(57)【要約】本発明は、適切なプライマーを用いて、試料に含まれる標的核酸、または１以上の標的核酸の少なくとも１つの変異ヌクレオチドの、有無または量を検出するための方法およびキットを提供する。本発明は、伸長に依存したプライマーの分解が、標的の存在下に起こるようになり、その分解が検出可能な信号をもたらす系に基づいている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる標的核酸または１以上の標的核酸の少なくとも１つの変異ヌクレオチドの有無または量を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）前記試料を、標的核酸配列の第１領域に対する第１オリゴヌクレオチドプライマーで処理して、ハイブリダイゼーション条件下にその標的核酸にアニーリングされる第１オリゴヌクレオチドプライマーを含む二重鎖の混合物を作る工程であって、該第１プライマーのヌクレオチド配列は、その標的核酸の該第１領域にそれが実質的に相補的であるようなもので、該第１領域は変異被疑ヌクレオチドを含む診断部分である工程、
（ｂ）アニーリングした第１プライマーを、伸長可能であれば伸長させて第１プライマーの伸長産物を合成するのに適切なヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼを含む伸長条件下に、工程（ａ）の混合物を維持する工程、ならびに
（ｃ）第１プライマーの伸長産物を、存在すれば分解条件下に分解する工程であって、それにより前記標的核酸、または標的核酸中の変異ヌクレオチドの存在および／もしくは量の指標である、検出可能な信号を発生させる工程を含む方法。
【請求項２】
工程（ｂ）において、アニーリングした第１プライマーは伸長条件下に伸長可能でなく、このため第１プライマーの伸長産物は生じず、これにより工程（ｃ）において分解条件下に第１プライマーの伸長産物の分解が起こらず、そのため検出可能な信号は発生せず、これが前記標的核酸または標的核酸中の変異ヌクレオチドの非存在の指標となる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１プライマーの３’末端ヌクレオチドが変異被疑ヌクレオチドに相補的であって、第１プライマーがその変異被疑ヌクレオチドを含む標的領域にアニーリングすると、アニーリングした第１プライマーは伸長可能となり、また第１プライマーが正常ヌクレオチドを含む標的領域にアニーリングすると、アニーリングした第１プライマーは伸長可能とならない、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記変異被疑ヌクレオチドは、ＳＮＰまたは１以上の突然変異ヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記分解は、鋳型に依存する分解として行なわれる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記分解条件は、ヌクレアーゼ活性を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ヌクレアーゼ活性は、エキソヌクレアーゼ活性である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記ヌクレアーゼ活性は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡポリメラーゼによってもたらされる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、工程（ｂ）で使用されるものと同じである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼである、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つはラベルされ、これによりその第１プライマーの伸長産物の分解により検出可能な信号が発生する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記第１プライマーはラベルされ、これによりその第１プライマーの伸長産物の分解により検出可能な信号が発生する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）は、標的核酸配列の第１領域に対する第１オリゴヌクレオチドプライマー、および標的核酸配列の同じ鎖の第２領域に対する第２オリゴヌクレオチドプライマーで試料を処理して、ハイブリダイゼーション条件下に標的核酸にアニールされる第１および第２オリゴヌクレオチドプライマーを含む二重鎖の混合物を作る工程を含み、
該第１プライマーのヌクレオチド配列は、それが標的核酸の該第１領域に実質的に相補的になるようなものであり、
該第２プライマーのヌクレオチド配列は、それが標的核酸の前記第２領域に実質的に相補的になるようなものであって、かつ
その標的核酸の第２領域は、標的核酸の第１領域の５’に位置するようになっている、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）はさらに、アニーリングした第１および第２プライマーを、適切なヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼを含む伸長条件下に、伸長可能であれば伸長させて、第１および第２プライマーの伸長産物を合成する工程を含み、工程（ｃ）では、第２プライマーの伸長の結果として第１プライマーの伸長産物の分解が起こる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）はさらに、標的核酸配列の第１領域に対する少なくとも２つの型の第１オリゴヌクレオチドプライマーで試料を処理して、ハイブリダイゼーション条件下に標的核酸にアニーリングされる第１オリゴヌクレオチドプライマーを含む二重鎖の混合物を作ることを含み、
該第１プライマーのヌクレオチド配列は、それが標的核酸の該第１領域に実質的に相補的であるようなものであり、かつ
第１プライマーの該第１型の３’末端ヌクレオチドは、変異被疑ヌクレオチドに相補的であり、かつ
第１プライマーの該第２型の３’末端ヌクレオチドは、対応する正常ヌクレオチドに相補的であって、
これにより工程（ｂ）で、標的核酸配列中の変異被疑ヌクレオチドを含む第１領域に、第１プライマーの該第１型がアニーリングする場合は第１プライマーの第１型の伸長産物が合成され、一方、標的核酸中の対応する正常ヌクレオチドを含む第１領域に、第１プライマーの該第１型がアニーリングする場合は伸長産物が合成されず、かつ
これにより工程（ｂ）で、標的核酸配列中の正常ヌクレオチドを含む第１領域に、第１プライマーの該第２型がアニーリングする場合は第１プライマーの第２型の伸長産物が合成され、一方、標的核酸中の対応する変異ヌクレオチドを含む第１領域に、第１プライマーの該第２型がアニーリングする場合は伸長産物は合成されない、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
第１プライマーの前記第１型と第２型とは分解可能である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
第１プライマーの前記第２型は分解可能でなく、第１プライマーの第２型は、修飾されたヌクレオチドまたは修飾された結合または非ヌクレオチドを含み、これにより前記第１プライマーの第２型の伸長産物が、第２プライマーから開始される伸長を阻止し、それにより変異被疑ヌクレオチドを含む標的核酸を濃縮する、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、ＰＣＲ反応の一部であり、
試料を変性条件下に処理して、プライマー伸長産物を、このような伸長産物が形成されたその鋳型から分離し、
前記のように生産した一本鎖を、適切なヌクレオシド三リン酸、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、１以上の型の第１プライマー、第２プライマーおよび第３プライマーと、同時または順次のいずれかにて接触させ、前記または各第１プライマーは、第１プライマーの伸長産物の分解により検出可能な信号が発生するようにラベルされ、これにより、可能な場合、前記のように生産した一本鎖を鋳型として用いてさらに伸長産物が合成され、かつ５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する該核酸ポリメラーゼによって成し遂げられる、第１プライマーの伸長産物の分解が第２プライマーの伸長時に起こり、かつ該第３プライマーは、第２プライマーの伸長産物に実質的に相補的な配列を含み、
以上の工程を充分な回数繰り返して、それにより前記標的核酸または標的核酸中の変異ヌクレオチドの存在下に前記または各第１プライマーの分解から、検出可能な信号をもたらすことを含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記第１プライマーは、５’終端でない位置でラベルされる、請求項１３または請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記第１プライマーは、５’終端から少なくとも３ヌクレオチド離間したところでラベルされる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記第１プライマーは、５’終端から少なくとも６ヌクレオチド離間したところでラベルされる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記第１プライマーは、５’終端から少なくとも９ヌクレオチド離間したところでラベルされる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記第１プライマーは、相互作用性対である第１および第２ラベルを含む、請求項１３または請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
前記第１プライマーは、（ａ）前記標的核酸配列の第１領域に相補的なプライミング部分を含み、かつさらに（ｂ）前記標的核酸配列に相補的でない、非核酸またはヌクレオチドの配列の第１尾部を５’端に含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記第１プライマーはさらに、前記第１尾部に結合し、かつその第１プライマーのプライミング部分に相補的な領域に隣接する標的核酸配列に実質的に相補的である、非核酸またはヌクレオチドの配列の第２尾部を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記第１プライマーは、第１尾部で二本鎖部分を含み、前記第１尾部に相補的な尾部相補体オリゴヌクレオチドが前記第１尾部配列にアニーリングされ、
該第１プライマーは第１ラベルでラベルされ、かつ該尾部相補体オリゴヌクレオチドは第２ラベルでラベルされ、そして
該第１ラベルと第２ラベルとは相互作用性対である、請求項２５または請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記第１プライマーは、その第１プライマーにハイブリダイズできる第１相補体オリゴヌクレオチドと、二本鎖二重鎖を形成できる領域を含んでおり、
前記第１プライマーは、前記第１相補体オリゴヌクレオチドに対するよりも強い親和性で前記標的核酸にハイブリダイズでき、かつ
