(57)【要約】インスリン様成長因子（ＩＧＦ）のシグナル伝達は細胞の増殖を刺激し、細胞の生存期間を延長させる。循環血中ＩＧＦ−１濃度の上昇に伴い、乳癌、前立腺癌および膵癌などよく見られるいくつかの癌のリスクが増大することが研究から示された。本発明は、ヒトインスリン様成長因子−１受容体（ＨＩＧＦ−１Ｒ）に結合する新規なペプチドおよびタンパク質と、それをコードする核酸と、そうした核酸を含むベクターおよび細胞と、そうした化合物を含む医薬組成物と、そのいずれかの使用方法とを対象とし、これを提供する。ＩＧＦ−１受容体を標的にする治療戦略の多くには抗癌活性が明らかにされている。
2010526776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたペプチドであって、
インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に結合することができるペプチドを含み、前記ペプチドの配列は配列番号１８（Ｆ４２９）との同一性が少なくとも９６％であるアミノ酸配列を含む、
ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）との同一性が少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）からなる、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
医薬組成物であって、
哺乳動物宿主における血管形成および／または癌の進行を低減するのに効果的な量でＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを含み、前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）との同一性が少なくとも９６％であるアミノ酸配列を含む、
医薬組成物。
【請求項６】
前記哺乳動物宿主はヒト宿主である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）との同一性が少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）からなる、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
癌を処置する方法であって、
その必要がある哺乳動物にＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを治療有効量で投与することを含み、ここで前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）との同一性が少なくとも９６％であるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌は、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−１Ｒが発現される癌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）との同一性が少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
薬物の生産における、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項１７】
癌の処置のための薬物の調製における、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項１８】
単離されたペプチドであって、
ＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを含み、前記ペプチドの配列は、配列番号８（Ｆ２９２）、配列番号９（Ｆ２９３）、配列番号１９６（Ｆ２９４）、配列番号７（Ｆ２５９）、配列番号１０（Ｆ２９６）、配列番号１１（Ｆ２９７）、配列番号１４（Ｆ３９２）、配列番号１６（Ｆ４０８）、配列番号２２（Ｆ１４２）、配列番号２１（Ｆ２３０）、配列番号２７（Ｆ２７０）、配列番号２６（Ｆ２６４）、配列番号１９７（Ｆ２６５）、配列番号１３６（Ｆ２９８）、配列番号１９２（Ｆ４４１）および配列番号２８（Ｆ３６４）からなる群から選択される配列との同一性が少なくとも９６％であるアミノ酸配列を含む、
ペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドの配列は、配列番号８（Ｆ２９２）、配列番号９（Ｆ２９３）、配列番号１９６（Ｆ２９４）、配列番号７（Ｆ２５９）、配列番号１０（Ｆ２９６）、配列番号１１（Ｆ２９７）、配列番号１４（Ｆ３９２）、配列番号１６（Ｆ４０８）、配列番号２２（Ｆ１４２）、配列番号２１（Ｆ２３０）、配列番号２７（Ｆ２７０）、配列番号２６（Ｆ２６４）、配列番号１９７（Ｆ２６５）、配列番号１３６（Ｆ２９８）、配列番号１９２（Ｆ４４１）および配列番号２８（Ｆ３６４）からなる群から選択される配列を含む、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２０】
医薬組成物であって、
哺乳動物宿主における血管形成および／または癌の進行を低減するのに効果的な量で請求項１８に記載のペプチドを含む、
医薬組成物。
【請求項２１】
前記ペプチドの配列は、配列番号８（Ｆ２９２）、配列番号９（Ｆ２９３）、配列番号１９６（Ｆ２９４）、配列番号７（Ｆ２５９）、配列番号１０（Ｆ２９６）、配列番号１１（Ｆ２９７）、配列番号１４（Ｆ３９２）、配列番号１６（Ｆ４０８）、配列番号２２（Ｆ１４２）、配列番号２１（Ｆ２３０）、配列番号２７（Ｆ２７０）、配列番号２６（Ｆ２６４）、配列番号１９７（Ｆ２６５）、配列番号１３６（Ｆ２９８）、配列番号１９２（Ｆ４４１）および配列番号２８（Ｆ３６４）からなる群から選択される配列を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
癌を処置する方法であって、
その必要がある哺乳動物に請求項１８に記載のペプチドを治療有効量で投与することを含む、
方法。
【請求項２３】
前記ペプチドの配列は、配列番号８（Ｆ２９２）、配列番号９（Ｆ２９３）、配列番号１９６（Ｆ２９４）、配列番号７（Ｆ２５９）、配列番号１０（Ｆ２９６）、配列番号１１（Ｆ２９７）、配列番号１４（Ｆ３９２）、配列番号１６（Ｆ４０８）、配列番号２２（Ｆ１４２）、配列番号２１（Ｆ２３０）、配列番号２７（Ｆ２７０）、配列番号２６（Ｆ２６４）、配列番号１９７（Ｆ２６５）、配列番号１３６（Ｆ２９８）、配列番号１９２（Ｆ４４１）および配列番号２８（Ｆ３６４）からなる群から選択される配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
薬物の生産における、請求項１８または１９に記載のペプチドの使用。
【請求項２５】
癌の処置のための薬物の調製における、請求項１８または１９に記載のペプチドの使用。
【請求項２６】
単離されたペプチドであって、
ＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを含み、前記ペプチドの配列は、式１、式２、式３および式４からなる群から選択される配列を含む、
ペプチド。
【請求項２７】
医薬組成物であって、
哺乳動物宿主における血管形成および／または癌の進行を低減するのに効果的な量で請求項２６に記載のペプチドを含む、
医薬組成物。
【請求項２８】
癌を処置する方法であって、
その必要がある哺乳動物に請求項２６に記載のペプチドを治療有効量で投与することを含む、
方法。
【請求項２９】
薬物の生産における、請求項２６に記載のペプチドの使用。
【請求項３０】
癌の処置のための薬物の調製における、請求項２６に記載のペプチドの使用。
【請求項３１】
癌を処置する方法であって、
ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−１Ｒが発現される癌をもつ哺乳動物に、ＩＧＦ−１Ｒのペプチドアンタゴニストを含む組成物を治療有効量で投与することを含み、ここで前記ペプチドは配列ＦＹｘｘＬｘｘＬを含む、
方法。
【請求項３２】
前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）、配列番号２０（ＲＰ６）、配列番号３（ＲＰ３３／Ｆ２５０）、配列番号１３（Ｆ１３８）および配列番号１９８（ＲＰ３０）からなる群から選択される配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
医薬組成物であって、
哺乳動物宿主における血管形成および／または癌の進行を低減するのに効果的な量でＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを含み、前記ペプチドは配列ＦＹｘｘＬｘｘＬを含む、
医薬組成物。
【請求項３４】
前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）、配列番号２０（ＲＰ６）、配列番号３（ＲＰ３３／Ｆ２５０）、配列番号１３（Ｆ１３８）および配列番号１９８（ＲＰ３０）からなる群から選択される配列を含む、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
哺乳動物宿主における血管形成および／または癌の進行を低減するのに効果的な量でＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドの、薬物の生産における使用であって、前記ペプチドは配列ＦＹｘｘＬｘｘＬを含む、使用。
【請求項３６】
前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）、配列番号２０（ＲＰ６）、配列番号３（ＲＰ３３／Ｆ２５０）、配列番号１３（Ｆ１３８）および配列番号１９８（ＲＰ３０）からなる群から選択される配列を含む、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
哺乳動物宿主における血管形成および／または癌の進行を低減するのに効果的な量でＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドの、癌の処置のための薬物の調製における使用であって、前記ペプチドは配列ＦＹｘｘＬｘｘＬを含む、使用。
【請求項３８】
前記ペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）、配列番号２０（ＲＰ６）、配列番号３（ＲＰ３３／Ｆ２５０）、配列番号１３（Ｆ１３８）および配列番号１９８（ＲＰ３０）からなる群から選択される配列を含む、請求項３７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００７年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／９２５，９８２号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第６０／９２５，９８２号は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、ヒトインスリン様成長因子−１受容体（ＩＧＦ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）−１Ｒ）に結合し、少なくともいくつかの態様でＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストとして働く分子と、そうした分子を含む医薬組成物と、そうした組成物および分子の製造方法および使用方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）のシグナル伝達は細胞の増殖を刺激し、細胞の生存期間を延長させる。循環血中ＩＧＦ−１濃度の上昇に伴い、乳癌、前立腺癌および膵癌などよく見られるいくつかの癌のリスクが増大することが研究から示された。ＩＧＦ−１受容体を標的にする治療戦略の多くには抗癌活性が明らかにされている。
【０００４】
本明細書に記載の本発明の発明者らの少なくとも一部の先行発明を示す特許文献１（および対応する特許文献２）には、特に、独特のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストおよびそれを含む医薬組成物と共に、そうした分子および組成物の生産方法および（たとえば、癌の処置における）使用方法が記載されている（また、関連する原理、方法、分子および組成物は特許文献３および特許文献４に記載されている）。本明細書に記載の主題の発明者らは、国際公開第’２４６号に示された研究を継続し、国際公開第’２４６号に記載されたアンタゴニストについて別の特性および／または改良された特性を持つ新たなＩＧＦ−１Ｒ結合分子およびＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストと、それを含む組成物と、そうした化合物および組成物の使用方法とを同定した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０３／０２７２４６号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００２３８８７号明細書
【特許文献３】国際公開第０１／７２７７１号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／０１９５１４７号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヒトインスリン様成長因子−１受容体（ＨＩＧＦ−１Ｒ）に結合する新規なペプチドおよびタンパク質と、それをコードする核酸と、その核酸を含むベクターおよび細胞と、そうした化合物を含む医薬組成物と、そのいずれかの使用方法とを対象とする。
【０００７】
ある態様では、本発明は、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に結合できるペプチドを含む単離されたペプチドであって、前記ペプチドの配列は配列番号１８（Ｆ４２９）との同一性が少なくとも９６％であるアミノ酸配列を含む、ペプチドを対象とする。
【０００８】
ある実施形態では、このペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）との同一性が少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
ある実施形態では、このペプチドの配列は配列番号１８（Ｆ４２９）を含む。
【００１０】
ある実施形態では、このペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）からなる。
【００１１】
ある態様では、本発明は、哺乳動物宿主における血管形成および／または癌の進行を抑制するのに効果的な量でＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを含む医薬組成物であって、このペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）との同一性が少なくとも９６％であるアミノ酸配列を含む、医薬組成物を対象とする。
【００１２】
ある実施形態では、この医薬組成物は、ヒト宿主における血管形成および／または癌の進行を抑制するのに効果的な量でＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを含む。
【００１３】
ある実施形態では、この医薬組成物は、配列番号１８（Ｆ４２９）との同一性が少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含有するペプチドを含む。
【００１４】
ある実施形態では、この医薬組成物は、配列番号１８（Ｆ４２９）からなるペプチドを含む。
【００１５】
ある態様では、本発明は、癌を処置する方法であって、処置の必要がある哺乳動物にＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを治療有効量で投与することを含み、このペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）との同一性が少なくとも９６％であるアミノ酸配列を含む、方法を対象とする。
【００１６】
ある実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒに結合できる治療有効量のペプチドを必要とする（ｉｎ  ｎｅｅｄ  ｔｈｅｒｅｏｆ）哺乳動物はヒトである。
【００１７】
ある実施形態では、本方法は、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−１Ｒを発現する癌を処置する方法である。
【００１８】
ある実施形態では、本方法は、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−１Ｒを過剰に発現する癌を処置する方法である。
【００１９】
ある実施形態では、本方法を用いて膵癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌および胃癌を処置する。
【００２０】
ある実施形態では、配列番号１８（Ｆ４２９）との同一性が少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含有するペプチドを治療有効量で哺乳動物に投与する。
【００２１】
ある実施形態では、配列番号１８（Ｆ４２９）との同一性が少なくとも９８％であるアミノ酸配列からなるペプチドを治療有効量で哺乳動物に投与する。
【００２２】
ある実施形態では、配列番号１８（Ｆ４２９）を含むペプチドを治療有効量で哺乳動物に投与する。
【００２３】
ある実施形態では、配列番号１８（Ｆ４２９）からなるペプチドを治療有効量で哺乳動物に投与する。
【００２４】
ある実施形態では、薬物の生産に本ペプチドを使用する。
【００２５】
ある実施形態では、薬物の製造に本ペプチドを使用する。
【００２６】
ある態様では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを含む単離されたペプチドであって、このペプチドの配列は、
配列番号８（Ｆ２９２）、配列番号９（Ｆ２９３）、配列番号１９６（Ｆ２９４）、配列番号７（Ｆ２５９）、配列番号１０（Ｆ２９６）、配列番号１１（Ｆ２９７）、配列番号１４（Ｆ３９２）、配列番号１６（Ｆ４０８）、配列番号２２（Ｆ１４２）、配列番号２１（Ｆ２３０）、配列番号２７（Ｆ２７０）、配列番号２６（Ｆ２６４）、配列番号１９７（Ｆ２６５）、配列番号１３６（Ｆ２９８）、配列番号１９２（Ｆ４４１）および配列番号２８（Ｆ３６４）ならびにこれらの組み合わせ
からなる群から選択される配列との同一性が少なくとも９６％であるアミノ酸配列を含むペプチドを対象とする。
【００２７】
ある実施形態では、前記ペプチドの配列は、配列番号８（Ｆ２９２）、配列番号９（Ｆ２９３）、配列番号１９６（Ｆ２９４）、配列番号７（Ｆ２５９）、配列番号１０（Ｆ２９６）、配列番号１１（Ｆ２９７）、配列番号１４（Ｆ３９２）、配列番号１６（Ｆ４０８）、配列番号２２（Ｆ１４２）、配列番号２１（Ｆ２３０）、配列番号２７（Ｆ２７０）、配列番号２６（Ｆ２６４）、配列番号１９７（Ｆ２６５）、配列番号１３６（Ｆ２９８）、配列番号１９２（Ｆ４４１）および配列番号２８（Ｆ３６４）ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含む。
【００２８】
ある態様では、本発明は、哺乳動物宿主における血管形成および／または癌の進行を抑制するのに効果的な量でＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを含む医薬組成物であって、このペプチドの配列は、配列番号８（Ｆ２９２）、配列番号９（Ｆ２９３）、配列番号１９６（Ｆ２９４）、配列番号７（Ｆ２５９）、配列番号１０（Ｆ２９６）、配列番号１１（Ｆ２９７）、配列番号１４（Ｆ３９２）、配列番号１６（Ｆ４０８）、配列番号２２（Ｆ１４２）、配列番号２１（Ｆ２３０）、配列番号２７（Ｆ２７０）、配列番号２６（Ｆ２６４）、配列番号１９７（Ｆ２６５）、配列番号１３６（Ｆ２９８）、配列番号１９２（Ｆ４４１）および配列番号２８（Ｆ３６４）ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される配列との同一性が少なくとも９６％であるアミノ酸配列を含む、医薬組成物を対象とする。
【００２９】
ある実施形態では、医薬組成物は、配列番号８（Ｆ２９２）、配列番号９（Ｆ２９３）、配列番号１９６（Ｆ２９４）、配列番号７（Ｆ２５９）、配列番号１０（Ｆ２９６）、配列番号１１（Ｆ２９７）、配列番号１４（Ｆ３９２）、配列番号１６（Ｆ４０８）、配列番号２２（Ｆ１４２）、配列番号２１（Ｆ２３０）、配列番号２７（Ｆ２７０）、配列番号２６（Ｆ２６４）、配列番号１９７（Ｆ２６５）、配列番号１３６（Ｆ２９８）、配列番号１９２（Ｆ４４１）および配列番号２８（Ｆ３６４）ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含有するペプチドを含む。
【００３０】
ある態様では、本発明は、癌を処置する薬物の生産または調製におけるペプチドの使用であって、ペプチドは、配列番号８（Ｆ２９２）、配列番号９（Ｆ２９３）、配列番号１９６（Ｆ２９４）、配列番号７（Ｆ２５９）、配列番号１０（Ｆ２９６）、配列番号１１（Ｆ２９７）、配列番号１４（Ｆ３９２）、配列番号１６（Ｆ４０８）、配列番号２２（Ｆ１４２）、配列番号２１（Ｆ２３０）、配列番号２７（Ｆ２７０）、配列番号２６（Ｆ２６４）、配列番号１９７（Ｆ２６５）、配列番号１３６（Ｆ２９８）、配列番号１９２（Ｆ４４１）および配列番号２８（Ｆ３６４）ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される配列との同一性が少なくとも９６％であるアミノ酸またはその群から選択される配列を含有するアミノ酸を含む、ペプチドの使用を対象とする。
【００３１】
ある態様では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを含む単離されたペプチドであって、このペプチドの配列は、式１、式２、式３および式４ならびに、本出願の図のいずれかに開示されたペプチドなど、本出願の任意のペプチドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含むペプチドを対象とする。
【００３２】
ある態様では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを含む医薬組成物であって、このペプチドの配列は、式１、式２、式３および式４ならびに、本出願の図のいずれかに開示されたペプチドなど、本出願の任意のペプチドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含む医薬組成物を対象とする。
【００３３】
ある態様では、本発明は、癌を処置する方法であって、その必要がある哺乳動物にＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを治療有効量で投与することを含み、このペプチドの配列は、式１、式２、式３および式４ならびに、本出願の図のいずれかに開示されたペプチドなど、本出願の任意のペプチドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含む方法を対象とする。
