(57)【要約】本発明は、標的核酸を、前記標的核酸を含む試料から単離するための方法に関し、該方法は、前記標的核酸を含有する試料を結合溶液及び核酸結合マトリクスと混合する工程、前記標的核酸の少なくとも一部を前記核酸結合マトリクスに結合させる工程を含み、その際、非標的核酸の混入を減らすために、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物によって前記核酸結合マトリクスは同時に処理され、又はあらかじめ処理されており、或いは前記核酸結合マトリクスは疎水性基で修飾される。さらに、それぞれのキット及び試薬は、本発明の教示により提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸、すなわち、ＲＮＡを、前記標的核酸を含む試料から単離する方法であって、
（ａ）前記試料を核酸結合マトリクスに接触させる工程、
（ｂ）前記標的核酸の少なくとも一部を前記核酸結合マトリクスに結合させる工程、
その際、（ｉ）前記核酸結合マトリクスは、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物によって同時に処理されるか、又はあらかじめ処理されており、その際、得られる標的核酸の調製物における非標的核酸の混入を減らすために前記化合物は解離した形態又は溶媒和の形態又は塩の形態で使用されてもよく；及び／又は
（ｉｉ）得られる標的核酸の調製物における非標的核酸の混入を減らすために、前記核酸結合マトリクスは疎水性基を持っており；
（ｃ）前記核酸結合マトリクスから前記標的核酸を得る工程を含む方法。
【請求項２】
カオトロピック剤を含む結合溶液が使用される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸が吸着によって結合される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、Ｓｎ、Ｆｅ、Ｚｒ、Ｔａ、Ｔｉ、Ａｌ及びＧｅから成る群から選択される金属物質を含む請求項１〜３の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項５】
主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む前記化合物が、塩の形態、塩錯体の形態又は加水分解可能な化合物の形態で使用される請求項１〜４の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が塩の形態で使用され、その際、ハロゲン化物、偽ハロゲン化物、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩から成る群から選択されるアニオンが使用され、および酢酸塩、クエン酸塩及び酒石酸塩のような有機酸の共役塩基が好適である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物が、塩化ジルコニウム、四塩化チタン、塩化アルミニウム、塩化スズ、塩化第二鉄、塩化第三鉄、アルミニウムイソプロポキシド、チタンイソプロポキシド、ジルコニウムイソプロポキシド、オルソチタン酸クロロトリイソプロピル、ホウ酸トリイソプロピル、ジルコニウムイソプロポキシドイソプロパノール錯体、酸化塩化ジルコニウム、アルミニウムトリイソプロピレート及び五塩化タンタルから成る群から選択される請求項５及び６に記載の方法。
【請求項８】
以下の方法の少なくとも１つに従って、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む前記化合物に前記核酸結合マトリクスを接触させる請求項１〜７の少なくとも１項に記載の方法：
（ａ）主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物を含有する溶液に前記核酸結合マトリクスを浸漬し、および前記浸漬された核酸結合マトリクスを乾燥させること；及び／又は
（ｂ）気相にて、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物と前記核酸結合マトリクスを反応させること；及び／又は
（ｃ）少なくとも２つの異なった種類の核酸を含有する試料からの核酸単離を実施する前に、核酸結合マトリクスに適用する液体溶液に、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物を添加すること；及び／又は
（ｄ）核酸単離に使用される溶解及び／又は結合緩衝液に主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物を添加すること。
【請求項９】
前記核酸結合マトリクスの処理が以下のようにさらに特定される請求項８に記載の方法：
（ａ）前記浸漬溶液は、少なくとも０．０５％、好ましくは少なくとも０．１％の濃度で、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む前記化合物を含み、および、前記物質は好ましくは、ジルコニウム、チタン、タンタル、アルミニウム、ホウ素、ゲルマニウム、鉄及びスズから成る群から選択される、及び／又は
（ｃ）前記前処理溶液は、少なくとも０．０５％、好ましくは少なくとも０．１％の濃度で、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む前記化合物を含み、および、前記化合物は好ましくは、スズ化合物又は第二鉄化合物又は第一鉄化合物である、及び／又は
（ｄ）前記溶解及び／又は結合緩衝液は、少なくとも０．０５ｍＭの濃度で前記化合物を含み、および前記化合物は好ましくはスズ化合物又は第二鉄化合物又は第一鉄化合物である。
【請求項１０】
標的核酸と接触させる核酸結合マトリクスの表面が珪素を含む請求項１〜９の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸結合マトリクスがシリカに基づく物質を含み、又はシリカで被覆した物質を含み、または珪素含有化合物の使用によって核酸結合マトリクスに疎水性基が提供される請求項１〜１０の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記疎水性基が１〜５０の炭素原子の間の長さを有する置換又は非置換のアルキル置換基であり、前記アルキル置換基は分枝鎖構造又は直鎖構造を有してもよい請求項１〜１１の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸結合マトリクスを、少なくとも１つの疎水性基を含むシラン化合物と接触させる請求項１〜１２の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記珪素含有核酸結合マトリクスには、以下の化合物群から選択される化合物と前記マトリクスを接触させることによって疎水性基が提供される請求項１３に記載の方法；
（ａ）少なくとも１つの疎水性基を含む反応性シラン化合物
（ｂ）少なくとも１つの疎水性基を含む単官能性、二官能性又は三官能性のシラン化合物
（ｃ）少なくとも１つの疎水性基を含むアルコキシシラン化合物、ハロシラン化合物又はアミノシラン化合物
（ｄ）      R1R2R3Si-OR4
R1R2Si (OR3) -OR4
R1Si (-OR2)(-OR3)-OR4
又は
R1R2R3Si-N(CH3)2
R1R2Si Me-(N(CH3)2
R1Si Me2-(N(CH3)2
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及び／又はＲ4は、同一の意味を有するか、又は異なった意味を有し、ならびに独立して水素、アルキル置換基、アルキレン置換基、又は官能基から成る群から選択され、およびＲ1、Ｒ2、又はＲ3及び／又はＲ4の少なくとも１つが置換されてもよい又は非置換であってもよい１〜５０の炭素原子の長さを有するアルキル置換基である。
【請求項１５】
疎水性基で前記核酸結合マトリクスを改変するのに使用される前記化合物は、プロピルトリエトキシシラン（ＰＴＳ）、オクタデシルトリメトキシシラン（ＯＴＭ）、ヘキサデシルトリメトキシシラン（ＨＭＳ）、オクチルトリメトキシシラン（ＯＴＳ）、テトラデシルトリメトキシシラン及びオクタデシルトリメトキシシランから成る群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
−前記標的核酸を含む前記試料が溶解され、
−標的核酸と前記核酸結合マトリクスとの複合体が形成され、
−溶解緩衝液が使用されるのであれば、任意で得られた複合体から溶解緩衝液混合物が除かれ
−複合体が任意で洗浄され、
−複合体から標的核酸が得られ、好ましくは溶出される請求項１〜１５の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸結合マトリクスが磁性であり、および結合した標的核酸を有する前記マトリクスが磁界を利用して液相から単離される請求項１〜１６の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１８】
疎水性基を有する核酸結合マトリクスが使用され、請求項１の（ｃ）（ｉ）及びそれに従属している請求項２〜１７に記載されているようにさらに処理が実施される、又は処理が実施されている請求項１〜１７の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１９】
標的核酸、すなわち、ＲＮＡを、前記標的核酸を含む試料から単離するための核酸結合マトリクスの使用であって、少なくとも以下の選択肢の１つによって、得られた標的核酸調製物において非標的核酸の混入を減らすために前記核酸結合マトリクスの結合特性が改変される又は改変されている使用：
（ｉ）主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物によって前記核酸結合マトリクスが同時に処理されるか、又はあらかじめ処理されており、その際、前記化合物が、解離した形態又は溶媒和の形態又は塩の形態で使用されてもよい；及び／又は
（ｉｉ）前記核酸結合マトリクスは疎水性基を有する。
【請求項２０】
前記核酸結合マトリクスが処理される又は処理されている、又は上記請求項１〜１８の少なくとも１項で定義されるような特徴を示す請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
改良された結合特性を有する核酸結合マトリクスの調製及び／又は製造のための、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む化合物の使用。
【請求項２２】
前記化合物、前記核酸結合マトリクスが、請求項１〜１８の少なくとも１項で定義されるように処理される、又は処理されている請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
核酸結合マトリクスであって、
（ａ）以下の方法の少なくとも１つに従って、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物と前記核酸結合マトリクスを接触させることによって得ることができ、その際、前記化合物は、解離した形態又は溶媒和の形態又は塩の形態で使用されてもよく：
−主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物を含有する溶液に前記核酸結合マトリクスをインキュベートし、および前記核酸結合マトリクスを乾燥させること；及び／又は
−気相にて、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物と前記核酸結合マトリクスを反応させること；及び／又は
−標的核酸単離プロトコールを実施する前に、前記核酸結合マトリクスに適用する液体溶液に主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物を添加すること、及び／又は
（ｂ）請求項１３〜１５の少なくとも１項で定義された化合物と前記核酸結合マトリクスを接触させることによって得ることができる核酸結合マトリクス。
【請求項２４】
前記核酸結合マトリクス、前記化合物又は処理条件が請求項１〜１８の少なくとも１項で定義されたものである請求項２３に記載の核酸結合マトリクス。
