(57)【要約】  本発明は、癌の種類の診断のための方法に関し、その際抗アポトーシス性サイトカインの発現が、腫瘍細胞中で決定される。本発明の鑑別診断は、腫瘍疾病を分類するために、そして、要求される治療を推奨するために、そして、この治療に対する進行及び応答をモニターするために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）腫瘍細胞を含有する充実性腫瘍から試料を提供する工程、
（ｂ）前記腫瘍細胞中の少なくとも１の抗アポトーシス性サイトカインの発現を決定する工程、及び
（ｃ）前記充実性腫瘍を非サイトカイン発現腫瘍またはサイトカイン発現腫瘍に分類する工程
を含む、癌の種類を診断するための方法。
【請求項２】
抗アポトーシス性サイトカインがＩＬ−４及び／又はＩＬ−１０、有利にはＩＬ−４である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記充実性腫瘍が、ＩＬ−４発現腫瘍またはＩＬ−４非発現腫瘍に分類される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記充実性腫瘍が、ＩＬ−１０発現腫瘍又はＩＬ−１０非発現腫瘍に分類される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
前記充実性腫瘍が、ＩＬ−４及びＩＬ−１０発現腫瘍又は非ＩＬ−４及び非ＩＬ−１０発現腫瘍に分類される、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
充実性腫瘍が上皮腫瘍である、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
上皮腫瘍が、甲状腺、胸、前立腺、膀胱、結腸、胃、膵臓、腎臓、肝臓及び肺の癌の群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
腫瘍が有利には、結腸、胃、胸、肺、膀胱又は前立腺の癌である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
腫瘍細胞が、プライマリーな腫瘍細胞及び／又は癌胚細胞である、請求項１か８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍細胞中での抗アポトーシス性サイトカイン発現の検出が、タンパク質レベル及び／又は核酸レベルでの検出を含む、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質レベルでの検出が、抗アポトーシス性サイトカインの検出、有利には免疫化学及び／又は質量分析方法を用いた検出を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
核酸レベルでの決定が、核酸ハイブリダイゼーション、及び場合により増幅方法、有利にはＲＴ−ＰＣＲ方法を用いた抗アポトーシス性サイトカインｍＲＮＡ発現レベルの決定を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
（ｄ）少なくとも１種の化学療法剤又はアポトーシス促進剤に対する、発現されたサイトカイン及び／又はそのレセプターのアンタゴニストの存在及び／又は非存在中での、サイトカイン発現腫瘍の細胞の感受性を決定する工程、及び
（ｅ）場合により、癌の種類に特異的な処理を選択する工程
を更に含む、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
（ｄ）工程において、サイトカイン発現腫瘍の細胞が感受性である化学療法剤又はアポトーシス促進剤が決定される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
工程１３（ｅ）において、処理が、サイトカイン中和剤及び化学療法剤又はアポトーシス促進剤の組み合わせの投与を含む選択される、請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
化学療法剤が、代謝拮抗剤、ＤＮＡ断片化剤、ＤＮＡ架橋剤、インターカレーション剤、タンパク質合成阻害剤、トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤、微小管指向した剤、キナーゼ阻害剤、ホルモン及びホルモンアンタゴニストから選択される、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
化学療法剤が、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンから選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
アポトーシス促進剤が、ＴＲＡＩＬ及びＣＤ９５リガンドから選択される、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１９】
サイトカイン中和剤が、抗体、有利には抗ＩＬ−４抗体及び／又は抗ＩＬ−１０抗体又はその抗原結合断片である、請求項１４から１８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
抗ＩＬ−４抗体が、ハイブリドーマ細胞ECACC 93100620又はその抗原結合断片に由来する抗体である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
サイトカイン中和剤が、溶解性のＩＬ−４レセプターポリペプチド又は融合ポリペプチドである、請求項１４から１８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
（ｉ）少なくとも１種のサイトカイン中和剤及び
（ｉｉ）少なくとも１種の化学療法剤又はアポトーシス促進剤
の組み合わせの、微小残存病変の治療のための医薬品の製造のための使用。
【請求項２３】
（ｉ）少なくとも１種のサイトカイン中和剤及び
（ｉｉ）少なくとも１種の化学療法剤又はアポトーシス促進剤
の組み合わせの、サイトカイン発現腫瘍として分類される癌の種類の治療のための医薬品の製造のための使用。
【請求項２４】
（ｉ）少なくとも１種のサイトカイン中和剤及び
（ｉｉ）少なくとも１種の化学療法剤又はアポトーシス促進剤
の組み合わせの、手術及び／又は放射線療法との組み合わせにおける、サイトカイン発現腫瘍として分類される癌の種類の治療のための医薬品の製造のための使用。
【請求項２５】
医薬品が、手術及び／又は放射線療法との、同時の、別個の又は逐次の組み合わせ療法のためである、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
（ｉ）少なくとも１種のサイトカイン中和剤及び
（ｉｉ）少なくとも１種の化学療法剤又はアポトーシス促進剤
の組み合わせの、サイトカイン発現腫瘍の治療のための医薬品の製造のためであって、（ｉ）及び（ｉｉ）の投与が同時に開始される使用。
【請求項２７】
（ｉ）少なくとも１種のサイトカイン中和剤及び
（ｉｉ）少なくとも１種の化学療法剤又はアポトーシス促進剤
の組み合わせの、サイトカイン発現腫瘍の治療のための医薬品の製造のためであって、（ｉ）及び（ｉｉ）の投与が段階的に開始される、使用。
【請求項２８】
（ｉ）の投与の開始が、（ｉｉ）の≧１週間前であるか、又は、（ｉｉ）の投与の開始が、（ｉ）の≧１週間前である、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
Ｃ末端で短縮された細胞外ＩＬ−４レセプタードメインを含有する、溶解性のＩＬ−４レセプターポリペプチド。
【請求項３０】
融合ポリペプチドである、請求項２９記載のポリペプチド。
【請求項３１】
請求項２９又は３０記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、癌の種類の診断のための方法に関し、その際腫瘍細胞中の抗アポトーシス性サイトカインの発現が決定される。本発明の鑑別診断は、腫瘍疾病を分類するために、そして、要求される治療を推奨するために、そして、この治療に対する進行及び応答をモニターするために使用される。
