(57)【要約】  本発明は、少なくとも１個の異種遺伝子を含むように改変された組換え宿主細胞であって、異種遺伝子が、フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびオキシドレダクターゼをコードする遺伝子およびＩＳＣオペロンから選択される、改変された組換え宿主細胞に関する。本発明はまた、そのような改変された組換え宿主細胞を作製するステップと、宿主細胞を培地で培養するステップと、水素を収集するステップとを含む、水素を生産するための方法に関する。本発明はまた、ｉｓｃＲ遺伝子の欠失により高いヒドロゲナーゼ活性を有する改変された宿主細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個の異種遺伝子を含むように改変されている改変された組換え宿主細胞であって、異種遺伝子が、フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびオキシドレダクターゼをコードする遺伝子およびＩＳＣオペロンから選択される、改変された組換え宿主細胞。
【請求項２】
前記オキシドレダクターゼが、ＮＦＯＲ（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシン−オキシドレダクターゼ）、ＧＡＰＯＲ（グリセルアルデヒド−３−リン酸：フェレドキシン−オキシドレダクターゼ）、ＨｙｄＢ、ＨｙｄＣおよび上記の組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項３】
前記ヒドロゲナーゼがＦｅＦｅ型および／またはＮｉＦｅ型である、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項４】
前記ヒドロゲナーゼがＨｙｄＡであり、前記細胞が、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧをコードする異種遺伝子を含むようにさらに改変されている、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項５】
前記細胞が、フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびオキシドレダクターゼをコードする前記異種遺伝子を含むように改変されており、前記宿主細胞におけるＨ２の合成が促進される、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項６】
前記細胞が、フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびオキシドレダクターゼをコードする前記異種遺伝子およびＩＳＣオペロンを含むように改変されている、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項７】
前記細胞が、オキシドレダクターゼをコードする前記異種遺伝子を含むように改変されており、異種フェレドキシンまたはフラボドキシンをさらに含む、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項８】
前記細胞が、異種オキシドレダクターゼおよび異種ヒドロゲナーゼを含む、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞が、異種ヒドロゲナーゼおよび同種オキシドレダクターゼを含む、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、異種オキシドレダクターゼおよび同種ヒドロゲナーゼを含む、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、ＨｙｄＡ、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦ、ＨｙｄＧをコードする異種遺伝子およびＩＳＣオペロンを含むように改変されている、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１２】
前記細胞が、ＨｙｄＡ、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦ、ＨｙｄＧおよびＯＲをコードする異種遺伝子を含むように改変されている、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、ＨｙｄＡ、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦ、ＨｙｄＧおよびＯＲをコードする異種遺伝子を含むように改変されており、前記細胞が異種フェレドキシンまたはフラボドキシンをさらに含む、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、ＨｙｄＡ、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦ、ＨｙｄＧ、ＯＲをコードする前記異種遺伝子およびＩＳＣオペロンを含むように改変されており、前記細胞が異種フェレドキシンまたはフラボドキシンをさらに含む、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ザイモナス（Ｚｙｍｏｎａｓ）属およびハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属からなる群より選択される、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、  Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｚｙｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓおよび Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからなる群より選択される、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１７】
ｉｓｃＲ遺伝子が欠失している、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞を作製するステップと、宿主細胞を培地中で培養するステップと、水素を収集するステップとを含む、水素を生産するための方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞からヒドロゲナーゼを含むタンパク質製剤を作製するステップと、タンパク質製剤を電子および陽子のソースと混合するステップと、混合物をインキュベートするステップとを含む、水素を生産するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を使用して水素ガスおよび／またはヒドロゲナーゼ酵素を生産するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜微生物による水素産生＞
Ｈ２は、特にエネルギー変換に対するＨ２の最小限の環境影響の故に、可動適用および静止適用の両方のための有望な次世代エネルギーベクトルである（Ｃｈｏ，２００４；Ｋｅｉｔｈ  ａｎｄ  Ｆａｒｒｅｌｌ，２００３）。Ｈ２の現在の世界市場は、１６０，０００，０００，０００ＵＳドルに相当すると推定される。Ｈ２が移動および輸送への適用（たとえば自動車、飛行機）のための燃料として大規模に採用されれば、現在の市場ははるかに大きくなると予想される。石油代替エタノールと比較すると、Ｈ２の生産と使用が、環境影響を有するのに十分な規模で石油代替物として商業的成熟度に達するためには、多くの未解決の問題（Ｓｅｒｖｉｃｅ，２００４）がまださらなる研究と開発を必要とする。生産コストが、他の代替燃料に比較して輸送距離のコストへの影響と共に、主要な問題である。Ｈ２は、潜在的に、広い範囲の様々な非再生可能および再生可能な供給源に由来し得る。植物由来のバイオマスは再生可能エネルギーの１つの潜在的供給源を示す。バイオマスは発酵を通して微生物によってＨ２に変換され得るが、出発基質（糖）当たりの収率はエタノールに比べて非常に低い（Ａｎｇｅｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ，２００４によって総説されている）。バイオマスの生産は、バイオマス由来の燃料生産における主要な経済的および環境的コストであるので（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ，２００６）、基質当たりの生成物の収率は、依然として経済的および環境的に持続可能なＨ２生産を可能にするための決定的に重要な変数である。
【０００３】
多数の微生物がＨ２を生産することができ、極めて多様な代謝経路でＨ２を消費することができる。一般に、糖発酵する種に関しては、Ｈ２生産のための最も一般的な解糖中間ノードは、ギ酸（たとえばエンテロバクター属の細菌）またはフェレドキシン（たとえばクロストリジウム属の細菌）のいずれかを中間電子受容／供与体とするピルビン酸である（図１）。どちらの反応も熱力学的に良好であり、したがってＨ２の高い分圧でも進行し、最大収率は２Ｈ２／グルコースである。グリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）ノードは、微生物が酸化を通して生成される不要の電子を除去するために炭素依存性（エタノール、乳酸、ブタノール）および炭素非依存性（Ｈ２）経路へと進行するためのその他の最も重要な中間体である。大部分の生物において、ピリジンヌクレオチド共役ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋は主要なＧＡＰ由来の中間体として機能し、他の代謝的に重要な多数の反応へのその関与のゆえに全体的細胞代謝における中心的役割を果たす。そのような中心的役割の結果として、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋の相対比率は代謝全体に重要な意味を有し、測定可能ないわゆる「定常状態」レベルに維持される（Ａｌｅｘｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。理論的には、ＧＡＰＤＨ依存性反応において生成されるＮＡＤＨのすべてが反応（１）：
（１）ＮＡＤＨ  ＋  Ｈ＋  ←→  ＮＡＤ＋  ＋  Ｈ２