【００３４】
ある態様では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに結合できる薬物の生産におけるペプチドの使用であって、このペプチドの配列は、式１、式２、式３および式４ならびに、本出願の図のいずれかに開示されたペプチドなど、本出願の任意のペプチドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含むペプチドの使用を対象とする。
【００３５】
ある態様では、本発明は、癌を処置する薬物の調製における、ＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドの使用であって、このペプチドの配列は、式１、式２、式３および式４ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含むペプチドの使用を対象とする。
【００３６】
ある態様では、本発明は、癌を処置する方法であって、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−１Ｒを発現する癌の哺乳動物に、ＩＧＦ−１Ｒのペプチドアンタゴニストを含む組成物を治療有効量で投与することを含み、ペプチドは配列ＦＹｘｘＬｘｘＬを含む方法を対象とする。
【００３７】
ある態様では、本発明は、癌を処置する方法であって、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−１Ｒを過剰に発現する癌の哺乳動物に、ＩＧＦ−１Ｒのペプチドアンタゴニストを含む組成物を治療有効量で投与することを含み、ペプチドは少なくとも１５アミノ酸長であり、かつ配列ＦＹｘｘＬｘｘＬを含む方法を対象とする。
【００３８】
ある実施形態では、治療有効量の組成物は、ＩＧＦ−１Ｒのペプチドアンタゴニストを含み（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、このペプチドの配列は、配列番号１８（Ｆ４２９）、配列番号２０（ＲＰ６）、配列番号３（ＲＰ３３／Ｆ２５０）、配列番号１３（Ｆ１３８）および配列番号１９８（ＲＰ３０）ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含む。
【００３９】
ある態様では、本発明は、哺乳動物宿主における血管形成および／または癌の進行を抑制するのに効果的な量でＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを含む医薬組成物であって、前記ペプチドは配列ＦＹｘｘＬｘｘＬを含む医薬組成物を対象とする。
【００４０】
ある態様では、本発明は、哺乳動物宿主における血管形成および／または癌の進行を抑制するのに効果的な量でＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドを含む医薬組成物であって、前記ペプチドは少なくとも１５アミノ酸長であり、かつ配列ＦＹｘｘＬｘｘＬを含む医薬組成物を対象とする。
【００４１】
ある態様では、この医薬組成物は、配列番号１８（Ｆ４２９）、配列番号２０（ＲＰ６）、配列番号３（ＲＰ３３／Ｆ２５０）、配列番号１３（Ｆ１３８）および配列番号１９８（ＲＰ３０）ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含有するペプチドを含む。
【００４２】
ある実施形態では、本発明は、哺乳動物宿主における血管形成および／または癌の進行を抑制するのに効果的な量でＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドの、薬物の生産における使用であって、ペプチドは配列ＦＹｘｘＬｘｘＬを含むペプチドの使用を対象とする。
【００４３】
ある実施形態では、本発明は、哺乳動物宿主における血管形成および／または癌の進行を抑制するのに効果的な量でＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドの、薬物の生産における使用であって、ペプチドは少なくとも１５アミノ酸長であり、かつ配列ＦＹｘｘＬｘｘＬを含むペプチドの使用を対象とする。
【００４４】
ある態様では、ペプチドは、配列番号１８（Ｆ４２９）、配列番号２０（ＲＰ６）、配列番号３（ＲＰ３３／Ｆ２５０）、配列番号１３（Ｆ１３８）および配列番号１９８（ＲＰ３０）ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含む。
【００４５】
ある態様では、本発明は、哺乳動物宿主における血管形成および／または癌の進行を抑制するのに効果的な量でＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドの、癌を処置する薬物の調製における使用であって、前記ペプチドは配列ＦＹｘｘＬｘｘＬを含むペプチドの使用を対象とする。
【００４６】
ある態様では、本発明は、哺乳動物宿主における血管形成および／または癌の進行を抑制するのに効果的な量でＩＧＦ−１Ｒに結合できるペプチドの、癌を処置する薬物の調製における使用であって、前記ペプチドは少なくとも１５アミノ酸長であり、かつ配列ＦＹｘｘＬｘｘＬを含むペプチドの使用を対象とする。
【００４７】
ある実施形態では、ペプチドは、配列番号１８（Ｆ４２９）、配列番号２０（ＲＰ６）、配列番号３（ＲＰ３３／Ｆ２５０）、配列番号１３（Ｆ１３８）および配列番号１９８（ＲＰ３０）ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１Ａは、ＨＩＲ（ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をコードするＤＮＡをＳＧＢＳ脂肪細胞にトランフェクトしてインスリンまたはＩＧＦ−１の存在下での３Ｈグルコースの取り込みに対するペプチドＦ１３８の作用を判定する実験から得られたデータを示す。結果については、完全なインスリン反応に対する増加率で表し、インスリン反応のＥＤ２０（近似値）に対するペプチドＦ１３８または（インスリンまたはＩＧＦ−１との組み合わせ）の作用としてグラフで示してある。データは完全なインスリン反応を基準に補正した。
【００４９】
図１Ｂは、ＨＩＲをコードするＤＮＡをＳＧＢＳ脂肪細胞にトランフェクトしてインスリンまたはＩＧＦ−１の存在下での３Ｈグルコースの取り込みに対するペプチドＦ２９３の作用を判定する実験から得られたデータを示す。結果については、完全なインスリン反応に対する増加率で表し、インスリン反応のＥＤ２０（近似値）に対するＦ２９３または（インスリンまたはＩＧＦ−１との組み合わせ）の作用としてグラフで示してある。データは完全なインスリン反応を基準に補正した。
【図２】ＩＧＦ−１Ｒ活性化を判定するためにペプチドＦ２３５およびＦ２５９を用いて行ったキナーゼアッセイの結果を示す。図２に示すように、ペプチドＦ２３５およびＦ２５９は、ＩＧＦ−１によるＩＧＦ−１Ｒのキナーゼ活性化を完全に阻害する能力を示す。
【図３】図３Ａは、脂肪細胞を刺激してインスリン受容体のチロシンリン酸化のレベルを調査（ウエスタンブロット）することで細胞のＨＩＲの活性化を測定した試験の結果を示す。
【００５０】
図３Ｂは、脂肪細胞を刺激してＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化のレベルを調査（ウエスタンブロット）することで細胞のＨＩＧＦ−１Ｒの活性化を測定した試験の結果を示す。
【図４】ＩＲＳシグナル伝達のチロシンリン酸化（チロシンリン光体ウエスタンブロットの１８０ｋＤａバンド）と、エフェクターＭＡＰＫ４４および４２ならびにＰＫＢの活性化とを活性型に特異的な抗体により解析した下流のシグナル伝達試験の結果を示す。
【図５】Ｆ１３８を用いて行ったミトコンドリア活性アッセイの細胞増殖／密度試験の結果を示す。
【図６】ＩＧＦ−１またはＦ１３８を用いて行ったミトコンドリア活性アッセイの細胞増殖／密度試験の結果を示す。
【図７】３ｎＭのＩＧＦ−１＋／−（の存在下または非存在下で）Ｆ４２９あるいはＦ１３８の存在下でＩＲＳ−１リン酸化を調査した下流のシグナル伝達試験の結果を示す。
【図８】３ｎＭのＩＧＦ−１＋／−（の存在下または非存在下で）Ｆ４２９あるいはＦ１３８の存在下でＩＲＳ−１リン酸化を調査した下流のシグナル伝達試験の結果を示す。
【図９】図９Ａは、ＭｉａＰａＣａ細胞を用いた癌モデルの細胞増殖が、ＩＧＦ−１に対して用量関連的に増加することを示す。
【００５１】
図９Ｂは、ＭＣＦ−７細胞を用いた癌モデルの細胞増殖が、ＩＧＦ−１に対して用量関連的に増加することを示す。
【００５２】
図９Ｃは、ＭｉａＰａＣａ細胞を用いた癌モデルの細胞増殖が、ＩＧＦ−２に対して用量関連的に増加することを示す。
【００５３】
図９Ｄは、ＭＣＦ−７細胞を用いた癌モデルの細胞増殖が、ＩＧＦ−２に対して用量関連的に増加することを示す。
【００５４】
図９Ｅは、ＭｉａＰａＣａ細胞を用いた癌モデルの細胞増殖が、インスリンに対して用量関連的に増加することを示す。
【００５５】
図９Ｆは、ＭＣＦ−７細胞を用いた癌モデルの細胞増殖が、インスリンに対して用量関連的に増加することを示す。
【図１０】図１０Ａは、Ｆ２５０がＩＧＦ−１の結合と競合し、細胞を用いた癌モデルの活性を抑制することを明らかにする結合アッセイの結果を示す。Ｆ２５０の濃度に応じてＩＧＦ−１結合が阻害されることを示す。
【００５６】
図１０Ｂは、Ｆ２５０がＩＧＦ−１の結合と競合し、細胞を用いた癌モデルの活性を抑制することを明らかにする細胞増殖アッセイの結果を示す。ＭＣＦ−７細胞のＩＧＦ−１活性に対するＦ２５０による拮抗作用を示す。
【００５７】
図１０Ｃは、Ｆ２５０がＩＧＦ−１の結合と競合し、細胞を用いた癌モデルの活性を抑制することを明らかにする細胞増殖アッセイの結果を示す。ＭｉａＰａＣａ細胞のＩＧＦ−１活性に対するＦ２５０による拮抗作用を示す。
【図１１】図１１Ａは、ＩＧＦ−１が癌細胞モデルのリン酸化を刺激すると共に、本発明の候補ペプチドにより阻止または抑制され得ることを明らかにする実験の結果を示す。ＩＧＦ−１がＭＣＦ７細胞においてＩＲＳ−１の一過性のリン酸化を刺激することを示す。
【００５８】
図１１Ｂは、ＩＧＦ−１が癌細胞モデルのリン酸化を刺激すると共に、本発明の候補ペプチドにより阻止または抑制され得ることを明らかにする実験の結果を示す。ＭＣＦ７細胞においてＩＧＦ−１が引き起こすＩＲＳ−１のリン酸化が用量依存的（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ）であることを示す。
【００５９】
図１１Ｃは、ＩＧＦ−１が癌細胞モデルのリン酸化を刺激すると共に、本発明の候補ペプチドにより阻止または抑制され得ることを明らかにする実験の結果を示す。
【図１２】ペプチドＦ４２９、Ｆ４４１およびＦ４０８の拮抗作用を示す結合および拮抗作用アッセイの結果を表す。
【図１３】Ｆ４２９の個別の血漿中濃度と、１００μｇ／ｍＬのＦ４２９のインキュベーション時間との関係を示す。
【図１４】Ｆ４２９の平均の血漿中濃度と、１００μｇ／ｍＬのＦ４２９のインキュベーション時間との関係を示す。
【図１５】被験物質Ｆ４２９の残存率の対数を示す。
【図１６】図１６Ａは、遺伝子発現の変化をＩＧＦ−１で増殖させたＡＮＴ−４２９間で解析した遺伝子アレイを示す。
【００６０】
図１６Ｂは、遺伝子発現の変化をＩＧＦ−１で増殖させたＭｉａＰａＣａ細胞間で解析した遺伝子アレイを示す。
【図１７】ＡＮＴ−４２９で処置した細胞においてダウンレギュレートされることが分かった遺伝子のリストを示す。
【図１８】図１８Ａは、ＡＮＴ−４２９で処置した際にアップレギュレートされた遺伝子のリストを示す。
【００６１】
図１８Ｂは、ＡＮＴ−４２９で処置した際にダウンレギュレートされた遺伝子のリストを示す。
【図１９Ａ】ＡＮＴ−４２９が腫瘍増殖を阻害することを明らかにするデータを示す。
【図１９Ｂ】ＡＮＴ−４２９が腫瘍増殖を阻害することを明らかにするデータを示す。
【図２０】ＡＮＴ−４２９がインビボで毒性がないことを明らかにするデータを示す。
【図２１】ヒト血漿中のＡＮＴ−４２９の安定性を明らかにするデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本発明の詳細な説明に先立ち、本発明は、他に記載がない限り、特定の製剤、活性剤、非活性剤、投与モードまたは処置方法もしくは使用方法に限定されるものではなく、したがって、変わる場合があることを理解されたい。さらに、言うまでもなく、本明細書に使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するための用語であり、限定的であることを意図するものではない。本書の様々なセクションで引用する科学出版物、特許または特許出願については、すべての面で参照によって本明細書に援用する。
【００６３】
本明細書に記載の本発明は、ヒトＩＧＦ−１Ｒに結合し、通常アンタゴニストとして働く新規なタンパク質およびペプチドであって、本明細書に記載の式の１つに従うアミノ酸配列および／または本明細書に記載の特定のアミノ酸配列に従うアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなることで現れる一定の化学的性質を持つタンパク質およびペプチドを提供する。
【００６４】
本明細書の文脈において「ペプチド」とは、長さは任意だが、好ましくは約２０〜約３５（たとえば、約２５〜約３０）など約１５〜約４０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸の単鎖配列化合物を意味する。本明細書の文脈においてタンパク質とは、本明細書に記載の式の１つに従うアミノ酸配列あるいは他の形で本明細書に具体的に記載するアミノ酸配列を含有する、ペプチドよりかなり大きな（たとえば、少なくとも約４０個のアミノ酸残基を含む）少なくとも１本の鎖を含む（１つまたは複数の鎖、単量体または多量体などを含むかを問わない）任意のタンパク質を意味する。本発明のペプチドおよびタンパク質の態様は、たとえば、生産のしやすさ、安定性、投与などの観点から大きく異なる場合がある。一般に、本発明の方法はペプチドを用いて実施し、本発明の組成物はペプチドを含む。
【００６５】
本明細書では、「ペプチド」および「タンパク質」という語はどちらも、そうしたアミノ酸ポリマーの「誘導体」を包含する（および本質的にそれを示す）のが通常である。「誘導体」とは、１つまたは複数の異種置換基（たとえば、親油性置換基、ＰＥＧ部分、好適な有機系リンカーにより結合したペプチド側鎖など）との共有結合などにより、そのアミノ酸残基の１つまたは複数に人工的に化学修飾（たとえば、アルキル化、アシル化、エステル形成、アミド形成または類似した他のタイプの修飾）を施してあるタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸配列をいう。ある誘導体ではＰＥＧ部分、ペプチド側鎖または同種のものなどのかなり大きい異種置換基がアミノ酸配列「骨格」に結合しており、この誘導体は「コンジュゲート」と呼ばれることもある。本発明のタンパク質またはペプチドに１つまたは複数の修飾アミノ酸を付加すると、たとえば、（ａ）ポリペプチドの血清中半減期を延長させたり、（ｂ）ポリペプチドの抗原性を低下させたり、あるいは（ｃ）ポリペプチドの保存性を向上させたりするうえで都合がよい場合がある。アミノ酸（類）については、たとえば、組換え体の生産中に同時翻訳的に、あるいは翻訳後に修飾してもよいし（たとえば、哺乳動物細胞の発現中に導入されるＮ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフのＮ結合型グリコシル化）、合成手段によって修飾してもよい。修飾アミノ酸の非限定的な例として、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化（ｐｒｅｎｌｙａｔｅｄ）（たとえば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸および同種のものが挙げられる。アミノ酸修飾の際に当業者の指針となるような参考文献は枚挙に暇がない。例示的なプロトコルは、たとえば、Ｗａｌｋｅｒ（１９９８）ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＯＮ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ．に掲載されている。したがって、たとえば、誘導体に付加してもよい修飾アミノ酸は、グリコシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸および有機誘導化剤にコンジュゲートされたアミノ酸から選択することができる。また、タンパク質およびペプチドは、ポリマーに共有結合的にコンジュゲートすることで化学修飾を施して、たとえば、循環半減期を延長させてもよい。例示的なポリマーおよびそうしたポリマーをペプチドに結合する方法は、たとえば、米国特許第４，７６６，１０６号；同第４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号；および同第４，６０９，５４６号に説明されている。他の具体的なポリマーとして、ポリオキシエチル化ポリオール部分およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）部分が挙げられる（たとえば、融合タンパク質を、たとえば、分子量約３，０００〜１２，０００、約２０００〜約２０，０００のような約１，０００〜約４０，０００のＰＥＧにコンジュゲートすることができる）。さらに、あるいはその代わりに、放射性核種、酵素基質、補助因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、別のペプチドタグ、磁性粒子または薬剤など、新規な生物学的／薬理学的特性をタンパク質誘導体に付与できる第２の分子にタンパク質およびペプチドをコンジュゲートしてもよい。誘導体化アミノ酸の他の例については、たとえば、米国特許第６，８００，７４０号に記載されている。
【００６６】
一態様では、分子量（「ＭＷ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ」）が約１７５０〜５０００など約１５００〜約６０００の本発明のペプチドを提供する。より具体的な態様では、ＭＷが約２０００〜約３０００、さらに約２０００〜約２５００など約２０００〜約４０００のペプチドを提供する。
【００６７】
本発明により提供されるペプチドおよびタンパク質は通常、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対する親和性（Ｋｄ）が約１０−７〜約１０−１５Ｍである。一般には、親和性は約１０−１０〜約１０−１２Ｍなど１０−８〜約１０−１２Ｍである。このアミノ酸配列を他のリガンドを同定するために競合結合アッセイで試薬として使用する場合、受容体に対する親和性は通常、約１０−５〜約１０−１２Ｍである。本発明の一部のペプチドおよびタンパク質は、ＨＩＧＦ−１Ｒに対する親和性が約５×１０−６から５×約１０−９〜１０−１１Ｍ（たとえば、約５×１０−９または約１０−１０Ｍ）である。
【００６８】
ほとんどの場合、本発明のペプチドおよびタンパク質は、ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）よりもヒトＩＧＦ−１Ｒ（ＨＩＧＦ−１Ｒ）に対する親和性が高く、多くの場合、その選択性は少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍またはそれ以上を示す。一態様では、このペプチドは、たとえば、本書の実験方法およびデータのセクションに記載した方法を用いて判定する場合、ＨＩＲに対して検出可能な親和性をまったく示さない。
【００６９】
本発明により提供されるペプチドおよびタンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストとして働くことができる。拮抗作用については、任意の好適な方法を用いて検出可能なＩＧＦ−１Ｒ活性および／またはシグナル伝達の低下などから測定できる。より具体的な態様では、本発明により提供されるペプチドおよびタンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒ拮抗作用を示すものの、インスリンまたはＩＧＦによるグルコース取り込みに対しては顕著な作用、あるいはおそらく検出可能な作用さえも示さない。さらなる態様では、本発明のペプチドおよびタンパク質は、望ましいことにヒト患者などの哺乳動物宿主において検出可能で治療上有益な血管新生阻害作用および／または他の抗癌作用も示す。
【００７０】
特定の「親」（参照）ペプチド／配列に対して高度の同一性を持つが、（親配列／ペプチドのアミノ酸残基に）１つまたは複数の挿入、欠失、付加および／または置換を含む、本明細書に記載の特定のペプチド／配列の「アナログ」は、その親ペプチド／配列に類似したＩＧＦ−１Ｒ結合性、場合によってはＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト特性を示す場合がある（たとえば、そのアナログには、親ペプチドが示す親和性および／または活性の少なくとも約３３％、少なくとも約５０％または少なくとも約７５％、場合によっては親ペプチド／配列が示す活性および／または親和性の約１００％、あるいは１００％を超えて（たとえば、少なくとも約１２５％）持つ場合がある）。一般に実際に置換を行う場合、大部分は「保存的」置換であり、欠失および／または挿入を回避する。保存的置換とは、以下の３つのアミノ酸分類表の１つまたは複数に示すアミノ酸クラス内での置換と定義することができる：
【００７１】
【表１】
2010526776.tif 000003
【００７２】
【表２】
2010526776.tif 000004
【００７３】
【表３】
2010526776.tif 000005
さらなる保存的アミノ酸残基の置換群として、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリンおよびアスパラギン−グルタミンが挙げられる。たとえば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ（２ｄ  Ｅｄ．１９９３），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載された原理を用いて他のアミノ酸群を形成することもできる。場合によっては、上記の特徴の２つ以上を基準に置換の特徴付けをさらに行うと有用な場合がある（たとえば、Ｔｈｒ残基などの「低分子極性」残基と置換を行えば、適切な場合に高度な保存的置換を示す場合がある）。
【００７４】
また、上述の群の１つに特定されたアミノ酸残基と類似した既知の生理化学的性質を持つ、既知の合成アミノ酸残基、珍しいアミノ酸残基または修飾アミノ酸残基を、ある配列中の特定のアミノ酸残基の「保存的」置換基として用いることができる場合もある。たとえば、Ｄ−Ａｒｇ残基は、通常の（Ｌ−）Ａｒｇ残基に代わる置換基として役立つことがある。さらに、上述のクラスの２つ以上に記載された残基についても、こうした特定の置換を行える場合もある（たとえば、低分子で疎水性の残基による置換とは、上述のこの２つのクラスに記載されている残基による置換を意味しても、２つの定義を満たすそうした残基に類似した生理化学的性質を持つ当該技術分野において公知の他の合成残基、珍しい残基また修飾残基による置換を意味してもよい）。