【請求項２５】
前記核酸結合マトリクスが、スズ化合物及び／又は第二鉄化合物又は第一鉄化合物、好ましくはそれぞれのハロゲン化物、最も好ましくはそれぞれの塩化物で処理される請求項２３又は２４に記載の核酸結合マトリクス。
【請求項２６】
前記核酸結合マトリクスが、磁性金属酸化物を含む請求項２３〜２５の少なくとも１項に記載の核酸結合マトリクス。
【請求項２７】
前記シリカ含有磁性粒子が、塩化ジルコニウム、四塩化チタン、塩化アルミニウム、塩化スズ、塩化第二鉄、塩化第三鉄、アルミニウムイソプロポキシド、チタンイソプロポキシド、ジルコニウムイソプロポキシド、オルソチタン酸クロロトリイソプロピル、ホウ酸トリイソプロピル、ジルコニウムイソプロポキシドイソプロパノール錯体、酸化塩化ジルコニウム、アルミニウムトリイソプロピレート及び五塩化タンタルから成る群から選択される化合物で処理されている請求項２６に記載の核酸結合マトリクス。
【請求項２８】
標的核酸、すなわち、ＲＮＡを、前記標的核酸を含む試料から単離するためのキットであって、
ａ）（ｉ）主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物によって任意で前処理され、その際、混入物を減らすために前記化合物は解離した形態又は溶媒和の形態又は塩の形態で使用されてもよく；及び／又は
（ｉｉ）標的核酸と接触するその表面に疎水性基を有する核酸結合マトリクス；
ｂ）任意で、混入物を減らすために核酸結合マトリクスの結合特性を改変するための溶液、ただし、前記溶液は主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物を含む；
ｃ）非標的核酸の混入を減らすために主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物を含有する溶解及び／又は結合溶液；
ｄ）任意で、洗浄溶液；
ｅ）任意で、核酸結合マトリクスから標的核酸を溶出するための溶液；
を含み、少なくとも選択肢ａ）、ｂ）又はｃ）の１つが満たされるキット。
【請求項２９】
選択肢ａ）とｂ）又は選択肢ａ）とｃ）又は選択肢ｂ）とｃ）又は選択肢ａ）とｂ）とｃ）が実現される請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記化合物、前記核酸結合マトリクス及び／又は前記溶液が請求項１〜１８の少なくとも１項で特定されたように定義される請求項２８又は２９に記載のキット。
【請求項３１】
標的核酸と接触する核酸結合マトリクスの表面が珪素を含む請求項２８〜３０の少なくとも１項に記載のキット。
【請求項３２】
前記核酸結合マトリクスが磁性粒子を含む請求項２８〜３１の少なくとも１項に記載のキット。
【請求項３３】
前記シリカ含有磁性粒子が、塩化ジルコニウム、四塩化チタン、塩化アルミニウム、塩化スズ、塩化第二鉄、塩化第三鉄、アルミニウムイソプロポキシド、チタンイソプロポキシド、ジルコニウムイソプロポキシド、オルソチタン酸クロロトリイソプロピル、ホウ酸トリイソプロピル、ジルコニウムイソプロポキシドイソプロパノール錯体、酸化塩化ジルコニウム、アルミニウムトリイソプロピレート及び五塩化タンタルから成る群から選択される化合物で処理される又は処理されている請求項３２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＲＮＡ及びＤＮＡ双方の核酸を単離し、調製する方法は、技術水準で数年来使用され、ますます重要性を高めている。たとえば、抽出／沈殿、クロマトグラフィ、特に吸着クロマトグラフィ、電気泳動及びアフィニティ分離のような幾つかの精製方法が知られている。
【背景技術】
【０００２】
既知の方法は普通、機械的な作用及び／又は化学的な作用及び／又は生物学的な作用によって、たとえば、タンパク分解酵素の存在下で界面活性剤によって材料を処理することによって生体材料を溶解することを含む。溶解の後、核酸を回収するために幾つかの異なった方法も知られている。一部は、有機溶媒による、たとえば、フェノール及び／又はクロロホルムによる抽出を含む。核酸を単離するこれらの標準的な方法は、非常に手間がかかり、時間がかかる。出発材料から核酸を精製するのに必要とされる相対的に数の多い工程は、特に、非標的核酸による混入物のリスクも高める。
【０００３】
特に有用なのは、たとえば、シリカマトリクスのような結合マトリクスへの核酸の非配列特異的な吸着に基づく方法である。核酸を単離するための改善された方法には、カオトロピック塩、たとえば、塩化グアニジニウムの使用及び／又はアルコール、たとえば、エタノール若しくはイソプロパノールの使用が含まれる（特許文献１及び特許文献２を参照のこと）。
【０００４】
特許文献３は、核酸を単離する方法に関する。核酸を含有する原料をカオトロピックイオンの存在下で溶解し、次いで核酸の単離に一般に使用される、たとえば、珪藻土又は他のシリカ含有鉱物の支持体のような核酸を吸着する材料で処理する。
【０００５】
特許文献４は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びそのほかの細胞内容物を含有する生体原料から生物学的に活性のあるＲＮＡを単離し、精製する方法を開示している。ＲＮＡを含有する原料を、たとえば、微細に分散されたガラスのようなシリカ含有材料から成る粒子と接触させる。それからＲＮＡが材料に吸着する結合緩衝液は、カオトロピック塩を含有する酸性化された溶液を含む。そのような条件下で、ＲＮＡはシリカ材料に特異的に結合される。
【０００６】
特許文献５は、核酸を結合するシリカに基づく材料又はシリカを被覆した材料から成る多孔性マトリクスの使用も組み入れる単離精製技術を開示している。しかしながら、記載された方法は、カオトロピック塩及びアルコールの非存在下で実施される。
【０００７】
その後の分析反応を可能にするために、標的核酸の未加工の調製を普通実施する。これらその後の反応は、単離手順と単離された標的核酸の純度及び整合性との双方に特定の要求を課する。特に、たとえば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ鎖反応）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）又はＳＳＲ（自己配列複製）のような酵素的増幅反応が後に続く場合、間違った結果を回避するために、標的核酸の調製には、たとえば、細胞成分及び特に非標的核酸のような混入物が混ざっていてはならない。
【０００８】
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、ＲＮＡの単離における一般的な混入物である。このため、一部の市販のＲＮＡ単離キットは、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮＡ分解酵素Ｉ）による混入ｇＤＮＡの選択的な酵素的除去のためのプロトコールを提供している。しかしながら、ＤＮＡ分解酵素Ｉによる処理は結果的にＲＮＡ収量の低下を生じ、商業的に製造されたＤＮＡ分解酵素Ｉに混入しうるリボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）によるＲＮＡの分解を生じる。それに加えて、ＤＮＡ分解酵素Ｉの処理によって、直接手に触れる時間が加えられ、工程に求められる時間の長さが伸び、下流の工程を妨害する可能性がある金属イオンの添加が必要とされ、さらに、ＲＮＡ単離の全体的なコストが高くなる。
【０００９】
従って、核酸調製の、特にＲＮＡ調製の純度を改善することが試みられたが、その際、ゲノムＤＮＡのような混入物の含量をできるだけ低く保つことが目標とされた。
【００１０】
特許文献６は、精製ＲＮＡの収量を高めるために、及びゲノムＤＮＡの混入を減らすために、特定の条件下でカオトロピック溶解溶液におけるリチウム塩の使用を開示している。しかしながら、得られた結果は満足の行くものではない。
【００１１】
特許文献７は、ＲＮＡ分画からゲノムＤＮＡを除くために予備ろ過技術の使用を教示している。方法は、カオトロピック塩及びＲＮＡ吸着用のシリカマトリクスを用いた既知のＲＮＡ技術に基づく。しかしながら、ＲＮＡを単離用のシリカマトリクスに吸着させる前に、ＤＮＡを除くために溶解物を予備ろ過カラムに適用する。ホモジネートが予備ろ過カラムを通過する間に、ゲノムＤＮＡを始めとする細胞性混入物質は予備ろ過カラム内に残存する一方で、溶出物は部分的に精製されたＲＮＡを含有する。次いで、ＲＮＡを吸着し、洗浄するための第２のろ過カラムに溶出物を適用することによってこのＲＮＡをさらに精製する。精製に２つのカラムを必要とし、直接手に触れる時間とコストを増やすので、この方法の欠点は明らかである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，２３４，８０９号
【特許文献２】ＥＰ１１４６０４９
【特許文献３】ＥＰ０３８９０６３
【特許文献４】米国特許第５，１５５，０１８号
【特許文献５】ＷＯ２００５／０４５０３０号
【特許文献６】ＥＰ０８１８４６１
【特許文献７】ＥＰ１５２６１７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、試料から標的とする核酸を単離し／精製するための改善された方法を提供することである。各核酸の単離／精製キット及び核酸結合マトリクスを提供することも本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第１の側面によれば、本発明は、標的核酸を、少なくとも前記標的核酸を含む試料から単離する方法であって、前記標的核酸を含有する前記試料を核酸結合マトリクスと接触させ、前記標的核酸の少なくとも一部を前記核酸結合マトリクスに結合させる工程を含み、その際、前記核酸結合マトリクスへの混入物質の結合を減らすために前記核酸結合マトリクスの結合特性を改変するために、前記核酸結合マトリクスが処理される又は処理されている方法を提供することによって本目的を解決する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】四塩化チタンで前処理したカラムで単離した全ＲＮＡのプロファイルを示す。
【図２】未処理の対照カラムで単離した全ＲＮＡのプロファイルを示す。
【図３】単離されたＲＮＡの純度及び整合性を決定するために、溶出物をホルムアルデヒドゲルに適用した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
第１の実施態様によれば、得られた標的核酸における非標的核酸の混入物を減らすために、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物によって、前記核酸結合マトリクスが同時に（標的核酸の接触／結合の間に）処理される、又はあらかじめ処理されている。次いで、既知の手順、たとえば、溶出工程を用いることによって標的核酸は、核酸結合マトリクスから得られる。
【００１７】
驚くべきことに、本発明者らは、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物による核酸結合マトリクスの処理が、単離された標的核酸プローブに見い出される非標的核酸の混入量を相当に減少させることを見い出した。たとえば、本発明に係る技術を使用した場合、ＲＮＡ調製物におけるゲノムＤＮＡの混入量は、６０倍にまで低下させることができる。
【００１８】
第２の実施態様によれば、混入物質の、特にＲＮＡ調製物の場合のゲノムＤＮＡの結合を減らすために、前記核酸結合マトリクスは、疎水性基を有する／疎水性基が提供される。驚くべきことに、核酸結合マトリクスの表面に疎水性基を提供することは、金属化合物による処理と同様の有利な効果を有することが見出された。前記疎水性基は核酸結合マトリクスに共有結合してもよいし、非共有結合してもよい。
【００１９】
