(57)【要約】  本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性の調節に関する方法および組成物を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節するために、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質を用いる組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、菌株の組み合わせ、およびスターター培養物のローテーションの開発および利用に役立つ方法および組成物を提供する。付加的な実施形態において、本発明は、バクテリアを標識化および／または同定する方法を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、細胞に対するファージの潜在的な毒性を決定するためにＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を利用する方法、およびファージの遺伝子配列を調節して毒性レベルを増加させるためにＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓを利用する方法を提供する。なおさらなる実施形態において、本発明は、生物的防除剤としてファージを開発および利用する手段および組成物を提供する。【選択図】なし
2010519929.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を生み出す方法であって、
（ａ）改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える、少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を備えるバクテリアの混合物をつくるために、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を備える親バクテリア菌株を少なくとも１つの核酸配列に暴露するステップ；
（ｂ）バクテリアの前記混合物から前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で選択された前記バクテリオファージ耐性菌株から、前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；および
（ｄ）前記少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株であって、前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える前記菌株を単離するステップ
を備える方法。
【請求項２】
前記方法は、前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座にはない少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に備えるバクテリオファージ耐性変異菌株を同定するために、前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分、および前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を比較するステップをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップをさらに備える、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記親バクテリア菌株は、２つまたはそれ以上の核酸配列に暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記親バクテリア菌株は、２つまたはそれ以上の核酸配列に同時に暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記親バクテリア菌株は、２つまたはそれ以上の核酸配列に順次暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記親バクテリア菌株は、前記核酸配列を備える少なくとも１つのバクテリオファージによる感染を通じて、前記核酸配列に暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのバクテリオファージは、コルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科、マイオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科、およびテクティウイルス科からなるウイルス科の群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのバクテリオファージは、自然発生のバクテリオファージである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのバクテリオファージは、バクテリオファージ耐性バクテリアを用いた選択圧を通じて得られる変異バクテリオファージである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記親バクテリア菌株は、核酸を取込む自然のメカニズムを通じて前記核酸に暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
核酸を取込む前記自然のメカニズムは、自然応答能を備える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸を取込む前記自然のメカニズムは、接合または形質転換による親バクテリア菌株、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記バクテリオファージ耐性菌株は、バクテリオファージ非感受性変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記親バクテリア菌株は、バクテリオファージ非感受性変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の前記５’末端および／または前記３’末端が、前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも前記第１のＣＲＩＳＰＲリピートまたは少なくとも前記第１のＣＲＩＳＰＲスペーサーの前記５’および／または前記３’末端が、前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記バクテリオファージ耐性変異菌株は、前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の前記少なくとも一部分、および前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分が、前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分、および前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を増幅し、増幅されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座配列、および増幅された改変ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座配列をつくることによって比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅することは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行なわれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の前記少なくとも一部分、および前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分が、前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分、および前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を配列決定することによって比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記増幅されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座配列、および前記増幅された改変ＣＲＩＳＰＲ配列遺伝子座を配列決定するステップをさらに備える、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における前記付加的な核酸フラグメントは、付加的なリピート−スペーサー・ユニットである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、少なくとも約４４ヌクレオチドを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、約４４から約１１９の間のヌクレオチドを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲリピートに対して少なくとも約９５％の同一性をもつ、少なくとも１つのヌクレオチド配列を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、少なくとも１つのバクテリオファージのゲノムにおけるヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％の同一性をもつ、少なくとも１つのヌクレオチド配列を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記親バクテリア菌株は、工業的に有用な菌株である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記親バクテリア菌株は、少なくとも１つのバクテリオファージによる感染に対し感受性が高い、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記親バクテリア菌株は、スターター培養物、プロバイオティック培養物、およびダイエタリーサプリメント培養物から選択される培養物から得られる菌株を備える、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記親バクテリア菌株は、エシェリキア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルウィニア属、エルシニア属、バチルス属、ビブリオ属、レジオネラ属、シュードモナス属、ナイセリア属、ボルデテラ属、ヘリコバクター属、リステリア属、アグロバクテリウム属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、フランシセラ属、ブルセラ属、カンピロバクター属、クレブシエラ属、フランキア属、バルトネラ属、リケッチア属、シュワネラ属、セラチア属、エンテロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、ブロコトリクス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、およびオエノコッカス属から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の方法を用いて得られる少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株。
【請求項３３】
前記バクテリオファージ耐性変異菌株は、工業的に有用な菌株である、請求項１に記載のバクテリオファージ耐性変異菌株。
【請求項３４】
前記バクテリオファージ耐性変異菌株は、スターター培養物、プロバイオティック培養物およびダイエタリーサプリメント培養物から選択される、請求項１に記載のバクテリオファージ耐性変異菌株。
【請求項３５】
請求項１に記載の方法を用いてつくられたバクテリオファージ耐性変異菌株を備える組成物。
【請求項３６】
請求項１に記載の方法を用いてつくられた少なくとも２つのバクテリオファージ耐性変異菌株を備える組成物。
【請求項３７】
請求項３５または３６に記載の組成物を備える食品または飼料。
【請求項３８】
請求項３５または３６に記載の前記組成物を食品または飼料に加えることを備える、食品または飼料を調製する方法。
【請求項３９】
請求項３５または３６に記載の前記組成物を備える、スターター培養物、プロバイオティック培養物、またはダイエタリーサプリメント培養物。
【請求項４０】
請求項３５または３６に記載の前記組成物をスターター培養物に加えることを備える発酵方法。
【請求項４１】
請求項３５または３６に記載の前記組成物を発酵培地に、前記発酵培地の前記成分の発酵が生じるような条件下で加えることを備える発酵方法。
【請求項４２】
前記発酵は、バクテリオファージの存在によって影響されない、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記発酵培地は食料製品である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記食料製品は乳製品である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記乳製品は乳汁である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
２つまたはそれ以上のバクテリオファージ耐性変異菌株を備える少なくとも２つの異なった組成物が、前記発酵培地に順次暴露される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
発酵培地における前記有害なバクテリオファージの個体数を低減する方法であって、発酵培地を請求項１に記載の方法を用いてつくられた少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株に、前記バクテリオファージの個体数が低減される条件下で暴露することを備える方法。
【請求項４８】
少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を生み出す方法であって、
（ａ）改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を備えるバクテリアの混合物をつくるために、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を備える親バクテリア株を、少なくとも１つの核酸配列に暴露するステップ；
（ｂ）バクテリアの前記混合物から前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；
（ｃ）前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座にはない少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に備えるバクテリオファージ耐性変異株菌株を同定するために、前記親バクテリア菌株の前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分、および前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を比較するステップ；
（ｄ）前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；
（ｅ）前記少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を同定するために、前記改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における前記少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを解析するステップ；および
（ｆ）前記少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を単離するステップ
を備える方法。
【請求項４９】
ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を生み出す方法であって、
（ａ）少なくとも１つの親ファージ、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備えるファージ耐性バクテリア菌株を得ることであって、前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、前記少なくとも１つの親ファージのゲノムにおける少なくとも１つの原スペーサー配列に対して、少なくとも約９５％同一な核酸配列を備える、前記得ること；
（ｂ）少なくとも１つのファージ変異株がつくられる条件下で、前記少なくとも１つの親ファージを前記ファージ耐性バクテリア菌株に暴露すること；および
（ｃ）前記少なくとも１つのファージ変異株であって、前記ファージ耐性バクテリア菌株に感染する能力を示し、かつＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体である前記少なくとも１つのファージ変異株を選択すること
を備える方法。
【請求項５０】
前記ファージ耐性バクテリア菌株は、請求項４８に記載の方法を用いて得られるバクテリオファージ耐性変異菌株である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ファージ変異株における前記少なくとも１つの原スペーサー配列の少なくとも一部分および前記少なくとも１つの原スペーサー配列の近くに位置するＣＲＩＳＰＲモチーフを、前記親ファージの前記少なくとも１つの原スペーサー配列、およびＣＲＩＳＰＲモチーフと比較するステップをさらに備える、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法は、前記ファージ耐性バクテリア菌株に感染する前記変異株ファージを選択するステップをさらに備え、前記変異株ファージは、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を備え、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージは、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体の前記少なくとも１つの原スペーサー配列および／または前記ＣＲＩＳＰＲモチーフに、少なくとも１つの変異を備える、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記方法は、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える異なったＣＲＩＳＰＲファージ耐性バクテリア菌株を用いて、1回またはそれ以上反復して繰り返され、前記ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体のゲノムにおける少なくとも１つの原スペーサー配列に対して少なくとも約９５％同一な核酸配列を備える、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記少なくとも１つのバクテリオファージは、次の通り、コルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科、マイオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科、およびテクティウイルス科からなるウイルス科の群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記ファージ耐性バクテリア菌株は、エシェリキア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルウィニア属、エルシニア属、バチルス属、ビブリオ属、レジオネラ属、シュードモナス属、ナイセリア属、ボルデテラ属、ヘリコバクター属、リステリア属、アグロバクテリウム属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、フランシセラ属、ブルセラ属、カンピロバクター属、クレブシエラ属、フランキア属、バルトネラ属、リケッチア属、シュワネラ属、セラチア属、エンテロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、ブロコトリクス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属およびオエノコッカス属から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
請求項４９に記載の方法を用いて得られるＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項５７】
少なくとも２つの原スペーサー配列および／または前記ＣＲＩＳＰＲモチーフに２つまたはそれ以上の変異が存在する、請求項５６に記載のＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項５８】
前記ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体の前記ゲノムは、少なくとも１つの原スペーサーおよび／または前記ＣＲＩＳＰＲモチーフに変異を備えるために遺伝子操作されている、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項５９】
少なくとも１つの前記ＣＲＩＳＰＲモチーフが変異した、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項６０】
少なくとも１つの前記ＣＲＩＳＰＲモチーフが削除された、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体。
【請求項６１】
請求項５６に記載の少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を備える組成物。
【請求項６２】
前記発酵培地は、望ましくないバクテリアの少なくとも１つの個体数を含む発酵培地に請求項６１に記載の前記組成物を、前記望ましくないバクテリアの前記個体数が低減される条件下で暴露することを備える、製品におけるバクテリアの個体数を制御する方法であって、前記発酵培地は、前記製品を生み出すために用いられる方法。
【請求項６３】
前記製品は、食品、飼料、化粧品、パーソナルケア製品、ヘルスケア製品、動物薬品、およびダイエタリーサプリメントから選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記方法は、少なくとも1回繰り返され、請求項６１に記載の前記異なった組成物は、ローテーションして用いられる、請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性の調節に関する方法および組成物を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節するために、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質を用いる組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、菌株の組み合わせ、およびスターター培養物のローテーションの開発および利用に役立つ方法および組成物を提供する。付加的な実施形態において、本発明は、バクテリアを標識化および／または同定する方法を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、細胞に対するファージの潜在的な毒性を決定するためにＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を利用する方法、およびファージの遺伝子配列を調節して毒性レベルを増加させるためにＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓを利用する方法を提供する。なおさらなる実施形態において、本発明は、生物的防除剤としてファージを開発および利用する手段および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
培養物、特にスターター培養物は、食品産業において乳製品（例えば、ヨーグルト、バターミルク、およびチーズ）、肉製品、ベーカリー製品、ワイン、並びに野菜製品を含む発酵製品の製造に広範囲に用いられている。培養物の調製は、労働集約的で多大なスペースおよび設備を必要として、かつ繁殖ステップの間に腐敗バクテリアおよび／またはファージで汚染されるかなりのリスクがある。バクテリオファージ（ファージ）の感染および繁殖に起因するバクテリア培養物の不良は、バクテリア培養物の工業利用に関する重要問題である。バクテリオファージには多くの異なったタイプがあり、新しい株が出現し続けている。加えて、かかる培養物に用いるバクテリアを追跡する方法および組成物が必要である。実際、培養物開発の進歩にも関わらず、産業利用のために培養物を改良することが持続的に必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節することに関する方法および組成物を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節するために、1つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子またはタンパク質を用いる組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、菌株の組み合わせ、およびスターター培養物のローテーションの開発および利用に役立つ方法および組成物を提供する。付加的な実施形態において、本発明は、バクテリアを標識化および／または同定する方法を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、細胞に対するファージの潜在的な毒性を決定するためにＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を利用する方法、およびファージの遺伝子配列を調節して毒性レベルを増加させるためにＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓを利用する方法を提供する。なおさらなる実施形態において、本発明は、生物的防除剤としてファージを開発および利用する手段および組成物を提供する。
【０００４】
本発明は、少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を生み出す方法であって、（ａ）改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える、少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を備えるバクテリアの混合物をつくるために、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を備える親バクテリア菌株を少なくとも1つの核酸配列に暴露するステップ；（ｂ）バクテリアの該混合物からバクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で選択された該バクテリオファージ耐性変異菌株から、該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える該バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；および（ｄ）少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株であって、該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える該菌株を単離するステップ、を備える方法を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本方法は、該親バクテリア菌株の該ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座にはない少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に備えるバクテリオファージ耐性変異菌株を同定するために、該親バクテリア菌株の該ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分、および該バクテリオファージ耐性変異菌株の該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を比較するステップをさらに備える。いくつかの特に好ましい実施形態において、本方法は、改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える、バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップをさらに備える。いくつかの実施形態において、該親バクテリア菌株は、２つまたはそれ以上の核酸配列に暴露される。いくつかの好ましい実施形態において、該親バクテリア菌株は、２つまたはそれ以上の核酸配列に同時に暴露されるが、しかし一方でいくつかの代わりの実施形態において、該親バクテリア菌株は、２つまたはそれ以上の核酸配列に順次暴露される。いくつかの特に好ましい実施形態において、該親バクテリア株は、核酸配列を備える少なくとも１つのバクテリオファージによる感染を通じて、該核酸配列に暴露される。いくつかのさらなる好ましい実施形態において、該少なくとも１つのバクテリオファージは、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、シストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、レビウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）およびテクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）からなるウイルス科の群から選択される。いくつかの付加的な好ましい実施形態において、該少なくとも１つのバクテリオファージは、自然発生のバクテリオファージであり、しかし一方で他の好ましい実施形態において、少なくとも１つのバクテリオファージは、バクテリオファージ耐性バクテリア菌株を用いた選択圧を通じて得られる変異バクテリオファージである。またさらなる好ましい実施形態において、該親バクテリア菌株は、核酸を取込む自然のメカニズムを通��て該核酸に暴露される。いくつかの実施形態において、核酸を取込む自然のメカニズムは、自然形質転換能を備える。いくつかの付加的な実施形態において、核酸を取込む該自然のメカニズムは、接合または形質転換による親バクテリア菌株である。なお他の実施形態において、該バクテリオファージ耐性菌株は、バクテリオファージ非感受性変異体である。また付加的な実施形態において、該親バクテリア菌株は、バクテリオファージ非感受性変異体である。いくつかのさらなる実施形態において、該親バクテリア菌株の該ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の該５’末端および／または該３’末端が、該バクテリオファージ耐性変異菌株の該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と比較される。いくつかのなおさらなる実施形態において、該親バクテリア菌株の該ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における、少なくとも第１のＣＲＩＳＰＲリピートまたは少なくとも第１のＣＲＩＳＰＲスペーサーの該５’および／または該３’末端が、該バクテリオファージ耐性変異菌株の該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と比較される。なおさらなる実施形態において、該バクテリオファージ耐性変異菌株は、該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを備える。いくつかの付加的な実施形態において、該親バクテリア菌株の該ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分、および該ファージ耐性変異菌株の該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分が、該ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分、および該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を増幅し、増幅されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座配列、および増幅された改変ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座配列をつくることによって、比較される。なおさらなる実施形態において、該増幅することは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行なわれる。いくつかの好ましい実施形態において、該親バクテリア菌株の該ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分、および該バクテリオファージ耐性変異菌株の該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分が、該ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分、および該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を配列決定することによって比較される。いくつかの特に好ましい実施形態において、本方法は、該増幅されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座配列、および該増幅された改変ＣＲＩＳＰＲ配列遺伝子座を配列決定するステップをさらに備える。いくつかの付加的な実施形態において、該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における該付加的な核酸フラグメントは、付加的なリピート−スペーサー・ユニットである。いくつかの好ましい実施形態において、該付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、少なくとも約４４ヌクレオチドを備える。いくつかの代わりの好ましい実施形態において、付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、約４４乃至約１１９ヌクレオチドの間を備える。しかしながら、本明細書に記載されるように、他のサイズも本発明に役立つので、本発明は、これら特定サイズの範囲に限定される意図はもたない。いくつかの実施形態において、該付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、該親バクテリア菌株の該ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲリピートに対して少��くとも約９５％の同一性をもつ少なくとも１つのヌクレオチド配列を備える。いくつかのさらなる実施形態において、該付加的なリピート−スペーサー・ユニットは、少なくとも１つのバクテリオファージゲノムにおけるヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％の同一性をもつ少なくとも１つのヌクレオチド配列を備える。いくつかの特に好ましい実施形態において、該親バクテリア菌株は、工業的に有用な菌株である。いくつかの付加的な実施形態において、該親バクテリア菌株は、少なくとも１つのバクテリオファージによる感染に敏感である。いくつかのさらなる好ましい実施形態において、該親バクテリア菌株は、スターター培養物、プロバイオティック培養物およびダイエタリーサプリメント培養物から選択される培養物を備える。いくつかの好ましい実施形態において、該親バクテリア菌株は、培養物から得られる菌株を備える。いくつかの特に好ましい実施形態において、該培養物は、スターター培養物、プロバイオティック培養物、および／またはダイエタリーサプリメント培養物である。さらに付加的な実施形態において、親バクテリア菌株は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、フランキア属（Ｆｒａｎｋｉａ）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、ブロコトリクス属（Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓ��ｏｃ）、およびオエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）から選択される。
【０００５】
本発明は、本明細書に記載の方法を用いて得られる少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株も提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、バクテリオファージ耐性変異菌株を提供し、該バクテリオファージ耐性変異菌株は、工業的に有用な菌株である。いくつかの好ましい実施形態において、該バクテリオファージ耐性変異菌株は、スターター培養物、プロバイオティック培養物、ダイエタリーサプリメント培養物、および／または他の有用な培養物の少なくとも１つの成分である工業的に有用な菌株を備える。
【０００６】
本発明は、本明細書に記載の方法を用いてつくられたバクテリオファージ耐性変異菌株を備える組成物も提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の方法を用いてつくられた少なくとも２つのバクテリオファージ耐性変異菌株を備える組成物も提供する。本発明は、これらの組成物の少なくとも１つを備える食品および／または飼料も提供する。本発明は、これらの組成物の少なくとも１つを食品または飼料に加えることを備える、食品および／または飼料を調製する方法も提供する。本発明は、これらの組成物の少なくとも１つを備える、スターター培養物、プロバイオティック培養物、ダイエタリーサプリメント培養物、および他の有用な培養物も提供する。本発明は、これらの組成物の少なくとも１つをスターター培養物に加えることを備える発酵方法も提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、これらの組成物の少なくとも１つを、発酵培地の成分の発酵が生じるような条件下で、発酵培地に加えることを備える発酵方法を提供する。いくつかの実施形態において、該発酵は、バクテリオファージの存在によって影響されない。いくつかの実施形態において、該発酵培地は食料製品である。いくつかの好ましい実施形態において、該食料製品は乳製品である。いくつかの特に好ましい実施形態において、該乳製品は乳汁である。いくつかのさらなる実施形態において、２つまたはそれ以上のバクテリオファージ耐性変異菌株を備える少なくとも２つの異なった組成物が、発酵培地に順次暴露される。
【０００７】
本発明は、発酵培地における該有害なバクテリオファージの個体数を低減する方法であって、発酵培地を本明細書に記載の方法を用いてつくられた少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株に、バクテリオファージの個体数が低減される条件下で暴露することを備える方法も提供する。
【０００８】
本発明は、少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を生み出す方法であって、（ａ）改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える、少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を備えるバクテリアの混合物をつくるために、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも一部分を備える親バクテリア菌株を、少なくとも１つの核酸配列に暴露するステップ；（ｂ）バクテリアの該混合物からバクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；（ｃ）該親バクテリア菌株の該ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座にはない少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に備えるバクテリオファージ耐性変異菌株を同定するために、該親バクテリア菌株の該ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分、および該バクテリオファージ耐性変異菌株の該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を比較するステップ；（ｄ）該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える該バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ；（ｅ）該少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を同定するために、該改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における該少なくとも１つの付加的な核酸フラグメントを解析するステップ；および（ｆ）該少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異菌株を単離するステップを備える方法も提供する。
【０００９】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を生み出す方法であって、（ａ）少なくとも１つの親ファージ、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備えるファージ耐性バクテリア菌株を得ることであって、該ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、該少なくとも１つの親ファージゲノムにおける少なくとも１つの原スペーサー配列に対して少なくとも約９５％同一の核酸配列を備える、得ること；（ｂ）少なくとも１つのファージ変異株がつくられる条件下で、該少なくとも１つの親ファージを該ファージ耐性バクテリア菌株に暴露すること；および（ｃ）該少なくとも１つのファージ変異株であって、該ファージ耐性バクテリア菌株に感染する能力を示し、かつＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体である、該少なくとも１つのファージ変異株を選択することを備える方法も提供する。いくつかの実施形態において、該ファージ耐性バクテリア菌株は、本明細書に記載の方法を用いて得られるバクテリオファージ耐性変異菌株である。いくつかの実施形態において、本方法は、該ファージ変異株における該少なくとも１つの原スペーサー配列の少なくとも一部分、および該少なくとも１つの原スペーサー配列の近くに位置するＣＲＩＳＰＲモチーフを、該親ファージの該少なくとも１つの原スペーサー配列およびＣＲＩＳＰＲモチーフと比較するステップをさらに備える。さらに付加的な実施形態において、本方法は、該ファージ耐性バクテリア菌株に感染する該変異株ファージを選択するステップをさらに備える方法であって、該変異株ファージは、該ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を備え、該ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージは、該ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体の該少なくとも１つの原スペーサー配列および／または該ＣＲＩＳＰＲモチーフに、少なくとも１つの変異を備える。さらに付加的な実施形態において、本方法は、該ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える、異なったＣＲＩＳＰＲファージ耐性バクテリア菌株を用いて、１回またはそれ以上反復して繰り返され、該ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、該ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体のゲノムにおける少なくとも１つの原スペーサー配列に対して少なくとも約９５％同一の核酸配列を備える。さらに付加的な実施形態において、少なくとも１つのバクテリオファージは、コルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科、マイオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科およびテクティウイルス科、からなるウイルス科の群から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、該ファージ耐性バクテリア菌株は、エシェリキア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルウィニア属、エルシニア属、バチルス属、ビブリオ属、レジオネラ属、シュードモナス属、ナイセリア属、ボルデテラ属、ヘリコバクター属、リステリア属、アグロバクテリウム属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属、カンピロバクター属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、フランシセラ属、ブルセラ属、クレブシエラ属、フランキア属、バルトネラ属、リケッチア属、シュワネラ属、セラチア属、エンテロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、ブロコトリクス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属およびオエノコッカス属から選択される。
【００１０】
本発明は、本明細書に記載の方法を用いて得られるＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体も提供する。いくつかの実施形態において、該ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体は、少なくとも２つの原スペーサー配列および／または該ＣＲＩＳＰＲモチーフに存在する２つまたはそれ以上の変異を備える。
【００１１】
本発明は、該ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体の該ゲノムが、少なくとも１つの原スペーサーおよび／または該ＣＲＩＳＰＲモチーフに変異を備えるために遺伝子操作された、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体も提供する。いくつかの実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体において少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲモチーフが変異し、一方でいくつかの代わりの実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体において少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲモチーフが削除される。本発明は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を備える組成物も提供する。
【００１２】
本発明は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を備える組成物を発酵培地に暴露することを備える、製品におけるバクテリアの個体数を制御する方法であって、該発酵培地は、望ましくないバクテリアの少なくとも１つの個体数を該望ましくないバクテリアの該個体数が低減される条件下で含み、該発酵培地は、該製品を生み出すために用いられる方法も提供する。いくつかの実施形態において、該製品は、食品、飼料、化粧品、パーソナルケア製品、ヘルスケア製品、動物薬品、およびダイエタリーサプリメントから選択される。いくつかのさらなる実施形態において、本方法は、少なくとも１回繰り返され、該異なった組成物、および／または異なったＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ変異体を備える組成物は、ローテーションして用いられる。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節するために、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子またはタンパク質を用いる方法および組成物を提供する。いくつかの付加的な実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する耐性を調節するために、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーであって、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子および／または少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートに対して非相同的な少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサー、とともに備える、組換え核酸配列を用いる組成物および方法を提供する。さらに付加的な実施形態において、本発明は、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子を備える少なくとも１つの核酸配列を提供する。
【００１４】
なおさらなる実施形態において、本発明は、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを備える少なくとも１つの核酸配列を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーを備える核酸配列を提供する。またさらなる実施形態において、本発明は、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサー、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを備える核酸配列を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーとともに備える組換え核酸配列を提供し、該ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子および／または少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートに対して非相同的である。
【００１５】
本発明は、本明細書に記載される核酸の１つまたはそれ以上を備えるコンストラクトも提供する。また付加的な実施形態において、本発明は、本明細書に記載される核酸配列の１つまたはそれ以上、或いはコンストラクトの１つまたはそれ以上を備えるベクターを提供する。なおさらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載される核酸配列、またはコンストラクト、或いはベクターを備える細胞を提供する。
【００１６】
本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節する（例えば、授けるか、または増加させる）方法であって、（ｉ）生物における配列（例えば、保存配列）を同定するステップ（いくつかの実施形態において、これは生物の機能または生存に必須の配列である）；（ｉｉ）同定された配列に相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサーを調製するステップ；（ｉｉｉ）少なくとも１つのｃａｓ遺伝子、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを、ＣＲＩＳＰＲスペーサーとともに備える核酸（例えば、組換え核酸）を調製するステップ；および（ｉｖ）かくして細胞に標的核酸またはその転写産物に対する耐性をもたせるために、細胞に該核酸を導入するステップを備える方法も提供する。
【００１７】
本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節する（例えば、授けるか、または増加させる）方法であって、（ｉ）標的核酸またはその転写産物に対する耐性をもつ生物における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー或いは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；（ｉｉ）少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを、同定された１つまたはそれ以上のスペーサーとともに備える組換え核酸を調製するステップ；および（ｉｉｉ）かくして細胞に標的核酸またはその転写産物に対する耐性をもたせるために、細胞に組換え核酸を導入するステップを備える方法も提供する。
【００１８】
本発明は、少なくとも１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートを備える細胞の、標的核酸またはその転写産物に対する耐性を調節する（例えば、授けるか、または増加させる）方法であって、（ｉ）標的核酸またはその転写産物に対する耐性をもつ生物における、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および（ｉｉ）細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）の配列を、該ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）が、該生物におけるＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に対して相同性をもつように調節するステップを備える方法も提供する。
【００１９】
本発明は、少なくとも１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートを備える細胞の、標的核酸またはその転写産物に対する耐性を調節する（例えば、低減するか、または減少させる）方法であって（ｉ）標的核酸またはその転写産物に対して実質的を耐性もつ生物における、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および（ｉｉ）細胞における少なくとも１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）の配列を、該ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）が、該生物におけるスペーサー（単数または複数）に対してより低減された度合いの相同性をもつように調製するステップを備える方法も提供する。
【００２０】
本発明は、少なくとも１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートを備える細胞の、標的核酸またはその転写産物に対する耐性を調節する（例えば、低減するか、または減少させる）方法であって、細胞における１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および／または２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートを改変することを備える方法も提供する。
【００２１】
本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節するのに用いるＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定する方法であって、（ｉ）少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピート、および少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質を備える細胞を調製するステップ；（ｉｉ）標的核酸またはその転写産物に対して実質的に耐性をもつ生物における、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；（ｉｉｉ）該細胞におけるＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を、該ＣＲＩＳＰＲスペーサーが該生物のスペーサーに対して相同性をもつように改変するステップ；および（ｉｖ）該細胞が、標的核酸またはその転写産物に対する耐性を調節するかどうか決定するステップであって、標的核酸またはその転写産物に対する該細胞の耐性を調節することは、該ＣＲＩＳＰＲスペーサーが細胞の耐性を調節することを示すステップを備える方法を提供する。
【００２２】
本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節するのに用いるｃａｓ遺伝子を同定する方法であって、（ｉ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーおよび少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを備える細胞を調製するステップ；（ｉｉ）少なくとも１つのｃａｓ遺伝子を備えるように、該細胞を操作するステップ；および（ｉｉｉ）該細胞が、標的核酸またはその転写産物に対する耐性を調節するかどうか決定するステップであって、標的核酸またはその転写産物に対する該細胞の耐性を調節することは、該細胞の耐性を調節するために該ｃａｓ遺伝子を用いることができることを示すステップを備える方法を提供する。
【００２３】
本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節するのに用いるＣＲＩＳＰＲリピートを同定する方法であって、（ｉ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーおよび少なくとも１つのｃａｓ遺伝子を備える細胞を調製するステップ；（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲリピートを含むように該細胞を操作するステップ；および（ｉｉｉ）該細胞が、標的核酸またはその転写産物に対する耐性を調製するかどうか決定するステップであって、標的核酸またはその転写産物に対する該細胞の耐性を調節することは、耐性を調節するために該ＣＲＩＳＰＲリピートを用いることができることを示すステップを備える方法も提供する。
【００２４】
本発明は、ｃａｓ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲリピートの機能的な組み合わせを同定する方法であって、（ａ）ｃａｓ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲリピートの配列を決定するステップ；（ｂ）配列比較分析によって決定されたｃａｓ遺伝子の１つまたはそれ以上のクラスターを同定するステップ；（ｃ）ＣＲＩＳＰＲリピートの１つまたはそれ以上のクラスターを同定するステップ；および（ｄ）同じクラスター内に入るｃａｓ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲリピート配列を組み合わせるステップであって、同じクラスター内におけるｃａｓ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲリピート配列の組み合わせは、該組み合わせが機能的な組み合わせであることを示すステップを備える方法も提供する。
【００２５】
本発明は、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートを備えるバクテリア細胞の溶原型を調節する方法であって、（ｉ）それに対する耐性を調節すべきバクテリオファージゲノム配列における、１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および（ｉｉ）バクテリア細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）が、それに対する耐性を調節すべき該バクテリオファージの偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に相同性をもつように、該バクテリア細胞の１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を改変するステップを備える方法も提供する。
【００２６】
本発明は、バクテリオファージに対するバクテリア細胞の耐性を調節する（例えば、授けるか、または増加させる）方法であって、（ｉ）バクテリオファージにおける配列（例えば、保存配列）を同定するステップ（好ましくは、バクテリオファージの機能または生存に不可欠な配列）；（ｉｉ）同定された配列に相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサーを調製するステップ；（ｉｉｉ）少なくとも１つのｃａｓ遺伝子、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを、該ＣＲＩＳＰＲスペーサーとともに備える核酸を調製するステップ；および（ｉｖ）かくしてバクテリア細胞に標的核酸またはその転写産物に対する耐性をもたせるために、バクテリア細胞に該核酸を導入するステップを備える方法も提供する。
【００２７】
本発明は、標的核酸、またはバクテリオファージにおけるその転写産物に対するバクテリア細胞の耐性を調節する（例えば、授けるか、または増加させる）方法であって（ｉ）標的核酸またはその転写産物に対する耐性を提供することができる、バクテリオファージゲノムにおける１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；（ｉｉ）少なくとも１つのｃａｓ遺伝子、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを、該同定された１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーとともに備える組換え核酸を調製するステップ；および（ｉｉｉ）かくしてバクテリア細胞に標的核酸またはその転写産物に対する耐性をもたせるために、バクテリア細胞に該組換え核酸を導入するステップを備える方法も提供する。
【００２８】
本発明は、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートを備えるバクテリア細胞の、バクテリオファージにおける標的核酸またはその転写産物に対する耐性を調節する方法であって、（ｉ）標的核酸またはその転写産物に対する耐性を提供することができる、バクテリオファージにおける１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；（ｉｉ）耐性が調節されるべきバクテリア細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および（ｉｉｉ）耐性が調節されるべきバクテリア細胞における該ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）の配列を、該ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）が、それに対する耐性を調節すべきバクテリオファージの該偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に対してより高い度合いの相同性をもつように改変するステップを備える方法も提供する。
【００２９】
本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を決定する方法であって、１つまたはそれ以上の機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせ、および１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーを細胞において同定することを備える方法も提供する。
【００３０】
本発明は、本明細書に示される方法（単数または複数）を用いて得られるか、または入手できる細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載される方法（単数または複数）によって得られるか、または入手できるＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを提供する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載される方法（単数または複数）によって得られるか、または入手できるｃａｓ遺伝子を提供する。いくつかのさらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載される方法（単数または複数）によって得られるか、または入手できるＣＲＩＳＰＲリピートを提供する。またさらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載される方法（単数または複数）によって得られるか、または入手できる機能の組み合わせを提供する。なおさらなる実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、および／または少なくとも１つのｃａｓ遺伝子、および／または少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲリピート、および／または機能的な組み合わせを備える、組換えＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節するために、細胞、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲリピート、或いはそれらの機能的な組み合わせを用いる方法を提供する。
【００３３】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節するために、少なくとも１つの細胞、少なくとも１つＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子、少なくとも１つＣＲＩＳＰＲリピート、またはそれらの機能的な組み合わせを備える細胞培養物を提供する。
【００３４】
なおさらなる実施形態において、本発明は、本明細書に示される培養物を備える食料製品および／または飼料を提供する。いくつかの付加的な実施形態において、本発明は、本明細書に示される培養物を備える食料製品および／または飼料を調製するプロセスを提供する。さらに付加的な実施形態において、本発明は、本明細書に示される方法によって得られるか、または入手できる食料製品および／または飼料を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、食料製品および／または飼料を調製するために、本明細書に示される培養物を用いる方法を提供する。
【００３５】
本発明は、配列番号（SEQ ID NO）：７〜１０および配列番号：３５９〜４０５、ならびにそれらの変異形、フラグメント、ホモログ、および誘導体のいずれかに示される配列を備えるか、または配列から成るヌクレオチド配列をさらに提供する。本発明は、本明細書に示されるヌクレオチド配列によってコード化されるアミノ酸も提供する。またさらなる実施形態において、本発明は、本明細書に示されるヌクレオチド配列の１つまたはそれ以上を備えるコンストラクトおよび／またはベクターを提供する。本発明は、本明細書に示されるコンストラクトおよび／またはヌクレオチド配列の少なくとも１つを備える宿主細胞も提供する。
【００３６】
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質は、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートと組み合わせて用いられる。いくつかのさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および／または２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートは、同じ細胞に由来する。いくつかの付加的な実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートは、同じ細胞に自然に同時に発生する。いくつかのなおさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質は、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーと組み合わせて用いられる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）は、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および／または２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートが由来する細胞とは異なる生物に由来する。
【００３８】
いくつかの実施形態において、該スペーサーは、標的核酸に対する耐性をもつ細胞から得られる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、合成の核酸配列である。いくつかのさらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）は、標的核酸に対して相同性をもつ。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）は、少なくともＣＲＩＳＰＲスペーサーコアの長さにわたって標的核酸と１００％の同一性をもつ。
【００３９】
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質は、少なくとも１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー、および少なくとも２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートと組み合わせて用いられる。いくつかの実施形態において、標的核酸またはその転写産物は、バクテリオファージのＤＮＡに由来する。またさらなる実施形態において、標的核酸またはその転写産物は、少なくとも１つのプラスミドに由来する。いくつかのさらなる実施形態において、標的核酸またはその転写産物は、少なくとも１つの可動遺伝因子のＤＮＡに由来する。いくつかの実施形態において、標的核酸またはその転写産物は、転位因子および／または挿入配列に由来する。いくつかの代わりの実施形態において、標的核酸またはその転写産物は、抗生物質／抗菌薬の耐性遺伝子に由来する。いくつかのさらなる実施形態において、標的核酸またはその転写産物は、少なくとも１つの毒性因子をコード化する核酸に由来する。いくつかの好ましい実施形態において、該毒性因子は、トキシン、インターナリン、ヘモリシンおよび／または他の毒性因子を含む。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子、および２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートは、同じ細胞に由来する。いくつかの代わりの実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子、および２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートは、同じ細胞に自然に同時に生じる。またさらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子、および／または２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートが由来する細胞とは異なった生物に由来する。いくつかの実施形態において、該細胞は、受容細胞または宿主細胞である。
【００４１】
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および／またはＣＲＩＳＰＲリピートは、同じ細胞に由来する。いくつかの実施形態において、スペーサーは、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および／または２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートを備える細胞とは異なった生物に由来する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートは、同じ細胞に自然に同時に生じる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、改変は、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー、および／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを細胞に挿入することを備える。いくつかの実施形態において、改変は、細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーを遺伝子操作することを備える。いくつかの実施形態において、細胞のスペーサーは、生物のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して１００％の相同性をもつ。いくつかの実施形態において、細胞におけるスペーサーのすべてまたは部分が改変される。いくつかの実施形態において、改変は、組換えスペーサーの改変を備える。いくつかの実施形態において、改変は、自然突然変異または突然変異誘発を通じて生じる。いくつかの実施形態において、細胞中の少なくとも１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）が削除される。いくつかの実施形態において、細胞における少なくとも１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）が削除される。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子が削除される。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ、および／または１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子が削除される。いくつかの実施形態において、細胞における１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および／または２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートが削除される。いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲリピートのヌクレオチド配列は、同じか、または異なった菌株に由来する。いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲリピートのヌクレオチド配列は、同じか、または異なった種に由来する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲリピートのヌクレオチド配列は、同じか、または異なった属に由来する。いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲリピートのヌクレオチド配列は、同じか、または異なった生物に由来する。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態において、バクテリオファージにおける標的核酸は、高度に保存された核酸配列である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージにおける標的核酸は、宿主特異性タンパク質をコード化する。いくつかのさらなる実施形態において、バクテリオファージにおける標的核酸は、バクテリオファージの生存、複製または成長に不可欠なタンパク質をコード化する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージにおける標的核酸は、ヘリカーゼ、プライマーゼ、ヘッドまたはテール構造タンパク質、保存ドメインをもつタンパク質（例えば、ホリン、リシンなど）、または重要なファージ遺伝子のうち少なくとも１つの保存配列をコード化する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を決定する方法は、細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を、標的核酸の配列と比較する付加的なステップを備える。いくつかの代わりの実施形態において、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を決定する方法は、細胞の耐性プロフィルを決定する付加的なステップを備える。
