(57)【要約】  本発明は、宿主における免疫応答を高めるための新規アジュバントとしてのＰＧＥ２を提供し、ならびに、Ｂ細胞応答を高めかつそれにより所定の免疫原に対する抗体力価を増大するためのＰＧＥ２の使用方法、および本発明の最低１種の方法により製造された抗体もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原および有効補助量のＰＧＥ２を宿主に投与することを含んでなる、宿主における免疫原に対する免疫応答を高める方法。
【請求項２】
免疫原およびＰＧＥ２が同時に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫原およびＰＧＥ２が続けて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
宿主がげっ歯類である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
宿主がＢａｌｂ／ｃマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＰＧＥ２の有効補助量が約０．１ｎｍｏｌないし約１０ｎｍｏｌの範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
投与が、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、皮内若しくは足蹠注入よりなる群から選択される適する経路を介する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
免疫原に対する抗体の製造方法であって、
免疫原および有効補助量のＰＧＥ２を宿主に投与してそれにより該免疫原に対する免疫応答を高めること、ならびに該免疫原と特異的に反応性である抗体若しくは抗体を産生する細胞についてスクリーニングすること
を含んでなる、上記方法。
【請求項９】
抗体を産生する細胞を骨髄腫細胞と融合すること、および
該免疫原と特異的に反応性である融合細胞を単離すること
をさらに含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
免疫原およびＰＧＥ２が同時に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
免疫原およびＰＧＥ２が続けて投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
宿主がげっ歯類である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
宿主がＢａｌｂ／ｃマウスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＧＥ２の有効補助量が約０．１ｎｍｏｌないし約１０ｎｍｏｌの範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
投与が、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、皮内若しくは足蹠注入よりなる群から選択される適する経路を介する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法により製造された最低１種の抗体。
【請求項１７】
請求項８に記載の方法により製造された最低１種の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の製造において補助するための宿主における免疫応答を高めるためのアジュバントとしてのＰＧＥ２の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用剤としてのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用は多様な疾患の処置のための有効なアプローチとなってきた。加えて、ｍＡｂは多様な疾患の免疫病因論のより良好な理解を得るための強力なツールである。ｍＡｂの標準的生成方法は、免疫したＢａｌｂ／ｃマウスから収集したリンパ節細胞若しくは脾細胞と骨髄腫細胞を融合することよりなる。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、それらが容易に入手可能であるためにｍＡｂを生じさせるための選択すべき宿主を代表する。より重要なことに、外来のＴ依存性抗原で感作したＢａｌｂ／ｃマウスにおける免疫応答は、それらのＴ細胞由来サイトカイン産生のＴｈ２様表現型への極性化を特徴とする。このＴｈ２様応答は高レベルの抗原特異的Ａｂの生成に随伴し、これは抗原特異的Ｂ細胞クローンの頻度の増大およびｍＡｂを得るためのＢ細胞融合後のハイブリッドの数の増大と相関する。
【０００３】
