(57)【要約】  患者組織サンプルにおける表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの発現レベルを評価することを含む、Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格がある癌患者を同定するための及びＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療に対する患者応答をモニターするための方法。本発明の方法により、Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受けるべき患者をより効果的に同定し、治療に対する患者応答を判定することができる。
2010511407.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）患者から組織サンプルを用意すること；（ｂ）前記組織サンプルにおける表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの発現レベルを測定すること；（ｃ）前記発現レベルを正常組織における対応のバイオマーカー組中の遺伝子のレベルと比較して分類すること；および（ｄ）患者のサンプルがバイオマーカー組中の遺伝子の変化したレベルを有していると分類された場合、患者を癌治療を受ける資格があるとして同定することを含む、癌治療を受ける資格について患者を同定する方法。
【請求項２】
組織サンプルが、末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞学的サンプル、微小針吸引サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラッシングサンプル、膀胱または肺洗浄サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、乳管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結した組織サンプル、パラフィン包埋した組織サンプル、或いは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞学的サンプル、微小針吸引サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラッシングサンプル、膀胱または肺洗浄サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、乳管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結した組織サンプルまたはパラフィン包埋した組織サンプルから作成した抽出物または加工サンプルからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
末梢血サンプルが、肺癌及び白血病／リンパ腫からなる群から選択される癌を有する患者由来である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組織サンプルが、パラフィン包埋した固定組織サンプル、微小針吸引サンプルまたは新鮮凍結した組織サンプルである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
測定ステップ（ｂ）がインサイツハイブリド形成により実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
インサイツハイブリド形成が蛍光標識されている核酸プローブを用いて実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
インサイツハイブリド形成が少なくとも２つの核酸プローブを用いて実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
インサイツハイブリド形成がペプチド核酸プローブを用いて実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
測定ステップ（ｂ）がポリメラーゼ連鎖反応により実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
測定ステップ（ｂ）が核酸マイクロアレイアッセイにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
患者がＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−ｘｌの１つに結合するように設計されたアンチセンス治療化合物を受ける資格があるとして分類される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
癌治療がＢｃｌ−２ファミリー阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
患者がＮ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミドを受ける資格があるとして分類される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
患者がＮ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミドを受ける資格があるとして分類される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
癌治療が化学療法と組み合わせてＢｃｌ−２ファミリー阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
患者がＮ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミドを受ける資格があるとして分類される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
患者がＮ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミドを受ける資格があるとして分類される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）患者から肺癌組織サンプルを用意すること；（ｂ）前記組織サンプルにおける発現レベルを検出することを含み、表１または２に列挙されているバイオマーカーの組合せの差別的発現は患者がＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があることを示す、Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格について患者を同定する方法。
【請求項１９】
測定ステップ（ｂ）がＰＣＲにより実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
測定ステップ（ｂ）が核酸マイクロアレイアッセイにより実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
患者がＮ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミドを受ける資格があるとして分類される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
患者がＮ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミドを受ける資格があるとして分類される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
患者がＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−ｘｌの１つに結合するように設計したアンチセンス治療化合物を受ける資格があるとして分類される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
癌治療が化学療法と組み合わせてＢｃｌ−２ファミリー阻害剤を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
患者がＮ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミドを受ける資格があるとして分類される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
患者がＮ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミドを受ける資格があるとして分類される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）患者から白血病／リンパ腫組織サンプルを用意すること；（ｂ）前記組織サンプルにおける表３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの発現レベルを測定すること；（ｃ）前記レベルを正常組織におけるバイオマーカー組中の遺伝子のレベルと比較して分類すること；（ｄ）患者のサンプルがバイオマーカー組中の遺伝子の変化したレベルを有すると分類された場合には、患者をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があるとして同定することを含む、Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格について患者を同定する方法。
【請求項２８】
測定ステップ（ｂ）がＰＣＲにより実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
測定ステップ（ｂ）が核酸マイクロアレイアッセイにより実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
患者がＮ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミドを受ける資格があるとして分類される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
患者がＮ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミドを受ける資格があるとして分類される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
