(57)【要約】本発明は、水不混和性の有機の第一液体中に荷電した核酸を溶解させるための方法に関する。上記方法は、以下の工程を包含する：ａ）水性の第二液体中に核酸の溶液を提供する工程、ｂ）第二液体中で核酸と不溶性の錯体を形成する錯体形成因子を第二液体に加えることによって、核酸を沈殿させる工程、ｃ）第二液体から錯体を取り出す工程、ｄ）両親媒性化合物から構成されるか、または、両親媒性化合物を含む第三液体中に、錯体を溶解させる工程、および、ｅ）第三液体を第一液体と混合する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不混和性の液体に核酸を溶解させるための方法であって、該方法は、両親媒性の液体中に錯体形成因子と共に存在している核酸を、水不混和性の液体と混合する工程を包含する、方法。
【請求項２】
水不混和性の有機の第一液体中に荷電した核酸を溶解させるための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）水性の第二液体中に該核酸の溶液を提供する工程、
ｂ）該第二液体中で該核酸と不溶性の錯体を形成する錯体形成因子を該第二液体に加えることによって、該核酸を沈殿させる工程、
ｃ）該第二液体から該錯体を取り出す工程、
ｄ）両親媒性化合物から構成されるか、または、両親媒性化合物を含む第三液体中に、該錯体を溶解させる工程、および
ｅ）該第三液体を該第一液体と混合する工程
を包含する、方法。
【請求項３】
前記錯体形成因子が、カチオン性界面活性剤または有機アミン、特に、第四級アミンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第四級アミンが、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記錯体形成因子が、工程ｂ）の前記第二液体に、溶解した形態で加えられる、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が、合成により調製された、既知配列を有する核酸である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記核酸が、各々、５〜１００ヌクレオチドの鎖長、好ましくは、１０〜８０ヌクレオチドの鎖長、特に好ましくは、１５〜６０ヌクレオチドの鎖長を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記核酸が、アンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸が、ヒト遺伝子の配列の少なくとも一部分を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸が、一本鎖または二本鎖の形状を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
工程ｃ）における前記錯体を取り除く工程が、遠心分離または濾過によってなされる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記両親媒性化合物が有機溶媒である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記両親媒性化合物が少なくとも１つのエーテル基を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記両親媒性化合物が少なくとも１つのヒドロキシル基を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記両親媒性化合物が、式ＨＯ−Ｒ１−Ｏ−Ｒ２によって記述され得、ここで、Ｒ１およびＲ２が、各場合において、１〜１００個の炭素原子を有する炭化水素残基である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記両親媒性化合物が、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、または、エチレングリコールモノメチルエーテルである、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
０．１ｍｇ／ｍｌより高い、特に、１ｍｇ／ｍｌより高い、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌより高い、前記第三液体中の核酸の濃度が生じるような量で、前記錯体が該第三液体中に溶解される、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記第一液体が、植物性または動物性の油または油脂である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記第一液体が、２０℃において、固体、特に、蝋である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記第一液体が、内燃機関のための燃料である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記第一液体が、鉱物油脂、鉱物油、または、鉱物油の蒸留液、もしくは、蒸留液の残留物、特に、ディーゼル燃料、軽油、重油、トルエン、ベンゼンまたはガソリンである、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
荷電した、合成により調製された核酸と、両親媒性化合物とが内部に溶解された水不混和性の有機液体であって、該核酸は、錯体形成因子によって錯体形成されており、かつ、既知配列を有する、液体。
【請求項２４】
前記錯体形成因子が、カチオン性界面活性剤または有機アミン、特に、第四級アミンである、請求項２３に記載の液体。
【請求項２５】
前記第四級アミンが、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）である、請求項２４に記載の液体。
