(57)【要約】本発明は、癌の処置に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物における抗癌活性が、相乗有効量のＴＮＦおよびα−ガラクトシルセラミドの組み合わせを哺乳動物宿主に投与することによって増大され得ることを示す。
2010519274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦおよびα−ガラクトシルセラミドを含む医薬組成物。
【請求項２】
ＴＮＦが組換え体であり、そして該ＴＮＦがヒトである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
化学療法剤をさらに含む、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
癌を処置するための医薬の製造のための、請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬組成物の使用。
【請求項５】
単回α−ガラクトシルセラミド用量がＴＮＦの投与の少なくとも１時間前に投与される、請求項４記載の使用。
【請求項６】
ＴＮＦでの処置が少なくとも５連続日間毎日施される、請求項５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌の処置に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物における抗癌活性が、相乗有効量のＴＮＦおよびα−ガラクトシルセラミドの組み合わせを哺乳動物宿主に投与することによって増大され得ることを示す。
【０００２】
発明の緒言
ヒトにおける悪性腫瘍を処置するための２個以上の抗癌薬を使用する併用療法が、研究および臨床において現在使用されている。抗癌薬は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、免疫賦活剤、サイトカインなどであり得る。前記薬物の組み合わせは、大部分の癌（例えば、癌腫、黒色腫、リンパ種および肉種）に対する相乗的細胞傷害効果を得ようとして、薬剤耐性細胞の出現を低下させるかまたは排除しようとして、そして各々の薬物に対する副作用を低下させようとして投与される。
【０００３】
１５７アミノ酸のタンパク質である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、元来、Carswell et al (1975) (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1975:72, 666)によって、細菌性内毒素への曝露の後に宿主によって放出される可溶性因子として、そして腫瘍細胞傷害性を担うとして見出された。その抗腫瘍効果に加えて、ＴＮＦは、免疫調節、代謝、造血および筋骨格成長に関与する。しかし、ＴＮＦは非常に毒性であり、そして、癌の処置においてＴＮＦを評価しようとする試みにおいて、低血圧、発熱、悪寒、疲労および頭痛が一般に観察されることが臨床試験により示されており、このことがＴＮＦの全身的使用を妨げている。
【０００４】
α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）は、元来、海綿Agelas mauritianusから単離されており、そしてこの化合物が前臨床動物モデルにおいて抗腫瘍および免疫賦活活性を示すことが見出された（例えば特許ＥＰ０６０９４３７Ｂ１参照）。ＫＲＮ７０００は、実験研究において最も頻繁に使用されている合成α−ＧａｌＣｅｒである。臨床的抗腫瘍効果は記録されなかったので、ＫＲＮ７０００を使用する臨床試験は期待に反するものであった（Giaccone G et al (2002) Clin Cancer Res 8: 3702）。さらに、近年の研究は、α−ＧａｌＣｅｒの逐次的用量の使用がＴ細胞のアネルギー性状態を導き得ることを指摘している（Parekh VV et al (2005) J Clin. Invest. 115(9):2572-83）。
【０００５】