前記第１プライマーおよび前記第１相補体オリゴヌクレオチドは、第１ラベルと第２ラベルとからなる相互作用性ラベル対の一方のメンバーで各々ラベルされ、
前記標的核酸の増幅に伴い、前記第１プライマーは、前記第１相補体オリゴヌクレオチドよりも前記標的ヌクレオチドの増幅産物に優先的にハイブリダイズするようになっており、それにより前記相互作用性ラベル対は分離される、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記第２プライマーは、第２プライマーにハイブリダイズできる第２相補体オリゴヌクレオチドと、二本鎖二重鎖を形成できる領域を含んでおり、
前記第２プライマーは、前記第２相補体オリゴヌクレオチドに対するよりも強い親和性で前記標的核酸にハイブリダイズでき、かつ
前記プライマーおよびその相補体オリゴヌクレオチドは、第１ラベルと第２ラベルとからなる相互作用性ラベル対の一方のメンバーで各々ラベルされ、
前記標的核酸の増幅に伴い、前記プライマーは、前記相補体オリゴヌクレオチドよりも前記標的ヌクレオチドの増幅産物に優先的にハイブリダイズするようになっており、それにより前記相互作用性ラベル対は分離される、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記第３プライマーは、第３プライマーにハイブリダイズできる第３相補体オリゴヌクレオチドと、二本鎖二重鎖を形成できる領域を含んでおり、
前記第３プライマーは、前記第３相補体オリゴヌクレオチドに対するよりも強い親和性で前記標的核酸にハイブリダイズでき、かつ
前記プライマーおよびその相補体オリゴヌクレオチドは、第１ラベルと第２ラベルとからなる相互作用性ラベル対の一方のメンバーで各々ラベルされ、
前記標的核酸の増幅に伴い、前記プライマーは、前記相補体オリゴヌクレオチドよりも前記標的ヌクレオチドの増幅産物に優先的にハイブリダイズするようになっており、それにより前記相互作用性ラベル対は分離される、請求項１９記載の方法。
【請求項３１】
前記第１ラベルと第２ラベルとは、各々フルオロフォアおよびクエンチャーである、請求項２４または請求項２７〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記２つの型の第１プライマーに、前記第１プライマーの両方の型が伸長された場合にその第１プライマーの伸長産物の分解の際に識別可能な信号を発生する異なるラベルが付けられている、請求項１７記載の方法。
【請求項３３】
試料に含まれる少なくとも１以上の核酸の有無を検出するためのキットであって、該キットは、
（ａ）標的核酸配列の診断領域に対する第１プライマー、あるいは標的核酸配列の１以上の診断領域の各々に対する第１および第２型の第１プライマー、ならびに
前記第１プライマーにアニーリングしているその診断領域を含む標的配列を増幅するための対応する第２および第３プライマー
を含み、前記第１プライマーの第１型の３’末端ヌクレオチドは変異被疑ヌクレオチドに相補的であり、かつ／または前記第１プライマーの第２型の３’末端ヌクレオチドは対応する正常ヌクレオチドに相補的であって、使用時にその第１プライマーの前記末端ヌクレオチドが前記標的核酸中の対応するヌクレオチドに相補的であれば第１プライマーの伸長産物が合成されて、その後前記第１プライマーの伸長産物は分解され、それにより検出可能な信号が発生するようになっており、かつその第１プライマーの前記末端ヌクレオチドが前記標的核酸配列中の対応するヌクレオチドに相補的でなければ伸長産物は合成されないようになっているキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料に含まれる標的核酸または１以上の変異ヌクレオチド配列を検出および／または定量するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一塩基多型（ＳＮＰ）は、ヒトゲノムにおいて最も多発する型の変異である。突然変異は通常はＳＮＰでもあるが、この用語は普通、頻度が１％よりも稀少なものに対して、または疾病を引き起こす既知の機能的役割がその変異にある場合のものである（非特許文献１）。多型の遺伝子型特定、および稀少突然変異の検出には、多くの応用例がある。稀少変異の検出は、病理学的突然変異の初期検出にとって、特に癌において重要である。例えば、癌に関わる点突然変異の臨床検体における検出によって、化学療法の際の微小残存病変の同定を改善でき、また再発患者での腫瘍細胞の出現を検出することができる。突然変異荷重の測定は、変異誘発物質への環境曝露の評価、内在ＤＮＡ修復のモニター、および高齢の個体における体細胞性突然変異の蓄積の研究にも重要である。また、感度および定量性がより高い、稀少変異の検出方法は、出生前診断に大きな変革をもたらすことができ、母方の血液中に存在する胎児細胞の特徴付けが可能になる。おびただしい数の方法が導入されているが、単一の方法で広く認められているものはない。ゲノムＤＮＡでの低頻度変異を検出するための多くの方法で、突然変異体および野生型の標的を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用される。ＰＣＲ産物はその後、配列決定、オリゴヌクレオチドライゲーション、制限酵素消化、質量分析、またはアレル特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを含む様々な方法で分析され、野生型ＤＮＡのバックグラウンドに対する変異が同定される。他の方法では、付加的な選択を行うかまたは行わずに、アレル特異的ＰＣＲを用いて低頻度変異からの選択的作業を行う。例えば、野生型産物を特異的に切断する制限酵素でＰＣＲ産物を消化することによって行なわれる。擬陽性をもたらす、ＰＣＲの際のアレル特異的プライマーの総体的特異性欠如のせいで、現今のアプローチには固有の限界がある。その結果、現今のアプローチはすべて、感度および精度に限度があった（非特許文献２に総説）。
【０００３】
リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をＳＮＰ遺伝子型特定のために使用できる。これは閉管式で行われ、定量的なものである。リアルタイムのＰＣＲを実施するために、現在いくつかの方法を使用でき、ＴａｑＭａｎプローブ（特許文献１および特許文献２、ならびに非特許文献３）、分子ビーコン（特許文献３および特許文献４、ならびに非特許文献４）、自己探索単位複製配列（サソリ）（特許文献５、および非特許文献５）、Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ（非特許文献６）、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（特許文献６、および非特許文献７）、変位ハイブリダイゼーションプローブ（非特許文献８）；ＤｚｙＮＡ−ＰＣＲ（非特許文献９）、蛍光制限酵素検出（非特許文献１０）および隣接ハイブリダイゼーションプローブ（特許文献７および非特許文献１１）の利用などが挙げられる。しかし、これらの方法は一般的に、精度が低いため突然変異検出に適していない。
【０００４】
稀少変異体を検出するためのこれらＰＣＲアプローチのすべてに潜む一元的な課題は、増幅時の複製の背信、またはプローブハイブリダイゼーションの不正確さである。これは、Ｎｅｗｔｏｎら（非特許文献１２；特許文献８）に記載の一般的な突然変異検出方法において明らかである。この系、すなわち増幅不応突然変異系（ＡＲＭＳ）では、ＰＣＲ反応のために使用されるアレル特異的プライマーを活用する。増幅時のミスプライミングによって、不正確な結果がもたらされることが多い。
【０００５】
特許文献９は、ポリヌクレオチドを検出する方法であって、既知ヌクレオチド配列のポリヌクレオチドを、当該ポリヌクレオチドの一部に相補的な配列を有するヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズして、次いで少なくとも１種のデオキシヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレアーゼをそれに添加して、当該プライマーの３’末端に隣接して位置し、かつ当該ポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド種である相補鎖を合成して、その後それを分解して、当該相補鎖の合成および分解を１回以上繰り返して、得られたピロリン酸またはデオキシヌクレオシド一リン酸を検出することによってポリヌクレオチドを検出する方法に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５２１００１５号明細書
【特許文献２】米国特許第５４８７９７２号明細書
【特許文献３】米国特許第５９２５５１７号明細書
【特許文献４】米国特許第６１０３４７６号明細書
【特許文献５】米国特許第６３２６１４５号明細書
【特許文献６】米国特許第６１１７６３５号明細書
【特許文献７】米国特許第６１７４６７０号明細書
【特許文献８】米国特許第５５９５８９０号明細書
【特許文献９】欧州特許第０６６３４４７号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｉｂｓｏｎ  ＮＪ、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．、２００６年、第３６３巻、第１−２号、３２−４７頁
【非特許文献２】Ｊｅｆｆｒｅｙｓ  ＡＪおよびＭａｙ  ＣＡ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２００３年、第１３巻、第１０号、２３１６−２４頁
【非特許文献３】Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９３年、第２１巻、３７６１−６頁
【非特許文献４】ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９６年、第１４巻、３０３−８頁
【非特許文献５】Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９９年、第１７巻、８０４−７頁
【非特許文献６】Ｃｈｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９８年、第６４巻、４２１０−６頁
【非特許文献７】Ｎａｚａｒｅｎｋｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９７年、第２５巻、２５１６−２１頁
【非特許文献８】Ｌｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００２年、第３０巻、Ｅ５頁
【非特許文献９】Ｔｏｄｄら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、第４６巻、６２５−３０頁
【非特許文献１０】Ｃａｉｒｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００４年、第３１８巻、６８４−９０頁
【非特許文献１１】Ｗｉｔｔｗｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９７年、第２２巻、１３０−１頁、１３４−８頁