患者がＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−ｘ１の１つに結合するように設計したアンチセンス治療化合物を受ける資格があるとして分類される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
癌治療が化学療法と組み合わせてＢｃｌ−２ファミリー阻害剤を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
患者がＮ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミドを受ける資格があるとして分類される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
患者がＮ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミドを受ける資格があるとして分類される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）患者から末梢血サンプルを用意すること；（ｂ）前記末梢血サンプルにおける表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの発現レベルを測定すること；（ｃ）前記発現レベルを表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの患者ベースライン血液レベルと比較して判定することを含む、Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤治療で治療を受けている患者をモニターする方法。
【請求項３７】
患者がＮ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミドを受ける資格があるとして分類される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
患者がＮ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミドを受ける資格があるとして分類される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
（ａ）肺癌組織における表１、２、３、４、５または６に列挙されている遺伝子の組の発現レベルを同定する情報を含むデータベース；及び（ｂ）前記情報を検分するためのユーザインターフェースを含むコンピュータシステム。
【請求項４０】
データベースが更に遺伝子の配列情報を含む、請求項３９に記載のコンピュータシステム。
【請求項４１】
データベースが更に正常組織における遺伝子の発現レベルを同定する情報を含む、請求項３９に記載のコンピュータシステム。
【請求項４２】
データベースが更に肺腫瘍由来の組織における遺伝子の発現レベルを同定する情報を含む、請求項３９に記載のコンピュータシステム。
【請求項４３】
更に、外部データベースからの記述的情報を含むレコードを含み、前記情報は遺伝子を外部データベース中のレコードと相関している、請求項３９から４２のいずれかに記載のコンピュータシステム。
【請求項４４】
外部データベースがジェンバンクである、請求項４３に記載のコンピュータシステム。
【請求項４５】
（ａ）組織または細胞における表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの発現レベルをデータベース中の遺伝子の発現レベルと比較することを含む、組織または細胞における表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの発現レベルを同定する情報を提供するための、請求項３９から４２のいずれか１項に記載のコンピュータシステムの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療を選択するために患者を分類する際に有用な診断アッセイに関し、特に癌治療、とりわけＢｃｌ−２−ファミリーアンタゴニスト治療に対する応答に相関している発現印章、特にバイオマーカーの組合せの測定に関する。更に、本発明の方法、特にバイオマーカーの組合せはＢｃｌ−２−ファミリーアンタゴニスト治療を受ける資格がある患者を同定するのに有用であり、前記治療に対する患者の応答をモニターすることができる。
【背景技術】
【０００２】
癌の遺伝子異質性は有効な癌治療薬の開発を複雑にしている要因である。従来の組織病理学的分類に従って１つの疾患単位と見なされている癌を分子プロファイリングにかけると、その癌はしばしば複数のゲノムサブタイプを示す。幾つかの場合には分子分類が従来の病理学よりも正確であることが判明した。標的癌治療薬の効果はゲノム特性、例えば遺伝子増幅（Ｃｏｂｌｅｉｇｈ，Ｍ．Ａ．ら，“Ｍｕｌｔｉｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｗｏｍｅｎ  ｗｈｏ  ｈａｖｅ  ＨＥＲ２−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈａｔ  ｈａｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７：２６３９−２６４８，１９９９）、または突然変異（Ｌｙｎｃｈ，Ｔ．Ｊ．ら，“Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ”，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５０：２１２９−２１３９，２００４）に相関し得る。乳癌におけるＨｅｒ−２に関して、遺伝子増幅の検出はタンパク質過剰発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）による検出と比較して優れた予後及び治療選択情報を与えることが立証された（Ｐａｕｌｅｔｔｉ，Ｇ．ら，“Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ：Ａ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１８：３６５１−３６６４，２０００）。特に、細胞株発現パターンデータは化学治療薬に対する患者の感受性を予測することが判明した（Ｐｏｔｔｉ  Ａ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００６，電子ジャーナル版，ＰＭＩＤ：１７０５７７１０）。従って、標的癌治療に対する患者の応答率を向上させ得るゲノム分類マーカーが要望されている。
【０００３】
目標を定めた癌治療研究がプログラム細胞死の中心的調節因子であるＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーに対して報告されている。アポトーシスを抑制するＢｃｌ−２ファミリーメンバーは癌において過剰発現しており、腫瘍形成の原因となっている。Ｂｃｌ−２発現は癌治療に対する耐性及び低い生存率に強く相関していた。
【０００４】
ＡＢＴ−７３７と称される化合物はＢｃｌ−２ファミリーメンバーのＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ及びＢｃｌ−ｗの小分子抑制剤であり、充実性腫瘍の退縮を誘発することが判明している（Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆ，Ｔ．，“Ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，４３５：６７７−６８１，２００５）。ＡＢＴ−７３７をヒト癌細胞株の各種パネルに対して試験したところ、ＳＣＬＣ及びリンパ腫細胞株に対して選択的な効力を呈した（同書）。ＡＢＴ−７３７の化学構造はＯｌｔｅｒｓｄｏｒｆら，ｐ．６７９に記載されている。
【０００５】
Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーに対する阻害剤が治療上使用される可能性があるために、Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格がある患者を同定するコンパニオン診断アッセイが必要とされている。加えて、この治療をＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療の効果をモニターするのを助けるバイオマーカーを用いた診断アッセイで裏付けることが明らかに必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｏｂｌｅｉｇｈ，Ｍ．Ａ．ら，“Ｍｕｌｔｉｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｗｏｍｅｎ  ｗｈｏ  ｈａｖｅ  ＨＥＲ２−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈａｔ  ｈａｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７：２６３９−２６４８，１９９９
【非特許文献２】Ｌｙｎｃｈ，Ｔ．Ｊ．ら，“Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ”，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５０：２１２９−２１３９，２００４
【非特許文献３】Ｐａｕｌｅｔｔｉ，Ｇ．ら，“Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ：Ａ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１８：３６５１−３６６４，２０００
【非特許文献４】Ｐｏｔｔｉ  Ａ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００６，電子ジャーナル版，ＰＭＩＤ：１７０５７７１０