しかしながら、多くの免疫原はマウスにおいて十分な抗体応答を誘発することが可能でない。これは、免疫原に対する抗体を産生するＢ細胞がわずかしか存在せず、ハイブリドーマを形成した後にこれらの細胞株を単離することを困難にすることを意味している。該低抗体応答は、該免疫原が免疫原に特異的なＢ細胞クローンを認めうる程度まで増殖させるのに十分なＴ細胞ヘルプを導き出さないため生じる。加えて、数種の免疫原に対するｍＡｂの生成は反復注入後の毒性の問題により困難であることを示す。
【０００４】
免疫原に対する抗体を産生するＢ細胞の数を増大させるために、免疫原に対して向上した抗体応答を引き起こすアジュバントをしばしば使用する。アジュバントは、免疫原とともに投与される場合により高い抗体力価を生じかつ宿主応答を延長するように免疫系の応答を高める化合物である。一般に使用されるアジュバントは、油中水乳剤よりなるフロイントの不完全アジュバント、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の添加とともにフロイントの不完全アジュバントの成分を含んでなるフロイントの完全アジュバント、およびミョウバンを包含する。しかしながら、規制当局はそれらの重大な副作用によりある種のアジュバントの使用を妨げる。さらに、これらのアジュバントは外来の免疫原に対する体液性応答を刺激し得る一方、それらはまた数種のタンパク質免疫原を変性もする。これは生物活性抗体の生成のための重要な免疫原エピトープのプロセシングおよび提示に影響し得る。従って、これらの問題のもう１つを克服する新たなアジュバントを提供する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
一つのアスペクトにおいて、本発明は宿主における免疫応答を高めるための新規アジュバントとしてのＰＧＥ２を提供する。一態様において、本発明は動物におけるＢ細胞応答を高めるためのアジュバントとしてのＰＧＥ２を提供する。
【０００６】
別のアスペクトにおいて、本発明は宿主における所定の免疫原に対する免疫応答を高める方法を提供する。一態様において、該方法は目的の免疫原および有効補助量（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ）のＰＧＥ２を宿主に投与することを含んでなる。本発明の方法により高められる免疫応答はＢ細胞応答であることができ、および、増大された抗体力価により例示されうる。
【０００７】
別のアスペクトにおいて、本発明は免疫原に対する抗体の改良された製造方法を提供し、該方法は、免疫原および有効補助量のＰＧＥ２を投与してそれにより該免疫原に対する免疫応答を増大させること、および該免疫原と特異的に反応性である抗体若しくは抗体を産生する細胞についてスクリーニングすることを含んでなる。本発明の方法は抗体のより効率的な生成方法を提供する。従って、別のアスペクトにおいて、本発明は本発明の改良された方法を使用して製造される抗体を提供する。本発明を使用して製造される抗体は治療、診断および／若しくは研究目的に使用し得る。
【０００８】
［発明の詳細な記述］
本明細書に引用される全部の刊行物若しくは特許は、それらが本発明の時点での従来技術を示すため、ならびに／若しくは本発明の記述および実施可能性（ｅｎａｂｌｅｍｅｎｔ）を提供するために、引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる。
【０００９】
本発明は、宿主における免疫応答を高めるのに効果的に使用し得る新規アジュバントとしてのＰＧＥ２を提供する。高められる免疫応答はＢ細胞応答でありうる。一態様において、本発明は、マウスにおける所定の免疫原に対する抗体力価を増大させるためのアジュバントとしてのＰＧＥ２を提供する。
【００１０】
ＰＧＥ２は多様な細胞型により産生されるアラキドン酸（ＡＡ）代謝物である。それは内分泌、心血管、胃腸、神経、生殖器および免疫系における広範な生理学的活動を調節し、ならびに局所恒常性を維持する。ＰＧＥ２合成は３段階で起こる。第一にＡＡがホスホリパーゼＡ２の作用を介して膜リン脂質から遊離される。次に、ＡＡがＰＧＧ２に、およびその後ＰＧＨ２にシクロオキシゲナーゼ１および２（Ｃｏｘ−１およびＣｏｘ−２）により転化される。最後にＰＧＨ２が終末（ｔｅｒｍｉｎａｌ）ＰＧＥ合成酵素によりＰＧＥ２に異性化される。
【００１１】
免疫系において、ＰＧＥ２は主に単球、マクロファージおよび樹状細胞のようなＡＰＣにより産生される。ＰＧＥ２はＴｈ１関連免疫応答に対し抑制性である。それはＴｈ１クローンによるＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生を抑制するがしかしＴｈ２クローンによるＩＬ−４およびＩＬ−５産生を抑制しない。ナイーブなＴ細胞の分化期に、ＰＧＥ２はｃＡＭＰ蓄積を介してＴｈ１の分化およびＩＬ−１２Ｒ発現を阻害する。ＰＧＥ２はＡＰＣによるＬＰＳ誘発性ＩＬ−１２産生を抑制するがしかしＩＬ−１０産生を高める。Ｂ細胞では、ＰＧＥ２はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−４およびＬＰＳで刺激したＢ細胞によるＩｇＥ産生を高める。ＰＧＥ２がＴｈ２応答の生成における重要な演者として今や発見されている。
