(57)【要約】  本発明は、キナーゼ、キナーゼ結合ポリペプチドのモジュレーター又は／及びインフルエンザウィルス感染のためのインヒビターを含有する、インフルエンザの予防又は／及び治療のための医薬組成物に関する。
2010505897.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キナーゼの少なくとも１種のモジュレーター又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの少なくとも１種のモジュレーターを、場合により、医薬的に許容可能な担体、助剤、希釈剤又は／及び添加剤と一緒に含む、インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のための医薬組成物。
【請求項２】
インフルエンザウィルス感染が、インフルエンザＡウィルス感染、より有利には、プエルトリコ／８／３４株又はトリインフルエンザウィルス単離体、例えばＨ５Ｎ１での感染である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
少なくとも１種のモジュレーターが、核酸、核酸アナログ、例えばリボザイム、ペプチド、ポリペプチド、及び抗体からなる群から選択される、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
少なくとも１種のキナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドが、表１Ａ及び表１Ｂから選択された核酸又は／及び遺伝子によりコードされている、請求項１から３までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項５】
少なくとも１種のモジュレーターがアクチベーターである、請求項１から４までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項６】
少なくとも１種のアクチベーターが、
（ａ）表１Ａから選択されたヌクレオチド配列又はその断片、又は／及び
（ｂ）少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％（ａ）の配列に同一である断片を含有し、
又は／及び少なくとも１種のアクチベーターが、配列（ａ）又は／及び（ｂ）を含む遺伝子の発現又は／及び遺伝子産物の活性を活性化することができる、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも１種のモジュレーターがインヒビターである、請求項１から４までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項８】
少なくとも１種のインヒビターが、
（ａ）表１Ｂから選択されたヌクレオチド配列又は／及びその断片、又は
（ｂ）少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％（ａ）の配列に同一である配列を含有し、
又は／及び少なくとも１種のインヒビターが、配列（ａ）又は／及び（ｂ）を含む遺伝子の発現又は／及び遺伝子産物の活性を阻害することができる、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
核酸が、表２の配列から選択されたヌクレオチド配列及びその断片を含む、請求項３から８までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
インフルエンザウィルス複製の少なくとも１種のインヒビターを、場合により、医薬的に許容可能な担体、助剤、希釈剤又は／及び添加剤と一緒に含有する、インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のための医薬組成物。
【請求項１１】
少なくとも１のインヒビターが、
（ａ）表１Ｂ及び４から選択されたヌクレオチド配列又は／及びその断片、又は
（ｂ）少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％（ａ）の配列に同一な配列を含有し、
又は／及び、少なくとも１種のインヒビターが、配列（ａ）又は／及び（ｂ）を含む遺伝子の発現又は／及び遺伝子産物の活性を阻害することができる、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
核酸が、表４の配列から選択されたヌクレオチド配列及びその断片を含む、請求項１０又は１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
核酸がＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項３から１２までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１４】
核酸が、
（ｉ）ＲＮＡ干渉可能なＲＮＡ分子、
（ｉｉ）ＲＮＡ分子（ｉ）の前駆体、又は／及び
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子（ｉ）又は／及び前駆体（ｉｉ）をコードするＤＮＡ分子
である、請求項７から１３までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＲＮＡ分子が、一末端のみに又は両末端に、一重鎖のオーバーハングを有するか又は有しない二重鎖ＲＮＡ分子、有利には二重鎖ｓｉＲＮＡ分子である、請求項７から１４までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＲＮＡ分子が、少なくとも１つのヌクレオチドアナログ又は／及びデオキシリボヌクレオチドを含有する、請求項１３から１５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１７】
核酸が、アンチセンス核酸又はアンチセンス核酸をコードするＤＮＡである、請求項３から１３までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１８】
核酸が、少なくとも１５、有利には少なくとも１７、より有利には少なくとも１９、最も有利には少なくとも２１ヌクレオチドの長さを有する、請求項３から１７までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１９】
核酸が、最大で２９、有利には最大で２７、より有利には最大で２５、特により有利には最大で２３、最も有利には最大で２１ヌクレオチドの長さを有する、請求項３から１７までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２０】
抗体が、キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドに対して指向している、請求項３又は４記載の医薬組成物。
【請求項２１】
抗体が、
（ａ）表１Ａ及び表１Ｂから選択される核酸又は／及び遺伝子によりコードされるアミノ酸配列、又は／及び
（ｂ）少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％（ａ）の配列と同一であるアミノ酸配列
を含むキナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドに対して指向している、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
抗体を含み、前記抗体が有利には、
（ａ）表４Ａから選択される核酸又は／及び遺伝子によりコードされるアミノ酸配列、又は／及び
（ｂ）少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％（ａ）の配列と同一であるアミノ酸配列
を含むポリペプチドに対して指向している、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項２３】
キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの少なくとも１種のモジュレーターの細胞中への、特に肺上皮細胞中への輸送に適している剤を更に含む、請求項１から２２までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２４】
更なる剤がキトサンであり、これが有利にはナノ粒子中に処方されている、請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
以下の工程、
（ａ）キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドを提供する工程、