に従ってＨ２に変換された場合、もう１つの２Ｈ２／グルコースが潜在的にＧＡＰノードから入手できる。
【０００４】
しかし、この反応が、少なくともＨ２を消費する栄養共生パートナーの不在下で、生理的に適切であるかどうかについては疑問が残る（Ｊｕｎｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，１９７３）。報告されている細胞ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比率でのＮＡＤＨ依存性のＨ２合成は、推定されるＨ２の非常に低い分圧で反応が平衡に達する場合、生物工学的工程において利用可能である可能性は低い（Ａｎｇｅｎｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。
【０００５】
主要な電子供与体としての細胞外糖に基づき、４ｍｏｌ／グルコース（３３．３％の理論的潜在能）以上の収率を有する微生物のＨ２生産経路は、そのステップが理解される段階まではまだ特性決定されておらず、すべての場合に、定義されない複合培地を使用して実施されてきた（Ｏｏｔｅｇｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ，２００４；Ｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。しかし、２〜ｍｏｌ／グルコース（１６．７％〜３％の理論的潜在能）Ｈ２の収率が実験室条件下で最小培地を用いて報告された（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。この方法がＧ３Ｐ酸化に由来するＨ２に依存する場合、まだ回答の得られていない疑問は、２ｍｏｌ  Ｈ２／グルコース以上の収率がＮＡＤＨを中間体としてどのような機構によって実現され得るかということである。
【０００６】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：Ｈ２経路は、多量体ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性ヒドロゲナーゼ（Ｍａｌｋｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｓｏｂｏｈ  ｅｔ  ａｌ，２００４）によってまたは独立成分であるＮＦＯＲ、フェレドキシンおよびヒドロゲナーゼの収集によって（Ｔｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９７１）触媒される。いくつかのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性多量体ヒドロゲナーゼが同定され、特性決定されたが（Ｖｅｒｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９；Ｓｏｂｏｈ  ｅｔ  ａｌ，２００４）、そのような錯体の生理的役割は、Ｈ２消費の証拠だけが存在し、Ｈ２生産の証拠は存在しないＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｆｒｕｃｔｏｓｏｖｏｒａｎｓのＨ２依存性ＮＡＤＰ＋レダクターゼを除いて（Ｍａｌｋｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）、まだ明らかにされていない。Ｈ２を生産するクロストリジウム属細菌からのいくつかのＮＦＯＲが、インビトロでＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性Ｈ２合成を触媒することが以前に示されたが（Ｊｕｎｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，１９７１；Ｔｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９７１）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：Ｈ２経路において機能する１個の独立したＮＦＯＲは、遺伝子配列レベルでまだ同定されていない。最近、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）からのＮＡＤＰＨ：［４Ｆｅ４Ｓ］−フェレドキシン−オキシドレダクターゼ（ｙｕｍＣ遺伝子によってコードされるＢｓＮＦＯＲ）（Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ，２００４）およびＣｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍからのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：［４Ｆｅ４Ｓ］−フェレドキシン−オキシドレダクターゼ（ＣｔＮＦＯＲ）（Ｓｅｏ  ａｎｄ  Ｓａｋｕｒａｉ，２００２）が記述された。前者の酵素は、おそらくＨ２代謝には関与しないと考えられ、その生理的役割は不明のままであるが、後者の酵素は、おそらく植物ＮＡＤＰＨ：［２Ｆｅ２Ｓ］−フェレドキシン−オキシドレダクターゼに類似した光合成における役割を有する（Ｃａｒｒｉｌｌｏ  ａｎｄ  Ｃｅｃｃａｒｅｌｌｉ，２００３）。
【０００７】
Ｈ２代謝性微生物は、しばしば、ほとんどの場合定義されないままである複雑な調節と生理的役割および方向性を備えた、多数のヒドロゲナーゼを含む（Ｖｉｇｎａｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。これらの微生物の大部分は、まだ遺伝子修飾に従わず、特に多量体ヒドロゲナーゼは、異種発現系が存在しないか（ＮｉＦｅ型ヒドロゲナーゼ）または最近になって初めて実現された（ＦｅＦｅ型ヒドロゲナーゼ、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００６）、大きな多遺伝子オペロンの成分である。したがって、本発明は、フェレドキシン、１つまたは複数のオキシドレダクターゼ、およびフェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼからなるモジュラーシステムを大腸菌における組換えタンパク質の共発現によって結合する選択的アプローチを述べる。このアプローチはまた、天然のフェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよび／または天然フェレドキシンを既に含む他の生物にも導入し得る。
【０００８】
＜グリセルアルデヒド−３−リン酸：フェレドキシン−オキシドレダクターゼ＞
ほとんどの生物において、ＧＡＰの酸化は、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を還元する酵素、すなわちＧＡＰＤＨまたはＧＡＰＮによって実施される。ごくわずかな微生物で認められる選択的酵素活性は、グリセルアルデヒド−３−リン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＧＡＰＯＲ）である。ＧＡＰＯＲは、グリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）の酸化が、酸化型フェレドキシンの還元と同時に３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）を生成する二重基質電子伝達反応を触媒する。ＧＡＰＯＲおよびそのホモログは、主として、ユリアーキオータ（ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）およびクレンアーキオータ（ｃｒｅｎａｒｃｈｅａｏｔａ）の両方を含む古細菌、特に超好熱菌において認められる（Ｍｕｋｕｎｄ  ａｎｄ  Ａｄａｍｓ，１９９５；Ｓｅｌｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｏｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。超好熱古細菌であるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（パイロコッカス・フリオサス）において、ＧＡＰＯＲ反応が最終的電子受容体としての分子水素の合成に共役することが示唆されてきたが、いまだ証明されていない（Ｍｕｋｕｎｄ  ａｎｄ  Ａｄａｍｓ，１９９５）。それにもかかわらず、ＧＡＰＯＲは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒなどの水素生産種において活性酵素として（Ｓｅｌｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、およびＰ．ａｂｙｓｓｉ（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｓｃｏｐｅ．ｃｎｓ．ｆｒ／Ｐａｂ／）およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ（サーモコッカス・コダカレンシス）（Ｆｕｋｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）において仮説上のホモログとして認められるのみならず、活性酵素としてＤｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｓｅｌｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、および仮説上のホモログとしてＴｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｔｅｎａｘ（サーモプロテウス・テナックス）（Ｓｉｅｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ヤニシ）（Ｂｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）のような水素非生産性、むしろ水素消費性の種においても認められる。特に後者の群の生物において、ＧＡＰＤＨ−／ＰＧＫ−依存性経路に代わるＧＡＰＯＲ依存性解糖系の進化の背後にある論理的根拠は解明されないままである。
【０００９】
