(57)【要約】チロシンキナーゼ阻害剤を用いて炎症性疾患を治療および防止するための方法を提供する。阻害剤は例えばＴリンパ球、及び／又はＢリンパ球の機能、線維芽細胞増殖、肥満細胞活性化、及び／又は単球分化を抑制する。１つの特徴において、少なくとも１つのチロシンキナーゼの活性を抑制する為に十分な量において炎症性疾患に罹患している対象にチロシンキナーゼ阻害剤を経口投与することを含む炎症性疾患を治療するための方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼの活性を抑制する為に十分な量において炎症性疾患に罹患している対象にチロシンキナーゼ阻害剤を経口投与すること；
を含む炎症性疾患を治療するための方法。
【請求項２】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がイマチニブ、ＣＧＰ５３７１６、ＳＵ９５１８、ＰＤ１６６３２６及びＧＷ２５８０から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がイマチニブであり、そして前記受容体チロシンキナーゼがｃ−Ｆｍｓ、ｃ−Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＦＧＦＲ及びＡｂｌから選択される請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がＣＧＰ５３７１６であり、そして前記受容体チロシンキナーゼがＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ及びｃ−Ｋｉｔから選択される請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がＧＷ２５８０であり、そして前記受容体チロシンキナーゼがｃ−Ｆｍｓ及びＰＤＧＦＲから選択される請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がＰＤ１６６３２６であり、そして前記受容体チロシンキナーゼがｃ−Ｋｉｔ及びＡｂｌから選択される請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がＳＵ９５１８であり、そして前記受容体チロシンキナーゼがＰＤＧＦＲ及びＦＧＦＲである請求項２記載の方法。
【請求項８】
前記炎症性疾患が自己免疫疾患である請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記炎症性疾患が慢性関節リウマチである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記炎症性疾患が全身性硬化症である請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記炎症性疾患が多発性硬化症である請求項８記載の方法。
【請求項１２】
前記炎症性疾患が乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、及び肺線維症から選択される請求項８記載の方法。
【請求項１３】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が約０．２マイクロモルの血中レベルを達成する用量において経口投与される請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が約１マイクロモルの血中レベルを達成する用量において経口投与される請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が約５マイクロモルの血中レベルを達成する用量において経口投与される請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が一日当たり約１回経口投与される請求項１記載の方法。
【請求項１７】
炎症性疾患に罹患した対象にチロシンキナーゼ阻害剤をキナーゼ２つ以上を阻害するために十分な量において経口投与することにより該炎症性疾患を治療することを含む炎症性疾患を治療するための方法。
【請求項１８】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が単一の化合物である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がＰＤＧＦＲを阻害する請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がｃ−Ｋｉｔを阻害する請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がｃ−Ｆｍｓを阻害する請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がｃ−Ａｂｌを阻害する請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がＦＧＦＲを阻害する請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
前記炎症性疾患が自己免疫疾患である請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
前記炎症性疾患が慢性関節リウマチである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記炎症性疾患が全身性硬化症である請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記炎症性疾患が多発性硬化症である請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
前記炎症性疾患が乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、及び肺線維症から選択される請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が約０．２マイクロモルの血中レベルを達成する用量において経口投与される請求項１７記載の方法。
【請求項３０】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が約１マイクロモルの血中レベルを達成する用量において経口投与される請求項１７記載の方法。
【請求項３１】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が約５マイクロモルの血中レベルを達成する用量において経口投与される請求項１７記載の方法。
【請求項３２】
前記チロシンキナーゼ阻害剤が一日当たり約１回経口投与される請求項１７記載の方法。
【請求項３３】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がイマチニブ、ＣＧＰ５３７１６、ＳＵ９５１８、ＰＤ１６６３２６及びＧＷ２５８０から選択される請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００６年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／８１０，０３０号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／８１０，０３０号は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府の関与に関する声明）
本研究は、部分的に、ＮＩＨ  Ｋ０８  ＡＲ０２１３３、ＮＩＨ  ＮＨＬＢＩ  ｃｏｎｔｒａｃｔ  Ｎ０１  ＨＶ  ２８１８３、ＮＩＨ  Ｆ３１  Ｆｅｌｌｏｗｓｈｉｐ  Ａｗａｒｄ、およびＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ基金によって支援された。したがって、米国合衆国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本明細書に記載した主題はチロシンキナーゼ阻害剤を用いて炎症性疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
炎症性及び自己免疫疾患は合衆国及び世界人口の３〜５％に及んでいると推定されている（Ｊａｃｏｂｓｏｎ等（１９９７）Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８４：２２３−４３）。正常個体においては、免疫応答はウィルス及び細菌感染に対抗して保護を与える。自己免疫疾患においては、これらの同様の細胞応答は宿主組織をターゲティングし、臓器及び／又は組織の損傷を、例えば、関節、皮膚、膵臓、脳、甲状腺又は胃腸管に対してもたらす。自己免疫障害の別の顕在化も慢性の炎症状態における調節不全の宿主細胞応答により誘発される。
【０００５】
本明細書に記載する方法及び組成物は、後述する背景情報が提供されるチロシンキナーゼ及び炎症性の疾患、障害、及び状態に関する。
【０００６】
Ａ．チロシンキナーゼ
キナーゼによる標的蛋白のホスホリル化はシグナリングトランスダクションにおいて、そして、酵素活性の調節のための重要な機序である。チロシンキナーゼ（ＴＫ）はポリペプチド中のチロシン残基にＡＴＰからホスフェート基を転移させる１００を超える異なる酵素のクラスである（表１）。チロシンキナーゼはシグナリング、アダプター、酵素及び他のポリペプチドをホスホリル化し、そのようなポリペプチドにシグナルを伝達させて特定の細胞機能および応答を活性化（不活性化）する。チロシンキナーゼには２つの主要なサブタイプ、即ち受容体チロシンキナーゼ及び細胞質／非受容体チロシンキナーゼが存在する。
【０００７】
１．受容体チロシンキナーゼ
今日までヒトにおいて報告されている約６０の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ；チロシン受容体キナーゼ（ＴＲＫ）としても知られている）が存在している。これらのキナーゼはホルモン、成長因子及びサイトカインに対する高親和性の受容体である（表１）（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等（２００１）Ｏｎｇｏｇｅｎｅ  １９：５５４８−５７）。ホルモン、成長因子、及び／又はサイトカインの結合は一般的にこれらのキナーゼを活性化することにより細胞の成長及び分裂を増進する。例示されるものはインスリン様成長因子受容体、表皮成長因子受容体、血小板誘導成長因子受容体等である。大部分の受容体チロシンキナーゼは単一サブユニット受容体であるが、一部のもの、例えばインスリン受容体は多量体複合体である。各単量体は細胞外Ｎ末端領域、２５〜３８アミノ酸の単一の膜貫通スパニングドメイン、及びＣ末端細胞内ドメインを含有している。細胞外Ｎ末端領域は細胞外リガンド、例えば特定の成長因子又はホルモンに結合する極めて大型の蛋白ドメインを有する。Ｃ末端細胞内領域はこれらの受容体のキナーゼ活性を与える。今日まで、受容体チロシンキナーゼの約２０種の異なるサブクラスが発見されている（表１）（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等（２００１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：５５４８−５７）。受容体チロシンキナーゼは正常な細胞プロセスの不可欠な調節物質であり、そして多くの型の癌の発生及び進行において重要な役割を果たす（Ｚｗｉｃｋ等（２００１）Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  ８：１６１−１７３）。
【０００８】
ＲＴＫはそれらのリガンドに対する細胞外結合部位、膜貫通ドメイン、及び細胞質内のキナーゼドメインを包含する。ＲＴＫは更にＡＴＰ結合部位、キナーゼ基質に結合するためのドメイン、及びホスフェート基を転移させるための触媒部位を包含する。触媒部位は開放（活性）又は閉鎖（不活性）の型であることができる裂溝の内部に存在する。閉鎖型は基質及び他の残基が触媒部位に運搬され得るようにし、そして解放型はＡＴＰとの接触を可能にすることにより触媒反応を駆動する（Ｒｏｓｋｏｓｋｉ，Ｒ（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３８８：１３０７−１５）。
【０００９】
クラスＩＩＩのＲＴＫはＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ｃ−Ｆｍｓ、ｃ−Ｋｉｔ及びＦｍｓ様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ−３）を包含し、それらの細胞外結合部位内部の５つの免疫グロブリン様ドメイン並びにキナーゼドメイン内の７０〜１００アミノ酸インサートを有することにおいて他のクラスのＲＴＫとは区別される（Ｒｏｓｋｏｓｋｉ，Ｒ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３８：１３０７−１５）。クラスＩＩＩのＲＴＫ内の構造的同様性はＰＤＧＦＲａ、ＰＤＧＦＲｂ、ｃ−Ｆｍｓ、及びｃ−Ｋｉｔをブロックするイマチニブの場合において顕在化する通りリガンドに関して交差反応性をもたらす。血小板誘導成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）はＰＤＧＦＲ−アルファ（ＰＤＧＦＲα）及びＰＤＧＦＲ−ベータ（ＰＤＧＦＲβ）を包含する（Ｙｕ．Ｊ．等（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２８２：６９７−７００）。ＰＤＧＦのＢ鎖ホモ２量体ＢＤＧＦＢＢはＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβの両方を活性化し、そして線維芽細胞、平滑筋及び他の細胞における増殖、遊走及び他の細胞機能を増進する。ＰＤＧＦ−Ａ鎖のホモ２量体ＰＤＧＦＡＡはＰＤＧＦＲαのみを活性化する。ＰＤＧＦ−ＡＢはＰＤＧＦＲαに高親和性で結合し、そしてＰＤＧＦＲαの非存在下ではより低い親和性において結合できる（Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｒ．Ａ．等（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：４４７３−８０）。最近、ＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤを包含する別のＰＤＧＦＲリガンドが発見された。線維芽細胞及び他の間葉の細胞は組織修復、創傷治癒、血管形成及び他の細胞機能を媒介する線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）を発現する。
【００１０】
チロシンキナーゼ活性をブロックするための数種の直接及び間接の経路が存在し、例えば（ｉ）ＡＴＰ結合部位の競合的抑制、（ｉｉ）解放型から閉鎖型への裂溝の遷移を妨害すること、（ｉｉｉ）基質のチロシンキナーゼの結合部位への結合を直接ブロックすること、及び（ｉｖ）リガンド又は基質の生成又はリクルートメントをブロックすることを包含する。イマチニブ、ＣＧＰ５３７１６及びＧＷ２５８０はキナーゼへのＡＴＰ結合の競合的阻害剤である小分子チロシンキナーゼ阻害剤の例である。イマチニブはＡｂｌの閉鎖（不活性）型に結合するのに対し、開放（活性）型はイマチニブの結合に関しては立体的に不適合である。ＡＴＰはイマチニブが結合している場合にはＴＫに結合することができず、そして基質はホスホリル化されることができない。今日まで認可されている小分子チロシンキナーゼ阻害剤（表２）はＡＴＰ結合部位に結合し、そしてＡＴＰの結合をブロックすることにより、チロシンキナーゼがその基質標的をホスホリル化することを抑制する。
【００１１】
【表１】
2010500283.tif 000002
２．細胞質／非受容体チロシンキナーゼ
３０超の細胞質性チロシンキナーゼがヒトにおいて報告されている（表１）。発見された最初の細胞質性のチロシンキナーゼはウィルス性のＳｒｃ（ｖ−Ｓｒｃ）であり、これは正常細胞を癌細胞に形質転換することができる哺乳類のＳｒｃの突然変異した構成的に活性な形態を示す。ＳＲＣファミリーメンバーは多くの細胞プロセスを調節することが分かっている。例えば、Ｔ細胞抗原受容体はＳｒｃと構造的に同様である２つの蛋白Ｌｃｋ及びＦｙｎの活性化により細胞内シグナリングをもたらす。Ａｂｌ（又はｃ−Ａｂｌ）は非受容体チロシンキナーゼのＡＢＬファミリーのメンバーであり、細胞の増殖、生存、接着及び遊走を媒介する。Ｂｃｒ−Ａｂｌ染色体転座（フィラデルフィア染色体）はＡｂｌの過剰発現を誘発し、これは未制御の細胞成長及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の発症をもたらす。
【００１２】
Ｂ．癌を治療するための小分子キナーゼ阻害剤の開発
小分子チロシンキナーゼ阻害剤は癌の治療のために開発されている。例えばイマチニブメシレート（ＧＬＥＥＶＥＣ）はフィラデルフィア染色体Ｂｃｒ−Ａｂｌ転座に関連する慢性骨髄性白血病の治療のためにＡｂｌを抑制するために開発されている。癌の治療のための小分子チロシンキナーゼ阻害剤を表２に列挙する。
【００１３】
【表２】
2010500283.tif 000003
医薬品及び生化学産業の主要な目的は「オフターゲット」作用に起因する副作用及び毒性を最小限とするための所望の標的蛋白又は細胞に対して高度に特異的である薬物の開発である。表２に記載された癌はキナーゼにおける遺伝子的な突然変異（又はキナーゼ遺伝子の過剰発現をもたらす突然変異）により媒介され、そしてそのような癌の治療のためには、毒性と相対比較した場合に薬効を最大限とするための高度に特異的なチロシンキナーゼ阻害剤を利用することが最も望ましい。その結果として、単一のＴＫに結合するのみである化合物を発見するために多大な努力がはらわれてきた。
【００１４】
イマチニブはＡｂｌを抑制するために開発され、ＦＤＡより認可されている（Ｂｃｒ−Ａｂｌ転座遺伝子型の場合）。イマチニブは後にＫｉｔを抑制することも判明し、そしてＫｉｔ発現胃腸支質性腫瘍（ＧＩＳＴ）の治療に関してＦＤＡより認可される。より最近では、イマチニブはＦｍｓ及びＰＤＧＦＲも抑制することが観察されている。５年間に渡りイマチニブ１日当たり４００ｍｇで治療されたＣＭＬ患者の最近の研究では、患者の＞４０％が浮腫、悪心、筋肉痙攣、筋骨格の疼痛、及び発疹を経験している（ＤｒｕｋｅｒＢＪ等（２００６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５５：２４０８−１７）。イマチニブ投与患者のかなりの比率がやはり骨髄抑制を発症しており、患者の１７％が好中球減少症、９％が血小板減少症、そして４％が貧血を呈している（ＤｒｕｋｅｒＢＪ等（２００６）Ｎ．Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５５：２４０８−２４１７）。心臓毒性も又イマチニブ投与患者で報告されており、Ａｂｌの抑制に二次的なミトコンドリア及び筋小胞体の機能不全に起因する可能性があるとされている（Ｋｅｒｋｅｌａ  Ｒ等（２００６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２：９０８−１６）。
【００１５】
ＴＫのＡＴＰ結合部位における僅かな構造的相違は、特定のチロシンキナーゼに関しては小分子阻害剤に対するある程度の特異性をもたらすが、他のものに対してはもたらさない。Ａｂｌ活性をブロックするイマチニブの例においては、イマチニブは裂溝の内部及び裂溝の外部の両方においてペプチドセグメントとの広範な接触を呈する（Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｓ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２：７３５−４１）。
【００１６】
Ｃ．自己免疫疾患
慢性関節リウマチ：慢性関節リウマチ（ＲＡ）においては、滑膜を有する（管壁を有する）関節が適応免疫系により攻撃され、そして患者が関節炎を呈する。異常な宿主免疫及び組織細胞応答が発症において中枢的役割を果たしており、慢性自己免疫性炎症を伴い、滑膜中への多数の好中球、マクロファージ及びリンパ球の流入をもたらし、これにより（ｉ）これらの浸潤性免疫細胞の活性化によるＴＮＦα及びＩＬ−６を包含するプロ炎症性サイトカインの生産、（ｉｉ）マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及び関節組織を分解して破壊する他の酵素を包含する分解性酵素の生成、放出及び活性化、（ｉｉｉ）滑膜管壁の炎症誘導性の増殖及び過形成性成長による隣接関節組織の侵襲及び破壊をもたらす。慢性関節リウマチの病因は不明であるが、マクロファージ、好中球、肥満細胞、Ｔ及びＢ細胞、及び線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）が活性化され、そして滑膜炎症及び関節破壊に寄与している。
【００１７】
