(57)【要約】  ＬＸＲアゴニストの使用を介して、変形性関節症を予防および治療する方法を本明細書に開示する。
2010503730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変形性関節症を罹患する哺乳動物を治療するための方法であって、それを必要としている前記哺乳動物に、ＬＸＲ応答遺伝子発現を調節する量のＬＸＲアゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記ＬＸＲアゴニストが、天然オキシステロール、合成オキシステロール、合成非オキシステロール、または天然非オキシステロールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＬＸＲアゴニストが、２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）、２５エポキシコレステロール、２７−ヒドロキシコレステロール、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３β−ヒドロキシコレンアミド、Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）−Ｎ−｛４−［２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−（トリフルオロメチル）エチル］フェニル｝ベンゼンスルホンアミド、［３−（３−（２−クロロ−トリフルオロメチルベンジル−２，２−ジフェニルエチルアミノ）プロポキシ）フェニル酢酸］、Ｎ−メチル−Ｎ−［４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−トリフルオロメチル−１−エチル）−フェニル］−ベンゼンスルホンアミド、４，５−ジヒドロ−１−（３−（３−トリフルオロメチル−７−プロピル−ベンズイソキサゾール−６−イルオキシ）プロピル）−２，６−ピリミジンジオン、３−クロロ−４−（３−（７−プロピル−３−トリフルオロメチル−６−（４，５）−イソオキサゾリル）プロピルチオ）−フェニル酢酸、アセチル−ポドカルプ２量体、パキシリン、デスモステロール、またはスチグマステロールである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＬＸＲアゴニストが、Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）−Ｎ−［４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−トリフルオロメチル−１−エチル）−フェニル］−ベンゼンスルホンアミドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＬＸＲアゴニストでの治療が、軟骨分解を抑制し、軟骨再生を誘発する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＬＸＲアゴニストが、アグリカナーゼ活性を抑制する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＬＸＲアゴニストが、変形性関節症関節における炎症促進性サイトカインおよび／または炎症性メディエータの生成を抑制する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記炎症性メディエータが、プロスタグランジンＥ２である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＬＸＲアゴニストでの治療が、変形性関節症関節において除痛を提供する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
記ＬＸＲ応答遺伝子は、アポリポタンパク質Ｄである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
変形性関節症軟骨を有する哺乳動物においてアポリポタンパク質Ｄの発現を誘発する方法であって、それを必要としている前記哺乳動物に、有効量のＬＸＲアゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項１２】
変形性関節症を予防する方法であって、
（ａ）対象の正常軟骨におけるアポリポタンパク質Ｄ発現レベルのベースラインを決定するステップと、
（ｂ）ＬＸＲアゴニストでの治療を介して、前記対象の軟骨におけるアポリポタンパク質Ｄ発現レベルのベースラインを維持するステップと、
を含む、方法。
【請求項１３】
変形性関節症を罹患する哺乳動物を治療するための方法であって、それを必要としている前記哺乳動物に、アグリカナーゼ活性を抑制する量のＬＸＲアゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
変形性関節症軟骨を有する哺乳動物においてアグリカナーゼの活性を抑制する方法であって、それを必要としている前記哺乳動物に、有効量のＬＸＲアゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項１５】
変形性関節症を罹患する哺乳動物を治療するための方法であって、変形性関節症関節における炎症促進性サイトカインおよび脂質の生成を抑制するために、それを必要としている前記哺乳動物に、有効量のＬＸＲアゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項１６】
変形性関節症を罹患する哺乳動物を治療するための方法であって、変形性関節症関節の痛みを軽減するために、それを必要としている前記哺乳動物に、有効量のＬＸＲアゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項１７】
前記ＬＸＲアゴニストが、ＴＮＦα発現を抑制する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象における変形性関節症の表現型を検出する方法であって、
（ａ）正常軟骨におけるアポリポタンパク質Ｄ発現レベルのベースラインを決定するステップと、
（ｂ）変形性関節症を有する疑いがある対象から軟骨試料を得るステップと、
（ｃ）前記試料中のアポリポタンパク質Ｄの発現レベルを検出するステップと、
を含み、アポリポタンパク質Ｄ発現のベースラインと比べて、前記試料中のより少量のアポリポタンパク質Ｄ発現は、変形性関節症を示す、方法。
【請求項１９】
軟骨における変形性関節症の影響を減少させることが可能なＬＸＲリガンドを同定する方法であって、
（ａ）ＬＸＲを含有する試料を提供するステップと、
（ｂ）前記試料を試験化合物と接触させるステップと、
（ｃ）前記試験化合物が、アポリポタンパク質Ｄ発現を誘発するかどうか、アグリカナーゼ活性を抑制するかどうか、炎症促進性サイトカインの生成を抑制するかどうか、またはそれらの組み合わせであるかを判定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２０】
変形性関節症の治療または予防のための薬物の製造における、ＬＸＲアゴニストの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＸＲアゴニストを用いて変形性関節症を治療または予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節疾患としても知られる変形性関節症は、関節軟骨の変性ならびに軟骨下骨の増殖および再形成に特徴付けられる。通常の症状は、硬直、動作制限、および疼痛である。変形性関節症は、最も多く見られる関節炎であり、有病率は、年齢とともに顕著に増加する。
【０００３】
既存の変形性関節症治療アプローチには、運動、薬、安静および関節ケア、手術、除痛技術、代替療法、ならびに体重管理が含まれる。変形性関節症を治療するために一般的に使用される薬は、例えば、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセンナトリウム、ケトプロフェン等の非ステロイド性抗炎症薬（Ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇ：ＮＳＡＩＤ）、皮膚に直接塗布される局所用鎮痛クリーム、塗り薬、およびスプレー（例えば、カプサイシンクリーム）、痛みを一時的に軽減させるために、典型的に患部関節に注射される副腎皮質ステロイド、ならびにヒアルロン酸を含む。骨を再表面化し（滑らかにする）、骨を再配置し、関節を置換するために、手術が行われる場合がある。種々の薬物療法が、疾患を治療するために使用されているが、それらは、長期にわたる管理および予防には有効でない。
