(57)【要約】本発明は成長ホルモンならびにプロラクチンおよび胎盤性ラクトゲンおよびその他のホルモンを含む関連ホルモンの新規の阻害剤を包含する。本発明は、特に、抗体、抗体フラグメントおよびそれらの修飾型、ならびにアンチセンスポリヌクレオチド、干渉RNAおよび低分子干渉RNAのようなポリヌクレオチド、ならびに上記のようなホルモンの一つまたはいくつかを阻害するためのそれらの用途を包含する。特定の局面において、本発明はこのような阻害剤、これらの阻害剤の一つまたはいくつかを含む組成物を作成する方法、および該阻害剤の一つまたはいくつかを用いて例えば特に癌細胞において細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性の阻害など、細胞を阻害する方法を包含する。本発明はまた、開示される組成物または阻害剤の一つまたはいくつかを用いて、特に癌に対する、診断およびモニタリングの方法、ならびに治療の方法も包含する。2010530215.tif 000016
2010530215.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の増殖または生存性を阻害する方法であって、該細胞を以下に対する阻害剤と接触させる工程を含む、方法：
（a）ヒト成長ホルモン遺伝子クラスターの遺伝子メンバー、プロリフェリン遺伝子もしくはプロラクチン遺伝子；または
（b）ヒト成長ホルモン遺伝子クラスターの遺伝子メンバー、プロリフェリン遺伝子もしくはプロラクチン遺伝子のペプチド産物。
【請求項２】
それを必要とする対象において癌、細胞増殖性疾患または細胞生存性疾患（cell survival disorder）を治療または予防するための方法であって、該細胞を以下に対する阻害剤と接触させる工程を含む、方法：
（a）ヒト成長ホルモン遺伝子クラスターの遺伝子メンバー、プロリフェリン遺伝子もしくはプロラクチン遺伝子；または
（b）ヒト成長ホルモン遺伝子クラスターの遺伝子メンバー、プロリフェリン遺伝子もしくはプロラクチン遺伝子のペプチド産物。
【請求項３】
ヒト成長ホルモン遺伝子クラスターの遺伝子メンバーがヒト成長ホルモン1（hGH1）遺伝子、ヒト成長ホルモン2（hGH2）遺伝子、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン1（CSH1）遺伝子、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン2（CSH2）遺伝子、絨毛性ソマトマンモトロピン様ホルモン（CSL）遺伝子、絨毛性ソマトマンモトロピン様2ホルモン（CSL-2）遺伝子、絨毛性ソマトマンモトロピン様3ホルモン（CSL-3）遺伝子、および絨毛性ソマトマンモトロピン様4ホルモン（CSL-4）遺伝子からなる群より選択される、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
プロリフェリン遺伝子がプロリフェリンまたはプロリフェリン関連タンパク質の遺伝子である、請求項1または2記載の方法。
【請求項５】
プロラクチン遺伝子がプロラクチンまたはプロラクチン関連タンパク質の遺伝子である、請求項1または2記載の方法。
【請求項６】
阻害剤がヒト成長ホルモン遺伝子クラスターの遺伝子メンバー、プロリフェリン遺伝子またはプロラクチン遺伝子のペプチド産物の発現を阻害することができる単離されたsiRNAである、請求項1または2記載の方法。
【請求項７】
阻害剤がヒト成長ホルモン遺伝子クラスターの遺伝子メンバーのペプチド産物の発現を阻害することができる単離されたsiRNAである、請求項1または2記載の方法。
【請求項８】
ヒト成長ホルモン遺伝子クラスターの遺伝子メンバーのペプチド産物が、プロラクチン（PRL）、プロラクチン関連タンパク質、成長ホルモン1（GH1）、成長ホルモン2（GH2）、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン1（CSH1）、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン2（CSH2）、絨毛性ソマトマンモトロピン様ホルモン（CSL）、絨毛性ソマトマンモトロピン様2ホルモン（CSL-2）、絨毛性ソマトマンモトロピン様3ホルモン（CSL-3）、絨毛性ソマトマンモトロピン様4ホルモン（CSL-4）、プロリフェリン、およびプロリフェリン関連タンパク質からなる群より選択される、請求項1、2、6または7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
プロリフェリン遺伝子のペプチド産物がプロリフェリンまたはプロリフェリン関連タンパク質である、請求項1、2、6または7のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
プロラクチン遺伝子のペプチド産物がプロラクチンまたはプロラクチン関連タンパク質である、請求項1、2、6または7のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
単離されたsiRNAがSEQ ID NO：33〜60および97〜98からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
阻害剤がヒト成長ホルモン遺伝子クラスターの遺伝子メンバー、プロリフェリン遺伝子またはプロラクチン遺伝子のペプチド産物の線形エピトープまたは立体構造エピトープに結合する抗体である、請求項1または2記載の方法。
【請求項１３】
阻害剤がヒト成長ホルモンポリペプチドまたはヒトプロラクチンポリペプチドに結合する抗体である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
ヒト成長ホルモンポリペプチドがSEQ ID NO：10〜20からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
ヒトプロラクチンポリペプチドがSEQ ID NO：21〜26からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍細胞が上皮腫瘍細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
上皮腫瘍細胞が肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌および子宮内膜癌から選択される腫瘍に由来する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
細胞増殖性疾患が子宮内膜症である、請求項2記載の方法。
【請求項１９】
化学療法剤または抗新生物剤である第二の化合物を投与する段階をさらに含む、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
ヒト成長ホルモンポリペプチドの立体構造エピトープに結合する、ヒト成長ホルモンポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２１】
立体構造エピトープが表2に示される立体構造エピトープより選択される、請求項20記載の抗体。
【請求項２２】
ヒト成長ホルモンポリペプチドの配列エピトープ（sequential epitope）に結合する、ヒト成長ホルモンポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２３】
配列エピトープが表3に示される配列エピトープより選択される、請求項22記載の抗体。
【請求項２４】
表1に示される抗原決定基より選択される抗原決定基を含む、ヒト成長ホルモンポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２５】
ヒトプロラクチンポリペプチドの立体構造エピトープに結合する、ヒトプロラクチンポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２６】
立体構造エピトープが、表5に示される立体構造エピトープより選択される、請求項25記載の抗体。
【請求項２７】
表4に示される抗原決定基より選択される抗原決定基を含む、ヒトプロラクチンポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２８】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項20〜27のいずれか一項記載の抗体を含む組成物。
【請求項２９】
ヒト成長ホルモンポリペプチドの発現を阻害することができる、SEQ ID NO：33〜39および97〜98からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたsiRNA。
【請求項３０】
RNA二本鎖を形成するセンスRNA鎖およびアンチセンスRNA鎖を含み、SEQ ID NO：40〜60からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、かつ、ヒト成長ホルモンポリペプチドの発現を阻害することができる、単離されたsiRNA。
【請求項３１】
ヒト成長ホルモンポリペプチドがプロラクチン（PRL）、プロラクチン関連タンパク質、成長ホルモン1（GH1）、成長ホルモン2（GH2）、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン1（CSH1）、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン2（CSH2）、絨毛性ソマトマンモトロピン様ホルモン（CSL）、絨毛性ソマトマンモトロピン様2ホルモン（CSL-2）、絨毛性ソマトマンモトロピン様3ホルモン（CSL-3）、絨毛性ソマトマンモトロピン様4ホルモン（CSL-4）、プロリフェリン、およびプロリフェリン関連タンパク質からなる群より選択される、請求29または30記載のsiRNA。
【請求項３２】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項29〜31のいずれか一項記載のsiRNAを含む組成物。
【請求項３３】
対象において癌、細胞増殖性疾患または細胞生存性疾患を診断する方法であって、該対象に由来する試験試料を請求項20〜27のいずれか一項記載の抗体と接触させる工程、および該試料に結合する抗体の値を検出する工程を含み、対照試料における結合の値と比較した該試料における抗体結合の値の増加が癌、細胞増殖性疾患または細胞生存性疾患の存在を示す、方法。
【請求項３４】
癌が上皮癌である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
上皮癌が肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮内膜癌より選択される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
細胞増殖性疾患が子宮内膜症である、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
対象がヒト対象である、請求項1〜19または33〜36のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
この非仮出願は2007年5月30日に出願されて参照としてその全体が本明細書に組み入れられるU.S.S.N. 60/940,939に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は成長ホルモンおよび関連するホルモン、特にプロラクチンおよび胎盤性ラクトゲン、ならびに本明細書に記載されるその他のホルモンの新規の阻害剤に関する。本発明は、特に、成長ホルモンおよび／または関連ホルモンの阻害に対する抗体、抗体フラグメント、およびその修飾型、ならびにアンチセンスポリヌクレオチド、干渉RNAおよび低分子干渉RNAのようなポリヌクレオチド、ならびにそれらの使用に関する。特定の局面において、発明はこのような阻害剤を産生する方法、これらの阻害剤の一つまたはいくつかを含む組成物、および一つまたはいくつかの阻害剤を用いて特に癌細胞において、例えば細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性の阻害などの細胞を阻害する方法に関する。発明は、特に一つまたはいくつかの開示された組成物または阻害剤を用いて、特に癌細胞における診断およびモニタリングの方法ならびに治療の方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒト成長ホルモン（hGH）は成長、発育および性成熟において中心的な役割を果たし、1944年に単離されて以来、幅広く調べられている（C.H. Li, H.M. Evans, Isolation of pituitary growth hormone, Science 99 (1944) 183-184（非特許文献1））。内分泌性hGHは下垂体前葉から分泌されて、身体成長の調節に対して直接的な影響を及ぼす。この影響は膜結合型成長ホルモンレセプター（GHR）との相互作用を介して調節される（T. Zhu, E.L. Goh, R. Graichen, L. Ling, P.E. Lobie, Signal transduction via the growth hormone receptor, Cell Signal 13 (2001) 599-616（非特許文献2）; D. Le Roith, C. Bondy, S. Yakar, J.L. Liu, A. Butler, The somatomedin hypothesis: 2001, Endocr. Rev. 22 (2001) 53-74（非特許文献3）において総評）。主なメカニズムとして、hGHは肝臓IGF-1分泌の刺激を介して成長を促進する（D. Le Roith, C. Bondy, S. Yakar, J.L. Liu, A. Butler, The somatomedin hypothesis: 2001, Endocr. Rev. 22 (2001) 53-74（非特許文献3）において総評）。それにも関わらず、hGHは成長に対して多くのIGF-1非依存性の作用も発揮する。
【０００４】
下垂体前葉からのhGHの分泌は成長ホルモン放出ホルモン（GHRH）およびグレリンによって誘発されて、ソマトスタチン（SS）によって負の制御を受ける。しかし、hGHの合成は体内の多くの下垂体以外の部位においても起こる。このように、hGHは内分泌のレベルで作用するが重要なオートクリンおよびパラクリン活性も有する（例えば、D. Le Roith, C. Bondy, S. Yakar, J.L. Liu, A. Butler, The somatomedin hypothesis: 2001, Endocr. Rev. 22 (2001) 53-74（非特許文献3）; N. Liu, H.C. Mertani, G. Norstedt, J. Tornell, P.E. Lobie, Mode of the autocrine/paracrine mechanism of growth hormone action, Exp. Cell. Res. 237 (1997) 196-206（非特許文献4）; S. Harvey, K.L. Hull, Growth hormone. A paracrine growth factor? Endocrine 7 (1997) 267-279（非特許文献5）を参照）。hGHの下垂体以外での分泌は中枢神経系内の非連続のニューロン集団、乳腺の上皮細胞、血管線維芽細胞の内皮細胞、胸腺上皮細胞、ならびにマクロファージ、B細胞、T細胞およびナチュラルキラー細胞を含む免疫系の細胞を含む多くの部位に局在している（例えば、N. Liu, H.C. Mertani, G. Norstedt, J. Tornell, P.E. Lobie, Mode of the autocrine/paracrine mechanism of growth hormone action, Exp. Cell. Res. 237 (1997) 196-206（非特許文献4）; S. Harvey, K.L. Hull, Growth hormone. A paracrine growth factor? Endocrine 7 (1997) 267-279（非特許文献5）、および本明細書の参照を参照）。
【０００５】
GHは、プロラクチン（PRL）および胎盤性ラクトゲン（PL）、ならびに内皮細胞または周囲の細胞によって局所的に産生され得る余り知られていないメンバーであるプロリフェリンおよびプロリフェリン関連タンパク質を含むホルモンのファミリーに属する（AM Corbacho et al., Journal of Endocrinology, 2002, 173, 219-238（非特許文献6）により総評）。このファミリーの古典的なメンバーであるGH、PRLおよびPLのペプチドホルモンは広く見られる先祖遺伝子から生じたと考えられている相同タンパク質である。PRLおよびGHは主としてすべての脊椎動物の下垂体前葉より分泌されて、PLは哺乳動物にのみ存在して胎盤によって分泌される。これらの3つのホルモンは多くの構造および生物学的な特徴を共有する。GH、PLおよびPRLの間のmRNAおよびタンパク質レベルでの類似性は広範囲に特徴づけられている（Nicoll CS, Mayer GL & Russell SM 1986 Structural features of prolactins and growth hormones that can be related to their biological properties. Endocrine Reviews 7 169-203（非特許文献7）, Goffin V, Shiverick KT, Kelly PA & Martial JA 1996b Sequence-function relationships within the expanding family of prolactin, growth hormone, placental lactogen and related proteins in mammals. Endocrine Reviews 17 385-410（非特許文献8）; Kelly PA 1990 Growth hormone and prolactin. In Hormones from Molecules to Disease, pp 190-217. Eds E-E Baulieu & PA Kelly. Paris: Herman, Publishers in Arts and Science（非特許文献9））。
【０００６】
癌の増殖を停止させるための特異的な経路のターゲティングは、毒性が低く耐用性が高いことから、新薬開発のための代替となる方法として登場した。例えば、EGFRおよびHER2レセプターに対する多くの化合物が臨床開発に進んでおり、現在、臨床試験が行われている。一つの特定の例として、Herceptin（登録商標）はHER2の機能のターゲティングおよび遮断のためのヒト化したモノクローナル抗体として開発されている。さらに、Tykerb（登録商標）は上皮増殖因子レセプター（EGFR）およびヒト上皮増殖因子レセプター2（HER-2）に対する二重チロシンキナーゼ阻害剤として開発されている。依然として、新しい抗癌剤の必要性が引き続き存在する。特に、癌細胞の増殖を阻害するためにターゲティングすることができる特異的な遺伝子およびタンパク質を同定する必要がある。本発明はこの必要性およびその他の必要性を満たすものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】C.H. Li, H.M. Evans, Isolation of pituitary growth hormone, Science 99 (1944) 183-184
【非特許文献２】T. Zhu, E.L. Goh, R. Graichen, L. Ling, P.E. Lobie, Signal transduction via the growth hormone receptor. Cell Signal 13 (2001) 599-616
【非特許文献３】D. Le Roith, C. Bondy, S. Yakar, J.L. Liu, A. Butler, The somatomedin hypothesis: 2001, Endocr. Rev. 22 (2001) 53-74
【非特許文献４】N. Liu, H.C. Mertani, G. Norstedt, J. Tornell, P.E. Lobie, Mode of the autocrine/paracrine mechanism of growth hormone action, Exp. Cell. Res. 237 (1997) 196-206
【非特許文献５】S. Harvey, K.L. Hull, Growth hormone. A paracrine growth factor? Endocrine 7 (1997) 267-279
【非特許文献６】AM Corbacho et al., Journal of Endocrinology, 2002, 173, 219-238
【非特許文献７】Nicoll CS, Mayer GL & Russell SM 1986 Structural features of prolactins and growth hormones that can be related to their biological properties. Endocrine Reviews 7 169-203
【非特許文献８】Goffin V, Shiverick KT, Kelly PA & Martial JA 1996b Sequence-function relationships within the expanding family of prolactin, growth hormone, placental lactogen and related proteins in mammals. Endocrine Reviews 17 385-410
【非特許文献９】Kelly PA 1990 Growth hormone and prolactin. In Hormones from Molecules to Disease, pp 190-217. Eds E-E Baulieu & PA Kelly. Paris: Herman, Publishers in Arts and Science
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ヒト成長ホルモン遺伝子クラスターの一つまたはいくつかのメンバー、プロラクチン（PRL）遺伝子、および／またはプロリフェリン遺伝子、ならびにそれらのそれぞれの遺伝子産物（即ち、ペプチド）のような、成長ホルモン（GH）および関連ホルモンの遺伝子およびそれぞれの遺伝子産物のための阻害剤を包含する。ヒト成長ホルモン遺伝子クラスターのメンバーは、ヒト成長ホルモン1（hGH1）遺伝子、成長ホルモン2（hGH2）遺伝子、ヒト絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン1（CSH1）遺伝子（ヒト胎盤性ラクトゲン（PL、例えば、hPL-1、hPL-2、hPL-3）としても公知である）、ヒト絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン2（CSH2）遺伝子、ヒト絨毛性ソマトマンモトロピン様ホルモン（CSL）遺伝子、ヒト絨毛性ソマトマンモトロピン様2ホルモン（CSL-2）遺伝子、ヒト絨毛性ソマトマンモトロピン様3ホルモン（CSL-3）遺伝子、ヒト絨毛性ソマトマンモトロピン様4ホルモン（CSL-4）遺伝子、またはそれらの任意の変異型を含む。ヒト成長ホルモン遺伝子クラスターのメンバーをコードする遺伝子の例は、GenBankアクセッション番号AAA72260、AAK69708、NP_001308、NP_002050、AAA98621、AAA39404、NP_851350、NP_072171、NP_066271、NP_072170、NP_001308、NP_072167およびNP_072166に記載されるアミノ酸配列を含むが、これらに限定されるものではない。プロラクチンの遺伝子はプロラクチン遺伝子、プロラクチン関連タンパク質遺伝子またはその任意の変異型を含むが、これらに限定されるものではない。プロラクチンをコードする遺伝子の例は、GenBankアクセッション番号CAA38264、NP_000939、CAA25214、CAA25108、AAH88370、CAA23829、およびCAA38265に記載されるアミノ酸配列を含むが、これらに限定されるものではない。プロリフェリンの遺伝子はプロリフェリン遺伝子、プロリフェリン関連タンパク質遺伝子またはその任意の変異型を含むが、これらに限定されるものではない。プロリフェリンをコードする遺伝子の例は、GenBankアクセッション番号S48671に記載されるアミノ酸配列を含むが、これらに限定されるものではない。
【０００９】
ヒト成長ホルモン遺伝子クラスターの遺伝子産物は、ヒト成長ホルモン1（hGH1）、成長ホルモン2（hGH2）、ヒト絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン1（CSH1）（ヒト胎盤性ラクトゲン（PL、例えば、hPL-1、hPL-2、hPL-3）としても公知である）、ヒト絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン2（CSH2）、ヒト絨毛性ソマトマンモトロピン様ホルモン（CSL）、ヒト絨毛性ソマトマンモトロピン様2ホルモン（CSL-2）、ヒト絨毛性ソマトマンモトロピン様3ホルモン（CSL-3）、ヒト絨毛性ソマトマンモトロピン様4ホルモン（CSL-4）、またはそれらの任意の変異型を含む。プロラクチン遺伝子の遺伝子産物はプロラクチンおよびプロラクチン関連タンパク質を含むがこれらに限定されるものではない。プロリフェリンに関する遺伝子産物はプロリフェリンおよびプロリフェリン関連タンパク質を含むがこれらに限定されるものではない。
【００１０】
本発明に基づく成長ホルモン用阻害剤は、抗体、ならびにアンチセンスポリヌクレオチド、干渉RNA（iRNA）および低分子干渉RNA（siRNA）を含むポリヌクレオチドのような阻害剤を含む。
【００１１】
一つの局面において、本発明は、GHおよび／もしくは関連ホルモンまたはその変異型に対する抗体、および抗体フラグメント、ならびにその修飾型を包含する。本発明の抗体は、hGH、プロラクチンもしくはプロリフェリンポリペプチド、および／または例えばhGH1、hGH2、hPRLもしくはhPLのようなその変異型に特異的に結合する能力によって特徴付けられる。本発明の抗体が特異的に結合するhGH、hPRLおよび／またはhPLポリペプチドは該hGH、hPRLおよび／またはhPLポリペプチド上の一つまたはいくつかの立体構造エピトープ（および／または配列エピトープ（sequential epitope）を含む。hGHポリペプチドまたはその変異型の立体構造エピトープおよび配列エピトープは、本明細書に記載される通り、それぞれ、表2に示される立体構造エピトープ、および表3に示される配列エピトープを含むが、これらに限定されるものではない。hPRLポリペプチドの立体構造エピトープは、本明細書に記載される通り、表5に示される立体構造エピトープを含むがこれらに限定されるものではない。本発明の抗体は、本明細書において表1および4に記載される抗原決定基のような、hGH、hPRL、および／またはhPLなどの成長ホルモンポリペプチドの抗原決定基を含み得る。
【００１２】
特定の局面において、本発明はGHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体、および抗体フラグメント、ならびにその修飾型を包含する。一部の局面において、抗体は、例えばSEQ ID NO：1〜26の少なくとも一つ、好ましくはSEQ ID NO：10〜26の少なくとも一つのポリペプチドまたはその修飾された配列に向けられる。様々な局面において、抗体は固有のポリペプチド、このポリペプチドに由来する任意のペプチド、これらのポリペプチドもしくはペプチドの任意の修飾型（例えば、一次構造が前記ホルモンの配列に基づく場合）、または前記ホルモンの3D構造を模倣する任意のポリペプチドもしくはペプチドに向けられる。
【００１３】
もう一つの特定の局面において、本発明はポリクローナル抗体、抗体フラグメントまたはその修飾型を包含する。
【００１４】
さらなる特定の局面において、本発明はモノクローナル抗体、抗体フラグメントまたはその修飾型を包含する。
【００１５】
もう一つの局面において、本発明は、例えばアンチセンスポリヌクレオチド、iRNAおよびsiRNAを含む、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRLまたはhPLの阻害性ポリヌクレオチドを包含する。
【００１６】
特定の局面において、阻害剤は使用時にGHおよび／または関連ホルモンを阻害するために適合されたポリヌクレオチドである。具体的な局面において、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO：27〜96のヌクレオチド配列またはその修飾配列の少なくとも一つを含む。より具体的には、該剤はGHおよび／または関連ホルモン転写物に対するアンチセンス核酸；使用時にこのようなアンチセンスを発現するために適合された核酸；GHおよび／または関連ホルモン転写物に対するiRNA；ならびに使用時にこのようなiRNAを発現するために適合された核酸からなる群より選択される。
【００１７】
その他の特定の局面において、本発明はGHおよび／もしくは関連ホルモン転写物に対する単離されたiRNA（例えば、siRNA）、またはGHおよび／もしくは関連ホルモン転写物に対するiRNAを発現するために使用されている適合された核酸を包含する。具体的な局面において、単離されたiRNAはSEQ ID NO：33〜60もしくは97〜98のヌクレオチド配列またはその修飾配列の任意の一つを含む。いくつかの局面において、単離されたiRNAは二本鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み得る。このようなアンチセンスポリヌクレオチドおよびiRNA、特にsiRNAは、例えばSEQ ID NO：27〜32またはその修飾配列などの、GHおよび／または関連ホルモンに対するポリヌクレオチドおよび／またはペプチド産物の発現を阻害することができる。
【００１８】
その他の局面において、本発明はこれらのアンチセンスポリヌクレオチドまたはiRNAを作成するための発現ベクターおよび宿主細胞を包含する。本発明はまた、少なくとも一つの発現ベクターを含む、例えば微生物宿主細胞の宿主細胞もさらなる特徴とする。
【００１９】
もう一つの局面において、本発明はGHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLの遺伝子およびそれぞれの遺伝子産物（即ち、ペプチド）を阻害する方法であって、本発明に従ってGHおよび／または関連ホルモンを抗体もしくは抗体フラグメントまたはその修飾型に接触させる工程を含む方法を包含する。特定の局面において、本方法はGHおよび／または関連ホルモンの活性または発現レベルを低下させるために用いられる。
【００２０】
さらなる局面において、本発明はGHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLの遺伝子およびそれぞれの遺伝子産物（即ち、ペプチド）を阻害する方法であって、本発明に従ってGHおよび／または関連ホルモンのポリヌクレオチドをアンチセンス、iRNAまたはsiRNAのようなポリヌクレオチド阻害剤と接触させる工程を含む方法を包含する。特定の局面において、本方法はGHおよび／または関連ホルモンの活性または発現レベルを低下させるために用いられる。
【００２１】
さらなる局面において、本発明はGHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLの相互作用を阻害する方法であって、本発明に従ってレセプターを抗体もしくは抗体フラグメントまたはその修飾型と接触させる工程を含む方法を包含する。
【００２２】
さらなる局面において、本発明は細胞、特に腫瘍細胞（例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮内膜癌、および／または子宮内膜症に由来する細胞のような上皮腫瘍細胞）の増殖、生存性および／または運動性を阻害する方法を包含する。具体的には、本方法は本明細書に記載される通りGHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRLまたはhPLの少なくとも一つの阻害剤の使用を含んでもよく、細胞を該阻害剤と接触させる工程を含む。特定の局面において、阻害剤は、本明細書に記載される通り、抗体もしくは抗体フラグメントまたはその修飾型である。その他の特定の局面において、阻害剤は、本明細書に記載される通り、アンチセンス、iRNAまたはsiRNAのようなポリヌクレオチド阻害剤、もしくはフラグメント、またはその修飾型である。
【００２３】
関連する局面において、本発明はそれを必要とする対象において癌（乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮内膜癌を含むがこれらに限定されない）のような疾患、腫瘍増殖疾患（子宮内膜症を含むがこれに限定されない）、および／または細胞生存性疾患（cell survival disorder）を治療または予防する方法であって、該細胞をヒト成長ホルモンおよび／もしくは関連ホルモンまたはその変異型の阻害剤と接触させる工程を含む方法を包含する。hGH阻害剤は単独で、または化学療法剤または抗腫瘍薬剤のような第二の治療用化合物と（同時にまたは連続して）組み合わせて投与してもよい。例えば、細胞と阻害剤の接触は、本明細書に記載されるような抗体、抗体フラグメントまたはその修飾型を含むがこれらに限定されない本明細書に記載される阻害剤の一つまたはいくつかの有効量を対象に投与することによって達成することができる。
【００２４】
もう一つの関連する局面において、本発明はそれを必要とする対象において癌（乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮内膜癌を含むがこれらに限定されない）のような疾患、腫瘍増殖疾患（子宮内膜症を含むがこれに限定されない）、および／または細胞生存性疾患を治療または予防する方法であって、細胞をhGHおよび／もしくは関連ホルモンまたはその変異型の阻害剤と接触させる工程を含む方法を包含する。hGH阻害剤は単独で、または化学療法剤もしくは抗腫瘍剤のような第二の治療用化合物と（同時にまたは連続して）組み合わせて投与してもよい。例えば、細胞と阻害剤の接触は、本明細書に従ってアンチセンス、iRNAまたはsiRNAのようなポリヌクレオチド阻害剤を含むがこれらに限定されない本明細書に記載される阻害剤の一つまたはいくつかの有効量を対象に投与することによって達成することができる。
【００２５】
