについての細胞生存率は処理後サンプルで評価し、約６％〜約１００％の生存率にわたり、平均約７２％の生存率であった。３つのサンプルのみが５０％未満の生存率であると評価された。このグループについての全有核細胞カウントは処理後サンプルで評価し、約２０万細胞〜約９２４万細胞にわたり、平均約９２４万細胞であった。処理後の月経血細胞を本発明の凍結保存方法に従って凍結保存し、次に細胞生存率および全有核細胞カウントの追加の評価のための調製において解凍した。培養された解凍サンプルにおいて、トリパンブルーによって評価した細胞生存率は約６０％〜約１００％の範囲の生存率を示した。解凍したサンプルにおいて、全有核細胞カウントは約１０万細胞〜約１３００万細胞間にわたり、平均約３２４万細胞であった。
【０２３４】
収集器具を使用して収集し、抗生物質不含有収集培地中に置き、室温で輸送した３４の月経流出物サンプルもまた評価した。月経流出物サンプルは、約２１℃〜約２５℃にわたる温度で処理施設で到着し、このグループについての到着に際しての平均温度は約２２．８℃であった。このグループにおける月経流出物サンプルは、サンプル収集後の約７時間〜約９４時間の間で処理施設に到着し、このグループについての平均時間は約３７時間であった。収集培地中の月経流出物を含む月経流出物サンプル体積は、約７．４ｍｌ〜約１７．５ｍｌにわたり、このグループについては平均１０．８ｍｌであった。このグループについての細胞生存率は処理後サンプルで評価し、約１２％〜約１００％の生存率にわたり、平均約８０％の生存率であった。このグループについての全有核細胞カウントは処理後サンプルで評価し、約３０万細胞〜約５０００万細胞にわたり、平均約１１６０万細胞であった。処理後の月経血細胞を本発明の凍結保存方法に従って凍結保存し、次に細胞生存率および全有核細胞カウントの追加の評価のための調製において解凍した。解凍したサンプルにおいて、トリパンブルーによって評価した細胞生存率は約３７％〜約１００％の範囲の生存率を示した。解凍されたサンプルにおいて、全有核細胞カウントは約１０万細胞〜約５９０万細胞間にわたり、平均約１６２万細胞であった。
【０２３５】
収集器具を使用して収集し、抗生物質不含有収集培地中に置き、氷上で輸送した８１の月経流出物サンプルもまた評価した。月経流出物サンプルは、約５．８℃〜約２５．８℃にわたる温度で処理施設で到着し、このグループについての到着に際しての平均温度は約１５．５℃であった。このグループにおける月経流出物サンプルは、サンプル収集後の約２．５時間〜約１６４時間の間で処理施設で到着し、このグループについての平均時間は約５４．６時間であった。収集培地中の月経流出物を含む月経流出物サンプル体積は、約５．１ｍｌ〜約２１．５ｍｌにわたり、このグループについては平均１０．８ｍｌであった。このグループについての細胞生存率は処理後サンプルで評価し、約１０％〜約１００％の生存率にわたり、平均約７３％の生存率であった。グループについての全有核細胞カウントは処理後サンプルで評価し、約１０万細胞〜約４２００万細胞にわたり、平均約５８４万細胞であった。処理後の月経血細胞を本発明の凍結保存方法に従って凍結保存し、次に細胞生存率および全有核細胞カウントの追加の評価のための調製において解凍した。解凍したサンプルにおいて、トリパンブルーによって評価した細胞生存率は約４５％〜約１００％の範囲の生存率を示した。解凍したサンプルにおいて、全有核細胞カウントは約１０万細胞〜約４８３０万の細胞間にわたり、平均約８４５万細胞であった。
【０２３６】
月経血幹細胞クローン
月経流出物サンプルは本発明の収集方法に従って４人の異なるドナーから収集し、ＭＳＣクローンを月経流出物サンプルから生じさせた。
【０２３７】
月経血幹細胞クローン−Ｍ２−０１４−０２
本発明の実行に従って、いくつかの異なる月経血幹細胞クローンを得た。特に、Ｍ２−０１４−０２として本明細書において呼ばれて参照される約３０ｍｌの月経流出物サンプルを収集した。月経流出物および収集培地を含んだ月経流出物サンプルは月経周期の間にドナーによって収集された。滅菌された収集器具を石鹸および水により洗浄し、月経流出物のサンプルを収集するのに十分な時間の間ドナーの膣内に置いた。収集培地は、カルシウム、マグネシウムまたはフェノールレッド不含有ＤＰＢＳ（メディアテック社）、ＤＰＢＳ培地１ミリリットルあたり約１００単位のペニシリン、ＤＰＢＳ培地１ミリリットルあたり約１００マイクログラムのストレプトマイシン、およびＤＰＢＳ培地１ミリリットルあたり約１０単位〜約２０単位の範囲の防腐剤不含有ヘパリンを含んでいた。月経流出物サンプルおよび収集培地を、収集チューブ中にシールし、収集容器中で氷の上にパックし、発送して処理施設に輸送した。
【０２３８】