【００１２】
本明細書で使用されるところの「免疫原」という用語は、被験体において免疫応答を潜在的に導き出し得るいかなる分子も意味している。数種の免疫原はアジュバントの非存在下に投与される場合に免疫応答を導き出さないため、「免疫原」という用語はアジュバントと共投与される場合にのみ免疫応答を導き出す分子を包含する。
【００１３】
本明細書で使用されるところの「アジュバント」という用語は、免疫原の免疫刺激特性を高める物質を指す。アジュバントは、抗体力価、応答持続時間、アイソタイプ、アビディティーおよび免疫の他の特性に影響する能力を有する。アジュバントの使用は独力で弱く免疫原性である多くの免疫原に好ましいか若しくは必要である。アジュバントは多数の異なる機構により作用しうる。現在既知のかつ／若しくは利用されるアジュバントは毒性およびアレルギー誘発効果により制限されるか、若しくは製造するのが極めて高価である。
【００１４】
本明細書で使用されるところの、免疫原に対する免疫応答に関する「高めること」若しくは「高められた」という用語は、該免疫原に対する免疫応答を増大、強化若しくは誘導することを記述する。本発明において、アジュバントとしてのＰＧＥ２は、強免疫原に対してのみならずしかしまた困難な／名目上の（ｎｏｍｉｎａｌ）免疫原に対する免疫応答も高める。
【００１５】
本明細書で使用されるところの「抗体」という用語はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を包含する。一般に、抗体は特定の一免疫原に対する結合特異性を表すタンパク質若しくはポリペプチドである。無傷の抗体は２本の同一のＬ鎖および２本の同一のＨ鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的に、各Ｌ鎖は１個の共有ジスルフィド結合により１本のＨ鎖に連結される一方、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプのＨ鎖間で変動する。各ＨおよびＬ鎖はまた規則的に間隔を空けられた鎖間ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）次いで多数の定常ドメインを有する。各Ｌ鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）およびその他端に１個の定常ドメインを有し；Ｌ鎖の定常ドメインはＨ鎖の第一の定常ドメインと整列され、およびＬ鎖可変ドメインはＨ鎖の可変ドメインと整列される。いかなる脊椎動物種の抗体Ｌ鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき２種の明確に異なる型すなわちκおよびλの一方に帰属し得る。
【００１６】
免疫グロブリンはＨ鎖定常ドメインのアミノ酸配列に依存して５個の主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに帰属し得る。ＩｇＡおよびＩｇＧはアイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４としてさらに細分される。
【００１７】
本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は特定の一エピトープに対する単一結合特異性およびアフィニティーを表す。モノクローナル抗体は、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を包含する。
【００１８】
本発明は、宿主における所定の免疫原に対する免疫応答を高める方法もまた提供する。一態様において、該方法は、目的の免疫原および有効補助量のＰＧＥ２を宿主に投与することを含んでなる。本発明の方法により高められる免疫応答はＢ細胞応答であることができ、そして増大された抗体力価により例示されうる。
【００１９】
本明細書で使用されるところの「有効補助量」という用語は、免疫原と同時に若しくは続けて投与される場合に、該免疫原単独で得られる効果の増強を生じるか、若しくは、あるいは、該免疫原に対する免疫応答を誘導するアジュバントの量を指す。当業者はある種の免疫原を補助するためのＰＧＥ２の適する量を容易に決定することが可能であることが期待される。こうした量は、典型的に、免疫原の性質、免疫原の投薬量、宿主の種および身体状態ならびに投与経路に依存することができる。例えば、本明細書に記述されるＰＧＥ２の有効補助量は、限定されるものでないが０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｎｍｏｌ、あるいは、限定されるものでないが０．０１〜１０ｎｍｏｌ、０．０５〜５ｎｍｏｌ、０．１〜２ｎｍｏｌ、０．５〜０．９ｎｍｏｌ、０．１〜１．０、０．０１〜０．０５、０．０５〜０．１、０．１〜０．５、０．６〜１．０、１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０ｎｍｏｌまたはその中のいずれかの範囲若しくは値を挙げることができるその中のいずれかの範囲若しくは値を挙げることができる、約０．１ｎｍｏｌから約１０ｎｍｏｌまでの範囲にわたることが