【０００４】
本来オーファン受容体として肝臓から同定された肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ  Ｘ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＬＸＲ）は、核内ホルモン受容体スーパーファミリーの成員であるが、マクロファージ炎症性遺伝子発現の負の制御因子であることが分かった（公開米国特許出願第２００４／０２５９９４８号；Ｊｏｓｅｐｈ  ＳＢら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：２１３−１９（２００３）を参照）。ＬＸＲは、リガンド活性化の転写因子であり、レチノイドＸ受容体を持つヘテロ２量体としてＤＮＡに結合する。ＬＸＲαが、肝臓、腎臓、脂肪、腸、およびマクロファージ等の特定の組織に限定されるのに対し、ＬＸＲβは、遍在的な組織分布パターンを示す。マクロファージ内のオキシステロール（内因性リガンド）によるＬＸＲの活性化は、脂質代謝ならびにＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１、およびアポリポタンパク質Ｅを含むコレステロール逆輸送に関与する、いくつかの遺伝子の発現をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願第２００４／０２５９９４８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｓｅｐｈ  ＳＢら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：２１３−１９（２００３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一側面は、変形性関節症を罹患する哺乳動物を治療するための方法であって、それを必要としている該哺乳動物に、ＬＸＲ応答遺伝子発現を誘発する量のＬＸＲアゴニストを投与するステップを含む、方法である。
【０００８】
別の側面は、変形性関節症軟骨を有する哺乳動物において、アポリポタンパク質Ｄの発現を誘発する方法であって、それを必要としている該哺乳動物に、有効量のＬＸＲアゴニストを投与するステップを含む、方法である。
【０００９】
さらなる側面は、変形性関節症を予防する方法であって、（ａ）対象の正常軟骨におけるアポリポタンパク質Ｄ発現レベルのベースラインを決定するステップと、（ｂ）ＬＸＲアゴニストを用いた治療を介して、該被験者の軟骨におけるアポリポタンパク質Ｄ発現レベルのベースラインを維持するステップと、を含む方法に関する。
【００１０】
付加的な側面は、変形性関節症を罹患する哺乳動物を治療するための方法であって、それを必要としている該哺乳動物に、アグリカナーゼ活性を抑制する量のＬＸＲアゴニストを投与するステップを含む、方法である。
【００１１】
さらなる側面は、変形性関節症軟骨を有する哺乳動物においてアグリカナーゼの活性を抑制する方法であって、それを必要としている該哺乳動物に、有効量のＬＸＲアゴニストを投与するステップを含む、方法である。
【００１２】
別の側面は、変形性関節症を罹患する哺乳動物を治療するための方法であって、変形性関節症病変部における炎症促進性サイトカインの生成を抑制するために、それを必要としている該哺乳動物に、有効量のＬＸＲアゴニストを投与するステップを含む、方法に関する。
【００１３】
付加的な側面は、対象における変形性関節症の表現型を検出する方法であって、（ａ）正常軟骨におけるアポリポタンパク質Ｄ発現レベルのベースラインを決定するステップと、（ｂ）変形性関節症を有する疑いがある対象から軟骨試料を得るステップと、（ｃ）該試料中のアポリポタンパク質Ｄの発現レベルを検出するステップと、を含み、アポリポタンパク質Ｄのベースラインと比べて、該試料中のより少量のアポリポタンパク質Ｄ発現は、変形性関節症を示す、方法に関する。
【００１４】
さらなる側面は、軟骨における変形性関節症の影響を減少させることが可能なＬＸＲリガンドを同定する方法であって、（ａ）ＬＸＲを含有する試料を提供するステップと、（ｂ）該試料を試験化合物と接触させるステップと、（ｃ）該試験化合物が、アポリポタンパク質Ｄ発現を誘発するかどうか、アグリカナーゼ活性を抑制するかどうか、炎症促進性サイトカインの生成を抑制するかどうか、またはそれらの組み合わせであるかを判定するステップと、を含む、方法である。
【００１５】
本発明の他の側面および利点は、下記の発明を実施するための形態を参照することにより、当業者に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、重度の変形性関節症（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＯＡ）の軟骨における核内受容体（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＮＲ）発現の相対発現レベルを示す棒グラフである。図１Ｂは、重度ＯＡの軟骨におけるレチノイド受容体発現の相対発現レベルを示す棒グラフである。
【図２】図２Ａは、正常軟骨、ならびに軽度ＯＡおよび重度ＯＡの軟骨におけるＡｐｏＤ発現を示す棒グラフである。疾患重症度は、軟骨検体における病変部のサイズおよび深度を検査することによって、巨視的に評価した。図２Ｂは、正常軟骨、ならびに軽度ＯＡおよび重度ＯＡの軟骨におけるＴＮＦα発現を示す棒グラフである。
【図３】ヒトＯＡ軟骨外植片からのサイトカイン誘発のプロテオグリカン分解／遊離が、ＬＸＲアゴニストによって抑制され、これらの外植片中の、サイトカイン誘発による総プロテオグリカン含有量の減少が、ＬＸＲアゴニストによって予防されることを示す棒グラフである。
【図４】図４Ａはアグリカナーゼ生成のアグリカンカタボライト上のＮ末端を認識するＢＣ−３抗体を使用した、アグリカナーゼ生成のアグリカンネオエピトープを示すウエスタンブロットである。末期ＯＡを有する２人のヒトドナー（人工関節置換術後）からの軟骨外植片を使用した。ドナー番号２５９は、５７歳の男性患者であり、ドナー番号２６１は、５５歳の女性患者である。レーン１、５：媒体。レーン２、６：ＴＯ９０１３１７（２μＭ）。レーン３、７：ＩＬ−１β＋オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（各１０ｎｇ／ｍｌ）。レーン４、８：ＩＬ−１β＋ＯＳＭ＋ＴＯ９０１３１７。図４Ｂは、アグリカナーゼにより生成される、アグリカンカタボライト上の異なるエピトープを認識するＡＧＥＧ抗体を使用した、アグリカナーゼにより生成されたアグリカンネオエピトープを示すウエスタンブロットである。レーン１、５：媒体。レーン２、６：ＴＯ９０１３１７（２μＭ）。レーン３、７：ＩＬ−１β＋ＯＳＭ（各１０ｎｇ／ｍｌ）。レーン４、８：ＩＬ−１β＋ＯＳＭ＋ＴＯ９０１３１７。
【図５】図５Ａは、サイトカイン処置を施したヒト軟骨外植片からの総プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生の、ＬＸＲアゴニストによる抑制を示す棒グラフである。図５Ｂは、媒体対照またはＬＸＲアゴニストＧＷ３９６５（２μＭ）で２１日間処置した外植片における、膜リン脂質ＰＣおよびＰＥの形でのアラキドン酸の量を比較する。この研究では２人のヒトＯＡドナーからの軟骨試料を使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
出願人らは、全ての引用文献の全内容を本開示に明確に組み込む。さらに、量、濃度、または他の値もしくはパラメータが、範囲、好適な範囲、または最大の好適な値および最低の好適な値のリストのいずれかとして示される場合、範囲が別に開示されているかどうかにかかわらず、任意の範囲上限または好適な値および任意の範囲下限または好適な値の、任意の対から形成される全ての範囲を明確に開示するものと理解されたい。数値範囲が本明細書に記載されている場合、特に別段の記載がない限り、範囲は、その終点、ならびに範囲内の全ての整数および端数を含むものとする。本発明の範囲は、範囲を定義する時に挙げた特定の値に限定されるものではない。
