(57)【要約】  本発明は、インビトロアッセイ、細胞又は多細胞生物における選択されたカテプシンの触媒活性の観察を可能にする、本明細書において定義される式（Ｉ)      ｛Ｌ１−Ｒ１−Ｌ｝ｎ−Ａ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ２−Ｌ２      (Ｉ)の分子プローブ、それらの製造方法、及びそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）  
｛Ｌ１−Ｒ１−Ｌ｝ｎ−Ａ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ２−Ｌ２        （Ｉ）
［式中、
Ａはカテプシンにより認識可能な基であり；
Ｒ１はリンカーであり；
Ｒ２は結合若しくはリンカーであり；
Ｌは結合、若しくは基Ｌ１の容易な連結を可能にする基であり；
Ｌ１及びＬ２は、互いに独立して、場合により固体支持体に結合する少なくとも１種の標識であり；そして
ｎは１であり、
又は
Ｒ２は結合であり；
Ｌ２は、結合生物発光アッセイに適した基質であり；そして
ｎは０である］
のシステインプロテアーゼのための分子プローブ。
【請求項２】
式中、
ｎは１であり、
Ａはシステインカテプシンにより認識可能な基であり；
Ｒ１及びＲ２は互いに独立して、リンカーであり；
Ｌは結合、又は基Ｌ１の容易な連結を可能にする基であり；そして
Ｌ１及びＬ２は互いに独立して、固体支持体に場合により結合する少なくとも１種の標識である、
請求項１に記載の分子プローブ。
【請求項３】
システインプロテアーゼが、システインカテプシンサブファミリーより選択される、請求項１又は２に記載のプローブ。
【請求項４】
システインカテプシンが、カテプシンＫ、Ｓ又はＢである、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
Ｌが直接結合、又は
【化１】
2010519320.tif 000078
−（ＮＲｘ）−、−Ｏ−、−Ｃ＝Ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−ＣＲｘ＝ＣＲｙ−、−Ｃ≡Ｃ−及びフェニル、［ここでＲｘ及びＲｙは独立してＨ又は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである］より選択される基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項６】
Ｒ１又はＲ２が、１〜３００個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキレン基であり、ここで場合により、
（ａ）１個又はそれ以上の炭素原子が酸素で置き換えられ、特にここで３個の炭素原子ごとに１個の酸素で置き換えられ、例えば１〜１００のエチレンオキシ単位を有するポリエチレンオキシ基であり；かつ／又は
（ｂ）１個又はそれ以上の炭素原子が、水素原子を有する窒素で置き換えられ、そして隣接する炭素原子がオキソで置換されてアミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−を表し；かつ／又は
（ｃ）１個又はそれ以上の炭素原子がエステル官能基−Ｏ−ＣＯ−で置き換えられ；
（ｄ）２個の隣接する炭素原子間の結合が二重結合若しくは三重結合であり；かつ／又は
（ｅ）２個の隣接する炭素原子がジスルフィド結合で置き換えられている、
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項７】
標識Ｌ１及びＬ２は互いに独立して、フルオロフォアのような分光学的プローブ；クエンチャー若しくは発色団；磁気プローブ；造影剤；パートナーに特異的に結合し得る特異的結合対の一方の部分である分子；固体支持体に共有結合した分子、［ここで支持体はスライドガラス、マイクロタイタープレートまたは当業者に公知のあらゆるポリマーであり得る］；所望の酵素的、化学的若しくは物理的特性を有する生体分子；又は上に列挙した特性のいずれかの組み合わせを有する分子；又は正に荷電した直鎖若しくは分枝鎖のポリマーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項８】
標識Ｌ１及びＬ２は互いに独立して、正に荷電した直鎖又は分枝鎖のポリマーに結合している、請求項７に記載のプローブ。
【請求項９】
１つの標識Ｌ１及びＬ２が、６〜１５個のアルギニン残基を有するＤ−及び／又はＬ−アルギニンの直鎖のポリ（アルギニン）である、請求項８に記載のプローブ。
【請求項１０】
Ｌ１が、２つの相互作用している分光学的プローブＬ１／Ｌ２のうちの一方のメンバーであり、そしてＬ２が他方のメンバーである、請求項７〜９のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項１１】
Ｌ１／Ｌ２がＦＲＥＴ対である、請求項１０に記載のプローブ。
【請求項１２】
一方のＬ１／Ｌ２が、Ａｌｅｘａ３５０、ジメチルアミノクマリン、５／６−カルボキシ−フルオレセイン、Ａｌｅｘａ４８８、ＡＴＴＯ４８８、ＤＹ−５０５、５／６−カルボキシフルオレセイン、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５３２、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５５５、ＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ５３２、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３、ＤＹ−５０５、ＤＹ−５４７、Ａｌｅｘａ６３５、Ａｌｅｘａ６４７、ＡＴＴＯ６００、ＡＴＴＯ６５５、ＤＹ−６３２、Ｃｙ５、ＤＹ−６４７ Ｃｙ５．５より選択されるフルオロフォアであり、そして他方の標識Ｌ１／Ｌ２が、Ｄａｂｓｙｌ、Ｄａｂｃｙｌ、ＢＨＱ１、ＱＳＹ３５、ＢＨＱ２、ＱＳＹ９、ＡＴＴＯ５４０Ｑ、ＢＨＱ３、ＡＴＴＯ６１２Ｑ、ＱＳＹ２１より選択されるクエンチャーである、請求項１１に記載のプローブ。
【請求項１３】
ｎが０であり、Ｒ２が結合であり、そしてＬ２が、中央の足場Ａからの切断の際にルシフェラーゼによるその変換によって発光シグナルを生じることができるレポーター基としての修飾されたアミノルシフェリン又はそのカルボキシ末端保護された誘導体を特徴とする、結合生物発光アッセイに適した基質である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１４】
Ａが、
【化２】
2010519320.tif 000079
【化３】
2010519320.tif 000080
【化４】
2010519320.tif 000081
【化５】
2010519320.tif 000082
【化６】
2010519320.tif 000083
【化７】
2010519320.tif 000084
【化８】
2010519320.tif 000085
【化９】
2010519320.tif 000086
【化１０】
2010519320.tif 000087
【化１１】
2010519320.tif 000088
【化１２】
2010519320.tif 000089
【化１３】
2010519320.tif 000090
【化１４】
2010519320.tif 000091
［ここで
Ｘは−ＣＯＮＨ−Ｒ２−Ｌ２であり、
Ｙは−Ｌ−Ｒ１−Ｌ１であり、そして
ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルである］
より選択される選択的カテプシンＫ足場である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１５】
Ａが、
【化１５】
2010519320.tif 000092
【化１６】
2010519320.tif 000093
【化１７】
2010519320.tif 000094
【化１８】
2010519320.tif 000095
【化１９】
2010519320.tif 000096
【化２０】
2010519320.tif 000097
【化２１】
2010519320.tif 000098
【化２２】
2010519320.tif 000099
【化２３】
2010519320.tif 000100
【化２４】
2010519320.tif 000101
【化２５】
2010519320.tif 000102
【化２６】
2010519320.tif 000103
【化２７】
2010519320.tif 000104
［ここで
Ｘは−ＣＯＮＨ−Ｒ２−Ｌ２であり、
Ｙは−Ｌ−Ｒ１−Ｌ１であり、そして
ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ６−アルキルである］
より選択される選択的カテプシンＳ足場である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１６】
以下の群
【化２８】
2010519320.tif 000105
【化２９】
2010519320.tif 000106
【化３０】
2010519320.tif 000107
【化３１】
2010519320.tif 000108
【化３２】
2010519320.tif 000109
【化３３】
2010519320.tif 000110
【化３４】
2010519320.tif 000111
【化３５】
2010519320.tif 000112
【化３６】
2010519320.tif 000113
【化３７】
2010519320.tif 000114
【化３８】
2010519320.tif 000115
【化３９】
2010519320.tif 000116
【化４０】
2010519320.tif 000117
【化４１】
2010519320.tif 000118
【化４２】
2010519320.tif 000119
【化４３】
2010519320.tif 000120
【化４４】
2010519320.tif 000121
【化４５】
2010519320.tif 000122
【化４６】
2010519320.tif 000123
【化４７】
2010519320.tif 000124
【化４８】
2010519320.tif 000125
［ここで
【化４９】
2010519320.tif 000126
は量子ドットである］
より選択される、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の式（Ｉ）のプローブの製造方法であって、
（ａ）  式（ＩＩ）
Ｌ’−Ａ−ＣＯ−ＯＨ      （ＩＩ）
の化合物を、式Ｌ１−Ｒ１−Ｈの化合物と反応させて、式（ＩＩＩ）
Ｌ１−Ｒ１−Ｌ−Ａ−ＣＯ−ＯＨ      （ＩＩＩ）
の化合物とすること、
（ｂ）  化合物（ＩＩＩ）を、化合物Ｈ２Ｎ−Ｒ２−Ｌ２と反応させて式（Ｉ）のプローブとすること
を特徴とし、