【非特許文献５】Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆ，Ｔ．，“Ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，４３５：６７７−６８１，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、癌治療に臨床的に関連した遺伝子発現パターン（または、プロフィールまたは印章）の同定及び使用に関する。特に、癌治療、とりわけＢｃｌ−２ファミリーアンタゴニスト治療に対する患者の同定、治療及びモニターに相関している遺伝子の身元に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、患者組織サンプルにおける表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せのレベルを評価することを含む患者を癌治療に対して分類するためのコンパニオン診断アッセイを提供する。本発明のアッセイは、Ｂｃｌ−２ファミリーアンタゴニスト治療を受ける資格がある患者を同定するためのアッセイ及び前記治療に対する患者応答をモニターするためのアッセイ方法の両方を含む。本発明の方法は、血液、尿または他の体液サンプル中のバイオマーカーをイムノアッセイ、プロテオミックアッセイ、或いは核酸ハイブリド形成または増幅アッセイにより、組織または他の細胞体サンプル中のバイオマーカーを免疫組織化学またはインサイツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリド形成アッセイにより評価することを含む。
【０００９】
本発明の遺伝子発現パターンは以下のように同定される。通常、バイオマーカーの組合せ中で同定される多くの遺伝子に相当するｍＲＮＡの発現レベルを定量することにより、サンプルの遺伝子発現プロフィールを大規模にサンプリングする。次いで、プロフィール、すなわち組合せ組を分析して、その発現が癌治療、とりわけＢｃｌ−２ファミリーアンタゴニスト治療を受ける資格がある患者の同定及びモニタリングと正に相関している遺伝子を同定する。
【００１０】
好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）患者から末梢血サンプルを用意すること；
（ｂ）前記末梢血サンプルにおける表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの発現レベルを測定すること；（ｃ）前記発現レベルを表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの正常末梢血レベルと比較して分類すること；および（ｄ）患者の血液サンプルが表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの高い発現レベルを有していると分類された場合には、患者を癌治療を、とりわけＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があるとして同定すること；を含む、患者を癌治療を、好ましくはＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があるとして同定するための方法を含む。この実施形態において、末梢血サンプル中のレベルを好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにより測定し、または例えば肺癌腫瘍生検サンプルに対して実施する。
【００１１】
好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）患者から組織または細胞サンプルを用意すること；（ｂ）前記組織または細胞サンプルを表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せに結合し得る標識抗体またはタンパク質と接触させること；（ｃ）発現レベルを表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの正常組織または細胞レベルと比較して分類すること；および（ｄ）患者サンプルが表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せのメンバーの差別的レベルを有していると分類された場合には、患者を癌治療を、最も好ましくはＢｃｌ−２ファミリー治療を受ける資格があるとして同定すること；を含む、患者を癌治療を、最も好ましくはＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格があるとして同定するための方法を含む。
【００１２】
本発明は、癌治療、とりわけＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療に対する患者の階層化を改善し得るという高い可能性を有している。本発明でバイオマーカーを評価すると、治療に対する個々の患者の応答を追跡することもできる。本発明のアッセイは小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び白血病／リンパ腫患者を分類するために特に使用される。
【００１３】
本発明は、（ａ）患者から末梢血サンプルを用意すること；（ｂ）前記末梢血サンプルにおける表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの発現レベルを測定すること；および（ｃ）前記発現レベルを表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの患者ベースライン血液レベルと比較して判定することを含む、癌治療を受けている、好ましくはＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受けている患者をモニターするための好ましい方法をも含む。
【００１４】
本発明は、表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せ由来のＲＮＡのレベルに対するアッセイのための試薬キット及び表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せ由来の少なくとも１つのＲＮＡのレベルのための試薬キットをも含む。本発明は、癌治療について、とりわけＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療について患者の階層化を改善するという高い可能性を有している。本発明に従ってバイオマーカーを評価すると、治療に対する個々の患者の応答を追跡することもできる。本発明のアッセイはＳＣＬＣ及びリンパ腫患者を分類するために特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】小細胞肺癌細胞（図１−Ａ）及び白血病／リンパ腫細胞（図１−Ｂ）についてＡＢＴ−７３７に対して感受性及び耐性の細胞株を区別するバイオマーカー組合せ群の発現プロフィールを示す。
【図２】小細胞肺癌細胞（図２−Ａ）及び白血病／リンパ腫細胞（図２−Ｂ）についてＡＢＴ−２６３に対して感受性及び耐性の細胞株を区別するバイオマーカー組合せ群の発現プロフィールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
Ｉ．概要
本発明は、小細胞肺癌細胞（ｓｃｌｃ）株及び白血病／リンパ腫細胞株中の遺伝子及び遺伝子印章群が治療耐性及び感受性に相関しているという本出願人の知見に基づいている。特に、本出願人は、Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤に対する感受性及び耐性に相関している新規なバイオマーカーの組合せの差別的な発現レベルに相関させた。
【００１７】
本明細書中で使用されている「Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤」は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ及びＢｃｌ−ｗの少なくとも１つに結合し、Ｂｃｌ−２ファミリー関連核酸またはタンパク質の活性を拮抗させる任意のタイプの治療用化合物を指し、これには小分子、抗体、アンチセンス、小さい干渉ＲＮＡまたはミクロＲＮＡをベースとする化合物が含まれる。本発明の方法は公知のまたは今後開発されるＢｃｌ−２ファミリー阻害剤に対して有用である。１つのＢｃｌ−２ファミリー阻害剤は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ及びＢｃｌ−ｗの各々に結合するＡＢＴ−７３７、すなわちＮ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミドである。別のＢｃｌ−２ファミリー阻害剤はＡＢＴ−２６３、すなわちＮ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミドである。ＡＢＴ−２６３の化学構造は
【００１８】
【化１】
2010511407.tif 000003
である。
【００１９】
本発明において有用なＢｃｌ−２ファミリー関連化合物の他の例は、いずれも２００５年６月２日に公開された国際特許出願公開ＷＯ  ０５／０４９５９３及びＷＯ  ０５／０４９５９４に見つけることができる。
【００２０】
本発明のアッセイは標的癌治療に対して潜在的に有用である。特に、本発明のアッセイは小細胞肺癌及び白血病／リンパ腫患者に対する治療選択、例えばＢｃｌ−２ファミリー阻害剤を用いる治療に対して有用である。前記癌の他の例には、充実性組織上皮癌（例えば、前立腺癌、卵巣癌及び食道癌）が含まれる。本発明のアッセイは任意のタイプの患者組織サンプルまたはその派生物に対して実施され、前記サンプルには末梢血、（新鮮凍結した及び固定またはパラフィン包埋した組織を含めた）腫瘍または疑わしい腫瘍組織、細胞分離株（例えば、血液サンプル中で分離または同定された循環上皮細胞）、リンパ節組織、骨髄及び微小針吸引物が含まれる。
【００２１】
本明細書中で使用されている「Ｂｃｌ−２（公式遺伝子名ＢＣＬ２）」はヒトＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２遺伝子を意味し、Ｂｃｌ−ｘｌ（公式遺伝子名ＢＣＬ２Ｌ１）はヒトＢＣＬ２−ｌ様１遺伝子を意味し、Ｂｃｌ−ｗ（公式遺伝子名ＢＣＬ２Ｌ２）はヒトＢＣＬ２様２遺伝子を意味する。
【００２２】