【非特許文献１２】Ｎｅｗｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９８９年、第１７巻、２５０３−１６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それでもやはり、精度と感度を兼ね備えた核酸検出方法を提供することは、当該技術分野に貢献をもたらすはずであると理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の様々な態様を、下記態様、実施形態および請求の範囲に記載する。
【００１０】
本発明の１つの態様で、試料中の標的核酸（少なくとも１つの変異ヌクレオチドを含むかまたは含まない標的配列でありうる）を検出および／または定量するための方法であって、
（ａ）その試料を、ハイブリダイゼーション条件下に、当該標的核酸の第１領域にハイブリダイズできる第１オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、
（ｂ）工程（ａ）の混合物を伸長条件（例えば、適切なヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼを含んでもよい）下に維持して、任意のアニーリングしたプライマーを伸長させ、ここでプライマーの伸長は標的核酸配列の存在に（例えば、変異ヌクレオチドの存在または非存在に）依存しており、
（ｃ）工程（ｂ）の混合物を分解条件下に維持して、存在すれば第１プライマーの伸長産物を分解し、ここで第１プライマーを含む第１プライマー伸長産物の分解は当該第１プライマーの伸長に依存しており、またここで当該第１プライマー伸長産物の分解によって、その標的核酸の存在の（例えば、標的核酸中の変異ヌクレオチドの）指標となる検出可能な信号が発生する工程を含む方法を提供する。
【００１１】
このように、かかる第１プライマー伸長産物の分解によって、その産物の少なくとも第１プライマー部分が分解される。
【００１２】
任意に、検出可能な信号の存在またはレベルは、その標的核酸配列もしくは標的核酸配列の特定の変異ヌクレオチドの存在および／または量に相関する。
【００１３】
よって手短にいうと、上述の方法では、伸長されているプライマーに依存し、転じて標的配列または標的配列の変異ヌクレオチドの存在に依存する、第１プライマー（伸長産物内）の選択的な分解が用いられる。第１プライマーがアニーリングする領域は通常、変異被疑ヌクレオチドを含むかまたはそれに隣接する「診断部分」であろう。
【００１４】
この場合の「〜に依存する」とは、量的であっても質的であってもよいことは理解されよう。よって、標的配列または標的配列の特定の変異ヌクレオチドが存在しなければ、第１プライマーの伸長はないが、標的配列または標的配列上の被疑ヌクレオチドの存在下には、第１プライマーが比例的に伸長することになる。
【００１５】
以下に記載のとおり、分解は好ましくは、第１プライマーの上流の第２プライマーの伸長を介して、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによって成し遂げられる。これによって、第１プライマー伸長産物（その標的と安定な二重鎖を形成する）は大幅に分解することになるが、伸長条件下に鋳型から解離する、アニーリングして伸長していない第１プライマーは分解しえない。
【００１６】
下記のとおり、第１プライマーのアニーリングにより標的核酸の存在に依存して伸長がなされ、その末端３’ヌクレオチドが標的配列中の別違のヌクレオチド（例えば、変異ヌクレオチド）に相補的になるようにするのが好ましい。こうして、標的配列中の別異のヌクレオチドが存在しなければ、第１プライマーの伸長は阻害または防止されることになる。
【００１７】
下記の様々な実施形態および請求項（従属請求項を含む）のあらゆる組合せを、上記本発明の態様に準用する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】開示した方法の工程および産物を示す図であり、図中、標的シーケンサー上の対応するヌクレオチドに相補的である３’末端ヌクレオチドを備えた第１プライマーは、診断領域（第１領域）とアニーリングする。アニーリングした第１プライマーは、伸長条件下に、適切なヌクレオチドを含む鋳型上で伸長する。分解条件下に、第１プライマーからの伸長鎖は分解して、検出可能な信号を発生する。
【図２】本発明の別の実施形態を示す図であり、図中、標的シーケンサー上の対応するヌクレオチドに相補的である３’末端ヌクレオチドを備えた第１プライマーは、診断領域（第１領域）とアニーリングする。第２プライマーは、第１プライマーの５’上流の第２領域とアニーリングする。このようにアニーリングした第１および第２プライマーは、伸長条件下に、適切なヌクレオチドを含む鋳型上で伸長する。分解条件下に、第１プライマーからの伸長鎖は分解して検出可能な信号を発生する。
【図３】ＳＮＰまたは突然変異を検出するための方法を示す図であり、図中、ＳＮＰまたは突然変異ヌクレオチドに相補的である３’末端ヌクレオチドを備えた第１プライマーは、正常または変異ヌクレオチドを備えた診断領域（第１領域）とアニーリングする。第２プライマーは、第１プライマーの上流の第２領域にアニーリングする。マッチした第１および第２プライマーは、伸長条件下に、適切なヌクレオチドを含む鋳型上で伸長する。分解条件下に、第１プライマーから伸長した鎖は第１プライマーを含めて分解し、検出可能な信号を発生する。ミスマッチの第１プライマーは伸長不可能であり、鋳型から解離して、検出可能な信号は発生しない。
【図４】標的核酸配列にアニーリングする様々な第１および第２プライマーを示す。（Ａ）第１プライマーは、５’端に位置しない相互作用性ラベル対を用いてラベルされる。この相互作用性対は、フルオロフォアおよびクエンチャーであってもよい。（Ｂ）第１プライマーは、相補体オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする５’尾部を含んでいる。第１プライマーおよび相補体オリゴヌクレオチドは、相互作用性対の一方のメンバーで各々ラベルされる。この相互作用性対は、フルオロフォアおよびクエンチャーであってもよい。（Ｃ）第１プライマーは、第１の５’尾部と別に、標的核酸とハイブリダイズできる第２の５’尾部を含んでいる。第１の５’尾部は、相補体オリゴヌクレオチドにハイブリダイズできる。この第１プライマーと相補体オリゴヌクレオチドは、相互作用性対の一方のメンバーで各々ラベルされる。この相互作用性対は、フルオロフォアおよびクエンチャーであってもよい。（Ｄ）第１プライマーは、第１プライマーにハイブリダイズできる相補体オリゴヌクレオチドと、二本鎖二重鎖を形成できる領域を含んでいる。この第１プライマーは、それが相補体オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする場合よりもさらに強固に、標的核酸にハイブリダイズする。この第１プライマーと、当該第１プライマーの相補体とは、相互作用性ラベル対（第１ラベルと第２ラベル）の一方のメンバーで各々ラベルされて、第１プライマーと増幅産物とのハイブリダイゼーションに伴い相互作用性ラベルが分離されるようにする。それら２つのラベルは、第１プライマーおよび相補体オリゴ上の任意の場所に配置できる。（Ｅ）第２プライマーは、第２プライマーにハイブリダイズできる相補体オリゴヌクレオチドと二本鎖二重鎖を形成できる領域を含んでいる。この第２プライマーは、それが相補体オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする場合よりもさらに強固に、標的核酸にハイブリダイズする。この第２プライマーと、当該第２プライマーの相補体とは、相互作用性ラベル対（第１ラベルと第２ラベル）の一方のメンバーで各々ラベルされて、第２プライマーと増幅産物とのハイブリダイゼーションに伴い相互作用性ラベルが分離されるようにする。
【図５】本発明の実施形態の模式図を示すが、図中、対応する正常ヌクレオチド（Ａ、アデノシン）に相補的である３’末端ヌクレオチド（Ｔ、チミジン）を備えた第１プライマーの第２型を修飾して、第１プライマーの全体または一部がヌクレアーゼ切断に対して耐性になるようにしている。突然変異ヌクレオチド（Ｃ、シチジン）に相補的である３’末端ヌクレオチド（Ｇ、グアニン）を備えた第１プライマーの第１型は修飾せず、ヌクレアーゼ切断に対して感受性である。アニーリングした第１プライマー、さらには第２プライマーが、伸長条件下に適切なヌクレオチドを含む鋳型上で伸長する。伸長条件と同じ条件であってもよい分解条件下に、第１プライマーの第１型からの伸長鎖を分解して、検出可能な信号を発生させる。ＤＮＡポリメラーゼであってもよい酵素の５’ヌクレアーゼ活性は、第１プライマーの第２型を切断できないので、第１プライマーの第２型の伸長産物によって上流の第２プライマーの伸長が阻止され、そのため正常ヌクレオチドを含んでいる標的核酸の増幅が抑制される。
【図６】リアルタイムのＰＣＲにより、かつアガロースゲルにおいて検出される、実験デザインおよびその増幅産物の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、標的核酸を検出および／もしくは定量する、標的核酸の有無を検出する、または１以上の標的核酸配列中の１以上の変異ヌクレオチドの量を定量するための方法に関する。本発明は、癌または他の疾病における突然変異の診断用検出、ＳＮＰ遺伝子型特定、およびＤＮＡプールでのアレル数量化によるＳＮＰ関連試験の場合に特に注目すべきである。本発明は、変異ヌクレオチドを含むコントロールの標準核酸を設計することによる、ウイルス負荷量の数量化に有用である。感染性病原体のＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを分析することによってそれらを検出および分類するのにも、本発明は有用である。
【００２０】
（Ｉ．材料）
Ａ．試料中の標的核酸
試料とは、核酸を含有しているか、または含有すると推定される任意の物質をいい、一個体または複数個体から単離した組織または体液の試料が挙げられる。本願明細書の、「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、プライマー、プローブ、検出すべきオリゴマー断片、オリゴマーコントロール、およびラベルされていないブロッキングオリゴマーをいい、またポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボース含有）や、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボース含有）や、プリンもしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシド、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基である他の任意の型のポリヌクレオチドを示す総称たるべきものである。「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」の用語間で長さの区別は意図せず、これらの用語は互換的に使用される。これら用語では、分子の一次構造のみを言及する。よって、これらの用語には二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、さらには二本鎖および一本鎖ＲＮＡが包含される。オリゴヌクレオチドは、設計されたヌクレオチド配列の領域に対応する、およそ少なくとも６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの配列で構成される。
【００２１】