【００４７】
いくつかの実施形態において、培養物は、スターター培養物またはプロバイオティック培養物である。
【００４８】
本発明は、ファージに対する耐性をもつ「標識化されたバクテリア」（すなわち、「バクテリオファージ非感受性変異体（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔ）」：「ＢＩＭ」）も提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのバクテリオファージゲノムに起源があり、バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組込まれた、１つまたはそれ以上の配列を備えるバクテリアを提供する。このファージ由来の配列は、その位置および／または配列および／または近接配列によって同定し得る標識を提供する。
【００４９】
いくつかの代わりの実施形態において、本発明は、親バクテリアに起源があり、バクテリオファージゲノムに起源がある配列とともに、反復して、順次、同時または実質的に同時に組込まれ得る重複配列（例えば、重複ＣＲＩＳＰＲリピート）を提供する。
【００５０】
加えて、本発明は、バクテリア菌株のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への１つまたはそれ以上の異なったバクテリオファージ配列の組込みを容易にする方法を提供する。いくつかの実施形態において、バクテリア菌株のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における異なったバクテリオファージ配列の組込みは、ランダム事象である。いくつかの代わりの実施形態において、バクテリア菌株のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における異なったバクテリオファージ配列の組込みは、ランダム事象ではない。かくして、バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組込まれるのは、バクテリオファージゲノムのいつも同じ遺伝子座とは限らない。しかしながら、一度組込まれると維持されて、バクテリアを標識化および／または追跡するための着実なタグになる。従って、バクテリオファージゲノムを起源とする１つまたはそれ以上の配列は親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座にとって新しいのみならず、各々のバクテリアにとってもユニークな標識である。それ故に、バクテリアを標識化（例えば、タグ付け）および／または同定するための方法が、本明細書に提供されている。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、「自然であり」遺伝子組換え生物をつくり出すことがない。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、バクテリアを標識化する方法であって、（ａ）親バクテリアをバクテリオファージに暴露するステップ；（ｂ）バクテリオファージ非感受性変異体を選択するステップ；（ｃ）親バクテリア、および該バクテリオファージ非感受性変異体からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分を比較するステップ；および（ｄ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に、親バクテリアには存在しない、付加的なＤＮＡフラグメントを備える標識化されたバクテリアを選択するステップを備える方法を提供する。
【００５２】
本発明は、本発明の方法を用いて得られる標識化されたバクテリアも提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの標識化されたバクテリア菌株を備える細胞培養物を提供する。なおさらなる実施形態において、本発明は、限定されることなしに、かかる標識化されたバクテリアを備える細胞培養物を含む、標識化されたバクテリアを備える食品および／または飼料を提供する。本発明は、少なくとも１つの標識化されたバクテリア菌株を備える食品および／また飼料を調製する方法も提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも１つの標識化されたバクテリア菌株または細胞培養物を食品および／または飼料に加えることを備える。
【００５３】
本発明はＣＲＩＳＰＲ変異株を生み出す方法であって、（ａ）親バクテリアをバクテリオファージに暴露するステップ；（ｂ）バクテリオファージ耐性バクテリア（すなわち、「バクテリオファージ非感受性変異体」）を選択するステップ；（ｃ）親バクテリアおよび該バクテリオファージ非感受性変異体からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分を比較するステップ；（ｄ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に、親バクテリアには存在しない、付加的なＤＮＡフラグメントを備える標識化されたバクテリアを選択するステップ；および（ｅ）該付加的なＤＮＡフラグメントを単離、および／またはクローニング、および／または配列決定するステップを備える方法も提供する。本発明は、本明細書に記載の方法を用いてつくられるＣＲＩＳＰＲ変異株も提供する。いくつかの特に好ましい実施形態において、該ＣＲＩＳＰＲ変異株は、付加的なスペーサーのある改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座をもつファージ耐性変異体菌株である。
【００５４】
いくつかの付加的な実施形態において、本発明は、バクテリアをタグ付け、および／または同定するために、バクテリオファージから得られるか、または入手可能な少なくとも１つのヌクレオチド配列を用いる方法であって、該ヌクレオチド配列は、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組込まれる方法も提供する。
【００５５】
なおさらなる実施形態において、本発明は、バクテリアを標識化および／または同定するために、少なくとも１つのヌクレオチド配列を用いる方法であって、該ヌクレオチド配列は、（ａ）親バクテリアをバクテリオファージに暴露すること；（ｂ）バクテリオファージ非感受性変異体を選択すること；（ｃ）親バクテリア、および該バクテリオファージ非感受性変異体からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分を比較すること；および（ｄ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に、親バクテリアには存在しない、付加的なＤＮＡフラグメントを備える標識化されたバクテリアを選択することによって得られるか、または入手可能な方法を提供する。さらに付加的な実施形態において、本発明は、標識化されたバクテリアを同定する方法を提供し、該方法は、バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内の付加的なＤＮＡフラグメントに対してバクテリアをスクリーニングするステップを備え、本発明のさらなる様態にも示される。
【００５６】
またさらなる実施形態において、本発明は、標識化されたバクテリアを同定する方法であって、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における付加的なＤＮＡフラグメントに対してバクテリアをスクリーニングするステップ；（ｂ）該付加的なＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列を決定するステップ；（ｃ）該付加的なＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列を、本発明の方法によって得られるか、または入手可能な、標識化されたバクテリアのデータベースと比較するステップ；および（ｄ）該付加的なＤＮＡフラグメントと一致する、標識化されたバクテリアのデータベースにおけるヌクレオチド配列を同定するステップを備える方法を提供する。
【００５７】
いくつかの好ましい実施形態において、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端、および／または３’末端が、標識されたバクテリアと比較される。いくつかの代わりの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端の少なくとも第1のＣＲＩＳＰＲリピート、または第1のＣＲＩＳＰＲスペーサー（例えば、第１のＣＲＩＳＰＲスペーサーコア）が比較される。またさらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端における少なくとも最後のＣＲＩＳＰＲリピート、または最後のＣＲＩＳＰＲスペーサー（例えば、最後のＣＲＩＳＰＲスペーサーコア）が比較される。
【００５８】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端および／または３’末端に、親バクテリアには存在しない、付加的なＤＮＡフラグメントを備える、標識化されたバクテリアを選択するステップを備える。いくつかの代わりの実施形態において、本方法は、親バクテリアを、２つまたはそれ以上のバクテリオファージに、同時か、または順次かいずれか暴露することをさらに備える。またさらになる実施形態において、親バクテリア、および／またはバクテリオファージ非感受性変異体からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分を増幅することによって、親バクテリア、およびバクテリオファージ非感受性変異体からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分が比較される。いくつかの特に好ましい実施形態において、増幅は、ＰＣＲを用いて行なわれる。いくつかの代わりの実施形態において、親バクテリア、および／またはバクテリオファージ非感受性変異体からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分を配列決定することによって、親バクテリア、およびバクテリオファージ非感受性変異体からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分が比較される。いくつかの好ましい実施形態において、親バクテリア、および／またはバクテリオファージ非感受性変異体からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分を増幅し、次に配列決定することによって、親バクテリア、およびバクテリオファージ非感受性変異体からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分が比較される。いくつか代わりの好ましい実施形態において、付加的なＤＮＡフラグメントは、少なくとも４４ヌクレオチド長である。いくつかの付加的な好ましい実施形態において、２つ、または３つ、或いはそれ以上の付加的なＤＮＡフラグメントを備える標識化されたバクテリアが選択される。またさらなる実施形態において、付加的なＤＮＡフラグメントは、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲリピートに対して少なくとも約９５％の同一性、或いは好ましくは、１００％の同一性をもつ少なくとも１つのヌクレオチド配列を備える。なおさらなる実施形態において、付加的なＤＮＡフラグメントは、標識化されたバクテリアを選択するために用いられるバクテリオファージゲノムにおけるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９５％の同一性、およびいくつかの実施形態において、好ましくは１００％の同一性をもつ少なくとも１つのヌクレオチド配列を備える。いくつかの実施形態において、本発明は、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を備える、少なくとも１つの付加的なＤＮＡフラグメントであって、該ヌクレオチド配列の少なくとも１つは、標識化されたバクテリアを選択するために用いられるバクテリオファージゲノムにおけるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９５％の同一性、またはいくつかの好ましい実施形態において、約１００％の同一性をもつＤＮＡフラグメントも提供する。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本発明は、スターター培養物、プロバイオティック培養物、および／またはダイエタリーサプリメントとして用いるのに適した親バクテリアを提供する。いくつかの実施形態において、親バクテリアは、限定されることなしに、エシェリキア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルウィニア属、エルシニア属、バチルス属、ビブリオ属、レジオネラ属、シュードモナス属、ナイセリア属、ボルデテラ属、ヘリコバクター属、リステリア属、アグロバクテリウム属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、フランシセラ属、ブルセラ属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、およびオエノコッカス属を含む任意の適切な属から選択される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、限定されることなしに、コルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科、マイオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科、およびテクティウイルス科を含む適切なウイルス科から選択される。いくつかの実施形態において、本発明は、スターター培養物、プロバイオティック培養物、および／またはダイエタリーサプリメントから選択される細胞培養物を提供する。いくつかの特に好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも１つの付加的なＤＮＡフラグメントを、バクテリオファージ配列データベース、および／またはバクテリア配列データベースと比較するステップを備える、標識化されたバクテリアを同定する方法を提供する。
【００６０】
本発明は、バクテリオファージから得られるか、または入手可能な配列を備えるＳ．サーモフィルス菌株も提供し、該配列は、配列番号：６８０（ｃａａｃａｃａｔｔｃａａｃａｇａｔｔａａｔｇａａｇａａｔａｃ；配列番号：６８０）と本明細書で呼ばれる、ストレプトコッカス・サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７７８からのＣＲＩＳＰＲスペーサーを備える。
【００６１】
さらに付加的な実施形態において、本発明は、バクテリオファージから得られるか、または入手可能な配列を備えるＳ．サーモフィルス菌株を提供し、該配列は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の第１のＣＲＩＳＰＲリピートの下流（例えば、直接に下流）に配列番号：６８０を備える。
【００６２】
さらなる実施形態において、本発明は、バクテリオファージから得られるか、または入手可能な配列を備えるＳ．サーモフィルス株を提供し、該配列は、ストレプトコッカス・サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７７８からのＣＲＩＳＰＲスペーサー（５’−３’）（ｔｃｃａｃｔｃａｃｇｔａｃａａａｔａｇｔｇａｇｔｇｔａｃｔｃ；配列番号：６８１）を備える。さらに付加的な実施形態において、本発明は、バクテリオファージから得られるか、または入手可能な配列を備えるＳ．サーモフィルス株を提供し、該配列は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の第１のＣＲＩＳＰＲリピートの下流（例えば、直接に下流）に配列番号：６８１を備える。
【００６３】
なおさらなる実施形態において、本発明は、バクテリオファージから得られるか、または入手可能な配列を備えるＳ．サーモフィルス菌株を提供し、該配列は、配列番号：６８３を備える。：
ストレプトコッカス・サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ１のＣＲＩＳＰＲ１配列（５’−３’）
【００６４】
【化１】
2010519929.tif 000003
【００６５】
さらに付加的な実施形態において、本発明は、バクテリオファージから得られるか、または入手可能な配列を備えるＳ．サーモフィルス菌株を提供し、該配列は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における第１のＣＲＩＳＰＲリピートの下流（例えば、直接に下流）に配列番号：６８３を備える。バクテリオファージから得られるか、または入手可能な配列を備えるＳ．サーモフィルス菌株、該配列は、配列番号：６８５（すなわち、５’−ＴＡＣＧＴＴＴＧＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＣＡＡＡＴＣＡＡＴＧＡ−３’）を備える。
【００６６】
さらに付加的な実施形態において、本発明は、バクテリオファージから得られるか、または入手可能な配列を備えるＳ．サーモフィルス菌株を提供し、該配列は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における第１のＣＲＩＳＰＲリピートの下流（例えば、直接に下流）に配列番号：６８５を備える。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本発明は、菌株の組み合わせ、並びにスターター培養物のローテーションの開発および使用に役立つ方法および組成物を提供する。いくつかの付加的な実施形態において、スターター培養物に１つまたはそれ以上のＢＩＭを同時に使用すること（すなわち、ＢＩＭの組み合わせ）が提供される。いくつかのさらなる実施形態において、ローテーションの仕組みで１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ  ＢＩＭを使用することが提供される。いくつかのさらなる実施形態においては、ローテーションの仕組みで１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ  ＢＩＭの組み合わせを使用することが提供される。
【００６８】
本発明は、生物的防除ファージゲノムに対するスペーサー配列間の比較を可能にするために、標的生物のＣＲＩＳＰＲを分析する手段も提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ファージの毒性を予測する手段、および少なくとも１つの標的微生物に対する少なくとも１つの生物的防除ファージの選択を提供する。
【００６９】
本発明は、少なくとも標的微生物の少なくとも１つのファージ耐性ＣＲＩＳＰＲ変異株を構築するために、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ（すなわち、いくつかの好ましい実施形態では、自然変異誘発）を利用する方法および組成物も提供し、該ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓは、次にファージ毒性を高めるために、スペーサー配列、偽スペーサー配列、近位配列、認識モチーフなどから選択される配列に対応する、ファージ内の変異を介してＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ耐性を回避する変異体ファージを生み出すために用いられる。いくつかの好ましい実施形態において、毒性が高められたファージは、生物的防除剤として役立つ。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本発明は、親ファージと比較して毒性が高められたファージをつくるのに適した組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、変異体ファージを生み出すのに用いられるファージ耐性細胞変異株をつくるために、少なくとも１つのクローニングされたスペーサーが、活性なＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ遺伝子座に導入される。いくつかの好ましい実施形態において、本方法は、ファージゲノム配列の特異的な標的（例えば、スペーサーの標的またはスペーサーを宿主に組込むための認識配列として、非常に敏感な領域）として機能する配列を導入することを備える。いくつかの付加的な実施形態において、本発明は、スペーサーに対応するゲノム配列が、然るべく変異するように、ファージを直接に操作するための方法および組成物を提供する。
【００７１】
本発明は、より毒性があり、従って有効な生物的防除剤をつくり出すために、対応する宿主菌株が取得したＣＲＩＳＰＲファージ耐性を用いて、所与のファージの進化を方向づける方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】Ｓ．サーモフィルスのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座へのＣＲＩＳＰＲスペーサーの組込みは、該ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、それに対して同一性を示すバクテリオファージに対する耐性を提供することを説明する概略図を示す。親ＤＧＣＣ７７１０は、ファージ感受性をもち、ＢＩＭ  ＤＧＣＣ７７１０ＲＨ１は、ファージ耐性をもつ。ＢＩＭ  ＤＧＣＣ７７１０ＲＨ１は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に、ファージの配列に対して１００％の同一性を示す新しいスペーサー（Ｓｎ）をもつ。ステップ（Ｂ）に示されるように、菌株がファージ８５８にチャレンジされて、ファージ耐性変異体が選択される。ステップ（Ｃ）に示されるように、該変異体のＣＲＩＳＰＲＩ遺伝子座は、ファージの領域３１．９２１〜３１．９５０ｂｐと１００％の同一性を共有する付加的なスペーサーをもつ。
【図２】Ｓ．サーモフィルスのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座へのＣＲＩＳＰＲスペーサーの組込みは、該ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、それに対して同一性を示すバクテリオファージに対する耐性を提供することを説明する概略図を示す。親ＤＧＣＣ７７１０は、ファージ感受性をもち、ＢＩＭ  ＤＧＣＣ７７１０ＲＨ２は、ファージ耐性をもつ。ＢＩＭ  ＤＧＣＣ７７１０ＲＨ２は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に、ファージ配列に１００％の同一性を示す新しいスペーサー（Ｓｎ）をもつ。ステップ（Ｂ）に示されるように、菌株がファージ８５８にチャレンジされて、ファージ耐性変異体が選択される。ステップ（Ｃ）に示されるように、実験が独立して繰り返され、また別の変異体が選択された。該変異体のＣＲＩＳＰＲＩ遺伝子座は、ファージの領域１７．１２５〜１７．２４４ｂｐと１００％の同一性を共有する（ＲＨ１のものとは異なった）付加的なスペーサーをもつ。
【図３】ｃａｓ１遺伝子が相同組換えによって破壊された、ＣＡＳＩＫＯコンストラクトの調製を説明するグラフィック表示を示す。
【図４】Ｓ１Ｓ２コンストラクトからＲＴコンストラクトを生み出すための、制限酵素を用いたＲＴコンストラクトの調製に関するグラフィック表示を示す。リピート内に、コンストラクトの「中央」部分が切断されることが可能なＢｇｌＩ制限部位が存在する。酵素消化の後に、２つの末端片を継ぎ合わせるためにリガーゼが用いられ、かくしてＲＴをもつがスペーサーのない新しいコンストラクトが生み出される。
【図５】ＲＴコンストラクトの組込みのグラフィック表示を示す。
【図６】特異的なプライマーおよび反復ＰＣＲ反応を用いたＳ１Ｓ２コンストラクトの操作を説明するグラフ表示を示す。第１のパネルは、全使用プライマー、および最初の２つのＰＣＲ反応（プライマーＰ１およびＰ２を用いた反応#１、およびプライマーＰ２およびＰ３を用いた反応#２）を図解する。第２のパネルは、最初の２つのＰＣＲ反応から得られるＰＣＲ産物を、反応#１からの産物を左、反応#２からの産物を右に示す。第３のパネルは、第３のＰＣＲ反応の鋳型として最初の２つのＰＣＲからの産物、および第１の反応からのプライマーを第２の反応からのプライマー４と一緒に組み合わせて用いた、第３のＰＣＲ反応を示す。第４のパネルは、Ｓ１Ｓ２コンストラクトを技術的に生み出すＰＣＲ#３の産物を示す。
【図７】実験の鍵となる、ファージの配列と同一のスペーサーに由来する配列を含むプライマー２および３のプライマー設計の詳細のグラフィック表示を示す。（これらのＰＣＲプライマーから得られるＰＣＲ産物は、ファージに対する耐性を最終的に提供することになるスペーサーを生み出す）。
【図８】Ｓ１Ｓ２コンストラクトの組込みのグラフィック表示を示す。
【図９】Ｓ．サーモフィルスのＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座、ファージ耐性変異体に新たに獲得されたスペーサー、および対応するファージ感受性の概観のグラフィック表示を示す。ＤＧＣＣ７７１０（ＷＴ）のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座が最上部に示される。ＷＴのリピート／スペーサー領域が中央部に示される：リピート（黒ダイヤ）、スペーサー（番号付けした灰色ボックス）、リーダー（Ｌ、白ボックス）および末端リピート（Ｔ、黒ダイヤ）。底部には、ファージ耐性変異体の遺伝子座におけるリーダー側のスペーサーの内容が左側に、新しく獲得されたスペ−サー（白ボックスＳ１〜Ｓ１４）とともに詳細に示される。右側には、各々の菌株のファージ８５８および２９７２に対する感受性が、プラーク形成効率（ＥＯＰ）、すなわち変異株のプラークカウントの野生型に対する比率のヒストグラムとして示される。
【図１０】ＣＲＩＳＰＲスペーサーの操作、ｃａｓ遺伝子の不活性化、および対応するファージ感受性を示す。Ｉ、変異体ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２；ＩＩ、変異体ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２ΔＣＲＩＳＰＲ１（ＣＲＩＳＰＲ１が削除された）；ＩＩＩ、変異体ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐＲ（ＣＲＩＳＰＲ１が移されてユニークなリピートに置き換えられた）；ＩＶ、ＷＴΦ２９７２＋Ｓ４：：ｐＳ１Ｓ２（ＣＲＩＳＰＲ１が移されてＳ１およびＳ２を含むバージョンに置き換えられた菌株ＷＴΦ２９７２＋Ｓ４の変異体）；Ｖ、ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐｃａｓ５−（ｃａｓ５が不活性化された）；ＶＩ、ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐｃａｓ７−（ｃａｓ７が不活性化された）。ｐＯＲＩは、組込まれたプラスミドを示す（１２）。各菌株のファージ８５８および２９７２に対するファージ感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）のヒストグラムとして底部に示される。
【図１１】Ｓ１Ｓ２コンストラクトの構成の概略図を示す。
【図１２】ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２ΔＣＲＩＳＰＲ１の構造の概略図を示す。
【図１３】ファージ５８５、および菌株ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２のＣＲＩＳＰＲ耐性を回避した２つの変異体ファージにおける、対応するゲノム領域に対するＣＲＩＳＰＲスペーサーＳ１のアラインメントを示す。
【図１４】第１レベルのファージ耐性変異株の構造の概略図を示す。各々の変異株は、ＣＲＩＳＰＲ内に単一の付加的なスペーサーをもつ。付加的なスペーサーは、他の各々と無関係である（例えば、各々が異なった配列をもつ）。すべてのスペーサーは、ファージＰを起源とする。
【図１５】ファージに対して増加した耐性を示す、ファージ耐性変異株の第２レベルの概略図を示す。最終的な変異株（Ａ１．ｎおよびＡ２．ｎ）は、菌株Ａを起源とし、順次組込まれた付加的なスペーサーをＣＲＩＳＰＲ内にもつ。すべてのスペーサーは、他の各々と異なりファージＰを起源とする。
【図１６】ファージに対して拡張された耐性を提示するファージ耐性変異株の第２レベルの概略図を示す。最終的な変異株（Ａ１ｐｑｒ）は，菌株Ａを起源とし、順次組み込まれた、３つの異なるファージ（すなわち、ファージＰ、ＱおよびＲ）由来の付加的なスペーサーをＣＲＩＳＰＲ内にもつ。
【図１７】実施例７から実施例１６に記載される、Ｓ．サーモフィルス菌株のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座（パネルＡ）およびＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座（パネルＢ）の概略図を示す。菌株名は、図の左側に示される。黒矢印はＣＲＩＳＰＲリピートを示し、「Ｒ」はリピートを表し、「ＲＴ」は末端リピートを表す。Ａ部分で１から３２まで、Ｂ部分で１から１２まで番号を付けたグレー矢印は、ＤＧＣＣ７７１０に存在するようなＣＲＩＳＰＲ１スペーサーおよびＣＲＩＳＰＲ３スペーサーをそれぞれ表す。Ｓ４からＳ３５まで番号を付けた白矢印は、記載された菌株に固有の付加的なＣＲＩＳＰＲスペーサーを表す。
【図１８】タグ付け配列、およびＣＲＩＳＰＲリピートが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方の末端に組込まれた本発明の実施形態の概略図を示す。パネルＡには、リピート（Ｒ）、スペーサー（Ｓ）、上流リーダーおよび下流トレーラーを、トレーラーに近接する末端リピート（ＲＴ）、および近傍のｃａｓ遺伝子（本明細書でｃａｓ１からｃａｓ４と名付けた４つのｃａｓ遺伝子、縮尺通りではない）とともに含んだ、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座およびエレメントが示される。ｃａｓ遺伝子は、いずれかの末端にあることも、或いは分割されて両端に存在することもできる。加えて、ｃａｓ遺伝子は、２つのＤＮＡ鎖のいずれに位置することもできる。パネルＢは、付加的なスペーサー（すなわち、タグ付け配列）として用いられる配列のフラグメント（Ｓｎ）をもつファージの配列を示す。パネルＣは、新しいスペーサー（Ｓｎ）（すなわち、タグ付け配列）を、（この例ではＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端のリーダーに近い）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方の末端において、２つのリピートの間に挿入することを示す。パネルＤは、親、および（この例ではリーダーに近い）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の末端においてリピート間に組込まれた新しいスペーサー（Ｓｎ）（すなわち、タグ付け配列）をもつ変異体バクテリア（すなわち、標識されたバクテリア）の間で、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の内容を比較することを示す。新しいスペーサー（Ｓｎ）は、変異体バクテリアに固有のタグ付け配列を構成する（すなわち、標識化されたバクテリア）。いくつかの実施形態において、この方法を用いる結果として、ファージ配列からの１つまたはそれ以上のスペーサーの付加がもたらされる。
【図１９】２つのタグ付け配列、および２つのＣＲＩＳＰＲリピートが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方の末端に組込まれた、本発明の実施形態の概略図を示す。パネルＡには、リピート（Ｒ）、スペーサー（Ｓ）、上流リーダーおよび下流トレーラーを、トレーラーに近接する末端リピート（ＲＴ）、および近傍のｃａｓ遺伝子（本明細書ではｃａｓ１からｃａｓ４と名付けた４つのｃａｓ遺伝子、縮尺通りではない）とともに含んだ、（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座およびエレメントが示される。ｃａｓ遺伝子は、いずれかの末端にあることも、或いは分割されて両端に存在することもでき、ｃａｓ遺伝子は、２つのＤＮＡ鎖のいずれに位置することもできる。パネルＢは、ファージ配列を黒で、付加的なスペーサー（すなわち、タグ付け配列）として用いられる配列の２つのフラグメント（ＳｎおよびＳｎ’）とともに示す。パネルＣは、新しいスペーサー（すなわち、タグ付け配列）（ＳｎおよびＳｎ’）を、（この例では５’末端のリーダーに近い）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の同じ末端に挿入することを示し、これらの各々は、２つのリピートの間にある。パネルＢは、親と、変異体バクテリア（すなわち、標識化されたバクテリアであって、（この例では５’末端のリーダーに近い）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の同じ末端に組込まれて、リピートの間に各々が位置する２つの新しいスペーサー（ＳｎおよびＳｎ’）をもつ変異体バクテリアとの間のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の内容の比較を示す。新しいスペーサーＳｎおよびＳｎ’は、変異体に固有のタグ付け配列を構成する。いくつかの実施形態において、この方法の結果として、ファージ配列からの１つまたはそれ以上のスペーサーが付加される。
【図２０】ＤＧＣＣ７７１０（黒ダイヤ）またはＤＧＣＣ９８３６（白四角）を用いた発酵の間に、１０７ｐｆｕ／ｍｌのＤ２９７２を含んだミルクにおけるファージ・カウントの進展に関するグラフを示す。ミルクは、１０％（ｗ／ｖ）の粉乳を水に含む。インキュベーション温度は４２℃であった。
【図２１】ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０（ダッシュ付き）またはＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１（薄灰色）、或いはＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１の両方（暗灰色）を接種した発酵の間における、１０７ｐｆｕ／ｍｌのＤ２９７２を含んだミルクの累積ファージ・カウントの進展を、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１についてグラフに示す。ミルクは、１０％（ｗ／ｖ）の粉乳を水に含む。インキュベーション温度は４２℃であった。
【図２２】ＣＲＩＳＰＲ１モチーフＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号：６９６）に対するウェッブロゴを示す。
【図２３】選択されたＣＲＩＳＰＲ３原スペーサーおよび隣接する領域のアラインメント、およびＣＲＩＳＰＲ３モチーフＮＧＧＮＧ（配列番号：７２３）に対するウェッブロゴを示す。この図には、Ｓ４２  ＤＧＣＣ７７１０ｐｈｉ２９７２＋Ｓ４０ｐｈｉ３８２１＋Ｓ４１Ｓ４２（配列番号：７２４）、Ｓ４１  ＤＧＣＣ７７１０ｐｈｉ２９７２＋Ｓ４０ｐｈｉ３８２１＋Ｓ４１Ｓ４２（配列番号：６９９）、Ｓ４１  ＤＧＣＣ７７１０ｐｈｉ８５８＋Ｓ１Ｓ２ｄｅｌｔａＣＲＩＳＰＲ１ｐｈｉ８４８＋Ｓ４３（配列番号：７００）、およびＳ７８  ＬＭＤ−９ｐｈｉ４２４１＋Ｓ７８（配列番号：７０１）が示される。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節することに関連する方法および組成物を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節するために、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質を用いる組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、菌株の組み合わせ、およびスターター培養物のローテーションの開発および使用に役立つ方法および組成物を提供する。付加的な実施形態において、本発明は、バクテリアを標識化および／または同定するための方法を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、細胞に対するファージの潜在的毒性を決定するためのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の利用法、および毒性レベルの増加に向けてファージの遺伝子配列を改変するためのＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓの利用法を提供する。なおさらなる実施形態において、本発明は、生物的防除剤としてファージを開発および利用する手段および組成物を提供する。
【００７４】
ストレプトコッカス・サーモフィルスは、ヨーグルトおよびチーズを生産する食物培養系の配合に主要種として利用される、低Ｇ＋Ｃのグラム陽性バクテリア種である。Ｓ．サーモフィルスの近縁株に関するゲノムの比較解析は、遺伝的多型が、ｅｐｓおよびｒｐｓオペロン、並びに２つの規則的なスペースをもつクラスター化した短かいパリンドローム様リピート（ＣＲＩＳＰＲ：ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）遺伝子座のような、高頻度可変性の遺伝子座で主として生じることをこれまでに明らかにした（例えば、ジャンセン（Ｊａｎｓｅｎ）ら、モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）４３：１５６５［２００２］；ボロティン（Ｂｏｌｏｔｉｎ）ら、マイクロバイオロジー１５１：２５５１［２００５］；およびボロティンら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）２２：１５５４［２００４］を参照）。本明細書により詳細に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、スペーサーと呼ばれる可変配列の一続きによって分離されたいくつかの不連続ダイレクトリピートから通常はなり、かつしばしば（ＣＲＩＳＰＲに結合した）ｃａｓ遺伝子の近傍にある。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の機能は生物学的に確立していないが、スペーサーのコンピュータ解析から、バクテリオファージおよびプラスミドの配列を含めて、外来エレメントとの配列相同性が明らかになった（例えば、ボロティンら、マイクロバイオロジー、上記；モジカ（Ｍｏｊｉｃａ）ら、上記；およびプールセル（Ｐｏｕｒｃｅｌ）ら、上記を参照）。ＣＲＩＳＰＲおよびｃａｓ遺伝子の役割を提案するいくつかの仮説は、もっぱらコンピュータ解析に基づいて提案されており、外来遺伝因子に対する免疫性がＲＮＡ干渉に基づくメカニズムを介して供与されることもこれに含まれる（マカロバ（Ｍａｋａｒｏｖａ）ら、バイオロジー・ダイレクト（Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ．）１：７［２００６］を参照）。しかしながら、本発明は、いかなる特定のメカニズムおよび／または作用手段にも限定される意図をもたない。
【００７５】
バクテリオファージの感染、およびその結果として生じるバクテリア培養物の不良を最小限に抑えるために、工業的に用いられる現在の方策は：（ｉ）混合スターター培養物；および（ｉｉ）ファージに対する敏感性プロフィルが異なる菌株を交互に用いること（すなわち、菌株ローテーション）を含む。伝統的に、乳業に用いられるスターター培養物は、乳酸バクテリア菌株の混合物である。混合スターター培養物の複雑な組成は、ファージ攻撃に対する一定レベルの耐性を提供することを保証する。しかしながら、混合菌株の培養物を繰り返し継代培養すると、個々の菌株の分布は予想できない変化を生じ、結果的にしばしば望ましくない菌株が優勢になってしまう。これは、次にはファージ攻撃に対する敏感性を増加させ、発酵に失敗するリスクに繋がりかねない。
【００７６】
ファージの発育を抑制するために現在用いられるまた別の手法に、異なったファージに感受性をもつ選択されたバクテリア菌株のローテーションがある。しかしながら、異なったファージ型プロフィルをもつ十分な数の菌株を同定して選択し、効率的で信頼性の高いローテーション・プログラムを提供することは、困難かつ煩雑である。加えて、菌株の連続的な使用には、新しい感染性ファージの注意深いモニタリング、および耐性バクテリア菌株による感染菌株の迅速な置き換えが必要である。多量のバルクスターター培養物を使用よりかなり前に調製する生産プラントでは、このように迅速に対応することは通常はできない。かくして、工業的に用いられる培養物の耐性を改善するために、いくつかの試みがなされてきた。
【００７７】
加えて、起源を決定できるようにスターター培養物を標識化することが有用であろうが、これまで行われなかった。実際、組換えＤＮＡ技術を用いて、タグ付け、または標識化のために合成のオリゴヌクレオチドを菌株に挿入することが可能であるが、標識化された菌株は、遺伝子組換え体と見做されることになり、その結果として商業応用上の規制問題に直面しかねない。このように、バクテリアの同定および／または追跡に用いることができるユニークな配列を、バクテリアに導入するのに適した自然な方法および組成物が当分野に必要とされている。
【００７８】
バクテリオファージは、ほぼ間違いなく地球上で最も豊富な生物学的存在である（ブライトバルトおよびローウェル（Ｂｒｅｉｔｂａｒｔ  ａｎｄ  Ｒｏｈｗｅｒ）、トレンズ・マイクロビオロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１３：２７８［２００５］を参照）。それらが至るところに分布し、かつ豊富なことは、微生物の生態学およびバクテリアのゲノムの進化に重要な影響を与える（チバーニ−チェノフィー（Ｃｈｉｂａｎｉ−Ｃｈｅｎｎｏｕｆｉ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１８６：３６７７［２００４］を参照）。かくして、バクテリアは、とりわけ吸着の阻止、ＤＮＡ注入の防止、外来ＤＮＡおよび不稔感染系の制限などファージのライフサイクルの多様な階段を狙った、様々な自然の防衛メカニズムを発達させてきた。ファージの個体数を一層よく制御するために、これらの抗ウイルス障壁を設計および操作することもできる（例えば、チバーニ−チェノフィーら、上記；並びにスツリノおよびクレンハマー（Ｓｔｕｒｉｎｏ  ａｎｄ  Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ）、ネイチャー・レビューズ・マイクロバイオロジー（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）４；３９５［２００６］）。
【００７９】
多数のバクテリアがヒトによって選択されて、発酵およびバイオテクノロジープロセスに広範に用いられてきた。残念なことに、乳製品の培養物として広く用いられる属および種を含めて、工業的に応用される培養バクテリアは、しばしばファージの攻撃に敏感である（ブルソウ（Ｂｒｕｓｓｏｗ）、アニュアル・レビュー・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）５５：２８３［２００１］を参照）。それ故に、菌株の多様性、バクテリオファージ非感受性変異体、およびファージ耐性メカニズムを担うプラスミドに基づく、ファージと戦うための様々な戦略が工業的に考え出されてきた。
【００８０】
定義
本明細書において別に定義されなければ、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されることを実施するのに、本明細書に記載されるのと同様または等価な任意の方法および材料が役立つとは言え、例となる方法および物質は、本明細書に記載される。本明細書では、文脈に明らかに別の指示がなければ、単数用語「ａ（１つの）」「ａｎ（１つの）」「ｔｈｅ（前記、該）」は、複数の参照を含む。別の指示がなければ、核酸は、５’から３’方向に左から右に書かれる；アミノ酸配列は、それぞれ、アミノからカルボキシ方向に左から右に書かれる。当然のことながら、記載される特定の方法論、プロトコル、および薬剤は、当業者がそれらを用いる状況によって変化しうるので、本発明は、これらには限定されない。
【００８１】
この明細書を通じて与えられるすべての最高数値の限定は、すべてのより低い数値の限定が、あたかも本明細書に明示的にかかるより低い数値の限定が書かれていたかのように含まれることを意図する。この明細書を通じて与えられるすべての最低数値の限定は、すべてのより高い数値の限定が、あたかも本明細書に明示的にかかるより高い数値の限定が書かれていたかのように含まれることを意図する。この明細書を通じて与えられるすべての数値範囲は、すべてのより狭い数値範囲が、あたかも本明細書に明示的にかかるより狭い数値範囲が書かれていたかのように含まれることを意図する。
【００８２】
本明細書では、用語「自然発生の」は、自然に発生するエレメントおよび／またはプロセスを指す。
【００８３】
本明細書では、用語「コンストラクト」、「コンジュゲート」、「カセット」および「ハイブリッド」は、また別の配列（例えば、プロモーターのような制御配列）に直接または間接的に付着したヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、かかる制御配列に機能できるように連結されたヌクレオチド配列を備えるコンストラクトを提供する。用語「機能できるように連結された」は、記載される構成部分が意図された仕方で機能できる関係にある並置を指す。コード配列に「機能できるように連結される」制御配列は、コード配列が、制御配列と適合する条件下で発現するように連結される。本明細書では、用語「制御配列」は、プロモーター、およびエンハンサー、並びに制御シグナルを含む。本明細書では、用語「プロモーター」は、当分野の標準的な意味、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位に用いられる。いくつかの実施形態において、コンストラクトは、例えば、バクテリアにおけるヌクレオチド配列コンストラクトを選択することを可能にするマーカーを備えるか、または発現する。用いることができる様々なマーカー、例えば抗生物質／抗菌薬耐性を提供するマーカーが存在する。
【００８４】
いくつかの実施形態において、該コンストラクトは、ベクター（例えば、プラスミド）を備える。いくつかのさらなる実施形態において、本発明は、該コンストラクトの１つまたはそれ以上、或いは本明細書に記載される配列を備えるベクターを提供する。本明細書では、用語「ベクター」は、発現ベクター、形質転換ベクターおよびシャトルベクターを含む。用語「形質転換ベクター」は、１つの実体から、同じ種でも或いは異なった種でもよい、また別の実体に導入することができるコンストラクトを意味する。１つからまた別の種に導入することができるコンストラクトは、時に「シャトルベクター」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、ベクターは、本明細書に記載されるように、然るべき宿主細胞中に形質転換される。いくつかの実施形態において、ベクターは、複製の起点、随意的にポリヌクレオチド発現のためのプロモーター、および随意的にプロモーターの制御因子が備わったプラスミドまたはファージベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカーのヌクレオチド配列を含む。工業用の微生物の最も適切な選択システムは、宿主生物における変異を必要としない、選択マーカーの群によって形成されるシステムである。いくつかの実施形態において、ベクターは、インビトロに（例えば、ＲＮＡの産生、或いは宿主細胞の形質移入または形質転換のために）用いられる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドが、クローニングまたは発現ベクターのような組換えベクター（典型的に複製可能なベクター）に組込まれる。該ベクターは、適合する宿主細胞における核酸の複製に役立つ。
【００８５】
核酸（例えば、ファージ、コンストラクトまたはベクター）の細胞への導入は、様々な方法によって達成することができる。例えば、いくつかの実施形態において、形質導入、形質転換、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥデキストラン介在形質移入、陽イオン性脂質介在形質移入、エレクトロポレーション、形質導入または感染が、役立つことができる。実際、当分野で知られる任意の適切な方法が、本発明に役立つ。いくつかの実施形態において、（ファージ、コンストラクト、またはベクターを用いて導入される）外来性の核酸を含む細胞が、当分野で知られる任意の適切な方法を用いるために選択される。
【００８６】
当分野では、細胞の形質転換に関する教材はよく文書化されている、例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：ラボラトリー・マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、１９８９、コールドスプリングハーバー研究所出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９５）、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）を参照。
【００８７】
いくつかの実施形態において、細胞に核酸を導入する文脈での用語「導入すること」は、形質転換すること、形質移入すること、接合すること、接合または形質導入することのうち１つまたはそれ以上を意味する。いくつかの特に好ましい実施形態において、バクテリア菌株（例えば、親バクテリア菌株、変異バクテリア菌株など）は、ファージの核酸がバクテリア菌株の細胞に導入されるように、少なくとも１つのファージに「暴露」される。
【００８８】
本明細書では、用語「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、および「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノム、合成、組換え（例えば、ｃＤＮＡ）を含めて、任意の核酸配列を指す。該用語は、２本鎖および／または、センス、ないしアンチセンス鎖、或いはそれらの組み合わせのいずれを表わすかに関わらず１本鎖の配列、を包含する意図をもつ。組換え核酸配列は、任意の適切な組換えＤＮＡ技術を用いることによって調製される。本明細書のいくつかの実施形態において、提供される核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓまたは他の配列をコード化する遺伝子配列を含む。実際、文脈に用いられるように、本発明は、限定されることなしに、ｃａｓ配列のみならず、スペーサー、偽スペーサー、リーダーなどを含めて、様々なＣＲＩＳＰＲ配列をコード化する核酸配列、および他のバクテリアおよびファージ（「バクテリオファージ」）の核酸配列を包含する。
【００８９】
用語「核酸分子のコード化」、「核酸配列のコード化」、「ＤＮＡ配列のコード化」および「ＤＮＡのコード化」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。ＤＮＡ配列は、このようにアミノ酸配列のためのコード化を行う。
【００９０】
細胞に核酸配列を導入する文脈で本明細書に用いられるように、用語「導入された」は、細胞に核酸を移すのに適した任意の方法を指す。かかる導入法は、限定されることなしに、プロトプラスト融合、形質移入、形質転換、接合および形質導入を含む。いくつかの特に好ましい実施形態において、核酸は、受容細胞がバクテリオファージ（単数または複数）に感染した時点で該細胞に導入される。
【００９１】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される核酸配列および核酸は、単離されるか、または実質的に精製される。「単離される」または「実質的に精製される」は、核酸分子、またはその生物学的に活性なフラグメントないし変異形、相同体、或いはそれらの誘導体に、自然な状態では核酸に結合して標準的に見出される成分が、実質的或いは本質的にないことを意図する。かかる成分は、限定されることなしに、他の細胞物質、培地、組換え産生による物質、および核酸の化学合成に用いる様々な化学物質を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、「単離された」核酸配列または核酸は、該核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡでは件の核酸の脇に接している核酸配列（例えば、５’または３’末端に存在するコード配列）が、典型的にはない。しかしながら、該分子は、組成物の基本的な特性に悪影響を与えないいくつかの付加的な塩基または部分を含んでいてもよい。
【００９３】
本明細書では、用語「改変」は、核酸および／またはアミノ酸配列内でなされる変化を指す。いくつかの実施形態において、改変は、遺伝子操作（例えば、組換え）の方法を用いて達成されるが、一方で他の実施形態において、改変は、自然発生の遺伝メカニズムを用いてなされる。本発明の方法を用いて、配列のすべてまたは部分が改変されることが意図される。いくつかの好ましい実施形態において、改変される核酸は、１つまたはそれ以上の自然発生の、或いは組換えによって産生される、ＣＲＩＳＰＲスペーサー、ｃａｓ遺伝子またはタンパク質、ＣＲＩＳＰＲリピート、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、並びにバクテリオファージの核酸を含む。当分野で知られる任意の適切な方法は、限定されることなしに、ＰＣＲ、クローニング、部位特異的変異誘発の使用を含めて、本発明に役立つ。実際、市販キットが本発明に役立つ。いくつかの実施形態においては、合成のオリゴヌクレオチドが用いられる。いくつかの実施形態において、相同組換えのような方法が、（例えば、ＲＩＳＰＲスペーサーの挿入または削除に）役立つ。いくつかの実施形態において、遺伝子操作は、１つまたはそれ以上の核酸配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、ＣＲＩＳＰＲリピート、ＣＲＩＳＰＲスペーサー、ｃａｓ遺伝子またはタンパク質、ｃａｓ遺伝子またはタンパク質およびＣＲＩＳＰＲリピートの機能的な組み合わせ、或いはそれらの組み合わせ）の活性化を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、少なくとも１つＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に挿入される。いくつかのさらなる実施形態において、改変は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子を遮らない。他の実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子は、もとのままである。いくつかの付加的な実施形態において、改変は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の１つまたはそれ以上ＣＲＩＳＰＲリピートを遮らない。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートは、もとのままである。いくつかのさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、少なくとも１つＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその内に挿入される。いくつかのさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端に挿入される。
【００９５】
いくつかの実施形態において、改変は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを細胞（例えば、受容細胞）に挿入することを備える。いくつかの他の実施形態において、改変は、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを、受容細胞の１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーに（例えば、改変または置き換えのために）挿入することを備える。いくつかの実施形態において、細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーは同じであるが、一方で他の実施形態において、それらは異なっている。いくつかの実施形態において、改変は、ドナー生物からの少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを受容細胞に挿入することを備える。いくつかのさらなる実施形態において、改変は、受容細胞の１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを改変するか、または置き換えるのに適した条件下で、ドナー生物からの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを受容細胞に挿入することを備える。いくつかの実施形態において、ドナー生物からの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、細胞の１つまたはそれ以上、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートに挿入される。いくつかの好ましい実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせは、細胞中においてもとのままである。
【００９６】
いくつかのさらなる実施形態において、挿入は、１つまたはそれ以上の（好ましくは２つまたはそれ以上の）ＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽スペーサーに近接して生じる。本明細書では、用語「近接して」は、その最も広い意味で「の隣で」を意味し、「直接に近接して」を含む。かくして、いくつかの実施形態において、生物からの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、受容細胞の１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに「直接に近接して」挿入される。（すなわち、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）は、スペーサー間にいかなる介在ヌクレオチドもないように挿入される）。
【００９７】
いくつかの付加的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）は、少なくとも約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１０，０００、１約００，０００、または約１，０００，０００或いはそれ以上の介在クレオチドがスペーサー間に存在するように、挿入される。
【００９８】
いくつかのさらなる実施形態において、介在ヌクレオチドは、「リーダー配列」と呼ばれる。これらの用語は、本明細書で同義に用いられる。リーダー配列は、異なったバクテリアにおいて異なった長さであってもよい。いくつかの実施形態において、リーダー配列は、少なくとも約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約２００、約３００、約４００、または約５００或いはそれ以上のヌクレオチド長である。いくつかの好ましい実施形態において、リーダー配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の最後の（３’末端における）ｃａｓ遺伝子および最初の（５’末端における）ＣＲＩＳＰＲリピートの間にある。いくつかの実施形態において、リーダー配列は、約２０〜５００ヌクレオチド長の間にある。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ドナー生物からの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、受容細胞の１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子に近接して挿入され、該ｃａｓ遺伝子は同じか、または異なる。いくつかの付加的な実施形態において、ドナー生物からの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、受容細胞の同じか、または異なったスペーサーに近接して挿入される。
【０１００】
また別の実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、例えば、ドナー生物からの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、細胞の同じか、または異なったＣＲＩＳＰＲリピートに近接して各々が挿入される。また別の実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、例えば、ドナー生物からの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーの各々は、受容細胞の同じか、または異なったｃａｓ遺伝子に近接して挿入される。
【０１０１】
いくつかのさらなる実施形態において、ドナー生物からの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）が、ドナー生物のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対してＣＲＩＳＰＲスペーサーが相同性をもつように受容細胞が改変される条件下で、提供される。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、ドナー生物のＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して１００％の相同性をもつ。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、ゲノム、合成、または組換え起源のＤＮＡまたはＲＮＡを備える。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、２本鎖であるが、しかし一方で他の実施形態において、それらはセンスまたはアンチセンス鎖、或いはそれらの組み合わせに関わらず、一本鎖である。本明細書に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、組換えＤＮＡ技術（例えば、組換えＤＮＡ）を用いて調製することが考えられる。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、改変は、標的核酸またはその転写産物に対して実質的に耐性をもつドナー生物からの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを、実質的に感受性をもつ細胞の１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に挿入することを備える。いくつかの実施形態において、挿入は、実質的に感受性をもつ細胞における少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピート、および少なくとも１つのｃａｓ遺伝子の機能的な組み合わせに、またはその間に生じる。いくつかの実施形態において、改変は、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子が細胞のＤＮＡでつくり出されるように、受容細胞のＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を改変すること（例えば、変異させること）を備える。いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子は、コンストラクト、プラスミドまたはベクターなどの中にクローニングされて、次にそれが任意の適切な方法を用いて細胞中に形質転換される。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、改変は、１つまたはそれ以上、好ましくは２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートが細胞のＤＮＡでつくり出されるように、受容細胞の（例えば、プラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのような）ＤＮＡを改変すること（例えば、変異させること）を備える。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピートは、コンストラクト、プラスミドまたはベクターなどの中にクローニングされて、次にそれが任意の適切な方法を用いて、細胞中に形質転換される。
【０１０５】
いくつかのさらなる実施形態において、改変は、１つまたはそれ以上のｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲリピートの機能的な組み合わせが細胞のＤＮＡでつくり出されるように、受容細胞のＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を改変すること（例えば、変異させること）を備える。いくつかの実施形態において、ｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲリピートの機能的な組み合わせは、コンストラクト、プラスミドまたはベクターの中にクローニングされることができ、次にそれが、任意の適切な方法を用いて、細胞中に形質転換される。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、改変は、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーが細胞のＤＮＡでつくり出されるように、受容細胞のＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を改変すること（例えば、変異させること）を備える。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、コンストラクト、プラスミドまたはベクターの中にクローニングされることができ、次にそれが、任意の適切な方法を用いて、細胞中に形質転換される。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、２つのＣＲＩＳＰＲリピートが脇に接している（すなわち、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、両脇に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲリピートをもつ）。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、改変は、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子および／またはリーダー配列の近傍に（例えば、近接して／直接に近接して）、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー（例えば、非相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサー）を挿入することを備える。かくして、いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーの挿入後に、自然発生のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の構成が維持される。
【０１０８】
本明細書では、用語「標的核酸」は、それに対する細胞（例えば、受容細胞）の耐性が調節される、任意の核酸配列またはその転写産物を指す。いくつかの実施形態において、耐性は、標的核酸の配列それ自体を対象とする。有利なことに、これは、標的核酸（単数または複数）の起源となり得るドナー生物に対する耐性を細胞に与える。かくして、いくつかの実施形態において、バクテリオファージに由来する偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、或いは１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に相補的または相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）を受容細胞に挿入することは、バクテリオファージに対する耐性を授ける。かくして、いくつかの好ましい実施形態において、バクテリオファージに由来する偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、或いは１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に相補的または相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）を、受容細胞中の２つのＣＲＩＳＰＲリピートの間に挿入することは、バクテリオファージに対する耐性を授ける。さらなる様態において、標的核酸またはその転写産物に対する受容細胞の耐性を調節する方法が提供されている。
【０１０９】
本発明は、標的核酸に対する細胞の耐性プロフィルを決定する方法も提供する。本明細書では、用語「耐性プロフィル」は、細胞が、それに対する感受性または耐性をもつ１つまたはそれ以上の実体を意味する。従って、いくつかの実施形態において、細胞の耐性プロフィルは、細胞が、第１のバクテリオファージに対する耐性をもつこと、第２のバクテリオファージに対する感受性をもつこと、第1の可動遺伝因子に対する耐性をもつこと、および第1の抗生物質耐性遺伝子に対する感受性をもつことなどを反映する。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、細胞内の１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子またはタンパク質、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピート、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子、１つまたはそれ以上のｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲリピートの機能的な組み合わせ、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー、および／または１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーなどが、特定の細胞の確からしい耐性プロフィルを予測／決定するために、検出および／または配列決定される。いくつかの他の実施形態において、細胞内の１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーが、特定の細胞の確からしい耐性プロフィルを予測／決定するために、検出または配列決定される。適切な検出方法は、ＰＣＲ、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイなどを含むが、それらには限定されない。実際、任意の適切な方法が本発明に役立つことが意図される。付加的な実施形態において、微生物を選択するための溶原型の予測因子として、１つまたはそれ以上のバクテリオファージに対する特定のバクテリア細胞の確からしい耐性プロフィルが用いられる。いくつかのさらなる実施形態において、ｃａｓ遺伝子−ＣＲＩＳＰＲリピートの組み合わせの両立性を検証するため、または両立し得るｃａｓ／リピートの組み合わせの新しいペアを同定するために、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーに加えて、１つまたはそれ以上のＣａｓ遺伝子、および／または１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートが、配列決定される。
【０１１１】
本明細書では、用語「耐性を調節すること」は、文脈から解釈されるように、標的核酸に対する細胞の耐性を抑制する、低減する、減少させる、誘発する、授ける、回復させる、高める、増加させる、或いは別なように影響を与えることを示す。
【０１１２】
本明細書では、用語「耐性」は、細胞が、標的核酸またはその転写産物に対して１００％耐性があることを示唆する意図はもたないが、しかし標的核酸またはその転写産物に対して寛容な細胞を含む。
【０１１３】