本明細書中で使用されている場合、ＡＮＸＡ２（公式遺伝子名ＡＮＸＡ２）アネキシンＡ２；ＣＤＣ４２ＥＰ１（公式遺伝子名ＣＤＣ４２ＥＰ１）；ＣＤＣ４２（公式遺伝子名ＣＤＣ４２）エフェクタータンパク質（Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ結合１）；ＣＮＮ２（公式遺伝子名ＣＮＮ２）カルポニン２；ＥＰＨＢ４（公式遺伝子名ＥＰＨＢ４）ＥＰＨ受容体Ｂ４；Ｆ２Ｒ（公式遺伝子名Ｆ２Ｒ）凝固因子ＩＩ（トロンビン）受容体；ＦＺＤ２（公式遺伝子名ＦＺＤ２）フリズルドホモログ２（ショウジョウバエ）；ＧＮＰＤＡ１（公式遺伝子名ＧＮＰＤＡ１）グルコサミン−６−ホスフェート脱アミナーゼ１；ＨＯＭＥＲ３（公式遺伝子名ＨＯＭＥＲ３）ホーマーホモログ３（ショウジョウバエ）；ＭＦＧＥ８（公式遺伝子名ＭＦＧＥ８）乳脂肪球−ＥＧＦ因子８タンパク質；ＭＧＭＴ（公式遺伝子名ＭＧＭＴ）Ｏ−６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ；ＭＭＥ（公式遺伝子名ＭＭＥ）膜メタロ−エンドペプチダーゼ（中性エンドペプチダーゼ，エンケファリナーゼ，ＣＡＬＬＡ，ＣＤ１０）；ＮＯＴＣＨ２（公式遺伝子名ＮＯＴＣＨ２）ノッチホモログ２（ショウジョウバエ）；ＰＴＰＮ１４（公式遺伝子名ＰＴＰＮ１４）タンパク質チロシンホスファターゼ，非受容体タイプ１４；ＱＫＩ（公式遺伝子名ＱＫＩ）クエーキングホモログ，ＫＨドメインＲＮＡ結合（マウス）；ＲＢＭＳ２（公式遺伝子名ＲＢＭＳ２）ＲＮＡ結合モチーフ，一本鎖相互作用タンパク質２；ＴＣＦ７Ｌ１（公式遺伝子名ＴＣＦ７Ｌ１）転写因子７様１（Ｔ細胞特異的，ＨＭＧボックス）；ＴＣＦ７Ｌ２（公式遺伝子名ＴＣＦ７Ｌ２）転写因子７様２（Ｔ細胞特異的，ＨＭＧボックス）；ＶＣＬ（公式遺伝子名ＶＣＬ）ビンキュリン；ＶＩＭ（公式遺伝子名ＶＩＭ）ビメンチン；ＷＷＴＲ１（公式遺伝子名ＷＷＴＲ１）ＷＷドメイン含有転写調節因子１；ＺＦＰ３６Ｌ１（公式遺伝子名ＺＦＰ３６Ｌ１）ジンクフィンガータンパク質３６，Ｃ３Ｈタイプ様１；ＰＧＤ（公式遺伝子名ＰＧＤ）ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ；ＵＢＥ２Ｓ（公式遺伝子名ＵＢＥ２Ｓ）ユビチキン−コンジュゲート酵素Ｅ２Ｓ；ＣＲＹＺ（公式遺伝子名ＣＲＹＺ）結晶質，ゼータ（キノンレダクターゼ）；ＨＭＢＳ（公式遺伝子名ＨＭＢＳ）ヒドロキシメチルビランシンターゼ；ＤＮＡＪＢ４（公式遺伝子名ＤＮＡＪＢ４）ＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０）ホモログ，サブファミリーＢ，メンバー４；ＲＡＰ１ＧＡ１（公式遺伝子名ＲＡＰ１ＧＡ１）ＲＡＰ１，ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質１；ＧＣＬＭ（公式遺伝子名ＧＣＬＭ）グルタメート−システインリガーゼ，修飾因子サブユニット；ＡＲＧ２（公式遺伝子名ＡＲＧ２）アルギナーゼ，タイプＩＩ；ＡＴＰ７Ｂ（公式遺伝子名ＡＴＰ７Ｂ）ＡＴＰアーゼ，Ｃｕ＋＋輸送，ベータポリペプチド（ウィルソン病）；ＧＣＡＴ（公式遺伝子名ＧＣＡＴ）グリシンＣ−アセチルトランスフェラーゼ（２−アミノ−３−ケトブチレート補酵素Ａリガーゼ）；ＫＣＮＨ２（公式遺伝子名ＫＣＮＨ２）カリウム電位依存性チャネル，サブファミリーＨ（ｅａｇ関連），メンバー２；ＴＥＳＫ２（公式遺伝子名ＴＥＳＫ２）精巣特異的キナーゼ２；ＴＡＬ１（公式遺伝子名ＴＡＬ１）Ｔ細胞急性リンパ球性白血病１；Ｔ���ＦＲＳＦ８（公式遺伝子名ＴＮＦＲＳＦ８）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー，メンバー８；ＡＴＰ２Ａ３（公式遺伝子名ＡＴＰ２Ａ３）ＡＴＰアーゼ，Ｃａ＋＋輸送，偏在；ＴＢＰＬ１（公式遺伝子名ＴＢＰＬ１）ＴＢＰ様１；ＥＰＨＸ２（公式遺伝子名ＥＰＨＸ２）エポキシドヒドロラーゼ２，細胞質；ＫＣＮＨ２（公式遺伝子名ＫＣＮＨ２）カリウム電位依存性チャネル，サブファミリーＨ（ｅａｇ関連），メンバー２；ＭＯＣＳ１（公式遺伝子名ＭＯＣＳ１）モリブデン補因子合成１；ＫＩＡＡ０２４１（公式遺伝子名ＫＩＡＡ０２４１）ＫＩＡＡ０２４１タンパク質；ＭＧＣ１４３７６（公式遺伝子名ＭＧＣ１４３７６）仮説的タンパク質ＭＧＣ１４３７６；ＹＯＤ１（公式遺伝子名ＹＯＤ１）ＹＯＤ１  ＯＴＵ脱ユビキチン化酵素１ホモログ（酵母）；ＡＧＰＡＴ１（公式遺伝子名ＡＧＰＡＴ１）１−アシルグリセロール−３−ホスフェートＯ−アシルトランスフェラーゼ１（リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ，アルファ）；ＲＨＣＥ（公式遺伝子名ＲＨＣＥ）Ｒｈ式血液型，ＣｃＥｅ抗原；ＣＤＣ４２ＳＥ１（公式遺伝子名ＣＤＣ４２ＳＥ１）ＣＤＣ４２スモールエフェクター１；ＴＲＩＴ１（公式遺伝子名ＴＲＩＴ１）ｔＲＮＡイソペンテニルトランスフェラーゼ１；ＹＲＤＣ（公式遺伝子名ＹＲＤＣ）虚血／再灌流誘導タンパク質；ＡＢＨＤ５（公式遺伝子名ＡＢＨＤ５）アブヒドロラーゼドメイン含有５；ＤＤＥＦＬ１（公式遺伝子名ＤＤＥＦＬ１）発生及び分化強化因子様１；ＣＰＥＢ１（公式遺伝子名ＣＰＥＢ１）細胞質ポリアデニル化エレメント結合タンパク質１；ＣＣＤＣ２１（公式遺伝子名ＣＣＤＣ２１）コイルドコイルドメイン含有２１；ＭＴＬ５（公式遺伝子名ＭＴＬ５）メタロチオネイン様５，精巣特異的（テスミン）；Ｃ６ｏｒｆ６０（公式遺伝子名Ｃ６ｏｒｆ６０）染色体６オープンリーディングフレーム６０；ＦＬＪ２２６３９（公式遺伝子名ＦＬＪ２２６３９）仮説的タンパク質ＦＬＪ２２６３９；ＨＢＱ１（公式遺伝子名ＨＢＱ１）ヘモグロビン，シータ１；ＭＲＰＳ１８Ａ（公式遺伝子名ＭＲＰＳ１８Ａ）ミトコンドリアリボソームタンパクＳ１８Ａ；ＡＧＰＡＴ１（公式遺伝子名ＡＧＰＡＴ１）１−アシルグリセロール−３−ホスフェートＯ−アシルトランスフェラーゼ１（リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ，アルファ）；ＰＩＡＳ１（公式遺伝子名ＰＩＡＳ１）活性化ＳＴＡＴのタンパク質阻害剤，１；ＰＵＭ２（公式遺伝子名ＰＵＭ２）プミリオホモログ２（ショウジョウバエ）；ＳＬＣ２Ａ３（公式遺伝子名ＳＬＣ２Ａ３）溶質担体ファミリー２（促進性グルコース輸送体），メンバー３；転写因子７様２（Ｔ細胞特異的，ＨＭＧ−ボックス）；ＴＭＢＩＭ１（公式遺伝子名ＴＭＢＩＭ１）貫膜ＢＡＸ阻害剤モチーフ含有１；ＭＯＳＣ１（公式遺伝子名ＭＯＳＣ１）ＭＯＣＯスルフラーゼＣ末端ドメイン含有１；ＣＸＸ１（公式遺伝子名ＣＸＸ１）ＣＡＡＸボックス１；ＳＹＮＧＲ３（公式遺伝子名ＳＹＮＧＲ３）シナプトギリン３；ＣＣＮＧ１（公式遺伝子名ＣＣＮＧ１）サイクリンＧ１；ＭＧＣ１４３７６（公式遺伝子名ＭＧＣ１４３７６）仮説的タンパク質ＭＧＣ１４３７６；ＰＲＳＳ２１（公式遺伝子名ＰＲＳＳ２１）プロ��アーゼ，セリン，２１（テスティシン）；ＣＡＳＰ９（公式遺伝子名ＣＡＳＰ９）カスパーゼ９，アポトーシス関連システインペプチダーゼ；ＡＬＡＳ２（公式遺伝子名ＡＬＡＳ２）アミノレブリネート，デルタ−，シンターゼ２（鉄芽球性／低色素性貧血）；ＳＴ３ＧＡＬ２（公式遺伝子名ＳＴ３ＧＡＬ２）ＳＴ３ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ２；ＢＣＬ２Ｌ１３（公式遺伝子名ＢＣＬ２Ｌ１３）ＢＣＬ２様１３（アポトーシス促進因子）；ＰＰＩＣ（公式遺伝子名ＰＰＩＣ）ペプチジルプロリルイソメラーゼＣ（シクロフィリンＣ）；ＣＬＩＣ４（公式遺伝子名）クロリド細胞内チャネル４；ＴＢＰＬ１（公式遺伝子名ＴＢＰＬ１）ＴＢＰ様１；ＨＢＢ（公式遺伝子名ＨＢＢ）ヘモグロビン，ベータ／／／ヘモグロビン，ベータ；及びＨＴＡＴＩＰ２（公式遺伝子名ＨＴＡＴＩＰ２）ＨＩＶ−１  Ｔａｔ相互作用性タンパク質２，３０ｋＤａ。
【００２３】
本明細書中で使用されている「本質的に構成される」は、癌治療、とりわけＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療のために患者の階層化を向上させるためにバイオマーカーを使用することが必要な遺伝子の最大数を指す。１つの実施形態では、癌治療、とりわけＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療のために患者の階層化を向上させるためのバイオマーカーは本質的に本発明のバイオマーカーの少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個またはすべてから構成されている。別の実施形態では、癌治療、とりわけＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療のために患者の階層化を向上させるためのバイオマーカーは本質的に表１のバイオマーカーのいずれか１個から構成されている。別の実施形態では、癌治療、とりわけＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療のために患者の階層化を向上させるためのバイオマーカーは本質的に表２のバイオマーカーのいずれか１個から構成されている。別の実施形態では、癌治療、とりわけＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療のために患者の階層化を向上させるためのバイオマーカーは本質的に表３のバイオマーカーのいずれか１個から構成されている。別の実施形態では、癌治療、とりわけＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療のために患者の階層化を向上させるためのバイオマーカーは本質的に表４のバイオマーカーのいずれか１個から構成されている。別の実施形態では、癌治療、とりわけＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療のために患者の階層化を向上させるためのバイオマーカーは本質的に表５のバイオマーカーのいずれか１個から構成されている。別の実施形態では、癌治療、とりわけＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療のために患者の階層化を向上させるためのバイオマーカーは本質的に表６のバイオマーカーのいずれか１個から構成されている。
【００２４】
表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せは単独でまたは相互に組み合わせて使用され得る。
【００２５】
本明細書中で使用されている用語「差別的発現」は、１つのサンプルにおけるｍＲＮＡの量またはレベルにより測定される１つ以上の本発明のバイオマーカーのＲＮＡ及び／または１つ以上のバイオマーカーのＲＮＡのスプライスバリアントの発現レベルを第２サンプルにおける同一の１つ以上の本発明のバイオマーカーの発現レベルと比較した差を指す。「差別的に発現した」は、第２のサンプルまたはサンプル集団におけるタンパク質発現の量またはレベルと比較したサンプルまたはサンプル集団における本発明のバイオマーカーによりコードされるタンパク質の測定量を含み得る。差別的発現は本明細書中に記載されているように測定され得、当業者に理解されている通りである。