（ｂ）化合物を（ａ）のキナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドと接触させる工程、
（ｃ）キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの活性を決定する工程、
（ｄ）キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの活性を調節する化合物を選択する工程
を含む、キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの調節のために適した化合物を同定するためのスクリーニング方法。
【請求項２６】
細胞スクリーニングアッセイ又は／及び分子スクリーニングアッセイを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドを、キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドを発現することができる細胞又は／及び非ヒト生物により提供する、請求項２５又は２６記載の方法。
【請求項２８】
キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドが単離された形態で提供される、請求項２５又は２６記載の方法。
【請求項２９】
（Ｉ）インフルエンザウィルスで感染されることができ、かつ、キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドを発現することができる細胞又は／及び非ヒト生物を提供する工程、
（ＩＩ）インフルエンザウィルスと、及び、前記キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの発現又は／及び活性を調節することができることが知られている化合物と、（ｉ）の細胞又は／及び生物とを接触させる工程、
（ＩＩＩ）細胞又は／及び生物により産生されるインフルエンザウィルスの量を決定する工程、及び
（ＩＶ）細胞又は／及び生物により産生されるインフルエンザウィルスの量を減少させる化合物を選択する工程を含む、
インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のために適したキナーゼモジュレーターの同定のためのスクリーニング方法。
【請求項３０】
（Ａ）インフルエンザウィルスで感染されることができ、かつ遺伝子を発現することができる細胞又は／及び非ヒト生物を提供する工程、その際、遺伝子又は／及びその遺伝子産物は、インフルエンザウィルスの複製を調節することができる、
（Ｂ）インフルエンザウィルスと、及び、（Ａ）の遺伝子又は／及びその遺伝子産物の発現又は／及び活性を調節することができることが知られている化合物と、（Ａ）の細胞又は／及び生物とを接触させる工程、
（Ｃ）細胞又は／及び生物により産生されるインフルエンザウィルスの量を決定する工程、及び
（Ｄ）細胞又は／及び生物により産生されるインフルエンザウィルスの量を減少させる化合物を選択する工程を含む、
インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のために適した化合物の同定のためのスクリーニング方法。
【請求項３１】
（Ａ）の遺伝子が、表１Ａ、１Ｂ及び４から選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
（ｉ）キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドを発現することができる細胞又は／及び非ヒト生物を提供する工程、
（ii）化合物と（ｉ）の細胞又は／及び生物とを接触させる工程、
（ｉｉｉ）キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの量又は／及び活性を決定する工程、及び
（ｉｖ）キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの量又は／及び活性を調節する化合物を選択する工程を含む、
インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のために適した化合物の同定のためのスクリーニング方法。
【請求項３３】
工程（ｉｉｉ）又は／及び（ｉｖ）におけるキナーゼ活性が、キナーゼ発現の測定により決定される、請求項３２記載のスクリーニング方法。
【請求項３４】
ｉ．遺伝子を発現することができる細胞又は／及び非ヒト生物を提供する工程、その際、遺伝子又は／及びその遺伝子産物は、インフルエンザウィルスの複製を調節することができる、
ｉｉ．化合物と、ｉ．の細胞又は／及び生物とを接触させる工程、
ｉiｉ．（ｉ）の遺伝子の遺伝子産物の量又は／及び活性を決定する工程、及び
ｉｖ．ｉ．の遺伝子産物の量又は／及び活性を調節する化合物を選択する工程を含む、
インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のために適した化合物の同定のためのスクリーニング方法。
【請求項３５】
ｉ．の遺伝子が、表１Ａ、１Ｂ及び４から有利に選択される請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
（１）遺伝子を発現、特に過剰発現又は過少発現することができる細胞又は／及び非ヒト動物を提供する工程、
（２）インフルエンザウィルスと、（１）の細胞又は／及び生物とを接触させる工程、
（３）前記遺伝子の発現又は／及び活性を調節し、かつ、細胞又は／及び生物により産生されたインフルエンザウィルスの量を決定する工程、及び
（４）発現又は／及び活性が、細胞又は／及び生物により生産されるインフルエンザウィルスの量の減少と正の又は負の相関を示す遺伝子を選択する工程を含む、
インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のためにターゲットとして適した遺伝子の同定のためのスクリーニング方法。
【請求項３７】
遺伝子の発現の調節が、下方制御又は上方制御である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
遺伝子の活性の調節が、活性の増加又は減少である、請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項３９】
インフルエンザが、インフルエンザＡウィルス、より有利にはプエルトリコ／８／３４株及びトリインフルエンザウィルス単離体、例えばＨ５Ｎ１から選択される、請求項２５から３８までのいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項４０】
細胞が、哺乳類の細胞である、請求項２５から３９までのいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項４１】
キナーゼモジュレーター又は／及びキナーゼ結合タンパク質モジュレーターの、インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び予防のための医薬品の製造のための使用。
【請求項４２】
表１ｂ及び４から選択された遺伝子の発現を阻害することができる、又は／及び、その遺伝子産物を阻害することができる、インフルエンザウィルス複製の阻害剤の、インフルエンザウィルス感染の予防、緩和及び／又は予防のための医薬品の製造のための使用。
【請求項４３】
表１ａ、１ｂ、２又は／及び４から選択される遺伝子配列又は／及びヌクレオチド配列を含む核酸及びその断片の、インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のために適した化合物又は／及び標的のためのスクリーニング方法における使用。
【請求項４４】
少なくとも２種の核酸の組み合わせを使用する、請求項４３記載の使用。
【請求項４５】
表１ｂ及び４から核酸又はその組み合わせが選択される、請求項４３又は４４記載の使用。
【請求項４６】
核酸の組み合わせが、１つの遺伝子の発現及び／又は活性を阻害する、請求項４５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、インフルエンザウィルス複製のインヒビターを含有する医薬組成物に関する。特に、本発明は、キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドのモジュレーターを含有する、インフルエンザの予防又は／及び治療のための医薬組成物に関する。更に、本発明は、キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドのモジュレーターの同定のためのスクリーニング方法に関し、前記モジュレーターは、インフルエンザの予防及び／又は治療のために適している。また、更なる観点は、インフルエンザの予防、緩和又は／及び治療のための、新規の標的の同定のためのスクリーニング方法である。