ＲＡにおいては、単球は滑膜に浸潤して、ＴＮＦα及び炎症を強化する別のプロ炎症性サイトカインを分泌するマクロファージ（Ｂｕｒｍｅｓｇｔｅｒ，Ｇ．Ｒ．等（１９９７）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ４０：５−１８；Ｋｉｎｎｅ，Ｒ．Ｗ．等（２０００）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ２：１８９−２０２）及び骨を腐食させる破骨細胞に分化する。ＴＮＦαはマウス関節炎における滑膜炎及び関節破壊（Ｋｏｎｔｏｙｉａｎｎｉｓ，Ｄ．等（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：３８７−３９８）及びヒト慢性関節リウマチ（Ｗｅｉｎｂｌａｔｔ，Ｍ．Ｅ．等（１９９９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０：２５３−２５９）において中枢的役割を果たしている。
【００１８】
多発性硬化症：多発性硬化症（ＭＳ）は中枢神経系の脱髄を特徴とする消耗性の炎症性の神経学的な病気である。疾患は主に青年成人において起こり、女性の発生率がより高値である。疾患の症状は疲労、麻痺、振せん、刺痛、知覚不全、視覚攪乱、眩暈、認知障害、泌尿器機能不全、運動性低下、及び抑鬱を包含する。疾患の臨床パターンは４つの型、即ち回帰−弛張、二次進行、一次進行及び進行−回帰に分類される（Ｓ．Ｌ．Ｈａｕｓｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｅ．Ｇｏｏｄｋｉｎ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第１４版、２巻、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，１９９８，ｐｐ．２４０９−１９）。
【００１９】
全身性硬化症：全身性硬化症（ＳＳｃ、又は硬皮症）は皮膚及び内部臓器の線維症及び広範な血管症を特徴とする自己免疫疾患である。ＳＳｃを有する患者は皮膚の硬化症の範囲に従って分類され、限定されたＳＳｃを有する患者は、顔面、頸部、及び遠位の四肢の皮膚の硬化を有するのに対し、びまん性のＳＳｃを有する者では胴体、腹部、及び近位の四肢も同様に関与している。内部臓器の関与は限定された疾患と比較してびまん性である患者において疾患の過程のより早期に起こる傾向がある（Ｌａｉｎｇ等（１９９７）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．４０：７３４−４２）。重度の内部臓器の関与を発症しているびまん性ＳＳｃを有する患者の大部分は、皮膚が進行性に線維症化するのと同時に、診断後の最初の３年以内にそのようになる（Ｓｔｅｅｎ  ａｎｄ  Ｍｅｄｓｇｅｒ（２０００）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４３：２４３７−４４）。かなりの罹患率及び死亡率の原因となるびまん性ＳＳｃの共通の現れ方は間質性肺疾患（ＩＬＤ）、レイノー現象、及び指の潰瘍、肺動脈高血圧（ＰＡＨ）（Ｔｒａｄ等（２００６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．５４：１８４−９１）、筋骨格症状及び心臓及び腎臓の関与（Ｏｓｔｏｊｉｃ  ａｎｄ  Ｄａｍｊａｎｏｖ（２００６）Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２５：４５３−７）を包含する。現在の治療は特定の症状の治療に着目しているが、伏在する病因をターゲティングする疾患変更剤は欠如している。
【００２０】
乾癬：乾癬は鱗屑化及び炎症を特徴とする慢性皮膚疾患である。乾癬は合衆国の１．５〜２パーセント、或いは概ね５００万人が罹患している。全ての年齢層において、そして男性及び女性で概ね等しく起こっている。乾癬を有する者は関節の不快な制限された運動性、及び情緒的窮迫という困難を有する。乾癬が発症する場合、皮膚の斑紋が肥厚化、赤色化し、そしてプラークと称される銀色鱗屑により被覆される。乾癬は肘、膝、頭皮、下部背部、顔面、足底、及び足底に起こる場合が最も多い。疾患は又手の爪、足の爪、及び口腔及び生殖器の内部の軟組織において起こる場合もある。乾癬を有する者の約１０パーセントが関節炎の症状をもたらす関節の炎症を有している。
【００２１】
皮膚が創傷を有する場合、再生成熟化としても知られる創傷治癒プログラムがトリガーされる。疾患性の乾癬はこの交代性の成長プログラムにおける細胞成長を特徴とする。多くの態様において、乾癬皮膚は創傷から治癒している、又は、刺激に対して反応している皮膚、例えばケラチノサイトが正常な生長プログラムから再生成熟化に切り替えている感染症の場合と同様である。２〜４日間以内もの短期間のうちに細胞が創生されて表面まで押し出され、そして皮膚は十分迅速に細胞を脱落させることができない。過剰な皮膚細胞が集結し、そして隆起した鱗屑性の患部を形成する。通常患部を被覆している白色の鱗屑（「プラーク」と称される）は死滅した皮膚細胞より構成され、そして患部の赤熱状態は急速に分裂している皮膚細胞の領域への増大した血流供給により生じる。
【００２２】
ヒトにおける乾癬の厳密な原因は不明であるが、遺伝的要素を有していることは一般的に受け入れられており、そして最近の研究では自己免疫の要素を有することも明らかにされた。ある者が実際に乾癬を発症するかどうかはその出現を「トリガー」する何かに依存しているという仮説がある。潜在的な「トリガー因子」の例は全身の感染症、皮膚の傷害（Ｋｏｅｂｎｅｒ現象）、ワクチン接種、特定の薬物療法、及び筋肉内注射又は経口ステロイド薬物療法を包含する。乾癬の慢性皮膚炎症は過形成の表皮ケラチノサイト及び浸潤性の単核細胞、例えばＣＤ４＋メモリーＴ細胞、好中球及びマクロファージを伴っている。ＴＮＦを生産するマクロファージは乾癬における炎症の駆動及び発症において重要な役割を果たしていると考えられる。
【００２３】
全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）：ＳＬＥは種々の抗蛋白及び非蛋白の自己抗体をもたらすポリクローナルＢ細胞活性化を特徴とする自己免疫疾患である（疾患の考察に関しては例えばＫｏｔｚｉｎ等（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８５：３０３−０６参照）。これらの自己抗体は組織損傷をもたらす多数の臓器系に沈着する免疫複合体を形成する。ＳＬＥは悪化及び弛張を特徴とする可変の経過を有し、そして研究することが困難である。例えば、一部の患者は主に皮膚発疹及び関節痛を示し、自発的な弛張を呈し、そして薬物療法をほとんど必要としない場合がある。スペクトルのもう一方の末端は、高用量のステロイド及び細胞毒性剤、例えばシクロホスファミドにより治療を必要とする重度で進行性の腎臓への影響（糸球体腎炎及び脳炎）を示す患者を包含する。
【００２４】
炎症性腸疾患：炎症性腸疾患はクローン病及び潰瘍性結腸炎を包含し、腸の自己免疫攻撃が関与している。これらの疾患は頻繁には出血性である慢性の下痢、並びに結腸機能不全の症状を誘発する。
【００２５】
自己免疫性糖尿病：インスリン依存性真性糖尿病及びＩ型糖尿病としても知られている自己免疫性糖尿病においては、免疫系が膵臓のベータ細胞を攻撃して破壊する。ベータ細胞はインスリンを生産し、その結果、患者はインスリン不全となり、多尿、多渇症、及び多食を包含する糖尿病の臨床症状を顕在化させる。自己免疫性糖尿病を有する患者はインスリン注射で治療され、そしてインスリンの投与無くしては生存できない。
【００２６】
自己免疫疾患のその他の例は甲状腺（グレーブス病及び橋本甲状腺炎）、末梢神経（ギャンバレー症候群及び他の自己免疫性の末梢神経障害）、ＣＮＳ（急性播種性脳脊髄炎ＡＤＥＭ）、皮膚（類天疱瘡（水疱性）、落葉状天疱瘡、尋常天疱瘡、セリアックスプルー皮膚炎、白斑）、肝臓及び胃腸系（原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫性肝炎）、及び眼（自己免疫性ブドウ膜炎）が関与するものを包含する。更に又、多数の「自己免疫性リウマチ性疾患」（シェーグレン症候群、円板状エリテマトーデス、抗リン脂質症候群、ＣＲＥＳＴ、混合型結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、多発性筋炎、及び皮膚筋炎、及びウエーゲナー肉芽腫症）も挙げられる。
【００２７】
免疫及び宿主細胞の応答をモジュレートする化合物は上記及び炎症に関連する他の疾患を治療する場合に有用であることができる。本発明の組成物及び方法はチロシンキナーゼ阻害剤を用いた自己免疫性及び炎症性の疾患を治療するための新しい方策を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２８】
（簡単な要旨）
後述する以下の特徴及びその実施形態は例示及び説明であり、範囲の制限を意味するものではない。
【００２９】
１つの特徴において、少なくとも１つのチロシンキナーゼの活性を抑制する為に十分な量において炎症性疾患に罹患している対象にチロシンキナーゼ阻害剤を経口投与することを含む炎症性疾患を治療するための方法が提供される。
【００３０】
一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はイマチニブ、ＣＧＰ５３７１６、ＳＵ９５１８、ＰＤ１６６３２６及びＧＷ２５８０から選択される。
【００３１】
一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はイマチニブであり、そしてチロシンキナーゼはｃ−Ｆｍｓ、ｃ−Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、及びＡｂｌから選択される。
【００３２】
一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はＣＧＰ５３７１６であり、そしてチロシンキナーゼはＰＤＧＦＲ（ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβ）、ＦＧＦＲ及びｃ−Ｋｉｔから選択される。
【００３３】
一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はＧＷ２５８０であり、そしてチロシンキナーゼはｃ−Ｆｍｓ及びＰＤＧＦＲから選択される。
【００３４】
一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はＰＤ１６６３２６であり、そしてチロシンキナーゼはｃ−Ｋｉｔ及びＡｂｌから選択される。
【００３５】
一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はＳＵ９５１８であり、そしてチロシンキナーゼはＰＤＧＦＲ及びＦＧＦＲである。
【００３６】
一部の実施形態においては、炎症性疾患は自己免疫疾患である。特定の実施形態においては、炎症性疾患は慢性関節リウマチである。他の特定の実施形態においては、炎症性疾患は全身性硬化症である。更に別の特定の実施形態においては、炎症性疾患は多発性硬化症である。更に別の特定の実施形態においては、炎症性疾患は乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、及び肺線維症から選択される。
【００３７】
一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤は約０．２マイクロモルの血中レベルを達成する用量において経口投与される。一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤は約１マイクロモルの血中レベルを達成する用量において経口投与される。一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤は約５マイクロモルの血中レベルを達成する用量において経口投与される。一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤は一日当たり約１回経口投与される。
【００３８】
別の特徴においては、炎症性疾患に罹患した対象にチロシンキナーゼ阻害剤をキナーゼ２つ以上を阻害するために十分な量において経口投与することにより炎症性疾患を治療することを含む炎症性疾患を治療するための方法が提供される。
【００３９】
一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤は単一の化合物である。
【００４０】
一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はＰＤＧＦＲを抑制する。一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はｃ−Ｋｉｔを抑制する。一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はｃ−Ｆｍｓを抑制する。一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はｃ−Ａｂｌ（Ａｂｌ）を抑制する。
【００４１】
一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はＰＤＧＦＲ及びｃ−Ｆｍｓを抑制する単一の化合物である。一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はＰＤＧＦＲ及びｃ−Ａｂｌを抑制する単一の化合物である。一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はＰＤＧＦＲ及びｃ−Ｋｉｔを抑制する単一の化合物である。一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はｃ−Ｆｍｓ及びｃ−Ａｂｌを抑制する単一の化合物である。一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はｃ−Ｆｍｓ及びｃ−Ｋｉｔを抑制する単一の化合物である。一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はＦＧＦＲ及びＰＤＧＦＲを抑制する単一の化合物である。
【００４２】
一部の実施形態においては、炎症性疾患は自己免疫疾患である。
【００４３】
特定の実施形態においては、炎症性疾患は慢性関節リウマチである。別の特定の実施形態においては、炎症性疾患は全身性硬化症である。一部の特定の実施形態においては、炎症性疾患は多発性硬化症である。
【００４４】
更に別の特定の実施形態において、炎症性疾患は乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、及び肺線維症から選択される。
【００４５】
一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤は約０．２マイクロモルの血中レベルを達成する用量において経口投与される。一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤は約１マイクロモルの血中レベルを達成する用量において経口投与される。一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤は約５マイクロモルの血中濃度を達成する用量において経口投与される。特定の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤は一日当たり約１回経口投与される。
【００４６】
一部の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はイマチニブ、ＣＧＰ５３７１６、ＳＵ９５１８、ＰＤ１６６３２６及びＧＷ２５８０から選択される。
【００４７】
上記した例示される特徴及び実施形態に加えて、その他の特徴及び実施形態は図面を参照することにより、そして以下の説明を検討することにより自明となるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは３３ｍｇ／ｋｇ（四角）又は１００ｍｇ／ｋｇ（菱形）の用量におけるチロシンキナーゼ阻害剤イマチニブの投与によるマウスにおけるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の防止を示すグラフであり、ここでは１日２回の経口投与をＣＩＡの誘導の前１日に開始した。対照マウスにはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、丸）を投与した。図１Ａは一次免疫化後の日程における目視関節炎採点システムを用いて評価した場合の平均関節炎評点を示す。図１Ｂは一次免疫化の後の日程におけるｍｍ単位の足底厚みを示す。図１Ｃは試験の終了時における関節炎の発生率を示す。図１Ｄは各群のマウスの平均体重を示す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは１日２回経口投与した３３ｍｇ／ｋｇ（四角）又は１００ｍｇ／ｋｇ（菱形）の用量におけるチロシンキナーゼ阻害剤イマチニブで治療した場合の樹立されたＣＩＡを有するマウスにおける関節炎（平均目視関節炎評点４）の治療を説明するグラフである。対照マウスにはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、丸）を投与した。図２Ａは一次免疫化後の日程における目視関節炎採点システムを用いて評価した場合の平均関節炎評点を示す。図２Ｂは一次免疫化の後の日程におけるｍｍ単位の足底厚みを示す。
【図３】図３Ａ〜３ＩはＣＩＡにおいて滑膜炎、パンヌス形成、及び関節の腐食をイマチニブが低減することを明らかにした実験の結果を示す。図３Ａ〜３Ｃは図１Ａ〜１Ｄに記載した試験において治療されたマウスに由来する代表的なＨ＆Ｅ染色関節組織切片である。図３Ｄ〜３Ｉはそれぞれ図１Ａ〜１Ｄ及び図２Ａ〜Ｂの防止（図３Ｄ〜３Ｆ）及び治療（図３Ｇ〜３Ｉ）の試験におけるＣＩＡに関して誘導されたマウスにおける炎症、パンヌス、及び骨及び軟骨の腐食の組織学的評点を示す棒グラフである。
【図４】図４ＡはＣＩＡを有するマウスに由来する代表的な関節切片の写真であり、関節切片はトルイジンブルーで染色した。緻密に炎症を起こしたＣＩＡ滑膜組織中に存在する肥満細胞は矢印で示す。Ｂ＝骨、ＪＳ＝関節の空間。オリジナル倍率２００Ｘ。図４Ｂ〜４Ｄは肥満細胞のｃ−Ｋｉｔ活性化及びプロ炎症性サイトカイン生産をイマチニブが抑制することを示す棒グラフである。図４Ｂ〜４Ｄは１μＭ及び５μＭのイマチニブの存在下で幹細胞因子により４８時間刺激した後の肥満細胞におけるＴＮＦα（図４Ｂ）、ＧＭ−ＣＳＦ（図４Ｃ）及びＩＬ−６（図４Ｄ）の濃度を示す。図４Ｅ〜４Ｆはイマチニブと共に予備インキュベートし、そしてイマチニブの存在下又は非存在下で１０分間幹細胞因子で刺激した血清枯渇肥満細胞から形成した溶解物の免疫ブロットである。免疫ブロットはホスホ（ｐ）−ｃ−Ｋｉｔ、及び全ｃ−Ｋｉｔ（図４Ｅ）及びｐ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）及び全Ａｋｔ（図４Ｆ）に特異的な抗体でプローブした。図４Ｇは図４Ｅ〜４Ｆに関して記載した刺激条件を用いながら形成した肥満細胞溶解物の逆相蛋白（ＲＰＰ）アレイである。ＲＰＰアレイはホスホリル化（活性化）蛋白チロシンキナーゼに対して特異的な種々の抗体でプローブし、そしてシグナルレベルを見刺激細胞におけるものに対して規格化した。黄色は抗蛋白チロシンキナーゼ抗体の反応性を示し、青色は反応性の欠如を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｃはイマチニブによるマクロファージｃ−Ｆｍｓ及び下流のＭＡＰＫ経路の抑制を示す実験の結果である。図５Ａ〜５Ｂは単離されたレジデント腹膜マクロファージから製造し、血清枯渇させ、そしてイマチニブと共に予備インキュベートし、そして次にイマチニブの存在下に１０分間Ｍ−ＣＳＦで刺激した溶解物の免疫ブロットである。免疫ブロットはｐ−ｃ−Ｆｍｓ、及び全Ｆｍｓ（図５Ａ）又はｐ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）及び全Ａｋｔ（図５Ｂ）に特異的な抗体でプローブした。図５Ｃは同じ刺激条件を用いながら形成した腹膜マクロファージ溶解物のＲＰＰアレイである。ＲＰＰアレイはＭＡＰＫ経路及び他の蛋白チロシンキナーゼに対して特異的な種々の抗体でプローブし、そして規格化したキナーゼレベルをヒートマップとして表示した。図５Ｄ〜５Ｆはマクロファージへの単球の分化をイマチニブが抑制することを示す細胞の画像である。図５Ｄは未処理のまま７２時間培養され、そして単球の古典的な丸型の形態を示している滑液単球を示す。図５Ｅは１００ｎｇ／ｍｌＭ−ＣＳＦと共に７２時間培養された滑液単球を示す。図５Ｅにおける細胞は多極性の突起の伸長、不均質な細胞質の空胞及び封入体を包含するマクロファージの形態を明確に示している。図５Ｆはマクロファージへの単球のＭ−ＣＳＦ誘導分化をイマチニブがブロックすることを示している。