【００２６】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド、ＲＮＡ（非限定例として、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡが含まれる）または前駆体（例えば、前駆体）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチド、ＲＮＡまたは前駆体は完全長コード配列により、または完全長または断片の所望活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達等）が維持される限りコード配列の一部によりコードされ得る。この用語は、構造遺伝子のコード領域、及び遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに相当するように５’及び３’末端の両方のコード領域に隣接していずれかの末端上に約１ｋｂの間で配置されている配列をも含む。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は３’非翻訳配列と称される。用語「遺伝子」は遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態、すなわちクローンは、「イントロン」、「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列で中断されているコード領域を含む。イントロンは核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントである。イントロンがエンハンサーのような調節因子を含んでいてもよい。イントロンは核または一次転写物から除去またはスプライシング分離される。従って、イントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物中に存在しない。ｍＲＮＡは翻訳中新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を特定するように機能する。
【００２７】
特に、用語「遺伝子」は完全長ヌクレオチド配列を指す。しかしながら、この用語は配列の断片及び完全長ヌクレオチド配列内の他のドメインを包含するとも意図される。更に、用語「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド配列」はＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）配列を包含する。
【００２８】
本明細書中で使用されている「遺伝子発現パターン」、「遺伝子発現プロフィール」または「遺伝子印章」は、癌治療、とりわけＢｃｌ−２ファミリーアンタゴニスト治療のために患者の分類に相関させた遺伝子の相対的発現；及び癌治療、とりわけＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受けている患者の応答性及びモニタリングと相関させた遺伝子の発現を指す。更に、用語「遺伝子発現パターン」、「遺伝子発現プロフィール」または「遺伝子印章」は、本発明のバイオマーカーの３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはすべてを含めた２個以上の本発明のバイオマーカーの発現レベルの分析の結果の組合せパターンを示す。遺伝子発現パターン、遺伝子発現プロフィールまたは遺伝子印章は、本発明のバイオマーカーに相当する遺伝子により発現されるＲＮＡ及び／またはタンパク質の発現を調べることにより生じ得る。ＲＮＡの場合、本発明のバイオマーカーに相当する遺伝子から転写されたＲＮＡ転写物を指す。タンパク質の場合、本発明のバイオマーカーに相当する遺伝子から翻訳されたタンパク質を指す。例えば、本発明のバイオマーカーのＲＮＡ産物の発現を調べるための技術には、（ＲＴ−ＰＣＲを含めた）ＰＣＲ法及び非ＰＣＲ法、並びにマイクロアレイ分析が含まれる。本発明のバイオマーカーのタンパク質産物を調べるための技術にはウェスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡ分析が含まれる。
【００２９】
本発明は過剰発現する遺伝子の同定に頼っているので、本発明の１つの実施形態は、サンプル細胞のｍＲＮＡ、或いはその増幅またはクローン化物を特定の遺伝子配列についてユニークなポリヌクレオチドへのハイブリド形成により発現を調べることを含む。このタイプの好ましいポリヌクレオチドは他の遺伝子配列中に存在しない遺伝子配列の少なくとも約２０個、少なくとも約２２個、少なくとも約２４個、少なくとも約２６個、少なくとも約２８個、少なくとも約３０個、または少なくとも約３２個の連続塩基対を含む。前文中で使用されている用語「約」は指定されている数値の±１を指す。他の遺伝子配列中に存在しない配列の少なくともまたは約５０個、少なくともまたは約１００個、少なくとも約または１５０個、少なくともまたは約２００個、少なくともまたは約２５０個、少なくともまたは約３００個、少なくともまたは約３５０個、少なくともまたは約４００個、少なくともまたは約４５０個、または少なくともまたは約５００個の連続塩基を有するポリヌクレオチドがより好ましい。前文中で使用されている用語「約」は指定されている数値の±１０％を指す。勿論、より長いポリヌクレオチドがサンプルの核酸に対するハイブリド形成に影響を与えないマイナーなミスマッチ（例えば、突然変異の存在のために）を含んでいてもよい。前記ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されている遺伝子の配列またはそのユニークな部分にハイブリド形成し得るポリヌクレオチドプローブとも称されている。前記ポリヌクレオチドを検出を助けるために標識してもよい。好ましくは、配列は遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ、前記ｍＲＮＡに対する対応ｃＤＮＡ及び／または前記配列の増幅物である。本発明の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドプローブをアレー上、他の固相支持デバイス上、またはプローブを局在させる個々のスポット中に固定させる。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、開示されている配列の全部または一部は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びその変形のような方法により増幅され、検出され得る。前記方法として、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）及びリアルタイムＰＣＲ、場合によりリアルタイムＲＴ−ＰＣＲが非限定的に挙げられる。前記方法は開示されている配列の部分に相補的である１つまたは２つのプライマーを使用し、これらのプライマーは核酸合成をプライミングするために使用する。新たに合成した核酸は、場合により標識され、直接または本発明のポリヌクレオチドにハイブリド形成させることにより検出し得る。新たに合成した核酸をハイブリド形成を可能にする条件下で本発明の（配列を含む）ポリヌクレオチドと接触させ得る。
【００３１】
或いは、本発明の別の実施形態では、遺伝子発現は当該細胞サンプル中の発現タンパク質を前記細胞サンプル中の個々の遺伝子産物（タンパク質）の１つ以上のエピトープに対して特異的な１つ以上の抗体を使用して分析することにより測定され得る。前記抗体は、好ましくは遺伝子産物に結合させた後容易に検出し得るように標識され得る。
【００３２】
治療上処置を指すときに本明細書中で使用されている用語「と組み合わせて」は、１つ以上のタイプの治療（例えば、１つ以上の予防薬及び／または治療薬）の使用を指す。用語「と組み合わせて」の使用は治療（例えば、予防及び／または治療薬）を被験者に投与する順序を限定しない。一次治療（例えば、一次予防または治療薬）は、二次治療（例えば、二次予防または治療薬）を被験者に投与する前（例えば、５分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、１２時間前、２４時間前、４８時間前、７２時間前、９６時間前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、８週間前または１２週間前）、投与と同時に、或いは投与後（例えば、５分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、８週間後または１２週間後）に投与することができる。
【００３３】
更に、Ｂｃｌ−２阻害剤ファミリー治療を放射線または化学療法剤を含めた１つ以上の追加治療薬と一緒に投与してもよい。前記化学療法剤にはカルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、デキサメタゾン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、フルダラビン、イリノテカン，ＣＨＯＰ（Ｃ：Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）（シクロホスファミド）；Ｈ：Ａｄｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）（ヒドロキシドキソルビシン）；Ｏ：ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））；Ｐ：プレドニゾン）、パクリタクセル、ラパマイシン、Ｒｉｔｕｘｉｎ（登録商標）（リツキシマブ）及びビンクリスチンが含まれる。
【００３４】