【００７５】
多くの場合、本明細書のアナログは、特定の残基における置換の観点から記載されている。その場合、保存的置換は、その位置に通常認められる残基によって判断される。場合によっては、本明細書のアナログは、（本明細書に記載するような）従来の研究により一般に確認された１つまたは複数の特定の残基により、ある残基が置換されていることを基準に記載されていることもある。そうした場合、保存的置換は、置換される残基と、その残基の置換に好適であると認められた残基との両方から判断することができる。一般に、任意の好適なアミノ酸残基を置換残基と交換することができる。置換に使用する残基は、ヒトタンパク質に頻繁に組み込まれる２０種の残基の１つであるのが一般的あるが、珍しい人工的な誘導体化アミノ酸残基を本発明のペプチド／配列に組み込むこともできる。適合性に関しては、生物学的機能の保持を基準に判定するのが一般的である。タンパク質工学の当業者であれば、柔軟性部位または剛直性部位の不適切な導入；機能的に重要な残基の除去；または重要な構造特性を与える残基の除去のため、ある種の置換が好適でないことが認識できるであろう。
【００７６】
タンパク質／ドメイン／配列機能については、上記で定義した群に示してある置換ほど保存的でない置換を選択することで、大幅に変更することができる。したがって、いくつかの態様では、アナログは、１つまたは複数の非保存的残基を含んでも構わない。たとえば、変更領域におけるペプチドの構造；分子の標的部位の電荷または疎水性；または側鎖の大部分に顕著な影響を与える非保存的置換を作製することができる。ペプチドの特性に通常大きな変化を与えると予想される置換は、１）親水性残基、たとえば、セリルまたはトレオニルが疎水性残基、たとえば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルに（によって）置換される；２）システインまたはプロリンが任意の他の残基に（によって）置換される；３）陽性側鎖を持つ残基、たとえば、リジル、アルギニルまたはヒスチジルが陰性残基、たとえば、グルタミルまたはアスパルチルに（によって）置換される；あるいは４）かさ高い側鎖を持つ残基、たとえば、フェニルアラニンが側鎖を持たない残基、たとえば、グリシンに（によって）置換される置換である。したがって、機能／構造の大きな変更が望ましい場合、こうした非保存的置換および他の非保存的置換をペプチドアナログに導入してもよく、構造／機能の保存が望ましい場合、そうした変更を回避してもよい。
【００７７】
当業者であれば、ペプチドアナログの設計および選択に有用な原則を新たに認識するであろう。たとえば、ペプチドの表面位置の残基は一般に親水性アミノ酸に対して強い選択性。アミノ酸の立体特性は、タンパク質に導入または選択される局所構造に大きく影響する場合がある。たとえば、プロリンはねじれの自由度が低いため、ペプチド骨格のコンフォメーションをターンに閉じ込めて水素結合を消失させることがあり、さらにこの残基はタンパク質の表面ループに出現することも多い。Ｐｒｏとは対照的にＧｌｙは、ペプチドの主鎖の周りで完全なねじれ自由度を持っているため、タンパク質の内部に埋もれた堅固なターンおよび領域に関係していることが多い（たとえば、疎水性ポケット）。こうした残基はその特徴により、二次構造への関与が限定的になることが多い。一方、二次構造の形成に典型的に関与する残基も知られている。たとえば、Ａｌａ、ＬｅｕおよびＧｌｕなどの残基（あまりかさ高くない、および／または極性残基を持たないアミノ酸）は一般にαヘリックスの形成に関連しているのに対し、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、ＡｓｐおよびＡｓｎなどの残基はαヘリックスの形成を妨げる場合がある。βシート構造を形成し、組み込まれやすい残基にはＶａｌおよびＩｌｅがあり、ターン構造に関連している残基にはＰｒｏ、ＡｓｐおよびＧｌｙがある。当業者は、好適なペプチドアナログの設計および選択に際し、こうしたアミノ酸特性および類似のアミノ酸特性を考慮できるため、通常の実験を用いるのみで好適なアナログを調製することができる。
【００７８】
また、親ペプチドと比較したアナログペプチドの保存性は、ハイドロパシー／親水性特性の面でも実質的に維持される場合が多い（たとえば、２つの配列の重量クラス、ハイドロパシースコアまたはその両方は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上（たとえば、約６５〜９９％）維持されている）。残基／配列におけるハイドロパシー特性の保存性を評価する方法は、当該技術分野において公知であり、ＳＤＳＣ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈから入手できるＧＲＥＡＳＥプログラムなどの市販のソフトウェアパッケージに組み込まれている（ＧＲＥＡＳＥおよび類似のプログラムに組み込まれた原理の考察には、たとえば、Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ（１９８８）８５：２４４４−２４４８，ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８３：６３−９８も参照されたい）。
【００７９】
したがって、置換、欠失、挿入、付加および同種のものを行う場合、（他の因子に加えて）アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮してもよい。各アミノ酸には、疎水性および電荷特性に基づき、以下のハイドロパシーインデックスが付与されている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタマート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルタート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００８０】
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際のアミノ酸ハイドロパシーインデックスの重要性は、当該技術分野において理解されている。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）を参照されたい。ある種のアミノ酸は、類似したハイドロパシーインデックスまたはスコアを持つ他のアミノ酸に置換されても、類似した生物活性を維持する場合があることが知られている。一般に、ハイドロパシーインデックスに基づき変更を行う際は、ハイドロパシーインデックスが±２以内のアミノ酸置換が好ましく、通常±１以内の値は特に好ましく、通常±０．５以内であれば特に一層好ましい。
【００８１】
また、たとえば、類似のアミノ酸を置換するとき、置換により作製される生物学的機能が等価なタンパク質またはペプチドを特に本発明のように免疫学的な実施形態で使用することを意図している場合、親水性を基準にすると効果的に行うことができることも当該技術分野において理解されている。隣接するアミノ酸の親水性によって決まるタンパク質の局所平均親水性の最大値は、免疫原性および抗原性、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関する。
【００８２】
アミノ酸残基には以下の親水性値が付与されている：アルギニン（＋３．０）；リジン（’３．０）；アスパルタート（＋３．０±１）；グルタマート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。類似した親水性値に基づき変更を行う場合、親水性値が±２以内のアミノ酸置換が一般に好ましく、通常±１以内の値は特に好ましく、通常±０．５であれば特により一層好ましい。
【００８３】
また、アナログペプチドの構造が親ペプチドの構造に実質的に類似していると都合がよい。保存的置換、ハイドロパシー特性、重量保存および類似の項目におけるペプチドの類似性を評価する方法は、たとえば、国際公開第０３／０４８１８５号、国際公開第０３／０７０７４７号および国際公開第０３／０２７２４６号に記載されている。機能的なアナログタンパク質および配列を作製する例示的な方法（たとえば、「ＤＮＡシャフリング」、「合理的設計」法、アラニンスキャニング法およびランダム変異誘発法）も、上記の参考文献および本明細書に引用する他の参考文献に記載されている。構造の決定については、当該技術分野においてよく知られた核磁気共鳴（ＮＭＲ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分光学的構造決定技法（たとえば、Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，ＮＭＲ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６；Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ｋ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：４５−５０（１９８９）；Ｃｌｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：４７９−５６４（１９８９）；Ｃｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ８：５２−５６（１９８８）を参照されたい）を、一般にコンピューターモデリング法（たとえば、ＭＡＣＲＯＭＯＤＥＬ（商標）、ＩＮＳＩＧＨＴ（商標）およびＤＩＳＣＯＶＥＲ（商標）などのプログラムの使用と組み合わせて構造アナログの空間および配向条件を得るなど、任意の好適な手法で行うことができる。こうした好適な既知の技法および他の好適な既知の技法で得られた情報を用いて、合理性に基づいたアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を行うことで、構造アナログを設計および作製することができる。こうした構造アナログは、本発明の方法の実施に有用な場合がある。二次構造の予測は、多くの科学出版物で取り上げられてきた。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６），Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６  ａｎｄ  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）を参照されたい。現在、二次構造の予測に役立つ様々なコンピュータープログラムが入手可能である。二次構造を予測する一方法は、ホモロジーモデリングに基づくものである。最近のタンパク質構造データベース（ＰＤＢ：ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄａｔａ  ｂａｓｅ）の発達により、ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の推定されるフォールド数など、二次構造の予測性が向上してきた。Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（ｌ）：２４４−２４７（１９９９）を参照されたい；さらに、（関連する原理の考察にには）Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９−３７６（１９９７）も参照されたい。二次構造を予測する新たな方法として、「スレッディング」法（たとえば、Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（ｌ）：１５−９（１９９６）），「ｐｒｏｆｉｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ」（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７）を参照されたい）および「進化的連鎖」法が挙げられる（Ｈｏｍｅ，ｓｕｐｒａ，ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，ｓｕｐｒａを参照されたい）。
【００８４】
アミノ酸配列の挿入として、長さが１残基から、１００あるいはそれ以上の残基を含むポリペプチドに及ぶアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合のほか、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例には、Ｎ末端にメチオニル残基を持つペプチドまたはエピトープタグとの融合体がある。ペプチド分子の他の挿入アナログとして、酵素、別のポリペプチド、またはこの鎖の血清中半減期を延長させるＰＥＧのペプチドのアミノ酸配列（通常、ＮまたはＣ末端）との融合体が挙げられる。
【００８５】
一般に、都合がよい配列変更は、当該アナログ配列／アナログペプチドについて（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）アナログ配列の結合親和性を変化させる（一般に親和性を高めることが望ましい）および／または（４）他の物理化学的特性または機能特性を付与したり、それを改変したりする変更である。
【００８６】
一般に、本明細書に記載の具体的なペプチドまたは配列のアナログについては、本明細書に開示したペプチド／配列の定義済みの機能特性（たとえば、ＩＧＦ−１Ｒ結合性および／またはＩＧＦ−１Ｒ拮抗作用）の少なくとも約５０％、一般には約１００％またはそれ以上など少なくとも約７５％を示すタンパク質、ペプチドまたは配列として特徴付けることができる。
【００８７】
アナログを含む本発明のペプチドおよびタンパク質は、１つまたは複数の任意の誘導体（たとえば、ＰＥＧ部分、アシル部分など）の付加により誘導体化されていてもよい。
【００８８】
さらなる態様では、アナログまたはその誘導体を含む本発明のペプチドおよびタンパク質は、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％またはそれ以上（たとえば、約８０％）など、少なくとも約１５％ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ活性を低下させることを特徴としてもよい。
【００８９】
さらに、あるいはその代わりに、追加の態様では、本発明のペプチドおよびタンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒに関連するＭＡＰＫ４４シグナル伝達を顕著に低下させることを特徴としてもよい。
【００９０】
さらに、あるいはその代わりに、追加の態様では、本発明のペプチドおよびタンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒに関連するＭＡＰＫ４２シグナル伝達を顕著に低下させることを特徴としてもよい。
【００９１】
さらに、あるいはその代わりに、追加の態様では、本発明のペプチドおよびタンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒに関連するＩＲＳ−１シグナル伝達を顕著に低下させることを特徴としてもよい。
【００９２】
さらに、あるいはその代わりに、別の態様では、本発明のペプチドおよびタンパク質は、ＩＧＦ−１のＩＧＦ−１Ｒキナーゼ活性化を完全に阻害できることを特徴としてもよい。
【００９３】
さらに、あるいはその代わりに、なおさらなる側面では、本発明のペプチドおよびタンパク質は、（比較的低レベルのインスリン受容体のチロシンリン酸化を示すことで）ＩＧＦ−１Ｒによるチロシンリン酸化を特異的に阻害することを特徴としてもよい。
【００９４】
さらに、本発明のペプチドおよびタンパク質は、本明細書に記載の特定の式または配列のいずれかを特徴としてもよく、その具体的な例を次に説明する。
【００９５】
式１のペプチドおよびタンパク質
第１の態様では、本発明は、ヒトＩＧＦ−１Ｒに結合し、通常アンタゴニストとして働く新規なタンパク質およびペプチドであって、式１に記載のアミノ酸配列を含む（あるいは、それからなる、あるいは、それから本質的になる）新規なタンパク質およびペプチドを提供する。
【００９６】
式１は以下のとおり定義する：
Ｘ１ＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＸ２Ｘ３ＰＡＥＫＳＲＧＱＷＸ４Ｘ５ＣＲＸ６Ｘ７（配列番号１）、式中、Ｘは任意に存在するＥ残基を表し；Ｘ２は任意の好適な残基（ただし、通常Ｎ、Ａ、ＱまたはＴ残基から選択される）を表し；Ｘ３は任意の好適なアミノ酸残基（ただし、通常は低分子残基、超低分子残基、さらにより詳細にはＧまたはＡ残基（またはＤ−Ａｌａ（「ａ」）残基を表す）を表し；Ｘ４はＤまたはＥ残基を表し；Ｘ５は任意の好適な残基（ただし、通常は低分子残基、超低分子残基、さらにより詳細にはＧまたはＡ残基を表す）を表し；Ｘ６は任意に存在するＫまたはＥ残基を表し；Ｘ７は任意に存在するＳまたはＫ残基を表し、このペプチドまたは配列はＦ２４９（ＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＮＧＰＡＥＫＳＲＧＱＷＤＧＣＲ−配列番号２）、Ｆ２５０（ＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＮＧＰＡＥＫＳＲＧＱＷＤＧＣＲＫ−配列番号３）またはＲＰ３３−ＩＧＦ（ＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＮＧＰＡＥＫＳＲＧＱＷＤＧＣＲＫＫ−配列番号４）ではない。
【００９７】
式１配列は、ＩＧＦ−１Ｒに結合し、ＩＧＦ−１Ｒ拮抗作用を示すことが以前明らかにされたＦ２４９、Ｆ２５０およびＲＰ３３−ＩＧＦ（それぞれ国際公開第’２４６号開示されている）非常に類似している。このことと、他の多くの式１配列がＩＧＦ−１Ｒ結合性、場合によっては拮抗作用を示すという知見とを合わせて判断すると、この配列の多くを通常の実験で同定できることが予想され得る。
【００９８】
例示的な一態様では、このペプチドまたは配列は、Ｆ２１５（すなわち、ＥＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＮＧＰＡＥＫＳＲＧＱＷＤＧＣＲＥ−配列番号５）であるか、またはそれを含む。Ｆ２１５ペプチドは、ＩＧＦ−１Ｒに対して０．８〜３×１０−７Ｍの結合親和性を持つことが確認されている。別の態様では、本発明は、配列番号５に対する同一性が少なくとも約８８％、少なくとも約９２％または少なくとも約９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ２１５のアナログ（またはそれを含むタンパク質）を提供する。
【００９９】
例示的な一態様では、このペプチドまたは配列は、ＲＰ３０（すなわち、ＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＮＧＧＡＥＲＳＤＧＱＷＥＧＣＲ−配列番号１９８）であるか、またはそれを含む。別の態様では、本発明は、配列番号１９８に対する同一性が少なくとも約８８％、少なくとも約９２％または少なくとも約９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＲＰ３０のアナログ（またはそれを含むタンパク質）を提供する。
【０１００】
別の説明に役立つ側面では、このペプチドまたは配列は、Ｆ２５８（すなわち、ＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＡＧＰＡＥＫＳＲＧＱＷＥＧＣＲ−配列番号６）であるか、またはそれを含む。別の態様では、本発明は、配列番号６に対する同一性が少なくとも約８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ２５８のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。Ｆ２５８ペプチドは、Ｆ２４９（約２×１０−７Ｍ）に類似した親和性を持つが、安定性が高いことが明らかになっている。
【０１０１】
本発明の別の側面は、Ｆ２５９、ＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＡＧＰＡＥＫＳＲＧＱＷＥＧＣＲＫ（配列番号７）からなる、それから本質的になる、またはそれを含むペプチドまたはタンパク質に具体化される。Ｆ２５９ペプチドは、ＩＧＦ−１Ｒに対して８×１０−８Ｍの親和性を持つことと、ＳＷ４８０細胞およびＭＣＦ−７細胞のＩＧＦ−１依存性の増殖に対する拮抗作用を持ち、そのＩＣ５０が２×１０−６Ｍであることと、Ｆ２５０よりも安定性が高いこととが明らかになっている。別の態様では、本発明は、配列番号７に対する同一性が少なくとも約８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に別途記載されたペプチドではないＦ２５９のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１０２】
なお別の側面では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに対して１×１０−７Ｍの結合親和性を持つＦ２９２、ＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＴＧＰＡＥＫＳＲＧＱＷＥＧＣＲＫ（配列番号８）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になるタンパク質またはペプチドを提供する。別の態様では、本発明は、配列番号８に対する同一性が少なくとも約８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に別途記載されたペプチドではないＦ２９２のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１０３】
本発明のさらなる例示的な態様は、Ｆ２９３（ＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＱＧＰＡＥＫＳＲＧＱＷＥＧＣＲＫ−配列番号９）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になるタンパク質およびペプチドに具体化される。Ｆ２９３ペプチドは、ＩＧＦ−１Ｒに対して９×１０−８Ｍの結合親和性を持つことと、ＩＧＦ−１依存性のＳＷ４８０細胞およびＭＣＦ−７細胞の増殖に対して拮抗作用を持ち、ＩＣ５０がそれぞれ１〜２０×１０−７Ｍ、１×１０−５Ｍであることとが確認されている。ＳＷ４８０の場合、Ｆ２９３で基礎増殖の阻害が観察された（１実験のみ）。Ｆ２９３を用いることで、Ｌ６のＩＧＦ−１Ｒ（主として対称的ＩＧＦ−１Ｒ）およびＬ６  ｈＩＲのＩＧＦ−１Ｒ（主としてハイブリッドＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ）に対するＩＧＦ−１の結合は、１．５×１０−７Ｍで阻害することができ、ＩＧＦ−１の処置を受けたＩＧＦ−１ＲおよびＭＡＰＫ４２／４４のリン酸化は５×１０−７ＭのＩＣ５０で阻害された。Ｌ６−ｈＩＲの場合、Ｆ２９３によるリン酸化の阻害は、インスリンによるリン酸化よりもＩＧＦ−１によるリン酸化の方が効果的であった。インスリン／ＩＧＦ−１に応答したＳＧＢＳ細胞のグルコース取り込みは、Ｆ２９３を＜５×１０−６Ｍで投与しても影響を受けない。別の態様では、本発明は、配列番号９に対する同一性が少なくとも約８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または上記の国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に別途記載されたペプチドではないＦ２９３のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１０４】