【図６】図６Ａ〜６ＥはＢ細胞機能およびエピトープ拡張をイマチニブが抑制することを明らかにした実験の結果を示す。図６ＡはＢ細胞をＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた陰性選択によりナイーブのＤＢＡ／１マウス脾臓から単離し、そしてフローサイトメトリーにより高度に精製したことを示す３次元のグラフである。単離されたＢ細胞を５０μｇ／ｍｌのμ特異的抗ＩｇＭ（Ｆａｂ’）２又は５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで７２時間刺激した。図６Ｂ及び６Ｃは抗ＩｇＭ又はＬＰＳ刺激Ｂ細胞増殖をイマチニブがブロックすることを示す棒グラフである。図６ＤはＩｇＭのＬＰＳ刺激Ｂ細胞生産もイマチニブがブロックすることを示す棒グラフである。図６Ｅは食塩水又は１００ｍｇ／ｋｇのイマチニブを投与したＣＩＡを有するマウスから誘導した血清自己抗体の滑膜ＲＰＰアレイプロファイルを示す。抗体の反応性はヒートマップとして示し、イマチニブ投与マウス由来の試料は右側に集合しており、多数の関節抗原に対して抗体反応性が低減していることを示している。
【図７】図７Ａ〜７ＥはＴ細胞応答をイマチニブが抑制することを示すグラフである。図７ＡはＣＩＩ特異的ＴＣＲをコードするトランスジーンを発現するマウスから誘導され、そして０〜１０μＭイマチニブの存在下に０〜４０μｇ／ｍＬの熱変性全ＣＩＩで刺激された脾細胞における、ＣＩＩ特異的Ｔ細胞の増殖の尺度としての、３Ｈ−チミジンの取り込みを示すＸ−Ｙグラフである。図７Ｂ〜７Ｅは図７Ａの２０μｇ／ｍＬＣＩＩで刺激した抗ＣＩＩＴＣＲトランスジェニック脾細胞の上澄みにおけるサイトカインインターフェロン−γ（図７Ｂ）、ＩＬ−４（図７Ｃ）、ＴＮＦα（図７Ｄ）及びＩＬ−２（図７Ｅ）の濃度を示す棒グラフである。早期のアポトーシス（ＰＩ−ＡｎｎｅｘｉｎＶ−）並びに後期のアポトーシス又は細胞死（ＰＩ＋ＡｎｎｅｘｉｎＶ−）を測定するためにヨウ化プロピジウム及びＡｎｎｅｘｉｎＶで染色したイマチニブ投与細胞のフローサイトメトリーによれば、イマチニブはこれらの細胞においてアポトーシス又は死滅を誘導しないことがわかった。
【図８】図８Ａ〜８ＥはＲＡ体外移植組織におけるサイトカイン生産及び線維芽細胞ＰＤＧＦＲの抑制を明らかにした実験の結果を示す。図８Ａ〜８Ｃは人ＲＡ患者から誘導し０〜８μＭイマチニブの存在下に４８時間１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激した滑液単核細胞におけるサイトカイン濃度、ＴＮＦα（図８Ａ）、ＩＬ−２（ｐ４０）（図８Ｂ）、及びＩＬ−１α（図８Ｃ）を示す棒グラフである。図８Ｄ〜８ＥはヒトＲＡ患者から誘導した線維芽細胞様滑膜細胞におけるＰＤＧＦＲ活性化をイマチニブが抑制することを示す免疫ブロットを示す。培養した線維芽細胞様滑膜細胞はイマチニブと共に予備インキュベートした後に１０分間２５ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢで刺激した。溶解物を作成し、ｐ−ＰＤＧＦＲβ及び全ＰＤＧＦＲβ（図８Ｄ）及びｐ−Ａｋｔ及び全Ａｋｔ（図８Ｅ）に対して特異的な抗体でプローブした。
【図９】図９Ａ〜９ＣはＰＤＧＦ−ＢＢ及びＴＧＦ−βに応答した線維芽細胞の増殖をイマチニブが抑制することを示すグラフである。図９Ａは０〜６μＭイマチニブ存在下のヒト慢性関節リウマチ患者から誘導した線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）の３Ｈ−チミジン取り込みにより測定した場合のＰＤＧＦ−ＢＢ誘導増殖を示す棒グラフである。図９Ｂは抗ＣＤ６８抗体を用いたフローサイトメトリー分析によるＦＬＳ細胞培養物中の夾雑マクロファージの非存在を示すグラフである（図９Ｂ、腹膜細胞＝ＣＤ６８が系統マーカーである腹膜マクロファージ）。図９ＣはＴＧＦ−β駆動線維芽細胞増殖をイマチニブがブロックすることを示す棒グラフである。ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞を０〜２μＭイマチニブ存在下に１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βで刺激した。ＴＧＦ−β刺激後には頑健な増殖が観察され、そして増殖は０．１５μＭ以上の濃度のイマチニブの添加により未刺激細胞のレベルにまで顕著に下げ戻った。
【図１０】図１０ＡはイマチニブがマウスＥＡＥ（多発性硬化症のモデル）の発症を遅延させ重症度を低減することを示すグラフである。対照（食塩水投与）及びイマチニブ（１００ｍｇ／ｋｇ）投与ＥＡＥマウスの平均のＥＡＥ評点をＥＡＥ誘導後の日程において示す。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂはチロシンキナーゼｃ−Ｋｉｔ及びＰＤＧＦＲに関するＣＧＰ５３７１６、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、及びＧＷ２５８０のＩＣ５０を示すグラフである。図１１Ａはｃ−Ｋｉｔに関するＣＧＰ５３７１６（０．００２μＭ）、イマチニブ（０．０９μＭ）、及びＧＷ２５８０（７４μＭ）のＩＣ５０を測定するためのインビトロのｃ−Ｋｉｔホスホリル化試験の結果を示すグラフである。組み換えｃ−Ｋｉｔを記載した小分子阻害剤と共に予備インキュベートし、ＡＴＰ及び基質を添加することによりホスホリル化反応を開始し、３０分後に反応を停止し、抗ホスホチロシン染色を実施することによりホスホ−ｃ−Ｋｉｔを検出し、そして時間分解蛍光を使用することによりｃ−Ｋｉｔホスホリル化を定量した（ＨＴＳｃａｎｃ−Ｋｉｔキナーゼ試験、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。図１１ＡはＣＧＰ５３７１６及びイマチニブの両方がｃ−Ｋｉｔを強力に抑制し、そしてＧＷ２５８０が臨床的に該当する濃度（５μＭ未満）ではｃ−Ｋｉｔを抑制しないことを示している。図１１ＢはＰＤＧＦｂｂ−誘導増殖に関するＣＧＰ５３７１６（０．０１１μＭ）、イマチニブ（０．１４７μＭ）、及びＧＷ２５８０（４．３５μＭ）のＩＣ５０を測定するためのインビトロの線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）増殖試験の結果を示す。ヒトＲＡ患者から誘導したＦＬＳ（第４〜６継代）をある範囲の濃度の特異的阻害剤と共に予備インキュベートし、ＰＤＧＦｂｂ（ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβの両方に結合する）で刺激し、そして３Ｈ−チミジンの取り込みにより増殖を測定した。図１１ＢはＣＧＰ５３７１６、イマチニブ、及びＧＷ２５８０の全てが標準的なマウス投薬用法により達成される血漿中濃度においてＰＤＧＦＲを抑制することを示している。ＩＣ５０はキナーゼ活性（図１１Ａ）又はその相当する細胞応答（図１１Ｂ）の５０％が抑制される小分子キナーゼ阻害剤の濃度である。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｅは慢性関節リウマチに関するげっ歯類のモデルにおいてＦｍｓ及びＰＤＧＦＲ阻害剤ＧＷ２５８０は樹立されたＣＩＡを治療することを示す実験の結果を示す。図１２Ａ及び１２Ｂは５０ｍｇ／ｋｇで５日間ＣＩＡマウスを治療したところ、平均の目視による関節炎評点（図１２Ａ）及び足底厚み計測（図１２Ｂ）に基づけば、ビヒクル投与対照マウスと比較して関節炎の重症度が低下したことを示すグラフである。エラーバーは平均の標準誤差を示し（Ａ、Ｂ）、そしてアスタリスクはＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ統計分析によりｐ＜０．０５であることを示す（Ｂ）。図１２ＣはＧＷ２５８０又はイマチニブのようなｃ−Ｆｍｓの小分子阻害剤が機能すると考えられる経路における種々の点を示す単球系統の細胞の分化及び機能の模式図である。図１２Ｄ〜１２Ｅにおいて、単球はヒト慢性関節リウマチ患者から単離し、そしてある範囲の濃度のイマチニブ又はＧＷ２５８０の存在下又は非存在下においてマクロファージへの分化を増進するために９日間Ｍ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。図１２Ｄはイマチニブ又及びＧＷ２５８０の両方がヒト血液単球からマクロファージへのＭ−ＣＳＦ誘導分化をブロックすることを示している。マクロファージは形態学的特徴、例えば、細胞質の封入体、多極性の突起物の伸長、及び不均質な細胞質の空胞に基づいて計数した（％マクロファージはマクロファージに特徴的な形態学的特徴を有する全細胞の％を示す）。図１２Ｅはイマチニブ（０．９７μＭ）、及びＧＷ２５８０（０．０１μＭ）に関してＩＣ５０データを求めた阻害曲線を示しており、Ｆｍｓに対してはＧＷ２５８０はイマチニブよりも約１００倍強力に、マクロファージへの単球のＭ−ＣＳＦ誘導分化を抑制した。
【図１３】図１３Ａ〜１３ＤはＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ及びＫｉｔ阻害剤ＣＧＰ５３７１６がＣＩＡを防止することを示すグラフである。１５匹の雄性ＤＢＡ／１マウスの群をＣＦＡ中に乳化したＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ、２００ｍｇ／匹）でＣＩＡ誘導し、そして第２１日にＩＦＡ中に乳化したＣＩＩでブーストした。ＣＧＰ５３７１６はＣＩＡ誘導の前１日に開始した毎日腹腔内投与により送達した。図１３Ａは一次免疫化の後の日程において目視関節炎採点システムを用いながら評価した低及び高用量のＣＧＰ５３７１６を投与したマウスの平均関節炎評点を示す。図１３Ｂは一次免疫化の後の日程における低及び高用量のＣＧＰ５３７１６を投与したマウスのｍｍ単位における足底厚みを示す。図１３Ｃ（評点）及び図１３Ｄ（足底計測）はイマチニブ及びＣＧＰ５３７１６のＣＩＡ薬効を直接比較する試験の結果を示す。ＣＧＰ５３７１６およびイマチニブの両方は、ＣＩＡの程度を統計的に大幅に軽減する結果となった。１つのアスタリスクはＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によるｐ＜０．０５のＣＧＰ５３７１６対ビヒクル対照の差を示し、２つのアスタリスクはｐ＜０．０１を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４ＦはヒトＲＡ滑膜におけるｃ−Ｆｍｓ（ＣＳＦ−１Ｒ）、ＰＤＧＦＲα、及びＰＤＧＦＲβの示差的発現を示す免疫組織化学的特徴（４００ｘ倍率）の結果を示す。膝置換時に慢性ＲＡを有する患者から得た滑膜を固定し、パラフィン包埋し、そして切片をそれぞれｃ−Ｆｍｓ（図１４Ｂ）、ＰＤＧＦＲα（図１４Ｄ）、及びＰＤＧＦＲβ（図１４Ｆ）又は相当するアイソタイプ対照抗体（図１４Ａ、Ｃ、Ｅ）に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体で染色し、その後ＨＲＰ系の検出に付した（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）。図１４Ｂは抗ｃ−Ｆｍｓ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−１３９４９）が滑膜管壁を強力に染色したことを、伏在組織の低強度の染色を付随させながら示したものである。図１４Ｄは抗ＰＤＧＦＲα抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−３３８）がＲＡ滑膜組織においてより高深度で細胞を染色したことを、滑膜管壁近傍の細胞を付随させながら示したものである。図１４Ｆは滑膜管壁に伏在する細胞のサブセットを抗ＰＤＧＦＲβ抗体が強力に染色したことを示している（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃３１６９）。
【図１５】図１５Ａ〜１５ＥはヒトＲＡ滑膜組織から誘導した肥満細胞、線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）、及び滑膜マクロファージの集団のフローサイトメトリーによる識別を示すグラフである。レムナントヒト膝滑膜を関節形成術時にＲＡ患者から入手し、そして単細胞懸濁液をＩＶ型コラゲナーゼによる酵素的消化により作成した。得られた細胞懸濁液を、造血細胞（ＣＤ４５）（図１５Ｂ）、ＦＬＳ（ＣＤ９０）（図１５Ｃ）、肥満細胞（ｃ−Ｋｉｔ）（図１５Ｄ）、及び滑膜マクロファージ（ＣＤ１４）（図１５Ｅ）の細胞表面マーカーに対して特異的な蛍光色素コンジュゲート抗体で染色し、アイソタイプマッチの対照（図１５Ａ）及び抗ＭＨＣクラスＩ抗体で同時平行に染色した。表示したプロットはＭＨＣクラスＩ陽性細胞集団を示す。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｅは低用量のイマチニブと低用量のアトルバスタチン、ロシグリタゾン、又はエノキサパリンの間の薬物の組み合わせがコラーゲン誘導関節炎の臨床的重症度を低減するために相乗作用的に作用する場合があることを示すグラフである。図１６ＡはＣＩＡ誘導し、そしてイマチニブ滴定（６０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、３．７５ｍｇ／ｋｇ、０ｍｇ／ｋｇ［ビヒクル対照］）により第１日から投与開始したマウスの群で得られた評点を示しており、これによりイマチニブの薬効の下限が判明し、それは１５ｍｇ／ｋｇの投薬用法であった。図１６Ｂはアトロバスタチン単独では使用した何れの濃度（０〜２０ｍｇ／ｋｇ）においてもＣＩＡの防止に有効ではなかったことを示している。図１６Ｃは何れも単独ではＣＩＡを防止しなかった１５ｍｇ／ｋｇのイマチニブ及び５ｍｇ／ｋｇのアトロバスタチンが組み合わせて使用された場合にはＣＩＡの防止において高度に有効であったことを示している。図１６Ｄは１５ｍｇ／ｋｇの低用量のイマチニブ及び１５ｍｇ／ｋｇの低用量のロシグリタゾンはＣＩＡを防止したことを示している。図１６Ｅは１５ｍｇ／ｋｇの低用量のイマチニブ及び５ｍｇ／ｋｇの低用量のエノキサパリンはＣＩＡを防止したことを示している。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｂは欠損性のｃ−Ｋｉｔシグナリングを示すＣ５７ＢＬ／６−ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈ（Ｗｓｈ）マウスが有意に減少した肥満細胞を有し、コラーゲン抗体誘導関節炎に対して部分的に抵抗性であることを示すグラフである。Ｗｓｈマウス（丸）及び対照Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃ５７、菱形）同腹仔を１ｍｇコラーゲン抗体でコラーゲン抗体誘導関節炎に関して誘導し、そして第３日に５０μｇＬＰＳを腹腔内投与することにより関節炎を誘導した。図１７ＡはＷｓｈマウスが低減した平均関節炎評点を呈し、そして図１８が足底厚みにおいて低減した変化を呈したことを、Ｃ５７対照マウスとの比較において示している。これらの結果はＫｉｔ及び肥満細胞が自己免疫性関節炎の病因に寄与していることを示唆している。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｆはイマチニブが全身性硬化症（ＳＳｃ、硬皮症）を治療することを示す画像である。全身性硬化症を有する２４歳の患者において、イマチニブは指の潰瘍の治癒、間質性肺疾患の消散、及び皮膚コラーゲン構造の再生を可能にした。イマチニブ療法の前の左第４近位指節間関節上に位置した指潰瘍（図１８Ａ）はイマチニブ療法３か月の後に有意な治癒を示している（図１８Ｂ）。イマチニブ療法の前の胸部の高解像度のコンピューター断層撮影（ＨＲＣＴ）スキャンは、両側性の下葉におけるすりガラス不透明性を伴った斑紋状の浸潤を示しており（図１８Ｃ）、イマチニブ療法３ヶ月後にはすりガラス不透明性は消散している（図１８Ｄ）。イマチニブ療法前の右腕のヘマトキシリンエオシン染色皮膚生検は、平均の皮膚厚み２．８１ｍｍ（倍率１００ｘ）（図１８Ｅ）の乳頭細網状の真皮の稠密な好酸球性の堅固に充填されたコラーゲン束を示しているのに対し、初回生検の１ｃｍ以内においてとったイマチニブ３か月後の反復皮膚生検は、コラーゲン束の緩慢な間隔及び薄束化、及び平均皮膚厚み２．３１ｍｍを有するコラーゲン構造の正常化を示している（図１８Ｆ）。
【図１９】図１９は小分子チロシンキナーゼ阻害剤ＳＵ９５１８、ＣＧＰ５３７１６、ＰＤ１６６３２６、及びＧＷ２５８０の構造を示す。ＣＧＰ５３７１６はＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ及びＫｉｔを抑制し、そしてＲＡに関するコラーゲン誘導関節炎モデルにおいて利益を供する（例えば図１３参照）。ＧＷ２５８０は高度に強力なＦｍｓ阻害剤であり、そしてＰＤＧＦＲも抑制し（例えば図１１Ｂ及び図１２Ｅ）、そして樹立されたコラーゲン誘導関節炎を治療している（例えば図１２）。
【図２０】図２０は種々の悪性疾患の治療に関してＦＤＡ認可された小分子チロシンキナーゼ阻害剤の構造を示す。これらのチロシンキナーゼはイマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ダサチニブ、及びラパチニブを包含する。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
（詳細な説明）
Ｉ．定義
「治療する」又は「治療すること」とは何れかの治療、例えば限定しないが疾患、障害、又は状態の症状の軽減、疾患、障害又は状態の原因の排除を一時的又は永久的に行うこと；又は進行中の病理学的プロセスの緩徐化、低減又は抑制を無症候性の個体において行うこと包含する。そのような無症候性の個体においては、病理学的プロセスは最終的には症状を誘発する場合が多い。病理学的プロセスの例は限定しないが自己免疫、炎症、又は変性のプロセス、状態、又は障害を包含する。
【００５０】
「防止すること」とは最終的には症状の発生をもたらす病理学的プロセスが絶対に発生しないように病理学的プロセスの初回開始を抑制すること（即ち予防的な態様において疾患、障害又は状態の発生を防止すること）を指す。
【００５１】
「治療有効量」とは特定の障害又は状態を治療又は防止する場合に有効である化合物の量を意味する。
【００５２】
「製薬上許容しうる担体」とは医薬組成物、即ち対象又は患者に投与できる剤型の製剤において使用されている非毒性の溶媒、分散剤、賦形剤、又は他の物質である。
【００５３】
「チロシンキナーゼ」は「ＴＫ」等と略記してよい。
【００５４】
「チロシン受容体キナーゼ」は「受容体キナーゼ」と称してよく、或いは「ＲＴＫ」、「ＴＲＫ」等と略記される。
【００５５】
受容体の名称は当該分野においては例えば「ｃ−Ｆｍｓ」と略記され、そして「ｃ−Ｋｉｔ」は「Ｆｍｓ」及び「Ｋｉｔ」等と称してよい。
【００５６】
本明細書においては、「自己免疫疾患」は炎症応答の少なくとも一部分が自己抗原に指向される「炎症性疾患」のサブセットである。自己免疫疾患は固有には炎症性疾患であるが、逆の関係は必ずしも真ではない。これらの疾患の多くの例を本文、図面及び表中に示す。本発明の組成物及び方法は一部が自己免疫疾患である炎症性疾患の治療及び／又は防止のために有用である。
【００５７】
本明細書においては、「単一の化合物」とは活性化合物を指し、そして対応するプロドラッグ（存在する場合）、活性な薬物、及び活性な代謝産物（存在する場合）を包含する。
【００５８】
ＩＩ．治療方法
Ａ．概要
種々の特徴において、炎症性疾患を治療および防止するための方法を記載する。そのような方法は、Ｔリンパ球及び／又はＢリンパ球の機能の抑制、線維芽細胞増殖の抑制、肥満細胞に関連する炎症性疾患の抑制、活性化マクロファージの関与する炎症性疾患の抑制、及び破骨細胞の関与する炎症性疾患の抑制のためのものを包含する。方法は標的キナーゼ受容体を抑制するために十分な用量においてチロシンキナーゼの阻害剤を投与することによりキナーゼ受容体の下流のシグナリング作用をモジュレートし、これにより対象／患者に対して有利な治療上の影響をもたらすこと。一部の実施形態においては、方法及び組成物は少なくとも２つの受容体を抑制するためのものである。
【００５９】
１つの実施形態において、チロシンキナーゼ阻害剤はイマチニブである。イマチニブは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を有するヒト対象において観察されるＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ染色体Ｂｃｒ／Ａｂｌ転座の遺伝子産物をターゲティングすることがわかっている小分子蛋白チロシンキナーゼ阻害剤である。イマチニブはＢｃｒ／Ａｂｌ陽性ＣＭＬの治療に関して、そして、ｃ−Ｋｉｔ発現胃腸支質腫瘍（ＧＩＳＴ）に関して、認可されている（Ｄｒｕｋｅｒ，Ｂ．Ｊ．等、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４４：１０３１−１０３７（２００１）；Ｄｅｍｅｔｒｉ，Ｇ．Ｄ．等、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４７：４７２−４８０（２００２））。Ａｂｌ及びＡｂｌ関連キナーゼをマイクロモル濃度未満で阻害することのほかに、イマチニブはｃ−Ｆｍｓ（ＩＣ５０＝１．４μＭ）、ｃ−Ｋｉｔ（ＩＣ５０＝０．１μＭ）、及びＰＤＧＦＲα／β（ＩＣ５０＝０．１μＭ）を包含する他のチロシンキナーゼのスペクトルも特異的及び強力に抑制する（Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ，Ｅ．等、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５５１：Ｍ１１−１８（２００１）；Ｄｅｗａｒ，Ａ．Ｌ．等、Ｂｌｏｏｄ  １０５：３１２７−３１３２（２００５）；Ｆａｂｉａｎ，Ｍ．Ａ．等、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：３２９−３３６（２００５））。