できる。
【００２０】
ＰＧＥ２は免疫原と同時に若しくは続けて投与しうる。ＰＧＥ２を免疫原と同時に投与する場合、免疫原およびＰＧＥ２双方が同一組成物の一部を形成し得る。あるいは、ＰＧＥ２の補助効果はＰＧＥ２を免疫原と別個に投与することにより使用しうる。別個に投与される場合、ＰＧＥ２は好ましくは生理的食塩水若しくはＰＢＳのような適する担体中で提供される。ＰＧＥ２は免疫原と同時に、または、あるいは、免疫原投与の前若しくは後に投与しうる。免疫原およびＰＧＥ２の投与の間の時間間隔は免疫原に依存する。
【００２１】
免疫原は該免疫原の免疫化スケジュールに従って投与する。例えば、効果的免疫応答を導き出すのに十分な量の免疫原の単回投与を使用しうる。あるいは、免疫原の初回投与、次いで１回若しくはそれ以上の追加免疫という他の投与計画を使用しうる。免疫原の複数回投与が望ましい場合、ＰＧＥ２は、最初の投与内のみで若しくは計画された投与の全部でのいずれでも免疫原とともに投与し得る。投与は、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、皮内若しくは足蹠注入によりのようないかなる適する経路も介しうる。
【００２２】
本発明は免疫原に対する抗体の改良された製造方法をさらに提供し、該方法は、目的の免疫原および有効補助量のＰＧＥ２を投与すること、およびそれにより該免疫原に対する免疫応答を増大させること、ならびに該免疫原と特異的に反応性である抗体若しくは抗体を産生する細胞についてスクリーニングすることを含んでなる。
【００２３】
引用：本明細書で引用される全部の刊行物若しくは特許は、それらが本発明の時点で従来技術を示すため、ならびに／若しくは本発明の記述および実現可能性を提供するために引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる。刊行物は、いかなる学術刊行物若しくは特許公開、または全部の記録、電子若しくは印刷形式を包含するいずれかの媒体形式で入手可能ないかなる他の情報も指す。以下の参考文献は引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる：Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７−２００６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９４−２００６）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９９７−２００６）。
【００２４】
一般に抗体の製造および特徴付け手段は当該技術分野で公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、およびＣｏｌｌｉｇａｎ、上記。しかしながら、ある種の免疫原は免疫学的に潜在的であり、そして一般に宿主に与えられる場合に満足な抗体応答を導き出さない。本発明は、免疫原に対する抗体応答を促進するように標準的方法を操作し得る抗体の改良された製造方法を提供する。
【００２５】
本発明のポリクローナル抗体を製造するため、宿主に免疫原および有効補助量のＰＧＥ２を投与する。抗血清を宿主から収集する。広範な動物種を抗血清の製造に使用し得る。典型的には、抗血清の製造に使用される動物はウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット若しくはヤギである。ポリクローナル抗体の製造は、免疫化後の多様な時点で免疫した動物の血液をサンプリングすることによりモニターしうる。１回若しくはそれ以上の追加免疫注入もまた与えうる。追加免疫および力価測定（ｔｉｔｅｒｉｎｇ）の過程を
適する力価が達成されるまで反復する。例えばＣｏｌｌｉｇａｎ、第２章、上記（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい。
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体を製造するため、宿主に免疫原および有効補助量のＰＧＥ２を投与する。典型的にはマウスおよびラットのようなげっ歯類を使用しうる。免疫化後に抗体を産生するための能力をもつ体細胞、具体的にはＢリンパ球（Ｂ細胞）をｍＡｂ生成プロトコルでの使用に選択する。これらの細胞は生検した脾、扁桃若しくはリンパ節または末梢血サンプルから得ることができる。
【００２７】