収集から約１７時間後、収集培地中の約３０ｍｌの月経流出物サンプルに、月経血幹細胞を単離し収集する処理を行なった。月経流出物サンプルは約１０℃で処理施設に到着した。月経流出物サンプルおよび抗生物質含有収集培地を、処理施設への到着と同時に消毒し、クリーンルームへと移し、氷上に置いた。収集容器を約１８℃の温度で約７分間約２０００ｒｐｍで遠心分離し、次に消毒した。約５ｍｌの上清のサンプルを吸引し、２本のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ血液培養ボトル（好気培養ボトルの中へ約４ｍｌおよび嫌気培養ボトルの中へ約１ｍｌ）を接種のために使用した。培養ボトルを、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴシステムにおいて約３７℃で約１４日間インキュベートした。結果は、好気性微生物および嫌気性微生物について陰性であった。
【０２３９】
残りの上清を吸引して廃棄した。沈殿を約２ｍｌのＤＰＢＳ中に懸濁した。約１ｍｌの細胞懸濁を処理後サンプルとして収集し、細胞カウント、フロー分析および生存率のために解析した。血球計数器を使用して実行された全細胞カウントは、約４１００万細胞が処理後サンプル中に収集されることを示した。収集された細胞は、凍結保存の前に約７５％の生存率を示した。
【０２４０】
凍結保存した月経血幹細胞を解凍し、トリプシン処理し、培養した。培養の前に、解凍後月経血幹細胞を解析した。解凍後サンプルの全細胞カウントは、約７００万の月経血細胞が約６６％の生存率で存在することを示した。
【０２４１】
培養の前に、細胞は、２０％のチャン培地による２工程希釈で、１ｍｌあたり約２．５細胞、１ｍｌあたり約５．０細胞、１ｍｌあたり約１０．０細胞、および１ｍｌあたり約１５．０細胞に希釈する。約０．２ｍｌの各希釈を９６ウェルプレート中の８４ウェルに個別に追加し、残りの１２ウェルはプレートを湿らすためにＤＰＢＳで満たす。１ｍｌあたり約２．５細胞の希釈は１ウェルあたり０．５細胞のプレートを産生する。１ｍｌあたり約５．０細胞の希釈は１ウェルあたり１．０細胞のプレートを産生する。１ｍｌあたり約１０．０細胞は１ウェルあたり２細胞のプレートを産生する。１ｍｌあたり約１５．０細胞の希釈は１ウェルあたり３細胞のプレートを産生する。ウェルは単一細胞について倒立顕微鏡下で検査する。培地は、４日〜６日ごとに新鮮な２０％のチャン培地と交換した。単一細胞を有するウェルを５０％コンフルエンシーまで増殖させ、この時点で細胞をトリプシン処理し、Ｔ−２５フラスコ中に２０％のチャン培地により細胞を播種する。特定の細胞を本発明の方法に従う細胞培養のためにウェルから取り出した。
【０２４２】
細胞培養の前に、６つの月経血幹細胞クローンをプレートから収集し、各クローンを細胞表面特性について本明細書において開示された方法に従うフローサイトメトリーによって解析した。各クローンの細胞表面特性の要約を表Ｆにおいて示す。
【０２４３】
【表６】
2010530214.tif 000009
【０２４４】
月経血幹細胞クローン−Ｍ２−０１５−０３
本発明の実行に従って、いくつかの異なる月経血幹細胞クローンを得た。特に、Ｍ２−０１５−０３として本明細書において呼ばれて参照される約３０ｍｌの月経流出物サンプルを収集した。月経流出物および収集培地を含んだ月経流出物サンプルは月経周期の間にドナーによって収集された。滅菌された収集器具を石鹸および水により洗浄し、月経流出物のサンプルを収集するのに十分な時間の間ドナーの膣内に置いた。収集培地は、カルシウム、マグネシウムまたはフェノールレッド不含有ダルベッコリン酸緩衝液生理食塩水（ＤＰＢＳ）（メディアテック社）、ＤＰＢＳ培地１ミリリットルあたり約１００単位のペニシリン、ＤＰＢＳ培地１ミリリットルあたり約１００マイクログラムのストレプトマイシン、およびＤＰＢＳ培地１ミリリットルあたり約１０単位〜約２０単位の範囲の防腐剤不含有ヘパリンを含んでいた。月経流出物サンプルおよび収集培地を、収集チューブ中にシールし、収集容器中で氷の上にパックし、発送して処理施設に輸送した。
【０２４５】
収集から約６時間後、収集培地中の約２３ｍｌの月経流出物サンプルに、月経血幹細胞を単離し収集する処理を行なった。月経流出物サンプルは約１０℃で処理施設に到着した。月経流出物サンプルおよび抗生物質含有収集培地を、処理施設への到着と同時に消毒し、クリーンルームへと移し、氷上に置いた。収集容器を約１８℃の温度で約７分間約２０００ｒｐｍで遠心分離し、次に消毒した。約５ｍｌの上清のサンプルを吸引し、２本のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ血液培養ボトル（好気培養ボトルの中へ約４ｍｌおよび嫌気培養ボトルの中へ約１ｍｌ）を接種のために使用した。培養ボトルを、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴシステムにおいて約３７℃で約１４日間インキュベートした。結果は、好気性微生物および嫌気性微生物について陰性であった。