【０００２】
細胞の生存と細胞の死の間での均衡は、アポトーシス促進性及び抗アポトーシス性の因子により制御され、この調節不全は、癌を含む幾つかの病理学的な状態の発達に寄与する。抗アポトーシス性因子の高度の発現は、ヒトの癌中で一般的に見出され、かつ、癌細胞の増殖及び細胞毒性薬剤の治療作用に対する抵抗性の両方に寄与する。腫瘍細胞による抗アポトーシス性サイトカインのオートクライン生産は、レセプター及び化学療法により誘導されるアポトーシスに対する感受性を強く調節することが既に報告されている。特に、ＩＬ−４及びＩＬ−１０は癌細胞中で、抗アポトーシスタンパク質の上方調節を含め、オートクライン成長因子として作用することが以前に報告されており、これは、腫瘍細胞を、化学療法剤により誘導される死から保護する（Stassi et al., Cancer Res. 63, 6784-90 (2003), Todaro et al., Cancer Res. 66, 1491-9 (2006)）。
【０００３】
腫瘍は、異なる治療的特使得及び異なる増殖可能性を有する細胞の不均一な組み合わせからなる。特に、癌細胞は、細胞の表現型的に多様な子孫を生じる可能性があり、これは一定の増殖可能性を授けられているか又は限定された増殖可能性を有するか又は増殖可能性を有しない。
【０００４】
この観点において、最近の証拠は、催腫瘍性の成長能力が、実際には、いわゆる癌胚細胞（ＣＳＣ）とよばれる小さなサブセットに限定されることを示唆する。国際出願PCT/IT2005/000523、は、充実性腫瘍からの胚細胞の単離及び培養のための方法を開示する。癌細胞のこのサブポピュレーションは、自己複製でき、かつ、多様な程度の分化を示す不均一な細胞のポピュレーションを生じる。更に、最近では、癌胚細胞は、薬剤誘発されたアポトーシスに対して顕著に抵抗性であり、従って、抗腫瘍療法を免れ、かつ、ことによるとこれが化学療法の非効率性の根底をなす理由であることが見出されている。
【０００５】
ＣＳＣが、主としてＩＬ−４及びＩＬ−１０を産生し、かつ、薬剤誘発された細胞死に対する感受性の上記した改変に対して責任があることがいまや実証されている。
【０００６】
本発明の発明者らにより、充実性腫瘍が、抗アポトーシス性発現レベル及び／又は特性の観点において相違していてよいことも、いまや見出されている。抗アポトーシス性サイトカインの発現は、同じ臓器の個々の腫瘍の間、そして、単一の腫瘍の細胞又は部分内ですら相違する。これらの結果は、腫瘍診断及び／又は療法における新規の有効な戦略を生じる。
【０００７】
特に、本発明の課題は、抗アポトーシス性サイトカインを発現する癌の種類及び癌細胞の同定及び診断を可能にする方法を提供することであった。
【０００８】
従って、本発明は、抗アポトーシス性サイトカインを標的として、腫瘍の種類、特に充実性腫瘍の種類を診断するための方法を提供する。  特に、本発明は、
（ａ）腫瘍細胞を含有する充実性腫瘍から試料を提供する工程、
（ｂ）前記腫瘍細胞中の少なくとも１の抗アポトーシス性サイトカインの発現を決定する工程、及び
（ｃ）前記充実性腫瘍を非サイトカイン発現腫瘍又はサイトカイン発現腫瘍に分類する工程
を含む、癌の種類を診断するための方法に関する。
【０００９】
従って、本発明は、腫瘍試料中での抗アポトーシスサイトカインの発現特性及び／又はレベルの、決定及び／又は定量化の手段による、癌の種類の鑑別的診断に関する。抗アポトーシス性サイトカインとして、IL−４及び／又はIL−１０、特にＩＬ−４が有利である。
【００１０】
本発明による鑑別診断は、腫瘍細胞を分類し、かつ、抗アポトーシス性サイトカインの発現を示し、かつ、化学療法剤での治療に対して不応性であるものを同定することを可能にする。従って、抗アポトーシス性サイトカインの発現は、目的とされる治療的戦略の選択を可能にする腫瘍分類のための有効なマーカーである。
【００１１】
例えば、本発明の方法は、特定の癌の種類に苦しむ患者が、特定の療法に対して抵抗性であるか又は感受性であるかを予測し、かつ、最適化された治療的戦略を提供するために使用可能であってよい。
【００１２】
本発明によれば、癌の種類は、非サイトカイン発現腫瘍又はサイトカイン発現腫瘍として分類されることができることが見出された。
【００１３】
ＩＬ−４及び／又はＩＬ−１０の発現、特にＩＬ−４の発現を決定する場合には、充実性腫瘍は、ＩＬ−４のみ、又はＩＬ−１０のみ、又はＩＬ−４及びＩＬ−１０の両方の発現に関して分類されてよい。従って、本発明の方法は、ＩＬ−４発現腫瘍又はＩＬ−４非発現腫瘍として分類される充実性腫瘍、ＩＬ−１０発現腫瘍又はＩＬ−１０非発現腫瘍として分類される充実性腫瘍、及び、ＩＬ−４及びＩＬ−１０発現腫瘍又は非ＩＬ−４及び非ＩＬ−１０発現腫瘍として分類される充実性腫瘍の区別化を可能にする。
【００１４】
本発明の方法は、有利には、充実性腫瘍に対して実施され、特に上皮腫瘍に対して実施される。前記上皮腫瘍は、甲状腺、胸、前立腺、膀胱、結腸、胃、膵臓、腎臓、肝臓及び肺の癌からなる群から選択されてよい。より有利には、上皮腫瘍は、結腸、胃、胸、肺、膀胱又は前立腺の癌である。
【００１５】
本発明の診断方法は、充実性腫瘍からの様々な細胞試料に対して実施されてよい。この試験試料は有利には、被験体、例えばヒト患者から単離された、プライマリーな腫瘍及び／又は腫瘍環境からの細胞試料である。例えば、バイオプシー、切除又は他の技術により得られる腫瘍細胞組織が試験されることができる。腫瘍試料は、腫瘍細胞を含む。抗アポトーシス性サイトカインの腫瘍細胞中での発現は、有利には、プライマリーな腫瘍細胞及び／又は癌胚細胞に対して決定される。
【００１６】
腫瘍細胞中の抗アポトーシス性サイトカイン発現の決定のための方法は、この分野で良く知られている。腫瘍細胞中での抗アポトーシス性サイトカインの発現、特に過剰発現の決定は、タンパク質レベル及び／又は核酸レベルに対するサイトカインの検出により実施される。
【００１７】
サイトカインタンパク質の決定は、腫瘍細胞中で又は腫瘍微小環境中で実施されてよい。所定の試料中でのサイトカインタンパク質の存在及び量の決定のための方法は、この分野の当業者に良く知られていて、かつ、免疫化学的方法、例えば免疫組織化学、ウェスタンブロッティング、免疫沈殿及びＥＬＩＳＡ方法であってよい。質量分析に基づく更なる方法（ＭＡＬＤＩＭＳを含む）が、サイトカインタンパク質の存在及び量を決定するために使用されることができる。
【００１８】
サイトカイン核酸は、この分野の当業者に良く知られたいかなる手段を用いて、本願明細書においては検出及び定量化されることができる。場合による増幅方法と一緒でのハイブリダイゼーション技術は、しばしば、核酸の検出のために使用される。サイトカインｍＲＮＡの発現は例えば、ノーザンブロット分析又は逆転写及び引き続くＰＣＲによる増幅により検出されてよい。
【００１９】
本発明による方法は、更なる工程、
（ｄ）少なくとも１種の化学療法剤又はアポトーシス促進剤に対する、発現されたサイトカイン及び／又はレセプターのアンタゴニストの存在及び／又は非存在中での、サイトカイン発現腫瘍の細胞の感受性を決定する工程を含んでよい。
【００２０】
化学療法剤及び／又はアポトーシス促進剤に対するサイトカイン発現腫瘍細胞の感受性を決定するために、前記化学療法剤又はアポトーシス促進剤に対して暴露された腫瘍細胞の生存率が、サイトカイン中和剤の非存在及び／又は存在下で測定されてよい。所定の剤に対する腫瘍細胞の感受性の決定のための方法は、この分野の当業者により良く知られている（例えば実施例において開示されるとおりである）。
【００２１】
この決定に基づき、本発明の方法は、更に、
（ｅ）癌の種類に特異的な処理を選択する工程
を含んでよい。
【００２２】
既に述べたとおり、本発明は充実性腫瘍が、抗アポトーシス性サイトカイン、特にＩＬ−４及びＩＬ−１０サイトカインのその発現又は発現の程度により区別化されてよいとの観察に基づく。ＩＬ−４及びＩＬ−１０抗アポトーシス性サイトカインの腫瘍又は腫瘍細胞中での発現が、治療、例えば化学療法剤及び／又はアポトーシス促進剤を用いた治療に対する不応性に対して責任があるので、抗アポトーシス性サイトカインは、治療に対するこの腫瘍の感受性を増加させるために中和されなくてはならない。従って、本発明は、腫瘍により発現されるサイトカインのアンタゴニストとの組み合わせでの、化学療法剤及び／又はアポトーシス促進剤に対する感受性又は抵抗性の検査を含んでもよい。