本発明に係る方法は、試料からのＲＮＡの単離／精製に特に好適である。ＲＮＡは、いかなる種類及びサイズであってもよい。ＲＮＡに比べてゲノムＤＮＡはかなり安定なので除去のためには過酷な方法を必要とするので（たとえば、上記参照）、ゲノムＤＮＡの混入が少ないＲＮＡの単離は特に望ましい。しかしながら、本発明に係る前記結合特性を改変する化合物により核酸結合マトリクスを処理する又は誘導体化することによって（上述の選択肢を参照）、技術水準で既知のＲＮＡ単離／精製の標準的なプロトコールを使用した場合、ゲノムＤＮＡの混入量はかなり減少する。得られるＲＮＡの純度に対する顕著な効果によって多数の適用のための上述の追加処理（たとえば、ＤＮＡ分解酵素処理）が陳腐なものになる。数個のカラム／マトリクスを使用することも必要ではなく、１個のカラム／マトリクス手段を使用すればよい。従って、本発明により教示されるような核酸結合マトリクスの特別の処理は、混入、特に非標的核酸による混入が回避されるので、核酸及び特にＲＮＡの単離及び精製のための標準的な方法をかなり改善する。ＲＮＡ調製物の場合、一部の実施態様（たとえば、例５を参照のこと）によれば、ゲノムＤＮＡの混入の得られる減少後について、少なくとも２倍、しかし、普通、さらに大きく、たとえば、少なくとも４倍、６倍、１０倍、１２倍、１４倍、２０倍、又はさらに大きく、たとえば、３０、５０、さらに６０倍を超える。
【００２０】
核酸は好ましくは吸着によって結合するので、イオン交換クロマトグラフィ又は親和性に基づいた精製方法とは異なる。得られる標的核酸調製物での混入物を減らす効果を有する本発明に係る結合特性を改変する化合物は、第１の実施態様によれば、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む。前記化合物は、アルカリ金属物質又はアルカリ土類金属物質、たとえば、リチウム、カリウム及びマグネシウムからは選択されない。従って、前記定義は、たとえば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ2及びＣａＣｌ2のような化合物を含まない。
【００２１】
本発明の結合特性を改変する化合物は、固形物の形態で使用されてもよい。しかしながら、それは、解離した形態又は溶媒和した形態、従って溶液中で、使用されてもよく、存在してもよい。化合物が塩自体ではない場合は、特定の実施態様によって好まれるので、化合物は塩の形態で存在してもよい。核酸結合マトリクスを処理するために使用される化合物は上記で定義されたような金属を含み、元素の形態ではなく、化合物の種類（たとえば、塩又は加水分解可能な化合物）及び含まれる金属に応じて異なった酸化状態で存在することが理解されるべきである。しかしながら、実際の化合物（普通、解離した状態）を得ることについて元素金属から適当な酸化状態の金属を生成するために、適当な還元剤を用いることによって結合特性を改変する化合物をその場で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）作製することも本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。
【００２２】
主要な１３族〜１６族の金属は、Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ及びＰｏである。Ｓｎ及びＡｌは、核酸マトリクスの結合特性を改変するための化合物構成成分として使用されるこの族の非常に好適な金属物質である。しかしながら、Ｓｎが最も好まれる。主要な１３族〜１６族の金属は、Ｇａ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｔｌ及びＰｏから成る群から選択されてもよい。
【００２３】
古典的な半金属は、たとえば、Ｂ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｂ及びＴｅである。非標的核酸の混入を減らすために核酸マトリクスの結合特性を改変することについて、Ｂ及びＧｅは特に好適な半金属物質である。
【００２４】
古典的な遷移金属は、たとえば、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｙ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｌａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇである。遷移金属は、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇから成る群から選択されてもよく、又はＴｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｚｒ、Ｍｏ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｔａ、Ｗ及びＯｓから成る群から選択されてもよい。Ｆｅ、Ｚｒ、Ｔａ及びＴｉが特に好適な遷移金属物質である。
【００２５】
核酸結合マトリクスの結合特性を改変するのに好適な主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む化合物は、好ましくは塩、塩錯体又は加水分解可能な化合物、たとえば、アルコキシド若しくはアミド、アルキレン若しくは水素化物の形態で使用される。本発明に従って使用することができる主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属の好適なアニオンは、たとえば、ハロゲン化物、偽ハロゲン化物、硝酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩である。塩化物、臭化物及びヨウ化物のようなハロゲン化物が特に好まれる。さらに、たとえば、酢酸塩、クエン酸塩及び酒石酸塩のような有機酸の共役塩基も好適である。
【００２６】
本発明の教示に従って使用されてもよい好適な化合物は、とりわけ（ｉｎｔｅｒ  ａｌｉａ）、塩化ジルコニウム、四塩化チタン、塩化アルミニウム、塩化スズ、塩化第二鉄、塩化第三鉄、アルミニウムイソプロポキシド、チタンイソプロポキシド、ジルコニウムイソプロポキシド、オルソチタン酸クロロトリイソプロピル、ホウ酸トリイソプロピル、ジルコニウムイソプロポキシドイソプロパノール錯体、酸化塩化ジルコニウム、アルミニウムトリイソプロピレート及び五塩化タンタルである。
【００２７】
一般的に及び特に非標的核酸の混入を回避するために核酸結合マトリクスの結合特性を改変するために、本発明の実施態様の１つによれば、核酸結合マトリクスを前記結合特性を改変する化合物に接触させることが必要なだけである。別の実施態様によれば、前記核酸結合マトリクスは、少なくとも部分的に疎水性基で修飾されているので、標的核酸と接触する表面に疎水性基を有する。
【００２８】
それぞれ処理された／修飾された核酸結合マトリクスは、そのとき、普通、少なくとも異なった２種の核酸を含む試料から標的核酸を単離する準備が整っており、その際、単離された標的検体中で、標的ではない混入物は減少する。
【００２９】
上記で示されたように、標的核酸（特にＲＮＡ）に向けた結合特性を改善するために核酸結合マトリクスを処理する好適な方法は幾つかある。
【００３０】
実施態様の１つによれば、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む前記化合物を含有する溶液中に核酸結合マトリクスを浸漬することによって前記核酸結合マトリクスを、前記結合特性を改変する化合物に接触させる。そのような溶液中で、化合物は普通、解離した形態で存在する。浸漬及び任意での溶媒の除去及び核酸結合マトリクスの乾燥の後、前記それぞれ処理された核酸結合マトリクスは使用の準備が整っている。前記前処理は、たとえば、より少ない非標的核酸（たとえば、ゲノムＤＮＡ）が結合するので、標的核酸（好ましくは、ＲＮＡ）に向けた核酸結合マトリクスの結合選択性を高める。これは、化合物（または化合物構成成分）とマトリクスの間の化学吸着及び／又は物理吸着の過程によると考えられている。この方法は、改善された特性を有する改変した核酸結合マトリクスを、技術水準で使用される標準的な核酸単離のプロトコール／キットに直接含めることができるという利点を有する。各キットの供給者／製造元又は核酸結合マトリクスの製造元がこの前処理を実施することができる。この手順は、顧客は新しいプロトコールに対応せずに、既知の核酸単離の手順を堅持できるという利点を有する。この方法は、非プロトン性の無水溶媒、たとえば、ＴＨＦ中で使用されてもよい金属ハロゲン化物又は金属アルコキシドのような加水分解可能な金属化合物で核酸結合マトリクスが処理されるべきであるならば、特に好適である。この処理方法に好ましい物質は、ジルコニウム、チタン、タンタル、アルミニウム及びホウ素である。ただし、核酸結合マトリクスの結合特性を改変するために、すでに言及されたような金属塩、たとえば、金属ハロゲン化物、金属硝酸塩、金属リン酸塩及び金属硫酸塩がこの処理方法に好適である。これらの化合物は、プロトン性溶媒又は非プロトン性溶媒における前処理に使用されてもよい。好ましい金属は、アルミニウム、ゲルマニウム及びスズを始めとする非鉄金属（非鉄重金属）である。
【００３１】
前記浸漬溶液は、少なくとも０．０５％、好ましくは少なくとも０．１％の濃度で好ましくは主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む前記化合物を含む。約０．０５〜２０％、０．１〜１５％又は０．１〜１０％の範囲にある濃度で前記化合物を含む浸漬溶液によって良好な結果を得ることができる。さらに高い濃度も当然可能であり、本発明の範囲内に含まれるが、良好な結果を達成するためには必要ではない。
【００３２】
さらなる実施態様によれば、気相において核酸結合マトリクスを、本発明の前記結合特性を改変する化合物に接触させ、その際、化合物の蒸気が、マトリクスの結合特性を改変する役目を負う。
【００３３】
異なった実施態様によれば、標的核酸の単離プロトコールの間に核酸結合マトリクスに適用される液体溶液に前記結合特性を改変する化合物が添加される：
【００３４】
本発明に係る前記結合特性を改変する化合物を含む溶液は、核酸単離を実施する前に前記核酸結合マトリクスを直接前処理するために広く設計されてもよい。従って、単離されるべき標的核酸を含む試料を核酸吸着マトリクスに適用する前に、マトリクスを前処理溶液で前処理し、それによって、標的核酸単離物に非標的核酸混入物があまり存在しないように核酸結合マトリクスの結合特性を改変して、それぞれ改善する。化合物は普通、その解離形態で前記溶液に存在する。そのような前処理溶液は、たとえば、核酸単離キットの構成成分であってもよい。前記前処理溶液は、好ましくは少なくとも０．０５％、好ましくは少なくとも０．１％の濃度で前記化合物を含む。たとえば、１％、５％、１０％以上のようなさらに高い濃度を使用してもよい。しかしながら、良好な結果は、およそ０．０５〜１５％、０．１〜１０％、０．１〜５％又は０．１〜２．５％又は０．１〜１．５％の濃度を有する溶液で得られうる。プロトン性又は非プロトン性の溶媒を使用してもよい。前記前処理溶液と前記核酸結合マトリクスの完全な接触、及び処理後のその容易な取り出しを円滑にするために、前記マトリクスを遠心してもよいし、又は真空を適用してもよい。
【００３５】
或いは、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む前記化合物は、標的核酸を単離するのに普通用いられる溶解緩衝液及び／又は結合緩衝液に添加されてもよい。この方法は再び、核酸の単離に使用される標準的なプロトコールが顧客／ユーザーに好都合なものを変えなくてもよいという利点を有する。実施態様の１つによれば、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む前記化合物は、カオトロピック剤を含む溶解緩衝液及び／又は結合緩衝液に含まれる。カオトロピック剤は一般に核酸の二次構造を緩めるために十分に高い濃度で提供されるカオトロピックイオンを含む。カオトロープは水中で水素結合を崩壊させると考えられている。典型的なカオトロピック剤は、グアニジウム塩、尿素、又はヨウ化物、塩素酸塩、過塩素酸塩又は（イソ）チオシアン酸塩を含む。好ましいカオトロピック剤には、チオシアン酸グアニジニウム及び塩酸グアニジニウムが挙げられる。主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む前記化合物がカオトロピック塩を含む溶液に添加される場合、前記核酸結合マトリクスの結合特性を改変する化合物は、好ましくは、カオトロピック塩自体ではない。前記化合物は好ましくは、少なくとも０．０５ｍＭの濃度で溶解緩衝液及び／又は結合緩衝液に存在する。非常に好適な濃度は、およそ１ｍＭ〜１０ｍＭ又は２０ｍＭの範囲である。