式中、Ｌ’はフルオロ、クロロ、ブロモ、シアノ、ニトロ、アミノ、アジド、アルキルカルボニルアミノ、カルボキシ、カルバモイル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルバルデヒド、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、炭素−炭素二重結合、炭素−炭素三重結合、好ましくはアミノ、アジド、ヒドロキシ、シアノ、カルボキシ、カルバモイル、カルバルデヒド、又は炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合、より好ましくはアミノであり、そして
Ｒ１及び／又はＲ２は、適切なオルトゴナル保護基で保護されて、化合物（Ｉ）の製造過程において順次切断されてもよい、方法。
【請求項１８】
インビトロ、細胞培養実験、エキソビボ実験又は生体 における分子イメージングのための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の式（Ｉ）のプローブの使用。
【請求項１９】
生体のイメージングのための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の式（Ｉ）のプローブの使用であって:
（ａ）該生体に式（Ｉ）のプローブを投与すること、
（ｂ）該生体を、非クエンチフルオロフォアを励起して検出可能なシグナルを生じる電磁放射線に暴露させること、及び
（ｃ）該シグナルを検出して、それにより画像を作成すること、
を含む、使用。
【請求項２０】
生体のイメージングのための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の式（Ｉ）のプローブの使用であって:
（ａ）該生体に式（Ｉ）のプローブを投与すること、
（ｂ）該生体を、フルオロフォアを励起して検出可能なシグナルを生じる電磁放射線に暴露させること；及び
（ｃ）該シグナルを検出して、それにより画像を作成すること、
を含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロアッセイ、細胞又は多細胞生物における個々のタンパク質分解酵素又はタンパク質分解酵素の群の触媒活性の観察を可能にする分子プローブ（基質）に関する。本発明はさらに、上記プローブ（基質）の合成及び設計のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質分解酵素(プロテアーゼ)は、生細胞の内側及び外側で他の酵素又はペプチドを切断又は分解する。プロテアーゼは多数の生命過程に関与しており、その多くは細胞のシグナル伝達及び組織ホメオスタシスにおいて決定的に重要である。プロテアーゼの異常な又は増大した活性は、癌、変形性関節症、動脈硬化症、炎症及びその他多くのものを含む種々の疾患に関連する(非特許文献１)。タンパク質分解活性は、生物系における緊縮調節下で残っていなければならないので、多くのプロテアーゼは、制御されたタンパク質分解切断により活性化される不活性な前駆体タンパク質(チモーゲン)として発現される。タンパク質分解活性のさらなる制御は、結合してそれにより酵素の触媒活性形態を不活化する内因性阻害剤により生じる。この緊縮調節を考慮して、細胞事象又は生理学的事象におけるプロテアーゼ機能の調査は、プロテアーゼ発現のみのモニタリングよりもプロテアーゼ活性のモニタリングを必要とする。結果として、活性ベースの種々の化学的プローブが文献において提案されてきた。一般的に適用されるプロテアーゼプローブは、(i) 蛍光クエンチャーからのフルオロフォアの空間的分離をもたらすペプチド結合の酵素による切断により、又は(ii)目的のプロテアーゼに対する、メカニズムに基づく阻害剤の共有結合のいずれかにより検出可能なシグナルを生じる。特定のプロテアーゼ又はプロテアーゼの群の活性及び阻害の局在性及び量の調査(例えば、細胞ベースのアッセイ又は動物全身のイメージング実験において)は、(i) 生理学的に関連性のある位置のプロテアーゼ作用(例えば、細胞の細胞質ゾル又は動物全身イメージングにおける特定の器官において)に達し、そして(ii)所望のプロテアーゼ又はプロテアーゼの群に対して選択的である、イメージングプローブの開発を必要とする。プロテアーゼ選択的プローブの作製は、この分野にとって相当な課題を強いた。本発明は、(i) 好ましくはカテプシンサブファミリーからのシステインプロテアーゼのための新規な高度に選択的なプローブ、(ii) インビトロアッセイ、細胞又は多細胞生物におけるこれらのプローブの適用(例えば、分子イメージングによる）、並びに(iii) 上記プローブを合成及び設計する方法に関する。
【０００３】
近年、いくつかの分子イメージング技術(光学的及び非光学的)は、インビボでの特定の分子標的及び経路の非侵襲的可視化のためにますます重要になってきた。あらゆる画像シグナルの情報内容は、主として内部のコントラストの関数であるので、酵素反応（例えばペプチド結合の切断）の際に活性化可能である内部でクエンチされるイメージングプローブの開発は、一般的に、触媒的に活性なプロテアーゼを画像化及び局在化させるために適用されてきた。個々のプロテアーゼに対して選択的であり、かつインビボでプロテアーゼ作用の位置に達する能力を示すプローブの生成は、従来のアプローチではほとんど達成されなかった。製薬業界の医薬品化学者らは、適切な薬物動態特性及び所定の標的に対する適切な特異性を有する薬物の開発において関連した難問に直面する。本発明において、発明者らは、システインプロテアーゼの選択的活性に基づいたプローブへの新しい経路を発案し、そしてこのアプローチをシステインカテプシンサブファミリー由来のプロテアーゼに適用した。
【０００４】
システインプロテアーゼは、触媒の間に求核試薬として作用する活性部位におけるシステイン残基を特徴とする。触媒のシステインは一般的に適切な隣接する残基と水素結合し、その結果チオレートイオンを形成することができる。 基質がプロテアーゼにより認識される場合、切断しやすいペプチド結合が触媒システインの近くに位置し、これがカルボニル炭素を攻撃してオキソ−アニオン中間体を形成する。次いでアミド結合が切断されてＣ末端ペプチドをアミンとして遊離させる。切断しやすいペプチドのＮ末端部分はアシル−酵素中間体に共有結合したままであり、これはその後水により切断され、結果として酵素の再生となる。基質のN末端切断生成物はカルボン酸として遊離する。
【０００５】
ヒトゲノムは、11種のパパイン様カテプシン (ヒトclan CAプロテアーゼ又はシステインカテプシン: B、C、F、H、K、L、O、S、V、W、X)をコードし、これらは、リソソームにおける一般的なタンパク質分解(ハウスキーピング機能)、抗原のプロセシング、粒状プロテアーゼのプロセシング、及びマトリックスコラーゲン分解を含む種々の機能に関与する。システインカテプシン類の機能不良は、多数の病的事象、例えば変形性関節症、癌生物学（cancer biology）(血管形成及び腫瘍形成)、神経系障害(例えば疼痛)及び骨粗鬆症(非特許文献２)に関連しており、そしてその結果として、システインカテプシンのいくつかは、ここ数年治療の適切な薬物標的として認められてきた(非特許文献３)。
【０００６】
例えば、カテプシンＫ及びＳは、骨及び軟骨の分解に関与し、そして骨粗しょう症及び関節炎に関連する。
【０００７】
さらに、カテプシンＫは、主に破骨細胞に見いだされ、正常な骨リモデリング（remodelling）(骨吸収)に不可欠であることが示された。カテプシンＫ活性の欠如は骨硬化症(濃化異骨症（pycnodysosis）)を生じ、一方カテプシンＫの過剰発現は、骨物質のターンオーバーを加速し、これは骨粗しょう症の指標である。カテプシンＫはまた、強力なコラゲナーゼ活性を示し、三重らせんコラーゲンをそれらのらせんドメインにおいて切断する。変形性関節症において、軟骨基質はII型コラーゲンの分解を含む大規模な侵食を受けている(非特許文献２)。従って、例えばカテプシンＢ及びＫの阻害は、変形性の関節疾患、例えば変形性関節症の処置のための有用な方法である。例えばカテプシンＫ阻害は、骨の抑制をもたらす。カテプシンＳは、抗原に対するMHC クラスII関連免疫応答の開始に主要な役割を果たす。樹状細胞における主要な不変のcain−プロセシングプロテアーゼであるカテプシンＳは、免疫関連疾患における魅力的な薬物標的と思われる。さらに、カテプシンＳはまた、細胞外マトリックス分解に重要であり得、そして有意なエラスターゼ及びプロテオグリカン分解活性を示す。従ってカテプシンＳは、過剰なエラストリシスを含む障害、例えば慢性閉塞性肺疾患(例えば気腫)、気管支梢炎、喘息における過剰な気道エラストリシス並びに気管支炎、肺炎及び心血管疾患（例えば粥腫崩壊及びアテローム）に関与する。
【０００８】
カテプシンＬは、表皮のホメオスタシス、毛周期の調節及びMHC クラスII媒介抗原提示にも関与すると思われる。
【０００９】
カテプシンＢは、膵炎の初期段階における病的なトリプシン活性化に関連し、TNF−アルファ誘導肝細胞アポトーシスに寄与する。
【００１０】
タンパク質分解酵素について、細胞の生理機能及び病理におけるそれらの機能的役割を決定しているのは、単なる発現レベルではなくそれらの活性である。従って、カテプシンプロテアーゼの活性を阻害する分子は、疾患の処置における治療剤として、及びタンパク質活性を可視化する特異的なイメージングバイオマーカーの開発において有用であり、さらに薬物候補によるそれらの阻害は、標的の検証、薬物開発そして臨床試験でさえ促進し得る(非特許文献４)。活性ベースのイメージング試薬を使用して、特定のタンパク質又はタンパク質ファミリーを、複雑なタンパク質混合物、無傷細胞において及びインビボにおいてさえ容易にモニタリングすることができる。さらに、酵素クラス特異的プローブを使用して、機能研究に使用することができる低分子阻害剤のためのふるいを開発することができる(非特許文献５)。
【００１１】
これまでに、活性ベースのイメージングプローブは、細胞ベースのアッセイにおけるカテプシンＢ及びＬ (非特許文献６)、いくつかのカテプシン(非特許文献７)並びに腫瘍組織におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ(非特許文献８)をモニタリング及び標識するために開発されてきた。
【００１２】
プロテアーゼ活性をモニタリングするための別のツールは生物発光アッセイにある。この方法は、ルシフェリン誘導体が所望の酵素に対して基質として作用し、そしてルシフェラーゼに対してはプロ基質（prosubstrate）である酵素活性アッセイ又は非酵素生物学的アッセイにおいてルシフェリン誘導体を利用する。最初のタンパク質分解切断でルシフェリンが放出されて、これが続いてルシフェラーゼにより変換されて発光シグナルとして検出可能となる。この二次アッセイは、蛍光プローブと同様の適用範囲を有し、そして高いシグナル対ノイズ比というさらなる利点を示す。
【００１３】
システインカテプシン類に使用される酵素メカニズムは十分に研究されており、高度に保存されている。切断可能なペプチドの調査及びスクリーニングデータから、この保存された活性部位の状況においてのみ反応する求電子的基質類縁体が開発されてきた。このようなプローブにおける求電子中心は通常、いわゆる「弾頭」の一部（システインカテプシンの活性部位に完全に適合するようにその求電子特性及びその幾何学的配置を最適化した分子実体）であり、ここで触媒システイン残基と反応する。広範な種々のこのような求電子性基質が、メカニズムベースのシステインプロテアーゼ阻害剤として記載されており、これらとしては、例えば以下が挙げられるが排他的ではない: ジアゾメチルケトン類、フルオロメチルケトン類、アシルオキシメチルケトン類、O−アシルヒドロキシアミン類、ビニルスルホン類及びエポキシコハク酸誘導体(非特許文献９)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】M.J. Evans, B. F. Cravatt, Chem.Rev. 2006,106, 3279−3301