加えて、本発明は、Ｆ２９６（ＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＮＡＰＡＥＫＳＲＧＱＷＥＧＣＲＫ−配列番号１０）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になるタンパク質およびペプチドを提供する。Ｆ２９６ペプチドは、ＩＧＦ−１Ｒに対して６×１０−８Ｍの結合親和性を持つことが確認されている。別の態様では、本発明は、配列番号１０に対する同一性が少なくとも約８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ２９６のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１０５】
本発明はまた、Ｆ２９７（ＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＮａＰＡＥＫＳＲＧＱＷＥＧＣＲＫ−配列番号１１）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になるタンパク質およびペプチドも提供する。Ｆ２９７ペプチドは、Ｄ−Ａｌａを含むＩＧＦ−１Ｒに対して５×１０−８Ｍの結合親和性を持つことが明らかにされている。別の態様では、本発明は、配列番号１１に対する同一性が少なくとも約８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ２９７のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１０６】
なお別の態様では、本発明は、Ｆ２９４（ＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＮＡＰＡＥＫＳＲＧＱＷＤＧＣＲＫ−配列番号１９６）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になるタンパク質およびペプチドを提供する。別の態様では、本発明は、配列番号１９６に対する同一性が少なくとも９２％または少なくとも９６％であるＦ２９４のアナログを提供する。ただし、このアナログは、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に明示的に開示したペプチドではない。
【０１０７】
式２のペプチドおよびタンパク質
別の態様では、本発明は、ヒトＩＧＦ−１Ｒに結合し、通常アンタゴニストとして働く新規なタンパク質およびペプチドであって、式２に記載のアミノ酸配列を含む（あるいは、それからなる、あるいは、それから本質的になる）タンパク質およびペプチドを提供する。
【０１０８】
式２は以下のとおり定義される：
Ｘ８Ｘ９ＦＹＧＣＬＬＤＬＳＬＧＶＰＳＸ１０ＧＷＸ１１Ｘ１２Ｘ１３ＣＩＴＸ１４Ｘ１５（配列番号１２）、式中、Ｘ８は任意に存在するＡｒｇ（Ｒ）残基を表し；Ｘ９は任意の好適な残基（通常は極性残基および普通はＤ、ＮまたはＱ残基）を表し；Ｘ１０は任意の好適な残基（通常はＦまたはＬ残基）を表し；Ｘ１１は任意の好適なアミノ酸残基（通常は極性残基、より一般的には塩基性残基、あるいはなおより詳細にはＲ、ＫまたはＤ−Ａｒｇ（「ｒ」）残基）を表し；Ｘ１２は任意の好適なアミノ酸残基（通常は極性残基、より一般的には塩基性残基、あるいはなおより詳細にはＲ、ＫまたはＤ−Ａｒｇ（「ｒ」））を表し；Ｘ１３は任意の好適なアミノ酸残基（通常は極性残基、より一般的には塩基性残基、あるいはなおより詳細にはＲ、ＫまたはＤ−Ａｒｇ（「ｒ」））を表し；Ｘ１４は任意に存在するＡ残基を表し；Ｘ１５は任意に存在するＲ残基を表し、このアミノ酸配列は、Ｆ１３８（ＱＦＹＧＣＬＬＤＬＳＬＧＶＰＳＦＧ  ＷＲＲＲＣＩＴＡ−配列番号１３）ではなく、それを含まない。
【０１０９】
式２の配列は、国際公開第’２４６号に記載されたＦ１３８に非常に類似している。Ｆ１３８は、ＩＧＦ−１Ｒに対して６〜１０×１０９Ｍの結合親和性を持つことが明らかにされている。さらに、Ｆ１３８は、ＩＧＦ−１依存性のＳＷ４８０の増殖に対する拮抗作用を持ち、そのＩＣ５０が１．５×１０−７Ｍであること；約１〜５×１０−７Ｍの範囲のＭＣＦ−７では、そのＩＣ５０が５×１０−７Ｍであることも明らかにされている。また、Ｆ１３８は、＞１×１０−７Ｍで投与するとＳＷ４８０の基礎増殖も阻害する。ＳＷ４８０では、ＩＧＦ−１依存性の増殖で観察されたＦ１３８に伴う阻害作用が、ＩＧＦ−２依存性の増殖でも同様に見られた。Ｌ６のＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１の結合は、１×１０−７ＭのＦ１３８で阻害できた。Ｌ６細胞（主として対称的ＩＧＦ−１Ｒ）およびＬ６  ｈＩＲ（主としてハイブリッドＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ）の場合、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＳ−１、ＭＡＰＫ４２／４４およびＰＫＢ／ＡｋｔのＩＧＦ−１によるリン酸化は、ペプチドＦ１３８で阻害され、そのＩＣ５０は１〜６×１０−７Ｍであった。Ｌ６−ｈＩＲとＦ１３８との関係では、インスリンによるリン酸化に比べてＩＧＦ−１によるチロシンリン酸化を阻害する選択性がある程度認められる。さらに、インスリン／ＩＧＦ−１に応答したＳＧＢＳ細胞のグルコース取り込みは、ペプチドＦ１３８を＜５×１０−６Ｍで投与しても影響を受けない。こうした特性と、ＩＧＦ−１Ｒに結合し、場合によってはＩＧＦ−１Ｒ拮抗作用を示す式２のペプチドが他にも多く同定されていることとを踏まえると、ＩＧＦ−１Ｒに対して結合性を示し、さらにＩＧＦ−１Ｒ拮抗作用を示す可能性がある式２の新たな特異的配列が通常の実験で同定されると予想できる。
【０１１０】
特定の例示的な態様では、本発明は、配列Ｆ３９１（ＱＦＹＧＣＬＬＤＬＳＬＧＶＰＳＦＧＷｒｒｒＣＩＴＡ−配列番号２０８）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になる式２のタンパク質またはペプチドを提供する。ペプチドＦ３９１は、ＩＧＦ−１Ｒに対して８×１０−７Ｍの結合親和性を持つことが明らかにされている。別の態様では、本発明は、Ｆ３９１に対する同一性が少なくとも約８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ３９１のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１１１】
別の代表的な式２のタンパク質およびペプチドは、配列Ｆ３９２（ＱＦＹＧＣＬＬＤＬＳＬＧＶＰＳＦＧＷＫＫＫＣＩＴＡ−配列番号１４）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になるタンパク質およびペプチドに具体化される。ペプチドＦ３９２は、ＩＧＦ−１Ｒに対して２×１０−８Ｍの結合親和性を持つことが明らかにされている。さらに、ペプチドＦ３９２は、ＳＷ４８０のＩＧＦ−１依存性の増殖に対して拮抗作用を示し、そのＩＣ５０が８×１０−７Ｍであることも明らかになった。別の態様では、本発明は、配列番号１４に対する同一性が少なくとも約８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ３９２のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１１２】
さらなる例示的態様では、本発明は、配列Ｆ４０７（ＲＱＦＹＧＣＬＬＤＬＳＬＧＶＰＳＦＧＷＲＲＲＣＩＴＡＲ−配列番号１５）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になるタンパク質またはペプチドを提供する。ペプチドＦ４０７は、７×１０−８Ｍの結合でＩＧＦ−１Ｒに結合することが明らかにされている。別の態様では、本発明は、配列番号１５に対する同一性が少なくとも約８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ４０７のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１１３】
なお別の特定の態様では、本発明は、配列Ｆ４０８（ＮＦＹＧＣＬＬＤＬＳＬＧＶＰＳＦＧＷＲＲＲＣＩＴＡ−配列番号１６）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になるタンパク質またはペプチドを提供する。ペプチドＦ４０８は、ＩＧＦ−１Ｒに対して２×１０−９Ｍの結合親和性を持つことが明らかにされている。別の態様では、本発明は、配列番号１６に対する同一性が少なくとも約８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ４０８のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１１４】
別の例示的な式２のペプチドおよびタンパク質は、配列Ｆ４２８（ＤＦＹＧＣＬＬＤＬＳＬＧＶＰＳＬＧＷＲＲＲＣＩＴ−配列番号１７）を含む。ペプチド４２８は、ＩＧＦ−１Ｒに対して１×１０−９Ｍの結合親和性を持つことが確認されている。さらに、ペプチド４２８は、ＳＷ４８０のＩＧＦ−１依存性の増殖に対して拮抗作用を持ち、そのＩＣ５０が５〜１０×１０−７Ｍであることが実験で確認されている。別の態様では、本発明は、配列番号１７に対する同一性が少なくとも約８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ４２８のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１１５】
なおさらなる態様では、本発明は、配列Ｆ４２９（ＤＦＹＧＣＬＬＤＬＳＬＧＶＰＳＬＧＷＲＲＲＣＩＴＡ−配列番号１８）からなり、それから本質的になる、あるいは、それを含むペプチドおよびタンパク質を提供する。ペプチドＦ４２９は、ＩＧＦ−１Ｒに対して６×１０−１０Ｍの結合親和性を持つことが確認されている。さらに、ペプチドＦ４２９は、ＳＷ４８０のＩＧＦ−１依存性の増殖に対して拮抗作用を持ち、そのＩＣ５０が３〜１０×１０−７Ｍであることも明らかになっている。別の態様では、本発明は、配列番号１８に対する同一性が少なくとも約８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ４２９のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１１６】
別の態様では、本発明は、Ｎ末端ピログルタマート残基を含むＦ１３８の誘導体（Ｆ１３８Ｐ）を提供する。Ｆ１３８Ｐは、Ｆ１３８と同様にＩＧＦ−１Ｒに対して結合親和性を持つことが明らかにされている。Ｆ１３８Ｐは、ＩＧＦ−１依存性のＳＷ４８０の増殖に対して拮抗作用を示し、そのＩＣ５０が５×１０−７Ｍであることが示されている。さらに、Ｆ１３８Ｐは、＞１×１０−７Ｍで投与するとＳＷ４８０の基礎増殖も阻害する。
【０１１７】
式３のタンパク質およびペプチド
別の態様では、本発明はさらに、ヒトＩＧＦ−１Ｒに結合し、通常アンタゴニストとして働くタンパク質およびペプチドであって、式３に記載のアミノ酸配列を含む（あるいは、それからなる、あるいは、それから本質的になる）タンパク質およびペプチドを提供する。
【０１１８】
式３は以下のとおり定義される：
Ｘ１６Ｘ１７ＦＹＳＣＬＡＳＬＸ１８Ｘ１９ＧＸ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５ＧＸ２６ＷＥＲＣＲＸ２７Ｘ２８（配列番号１９）、式中、Ｘ１６は任意に存在するＥ残基を表し；Ｘ１７はＴまたはＳ残基を表し；Ｘ１８は任意の好適な残基（ただし、通常は疎水性残基、脂肪族非電荷残基、脂肪族残基、あるいはなおより詳細にはＬまたはＶ残基）を表し；Ｘ１９は任意の好適な残基（ただし、通常はＴまたはＡ残基などの低分子残基および／または疎水性残基）を表し；Ｘ２０は任意の好適な残基（ただし、通常はＴまたはＰ残基などの低分子残基）を表し；Ｘ２１は任意の好適な残基（ただし、通常はＰまたはＲ残基などの柔軟な残基）を表し；Ｘ２２は任意の好適な残基（たとえば、Ｑ、ＥまたはＷ残基）を表し；Ｘ２３は任意の好適な残基（ただし、通常はＰまたはＱ残基などの柔軟な残基）を表し；Ｘ２４は任意の好適な残基（ただし、通常はＮまたはＫ残基などの極性残基）を表し；Ｘ２５は任意の好適な残基（ただし、通常はＲまたはＧ残基などの疎水性および／または柔軟な残基）を表し；Ｘ２６は任意の好適な残基（ただし、通常はＳ、ＡまたはＰ残基などの低分子残基）を表し；Ｘ２７は任意に存在する柔軟な残基および／または極性残基（たとえば、Ｅ、ＲまたはＫ残基）を表し；Ｘ２８は任意に存在する柔軟な残基および／または極性残基（たとえば、ＫまたはＥ残基）を表し、この配列は、（国際公開第’２４６号に開示されている）ＲＰ６（ＴＦＹＳＣＬＡＳＬＬＴＧＴＰＱＰＮＲＧＰＷＥＲＣＲ−配列番号２０）ではない（それを含まない）。
【０１１９】
例示的な一態様では、式３のペプチドまたはタンパク質は、配列Ｆ２３０（ＥＳＦＹＳＣＬＡＳＬＶＡＧＴＰＷＰＫＧＧＳＷＥＲＣＲＥＥ−配列番号２１）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になる。ペプチドＦ２３０は、ＩＧＦ−１Ｒに対して２〜５×１０−８Ｍの結合親和性を持つことが実験で確認された。別の態様では、本発明は、配列番号２１に対する同一性が少なくとも約８０％、８４％、８７％、９０％、９３％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ２３０のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１２０】
別の例示的な（ｅｘｅｍｐｌａｒ）側面では、本発明は、配列Ｆ１４２（ＴＦＹＳＣＬＡＳＬＬＴＧＰＲＥＱＮＲＧＡＷＥＲＣＲＲ−配列番号２２）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になる式３のペプチドおよびタンパク質を提供する。ペプチドＦ１４２は、ＩＧＦ−１Ｒに対して４×１０−８Ｍの結合親和性を持つことが確認されている。別の態様では、本発明は、配列番号２２に対する同一性が少なくとも約８０％、８５％、８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ１４２のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１２１】
式４の配列を含む新たなＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト
別の態様では、本発明はさらに、ヒトＩＧＦ−１Ｒに結合し、通常アンタゴニストとして働くタンパク質およびペプチドであって、式４に記載のアミノ酸配列を含む（あるいは、それからなる、あるいは、それから本質的になる）タンパク質およびペプチドを提供する。
【０１２２】
式４は以下のとおり定義される：
Ｘ２９Ｘ３０ＤＣＸ３１Ｘ３２ＲＰＣＧＤＡＸ３３Ｘ３４ＦＹＸ３５ＷＦＸ３６ＱＱＸ３７ＳＸ３８（配列番号２３）、式中、Ｘ２９は任意の好適な残基（たとえば、Ｙ残基）を表すが、頻繁にＱ残基であり、Ｘ３０は任意の好適な残基を表し；Ｘ３１は任意の好適な残基（たとえば、Ｗ）を表し、ただし、通常はＲ残基であり；Ｘ３２は任意の好適な残基（ただし、通常はＡ、ＤまたはＧ残基などの低分子残基）を表し；Ｘ３３は任意の好適な残基（たとえば、Ａ、Ｐ、ＥまたはＤ残基）を表し；Ｘ３４は任意の好適な残基を表し、ただし、通常はＮまたはＳ（または他の低分子および／または極性残基）であり；Ｘ３５は任意の好適な残基を表し、ただし、通常はＤまたはＥであり；Ｘ３６は任意の好適な残基を表し、ただし、通常はＤまたはＶ残基（または他の低分子残基）であり；Ｘ３７は任意の好適な残基（ただし、通常はＡまたはＲ残基などの疎水性残基）を表し；Ｘ３８は任意に存在する任意のＥまたはＤ残基（一般にＥ残基）を表し、この配列は、Ｃ１またはＤ１１２（ＣＷＡＲＰＣＧＤＡＡＮＦＹＤＷＦＶＱＱＡＳ−配列番号２４）（この２つの名称で国際公開第’２４６号開示されている）ではなく、それを含まない。
【０１２３】
特定の例示的一態様では、本発明は、配列Ｆ２６３（ＶＱＤＤＣＲＧＲＰＣＧＤＡＤＳＦＹＥＷＦＤＱＱＡＳ−配列番号２５）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になる式４のタンパク質またはペプチドを提供する。Ｆ２６３ペプチドは、３×１０−８ＭのＩＧＦ−１Ｒに対して結合親和性を持つことが確認されている。別の態様では、本発明は、配列番号２５に対する同一性が少なくとも約８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ２６３のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１２４】
別の例示的な態様では、本発明は、配列Ｆ２６４（ＲＱＷＤＣＲＧＲＰＣＧＤＡＥＳＦＹＥＷＦＤＱＱＲＳ−配列番号２６）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になる式４のペプチドおよびタンパク質を提供する。ペプチドＦ２６４は、ＩＧＦ−１Ｒに対して４×１０−８Ｍの結合親和性を持つことが確認されている。さらに、ペプチドＦ２６４は、ＩＧＦ−１依存性のＳＷ４８０細胞の増殖に対する拮抗作用を持ち、そのＩＣ５０が＞１×１０−６Ｍであることも明らかにされている。別の態様では、本発明は、配列番号２６に対して少なくとも約８８％、少なくとも９２％、少なくとも約９６％など少なくとも約８０％の同一性（ただし、同一性は１００％未満）を示すが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されていないＩＧＦ−１Ｒ結合ペプチド（および少なくともいくつかの場合にはＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト）を提供する。
【０１２５】
別の例示的な実施形態は、配列Ｆ２７０（ＥＳＹＧＤＣＲＤＲＰＣＧＤＡＰＮＦＹＤＷＦＶＱＱＡＳＥ−配列番号２７）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になるペプチドおよびタンパク質で提供される。ペプチドＦ２７０は、ＩＧＦ−１Ｒに対して７×１０−８Ｍの結合親和性を持つことが確認されている。さらに、ペプチドＦ２７０は、ＩＧＦ−１依存性のＳＷ４８０細胞の増殖に対する拮抗作用を示し、そのＩＣ５０が２０×１０−７Ｍであることも確認されている。しかしながら、ＭＣＦ−７に対するアゴニスト作用が認められた（１実験のみ）。別の態様では、本発明は、配列番号２７に対する同一性が少なくとも約８０％、８５％、８９％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ２７０のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１２６】
なお別の態様では、本発明は、配列Ｆ２６５（ＶＱＲＤＣＲＧＲＰＣＧＤＡＡＳＦＹＤＷＦＤＱＱＲＳ−配列番号１９７）を含む、それからなる、あるいは、それから本質的になるペプチドおよびタンパク質を提供する。さらなる態様では、本発明は、配列番号１９７に対する同一性が少なくとも約８０％、８８％、９２％または９６％であるが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されたペプチドではないＦ２６５のアナログ（またはそのアナログを含むタンパク質）を提供する。
【０１２７】
Ｆ３６４およびそのアナログ
本発明はまた、Ｆ３６４（ＦＶＱＤＤＣＲＧＲＰＣＧＤＡＤＳＦＹＥＷＦＤＱＱＡＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ−配列番号２８）を含むタンパク質を提供し、さらに、本発明は、Ｆ３６４からなるか、あるいは、Ｆ３６４から本質的になるペプチドも提供する。Ｆ３６４ペプチドは、５×１０−８Ｍの結合親和性でＩＧＦ−１Ｒに結合することが確認されている。別の態様では、本発明は、配列番号２８に対する同一性が、たとえば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％など、少なくとも約８０％を示すが、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に具体的に記載されていないＩＧＦ−１Ｒ結合ペプチドを提供する。
【０１２８】
新たなＩＧＦ−１Ｒ結合ペプチド／タンパク質
本発明は、本書の例示的な実験方法およびデータのセクションに示した各表に記載した新たなＩＧＦ−１Ｒ結合ペプチド（たとえば、表４に示した配列番号２９〜５４および５６〜１９５で定義したペプチドおよび／またはその配列番号の少なくとも１つを含むタンパク質）を提供する。また、そうしたペプチドに対する同一性が、たとえば、少なくとも約８２％（たとえば、約８５％またはそれ以上）、少なくとも約８６％（たとえば、約９０％またはそれ以上）、少なくとも約９２％、あるいは少なくとも約９６％（たとえば、約９５％またはそれ以上）など、高い同一性を持ち、類似したＩＧＦ−１Ｒ結合特性および／または拮抗作用特性を持つそうしたペプチドのアナログも、本発明のさらなる側面として提供する（ただし、そうしたアナログは、本明細書または国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に明示的に開示されていない。表４に開示したペプチドに見られるように、本明細書に記載した配列のいずれかの多量体も有用な生物学的特性を示す場合がある。そうしたペプチドおよびタンパク質は、本発明の別の特徴である。本発明の新たな特徴は、別の機能的部分（たとえば、抗癌剤（たとえば、毒性タンパク質）または血管新生阻害薬（たとえば、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ：ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ））または検出しやすくする配列（たとえば、緑色蛍光タンパク質またはエピトープタグ配列））に連結されている、本明細書に開示した配列の１つまたは複数を含む融合タンパク質である。機能的部分または検出しやすくする配列は、本発明の１つまたは複数の配列に直接コンジュゲートされていても、リンカーでコンジュゲートされていてもよい。リンカーについては、たとえば、「柔軟な」アミノ酸配列リンカー（たとえば、ＧＳＧＳ（配列番号５５）または以下に記載するＬｉｇまたはＰｏｘ部分などの化学部分）であってもよい。