本明細書では、用語「標的核酸またはその転写産物に対する耐性」は、標的核酸またはその転写産物を備えるか、または産生する細胞または生物（例えば、ファージ）に対する耐性が授けられることを意味する。いくつかの実施形態において、標的核酸またはその発現産物に対する免疫または耐性を授けるのに必要な最小限の構成要素は、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子（または１つのＣａｓタンパク質）、およびスペーサーに隣接する少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートである。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節する（例えば、授けるか、または増加させる）方法であって、生物における配列（例えば、保存配列）を同定するステップ（好ましくは、生物の機能または生存に不可欠な配列）；同定された配列に対して相同的な（例えば、１００％同一の）配列を備えるＣＲＩＳＰＲスペーサーを調製するステップ；少なくとも１つのｃａｓ遺伝子、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを、該ＣＲＩＳＰＲスペーサーとともに備える核酸を調製するステップ；および（ｉｖ）かくして細胞に標的核酸またはその転写産物に対する耐性を与えるために、細胞を該核酸で形質転換するステップを備える方法を提供する。
【０１１５】
本明細書に用いられるように、生物の保存配列を同定する文脈における用語「保存配列」は、所与の生物からの１つの配列に関する知識で十分なので、最も厳密な意味で保存されている必要は必ずしもない。その上に該配列は、必須の実体の部分である必要はない。しかしながら、いくつかの実施形態において、保存配列は、生物または細胞の機能、および／または生存、および／または複製、および／または感染性などに必須の配列である。いくつかの実施形態において、保存配列は、ヘリカーゼ、プライマーゼ、ヘッドまたはテール構造蛋白質、保存ドメインをもつタンパク質（例えば、ホーリング（ｈｏｌｉｎｇ）、リジンなど）、或いは重要なファージ遺伝子のうちの保存配列を備える。
【０１１６】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節する（例えば、授けるか、または増加させる）方法であって、標的核酸またはその転写産物に対する耐性をもつ生物における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを、同定された１つまたはそれ以上のスペーサーとともに備える組換え核酸を調製するステップ；およびかくして受容細胞に標的核酸またはその転写産物に対する耐性を与えるために、細胞を該組換え核酸で形質転換するステップを備える方法を提供する。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートを備える細胞の、標的核酸またはその転写産物に対する耐性を調節する（例えば、授けるか、または増加させる）方法であって、標的核酸またはその転写産物に対する耐性をもつ生物における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；およびＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）が、該生物におけるＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して相同性をもつように、細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）の配列を改変するステップを備える方法を提供する。いくつかの実施形態において、標的核酸に対する耐性を細胞に与えるために、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）が標的核酸またはその転写産物に対して実質的に耐性をもつドナー生物における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に相同性をもつように、受容細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーが改変される（例えば、遺伝子操作される）。いくつかの好ましい実施形態において、細胞における１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートは、明細書に記載されるように機能的な組み合わせである。
【０１１８】
遺伝子操作法は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、ドナー生物の１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して相同性（例えば、遺伝子操作後に増加した相同性）をもつように、細胞において１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー、および／または１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を加える（例えば、挿入する）、削除する（例えば、除去する）または改変する（例えば、変異させる）ことを含むがそれらには限定されない、当分野で知られる任意の適切な方法を含む。この操作ステップの結果として、標的核酸またはその転写産物に対して実質的に感受性があった細胞は、該標的核酸またはその転写産物に対して実質的に耐性をもつようになる。
【０１１９】
いくつかの付加的な実施形態において、本発明は、少なくとも１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートを備える受容細胞の、標的核酸またはその転写産物に対する耐性を減少させるか、または低減する方法を提供する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、本方法は、標的核酸またはその転写産物に対して実質的に耐性をもつ生物における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；およびＣＲＩＳＰＲスペーサーが、該生物におけるＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に対して低減された度合の相同性をもつように、細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）の配列を改変するステップを備える。
【０１２１】
他の実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートを備える細胞の、標的核酸またはその転写産物に対する耐性を調節する（例えば、減少させる）方法であって、該方法は、それに対する耐性を調節すべき標的核酸またはその転写産物を備える生物におけるＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および耐性が調節されるべき生物におけるＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；並びに（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、それに対する耐性を調節すべき標的核酸またはその転写産物を備える生物のＣＲＩＳＰＲスペーサー、または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対してより低い度合の相同性をもつように、耐性が調節されるべき生物におけるＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を適応させるステップを備える。
【０１２２】
実質的に耐性をもつ細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーが、標的核酸に対する感受性を細胞に与えるために操作される。役立つ遺伝子操作法は、限定されることなしに、実質的に耐性をもつ細胞における、１つまたはそれ以上の機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせ、ないしその部分、或いはフラグメントの付加（例えば、挿入）、削除（例えば、除去）または改変、および／または実質的に耐性をもつ細胞における、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー、ないしその部分、或いはフラグメントの付加（例えば、挿入）、削除（例えば、除去）または改変を含む。この操作ステップの結果として、標的核酸またはその転写産物に対して実質的に耐性があった細胞は、標的核酸またはその転写産物に対して実質的に感受性をもつようになる。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、細胞に感受性を授けるために、実質的に耐性をもつ細胞から、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピート、および／または１つまたはそれ以上の機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせが、耐性がもはや授けられないように除去、削除、または改変することが考えられる。いくつかの実施形態において、標的核酸またはその転写産物に対する感受性をもつ細胞が、所与の培養物（例えば、スターター培養物）におけるそれらのレベルが所望の通り調節（例えば、低減）できるように調製される。かくして、いくつかの実施形態において、培養物のすべてのメンバーが同じエージェント（例えば、同じバクテリオファージ）に対して感受性をもつ、２つまたはそれ以上のバクテリア菌株を備えるスターター培養物が開発される。かくして、培養物の生存がもはや望まれなくなると、培養物は、培養物中のすべてのメンバーを殺すために同じ１つのエージェントに接触される。いくつかの実施形態において、エージェントが所与の培養物中の細胞を一定の割合（例えば、培養物中の細胞の約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約９５％）だけを殺すように、細胞の感受性が、１つまたはそれ以上のエージェント（例えば、ファージ）に対して調節される。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、受容細胞は、偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対応するＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは配列を備えるように操作され、それによって標的核酸またはその転写産物に対する耐性が細胞に与えられる。適切には、本明細書に記載されるように、細胞は、偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対応するＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは配列が、機能的なｃａｓ遺伝子−ＣＲＩＳＰＲリピートの組み合わせと一緒に用いられるように操作される。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、標的核酸またはその転写産物に対する耐性をもつ細胞は、標的核酸またはその転写産物に対する免疫を授けるＣＲＩＳＰＲスペーサーが、機能的なｃａｓ遺伝子−ＣＲＩＳＰＲリピートの組み合わせを備える細胞に挿入されるように操作され、それによって標的核酸またはその転写産物に対する耐性が細胞に与えられる。
【０１２６】
いくつかのさらなる実施形態において、標的核酸またはその転写産物に対する耐性をもつ細胞の１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列が決定される。受容細胞は、次に該ＣＲＩＳＰＲスペーサー、および機能的なｃａｓ遺伝子−ＣＲＩＳＰＲリピートの組み合わせの配列を備えるように操作され、それによって標的核酸またはその転写産物に対する耐性が細胞に与えられる。
【０１２７】
いくつかの付加的な実施形態において、受容細胞からのＣＲＩＳＰＲスペーサー、および同じか、または異なった細胞（例えば、同じか、または異なった受容細胞）からの機能的なｃａｓ遺伝子−ＣＲＩＳＰＲリピートの組み合わせが調製される。さらなる受容細胞が、次に該ＣＲＩＳＰＲスペーサー配列、および機能的なｃａｓ遺伝子−ＣＲＩＳＰＲリピートの組み合わせを備えるように操作され、それによって標的核酸またはその転写産物に対する耐性が細胞に与えられる。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、耐性は、標的核酸配列の転写産物（例えば、標的核酸配列の転写物、特にＲＮＡまたはｍＲＮＡ）、転写物（例えば、センスまたはアンチセンスＲＮＡ転写物）、或いはポリペプチド転写産物を対象とする。いくつかの実施形態において、これは、転写産物が由来するドナー生物に対する耐性を細胞に授ける。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、ゲノム、合成または組換え起源のＤＮＡまたはＲＮＡを備える。いくつかのさらなる実施形態において、該ヌクレオチド配列は２本鎖であり、一方で他の実施形態において、それはセンス、またはアンチセンス鎖、或いはそれらの組み合わせのいずれを表すかに関わらず、１本鎖である。さらに付加的な実施形態において、該ヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術（例えば、組換えＤＮＡ）を用いることによって調製される。該ヌクレオチド配列は、なおさらなる実施形態において自然発生の形態と同じであり、一方で他の実施形態において、それに由来する。またさらなる実施形態において、標的核酸配列は、遺伝子に由来する。いくつかの他の実施形態において、標的核酸配列は、変異形、相同体、遺伝子のフラグメントまたは誘導体に由来する。いくつかの好ましい実施形態において、標的核酸配列は、バクテリオファージであるか、或いはそれに由来する。いくつかの実施形態において、標的核酸配列は、プラスミドＤＮＡに由来する。いくつかの実施形態において、標的核酸配列は、可動遺伝因子に由来する。いくつかの付加的な実施形態において、標的核酸配列は、転位因子または挿入配列に由来する。さらに付加的な実施形態において、標的核酸配列は、耐性を授ける遺伝子に由来する。いくつかのさらなる実施形態において、標的核酸配列は、抗生物質または抗菌薬に対する耐性を授ける遺伝子に由来する。いくつかの実施形態において、標的核酸配列は、毒性因子に由来する。いくつかの付加的な実施形態において、標的核酸配列は、トキシン、インターナリンまたはヘモリシンに由来する。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、核酸配列またはその転写産物は、１つまたはそれ以上のバクテリアに由来する。かくして、いくつかの好ましい実施形態において、バクテリア細胞の耐性が、本発明の方法および組成物を用いて調節される。いくつかの好ましい実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、バクテリアにおけるプラスミドの導入に対する耐性に関わる遺伝子に由来する。いくつかの実施形態において、細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーは、細胞の該ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、バクテリア細胞のプラスミドＤＮＡに含まれるＣＲＩＳＰＲスペーサーおよび／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに相同性をもつように改変され、それによって特定のプラスミド（単数または複数）に対する耐性を提供する。かくして、細胞への外来ＤＮＡの導入が防がれる。いくつかの好ましい実施形態において、プラスミドＤＮＡに対する免疫を提供するために、プラスミドＤＮＡ内の特定の領域が標的とされる。例えば、いくつかの実施形態において、プラスミドの複製起源内の配列、すなわち複製タンパク質をコード化する遺伝子内の配列が標的とされる。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、本発明は、それに対する耐性を調節すべきバクテリア細胞のプラスミドＤＮＡに由来するＣＲＩＳＰＲスペーサーおよび／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーが、該バクテリア細胞のプラスミドＤＮＡに含まれるＣＲＩＳＰＲスペーサーおよび／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して相同性をもつように、耐性が調節されるべき細胞におけるＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を改変するステップを備える方法を提供する。
【０１３２】
なおさらなる実施形態において、本発明は、プラスミドの導入に対する耐性を細胞に授けるための方法であって、プラスミドＤＮＡに由来するＣＲＩＳＰＲスペーサーおよび／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；プラスミドに対して実質的に感受性をもつ細胞における１つまたはそれ以上の機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓ遺伝子の組み合わせを同定するステップ；実質的に感受性をもつ細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が、プラスミドからの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーおよび／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを備えるようにそれらを操作するステップを備え、それによって細胞に耐性を与える方法を提供する。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、１つまたはそれ以上の可動遺伝因子に対する耐性に関わる遺伝子に由来する。いくつかの実施形態において、可動遺伝因子（例えば、転位因子および挿入配列）に対する耐性を提供するために、１つまたはそれ以上の可動遺伝因子に由来する、特定のＣＲＩＳＰＲスペーサー、および／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、細胞のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に加えられ、かくして外来ＤＮＡの導入および遺伝的浮動を防ぐ。いくつかの実施形態において、可動遺伝因子に対する免疫を提供するために、トランスポゾン内の特定領域および挿入配列が標的とされる。例えば、いくつかの実施形態において、標的は、限定されることなしに、接合性トランスポゾン（Ｔｎ９１６）、クラスＩＩトランスポゾン（Ｔｎ５０１）、挿入配列（ＩＳ２６）およびトランスポゼース遺伝子を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、本発明はそれに対する耐性を調節すべき細胞の１つまたはそれ以上の可動遺伝因子に由来するＣＲＩＳＰＲスペーサーおよび／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および耐性が調節されるべき細胞におけるＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を、該細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーおよび／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、細胞の該可動遺伝因子（単数または複数）に含まれるＣＲＩＳＰＲスペーサーに相同性をもつように改変するステップを備える方法を提供する。
【０１３５】
なおさらなる実施形態において、本発明は、１つまたはそれ以上の可動遺伝因子に対する耐性を細胞に授ける方法であって、１つまたはそれ以上の可動遺伝因子に由来するＣＲＩＳＰＲスペーサー、および／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；１つまたはそれ以上の可動遺伝因子に実質的に感受性をもつ細胞における、１つまたはそれ以上の機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせを同定するステップ；および細胞に耐性を与えるために、１つまたはそれ以上の可動遺伝因子からの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーおよび／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して相同性を備えるか、またはもつように、実質的に感受性をもつ細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を操作するステップ、を備える方法を提供する。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、抗生物質および／または抗菌薬に対する耐性に関わる遺伝子に由来する。本明細書では、用語「抗菌薬」は、微生物の成長または繁殖を殺すか、または抑制する任意の組成物を指す。該用語は、合成的に製造された組成物のみならず、抗生剤（すなわち、他の微生物によって産生される組成物）も包含する。抗菌薬耐性遺伝子は、ｂｌａｔｅｍ、ｂｌａｒｏｂ、ｂｌａｓｈｖ、ａａｄＢ、ａａｃＣ１、ａａｃＣ２、ａａｃＣ３、ａａｃＡ４、ｍｅｃＡ、ｖａｎＡ、ｖａｎＨ、ｖａｎＸ、ｓａｔＡａａｃＡ−ａｐｈＨ、ｖａｔ、ｖｇａ、ｍｓｒＡ  ｓｕｌ、および／またはｉｎｔを含むが、それらには限定されない。抗菌薬耐性遺伝子は、エシェリキア属、クレブシエラ属、シュードモナス属、プロテウス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、ヘモフィルス属（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、およびモラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）を含むが、それらには限定されないバクテリア種から得られるものを含む。抗菌薬耐性遺伝子は、同様に大腸菌（Ｅｓｃｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、腐生ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）およびカタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）を含むが、それらには限定されないバクテリア種から得られるものを含む。いくつかの実施形態において、抗菌薬耐性のコード化遺伝子に由来する特定のＣＲＩＳＰＲスペーサー、および／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、耐性遺伝子の導入を妨げる条件下で、受容細胞のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に加えられる。かくして、抗菌薬耐性遺伝子（すなわち、マーカー）を獲得するリスクが低減される。いくつかの実施形態において、標的は、ｖａｎＲ（すなわち、バンコマイシン耐性）、ｔｅｔＲ（すなわち、テトラサイクリン耐性）および／またはβラクタマーゼ耐性を提供する耐性因子も含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、本発明は、１つまたはそれ以上の抗菌薬耐性遺伝子またはマーカーを備える細胞に由来する１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー、および／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および抗菌薬耐性遺伝子またはマーカーを備えないか、または発現しない細胞におけるＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を、該細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーが、１つまたはそれ以上の抗菌薬耐性遺伝子またはマーカーを備える細胞に含まれる１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーおよび／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して相同性をもつように、改変するステップを備える方法を提供する。
【０１３８】
なおさらなる実施例において、本発明は、細胞における抗菌薬耐性マーカーの獲得を調節する方法であって、１つまたはそれ以上の抗菌薬耐性遺伝子またはマーカーを備える細胞に由来する１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー、および／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；抗菌薬耐性遺伝子またはマーカーを備えないか、または発現しない細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を同定するステップ；および抗菌薬耐性遺伝子またはマーカーを備えないか、または発現しない細胞におけるＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を、該ＣＲＩＳＰＲスペーサーおよび／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、遺伝子の導入に対して耐性をもつ細胞に含まれるＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して相同性をもつをもつように改変して、１つまたはそれ以上の抗菌薬に対する耐性を授けるステップを備える方法を提供する。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、毒性因子（単数または複数）に関わる少なくとも１つの遺伝子に由来する。いくつかの実施形態において、バクテリアに毒性を与える遺伝子の導入に対する耐性を提供するために、毒性因子をコード化する遺伝子に由来する特定のＣＲＩＳＰＲスペーサーおよび／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に加えられる。いくつかの実施形態において、微生物（例えば、病原体における）毒性に一般に寄与する、トキシン、インターナリン、ヘモリシンおよび他の毒性因子のような因子が標的とされる。
【０１４０】
本発明は、方法であって、１つまたはそれ以上の毒性因子を備える細胞に由来する、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー、および／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および毒性因子（単数または複数）或いはマーカー（単数または複数）を備えないか、または発現しない細胞におけるＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を、該細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーが、１つまたはそれ以上の毒性因子を備える細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー、および／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して相同性をもつように、改変するステップを備える方法も提供する。
【０１４１】
なおさらなる実施形態において、本発明は、１つまたはそれ以上の毒性因子（単数または複数）或いはマーカー（単数または複数）に対する耐性を細胞に授ける方法であって、１つまたはそれ以上の毒性因子（単数または複数）或いはマーカー（単数または複数）に由来するＣＲＩＳＰＲスペーサー、および／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；１つまたはそれ以上の毒性因子（単数または複数）或いはマーカー（単数または複数）に対して実質的に感受性をもつ細胞における、１つまたはそれ以上の機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせを同定するステップ；および細胞に耐性を与えるために、実質的に感受性をもつ細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、毒性因子（単数または複数）或いはマーカー（単数または複数）からの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー、および／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを備えるように操作するステップを備える方法を提供する。
【０１４２】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、ＣＲＩＳＰＲスペーサー、偽ＣＲＩＳＲスペーサー、ｃａｓ遺伝子またはタンパク質、ＣＲＩＳＰＲリピート、機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓ遺伝子の組み合わせおよび標的核酸配列またはその転写産物の変異形、相同体、誘導体およびフラグメントを含む変異形、相同体、誘導体およびそれらのフラグメントの使用を包含する。
【０１４３】
用語「変異形」は、野生型配列とは異なる自然発生のポリペプチドまたはヌクレオチド配列を意味するために用いられる。
【０１４４】
用語「フラグメント」は、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列が野生型配列の画分を備えることを示す。それは、配列の１つまたはそれ以上の大きい連続セクション、または複数の小さいセクションを備えてもよい。該配列は、配列の他のエレメントも備えることができ、例えば、それはまた別のタンパク質との融合蛋白質であってもよい。好ましくは、該配列は、野生型配列の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％を備える。
【０１４５】
好ましくは、該フラグメントは、野生型ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、または最も好ましくは９９％の活性を保持する。
【０１４６】
好ましくは、ＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、野生型配列の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％を備える。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、野生型ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、または最も好ましくは９９％の活性を保持する。
【０１４７】
好ましくは、ｃａｓ遺伝子は、野生型配列の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％を備える。好ましくは、ｃａｓ遺伝子は、野生型ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、または最も好ましくは９９％の活性を保持する。
【０１４８】
好ましくは、Ｃａｓタンパク質は、野生型配列の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％を備える。好ましくは、Ｃａｓタンパク質は、野生型ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、または最も好ましくは９９％を保持する。
【０１４９】
好ましくは、ＣＲＩＳＰＲリピートは、野生型配列の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％を備える。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲリピートは、野生型ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、または最も好ましくは９９％の活性を保持する。
【０１５０】
好ましくは、機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせは、野生型配列の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％を備える。好ましくは、機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせは、野生型ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、または最も好ましくは９９％の活性を保持する。
【０１５１】
好ましくは、標的核酸配列は、野生型配列の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％を備える。好ましくは、標的核酸配列は、野生型ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、または最も好ましくは９９％の活性を保持する。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、該フラグメントは、機能的なフラグメントである。分子の「機能的なフラグメント」は、もとのままの分子と実質的に同じ生物活性を保持または所有するフラグメントと理解される。すべての例において、分子の機能的なフラグメントは、もとのままの分子の生物活性の少なくとも１０％および少なくとも約２５％、約５０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％、を保持する。
【０１５３】
用語「相同体」は、対象アミノ酸配列および対象ヌクレオチド配列とある相同性をもつ実体を意味する。ここで、用語「相同性」は「同一性」と同じと見做すことができる。
【０１５４】
本文脈において、相同配列は、対象配列に対して少なくとも７５、８５または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る、アミノ酸配列を含むと解釈される。相同性は、類似性（すなわち、類似した化学的特性／機能をもつアミノ酸残基）の観点からも考えることができるが、本発明の文脈において、相同性は、配列の同一性の観点から表現することが望ましい。
【０１５５】
本文脈において、相同配列は、対象配列に対して少なくとも７５、８５または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る、ヌクレオチド配列を含むと解釈される。相同性は、類似性（すなわち、類似した化学的特性／機能をもつアミノ酸残基）の観点からも考えることができるが、本発明の文脈において、相同性は、配列の同一性の観点から表現することが望ましい。
【０１５６】
相同性の比較は、目視によって、或いはより普通に利用しやすい配列比較プログラムを活用して行うことができる。これらの市販コンピュータ・プログラムは、２つまたはそれ以上の配列間の％相同性を計算することができる。
【０１５７】
パーセント（％）相同性は、連続した配列にわたって計算することができる（すなわち、１つの配列が他の配列にアラインメントされて、１つの配列における各アミノ酸が、他の配列における対応するアミノ酸と一回に１残基ごとに直接比較される）。これは「ギャップのない」アラインメントと呼ばれる。典型的に、かかるギャップのないアラインメントは、比較的短い残基数にわたってしか行なわれない。
【０１５８】
これは非常に簡便で着実な方法であるが、例えば、他はまったく同じ配列ペアについて１つの挿入または欠失が、次のアミノ酸残基のアラインメントずれを生じさせ、かくしてグローバル・アラインメントを行ったときに％相同性が大きく減少してしまう可能性が考慮されていない。そのため、ほとんどの配列比較法は、挿入および欠失の可能性を考慮に入れて、総合的な相同性スコアを不当に損なうことなく最適アラインメントを行うように設計されている。これは配列アラインメントに「ギャップ」を挿入し、局所的な相同性を最大化することによって達成される。
【０１５９】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、アラインメントに生じる各々のギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てるので、同一のアミノ酸の同じ数に対して、ギャップが多いものに比べてできるだけギャップが少ない配列アラインメントが、２つの比較配列間の関連性がより高いことを反映して、より高いスコアを達成することになる。通常は、ギャップの存在に対して相対的に高いコスト、ギャップ中に続く個々の残基に対してより小さいペナルティを課す「アフィン・ギャップコスト」が用いられる。これは、最もよく利用されるギャップスコア・システムである。ギャップペナルティーが高いと、アラインメントはもちろんギャップがより少ないときに最適化されることになる。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを修正することが可能である。しかしながら、かかるソフトウェアを配列比較に用いるときには、デフォルト値を用いることが望ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを用いるとき、アミノ酸配列に対するギャップペナルティーのデフォルト値は、ギャップに対して−１２、各伸長に対して−４である。それ故に、最大％相同性の計算は、初めにギャップペナルティーを考慮に入れて、最適なアラインメントを生成する必要がある。
【０１６０】
かかるアラインメントを実行するのに適したコンピュータ・プログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；デブロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら、１９８４、ニュークリイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１２：３８７）。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例は、限定されることなしに、ＢＬＡＳＴパッケージ（アウスベルら、１９９９、上記、第１８章を参照）、ＦＡＳＴＡ（アッシュル（Ａｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９０、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー  ４０３−４１０）、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールセット、およびＣＬＵＳＴＡＬを含む。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは、両方ともにオフラインおよびオンライン検索に利用できる（アウスベルら、１９９９、上記、ページ７−５８〜７−６０を参照）。しかしながら、いくつかの応用にはＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを用いることが望ましい。タンパク質およびヌクレオチド配列を比較するために、ＢＬＡＳＴ  ２と呼ばれる新しいツールも利用可能である（ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レターズ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ）１９９９,１７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レターズ  １９９９,１７７（１）：１８７−８を参照）。
【０１６１】
最終的な％相同性は、同一性の観点から測定することができるが、アラインメント処理自身は、全か無かのペア比較に通常は基づいていない。その代わりに、化学的な類似性または進化距離に基づいて各々のペアを比較して、スコアを割り当てるスケーリングされた類似性スコア・マトリックス（ｓｃａｌｅｄ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ）が一般に用いられる。一般に用いられるかかるマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、すなわちＢＬＡＳＴプログラムセットのためのデフォルトマトリックスである。ＧＣＧウィスコンシンプログラムは、一般に公開デフォルト値、または供給されるならばカスタムのシンボル比較テーブルのいずれかを用いる（さらに詳細にはマニュアルを参照）。いくつかの応用に関して、ＧＣＧパッケージングには公開デフォルト値、または他のソフトウェアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリックを用いることが望ましい。
【０１６２】
ソフトウェアが最適なアラインメントを与えた時点で、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能である。ソフトウェアは、通常は配列比較の一部分としてこれを行い、数値結果を発生させる。
【０１６３】
配列同一性を決定するときに、もしギャップペナルティを用いる必要があれば、その時には次のパラメータは用いることが適切である：
【０１６４】
【表１】
2010519929.tif 000004
【０１６５】
ポリペプチドの配列比較に対して、次の設定を用いることができる：３．０のＧＡＰ生成ペナルティ、および０．１のＧＡＰ伸張ペナルティ。適切には、アミノ酸配列に関する同一性の度合いは、少なくとも５つの近接アミノ酸にわたって決定され、少なくとも１０の近接アミノ酸にわたって、少なくとも１５の近接アミノ酸にわたって、少なくとも２０の近接アミノ酸にわたって、少なくとも３０の近接アミノ酸にわたって、少なくとも４０の近接アミノ酸にわたって、少なくとも５０の近接アミノ酸にわたって、または少なくとも６０の近接アミノ酸にわたって決定される。
【０１６６】
本配列は、サイレントな変化をつくり出して機能的に同等の物質をもたらす、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有してもよい。物質の２次的な結合活性が維持されるならば、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒特性に基づいて、意図的にアミノ酸を置換することが可能である。例えば、負電荷を帯びたアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み；正電荷を帯びたアミノ酸は、リジンおよびアルギニンを含み；親水性値が同様の無電荷極性頭部基をもつアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。
【０１６７】
同類置換は、例えば、以下のテーブルに従ってなされることができる。第２列の同じブロック、および好ましくは第３列の同じラインにおけるアミノ酸は、相互に置換されることができる：
【０１６８】
【表２】
2010519929.tif 000005
【０１６９】
本発明は、相同的置換（置換および置き換えは、本明細書ではともに、現存のアミノ酸残基を別の残基と入れ替える意味で用いられる）、すなわち、塩基に対する塩基、酸に対する酸、極性に対する極性のような、同等置換が生じ得ることも包含する。非相同的な、すなわち、一方から他方の種類の残基へ、または代わりに、（以下にＺと呼ぶ）オルニチン、（以下にＢと呼ぶ）ジアミノ酪酸オルニチン、（以下にＯと呼ぶ）ノルロイシンオルニチン、ピリルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンのような、非天然アミノ酸の含有を伴う置換も生じ得る。
【０１７０】
置き換えは、非天然アミノ酸によってなされることもでき、α*およびα−二置換*アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸*、乳酸*、トリフルオロチロシン*のような天然アミノ酸のハロゲン化物誘導体、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン*、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン*、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン*、Ｌ−アリルグリシン*、β−アラニン*、Ｌ−α−アミノ酪酸*、Ｌ−γ−アミノ酪酸*、Ｌ−α−アミノイソ酪酸*、Ｌ−ε−アミノカプロン酸#、７−アミノヘプタン酸*、Ｌ−メチオニンスルホン#*、Ｌ−ノルロイシン*、Ｌ−ノルバリン*、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン*、Ｌ−ヒドロキシプロリン#、Ｌ−チオプロリン*、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体−例えば４−メチル−Ｐｈｅ*、ペンタメチル−Ｐｈｅ*、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）#、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）*、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）*、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）*、Ｌ−ジアミノプロピオン酸#、およびＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）*が含まれる。表記*は（相同的または非相同的置換に関する）上述の議論に関して誘導体の疎水性を示すために利用され、一方で#は誘導体の親水特性を示すために利用されており、#*は両親媒特性を示す。
【０１７１】
変異形アミノ酸配列は、グリシンまたはβ−アラニン残基のようなアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチルまたはプロピル基のようなアルキル基を含めて、配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入されるのに適した然るべきスペーサー基を含む。変異のさらなる形態は、当業者によって十分に理解されるであろうぺプトイド型の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の存在を伴う。誤解を避けるために、「ぺプトイド型」は、α−カーボンの置換基が、α−カーボンよりむしろ残基の窒素原子上にある変異形アミノ酸残基を指すために用いられる。ぺプトイド型のペプチド類を調製するためのプロセスは、当業者によく知られている。
【０１７２】
本発明に用いるためのヌクレオチド配列は、合成または改変ヌクレオチドをなかに含むことができる。オリゴヌクレオチドに対する多くの異なったタイプの改変が、当分野で知られている。これらは、メチルホスホナートおよびホスホロチオアート主鎖、および／または分子の３’および／または５’末端におけるアクリジン或いはポリリジン鎖の付加を含む。本発明のために、ヌクレオチド配列は、当分野で利用可能な任意の方法によって改変できることが理解されるべきである。かかる改変は、本発明に役立つヌクレオチド配列のインビボの活性または寿命を向上させるために行うことができる。
【０１７３】
ＣＲＩＳＰＲ
ＣＲＩＳＰＲ（規則的なスペースをもつ、クラスター化した短いパリンドローム様リピート）は、ＳＰＩＤＲ（スペーサーが散在したディレクトリピート：ＳＰａｃｅｒ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｅａｔｓ）としても知られており、最近記載されたように、典型的に特定のバクテリア種に固有のＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌で最初に認められた散在する短い配列リピート（ＳＳＲ：ｓｈｏｒｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｅａｔ）の異なった種類である（イシノ（Ｉｓｈｉｎｏ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー  １６９：５４２９−５４３３［１９８７］；およびナカタ（Ｎａｋａｔａ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー  １７１：３５５３−３５５６［１９８９］）。同様の散在ＳＳＲは、ハロフェラックス・メディテラネイ、化膿性連鎖球菌、アナベナ属、および結核菌で同定されている（グレーネン（Ｇｒｏｅｎｅｎ）ら、モレキュラー・マイクロバイオロジー  １０：１０５７−１０６５［１９９３］；ホー（Ｈｏｅ）ら、イマージング・インフェクシャス・ディジーズ（Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）５：２５４−２６３［１９９９］；マセポール（Ｍａｓｅｐｏｈｌ）ら、バイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）１３０７：２６−３０［１９９６］；およびモジカら、モレキュラー・マイクロバイオロジー  １７：８５−９３［１９９５］を参照）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、他のＳＳＲとリピートの構造が異なっており、これは、短い規則的にスペースのあるリピート（ＳＲＳＲ：ｓｈｏｒｔ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｓｐａｃｅｄ  ｒｅｐｅａｔ）と呼ばれてきた（ジャンセンら、オーミクス・ジャーナル・オブ・インテグライティブ・バイオロジー（ＯＭＩＣＳ  Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．）６：２３−３３［２００２］；およびモジカら、モレキュラー・マイクロバイオロジー  ３６：２４４−２４６［２０００］）。このリピートは，短いエレメントがクラスター状に生じたもので、一定の長さをもつユニークな介在配列がこれらの間に常に規則的なスペースを成している（モジカら、［２０００］、上記を参照）。リピート配列は、菌株間で高度に保存されるが、散在するリピートの数、およびスペーサー領域の配列は菌株毎に異なっている（ファン・エムデン（ｖａｎ  Ｅｍｂｄｅｎ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー  １８２：２３９３−２４０１［２０００］）。
【０１７４】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、短くて高度に保存された典型的に２４から４０ｂｐまでの部分的にパリンドローム様のＤＮＡリピートからなり、内部および末端に１１ｂｐまでの逆方向リピートを含んでいる。これらのリピートは、１から１４０回まで生じることが報告されている。単離されたエレメントが検出されているとはいえ、これらは通常、リピートユニットが（ゲノム当たり約２０またはそれ以上）クラスター状に並び、２０〜５８ｂｐのユニークな介在配列がこれらの間にスペースを成したものである。現在までに、２０までの異なったＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が単一の染色体内に見出されている。
【０１７５】
ＣＲＩＳＰＲは、一般に所与のゲノム内で均一であり、そのほとんどが同一である。しかしながら、例えば、ザ・アーキア（ｔｈｅ  Ａｒｃｈａｅａ）（モジカら、［２０００］、上記を参照）に不均一性の例がある。
【０１７６】
本明細書では、用語「ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座」は、第１のＣＲＩＳＰＲリピートの第１のヌクレオチドから始めて最後（末端）のＣＲＩＳＰＲリピートの最後のヌクレオチドで終わるまでＣＲＩＳＰＲリピートのすべてを含む、ＤＮＡセグメントを指す。
【０１７７】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の生物学的な機能は未知であるとはいえ、いくつかの仮説が提案されてきた。例えば、それらが、細胞構造への染色体の付着、または染色体の複製およびレプリコンの分割に関与し得ることが提案されている（ジャンセンら、オーミクス（ＯＭＩＣＳ）６：２３−３３［２００２］；ジャンセンら、モレキュラー・マイクロバイオロジー  ４３：１５６５−１５７５［２００２］；およびプールセルら、マイクロバイオロジー  １５１：６５３−６６３［２００５］）。モジカら（モジカら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・エボリューション  ６０：１７４−１８２［２００５］）は、ＣＲＩＳＰＲが、外来ＤＮＡに対する特異免疫の付与に関与し得ると仮設を立て、プールセルら（上記を参照）は、ＣＲＩＳＰＲが、防御メカニズムの部分として外来ＤＮＡ断片を取り込み得る構造であると仮説を立てている。ボロティンら（上記を参照）は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーエレメントが、染色体外エレメントが過去に侵入した痕跡であると提案し、それらが、アンチセンスＲＮＡをコード化することによって、ファージ感染、より一般的には外来ＤＮＡの発現に対する免疫を細胞に提供すると仮説を立てている。ボロティンら（上記を参照）は、ＣＲＩＳＰＲを形成するためには、ｃａｓ遺伝子が必要であることも提案している。しかしながら、本発明は、いかなる特定のメカニズム、機能、理論、または行動手段にも限定される意図をもたない。
【０１７８】
ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ１８３１１のゲノムは，３つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含む；３６ｂｐの繰り返し配列は、ＣＲＩＳＰＲ１（３４リピート）、ＣＲＩＳＰＲ２（５リピート）、およびＣＲＩＳＰＲ３（単一配列）で異なっている。それにも関らず、これらは、各々の遺伝子座内に完全に保存される。ＣＲＩＳＰＲ１およびＣＲＩＳＰＲ２リピートは、リピート間のスペースをそれぞれ３３および４つの３０ｂｐ長の配列が占めている。スペースを占めるこれらすべての配列は、互いに異なっている。それらは、両方ともにＳ．サーモフィルスである菌株ＣＮＲＺ１０６６（ＣＲＩＳＰＲ１内にスペースを占める配列が４１）、および菌株ＬＭＤ−９（ＣＲＩＳＰＲ１内に１６、およびＣＲＩＳＰＲ３内に８）で見出されるものとも異なっている。
【０１７９】
当分野においてＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を同定する様々な方法が知られている。例えば、ジャンセンら（ジャンセンら、［２００２］、上記を参照）は、アルゴンヌ国立研究所（米国、イリノイ州、アルゴンヌ）の数学およびコンピュータサイエンス部門のサーバーにおけるＰＡＴＳＣＡＮプログラムを用いて、ＣＲＩＳＰＲモチーフのヌクレオチド配列を検索するコンピュータベースの手法を記載している。ＣＲＩＳＰＲモチーフの同定に用いられたアルゴリズムは、ｐ１＝ａ．．．ｂｃ．．．ｄｐ１ｃ．．．ｄｐ１ｃ．．．ｄｐ１であり、ａおよびｂは、リピートのサイズの下限および上限、ｐ１およびｃ並びにｄは、スペーサー配列のサイズの下限および上限である。ａ、ｂ、ｃ、ｄの値は、約１５から約７０ｂｐまで約５ｂｐの増分で変化することができる。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ドットプロットを用いて（例えば、Ｄｏｔｔｅｒコンピュータ・プログラムを用いて）同定される。
【０１８０】
当分野で知られる任意の適切な方法が、配列の類似性を解析するために役立つ。例えば、当分野で知られるように、微生物ゲノムデータベースおよびＧｅｎＢａｎｋとともにＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴを用いて解析を行うことができる。加えて、ヌクレオチド配列は、本明細書に示されるものを含めて、データベースに含まれている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたはＪＧＩゲノム・ウェブサイト）。本明細書では、「上流」は５’方向、「下流」は３’方向を意味する。
【０１８１】
付加的な実施形態において、本発明の方法は、増幅手順を利用する（例えば、モジカら、［２００５］、上記；およびプールセルら、［２００５]、上記を参照）。ＤＮＡの所望の領域の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を含めて、当分野で知られる任意の方法によって達成することができる。「増幅」は、核酸配列の付加的なコピーの産生を指す。これは、当分野でよく知られるＰＣＲ技術を用いて一般に行なわれている。「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、当業者によく知られている。本発明において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のすべてまたは部分を増幅するＰＣＲ反応に用いるために、オリゴヌクレオチド・プライマーが設計される。
【０１８２】
用語「プライマー」は、精製された制限消化物におけるように自然に生じるか、または合成的に産生されるかに関わらず、核酸鎖に対して相補的なプライマー伸長産物が誘導される条件下に（すなわち、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼのような誘導物質の存在下、並びに適切な温度およびｐＨに）置かれたときに、合成の開始点として機能することができるオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、プライマーは、増幅における効率を最大にするために１本鎖であるが、しかし他の実施形態において、プライマーは２本鎖である。いくつかの実施形態において、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導物質の存在下で伸長産物の合成を開始させるために十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給元、および使用方法を含めて、多くの因子に依存する。ＰＣＲプライマーは、典型的には少なくとも約１０ヌクレオチド長であり、最も典型的には少なくとも約２０ヌクレオチド長である。ＰＣＲを設計かつ実行する方法は、当分野でよく知られており、限定されることなしにペアードプライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを用いる方法を含む。
【０１８３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、親バクテリア、および標識化されたバクテリアからのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分が、当分野で知られる任意の適切な方法を用いて比較される。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、親バクテリア、および標識化されたバクテリアからのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分が、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分を増幅することによって比較される。よく知られるサイクリング増幅法（例えば、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応など）に加えて、等温増幅法を含むがそれらには限定されない他の方法が、本発明に役立つ。本発明に役立つよく知られる等温増幅法は、限定されることなしに、鎖置換増幅（ＳＤＡ：ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｑβレプリカーゼ、核酸ベースの配列増幅（ＮＡＳＢＡ：ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ），および自律性配列複製を含む。
【０１８４】
本発明のいくつかの他の好ましい実施態様において、親バクテリア、および標識化されたバクテリアからのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分が、本発明のそれの配列決定によって比較され、親バクテリア、および標識化されたバクテリアからのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分が、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分を増幅および次に配列決定することによって比較される。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の１つの末端が比較され、一方で他の実施形態において、該遺伝子座の５’および３’両末端が比較される。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の１つの末端（例えば、５’末端）が比較される。さらに他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端における少なくとも最後のＣＲＩＳＰＲリピート、および／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端における少なくとも最後のＣＲＩＳＰＲスペーサー（例えば、最後のＣＲＩＳＰＲスペーサーコア）、および／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における少なくとも第1のＣＲＩＳＰＲリピート、および／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における少なくとも第1のＣＲＩＳＰＲスペーサー（例えば、第1のＣＲＩＳＰＲスペーサーコア）が比較される。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における少なくとも第1のＣＲＩＳＰＲリピート、および／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における少なくとも第1のＣＲＩＳＰＲスペーサー（例えば、第1のＣＲＩＳＰＲスペーサーコア）が比較される。いくつかの付加的な好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端における少なくとも最後のＣＲＩＳＰＲスペーサー（例えば、最後のＣＲＩＳＰＲスペーサーコア）、および／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における少なくとも第1のＣＲＩＳＰＲスペーサー（例えば、第1のＣＲＩＳＰＲスペーサーコア）が比較される。いくつかのさらなる好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における少なくとも第1のＣＲＩＳＰＲスペーサー（例えば、第1のＣＲＩＳＰＲスペーサーコア）が比較される。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はＤＮＡを備え、一方で他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はＲＮＡを備える。いくつかの実施形態において、核酸はゲノム起源であり、一方で他の実施形態において、それは合成または組換え起源である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、２本鎖であり、一方で他の実施形態において、それらは、センス、またはアンチセンス鎖、或いはそれらの組み合わせのいずれを表すかに関わらず１本鎖である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、本明細書に記載されるように、組換えＤＮＡ技術（例えば、組換えＤＮＡ）を用いて調製される。
【０１８６】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ変異株を生み出す方法も提供する。これらの変異株は、当分野で知られる任意の適切な方法を用いて発現、単離、クローニング、および／または配列決定される。いくつかの特に好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ変異株は、付加的なスペーサーのある改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を有するファージ耐性変異体の菌株である。いくつかの付加的な実施形態において、これらの変異株は、検出／同定のターゲットとして、または核酸分子に対する耐性を操作するために役立つ。なおさらなる実施形態において、これらの変異株は、生物的防除剤の開発に役立つ。
【０１８７】
本発明の文脈において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、以下に記載されるように方向付けられる。ＣＲＩＳＰＲリーダーは、確定したサイズをもつ保存されたＤＮＡセグメントである。Ｓ．サーモフィルスのＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座の方向付けは、次の特性を用いて確立される：
【０１８８】
近接するｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲに結合した配列：ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）遺伝子に対するＣＲＩＳＰＲの相対位置；ＣＲＩＳＰＲ１は、４つのｃａｓ遺伝子（ＣＮＲＺ１０６６染色体配列内の遺伝子ｓｔｒ０６５７，ｓｔｒ０６５８，ｓｔｒ０６５９，およびｓｔｒ０６６０）の下流に位置する；
【０１８９】
この繰り返し配列は、完全にパリンドローム様ではないがヘアピン二次構造、および逆相補配列を形成する潜在力をもつ；（５’−ＧＴＴＧＴＡＣＡＧＴＴＡＣＴＴＡＡＡＴＣＴＴＧＡＧＡＧＴＡＣＡＡＡＡＡＣ−３’；配列番号：６９５）は、直接配列（５’−ＧＴＴＴＴＴＧＴＡＣＴＣＴＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＧＴＡＡＣＴＧＴＡＣＡＡＣ−３’；配列番号：１）とは異なる。一般に、直接配列の５’末端は、逆相補配列の５’末端に比べて、ヌクレオチドＧおよびＴにより富んでいる。その上に、Ｇ−Ｔ塩基対合はＡ−Ｃ塩基対合より良好なので、直接鎖上の方がヘアピン構造は一般により強固である；
【０１９０】
本明細書に用いられるように、末端リピートの位置は終端のリピートであり、３’末端における配列変化が一般に末端リピートであることを示す。
【０１９１】
ＣＲＩＳＰＲリーダーは、第１のリピートのすぐ上流に位置する、確定したサイズの保存されたＤＮＡセグメントである。例えば、Ｓ．サーモフィルスのＣＲＩＳＰＲ１のリーダー配列は、遺伝子ｓｔｒ０６６０の終止コドンのすぐ後に始まり、第１のリピートの直前で終わるＤＮＡセグメントである。ＣＲＩＳＰＲリーダーは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端に位置する。ＣＲＩＳＰＲリーダーは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の第１のＣＲＩＳＰＲリピートのすぐ上流に位置する。
【０１９２】
ＣＲＩＳＰＲトレーラーは、末端リピートのすぐ下流に位置する、確定したサイズの保存されたＤＮＡセグメントである。例えば、Ｓ．サーモフィルスＣＲＩＳＰＲ１のトレーラー配列は、末端リピートのすぐ後に始まって、（逆ＤＮＡ鎖上に位置する）遺伝子ｓｔｒ０６６１の停止コドンの直前で終わるＤＮＡセグメントである。ＣＲＩＳＰＲトレーラーは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端に位置する。ＣＲＩＳＰＲトレーラーは、末端リピートのすぐ下流に位置する。
【０１９３】
例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス菌株ＣＮＲＺ１０６６のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲリーダーおよびＣＲＩＳＰＲトレーラー配列は、以下の通りである：
【０１９４】
【化２】
2010519929.tif 000006
【０１９５】
Ｓ．サーモフィルスの全ゲノム（ＣＰ００００２４）において、ＣＲＩＳＰＲリーダーは、ポジション６２５０３８から６２５１００までに対応し、ＣＲＩＳＰＲトレーラーは、ポジション６２７８４５から６２７８８５までに対応する。
【０１９６】
本明細書では、用語「上流」は５’方向にあることを意味し、用語「下流」は３’方向にあることを意味する。本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の文脈における用語「その部分」は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約４４ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約９８ヌクレオチド、またはなお約１００或いはそれ以上のヌクレオチド（例えば、少なくとも約４４〜９８ヌクレオチド）を意味する。いくつかの好ましい実施形態において、用語「その部分」は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方または両方の末端（すなわち、５’および／または３末端）から少なくとも約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約４４ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約９８ヌクレオチド、または約１００或いはそれ以上のヌクレオチド（例えば、少なくとも約４４〜９８ヌクレオチド）を意味する。いくつかの好ましい実施形態において、用語「その部分」は、少なくともＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における最初の約４４ヌクレオチド、或いはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端における最後の約４４ヌクレオチドを指す。
【０１９７】
いくつかのさらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の文脈における用語「その部分」は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における第1のＣＲＩＳＰＲリピートの第1のヌクレオチドから下流の、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端における最後のＣＲＩＳＰＲリピートの最後のヌクレオチドから上流の、少なくとも最初の約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約４４ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約９８ヌクレオチド、または約１００或いはそれ以上のヌクレオチド（例えば、少なくとも約４４〜９８ヌクレオチド）を意味する。いくつかの好ましい実施形態において、用語「その部分」は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における第1のＣＲＩＳＰＲリピートの第1のヌクレオチドから下流の少なくとも最初の約４４ヌクレオチド、或いはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端における最後のＣＲＩＳＰＲリピートの最後のヌクレオチドから上流の少なくとも約４４ヌクレオチドを指す。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、複製される配列の最小サイズは、約２４ヌクレオチドであり、タグ付け配列の最小サイズは、約２０ヌクレオチドである。かくして、いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の文脈における用語「その部分」は、少なくとも４４ヌクレオチドを意味する。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、複製される配列の最大サイズは、約４０ヌクレオチドであり、タグ付け配列の最大サイズは、約５８ヌクレオチドである。かくして、いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の文脈で用いられるとき、用語「その部分」は、少なくとも９８ヌクレオチドを意味する。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の文脈における用語「その部分」は、少なくとも約４４〜９８ヌクレオチドを意味する。
【０２００】
親バクテリアおよび標識化されたバクテリアからのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその部分を比較するとき、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約４４ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約９８ヌクレオチド、または約１００ヌクレオチド（例えば、少なくとも約４４〜９８ヌクレオチド）が比較される。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方または両方の末端における少なくとも約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約４４ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約９８ヌクレオチド、または約１００或いはそれ以上のヌクレオチド（例えば、少なくとも約４４〜９８ヌクレオチド）が比較される。
【０２０１】
いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端における少なくとも最初の約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約４４ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約９８ヌクレオチド、または約１００或いはそれ以上のヌクレオチド（例えば、少なくとも約４４〜９８ヌクレオチド）が比較される。いくつかの好ましい実施形態において、少なくとも、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における最初の約４４ヌクレオチド、または約ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端における最後の約４４ヌクレオチドが比較される。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における第1のＣＲＩＳＰＲリピートの第1のヌクレオチドから下流、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端における最後のＣＲＩＳＰＲリピートの最後のヌクレオチドから上流の、少なくとも最初の約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２４のヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約４４ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約９８ヌクレオチド、または約１００或いはそれ以上のヌクレオチド（例えば、少なくとも約４４〜９８ヌクレオチド）が比較される。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における第1のＣＲＩＳＰＲリピートの第1のヌクレオチドから下流の最初の約４４ヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端における最後のＣＲＩＳＰＲリピートの最後のヌクレオチドから上流の少なくとも約４４ヌクレオチドが比較される。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、複製される配列の最小サイズは、約２４ヌクレオチドであり、タグ付け配列の最小サイズは、約２０ヌクレオチドである。いくつかの好ましい実施形態において、少なくとも４４ヌクレオチドが比較される。いくつかの代わりの実施形態において、複製される配列の最大サイズは、約４０ヌクレオチドであり、タグ付けさ配列の最大サイズは、約５８ヌクレオチドである。いくつかの好ましい実施形態において、少なくとも９８ヌクレオチドが比較される。いくつかの代わりの好ましい実施形態において、少なくとも約４４〜９８ヌクレオチドが比較される。
【０２０４】
本明細書では、用語「ＣＲＩＳＰＲリピート」は、当分野に用いられる従来の意味をもち（すなわち、複数の短い直接的リピートであり、所与のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内でほとんどまったく配列の変動を示さない）。本明細書の文脈において「ＣＲＩＳＰＲリピート」は、用語「ＣＲＩＳＰＲ」と同義である。
【０２０５】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーが存在するのより１つまたはそれ以上多いＣＲＩＳＰＲリピートを備える。かくして、ＣＲＩＳＰＲリピートは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内の繰り返し配列に対応する。例えば、末端リピートを除いて、Ｓ．サーモフィルスのＣＲＩＳＰＲ１配列の典型的なリピート配列は、次の通りである：５’−ＧＴＴＴＴＴＧＴＡＣＴＣＴＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＧＴＡＡＣＴＧＴＡＣＡＡＣ−３’（配列番号：１）。
【０２０６】
このリピート配列の点変動が観察されているが、しかしごく稀である。この典型的なリピート配列と比較して、末端リピート配列は、常に同じ変動を３’末端で示す。この末端リピート配列の点変動も観察されているが、しかし稀である。ＣＲＩＳＰＲリピートは、親バクテリアで自然に生じることができる。ＣＲＩＳＰＲ１配列のＧｅｎｂａｎｋ受入番号は、以下を含む：ＣＰ００００２３、ＣＰ００００２４、ＤＱ０７２９８５、ＤＱ０７２９８６、ＤＱ０７２９８７、ＤＱ０７２９８８、ＤＱ０７２９８９、ＤＱ０７２９９０、ＤＱ０７２９９１、ＤＱ０７２９９２、ＤＱ０７２９９３、ＤＱ０７２９９４、ＤＱ０７２９９５、ＤＱ０７２９９６、ＤＱ０７２９９７、ＤＱ０７２９９８、ＤＱ０７２９９９、ＤＱ０７３０００、ＤＱ０７３００１、ＤＱ０７３００２、ＤＱ０７３００３、ＤＱ０７３００４、ＤＱ０７３００５、ＤＱ０７３００６、ＤＱ０７３００７、ＤＱ０７３００８、およびＡＡＧＳ０１０００００３。
【０２０７】
本明細書にさらに詳細に記載されるように、複製される配列は、親バクテリアから由来する、由来し得る、得られるか、または入手可能である。いくつかの好ましい実施形態において、該配列は、親バクテリアのゲノムＤＮＡを備える。いくつかの特に好ましい実施形態において、（例えば、同じＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に）複製されるＣＲＩＳＰＲリピートは、反復して、順次、同時または実質的に同時に、タグ付け配列とともに組込まれて標識化されたバクテリアをつくり出す。
【０２０８】
リピートにおけるヌクレオチド数は、一般に約２０から約４０塩基対まで（例えば、３６塩基対）であるが、しかし他の実施形態においては、約２０から約３９塩基対まで、約２０から約３７塩基対まで、約２０から約３５塩基対まで、約２０から約３３塩基対まで、約２０から約３０塩基対まで、約２１から約４０塩基対まで、約２１から約３９塩基対まで、約２１から約３７塩基対まで、約２３から約４０塩基対まで、約２３から約３９塩基対まで、約２３から約３７塩基対まで、約２５から約４０塩基対まで、約２５から約３９塩基対まで、約２５から約３７塩基対まで、約２５から約３５の塩基対まで、または約２８ないし２９塩基対である。
【０２０９】
リピートにおけるヌクレオチドの数は、一般に約２０から約４０塩基対までであるが、しかし約２０から約３９塩基対まで、約２０から３７塩基対まで、約２０から約３５塩基対まで、約に２０から約３３塩基対まで、約２０から約３０塩基対まで、約２１から約４０塩基対まで、約２１から約３９塩基対まで、約２１から約３７塩基対まで、約２３から約４０塩基対まで、約２３から約３９塩基対まで、約２３から約３７塩基対まで、約２５から約４０塩基対まで、約２５から約３９塩基対まで、約２５から約３７塩基対まで、約２５から約３５塩基対まで、または約２８ないし約２９塩基対であってもよい。リピートの数は、約１から約１４０まで、約１から約１００まで、約２から約１００まで、約５から約１００まで、約１０から約１００まで、約１５から約１００まで、約２０から約１００まで、約２５から約１００まで、約３０から約１００まで、約３５から約１００まで、約４０から約１００まで、約４５から約１００まで、約５０から約１００まで、約１から約１３５まで、約１から約１３０まで、約１から約１２５まで、約１から約１２０、約１から約１１５まで、約１から約１１０、約１から約１０５まで、約１から約１００まで、約１から約９５まで、約１から約９０まで、約１から約８０まで、約１から約７０まで、約１から約６０まで、約１から約５０まで、約１０から約１４０まで、約１０から約１３０まで、約１０から約１２０まで、約１０から約１１０まで、約１０から約９５まで、約１０から約９０まで、約２０から約８０まで、約３０から約７０まで、約３０から約６０まで、約３０から約５０まで、約３０から約４０、または約３２の範囲であってもよい。
【０２１０】
いくつかの他の実施形態において、リピートにおけるヌクレオチドの数は、約２０から約３９塩基対まで、約２０から約３７塩基対まで、約２０から約３５塩基対まで、約２０から約３３塩基対まで、約２０から約３０塩基対まで、約２１から約４０塩基対まで、約２１から約３９塩基対まで、約２１から約３７塩基対まで、約２３から約４０塩基対まで、約２３から約３９塩基対まで、約２３から約３７塩基対まで、約２５から約４０塩基対まで、約２５から約３９塩基対まで、約２５から約３７塩基対まで、約２５から約３５塩基対まで、または約２８ないし２９塩基対である。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、リピートの数は、約１から約１４４まで、約１から約１００まで、約２から約１００まで、約５から約１００まで、約１０から約１００まで、約１５から約１００まで、約２０から約１００まで、約２５から約１００まで、約３０から約１００まで、約３５から約１００まで、約４０から約１００まで、約４５から約１００まで、約５０から約１００まで、約１から約１３５まで、約１から約１３０まで、約１から約１２５まで、約１から約１２０まで、約１から約１１５まで、約１から約１１０まで、約１から約１０５まで、約１から約１００まで、約１から約９５まで、約１から約９０まで、約１から約８０まで、約１から約７０まで、約１から約６０まで、約１から約５０まで、約１０から約１４０まで、約１０から約１３０まで、約１０から約１２０まで、約１０から約１１０まで、約１０から約９５まで、約１０から約９０まで、約２０から約８０まで、約３０から約７０まで、約３０から約６０まで、約３０から約５０まで、約３０から約４０まで、或いは約３０、３１、３２、３３、３４または３５リピートの範囲である。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、リピートの数は、約２から約１４０まで、約２から約１００まで、約２から約１００まで、約５から約１００まで、約１０から約１００まで、約１５から約１００まで、約２０から約１００まで、約２５から約１００まで、約３０から約１００まで、約３５から約１００まで、約４０から約１００まで、約４５から約１００まで、約５０から約１００までの範囲である。
【０２１３】
いくつかのさらなる実施形態において、リピートの数は、約２から約１３５まで、約２から約１３０まで、約２から約１２５まで、約２から約１２０、約２から約１１５まで、約２から約１１０まで、約２から約１０５まで、約２から約１００まで、約２から約９５まで、約２から約９０まで、約２から約８０まで、約２から約７０まで、約２から約６０まで、約２から約５０まで、約２から約４０まで、約２から約３０まで、約２から約２０まで、約2から約１０まで、約２から約９まで、約２から約８まで、約２から約７まで、約２から約６まで、約２から約５まで、約２から約４まで、または約２から約３までの範囲である。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピートはＤＮＡを備え、一方で他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピートはＲＮＡを備える。いくつかの実施形態において、核酸はゲノム起源であり、一方で他の実施形態において、それは合成または組換え起源である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピート遺伝子は、２本鎖、またはセンス、ないしアンチセンス鎖、或いはそれらの組み合わせのいずれを表すかに関わらず、一本鎖である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピート遺伝子は、本明細書に記載されるように、組換えＤＮＡ技術（例えば、組換えＤＮＡ）を用いて調製される。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピートの１つまたはそれ以上が、細胞（例えば、受容細胞）を操作するために用いられる。いくつかの好ましい実施形態において、１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートが、細胞（例えば、受容細胞）を操作するために用いられ、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーと一緒に、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節する。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）は、当分野で知られた任意の適切な方法を用いて、細胞のＤＮＡ（例えば、受容細胞のプラスミドおよび／またはゲノムＤＮＡ）に挿入される。付加的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）は、細胞のＤＮＡにおいてＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）がつくり出されるか、或いは操作されるように、該細胞のＤＮＡ（例えば、受容細胞のプラスミドおよび／またはゲノムＤＮＡ）を改変する（例えば、変異させる）ための鋳型として役立つ。付加的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）は、少なくとも１つのコンストラクト、少なくとも１つのプラスミド、および／または少なくとも１つベクターなどに存在する。さらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピートは、当分野で知られる任意の適切な方法を用いて、細胞に導入される。
【０２１６】
付加的な実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性の調節に用いるためにＣＲＩＳＰＲリピートを同定する方法であって、（ｉ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサー、および少なくとも１つのｃａｓ遺伝子を備える細胞を調製するステップ；（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲリピートを含むように、該細胞を操作するステップ；および（ｉｉｉ）該細胞が標的核酸またはその転写産物に対する耐性を調節するかどうか決定するステップであって、標的核酸またはその転写産物に対する該細胞の耐性を調節することは、耐性を調節するために該ＣＲＩＳＰＲリピートが使えることを示す、ステップを備える方法を提供する。
【０２１７】
いくつかのさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質が、１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピート、および随意的に１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーと一緒に、或いは組み合わせて用いられる。いくつかの特に好ましい実施形態において、ｃａｓ遺伝子（単数または複数）ないしタンパク質（単数または複数）、およびＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）が、以下に記載されるように機能的な組み合わせを形成する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピートは、配列番号：１〜２２に示されるヌクレオチドのいずれかを備える。配列番号：１〜１２はＳ．サーモフィルスから、一方で配列番号：１３〜１６はストレプトコッカス・アガラクチアから、ＳＥＱ  ＮＯ：１７はＳ．ミュータンスから、および配列番号：１８〜２２は、Ｓ．ピオゲネスからのものである。
【０２１８】
【化３】
2010519929.tif 000007
【０２１９】
ＣＲＩＳＰＲスペーサー
本明細書では、「ＣＲＩＳＰＲスペーサー」は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の複数の短い直接リピート（すなわち、ＣＲＩＳＰＲリピート）の間に見出される非反復のスペーサー配列を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、「ＣＲＩＳＰＲスペーサー」は、２つのＣＲＩＳＰＲリピートが隣接する核酸セグメントを指す。ＣＲＩＳＰＲスペーサー配列は、しばしば様々な可動性のＤＮＡ分子（例えば、バクテリオファージおよびプラスミド）に対して著しい類似性をもつことが見出されている。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、２つの同一のＣＲＩＳＰＲリピートの間に位置する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、２つのＣＲＩＳＰＲリピートの間に位置するＤＮＡ伸長鎖における配列解析によって同定される。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、２つの同一の短いパリンドローム様の多重直接リピートの間に自然に存在する。
【０２２０】
興味深いことに、これらのＣＲＩＳＰＲスペーサーを担う細胞は、該スペーサーに相同的な配列を含むＤＮＡ分子によって感染されることができない（モジカら、２００５）。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、標的核酸またはその転写産物、或いは同定された配列に相同的である。相同性は、類似物の観点からも考慮され得るとはいえ、本発明の文脈においては、配列の同一性の観点から相同性を表現することが望ましい。相同的配列は、標的核酸またはその転写産物、或いは同定された配列に対して少なくとも約７０、約７５、約８０、約８５、または９０％が同一であるか、或いは少なくとも約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９％が同一でありうるＣＲＩＳＰＲスペーサーを含むと解釈される。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、標的核酸の配列に対して約１００％が同一である。所与のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（単数または複数）におけるＣＲＩＳＰＲスペーサーの数が、種の間で変化しうることも付記しておく。加えて、スペーサーの数は、約１から約１４０まで、約１から約１００まで、約２から約１００まで、約５から約１００まで、約１０から約１００まで、約１５から約１００まで、約２０から約およそ１００まで、約２５から約１００まで、約３０から約１００まで、約３５から約１００まで、約４０から約１００まで、約４５から約１００まで、または約５０から約１００までの範囲にある。いくつかの好ましい実施形態において、スペーサーの数は、約１から約１３５まで、約１から約１３０まで、約１から約１２５まで、約１から約１２０まで、約１から約１１５まで、約１から約１１０まで、約１から約１０５まで、約１から約１００まで、約１から約９５まで、約１から約９０まで、約１から約８０まで、約１から約７０まで、約１から約６０まで、約１から約５０まで、約１から約４０まで、焼１から約３０まで、約１から約２０まで、約およそ１からおよそ１０まで、約１から約９まで、約１から約８まで、約１から約７まで、約１から約６まで、約１から約５まで、約１から約４まで、約１から約３まで、または約１から約２まで、の範囲にある。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、２つのリピートの間に位置するＤＮＡ伸張鎖として配列解析によって同定される。
【０２２１】
本明細書に記載されるように、本発明は、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子またはタンパク質を用いることであって、受容細胞における少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーに免疫の特異性を授けるのに適した１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートとともに、用いることを容易にする方法および組成物を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲリピートが、細胞における少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーに免疫の特異性を授けるために、機能的に組み合わせて用いられる。
【０２２２】
本明細書において、「免疫の特異性」は、特定の核酸配列またはその転写産物に対する免疫が、特定のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー配列を用いて授けられることを意味する。本明細書に示されるように、所与のＣＲＩＳＰＲスペーサーは、任意の核酸配列またはその転写産物に対する耐性を授けるわけではなく、該ＣＲＩＳＰＲスペーサーまたは偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーが相同的な（例えば、約１００％が同一の）配列に対する耐性のみを授ける。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）は、受容細胞とは異なったドナー生物から得られる。いくつかの好ましい実施形態において、ドナーおよび受容細胞は、異なったバクテリアの菌株、種および／または属である。いくつかの好ましい実施形態において、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および／または少なくとも１つＣＲＩＳＰＲリピートが、受容生物とは異なった生物から得られる。いくつかの好ましい実施形態において、少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートが導入される。いくつかの付加的な好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、レシピエント、または少なくとも１つのｃａｓ遺伝子および／またはタンパク質、および／または少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲリピートがそれから得られるさらなるドナー細胞に対して非相同的な生物から得られる。いくつかの代わりの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、レシピエント、または少なくとも１つのｃａｓ遺伝子および／またはタンパク質および／または少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲリピートがそれから得られるさらなるドナー細胞に対して相同的な生物から得られる。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）は、当分野で知られる組換え法を用いて設計および産生される。実際、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、当分野で知られる任意の適切な方法を用いられて産生されることが意図される。
【０２２４】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および／または少なくとも１つの、いくつかの実施形態において好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートがそれから得られる受容細胞に対して非相同的である。いくつかの代わりの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および／または少なくとも１つの、いくつかの実施形態において好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートがそれから得られる受容細胞に対して相同的である。実際、本方法に利用されたエレメントは、いずれも非相同的か、または相同的であることが意図される。いくつかの実施形態において、複数のエレメントを用いる場合には（例えば、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）、ＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）、ｃａｓ遺伝子（単数または複数）、Ｃａｓタンパク質（単数または複数）の任意の組み合わせ）、いくつかのエレメントは互いに相同的であり、いくつかのエレメントは互いに非相同的である（例えば、いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）およびｃａｓ遺伝子は相同的であるが、しかしＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）は非相同的である）。かくして、いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、ＣＲＩＳＰＲリピート、および／またはｃａｓ遺伝子、および／または機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓ遺伝子の組み合わせと自然には結合されない。実際、非相同的、および相同的なエレメントの任意の組み合わせが、本発明に役立つことが意図される。さらに付加的な実施形態において、ドナーおよび受容細胞は非相同的であり、一方でさらなる実施形態において、それらは相同的である。ドナーおよび受容細胞に含まれるエレメントは、相同的および／または非相同的であることが意図される。エレメント（例えば、ＣＲＩＳＰＲスペーサー）は、当分野で知られる任意の適切な方法を利用して、受容細胞のプラスミドおよび／またはゲノムＤＮＡに導入される。
【０２２５】
いくつかの好ましい実施形態において、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーが、細胞（例えば、受容細胞）を操作するために用いられる。いくつかの付加的な実施形態において、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節して操作された細胞をつくるために、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーが、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および／または１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートと組み合わせて用いられる（いくつかの好ましい実施形態においては、１つまたはそれ以上の、それらの機能的な組み合わせが用いられる）。いくつかのさらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、細胞のＤＮＡにＣＲＩＳＰＲスペーサーがつくり出されるように、該細胞（例えば、受容細胞）のプラスミドおよび／またはゲノムＤＮＡをその上で改変する（例えば、変異させる）鋳型として用いられる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）は、プラスミドまたは他のベクターにクローニングされ、それらを用いて受容細胞が、当分野で知られた任意の適切な方法により次に形質転換される。
【０２２６】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性の調節に用いるためにＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定する方法であって、少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピート、および少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質を備える細胞を調製するステップ；生物（例えば、ドナー生物）における少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；標的核酸を備えるドナー生物のＣＲＩＳＰＲスペーサーに相同性をもつように、該細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサー配列を改変するステップ；および該細胞が、標的核酸に対する耐性を調節するかどうか決定するステップであって、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節することは、ＣＲＩＳＰＲスペーサーが、標的核酸に対する細胞の耐性を調節することを示すステップ、を備える方法を提供する。
【０２２７】
いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、配列番号：２３〜４６０および／または配列番号：５２２〜６６５のいずれかにおける、任意の１つまたはそれ以上に示されるヌクレオチド配列を備えるか、或いはそれらからなる。配列番号：２３〜３３９、３５９〜４０８、５２２〜６６５はＳ．サーモフィルスからであり、一方で配列番号：３４０−３５８はＳ．ベスティブラリスからであり、配列番号：４０９−４４６はＳ．アガラクティエからであり、配列番号：４４７−４５２はＳ．ミュータンスからであり、配列番号：４５３−４６０がＳ．ピオゲネスからである。
【０２２８】
【化４】
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【０２２９】
特に好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、２つのＣＲＩＳＰＲリピートが隣接する（すなわち、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、各々の脇に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲリピートをもつ）。本発明は、任意の特定のメカニズム、理論、または仮説に限定される意図をもたないが、所与のＣＲＩＳＰＲスペーサーが、ｃａｓ遺伝子（単数または複数）および／またはリーダー配列を備えるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端からより遠いほど、そのＣＲＩＳＰＲスペーサーによって授けられる耐性はより低いことが考えられる。かくして、本発明のいくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端から最初の１００ＣＲＩＳＰＲスペーサーのうちの１つまたはそれ以上が改変され、一方で他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端から最初の５０ＣＲＩＳＰＲスペーサーのうちの１つまたはそれ以上が改変される。いくつかの付加的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端から最初の４０ＣＲＩＳＰＲスペーサーのうちの１つまたはそれ以上が改変され、一方でいくつかのなおさらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端から最初の３０ＣＲＩＳＰＲスペーサーのうちの１つまたはそれ以上が改変され、さらに付加的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端から最初の２０ＣＲＩＳＰＲスペーサーのうちの１つまたはそれ以上が改変され、なおより多くの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端から最初の１５ＣＲＩＳＰＲスペーサーのうちの１つまたはそれ以上が改変される。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端から最初の１０ＣＲＩＳＰＲスペーサーのうちの１つまたはそれ以上が改変される。本明細書に示されるように、異なったバクテリアは、異なった数のＣＲＩＳＰＲスペーサーをもち、かくしていくつかの実施形態において、様々なスペーサーが改変される。
【０２３０】
ＣＲＩＳＰＲスペーサーコア
微生物種のうちの特定のＣＲＩＳＰＲタイプに対して、ＣＲＩＳＰＲスペーサーのサイズは変化しうるが、典型的に予め確定した長さを示す。これまでに記載されたＣＲＩＳＰＲタイプは、主に約２０ｂｐおよび約５８ｂｐの間のスペーサー長を含むことが見出されている。
【０２３１】
本明細書では、用語「ＣＲＩＳＰＲスペーサーコア」は、１つのＣＲＩＳＰＲタイプのうちで観測された最も短いスペーサーを指す。かくして、例えば、Ｓ．サーモフィルスのＣＲＩＳＰＲタイプ１（ＣＲＩＳＰＲ１）のうちで支配的なスペーサー長は３０ｂｐであり、少数が２８ｂｐおよび３２ｂｐの間のサイズである。かくして、Ｓ．サーモフィルスのＣＲＩＳＰＲタイプ１において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーコアは２８ｂｐの連続伸長鎖と定義される。
【０２３２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーコアは、標的核酸、その転写産物、または同定された配列に対して、コア配列の長さにわたって相同的である。上述のように、相同性は、類似物の観点から考えることもできるが、本発明のいくつかの好ましい実施形態において、相同性は、配列の同一性によって表現される。かくして、いくつかの実施形態において、相同的配列は、標的核酸配列、その転写産物、または同定された配列に対して、コア配列の長さにわたって、少なくとも約９０％が同一、または少なくとも約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９％が同一であるＣＲＩＳＰＲスペーサーコアを包含する。いくつかの特に好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーコアは、標的核酸配列、その転写産物、または同定された配列に対して、コア配列の長さにわたって、約１００％が同一である。
【０２３３】
本発明に関する開発の間に、密接に関連した工業用菌株およびファージ耐性変異株を含めて、様々なＳ．サーモフィルス菌株のＣＲＩＳＰＲ配列が解析された。スペーサーのタイプおよび数の相違は、主にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座において観測された。とりわけ、ファージ感受性は、ＣＲＩＳＰＲ１スペーサーの内容に関連づけられるように思われた。特に、スペーサーの内容は、親菌株およびファージ耐性誘導体の間で、後者に存在する付加的なスペーサーを除いて、ほとんど同一であった。これらの知見は、付加的なスペーサーの存在と、所与の菌株のファージ感受性において観測された相違との間の潜在的な関係を示唆した。この所見は、ファージ耐性変異体に存在する付加的なスペーサーの起源および機能の検討を促進した。
【０２３４】
偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー
本明細書では、用語「偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー」は、生物（例えば、バクテリオファージを含むがそれには限定されない、ドナー生物）に存在し、好ましくは機能、および／または生存、および／または複製、および／または感染性などに好ましくは必須で、ＣＲＩＳＰＲスペーサー配列を備える核酸配列を指す。いくつかの実施形態において、偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して相補的か、または相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサー配列を産生するのに役立つ。いくつかの特に好ましい実施形態において、これらの配列は、耐性を調節するのに役立つ。
【０２３５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、および少なくとも１つの偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に対して相補的か、または相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）が、受容細胞を操作するために用いられる。いくつかの好ましい実施形態において、受容細胞の耐性が標的核酸またはその転写産物に対して調節されるように、受容細胞を操作するために、少なくとも１つの偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、または少なくとも１つの偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に対して相補的か、または相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）が、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および／または１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピート（例えば、それらの１つまたはそれ以上の機能的な組み合わせ）と組み合わせて、用いられる。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、または１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に対して相補的か、または相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）が、当分野で知られる任意の適切な方法を用いられて、受容細胞のプラスミドおよび／またはゲノムＤＮＡに挿入される。
【０２３７】
いくつかの付加的な実施形態において、偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、ＣＲＩＳＰＲスペーサーが細胞のプラスミドおよび／またはゲノムＤＮＡ中につくり出されるように、該受容細胞のプラスミドおよび／またはゲノムＤＮＡをその上で改変する（例えば、変異させる）ための鋳型として用いられる。いくつかのさらなる実施形態において、偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、または１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に対して相補的か、または相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）が、当分野で知られる任意の適切な方法を用いて、コンストラクト、プラスミドおよび／またベクターなどのなかにクローニングされ、宿主細胞に導入される。
【０２３８】
ＣＡＳおよびｃａｓ遺伝子
本明細書では、用語「ｃａｓ遺伝子」は、当分野で用いられる従来の意味をもち、隣接するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に一般に連結された、結合された、近接する、或いは近傍にある１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子を指す。Ｃａｓタンパク質ファミリーの包括的なレビューは、ハフト（Ｈａｆｔ）らによって示されており（ハフトら、ＰＬｏＳコンピュテーショナル・バイオロジー（ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．）１（６）：ｅ６０［２００５］）、これまでに知られた４つの遺伝子ファミリーに加えて、新たに認められた４１のＣＲＩＳＰＲに結合した（ｃａｓ）遺伝子ファミリーがそこに記載されている。そこに示されるように、異なった反復パターン、遺伝子のセット、および種の範囲をもつＣＲＩＳＰＲシステムは、異なったクラスに属する。本明細書に示されるように、所与のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるｃａｓ遺伝子の数は、種の間で変化し得る。
【０２３９】
いくつかの実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞（例えば、受容細胞）の耐性を調節するために、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子またはタンパク質を、単独で、或いは１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーと任意に組み合わせて用いるための方法および組成物を提供する。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子および／またはタンパク質の１つまたはそれ以上は、受容細胞に自然に生じ、１つまたはそれ以上の非相同的なスペーサーは、ｃａｓ遺伝子またはタンパク質の１つまたはそれ以上の近傍に組込まれるか、または挿入される。いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子またはタンパク質の１つまたはそれ以上は、受容細胞に対して非相同的であり、スペーサーの１つまたはそれ以上は、相同的であるか、または非相同的である。いくつかの好ましい実施形態において、スペーサーは、ｃａｓ遺伝子またはタンパク質の１つまたはそれ以上の近傍に組込まれるか、または挿入される。
【０２４１】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞（例えば、受容細胞）の耐性を調節するために、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを用いる方法および組成を提供する。
【０２４２】
さらに付加的な実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞（例えば、受容細胞）の耐性を調節するために、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子またはタンパク質、少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピート、および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーを用いる方法および組成物を提供する。
【０２４３】
ＣＲＩＳＰＲ構造は、通常はｃａｓ１からｃａｓ４と名付けられた４つの遺伝子の近傍に見出される。これらの遺伝子の最も一般的な配置は、ｃａｓ３−ｃａｓ４−ｃａｓ１−ｃａｓ２である。Ｃａｓ３タンパク質は、ヘリカーゼであるように思われ、一方でＣａｓ４は、エクソヌクレアーゼのＲｅｃＢファミリーに似ており、ＤＮＡ結合を示唆するシステインに富んだモチーフを含む。Ｃａｓ１は、一般に高塩基性で、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含むすべての種に一貫して見出される唯一のＣａｓタンパク質である。Ｃａｓ２は、まだ解析されていないが、ｃａｓ１−４は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への近接近、並びにバクテリアおよび古細菌種にわたる広い分布によって典型的に特徴づけられる。すべてのｃａｓ１−４遺伝子がすべてのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に結合するわけではないが、それらのすべてが複数のサブタイプに見出される。
【０２４４】
加えて、本明細書においてｃａｓ１Ｂ、ｃａｓ５およびｃａｓ６（ボロティンら、［２００５］上記を参照）と呼ばれる、多くのバクテリア種でＣＲＩＳＰＲ構造に結合する３つの遺伝子のまた別のクラスターが存在する。ｃａｓ遺伝子の命名法が流動的なことを付記しておく。かくして、本明細書の本文は、文脈に応じて解釈されなくてはならない。いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子はｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃａｓ３、ｃａｓ４、ｃａｓ１Ｂ、ｃａｓ５および／またはｃａｓ６から選択される。いくつかの好ましい実施形態において、ｃａｓ遺伝子は、ｃａｓ１である。さらに他の実施形態において、ｃａｓ遺伝子は、ｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃａｓ３、ｃａｓ４、ｃａｓ１Ｂ、ｃａｓ５および／またはｃａｓ６のフラグメント、変異形、相同体および／またはそれらの誘導体から選択される。いくつかの付加的な実施形態において、２つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子の組み合わせが、参照により本明細書に組込まれる国際公開第０７／０２５０９７号に示されるのを含む任意の適切な組み合わせを含めて役立つ。いくつかの実施形態において、複数のｃａｓ遺伝子が提供される。いくつかの実施形態において、国際公開第０７／０２５０９７号に示されるように、複数の異なった、および／または同じｃａｓ遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせがある。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子はＤＮＡを備えるが、一方で他の実施形態において、ｃａｓはＲＮＡを備える。いくつかの実施形態において、核酸はゲノム起源であり、他の実施形態において、それは合成または組換え起源である。いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子は２本鎖であるか、或いはセンスまたはアンチセンス鎖、ないしそれらの組み合わせのいずれを表すかに関わらず、１本鎖である。いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子は、本明細書に記載されるように、組換えＤＮＡ技術（例えば、組換えＤＮＡ）を用いて調製される。
【０２４６】
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子は、ｃａｓ遺伝子のフラグメントを備える（すなわち、ｃａｓ遺伝子のこのフラグメントは、野生型配列の一部分を備える）。いくつかの実施形態において、該配列は、野生型配列の少なく約３０％、少なく約４０％、少なく約５０％、少なく約６０％、少なく約６５％、少なく約７０％、少なく約７５％、少なく約８０％、少なく約８５％、少なく約９０％、少なく約９５％、少なく約９６％、少なく約９７％、少なく約９８％、または少なく約９９％を備える。
【０２４７】
いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子は、ｃａｓ４またはｃａｓ６のように、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端におけるリーダー配列、または第1のＣＲＩＳＰＲリピートに最も近いｃａｓ遺伝子であることが望ましい。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ５および／またはＣａｓ６、並びにそれらのフラグメント、変異形、相同体および／または誘導体から選択される。いくつかのさらなる実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、国際公開第０７／０２５０９７号に記載されるように、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ５および／またはＣａｓ６、並びにそれらの組み合わせから選択される。さらに付加的な実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ５および／またはＣａｓ６、或いは複数の同じ、および／または異なったＣａｓタンパク質から、任意の適切な数および／または組み合わせで、選択される。
【０２４９】
用語「Ｃａｓタンパク質」は、複数のＣａｓタンパク質（例えば、約２と約１２との間のＣａｓタンパク質、より好ましくは、約３と約１１との間のＣａｓタンパク質、より好ましくは、約４と約１０との間のＣａｓタンパク質、より好ましくは、約４と約９との間のＣａｓタンパク質、より好ましくは、約４と約８との間のＣａｓタンパク質、およびより好ましくは、４、５、６、または７のＣａｓタンパク質のように約４と約７との間のタンパク質の遺伝子）も包含する。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡを備えるｃａｓ遺伝子によってコード化され、一方で他の実施形態において、ｃａｓはＲＮＡを備える。いくつかの実施形態において、核酸はゲノム起源であり、一方で他の実施形態において、それは合成または組換え起源である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコード化するｃａｓ遺伝子は２本鎖であるか、或いはセンスまたはアンチセンス鎖、ないしそれらの組み合わせのいずれを表すかに関わらず、１本鎖である。いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子は、本明細書に記載されるように、組換えＤＮＡ技術（例えば、組換えＤＮＡ）を用いて調製される。
【０２５１】
本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性の調節に用いるためにｃａｓ遺伝子を同定する方法であって、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーおよび少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを備える細胞を調製するステップ；少なくとも１つのｃａｓ遺伝子を備えるように該細胞を操作するステップ；および該細胞が、標的核酸またはその転写産物に対する耐性を調節するかどうか決定するステップであって、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節することは、細胞の耐性を調節するのにｃａｓ遺伝子が有用であることを示すステップを備える方法も提供する。
【０２５２】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明は、細胞（例えば、受容細胞）を操作するのに有用な方法、およびｃａｓ遺伝子の１つまたはそれ以上を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子は、細胞（例えば、受容細胞）を操作するために用いられ、該ｃａｓ遺伝子は、１つまたはそれ以上の、より好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピート、および１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーと組み合わせて、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節するのに役立つ。例えば、いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子（単数または複数）は、当分野で知られる任意の適切な方法を用いて、細胞のＤＮＡ（例えば、受容細胞のプラスミドおよび／またはゲノムＤＮＡ）に挿入される。いくつかの付加的な実施形態において、ｃａｓ遺伝子は、細胞のＤＮＡにおいてｃａｓ遺伝子がつくり出されるか、または形成されるように該細胞のＤＮＡ（例えば、受容細胞のプラスミドおよび／またはゲノムＤＮＡ）をその上で改変する（例えば、変異させる）ための鋳型として用いられる。いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子は、少なくとも１つのコンストラクト、少なくとも１つのプラスミド、および／または少なくとも１つのベクターに存在し、それらは次に、当分野で知られる任意の適切な方法を用いられて細胞に導入される。
【０２５３】
いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子は、配列番号：４６１、４６６、４７３、４７８、４８８、４９３、４９８、５０４、５０９、および５１７のうちの任意の１つまたはそれ以上から選択される、少なくとも１つのｃａｓクラスターを備える。さらなる実施形態において、ｃａｓ遺伝子は、配列番号：４６２〜４６５、４６７〜４７２、４７４〜４７７、４７９〜４８７、４８９〜４９２、４９４〜４９７、４９９〜５０３、５０５〜５０８、５１０〜５１７のうちの任意の１つまたはそれ以上を、単独で、或いは任意の適切な組み合わせで一緒に備える。いくつかの好ましい実施形態において、該クラスター（単数または複数）は、１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピート、および随意的に１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーと組み合わせて用いられる。いくつかの付加的な実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子またはタンパク質が、適切な組み合わせで用いられる。
【０２５４】
本明細書に示されるように、ｃａｓ遺伝子またはタンパク質の所与の一組は常に、特定のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内の所与の反復配列に結合される。かくして、ｃａｓ遺伝子またはタンパク質は、所与のＤＮＡリピートに対して特異的である（すなわち、ｃａｓ遺伝子またはタンパク質および反復配列は、機能的ペアを成す）ように見える。
【０２５５】
それ故に、細胞（例えば、受容細胞）における、標的核酸またはその転写産物に対する耐性をＣＲＩＳＰＲスペーサーが授けるように、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートの特定の組み合わせが用いられる。それ故に、ただ単に任意のｃａｓ遺伝子またはタンパク質、或いは任意のＣＲＩＳＰＲリピートを用いることができないことが意外にも見出された。その代わり、その組み合わせが機能的なことが、本発明の特徴である。
【０２５６】
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓ遺伝子またはタンパク質の組み合わせの文脈において、用語「機能的な」は、標的核酸またはその転写産物に整列する、すなわち相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサーと一緒に用いられるときに、該組み合わせが、標的核酸またはその転写産物に対する耐性を授けることができることを意味する。本明細書では、用語「機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせ」および「機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓ遺伝子の組み合わせ」は、ｃａｓがｃａｓ遺伝子またはＣａｓタンパク質である機能的な組み合わせを含む。
【０２５７】
適切には、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および／または１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートが同じ細胞（例えば、同じ受容細胞）に由来する。いくつかの実施形態において、用語「由来し得る」は、文脈に用いられるように、用語「入手可能な」と同義である。本発明は、「由来する」エレメントに特に限定される意図をもたないので、いくつかの好ましい実施形態において、用語「由来し得る」は、文脈に用いられるように「由来する」と同義である。いくつかの実施形態において、用語「由来する」は、文脈に用いられるように用語「得られる」と同義である。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および／または１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートは、ゲノムまたはプラスミド、好ましくは同じ菌株、種または属のゲノムまたはプラスミド内の同じＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する。いくつかのさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および／または１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートは、単一のゲノムまたはプラスミド、好ましくは同じ菌株、種または属の単一のゲノムまたはプラスミド内の同じＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートは、自然に同時に生じる。また付加的な実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートは、同じ細胞（例えば、受容細胞）に自然に同時に生じる。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートは、細胞（例えば、受容細胞）の同じゲノムに自然に同時に生じる。なお付加的な実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートは、菌株、種または属の同じゲノムに自然に同時に生じる。いくつかのさらなる好ましい実施形態において、本発明は、本質的に少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピート、および少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質からなる核酸の任意の適切な組み合わせを提供する。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、用語「から本質的に成る」は、少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピート、および少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質の組み合わせを指し、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも１つのさらなる構成要素は除外される（例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）は含まれず、および／または１つまたはそれ以上の共通のリーダー配列（単数または複数）は含まれない）。いくつかの代わりの実施形態において、用語「から本質的に成る」は、少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピート、および少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質の組み合わせのみを指し、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（例えば、自然発生のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座）の他のすべての構成要素は除外される。いくつかのさらなる実施形態において、用語「から本質的に成る」は、少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピート、および少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質の組み合わせのみを指し、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも１つのさらなる構成要素は除外され、好ましくは自然発生のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも１つのさらなる構成要素は除外される。いくつかのなおさらなる実施形態において、用語「から本質的に成る」は、自然発生のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の少なくとも１つのさらなる構成要素はない（例えば、実質的にない）という条件で、少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピート、および少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質の組み合わせを指す。かくして、本用語が文脈に役立つことが意図される。いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のすべての他の構成要素はない（例えば、実質的にない）、好ましくはＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）およびｃａｓ遺伝子（単数または複数）の自然の組み合わせのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のすべての他の構成要素はないという条件で、少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピート、および少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質の任意の適切な組み合わせを提供する。いくつかのさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質は、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーと組み合わせて、または一緒に用いられる。いくつかの付加的な実施形態において、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質は、少なくとも１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー、および少なくとも１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートと組み合わせて、または一緒に用いられる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）は、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および／または１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートがそれに由来する細胞（例えば、受容細胞）とは異なった生物（例えば、ドナー生物）に由来する。
【０２６０】
ＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）、およびｃａｓ遺伝子（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）、特に機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせの様々な配置が提供される。いくつかの実施形態において、該組み合わせは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質のいずれかと組み合わせた、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０のＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）の少なくともいずれか（例えば、１６ＣＲＩＳＰＲリピートおよび１２ｃａｓ遺伝子またはタンパク質、ないし１８ＣＲＩＳＰＲリピートおよび２０ｃａｓ遺伝子またはタンパク質、或いはそれらの任意の他の組み合わせ）を備える、からなる、或いはから本質的になる。本発明は、国際公開第０７／０２５０９７号に示されるように、様々に配置されたＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）およびｃａｓ遺伝子（単数または複数）を提供する。ｃａｓ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲリピートの組み合わせが、１つより多いｃａｓ遺伝子を備えるいくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子の少なくとも１つが機能的なままであるとして、ＣＲＩＳＰＲリピートは、当然のことながらｃａｓ遺伝子の３’末端、ｃａｓ遺伝子の５’末端、またはｃａｓ遺伝子の間に挿入されるであろう。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、（少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを備え、両方ともにゲノム内の同じＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する）第１のＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓ遺伝子またはタンパク質の組み合わせが、（少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを備え、両方ともにゲノム内の同じか、または異なったＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する）第２のＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓ遺伝子またはタンパク質の組み合わせと組み合わせて用いられる。したがって、本発明のこれらの実施形態において、第１および第２の組み合わせは、ゲノム内の同じか、または異なったＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する。かくして、いくつかの実施形態において、第１および第２のＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓ遺伝子またはタンパク質の組み合わせは、本明細書にさらに詳細に記載されるように、異なったゲノムから（例えば、同じクラスター内の異なったゲノムから）のものである。
【０２６２】
本発明のなおさらなる実施形態において、（ゲノム内の同じＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する少なくとも１つのｃａｓ遺伝子、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを備える）第１および／または第２のＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓ遺伝子またはタンパク質の組み合わせが、（各々が、ゲノム内の同じか、または異なったＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する少なくとも１つのｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートを備える）約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０或いはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓ遺伝子またはタンパク質の組み合わせと組み合わせて用いられる。従って、本発明のこれらの実施形態において、該組み合わせは、ゲノム内の同じか、または異なったＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する。本発明のいくつかのさらなる実施形態において、本明細書にさらに詳細に記載されるように、該組み合わせは、異なったゲノム（例えば、同じクラスター内の異なったゲノム）からのものである。
【０２６３】
かくして、いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓ遺伝子またはタンパク質の組み合わせが耐性を授けるために、ＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）、およびｃａｓ遺伝子（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）が、ゲノムの所定のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に自然に同時に生じる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）、およびｃａｓ遺伝子（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）が、ゲノムの同じＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に自然に同時に生じる。いくつかの実施形態において、これらの機能的な組み合わせが一緒に用いられるとき、標的核酸またはその転写産物に対する耐性を授ける。
【０２６４】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明は、ｃａｓ遺伝子またはタンパク質、およびＣＲＩＳＰＲリピートの機能的な組み合わせを同定する方法であって、ｃａｓ遺伝子またはタンパク質、およびＣＲＩＳＰＲリピートの配列（例えば、核酸またはタンパク質配列）を解析するステップ；ｃａｓ遺伝子またはタンパク質の１つまたはそれ以上のクラスターを同定するステップ；ＣＲＩＳＰＲリピートの１つまたはそれ以上のクラスターを同定するステップ；および同じクラスター内に含まれるｃａｓ遺伝子またはタンパク質、およびＣＲＩＳＰＲリピートの配列を組み合わせるステップを備える方法を提供する。
【０２６５】
いくつかの付加的な実施形態において、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性の調節に用いるために、ｃａｓ遺伝子またはタンパク質、およびＣＲＩＳＰＲリピートの機能的な組み合わせを同定する方法であって、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子またはタンパク質、および１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートの組み合わせを備える細胞を調製するステップ；１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーを含むように、該細胞を操作するステップ；および該細胞が、標的核酸に対する耐性を調節するかどうか決定するステップであって、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節することは、この組み合わせが標的核酸に対する細胞の耐性を調節するために使えることを示すステップ、を備える方法を提供する。
【０２６６】
いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子および／またはタンパク質、および／またはＣＲＩＳＰＲリピートの配列は、同じか、または異なった菌株、種、属、および／または生物か、或いはそれらに由来する。いくつかの実施形態において、組み合わせは、ゲノム、組換え、および／または合成起源のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを備える。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）は、ゲノム、組換え、および／または合成起源のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを備える。いくつかの実施形態において、ｃａｓ遺伝子（単数または複数）は、ゲノム、組換え、および／または合成起源のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを備える。実際、本発明は、エレメント（例えば、ｃａｓ遺伝子および／またはＣＲＩＳＰＲリピート）の各々に対するＤＮＡおよび／またはＲＮＡの任意の組み合わせを包含する意図をもつ。いくつかの実施形態において、該エレメントは、当分野で知られる任意の適切な方法を用いて解析される。いくつかの好ましい実施形態において、解析はドットプロット解析を用いて行なわれる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピートおよび／またはｃａｓ遺伝子は２本鎖であり、一方で他の実施形態において、センスまたはアンチセンス鎖、或いはそれらの組み合わせを表すか否かに関わらず、いずれかは一本鎖である。
【０２６７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される機能的な組み合わせの１つまたはそれ以上は、細胞（例えば、受容細胞）を操作するために用いられる。いくつかの好ましい実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーと組み合わせて、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節するのに役立つ１つまたはそれ以上の機能的な組み合わせが、細胞（例えば、受容細胞）を操作するために用いられる。いくつかの実施形態において、機能的な組み合わせは、当分野で知られる任意の適切な方法を用いて、（例えば、細胞のプラスミドまたはゲノムＤＮＡのような）受容細胞のＤＮＡに挿入される。いくつかの付加的な実施形態において、機能的な組み合わせは、細胞のＤＮＡに機能的な組み合わせがつくり出されるように、受容細胞のＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）をその上で改変する（例えば、変異させる）ための鋳型として用いられる。さらに付加的な実施形態において、機能的な組み合わせは、コンストラクト、プラスミド、またはベクター中にクローニングされ、それらが次に、本明細書に記載され、かつ当分野で知られる方法を用いて、細胞中に形質転換される。
【０２６８】
いくつかの実施形態において、機能的な組み合わせは、ｃａｓ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲリピートの配列を解析するステップ；ｃａｓ遺伝子の１つまたはそれ以上のクラスターを同定するステップ；ＣＲＩＳＰＲリピートの１つまたはそれ以上のクラスターを同定するステップ；同じクラスター内に入るｃａｓ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲリピートの配列を組み合わせるステップであって、同じクラスター内のｃａｓ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲリピートの配列を組み合わせることは、該組み合わせが機能的な組み合わせであることを示すステップ、を備える方法によって得られるか、または入手可能である。
【０２６９】
先述のように、任意の細胞（例えば、任意の菌株、種または属の細胞）の間でＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせをただ単に交換することは、必ずしも機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせをもたらさないので、実施できないことが意外にも見出された。実際、ＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせ（単数または複数）が機能的なためには、それらが適合性をもつ必要がある。かくして、異なったＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の間でｃａｓ遺伝子またはＣＲＩＳＰＲリピートを交換することは、それらが同じクラスターに由来しない限り、不可能なことが考えられる。なおさらに意外なことに、該クラスターは、「生物」の系統発生に従わない。特に、１つの生物のなかに、１つより多いＣＲＩＳＰＲが存在し得る。これらのＣＲＩＳＰＲ（単数または複数）は、同じ生物中に存在するが、異なったクラスターに属することもある。それ故に、ＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせが機能的なためには、生物内ではなくクラスター内で交換されることが必要と考えられる。
【０２７０】
誤解を避けるために、本明細書に用いられる用語「クラスター」は、同じ遺伝子座に位置する遺伝子のクラスターではなく、配列比較解析（例えば、多重配列比較解析、および／または多重配列アラインメント、および／またはドットプロット解析）からの出力を指す。従って、いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のクラスター解析は、（例えば、本明細書に記載されるドットプロット解析のような）当分野で知られる様々な方法、または多重アラインメントに続くデンドログラム計算を用いて行なわれる。いくつかの実施形態において、クラスターは、配列のクラス、ファミリーまたはグループである。
【０２７１】
有利なことに、自然に同時に生じるＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせ（単数または複数）を用いると、所与の菌種中または間の両方で該組み合わせを交換することができ、その結果としてある菌株からの組み合わせを用いて、異なった菌株の耐性を操作することが可能になる。