【０００２】
脅威的なインフルエンザパンデミックの観点において、使用可能な持続的に有効な薬剤を開発し、かつ、製造する迅速な必要性が存在する。ドイツ国のみで、インフルエンザの年間の発生は、一年間に５０００〜２００００の死を引き起こす（供給源、ロベルトコッホインスティチュート（Robert-Koch Institute））。繰り返し発生する大きなインフルエンザパンデミックは特に畏怖される。この最初の大きなパンデミック、いわゆる「スペイン風邪」は、約４千万人の命を、１９１８〜１９１９の間に犠牲にし、これは、健康な、中年の人々の高いパーセンテージを含む。類似のパンデミックは、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウィルスによって引き起こされることができ、これは、現在では、主としてトリ中で複製し、獲得した場合には、突然変異により、このウィルスは、ヒトからヒトへと移されることになる。ヒトのパンデミックの可能性は、現在では、トリインフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）の世界的広がり及び家畜動物の感染と共により一層迅速に成長する。高度に病原性なヒトインフルエンザ組換体が生じるのは単に時間の問題である。インフルエンザ感染の予防又は療法のための現在入手可能な方法、例えば、ウィルス表面タンパク質でのワクチン接種又は抗ウィルス薬剤の使用（ノイラミニダーゼ阻害剤又はイオンチャンネルブロッカー）は、様々な欠点を有する。既にこの初期の段階で、我々の最も有効な調製物うちの１つに対して（タミフル）抵抗性が生じているようであり、これは、パンデミックを封じ込むためにはこれを不適当にするようである。インフルエンザに対するワクチン及び薬剤の使用において主となる問題は、この病原性の生存性である。これまでには、効果的なワクチンの開発には、この病原体の変異体の正確な予測を必要とした。ウィルス成分に対して指向した薬剤は、迅速にその有効性を失うことができ、これは、この病原体の突然変異のためである。
【０００３】
これまでにほとんど興味を引かれていない研究分野は、宿主細胞中での決定的な標的の構造の同定である。ウィルスは、宿主内で複製できるように特定の細胞タンパク質に依存性である。ウィルス複製にとって重要であり、しかし、ヒトのためには、（少なくとも一時的に）無くても良い、このような細胞性因子の知識は、新規の薬剤の開発を生じることができた。おおよその推測では、ウィルス増殖のために必須である、ヒトゲノム中の約５００個の遺伝子を予測している。無論、少なくとも１０％は、ことによると、一時的に又は永続的にも、ヒト生物のためには無くもよい。これらの遺伝子及びその産物の阻害は、これは、ウィルス標的とは対照的に、その構造において一定であり、短縮した時間内での抗ウィルス薬剤の新規の発生の開発を可能にするものであろう。このような遺伝子産物の阻害は、抗ウィルス薬剤に対してもはや感受性でないウィルス逃亡突然変異体の開発を乗り越えることができるものである。他の遺伝子ファミリーのなかで、細胞中で重要な調節性タンパク質であるキナーゼは、しばしばウィルスによりハイジャックされ、この宿主細胞の構成要素を操作する。
【０００４】
本発明の課題は、インフルエンザウィルス複製に関連している遺伝子のためのスクリーニング方法を提供することである。他の課題は、このような遺伝子のモジュレーターの同定のためのスクリーニング方法である。
【０００５】
本発明の文脈において、意外にも、特定の遺伝子の阻害又はキナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの調節が、インフルエンザウィルスの減少を生じることが見出された。
【０００６】
表１ａ、１ｂ及び４は、インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のための標的を説明する。
【０００７】
下方制御によりインフルエンザウィルス複製を増加させる遺伝子の例は、表１ａ中に説明されている。従って、この遺伝子又は／及び遺伝子産物の発現又は／及び活性を増加させることにより、このインフルエンザウィルス複製が減少されることができる。
【０００８】
下方制御によりインフルエンザウィルス複製を減少させる遺伝子の例は、表１ｂ及び４中に説明されている。従って、この遺伝子又は／及び遺伝子産物の発現又は／及び活性を減少させることにより、インフルエンザウィルス複製は減少されることができる。
【０００９】
本発明の主題は、従って、インフルエンザウィルス感染、特にインフルエンザウィルス複製に関連した、様々な観点をカバーする、スクリーニング方法である。
【００１０】
第１の観点において、このスクリーニング方法は、以下の工程、
（ａ）キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドを提供する工程、
（ｂ）化合物を（ａ）のキナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドと接触させる工程、
（ｃ）キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの活性を決定する工程、
（ｄ）キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの活性を調節する化合物を選択する工程
を含む、キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの調節のために適した化合物を同定するためのスクリーニング方法である。
【００１１】
本発明のスクリーニング方法は、細胞スクリーニングアッセイ又は／及び分子スクリーニングアッセイを含んでよい。細胞スクリーニングアッセイは、キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの細胞又は／及び非ヒト生物中での活性又は／及び発現の決定を含む。分子スクリーニングアッセイは、単離されたキナーゼ又は／及び単離されたキナーゼ結合ポリペプチドの活性の決定を含む。
【００１２】
本発明のスクリーニング方法におけるスクリーニングアッセイは、インビボ又は／及びインビトロで実施されてよい。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法において、キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドは、単離された形態で提供されてよい。「単離された」とは、本発明の文脈において、当業者に知られている、任意のタンパク質又はポリペプチド単離工程を指す。「単離された形態」又は「単離されたキナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチド」とは、本質的に、純粋な又は粗製の、キナーゼ又は／及び単離されたキナーゼ結合ポリペプチドの調製物又は処方物を含む。
【００１４】
本発明のスクリーニング方法において、キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドを、キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドを発現することができる細胞又は／及び非ヒト生物により提供されてよい。
【００１５】
更なる別の観点において、スクリーニング方法は、
（Ｉ）インフルエンザウィルスで感染されることができ、かつ、キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドを発現することができる細胞又は／及び非ヒト生物を提供する工程、
（ＩＩ）インフルエンザウィルスと、及び、前記キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの発現又は／及び活性を調節することができることが知られている化合物と、（Ｉ）の細胞又は／及び生物と接触させる工程、
（ＩＩＩ）細胞又は／及び生物により産生されるインフルエンザウィルスの量を決定する工程、及び
（ＩＶ）細胞又は／及び生物により産生されるインフルエンザウィルスの量を減少させる化合物を選択する工程を含む、
インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のために適したキナーゼモジュレーターの同定のためのスクリーニング方法である。
【００１６】
更なる観点において、スクリーニング方法は、
（Ａ）インフルエンザウィルスで感染されることができ、かつ遺伝子を発現することができる細胞又は／及び非ヒト生物を提供する工程、その際、遺伝子又は／及びその遺伝子産物は、インフルエンザウィルスの複製を調節することができる、