【００３６】
これらの方法（直接前処理溶液、改変された緩衝液）は、有益な結果を達成するのに長い浸漬工程などを必要としないので方法が非常に迅速であるという利点を有する。これらの処理方法は、たとえば、塩化スズ又は塩化第二鉄又は塩化第一鉄のような塩として好ましくは使用されるスズ化合物及び第二鉄又は第一鉄化合物にとって特に好ましい。
【００３７】
核酸結合マトリクスを処理するために記載される１より多い方法を使用することも本発明の範囲内である。各処理に１を超える化合物（たとえば、２、３又は４の化合物）を使用することもできる。本発明者らは、併用処理は、上記手順が単離された標的核酸の純度をさらに改善し、混入物、特に標的ではない混入物、たとえばＲＮＡ調製物の場合のＤＮＡをさらに減らすので、かなりの相乗効果をもたらすことを見い出した。
【００３８】
従って、実施態様の１つによれば、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物を含む溶液中で核酸結合マトリクスを浸漬する。次いで任意でマトリクスから溶媒を除き、マトリクスを乾燥させる。次いで、そのような前処理された核酸結合マトリクスを標的核酸の単離に又はキットの構成成分として使用する。混入のリスクをさらに減らすために、方法又は個別のキットは、核酸結合マトリクスの結合特性をさらに改変するために主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む化合物を含む溶液を提供する。前記化合物はたとえば、分離緩衝液に含まれてもよく、又は溶解緩衝液及び／又は結合緩衝液に含まれてもよい。
【００３９】
本発明の第２の選択肢によれば、非標的核酸の混入、特にゲノムＤＮＡの混入の量を減らして標的核酸調製物、好ましくはＲＮＡ調製物を得るために、核酸結合マトリクスは疎水性基を有する。従って、本発明の根底にある課題を解決するために、この代替実施態様によって上述の金属化合物の選択肢と同じ結果が達成される。
【００４０】
核酸結合マトリクスに疎水性基を共有結合で又は非共有結合で結合することができる。共有結合は、たとえば、適当なリンカーを介して生じることができる。
【００４１】
前記疎水性基は好ましくは、１〜５０の間の、好ましくは１〜４０、さらに好ましくは１〜２０の間の炭素原子の長さを有する置換又は非置換のアルキル置換基である。前記アルキル置換基は、分枝鎖又は直鎖の構造を有してもよい。前記アルキル置換基は置換基、たとえば、アルコール類、エーテル、エステル、アミド類、アミン類、ニトリル類のようなＯ、Ｓ、Ｎ、ハロゲン又はリン基を含むもの、又は類似の官能基を持っていてもよい。
【００４２】
実施態様の１つによれば、前記核酸結合マトリクスは、少なくとも１つの疎水性基を有するシラン化合物で誘導体化される。前記シラン化合物は好ましくは反応性シラン化合物であり、官能基を有してもよい。シラン化合物は基本的にアルカン類と同じ官能基を組み入れてもよい。少なくとも１つの疎水性基を有する前記シラン化合物は、アルコキシシラン類及びアミノシラン類、ハロシラン類から成る群から選択することができる。前記シラン化合物は、単官能性、二官能性又は三官能性であってもよい。
【００４３】
使用されるシラン化合物の種類によって、疎水性基の結合／疎水性コーティングが異なってもよい。単官能性シラン化合物は、たとえば、核酸結合マトリクスに共有結合する単層の形態で結合されてもよい。二官能性又は三官能性のシラン化合物の場合、三次元の層／コーティングが核酸結合マトリクス上に形成されることが想定される。前記層は、基礎になる核酸結合マトリクスと必ずしも共有結合していなくてもよい。しかしながら、共有結合は前記層／コーティングの範囲内に形成される。前記三次元の層は核酸結合マトリクスを部分的に又は完全に覆ってもよい。核酸結合マトリクスが基本的に前記三次元層で基本的に、完全に覆われる場合、大部分、前記新しい層が単離されるべき核酸分子と接触する。従って、核酸を吸着してもよい前記シラン化合物によってシリカの比率が提供される。
【００４４】
実施態様の１つによれば、以下の化合物群から選択される化合物と前記マトリクスを接触させることにより疎水性基によって前記珪素含有核酸結合マトリクスが誘導体化される：
-  Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｓｉ−ＯＲ4
-  Ｒ1Ｒ2Ｓｉ（ＯＲ3）−ＯＲ4
-  Ｒ1Ｓｉ（−ＯＲ2）（−ＯＲ3）−ＯＲ4
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及び／又はＲ4は、同一の意味を有するか、又は異なった意味を有し、及び独立して水素、アルキル置換基、アルキレン置換基、又は官能基からなる群から選択され、並びにＲ1、Ｒ2、若しくはＲ3及び／又はＲ4の少なくとも１つが置換されてもよい又は非置換であってもよいアルキル置換基である。アルコキシ基（ＯＲ）のアルキル置換基は１〜２０の間、好ましくは１〜９の間の炭素原子の長さを有してもよく、及び直鎖又は分枝鎖の構造を有してもよい。好ましくは、前記アルキル置換基は、１〜５、好ましくは１〜３の炭素原子の短いアルキル置換基である。好ましくは、前記アルコキシ基はメトキシ基又はエトキシ基である。シラン化合物は、幾つかの同一のアルコキシ基、たとえば、Ｒ1Ｓｉ（ＯＲ2）3を有してもよい。
【００４５】
アルコキシ基でない／アルコキシ基に存在しないアルキル置換基は好ましくは、アルコキシ基に含まれるアルキル基よりも長い長さを有する。前記アルキル置換基は、１〜４０の炭素原子の長さを有してもよい。前記アルキル基は直鎖でも分枝鎖でもよい。好ましくは、それは、１〜２５、さらに好ましくは１〜２０の炭素原子の長さを有し、官能基を有していない。
【００４６】
上述したようなアルキル基のような少なくとも１つの疎水性基を有する反応性ハロシラン類は、官能基としてクロロ基又はブロモ基を含んでもよい。
【００４７】
少なくとも１つの疎水性基を持つ好適なアミノシラン類は、上述のようなアルキル基を持っていてもよい。それらは、以下の群の化合物から選択されてもよい。
Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｓｉ−Ｎ（ＣＨ3）2
Ｒ1Ｒ2ＳｉＭｅ−（Ｎ（ＣＨ3）2
Ｒ1ＳｉＭｅ2−（Ｎ（ＣＨ3）2
式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は上記で定義されたのと同じ意味を有する。
【００４８】
実施態様の１つによれば、プロピルトリエトキシシラン（ＰＴＳ）、オクタデシルトリメトキシシラン（ＯＴＭ）、ヘキサデシルトリメトキシシラン（ＨＭＳ）、オクチルトリメトキシシラン（ＯＴＳ）、及びテトラデシルトリメトキシシラン及びオクタデシルトリメトキシシランから成る群から選択されるシラン化合物に前記マトリクスを接触させる。
【００４９】
技術水準で既知の幾つかの方法を介して、前記疎水性基を珪素含有核酸結合マトリクスに適用することができる。非限定例は、たとえば、適当な化合物（上記を参照）中での浸漬、酸性加水分解、ポリマーコーティングを塗布すること、重合へのプラズマコーティンググラフト又はそのほかの好適な方法である。
【００５０】
実施態様の１つによれば、非標的核酸の混入物を減らすために核酸結合マトリクスの結合特性を改変するための前記代替的処理方法は組み合わせで使用されてもよい。実施例から分かるように、相加効果を認めることができる。
【００５１】
上記で概説したように、本明細書で記載される方法は、試料からＲＮＡを単離するのに特に好適であり、その際、ゲノムＤＮＡの混入量が低下する。
【００５２】
本発明に従って使用することができる核酸結合マトリクスは、各核酸の単離／精製を実施するのに好適であるいかなる種類であってもよい。核酸の結合を高めるために、標的核酸と接触する核酸結合マトリクスの表面が珪素を含むことが好ましい。使用される実施態様に応じて、各珪素含有表面を得るための幾つかの実施態様がある。たとえば、前記核酸結合マトリクスは鉱物又はポリマーを含んでもよい。鉱物マトリクスは好ましくは、多孔性若しくは非多孔性の金属酸化物若しくは混合金属酸化物、特にシリカゲル、シリカ粒子、又は大部分、ガラスからなる物質、たとえば、非修飾のガラス粒子、粉末化ガラス、石英、アルミナ、ゼオライト、チタン及び二酸化ジルコニウムから成る。前記多孔性若しくは非多孔性のマトリクスは、緩い充填物の形態で存在してもよく、又は、たとえば、ガラス、石英若しくはセラミックス製のろ過層の形態、及び／又はシリカゲルが配置される膜の形態、及び／又は官能基有り若しくは無しのラテックス粒子と同様に、石英若しくはグラスウールの鉱物支持体及び織物で出来た粒子若しくは繊維の形態、又はポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、特に、超高分子量ポリエチレン及び超高密度ポリエチレンで出来たフリット材の形態で存在してもよい。一部の実施態様では、マトリクスは、ポリアクリレート、ポリスチレン、ラテックス、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、メタクリレート及び／又はメタクリル酸メチルである、又はこれらを含む。ＲＮＡの単離に好適な膜もまた、ＢＴＳ、ＰＶＤＦ、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスルホン、ＭＭＭ、ＰＶＰ、及びたとえば、ＥＰ１５２６１７６号に記載されたようなそれらの複合材から成る群から選択されてもよい。さらなる実施態様によれば、適当なコーティング、たとえば、上述のようなシランコーティングによってシリカの表面が提供される。
【００５３】
核酸結合マトリクスの一般的な、だから好適な形態には、ビーズ、磁気粒子、カラム、膜及びフィルターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
マトリクス材には、たとえば、シリカに基づくマトリクスのように鉱物が含まれることが好ましい。従って、実施態様の１つによれば、シリカ含有の核酸結合マトリクスが使用される。シリカはマトリクス担体の一部を構成してもよく、又は表面コーティングに含まれればよい。各マトリクスは、核酸を可逆的に結合することが可能である。前記結合は、析出反応と同様に吸着を介して生じると考えられている。ＤＮＡはＲＮＡよりも明らかに良好に各シリカ含有の核酸結合マトリクスに結合する。この理論に束縛されることなく、実際、本発明の教示に従って実施される処理によってマトリクスへのＤＮＡの結合が低下することが前提とされる。析出反応を介して生じることが多いＲＮＡの結合は、基本的に前記処理に影響されない。従って、ＲＮＡ調製物の場合、ＲＮＡ調製物において存在するゲノムＤＮＡの混入は少ない。
【００５５】
核酸を単離する技術水準では、多孔性シリカ膜が頻繁に使用されるので、好ましい。そのような膜はＲＮＡを単離するのに特に好適である。実施態様の１つによれば、前記多孔性マトリクス材は、単一のカラムフィルターチューブに埋め込まれた膜であるか、又は多穴フィルタープレート、好ましくは９６穴フィルタープレート又は３８４穴フィルタープレートで一体化される。溶解物−又は遠心工程の場合、遠心された溶解物−の上清は、多孔性マトリクス材を介して溶解物を移動することによって、たとえば、遠心によって、又は真空などを適用することによって、ろ過される。通過の間、標的核酸は、前記核酸結合マトリクスに結合する。
【００５６】
好ましい実施態様によれば、前記核酸結合マトリクスは磁気特性を有し、従って磁気的に誘引可能である。個別の磁気粒子は、磁石を用いて容易に加工することができるので、一般的に使用されている。磁気特性は、磁性金属酸化物、たとえば、酸化鉄を用いて提供することができる。好ましくは、酸化鉄のような前記磁性物質は、珪酸含有材が磁性コアを覆うコアを形成する。前記コアは、第二鉄の特性、第一鉄の特性又は超常磁性特性を有してもよい。これらの粒子が、上述の主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される物質を含む化合物で処理されるのであれば、各磁性シリカ粒子のＲＮＡ単離特性を大きく改善することができる。個別に処理された磁性粒子は好ましくは自動化されたＲＮＡ単離プロトコールで使用され、その際、精製されたＲＮＡを得るのに必要な工程数は減ると考えられる。上述のように、所望であれば、実施できるとしても、本発明によって、たとえば、ＤＮＡ分解酵素による処理のような追加の工程が陳腐化される。