本願明細書で用いる「標的配列」または「標的核酸配列」の用語は、増幅、検出のいずれかまたは両方を行うべき領域をいう。この標的配列は、増幅および検出の対象であり、任意の核酸であることができる。この標的配列は、疾病を引き起こす微生物またはウイルス由来のＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＤＮＡでありうる。この標的配列は、化学試薬、様々な酵素または物理的曝露によって処理されたＤＮＡであることもできる。試料中の目的とする標的核酸配列は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、他のＲＮＡなどの一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡとして、または分離された相補鎖として呈示されてもよい。標的核酸の相補鎖の分離は、物理的、化学的または酵素的手段によって成し遂げることができる。
【００２２】
Ｂ．プライマー
本願明細書で用いる「プライマー」という用語は、自然発生のものでも、または合成により生産したものでも、ある核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に、すなわちヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼなどの重合用薬剤との存在下に好適な温度およびバッファーに置かれた場合に、合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドをいう。このプライマーは、増殖の効率を最大にするにためは好ましくは一本鎖であるが、代わりに二本鎖であってもよい。このプライマーは、誘導剤の存在下に伸長産物の合成のプライミングをするのに充分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源およびその使用方法を含む多くの因子に依存することになろう。
【００２３】
本願明細書でヌクレオチドに関連した「〜に相補的な」という用語は、別の特異的ヌクレオチドと塩基対を形成することになるヌクレオチドを意味するのに用いる。従って、アデノシン三リン酸はウリジン三リン酸またはチミジン三リン酸に相補的であり、グアノシン三リン酸はシチジン三リン酸に相補的である。チミジン三リン酸とグアノシン三リン酸は特定環境下に塩基対を形成しうるが、本願明細書の目的とするところでは相補的とはみなされないことは理解される。シトシン三リン酸とアデノシン三リン酸は特定環境下に塩基対を形成しうるが、本願明細書の目的とするところでは相補的とはみなされなことも理解されよう。同じことが、シトシン三リン酸とウラシル三リン酸にもあてはまる。
【００２４】
本願明細書でプライマーは、複製すべき各特異的配列の異なる鎖に「実質的に」相補的となるように選択される。これは、そのプライマーがそれらのそれぞれの鎖にハイブリダイズするよう、充分に相補的でなければならないことを意味する。従って、そのプライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、３’末端ヌクレオチドが変異被疑ヌクレオチドまたは対応する正常ヌクレオチドのいずれかに相補的であるヌクレオチド配列を第１プライマーが含む場合、非相補的ヌクレオチド断片をそのプライマーの５’端に付け、かかるプライマー配列の残部は標的塩基配列の診断部分に相補的であるものとしてもよい。しかし、プライマーは通常、非相補的ヌクレオチドが以上に記載したような所定のプライマー終端で存在しえない限り、正確な相補性を有する。
【００２５】
しかし、特定環境では、たとえ非相補的３’末端残基の存在下であってもプライマー伸長産物の合成が誘導されて生じるかもしれないことは理解されるであろう。アーチファクトは、低すぎるアニーリング／インキュベーション温度（この場合温度を上昇させるとよい）、長すぎるインキュベーション／アニーリング時間（この場合時間を短縮するとよい）、高すぎる塩濃度（この場合塩濃度を低減するとよい）、高すぎる酵素またはヌクレオシド三リン酸濃度、不正確なｐＨ、または不正確なオリゴヌクレオチドプライマー長に起因しうる。アーチファクトによる結果は、１以上のよりミスマッチの残基を故意に導入することによって、または所望の場合、診断用プライマー内での欠失または挿入で、プライマーを不安定化することによりハイブリダイゼーション時の結合をさらに低減することによって回避しうる。
【００２６】
本願明細書で用いる「第１プライマー」は、診断用プライマーであって、標的配列の診断領域にハイブリダイズし、標的配列中に適切なヌクレオチドが存在してその後第１プライマーが（その伸長産物中で）分解すれば伸長するプライマーをいう。この第１プライマーは、変異被疑ヌクレオチド、または対応する正常ヌクレオチドのいずれかに相補的になるべくその末端ヌクレオチドが選択されるように、ヌクレオチド配列を有してもよい。この第１プライマーの伸長産物は、第１プライマーの末端ヌクレオチドが標的核酸配列の対応する診断部分（第１領域）の適切なヌクレオチドに相補的である場合には合成されうるが、第１プライマーの末端ヌクレオチドが標的核酸配列の対応する診断部分（第１領域）の適切なヌクレオチドに相補的でない場合にはこのような伸長産物は合成されえない。
【００２７】
この第１プライマーはまた、変異被疑ヌクレオチド、または対応する正常ヌクレオチドのいずれかに相補的になるべくその非末端ヌクレオチドが選択されるように、ヌクレオチド配列を有してもよい。この第１プライマーの伸長産物は、変異被疑ヌクレオチドに相補的な非末端ヌクレオチドを含む第１プライマーが標的核酸配列の診断部分（第１領域）の適切なヌクレオチドを含む標的配列にハイブリダイズする場合に合成されうるが、第１プライマーの非末端ヌクレオチドが標的核酸配列の対応する診断部分（第１領域）の適切なヌクレオチドに相補的でない場合にはこのような伸長産物は合成されえない。
【００２８】
よって、本願明細書の任意の態様または請求項で「末端ヌクレオチド」という場合、同じ効果を成し遂げるように、すなわち関連プライマーが相補的または非相補的である診断部分にアニーリングする場合にそれぞれ伸長を許容または防止するように、末端ヌクレオチドに充分近接した非末端ヌクレオチドを用いて、本発明を同様に実施してもよいことが理解されよう。典型的には、このような非末端ヌクレオチドはやはり、終端から１、２、または３つのヌクレオチドだけは、分かたれることになろう。
【００２９】
標的核酸の第１鎖上のある変異被疑ヌクレオチドに対して、対応する相補的変異ヌクレオチドが標的核酸の第２鎖上にあり、これが第１鎖に相補的であることを理解すべきである。本発明の方法の実施に際して、一反応において標的配列の第１鎖に対して１つの第１プライマーを含めてもよいし、あるいは単一反応において標的配列の第１鎖に対して１つの第１プライマーと、標的配列の第２鎖に対して別の第１プライマーとを含めてもよい。後者の場合、標的配列の第１鎖に対する１つの第１プライマーは、標的配列の第２鎖に対する第１プライマーと重複する（相補的）３’末端ヌクレオチドを有する。
【００３０】
この第１プライマーは、ラベルされたオリゴヌクレオチドであってもよい。本願明細書で用いる「ラベル」という用語は、検出可能な（好ましくは定量可能な）信号をもたらすのに使用でき、かつ核酸または蛋白質に付けることができる任意の原子または分子をいう。ラベルは、蛍光、放射活性、比色、重量測定、磁性、酵素活性等により検出可能な信号を提供しうる。
【００３１】
第１プライマーは、固体支持体に付けてもよい。複数の第１プライマーを固体支持体上に整列させてもよい。固体支持体は、オリゴヌクレオチドをカップリングできる任意の固体材料を含むことができる。これには、限定しないが、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フッ化炭素、ナイロン、シリコーンゴム（ｓｉｌｉｃｏｎ  ｒｕｂｂｅｒ）、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸などの材料が挙げられる。固体基材は、薄膜または膜、ビーズ、ビン、皿、繊維、繊維織り物、造形ポリマー、粒子および微粒子を含む任意の有用な形態を有することができる。固体支持体に好ましい形態は、スライドガラスである。
【００３２】
１つの実施形態で、目的とする標的配列の濃縮および検出を同じ反応で実施することが望ましい場合がある（図５）。上述の第１プライマーは、ブロッキングプライマーのみならず検出用プライマーとして作用してもよい。この第１プライマーがブロッキングプライマーとしての役割を果たすのに、第１プライマーは、ブロッキングプライマーの全体または一部をヌクレアーゼ切断に対して耐性にする、修飾されたヌクレオチドまたは修飾された結合を含んでもよい。特に、対応する正常ヌクレオチドに相補的である３’末端ヌクレオチドを備えた第１プライマーの第２型が修飾される。この第１プライマーがヌクレアーゼ切断に対して耐性となるように、３’端および／または５’端の最後の５つのヌクレオチドまたは結合を修飾することが好ましい。ブロッキングプライマーがヌクレアーゼ切断に対して耐性となるように、３’端および／または５’端の最後のヌクレオチドまたは結合を修飾することも可能である。プライマーをエキソヌクレアーゼ切断に対して耐性となるようにする修飾の任意の型が使用可能である。例として、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ＬＮＡ、ＰＮＡ、オリゴ−２’−ＯＭｅ−ヌクレオチド等が挙げられる。
【００３３】
第１プライマーは、この第１プライマーの伸長産物を指数関数的増幅に好適でないものとする部分を含んでもよい。１つの実施形態で、上記の部分はブロッキング部分であってもよく、ここで当該第１プライマーのすべてまたは一部の複製が阻止され、第１プライマー伸長鎖の鋳型から生じるプライマー伸長分子は従って、プライマー結合部位を欠くことから、さらなるプライマー伸長のための鋳型としては好適でない。このブロッキング部分は、ＨＥＧ、非ヌクレオチド結合、ヌクレオチド誘導体、または染料であってもよい。このブロッキング部分は、第１プライマーの３’終端から１８ヌクレオチド未満、離間して位置してもよい。このブロッキング部分は、第１プライマーの３’終端から６ヌクレオチド未満、離間して位置しうることが好ましい。このブロッキング部分は、第１プライマーの３’終端から３ヌクレオチド未満、離間して位置しうることがより好ましい。
【００３４】
上記第２プライマーは、第１プライマーがハイブリダイズできるのと同じ核酸鎖にハイブリダイズすることができる。第２プライマーがアニーリングする標的核酸配列の部分を、第２領域と称する。標的配列の第２領域と第１領域とは、重複しても、または重複していなくてもよい。
【００３５】
第２領域は、第１領域の３’に位置する。換言すれば、第２プライマーの３’端が、第１プライマーの５’端に隣接するかまたはその上流になるように、第１プライマーと第２プライマーとが標的核酸にアニーリングする。異なる２つの非重複オリゴヌクレオチドが、同じ直鎖状の相補的核酸配列の異なる領域にアニーリングし、かつ１つのオリゴヌクレオチドの３’端が他の５’端の方へ向いている場合、前者を「上流」オリゴヌクレオチドと称し、そして後者は「下流」オリゴヌクレオチドと称しうる。本願明細書で、第２プライマーが上流プライマーである。
【００３６】
第３プライマーは、第１プライマーおよび第２プライマーがハイブリダイズできる核酸鎖に相補的な核酸鎖にハイブリダイズすることができる。第２および第３プライマーは各々、その相補体から分離した後に他のプライマーの伸長産物に各々がハイブリダイズできるように、ヌクレオチド配列を備えた増幅プライマーであってもよく、これにより第１および第３プライマー伸長産物は増幅プライマーの伸長産物の合成用鋳型として働き、そのため増幅が促進される。