本発明において、本発明者らは、α−ガラクトシルセラミドとの組み合わせでの、治療量以下（sub-therapeutic）の量のＴＮＦの使用が、種々の形態の癌の処置において驚くべき相乗作用を与えることを見出した。さらに、本発明者らは、この相乗的組み合わせが正常細胞に対する有意な細胞傷害効果を有さず、従って癌と戦うために安全に使用され得ることを示した。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】腫瘍実験。グラフの下の線は処置期間を表す。矢印はα−ＧａｌＣｅｒの注射の時点を示す。データを平均±ＳＥＭとして示す。ＰＢＳについてはｎ＝６であり、ヒトＴＮＦ（ｈＴＮＦ）についてはｎ＝７であり、全ての他の群についてはｎ＝２である。（Ａ）α−ＧａｌＣｅｒ（２μｇ／マウス）およびｈＴＮＦでの処置の後の、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける皮下成長Ｂ１６ＢＩ６黒色腫の成長曲線。（Ｂ）全身毒性についての尺度としての処置の間のマウスの相対的体重。処置前の平均体重は２２．３ｇであった（１３日目）。
【図１Ｂ】腫瘍実験。グラフの下の線は処置期間を表す。矢印はα−ＧａｌＣｅｒの注射の時点を示す。データを平均±ＳＥＭとして示す。ＰＢＳについてはｎ＝６であり、ヒトＴＮＦ（ｈＴＮＦ）についてはｎ＝７であり、全ての他の群についてはｎ＝２である。（Ａ）α−ＧａｌＣｅｒ（２μｇ／マウス）およびｈＴＮＦでの処置の後の、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける皮下成長Ｂ１６ＢＩ６黒色腫の成長曲線。（Ｂ）全身毒性についての尺度としての処置の間のマウスの相対的体重。処置前の平均体重は２２．３ｇであった（１３日目）。
【図２Ａ】α−ＧａｌＣｅｒでの前処置は治療量以下のＴＮＦに対して感作する。グラフの下の線はｈＴＮＦまたはマウスＴＮＦ（ｍＴＮＦ）での処置期間を表す。緑色矢印はα−ＧａｌＣｅｒの注射の時点を示す。データを平均±ＳＥＭとして示す、ｎ＝７。（Ａ）α−ＧａｌＣｅｒ（１μｇ／マウス）、ｈＴＮＦおよび低用量ｍＴＮＦでの処置の後の、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける皮下成長Ｂ１６ＢＩ６黒色腫の成長曲線。（Ｂ）全身毒性についての尺度としての処置の間のマウスの相対的体重。処置前の平均体重は２２．２ｇであった（１３日目）。
【図２Ｂ】α−ＧａｌＣｅｒでの前処置は治療量以下のＴＮＦに対して感作する。グラフの下の線はｈＴＮＦまたはマウスＴＮＦ（ｍＴＮＦ）での処置期間を表す。緑色矢印はα−ＧａｌＣｅｒの注射の時点を示す。データを平均±ＳＥＭとして示す、ｎ＝７。（Ａ）α−ＧａｌＣｅｒ（１μｇ／マウス）、ｈＴＮＦおよび低用量ｍＴＮＦでの処置の後の、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける皮下成長Ｂ１６ＢＩ６黒色腫の成長曲線。（Ｂ）全身毒性についての尺度としての処置の間のマウスの相対的体重。処置前の平均体重は２２．２ｇであった（１３日目）。
【０００７】
目的および詳細な説明
本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびα−ガラクトシルセラミドの組み合わせ、ならびに抗腫瘍治療剤としての前記組み合わせの使用に関する。
【０００８】
従って、本発明は、ＴＮＦおよびα−ガラクトシルセラミドを含む医薬組成物を提供する。
【０００９】
特定の実施態様において、前記医薬組成物は、相乗有効量のＴＮＦおよびα−ガラクトシルセラミドを含む。
【００１０】
別の特定の実施態様において、前記ＴＮＦは哺乳動物種、好ましくはヒト由来である。別の特定の実施態様において、前記医薬組成物は細胞を含まず、そしてリンホトキシンを含まない。
【００１１】
さらに別の特定の実施態様において、前記医薬組成物中の前記ＴＮＦは、治療量以下の量で存在する。化合物（ここではＴＮＦ）の治療量以下の効果は、当該化合物が腫瘍を保有する哺乳動物宿主に当該化合物（すなわち、ここではＴＮＦ）単独の治療量以下の用量として投与されるときに、統計的に関係のある効果が腫瘍成長に対して観察されないことを意味する。
【００１２】
さらに別の実施態様において、ＴＮＦおよびα−ガラクトシルセラミドを含む医薬組成物は、化学療法剤をさらに含む。
【００１３】
さらに別の実施態様において、本発明は、癌の治療的処置のためのＴＮＦおよびα−ＧａｌＣｅｒを含む医薬組成物の使用を提供する。
【００１４】
さらに別の実施態様において、ＴＮＦおよびα−ＧａｌＣｅｒを含む医薬組成物の使用は転移の処置のために使用される。
【００１５】
特定の実施態様において、前記ＴＮＦおよびα−ガラクトシルセラミドは逐次的に投与される。
【００１６】