もう一つの局面において、本発明は試料中におけるGHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLの存在またはレベルを検出する方法であって、該試料を本明細書に記載されるように抗体、抗体フラグメントまたはその修飾型の一つまたはいくつかと接触させる工程を含む方法を包含する。特定の局面において、試料は生物学的な液体または組織である。
【００２６】
さらにもう一つの局面において、本発明は試料中におけるGHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLの存在またはレベルを検出する方法であって、該試料を本明細書に記載されるようにポリヌクレオチド、フラグメントまたはその修飾型の一つまたはいくつかと接触させる工程を含む方法を包含する。特定の局面において、試料は生物学的な液体または組織である。
【００２７】
さらなる局面において、本発明は、対象（例えば、ヒト対象）における癌（乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、および／または子宮内膜癌のような上皮癌を含むがこれらに限定されない）、細胞増殖性疾患（子宮内膜症を含むがこれに限定されない）、および／または細胞生存性疾患のような疾患を診断またはモニターする方法であって、該対象からの試料を本明細書に記載されるような成長ホルモン（GH）および関連ホルモン、特にヒト成長ホルモン（hGH）およびその変異型の遺伝子およびそれぞれのペプチド産物に対する阻害剤と接触させる工程、ならびに該試料における抗体結合の値を対照試料の結合の値と比較して測定する工程を含む方法を包含する。対照試料と比べた該試料中の抗体結合の値の増加は癌、細胞増殖性疾患および／または細胞生存性疾患の存在を示唆する。特定の局面において、対象に由来する試料は生物学的な液体または組織である。
【００２８】
特定の局面において、本発明は、対象（例えば、ヒト対象）における癌（乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、および／または子宮内膜癌のような上皮癌を含むがこれらに限定されない）、細胞増殖性疾患（子宮内膜症を含むがこれに限定されない）および／または細胞生存性疾患のような疾患を診断またはモニターする方法であって、本明細書に記載されるような少なくとも一つの抗体を対象由来の試料と接触させる工程、および該試料中の抗体結合のレベルを対照試料における結合のレベルと比較して測定する工程を含み、対照試料と比較した該試料中の抗体結合のレベルの増加が癌、細胞増殖性疾患および／または細胞生存性疾患の存在を示唆する方法を包含する。
【００２９】
もう一つの特定の局面において、本発明は、対象（例えば、ヒト対象）における癌（乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、および／または子宮内膜癌のような上皮癌を含むがこれらに限定されない）、細胞増殖性疾患（子宮内膜症を含むがこれに限定されない）および／または細胞生存性疾患のような疾患を診断またはモニターする方法であって、本明細書に記載される少なくとも一つの抗体を対象由来の試料と接触させる工程、および該試料中の抗体結合のレベルを対照試料における結合のレベルと比較して測定する工程を含み、対照試料と比較した該試料中の抗体結合の値の増加が癌、細胞増殖性疾患および／または細胞生存性疾患の存在を示唆する方法を包含する。
【００３０】
具体的な局面において、診断またはモニターする方法は前記試験試料におけるGHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRLまたはhPLの値を標準または基準値と比較する工程を含む。特定の局面において発明のこの方法はELISAを用いる。代替的または追加的に、この方法はRIA、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学的染色法、アフィニティークロマトグラフィー、競合結合アッセイ、および凝集試験の一つまたはいくつかを用いる。
【００３１】
もう一つの局面において、本発明は、例えば、本明細書に記載されるような抗体もしくは抗体フラグメントまたはその修飾型の少なくとも一つを含む薬学的組成物である組成物を包含する。具体的な局面において、組成物は一つまたはいくつかの薬学的に許容される希釈剤、担体および／または賦形剤との配合剤を含むことができる。
【００３２】
さらにもう一つの局面において、本発明は、例えば、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチド、もしくはフラグメントまたはその修飾型の少なくとも一つを含む薬学的組成物である組成物を包含する。具体的な局面において、組成物は一つまたはいくつかの薬学的に許容される希釈剤、担体および／または賦形剤との配合剤を含むことができる。
【００３３】
さらなる局面において、本発明は、対象における疾患、特に癌、および特に乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮内膜癌、または子宮内膜症の治療のための医薬の製造における、本明細書に記載されるような抗体、もしくは抗体フラグメント、またはその修飾型の一つまたはいくつかの使用を包含する。
【００３４】
さらなる局面において、本発明は、対象における疾患、特に癌、特に乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮内膜癌、または子宮内膜症の治療のための医薬の製造における、本明細書に記載されるポリヌクレオチドもしくはフラグメント、またはその修飾型の一つまたはいくつかの使用を包含する。
【００３５】
もう一つの局面において、本発明は、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLの単離または精製のための方法における、本明細書に記載される抗体もしくは抗体フラグメント、またはその修飾型の使用を包含する。
【００３６】
さらにもう一つの局面において、本発明は、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子または転写物）、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLの同定のための方法における、本明細書に記載されるポリヌクレオチドもしくはフラグメント、またはその修飾型の使用を包含する。
【００３７】
さらなる局面において、本発明は、対象における疾患、特に癌、特に乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮内膜癌または子宮内膜症を診断、モニターまたは治療するためのキットであって、本明細書に記載される抗体もしくは抗体フラグメントまたはその修飾型の少なくとも一つを含むキットを包含する。
【００３８】
さらなる局面において、本発明は、対象における疾患、特に癌、特に乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮内膜癌または子宮内膜症を診断、モニターまたは治療するためのキットであって、本明細書に記載されるポリヌクレオチドもしくはフラグメントまたはその修飾型の少なくとも一つを含むキットを包含する。
【００３９】
特定の局面において、キットは（a）本明細書に示されるように、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLの少なくとも一つの阻害剤（例えば、ポリヌクレオチドまたは抗体）、ならびに（b）任意で使用のための説明書を含んでよい。
【００４０】
その他の特定の局面において、本発明に基づくキットは、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRL、hPL、もしくはフラグメント、またはその修飾型の既知のレベルを含む一つまたはいくつかの対照試料をさらに含んでもよい。もう一つの局面において、キットはヒト対象から単離された可溶性ホルモンをさらに含むことができる。
【００４１】
その他の特定の局面において、キットは、開示される方法に従って、特に癌、特に乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮内膜癌または子宮内膜症のモニター、診断または治療のための本発明の組成物を含む。
【００４２】
関連する局面において、本発明は、疾患、特に癌、特に乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮内膜癌または子宮内膜症の診断、モニターまたは治療のためのキットの製造における、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRLもしくはhPL、またはそのフラグメントもしくは修飾型の使用をさらに提供する。
【００４３】
様々な局面において、本発明の方法はインビボまたはインビトロにおける発現系を利用する。その他の局面において、方法は、組換え、合成または半合成的な方法によって作成されるポリヌクレオチドもしくは抗体、または内因性の方法によって作成されるポリヌクレオチドもしくは抗体（例えば、天然の成分）を用いる。
【００４４】
本発明は、概して、個々に、または該部分、要素もしくは特徴の二つ以上の任意のまたはすべての組み合わせにおいて集合的に、本出願の本明細書において言及または記載される部分、要素および特徴からなるといえる。また、本発明が属する技術分野において公知の等価物を含む特定の全体物が本明細書において言及される場合、そのような公知の等価物は個々に引用されるかのように本明細書に組み入れられると考えられる。
【００４５】
本発明のその他の局面および態様を、下記に記載する。
【００４６】
そのすべての局面において検討されるべき本発明のこれらおよびその他の局面は、添付の図を参照として、例としてのみ示される下記の説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図1A〜1D：RL95-2子宮内膜癌細胞株におけるオートクリン-hGHの強制発現の実証およびその細胞生存率に対する影響。RL95-2細胞は、pcDNA3ベクターをビヒクルとして用いて、hGH cDNAを安定的にトランスフェクトした。（図1A）hGH mRNAおよびhGHレセプターの値をRT-PCRによって測定した。（図1B）ELISAによる、ベクターおよびhGH cDNA をトランスフェクトしたRL95-2細胞による培地へのhGH分泌の測定。hGH強制発現がRL95-2細胞生存率に及ぼす影響はMTTアッセイにより調べた。図1Cは10％FBS培地を、図1Dは血清欠乏培地（0.2％）の条件を示す。*p値＜0.001、**p値＜0.05。
【図２】図2A〜2D：RL95-2ヒト子宮内膜癌細胞によるオートクリン-hGH産生は細胞増殖および細胞生存性を高める。（図2A）10％FBS培地中でのRL95-2-ベクターおよびRL95-2-hGH細胞の増殖曲線。（図2B）オートクリン-hGH産生のBrdUの核取り込みによって示される細胞周期の進行に対する影響、および（図2C）TUNELアッセイによるアポトーシスに対する影響、アポトーシスは48時間の血清除去により誘発。（図2D）リアルタイムPCRによる、様々な細胞周期制御因子、抗アポトーシスマーカー、アポトーシス促進マーカーおよび癌遺伝子マーカーの発現に対するオートクリン-hGH発現の影響。*p値＜0.001、**p値＜0.05。
【図３】図3A〜3D：ヒト子宮内膜癌細胞によるオートクリン-hGH産生により、足場非依存性の増殖、病巣形成、管腔の充填、および腺房の形態の乱れが生じる。（図3A）懸濁培養中でのRL95-2-ベクターおよびRL95-2-hGH安定細胞の増殖曲線。10％FBS培地中での懸濁培養コロニーの可視化。（図3B）10％FBS培地におけるRL95-2-ベクターおよびRL95-2-hGH安定細胞の軟寒天コロニー形成。倍率150倍でのコロニーの可視化。（図3C）RL95-2-ベクターおよびRL95-2-hGH安定細胞のマトリゲルコロニー。グラフは腺房の形態の乱れの見られる総コロニー数を示す。コロニーの画像は400倍の倍率で記録した。（図3D）10％FBS培地中でのRL95-2-ベクターおよびRL95-2-hGH安定細胞の病巣形成。*p値＜0.001、**p値＜0.05。
【図４】図4A〜4D：ヒト子宮癌細胞によるオートクリン-hGH産生は間葉系の表現型を刺激して、その結果、細胞運動性が高まって浸潤性の表現型を獲得する。（図4A）プラスチック上で10％FBS培地にて培養したRL95-2-ベクターおよびRL95-2-hGH安定細胞の形態を倍率400倍において明視野の顕微鏡検査により調べた。（図4B）創傷治癒アッセイ。損傷領域は100倍の倍率で調べた。RL95-2-ベクターおよびRL95-2-hGH安定細胞の運動性（図4C）および浸潤性（図4D）はTranswellチャンバーアッセイにより調べた。*p値＜0.001、**p値＜0.05。
【図５】図5A〜5C：AN3細胞株におけるオートクリン-hGH強制発現の実証およびその機能的特徴。（図5A）hGH mRNAの値はRT-PCRにより測定した。（図5B）10％FBS培地中でのAN3-ベクターおよびAN3-hGH安定細胞の増殖曲線。（図5C）10％FBS培地中でのAN3-ベクターおよびAN3-hGH安定細胞の軟寒天コロニー形成。倍率 150倍でのコロニーの可視化。*p値＜0.001、**p値＜0.05。
【図６】図6A〜6D：ウサギhGH抗血清のRL95-2細胞に対する影響。hGH抗血清処理によるRL95-2細胞生存率に対する影響はMTTアッセイにより調べた。（図6A）10％FBS培地；および（図6B）血清欠乏（0.2％）培地；NRC＝正常ウサギ血清；細胞は48時間間隔で2回、抗体処理して、4日目にアッセイを終了した。（図6C）非特異的ウサギIgGを基準とした、hGH抗血清適用後の細胞周期およびアポトーシス遺伝子マーカーの発現パターン。（図6D）正常ウサギ血清を基準とした、CASPASE-GLO（商標）3/7 ASSAYキット（Promega）により評価した3/7カスパーゼ活性におけるhGHに対する抗体の濃度増加の影響。
【図７】様々な細胞株におけるhGH遺伝子発現パターン。様々な細胞株におけるhGH遺伝子の発現プロファイルはリアルタイムPCRで調べた。棒グラフは、MCF7（ATCC）細胞株に対するhGH遺伝子の相対的な発現を示す。記号：r2＝0.984；SF＝血清フリー；HP＝継代回数多数、vec＝ベクター。
【図８】図8A〜8D：GHおよび関連ホルモンの配列情報。（図8A）hPRL、GH1、GH2、CSH1、CSH2、hCSL、hCSL-2、hCSL-3およびhCSL-4におけるCLUSTALWアミノ酸配列アラインメント。シグナルペプチド配列は下線を引いて示す。（図8B）hPRL、GH1、GH2、CSH1、CSH2、hCSL、hCSL-2、hCSL-3およびhCSL-4のアミノ酸配列。シグナルペプチド配列は下線を引いて示す。（図8C）GH1、GH2、CSHL、CSH2、CSH1およびhPRLのCLUSTALWヌクレオチド配列アラインメント。（図8D）GH1、GH2、CSHL、CSH2、CSH1およびhPRLのヌクレオチド配列。
【図９】図9A〜9C：子宮内膜癌細胞におけるsiRNAによるhGH mRNAの枯渇はアポトーシスを促進する：2つのsiRNA構築物（sihGH5およびsihGH6（SEQ ID NO：97およびSEQ ID NO：98）によるhGH mRNAの枯渇はRL95-2細胞におけるアポトーシス活性を亢進させた（アポトーシスはカスパーゼ3/7活性により評価した）（図9Aおよび9B）；リアルタイムPCR定量分析により、sihGH5およびsihGH6を用いたRL95-2細胞中でのhGH遺伝子発現の枯渇が実証された（図9C）。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な説明
以下は、一般的な用語で示したその好ましい態様を含む本発明の説明である。本発明は、本発明およびその具体例を支持する実験データを提供する「実施例」の項に示される開示からさらに明らかにされる。
【００４９】
定義
「抗体」という用語（例えば、「GH抗体」または類似の用語）は、想定される最も広い意味で理解されるべきであり、無傷のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含むことが意図される。それらが所望の生物学的活性を示す限り、それはフラグメントおよびその他の修飾型を含むことも意図される。抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ig）分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原と特異的に結合する（免疫応答する）抗原結合部位を含む分子を包含する。これらは、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fc、Fab、Fab'、およびFab2のフラグメント、ならびにFab発現ライブラリーを含むが、これらに限定されるものではない。抗体分子は、分子に存在する重鎖の性状によって互いに異なるIgG、IgM、IgA、IgEおよびIgDの任意のクラスに関連する。これらは、同様にIgG1、IgG2およびその他のようなサブクラスを含む。軽鎖はκ鎖またはλ鎖であり得る。抗体に対する本明細書での言及はすべてのクラス、サブクラスおよびタイプに対する言及を含む。例えば、マウスまたはヒトの配列などの、複数の供給源に特異的である、例えばモノクローナル抗体またはそのフラグメントなどのキメラ抗体も含まれる。さらにラクダの抗体またはナノボディも含まれる。本明細書において「抗体」または任意の類似の用語に対する各言及は無傷の抗体、ならびに任意のフラグメントおよびその任意の修飾型を含むことが理解される。
【００５０】
「抗原結合部位」または「抗原結合部分」という用語は、免疫グロブリン分子もしくはフラグメントまたはその修飾型の、抗原相互作用に関与する部分を指す。抗原結合部位は、一般的には重（「H」）鎖および軽（「L」）鎖のN末端可変（「V」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖および軽鎖のV領域内の3つの変化が大きい区間は、「フレームワーク領域」として公知であるより保存的な隣接区間の間に挿入される。従って、「フレームワーク領域」または「FR」という用語は免疫グロブリンの超可変領域の間および隣接して自然の状態で見られるアミノ酸配列を指す。抗体分子内において、軽鎖の3つの超可変領域および重鎖の3つの超可変領域は三次元空間において抗原結合表面を形成するように互いに対して位置する。抗原結合表面は一般に、結合した抗原の三次元表面に対して相補的であり、重鎖および軽鎖のそれぞれの3つの超可変領域は「相補性決定領域」または「CDR」と呼ばれる。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては認められている定義（例えば、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991；およびChothia &Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917,1987, Chothia et al. Nature 342:878-883,1989を参照）に基づく。
【００５１】
本明細書で用いられるように「変化した」ポリヌクレオチドは、異なるヌクレオチドの欠失、挿入または置換によって同一または機能的に同等なものをコードするポリヌクレオチドが生じるポリヌクレオチドを含む。コードされるポリペプチドおよび抗体も「変化」して、サイレントな変化を生じて、機能的に同等な配列となるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含み得る。計画的なアミノ酸置換は、少なくとも一つの生物学的活性（例えば、細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性の刺激）、または免疫原性もしくは免疫学的な活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の特徴の類似性に基づいて起こり得る。例えば、負に帯電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含み得る；正に帯電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含み得る；等しい親水性値を有する無荷電の極性頭部基を持つアミノ酸はロイシン、イソロイシン、ならびにバリン、グリシンおよびアラニン、アスパラギンおよびグルタミン、セリンおよびスレオニン、ならびにフェニルアラニンおよびチロシンを含み得る。置換および／もしくは欠失または付加を行う際の指針は、例えば、本明細書において図に示される通り関連配列に対するアラインメントにより得ることができる。
【００５２】
「癌」および「癌性の」という用語は、典型的には異常または制御されていない細胞増殖、細胞生存性および／または細胞運動性を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指す。癌および癌病理学は、例えば、転移、周辺細胞の正常な機能の干渉、サイトカインまたはその他の分泌産物の異常な値での放出、炎症性または免疫学的反応の抑制または増強、新生物、前悪性、悪性、リンパ節のような周辺または遠位の組織または臓器への浸潤などに関連し得る。具体的には乳癌が含まれ、それには上皮の腫瘍、非上皮の腫瘍、例えばインサイチューの癌などの癌、および浸潤性の乳癌を含まれ得る。結腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮内膜癌、およびその他の状態の内の子宮内膜症も含まれる。
【００５３】
本明細書で用いられる「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合による、許容される塩および温度の条件下でのポリヌクレオチドの自然の結合を指す。A-G-T配列の場合、相補的配列はT-C-Aであり、逆相補配列はA-C-Tであり、逆配列はT-G-Aである。2つの一本鎖分子の相補性は、核酸のいくつかのみが結合する部分的なものであってもよく、または一本鎖分子間に完全な相補性が存在する完全なものであってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの有効性および強度に大きく影響する。これは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応、ならびにiRNAおよびPNAの設計および使用において特に重要である。
【００５４】
本明細書で用いられるように「誘導型」という用語は、ポリヌクレオチドまたはそれに相補的なポリヌクレオチドの化学的修飾を指す。このような修飾型は、例えば、アルキル、アシルまたはアミノ基による水素の置き換えを含む。好ましい局面において、ポリヌクレオチド誘導型は天然分子の生物学的または免疫学的機能を保持するポリペプチドまたは抗体をコードする。誘導型ポリペプチドまたは抗体は、グリコシル化、ペグ化、または誘導元の配列の一つまたはいくつかの生物学的機能（例えば、細胞増殖、細胞生存性もしくは細胞運動性に対する作用）または免疫学的機能を保持する任意の同様のプロセスによって修飾されるものである。抗体への言及において「誘導型」という用語は例えばハイブリッドおよび組換え抗体を含む。抗体のハイブリッドおよび組換え型は、例えば、ヒト化抗体、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）および一本鎖抗体を含む。
【００５５】
本明細書で用いられる「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンもしくは例えばscFvのような関連分子、またはT細胞レセプターに特異的に結合することができる任意のポリペプチドまたはペプチド決定基を含む。エピトープ決定基は、一般に、アミノ酸および／または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面基群を含み、通常は特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を持つ。エピトープは2つの主なタイプ、つまり、抗体がペプチド結合によって連結されるアミノ酸残基の連続する区間に結合する配列エピトープ（SE）、および抗体が非連続の残基に結合してポリペプチド鎖の折り畳みによって集塊する立体構造エピトープ（CE）を含む。立体構造エピトープは、本明細書では固有エピトープとも記載される。抗原−抗体複合体の結晶構造の解析から、抗体によって認識されるためには残基は一般に相互作用に関して接触可能であり、従って抗原の表面近くに存在しなければならないことが公知である。SEおよびCEの推定には市販のアルゴリズムが用いられた。解離定数が≦1μM；好ましくは≦100nMおよび最も好ましくは≦10nMである場合、抗体は抗原に特異的に結合すると言われる。
【００５６】
「発現」という用語はポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生、特に遺伝子または遺伝子の一部からのRNA（例えば、mRNA）の産生を含み、RNAまたは遺伝子もしくは遺伝子の一部によってコードされるアミノ酸配列の産生、ならびに発現に関連する検出可能な物質の出現を含む。例えば、ポリペプチド−ポリペプチド相互作用、ポリペプチド−ヌクレオチド相互作用などからの複合体の形成は「発現」という用語の範囲に含まれる。もう一つの例は、ハイブリダイゼーションプローブまたは抗体のような結合リガンドの、遺伝子またはその他のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、ポリペプチドもしくはタンパク質フラグメントへの結合、および結合リガンドの可視化である。従って、マイクロアレイ、ノーザンブロットのようなハイブリダイゼーションブロット、またはウェスタンブロットのような免疫ブロット、もしくはビーズアレイ上の、もしくはPCR分析によるスポットの強度の増強は「発現」という用語の範囲に含まれる。
【００５７】
本明細書で用いられるように「成長ホルモンおよび関連ホルモン」とは、成長ホルモン（GH）、プロラクチン（PRL）およびプロラクチン関連タンパク質；成長ホルモン1（GH1）、成長ホルモン2（GH2）、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン1（CSH1；胎盤性ラクトゲンとも呼ばれる（PL、PL-1、PL-2およびPL-3））、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン2（CSH2）、絨毛性ソマトマンモトロピン様ホルモン（CSL）、絨毛性ソマトマンモトロピン様2ホルモン（CSL-2）、絨毛性ソマトマンモトロピン様3ホルモン（CSL-3）、および絨毛性ソマトマンモトロピン様4ホルモン（CSL-4）を含むヒト成長ホルモン遺伝子クラスター；ならびにプロリフェリンおよびプロリフェリン関連タンパク質を含むがこれらに限定されない同等の配列および／または機能を有するホルモンを指す。ヒトホルモンは特にこの定義に含まれる。本発明のホルモンは多重配列識別子を含み、例えば、GH1はGH、GHNおよびGH-N（成長ホルモン−ノーマル）とも命名される；GH2はGHL、GHVおよびGH-V（成長ホルモン変異型）とも命名される；CSLはCSHL1、CS-5、CSHP1およびhCS-Lとも命名される；CSH1はPL、hCS-AおよびCSMTとも命名される；GH2はGHL、GHV、GH-V（成長ホルモン変異型）とも命名される；さらにCSH2はCSB、CS-2およびhCS-Bとも命名される。本明細書で用いられるように、絨毛性ソマトマンモトロピンおよび胎盤性ラクトゲンという用語、ならびにそれぞれの配列識別子は互換的に用いることができる。本明細書におけるホルモン（例えば、hGH、hPRLまたはhPL）または類似の用語へのそれぞれの言及は完全長の配列、および任意のフラグメントまたはその修飾型（変異型を含む）を含む。
【００５８】
GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLの「阻害剤」および「阻害」または「阻害性」は、GHおよび／または関連ホルモンの遺伝子およびそれぞれの遺伝子産物の生物学的活性および／または発現のレベルを遮断または抑制する局面を指すことを意図する。ホルモンの活性を完全に阻害することが望ましい場合があるが、これは必ずしも必須ではない。「阻害」は、ホルモンの発現および産生のレベル（例えば、転写または翻訳のレベル）において、または例えばホルモン機能のターゲティングによって生じ得る。本明細書で用いられるように、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRLまたはhPLを「阻害する」または「阻害」という用語は、例えば、DNAレベル（例えば、DNA合成の減少、代謝回転の亢進、および／または安定性の低下）、RNAレベル（例えば、転写の減少、代謝回転の亢進、および／または安定性の低下）、もしくはポリペプチドレベル（例えば、翻訳の減少、代謝回転の亢進、および／または安定性の低下）、もしくは活性の低下または翻訳後修飾を指す。阻害剤は、ホルモン経路の下流または上流の作用物質の活性または発現レベルを減少させるまたは遮断することもできる。一部の局面において、阻害剤は本明細書において記載される通りホルモンと特異的に結合または反応することができる。抗体の場合、「特異的に結合する」または「〜と特異的に免疫応答する」は、抗体が所望の抗原の一つまたはいくつかの抗原決定基と反応して、その他のポリペプチドとは反応（即ち、結合）しないまたはその他のポリペプチドとは非常に低い親和性（例えば、Kd＞10−6）で結合することを意味する。
【００５９】
特定の局面において、本発明の阻害剤は、本明細書に記載されるように、特に癌細胞において細胞増殖、細胞生存性および／または細胞運動性を阻害するために有用である。特に、本剤は細胞増殖の減少（例えば、細胞分裂を減少させることによって）、細胞死の増加（例えば、アポトーシスまたは壊死を増加させることによって）、または細胞の浸潤および/もしくは転移の減少（例えば、細胞骨格活性、細胞運動を減少させることによって）の一つまたはいくつかにおいて有用であり得る。本発明は一般にGHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLの阻害剤を対象とするが、いくつかの状況においてはホルモンレベルの維持または増加において有益な局面があり得る。開示されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドは周知の方法に従ってこのような目的のために用いることもできる。
【００６０】
「修飾された」という用語は、本明細書に記載される通り、配列の変化ならびに配列フラグメント、変異型および誘導型を指す。この用語は、本明細書で記載されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体および類似の薬剤を含む。
【００６１】
本明細書で用いられるように、「モノクローナル抗体」、「MAb」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、固有の軽鎖遺伝子産物および固有の重鎖遺伝子産物を含む抗体分子の分子種を含む抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）は固有である。MAbは、それにおける固有の結合親和性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫応答することができる抗原結合部位を含む。
【００６２】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖DNA、一本鎖または二本鎖RNA、RNA：DNAハイブリッド、および二本鎖DNAを含むがこれらに限定されないポリヌクレオチド、典型的にはプローブまたはプライマーを指す。一本鎖DNAプローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドは、しばしば、例えば、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いるような化学的方法によって、またはインビトロ発現系、組換え技術、ならびに細胞および生物体における発現を含むその他の様々な方法によって合成される。
【００６３】
「精製された抗体」とは、タンパク質および自然界で会合する天然の有機分子を含まない、重量に基づいて少なくとも60％の抗体を意味する。好ましくは、調製物は、重量に基づいて少なくとも75％、より好ましくは90％、最も好ましくは少なくとも99％の抗体、例えばGPR30特異抗体である。精製された抗体は、例えば、組換え技術によって産生されたタンパク質または保存的モチーフのペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーおよび標準的な技術によって得ることができる。
【００６４】
「精製された」または「単離された」という用語は、天然で付随する成分から分離された核酸、ポリペプチドまたはその他の分子を意味する。典型的には、ポリペプチドは重量に基づいて少なくとも60％、70％、80％、90％、95％または99％であり、タンパク質および自然界で会合する天然の有機分子を含まない場合に、実質的に純粋である。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、天然の供給源からの抽出によって、当該タンパク質を天然では発現しない細胞中での組換え核酸の発現によって、または化学的合成によって得ることができる。
【００６５】
単離された核酸は、所与の核酸が派生する生物体の天然のゲノムにおいて配列の両端に位置する遺伝子または配列を含まない核酸である。例えば、「単離されたDNAまたはRNA」は、例えばcDNA、クローニングされたゲノムDNA、合成DNAおよびsiRNA構造物を包含する。
【００６６】
「有効量」とは、臨床的に望ましい結果を誘発するために必要な単独または組み合わせにおける組成物の量を意味する。例えば、癌治療において、本明細書に記載される阻害剤の有効量は哺乳動物における腫瘍の増殖または浸潤性を抑制または予防する。活性な化合物の有効量は、投与経路、対象の齢期、体重および健康状態に応じて異なる。究極的には、担当する医師または獣医師が適切な量および投与計画を決定する。
【００６７】
「患者」または「対象」という用語はヒトおよびヒト以外の動物を含む。ヒト以外の動物には、鳥および哺乳動物、特にマウス、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシおよびウマが含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００６８】
本明細書で用いられるように、「薬学的に許容される希釈剤、担体、および／または賦形剤」という語句は、薬学的組成物の調製に有用であり、かつその意図される機能を実施することを可能とすると共に本発明に従って薬剤と同時投与され得る物質を含むことを意図する。これらは、一般に安全で無毒であり、生物学的またはその他の点で望ましくないものではない。薬学的に許容される希釈剤、担体および／または賦形剤の例には、溶液、溶媒、分散媒、遅延剤、乳濁剤などが含まれる。希釈剤、担体および／または賦形剤は、等張性および化学的安定性を高める物質のような微量の添加剤を含んでもよい。