【００３７】
所定のヌクレオチド変異、例えば点突然変異について、その有無は、１）第１プライマーが被疑ヌクレオチド変異体に相補的な適切な末端ヌクレオチドを有して、この第１プライマー伸長産物の合成および分解が被疑ヌクレオチド変異体の存在の指標となるように、かつ第１プライマー伸長産物の合成および分解がないことが被疑ヌクレオチド変異体が非存在の指標となるように設計すること、または２）第１プライマーが対応する正常ヌクレオチド（他のアレル）に相補的な適切な末端ヌクレオチドを有して、この第１プライマー伸長産物の合成および分解が正常ヌクレオチドの存在の指標となるように、かつ第１プライマー伸長産物が合成されないことが正常ヌクレオチドの非存在の指標となるように設計することのいずれかによって検出しうる。これに関し、本願明細書でいう「適切な末端ヌクレオチド」は、使用時に可能であればそこから合成が開始されることになるはずであるプライマーの末端ヌクレオチドを意味する。従って、一般に重合用の試薬はプライマーの３’端で合成を開始するはずなので、適切な末端ヌクレオチドは一般に、３’末端ヌクレオチドであろうはずである。
【００３８】
反応において上記第１プライマーは、３’末端ヌクレオチドで異なり、かつ異なるラベルを含む２つの型を含むことが好ましい。この第１プライマーの第１型は、被疑ヌクレオチド変異体（１つのアレル）に相補的な適切な末端ヌクレオチドを含み、これに対して第１プライマーの第２型は、正常ヌクレオチド（より高頻度のアレル）に相補的な適切な末端ヌクレオチドを含む。この第１プライマーの１つの型が、適切な変異ヌクレオチドを備えた標的の第１領域にアニーリングする場合、この第１プライマーはその標的の適切な領域にマッチし、そのためプライマー伸長が開始する。この第１プライマーの１つの型が、目的のヌクレオチドが第１プライマーの３’末端ヌクレオチドに相補的でない標的の第１領域にアニーリングする場合、第１プライマーのこの型は標的の適切な領域にマッチせず、そのためプライマー伸長は開始しない。「マッチ」または「ミスマッチ（マッチしない）」の用語は、ＤＮＡの相補鎖における対合ヌクレオチドのハイブリダイゼーション潜在力をいう。古典的なＡ／ＴおよびＧ／Ｃ塩基対など、マッチしたヌクレオチドは効率的にハイブリダイズする。
【００３９】
当然、２つより多くの型の弁別的にラベルしたプライマーも、所望に応じて使用できるであろう。１つの実施形態で、本発明は、同じ試料中の１より多くの変異被疑ヌクレオチドの有無の検出、または数量化に関する。この場合、異なるＳＮＰまたは突然変異を標的とする１より多くの第１プライマーを、反応に含めてもよい。
【００４０】
上記第１プライマーはラベルされることが好ましい（図４）。この第１プライマーの標識化は、５’終端でないことがさらに好ましい。この第１プライマー伸長産物が分解されて、それが検出可能な信号を発生するように設計される。この第１プライマーは、標的にアニーリングしうるが、適切なヌクレオチドにマッチしなければ伸長せず、そのため検出可能な信号は発生しない。プライマーアニーリングの場合に用いる温度よりも高温などといった適切な伸長条件下に、アニーリングして伸長していない第１プライマーは鋳型から解離することになる。いくつかの環境で、通常プライマーアニーリングに有利に働くハイブリダイゼーション条件、例えば温度は、プライマー伸長および分解の残効性を含みうる。分解の残効性は、アニーリングした第１プライマーのごく一部分を切断しえ、この結果、第１プライマーの残部は不安定化して鋳型分子からの解離が起こる。ラベルは、その第１プライマーの中央および３’端の近傍に位置するので、このアニーリングしているが伸長していない第１プライマーからは検出可能な信号が発生することにならない。これに関連して、第１プライマーは５’終端から少なくとも３ヌクレオチド離れたところでラベルされることが好ましい。この第１プライマーは、５’終端から少なくとも６ヌクレオチド離間したところでラベルされることがさらに好ましい。この第１プライマーは、５’終端から少なくとも９ヌクレオチド離間したところでラベルされることがより好ましい。
【００４１】
上記第１プライマーは、第１ラベルと第２ラベルとを含んでもよい。第１ラベルと第２ラベルとは、フルオロフォアまたは非フルオロフォア染料を含む相互作用性対であってもよい。このような相互作用性ラベルの一例は、フルオロフォア−クエンチャーである。第１ラベルと第２ラベルとの間のスペースは、伸長産物の分解時に２つのラベルの分離が可能になるように設けられる。
【００４２】
本願明細書で用いる「フルオロフォア」は、規定の励起波長で光エネルギーを吸収し、かつ異なる規定の波長で光エネルギーを放射する部分をいう。蛍光ラベルの例として、限定しないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ染料（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ−Ｓ、ＢＯＤＩＰＹ染料（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５）、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、カスケードブルー、カスケードイエロー、シアニン染料（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５）、ダンシル、ダポキシル、ジアルキルアミノクマリン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ＤＭ−ＮＥＲＦ、エオシン、エリスロシン、フルオレセイン、ＦＡＭ、ヒドロキシクマリン、ＩＲ染料（ＩＲＤ４０、ＩＲＤ  ７００、ＩＲＤ  ８００）、ＪＯＥ、リサミンローダミンＢ、マリーナブルー、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ロードルグリーン、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テキサスレッドおよびテキサスレッド−Ｘが挙げられる。
【００４３】
本願明細書の、「クエンチャー」という用語には、それが蛍光ラベルに近接するように位置する場合に励起蛍光ラベルのエネルギーを吸収でき、かつ可視光の発光なしにエネルギーを散逸させることができる任意の部分が包含される。クエンチャーの例としては、限定しないが、ＤＡＢＣＹＬ（４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）スクシンイミジルエステル、ジアリールローダミンカルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＱＳＹ−７）、および４’，５’−ジニトロフルオレセインカルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＱＳＹ−３３）、クエンチャーｌ、または「ブラックホールクエンチャー類」（ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３）が挙げられる。
【００４４】
本発明に開示の方法で使用するための第１プライマーは、標的配列に相補的な３’配列を含み、これが通常、伸長反応をプライミングするために使用される。プライマーのこの部分は、第１プライマーの３’プライミング部分と称される。この第１プライマーは、標的配列に相補的であってもなくてもよい第１プライマーのプライミング部分の５’の追加配列を含んでもよく、この追加配列は尾部と称される。１つの実施形態で、この第１プライマーは、標的配列に相補的でない第１尾部を含む。この第１尾部は、非核酸、またはヌクレオチドの配列を含んでもよい。この第１尾部は二本鎖であってもよく、ここで第１尾部に相補的なオリゴヌクレオチドが、第１尾部配列にアニーリングする。この第１プライマーは、第１ラベルで非尾部配列にてラベルされることが好ましく、ここで第１尾部に対する相補体オリゴヌクレオチドは、第２ラベルで５’終端にて、または５’終端近傍にてラベルされる（図４Ｂ）。この場合もやはり、第１ラベルと第２ラベルとは、先に規定したとおりの相互作用性フルオロフォアまたは非フルオロフォア染料でありうる。
【００４５】
別の実施形態で、上記第１プライマーは、さらに第１尾部に連結され標的核酸配列に実質的に相補的な非核酸またはヌクレオチドの配列の第２尾部を含んでもよい。第２尾部は、第１プライマーのプライミング部分がアニーリングできる領域に対して３’の隣接領域にアニーリングすることができる配列を含んでもよい（図４Ｃ）。
【００４６】
第１プライマーは、この第１プライマーにハイブリダイズできる相補体オリゴヌクレオチドと二本鎖二重鎖を形成できる領域を含んでもよい。この第１プライマーは、それが相補体オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするよりもさらに強固に標的核酸にハイブリダイズする。第１プライマーと、その第１プライマーの相補体オリゴは各々、相互作用性ラベル対（第１ラベルと第２ラベル）の一方のメンバーで、増幅産物との第１プライマーのハイブリダイゼーションに伴い第１ラベルと第２ラベルが分離するようにラベルする。この相補体オリゴヌクレオチドは、３’端でブロックされることが好ましい。ラベルは、第１プライマーおよび相補体オリゴヌクレオチド上の任意の位置に配置できる。好ましくは、１つのラベルは第１プライマーの５’端に配置しなくてもよい（図４Ｄ）。
【００４７】
第２プライマーは、第２プライマーにハイブリダイズできる相補体オリゴヌクレオチドと二本鎖二重鎖を形成できる領域を含んでもよい。この第２プライマーは、それが相補体オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするよりもさらに強固に、標的核酸にハイブリダイズする。第２プライマーと、その第２プライマーの相補体オリゴヌクレオチドは各々、相互作用性ラベル対（第１ラベルと第２ラベル）の一方のメンバーで、増幅産物との第２プライマーのハイブリダイゼーションに伴い第１ラベルと第２ラベルとが分離するようにラベルする。ラベルは、第２プライマーおよび相補体オリゴヌクレオチド上の任意の位置に配置できる。１つのラベルは、第２プライマーの５’端に配置してもよい（図４Ｅ）。
【００４８】
Ｂ．ヌクレオシド三リン酸
「ヌクレオシド三リン酸」の用語は、本願明細書でＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかにて存在するヌクレオシドをいうのに用いられ、よって塩基としてアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルを組み込み、糖部分がデオキシリボースまたはリボースであるヌクレオシドを含む。一般にデオキシリボヌクレオシドは、ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて用いられることになる。しかし、通常の塩基であるアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルの１つと塩基対を形成できる他の修飾塩基を用いうることが理解されるであろう。このような修飾塩基としては、例えば８−アザグアニンおよびヒポキサンチンが挙げられる。
【００４９】