【０２７２】
バクテリオファージ
本明細書では、用語「バクテリオファージ」（または「ファージ」）は、当分野で理解される従来（すなわち、１つまたはそれ以上のバクテリア種に選択的に感染するウイルス）の意味をもつ。多くのバクテリオファージは、バクテリアの特定の属または種ないし菌株に対して特異性がある。いくつかの好ましい実施形態において、ファージは、親バクテリアおよび／または宿主細胞に感染することができる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、親バクテリアに対して毒性をもつ。いくつかの実施形態において、ファージは溶菌性であり、一方で他の実施形態において、ファージは溶原性である。
【０２７３】
溶菌性バクテリオファージとは、溶原経路に入るよりむしろ溶菌サイクルが終わるまでずっと溶菌経路を辿るバクテリオファージのことである。溶菌性バクテリオファージは、ウイルスの複製を経て細胞膜の溶解、細胞の破壊、および他の細胞に感染が可能な子孫バクテリオファージ粒子の放出をもたらす。
【０２７４】
溶原性バクテリオファージは、溶原性経路に入ることが可能なバクテリオファージであり、この経路でバクテリオファージは、溶菌サイクルが終わる前までずっと細胞ゲノムにおける受動性の休眠部分となる。
【０２７５】
本発明に役立つバクテリオファージは、限定されることなしに、次のウイルス科のいずれかに属するバクテリオファージを含む：コルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科、マイオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科、またはテクティウイルス科。いくつかの実施形態において、植物および／または（ヒトを含む）動物に対して病原性があるバクテリアに感染するバクテリオファージは、特に役立つ。いくつかの特に好ましい実施形態において、バクテリオファージに対する細胞の耐性が調節される。
【０２７６】
いくつかの特に好ましい実施形態において、本発明のバクテリオファージは、限定されることなしに、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を自然に備えるバクテリアに感染することができるバクテリオファージを含む。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、限定されることなしに、以下を含めて、４０以上の原核生物（例えば、ジャンセンら、モレキュラー・マイクロバイオロジー、４３：１５６５−１５７５［２００２］；およびモジカら、［２００５］を参照）で同定されている：アエロピルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピロバキュラム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルフォロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーケオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコックス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシーナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピルス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィラス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクイフェックス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サームス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バチルス属、リステリア属、スタフィロコッカス属、クロストリジウム属、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デサルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｒｉｄａｅ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミクソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属、エシェリキア属、レジオネラ属、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈａｍｏｎａｓ）、エルシニア属、トレポネーマ属およびサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）。
【０２７７】
いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、限定されることなしに、次の属に属するバクテリアに感染することができるバクテリオファージを含む：エシェリキア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルウィニア属、エルシニア属、バチルス属、ビブリオ属、レジオネラ属、シュードモナス属、ナイセリア属、ボルデテラ属、ヘリコバクター属、リステリア属、アグロバクテリウム属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、フランシセラ属、ブルセラ属およびキサントモナス属。
【０２７８】
また付加的な実施形態において、バクテリオファージは、限定されることなしに、乳酸菌、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属（例えば、Ｌ．アシドフィルス）、エンテロコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属およびオエノコッカス属に感染する（または形質導入する）ことができるバクテリオファージを含む。
【０２７９】
なおさらなる実施形態において、バクテリオファージは、限定されることなしに、ラクトコッカス・ラクティ（Ｌ．Ｌａｃｔｉ）（例えば、Ｌ．ラクティス亜種ラクティス（Ｌ．  Ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ）およびＬ．ラクティス亜種クレモリス（Ｌ．  Ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、並びにＬ．ラクティス亜種ラクティス次亜種ジアセチラクチス（Ｌ．Ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ））、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキ亜種ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）またはビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）に感染することができるバクテリオファージを含む。
【０２８０】
またさらなる実施形態において、バクテリオファージは、バクテリオファージ感染による破壊に敏感であって、抗生物質、アミノ酸、および溶剤を産生するプロセスを含むが、それらには限定されない、任意の発酵バクテリアに感染することができるバクテリオファージを含む。発酵によって生産される製品であって、バクテリオファージの感染、および感染した発酵バクテリアを経験することで知られる製品は、以下を含む：チェダーおよびカッテージチーズ（ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス）、ヨーグルト（ラクトバチルス・デルブリュッキ亜種ブルガリクス、ストレプトコッカス・サーモフィルス）、スイスチーズ（Ｓ．サーモフィルス、ラクトバチルス・ラクティス、ラクトバチルス・ヘルベティカス）、ブルーチーズ（ロイコノストック・クレモリス）、イタリアンチーズ（Ｌ．ブルガリクス、Ｓ．サーモフィルス）、ヴィーリ（ｖｉｌｌｉ）（ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス次亜種ジアセチラクチス、ロイコノストック・クレモリス）、ヤクルト（ラクトバチルス・カゼイ）、カゼイン（ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス）、納豆（納豆菌）、ワイン（ロイコノストック・エノス）、日本酒（ロイコノストック・メセンテロイデス）、ポリミキシン（バチルス・ポリミキサ）、コリスチン（バチルス・コリストリウム）、バシトラシン（バチラス・リケニホルミス）、Ｌ−グルタミン酸（ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム）、およびアセトン並びにブタノール（クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム）。
【０２８１】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に役立つバクテリアは、限定されることなしに、Ｓ．サーモフィルス、Ｌ．デルブリュッキ亜種ブルガリクスおよび／またはＬ．アシドフィルスを含む。
【０２８２】
特に好ましい実施形態において、バクテリオファージは、限定されることなしに、１つまたはそれ以上の非相同的なＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備えるバクテリアに感染することができるバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態において、バクテリアは、１つまたはそれ以上の非相同的なＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、および／または１つ或いはそれ以上の非相同的なｃａｓ遺伝子、および／または１つ或いはそれ以上の非相同的なＣＲＩＳＰＲリピート、および／または１つ或いはそれ以上の非相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサーを備える。
【０２８３】
ファージによるバクテリアの感染は、ファージのＤＮＡの細胞への注入または導入の結果として生じる。いくつかの実施形態において、感染は、細胞内におけるバクテリオファージの核酸の発現（すなわち、転写および翻訳）、並びにバクテリオファージの生活環の継続につながる。組換えバクテリオファージを伴ういくつかの実施形態において、ファージゲノム内の組換え配列（例えば、レポーター核酸）も発現される。
【０２８４】
原核生物におけるＣＲＩＳＰＲスペーサー配列は、染色体、バクテリオファージ、および接合性プラスミドのような遺伝因子を含めて、様々なＤＮＡ分子に対してしばしば著しい類似性を有することは見出されている。これらのＣＲＩＳＰＲスペーサーを担う細胞は、該スペーサーに対して相同的な配列を含むＤＮＡ分子によって感染されることができないことが報告されている（モジカら、［２００５］を参照）。
【０２８５】
本発明のいくつかの実施形態において、特定のバクテリオファージに対する耐性を調節（例えば、提供）し、かくしてファージの攻撃を実質的に防ぐために、１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に対して相補的または相同的な、バクテリオファージＤＮＡまたはＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に由来する１つまたはそれ以上の特定の偽スペーサーが、細胞（例えば、受容細胞）のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に加えられる。
【０２８６】
いくつかの好ましい実施形態において、限定されることなしに、ヘリカーゼ、プライマーゼ、ヘッドまたはテール構造蛋白質、保存ドメインをもつタンパク質（例えば、ホーリング（ｈｏｌｉｎｇ）、リジンなど）、或いは重要ファージ遺伝子のうちの保存配列のような、特定のファージ−宿主認識を提供するものを含めて、宿主特異性タンパク質をコード化する遺伝子を含む偽スペーサーを調製するために、ファージゲノム内の特定領域が標的とされる。
【０２８７】
ファージゲノムを起源とするいずれの核酸も、例えば、活性なＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における２つのリピート間に挿入されたとき、ファージに対する免疫を授けることができる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーがファージの遺伝子の内部配列に対応しているときに、免疫はより「有効」である。いくつかの特に好ましい実施形態において、遺伝子が「必須」タンパク質（例えば、抗受容体）をコード化するときに、免疫は、なおさらに「有効」になる。
【０２８８】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、バクテリオファージに対する耐性を細胞（例えば、バクテリア細胞）に授ける方法であって、（ａ）少なくとも１つのバクテリオファージからの１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを提供するステップ；（ｂ）該バクテリオファージに実質的に感受性をもつ少なくとも１つの細胞における、１つまたはそれ以上の機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせを同定するステップ；および（ｃ）細胞に耐性を与えるために、バクテリオファージからの１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、或いは１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に相補的か、または相同的な１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーを備えるように、実質的に感受性をもつ細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を操作するステップを備える方法を提供する。
【０２８９】
また付加的な実施形態において、本発明は、バクテリオファージに対する耐性を細胞（例えば、バクテリア細胞）に授けるための方法であって、（ａ）少なくとも１つのバクテリオファージからの１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを提供するステップ；（ｂ）該バクテリオファージに対して実質的に感受性をもつ少なくとも１つの細胞における、１つまたはそれ以上の機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせを同定するステップ；および（ｃ）バクテリオファージに対する実質的な耐性を細胞に与えるように、バクテリオファージからの１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、或いは１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に対して相補的か、または相同的な１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）を、実質的に感度をもつ細胞に挿入するステップを備える方法を提供する。
【０２９０】
さらに付加的な実施形態において、本発明は、バクテリア細胞の溶原型を調節する方法であって、（ａ）少なくとも１つのバクテリオファージからの１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを提供するステップ；（ｂ）該バクテリオファージに対して実質的に感受性をもつ少なくとも１つの細胞における１つまたはそれ以上の機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせを同定するステップ；（ｃ）バクテリオファージからの１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、或いは１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に対して相補的か、または相同的な１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）を備えるように、実質的に感度をもつ細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を操作するステップを備える方法を提供する。
【０２９１】
なおさらなる実施形態において、本発明は、バクテリア細胞の溶原型を調節する方法であって、（ａ）少なくとも１つのバクテリオファージからの１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを提供するステップ；（ｂ）該バクテリオファージに対して実質的に感受性をもつ少なくとも１つの細胞における１つまたはそれ以上の機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせを同定するステップ；および（ｃ）バクテリオファージからの１つまたはそれ以上の１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、或いは１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に対して相補的か、または相同的な１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーを、実質的に感受性をもつ細胞に挿入するステップを備える方法を提供する。
【０２９２】
いくつかのさらなる好ましい実施形態において、本発明は、バクテリオファージに対する耐性を細胞（例えば、バクテリア細胞）に授ける方法であって、（ｉ）それに対する耐性を調節すべき標的核酸またはその転写産物を備えるバクテリオファージにおける偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および（ｉｉ）細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーが、標的核酸を備えるバクテリオファージの偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して相同性をもつように、細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を改変するステップを備える方法を提供する。
【０２９３】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明は、バクテリオファージに対する耐性を細胞（例えば、バクテリアの細胞）に授ける方法であって、（ｉ）それに対する耐性を調節すべき標的核酸またはその転写産物を備えるバクテリオファージにおける偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および（ｉｉ）細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーが、標的核酸を備えるバクテリオファージの偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して１００％の相同性または同一性をもつように、細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を改変するステップを備える方法を提供する。
【０２９４】
さらに付加的な実施形態において、本発明は、バクテリア細胞の溶原型を調節する方法であって、（ｉ）それに対する耐性を調節すべき標的核酸またはその転写産物を備えるバクテリオファージにおける偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および（ｉｉ）細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーが、標的核酸を備えるバクテリオファージの偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して相同性をもつように、細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を改変するステップを備える方法を提供する。
【０２９５】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明は、バクテリア細胞の溶原性を調節する方法であって、（ｉ）それに対する耐性を調節すべき標的核酸またはその転写産物を備えるバクテリオファージにおける偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および（ｉｉ）細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーが、標的核酸を備えるバクテリオファージの偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して１００％の相同性または同一性をもつように、細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を改変するステップを備える方法を提供する。
【０２９６】
いくつかの実施形態において、バクテリア細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーは、標的核酸を備えるバクテリオファージにおける（たとえば、偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーのような）配列に対して１００％の相同性または同一性をもつ。
【０２９７】
いくつかの代わりの実施形態において、バクテリア細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーは、本明細書に記載されるように、機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせを備えるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の構成部分を成す。
【０２９８】
いくつかの特に好ましい実施形態において、バクテリオファージにおける標的核酸またはその転写産物は、高度に保存された核酸配列である。いくつかのさらなる実施形態において、バクテリオファージにおける標的核酸またはその転写産物は、宿主特異性タンパク質をコード化する遺伝子である。いくつかの付加的な実施形態において、バクテリオファージにおける標的核酸またはその転写産物は、バクテリオファージの生存、複製および／または成長に必須の酵素をコード化する。さらに付加的な実施形態において、バクテリオファージにおける標的核酸またはその転写産物は、ヘリカーゼ、プライマーゼ、ヘッドまたはテール構造タンパク質、或いは保存領域をもつタンパク質（例えば、ホーリング、リジンなど）をコード化する。
【０２９９】
いくつかの好ましい実施形態において、「バクテリオファージの増殖または感染に対する敏感性が低減された」バクテリア細胞が調製される。本明細書では、この用語は、（例えば、ミルク培地で）培養された野生型バクテリアと比較したときに、バクテリオファージの増殖または感染に対するバクテリアの敏感性が低いか、またはないことを指す。
【０３００】
いくつかの実施形態において、いくつかのバクテリア細胞は、「バクテリオファージの増殖に対して低い敏感性」を示す。この用語は、バクテリアにおけるバクテリオファージの増殖レベルが、所定の期間内に培養物に有害な影響を及ぼすであろうレベル以下であることを指す。培養物へのかかる有害な影響は、限定されることなしに、発酵乳製品（例えば、ヨーグルトまたはチーズ）の生産の間に乳が凝固しないこと、発酵乳製品（例えば、ヨーグルトまたはチーズ）の生産の間のｐＨ低下が不十分か、または遅いこと、チーズの熟成が遅いこと、および／または食品のテクスチャーが食欲をそぐか、または消費に不適なまでに劣化することを含む。
【０３０１】
同等の培養条件の一組に対して、本発明におけるバクテリアのバクテリオファージに対する敏感性は、一般に野生型バクテリアと比較して表現される。いくつかの実施形態において、本バクテリアは、約１００分の１の（プラーク効率［ＥＯＰ]＝１０−2）、好ましくは約１０００分の１の（ＥＯＰ＝１０−３）、より好ましくは１０，０００分の１の（ＥＯＰ＝１０−４）、および最も好ましくは約１００，０００分の１の（ＥＯＰ＝１０−５）をもつ。いくつかの好ましい実施形態において、培養物におけるバクテリオファージの増殖レベルは、培養物の約１４時間のインキュベーション後、より好ましくは約１２時間後、さらにより好ましくは約７時間後、なおより好ましくは約６時間後、またより好ましくは約５時間後、および最も好ましくは約４時間後に測定される。
【０３０２】
付加的な実施形態において、本発明は、バクテリオファージに対する感受性を細胞（例えば、バクテリア細胞）に授ける方法であって、（ａ）少なくとも１つのバクテリオファージからの偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを提供するステップ；（ｂ）実質的に該バクテリオファージに対する耐性をもつ細胞における１つまたはそれ以上の機能的なＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせを同定するステップ；および（ｃ）実質的に感受性をもつ細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、該遺伝子座が、実質的に耐性をもつ細胞における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と比較して低減された度合いの相同性をもつ、１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー、または１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に対して相補的か、または相同的な１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）を備えるように、操作するステップを備える方法を提供する。
【０３０３】
さらなる実施形態において、本発明は、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートを備える細胞（例えば、バクテリア細胞）の溶原型を調節する（例えば、低減する）方法であって、（ｉ）それに対する耐性を調節すべきバクテリオファージにおける偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および（ｉｉ）細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーが、標的核酸を備えるバクテリオファージの偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対して低減された度合いの相同性をもつように、細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーの配列を改変するステップを備える方法を提供する。
【０３０４】
なおさらなる実施形態において、本発明は、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートを備えるバクテリア細胞のバクテリオファージに対する耐性を調節する（例えば、低減するか、または減少させる）ための方法であって、（ｉ）それに対する耐性を調節すべきバクテリオファージにおける１つまたはそれ以上の偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；（ｉｉ）耐性が調節されるべきバクテリア細胞における、該偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）に対して相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサーを同定するステップ；および（ｉｉｉ）それに対する耐性を調節すべきバクテリオファージの該偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーに対してより低い度合いの相同性をもつように、耐性が調節されるべきバクテリア細胞における該ＣＲＩＳＰＲスペーサー配列を改変するステップを備える方法を提供する。
【０３０５】
いくつかの実施形態において、細胞のＣＲＩＳＰＲスペーサーは、それに対する耐性を調節すべきバクテリオファージの偽ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）と比較して、低減された度合いの相同性をもつ（例えば、相同性が約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約９０、または約９５％低減される）。
【０３０６】
いくつかの実施形態において、バクテリア細胞は、該細胞が「バクテリオファージの増殖に対して増加した敏感性」をもつように、本発明の方法を用いて調製される。本明細書では、この用語は、（例えば、ミルク培地で）培養されたときに、野生型細菌類と比較して、バクテリオファージの増殖に対する敏感性が増加したか、或いはより高いバクテリアを指す。
【０３０７】
いくつかの実施形態において、用語「バクテリオファージの増殖に対する高い敏感性」は、バクテリオファージの増殖レベルが、所定の期間内に培養物に有害な影響をもたらすであろうレベル以上であることを指す。培養物へのかかる有害な影響は、限定されることなしに、発酵乳製品（例えば、ヨーグルトまたはチーズ）の製造の間に乳凝固しないこと、発酵乳製品（例えば、ヨーグルトまたはチーズ）の製造の間のｐＨの低下が不十分か、または遅いこと、チーズの熟成が遅いこと、および／または食欲をそぐか、または消費に不適なまでに食品のテクスチャーが劣化することを含む。
【０３０８】
同等の培養条件の一組に対して、本発明におけるバクテリアのバクテリオファージに対する敏感性は、一般に野生型バクテリアと比較して表現される。いくつかの実施形態において、本バクテリアは、約１００分の１の（プラーク効率［ＥＯＰ]＝１０−2）、好ましくは約１０００分の１の（ＥＯＰ＝１０−３）、より好ましくは１０，０００分の１の（ＥＯＰ＝１０−４）、および最も好ましくは約１００，０００分の１の（ＥＯＰ＝１０−５）をもつ。いくつかの好ましい実施形態において、培養物におけるバクテリオファージの増殖レベルは、培養物の約１４時間のインキュベーション後、より好ましくは約１２時間後、さらにより好ましくは約７時間後、なおより好ましくは約６時間後、まだより好ましくは約５時間後、最も好ましくは約４時間後に測定される。
【０３０９】
いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、２つのＣＲＩＳＰＲリピートが隣接する（すなわち、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、各々の脇に少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲリピートをもつ）。
【０３１０】
本発明のいくつかの実施形態において、親バクテリア（例えば、「親バクテリア菌株」）は、１つより多いバクテリオファージ（例えば、１つまたはそれ以上のファージの混合物）に（例えば、反復して、順次、同時にまたは実質的に同時に）暴露される。いくつかの実施形態において、親バクテリア菌株は、混合物において暴露されるバクテリオファージの各々に対して感受性をもつが、一方で他の実施形態において、バクテリア株菌は、バクテリオファージのいくつかに対して感受性をもつが、しかし他に対しては耐性をもつ。
【０３１１】
本明細書では、用語「タグ付け配列」は、本発明の方法に従って親バクテリアが暴露される、１つまたはそれ以上のバクテリオファージゲノムに由来する付加的なＤＮＡフラグメントの部分（例えば、１つまたはそれ以上のバクテリオファージゲノムのプラス鎖）を指し、標識またはタグとして用いられる（例えば、ユニークな標識またはユニークなタグを提供する）。
【０３１２】
タグ付け配列は、典型的にバクテリオファージに自然発生する配列である。好ましくは、タグ付け配列は、バクテリオファージに自然発生する配列（例えば、それが由来するバクテリオファージゲノム）に対して、少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性をもつ。いくつかの最も好ましい実施形態において、タグ付け配列は、バクテリオファージに自然発生する配列（例えば、それが由来するバクテリオファージゲノム）に対して、約１００％の同一性をもつ。
【０３１３】
いくつかの実施形態において、タグ付け配列は、標識化されたバクテリアの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における任意の他のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたはＣＲＩＳＰＲスペーサーコアに対して、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約４％、約約３％、約２％、約１％、または約０％より少ない同一性をもつ。
【０３１４】
いくつかの実施形態において、タグ付け配列は、標識化されたバクテリアの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における任意の他の配列に対して、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または約０％より少ない同一性をもつ。
【０３１５】
いくつかの付加的な実施形態において、タグ付け配列は、バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における（例えば、ＣＲＩＳＰＲスペーサーのような）配列と同一の配列をもつ。いくつかのさらなる実施形態において、タグ付け配列は、バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲスペーサー）と、１つまたはそれ以上の一塩基多型（例えば、１つまたは２つの一塩基多型）は別として同一の配列をもつ。
【０３１６】
いくつかの好ましい実施形態において、タグ付け配列は、少なくとも約２０ヌクレオチド長であり、一方でいくつかの特に好ましい実施形態において、それは約２０から約５８ヌクレオチド長までである。
【０３１７】
いくつかの特に好ましい実施形態において、少なくとも１つのタグ付け配列が、親バクテリアに組込まれる。いくつかの付加的な実施形態において、親バクテリアのゲノム、または親バクテリアのプラスミド（例えば、メガプラスミド）の１つまたはそれ以上に由来する少なくとも１つの重複配列（例えば、重複したＣＲＩＳＰＲリピート配列）も組込まれる。本発明は、任意の特定のメカニズムまたは理論に限定される意図をもたない。しかしながら、少なくとも１つの重複配列を親バクテリアのゲノムからコピーまたは複製することが考えられる。特に、典型的にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のＣＲＩＳＰＲリピート配列が複製されて、タグ付け配列が新たな重複ＣＲＩＳＰＲリピートのすぐ後（すなわち、下流）でバクテリアのゲノムに組込まれることが考えられる。
【０３１８】
いくつかの特に好ましい実施形態において、少なくとも１つの重複配列は、親バクテリアおよび／または標識化されたバクテリアの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲリピートに対して、少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の同一性をもつＣＲＩＳＰＲリピート配列である。最も好ましくは、少なくとも１つの重複配列は、親バクテリアおよび／または標識化されたバクテリアの１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲリピートに対して、少なくとも約１００％の同一性をもつＣＲＩＳＰＲリピート配列である。いくつかの好ましい実施形態において、重複配列は、少なくも約２４ヌクレオチド長であり、一方でいくつかの特に好ましい実施形態において、それは約２４から約４０ヌクレオチド長までである。
【０３１９】
いくつかの好ましい実施形態において、少なくとも１つのタグ付け配列、および少なくとも１つの複製配が親バクテリアに組込まれる。本発明は、任意の特定のメカニズムまたは理論に限定される意図をもたない。しかしながら、タグ付け配列を親バクテリアのゲノムに組込むたびに、この組込みは、少なくとも１つの重複配列を反復して、順次、同時または実質的に同時に組込むことによって達成されると考えられる。それ故に、タグ付け配列、および重複配列を備える少なくとも１つの配列ペアが親バクテリアに組込まれ、それによって標識化されたバクテリアが生み出される。
【０３２０】
いくつかの好ましい実施形態において、少なくとも１つのタグ付け配列、および少なくとも１つの重複配列は、互いに近接して組み込まれる。より好ましくは、少なくとも１つのタグ付け配列、および少なくとも１つの重複配列は、配列の間に介在するヌクレオチドがないように、互いに直接に近接して組み込まれる。
【０３２１】
いくつかの実施形態において、重複配列は、タグ付け配列の一方の末端（例えば、５’または３’末端）に付着、連結、または融合される。好ましくは、重複配列は、タグ付け配列の５’末端に、付着、連結、または融合される。従って、単一の配列ペアが組込まれた後に、重複配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における第１の配列であり、タグ付け配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における重複配列の下流の第２の（例えば、次の）配列になる。いくつかの好ましい実施形態において、これらの配列は、重複配列とタグ付け配列との間に介在するヌクレオチドがないように、直接的に付着、直接的に連結、または直接的に融合される。
【０３２２】
かくして、いくつかの実施形態において、重複配列とタグ付け配列とのペアが、親バクテリアのゲノムに組込まれ、標識化されたバクテリアが生じる。重複配列は、親バクテリアのゲノムから由来する、由来し得る、得られるか、または入手することができ、タグ付け配列は、親バクテリアへの感染に用いられるバクテリオファージゲノムから由来する、由来し得る、得られるか、または入手することができる。
【０３２３】
驚くべきことに、いくつかの実施形態において、複数の配列ペアが親バクテリアのゲノムに組込まれることが見出された。これらの実施形態によれば、複数のペアは、重複配列およびタグ付け配列を備える第１のペア、および第２の重複配列および第２のタグ付け配列を備える第２のペアを備える。第２の重複配列は、典型的に第１の重複配列と同じ配列（例えば、約９５％、約９６、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％より大きい同一性）を備える。タグ付け配列は、典型的に第１のタグ付け配列と異なる配列（例えば、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または０％より少ない同一性）を備える。これは、付加的な配列ペアが組込まれる実施例においても同様である。
【０３２４】
従って、複数のペアの構成は、典型的に以下を備える：
［重複配列−タグ付け配列］ｎ、但しｎ＝２，３，４，５，６またはそれ以上。好ましくは、複数のペアの構成は、典型的に以下を備える：
［ＣＲＩＳＰＲリピート−タグ付け配列］ｎ、但しｎ＝２，３，４，５，６またはそれ以上。いくつかの実施形態において、複数のペアの構成は、以下の通りである：
５’−［重複配列−タグ付け配列］ｎ−３’、但しｎ＝２，３，４，５，６またはそれ以上。好ましくは、複数のペアの構成は、以下の通りである：
５’−［ＣＲＩＳＰＲリピート−タグ付け配列］ｎ−３’、但しｎ＝２，３，４，５，６またはそれ以上。
【０３２５】
従って、いくつかの実施形態において、複数の配列ペアが親バクテリアに組込まれる。いくつかの実施形態において、タグ付け配列は、（ｉ）親バクテリアに自然発生する配列に対して相同的な（例えば、同一の）重複配列；（ｉｉ）親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に自然発生する配列に対して相同的な（例えば、同一の）重複配列；または（ｉｉｉ）最も好ましくは、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に自然発生するＣＲＩＳＰＲリピートに対して相同的な（例えば、同一の）重複配列に近接して組込まれる。
【０３２６】
独立した実験において、親バクテリアを所与のバクテリオファージに各々暴露した後に、標識化されたバクテリアの各々におけるタグ付け配列は、異なったヌクレオチド配列を提示し、それによって各々のバクテリアにユニークな配列がもたらされる。かくして、任意の特定の理論に束縛されることなしに、親バクテリアを所与のバクテリオファージに暴露した時点で、親バクテリアに組込まれるタグ付け配列は、バクテリオファージゲノムから一見してランダムに選択されることが考えられる。しかしながら、本発明は、ランダムな組込み事象に限定される意図をもたない。
【０３２７】
有利なことに、ランダムに選択されたタグ付け配列が、標識化されたバクテリアにおけるユニークなタグまたは標識を提供するという事実故に、この驚くべき知見が本発明の文脈に利用される。驚くべきことに、同じ親バクテリアが同じバクテリオファージに暴露されたとき、独立／別の実験で組込まれたタグ付け配列は異なった配列であり、各々の暴露の結果として標識化されたバクテリアにはユニークな標識が生じることも見出された。
【０３２８】
いくつかの実施形態において、標識化されたバクテリアにおけるランダムに選択されたタグ付け配列は、タグ付け配列の次の特性の１つまたはそれ以上によって同定される：
（１）バクテリオファージ非感受性変異体の１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるタグ付け配列の位置。本明細書に記載されるように、タグ付け配列は、標識化されたバクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方および／または両方の末端（例えば、５’および／または３’末端、より好ましくは、５’末端）に典型的に位置する。
（２）タグ付け配列は、親バクテリアがそれに対して暴露されるバクテリオファージゲノムにおける配列に対して、高い度合の相同性または同一性（例えば、１００％の同一性）をもつ；および／または
（３）タグ付け配列は、親バクテリアのゲノムから複製された少なくとも１つの配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲリピート）に、融合、連結または付着する（例えば、直接に融合、連結または付着する）。典型的に、本明細書に記載されるように、この付加的な配列ペアは、標識化されたバクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方および／または両方の末端（例えば、５’および／または３’末端、好ましくは、５末端）に位置する。
【０３２９】
本明細書に示されるいくつかのタグ付け／標識化の実施形態において、１つまたはそれ以上のタグ付け配列、および／または１つまたはそれ以上の重複配列（例えば、親バクテリアから複製されたＣＲＩＳＰＲリピート）は、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。いくつかの好ましい実施形態において、本明細書に記載されるような１つまたはそれ以上の重複−配列−タグ付けの配列ペアは、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組込まれる。いくつかの実施形態において、タグ付け配列（単数／複数）および／または重複配列（単数／複数）は、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組込まれる。いくつかの他の実施形態において、タグ付け配列（単数／複数）および／または重複配列（単数／複数）は、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方または両方の末端に組込まれる。またさらなる実施形態において、タグ付け配列（単数／複数）および／または重複配列（単数／複数）は、該配列が、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端および３’末端に存在するように、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の両方の末端に組込まれる。重複配列の一方は、典型的にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における第１の配列になり、タグ付け配列は、重複配列のすぐ下流に存在することになる。他方の重複配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端における最後の配列となり、タグ付け配列は、重複配列のすぐに上流に存在することになる。
【０３３０】
いくつかの実施形態において、タグ付け配列（単数／複数）および／または重複配列（単数／複数）は、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組込まれる。またさらなる実施形態において、タグ付け配列（単数／複数）および／または重複配列（単数／複数）は、該配列（単数／複数）が、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端に存在するように、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方の末端に組込まれる。重複配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端における最後の配列になり、タグ付け配列は、重複配列のすぐ上流に存在することになる。好ましくは、タグ付け配列（単数／複数）および／または重複配列（単数／複数）は、該配列が、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端に存在するように、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方の末端に組込まれる。重複配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端における第１の配列であり、タグ付け配列は、重複配列のすぐ下流に存在する。
【０３３１】
本明細書に記載されるように、タグ付け配列（単数／複数）は、親バクテリア（例えば、同じ親バクテリア）が、バクテリオファージ（例えば、同じバクテリオファージ）に暴露されるたびに、バクテリオファージから親バクテリアに組込まれるか、または挿入されるタグ付け配列が異なるという意味で、菌株に固有のタグである。それ故に、タグ付け配列は、所与のバクテリア菌株のためのユニークなタグとして役立つ。
【０３３２】
タグ付け配列（単数／複数）および／または重複配列（単数／複数）は、１つまたはそれ以上の異なったＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組込まれ、一方で他の実施形態において、２つまたはそれ以上の異なったタグ付け配列（単数／複数）および／または重複配列（単数／複数）は、１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組込まれ、なおさらなる実施形態であり、２つまたはそれ以上の異なったタグ付け配列（単数／複数）および／または重複配列（単数／複数）は、各々が２つまたはそれ以上の異なったＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組込まれる。バクテリオファージの各々からのタグ付け配列の各々、および／または親バクテリアからの重複配列（例えば、複製されたＣＲＩＳＰＲリピート）の各々は、同じＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組込まれることができる。
【０３３３】
いくつかの実施形態において、タグ付け配列の各々、および／または重複配列の各々は、同じＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方または両方の末端に組込まれる。いくつかのさらなる実施形態において、タグ付け配列の各々、および／または重複配列の各々は、同じＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’および／または３’末端に組込まれる。好ましくは、タグ付け配列の各々、および／または重複配列の各々は、同じＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端に組込まれる。いくつかの付加的な実施形態において、タグ付け配列の各々、および／または親バクテリア重複配列の各々は、反復して、同時または実質的に同時に組込まれる。いくつかの実施形態において、タグ付け配列の各々、および／または重複配列の各々は、順次組込まれ、それによって第１のタグ付け配列、および／または第１の重複配列が親バクテリアに組込まれる。第２のバクテリオファージからの第２のタグ付け配列、および／または別の重複配列が次に親バクテリアに組込まれる。適切には、タグ付け配列、および／または重複配列は、親バクテリアの染色体ＤＮＡに組込まれる。
【０３３４】
いくつかの実施形態において、タグ付け配列の各々、および／または重複配列の各々は、同じＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方の末端（例えば、５’末端）に、互いに近接して（例えば、隣に）組込まれる。かくして、いくつかの実施形態おいて、タグ付け配列の各々、および／または重複配列の各々は、順次組込まれ、それによって第１の配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方の末端で（例えば、５’および／または３’末端内、または同末端で）親バクテリアに組込まれる。次に第２のタグ付け配列、および／または重複配列は、第１の配列ペアに近接（例えば、直接に近接）して親バクテリアに組込まれる。いくつかの実施形態において、第２の配列は、第１の配列の５’または３’末端に近接（例えば、直接に近接）して親バクテリアに組込まれる。好ましくは、第２の配列は、第１の配列の３’末端に近接（例えば、直接に近接）して親バクテリアに組み込まれるなどである。いくつかの実施形態において、配列の各々は、親バクテリアの同じＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の３’末端内または同末端に、および／または５’末端に、互いに近接して（例えば、隣に）組込まれる。いくつかの好ましい実施形態において、配列の各々は、親バクテリアの同じＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端に、互いに近接して（例えば、隣に）組込まれる。より好ましくは、配列の各々は、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端の上流に、互いに近接して（例えば、隣に）組込まれる。より好ましくは、配列の各々は、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’ＣＲＩＳＰＲリピートの上流に、互いに近接して（例えば、隣に）組込まれる。最も好ましくは、配列の各々は、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の第１の５’ＣＲＩＳＰＲリピートの上流に、互いに近接して（例えば、隣に）組込まれる。
【０３３５】
標識化されたバクテリア
本明細書では、「標識化されたバクテリア（複数）」および「標識化されたバクテリア（単数）」は、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、或いはその一部分が、それが暴露された１つまたはそれ以上のバクテリオファージに対して非感受性であるように改変された（例えば、変異した）、親バクテリア（単数）、親バクテリア（複数）、または親バクテリア菌株を指す。本明細書にさらに詳細に記載されるように、いくつかの実施形態において、標識化されたバクテリアは、１つより多いバクテリオファージに（例えば、反復して、順次また同時に）暴露されることであって、暴露されたバクテリオファージの各々に対して非感受性になる仕方で１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に１つまたはそれ以上のゲノムの改変を蓄積するように暴露される。
【０３３６】
細胞に感染するために、バクテリオファージは、核酸、すなわち細胞のゲノムと独立に存在しているファージの核酸を細胞に注入または導入する。いくつかの実施形態において、感染は、細胞内におけるバクテリオファージの核酸の発現（すなわち、転写および翻訳）、並びにバクテリオファージの生活環の継続をもたらす。
【０３３７】
本発明のいくつかの実施形態において、バクテリオファージへの暴露後に、標識化されたバクテリアは、親バクテリアと比較してファージ感染および／または増殖に対する敏感性が低減されるか、またはなくなる。本明細書では、用語「バクテリオファージ感染および／または増殖に対する敏感性の低減」は、標識化されたバクテリアにおけるバクテリオファージ感染および／または増殖のレベルが、標識化されたバクテリアに有害な影響をもたらさないことを意味する。
【０３３８】
かくして、本発明のいくつかの実施形態において、親バクテリアは、バクテリオファージに対して非感受性になるように変異したために、バクテリオファージへの暴露後に死なない。
【０３３９】
いくつかの実施形態において、標識化されたバクテリアは、バクテリオファージによるさらなる感染および／または増殖に対して非感受性または実質的に非感受性である。付加的な実施形態において、標識化されたバクテリアは、バクテリオファージが、バクテリア中に感染および／または増殖するために用いるメカニズムの１つまたはそれ以上に対して非感受性または実質的に非感受性である。なおさらなる実施形態において、標識化されたバクテリアは、バクテリオファージが、バクテリア中に感染および／または増殖するために用いるメカニズムのすべてに対して非感受性または実質的に非感受性である。さらに付加的な実施形態において、標識化されたバクテリアは、感染サイクルの間にバクテリオファージを弱毒化、不活性化または破壊する１つまたはそれ以上のメカニズムを発達させる。いくつかのさらなる実施形態において、本発明は、バクテリオファージ非感受性変異体を単離するために、当分野で知られる標準的なスクリーニング手順によって選択された標識化菌株を提供する。
【０３４０】
本発明のいくつかの実施形態において、親バクテリアおよび標識化されたバクテリアからのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分の比較に続いて、親バクテリアに存在しないタグ付け配列をＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に備える標識化されたバクテリアが選択される。
【０３４１】
いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’および／または３’末端内或いは同末端に、親バクテリアに存在しない付加的なＤＮＡフラグメントを備える標識化されたバクテリアが選択される。より好ましくは、標識化されたバクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における新たな重複配列の３’末端に近接（例えば、直接に近接）して、親バクテリアに存在しないタグ付け配列を備える標識化されたバクテリアが選択される。最も好ましくは、標識されたバクテリアにおけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の第１のＣＲＩＳＰＲリピートの３’末端に近接（例えば、直性に近接）して、親バクテリアに存在しないタグ付け配列を備える標識されたバクテリアが選択される。
【０３４２】
いくつかの実施形態において、タグ付け配列（例えば、１つまたはそれ以上のタグ付け配列）が単離および／またはクローニングされる。いくつかのさらなる実施形態において、タグ付け配列（例えば、１つまたはそれ以上のタグ付け配列）が配列決定される。これらの実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内のタグ付け配列の位置に関する情報だけでなく、その具体的な配列も提供する利点をもつ。いくつかの実施形態において、この情報はデータベースに蓄積され、それによって所与のバクテリアに対するユニークな標識、さらにバクテリアを続いて追跡および／または同定する手段を提供する。
【０３４３】
標識化されたバクテリアにおけるタグ付け配列がわかると、タグ付け配列のみでバクテリアの同定に役立つ。当分野で知られる、および本明細書に記載される様々な方法を用いられて、タグ付け配列およびその位置が決定される。この配列は、次にバクテリアを同定するために、例えば、バクテリアの配列データベース、および／またはバクテリオファージの配列データベース、および／またはデータベースないし標識／タグに対してマッチングが行われる。
【０３４４】
ドナー生物
本明細書のいくつかの実施形態に用いられるように、用語「ドナー生物」は、ＣＲＩＳＰＲリピート、および／またはｃａｓ遺伝子、および／またはそれらの組み合わせ（単数または複数）、および／またはＣＲＩＳＰＲスペーサーがそれに由来する生物または細胞を指す。これらは、同じあっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、用語「ドナー生物」は、１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピート、および／または１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子、および／またはそれらの組み合わせ（単数または複数）、および／またはＣＲＩＳＰＲスペーサーがそれに由来する生物または細胞を指す。これらは、同じあっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサー、および／または偽ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、合成起源である。またさらなる実施形態において、ドナー生物または細胞は、標的核酸またはその転写産物に対する免疫の特異性を授ける１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーを備える。付加的な実施形態において、ｃａｓ遺伝子、および／またはＣＲＩＳＰＲリピート、および／またはそれらの組み合わせがそれに由来するドナー生物または細胞は、組換えＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のための受容細胞／生物でもある。これらは、同じであっても異なっていてもよい。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーがそれに由来するドナー生物または細胞は、組換えＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のための受容細胞／生物でもある。これらは、同じであっても異なっていてもよい。ドナー生物がバクテリア細胞である実施形態では、ドナー生物は、標的核酸またはその転写産物に対する特異免疫を授けるＣＲＩＳＰＲスペーサーを典型的に備える。いくつかの実施形態において、該生物はバクテリア細胞であり、一方で他の実施形態において、それはバクテリオファージである。
【０３４５】
宿主細胞
本明細書では、用語「宿主細胞」は、本明細書による組み合わせ、コンストラクトまたはベクターなどを備える任意の細胞を指す。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ベクター（例えば、クローニング・ベクター）に含まれるヌクレオチド配列により形質転換または形質移入される。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列を複製および／または発現するためにベクターが担うことができる。該細胞は、ベクターと適合するように、いくつかの実施形態において、原核生物（例えば、バクテリア）細胞が選ばれる。
【０３４６】
受容細胞
本明細書では、用語「受容細胞」は、標的核酸またはその転写産物に対する耐性が、そのなかで調節されるか、または調節されるべき任意の細胞を指す。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本発明による組換え核酸を備える任意の細胞を指す。いくつかの実施形態において、受容細胞は、１つまたはそれ以上の、好ましくは、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピート、および１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質を備える。適切には、ＣＲＩＳＰＲリピートおよびｃａｓ遺伝子またはタンパク質は、本明細書に記載されるように、受容細胞において機能的な組み合わせを成す。いくつかのさらなる実施形態において、宿主細胞は、１つまたはそれ以上の改変されたＣＲＩＳＰＲリピート、および／または１つまたはそれ以上の改変されたｃａｓ遺伝子或いはタンパク質を備える。適切には、改変されたＣＲＩＳＰＲリピート、および／または改変されたｃａｓ遺伝子またはタンパク質は、本明細書に記載されるように、受容細胞において機能的な組み合わせを成す。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、１つまたはそれ以上の遺伝子操作されたＣＲＩＳＰＲリピート、および／または１つまたはそれ以上の遺伝子操作されたｃａｓ遺伝子或いはタンパク質を備える。適切には、遺伝子操作されたＣＲＩＳＰＲリピート、および／または遺伝子操作されたｃａｓ遺伝子またはタンパク質は、本明細書に記載されるように、受容細胞における機能的な組み合わせを成す。いくつかの代わりの実施形態において、受容細胞は、１つまたはそれ以上の組換えＣＲＩＳＰＲリピート、および／または１つまたはそれ以上の組換えｃａｓ遺伝子或いはタンパク質を備える。適切には、本明細書に記載されるように、組換えＣＲＩＳＰＲリピート、および／または組換えｃａｓ遺伝子或いはタンパク質は、受容細胞において機能的な組み合わせを成す。さらに付加的な実施形態において、受容細胞は、１つまたはそれ以上の自然発生のＣＲＩＳＰＲリピート、および１つまたはそれ以上の自然発生のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質を備える。適切には、ＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）、およびｃａｓ遺伝子（単数または複数）またはタンパク質は、機能的な組み合わせを成す。
【０３４７】
いくつかの実施形態において、受容細胞は、１つまたはそれ以上の改変された、遺伝子操作された、組み換えまたは自然発生のＣＲＩＳＰＲリピート、および１つまたはそれ以上の改変された、遺伝子操作された、組換えまたは自然発生のｃａｓ遺伝子またはタンパク質の組み合わせを備える。適切には、１つまたはそれ以上の改変された、遺伝子操作された、組換えまたは自然発生のＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）、または１つまたはそれ以上の改変された、遺伝子操作された、組み換えまたは自然発生のｃａｓ遺伝子（単数または複数）またはタンパク質は機能的な組み合わせを成す。
【０３４８】
いくつかの実施形態において、受容細胞は、原核細胞である。いくつかの好ましい実施形態において、宿主細胞は、バクテリア細胞である。適切なバクテリア細胞は、本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、バクテリア細胞は、乳酸菌種、ビフィドバクテリウム種、ブレビバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種、ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、エンテロコッカス種を含むラクトバチルス種、ペディオコッカス種、ロイコノストック種およびオエノコッカス種から選択される。適切な種は、限定されることなしに、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスおよびラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスを含むラクトコッカス・ラクティス、ロイコノストック種、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス次亜種、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・デルブリュッキ亜種ブルガリクスおよびラクトバチルス・ヘルベティカス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ラクトバチル・アシドフィルス、ラクトバチルス・カゼイを含む。
【０３４９】
細胞の耐性が調節されべきいくつかの実施形態において、（牛、豚および鶏を含む）肉を発酵させるために、限定されることなしに、当分野で知られるように、乳酸菌（Ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、ペディオコッカス・セレビシエ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ミクロコッカス種、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）、ラクトバチルス・クルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、スタフィロコッカス・キシローサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓ）およびスタフィロコッカス・ビツリヌス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ）、並びにそれらの混合物を含めて、バクテリア細胞が用いられる。いくつかの代わりの実施形態において、野菜（例えば、ニンジン、キュウリ、トマト、ペッパーおよびキャベツ）を発酵させるために、限定されることなしに、当分野で知られるように、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ペディオコッカス・ペントサセウス、およびそれらの混合物を含めて、バクテリア細胞が用いられる。いくつかの代わりの実施形態において、穀類（例えば、小麦、ライ麦、米、オート麦、大麦およびトウモロコシ）から作られたパン生地を発酵させるために、バクテリア細胞が用いられる。いくつかのさらなる実施形態において、ワインを製造するために、バクテリア細胞が用いられる。典型的に、これは果汁、通常はブドウ果汁の発酵によって達成される。なおさらなる実施形態において、乳発酵させてチーズを製造するために、当分野で知られるように、バクテリア細胞（例えば、ラクトバチルス・デルブリュッキ亜種ブルガリクス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス次亜種ジアセチラクチス、ラクトコッカス属、ビフィドバクテリウム属、およびエンテロコッカス属など、並びにそれらの混合物）が用いられる。なおさらなる実施形態において、卵を発酵させるために、当分野で知られるように、バクテリア細胞（例えば、ペディオコッカス・ペントサセウス、ラクトバチルス・プランタラムおよびそれらの混合物）が用いられる。いくつかのさらなる実施形態において、バクテリア細胞は、化粧品または医薬組成物に用いられる。
【０３５０】
いくつかの実施形態において、耐性が調節されるべき細胞は、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を自然に備えるバクテリアである。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、アエロピルム属、ピロバキュラム属、スルフォロブス属、アーケオグロブス属、ハロアーキュラ属、メタノバクテリウム属、メタノコックス属、メタノサルシーナ属、メタノピルス属、パイロコッカス属、ピクロフィラス属、サーモプラズマ属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ストレプトミセス属、アクイフェックス属、ポルフィロモナス属、クロロビウム属、サームス属、バチルス属、リステリア属、スタフィロコッカス属、クロストリジウム属、サーモアナエロバクター属、マイコプラズマ属、フゾバクテリウム属、アゾアルカス属、クロモバクテリウム属、ナイセリア属、ニトロソモナス属、デサルフォビブリオ属、ジオバクター属、ミクソコッカス属、カンピロバクター属、ウォリネラ属、アシネトバクター属、エルウィニア属、エシェリキア属、レジオネラ属、メチロコッカス属、パスツレラ属、フォトバクテリウム属、サルモネラ属、キサントモナス属、エルシニア属、トレポネーマ属およびサーモトガ属を含むが、それらには限定されない、４０以上の原核生物で同定されている（ハフトら、２００５、上記を参照）。
【０３５１】
親バクテリア菌株
本明細書では、用語「親バクテリア（単数）」、「親バクテリア（複数）」および「親菌株」は、１つまたはそれ以上のバクテリオファージ（単数または複数）に暴露される任意のバクテリア（単数）／バクテリア（複数）／菌株を指す。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、親バクテリア菌株に対して毒性があり、一方で他の実施形態において、それらは非毒性である。いくつかの特に好ましい実施形態において、親バクテリアは、毒性ファージに対して感受性をもつ。いくつかの好ましい実施形態において、親菌株は、バクテリオファージに感染する。いくつかの特に好ましい実施形態において、ファージによる感染は、親バクテリア（単数）／バクテリア（複数）／菌株またはそれらの亜集団をバクテリオファージによるさらなる感染に対して非感受性にする。いくつかの好ましい実施形態において、１つまたはそれ以上のバクテリオファージによる「親バクテリア」の感染は、その結果としてバクテリオファージに対する非感受性に基づいて選択され得る標識化された菌株をつくり出す。いくつかの好ましい実施形態において、「バクテリオファージ耐性変異体」は、本発明の方法に従ってタグ付けまたは標識化されたバクテリアである。いくつかの実施形態において、親バクテリアは、野生型バクテリア菌株である。いくつかの好ましい実施形態において、親バクテリアは、これまでにいかなるバクテリオファージにも感染しなかったバクテリアの野生型菌株である。いくつかの好ましい実施形態において、親バクテリアは、これまでにタグ付けまたは標識化されなかったバクテリアの野生型菌株であり、一方でいくつかの代わりの実施形態において、親バクテリアは、これまでにタグ付けまたは標識化されたバクテリオファージ耐性変異体である。
【０３５２】
いくつかの特に好ましい実施形態において、親バクテリアは、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を自然に備える任意のバクテリアから選択される。上述のように、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、アエロピルム属、ピロバキュラム属、スルフォロブス属、アーケオグロブス、ハロアーキュラ属、メタノバクテリウム属、メタノコックス属、メタノサルシーナ属、メタノピルス属、パイロコッカス属、ピクロフィラス属、サーモプラズマ属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ストレプトミセス属、アクイフェックス属、ポルフィロモナス属、クロロビウム属、サームス属、バチルス属、リステリア属、スタフィロコッカス属、クロストリジウム属、サーモアナエロバクター属、マイコプラズマ属、フゾバクテリウム属、アゾアルカス属、クロモバクテリウム属、ナイセリア属、ニトロソモナス属、デサルフォビブリオ属、ジオバクター属、ミクソコッカス属、カンピロバクター属、ウォリネラ属、アシネトバクター属、エルウィニア属、エシェリキア属、レジオネラ属、メチロコッカス属、パスツレラ属、フォトバクテリウム属、サルモネラ属、キサントモナス属、エルシニア属、トレポネーマ属およびサーモトガ属を含むが、それらには限定されない、４０以上の原核生物で同定されている（ハフトら、２００５、上記を参照）。
【０３５３】
いくつかの実施形態において、親バクテリアは、１つまたはそれ以上の非相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサー、１つまたはそれ以上の非相同的なＣＲＩＳＰＲリピート、および／または１つまたはそれ以上の非相同的なｃａｓ遺伝子を備える。いくつかの代わりの実施形態において、親バクテリアは、１つまたはそれ以上の非相同的なＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、好ましくは、１つまたはそれ以上の完全なＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える。いくつかのさらなる実施形態において、親バクテリアは、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、さらに１つまたはそれ以上の非相同的なＣＲＩＳＰＲスペーサー、１つまたはそれ以上の非相同的なＣＲＩＳＰＲリピート、および／または１つまたはそれ以上の非相同的なｃａｓ遺伝子を自然に備える。いくつかの付加的な実施形態において、親バクテリアは、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を自然に備え、さらに１つまたはそれ以上の非相同的なＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、好ましくは、１つまたはそれ以上の完全なＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を備える。
【０３５４】
いくつかの好ましい実施形態において、親バクテリアを少なくとも１つのファージに暴露することによってつくり出されたファージ耐性の亜集団は、純粋培養物である。しかしながら、本発明は、バクテリア菌株、変異株、またはファージの純粋培養物に限定される意図をもたない。実際、本発明は、細胞およびファージの混合培養物を包含する意図をもつ。いくつかの実施形態において、該混合培養物は、同じ、および／または異なったＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における異なった組み込み事象に対応する異なった変異体の混合物である。
【０３５５】