免疫した動物からの抗体産生Ｂリンパ球をその後不死骨髄腫細胞株の細胞と融合する。ハイブリドーマを生じる融合処置での使用に適する骨髄腫細胞株は、好ましくは抗体を産生せず、高い融合効率、および所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支援するある種の選択培地中でそれらが増殖することを不可能にする酵素欠損を有する。例えば、免疫される動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌを使用しうる。
【００２８】
抗体を産生する脾若しくはリンパ節細胞および骨髄腫細胞のハイブリッドの生成方法は当該技術分野で公知である。一般に、体細胞を２：１の比率で骨髄腫細胞と混合するとは言え、該比率は、細胞膜の融合を促進する剤（１種若しくはそれ以上、化学的若しくは電気的）の存在下でそれぞれ約２０：１から約１：１まで変動しうる。センダイウイルスを使用する融合方法がＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５；１９７６）により、および、３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧのようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用するものがＧｅｆｔｅｒら（１９７７）により記述されている。電気で誘発される融合法の使用もまた適切である（Ｇｏｄｉｎｇ  ｐｐ．７１−７４、１９８６）。
【００２９】
ハイブリドーマの集団を選択培地で培養しそして特定のハイブリドーマを選択する。典型的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中で単一クローン希釈により細胞を培養すること、次いで個々のクローンの上清（約２ないし３週後）を所望の反応性について試験することにより実施する。該アッセイは、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなどでありうる。
【００３０】
抗体産生細胞は、目的の抗原で免疫したヒト若しくは他の適する動物の末梢血または好ましくは脾若しくはリンパ節からもまた得ることができる。本発明の抗体、指定されるフラグメント若しくはそれらのバリアントをコードする異種若しくは内因性核酸を発現させるためのいかなる他の適する宿主細胞もまた使用し得る。融合細胞（ハイブリドーマ）若しくは組換え細胞は、選択的培養条件若しくは他の適する既知の方法を使用して単離し得、そして限界希釈若しくは細胞分取または他の既知の方法によりクローン化し得る。所望の特異性をもつ抗体を産生する細胞は適するアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）により選択し得る。
【００３１】
必須の特異性の抗体の他の適する製造若しくは単離方法は当該技術分野（例えばＣｏｌｌｉｇａｎ、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記（それらのそれぞれは引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい）で既知のとおり使用し得る。
【００３２】
ヒト以外若しくはヒト抗体の工作若しくはヒト化方法もまた使用することができ、そして当該技術分野で公知である。一般に、ヒト化若しくは工作した抗体はヒト以外、例えば、限定されるものでないがマウス、ラット、ウサギ、ヒト以外の霊長類若しくは他の哺乳
動物である供給源からの１個若しくはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒトアミノ酸残基はしばしば「輸入」残基と称され、それらは典型的に既知のヒト配列の「輸入」可変、定常若しくは他のドメインから採られる。既知のヒトＩｇ配列は当該技術分野で公知であり、そしていずれの既知の配列でもあり得る。例えば、限定されるものでないがＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ  ０５／３３０２９号、および２００４年６月２１日に出願された米国特許第ＵＳ  １０／８７２，９３２号（引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい。
【００３３】
こうした輸入された配列は、当該技術分野で既知のとおり、免疫原性を低下、または結合、アフィニティー、オン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）、オフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、アビディティー、特異性、半減期若しくはいずれかの他の適する特徴を低下する、高める若しくは改変するのに使用し得る。一般に、ヒト以外若しくはヒトＣＤＲ配列の一部若しくは全部が維持される一方、可変および定常領域のヒト以外配列がヒト若しくは他のアミノ酸で置き換えられる。抗体はまた、場合によっては抗原に対する高アフィニティーおよび他の好都合な生物学的特性の保持を伴いヒト化もし得る。