【００６０】
他の実施形態において、チロシンキナーゼ阻害剤はＰＤＧＦＲ及び／又はｃ−Ｋｉｔに対して力価を有する。例えば、ＣＧＰ５３７１６はｃ−Ｋｉｔ（ＩＣ５０＝０．００２μＭ、図１１Ａ）、ＰＤＧＦＲ（ＩＣ５０＝０．０１１μＭ、図１１Ｂ）、ＦＧＦＲ（ＩＣ５０＝１．１μＭ）、及びＡｂｌ（ＩＣ５０＝０．６μＭ）を抑制するチロシンキナーゼ阻害剤であるが、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、インスリン受容体、Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、ＰＫＡ及びＰＫＣを包含する他のキナーゼを臨床的に該当する濃度では抑制しない（Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ，Ｅ．等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：２５５８−２５６２（１９９５）；Ｋａｌｌｉｏ，Ｅ．等、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６０：１３２４−１３３２（１９９９））。１００ｍｇ／ｋｇＣＧＰ５３７１６のＩＰ投与は投与後８時間及び２４時間においてそれぞれ１．６及び１．９μＭの血漿中濃度をもたらした（Ｍｙｌｌａｒｎｉｅｍｉ，Ｍ．等、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １１：１１１９−１１２６（１９９７））。
【００６１】
ＰＤ１６６３２６はｃ−Ｋｉｔ（ＩＣ５０＝０．０１２μＭ）及びＡｂｌ（ＩＣ５０＝０．００２μＭ）に対する力価を有する小分子チロシンキナーゼ阻害剤である（Ｗｏｌｆｆ，Ｎ．等、Ｂｌｏｏｄ１０５：３９９５−４００３（２００５））。マウスにおいて２５及び５０ｍｇ／ｋｇで投与したＰＤ１６６３２６は０．０２６及び０．０９８μＭのピーク血漿中レベル、及び約０．００５及び０．０１８μＭの定常レベル（投与後１５時間）をもたらした（Ｗｏｌｆｆ，Ｎ．等、Ｂｌｏｏｄ  １０５：３９９５−４００３（２００５））。
【００６２】
ＳＵ９５１８はＰＤＧＦＲ（ＩＣ５０＝０．０５３μＭ）及びＦＧＦＲ（ＩＣ５０４．４）に対する力価を有する小分子チロシンキナーゼ阻害剤である（Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｙ．等、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ８８：６３０−６３６（２００１）；Ａｂｄｏｌｌａｈｉ，Ａ．等、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１：９２５−９３５（２００５））。ラットにおいて５０ｍｇ／ｋｇのＳＵ９５１８を経口投与した後、血漿中レベルは１．７６μＭにおいてピーク値となり、投与後８時間においてもレベルはなお１μＭ超であった（Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｙ．等、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ８８：６３０−６３６（２００１））。
【００６３】
他の実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤はＦｍｓ及び／又はＰＤＧＦＲを抑制することに関しても力価を有している。例えばＧＷ２５８０はＦｍｓ（ＩＣ５０＝０．０１μＭ、図１２Ｅ）（Ｃｏｎｗａｙ，Ｊ．等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：１６０７８−１６０８３（２００５））及びＰＤＧＦＲ（ＩＣ５０＝４．３μＭ）（図１１Ｂ）を抑制する小分子である。８０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに投与したＧＷ２５８０は５．６μＭのピーク血漿中濃度をもたらした（Ｃｏｎｗａｙ，Ｊ．等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：１６０７８−１６０８３（２００５））。
【００６４】
これら及び他の小分子チロシンキナーゼ阻害剤の阻害プロファイルは旺盛に特性化及び定義されつつある。今日まで、大多数のキナーゼ（表１）及び小分子阻害剤（表２に示すＦＤＡ認可阻害剤を包含）に関して、厳格なインビトロのキナーゼ基質ホスホリル化試験（例えば図１１Ａに示すもの）及びインビトロの細胞応答試験（例えば図１１Ｂに示すもの）は実施されていない。その結果、示した抑制及びＩＣ５０のデータは現時点での当該分野における知識を示すものであり、そして今後の研究により、多数の新しい未報告のチロシンキナーゼ阻害剤の活性が、本出願に記載した小分子阻害剤に関して発見されることが期待される。更に又、これらの新しい抑制特異性は自己免疫性及び他の炎症性疾患において観察される薬効に寄与すると考えられる。
【００６５】
Ｂ．慢性関節リウマチを治療するためのイマチニブ
本明細書に記載した試験において、イマチニブは炎症性疾患の病因において中枢となるシグナルトランスダクション経路のスペクトルを選択的に抑制することにより炎症性疾患を防止及び治療することが示されている。例示される炎症性疾患である慢性関節リウマチ（ＲＡ）のマウスにおけるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を用いた場合、マウスへのイマチニブの経口投与はＣＩＡの発症及び進行を防止するために有効であることがわかった（例えば実施例１及び図１Ａ〜１Ｄ）。イマチニブは又、樹立された臨床的関節炎を有するマウスにおいても炎症性疾患ＣＩＡを治療する場合において有効であった（例えば実施例２及び図２Ａ〜２Ｂ）。イマチニブで治療されたＣＩＡマウスの後足底に対する組織病理学的な分析によれば、阻害剤はＣＩＡの防止及びＣＩＡの治療において滑膜炎、パンヌス、及び腐食の評点を低減することを示している（図３Ａ〜３Ｉ）。
【００６６】
インビボ及びインビトロのデータは、イマチニブが慢性関節リウマチにおける滑膜炎、パンヌス形成及び関節破壊の駆動において役割を果たす多様な細胞応答を強力に抑制することを示している。例えばイマチニブはヒトＲＡ患者線維芽細胞様滑膜細胞におけるＰＤＧＦＲシグナリング、線維芽細胞におけるＴＧＦ−β媒介Ａｂｌシグナリング、肥満細胞によるｃ−Ｋｉｔ活性化及びプロ炎症性サイトカインの生産、滑液マクロファージによるＬＰＳ誘導ＴＮＦα生産、及びＴ及びＢリンパ球の機能を停止させる。
【００６７】
実施例３において詳述する通り、滑膜組織中の肥満細胞の存在を確認した後（図４Ａ）、肥満細胞をイマチニブの非存在下又は存在下に幹細胞因子（ＳＣＦ）で刺激し、そしてサイトカイン分析を培養上澄みに対して実施した。図４Ｂ〜４Ｄに示す通り、イマチニブの存在はＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−６の肥満細胞生産を低減している。
【００６８】
免疫ブロッティング及び逆相蛋白（ＲＰＰ）溶解物アレイ分析を肥満細胞系統に対して実施することによりイマチニブにより調節されたチロシンキナーゼ活性化状態及びシグナルトランスダクション経路を特性化した。免疫ブロッティング結果はイマチニブがｃ−Ｋｉｔの幹細胞因子誘導ホスホリル化を抑制し（図４Ｅ）、下流Ａｋｔのホスホリル化の相当する低減も伴っていた（図４Ｆ）ことを示している。図４Ｇに示される通り、イマチニブはシグナリング分子Ａｋｔ（例えばＳｅｒ４７３及びＴｈｒ３０８において）、Ｐ７０Ｓ６Ｋ及びＲａｆのホスホリル化を防止している。
【００６９】
免疫ブロッティング及びＲＰＰアレイ技術による実験は、イマチニブは肥満細胞においてＳＣＦ誘導ｃ−Ｋｉｔホスホリル化及びＭＡＰＫ経路の下流の活性化を抑制することを示している。更に又、イマチニブは炎症性サイトカインＴＮＦα、ＩＬ−６及びＧＭ−ＣＳＦのＳＣＦ誘導肥満細胞生産を抑制している。これらのデータは肥満細胞活性化のイマチニブ媒介抑制がＣＩＡ及び潜在的にはヒトＲＡにおいてもその薬効に寄与できることを示唆している。
【００７０】
総括すれば、イマチニブは、おそらくは（ｉ）滑膜線維芽細胞のＰＤＧＦＲ及びｃ−Ａｂｌ媒介増殖、（ｉｉ）ＴＮＦα産生マクロファージ及び骨破壊破骨細胞へのｃ−Ｆｍｓ媒介単球成熟化、（ｉｉｉ）肥満細胞によるＴＮＦαのｃ−Ｋｉｔ媒介放出、及び（ｉｖ）Ｂ及びＴ細胞のｃ−Ａｌｂ及びＬｃｋ媒介活性化を包含するＲＡの病因に寄与している多数のチロシンキナーゼ及び細胞応答を同時に抑制することによりＣＩＡにおける薬効を与えている。
【００７１】
Ｃ．ｃ−Ｆｍｓに関連する疾患を治療するためのイマチニブ
ｃ−Ｆｍｓは単球系統の細胞上に主に発現され、そしてマクロファージ及び破骨細胞への単球の分化を刺激する。Ｆｍｓは又、マクロファージの増殖、分化、及び生存を調節する（Ｄｅｗａｒ，２００５；Ｐｉｘｌｅｙ，Ｆ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：６２８−６３８（２００４））。
【００７２】
本発明の組成物及び方法を用いて実施した実験において、実施例５に記載する通り、レジデントの腹膜マクロファージ細胞をマウスから単離し、イマチニブを予備投与し、そしてＭ−ＣＳＦにより刺激した。免疫ブロッティング及びＲＰＰアレイによる分析のために溶解物を作成した。図５Ａ及び５Ｂの免疫ブロットはイマチニブがｃ−ＦｍｓのＭ−ＣＳＦ誘導ホスホリル化を抑制したが、総ｃ−Ｆｍｓのレベルは全試料において同様であったことを示している（図５Ａ）。下流のシグナリング分子Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）もまた図５Ｂに示す通りイマチニブを予備投与されたマクロファージにおいて低減されたホスホリル化を示している。Ｍ−ＣＳＦ刺激マクロファージ溶解物のＲＰＰアレイ分析（図５Ｃ）はイマチニブがＭＡＰＫファミリー及びＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３及びＴｈｒ３０８）、ＥＲＫ、ＳＴＡＴ３、ＪＮＫ、Ｐ７９Ｓ６Ｋ及びｐ３８を包含するｃ−Ｆｍｓの下流の他の経路における蛋白チロシンキナーゼのホスホリル化をブロックしたことを示している。免疫ブロット及びＲＰＰアレイデータはイマチニブがｃ−Ｆｍｓを介したＭ−ＣＳＦ誘導マクロファージ活性化を強力に抑制することを示している。
【００７３】
これらの結果はＴＮＦαを生産することが知られているプロセスであるマクロファージへの単球の分化を抑制することが、慢性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、強直性脊椎炎、及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような炎症性疾患をモジュレート、治療、又は防止するために使用できることを示唆している。破骨細胞への単球の分化のイマチニブ媒介抑制もまた、ＲＡ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び他の炎症性の関節炎における破骨細胞媒介骨破壊を防止すると考えられる。
【００７４】
Ｄ．Ｂ細胞及びＴ細胞のＴＫが関与する疾患を治療するためのイマチニブ
イマチニブは又、Ｂ細胞において発現されるｃ−Ａｂｌ及びＴ細胞において発現されるＬｃｋを抑制し、そしてこれにより、慢性関節リウマチのような疾患における適応自己免疫応答を減衰させることができる。慢性関節リウマチにおける抗シトルリン抗体の存在、関節炎のげっ歯類モデルにおける破壊的関節炎への抗シトルリン抗体の寄与、及び抗ＣＤ２０療法の薬効は全て、慢性関節リウマチの病因におけるＢ細胞の重要な役割を示唆している（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：３５６−３６１（２００３）；Ｋｕｈｎ，Ｋ．Ａ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）。
【００７５】
本発明の試験において、抗滑膜Ｂ細胞応答のエピトープ拡張はイマチニブ投与ＣＩＡマウスにおいて低減されている（実施例５及び図６Ａ〜６Ｅ）。この相違はｃ−Ａｂｌに対するイマチニブの作用であった可能性がある。ｃ−ＡｂｌはＢ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）の刺激後にＢ細胞表面上でＣＤ１９をホスホリル化して共局在化し、そしてｃ−Ａｂｌ不全マウスは欠損性のＢＣＲシグナリングを有する（Ｚｉｐｆｅｌ，Ｐ．Ａ．等、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：６８７２−６８７９，（２０００））。イマチニブはマイクロモル未満の濃度でｃ−Ａｂｌキナーゼ活性をブロックするため（Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ，２００１；Ｄｅｗａｒ，２００５；Ｆａｂｉａｎ，２００５）、イマチニブがＢＣＲシグナリングを抑制することによりＣＩＡにおける自己反応性Ｂ細胞応答の拡大を低減する可能性がある。
【００７６】
ＲＡにおける自己反応性Ｔ細胞の役割はリウマチ様の滑膜炎におけるＴ細胞浸潤の存在、ＲＡとの共有エピトープＨＬＡ−ＤＲ４多形の関連、及びＣＴＬＡ４−Ｉｇの薬効により裏付けられている（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ，２００３；Ｇｅｎｏｖｅｓｅ，Ｍ．Ｃ．等、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５３：１１１４−１１２３（２００５））。インビトロ試験はイマチニブがＴＣＲ−関連チロシンキナーゼＬｃｋの抑制を介してＴ細胞の活性化を減衰させることを示唆している（Ｄｉｅｔｚ，Ａ．Ｂ．等、Ｂｌｏｏｄ  １０４：１０９４−１０９９（２００４））。本明細書に記載したインビトロの試験（実施例６）は試験した最高濃度である１０μＭにおいて抗ＣＩＩＴ細胞の増殖をイマチニブが抑制したことを示している。
【００７７】
Ｅ．Ｆｍｓ及びＰＤＧＦＲの関与する疾患を治療するためのＧＷ２５８０
別の実施形態においてＦｍｓに対して高度に強力でアリ、そしてＰＤＧＦＲも抑制する小分子チロシンキナーゼ阻害剤はＲＡに関するコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルを治療する場合に薬効を呈する。図１２に示し、そして実施例９において説明したデータはＦｍｓ及びＰＤＧＦＲ阻害剤であるＧＷ２５８０は樹立されたコラーゲン誘導関節炎を治療することを示している。更に又、この阻害剤はＴＮＦα及び他のプロ炎症性サイトカインを生産することができるマクロファージへの単球の分化をブロックすることが明らかにされている。免疫組織化学実験はＦｍｓ及びＰＤＧＦＲが滑膜管壁において高レベルで、そしてＲＡ患者から誘導した滑膜のより深部において中等度のレベルで発現されることを示している（図１４及び実施例１１）。ＧＷ２５８０は又、ＣＩＡ及びＲＡにおいて骨を代謝して破壊する破骨細胞のＦｍｓ媒介分化および活性化を抑制することによっても利益を与えると考えられる。ＰＤＧＦＲのＧＷ２５８０の抑制は又、侵襲性のパンヌス組織を形成する滑膜線維芽細胞の増殖を抑制することによりＣＩＡにおけるその薬効に寄与していると考えられる。
【００７８】
Ｆ．ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ及びＫｉｔの関与する疾患を治療するためのＣＧＰ５３７１６
更に別の実施形態において、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ及びＫｉｔを抑制する小分子チロシンキナーゼ阻害剤はＲＡの誘導の防止において薬効を与える。図１３に示し、そして実施例１０において説明する通り、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ及びＫｉｔ阻害剤であるＣＧＰ５３７１６はマウスがＣＩＡを発症することを防止している。ＰＤＧＦＲ及びＦＧＦＲは滑膜線維芽細胞の増殖を媒介し、そしてＣＧＰ５３７１６は隣接する軟骨及び軟組織を侵襲するパンヌス組織を形成する滑膜管壁線維芽細胞の過形成を防止することにより利益を与えると考えられる。更に又、Ｋｉｔを抑制することにより、ＣＧＰ５３７１６は肥満細胞活性化及び炎症メディエーターの放出をブロックする。免疫組織化学的検討によれば、ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβは両方ともＲＡを有する患者から誘導した滑膜において発現される（図１４及び実施例１１）。
【００７９】
Ｇ．多発性硬化症を治療するためのイマチニブ
本発明の組成物及び方法を使用しながら実施した別の実験において、別の例示される炎症性の状態である実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）を治療及び／又は防止するイマチニブの能力を評価した。ＥＡＥは多発性硬化症（ＭＳ）に関する広範に使用されている動物モデルである。
【００８０】
ＥＡＥマウスに１日２回イマチニブを投与し、そして疾患の重症度を実施例８に記載した標準的採点システムを用いて測定した。結果を図１０に示す。イマチニブを投与した動物は対照マウスと比較してＥＡＥの遅延した発症及び低減された重症度を示した。イマチニブは（ｉ）マクロファージへのＦｍｓ媒介単球分化を抑制すること；（ｉｉ）Ｋｉｔ媒介肥満細胞炎症メディエーター放出を抑制すること；（ｉｉｉ）Ｔ及びＢ細胞の機能をそれぞれＬｃｋ及びＡｂｌを介して抑制すること；（ｉｖ）ＰＤＧＦＲ及びＡｂｌにより媒介されると考えられる神経膠症を抑制すること；及び／又は（ｖ）これらの作用の組み合わせにより有益な治療効果を与えている。多数のチロシンキナーゼの同時阻害は本発明の組成物及び方法の作用機序のために重要であると考えられる。
【００８１】
Ｈ．全身性硬化症を治療するためのイマチニブ
全身性硬化症（ＳＳｃ、硬皮症）の病因には線維症、血管症、炎症及び自己免疫が関与している。ＳＳｃにおける前線維性の経路の活性化にはサイトカイン形質転換成長因子（ＴＧＦ）−ベータ（ＴＧＦ−β）及び血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）の過剰発現が関与している。ＰＤＧＦ受容体はＳＳｃを有する患者の皮膚及び気管支肺胞洗浄液においてアップレギュレートされ、そして、活性化された場合には、線維芽細胞及び筋線維芽細胞の増殖をもたらす（Ｙａｍａｋａｇｅ，Ａ．等（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１２２７−１２３４；Ｌｕｄｗｉｃｋａ，Ａ．等（１９９５）Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ２２：１８７６−８３）。更に又、ＰＤＧＦＲは単球化学誘引物質蛋白１（ＭＣＰ−１）の生産を刺激することを介して、ＳＳｃにおける炎症応答の開始における関与が示唆されている（Ｄｉｓｔｌｅｒ，Ｏ．等（２００１）、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４４：２６６５−７８）。最近の報告は、ＳＳｃ患者が疾患の血管症及び線維症の特徴と合致して、反応性酸素物質種の生産及びＩ型コラーゲンの発現を刺激するＰＤＧＦＲに対抗する自己抗体を有することを示している（Ｂａｒｏｎｉ，Ｓ．（２００６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４：２６６７−７６）。
【００８２】
ＴＧＦ−βシグナリングは全身性硬化症における重要な前線維性の経路である（Ｄｉｓｔｌｅｒ，Ｊ．等、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５６：３１１−３３３（２００７））。線維芽細胞におけるＴＧＦ−β刺激はｃ−Ａｂｌを介してシグナルされ（Ｗａｎｇ，Ｓ．等、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １９：１−１１（２００５））、そしてＡｂｌを介したシグナリングは恐らくは全身性硬化症における皮膚、肺、腎臓及び他の臓器の線維症に多大に寄与していると考えられる。
【００８３】