別の特定の実施態様において、ＴＮＦの投与はα−ガラクトシルセラミドの投与に先行する。
【００１７】
好ましい実施態様において、α−ガラクトシルセラミドの投与はＴＮＦの投与に先行する。
【００１８】
さらに別の好ましい実施態様において、α−ＧａｌＣｅｒの投与はＴＮＦの投与に先行し、ここで前記α−ＧａｌＣｅｒの投与は、ＴＮＦの投与の少なくとも１時間前に投与される単回用量からなる。特定の実施態様において、前記α−ＧａｌＣｅｒの単回用量は、ＴＮＦの投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２時間前に投与される。さらに別の特定の実施態様において、前記α−ＧａｌＣｅｒの単回用量は、ＴＮＦの投与の少なくとも１日前に投与される。さらに別の特定の実施態様において、α−ＧａｌＣｅｒの少なくとも２つの用量が、ＴＮＦの投与の前に投与される。
【００１９】
別の好ましい実施態様において、ＴＮＦの投与は少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８または少なくとも９連続日間毎日である。
【００２０】
用量および投与計画が、ＴＮＦおよびα−ガラクトシルセラミドが別々にまたは混合物として投与されるかどうか、癌の型、患者、および患者の病歴に主に依存することは、医師の当業者にとって明らかなはずである。量は、相乗的な腫瘍縮小を達成するために有効でなければならない。多回用量が用いられる場合（例えば、ＴＮＦについて好ましい）、投与の頻度は、例えば、宿主の型および癌の型、投与量などに依存する。いくつかの型の癌については毎日の投与が有効であり、一方他については１日おきまたは３日ごとの投与が有効であるが毎日の投与は有効ではない。医師は、日常的実験に際して、どの投与経路および投与頻度が任意の特定の症例において最も有効であるかを確認することができる。
【００２１】
「ＴＮＦ」によって、下記の種々の形態のＴＮＦが意味される：
１５１および１５５アミノ酸（ネイティブ形態より２および６個少ない）を有するヒトＴＮＦのクローニングがＥＰ１５５，５４９（Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.）に開示されており、そして１５５アミノ酸を有するヒトＴＮＦがＥＰ１５８，２８６（Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha）に開示されている。成熟ＴＮＦ（１５７アミノ酸）およびその種々の改変形態（ムテイン）のクローニングがＥＰ１６８，２１４（Genentech）に開示されている。組換えヒトＴＮＦはPennica et al., Nature (1984), 312:724-729；Yamada et al., J. Biotechnology (1985), 3:141-153；Wang et al., Science (1985), 228:149-154、ＥＰ１５５，５４９およびＥＰ１６８，２１４によって記載されるように得られ得る。ＴＮＦは好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約１５，０００〜２０，０００ダルトンの分子量を有するヒト非グリコシル化ＴＮＦである。特定の実施態様において、ＴＮＦは、最初の８個までのアミノ酸残基が、ＵＳ４，６７７，０６４およびＵＳ４，６７７，０６３に記載の手順を使用して欠失されている、ヒトＴＮＦムテインである。ＴＮＦはＵＳ６９８，９３９に記載のシステイン枯渇ムテインである。ヒト適用のために、好ましくは、ＴＮＦはヒト供給源に由来する。さらにより好ましくは、ヒト適用のためのＴＮＦは組換え非グリコシル化ヒトＴＮＦである。
【００２２】
「α−ガラクトシルセラミドまたはα−ＧａｌＣｅｒ」によって、可変長さのスフィンゴシン鎖およびアシルを有するセラミド脂質にα結合によって結合されたガラクトース炭水化物を含むスフィンゴ糖脂質由来の誘導体またはアナログが意味される。ＫＲＮ７０００（２Ｓ  ３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｎ−ヘキサコサノイル−２−アミノ−１，３，４−オクタデカントリオール）は、実験研究において、そしてまた本発明の実施例１において、最も頻繁に使用されている合成α−ＧａｌＣｅｒである。本発明はまた、特許ＥＰ０６０９４３７Ｂ１（Kirin Beer Kabushiki Kaisha）、出願ＷＯ２００６０２６３８９（Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University）、出願ＵＳ２００４０１２７４２９に記載されるα−ガラクトシルセラミドを意図する。