【００１８】
本発明の実施は、特に別段の記載がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換ＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を採用し、これらは当技術分野の範囲内である。かかる技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）、ＤＮＡ  ＣｌｏｎｉｎｇＩ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）、米国特許第４，６８３，１９５号、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４および１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照。
【００１９】
本明細書において、出願人らは、ＬＸＲαおよびＬＸＲβ（肝臓Ｘ受容体αおよびβ）が正常、軽度変形性関節症、および重度変形性関節症軟骨に発現されることを示す。また、出願人らは、正常軟骨において非常に高レベルで発現されるアポリポタンパク質（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ：ＡｐｏＤ）の発現が、軽度および重度変形性関節症軟骨において劇的に減少するという理由で、変形性関節症における妥当であろうと考えられる脂質異常を初めて実証する。ＬＸＲリガンドは、アポリポタンパク質Ｄプロモータ領域内に存在するＬＸＲ応答配列を介して、ＡｐｏＤの発現を誘発する。発現データに従って、プロアポリポタンパク質Ｄのタンパク質レベルもまた、正常軟骨と比較した場合、変形性関節症軟骨試料において減少する。ＡｐｏＤは、脂質（アラキドン酸およびコレステロール）結合タンパク質であるため、変形性関節症軟骨におけるその減少は、変形性関節症軟骨で観察される脂質レベルが増加する原因となり得る。軟骨におけるアラキドン酸の増加は、病変組織における炎症脂質メディエータ（ＰＧＥ２、ロイコトリエン等）レベルの増加をもたらすと予想される。また、変形性関節症軟骨は、軟骨分解酵素（アグリカナーゼおよびメタロプロテアーゼ）の活性増加も示す。
【００２０】
また、出願人らは、ＬＸＲリガンドが、ヒト変形性関節症関節軟骨組織外植片において、アグリカナーゼの活性を抑制することも初めて示す。ＬＸＲリガンドは、また、ＴＮＦαおよび多くの他の炎症促進性サイトカインの発現も抑制する。したがって、ＬＸＲリガンドは、変形性関節症に治療上効果的であり、脂質異常を正常化させ、アグリカナーゼ／メタロプロテアーゼの発現および／または活性を抑制し、変形性関節症病変における炎症促進性サイトカインの生成を抑制することによって、現在および今後の変形性関節症治療よりもより効果的であることが予想される。さらに、ＬＸＲリガンドは、タンパク質のｃ−ｊｕｎ／ｃ−ｆｏｓファミリーを誘発し、その結果として、軟骨形成に必要とされるＡＰ１活性を増強させる。したがって、ＬＸＲリガンドによって、初めて、変形性関節症治療は、軟骨分解を抑制し得るのみならず、軟骨再生も誘発し得る。
【００２１】
Ｉ．定義
本開示に関連して、多くの用語が利用される。
【００２２】
本明細書では、用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
【００２３】
用語「アグリカナーゼ活性」は、アグリカンに結合するアグリカナーゼ酵素によって中断または開始される少なくとも１つの細胞過程を言う。概して、活性は、アグリカナーゼによるアグリカンのタンパク質切断を言う。他のアグリカナーゼ活性は、アグリカンとのアグリカナーゼの結合、およびアグリカナーゼによるアグリカンとの結合またはその切断に起因する生物学的応答を含むが、これらに限定されない。
【００２４】
用語「サイトカイン生成」は、軟骨組織または軟骨細胞によるサイトカインの産生を言う。
【００２５】
用語「有効量」、「治療上有効量」、「ＬＸＲ応答遺伝子発現を誘発する量」、「アグリカナーゼ活性を抑制する量」、および「有効投与量」は、本明細書では、必要としている哺乳動物に投与される時に、変形性関節症に関連する状態を少なくとも部分的に回復させる、または少なくとも部分的に予防するのに有効であるエフェクタ分子の量を言う。
【００２６】
本明細書では、用語「発現」は、ＤＮＡが、ｍＲＮＡへと転写され、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳される過程を含む。
【００２７】
アポリポタンパク質Ｄ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ：ＡｐｏＤ）発現を「誘発する」または、その「誘発」という用語は、アポリポタンパク質ＤのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現の増加、誘発、あるいはその他の増大を言う。増加、誘発、または増大は、本明細書に提供されるアッセイのうちの１つによって測定することができる。アポリポタンパク質Ｄ発現の誘発は、アポリポタンパク質Ｄの最大の発現を必ずしも示すわけではない。ＡｐｏＤ発現の増加は、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上であり得る。一実施形態において、誘発は、正常軟骨からのＡｐｏＤのｍＲＮＡ発現レベルを、変形性関節症軟骨からのＡｐｏＤのｍＲＮＡ発現レベルと比較することによって測定される。
【００２８】
アグリカナーゼまたはアグリカナーゼ活性を「抑制する」または、その「抑制」という用語は、アグリカナーゼの少なくとも１つの活性の減少、抑制、あるいはその他の減退を言う。結合の減少、抑制、または減退は、本明細書に提供したアッセイのうちの１つによって測定することができる。アグリカナーゼ活性の抑制は、アグリカナーゼ活性が完全に存在しないことを必ずしも示すわけではない。活性の減少は、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上であり得る。一実施形態において、抑制は、アグリカンの切断産物の検出量の減少によって測定される。
【００２９】
炎症促進性サイトカインの生成を「抑制する」または、その「抑制」という用語は、例えば、ｉＮＯＳ、ＭＣＰ−３、ＣＯＸ−２、ＭＩＰ１β、ＭＭＰ−９、ＩＰ−１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６等のサイトカインの活性の減少、抑制、あるいはその他減退を言う。サイトカイン生成の減少、抑制、または減退は、本明細書に提供したアッセイのうちの１つによって測定することができる。炎症促進性サイトカイン生成の抑制は、炎症促進性サイトカイン生成が完全に存在しないことを必ずしも示すわけではない。生成の減少は、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上であり得る。一実施形態において、抑制は、正常軟骨からのＴＮＦαのｍＲＮＡ発現レベルを、変形性関節症軟骨からのＴＮＦαのｍＲＮＡ発現レベルのものと比較することによって測定される。
【００３０】