本願明細書で用いる「ヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかにて存在するヌクレオチドをいうことができ、よって塩基としてアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルを組み込み、糖部分がデオキシリボースまたはリボースであるヌクレオチドを含む。しかし、通常の塩基であるアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルの１つと塩基対を形成できる他の修飾塩基を、本発明で用いるプライマーにて使用しうることが理解されるであろう。このような修飾塩基には、例えば８−アザグアニンおよびヒポキサンチンが挙げられる。
【００５０】
４つの異なるヌクレオチドすべてを含むわけではない標的塩基配列の一部分に隣接する変異被疑ヌクレオチドの有無を検出するために本発明の方法を使用すべき場合であれば、第１プライマーの伸長産物、および所望の場合には他のプライマーの伸長産物が、適切な対応するヌクレオシド三リン酸のみの存在下に形成されえ、４つの異なるヌクレオシド三リン酸すべてが必ずしも必要ではないはずであることは理解されるであろう。
【００５１】
１つの実施形態で、ヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つがラベルされ、これにより第１プライマーの伸長産物が分解して検出可能な信号が発生する。ラベルされたヌクレオチドの例として、限定しないが、ＡＭＣＡ−ｄＵＴＰ、ビオチン−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ、ＴＭＲ−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、Ｒｈｏ−グリーン−Ｘ−ｄＵＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰおよびＴＲ７７０−ｄＡＴＰが挙げられる。
【００５２】
Ｃ．酵素
開示の方法は、プライマー伸長のための核酸ポリメラーゼ、およびプライマー伸長産物の分解のためのヌクレアーゼ活性を利用する。このヌクレアーゼ活性は、エキソヌクレアーゼ活性であることが好ましい。このエキソヌクレアーゼ活性は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性であることが最も好ましい。このようなヌクレアーゼ活性を提供するために好適な酵素には、他の酵素のうち、例えばラムダエキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼが包含される。任意の核酸ポリメラーゼが使用可能である。プライマー伸長および分解は、同じ酵素によってもたらされることが好ましく、その候補はＴａｑＤＮＡポリメラーゼである。増幅用に同じ酵素が使用可能であることも好ましい。ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであることが特に好ましい。
【００５３】
（ＩＩ．方法）
開示の方法は、標的核酸鋳型にアニーリングした第１プライマーの伸長、およびそれに続く第１プライマーの伸長産物の分解を含み、そのため検出可能な信号が発生する。この方法の重要な因子は、アニーリングした第１プライマーを伸長させる能力であり、これが検出可能な信号を発生することができるかどうかを決定する。様々な理由で、例えば、その第１プライマーの３’終端ヌクレオチドが、第１プライマーがアニーリングする標的上の変異（または正常）ヌクレオチドに相補的でなければ、標的鋳型上でアニーリングする第１プライマーは伸長可能でなくてもよい。よって、第１プライマーの２つの型は、第１プライマーの第１型は変異ヌクレオチドに対して特異的に、かつ第１プライマーの第２型は正常ヌクレオチドに対して特異的になるように設計できる。この第１プライマーの両方の型は、相違するようにラベルしてもよく、これにより異なるアレルの正確な分類、または特定のヌクレオチドの有無を求めることができる。
【００５４】
本発明は、米国特許第５４８７９７２号に以前記載された方法と異なっている。まず、米国特許第５４８７９７２号の方法では、信号発生のための唯一の手段としてプローブハイブリダイゼーションを使用し、プローブが標的にアニーリングして信号が発生する。このプローブは不適切にアニーリングする可能性があり、そのため擬似信号が発生すると考えることができる。従って、米国特許第５４８７９７２号の方法は、稀少突然変異を正確に検出したり、または標的配列中の変異ヌクレオチドを数量化したりするには不適切でありうる。これに対し、本発明の方法では、第１プライマーの正確な重合の力を使用し、ここでプライマー伸長は、検出および数量化信号を発生するために必要不可欠である。本発明の方法では、米国特許第５４８７９７２号に記載の方法とは異なり、プライマー／プローブを、それが標的配列にハイブリダイゼーションする際に検出信号を発生しないように設計する。第２に、米国特許第５４８７９７２号の方法は、５’終端でラベルしたプローブを使用するが、本発明で使用するプライマーは、好ましくは５’終端でラベルされていない。以上に概説したように、米国特許第５４８７９７２号の方法では、信号の発生はプローブハイブリダイゼーションに相関している。本願の方法では、プローブ（プライマー）の単純なアニーリングは検出信号を発生することがなく、その代わりに第１プライマーの伸長の惹起が、検出信号を発生させるのに必要であるという、完全に異なるアプローチを利用している。第１プライマーの５’終端にラベルがないことで、アニーリングして伸長していない第１プライマーの分解の残効性による擬似信号の発生が排除される。第３に、米国特許第５４８７９７２号の方法では、３’端でブロックされるプローブを使用するが、本発明の方法では、伸長可能なプライマーを使用する。第４に、変異標的核酸と正常核酸との間の正確な比（すなわち、定量データ）を本発明の方法では得ることができるが、米国特許第５４８７９７２号の方法では、このような定量データを得ることはできない。最後に、本発明の方法は、プライマー伸長産物内に取り込まれ、そしてプライマー伸長産物の分解に際して検出信号を発生する、ラベルされたヌクレオシド三リン酸を使用できる。
【００５５】
本発明の１つの方法は、個体からの被検試料に含まれる標的核酸または１以上の標的核酸中の少なくとも１つの変異ヌクレオチドの有無を、コントロール（単数種）またはコントロール（複数種）を参照して検出するために提供され、当該方法は、
（ａ）その試料を、標的核酸配列の第１領域に対する第１オリゴヌクレオチドプライマーで処理して、ハイブリダイゼーション条件下にその標的核酸にアニーリングされる第１オリゴヌクレオチドプライマーを含む二重鎖の混合物を作る工程であって、上記第１プライマーのヌクレオチド配列は、その標的核酸の上記第１領域にそれが実質的に相補的であるようなもので、上記第１領域は変異被疑ヌクレオチドを含んでいる工程、
（ｂ）アニーリングした第１プライマーを、伸長可能であれば伸長させて第１プライマーの伸長産物を合成するのに適切なヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼを含む伸長条件下に、工程（ａ）の混合物を維持する工程、および
（ｃ）第１プライマー伸長産物（第１プライマーを含む）を、存在すれば分解条件下に分解する工程であって、それにより検出可能な信号を発生させ、これは標的核酸、もしくは標的核酸中の変異ヌクレオチドの存在の指標であるか、または検出可能な信号のレベルが標的核酸配列もしくは標的核酸配列上の特定の変異ヌクレオチドの量に相関する、工程を含む。
【００５６】
第１オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸にアニーリングして、適切なバッファーおよび温度を含むハイブリダイゼーション条件下に二重鎖の混合物を形成する。アニーリングした第１プライマーが工程（ｂ）で伸長条件下に伸長しなければ、第１プライマーの伸長産物は生産されない。この結果、工程（ｃ）で分解条件下に第１プライマーの伸長産物の分解が起こらず、従って検出可能な信号は発生せず、これが標的核酸または標的核酸中の特定の変異ヌクレオチドの非存在の指標となる。工程（ｂ）で、アニーリングした第１プライマーの部分は伸長条件下に伸長される。伸長した第１プライマーの部分は、標的配列中に存在する特定のヌクレオチドの量に相関する。特定のヌクレオチドは、ＳＮＰまたは１以上の突然変異ヌクレオチドであってもよい。第１プライマーは、ＳＮＰまたは突然変異ヌクレオチドに相補的な３’終端ヌクレオチドを含みうる。その結果、工程（ｃ）で分解条件下に第１プライマーの伸長産物の分解が起こり、従って、検出可能な信号が発生し、これが標的核酸または標的核酸中の特定の変異ヌクレオチドの量の指標となる。
【００５７】
第１プライマーの伸長産物の分解は、鋳型に依存して起こることが好ましい。多くの酵素が、鋳型に依存してプライマー伸長産物を切断でき、例えば、Ｔ７エキソヌクレアーゼまたはＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性が挙げられる。プライマー伸長と分解をもたらすそれらの酵素は、同じ酵素、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。
【００５８】
別の実施形態で、上記工程（ａ）は、標的核酸配列の第１領域に対する第１オリゴヌクレオチドプライマー、および標的核酸配列の同じ鎖の第２領域に対する第２オリゴヌクレオチドプライマーで試料を処理して、ハイブリダイゼーション条件下に標的核酸にアニールされる第１および第２オリゴヌクレオチドプライマーを含む二重鎖の混合物を作る工程を含み、ここで上記第１プライマーのヌクレオチド配列は、それが標的核酸の第１領域に実質的に相補的になるようなものであり、上記第２プライマーのヌクレオチド配列は、それが標的核酸の上記第２領域に実質的に相補的になるようなものであって、またここで、二重鎖は第１プライマーに、そして第２プライマーにアニーリングする標的核酸を含み、第２プライマーの３’端は第１プライマーの５’端に隣接するかまたはその上流にある、換言すれば、標的核酸の第２領域は、この標的核酸の第１領域の５’に位置するようになっている。
【００５９】
本実施形態で、工程（ｂ）はさらに、アニーリングした第１および第２プライマーを、伸長可能であれば伸長させて、適切なヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼを含む伸長条件下に、第１および第２プライマーの伸長産物を合成する工程を含み、かつ工程（ｃ）では、第１プライマーの伸長産物の分解が第２プライマーの伸長の際に起こる。
【００６０】
別の実施形態で、工程（ａ）はさらに、標的核酸配列の第１領域に対する第１オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも２つの型で試料を処理して、ハイブリダイゼーション条件下に標的核酸にアニーリングする第１オリゴヌクレオチドプライマーを含む二重鎖の混合物を作ることを含む。この第１プライマーのヌクレオチド配列は、それが標的核酸の第１領域に実質的に相補的であるようになっており、第１プライマーの第１型の３’末端ヌクレオチドが変異被疑ヌクレオチドに相補的であり、かつ第１プライマーの第２型の３’末端ヌクレオチドが対応する正常ヌクレオチドに相補的である。工程（ｂ）で、標的核酸配列中の変異被疑ヌクレオチドを含む第１領域に、第１プライマーの第１型がアニーリングする場合は第１プライマーの第１型の伸長産物が合成され、標的核酸中の対応する正常ヌクレオチドを含む第１領域に、第１プライマーの第１型がアニーリングする場合は伸長産物が合成されない。標的核酸配列中の正常ヌクレオチドを含む第１領域に、第１プライマーの第２型がアニーリングする場合は第１プライマーの第２型の伸長産物が合成され、標的核酸中の対応する変異ヌクレオチドを含む第１領域に、第１プライマーの第２型がアニーリングする場合は伸長産物は合成されない。