【００６９】
単数形または複数形で用いられる場合「ポリヌクレオチド」（例えば、ポリヌクレオチドについて考察するために用いることができる「GH」、「hGH」、「hPRL」または「hPL」）は、一般に、例えば修飾されていないRNAもしくはDNAまたは修飾されたRNAもしくはDNAであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドなどの、任意の核酸配列を指す。これには、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域を含むDNA、一本鎖および二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖領域を含むRNA、一本鎖、より典型的には二本鎖であり得るDNAおよびRNAを含むまたは一本鎖および二本鎖領域を含むハイブリッド分子が含まれるが、制限されるものではない。RNAもしくはDNA、またはRNAおよびDNAの双方を含む三本鎖領域も含まれる。具体的には、mRNA、cDNA、およびゲノムDNA、ならびにその任意のフラグメントおよび修飾型が含まれる。この用語は、トリチウム化した塩基のような一つまたはいくつかの修飾された塩基、またはイノシンのような通常にはない塩基を含むDNAおよびRNAを含む。本発明のポリヌクレオチドはコードもしくは非コード配列、またはセンスもしくはアンチセンス配列、またはsiRNAのようなiRNAを包含することができる。本明細書における「ポリヌクレオチド」または類似の用語へのそれぞれの言及は完全長の配列、ならびに任意のフラグメントまたはその修飾型を含むことが理解される。
【００７０】
本明細書において用いられるように「ポリペプチド」（例えば、ポリペプチドについて考察するために用いることができる「GH」、「hGH」、「hPRL」、または「hPL」）はオリゴペプチド、ペプチド、もしくはタンパク質、またはそのフラグメント、および天然、組換え、合成または半合成の分子を指す。本明細書において天然のタンパク質分子のアミノ酸配列について言及するために「ポリペプチド」が記載される場合は、「ポリペプチド」および類似の用語はアミノ酸配列を完全長の分子における完全で固有のアミノ酸配列に制限することを意味しない。本明細書における「ポリペプチド」または類似の用語へのそれぞれの言及は完全長の配列、および任意のフラグメントまたはその修飾型を含むことが理解される。
【００７１】
本明細書で言及される「SEQ ID NO：」とは、個々の各配列識別子、もしくはその任意の組み合わせ、またはそのような配列識別子すべてを示し得る。
【００７２】
本明細書で用いられるように「実質的に精製された」または「単離された」という用語は、それらの細胞、組換え、合成または半合成の環境から回収されて、それらの環境に関連するその他の成分から少なくとも60％フリー、好ましくは75％フリー、最も好ましくは少なくとも90％フリーまたは少なくとも99％フリーである核酸配列またはアミノ酸配列を指す。「単離された」ポリヌクレオチドおよび抗体は、同定され、それらの自然の状態に関連する少なくとも一つの混入分子から分離されている。従って、単離されたポリヌクレオチドおよび抗体はそれらが自然の状態で見られる形または状況とは異なる形であることが理解される。さらに、「単離された」は配列が精製されている正確な程度（例えば、具体的なパーセント）を必ずしも反映する必要はないことがさらに認識される。
【００７３】
「治療」および類似の用語は、医学的な疾患（例えば、医学的な疾病、状態または症候群）を予防、治療もしくは改善する、またはこのような疾患の少なくとも一つの症状を抑制するための方法および組成物を指す。特に、これは医学的疾患の発症を予防もしくは遅延させる、疾患の身体的もしくは発育に対する影響を治す、是正、抑制、鈍化または軽減する、および／または疾患を引き起こす疼痛もしくは苦痛を予防、終了、抑制もしくは軽減するための方法および組成物を含む。「治療」という用語はその最も広い文脈において検討されるべきである。本用語は、必ずしも対象が完全に回復するまで治療されることを意味する必要はない。従って、本明細書で用いられる「治療」とは、例えば、癌、特に、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮内膜癌、およびその他の状態の内の子宮内膜症において、細胞増殖、細胞生存性および／もしくは細胞運動性の阻害、抑制または予防；細胞増殖、細胞生存性および／もしくは細胞運動性の症状もしくは程度の軽減；または細胞増殖、細胞生存性および／もしくは細胞運動性を発現するリスクの予防もしくはそれ以外の場合は抑制を広く含む。
【００７４】
本明細書で用いられる、ポリペプチドの「変異型」とは、一つまたはいくつかのアミノ酸が変化したアミノ酸配列を指す。同様に、変異型抗体は一つまたはいくつかのアミノ酸によって変化する。変異型ポリヌクレオチドは一つまたはいくつかのヌクレオチドによって変化する。変異型は、例えば、ロイシンのイソロイシンでの置き換えなど、置換されたアミノ酸がほぼ等しい構造または化学的特性を持つ「保存的」変化を起こし得る。より稀であるが、変異型は、例えばグリシンのトリプトファンでの置き換えなど、「非保存的」変化を起こす場合もある。類似の軽微な変異型はアミノ酸の欠失もしくは挿入、または両者を含む場合もある。生物学的または免疫原性の活性を無効にすることなくどのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失し得るかを解明する指針は、例えば、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）のような当技術分野において周知のコンピュータプログラムを用いて明らかにすることができる。
【００７５】
本発明は、少なくとも一つの生物学的活性（例えば、細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性に対する作用）または免疫原性の機能を保持する変異型をさらに包含する。好ましい変異型は開示される配列と少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％の配列同一性を有する変異型である。最も好ましい変異型は、本明細書において開示される配列と少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する変異型である。同一性パーセントは、以下に説明する通り比較する2つの配列を整列させて、整列させた部分の同一の残基の数を求めて、その数を本発明の（検索された）配列における残基の総数で割って、その結果に100を掛けることによって求められる。有用なアラインメントプログラムはAlignX（Vector NTI）である。
【００７６】
本発明の実践では、特記する場合を除いて、当技術分野における分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学および生化学の一般的な技術が用いられる。これらの技術については、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook et al., 1989；同じくMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Sambrook et al., 2000；Oligonucleotide Synthesis, MY Gait, ed., 1984；Animal Cell Culture, R.I. Freshney, ed., 1987；Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.；Handbook of Experimental Immunology, 4th edition, D .M. Weir & CC. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, JAM. Miller & MAP. Calos, eds., 1987；Current Protocols in Molecular Biology, FEM. Ausubel et al., eds., 1987；およびPCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., 1994のような文献中で詳細に説明されている。
【００７７】
成長ホルモンおよび関連ホルモン
ヒトにおいて、hGH遺伝子は5つの構造的および機能的な関連遺伝子から構成される遺伝子クラスターの一部である。下垂体特異的hGH-N遺伝子ならびに4つの構造的および機能的な関連遺伝子（胎盤においてのみ発現するhGH-V、hCS-A、hCS-B、およびhCS-L）。それらは5'から3'へ配列する；hGH-N；N＝正常（hGH1とも呼ばれる）、hCS-L；Lは類似（hPL-1としても公知）、hCS-A（hPL-2としても公知）、hGH-V；V＝変異型（hGH2とも呼ばれる）、およびhCS-B（hPL-3としても公知）。5つのhGH−hCS遺伝子は、q22〜24のバンドにおけるヒト17番染色体の長腕に位置する約50kbのDNAセグメントにクラスターを形成する。これらの遺伝子は、Aluタイプの29の分散する中央の反復配列エレメントを含む6〜13kbの遺伝子間領域によって分離される。このクラスターは先祖遺伝子から進化して、本プロセスの開始は3.5×108年以上昔であった。遺伝子座の現在の形の生成は重複、推定される対照エレメントの挿入、および少なくとも一回の遺伝子転換事象を伴う。ヒトの場合、5つの遺伝子はそれらのコード領域およびフランキング領域において92％よりも高いヌクレオチド配列同一性を有する。それらの分子構造も同一である；4つの小さなイントロンが同一の位置において転写ユニットを分割して、オープンリーディングフレームのすべてにおいて完全なコドン共直線性が存在する。
【００７８】
hGH-Nの2つのイソ型（22kDaおよび20kDa hGHとする）のメッセンジャーRNAは、一次転写産物の示差的スプライシング（differential splicing）によって生成する。22kDaのhGH-Nは、hGH-Nにおける下垂体mRNAの90％を含む優性型である。20kDa hGH-Nは、32〜46のアミノ酸残基の欠失を除いて、22kDa hGHと一致する。22kDaのhGH-Vイソ型も胎盤で発現するhGH-V遺伝子から生成する。hGH-Vの20kDaのイソ型は検出されていないが、インフレームの第4のイントロンを保持して第5のエクソン内に20コドンを伸長して26kDaの膜結合型hGH-Vイソ型に翻訳され得るmRNA種については記述されている。その他の多くの種のGHのヌクレオチドおよびアミノ酸配列については、概略が示されている。ヒトGHは、ブタGH（73％）、ウシGH、ヒツジGH、ウマGHおよびラットGH（それぞれ、約65％）、またはPRLファミリー（約27％）よりもhPL（87％）と高い配列同一性を共有する。霊長類のGHのみがhGHレセプターに結合する。一部の条件下において、hGHはPRLレセプターにも結合して活性化する。
【００７９】
hGHは、アミノ末端に、細胞からの分泌中に除去されるシグナルペプチドを有するプロホルモンとして合成される。hGH-Nの成熟した22kDaのイソ型は191個のアミノ酸ポリペプチドであり、血漿中において最も豊富なhGHのイソ型である。hGHのヒトにおける半減期は約25分である。哺乳動物のGHの三次元構造も調べられている。それは、それぞれ、アミノ酸21〜30個の長さの4つのαヘリックスを含む。らせんは、通常とは異なる上−上−下−下の位相幾何学の左回りの束の配向で配置される。この独特の位相幾何学の配向に関して、GHは二組の平行ならせんの間の長い連結ループ構造、ならびにらせん2およびらせん3の間の短いループ領域を含む。hGHはCys35〜Cys165およびCys182〜Cys189に2つのジスルフィド架橋を含む。Cys残基はループ構造の成分である。GH分子の中心コアは約20個の疎水性のアミノ酸を含み、これよりも小さいアミノ酸の疎水性クラスターが4つのらせん束を安定に維持する。
【００８０】
hGH-N遺伝子の近位の0.5kbのプロモーターは、hGH-N発現のための転写および推定される組織特異性を司る調節DNAエレメントの多くを含む。TATAボックスに加えて、近位のhGH-N遺伝子プロモーターは、hGHの発現に必要な推定される下垂体特異的転写因子であるPit-1（GHF-1としても公知）の2カ所の結合部位を含む。しかし、hGH-N遺伝子の効率的な発現にはhGH-N転写開始部位の上流15kb離れた配列が必要である。近位のhGH-N遺伝子プロモーターはまた、ホルモンのシグナルに反応して転写を調節するシス作用エレメントも含む。
【００８１】
GHレセプター（GHR）は、ポリペプチド鎖の4つの残基（124〜127）に連結する2つのドメイン（アミノ酸1〜123およびアミノ酸128〜238）からなる。各ドメインは2つの逆平行のβシートのサンドウィッチを形成するように配置した7本のβ鎖を含む。GHレセプターはさらにCys38〜Cys48、Cys83〜Cys94、およびCysl08〜Cysl22の間に3つのジスルフィド結合を含む。Arg43およびGlu169の間の水素結合、ならびにArg39およびAsp123の間の塩橋はレセプターの安定化にも役立つ。アミノ酸配列からのGHレセプターの予想される分子量は70kDaである。グリコシル化およびユビキチン化のような翻訳後の修飾によってレセプターの質量は100〜130kDaとなる。GHレセプターは5つのN連結グリコシル化部位を含み、それぞれがレセプターに約10kDaを付加する。GHレセプターは19の潜在的なユビキチン化部位を持ち、多数のリジン残基においてポリユビキチン化される。レセプターのユビキチン化はリガンド結合によって増加して、GHレセプターの内在化に必要である。
【００８２】
GHレセプター発現は、胃腸管、雌雄の生殖器系、筋骨格系、心呼吸器系、造血および免疫系、中枢神経系、外皮系、腎臓および泌尿器系、ならびに内分泌系を含む大半の臓器系において実証されている。これらの系において、GHレセプターは分化および未分化の細胞タイプの双方において発現する。GHレセプターは発生中の胎児の外胚葉、中胚葉および内胚葉から派生する細胞でも発現する。ヒトのGHBPは、金属プロテアーゼファミリーのメンバーによって膜結合GHレセプターの限定的なタンパク質分解によって生成する。循環しているGHの60％までがGHBPに結合する。GHBPは、クリアランスおよびその後の分解の速度を低下させることによって血清中のGHの半減期を増大させる。ラット、マウスおよびサルの場合、GHBPはGHレセプター前駆体mRNAの選択的スプライシングによって生成する。短いが膜アンカー型のGHレセプターのいくつかのイソ型がヒトにおいて報告されている。
【００８３】
一つのhGH分子は、2つのレセプターの細胞外ドメインと相互作用してレセプターのホモ二量体化を起こす。hGHは、2つの別々のレセプター分子内の結合「ポケット」と順次相互作用する高親和性の部位である「部位1」および低親和性部位である「部位2」の2つのレセプター結合部位を持つ。部位2におけるhGHとレセプターの2つの細胞外ドメイン間の約500Åの二量体化インターフェースとが接触すると二番目のレセプターと複合体との結合が安定化する。GHレセプターにおいて、二つのリガンド結合部位は主として同一のアミノ酸残基から構成されて、全体としてほぼ等しい形状および構造を持つ。GHBPの部位1および2を形成するアミノ酸残基は43〜218残基の6つのクラスター内に位置する。結果として生じるレセプターの二量体化は恐らく生物学的反応を起こすためのシグナルを発する。部位2において突然変異したhGHは有効なGHレセプター拮抗薬の開発のための基礎を形成している。
【００８４】
PRLは、3つのジスルフィドループを有する4つの逆平行αヘリックス内に199のアミノ酸を含む23kDaのタンパク質である。ループの位置は保存されるが、一次配列は種によって異なる。グリコシル化、リン酸化、開裂および重合のような翻訳後の修飾が分子の異種性を生じる（Sinha, Y.N. (1995) Structural variants of prolactin: occurrence and physiological significance. Endocr. Rev. 16, 354-369）。ヒトPRL（hPRL）はAsp31においてN-グリコシル化して、グリコシル化および非グリコシル化型の双方が様々な割合で循環している。グリコシル化したPRLはPRLレセプターに対する低い結合親和性およびいくつかのバイオアッセイにおいて低下した活性を有して、リン酸化したPRLはレセプターにはよく結合するものの拮抗薬として作用する可能性がある（Xu, X. et al. (2001) A molecular mimic of phosphorylated prolactin markedly reduced tumor incidence and size when DU145 human prostate cancer cells were grown in nude mice. Cancer Res. 61, 6098-6104）。
【００８５】
PRLの開裂型（16K PRL）は抗血管形成特性を有する（Struman, I. et al. (1999) Opposing actions of intact and N-terminal fragments of the human prolactin/growth hormone family members on angiogenesis: an efficient mechanism for the regulation of angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 1246-1251）。重合およびIgGへの抱合は大きな分子種を形成することができる；「大きな」PRL（50〜60kDa）およびマクロ-PRL（150〜170kDa）は高プロラクチン血症を有する患者の血清中に存在する。hPRLはヘパリンに結合するが、その他の種に由来するPRLまたは成長ホルモン（GH）は結合しない（Khurana, S. et al. (1999) Heparin-binding property of human prolactin: a novel aspect ofprolactin biology. Endocrinology 140, 1026-1029）。
【００８６】
PRLは、脱落膜、子宮筋層、乳房、前立腺、脳および免疫細胞を含む多くの下垂体以外の部位で合成される（Ben-Jonathan, N. et al. (1996) Extrapituitary prolactin: distribution, regulation, functions and clinical aspects. Endocr. Rev. 17, 639-669）。循環からの取り込みおよび保持がPRLのもう一つの際立った特徴である。取り込みは脳脊髄液および乳汁などの液体区画へのPRLの輸送に用いられることができ（Ollivier-Bousquet, M. et al. (1993) Prolactin transit through mammary epithelial cells and appearance in milk. Endocr. Regul. 27, 115-124）、一方細胞外マトリックスによるPRLの保持は応答細胞周辺においてその濃度を高めることができる。またPRLは標的細胞内で内在化されるが（Rycyzyn, M.A. et al. (2000) Role of cyclophilin B in prolactin signal transduction and nuclear retrotranslocation. Mol. Endocrinol. 14, 1175-1186）、細胞内PRLの正確な機能またはその再利用およびエキソサイトーシスの可能性は明らかでない。
【００８７】
構造的な相同性に関して、hGHおよびhPLのペプチド配列は85％の配列同一性を共有して、hPRLはその他の2つのホルモンと約25％の類似性を共有する（AM Corbacho et al., Journal of Endocrinology, 2002, 173, 219-238により概説）。hPLはGHRに関して比較的低い親和性を示すが（Lowman et al. 1991）、3つのヒトホルモンはすべてPRLレセプターに対して高い親和性で結合する（Nicoll et al. 1986、前記、Goffin et al. 1996b、前記）。さらに、3つのホルモンはすべて190〜200のアミノ酸を含み、成熟タンパク質の分子量は約22〜23kDaである。それらの三次構造は鎖内のジスルフィド結合によって安定化して、基本的には4つの逆平行αヘリックスから構成される（概説として、Goffin et al. 1996b、前記、Bole-Feysot C, Goffin V, Edery M, Binart N & Kelly PA 1998 Prolactin (PRL) and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout mice. Endocrine Reviews 19 225-268を参照）。さらに、PRLおよびGHのレセプターは構造的および機能的にサイトカインレセプターのクラス1スーパーファミリーのメンバーに関連する（Bazan F 1989 A novel family of growth factor receptors: a common binding domain in the growth hormone, prolactin, erythropoietin and IL-6 receptors, and the p75 IL-2 receptor beta-chain. Biochemical and Biophysical Research Communications 164 788-795, Kelly PA, Djiane J, Postel-Vinay MC & Edery M 1991 The prolactin/growth hormone receptor family. Endocrine Reviews 12 235-251, Cosman D 1993 The hematopoietin receptor superfamily. Cytokine 5 95-106）。
【００８８】
これらのホルモンレセプターは細胞外および細胞内ドメインにおいて高度に保存される配列を共有する膜貫通タンパク質であり（AM Corbacho et al., Journal of Endocrinology, 2002, 173, 219-238により概説；Murakami M, Narazaki M, Hibi M, Yawata H, Yasukawa K, Hamaguchi M, Taga T & Kishimoto T 1991 Critical cytoplasmic region of the interleukin 6 signal transducer gp130 is conserved in the cytokine receptor family. PNAS 88 11349-11353 1991, Cosman 1993、前記、O'Neal KD & Yu-Lee L-Y 1993 The proline-rich motif (PRM): a novel feature of the cytokine/hematopoietin receptor superfamily. Lymphokine and Cytokine Research 12 309-312, Bole- Feysot et al. 1998、前記。Waters MJ, Shang CA, Behncken SN, Tam S-P, Li H, Shen B & Lobie PE 1999 Growth hormone as a cytokine. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 26 760-764も参照）、それらはすべて、リガンド結合誘発性のレセプターのホモ二量体化の結果としてJAK/STAT（ヤーヌスキナーゼ／シグナルトランスデューサーおよび転写アクチベーター）シグナル伝達経路を活性化することができる（Ihle JN & Kerr IM 1995 Jaks and Stats in signaling by the cytokine receptor superfamily. Trends in Genetics 11 69-74, Yu-Lee L-Y 1997 Molecular actions of prolactin in the immune system. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 215 35-52., Bole-Feysot et al. 1998、前記、Waters et al. 1999、前記）。
【００８９】
成長ホルモンおよび癌
近年、多くの刊行物がヒトおよび動物モデルの双方における成長ホルモンと癌の関連について述べている。トランスジェニックマウスモデルは明らかに癌におけるGHの役割を裏付けているが、ヒトの新生物における対応する臨床的エビデンスは入手が非常に困難であり、論争の的である。多くの試験において循環hGHが増加すると、悪性のリスクに関連しているIGF-1の発現が増加することが公知である（C. Laban, S.A. Bustin, P.J. Jenkins, The GH-IGF-I axis and breast cancer, Trends Endocrinol. Metab. 14 (2003) 28-34; H.M. Khandwala, I.E. McCutcheon, A. Flyvbjerg, K.E. Friend, 892 The effects of insulin-like growth factors on tumourigenesis and neoplastic growth, Endocr. Rev. 21 (2000) 215-244. 894）。しかし、閉経前の乳癌女性の試験では血清中hGH値が変化しないことが認められた（R.R. Love, D.R. Rose, T.S. Surawicz, P.A. Newcomb, Prolactin and growth hormone levels in premenopausal women with breast cancer and healthy women with a strong family history of breast cancer, Cancer 68 (1991) 1401-1405）。
【００９０】
さらに、近年の試験において、hGHの血清中濃度は前立腺癌のリスクに反比例することが見出された（B. Fuhrman, M. Barba, H.J. Schunemann, T. Hurd, T. Quattrin, R. Cartagena, et al., Basal growth hormone concentrations in blood and the risk for prostate cancer: a case-control study, Prostate 64 (2005) 109-115）。この逆の相関性は、腫瘍によって産生されるIGF-1により生じるhGH分泌の負のフィードバックループに起因する可能性がある（S. Yakar, D. Leroith, P. Brodt, The role of the growth hormone/insulin-like growth factor axis in tumor growth and progression: lessons from animal models, Cytokine Growth Factor Rev. 16 (2005) 407-420; R.R. Love, D.R. Rose, T.S. Surawicz, P.A. Newcomb, Prolactin and growth hormone levels in premenopausal women with breast cancer and healthy women with a strong family history of breast cancer, Cancer 68(1991)1401-1405）。
【００９１】
ヒトにおけるPRLの機能の全範囲も発癌におけるその関与も十分には理解されていない。乳癌に関して、PRLの投与は、げっ歯類において、自然発生性およびウイルス誘発性の乳房の腫瘍の発生率、サイズおよび数を増大させて、発癌物質に誘発される腫瘍の増殖を持続させる（Nandi, S. et al. (1995) Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 3650-3657）。さらに、PRLをコードする遺伝子を過剰発現しているトランスジェニックマウスは乳房の腫瘍を発症する（Wennbo, H. et al. (1997) Activation of the prolactin receptor but not the growth hormone receptor is important for induction of mammary tumours in transgenic mice. J. Clin. Invest. 100, 2744-2751）。それにも関わらず、ヒトにおけるPRLの循環値と乳癌の関連性は明らかでない。
【００９２】
PRLと腫瘍内膜新生物の関係も明らかでない。血清PRLは子宮内膜症を伴う女性の部分母集団では上昇するが、子宮内膜癌を伴う患者では変化しない（Gregoriou, G. et al. (1999) Evaluation of serum prolactin levels in patients with endometriosis and infertility. Gynecol. Obstet. Invest. 48,48-51）。しかし、不死化したヒト子宮内膜ストローマ細胞株であるN5はPRLを発現して、エストロゲンおよびプロゲステロンに反応する（Brar, A.K. et al. (1999) N5 endometrial stromal cell line: a model system to study decidual prolactin gene expression. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 35, 150-154）。
【００９３】
前立腺癌に関して、PRLレセプターは胎児、思春期前および成人のヒト前立腺上皮細胞において発現する（Leav, I. et al. (1999) Prolactin receptor expression in the developing human prostate and in hyperplastic, dysplastic, and neoplastic lesions. Am. J. Pathol. 154, 863-870）。それは良性前立腺肥大症においても検出されて、その発現は異形成では多いが、より後の病期の癌では少ない。癌細胞株の内、PRLレセプターはLNCaP細胞およびPC-3細胞によって発現する（Peirce, S.K. et al. (2001) Quantification of prolactin receptor mRNA in multiple human tissues and cancer cell lines by real time RT-PCR. J. Endocrinol. 171, R1-R443 Leav, I. et al. (1999) Prolactin receptor expression in the developing human prostate and in hyperplastic, dysplastic, and neoplastic lesions. Am. J. Pathol. 154, 863-870）。それにも関わらず、PRLはDU145およびPC3細胞の増殖を刺激するがLNCaP細胞に対しては影響を及ぼさない（Janssen, T. et al. (1996) In vitro characterization of prolactin-induced effects on proliferation in the neoplastic LNCaP, DU145, and PC3 models of the human prostate. Cancer 77, 144-149）。従って、成長ホルモンおよびヒトの癌におけるその役割に関するデータおよび試薬については持続的な必要性がある。
【００９４】
本明細書に開示される所見に一致して、hGHは子宮内膜癌の細胞株を含む複数の癌細胞株において高度または中等度に発現する（実施例を参照）。さらに、hGHを過剰発現している子宮内膜癌の細胞は、総細胞数によって示される通り、空のベクターによって安定的にトランスフェクトされた対照細胞よりも著しく早く増殖する。BrdU取り込みアッセイは、総細胞数の増加は細胞増殖亢進の結果であることを示す。アポトーシスの測定は、オートクリンhGHが細胞生存性を高めることによって総細胞数を増加させるようにも作用することを示す。加えて、細胞の増殖および生存性の亢進は抗hGH抗体を用いてhGHをターゲティングすることによって効率的に逆転させることができる。このような抗体はオートクリンhGHの機能を阻害して、その結果、増殖速度を低下させて細胞の増殖および細胞生存性を阻害する（実施例を参照）。
【００９５】
癌患者を治療するために用いられる従来の治療は手術、放射線照射、化学療法および性ホルモン療法を含む。しかし、状態がこれらの従来の治療に応答しない多くの癌患者が常に存在する。制御されない細胞増殖、細胞生存性および／または細胞運動性が癌の際立った特徴であることから、細胞分裂を遮断することによって癌の増殖を停止する、癌治療の分野において最も直接的かつ効果的な方法が、何十年もの間、試みられている。従って、従来の化学療法剤は癌細胞に加えて健康な細胞に対しても有毒である。さらに、新生物細胞の固有の遺伝的不安定性は最終的には化学療法に対する長期曝露後に薬剤耐性クローンの選択を引き起こす。
【００９６】
本発明の阻害剤は、細胞の生育および増殖に関与する特定の遺伝子をターゲティングすることによって癌の増殖を治療、予防および／または阻害するための新規の組成物および方法を提供する。特に、本発明の阻害剤は、ヒト成長ホルモンおよび関連ホルモンをターゲティングすることによって癌の増殖を治療、予防および／または阻害するための新規の組成物および方法を提供する。本発明の抗体は、特異性の低下、長期有効性の欠如、および有害な免疫応答を含む、その他の公知の阻害剤に影響を及ぼす問題を回避することが予測される。抗体は化学療法剤に優れた増強を提供することも予測される。特に、抗体は、例えばペプチド試薬に比べて高い安定性を有する。さらに、hGH抗体はhGHには結合してレセプターには結合せず、従って、刺激シグナル（即ち、アゴニストまたは部分的アゴニスト活性）を示すことがない。本発明者らは、エンドクリンhGHとは対照的に、オートクリンhGHの抗体阻害の有効性を観察している。このように、本開示の阻害剤（例えば、抗体およびポリヌクレオチド）はそれぞれの独自のhGHを分泌する腫瘍の治療において優れている。このような阻害剤は、それらが必ずしも腫瘍の内部に浸透または細胞表面のレセプターに結合する必要はないが腫瘍環境において可溶性hGHに結合することによって作用することができることから、固体腫瘍の治療にとって好ましい。それによって、阻害剤は、例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮内膜癌および子宮内膜症など、GHおよび関連ホルモンを産生するまたはGHおよび関連ホルモンに反応するその他の癌において使用することができる。同様に、siRNAはこれらの癌におけるホルモンの発現を抑制するために用いることができて、それによって治療を提供する。