（Ｂ）インフルエンザウィルスと、及び、（Ａ）の遺伝子及び／又はその遺伝子産物の発現又は／及び活性を調節することができることが知られている化合物と、（Ａ）の細胞又は／及び生物とを接触させる工程、
（Ｃ）細胞又は／及び生物により産生されるインフルエンザウィルスの量を決定する工程、及び
（Ｄ）細胞又は／及び生物により産生されるインフルエンザウィルスの量を減少させる化合物を選択する工程を含む、
インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のために適した化合物の同定のためのスクリーニング方法である。
【００１７】
（Ａ）の遺伝子は、有利には、表１Ａ、１Ｂ及び４から選択され、より有利な実施態様において、表１Ａ、１Ｂ又は４の１つから選択される。（Ａ）及び（Ｂ）における「調節」は、「活性化」又は「阻害」、特に「阻害」であってよい。
【００１８】
更なる観点において、スクリーニング方法は、
（ｉ）キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドを発現することができる細胞又は／及び非ヒト生物を提供する工程、
（ｉｉ）化合物と（ｉ）の細胞又は／及び生物と接触させる工程、
（ｉｉ）キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの量又は／及び活性を決定する工程、及び
（ｉｖ）キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの量又は／及び活性を調節する化合物を選択する工程を含む、
インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のために適した化合物の同定のためのスクリーニング方法である。
【００１９】
更なる観点において、スクリーニング方法は、
ｉ．遺伝子を発現することができる細胞又は／及び非ヒト生物を提供する工程、その際、遺伝子又は／及びその遺伝子産物は、インフルエンザウィルスの複製を調節することができる、
ｉｉ．化合物と、ｉ．の細胞又は／及び生物とを接触させる工程、
ｉｉｉ．（ｉ）の遺伝子の遺伝子産物の量又は／及び活性を決定する工程、及び
ｉｖ．ｉ．の遺伝子産物の量又は／及び活性を調節する化合物を選択する工程を含む、
インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のために適した化合物の同定のためのスクリーニング方法である。
【００２０】
（ｉ）の遺伝子は、有利には、表１Ａ、１Ｂ及び４から選択され、より有利な実施態様において、表１Ａ、１Ｂ又は４の１つから選択される。ｉ．及びｉｉ．における「調節」は、「活性化」又は「阻害」、特に「阻害」であってよい。
【００２１】
本発明のまた更なる観点において、スクリーニング方法は、
（１）遺伝子を発現、有利には過剰発現又は過少発現することができる細胞又は／及びトランスジェニック非ヒト生物を提供する工程、
（２）インフルエンザウィルスと、（１）の細胞及び／又は生物とを接触させる工程、
（３）前記遺伝子の発現及び／又は活性を調節し、かつ、細胞又は／及び生物により産生されたインフルエンザウィルスの量を決定する工程、及び
（４）発現又は／及び活性が、細胞又は／及び生物により生産されるインフルエンザウィルスの量の減少と正の又は負の相関を示す遺伝子を選択する工程を含む、
インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び予防のために標的として適した遺伝子の同定のためのスクリーニング方法である。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法において使用される少なくとも１種のキナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドは、有利には、表１Ａ及び表１Ｂから選択される核酸又は／及び遺伝子によりコードされている。表１ａ、１ｂ、２又は／及び４の少なくとも１つの配列を含有する核酸及びその断片は、本発明のスクリーニング方法において使用されてよい。
【００２３】
本発明の文脈において、「標的」は、遺伝子又は／及びゲノムにあるヌクレオチド配列、核酸、又は／及びポリペプチドを含み、これは、宿主細胞中でのインフルエンザウィルス複製の調節に関連している。この標的は、直接的に又は非直接的に、インフルエンザウィルスの複製の調節に関連していてよい。特に、標的は、標的の活性化又は標的の阻害により、インフルエンザウィルス複製の減少に、適している。
【００２４】
標的の例は、遺伝子及び遺伝子の部分配列であり、例えば、調節性配列である。「標的」との用語はまた、遺伝子産物、例えばＲＮＡ、特にｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ポリペプチド又は／及びタンパク質であり、この標的遺伝子によりコードされたものを含む。標的遺伝子の有利な遺伝子産物は、ｍＲＮＡ、ポリペプチド及びタンパク質であって、標的遺伝子によりコードされたものから選択される。最も有利な遺伝子産物は、ポリペプチド又はタンパク質であって標的遺伝子によりコードされたものである。標的タンパク質又は標的ポリペプチドは、後翻訳により修飾されるか又は修飾されなくてよい。
【００２５】
遺伝子の「遺伝子産物」は、本明細書中で使用される場合に、ＲＮＡ（特に、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ）、ポリペプチド又は／及びタンパク質であって、前記遺伝子によりコードされたものを含む。
【００２６】
本発明の文脈において、遺伝子又は／及び遺伝子産物の「活性」は、転写、翻訳、後翻訳による修飾、遺伝子又は／及び遺伝子産物の活性の調節を含む。活性は、リガンド結合により調節されてよく、このリガンドはアクチベーター又はインヒビターであってよい。
【００２７】
本発明の更なる主題は、インフルエンザウィルス複製の少なくとも１種のインヒビターを、場合により、医薬的に許容可能な担体、助剤、希釈剤又は／及び添加剤と一緒に含有する、インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のための医薬組成物である。
【００２８】
また更なる本発明の主題は、キナーゼの少なくとも１種のモジュレーター又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドの少なくとも１種のモジュレーターを、場合により、医薬的に許容可能な担体、助剤、希釈剤又は／及び添加剤と一緒に含む、インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のための医薬組成物である。
【００２９】
インフルエンザウィルス感染は、インフルエンザウィルスＡ感染であってよい。インフルエンザＡウィルスは、これまでのところトリ及び哺乳類生物から単離されたインフルエンザＡウィルスから選択されてよい。特に、インフルエンザＡウィルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ３、Ｈ１Ｎ４、Ｈ１Ｎ５、Ｈ１Ｎ６、Ｈ１Ｎ７、Ｈ１Ｎ９、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ４、Ｈ２Ｎ５、Ｈ２Ｎ７、Ｈ２Ｎ８、Ｈ２Ｎ９、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ３、Ｈ３Ｎ４、Ｈ３Ｎ５、Ｈ３Ｎ６、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ１、Ｈ４Ｎ２、Ｈ４Ｎ３、Ｈ４Ｎ４、Ｈ４Ｎ５、Ｈ４Ｎ６、Ｈ４Ｎ８、Ｈ４Ｎ９、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ６Ｎ３、Ｈ６Ｎ４、Ｈ６Ｎ５、Ｈ６Ｎ６、Ｈ６Ｎ７、Ｈ６Ｎ８、Ｈ６Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ５、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ８、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ３、Ｈ９Ｎ５、Ｈ９Ｎ６、Ｈ９Ｎ７、Ｈ９Ｎ８、Ｈ１０Ｎ１、Ｈ１０Ｎ３、Ｈ１０Ｎ４、Ｈ１０Ｎ６、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ１０Ｎ９、Ｈ１１Ｎ２、Ｈ１１Ｎ３、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ１、Ｈ１２Ｎ４、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１２Ｎ９、Ｈ１３Ｎ２、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１３Ｎ８、Ｈ１３Ｎ９、Ｈ１４Ｎ５、Ｈ１５Ｎ２、Ｈ１５Ｎ８、Ｈ１５Ｎ９及びＨ１６Ｎ３から選択されてよい。より特に、インフルエンザＡウィルスは、プエルトリコ／８／３４株又はトリインフルエンザウィルス単離体Ｈ５Ｎ１である。本明細書中で説明したとおりインフルエンザウィルスは、本発明のスクリーニング方法において使用されてよい。