「肝臓Ｘ受容体」または「ＬＸＲ」は、ＬＸＲαとＬＸＲβの両方、ならびにそれらの変異形、アイソフォームおよび活性断片を言う。ＬＸＲβは、遍在的に発現され、一方、ＬＸＲα発現は、肝臓、腎臓、腸、脾臓、脂肪組織、マクロファージ、骨格筋、および本明細書で実証されるように軟骨に限定される。ＬＸＲα配列の代表的なＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号としては、以下が挙げられる。ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｑ１３１３３）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｑ９Ｚ０Ｙ９）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｑ６２６８５）、雌ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｑ５Ｅ９Ｂ６）、ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、ＡＡＹ４３０５６）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、ＡＡＭ９０８９７）。ＬＸＲβの代表的なＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号としては、以下が挙げられる。ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｐ５５０５５）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｑ６０６４４）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｑ６２７５５）、雌ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｑ５ＢＩＳ６）。
【００３１】
用語「哺乳動物」は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、または他の獣医学のもしくは実験哺乳動物を言う。当業者は、哺乳動物の一種において病理学の重症度を減少させる治療は、哺乳動物の別の種への治療効果の予測となることを認識する。
【００３２】
用語「調節する」は、標的分子に応じて、活性または発現の減少または増加のいずれか一方を包含する。例えば、ＡｐｏＤモジュレータは、そのようなＡｐｏＤモジュレータの存在が、ＡｐｏＤ発現の増加または減少に繋がるならば、ＡｐｏＤの発現を調節するとみなされる。
【００３３】
ＩＩ．ＬＸＲアゴニスト
本発明において有用なＬＸＲアゴニストは、天然オキシステロール、合成オキシステロール、合成非オキシステロール、および天然非オキシステロールを含む。例示的な天然オキシステロールは、２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）、２５エポキシコレステロール、および２７−ヒドロキシコレステロールを含む。例示的な合成オキシステロールは、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３β−ヒドロキシコレンアミド（ＤＭＨＣＡ）を含む。例示的な合成非オキシステロールは、Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）−Ｎ−｛４−［２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−（トリフルオロメチル）エチル］フェニル｝ベンゼンスルホンアミド（ＴＯ９０１３１７；Ｔｕｌａｒｉｋ  ０９０１３１７）、［３−（３−（２−クロロ−トリフルオロメチルベンジル−２，２−ジフェニルエチルアミノ）プロポキシ）フェニル酢酸］（ＧＷ３９６５）、Ｎ−メチル−Ｎ−［４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−トリフルオロメチル−１−エチル）−フェニル］−ベンゼンスルホンアミド（ＴＯ３１４４０７）、４，５−ジヒドロ−１−（３−（３−トリフルオロメチル−７−プロピル−ベンズイソキサゾール−６−イルオキシ）プロピル）−２，６−ピリミジンジオン、３−クロロ−４−（３−（７−プロピル−３−トリフルオロメチル−６−（４，５）−イソオキサゾリル）プロピルチオ）−フェニル酢酸（Ｆ３ＭｅｔｈｙｌＡＡ）、ならびにアセチル−ポドカルプ２量体を含む。例示的な天然非オキシステロールは、パキシリン、デスモステロール、およびスチグマステロールを含む。
【００３４】
他の有用なＬＸＲアゴニストは、例えば、公開米国特許出願第２００６／００３０６１２号、第２００５／０１３１０１４号、第２００５／００３６９９２号、第２００５／００８０１１１号、第２００３／０１８１４２０号、第２００３／００８６９２３号、第２００３／０２０７８９８号、第２００４／０１１０９４７号、第２００４／００８７６３２号、第２００５／０００９８３７号、第２００４／００４８９２０号、および第２００５／０１２３５８０号、米国特許第６，３１６，５０３号、第６，８２８，４４６号、第６，８２２，１２０号、および第６，９００，２４４号、ＷＯ第０１／４１７０４号、Ｍｅｎｋｅ  ＪＧら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３：２５４８−５８（２００２）、Ｊｏｓｅｐｈ  ＳＢら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：７６０４−０９（２００２）、Ｆｕ  Ｘら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３８３７８−８７（２００１）、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＪＲら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：２８３１−３８（２０００）、Ｓｐａｒｒｏｗ  ＣＰら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１００２１−２７（２００２）、Ｙａｎｇ  Ｃら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  Ｍ６０３７８１２００（２００６年７月２０日）、Ｂｒａｍｌｅｔｔ  ＫＳら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０７：２９１−９６（２００３）、Ｏｎｄｅｙｋａ  ＪＧら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ）５８：５５９−６５（２００５）に開示される。
【００３５】
ＩＩＩ．治療／予防の方法
一調節方法によれば、ＬＸＲ活性は、細胞内で、細胞をＬＸＲアゴニストと接触させることによって、刺激される。そのようなＬＸＲアゴニストの例は、上記、項目ＩＩにおいて説明する。ＬＸＲ活性を刺激するために使用することができる他のＬＸＲアゴニストは、本明細書（項目Ｖ）において詳細に説明する、そのような化合物を選択するスクリーニングアッセイを使用して同定することができる。
【００３６】
調節方法は、生体外で（例えば、細胞をＬＸＲアゴニストで培養することによって、または培養下で細胞内にＬＸＲアゴニストを導入することによって）、またはその代わりに、生体内で（例えば、ＬＸＲアゴニストを対象に投与することによって、または対象の細胞内にＬＸＲアゴニストを導入することによって）行うことができる。生体外の調節方法を実施するために、細胞は、標準的な方法で対象から得ることができ、細胞内のＬＸＲ活性を調節するために、ＬＸＲアゴニストとともに生体外でインキュベート（すなわち、培養）することができる。
【００３７】
１．予防的方法
一側面において、本発明は、ＡｐｏＤ発現を誘発する、および／またはアグリカナーゼ活性を抑制する、および／または変形性関節症の病変における炎症促進性サイトカインの生成を抑制するＬＸＲアゴニストを、対象に投与することによって、対象となる変形性関節症を予防するための方法を提供する。予防的ＬＸＲアゴニストの投与は、変形性関節症が予防されるように、またはその代わりに、その進行において遅延されるように、変形性関節症症状の徴候が生じる前に行うことができる。
【００３８】
２．治療方法
本発明の別の側面は、変形性関節症の治療目的のために、ＬＸＲ活性を調節する方法に関する。したがって、例示的な実施形態において、本発明の調節方法は、ＡｐｏＤ発現および／またはアグリカナーゼ活性を調節する、および／または変形性関節症の病変における炎症促進性サイトカインの生成を抑制するＬＸＲアゴニストと、細胞を接触させることを含む。これらの調節方法は、生体外で（例えば、ＬＸＲアゴニストで細胞を培養することによって）またはその代わりに、生体内で（例えば、対象にＬＸＲアゴニストを投与することによって）行うことができる。したがって、本発明は、ＡｐｏＤ発現および／またはアグリカナーゼ活性および／または変形性関節症の病変における炎症促進性サイトカイン同化の調節が有効であろう変形性関節症に苦しむ個人を治療する方法を提供する。
【００３９】
ＩＶ．ＬＸＲアゴニストの投与