本発明はそのように限定される意図をもたないが、好ましい親バクテリア属は、ストレプトコッカス属およびラクトバチルス属である。実際、限定されることなしに、エシェリキア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルウィニア属、エルシニア属、バチルス属、ビブリオ属、レジオネラ属、シュードモナス、ナイセリア属、ボルデテラ属、ヘリコバクター属、リステリア属、アグロバクテリウム属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、フランシセラ属、ブルセラ属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、エンテロコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、オエノコッカス属、および／またはキサントモナス属を含めて、任意のバクテリア種が本発明に役立つ。いくつかの実施形態において、親バクテリアは、限定されることなしにビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属（例えば、アシドフィルス菌）、エンテロコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、および／またはオエノコッカス属を含めて、乳酸菌であるか、またはそれらに由来する。さらなる実施形態において、親バクテリアは、ラクトコッカス・ラクティス（例えば、Ｌ．ラクティス亜種ラクティスおよびＬ．ラクティス亜種クレモリス、およびＬ．ラクティス亜種ラクティス次亜種ジアセチラクチス）、Ｌ．デルブリュッキ亜種ブルガリクス、Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．アシドフィルス、Ｌ．カゼイ、Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．サリバリウス、Ｌ．プランタラム、Ｌ．ロイテリー、Ｌ．ガセリ、Ｌ．ジョンソニイ、ビフィドバクテリウム・ラクティス、Ｂ．インファンティス、Ｂ．ロングム、および／またはストレプトコッカス・サーモフィルスであるか、またはそれらに由来する。
【０３５６】
本発明のいくつかの実施形態において、親バクテリアは、「食物等級のバクテリア」（すなわち、食品および／または飼料の調製および／または製造に使用され、かつその使用が一般に安全と見做されるバクテリア）である。いくつかの好ましい実施形態において、親バクテリアは、スターター培養物、プロバイオティック培養物および／またはダイエタリーサプリメントとして用いるのに適する。付加的な実施形態において、親バクテリアは、限定されることなしに、乳酸菌、ペディオコッカス・セレビシエ、ラクトバチルス・プランタラム、Ｌ．ブレビス、Ｌ．サケイ、Ｌ．クルバタス、ミクロコッカス種、ペディオコッカス・ペントサセウス、スタフィロコッカス・キシローサス、Ｓ．ビツリヌスおよびそれらの混合物を含めて、肉（例えば、牛、豚、ラムおよび鶏）の発酵に役立つ（例えば、クノール（Ｋｎｏｒｒ）編，フード・バイオテクノロジー（Ｆｏｏｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５３８−３９［１９８７］；およびペダーソン（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ）、マイクロバイオロジー・オブ・ファーメンテッド・フーズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  Ｆｏｏｄｓ）２１０−３４，２ｄ  ｅｄ．，［１９７９］；並びに、その全体が参照により本明細書に組込まれる、米国特許第２，２２５，７８３号、を参照）。さらに付加的な実施形態において、親バクテリアは、限定されることなしに、Ｌ．プランタラム、Ｌ．ブレビス、ロイコノストック・メセンテロイデス、ペディオコッカス・ペントサセウス、およびそれらの混合物を含めて、野菜（例えば、ニンジン、キュウリ、トマト、ペッパーおよびキャベツ）の発酵に役立つ（例えば、クノール、上記；ペダーソン、上記；および米国特許第３，０２４，１１６号、３，４０３，０３２号、３，９３２，６７４号、および３，８９７，３０７号を参照）。またさらなる実施形態において、親バクテリアは、穀類（例えば、小麦、ライ麦、米、オート麦、大麦およびトウモロコシ）から作られたパン生地の発酵に役立つ。なおさらなる実施形態において、親バクテリアは、果汁（例えば、ブドウ果汁）の発酵を通してワインの製造に役立つ。いくつかの付加的な実施形態において、親バクテリアは、乳発酵に役立つ（例えば、Ｌ．デルブリュッキ亜種ブルガリクス、Ｌ．アシドフィルス、Ｓ．サーモフィルス、およびそれらの混合物（クノール、上記；およびペダーソン、上記、１０５−３５ページを参照）。いくつかの好ましい実施形態において、親バクテリアは、限定されることなしに、Ｌ．デルブリュッキ亜種ブルガリクス、Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．ラクティス亜種ラクティス、Ｌ．ラクティス亜種クレモリス、Ｌ．ラクティス亜種ラクティス次亜種ジアセチラクチス、Ｓ．サーモフィルス、ビフィドバクテリウム・エンテロコッカスなど、およびそれらの混合物を含めて、チーズの製造に役立つ（例えば、クノール、上記およびペダーソン、上記、１３５−５１ページを参照）。またさらなる実施形態において、親バクテリアは、限定されることなしに、ペディオコッカス・ペントサセウス、ラクトバチルス・プランタラム、およびそれらの混合物を含めて、卵の発酵に役立つ（クノール、上記を参照）。いくつかの実施形態において��親バクテリアは、限定されることなしに、チェダーおよびカッテージチーズ（例えば、Ｌ．ラクティス亜種ラクティス、Ｌ．ラクティス亜種クレモリス）、ヨーグルト（Ｌ．デルブリュッキ亜種ブルガリクスおよびＳ．サーモフィルス）、スイスチーズ（例えば、Ｓ．サーモフィルス、Ｌ．ラクティスおよびＬ．ヘルベティカス）、ブルーチーズ（ロイコノストック／クレモリス）、イタリアンチーズ（Ｌ．ブルガリクスおよびＳ．サーモフィルス）、ヴィリ（Ｌ．ラクティス亜種クレモリス、Ｌ．ラクティス亜種ラクティス次亜種ジアセチラクチス、ロイコノストック・クレモリス）、ヤクルト（Ｌ．カゼイ）、カゼイン（Ｌ．ラクティス亜種クレモリス）、納豆（納豆菌）、ワイン（ロイコノストック／エノス）、日本酒（ロイコノストック・メセンテロイデス）、ポリミキシン（ポリミキサ）、コリスチン（バチルス・コリストリウム）、バシトラシン（バチラス・リケニホルミス）、Ｌ−グルタミン酸（ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムおよびミクロバクテリウム・アンモニアフィラム）、並びにアセトンおよびブタノール（クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム）を含めて、様々な製品を製造するための発酵に役立つ。いくつかの好ましい実施形態において、親バクテリア種は、Ｓ．サーモフィルス、Ｌ．デルブリュッキ亜種ブルガリクス、および／またはＬ．アシドフィルスから選択される。さらに付加的な実施形態において、親バクテリアは、抗生物質の製造、アミノ酸の製造、溶媒の製造、および他の経済に役立つ物質の製造を含むが、それらには限定されない方法に役立つ。なお他の実施形態において、親バクテリアは、化粧品、治療および／または医薬組成物に役立つ。いくつかの実施形態において、該組成物は、限定されることなしに、アンチリンクル特性、古い傷跡を消すこと、やけどで傷めた組織を治すこと、皮膚の回復を促進すること、色素斑をなくすことなどを含めて、際立った活性を有する。いくつかの実施形態において、該組成物は、爪、毛髪（単数または複数）の成長を促進するか、または抑制する。いくつかの付加的な実施形態において、該組成物は、本発明の方法および組成物を用いてつくられた少なくとも１つの微生物の培養物、および／または標識化されたバクテリア、および／または細胞培養物を備える。さらなる実施形態において、親バクテリアは、バクテリオファージ非感受性変異体である。かくして、いくつかの実施形態において、親バクテリアは、１つまたはそれ以上のバクテリオファージに対して非感受性である。いくつかの好ましい実施形態において、親バクテリアは、本発明を使用する間に暴露されるべきバクテリオファージに対して、バクテリオファージ非感受性変異体ではない。
【０３５７】
スターター培養物
スターター培養物は、食品産業において乳製品（例えば、ヨーグルトおよびチーズ）、並びに肉製品、パン製品、ワインおよび野菜製品を含む発酵製品の製造に広範囲に用いられる。
【０３５８】
多くの発酵乳、チーズおよびバター製品の生産に用いられるスターター培養物は、一般に乳酸菌として分類されるバクテリアの培養物を含む。かかるバクテリアのスターター培養物は、多くの機能を実行することによって様々な乳製品に固有の特徴を与える。
【０３５９】
濃縮されていない市販のバクテリア培養物は、業界では「マザー培養物」と呼ばれ、例えば、乳製品製造所のような製造現場で、発酵のために乳汁のような食用出発原料に加える前に繁殖が行われる。食用出発原料に接種するために生産現場で繁殖させたスターター培養物は、「バルクスターター」と呼ばれる。
【０３６０】
本発明に用いるのに適したスターター培養物は、食品、化粧品または製薬業界に役立つ任意の生物（すなわち、「工業的に有用な培養物」または「工業的に有用な菌株」）を含む。
【０３６１】
スターター培養物は、当分野でよく知られる技術によって調製される（例えば、参照により本明細書に組込まれる米国特許第４，６２１，０５８号を参照）。いくつかの実施形態において、スターター培養物は、接種材料、例えばバクテリアを成長培地（例えば、発酵培地または製品）に導入して接種培地をつくり、該接種培地をインキュベートしてスターター培養物をつくることによって調製される。
【０３６２】
乾燥スターター培養物は、当分野でよく知られる技術によって調製される（例えば、米国特許第４，４２３，０７９号および第４，１４０，８００号を参照）。加湿性で、噴霧乾燥、フリーズドライまたは凍結乾燥した固体調製物（例えば、タブレット、ペレット、カプセル、ダスト、顆粒または粉末）を含む乾燥スターター培養物の任意の適切な形態が本発明に役立つ。いくつかの実施形態において、本発明に用いるための乾燥スターター培養物は、冷凍ペレット形態か、またはフリーズドライ粉末形態のいずれかである。本発明に用いるための冷凍ペレット、またはフリーズドライ粉末形態の乾燥スターター培養物は、当分野で知られる任意の適切な方法に従って調製される。
【０３６３】
いくつかの実施形態において、本発明に用いられるスターター培養物は、実質的に高い濃度を備える、１つまたはそれ以上のバクテリア菌株の濃縮物の形態である。いくつかの実施形態において、濃縮物は、水で希釈されるか、または水ないしは他の適切な希釈液（例えば、然るべき成長培地、鉱油、または植物油）に再懸濁される。濃縮物の形態の本発明の乾燥スターター培養物は、当分野で知られる方法（例えば、遠心分離、濾過またはかかる技術の組み合わせ）に従って調製される。
【０３６４】
いくつか実施形態において、スターター培養物は、乳業に用いるのに適している。乳業に用いるとき、スターター培養物は、乳酸菌種、ビフィドバクテリウム属菌種、ブレビバクテリウム属菌種、プロピオニバクテリウム属菌種からしばしば選択される。乳酸菌群の適切なスターター培養物は、一般に用いられるラクトコッカス属菌種、ストレプトコッカス属菌種、ラクトバチルス・アシドフィルスを含むラクトバチルス属菌種、エンテロコッカス属菌種、ペディオコッカス属菌種、ロイコノストック属菌種およびオエノコッカス属菌種の菌株を含む。
【０３６５】
乳酸菌の培養物は、一般に発酵乳製品（例えば、バターミルク、ヨーグルトまたはサワークリーム）の製造、並びにバターおよびチーズ（例えば、ブリまたはハバーティ）の製造に用いられる。ラクトコッカス属菌種は、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、およびラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスを含めて、広く用いられるラクトコッカス・ラクティスを含む。
【０３６６】
他の乳酸菌種は、ロイコノストック属菌種、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・デルブリュッキ亜種ブルガリクス、およびラクトバチルス・ヘルベティカスを含む。加えて、プロバイオティック菌株（例えば、ラクトコッカス属菌種）は、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、およびラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスを含めて、広く用いられるラクトコッカス・ラクティスを含む。
【０３６７】
乳酸菌の中温性培養物は、バターミルク、ヨーグルトまたはサワークリームのような発酵乳製品の製造、並びにバターおよびチーズ（例えば、ブリあるいはハバーティ）の製造に一般に用いられる。他のラクトコッカス属菌種は、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス、ラクトコッカス・ラクティス、ロイコノストック属菌種、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス次亜種、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・デルブリュッキ亜種ブルガリクスおよびラクトバチルス・ヘルベティカスを含む。加えて、いくつかの実施形態において、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・カゼイのようなプロバイオティック菌株は、フレイバーを高めるか、または健康を増進するために製造中に加えられる。
【０３６８】
チェダーおよびモントレー・ジャック・チーズの製造に一般に用いられる、乳酸菌の培養物は、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、およびラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス、またはそれらの組み合わせを含む。
【０３６９】
パスタ・フィラータまたはパルメザンのようなイタリアンチーズの製造に一般に用いられる、乳酸菌の好熱性培養物は、ストレプトコッカス・サーモフィルス、およびラクトバチルス・デルブリュッキ亜種ブルガリクスを含む。他のラクトバチルス属菌種（例えば、ラクトバチルス・ヘルベティカス）は、所望のフレイバーを得るために製造中に加えられる。
【０３７０】
いくつかの好ましい実施形態において、スターター培養物の生物は、上述の乳酸菌株の１つまたは任意の他のスターター培養菌株の、本明細書に示される方法に従って調製された遺伝子操作菌株を備えるか、またはそれらからなる。
【０３７１】
本発明のスターター培養物用生物の選択は、調製または処理される製品の特定のタイプに依存することになる。かくして、例えば、チーズおよびバターを製造するためにラクトコッカス属菌種、ロイコノストック属菌種およびラクトバチルス属菌種の中温性培養物が一般に用いられ、一方でヨーグルトおよび他の発酵乳製品にストレプトコッカス属菌種の、およびラクトバチルス属菌種の好熱性菌株が典型的に用いられる。
【０３７２】
いくつかの実施形態において、スターター培養物は、乾燥スターター培養物、脱水スターター培養物、冷凍スターター培養物、または濃縮スターター培養物である。いくつかの実施形態において、スターター培養物は、発酵培地または製品に直接に接種して用いられる。
【０３７３】
いくつかの実施形態において、スターター培養物は、純粋培養物を備える（すなわち、ただ１つのバクテリア菌株を備える）。いくつかの代わりの実施形態において、スターター培養物は、混合培養物である（すなわち、少なくとも２つの異なったバクテリア菌種を備える）。
【０３７４】
乳酸菌
本発明に用いるのに特に適したスターター培養物、特に乾燥スターター培養物は、乳酸菌を備える。
【０３７５】
本明細書では、用語「乳酸菌」は、糖類を発酵させて、主に産生する酸として乳酸、酢酸、ギ酸およびプロピオン酸を含む酸を産生する、グラム陽性、微好気性または嫌気性のバクテリアを指す。工業的に最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス・ラクティスのようなラクトコッカス属菌種、ラクトバチルス属菌種、ビフィドバクテリウム属菌種、ストレプトコッカス属菌種、ロイコノストック属菌種、ペディオコッカス属菌種、およびプロピオニバクテリウム属種のうちに見出される。
【０３７６】
本発明のスターター培養物は、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・デルブリュッキ亜種ブルガリクス、およびストレプトコッカス・サーモフィルスまたはそれらの組み合わせ、のような１つまたはそれ以上の乳酸菌種を備えることができる。
【０３７７】
乳酸菌スターター培養物は、食品産業において１つまたはそれ以上の菌種を備える混合菌株培養物として一般に用いられる。ラクトバチルス・デルブリュッキ亜種ブルガリクスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスの菌株を備えるヨーグルト・スターター培養物のような多くの混合菌株培養物において、単一菌株の培養物と比較して乳酸の産生がより大きい、菌種間の共生関係が存在する（例えば、ラジャゴパル（Ｒａｊａｇｏｐａｌ）ら、ジャーナル・オブ・デアリー・サイエンス（Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．）７３：８９４−８９９［１９９０］を参照）。
【０３７８】
製品
本発明に用いるのに適した製品は、限定されることなしに、食料品、化粧品または医薬品を含む。培養物から調製される、または培養物を備える任意の製品が、本発明に従って考えられる。これらは、限定されることなしに、果物、マメ科植物、飼料農作物、および派生製品を含む野菜、穀物および穀物派生製品、酪農食品および酪農食品の派生製品、食用肉、鶏肉、シーフード、化粧品および医薬品を含む。
【０３７９】
用語「食品」は広義に用いられ、飼料、食料品、食品成分、サプリメント食品、および機能性食品を含む。
【０３８０】
本明細書では、用語「食品成分」は、食品に加えられるか、または加えることができる配合物を含み、例えば、酸性化または乳化が必要な多種多様な製品に少量に用いることができる配合物を含む。
【０３８１】
本明細書では、用語「機能性食品」は、栄養の効果、および／または味覚の満足だけでなく、消費者にさらなる有益な効果も提供できる食品を意味する。機能性食品の法的な定義がないが、この分野に興味をもつ関係者のほとんどが、健康に具体的な効果があるとして市販される食品の存在を承知している。
【０３８２】
用語「食品」は、ヒトのための食品、並びに動物のための食品（すなわち、飼料）を含む。好ましい様態において、食品はヒトの食用である。
【０３８３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞は、食品成分、サプリメント食品、または機能性食品を構成するか、またはそれらに加えられる。いくつかの実施形態において、食品は、応用および／または管理の仕方により必要に応じて、液体形態（例えば、溶液）、ゲル、乳濁液、または固体である。
【０３８４】
本明細書に記載される細胞は、菓子製品、乳製品、肉製品、家禽食品、魚加工品およびパン製品の１つまたはそれ以上のような食物製品の調製に役立つ。いくつかの実施形態において、バクテリアは、清涼飲料、フルーツジュース、乳清タンパク質を備える飲み物、健康茶、ココア飲料、ミルク飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト、飲用ヨーグルト、およびワインなどの成分として役立つ。
【０３８５】
食品を調製する方法、本発明に従って細胞を（食品出発原料のような）食品成分に混ぜることを備える方法も提供されている。食品を調製する方法も本発明のまた別の様態である。
【０３８６】
適切には、本明細書に記載される食品は、乳製品である。いくつかの好ましい実施形態において、該乳製品は、ヨーグルト、チーズ（例えば、酸いカードチーズ、ハードチーズ、セミハードチーズ、カッテージチーズなど）、バターミルク、クワルク、サワークリーム、ケフィア、クリーム・フレッシュ、発酵乳清ベースの飲み物、クミス、ミルク飲料、またはヨーグルト飲料である。
【０３８７】
本明細書では、用語「食品」は、ヒトのための食品、並びに非ヒト動物のための食品（すなわち、飼料）を含むので非常に広義である。いくつかの好ましい実施形態において、食品は、ヒトの食用である。本明細書に用いられる用語「飼料」は、未加工、または加工植物性素材、および非植物性素材を含む。この用語は、限定されることなしに、家畜、家禽、魚類、甲殻類、および／またはペットを含む動物の食用に適した任意の飼料を包含する。
【０３８８】
ファージ耐性菌株およびスターター培養物の開発
本発明の開発の間に、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ遺伝子が関与するファージ耐性、並びに外来ＤＮＡへの耐性におけるそれらの役割、さらにＣＲＩＳＰＲ内に挿入されたスペーサーがこの耐性の特異性に果たす役割について解明された。重要なことに、本発明は、ファージ耐性菌株、およびスターター培養物を開発する方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態において、親菌株「Ａ」は、ファージ「Ｐ」に暴露されて、ファージ耐性変異株（変異株「Ａ１．０」）が選択される。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に付加的に挿入されたスペーサーの存在を確認するために、変異株Ａ１．０が、（例えばＰＣＲ、および／またはＤＮＡ配列決定によって）解析される。付加的なスペーサー（スペーサーＳｐ１．０）のヌクレオチド配列が次に決定される。典型的に、スペーサーＳｐ１．０は、ファージＰ由来のおよそ３０ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、ファージＰおよび関連ファージに対する耐性を与える（「関連ファージ」は、それらのゲノムに該スペーサー配列を含み、ファージ科を規定する）。
【０３８９】
第１のファージ暴露とは独立に、同じ親菌株Ａが、同じファージＰに暴露されて、第２のファージ耐性変異株（変異株Ａ２．０）が選択される。変異株Ａ２．０は、同様にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に挿入された付加的なスペーサー（スペーサーＳｐ２．０）をもつが、しかしスペーサーＳｐ２．０の配列は、スペーサーＳｐ１．０の配列とは異なるように選択される。典型的に、スペーサーＳｐ２．０は、ファージＰ由来のおよそ３０ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、ファージＰおよび関連ファージに対する耐性を与える。同様に、いくつかの実施形態において、同じ菌株Ａの同じファージＰへの暴露を通じて、変異株Ａ３．０から変異株Ａｘ．０が生み出される。すべての「Ａ」変異株は、同様にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に挿入された付加的なスペーサー（スペーサーＳｐ３．０からＳｐｘ．０）もつが、しかしすべての「Ｓｐ」スペーサーの配列は、他の各々と異なるように選択される。典型的に、「Ｓｐ」スペーサーは、ファージＰ由来のおよそ３０ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、すべてがファージＰおよび関連ファージに対する耐性を与える。
【０３９０】
これらの変異株は、有用であるとはいえ、耐性の範囲の観点からは限られている。かくして、いくつかの実施形態において、第２レベルのファージ耐性菌株を開発することが有利である。実際、ファージに対するこれらの耐性を増加かつ拡大させることによって、これらのファージ耐性変異株のさらなる開発を行うことが有利である。典型的に、耐性レベルはおよそ、ファージゲノムでスペーサーに対応する配列内に生じる単一変異のレベル（すなわち、概ね１０−４から１０−６）であろうと見積もることができる。その結果、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に異なったスペーサーを蓄積したファージ耐性菌株は、（すなわち、複数の単一変異がファージゲノム内に生じる必要があるので）、ゲノム内にこれらのスペーサー配列を含むファージに対する耐性レベルが向上する。
【０３９１】
いくつかの実施形態において、第２レベルの変異株は、変異株Ａ１．０のファージＰへの暴露を通じて、変異ファージを単離することによってつくられる。典型的に、この変異ファージ（ファージＰ１．０）は、ゲノムのスペーサーＳｐ１．０の配列を含む領域内に変異（欠失、点変異など）をもつ。変異株Ａ１．０は、ファージＰ１．0に対して感受性をもつ。次に、変異株Ａ１．０がファージＰ１．０に暴露されて、ファージ耐性変異株（変異株Ａ１．１）が選択される（図１５を参照）。変異株Ａ１．１は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に挿入された付加的なスペーサー（スペーサーＳｐ１．１）をもつが、しかしスペーサーＳｐ１．１の配列は、スペーサーＳｐ１．０、Ｓｐ２．０からＳｐｘ．０の配列とは異なるように同様に選択される。典型的に、スペーサーＳｐ１．１は、ファージページＰ１．０由来のおよそ３０ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、ファージＰ１．０および関連ファージに対する耐性を与えることになる。変異株Ａ１．１は、ファージページＰ１．０に対する耐性をもち、好ましくは、スペーサーＳｐ１．０およびＳｐ１．１が蓄積されたために、ファージＰに対する耐性が増加する。
【０３９２】
付加的な実施形態において、変異株Ａ１．１のファージＰ１．０への暴露を通じて、新たな変異ファージ（ファージＰ１．１）が生み出される。次に、変異株Ａ１．１をファージＰ１．１に暴露した時点で、１つの新しい付加的なスペーサー（Ｓｐ１．２）を含む、新しい変異株Ａ１．２が得られる。このスペーサーは、ファージＰ１．１に対する耐性を与え、好ましくは（すなわち、スペーサーＳｐ１．０、Ｓｐ１．１、Ｓｐ１．２の蓄積によって）ファージＰ１．０およびＰに対する耐性を向上させる。さらに付加的な実施形態において、ファージに対する高い耐性をもつ変異株（変異株Ａ１．ｎ）を得るために、異なったスペーサー（例えば、２、３または４が、変異株Ａから変異株Ａ１、次に変異株Ａ１．１、次に変異株Ａ１．２などに反復して蓄積される。なおさらなる実施形態において、ファージに対する高い耐性をもつ菌株Ａのまた別の変異株（変異株Ａ２．ｎ）を並行して生み出すために、変異株Ａ２、次に変異株Ａ２．１、次に変異株Ａ２．２などを通じて、同じ菌株中に付加的な異なるスペーサーを蓄積することができる。同じ戦略は、変異株Ａ３．０からＡｘ．０にも役立つ。
【０３９３】
いくつかの実施形態において、１つより多いファージ科に対する耐性をもつ菌株が提供される。所与の菌株は、１つより多いファージ科に対して感受性をもつことがあるので、いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に他のファージ科に由来する付加的なスペーサー（単数または複数）を導入することによって、菌株の耐性を複数のファージ科に対して拡大することが望まれる（図１６を参照）。例えば、バクテリオファージＰ、Ｑ、Ｒは、菌株Ａに感染することができるファージの３つの科を代表するファージである。先に、およびここに概説される方法を用いて、３つすべてのファージ科に対して耐性をもつ変異株がつくられる。いくつかの実施形態において、ファージＰに対して耐性をもつ（スペーサーＳｐ１を含む）変異株Ａ１Ｐをつくり出すために、ファージＰが用いられる。次に、変異株Ａ１ＰがファージＱに暴露されて、ファージ耐性変異株（変異株Ａ１ｐｑ）が選択される。変異株Ａ１ｐｑは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に挿入された１つの付加的なスペーサー（Ｓｑ１）をもつ。典型的に、スペーサーＳｑ１は、ファージＱ由来のおよそ３０ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、ファージＱおよび関連ファージに対する耐性を与える。変異株Ａ１ｐｑは、ＰおよびＱ両方のファージに対する耐性をもつ。次に、変異株Ａ１ｐｑがファージＲに暴露されて、ファージ耐性変異株（変異株Ａ１ｐｑｒ）が選択される。変異株Ａ１ｐｑｒは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に挿入された第３の付加的なスペーサー（Ｓｒ１）をもつ。典型的に、スペーサーＳｒ１は、ファージＲ由来のおよそ３０ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、ファージＲおよび関連ファージに対する耐性を与える。変異株Ａ１ｐｑｒは、３つすべてのファージに対する耐性をもつ。いくつかの特に好ましい実施形態において、該変異株は、関連するファージに対しても耐性をもつ。
【０３９４】
付加的な実施形態において、上述の方法は、ファージに対する耐性の向上および拡大をもたらすために、組み合わせて用いられる。いくつかの特に好ましい実施形態において、これらの変異株は、複数のファージ科に対する高い耐性をもつ。なおさらなる実施形態において、特定の工場および／または発酵槽で問題となる特定のファージまたはファージ科に対する耐性をもつ菌株がつくられる。
【０３９５】
ＣＲＩＳＰＲ介在免疫およびファージ耐性菌株への応用
特異免疫を授けるのにＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲスペーサーが関与しうることを仮定する先行技術の教えとは対照的に、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する免疫にはｃａｓ遺伝子またはタンパク質が必要という驚くべき知見に、部分的には基づいている。しかしながら、本発明は、いかなる特定のメカニズム、機能、または実行手段にも限定される意図をもたない。
【０３９６】
なおさらに驚くべきことに、本発明の開発の間に、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内で、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質が、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピートに結合することが見出された。言い換えれば、ｃａｓ遺伝子またはタンパク質は、所与のＤＮＡのＣＲＩＳＰＲリピートに対して特異的であるように思われるが、これはｃａｓ遺伝子またはタンパク質とリピート配列とが機能的なペアを成すことを意味する。それ故に、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーは、これらの機能的なペア（すなわち、ＣＲＩＳＰＲリピートおよびｃａｓ遺伝子）の１つまたはそれ以上と一緒に、標的核酸またはその転写産物に対する細胞の耐性を調節するのに役立つ。
【０３９７】
一実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーが、細胞に免疫を授けるために、ＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）、およびｃａｓ遺伝子（単数または複数）またはタンパク質は、機能的な組み合わせを成す（すなわち、ＣＲＩＳＰＲリピート（単数または複数）、およびｃａｓ遺伝子（単数または複数）またはタンパク質は適合する）。
【０３９８】
付加的な好ましい実施形態において、本発明は、ファージに対するバクテリアの耐性に影響を与えるｃａｓ遺伝子／タンパク質を提供する。付加的なさらなる好ましい実施形態において、本発明は、ファージに対するバクテリアの耐性を予測、決定、および／または改変するのに役立つ少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲリピートおよび少なくとも１つのｃａｓ遺伝子／タンパク質を提供する。実際、本発明は、バクテリアの溶原型（すなわち、様々なファージに対する耐性／感受性）を改変する方法を提供する。その結果、細胞およびファージにおけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の同定および検出は、細胞の耐性プロフィル、並びにファージ−宿主相互作用を決定、予測および改変する手段を提供する。
【０３９９】
有利なことに、遺伝子工学における１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、２つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲリピート、１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子或いはタンパク質、および／または１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲスペーサーの応用は、バイオテクノロジー産業の多種多様な応用に用いるための耐性または感受性の細胞変異株をつくる手段を提供する。
【０４００】
以下により詳細で論じられるように、バクテリオファージは、発酵の間に発生し得るバクテリアの天然寄生生物である。バクテリオファージに感染すると、バクテリアが死んで発酵プロセスを損なう。乳製品の発酵において、これらのファージ感染は、発酵製品の品質低下から製品の完全な喪失に至るまでしばしば経済的に大きな影響を与える。
【０４０１】
ファージの問題を克服するために、スターター培養物企業は、様々な戦略を展開してきた。伝統的なスターター培養物のプログラムは、ファージ攻撃に起因する不良を最小限に抑えるために、ファージ防衛ローテーション戦略（ＰＤＲＳ：ｐｈａｇｅ  ｄｅｆｅｎｃｅ  ｒｏｔａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）に依存してきた（例えば、クレンハマー、アドバンシズ・イン・アプライド・マイクロバイオロジー（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）３０：１［１９８４］；ローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）ら、ジャーナル・オブ・デアリー・リサーチ（Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ．）４３：１４１［１９７６）；およびホワイトヘッドおよびハンター（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ）、ジャーナル・オブ・デアリー・リサーチ  １５：１１２［１９４７］を参照）。これらの戦略は、ファージ感受性の異なったスペクトル（すなわち、異なった溶原型）を提供すると思われる複数の遺伝的に無関係な菌株に依存する。確定した菌株を用いた発酵プロセスの間にファージが出現したとき、理想的に異なった溶原型の（すなわち、ファージに対する異なった感受性パターンをもつ）菌株が代わりに発酵に用いられる。しかしながら、これらの戦略を首尾よく利用するために十分な数の異なった溶原型を同定することが難しいことは、歴史が証明してきた。実際、産業上注目される多くの菌株は、稀な機能的形質を示す（例えば、Ｓ．サーモフィルスは、酸性化およびテクスチャー変化が速い）。加えて、菌株のすべてがスターター培養物として生産されるのに適した形質を提示するわけではない。さらにまた、これらの菌株は、稀少で乳製品工場の規模が増大したために集中的に使われる。
【０４０２】
伝統的なスターター培養物ローテーション戦略には、付加的な問題もある。いくつかの菌株は、導入時に存在するファージによっては攻撃されないが、ファージはしばしばファージ変異、改変、および蓄積によっていずれは出現して、新たに導入された菌株を攻撃する（例えば、ヒープおよびローレンス（Ｈｅａｐ  ａｎｄ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ）、ニュージーランド・ジャーナル・オブ・デアリー・サイエンス・アンド・テクノロジー（Ｎ．Ｚ．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．）１１：１６［１９７６］；リムソウティンおよびテルザギー（Ｌｉｍｓｏｗｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｅｒｚａｇｈｉ）、ニュージーランド・ジャーナル・オブ・デアリー・サイエンス・アンド・テクノロジー  １１：２５１［１９７６］；ピアース（Ｐｅａｒｃｅ）、ニュージーランド・ジャーナル・オブ・デアリー・サイエンス・アンド・テクノロジー  １３：１６６［１９７８］；およびサンダースおよびクレンハマー（Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ）、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）４０：５００［１９８０］を参照）。さらに、多くの場合に、複雑な菌株ローテーションの寿命およびスターター活性は予想できず、しばしば早期の不良につながる（例えば、リムソウティンら、ニュージーランド・ジャーナル・オブ・デアリー・サイエンス・アンド・テクノロジー  １３：１［１９７７］；およびタネル（Ｔｈｕｎｅｌｌ）ら、ジャーナル・オブ・デアリー・サイエンス  ６４，２２７０［１９８１］を参照）。多数の菌株を伴う長期のローテーションは、プラントを汚染するファージのレベルおよび多様性を増加させる（例えば、ヒープおよびローレンス、ニュージーランド・ジャーナル・オブ・デアリー・サイエンス・アンド・テクノロジー  １２：２１３［１９８１］；ローレンスら、ジャーナル・オブ・デアリー・サイエンス  ６１：１１８１［１９７８］；およびタネルら、ジャーナル・オブ・デアリー・サイエンス  ６４，２２７０［１９８１］を参照）。
【０４０３】
ファージの繁殖と戦うために、従来のスターター培養物プログラムは、技術的な機能性は同様であるが異なったファージ感受性を提示する菌株の使用に依存してきた。該菌株は、連続的な発酵を行なうためにローテーションして用いられる。これらのプログラムは、遺伝的に無関係で、それ故に異なったファージ感受性（溶原型）スペクトルに示す複数の菌株に伝統的に依存する。代わりの手法（例えば、米国特許第５，５９３，８８５号を参照）は、異なった溶原型を提示する遺伝的に無関係な菌株の代わりに、異なったファージ感受性を提示する一組の同質遺伝子系統菌株の使用に基づくスターター培養物プログラムを利用する。本明細書に用いられる用語「一組の同質遺伝子系統菌株」は、染色体の観点からは同一であるが、プラスミドが担う１つまたはそれ以上のファージ耐性メカニズムの有り方が各々異なる菌株と定義される。かかるスターター培養物ローテーション・プログラムにおいて、既定の菌株を用いた発酵プロセスの間にファージが出現すると、溶原型が理想的に異なった（すなわち、ファージに対する感受性スペクトルが異なった）菌株が、代わりに発酵に用いられる。この異なった溶原型のために、第２の菌株は、該環境でファージによって影響されることがなく、ファージは休眠状態のままでいる。もしシステムが意図通りに機能すれば、休眠状態のバクテリオファージ集団の大部分は、その後の連続的な発酵および衛生管理によってウォッシュアウトされ、第１の菌株が再び発酵に用いられる時までに根絶される。
【０４０４】
本発明は、発酵産業でこれらの問題に対処するのに適した改善された方法および組成物を提供する。実際、本発明は、発酵産業、および特に乳業のための方法および組成物を、ファージ防衛ローテーション戦略の必要性を満たすのに適した菌株の選択とともに提供する。加えて、本発明は、特定のファージ環境に適応する溶原型をもつ菌株をカスタマイズするのに適した方法および組成物を提供する。特に、本発明は、ファージ感受性（溶原型）スペクトルのみが互いに異なる菌株をつくるために、所与の菌株の様々な溶原型への進化を方向づけるのに適した方法および組成物を提供する。本明細書に記載されるように、溶原型のこの相異は、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓシステムの作用である。いくつかの好ましい実施形態において、異なった溶原型は、ファージ耐性の「調節」を通じて得られる。いくつかの特に好ましい実施形態において、溶原型が異なるとはいえ、このタイプの菌株は、同一の物質代謝（例えば、炭素、窒素など）、従って同一の機能性（例えば、酸性化、風味、テクスチャーなど）を有する。これは、スターターローテーションの構成を拡大する手段を提供する。加えて、ファージ耐性菌株の工業的なプロセスしやすさ（例えば、栄養の必要性、プロセス工程への耐性など）は同一であり、従って個別の生産プロセス開発の必要性が低減される。実際、本発明は、ファージ攻撃に起因する発酵の失敗を最小限に抑えるのに適した方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態において、溶原型が異なる複数のファージ耐性菌株の組み合わせによって、ファージ耐性の高いスターター培養物を生産する方法および組成物が提供される。いくつかの代わりの実施形態において、乳製品のローテーション発酵に用いるために、厳密に同一の工業的な機能性をもつスターター培養物を生産する方法および組成物が提供される。さらなる実施形態において、これらのファージ攻撃に関与するファージに耐性をもつ新しいバクテリア菌株を導入することによって、乳製品プラントにおける頻繁なファージ攻撃を防ぐことにより、現在のスターターと置き換えるのに適した方法および組成物が提供される。いくつかの実施形態において、これらの方法および組成物は、連続的なファージ攻撃と戦うために反復して用いられる。
【０４０５】
いくつかの付加的な実施形態において、スターター培養物は、混合バクテリア培養物である。いくつかの特に好ましい実施形態において、該スターターは、それらのＣＲＩＳＰＲ、およびそれらのファージに対する感受性のみが異なる、複数（すなわち、少なくとも２つ）のファージ耐性変異株の等量を備える。いくつかの実施形態において、これらの変異株は、ファージ耐性変異株の第１レベル（例えば、上述の変異株Ａ１．０プラスＡ２．０）である。いくつかの好ましい実施形態において、変異株は、ファージ耐性変異株の第２レベルのもの（例えば、上述の変異株Ａ１．４プラスＡ２．４）から選択される。いくつかの特に好ましい実施形態において、変異株は、ファージ耐性変異株の第３レベルのうちで選択される。かかる混合バクテリア培養物において、変異株の１つが所与のファージによって攻撃されたとき、他の変異株は、それらのファージ感受性が異なるためにファージによって攻撃されることがなく、発酵は悪影響を受けない。
【０４０６】
いくつかのさらなる実施形態において、主たるスターターおよびバックアップ・スターターが用いられる。主たるスターターは、単一の菌株からなる。いくつかの実施形態において、この菌株は、ファージ耐性変異株の第１レベルであり、一方で他の好ましい実施形態において、該菌株は第２レベルであり、なお他のより好ましい実施形態において、該菌株は第３レベルである。いくつかの好ましい実施形態において、バックアップ・スターターは、同じ親菌株から独立に得られたファージ耐性変異株に基づく。この第２のファージ耐性変異株は、他の変異株とそのＣＲＩＳＰＲが異なり、ファージ耐性変異株の第１レベルであり、一方で他の好ましい実施形態において、該菌株は第２レベルであり、なお他のより好ましい実施形態において、該菌株は第３レベルである。例えば、いくつかの実施形態において、主たるスターターは変異株Ａ１．４でできており、バックアップ・スターターは変異株Ａ２．４でできている。主たるスターターを用いた発酵の間にファージが最初に出現した時点で、主たるスターターは捨てられ、バックアップ・スターターに置き換えられる。いくつかのより好ましい実施形態において、第３スターターも同様に、バックアップのためのバックアップとして機能することになるバックアップ・スターターとして調製される。いくつかの好ましい実施形態において、スターターは、各々が複数のファージ耐性変異株でできている。
【０４０７】
またさらなる実施形態において、本発明は、ローテーション戦略に適した方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ファージによってしばしば攻撃されるスターターを捨てる代わりに、たとえファージ攻撃が観測されたとしても、スターターは循環的に用いられる。この戦略は、開発すべきスターターの数を抑える。いくつかの特に好ましい実施形態において、スターターは、各々が単一菌株の代わりに複数のファージ耐性菌株でできている。これは、出現するファージに対する強さを増加させる。なおさらなる実施形態において、カスタマイズされたスターターが提供される。いくつかの好ましい実施形態において、ファージ耐性変異株が所与の発酵プラントまたは設備に存在するファージと特異的に戦うためにつくられる。
【０４０８】
分類
本発明のさらなる様態において、標識化されたバクテリアを同定（例えば、分類）する方法が提供されている。
【０４０９】
一実施形態において、同定ステップは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分を増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）することによって行なわれる。
【０４１０】
第１のプライマーは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の第１のＣＲＩＳＰＲリピートの上流に位置する配列にハイブリダイズするように設計されることができる。例として、第１のプライマーは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の共通のリーダー配列の部分にハイブリダイズすることができる。さらなる例として、第１のプライマーは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の上流に位置する近接遺伝子にハイブリダイズすることができる。
【０４１１】
第２のプライマーは、少なくとも第１のＣＲＩＳＰＲスペーサーから、または少なくとも第１のＣＲＩＳＰＲスペーサーコアから下流にハイブリダイズすることができる。第２のプライマーは、トレーラー、または下流の近接遺伝子にまでハイブリダイズすることができる。好ましくは、第２のプライマーは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内にハイブリダイズする。好ましくは、第２のプライマーは、少なくとも一部、下流のＣＲＩＳＰＲスペーサーまたはＣＲＩＳＰＲスペーサーコアにハイブリダイズする。
【０４１２】
増幅後に、タグ付け配列は、当分野で知られる様々な方法を用いて同定することができる。
【０４１３】
例として、タグ付け配列は、増幅産物の制限パターンを決定することによって、同定することができる。従って、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、またはその一部分を備えるＤＮＡは、増幅された時点で、１つまたはそれ以上の制限酵素を用いて消化（例えば、切断）されるとよい。
【０４１４】
本明細書では、用語「制限酵素」は、その各々が、特定のヌクレオチド配列またはその近傍で２本鎖ＤＮＡを切断する酵素（例えば、バクテリア酵素）を指す。制限酵素は、当分野でよく知られており、例えば、様々な商業的供給元（例えば、ニューイングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．），ビバリー、マサチューセッツ州）から容易に得ることができる。同様に、制限酵素を用いる方法も一般によく知られており、当分野で日常的である。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分を切断するとき、１０から２４の間のＤＮＡフラグメントをつくる制限酵素を用いることができる。かかる酵素の例は、限定されることなしに、ＡｌｕＩ、ＭｓｅＩおよびＴｓｐ５０９１を含む。制限酵素を用いて得られたＤＮＡフラグメントは、例えば、ゲル電気泳動法によるバンドとして検出することができる。制限酵素は、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ：Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）をつくり出すために用いることができる。
【０４１５】
ＲＦＬＰは、制限エンドヌクレアーゼを用いてＤＮＡ分子を切断すること（「制限すること」）によって生成される。バクテリアが自然につくる何百ものかかる酵素が単離されている。要するに、バクテリアは、バクテリア細胞に侵入（例えば、ウイルス感染する）かもしれない外来ＤＮＡ分子を認識して次に開裂（制限）するために、防衛システムとしてかかる酵素を用いる。何百もの異なった制限酵素の各々が、すべてのＤＮＡ分子を構成する４つの塩基性ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）からなる異なった配列においてＤＮＡを切断（すなわち、「開裂」または「制限」）することが見出されており、例えば、１つの酸素は特異的に配列Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃのみを認識するかもしれず、一方でまた別の酵素は特異的にＧ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ａのみを認識するかもしれないなどである。関与するユニークな酸素に依存して、かかる認識配列は、わずかに４ヌクレオチドから多ければ２１ヌクレオチドまで長さが異なり得る。認識部位が大きくなるにつれて、ＤＮＡ全体を通じて繰り返して見出される確率は低くなるので、認識配列がより大きければ、生じる制限フラグメントはより少なくなる。
【０４１６】
さらなる例として、タグ付け配列は、増幅産物の測定、または増幅産物のサイズの違いの測定により同定することができる。
【０４１７】
分離は、限定されることなしに、ゲル電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、質量分析法、およびマイクロ流体デバイスの使用を含めて、ＤＮＡを分離するのに適した任意の方法によって達成することができる。一実施形態において、増幅産物またはＤＮＡフラグメントは、アガロースゲル電気泳動法によって分離される。ゲル電気泳動法は、異なったサイズの荷電分子が、電流の影響下で固定ゲルを通過する移動速度によってそれらを分離する。これらの分離された増幅産物またはＤＮＡフラグメントは、エチジウムブロミドで染色することによって、およびＵＶ照射下でゲルを見ることによって容易に視覚化することができる。バンド形成パターンは、制限消化されたＤＮＡ、または増幅産物のサイズを反映する。
【０４１８】
さらなる例として、タグ付け配列は、増幅産物を配列決定することによって、同定することができる。
【０４１９】
増幅産物の配列は、自動または手動の配列決定法を含めて、当分野で知られる任意の方法によって得ることができる。例えば、サムブルックら（１９８９）モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マニュアル（第２版、コールドスプリングハーバー研究所出版局、プレーンビュー、ニューヨーク州）；ロー（Ｒｏｅ）ら（１９９６）ＤＮＡアイソレーション・アンド・シークエンシング（ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（エッセンシャル・テクニクス・シリーズ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ），ジョン・ワイリー＆サンズ）を参照。
【０４２０】
プローブとしての核酸分子、または特定のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる核酸分子のいずれかを用いるハイブリダイゼーション法も本発明の範囲内である。例えば、サムブルックら（１９８９）モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マニュアル（第２版、コールドスプリングハーバー研究所出版局、プレーンビュー、ニューヨーク州）を参照。
【０４２１】
ハイブリダイゼーション技術において、ハイブリダイゼーションプローブ（単数または複数）は、ゲノムのＤＮＡフラグメント、ＰＣＲ増幅産物、または他のオリゴヌクレオチドであってもよく、既知のヌクレオチド配列のすべて、または部分を含んでもよい。加えて、それは、３２Ｐのような検出可能グループ、或いは他の放射性同位元素、螢光化合物、酸素、または酸素補因子のような、任意の他の検出可能マーカーで標識化されてもよい。プローブに関する用語「標識化された」は、検出可能な物質をプローブに結合する（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブの直接標識化、および直接標識化されたまた別の試薬との反応性によるプローブの間接標識化を包含する意図をもつ。間接標識化の例は、蛍光標識化されたストレプトアビジンを用いて検出できるようにＤＮＡプローブの末端をビオチンで標識化することを含む。
【０４２２】
バクテリア菌株を検出または識別するためのハイブリダイゼーション技術を含む方法も同様に包含される。これらは、限定されることなしに、サザンブロット法（例えば、ファン・エムデンら（１９９３）ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）３１：４０６−４０９を参照）、移動度シフトアッセイ（例えば、米国特許出願公開第２００３０２１９７７８号を参照）、オリゴヌクレオチドアレイを用いたシークエンス・アッセイ（例えば、ピーズ（Ｐｅａｓｅ）ら（１９９４）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９１：５０２２−５０２６を参照）、スポリゴタイピング（例えば、カマービーク（Ｋａｍｅｒｂｅｅｋ）ら（１９９７）ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー  ３５：９０７−９１４を参照）、螢光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（例えば、アマン（Ａｍａｎｎ）ら（１９９０）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー  １７２：７６２−７７０を参照）、およびヘテロ２本鎖トラッキング・アッセイまたはヘテロ二本鎖移動度アッセイ（例えば、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら（２０００）ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー  ３８：４７７−４８２を参照）を含む。
【０４２３】
同定されたタグ付け配列は，ファージ配列データベース、および／またはバクテリア配列データベースと比較することができる。典型的に、タグ付け配列は、ファージ配列データベースにおける１つまたはそれ以上の配列と一致するが、しかしバクテリア配列データベースとは一致しないであろう。
【０４２４】
新たに標識化されるバクテリアは、本明細書に記載される方法を用いて調製されるので、標識化されたバクテリアを特異的に同定することを可能にする標識データべースをつくり出すことができる。
【０４２５】
一様態において、（例えば、標識化されたバクテリアの製造時に）バクテリオファージから得られるか、または入手可能な、バクテリアを標識化および／または同定するための配列であって、親バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方の末端に組み込まれた該配列を用いることが提供されている。
【０４２６】
さらなる様態において、（例えば、標識化されたバクテリアの製造時に）バクテリオファージから得られるか、または入手可能な、バクテリアを標識化および／または同定するための配列であって、（ｉ）該バクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲリピートに対して相同的な（例えば、同一の）少なくとも１つの配列；および（ｉｉ）タグ付け配列を備える該配列を用いることが提供されている。
【０４２７】
さらなる様態において、（例えば、標識化されたバクテリアの製造時に）バクテリアを標識化および／または同定するための配列であって、（ａ）親バクテリアをバクテリオファージに暴露すること；（ｂ）バクテリオファージ非感受性変異体を選択すること；（ｃ）親バクテリア、およびバクテリオファージ非感受性変異体からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分を比較すること；および（ｄ）親バクテリアには存在しない、バクテリオファージ非感受性変異体のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部分における配列を選択することによって、得られるか、または入手可能な該配列の使用法が提供されている。
【０４２８】
ＣＲＩＳＰＲおよび真核生物
本明細書に詳述されるように、ＣＲＩＳＰＲは、原核生物に侵入する核酸に対する耐性を提供することが示されている。特に、ウイルスのＤＮＡ（例えば、バクテリオファージの核酸）に対して相同性を示すＣＲＩＳＰＲスペーサーは、少なくとも１つのスペーサー配列と配列の同一性を共有するウイルスに対する耐性を提供することが示された。しかしながら、現時点でＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含まない細胞に、ｃａｓ遺伝子および／またはタンパク質を、スペーサー、リピート、リーダーおよびトレーラーと一緒に含ませたＣＲＩＳＰＲシステムが、核酸に対する耐性を新規に提供するのに役立つであろうことも考えられる。実際、いくつかの実施形態において、かかる操作は、限定されることなしに、ヒト、他の動物、真菌などを含む様々な真核生物に役立つ。ＣＲＩＳＰＲシステムを、限定されることなしに、プラスミドを介する形質転換を含めて、当分野で知られる任意の適切な方法を利用して真核細胞に導入することが考えられる。これらの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、並びに必要な転写／翻訳シグナルが、すべて真核細胞においてその配列が発現かつ機能するようにプラスミドＤＮＡに含められる。
【０４２９】
いくつかの付加的な実施形態において、スペーサー配列は、注目すべきウイルスの配列に対して同一性をもち、関与する宿主に感染するように操作される。いくつかの好ましい実施形態において、これらの方法および組成物は、細胞に導入されたＣＲＩＳＰＲスペーサーと配列の同一性を共有するウイルスに対する耐性を宿主細胞に提供する。いくつかの特に好ましい実施形態において、ウイルスは、限定されることなしにＨＩＶ、オルソミクソウイルス（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、シュードミクソウイルス（ｐｓｅｕｄｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ、インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、麻疹（ｒｕｂｅｏｌａ）、水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ）、風疹（ｒｕｂｅｌｌａ）、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、カリシウイルス（ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、パポーバウイルス（ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓ）、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、エンテロウイルス（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス（ａｒｂｏｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス（ａｒｂｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）などを含む。さらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーにおける高度に保存された核酸を特異的な標的とすることは、かかるウイルスに対する真核細胞の耐性を向上させる。いくつかの特に好ましい実施形態において、真核細胞はヒト細胞である。
【０４３０】
ＣＲＩＳＰＲおよびファージ耐性変異体の生成
本発明の開発の間に、ファージ耐性変異体の自然生成の間にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が変化するかどうか決定するために実験が行なわれた。乳業で広く用いられる、ファージ感受性の野生型Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０（ＷＴ）、および工業用ヨーグルト試料から単離された、異なるがしかし密接に関連した２つの毒性バクテリオファージ、すなわち、ファージ８５８およびファージ２９７２（レベスク（Ｌｅｖｅｓｑｕｅ）ら、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー  ７１：４０５７［２００５］）からなるファージ−宿主モデルシステムが選択された。ファージ８５８、ファージ２９７２、または同時に両方をＷＴ菌株にチャレンジすることによって、９つのファージ耐性変異体が独立に生み出され、それらのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が解析された。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座には一貫して違いが観測され、ＷＴ菌株に存在する３２のスペーサーの隣に、１から４の付加的なスペーサーが挿入されていた（図９を参照）。ファージ感染に反応しての新しいスペーサーの付加は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方の末端に向かって極性をもつように思われた。これは、様々な菌株におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のリーダー末端におけるスペーサーの超可変性に関するこれまでの観測とつじつまが合う（例えば、プールセルら、マイクロバイオロジー  １５１：６５３［２００５］；およびリレストル（Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌ）ら、アーキア  ２：５９［２００６］を参照）。様々なファージ耐性変異体のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に挿入された付加的なスペーサーの配列解析は、チャレンジに用いたファージゲノム内に見出される配列に対する類似性を明らかにした。類似性は、ファージゲノムの至るところ、ほとんどの機能モジュールのコードおよび非コード鎖上の両方に観測された。いかなる特定の配列、遺伝子または官能基も特異的に標的にされているように思われなかった。これらの結果は、バクテリオファージ耐性をもった時点で、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が、ファージＤＮＡに由来すると思われる新規のスペーサーの組込みによって改変されたことを示唆する。しかしながら、本発明は、任意の特定のメカニズムに限定される意図を持たない。
【０４３１】
驚くべきことに、いくつかの菌株は、両方のファージに対して耐性があり、一方で他の菌株は、チャレンジに用いたファージに対してのみ耐性があることが観測された（図９を参照）。ファージ耐性プロフィルは、スペーサーの内容に関連するように思われ、それによればスペーサーＳ３、Ｓ６およびＳ７のように、両方のファージの保存配列に対して１００％の同一性を示すスペーサーをもつ菌株は、両方のファージに対して耐性があった。それと対照的に、スペーサーＳ１，Ｓ２，Ｓ４，Ｓ５，およびＳ８のように、スペーサーおよびファージ配列の間にヌクレオチド多型（２９または３０ヌクレオチドにわたって１から１５までのＳＮＰ）が観測されたとき、スペーサーは、耐性を提供するように思われなかった（図９を参照）。
【０４３２】
加えて、いくつかのスペーサーが挿入されたとき（Ｓ９〜Ｓ１４）、ファージ耐性レベルはより高かった。これらの知見は、ファージの暴露が原動力となって、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座がダイナミックで急速な変化を被ることを示唆する。これらの結果は、ファージ耐性変異体の生成の間に、確かにＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を変えることができることを示し、ＣＲＩＳＰＲの内容とファージ感受性との関連性を確立する。かくして、ファージ配列と同一のＣＲＩＳＰＲスペーサーが存在することが、この特定の配列を含むファージに対する耐性を提供することが考えられる。
【０４３３】
ＣＲＩＳＰＲスペーサーの内容がファージ耐性を規定するかどうか決定するために、スペーサーを付加または削除することによって、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座が変更されて、ファージに対する菌株の感受性がテストされた。すべてのコンストラクトは、当分野で知られる方法を用いて生成されて、Ｓ．サーモフィルスの染色体に組込まれた（例えば、ラッセルおよびクレンハマー、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー  ６７：４３６１［２００１］を参照）。菌株ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座におけるスペーサーおよびリピートが除去されて、いかなるスペーサーもない単一のリピートで置き換えられた。結果として生じた菌株ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２ΔＣＲＩＳＰＲ１は、ファージ８５８に対して感受性があり、もとのファージ耐性変異体（ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２）のファージ耐性は、Ｓ１およびＳ２の存在におそらく関連づけられることを示唆した（図１０を参照）。
【０４３４】
加えて、スペーサーを付加することが、新規なファージ耐性を提供するかどうか決定するために、菌株ＷＴΦ２９７２＋Ｓ４のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座が、スペーサーＳ１およびＳ２のみを含むバージョンに置き換えられた。得られたコンストラクトのファージ感受性が次にテストされた。結果として生じた菌株ＷＴΦ２９７２＋Ｓ４：：ｐＳ１Ｓ２は、ファージ８５８に対する耐性を獲得し、これら２つのスペーサーが、ファージ耐性を新規に提供する能力をもつことを示唆した（図１０を参照）。観測されたこれらの改変は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーの内容とファージ耐性との間の関連性を確立する。
【０４３５】
菌株ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２ΔＣＲＩＳＰＲ１の生成過程において、ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐＲ、ｃａｓ遺伝子およびネイティブなＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座の間に挿入された単一リピートをもつ組込みベクターを含む変異株がつくり出された（図１０を参照）。意外なことに、菌株ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐＲは、スペーサーＳ１およびＳ２が染色体に存在したままであったが、ファージ８５８に対する感受性があった（図１０を参照）。同様に、ＷＴΦ２９７２＋Ｓ４：：ｐＳ１Ｓ２コンストラクトは、スペーサーＳ４が染色体に存在するが、ファージ２９７２に対する耐性を喪失した（図１０を参照）。これらの結果は、スペーサーが、それだけで耐性を提供するわけではなく、おそらく特定の遺伝学的に有効な状況になければならないことを示した。
【０４３６】
初期の実験は、ＤＮＡ修複の関与を示唆したが（マカロバら、ニュークリイック・アシッズ・リサーチ  ３０：４８２［２００２］）、現在の仮説は、ｃａｓ遺伝子（ジャンセンら、モレキュラー・マイクロバイオロジー  ４３：１５６５［２００２］；およびハフトら、ＰｌｏＳコンピュテーショナル・バイオロジー  １：ｅ６０［２００５］）が、ＣＲＩＳＰＲ介在免疫に関与することである（マカロバら、バイオロジー・ダイレクト  １：７［２００６］）。付加的な実験において、菌株ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２における２つのｃａｓ遺伝子、すなわちｃａｓ５（ＣＯＧ３５１３）およびｃａｓ７が不活性化されたが、これらはそれぞれ、ｓｔｒ０６５７ｌｓｔｕ０６５７およびｓｔｒ０６６０ｌｓｔｕ０６６０に相当する（ボロティンら、ネイチャー・バイオテクノロジー  ２２：１５５４［２００４］；およびボロティンら、マイクロバイオロジー  １５１：２５５１［２００５］を参照）。ｃａｓ５の不活性化は、ファージ耐性の喪失をもたらした（図１０を参照）。加えて、Ｃａｓ５は、ＨＮＨ型ヌクレアーゼモチーフを含む故に、ヌクレアーゼとして機能することが可能である。それと対照的に、ｃａｓ７の不活性化は，ファージ８５８に対する耐性を変化させなかった（図１０を参照）。しかしながら、本発明は、いかなる特定のメカニズムにも限定される意図をもたない。加えて、ｃａｓ７ノックアウトからＣＲＩＳＰＲ１ファージ耐性変異体を生み出す実験はうまくいかなかった。本発明は、いかなる特定のメカニズムにも限定される意図をもたないとはいえ、これは、Ｃａｓ７が新しいスペーサーおよび付加的なリピートの合成、および／または挿入に関与するからであろう。
【０４３７】
ファージ耐性変異体の感受性をテストした時点でプラーク形成が劇的に減少すること、しかしながら比較的少ない個体数のバクテリオファージが変異体に感染する能力を保持することが見出された。ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２に感染する能力を保持したファージ８５８由来のファージ変異株がさらに解析された。特に、２つの毒性ファージ変異株における、付加的なスペーサーＳ１およびＳ２に対応するゲノム領域の配列が調べられた。両方の場合に、ファージ変異株のゲノム配列は変異しており、スペーサーＳ１に対応する配列に２つの異なる一塩基多型が同定された（図１３を参照）。
【０４３８】
概して、原核生物は、核酸ベースの「免疫」システムを発展させたように思われるが、それによれば特異性は、ＣＲＩＳＰＲスペーサーの内容によって決定づけられ、一方で耐性は、Ｃａｓ酵素の機構によって提供される。加えて、耐性を直接には提供しないｃａｓ遺伝子のいくつかは、実際には適応「免疫」反応の一部として、付加的なＣＲＩＳＰＲスペーサーおよびリピートの挿入に関与すると推測された。この核酸ベースのシステムは、真核生物でこれに対応するが、適応免疫が遺伝性でないアミノ酸ベースのシステムとは対照的である。ＣＲＩＳＰＲスペーサーの遺伝的特質は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、進化、分類および比較ゲノムの研究のための標的として用いることを支持する（プールセルら、上記；グレーネンら、モレキュラー・マイクロバイオロジー  １０：１０５７［１９９３］；モンゴディン（Ｍｏｎｇｏｄｉｎ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー  １８７：４９３５［２００５］；およびデボーイ（ＤｅＢｏｙ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー  １８８：２３６４［２００６］を参照）。このシステムは、ファージ環境に対して反応性なので、原核生物の進化および生態学に重要な役割を果たし、かつファージ暴露に関する歴史的な視点、並びにファージ感受性の予測手段を提供すると思われる。しかしながら、本発明は、いかなる特定のメカニズムにも限定される意図をもたない。それにも関らず、本発明は、ウイルス防衛手段として、さらに可動遺伝因子の拡散、並びに抗菌薬耐性遺伝子および毒性マーカーのような望ましくない形質の獲得を潜在的に低減するために、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓシステムを利用する方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ファージの進化の視点から、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組込まれたファージの配列は、次のファージ感染の間に組換えを促進する付加的なアンカーポイントも提供し、かくしてファージがアクセスできる遺伝子プールを増加させることも考えられる。（ヘンドリックス（Ｈｅｎｄｒｉｘ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ  ９６：２１９２［１９９９］を参照）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、バクテリア属の大多数に見出され、かつ古細菌に遍在しており（ジャンセンら、前記；リレストルら、前記；およびグードおよびビッカートン（Ｇｏｏｄｅ  ａｎｄ  Ｂｉｃｋｅｒｔｏｎ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・エボリューション（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．）６２：７１８［２００６］を参照）、原核生物とその捕食者との関係、および相互指向進化に関する新しい知見を提供する。
【０４３９】
生物的防除ファージ
本発明は、生物的防除剤としてファージを開発する方法および組成物も提供する。本明細書に示されるように、バクテリアは、活性なＣＲＩＳＰＲ遺伝子座にファージ由来の配列（スペーサー）を取り込むことによって、ファージ攻撃に対して耐性になることができる。ファージは、所与のＣａｓ−ＣＲＩＳＰＲシステムに対応する、スペーサーまたはＣＲＩＳＰＲモチーフ認識配列に対応するゲノム配列の変異によって、この耐性をエスケープすることができる。宿主菌株のＣＲＩＳＰＲ介在ファージ耐性誘導体をつくり出すためのファージ・チャレンジ、およびファージ・エスケープ変異体の単離の反復ラウンドを通じて、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ標的配列、および／またはスペーサー挿入を方向づける想定ＣＲＩＳＰＲ認識部位内が変化したファージを提供する。さらにまた、本発明は、所与のＣａｓ−ＣＲＩＳＰＲシステムに対するＣＲＩＳＰＲモチーフ配列が削除されるように、合成的に設計されたファージを提供する。これらの「変化した」ファージは、カクテルとして、または「順次ローテ―ションの仕組み」で適用され、標的バクテリアが、ＣＲＩＳＰＲシステムを介して耐性に適応する能力を低減させる。実際、本発明は、生物的防除剤として用いるための毒性ファージの多様な一組を提供する。特に好ましい実施形態において、この多様性は、ファージ攻撃に対抗して（ＣＲＩＳＰＲを介して）急速に進化する、宿主生物の能力を著しく低減または喪失させるために、ＣＲＩＳＰＲ指向のファージ耐性メカニズムが目標とされる。多様なファージの管理は、カクテルとして、または順次ローテ―ションの仕組みのいずれにしろ、宿主生物が、ＣＲＩＳＰＲ指向のファージ耐性に適応するか、またはそれを発達させる可能性をさらに低減させる。
【０４４０】
ファージは、抗生物質に代わる治療薬として、広範囲に研究されてきた天然の抗菌薬である。抗生物質多剤耐性病原体の蔓延に起因して、この興味が最近になって見直されている。バクテリアは、抗生物質と同様に、ファージ攻撃を克服するための複数のメカニズムを発展させてきた。本発明は、ファージ耐性を調節して多様なファージ集団を生み出し、ＣＲＩＳＰＲモチーフ配列を欠いた合成的なファージをつくり出すのに、Ｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲを用いることを伴う方法および組成物、並びに、該ファージへの耐性を発達させる標的生物の能力を低減させることになるファージを管理する方法を提供する。