【非特許文献２】Y. Yasudaら Adv. Drug Delivery Rev. 2005, 57, 973−993
【非特許文献３】Turk, V.; Turk, B.; Turk, D. Embo J, 2001, 20, 4629−4633
【非特許文献４】H. Pien, A.J. Fischman, J.H. Thrall, A.G. Sorensen, Drug Discovery Today, 2005, 10, 259−266
【非特許文献５】D.A. Jeffery, M. Bogyo Curr.Opp.Biotech. 2003, 14, 87−95
【非特許文献６】G. Blumら Nat. Chem.Biol, 2005, 1, 203−209
【非特許文献７】R. Weisslederら Nat.Biotech. 1999, 17, 375−378
【非特許文献８】C. Bremerら Nat. Med. 2001, 7, 743−748
【非特許文献９】S. Verhelst, M. Bogyo QSAR Comb. Sci. 2005, 24, 261−269
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
生物学的ツールとして有効であるために、プロテアーゼ阻害剤は非常に強力であるだけではなく、特定のプロテアーゼへの結合において高度に選択的でなければならない。特定のプロテアーゼに対する低分子阻害剤の開発は、しばしばペプチド基質から始められてきた。ペプチドは様々な生物学的特性を示すが、薬物としてのそれらの使用は、それらの不安定性及びそれらの低い経口バイオアベイラビリティにより危うくされ得る。有効な薬物であるために、低減されたペプチド様の特徴、非選択的タンパク質分解に対する高い安定性、所定のプロテアーゼに対する高い選択性、及びプロテアーゼ作用の場所への良好なバイオアベイラビリティを有するプロテアーゼ阻害剤が望ましい。これらの要件は非ペプチド化学的足場Ａを有するシステイン−カテプシン阻害剤Ａ−Ｂ（これらは求電子的弾頭Ｂと共有結合で連結される）の開発をもたらした。システイン−カテプシンＢに結合される場合、触媒システイン(メカニズムベースの阻害剤)と共有結合形成反応をする。多くの場合、このような阻害剤の選択性及び薬物動態特性は、生物医学的研究の状況において首尾良く最適化された。触媒システインによる効果的な求核攻撃を可能にするために、上記阻害剤の求電子中心は酵素の活性部位内に正確に配向していなければならない。弾頭の求電子的炭素原子に対する触媒システインの特別な配置は、触媒システインと切断されやすいペプチド基質のペプチドカルボニルの空間配置によく対応している。この比較から本発明者らは、最適化された(化学的足場Ａと求電子的弾頭Bとの)共有結合阻害剤を、切断可能な基質に「再設計」することが可能であるはずという考えを導いた。化学的足場Ａは阻害剤の選択性の主要な決定要因と考えられるので、本発明者らのアプローチは、最適化された阻害剤の選択性又は選択性の一部を活性ベースの化学的プローブに移すことを可能にするだろう。本発明者らはこのプロセスを、選択的システインカテプシン阻害剤からの選択的な活性ベースのプローブの「逆設計」と呼ぶ。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、式（Ｉ）  
｛Ｌ１−Ｒ１−Ｌ｝ｎ−Ａ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ２−Ｌ２        （Ｉ）
［式中、
Ａはカテプシンにより認識可能な基であり；
Ｒ１はリンカーであり；
Ｒ２は結合若しくはリンカーであり；
Ｌは結合、若しくは基Ｌ１の容易な連結を可能にする基であり；
Ｌ１及びＬ２は、互いに独立して、場合により固体支持体に結合する少なくとも１種の標識であり；そして
ｎは１であり、
又は
Ｒ２は結合であり；
Ｌ２は、結合(coupled)生物発光アッセイに適した基質であり；そして
ｎは０である］
のシステインプロテアーゼのための分子プローブに関する。
【００１７】
本発明のさらなる実施態様は、式中、
ｎは１であり、
Ａはシステインカテプシンにより認識可能な基であり；
Ｒ１及びＲ２は互いに独立して、リンカーであり；
Ｌは結合、又は基Ｌ１の容易な連結を可能にする基であり；そして
Ｌ１及びＬ２は互いに独立して、固体支持体に場合により結合する少なくとも１種の標識である、
式（Ｉ）のシステインプロテアーゼのための分子プローブである。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物は、システインプロテアーゼ（好ましくはシステインカテプシンサブファミリーからのもの）のための活性ベースのプローブ(基質)である。
【００１９】
それらの最も基本的な形態において、化学的プローブは、４つの機能的要素、a) プロテアーゼの作用により切断することができる、反応性基としてのアミド基 −CO−NH−、b) 所定のプロテアーゼ標的に対する選択性を規定する足場Ａ、c) サブユニットを互いに接続するためのリンカー部分R1及びR2、並びにd) 検出のための標識L1及びL2のセット、から構成される。
【００２０】
基Ａは、化合物2.−114に示されるように、好ましくは所定のシステインカテプシン又はシステインカテプシンの群、好ましくはカテプシンＫ又はＳに対する特異性に関する主な決定要因である。本発明のイメージングプローブは、所定のシステインカテプシンに対して1000対１の係数の選択性、好ましくは100対１の係数の選択性を示し、ここで選択性は、好ましい基質濃度における相対的ターンオーバー数（酵素１でのターンオーバー数対酵素２でのターンオーバー数)により定義される。相対的ターンオーバー数は、対象の酵素（酵素１）のターンオーバー数を、それに対する選択性が所望される別の酵素（酵素２）のターンオーバー数で割ることにより各酵素対について決定される。インビボでの適用には、低い基質濃度（例えばマイクロモル濃度又はマイクロモル濃度以下)での高い選択性が望ましい。
【００２１】
スキーム１は、プロテアーゼＰと基質の反応を示し、ここでＡは特異性決定基を示し、そしてＰはチオール基Ｓ-を含むその反応性システインを有するプロテアーゼを表す:
【化１】
2010519320.tif 000002
【００２２】
反応速度は基質の構造に依存する。
【００２３】
リンカー基R1又はR2は、好ましくはそれぞれ標識L1若しくはL2に、又は複数の同じか若しくは異なる標識L2若しくはL1に接続された柔軟なリンカーである。このリンカー基は、想定された適用の状況において、すなわち特定のプロテアーゼのための活性ベースのイメージングプローブの状況において選択される。リンカーはまた、適切な溶媒中での基質の溶解度を増大し得る。使用されるリンカーは、実際の適用の条件下で化学的に安定である。リンカーは、選択されたプロテアーゼ標的の反応も、標識L1及び／又はL2の検出も妨害しないが、適切な時期のある時点で切断されるように構築されていてもよい。より詳細には、リンカー基R1又はR2は、１〜３００個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキレン基であり、ここで場合により
（ａ）１個又はそれ以上の炭素原子が酸素で置き換えられ、特にここで３個の炭素原子ごとに１個の酸素で置き換えられ、例えば１〜１００のエチレンオキシ単位を有するポリエチレンオキシ基であり；かつ／又は
（ｂ）１個又はそれ以上の炭素原子が、水素原子を有する窒素で置き換えられ、そして隣接する炭素原子がオキソで置換されてアミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−を表し；かつ／又は
（ｃ）１個又はそれ以上の炭素原子がエステル官能基−Ｏ−ＣＯ−で置き換えられ；
（ｄ）２個の隣接する炭素原子間の結合が二重結合若しくは三重結合であり；かつ／又は
（ｅ）２個の隣接する炭素原子がジスルフィド結合で置き換えられている。
【００２４】
基質の標識L1及びL2は、プローブが意図される適用に依存して当業者により選択され得る。
【００２５】
標識L1及びL2は互いに独立して、フルオロフォアのような分光学的プローブ；クエンチャー若しくは発色団；磁気プローブ；造影剤；パートナーに特異的に結合し得る特異的結合対の一方の部分である分子；当業者に公知の、ポリマー支持体、デンドリマー、スライドガラス、マイクロタイタープレートに共有結合した分子；所望の酵素的、化学的若しくは物理的特性を有する生体分子；又は上に列挙した特性のいずれかの組み合わせを有する分子である。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様は、レポーター基としての、修飾されたアミノルシフェリン又はカルボキシ末端を保護したその誘導体の使用であり、 これは中心の足場Ａから切断されると、ルシフェラーゼによるその変換を通して発光シグナルを生成することができる。従って、あるいは標識L2は、レポーター基としての修飾されたアミノルシフェリン又はカルボキシ末端を保護されたその誘導体を特徴とする、結合（coupled）生物発光アッセイに適した基質であり得る。 
【００２７】
US7148030は、修飾されたアミノルシフェリンに連結されるカテプシン基質としてペプチドを含む生物発光プロテアーゼアッセイの例を開示する。
【００２８】
ポリマー骨格及び蛍光クエンチングをもたらす密度で足場Ａを介して骨格に共有結合で連結されている複数の蛍光色素を含む分子内クエンチ蛍光プローブからなるプローブが好ましい。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施態様は、２つ又はそれ以上のフルオロフォアが、蛍光クエンチングをもたらす密度で足場Ａを介して共有結合で連結されている樹枝状高分子の使用である。ポリマープローブの使用は、局在的なプローブ送達(ターゲッティング)及び動物又はヒトの血流における長い循環時間という利点を有する。ポリマー連結は、低分子量物質の生体内分布を変更し、毒性の部位へのアクセスを低減しながら腫瘍特異的ターゲッティングを可能にし（増大した透過性及び保持効果(EPR効果)による)、そしてポリマー結合体（conjugates）と低分子量イメージングプローブとの組み合わせは、多細胞生物（マウス、ラットなどのような哺乳動物を含む）のイメージングのための、本発明の最も好ましい実施態様である。ポリマー骨格は、あらゆる生体適合性ポリマーから構成され得、そしてポリペプチド、多糖、核酸又は合成ポリマーを含み得る。本発明の状況で有用なポリマーの総合的な要約は、M.J. Vincentら、Trends Biotech. 2006, 24, 39−47及びR. Duncan, Nature Reviews Cancer, 2006, 688−701で見いだすことができる。本発明の状況で有用なポリマーのさらなる記載は、WO99／58161に開示される。ポリマープローブ又はデンドリマープローブは、骨格又は樹枝状分子に共有結合で連結された保護鎖を含み得る。保護鎖は、ポリエチレングリコールメトキシポリエチレングリコール及びさらにエチレングリコールのコポリマーを含む。