ＬＸＲアゴニストは、ＡｐｏＤ発現を増強する、および／またはアグリカナーゼ活性を抑制する、および／または炎症促進性サイトカインの生成を抑制するために、生体内の医薬投与に好適である生物学的に適合した形態で対象に投与される。「生体内の医薬投与に好適である生物学的に適合した形態」は、アゴニストの治療効果があらゆる毒性効果を上回る、投与されるＬＸＲアゴニストの形態を意味する。用語「対象」は、免疫応答が引き出され得る生体、例えば、哺乳動物を含むことが意図される。本明細書に記述するＬＸＲアゴニストの投与は、単独または薬学的に許容可能な担体との組み合わせでの治療上有効量のＬＸＲアゴニストを含む、任意の薬理学的形態であり得る。
【００４０】
ＬＸＲアゴニストの治療上有効量は、個人の病状、年齢、性別および体重、ならびに個人において所望の応答を引き出すＬＸＲアゴニストの能力に応じて異なり得る。用法・用量は、最適な治療的応答を提供するために調整することができる。例えば、いくつかに分割した用量を毎日投与することができ、または用量は、治療状況の要件によって示唆される通りに比例的に減少させることができる。
【００４１】
本発明の治療または医薬組成物は、例えば、経口、静脈内、皮下、筋肉内、経皮的、髄腔内、もしくは脳内または生体外の治療プロトコルにおける細胞への投与を含む当技術分野において既知の任意の好適な経路によって投与することができる。投与は、注射等により迅速、またはゆっくりとした注入あるいは徐放調剤の投与等による長時間にわたるものであり得る。変形性関節症を治療または予防するために、本発明の治療または医薬組成物の投与は、例えば、経口投与によって、または関節内注射によって行うことができる。
【００４２】
さらに、ＬＸＲアゴニストは、溶解度、安定度、半減期の所望の特性、ならびに他の薬学的に有利な特性（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｇ．４：１６９−７３（１９７８）、Ｂｕｒｎｈａｍ  ＮＬ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．５１：２１０−１８（１９９４）を参照）を得るために、ポリエチレングリコール等のポリマーに安定的に連結することができる。
【００４３】
ＬＸＲアゴニストは、細胞のサイトゾルへの送達に役立つ組成物中に含めることができる。例えば、ＬＸＲアゴニストは、細胞のサイトゾル内にアゴニストを送達することが可能なリポソーム等の担体部分に抱合され得る。そのような方法は、当技術分野において既知である（例えば、Ａｍｓｅｌｅｍ  Ｓら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ  ６４：２１９−３７（１９９３）を参照）。さらに、ＬＸＲアゴニストは、微量注入によって細胞内に直接送達することができる。
【００４４】
ＬＸＲアゴニストは、医薬品の形態で用いることができる。そのような製剤は、医薬技術において既知の方法で作られる。好適な一製剤は、生理食塩水の媒体を利用するが、生理的濃度の無毒性塩、５パーセント含水グルコース溶液、滅菌水等の他の薬学的に許容可能な担体も使用され得ることが検討される。本明細書では、「薬学的に許容可能な担体」は、任意の、および全ての溶剤、分散媒、被覆、抗菌および抗真菌薬、等張および吸収遅延剤等を含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒介物または薬剤の使用は、当技術分野において既知である。従来の任意の媒介物または薬剤が、ＬＸＲアゴニストと不適合であるという限定された状態を除き、治療組成物におけるそれらの使用が検討される。補助的な活性化合物も組成物に取り込むことができる。好適な緩衝液が組成物中に存在することも望ましい場合がある。そのような溶液は、望ましい場合、凍結乾燥することができ、即時注射用の滅菌水の添加による再構成の準備のために、無菌アンプル内に保存することができる。一次溶剤は、水溶性、あるいは非水溶性であり得る。ＬＸＲアゴニストは、治療を必要とする組織に植え込むことができる、固体または半固体の生物学的に適合したマトリックスに取り込むこともできる。
【００４５】
担体は、調剤のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色、無菌性、安定度、溶解速度、または匂いを変更または維持するために、他の薬学的に許容可能な賦形剤を含有することもできる。
【００４６】
用量投与は、投与量処方の薬物動態パラメータおよび使用する投与経路に応じて繰り返すことができる。
【００４７】
また、経口投与されるＬＸＲアゴニストを含有する特定の調剤も提供する。そのような調剤は、好ましくは被包され、固形の剤型において好適な担体で処方される。担体、賦形剤、および希釈液の一部の実施例は、ラクトース、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ケイ酸カルシウム、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウム、ステアリン酸、水、ミネラルオイル等を含む。調剤は、付加的に、平滑剤、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、保存剤、甘味剤、または香料添加剤を含むことができる。組成物は、当技術分野において既知の手順を用いることにより患者に投与された後、活性成分の急速、持続、または遅延放出を提供できるように処方することができる。また、調剤は、例えば界面活性剤等の、タンパク質分解を減少させる物質および／または、吸収を促進する物質を含有することもできる。
【００４８】
投与を容易にし、投与量を均一にするため、投与量単位形態において組成物を処方するのが特に有利である。本明細書では、投与量単位形態は、治療される哺乳類対象のための単位投与量として適した物理的に不連続な単位を言い、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生成するように計算された、所定量の活性化合物を含有する。本発明の投与量単位形態に関する仕様は、（ａ）ＬＸＲアゴニストの特有の性質および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個人における感度の治療のために、そのような活性化合物を構成する技術に内在する制限によって決定され、それらに直接依存する。特定の用量は、例えば、患者のおおよその体重もしくは体表面積または占有される体の空間の体積に従って、当業者が容易に計算することができる。また、用量は、選択した特定の投与形態に応じても計算される。治療に適切な投与量を決定するのに必要な計算のさらなる改良は、当業者によって定期的になされる。そのような計算は、標的細胞のアッセイ製剤における本明細書に開示したＬＸＲアゴニスト活性の観点から、当業者による過度の実験を行うことなく求めることができる。正確な投与量は、標準的な用量応答研究と関連付けて決定される。実際に投与される組成物の量は、治療される（一つもしくは複数の）状態、投与される組成物の選択、個々の患者の年齢、体重、および反応、患者の症状の重症度、ならびに投与の選択経路を含む関連する状況を踏まえて、施術者により決定されることを理解されたい。
【００４９】
そのようなＬＸＲアゴニストの毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。毒性および治療効果間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。治療指数が大きいＬＸＲアゴニストが好ましい。毒性副作用を示すＬＸＲアゴニストが使用され得るが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小化し、それによって副作用を減少させるために、患部組織の部位に対してそのようなアゴニストを標的にする送達システムを設計するには注意を要する。