【０４４１】
本明細書に詳述されるように、病原性の属の例を含む広範囲の生物でｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲシステムが記載されてきた。ファージに感染した時点で、溶菌を回避したバクテリアでは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に新しいスペーサー配列（単数または複数）を含むことを見出すことができる。この新しいスペーサーは、典型的に確定した長さであって、所与のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に特徴的で、かつ該スペーサーがそれに対する耐性を授ける攻撃ファージゲノムに由来する長さをもつ。単一のスペーサーが授ける耐性レベルは、しばしば完全ではないので、ファージは、このメカニズムをエスケープすることができる。「エスケープ・ファージ」の解析は、そのゲノムが、耐性のある宿主変異株で見出されたのに対応するスペーサー、またはその近位で変異していることを示した。その上に、「エスケープ・ファージ」は、それらが由来するＣＲＩＳＰＲ介在宿主変異株に対して完全に毒性をもつ。
【０４４２】
治療用ファージを伝統的な抗生物質から区別しているユニークな一様態は、感染したバクテリアと連携して指数関数的に繁殖する能力である。これは、薬理学的な見地から有利であり得る一方で、ファージが、ファージ攻撃に対する標的バクテリアの適応反応に対して進化するユニークな機会も提供する。
【０４４３】
バクテリアは、毒性ファージに対するいくつかの防衛メカニズムを発達させてきた。本明細書に示されるように、Ｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、バクテリアにファージ耐性を授ける役割を果たす。ファージ感染後における、生存バクテリアの解析は、いくつかの分離株が、その常在のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に新しいスペーサーエレメントを挿入したことを見出したが、その配列は、対応するファージゲノムで見出されたものと同一であった。ファージにチャレンジされたときに、これらの第１世代のＣＲＩＳＰＲ介在ファージ耐性変異株がプラークを発生させ、このファージが、親および誘導体の両方に対して完全に感染性であることが見出された。これらの「ＣＲＩＳＰＲエスケープ」ファージの解析は、ファージゲノムが、ファージ耐性変異株が抱くＣＲＩＳＰＲスペーサーに対応する配列、またはスペーサー挿入を方向づけると信じられ、かつ所与のＣａｓ−ＣＲＩＳＰＲシステムに特異的なＣＲＩＳＰＲモチーフとして同定された近位の配列、に変異が生じたことを示した。それ故に「ＣＲＩＳＰＲエスケープ」ファージは、親株および第１世代のＣＲＩＳＰＲ変異株の両方に感染することができるため、親および第１世代変異株に比べて潜在的により毒性をもつ。
【０４４４】
先述のように、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、既知の病原体および腐敗微生物の例を含む、バクテリアのいくつかの属／菌種で同定されてきた。本明細書に同じく記載されるように、本発明は、侵入する外来ＤＮＡ、特にバクテリオファージ、に対する「免疫」を授けるために、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座をＣａｓタンパク質と組み合わせて利用する方法および組成物を提供する。本明細書に同じく記載されるように、ファージゲノム内の対応する配列（すなわち、「原スペーサー」）と同一のスペーサーを含む「活性な」ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ遺伝子座を抱くバクテリア菌株は、ファージに対する耐性をそのバクテリア菌株に授ける。いくつかの好ましい実施形態において、生物的防除ファージゲノム配列が知られている。いくつかの特に好ましい方法において、分離された標的微生物がＣＲＩＳＰＲ遺伝子座について検査される。いくつかの好ましい実施形態において、標的微生物のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接する保存配列に対して特異的なプライマーを用いるＰＣＲが役立つ。いくつかの好ましい実施形態において、増幅産物（単数または複数）が、生物的防除ファージゲノム配列と比較して配列決定される。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲファージ耐性変異体の生成、およびスペーサー／原スペーサーの解析は、特異的なＣＲＩＳＰＲモチーフを同定する手段を提供する。同定された時点で、配列情報は、ＣＲＩＳＰＲモチーフを欠いたファージを設計および合成するために用いられる。かくして、結果として生じるファージは、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ介在耐性に対して非感受性である。これらのアセスメントにおいて、ファージゲノムに類似性をもつスペーサーの欠如は、標的微生物の生物的防除ファージに対する敏感性を示唆する。かくして、生物的防除ファージは、生物的防除としてより大きい度合いの毒性および有効性をもつ。
【０４４５】
本発明は、食品、飼料、医薬、および動物薬産業においてより広い宿主範囲をもつファージを生み出すために用いるのに適した方法および組成物、並びにより効果的なバクテリアの生物的防除を利用する方法を提供する。本発明は、ネイティブなバクテリアが、有効なＣＲＩＳＰＲ介在耐性を進化させる能力を著しく低減させるために、（ＣＲＩＳＰＲに応じて）変化したファージを十分な数つくるための手段を提供する。本発明は、ネイティブなバクテリアが進化する速度を著しく低減するように設計された応用／管理の方法も提供する。
【０４４６】
実験
次の実施例は、本発明のいくつかの好ましい実施形態、および様態を実証し、さらに例示するために提供されるもので、その範囲を限定すると解釈すべきではない。
【０４４７】
以下の実験的な開示において、次の省略が適用される：℃（摂氏温度）；ｒｐｍ（一分間当たりの回転数）；Ｈ２Ｏ（水）；ＨＣｌ（塩酸）；ａａ（アミノ酸：ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）；ｂｐ（塩基対：ｂａｓｅ  ｐａｉｒ）；ｋｂ（キロ塩基対：ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｐａｉｒ）；ｋＤ（キロダルトン：ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ）；ｇｍ（グラム）；μｇおよびｕｇ（マイクログラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｎｇ（ナノグラム）；μｌおよびｕｌ（マイクロリットル）；ｍｌ（ミリリットル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；μｍおよびｕｍ（マイクロメートル）；Ｍ（モル）；ｍＭ（ミリモル）；ｕＭおよびｕＭ（マイクロモル）；Ｕ（単位）；Ｖ（ボルト）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分（単数）／分（複数））；ｈｒ（ｓ）（時間（単数）／時間（複数））；ＭＯＩ（感染多重度：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）；ＥＯＰ（プラーク形成効率：ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｐｌａｑｕｉｎｇ）；ＰＦＵ（プラーク形成単位：ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）；ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ＯＤ４２０（４２０ｎｍにおける光学濃度：ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｔ  ４２０ｎｍ）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動法：ｐｏｌｙａｃｒｙａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．２］）；ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム：ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）；Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；ｗ／ｖ（体積に対する重さ）；ｖ／ｖ（体積に対する体積）；Ａｍｉｃｏｎ（アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．）、ビバリー、マサチューセッツ州）；ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、マナサス、バイジニア州）；Ａｍｅｒｓｈａｍ（アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）；ＮＥＢ（ニューイングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー、マサチューセッツ州）；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ベクトン・ディキンソン・ラブウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）、リンカーンパーク、ニュージャージー州）；ＢｉｏＲａｄ（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）、リッチモンド、カリフォルニア州）；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（クローンテック・ラボラトリーズ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、パロアルト、カリフォルニア州）；Ｄｉｆｃｏ（ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、デトロイト、ミシガン州）；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬまたはＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ（ライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ゲイザースバーグ、メリーランド州）；Ｓｉｇｍａ（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、��ントルイス、ミズーリ州）；およびＳｏｒｖａｌｌ（ソーヴォール・インスツルメント（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、デュポン社（Ｄｕｐｏｎｔ  Ｃｏ）、バイオテクノロジー・システムズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の子会社、ウィルミントン、デラウェア州）。
【０４４８】
本発明は、別に指示がなければ、当業者の能力の及ぶ化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を利用する。かかる技術は、当業者によく知られている。
【０４４９】
本明細書では、ＤＧＣＣ７７１０は、「ＷＴ」とも呼ばれる；ＤＧＣＣ７７１０ＲＨ１は、「ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ１」および「ＲＨ１」とも呼ばれる；ＤＧＣＣ７７１０ＲＨ２は、「ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ２」および「ＲＨ−２」とも呼ばれる；ＤＧＣＣ７７７８ｃａｓ１は、「ＤＧＣＣ７７７８ｃａｓ１ＫＯ」、「ＣＡＳ１ＫＯ」および「ｃａｓ１  ＫＯ」とも呼ばれる；ＤＧＣＣ７７７８ｃａｓ４は、「ＤＧＣＣ７７７８ｃａｓ４ＫＯ」とも呼ばれる；ＤＧＣＣ７７７８は、「ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２」とも呼ばれる；ＤＧＣＣ７７７８ＲＴは、「ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐＲ」とも呼ばれる；ＤＧＣＣ７７７８ＲＴ’は、「ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２ΔＣＲＩＳＰＲ１」とも呼ばれる；ＤＧＣＣ７７１０−Ｒ２は、「ＷＴΦ２９７２＋Ｓ４」とも呼ばれる；およびＤＧＣＣ７７１０−Ｒ２Ｓ１Ｓ２は、「ＷＴΦ２９７２＋Ｓ４：：ｐＳ１Ｓ２」とも呼ばれる。
【実施例１】
【０４５０】
ファージに特異的なスペーサーの操作
この実施例では、ファージに特異的なスペーサーを操作するために行なわれた実験が記載される。いくつかの実験では、対応するファージに対する耐性を提供するために、ファージに特異的なスペーサーが、機能している既存のＣＲＩＳＰＲに挿入されたことが記載される。用いられたバクテリア菌株はストレプトコッカス・サーモフィルスＳＴ００８９、ファージはファージ２９７２であった。Ｓ．サーモフィルスＳＴ００８９は、ヨーグルトの製造に用いられる工業的に重要な菌株である。この菌株は、遺伝的な操作が容易で、よく知られる毒性ファージ２９７２に感染されやすい。
【０４５１】
菌株ＳＴ００８９のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が決定された。これはＳＴ００８９のゲノム全体を配列決定することにより行われた。代わりに、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、これまでに同定されたＳ．サーモフィルスのＣＲＩＳＰＲエレメントと同一の配列をもつプライマーセットを用いてＰＣＲによって同定される。
【０４５２】
同定された時点で、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の配列、並びに関連するｃａｓ遺伝を含む近位の領域が決定された。
【０４５３】
少なくとも１つの特定のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ遺伝子座がさらなる操作のために選択された。この遺伝子座の機能性は、スペーサー領域のコンピュータによる解析、およびファージのＤＮＡ配列に対するそれらの相同性（すなわち、スペーサー配列の欠如および／または存在、並びに菌株ＳＴ００８９とのファージ感染性への相関性）を通じて確認された。この相関性が無いとき、機能性は、文献にあるすべてのエレメント（すなわち、リピート、スペーサー、リーダー配列、および想定的に完全長のタンパク質をコード化するｃａｓ遺伝子）の存在に基づいて、仮定された。
【０４５４】
適切なスペーサー配列（単数または複数）は、ファージ２９７２のゲノムから選択された。スペーサーを選択するのに用いた評価基準は、選択されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内のスペーサーの長さ、およびファージ配列に対する同一性（好ましくはおよそ１００％）に一般に基づいた。実際、任意の適切なファージ配列が本発明の様々な実施形態に役立つ。
【０４５５】
いくつかの実施形態において、ファージ２９７２のスペーサー配列からなり、（選択されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と同一の）２つの繰り返しエレメントが隣接するＣＲＩＳＰＲユニットが化学的に合成された。当然ながら、この合成「ＣＲＩＳＰＲユニット」はおよそ１００ｂｐの長さで、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中に確実に組込むにはあまりに短い。
【０４５６】
それ故に、ＣＲＩＳＰＲユニットとともに、隣接する付加的なＤＮＡが構築された。合成ＣＲＩＳＰＲユニットに隣接する、標的遺伝子座と同一の最短５００ｂｐの相同的なＤＮＡが組込みを容易にするためにつくられた。
【０４５７】
付加的な実施形態において、複数のアプローチが存在する。一実施形態では、コンストラクトが既存のＣＲＩＳＰＲに新しいスペーサーを付加することを倣う。いくつかの代わりの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の全体が合成ＣＲＩＳＰＲユニットに置き換えられる。
【０４５８】
結果として生じたＣＲＩＳＰＲ組込み体は、生物学的なテストの前に、ＤＮＡ配列決定を通じた検証がなされた。加えて、ファージ２９７２に対するＣＲＩＳＰＲ組込み体のファージ感受性パターンがテストされて、親菌株と比較された。
【０４５９】
構築されたＣＲＩＳＰＲ組込み体は、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓが適切な状況下で首尾よく、特異的なスペーサーの存在との直接的な相関性を実証した。
【０４６０】
付加的な実験では、ファージＤＮＡに対して相同的なスペーサーが受容細胞に挿入された。これらの実験では、抗受容体遺伝子内のファージＤＮＡからの（ファージＤＮＡに対して１００％の同一性をもつ）新しいＣＲＩＳＰＲスペーサーが設計されて、細胞のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に挿入された。他の菌株からのＣＲＩＳＰＲスペーサーがファージの抗受容体遺伝子に類似性を示すことが見出されたため、抗受容体遺伝子を標的とした。ファージの抗受容体遺伝子に対して同一性を示すスペーサーを担う４つの菌株は、際立ったファージ耐性があった。該変異体がファージに暴露されて、耐性があることが見出された。
【０４６１】
付加的な実験では、もとの宿主に、但しＣＲＩＳＰＲ遺伝子座ではないところにスペーサーが挿入された。結果として生じた変異体は、ファージに対する感受性を維持した。かくして、これらの実験は、スペーサーがＣＲＩＳＰＲおよびｃａｓ遺伝子の構成する特定の環境下に存在する必要性を示した。
【０４６２】
他の実験では、特定のＣＲＩＳＰＲスペーサーが、自然発生のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から削除された。この削除は、所与のファージに対する免疫を取り除き、宿主は、スペーサーがそれに相同的なファージに対して感受性になった（すなわち、耐性を喪失した）。これらの実験の結果は図１０に示される。
【０４６３】
さらに付加的な実験では、侵入する核酸に対する免疫を提供するために、ＣＲＩＳＰＲリピート−ｃａｓの組み合わせの全体が受容細胞に挿入された。
【０４６４】
付加的な実験では、本明細書に示される方法を用いて、ＣＲＩＳＰＲスペーサーを備えるプラスミドが調製された。このプラスミドを同じスペーサーを含む細胞に導入する試みは、成功しなかった。しかしながら、該スペーサーを含まないプラスミドは、細胞中に形質転換することができる。図１１および１２がこれらの結果を図解する。
【０４６５】
さらなる実験では、２つの異なった菌株に存在するＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓの組み合わせが交換された。このスペーサー交換がこれらの表現型（ファージ感受性／耐性）を改変することが示された。本明細書に示されるように、Ｓ４をもつ菌株にＳ１Ｓ２が導入されるとき、ファージ感受性がスィッチされる（図１０を参照）。
【０４６６】
付加的な実験では、異なったｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲリピートの組み合わせが調製される。機能性にとってｃａｓ遺伝子またはタンパク質が必要なだけでなく、特定のｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲリピートの組み合わせが必要とされる。ｃａｓ遺伝子またはタンパク質がまた別のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から供給されるときには、菌株はファージに対して感受性のままでいる。
【０４６７】
なお付加的な実験では、（機能的なＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓユニットから）１つまたはそれ以上のｃａｓ遺伝子が削除された。免疫が提供されるためにはＣａｓ遺伝子が必要である。Ｃａｓ変異体は、ファージのＤＮＡと同一のスペーサーの存在にも関らず、依然としてファージに対して感受性である。これらの実験では（先にｃａｓ１として知られた）ｃａｓ５および（先にｃａｓ４として知られた）ｃａｓ７が削除された。ｃａｓ５が耐性に必要なことを示された。加えて、新しいスペーサーを組込むためにｃａｓ７が必要なことが示された。
【０４６８】
付加的な実験では、ｃａｓ遺伝子は、宿主にトランス配列で提供される。ｃａｓ遺伝子がノックアウトされる場合、免疫が回復する。
【実施例２】
【０４６９】
ＣＲＩＳＰＲスペーサー（単数または複数）の組込み
これらの実験では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座へのＣＲＩＳＰＲスペーサーの組込みが、該ＣＲＩＳＰＲスペーサーがそれに対して同一性を示すバクテリオファージに対する耐性を提供することが示された。これらの実験では、Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０ＲＨ１がつくられた。
【０４７０】
（番号ＣＮＣＭ  Ｉ−２４２３のもとにフランスの「コレクション・ナショナル・ド・カルチャー・ド・ミクロオーガニズムＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ」に寄託された）ストレプトコッカス・サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０は、少なくとも３つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座：ＣＲＩＳＰＲ１、ＣＲＩＳＰＲ２およびＣＲＩＳＰＲ３を所有する。完全なゲノム配列が知られるＳ．サーモフィルス菌株ＣＮＲＺ１０６６およびＬＭＧ１８３１１（ボロティンら、マイクロバイオロジー  １５１：２５５１−１５６１［２００５］）では、ＣＲＩＳＰＲ１は、同じ染色体遺伝子座：ｓｔｒ０６６０（またはｓｔｕ０６６０）およびｓｔｒ０６６１（またはｓｔｕ０６６１）の間に位置する。
【０４７１】
菌株ＤＧＣＣ７７１０では、ＣＲＩＳＰＲ１は、同じ染色体遺伝子座のよく類似した遺伝子間に同様に位置する。菌株ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ１は、（末端リピートを入れて）３３リピート、従って３２スペーサーを含む。
【０４７２】
これらすべてのスペーサーは、互いと異なっている。これらのスペーサーの大部分は新しい（すなわち、これまでＣＲＩＳＰＲ遺伝子座で記載されていない）が、しかしＣＲＩＳＰＲ１トレーラーに近い４スペーサーは、すでに知られるＣＲＩＳＰＲ１スペーサーと同一である：
−ＤＧＣＣ７７１０の第２８スペーサーは菌株ＣＮＲＺ１５７５（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＤＱ０７２９９１）の第３１ＣＲＩＳＰＲ１スペーサーと１００％同一である；
−ＤＧＣＣ７７１０の第３０スペーサーは菌株ＣＮＲＺ７０３（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＤＱ０７２９９０）の第２７ＣＲＩＳＰＲ１スペーサーと１００％同一である；
−ＤＧＣＣ７７１０の第３１スペーサーは菌株ＣＮＲＺ７０３（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＤＱ０７２９９０）の第２８ＣＲＩＳＰＲ１スペーサーと１００％同一である；
−ＤＧＣＣ７７１０の第３２スペーサーは菌株ＣＮＲＺ７０３（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＤＱ０７２９９０）の第３０ＣＲＩＳＰＲ１スペーサーと１００％同一である。
【０４７３】
本発明の開発の間に、親菌株としてＤＧＣＣ７７１０および毒性ファージとしてＤ８５８を用いて、Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０ＲＨ１が天然のファージ耐性変異体として単離された。Ｄ８５８、ウイルスのシホウイルス科に属するバクテリオファージが用いられた。
【０４７４】
菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ１のＣＲＩＳＰＲ１は、（末端リピートを入れて）３４リピート、従って３３スペーサーを含む。Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ１配列と比較したとき、Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ１のＣＲＩＳＰＲ１配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方の末端（すなわち、リーダーの近く、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端）に１つの付加的な新しいスペーサー（および該新しいスペーサーに隣接する付加的なリピート）を保有する。ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座のすべての他のスペーサーは、変化しないままであった。
【０４７５】
菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨの１ＣＲＩＳＰＲ１配列（５’〜３’）は、以下に示される：
【０４７６】
【化５】
2010519929.tif 000019
【０４７７】
上記の配列において、リーダーは次の配列をもつ：
５’ｃａａｇｇａｃａｇｔｔａｔｔｇａｔｔｔｔａｔａａｔｃａｃｔａｔｇｔｇｇｇｔａｔａａａａａｃｇｔｃａａａａｔｔｔｃａｔｔｔｇａｇ  ３’（配列番号：６８８）
【０４７８】
ＣＲＩＳＰＲリピートを備える組込み配列
（ＧＴＴＴＴＴＧＴＡＣＴＣＴＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＧＴＡＡＣＴＧＴＡＣＡＡＣｔｃａａｃａａｔｔｇｃａａｃａｔｃｔｔａｔａａｃｃｃａｃｔｔ；配列番号：６８９）は大文字で、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（すなわち、タグ付け配列）は小文字でされ；両方とも上に灰色で示されている。ＣＲＩＳＰＲリピートの末端リピートおよびトレーラー配列は、以下に示される：
末端リピート：５’ｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａａｇｔａａｃｔｇｔａｃａｇｔ３’（配列番号：３）
トレーラー配列：５’ｔｔｇａｔｔｃａａｃａｔａａａａａｇｃｃａｇｔｔｃａａｔｔｇａａｃｔｔｇｇｃｔｔｔ（配列番号：６９１）
【０４７９】
新しいスペーサーの配列５−ＴＣＡＡＣＡＡＴＴＧＣＡＡＣＡＴＣＴＴＡＴＡＡＣＣＣＡＣＴＴ（配列番号：５３４）は、Ｄ８５８ファージゲノム内に存在する。
【０４８０】
スペーサーの配列は、Ｄ８５８のゲノムの位置３１９２１および３１９５０ｂｐの間（すなわち、プラス鎖上）に見出される（かつ３０ヌクレオチドにわたってＤ８５８のゲノム配列に対して１００％の同一性をもつ）：
【０４８１】
【化６】
2010519929.tif 000020
【０４８２】
Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ１のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組込まれた新しいスペーサーは、図１および表２−１に示されるように、ファージＤ８５８に対する耐性をこの菌株に授ける。
【０４８３】
【表３】
2010519929.tif 000021
【０４８４】
加えて、本発明の開発の間に、親菌株としてＳ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０、毒性ファージとしてファージ８５８を用い、天然のファージ耐性変異体としてＳ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ２が単離された。
【０４８５】
サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ２のＣＲＩＳＰＲ１は、（末端リピートを含めて）３４リピート、従って３３スペーサーを含む。Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ１配列と比較したとき、Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ２のＣＲＩＳＰＲ１配列は、１つの付加的な新しいスペーサー（および新しいスペーサーに隣接する１つの付加的なリピート）をＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の１つの末端（すなわち、リーダーの近く、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端）に所有する。ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座のすべての他のスペーサーは、変化しないままでいた。菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ２のＣＲＩＳＰＲ１配列（５’〜３’）が、以下に示される：
【０４８６】
【化７】
2010519929.tif 000022
【０４８７】
上記の配列において、リーダー配列は、以下の通りである：
５’−ｃａａｇｇａｃａｇｔｔａｔｔｇａｔｔｔｔａｔａａｔｃａｃｔａｔｇｔｇｇｇｔａｔａａａａａｃｇｔｃａａａａｔｔｔｃａｔｔｔｇａｇ−３’（配列番号：６８８）。
【０４８８】
ＣＲＩＳＰＲリピートを備える組込み配列は大文字で、ＣＲＩＳＰＲスペーサー（すなわち、タグ付け配列）は小文字で示され；両方とも上に灰色で示されている
（ＧＴＴＴＴＴＧＴＡＣＴＣＴＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＧＴＡＡＣＴＧＴＡＣＡＡＣｔｔａｃｇｔｔｔｇａａａａｇａａｔａｔｃａａａｔｃａａｔｇａ；配列番号：６９４）。ＣＲＩＳＰＲリピートの末端リピートおよびトレーラー配列が、以下に示される：
末端リピート：５’−ｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａａｇｔａａｃｔｇｔａｃａｇｔ−３’（配列番号：３）
トレーラー配列：５’−ｔｔｇａｔｔｃａａｃａｔａａａａａｇｃｃａｇｔｔｃａａｔｔｇａａｃｔｔｇｇｃｔｔｔ−３’（配列番号：６９１）。
【０４８９】
新しいスペーサーの配列が、Ｄ８５８ファージゲノム内に存在することが示された。
【０４９０】
スペーサーの配列（配列番号：５３５）は、Ｄ８５８のゲノムの位置１７２１５および１７２４４ｂｐの間（すなわち、プラス鎖上）に見出される
（３０ヌクレオチドにわたって、Ｄ８５８のゲノム配列に対して１００％の同一性をもつ）：
【０４９１】
【化８】
2010519929.tif 000023
【０４９２】
Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ２のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に組込まれた新しいスペーサーは、図２および表２−１（図１０も参照）に示されるように、ファージＤ８５８に対する耐性をＳ．Ｓサーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ２に授ける。
【実施例３】
【０４９３】
コンストラクトの組込みおよびノックアウト
この実施例では、コンストラクトの組込み、およびノックアウトに用いる方法が記載される。
【０４９４】
これらの実験に用いられた菌株は、以下の通りである：
Ｓ．サーモフィルスＤＧＣＣ７７１０親菌株、ファージ８５８および２９７２に感受性がある
Ｓ．サーモフィルスＤＧＣＣ７７７８  ＣＲＩＳＰＲ変異体、８５８に耐性がある
Ｓ．サーモフィルスＤＧＣＣ７７７８ｃａｓ１ＫＯ
Ｓ．サーモフィルスＤＧＣＣ７７７８ｃａｓ４ＫＯ
Ｓ．サーモフィルスＤＧＣＣ７７７８ＲＴ
Ｓ．サーモフィルスＤＧＣＣ７７７８ＲＴ’
Ｓ．サーモフィルスＤＧＣＣ７７１０Ｒ２  ＣＲＩＳＰＲ変異体、２９７２に耐性がある
Ｓ．サーモフィルスＤＧＣＣ７７１０Ｒ２Ｓ１Ｓ２
大腸菌ＥＣ１，０００が提供するｐＯＲ１２８（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６７：４３６９１−４３６４［２００１］を参照）
大腸菌ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯが提供するｐＴＯＰＯ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）カタログ＃Ｋ４５００−０１を参照）
【０４９５】
次のプラスミドが、これらの実験に用いられた：
ｐＴＯＰＯ、様々なコンストラクトのサブクローニングに用いられるプラスミド
ｐＴＯＰＯｃａｓ１ｋｏは、ｃａｓ１の不可欠なフラグメントを含む
ｐＴＯＰＯｃａｓ４ｋｏは、ｃａｓ４の不可欠なフラグメントを含む
ｐＴＯＰＯＳ１Ｓ２は、Ｓ１Ｓ２スペーサーコンストラクトを含む
ｐＴＯＰＯ  ＲＴは、ＲＴ末端リピートコンストラクトを含む
ｐＯＲＩ２８は、Ｓ．サーモフィルス菌株の染色体に様々なコンストラクトを組込むために用いられるプラスミドである
ｐＯＲＩｃａｓ１ｋｏは、ｃａｓ１の不可欠なフラグメントを含む
ｐＯＲＩｃａｓ４ｋｏは、ｃａｓ４の不可欠なフラグメントを含む
ｐＯＲＩＳ１Ｓ２は、Ｓ１Ｓ２スペーサーコンストラクトを含む
ｐｕｒｉｓｔは、ＲＴ末端リピートコンストラクトを含む
【０４９６】
次のプライマーがこれらの実験に用いられた：
Ｃａｓ１
５’−ｃａａａｔｇｇａｔａｇａｇａａａｃｇｃ−３’（配列番号：６７０）、および５’−ｃｔｇａｔａａｇｇｔｇｔｔｃｇｔｔｇｔｃｃ−３’（配列番号：６７１）
Ｃａｓ４
５’−ｇｇａｇｃａｇａｔｇｇａａｔａｃａａｇａａａｇｇ−３’（配列番号：６７２）、および５’−ｇａｇａｇａｃｔａｇｇｔｔｇｔｃｔｃａｇｃａ−３’（配列番号：６７３）
Ｓ１Ｓ２およびＲＴ
Ｐ１  ５’−ａｃａａａｃａａｃａｇａｇａａｇｔａｔｃｔｃａｔｔｇ−３’tg−３フィート（配列番号：６６６）
Ｐ２  ５’−ａａｃｇａｇｔａｃａｃｔｃａｃｔａｔｔｔｇｔａｃｇ−３’（配列番号：６６７）
Ｐ３  ５’−ｔｃｃａｃｔｃａｃｇｔａｃａａａｔａｇｔｇａｇｔｇｔａｃｔｃｇｔｔｔｔｔｇｔａｔｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａａｇｔａａｃｔｇｔａｃａｇｔｔｔｇａｔｔｃａａｃａｔａａａａａｇ−３’（配列番号：６６８）
Ｐ４  ５’−ｃｔｔｔｃｃｔｔｃａｔｃｃｔｃｇｃｔｔｔｇｇｔｔ−３’（配列番号：６６９）
【０４９７】
菌株およびファージは、ダニスコ・カルチャーコレクション、または参照される素材から得られた（ラッセルおよびクレンハッマー、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー  ６７：４３６９１−４３６４［２００１］；およびレベスクら、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー  ７１：４０５７−４０６８［２００５］）。
【０４９８】
ファージの調製、精製およびテストは、当分野で知られる方法を用いて行われた（例えば、デュプレシス（Ｄｕｐｌｅｓｓｉｓ）ら、バイロロジー（Ｖｉｒｏｌ．）３４０：１９２−２０８［２００５］；およびレベスクら、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー  ７１：４０５７−４０６８［２００５］を参照）。
【０４９９】
Ｓ．サーモフィルス菌株は、０．５％のラクトースまたはスクロースを補充したＭ１７（ディフコ）中において３７℃ないし４２℃で成長させた。ファージ感染については、当分野で知られるようにファージ感染の前に培地に１０ｍＭのＣａＣｌ２が加えられた（例えば、デュプレシスら、上記；およびレベスクら、上記を参照）。
【０５００】
制限酵素消化およびＰＣＲを行うために用いる酵素は、インビトロジェンから購入されて、製造者のインストラクションに従って用いられた。ＰＣＲは、当分野で知られるように、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔサーモサイクラー上で行われた（例えば、バランゴ（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ）ら、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー  ６８：２８７７−２８８４［２００２］を参照）。
【０５０１】
Ｓ．サーモフィルスの染色体における相同組換えを通じた、遺伝子の不活性化および部位特異的なプラスミドの挿入は、インビトロジェンのｐＣＲ２．１ＴＯＰＯシステムへのサブクローニング、次に大腸菌を宿主として用いたｐＯＲＩシステムにおけるクローニングによって行なわれ、コンストラクトは、最終的に精製されて、上述のようにＳ．サーモフィルス中に形質転換された（ラッセルおよびクレンハマー、上記を参照）。
【０５０２】
ＲＴコンストラクトの組込み
図４に示されるように操作されたコンストラクを用いて、図５に示されるように、コンストラクトがｃａｓ４のすぐ後に挿入された。親ＤＧＣＣ７７７８は、ファージ８５８に対して耐性をもつ。親は、ファージ８５８のＤＮＡと同一の２つのスペーサー（Ｓ１およびＤ２）をもつ。結果として生じた菌株（ＲＴ）は、ファージ８５８に対する耐性を喪失した。この結果は、耐性を授けるためには、ｃａｓ遺伝子がスペーサー（単数または複数）のごく近傍に存在する必要があることを示す。図３に示されるように、親ＤＧＣＣ７７７８は、ｃａｓ１遺伝子が破壊されるように操作された結果、耐性が失われており、このことは耐性を授けるためにｃａｓ１が必要なことを意味する。図３に示されるように、親ＤＧＣＣ７７７８は、ｃａｓ４遺伝子が破壊されるように操作された。加えて、図６〜８に示されるように、Ｓ１Ｓ２コンストラクトが親ＤＧＣＣ７７１０に組込まれた。
【実施例４】
【０５０３】
ファージ耐性変異体の単離およびＣＲＩＳＰＲ配列の確認
この実施例では、ファージ耐性変異体の単離およびＣＲＩＳＰＲ配列の確認に用いる方法が記載される。野生型宿主菌株ＤＧＣＣ７７１０（「ＲＤ５３４」とも呼ばれる）に、ファージ２９７２および／またはファージ８５８をチャレンジすることによってＳ．サーモフィルスのファージ耐性変異体が得られた（レベスクら、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー  ７１：４０５７［２００５］）。宿主菌株は、０．５％のラクトースを補充したＭ１７ブロス（ＬＭ１７）１０ｍｌ中において４２℃で成長させた。光学濃度（６００ｎｍ）が０．３に達したとき、ファージおよび塩化カルシウム１０ｍＭをそれぞれの最終濃度が１０７ｐｆｕ／ｍｌおよび５０ｍＭとなるように加えた。ファージを含む培養物が４２℃で２４時間インキュベートされ、溶菌のモニターが行われた。次に、１００μｌの溶菌液が１０ｍｌの新鮮なＬＭ１７中に接種された。残った溶菌液は遠心分離されて、ペレットが１０ｍｌの新鮮なＬＭ１７を含んだまた別の試験管中に接種された。これら２つの培養物は、４２℃で１６時間インキュベートされた。最終的に、これらの培養物が希釈されて、ＬＭ１７上で平板培養された。単離されたコロニーは、当分野で知られるようなファージ感受性のテストが行われた（モアノー（Ｍｏｉｎｅａｕ）ら、カナディアン・ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）３８：８７５［１９９２］を参照）。耐性をもつ分離株のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座がＰＣＲ産物の配列決定によって、かつ当分野で知られる関連ファージゲノム情報を用いて検証された（レベスクら、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー  ７１：４０５７［２００５］を参照）。
【実施例５】
【０５０４】
ＣＲＩＳＰＲスペーサーの操作
この実施例では、ＣＲＩＳＰＲスペーサーを操作するために、いくつかの実施形態で用いられる方法が記載される。制限酵素消化およびＰＣＲを行うために用いる酵素は、インビトロジェンから購入されて製造者のインストラクションに従って用いられた。ＰＣＲは、当分野で知られる方法を用いて、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔサーモサイクラー上で行われた。
【０５０５】
Ｓ．サーモフィルスの染色体における相同組換えを通じた遺伝子の不活性化および部位特異的なプラスミドの挿入は、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯシステム（インビトロジェン）へのサブクローニング、次に大腸菌を宿主として用いたｐＯＲＩシステムにおけるクローニングによって行われ、コンストラクトは、最終的に精製されて、当分野で知られるようにＳ．サーモフィルス中に形質転換された（ラッセルおよびクレンハマー、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー  ６７：４３６１［２００１］を参照）。
【０５０６】
２つの異なったＰＣＲフラグメントを増幅するために、１つの反応ではＰ１（５’−ａｃａａａｃａａｃａｇａｇａａｇｔａｔｃｔｃａｔｔｇ−３’；配列番号：６６６）およびＰ２（５’−ａａｃｇａｇｔａｃａｃｔｃａｃｔａｔｔｔｇｔａｃｇ−３’；配列番号：６６７）、並びにまた別の反応ではＰ３（５’−ｔｃｃａｃｔｃａｃｇｔａｃａａａｔａｇｔｇａｇｔｇｔａｃｔｃｇｔｔｔｔｔｇｔａｔｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａａｇｔａａｃｔｇｔａｃａｇｔｔｔｇａｔｔｃａａｃａｔａａａａａｇ−３’；配列番号：６６８）およびＰ４（５’−ｃｔｔｔｃｃｔｔｃａｔｃｃｔｃｇｃｔｔｔｇｇｔｔ−３’；配列番号：６６９）を用い、２つの異なったＰＣＲフラグメントを増幅するための鋳型として変異体ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２からのＤＮＡが用いられた。両方のＰＣＲ産物は、その後、図１１に従ってＳ１Ｓ２コンストラクトを生み出すために、プライマーＰ１およびＰ４を利用したまた別のＰＣＲ反応における鋳型として用いられた。
【０５０７】
Ｓ１Ｓ２コンストラクトは、インビトロジェン  ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯシステム中にサブクローニングされた。このコンストラクトは、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化され、続いてＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位でｐＯＲＩ中にクローニングされてｐＳ１Ｓ２コンストラクトが提供された。ＷＴΦ２９７２＋Ｓ４のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座へのｐＳ１Ｓ２の組込みは、ｃａｓ７の３’末端３における相同組換えを通じて生じ、ＷＴΦ２９７２＋Ｓ４：：ｐＳ１Ｓ２が生み出された。
【０５０８】
ｐＲコンストラクトは、ｐＳ１Ｓ２コンストラクトを鋳型に用いて生成された。具体的には、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにサブクローニングされたＳ１Ｓ２コンストラクトが、ＣＲＩＳＰＲリピート内で切断を行うＢｓｒＧＩを用いて消化された。この消化物は、次に再びライゲーションされた後に、単一のリピートを含むがスペーサーのないプラスミドを用い、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを利用してｐＯＲＩにクローニングされてｐＲが生成された。ｐＲをＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２の染色体のｃａｓ７の３’末端に相同組換えを通じて組込むことで、ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐＲ、すなわちＣＲＩＳＰＲ１が置き換えられて代わりにユニークなリピートが挿入された変異体が生み出された。
【０５０９】
変異体ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐＲは、次にエリスロマイシンのない状態で育成されて、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座が完全に欠失した変異体を見出すために抗生物質感受性変異株が解析される。欠失は、（ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２菌株の回復をもたらしたであろうｃａｓ７の３’末端で生じる組換え事象とは対照的に）ＯＲＦの３’末端で生じた相同組換えに由来し、ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ2ΔＣＲＩＳＰＲ１（図12を参照）、すなわちＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座が欠失した変異体（図１０を参照）が生み出された。
【実施例６】
【０５１０】
ｃａｓ遺伝子の不活性化
ｃａｓ５の不活性化のために、ｃａｓ５の８０１ｂｐの内部小片が、プライマー５’−ｃａａａｔｇｇａｔａｇａｇａａａｃｇｃ−３’（配列番号：６７０）および５’−ｃｔｇａｔａａｇｇｔｇｔｔｃｇｔｔｇｔｃｃ−３’（配列番号：６７１）を用いてＰＣＲによって増幅されて、大腸菌ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）中にサブクローニングされた。このコンストラクトは、ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されて、次にＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位でｐＯＲＩ中にクローニングされた。このコンストラクトのＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ2のｃａｓ５遺伝子への組込みは、遺伝子の該内部小片の相同組換えを通じて生じ、ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐｃａｓ５−をもたらした。
【０５１１】
同様に、ｃａｓ７の６７２ｂｐの内部小片が、プライマー５’−ｇｇａｇｃａｇａｔｇｇａａｔａｃａａｇａａａｇｇ−３’（配列番号：６７２）および５’−ｇａｇａｇａｃｔａｇｇｔｔｇｔｃｔｃａｇｃａ−３’（配列番号：６７３）を用いてＰＣＲによって増幅されて、大腸菌ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）中にサブクローニングされた。このコンストラクトは、ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されて、次にＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位でｐＯＲＩ中にクローニングされた。このコンストラクトのＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２のｃａｓ７遺伝子への組込みは、遺伝子の該内部小片の相同組換えを通じて生じ、ＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐｃａｓ７−をもたらした（図１０〜１２を参照）。
【実施例７】
【０５１２】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な配列を挿入する自然な方法
この実施例では、バクテリア菌株のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への付加的な配列の挿入を自然に生じさせるのに用いる方法が記載される。本明細書で用いられる「付加的な配列」は、ＣＲＩＳＰＲリピート配列に結合したスペーサー配列として定義される。より詳しくは、「付加的な配列」は、部分的には標的バクテリアに感染することができるドナーファージに、かつ部分的にはＣＲＩＳＰＲリピート配列の複製に起源がある。ドナーファージのＤＮＡのバクテリア細胞への導入は、ドナーファージによる細胞の感染をもたらす。付加的な配列を含む細胞の選択は、選択された改変細胞がファージに対する耐性をもつように、ドナーファージによる選択圧を通じてなされる。
【０５１３】
これらの実験では、親菌株がドナーファージに暴露されて、親菌株のファージ耐性変異株（すなわち、変異菌株）が選択された。変異菌株は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内の付加的な配列の存在を確認するために、（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定によって）解析された。付加的な配列のヌクレオチド配列が測定された。典型的に、付加的な配列は、ＣＲＩＳＰＲリピート配列に結合（融合）した、ドナーファージ由来のおよそ３０ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、該ドナーファージに対する耐性を授ける。
【０５１４】
いくつかの実験では、親菌株は、乳汁ベースの培地において４２℃で終夜にわたって予備培養された。乳汁ベースの培地に、次に０．１％（ｖ／ｖ）の親菌株の予備培養物、およびＭＯＩが１０のドナーファージの浮遊液が接種された。４２℃で６ｈのインキュベーション後に分離コロニーを得るために、希釈した培養物が栄養培地上で平板培養された。次に分離コロニーは、ドナーファージに対する耐性についてテストされた（当分野で知られる任意の適切な方法が、これらの実験に役立つ）。続いて変異株は、１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内の付加的な配列の存在について解析された。
【０５１５】
当分野で知られる標準的なＰＣＲおよび配列決定法を用いて、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の増幅、および結果として生じたＰＣＲ産物のヌクレオチド配列のＤＮＡ配列決定が行われた。その後、これらの配列は、当分野で知られる標準的な方法を用いて親菌株のものと比較された。
【０５１６】
いくつかの実験では、親菌株としてＤＧＣＣ７７１０が用いられ、ドナーファージとしてＤ２９７２が用いられた。Ｓ．サーモフィルス親菌株ＤＧＣＣ７７１０は、上述のようにドナーファージＤ２９７２に暴露された。ＷＴＰｈｉ２９７２＋Ｓ６と名付けた変異菌株が得られた（表７−１を参照）。表７−１は、他の実施例に記載される変異菌株に関する結果も含む。表７−１において、ＥＯＰはファージＤ２９７２に対する相対値が示されている。ファージゲノムにおける付加的な配列の配置は、別に明示されなければ、ファージＤ２９７２に対して相対的に示されている。
【０５１７】
【表４】
2010519929.tif 000024
2010519929.tif 000025
2010519929.tif 000026
【０５１８】
この変異株は、ＷＴＰｈｉ２９７２＋Ｓ６に対するＤ２９７２のプラーク形成効率（ＥＯＰ）が４桁低減されたことから、Ｄ２９７２に対する耐性を示した。ＤＮＡが、ＷＴＰｈｉ２９７２＋Ｓ６から抽出されて、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座が、当分野で知られるように（例えば、Ｂｏｌｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．［２００５］、上記を参照）１つのフォワードプライマー（ＹＣ７０および／またはＳＰＩＤＲ−ｕｐｓ（５’−ｇＴＣＴＴＴＡｇＡＡＡＣＴｇＴｇＡＣＡＣＣ−３’；配列番号：６７４）のいずれか）、並びに１つのリバースプライマー（ＹＣ３１および／またはＳＰＩＤＲ−ｄｗｓ（５’−ＴＡＡＡＣＡｇＡｇＣＣＴＣＣＣＴＡＴＣＣ；配列番号：６７５）のいずれか）の組み合わせを用いて、ＰＣＲによって解析された。ＰＣＲ産物の配列が決定されて、ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座のものと比較された。ＤＧＣＣ７７１０と比較して、ＷＴＰｈｉ２９７２＋Ｓ６は、図１４に示されるように、そのＣＲＩＳＰＲ１領域の５’末端における３０ｂｐの単一のスペーサー配列の付加によって、およびリピート配列の重複によって異なることが見出された。付加的な配列をＤ２９７２のゲノムの配列と比較すると、新しいスペーサー配列が、ヌクレオチド３４５２１からヌクレオチド３４４９２まで、Ｄ２９７２の配列と１００％同一であることがわかる。
【０５１９】
いくつかの付加的な実験では、親菌株としてＷＴｐｈｉ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐｃａｓ５が用いられ、ドナーファージとしてＤ８５８が用いられた。結果として生じた、ＷＴｐｈｉ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐｃａｓ５ｐｈｉ８５８＋Ｓ１９と名付けた変異菌株（表７−１を参照）は、Ｄ８５８に対して耐性がありＥＯＰが５桁低減された。ＤＮＡが、ＷＴｐｈｉ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐｃａｓ５ｐｈｉ８５８＋Ｓ１９から抽出されて、そのＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座が、１つのフォワードプライマー（ＣＲ３＿ｌｅａｄＦ１，５’−ＣＴＧＡＧＡＴＴＡＡＴＡＧＴＧＣＧＡＴＴＡＣＧ；配列番号：６７６）、および１つのリバースプライマー（ＣＲ３＿ｔｒａｉｌＲ２，５’−ＧＣＴＧＧＡＴＡＴＴＣＧＴＡＴＡＡＣＡＴＧＴＣ；配列番号：６７７）を用いてＰＣＲによって解析された。ＰＣＲ産物の配列が決定されて、ＷＴｐｈｉ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐｃａｓ５のＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座の配列と比較された。ＷＴｐｈｉ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐｃａｓ５と比較して、ＷＴｐｈｉ８５８＋Ｓ１Ｓ２：：ｐｃａｓ５ｐｈｉ８５８＋Ｓ１９は、そのＣＲＩＳＰＲ３領域の５’末端における３０ｂｐの単一のスペーサー配列の付加によって、およびリピート配列の重複によって異なる。付加的な配列をＤ８５８のゲノムの配列と比較すると、新しいスペーサー配列が、ヌクレオチド３３８２４からヌクレオチド３３８５３まで、Ｄ８５８の配列と１００％同一であることがわかる。
【０５２０】
他の付加的な実験では、親菌株としてＤＧＣＣ７８０９が用いられ、ドナーファージとしてＤ３７４３が用いられた。結果として生じた、ＤＧＣＣ７８０９ｐｈｉＤ３７４３＋Ｓ２８と名付けた変異菌株（表７−２を参照）は、Ｄ３７４３に対する耐性があり、ＥＯＰが８桁低減された。ＤＮＡが、ＤＧＣＣ７８０９ｐｈｉＤ３７４３＋Ｓ２８から抽出されて、そのＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座が、１つのフォワードプライマー（ＣＲ３＿ｌｅａｄＦ１，５’−ＣＴＧＡＧＡＴＴＡＡＴＡＧＴＧＣＧＡＴＴＡＣＧ；配列番号：６７６）、および１つのリバースプライマー（ＣＲ３＿ｔｒａｉｌＲ２，５’−ＧＣＴＧＧＡＴＡＴＴＣＧＴＡＴＡＡＣＡＴＧＴＣ；配列番号：６７７）を用いて、ＰＣＲによって解析された。ＰＣＲ産物の配列が決定されて、ＳＴ０１８９のＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座の配列と比較された。ＤＧＣＣ７８０９と比較して、ＤＧＣＣ７８０９ｐｈｉＤ３７４３＋Ｓ２８は、そのＣＲＩＳＰＲ３領域の５’末端における２９ｂｐの単一のスペーサー配列の付加によって、およびリピート配列の重複によって異なる。ファージＤ３７４３の配列は知られていない；しかしながら、他のストレプトコッカス・ファージのゲノム配列との付加的な配列の比較は、新しいスペーサー配列が、ヌクレオチド６９６７からヌクレオチド６９９６まで、ファージＤＴ１のゲノムの配列と１００％同一であることを示す。
【０５２１】
他の付加的な実験では、親菌株としてＤＧＣＣ３１９８が用いられ、ドナーファージとしてＤ４２４１が用いられた。結果として生じたＤＧＣＣ３１９８ｐｈｉ４２４１＋Ｓ２９と名付けた変異菌株（表７−２を参照）は、Ｄ４２４１に対して耐性がありＥＯＰが８桁低減された。ＤＮＡが、ＤＧＣＣ３１９８ｐｈｉ４２４１＋Ｓ１から抽出されて、そのＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座が、１つのフォワードプライマー（ＹＣ７０および／またはＳＰＩＤＲ−ｕｐｓ（５’−ｇＴＣＴＴＴＡｇＡＡＡＣＴｇＴｇＡＣＡＣＣ−３’；配列番号：６７４）のいずれか）、並びに１つのリバースプライマー（ＹＣ３１および／またはＳＰＩＤＲ−ｄｗｓ（５’−ＴＡＡＡＣＡｇＡｇＣＣＴＣＣＣＴＡＴＣＣ；配列番号：６７５）のいずれか）を用いてＰＣＲによって解析された。ＰＣＲ産物の配列が決定されて、ＤＧＣＣ３１９８のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座の配列と比較された。ＤＧＣＣ３１９８と比較して、ＤＧＣＣ３１９８ｐｈｉ４２４１＋Ｓ２９は、そのＣＲＩＳＰＲ１領域の５’末端における３０ｂｐの単一のスペーサー配列の付加によって、およびリピート配列の重複によって異なる。ファージＤ４２４１の配列は知られていない；しかしながら、他のストレプトコッカス・ファージのゲノム配列と付加的な配列との比較は、新しいスペーサー配列が、ヌクレオチド３４８４からヌクレオチド３４５５まで、ＤＴ１ファージゲノムの配列と１００％同一であることを示す。
【０５２２】
以下の表７−２は、ＤＧＣＣ７８０９、およびＤＧＣＣ３１９８からのＣＲＩＳＰＲが調節された変異菌株に関する記載を示す。この表においてＥＯＰは、ドナーバクテリオファージに対する相対値的が示されている。ファージゲノムにおける付加的な配列の位置は、ファージＤＴ１に対して相対的に示されている。
【０５２３】
【表５】
2010519929.tif 000027
【実施例８】
【０５２４】
同じ親菌株からＣＲＩＳＰＲが改変された変異菌株の一組の選択
この実施例では、同じ親菌株からの、同じファージに由来する付加的な配列が異なった変異菌株の一組を選択するのに用いる方法が記載される。ドナーファージの様々な部分は、付加的な配列の供給源として役立つので、複数の異なった変異菌株を所与のドナーファージから生み出すことができる。その上、各々の変異菌株は、異なった付加的な配列をもつ。その結果として、実施例７に記載された変異菌株に加えて、同じ親菌株から複数の菌株が開発された。いくつかの実験では、これらの付加的な菌株は、受容菌株を同じドナーファージに暴露することによって生み出された。結果として生じた様々な変異菌株が、ファージ感受性の異なったスペクトルを提示することが考えられた。
【０５２５】
独立した培養で、親菌株に同じドナーファージ処理がなされた。各々の培養に対して、単一のファージ耐性変異株が実施例７に記載されるように単離されて、次に解析された。変異菌株の各々における付加的な配列が互いに比較された。ドナーファージおよび他のファージに対する変異菌株の感受性スペクトルは、当分野で知られる典型的な微生物学的方法を用いて測定された。様々な菌株の感受性スペクトルが次に比較された。選択された変異菌株は、異なった付加的な配列（単数または複数）、および異なったファージ感受性スペクトラムを提示する菌株であった。
【０５２６】
いくつかの実験では、単一のドナーファージとしてＤ２９７２を用いて、ＤＧＣＣ７７１０の様々な変異菌株の選択が行なわれた。親菌株ＤＧＣＣ７７１０は、実施例７に記載されるように、４つの独立した培養物でドナーファージＤ２９７２に暴露された。培養物の各々から変異株が単離されて、それぞれＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１、およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２２と名付けられた（表７−１を参照）。
【０５２７】
これらの変異菌株は、４つのファージ耐性変異株上のＤ２９７２のプラーク形成効率（ＥＯＰ）が３から５桁低減されたことから、Ｄ２９７２に対する耐性を示した。ＤＮＡが、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１、およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２２から抽出されて、当分野で知られる方法を用いて（例えば、Ｂｏｌｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．［２００５］、前記を参照）、１つのフォワードプライマー（ＹＣ７０および／またはＳＰＩＤＲ−ｕｐｓ（５’−ｇＴＣＴＴＴＡｇＡＡＡＣＴｇＴｇＡＣＡＣＣ；配列番号：６７４）のいずれか）、並びに１つのリバースプライマー（ＹＣ３１および／またはＳＰＩＤＲ−ｄｗｓ（５’−ＴＡＡＡＣＡｇＡｇＣＣＴＣＣＣＴＡＴＣＣ；配列番号：６７５）のいずれか）の組み合わせを利用して、ＰＣＲによって解析された。ＰＣＲ産物の配列が決定されて、ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座の配列と比較された。ＤＧＣＣ７７１０と比較して、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２２は、図１７に示されるように、そのＣＲＩＳＰＲ１領域の５’末端における３０ｂｐのスペーサー配列の付加によって、およびリピート配列の重複によって異なる。これらの新しいスペーサー配列のＤ２９７２のゲノム配列との比較は、新しいスペーサー配列が、それぞれヌクレオチド３１５８２からヌクレオチド３１６１１まで、ヌクレオチド２５６９３からヌクレオチド２５７２２まで、ヌクレオチド２７５６０からヌクレオチド２７５８９まで、およびヌクレオチド２４６２４からヌクレオチド２４６５３まで、Ｄ２９７２のゲノムの配列と１００％同一であることを示す。４つのすべての付加的なスペーサーは、互いに異なり、かつ実施例７に記載されるスペーサーとも異なることが見出された。
【実施例９】
【０５２８】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に第２の付加的な配列を挿入するために用いる自然な方法
この実施例では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に第２の付加的な配列の挿入を引き起こすために用いる自然な方法が記載される。所与のドナーからの付加的な配列がバクテリアのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に挿入された時点で、変異株菌株は、このファージに対して耐性になるか、または少なくともより低感受性になる。それ故に、実施例７に記載される方法は、この変異菌株のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な配列を挿入するのにもはや能率的ではない。例えば、変異菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６は、Ｄ２９７２に対する感受性が著しく減少したため（実施例７を参照）、ドナーファージにＤ２９７２を用いて、この方法をＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６（親菌株）に適用することはできない。
【０５２９】
いくつかの実験では、この問題は、Ｄ２９７２に由来し、ゲノム内に少なくとも１つの特異的な改変を含む変異ドナーファージ（すなわち、「変異ファージ」）を用いることによって克服された。この変異ファージは、親ファージの改変（すなわち、変異）によって変異菌株に対する毒性が与えられるように、ドナーファージを変異菌株に暴露することによって選択された。
【０５３０】
いくつかの実験では、変異ファージは、付加的なスペーサーの配列、すなわち変異菌株における付加的な配列の部分、を含む領域内のゲノムに変異を有した。変異菌株は、この変異ファージに対して感受性があった。変異菌株がこの変異ファージに暴露されて、変異菌株のうちの新しいファージ耐性変異株（第２世代変異株）が選択された。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内の付加的な配列の存在を確認するために、当分野で知られる適切な方法（例えば、ＰＣＲおよび配列決定法）を用いて、第２世代変異株が解析された。付加的な配列のヌクレオチド配列が決定された。いくつかの実験では、付加的な配列は、変異ファージからのもので、変異ファージに対する耐性を与えるおよそ３０ヌクレオチド・サイズのフラグメントを含むことが見出された。
【０５３１】
いくつかの実験では、変異菌株が乳汁ベースの培地において４２℃で終夜にわたって予備培養された。次に適切な乳汁ベースの培地に、約１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度の変異菌株の予備培養物、およびＭＯＩが１００より大きいドナーファージの浮遊液が接種された。培養物は、４２℃で一晩にわたってインキュベートされ、次に遠心分離された。上澄みが集菌されて、０．４５μｍフィルターで濾過された。当分野で知られる任意の適切な方法を用いて、分離したファージプラークを得るために、変異菌株を撒いた栄養寒天培地に濾過した上澄みの希釈液物が接種された。当分野で知られる任意の適切な方法を用いて、液体栄養培地の変異菌株上で分離したプラークが培養された。培養物を０．４５μｍフィルターで濾過することによって、変異ファージの浮遊液が得られた。変異ファージは、次に、変異菌株のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に第２の付加的なスペーサー配列の挿入を引き起こすために、上述のように用いられた（実施例７を参照）。
【０５３２】
いくつかの実験では、親菌株としてＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６（実施例７および表７−１を参照）が用いられ、ドナーファージとしてＤ４７２４が用いられた。変異菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６が高濃度のファージＤ２９７２の存在下で培養された。上述の方法を用いて、この培養物からの上澄みを菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６上でプラーク形成することによってＤ４７２４と名付けた変異ファージが単離された。変異ファージＤ４７４２のＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６に対する毒性が検証された。変異菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６が実施例７に記載されるように、培養物中で変異ファージＤ４７４２に暴露された。ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６ｐｈｉ４７２４＋Ｓ１５と名付けたファージ耐性変異菌株（表７−１を参照）が得られた。
【０５３３】
ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６ｐｈｉ４７２４＋Ｓ１５上におけるＤ２９７２のプラーク形成効率（ＥＯＰ）が（４桁の代わりに）８桁低減されたことから、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６に比べて、この変異菌株は、Ｄ２９７２に対する耐性の向上を示した；加えて、Ｄ４７２４に対するある程度の耐性を提示することから、ＷＴｐｈｉ２９７２に比べても耐性が拡大された（表９−１を参照）。ＤＮＡが、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６ｐｈｉ４７２４＋Ｓ１５から抽出されて、上述のプライマーと同じ組み合わせを用いて、上述のようにＰＣＲによって解析された。ＰＣＲ産物の配列が決定されて、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座のものと比較された。ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６と比較して、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６ｐｈｉ４７２４＋Ｓ１５は、図１７に示されるように、そのＣＲＩＳＰＲ１領域の５’末端における３０ｂｐのスペーサー配列の付加によって、およびリピート配列の重複によって異なる。この付加的なスペーサー配列のＤ２９７２のゲノム配列との比較は、第２の付加的なスペーサー配列が、ヌクレオチド１１１３からヌクレオチド１１４２まで、Ｄ２９７２ゲノムの配列のものと１００％同一であることを示した。
【０５３４】
同一の実験条件を用いた独立した培養物から、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６ｐｈｉ４７２４＋Ｓ１７、およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６ｐｈｉ４７２４＋Ｓ２４変異菌株が単離されて解析された（表7−１を参照）。ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６ｐｈｉ４７２４＋Ｓ１７、およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６ｐｈｉ４７２４＋Ｓ２４上におけるＤ２９７２のプラーク形成効率（ＥＯＰ）が両方の変異菌株に対して８桁以上低減されたことから、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６と比較して、これらの変異菌株は、Ｄ２９７２に対する耐性の向上を示した；これらがＤ４７２４に対するある程度の耐性を提示したことから、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６に比べてもこれらの耐性は拡大された（表９−１を参照）。加えて、これらの変異菌株は、それぞれヌクレオチド３３９６８からヌクレオチド３３９９７まで、およびヌクレオチド３０８０３からヌクレオチド３０８３２まで、Ｄ２９７２のゲノム配列と１００％同一の付加的なスペーサー配列をＣＲＩＳＰＲ１に提示する。
【０５３５】
付加的な実験では、親菌株としてＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６ｐｈｉ４７２４＋Ｓ１５が用いられ、ドナーファージとしてＤ４７３３が用いられた。ファージＤ４７２４から変異ファージＤ４７３３を生み出すために上述の方法が用いられた。次にＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６ｐｈｉ４７２４＋Ｓ１５からファージ耐性変異菌株を得るために、ファージ４７３３が用いられた。結果として生じた変異菌株は、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６ｐｈｉ４７２４＋Ｓ１５ｐｈｉ４７３３＋Ｓ１６と名付けられた（表７−１を参照）。この変異菌株は、ヌクレオチド２９９２３からヌクレオチド２９８９４まで、Ｄ２９７２のゲノムからの配列と１００％同一のスペーサー配列を含んだ１つの付加的な配列を含む。この変異菌株は、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６ｐｈｉ４７２４＋Ｓ１５ｐｈｉ４７３３＋Ｓ１６上におけるＤ２９７２のプラーク形成効率（ＥＯＰ）が８桁以上低減されたことから、Ｄ２９７２に対する耐性の向上を示し、かつファージＤ４７３３に対して耐性が拡大された。（表９−１を参照）。表９−１は、ＤＧＣＣ７７１０からＣＲＩＳＰＲが改変されたいくつかの変異菌株のファージ耐性に関する記載を示す。この表で「ｎｄ」は、結果が決定されなかったことを示す。
【０５３６】
【表６】
2010519929.tif 000028
【０５３７】
なおさらなる実験では、親株としてＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４が用いられ、ドナーファージとしてＤ４７２０が用いられた。上述したのと同じ方法を用いて、ファージＤ２９７２から変異ファージＤ４７２０が生み出された。ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４からファージ耐性変異株を得るために、ファージＤ４７２０が用いられた。結果として生じた変異菌株は、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４ｐｈｉ４７２０＋Ｓ１７と名付けられた（表７−１を参照）。この変異菌株は、ヌクレオチド３３９６８からヌクレオチド３３９９７まで、Ｄ２９７２のゲノムからの配列と１００％同一のスペーサー配列を含んだ１つの付加的な配列を含む。この変異菌株は、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４ｐｈｉ４７２４＋Ｓ１７上におけるＤ２９７２のプラーク形成効率（ＥＯＰ）が（５桁に比べて）６桁低減されたことから、Ｄ２９７２に対する耐性の向上を示し、かつファージＤ４７２０に対して耐性が拡大された。（表９−１を参照）。
【実施例１０】
【０５３８】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に第２の付加的な配列（単数または複数）を挿入するための自然な別法
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に第２の付加的な配列を挿入するための自然な別法が記載される。所与の親菌株は、１つより多いファージ科に対して感受性をもち得ることが知られている。本明細書に記載されるように、変異菌株のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加的な配列を挿入するために、この感受性の多様性が有利に用いられた。これらの実験では、親菌株および変異菌株（単数または複数）に対する取り揃えたファージの毒性をテストすることによって、第２のドナーファージが選択された。注目すべき第２のドナーファージは、両方の菌株に対して毒性があった。これらのファージは、最初のドナーファージが代表するファージ科とは異なったファージ科を代表するであろうと考えられた。その選択に続いて、第２のドナーファージが変異菌株への感染に用いられた。上述の方法に記載されたように、第２世代ファージ耐性変異菌株が単離されて、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内の付加的な配列がテストされた。
【０５３９】