【００３０】
本発明のプローブは、ターゲッティング部分、例えば抗体、抗体フラグメント受容体結合リガンド、ペプチドフラグメント又は合成タンパク質阻害剤をさらに含むことができる。
【００３１】
標識L1及びL2はさらに、正に荷電した直鎖又は分枝鎖のポリマーであり得る。上記ポリマーは、生細胞の原形質膜を超える、結合した分子の移動を容易にすることが当業者に公知である。これは、他の方法では低い細胞膜透過性を有するか又は生細胞の細胞膜に対して事実上不透過性である物質に特に好ましい。細胞非透過の化学的プローブは、L1又はL2のような基と連結すると細胞膜透過性になる。このような細胞膜輸送を増強する基L1及びL2は、例えば６〜15個のアルギニン残基を有するＤ−及び／若しくはL−アルギニンの線状ポリ(アルギニン)、それぞれがグアニジニウム基を有する６〜15個のサブユニットの線状ポリマー、オリゴマー又は６から５０までのサブユニットの短いポリマー、グアニジニウム基を結合した部分、及び／若しくはHIV−tatタンパク質の配列の一部、例えばサブユニットTat49−Tat57 (一文字アミノ酸コードではRKKRRQRRR)を含む。６〜15個のアルギニン残基を有するＤ−及び／又はＬ−アルギニンの線状ポリ(アルギニン)は、L1が、２つの相互作用する分光学的プローブL1／L2（例えば、FRET対）の一方のメンバーであり、そしてL2が他方のメンバーである場合のポリマー標識として好ましく利用される。
【００３２】
標識L1及び／又はL2として最も好ましいのは分光学的プローブである。標識L2として最も好ましいのは、L1との分光学的相互作用対の一方の部分を表す分子であり、さらにパートナーに特異的に結合することができる標識、及び固体支持体に共有結合で結合された分子である。
【００３３】
L1が２つの相互作用する分光学的プローブL1／L2の一方のメンバーであり、そしてL2が他方のメンバーであるような標識が特に好ましく、この場合エネルギーはドナーとアクセプター（クエンチャー）との間で動的又は静的クエンチングのいずれかにより無輻射移動することができる。上記の標識L1／L2対は、対応するシステインカテプシンプロテアーゼからの反応／切断の際にその分光学的特性を変化させる。 このような標識L1／L2対の例は、FRET(フェルスター共鳴エネルギー移動)対、例えば一端(例えばL1)においてドナー（レポーター）で共有結合で標識され、そして別の位置(L2)においてアクセプター(クエンチャー)と共有結合で標識されるか、又はその逆でもよい、プロ蛍光性（pro−fluorescent）プローブである。
【００３４】
詳細には、L1がドナー(レポーター)であり、L2がアクセプター(クエンチャー)であるか、又はL1がクエンチャーであり、L2がレポーターである。このプローブを使用する際には、システインプロテアーゼのプローブとの反応は蛍光の変化をもたらす。二重標識された基質内のレポーター−クエンチャー距離は、プロテアーゼとの反応の際に変化し、レポーターとクエンチャーとの空間的分離をもたらし、これにより蛍光の出現又は発光波長の変化が引き起こされる。広範な選択のレポーター基は、それぞれ標識L1又はL2として使用され得、例えば近赤外発光フルオロフォアが含まれる。レポーター及びクエンチャーを含む基質は、それがプロテアーゼと反応するまでは暗いままであり、その後、レポーター標識とクエンチャー標識とが空間的に分離されると、フルオロフォア発光のスイッチが入って反応混合物が「点灯」される。蛍光クエンチング及びエネルギー移動は、２つの標識のうちの一方のみの発光、クエンチングされた又はエネルギードナー標識により測定することができる。エネルギー移動が起こり、そしてエネルギーを受容する標識も蛍光性である場合、アクセプター標識の蛍光も測定することができる。これら２つの相互作用する標識のうちのドナー標識は、励起ランプの必要性をなくし、アクセプターのバックグラウンド蛍光を低減する化学発光ドナープローブから選択され得る。このような二重標識基質を使用する上述の特定の方法は、蛍光時間測定に基づいて反応速度論を決定するために有用であり、そしてインビトロと同様にインビボで適用され得る。
【００３５】
あるいは、基質の標識L2は固体支持体であっても、追加的に固体支持体に結合されても、ポリマー／固体支持体に結合されるか又は結合可能であってもよい。６〜15のアルギニン残基を有するＤ−及び／又はＬ−アルギニンの線状ポリ(アルギニン)は、L1／L2 FRET対のためのポリマー標識として好ましく利用される。
【００３６】
特定の好ましい組み合わせは、２つの異なる親和性標識、特に一対の分光学的に相互作用する標識L1／L2、例えばFRET対である。親和性標識は、パートナーに特異的に結合することができる特異的結合対の一方の部分である分子として定義される。考慮される特異的結合対は、例えばビオチン及びアビジン又はストレプトアビジン、さらにメトトレキサートであり、これは酵素ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の強く結合する阻害剤である。
【００３７】
レポーターとクエンチャーの適切な対は、当業者により選択され得る。典型的にはレポーター及びクエンチャーは、広いスペクトルの重なりを有する蛍光色素であり、例えばレポーターとしてのフルオレセイン及びクエンチャーとしてのローダミンである。他のクエンチャーは金クラスター及び金属クリプテートである。
【００３８】
本発明において使用されるクエンチャーの第二のクラスは、「ダーククエンチャー（dark quenchers）」(Johansson, M.K.ら, Chem. Eur. J. 9:3466−3471, 2003)、すなわち、最大のFRETクエンチングをもたらす共通レポーター色素の発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有する固有の蛍光がない色素である。さらに色素対は、基底状態複合体内で共鳴双極子−双極子相互作用メカニズム(静的クエンチング)を促進するように、それらの吸収帯が重なるように選択され得る。
【００３９】
考慮される特定のフルオロフォア及びクエンチャーは以下である: Alexa 350、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 555、Alexa 635及びAlexa 647を含むAlexa色素(Panchuk− Voloshina、N.ら、J. Histochem.＆Cytochem. 47:1179−1188、1999); ジメチルアミノクマリン (Molecular Probesにより製品D374として供給される7−ジメチルアミノクマリン−4−酢酸 スクシンイミジルエステル); クエンチャーQSY 35、QSY 9及びQSY 21 (Molecular Probes、Inc.、Eugene、OR 97402、USA); Cyanine−3 (Cy 3)、Cyanine 5 (Cy 5)及びCyanine 5.5 (Cy 5.5) (Amersham − GE Healthcare、Solingen、Germany); BHQ−1、BHQ−2及びBHQ−3 (Black Hole QuencherTM of Biosearch Technologies、Inc.、Novato、CA 94949、USA); フルオロフォア ATTO 488、ATTO 532、ATTO 600及びATTO 655並びにクエンチャー ATTO 540Q及びATTO 612Q (Atto−Tec、D57076 Siegen、Germany); フルオロフォア DY−505、DY−547、DY−632及びDY−647 (Dyomics、Jena、Germany); 5／6−カルボキシフルオレセイン、テトラメチルローダミン、4−ジメチルアミノアゾベンゼン−4’−スルホニル誘導体(Dabsyl)及び4−ジメチルアミノアゾベンゼン−4’−カルボニル誘導体(Dabcyl)。これらは以下の組み合わせにおいて有利に組み合わせることができる：
【表１】
2010519320.tif 000003
【００４０】
酵素事象と関連づけられた生物発光アッセイは、触媒反応の瞬間速度に合わせて光を生じる。この方法は、アミノ修飾したカブトムシアミノ−ルシフェリン又はそのカルボキシ末端を保護した誘導体を含み、ここでアミノルシフェリンのアミノ基は、アミド結合を介して中央の足場Ａに連結されており、結果としてカテプシンに認識されてその後切断される基質となる。カテプシンの酵素活性は、アミノルシフェリンを足場Ａに連結するペプチド結合の切断をもたらし、ルシフェラーゼの基質であるアミノルシフェリンを遊離させる。ルシフェラーゼとその基質とのその後の反応は検出可能なシグナルを生じる(発光)。従ってこの方法は、カテプシン活性を第二の酵素反応と関連づけ、読み出しシグナルとして発光を生じる。この種類のアッセイは、「プロ−ルシフェリン（pro−luciferin）」(「ケージド（caged）ルシフェリン」)の開発を必要とし、これは先行する酵素事象（例えばタンパク質分解切断）によりルシフェリンに変換された場合にのみ基質としてルシフェラーゼに認識される。このようにして、発光シグナルは、以前の酵素事象に直接依存する。従って、発光によりカテプシンのタンパク質分解活性を検出するためのプローブを提供することが本発明のさらなる実施態様である。
【００４１】
特定の実施態様において、本方法は、L2が固体支持体であるか若しくはレポーター／クエンチャー対の一方のメンバーをさらに有する固体支持体に結合されており、又はここでL2は固体支持体とレポーター／クエンチャー対の一方のメンバーとの組み合わせであり、そしてL1はこの対の他方のメンバーである基質を含む。このようにして、暗い固体支持体が、適切なプロテアーゼとの反応の際に蛍光性になる。
【００４２】
固体支持体は、スライドガラス、マイクロタイタープレートまたは当業者に公知のあらゆるポリマー、例えば官能基化ポリマー(好ましくはビーズの形態)、化学的に修飾した酸化物（oxidic）表面（例えば二酸化ケイ素、五酸化タンタル、又は二酸化チタン）、又は化学的に修飾した金属表面、例えば、貴金属表面（例えば金又は銀の表面）でもよい。固体支持体は適切なセンサー素子でもよい。
【００４３】
好ましくは、式(Ｉ)の化合物は、カテプシンＫの阻害剤である基Ａを含む。国際特許出願WO06076796、WO06076797、WO06063762及びWO05049028は、式（Ｉ)のプローブに変換されるために使用され得る選択的カテプシンＫ阻害剤の例を開示する。より好ましくは、式(Ｉ)の化合物は、以下の好ましい足場Ａを含む化合物を特徴とする、カテプシンＫのためのプローブである:
【００４４】
【化２】
2010519320.tif 000004
【００４５】
【化３】
2010519320.tif 000005
【００４６】
【化４】
2010519320.tif 000006
【００４７】
【化５】
2010519320.tif 000007
【００４８】
【化６】