【０２４６】
残りの上清を吸引して廃棄した。沈殿を約２ｍｌのＤＰＢＳ中に懸濁した。約１ｍｌの細胞懸濁を処理後サンプルとして収集し、細胞カウント、フロー分析および生存率のために解析した。血球計数器を使用して実行された全細胞カウントは、約１００万細胞が処理後サンプル中に収集されることを示した。収集された細胞は、凍結保存の前に約１８％の生存率を示した。
【０２４７】
凍結保存した月経血幹細胞を解凍し、トリプシン処理し、培養した。培養の前に、解凍後月経血幹細胞を解析した。解凍後サンプルの全細胞カウントは、約３０万の月経血細胞が約６０％の生存率で存在することを示した。
【０２４８】
培養の前に、細胞は、２０％のチャン培地により処理する２工程希釈で、１ｍｌあたり約２．５細胞、１ｍｌあたり約５．０細胞、１ｍｌあたり約１０．０細胞、および１ｍｌあたり約１５．０細胞に希釈する。約０．２ｍｌの各希釈を９６ウェルプレート中の８４ウェルに個別に追加し、残りの１２ウェルはプレートを湿らすためにＤＰＢＳで満たす。１ｍｌあたり約２．５細胞の希釈は１ウェルあたり０．５細胞のプレートを産生する。１ｍｌあたり約５．０細胞の希釈は１ウェルあたり１．０細胞のプレートを産生する。１ｍｌあたり約１０．０細胞は１ウェルあたり２細胞のプレートを産生する。１ｍｌあたり約１５．０細胞の希釈は１ウェルあたり３細胞のプレートを産生する。ウェルは単一細胞について倒立顕微鏡下で検査する。培地は、４〜６日ごとに新鮮な２０％のチャン培地と交換した。単一細胞を有するウェルを５０％コンフルエンシーまで増殖させ、この時点で細胞をトリプシン処理し、Ｔ−２５フラスコ中に２０％のチャン培地により細胞を播種する。特定の細胞を本発明の方法に従う細胞培養のためにウェルから取り出した。
【０２４９】
継代２で、２つの月経血幹細胞クローンをプレートから収集し培養した。各クローンを、細胞表面特性について本明細書において開示された方法に従うフローサイトメトリーによって解析した。各クローンの細胞表面特性の要約を表Ｇにおいて示す。
【０２５０】
【表７】
2010530214.tif 000010
【０２５１】
月経血幹細胞クローン−Ｍ２−０１７−０３
本発明の実行に従って、いくつかの異なる月経血幹細胞クローンを得た。特に、Ｍ２−０１５−０３として本明細書において呼ばれて参照される約３０ｍｌ月経流出物サンプルを収集した。月経流出物および収集培地を含んだ月経流出物サンプルは月経周期の間にドナーによって収集された。滅菌された収集器具を石鹸および水により洗浄し、月経流出物のサンプルを収集するのに十分な時間の間ドナーの膣内に置いた。収集培地は、カルシウム、マグネシウムまたはフェノールレッド不含有ＤＰＢＳ（メディアテック社）、およびＤＰＢＳ培地１ミリリットルあたり約１０単位〜約２０単位の範囲の防腐剤不含有ヘパリンを含んでいた。月経流出物サンプルおよび収集培地を、収集チューブ中にシールし、氷なしで発送して処理施設に輸送した。
【０２５２】
収集から約２８時間後、収集培地中の約８ｍｌの月経流出物サンプルに、月経血幹細胞を単離し収集する処理を行なった。月経流出物サンプルは約２３℃で処理施設に到着した。月経流出物サンプルおよび抗生物質含有収集培地を、処理施設への到着と同時に消毒し、クリーンルームへと移し、氷上に置いた。収集容器を約１８℃の温度で約７分間約２０００ｒｐｍで遠心分離し、次に消毒した。約５ｍｌの上清のサンプルを吸引し、２本のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ血液培養ボトル（好気培養ボトルの中へ約４ｍｌおよび嫌気培養ボトルの中へ約１ｍｌ）を接種のために使用した。培養ボトルを、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴシステムにおいて約３７℃で約１４日間インキュベートした。結果は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）による汚染を示す。
【０２５３】
残りの上清を吸引して廃棄した。沈殿を約２ｍｌのＤＰＢＳ中に懸濁した。約１ｍｌの細胞懸濁を処理後サンプルとして収集し、細胞カウント、フロー分析および生存率のために解析した。血球計数器を使用して実行された全細胞カウントは、約８０万細胞が処理後サンプル中に収集されることを示した。収集された細胞は、凍結保存の前に約８７％の生存率を示した。
【０２５４】
凍結保存した月経血幹細胞を解凍し、トリプシン処理し、培養した。培養の前に、解凍後月経血幹細胞を解析した。解凍後サンプルの全細胞カウント、約２０万の月経血細胞が約６３％の生存率で存在することを示した。
【０２５５】