【００２３】
有利な一実施態様において、本方法の工程（ｄ）で実施されるこの感受性アッセイは、サイトカイン発現腫瘍の細胞が特に感受性である化学療法剤又はアポトーシス促進剤の決定を導く。
【００２４】
結果として、本発明の工程（ｅ）によれば、成功した腫瘍種類特異的な治療が選択され、これは、サイトカイン中和剤及び化学療法剤又はアポトーシス促進剤の組み合わせの投与を含む。
【００２５】
サイトカイン中和剤は、サイトカインの量及び／又は活性を減少させるいかなる化合物であってよい。例えば、サイトカイン中和剤は、腫瘍細胞により自己分泌的に発現されるサイトカインにより引き起こされるシグナルトランスダクション経路を阻害する剤であってよい。従って、全ての剤が、サイトカインの発現及び／又は機能を直接的に及び／又は非直接的に調節することができる、即ち、それぞれのサイトカインタンパク質及び／又はサイトカインレセプターの発現及び／又は機能に作用する剤として考慮されることができる。
【００２６】
有利には、サイトカイン中和剤は、ＩＬ−４及び／又はＩＬ−１０中和剤であり、即ち、ＩＬ−４及び／又はＩＬ−１０の自己分泌発現により引き起こされるシグナルトランスダクション経路を阻害することができる全ての剤である。
【００２７】
サイトカイン中和剤は、特に、発現されたサイトカインタンパク質活性を阻害及び／又は減少する剤、発現されたサイトカインタンパク質を分解する剤、及び、サイトカイン産生を阻害する剤から選択されてよい。サイトカイン活性を遮断する剤は、例えば、サイトカインレセプターを遮断するアンタゴニスト、例えば、サイトカインのもともとのシグナルに比較してアンタゴニスト性の活性を示す、サイトカインのペプチド、小分子、突然変異タンパク質である。このような突然変異タンパク質の例は特に、ＩＬ−４突然変異タンパク質、例えば、AerovanceからのAerolast(R)及びBayerからのPitrakinra(R)及びBAY-36-1677である。サイトカインレセプターに対する更なる抗体又はサイトカインタンパク質に対する抗体が使用されてよい。この抗体は有利には、ＩＬ−４及び／又はＩＬ−１０に対する抗体、例えばAmgen及びImmunexからの抗体又はＩＬ−４レセプター及び／又はＩＬ−１０レセプターに対する抗体、例えばGlaxoからの抗体Pascolizumab(R)である。
【００２８】
この抗体は、完全抗体、例えばＩｇＧ抗体、又は、この抗原結合断片であってよい。有利には、この抗体は、モノクローナルのキメラの又はヒト化した抗体であり、これは、ヒト定常ドメイン、例えばヒト定常ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ドメインを有する。より有利には、この抗体は、更にヒトのフレームワーク領域を含有するヒト化した抗体である。また有利には、抗体断片、例えば、二価の又は一価の抗体断片、例えばＦ（ａｂ）2断片である。他方では、この抗体は、組み換え抗体、例えば、単鎖抗体又はこの断片、例えばｓｃＦｖ断片であってよい。
【００２９】
溶解性のサイトカインレセプター（有利には、膜貫通性の及び細胞内のドメインを有しない）が、サイトカイン活性を遮断する剤として使用されることもできる。これらの溶解性レセプターは、例えば、Regeneronからの、特にＩＬ−４Ｒ／ＩＬ−１３−Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質、Amgen及びImmunexからの溶解性のレセプター、特にNuvance(R)及びAltrakincept(R)である。溶解性のレセプターの特定の例は、ヒトのＩＬ−４レセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、例えばヒトのＩＬ−４Ｒαアミノ酸２４〜アミノ酸２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９又は２３０及び場合により更なるドメイン、例えばヒトＩｌ−１３レセプター及び／又はヒトＦｃ免疫グロブリンドメインの細胞外ドメインの短縮したＥＣＤからである。
【００３０】
発現されたサイトカインタンパク質を分解する剤の有利な一例として、デザイナープロテアーゼを、本発明の文脈内で言及することができる。このサイトカインタンパク質の産生は、他方では、例えば、核酸レベルで作用する剤により阻害されることができ、この剤は、例えばアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ分子及び／又はリボザイムである。
【００３１】
有利なサイトカインアンタゴニストは、国際特許出願WO 2004/069274中に説明されている。サイトカインに対して指向した抗体は、有利には、サイトカイン中和剤として使用される。ヨーロッパ特許出願EP-A-0 730 609中に開示されている抗IL−４抗体は、本発明の方法のサイトカイン中和剤としてとりわけ適している。極めて有利な一実施態様において、ハイブリドーマ細胞系列ACC93100620により産生されるモノクローナル抗体６A１に由来する抗体又はその抗原結合断片が、サイトカイン中和剤として使用される。
【００３２】
工程（ｄ）及び／又は（ｅ）中で使用される化学療法剤は、代謝拮抗剤、ＤＮＡ断片化剤、ＤＮＡ架橋剤、インターカレーション剤、タンパク質合成阻害剤、トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤、微小管指向した剤、キナーゼ阻害剤、ホルモン及びホルモンアンタゴニストから選択される。特に、化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンから選択される。有利なアポトーシス促進剤として、ＴＲＡＩＬ大日ＣＤ９５リガンドが選択されることができる。
【００３３】
腫瘍細胞に対する抗治療的なサイトカインアンタゴニストと化学療法剤及び／又はアポトーシス促進剤との組み合わせた投与から得られる結果に基づき、治療的戦略が、有効であると証明された剤の特定の組み合わせに基づき発達されることができる。
【００３４】
本発明の更なる観点は、従って、サイトカイン中和剤と化学療法剤又はアポトーシス促進剤との組み合わせの使用及び腫瘍治療、例えば最初の腫瘍治療又は第２又は第３の系列の腫瘍治療、例えば不応性の腫瘍、例えば１種以上の抗腫瘍剤に対して不応答性になった腫瘍の治療のための、医薬品の製造である。
【００３５】
従って、本発明の更なる観点は、
（ｉ）少なくとも１種のサイトカイン中和剤及び
（ｉｉ）少なくとも１種の化学療法剤又はアポトーシス促進剤
の組み合わせの、サイトカイン発現腫瘍として分離される癌の種類の治療のための医薬品の製造のための使用である。
【００３６】
腫瘍細胞中での薬剤耐性の主要な理由の１つは、腫瘍細胞、特に腫瘍胚細胞の生存する小さな集団が、プライマリーな腫瘍の明らかに完全な退行又は外科的切除の後に、この腫瘍を再生でき、かつ、いわゆる微小残存病変（MRD）に寄与するとの観察に基づく。
【００３７】
この観点において、組み合わせ療法は特に、腫瘍胚細胞の治療的な感受性の増加に適しているので、本発明の更なる観点は、
（iii）少なくとも１種のサイトカイン中和剤及び
（ｉｖ）少なくとも１種の化学療法剤又はアポトーシス促進剤
の組み合わせの、微小残存病変の治療のための医薬品の製造のための使用である。
【００３８】
本発明の有利な一実施態様によれば、上述の剤（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせた療法の使用は、更に、手術及び／又は放射線療法と組み合わせられることができる。特に、前記医薬品組み合わせは、同時の、別個の又は逐次の手術及び／又は放射線療法との組み合わせ療法のためである。
【００３９】