特に、後者の出願において、Ｏ−グリコシドよりインビボにおいて酵素分解に対する感受性が低いα−ＧａｌＣｅｒのＣ−グリコシドアナログが記載されている。特定のＣ−グリコシド（ＫＲＮ７０００のアナログ）がYang G. et al (2004) Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3818-3822に記載されている。本発明の医薬組成物において使用するα−ＧａｌＣｅｒの好ましい範囲は２０〜２００μｇ／ｋｇである。
【００２３】
従って、α−ガラクトシルセラミドおよびＴＮＦの組み合わせは、黒色腫、肺癌およびリンパ腫のような種々の形態の癌の処置において驚くべき相乗作用を提供することが見出される。
【００２４】
本明細書において使用する用語「治療的」処置は、宿主が癌にかかった（任意の手段によって決定される）後の宿主へのＴＮＦおよびα−ガラクトシルセラミドの投与を指す。存在する腫瘍負荷が減少されないかまたはより優先的には除去されない場合、処置は治療的であるとはみなされない。
【００２５】
本明細書において使用する用語「癌」は、例えば、腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性白血病、乳癌、肉腫、卵巣癌、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭扁平上皮癌、および胃腸癌または胃癌のような細胞性障害を含む任意の腫瘍性障害を指す。好ましくは、癌は肺癌、黒色腫およびリンパ腫である。
【００２６】
ＴＮＦおよびα−ガラクトシルセラミドに適用される本明細書において使用する用語「相乗有効量」は、腫瘍体積の減少に有効であり、そして、ＴＮＦの用量対α−ガラクトシルセラミドの用量対腫瘍体積の減少の用量応答プロットにおいて、用量ＴＮＦ軸または用量α−ガラクトシルセラミド軸のいずれかと交差しない効果を生じる医薬組成物の各成分の量を指す。当該分野において相乗作用を決定するために使用される用量応答曲線は、Sande et al., p. 1080-1105 in A. Goodman et al, ed., the Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan Publishing Co., Inc., New York (1980)に十分に記載されている。９５％信頼限界を使用して、用量レベル、スケジュールおよび応答のような因子を変動させ、そしてα−ガラクトシルセラミドおよびＴＮＦの種々の組み合わせについての用量応答曲線からイソボログラムを生成するコンピューター生成モデルを使用することによって、至適相乗量を決定することができる。用量応答曲線上での腫瘍体積の最高の減少は至適投与量レベルと相関する。
【００２７】
本明細書において使用する用語「組換え体」は、組換えＤＮＡ技術によって産生されるＴＮＦを指し、ここで一般にＴＮＦをコードする遺伝子は公知の組換えＤＮＡ技術によってクローン化される。組換え宿主は真核生物または原核生物宿主であり得る。
【００２８】
本明細書において使用する用語「薬学的に許容しうる」は、活性成分の生物活性の有効性に干渉せず、そしてそれが投与される宿主に対して毒性でない担体媒体を指す。
【００２９】
本発明の医薬組成物の投与は、非経口投与を含む任意の適切な技術によって生じ得る。非経口投与の例には、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、および腹腔内が含まれ、マウスモデルについては腹腔内投与が好ましく（利便性のために）、そしてより高等な哺乳動物のためには静脈内および皮下が好ましい。
【００３０】
本明細書において最も有効であるようである投与量は、腫瘍退縮または完全退縮を生じ、そして宿主に対して毒性でないものである。この至適レベルは、多くの因子、例えば宿主の型および癌の型、投与の経路、スケジュール、存在する腫瘍負荷、α−ガラクトシルセラミドおよびＴＮＦの型、ならびに毒性の定義に依存する。宿主に対する毒性は、副作用の程度および型によって、または体重減少の量によって、または特定期間後の死亡によって定義され得る。体重減少が毒性の規準である場合、典型的には、１０〜２０％の体重減少が許容され、２０％より多い減少が毒性であるとみなされる。