【００５７】
実施態様の１つによれば、本発明に係る核酸単離の方法は、以下の基本工程を含む。
【００５８】
たとえば、溶解緩衝液、機械的溶解、物理的溶解、又は必要に応じて適当な酵素を用いた生物学的溶解を用いて、標的核酸を含む試料が溶解される。好ましくは、溶解緩衝液の存在下で試料が崩壊させられる。その後、標的核酸が核酸結合マトリクスに結合する際、標的核酸（たとえば、ＲＮＡ）と好ましくはシリカを基にしたマトリクスの複合体が形成される。たとえば、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される物質を含む化合物により、又は疎水性基により前記核酸結合マトリクスを誘導体化することによる核酸結合マトリクスの特別の処理のために、処理されていない核酸結合マトリクスに比べて、標的核酸（たとえば、ＲＮＡ）がより高い純度で単離されるということは、得られた標的核酸試料は、非標的核酸（特にゲノムＤＮＡ）の混入をさほど含まないことを意味する。たとえ、一般的に望ましくても、本発明の背景では、前記処理によって標的核酸の結合が改善されることは必要とされないことに留意のこと。非標的核酸の混入を減らすことに関する前記記載された有益な結果を得るために、たとえば、非標的核酸（たとえば、ゲノムＤＮＡ）のような混入物への核酸結合マトリクスの結合が、未処理のマトリクスに比べて低下していれば、すでに十分であろう。このことは、核酸結合マトリクスによって非標的核酸が結合され、標的核酸と一緒に混入物として溶出されるリスクをすでに低下させている。前記メカニズム−非標的核酸へのマトリクスの親和性を低下させること−は、ＤＮＡがＲＮＡよりも特にシリカ系マトリクスに対して高い親和性を有することが多いので（上記参照）、ゲノムＤＮＡの混入を回避するためには特に好適である。
【００５９】
使用するならば、溶解緩衝液混合物は普通、得られた標的核酸（たとえば、ＲＮＡ）と核酸結合マトリクスの複合体から除かれる。その後、複合体を好ましくは洗浄し、標的核酸(ＲＮＡ)が得られる、たとえば、溶出される。
【００６０】
上記で概説したように、本発明は、非標的核酸混入物（特にゲノムＤＮＡ）の含量を低下させることによって、得られる標的核酸（特にＲＮＡ）の純度を改善することによる標準的な核酸、特にＲＮＡの単離プロトコールの顕著な改善を記載する。このことは、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む化合物により核酸結合マトリクスを処理することによる実施態様の１つに従って達成される。或いは、核酸結合マトリクスを疎水性基で誘導体化する。
【００６１】
本明細書で記載される方法は、いかなる種類の標的核酸を選択的に単離するのにも使用することができる。核酸結合マトリクスによってどの標的核酸が結合するかは（たとえば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）、それに応じて調整されるべきである選択される結合／緩衝液の条件に普通依存する。従って、単離されるべき核酸は、任意のサイズのＤＮＡ、ＲＮＡ又はその修飾形態であってもよい。核酸がＤＮＡである場合、これは、ｄｓであってもｓｓであってもよい。核酸がＲＮＡである場合、これは、いかなるサイズのいかなるＲＮＡであってもよく、たとえば、全ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、たとえば、ｍｉＲＮＡやｓｉＲＮＡのような小型ＲＮＡであってもよい。本発明の本質は、核酸結合マトリクスの前記処理／改変にあるので、核酸結合マトリクスの使用を採用している核酸単離の定義されたプロトコールを詳細に引用する必要はない。これらのプロトコールは、数えることができ、技術水準で周知であり、広く使用されているからである。核酸及び特にＲＮＡの単離に関するこれら既知の常法はすべて本発明の背景で使用することができる（たとえば、ＵＳ２００２／００８１６１９、ＥＰ１１４６０４９、ＷＯ０３／０８４９７６、ＷＯ０３／０９１４５２、米国特許第６，０２７，９４５号をさらなる参考文献を引用して参照のこと。すべて参照によって本明細書に組み入れる）。続いて、本発明の背景での使用に好適な常法の一部の一般的な側面を、情報目的で考察する。
【００６２】
好ましくは、先ず、標的核酸を含有する試料を溶解する。標的核酸を細胞から抽出する場合、最も簡単な場合、細胞に添加することによってカオトロピック物質及び／又はそのほかの塩を含有する水性溶解系を使用することが好ましい。任意で、溶解工程を機械的作用によって実施してもよい。核酸を含有する原料を溶解するための系は、好ましくは、０．１〜約１０Ｍの濃度でのカオトロピック物質の溶液である。前記カオトロピック物質として、特に塩、たとえば、過塩素酸ナトリウム、塩化グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム／チオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム及び／又はそれらの組み合わせを用いてもよい。ＲＮＡの単離については、溶解緩衝液及び／又は結合緩衝液として、特に０．５〜８Ｍのイソチオシアン酸グアニジニウム／チオシアン酸グアニジニウム及び／又は塩化グアニジニウム及び０〜５０％のエタノール及び／又はイソプロパノールを含有する水溶液を使用してもよいことが、操作の良好な様式として見い出された。
【００６３】
核酸は一般に、たとえば、塩化ナトリウム／エタノール混合物中で鉱物支持体に良好に結合し、イオン強度の低い条件下で又は水とともに溶出することができるので、本発明に係る工程で使用される塩溶液は必ずしもカオトロピック塩（いずれにしろ好ましい成分ではあるが）を含有する必要はないが、特定の実施態様に従って（たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ２００２／００８１６１９に記載された方法を参照のこと）、アルコール基を含有する物質との組み合わせで塩溶液を用いてもよいことが想定される。
【００６４】
０．１〜１０Ｍの濃度で塩、たとえば、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、塩化マグネシウムを含有する、又は０．１〜１０Ｍの相当する濃度で尿素を含有する、及び／又はそのような物質の組み合わせを含有する水溶液も、核酸を含有する原料を溶解する又は結合する水性系として使用されてもよい。
【００６５】
アルコール基を含有する物質は好ましくは、１〜５の炭素原子を含む低級脂肪族アルコールであり、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール及びペンタノールである。それらは好ましくは、容積当たり１〜９０％の濃度で用いられる。
【００６６】
任意で、各標的核酸（一本鎖の核酸又は二本鎖の核酸）の溶出に先立って洗浄工程を実施してもよい。
【００６７】
好ましくはシリカ系マトリクスのような鉱物支持体であるマトリクスに結合した核酸を洗い流す又は溶出するための溶液として、１〜３０％のエタノール及び／又はイソプロパノールと共に０．１〜３Ｍのイソチオシアン酸グアニジニウム／チオシアン酸グアニジニウム及び／又は塩化グアニジニウムを含有する水溶液を使用してもよい。
【００６８】
互いに分離されるべき（ＤＮＡからＲＮＡを）前記核酸を含有する試料を普通、少なくとも１つの核酸結合マトリクスと接触させるが、その際、ＲＮＡを含有する一本鎖核酸分画が核酸結合マトリクスによって大部分吸着されるが、二本鎖核酸（ＤＮＡ）は吸着されないように、塩、特にカオトロピック物質、及び好ましい実施態様に従って、アルコール基を含有する物質の適当な水性混合物によって処理条件が調整される。本発明に係る前記結合特性を改変する化合物による追加の特別の処理によって、核酸結合マトリクスの特異性は、核酸結合マトリクスによってＤＮＡがほとんど結合されないように改変され、それによって精製されたＲＮＡ試料中のＤＮＡの混入量を相当に減らす。次いで、流出する二本鎖核酸を所望によって自体既知の方法でさらに処理することができる。任意で洗浄工程を実施した後、核酸結合マトリクスに吸着された一本鎖の核酸をイオン強度の低い条件下で、又は水によって溶出する。回収された吸着されない二本鎖核酸は、その後、たとえば、塩、特にカオトロピック物質とアルコール基を含有する物質の適当な水性混合物によって分画を調整することによって、二本鎖の核酸が第２の核酸結合マトリクスに吸着可能になり、任意で洗浄工程を実施した後、イオン強度の低い条件下で、又は水で溶出可能になるような条件によってさらに精製することができる。
【００６９】
ＲＮＡを単離するためのその他の方法は、たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ２００２／００８１６１９号に詳細に記載されている。ＵＳ２００２／００８１６１９号はまた、すべて本発明の背景で使用することができるので、参照によって本明細書に完全に組み入れられるシリカ支持体材料、シリカ粒子、溶解緩衝液、結合緩衝液及び洗浄緩衝液の好適な例も記載している。同様のものが試料からＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかを単離する記載された詳細なプロトコールに適用され、それらも参照によって本明細書に組み入れられる。また、ＷＯ２００５／０４５０３０は、好適な溶解緩衝液及び洗浄緩衝液を記載している。その開示も参照によって本明細書に組み入れられる。非標的核酸の混入量を減らすことによってさらに相当に精製単離物をもたらす主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む前記結合特性を改変する化合物により核酸結合マトリクスを処理することによる本発明の教示に従って、これら既知のプロトコールが改善される。
【００７０】
本発明に係る工程によって単離される標的核酸を含有する試料／原料には、たとえば、標的核酸を含む溶液、生体材料、たとえば、細胞、細胞培養物、あらゆる種類の組織、あらゆる種類の体液、たとえば、血液、血漿、血清、尿、糞便；微生物、たとえば、細菌、ウイルス、たとえば、サイトメガロウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎及びデルタ型肝炎のウイルス；植物、植物の一部、胚、胚芽、果実、真菌、又は酵素反応、たとえば、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の転写及び／又はｃＤＮＡ合成及び／又は逆転写それに続くポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の後の核酸を含有する混合物が挙げられてもよい。
【００７１】
また、本発明で提供されるのは、標的核酸を、前記標的核酸を含む試料から単離するための核酸結合マトリクスの使用であり、その際、実施態様の１つによれば、前記核酸結合マトリクスは、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物によって処理されるか、又は処理されている。
【００７２】
代わりの実施態様によれば、前記核酸結合マトリクスは少なくとも部分的に疎水性基によって誘導体化される。各核酸マトリクスを得るための好適な例及び誘導体化の方法は、上述されている。
【００７３】
上記で詳細に概説されたように、前記化合物による核酸結合マトリクスの処理は、混合物、特に非標的核酸の混入を減らすという利点を有する。この目的で、詳細に上述されたようにマトリクスが処理されるか、又は処理されている。化合物、前処理方法、溶液の濃度、緩衝液、核酸結合マトリクスの性質などに関するさらなる詳細は、上記で詳細に概説された。従って、反復を回避するために上記の開示を参照する。
【００７４】
核酸結合マトリクスの調製のための主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される物質を含む少なくとも１つの化合物の使用も本発明の範囲内である。上記で詳細に概説したように、前記処理は、たとえば、ＲＮＡのような標的核酸が、たとえば、ｇＤＮＡの混入をあまり含まないはるかに高い純度で得られるという効果を有する。化合物、前処理方法、溶液の濃度、緩衝液、核酸結合マトリクスの性質などに関するさらなる詳細が上記で詳細に概説されたので、反復を回避するために、上記開示を参照する。