本発明の有利な一実施態様によれば、（ｉ）の剤及び（ｉｉ）の剤の投与は同時に開始される。又は、この組み合わせ療法は、段階式Ｉに開始されることができる。本発明のこの有利な一実施態様によれば、サイトカイン中和剤（ｉ）の投与の開始は、化学療法剤又はアポトーシス促進剤（ｉｉ）の投与の≦１週間前である。代わりに、化学療法剤又はアポトーシス促進剤（ｉｉ）の投与は、サイトカイン中和剤（ｉ）の投与の≧１週間前に開始されてよい。
【００４０】
本発明の更なる一実施態様は、溶解性のＩＬ−４レセプターポリペプチド又は融合ポリペプチドであり、これは、Ｃ末端で短縮された細胞外ドメイン、例えばこのようなペプチドをコードする、１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれより多いアミノ酸又は核酸分子だけ短縮されたドメインを含有する。この短縮された細胞外ドメインは、例えばヒトのＩＬ−４レセプターアルファ（NCBI アクセッションNP_000409）に由来し、これはＣ末端がアミノ酸２３０、２２９、２２８、２２７、２２６、２２５又は２２４で終了する。有利にはこのＣ末端は、アミノ酸２２４である。このポリペプチドは、少なくとも１つの更なるドメイン、例えばＮ末端シグナルペプチド、更なるエフェクタードメイン、例えばＩＬ−１３レセプター細胞外ドメイン、Ｆｃ免疫グロブリンドメイン、及び／又は精製ドメインを含有してよい。短縮されたＩＬ−４Ｒポリペプチドの一例は、実施例４中に説明されている。この短縮したＩＬ−４Ｒポリペプチドは、医薬的な適用のために適し、例えば、腫瘍の治療のために適し、特にＩＬ−４関連した腫瘍の治療のために適し、これは上述したとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１ａ】図１ａは、癌細胞は、ＩＬ−４のための高い産生源であり、そしてＩＬ−１０のためにはそうでないことを示唆する図である。
【図１ｂ】図１ｂは、精製された癌細胞のＩＬ−４のｍＲＮＡ発現のレベルは、関連する正常細胞と比較してかなり増加することを示す図である。
【図２ａ】図２ａは。ウェスタンブロット分析により、上皮の癌腫細胞は、ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１及びＴＲＡＩＬ  Ｒ２を発現することを示す図である。
【図２ｂ】図２ｂは、免疫組織化学分析により、上皮の癌腫細胞は、ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１及びＴＲＡＩＬ  Ｒ２を発現することを示す図である。
【図３ａ】図３ａは、パラフィン包理した画分に対する免疫組織化学は、ＩＬ−４レセプターが、全ての分析した組織中で発現していることを示す図である。
【図３ｂ】図３ｂは、ＩＬ−４は、結腸、胸及び肺の正常細胞の成長速度を顕著に増加させることを示す図である。
【図３ｃ】図３ｃは、ＩＬ−４は、ｃＦＬＩＰ、ＰＥＤ／ＰＥＡ−１５、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−１２の正常な結腸、胸中でのタンパク質レベルを増加させることを示す図である。
【図４ａ】図４ａは、新規に精製した結腸、胸、胃及び肺の癌細胞の、ＩＬ−４に対する中和抗体に対する４８時間の暴露は、癌細胞を化学療法及びデスレセプター誘発された細胞死に対して敏感化させることを示す図である。
【図４ｂ】図４ｂは、新規に精製した結腸、胸、胃及び肺の癌細胞の、ＩＬ−４に対する中和抗体に対する４８時間の暴露は、癌細胞を化学療法及びデスレセプター誘発された細胞死に対して敏感化させることを示す図である。
【図４ｃ】図４ｃは、新規に精製した結腸、胸、胃及び肺の癌細胞の、ＩＬ−４に対する中和抗体に対する４８時間の暴露は、癌細胞を化学療法及びデスレセプター誘発された細胞死に対して敏感化させることを示す図である。
【図５】図５は、ＩＬ−４中和は、結腸、胸、胃及び肺の腫瘍細胞成長を、１５日間まで遮断することを示す図である。
【図６ａ】図６ａは、ＣＳＣが、薬剤により誘発されるアポトーシスに対して比較的不活性であることを示す図である。
【図６ｂ】図６ｂは、ｃ−ＦＬＩＰ、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＰＥＤ、抗アポトーシスタンパク質のタンパク質レベルは前に、癌中でＩＬ−４により発現されることが示され、これは、抗ＩＬ−４に暴露されたＣＳＣ中で２倍まで減少されることを示す図である。
【図６ｃ】図６ｃは、ｃ−ＦＬＩＰ、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＰＥＤ、抗アポトーシスタンパク質のタンパク質レベルは前に、癌中でＩＬ−４により発現されることが示され、これは、抗ＩＬ−４に暴露されたＣＳＣ中で２倍まで減少されることを示す図である。
【図６ｄ】図６ｄは、ＩＬ−４遮断に引き続き、ＣＳＣ細胞死が、化学療法剤又はＴＲＡＩＬでの処理により顕著に増加されることを示す図である。
【図６ｅ】図６ｅは、ＩＬ−４遮断に引き続き、ＣＳＣ細胞死が、化学療法剤又はＴＲＡＩＬでの処理により顕著に増加されることを示す図である。
【図７ａ】図７ａは、マウス中での腫瘍サイズの減少、化学療法の処置の効率は、ＩＬ−４中和性抗体により顕著に促進されたことを示す図である。
【図７ｂ】図７ｂは、マウス中での腫瘍サイズの減少、化学療法の処置の効率は、ＩＬ−４中和性抗体により顕著に促進されたことを示す図である。
【図８Ａ】図８Ａは、銀染色後のＩｌ  ４Ｒ−ＩＬ  １３Ｒ−Ｆｃのストレプタクチン親和精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＩＬ  ４Ｒ−ＩＬ  １３  Ｒ−Ｆｃについて２８０ｎｍでの吸光度により観察される溶出特性を示す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、ＩＬ  ４Ｒ  Ｆｃについて２８０ｎｍでの吸光度により観察される溶出特性を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＩＬ  ４Ｒ−ＦｃについてのＳＥＣ画分を更に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色により、変性条件下での分析を示す図である。
【図１０】図１０は、ＩＬ  ４Ｒ−Ｆｃ及びＩＬ  ４Ｒ−ＩＬ  １３  Ｒ−Ｆｃの両方が、ヒトのＩＬ４の特異的な結合を示すことを示す図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＰＢＳ（ｗ／ｏ）又は１０μｇのＩＬ  ４Ｒ−Ｆｃ、ＩＬ  ４Ｒ−ＩＬ  １３Ｒ−Ｆｃ又は抗ＩＬ４抗体を用いて２４時間前処理し、かつ、引き続き更なる２４時間５μＭドキソルビシンで暴露した、乳癌球体の免疫蛍光分析を示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、アポトーシス性の細胞と生細胞を区別し、引き続き細胞生存率のパーセンテージについてプロットされた細胞カウントは、アポトーシスの誘発のためのこの組み合わせ治療の有効性をも実証する図である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、両方のコンストラクトは、プライマリー大腸癌細胞をオキサリプラチンにより誘発されたアポトーシスのために敏感化させることができることを示す図である。
【００４２】
本発明は更に、以下の実施例により説明される。
【００４３】
実施例
材料と方法
ヒトの組織。癌試験体を、ヒトの実験に責任のある機関委員会の倫理的な基準に一致して、外科処理の時に獲得した。その一方で正常な組織を、この外科的に除去された腫瘍の反対側の部分から獲得した。組織学的診断は、癌腫細胞の挙動的な顕微鏡特徴に基づいていて、組織学的なタイプと程度を決定した。
【００４４】