2010519320.tif 000008
【００４９】
【化７】
2010519320.tif 000009
【００５０】
【化８】
2010519320.tif 000010
【００５１】
【化９】
2010519320.tif 000011
【００５２】
【化１０】
2010519320.tif 000012
【００５３】
【化１１】
2010519320.tif 000013
【００５４】
【化１２】
2010519320.tif 000014
【００５５】
【化１３】
2010519320.tif 000015
【００５６】
【化１４】
2010519320.tif 000016
式中、
Ｘは−CONH−R2−L2であり、
Ｙは−｛L−R1−L1｝ｎであり、
R1、R2、L、L1、L2及びｎは上記のとおりであり、そして
ＲはＨ、C1−C6−アルキルである。
【００５７】
化合物1.−28.は、L1がS1ポケット中にあるカテプシンＫの基質であり、化合物29.−63.は、L1がS3ポケット中又はS3ポケットを超えている(外側)カテプシンＫの基質である。
【００５８】
さらに好ましくは、式(Ｉ)の化合物は、カテプシンＳの阻害剤である基Ａを含む。国際特許出願WO04089395、WO05040142、WO0055144、WO05074904及びWO0069855は、式(Ｉ)のプローブに変換するために使用され得る選択的カテプシンＳ阻害剤の例を開示する。より好ましくは、式(Ｉ)の化合物は、以下の好ましい足場Ａを含む化合物を特徴とするカテプシンＳのためのプローブである:
【００５９】
【化１５】
2010519320.tif 000017
【００６０】
【化１６】
2010519320.tif 000018
【００６１】
【化１７】
2010519320.tif 000019
【００６２】
【化１８】
2010519320.tif 000020
【００６３】
【化１９】
2010519320.tif 000021
【００６４】
【化２０】
2010519320.tif 000022
【００６５】
【化２１】
2010519320.tif 000023
【００６６】
【化２２】
2010519320.tif 000024
【００６７】
【化２３】
2010519320.tif 000025
【００６８】
【化２４】
2010519320.tif 000026
【００６９】
【化２５】
2010519320.tif 000027
【００７０】
【化２６】
2010519320.tif 000028
【００７１】
【化２７】
2010519320.tif 000029
式中、
Ｘは−CONH−R2−L2であり、
Ｙは−｛L−R1−L1｝nであり、
R1、R2、L、L1、L2及びｎは上記のとおりであり、そして
ＲはＨ、C1−C6−アルキルである。
【００７２】
化合物64.−85.は、L1がS1ポケット中にあるカテプシンＳの基質であり、化合物は86.−119. L1がS3ポケット中又はS3ポケットを超えている(外側)カテプシンＳの基質である。
【００７３】
本発明のイメージングプローブは、中央の足場Ａを構築していずれかのリンカー及び標識１又は２をこのユニットに基Ｌ及び基−C(O)−NH−を介して結合させるために、当該分野で公知の適切な保護基化学を使用することにより合成し得る。適切なビルディングブロックに加えてFRET−対、例えばシアニン−色素(例えばCy3 B、Cy 5.5、Cy 7)は市販されている(例えばSigma−Aldrich、GE−Healthcare)。本発明に記載されるプローブサブセットについて、固相合成法が特に有用である(B. J. Merrifield、Methods in Enzymology 1997,289、3−13)。合成の要件に依存して、リンカー、クエンチャー又はフルオロフォアの結合は、固体支持体上又は溶液相化学によりなされ得る。
【００７４】
一般的に、中央足場Ａ及び場合により基L上の反応性側鎖残基は、それぞれサブユニットL1R1及びL2R2でのさらなる修飾のために保護され、そして連続して遊離される。これらのサブユニットの連結は、公知の化学合成法により達成することができる。色素活性エステルと足場Ａの第一級アミン基との間で反応させて両方のユニットをアミド結合を介して接続することが特に有用である。最終プローブ分子はもちろん中間体も、標識及びイメージング実験において使用する前に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により精製して、質量分析法及び分析用HPLCにより特徴付けされ得る。
【００７５】
本発明は、いくつかの非限定的な実施例により以下の段落において説明される:
好ましい実施態様において、式(Ｉ)のプローブは、上に62番として示され、P1位及びP1’位に発色団を有してWO2005／082876に開示されるジペプチドカテプシンＳ阻害剤から誘導された足場Ａを含む。適切な発色団は、それらのスペクトル特性が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に適しているように選択される。発色団は蛍光性でも非蛍光性でもよい。原理上は、ペプチド結合のタンパク質分解切断後のスペクトル変化という主要な要件を満たしているかぎり、広範な種々の発色団が本発明において使用され得る。このような相互作用する発色団及び中央足場の結合は、場合によりリンカーユニットを介して行われる。
【００７６】
好ましくは、フルオロフォアは、キサンテン色素又はシアニン色素の群から選択される。カルバシアニン類（carbacyanines）、チアシアニン類、オキサシアニン類及びアザシアニン類の群からのシアニン色素がより好ましい。本発明の状況において使用されるために適切なシアニン色素は、US 5,268,468及びU.S. 5,627,027に開示される。これらには、商標(Amersham、GE Healthcare) Cy 3、Cy 3B、Cy 3.5、Cy 5、Cy 5.5、Cy 7及びCy 7.5を有する色素が含まれる。
【００７７】
好ましくは、クエンチャーユニットは非蛍光性発色団であり、これらとしては2,4−ジニトロフェニル、4−(4−ジメチルアミノフェニル)アゾ安息香酸(DABCYL)、7−メトキシクマリン−4イル)アセチル及びWO 9964519に記載されるような非蛍光性のシアニン色素が挙げられる。
【００７８】
好ましい実施態様において、クエンチャーは有意な発光を示さず、そしてより好ましくは非蛍光性の発色団である。この実施態様において、イメージング試薬はフルオロフォア及び非蛍光性（ダーク）アクセプター発色団を含む。P1位にBHQ3−クエンチャーを有し、そしてP1’位にCY 7フルオロフォア(Abb.2)を有する、カテプシンＳ特異的足場に基づくプローブがより好ましい。
【００７９】
P1位にQSY 21−クエンチャーを有し、そしてP1’位にCY 5.5フルオロフォアを有する、モルホリンジペプチド足場に基づく式（Ｉ）のプローブがより好ましい(スキーム２):
【化２８】
2010519320.tif 000030
【００８０】
さらに好ましい実施態様は、P1位にダーククエンチャーBHQ 3を有し、そしてP1’位にCy 7フルオロフォアを有する 同じ足場を含む(スキーム３):
【化２９】
2010519320.tif 000031
【００８１】
さらに好ましい実施態様において、WO9924460に開示されるようなカテプシンＳのためのベンズアミドジペプチド足場Ａは、クエンチャー 分子QSY 21をP1位に配置し、そしてフルオロフォアCY 5.5をP1’位に配置することによりイメージングプローブに変換される(スキーム４):
【化３０】
2010519320.tif 000032
【００８２】
さらなる好ましい実施態様において、上記のベンズアミドジペプチド足場を修飾し、そしてクエンチャー QSY 21をP3に対応する位置に配置する(スキーム５)。
【化３１】
2010519320.tif 000033
【００８３】
P1位に非蛍光性BHQ 3クエンチャーを有し、そしてP1’位においてCY7フルオロフォアを有するカテプシンＳ特異的ベンズアミド足場に基づくプローブがさらに好ましい(スキーム６)。
【化３２】
2010519320.tif 000034
【００８４】
さらなる好ましい実施態様において、上記のベンズアミド足場を修飾し、そして非蛍光BHQ 3クエンチャーをP3に対応する位置に配置する(スキーム７)。
【化３３】
2010519320.tif 000035
【００８５】
カテプシンＫのための特異的イメージングプローブは、上記のカテプシンＳプローブと同様のやり方で構築される。
【００８６】
さらなる好ましい実施態様において、式（Ｉ）のプローブは基Ａとして、P1位及びP1’位に発色団を有する、WO2005049028に開示されそして上で１番として示されるカテプシンＫ阻害剤から誘導されたピペラジンベースの足場を含む。 
【００８７】
好ましい実施態様において、フルオレセイン及びテトラメチルローダミンは相互作用するFRET対として選択され、テトラメチルローダミンは足場のP1位に位置し、一方フルオレセインはスキーム８に示されるようにP1’部位を介して連結される:
【化３４】
2010519320.tif 000036
【００８８】
好ましい実施態様において、クエンチャーは有意な発光を示さず、より好ましくは非蛍光性の発色団である。この実施態様において、イメージング試薬はフルオロフォア及び非蛍光性（ダーク）アクセプター発色団を含む。スキーム９で概説されるように、BHQ3クエンチャーをP1位に有し、そしてCY7フルオロフォアをP1’位に有するカテプシンＫ特異的足場に基づく式（Ｉ)のプローブがより好ましい: 
【化３５】
2010519320.tif 000037
【００８９】
ピペラジン足場に基づく、さらなる好ましい実施態様は、クエンチャー分子が足場のP3位に位置し、一方対応するフルオロフォアCy 5.5はP1’位のままである式（Ｉ)のカテプシンＫプローブを含む(スキーム10):
【化３６】
2010519320.tif 000038
【００９０】
さらなる好ましい実施態様において、カテプシンＫプローブのクエンチャーユニットは非蛍光性BHQ3クエンチャーをP3位に含み、そして対応するフルオロフォアCy7をP1’位に含む(スキーム11):
【化３７】
2010519320.tif 000039
【００９１】
さらなる好ましい実施態様は、足場Ａとしてチアゾールを含むカテプシンＫのためのプローブ(U. Grabowskaら、Curr. Opin. Drug Disc. 2005、8、619−630において開示される)である。従って、カテプシンＫ活性のイメージングのためのさらなる好ましい式（Ｉ）の化合物は、クエンチャーをチアゾール足場のP1位に含み、そしてフルオロフォアCy 5.5をP1’部位に含む(スキーム12):
【化３８】
2010519320.tif 000040
【００９２】
同じ設計方針をカテプシンＫプローブに適用し、この場合は非蛍光性クエンチャー分子BHQ 3をP1位において使用し、そしてフルオロフォアCY 7をP1’位を介して結合させる(スキーム13):
【化３９】
2010519320.tif 000041
【００９３】