【００３０】
本発明の医薬組成物中で使用されるインフルエンザウィルス複製の阻害剤又は／及びモジュレーターは、有利には、核酸、核酸アナログ、例えばリボザイム、ペプチド、ポリペプチド及び抗体からなる群から選択される。本明細書中で説明したとおりインフルエンザウィルスは、本発明のスクリーニング方法において使用されてよい。
【００３１】
インフルエンザウィルス複製のインヒビター又は／及びモジュレーターはまた、１０００ダルトンよりも少ない分子量を有する化合物であってもよい。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、インフルエンザウィルス複製の少なくとも１種のインヒビターを含有してよく、その際、この少なくとも１種のインフルエンザウィルス複製のインヒビターは、表１Ａ、表１Ｂ、及び表４、から選択される遺伝子又は／及びその遺伝子産物の発現を調節する。特に、インフルエンザウィルス複製の少なくとも１種のインヒビターは、表１Ｂ及び表４から選択される遺伝子又は／及びその遺伝子産物の発現を阻害し、又は、この少なくとも１種のインフルエンザウィルス複製のインヒビターは、表１Ａから選択された遺伝子又は／及びその遺伝子産物の発現を活性化する。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、キナーゼのモジュレーター又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドのモジュレーターを含んでよく、その際、この少なくとも１種のキナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドは、表１Ａ及び表１Ｂから選択される核酸又は／及び遺伝子によりコードされる。このようなキナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドは、従って、このモジュレーターの標的であってよい。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、アクチベーターである少なくとも１種のモジュレーターを含んでよい。本発明の医薬組成物は、少なくとも１種のアクチベーターを含有してよく、
少なくとも１種のアクチベーターは、
（ａ）表１Ａから選択されたヌクレオチド配列又はその断片、又は／及び
（ｂ）少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％（ａ）の配列に同一である断片を含有し、又は／及び少なくとも１種のアクチベーターが、配列（ａ）又は／及び（ｂ）を含む遺伝子の発現又は／及び遺伝子産物の活性を活性化することができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、インヒビターである少なくとも１種のモジュレーターを含んでよい。適したインヒビターは、ＲＮＡ干渉可能であるＲＮＡ分子である。  本発明の医薬組成物は、少なくとも１のインヒビターを含んでよく、
少なくとも１のインヒビターが、
（ａ）表１Ｂ及び４から選択されたヌクレオチド配列又は／及びその断片、又は
（ｂ）少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％（ａ）の配列に同一な配列を含有し、
又は／及び、少なくとも１種のインヒビターが、配列（ａ）又は／及び（ｂ）を含む遺伝子の発現又は／及び遺伝子産物の活性を阻害することができる。
【００３６】
本明細書中で説明したとおりアクチベーター又は／及インヒビターは、本発明のスクリーニング方法において使用されてもよい。
【００３７】
本発明の医薬組成物は、有利には、核酸を含み、その際、この核酸は、表２及び表４の配列から選択されたヌクレオチド配列及びその断片を含む。有利には、核酸はＲＮＡ又はＤＮＡである。
【００３８】
より有利な実施態様において、本発明の医薬組成物は、
（ｉ）ＲＮＡ干渉可能なＲＮＡ分子
（ｉｉ）ＲＮＡ分子（ｉ）の前駆体又は／及び
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子（ｉ）又は／及び前駆体（ｉｉ）をコードするＤＮＡ分子
を含む。
【００３９】
ＲＮＡ干渉可能なＲＮＡ分子は、WO 02/44321中に説明され、これは、参照により本願明細書中に組み込まれる。
【００４０】
本発明のＲＮＡ分子は、二重鎖ＲＮＡ分子であってよく、有利には、二重鎖ｓｉＲＮＡ分子であって、一末端にのみ又は両末端に一重鎖のオーバーハングを有するか又は有しない。ＲＮＡ分子は、少なくとも１つのヌクレオチドアナログ又は／及びデオキシリボヌクレオチドを含有してよい。
【００４１】
本発明において使用されるＤＮＡ分子は、ベクターであってよい。
【００４２】
本発明において使用される核酸は、アンチセンス核酸又はアンチセンス核酸をコードするＤＮＡであってよい。
【００４３】
本発明において使用される核酸又は／及び核酸断片は、少なくとも１５、有利には少なくとも１７、より有利には少なくとも１９、最も有利には少なくとも２１ヌクレオチドの長さを有してよい。この核酸又は／及び核酸断片は、最大で２９、有利には最大で２７、より有利には最大で２５、特により有利には最大で２３、最も有利には最大で２１ヌクレオチドの長さを有してよい。
【００４４】
別の有利な一実施態様において、本発明の医薬組成物は、抗体を含有し、その際、この抗体は、キナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドに対して指向されていてよい。
【００４５】
有利には、抗体が、
（ａ）表１Ａ及び表１Ｂから選択される核酸又は／及び遺伝子によりコードされるアミノ酸配列、又は／及び
（ｂ）少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％（ａ）の配列と同一であるアミノ酸配列
を含むキナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチドに対して指向している。
【００４６】
別の有利な一実施態様において、抗体は、
（ａ）表４Ａから選択される核酸又は／及び遺伝子によりコードされるアミノ酸配列、又は／及び
（ｂ）少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％（ａ）の配列と同一であるアミノ酸配列
を含むポリペプチドに対して有利に指向している。
【００４７】
本発明の抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体、キメラ抗体、キメラ一重鎖抗体、Ｆａｂ断片又はＦａｂ発現ライブラリーにより産生された断片を含んでよい。
【００４８】
本発明の抗体の調製技術は、当業者に知られている。モノクローナル抗体は、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術又はＥＢＶハイブリドーマ技術により調製されて良い（Koehler et al., 1975, Nature 256:495-497, Kozbor et al., 1985, J. Immunol. Methods 81 ,31-42, Cote et al., PNAS, 80:2026-2030, Cole et al., 1984, MoI. Cell Biol. 62:109-120）。キメラ抗体（マウス／ヒト）は、Morrison et al. (1984, PNAS, 81 :6851-6855),Neuberger et al. (1984, 312:604-608)及びTakeda et al. (1985, Nature 314:452-454)の方法を実施することにより調製されてよい。
【００４９】
一重鎖抗体は、当業者に知られた技術により調製されてよい。
【００５０】
組み換え免疫グロブリンライブラリー（Orlandi et al, 1989, PNAS 86:38333837, Winter et al., 1991 , Nature 349:293-299）は、本発明の抗体を得るためにスクリーニングされてよい。ランダムコンビナトリ免疫グロブリンライブラリー（Burton, 1991 , PNAS1 88:11120-11123）は、異なるイデオタイプ組成を有する関連した特異性を有する抗体を産生するために使用されてよい。
【００５１】
抗体産生のための別の戦略は、リンパ球集団のインビボ刺激である。
【００５２】