ヒトのプライマリー細胞精製。通常の及び癌の組織を、２時間コラゲナーゼ（１．５ｍｇ／ｍｌ）（Gibco BRL., Grand Island, NY）及びヒアルロニダーゼ（２０μｇ／ｍｌ）（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を用いて以前説明したとおり（１）に消化した。消化したら、細胞をプラスチック上にＤＭＥＭ培地（EuroClone Ltd., West York, UK）中で３７℃で５％ＣＯ2の湿度化した雰囲気中に維持した。培養１２時間後に、癌細胞を単層で免疫細胞化学のために成長させるか、又は、トリプシン＋ＥＤＴＡを用いて、機能的な、タンパク質発現及び遺伝子転写レベル分析のために剥離した。結腸及び胃の細胞培養のために、プラスチックをコラーゲン（Calbiochem GmbH, Darmstadt, Germany）／ｃｍ2で被覆した。癌細胞を、ヒトの組み換えＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（４０ｎｇ／ｍｌ）（Euroclone, Paignton, UK）、ヒトＩＬ−４に対する中和抗体（１０μ／ｍｌ）（R&D Systems, Europe, Ud）の存在又は非存在下で４８時間培養した。抗ＣＤ９５（mAb CH-11 , IgM; Upstate Biotechnology Inc.）又は対照ＩｇＭ（Sigma）又はイソロイシンジッパーＴＲＡＩＬ（iz-TRAIL; 200 ng/ml）を使用して、癌細胞中でのＣＤ９５又はＴＲＡＩＬ誘導されるアポトーシスに対する感受性を決定した。更に、抗ＩＬ−４及び抗ＩＬ−１０癌細胞に対する暴露後に、オキサリプラチン（１００μＭ）又はドキソルビシン（５μＭ）又はシスプラチン（３００ｎｇ／ｍｌ）又はタキソール（５μｇ）（Sigma）又はエトポシド（1 μM; Biomol, Plymouth Meeting, PA）で処理した。
【００４５】
生存及び死のアッセイ。アポトーシスの発生を評価するために、ＤＮＡ染色及びフローサイトメトリー分析を実施した。低二倍体の核のパーセンテージは、Stassi et al., Cancer Res. 2003, 63 (20):6784-90に説明されるとおりに評価した。又は、ヒトの精製した癌細胞を、９６ウェルプレート中に、トリプリケートで、１５０００細胞／ウェルで配置し、かつ、培養した。生細胞の数をCellTiter Aqueous Assay Kit (Promega Corporation, Wl, USA)により検出し、この際製造者の指示に従った。２×１５０／ｍｌで配置され、かつ、ＣＤ９５活性化抗体ＣＨ１１（２００ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＨｕＴ７８細胞を、細胞死の測定のためのポジティブコントロールとして使用した。
【００４６】
免疫組織化学分析。免疫組織化学を、５μｍの厚さのパラフィン−包理された結腸、胃、前立腺、胸、胚、肝臓、膵臓、腎臓及び膀胱の正常の及び腫瘍の試料画分に対して実施した。脱ワックスされた画分を、１０分間電子レンジ炉中で０．１Ｍのクエン酸緩衝液中で処理した。次いで、画分を１０分間トリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ）（非特異的な染色を遮断するため１０％のＡＢ  ヒト血清を含有する）でインキュベーションした。過剰の血清を除去した後に、画分を一晩４℃で、ＩＬ−４（B-S4 マウス IgGI , Caltag Laboratories, Burlingame, CA）、ＩＬ−１０（B-N10 マウス IgG2a, Caltag）、ＩＬ−４Ｒα（C-20 ウサギ IgG Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA）、ＩＬ−１０Ｒ（C-20 ウサギIgG Santa Cruz Biotechnology）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（HS101 マウスIgGI , Alexis Biochemicals, Lausen, CH）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（HS201 マウスIgGI , Alexis）に対する特異的な抗体又はアイソタイプがマッチした対照に適した希釈で曝した。一次抗体に対する暴露後に、細胞をビオチン化した抗ウサギ又は抗マウス免疫グロブリンで処理し、ＴＢＳ中で洗浄し、次いで、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Dako LSAB 2 Kit, Dako Corporation Carpinteria CA, USA）でインキュベーションした。染色を３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）を比色基質として使用して検出した。細胞の対比染色を水性のヘマトキシリンを用いて実施した。
【００４７】
ＲＴ−ＰＣＲ分析。全ＲＮＡを、製造者の指示に従って、the Rneasy Mini Kit（Qiagen GmbH, Germany）を用いて培養した細胞から調製した。逆転写及びＰＣＴ増幅をそれぞれの調製物に対して１μｇの全ＲＮＡを用いて、OneStep RT-PCR Kit（Qiagen）を用いて実施した。ＩＬ−４をコードする配列に対して特異的な２つのプライマー5'-CCA CGG ACA CAA GTG CGA TAヌクレオチド４３６−４５５（エキソン１）及び5'-CCT TGC AGA AGG TTT CCT TCT-3′ ヌクレオチド５６４−５８４に対する相補配列（エキソン３）（GenBank アクセッション番号 NM 000589.2）を、ＩＬ−４を特異的に増幅するために選択した。ＧＡＰＤ遺伝子を、同じＲＮＡ調製物からハウスキーピング対照として増幅した（コード配列：5'-TGA CAT CAA GAA GGT GGT GA-3' 、ヌクレオチド843-863及び5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'、ヌクレオチド1033-1053に対して相補的 ; NM-002046 アクセッション番号）。３５回のサイクルを実施し、それぞれは以下の条件からなる：９４℃、３０秒間、５８℃、３０秒間、７２℃、３０秒間。
【００４８】
タンパク質単離及びウェスタンブロット分析。細胞ペレットを、氷冷したＮＰ−４０溶解緩衝液（５０ｍＭ、トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  ＮＰ−４０）中に再懸濁し、これは、Stassi et al. Nature Immunology 2000, 1 , 1-6に説明されるとおりの、プロテアーゼ阻害剤を含有する。アクチン（Ab-1 , マウス IgM, Calbiochem, Darmstadt, Germany）、ＣＤ９５Ｌ（G247-4, マウス IgG1 , PharMingen, San Diego）、ＣＤ９５（C-20, Santa Cruz Biotechnology）、ｃＦＬＩＰ（NF6 マウスIgG1 , Alexis Biochemicals, Switzerland）、ＰＥＤ／ＰＥＡ−１５（ウサギ IgG G. Condorelliの親切により提供）、Ｂｃｌ−２（124, マウスIgG1 , Upstate Biotechnology Inc.）及びＢｃｌ−Ｘｌ（H-5, マウスIgG1 , Santa Cruz Biotechnology）に対して特異的なＡｂｓの免疫ブロッティングをＨＲＰにコンジュゲートした抗マウス又は抗ウサギＡｂｓ（Amersham Biosciences UK Limited, England）によって検出し、かつ、化学発光検出系（SuperSignal West Dura Extended duration Sustrate, Pierce, Illinois, USA）を用いて視覚化した。
【００４９】
実施例１
癌細胞中でのＩＬ−４の自己分泌産生
腫瘍微小環境が、癌細胞の表現型及び機能に影響を及ぼすかどうかを検査するために、自己分泌的に癌の甲状腺細胞により産生されることが以前に見出されたＩＬ−４及びＩＬ−１０の存在を評価した。免疫組織化学分析は、検査された充実性腫瘍の組織型（histotype）の全てが、高レベルのＩＬ−４を発現し、その一方でＩＬ−１０はあまり検出可能でないことを実証した。結果は第１表中に示される。