【００５０】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒトにおいて使用されるさまざまな投与量を処方するために使用することができる。そのようなＬＸＲアゴニストの投与量は、好ましくは、毒性がほとんど無いまたは全く示さず、ＥＤ５０を含むさまざまな循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤型および利用される投与経路に応じて、この範囲内で異なり得る。本発明の方法に使用される任意のＬＸＲアゴニストに対する治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイにより初期に推定することができる。用量は、細胞培養において判定される、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半分の抑制を達成するＬＸＲアゴニストの濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定することができる。
【００５１】
ＡｐｏＤの発現および／またはアグリカナーゼの活性および／または炎症促進性サイトカインの生成へのＬＸＲアゴニストの影響を監視することは、基本的な薬物スクリーニングのみならず、臨床治験にも適用することができる。例えば、ＬＸＲアゴニストの有効性は、軟骨細胞内のＡｐｏＤ遺伝子発現の減少および／またはアグリカナーゼ活性の増加および／または変形性関節症の病変内の炎症促進性サイトカイン生成の増加を示す被験者の臨床治験において監視することができる。そのような臨床治験において、ＡｐｏＤの発現および／またはアグリカナーゼの活性および／または炎症促進性サイトカインの生成は、異なる変形性関節症段階の表現型の「読み取り」またはマーカーとして使用することができる。
【００５２】
したがって、例えば、臨床治験において、変形性関節症へのＬＸＲアゴニストの効果を研究するために、細胞は単離し、ＲＮＡは調製して、変形性関節症（例えば、ＴＮＦα）に結び付けられるＡｐｏＤまたは他の遺伝子の発現レベルを分析することができる。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、全て当業者に既知の方法により、生成されるタンパク質の量を測定することによって、またはＡｐｏＤもしくは他の遺伝子のレベルを測定することによって、ノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲで数量化することができる。このようにして、遺伝子発現パターンは、ＬＸＲアゴニストに対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとして機能することができる。したがって、この応答状態は、ＬＸＲアゴニストを用いた個人の治療の前およびその間の種々の時点で判定され得る。
【００５３】
また、本発明は、ＬＸＲアゴニストを用いた対象の治療の有効性を監視するための方法も提供し、該方法は、（ｉ）ＬＸＲアゴニストの投与前に、対象から投与前試料を得るステップと、（ｉｉ）投与前試料中の、ＡｐｏＤの発現のレベルおよび／またはアグリカナーゼ活性のレベルおよび／または炎症促進性サイトカインの生成のレベルを検出するステップと、（ｉｉｉ）対象から１つ以上の投与後試料を得るステップと、（ｉｖ）投与後試料中の、ＡｐｏＤの発現もしくは活性のレベルおよび／またはアグリカナーゼ活性のレベルおよび／または炎症促進性サイトカインの生成のレベルを検出するステップと、（ｖ）投与前試料中の、アポリポタンパク質の発現のレベルおよび／またはアグリカナーゼ活性のレベルおよび／または炎症促進性サイトカインの生成のレベルを、投与後試料中の、ＡｐｏＤ発現および／またはアグリカナーゼ活性および／または炎症促進性サイトカインの生成のレベルと比較するステップと、（ｖｉ）それに応じて、対象へのＬＸＲアゴニストの投与を変更するステップと、を含む。例えば、ＬＸＲアゴニストの投与の増加は、検出されたレベルよりも高いレベルまでＡｐｏＤ発現を増加させるために、および／または検出されたレベルよりも低いレベルまでアグリカナーゼ活性を減少させるために、および／または検出されたレベルよりも低いレベルまで炎症促進性サイトカインの生成を減少させるために、つまり、ＬＸＲアゴニストの有効性を増加させるために望ましい場合がある。あるいは、ＬＸＲアゴニストの投与の減少は、検出されたレベルよりも低いレベルまでＡｐｏＤ発現を減少させるために、および／または検出されたレベルよりも高いレベルまでアグリカナーゼ活性を増加させるために、および／または検出されたレベルよりも高いレベルまで炎症促進性サイトカインの生成を増加させるために、つまり、ＬＸＲアゴニストの有効性を減少させるために望ましい場合がある。そのような実施形態によれば、ＡｐｏＤ発現および／またはアグリカナーゼ活性および／または炎症促進性サイトカイン生成は、観察可能な表現型応答の非存在下でさえも、ＬＸＲアゴニストの有効性の指標として使用することができる。
【００５４】
さらに、変形性関節症の治療において、ＬＸＲアゴニストを含有する組成物は、外因的に投与することができ、血清、任意の所望の組織区画、および／または患部組織におけるＬＸＲアゴニストの特定の標的レベルを達成するために望ましい場合が有り得るだろう。したがって、患者における、または患者から得た組織生検試料を含む生体試料におけるＬＸＲアゴニスのレベルを監視できること、また、一部の例においては、ＡｐｏＤ発現および／またはアグリカナーゼ活性および／または炎症促進性サイトカイン生成のレベルを監視することが有利であろう。したがって、本発明は、患者からの試料におけるＬＸＲアゴニストの存在を検出するための方法もまた提供する。
【００５５】
Ｖ．スクリーニングアッセイ
一実施形態において、ＬＸＲ応答遺伝子の発現レベルまたはそこからのタンパク質の活性レベルは、ＬＸＲベースの機構を通じて変形性関節症を治療する化合物の設計および／または同定を促進するために使用することができる。したがって、本発明は、モジュレータを、すなわち、例えばＡｐｏＤ発現および／またはアグリカナーゼ活性および／またはサイトカイン生成への促進もしくは抑制効果を有するＬＸＲアゴニストを同定するための方法（本明細書において「スクリーニングアッセイ」とも称する）を提供する。そのようにして同定された化合物は、本明細書の他の部分に記述する変形性関節症の治療に使用することができる。
【００５６】
試験化合物は、例えば、空間的にアドレス可能な平行固相または溶液相ライブラリ、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ方法、「１ビーズ１化合物」ライブラリ方法、およびアフィニティークロマトグラフィ選択を使用する合成ライブラリ方法を含む、当技術分野において既知のコンビナトリアルライブラリ方法における多数のアプローチのいずれかを使用して得ることができる。
【００５７】
分子ライブラリを合成するための方法の実施例は、例えば、ＤｅＷｉｔｔ  ＳＨ  ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９−１３（１９９３）、Ｅｒｂ  Ｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−２６（１９９４）、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ＲＮら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５（１９９４）、Ｃｈｏ  ＣＹら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３−０５（１９９３）、Ｃａｒｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９（１９９４）、Ｃａｒｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１（１９９４）、Ｇａｌｌｏｐ  ＭＡら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−５１（１９９４）に見出すことができる。
【００５８】