【００７５】
主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む化合物に核酸結合マトリクスを接触させることによって得ることができる前記核酸結合マトリクスも本発明の範囲内である。
【００７６】
前記核酸結合マトリクスは、たとえば、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む前記化合物を含有する液体溶液中で前記核酸結合マトリクスをインキュベートすることによって得ることができる（上記参照）。
【００７７】
異なった実施態様によれば、気相にて前記核酸結合マトリクスを、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む前記化合物と反応させる。
【００７８】
さらなる実施態様によれば、前記核酸結合マトリクスの結合特性の前記改変は、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される物質を含む前記化合物を液体溶液に添加し、次いでそれを核酸結合マトリクスに適用することによって達成される。前記溶液は、キットに含まれる前処理緩衝液であってもよいし、又はたとえば、使用された溶解緩衝液及び／又は結合緩衝液であってもよい（上記参照）。
【００７９】
これらの方法はすべて、たとえば、非標的核酸（特にＲＮＡ調製物の場合のｇＤＮＡ）などの混入が少ない標的核酸、特にＲＮＡの単離を可能にする改変された結合特性を有する核酸結合マトリクスを提供する。これら核酸結合マトリクスの処理の組み合わせは、相乗効果をもたらすので有利である。化合物、前処理方法、溶液の濃度、緩衝液、核酸結合マトリクスの性質などに関するさらなる詳細は、上記で詳細に概説された。従って、反復を回避するために上記開示を参照する。
【００８０】
本明細書で記載される組成物のいずれかがキットに含まれてもよい。本発明では、標的核酸を含有する試料から前記標的核酸を単離するためのキットが提供され、それは、以下を含む。
ａ）（ｉ）主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物によって任意で前処理され、その際、混入物を減らすために前記化合物が、解離された形態若しくは溶媒和の形態若しくは塩の形態で使用される、及び／又は
（ｉｉ）疎水性基を有する
核酸結合マトリクス；
ｂ）任意で、混入物を減らすために核酸結合マトリクスの結合特性を改変するための溶液であって、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物を含む溶液；
ｃ）非標的核酸の混入を減らすために、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む少なくとも１つの化合物を含有する溶解溶液及び／又は結合溶液；
ｄ）任意で、洗浄溶液；
ｅ）任意で、核酸結合マトリクスから標的核酸を溶出するための溶液。
その際、単離される標的核酸の調製物において混入物（たとえば、ゲノムＤＮＡのような非標的核酸など）を減らすために、前記核酸結合マトリクスの核酸結合特性を特異的に改変するために、選択肢、ａ）、ｂ）又はｃ）の少なくとも１つが満たされる。これらの処理の組み合わせが、混入物を減らすことについて相乗効果をもたらすので、たとえば、前記選択肢は、選択肢ａ（ｉ）及び／又は（ｉｉ）とｂ）、又は選択肢ａ）とｃ）、又は選択肢ｂ）とｃ）のように組み合わせることができる。
【００８１】
化合物、前処理方法、溶液の濃度、緩衝液、核酸結合マトリクスの性質などに関するさらなる詳細は、上記で詳細に概説された。従って、反復を回避するために上記開示を参照する。
【００８２】
非限定例では、細胞を溶解する、細胞溶解物からＲＮＡを抽出する、及び／又は得られたＲＮＡを分析する及び／又は定量するための試薬がそのようなキットに含まれてもよい。従って、キットは、好適な容器手段の中に本明細書で開示される試薬のいずれかを含む。それは、１以上の緩衝液又は溶液、たとえば、適当な溶解緩衝液、結合緩衝液、添加されたアルコールを有する溶液、溶出溶液、洗浄溶液及び所望のＲＮＡを単離するのに好適なその他の成分も含んでもよい。
【００８３】
キットの成分は、水性媒体の形態又は凍結乾燥の形態のいずれかで包装されてもよい。キットの容器手段には一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、シリンジ又はそのほかの容器手段が含まれ、その中に成分が入れられ、好ましくは、好適には等分されてもよい。キットに１より多くの成分がある場合（それらを一緒に包装してもよい）、キットはまた一般に、追加の成分を別々に入れてもよい第２、第３又はそのほかの追加の容器を含有する。本発明のキットはまた、核酸、特にＲＮＡを含有する手段及びそのほかの試薬の容器を市販のために厳重な管理下で含んでもよい。そのような容器には、その中に所望のバイアルが保持されるプラスチック容器が挙げられる。キットの成分が提供される場合、１及び／又はそれを超える液体溶液において、水溶液、特に無菌水溶液が特に好ましい。
【００８４】
しかしながら、キットの成分は乾燥粉末として提供されてもよい。試薬及び／又は成分が乾燥粉末として提供される場合、好適な溶媒の添加によって粉末を再構成することができる。溶媒も別の容器手段で提供されることが想定される。容器手段は一般に上述されたものが挙げられる。キットはまた、無菌の薬学上許容可能な緩衝液及び／又はそのほかの希釈液を含有するための第２の容器手段を含んでもよい。
【００８５】
そのようなキットは、核酸、特に繊細なＲＮＡを保護する若しくは保持する、又は分解からそれを保護する成分も含んでもよい。そのような成分は、ＲＮＡ分解酵素を含まず、ＲＮＡ分解酵素に対して保護する。そのようなキットは一般に好適な手段にて各個々の試薬又は溶液について別個の容器を含む。
【００８６】
キットはまた普通、キットに含まれていないその他の試薬の使用と同様にキット成分を用いるための指示書を含む。指示書は、実施可能である変化を含んでもよい。
【００８７】
本発明の方法、化合物及びキットは、研究及び開発の種々の分野で利用されてもよく、診断及び臨床の目的で利用されてもよい。
【実施例】
【００８８】
以下の例を挙げて本発明の好ましい実施態様を実証する。後に続く例で開示される技術は、本発明者らによって発見された技術を表し、本発明の実践で上手く機能し、またそれ故、それを実践するための好ましい様式を構成すると考えられるということが当業者によって十分に理解されるべきである。しかしながら、当業者は本開示を踏まえて、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、開示され、同様の又は類似した結果をさらに得る具体的な実施態様において多数の変更を実施することができることを十分に理解すべきである。
【００８９】
（例１）
市販のＲＮｅａｓｙキットにおいて普通使用される種類のシリカ膜のロールで直径７．５ｍｍを有する単一の膜試料を打ち抜いた。従って、前記シリカ膜は普通、ＲＮＡを単離するのに用いる核酸結合マトリクスを構成する。四塩化チタン（５％）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（メルク、ダルムシュタット）溶液中で４時間、室温にて、前記膜試料をインキュベートした。膜試料をフィルター上に置き、水で５回洗浄し、その後、乾燥チャンバーで４０℃にて２０時間乾燥させた。フリント（ｆｒｉｔ）及びテンションリングを含むＲＮｅａｓｙカラム構造にクワイヤのように手動で、各々処理された／被覆された膜試料を置いた。未処理の膜もフリント及びテンションリングを含むＲＮｅａｓｙカラムに入れ、対照として用いた。
【００９０】
ＲＮｅａｓｙのプロトコール（ヒルデンのキアゲン）を用いて１０ｍｇのラットの腎臓から、これらのカラムを用いて全ＲＮＡを単離した。収量の光度定量によって、四塩化チタンで前処理したカラムについて、１０ｍｇのラット腎臓当り、およそ１４μｇの核酸の収量、一方、未処理の対照カラムを用いた場合、１０ｍｇのラット腎臓当り、およそ９μｇの核酸の収量が示された。抽出された全ＲＮＡの質及び純度を分析するために、製造元のプロトコールを用いてアギレント２１００バイオアナライザー（ベーブリンゲンのアギレント）にて１μＬの溶出物を分析した。四塩化チタンで前処理したカラムで単離した全ＲＮＡのプロファイルと未処理の対照カラムでのプロファイルを比較した（図１及び図２）。
【００９１】
図１は、四塩化チタンで前処理したカラムの溶出物のプロファイルが、前方の溶媒に起因するピークを除いてたった２つのピークを示し、それが、１８Ｓと２８ＳのｒＲＮＡであることを示している。ゲノムＤＮＡは２つのｒＲＮＡのピークの間での上昇したプロファイルラインとして検出可能であろう。しかしながら、本発明の方法に従って単離されたプローブのプロファイルラインは、２つのｒＲＮＡピークの間をベースラインに戻している。このことは、本発明の方法に従って精製された単離ＲＮＡプローブではゲノムＤＮＡは検出できないことを示している。対照的に、未処理の対照カラム（図２）は、１８Ｓと２８ＳのｒＲＮＡのピークの間にプロファイルラインの明瞭な上昇を示す。このことは、技術水準で既知のプロトコールに従って単離されたＲＮＡプローブは依然として検出可能な微量のゲノムＤＮＡを含有することを示している。
【００９２】
このことは、遷移金属化合物、本例では四塩化チタンを含む液体溶液中での、核酸結合マトリクス、本例では一般的なシリカマトリクスは、標準のプロトコールに比べて、ＲＮＡの溶出物にてゲノムＤＮＡの混入を相当に減らす効果を有することを立証している。微量なゲノムＤＮＡが残ったとしても少なくともアギレント２００１バイオアナライザーでは検出できない。
【００９３】
(例２）
シリカ膜の処理は例１に記載されたように実施した。しかしながら、一方で、四塩化チタン溶液の代わりに塩化ジルコニウム（１％）のＴＨＦ溶液を用いた。ＲＮｅａｓｙカラムにて本発明の教示に従って前処理した膜を組み立てた後、比較のＲＮＡの単離及び精製を実施した。手動、又は機械的に、のいずれかで組み立てた未処理のカラムを対照として用いた。
【００９４】
ＲＮＡ原料として１０6個のＨｅＬａ細胞を用いた。定評のあるＲＮｅａｓｙプロトコールに従って再び単離を実施した。全核酸収量の光度定量によって、機械的に作製した未処理のＲＮｅａｓｙカラムでは、約２７５μｇ、手動で組み立てた未処理の参照カラムでは約２４０μｇ、及び塩化ジルコニウムで前処理した核酸結合マトリクスを含むカラムでは、約１９０μｇが示された。
【００９５】
単離されたＲＮＡの純度及び整合性を決定するために、４重測定を実施するために、８μＬの溶出物をホルムアルデヒドゲル（１％）に適用した（図３）。図３は、３種のカラムすべてにおいて分解されていないＲＮＡが得られたことを明瞭に示す。２８ＳｒＲＮＡと同様に１８Ｓも無傷のままなので、分解は検出できなかった。しかしながら、機械的に作製した未処理の参照カラム又は手動で組み立てた未処理の参照カラムにより単離された試料は、ｒＲＮＡのバンドの上に、微量のゲノムＤＮＡを伴う試料の混入を示すバンドを示した。各バンドは、塩化ジルコニウムによる本発明の教示に従って前処理されたカラムから得られたＲＮＡプローブでは検出できなかった。従って、ゲノムＤＮＡの減少は、未処理の参照マトリクスに比べて、塩化ジルコニウムで前処理された核酸結合マトリクスを用いた場合、より効率的である。手動で作製された未処理のカラムに比べてやや少ない手動で組み立てた前処理されたカラムの核酸の収量は、少なくとも部分的には、溶出物での先に出たゲノムＤＮＡのわずかな量に起因する。さらに、ＲＮＡの収率は単離ごとに変わることもある。
【００９６】
従って、塩化ジルコニウム（１％）溶液による核酸結合マトリクスの処理もまた、同一のＲＮＡ単離プロトコールを用いた場合、ゲノムＤＮＡの混入を相当に減らす効果を有する。
【００９７】
（例３）