【００５０】
第１表  癌細胞中でのサイトカイン発現
【表１】
2010514409.tif 000002
【００５１】
興味深いことに、ＩＬ−４に対する反応性は、結腸、胸、肺、胃、肝臓、前立腺、膵臓、腎臓及び膀胱の癌細胞に局在しており、このことは、癌細胞は、ＩＬ−４のための高い産生源であり、そしてＩＬ−１０のためにはそうでないことを示唆する（第１表及び図１ａ）。腫瘍細胞中で観察された反応性がもっぱら、浸潤するＴ細胞による２の種類のサイトカインの放出のためであるとの可能性を排除するために、新規に精製された結腸、胸、胃及び肺の癌細胞をＲＴ−ＰＣＲにより分析した。免疫組織化学的試験と一致して、精製された癌細胞のＩＬ−４のｍＲＮＡ発現のレベルは、関連する正常細胞と比較してかなり増加しており（図１ｂ）、これは、ＩＬ−４の自己分泌産生が、甲状腺の癌細胞に限定されるのではなく、ＩＬ−４のかなりの量を産生する充実性腫瘍からの他の上皮の悪性の細胞中でも起こることを実証する。
【００５２】
上皮癌細胞は、高レベルの抗アポトーシス性タンパク質を発現する。 結腸、胸、胃及び肺の癌細胞は、デスリガンドに対して、そして、化学療法により誘発される細胞死に対して抵抗性である。この不応答性を担う機構を決定するために、抗アポトーシス因子の異常発現が、デスリガンド又は化学療法により生じられる、損なわれた「外因性の」及び「内因性」の、アポトーシスシグナル経路において関連付けられることができるかどうかを検査した。免疫組織化学及びウェスタンブロット分析により、上皮の癌腫細胞は、ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現することが見出された（図２ａ及びｂ）。従って、本発明の発明者らは、ｃＦＬＩＰ、ＰＥＤ／ＰＥＡ−１５、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−２の、結腸、胸、胃及び肺の正常及び癌の細胞中での存在を評価し、そして、発現レベルを測定した。ｃＦＬＩＰ及びＰＥＤ／ＰＥＡ−１５のレベルが、新規に精製された癌の細胞中で、正常の結腸、胸及び肺の細胞に比較して、約３倍より高く（図２ａ）、Ｂｃｌ−ｘＬレベルは、４倍より高い。Ｂｃｌ−２発現のレベルは、全ての分析した癌細胞中で、正常細胞と比較して２倍のみより高かった。従って、結腸、胸、胃及び肺の癌細胞中の抗アポトーシス遺伝子上方調節は、ＣＤ９５−、ＴＲＡＩＬ−及び化学療法誘発されたアポトーシスに対して、抵抗性を付与する可能性がある。
【００５３】
ＩＬ−４は、上皮の癌細胞の生存、成長を増加させる。正常の及び癌の両者の細胞中のＩＬ−４レセプターの発現を評価した。パラフィン包理した画分に対する免疫組織化学は、ＩＬ−４レセプターが、全ての分析した癌組織中で発現していることを示した。この結果を、以下の第２表及び図３ａ中に示す。
第２表  癌細胞中でのＩＬ−４発現
【表２】
2010514409.tif 000003
【００５４】
腫瘍細胞の生存に対するＩＬ−４の可能性のある関与を検査するために、結腸、胸、胃及び肺の正常細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４に暴露し、かつ、細胞成長について分析した。ＩＬ−４は、結腸、胸及び肺の正常細胞の成長速度を顕著に増加させた（図３ｂ）。更に、癌細胞の、ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ及び化学療法剤に対する不応性におけるＩＬ−４の関与を決定するために、正常の結腸、胸、胃及び肺の細胞をＩＬ−４で前もってインキュベーションし、ついで、デスリガンド及び化学療法細胞死抵抗性において関連する、これらの抗アポトーシス性タンパク質の発現について分析した。ＩＬ−４はｃＦＬＩＰ、ＰＥＤ／ＰＥＡ−１５、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−１２の正常な結腸、胸（図３ｃ）、胃及び肺の細胞中でのタンパク質レベルを増加させ、このことは、自己分泌的なＩＬ−４産生が、癌細胞を、化学療法及びデスレセプター刺激から保護し、抗アポトーシス因子を上方調節している可能性があることを示唆する。
【００５５】
ＩＬ−４の中和は、ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ及び化学療法により誘発される癌細胞中での増殖停止（growth arrest）及び細胞死を促進する。ＩＬ−４の自己分泌産生がＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ及び化学療法から細胞死を保護することに寄与していることを直接的に実証するために、我々はＩＬ−４中和の効果を、結腸、胸及び肺の癌細胞中で検査した。新規に精製した結腸、胸、胃及び肺の癌細胞の、ＩＬ−４に対する中和抗体への４８時間の暴露は、癌細胞を化学療法−及びデスレセプター誘発細胞死に対して敏感化させ、これは、ＩＬ−４の充実性癌における抗アポトーシス的な役割を確認する。この結果を図４ａ〜ｃに示す。
【００５６】
更に、ＩＬ−４中和は、結腸、胸、胃及び肺の腫瘍細胞成長を、１５日間まで遮断し（図５）、そして、ｃＦＬＩＰ、ＰＥＤ／ＰＥＡ−１５、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−２のタンパク質発現レベルを下方調節する。これらのデータは、ＩＬ−４の自己分泌産生が、成長制御において重要な役割を果たす可能性があること、そして、癌細胞の生存に対して、特異的に要求されることを示す。
【００５７】
新規に手術された腫瘍患者からの組織試験体を、ＩＬ−４及びＩＬ−１０発現について、種々の標準的な手法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット及び免疫組織化学によりスクリーニングした。同様に、このそれぞれのレセプターの発現を、同じ方法により分析した。精製した癌細胞を次いで、化学療法剤、例えばエトポシド、ドキソルビシン、オキサリプラチン及びアポトーシス誘発剤、例えばＴＲＡＩＬ及びＣＤ９５リガンドに対するその感受性について試験した。この結果を第３表に示す。
第３表、デスレセプター及び化学療法により誘発される細胞死に対する敏感化
【表３】
2010514409.tif 000004
【００５８】
第３表中の結果から示されるとおり、ＩＬ−４抗体の存在下でインキュベーションされた場合に、ＩＬ−４及び／又はＩＬ−１０を発現する正常に抵抗性のあるプライマリーな腫瘍細胞が、この試験された化学療法剤及び／又はアポトーシス促進剤に対して感受性になり、この結果数日のうち細胞の９０％より多くが死亡することが意外にも見出された。デスレセプター及び化学療法により誘発される細胞死に対する特に顕著な敏感化が、結腸、胃、胸、肺、前立腺及び膀胱の癌細胞について示された。
【００５９】
実施例２
この実施例において報告されるデータは、精製された結腸の癌の胚細胞が、高レベルのＩＬ−４を産生し、かつ、癌細胞の、ＩＬ−４に対する中和性の抗体への暴露が、細胞毒性薬剤及びＴＲＡＩＬ−誘発アポトーシスに対して細胞を敏感化させることを明らかにする。更に、以下のデータは、結腸の腫瘍の、化学療法剤及び抗ＩＬ−４剤での組み合わせた処置が、腫瘍の増殖を顕著に減少させることを示す。
【００６０】
結腸のＣＳＣの化学療法剤に対する感受性を検査するために、シスプラチン（３００ｎｇ／ｍｌ）及びオキサリプラチン（１００μＭ）に対して暴露された結腸のＣＳＣスフェロイドの生存率を測定し、これに均等な用量は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの癌治療の間に達成される。更に、結腸のＣＳＣを、アポトーシス誘発性のデスリガンドＴＲＡＩＬ（２００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。ヒトの大腸癌の試験体からのプライマリー（付着性の）細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで同じ感受性を、全ての試験した３種の薬剤に対して示し、これに対して結腸のＣＳＣは顕著に抵抗性であり、このことは、ＣＳＣが、薬剤により誘発されるアポトーシスに対して比較的不活性であることを確認する（図６ａ）。これは、ＣＳＣは、抗腫瘍療法を免れる可能性があること、そしてこれが、化学療法の非効率性の根底をなす理由であることを示唆する。