モリブデンとタングステンは化学的に類似し（Ｋｌｅｔｚｉｎ  ａｎｄ  Ａｄａｍｓ，１９９６）、一般に窒素、硫黄および炭素代謝における基本反応を触媒する様々な酸化還元活性酵素に関連する（Ｋｉｓｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（パイロコッカス・フリオサス）からのＧＡＰＯＲ（ｐｆＧＡＰＯＲ）はＷ−プテリンを含み（Ｍｕｋｕｎｄ  ａｎｄ  Ａｄａｍｓ，１９９５）、過剰のＭｏまたはバナジウム（Ｖ）と微量のＷを含む培地でさえも、Ｍｏ−またはＶ−プテリンではなくＷ−プテリンを有するｐｆＧＡＰＯＲ  が生産されるので、Ｗに特異的であると思われる（Ｍｕｋｕｎｄ  ａｎｄ  Ａｄａｍｓ，１９９６）。ＧＡＰＯＲがＨ２合成を生じさせる経路において機能することはまだ証明されていないが、その可能性は明らかに存在する。本発明は、フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼとフェレドキシンを使用する開放系を述べる。したがって、そのような系における組換えＧＡＰＯＲの発現は、電子伝達の以下のようなＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）非依存性経路を創造し得る；
（２）ＧＡＰ  →  フェレドキシン  ←→  Ｈ２
【００１０】
ＧＡＰＯＲ依存性経路は、ＧＡＰＯＲだけがフェレドキシンの還元を触媒することができ、逆は不可能であるので、おそらく正味の一方向性経路を生成する。
【００１１】
＜ヒドロゲナーゼおよび鉄硫黄クラスターの完全性の重要性＞
水素の微生物進化は、陽子の水素への可逆的還元を触媒するヒドロゲナーゼとして公知の酵素のファミリーに起因すると考えられる（５）。触媒中心に依存して、ヒドロゲナーゼは３つのサブファミリー：ニッケル−鉄を含む（Ｎｉ−Ｆｅ）（６）、鉄のみを含む（Ｆｅ−Ｆｅ）（７）および鉄−硫黄（Ｆｅ−Ｓ）フリーヒドロゲナーゼ（８）に分類することができる。酵素学的観点から、Ｆｅ−Ｆｅ型ヒドロゲナーゼは、一般に水素の生合成において最も効率的な酵素であるとみなされ、したがって現在も、大規模水素生産のための生物的戦略を開発する上で最も魅力的な選択である。最近の研究は、藻類およびシアノバクテリアにおける水素の光生物学的生産に集中してきた（９）。鉄のみを含むヒドロゲナーゼは、Ｈクラスターとして公知の活性部位内に独特の一酸化炭素二鉄およびシアン化物配位錯体および全部ではないがほとんどの場合、Ｆクラスターとして公知の付加的なフェレドキシン様ドメインを特徴的に含む。酸素または酸素由来ラジカルによる不活性化に対するＨクラスターの高い感受性は、生体内変換のための鉄だけを含むヒドロゲナーゼの開発における最大の障害を示す（１０，Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。鉄のみを含むヒドロゲナーゼの完全な成熟には、一般にＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧとして公知のタンパク質のサブセットを必要とし、一方その還元のために必要な電子は、ほとんどの場合、還元型フェレドキシンによって提供される（１１）。上記タンパク質全部において共通の基礎となる特徴は、鉄−硫黄（Ｆｅ−Ｓ）クラスターの普遍的存在である（１２）。細菌におけるＦｅ−Ｓクラスターの形成と取込みに関して、３つの異なる経路が存在することが知られている；一般に、ＮＩＦ（窒素固定）、ＳＵＦ（硫黄動員）およびＩＳＣ（鉄硫黄クラスター）経路と称される（１３）。３つのうちで、ＩＳＣ経路は、大腸菌における通常の増殖条件下でＦｅ−Ｓ含有タンパク質の大部分のためにＦｅ−Ｓ補因子挿入の「ハウスキーピング」の役割を提供すると考えられる（１４）。Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ（２１）は、いくつかの組換えフェレドキシンをレポータータンパク質として使用して、大腸菌におけるＦｅ−Ｓタンパク質合成へのＩＳＣマシナリーの生理的作用を検討した。フェレドキシン合成が、ＩＳＣ共発現により定量的に数倍増強され得ることが認められた。他のＦｅ−Ｓタンパク質、リポ酸シンターゼ（２２）、ｉｓｐＨ（２３）およびｉｓｐＧ（２４）に関する試験からの同様の報告は、Ｆｅ−Ｓ形成と取込みが大腸菌において合成されたＦｅ−Ｓ組換えタンパク質の大部分にとっての制限因子であり、この制限はＩＳＣ遺伝子量を上昇させることによって回避できるという全体的結論を確認した。
【００１２】
本発明は、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからの鉄のみを含むヒドロゲナーゼ（ＨｙｄＡ）の組換え発現を述べる。ＨｙｄＡは５つの異なるＦｅ−Ｓ補因子の取込みを必要とし、ヒドロゲナーゼの成熟は、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧと称される付加的なＦｅ−Ｓタンパク質のサブセットの共発現に依存するため（２５）、本発明者らは、Ｆｅ−Ｓクラスターの形成と挿入が大腸菌における鉄のみを含むヒドロゲナーゼの合成に何らかの制限を課すのかどうかを検討した。明らかに、これまでのすべてのＩＳＣ共発現試験は、Ｆｅ−Ｓクラスターは一般に酸素に対して高度に感受性であることが周知であるにもかかわらず、組換えＦｅ−Ｓタンパク質の発現のために無酸素ではなく有酸素条件を使用していた（２８）。
【００１３】
上述したように、ＦｅＦｅ型ヒドロゲナーゼがＯ２依存性不活性化に感受性であることは周知であり、ほとんどの場合、この不活性化は不可逆的である（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。酸素または酸素由来ラジカルがＨクラスターに結合することから生じる鉄のみを含むヒドロゲナーゼの不活性化は、藻類Ｈ２生産の開発に対する主要な障害である（Ｇｈｉｒａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。Ｏ２またはＯ２由来ラジカルに対するＨ２の耐性を高めるための２つの主要な方法が考えられる；（１）Ｏ２またはＯ２由来ラジカルによるＨクラスターへの物理的アクセスを低下させるＨｙｄＡ構造を工作する、および（２）ＨｙｄＡ含有細胞の細胞内環境における直接活性種（Ｏ２またはＯ２由来ラジカル）の濃度を低下させる。本発明は後者の方法を述べる。両方の方法はおそらく互いに補完し合うと思われる。
【発明の開示】
【００１４】
１つの実施形態では、本発明は、細胞が少なくとも１個の異種遺伝子を含むように改変されており、異種遺伝子がフェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびオキシドレダクターゼをコードする遺伝子およびＩＳＣオペロンから選択される、改変された組換え宿主細胞を提供する。
【００１５】
もう１つの実施形態では、本発明は、オキシドレダクターゼがＮＦＯＲ（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：フェレドキシン−オキシドレダクターゼ）、ＧＡＰＯＲ（グリセルアルデヒド−３−リン酸：フェレドキシン−オキシドレダクターゼ）、ＨｙｄＢ、ＨｙｄＣおよび上記の組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞を提供する。
【００１６】
上記実施形態では、ヒドロゲナーゼはＦｅＦｅ型および／またはＮｉＦｅ型であり得る。ヒドロゲナーゼはＨｙｄＡであり得、および細胞は、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧをコードする異種遺伝子を含むようにさらに改変され得る。
【００１７】
上記実施形態では、細胞は、フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびオキシドレダクターゼをコードする異種遺伝子を含むように改変され得、それによって宿主細胞におけるＨ２の合成が促進され得る。
【００１８】
上記実施形態では、細胞は、フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびオキシドレダクターゼをコードする異種遺伝子およびＩＳＣオペロンを含むように改変され得る。
【００１９】
上記実施形態では、細胞は、オキシドレダクターゼをコードする異種遺伝子を含むように改変され得、および細胞は異種フェレドキシンまたはフラボドキシンをさらに含み得る。
【００２０】
上記実施形態では、細胞は、異種オキシドレダクターゼおよび異種ヒドロゲナーゼを含み得る。あるいは、細胞は、異種ヒドロゲナーゼおよび同種オキシドレダクターゼを含み得る。細胞は、異種オキシドレダクターゼおよび同種ヒドロゲナーゼを含み得る。
【００２１】
上記実施形態では、細胞は、ＨｙｄＡ、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦ、ＨｙｄＧをコードする異種遺伝子およびＩＳＣオペロンを含むように改変され得る。細胞は、ＨｙｄＡ、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦ、ＨｙｄＧおよびＯＲをコードする異種遺伝子を含むように改変され得る。細胞は、ＨｙｄＡ、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦ、ＨｙｄＧおよびＯＲをコードする異種遺伝子を含むように改変され得、および細胞は異種フェレドキシンまたはフラボドキシンをさらに含む。細胞は、ＨｙｄＡ、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦ、ＨｙｄＧ、ＯＲをコードする異種遺伝子およびＩＳＣオペロンを含むように改変され得、および細胞は異種フェレドキシンまたはフラボドキシンをさらに含む。
【００２２】