さらなる好ましい実施態様において、FRET対の一方の相互作用パートナーは、ナノ粒子を含む。CdSeナノ粒子(例えば量子ドット)及びランタニドイオンドープ酸化物ナノ粒子(例えばY0.6Eu0.4VO4)が本発明の状況においてより好ましい。このようなナノ粒子がFRET対においてドナーとして使用される場合、それらはアクセプター吸収よりかなり短い波長で励起することができ、その結果直接アクセプター励起を最少にする。さらに、狭いドナー発光は、アクセプター発光と重ならない。さらにこのようなナノ粒子は、急速な光退色を受ける有機色素よりかなり光安定性であることが判明した。活性化量子ドットは市販されており(Invitrogen、Molecular probes)、そしてそれらの発光波長は種々の製品から選択することができる。
【００９４】
スキーム14及び15は、システインカテプシンＳに特異的な、量子ドットに基づく式（Ｉ）のプローブを示す。従って、式（Ｉ）のさらなる好ましいプローブにおいて、量子ドット(QD605)は、カテプシンＳプローブのP1か(スキーム14) 
【化４０】
2010519320.tif 000042
【００９５】
又はP1’位(スキーム15)
【化４１】
2010519320.tif 000043
のいずれかに適切なリンカーを介して位置づけられ得る。
【００９６】
量子ドットは灰色の円で表され、適切なアクセプター分子はシアニン色素CY7で表される。
【００９７】
さらなる好ましい実施態様において、式（Ｉ）のプローブにおける量子ドットは、タンパク質分解で切断可能なサブユニットを介して金ナノ粒子に接続される(スキーム16): 
【化４２】
2010519320.tif 000044
【００９８】
金ナノ粒子(AuNPs)は、有機蛍光色素、さらには量子ドットに有効なクエンチャーとして示されてきた。AuNPsと組み合わせた量子ドットの適用は、例えばWO2006126570に開示される。
【００９９】
さらなる好ましい実施態様において、式（Ｉ）のプローブは、２つの特異的プロテアーゼプローブが共有結合で一緒に連結されているマルチ−FRET系から構成される(スキーム17):
【化４３】
2010519320.tif 000045
【０１００】
この構成において、単一の波長で励起して、独特のFRETシグニチャー（signatures）として異なる発光比を使用することが可能である(K.E Sapsfordら Angew. Chem. Int. Ed. 2006、45、4562−4588を参照のこと)。このプローブは、１つの分子内に、カテプシンＫのための足場及びカテプシンＳのための足場という２つの特異性を兼ね備えている。 
【０１０１】
２つのサブグループＡ (カテプシンＫに対して特異的)がダーククエンチャーBHQ−3で誘導体化されそして同じ蛍光色素（例えばCy 7）に共有結合で接続されている、式（Ｉ）の化合物の状況において好ましく使用されるカテプシンＫプローブの配置をスキーム18に示す:
【化４４】
2010519320.tif 000046
【０１０２】
さらなる好ましい実施態様において、式（Ｉ）のプローブは、長い循環期間を有し、高い腫瘍蓄積性を有し、そして酵素活性化後に近赤外スペクトルにおいて蛍光性になるクエンチされた蛍光マーカーを含むように設計される。これらのプローブは、複数のNIR蛍光色素が遊離ポリ−リジン残基に結合されている合成グラフトコポリマー [部分的にメトキシポリ(エチレングリコール)修飾されたポリ−D又はL−リジン]に基づく。これら高分子の蛍光は、NIR−発色団の高い密度及び近接性による内部クエンチングに起因して高度に低減される。
【０１０３】
例として、スキーム19は、ポリ−リジン骨格へのＡの接続がP1位にあるリンカーを介して達成され、一方NIR−発色団Cy 5.5はP1’位に結合している、ポリマーベースのカテプシンＫプローブを示す:
【化４５】
2010519320.tif 000047
【０１０４】
逆の状況をスキーム20に示す。この場合NIR−発色団Cy 5.5はP1部位に結合しているが一方ポリ−リジン骨格はP1’位にあるリンカーを介して接続されている:
【化４６】
2010519320.tif 000048
【０１０５】
さらなる好ましい実施態様において、式（Ｉ）のプローブは、均一系酵素連結発光アッセイにおいて使用されるように設計される。以下のスキームは、一般的に上述の作用メカニズムを示す。ルシフェリンはルシフェラーゼの基質であり、そして発光シグナルは第二の酵素反応により生じる:
【化４７】
2010519320.tif 000049
【０１０６】
以下のスキームは上述の作用メカニズムを示し、ここでルシフェリンはピリダジノジアゼピン誘導体でマスクされて上記カテプシンＫのタンパク質分解活性により遊離する:
【化４８】
2010519320.tif 000050
【０１０７】
本発明はさらに、個々のタンパク質分解酵素又はタンパク質分解酵素の群（例えば、システインカテプシン）の触媒活性の、インビトロアッセイ、細胞又は多細胞生物における観察のための分子プローブの設計のための方法に関し、この方法は、個々のタンパク質分解酵素又はタンパク質分解酵素の群の阻害剤を、これらの個々のタンパク質分解酵素又はタンパク質分解酵素の群（好ましくはシステインカテプシン酵素）のための選択的な活性ベースのプローブに変換することを特徴とする。これを達成するために、本発明者らは、特定の公知のシステインカテプシン阻害剤の求電子性基を、切断されやすいペプチド結合と置き換える。好ましい化合物は、検出可能なシグナルが特定の標的の酵素（タンパク質分解）活性により生成されるように合成される。詳細には、好ましいプローブは、(i) 切断されやすい結合のＮ末端部分にある特異性決定基A、及び(ii)切断されやすい結合のC末端部分にて連結される内部クエンチされたフルオロフォア（例えば適切なFRET対）を含む。本発明は、公知の阻害剤の望ましい以前に最適化された特性を、新規な活性ベースのプローブに移すことを可能にする。
【０１０８】
従来技術において記載されるカテプシン阻害剤は、ニトリル基を利用する。本発明のイメージングプローブは、上記の公知の足場を利用し、そして２つの修正を、第一にニトリル基を切断可能なアミド基で置き換えること、及び第二に相互作用する標識化対又は特性モジュレータをアミド基の両側に位置づけることにより導入する。
【０１０９】
インビトロにおいて、プロテーゼと本発明の基質との反応は、一般的に細胞抽出物中か又はプロテアーゼの精製若しくは富化した形態を用いて行うことができる。インビボ適用については、その領域は妨害する生物蛍光（biofluorescence）がないので、レポーターは好ましくは近赤外(NIR)領域で発光する。これらの要件に適合する公知のシアニンNIR色素は、本発明の基質に好ましく組み込まれる。
【０１１０】
式（Ｉ）の化合物の分子構成は、アミド官能基を有する中央足場Ａ並びにそれぞれ２つのサブユニットL1R1及びL2R2からなる。アミド基はカテプシン酵素で切断することができるので、L2R2は、式（Ｉ）に示されるように、常にアミド基を介して足場Ａに接続される。サブユニットL1R1を足場Ａに結合するために適切な官能基を当業者は選択することができ、例を以下に示す。前駆体化合物中の特定の官能基L’は、適切なL1R1サブユニットの結合のために足場Ａ上に配置して式（Ｉ）の化合物内の基Lを得ることができ、合成戦略及び活性ベースのイメージング試薬としてのこのような基質の最終用途の要件にのみ制限される。 従ってそれらの選択は所望の基質を構築するために選択される特定の試薬に依存する。ＡをサブユニットR1L1に接続するために足場Ａ上に供給することができる官能基L'の例としては、フルオロ、クロロ、ブロモ、シアノ、ニトロ、アミノ、アジド、アルキルカルボニルアミノ、カルボキシ、カルバモイル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルバルデヒド、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、炭素−炭素二重結合、炭素−炭素三重結合などが挙げられる。最も好ましい例としては、アミノ、アジド、ヒドロキシ、シアノ、カルボキシ、カルバモイル、カルバルデヒド、又は炭素−炭素二重結合若しくは炭素−炭素三重結合が挙げあられる。従って、Ｌは好ましくは直接結合又は以下より選択される基である：
【化４９】
2010519320.tif 000051
−(NRx)−、−O−、−C＝N−、−C(＝O)−、−C(＝O)−NH−、−NH−C(＝O)−、−C(＝O)H、−CRx＝CRy−、−C≡C−及びフェニル［ここでRx及びRyは独立してＨ又は(C1−C6)アルキルである]。
【０１１１】
詳細には、式（Ｉ）の化合物の好ましい合成は、オルトゴナル保護官能基（orthogonally protected functional groups）を利用する。このような保護基の選択は、別々の脱保護を可能にし、その結果、順にそれぞれ放出された官能基は、対応するサブユニットの足場Ａへの結合に向けてさらに化学的に操作することができる。想定される官能基に適切な保護基を当業者が選択することができ、それらは例えばT.W. Greene及びP.G.M. Wutsの「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、New York 1991においてまとめられている。
【０１１２】
式L’−A−CO−OHの化合物(足場)は、当該分野で公知の標準的な方法により、例えば国際特許出願WO06076796、WO06076797、WO06063762、WO05049028、WO04089395、WO05040142、WO0055144、WO05074904及びWO0069855に記載されるように製造することができる。
【０１１３】
本発明はまた、nが1である式（Ｉ）の化合物の製造方法に関し、この方法は、
(a) 式(II)
L’−A−CO−OH      (II)
［式中、Ａはその一般的かつ好ましい意味で上で定義されたとおりであり、そしてL’はフルオロ、クロロ、ブロモ、シアノ、ニトロ、アミノ、アジド、アルキルカルボニルアミノ、カルボキシ、カルバモイル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルバルデヒド、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、炭素−炭素二重結合、炭素−炭素三重結合であり、好ましくはアミノ、アジド、ヒドロキシ、シアノ、カルボキシ、カルバモイル、カルバルデヒド、又は炭素−炭素二重結合若しくは炭素−炭素三重結合であり、より好ましくはアミノである］
の化合物を、当業者に公知の条件下で、式L1−R1−H [式中L1はその一般的かつ好ましい意味で上で定義されたとおりである]と反応させて、式(III)
L1−R1−L−A−CO−OH      (III)
の化合物とすること、
(b) 化合物(III)を化合物H2N−R2−L2と反応させて式（Ｉ）の化合物とすること、
を特徴とする。
【０１１４】
場合により、式（Ｉ）の化合物の合成は、オルトゴナル保護官能基を利用する。このような保護基の選択は、別々の脱保護を可能にし、その結果、順にそれぞれ放出された官能基は、標識をそれに結合するため又はリンカーR1及び／若しくはR2のさらなる延長を導入するためにさらに化学的に操作することができる。想定される官能基に適切な保護基を当業者は選択することができ、そしてこれらは例えばT.W. Greene及びP.G.M. Wutsの「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、New York 1991においてまとめられている。