【００９７】
このように、本明細書に示されるデータは、hGHが子宮内膜癌細胞の増殖および生存性を促進して、この増殖および生存性が抗体結合を介してオートクリンhGHの機能を阻害することによって効率的に阻害されることができることを実証する。このように、GHおよび関連ホルモン、特にhGHおよびその変異型、hPRLならびにhPLは、特に子宮内膜癌もしくは子宮内膜症、または乳癌、結腸癌、肺癌もしくは前立腺癌の癌の治療および診断において、理想的な新規のターゲットである。これらのホルモンの生物学的活性（例えば、オートクリン活性）を阻害する任意の試薬は癌細胞の増殖、生存性および／または運動性を阻害するために用いることができる。これらの試薬は、例えば、化学的化合物（例えば、小分子）、拮抗薬、抗体およびiRNAを含むことができる。同様に、診断用の薬剤（例えば、ポリヌクレオチドおよび抗体）は、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLの存在または値を調べるために、ならびに例えば、癌の発症、進行または再発などの癌性の状態を検出するために用いることができる。
【００９８】
単離されたGHおよび関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRLまたはhPLは様々な用途を見出し得る。例えば、ホルモンは本明細書で記載する通り診断用のアッセイにおいて、またはキットにおいて対照として用いることができる。または、ホルモンは治療用または診断用の用途のさらなる抗体を生成するために用いることもできる。ホルモンは、細胞増殖、細胞生存性および細胞運動性の進行、ならびにその他の細胞メカニズムを調べるための基質として用いることもできる。
【００９９】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明は、SEQ ID NO：1〜26およびそのフラグメントならびにその修飾型の少なくとも一つを含むポリペプチドを含む、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRLまたはhPLのポリペプチドの使用を包含する。本発明は、癌、特に子宮内膜癌もしくは子宮内膜症、または乳癌、結腸癌、肺癌もしくは前立腺癌の診断におけるこれらのポリペプチドの使用も包含する。本発明は、このような細胞の細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性を阻害するための抗体を調製するためのポリペプチドの使用をさらに包含する。
【０１００】
本明細書で用いられるようにポリペプチドは、（a）SEQ ID NO：1〜26もしくはそのフラグメントまたはその修飾型からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；（b）SEQ ID NO：1〜26およびそのフラグメントならびにその修飾型からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列の機能ドメインを含むポリペプチド；および（c）SEQ ID NO：1〜26またはその修飾型からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列の少なくとも特定の数の連続する残基を含むポリペプチドからなる群より選択される少なくとも一つの配列を含む。一つの特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO：1〜26の少なくとも一つのアミノ酸配列を含むGHまたは関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRLまたはhPLの単離されたポリペプチドを包含する。これらの配列はすべて、本発明を用いた用途におけるポリペプチドとして本明細書に集合的に含められる。
【０１０１】
ポリペプチドは、ポリペプチドの活性および／または値を検出または測定するために様々なアッセイにおいて発現および用いることができる。ポリペプチドは、例えば商業的生産のための大規模な合成および単離プロトコルにおいて使用することもできる。このようなポリペプチドは、抗体を産生するため、対応するアミノ酸配列を単離するため、およびアミノ酸配列の値を定量的に求めるために使用することもできる。
【０１０２】
本発明は、SEQ ID NO：27〜96およびそのフラグメントならびにその修飾型のポリヌクレオチドを含む、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRLまたはhPLのポリヌクレオチドの使用を包含する。本発明は、癌、特に乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮内膜癌または子宮内膜症の診断におけるこれらのポリヌクレオチドの使用も包含する。本発明は、このような細胞の細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性の阻害のためのこれらのポリヌクレオチドの使用をさらに包含する。従って、本発明は、発現ベクターおよび宿主細胞の作成、ならびにアンチセンスポリヌクレオチドおよびiRNAの作成におけるこれらのポリヌクレオチドの使用を包含する。
【０１０３】
本明細書で用いられるようにポリヌクレオチドは、（a）SEQ ID NO：1〜26もしくはそのフラグメントまたはその修飾型からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列のコード配列を含む配列；（b）SEQ ID NO：1〜26もしくはフラグメントまたはその修飾型からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列のコード配列の相補体、逆配列および逆相補体；（c）SEQ ID NO：1〜26もしくはそのフラグメントまたはその修飾型からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列のコード配列に含まれるオープンリーディングフレーム（d）SEQ ID NO：1〜26またはそのフラグメントもしくは修飾型からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列のコード配列の機能ドメイン；（e）SEQ ID NO：1〜26またはその修飾型からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列のコード配列の少なくとも特定の数の連続する残基を含む配列；および（f）SEQ ID NO：27〜96またはその修飾型の少なくとも特定の数の連続するヌクレオチドを含む配列からなる群より選択される少なくとも一つの配列を含む。一つの特定の態様において、本発明はSEQ ID NO：1〜26からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列のコード配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを包含する。もう一つの特定の態様において、本発明はSEQ ID NO：27〜96からなる群より選択される配列を含む単離されたポリヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーならびにそれらの修飾型も使用することができる。これらのポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーはすべて、本発明を用いた用途におけるポリヌクレオチドとして集合的に含められる。
【０１０４】
単離されたポリヌクレオチドは、ゲノムマッピングにおいて、物理的マッピングにおいて、さらにいくらか関連する種の遺伝子のクローニングにおいても用いることができる。ポリヌクレオチドを用いて設計されるプローブは、スロットブロット技術またはマイクロアレイ分析のように当技術分野において周知の技術を用いて、それらの細胞内に十分に相同なDNAおよびRNA配列を有する任意の生物体における遺伝子の存在を検出して発現パターンを調べるために用いることができる。ポリヌクレオチドを用いて設計されるプライマーはシーケンシングおよびPCR増幅のために使用することができる。ポリヌクレオチドは、例えば薬学的組成物のような組成物として用いてもよい。ポリヌクレオチドは健康上の利益を提供するために用いることもできる。このような利益に関して、ポリヌクレオチドは発現ベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞として提供されることができる。
【０１０５】
当業者は、遺伝暗号の縮重の結果として、本発明のポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が生成し得て、そのいくつかは任意の公知および天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対しても最小限の相同性を有することを認識する。このように、本発明は、可能性のあるコドン選択肢に基づく組み合わせを選択することによって行われ得るヌクレオチド配列のそれぞれの可能性のある個々の変異について検討する。これらの組み合わせは、天然のアミノ酸配列に対して応用される標準的なトリプレット（triplet）遺伝暗号に従って作成されて、このような変異はすべて具体的に開示されると考えられるべきである。
【０１０６】
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列もしくはそれらのフラグメント、または修飾型は好ましくは適切に選択されたストリンジェンシーな条件下において自然に発生する配列のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。しかし、実質的に異なるコドン使用頻度を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントまたは修飾型を産生することが有利である場合がある。コドンは、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に従って、特定の原核性または真核性の宿主においてそのポリペプチドの発現が生じる割合を増加させるように選択することができる。コードされるアミノ酸配列を変化させることなくヌクレオチド配列を実質的に変化させるその他の理由は、より長い半減期など、天然の配列から産生される転写物よりもより好ましい特性を有するRNA転写物の産生を含む。
【０１０７】
本発明は、完全に合成化学による、ポリヌクレオチドもしくはそのフラグメントまたはその修飾型の産生も包含する。産生後、合成配列は当技術分野において周知である試薬を用いて、多くの有効な発現ベクターおよび細胞系のうちの任意のものに挿入することができる。さらに、合成化学はポリペプチドもしくはその任意のフラグメントまたはその修飾型をコードする配列に変異を導入するために用いられ得る。Wahl, G. M. and S. L. Berger（1987; Methods Enzymol. 152:399-407）およびKimmel, A. R.（1987; Methods Enzymol. 152:507-511）において述べられる様々なストリンジェンシーな条件下において、本願で特許請求されるヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列、特にSEQ ID NO：27〜96に示されるポリヌクレオチド配列も本発明に包含される。
【０１０８】
当技術分野において周知であり、一般的に有効であるDNAシーケンシングのための方法は本発明の任意の態様を実践するために用いてよい。本方法は、DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントであるSEQUENASE（U.S. Biochemical Corp, Cleveland, OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）、またはELONGASE Amplification System（Life Technologies, Gaithersburg, MD）に見出されるようなポリメラーゼおよび校正エキソヌクレアーゼの組み合わせのような酵素を用いてもよい。好ましくは、本プロセスは、Hamilton Micro Lab 2200（Hamilton, Reno, NV）、Peltier Thermal Cycler（PTC200; MJ Research, Watertown, MA）ABI Catalyst and 373 and 377 DNA Sequencers（Perkin Elmer）、またはGenome Sequencer 20（商標）（Roche Diagnostics）のような機械を用いて自動化される。
【０１０９】
ポリペプチドをコードする核酸配列は、部分的なヌクレオチド配列を利用して、さらにプロモーターおよび調節エレメントのような上流の配列を検出するために当技術分野において公知である様々な方法を用いて伸長され得る。例えば、用いられ得る一つの方法である「制限部位」PCRは、公知の遺伝子座に隣接する未知の配列を検索するためのユニバーサルプライマーを用いる（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322）。特に、ゲノムDNAは先ずリンカー配列のプライマーおよび公知の領域に特異的なプライマーの存在下において増幅される。次に、増幅された配列は、同一のリンカープライマーおよび最初のものに内在するもう一つの特異的プライマーを用いてPCRの第二段階に供される。PCRの各回の産物は適切なRNAポリメラーゼを用いて転写されて、逆転写酵素を用いてシーケンシングされる。
【０１１０】
シーケンシングまたはPCR産物のサイズを分析またはヌクレオチド配列を確認するために、市販されているキャピラリー電気泳動系を用いてもよい。特に、キャピラリーシーケンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、レーザーで活性化される4つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドに対して一つ）、および電荷結合素子カメラによる放出波長の検出を用い得る。出力／光強度は適切なソフトウェア（例えば、GENOTYPER and Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer）を用いて電気信号に変換してもよく、試料の投入からコンピュータ解析および電子データ表示までの過程全体がコンピュータ制御され得る。キャピラリー電気泳動は、特定の試料中に限られた量で存在する可能性のあるDNAの小片のシーケンシングに特に好ましい。
【０１１１】
もう一つの態様において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、適切な宿主細胞におけるポリペプチドもしくはそのフラグメントまたはその修飾型の発現を誘導するために組換えDNA分子において用いられ得る。遺伝暗号の固有の縮重のために、実質的に同一または機能的に同等のアミノ酸配列をコードするその他のDNA配列が産生される可能性があり、これらの配列はポリペプチドをクローニングおよび発現するために用いることができる。本発明のヌクレオチド配列は、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を変更する変化を含むが限定されない様々な理由によって、配列をコードするアミノ酸を変化させるために、当技術分野において一般的に公知の方法を用いて操作することができる。ヌクレオチド配列を操作するために、遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドの無作為断片化およびPCR再構築によるDNAシャッフリングを用いてもよい。例えば、部位特異的突然変異誘発は、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン選択の変化、突然変異の導入などのために用いることができる。
【０１１２】
本発明のもう一つの態様において、ポリペプチドをコードする天然、修飾、または組換え核酸配列は融合タンパク質をコードするように異種配列に連結され得る。例えば、それは市販の抗体によって認識されることができるキメラ配列をコードするために有用であり得る。融合タンパク質は、ポリペプチドを切断して異種分子から精製できるように、本発明のポリペプチドと異種タンパク質配列との間に位置する開裂部位を含むように操作することもできる。
【０１１３】
もう一つの態様において、ポリペプチドをコードする配列は、当技術分野において周知の化学的方法（Caruthers, M. H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232を参照）を用いて全体的にまたは部分的に合成されることができる。または、アミノ酸配列またはそのフラグメントを合成するための化学的方法を用いてポリペプチド自体を産生することもできる。例えば、ポリペプチド合成は様々な固相技術（Roberge, J. Y. et al. (1995) Science 269:202-204; Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154）を用いて実施することができて、また、例えばABI 431 A Peptide Synthesizer（Perkin Elmer）を用いて自動化された合成を達成することもできる。ポリペプチドの様々なフラグメントは、完全長の分子を作成するための化学的方法を用いて別々におよび組み合わせて化学的に合成することができる。
【０１１４】
新たに合成されるポリペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー（例えば、Creighton, T. (1983) Proteins Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, NY）によって単離され得る。合成ポリペプチドの組成は、アミノ酸の分析またはシーケンシング（例えば、Edman degradation procedure; Creighton、前記）によって確認することができる。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその任意の部分は、直接的な合成中に変更されることが可能であり、かつ／または、化学的方法を用いて、修飾された分子を作成するためのその他のタンパク質に由来する配列またはその任意の一部と組み合わせることが可能である。
【０１１５】
生物学的に活性なポリペプチドを発現するために、ポリペプチドまたは機能的な同等物をコードするヌクレオチド配列を、例えば挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターなど、適切な発現ベクターに挿入してよい。ポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写および翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを構築するためには、当技術分野において周知の方法が用いられ得る。これらの方法は、インビトロにおける組換えDNA技術、合成技術、およびインビボにおける遺伝子組換えを含む。このような技術は、Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY；さらにSambrook, J. et al. (2000) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY；およびAusubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NYに記載されている。
【０１１６】
様々な発現ベクター／宿主系が本発明のポリペプチドをコードする配列を含有して発現するために利用され得る。これらには、組換えファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターを用いてトランスフォームした細菌；酵母発現ベクターを用いてトランスフォームした酵母のような微生物；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いて感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、タバコモザイクウイルス（TMV）または細菌発現ベクター（例えば、TiまたはpBR322プラスミド）を用いてトランスフォームした植物細胞系；または動物細胞系が含まれるが、これらに限定されるものではない。細菌の場合、有用なプラスミドにはInvitrogenのpET、pRSET、pTrcHis2およびpBADプラスミド、NovagenのpETおよびpCDFプラスミド、ならびにSigma-AldrichのDirector（商標）プラスミドが含まれる。特に、大腸菌（E. coli）は発現ベクターpETと共に使用することができる。本発明は用いられる発現ベクターまたは宿主細胞によって制限されない。
【０１１７】
「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実施するために宿主細胞のタンパク質と相互作用する非翻訳領域（例えば、エンハンサー、プロモーター、5'および3'非翻訳領域）である。このようなエレメントはそれらの長さおよび特異性において様々であり得る。使用されるベクター系および宿主に依存して、構成型および誘導型プロモーターを含む任意の数の適切な転写および翻訳エレメントを用いてよい。例えば、細菌系におけるクローニングの場合、BLUESCRIPTファージミド（Stratagene, LaJolla, CA）またはpSPORT1プラスミド（Life Technologies）などのハイブリッドlacZプロモーターのような誘導型プロモーターが用いられ得る。昆虫細胞ではバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターを使用してもよい。植物細胞のゲノム（例えば、熱ショック、RUBISCOおよび貯蔵タンパク質遺伝子）または植物ウイルス（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）から派生したプロモーターまたはエンハンサーはベクター内にクローニングすることができる。
【０１１８】
細菌系の場合は、ポリペプチドに関して意図される用途に応じて、多くの発現ベクターが選択され得る。例えば、大量のポリペプチドが必要な場合には容易に精製される融合タンパク質の多量の発現を誘導するベクターが用いられ得る。このようなベクターには、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、ポリペプチドをコードする配列がβ-ガラクトシダーゼのアミノ末端のMetおよびこれに続く7つの残基の配列とインフレームでベクターにライゲートされ得る、BLUESCRIPT（Stratagene）；pINベクター（Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509）などのような多機能大腸菌クローニングおよび発現ベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
pGEXベクター（Promega, Madison, WI）も、ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現するために用いることができる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビースへの吸着およびこれに続く遊離グルタチオン存在下での溶出によって溶解した細胞から容易に精製できる。このような系において作成されたタンパク質は、クローニングされた関心対象のポリペプチドがGST分子から自在に放出できるように、ヘパリン、トロンビンまたは活性化第Xa因子のプロテアーゼ開裂部位を含むように設計されることができる。出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）では、α因子、アルコールオキシダーゼおよびPGHのような構成型または誘導型のプロモーターを含む多くのベクターを用いることができる。総説として、Ausubel et al.（前記）およびGrant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544を参照されたい。
【０１２０】
本発明のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために、特異的な開始シグナルを用いることもできる。このようなシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列が適切な発現ベクターに挿入される場合、追加の転写または翻訳制御シグナルは必要でないこともある。しかし、コード配列またはそのフラグメントのみが挿入される場合は、ATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが提供されなければならない。さらに、挿入物全体の翻訳を確実とするためには開始コドンが適正なリーディングフレーム内になければならない。外因性の翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成双方の様々な起源のものであってよい。発現の効率は、文献（Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162）に記載されているもののように、用いられる特定の細胞系に適したエンハンサーを含むことによって促進され得る。
【０１２１】
さらに、宿主細胞は挿入された配列の発現を調節する能力または所望の様式で発現されたポリペプチドをプロセシングする能力に関して選択され得る。配列のこのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。適正な挿入、折り畳み、および／または機能を促進するために、ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻訳後のプロセシングを用いることもできる。翻訳後の活性に関して特異的な細胞の機械的および特徴的なメカニズムを有する異なる宿主細胞がAmerican Type Culture Collection（ATCC; Bethesda, MD）から入手可能であり、配列の適正な修飾およびプロセシングを確実とするために選択され得る。具体的な宿主細胞には、ロドトルラ属（Rhodotorula）、オーレオバシジウム属（Aureobasidium）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、スポロボロミセス属（Sporobolomyces)、シュードモナス属（Pseudomonas）、エルウィニア属（Erwinia）、およびフラボバクテリウム属（Flavobacterium）；またはエシェリキア属（Escherichia）、乳酸桿菌属（Lactobacillus）、バチルス属（Bacillus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）などのその他の生物体が含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の宿主細胞には、本発明を用いた使用に特に適している大腸菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、バチルスチューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ストレプトミセスリビダンス（Streptomyces lividans）などが含まれる。
【０１２２】
インビトロで培養された真核細胞に核酸を導入するためのいくつかの技術がある。これらには化学的方法（Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:7413 7417 (1987)；Bothwell et al., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Eds., Jones and Bartlett Publishers Inc., Boston, Mass. (1990), Ausubel et al.. Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY (1992）；およびFarhood, Annal. NY Acad. Sci., 716:23 34 (1994)）、プロトプラスト（Bothwell、前記）または電気的パルス（Vatteroni et al., Mutn. Res., 291:163 169 (1993)；Sabelnikov, Prog. Biophys. Mol. Biol., 62: 119 152 (1994)；Bothwell et al.、前記；およびAusubel et al.、前記）の使用、弱毒化ウイルスの使用（Davis et al., J. Virol. 1996,70(6), 3781 3787; Brinster et al. J. Gen. Virol. 2002, 83(Pt 2), 369 381; Moss, Dev. Biol. Stan., 82:55 63 (1994)；およびBothwell et al.、前記）、ならびに物理的方法（Fynan et al.、前記；Johnston et al., Meth. Cell Biol., 43(Pt A):353 365 (1994)；Bothwell et al.、前記；およびAusubel et al.、前記）が含まれる。
【０１２３】
動物組織への核酸の適切な送達は、カチオン性リポソーム（Watanabe et al., Mol. Reprod. Dev., 38:268 274 (1994)）、動物筋組織（Robinson et al., Vacc., 11:957 960 (1993); Hoffman et al, Vacc. 12:1529 1533; (1994); Xiang et al., Virol., 199:132 140 (1994); Webster et al., Vacc., 12:1495 1498 (1994); Davis et al., Vacc., 12:1503 1509 (1994); Davis et al., Hum. Molec. Gen., 2:1847 1851 (1993); Dalemans et al. Ann NY Acad. Sci. 1995, 772, 255 256. Conry, et al. Cancer Res. 1995, 55(7), 1397-1400）および胚（Naito et al., Mol. Reprod. Dev., 39:153 161 (1994); and Burdon et al., Mol. Reprod. Dev., 33:436 442 (1992)）への裸のDNAまたはRNAの直接挿入、自己複製RNAワクチンの筋肉内注入（Davis et al., J. Virol. 1996, 70(6), 3781 3787; Balasuriya et al. Vaccine 2002,20(11 12), 1609 1617）または「遺伝子銃」技術を用いたDNAの皮内注入（Johnston et al.、前記）によって達成することができる。
【０１２４】
タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いた、本発明のポリペプチドの発現を検出および測定するための様々なプロトコールは、当技術分野において公知である。例として、酵素捕捉免疫吸着法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、および蛍光標識細胞分取法（FACS）が含まれる。モノクローナルベースの2点結合イムノアッセイはポリペプチドの2つの非干渉エピトープに反応性であるモノクローナル抗体を用いて使用することができるが、競合結合アッセイも使用できる。これらおよびその他のアッセイは特に、Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN)およびMaddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216）において記載されている。
【０１２５】
様々な標識および抱合の技術が当業者によって公知であり、様々な核酸およびアミノ酸のアッセイにおいて使用することができる。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはPCRプローブを作成するための方法は、標識ヌクレオチドを用いたオリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、またはPCR増幅を含む。または、ポリペプチドをコードする配列もしくはその任意のフラグメントまたはその修飾型を、mRNAプローブの作成のためにベクター内にクローニングすることもできる。このようなベクターは当技術分野において周知であり、市販されていて、T7、T3またはSP6のような適切なRNAポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドの添加によって、インビトロにおいてRNAプローブを合成するために用いることができる。これらの手順は、Amersham Pharmacia Biotech、PromegaおよびUS Biochemicalの様々な市販のキットを用いて実施することができる。容易な検出のために用いられ得る適切なレポーター分子または標識には、基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などに加えて放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、色素生成剤が含まれる。
【０１２６】
発現ベクター、または発現ベクターを用いてトランスフォームされる宿主細胞は、培養物からのポリペプチドの発現および回収に適した条件下で培養され得る。培養物はインビトロまたはインビボにおける発現のための成分を含むことができる。インビトロにおける発現の成分は、例えば、InvitrogenのExpressway（商標）またはRiPsの系、iNtRON BiotechnologyのGenelator（商標）の系、NovagenのEcoPro（商標）またはSTP3（商標）の系、PromegaのTNT（登録商標）Quick Coupledの系、およびQIAGENのEasyXpressの系など、ウサギ網赤血球溶解物、大腸菌溶解物およびコムギ胚芽抽出物における成分を含む。培養物から作成されるポリペプチドは、用いられる配列および／またはベクターに応じて、分泌される場合もあれば細胞内に含まれる場合もある。特定の局面において、ファージポリペプチドをコードする発現ベクターは、原核または真核細胞の膜を介してポリペプチドの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計されることができる。