更に、本発明の抗体断片（Ｆ（ａｂ′）2断片を含有する）は、例えばペプシンによる抗体のプロテアーゼ分解により調製されることができる。このようなＦ（ａｂ′）2のジスルフィド結合の減少化は、Ｆａｂ断片を生じる。別のアプローチにおいて、このＦａｂ断片は、直接的に、Ｆａｂ発現ライブラリーから得られてよい（Huse et al., 1989, Science 254:1275-1281）。
【００５３】
本発明のポリクローナル抗体は、表１Ａ及び表１Ｂから選択された核酸又は／及び遺伝子によりコードされたアミノ酸又はその免疫原性断片を使用して抗原として宿主、例えばウマ、ヤギ、ウサギ、ヒト、その他の標準的な免疫化プロトコルによりこ調製されてよく、この標準的な免疫化プロトコルは、当業者に公知である。
【００５４】
この抗体は、標的遺伝子の遺伝子産物に特異的な抗体であってよく、特に、標的遺伝子によりコードされるポリペプチド又はタンパク質にとって特異的な抗体であってよい。
【００５５】
本明細書中で説明したとおり抗体は、本発明のスクリーニング方法において使用されてよい。
【００５６】
本発明において使用されるポリペプチド又は／及びペプチドの断片は、特に、表１Ａ、表１Ｂ及び表４から選択される核酸又は／及び遺伝子によりコードされるアミノ酸の断片は、少なくとも５アミノ酸残基、有利には少なくとも１０、より有利には少なくとも２０アミノ酸残基の長さを有してよい。前記断片の長さは、最大で２００アミノ酸残基、有利には最大で１００アミノ酸残基、より有利には最大で６０アミノ酸残基、最も有利には最大で４０アミノ酸残基であってよい。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法において、遺伝子の発現の調節は、下方調節又は上方調節であってよく、特に、転写又は／及び翻訳の調節である。
【００５８】
当業者は、遺伝子が上方調節されているか又は下方調節されているかを容易に決定できる。本発明の文脈において、遺伝子発現の上方調節は、少なくとも２、有利には少なくとも４倍の上方調節であってよい。本発明の文脈において、下方調節は、少なくとも２倍、有利には４倍の遺伝子発現の減少であってよい。最も有利には、例えばＲＮＡ干渉による本質的に完全な遺伝子発現の阻害である。
【００５９】
「量の減少（増加）」は、少なくとも２倍、有利には少なくとも４倍の遺伝子発現の下方調節（上方調節）であってよい。減少の場合には、例えばＲＮＡ干渉による、遺伝子発現の本質的に完全な阻害が最も有利である。
【００６０】
遺伝子の活性の調節は、活性の減少又は増加であってよい。
【００６１】
「活性の減少（増加）」は、遺伝子又は遺伝子産物の少なくとも２倍、有利には少なくとも４倍の活性の減少（増加）であってよい。活性の減少の場合には、活性の本質的に完全な阻害が最も有利である。
【００６２】
調節は、１つの核酸種により又は２、３、４、５、６又はそれ以上の異なる核酸種を含む核酸の組み合わせにより実施されてよく、これは、表１ａ、１ｂ又は／及び２及びその断片から選択されてよい。有利な組み合わせは、表３（「プール」とも本明細書中では呼ばれる）中に説明されている。表３は、少なくとも２つのキナーゼ又は／及びキナーゼ結合ポリペプチド遺伝子の組み合わせを含む。組み合わせが、１つの遺伝子、例えば表１ａ及び１ｂから選択された１つの遺伝子を調節することも有利である。２つの核酸種の組み合わせが有利である。より有利には、表２の２つの核酸種の組み合わせである。最も有利には、表２の２つの核酸種の組み合わせであり、これは１つの遺伝子を調節する。
【００６３】
調節は、ＲＮＡ干渉によるノックダウンにより実施されてよい。核酸又は核酸種の組み合わせは、ｓｉＲＮＡであってよく、これは、表２及び表４の配列から選択された配列及びその断片を含む。組み合わせが、１つの遺伝子、例えば表１ｂ及び表４から選択された１つの遺伝子をノックダウンすることも有利である。２つのｓｉＲＮＡ種の組み合わせが有利であり、これは、表２の配列から選択されてよく、これは、表１ｂの遺伝子及び表４の配列に由来し、であり、その際この組み合わせは、有利には、１つの遺伝子をノックダウンする。
【００６４】
本発明の様々な実施態様において使用される遺伝子は、表１Ａ、１Ｂ、２又は４のいづれかから選択されるか又はこの任意の組み合わせであってよい。発現されたか又は上方調節される場合に、インフルエンザウィルス複製を調節することができる遺伝子は、表１Ａ及び表１Ｂから、表１Ａ、１Ｂ及び４から、表１Ａ、１Ｂ、２及び４から選択されてよい。発現されたか又は上方発現された場合に、インフルエンザウィルス複製を阻害できる遺伝子は、表１Ｂから、表１Ｂ及び４から、又は、表１Ｂ、２及び４から選択されてよい。発現されたか又は上方発現された場合に、インフルエンザウィルス複製を活性化できる遺伝子は、表１Ａから、又は表１Ａ及び２から選択されてよい。
【００６５】
本発明の任意のスクリーニング方法において使用される細胞は、インフルエンザウィルスで感染されることができる任意の細胞であってよい。有利には、この細胞は、哺乳類細胞又はトリ細胞である、より有利には、細胞はヒト細胞である。更に一層有利には、上皮細胞である。最も有利には肺の上皮細胞である。この細胞は、細胞系列であってよい。適した肺の上皮細胞系列は、Ａ５９４細胞である。別の適した細胞は、ヒトの胚性腎細胞系列２９３Ｔである。
【００６６】
標的遺伝子又は／及びその遺伝子産物のモジュレーターは、本明細書中で説明したとおり、インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び予防のための医薬組成物の製造のために使用されてよい。
【００６７】
本発明の別の主題は、インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び予防のための、本願明細書中で説明したとおりの、インフルエンザウィルス複製のインヒビターの使用である。有利であるのは、表１ｂ及び４から選択される遺伝子の発現を阻害できるインヒビターの、インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び予防のための医薬品の製造のための使用である。また有利であるのは、表１ｂ及び４から選択される遺伝子の遺伝子産物を阻害できるインヒビターの、インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び予防のための医薬品の製造のための使用である。
【００６８】
また更なる本発明の主題は、キナーゼモジュレーター又は／及びキナーゼ結合タンパク質モジュレーターの、インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び予防のための医薬品の製造のための使用である。
【００６９】
また更なる本発明の観点は、表１ａ、１ｂ、２又は／及び４の遺伝子配列又は／及びヌクレオチド配列を含む核酸及びその断片の、インフルエンザウィルス感染の予防、緩和又は／及び治療のために適した化合物又は／及び標的のためのスクリーニング方法における使用である。
本発明は、更に、以下の図、表及び実施例により説明される。
【００７０】
図及び表の説明：
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１：実施例のｓｉＲＮＡキナーゼスクリーンの実験的な設定。
【図２】図２：ルミネセンスデーターに関する、トランスフェクションした（対照）ｓｉＲＮＡの効果。この図面は、１つの９６ウェルプレートからの典型的なスクリーニング結果を示す。全ての実験の間に、幾つかの対照を３つのトリプリケートに含め、未感染のように、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、ｍｏｃｋ処理しかつ、インフルエンザＡウィルスからのウィルス殻タンパク質遺伝子（ＮＰ）に対してｓｉＲＮＡｓでトランスフェクションした。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡｓ及び抗ＮＰｓｉＲＮＡｓで処理した細胞の間でのルミネッセンスの差異を、定義により１００％阻害に設定した。
【図３】図３：実施例において試験した全てのｓｉＲＮＡｓについて示したインフルエンザウィルス複製の阻害。
【図４】図４：全ての分析したｓｉＲＮＡｓからの「％阻害」の値をｚスコアを計算するために使用した。高度に有効なｓｉＲＮＡｓをピンクに標識化し、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡトランスフェクションした対照細胞に比較して５０％よりも多い阻害を示す。