この最終目標を達成するため、ヒト化抗体は、場合によっては、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用する親配列および多様な概念的ヒト化生成物の解析の過程により製造し得る。三次元の免疫グロブリンモデルは一般に入手可能でありかつ当業者になじみがある。選択された候補免疫グロブリン配列のありそうな三次元コンホメーション構造を具体的に説明しかつ表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査は候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の解析、すなわちその抗原を結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の解析を可能にする。こうして、標的抗原（１種若しくは複数）に対する増大されたアフィニティーのような所望の抗体の特徴が達成されるように、コンセンサスおよび輸入配列からＦＲ残基を選択かつ組合せ得る。一般に、ＣＤＲ残基は抗原結合に直接かつ最も実質的に影響することに関与する。本発明の抗体のヒト化若しくは工作は、限定されるものでないが、Ｗｉｎｔｅｒ（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第：５７２３３２３号、同第５９７６８６２号、同第５８２４５１４号、同第５８１７４８３号、同第５８１４４７６号、同第５７６３１９２号、同第５７２３３２３号、同第５，７６６８８６号、同第５７１４３５２号、同第６２０４０２３号、同第６１８０３７０号、同第５６９３７６２号、同第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５２２５５３９号；同第４８１６５６７号、ＰＣＴ／：第ＵＳ９８／１６２８０号、同第ＵＳ９６／１８９７８号、同第ＵＳ９１／０９６３０号、同第ＵＳ９１／０５９３９号、同第ＵＳ９４／０１２３４号、同第ＧＢ８９／０１３３４号、同第ＧＢ９１／０１１３４号、同第ＧＢ９２／０１７５５号；第ＷＯ９０／１４４４３号、同第ＷＯ９０／１４４２４号、同第ＷＯ９０／１４４３０号、第ＥＰ  ２２９２４６号、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ａｕｓｕｂｅｌ、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、上記（それぞれ引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）、その中で引用���れる包含される参考文献に記述されるものを挙げることができるいずれかの既知の方法を使用して実施し得る。
【００３４】
抗体は、場合によっては、本明細書に記述されかつ／若しくは当該技術分野で既知のところのヒト抗体のレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ヒト以外の霊長類など）の免疫化によってもまた生成し得
る。所望の抗体を産生する細胞をこうした動物から単離し得、そして本明細書に記述される方法のような適する方法を使用して不死化し得る。
【００３５】
ヒト抗原に結合するヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニックマウスは既知の方法により製造し得る（例えば、限定されるものでないが、Ｌｏｎｂｅｒｇらに交付された米国特許第：５，７７０，４２８号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号および同第５，７８９，６５０号、；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら  第ＷＯ  ９８／５０４３３号、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら  第ＷＯ  ９８／２４８９３号、Ｌｏｎｂｅｒｇら  第ＷＯ  ９８／２４８８４号、Ｌｏｎｂｅｒｇら  第ＷＯ  ９７／１３８５２号、Ｌｏｎｂｅｒｇら  第ＷＯ  ９４／２５５８５号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅら  第ＷＯ  ９６／３４０９６号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅら  第ＥＰ  ０４６３  １５１  Ｂ１号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅら  第ＥＰ  ０７１０  ７１９  Ａ１号、Ｓｕｒａｎｉら  米国特許第５，５４５，８０７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら  第ＷＯ  ９０／０４０３６号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら  第ＥＰ  ０４３８  ４７４