ＲＮＡを指すときに本明細書中で使用されている用語「発現レベル」は、ハイブリド形成または測定（例えは、リアルタイムＲＴ  ＰＣＲ）により決定される所与の核酸の測定され得る量を指し、ＳＹＢＲ．ＲＴＭ．ｇｒｅｅｎ及びＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．テクノロジーの両方の使用を含み、遺伝子が発現される程度に直接比例している。核酸の発現レベルは当業界で公知の方法により測定される。マイクロアレイ分析の場合、発現レベルは当業界で公知の方法に従って１つ以上の個人から単離したＲＮＡに相当する標識核酸を用いてハイブリド形成分析により調べられる。ハイブリド形成のために使用される核酸上の標識は発光標識、酵素標識、放射性標識、化学標識または物理標識であり得る。標的核酸を蛍光分子で標識することが好ましい。好ましい蛍光標識にはフルオレセイン、アミノクマリン酢酸、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド、シアニン３（Ｃｙ３）及びシアニン５（Ｃｙ５）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
用語「標識」は、標識された分子の存在を示す検出可能なシグナルを発生し得る組成物を指す。適当な標識には放射性同位元素、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、磁気粒子、バイオルミネセント部分等が含まれる。よつて、標識は分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な組成物である。
【００３６】
「マイクロアレイ」は、支持体上のハイブリド形成可能なアレーエレメント（好ましくは、ポリヌクレオチドプローブ）の規則配置を指す。
【００３７】
本明細書中で使用されている用語「公式遺伝子名」は、米国国立バイオテクノロジー情報センターにより維持されているＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅデータベースを指す。
【００３８】
用語「支持体」は、慣用されている支持体、例えばビーズ、粒子、ディップスティック、ファイバ−、フィルター、膜、及びシランまたはシリケート支持体（例えば、ガラススライド）を指す。
【００３９】
本発明は、任意のタイプの患者組織サンプルまたはその派生物に対して実施される診断アッセイを含み、前記サンプルには末梢血、腫瘍または疑わしい腫瘍組織（新鮮凍結した、及び固定またはパラフィン包埋した組織を含む）、細胞単離物（例えば、血液サンプル中で分離または同定した循環上皮細胞）、リンパ節組織、骨髄及び微小針吸引物が含まれる。本発明で使用するために好ましい組織サンプルは末梢血、腫瘍または疑わしい腫瘍組織及び骨髄である。
【００４０】
ＩＩ．Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤バイオマーカー
本出願人は、癌治療、とりわけＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療に対する患者の応答を階層化及び／またはモニターするために有用な新規なバイオマーカーの組合せを同定した。
【００４１】
本発明は、バイオマーカー組中の遺伝子を発現されたタンパク質レベルまたは翻訳されたメッセンジャーＲＮＡで調べることにより患者組織サンプルにおける前記遺伝子のレベルを評価することを含む。
【００４２】
これらのゲノムバイオマーカーは、インビトロ及びインビボ、並びにその臨床的意義の研究でＢｃｌ−２阻害剤を試験するために使用されるヒトｓｃｌｃ及び白血病／リンパ腫細胞株の遺伝子発現を分析することにより本出願人により同定された。これらのゲノムバイオマーカーの組合せはＡＢＴ−７３７及びＡＢＴ−２６３の使用に対するコンパニオン診断アッセイにおいて使用するために特に興味深い。
【００４３】
特に、本出願人はＡＢＴ−７３７に対して感受性及び耐性を示す細胞株群ｓｃｌｃ（表１参照）及び白血病／リンパ腫（表２参照）を識別する新規なバイオマーカーの組合せを同定した。
【００４４】
【表１】
2010511407.tif 000004
2010511407.tif 000005
【００４５】
【表２】
2010511407.tif 000006
2010511407.tif 000007
2010511407.tif 000008
【００４６】
本出願人は更に、ＡＢＴ−２６３に対して感受性及び耐性を示し、更に細胞株ｓｃｌｃ（表３及び４参照）及び白血病／リンパ腫（表５及び６参照）を識別するバイオマーカーの組合せを同定した。
【００４７】
【表３】
2010511407.tif 000009
【００４８】
【表４】
2010511407.tif 000010
【００４９】
【表５】
2010511407.tif 000011
【００５０】
【表６】
2010511407.tif 000012
【００５１】
ＩＩＩ．アッセイ
本発明のアッセイは、Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格がある患者を選択するアッセイ及び患者応答をモニターするためのアッセイの両方を含む。応答を予測するためのアッセイは治療選択の前に実行され、高レベルを有する患者がＢｃｌ−２ファミリー阻害剤治療を受ける資格がある。患者応答をモニターするためには、アッセイを組織サンプルにおけるバイオマーカーのベースラインレベルを決定するために治療開始時に実行する。次いで、同一組織を採取し、アッセイし、バイオマーカーのレベルをベースラインと比較する。レベルが同じであるか低くなっている場合には、治療は効果がありそうであり、継続され得る。ベースラインレベルに比して有意に高くなったら、患者は応答していない恐れがある。
【００５２】
本発明のアッセイはタンパク質アッセイ方法及び核酸アッセイ方法により実施され得る。タンパク質または核酸アッセイのいずれのタイプも使用可能である。本発明において有用なタンパク質アッセイ方法は当業界で公知であり、（ｉ）標識抗体またはタンパク質のバイオマーカー組中の遺伝子の発現タンパク質または断片への結合を含むイムノアッセイ方法、（ｉｉ）バイオマーカーの発現タンパク質または断片を調べる質量分析方法、及び（ｉｉｉ）プロテオミックベースの、すなわち“タンパク質チップ”アッセイが含まれる。有用なイムノアッセイ方法には当業界で公知のフォーマット（前記フォーマットには非限定的にＥＬＩＳＡフォーマット、サンドイッチフォーマット、競合阻害フォーマット（正または逆競合阻害アッセイの両方を含む）または蛍光偏光フォーマットが含まれる）を用いて実施される液相アッセイ；及び固相アッセイ、例えば免疫組織化学（“ＩＨＣ”と呼ぶ）が含まれる。
【００５３】
ＩＨＣ方法が特に好ましいアッセイである。ＩＨＣは細胞または組織中の特定タンパク質の存在を検出する方法であり、１）調べようとする組織を用いてスライドを作成するステップ、２）前記スライドに一次抗体を適用し、特定抗原に結合させるステップ、２）生じた抗体−抗原複合体を二次の酵素コンジュゲート抗体に結合させるステップ、３）基質及び色素原の存在下で酵素が抗体−抗原結合の部位で着色析出物（“ステイン”）を形成するステップ、及び４）スライドを顕微鏡下で検査して、ステインの存在及び程度を同定するステップを含む。
【００５４】
本発明において有用な核酸アッセイ方法も当業界で公知であり、（ｉ）ｍＲＮＡレベルを検出するための無傷の組織または細胞サンプルに対するインサイツハイブリド形成アッセイ、（ｉｉ）ｍＲＮＡレベルを検出するためのマイクロアレイハイブリド形成アッセイ、（ｉｉｉ）ｍＲＮＡレベルを検出するためのＲＴ−ＰＣＲアッセイまたは他の増幅アッセイが含まれる。これらのフォーマットで核酸の合成アナログ（例えば、ペプチド核酸）を用いるアッセイも使用可能である。
【００５５】
本発明のアッセイでは、検出可能に標識した核酸プローブ（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブまたはタンパク質核酸（ＰＮＡ）プローブ）または具体的に設計した遺伝子標的にハイブリド形成するように設計／選択した非標識プライマーを用いるハイブリド形成アッセイによりゲノムバイオマーカーを検出する。非標識プライマーは、プライマー結合後その後検出するためにポリメラーゼにより標的核酸配列を増幅させるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅アッセイにおいて使用される。ＰＣＲまたは他の増幅アッセイにおいて使用される検出プローブは好ましくは蛍光であり、より好ましくは“リアルタイムＰＣＲ”において有用な検出プローブである。インサイツハイブリド形成においては蛍光標識が好ましく使用されるが、ハイブリド形成技術において慣用されている他の検出可能な標識、例えば酵素、色素原及び同位体標識も使用され得る。有用なプローブ標識技術はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｙ．−Ｓ．Ｆａｎ編，第２章，“Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  インサイツ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ”，Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，ｐ．２１−４０，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００２に記載されている。
【００５６】
更なる実施形態において、表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの遺伝子発現レベルは核酸アレー（例えば、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドアレー）またはタンパク質アレーを用いて評価され得る。
【００５７】
核酸アレーにより、多数の遺伝子の発現レベルを一度に定量的に検出することができる。核酸アレーの例にはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（カリフォルニア州サンタクララに所在）製Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州パロアルトに所在）製ｃＤＮＡマイクロアレイ、及び米国特許第６，２８８，２２０号明細書及び同第６，３９１，５６２号明細書に記載されているビーズアレイが含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