化合物のライブラリは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ＲＡら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−２１（１９９２））、またはビーズ上（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ＲＡら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ上（Ｆｏｄｏｒ  ＳＡら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５６（１９９３））、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ  ＭＧら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−６９（１９９２））あるいはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ＪＫおよびＳｍｉｔｈ  ＧＰ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−９０（１９９０）、Ｄｅｖｌｉｎ  ＪＪら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−０６（１９９０）、Ｃｗｉｒｌａ  ＳＥら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−８２（１９９０）、Ｆｅｌｉｃｉ  Ｆら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−１０（１９９１）、米国特許第５，２２３，４０９号）に存在し得る。
【００５９】
例示的なスクリーニングアッセイは、ＬＸＲを発現する細胞が試験化合物と接触する細胞ベースのアッセイ、ならびに、ＬＸＲベースの機構を通じてＡｐｏＤ発現および／またはアグリカナーゼ活性および／またはサイトカイン生成を調節する試験化合物の能力である。ＡｐｏＤ発現および／またはアグリカナーゼ活性および／またはサイトカイン生成を調節する試験化合物の能力の判定は、全て当業者には既知の方法により、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくはタンパク質レベルを監視することによって、またはＡｐｏＤ、アグリカナーゼ、および／またはＴＮＦαの活性のレベルを測定することによって、達成することができる。例えば、細胞は、例えばヒト等の哺乳類起源であり得る。
【００６０】
上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規モジュレータは、本明細書に記述する治療のために使用することができる。
【００６１】
実施例
本発明は、以下の実施例でさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好適な実施形態を記載するが、説明のためのみに提供されることを理解すべきである。上記の記述およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の好適な特徴を確認することができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明を種々の使用および条件に適合させるよう本発明の種々の変更および修正を行うことができる。
【００６２】
実施例１
関節炎のまたは正常の関節軟骨のいずれか一方において発現した転写物を同定するため、末期の膝置換術を受けた関節炎患者および関節炎を有さない切断患者から組織試料を得た。関節炎の存在の有無は、組織学により確認した。
【００６３】
発現プロファイリングのために、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５Ａｖ２（ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）を使用した。ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２チップは、ヒトゲノムに由来するほぼ１２，０００の主に全長配列（ほぼ１６プローブ対／配列）を表す２５塩基長オリゴヌクレオチドプローブを含有する。標的配列と完全に相補的であるように設計されたプローブごとに、その中心での単一塩基ミスマッチを除いて同一であるパートナープローブを産生する。これらのプローブ対は、シグナル定量化および非特異的ノイズの減算を可能にする。
【００６４】
ＲＮＡを、個々の関節軟骨組織から抽出し、ビオチン化ｃＲＮＡに変換し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルに従って断片化した。断片化したｃＲＮＡは、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡおよび５００μｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡを含有する１×ＭＥＳ緩衝液中に希釈し、５分間９９℃で、その直後に５分間４５℃で変性させた。不溶性物質は、短時間の遠心分離によってハイブリダイゼーション混合物から除去し、ハイブリダイゼーション混合物を各アレイに添加し、６０ｒｐｍでの持続回転を用いて１６時間４５℃でインキュベートした。インキュベーション後、ハイブリダイゼーション混合物を除去し、チップを６×ＳＳＰＥＴで広範に洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルに記載されるＳＡＰＥ溶液で染色した。
【００６５】
各転写物の蛍光強度素値を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  Ｇｅｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いて６ｍｍの解像度で測定した。遺伝子が「存在する」または「存在しない」かどうか、ならびにアレイ上の各遺伝子の特異的なハイブリダイゼーション強度値または「平均差」を判定するアルゴリズムを使用するＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェア３．２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を、蛍光データを評価するために使用した。遺伝子ごとの平均差は、Ｈｉｌｌ  ＡＡら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：８０９−１２（２０００）の手順に従って、各ハイブリダイゼーション混合物にスパイクされた既知の存在量の１１の対照転写物の平均差を参照することによって、頻度値に正規化した。各遺伝子の頻度が計算され、１０６合計転写物ごとの個々の遺伝子転写物の総数に等しい値を示す。
【００６６】
図１Ａは、１９の異なるメンバーの核内ホルモン受容体スーパーファミリー（ＬＸＲα、ＬＸＲβ、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ、ＧＲ、ＥＡＲ２、ＣＯＵＰ  ＴＦ−Ｉ、ＣＯＵＰ  ＴＦ−ＩＩ、ＣＡＲ、ＰＸＲ、ＭＲ、ＳＦ−１、ＴＲ−２、ＴＲ−４、ＮＯＲ−１、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒ７７、ＳＨＰ、ＦＸＲ）に対する重度変形性関節症軟骨（１００万分の１（ｐｐｍ）で表す）におけるｍＲＮＡレベルを図示する。これらの遺伝子チップ研究に対する検出の定量下限は、およそ５ｐｐｍと決定した。図１に示すデータは、ＬＸＲβ、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、およびＧＲが、遺伝子チップの感受性のレベルで、関節軟骨によって発現されるように思われることの証拠を提供する。図１Ｂにおいて、６つのレチノイド受容体ファミリーメンバー（レチノイン酸受容体（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＲＡＲ）およびレチノイドＸ受容体（Ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＲＸＲ））の発現レベルを示す。これらのデータは、ＲＸＲαが、容易に検出可能なレベルで、関節軟骨組織内で発現されることを示す。ＲＸＲαは、ＬＸＲのヘテロ２量体パートナーであり、ＬＸＲリガンド作用の生物学的に活性な単位は、ＬＸＲ−ＲＸＲヘテロ２量体である。これらのデータは、関節軟骨におけるＬＸＲ発現の機能的効果を考察するための推進力を提供した。
【００６７】
実施例２