【００６１】
結腸ＣＳＣ中でのＩＬ−４産生が、抗アポトーシスタンパク質の上方調節を、そして従って、療法不応性を担うことを正式に証明するために、ＣＳＣを、２日間ＩＬ−４中和性抗体で前処理し、次いで、細胞死及び抗アポトーシス性発現について測定した。ｃ−ＦＬＩＰ、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＰＥＤのタンパク質レベル、抗アポトーシスタンパク質は前に、癌中でＩＬ−４により制御されることが示され、これは、抗ＩＬ−４に暴露されたＣＳＣ中で〜２分の１倍まで減少される（図６ｂ−ｃ）。更に重要なことは、ＩＬ−４遮断に引き続き、ＣＳＣ細胞死が、化学療法剤又はＴＲＡＩＬでの処理により顕著に増加される（図６ｄ−ｅ）。
ＩＬ−４が、ＣＳＣにより産生される大腸癌を化学療法剤から保護することを直接的に実証するために、ＩＬ−４中和の効果をｉｎ  ｖｉｖｏ中で検査した。腫瘍を１０日間成長させ（サイズ〜０．２ｃｍ3）、そして次いで腫瘍内にＩＬ−４に対する中和性の抗体で又は対照のＩｇＧで、一週間に２回３週間処置した。対照ＩｇＧと組み合わせた、オキサリプラチンでの、一週間に１回、４週間の腹腔内（ｉ．ｐ．）処理がマウス中での腫瘍サイズを減少させたにもかかわらず、化学療法の処置の効率は、ＩＬ−４中和性抗体により顕著に促進された（図７ａ及び７ｂ）。
【００６２】
実施例３
ＩＬ−４ＲＩＬ  １３Ｒ−Ｆｃ融合ポリペプチドの構築
シグナルペプチド及びＩＬ−４レセプター−アルファの細胞外ドメイン（aa1aa231、NCBI アクセッションNP_000409）を、Ｎ末端でＩＬ−１３レセプターアルファ細胞外ドメイン（aa27-aa343 、NCBI アクセッションNP_001551）に対して融合させた。２点突然変異を、ＩＬ−４Ｒ−アルファ１配列（Gly2->Val2 及び Cys207->Ser207）中に導入し、かつ、単一の点突然変異をＩＬ  １３Ｒ−アルファ１配列（Cys46->Ala46）中に導入した。点突然変異の列挙は、ＮＣＢＩデータベースエントリ、ＩＬ−４Ｒアルファ１に対してNP_000409そして、ＩＬ−１３Ｒ  アルファ１に対してNP_001551をも示す。
【００６３】
このＩＬ４ＲＩＬ１３Ｒタンパク質配列は、ヒトのＩＧＨＧ１のＦｃ部分に融合された（aa254-aa479、 NCBIアクセッション AAH69020）。更に、柔軟なリンカー要素及びFlexstreptag-ll−モチーフ(SSSSSSAWSHPQFEK) をＣ末端に付加した。この生じるＩＬ４ＲＩＬ  １３Ｒ−Ｆｃコンストラクトのアミノ酸配列を以下に示し、これは合成のＤＮＡ配列に逆翻訳され、かつ、このコドン利用は、哺乳類の細胞ベースの発現について最適化された。遺伝子合成を、ENTELECHON GmbH（Regensburg, Germany）により実施した。この最終的な発現カセットを、プラスミドのユニークなＨｉｎｄ−ＩＩＩ及びＮｏｔ−Ｉ部位を用いてpCDNA4-HisMax-骨格中にサブクローニングした。
【表４】
2010514409.tif 000005
【００６４】
ＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−Ｆｃ融合ポリペプチドの改変は以下のようであってよい：
−シグナルペプチドの非存在又は非相同性のシグナルペプチドの存在、
−異なる、例えば短縮されたＩＬ−４Ｒ  ＥＣＤの存在、例えば様々な突然変異、特に点突然変異有り又は無しで、
−異なるエフェクタードメインの存在、
−異なるＦｃドメインの存在、及び／又は
−Ｃ末端の精製ドメインの非存在（特に、医薬適用のために）。
【００６５】
実施例４
ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ融合ポリペプチドの構築
シグナルペプチド及び短縮した、ＩＬ４−レセプターアルファの細胞外ドメイン（aa1-aa224 、NCBI アクセッション NP_000409）をＮ末端で、ヒトのＩＧＨＧ１のＦｃ部分（aa250-aa479 、NCBI アクセッション  AAH69020）に融合した。２個の点突然変異を、ＩＬ４Ｒ−アルファ１配列（Gly2>Val2及びCys207->Ser207）中に導入した。１つのグリシンを、この２つのドメイン中に挿入し、かつ、ヒンジ領域中の、ヒトのＩＧＨＧ１のＬｙｓ２５１をアルギニンに突然変異させた。この説明した突然変異の列挙は、ＮＣＢＩデータベースエントリ、ＩＬ４Ｒアルファ１に対してNP_000409そして、ＩＧＨＧ１に対してNCBI アクセッション AAH69020をも示す。
【００６６】
更に、柔軟なリンカー要素及びFlexstreptag-ll−モチーフ(SSSSSSAWSHPQFEK) をＣ末端に付加した。この生じるＩＬ４Ｒ−Ｆｃコンストラクトのアミノ酸配列を以下に示し、これは合成のＤＮＡ配列に逆翻訳され、かつ、このコドン利用は、哺乳類の細胞ベースの発現について最適化された。遺伝子合成を、ENTELECHON GmbH（Regensburg, Germany）により実施した。この最終的な発現カセットを、プラスミドのユニークなＨｉｎｄ−ＩＩＩ及びＮｏｔ−Ｉ部位を用いてpCDNA4-HisMax-骨格中にサブクローニングした。
【表５】
2010514409.tif 000006
【００６７】
短縮化されたＩＬ−４Ｒ融合ポリペプチドの改変は以下のようであってよい：
−シグナルペプチドの非存在又は非相同性のシグナルペプチドの存在、
−異なる、例えば短縮されたＩＬ−４Ｒ  ＥＣＤの存在、例えば様々な突然変異、特に点突然変異有り又は無しで、
−異なるＦｃドメインの存在、
−ＩＬ−４Ｒ  ＥＣＤ及びＦｃドメインの間の異なる融合ドメイン、例えば、配列ＲＳＣ（位置227-229）の１つ異常のアミノ酸の欠失、及び／又は
−Ｃ末端の精製ドメインの非存在（特に、医薬適用のために）。
【００６８】
実施例５
ＩＬ−４結合タンパク質、ＩＬ４Ｒ−Ｆｃ及びＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−Ｆｃの発現及び精製
１０％ＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ＋GlutaMAX (GibCo)中で成長させたＨｅｋ  ２９３細胞を、ＩＬ４Ｒ−Ｆｃ及びＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−Ｆｃそれぞれをコードするプラスミドで一過的にトランスフェクションした。組み換えタンパク質を含有する細胞培地上清を、トランスフェクション３日後に回収し３００ｇの遠心分離により清澄にし、この後に、０．２２μｍの滅菌フィルターを通じて濾過した。アフィニティ精製のために、ストレプタクチンセファロースをカラムに充填し（ゲル床  １ｍｌ）、１５ｍｌの緩衝液Ｗ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍｌ  ＮａＣｌ、ｐｈ８．０）で平衡化し、かつ、このそれぞれの細胞培地の上清を、このカラムに流速４ｍｌ／分で適用した。引き続き、このカラムを、緩衝液Ｗで洗浄し、結合したＩＬ４Ｒ−Ｆｃ又はＩＬ４Ｒ−ＩＬ  １３Ｒ−Ｆｃを段階式に、６×１ｍｌの緩衝液Ｅ（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  デスチオビオチン  ｐＨ８．０）の添加により溶出した。この溶出物画分のタンパク質の量を定量化し、かつ、このピーク画分を、超濾過により濃縮化し、そして更に、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により精製した。銀染色後のＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−Ｆｃのストレプタクチン親和精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図８Ａ中に示す。