【図５】図５：ゲノム全域ｓｉＲＮＡスクリーンの実験的な設定（実施例４参照）。  表１：ｓｉＲＮＡキナーゼスクリーンの結果：ａ：％におけるウィルス複製の活性化（"負"の阻害）、細胞数に対して標準化、そして、この標準偏差を、４つの独立した実験を用いて計算、ｂ：％におけるウィルス複製の阻害、細胞数に対して標準化、そして、標準偏差を、４つの独立した実験を用いて計算した。プールＸ、その際、Ｘは、プールの数を指し、表３中で説明された組み合わせを指す。  表２：実施例１のｓｉＲＮＡキナーゼスクリーンにおいて使用されたオリゴヌクレオチド配列。特定の遺伝子のノックダウンを、（ａ）前記遺伝子に特異的な２つのオリゴヌクレオチド配列（"標的１"及び"標的２"）の組み合わせにより、又は、（ｂ）異なる遺伝子に対して特異的なプールされたオリゴヌクレオチドにより（"プールＸ"、その際、Ｘは、表３中に説明されたプールの数を示す）、実施した。  表３：実施例のｓｉＲＮＡキナーゼスクリーンにおいて使用したオリゴヌクレオチドプール。  表４：実施例４のｓｉＲＮＡｓスクリーンにおいて使用したオリゴヌクレオチド配列。遺伝子に対して特異的な４つまでのオリゴヌクレオチド配列（"標的配列１"、"標的配列２"、"標的配列３"、"標的配列４"）を使用した（それぞれ別個の試験において）。
【００７２】
実施例１
キナーゼは、ウィルス子孫に影響を及ぼすことができる最も有望な候補の１つであるので、我々は、この遺伝子の群に対するｓｉＲＮＡＳを使用して、インフルエンザウィルスの修飾した複製の観点において、それぞれのキナーゼ又はキナーゼ結合ポリペプチドの個々の役割を同定した。全てのｓｉＲＮＡｓを４つの独立した実験において試験した。キナーゼに対するｓｉＲＮＡは、細胞の複製又は細胞毒性さえも影響することができるので、それぞれの個々のｓｉＲＮＡｓトランスフェクションの影響を細胞数に関して、自動顕微鏡を用いて分析した。複製可能なインフルエンザウィルスの量をインフルエンザウィルスリポータープラスミドを用いて定量化し、これは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター／ターミネーターカセットを用いて、インフルエンザＡ／ＷＳＭ／３３核タンパク質（ＮＰ）部分の翻訳されない領域により隣接される、ホタルルシフェラーゼをコードするＲＮＡ転写物を発現すべく構築されたものである。ヒト胚性腎細胞（２９３Ｔ）を、この指示薬プラスミドでインフルエンザ感染の１日前にトランスフェクションした。この細胞を選択したのは、これらが、インフルエンザＡウィルス感染後にルシフェラーゼ発現の非常に強力な増幅を示すからである。細胞を基礎とするアッセイは、以下の工程（図１も、このｓｉＲＮＡキナーゼスクリーンの実験的な構成を説明する）を含んだ：
１日目：Ａ５４９細胞（肺の上皮細胞）の９６ウェルプレート中への播種。
２日目：キナーゼ又はキナーゼ結合タンパク質に対して指向したｓｉＲＮＡｓでのトランスフェクション。
３日目：インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３での感染＋２９３Ｔ細胞のインフルエンザウィルス指示薬プラスミドでのトランスフェクション。
４日目：２９３Ｔ細胞のＡ５４９細胞の上清での感染＋自動的顕微鏡による細胞数の決定。
５日目：指示薬細胞の溶解及びウィルス複製を定量化するためのルシフェラーゼアッセイの実施。
【００７３】
インフルエンザ関連キナーゼの同定のために、このルミネッセンス値を、細胞数に対して標準化した（ｓｉＲＮＡ感染及びウィルス感染後に測定）。これにより、より低い（又はより高い）細胞数のための非特異的な作用が最小限にされる。
【００７４】
複数のコントロールを含め、この全体のスクリーニング手順の間の正確なアッセイを実施できる（図２）。このウィルス核タンパク質に対するコントロールｓｉＲＮＡは、非感染細胞のレベルにこの複製を減少させることができた。
【００７５】
この阻害のパーセンテージでの説明は、いくつかのｓｉＲＮＡが、このインフルエンザウィルス複製を促進でき、その一方で、この他のものは、この複製を、インフルエンザＮＰ遺伝子に対する、抗ウィルス性のコントロールｓｉＲＮＡに比較して、より強力に阻害することができる（図３）。これにより、４７ｓｉＲＮＡは、この複製を５０％よりも多く減少させ、９ｓｉＲＮＡは、８０％よりも多い阻害を示した。この結果の列記は、表１ａ及び１ｂ中に提供されていて、これは、ウィルス複製の％における、活性（表１ａ、「ネガティブな」阻害）及び阻害（表１ｂ）を示し、これは細胞数に対して標準化されていて、かつ、この標準偏差は、４つの独立した実験を用いて計算されている。
【００７６】
同様の結果は、ｚ−スコアの計算を用いて得られた。このｚスコアは、この生スコアと母集団平均の間での、標準偏差単位における、距離を示す。ｚスコアを、以下の式を用いて計算した：
【数１】
2010505897.tif 000003
［式中、Ｘは、標準化されるべき生スコアであり、σは集団の標準偏差であり、かつ、μは集団の平均である］
実施例２
将来の実験において、抗ウィルス性作用が、より詳細に、個々のｓｉＲＮａをプールされた（pooled）ｓｉＲＮＡの代わりに使用することにより、評価されるであろう。更に、新規のｓｉＲＮＡ（同定された遺伝子につき、少なくとも２つの更なるｓｉＲＮＡ）が、この実施例１の実験的構成を用いて試験されるだろう。これらの確認された遺伝子は、インフルエンザウィルスの複製のために重要であるように見え、経鼻により投与されるｓｉＲＮＡを用いてマウス中でノックダウンされるだろう。この抗ウィルス療法の評価については、この化合物の肺上皮組織に対する輸送効率を決定することが最も重要である。療法の成功は、高い効率のキナーゼ阻害剤及び適当な輸送系の組み合わせに依存する。可能性のある相容性のかつコスト的に効率的な剤は、キトサンであり、これは、インビボ研究において成功してｓｉＲＮＡｓの輸送のために適用している。この化合物を経鼻的に適用するか、又は、この化合物を、直接的に肺中に投与するだろう。
【００７７】
効率的なｓｉＲＮＡは、減少したウィルス力価を肺組織中で生じるべきであり、かつ、このために、動物は、生じうる致命的なインフルエンザウィルス感染に対して保護されるべきである。
【００７８】
このキナーゼ阻害剤の生物学的な作用の試験のために、我々は、この実験を４つの部分に分けるだろう。
１．化合物／キトサンナノ粒子の経鼻適用後の、呼吸器官中でのキナーゼ阻害剤分布の分析。
この化合物／キトサン濃度の、最良の有効性のための最適化。更に、試験は、成功の場合にのみ実施されるだろう。
２．ＬＤ５０試験において、単離体インフルエンザウィルスＡ／プエルトリコ／Ｓ／３４及びトリインフルエンザウィルス単離体（試験４のため）の絶対的な病原性が確立されるだろう。
３．インフルエンザＡウィルス／プエルトリコ／８／３４での経鼻適用及び感染後の選択されたｓｉＲＮＡの抗ウィルス性作用の、肺組織中でのウィルス力価又は生存率の分析による試験（特定の場合において）。
４．高度に病原性のトリインフルエンザウィルス単離体（例えばＨ５Ｎ１）での経鼻適用及び感染後の選択されたｓｉＲＮＡの抗ウィルス性作用の、肺組織中でのウィルス力価又は生存率の分析による試験（特定の場合において）。
【００７９】
この使用されたウィルス単離体は、現在の発展及びトリインフルエンザの拡大に依存している。我々は、インビボにおける現在の一般的な株の複製を効率的に阻害することを目的とする。
【００８０】
確認された遺伝子に対するキナーゼ阻害剤はまた、損なわれたウィルス複製に関してマウス中でも試験されるだろう。
【００８１】
マックスプランク感染生物学研究所（Max-Planck-lnstitut fuer Infektionsbiologie）（ベルリン、ドイツ国）は、ゲノム全域ＲＮＡｉライブラリーを有し、原則的に、全ての個々のヒトの遺伝子のシャッフリングオフ（shutting-off）を適した細胞培養体（Ａ５４９遺伝子）中で可能にする。従って、次の段階においては、このスクリーンは、ゲノム全域スケールに拡大されるものであり、というのも、ウィルスの吸着、複製及び出芽に関連する多くの更なる細胞内因子が、まだなお未知であるからである。
【００８２】
実施例３
更なるｓｉＲＮＡｓ（キナーゼ又はキナーゼ結合タンパク質に対するｓｉＲＮＡｓのみでなく）も、インフルエンザＡウィルスの複製の減少に関して評価されるだろう。これらのｓｉＲＮＡｓの評価のためには、細胞数が、市販の細胞生存アッセイ（自動化した顕微鏡を使用する代わりに）を用いることにより、非直接的に定量化されている点、及び、これらのｓｉＲＮＡｓが、逆トランスフェクションされる、即ち、細胞が、３８４ウェルプレート中に既に、調製されたｓｉＲＮＡトランスフェクションミックスに添加されるだろう点を除き、実施例１に説明されたものと同じである実験的構成が使用されるだろう。
【００８３】
実施例４
ヒトゲノムのうち、数百の遺伝子は、インフルエンザウィルスの複製に関連していると予想される。従って、キナーゼ及びキナーゼ結合因子（実施例１に説明されるとおり）のスクリーニング手順は、ゲノム全域スケールへと拡大され、これは、全ての既知のヒトの遺伝子を、約５９８８８個のｓｉＲＮＡｓを使用することにより、分析する。
【００８４】