【００６１】
第１プライマーの第２型をヌクレアーゼ切断に対して耐性にする、修飾されたヌクレオチドまたは結合を、第１プライマーの第２型が含むのであれば、第１プライマーの第２型はブロッキングプライマーとしての役割を果たしうる。修飾された第１プライマーの第２型が、標的核酸配列中の正常ヌクレオチドを含む第１領域にアニーリングする場合、伸長産物が合成される。酵素の５’ヌクレアーゼ活性は、第１プライマーの第２型を切断できないので、上流の第２プライマーの伸長は第１プライマーの第２型の伸長産物によって阻止され、そのため正常ヌクレオチドを含む標的配列の増幅は抑制される。その結果、変異ヌクレオチドを含む標的配列が、この反応により濃縮される。
【００６２】
好ましい実施形態で、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、ＰＣＲ反応の一部であり、
ｉ）試料を変性条件下に処理して、プライマー伸長産物を、このような伸長産物が形成された場合にその鋳型から分離し、
ｉｉ）上記のように生産した一本鎖を、適切なヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、第１プライマー（または２つの型の第１プライマー）、第２プライマーおよび第３プライマーと、同時または順次のいずれかにて接触させ、これにより、可能な場合に、上記のように生産した一本鎖を鋳型として用いてさらに伸長産物が合成され、ここで５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する上記核酸ポリメラーゼを用いて、第１プライマーの伸長産物の分解が第２プライマーの伸長時に起こり、かつ上記第３プライマーは第２プライマーの伸長産物に実質的に相補的な配列を含み、
ｉｉｉ）以上の工程を充分な回数繰り返して、それにより検出ラベルの検出可能な変化を引き起こす、ことを含む。
【００６３】
上記ＰＣＲ反応は、標的配列の第１鎖に対する１つの第１プライマーと、その標的配列の第１鎖に相補的な標的配列の第２鎖に対する別の第１プライマーとを含みうることは理解されるべきである。標的配列の双方の鎖に対する第１プライマーを使用することで、検出信号および特異性を増大しうる。
【００６４】
本願明細書に記載のいずれの方法でも、標的核酸または目的とする特定のヌクレオチド変異を含む疑いのある試料が準備される。試料中に含まれる標的核酸は、二本鎖ゲノムＤＮＡ、または必要ならばｃＤＮＡであってもよく、これは次いで、当業者に既知の物理的、化学的、または酵素的手段を含む任意の好適な変性方法を用いて変性される。鎖の分離のために好ましい物理的な手段は、核酸が完全に（＞９９％）変性するまでそれを加熱することを包含する。代表的な加熱変性は、約８０℃〜約１０５℃の範囲の温度、数秒〜数分の範囲の所要時間が関わる。変性するのでなくその代わりに、標的核酸が試料中で一本鎖形態、例えば一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスにて存在してもよい。
【００６５】
変性した核酸鎖は次いでハイブリダイゼーション条件下に、第１プライマー、第２プライマーまたは第３プライマーを含んでもよいオリゴヌクレオチドプライマーとインキュベートされ、この条件は、核酸一本鎖へのプライマーの結合を可能にするものとする。第１プライマー伸長産物はその後分解され、そのため鋳型として働かなくなり、一方、第２および第３プライマーは、二重鎖配列に沿ったそれらの相対位置が、片方のプライマーから合成された伸長産物がその鋳型（相補体）から分離されると他方のプライマーの伸長用の鋳型として働くものになるように選択される。理論上は、第１プライマー伸長産物は完全に分解されうる。実際に、ある程度の漏れがあって、これにより第１プライマー伸長産物の小画分が分解されず、二本鎖断片へ取り込まれなくなるおそれがある。しかし、この漏れが本発明の精度に悪影響をおよぼすことはない。
【００６６】
同様に、本発明は伸長に依存した分解に基づいており、これにより（例えば）第１プライマーの伸長産物の有意な分解が分解条件下に起こらず、そのため実際に検出可能な信号が発生することはないものの、やはり、伸長していないプライマーであっても若干の些事分解が原則的に起こりうることが理解されるであろう。しかしこのようなことも、本発明の精度に悪影響をおよぼすことはない。
【００６７】
本発明の実施において、第２プライマーの伸長が第１プライマー結合部位をブロッキングするより前に、第１プライマーを最初にまたは同時に、相補的核酸にアニーリングしなければならない。これを成し遂げるために、多種多様な技術を用いることができる。第１プライマーの５’端が第２プライマーの３’端から比較的離れるように第１プライマーを配置して、それにより第１プライマーにアニーリングするより多くの機会を与えることができる。また、第２プライマーよりも高い融解温度を有する第１プライマーを使用することもできる。融解温度（Ｔｍ）とは定義上、ＤＮＡ二重鎖の半分が解離して一本鎖になる温度であり、かつ二重鎖安定性を示す。例えば、第１プライマーを第２プライマーよりも長くなるように設計できる。第１プライマーのヌクレオチド組成は、Ｇ／Ｃ含量がより高くなって、その結果第２プライマーよりも熱安定性が高くなるように選択できる。同様に、天然由来の核酸に典型的に存在する塩基よりも安定性の高い塩基対を形成する塩基類似体を含む修飾されたヌクレオチドを、第１プライマー組み込ませることができる。
【００６８】
熱サイクルパラメータを変動させて、第１プライマーの２つの型と、第２および第３プライマーとの差次的熱安定性を活用することもできる。例えば、熱サイクルにおける変性工程後に、第１プライマー結合にとっては許容できるが第２および第３プライマー結合にとっては許容できない中間温度を導入し、その後伸長温度（例えば７２℃）にまで昇温して、それによりマッチした第１プライマーの伸長を許容すると共にミスマッチの第１プライマーを融解除去してもよい。できるだけ多くの標的鋳型上で、マッチした第１プライマーの伸長を可能とするのに望ましいように、中間温度と伸長温度とのサイクルをできるだけ多くの回数繰り返すことができる。その後、温度を下げて、第２および第３プライマーのアニーリングおよび伸長を許容することができる。
【００６９】
第１プライマー伸長産物は、複製用の鋳型として使用すべきでないので、その第１プライマーの一部または全体の複製を阻止することになる、第１プライマーに組み込むブロッキング部分を使用できる。原則的に、第１プライマーに含められるブロッキング部分は、ポリメラーゼによって好適な鋳型として認識されない任意の実体であってよい。
【００７０】
１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの、鋳型に依存した伸長は、適量の４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）または上記のようなそれらの類似体の存在下に、適切な塩、金属カチオン、およびｐＨ緩衝系を含む反応媒体中で重合剤により触媒される。好適な重合剤は、プライマーと鋳型とに依存するＤＮＡ合成を触媒し、好ましくは５’から３’へのヌクレアーゼ活性を持つことが知られている酵素である。既知のＤＮＡポリメラーゼとして、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。これらＤＮＡポリメラーゼでのＤＮＡ合成を触媒するための反応条件は、当該技術分野で周知である。
【００７１】
プライマー伸長産物の、鋳型に依存した分解は、適切な塩、金属カチオン、およびｐＨ緩衝系を含む反応媒体の存在下に、５’エキソヌクレアーゼ活性によって触媒される。分解条件は伸長条件と共通の条件とし、かつ５’エキソヌクレアーゼ活性は、プライマー伸長のために使用されるＤＮＡポリメラーゼによってもたらされることが好ましい。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、重合剤および分解剤の双方として使用されることが好ましい。
【００７２】
プライマー伸長、および第１プライマー伸長の分解産物の検出または検証は、多種多様な方法によって成し遂げることができ、用いた１つのラベルまたは複数のラベルの供給源に依存しうる。好ましい方法において、リアルタイムのＰＣＲを使用して、その反応の各サイクルに対する信号の発生がモニターされる。１つの実施形態で、ヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つがラベルされ、これにより第１プライマーの伸長産物の創出および／または分解により検出可能な信号が発生する。好ましい実施形態では、第１プライマーがラベルされる。この第１プライマーは、５’端に位置しない単一のラベルを含んでもよい。この第１プライマーは、５’端に位置しなくてもよい相互作用性ラベル対を含むことができるのが好ましい。この第１プライマーは、第１および第２ラベルがＦＲＥＴまたは接触クエンチング関係をとるように設計して、第１プライマー伸長産物が分解すると検出信号が発生するようにしてもよく、これがＰＣＲ増幅の各サイクルでモニターされうる。検出蛍光信号と、標的核酸配列または標的配列中に存在する突然変異ヌクレオチドの量との相関は、ラベルされた第１プライマーの伸長産物の分解によって成し遂げることができる。
【００７３】
コントロールを提供するために、変異ヌクレオチドが位置する診断領域の外側の区域にハイブリダイズする一般的なプローブを、反応に含めることが可能である。この一般的なプローブは、野生型および突然変異標的配列の双方を含む総増幅産物を示す信号をもたらすことになる。この一般的なプローブからのリアルタイムモニタリングの結果は、反応容器に加えられている出発物質の量の指標を提供することになる。変異ヌクレオチドに特異的な第１プライマーからの検出信号は、その一般的なプローブからの検出信号を用いて規準化し、それにより正確な定量データを提供することができる。しかし、ラベルされた第１プライマーからの終点蛍光信号は、意外にも試料中に存在する変異ヌクレオチドの量と良好に相関することが見出されているので、終点検出信号から定量データを推測することもできる。これは、反応がプラトーに達すると、増幅産物の量は異なる反応器中で同じかまたは同様になり、増幅中は変異ヌクレオチドと野生型ヌクレオチドとの比が維持されるという事実が原因となりうる。このため、ある反応について、リアルタイムの検出として各サイクルをモニターする必要はないことが理解されるであろう。代わりに終点の読み取り値を取ってもよく、これがいくつかの応用例の場合、またいくつかの状況に対して非常に適していることがある。例えば、リアルタイムの検出機が利用できない場合に、蛍光リーダーを使用して終点データと出発点データとを取ってもよい。
【００７４】
核酸配列の複数座位での突然変異または多型の存在および／または量について、生物学的試料を分析するための方法を、単一の反応容器内で実施できる。１つの実施形態によれば、各突然変異または多型に対する複数の第１プライマー、ならびに各突然変異または多型を保有する各領域を増幅するように設計された複数の第２プライマーおよび第３プライマーが、単一の反応に含められる。
【００７５】