【０１２７】
その他の構築物はポリペプチドの精製を促進するアミノ酸ドメインを含み得る。このようなドメインには、固定化された金属上での精製を可能とするヒスチジン−トリプトファン（例えば、6x-HIS）モジュールのような金属キレート化ペプチド、固定化された免疫グロブリン上での精製を可能とするプロテインAドメイン、およびFLAG（登録商標）伸長／アフィニティー精製系（Immunex Corp., Seattle, WA）において使用されるドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。有用なエピトープタグには3X-FLAG（登録商標）、HA、VSV-G、V5、HSV、GST、GFP、MBP、GAL4、およびβ-ガラクトシダーゼが含まれる。有用なプラスミドには、ビオチンタグ（例えば、PromegaのPinPoint（商標）プラスミド）、カルモジュリン結合タンパク質（例えば、StratageneのpCALプラスミド）、ストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、StratageneのInterPlay（商標）プラスミド）、c-mycもしくはFLAG（登録商標）タグ（例えば、Sigma-Aldrichの免疫沈降プラスミド）、またはヒスチジンタグ（例えば、QIAGENのQIAExpressプラスミド）を含むプラスミドが含まれる。
【０１２８】
精製を促進するために、発現ベクターは活性化第Xa因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）に特異的な配列のような開裂可能なリンカー配列を含むことができる。例えば、ベクターは精製ドメインおよびポリペプチドの間に一つまたはいくつかのリンカーを含むことができる。このような一つの発現ベクターは、本発明のポリペプチドおよびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位の前の6つのヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基はIMAC（Porath, J. et al. (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263-281において記載された、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー：immobilized metal ion affinity chromatography）上での精製を促進して、エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からのポリペプチドの精製のための方法を提供する。融合タンパク質を含むベクターに関する考察はKroll, D. J. et al.（1993; DNA Cell Biol. 12:441-453）に示されている。
【０１２９】
GHおよび／または関連ホルモンの阻害のためのポリヌクレオチド
本明細書に記載される通り、一つの態様において、ポリヌクレオチドは、本発明に従って、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLを阻害するために利用することができる。このようなポリヌクレオチドは、DNA、RNA、一本鎖または二本鎖であってよい。本発明を用いた使用のためのポリヌクレオチドは、本明細書において、「単離された」ポリヌクレオチドと記載される場合がある。単離されたポリヌクレオチドは当技術分野において公知の多くの技術を用いて得ることができる。例えば、組換えDNA技術は、例えば、Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY、およびSambrook and Russell (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NYにおいて述べられた通りに用いることができる。同様に、例えば、ホスホラミダイトおよび固相化学を用いた化学的合成を用いてもよい。ポリヌクレオチドは、開示される核酸配列データ、ヌクレオチド塩基間の公知の相対的な相互作用、公知の配列同一性、および本明細書において下記にて例証されるように、用いられるべき特定の核酸技術に基づいて設計され得る。
【０１３０】
一つの態様において、干渉RNA（iRNAまたはsiRNA）は、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLの発現を阻害するために用いられ得る。iRNA技術において用いられるポリヌクレオチドは、典型的にはそれらのターゲットに対して100％相補性を有する。しかし、iRNAがそのターゲットに対する特異性および翻訳遮断能を保持するならば、必ずしもこれが該当する必要はないことが認識されるべきである。例示的なiRNA分子は3'ジヌクレオチドオーバーハングを有する約18〜21bpの二本鎖RNAの形であり得るが、より短いまたはより長い分子も適切である。適切な核酸ベクターによってインビボにおいてiRNAが産生される場合、それは、典型的には、例えば約19ヌクレオチドのステムおよび9ヌクレオチドのループのステムループ構造を有し、3'末端に2〜3のUを持つRNA分子の形をとる。siRNAの設計において有用なアルゴリズムはCenix（Dresden, Germany, via Ambion,TX）から得られる。
【０１３１】
例示的なsiRNA分子は次の配列を含むことができる：
一つの局面において、iRNAは以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む：
2010530215.tif 000003
【０１３２】
一つの好ましい局面において、iRNAは以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む：
2010530215.tif 000004
【０１３３】
もう一つの好ましい局面において、iRNAは以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む：
2010530215.tif 000005
【０１３４】
「X」は、例えば、iRNAのクローニングおよび発現において有用であり得る終結シグナルおよび制限部位など、存在し得る任意の数の付加ヌクレオチドを示す。
【０１３５】
非制限的な例として、本発明における有用なiRNAを所望のベクターにおいてクローニングおよび発現するために、次の核酸が用いられ得る：
2010530215.tif 000006
【０１３６】
iRNA分子は本明細書の「実施例」の項に記載される技術に従って作成することができる。このような分子の作成および設計の仕方に関するより詳細な情報は、例えば、McManus MT and Sharp PA (2002) Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Rev. Genet. 3: 737747；Dillin A (2003) The specifics of small interfering RNA specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(11): 6289-6291；およびTuschl T (2002) Expanding small RNA interference. Nature Biotechnol. 20: 446-448から得られる。
【０１３７】
当業者は、siRNAが、典型的には21〜23塩基対を含む、化学的に合成することができる二本鎖RNAを含む短鎖／低分子干渉RNAを指すことを理解する。比較により、shRNAは短鎖ヘアピンRNAを指して、ベクターをベースとするsiRNAとも呼ばれて、例えば、インビトロまたはインビボで転写される一本鎖RNAを含む。典型的には、shRNAはターゲットmRNAと相同の配列（センス配列）、「ループ」領域、およびターゲット配列に相補的な配列（アンチセンス配列）を含む。shRNAはヘアピンの二次構造を形成して、酵素ダイサーがこの構造を開裂してヘアピンを除去し、siRNAへと変換する。このように、本明細書において開示される配列はshRNAを産生して、続いて所望される通りにsiRNAに転換することができる。
【０１３８】
本発明のもう一つの態様において、アンチセンス分子が用いられる。本明細書において用いられる「アンチセンス」という用語は広義にとられるべきである。これは、ホルモン転写物に結合することができる任意の核酸（好ましくはRNAであるが、一本鎖DNAを含む）を意味することが意図される。典型的には、アンチセンス分子またはオリゴヌクレオチドはそれらのターゲットmRNAに対して完全に相補性である約15〜25のヌクレオチドを含む。しかし、完全長の配列を含めて、より大きなアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができることが認識されるべきである。また、ターゲットに対する特異性および発現を阻害する能力を保持するならば、それらのターゲットに対して完全には相補性ではないアンチセンス分子が利用され得ることも認識されるべきである。
【０１３９】
当業者は、本明細書において提供される記載および有効な配列データを考慮して、本発明において有用なアンチセンス分子を認識する。アンチセンス技術に関するさらなる情報は、例えば、Kandimalla ER, Manning A, Lathan C, Byrn RA, Agrawal S. Design, biochemical, biophysical and biological properties of cooperative antisense oligonucleotides; Nucleic Acids Res. 1995 Sep 11;23(17):3578-84；Tseng BY, Brown KD. Antisense oligonucleotide technology in the development of cancer therapeutics；Cancer Gene Ther. 1994 Mar;1(1):65-71；Brysch W, Schlingensiepen KH. Design and application of antisense oligonucleotides in cell culture, in vivo, and as therapeutic agents; Cell Mol Neurobiol. 1994 Oct;14(5):557-68；Han J, Zhu Z, Hsu C, Finley WH. Selection of antisense oligonucleotides on the basis of genomic frequency of the target sequence; Antisense Res Dev. 1994 Spring;4(1):53-65から得られる。
【０１４０】
DNAザイム、一本酸DNA、リボザイムおよび三重らせんDNAも本発明に従ってホルモンの阻害において有用であり得ることが認識されるべきである。当業者は、本明細書において示される記載、有効な配列データおよび現行の方法を考慮して、リボザイム、DNAザイム、三重らせんおよび一本鎖DNAを容易に認識することができる。しかし、例として、これらの技術に関連する方法がJoseph Sambrook and David W. Russell. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NYに記載されている。
【０１４１】
アンチセンス、iRNA、リボザイムおよびDNAザイムを含む、本発明において有用なポリヌクレオチドは、安定性を高めるために、または分解もしくはその他を予防するために化学的に修飾してもよい。例えば、核酸分子は非天然の塩基、特にリボースの2'の位置における修飾された糖、または変化したリン酸骨格を伴う類似体を含んでもよい。本発明において有用なポリヌクレオチドは、それらが結合する任意の転写物のターゲティングされた分解を可能とする配列も含み得る。例えば、RNアーゼHに特異的な配列が含まれ得る。もう一つの例は、アンチセンス分子が結合する転写物を消化するためにリボザイム（RNアーゼP）を動員することができる外部ガイド配列（EGS）の使用である。
【０１４２】
トランスクリプトームにおけるその他の配列、活性化された遺伝子の完全相補体、mRNA、または特定の細胞における転写物との相同性に関して候補配列をスクリーニングすることによって、アンチセンスオリゴヌクレオチド、iRNA、リボザイム、DNAザイムおよびcDNAなどの特異性を保証することに役立てることができる。また、当業者は、このようなポリヌクレオチドの設計および特異性の保証に有用な適切なアルゴリズムを認識することができる。
【０１４３】
本発明において有用なポリヌクレオチドは、例えば、一本鎖DNA、iRNA、アンチセンスRNA、またはDNAザイムのようにインビトロにおいて作成される核酸分子の形で用いられ得る。または、適切な場合は、それらは、例えば、アンチセンス分子、iRNAまたはリボザイムのような適切な核酸を作成するように適合させたベクターの形で用いてもよい。本発明者らは、当技術分野において公知であり得る任意のベクターの使用について検討する。例えば、CMVプロモーターを利用する裸のプラスミドが用いられ得る。アデノ随伴ウイルス（AAV）およびレンチウイルスのような、ウイルスベクターも適切である可能性がある。適切なプロモーターおよびウイルスベクターのその他の例は本明細書において後述する。このようなウイルスベクターを用いる一つの利点は、組織または腫瘍への局所的な投与とは対照的にそれらが全身投与を可能とし得ることである。
【０１４４】
本発明において有用なベクターまたは構築物は、誘導型、構成型または組織特異的なプロモーターを含めて、当技術分野において公知であるプロモーター、エンハンサー、複製起源などの適切な遺伝的エレメントを含み得る。具体的態様において、ベクターは、核酸の発現が転写の適切なインデューサーの存在または不在を制御することによって制御可能であるように、本発明の核酸（例えば、アンチセンスまたは適切なsiRNA）をコードする領域に機能的に連結される誘導型プロモーターを含む。もう一つの態様において、本発明の核酸はゲノムの所望の位置における相同的組換えを促進する領域によってフランキングされて、従って、所望の核酸の染色体内の組み込みを提供する（Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438）。勿論、ベクターは染色体外に留まり得る。
【０１４５】
本発明のもう一つの態様において、PNAが用いられる。PNAは、リン酸骨格がN-(2-アミノエチル)-グリシン単位から作られるアキラルかつ中性の骨格によって置き換えられているペプチド−核酸ハイブリッドである（例えば、Eurekah Bioscience Collection. PNA and Oligonucleotide Inhibitors of Human Telomerase. G. Gavory and S. Balasubramanian, Landes Bioscience, 2003を参照）。A、G、T、Cの塩基はメチレンカルボニル連結を介して骨格のアミノ窒素に結合する（P.E. Nielsen et al., Science 1991. 254: 1497-1500；M; Egholm et al., Nature 1993. 365: 566-568）。PNAは、高い特異性、および類似のDNAまたはRNAに比してより高い親和性で相補性配列に結合する（M. Egholm et al.、前記）。PNA／DNAまたはPNA／RNAのハイブリッドは、対応するDNA／DNAまたはDNA／RNA二本鎖に比べてより高い末端安定性も示す（M. Egholm et al.、前記）。PNAは、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼによって認識されない非天然のアミド骨格のために、高い化学的および生物学的安定性も有する（V. Demidov et al., Biochem Pharmacol 1994. 48: 1310-1313）。典型的には、PNAは少なくとも5塩基の長さであり、末端のリジンを含む。PNAはそれらの寿命をさらに延長するためにペグ化され得る（Nielsen, P. E. et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63）。非制限的な例として、アンチジーンPNAは遺伝子のコードDNA鎖における固有の配列に対する相補体として提供されてmRNA合成を阻害するように設計されることもできる。
【０１４６】
GHおよび／または関連ホルモンの阻害のための抗体
本発明は、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHもしくはヒト成長ホルモン遺伝子クラスターによってコードされるホルモン、プロリフェリン遺伝子産物、もしくは例えばhPRLのプロラクチン遺伝子産物、またはhPLに対する抗体を包含する。例えば、ホルモンの少なくとも一部またはその修飾された配列に結合する抗体。本発明の一部の局面において、抗体はこれらのホルモンの一つまたはいくつかを阻害するために用いられ得る。本発明の目的のために、抗体のフラグメントまたは修飾型が抗体として十分に機能する必要はないことが理解される。換言すれば、フラグメントまたは修飾型はインビボにおいてホルモンに結合する部位に免疫系細胞を動員できる必要はない。必ずしも中和抗体を産生する必要はない。当業者は抗体フラグメントを作成するための方法を認識する。本発明の抗体フラグメントは、無傷の抗体の一つ、一般的には抗体の抗原結合または可変領域の一部を包含することができる。一般的な例として、フラグメントが作成されることが可能であり、無傷の抗体のタンパク質分解による消化が用いられ得て、または組換え核酸技術を介して直接フラグメントを産生することもできる。本発明者らは、本明細書に記載される通り、抗体、抗体フラグメントまたはその修飾型はホルモン介在性の機能の調節において用途を見出すと考えている。特に、本発明者らは、抗体がホルモンのレベルおよび／または活性を阻害するために用いられることができて、従って、対象における様々な疾患の治療に応用可能であり得ることを発見した。
【０１４７】
基本的な抗体構造単位は四量体を含むことが公知であることが理解される。各四量体はポリペプチド鎖の2組の同一のペアから構成されて、各ペアは一つの「軽」鎖（約25kDa）および一つの「重」鎖（約50〜70kDa）を持つ。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に司る約100〜110またはそれよりも多いアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒトの軽鎖はκおよびλの軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはυとして分類されて、抗体のイソタイプをそれぞれIgM、IgD、IgAおよびIgEとして定義する。軽鎖および重鎖内において、可変領域および定常領域は約12個またはそれよりも多いアミノ酸の「J」領域によって連結されて、重鎖にはさらに約10個のアミノ酸の「D」領域も含まれる。一般的には、Fundamental Immunology Ch. 7（Paul, W., ea., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)）を参照されたい。各軽鎖／重鎖ペアの可変領域が抗体結合部位を形成する。
【０１４８】
本発明の抗体は、イソタイプおよびエピトープマッピング、ならびにいくつかの場合にはそのレセプターに対するホルモンの結合遮断能に基づいて特徴付けることができる。本発明者らは、遮断抗体を作成するために有用な各ホルモンのドメインを特定している。ホルモンの結合または活性化を遮断する試薬は、本明細書に開示される通り、様々な疾患の治療のための方法において用途を持つ。GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLを認識するがレセプター結合を遮断することはできない抗体も意図される。このような抗体は、そのようなホルモンの検出および精製、ならびに本明細書において下記にて詳述される通り、対象における疾患の進行の診断およびモニタリングのための方法において用途を見出す。このような抗体は、ホルモンの翻訳後の修飾型またはその他のその修飾配列の分析においても用途を見出され得る。
【０１４９】
抗体のヒト化は、その他の動物において産生された抗体の免疫原性を抑制するために用いることができる。ヒト化抗体の作成または抗体のヒト化は当技術分野において公知の技術を用いて達成することができる。げっ歯類のモノクローナル抗体のヒト化のために最も頻繁に用いられる方法はCDR移植（Reichmann, L., M. Clark, H. Waldman, and G. Winter. 1998. Reshaping human antibodies for therapy. Nature 332L323-327；Jones PT, Dear PH, Foote J, Neuberger MS, Winter G. 1986. Replacing the complementarity determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature 321:522-25）およびリサーフェイシング（resurfacing）（Pedersen, J. T., A. H. Henry, S. J. Searle, B. C. Guild, M. Roguska, and A. R. Rees. 1994. Comparison of surface accessible residues in human and murine immunoglobulin Fv domains. Implication for humanization of murine antibodies. J. Mol. Biol. 235:959-973）である。抗体のヒト化はエピトープをガイドとする選択（Wang et al, J. Immunological Methods 241: 171-184, 2000）によっても達成することができる。Maynard, J., and Georgiou, G. 2000. Antibody engineering. Annu Rev Biomed Eng 2: 339-376の方法はさらなる例を提供する。
【０１５０】
ヒト化抗体は、合理的な設計アプローチおよび反復性の最適化、即ち、コンピュータモデル化によって促進される、フレームワークの残基の部位特異的突然変異誘発に基づいて作成することができる。ファージディスプレイを用いたその他の選択的ヒト化の方法を用いることができる。例えば、Baca, M., L. G. Presta, S. J. O'Connor, and J. A. Wells. 1997. Antibody humanization using monovalent phage display. J. Biol. Chem. 272:10678-10684；Hoogenboom, H. R., A. P. de Bruine, S. E. Hufton, R. M. Hoet, J. W. Arends, and R. C. Roovers. 1998. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4:1-20；Jespers, L. S., A. Roberts, S. M. Mahler, G. Winter, and H. R. Hoogenboom. 1994. Guiding the selection of human antibodies from phage display repertoires to a single epitope of an antigen. Biotechnology (NY) 12:899-903；Rader, C. and C. F. Barbas, III. 1997. Phage display of combinatorial antibody libraries. Curr. Opin. Biotechnol. 8:503-508；Rader, C., D.A. Cheresh, and C. F. Barbas, III. 1998. A phage display approach for rapid antibody humanization: designed combinatorial V gene libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95:8910-8915；Rosok, M. J., D. E. Yelton, L. J. Harris, J. Bajorath, K. E. Hellstrom, I. Hellstrom, G. A. Cruz, K. Kristensson, H. Lin, W. D. Huse, and S. M. Glaser. 1996. A combinatorial library strategy for the rapid humanization of anticarcinoma BR96 Fab. J. Biol. Chem. 271:22611-22618を参照されたい。
【０１５１】
その他の局面において、ヒトの抗体は、例えばXenomouseの系統など、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を用いて再構成されたトランスジェニック動物の系統を用いて作成することができる。このような系統は、動物宿主において完全なヒト抗体を産生することを可能とする（Mendez, M. J., L. L. et al. 1997. Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. Nat. Gen. 15:146-156）。Xenomouseの動物は、特に、それらのゲノム内に66ヒト重鎖および32κ軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む酵母人工染色体（YAC）を含み、内因性の重鎖およびκ遺伝子座はターゲティングされた欠損（Mendez et al.、前記）によって機能的に不活化される。マウスはヒトのμ、δ、γ2およびκ鎖ならびにマウスλ鎖を、75：1のヒトκ対マウスλの割合で発現する（Mendez et al.、前記）。Xenomouseの動物は、これまでにタンパク質抗原に対するヒト抗体を作成することが示されていて（Green, L. L., et al. 1994. Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nat. Gen. 7:13-21；Mendez et al.、前記）、多糖類のようなT細胞非依存性抗原にも応答し得る。一つの例として、Xenomouseの動物の2つまたはそれよりも多くの遺伝的に異なる群は、例えば、重鎖および軽鎖の双方の遺伝子を含む一つの二重YACを用いて再構成されたXm2a-3の系統、および重鎖を持つ一つおよび軽鎖の遺伝子を持つ他方の2つのYACを用いて再構成されたXm2a-5の系統の抗体を作成するために用いることができる（Jakobovits, A. 1995. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Curr. Opin. Biotechnol. 6:561-566；Russell ND et al., Production of protective human antipneumococcal antibodies by transgenic mice with human immunoglobulin loci. Infect Immun. 2000 Apr;68(4): 1820-6も参照）。
【０１５２】
当業者は「ダイアボディ」および「トリアボディ」の用語を認識する。これらは、短すぎて同一の鎖上の2つのドメイン間の対合を可能とすることができない短いペプチドリンカーによって軽鎖の可変性ドメイン（VL）に接続した重鎖可変性ドメイン（VH）を含む分子である。これは一つまたはいくつかのその他の鎖の相補性ドメインとの対合を促進して、2つまたはそれよりも多い機能性抗原結合部位を有する二量体または三量体分子の形成を促す。形成される抗体分子は単一特異性または多特異性（例えば、ダイアボディの場合は二重特異性）であり得る。このような抗体分子は当技術分野において標準的な方法を用いて2つまたはそれよりも多い抗体から作ることができる。例えば、Todorovska et al. Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting. J. Immunol. Methods. 2001 Feb 1;248(1-2):47-66；Holliger P, Prospero T, and Winter G, Diabodies: small bivalent and bispecific antibody fragments, Proc Natl Acad Sci USA, 90, 6444-6448,1993；およびTomlinson I and Holliger P, Methods for generating multivalent and bispecific antibody fragments, Methods Enzymol, 326, 461-479, 2000を参照されたい。
【０１５３】
抗体の作成は当技術分野において標準的な方法に従って実施してよい。例えば、ポリクローナル抗体の作成の場合は、Bean（Eric S. Bean (2001) Polyclonal Antibodies. In: Basic Methods in Antibody Production and Characterization antibodies. Howard, G, and Bethel D. (ed.), CRC Press, 5:21-50, 2000）によって記載された方法を用いることができる。モノクローナル抗体および対応するハイブリドーマは、例えば、Stewart（Sandy J. Stewart (2001) Monoclonal Antibody Production. In: Basic Methods in Antibody Production and Characterization antibodies. Howard, G. and Bethel D. (ed.), CRC Press, 6:51-68, 2000）の方法に従って、またはMonocolonal Antibody Production Techniques and Applications, Lawrence B Schook eds., Marcel Dekker Inc., New York, 1987で調製することができる。ハイブリドーマは当技術分野において標準的な技術を用いてサブクローニング、培養および維持することができる。例えば、それらはDMEMまたはRPMI-1640のような培地においてインビトロで培養および維持することができる。または、これは任意の動物における腹水腫瘍としてインビボにおいて実施することもできる。
【０１５４】
本発明の抗体は、当技術分野において公知の標準的な方法を用いて、例えば、培養上清、腹水または血清から単離することができる。このような技術の例は本明細書において以下に示す。しかし、その他の例として、単離または精製は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、チオフィリック（thiophilic）ゲルクロマトグラフィー、等電点電気泳動法、プロテインAまたはGセファロースカラム、ヒドロキシアパタイトカラム、界面活性剤抽出法、電気泳動法、浸透圧衝撃療法、封入体精製法、硫酸アンモニウム沈殿、脂質ポリマーを用いた遠心分離、ろ過および透析などの一つまたはいくつかの方法を介して実施され得る。本発明に基づく組換え抗体は、当技術分野において標準的である様々な技術を用いて、トランスフォームした宿主細胞もしくは培養培地、またはトランスジェニックの生物体から回収され得る。本発明の抗体のアミノ酸配列は、例えばEdman分解およびHPLCを用いる標準的な方法、または質量分析法（M.W. Hunkapiller, R.M. Hewick, W.J. Dreyer, and L.E. Hood. 1983. High-Sequencing with a Gas-Phase Sequenator. Methods Enzymol. 91: 399）を用いて調べられ得ることが認識される。
【０１５５】
抗体の作成に有用なアミノ酸配列の特定には、標準的な方法を用いることができる。ポリペプチドの抗原性セグメントは、例えば、Abie Pro 3.0: Peptide Antibody Design（http://www. changbioscience.com/abie/ abie.html）によって予測することができる。特に、抗原性セグメントはHopp-Woodsスケール（Hopp TP, Woods KR. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 Jun;78(6):3824-8）および／またはKyte−Doolittleスケール（Kyte J, Doolittle RF. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol. 1982 May 5; 157(1): 105-32）に従って予測することができる。特定のコンピュータプログラムには、MAPAG（Aguilar RC, Retegui LA, Roguin LP Int J Biomed Comput. 1994 Nov-Dec;37(3):225-35）；PEOPLE（Alix AJ.: Vaccine. 1999 Sep;18(3-4):311-4）；およびHYDRPHIL（E A Mesri et al. J Clin Microbiol. 1990 June; 28(6): 1219-1224）が含まれる。
【０１５６】
このようなエピトープは、非隣接の残基を含み得る、予想される抗原配列の様々な部分（例えば、SEQ ID NO：10〜20の任意の一つの部分、以下 参照）または予想される抗原配列の一つもしくはいくつかの部分の組み合わせ（例えば、SEQ ID NO：10〜20の一つまたはいくつかの組み合わせ）または完全長の配列の一つもしくはいくつか（例えば、SEQ ID NO：10〜20の一つまたはいくつか）を構成することができるという点で立体構造特異的であり得る。抗原配列は、固有のポリペプチドにおいて生じるものとほぼ等しい3D構造（例えば、表面残基）を形成するアミノ酸またはそれらの誘導型の任意の組み合わせを含むことができる。