上記実施形態では、宿主細胞は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ザイモナス（Ｚｙｍｏｎａｓ）属およびハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属からなる群より選択され得る。宿主細胞は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（エンテロバクター・エロゲネス）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ（エンテロバクター・クロアカ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（クロストリジウム・アセトブチリカム）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ（クロストリジウム・パスツリアヌム）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ（クロストリジウム・サーモセラム）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｙｔｉｃｕｍ（クロストリジウム・セルリチクム）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（コリネバクテリウム・グルタミクム）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（サーモトガ・マリティマ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（サーモトガ・ネアポリタナ）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｚｙｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）からなる群より選択され得る。
【００２３】
もう１つの実施形態では、本発明は、改変された組換え宿主細胞を作製するステップと、宿主細胞を培地で培養するステップと、水素を収集するステップとを含む、水素を生産するための方法を提供する。
【００２４】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、改変された組換え宿主細胞からヒドロゲナーゼを含むタンパク質製剤を作製するステップと、タンパク質製剤を電子および陽子のソースと混合するステップと、混合物をインキュベートするステップとを含む、水素を生産するための方法を提供する。
【００２５】
本発明の目的および特徴は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照してよりよく理解できる。ほとんどの図面は、明瞭性および情報の内容を最適化するために色（脱色）、明るさおよびコントラストに関して調整されている（各々それぞれの図面全体において等しく）ことに留意されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、広く２つの章に分けることができる。（１）フェレドキシン依存性オキシドレダクターゼ（例を構成するＮＦＯＲおよび／またはＧＡＰＯＲ）、フェレドキシンおよびフェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼの組換え発現によるＨ２生産の増強、および（２）生産工程の間のいずれかの段階でＯ２の存在下にて、大腸菌ＩＳＣオペロンの発現によるおよび／または大腸菌におけるｉｓｃＲ遺伝子の欠失による、ヒドロゲナーゼ活性、ヒドロゲナーゼ合成およびＨ２生産の増強。一例として、最初の場合、（１）組換えヒドロゲナーゼ、フェレドキシンおよびＮＦＯＲまたはＧＡＰＯＲを同時に発現させる。オキシドレダクターゼの選択は閉鎖条件下でのＨ２蓄積に影響を及ぼす。ＮＡＤＰ（Ｈ）だけに基質特異性を有し、ＮＡＤ（Ｈ）には特異性を有さないＮＦＯＲがＨ２蓄積のために好ましいことが明らかにされる。２番目の場合、（２）組換えヒドロゲナーゼを大腸菌ＩＳＣオペロンと共に過剰発現させる。この手順を実験のいずれかの段階でＯ２の存在下にて実施したとき、ＩＳＣオペロンの組換え発現がない場合と比較して、大腸菌ＩＳＣオペロンが過剰発現される場合、ヒドロゲナーゼのより多くの量およびヒドロゲナーゼのより大きな特異的活性および総活性が得られることが明らかにされる。また、大腸菌遺伝子ｉｓｃＲの欠失が大腸菌ＩＳＣオペロンの組換え発現に置き換わり得ることも明らかにされる。
【００２７】
＜相同性＞
Ｃ．ｔｅｐｉｄｕｍのＣ１５１２（公知のＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ依存性ＮＦＯＲをコードする）は、コードされるアミノ酸レベルでＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｙｕｍＣに６０％の相同性を示す。Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ（２００４）およびＳｅｏ  ａｎｄ  Ｓａｋｕｒａｉ（２００２）による分析に基づき、チオレドキシンレダクターゼと注釈づけられた、ＮＦＯＲ反応を触媒するすべての推定上のチオレドキシンレダクターゼにおいて欠如している本物のチオレドキシンレダクターゼの機能のために明らかに必要なジシステインモチーフ（Ｓｅｏ  ａｎｄ  Ｓａｋｕｒａｉ，２００２の図９においてアミノ酸１２０〜１５０の間に位置する）を欠く任意の推定タンパク質が、ＮＦＯＲ反応を触媒する可能性がある。
【００２８】
Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓのＧＡＰＯＲ（ＡＥ０１０１６９．１）は、Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓのものを別にして、他の唯一の証明されたＧＡＰＯＲコード遺伝子であり、Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓのＧＡＰＯＲの推定アミノ酸配列は、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓのＧＡＰＯＲの推定アミノ酸配列に６０％の相同性を示す。
【００２９】
１．１８．１．２（フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋レダクターゼ）または１．１８．１．３（フェレドキシン−ＮＡＤ＋レダクターゼ）のＥＣカテゴリーに分類される任意のオキシドレダクターゼは、理論的にはｙｕｍＣのものと同様に使用できる。
【００３０】
「植物型」ＦＮＲ（ＥＣ  １．１８．１．２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｄｂｇｅｔ−ｂｉｎ／ｗｗｗ＿ｂｇｅｔ？ｅｃ：１．１８．１．２）−フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋−レダクターゼ。大腸菌ｆｐｒ（Ｂｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９３）、Ａｎａｂａｅｎａ  ｐｅｔＨ（Ｆｉｌｌａｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）およびそれらのホモログのＦＮＲは、一組の候補物質を構成する。
【００３１】
［実施例］
＜すべての実施例についての材料および方法＞
＜材料＞
すべての化学的試薬（注記されている場合を除く）は、明言されている場合を除き、ＳＩＧＭＡ（Ｊａｐａｎ）またはＷＡＫＯ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）のいずれかより入手した。プラスミドＤＮＡ発現ベクターはすべてＮｏｖａｇｅｎ（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より入手した。制限酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＵＳＡ）より購入した。コンピテント大腸菌宿主細胞はＮｏｖａｇｅｎ（Ｎｏｖａｂｌｕｅ（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３））またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＢＬ２１−ｇｏｌｄ（ＤＥ３））より入手した。標準ガスは、ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ；１００％（ｖ／ｖ）ＣＯ２；１００％（ｖ／ｖ）Ｏ２；１００％（ｖ／ｖ）Ｈ２）またはＫａｍｉｍａｒｕ（Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ）（５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、５％（ｖ／ｖ）Ｈ２、９０％（ｖ／ｖ）Ｎ２）より入手した。ＰＣＲ増幅のためのゲノムＤＮＡは、ＡＴＣＣから直接入手するか（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ８２４Ｄ−５、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ  ４９６５２Ｄ）またはＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ  ４０２；Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ  ＤＳＭ  ５２５）またはＪａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（Ｓａｉｔａｍａ，Ｊａｐａｎ）（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  ＪＣＭ  １３０３０）から入手した標準株から単離した。Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡｅａｓｙをＤＮＡ単離のために使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、プレキャスト１２％ゲル（ＴＥＦＣＯ，Ｊａｐａｎ）を用いて実施した。テリフィックブロス（ＴＢ）培地のために、Ｂａｃｔｏ（商標）酵母抽出物およびＢａｃｔｏ（商標）トリプトンをＢＤ，Ｊａｐａｎより入手した。合成オリゴヌクレオチドはＨｏｋｋａｉｄｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｈｏｋｋａｉｄｏ，Ｊａｐａｎ）から入手した。
【００３２】
＜細菌株、プラスミドおよび増殖条件＞