【０１２９】
ペプチド／タンパク質を作製する核酸、ベクター、細胞および方法
別の態様では、本発明は、上述の本発明のペプチドまたはタンパク質のいずれかの少なくとも１個をコードする配列を含む単離された核酸配列を提供する。この核酸は、任意の好適な組成物の核酸で構わない。たとえば、この核酸は、ＤＮＡ分子（一本鎖または二本鎖）、ＲＮＡ分子（一本鎖または二本鎖）、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子または上述のペプチドの１個をコードする発現可能な核酸配列を含む他の核酸分子であってもよい。この核酸は、ホスホチオアート骨格など、他の修飾および／または特徴を含んでも構わない。
【０１３０】
追加的な側面では、本発明は、上述したばかりの態様に記載の核酸を含むベクターを提供する。「ベクター」とは、（ａ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列の発現を促し、（ｂ）そこからペプチド／タンパク質を産生しやすくし、（ｃ）標的細胞にそのトランスフェクション／形質転換を促進し、（ｄ）核酸配列の複製を促し、（ｅ）核酸の安定性を高め、（ｆ）核酸および／または形質転換／トランスフェクト細胞を検出しやすくし、および／または（ｇ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸に有利な生物学的および／または生理化学的機能を別途付与する送達ビヒクルをいう。本明細書の文脈において、ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクターおよび合成核酸ベクター（一連の好適な発現制御エレメントを含む核酸配列）など、任意の好適なベクターで構わない。そうしたベクターの例として、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡを組み合わせて得られるベクターおよびウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターが挙げられる。例示的な一態様では、核酸は、たとえば、直鎖状発現エレメント（たとえば、Ｓｙｋｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：３５５−５９に記載されている）、コンパクト核酸ベクター（たとえば、米国特許第６，０７７，８３５号および／または国際公開第００／７００８７号に記載されている）、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８またはｐＵＣ１１８／１１９などのプラスミドベクター、「ｍｉｄｇｅ：ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ，ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」最小核酸ベクター（たとえば、Ｓｃｈａｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ３：７９３−８００に記載されている）またはＣａＰＯ４沈殿法によるコンストラクトなどの沈殿法による核酸ベクターコンストラクト（たとえば、国際公開第００／４６１４７号，Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｈｅｆ（１９８６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：９５５１−５５，Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８），Ｃｅｌｌ  １４：７２５，ａｎｄ  Ｃｏｒａｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ（１９８１）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３に記載されている）などの裸のＤＮＡまたはＲＮＡベクターに含まれる。こうした核酸ベクターおよびその使用法は、当該技術分野において周知である（たとえば、米国特許第５，５８９，４６６号および同第５，９７３，９７２号を参照されたい）。
【０１３１】
ベクターについては、任意の好適な細胞型（たとえば、哺乳動物細胞、酵母細胞など）で発現できるかどうかを基準に選択すればよい。一態様では、ベクターは、細菌細胞でのペプチド／タンパク質の発現に好適である。そうしたベクターの例として、たとえば、精製しやすい融合タンパク質の高度な発現を誘導するベクター（たとえば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：５５０３−５５０９（１９８９）などの多機能の大腸菌クローニングおよび発現ベクター；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）；および同種のもの）が挙げられる。さらに、あるいはその代わりに、発現ベクターは、たとえば、酵母系での発現に好適なベクターであってもよい。酵母系での発現に好適であれば、どのような任意のベクターを用いても構わない。たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに使用される好適なベクターには、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨなど、構成的または誘導性プロモーターを含むベクターがある（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｓｕｐｒａ，ａｎｄ  Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５３：５１６−５４４（１９８７）を参照されたい）。
【０１３２】
ベクターは、任意の好適なプロモーター、エンハンサーおよび他の発現を促進するエレメントを含んでいても、それと結合していてもよい。そうしたエレメントの例として、強力な発現プロモーター（たとえば、ヒトＣＭＶ  ＩＥプロモーター／エンハンサー、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＬ３−３プロモーター、ＭＭＴＶプロモーターまたはＨＩＶ  ＬＴＲプロモーター）、効率的なｐｏｌｙ（Ａ）終止配列、大腸菌のプラスミド産物の複製起点、選択可能なマーカーとしての抗生物質耐性遺伝子および／または簡便なクローニング部位（たとえば、ポリリンカー）が挙げられる。さらに、ベクターは、ＣＭＶ  ＩＥなどの構成的プロモーターではなく誘導性プロモーターを含んでも構わない（一定の条件下での遺伝子発現の相対的な度合いを実際にこうした用語で記述することを当業者であれば理解するであろう）。一態様では、本発明は、癌関連組織などの標的組織における配列の発現を促す組織特異的プロモーターに作動的に連結された、ペプチド／タンパク質をコードする配列を含有する核酸を提供する。そうした癌関連組織に特異的なプロモーター系の例については、たとえば、Ｆｕｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４  Ｊａｎ  １；６４（１）：３６３−９；Ｌａｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００  Ｊａｎ  １５；６０（２）：３３４−４１；ａｎｄ  Ｓｈｉｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｕｒｏｌ．２０００  Ｓｕｍｍｅｒ；４（２）：７３−８２に記載されている。
【０１３３】
別の態様では、この核酸は、ウイルスベクターを介して宿主細胞または宿主動物内に位置する、および／または、そこに送達される。この場合、任意の好適なウイルスベクターを用いてもよく、複数のベクターが当該技術分野において公知である。ウイルスベクターは、単独で、あるいは所望の宿主細胞で本発明の核酸の送達、複製および／または発現を促進する１つまたは複数のウイルスタンパク質を組み合わせて、どのようなウイルスポリヌクレオチドを含んでもよい。ウイルスベクターは、ウイルスゲノムの全部または一部を含むポリヌクレオチド、ウイルスタンパク質／核酸コンジュゲート、ウイルス様粒子（ＶＬＰ：ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）またはウイルス核酸および本発明の核酸を含むインタクトなウイルス粒子であってもよい。ウイルス粒子のウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子を含んでも、改変されたウイルス粒子を含んでもよい。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター単位複製配列など、複製および／または発現に別のベクターまたは野生型ウイルスの存在が欠かせないベクターでも構わない（すなわち、ウイルスベクターはヘルパー依存ウイルスでもよい）。一般に、そうしたウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子、あるいは導入遺伝子の容量を増加させたり、核酸のトランスフェクションおよび／または発現を補助したりするためタンパク質および／または核酸の内容が改変されたウイルス粒子から本質的になる（そうしたベクターの例として、ヘルペスウイルス／ＡＡＶ単位複製配列がある）。一般に、ウイルスベクターは、通常ヒトに感染するウイルスに類似している、および／またはそれに由来する。この場合、好適なウイルスベクター粒子として、たとえば、アデノウイルスベクター粒子（アデノウイルス科またはアデノウイルス科のウイルスに由来する任意のウイルス）、アデノ随伴ウイルスベクター粒子（ＡＡＶベクター粒子）または他のパルボウイルスおよびパルボウイルスベクター粒子、パピローマウイルスベクター粒子、フラビウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターがある。ウイルスベクターまたは他のベクターは、複製欠損性を特徴とする場合が多い。そうしたウイルスおよびウイルスベクターの例は当該技術分野において周知である。
【０１３４】
本発明の他の特徴として、核酸、ベクターまたはそのいずれかあるいは両方を含む、酵母細胞、細菌細胞および哺乳動物細胞（たとえば、不死化した哺乳動物細胞）などの組換え細胞が挙げられる。たとえば、例示的な一態様では、本発明は、本発明の様々な態様の１つに記載のペプチド／タンパク質の発現をコードする配列を含むプラスミド、コスミド、ファージミドまたは直鎖状発現エレメントなどの組み込まれてない核酸を含む細胞を提供する。
【０１３５】
なお別の態様では、本発明は、上述の本発明の態様のいずれかに記載のペプチドまたはタンパク質を作製する方法であって、ペプチド／タンパク質の発現をコードする核酸またはそれを含むベクターで細胞を形質転換／トランスフェクトすることと、通常核酸の発現に好適な条件下で細胞を培養することと、そこから発現産物を（たとえば、分泌産物の場合、細胞ライセートまたは細胞培地から）回収することを含み、通常それと共におよび／またはその後に単離されたタンパク質／ペプチドを得るための１つまたは複数の精製方法（たとえば、遠心分離、クロマトグラフィー精製および／または濾過）を含む方法を提供する。タンパク質およびペプチドのトランスフェクション／形質転換、培養および精製の方法は、当該技術分野において公知であり、したがって、本明細書に記載する必要はない。
【０１３６】
また、本発明により提供されるペプチドは、化学「合成」法で作製してもよい。数多くの化学合成の方法が公知で利用可能であり、作製にはそうした方法の任意の好適なタイプを用いればよい。そうした技法の例として、単独の固相合成、部分的な固相法、フラグメント縮合、古典的な溶液合成が挙げられる。さらに、ペプチドを作製する組換え法および合成法を組み合わせて半合成ペプチドを作製してもよい。このため、たとえば、その鎖については、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；１９９７に記載されているような固相ペプチド合成で調製することができる。一実施形態では、α−アミノ基末端が保護されているアミノ酸で合成を行う。また、不安定な側鎖を持つ三官能性アミノ酸については、ペプチドの構築過程で好ましくない化学反応が起こらないように好適な基で保護してもよい。α−アミノ基の保護基は、アミノ末端で後続反応が起こるように選択的に除去することができる。この条件では、α−アミノ基の保護基を除去しても側鎖の保護基は除去されない。こうした方法に関する他の原理は、たとえば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｒ  Ｂ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．１９８５；９７：７９９−８１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９７；２８９：３−１３；Ｈａｃｋｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９６，ｐｐ．１００６８−１００７３，Ａｕｇｕｓｔ  １９９９；Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，１０６−１１０，１９７９；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３１０：１０５−１１１；ａｎｄ  Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３  Ａｐｒｉｌ  ２９；１００（９）：５０７５−５０８０に記載されている。
【０１３７】
医薬組成物
本発明の本発明の化合物（タンパク質、ペプチド、核酸、ベクターなど）および／または任意の第２の作用物質（たとえば、１つまたは複数の新たな抗癌および／または血管新生阻害化合物／組成物）は、任意の好適なキャリア、希釈液、賦形剤および同種のものと一緒に製剤化してもよい（たとえば、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１（１９９８）を参照されたい。「ビヒクル」および「キャリア」という語を用いる場合、本発明において記載されたそうしたタイプの作用物質および／または指定の投与経路（および意図した保存など）に適切な機能性向上剤（たとえば、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、乳化剤、防腐剤、充填剤、塩（類）、可溶化剤、洗浄剤、抗凝集剤（たとえば、抗凝集アミノ酸製剤）分散媒、等張剤、組織固定液、キレート化剤、緩衝液、抗菌薬、酸化防止剤、色素、着香剤、吸収遅延剤、放出制御剤など）をすべて総称し、参照によって個別に指称することがある。そのような追加成分が、本発明の医薬製剤の全体的な安定性によくない影響を与えてはならないことは言うまでもない。好適なキャリア、希釈液、アジュバントおよび機能性向上剤、さらにそうした組成物の投与モード／製剤化については、医薬品技術分野でよく知られている。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照されたい。さらに、たとえば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｈ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６６１），１−１９（１９７７）；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ：４２，Ｓ４−Ｓ６（１９８８），米国特許第６，１６５，７７９号および同第６，２２５，２８９号も参照されたい。これに関連する新たな原理、方法および作用物質は、たとえば、Ｕｒｑｕｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，１６，３６７（１９８０），Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ−ＤＩＳＰＥＲＳＥ  ＳＹＳＴＥＭＳ（２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．３，１９９８）；Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＆  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ（７ｔｈ  ｅｄ．２０００）；Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ，ＴＨＥ  ＥＸＴＲＡ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＰＥＩＡ（３１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（１６ｔｈ−２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎｓ）；Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，Ｅｄｓ．（９ｔｈ  ｅｄ．−１９９６）；Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｉｓｖｏｌｄｓ’  ＴＥＸＴＢＯＯＫ  ＯＦ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＭＥＤＩＣＩＮＡＬ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｄｅｌｇａｄｏ  ａｎｄ  Ｒｅｍｅｒｓ，Ｅｄｓ．（１０ｔｈ  ｅｄ．−１９９８）ならびに米国特許第５，７０８，０２５号および同第５，９９４，１０６号に記載されている。また、薬学的に許容される組成物を製剤化する原理は、たとえば、Ｐｌａｔｔ，Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ  Ｍｅｄ．，７：２８９−９９（１９８７），Ａｕｌｔｏｎ，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＳ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＯＦ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭ  ＤＥＳＩＧＮ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８８），ＥＸＴＥＭＰＯＲＡＮＥＯＵＳ  ＯＲＡＬ  ＬＩＱＵＩＤ  ＤＯＳＡＧＥ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ，ＣＳＨＰ（１９９８）および「Ｄｒｕｇ  Ｄｏｓａｇｅ，」  Ｊ．Ｋａｎｓ．Ｍｅｄ．Ｓｏｃ，７０（Ｉ），３０−３２（１９６９）に記載されている。
【０１３８】
本発明の組成物は、たとえば、溶液（たとえば、注射および注入溶液）、分散液または懸濁液および同種のものなど、液体剤形、半固形剤形および固形剤形のように任意の好適な形態で製剤化してもよい。任意の組成物の最適な形態は、予定の投与モード、組成物または組み合わせの性質、および治療分野または他の用途によって異なる。本発明の組成物の典型的な送達モードは、非経口投与（たとえば、静脈内投与）である。一態様では、点滴静注または注射で本発明の組成物をヒト患者に投与する。
【０１３９】
薬学的に許容される組成物は一般に無菌であり、十分な量の本発明（および含まれている任意の第２の作用物質）の化合物を溶解し、製造および保存の条件下で安定であり、かつ使用を予定している被検体に危険性がない（すなわち、たとえば、臨床試験で判定した場合に類似した被検体の多く、ほとんどの場合、かなりの多数（少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％など）に少なくとも危険性がない）。このようにして本発明により提供される（および／または本明細書の他の箇所に記載した様々な方法で用いられる）組成物は、滅菌、精製など従来の製剤工程に供してもよい（このため、組成物の活性成分は、少なくとも実質的に単離されるか、または単離されると考えられる）。
【０１４０】
本発明の一実施形態では、この医薬製剤は、水性製剤、すなわち、水を含む製剤である。こうした製剤は一般に溶液か懸濁液である。本発明のさらなる実施形態では、医薬製剤は水溶液である。「水性製剤」という語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤と定義される。同様に、「水溶液」という語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液と定義され、「水性懸濁液」という語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液と定義される。
【０１４１】
別の実施形態では、この医薬製剤は凍結乾燥製剤であり、使用前に医師または患者が溶媒および／または希釈液を加える。
【０１４２】
注射用医薬品は一般に、無菌で実質的にパイロジェンフリーであり、かつ医学的に許容されない作用がなければ、「治療的使用に問題がない」と考えられる。たとえば、この医薬品はヒト被験者に注射したとき、医学的に許容されない免疫学的反応を起こしてはならない。医学的に許容されない作用については、医療分野の当業者であれば判定できる。組成物の成分を精製して、本明細書に記載し当該技術分野において公知の原理によるそうした成分の製剤化を行い、かつ標準的な試験手順を用いることで、こうした特徴および／または本明細書に記載のそれ以外の特徴に適合した組成物を、過度の実験または作業を行うことなく得ることができる。
【０１４３】
治療の用途／方法への応用
本発明により提供される化合物および組成物は、多様な分野で有用である。
【０１４４】
例示的な一態様では、本発明のある種の化合物および組成物は抗癌特性を持つ。このため、本発明の少なくともいくつかの化合物および組成物は、癌の処置に使用することができる（本発明の態様は以下にさらに記載する）。本発明に関して文法上様々な形をとる「処置する」という語は、疾患（癌）の状態、疾患（癌）の進行、疾患（癌）の原因因子または他の異常な癌性状態、前癌状態または新生物状態の有害な影響を予防したり、取り除いたり、消失させたり、減弱したり、緩和したり、最小限に抑えたり、抑制したり、阻止したりすることをいう。
【０１４５】
別の例示的な態様では、本発明の化合物および組成物は血管新生阻害特性を示す。この場合、そうした化合物および組成物を、用途の類似した既知の他の血管新生阻害薬の代用物および／または既知の他の血管新生阻害薬と組み合わせた第２の作用物質として用いることができる（たとえば、一態様では、糖尿病性網膜症を処置するため、あるいは、より一般的には網膜血管新生の抑制／予防のため、たとえば、眼に注射する、および／または点眼剤に加えることで、本発明の化合物または組成物を患者に投与あるいは別途送達してもよい）。
【０１４６】