【０１５７】
以下の表1は、hGHにおける予想される抗原決定基（AD）を示す。表2は、hGHにおける予想される立体構造エピトープを示す。表3は、hGHにおける予想される配列エピトープを示す。表4はhPRLにおける予想される抗原決定基を示す。表5は、hPRLにおける予想される立体構造エピトープを示す。これらの表において、小文字は、ペプチドの3D立体構造の生成に関与する可能性が低い（即ち、抗原決定基として役立つ可能性が低い）アミノ酸を示し、大文字は、ペプチドの3D立体構造の生成に関与する可能性が高い（即ち、抗原決定基として役立つ可能性が高い）アミノ酸を示す。
【０１５８】
（表１）
2010530215.tif 000007
【０１５９】
（表２）
2010530215.tif 000008
【０１６０】
（表３）
2010530215.tif 000009
【０１６１】
hGH NMR座標のタンパク質データバンク（pdbファイルID：1HGU）は37、38および39のアミノ酸に関する欠失情報を有することが留意されるべきである。これらのアミノ酸はコアらせんの外側に、2つのSEの間に直接あるので、それらは抗原決定基X_37：PKE：39（SEQ ID NO：17）を含むことができて、または2つのSEであるX_33：EAYIPKE：39（SEQ ID NO：18）およびX_37：PKEQKYSFIQAPQASL：52（SEQ ID NO：19）の任意の一つの部分であり得て、または例えば、X_33：EAYIPKEQKYSFIQAPQASL：52（SEQ ID NO：20）（上記の表の3を参照）の、より大きなSEを形成するその他の2つのSEと一緒でもあり得る。
【０１６２】
（表４）
2010530215.tif 000010
【０１６３】
（表５）
2010530215.tif 000011
【０１６４】
本発明において有用な抗体は標準的な組換え技術を介して作成することもできて、例えば、Siegel (2002) Siegel DL, Recombinant monoclonal antibody technology, Transfus Clin Biol, 9(1):15-22 2002；Welschof, M., C. Christ, I. Hermes, A. Keller, C. Kleist, and M. Braunagel. 2003. Generation and screening of a modular human scFv expression library from multiple donors. Methods Mol. Biol. 207:103-121）を参照されたい。本発明者らは、組換え技術は商業規模での抗体の作成の好ましい方法であると考える。抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体のアミノ酸配列、遺伝暗号およびその中の理解されている縮重に基づいて容易に特定することができる。抗体をコードするポリヌクレオチドは例えばハイブリドーマ細胞から単離されて、その後、当技術分野において標準的な方法を用いて特徴づけることができる。例えば、ポリヌクレオチドプローブが抗体の一部のアミノ酸配列に基づいて設計されて、抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする遺伝子を単離するために用いられることが可能である。または、ポリヌクレオチドは、例えば、ホスホラミダイトおよび固相化学を用いた標準的な化学合成法によって産生することもできる。
【０１６５】
本発明がフラグメントおよび本明細書において具体的に言及される抗体の修飾型にも及ぶ限り、抗体をコードする核酸は適切に修飾され得ることが認識されるべきである。例えば、重鎖および軽鎖の定常ドメインにおけるコード配列は相同のヒトドメインで置き換えられ得る。または、CDR（相補性決定領域または抗原結合部位）の領域は相同のヒトβシートフレームワークに移植されることができる。この方法で、ヒト化抗体のような抗体修飾型は組換え技術を介して産生され得る。本明細書で記載される通り、本発明の抗体は標準的な組換え方法を介して作成してよい。従って、本発明は、抗体をコードするポリヌクレオチド、抗体フラグメントまたはその修飾型、それらを含む構築物、および該構築物を含む宿主細胞に及ぶ。本発明に基づくポリヌクレオチドは、本明細書において記載される通り、DNA、RNA、または例えば二本鎖もしくは一本鎖のセンスもしくはアンチセンス配列のcDNAであり得る。
【０１６６】
認識されるように、本発明に基づく抗体もしくは抗体フラグメント、またはその修飾型はホルモンの検出および精製の一般的な目的のために使用することができる。ホルモンは天然由来または細胞培養物のような人為的供給源由来であり得る。好ましくは、ホルモンはヒト起源である。さらに、一部の応用において有用であり得るように、抗体は検出可能なシグナルを発する化合物での標識によって修飾されてよい。例えば、酵素、蛍光剤および放射性同位体が使用されることができる。当業者はこのような適切な標識系を容易に同定する。従って、ホルモンに対する抗体の治療用の使用に加えて、抗体はホルモンの精製または診断用の応用において用途を見出すことができる。例えば、固相上に固定化された抗体は試料中のホルモンの精製および／または定量に役立つ。当業者はこれが実施され得る技術を認識する。しかし、例として、抗体、抗体フラグメント、または修飾型を用いたアフィニティークロマトグラフィーはクロマトグラフの支持上に固定化して用いられ得る。診断または精製の方法の場合は、抗体は必ずしも阻害活性を持つ必要はない。
【０１６７】
ELISAまたは同様のアッセイは直接的および間接的な検出方法を組み入れることが可能であり、本発明の抗体もしくは抗体フラグメントまたはその修飾型は捕捉抗体または検出抗体のいずれかとして用いられ得ることが認識される。認識される通り、本発明の抗体の一つまたはいくつかは単一のアッセイにおいて用いられ得る。例えば、本発明の2つの抗体がホルモン上の同一の抗原決定基を認識しない場合、一方の抗体は捕捉抗体として用いられ得て、もう一方の抗体は検出抗体として用いられ得る。または、本発明の抗体はホルモンに対する予め同定された抗体と組み合わせて用いることができる。当業者によって認識される通り、ELISAにおいて用いられる検出抗体は本明細書において記載される通り検出可能な標識に結合されてもよい。
【０１６８】
対象の状態の診断または全般的なモニタリングに有用な情報は、試験試料中のホルモンレベルを測定された基準値または標準と直接比較することによって得ることができる。例えば、正常な対象（即ち、本明細書に記載されるような医学的疾患を示さないことが既知である対象）におけるGHおよび／または関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRLまたはhPLの平均血清中値は測定することができる。これらの濃度は基準値として用いることが可能であり、この範囲を上回る結果は医学的疾患の徴候である可能性がある。好ましくは、疾患の徴候であるために必要な値は正常として特定される範囲の統計学的に有意な増加である。しかし、統計学的に有意な増加がない場合であっても、得られる結果が対象の状態に関する有益な情報を提供する場合がある。ホルモンの正常範囲は、違う体液および組織では異なり得ることが認識されるべきである。同様に、局在するホルモンの正常値は血清における正常値の範囲を逸脱する場合がある。
【０１６９】
対象の状態の診断または全般的な測定は、試験試料中に存在するホルモンの値をその他の対象の範囲から得られる結果のデータベースに対して比較することによって実施してもよい。基準値の濃度は、多くの正常な対象から得られるホルモンの標準または基準値の濃度を利用する代わりに、医学的疾患が存在しないことが既知である期間中または活発な医学的疾患の期間中に単一の対象から求めてもよい。これは、進行中および／もしくは間欠性の疾病の事象、または対象の状態の絶え間ないモニタリングが要求される疾患の場合に特に応用可能であり得る。例えば、基準値を、疾患からの緩解期の間に測定して、状態を評価するためにその後の様々な時期に診断手順を実施してもよい。これは、疾患の進行に関する有益な情報を提供する、または疾患の治療が適切に提供されているかどうかの評価に役立つ可能性がある。
【０１７０】
本明細書に記載される通り、本発明に従って作成される抗体は、例えば、細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性を予防、低下または阻害するための治療用薬剤として特定の用途を見出し得る。一つの広範囲な態様において、本発明は少なくとも一つのホルモンと一つまたはいくつかのホルモンレセプターの相互作用を遮断する方法、より広範囲には、ホルモンと結合剤の相互作用を遮断する方法であって、本発明に従って抗体、抗体フラグメントまたはその修飾型を接触させる工程を含む方法を提供する。この方法はインビボまたはインビトロにおいて実施することができる。当業者は、細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性の予防、低下または阻害における抗体の有効性を測定するための方法を容易に認識する。しかし、例として、「実施例」の項において言及されるアッセイの一つまたはいくつかを含めて、本明細書においてその他のところで記載される方法を使用してよい。さらに、本発明の抗体は、例えば、治療を助けるために細胞または組織に対して毒素、放射性ヌクレオチド、同位体、遺伝子またはその他の治療用分子を運搬するための担体として用いることができる。
【０１７１】
GHおよび／または関連ホルモンの阻害のための組成物
GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLの阻害に有用な薬剤は、単独で、または一つもしくはいくつかの薬学的に許容される希釈剤、担体、および／または賦形剤との組み合わせにおける組成物の形で使用され得る。当業者は、本発明の組成物において用いられ得る薬学的に許容される様々な希釈剤、担体および／または賦形剤を容易に認識する。認識される通り、このような希釈剤、担体および／または賦形剤の選択は、用いられる薬剤の性状、組成物の意図される投与剤形、および投与モードによってある程度決定される。例として、アンチセンスまたはiRNAを発現するように適合されたベクターのようなポリヌクレオチドの投与の場合、適切な担体には等張の溶液、水、水性生理食塩液、水性デキストロース溶液などが含まれる。
【０１７２】
標準的な希釈剤、担体および／または賦形剤に加えて、本発明の薬学的組成物は、追加の構成物と共に、または薬剤の活性を促進するような、もしくは薬剤の完全性の保護に役立つような方法で製剤化され得る。例えば、組成物は対象への投与時に分解からの保護を提供する、または薬剤の抗原性を低下させるアジュバントまたは構成物をさらに含んでもよい。または、薬剤は特異的な細胞、組織または腫瘍へのターゲティングを可能とするように修飾されてもよい。
【０１７３】
薬剤は徐放性システムを組み込むように製剤化されることができる。この場合、組成物は半浸透性のポリマーマトリックスを例えば、フィルムまたはマイクロカプセルなど成形物の形で含むことができる。徐放性のマトリックスには、ポリ乳酸（U.S. Pat. No. 3,773,919；EP 58,481）、L-グルタミン酸およびγ-エチル-L-グルタミン酸のコポリマー（Sidman et al., 1983, Biopolymers: 22: 547-56）、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリル酸）（Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.: 15: 267）、エチレン酢酸ビニル（Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.: 15: 267）、またはポリ-D-(−)-3-ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）が含まれる。
【０１７４】
本発明の薬剤はリポソームにも製剤化されることができる。化合物を含むリポソームは当技術分野において公知の技術を用いて調製することができる。例として、DE 3,218,121、EP 52,322、EP 36,676、EP 88,046、EP 143,949、EP 142,641、Japanese Pat. Appln. 83-118008、U.S. Pat. Nos. 4,485,045および4,544,545、ならびにEP 102,324を参照されたい。通常、リポソームは小さな（約200からまたは約200ないし800オングストローム）の単層のタイプであり、内部の脂質含有量は約30molパーセントコレステロールよりも多く、選択される割合は最も効果的な療法のために調節される。本発明において有用な薬剤はそれらの寿命を延長するためにペグ化することもできる。
【０１７５】
さらに、本発明に基づく組成物は特定の場合において対象に有利であり得るその他の成分と共に製剤化されてよい。例えば、適切ならば、一つまたはいくつかの抗腫瘍剤の組み入れにおいて有利であり得る。このような薬剤の例には、クロランブシル（例えば、Leukeran（商標））、シクロホスファミド（例えば、Endoxan（商標）、Cycloblastin（商標）、Neosar（商標）、Cyclophosphamide（商標））、イホスファミド（例えば、Holoxan（商標）、Ifex（商標）、Mesnex（商標）、チオテパ（例えば、Thioplex（商標）、Thiotepa（商標））のアルキル化薬剤；および例えばメトトレキセートナトリウム（例えば、Folex（商標）、Abitrexate（商標）、Edertrexate（商標））、5-フルオロウラシル（例えば、Efudix（商標）、Efudex（商標））、ヒドロキシウレア（例えば、Droxia（商標）、Hydroxyurea、Hydrea（商標））、アムサクリン、ゲムシタビン（例えば、Gemzar（商標））、ダカルバジン、チオグアニン（例えば、Lanvis（商標））などの抗代謝剤／S期阻害剤が含まれる。
【０１７６】
例えば、エトポシド（例えば、Etopophos（商標）、Etoposide、Toposar（商標））、ビンブラスチン（例えば、Velbe（商標）、Velban（商標））、ビンデスチン（例えば、Eldesine（商標））、ビノレルビン（例えば、Navelbine（商標））、パクリタキセル（例えば、Taxol（商標））などの抗代謝剤／分裂毒；例えば、ドキソルビシン（例えば、Rubex（商標））、ブレオマイシン（例えば、Blenoxane（商標））、ダクチノマイシン（例えば、Cosmegen（商標））、ダウノルビシン（例えば、Cerubidin（商標））、マイトマイシン（例えば、Mutamycin（商標））などの抗生剤型の薬剤；例えば、アミノグルテチミド（例えば、Cytadren（商標））、アナストロゾール（例えば、Arimidex（商標））、エストラムスチン（例えば、Estracyt（商標）、Emcyt（商標））、ゴセレリン（例えば、Zoladex（商標））、ヘキサメチルメラニン（例えば、Hexamet（商標））、レトロゾール（例えば、Femara（商標））、アナストロゾール（例えば、Arimidex（商標））およびタモキシフェン（例えば、Estroxyn（商標）、Genox（商標）、Novaldex（商標）、Soltamox（商標）、Tamofen（商標））などのホルモン剤も含まれる。
【０１７７】
任意の2つまたはそれよりも多い抗新生物剤（例えば、アドリアマイシン／5-フルオロウラシル／シクロホスファミド（FAC）；およびシクロホスファミド／メトトレキセート／5-フルオロウラシル（CMF））の組み合わせがさらに含まれる。例えば、シクロホスファミド（例えば、CYTOXAN）、メトトレキセート（例えば、RHEUMATREX）、5-フルオロウラシル（例えば、ADRUCIL）、ドキソルビシン（例えば、ADRIAMYCIN）、およびシクロホスファミド（例えば、CYTOXAN）のような少なくとも2つまたはそれよりも多い薬剤を含む組み合わせは特に有用である。カペシタビン（例えば、XELODA）、そのリポソーム製剤を含むドキソルビシン（例えば、ADRIAMYCIN）、ゲムシタビン（例えば、GEMZAR）、パクリタキセル（例えば、TAXOL）およびドセタキセル（例えば、TAXOTERE）を含むタキシン、ビノレルビン（例えば、NAVELBINE）、ならびにトラスツズマブ（例えば、HERCEPTIN）のような薬剤は転移性疾患に有用である。当業者は、有用であり得るその他の薬剤の例を容易に認識する。本発明の薬剤は、受け入れられている分野の慣例に従って、本明細書において具体的に言及される以外の化合物および薬剤と共に製剤化されてもよい。
【０１７８】
認識される通り、ポリヌクレオチドの投与の場合、それらはウイルス送達系に包装され得て、ウイルスの系は本明細書において記載される組成物に製剤化することができる。当業者は、本明細書に記載される発明の特徴を考慮して、様々な適切なウイルスベクターを認識することができる。しかし、例として、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）が用いることができる。当業者は、本発明においてこのようなベクターを実行するために用いられ得る方法を容易に認識する。しかし、単なる例として、レトロウイルスベクターの使用がMiller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599、およびBoesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302において報告されている；アデノウイルスベクターの使用は、例えば、Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503；Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434；Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155；Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234；PCT Publication WO 94/12649；およびWang, et al., 1995, Gene Therapy 2:775-783において報告されている；さらにAAVの使用はWalsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300；U.S. Patent No. 5,436,146において報告されている。
【０１７９】
用いられる投与モード、ならびに使用される適切な薬学的な賦形剤、希釈剤および／または担体に従って、本発明の組成物は、溶液、経口的に投与可能な液体、注射可能な液体、錠剤、コーティング錠、カプセル、丸薬、顆粒、坐剤、経皮パッチ、懸濁液、乳濁剤、徐放性製剤、ゲル、エアロゾル、リポソーム、粉末およびイムノリポソームのような従来通りの投与剤形に適合させてもよい。選択される投与剤形は、用いられるべき所望の投与モード、治療対象である疾患、および用いられるべき薬剤の特徴を反映する。特に好ましい投与剤形には、経口で投与可能な錠剤、ゲル、丸薬、カプセル、半固体、粉末、徐放性製剤、懸濁液、エリキシル剤、エアロゾル、軟膏、または局所投与のための溶液、および注射可能な溶液が含まれる。当業者は適切な投与剤形および製剤化の方法を容易に認識する。一般に、組成物は具体的な薬剤および成分をもう一つのものと接触または混合することによって調製される。続いて、必要ならば、生成物は所望の製剤に成形される。例として、組成物の製剤化の一部の方法はGennaro AR: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2000のような参照において見出すことができる。
【０１８０】
組成物中の本発明の薬剤の量は、組成物のタイプ、単位投与量のサイズ、担体、希釈剤および／または賦形剤の種類、ならびに当業者に周知のその他の要因に応じて大きく異なり得る。一般に、最終的な組成物は、本発明の活性物を重量に基づいて0.0001パーセント（％w）から100％wまで、好ましくは0.001％wから10％wまで含むことができて、残りは任意のその他の活性薬剤ならびに／または担体、希釈および／もしくは賦形剤である。
【０１８１】
治療の方法
本発明者らの最初の研究は子宮内膜癌に関連するものであり、GHおよび関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRLおよびhPLは小腸、脾臓、肝臓、胎児の肝臓および腎臓、ならびに心臓、前立腺、子宮、結腸、胃、皮膚、肺、気管、脳、小脳、胎児の脳、脊髄、胎盤、副腎、脂肪、軟骨、造血および免疫系、膵臓、ならびに骨格筋、胸腺、唾液腺、甲状腺、臍帯および卵巣においても作用することが予想される。具体的には、これらのホルモンは、他の状態のうちで特に、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮内膜癌、および子宮内膜症において作用することが予想される。従って、本発明者らは、これらのホルモンの一つまたはいくつかの阻害が、変化した細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性を特徴とする様々な疾患の治療に応用可能であると考える。
【０１８２】
一つの態様において、本発明は、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLを阻害することによって、細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性を予防、抑制または阻害する方法に関する。好ましくは、本方法は対象における異常な細胞によって特徴付けられる疾患の治療用である。この異常な細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性は対象内における一つまたはいくつかの細胞タイプにおいて発現し得て、転移性疾患を含み得る。具体的な疾患には、例えば、癌（例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、または子宮内膜癌）および子宮内膜症が含まれる。疾患の例には、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、ミエローマ、肉腫、奇形癌のような癌、ならびに副腎、膀胱、骨、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、骨髄、筋、卵巣、膵臓、上皮小体、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺および子宮の癌が含まれる。様々な態様において、疾患は乳房、結腸、肺、前立腺、膵臓、胃、子宮内膜もしくは卵巣の上皮腫瘍、または扁平上皮癌、または黒色腫、または腎臓の癌もしくは腫瘍である。
【０１８３】
乳癌に関して、これらは上皮腫瘍（例えば、管または小葉の裏打ち細胞由来）または血管肉腫、原発性間質性肉腫および葉状腫瘍のような非上皮腫瘍（例えば、支持間質由来）を含むことができる。乳癌は、例えば、インサイチューの癌および浸潤性の癌などの癌も含むことができる。非浸潤癌は、管または小葉の内部における、間質組織の浸潤を伴わない癌細胞の増殖を含む。小葉非浸潤癌（LCIS）は、いずれかの乳房におけるその後の浸潤性の癌のリスク増大を示す可能性のある触診不可能な病変を含む。乳癌において、浸潤性の癌は一般に腺癌を含んで、大半は浸潤性の管のタイプの癌を含み、その他は浸潤性の小葉の癌を含む。乳癌の稀な型には、髄様癌、粘液癌および乳管癌が含まれる。乳癌の疾患は乳頭ページェット病および転移性乳癌も含む。
【０１８４】
結腸癌に関して、これは一般に、結腸、直腸および肛門の癌、ならびに特に腺癌を含んで、癌（例えば、再発性扁平上皮癌）、黒色腫、リンパ腫および肉腫も含む。類表皮（非角化性扁平上皮細胞または類基底）の癌も含まれる。結腸癌は、例えば、管状腺腫、管状絨毛腺腫（例えば、絨毛腺ポリープ）、絨毛性（例えば、乳頭状）腺腫（腺癌を伴うまたは伴わない）、過形成性ポリープ、過誤腫、若年性ポリープ、ポリープ状癌、偽ポリープ、脂肪腫または平滑筋腫など、ポリープまたはその他の病変の特定のタイプに関連する可能性がある。癌は家族性ポリポーシス、およびガードナー症候群またはポイツ・イェガース症候群のような関連する状態に関連する可能性がある。癌は、例えば、慢性瘻孔、放射線照射された肛門皮膚、白斑症、性病性リンパ肉芽腫症、ボーエン病（上皮内癌）、尖圭コンジローム、またはヒトポリオーマウイルスに関連し得る。その他の局面において、癌は、基底細胞癌、乳房外ページェット病、排泄腔由来癌または悪性黒色腫に関連し得る。
【０１８５】
子宮内膜癌に関して、これらは腺癌、ならびに乳頭状漿液性、明細胞、扁平上皮および粘液性の癌を含み得る。子宮内膜過形成のような前癌性の状態も含まれる。子宮内膜癌は、肥満、多嚢胞性卵巣症候群、未経産、遅い閉経、エストロゲン誘発性の腫瘍、無排卵（排卵機能障害)、ならびにプロゲステロンを用いないエストロゲン療法および遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌（HNPCC）症候群の一つまたはいくつかに関連する可能性がある。
【０１８６】
当業者は、特に本明細書において示されるホルモンの発現を考慮して、本発明が適用可能であり得る疾患の別のタイプを容易に認識することができる。さらに、当業者は、本発明の特徴および本明細書に報告される結果を考慮して、本発明が異なる様々な対象に対して適用可能であることを認識する。従って、診断および治療は関心対象の任意の対象に対して応用できる。特に、本発明は哺乳動物、特にヒトに対して応用可能である。
【０１８７】
当業者は、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRL、またはhPLを阻害するために有用な様々な方法および薬剤を認識する。例として、iRNA、アンチセンス、および三重らせんDNAを含む核酸技術が、発現を阻害するために用いることができる。または、ホルモンに対する抗体またはこのような抗体の機能的な修飾型を用いてもよい。本明細書では例示的な薬剤について詳細に記載する。本発明において有用な薬剤は好ましくは次の特徴の一つまたはいくつかを示す：（1）細胞増殖を予防、抑制または阻害する能力；（2）細胞生存性を予防、抑制または阻害する能力；（3）細胞運動性を予防、抑制または阻害する能力；（3）ホルモンの発現または活性を予防、抑制または阻害する能力；（4）腫瘍の転移を予防、低下、抑制または制御する能力。好ましくは、適切な薬剤はこれらの特徴の2つまたはそれよりも多くを示す。
【０１８８】
本明細書に示す通り、GHは一部の癌細胞において、また正常な成熟細胞の少なくとも一つのサブセットにより発現する細胞性の要因としてコードされる。従って、GHおよび関連ホルモン、特にhGHおよびその変異型、hPRLならびにhPLは腫瘍関連抗原と考えることができる。これらのホルモンを正常細胞および癌細胞における発現およびアクセスの相違に基づいてターゲティングするために、複数のアプローチを用いることができる（Paul, Fundamental Immunology, 1999, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, Chapter 37において全般的に概説されている）。癌細胞はこれらのホルモンを極めて多量に発現する可能性が高く、正常細胞および癌細胞におけるこのような発現値の差は治療において活用することができる（例えば、Brown JP, et al., Quantitative analysis of melanoma-associated antigen p97 in normal and neoplastic tissues. Proc Natl Acad Sci USA 1981;78:539-543を参照）。ターゲティングは、ホルモン特異的なエフェクター細胞が正常細胞よりも癌細胞に対してより良好にアクセスすることに起因して達成することもできる。例えば、癌細胞によって発現される抗原は、不完全なグリコシル化（例えば、上皮のムチンの場合のように）のために、結合に関してより利用可能であり得る。癌細胞の場合、MHC分子の発現の増加によって腫瘍はT細胞における直接のターゲットとなり得る（例えば、Uyttenhove C, et al. The expression of mouse gene P1A in testis does not prevent safe induction of cytolytic T cells against a PlA-encoded tumor antigen. Int J Cancer 1997:70:349-356を参照）。
【０１８９】
先天性または後天性免疫に関連する多様な免疫療法の方法は、（a）例えばBCGなどの生菌ワクチンの局所適用；（b）サイトカインの使用；（c）一つまたはいくつかのホルモンに対する能動免疫化；（d）一つまたはいくつかのホルモンを用いた受動療法；および（e）エフェクター細胞（例えば、T細胞）の養子移入を含み、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRLまたはhPLに関連する癌を制御するために用いることができる。少なくとも一つのホルモンに対する能動免疫化は、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRLまたはhPLに対するマウスモノクローナル抗体を用いて免疫応答または能動免疫化を惹起するために用いることができる。一般的な手引としては、例えば、Riethmuller G, et al., Monoclonal antibody therapy for resected Dukes' C colorectal cancer: seven-year outcome of a multicenter randomized trial. J Clin Oncol 1998; 16:1788-1794；Riethmuller G, et al., Randomized trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes' C colorectal carcinoma. German Cancer Aid 17-1A Study Group. Lancet 1994;343:1177-1183；Herlyn DM, et al., Inhibition of growth of colorectal carcinoma in nude mice by monoclonal antibody. Cancer Res 1980;40:717-721を参照されたい。
【０１９０】
免疫化において、一部のアジュバントが先天免疫を刺激するために用いられる場合を除いて、純粋な抗原は往々にして後天的（即ち、抗原特異的）な免疫応答の誘導には有効でない。従って、化学的および／または細菌性の薬剤の使用によってワクチン接種部位において先天免疫を刺激するための多くのアプローチが設計される。ワクチンにおいて用いられる合成ペプチドは、特定のMHCハプロタイプに関して設計することができる（例えば、Toes RE et al. Peptide vaccination can lead to enhanced tumor growth through specific T-cell tolerance induction. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:7855-7860を参照されたい）。抗原性ペプチドは、免疫化の有効性を高めるために熱ショックタンパク質に（または組換えウイルス様粒子として）負荷することができる。一般に、免疫応答の有効な誘導には、環境中での適切な補助的または二次的シグナルを発する抗原の提示が必要である。
【０１９１】
複数の実験的な設計は、腫瘍反応性T細胞および移植された腫瘍細胞の拒絶反応を誘導するために、ウイルス特異的または腫瘍関連ペプチドで刺激した樹状細胞を使用する。樹状細胞には合成抗原性ペプチドまたは組換えタンパク質を負荷することができる。樹状細胞には、腫瘍細胞表面から掻き取った固有のペプチド、腫瘍に由来するペプチドを負荷した熱ショックタンパク質、腫瘍由来のmRNA、または融合腫瘍細胞の一つまたはいくつかを負荷することができる（総説については、Shurin MR. Dendritic cells presenting tumor antigen. Cancer Immunol Immunother 1996,43:158-164を参照）。これらの方法の一つの利点は、（固有の）個々の特徴的な腫瘍抗原、および腫瘍関連抗原に対して強力な免疫が誘導され得ることである。
【０１９２】
さらなるアプローチとして、受動抗体療法または腫瘍特異的T細胞の養子移入を用いることができる。例えば、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRLまたはhPLの抗体を用いた受動免疫化は腫瘍細胞を用いた刺激に対して保護することができて、癌細胞を用いた刺激後直ちに投与されると治療的であることができる（例えば、Riethmuller G, et al. Monoclonal antibody therapy for resected Dukes' C colorectal cancer: seven-year outcome of a multicenter randomized trial. J Clin Oncol 1998;16:1788-1794；Riethmuller G, et al. Randomized trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes' C colorectal carcinoma. German Cancer Aid 17-1A Study Group. Lancet 1994:343:1177-1183；Herlyn DM, et al. Inhibition of growth of colorectal carcinoma in nude mice by monoclonal antibody. Cancer Res 1980;40:717-721を参照）。
【０１９３】
代替となるアプローチとして、癌細胞を持続性の休眠段階に入るように誘導するために抗イディオタイプの抗体投与を用いることができる（例えば、Miller RA, Maloney DG, Warnke R, Levy R. Treatment of B-cell lymphoma with monoclonal anti-idiotype antibody. N Engl J Med 1982,306:517-522を参照されたい）。さらに、腫瘍細胞に対する抗体は、サイトカインまたは放射性化合物もしくは天然の毒素のような細胞毒性物質のための担体として用いてもよい（例えば、Ghetie V, Vitetta E. Immunotoxins in the therapy of cancer: from bench to clinic. Pharmacol Ther 1994;63:209-234；Reisfeld RA, Gillies SD. Recombinant antibody fusion proteins for cancer immunotherapy. Curr Top Microbiol Immunol 1996:213:27-53を参照）。組換え抗体−サイトカインまたは抗体−毒素融合タンパク質は腫瘍細胞を取り巻く間質においてこれらの薬剤を濃縮するために用いられ得る。代替として、エフェクター細胞および癌細胞上の腫瘍抗原に結合するように二重特異性モノクローナル抗体を操作することができる。モノクローナル抗体は、患者による抗マウス中和抗体の刺激を抑制するためにヒト化することもできる。さらなるアプローチとして、より長く確立された腫瘍負荷と共にT細胞の養子移入を用いることができる。患者から単離されたT細胞はIL-2と共にインビトロにおいて増殖させた後、IL-2も同様に投与される患者に注入することができる（例えば、Smith CA, et al. Adoptive immunotherapy for Epstein-Barr virus-related lymphoma. Leuk Lymphoma 1996;23:213-220を参照）。