【００６９】
ＳＥＣを、Superdex 200カラムに対して、Aktaクロマトグラフィ系（GE-Healthcare）を用いて実施した。このカラムを、リン酸で緩衝化した食塩水で平衡化し、かつ、この濃縮した、ストレプタクチン精製したＩＬ４Ｒ  Ｆｃ又はＩＬ４Ｒ−ＩＬ  １３Ｒ−Ｆｃそれぞれを、このＳＥＣカラムに流速０．５ｍｌ／分で負荷した。２８０ｎｍでの吸光度により観察されるこの溶出特性は、１０．３１ｍｌでＩＬ４Ｒ−ＩＬ  １３Ｒ−Ｆｃについて（図８Ｂ）、そして１２．９７ｍｌでＩＬ４Ｒ−Ｆｃについて（図９Ａ）顕著なタンパク質ピークを示した。ＩＬ４Ｒ−ＦｃについてのＳＥＣ画分を更に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色により、変性条件下で分析した（図９Ｂ）。
【００７０】
天然の条件下でのこの見かけ分子量の決定のために、Superdex 200カラムに、既知の分子量の標準タンパク質を負荷した。この標準タンパク質の溶出容積に基づき、校正曲線を計算し、そして、精製したＩＬ４Ｒ−Ｆｃの見かけ分子量を１３７ｋＤａであると決定し、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察される分子量に良好にフィットする。ＩＬ４Ｒ−Ｆｃのアミノ酸配列に基づく理論分子量は、モノマー状タンパク質に対して５２．８ｋＤａである。生化学的分析に基づき、ＩＬ４Ｒ−Ｆｃは、タンパク質二量体として発現しているようである。
【００７１】
ＩＬ４Ｒ−ＩＬ  １３Ｒ−Ｆｃについては、ＳＥＣに基づく見かけの分子量は、約６００ｋＤａであると計算された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づき、このタンパク質は、約２５０ｋＤａを有するシングルバンドとして流れる。ＩＬ４Ｒ−ＩＬ  １３Ｒ−Ｆｃのアミノ酸配列に基づく理論分子量は、８７．７ｋＤａである。原則的に、この分子の構成は、理論分子量約１８０ＫＤａを有する安定な二量体のタンパク質を生じるべきである。従って、ＳＥＣにより見受けられるこの高い見かけ分子量は、ＳＥＣ中での異常な挙動又はタンパク質の更なるオリゴマー化を示す。
【００７２】
ＩＬ４−プルダウンアッセイ
ＩＬ４Ｒ−Ｆｃ及びＩＬ４Ｒ−ＩＬ  １３Ｒ−Ｆｃの特異的ねＩＬ４結合について試験するために、４μｇのそれぞれの両方のタンパク質を、ストレプタクチンセファロースに対してそのＳｔｒｅｐタグを介して固定した。この固定されたタンパク質を引き続き、６０分間４００ｎｇの組み換えにより発現したヒトのインターロイキン４（ＩＬ４）で、全容積４００μｌのリン酸緩衝化した食塩水中でインキュベーションした。引き続き、このビーズを洗浄し、そして結合したタンパク質を、全容積４０μｌの溶出緩衝液中でデスチオビオチンで特異的に溶出した。溶出されたタンパク質を最後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色を介して分析した。図１０中に示されるとおり、ＩＬ４Ｒ−Ｆｃ及びＩＬ４Ｒ−ＩＬ  １３Ｒ−Ｆｃの両方は、ヒトのＩＬ４の特異的な結合を示し、これは、対照の実験中では見ることができないＩＬ４タンパク質（１２ＫＤａ）の存在により示される。
【００７３】
実施例６
癌の胚細胞及びｌプライマリーな腫瘍細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性
ＩＬ４Ｒ−Ｆｃ及びＩＬ４Ｒ−ＩＬ  １３Ｒ−Ｆｃのアポトーシスを誘発するための能力を試験するために、両方のタンパク質を、乳癌の胚細胞の成長培地に単独で又はドキソルビシンと組み合わせて添加した。図１１Ａは、ＰＢＳ（ｗ／ｏ）又は１０μｇのＩＬ４Ｒ−Ｆｃ、ＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−Ｆｃ又は抗ＩＬ４抗体を用いて２４時間前処理し、引き続き更なる２４時間５μＭドキソルビシンに暴露した、乳癌球体の免疫蛍光分析を示す。オレンジのアクリジン／エチジウムブロミド（赤：死細胞、緑：生細胞）で細胞を染色した。この単一の処理（ドキソルビシン単独）と比較して、ドキソルビシンとＩＬ４Ｒ−Ｆｃ又はＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−Ｆｃそれぞれとの組み合わせは、アポトーシス性の乳癌胚細胞の量を明らかに増加させる。アポトーシス性の細胞と生細胞を区別し、引き続き細胞生存率のパーセンテージについてプロットされた細胞カウントもまた、アポトーシスの誘発のためのこの組み合わせ治療の有効性を実証する（図１１Ｂ）。重要なことは、ＩＬ４Ｒ−Ｆｃ及びＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−Ｆｃの両方が、ドキソルビシン誘発されたアポトーシスについて乳癌の胚細胞を、ＩＬ４特異的な抗体について示したのと同じ範囲内で敏感化させることができるであり、ＩＬ４は、この実験においてポジティブコントロールとして使用した。
【００７４】
プライマリーな大腸癌細胞に対してＩＬ４Ｒ−Ｆｃ及びＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−Ｆｃコストラクトを、オキサリプラチン処理と組み合わせて試験した。プライマリー大腸癌細胞を、ＰＢＳ（ｗ／ｏ）又は１０μｇのＩＬ４Ｒ−Ｆｃ、ＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−Ｆｃ又は抗ＩＬ４抗体を用いて２４時間前処理し、引き続き更なる２４時間１００μＭオキサリプラチンで暴露した。このグラフは、ＭＴＳ分析により測定される細胞生存率のパーセンテージを示す（CellTiter 96, Aquos, Promega）。図１１Ｃ中に示されるとおり、両方のコンストラクトは、プライマリー大腸癌細胞をオキサリプラチンにより誘発されたアポトーシスのために敏感化させることができ、これはオキサリプラチン処理単独と比較して減少した細胞生存率により示唆される。
【図１ａ】
2010514409.tif 000007
【図１ｂ】
2010514409.tif 000008
【図２ａ】
2010514409.tif 000009
【図２ｂ】
2010514409.tif 000010
【図３ａ】
2010514409.tif 000011
【図３ｂ】
2010514409.tif 000012
【図３ｃ】
2010514409.tif 000013
【図４ａ】
2010514409.tif 000014
【図４ｂ】
2010514409.tif 000015
【図４ｃ】
2010514409.tif 000016
【図５】
2010514409.tif 000017
【図６ａ】
2010514409.tif 000018
【図６ｂ】
2010514409.tif 000019
【図６ｃ】
2010514409.tif 000020
【図６ｄ】
2010514409.tif 000021
【図６ｅ】
2010514409.tif 000022
【図７ａ】
2010514409.tif 000023
【図７ｂ】
2010514409.tif 000024
【図８Ａ】
2010514409.tif 000025
【図８Ｂ】
2010514409.tif 000026
【図９Ａ】
2010514409.tif 000027
【図９Ｂ】
2010514409.tif 000028
【図１０】
2010514409.tif 000029
【図１１Ａ】
2010514409.tif 000030
【図１１Ｂ】
2010514409.tif 000031
【図１１Ｃ】
2010514409.tif 000032
【国際調査報告】
2010514409.tif 000033
2010514409.tif 000034
2010514409.tif 000035
2010514409.tif 000036
2010514409.tif 000037
2010514409.tif 000038