早期のびまん性のＳＳｃを有する患者はイマチニブメシレート（ＧｌｅｅｖｅｃＴＭ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）療法による治療に応答した自身の疾患の皮膚、肺、及び筋肉骨格における病態の改善を経験している（実施例１５及び図１８Ａ、Ｃ、Ｅ（治療前）、及び１８Ｂ、Ｄ、Ｆ（治療後））。イマチニブは（ｉ）皮膚、肺及び他の組織のＰＤＧＦＲ及び／又はＡｂｌ媒介増殖を抑制すること；（ｉｉ）マクロファージへのＦｍｓ媒介単球分化及びＴＮＦαを生産するためのマクロファージのプライミングを抑制すること；（ｉｉｉ）Ｋｉｔ媒介肥満細胞炎症メディエーター放出を抑制すること；（ｉｖ）Ｔ及びＢ細胞の機能をそれぞれＬｃｋ及びＡｂｌを介して抑制すること；；及び／又は（ｖ）これらの作用の組み合わせにより有益な治療効果を与えている。多数のチロシンキナーゼ及びそれらが媒介する病原性の細胞応答の同時阻害も全身性硬化症を治療する場合のイマチニブの薬効のために重要である。
【００８４】
Ｇ．結論
上記に基づけばイマチニブ、ＧＷ２５８０、ＳＵ９５１８、ＰＤ１６６３２６、及びＣＧＰ５３７１６により例示されるチロシンキナーゼ阻害剤の投与は多くの炎症性疾患を有する患者の防止及び治療を意図していることがわかる。
【００８５】
１つの実施形態において、疾患は重度のＲＡ、特にメトトレキセート、ＴＮＦ拮抗剤、又は他の疾患変更抗リウマチ薬による治療に対して難治性のＲＡである。本明細書に記載した試験において、イマチニブはＣＩＡを効果的に治療し、そして慢性関節リウマチにおける病原性細胞応答を駆動する多数のシグナルトランスダクション経路を抑制している。他の実施形態においては、炎症性疾患は自己免疫疾患、例えば限定しないが、乾癬、乾癬性関節炎、腎炎、糸球体腎炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、全身エリテマトーデス、自己免疫性糖尿病、硬皮症、クローン病等である。
【００８６】
マクロファージ成熟化及びＴＮＦα生産、肥満細胞活性化及びＴＮＦα放出、及び自己反応性Ｂ及びＴリンパ球の活性化のイマチニブ媒介抑制は多くの自己免疫疾患において治療上の利益を与えるが、ＰＤＧＦＲ及びＡｂｌを抑制するイマチニブの能力のために特にそれは慢性関節リウマチ、硬皮症及び病因に線維症のプロセスが役割を果たしている他の疾患の治療のために適するものとなっている。
【００８７】
理論に制約されないが、本発明の組成物及び方法は炎症性疾患の病因に関与している特定のＴＫを阻害することにより有益な作用をもたらすと考えられる。そのようなＴＫは炎症応答に直接関与、及び／又は炎症に対する宿主細胞の応答に関与していると考えられる。
【００８８】
自己免疫及び炎症応答に直接関与しているチロシンキナーゼの例は（ｉ）ｃ−Ｆｍｓ媒介単球突然変異及びマクロファージプライミングによるＴＮＦαの生産；（ｉｉ）ｃ−Ｋｉｔ媒介肥満細胞活性化及びプロ炎症メディエーター放出；及び（ｉｉｉ）Ａｂｌ及びＬｃｋ媒介リンパ球活性化を包含する。これらのキナーゼは臓器、組織又は細胞の傷害又は炎症を誘発する自己免疫性又は炎症性の応答に直接寄与している。
【００８９】
宿主細胞応答の場合、自己免疫性及び他の炎症性の疾患の臨床上の表現型に寄与する炎症及び組織傷害に対する異常な宿主細胞応答が多種存在する。そのような宿主細胞応答には、ＲＡにおけるパンヌス形成又は硬皮症における皮膚の堅固化において観察されるようなＰＤＧＦＲ媒介、ＦＧＦＲ媒介、及びＡｂｌ媒介の線維芽細胞増殖が包含される。線維症様の応答を包含する場合がある調節不全の宿主細胞応答は多くの他の自己免疫性及び炎症性の疾患、例えば損傷を受けた白質において神経膠症が生じる多発性硬化症；損傷を受けた糸球体において糸球体硬化症が生じる全身エリテマトーデス；顕著な肝臓及び短観の線維症が観察される自己免疫性の肝炎及び原発性胆汁性肝硬変；肺の線維症を特徴とする特発性肺線維症；及び腸壁及び腸間膜の線維症が生じるクローン病において観察される。
【００９０】
高度に選択的なチロシンキナーゼ阻害剤のほかに、炎症性疾患の病因に関与するキナーゼの選択されたサブセットを阻害するチロシンキナーゼ阻害剤がより顕著な利益をもたらすことになると期待される。
【００９１】
自己免疫性及び炎症性の疾患の病因に関与する多数のチロシンキナーゼを阻害する阻害剤の例は、Ｆｍｓ、Ｋｔ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、及びＡｂｌを抑制するイマチニブ；ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ及びｃ−Ｋｉｔを抑制するＣＧＰ５３７１６；及びＦｍｓ及びＰＤＧＦＲを抑制するＧＷ２５８０を包含する。
【００９２】
単一のチロシンキナーゼの阻害は、慢性関節リウマチ、乾癬、クローン病及び他の自己免疫疾患を治療する場合に中程度で限定された薬効を与えるのみである場合があると考えられる。このことはイマチニブ及び他のＴＫ阻害剤が作用する個々のチロシンキナーゼ（又は他の同族体リガンド）における遺伝子不全は中程度に自己免疫性関節炎を低減するのみであるという観察結果により裏付けられる。例えば、欠損性ｃ−Ｋｉｔシグナリングを示すＣ５７ＢＬ／６−ＫｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈ（Ｗｓｈ）マウスは関節炎の重症度において軽度の低減を示すのみである（図１７）。更に又、Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣ３ＨｅＢ／ＦｅＪバックグラウンド上の骨粗鬆症（ｏｐ／ｏｐ）マウスはＦｍｓ−リガンドＭ−ＣＳＦに関して不全でアリ、そして自己免疫性関節炎に対して中程度の抵抗性を示すのみである（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ等、Ｊ  Ｌｅｕｋ  Ｂｉｏｌ  ６８：１４４−１５０（２０００）。これらのデータは自己免疫性関節炎に対抗してマウスを完全に保護するにはｃ−ＫｉｔオアＦｍｓ−リガンドＭ−ＣＳＦにおける遺伝子的突然変異は不十分であること、そしてこのため、個々のチロシンキナーゼの阻害も同様に自己免疫性関節炎及び他の自己免疫疾患を治療するには不十分となることを示唆している。
【００９３】
単一のチロシンキナーゼの阻害が慢性関節リウマチ、乾癬、クローン病及び他の自己免疫疾患を治療する場合に中程度で限定された薬効を与えるのみであるという可能性は、薬物の組み合わせがこれらの自己免疫疾患を十分治療するためには必要となることが頻繁である現在の臨床慣行における観察結果によっても裏付けられる。ＲＡの場合、ヒドロキシコロキンがメトトレキセートと組み合わせて頻繁に使用されている。抗ＴＮＦ剤（アダリムマブ、エタネルセプト又はインフリキシマブ）は患者がメトトレキセートと組み合わせたヒドロキシコロキンに十分応答しない場合に追加される。同様の複合療法の方策が他の疾患を治療するために使用されている。例えば、クローン病においてはスルファサラジン及び抗ＴＮＦ剤が頻繁に組み合わせて使用されている。ＳＬＥ及び他のリウマチ疾患においては、プレドニゾンがイムラン、シトキサン又はミコフェノレートモフェチルと組み合わせて使用されている。本明細書に記載した結果と組み合わせた従来の療法に関連する上記観察結果に部分的に基づけば、病因に関与する多数のチロシンキナーゼを阻害する化合物は多大な臨床薬効を与えることが期待される。
【００９４】
チロシンキナーゼのＡＴＰ結合部位の間で共有されている構造的特徴に基づけば、ＡＴＰ結合部位と直接相互作用する多くの小分子チロシンキナーゼ阻害剤は数種のチロシンキナーゼを交差阻害すると考えられる（表１）。その結果、最も適切な阻害プロファイルを有する小分子チロシンキナーゼ阻害剤を特定のチロシンキナーゼの異常な発現又は活性を特徴とする疾患の治療のために選択できる。理想的にはそのようなチロシンキナーゼ阻害剤は該当する、そして病因駆動のキナーゼを交差阻害する単一の活性化合物である。
【００９５】
例示される阻害剤はイマチニブ（ｃ−Ｆｍｓ、ｃ−Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、及びＡｂｌを抑制する）、ＳＵ９５１８（ＰＤＧＦＲ及びＦＧＦＲを抑制）、ＧＷ２５８０（Ｆｍｓ及びＰＤＧＦＲを抑制）、ＣＧＰ５３７１６（ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ及びＫｉｔを抑制）及びＰＤ１６６３２６（Ｋｉｔ及びＡｂｌを抑制）である。これらの化合物の構造を図１９に示す。これらの化合物に関する更に別の情報は表５に示す。
【００９６】
図２０は小分子イチロシンキナーゼ阻害剤を阻害することが知られており、本発明の組成物及び方法において機能すると考えられる追加的化合物の構造を示す。これらの化合物に関する更に別の情報は表６及び７に示す。
【００９７】
ヒト自己免疫疾患を治療又は防止する場合に薬効をもたらすと考えられる追加的なチロシンキナーゼ阻害剤は例えば下記：
（ｉ）特定の自己免疫性又は他の炎症性疾患の病因に関与しているチロシンキナーゼ１つ、好ましくは少なくとも２つを阻害することが明らかにされているチロシンキナーゼ阻害剤化合物の合理的選択、及び、
（ｉｉ）自己免疫性又は他の炎症性疾患に該当するげっ歯類モデルにおける樹立された疾患をチロシンキナーゼ阻害剤化合物が治療できることを明らかにすること、
により発見することができる。
【００９８】
ヒト炎症性疾患を媒介することが分かっている機序は特定の自己免疫性又は他の炎症性疾患において薬効を与えると考えらエルチロシンキナーゼ阻害剤の選択の指針となり参考となりえるものであり、例えば下記の例、即ち：
（ｉ）慢性関節リウマチ、乾癬及びクローン病におけるＴＮＦαの顕著な役割を知ることは、（ａ）ＴＮＦα産生マクロファージへの単球細胞の分化を抑制するＦｍｓ阻害剤及び他の阻害剤（例えば図１２参照）、及び（ｂ）肥満細胞生産及びＴＮＦα及び他のプロ炎症メディエーターの放出（例えば図４参照）をブロックするＫｉｔ阻害剤は特定の疾患を治療する場合に有効であると考えられることを示唆しており；
（ｉｉ）臨床表現型における線維芽細胞増殖又は線維症様宿主細胞応答の顕著な役割を知ることであって、そのような線維症様の応答はＲＡ（線維芽細胞様滑膜細胞の増殖による侵襲性のパンヌスの形成、図８参照）、硬皮症（皮膚線維芽細胞の増殖による堅固な皮膚の形成）、特発性肺線維症（肺機能不全を誘発する線維症）、クローン病（腸の線維症が症状に寄与）、多発性硬化症（神経膠症及び損傷白質の瘢痕形成を特徴とする）、及び全身狼瘡（糸球体硬化症及び腎臓の瘢痕形成が起こる）において観察され、そしてＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ及びＡｂｌ阻害剤が特定の疾患を治療する場合に有効であることを示唆しており；及び（ｉｉｉ）炎症性疾患における自己免疫性のＢ及びＴ細胞の関与を知ることは、それぞれＢ及びＴ細胞を媒介するＡｂｌ及びＬｃｋ阻害剤は特定の疾患を治療する場合に有効であること（例えば図６及び７参照）が挙げられる。
【００９９】
同様に、例示されるチロシンキナーゼ標的はＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ、Ｆｍｓ、Ｋｉｔ及びＡｂｌであるが、他のチロシンキナーゼをターゲティングすることが望ましい場合もある。当業者の知る通り、活性化合物は本明細書に記載したキナーゼ阻害を媒介する活性な薬物、前薬剤（存在する場合）、又は活性な代謝産物（存在する場合）であってよい。或いは、各々が病因に関与するチロシンキナーゼに特異的な数種のＴＫ阻害剤を組み合わせて投与できる。
【０１００】
ＩＶ．送達及び製剤
ＣＭＬ、ＧＩＳＴ及び他の悪性疾患を治療するために必要なチロシンキナーゼ阻害剤の用量と比較して、自己免疫疾患においてはより低用量のイマチニブ及び他の小分子チロシンキナーゼ阻害剤が利益を与える場合がある。ＣＭＬ及びＧＩＳＴはＡｂｌ及びＫｉｔにおける一次突然変異から生じ、そしてこのため、悪性細胞の増殖を抑制するためには比較的高用量のイマチニブを必要とする。これとは対照的に、炎症性疾患は一般的にこれらのキナーゼにおける突然変異とは一般的に関連しておらず、そして野生型キナーゼが炎症、組織傷害、及び異常な宿主細胞応答を媒介する調節不全の細胞応答に関与している。野生型キナーゼに対するイマチニブ及び他のチロシンキナーゼ阻害剤のＩＣ５０は悪性疾患に関連する突然変異したキナーゼのものよりも低値であり、そしてより低用量の投薬用法が自己免疫性及び他の炎症性の疾患において利益を与える場合があることが期待される。
【０１０１】
イマチニブ、ＧＷ２５８０、ＳＵ９５１８、ＰＤ１６６３２６、ＣＧＰ５３７１６、又は他のチロシンキナーゼ阻害剤の用量は、当該分野で知られた手段、例えば限定しないが、治療すべき疾患、疾患の重症度、及び患者の状態に応じて担当の医療従事者により選択される。１つの実施形態において、イマチニブは少なくとも１日１回、より好ましくは少なくとも１日２回投与される。１日当たり２００ｍｇ１回、より好ましくは１日当たり４００ｍｇ１回、更には１日当たり６００ｍｇ１回が意図される。１つの実施形態において、ＲＡのような特定の炎症性疾患の治療のためのイマチニブの用量は、現在認可されている用量よりも低値の用量において投与される。特に、１００ｍｇ／日以下、５０ｍｇ／日以下、又は２５ｍｇ／日以下の用量が考えられる。
【０１０２】
毎日より少ない投与、例えば１日おき、又は週に数回の投与もまた意図される。更に又、イマチニブ又は他のチロシンキナーゼ阻害剤を用いた療法の間欠的日程、例えば１週間投与、次に１週間休薬、又は１週間投与、次に３週間休薬、又は疾患が再燃している期間のみの投与も意図される。
【０１０３】
好ましい実施形態においては、チロシンキナーゼ阻害剤は経口投与される。経口投与のための固体剤型はカプセル、錠剤、丸薬、粉末、及び顆粒を包含する。そのような固体剤型において、活性化合物は少なくとも１つの不活性の製薬上許容しうる賦形剤又は担体、例えばクエン酸ナトリウム又はリン酸２カルシウム、及び／又は（ａ）充填剤又は膨張剤、例えば澱粉、乳糖、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸、（ｂ）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアカシア、（ｃ）湿潤剤、例えばグリセロール、（ｄ）錠剤崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、バレイショ又はタピオカの澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えばパラフィン、（ｆ）吸収加速剤、例えば第４アンモニウム化合物、（ｇ）水和剤、例えばセチルアルコール及びグリセロールモノステアレート、（ｈ）吸収剤、例えばカオリン及びベントナイト粘土、及び（ｉ）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤及び丸薬の場合は、剤型は又緩衝剤を含んでよい。
【０１０４】
同様の型の固体組成物は又、乳糖又はミルクシュガー並びに高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を用いたソフト及びハード充填ゼラチンカプセルにおける充填剤としても使用してよい。
【０１０５】
錠剤、ドラジェ剤、カプセル、丸薬、及び顆粒の固体剤型はコーティング及びシェル、例えば腸溶性コーティング及び医薬品製剤分野でよく知られた他のコーティングと共に製造してよい。それらは場合により不透明化剤を含有してよく、そして活性成分のみを、又はそれを優先的に、腸管の特定部位において、場合により遅延化された態様において、放出すような組成物であることができる。使用できる包埋用組成物の例は、重合体物質及びワックスを包含する。活性化合物は又適切には上記賦形剤１つ以上を用いたマイクロカプセル形態において存在できる。
【０１０６】
経口投与用の液体剤型は製薬上許容しうる乳液、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを包含する。活性化合物に加えて液体剤型は当該分野で一般的に使用されている不活性希釈剤、例えば水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムミド、油脂類（特に綿実油、ピーナツ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、及びこれらの混合物を含有してよい。
【０１０７】
不活性希釈剤の他に、経口用組成物は補助剤、例えば水和剤、乳化及び懸濁剤、甘味料、フレーバー、及び香料を含むことができる。懸濁液は活性化合物の他に、懸濁剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、及びトラガカント、及びこれらの混合物を含有してよい。
【０１０８】
上記から、本発明の組成物方法の種々の追加的な特徴及び実施形態が明らかになるはずである。以下の実施例は組成物及び方法を説明するために提示するものであり、限定を意図していない。
【実施例】
【０１０９】
Ｖ．実施例
以下の実施例は本質的に説明であって、限定を全く意図しない。
【０１１０】
方法
Ａ．細胞系統及び抗体。マウス肥満細胞系統Ｃ１．ＭＣ／５７．１はＤｒ．Ｓ．Ｇａｌｌｉ  （Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８４：９１７５−９１７９（１９８７）；Ｔｓａｉ，Ｍ．等、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１０：Ａ１２５３（１９９６））により提供された。抗体の原料：抗ｃ−Ｆｍｓ及びＰＤＧＦＲβ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ）及び他の抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【０１１１】
Ｂ．動物。６〜８週齢の雄性ＤＢＡ／１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）はＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにより認可されたプロトコルにおいて、そしてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）のガイドラインに従って使用した。ＣＩＩに対して特異的なＴＣＲを発現するマウスはＤｒ．Ｗ．Ｌａｄｉｇｅｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）（Ｏｓｍａｎ，Ｇ．Ｅ．等、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：１６１３−１６２２（１９９８））により提供された。Ｃ５７バックグラウンド上のＷｓｈマウス及び野生型のＣ５７マウスはＤｒ．Ｓ．Ｇａｌｌｉ  （Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により提供された。
【０１１２】
Ｃ．ヒトＲＡ滑液及び組織の試料。ヒト滑液及び組織の試料はＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ認可プロトコルの下、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙの改定基準に基づいたＲＡ診断を有する患者のインフォームドコンセントが提出された後に収集した。
【０１１３】
Ｄ．コラーゲン誘導関節炎試験。ＤＢＡ／１マウスにおけるＣＩＡを誘導し、そして文献記載の通り採点した（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．等、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１５．１５．１１−１５．１５．２４（１９９４））。イマチニブの錠剤（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙより購入）を粉砕し、ＰＢＳ中に希釈し、３３ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇを胃管栄養法により１日２回、防止実験ではＣＩＡ誘導の前日から、そして投与実験では臨床関節炎発症後に送達した。ＣＧＰ５３７１６はＤｒ．Ｄａｒｒｅｎ  Ｖｅａｃｈ（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）により合成され、提供された。ＧＷ２５８０はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｃａｔａｌｏｇ＃３４４０３６）より購入した。
【０１１４】
Ｅ．組織病理学的試験。後肢を固定し、ＣａｌＥｘＩＩ（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で脱カルシウム処理し、パラフィン包埋し、そしてＨ＆Ｅ染色切片を、滑膜炎、パンヌス、及び骨及び／又は軟骨の破壊に関して採点した（Ｄｅｎｇ，Ｇ．Ｍ．等、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １１：１０６６−１０７２（２００５））。