【００３１】
２０％より多い体重減少が毒性であるとみなされる場合、宿主がマウスである場合、投与経路がインビトロで調製された混合物を介する腹腔内であり、そして毎日または１日おきである場合、組換え産生される治療量以下のＴＮＦの各々の投与における投与量レベルは、好ましくは約２０〜約５０μｇ  ＴＮＦ／ｋｇ宿主体重である（これらの治療量以下のレベルはマウス治療レベルより約５〜１０倍低いことに留意されたい）。ヒト適用に対して算出すると、ＴＮＦの範囲は約５０〜３００μｇ／ｍ２である。
【００３２】
非経口投与のために、医薬組成物は一般に単位投与量注射用形態（溶液、懸濁液、乳濁液）で、好ましくは固有に非毒性でありそして非治療的である薬学的に許容しうる担体媒体中で処方される。そのようなビヒクルの例には、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、マンニトールおよび正常血清アルブミンが含まれる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルも使用され得る。担体媒体は少量の添加物、例えば等張性および化学的安定性を増強する物質（例えば、緩衝剤および保存料）を含み得る。ＴＮＦは、典型的には、そのような担体中で約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で処方される。
【００３３】
あるいは、医薬組成物を、無菌安定凍結乾燥処方物に作製し得、ここで精製化合物（すなわちＴＮＦおよびα−ＧａｌＣｅｒ）はマンニトールのような水溶性担体（これはかさを与える）、および水中のα−ガラクトシルセラミドの溶解性を確実にするために十分な量の界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウムのような）と混合され得る。処方物は非経口投与用の水性注射剤中での再構成のために適切であり、そしてそれは安定でありそしてヒト患者において十分に許容される。
【００３４】
医薬組成物およびその使用が獣医学的動物の処置にも適用され得ることは明らかであるはずである。そのような適用のために、ＴＮＦを組織培養物からまたは組換え技術によって、そして例えばウサギ、霊長類、ブタ、ウシ、ネコおよびイヌのような任意の哺乳動物供給源から調製し得る。
【００３５】
本発明の種々の態様を以下の実施例によってさらに記載する。いかにしてもこれらが本発明を限定することは意図されない。
【００３６】
材料および方法
１．試薬
適切な発現プラスミドを含むEscherichia coliによって産生された組換えヒトＴＮＦ（ｈＴＮＦ）およびマウスＴＮＦ（ｍＴＮＦ）（Marmenout A. (1985) Eur J Biochem. 152(3):515-22）を見かけ上均一に精製した。記載されるＬ９２９ｓ細胞傷害性アッセイ（Takahashi et al., 1995）によって決定された比活性はそれぞれ６．１×１０７ＩＵ／ｍｇおよび１．２８×１０８ＩＵ／ｍｇであった。ｈＴＮＦおよびｍＴＮＦの両方について、リムルスアメーバ細胞溶解物アッセイ（Coatest; Chromogenix, Stockholm, Sweden）によってアッセイされた内毒素含量は＜１０Ｕ／ｍｇであった。使用したα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）はＫＲＮ７０００と同じ構造を有しており、そしてLaboratory for Medical Chemistry（Ghent University, Belgium）のSerge Van Calenberghのグループによって合成された。
【００３７】
２．マウス
雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ＠ＲＪマウスをJanvier（Le Genest-Saint-Isle, France）から購入した。動物を、１４−１０時間明／暗サイクルで、温度制御され、空気調節された部屋に収容し、そして食餌および水を随意に与えた。マウスを腫瘍実験のために８〜１２週齢で使用した。
【００３８】
３．腫瘍細胞
メラニン陽性黒色腫Ｂ１６ＢＩ６細胞（Hart et al., 1979）を、１０％ＦＣＳ、５０ＩＵ／ｍｌペニシリンＧ、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．４ｍＭ Ｎａ−ピルビン酸を補充したＲＰＭＩ １６４０（Invitrogen）中で培養した。腫瘍接種のために、細胞を培養フラスコから短時間のＥＤＴＡ処理によって剥離させ、内毒素不含無菌ＰＢＳ（Sigma）中で３回洗浄し、そしてＰＢＳ中に６×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。