この試験で使用した細菌株とプラスミドを表１に列挙する。合成ｐＣＤＯＰＦＥＧおよびその誘導体を除き、制限酵素消化を必要とするすべてのベクター構築物は一般に以下のように作製した。意図する標的タンパク質をコードするオープンリーディングフレームＤＮＡ（「インサートＤＮＡ」）を、表１に列挙するＤＮＡ鋳型とプライマーおよびＡｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用して、ＰＣＲ（３２〜３４サイクル）によって増幅した。各々のＤＮＡ鋳型に関する詳細は表２に列挙する。ＰＣＲ産物を１．５〜２．０％のＳｅａＰｌａｑｕｅ  ＧＴＧ  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＵＳＡ）中で電気泳動に供し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ核酸ゲル染料（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＵＳＡ）で染色して、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  ＦＬＡ−３０００（Ｆｕｊｉ  Ｐｈｏｔｏ  Ｆｉｌｍ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した蛍光イメージングによって視覚化した。標的ＰＣＲ産物を含む切り出したゲル切片を、ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用してゲル精製に供した。精製した「インサートＤＮＡ」とプラスミドＤＮＡを製造者の指示に従って制限酵素消化に供し（制限酵素を表３に列挙する）、次いで上述したように電気泳動およびゲル精製に供した。精製および消化したプラスミドＤＮＡを、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用して、表３によるそれぞれの「インサート」ＤＮＡに連結した。Ｅｋ／ＬＩＣベクターをプラスミド骨格として使用するベクター構築物（表３に示されている）を、上記のように（制限酵素消化は含まない）作製した「インサートＤＮＡ」を使用して製造者の指示に従って作製した。すべての連結反応を、製造者の指示に従ってＮｏｖａｂｌｕｅ（ＤＥ３）細胞を形質転換するために使用し、プラスミド保存溶液をＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて調製し、−３０℃で保存した。ＮｃｏＩとＡｖｒＩＩ（Ｅｋ／ＬＩＣ構築物）または「インサートＤＮＡ」の作製において使用したのと同じ制限酵素を用いた制限酵素分析後、ゲル電気泳動によって「陽性」クローンを同定した。ＰＣＲ増幅産物の同一性を確認するため、すべてのプラスミドベクター構築物の選択を可溶性組換えタンパク質の発現（以下で述べるように）および末端配列決定（ｅｎｄ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）に関して試験した（Ｈｏｋｋａｉｄｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｋｋａｉｄｏ，Ｊａｐａｎ）。すべてのｐＥＴ４６−Ｅｋ／ＬＩＣ構築物が５’末端にベクター由来のＨｉｓタグを含み、一方すべての他の非Ｅｋ／ＬＩＣベクターからベクター由来のＨｉｓタグおよびＭＣＳ２が除去された。各プラスミド遺伝子構築物の同一性を塩基配列決定によって確認し、試験発現後の粗溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび酵素活性アッセイによって機能を確認した。
【００３３】
３つのヒドロゲナーゼ成熟因子全部をコードする合成オペロン、ｐＣＤＯＰＦＥＧ、およびその誘導体の構築を以下で述べるように実施した。（５’方向に）リボソーム結合配列（ＲＢＳ）、８個の任意のヌクレオチド（ＡＡＡＡＴＡＡＡ）、次いでＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ｈｙｄＦについての遺伝子を含む、ＲＢＳ−ｈｙｄＦ  ＰＣＲ産物を、プライマーＣＡＨｙｄＦ＿Ｆｏｒ＿ＮｃｏＩおよびＲＢＳ＿ＣＡＨｙｄＦ＿ｒｅｖＳｔｕＩを用いて合成し、上述したように作製した。プラスミドｐＣＤＦ−Ｄｕｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を制限酵素ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、上述したように、ＲＢＳ−ｈｙｄＦ  ＰＣＲ産物に連結して、ｐＣＤＯＰＦを生成した。ｐＣＤＦＯＰＦＥを、ｐＣＤＦＯＰＦをプラスミド誘導体として使用し、プライマーＲＢＳ＿ＣＡＨｙｄｅＥ＿ＦｏｒＳｗａＩおよびＲＢＳ＿ＣＡＨｙｄＥ＿ＲｅｖＡｖｒＩＩを用いて合成したＰＣＲ産物を使用して同じように生成し、その後それを、プライマーＲＢＳ＿ＣａＨｙｄＧ＿ＦｏｒＳｗａＩおよびＲＢＳ＿ＣＡＨｙｄＧ＿ＲｅｖＡｖｒＩＩを用いてｐＣＤＯＰＦＥＧを生成するために使用した。ｐＣＤＰＯＰＦＥＧＡ、ｐＣＤＯＰＦＥＧＨｉｓＡ、およびｐＣＤＯＰＦＥＧＨｉｓＡＦｄｘを、ｐＣＤＦＯＰＦＥＧをプラスミド誘導体として使用し、プライマーＲＢＳ＿ＣＡＨｙｄＡ＿ＦｏｒＳｗａＩおよびＲＢＳ＿ＣＡＨｙｄＡ＿ＲｅｖＳｔｕＩ（ｐＣＤＯＰＦＥＧへのＨｙｄＡの添加）、ｐＥＴ４６Ｈｉｓ＿ＢｓｐＨＩ＿ＦｏｒおよびＲＢＳ＿ＣＡＨｙｄＡ＿ＲｅｖＳｔｕＩ（ｐＣＤＯＰＦＥＧへのＨｉｓＨｙｄＡの添加）、およびＣＰＦｄｘ４＿ＨｉｓＲＢＳ＿Ｆ＿ＢａｍＨ１    ａｎｄ  ＣＰＦｄｘ４＿ＲＨｉｓＲＢＳＡｖｒ（ｐＣＤＯＰＦＥＧＨｉｓＡへのＣｐＦｄの添加）をそれぞれ使用して、同じように生成した。ｐＣＤＯＰＦＥＧおよび誘導体の構築のために使用したすべてのプライマーを表１に列挙する。各段階後の塩基配列決定により、含まれるすべての標的遺伝子の発現を確認し、各々の新しいインサートの同一性を確認した。
【００３４】
遺伝子欠失を最初にＭＧ１６５５において作製し（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ）、次にＤＳＭＺから得たＰ１ファージ５７５７を用いたＰ１形質導入によってＮｏｖａｇｅｎ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に移入した。欠失のために使用したプライマーを表１に列挙する。ＭＧ１６５５  ｉｓｃＲ−菌株（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を、上述したようにＢＬ２１（ＤＥ３）ｉｓｃＲ−の作製のための鋳型として使用した。すべての染色体欠失をＰＣＲによって確認した。
【００３５】
ＮＦＯＲ関連実験のための培養は、炭素およびエネルギー源として１．５％グルコースを含むＭＯＰＳ最小培地（Ｔｅｋｎｏｖａ）２０〜５０ｍｌにおいて実施した。適宜にカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を培地に添加した。インビボでのＨ２合成のために、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびその誘導体またはＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）を表４に列挙したベクターの組合せで形質転換した。菌株は、各々の実験の前に新鮮形質転換するかまたは−８０℃以下で８％グリセロール保存溶液として保存した。ヘッドスペースのガス組成を、以下で述べるようにガスクロマトグラフィーによって分析した。前培養物を新鮮ＬＢプレートから接種し、３０〜３７℃で０．１〜１．０のＯＤ６００まで増殖させた（好気的または嫌気的に）。次に前培養物を使用して主培養物（０．０５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加した同じ培地）に約０．０２のＯＤ６００で接種した。すべての主培養物を、ブチルゴム隔壁で栓をし、９９．９９９５％  Ｎ２で接種後＞５分間スパージした血清ビンにおいて３０℃で増殖させた。ヒドロゲナーゼ関連実験のための培養は、ＭＯＰＳ最小培地の代わりにテリフィックブロス培地を使用したこと、およびゆるく栓をした遠心管または栓をしてスパージした血清ビンを増殖容器として使用したこと、および主培養物の接種を約２％（ｖ／ｖ）で実施したこと、および発現を誘導するために０．５ｍＭのＩＰＴＧを使用したことを除き、上記のように実施した。ＧＡＰＯＲ関連実験のための培養は、すべてＬＢまたはＭ９培地のいずれかを使用して３７℃で実施した。Ｍ９培地は、（脱イオン限外ろ過水１リットル当たり）ＮＨ４Ｃｌを０．８ｇ、ＮａＣｌを０．５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏを７．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を３．０ｇ含んだ。以下の成分を別々に滅菌し、その後添加した（培地１リットル当たり）：１ＭのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏを２ｍｌ、０．１ＭのＣａＣｌ２を１ｍｌ、１ｍＭフィルター滅菌チアミン−ＨＣｌを０．３ｍｌ、（１リットル当たり）ＦｅＣｌ３×６Ｈ２Ｏを１ｇ、ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏを０．１８ｇ、ＣｕＣｌ２×２Ｈ２Ｏを０．１２ｇ、ＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏを０．１２ｇ、およびＣＯＣｌ２×６Ｈ２Ｏを０．１８ｇ含む微量元素溶液１０ｍｌ。滅菌したグルコースを最終濃度２ｇ／ｌまで添加した。以下のいずれかをさらに添加した（培地１リットル当たり）：１０ｍＭのＮａ２ＷＯ４×２Ｈ２Ｏを１０ｍｌ、１０ｍＭのＮａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏを１０ｍｌ、１０ｍＭのＮａ２ＷＯ４×２Ｈ２Ｏを５ｍｌおよび１０ｍＭのＮａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏを５ｍｌ、または脱イオン限外ろ過水１０ｍｌ。
【００３６】
＜タンパク質の作製＞
０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｗａｋｏ）をｐＥＴマニュアル（Ｎｏｖａｇｅｎ）における指示に従って使用して、もしくはＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはＥａｓｙｌｙｓｅキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を製造者の指示に従って使用して、粗抽出物を細胞ペレットから調製した。酸素感受性タンパク質は、注記されている場合を除き、もっぱら無酸素条件下で取り扱った。組み換えタンパク質のＨｉｓタグアフィニティー精製を、Ｈｉｓ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＭｏｄｕｌｅまたはＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造者の指示に従って使用して実施した。