【０１１５】
Ｆ．ＲＡ滑膜細胞の単離及び刺激。ＲＡ滑液単核細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度購買を用いて単離し、プラスチックへの接着により選択し、そして４８時間１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。ＲＡ線維芽細胞様滑膜細胞は膝関節形成術において得られたレムナントパンヌスから単離した。パンヌスを粉砕し、３７℃で７５分間１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩ、０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ、及び０．０１５ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼで消化し、ＲＰＭＩ中に成長させ、そして４〜８継代の後、コンフルエントまで成長させ、そして１０分間２５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｓｉｇｍａ）で刺激した。
【０１１６】
Ｇ．肥満細胞刺激。免疫ブロッティング分析のため、Ｃ１．ＭＣ／５７．１肥満細胞を６〜８時間血清枯渇させ、２時間イマチニブと共に予備インキュベートし、そして１０分間１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で刺激し、そして溶解物を作成した。サイトカイン分析のため、Ｃ１．ＭＣ／５７．１細胞をイマチニブと共に予備インキュベートし、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦで９６時間刺激し、そして上澄みをサイトカイン分析用に採取した。
【０１１７】
Ｈ．マクロファージの単離及び刺激。レジデントの腹膜マクロファージは、ＤＢＡ／１マウスから、腹腔内注射及びＲＰＭＩ培地からの５〜７ｍｌの採取により単離し、接着したマクロファージを一夜培養し、イマチニブを２時間予備投与し、１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で１０分間刺激し、そして溶解物を作成した。形態学的検討のため、マクロファージを７２時間１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ及びイマチニブの存在下又は非存在下に刺激した。
【０１１８】
Ｉ．Ｂ細胞の単離及び刺激。Ｂ細胞をナイーブのＤＢＡ／１マウス脾臓からＭＡＣＳビーズの陰性選択により単離した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）。Ｂ細胞はＢ細胞マーカーＣＤ１９による染色及びフローサイトメトリーによる分析により純粋であることがわかった。単離されたＢ細胞をμ−特異的抗ＩｇＭＦ（ａｂ’）２（５０μｇ／ｍｌ；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）又はＬＰＳ（５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で７２時間刺激した。Ｂ細胞の増殖を計測するために、Ｂ細胞を１μＣｉ［３Ｈ］チミジン（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）で刺激の最後１８時間パルス処理し、そしてベータプレートシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて取り込まれた放射能を定量した。
【０１１９】
Ｊ．Ｔ細胞刺激。抗ＣＩＩＴＣＲトランスジェニックマウスに由来する脾細胞を０〜４０μｇ／ｍｌのＣＩＩ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）で７２時間刺激し、そして［３Ｈ］ＴｄＲ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を培養の最後１８時間添加し；上澄み中のサイトカインを分析した。
【０１２０】
Ｋ．免疫ブロッティング。溶解物は刺激した腹膜マクロファージ、Ｃ１．ＭＣ／５７．１肥満細胞、又は線維芽細胞様滑膜細胞から作成した（溶解緩衝液：１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、０．５％ＳＤＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ、Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）及びホスファターゼ阻害剤カクテル２（Ｓｉｇｍａ））。溶解物は７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転移させ、一次及び二次抗体でプローブし、そしてシグナルをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔピコケミルミネセント基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で検出した。
【０１２１】
Ｌ．逆相蛋白溶解物アレイ。Ｃ１．ＭＣ／５７．１肥満細胞を６時間血清枯渇させ、刺激し、そして等容量の２Ｘ溶解緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．８、１０ｍＭＥＤＴＡ、４％ＳＤＳ、１０％グリセロール、２％２−メルカプトエタノール、２％ホスファターゼ阻害剤カクテル２（Ｓｉｇｍａ）、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ））中で溶解した。刺激された腹膜マクロファージ及び線維芽細胞様滑膜細胞を上記した通り溶解した。以前に報告されている通り（Ｃｈａｎ，Ｓ．Ｍ．等、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０：１３９０−１３９６（２００４））、溶解物をＦＡＳＴスライド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）上に印刷し、アレイをホスホ特異的抗体、次にセイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、次にＢｉｏ−Ｒａｄ増幅試薬及びＯｐｔｉ−４ＣＮ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でプローブし、結合したビオチンをＣｙ３−ストレプトアビジンで検出し、スライドをＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂマイクロアレイスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）でスキャンし、そしてフィーチャー蛍光強度をＧｅｎｅＰｉｘ５．０Ｐｒｏを用いて定量した。提示した値（図４Ｇ及び図５Ｃ）は未刺激細胞におけるレベルに対して規格化した抗蛋白チロシンキナーゼ抗体シグナル（Ｃｙ３）を示す。
【０１２２】
Ｍ．滑膜アレイ分析。報告されている通り（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｗ．Ｈ．等、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８：２９５−３０１（２００２）；Ｈｕｅｂｅｒ，Ｗ．等、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５２：２６４５−２６５５（２００５））、自己抗原を提示する５００＋ペプチド及び蛋白をＳｕｐｅｒＥｐｏｘｙスライド（ＴｅｌｅＣｈｅｍ）上に印刷し、アレイを１：１５０希釈のマウス血清、次いでＣｙ３標識抗マウスＩｇＧ／Ｍ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共にインキュベートし、そしてＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂスキャナーを用いてスキャンした。各抗原につきメジアンのフィーチャー強度を核抗原を示す４〜８の２連の特徴から計算した。
【０１２３】
Ｎ．インビトロｃ−Ｋｉｔホスホリル化試験。組み換えｃ−Ｋｉｔを種々の濃度の小分子阻害剤と共に予備インキュベートし、ＡＴＰ及び基質を添加することによりホスホリル化反応を開始させ、３０分後に反応を停止し、抗ホスホチロシン染色を実施することによりホスホｃ−Ｋｉｔを検出し、そして時間分解蛍光を使用することによりｃ−Ｋｉｔホスホリル化を定量した（ＨＴＳｃａｎｃ−Ｋｉｔキナーゼ試験、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。
【０１２４】
Ｏ．慢性関節リウマチ滑膜の免疫組織化学的検討。膝置換時に慢性ＲＡを有する患者から得た滑膜を固定し、パラフィン包埋し、そして切片をそれぞれｃ−Ｆｍｓ、ＰＤＧＦＲα、及びＰＤＧＦＲβ、又は相当するアイソタイプ対照抗体に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体で染色し、その後ＨＲＰ系の検出に付した（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）。
【０１２５】
Ｐ．肥満細胞、線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）、及びヒトＲＡ滑膜組織から誘導した滑膜マクロファージ集団のフローサイトメトリーによる同定。レムナントヒト膝滑膜を関節形成術時にＲＡ患者から入手し、そして単細胞懸濁液をＩＶ型コラゲナーゼによる酵素的消化により作成した。得られた細胞懸濁液を、造血細胞（ＣＤ４５）、ＦＬＳ（ＣＤ９０）、肥満細胞（ｃ−Ｋｉｔ）、及び滑膜マクロファージ（ＣＤ１４）の細胞表面マーカーに対して特異的な蛍光色素コンジュゲート抗体で染色し、アイソタイプマッチの対照及び抗ＭＨＣクラスＩ抗体で同時平行に染色した。表示したプロットはＭＨＣクラスＩ陽性細胞集団を示す。
【０１２６】
Ｑ．サイトカイン分析。サイトカイン分析はＢｅａｄｌｙｔｅ（登録商標）ヒト又はマウスマルチサイトカイン検出システム（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）及びＬｕｍｉｎｅｘ１００システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて実施した。
【０１２７】
Ｒ．統計学的分析。目視による関節炎評点、足底厚み及び組織学的評点をＧｒａｐｈＰａｄ  ＩｎＳｔａｔバージョン３．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いながらＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定により比較した。ＣＩＡにおける差をＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）用のＡｎａｌｙｓｅ−ｉｔプラグイン（Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔソフトウエア）を用いながらＦｉｓｈｅｒの検定により調べた。サイトカインレベルの比較は非対Ｔ検定を用いて実施した（ＧｒａｐｈＰａｄ）。マイクロアレイ有意性分析（ＳＡＭ；Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．Ｇ．等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：５１１６−５１２１（２００１））及びＣｌｕｓｔｅｒ  ａｎｄ  ＴｒｅｅＶｉｅｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｅｉｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１４８６３−１４８６８（１９９８））を用いてアレイデータを分析してディスプレイした。
【０１２８】
実施例１：イマチニブによるコラーゲン誘導関節炎の防止
コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける自己免疫性関節炎は以下の通り評価した；即ち、ＣＦＡ中に乳化したウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）をＤＢＡ／１マウスに注射し、その後不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中に乳化したＣＩＩで２１日後にブーストすることによりＣＩＡを誘導した。
【０１２９】
ＤＢＡ／１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にリン酸塩緩衝食塩水（ｎ＝１５）、３３ｍｇ／ｍｌイマチニブ（ｎ＝１５）、又は１００ｍｇ／ｍｌイマチニブ（ｎ＝１４）を経口で１日２回、ＣＩＡ誘導の前１日から、マウス及びヒトに置いえるイマチニブ代謝の公開された薬物動態プロファイルに基づいて投与した（Ｄｒｕｋｅｒ，２００１；Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ，２００１；Ｗｏｌｆｆ，Ｎ．Ｃ．等、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：３５２８−３５３４（２００４））。イマチニブはヒトよりもマウスにおいてより急速に代謝され、そして１００ｍｇ／ｋｇイマチニブのマウスへの１日２回経口投与はヒトにおける４００ｍｇ１日１回の中等範囲の用量と同様の薬物動態プロファイルを呈する。マウス及びヒトに関するこの投薬用法は、それぞれ４．６〜６μＭ及び１〜１．５μＭの平均のピーク及び定常状態の血漿中レベルをもたらす（Ｄｒｕｋｅｒ，２００１；Ｗｏｌｆｆ，２００４）。
【０１３０】
ＣＩＡ防止試験に関しては、イマチニブの経口投与はＣＩＡの誘導前１日に開始した。３３又は１００ｍｇ／ｋｇのイマチニブの何れかを投与したマウスは図１Ａに示す通り平均の目視による関節炎評点により評価した場合の低減した足底の浮腫、紅斑及び関節の剛性に基づいたＣＩＡの重症度における有意な低減、及び図１Ｂに示す通りカリパス計測に基づいた低減された平均の足底厚みを示していた（一次免疫化後の第３８日以降の３３及び１００ｍｇ／ｋｇの両方に関するＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙによりｐ＜０．０１）。
【０１３１】
実験終了時（第４９日）の関節炎発生率及びマウス平均体重も各群において計測し、そして結果を図１Ｃ及び１Ｄに示した。イマチニブは又図１Ｃにも示される通りＣＩＡの発生率を低減している。イマチニブの治療効果は用量依存性の傾向を示した（図１Ａ〜１Ｃ）。これらの結果は３つの独立した実験の代表例である。図１Ｄに示される通り、イマチニブを投与されているマウスにおいて顕著な毒性又は体重減少は観察されなかった。
【０１３２】
実施例２：イマチニブによるコラーゲン誘導関節炎の治療
コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける樹立された自己免疫性関節炎を治療するイマチニブの能力を以下の通り評価した。樹立された臨床的関節炎を有するＤＢＡ／１（平均の目視評点４、実施例１に記載したＣＩＡモデル）を無作為割り付けし、３３又は１００ｍｇ／ｋｇのイマチニブ又はＰＢＳを投与した。樹立された関節炎の進行は目視採点システム及びカリパス計測に基づく平均足底厚みの両方により評価した。図２Ａ〜２Ｂに示す結果はイマチニブの３３又は１００ｍｇ／ｋｇの用量レベルの両方とも目視採点システム及びカリパス計測に基づく平均足底厚みの両方により評価した場合に樹立された関節炎の進行を抑制していた（治療開始後１０日の後にｐ＜０．０５；値は平均±ＳＥＭ。ＰＢＳ投与マウスと比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【０１３３】
防止（実施例１）及び治療試験においてイマチニブ又はＰＢＳを投与されたＣＩＡを有するマウスから採取した後肢足底に対して組織病理学的分析を実施した。ＣＩＡ防止試験におけるイマチニブ及びＰＢＳ投与マウスに由来するＨ＆Ｅ染色関節組織切片の代表的な画像を図３Ａ〜３Ｃに示す。投与群に関して盲検とした検査者による組織病理学的評価によれば、図３Ｄ〜３Ｆに示す通りＣＩＡ防止試験（滑膜炎及び腐食の評点に関するＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙによればｐ＜０．０１、パンヌス評点に関してはｐ＜０．０５；ＰＢＳはｎ＝８、イマチニブ３３ｍｇ／ｋｇはｎ＝８、イマチニブ１００ｍｇ／ｋｇはｎ＝８）及び図３Ｇ〜３Ｉに示す通り樹立されたＣＩＡの治療に着目した試験（滑膜炎、パンヌス予備腐食の評点に関してはｐ＜０．０５；ＰＢＳはｎ＝８、イマチニブ３３ｍｇ／ｋｇはｎ＝８、イマチニブ１００ｍｇ／ｋｇはｎ＝８）の両方において、滑膜炎、パンヌス、及び腐食の評点における統計学的に有意な低減をイマチニブがもたらしていることが分かる。即ち、イマチニブは臨床的及び組織病理学的な分析に基づけば樹立されたＣＩＡの防止及び治療の両方において有効であった。
【０１３４】
実施例３：肥満細胞のサイトカイン生産及びシグナリングに対するイマチニブの作用
Ａ．炎症ＣＩＡ滑膜組織における肥満細胞の存在
ＣＩＡを有するマウスから誘導した間接に肥満細胞が存在するという以前の観察結果（Ｋａｋｉｚｏｅ，Ｅ．等、Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｒｅｓ  ４８：３１８−３２４（１９９９））を確認するために、ＣＩＡ関節の切片をトルイジンブルーで染色した。トルイジンブルーは肥満細胞下流の高度にスルフェート化された酸ムコ多糖類（ヘパリン）成分を染色する異染性の染料である。トルイジンブルー染色により図４Ａに示す通り炎症ＣＩＡ滑膜組織において顕著な数量の肥満細胞が判明した。緊密に炎症したＣＩＡ滑膜組織中に存在する肥満細胞は、図４Ａにおいて矢印で示す（Ｂ＝骨、ＪＳ＝関節空間。元倍率２００ｘ）。
【０１３５】
Ｂ．イマチニブによるプロ炎症性サイトカインの肥満細胞生産の抑制
クローニングされたマウス肥満細胞系統Ｃ１．ＭＣ／５７．１（Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｊ．等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：９１７５−９１７９（１９８７））の活性化に対するイマチニブの作用を以下の通り評価した。Ｃ１．ＭＣ／５７．１肥満細胞は成長因子非依存性の態様において増殖し、そして成長は幹細胞因子（ＳＣＦ）に依存していないが、Ｃ１．ＭＣ／５７．１肥満細胞はサイトカインを分泌することによりＳＣＦに応答する（Ｆｕｒｕｔａ，Ｇ．Ｔ．等、Ｂｌｏｏｄ  ９２：１０５５−１０６１（１９９８）；Ｔｓａｉ，Ｍ．等、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１０：Ａ１２５３（１９９６））。Ｃ１．ＭＣ／５７．１肥満細胞を０〜５μＭイマチニブの存在下４８時間１００ｎｇ／ｍＬＳＣＦで刺激し、そしてサイトカイン分析をビーズ系サイトカイン試験を用いて培養上澄みに対して実施した。図４Ｂ〜４Ｄに示される通りイマチニブは１μＭ及び５μＭにおいてＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−６の肥満細胞生産を未刺激細胞集団におけるものと同様のレベルにまで劇的に低減している。値は平均±ＳＥＭであり、イマチニブを用いない場合の刺激細胞と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【０１３６】
Ｃ．イマチニブを用いた幹細胞因子による肥満細胞シグナリングの抑制
イマチニブによりモジュレートされるチロシンキナーゼ活性化状態及びシグナルトランスダクション経路を特性化するために、免疫ブロット及び逆相蛋白（ＲＰＰ）溶解物アレイ（Ｃｈａｎ，Ｓ．Ｍ．等、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０：１３９０−１３９６（２００４））分析を実施した。肥満細胞に０〜５μＭイマチニブを予備投与し、１０分間ＳＣＦで刺激した。溶解物を免疫ブロッティング及びＲＰＰ溶解物アレイ用に作成した。図４Ｅ〜４Ｆからわかるとおり、免疫ブロッティングはイマチニブがｃ−ＫｉｔのＳＣＦ誘導ホスホリル化を強力に抑制したことを示しており（図４Ｅ）、下流のＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）のホスホリル化の相当する低減を伴っていた（図４Ｆ）。
【０１３７】