さらなる側面では、ＩＧＦ−１Ｒに対して拮抗作用を持つ新たな化学物質のスクリーニングの参照物質／ツールとして本発明のペプチドを使用してもよい（そうしたスクリーニング方法の例は、国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号もしくは米国特許出願公開第’１４７号に記載されている）。
【０１４７】
なお別の態様では、（「天然の」ＣＤＲ／可変領域残基／配列／モチーフと、本明細書に開示したペプチド／配列の残基／配列／モチーフとの置換により）改変された抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＣＤＲ／可変領域配列の最適化における参照物質として本発明のペプチドを使用してもよい。
【０１４８】
別の態様では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合ペプチド／配列を融合タンパク質の標的物質として使用することもできる。
【０１４９】
さらに、ＩＧＦ−１Ｒ分子を精製するために本発明のペプチド／タンパク質を用いてもよい。
【０１５０】
さらに、たとえば、体内または他の媒体におけるＩＧＦ−１Ｒの分布を追跡するため、本発明のペプチド／タンパク質を診断剤として使用することもできる（たとえば、蛍光タンパク質部分およびＩＧＦ−１Ｒ結合部分など、検出可能な部分を含む融合タンパク質の場合）。
【０１５１】
癌の処置に関しては、以下に限定されるものではないが、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌および卵巣癌など、様々なタイプの癌の処置に本発明により提供されるＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストを使用することができる。
【０１５２】
特定の態様では、本発明のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト化合物または組成物を膵癌または乳癌の処置剤として使用する。特定の態様では、そうした方法に使用するＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの選択については、１つには培養膵癌細胞または乳癌細胞に対してナノモル範囲またはピコモル範囲のＩＣ５０（たとえば、約６００ピコモル）および／またはＥＤ５０（たとえば、ＥＤ５０が約１０−９）を基準に行う。一般に、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト化合物または組成物は、ヌードマウスまたは他の好適な動物モデル（最も好ましいのはヒト患者）の膵臓腫瘍の増殖に対して阻害作用を示す。
【０１５３】
本発明の化合物については、任意の好適な用量で任意の好適な送達レジメンにより送達することができる。一態様では、癌の処置に送達される本発明の化合物または組成物を、注射または注入により皮下、静脈内または腫瘍内に投与する。
【０１５４】
動物モデル（たとえば、ヌードマウスまたはヒト患者）に対する例示的な投与量は、少なくとも約４週間、週２回投与で約３．７５ｍｇ／ｋｇである。この投与量は１日、週間、隔週、月間または年間のレジメンに置き換えられることが理解されるであろう。たとえば、患者には、２０〜１６ｍｇ／ｋｇまたは１５〜１０ｍｇ／ｋｇまたは９〜５ｍｇ／ｋｇまたは４〜１ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇの範囲の一定の投与量を週２回、あるいは、１日間、３日間、５日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間など数日間、数週間、数ヶ月間または数年間にわたり投与してもよい。
【０１５５】
一般に、本発明の治療方法に使用するＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの量は、有効量（治療効果のある量および／または予防有効量）であることが確認されている量である。
【０１５６】
本発明の組成物は、本発明の化合物（または本発明の化合物および第２の作用物質を含む組み合わせ組成物の場合、第１および第２の量）の「治療有効量」または「予防有効量」を含んでもよい。「治療有効量」とは、宿主において所望の治療結果（たとえば、血管形成または癌の進行の抑制に関連した生理反応の誘導、促進および／または増強）が得られる適切な投与量で適切な期間にわたり送達した際に有効な量をいう。治療有効量は、個体の病状、年齢、性別および体重および個体に所望の反応を惹起する化合物（または化合物／第２の作用物質）の能力など、要因によって異なる場合がある。また、治療有効量は、治療上有益な作用が、本発明のペプチド／分子の任意の毒性作用または有害作用を凌駕する量でもある。「予防有効量」とは、所望の予防結果（たとえば、予防レジメンを受けていない類似の患者と比較した際の障害が発症する可能性の低下、障害の強度または拡大の抑制、差し迫った障害における生存可能性の向上、疾患状態の発症の遅延、差し迫った状態の進展が抑制されていることなど）を得るのに必要な投与量および期間で有効な量をいう。一般に、予防用量は疾患になる前または疾患の比較的初期に被検体に使用するため、予防有効量は、治療有効量よりも少なくなる。本明細書で「処置」という語は、任意の症状または病状の発症を予防するため、あるいは、すでに発症しているそうした症状または病状を緩和したり、軽減したり、根絶（治癒）したりするために有効量の本発明の治療活性化合物を送達することをいう。このため、「処置」という語は、予防的処置を含むことを意図している。しかしながら、本発明の治療レジメンおよび予防レジメンはやはり本発明の別々に独立した態様と考えられることも理解されよう。したがって、この語が本明細書のどこで使用されても、やはり、そうした別々の予防および緩和／治療用途を示すものとして理解すべきである。
【０１５７】
他のタイプの癌についても、本発明の化合物または組成物を有効量で投与または送達することで処置できる。非限定的な例として、そうした癌は、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病およびリンパ腫のほか、腺扁平上皮癌、混合性中胚葉腫、癌肉腫および奇形癌などの混合型の癌であってもよい。代表的な癌として、膀胱癌、肺癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、頭頸部癌、前立腺癌およびメラノーマがあるが、これに限定されるものではない。具体的には、ＡＩＤＳ関連癌（たとえば、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫）、骨癌（たとえば、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、ユーイング肉腫およびそれに関連する癌）および血液の癌／血液癌（たとえば、成人急性リンパ芽球性白血病、小児急性リンパ芽球性白血病、成人急性骨髄性白血病、小児急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、成人ホジキン病、小児ホジキン病、妊娠中のホジキン病、菌状息肉腫、成人非ホジキンリンパ腫、小児非ホジキンリンパ腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群および骨髄増殖性障害）が挙げられる。
【０１５８】
さらに、本発明の方法の実施による処置の対象として、脳癌（たとえば、成人脳腫瘍、小児脳幹グリオーマ、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児上衣腫、小児髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性および松果体部ならびに小児視経路および視床下部グリオーマ）、消化器／胃腸癌（たとえば、肛門癌、肝外胆管癌、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、食道癌、胆嚢癌、成人原発性肝癌、小児肝癌、膵癌、直腸癌、小腸癌および胃癌）、筋骨格癌（たとえば、小児横紋筋肉腫、成人軟部組織肉腫、小児軟部組織肉腫および子宮肉腫）および内分泌癌（たとえば、副腎皮質癌、消化管カルチノイド腫瘍、膵島細胞癌（膵内分泌部）、副甲状腺癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍および甲状腺癌）が挙げられる。
【０１５９】
さらに、本明細書に記載の本発明の方法の実施における対象として、神経癌（たとえば、神経芽細胞腫、下垂体腫瘍および原発性中枢神経系リンパ腫）、眼癌（たとえば、眼内黒色腫および網膜芽細胞腫）、尿生殖器癌（たとえば、膀胱癌、腎（腎細胞）癌、陰茎癌、腎盂と尿管の移行上皮癌、精巣癌、尿道癌、ウィルムス腫瘍および他の小児腎腫瘍）、呼吸器／胸部癌（たとえば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫および悪性胸腺腫）、胚細胞癌（たとえば、小児頭蓋外胚細胞腫瘍および性腺外胚細胞腫瘍）、皮膚癌（たとえば、メラノーマおよびメルケル細胞癌）、婦人科癌（たとえば、子宮頸癌、子宮内膜癌、妊娠性絨毛性腫瘍、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、子宮肉腫、腟癌および外陰癌）および未知の原発癌が挙げられる。
【０１６０】
本発明の実施により処置できる具体的な乳癌として、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ：ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、乳管癌非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ：ｌｏｂｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、乳頭癌および面皰癌などの非浸潤性癌または、たとえば、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、浸潤性乳管および小葉癌、髄様癌、粘液（膠様）癌腫、面皰癌、パジェット病、乳頭癌、管状癌および炎症性癌のような腺癌または癌腫などの浸潤癌があるが、これに限定されるものではない。具体的な前立腺癌としては、腺癌および肉腫または前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ：ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）などの前癌状態が挙げられる。具体的な肺癌には、気管支カルチノイド（気管支腺腫）、軟骨性過誤腫（良性）、孤立性リンパ腫および肉腫（悪性）腫瘍などの腫瘍に関係した肺癌のほか、多中心性リンパ腫に関係した肺癌がある。気管支原性癌については、扁平上皮癌、小細胞癌、非小細胞癌または腺癌として現れる場合がある。具体的な癌の場合、たとえば、脾臓、肝臓、前立腺、卵巣、結腸または中枢神経系などの患部または患部臓器に本ペプチドを直接送達してもよいことが理解されよう。
【０１６１】
本発明のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストペプチドおよびタンパク質については、個別に投与しても、他のＩＧＦ−１もしくはＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストまたは阻害剤と組み合わせて投与もしてもよい。あるいは、開示したＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストペプチドを他の癌治療、たとえば、手術、放射線、生物学的応答調節、免疫療法、ホルモン療法および／または化学療法と組み合わせて用いてもよい。前立腺癌の場合、化学療法剤の非限定的な例として、ドセタキセル、パクリタキセル、エストラムスチン、エトポシド、ビンブラスチン、ミトキサントロンおよびパクリタキセルが挙げられる。乳癌の場合、化学療法剤および生物学的作用物質の非限定的な例として、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、タモキシフェン、パクリタキセル、ドセタキセル、ナベルビン、カペシタビン、マイトマイシンＣ、インターフェロン、インターロイキン−２、リンパ球活性化キラー細胞、腫瘍壊死因子およびモノクローナル抗体（たとえば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ受容体に対するｍＡｂ（トラスツズマブ）Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））が挙げられる。肺癌の場合、化学療法剤および生物学的作用物質の非限定的な例として、白金化合物（たとえば、シスプラチンまたはカルボプラチン）、ビンカアルカロイド類（たとえば、ビノレルビン、ビンクリスチンまたはビンブラスチン）、タキシン（たとえば、ドセタキセルまたはパクリタキセル）および様々なトポイソメラーゼ阻害剤があるが、これに限定されるものではない。
【０１６２】
別の態様では、本発明のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストを用いて、ヒト患者などの哺乳動物宿主の癌の進行または腫瘍の進行の１つまたは複数の段階を抑制する。「癌の進行」とは通常、正常な非腫瘍性細胞の癌性の腫瘍細胞への変化；そうした腫瘍細胞の移動；およびその後の腫瘍の形成、増殖および拡大（後者の態様を腫瘍の進行と呼ぶこともある）を促すか、それを示す任意の現象または現象の組み合わせをいう。そうした現象の例として、正常な非腫瘍性細胞の、前腫瘍と認められる表現型への形質転換に伴う細胞の表現型の変化と、前腫瘍細胞から腫瘍細胞への形質転換を示す細胞の表現型の変化とが挙げられる。本発明の方法を用いてＩＧＦ−１Ｒに関連する癌または腫瘍の進行の任意の段階を抑制することができる。特定の例示的な態様では、癌の進行の抑制とは、前腫瘍および／または腫瘍細胞の増加（増殖）および／または生存の減少を意味する。
【０１６３】
キット
さらに、本方法を実施するためのキットも提供する。本キットは、含まれる成分が大きく異なる場合がある。本キットは、ヒトインスリン様成長因子−１受容体（ＨＩＧＦ−１Ｒ）に結合する本発明のペプチドおよび／またはタンパク質を少なくとも含む。ある態様では、本キットは、本発明のペプチドまたはタンパク質をコードする核酸と、そうした核酸を含むベクターおよび細胞と、そうした化合物を含む医薬組成物とをさらに含む場合がある。
【０１６４】
ある実施形態では、本キットは、癌処置の投与を患者が行うための説明書を含む。
【０１６５】
この説明書は、好適な記録媒体または基盤に記録されていればよい。たとえば、この説明書は、紙またはプラスチックなど基盤に記録されている場合がある。このため、説明書は添付文書としてキットに含まれいることもあれば、キットまたはその要素の容器のラベル表示に含まれている（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージングに貼付されている）場合などもある。他の実施形態では、説明書は、好適なコンピューター読み取り可能な記録媒体、たとえば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット上に存在する電子記憶データファルとして含まれている。なお他の実施形態では、実際の説明書はキットに含まれていないが、たとえば、インターネットにより、説明書を遠隔の送信元から取得する手段が提供されている。この実施形態の例として、説明書を閲覧できる、および／または説明書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットが挙げられる。説明書を取得するこの手段は、説明書と同様、好適な基盤に記載されている
本キットの要素の一部または全部は、無菌性を保つため好適なパッケージングに包装されている。本キットの多くの実施形態では、キットの要素をキット収納エレメントに包装して取り扱いやすい単一ユニットにしてある。箱または類似の構造などのキット収納エレメントは、たとえば、キット要素の一部または全部の無菌性をさらに保つため、気密容器であることもあれば、そうでない場合もある。
【実施例】
【０１６６】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、こうした実施例を限定的に解釈してはならない。本出願において引用された参考文献、特許および公開された特許出願の内容についてはすべて参照によって本明細書に援用する。
【０１６７】
以下の例示的な実験方法およびデータは、本発明の様々な態様に関する説明を分かりやすくするために提示するものであり、いかなる場合も、本発明の範囲を限定するものと見なしてはならない。
【０１６８】
材料および方法の簡単な説明
本明細書に記載したデータの取得に用いた実験については、上記の国際公開第’２４６号、国際公開第’７７１号および米国特許出願公開第’１４７号に以前記載されたものに類似した標準的な方法を用いて行った。このため、本明細書では、本データの取得に使用した具体的な方法の一部をごく簡単に説明する。
【０１６９】
（実施例１）
ＩＧＦ−１Ｒの親和性試験
ＩＧＦ−１Ｒの親和性試験は原則として以下のとおり行った。ヒトＩＧＦ−１Ｒ（ＨＩＧＦ−１Ｒ）を様々な濃度の被検物質で１２５Ｉ標識ヒトＩＧＦ−１とインキュベートし、Ｋｄを算出した。ＨＩＧＦ−１Ｒについては、ＩＧＦ−１ＲのｃＤＮＡを安定にトランフェクトしたＢＨＫ細胞の細胞培養液から精製した。回収の前日に細胞を無血清状態に置き、回収前に細胞を氷冷ＰＢＳ溶液でリンスした。この細胞を、冷たい溶解緩衝液（４ｍｌの溶解緩衝液／１×１０８細胞）に可溶化し（ｓｏｌｕｂｉｌｌｉｚｅｄ）；激しくボルテックスして溶解緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ８．０）；１５０ｍＭのＮａＣｌ；１％トリトンＸ−１００；２ｍＭのＥＤＴＡ；１０μｇ／ｍｌのアプロチニン；０．５ｍＭのＰＥＦＡＢＬＯＣ（Ｒｏｃｈｅ））に溶解し；このライセートを２００００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。ＨＩＧＦ−１Ｒ部分をＷＧＡ−アガロースビーズに吸収させ、クロマトグラフィーによる精製（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｎｏ  １７−０７６０−０１）に供した（カラムはカラム体積の２０倍量の洗浄用緩衝液−５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ８．０）；１５０ｍＭのＮａＣｌ；０．１％トリトンＸ−１００；０．５ｍＭのＰＥＦＡＢＬＯＣ（Ｒｏｃｈｅ）で洗浄した）。次いでＨＩＧＦ−１Ｒ部分を、溶出緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ８．０）；１５０ｍＭのＮａＣｌ；０．１％トリトンＸ−１００；０．５ｍＭのＰＥＦＡＢＬＯＣ（Ｒｏｃｈｅ）；０．５Ｍのｎ−アセチルグルコサミン；１０％グリセロール）に加えた０．５Ｍのｎ−アセチルグリコサミン（ＮＡＧ：ｎ−Ａｃｅｔｙｌ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｅ）、１０％グリセロールで溶出した。溶出液についてＩＧＦ−１受容体チロシンキナーゼ活性およびＩＧＦ−１結合活性（以下でさらに記載する）を検査し、そうした活性を示す画分（ＨＩＧＦ−１Ｒ部分に相当する）を本明細書に記載の実験に使用できるように回収した。親和性の測定では、通常、受容体濃度を、１２５Ｉで標識したリガンド（Ｔｙｒ３１−１２５Ｉ−ＩＧＦ１）２０００ｃｐｍ（３ｐＭ）が３０〜６０％結合するように選択し、検査対象の物質の希釈系列を加えた。４℃で２日間平衡化させてから、通常、各サンプル（２００μｌ）を、４００μｌの２５％ＰＥＧ６０００を加えて沈殿させ、遠心し、１ｍｌの１５％ＰＥＧ６０００で洗浄し、γカウンターでカウントした。場合によって、主な被検ペプチドのヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）親和性を同様に測定した。
【０１７０】
一部の例では、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ）アッセイ）を用いてＩＧＦ−１Ｒ親和性を判定した。簡単に説明すると、抗マウスＳＰＡビーズをＨＩＧＦ−１Ｒ抗体（２４−３１）およびトランスフェクト細胞由来のＷＧＡ精製ＨＩＧＦ−１Ｒと混合した。結合緩衝液は、０．１ＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．８、０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０２５％ツイーン２０、０．５％ＢＳＡであった。この混合物に１２５Ｉ−ＩＧＦ１およびＩＧＦ１の希釈系列または判定対象のペプチドを加えた。室温で１６時間インキュベートしてから、９６ウェルプレートを遠心し、トップカウンターでカウントし、結合に対するＩＣ５０をＫｄの指標として使用した。
【０１７１】
多くのペプチドおよびペプチド誘導体に関するこの親和性試験の結果を表４に示す。この調査から、ＩＧＦ−１Ｒに対して高親和性を示す多くの新規なペプチドが同定された。
【０１７２】
（実施例２）
ＩＧＦ−１Ｒ活性化試験
被検ペプチドによるＩＧＦ−１Ｒ活性化を判定するため、原則として以下の条件によりキナーゼアッセイを採用した。キナーゼ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ１００ｍＭ（ｐＨ８，０）、ＭｇＣｌ２  ８ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ６ｍＭ、トリトンＸ１００  ０．１％ｖ／ｖ、ＢＳＡ０．２％ｗ／ｖ、４μｇ／ｍｌのＩＲＳ−１ペプチド（ＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍｌに加えたビオチン−ＫＳＲＧＤＹＭＴＭＱＩＧ））に溶かした各被検ペプチドの溶液を調製した。サンプルをマイクロタイタープレートで３回混合した。５０μｌの２×キナーゼ緩衝液を各ウェルに加えた。ＩＧＦ−１を当該ウェルにであった（１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍおよび１０−１１Ｍ）。容積を８８μＬに調整してから、精製ＨＩＧＦ−１Ｒ（２μｌ／ウェル）を加えた。プレートを振盪し、室温（ＲＴ：ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で５０分間インキュベートした。ＤＴＴおよび１０μｌ／ウェルのＡＴＰを加え、ウェルを１０分間インキュベートしてから、１０μｌの停止緩衝液（５０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））／ウェルを加え、振盪させて反応を停止させた。次いでこのサンプルをストレプトアビジンコートプレートに移し、ＲＴで１時間インキュベートした。このコートプレートを吸引し、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。１００μｌのＰ−ｔｙｒ  Ａｂ−ＰＯ（ホスホチロシン−ＲＣ２０：ＴＢＳ−Ｔで希釈したＨＲＰＯ（１：１０００））を加え、各プレートをＲＴで３０分間インキュベートした。このプレートを吸引し、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次いで（ＲＴに温めておいた）１００μｌのＴＭＢ−Ｏｎｅ基質（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ａ／Ｓ−Ｄｅｎｍａｒｋ）を加え、このプレートをＲＴで約２０分間さらにインキュベートした。１０μｌのＨ２ＳＯ４を加えてこの反応を止め、その後５〜１０分以内にプレートをＥＬＩＺＡリーダーにて４５０ｎＭで読み取った。ペプチドＦ２３５およびＦ２５９を用いて行った試験の結果を図２にグラフで示す。表７は、そうした実験の追加の結果を含めてある。