１０6個のＪｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞白血病に由来する細胞株）から全ＲＮＡを単離するために例２で記載された３種のカラムを用いた。再び標準のＲＮｅａｓｙプロトコール（キアゲン、ヒルデン）に従って単離を実施した。全体的な核酸濃度（従って、ＲＮＡ及びＤＮＡ）を決定するために定量ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）に、単離後得られた全核酸の５ｎｇを用いた。さらに、プローブ中のゲノムＤＮＡの濃度を決定できるように定量ＰＣＲを実施した。定量ＰＣＲの間、逆転写工程（ＰＣＲによって増幅されうるｃＤＮＡをもたらす）がないので、ＲＮＡは増幅されないし、検出されない。Ｔａｑｍａｎβ−アクチン対照試薬（アプライドバイオシステム、フォスターシティ）をプライマー及びプローブとして用いた。その後、各反応についてＣｔ値を決定した。Ｃｔ値（閾値サイクル）は反応の増幅サイクルを記載するが、蛍光はバックグランドの蛍光（交差点としても知られる）を超えて有意に上昇する。プローブにおけるゲノムＤＮＡの混入の尺度としてＣｔ値を用いてもよい。鋳型としてＲＮＡ調製物を用いて定量的ＰＣＲを実施する場合、ＰＣＲで使用されるＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ依存性でありＲＮＡを増幅しないので、ゲノムＤＮＡ混入物のみが増幅される。Ｃｔ値に達するのに必要とされるサイクルがより多くなれば、ＲＮＡ調製物に存在するゲノムＤＮＡ混入物はより少なくなる。逆に、Ｃｔ値に達するのに必要とされるサイクルが少なければ、試料中に存在するゲノムＤＮＡ混入物は多くなる。定量的ＰＣＲを実施した場合のＣｔ値の測定は、使用したカラム種について以下の結果をもたらした。
【００９８】
【表１】
2010505430.tif 000002
【００９９】
Ｃｔ値を分析することによってすでに、Ｃｔ値に達する前にさらに多くのサイクルを必要とするので、本発明の教示に従って処理されたカラムで精製された試料が少ないゲノムＤＮＡ混入物を含有することは容易に明らかになる。
【０１００】
プローブのΔ（デルタ）Ｃｔ値を決定した場合、ゲノムＤＮＡ混入物に関する一層さらに有意な情報が得られてもよい。デルタＣｔ値の決定は、溶出物における全核酸濃度に比べたＲＮＡ濃度の標準化である。定量的ＰＣＲから得られたＣｔ値としてのこれを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡ及びＤＮＡを定量する）から得られたＣｔ値から差し引く。デルタＣｔ値が高ければ高いほど、プローブ中に存在するＤＮＡ混入物は少ない。結果は以下のとおりである。
【０１０１】
【表２】
2010505430.tif 000003
【０１０２】
本発明の教示に従って処理されたカラムを用いた場合に得られた相当に高いデルタＣｔ値は、前記プローブが、標準のカラムによって得た試料よりも非常に少ないＤＮＡ混入物を含有することを明らかにしている。
【０１０３】
従って、非常に感度の高い定量的ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的ＰＣＲの使用は、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む化合物、本例では、塩化物の形態での遷移金属ジルコニウムによって核酸結合マトリクスを処理した場合、ゲノムＤＮＡの効率的な減少を実証する。参照カラムに比べて、４を超えるデルタＣｔ値で改善は達成される。これは、プローブにおいて１６倍を超えるゲノムＤＮＡ混入物の減少に相当する。従って、塩化ジルコニウムによって核酸結合マトリクスを処理することによって、同一の標準ＲＮＡ単離プロトコールを適用する場合の１６倍を超えて溶出物中でゲノムＤＮＡが減少した。
【０１０４】
（例４）
今回は、核酸結合マトリクスの結合特性を改変するために、ＴＨＦ中で０．１〜２．５％の範囲で化合物ＦｅＣｌ2、ＦｅＣｌ3及びＳｎＣｌ2を使用したという差異を伴って、シリカ含有の核酸結合マトリクスの処理を例１に記載されたように実施した。今回は、ＲＮＡの生体原料として１０6個のＨｅＬａ細胞を用いたという差異を伴って、ＲＮＡの単離手順は、例３に記載されたように実施した。ゲノムＤＮＡ混入物の測定には、Ｔａｑｍａｎβ−アクチン対照試薬（アプライドバイオシステム、フォスターシティ）を用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲと同様に定量的ＰＣＲを実施した。溶出物からの５ｎｇの全核酸を用いた場合、定量的ＰＣＲにて以下のＣｔ値が決定された。
【０１０５】
【表３】
2010505430.tif 000004
【０１０６】
決定されたＣｔ値は、異なった試験化合物溶液による核酸結合マトリクスの処理が、さらに低い化合物濃度を用いた場合、すべての場合でゲノムＤＮＡ混入物の相当な減少をもたらしたことを明らかにしている。この結論は、上記で説明されたように、未処理の対照の核酸結合マトリクスに比べて上昇したＣｔ値から引き出すことができ、ゲノムＤＮＡの混入が少ないことを示している。本実験で観察された差異は、５Ｃｔ値までであり、約３２倍のゲノムＤＮＡの減少に相当する。
【０１０７】
（例５）
例４に記載された塩化第２スズで処理されたシリカ核酸結合マトリクスを用いてＲＮｅａｓｙプロトコールに従って１ｍｇと５ｍｇのラット腎臓からＲＮＡを単離した。同一の未処理の参照の核酸結合マトリクスを対照として用いた。アプライドバイオシステムズ（フォスターシティ）のラットｃ−ｊｕｎキットを用いて定量的ＰＣＲを実施した。溶出物からの５ｎｇの全核酸を用いて以下のＣｔ値を決定した。
【０１０８】
【表４】
2010505430.tif 000005
【０１０９】
塩化第２スズによる核酸結合マトリクスの処理は、すべての場合で、ゲノムＤＮＡ混入物の明瞭な低下をもたらした。この実験では、６Ｃｔ値までの差異が認められ、約６４倍のゲノムＤＮＡの減少に相当する。
【０１１０】
（例６）
未処理の機械的に作製されたＲＮｅａｓｙカラムを用いて、１ｍｇのラット腎臓から全ＲＮＡを単離した。核酸を含有する溶解物をカラムに適用する前に、０．１％、０．５％又は１％の塩化第２スズのＴＨＦ溶液を用いることによって一部のカラムを活性化した。カラムの未処理の核酸結合マトリクスに５００μＬの各塩化第２スズ溶液を適用した。カラムを１０，６００ｘｇで１分間遠心し、室温で５分間乾燥させた。その後、標準的なＲＮｅａｓｙプロトコールを実施した。例５に係るプライマー及びプローブを用いて定量的ＲＮＡ及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施し、デルタＣｔ値を決定した。
【０１１１】
【表５】
2010505430.tif 000006
【０１１２】
これらの実験も、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属の群から選択される金属物質を含む化合物、たとえば、塩化第２スズによる核酸結合マトリクスの前処理が、核酸結合マトリクスの好ましい活性化をもたらし、普通のＲＮＡ単離プロトコールに従った場合、ゲノムＤＮＡを有する混入物の相当な減少をもたらすことを明らかにしている。得られた結果は、例１のさらに長いシリカマトリクスの前処理方法に匹敵する。このことは、試料から精製標的核酸を単離するために核酸結合マトリクスを迅速に改変するための本発明の好適性を実証している。
【０１１３】
(例７）
通常の未処理の機械的に作製したＲＮｅａｓｙカラムを用いて５ｍｇのラット腎臓から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ単離のためにＲＮｅａｓｙプロトコールを使用した。しかしながら、調製物の一部では、ＲＮｅａｓｙプロトコールの正規の溶解及び結合緩衝液であるＲＮｅａｓｙキットの緩衝液ＲＬＴに０．１ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ及び１０ｍＭの塩化第２スズを加えた。デルタＣｔ値の決定は、例６で示されたように実施した。
【０１１４】
【表６】
2010505430.tif 000007
【０１１５】
例７は、溶解及び／又は結合緩衝液に塩化第２スズのような、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む化合物を添加することも、核酸を含有する原料からＲＮＡを単離する場合、ゲノムＤＮＡ混入の相当な低下をもたらすことを明瞭に明らかにしている。結果は再び、例１に記載されたようなより長い前処理に匹敵する。
【０１１６】
（例８）
塩化第２スズで前処理した核酸結合マトリクスを全ＲＮＡの単離に使用した。改変核酸結合マトリクスの製造は例４に記載されたように実施した。塩化第２スズ溶液（１％）で被覆された／前処理されたシリカマトリクスを使用した。相乗効果を分析するために、ＲＮＡ単離プロトコールを実施する前に前処理されたシリカマトリクスをさらに塩化第２スズ溶液で直接処理した。従って０．１ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ及び１０ｍＭの塩化第２スズをさらに、溶解及び結合緩衝液に加えた。調製物当たり１０7個のＪｕｒｋａｔ細胞からＲＮＡを単離した。デルタＣｔ値の決定は、例３に記載されたように実施した。
【０１１７】
【表７】
2010505430.tif 000008
【０１１８】
この実験は、前処理した核酸結合マトリクスと、たとえば、塩化第２スズ溶液のような、主要な１３族〜１６族の金属、半金属及び遷移金属から成る群から選択される金属物質を含む化合物を含む溶解及び／又は結合緩衝液の併用使用が、異なった種類の核酸を含む複雑な生体原料からＲＮＡを単離する場合、ゲノムＤＮＡの減少の一層さらなる改善をもたらすことを明瞭に明らかにしている。
【０１１９】
（例９）
シリカ膜の代替として核酸結合マトリクスとして２つの異なった種類の市販の磁性シリカビーズ（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔＢ及びＭａｇＡｔｔｒａｃｔＣ−キアゲン）を用いた。ＳｎＣｌ2（１％）を含むＴＨＦ溶液中で、ビーズを互いに別々に一晩インキュベートした。調製物につき１０6個のＪｕｒｋａｔ細胞を溶解し、翌日緩衝液ＲＬＴ（キアゲン）を用いてホモジネートした。その後、５０μＬの磁性懸濁液と共にエタノールを溶解した細胞に添加した。結合調製物を室温にて５分間インキュベートした。磁性分離の後、上清を捨て、その後、磁性粒子を緩衝液ＡＷ１で１回、緩衝液ＲＰＥで２回洗浄した。２００μＬのＲＮＡを含まない水で溶出を実施した。デルタＣｔ値は、例３に記載されたように決定した。
【０１２０】
【表８】
2010505430.tif 000009
【０１２１】
この実験は、たとえば、磁性ビーズのような球形分子上で使用されてもよい本発明に係る方法の有効性を明瞭に明らかにしている。また、核酸結合マトリクスを処理するための上述のそのほかのプロトコールもこの適用で使用されてもよい。
【０１２２】
（例１０）
技術水準で既知の教示に比べて、本発明の教示によって得られる効果が相当に改善されることを実証するために、参考例を実施した。たとえば、ＥＰ０８１８４６１は、カオトロピック塩へのリチウム塩の添加がＲＮＡ吸着のための核酸結合担体の選択性を改変することを想定し、それによってＤＮＡの混入物を減らすことを開示している。しかしながら、以下に実証されるように、本発明に従って使用される化合物で見られるような改善が得られるように標準の核酸結合マトリクスの結合特性を改変するためには、塩化リチウムのようなアルカリ金属は好適ではない。以下で実証されるように、塩化リチウムは、精製されたＲＮＡ試料中のｇＤＮＡの混入量を変化させなかった。
【０１２３】
機械的に作製したＲＮｅａｓｙカラムを用いて試験試料当たり１０6個のＪｕｒｋａｔ細胞から標準のＲＮｅａｓｙプロトコールに従って全ＲＮＡを抽出した。０．１ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ及び１ＭのＬｉＣｌを溶解及び結合緩衝液ＲＬＴに加えた。対照には塩化リチウムを加えなかった（０ｍＭのＬｉＣｌ）。ゲノムＤＮＡ混入の定量は、例３に記載されたように実施した。結果は以下のとおりであった。
【０１２４】
【表９】
2010505430.tif 000010
【０１２５】
Ｃｔ値から分かるように、塩化リチウムの添加は、単離したＲＮＡ調製物におけるゲノムＤＮＡの減少を生じなかった。従って、塩化リチウムの添加は、非標的核酸の混入の程度にいかなる効果も有さなかった。定量的ＰＣＲは、調べた塩化リチウム濃度のすべてで、統計的に変化しているにすぎないほぼ同じＣｔ値を生じた。このことは、アルカリ金属、塩化リチウムの添加は、本発明に係る教示によって見られるようなＲＮＡ調製物におけるゲノムＤＮＡの減少に対する有益な効果を有さないことを明らかにしている。