培養の前に、細胞は、２０％のチャン培地による２工程希釈で、１ｍｌあたり約２．５細胞、１ｍｌあたり約５．０細胞、１ｍｌあたり約１０．０細胞、および１ｍｌあたり約１５．０細胞に希釈する。約０．２ｍｌの各希釈を９６ウェルプレート中の８４ウェルに個別に追加し、残りの１２ウェルはプレートを湿らすためにＤＰＢＳで満たす。１ｍｌあたり約２．５細胞の希釈は１ウェルあたり０．５細胞のプレートを産生する。１ｍｌあたり約５．０細胞の希釈は１ウェルあたり１．０細胞のプレートを産生する。１ｍｌあたり約１０．０細胞は１ウェルあたり２細胞のプレートを産生する。１ｍｌあたり約１５．０細胞の希釈は１ウェルあたり３細胞のプレートを産生する。ウェルは単一細胞について倒立顕微鏡下で検査する。培地は、４日〜６日ごとに新鮮な２０％のチャン培地と交換した。単一細胞を有するウェルを５０％コンフルエンシーまで増殖させ、この時点で細胞をトリプシン処理し、Ｔ−２５フラスコ中に２０％のチャン培地により細胞を播種する。特定の細胞を本発明の方法に従う細胞培養のためにウェルから取り出した。
【０２５６】
第１の継代までの培養の間に、アンフォテリシンＢは培養培地にペニシリン／ストレプトマイシンと共に含まれていた。継代３では、培養における各クローンを、細胞表面特性について本明細書において開示された方法に従うフローサイトメトリーによって解析した。各クローンの細胞表面特性の要約を表Ｈにおいて示す。
【０２５７】
【表８】
2010530214.tif 000011
【０２５８】
月経血幹細胞クローン−Ｍ２−５４−０２
本発明の実行に従って、いくつかの異なる月経血幹細胞クローンを得た。特に、Ｍ２−５４−０２として本明細書において呼ばれて参照される約１２ｍｌの月経流出物サンプルを収集した。月経流出物および収集培地を含んだ月経流出物サンプルは月経周期の間にドナーによって収集された。滅菌された収集器具を石鹸および水により洗浄し、月経流出物のサンプルを収集するのに十分な時間の間ドナーの膣内に置いた。収集培地は、カルシウム、マグネシウムまたはフェノールレッド不含有ＤＰＢＳ（メディアテック社）、およびＤＰＢＳ培地１ミリリットルあたり約１０単位〜約２０単位の範囲の防腐剤不含有ヘパリンを含んでいた。月経流出物サンプルおよび収集培地を、収集チューブ中にシールし、収集容器中で氷の上にパックし、発送して処理施設に輸送した。
【０２５９】
収集から約７３時間後、収集培地中の約１２ｍｌの月経流出物サンプルに、月経血幹細胞を単離し収集する処理を行なった。月経流出物サンプルは約２０℃で処理施設に到着した。月経流出物サンプルおよび抗生物質含有収集培地を、処理施設への到着と同時に消毒し、クリーンルームへと移し、氷上に置いた。収集容器を約１８℃の温度で約７分間約２０００ｒｐｍで遠心分離し、次に消毒した。約５ｍｌの上清のサンプルを吸引し、２本のＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ血液培養ボトル（好気培養ボトルの中へ約４ｍｌおよび嫌気培養ボトルの中へ約１ｍｌ）を接種のために使用した。培養ボトルを、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴシステムにおいて約３７℃で約１４日間インキュベートした。結果は、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）による汚染を示した。
【０２６０】
残りの上清を吸引して廃棄した。沈殿を約２ｍｌのＤＰＢＳ中に懸濁した。約１ｍｌの細胞懸濁を処理後サンプルとして収集し、細胞カウント、フロー分析および生存率のために解析した。血球計数器を使用して実行された全細胞カウントは、約８０万細胞が処理後サンプル中に収集されることを示した。収集された細胞は、凍結保存の前に約７２％の生存率を示した。
【０２６１】
凍結保存した月経血幹細胞を解凍し、トリプシン処理し、培養した。培養の前に、解凍後月経血幹細胞を解析した。解凍後サンプルの全細胞カウントは、約２１００万の月経血細胞が約９２％の生存率で存在することを示した。
【０２６２】
培養の前に、細胞は、２０％のチャン培地による２工程希釈で、１ｍｌあたり約２．５細胞、１ｍｌあたり約５．０細胞、１ｍｌあたり約１０．０細胞、および１ｍｌあたり約１５．０細胞に希釈する。約０．２ｍｌの各希釈を９６ウェルプレート中の８４ウェルに個別に追加し、残りの１２ウェルはプレートを湿らすためにＤＰＢＳで満たす。１ｍｌあたり約２．５細胞の希釈は１ウェルあたり０．５細胞のプレートを産生する。１ｍｌあたり約５．０細胞の希釈は１ウェルあたり１．０細胞のプレートを産生する。１ｍｌあたり約１０．０細胞は１ウェルあたり２細胞のプレートを産生する。１ｍｌあたり約１５．０細胞の希釈は１ウェルあたり３細胞のプレートを産生する。ウェルは単一細胞について倒立顕微鏡下で検査する。培地は、４〜６日ごとに新鮮な２０％のチャン培地と交換した。単一細胞を有するウェルを５０％コンフルエンシーまで増殖させ、この時点で細胞をトリプシン処理し、Ｔ−２５フラスコ中に２０％のチャン培地により細胞を播種する。特定の細胞を本発明の方法に従う細胞培養のためにウェルから取り出した。