【０１１５】
式（Ｉ）のプローブのさらなる製造方法は、
(a1) 式(II)の化合物と、式(IV)
H2N−L2−PG2        (IV)
の化合物とを当業者に公知の条件下で反応させて、式(V)
L’−A−CO−NH−R2−PG2        (V)
の化合物とすること、
(b) 次いで化合物(V)と化合物(VI)
PG1 −R1−L’’      (VI)
とを、それぞれの基について当業者に公知の条件下で反応させて、化合物
PG1−R1−L−A−CO−NH−R2−PG2        (VI)
［式中、
PG1及びPG2は互いに独立して保護基であり、好ましくは直交する保護基であり、L’’は当業者により選択される、L'のそれぞれの接続基、又は結合である］とすること、
(c1) 化合物(VI)の基PG2を切断し、生じた化合物を標識L2と反応させて、次いで保護基PG1を切断し、そして生じた化合物を標識L1と反応させて式（Ｉ）の化合物とすること、又は
(c2) 化合物(VI)の基PG1を切断し、そして生じた化合物を標識L1と反応させて、次いで保護基PG2を切断し、そして生じた化合物を標識L2と反応させて式（Ｉ）の化合物とすること、
を含む。
【０１１６】
工程(b)において、L’及びL’’並びに反応の種類 (括弧内)の好ましい組み合わせは以下のとおりである:
L’がフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードである場合、L’’はアミノ(R−NH2)、ヒドロキシ(R−OH)、三重結合(Sonogashira反応)、二重結合(Heck反応)、アルキルボラン(Suzuki反応)である;
L’がシアノである場合、L’’はアミノ(R−NH2)、ヒドロキシ(R−OH)、チオール(R−SH)である;
L’がアミノである場合、L’’は活性化カルボン酸(NHS−エステル、…)、カルバルデヒド、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードである;
L’がアジドである場合、L’’は三重結合、ホスフィン部分(Staudinger連結反応)である;
L’がカルボキシである場合、L’’はアミノ、ヒドロキシル、ヒドラジドである;
L’がアルコキシカルボニルである場合、L’’はアミノ、ヒドロキシル、ヒドラジドである;
L’がアリールオキシカルボニルである場合、L’’はアミノ、ヒドロキシル、ヒドラジドである;
L’がヒドロキシである場合、L’’はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ヒドロキシ(Mitsunobu反応)、カルボキシである;
L’がカルバルデヒドである場合、L’’はアミノ、ヒドラジンである;
L’が炭素−炭素二重結合、ブロモ、クロロ、ヨード(Heck反応)、アルキルボラン(Suzuki反応)である場合;
L’が炭素−炭素三重結合である場合、L’’はブロモ、クロロ、ヨード(Sonogashira反応)、アジドである。
【０１１７】
好ましくは、異なる標識で官能化されたシステインプロテアーゼ基質を固体支持体上で合成する。標識の固相合成への適合性に依存して、固体支持体及び溶液相合成の組み合わせが使用される。
【０１１８】
基ＡがカテプシンＳ阻害剤からなり、L1が6−((4,4−ジフルオロ−1,3−ジメチル−5−(4−メトキシフェニル)−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−2−プロピオニル)アミノ)ヘキサン酸,残基(商用名: BODIPY−TMR−X、Invitrogen)であり、そしてL2がクエンチャーQSY−7である式(1)の化合物の製造は、実施例５−８においてさらに記載される: 側鎖のBoc保護されたアミノ基を有するＣ末端リジン残基を有する実施例５の足場は、クロロ−トリチル樹脂を使用する固体支持体上で製造した。得られたＣ末端カルボン酸をモノ−Fmoc保護されたブタン−1,4−ジアミンにカップリングし、これを溶液中でさらに修飾した。リジン側鎖のBoc基を当該分野で公知の方法、例えばTFAとの反応により除去した後、フルオロフォア(好ましくはそのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルとして活性化されている)を標準的な条件下でペプチドにカップリングさせた。カップリングした中間体化合物を、場合により、例えば分取HPLCにより精製してもよい。C末端Fmoc基を除去した後、クエンチャー (好ましくはそのN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルとして活性化されている)をペプチドにカップリングさせて、最終生成物を分取HPLCにより精製した。
【０１１９】
ペプチド模倣構造を有するいくつかのシステインカテプシン基質の合成には、非ペプチドビルディングブロックを固相合成に利用してもよい。ビルディングブロック合成はそれぞれ実施例20−22、
【化５０】
2010519320.tif 000052
【０１２０】
実施例23−24、
【化５１】
2010519320.tif 000053
【０１２１】
及び実施例17、
【化５２】
2010519320.tif 000054
においてさらに記載される。
【０１２２】
ビルディングブロック(II)は、２つの異なる標識がプローブのＣ末端及びＮ末端に結合している式（Ｉ）の化合物の合成において好ましく使用される。
【０１２３】
ビルディングブロック(III)は、カテプシンＫプローブの合成に好ましく使用される。
【０１２４】
ビルディングブロック(IV)は、カテプシンＢプローブ、例えば実施例18及び19の化合物の合成に好ましく使用される。
【０１２５】
本発明のプローブは、好ましくはカテプシンＫ、カテプシンＳ又はカテプシンＢのためのプローブである。
【０１２６】
本発明のプローブは、インビトロ、細胞培養実験、エキソビボ実験又は生体（インビボ）における分子イメージング（スクリーニング及び動物全体のイメージングを含む）の状況において使用される。たいていは、光イメージング及び磁気共鳴イメージング(MRI)のようなイメージング様式が好ましい。
【０１２７】
本発明のプローブは、プロテアーゼ活性の診断用イメージングのために使用されることを意図される。 薬物又は薬物様物質の標的プロテアーゼに対する効果をモニタリングする方法を提供する適用が最も好ましい。
【０１２８】
このような薬物又は薬物様物質の投与は、本発明のプローブからのシグナルに対して測定可能な作用を有するべきである。
【０１２９】
本発明のプローブのさらなる最も好ましい局面は、手術の誘導（surgical guidance）において及び治療効果のモニタリングのためのイメージング試薬としてのそれらの使用である。手術の誘導には、腫瘍縁の検出及び腫瘍転移の進行の検出が含まれる。
【０１３０】
従って、本発明のさらなる局面は生体のイメージング方法であり、この方法は: 
(a) 該生体に式（Ｉ）のプローブを投与すること、
(b) 該生体を、非クエンチフルオロフォアを励起して検出可能なシグナルを生じる電磁放射線に暴露させること、及び
(c) 該シグナルを検出して、それにより画像を作成すること
を含む。
【０１３１】
あるいは、生体のイメージング方法は:
(a) 該生体に式（Ｉ）のプローブを投与すること、
(b) 該生体を、フルオロフォアを励起して検出可能なシグナルを生じる電磁放射線に暴露させること;及び
(c) 該シグナルを検出して、それにより画像を作成すること、
を含む。
【０１３２】
「生体」は、検出されるべきシステインプロテアーゼを含むあらゆる生細胞でも生物全体でもよく、好ましくは生体は哺乳動物、例えばマウス又はラットである。
【０１３３】
本発明のプローブは高度に選択的であり、それにより偽陽性の危険性を回避することができる。
【０１３４】
略語:
DMF＝ジメチルホルムアミド
DMSO＝ジメチルスルホキシド
DCM＝ジクロロメタン
equiv.＝当量
sat.＝飽和
THF＝テトラヒドロフラン
DIPEA＝ジイソプロピル−エチルアミン
HOBt＝1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HBTU＝O−ベンゾトリアゾール−N,N,N’,N’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート
NHS＝N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル
【０１３５】
固相ペプチド合成の一般的手順:
以下のプローブを、標準的な固相ペプチド合成を使用して合成した。クロロ−トリチル−樹脂を固体支持体として使用した。樹脂のロードに２equiv.のFmoc保護アミノ酸及び３equiv.のDIPEAをDCMに溶解し、そして反応混合物を樹脂に加えた(ローディング: 1.4mmol／ｇ)。反応混合物を室温で終夜撹拌した。樹脂をDCM及びDMFで洗浄した。Fmoc−脱保護のために樹脂を30％ ピペリジン／DMF溶液で15分間２回処理した。固相ペプチド合成のために、標準的なプロトコルを使用した: 4 equiv.のFmoc−保護アミノ酸、4 equiv.のHBTU、4 equiv.のHOBt及び8 equiv.のDIPEAをDCM／DMF(1／1)の混合物に溶解した。反応混合物を室温で２０分間攪拌し、次いで樹脂に加えた。反応混合物を２時間インキュベートした。固相からの切断のために、樹脂をDCM中２％ TFAで処理した。溶媒を減圧下でトルエンと共にエバポレートし（coevaporated）、そして最終生成物を分取HPLC (グラジエント: H2O＋0.05％ TFA; 5〜95％ CH3CN)により精製した。
【０１３６】
実施例１: カテプシンＳプローブ
【化５３】
2010519320.tif 000055
化合物を固体支持体上で一般的手順に従って製造し、そしてHPLC (H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN)により精製した。計算値: [M＋H]＋＝1033.25、実測値 [M＋H]＋＝1033.40. 収率: 97％。
【０１３７】
実施例２: カテプシンＳプローブ
【化５４】
2010519320.tif 000056
この化合物を固体支持体上で一般的手順に従って製造し、HPLC (H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN)により精製した。計算値: [M＋H]＋＝1042.26、実測値 [M＋H]＋＝1042.40. 収率：82％。
【０１３８】
実施例３: カテプシンＳプローブ
【化５５】
2010519320.tif 000057
この化合物を固体支持体上で一般的手順に従って製造し、HPLC (H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN) により精製した。計算値: [M＋H]＋＝1341.59、実測値 [M＋H]＋＝1341.45.
収率：91％.