ＲＰＰアレイを作成するためにニトロセルロースコーティング顕微鏡スライド上に細胞溶解物を印刷し、その後ホスホ特異的抗体と共にインキュベートし、そして抗体結合の蛍光系検出を行うことによりＭＡＰＫファミリー及び他の経路における蛋白チロシンキナーゼの活性化を確認した。図４Ｇに示す通り、ＲＰＰアレイ分析は１及び５μＭイマチニブがＥＲＫ、ＪＮＫ及びｐ３８を包含するＭＡＰＫ経路のメンバーを包含するｃ−Ｋｉｔの下流の多様な蛋白チロシンキナーゼのＳＣＦ誘導活性化を抑制したことを明らかにした。イマチニブは又シグナリング分子Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３及びＴｈｒ３０８）、ｐ７０Ｓ６Ｋ、及びＲａｆのホスホリル化も防止している（図４Ｇ）。ｃ−Ｋｉｔ及びＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）のホスホリル化のイマチニブ媒介抑制は免疫ブロッティング分析においても観察され（図４Ｅ）、これはＲＰＰアレイの結果を確認するものであった。総括すれば、免疫ブロッティング及びＲＰＰアレイのデータはイマチニブがＭＡＰＫ及び肥満細胞活性化及びプロ炎症性サイトカイン生産を媒介する他の経路のＳＣＦ誘導活性化を強力に抑制することを明らかにしている。
【０１３８】
肥満細胞は生得及び適応免疫の両方に影響し（Ｇａｌｌｉ，Ｓ．Ｊ．等、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：１３５−１４２，２００５）、リウマチ様滑膜組織に存在し、そしてＲＡの病因において重要な役割を果たすと考えられる（Ｗｏｏｌｌｅｙ，Ｄ．Ｅ．，２００３，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：１７０９−１７１１；Ｗｏｏｌｌｅｙ，Ｄ．Ｅ．等、２０００，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  ２：６５−７４；Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．等、Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：８７５−８７８；Ｌｅｅ，Ｄ．Ｍ．等、２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９７：１６８９−１６９２）。肥満細胞は慢性関節リウマチにおいて過形成滑膜管壁（パンヌス組織として知られている）における全細胞の約５％を構成し、そして肥満細胞は又、乾癬皮膚患部、多発性硬化症脳プラーク、及びクローン病炎症腸組織にも存在する。肥満細胞顆粒は大量のＴＮＦα、ＩＬ−６、ブラジキニン、及び種々のプロテアーゼ及び他の炎症性及び血管透過性メディエーターを含有する（Ｊｕｕｒｉｋｉｖｉ，Ａ．等、２００５，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６４：１１２６−１１３１）。ｃ−Ｋｉｔは幹細胞因子（ＳＣＦ）がリガンドとなる受容体チロシンキナーゼである。ＳＣＦ結合は間瀬におけるｃ−Ｋｉｔのホスホリル化及びＭＡＰＫ経路の下流の活性化を誘導し、ＴＮＦα、ＩＬ−６、及び多くの他の炎症メディエーターの放出及び生産をもたらす。更に又、肥満細胞不全マウスはＲＡのモデルにおいて重症度が低下した関節炎及び多発性硬化症のモデルにおいて重症度が低下した脱髄を示す。これらのデータを総括すれば、ＴＮＦα、ＩＬ−６、及び血管透過性及び炎症を増進する他のメディエーターの肥満細胞の生産及び放出は慢性関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、乾癬及び種々の他の炎症性及び自己免疫性の状態の病因に寄与していることが示唆される。即ち、肥満細胞の活性化及びプロ炎症性メディエーターの放出のイマチニブ又はｃ−Ｋｉｔを抑制する他のチロシンキナーゼ阻害剤による抑制はＲＡ及び他の炎症性疾患において利益を与える。
【０１３９】
実施例４：単球系統の細胞の分化及び機能に対するイマチニブの作用
受容体チロシンキナーゼＦｍｓを介した結合およびシグナリングを示すＭ−ＣＳＦはＲＡ滑膜組織中に存在し、そしてＣＩＡを悪化させることが分かっている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｋ．等、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ６８：１４４−１５０（２０００））。イマチニブがマクロファージにおけるＭ−ＣＳＦ媒介シグナルトランスダクションに影響するかどうかを調べるために、免疫ブロッティング及びＲＰＰアレイを適用することによりレジデント腹膜マクロファージから作成した溶解物を特性化した。レジデント腹膜マクロファージはＤＢＡ／１マウスから単離し、イマチニブを予備投与し、そして１００ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦで１０分間刺激し、そして分析用に溶解物を作成した。免疫ブロットによれば１及び５μＭのイマチニブはｃ−ＦｍｓのＭ−ＣＳＦ誘導ホスホリル化を抑制したが、総ｃ−Ｆｍｓのレベルは図５Ａに示す通り全ての試料において同様であった。下流のシグナリング分子Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）もまた図５Ｂに示す通りイマチニブ予備投与マクロファージにおいて低減されたホスホリル化を示した。
【０１４０】
Ｍ−ＣＳＦ刺激マクロファージ溶解物のＲＰＰアレイ分析は、図５Ｃに示す通り、イマチニブがＭＡＰＫファミリー及びＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３及びＴｈｒ３０８）、ＥＲＫ、ＳＴＡＴ３、ＪＮＫ、Ｐ７９Ｓ６Ｋ及びｐ３８を包含するｃ−Ｆｍｓの下流の他の経路における蛋白チロシンキナーゼのホスホリル化をブロックしたことを示している。即ち、免疫ブロット及びＲＰＰアレイデータはイマチニブがｃ−Ｆｍｓを介したＭ−ＣＳＦ誘導マクロファージ活性化を強力に抑制することを示している。
【０１４１】
図５Ｄに示す通りプラスチックに付着したＲＡ雄郎滑液単核細胞は７２時間単独で培地中で培養した場合には単球の形態を呈した。７２時間Ｍ−ＣＳＦで刺激した後、これらの細胞はマクロファージに分化し、図５Ｅに示す通り、多極性の突起の伸長、不均質な細胞質の空胞及び封入体を包含する古典的なマクロファージの形態学的特徴を有していた。５μＭイマチニブ及びＭ−ＣＳＦと共に同時インキュベートした細胞は、図５Ｆに示す通り、未刺激の細胞と同様の形態を示した。即ち、イマチニブはマクロファージへのヒトＲＡ患者由来の滑液単球の分化をブロックした。
【０１４２】
実施例５：Ｂ細胞応答に対するイマチニブの作用
Ａ．イマチニブはＢ細胞増殖及び免疫グロブリン生産を抑制する。
【０１４３】
ＤＢＡ／１マウス由来のＢ細胞を全脾細胞から単離し、その純度を図６Ａに示すフローサイトメトリーにより確認した。単離後のＢ細胞を１〜１０μＭイマチニブの存在下又は非存在下において抗ＩｇＭ（５０μｇ／ｍｌ）又はＬＰＳ（５μｇ／ｍｌ）で７２時間刺激した。抗ＩｇＭによるＢ細胞増殖は図５Ｂに示す通り５μＭ（ｐ＜０．００１）もの低値のイマチニブ濃度により抑制された。ＬＰＳ刺激Ｂ細胞は図５Ｃに示す通り用量依存的な態様において低減された増殖を示した（１μＭ以上の濃度でｐ＜０．００１）。更に又、図５Ｄに示す通り、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞によるＩｇＭ生産は１μＭの濃度のイマチニブにより軽度に低減され、そして１０μＭにおいて最も顕著な低減を示した。
【０１４４】
Ｂ．イマチニブは自己反応性Ｂ細胞応答のエピトープ拡張を低減する。
【０１４５】
ＰＢＳ（ｎ＝７）又は１００ｍｇ／ｋｇのイマチニブ（ｎ＝７）を投与したＣＩＡを有するマウスから誘導した血清自己抗体の滑膜アレイプロファイリングを実施した（第４９日）。ロボット式のマイクロアレイを用いてＲＡ及びＣＩＡにおける候補自己抗原を提示する蛋白及びペプチドのスペクトルを含有する滑膜アレイを作成した（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｗ．Ｈ．等、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８：２９５−３０１（２００２）；Ｈｕｅｂｅｒ，Ｗ．等、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５２：２６４５−２６５５（２００５））。アレイを１：１５０希釈血清と共にインキュベートし、自己抗体の結合をＣｙ３−標識抗マウスＩｇＧ／Ｍを用いて検出し、そしてアレイをスキャンして各抗原につきメジアンの蛍光を測定した。滑膜アレイ分析によれば、図６Ｅに示す通り、イマチニブのＣＩＡマウスへのインビボの投与は糖蛋白３９（ｇｐ３９）、クラステリン、ヒストン２Ｂ（Ｈ２Ｂ）、ｈｎＲＮＰＢ１及びビメンチンを提示するネイティブのエピトープに対する、並びに、フィラギン（ｃｙｓ−フィラギン、ｃｆｃ８及びＣＣＰｃｙｃＡｌａ−１２）及びクラステリンから誘導したシトルリン化エピトープに対する自己反応性Ｂ細胞応答の拡大を低減したことを明らかにしている。図６Ｅにおいて、マイクロアレイの有意性の分析（ＳＡＭ）を適用することによりイマチニブ投与マウスと比較してＰＢＳ中において統計学的に増大した反応性を有する抗原の特徴を発見した（疑似発見率（ＦＤＲ）＝０．０６）。クラスター及びツリービューソフトウエアを順次適用し、そしてヒートマップとしてアレイの反応性を標示した。ビヒクル（リン酸塩緩衝食塩水、ＰＢＳ）投与対照マウス由来の試料はヒートマップの左側にクラスタリングし、そして多数の滑膜蛋白に対する高い抗体反応性を呈したのに対し、イマチニブ投与マウスは右側にクラスタリングし、そして低減された自己抗体力価を呈した。
【０１４６】
実施例６：Ｔ細胞応答に対するイマチニブの作用
ＣＩＩペプチド２５７−７２に対して特異的なトランスジェニックＴＣＲを発現するＴ細胞に対するイマチニブの影響を検討した（Ｏｓｍａｎ，Ｇ．Ｅ．等、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：１６１３−１６２２（１９９８））。ＣＩＩ特異的ＴＣＲをコードするトランスジーンを発現するマウスから誘導した脾細胞を０〜１０μＭイマチニブ存在下に０〜４０μｇ／ｍＬの熱変性全ＣＩＩで刺激した。３Ｈ−チミジン取り込みを用いてＣＩＩ特異的Ｔ細胞の増殖を測定した。１μＭ又は３．３μＭのイマチニブの存在下に刺激した場合、ＣＩＩ特異的Ｔ細胞は頑健に増殖して熱変性全ＣＩＩとなったが、１０μＭイマチニブ（中程度の範囲のヒト用量により達成される１〜４．６μＭの血中レベルを超過）（Ｄｒｕｋｅｒ，２００１：Ｄｅｍｅｔｒｉ  ２００２）は図７Ａに示す通り増殖を強力に抑制した。
【０１４７】
ＣＩＩ刺激（２０μｇ／ｍＬ）ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞によるプロ炎症性のＩＦＮ−γ及びＴＮＦαの生産の中等度の低減が３．３μＭイマチニブにおいて観察されたが、治療水準超過の１０μＭイマチニブは図７Ｂ〜７Ｄに示す通り免疫調節サイトカインＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４及びＴＮＦαの生産を更に低減した。ＣＩＩに応答したＩＬ−２の抗ＣＩＩＴ細胞生産は試験したイマチニブ濃度の何れにおいても有意に低減されなかった（図７Ｅ）。値は平均±ＳＥＭである。イマチニブを用いない場合の刺激細胞と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。これらの実験においてＴ細胞は生存性であるように観察され、そして１０μＭのイマチニブはインキュベーション５時間（表３）又は２４時間（表４）の後のフローサイトメトリーによれば早期又は後期のアポトーシスマーカーであるＡｎｎｅｘｉｎＶ又はヨウ化プロピジウムをアップレギュレートしなかった。表３はＣＩＩで刺激し、そして次に汎用のＴ細胞マーカーＣＤ３、ヨウ化プロピジウム、及びＡｎｎｅｘｉｎＶに対するｍＡｂで５時間後に染色することによりフローサイトメトリーを用いながら早期のアポトーシス（ＰＩ−ＡｎｎｅｘｉｎＶ−）並びに後期のアポトーシス又は細胞死（ＰＩ＋ＡｎｎｅｘｉｎＶ−）を測定した抗ＣＩＩＴＣＲトランスジェニックマウス由来の脾細胞の分析の結果を示している。表４は抗ＣＤ４抗体、ヨウ化プロピジウム、及びＡｎｎｅｘｉｎＶで２４時間後に染色し、その後フローサイトメトリーを実施したＣＩＩ刺激脾細胞を示す。表３及び４に示したデータは、イマチニブ投与がＡｎｎｅｘｉｎＶ（早期アポトーシス細胞のみ染色）又はヨウ化プロピジウム（死滅細胞を染色）によるこれらのＴ細胞の染色を有意に改変しないことをフローサイトメトリーに基づいて示しており、イマチニブがこれらの細胞におけるアポトーシス又は死滅を誘導しないことを明らかにしている。総括すればこれらのデータはイマチニブがＬｃｋの抑制を介してＴ細胞応答を抑制することを示唆している。
【０１４８】
【表３】
2010500283.tif 000004
【０１４９】
【表４】
2010500283.tif 000005
実施例７：ＲＡ体外移植組織におけるサイトカイン生産及び線維芽細胞ＰＤＧＦＲに対するイマチニブの作用
単核細胞をＲＡ患者から誘導した滑液から単離した。Ｍ−ＣＳＦは単核細胞成熟は誘導するがＴＮＦα生産は誘導しないため（Ｐｉｘｌｅｙ，Ｆ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ，  Ｅ．Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：６２８−６３８（２００４））、ＬＰＳを用いて滑液単核細胞を刺激することによりＲＡにおける原型のプロ炎症性サイトカインであるＴＮＦα（Ｗｏｌｆ，Ａ．Ｍ．等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：１３６２２−１３６２７（２００５）；Ｄｅｗａｒ，Ａ．Ｌ．等、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８３：４８−５６（２００５））を生成した。滑液単核細胞を単離し、０〜８μＭイマチニブの存在下４８時間１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳでインビトロで刺激した。単核細胞の上澄みを採取し、ビーズ系のサイトカイン試験を用いてＴＮＦα、ＩＬ−１２（ｐ４０）及びＩＬ−１αを定量した。図８Ａ〜８Ｃに示す通り、培養上澄みのビーズ系のサイトカイン分析はＴＮＦα（図８Ａ）、及び、程度はより低くなるがＩＬ−１２（図８Ｂ）を包含するプロ炎症性サイトカインの生産の低減を示していた。イマチニブはＩＬ−１αのＬＰＳ誘導生産を抑制せず、イマチニブが滑液単核細胞の生存性に影響しなかったことを示していた（図８Ｃ））。（値は平均±ＳＥＭである。イマチニブを用いない場合の刺激細胞と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【０１５０】
線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）を膝関節形成術においてヒトＲＡ患者から誘導したパンヌスから単離した。培養したＦＬＳを０〜５μＭイマチニブと共に予備インキュベートし、その後１０分間２５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢで刺激した。溶解物を形成し、ｐ−ＰＤＧＦＲβ及び全ＰＤＧＦＲβに対する、そして、ｐ−Ａｋｔ及び全Ａｋｔに対しする免疫ブロッティングによりプローブした。図８Ｄ及び８Ｅに示す通り、イマチニブは０．５及び５μＭでＰＤＧＦＲβのホスホリル化、並びに下流のシグナリング分子Ａｋｔを強力に抑制した。
【０１５１】
ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞を０〜８μＭ井町の存在下にＮＩＨ−３Ｔ３細胞（Ｏｓｍａｎ，１９９８）の増殖を誘導することが以前に示されている刺激物質であるＰＤＧＦ−ＢＢ２０ｎｇ／ｍＬで刺激し、そして増殖を３Ｈ−チミジン取り込みにより測定した。増殖は３Ｈ−チミジン取り込みにより測定した。図９Ａに示す通り、０．２５μＭもの低値のイマチニブ濃度でヒトＲＡ患者から誘導した線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）のＰＤＧＦ−ＢＢ誘導増殖が抑制された（ｐ＜０．０１）。値は平均±ＳＥＭである。イマチニブを用いない場合の刺激細胞と比較して＊＊Ｐ＜０．０１。これらの結果は４人の異なる慢性関節リウマチ患者から誘導されたＦＬＳから得られた結果の代表例である。図９Ｂに示すデータは抗ＣＤ６８抗体を用いたフローサイトメトリー分析により夾雑マクロファージの非存在確認している（腹膜細胞＝ＣＤ６８が系統マーカーである腹膜マクロファージ）。
【０１５２】
更に又、ＲＡにおいて、滑膜線維芽細胞は血小板誘導成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ、ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβを総称するもの）を発現し、そして種々の血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）リガンドに応答して増殖する。ＰＤＧＦＲ及びそのリガンドは共に慢性関節リウマチ滑膜組織において過剰発現され、そしてＰＤＧＦは滑膜線維芽細胞増殖の強力な刺激物質である（Ｃｈｅｏｎ，Ｈ．等、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ６０：４５５−４６２（２００４）；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９４：１１２１−１１２９（２００２）；Ｒｅｍｍｅｒｓ，Ｅ．Ｆ．等、Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １８：７−１３（１９９１））。更に又、マクロファージは慢性関節リウマチにおけるＴＮＦαのようなプロ炎症性サイトカインの生産において中枢的役割を果たしていると考えられている。
【０１５３】
ＴＧＦ−βは重要な前線維性の経路である（Ｄｉｓｔｌｅｒ，Ｊ．等、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５６：３１１−３３３（２００７））。線維芽細胞におけるＴＧＦ−β刺激はｃ−Ａｂｌを介してシグナルされ（Ｗａｎｇ，Ｓ．等、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １９：１−１１（２００５））、そして図９Ｃはｃ−Ａｂｌのイマチニブ抑制は線維芽細胞増殖を強力にブロックすることを示している。即ち、イマチニブ及びｃ−Ａｂｌを抑制する他のチロシンキナーゼ阻害剤はＲＡにおける滑膜線維芽細胞（線維芽細胞様滑膜細胞、ＦＬＳとしても知られている）の増殖も抑制すると考えられる。イマチニブ又は他のチロシンキナーゼ阻害剤によるＰＤＧＦＲとＡｂｌの両方の同時抑制は相乗作用して滑膜線維芽細胞の増殖又は自己免疫疾患における他の異常な細胞応答を抑制すると考えられる。
【０１５４】
線維症様の応答を包含することができる調節不全の応答が多くの自己免疫性及び炎症性の疾患の病因において生じ、それに寄与しているというかなりの証拠が存在している。多発性硬化症においては、損傷を受けた白質の区域において反応性の神経膠症（瘢痕形成）が存在する。サイトカインＩＬ−６は神経膠症において重要な役割を果たしている（Ｗｏｉｃｉｅｃｈｏｗｓｋｙ，Ｃ．等（２００４）Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｍｏｎｉｔ．１０：ＢＲ３２５−３０）。更に又、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）及びＰＤＧＦＲは星状細胞において発現され、そして星状細胞の分化及び増殖を媒介することにより自己免疫性脱髄における神経膠症及び瘢痕形成を誘発する（Ｃａｓｓｉｎａ，Ｐ．等（２００５）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９３：３８−４６；Ｔａｋａｍｉｙａ，Ｙ．等（１９８６）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．３８３：３０５−９；Ｙａｍａｄａ，Ｈ．等（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５６：４７７−８７）。全身エリテマトーデスにおいては、糸球体腎炎及び腎臓の損傷は重度の疾患における糸球体硬化症を特徴とする（Ｋｒａｆｔ，Ｓ．Ｗ．等（２００５）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１６：１７５−１７９）。自己免疫性の肝炎及び原発性胆汁性肝硬変は肝臓実質及び胆管樹枝の線維症をそれぞれ特徴とする（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｋ．（２００７）Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ．２０  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ１５−３０）。特発性肺線維症は肺の線維性疾患であり、そしてＴＧＦ−β媒介線維症がこの疾患の病理における中枢的役割を果たす（Ａｓｋ，Ｋ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｏｃ．３：３８９−９３）。クローン病は腸壁及び腸間膜の線維症を特徴とし、そして線維症によりこの疾患の特徴である腸の狭窄が起こる（Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ，Ｄ．（２００７）Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．７５：２２−４）。