【０２６３】
培養の前に、１つの月経血幹細胞クローンを培養から収集し、細胞表面特性について本明細書において開示された方法に従うフローサイトメトリーによって解析した。各クローンの細胞表面特性の要約を表Ｉにおいて示す。
【０２６４】
【表９】
2010530214.tif 000012
【０２６５】
治療用使用
本発明の月経血幹細胞は、適切な細胞培地または薬学的に許容される賦形剤と共に細胞を組み合わせることによって調製されていてもよい。例えば、本発明の月経血幹細胞は、ＧＭＰ（医薬品最適製造基準）に従う注入または移植のために調製できる。適切な培地または希釈剤は、月経血幹細胞の保持に適切なｐＨを維持するヘペスバッファーを必要とするＨＢＳＳ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、アルファＭＥＭ、Ｍ１９９およびＤＭＥＭのような組織培養培地（分析証明書で立証される適切な試験および結果を含む）を含みうる。タンパク質を最小約０．２％で追加できるが、最高で約３０％追加できる。使用されるタンパク質は、ヒト血清アルブミン、ヒト血漿タンパク質画分、ウシ胎仔血清（畜産物を使用する場合、米国食品医薬品局によって必要に応じて適切な安全性試験を含まなくてはならない）、またはウシ血清アルブミンもまた含むことができる。細胞が、凝固、クランピングまたは血餅のリスクがある場合、培地は抗凝血剤を必要としうる。ヘパリン（防腐剤が幹細胞増殖および細胞の増殖能力に影響する可能性があるので、防腐剤不含有が好ましい）、酸性クエン酸デキストロースまたはクエン酸リン酸デキストロース、または生存細胞と組み合わせるのに安全な任意の適切な抗凝血剤を含む、抗凝血剤を使用できる。細胞は、細胞を増やす細胞培地が注入または移植のために安全である限り、その培地中で送ることができる。
【０２６６】
例えば、製品を病院において調製し、病院において投与する場合、近距離のために細胞をシリンジ中で送ることができる。他の場合には、製品は、ガス交換を含むか、または含まない滅菌済みバッグ中で輸送できる。近距離で発送する製品は、細胞が近距離のために耐性があり生存できる他のタイプの滅菌済み容器中でも輸送でき、それは滅菌済みコニカルチューブ、または円形または正方形の滅菌済み平面底容器を含みうる。製品が４時間以上の長い距離で発送される場合、ガス交換が可能なバッグ中で送ることができる。バッグは、空気交換を可能にする立体配置においてもまた発送されてもよい。製品バッグは、発送される容器中での適切なガス交換を可能にするためのラックに置くことができる。細胞を含む容器は、月経血幹細胞を維持するような適温に最適化できる。細胞が低温の環境を必要とする場合、氷パックまたは他の冷却器具を使用できる。細胞が約２０℃〜約２４℃の室温を必要とする場合、この温度を維持するためにゲルパックが必要となりうる。
【０２６７】
一旦細胞が注入または移植のために施設に到着したなら、モニタリングされた温度環境に細胞を置くことができる。後日の使用のために保存する細胞は、温度を維持する断熱容器中に凍結保存し、−１５０℃またはそれ以下で発送できる。凍結保存されて出荷した細胞は、解凍および注入の説明書、ならびに可能ならば治療用使用のために最適な生存細胞製品の維持に必要な培地と共に送ることができる。
【０２６８】
適切な輸送機構を、注入場所に製品を輸送するために使用するべきである。多数の異なるタイプの輸送サービス、例えば医療国際宅配便、国際宅配便、またはＵＰＳ、ＤＨＬもしくはフェデックスのような会社などを使用できる。ドライシッパーが移動期間の間は垂直のままでなくてはならないという事実のような、製品の必要性を、宅配便業者が理解している場合、培地中の月経血幹細胞はより高い安全性で輸送できる。シッパーを側面に置く場合、迅速に液体窒素のチャージが失われ、有効な温度を保持することができない。
【０２６９】
薬用化粧品用適用
用語の薬用化粧品は、（ａ）少なくとも１つの製品の使用者に対する効果を有する生物学的活性成分と、（ｂ）少なくとも１つの薬用化粧品用に許容される担体とを含む製剤形態または組成に関して使用される。生物学的活性成分は、例えば、本発明の実行に従って収集されたＭＳＣ、または本発明のＭＳＣ、遺伝子操作したＭＳＣもしくは分化したＭＳＣによって産生された、増殖因子もしくは他の組成物、化学物質もしくはタンパク質でありえる。さらなる実施例によって、例えば、増殖因子、または薬用化粧品として使用可能な他の生物学的活性成分のような、所望される細胞生産物を産生するように、ＭＳＣ、分化したＭＳＣ、または遺伝子操作したＭＳＣを培養において増殖させることができる。増殖因子または他の生物学的活性成分は、ＭＳＣ、分化したＭＳＣ、または遺伝子操作したＭＳＣが増殖される細胞培養培地または他の培地から収集できる。上清（それは後に精製するために処理するか、または成分を凝縮する）中の所望される成分を収集するために、増殖因子または他の生物学的活性成分を、遠心分離工程によって細胞培養培地または他の培地から収集できる。