図２Ａは、正常軟骨ならびに軽度および重度変形性関節症の患者から得た軟骨におけるＡｐｏＤのｍＲＮＡレベルの比較を示す（１００万分の１（ｐｐｍ）で表す）。これらの遺伝子チップ研究に対する検出の定量下限は、およそ５ｐｐｍと決定した。図２Ａに示すデータは、ＡｐｏＤメッセージの発現が、正常軟骨と比較した時に軽度および重度変形性関節症軟骨において劇的に減少することの証拠を提供する。図２Ｂは、正常軟骨ならびに軽度および重度変形性関節症の患者から得た軟骨におけるＴＮＦαのｍＲＮＡレベルの比較を示す（１００万分の１（ｐｐｍ）で表す）。これらの遺伝子チップ研究に対する検出の定量下限は、およそ５ｐｐｍと決定した。図２Ｂに示すデータは、ＴＮＦαの発現が、正常軟骨と比較した時に軽度および重度変形性関節症軟骨において著しく誘発されることの証拠を提供する。
【００６８】
実施例３
ヒトＯＡドナー（番号１５４、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅが提供）からの新鮮な軟骨外植片（〜２０片、合計〜２００ｍｇ／ウェル）を、１％  Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、インディアナ州、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を含有する１ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２中で１０日間培養した。１０日間の間、外植片は、ＬＸＲアゴニスト（既報告ＬＸＲアゴニストである２μＭ  ＧＷ３９６５、または下記式Ｉの２μＭのＬＸＲアゴニスト）の存在下、あるいは非存在下で、サイトカイン（１ｎｇ／ｍｌＩＬ１βプラス５ｎｇ／ｍｌオンコスタチンＭ）に曝露した。
【００６９】
【化１】
2010503730.tif 000003
【００７０】
培地は、２日ごとに新鮮なサイトカインおよびＬＸＲアゴニストと交換した。ＤＭＭＢ（ジメチルメチレンブルー）アッセイを使用した後、プロテオグリカンの蓄積的放出をこれらの培地中で測定した。１０日間の処置の最後に外植片をプロテイナーゼＫで消化させ、プロテオグリカン総含有量に対してアッセイした。ＬＸＲアゴニストは、培地中へのサイトカイン誘発のプロテオグリカンの放出を有意に減少させ、その結果として、ＬＸＲアゴニストを用いたＯＡ軟骨外植片の１０日間の処置は、外植片中のプロテオグリカン総含有量を有意に増加させた（図３）。ＩＬ１βおよびオンコスタチンＭの両方が、ＯＡのある関節に存在し、ＯＡ疾患進行に影響を与えると考えられるため、データは、ＬＸＲアゴニストが、ＯＡ軟骨において構造を修正する効果を有し得ることを示唆する。
【００７１】
実施例４
ヒトＯＡドナーからの新鮮な軟骨を小片（〜１０ｍｇ／片、〜２×２×２ｍｍ）に切り分けた。軟骨外植片を２４ウェルプレート（〜２５０ｍｇ湿重量／ウェル）に無作為に分けた。外植片の３つのウェルを、処置群ごとに含めた。外植片は、１０％ＦＢＳとともに３日間１ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ−１２中で培養し、次いで、完全培地を、無血清培地と交換した。１２時間後、培地を除去し、新鮮な無血清培地（１ｍｌ）を添加し、続いて、ＬＸＲアゴニストＴ０９０１３１７処置（２μＭ）を行った。８時間後にＩＬ１β／オンコスタチンＭ（各１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。次いで、外植片を、ＬＸＲアゴニストＴ０９０１３１７およびＩＬ１β／オンコスタチンＭの存在または非存在下でさらに２０時間培養した。処置群からの１８０μｌのプール培地を、５０ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下で、３時間３７℃でコンドロイチナーゼＡＢＣ、ケラタナーゼ、ケラタナーゼＩＩで脱グリコシルした。次いで、試料を濃縮し、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分離した。ウエスタン分析は、１次抗体としてマウスＢＣ３ネオエピトープ抗体（１：１５００）、またはウサギ抗ＡＧＥＧ抗体（１：１０００）のいずれか一方、ならびに２次抗体としてアルカリペルオキシダーゼ（１：５０００）に抱合される抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ抗体を使用して行った。図４Ａは、ＢＣ３抗体を使用した結果を示し、図４Ｂは、ＡＧＥＧ抗体を使用した結果を示す。ドナー番号２５９からの軟骨を使用した実験において、サイトカイン処置は、ＢＣ３およびＡＧＥＧ含有のアグリカン断片の両方の培地への放出を誘発した。Ｔ０９０１３１７での処置は、サイトカインによるＢＣ３およびＡＥＥＧ放出の誘発を遮断した。ドナー番号２６１を使用した実験において、ＢＣ３およびＡＥＧＥ含有のアグリカン断片を、未処置軟骨外植片から培地中に放出した。Ｔ０９０１３１７処置は、培地中のこれらの断片の量を減少させた。また、外植片からのＡＧＥＧ含有の断片の放出は、サイトカイン処置によって誘発され、Ｔ０９０１３１７処置によって遮断された。
【００７２】
実施例５
ヒトＯＡドナー（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅが提供）からの新鮮な軟骨外植片（〜２０片、合計〜２００ｍｇ／ウェル）を、１％Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含有する１ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２中で２１日間培養した。２１日間の間、外植片を、ＬＸＲアゴニスト（２μＭ  ＧＷ３９６５または式Ｉ）の存在下、あるいは非存在下で、サイトカイン（１０ｎｇ／ｍｌＩＬ１βプラス１０ｎｇ／ｍｌオンコスタチンＭ）に曝露した。２〜３日おきに、培地を新鮮なサイトカインおよびＬＸＲアゴニストと交換した。７、１４、２１日目に収集した培地試料中のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の総量を、ＥＩＡアッセイ（Ｃａｙｍａｎ）を使用して測定した。
【００７３】
図５は、両方のＬＸＲアゴニストが、３つの全ての時点でサイトカイン（ＩＬ１β／オンコスタチンＭ）誘発のＰＧＥ２合成を強力に抑制することを示す。脂質プロファイリング分析（Ｌｉｐｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．）結果は、アラキドン酸（ＡＡ）のほとんどがそこから来る２つの形の膜リン脂質の量が、ＬＸＲ活性によって減少することを示し、総ＰＧＥ２の減少は、ＯＡ軟骨中の総ＡＡ含有量の減少によって少なくとも部分的に媒介されることが示唆される。また、ＰＧＥ２合成に関与する酵素の発現も、ＬＸＲ活性によって抑制され得る。
【００７４】
ＰＧＥ２は、関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）またはＯＡのある関節に見られる主要な炎症促進性プロスタノイドである。また、軟骨におけるＰＧＥ２の増加は、関節炎疾患を特徴付ける炎症媒介の構造損傷にも影響を及ぼし得る。さらに重要なことには、ＰＧＥ２は、炎症の重要な特徴の１つである痛覚過敏に寄与する。したがって、ＬＸＲアゴニストは、ＯＡ関節中のＰＧＥ２産生を遮断することによって痛みを軽減させ、軟骨マトリックス分解を遮断することによって、疾患進行を予防するＯＡ治療法となる大いなる可能性を有する。
【図１】
2010503730.tif 000004
【図２】
2010503730.tif 000005
【図３】
2010503730.tif 000006
【図４Ａ】
2010503730.tif 000007
【図４Ｂ】
2010503730.tif 000008
【図５】
2010503730.tif 000009
【国際調査報告】
2010503730.tif 000010
2010503730.tif 000011
2010503730.tif 000012
2010503730.tif 000013
2010503730.tif 000014
2010503730.tif 000015
2010503730.tif 000016
2010503730.tif 000017
2010503730.tif 000018
2010503730.tif 000019
2010503730.tif 000020
2010503730.tif 000021