Ｂ１号、Ｌｏｎｂｅｒｇら  第ＥＰ  ０８１４  ２５９  Ａ２号、Ｌｏｎｂｅｒｇら  第ＧＢ  ２  ２７２  ４４０  Ａ号、Ｌｏｎｂｅｒｇら  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（４）５７９−５９１（１９９４）、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）、Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）、Ｔａｙｌｏｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０（２３）：６２８７−６２９５（１９９２）、Ｔｕａｉｌｌｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０（８）３７２０−３７２４（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３（１）：６５−９３（１９９５）およびＦｉｓｈｗａｌｄら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４（７）：８４５−８５１（１９９６）（それぞれ引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる））。一般に、これらのマウスは、機能的に再配列されるか若しくは機能的再配列を受け得る最低１種のヒト免疫グロブリン遺伝子座からのＤＮＡを含んでなる最低１種の導入遺伝子を含んでなる。こうしたマウス中の内因性免疫グロブリン遺伝子座は、内因性遺伝子によりコードされる抗体を産生する該動物の能力を排除するように破壊若しくは欠失し得る。
【００３６】
本発明の方法は、従って抗体のより効率的な生成方法を提供する。従って、本発明は、本発明の改良された方法を使用して製造される抗体もまた提供する。本発明の方法を使用して製造される抗体は治療、診断および／若しくは研究目的上使用し得る。
【００３７】
本発明を全般的に記述したので、それは、具体的説明のために提供されかつ制限するとして意図していない以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
【実施例１】
【００３８】
アジュバントとしてのＰＧＥ２は抗体力価を有意に増大した
卵アルブミン（ＯＶＡ）に対する抗体を生成するため、Ｂａｌｂ／ｃマウスをアジュバント中に乳化した２５μｇのＯＶＡで免疫した。ＰＧＥ２の効果を試験するため、該マウスに免疫化３時間前、ならびに免疫化２４および４８時間後に再度、１ｎｍｏｌのＰＧＥ２を腹腔内に（ｉ．ｐ．）注入した。対照群については、マウスに免疫化３時間前に等容量のＰＢＳを注入した（ｉ．ｐ．）。マウスは第１４日（ｉ．ｐ．）および第２８日（皮下で）に２５μｇのＯＶＡで追加免疫した。抗ＯＶＡ力価を第２７日および第３５日に測定した。表１に示されるとおり、ＰＧＥ２でのＢａｌｂ／ｃマウスの処置は抗ＯＶＡ力価を有意に高めた。
【００３９】
【表１】
2010505769.tif 000002
【００４０】
困難な標的に対する抗体の生成に対するＰＧＥ２の効果を評価するため、抗体応答を生じさせるのが困難であることが既知の名目上免疫原（ＡｇＸ）を使用した。簡潔には、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、２５μｇのＯＶＡ若しくはＡｇＸいずれかで上に概説された同一スケジュールに従って免疫し、そして２回のｉ．ｐ．注入後の第２７日に力価測定した。表２に示されるとおり、ＰＧＥ２添加はわずか２回の免疫原注入後に抗ＯＶＡ力価を高めた。従って、ＰＧＥ２はＢａｌｂ／ｃマウスにおける免疫応答を高め、そして免疫化スケジュールを短縮するのに使用しうる。
【００４１】
より重要なことに、ＰＧＥ２は、２回の注入後に抗ＡｇＸ力価もまた２〜３倍増大させた。反対の（ａｇａｉｎｓｔ）抗体を生成することのこの免疫原の困難な性質を考えればこれは大きな増大である。従って、ＰＧＥ２は、強免疫原に対してのみならずしかしまた困難な／名目上の免疫原に対しても免疫応答を高めるのにＢａｌｂ／ｃマウスで使用し得る。
【００４２】
【表２】
2010505769.tif 000003
【００４３】
要するに、本発明は、高度に効率的である新規アジュバントとしてＰＧＥ２を提供することにより現在既知かつ／若しくは利用されるアジュバントの欠点を成功裏に扱い、そして最小限の副作用を誘発するか若しくは副作用を誘発しない。
【００４４】
本発明は前述の記述および実施例にとりわけ記述されるもの以外の方法で実施し得ることが明らかであろう。本発明の多数の改変および変形が上の教示に照らして可能であり、そして従って本発明の範囲内にある。
【００４５】
【表３】
2010505769.tif 000004
【国際調査報告】
2010505769.tif 000005
2010505769.tif 000006
2010505769.tif 000007