【０１７３】
図２に示すように、ペプチドＦ２３５およびＦ２５９は、ＩＧＦ−１によるＩＧＦ−１Ｒキナーゼ活性化を完全に阻害する能力を示す。２つのペプチドは類似した効力を示し、ＩＣ５０は２〜３×１０−７Ｍである。表７に示すペプチドの一部も、ＩＧＦ−１によるＩＧＦ−１Ｒ活性化を阻害しており、こうしたペプチドが受容体に結合するだけでなく、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストとしても働くとする結論が裏付けられる。作用を示さないペプチドのみがアンタゴニストとして機能しなかった。この拮抗ペプチドの一部では、ＩＧＦ−１を加えない場合の受容体の自己リン酸化の基準レベル未満まで自己リン酸化を阻害した（データなし）。このデータは、本発明のペプチドがＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストとして働き得ることを示す。
【０１７４】
（実施例３）
細胞増殖／密度試験
細胞増殖／密度試験では、以下に例示するようなミトコンドリア活性アッセイを用いた。細胞（ＳＷ４８０、ＭＣＦ−７Ｓ８）を完全培地（ＤＭＥ：Ｆ１２、１０％ＦＣＳ（ＳＷ４８０）または５％ＦＣＳ（ＭＣＦ−７Ｓ８、Ｐ／Ｓ））で増殖させ、トリプシン処理し、０．５％ＦＣＳを含む培地に１０，０００細胞／ウェルになるように９６ウェルプレートに播種した。ウェルの外周をすべて除いて培地のみで満たした。一晩展開させてから、ウェルの容積を５０μＬに調整し、この細胞に、所望の濃度の２倍で５０μＬの培地を加えてＩＧＦ−１および／または被検ペプチドを投与した。すべての処置を３回行った。実験ごとにＩＧＦ−１の用量反応曲線を作成した（ＩＧＦ−１：１００、１０、２、１、０．１、０．０１ｎＭ最終濃度）。処置を４８時間（ＳＷ４８０細胞）または７２時間（ＭＣＦ−７Ｓ８細胞）継続してから細胞密度を定量した。培地は毎日交換した。培地およびペプチドをＤＭＳＯで希釈した。細胞密度の測定の際、各ウェルの容積を１００μＬに調整した。希釈しておいたＷＳＴ−Ｉ（１ｍｌ＋１．５ｍｌのＤＭＥ：Ｆ１２）を、バックグラウンドサンプルを含む各ウェルに２５μＬ加えた。培地のみを含む３つのウェルをバックグラウンドコントロールとした。インキュベーター内で光を遮断して、細胞を９０分間インキュベートした。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取った（参照波長６２０ｎｍ）。
【０１７５】
こうした実験の結果を表５および表６に示し、ペプチドＦ１３８の実験結果を図５および図６に（それぞれ様々な用量と、ＩＧＦ−１との関連とで）グラフで示してある（表５に報告したＳＷ４８０細胞およびＭＣＦ−７Ｓ８細胞の細胞密度に対するペプチドの作用については、ペプチド処置単独のほか、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）と競合するペプチドでも同時に測定したのに対し（該当する行に示した特定のペプチドで繰り返し実験も行った）、表６は、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）と競合するペプチドで処置したＳＷ４８０のデータのみを示す。空のセルは、表記のパラメーターのデータが収集できなかったことを意味する。ＥＤ５０とは最大効果の５０％の有効用量を意味し、ＩＣ５０とは５０％阻害の阻害濃度を意味する）。ＩＣ５０を判定できなかったペプチドについては、やや拮抗的（高用量で作用が一部見られる傾向があった）、あるいは細胞密度に変化が見られない場合、作用なしと報告してある。
【０１７６】
ＩＧＦ−１刺激によるＬ６細胞の増殖を阻害するＦ１３８およびＦ２９３ペプチドの拮抗作用を類似のやり方で試験した。３ｎＭのＩＧＦ−１による増殖の刺激作用は、２つのペプチドで阻害することができた。Ｆ１３８の方が増殖を強力に阻害し、そのＩＣ５０が４×１０−６Ｍであったの対し、Ｆ２９３の阻害はＩＣ５０＞１×１０−５Ｍであった。
【０１７７】
こうした結果から、本発明により提供されるペプチドは、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニスト特性を示し、場合によってはＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストが強力であることが明らかである。こうした結果からは、本発明により提供されるペプチドは、癌細胞で増殖抑制作用を示す場合があり、したがって、新規な抗癌治療薬として、あるいは、その開発に有用である可能性があることも明らかである。
【０１７８】
（実施例４）
インスリンアゴニスト活性の評価
インスリンは、脂肪細胞内への３Ｈグルコースの取り込みおよびその脂質への変換を促進する。脂質相への３Ｈの取り込みについては、閃光を発する混合物に脂質相を分割し、水溶性の３Ｈ産物を取り除くことで判定した。国際公開第’２４６号の実施例４に記載された方法にかなり類似した方法により、ＨＩＲをコードするＤＮＡをトランスフェクトされたＳＧＢＳ脂肪細胞を用いて、インスリンまたはＩＧＦ−１の存在下での３Ｈグルコース取り込みに対するペプチドＦ２９３およびペプチドＦ１３８の作用を（別々に）判定（および対照との比較）を行った。結果を完全なインスリン反応に対する増加率として表す。この実験から得られたデータを、インスリン反応のＥＤ２０（近似値）に対するペプチドＦ１３８またはペプチドＦ２９３または（インスリンまたはＩＧＦ−１との組み合わせ）の作用として図１Ａおよび図１Ｂにグラフで示してある。データはそれぞれ完全なインスリン反応を基準に補正した。この実験の結果から、ペプチドＦ１３８もペプチドＦ２９３も、インスリンまたはＩＧＦ−１により誘導されるグルコース取り込みに何ら実質的な作用を与えないことが明らかである。この実験の結果からは、（国際公開第’２４７号に記載されているように）２つの受容体が著しく類似しているにもかかわらず、本発明のペプチドはＩＧＦ−１Ｒのブロックには特性を示し、インスリン受容体には示さないことも明らかである。
【０１７９】
（実施例５）
ＨＩＲおよび／またはＨＩＧＦ−１Ｒのリン酸化
脂肪細胞のＨＩＲまたはＨＩＧＦ−１Ｒの活性化を、この細胞を刺激し、インスリン受容体／ＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化のレベルを調査（ウエスタンブロット）することで測定した。これを行うには、Ｌ６−ｈＩＲ（生理的レベルのインスリン受容体を発現する細胞クローン、すなわち、１００，０００受容体／細胞）および高レベルのＩＧＦ−１Ｒをインキュベートし、この細胞を、インスリンまたはＩＧＦ−１を単独で増量しながら、あるいは、被検ペプチドの存在下で増量しながら１０分間インキュベートした。ＩＧＦ−１Ｒは、対称的なホモ二量体複合体ばかりでなく、半分がインスリン受容体のヘテロ二量体として存在する。インスリンの濃度を上げながら１０分間刺激すると、基準レベル（１に設定）と比較してＬ６−ｈＩＲ細胞のインスリン受容体のチロシンリン酸化が促進され、Ｌ６−ｈＩＲ細胞のＩＧＦ−１の場合よりも強力に促進される（図３Ａ、図３Ｂ）。２μＭのＦ２９３を用いると、インスリン刺激によるチロシンリン酸化に対する作用が軽微である一方、ＩＧＦ−１によるチロシンリン酸化は阻害される。こうした結果から、Ｆ２９３はＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化を特異的に阻害することが示唆される。高濃度のインスリンで刺激ではハイブリッド（ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ）受容体のみ（軽微な作用として）リン酸化が見られる一方、ＩＧＦ−１による刺激ではこの受容体活性化がより明確に阻害される。
【０１８０】
（実施例６）
下流のシグナル伝達試験
ＩＲＳシグナル伝達のチロシンリン酸化（チロシンリン光体ウエスタンブロットの１８０ｋＤａバンド）と、エフェクターＭＡＰＫ４４および４２ならびにＰＫＢの活性化とについて、国際公開第’２４６号の実施例１４に記載された方法にかなり類似した方法により活性型に特異的な抗体を用いて解析した。ＩＲＳは、インスリンでもＩＧＦ−１でも１０分でチロシンリン酸化され、作用はほぼ類似していた（図４を参照）。ペプチドＦ２９３が存在すると、ＩＧＦ−１刺激によるＩＲＳ−１リン酸化はやはり非常に顕著に阻害されることから、Ｆ２９３はＩＧＦ−１Ｒ結合に対して特異性があるが、インスリン受容体に対してはないことが示唆される（図４を参照）。
【０１８１】
同様に、３ｎＭのＩＧＦ−１＋／−Ｆ４２９あるいはＦ１３８の存在下でのＩＲＳ−１リン酸化の試験では、ＩＧＦ−１刺激によるＩＲＳ−１を介した下流のシグナル伝達を阻害する効力はＦ４２９の方がＦ１３８よりも大きく、基準レベルに影響しないことが示される（図７および図８）。
【０１８２】
さらに、下流のシグナル伝達（ＭＡＰＫ４４、ＭＡＰＫ４２、ＰＫＢ／Ａｋｔ、ＩＲＳ−１およびＩＧＦ−１Ｒ）に対する主なペプチドの作用も、主としてＩＧＦ−１Ｒを発現し、インスリン受容体の発現が非常に限れているＬ６細胞のシグナル伝達を調べることで測定した。この実験結果を表８に示す（数字は、基準レベルに対する３ｎＭのＩＧＦ−１による刺激作用のダウンレギュレーションのＩＣ５０である）。ペプチドの拮抗作用は、ＩＧＦ−１Ｒの下流のシグナル伝達すべてに作用していることが認められる。
【０１８３】
こうしたデータから、本発明のペプチドはＩＲＳ−１の下流のシグナル伝達をダウンレギュレートできることが明らかであり、さらに本発明により提供されるペプチドのＩＧＦ−１Ｒ特異的性質が示される。
【０１８４】
【表４−１】
2010526776.tif 000006
【０１８５】
【表４−２】
2010526776.tif 000007
【０１８６】
【表４−３】
2010526776.tif 000008
【０１８７】
【表４−４】
2010526776.tif 000009
【０１８８】
【表４−５】
2010526776.tif 000010
【０１８９】
【表４−６】
2010526776.tif 000011
【０１９０】
【表４−７】
2010526776.tif 000012
【０１９１】
【表４−８】
2010526776.tif 000013
【０１９２】
【表４−９】
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表５
以下のデータは、主な被検ペプチドに関して行った細胞密度アッセイおよびキナーゼアッセイの結果を示す。細胞密度アッセイのＩＣ５０は２つの値、すなわち、１０ｎＭのＩＧＦ−１によるＩＧＦ−１の作用を低下させるのに必要な濃度および０．５％ＦＣＳでの基準レベルを阻害するのに必要な濃度で示す。
【０１９３】
【表５−１】
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【０１９４】
【表５−２】
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【０１９５】
【表５−３】
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【０１９６】
【表５−４】
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以下の表（表６）に記載のデータは、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）によるＳＷ４８０細胞の増殖に対する主な被検ペプチドの阻害作用を示す。数字は、ペプチドのμＭ単位のＩＣ５０値である。
【０１９７】
【表６】
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【０１９８】
【表７】
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表８−ＩＧＦ−１Ｒに関連した下流のシグナル伝達に対する主なペプチドの作用
拮抗ペプチドの作用を、主としてＩＧＦ−１Ｒを発現し、インスリン受容体の発現が非常に限れているＬ６細胞のシグナル伝達を調べることで測定した。数字は、基準レベルに対する３ｎＭのＩＧＦ−１による刺激作用のダウンレギュレーションのＩＣ５０である。
【０１９９】
【表８】
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（実施例７）
以下の追加試験は、本発明の様々な態様をさらに例証し、裏付けるのに役立つ。
【０２００】
材料および方法
追加試験の実施に際しては以下の材料および方法を用いた：
細胞および試薬。ＭＣＦ７細胞およびＭｉａＰａＣａ細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）から入手した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清および１％ｇｌｕｔａｍａｘを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で常法により増殖させた。ＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメインをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）から組換えタンパク質として入手した。
【０２０１】
全細胞ライセートの調製、免疫沈降およびウエスタンブロット解析。ＩＲＳ−１リン酸化の定性分析では、単層培養のＭＣＦ７細胞（約８０％コンフルーエント状態）を用いた。無血清のＲＰＭＩ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で約２０時間飢餓状態に置いた後、細胞を、ＩＧＦ−１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む、またはＩＧＦ−１と合成ペプチド（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を含む、または陰性対照としてそのどちらも含まない同じ培地で１０分間刺激した。処置後、０．２ｍＭのＰＭＳＦおよび１ｍＭのＮａ３ＶＯ４（すべてＳＩＧＭＡ社製）を含む氷冷ＰＢＳで細胞を２回リンスした。細胞を同じ緩衝液に削り取り、２００ｇで３分間遠心分離してペレット状にした。ホスファターゼ阻害剤カクテル１および２（ＳＩＧＭＡ）およびプロテアーゼカクテルインヒビタータブレット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（０．８７６６％ＮａＣｌ、０．１１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸（すべてＳＩＧＭＡ社製）、１％トリトンＸ−１００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））にて氷上で５分間溶解させた。細胞ライセートを１４０００ｇで５分間遠心分離して除き、得られた上清をＥｔＯＨ−ドライアイスで急速凍結し、−８０℃で保存した。タンパク質濃度は、Ｄｃタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて判定した。
【０２０２】
１μｇのポリクローナル抗ＩＲＳ−１抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および２５μＬのプロテインＡ／アガローススラリー（ＳＩＧＭＡ）を含む総タンパク質０．３〜０．５ｍｇを用いて、４０℃で４時間プレクリアしたライセートの免疫沈降を行った。固定化タンパク質を含むアガロースビーズをＩＰ洗浄用緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、０．２ｍＭのＰＭＳＦ）で３回洗浄した。タンパク質の溶出および変性を、０．５Ｍのβ−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ）を含む３０μＬのＬａｅｍｍｌｅサンプル緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて９５℃で３分間行った。
【０２０３】
免疫沈降物を４〜１５％トリス−ＨＣｌ  Ｒｅａｄｙ  ＧｅｌｓのＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｄｉｕｍニトロセルロース膜（どちらもＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）にトランスファーした。膜を、２％脱脂乳を含むＰＢＳ−ツイーン２０（ＳＩＧＭＡ）でブロッキングした。ＩＲＳ−１タンパク質の検出では、ブロットを抗ＩＲＳ−１抗体（二次抗体−ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰコンジュゲート）とインキュベートした。リン酸化ＩＲＳ−１の検出では、ブロットを、抗ホスホチロシン（４Ｇ１０）ＨＲＰコンジュゲートモノクローナル抗体（抗体はすべてＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）とインキュベートした。ブロットを高機能の化学蛍光基質（ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に接触させた。膜を展開し、定性解析のため蛍光シグナルを可視化した。
【０２０４】
細胞アッセイ。ＭＣＦ７細胞またはＭｉａＰａＣａ細胞を、７５μＬの無血清のＲＰＭＩ−１６４０を用いて濃度３×１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。ペプチドの希釈液を別々のワーキングプレートで調製し、７５μＬを細胞に加えた。アンタゴニストアッセイでは、ＩＧＦ−１を各ウェルにＥＤ５０（約５０ｎＭ）の１０倍量加えた。プレートを３７℃で４８〜７２時間インキュベートした。製造者の指示に従い１０μＬのＷＳＴ−１／ウェル（Ｒｏｃｈｅ）を加えて生存率を測定した。
【０２０５】
結合アッセイ。ＩＧＦ−１と比較したホットスポットペプチドリガンド（ＨＰ：ｈｏｔ  ｓｐｏｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄ）（すなわち、「候補ペプチド」または単に「候補物質」）の相対効力を、ビオチン標識ヒトＩＧＦ−１（ｂ−ｈＩＧＦ−１）およびＨｉｓタグ可溶性組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（ｓｒｈＩＧＦ−１Ｒ−ｈｉｓ；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて競合系で解析した。受容体リガンド相互作用の検出を増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ（ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎ；ＢｉｏＳｉｇｎａｌ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ）で測定した。このアッセイは、最終容量を４０μＬとして３８４ウェルＮｕｎｃ（商標）白色ポリスチレンマイクロプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）で行った。最終のインキュベーション条件は、１ｎＭのｂ−ｈＩＧＦ−１、１０ｎＭのｓｒｈＩＧＦ−１Ｒ−ｈｉｓ、０．０２５ＭのＨＥＰＥＳ（２５℃でｐＨ７．４）、０．１００ＭのＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ（Ｃｏｈｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１０μｇ／ｍＬのニッケルコンジュゲートアクセプタービーズおよび１０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンコンジュゲートドナービーズとした。アッセイの第１ステップでは、ｈＩＧＦ−１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、ｂ−ｈＩＧＦ−１（以下を参照されたい）および候補物質を室温で２時間インキュベートした。競合物質の各濃度を２回ずつアッセイした。３×１０−５ＭのｈＩＧＦ−１の存在下で非特異的結合を判定した。アッセイの第２のステップではアクセプタービーズを加え、インキュベーションを０．５時間継続した。最終ステップではドナービーズを加え、インキュベーションをさらに１時間継続した。インキュベーション時間の終了時に、５２０ｎｍの蛍光シグナルをＦｕｓｉｏｎ−α  ＨＴプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）で読み取った。主要なデータのバックグラウンド補正を行い、緩衝液対照を基準に補正してから、特異的結合に対する比率で表した。データを４変数非線形回帰分析（ｙ＝ｍｉｎ＋（ｍａｘ−ｍｉｎ）／（１＋１０∧（（ｌｏｇＩＣ５０−ｘ）＊Ｈｉｌｌｓｌｏｐｅ）））にフィッティングさせ、これを用いてＩＣ５０値を判定した。このアッセイのＺ’−ｆａｃｔｏｒは、０．７（Ｚ’＝１−（３σ＋＋３σ−）／｜μ＋−μ−｜）よりも大きく、シグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比は４０〜７０であった。
【０２０６】
Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（ＰＮ＃２１４３０，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてヒトＩＧＦ−１の遊離アミノ基をビオチン化した。ｐＨ７．２のＰＢＳに加えた２ｍｇ／ｍＬのヒトＩＧＦ−１を、理論的な全遊離アミノ基に対して２０倍過剰のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンと室温で３０分間インキュベートした。未反応ビオチンをＰＢＳで十分に透析（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ）して除去し、コンジュゲーションの程度をＨＡＢＡ（２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン）安息香酸）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ製品カタログ＃２１４３０）で判定した。ビオチン／ｈＩＧＦ−１の数は３〜５であった。
【０２０７】
追加試験の結果