核酸アレーにハイブリド形成させようとするポリヌクレオチドは、ハイブリド形成したポリヌクレオチド複合体を検出できるように１つ以上の標識部分で標識してもよい。標識部分には、分光的、光化学的、生化学的、生電気的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な組成物が含まれ得る。標識部分の例には放射性同位元素、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、分光マーカー（例えば、蛍光マーカー及び染料）、磁気標識、結合酵素、質量分光タグ、スピン標識、電子移動ドナー及びアクセプター等が含まれる。非標識ポリヌクレオチドも使用可能である。ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡまたはその修飾形態であり得る。
【００５９】
ハイブリド形成反応はアブソリュートまたはディファレンシャルハイブリド形成フォーマットで実施され得る。アブソリュートハイブリド形成では、抗癌治療の途中の特定時に１つのサンプル（例えば、末梢血、腫瘍または疑わしい腫瘍組織、或いは単離された細胞（例えば、血液サンプル中で分離または同定された循環上皮細胞））から作成したポリヌクレオチドを核酸アレイにハイブリド形成する。ハイブリド形成複合体を形成した後検出されたシグナルはサンプル中のポリヌクレオチドレベルを示す。１つの実施形態では、フルオロフォアＣｙ３及びＣｙ５（ニュージャージ州ピスカタウェイに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）がディファレンシャルハイブリド形成フォーマットのための標識部分として使用される。
【００６０】
核酸アレイから集めたシグナルは市販されているソフトウェア、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｃまたはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより提供されるソフトウェアを用いて分析され得る。例えばスキャン感度、プローブ標識及びｃＤＮＡ／ｃＲＮＡ定量のための対照をハイブリド形成実験に含めてもよい。多くの実施形態では、核酸アレイ発現シグナルを尺度化または正規化した後、更なる分析にかける。例えば、２つ以上のアレイを類似の試験条件下で使用したときのハイブリド形成強度の変動を考慮するために各遺伝子の発現シグナルを正規化し得る。個々のポリヌクレオチド複合体ハイブリド形成に対するシグナルも各アレイ中に含まれる内部正規化対照に由来する強度を用いて正規化され得る。加えて、サンプル間で比較的に一定の発現レベルを有する遺伝子を他の遺伝子の発現レベルを正規化するために使用してもよい。１つの実施形態では、サンプル間で遺伝子間の発現レベルを平均が０、標準偏差が１であるように正規化する。別の実施形態では、核酸アレイにより検出された発現データを変動フィルターにかけ、すべてのサンプル間で最小または微々たる変動を示す遺伝子を除外する。
【００６１】
ＩＶ．サンプル処理及びアッセイ性能
本発明の方法によりアッセイしようとする組織サンプルは任意のタイプのものからなり、末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞学的サンプル、微小針吸引サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラッシングサンプル、膀胱または肺洗浄サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、乳管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結した組織サンプル、パラフィン包埋した組織サンプル、或いは末梢血サンプル、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織、薄層細胞学的サンプル、微小針吸引サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラッシングサンプル、膀胱または肺洗浄サンプル、脊髄液サンプル、脳液サンプル、乳管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結した組織サンプルまたはパラフィン包埋した組織サンプルから作成した抽出物または処理サンプルが含まれる。例えば、患者の末梢血サンプルをまず処理して上皮細胞集団を抽出した後、この抽出物をアッセイし得る。疑わしい腫瘍細胞を多く含む細胞サンプルを得るために組織サンプルの顕微解剖を使用することもできる。本発明で使用するための好ましい組織サンプルは末梢血；微小針吸引物、新鮮凍結した組織及びパラフィン包埋した組織を含めた腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織；及び骨髄である。
【００６２】
組織サンプルは、インサイツハイブリド形成または他の核酸アッセイを実施するための望ましい方法により処理され得る。好ましいインサイツハイブリド形成アッセイの場合、パラフィン包埋した腫瘍組織サンプルまたは骨髄サンプルをガラス顕微鏡スライドに固定し、溶媒（典型的には、キシレン）を用いて脱パラフィンする。組織脱パラフィン及びインサイツハイブリド形成のための有用なプロトコルはＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．（イリノイ州デスプレーンズに所在）から入手可能である。本発明のアッセイを実施する際に適当な計測または自動化を使用することができる。ＰＣＲアッセイはｍ２０００計器システム（イリノイ州デスプレーンズに所在のＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いて実施され得る。好ましい蛍光インサイツハイブリド形成アッセイのためには自動イメージングが使用され得る。
【００６３】
１つの実施形態では、サンプルは患者からの末梢血サンプルからなり、このサンプルを処理して、バイオマーカー遺伝子が多く発現している循環腫瘍細胞の抽出物を得る。循環腫瘍細胞はＩｍｍｕｎｉｃｏｎ（ペンシルバニア州ハンチントンバレーに所在）から入手できるような免疫磁気分離技術により分離され得る。次いで、バイオマーカー遺伝子の変化した発現を示す循環腫瘍細胞の数を、好ましくは治療開始時に調べたバイオマーカー遺伝子の変化した発現を有する循環腫瘍細胞のベースラインレベルと比較する。
【００６４】
試験サンプルは臨床診断するのに十分な数の細胞を含み、典型的には少なくとも約１００個の細胞を含有している。
【００６５】
Ｖ．アッセイキット
別の態様で、本発明は、バイオマーカー組中の遺伝子に対する結合に対して特異的な標識抗体または標識タンパク質を含む検出用イムノアッセイキットを含む。前記キットはサンドイッチイムノアッセイを実施するために有用な抗体捕捉試薬または抗体インジケータ試薬をも含み得る。本発明の好ましいキットは容器を含み、前記容器はそれぞれ組中のバイオマーカーの少なくとも１つに対して特異的に結合し得る少なくとも１つの抗体及び対照遺伝子を収容している。特定バイオマーカーアッセイのために適当な対照組成物を本発明のキットに含めてもよい。対照組成物は、通常アッセイしようとするバイオマーカーを所望の添加剤と一緒に含む。１つ以上の追加容器はアッセイに使用しようとする成分、例えば試薬または緩衝液を収容していてもよい。前記キットは追加的または代替的に抗体結合を直接または間接的に検出するのに適したリポーター基を含む上記した検出試薬をも含み得る。
【００６６】
或いは、キットは、本発明のバイオマーカーの組合せ中に列挙されている遺伝子をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するように設計され得る。前記キットは通常少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、好ましくはタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリド形成する上記した表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せ群に相当するオリゴヌクレオチド組を含む。前記オリゴヌクレオチドは、例えばＰＣＲまたはハイブリド形成アッセイにおいて使用され得る。前記キット内に存在させてもよい追加成分には、第２オリゴヌクレオチドまたは表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せに相当するオリゴヌクレオチド組及び／または腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にする診断試薬または容器が含まれる。
【００６７】
ＶＩ．データベース
更なる態様で、本発明は、例えば表１、２、３、４、５または６の遺伝子の１つ以上に関する配列情報及び各種の肺癌及び白血病／リンパ腫組織サンプルにおける遺伝子発現情報を含む関係データベースを含む。データベースは、所与の配列または組織サンプルに関連する情報、例えば配列情報に関連する遺伝子についての記述的情報、組織サンプルの臨床状態に関する記述的情報、またはサンプルの由来元である患者に関する情報をも含み得る。データベースは別のパーツ、例えば配列データベース及び遺伝子発現データベースを含むように設計され得る。本発明のデータベースは市販されているコンピューター読み取り可能な媒体に保存され得る。前記データベースを構成及び構築するための方法は広く入手可能である。例えば、Ａｋｅｒｂｌｏｍら（米国特許第５，９５３，７２７号明細書）を参照されたい。
【００６８】
本発明のデータベースを外側または外部データベースにリンクさせてもよい。好ましい実施形態では、表１、２、３、４、５または６に記載されているように、外部データベースは、米国国立バイオテクノロジー情報センター、すなわちＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/）により維持されているジェンバンク及び関連データベースである。本発明において使用され得る他の外部データベースにはＣｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（http://stnweb.cas.org/)またはＩｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ(http://www.incyte.com/sequence/index.shtml）から提供されるものが含まれる。
【００６９】
配列情報、遺伝子発現情報、及びデータベータまたはインプットとして提供される他の情報間の必要な比較を実施するために適切なコンピュータプラットフォームが使用され得る。例えば、多数のコンピュータワークステーションはいろいろな製造業者から入手可能であり、例えばＳｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓから入手可能なものである。クライエントサーバ環境、データベースサーバ及びネットワークも広く入手可能であり、本発明のデータベースのための適切なプラットフォームである。