本発明の方法で用いられる試薬は、診断用キットの中に梱包することができる。診断用キットは、標的核酸配列の各診断領域に対する第１プライマー、ならびに第１プライマーにアニーリングしている診断領域を含む標的配列を増幅するための対応する第２および第３プライマーを含み、上記第１プライマーの第１型の３’の末端ヌクレオチドは変異被疑ヌクレオチドに相補的であり、かつ上記第１プライマーの第２型の３’の末端ヌクレオチドは対応する正常ヌクレオチドに相補的であって、使用時にその第１プライマーの上記末端ヌクレオチドが標的核酸中の対応するヌクレオチドに相補的であれば上記第１プライマーの伸長産物が合成され、その後この第１プライマーの伸長産物は分解されて、それにより検出可能な信号が発生し、かつその第１プライマーの上記末端ヌクレオチドが標的核酸配列中の対応するヌクレオチドに相補的でなければ伸長産物は合成されないようになっている。このキットはまた、他の好適に包装された、増幅に必要な試薬及び材料、例えば、バッファー、ｄＮＴＰ、および／または重合手段、さらには検出解析用のものや、アッセイの実施についての使用説明を含んでもよい。
【００７６】
本発明のこのような特定のキットは、本願明細書に規定の方法の性能に適応したものであり、例えば、好適にラベルされた第１（分解可能）プライマーと、第２（増幅プライマー）と、本願明細書に規定の任意の方法を実施するための使用説明書との組み合わせを含んでいる。これらはさらに、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ等を含んでいてもよい。
【００７７】
以下に、限定的な下記の実施例を参照して本発明をさらに説明する。本発明の他の実施形態は、これらに鑑みて当業者に想起されるであろう。
【００７８】
本願明細書に引用するすべての参考文献の開示は、それが本発明を実施する当業者によって実施されうる限り、相互参照によって本願明細書に特に援用される。
【実施例】
【００７９】
（実施例１）
以下の実験で用いたプライマーはすべて、ＥＵＲＯＧＥＮＴＥＣ，ＵＫによって合成された。プライマーは、正常ＢＲＡＦ遺伝子断片および突然変異ＢＲＡＦ遺伝子断片（Ｖ５９９Ｅを保有している）を含むプラスミドから標的ＤＮＡ配列ＢＲＡＦ遺伝子を増幅するように設計した。この遺伝子断片の配列は、以下の配列を含む。
【化１】
2010519896.tif 000002
【００８０】
このプライマーの位置と配向は、図６Ａに示すとおりである。これらのプライマーの配列は、ＢｒａｆＦ２はＧＧＡＡＡＧＣＡＴＣＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＴＡＡＣＡＣであり、ＢｒａｆＥｎｄＲはＧＡＣＴＴＴＣＴＡＧＴＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＡＧであり、ＢｒａｆＦａｍはＧＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＡ１ＣＧＡＧＡ２ＴＴＣＡ（１はｄＴ−Ｆａｍであり、２はｄＴ−ＢＨＱ１である）である。すべての核酸配列は、特に明記しない限り５’から３’に記載する。
【００８１】
プライマーは、１０μＭの最終濃度に希釈した。増幅は、以下の成分および条件、すなわち、１０ｘＰＣＲバッファー（ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、ＮＥＢ）を２．５μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰを０．５μｌ、添加する場合、各プライマーを０．５μｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を０．２５μｌ、プラスミドＤＮＡを０．５μｌ（１０５分子）、および最終体積を２５μｌとする量の水を用いて実施した。反応は、９４℃で１分間と、９４℃で９秒、５７℃で１５秒、７２℃で１５秒、５７℃で１５秒、７２℃で１５秒（この工程でプレートを読み取った）の４０サイクルで、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｈｒｏｍｏ４リアルタイムＰＣＲ機にて行った。反応に加えたプライマーは以下のとおりである。
【００８２】
【表１】
2010519896.tif 000003
【００８３】
ＰＣＲ後に、増幅したＤＮＡ産物をアガロースゲルに付した。その結果を図６Ｂに示す。リアルタイムのＰＣＲの結果（図６Ｃ）により、プライマーが正常ＤＮＡを検出するように設計されているチューブ４でのみ、陽性信号が検出されることが示された。
【００８４】
（実施例２）
増幅プライマーおよびプローブは、ＪＫＲ３ｃｃＦ２はＧＡＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＧＣＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡであり、ＪＫＲ３はＧＡＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡであり、ＪＫＦａｍｄＲはＧＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＧＴＣＴＣＣＡＣ６ＧＡＡであって、このプライマーにおいて第１１位の「Ｔ」はＢＨＱ−１（ｄＴ）で、「６」はＦａｍ−ｄＲである。
【００８５】
プライマーは、１０μＭの最終濃度に希釈する。増幅は、以下の成分および条件、すなわち、１０ｘＰＣＲバッファー（ＮＥＢ  ｔｈｅｒｍｏ  ｂｕｆｆｅｒ）を３μｌ、５μｌのベタイン、１０ｍＭ  ｄＮＴＰを０．５μｌ、プライマーＪＫＲ３を１．２５μｌ、プライマーＪＫＲ３ｃｃＦ２を０．５μｌ、ＪＫＦａｍｄＲを１μｌ（添加する場合）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を０．２５μｌ、プラスミドＤＮＡを０．５μｌ（１０５分子）、および最終体積を２５μｌとする量の水を用いて実施する。反応は、９４℃で１分間と、９５℃で１５秒、６１℃で１８秒、５４℃で１８秒、７２℃で１８秒、６０℃で２０秒、７２℃で２５秒、および７２℃で３０秒（データは各温度にて収集）の４０サイクルで、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３００５リアルタイムＰＣＲ機にて行う。プラスミド鋳型は、Ｖ６１７Ｆを含む突然変異ＤＮＡと、野生型ＤＮＡとを混合したものである。この方法は、リアルタイムのＰＣＲによって標的核酸配列を増幅すること、Ｆａｍにより吸収される４９２ｎｍ波長の光で生物学的試料を照射すること、当該フルオロフォアの蛍光発光を検出すること、および当該フルオロフォアからの温度依存性の蛍光をモニターすることを含む。
【００８６】
変性したＪＫＲ３ｃｃＦ２プライマー伸長産物は、アニーリング条件下にステムループ構造を形成する。Ｒ３プライマーは、ステムループ構造が原因でアニーリングすることができない。濃縮プライマーＪＫＦａｍｄＲは、ループ部分にアニーリングし、それが突然変異ヌクレオチドにアニーリングすれば伸長する。プライマーＪＫＦａｍｄＲの伸長によってステムループ構造を開き、そのためＲ３プライマーのアニーリングおよび伸長が可能になる。Ｒ３プライマーの伸長により、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ特性が原因となって濃縮プライマー伸長産物が分解する。濃縮プライマー伸長産物はまた、ポリメラーゼが鎖変位活性を有するのであれば変位することも可能である。プライマーの末端ヌクレオチドとミスマッチを形成するヌクレオチドを含む野生型ＤＮＡに濃縮プライマーがアニーリングすれば、濃縮プライマーは伸長せず、このためステムループ構造は完全体となっている。この結果、突然変異ヌクレオチドを含むＤＮＡの濃縮が起こる。この濃縮プライマーは、ラベルＦａｍおよびＢＨＱを含む。濃縮プライマー伸長産物の分解により、蛍光信号が得られる。この反応で、単一チューブ内で標的核酸の濃縮および検出が可能となる。
【００８７】
（実施例３）
増幅プライマーおよびプローブは、ＪＫＲ３ＨｅｘはＡＡＣＡＧＡＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡ（５’端はＨＥＸでラベル）であり、ＪＫＲ３ＤａｂはＣＣＴＴＴＣＴＣＡＧＡＧＣＡＴＣＴＧＴＴ（３’端はＤＡＢＣＹＬでラベル）であり、ＪＫＦ７はＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡである。
【００８８】
プライマーは、１０μＭの最終濃度に希釈する。増幅は、以下の成分および条件、すなわち、１０ｘＰＣＲバッファー（ＮＥＢ  ｔｈｅｒｍｏ  ｂｕｆｆｅｒ）を３．５μｌ、５μｌのベタイン、１０ｍＭ  ｄＮＴＰを０．５μｌ、プライマーＪＫＦ７を０．５μｌ、プライマーＪＫＲ３Ｈｅｘを０．７５μｌ、ＪＫＲ３Ｄａｂを１．２５μｌ、ＪＫＦａｍｄＲを１μｌ（添加する場合）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を０．２５μｌ、プラスミドＤＮＡを０．５μｌ（１０５分子）、および最終体積を２５μｌとする量の水を用いて実施する。反応は、９５℃で１５秒、５４℃で１５秒、６８℃で１５秒、５９℃で１５秒、５０℃で１５秒、６３℃で２５秒（データは各温度にて収集）の５０サイクルで、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３００５リアルタイムＰＣＲ機にて行う。プラスミド鋳型は、Ｖ６１７Ｆを含む突然変異ＤＮＡと、野生型ＤＮＡとを混合したものである。標的核酸配列の増幅は、リアルタイムのＰＣＲ法によって成し遂げられる。
【００８９】
プライマーＪＫＦａｍｄＲは、検出プライマーとして働く第１プライマーである。プライマーＪＫＲ３Ｈｅｘは、増幅プライマーの１つとして働く第２プライマーである。プライマーＪＫＦ７は、増幅プライマーの１つとして働く第３プライマーである。オリゴＪＫＲ３Ｄａｂは、上記ＪＫＲ３Ｈｅｘに相補的な相補体オリゴである。ＪＫＲ３ＨｅｘおよびＪＫＲ３Ｄａｂ上のラベルは、２つのオリゴが互いにハイブリダイズすれば接触クエンチング関係となる。その標的が存在する場合には、上記プライマーＪＫＲ３Ｈｅｘは、相補体オリゴＪＡＲ３Ｄａｂではなく標的配列にハイブリダイズすることが好ましいが、これは、標的配列に相補的な付加ヌクレオチドを含んでいるためである。Ｈｅｘ信号は、標的が成功裡に増幅されたことを示し、コントロールとして働くことができる。Ｆａｍ信号は、標的中に変異ヌクレオチドが存在することを示し、Ｆａｍ信号のレベルは標的中に存在する変異ヌクレオチドの量に相関する。本実施例でのプローブデザインの他にも、増幅産物に結合できる任意のプローブが、標的配列の増幅の成功に対するコントロールとしての役割を果たすことができる。
【００９０】
（実施例４）
ＧＧＡ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊ＣＣＡ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊ＡＧＡ６ＴＴＣ＊Ａ（ここで「＊」はホスホロチオエート結合であり、「６」はｄＲ−ビオチンである）の配列を有する、ブロッキングプライマーＢｒａｆＦａｍＷＴＢでもある第１プライマーを設計した。このホスホロチオエート結合修飾で、プライマーはヌクレアーゼ切断に対して耐性となる。このプライマーを反応で使用すると、その伸長鎖は分解されず、そのため上流プライマーから開始される伸長が阻止される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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