【００３７】
＜酵素アッセイ＞
すべてのオキシドレダクターゼアッセイは、オープントップねじぶた（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）およびブチルゴム栓（ＶＯＩＧＴ  ＧＬＯＢＡＬ  ＤＩＳＴＲＩＢＵＴＩＯＮ  ＬＬＣ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）を取り付けた石英キュベットを用いて嫌気的条件下で実施した。すべての反応緩衝液および他の添加物は、使用前にＮ２でスパージした。メチルビオロゲン（ＭＶ）のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性還元を、６００ｎｍ（吸光度）でのＭＶの還元を追跡することによって測定した。粗タンパク質１〜１０μｇまたは精製タンパク質０．５〜１．０μｇをＮ２スパージした反応混合物（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭフラビンアデニンジヌクレオチド、０．５〜１．０ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、１ｍＭのＭＶ）に添加して反応を開始させた。Ｈ２の亜ジチオン酸およびヒドロゲナーゼ依存性合成を、５０ｍＭリン酸カルシウム（ｐＨ７．５）を含む血清ビンを用いて測定した。緩衝液を窒素でスパージし、きつく密閉した。Ｈｉｓタグ精製ヒドロゲナーゼ（０．１〜２．８ｍｇ）およびＣ．Ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍフェレドキシン５μＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｊａｐａｎ）をスパージした緩衝液に添加し、溶液を３７℃で前平衡させた。亜ジチオン酸ナトリウム（２５ｍＭ）の添加による反応の開始後、容器のヘッドスペースを、選択した時点で水素に関して試料採取した。ＧＡＰＯＲ活性を、室温にてＡ６００（eＢＶ＝７，４００Ｍ−１ｃｍ−１）でベンジルビオロゲン（ＢＶ）の還元を追跡することにより（２）、Ｍｕｋｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ（２６）によって先に報告されたように常套的に測定した。反応混合物は、３０μＭのＧＡＰ、３ｍＭのＢＶ、５６μＭのＮａ２ＭｏＯ４、５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液、ｐＨ８．４を含んだ。フェレドキシンのＧＡＰ−依存性反応を、Ｓｏｂｏｈ  ｅｔ  ａｌ（４１）から修正されたように、室温にてＡ３２０（eＭＮＺ＝９．３ｍＭ−１ｃｍ−１）でメトロニダゾール（ＭＮＺ）の還元を追跡することによって観測した。反応混合物は、３０μＭのＧＡＰ、２ｍＭのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍフェレドキシン、０．１ｍＭのＭＮＺ、５６μＭのＮａ２ＭｏＯ４、５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液ｐＨ８．４を含んだ。商業的ソースからは入手できないＭ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓフェレドキシンの代わりにＣ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍフェレドキシンを使用した。６３ｍＭシステイン−ＨＣｌの添加によってアッセイを開始し、前記システイン−ＨＣｌは、完全な無酸素条件を確保するためにシリンジを用いて添加する。何らかの鍵となる成分を各々それぞれのアッセイから除いたとき活性が全く認められないかまたは最低限の活性しか認められないことを試験することにより、アッセイの依存性をすべてのアッセイに関して確認した。
【００３８】
＜分析＞
ガス試料を、Ｃａｒｂｏｘｅｎ（商標）１０１０  ＰＬＯＴ毛管カラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ）（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＵＳＡ）を取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０Ｎガスクロマトグラフを用いて分析した。ガス５ｍＬをシリンジで取り出し、大気圧（＜１０ｓ）に平衡させ、その後制御可能な弁室注入口に接続したガスループ（２５０μＬ）に注入した。ガスループ（環境気圧および温度）内に含まれる試料をスプリット付きまたはスプリットなしの注入口（環境温度、１０：１スプリット比）を通してカラムに注入した。あるいは、ガス１００〜２００μＬを、サンプルロックシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いて採集し、ゴム隔壁を通してスプリット付きまたはスプリットなしの注入口に直接注入した。各々の試料を熱プログラム（Ｈ２およびＣＯ２同時分析については（３５℃  ６．０分、傾斜２４ｏＣ／分で２００℃まで）、Ｈ２だけを分析する場合は（３５℃  ５．３分））に供した。キャリアーガスはＮ２（１７．６ｍＬ／分）であり、試料を検出するために熱伝導度検出器（２３０℃、２．０ｍＬ／分）を使用した。Ｈ２（約３．３分）、Ｏ２（４．５分）およびＣＯ２（１２．７分）を、様々な容積で適用した５％（ｖ／ｖ）および１００％（ｖ／ｖ）標準ガス試料に関して作成した検量線との比較によって定量した。
【００３９】
Ｒｏｃｈｅ−ＢｉｏｐｈａｒｍからのＤ−グルコースキットを製造者に指示に従って使用してグルコース分析を実施した。
【００４０】
補因子分析のために、精製タンパク質を、５ｍｌのＨＮＯ３および１ｍｌのＨＣｌＯ４による湿潤試料消化後、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ、ＳＰＱ−９０００、ＳＩＩ  ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた金属含量分析に供した（１３）。対照は、Ｓｐｉｎａｃｈ（Ｓｉｇｍａ）からの［２Ｆｅ−２Ｓ］−フェレドキシンおよびウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて実施した。
【００４１】
タンパク質含量を、蛍光検出（λ励起＝３６３ｎｍ、λ発光＝４４２ｎｍ）に関する先に述べられている方法（２４、３２）により、ＧＡＰＯＲを０．５ｍｇ用いて測定した。プテリン含量を、プテリン−６−カルボン酸との比較によって算定した。バター乳からのキサンチンオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を陽性対照として使用した。
【００４２】
酸不安定スルフィドを、ほかのところで述べた方法（６、３０）によって測定した。陽性対照はＮａ２Ｓ×９Ｈ２Ｏであり、Ｓ２−  １ｎｍｏｌはＡ６７０＝０．００１４を生じた。
【実施例１】
【００４３】
＜合成オペロンを用いた組換えヒドロゲナーゼおよびフェレドキシンの発現はＨ２蓄積を生じさせる＞
すべてＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからの、３つの成熟因子ＨｙｄＦ、ＨｙｄＥおよびＨｙｄＧ、およびＦｅＦｅ型ヒドロゲナーゼＨｙｄＡの同時発現を可能にする合成オペロンを含むプラスミドｐＤＯＰＦＥＧＡ、および同じくＣ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍからの［４Ｆｅ４Ｓ］−フェレドキシンをコードする２番目のプラスミド（ｐＤＯＰＦＥＧＡＦｄｘ、図２ａのプラスミド地図を参照）を作製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２ｂ）、ヒドロゲナーゼアッセイ（図２ｃ）および閉鎖条件下でのインビボＨ２合成（図２ｄ）によって機能することを確認した。閉鎖嫌気的条件下でのＢＬ２１（ＤＥ３）の増殖は、全くまたは極めて少量のＨ２蓄積しか生じさせない（図２ｄ）。同じ条件下での活性組換えヒドロゲナーゼ（すなわちｐＤＯＰＦＥＧＡ）の発現は、明らかに測定可能なＨ２蓄積を生じさせ、Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍフェレドキシン（すなわちｐＤＯＰＦＥＧＡＦｄｘ）の付加的な共発現は、少なくとも２の因数でＨ２蓄積を増強する（図２ｄ）。したがって、ＢＬ２１（ＤＥ３）は、未知の機構によって組換えフェレドキシンを還元することができる。２つの最も可能性の高い候補物質；ｆｐｒ（ＮＡＤＰＨ：フラボドキシン／フェレドキシン−オキシドレダクターゼ）およびｙｄｂＫ（推定上のピルビン酸：フラボドキシン／フェレドキシン−オキシドレダクターゼ）（Ｂｌａｓｃｈｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，１９８２）についての欠失突然変異体を作製した。ｆｐｒの除去はＮＦＯＲ非依存性Ｈ２蓄積には影響を及ぼさなかったが、ｐＤＯＰＦＥＧＡを担持するΔｙｄｂＫ菌株は空のプラスミドだけを有する菌株と同様のレベルのＨ２を生じたので、ｙｄｂＫの欠失はすべてのフェレドキシン非依存性であるがヒドロゲナーゼ依存性のＨ２蓄積を排除した。したがって、ｙｄｂＫ遺伝子は、未知の機構によってＨｙｄＡの還元に寄与したと考えられるが、ＣｐＦｄの還元に依存するＨ２合成には関与しなかった。
【実施例２】
【００４４】
＜組換えフェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびフェレドキシンとＮＡＤＰＨ依存性ＮＦＯＲの共発現はＨ２蓄積を生じさせる＞