【０１９４】
GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRLまたはhPLの阻害における薬剤の有効性は、本明細書における本発明に関する記載および公知の方法を考慮して測定され得る。例えば、薬剤の有効性は、ホルモンの発現を予防、抑制もしくは阻害する能力、またはホルモンの機能的効果の一つもしくはいくつかを観察することによって調べることができる。特定の例として、細胞浸潤、細胞の遊走、遺伝子転写およびホルモン反応性遺伝子の値の一つまたはいくつかに対する薬剤の影響を調べてもよい。このような試験はインビトロまたはインビボにおいて実施することができる。
【０１９５】
本明細書において「実施例」の項目名で後述されるアッセイは本発明に従って薬剤の適切性を調べるために用いることができる。具体的には、mRNAレベルでのGHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRLまたはhPLの発現を検出するためにRT-PCRおよびノーザンブロット分析を用いることができて、タンパク質レベルでの発現を検出するためにはウェスタンブロッティングおよび直接または間接免疫染色を用いることができる。ホルモン活性の検出には、細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性に関する細胞をベースとするアッセイを使用することができる。
【０１９６】
ホルモン阻害が転移に及ぼす影響に関しては、例えば、Fidler, I. J. (1973) Nat. New Biol. 242,148-149；およびPrice J. E. The biology of cancer metastasis. Prog. Clin. Biol. Res., 354A: 237-255,1990、またはKerbel R. S. What is the optimal rodent model for anti-tumor drug testing? Cancer Metastasis Rev., 17: 301-304, 1998；Killion J. J., Radinsky R., Fidler I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumours in mice. Cancer Metastasis Rev., 17:279-284, 1998；およびPrice J. E. Analyzing the metastatic phenotype. J. Cell. Biochem., 56: 16-22, 1994に記載されているようなインビボのアッセイを用いることができる。
【０１９７】
投与経路／計画
本発明者らは、対象の体内の標的部位に所望の活性（例えば、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRLまたはhPLの阻害）を送達することができる任意の方法による、本発明の任意の阻害剤または組成物の投与について検討する。このような薬剤および組成物は、それによって、標的部位での細胞増殖、細胞生存性および／または細胞運動性を阻害するために用いることができる。標的部位は疾患を有するまたは疾患に対して感受性であり得る体内の任意の部位であり得て、一つまたはいくつかの細胞、組織または具体的な腫瘍を含むことができる。例えば、投与には、非経口投与経路、全身投与経路、経口および局所適用が含まれ得る。投与は、注射、皮下、眼窩内、眼、脊髄内、槽内、局所、注入（例えば、浸透圧ポンプまたは皮膚パッチのような徐放性装置またはミニポンプを用いて）、移植、エアロゾル、吸入、乱切、腹腔内、関節内、筋肉内、腫瘍内、鼻腔内、経口、経頬、経皮、経肺、直腸または経膣送達を介することができる。認識される通り、選択される投与経路は、対象の体内における標的部位の位置、および使用される薬剤または組成物の特徴に依存し得る。
【０１９８】
具体的な態様において、ポリヌクレオチドの場合、それらは、例えば、欠陥もしくは弱毒化したレトロウイルスもしくはその他のウイルスベクターを用いた感染（例えば、米国特許第4,980,286号を参照）、もしくは裸のDNAの直接注入によって、または微粒子照射（例えば、遺伝子銃；Biolistic, DuPont）を使用することによって；脂質または細胞表面レセプターもしくはトランスフェクション薬剤でのコーティング；リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセルへの充填；核に侵入することが公知であるペプチドへの連結によって；またはレセプターなどを特異的に発現する細胞タイプをターゲティングするために用いることができるレセプター介在性のエンドサイトーシスを受けるリガンドへの連結における投与によって（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）、投与することができる。さらに、核酸−リガンド複合体が形成され得て、内部のリガンドはエンドソームを破壊するために融合性のウイルスペプチドを含み、核酸分子のリソソーム分解の回避が可能となる。
【０１９９】
さらにもう一つの態様において、ポリヌクレオチドは、例えば、1992年4月16日付けWO 92/06180（Wu et al.）；1992年12月23日付けWO 92/22635（Wilson et al.）；1992年11月26日付けWO 92/20316（Findeis et al.）；1993年7月22日付けWO 93/14188（Clarke et al.）；および1993年10月14日付けWO 93/20221（Young）に記載されるように特異的なレセプターをターゲティングすることによって、細胞特異的な取り込みおよび発現に関してインビボにおいてターゲティングされることができる。または、ポリヌクレオチドは、相同組換えKoller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438によって、発現のために細胞内に導入して宿主細胞のDNA内に組み入れることができる。本発明のためにポリヌクレオチドが導入され得る細胞は任意の所望の有効な細胞タイプを包含する。適切な細胞タイプは治療対象である疾患の特徴に依存する。しかし、例として、ポリヌクレオチドは癌細胞に導入されることができる。
【０２００】
認識される通り、投与される薬剤または組成物の用量、投与期間、および全般的な投与計画は、治療される状態の特徴、対象の症状の重症度、治療される任意の腫瘍のサイズ、治療される標的部位、選択される投与モード、ならびに対象の年齢、性別および／または全般的な健康などの変数に依存して、対象間で異なる可能性がある。当業者は、このような要因を考慮して適切な投与計画を容易に認識して、または決定することができる。投与は認識され得るように一日一回用量または複数の別個の分割用量の投与を含み得ることが認識されるべきである。本発明者らは、投与の異なるモードまたは経路を組み合わせる投与計画についても検討する。例えば、腫瘍内注射および全身投与を組み合わせることができる。
【０２０１】
本発明の方法は、治療すべき状態を考慮して、対象に有利であり得る追加の薬剤または組成物の投与などのさらなる工程を含んでもよいことが認識されるべきである。例えば、増殖性疾患の治療に有用なその他の薬剤（前記の抗腫瘍剤など）を投与することができる。このような追加の薬剤および組成物は本発明の薬剤および組成物と同時に、または連続的な様式で投与され得ることが認識されるべきである。例えば、追加の薬剤または組成物は本発明の薬剤または組成物の投与の前または後に投与することができる。薬剤または組成物の連続的な送達に関して、一つの薬剤または組成物のもう一つのものの後における連続的な投与は直ちに行われる必要はないが、これが望ましい場合があることが認識されるべきである。薬剤または組成物の送達の間には時間遅延があり得る。遅延の期間は、治療されるべき状態、および送達されるべき組成物または薬剤の特徴などの要因に依存する。しかし、例として、本発明者らは数時間から数日または数カ月の期間を検討する。
【０２０２】
診断の方法および組成物
一つの態様において、本発明は、細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性に関連する疾患の診断の方法における本発明の一つまたはいくつかの試薬の使用に関する。好ましくは、本方法は対象における異常な細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性によって特徴付けられる疾患の診断用である。この異常な細胞増殖、細胞生存性または細胞運動性は対象内における一つまたはいくつかの細胞タイプにおいて発生し得て、転移性疾患を含み得る。具体的な疾患には、例えば、癌（例えば、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、または子宮内膜癌）および子宮内膜症が含まれる。疾患の例には、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、ミエローマ、肉腫、奇形癌のような癌、ならびに副腎、膀胱、骨、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、骨髄、筋、卵巣、膵臓、上皮小体、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺および子宮の癌が含まれる。様々な態様において、疾患は乳房、肺、前立腺、結腸、膵臓、子宮内膜、胃もしくは卵巣の上皮腫瘍、または扁平上皮癌、または黒色腫、または腎臓の癌もしくは腫瘍である。具体的な乳房、結腸および子宮内膜の癌は本明細書において詳細に記載される。
【０２０３】
本発明に従って、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRLまたはhPLに特異的に結合する抗体は、これらのホルモンの一つまたはいくつかの発現を特徴とする状態もしくは疾患の診断のために、またはホルモン阻害剤を投与された患者をモニターするためのアッセイにおいて用いることができる。診断目的に有用な抗体は治療薬に関して前記と同一の方法で調製することができる。一つまたはいくつかのホルモンに関する診断的アッセイは、ヒトの体液または細胞もしくは組織の抽出液におけるGHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRLまたはhPLを検出するために抗体および標識を利用する方法を含む。抗体は修飾してまたは修飾せずに用いてよく、それらを共有結合または非共有結合でレポーター分子と結合させることによって標識することができる。当技術分野において公知である様々なレポーター分子が用いられ得て、その内のいくつかは上に記載されている。
【０２０４】
ELISA、RIAおよびFACSを含む様々なプロトコールが当技術分野において公知であり、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRLまたはhPLの発現の変化または異常な値を診断するための根拠を与える。ホルモン発現に関する正常または標準値は、正常な哺乳動物の対象、好ましくはヒトから採取された体液または細胞抽出液を、複合体形成に適した条件下において一つまたはいくつかのホルモンに対する抗体と混合することによって定められる。標準的な複合体形成の量は様々な方法によって定量され得るが、好ましくは測光の方法による。対象、対照、および疾病、生検組織に由来する試料における発現したホルモンの量を標準値と比較する。標準値および対象の値の差が疾患を診断するためのパラメータを定める。
【０２０５】
本発明のもう一つの態様において、ホルモンをコードするポリヌクレオチドを診断の目的に使用することができる。用いられ得るポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド配列、相補性RNAおよびDNA分子、ならびにPNAを含む。ポリヌクレオチドは、一つまたはいくつかのホルモンの発現が疾患に関連し得る生検組織における遺伝子発現を検出および定量するために用いられ得る。診断的アッセイは、少なくとも一つのホルモンの不在、存在および過剰な発現を識別するため、ならびに治療的介入中のホルモン値の調節をモニターするために用いることができる。
【０２０６】
一つの局面において、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRLまたはhPLをコードするゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出することができるPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションは、それらのホルモンをコードする核酸配列を同定するために使用することができる。プローブの特異性、それが例えば5'調節領域の10個の固有のヌクレオチドなど高度に特異的な領域または例えば特に3'コード領域における特異性の低い領域から作られるかどうか、およびハイブリダイゼーションまたは増幅のストリンジェンシー（最大、高い、中間、または低い）によって、プローブが、ホルモンをコードする天然配列、対立遺伝子または関連する配列のみを識別するかどうかが決定される。
【０２０７】
プローブは関連する配列の検出にも用いることができて、好ましくは任意の内因性配列に由来するヌクレオチドの少なくとも50％を含まなければならない。本発明のハイブリダイゼーションプローブはDNAまたはRNAであってよく、SEQ ID NO：27〜96のヌクレオチド配列、もしくはSEQ ID NO：27〜96の核酸配列を包含するフラグメント、またはプロモーター、エンハンサーエレメントおよび天然ホルモンのイントロンを含むゲノム配列に由来する可能性がある。
【０２０８】
GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRLまたはhPLをコードするDNAのための特異的ハイブリダイゼーションプローブを作成するための方法は、これらのホルモンをコードする核酸配列または修飾配列をmRNAプローブ作成のためにベクター内へクローニングすることを含む。このようなベクターは当技術分野において公知であり、市販されていて、適切なRNAポリメラーゼおよび適切な標識ヌクレオチドの添加によって、インビトロにおいてRNAプローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば、32Pもしくは35Sのような放射性核種、またはアビジン／ビオチン共役系などを介してプローブに結合するアルカリホスファターゼなどの酵素標識である様々なレポーターの群によって標識することができる。
【０２０９】
ホルモンをコードするポリヌクレオチド配列は、ホルモンの発現の増加または減少のいずれかに関連する疾患の診断に用いることができる。ホルモンをコードするポリヌクレオチド配列は、サザンもしくはノーザン分析；ドットブロットもしくはその他の膜をベースとする技術において；PCR技術において；またはディップスティック、ピン、ELISAアッセイにおいて；または変化したホルモン発現を検出するための患者の生検から得られる液体もしくは組織を用いたマイクロアレイにおいて用いることができる。このような定性的または定量的方法は当技術分野において周知である。
【０２１０】
特定の局面において、GHまたは関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRLまたはhPLをコードするヌクレオチド配列は、様々な癌、特に前記の癌の活性化または誘導を検出するアッセイにおいて有用であり得る。これらのホルモンをコードするヌクレオチド配列は標準的な方法で標識してよく、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下において、患者に由来する液体または組織の試料に加えてよい。適切なインキュベート期間後、試料を洗って、シグナルを定量して標準値と比較する。生検または抽出した試料中のシグナルの量が相当する対照試料のそれに対して著しく変化する場合、ヌクレオチド配列は試料中のヌクレオチド配列とハイブリダイズして、試料中のホルモンをコードするヌクレオチド配列の変化した値の存在が、関連する疾患の存在を示唆する。このようなアッセイは、動物試験、臨床試験、または個々の患者の投与のモニタリングにおける特定の治療的投与計画の有効性を評価するために用いることもできる。
【０２１１】
GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRLまたはhPLの発現に関連する疾患の診断のための根拠を与えるために、正常または標準的な発現のプロファイルが定められる。これは、動物またはヒトである正常な対象から採取された体液または細胞抽出液をハイブリダイゼーションまたは増幅に適した条件下において、GHをコードする配列またはそのフラグメントと混合することによって達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な対象から得られる値と実質的に精製されたポリヌクレオチドの公知の量が用いられる実験から得られる値とを比較して定量することができる。正常な試料から得られる標準値は疾患に関して症候性である患者の試料から得られる値と比較され得る。標準値および対象の値の差が疾患の存在を確立するために用いられる。
【０２１２】
疾患が診断されて投与プロトコルが開始されると、患者における発現のレベルが、正常な患者において観測されるレベルに近づき始めるかどうかを調べるために、ハイブリダイゼーションアッセイが定期的に反復され得る。継続的なアッセイから得られる結果は数日から数カ月までの範囲の期間を通しての投与の有効性を示すために用いることができる。癌に関して、個体から得られた生検組織における転写物の相対的に高い量の存在は、疾患の発症における素因を示す可能性があり、または実際の臨床症状の発現前に疾患を検出するための方法を提供し得る。このタイプのより確定的な診断は医療従事者がより早期に予防的対策または積極的な治療を行うことを可能として、これによって癌の発症またはさらなる進行が予防される。
【０２１３】
GHをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの追加の診断的用途はPCRの使用を伴ってもよい。このようなオリゴマーは化学的に合成される、酵素により産生される、またはインビトロにおいて作成することができる。オリゴマーは好ましくは一つはセンス配向（5'. fwdarw.3'）を持ちもう一つはアンチセンス配向（3'. fwdarw.5'）を持つ2つのヌクレオチド配列からなり、特定の遺伝子または条件の同定のために至適化された条件下で用いられる。同一の2つのオリゴマー、オリゴマーの入れ子集合、またはオリゴマーの縮重プールであっても、密接に関連するDNAまたはRNA配列の検出および／または定量のために低ストリンジェンシー条件下において用いることができる。
【０２１４】
GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRLまたはhPLの発現を定量するためにも用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン化、対照核酸の同時増幅、および実験結果が内挿される標準曲線が含まれる（Melby, P. C. et al. (1993) J. Immunol. Methods, 159:235-244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 229-236）。多数の試料の定量の速度は、関心対象のオリゴマーを異なる希釈で提供して分光光度法または比色分析の反応により迅速な定量がもたらされるELISAの様式でアッセイを実施することによって促進することができる。
【０２１５】
さらなる態様において、本明細書に記載される任意のポリヌクレオチド配列から派生するオリゴヌクレオチドまたはより長いフラグメントはマイクロアレイにおけるターゲットとして用いることができる。マイクロアレイは、多数の遺伝子の発現値を同時にモニターするために（転写イメージを作成するために）、および遺伝的変異型、突然変異および多型性を同定するために用いることができる。この情報は、遺伝子の機能を調べるため、疾患の遺伝的な根拠を理解するため、疾患を診断するため、および治療用薬剤を開発して活性をモニターするために用いられ得る。一つの態様において、マイクロアレイは、PCT出願WO 95/11995（Chee et al.）、Lockhart, D. J. et al.（1996；Nat. Biotech. 14: 1675-1680）およびSchena, M. et al.（1996；Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619）に記載されるように、当技術分野において公知の方法に従って調製および使用される。
【０２１６】
マイクロアレイは、好ましくは、多くの固有の一本鎖核酸配列、通常は固体支持体に固定化されたcDNAの合成アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはフラグメントから構成される。オリゴヌクレオチドは好ましくは約6から60ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは約15から30ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは約20から25ヌクレオチドの長さである。マイクロアレイの一部のタイプにおいて、7から10ヌクレオチドの長さであるオリゴヌクレオチドを使用することが望ましい。マイクロアレイは公知の5'または3'配列をカバーするオリゴヌクレオチドを含み得て、または完全長の配列をカバーする連続のオリゴヌクレオチドもしくは配列の長さに沿って特定の領域から選択される固有のオリゴヌクレオチドを含み得る。
【０２１７】
マイクロアレイにおいて用いられるポリヌクレオチドは、少なくとも配列のフラグメントが公知である関心対象の遺伝子に特異的である、または特定の細胞もしくは組織のタイプに、または正常、発達中もしくは疾患状態に広く見られる一つもしくはいくつかの未同定のcDNAに特異的であるオリゴヌクレオチドであってよい。一部の状況において、オリゴヌクレオチドのペアをマイクロアレイで使用することは適切であり得る。ペアは、好ましくは配列の中央に位置する一つのヌクレオチドを除いて、同一である。ペア（一方によってミスマッチである）における二番目のオリゴヌクレオチドは対照とする。オリゴヌクレオチドペアの数は1から1,000,000までの範囲であり得る。
【０２１８】
マイクロアレイのために公知の配列に対するオリゴヌクレオチドを作成するために、関心対象の遺伝子はヌクレオチド配列の5'において、より好ましくは3'末端において開始するコンピュータアルゴリズムを用いて調べる。本アルゴリズムは、遺伝子に固有の限定された長さでありハイブリダイゼーションに適した範囲のGC含有量を持ち、ハイブリダイゼーションに干渉する可能性のある予想される二次構造を持たないオリゴマーを同定する。一つの局面において、オリゴマーは光誘導性の化学的過程を用いて基質上の指定された領域において合成される。基質は、紙、ナイロン、もしくはその他の任意の種類の膜、フィルター、チップ、スライドガラス、またはその他の適切な固体支持体であってよい。
【０２１９】
一つの局面において、オリゴヌクレオチドは、PCT出願WO 95/251116（Baldeschweiler et al.）に記載されるような化学的共役方法およびインクジェット応用装置を用いることによって基質の表面に合成することができる。もう一つの局面において、吸引システム、温度、UV、機械的または化学的混合方法を用いてcDNAフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを基質の表面に配置および連結させるために、ドットまたはスロットブロット（HYBRIDOT装置、Life Technologies）と類似の格子アレイを用いてもよい。さらにもう一つの局面において、アレイは手動で、または有効な装置、材料、および機械（マルチチャンネルピペッターまたはロボット工学の装置を含む；Brinkmann, Westbury, NY）を用いることによって作成してもよく、約8、24、96、384、1536もしくは6144オリゴヌクレオチド、または市販の計測装置の有効利用に適した2から1,000,000までのその他の任意の複数を含み得る。
【０２２０】
マイクロアレイを用いて試料分析を実施するために、生物学的試料からポリヌクレオチドが抽出される。生物学的試料は、任意の体液（例えば、血液、尿、唾液、痰、胃液など）、培養細胞、生検材料、またはその他の組織調製物から得ることができる。プローブを作成するため、試料から抽出されたポリヌクレオチドがマイクロアレイにおいてオリゴヌクレオチドに相補性である核酸配列を作成するために用いられる。マイクロアレイがcDNAからなる場合は、アンチセンスRNAが適切なプローブである。従って、一つの局面において、mRNAはcDNAを作成するために用いられて、次に蛍光ヌクレオチドの存在下ではフラグメントまたはオリゴヌクレオチドアンチセンスRNAプローブを作成するためにcDNAが用いられる。プローブの配列がマイクロアレイのcDNAオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように、これらの蛍光標識されたプローブをマイクロアレイを用いてインキュベートする。もう一つの局面において、プローブとして用いられる核酸配列は、ハイブリダイゼーションの技術分野において周知である制限酵素、PCR技術およびオリゴ標識キット（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて作成されるポリヌクレオチド、フラグメント、および相補性またはアンチセンス配列を含むことができる。
【０２２１】
インキュベートの条件は、ハイブリダイゼーションが、正確な相補性一致で、または様々な低い相補性で生じるように調節される。ハイブリダイズしていないプローブを除去した後、蛍光の値およびパターンを調べるためにスキャナーを使用する。相補性の程度、およびマイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相対的な存在量を調べるために、スキャンした画像を調べる。異なるすべての配列におけるハイブリダイゼーションの不在、存在および量を同時に測定するために、検出装置を使用してよい。このデータは、試料中の配列、突然変異、変異型または多型性の大規模な相関試験または機能解析に使用することができる（Heller, R. A. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-55）。
【０２２２】
本発明のもう一つの態様において、ホルモンをコードする核酸配列は天然のゲノム配列のマッピングに有用なハイブリダイゼーションプローブを産生するために用いることができる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定領域、またはヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1構築物もしくは一染色体cDNAライブラリーのような人為的な染色体構築物にマッピングされ得る（Price, C. M. (1993) Blood Rev. 7:127-134; Trask, B. J. (1991) Trends Genet. 7:149-154参照）。
【０２２３】
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（Verma et al. (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, NYに記載されたFISH）はその他の物理的な染色体マッピング技術および遺伝子地図データと関連し得る。遺伝子地図データの例は、様々な科学的雑誌またはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のサイトにおいて見出すことができる。物理的染色体地図上のホルモンをコードする遺伝子の位置および具体的な疾患または具体的な疾患に対する素因の相関性は当該疾患に関連するDNAの領域を定めるのに役立つ可能性がある。本発明のヌクレオチド配列は、正常、キャリアおよび影響の見られる個体間の遺伝子配列の違いを検出するために用いることができる。
【０２２４】
染色体調製物のインサイチューハイブリダイゼーションおよび物理的マッピング技術、確立された染色体マーカーを用いた連鎖解析は、遺伝子地図を拡張するために用いられ得る。しばしば、マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置によって、特定のヒト染色体の数または腕が公知でない場合であっても、関連するマーカーが明らかになる場合がある。新しい配列は物理的マッピングによって染色体の腕またはその一部に割り付けることができる。これにより、ポジショナルクローニングまたはその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子について探索を行う研究者らに有益な情報が与えられる。疾患が、例えばATないし11q22〜23（Gatti, R. A. et al. (1988) Nature 336:577-580）など、特定のゲノム領域への遺伝連鎖によって大まかに位置づけられると、その領域にマッピングされる任意の配列はさらなる研究における関連または調節遺伝子となり得る。本発明のヌクレオチド配列は、正常、キャリアおよび影響の見られる個体における転座、逆位などに起因する染色体位置の差を検出するために用いることもできる。
【０２２５】
本発明のもう一つの態様において、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRLまたはhPL、またはその機能性もしくは免疫原性のフラグメントもしくはオリゴペプチドは、任意の様々な薬剤スクリーニング技術において化合物のライブラリをスクリーニングするために用いることができる。このようなスクリーニングで用いられるフラグメントは、溶液中で遊離していても、固体支持体に固定されていても、細胞表面に位置していても、または細胞内に分布していても良い。ホルモンと試験される薬剤との間の結合複合体の形成が測定され得る。さらなる態様において、ホルモンへの結合に関して中和抗体が試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイを利用してもよい。この同様の方法で、本発明の抗体は、抗体と一つまたはいくつかの抗原結合部位を共有する任意のアミノ酸配列の存在を検出するために用いることができる。
【０２２６】
用いられ得る薬剤スクリーニングのためのもう一つの技術は、WO 84/03564に記載されるように、関心対象のタンパク質に対して適切な結合親和性を有する化合物の大規模スクリーニングを提供する。この方法では、一つまたはいくつかのホルモンに応用されるように、多くの異なる小さな試験化合物がプラスチックのピンまたはその他の表面などの固体基質上で合成される。試験化合物はホルモンまたはそのフラグメントと反応して、洗われる。続いて、結合したGHは当技術分野において周知の方法によって検出される。精製されたホルモンは、前記の薬剤スクリーニング技術での使用のために、プレートに直接コーティングすることもできる。または、ペプチドを捕捉してそれを固体支持体上に固定化するために非中和抗体を用いることができる。
【０２２７】
さらなる態様において、GHまたは関連ホルモン、特にhGHもしくはその変異型、hPRLまたはhPLをコードするヌクレオチド配列は、新しい技術がトリプレット遺伝暗号および特異的塩基対相互作用のような特性を含むがこれらに限定されない現在公知であるヌクレオチド配列の特性に依存する限りにおいて、これから開発される任意の分子生物学技術において用いてもよい。
【０２２８】
治療または診断のためのキット
本発明の薬剤および組成物は、本明細書に定義される疾患の治療において、GHおよび／または関連ホルモン、特にhGHおよび／もしくはその変異型、hPRLまたはhPLを制御または阻害するための適切なキットにおいて用いることができる。その他の局面において、薬剤および組成物は診断用キットにおいて用いることができる。キットは適切な容器に入れられた本発明の少なくとも一つの薬剤を含む。薬剤は、例えば薬剤または薬学的組成物として、対象への直接投与に適切に製剤化され得る。または、キットは一つの容器に一つまたはいくつかの薬剤を、もう一つに薬学的な希釈剤、担体および／または賦形剤を含むことができ；各容器の内容物は投与前に一つに混合される。キットは、特定の適用において必要となり得るようなさらなる別の容器中に追加の薬剤および組成物をさらに含んでもよい。薬剤または組成物の保存および／または投与に適した任意の容器が本発明のキットにおいて用いられ得る。当業者は適切な容器を認識する。例として、このような容器はバイアルおよびシリンジを含む。容器は適切に滅菌されて密閉して封印されることができる。さらに、本発明のキットは、キットの組成物の使用および投与のための取り扱い説明書も含むことができる。本発明は、以下の実施例に関連してさらに明らかにされる。
【０２２９】
実施例
本明細書に記載される実施例は本発明の態様の例証の目的のためである。その他の態様、方法および分析のタイプは分子診断の技術分野における当業者の範囲内であり、本明細書において詳細に記載される必要はない。当技術分野の範囲内のその他の態様は本発明の一部であると考えられる。
【０２３０】
実施例1：材料および方法 
細胞株および細胞のトランスフェクション
ヒト子宮内膜癌細胞株であるRL95-2およびAN3はAmerican Type Culture Collection （ATCC）から入手した。RL95-2細胞は、10mM HEPESおよび2.0g/L炭酸水素ナトリウムを含む、10％ウシ胎児血清、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mM L-グルタミンおよび0.005mg/mlインスリンを加えたDulbeccoのEagle改変培地およびHam's F12培地（1：1）で増殖させた。AN3細胞は、2mM L-グルタミンを含む最小必須培地（Eagle）、ならびに1.5g/L炭酸水素ナトリウムを含むように調整して、10％ウシ胎児血清、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、0.1mM非必須アミノ酸および1.0mMピルビン酸ナトリウムを加えたEarleのBSSで増殖させた。双方の細胞株の増殖は加湿した5％CO2大気中で37℃にて維持した。