【０２７０】
薬用化粧品は、特定の適用において、および適切な条件下で、薬効または薬物様有効性を提供できる化粧品として見なすことができる。特定の適用において、例えば、薬用化粧品は、皮膚の下層にある構造に影響を与えるか、しわの深さを減少させるか、または皮膚の光酸化または加齢の影響を回復もしくは改善できる。薬用化粧品は、スキンケア製品、ヘアケア製品、組織または器官の修飾または増大、およびサンケア製品として特に有用でありうる。特定の実施形態において、薬用化粧品用組成物は、リポソーム、シクロデキストリン、ポリマー系、またはヒアルロン酸もしくは関連化合物の少なくとも１つを含む送達システムを含む。薬用化粧品用組成物は、薬用化粧品用に許容される担体を含む。局所適用のために適切な薬学的に許容される担体または製剤形態は、典型的には薬用化粧品用に許容される担体または製剤形態でもありえる。
【０２７１】
局所用の化粧品または薬用化粧品用の軟膏、ローションまたはゲル組成物は、典型的には、薬学的クリームベース、水中油滴型エマルジョン、油中水滴型エマルジョン、ゲルまたは同種のもののような、化粧品用に許容される担体または薬用化粧品用に許容される担体中に、約１〜９９％、約５〜９５％、約２０〜７５％、または約５〜２０％の濃度で、馴化培地またはその抽出物を含む活性成分を含む。局所用の使用のための様々な化粧品用および薬用化粧品用の組成物は、馴化培地または抽出物および適切な担体を含むドロップ、チンキ、ローション、クリーム、膏薬、血清、溶液および軟膏を含んでいる。各組成物中の馴化培地または抽出物の至適パーセンテージは、組成物の製剤形態および所望される治療効果に従って変化する。
【０２７２】
薬用化粧品は、製品のタイプ、組成物の性質、組成物の使用の場所、所望される効果および同種のものに依存して、多数の化粧品用に許容される製剤形態、薬用化粧品用に許容される製剤形態、または薬学的に許容される製剤形態のいずれかを含みうる。特許製剤形態は製剤形態技術中で一般的であるが、製剤化を行なう者は不必要な実験なしに、具体的適用のために適切な製剤形態を決定するか、または容易に選択することができる。
【０２７３】
発明の組成物の適切な担体は、典型的には化粧品分野および薬用化粧品分野において典型的には見出される、油脂、ワックスもしくは他の標準的な脂肪性物質、または従来のゲル化剤および／もしくは増粘剤；乳化剤；保湿剤；皮膚軟化剤；日焼け止め；セラミドのような親水性もしくは疎水性の活性薬剤；フリーラジカルと闘うための薬剤；殺菌剤；金属イオン封鎖剤；防腐剤；塩基性化剤もしくは酸性化剤；香料；界面活性剤；増量剤；アロエもしくは緑茶抽出物のような、天然産物もしくは天然産物の抽出物；ビタミン類；または着色材のような成分を含む。これらの様々な成分の量は、組成物の使用および所望される化粧品または薬用化粧品の効果に依存して変化する。
【０２７４】
化粧品用および薬用化粧品用に許容される成分および製剤形態の考察は、他のところ、ＦＤＡ化粧品ハンドブック（ＦＤＡ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、アメリカ食品薬品局；化粧品およびパーソナルケアの添加剤のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃａｒｅ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）、ＡｓｈおよびＡｓｈ編、１９９４年、ケミカル・パブリッシング（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）社、ニューヨーク、ニューヨーク；ベネットの化粧品処方集（Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ）、１９９３年、ケミカル・パブリッシング社；ハリーの化粧品学（Ｈａｒｒｙ’ｓ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｏｌｏｇｙ）第７版、ＷｉｌｋｉｎｓｏｎおよびＭｏｏｒｅ、１９８２年および第８版、Ｒｉｅｇｅｒ、２０００年、ケミカル・パブリッシング社；化粧品のための作業台での参考書（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｂｅｎｃｈ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）、２００１年、アレルッド・パブリッシング（Ａｌｌｅｒｕｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）社；ＣＴＦＡ化粧品成分組成物の大要（Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）、ＮｉｋｉｔａｋｉｓおよびＭｃＥｗｅｎ編、１９９０年、トイレ化粧品・香料工業協会、ワシントンＤ．