【００７０】
本発明のデータベースは特に、使用者が所与の遺伝子が発現している細胞型または組織を決定し、特定の組織または細胞における所与の遺伝子の発生量または発現レベルを測定することができるように電子ノーザンプロット（Ｅ−ノーザン）を作成するために使用され得る。Ｅ−ノーザン分析は、肝臓、腎臓または心臓のような組織中で過剰発現しない組織特異的候補治療標的を見つけるための道具として使用され得る。これらの組織型はしばしばいったん薬物が開発されたら望ましくない副作用につながり、標的発見及び確認プロセスの早期に前記標的を排除するための一次通過スクリーンは有効であろう。
【００７１】
本発明のデータベースは、組織または細胞における表１、２、３、４、５または６に列挙されている遺伝子の組合せの発現レベルを同定する情報を与えるために使用され得、組織における表１、２、３、４、５または６に列挙されているバイオマーカーの組合せの発現レベルをデータベース中の遺伝子の発現レベルと比較するステップを含む。この方法は、サンプルからの表１、２、３、４、５または６に列挙されている遺伝子の組合せの発現レベルを正常組織及び／または腫瘍組織からの組織中で見られる発現レベルと比較することにより所与組織の生理学的状態を予測するために使用され得る。この方法は本明細書中に記載されている薬物または物質スクリーニングアッセイにおいても使用され得る。
【００７２】
更に説明することなく、当業者は上記した記載及び以下の実施例を用いて本発明の化合物を作成し、使用し、本発明の方法を実施することができると考えられる。従って、実施例は単なる例示であり、本発明の範囲を決して限定するものと解釈されるべきでない。
【００７３】
ＶＩ．実験
【実施例１】
【００７４】
マイクロアレイを用いる遺伝子発現パターンのゲノムワイド見解
細胞培養
以下のＳＣＬＣ細胞株をＡＴＣＣ（バージニア州マナッサスに所在）から入手した：ＮＣＩ−Ｈ８８９、ＮＣＩ−Ｈ１９６３、ＮＣＩ−Ｈ１４１７、ＮＣＩ−Ｈ１４６、ＮＣＩ−Ｈ１８７、ＤＭＳ５３、ＮＣＩ−Ｈ５１０、ＮＣＩ−Ｈ２０９、ＮＣＩ−Ｈ２１１、ＮＣＩ−Ｈ３４５、ＮＣＩ−Ｈ５２４、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＤＭＳ７９、ＳＨＰ７７、ＮＣＩ−Ｈ１６８８、ＮＣＩ−Ｈ４４６、ＮＣＩ−Ｈ７４０、ＮＣＩ−Ｈ１０４８、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＮＣＩ−Ｈ１９６、ＳＷ１２７１、Ｈ６９ＡＲ、ＮＣＩ−Ｈ５２６、ＮＣＩ−Ｈ８６５、ＮＣＩ−Ｈ７４８、ＮＣＩ−Ｈ７１１及びＤＭＳ１１４。いずれの細胞もＡＴＣＣが推奨する培地において５％  ＣＯ２を含有する湿った雰囲気中３７℃で培養した。以下の白血病及びリンパ腫細胞株はＡＴＣＣ（バージニア州マナッサスに所在）から入手した：ＭＶ−４−１１、ＲＳ４；１１、Ｌｏｕｃｙ、ＫＧ−１Ａ、ＤＯＨＨ２、Ｒｓ１１３８０、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＥＭ／Ｃ１、Ｒｃｈ、ＳＵＰ−Ｂ１５、ＭＯＬＴ−４、ＳＵＤＨＬ４、ＨＬ−６０、ＲＰＭＩ８２２６、Ａ３、Ｄａｕｄｉ、ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、Ｊｕｒｋａｔ  Ｉ  ９．２、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＥＧ−０１、Ｕ−９３７、Ｋ−５６２及びＲａｊｉ。
【００７５】
遺伝子発現のマイクロアレイ分析
全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離し、ＲＮｅａｓｙカラム（カリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎ）を用いて精製した。標識ｃＲＮＡはマイクロアレイ製造業者のプロトコルに従って作成し、ヒトＵ１３３Ａ  ２．０アレイ（カリフォルニア州サンタクララに所在のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にハイブリド形成した。Ｕ１３３Ａ  ２．０チップは１４，５００個の十分に特徴づけられている遺伝子及び数千個のＥＳＴを含んでいる。分析のためにマイクロアレイデータファイルをＲｏｓｅｔｔａ  Ｒｅｓｏｌｖｅｒ（商標）ソフトウェアに書き込み、すべてのプローブ組の強度値をＲｅｓｏｌｖｅｒの実験定義を用いて正規化した。増幅領域内の遺伝子に相当するプローブ組の強度値を各遺伝子について正規化し、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（商標）ソフトウェアを用いてヒートマップにおいて比較した。
【００７６】
結果
２７個のＳＣＬＣ細胞株をＯｌｔｅｒｓｄｏｒｆ，Ｔ．，“Ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｕｒｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，４３５：６７７−６８１，２００５に記載されている手順を用いてＡＢＴ−７３７に対する感受性について試験し、細胞株をＥＣ５０が＜５μＭならば感受性、ＥＣ５０が＞５μＭならば耐性と分類した。感受性細胞株群はＮＣＩ−Ｈ８８９、ＮＣＩ−Ｈ１９６３、ＮＣＩ−Ｈ１４１７、ＮＣＩ−Ｈ１４６、ＤＭＳ５３、ＮＣＩ−Ｈ１８７、ＮＣＩ−Ｈ５１０、ＮＣＩ−Ｈ２０９、ＮＣＩ−Ｈ３４５、ＮＣＩ−Ｈ５２６、ＮＣＩ−Ｈ２１１、ＮＣＩ−Ｈ８６５、ＮＣＩ−Ｈ５２４、ＮＣＩ−Ｈ７４８、ＤＭＳ７９、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ７１１、ＳＨＰ７７、ＮＣＩ−Ｈ１６８８から構成され、耐性細胞株群はＮＣＩ−Ｈ４４６、ＮＣＩ−Ｈ７４０、ＮＣＩ−Ｈ１０４８、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＮＣＩ−Ｈ１９６、ＳＷ１２７１、ＤＭＳ１１４及びＮＣＩ−Ｈ６９ＡＲから構成された。
【００７７】
２２個のＳＣＬＣ細胞株をＯｌｔｅｒｓｄｏｒｆ，Ｔ．，“Ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｕｒｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，４３５：６７７−６８１，２００５に記載されている手順を用いてＡＢＴ−２６３に対する感受性について試験し、細胞株をＥＣ５０が＜５μＭならば感受性、ＥＣ５０が＞５μＭならば耐性と分類した。感受性細胞株群はＮＣＩ−Ｈ１４６、ＮＣＩ−Ｈ８８９、ＮＣＩ−Ｈ１９６３、ＮＣＩ−Ｈ１８７、ＮＣＩ−Ｈ１４１７、ＮＣＩ−Ｈ２１１、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２０９、ＮＣＩ−Ｈ５１０、ＤＭＳ５３、ＤＭＳ７９、ＮＣＩ−Ｈ３４５、ＮＣＩ−Ｈ１０４８、ＳＨＰ７７、ＮＣＩ−Ｈ４４６から構成され、耐性細胞株群はＮＣＩ−Ｈ１６８８、ＮＣＩ−Ｈ７４０、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＮＣＩ−Ｈ６９ＡＲ、ＳＷ１２７１、ＤＭＳ１１４及びＮＣＩ−Ｈ１９６から構成された。
【００７８】
２５個の白血病／リンパ腫細胞株も５ｕＭ  カットオフを用いてＡＢＴ−７３７に対する感受性について試験し、感受性細胞株はＭＶ−４−１１、ＲＳ４；１１、Ｌｏｕｃｙ、ＫＧ−１Ａ、ＤＯＨＨ２、Ｒｓ１１３８０、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＥＭ／Ｃ１、Ｒｃｈ、ＳＵＰ−Ｂ１５、ＭＯＬＴ−４、ＳＵＤＨＬ４、ＨＬ−６０、ＲＰＭＩ８２２６、Ａ３、Ｄａｕｄｉ、ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ及びＪｕｒｋａｔ  Ｉ  ９．２であり、耐性細胞株はＪｕｒｋａｔ、ＭＥＧ−０１、Ｕ−９３７、Ｋ−５６２及びＲａｊｉであった。
【００７９】
２５個の白血病／リンパ腫細胞株も５ｕＭ  カットオフを用いてＡＢＴ−２６３に対する感受性について試験し、感受性細胞株はＭＶ−４−１１、ＲＳ４；１１、Ｌｏｕｃｙ、ＫＧ−１Ａ、ＤＯＨＨ２、Ｒｓ１１３８０、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＥＭ／Ｃ１、Ｒｅｈ、ＳＵＰ−Ｂ１５、ＭＯＬＴ−４、ＳＵＤＨＬ４、ＨＬ−６０、ＲＰＭＩ８２２６、Ａ３、Ｄａｕｄｉ、ＷＳＵ−ＮＨＬ、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ及びＪｕｒｋａｔ  Ｉ  ９．２であり、耐性細胞株はＪｕｒｋａｔ、ＭＥＧ−０１、Ｕ−９３７、Ｋ−５６２及びＲａｊｉであった。
【００８０】
未処理のｓｃｌｃ細胞株及び白血病／リンパ腫細胞株からのＲＮＡ発現パターンを２２，０００以上のプローブ組を含むアフィメトリクスＨＧ−Ｕ１３３Ａ  ｖ．２．０マイクロアレイを用いて調べた。別の培養物と平行して、本出願人は各細胞株の化合物に対する感受性を調べた。発現プロフィールを感受性群及び耐性群に分け、感受性及び耐性細胞株を識別するのに最良である遺伝子を同定するために一連の統計フィルターを適用した。一次フィルターはＳｐｏｔｆｉｒｅソフトウェアを用いる分散分析（ＡＮＯＶＡ）であった。次いで、各種遺伝子（高ＣＶ）をフィルターにかけた。残りの遺伝子をＪＭＰの判別分析ファンクションを用いて分析して、感受性及び耐性細胞株を最良に識別する遺伝子を同定した。最良の識別組をＳＡＳのリーブ−ワン−アウト交差検定を用いて試験して、バイオマーカーの最良印章組を同定した。ＡＢＴ−２６３に対しては、各細胞型（ｓｃｌｃ及び白血病／リンパ腫細胞）の２組みがうまく機能することが判明した。
【００８１】
上記した例示的実施形態は限定的よりもむしろ本発明のすべての要素を例示することを意図している。よって、本発明は当業者が本明細書中の記載から誘導し得る多くの改変及び修飾で実施し得る。前記した改変及び修飾のすべてが以下の請求の範囲により規定される本発明の範囲及び趣旨の範囲に入ると考えられる。
【図１】
2010511407.tif 000013
【図２】
2010511407.tif 000014
【国際調査報告】
2010511407.tif 000015