【０２３１】
プラスミドpcDNA3-hGHは、完全なhGH遺伝子を含むベクターpMT-hGHに由来するBamHIフラグメント（Palmiter RD, Norstedt G, Gelinas RE, Hammer RE, Brinster RL (1983). Metallothionein-human GH fusion genes stimulate growth of mice. Science 222: 809-14）をpcDNA3にクローニングすることによって構築した。安定した細胞株の産生のため、RL95-2およびAN3の細胞をFuGENE（登録商標）6（Roche Applied Science, USA）を用いてpcDNA3またはpcDNA3-hGHのプラスミドを安定的にトランスフェクトした。安定なトランスフェクト細胞は、既報（Moller C, Hansson A, Enberg B, Lobie PE, Norstedt G (1992). Growth hormone (GH) induction of tyrosine phosphorylation and activation of mitogen-activated protein kinases in cells transfected with rat GH receptor cDNA. J Biol Chem 267: 23403-8）の通り、800μg/ml G418中で14日間インキュベートして選択した。pMT-hGHを安定的にトランスフェクトされたRL95-2およびAN3の細胞は、それぞれ、RL95-2-hGHおよびAN3-hGHと命名して、pcDNA3を安定的にトランスフェクトされた細胞はRL95-2-ベクターおよびAN3-ベクターと命名した。
【０２３２】
siRNA構築物であるsihGH5およびsihGH6はクローニングによって産生された。sihGH5構築物は、ヒト成長ホルモン1およびヒト成長ホルモン2に対する次の標的配列を含んだ。
2010530215.tif 000012
sihGH6構築物は、ヒト成長ホルモン1に対する次の標的配列を含んだ。
2010530215.tif 000013
安定細胞株の産生のため、RL95-2の細胞をFuGENE（登録商標）6（Roche Applied Science, USA）を用いてsiベクターのsihGH5、sihGH6のプラスミドを安定的にトランスフェクトした。安定なトランスフェクト細胞は、前記の通り、800μg/ml G418中で14日間インキュベートして選択した。sihGH5を安定的にトランスフェクトしたRL95-2細胞はRL95-2-sihGH5と命名して、sihGH6を安定的にトランスフェクトした細胞はRL95-2-hGH6と命名して、ベクターのみを安定的にトランスフェクトした細胞はRL95-2-siベクターと命名した。
【０２３３】
総細胞数アッセイ
細胞株を、10％FBSを含む培地または血清欠乏培地（0.2％FBS）のいずれかにおいて、6穴プレートを用いてウェル当たり5×104個の細胞密度にて三反復で接種した。細胞の増殖は5％CO2中、37℃にて維持した。指定された日に細胞を0.5％トリプシンでトリプシン処理して、血球計数器を用いて細胞数を求めた（Zhu Z, Mukhina S, Zhu T, Mertani HC, Lee KO, Lobie PE (2005). p44/42 MAP kinase-dependent regulation of catalase by autocrine human growth hormone protects human mammary carcinoma cells from oxidative stress-induced apoptosis. Oncogene 24: 3774-85）。実験は三反復にて実施して、各アッセイを少なくとも2回実施した。
【０２３４】
5'-ブロモ-2'-デオキシウリジン取り込みアッセイ
有糸分裂誘発は、DNA合成中の5'-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）の取り込みを測定することによって直接アッセイした（Sawa T, Sasaoka T, Hirai H, Ishihara H, Ishiki M, Wada T et al (1999). Intracellular signalling pathways of okadaic acid leading to mitogenesis in Rat1 fibroblast overexpressing insulin receptors: okadaic acid regulates Shc phosphorylation by mechanisms independent of insulin. Cell Signal 11: 797-803）。5'-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）の取り込みのため、安定細胞をPBSで2回洗って、トリプシン処理し、10％FBSを含む培地または血清欠乏培地（0.2％FBS）のいずれかにおいて6穴プレートに接種した。RL95-2およびAN3の両細胞を20μM BrdUで45分間、パルス標識して、PBSで2回洗い、冷却4％パラホルムアルデヒド中で30分間、固定した。BrdU検出はBrdU染色キット（VECTASTAIN Elite ABC Kit, Invitro Tech, NZ）を用いて、製造業者の取り扱い説明書に従って実施した。細胞＞5000個を超える集団全体は、BrdU標識指数（DNA合成細胞のパーセント）を求めるために、恣意的に選択した複数の顕微鏡視野中で解析した。実験は三反復にて実施して、各アッセイを少なくとも2回実施した。
【０２３５】
アポトーシスの測定
アポトーシスによる細胞死は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼビオチン-dUTPニック末端標識（TUNEL）アッセイにより測定した。6穴プレートに接種したサブコンフルエントな安定細胞を血清フリーの培地でインキュベートした。血清フリー培地での48時間の培養期間後、細胞を0.5％トリプシンでトリプシン処理して1×PBSで2回洗った。製造業者の取り扱い説明書に従って、（APO-BrdU（商標）TUNEL Assay, Invitrogen, NZ）キットを用いたTUNEL検出を実施した。TUNEL陽性細胞の集団を血球計数器を用いて測定して、細胞総数のパーセントとして表した。実験は三反復にて実施して、各アッセイを少なくとも2回実施した。アポトーシスの開始を示すためのカスパーゼ3/7活性は、Promegaのキットを用いて製造業者の取り扱い説明書に従って測定した。
【０２３６】
マトリゲルにおける細胞の行動および形態形成アッセイ
組織培養シャーレは、安定細胞株の添加前に30分間、37℃にてマトリゲル（BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ）でコーティングした。細胞株の行動は、倒立光学顕微鏡（Olympus 1X2-ILL100、日本）を用いて、24時間間隔で評価してディジタルで記録した。
【０２３７】
足場非依存性増殖アッセイ
懸濁培養を含む足場非依存増殖アッセイは既報（Zhang X, Zhu T, Chen Y, Mertani HC, Lee KO, Lobie PE (2003). Human growth hormone-regulated HOXA1 is a human mammary epithelial oncogene. J Biol Chem 278: 7580-90）の通り、実施した。安定細胞（5×105個）を75cm2のフラスコに野生型培地を用いて単層にて接種した。72時間後、細胞を0.5％トリプシンでトリプシン処理して、血球計数器を用いて細胞数を求めた。懸濁培養では、細胞（5×103個）をPoly-HEMA（Sigma）でコーティングした6穴プレートで増殖させた。指定された日に細胞を回収して、血球計数器を用いてカウントした。軟寒天コロニー形成のため、安定細胞を最初に寒天層（0.5％寒天を含む血清フリーの培地）で被覆した6穴プレートで培養した。中間の層は、10％FBSおよび0.35％寒天を含む培地にて5×103個の細胞を含んだ。アガロースゲルの乾燥を防ぐために、最上層として血清含有培地を加えた。プレートを18日間インキュベートして、その後、培養を目視で調べて写真撮影した。病巣形成のため、細胞（5×103個）を10％FBSを含む培地中で単層として6穴プレートに接種した。細胞を20日間インキュベートして、その後、培養を目視で調べて写真撮影した。
【０２３８】
インビトロにおける細胞遊走および浸潤アッセイ
アッセイはBD BioCoat Matrigelインベージョンチャンバーにおいて製造業者の取り扱い説明書に従って実施して、フィルターの孔（孔径 8μm）は細胞遊走の判定のためにコーティングせず、フィルターは細胞浸潤を調べるためにマトリゲル（Matrigel）で予めコーティングした。浸潤アッセイのため、フィルターは成長因子低減（growth factor-reduced）マトリゲル（1：5、マトリゲルおよび血清フリーDMEM-F12培地）500μlでコーティングした。実験前に24時間にわたって細胞から血清を除去した。各フィルターに血清フリーのDMEM-F12 50μl中の細胞（5×104個）を適用して、10％FBSを含むDMEM-F12で条件付けした培地を化学誘引剤として下の方のチャンバーに適用した。48時間インキュベート後、フィルターを4％パラホルムアルデヒドで固定して、クリスタルバイオレットで染色した。フィルターの上側表面の細胞を綿棒で除去した。フィルターの下側表面に浸潤した細胞を、フィルター当たり8を超える任意の視野を選択して顕微鏡検査によりカウントした（倍率 10倍）。細胞の遊走または浸潤の値は、三反復の顕微鏡視野当たり一フィルター当たりの平均細胞数として表した。実験は、結果を確認するために3回、繰り返した。創傷遊走アッセイのため、トランスフェクトした安定な細胞株のコンフルエントな単層をピペットの先端で掻き取ってPBSで洗い、10％FBSを加えた培養培地で6日間、インキュベートした。
【０２３９】
ELISA
安定な細胞株を6穴プレートでコンフルエントまで増殖させた。細胞をリン酸緩衝生理食塩液（PBS）pH 7.4で洗って、続いて、培地を血清フリーの培地に24時間、交換した。次に、24時間の期間を通して血清フリーの培地1ml中に産生および分泌されるhGHの量を求めた。hGHの定量のためのELISAは、hGHコーティングしたウェルのELISAキット（Diagnostic Systems Laboratories Inc., USA）を用いて製造業者の取り扱い説明書に従って実施した。
【０２４０】
細胞生存率
細胞生存率は、既報（van de LoosdrechtAA, Beelen RH, Ossenkoppele GJ, Broekhoven MG, Langenhuijsen MM (1994). A tetrazolium-based colorimetric MTT assay to quantitate human monocyte mediated cytotoxicity against leukemic cells from cell lines and patients with acute myeloid leukemia. J Immunol Methods 174: 311-20）の通り、MTTアッセイを用いて測定した。簡潔に言うと、細胞（ウェル当たり1×104個）を10％FBS含有または血清欠乏培地（0.2％FBS）200μlの最終液量にて96穴マイクロタイタープレートに接種した。細胞を37℃、5％CO2にて指定された期間インキュベートした後、MTT試薬（PBS中5mg/ml）20μlを各ウェルに加えて、プレートを37℃でさらに4時間インキュベートした。各ウェルに溶解試薬（12N HClを含む10％SDS）100μlを加えて、翌日、595nmでの吸光度を判定した。各実験は三反復にて実施して、結果を確認するために少なくとも2回繰り返した。
【０２４１】
hGH抗血清投与：
hGH抗血清はNational Hormone & Peptide Program（California, USA）から購入した。これらのhGH抗血清はウサギから採取された。細胞を異なる量のhGH抗血清で処理した。対照ウェルの培地には正常なウサギ血清（NRS）に相当する濃度を加えた。
【０２４２】
hGHに対する新しいポリクローナル抗体の作成
免疫化：ニワトリを0日に完全フロイントアジュバントを加えた組換えヒト成長ホルモン（〜0.5mg/ニワトリ）で免疫して、9、29および39日に再度、追加免疫した（〜0.17mg/ニワトリ）。免疫化の前後に卵を採取した。
【０２４３】
卵黄からのIgYの抽出：卵を採取して、卵黄を分離してプールした。精製は4℃にて実施した。卵黄を希釈して遠心分離した。IgYを透明な上清から沈殿させた。沈殿物を遠心分離によって分離して、PBSに溶解した。90％に等しいまたはより高い純度にて約5mg/mlの最終濃度が得られるように免疫化前後のニワトリIgY試料をろ過滅菌して、4℃にて保存した。
【０２４４】
アフィニティーカラムの調製：Affigel-15（Bio-Rad 153-6052）ビーズは、タンパク質中に存在するアミノ酸の一級アミンにすぐに結合する遊離カルボキシル基を持つスクシンイミドリンカー結合マトリックスである。ビーズは冷水で洗って結合緩衝液（10mM MOPS、pH 7.5）に再懸濁した。ヒト成長ホルモン（抗原）を水に溶解して、結合緩衝液に対して一晩透析した。抗原およびAffigel-15ビーズを4時間、静かに混合した。この後、タンパク質結合を促進するために1Mエタノールアミン-HCl、pH 8.0を加えて1時間撹拌した。続いて、抗原に結合したビーズをEconoColumn（Bio-Rad）に移して、一連の洗浄に供した。第一に、ビーズを結合緩衝液を用いて、次にPBS、続いてグリシン-HCl pH 2.4／150mM NaClにより洗浄して、その後PBSで再度洗浄した。
【０２４５】
抗hGH−IgY精製：調製したhGHアフィニティーカラムにIgYを2回適用した。カラムをPBSで洗って、次に抗hGH−IgYを100mMグリシン-HCl pH 2.4／150mM NaClで溶出した。溶出された画分は直ちに1M トリス-HCl、pH 8.0で中和した。続いて、抗hGH−IgYをPBS、pH 7.4に対して4℃で48時間透析して、4mg/mL以上に濃縮した。
【０２４６】
リアルタイムPCRおよび逆転写PCR
全RNAの抽出およびRT-PCRアッセイは既報（Mertani HC, Zhu T, Goh EL, Lee KO, Morel G, Lobie PE (2001). Autocrine human growth hormone (hGH) regulation of human mammary carcinoma cell gene expression. Identification of CHOP as a mediator of hGH-stimulated human mammary carcinoma cell survival. J Biol Chem 276: 21464-75）の通り実施した。RT-PCRに使用したオリゴヌクレオチドプライマー対の配列は次の通りであった。
2010530215.tif 000014
【０２４７】
リアルタイムPCRにおいて、全RNAはSuperScript（商標）III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR (Invitrogen, CA）を用いて製造業者の取り扱い説明書に従ってcDNAに転換した。分析にはABI7700（登録商標）リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems, USA）を使用した。ゲノム周辺に分布する多数の遺伝子マーカーおよび3つのハウスキーピング遺伝子をSYBR（登録商標）GreenER（商標）qPCR SuperMix for ABI PRISM（登録商標）（Invitrogen, CA）を用いたリアルタイムPCR分析に用いた。すべてのプライマーの配列情報を表6（以下）に列記した。
【０２４８】
（表６）リアルタイムPCRにおけるプライマー対
2010530215.tif 000015
【０２４９】
反応のため、試験遺伝子および内因性対照遺伝子の双方の全cDNA 5ngをSYBR（登録商標）GreenER（商標）qPCR SuperMix for ABI PRISM（登録商標）および各プライマー200nMを含む混合液20μlに加えた。384穴プレートにて、95℃において10分間の初回変性、続いて95℃において20秒間および60℃において30秒間の40サイクルの2段階の増幅プログラムを用いて、各マーカーについて三反復の反応を実施した。融解曲線の分析工程は増幅終了時に実施して、95℃において1分間の変性および55℃において1分間の再アニーリングからなった。無処置cDNAの5倍段階希釈を用いて、各実験プレートから標準曲線を作成した。
【０２５０】
各反応のCtはABIソフトウェアを用いて算出した。増幅効率は、等式E＝10（-1/勾配）（Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM (1996). Real time quantitative PCR. Genome Res 6: 986-94）に従って算出して、すべての遺伝子マーカーにおいて90〜104％の範囲であった；非特異的な増幅またはプライマーダイマーは、融解曲線の分析により確認される通り、いずれの反応においても観測されなかった。マーカー間のEにおける潜在的な相違を補償するために、相対発現を効率（E）に基づいて算出して、一群のハウスキーピング遺伝子、β-アクチン、HPRT、ならびに試料対対照のGAPDHおよびCtの差（△）（△Ctターゲット−対照）により正規化した。相対発現＝2−（Ct、ターゲット−Ct,HKG）−（Ct、対照−Ct,HKG）；相対発現＝2−ddCt。
【０２５１】
統計
すべてのデータは三反復の平均値±SDとして表す。実験はすべて少なくとも2回繰り返した。データは両側t検定またはANOVAを用いて解析した。
【０２５２】
実施例2：結果
子宮内膜細胞におけるhGHの強制発現により総細胞数が増加する
hGHのオートクリン産生は、乳癌細胞モデルにおいて細胞機能に影響を及ぼして腫瘍原性を高めることが先に示されている（Kaulsay KK, Zhu T, Bennett W, Lee KO, Lobie PE (2001). The effects of autocrine human growth hormone (hGH) on human mammary carcinoma cell behaviour are mediated via the hGH receptor. Endocrinology 142: 767-77, Mukhina S, Mertani HC, Guo K, Lee KO, Gluckman PD, Lobie PE (2004). Phenotypic conversion of human mammary carcinoma cells by autocrine human growth hormone. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 15166-71, Zhu T, Starling-Emerald B, Zhang X, Lee KO, Gluckman PD, Mertani HC et al (2005). Oncogenic transformation of human mammary epithelial cells by autocrine human growth hormone. Cancer Res 65: 317-24）。オートクリンhGHが子宮内膜癌モデルにおいて細胞機能に影響を及ぼすかどうかを調べるために、RL95-2細胞にhGH遺伝子をコードする発現プラスミドを安定的にトランスフェクトした（RL95-2-hGH）。並行して、対照として、ベクターを安定的にトランスフェクトした第二の細胞株（RL95-2-ベクター）を確立した。潜在的なクローン選択のあらゆる影響を最小限とするために、プールした安定なトランスフェクト細胞を使用した。
【０２５３】
RL95-2-hGH安定細胞は、RT-PCR（図1a）に示されるようにhGH mRNAを合成して、ELISA分析（図1b）に示されるように細胞外媒質中にhGHタンパク質を分泌した。この分析は、RL95-2細胞が少量のhGH転写物およびhGHタンパク質を内因性に発現することも示した（図1aおよびb）。安定的にトランスフェクトされた細胞株におけるhGHおよびhGHレセプターの値を調べるために、リアルタイムPCRの相対的な定量分析も実施した。この分析は、RL95-2-ベクター細胞に比べてRL95-2-hGH細胞株ではオートクリン-hGHは3×102倍に増加してhGHレセプター転写物は変化しないことが示された。
【０２５４】
安定的にトランスフェクトされた細胞株におけるhGHレセプターmRNAの継続的な発現はRT-PCRによっても実証された（図1a）。対照細胞株（RL95-2-ベクター）に比べてhGH発現安定細胞（RL95-2-hGH）ではレセプター発現の変化は観測されなかった。RL95-2-ベクターまたはRL95-2-hGHの細胞もリアルタイムPCRによって検出可能な値のIGF-1 mRNAを示さず、以下に報告されるオートクリンhGHに介在される反応が細胞機能に対するIGF-1の影響に起因しないことを示す。但し、リアルタイムPCRでは、RL95-2-ベクター細胞株に比べてRL95-2-hGH細胞ではIGF-2 mRNAが増加することが実証された。
【０２５５】
hGHのオートクリンのRL95-2細胞機能に対する影響を調べるために、安定的にトランスフェクトしたRL95-2細胞株の血清培地および血清欠乏培地中での増殖について調べた。MTTアッセイを用いた細胞の生存率および増殖の評価により、RL95-2-hGH細胞におけるオートクリンhGH発現は血清含有および血清欠乏培地の双方においてRL95-2ベクターと比べて生存率を高めることが示された（図1cおよびd）。10％血清培地中で実施された総細胞数アッセイでは、最初の播種密度が同一であるにも関わらず、RL95-2-hGH細胞数が6日間の期間を通してRL95-2-ベクター細胞数よりも劇的に早く増加することが示された（図2a）。細胞増殖の亢進は、増殖の亢進および／またはアポトーシス減少の真の影響に起因する可能性がある。hGHのオートクリン発現は、血清条件および血清フリー条件でのRL95-2-hGH細胞のBrdU取り込みにより調べられる通り、細胞周期の進行を有意に亢進した（図2b）。さらに、オートクリンhGHは、対照細胞株であるRL95-2-ベクターに比べて、血清欠乏の結果としてのアポトーシス細胞死を減少させた（図2c）。
【０２５６】
細胞周期の進行および細胞生存性に必要な遺伝子の転写調節は細胞の癌化に関与するシグナル伝達経路の活性化に直接関連する（Evan G, Littlewood T (1998). A matter of life and cell death. Science 281: 1317-22, Nagasawa H, Noguchi Y, Mori T, Niki K, Namiki H (1985). Suppression of normal and preneoplastic mammary growth and uterine adenomyosis with reduced growth hormone level in SHN mice given monosodium glutamate neonatally. Eur J Cancer Clin Oncol 21:1547-51）。オートクリンhGHは、MCF-7細胞において遺伝子発現を示差的に調節することが先に実証されている（Xu XQ, Emerald BS, Goh EL, Kannan N, Miller LD, Gluckman PD et al (2005). Gene expression profiling to identify oncogenic determinants of autocrine human growth hormone in human mammary carcinoma. J Biol Chem 280: 23987-4003）。細胞増殖およびアポトーシスに関与する複数の重要な遺伝子のmRNA値の測定には、リアルタイムPCR分析を利用した。RL95-2細胞におけるhGHの強制発現は、細胞周期の進行に必要なDDND1（サイクリンD1）およびサイクリンE1、ならびに細胞生存性に必要な抗アポトーシス遺伝子であるBcl-2のmRNA値をアップレギュレートした。アポトーシス促進性タンパク質であるp53（TP53）、BAD、およびBAK1をコードする遺伝子のmRNA値はダウンレギュレートされることが観測された。さらに、先にオートクリンhGH介在性の腫瘍形成と関連付けられている強力な癌遺伝子であるHOXA1のmRNA値はオートクリン-hGHの過剰発現で6倍にアップレギュレートされた（図2d）。
【０２５７】
子宮内膜癌細胞によるオートクリン-hGH発現は足場非依存性の増殖を強化する
発癌性に形質転換した細胞の特徴は足場非依存性の細胞増殖である（Evan G, Littlewood T (1998). A matter of life and cell death. Science 281: 1317-22；Zhu Z, Mukhina S, Zhu T, Mertani HC, Lee KO, Lobie PE (2005). p44/42 MAP kinase-dependent regulation of catalase by autocrine human growth hormone protects human mammary carcinoma cells from oxidative stress-induced apoptosis. Oncogene 24: 3774-85；Hanahan D, Weinberg RA (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100: 57-70）。RL95-2-hGH細胞におけるhGHのオートクリン発現は、軟寒天におけるコロニー形成（図3a）および懸濁培養における増殖（図3b）に示されるように、足場非依存性の増殖を強化した。さらに、軟寒天における個々のコロニーサイズはオートクリン-hGHによって著しく増大した（図3a）。RL95-2-hGH安定細胞におけるオートクリン-hGHの高い発現はRL95-2-ベクター対照細胞株に比べて病巣形成も増加した（図3d）。
【０２５８】
腫瘍原性に形質転換した上皮細胞は、マトリゲル中での増殖時には管腔を持たない大きくて非極性の分化していないコロニーを形成する（Petersen OW, Ronnov-Jessen L, Howlett. AR, Bissell MJ (1992). Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 89: 9064-8）。このエキソビボモデルはマトリゲルにおける管腔構造物に対するオートクリンhGHの影響を調べるために用いられた（Muthuswamy SK, Li D, Lelievre S, Bissell MJ, Brugge JS (2001). ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol 3: 785-92）。RL95-2-ベクター細胞およびRL95-2-hGH細胞を、成長因子含有マトリゲルおよび成長因子抑制マトリゲルに播種した。RL95-2-ベクター細胞は通常の三次元構造を形成した。これに対してRL95-2-hGH細胞は不規則な形態の無秩序な構造物を形成した（図3c）。さらに、成長因子抑制マトリゲルで増殖させたRL95-2-hGH細胞はより攻撃的であり、細胞極性化の破壊を示した（図3c）。
【０２５９】
安定細胞におけるhGHのオートクリン発現は間葉系の表現型を促進する
癌の低分化かつ高悪性状態への進行中、細胞は、遺伝子発現が変化すると同時に、それらの上皮特性を喪失して間葉系の形態を獲得する（Sommers CL, Byers SW, Thompson EW, Torri JA, Gelmann EP (1994). Differentiation state and invasiveness of human breast cancer cell lines. Breast Cancer Res Treat 31: 325-35；Thiery JP (2002). Epithelial- mesenchymal transitions in tumour progression. Nat Rev Cancer 2:442-54）。このような表現型の転換は上皮−間葉推移と呼ばれる。ヒト乳癌細胞におけるオートクリン-hGHは細胞の形態を変化させることが実証されていて浸潤性の表現型の発生に十分であることが示されている（Mukhina S, Mertani HC, Guo K, Lee KO, Gluckman PD, Lobie PE (2004). Phenotypic conversion of human mammary carcinoma cells by autocrine human growth hormone. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 15166-71）。同様に、RL95-2-hGH細胞におけるオートクリン-hGHの発現は変化した細胞の形態に関連した。RL95-2-hGH細胞は、対照細胞に比べて間葉系の表現型も呈した（図4a）。細胞外マトリックスタンパク質であるフィブロネクチン（FN1）、ならびにα-カテニン、β-カテニンおよびδ-カテニン（カテニンファミリー）もオートクリン-hGHの過剰発現でアップレギュレートされた。
【０２６０】
オートクリン-hGH発現細胞の観測された間葉系形態は遊走および浸潤の可能性が増大することを示唆した。創傷治癒アッセイを用いて細胞運動性を調べた結果、オートクリン-hGHは細胞の遊走を実際に刺激して、ベクターをトランスフェクトした細胞において観測されたよりもより速やかな創傷の閉鎖が観測された（図4b）。オートクリン-hGH発現細胞の遊走の亢進は、対照細胞株（図4c）をRL95-2親細胞株と比較するTranswellアッセイを用いても確認された。オートクリン-hGH発現RL95-2細胞は、標準的な浸潤アッセイにおいてマトリゲル通過能力の有意な増大も示した（図4d）。
【０２６１】
AN3細胞株に対するオートクリンhGH発現の影響
RL95-2細胞に対するオートクリンhGHの影響が細胞タイプ特異的な現象ではないことを実証するために、二番目の子宮内膜癌細胞株（AN3）におけるhGHオートクリン発現の影響について調べた。hGHを過剰発現しているAN3細胞および対応する対照細胞株を、RL95-2細胞について記載した通り、AN3-hGHおよびAN3-ベクターの安定なトランスフェクションにより産生した。RT-PCRおよびELISA分析より、AN3-hGH細胞では対照細胞株に比べてhGH mRNAおよびタンパク質の値が増加していること（図5a）、ならびに双方の細胞株が等しいhGH-レセプター転写物の値を有することが実証された（図5a）。2つの安定細胞株の細胞増殖を10％血清培地において評価した。AN3-hGH細胞の総細胞数は、最初の播種密度が同一であるにも関わらず、14日間の期間中に対照細胞よりも有意に増加した（図5b）。安定細胞におけるhGHのオートクリン発現も足場非依存性の細胞増殖を強化して、コロニーサイズは軟寒天におけるコロニー形成に示されるように著しく増加した（図5c）。
【０２６２】
hGH抗血清は内因性に発現するオートクリン-hGHの影響を抑制する
野生型のRL95-2細胞は少量のhGHタンパク質を産生する。そこで、hGHに対する抗体のRL95-2細胞機能に対する影響について調べた。ウサギにおいてhGHに対して上昇したhGH抗体を使用した。RL95-2細胞を異なる量のhGH抗体で処理した結果、MTTアッセイにおいて示される通り、10％血清培地および血清欠乏培地の双方において、4日間の期間を通して細胞生存性が低下した（図6aおよびb）。同様の結果がhGHに対して上昇したポリクローナルニワトリIgYにおいても得られた。細胞周期およびアポトーシスの様々な遺伝子マーカーに関する発現分析でも、細胞をhGH抗体で処理した結果、アポトーシスに一致する発現プロファイルが惹起されることが実証された（図6c）。hGHに対する抗体によるアポトーシスの開始は、hGHに対する抗体の濃度の増加に伴ってカスパーゼ3/7活性が増加することによってさらに確認された（図6d）。
【０２６３】
子宮内膜癌細胞におけるhGH mRNAの枯渇はアポトーシスを増加させる
RL95-2細胞機能に対するhGH mRNA枯渇の影響をsiRNAを用いて調べた。2つのsiRNA構築物（sihGH5（SEQ ID NO：97）およびsihGH6（SEQ ID NO：98））の安定発現は、3/7カスパーゼ活性のアッセイによって測定される通り、RL95-2細胞のアポトーシス活性を増加させた（図9Aおよび9B）。sihGH5およびsihGH6によるRL-95細胞におけるhGH mRNAの枯渇はq-PCRによって確認された（図9C）。
【０２６４】
本発明は、本発明を実践する際に必要以上の実験を行うことなく当業者の手助けとなるよう、一部の好ましい態様を参照として本明細書において説明されている。しかし、当業者は組成物およびパラメータの多くが本発明の範囲を逸脱することなく、ある程度、変更または修正され得ることを容易に認識する。さらに、表題、見出しなどは当業者の本書類の理解を促すために提供されるものであって、本発明の範囲を制限するものとして読まれるべきではない。
【０２６５】
前記および下記のすべての特許出願、特許および刊行物の全体の開示は、もしあれば、参照としてそれらの全体が本書に組み入れられる。
【０２６６】
文脈よりそうでないことが必要とされる場合を除いて、本明細書および添付の任意の特許請求の範囲を通して、「含む（comprise）」、「含む（comprising）」などの語句は排他的な意味に対立するものとしての包括的な意味において、つまり、「含むが、制限されるものではない」という意味において解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ−１】
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【図８Ｃ−２】
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【図８Ｃ−３】
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【図８Ｄ−１】
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【図８Ｄ−２】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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