【０１５５】
即ち、イマチニブ及びＰＤＧＦＲ又はＡｂｌを抑制する他のチロシンキナーゼ阻害剤は滑膜線維芽細胞の増殖及びＲＡ、全身性硬化症、クローン病、多発性硬化症、自己免疫性肝炎及びそのような応答が病因に寄与している他の炎症性疾患の病因に寄与する他の線維芽細胞様細胞の増殖を抑制できると考えられる。
【０１５６】
実施例８：多発性硬化症に対するイマチニブの作用
多発性硬化症（ＭＳ）のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を防止して治療するイマチニブメシレート（イマチニブ）の能力を調べるために試験を実施した。ＥＡＥは２ｍｇ／ｍｌの熱殺菌された結核菌Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化した１００μｇ／マウスのミエリン稀突起神経膠細胞糖蛋白（ＭＯＧ）ペプチド３５〜５５を用いた皮下免疫化によりＣ５７Ｂ／６マウスにおいて誘導した。誘導プロトコルの一部分として、マウスには、４μｇ／ｍＬ百日咳菌毒素０．１ｍｌを免疫化の当日及び４８時間後に静脈内注射した。ＥＡＥの重症度は標準的な採点システム、即ち：１、尾部の脆弱性又は麻痺；２、後足の脆弱性；３、後肢の麻痺；４、前肢の脆弱性又は麻痺；及び５、瀕死状態の動物又は死亡、に基づいて毎日測定した。１日２回１００ｍｇ／ｋｇのイマチニブを投与されたマウスは、図１０に示す通りＰＢＳビヒクル対照マウスと比較してＥＡＥの発症の遅延及び低減された重症度を示した（値は平均±ＳＥＭ）。これらのデータはイマチニブが多発性硬化症のげっ歯類モデルを治療する場合も有効であることを示している。
【０１５７】
実施例９：慢性関節リウマチを治療するためのＦｍｓ及びＰＤＧＦＲ阻害剤ＧＷ２５８０
上記した通り、イマチニブはＣＩＡの発症及び重症度を有意に防止する。イマチニブが薬効を示すと考えられる１つの可能な機序は単球系統の細胞上のｃ−Ｆｍｓを抑制することによるものである。ＧＷ２５８０はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カタログ＃３４４０３６）から購入した。ＧＷ２５８０はｃ−Ｆｍｓに対して高度な力価を有し、そしてインビトロのＦＬＳ増殖試験によればＧＷ２５８０は標準的なマウスの投薬用法により達成されるレベルにおいてＰＤＧＦＲも抑制することが示されている（ＩＣ５０４．３ｍＭ；図１１Ｂ）（Ｃｏｎｗａｙ，Ｊ．等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：１６０７８−１６０８３（２００５））。インビトロのｃ−Ｋｉｔホスホリル化試験では、ＧＷ２５８０は標準的なマウスの投薬用法により達成される濃度においてｃ−Ｋｉｔは抑制しなかったことが示されている（ＩＣ５０７３．５μＭ）（Ｃｏｎｗａｙ，Ｊ．等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：１６０７８−１６０８３（２００５））。図１２Ａ及び１２Ｂに示す通り、ｃ−Ｆｍｓ特異的小細胞チロシンキナーゼ阻害剤ＧＷ２５８０は平均関節炎評点（Ａ）及び足底厚み（Ｂ）の両方により評価した場合、ＲＡのげっ歯類モデルであるマウスにおける樹立されたコラーゲン誘導関節炎の治療において高度に有効であった。Ｆｍｓはマクロファージ及び破骨細胞への未成熟単球の分化において、並びに、ＴＮＦα及び他のサイトカインを生産するマクロファージのプライミング及び破骨細胞の活性化において中枢的役割を果たしている（Ｃ）。単球分化試験を実施することによりＧＷ２５８０及びイマチニブがマクロファージへの単球の分化を抑制する能力を更に評価した。ヒト末梢血単球をＣＳＦ−１で刺激することによりマクロファージへの分化を誘導し、そして細胞を種々の濃度のイマチニブ又はＧＷ２５８０と共に同時インキュベートした。イマチニブ及びＧＷ２５８０の両方ともマクロファージへのヒト血液中単球のＭ−ＣＳＦ誘導分化をブロックした（図１２Ｄ）。マクロファージは細胞質の封入体、多極性の突起の伸長、及び不均質な細胞質の空胞を包含する形態学的特徴に基づいて計数した（％マクロファージはマクロファージに特徴的な形態学的特徴を有する総細胞の％を示す）。ＩＣ５０データをＦｍｓの抑制に関してイマチニブ（０．９７μＭ）及びＧＷ２５８０（０．０１μＭ）について求めたところ、ＧＷ２５８０はイマチニブより約１００倍強力にマクロファージへの単球のＭ−ＣＳＦ誘導分化を抑制していた（図１２Ｅ）。即ち、Ｆｍｓに対して高度な力価を有し、そしてＰＤＧＦＲも抑制するＧＷ２５８０チロシンキナーゼ阻害剤は樹立されたコラーゲン誘導関節炎を治療する場合に高度に有効であった。
【０１５８】
Ｆｍｓ及びＰＤＧＦＲ阻害剤が自己免疫性の関節炎を治療する能力は予測さなかったものであり、そしてＲＡに伏在する病因機序に関する新しい知見を与えるものである。ｃ−Ｆｍｓ（コロニー刺激因子−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ））は単球系統の細胞上で発現され、そしてマクロファージ及び破骨細胞への単球の分化を媒介する。Ｆｍｓは又マクロファージをプライミングして活性化することにより他の炎症性サイトカインであるＴＮＦαを生産し、そして他のマクロファージ機能を実施する。マクロファージは専従的な抗原提示細胞であり、そして活性化されればＴＮＦαを分泌するエフェクター細胞でもある。ＴＮＦαはヒト慢性関節リウマチ（ＲＡ）における滑膜炎及び関節の破壊、乾癬、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患、例えばクローン病、強直性脊椎炎、及び他の自己免疫疾患において中枢的役割を果たしている。マクロファージはこれらの自己免疫疾患におけるＴＮＦα生産の主要な原料と考えら得ている。更に又、ＴＮＦαを抑制する３種の生物学的薬剤が合衆国食品医薬品局によりＲＡ、クローン病及び乾癬の治療に関して認可されており、そして乾癬性関節炎および強直性脊椎炎の治療において薬効を示している。破骨細胞はＲＡにおける骨の腐食及び破壊をもたらす骨の崩壊において、そして他の炎症性の関節炎、例えば乾癬性関節炎および強直性脊椎炎において中枢的役割を果たしている。
【０１５９】
Ｆｍｓは破骨細胞の活性化において中枢的役割を果たすことにより、これらの炎症性関節炎における骨の腐食及び破壊を媒介する。破骨細胞は慢性関節リウマチにおける骨の腐食及び破壊において主要な役割を果たしている。破骨細胞は主要機能が骨再吸収である骨髄様経路の多核細胞である。慢性関節リウマチ及びコラーゲン誘導関節炎において、破骨細胞は骨内部及び骨に隣接する部位における滑膜組織内部の両方に観察されている（Ｓｃｈｅｔｔ，Ｇ．（２００７）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ９：２０３）。破骨細胞は酵素及びプロトンポンプを利用することにより、それぞれ骨マトリックスを破壊お呼びＣａ＋＋を吸収する（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ等（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１５０４−１５０８）。ｃ−ＦｍｓおよびＲＡＮＫＬを介した骨髄様前駆体の刺激は破骨細胞への骨髄様前駆体の分化を誘導する（Ｔｈｅｉｌｌ等（２００２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：７９５−８２３）。ＲＡ滑膜は破骨細胞形成を刺激するシグナル（ＣＳＦ−１、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ−１７）を与える細胞と組み合わせられた単球及び他の骨髄様破骨細胞前駆体の存在に基づいて破骨細胞を蓄積させると考えられている（Ｓｃｈｅｔｔ，Ｇ．（２００７）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．９：２０３）。ｃ−Ｆｍｓの抑制はマクロファージ及び破骨細胞への骨髄様前駆体の分化を抑制することにより、並びに、マクロファージ及び破骨細胞のプライミング及び活性化を抑制することにより、自己免疫性の関節炎および他の自己免疫疾患を緩解すると考えられる。
【０１６０】
マウスの投薬用法により達成される濃度においてＰＤＧＦＲも抑制する高度な力価を有するＦｍｓ阻害剤であるＧＷ２５８０で観察された利益は、（ｉ）マクロファージ及び骨腐食性破骨細胞を生産するＴＮＦαへの骨髄様系統の分化、及び（ｉｉ）滑膜線維芽細胞増殖による侵襲性のパンヌス組織の形成の調和した抑制に起因していると考えられる。これらのデータは、Ｆｍｓ及び／又はＰＤＧＦＲを抑制するチロシンキナーゼ阻害剤はヒトＲＡにおいて薬効を与えることができることを示唆している。
【０１６１】
実施例１０：ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ及びｃ−Ｋｉｔ阻害剤ＣＧＰ５３７１６は自己免疫性関節炎を抑制する。
【０１６２】
インビトロのｃ−Ｋｉｔホスホリル化試験（図１１Ａ）及びＦＬＳ増殖試験（図１１Ｂ）は小分子チロシンキナーゼ阻害剤ＣＧＰ５３７１６がインビトロキナーゼ試験におけるｃ−Ｋｉｔの活性及びＰＤＧＦｂｂ誘導ＦＬＳ増殖の両方を強力に抑制することを明らかにしている。ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ及びｃ−Ｋｉｔの特異的阻害剤はＣＩＡの発症の防止及び重症度の低減において高度に有効であった（図１３Ａ〜１３Ｂ）。ＰＤＧＦＲに加えて、ＦＧＦＲは滑膜線維芽細胞の増殖を媒介することが明らかにされている（Ｍａｌｅｍｕｄ，Ｃ．Ｊ．（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．３７５：（１−２）：１０−９）。ＣＧＰ５３７１６でＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ及びｃ−ＫｉｔをブロックすることはＣＩＡの防止及び治療においてイマチニブとほぼ同様に有効であった（図１３Ｃ〜１３Ｄ。
【０１６３】
実施例１１：ヒト慢性関節リウマチ滑膜におけるＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ及びｃ−Ｆｍｓの発現
免疫組織化学的検討を行うことによりＲＡ滑膜（パンヌス）におけるＦｍｓ及びＰＤＧＦＲの発現を特性化した。高レベルのｃ−Ｆｍｓ蛋白がリウマチ様滑膜の表面に（図１４Ａ〜１４Ｂ）、そして伏在する滑膜組織にはより低いレベルで存在していた。ＰＤＧＦＲαは滑膜組織中より深部において優先的に発現される（図１４Ｃおよび１４Ｄ）のに対し、ＰＤＧＦＲβは滑膜管壁の近傍の細胞のサブセットにより集中的に発現されていた（図１４Ｅ及び１４Ｆ）。これらの結果は更にＲＡの病因におけるこれらのチロシンキナーゼの関与を示唆している。
【０１６４】
実施例１２：ヒト慢性関節リウマチ滑膜組織におけるマクロファージ、線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）、及び滑膜マクロファージの集団
図１５はＲＡ滑膜組織から直接単離した新鮮未培養細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。個々の染色は抗ＣＤ４５による染色に基づいた造血細胞、抗ＣＤ９０による染色によるＦＬＳ。抗ｃ−Ｋｉｔによる染色による肥満細胞、及び抗ＣＤ１４による染色による滑膜マクロファージの検出を示している。フローサイトメトリー分析はヒトＲＡ滑膜組織における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）、肥満細胞、及び滑膜マクロファージの異なる増殖を示している。これらの結果はＲＡの病因におけるこれらの細胞片の関与を更に示唆している。
【０１６５】
実施例１３：げっ歯類モデルにおける低用量のアトロバスタチン、ロシグリタゾン又はエノキサパリンと組み合わせた低用量イマチニブ
図１６Ａはイマチニブの異なる濃度のＣＩＡ薬効滴定曲線を示す。１５ｍｇ／ｋｇのイマチニブはＰＢＳビヒクル対照と比較して相対的に小さい薬効を示したことが観察された。慢性関節リウマチ患者は心臓血管疾患を発症する危険性が上昇しており、そしてアトロバスタチンのようなスタチン剤の投与の適応症となる場合が多い。１．２５〜２０ｍｇ／ｋｇにおけるアトロバスタチン単独ではＣＩＡの臨床評点を低下させるには有効ではなかった（図１６Ｂ）。しかしながら、ＣＩＡマウスに１５ｍｇ／ｋｇイマチニブ及び５ｍｇ／ｋｇアトロバスタチンの組み合わせを投与した場合、これらのマウスはビヒクル単独よりも有意に低い重症度の疾患を発症した（図１６Ｃ）。
【０１６６】
更に又、低用量のロシグリタゾン又は低用量のエノキサパリンと組み合わせた１５ｍｇ／ｋｇの低用量イマチニブは図１６Ｄ及び１６Ｅに示す通りＣＩＡの発症及び重症度の防止において有効であった。これらの結果はイマチニブ及び他のチロシンキナーゼ阻害剤と非チロシンキナーゼ阻害剤治療薬の複合療法が増大した利益をもたらすことを示唆している。既存及び新規の非チロシンキナーゼ治療薬の例は、本実施例において試験した治療薬；小分子抗増殖治療薬（メトトレキセート、ミコフェノレートモフェチル、イムラン）；抗サイトカイン治療薬（抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−１）；免疫細胞流出入の阻害剤（抗ＶＬＡ４（Ｔｙｓａｂｒｉ））；及び抗Ｂ細胞治療薬（リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、抗ＣＤ１９）；抗原特異的トレライジング治療薬を包含する。
【０１６７】
実施例１４：ｃ−Ｋｉｔ突然変異体マウスは野生型マウスよりも低い重症度の抗体転移関節炎を発症する。
【０１６８】
Ｗｓｈマウスを遺伝子的に変更することによりｃ−Ｋｉｔシグナリングに干渉する突然変異を有するようにすると、これらのマウスは肥満細胞不全となる。図１７Ａ〜１７Ｂに示す通り、ｃ−Ｋｉｔ突然変異体マウスは正常なｃ−Ｋｉｔ機能を有する野生型対照マウスと比較して、コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおいて関節炎を発症することに対して部分的に抵抗性であった。これらの観察結果は、ＲＡ及び他の自己免疫疾患における治療方策としてのｃ−Ｋｉｔの抑制を更に裏付けるものであるが、Ｋｉｔ単独の抑制では自己免疫性関節炎又は他の自己免疫疾患の治療には不十分であることを示唆している。
【０１６９】
実施例１５：全身性硬化症の治療のためのイマチニブ
ＳＳｃ病歴３年の２４歳女性が急速に進行する皮膚硬化症、多数の手指潰瘍（図１８Ａ）及び半ブロックのみ歩行可能の段階まで増大した息切れを伴って来院した。肺機能試験によれば予測値４８％までのＦＶＣの進行性の減少が示され、予測値６２％の安定な拡散容量を伴っていた。胸部ＨＲＣＴスキャンによれば増大した両側基底部のすりガラス不透明性を示していた（図１８Ｃ）。経胸壁超音波心臓検査図（ＴＴＥ）によれば正常な左右心室機能、右心室収縮期血圧（ＲＶＳＰ）２１、及び僅かな心内膜液浸出が示されていた。患者は自身のＩＬＤのためにシクロホスファミド療法を辞退しており、そして別の治療選択肢を求めて当院に来ていた。
【０１７０】
患者はイマチニブメシレートの治験に合意した。書面によるインフォームドコンセントを得ることにより写真及びアンケート並びに分子分析用の皮膚及び血液試料の形態で臨床情報を収集した。この試験は地域の研究所の評議委員会による認可を受けている。治療を開始する前において、患者の改良Ｒｏｄｎａｎ皮膚厚み評点（ｍＲＳＳ）は３６（スケール０〜５１）であった。患者の口腔開口部は１．０ｃｍであり、手の拡張幅は左１３．０ｃｍ、右１０．２ｃｍであった。９か所の手指潰瘍、及び肘と左第４指に拘縮を有していた。全ての血球数、包括的な代謝パネル、クレアチンキナーゼ、及び尿検査は正常範囲内であった。Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）レベルは２．８ｍｇ／ｄＬ（正常＜０．５ｍｇ／ｄＬ）であった。皮膚生検によれば平均皮膚厚み２．８１ｍｍを有する肥厚化した緻密に充填されたコラーゲン束が明らかになった（図１８Ｅ）。
【０１７１】
１日２回１００ｍｇイマチニブメシレート３か月の後、患者は自身の皮膚の軟化、関節運動性の増大、及び息切れの低下を報告している。身体検査によればｍＲＳＳは２１及び４手指潰瘍が判明し、手指潰瘍の５か所は有意に治癒していた。（図１８Ｂ）。ＣＲＰは０．２ｍｇ／ｄＬまで正常化しており、患者は自身のプレドニソロンを１日当たり５ｍｇまで調節することができていた。ＨＲＣＴは間質変化（図１８Ｄ）の消散を示しており、そして反復したＴＴＥは心内膜液浸出の兆候を示していなかった。再度皮膚生検を行ったところ、より広く拡張された、より薄片化したコラーゲン束が観察され、平均の皮膚厚みは２．３１ｍｍであった（図１８Ｆ）。
【０１７２】
患者はその後、４週毎に５０ｍｇ／ｋｇずつイマチニブの用量を３５０ｍｇ／日まで増量した。イマチニブ療法６か月の後、患者は職場復帰することができ、軽度の呼吸困難を伴うのみで４マイル歩行したことを報告している。患者の健康評価アンケートの障害指数（ＨＡＱ−ＤＩ）及び硬皮症特異的黙示アナログスケール評点は両方とも治療６ヶ月後には有意に改善されていた。自身のプレドニソロンを調節し、そして関節痛のかなりの改善を報告している。身体検査によれば、ｍＲＳＳは１８であり、右手の拡張幅は１４．５ｃｍまで改善していた。口腔開口部は１．５ｃｍまで増大し、手指潰瘍は２個残存するのみであった。
【０１７３】
イマチニブは（ｉ）皮膚線維芽細胞によるＰＤＧＦＲ媒介及びＡｂｌ媒介の増殖及びコラーゲン生産；（ｉｉ）マクロファージへのＦｍｓ媒介単球分化、及びマクロファージをプライミングすることによるＴＮＦα及び他の炎症性サイトカインの生産；（ｉｉｉ）恐らくはＫｉｔ媒介の肥満細胞炎症メディエーター放出；及び（ｉｖ）恐らくはＬｃｋおよびＡｂｌをそれぞれ介したＴ及びＢ細胞の機能、を抑制することにより全身性硬化症を有するこの患者において利益をもたらしたと考えられる。即ち、多数のチロシンキナーゼ、及びそれらが媒介する病原的な細胞応答の同時阻害が全身性硬化症を有するこの患者で観察されたイマチニブの薬効の中心であると考えられる。
【０１７４】
実施例１６：小分子チロシンキナーゼ阻害剤及び炎症性及び自己免疫性の疾患に関する臨床開発のための候補の選択
小分子チロシンキナーゼ阻害剤の化学構造を図１９及び２０に示す。図１９はＳＵ９５１８（ＰＤＧＦＲ及びＦＧＦＲを抑制）、ＧＷ２５８０（Ｆｍｓ及びＰＤＧＦＲを抑制）、ＣＧＰ５３７１６（ＰＤＧＦＲ，ＦＧＦＲ及びＫｉｔを抑制）、及びＰＤ１６６３２６（Ｋｉｔ及びＡｂｌ）の化学構造を示す（表５）。図２０はＦＤＡ認可チロシンキナーゼ阻害剤（表６）の化学構造を示し、これらは全てチロシンキナーゼにおける突然変異に起因する悪性疾患の治療に関してＦＤＡ認可されている。表７は自己免疫性及び他の炎症性の状態において利益を与える潜在性を有する、主に悪性疾患を治療するために臨床開発されている追加的なチロシンキナーゼ阻害剤のリストを示す。ＩＣ５０はキナーゼ活性の５０％が阻害されるキナーゼ阻害剤の濃度である。追加的チロシンキナーゼ阻害剤は前臨床開発中であるか、又は今後発見されるべきものである。
【０１７５】
【表５】
2010500283.tif 000006
【０１７６】
【表６】
2010500283.tif 000007
多くの例示される特徴及び実施形態を上記の通り考察したが、特定の変更、並べ替え、追加、及びそれらの準複合化は当業者の知る通りである。従って、以下の添付請求項および後述する請求項は全てのそのような変更、並べ替え、追加、及び準複合化をそれらの真の精神及び範囲内にあるものとして包含するものと解釈する。
【図１】
2010500283.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
2010500283.tif 000011
【図５】
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【図６】
2010500283.tif 000013
【図７】
2010500283.tif 000014
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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