【０１３９】
実施例４: カテプシンＳプローブ
【化５６】
2010519320.tif 000058
この化合物を固体支持体上で一般的手順に従って製造し、HPLC (H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN) により精製した。計算値: [M／2]＋＝829.95、実測値 [M／2]＋＝829.95. 収率：62％。
【０１４０】
実施例５
【化５７】
2010519320.tif 000059
この化合物を固体支持体上で一般的手順に従って製造し、精製することなくさらに使用した。計算値: [M＋H]＋＝513.7、実測値 [M＋H]＋＝513.3。
【０１４１】
実施例６
【化５８】
2010519320.tif 000060
実施例５の化合物、1.2 equiv. HOBt、1.3 equiv. HBTU及び2 equiv. DIPEAをDCM／DMFに溶解し、室温で20分間攪拌した。2 equiv.のモノ−Fmoc−保護ブタン−1,4−ジアミン及び1.5 equiv.のDIPEAを反応混合物に加え、次いでこれを終夜撹拌した。溶媒を除去し、残った残留物をシリカゲルで精製した(グラジエント: DCM／1−5％ MeOH). 計算値: [M＋H]＋＝805.0、実測値 [M＋H]＋＝806.5. 収率：55％。
【０１４２】
実施例７ 
【化５９】
2010519320.tif 000061
Boc基の除去のために、実施例６の化合物を50％TFA／CH2Cl2に溶解し、そして反応混合物を10分間室温で撹拌した。溶媒をトルエンと共にエバポレートし、残留物をDMFに溶解した。1 equiv.のBodipyTMR−X−OSu及び6 equiv.のDIPEAを反応混合物に加えた。この反応混合物を室温で12時間撹拌した。溶媒を除去し、そして最終生成物を分取HPLC (Plab)により精製した。計算値: [M＋Na]＋＝1221.3、実測値 [M＋Na]＋＝1221.6。
【０１４３】
実施例８
【化６０】
2010519320.tif 000062
Fmoc基の除去のために、実施例7の化合物をEt2NH／DMF (1／4)に溶解し、そして反応混合物を室温で３０分間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をDMFに再溶解した。QSY
7OSu及び6 equiv.のDIPEAを反応混合物に加えた。この反応混合物を室温で12時間撹拌した。溶媒を除去し、そして最終生成物を分取HPLC (グラジエント: H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN)により精製した。計算値: [M／2]＋＝808.4、実測値 [M／2]＋＝808.5。
【０１４４】
実施例９: カテプシンＳプローブ
【化６１】
2010519320.tif 000063
この化合物を固体支持体上で一般的手順に従って製造し、HPLC (グラジエント: H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN)により精製した。計算値: [M＋H]＋＝1114.3、実測値 [M＋H]＋＝1114.4。
【０１４５】
実施例10: カテプシンＳプローブ
【化６２】
2010519320.tif 000064
この化合物を固体支持体上で、固相ペプチド合成のための一般的手順に従って製造し、そしてさらに実施例５〜実施例８の変換について記載される方法と同じ方法で修飾した。この化合物をHPLC(グラジエント: H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN)により精製した。計算値: [M＋H]＋＝1198.3、実測値 [M＋H]＋＝1198.3。
【０１４６】
実施例11: カテプシンＳプローブ
【化６３】
2010519320.tif 000065
この化合物を固体支持体上で、固相ペプチド合成のための一般的手順に従って製造し、そしてさらに実施例５〜実施例８の変換について記載される方法と同じ方法で修飾した。この化合物をHPLC(グラジエント: H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN)により精製した。計算値: [M＋Na]＋＝1619.1、実測値 [M＋Na]＋＝1619.9。
【０１４７】
実施例11a: カテプシンＳプローブ
【化６４】
2010519320.tif 000066
この化合物を固体支持体上で、固相ペプチド合成のための一般的手順に従って製造し、そしてさらに実施例５〜実施例８の変換について記載される方法と同じ方法で修飾した。この化合物をHPLC(グラジエント: H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN)により精製した。
【０１４８】
実施例12: カテプシンＫプローブ
【化６５】
2010519320.tif 000067
この化合物を固体支持体上で一般的手順に従って製造し、HPLC(H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN)により精製した。計算値: [M＋H]＋＝1117.37、実測値 [M＋H]＋＝1117.50. 収率：45％。
【０１４９】
実施例13: カテプシンＫプローブ
【化６６】
2010519320.tif 000068
この化合物を固体支持体上で一般的手順に従って製造し、HPLC(H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN) により精製した。計算値: [M＋H]＋＝1186.4、実測値 [M＋H]＋＝1186.3. 収率：90％。
【０１５０】
実施例14: カテプシンＫプローブ
【化６７】
2010519320.tif 000069
この化合物を固体支持体上で一般的手順に従って製造し、HPLC(H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN) により精製した。計算値: [M＋H]＋＝1273.4、実測値 [M＋H]＋＝1273.4。
【０１５１】
実施例15: カテプシンＫプローブ
【化６８】
2010519320.tif 000070
この化合物を固体支持体上で、固相ペプチド合成のための一般的手順に従って製造し、そしてさらに実施例５〜実施例８の変換について記載される方法と同じ方法で修飾した。この化合物をHPLC (H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN)により精製した。計算値: [M＋H]＋＝1301.5、実測値 [M＋H]＋＝1301.3。
【０１５２】
実施例16: カテプシンＫプローブ
【化６９】
2010519320.tif 000071
この化合物を固体支持体上で、固相ペプチド合成のための一般的手順に従って製造し、そしてさらに実施例５〜実施例８の変換について記載される方法と同じ方法で修飾した。この化合物をHPLC(H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN)により精製した。計算値: [M]＋＝1663.9、実測値 [M]＋＝1663.7。
【０１５３】
実施例17: カテプシンＫプローブ
【化７０】
2010519320.tif 000072
この化合物を固体支持体上で、固相ペプチド合成のための一般的手順に従って製造し、そしてさらに実施例５〜実施例８の変換について記載される方法と同じ方法で修飾した。この化合物をHPLC (H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN)により精製した。
【０１５４】
実施例18: カテプシンＫプローブ
【化７１】
2010519320.tif 000073
この化合物を固体支持体上で、固相ペプチド合成のための一般的手順に従って製造し、そしてさらに実施例５〜実施例８の変換について記載される方法と同じ方法で修飾した。この化合物をHPLC (H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN)により精製した。
【０１５５】
実施例19
【化７２】
2010519320.tif 000074
4−Fmoc−アミノ酪酸、1.1 equiv.のHOBt、1.1 equiv.のHBTU及び2 equiv.のDIPEAをDMF／DCM (1／1)に溶解し、そして20分間室温で撹拌した。4−アミノ−2−フルオロ安息香酸及び2 equiv.のDIPEAを反応混合物に加え、そして室温で終夜撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、そして残った残留物をクロマトグラフィーにかけた(グラジエント: DCM／1−3％ MeOH)。計算値: [M＋H]＋＝463.5、実測値 [M＋H]＋＝463.1.収率：60％。
【０１５６】
実施例20: カテプシンＢプローブ
【化７３】
2010519320.tif 000075
この化合物を固体支持体上で一般的手順に従って製造し、HPLC(H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN)により精製した。計算値: [M＋H]＋＝1615.8、実測値 [M＋H]＋＝1615.5. 収率：42％。
【０１５７】
実施例21: カテプシンＢプローブ
【化７４】
2010519320.tif 000076
この化合物を固体支持体上で一般的手順に従って製造し、HPLC (H2O＋0.05％ TFA; 4−95％ CH3CN) により精製した。計算値: [M／2]＋＝718.3、実測値 [M／2]＋＝718.8. 収率：10％
【０１５８】
実施例22: 1−Boc−4−(3−クロロプロピル)−ピペラジン
4.94ｇ tert−ブチル−1−ピペラジン−カルボキシレート及び12.66ｇ 1−ブロモ−3−クロロプロパンの15ml DMF(乾燥)中溶液に、4.08ｇ K2CO3を加え、そして反応系を50℃に１分間加熱し、そして室温でさらに３時間撹拌した。この反応混合物を水200mlに注ぎ入れ、そしてDCMで抽出した。合わせた有機相を水で洗浄し、そしてMgSO4で乾燥し、真空でエバポレートした。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(n−ヘプタン／酢酸エチル 1：1、RF＝0.3)により精製した。収量3.9ｇ。
【０１５９】
実施例23: 1−Boc−4−(3−アジドプロピル)−ピペラジン
Tert−ブチル−4−(3−クロロプロピル)−1−ピペラジンカルボキシレート及びアジ化ナトリウムを８ml DMSO（乾燥）に溶解（懸濁）し、そして90℃に１５時間加熱した。この反応混合物を室温まで放冷させて水50mlに注ぎ入れた。生成物をDCMで抽出し、そして合わせた有機相をMgSO4で乾燥した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(n−ヘプタン／酢酸エチル 1：1、RF＝0.34)により精製した。収率：3.5ｇ。
【０１６０】
実施例24: (3−アジドプロピル)−ピペラジン
3.5ｇ 1−Boc−4−(3−アジドプロピル)−ピペラジンを30ml MeOH／DCM (3／1)に溶解し、そして１０ml TFAを加えた。この反応混合物を室温で２０分間撹拌し、そして150ml tert−ブチル−メチルエーテルを加えることにより生成物を沈殿させた。収量2.3ｇ。
【０１６１】
実施例25: メチル−ピペラジニルチオ尿素
チオカルボニルジイミダゾ−ル及び1equiv.のN−メチル−ピペラジンをTHFに溶解した。反応混合物を室温で１時間、そして５５℃で１時間撹拌した。溶媒の半分を除去して、同じ量の2.0 M NH3／MeOH溶液を反応混合物に加え、次いでこれを室温で終夜撹拌し、最後に55℃で２時間撹拌した。生成物をろ過し、そしてエーテルで洗浄した。収率：57％。
【０１６２】
実施例26: メチル−ピペラジニル−チアジル−安息香酸
4−メチルピペラジニルチオ尿素及び4−(2−ブロモアセチル)安息香酸をTHFに溶解した。反応混合物を３時間加熱還流させた。生成物をろ過し、そしてエーテルで洗浄した。
【０１６３】
実施例27: 活性−アッセイ
インビトロアッセイのために、20μl AHNP−Puffer (150mM アセタート（Acetat）／HEPES、300mM NaCl; 0.001％ プルロニック pH 6.5及び50μl システイン (300mM)中のプロテアーゼ１μgを５分間３７℃にて活性化した。基質をDMSOに溶解し、最終濃度50μMで酵素溶液に加えた。
【０１６４】
蛍光をTecan SAFIRE II分光計(励起波長: 336nm; 発光波長: 490nm; 励起帯: 10.0nm; 発光帯: 10.0nm; 増幅 (手動): 90)で測定した。
【０１６５】
【表２】
2010519320.tif 000077
【国際調査報告】
2010519320.tif 000127
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