ＭｉａＰａＣａ細胞およびＭＣＦ−７細胞を用いた癌モデルの細胞増殖が、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２およびインスリンに対して用量関連的に増加することを図９（９Ａ〜９Ｆ）に示す。上記のように細胞を、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２またはインスリンで７２時間処置した。具体的には、図９Ａ、図９Ｂはそれぞれ、ＩＧＦ−１のＭｉａＰａＣａ（ヒト膵癌）およびＭＣＦ７（ヒト乳癌）細胞の増殖に対する作用を示し、図９Ｃ、図９Ｄはそれぞれ、ＩＧＦ−２のＭｉａＰａＣａおよびＭＣＦ７に対する作用を示し、図９Ｅ、図９Ｆはそれぞれ、インスリンのＭｉａＰａＣａおよびＭＣＦ７に対する作用を示す。こうしたデータから、ＭｉａＰａＣａ細胞とＭＣＦ７細胞は共に３つのホルモン作用のどれにも反応しており、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストの生物学的作用を実証するモデルとして使用できることが明らかになる。
【０２０８】
図１０に示すように、結合および細胞増殖アッセイにより、Ｆ２５０はＩＧＦ−１の結合と競合し、細胞を用いた癌モデルの活性を抑制することが明らかになる。具体的には、図１０Ａは、Ｆ２５０の濃度に応じてＩＧＦ−１結合が阻害されることを示す。上記のようにＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎアッセイフォーマットを用いて競合実験を行った（データは阻害率を示す。結合速度パラメーターを判定するため、データを４変数ロジスティック式にフィッティングさせた）。
【０２０９】
図１０Ｂは、ＭＣＦ−７細胞のＩＧＦ−１活性に対するＦ２５０による拮抗作用を示す。材料および方法のセクションに記載されているように細胞を処置した。細胞に５×１０−８ＭのＩＧＦ−１の存在下でＦ２５０を加え、７２時間インキュベートしてから、細胞数を判定した。データは阻害率で示してある。結合速度パラメーターを判定するため、データを４変数ロジスティック式にフィッティングさせた。
【０２１０】
図１０Ｃは、ＭｉａＰａＣａ細胞のＩＧＦ−１活性に対するＦ２５０による拮抗作用を示す。材料および方法のセクションに記載されているようにＭｉａＰａＣａ細胞を処置した。細胞に５×１０−８ＭのＩＧＦ−１の存在下でＦ２５０を加え、７２時間インキュベートしてから、細胞数を判定した。このデータは阻害率で示してある。結合速度パラメーターを判定するため、データを４変数ロジスティック式にフィッティングさせた。
【０２１１】
図１１に示した実験結果から、ＩＧＦ−１が癌細胞モデルのリン酸化を刺激すると共に、本発明の候補ペプチドにより阻止または抑制され得ることが明らかになる。具体的には、図１１ａに示したデータは、ＩＧＦ−１がＭＣＦ７細胞においてＩＲＳ−１の一過性のリン酸化を刺激することを示す。この細胞については、１０ｎＭのＩＧＦ−１で０、２，１０、３０、６０分間刺激した。上記の解析ごとに総タンパク質０．５ｍｇを免疫沈降させた。図のパートＡは、内因性ＩＲＳ−１のウエスタンブロット解析結果であり、パート（Ｂ）は、リン酸化ＩＲＳ−１のウエスタンブロット解析結果である［（１）添加なし；（２）２分；（３）１０分；（４）３０分；（５）６０分］。図１１Ｂに示した結果は、ＭＣＦ７細胞においてＩＧＦ−１が引き起こすＩＲＳ−１のリン酸化が用量依存的（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ）であることを示す。この細胞を、濃度を上げながらＩＧＦ−１に１０分間曝露した。解析ごとに総タンパク質０．５ｍｇを免疫沈降させた。０．５０ｎＭのＩＧＦ−１による刺激では、リン酸化のレベルは最大下にあり、ウエスタンブロット解析で常に可視化できた：（Ａ）は内因性ＩＲＳ−１のウエスタンブロット解析結果；（Ｂ）はリン酸化ＩＲＳ−１のウエスタンブロット解析結果［（１）添加なし；（２）０．０５ｎＭのＩＧＦ−１；（３）０．１ｎＭのＩＧＦ−１；（４）５ｎＭのＩＧＦ−１；（５）１ｎＭのＩＧＦ−１；（６）０．５ｎＭのＩＧＦ−１；（７）１０ｎＭのＩＧＦ−１；（８）５０ｎＭのＩＧＦ−１］。図１１Ｃは、ＭＣＦ細胞においてＩＧＦ−１が引き起こすＩＲＳ−１のリン酸化に対する候補ペプチド（ＨＰ）ＲＰ６ＫＫおよびＦ２５０による遮断を示す。ペプチド（３０μＭ）の存在下または非存在下で０．５ｎＭのＩＧＦ−１で細胞を１０分間刺激した。解析ごとに総タンパク質０．３ｍｇを免疫沈降させた。ＲＰ６ＫＫおよびＦ２５０ペプチドは、ＩＧＦ−１が引き起こすＩＲＳ−１のリン酸化を阻害したが、無関係な２つの（対照）ペプチドＫＣＢ７およびＤＧＩ３−Ｄ８は阻害しなかった。具体的には、図１１Ｃのパート（Ａ）は、発現したＩＲＳ−１のウエスタンブロット解析結果であり、パート（Ｂ）は、リン酸化ＩＲＳ−１のウエスタンブロット解析結果である［（１）添加なし；（２）無関係なペプチド１；（３）無関係なペプチド２；（４）ＩＧＦ−１＋無関係なペプチド１；（５）ＩＧＦ−１＋無関係なペプチド２；（６）ＩＧＦ−１＋ＲＰ６ＫＫ；（７）ＩＧＦ−１＋Ｆ２５０；（８）ＩＧＦ−１］。
【０２１２】
（実施例８）
結合および拮抗作用の追加アッセイ
候補ペプチドを用いて結合および拮抗作用の追加アッセイを行った。拮抗作用アッセイでは、原則として以下の方法を用いた。細胞ＭＣＦ７細胞を「飢餓状態にし」（０．１％ＦＢＳで培養）、１０３細胞／ウェルに蒔いた。ウェルにＩＧＦ−１（ＥＤ８０（１ｎＭ））および候補ペプチドを同時に加えた。ペプチドの用量反応を評価した（解析は３０μＭから開始）。アッセイを７２時間行った。細胞の生存率を発光アッセイで判定し、標準的な技法を用いてＩＣ５０を算出した。
【０２１３】
こうした試験の結果を以下の表および図１２（ペプチドＦ４２９、Ｆ４４１およびＦ４０８の拮抗作用を示す）に示す。
【０２１４】
【表９】
2010526776.tif 000022
表１０−Ｆ１３８の変異体
ペプチドＦ１３８の変異体を作製し、以下の表に示すとおりＩＧＦ−１Ｒ結合性および拮抗作用の特性が改良されたペプチドを選択した：
【０２１５】
【表１０】
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表１１−主な候補ペプチドの結合性および細胞に関する追加データ
他のペプチドも同様に解析し、アンタゴニストまたは候補物質であると判定した：
【０２１６】
【表１１】
2010526776.tif 000024
【０２１７】
【表１２】
2010526776.tif 000025
（実施例９）
この試験では、３７℃でのインキュベーション後に１２のサンプリング時点でＣＤ−１マウスの血漿中の被験物質Ｆ４２９の安定性を評価した。被験物質Ｆ４２９の血漿レベルについては、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで判定し、結果を処理して判断した（半減期）。
【０２１８】
材料
被験物質Ｆ４２９を水溶液として取得し、使用前に−８０℃で保存しておいた。被験物質Ｆ４２９は分子量２８１２．３４のペプチドである。このペプチドは、２５個のアミノ酸を含み、配列は、［Ｈ］ＤＦＹＧＣＬＬＤＬＳＬＧＶＰＳＬＧＷＲＲＲＣＩＴＡ［ＯＨ］である。ＣＤ−１マウスの血漿は、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．（Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）から購入し、使用する前に２〜８℃で保存しておいた。
【０２１９】
被験物質調製
被験物質Ｆ４２９溶液を、水溶液を用いて濃度２．０ｍｇ／ｍＬに調製し、−８０℃で凍結してＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓに輸送した。
【０２２０】
試験デザイン
以下の表１３に試験デザインを示す。被験物質Ｆ４２９の１５０μＬのアリコート（２．０ｍｇ／ｍＬ）をＣＤ−１マウスの血漿２８５０μＬに加え、被験物質Ｆ４２９の最終濃度を１００μｇ／ｍＬとした。このサンプルを混合し、直ちに３７℃の往復振盪湯浴（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）に入れた。７５μＬのアリコートを１２の時点（被検物質未添加、１、２、５、１０、１５、２０、３０、６０分および２、４および２４時間）で３回ずつサンプル採取した。アリコートは直ちに−８０℃で凍結した。
【０２２１】
【表１３】
2010526776.tif 000026
血漿サンプルの解析−ＭＳに導入するイオン化モード（ポジティブまたはネガティブＥＳＩ／ＡＰＣＩ）の判定
ＤＭＳＯを用いてＦ４２９の原液１．０ｍｇ／ｍＬを調製した。原液１．０ｍｇ／ｍＬから使用溶液１００μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬを調製した。
【０２２２】
被験物質のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を最適化するため、３：１（ｖ／ｖ）アセトニトリル：Ｈ２Ｏに加えたＦ４２９（１００μｇ／ｍＬ）を用いた。Ｆ４２９にはポジティブモードＭＳおよびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ：ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を、トランジションをｍ／ｚ９３８．２／２３５．１０として用いた。
【０２２３】
被験物質Ｆ４２９をＣＤ−１マウスのブランク血漿にスパイクした。スパイクしたサンプルは、Ｆ４２９を１００、７５、５０、３７．５、２５、１０、５、２．５および０μｇ／ｍＬ（ブランク）含んでいた。
【０２２４】
固相抽出の評価のためのサンプル調製
マウスの血漿サンプルを自家製のＣＤ−１マウスのブランク血漿ですべて２倍希釈した。次いで、マウスの血漿およびＦ４２９をスパイクしたマウス血漿のサンプルのアリコート（５０μＬ）を２００μＬの水に加えてから、ｐＨ７．４、１０ｍＭのリン酸塩緩衝溶液２５０μＬと組み合わせてよく混合した。調製溶液の最終容量は、固相抽出サンプルを調製しやすい５００μＬとした。
【０２２５】
血漿の解析−標準物質および未知物質
Ｓｔｒａｔａ  Ｘ９６ウェルプレート固相抽出カートリッジ（８Ｅ−Ｓ１００−ＴＧＢ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を真空マニホールドに載せ、サンプル調製の真空度を５ｍｍＨｇとした。最初に、このプレートを１．０ｍＬの水で平衡化してから１．０ｍＬのアセトニトリルで処理した。次いで、プレートに５００μＬのサンプルを添加し、その後０．５ｍＬの５％アセトニトリル水溶液で２回洗浄した。レシーバーを９６ディープウェル捕集プレートに交換した。次いで、このカートリッジを、１％水酸化アンモニウムを含む８０％アセトニトリル水溶液で２回溶出させた。溶出サンプルの各アリコート１００μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる解析のためバイアルに移した。マウスの血漿中の被験物質Ｆ４２９の定量を、被験物質をマウスのブランク血漿にスパイクして作成した検量線（１００、７５、５０、３７．５、２５、１０、５および２．５μｇ／ｍＬ最終濃度）を参照して行った。
【０２２６】
被験物質Ｆ４２９のＨＰＬＣ条件を以下の表１４に示し、勾配プログラムを表１５に示す。
【０２２７】
【表１４】
2010526776.tif 000027
【０２２８】
【表１５】
2010526776.tif 000028
被験物質Ｆ４２９の質量分析計条件を以下の表１６に示し、モニターした電圧およびイオンのデータを表１７に示す。
【０２２９】
【表１６】
2010526776.tif 000029
【０２３０】
【表１７】
2010526776.tif 000030
解析方法の評価
各試験において、各濃度レベルでの８点標準曲線に３回ずつサンプルを当てはめた。各濃度の最も近い測定値を少なくとも２つ用いて検量線を作成した。許容基準は、８つの標準物質のうち５つが血漿サンプルの安定性解析の±３０％以内であることとした。検量線の結果は表１８に示す。
【０２３１】
データ解析
ＣＤ−１マウスの血漿を用いて、被験物質Ｆ４２９の血漿中安定性をインキュベーション後に評価した。
【０２３２】
結果−血漿サンプルの解析
被験物質Ｆ４２９のラットの個別の血漿中濃度と時間とのデータ、および各投与群に関する平均値データを表１９および表２０に示す。Ｆ４２９の個別の血漿中濃度および平均の血漿中濃度と、１００μｇ／ｍＬのＦ４２９のインキュベーション時間との関係を図１３および図１４に示す。定量限界未満のサンプルはすべてゼロ値とした。データはすべてＦ４２９遊離薬剤のμｇ／ｍＬで表す。
【０２３３】
データ解析および半減期
ゼロ時から様々な時点での被験物質Ｆ４２９の残存率を表２１に示す。残存被験物質Ｆ４２９の比率の対数を図１５に示す。Ｆ４２９の半減期は、７３．２分と算出した。（図２１）。
【０２３４】
【表１８】
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【０２３５】
【表１９】
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【０２３６】
【表２０−１】
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【０２３７】
【表２０−２】
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【０２３８】
【表２０−３】
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【０２３９】
【表２０−４】
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【０２４０】
【表２１】
2010526776.tif 000037
考察
被験物質Ｆ４２９のイオン、ｍ／ｚ９３８．４５の［Ｍ＋３Ｈ］３をポジティブモードのＭＳでモニターした。サンプルの調製には、Ｓｔｒａｔａ  Ｘ９６ウェルＳＰＥプレートを用いてした。２．５〜１００μｇ／ｍＬの範囲で８点標準検量線を用いてＦ４２９の血漿解析を行った。この解析方法は特異性が高く、定量下限（ＬＬＯＱ：ｌｏｗｅｒ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）は２．５μｇ／ｍＬである。
【０２４１】
結論
被験物質Ｆ４２９の血漿中安定性は３７℃で行い、ＣＤ−１マウスの血漿中の安定性半減期は、７３．２分であった。被験物質Ｆ４２９は４時間でなお確認できた（残存率９．６５％）。この解析方法は特異性に非常に優れている。
【０２４２】
（実施例１０）
ＭｉａＰａＣａ細胞をＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍｌ）＋／−ＡＮＴ−４２９で２４時間処置してから、ＰＢＳで３回洗浄し、削り取り（ｓｃｒａｐ）、遺伝子発現のために処理した（ｐｒｏｃｅｓｓ）。図１６Ａおよび１６Ｂは、遺伝子発現の変化を、ＩＧＦ−１で増殖させたＭｉａＰａＣａ細胞間とＡＮＴ−４２９間とで解析した遺伝子アレイである。図１７は、ＡＮＴ−４２９で処置した細胞においてダウンレギュレートされることが分かった遺伝子のリストである。ＩＧＦ−１で増殖させたＭｉａＰａＣａ細胞とＡＮＴ−４２９による処置とにおけるアポトーシス遺伝子発現の変化を調べた試験で、ＡＮＴ−４２９はアポトーシス遺伝子を調節することが示された。図１８Ａおよび１８Ｂは、ＡＮＴ−４２９で処置した際にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子のリストである。
【０２４３】
（実施例１１）
動物試験での阻害作用
ヌードマウスの側腹部にＭｉａＰａＣａ細胞（マトリゲル中の細胞１００万個）を接種し、腫瘍容積が１００ｍｍ３を超えるまで続けた。動物を無作為に抽出し、５つの処置群：対照（注射なし）、ビヒクル、ＡＮＴ−Ｇ１２、３００ｕｇ／注射（１２ｍｇ／ｋｇ）の標的が異なるＨＰ、５０ｕｇ／注射（２．５ｍｇ／ｋｇ）のＡＮＴ−４２９および３００ｕｇ／注射（１２ｍｇ／ｋｇ）のＡＮＴ−４２９に割り付けた。動物に週４回の注射を３週間皮下経路で行い、その後２週間は注射を行わなかった。腫瘍を週２回測定した。動物を屠殺し、腫瘍を切除し、秤量し、撮影した。この結果からは対照群およびビヒクル群で活発な増殖が認められる。１５ｍｇ／ｋｇのＡＮＴ−４２９群では、完全寛解１例を含め、増殖が著しく阻害された。２．５ｍｇ／ｋｇの群では、完全寛解１例を含め５匹の動物のうち２匹が処置に反応した（図１９Ａおよび図１９Ｂ）。こうした結果から、ＡＮＴ−４２９は腫瘍増殖を阻害することが明らかである。
【０２４４】
（実施例１２）
毒性試験
ヌードマウスの側腹部にＭｉａＰａＣａ細胞（マトリゲル中の細胞１００万個）を接種し、腫瘍容積が１００ｍｍ３を超えるまで続けた。動物を無作為に抽出し、３つの処置群：対照（注射なし）、ビヒクル、５００ｕｇ／注射（２０ｍｇ／ｋｇ）のＡＮＴ−４２９およびビヒクルに割り付けた。動物に週４回の注射を３週間皮下経路で行い、その後２週間は注射を行わなかった。腫瘍および体重を週２回測定した。ＡＮＴ−４２９で処置した動物は明らかな有害作用を何ら示さなかった（図２０）。この結果から、ＡＮＴ−４２９はインビボで毒性がないことが明らかである。
【０２４５】
解釈
本明細書に記載する本発明の様々な態様の説明については、以下の原則に従って解釈すべきである。
【０２４６】
本明細書に引用する刊行物、特許出願および特許などの参考文献についてはすべて、本明細書の他の箇所で各文書を個別にどのように援用しようとも、参照によって援用するために各参考文献を１つ１つ個々に示し、その全体を（法律で最大限認められる限度まで）本明細書に記載しているのと同程度まで、その全体を参照によって本明細書に援用する。
【０２４７】
本発明を説明する文脈で「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似の限定語を使用する場合、本明細書で他に記載がない限り、あるいは、文脈に明らかに矛盾する場合を除き、単数と複数を共に包含するものと解釈すべきである。
【０２４８】
他に記載がない限り、本明細書に記載する具体的な値はすべて、その近似値を代表した値である（たとえば、個々の計数または測定値に関して記載する例示的な具体値はすべて、必要に応じて「約（ａｂｏｕｔ）」で修飾した、その近似した測定値をも示すと考えることができる）。
【０２４９】
本明細書に他に記載がない限り、本明細書における数値範囲の記載には、その範囲に含まれ、かつその範囲の小さい方の端点と同じ桁内および同じ重要度（すなわち、すべての同じ有効数字）内にある１つ１つの値を個別に示す簡略な方法を単純に用いるものとし、１つ１つの値は個々に本明細書に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。したがって、たとえば、本明細書の範囲１〜１００は、１〜１００（１と１００を含む）の各整数（すなわち、１、２、３、４、．．．９８、９９および１００）を表し、範囲０．１〜１は、２つの端点を含む端点の間で０．１と同じ桁数および有効数字の各値（すなわち、０．１、０．２、０．３、．．．０．９、１．０）を表す。
【０２５０】
本明細書では、要素（単数または複数）に関して「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を持つ（ｈａｖｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「を含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの語を用いて本発明の任意の態様または実施形態を説明する場合、他に記載がない限り、あるいは、文脈に明らかに矛盾する場合を除き、その特定の要素（単数または複数）「からなる」、それ「から本質的になる」、あるいは、それ「を実質的に含む」、本発明の類似した態様または実施形態を示すことを意図している（たとえば、本明細書において、ある組成物が特定の要素を含むと記載する場合、他に記載がない限り、あるいは、文脈に明らかに矛盾する場合を除き、その要素からなる組成物についても記載していると理解すべきである）。本明細書に記載の特定の配列またはペプチド誘導体からなるタンパク質またはペプチドは一般にペプチド誘導体の参照配列に対して十分な構造的類似性を保持しており、タンパク質またはペプチドは、配列またはペプチド誘導体に類似した生物学的特性（たとえば、ＩＧＦ−１Ｒ結合性、ＩＧＦ−１Ｒ拮抗作用など）を示すことができる。
【０２５１】
本明細書では、式を使用して配列ファミリーを説明している場合がある。これは単に便宜のためであり、式のパラメーターに該当する各配列も、明示しなくても本発明の態様として本明細書に個々に開示されたものと見なすべきであることが理解されよう。
【０２５２】
本明細書の見出しおよび小見出しはすべて便宜のために使用しているに過ぎず、いかなる意味でも本発明を限定するものとして解釈してはならない。
【０２５３】
本明細書に記載したすべての例または例示表現（たとえば、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）は、本発明を分かりやすくすることだけを意図して使用したものであり、他に記載がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書のいかなる表現も、請求項に記載されていない要素が本発明の実施に不可欠なものであることを示していると解釈してはならない。
【０２５４】
本明細書における特許文書の引用および援用は単に便宜のためのものであり、その特許文書の妥当性、特許性および／または実行可能性に関するいかなる見解も反映するものではない。
【０２５５】
本発明は、準拠法で認められているように、本明細書に含まれる特許請求の範囲および／または本発明の態様に記載した主題の変形形態および等価物をすべて含む。
【０２５６】
等価物
当業者であれば、ごく通常の実験を用いるのみで、本明細書に記載の具体的な手順に対する等価物を数多く認識するか、あるいは確認することができるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内であると考えられ、以下の特許請求の範囲に包含される。特許請求の範囲で規定する本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明の様々な代用形態、変更形態および変形形態が可能な場合がある。記載された以外の態様、利点および変形形態も、本発明の範囲内にある。本出願において引用した参考文献、発行された特許および公開された特許出願の内容についてはすべて、全体を参照によって本明細書に援用する。そうした特許、出願および他の文書から適切な要素、プロセスおよび方法を選択して本発明およびその実施形態を行ってもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2010526776.tif 000047
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2010526776.tif 000049
【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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