【００３９】
４．腫瘍実験
０日目に、マウスに６×１０５個の細胞を皮下で後肢のちょうど前の背中に接種した。腫瘍サイズ指数（ＴＳＩ）（すなわち、最大の垂直直径（ｃｍ）の積）が０．５に達したときに（１３日目）処置を開始した。ｈＴＮＦ（３０μｇ／注射）または低用量ｍＴＮＦ（０．７μｇ／注射）での処置を９または１０連続日間毎日、病巣近傍（paralesional）注射（腫瘍部位の付近であるが小結節の外での皮下注射）を介して与えた。α−ＧａｌＣｅｒ（１〜２μｇ／注射）を腹腔内注射した。全ての薬剤をＰＢＳ中で１００μｌ／注射の最終容量に希釈した。コントロールマウスに１００μｌのＰＢＳを注射した。ＴＳＩおよび体重を、毎日注射の前に、そして処置が完了したときは２または３日毎に測定した。
【００４０】
実施例
１．α−ＧａｌＣｅｒとＴＮＦとの間の相互作用
ＮＫＴ細胞の活性化がＴＮＦでの治療量以下処置に対して感作するかどうか決定するために、皮下で成長するＢ１６ＢＩ６腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを特異的ＮＫＴ細胞アゴニストα−ＧａｌＣｅｒおよびｈＴＮＦまたは低用量ｍＴＮＦのいずれかの組み合わせで処置した。
【００４１】
本発明者らは、ＴＮＦと比較して何がα−ＧａｌＣｅｒを注射するために至適の時点であるかを評価するために、まずパイロット実験を行った。α−ＧａｌＣｅｒを、ＴＮＦでの処置の開始の１日前、１時間前、または１日後のいずれかで注射した。ＰＢＳ処置マウスにおいて、腫瘍は直線的に成長した。α−ＧａｌＣｅｒまたはｈＴＮＦ単独での処置は、それぞれ腫瘍成長に対する効果も腫瘍抑制性（tumouristatic）効果も有さなかった。しかし、α−ＧａｌＣｅｒおよびｈＴＮＦの組み合わせに対する応答は顕著であり、全ての処置した動物において腫瘍が退縮した（腫瘍サイズの２５％超の減少）（図１Ａ）。さらに、Ｂ１６ＢＩ６腫瘍の完全退縮（触知可能腫瘍なし）が、α−ＧａｌＣｅｒをｈＴＮＦの１日前に注射した場合に両方の処置したマウスにおいて、そしてα−ＧａｌＣｅｒをｈＴＮＦでの処置の開始の１日後に注射した場合に２匹の処置したマウスのうち１匹において得られた。α−ＧａｌＣｅｒおよびｈＴＮＦでの併用処置は、ｈＴＮＦ単独に比較して、全身毒性の穏やかな増加を引き起こした（図１Ｂ）。α−ＧａｌＣｅｒをｈＴＮＦの１時間前に注射した場合に、２匹の処置したマウスのうち１匹が死亡した。これらの結果から、本発明者らは、α−ＧａｌＣｅｒを注射するために至適の時点はＴＮＦでの処置の開始の１日前であると結論付けた。
【００４２】
次に、本発明者らは、α−ＧａｌＣｅｒでの前処置がＴＮＦの抗腫瘍効果の有意な増加を引き起こすかどうかを決定するために大規模実験を行った。α−ＧａｌＣｅｒまたは低用量ｍＴＮＦ単独での処置は腫瘍成長に対して小さな阻害効果を有し、一方ｈＴＮＦの効果は腫瘍抑制性であった。α−ＧａｌＣｅｒのｈＴＮＦまたは低用量ｍＴＮＦとの組み合わせは明らかに相乗的であった：処置は全ての処置した動物において腫瘍退縮を引き起こし（図２Ａ）、α−ＧａｌＣｅｒ＋ｈＴＮＦについて７匹の処置した動物のうち５匹において（２匹のマウスが処置の間に死亡した；ｈＴＮＦ単独についても２匹のマウスが処置の間に死亡した）、そしてα−ＧａｌＣｅｒ＋低用量ｍＴＮＦについて７匹の処置した動物のうち４匹において（１匹のマウスが処置の間に死亡した；ｍＴＮＦ単独についても１匹のマウスが処置の間に死亡した）完全であった。しかし、α−ＧａｌＣｅｒ＋ｈＴＮＦまたは低用量ｍＴＮＦの組み合わせは、ｈＴＮＦまたは低用量ｍＴＮＦ単独と比較して、全身毒性の穏やかな増加を引き起こすのみであった（図２Ｂ）。
【００４３】
総合すると、本発明者らは、α−ＧａｌＣｅｒの単回注射によるＮＫＴ細胞の特異的活性化がＴＮＦの抗腫瘍効果の選択的増加を誘導し得ることを示した。
【図１Ａ】
2010519274.tif 000003
【図１Ｂ】
2010519274.tif 000004
【図２Ａ】
2010519274.tif 000005
【図２Ｂ】
2010519274.tif 000006
【国際調査報告】
2010519274.tif 000007
2010519274.tif 000008