２つの組換えＮＦＯＲ（ＮＡＤＰＨ依存性ＢｓＮＦＯＲ、およびＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ依存性ＣｔＮＦＯＲ）の発現（図３ａ）および活性（図３ｂ）を確認した。閉鎖嫌気的バッチ条件下での、実施例１および２におけるすべての独立した成分、すなわちヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子、フェレドキシンおよびＮＦＯＲの共発現は、経時的に変化する閉鎖バッチ培養のヘッドスペースにおけるＨ２の蓄積を生じさせた（図３ｃ、ｄ）。最大収率、Ｈ２分圧およびＨ２蓄積の割合は、典型的にはヘッドスペースと液体培養容積比に依存して４８時間で５００〜１２００Ｐａの最大値に達するＨ２分圧と共に、活性ＨｙｄＡ、ＣｐＦｄおよびＢｓＮＦＯＲの併存に依存した。これに対し、ＣｐＦｄおよびＣａＨｙｄＡとＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ依存性ＣｔＮＦＯＲの共発現は、ＣｔＮＦＯＲを欠く細胞系と比較してＨ２収量の減少を生じさせた（図３ｃ）。Ｈ２の総収量は発酵容器の容積に強く依存し（図３ｄ）、多くとも１０〜５０ｍｍｏｌ  Ｈ２／ｍｏｌグルコースの間で変動した。ＣｐＦｄまたはＨｙｄＡのいずれかの除去は、２４時間にわたって５倍（またはそれ以上）低いＨ２蓄積を生じさせた。
【００４５】
ＣｔＮＦＯＲ発現細胞におけるＨ２蓄積の完全な欠如の理由を同定するため、２４〜４８時間の発現後にインビトロでのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性Ｈ２合成を実施した。何らかの生成物形成を観察するために補因子再生系の添加が必要であった。インビボでの結果と異なり、ＣｔＮＦＯＲを異種発現する細胞系からの抽出物は、ＢｓＮＦＯＲ（７０＋／−１４ｎｍｏｌｅＨ２／分／ｍｇタンパク質）を有する細胞系から調製した抽出物よりもＣｐＦｄを還元するより大きな能力（１１０＋／−６４ｎｍｏｌｅ  Ｈ２／分／ｍｇタンパク質）を示した。インビトロ反応への２５０μＭ  ＭＶの添加は、一般に１０〜２０の因数でＨ２合成の割合を増強した。組換えＮＦＯＲおよび組換えＣｐＦｄのいずれも発現しない細胞系の溶解産物を用いた反応では、Ｈ２形成は検出されなかった。２４時間の増殖後にＮ２でスパージした培養物へのＨ２の添加によってさらなる分析を実施した。ＢｓＮＦＯＲ発現細胞はＨ２を蓄積し続けたが、ＣｔＮＦＯＲ発現細胞に関しては蓄積が認められなかった（図３ｅ）。ＢｓＮＦＯＲおよびＣｔＮＦＯＲの両方が機能性ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：Ｈ２経路を触媒したと明確に結論される。ＣｔＮＦＯＲとＢｓＮＦＯＲの間で異なる唯一の（公知の）性質は異なる基質特異性であるので、既存のＮＡＤＰＨ特異性へのＮＡＤＨ特異性の付加は、逆の流れ、すなわちＨ２消費とそれに続くＮＡＤ＋の還元を生じさせるとさらに結論される。これが、ＣｔＮＦＯＲ発現細胞培養物においてＨ２蓄積が認められない理由である。
【実施例３】
【００４６】
＜組換えフェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびフェレドキシンとＭ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  ＧＡＰＯＲ（ＭｍＧＡＰＯＲ）の共発現はＨ２蓄積を生じさせる＞
Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ内のＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＧＡＰＯＲ（ＰｆＧＡＰＯＲ）のホモログをコードする遺伝子をクローニングし、大腸菌ＢＬ２１において発現させた（図４ａ）。標準実験用複合培地（ＬＢ）で発現させた、ＭｍＧＡＰＯＲの粗タンパク質および精製タンパク質製剤は、ベンジルビオロゲンのＧＡＰ依存性還元、メトロニダゾールのＣ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ［４Ｆｅ４Ｓ］−フェレドキシンおよびＧＡＰ依存性還元を触媒した（図４ｂ）。ＰｆＧＡＰＯＲはプテリン補因子として希元素タングステン（Ｗ）を含むので、これがＭｍＧＡＰＯＲについても当てはまるかどうかは興味深い問題であった。したがって、ＭｍＧＡＰＯＲを、規定された金属含量を有する最小培地で発現させた。モリブデン（Ｍｏ）だけを添加しておいた培地で培養した細胞だけが活性組換えＧＡＰＯＲを合成することができた（表６）。予想されたＭｏおよびＦｅ含量の＜２０％だけが精製ＭｍＧＡＰＯＲの酸加水分解物を用いたＩＣＰ−ＭＳによって検出されたので、タンパク質製剤の大部分はおそらく不活性であった。ｐＣＤＯＰＦＥＧＡを使用してＢＬ２１（ＤＥ３）においてＭｍＧＡＰＯＲをＣ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ［４Ｆｅ４Ｓ］−フェレドキシン、および活性ヒドロゲナーゼを共発現させたとき、閉鎖発酵容器においてＨ２蓄積が認められた（図４ｃ）。大腸菌ＧＡＰＤＨとの競合は、この場合には、潜在的Ｈ２形成を低減する。さらに、ＭｍＧＡＰＯＲをＢＬ２１（ＤＥ３）ではなくＲｏｓｅｔｔａ２−ｇａｍｉ細胞において発現させたとき、６０倍以上大きい比活性が検出された（表６）。したがって、ＢＬ２１（ＤＥ３）以外の菌株へのシフトは、Ｈ２を合成する潜在能を実質的に増強すると予想される。
【実施例４】
【００４７】
＜組換えＮＡＤＰＨ依存性ＮＦＯＲ、フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびフェレドキシンと大腸菌ｚｗｆの共発現はＨ２蓄積の増強を生じさせる＞
解糖から離れてペントースリン酸経路（ＰＰＰ）へと向かう最初の段階を触媒するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、大腸菌ｚｗｆの過剰発現は、高いＮＡＤＰＨ依存性代謝産物形成を生じさせる（Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。代謝フラックスへのｚｗｆの作用は、おそらく解糖フラックスを代償としたＰＰＰフラックス増強と解釈できる。
【００４８】
組換えフェレドキシン、フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼ、およびフェレドキシンおよびＮＡＤＰ依存性オキシドレダクターゼを発現する実施例２（上記）で使用した菌株に、付加的なプラスミドｐＣＯＬＡｚｗｆ（表３）の導入によって組換えｚｗｆの発現を追加した。閉鎖発酵容器におけるＨ２蓄積の収率は、ｚｗｆの過剰発現によって１０〜５０ｍｍｏｌ  Ｈ２／ｍｏｌグルコースから１００−１９０ｍｍｏｌ  Ｈ２／ｍｏｌグルコースに増大した。（ａ）代謝フラックスへのｚｗｆ過剰発現の作用についての文献における知識と、（ｂ）ｚｗｆの過剰発現がＮＡＤＰＨ依存性Ｈ２合成を増強することを明らかにした本発明における実験を合わせて考慮すると、エムデン−マイヤーホフ−パルナス経路から離れた、ＰＰＰへのフラックス分布のさらなるシフトは、Ｈ２／グルコースのさらに高い収率を生じさせると推測できる。したがって、実施例４は、ＰＰＰを通して糖を酸化するという全く新しいアプローチを、潜在的にＧＡＰおよびＰＹＲノードから入手できるものに加えてさらなるＨ２を生成するために組み合わせ得るという原理の証明を示す（図１）。
【実施例５】
【００４９】
＜組換えヒドロゲナーゼが有酸素条件下で発現され、および（ａ）大腸菌ＩＳＣオペロンも同時にプラスミドから発現されるか、または（ｂ）ヒドロゲナーゼの発現が大腸菌ｉｓｃＲ−菌株において実施されるときのヒドロゲナーゼ活性増強＞
Ｎ末端Ｈｉｓタグおよび３つの成熟因子ＨｙｄＦ、ＨｙｄＥおよびＨｙｄＧを有する組換えＣ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ［４Ｆｅ４Ｓ］フェレドキシンまたはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍフェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼ（ＨｙｄＡ）をＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｉｓｃＲにおいて発現させた。６つの大腸菌タンパク質ＩｓｃＳ、ＩｓｃＵ、ＩｓｃＡ、ＨｓｃＡ、ＨｓｃＢおよびＦｄｘをコードするＩＳＣオペロンの遺伝子を担持するプラスミドも付加的な変数として導入した。ｉｓｃＲの欠失は大腸菌ＩＳＣオペロンの上記の６つのタンパク質成員の発現増強を生じさせることが以前に明らかにされている（Ｇｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。（ａ）Ｎ２スパージした閉鎖血清ビンにおける厳密な無酸素条件下で、または（ｂ）室内の空気に曝露した容器において、すなわち有酸素条件下で、発現を実施した。発現と溶解後、ＨｙｄＡとフェレドキシンをそれぞれアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、ホロフェレドキシンの量およびＨｙｄＡの総活性と比活性を測定した。以下の考察では、ＩＳＣオペロンｉｓｃＲの負の転写調節が欠失しているＩＳＣオペロンまたは菌株の過剰発現の使用を、「ＩＳＣオペロンの過剰発現」と称し、ＩＳＣオペロンに変化が加えられていない野生型菌株と比較する。その結果（表５）はいくつかのキーポイントを明らかに示す。（１）「ＩＳＣオペロンの過剰発現」は無酸素条件下ではホロフェレドキシンの収量に有意の作用を及ぼさなかった、（２）有酸素条件下ではホロフェレドキシン収量への「ＩＳＣオペロンの過剰発現」のプラスの作用が認められた、（３）ＨｙｄＡの総活性および比活性は、無酸素条件下と比較して有酸素条件下では野生型菌株において強い負の影響を受けた、（４）「ＩＳＣオペロンの過剰発現」は、有酸素条件下でＨｙｄＡの総活性および比活性増強を生じさせ、無酸素条件下で比活性低下を生じさせた、および最も著明には（５）「ＩＳＣオペロンの過剰発現」は、無酸素条件下での野生型菌株を上回る、有酸素条件下での総活性を生じさせた。合わせて考慮すると、フェレドキシン実験からの結果は、本発明において使用したシステムが、「ＩＳＣオペロンの過剰発現」の正の作用が無酸素条件下で認められなかったという事実を除いて、予想されたように機能することを明らかにする。しかし、無酸素条件はこれまでの試験において一度も報告されていなかった。したがって、これまでに報告されたＦｅＳクラスタータンパク質への「ＩＳＣオペロンの過剰発現」の正の作用はＯ２に強く関係すると結論できる。ＨｙｄＡ実験からの結果は、「ＩＳＣオペロンの過剰発現」が、Ｏ２の存在下でヒドロゲナーゼの総活性および比活性の両方を劇的に上昇させるために有効に利用され得ることを明らかにする。その作用は、高い比活性と高いヒドロゲナーゼ蓄積の組合せによって得られ、現在のところ可能性のある２つの理由を区別することはできない；（１）「ＩＳＣオペロンの過剰発現」はＦｅＳクラスタータンパク質の新規合成を増強するおよび／または（２）「ＩＳＣオペロンの過剰発現」は損傷したＦｅＳクラスタータンパク質の修復を増強する。それにもかかわらず、「ＩＳＣオペロンの過剰発現」の戦略は、それ自体でまたはＯ２の存在下でのヒドロゲナーゼ活性を増強することを目的とした付加的な戦略を補足するために使用し得る。