Ｃ．、界面活性剤事典、改訂第２版、Ｒｉｅｇｅｒ、１９９６年、アルレッド・パブリッシング（Ａｌｌｕｒｅｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）社；化粧品の化学および製造（Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ）、第２版、Ｄｅ  Ｎａｖａｒｒｅ、ヴァン・ノストランド（Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ）社、プリンストン、ニュージャージー；食物、薬物および化粧品において使用される一般的な天然成分の事典（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ，  Ｄｒｕｇｓ，  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ）、Ｌｅｕｎｇ、１９９６年、ジョン・ワイリー（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ）社；消費者のための化粧品成分の辞典（Ａ  Ｃｏｎｓｕｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）、第５版、Ｗｉｎｔｅｒ、１９９９年、スリー・リバーズ・プレス（Ｔｈｒｅｅ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｐｒｅｓｓ）社、ニューヨーク、ニューヨーク；薬用化粧品：積極的なスキントリートメント（Ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｋｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、１９９８年、アルレッド・パブリッシング社；化粧品科学および技術のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＫｎｏｗｌｔｏｎおよびＰｅａｒｃｅ、１９９３年、エルゼビア・アドバンスト・テクノロジー（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、オックスフォード、イギリス；パーソナルケアの処方（Ｐｅｒｓｏｎａｌ−Ｃａｒｅ  Ｆｏｒｍｕｌａｓ）、１９９７年、アルレッド・パブリッシング社；化粧品化学の初歩（Ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ＳｃｈｅｕｌｌｅｒおよびＲｏｍａｎｏｗｓｋｉ（１９９９年）、アルレッド・パブリッシング社；ならびに皮膚浸透：基礎および適用（Ｓｋｉｎ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、Ｚａｔｚ、１９９３年、アルレッド・パブリッシング社の中に見出すことができる。薬学的に許容される成分および製剤形態の考察は、他のところ、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９０年、マック・パブリッシング（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）社の中に見出すことができる。
【０２７５】
定義
【０２７６】
本明細書において使用されるように、かかる用語が使用される文脈が特に示唆しなければ、以下の用語は以下の定義を示すものとする。
【０２７７】
ＤＭＥＭはダルベッコの最小必須培地を意味する。
【０２７８】
ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを意味する。
【０２７９】
ＤＮＡｓｅは、非生存細胞が溶解した後に見出されるＤＮＡを破壊するために使用されるデオキシリボヌクレアーゼを意味する。
【０２８０】
ＤＰＢＳはダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を意味する。
【０２８１】
ＨＢＳＳはハンクス平衡塩類溶液を意味する。
【０２８２】
ヘパリンは、抗凝血剤特性を有するグリコサミノグリカンである。
【０２８３】
ＨＳＡは、輸送体タンパク質として作用することができる多量の血漿タンパク質であるヒト血清アルブミンを意味する。
【０２８４】
ＬＳＭは、密度勾配細胞分離を実行するために使用されるリンパ球分離培地を意味する。