【０１２６】
（例１１）
本発明に係る教示に関連する特別な効果を実証するためにさらなる参考例を実施した。
【０１２７】
例１０に記載されたように実験を実施した。しかしながら、参考試料を生成するために、ＬｉＣｌの代わりにＭｇＣｌ2及びＣａＣｌ2を緩衝液ＲＬＴに加えた。以下の濃度、０ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ及び１Ｍを用いた。ゲノムＤＮＡを伴うＲＮＡ溶出物の混入物の定量は、例３に記載されたように実施した。
【０１２８】
【表１０】
2010505430.tif 000011
【０１２９】
結果は、少量のＭｇＣｌ2及びＣａＣｌ2の結合緩衝液ＲＬＴへの添加は、ＤＮＡ混入物の低下に積極的な効果を有さないことを明らかにしている。これらのアルカリ土類金属は、たとえば、塩化スズ（上記参照）のような本発明の教示に従って使用される化合物と同様には、非標的混入物を減らさない。さらに、結合緩衝液ＲＬＴで高い濃度のＭｇＣｌ2及びＣａＣｌ2を使用した場合、ゲノムＤＮＡの混入量が増えているので、混入物に対する負の効果が認められる。ゲノムＤＮＡの混入は、因数８まで高かった（３ＣＴ値と同等）。
【０１３０】
（例１２）
核酸結合マトリクスとして３種の異なった市販の磁性シリカビーズ（ＭａｇＡｔｔｒａｃｔＢ、ＭａｇＡｔｔｒａｃｔＧ及びＭａｇＡｔｔｒａｃｔＥの溶液−キアゲン）を使用した。保存溶液から磁石を介して前記ビーズを２ｍＬ分離した。種々の濃度のＳｎＣｌ2溶液中で湿った磁性粒子を４時間インキュベートした。０．１％、０．５％、１％及び２％のＳｎＣｌ2溶液を用いた。前記インキュベートの後、磁石を介してビーズを溶液から分離し、５０℃の乾燥機で磁性粒子を乾燥させた。前記粒子を乾燥させた後、それらを水中、又はＲＮｅａｓｙ結合緩衝液ＲＬＴのいずれかに入れた。
【０１３１】
未処理の対照粒子と同様に、それぞれ処理されたＭａｇＡｔｔｒａｃｔＢ、ＭａｇＡｔｔｒａｃｔＧ及びＭａｇＡｔｔｒａｃｔＥの粒子を用いて、１ｘ１０6個のＪｕｒｋａｔ細胞からＲＮＡを単離した。細胞をＲＮｅａｓｙ結合緩衝液ＲＬＴに入れ、ＱＩＡＳｈｒｅｄｄｅｒカラムを介して溶解のために遠心し、１容量の７０％エタノールと混合した。各磁性粒子を添加した後、核酸の結合を支えるために粒子／試料溶液を平面振盪器で５分間混合した。粒子を磁気的に分離した後、上清を回収して捨て、磁性粒子を７５０μＬの洗浄緩衝液ＲＷ１と混合し、再び５分間振盪した。磁気的分離の後、上清を捨て、５００μＬの緩衝液ＲＰＥで２回粒子を洗浄した。１００μＬの水で溶出を行い、５分間振盪することを繰り返した。分光光度計で収量を測定し、調べた粒子すべてについて比較した（データは示さず）。得られた溶出物５ｎｇを定量的ＰＣＲにて使用した（例３を参照）。結果を以下の表に要約する。
【０１３２】
【表１１】
2010505430.tif 000012
【０１３３】
得られた結果から分かるように、調べた前処理した磁性粒子はすべて、それぞれ未処理の対照粒子に対して高いＣｔ値を達成した。従って、本発明の教示に係る金属化合物による粒子の記載された処理は、ゲノムＤＮＡの減少を生じ、従って単離されたＲＮＡの純度の上昇を生じる。既に実施された例によって、５Ｃｔ値の差異までを達成することができたが、それは、未処理のＭａｇＡｔｔｒａｃｔ粒子に比べて３２倍のゲノムＤＮＡ混入物の減少に等しい。結果はまた、処理／コーティングの濃度がゲノムＤＮＡの減少に影響することも明らかにしている。粒子が水中に含有されるか、又はＲＬＴ中に含有されるかはゲノムＤＮＡの減少に影響を有さなかった。
【０１３４】
(例１３）
市販のＲＮｅａｓｙキットにおいて普通使用される種類のシリカ膜のロール（ｒｏｌｅ）にて直径７．５ｍｍを有する単一の膜試料を打ち抜いた。前記シリカ膜は普通、ＲＮＡを単離する／精製するのに用いられる核酸結合マトリクスを構成する。
【０１３５】
少なくとも部分的に膜を疎水性基で誘導体化するために各膜を特に被覆した／処理した。各誘導体化を達成するために、異なった時間、膜をプロピルトリエトキシシラン（ＰＴＳ）で処理／被覆した。５７ｇ（９１．２ｇ）の濃アンモニアと１０ｇ（１６ｇ）の蒸留水を反応バルブに供給し、無水エタノールで５００ｍＬ（８００ｍＬ）で満たし、ＫＰＧ撹拌器でゆっくり撹拌した。その後、打ち抜いた膜を反応溶液に加え、５分後、２００μＬのＰＴＳを加えた。前記反応溶液中で異なった時間、膜をインキュベートした。その後、ＶＥ水で３回、膜を洗浄し、乾燥機で５０℃にて４〜８時間乾燥させた。各処理した膜をその後スピンカラムに組立てた。これらのカラムを用いて、ＲＮｅａｓｙプロトコール（キアゲン、ヒルデン）を用いて、１ｘ１０6個のＪｕｒｋａｔ細胞から全ＲＮＡを単離した。対照として、機械的に組み立てたＲＮｅａｓｙカラム、及びさらに手動で組み立てた未処理のＲＮｅａｓｙカラムを用いて同様の調製を実施した。Ｔａｑｍａｎβ−アクチン対照試薬（アプライドバイオシステム、フォスターシティ）を用いてＤＮＡ混入物を測定するために、精製後得られた５ｎｇの全核酸を定量的ＰＣＲで使用した。各調製物を用いることによって、溶出された全体的な核酸分画に混入物としてどれくらいのゲノムＤＮＡが依然として存在するかを決定することが可能である。Ｃｔ値が高ければ高いほど、溶出物中の混入物として存在するゲノムＤＮＡは少なくなる。
【０１３６】
結果は以下のとおりに要約することができる。
【０１３７】
【表１２】
2010505430.tif 000013
【０１３８】
結果は、ＰＴＳと膜の非常に短いインキュベートでもゲノムＤＮＡの減少に軽い改善をもたらすことを示している。疎水性基を提供する化合物と膜が長く接触すればするほど、得られるＣｔ値は良くなる。結果から分かるように、１７時間のインキュベートの後得られたＣｔ値は相当に高い。一定量の核酸を用いたＣｔ値の増加は、各処理されたマトリクスが８倍のゲノムＤＮＡの減少を示すことを示している。
【０１３９】
(例１４）
例１３に記載されたのと同様にシリカ膜の処理を実施した。しかしながら、今回は、異なった時間、シリカ膜をオクタデシルトリメトキシシラン（ＯＴＭ）で被覆した。少なくとも部分的に疎水性基によって誘導体化されたシリカマトリクスを得るために、例１３で記載された反応溶液８００ｍＬを、シリカマトリクスの５分間のインキュベートに用いた。８、８０、又は８００μＬのＯＴＭを加えた後、シリカ膜をさらに４時間又は２４時間（ｃ（ＯＴＭ）：０．０２４ミリモル／Ｌ〜２．４ミリモル／Ｌ）インキュベートした。１０6個のＪｕｒｋａｔ細胞から再び全ＲＮＡを単離した。対照を含む精製、及びゲノムＤＮＡの混入の測定は、例１３で記載されたように実施した。しかしながら、追加でさらなる制御を実施した。その点で、溶媒のゲノムＤＮＡ減少への影響を排除するために、ＯＴＭなしの溶媒溶液でシリカ膜を２４時間インキュベートした。
【０１４０】
結果を以下のように要約することができる。
【０１４１】
【表１３】
2010505430.tif 000014
【０１４２】
この実験は、シリカ膜をＯＴＭで処理した場合、インキュベート時間もゲノムＤＮＡの減少の効率性に影響することを明らかにしている。しかしながら、影響はさほど重要ではない。しかしながら、シリカマトリクスを誘導体化するのに使用したＯＴＭの濃度に関して高い影響が認められた。この点で、ＯＴＭの使用濃度が高ければ、さらに良好な効率性が認められた。その際、８μＬ（０．２４ミリモル／Ｌ）から８０μＬ（２．４ミリモル／Ｌ）の上昇は、約４Ｃｔ値の大きな差異を生じたが、濃度のさらなる上昇は、１Ｃｔ値の上昇を生じたにすぎなかった。しかしながら、８００μＬのＯＴＭでシリカマトリクスを処理した場合、全核酸の収量はかなり低く、また、８０μＬのＯＴＭでシリカマトリクスを処理した場合、全収量は、対照に匹敵する範囲内である（データは示さず）。従って、全ＲＮＡの効率的な／高い収量を保つことによって、ゲノムＤＮＡの高度に効率的な減少を得るために、インキュベート時間及び濃度を調整することによって最適化されたコーティング／誘導体化を得ることができる。
【０１４３】
(例１５）
例１３に記載されたように処理を実施した。しかしながら、今回は、シリカマトリクスをヘキサデシルトリメトキシシラン（ＨＭＳ）によって異なった濃度を用いて処理した。例１４で記載されたように、例１３で記載された反応媒体８００ｍＬ中で８μＬ、８０μＬ及び８００μＬのＨＭＳを２４時間使用した（ｃ（ＨＭＳ）：０．０２５６ミリモル／Ｌ〜２．５６ミリモル／Ｌ）。ＲＮｅａｓｙプロトコールに従って、この例では１０6個のＪｕｒｋａｔ細胞から全ＲＮＡを単離した。対照を含む精製は例１４で記載されたように実施した。結果は以下のように要約することができる。
【０１４４】
【表１４】
2010505430.tif 000015
【０１４５】
この実験は、ＨＭＳのような化合物も全ＲＮＡに対するゲノムＤＮＡの特別な減少に関してかなりの改善をもたらすことを明らかにしている。６までのＣｔ値の差異が得られ、それは、ゲノムＤＮＡの６４倍の相対的な減少に相当する。この例はまた、シリカ膜に疎水性基を提供する化合物の濃度がゲノムＤＮＡの減少の効率性に影響することを明らかにしている。
【０１４６】
（例１６）
例１５に記載されたようにシリカ膜の処理を実施した。しかしながら、今回は、シリカマトリクスを化合物オクチルトリメトキシシラン（ＯＴＳ）によって異なった濃度を用いて処理した。例１４で記載されたように、例１３で記載された反応媒体８００ｍＬ中で８μＬ、８０μＬ及び８００μＬのＯＴＳを２４時間、膜とともに使用した（ｃ（ＯＴＳ）：０．０３２１ミリモル／Ｌ〜３．２１ミリモル／Ｌ）。例１３で記載されたように、１０6個のＪｕｒｋａｔ細胞から全ＲＮＡを単離し、定量的ＰＣＲを用いて、得られた核酸の５ｎｇを定量した。結果は以下のように要約することができる。
【０１４７】
【表１５】
2010505430.tif 000016
【０１４８】
先行する例とは対照的に、８μＬのＯＴＳによる処理はゲノムＤＮＡの減少に関して考慮すべき効果を生じない。しかしながら、８０μＬ又は８００μＬのＯＴＳへの濃度の上昇は、前に記載された化合物で得られたのと同様の結果を示した。達成されたＣｔ値は、未処理の対照と比べて４〜５高く、それは、１６〜３０倍のゲノムＤＮＡの減少に等しい。
【０１４９】
例１３〜１６に記載された化合物を用いて、例１３に記載されたように、シリカ膜の処理を実施した。今回は、細胞培養物からではなく、実験当たり１ｍｇ又は５ｍｇのラット肝臓から全ＲＮＡを単離した。単離にはＲＮｅａｓｙプロトコールを用いた。その後、アプライドバイオシステムズ（フォスターシティ）のラットｃ−ｊｕｎキットを用いて、定量的ＰＣＲを実施した。溶出物から得られた全核酸の５ｎｇを用いた場合、以下のＣｔ値が得られた。
【０１５０】
【表１６】
2010505430.tif 000017
【０１５１】
提供された例から分かるように、少なくとも部分的に疎水性基で誘導体化されたシリカマトリクスを用いると、たとえば、記載されたシラン化合物は、ゲノムＤＮＡの減少に関して積極的な影響を有する。再び、使用された化合物の濃度と同様にインキュベート時間の影響が、減少の効率性に対して認められうる。
【０１５２】
（例１８）
例１４に記載されたように８０μＬのＯＴＭで処理したシリカ膜を用いて培養細胞から全ＲＮＡを単離した。調製は、例１３に記載されたように実施した。しかしながら、今回は、ＳｎＣｌ2を異なった濃度で結合緩衝液ＲＬＴに加えた。ＳｎＣｌ2を結合緩衝液ＲＬＴと組み合わせることによって、疎水性基で誘導体化された核酸結合マトリクスの使用と併せて、相乗効果が認められるかどうか、すなわち、ゲノムＤＮＡの減少が改善されるかどうかを評価した。以下の結果が得られた。
【０１５３】
【表１７】
2010505430.tif 000018
【０１５４】
この実験は、双方の処理（ＯＴＭ及びＳｎＣｌ2）が、ゲノムＤＮＡ混入物のかなりの減少をもたらすことを明らかにしている。しかしながら、相乗効果も認められる。５ｍＭのＳｎＣｌ2で認められた相乗効果は、ゲノムＤＮＡの２倍の減少を生じる。
【図１】
2010505430.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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