【実施例６】
【００５０】
＜組換えヒドロゲナーゼが有酸素条件下で発現され、および（ａ）大腸菌ＩＳＣオペロンも同時にプラスミドから発現されるか、または（ｂ）ヒドロゲナーゼの発現が大腸菌ｉｓｃＲ−菌株において実施されるときのＨ２蓄積の増強＞
実施例５に続いて、同じＩＳＣベースの遺伝子／菌株戦略を、それらが閉鎖条件下でＨ２蓄積に影響を及ぼすかどうかを調べるために試験した。この場合は、これがかなりのＨ２蓄積を生じさせることが実施例１および３で明らかにされたので、Ｈ２の蓄積を可能にするために組換えフェレドキシンとヒドロゲナーゼを共発現させた。ｐＣＤＯＰＦＥＧＡＦｄｘまたはｐＣＤＯＰＦＥＧＡＦｄｘ  ＆  ｐＩＳＣのいずれかを保有するＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｉｓｃＲ宿主菌株を、空気または１００％（ｖ／ｖ）Ｎ２をヘッドスペースガスとして含む閉鎖血清ビンにおいて増殖させ、増殖の１７時間後にヘッドスペース内のＨ２を定量した（図５）。この実験からの主たる結論は以下の通りである。（１）Ｏ２は、野生型菌株バックグラウンドにおいてＨ２蓄積に強い負の作用を及ぼす、（２）「ＩＳＣオペロンの過剰発現」はＨ２蓄積を３０倍以上増大させる、（３）ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｉｓｃＲ宿主を用いて有酸素条件下で蓄積したＨ２の総量は、無酸素条件下での野生型ＢＬ２１（ＤＥ３）についての量を上回る。図５は、培養容器当たりの総Ｈ２蓄積を示す。Ｈ２を最終光学密度に対して基準化した場合、Ｈ２生産の割合は、最終光学密度が無産条件下で約５倍低かったので、無産条件下でより大きい（データは示していない）。しかし、大腸菌の代謝および増殖はＯ２の存在または不在に依存して大きく異なるので、これはまた、有産条件を使用するための理由も明らかにする。本発明において提示した最後の２つの実施例から、本発明者らは、ＩＳＣに基づく遺伝子戦略によって総ヒドロゲナーゼ活性が十分に高いまま維持され得る限り、最終的な正味の最大Ｈ２生産を得るためには無酸素条件から少なくとも部分的に有酸素条件に切り換えることが有益であり得ると結論することができる。
【００５１】
本発明の実施形態を示す添付の図面を参照して、本発明をより詳細に説明する。
【００５２】
【表１】
2010500001.tif 000002
【００５３】
【表２】
2010500001.tif 000003
【００５４】
【表３】
2010500001.tif 000004
【００５５】
【表４Ａ】
2010500001.tif 000005
【表４Ｂ】
2010500001.tif 000006
【表４Ｃ】
2010500001.tif 000007
【表４Ｄ】
2010500001.tif 000008
【００５６】
【表５】
2010500001.tif 000009
【００５７】
【表６】
2010500001.tif 000010
【００５８】
等モル含量のＷ、Ｍｏ、ＷおよびＭｏのいずれかを添加したまたは金属を添加していないＭ９最少培地で増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）の溶解産物から精製したＭｍＧＡＰＯＲを使用して得られた分析データの要約。Ｒｏｓｅｔｔａ−２−ｇａｍｉ（ＤＥ３）細胞において発現されたＭｍＧＡＰＯＲの比活性を下に示す。
【００５９】
参考文献
【表７Ａ】
2010500001.tif 000011
【表７Ｂ】
2010500001.tif 000012
【表７Ｃ】
2010500001.tif 000013
【表７Ｄ】
2010500001.tif 000014
【表７Ｅ】
2010500001.tif 000015
【表７Ｆ】
2010500001.tif 000016
【表７Ｇ】
2010500001.tif 000017
【表７Ｈ】
2010500001.tif 000018
【表７Ｉ】
2010500001.tif 000019
【表７Ｊ】
2010500001.tif 000020
【表７Ｋ】
2010500001.tif 000021
【表７Ｌ】
2010500001.tif 000022
【表７Ｍ】
2010500001.tif 000023
【表７Ｎ】
2010500001.tif 000024
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】天然および導入Ｈ２生産経路を示す。化学量論を考慮せずに、一般的に微生物における発酵Ｈ２生産のための重要な経路の図式的表示。
【図２】合成ヒドロゲナーゼ合成オペロンの構築と分析を示す。（ａ）合成オペロンｐＣＤＯＰＦＥＧＨｉｓＡＦｄｘのプラスミドマップの図式的表示。（ｂ）Ｈｉｓタグ精製後の組換えヒドロゲナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。左のレーンは陰性対照を示し（すなわち細胞内にＨｙｄＡをコードする遺伝子が存在しない）、右のレーン（ＨｙｄＡをコードする遺伝子が細胞内に存在する）。（ｃ）（破線）ｐＣＤＯＰＦＥＧＡまたは（実線）ｐＣＤＯＰＦＥＧのいずれかを保有する細胞の粗溶解産物とｐＥＴ４６−ＨｙｄＡのインビトロでのヒドロゲナーゼ活性の比較。（ｄ）フェレドキシンおよびヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むまたは含まないベクターを保有する菌株を用いたインビボでのＨ２蓄積。増殖は、２３または３０℃でＴＢ培地において実施した。各々の菌株系統の詳細は、表４に列挙する。
【図３】インビボでのＨ２蓄積へのＮＦＯＲ補因子特異性の影響を示す。（ａ）組換えＣｔＮＦＯＲ（レーン１）、ＢｓＮＦＯＲ（レーン２）を発現する細胞の粗抽出物、または空プラスミドを有する陰性対照（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＣｔＮＦＯＲおよびＢｓＮＦＯＲの予想分子量は、付加的なＮ末端６−Ｈｉｓタグなしで、それぞれ３９．２および３６．８ｋＤａである。（ｂ）各々それぞれの粗タンパク質溶解産物約２μｇを使用したメチルビオロゲンのＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨ依存性還元のアッセイ。アッセイは、Ｎ２でスパージした密閉キュベットにおいて実施した。（ｃ）それぞれｐＢｓＮＦＯＲ（黒い四角、ＥＭＥ１０１）およびｐＣｔＮＦＯＲ（白い菱形、ＥＭＥ１０３）の存在または不在に応答したｐＣＤＯＰＦＥＧＡおよびｐＣｐＦｄを担持するＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｙｄｂＫ宿主菌株（灰色の丸、ＥＭＥ１０２）の閉鎖培養についての蓄積ヘッドスペースｐＨ２（Ｐａ）。（ｄ）ｐＢｓＮＦＯＲを担持する細胞（ＥＭＥ１０１）の閉鎖培養のヘッドスペース（１６ｍＬヘッドスペース、灰色の四角；１０２ｍＬヘッドスペース、黒い菱形）におけるＨ２の蓄積モル量。組換えＮＦＯＲを発現しない培養（ＥＭＥ１０２）を含む同じそれぞれの培養フラスコ（小または大）に蓄積したＨ２のモル量を差し引いた。各々の値は、３回の独立した反復の平均値を示す。（ｅ）種々の細胞系によるＨ２の消費（灰色の四角、ＥＭＥ１０１；白い三角、ＥＭＥ１０２；黒い丸、ＥＭＥ１０３）。Ｈ２の３つの異なるレベル（０、約１２５Ｐａ、約３００Ｐａ）を、ＩＰＴＧによる誘導の２４時間後に添加し、その後ヘッドスペースｐＨ２の変化を観測した。
【図４】Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  ＧＡＰＯＲが、インビトロでフェレドキシンの還元を触媒し、インビボでＨ２のフェレドキシンおよびヒドロゲナーゼ依存生合成を増強することを示す。（ａ）Ｈｉｓタグ精製した組換えＧＡＰＯＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｎ末端６−Ｈｉｓタグを有さないＭ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  ＧＡＰＯＲの予想分子量は７０．８ｋＤａである。（ｂ）ベンジルビオロゲンのＧＡＰ依存性還元およびメトロニダゾールのＧＡＰおよびＣ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ［４Ｆｅ４Ｓ］−フェレドキシン依存性還元のアッセイ。Ｌ−システインを添加して、Ｎ２でスパージした密閉キュベット内で実施される各々の反応を開始させる。（ｃ）菌株系統ＥＭＥ１６（ＧＡＰＯＲ＋ＣｐＦｄ）、ＥＭＥ１３（ＢｓＮＦＯＲ＋ＣｐＦｄ）、ＥＭＥ１５（ＣｐＦｄ）または野生型ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養のヘッドスペースにおけるＨ２の蓄積。
【図５】主培養の開始時にヘッドスペースにおいて空気またはＮ２のいずれかで１７時間増殖させたＴＢ培地培養での、野生型ＡＥＦＧＦｄｘ、野生型ＡＥＦＧＩｓｃＦｄｘ、ＩｓｃＲ−ＡＥＦＧＦｄｘおよびＩｓｃＲ−ＡＥＦＧＩｓｃＦｄｘ菌株系統の閉鎖培養のヘッドスペースにおけるＨ２蓄積を示す。
【図１】
2010500001.tif 000025
【図２Ａ】
2010500001.tif 000026
【図２Ｂ】
2010500001.tif 000027
【図３Ａ】
2010500001.tif 000028
【図３Ｂ】
2010500001.tif 000029
【図４ａ】
2010500001.tif 000030
【図４ｂ】
2010500001.tif 000031
【図４ｃ】
2010500001.tif 000032
【図５】
2010500001.tif 000033
【国際調査報告】
2010500001.tif 000034
2010500001.tif 000035
2010500001.tif 000036