これらの実験では、一群のファージ（または、ファージ含有サンプル）が、当分野で知られた典型的な微生物学的方法を用いて、親菌株に対してテストされた。親菌株に対する毒性をもつファージ（またはサンプル）が、同じ方法を用いて、次に変異菌株に対してテストされた。変異菌株に毒性があった一ファージ（またはサンプル）が、第２のドナーファージとして選択された。ファージ含有サンプルの場合には、当分野で知られた典型的な微生物学的方法を用いて、変異菌株上で均一な１つの毒性ファージに精製された。いくつかの実験では、第２のドナーファージの配列が決定された。いくつかの実験では、第２のドナーファージは、次に変異菌株のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における第２の付加的な配列の挿入を引き起こすために、上述のように用いられた（実施例７を参照）。
【０５４０】
いくつかの実験において、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４（実施例８および表７−１を参照）が親菌株として用いられ、Ｄ８５８がドナーファージとして用いられた。様々なファージをテストした時点で、菌株ＤＧＣＣ７７１０が、ファージＤ２９７２およびファージＤ８５８の両方に対して感受性をもつことが見出された。加えて、Ｄ８５８は、変異菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４に対して毒性をもつことが見出された。それ故に、いくつかの実験においてファージＤ８５８が第２のドナーファージとして選ばれた。
【０５４１】
実施例７に記載されたように、変異菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４が第２のドナーファージＤ８５８に暴露された。Ｄ８５８に対して耐性をもつＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４ｐｈｉ８５８＋Ｓ１８と名付けたファージ耐性変異菌株（表７−１を参照）が得られた（表９−１を参照）。ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４ｐｈｉ８５８＋Ｓ１８上におけるＤ２９７２のプラーク形成効率が（ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４に対する５桁と比較して；表９−１を参照）８桁以上低減されたことから、この菌株は、Ｄ２９７２に対する耐性の向上を示した。ＤＮＡが、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４ｐｈｉ８５８＋Ｓ１８から抽出されて、そのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が、上述したものと同じ方法およびプライマーを用いてＰＣＲによって解析された。ＰＣＲ産物の配列が決定されて、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のものと比較された。ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４と比較して、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４ｐｈｉ８５８＋Ｓ１８は、図１７に示されるように、そのＣＲＩＳＰＲ１領域の５’末端における３０ｂｐのスペーサー配列の付加によって、およびリピート配列の重複によって異なることが見出された。この付加的なスペーサー配列とＤ８５８のゲノムの配列との比較は、ヌクレオチド３０３３８からヌクレオチド３０３６７まで、第2の付加的なスペーサー配列がＤ８５８のゲノムのものと１００％同一であることを示した。
【０５４２】
また別のＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４ｐｈｉ４７２０＋Ｓ２５（表７−１を参照）と名付けた変異菌株も、この方法を用いた独立した実験研究で得られた。この変異菌株は、ヌクレオチド３３８８６から３３９１５まで、Ｄ８５８のゲノムの配列と１００％同一のスペーサー配列を含んだ1つの付加的な配列を含む。この変異株は、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４ｐｈｉ４７２４＋Ｓ２５上におけるＤ２９７２のプラーク形成効率が７桁以上低減されたことから、Ｄ２９７２に対する耐性の向上を示す（表９−１を参照）。
【実施例１１】
【０５４３】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における付加的な配列の多重挿入により複数ファージに対して耐性をもつＣＲＩＳＰＲが改変された変異菌株の生成
すべてのファージに対する耐性を所与の菌株に授けるためには、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への２つのファージ配列の付加だけでは不十分なことから、この実施例では、ファージの配列をＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に反復して付加することによる、複数ファージ耐性菌株の開発について記載される。例えば、（実施例１０に記載された）菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４ｐｈｉ８５８＋Ｓ１８は、他の複数のファージに対して感受性をもつことが見出された。複数ファージ耐性菌株を開発するプロセスで、変異菌株を選択するために親菌株が第１のファージで処理され、次に該菌株が第２のファージで処理されて、両方のファージに対する耐性をもつ第2世代変異菌株が選択される。次に、最後の変異菌株は、入手可能なすべてのファージに対する耐性をもつ最終的な変異菌株が得られるまで、まだ感受性をもつファージで反復して処理された。
【０５４４】
当分野で知られる方法を用いて、菌株ＤＧＣＣ７７１０上で生育することができる多様なファージを代表する１０の参照ファージからなる一組、すなわちファージＤ８５８、Ｄ１１２６、Ｄ２７６６、Ｄ２９７２、Ｄ３２８８、Ｄ３８２１、Ｄ４０８３、Ｄ４７５２、Ｄ４７５３、およびＮ１４９５が同定された。実施例７に記載されたように、ＤＧＣＣ７７１０がファージＤ２９７２に暴露されて、変異菌株ＤＧＣＣ９７０５が生み出された。ＤＧＣＣ９７０５は、ファージＤ２９７２に加えて、ファージＤ２７６６およびＤ４７５２に対する耐性をもつことが判明したが、しかし表１１−１に示されるように、他のファージに対してはまだ感受性があった。ＤＧＣＣ９７０５は、表１１−１および図１７に記載される。ＤＧＣＣ９７０５は、ＣＲＩＳＰＲ１に１つの付加的な配列、およびＣＲＩＳＰＲ３に１つの付加的な配列を提示する。ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座、およびＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座の配列の解析は、実施例７に記載された方法に従って行われた。ＰＣＲ産物の配列が決定されて、ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ１および３遺伝子座のものと比較された。ＤＧＣＣ９７０５は、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に１つの付加的なスペーサー、およびＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座に１つの付加的なスペーサーを提示する。これらのスペーサー配列は、ファージＤ２９７２からの配列と同一である。同じ方法を用いて、ＤＧＣＣ９７０５が次にファージＤ３８２１に暴露されて、続いて変異菌株ＤＧＣＣ９７２６が単離された。Ｄ２９７２に対する耐性をもつのに加えて、ＤＧＣＣ９７２６は、ファージＤ８５８、Ｄ３８２１、Ｄ４０８３およびＮ１４９５に対する耐性をもつ（表１１−１を参照）。ＤＧＣＣ９７２６は、ＤＧＣＣ９７０５と比較して、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に１つの付加的なスペーサー配列をもつ（表７−１および図１７を参照）。この付加的なスペーサー配列は、Ｄ２９７２からの配列と同一である。菌株ＤＧＣＣ９７２６のファージＤ３２８８への暴露を通じて、ＤＧＣＣ９７３３が単離された。菌株ＤＧＣＣ９７３３は、ファージＤ３２８８およびＤ１１２６に対して付加的に耐性をもつ（表１１−１を参照）。ＤＧＣＣ９７３３は、ＤＧＣＣ９７２６と比較して、そのＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に１つの付加的なスペーサー配列をもつ（表７−１および図１７を参照）。このスペーサー配列は、ストレプトコッカス・ファージ７２０１の配列に対していくらかの同一性（２５／３０塩基ペアの同一性）をもつ。最後に、ファージＤ４７５３への最後の反復暴露によって、すべてのファージに対して耐性をもつＤＧＣＣ９８３６が単離された（表１１−１を参照）。ＤＧＣＣ９８３６は、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に２つの付加的なスペーサー配列、およびＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座に２つの付加的なスペーサー配列をもつ（表７−１および図１７を参照）。１つスペーサー配列は、ファージＤ２９７２における配列と同一であり、他の３つのスペーサー配列は、ファージＤ８５８における配列と同一である。
【０５４５】
表１１−１は、ＣＲＩＳＰＲが改変された変異菌株ＤＧＣＣ９８３６、およびＣＲＩＳＰＲが半ば改変された変異菌株のファージ感受性に関するデータを示す。この表で「Ｓ」は感受性を示し、「Ｒ」は耐性を示す。
【０５４６】
【表７】
2010519929.tif 000029
【実施例１２】
【０５４７】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に複数の付加的な配列（単数または複数）を挿入するための自然な方法
この実施例では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に複数の付加的な配列を挿入するための方法が記載される。これらの方法では、様々なファージを反復して用いるのではなく、親菌株が、複数のファージを含んだ混合物に暴露された。一群のファージが、それらの宿主スペクトルを決定するために典型的な微生物学的方法を用いて複数の菌株に対してテストされた。親菌株に対して毒性をもつが、しかし異なった宿主スペクトラムを有するファージが選択された。変異菌株のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における付加的な配列の挿入を引き起こすために、選択されたファージが混合されて上述の方法に用いられた（実施例７を参照）。
【０５４８】
いくつかの実験では、親菌株としてＤＧＣＣ７７１０が用いられて、ドナーファージとしてＤ８５８およびＤ２９７２が用いられた。様々なファージをテストした時点で、菌株ＤＧＣＣ７７１０がファージＤ２９７２およびファージＤ８５８の両方に対して感受性をもつことが見出された。しかしながら、Ｄ２９７２およびＤ８５８は、菌株ＤＧＣＣ７７７８上でテストされたときに異なった宿主スペクトラムを提示し、２つのファージが異なることを示唆した。
【０５４９】
実施例７に記載されたように、親菌株ＤＧＣＣ７７１０がファージＤ８５８およびＤ２９７２の混合物に暴露された。ＷＴｐｈｉ８５８ｐｈｉ２９７２＋Ｓ９Ｓ１０Ｓ１１Ｓ１２と名付けたファージ耐性変異菌株が得られた（表７−１を参照）。この菌株は、ＷＴｐｈｉ８５８ｐｈｉ２９７２＋Ｓ９Ｓ１０Ｓ１１Ｓ１２上におけるＤ２９７２のプラーク形成効率が７桁以上低減されたことからＤ２９７２に対する耐性を示すのみならず、ＷＴｐｈｉ８５８ｐｈｉ２９７２＋Ｓ９Ｓ１０Ｓ１１Ｓ１２上におけるＤ８５８のプラーク形成効率が７桁以上低減されたことからＤ８５８に対する耐性を示す。ＤＮＡが、ＷＴｐｈｉ８５８ｐｈｉ２９７２＋Ｓ９Ｓ１０Ｓ１１Ｓ１２から抽出されて、上述されたのと同じ方法およびプライマーを用いてＰＣＲによって解析された。ＰＣＲ産物の配列が決定されて、ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ１およびＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座のものと比較された。ＤＧＣＣ７７１０と比較してＷＴｐｈｉ８５８ｐｈｉ２９７２＋Ｓ９Ｓ１０Ｓ１１Ｓ１２は、図１７に示されるように、そのＣＲＩＳＰＲ１領域の５’末端における３０ｂｐの４つのスペーサー配列の付加によって、およびリピート配列の重複によって異なる。付加的なスペーサー配列のＤ２９７２ゲノムの配列との比較は、付加的なスペーサー配列が、ヌクレオチド７８７４からヌクレオチド７９０３まで、ヌクレオチド２０６５０からヌクレオチド２０６２１まで、ヌクレオチド８３６０からヌクレオチド８３８９まで、およびヌクレオチド１８９９８からヌクレオチド１９０２７まで、Ｄ２９７２のもと１００％同一であることを示した。
【０５５０】
さらなる実験では、これらの方法に従って、菌株ＷＴｐｈｉ８５８ｐｈｉ２９７２＋Ｓ１３Ｓ１４も得られた（表７−１を参照）。この菌株は、ＷＴｐｈｉ８５８ｐｈｉ２９７２＋Ｓ１３Ｓ１４上におけるＤ８５８のプラーク形成効率が７桁低減されたことからＤ８５８に対する耐性を示し、かつＷＴｐｈｉ８５８ｐｈｉ２９７２＋Ｓ１３Ｓ１４上におけるＤ２９７２のプラーク形成効率が８桁低減されたことからＤ２９７２に対する耐性を示した。付加的なスペーサー配列のＤ２９７２ゲノムの配列との比較は、付加的なスペーサー配列が、ヌクレオチド３３６０２からヌクレオチド３３６３１まで、およびヌクレオチド４８３０からヌクレオチド４８０１まで、Ｄ２９７２のものと１００％同一であることを示した。
【実施例１３】
【０５５１】
ＣＲＩＳＰＲが改変された変異菌株を用いた、発酵におけるファージとの戦い
この実施例では、親（すなわち、野生型、受容）菌株よりもしろ変異菌株の使用により、発酵においてファージと戦う方法が記載される。かくして、この実施例は、変異株によって提供される利益に関するさらに別の記載を示す。
【０５５２】
いくつかの実験では、ファージＤ２９７２の存在下の乳発酵において、菌株ＤＧＣＣ７７１０の菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０、および菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２６Ｓ２７との比較が行われた。ＤＧＣＣ７７１０は、乳発酵に用いられる工業用菌株である。菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０は、表７−１および実施例８に記載されており、菌株ＤＧＣＣ７７１０と比較して、そのＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に付加的なスペーサーを提示する。菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０は、ＤＧＣＣ７７１０と比較して、Ｄ２９７２に対して向上した耐性を示す。ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２６Ｓ２７は、Ｄ２９７２に対するいくらかの耐性を示す別の変異株であり（表７−１に記載される）、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に２つの付加的なスペーサーを提示する。
【０５５３】
各々の菌株を用いて一連の発酵が行なわれた。最初に、１０％の粉乳培地（ｗ／ｖ）に、１％（ｖ／ｖ）のテスト菌株の予備培養物、および１０４ｐｆｕ／ｍｌのファージＤ２９７２が撒かれた。培養物は、４２℃で６ｈインキュベートされた。第１の発酵後に、第２の発酵が設定された。先行した発酵における発酵物を０．１体積％添加した以外は、正確に同じ発酵条件が用いられた（添加前に、発酵物は０．４５μｍフィルターで濾過された）。次に、第２の発酵に用いたのと同じ実験条件を用いて一連の発酵が行なわれた。すべての発酵は、インピーダンス測定によって記録された。各々の発酵の終了時に、乳凝固がテストされ、当分野で知られる方法を用いてファージの滴定が行なわれた。
【０５５４】
ファージのない乳発酵の場合、ＤＧＣＣ７７１０によるインピーダンス変化は、６時間以内で２５００μＳ以上であった。Ｄ２９７２の存在下では、（ＤＧＣＣ７７１０はファージに対する感受性が非常に高いので）、Ｄ２９７２ファージは、最初の培養の間に高レベルの個体数に達し、発酵による乳凝固は生じなかった。６時間におけるインピーダンス変化は、常に５００μＳ以下であった。それに対して、Ｄ２９７２の存在下でのＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０による乳発酵は、少なくとも第３継代培養まで乳凝固が可能であり、ファージレベルの進展が遅いことが注目された。インピーダンス変化も、第３継代培養まで２５００μＳを超えるまで増加した。これは、変異菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０が、親菌株ＤＧＣＣ７７１０に比べて、ファージの存在下での乳汁酸性化に適することを実証する。その上に、Ｄ２９７２の存在下でのＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２６Ｓ２７による乳発酵では、最後の継代培養までファージが発育することなく乳凝固が可能であった。加えて、インピーダンス変化も同様に最後の継代培養まで２５００μＳを超えるまで増加した。これは、ファージの存在下での乳汁酸性化に、変異菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２６Ｓ２７が親菌株ＤＧＣＣ７７１０より適すること、およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０よりなおさらに適することを実証する。実験が繰り返されて、その結果は表１３−１に示される。
【０５５５】
【表８】
2010519929.tif 000030
【０５５６】
実験の第２セットにおいて、ファージＤ２９７２の存在下での乳発酵における菌株ＤＧＣＣ７７１０の菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０、および菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２６Ｓ２７との比較が再現された。加えて、菌株ＤＧＣＣ９８３６も研究された。菌株ＤＧＣＣ９８３６は、複数のファージ・チャレンジの結果としてなおさらに進化したＤＧＣＣ７７１０の変異菌株である。この菌株は、そのＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に５つの付加的なスペーサー、およびそのＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座に３つの付加的なスペーサーを提示する（実施例１１および図１７を参照）。ＤＧＣＣ９８３６は、テストされたすべてのファージに対する耐性をもつ。
【０５５７】
上述のように実験が行なわれた。結果は、表１３−２に示される。実験の第１の組において、Ｄ２９７２の存在下でのＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０による乳発酵は、第５継代培養まで乳凝固が可能であり、ファージレベルの進展が遅いことが測定された。インピーダンス変化は、５つの最初の継代培養の間２５００μＳを超えるまで増加し、乳汁酸性化がファージに影響されていないことを実証した。ファージレベルは、第６継代培養では著しく増加し、乳発酵が損なわれた。他の２つの変異菌株では、６つの継代培養の間ずっと乳発酵に影響は見られず、ファージの生育も決してなく、記録されたインピーダンス変化は、常に２５００μＳ以上であった。
【０５５８】
これら実験は、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に少なくとも１つの付加的なスペーサー配列を含んだ菌株は、たとえファージが存在しても、乳発酵を可能にすることを実証する。乳発酵は、菌株が、そのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に１つより多い付加的なスペーサー配列をもつときに、なおいっそう確実になる。
【０５５９】
【表９】
2010519929.tif 000031
【実施例１４】
【０５６０】
ＣＲＩＳＰＲが改変された変異菌株の組み合わせを用いた、発酵におけるファージとの戦い
この実施例では、単一の菌株を用いる代わりに、変異菌株の組み合わせの使用を通じて発酵においてファージと戦う方法が記載される。かくして、この実施例は、１つより多い変異菌株（すなわち、変異菌株の組み合わせ）の同時の使用について説明する。同じ機能性であるが、しかし異なったファージ感受性パターンを示す菌株の混合物がかかる応用に役立つ。例えば、本明細書に記載されるような２つ、または３つないしより多くの変異菌株がかかる応用に役立つ。それらのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加された異なったスペーサー配列をもつ変異菌株の組み合わせを用いることは、出現する任意の変異ファージに容易に耐える発酵を行うことを可能にする。
【０５６１】
いくつかの実験において、ファージＤ２９７２の存在下の乳発酵について、菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１のみと、３つの菌株の組み合わせ（すなわち、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１、およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２２）との比較がなされた。菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１、およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２２は、表７−１および実施例８に記載される。これらは、ＤＧＣ７７１０の独立した変異菌株である。各々の変異菌株は、菌株ＤＧＣＣ７７１０と比較して、そのＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に（ファージＤ２９７２を起源とする）異なる付加的なスペーサー配列を提示する。
【０５６２】
菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１のみ、または３つの菌株の組み合わせのいずれかを用いて一連の発酵が行われた。最初に、１０％の粉乳培地（ｗ／ｖ）に、菌株のみまたは菌株の組み合わせの１％（ｖ／ｖ）の予備培養物、および１０４ｐｆｕ／ｍｌのファージＤ２９７２が撒かれた。培養物は、４２℃で６ｈインキュベートされた。第１の発酵後に、第２の発酵が設定された。先行した発酵における発酵物を０．１体積％添加した以外は、正確に同じ発酵条件が用いられた（添加前に、発酵物は０．４５μｍフィルターで濾過された）。次に、第２の発酵に用いたのと同じ実験条件を用いて一連の発酵が行なわれた。すべての発酵は、インピーダンス測定によって記録された。各々の発酵の終了時に、乳凝固がテストされ、当分野で知られる方法を用いてファージの滴定が行なわれた。実験が繰り返されて、その結果は表１４−１に示される。
【０５６３】
【表１０】
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【０５６４】
ファージの存在下でのＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１による乳発酵は、両方の試行とも第３継代培養で破綻した。これは、乳凝固の欠如によって、および６時間の発酵後のインピーダンス変化の大幅な低下によって示された。それに対して、３つの菌株の混合物を用いたとき、ファージＤ２９７２がいくらか生育したにも関わらず、第５継代培養まで首尾よく発酵が行なわれた。乳凝固がすべての培養物で記録されて、６時間以内のインキュベーションでインピーダンス変化が３０００μＳ以下になることは決してなかった。
【０５６５】
これら実験は、そのＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に少なくとも１つの異なる付加的なスペーサー配列をもつ変異菌株の組み合わせを用いることが、単一の変異菌株を用いるのに比べて、ファージの存在下における乳発酵を可能にすることを実証する。
【実施例１５】
【０５６６】
ＣＲＩＳＰＲが改変された変異菌株のローテーションを用いた、発酵におけるファージとの戦い
付加的な実験では、変異菌株がローテーションして用いられた。いくつかの実験では、菌株は、機能性は同じであるが、しかし異なったファージ感受性パターンを有した。かくして、この実施例では、いくつかの異なった菌株（すなわち、ＣＲＩＳＰＲが改変された変異菌株）をローテーションの仕組みで順次、反復して／続けて用いることに関して行われた実験が記載される。
【０５６７】
いくつかの実験では、ファージＤ２９７２の存在下での乳発酵について、菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１のみと、連続的に（ローテーションして）用いられた菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１、およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２２との比較がなされた。第１の乳発酵は、菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０を用いて行なわれた。次に、菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２２が第２の発酵に用いられて、菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１が第３の発酵に用いられた。第４の発酵は、次に再び菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０を用いて行なわれて、続いて菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２２を用いた発酵、次に菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１、などが行われた。菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１および菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２２は、表７−１に記載される。これらは、菌株ＤＧＣＣ７７１０の独立した変異菌株である。各々の変異菌株は、菌株ＤＧＣＣ７７１０と比較して、そのＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に、ファージＤ２９７２を起源とする異なった付加的なスペーサー配列を提示する。
【０５６８】
実施例１４に記載されたのと同じ実験方法を用いて一連の発酵が行なわれた。３回実験が行われて、その結果は表１５−１に示される。ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０のみが接種された一連の発酵は、３０００μＳ以上のインピーダンス変化の値によって、および乳凝固によって示されるように、第３の継代培養まで成功した。次の継代培養は、乳凝固に失敗して高いファージ値が記録された。対照的に、３つの異なった変異菌株（ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２２）をローテーションして乳汁に接種することによりなされた一連の発酵は、第１０継代培養まで成功した。これらの実験条件下で、ファージは、繁殖に失敗して低レベルのままであった。この結果は、変異菌株のローテーションを用いると、発酵の間のファージ耐性が、単一の変異菌株を用いるのと比較して改善されることを示す。
【０５６９】
【表１１】
2010519929.tif 000033
【実施例１６】
【０５７０】
ＣＲＩＳＰＲが改変された変異菌株を用いた、ファージの個体数の低減および制御
この実施例では、ファージに対する耐性を与えられたＣＲＩＳＰＲ改変菌株が、該ファージを破壊する能力を決定するために行われた実験が記載される。ＣＲＩＳＰＲ改変菌株による発酵の間に、ファージの個体数が検知できないレベルまで低減されるかどうか決定するように、特に実験のデザインがなされた。
【０５７１】
いくつかの実験では、ファージＤ２９７２の存在下での乳発酵を、親菌株ＤＧＣＣ７７１０によってファージＤ２９７２の存在下でなされる発酵と比較して行うために、（実施例１１および図１７に記載された）ＤＧＣＣ９８３６が用いられた。１０パーセントの粉乳培地（ｗ／ｖ）に、１０６ｃｆｕ／ｍｌのテスト菌株の予備培養物、および１０７ｐｆｕ／ｍｌのファージＤ２９７２が撒かれた。培養物は、４２℃で２４ｈインキュベートされた。様々な時点で一定分量が採取され、ＤＧＣＣ７７１０が撒かれた重層寒天平板を用いて、当分野で知られる標準的な方法によりファージの個体数が測定された。図２０に結果が示される。ＤＧＣＣ７７１０による乳発酵ではファージＤ２９７２が生育して、１０８ｐｆｕ／ｍｌ以上の個体数に達した。それと対照的に、Ｄ２９７２ファージの個体数は、ＤＧＣＣ９８３６による発酵の間に次第に減少して６時間のインキュベーション後に極めて低レベル（１２０ｐｆｕ／ｍｌ）になり、２４時間のインキュベーション後にはほとんど検知できなかった。この最後の結果は、変異菌株ＤＧＣＣ９８３６による発酵プロセスの間にファージが破壊されたことを示唆する。
【０５７２】
ファージに感受性をもたないのみならず、ファージを破壊するこの変異菌株の特性は、菌株がファージに感受性をもたないが害もない従来のスターター培養物のローテーション・プログラムとの比較において、付加的な利点を表すものである。実際、変異株を用いることによって、（従来のスターター培養物を用いたローテーションにおけるような）ファージの洗い出し、およびファージの破壊の組み合わせを通じて、休眠状態のファージの絶滅が生じるであろう。
【０５７３】
他の実験では、Ｄ２９７２の存在下での乳発酵において、ファージＤ２９７２に対していくらかの、但し不完全な耐性を提示する変異菌株が組み合わされる。選択された変異菌株には、実施例８および表７−１に記載されたように、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１を含めた。これらの菌株は、ファージＤ２９７２に対してＥＯＰが約５桁の減少を示す。乳発酵は、上述のように行なわれた（１０６ｃｆｕ／ｍｌのバクテリア接種率；１０７ｃｆｕ／ｍｌのファージ接種率）。ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０、またはＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１、或いは２つの菌株の混合物のいずれかを用いて乳発酵が行われた。様々な時点で、ファージの個体数が記録された。そのために一定分量が採取されて、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０、またはＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１のいずれかを撒いた重層寒天平板を用いて、当分野で知られる標準的な方法によりファージの個体数が測定された。結果は図２１に示され、乳発酵の各々についてＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０、およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１上で検出されたファージ総数が示される。単一の菌株を発酵に用いたとき（ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０またはＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１）、接種時の検出ファージ数は、（ＥＯＰが５桁減少した結果）約１００ｐｆｕ／ｍｌであった。培養されると、４から５桁ファージが増殖し、これに対応して（上記のファージ数は（それぞれ）１０６または１０７に上昇した。２つの菌株が接種された乳発酵では、ファージの増殖率は非常に（２桁）低かった。実際、ファージ数は、１００ｐｆｕ／ｍｌから最大で約１０４ｐｆｕ／ｍｌまでの増加であった。これらの結果は、２つの変異菌株の共培養の間のファージの繁殖速度は、単一の変異菌株でできた培養物におけるファージの繁殖速度と比較して著しく減少することを決定的に示す。
【実施例１７】
【０５７４】
スペーサーの挿入
この実施例では、Ｓ．サーモフィルスＤＧＣ７７１０に２つのスペーサーを挿入するために用いる方法および組成物が記載される。（フランスの「コレクション・ナショナル・ド・カルチャー・ド・ミクロオーガニズム（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）」に、番号ＣＮＣＭ１−２４２３のもとに寄託された）Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０は、少なくとも３つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座：ＣＲＩＳＰＲ１、ＣＲＩＳＰＲ２およびＣＲＩＳＰＲ３を所有する。完全なゲノム配列が知られる菌株、ＣＮＲＺ１０６６およびＬＭＧ１８３１１（ボロティンら、［２００４］、上記を参照）では、ＣＲＩＳＰＲ１は、同じ染色体遺伝子座：ｓｔｒ０６６０（またはｓｔｕ０６６０）およびｓｔｒ０６６１（またはｓｔｕ０６６１）の間に位置する（図１８を参照）。菌株ＤＧＣＣ７７１０では、ＣＲＩＳＰＲ１は、同じ染色体遺伝子座におけるよく類似した遺伝子間に同様に位置する。菌株ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ１は、（末端リピートを入れて）３３リピート、従って３２スペーサーを含む（図１９を参照）。これらのスペーサーのすべては、互いと異なっている。これらのスペーサーの大部分は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内にあるとして、これまで記載されていなかったが、しかしＣＲＩＳＰＲ１トレーラーに近い４スペーサーは、既知のＣＲＩＳＰＲ１スペーサーと同一である。例えば、ＤＧＣＣ７７１０の第２８スペーサーは菌株ＣＮＲＺ１５７５（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＤＱ０７２９９１）の第３１ＣＲＩＳＰＲ１スペーサーと１００％同一である；ＤＧＣＣ７７１０の第３０スペーサーは菌株ＣＮＲＺ７０３（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＤＱ０７２９９０）の第２７ＣＲＩＳＰＲ１スペーサーと１００％同一である；ＤＧＣＣ７７１０の第３１スペーサーは菌株ＣＮＲＺ７０３（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＤＱ０７２９９０）の第２８ＣＲＩＳＰＲ１スペーサーと１００％同一である；ＤＧＣＣ７７１０の第３２スペーサーは菌株ＣＮＲＺ７０３（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＤＱ０７２９９０）の第３０ＣＲＩＳＰＲ１スペーサーと１００％同一である。菌株ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ１配列（５’〜３’）は、以下の配列番号：６７８に示される：
【０５７５】
【化９】
2010519929.tif 000034
【０５７６】
これらの実験に用いられるファージＤ８５８は、ウイルスのシホウイルス科に属するバクテリオファージである。そのゲノム配列は、完全に決定されているが、未公開と思われる。このファージは、Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０に対して毒性をもつ。天然のファージ耐性変異体としてＳ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７７８が、親菌株としてＤＧＣＣ７７１０、毒性ファージとしてファージＤ８５８を用いて単離された。菌株ＤＧＣＣ７７７８のＣＲＩＳＰＲ１は、（末端リピートを入れて）３５リピート、従って３４スペーサーを含む。ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ１配列と比較したとき、ＤＧＣＣ７７７８のＣＲＩＳＰＲ１配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方の末端（すなわち、リーダーの近く）に、２つの付加的な、近接した新しいスペーサー（およびもちろん、新しいスペーサーに隣接する２つの付加的なリピート）を所有する。ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座の他のすべてのスペーサーは変化しない。菌株ＤＧＣＣ７７７８のＣＲＩＳＰＲ１配列（５’〜３’）は、以下の配列番号：６７９に示される：
【０５７７】
【化１０】
2010519929.tif 000035
【０５７８】
ＤＧＣＣ７７７８の場合、第１のスペーサー（５’−ｃａａｃａｃａｔｔｃａａｃａｇａｔｔａａｔｇａａｇａａｔａｃ−３’；ＳＥＣ  ＩＤ  ＮＯ：６８０）、および第2のスペーサー（５’−ｔｃｃａｃｔｃａｃｇｔａｃａａａｔａｇｔｇａｇｔｇｔａｃｔｃ−３’；ＳＥＣ  ＩＤ  ＮＯ：６８１）は、この標識化された菌株を同定する菌株に特異的なタグを構成する。両方の新しいスペーサーの配列がＤ８５８ファージゲノム内に存在することが決定された。第２の新しいスペーサーの配列は、Ｄ８５８のゲノムの位置２５４７１および２５４４２ｂｐの間（すなわち、マイナス鎖上）に、１つのミスマッチとともに見出される（３０ヌクレオチドにわたって９６．７％のヌクレオチドが同一）：
【０５７９】
【化１１】
2010519929.tif 000036
【０５８０】
第１のスペーサーの配列は、Ｄ８５８のゲノムの位置３１４８１および３１４１０ｂｐの間（すなわち、プラス鎖上）に見出される（３０ヌクレオチドにわたって１００％のヌクレオチドが同一）：
【０５８１】
【化１２】
2010519929.tif 000037
【０５８２】
本発明は、いかなる特定のメカニズムないし理論にも限定される意図をもたないが、ＤＧＣＣ７７７８のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に存在する２つの新しいスペーサーは、ファージＤ８５８に対する新しい耐性を菌株ＤＧＣＣ７７７８に授けるために必要であると考えられる。（ＤＧＣＣ７７７８で見出されたような）スペーサー「２」が、ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座（３３リピートおよび３２スペーサー）に、すなわちこのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方の末端に１つのリピートとともに最初に挿入された。この挿入によって、付加的な新しいスペーサーでタグ付けされた（従って３４リピートおよび３３スペーサーを担う）バクテリオファージ非感受性変異体（中間的な菌株）が生み出された。このスペーサーは、Ｄ８５８のゲノムに由来するが、しかし挿入プロセスの間に複製エラーまたは逆転写エラーがあった模様で点変異が生じていた。新しく獲得されたスペーサーと標的ファージの配列とのこの不完全なマッチング（すなわち、１つのミスマッチ）に起因して、この中間的な菌株は、ファージＤ８５８に対する耐性の効率が低かった。（ファージＤ８５８に対して、親菌株ＤＧＣＣ７７１０より耐性があるが、しかしミスマッチ故に耐性が「十分」ではない）この中間的な菌株に第２のスペーサー挿入事象が生じ、その結果として第２の新しいスペーサー（すなわち、ＤＧＣＣ７７７８に見出されるようなスペーサー「１」）がＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座の同じ末端に１つのリピートとともに挿入された。この第２の挿入により、新しいバクテリオファージ非感受性変異体が生み出されて単離され、ＤＧＣＣ７７７８と名付けられた。ＤＧＣＣ７７７８は、標的ファージの配列に対して１００％同一のスペーサー「１」が存在するために、Ｄ８５８に対して中間的な菌株に比べて耐性があり、もちろん親菌株ＤＧＣＣ７７１０よりいっそう耐性があった。
【実施例１８】
【０５８３】
ＤＧＣＣ７７１０にタグ付けする方法、および標識化された菌株ＤＧＣＣ７７７８の選択
この実施例では、ＤＧＣＣ７７１０のタグ付けに用いる方法、および標識化された菌株ＤＧＣＣ７７７８の選択について記載される。約２．１０６ｃｆｕ／ｍｌの菌株ＤＧＣＣ７７１０、および約１．１０５ｐｆｕ／ｍｌのＤ８５８を低温殺菌乳に接種することによって、菌株ＤＧＣＣ７７１０がファージＤ８５８に感染／チャレンジされた。接種乳は、３５℃で１２時間培養された。インキュベーション後に、生菌（すなわち、バクテリオファージ非感受性突然変異体と思われるもの）が、感染培養物を然るべく希釈したものを用いて３５℃の非選択培地（ミルク寒天平板）上で単離された。ＤＧＣＣ７７７８と名付けた１つの分離株が３５℃のＭ１７−グルコース液体培地で増殖されて、当分野で知られる典型的なＤＮＡ抽出プロトコルを用いてそのＤＮＡが抽出された。
【０５８４】
ＤＮＡの抽出物は、当分野で知られるように（例えば、Ｂｏｌｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．［２００５］、前記を参照）、１つのフォワードプライマー（ｙｃ７０および／またはＳＰＩＤＲ−ｕｐｓ［５’−ｇＴＣＴＴＴＡｇＡＡＡＣＴｇＴｇＡＣＡＣＣ］；配列番号：６７４）のいずれか）、並びに１つのリバースプライマー（ｙｃ３１および／またはＳＰＩＤＲ−ｄｗｓ［５’−ＴＡＡＡＣＡｇＡｇＣＣＴＣＣＣＴＡＴＣＣ］；配列番号：６７５）のいずれか）の組み合わせを用いてＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ産物の配列が決定されて、ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のものと比較された。
【実施例１９】
【０５８５】
第２のタグ付け菌株の生成
この実施例では、第２のタグ付け菌株をつくるために用いる方法が記載される。天然のファージ耐性変異体としてＳ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ１が、親菌株としてＤＧＣＣ７７１０、毒性ファージとしてＤ８５８を用いて単離された。
【０５８６】
菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ１のＣＲＩＳＰＲ１は、（末端リピートを入れて）３４リピート、従って３３スペーサーを含む。Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ１配列と比較したとき、Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ１のＣＲＩＳＰＲ１配列は、１つの付加的な新しいスペーサー（すなわちタグ付け配列）（およびもちろん、新しいスペーサーに隣接する１つの付加的なリピート）を、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方の末端（すなわち、リーダーの近く、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端）に所有する。ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座の他のスペーサーのすべては、変化していない。菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ１のＣＲＩＳＰＲ１配列（５’〜３’）は、以下の通りである：
【０５８７】
【化１３】
2010519929.tif 000038
【０５８８】
リーダー配列は、５’ｃａａｇｇａｃａｇｔｔａｔｔｇａｔｔｔｔａｔａａｔｃａｃｔａｔｇｔｇｇｇｔａｔａａａａａｃｇｔｃａａａａｔｔｔｃａｔｔｔｇａｇ  ３’（配列番号：６８８）である。組込まれた配列（ＧＴＴＴＴＴＧＴＡＣＴＣＴＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＧＴＡＡ ＣＴＧＴＡＣＡＡＣｔｃａａｃａａｔｔｇｃａａｃａｔｃｔｔａｔａａｃｃｃａｃｔｔ；（配列番号：６８９）は、灰白で示され、ＣＲＩＳＰＲリピート（大文字）および小文字で示されたＣＲＩＳＰＲスペーサー（すなわち、タグ付け配列）を含む。末端リピート（５’ｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａａｇｔａａｃｔｇｔａｃａｇｔ３’（配列番号：３）、トレーラー配列：５’ｔｔｇａｔｔｃａａｃａｔａａａａａｇｃｃａｇｔｔｃａａｔｔｇａａｃｔｔｇｇｃｔｔｔ３’（配列番号：６９１）が示される。
【０５８９】
従って、Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ１の場合、スペーサー（５’−ｔｃａａｃａａｔｔｇｃａａｃａｔｃｔｔａｔａａｃｃｃａｃｔｔ−３’；配列番号：５３４）は、この変異菌株（すなわち、標識化されたバクテリア）を同定する菌株に特異的なタグ付け配列を構成する。新しいスペーサーの配列（すなわち、タグ付け配列）は、Ｄ８５８ファージゲノム内に存在する。スペーサーの配列は、Ｄ８５８のゲノムの位置３１９２１および３１９５０ｂｐ間（すなわち、プラス鎖上）に見出される（３０ヌクレオチドにわたってＤ８５８のゲノム配列に対して１００％の同一性をもつ）：
【０５９０】
【化１４】
2010519929.tif 000039
【０５９１】
ストレプトコッカス・サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ１のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に組込まれた新しいスペーサー（すなわち、タグ付け配列）は、ファージＤ８５８に対する新しい耐性をこの菌株に授ける。
【実施例２０】
【０５９２】
第３のタグ付け菌株の生成
この例では、第３のタグ付け菌株をつくるために用いる方法が記載される。天然のファージ耐性変異体としてＳ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ２が、親菌株としてＳ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０、毒性ファージとしてＤ８５８を用いて単離された。Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ２のＣＲＩＳＰＲ１は、（末端リピートを入れて）３４リピート、従って３３スペーサーを含む。Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ１配列と比較したとき、Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ２のＣＲＩＳＰＲ１配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一方の末端（すなわち、リーダーの近く、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端）に、１つの付加的なスペーサー（すなわち、タグ付け配列）（およびもちろん、新しいスペーサーに隣接する１つの付加的なリピート）を所有する。ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座の他のすべてのスペーサーは、変化していない。
【０５９３】
菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ２のＣＲＩＳＰＲ１配列（５’〜３’）は、以下の通りである：
【０５９４】
【化１５】
2010519929.tif 000040
【０５９５】
リーダー配列は、５’ｃａａｇｇａｃａｇｔｔａｔｔｇａｔｔｔｔａｔａａｔｃａｃｔａｔｇｔｇｇｇｔａｔａａａａａｃｇｔｃａａａａｔｔｔｃａｔｔｔｇａｇ３’：配列番号：６８８）である。
【０５９６】
組込まれた配列配列
（ＧＴＴＴＴＴＧＴＡＣＴＣＴＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＧＴＡＡＣＴＧＴＡＣＡＡＣｔｔａｃｇｔｔｔｇａａａａｇａａｔａｔｃａａａｔｃａａｔｇａ；配列番号：６９４）は、灰白で示され、ＣＲＩＳＰＲリピート（大文字）、および小文字で示されたＣＲＩＳＰＲスペーサー（すなわち、タグ付け配列）を含む。末端リピート（５’ｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａａｇｔａａｃｔｇｔａｃａｇｔ（配列番号：３）、トレーラー配列：５’ｔｔｇａｔｔｃａａｃａｔａａａａａｇｃｃａｇｔｔｃａａｔｔｇａａｃｔｔｇｇｃｔｔｔ３’（配列番号：６９１）が示される。
【０５９７】
かくして、ストレプトコッカス・サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ２の場合、スペーサー（５’−ｔｔａｃｇｔｔｔｇａａａａｇａａｔａｔｃａａａｔｃａａｔｇａ−３’；配列番号：６９７）は、この変異体菌株（すなわち、標識化されたバクテリア）を同定する菌株に特異的なタグを構成する。新しいスペーサーの配列は、Ｄ８５８ファージゲノム内に存在することが示された。スペーサーの配列は、Ｄ８５８のゲノムの位置１７２１５および１７２４４ｂｐの間（すなわち、プラス鎖上）に見出される（および３０ヌクレオチドにわたってＤ８５８のゲノム配列に対して１００％の同一性をもつ）：
【０５９８】
【化１６】
2010519929.tif 000041
【０５９９】
Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ２のＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座に組込まれた新しいスペーサーは、ファージＤ８５８に対する新しい耐性をＳ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０−ＲＨ２に授ける。
【実施例２１】
【０６００】
ファージ耐性バクテリア変異株からの「ＣＲＩＳＰＲエスケープ」ファージの構築
この実施例では、ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージ構築のための方法が記載される。ファージ耐性宿主変異株が、上述の実施例に記載されるように最初に構築される。これらの実験では、親菌株「Ａ」がファージ「Ｐ」に暴露されて、ファージ耐性変異株（変異株「Ａ１．０」）が選択される。変異株Ａ１．０は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に挿入された付加的なスペーサーの存在を確認するために、（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ塩基配列決定法によって）解析される。付加的なスペーサー（スペーサーＳｐ１．０）のヌクレオチド配列が次に決定される。典型的に、スペーサーＳｐ１．０は、ファージＰ由来のおよそ３０ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、ファージＰおよび関連ファージに対する耐性を与える（「関連ファージ」は、ゲノムに該スペーサーの配列を含むもので、ファージ科を規定する）。
【０６０１】
第１のファージ暴露とは独立に、同じ親菌株Ａが同じファージＰに暴露されて、第２のファージ耐性変異株（変異株Ａ２．０）が選択される。変異株Ａ２．０は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に挿入された付加的なスペーサー（スペーサーＳｐ２．０）を同様にもつが、しかしスペーサーＳｐ２．０の配列がスペーサーＳｐ１．０の配列とは異なるように選択される。典型的に、スペーサーＳｐ２．０は、ファージＰ由来のおよそ３０ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、ファージＰおよび関連ファージに対する耐性を与える。同様に、いくつかの実施形態において、変異株Ａ３．０から変異株Ａｘ．０が同じ菌株Ａの同じファージＰへの暴露を通じて生成される。すべての「Ａ」変異株は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に挿入された付加的なスペーサー（スペーサーＳｐ３．０からＳｐｘ．０）を同様にもつが、しかしすべての「Ｓｐ」スペーサーの配列は、他の各々と異なるように選択される。典型的に、「Ｓｐ」スペーサーは、ファージＰ由来のおよそ３０ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、すべてがファージＰおよび関連ファージに対する耐性を与える。
【０６０２】
典型的に、耐性のレベルは、およそファージゲノム内のスペーサーに対応する配列に生じる単一の変異のレベルであろうと推定できる（すなわち、概ね１０−４から１０−６）。かくして、ＣＲＩＳＰＲ介在耐性をエスケープするファージを単離することは容易である。変異ファージは、変異株Ａ１．０をファージＰに暴露することに通じて生み出される。典型的に、変異「ＣＲＩＳＰＲエスケープ」ファージ（Ｐ１．０）は、そのゲノムのスペーサーＳｐ１．０の配列（例えば、欠失（単数または複数）、点変異（単数または複数）など）に相当するところ、またはいくつかの好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲモチーフに相当するＳｐ１．０に隣接する領域プラスマイナス２０ｂｐに、少なくとも１つの変異をもつ。変異株Ａ１．０は、ファージＰ１．０に対して感受性をもつことになる。同様に、ユニークなスペーサー（それぞれＳｐ２．０、Ｓｐ３．０からＳｐｘ．０）をもち、独立して生み出されるファージＰ耐性をもつ変異株（変異株Ａ２．０、Ａ３．０からＡｘ．０）が、対応する変異体ファージ（それぞれＰ２．０、Ｐ３．０からＰｘ．０）を生み出すために、ファージＰにより同様にチャレンジされる。続いて、そのゲノムがＣＲＩＳＰＲスペーサーになると予測された配列に対して特異的に変異した、変異体毒性ファージのプールを生成することができる。
【０６０３】
実際、ファージＤ２７９２は、Ｓ．サーモフィルス菌株ＤＧＣＣ７７１０（ＷＴ）に対して十分に毒性をもつ生物的防除ファージを代表する。それと対照的に、関連する菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ４、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２０、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２１、およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ２２のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の解析は、ファージＤ２９７２で見出された配列と同様のスペーサー配列の存在を示し、ファージＤ２９７２が、これらの菌株に対して低減された毒性をもつことを示唆する。これらの菌株に対してファージＤ２９７２が低減された毒性をもつことは、プラーク形成データ（表７−１を参照）から確認される。菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６については、対応するＣＲＩＳＰＲスペーサーの存在故にファージＤ２９７２に対して耐性をもつことが解析されたが、毒性の十分な増加に関するＤ２９７２関連ファージのスクリーニングから、生物的防除剤の候補剤としてファージＤ４７２４およびＤ４７３３が同定される（表７−１を参照）。
【０６０４】
付加的な実験では、菌株ＤＧＣＣ７７１０がファージＤ２９７２に暴露されて、耐性変異株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６が生み出された。菌株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６がファージＤ２９７２に暴露されたとき、Ｄ４７２４のような変異体ファージを単離することが可能であった。このＤ４７２４ファージは、ＤＧＣＣ７７１０およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６に対する十分に毒性をもつことが見出された。2回目の繰り返しでは、ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６がファージＤ４７２４に暴露されて、耐性変異株ＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６ｐｈｉ４７２４＋Ｓ１５が生み出された。この菌株がＤ４７２４に暴露された時点で、ＤＧＣＣ７７１０およびＷＴｐｈｉ２９７２＋Ｓ６に対して十分に毒性をもつＤ４７３３のような変異体ファージが同定された。いくつかの実施形態において、所望の毒性レベルをもつファージを生み出すために一連の繰り返しが用いられる。
【０６０５】
付加的なファージ変異体の例が図１３に示される。この図では、親ファージＤ８５８に由来する変異体ファージ８５８−Ａおよび８５８−Ｂが示されている。この変異は、ファージＤ８５８でチャレンジしたＷＴΦ８５８＋Ｓ１Ｓ２からのスペーサーＳ１に対応する。
【０６０６】
またさらなる実施例では、ＣＲＩＳＰＲモチーフに変異が同定された十分に毒性をもつファージ変異体が表２０−１に示される。この表には野生型、およびＳ．サーモフィルス菌株が新たに獲得したスペーサーに対応する変異体ファージにおけるヌクレオチド配列が示される。ＡＧＡＡＷモチーフは、灰色で強調される。各々の変異は、太字で下線が引かれている。*は欠失を示す。この表は、ファージ耐性ＣＲＩＳＰＲ変異株、および毒性ファージ変異体のペアに対する配列を示す：ＤＧＣＣ７７１０Φ８５８＋Ｓ３／ファージ２９７２．Ｓ３Ｃ、ＤＧＣＣ７７１０Φ２９７２＋Ｓ４／ファージ２９７２．Ｓ４Ａまたはファージ２９７２．Ｓ４Ｃ、ＤＧＣＣ７７１０Φ２９７２＋Ｓ６／ファージ２９７２．Ｓ６Ａ、およびＤＧＣＣ７７１０Φ２９７２＋Ｓ４Φ８５８＋Ｓ３２／ファージ８５８．Ｓ３２Ａまたはファージ８５８．Ｓ３２Ｄ。この表では、新しいスペーサーは、配列番号：５３５（ＤＧＣＣ７７１０Φ８５８＋Ｓ３）に対応する。
【０６０７】
【表１２】
2010519929.tif 000042
2010519929.tif 000043
【実施例２２】
【０６０８】
第２レベルの「ＣＲＩＳＰＲエスケープ」ファージ
この実施例では、第２レベルの（すなわち、複数のスペーサーに向けた複数の変異をもつ）ＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージを構築するための実験が記載される。
【０６０９】
ＣＲＩＳＰＲ介在ファージ耐性変異株をつくり出す反復プロセス、それに続くｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲメカニズムを克服することが可能な変異（「ＣＲＩＳＰＲエスケープ」）ファージの単離を通じて、潜在的なＣＲＩＳＰＲ介在耐性に対抗する、複数の変異に「前適応」したファージをつくり出すことが可能である。
【０６１０】
いくつかの実施形態において、第２レベルの変異株は、変異株Ａ１．０のファージＰへの暴露を通じて変異ファージを単離することによってつくられる。典型的に、この変異ファージ（ファージＰ１．０）は、そのゲノム中のスペーサーＳｐ１．０の配列を含む領域、または、ＣＲＩＳＰＲモチーフに対応するＳｐ１．０に隣接する領域プラスマイナス２０ｂｐのうちに変異（欠失、点変異など）をもつ。変異株Ａ１．０は、ファージＰ１．０に対して感受性をもつ。次に、変異株Ａ１．０がファージＰ１．０に暴露されて、ファージ耐性変異株（変異株Ａ１．１）が選択される（図１５を参照）。変異株Ａ１．１は、同様にＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に挿入された付加的なスペーサー（スペーサーＳｐ１．１）をもつが、しかし、スペーサーＳｐ１．１の配列は、スペーサーＳｐ１．０、スペーサーＳｐ２．０からスペーサーＳｐｘ．０のものとは異なるように選択される。典型的に、スペーサーＳｐ１．１は、ファージＰ１．０由来のおよそ３０ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、ファージＰ１．０および関連ファージに対する耐性を与えることになる。変異株Ａ１．１は、ファージＰ１．０に対する耐性をもち、好ましくは、スペーサーＳｐ１．０およびスペーサーＳｐ１．１が蓄積されたためにファージＰに対して向上した耐性をもつ。
【０６１１】
付加的な実施形態において、変異株Ａ１．１のファージＰ１．０への暴露を通じて、新たに変異ファージ（ファージＰ１．１）が生み出される。次に、変異株Ａ１．１がファージＰ１．１に暴露されると、１つの新しい付加的なスペーサー（Ｓｐ１．２）を含む新しい変異株１．２が得られる。このスペーサーは、ファージＰ１．１に対する耐性を与え、好ましくは（すなわち、スペーサーＳｐ１．０、スペーサーＳｐ１．１、スペーサーＳｐ１．２が蓄積されたために）ファージＰ１．０およびＰに対する耐性が向上する。ファージＰ１．１は、変異株Ａ１．０およびＡ１．１のみならず、親菌株Ａに対しても十分に感染性をもつ。
【０６１２】
さらに付加的な実施形態において、ファージに対する耐性が非常に高い変異株（変異株Ａ１．ｎ）を得るために、異なったスペーサー（例えば、２、３または４）が、菌株Ａから変異株Ａ１、次に変異株Ａ１．１、次に変異株Ａ１．２などに繰り返して蓄積される。なおさらなる実施形態において、ファージに対する耐性が非常に高い菌株Ａのまた別の変異株（変異株Ａ２．ｎ）を並行して生み出すために、異なった付加的なスペーサーが、同じ菌株から変異株Ａ２、次に変異株Ａ２．１、次に変異株Ａ２．２などに蓄積されることができる。同じ戦略は、変異株Ａ３．0からＡｘ．０についても役立つ。
【０６１３】
ＣＲＩＳＰＲファージ耐性変異株の生成、および変異体「ＣＲＩＳＰＲエスケープ」ファージの単離の繰り返しプロセスに続いて、（例えば、変異株１．１のファージＰ１．１への暴露が、新しい変異株Ａ１．２を生み出し、該変異株Ａ１．２は、１つの新しい付加的なスペーサー（Ｓｐ１．２）を含み、そこから変異株Ａ１．２、Ａ１．１、Ａ１．０および親菌株Ａに対して十分に毒性をもつ変異ファージ（Ｐ１．２）が単離される。
【０６１４】
いくつかの実施形態において、コンビナトリアル変異は、異なったスペーサー（例えば、Ｓｐ２．０、Ｓｐ３．０からＳｐｘ．０）を組み合わせたバクテリア変異株の繰り返し構築、対応する第１レベルの変異体ファージ（Ｐ２．０、Ｐ３．０からＰｘ．０）への暴露、および第２レベルの変異体ファージの単離によって蓄積される。
【０６１５】
ＣＲＩＳＰＲファージ耐性変異株、および変異体「ＣＲＩＳＰＲエスケープ」ファージをつくり出す反復コンビナトリアル変異の例が、表２２−１に示される。この表は、ＣＲＩＳＰＲ１で見出された新しいスペーサー、およびファージ２９７２、８５８、またはＤＴ１における対応する領域のリストを示す。この表で、「ａ」は、ファージ８５８および２９７２の間で１００％同一のＤＮＡ領域を示す。「５’位置」は、ファージゲノムにおける原スペーサーの５’位置を指す。原スペーサー配列における下線および影付きのヌクレオチドは、ファージとスペーサーとのミスマッチを示す。アスタリスク（＊）は、欠失を示す。「３’隣接領域」は、ファージゲノムにおける３’隣接配列を示す。ＡＧＡＡＷモチーフにおけるミスマッチは、下線および灰色の影が付されている。「鎖／モジュール」と指定された列で、転写モジュールは、「Ｅ」（初期発現遺伝子）；「Ｍ」（中期発現遺伝子）；および「Ｌ」（後期発現遺伝子）である。
【０６１６】
【表１３】
2010519929.tif 000044
2010519929.tif 000045
【０６１７】
ＤＧＣＣ７７１０がファージ２９７２に暴露されて、ＣＲＩＳＰＲファージ耐性変異株ＤＧＣＣ７７１０Φ２９７２＋Ｓ６がつくり出されて、それからＣＲＩＳＰＲエスケープ変異体ファージ２９７２．Ｓ６Ｂが生み出された。ＤＧＣＣ７７１０Φ２９７２＋Ｓ６のファージ２９７２．Ｓ６Ｂへの暴露は、ＣＲＩＳＰＲファージ耐性変異株ＤＧＣＣ７７１０Φ２９７２＋Ｓ６Φ２９７２．Ｓ６Ｂ＋Ｓ２０をつくり出し、それからＣＲＩＳＰＲエスケープ変異体ファージ２９７２．Ｓ２０Ａが単離された。
【０６１８】
いくつかの実施形態において、１つより多いファージ科に対して耐性をもつ菌株が提供される。所与の菌株は、１つより多いファージ科に対して感受性をもち得るので、いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に他のファージ科に起源がある付加的なスペーサー（単数または複数）を導入することによって、複数のファージ科に対して菌株の耐性を拡大することが望ましい（図１６を参照）。例えば、ファージＰ、Ｑ、Ｒは、菌株Ａに感染することができる３つのファージ科を代表するファージである。先におよびここに概説される方法を用いて、３つすべてのファージ科に対する耐性をもつ変異株がつくられる。いくつかの実施形態において、ファージＰに対する耐性をもつ（スペーサーＳｐ１を含んだ）変異株Ａ１Ｐを生み出すためにファージＰが用いられる。次に、変異株Ａ１ＰがファージＱに暴露されて、ファージ耐性変異株（変異株Ａ１ｐｑ）が選択される。変異株Ａ１ｐｑは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に挿入された１つの付加的なスペーサー（Ｓｑ１）を有する。典型的に、スペーサーＳｑ１は、ファージＱ由来のおよそ３０ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、ファージＱおよび関連ファージに対する耐性を与える。変異株Ａ１ｐｑは、ＰとＱ両方のファージに対する耐性をもつ。次に、変異株Ａ１ｐｑがファージＲに暴露されて、ファージ耐性変異株（変異株Ａ１ｐｑｒ）が選択される。変異株Ａ１ｐｑｒは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に挿入された第３の付加的なスペーサー（Ｓｒ１）をもつ。典型的に、Ｓｒ１は、ファージＲ由来のおよそ３０ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、ファージＲおよび関連ファージに対する耐性も与える。変異株Ａ１ｐｑｒは、３つすべてのファージに対する耐性をもつ。いくつかの特に好ましい実施形態において、該変異株は、関連ファージに対しても耐性をもつ。
【０６１９】
これらのＣＲＩＳＰＲエスケープ・ファージは、生物的防除／治療用ファージとして役立つ。上述のように、ＣＲＩＳＰＲ介在ファージ耐性変異株をつくり出すプロセス、ファージへの暴露、および毒性「ＣＲＩＳＰＲエスケープ」ファージの単離を通じて、潜在的なＣＲＩＳＰＲスペーサー標的である単一および／または複数のファージゲノム配列を標的とする単一および／または複数の変異をもつファージ種の混合物が生み出される。標的宿主バクテリアは、単一または複数のスペーサーの組込みを通じてファージに対する耐性をもつことができ、しかもｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲメカニズムが、ファージゲノムにおけるかかるスペーサーに対応した変異を通じて克服され得ることから、様々な変異をもつファージの混合物を用いることで、個々のバクテリアが新しいスペーサーを首尾よく獲得して繁殖する速度が低減される。
【０６２０】
付加的な実施形態において、対応するＣＲＩＳＰＲファージ耐性変異株におけるスペーサーから決定される原スペーサーおよび隣接する領域の解析は、特異的なＣＲＩＳＰＲに対するＣＲＩＳＰＲモチーフを同定することを容易にする。ＤＧＣＣ７７１０の例では、ファージ２９７２または８５８によるチャレンジ後に、スペーサーＳ１〜Ｓ３３を含むＣＲＩＳＰＲ１ファージ耐性変異株が生み出された。スペーサーＳ１〜Ｓ３３に対応する、ファージ２９７２または８５８のゲノム由来の原スペーサーおよび隣接する領域をソフトウェアプログラムＣｌｕｓｔａｌ  Ｘを用いてアラインメントすることにより、ＣＲＩＳＰＲ１モチーフがＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号：６９６）として同定されてＷｅｂＬｏｇｏを用いて視覚化された（図２２）。
【０６２１】
さらなる例において、ＣＲＩＳＰＲ３ファージ耐性変異株が、ファージ８５８および３８２１によるチャレンジ後にＤＧＣＣ７７１０から、並びにファージ４２４１によるチャレンジ後にＬＭＤ−９から得られた。それぞれのファージゲノム由来の原スペーサーおよび隣接する領域と、それぞれのＣＲＩＳＰＲ３ファージ耐性変異株の対応するスペーサーとのアラインメントから、ＣＲＩＳＰＲ３モチーフがＮＧＧＮＧとして同定された（配列番号：７２３）（図２３）。
【０６２２】
特異的なＣＲＩＳＰＲモチーフの存在に関する解析は、ゲノムまたは他の特定された配列（例えば、プラスミドまたは別の可動遺伝因子）における推定原スペーサーの位置を同定する手段を提供する。配列決定されたファージ８５８、２９７２、およびＤＴ１の例では、ＡＧＡＡＷ  ＣＲＩＳＰＲ１モチーフの分布に関する解析が、それぞれのゲノムで可能性のある原スペーサーの位置を同定した。当分野で知られるように、ファージΦＸ１７４について記載されたゲノムを化学的に合成するプロセスで、各々のＡＧＡＡＷモチーフが遺伝コードの縮重および／または保存的アミノ酸置換を利用して削除された。かくして、該ファージは、Ｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲ１耐性システムに対して非感受性になった。それ故に、特異的なＣＲＩＳＰＲモチーフを欠いたＤＮＡ分子は、対応するＣａｓ−ＣＲＩＳＰＲシステムに対して非感受性である。
【０６２３】
これらのファージ、および複数のファージタイプの「カクテル」は、ローテーション戦略に役立つ（例えば、規定順序によるファージ管理）。複数の異なったスペーサー変異をもつファージからなる単一カクテルの使用を拡張して、いくつかの実施形態では、1つの異なったスペーサー変異を各々がもつ複数の毒性ファージが規定順序方式に用いられる。例えば、標的バクテリアが、ファージに対するＣＲＩＳＰＲ介在耐性を発達させる確率を最小限にとどめるために、「ＣＲＩＳＰＲエスケープ」ファージの一組（Ｐ１．０、Ｐ２．０、およびＰ３．０、或いはＰ１．０、Ｐ１．１、Ｐ１．２、またはそれらのいくつかの組み合わせ）を用いて、各々のファージが、個別に、かつ規定順序およびローテーション（Ｐ．１０＞Ｐ２．０＞Ｐ３．０＞Ｐ１．０、Ｐ２．０＞など）で提供される。同様に、ファージカクテルの一組（すなわち、各カクテルのみならず、カクテル内の各ファージが変異のユニークな組み合わせを所有する）は、順序付けおよびローテーションに役立つ。いくつかの実施形態において、ファージおよび／またはカクテルは単一のファージ科から成り、一方で他の実施形態において、ファージおよび／またはカクテルは複数のファージ科から成る。
【実施例２３】
【０６２４】
機能的な組み合わせ
この実施例は、本発明に役立つ様々な機能的な組み合わせを提供する。単に例を示すものとして、本発明に従って、次の機能的な組み合わせを用いることができる。
【０６２５】
機能的な組み合わせ＃１：
ｃａｓ配列：配列番号：４６１から配列番号：４６５まで、および配列番号：４７３から配列番号：４７７まで（これらすべてはＳ．サーモフィルス配列である）が以下に示される。
【０６２６】
【化１７】
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リピート配列；配列番号：１から配列番号：１０までを伴う。
【０６２７】
機能的な組み合わせ＃２：
ｃａｓ配列：配列番号：４６６から配列番号：４７２まで、および配列番号：４７８から配列番号：４８７まで（これらすべてはＳ．サーモフィルスの配列である）が以下に示される。
【０６２８】
【化１８】
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リピート配列；配列番号：１１および／または配列番号：１２までを伴う。
【０６２９】
機能的な組み合わせ＃３：
ｃａｓ配列：配列番号：４８８から配列番号：５０８まで、および配列番号：５１７から配列番号：５２１までが、以下に示される。配列番号：４８８〜４９７はＳ．アガラクチアから、一方で配列番号：４９８〜５０３はＳ．ミュータンスから、および配列番号：５０４〜５０８、５１７〜５２１はＳ．ピオゲネスからである。
【０６３０】
【化１９】
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リピート配列；配列番号：１３から配列番号：１９までを伴う。
【０６３１】
機能的な組み合わせ＃４：
ｃａｓ配列：配列番号：５０９から配列番号：５１６まで（これらすべてはＳ．ピオゲネスからである）が、以下に示される。
【０６３２】
【化２０】
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リピート配列；配列番号：２０および配列番号：２２を伴う。
【０６３３】
本明細書に挙げられるすべての特許および出版物は、本発明が属する分野における当業者のレベルを示唆する。すべての特許および出版物は、各個別の出版物が参照により組込まれることが具体的かつ個別に示されたのと同じレベルで参照により本明細書に組込まれる。
【０６３４】
当業者であれば、本発明が、目的の実行、記載された結果および利益の達成、並びに本発明に本来備わった結果および利益の達成によく適合することが容易にわかる。本明細書に記載される組成物および方法は、好ましい実施形態を代表するもので、例示であり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。本発明の範囲および精神を逸脱することなく、本明細書に開示される本発明に様々な置換えおよび変更がなされ得ることは、当業者であれば容易にわかることである。
【０６３５】
本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されない任意の要素要素または複数の要素、限定または複数の限定がない場合でも適切に実施することができる。採用された用語および表現は、限定ではなく記載のための用語として用いられており、かかる用語および表現が用いられるとき、明示かつ記載される特徴またはその部分の任意の等価物を除外しようとするものではなく、発明の範囲内で様々な変更が可能なことが認識される。かくして、当然のことながら本発明は、好ましい実施形態および随意的な特徴によって具体的に開示されたとはいえ、本明細書に開示された概念の修正および変更が当業者によってなされてもよく、かかる修正および変更は、本発明の範囲内と考えられる。
【０６３６】
本発明は、本明細書において広く包括的に記載されている。包括的な開示に含まれる、より狭い種および下位グループの各々も本発明の部分を成す。これは、任意の対象を属から除いたただし書きまたは否定的な限定を伴う本発明の包括的な記載を含む。これは、除かれたものが、本明細書に具体的に列挙されたか否かに関わらない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2010519929.tif 000106
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年11月2日(2009.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４８６】
【化７】
2010519929.tif 000112
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６１６】
【表１３】
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【国際調査報告】
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