【０２８５】
μｇはマイクログラムを意味する。
【０２８６】
μｌ、μＬ、ｕｌおよびｕＬは、マイクロリットルを意味するように同義的に使用される。
【０２８７】
ｍｌおよびｍＬは、ミリリットルを意味するように同義的に使用される。
【０２８８】
×は、すなわち濃度または希釈によって掛けることを意味する。
【０２８９】
本明細書において参照された具体的な試薬および製品および製造者の代わりに、他の適切な代わりの試薬、製品および製造者を使用することができる。
【０２９０】
その幅広い発明の概念から逸脱せずに、上述された実施形態に対して修飾を行なうことができる。本発明の好ましい実施形態、追加の実施形態、適応、変形、修飾および同等のアレンジについて記述したことは、当業者に対して明らかである。これらおよび他の実施形態は、添付された請求項の範囲内であることが理解される。
【図１】
2010530214.tif 000013
【図２】
2010530214.tif 000014
【図３】
2010530214.tif 000015
【図４】
2010530214.tif 000016
【図５】
2010530214.tif 000017
【図６】
2010530214.tif 000018
【図７】
2010530214.tif 000019
【図８】
2010530214.tif 000020
【図９】
2010530214.tif 000021
【図１０】
2010530214.tif 000022
【図１１】
2010530214.tif 000023
【図１２】
2010530214.tif 000024
【図１３】
2010530214.tif 000025
【図１４】
2010530214.tif 000026
【図１５】
2010530214.tif 000027
【図１６】
2010530214.tif 000028
【図１７】
2010530214.tif 000029
【図１８】
2010530214.tif 000030
【図１９】
2010530214.tif 000031
【図２０】
2010530214.tif 000032
【図２１】
2010530214.tif 000033
【図２２】
2010530214.tif 000034
【図２３】
2010530214.tif 000035
【図２４】
2010530214.tif 000036
【図２５】
2010530214.tif 000037
【図２６】
2010530214.tif 000038
【図２７】
2010530214.tif 000039
【図２８】
2010530214.tif 000040
【図２９ａ】
2010530214.tif 000041
【図２９ｂ】
2010530214.tif 000042
【図２９ｃ−２９ｆ】
2010530214.tif 000043
【図２９ｇ−２９ｊ】
2010530214.tif 000044
【図３０ａ−３０ｄ】
2010530214.tif 000045
【図３０ｅ】
2010530214.tif 000046
【図３１ａ−３１ｅ】
2010530214.tif 000047
【図３１ｆ−３１ｊ】
2010530214.tif 000048
【図３１ｋ−３１ｎ】
2010530214.tif 000049
【図３１ｏ−３１ｓ】
2010530214.tif 000050
【図３１ｔ−３１ｘ】
2010530214.tif 000051
【図３１ｙ−３１ｃｃ】
2010530214.tif 000052
【図３２ａ−３２ｅ】
2010530214.tif 000053
【図３２ｆ−３２ｊ】
2010530214.tif 000054
【図３２ｋ−３２ｎ】
2010530214.tif 000055
【図３２ｏ−３２ｓ】
2010530214.tif 000056
【図３２ｔ−３２ｘ】
2010530214.tif 000057
【図３２ｙ−３２ｃｃ】
2010530214.tif 000058
【図３３】
2010530214.tif 000059
【図３４】
2010530214.tif 000060
【図３５】
2010530214.tif 000061
【図３６】
2010530214.tif 000062
【図３７】
2010530214.tif 000063
【図３８】
2010530214.tif 000064
【図３９】
2010530214.tif 000065
【図４０】
2010530214.tif 000066
【図４１】
2010530214.tif 000067
【図４２】
2010530214.tif 000068
【図４３】
2010530214.tif 000069
【図４４】
2010530214.tif 000070
【国際調査報告】
2010530214.tif 000071