この実験的構成は、実施例１にて説明されたものと同様に実施されたが、次の点で異なる：
・スクリーンは、５９８８６個のｓｉＲＮＡｓを用いてゲノム全域レベルに拡大された。
・細胞は３８４ウェルプレート中に播種された。
・極めて多数のトランスフェクションされた細胞のために、全ての細胞数が自動化顕微鏡により分析されることはできなかった。
・ｓｉＲＮＡｓは、新規に播種されたＡ５４９細胞中に、トランスフェクション剤HiperFect (Qiagen, Hilden, ドイツ国）を用いて逆トランスフェクションされた。
・特定の遺伝子のノックダウンを、独立して、特定の遺伝子に対して特異的な、４個までのｓｉＲＮＡ（"標的配列１"、"標的配列２"、"標的配列３"、及び"標的配列４"、表４中）により、実施した。
・更なるコントロールを含めた：ネガティブコントロールとして、"AllStars Negative Control siRNA"（Qiagen, Hilden, ドイツ国, 注文番号1027280）。
ＰＫＭＹＴに対して指向したｓｉＲＮＡｓ（GenelD: 9088, GenBank アクセッション番号: NM_182687, 標的配列:CTGGGAGGAACTTACCGTCTA）をポジティブコントロールとして（インフルエンザ複製に対する細胞因子として）、ＰＬＫに対して指向したｓｉＲＮＡｓ（GenelD: 5347, GenBank アクセッション番号: BC014135, 標的配列:CCGGATCAAGAAGAATGAATA）をトランスフェクションコントロールとして（トランスフェクション後の細胞毒性）。
・選択したウェル中でのトランスフェクションしたＡ５４９細胞の感染割合を、自動化顕微鏡により、阻害性の作用をこの感染プロセスの間の早期の又は後期の事象に区別できるよう測定した。
・結果を、統計学的なＲパッケージ"cellHTS"ソフトウェアにより分析し、これは、Michael Butros, Ligia Bras及びWolfgang Huberにより開発され、そして、Ｂスコア通常化した方法を用いた（"Allstars Negative Control siRNA"トランスフェクションしたコントロールウェルに基づき）。・読み取りは、ウィルス複製の阻害である。
【００８５】
強力な抗ウィルス活性（ｚスコア＜−２．０）を示すｓｉＲＮＡｓ及び相応する遺伝子を表４中に列記する。
【００８６】
細胞を基礎とするアッセイは、以下の工程（図５も参照のこと、これはゲノム全域ｓｉＲＮＡスクリーンの実験的な構成を説明する）を含んだ：
１日目：Ａ５４９細胞（肺上皮細胞）の播種＋ｓｉＲＮＡｓの逆トランスフェクション、
３日目：インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３での感染＋２９３Ｔ細胞ｚｑの指示薬プラスミドでのトランスフェクション、
４日目：Ａ５４９細胞の上清での２９３Ｔ細胞の感染＋ホルムアルデヒドでのＡ５４９細胞の固定、
５日目：２９３Ｔ細胞中でのウィルス複製の定量のためのルシフェラーゼアッセイ、
ｘ日目：自動化顕微鏡による感染割合の決定。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図５−１１】
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【図５−１３】
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【図５−１９】
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【図５−２８】
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【図５−２９】
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【図５−３０】
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【図５−４０】
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【図５−９４】
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【図５−１３３】
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【図５−１４３】
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【図５−１４４】
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【図５−１４９】
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【図５−１５０】
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【図５−１７１】
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【図５−１７２】
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【図５−１７３】
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【図５−１７４】
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【図５−１７５】
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【図５−１７６】
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【図５−１７７】
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【図５−１７９】
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【図５−１８０】
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【図５−１８１】
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【図５−１８３】
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【図５−１８４】
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【図５−１８５】
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【図５−１８６】
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【図５−１８７】
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【図５−１８８】
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【図５−１８９】
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【図５−１９０】
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【図５−１９１】
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【図５−１９２】
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【図５−１９３】
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【図５−１９４】
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【図５−１９５】
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【図５−１９６】
2010505897.tif 000203
【図５−１９７】
2010505897.tif 000204
【図５−１９８】
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【配列表】
2010505897000001.app
【国際調査報告】
2010505897.tif 000206
2010505897.tif 000207
2010505897.tif 000208
2010505897.tif 000209
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