【請求項２６】
前記核酸が、各々、５〜１００ヌクレオチドの鎖長、好ましくは、１０〜８０ヌクレオチドの鎖長、特に好ましくは、１５〜６０ヌクレオチドの鎖長を有する、請求項２３〜２５のいずれかに記載の液体。
【請求項２７】
前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成される、請求項２３〜２６のいずれかに記載の液体。
【請求項２８】
前記核酸が、アンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項２３〜２７のいずれかに記載の液体。
【請求項２９】
前記核酸が、ヒト遺伝子の配列の少なくとも一部分を含む、請求項２３〜２８のいずれかに記載の液体。
【請求項３０】
前記核酸が、一本鎖または二本鎖の形状を有する、請求項２３〜２９のいずれかに記載の液体。
【請求項３１】
前記両親媒性化合物が有機溶媒である、請求項２３〜３０のいずれかに記載の液体。
【請求項３２】
前記両親媒性化合物が少なくとも１つのエーテル基を含む、請求項２３〜３１のいずれかに記載の液体。
【請求項３３】
前記両親媒性化合物が少なくとも１つのヒドロキシル基を含む、請求項２３〜３２のいずれかに記載の液体。
【請求項３４】
前記両親媒性化合物が、式ＨＯ−Ｒ１−Ｏ−Ｒ２によって記述され得、ここで、Ｒ１およびＲ２が、各場合において、１〜１００個の炭素原子を有する炭化水素残基である、請求項２３〜３３のいずれかに記載の液体。
【請求項３５】
前記両親媒性化合物が、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、または、エチレングリコールモノメチルエーテルである、請求項２３〜３４のいずれかに記載の液体。
【請求項３６】
前記核酸が、０．１ｍｇ／ｍｌより高い、特に、１ｍｇ／ｍｌより高い、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌより高い濃度で存在する、請求項２３〜３５のいずれかに記載の液体。
【請求項３７】
前記液体が、植物性または動物性の油または油脂である、請求項２３〜３６のいずれかに記載の液体。
【請求項３８】
前記液体が、２０℃において、固体、特に、蝋である、請求項２３〜３７のいずれかに記載の液体。
【請求項３９】
前記液体が、内燃機関のための燃料である、請求項２３〜３７のいずれかに記載の液体。
【請求項４０】
前記液体が、鉱物油脂、鉱物油、または、鉱物油の蒸留液、もしくは、蒸留液の残留物、特に、ディーゼル燃料、軽油、重油、トルエン、ベンゼンまたはガソリンである、請求項２３〜３９のいずれかに記載の液体。
【請求項４１】
前記核酸を検出して前記液体を同定するための方法を行うための、請求項２３〜４０のいずれかに記載の液体の使用。
【請求項４２】
前記核酸の配列が同定される、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記核酸の配列の同定が、配列決定、ハイブリダイゼーションによってなされるか、または、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによってなされる、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
請求項２３〜４０のいずれかに記載の液体を含む、薬学的組成物。
【請求項４５】
局所適用のために設計された、請求項４４に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
水不混和性の液体から核酸を単離するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）水混和性の溶媒を用いて該液体から該核酸を抽出する工程であって、該工程は、該水不混和性の液体を該水混和性の溶媒と接触させることによってなされ、そして、該水混和性の溶媒が、１以上の塩を含む、工程；
ｂ）該水混和性の溶媒を、該水不混和性の液体から分離する工程；および
ｃ）該水混和性の溶媒から該核酸を単離する工程
を包含する、方法。
【請求項４７】
水不混和性の液体から核酸を単離するための方法であって、該方法は、該液体を、１以上の塩を含みかつ該水不混和性の液体中に溶解する溶媒と混合することにより、該核酸を沈殿させる工程を包含する、方法。
【請求項４８】
食品を分析するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）請求項４６または４７に記載の方法のうちの一方を用いて、該食品の１以上の水不混和性成分から核酸を単離する工程；および
ｂ）該核酸を分析する工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水不混和性の有機液体中に荷電した核酸を溶解させるための方法に関する。本発明はさらに、内部に溶解され、錯体形成因子によって錯体形成された核酸を含む、水不混和性の有機液体に関する。本発明はさらに、本発明の方法を行うためのこのような液体の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、石油性物質へのＤＮＡの添加を開示する。この文献の場合、ＤＮＡは、石油性物質中に溶解され得、そして本質的には、水で洗浄することによってはそこから除去され得ないように調製される。特許文献１に開示される方法は、物質（特に、石油製品）の輸送を監視するために使用される。ＤＮＡは、増幅反応によって石油製品から取り出され得、そして検出され得る。石油製品中にＤＮＡを溶解するためには、ＤＮＡは、疎水性のハプテンと組み合され得る。別の可能性は、疎水性となるような方法で化学修飾されたＤＮＡを使用することである。この目的に関して、ＤＮＡとしては、ヨードエタノールのような適切な薬剤によって修飾されたチオホスフェートを含む、スルホヌクレオチドが挙げられ得る。あるいは、メチル化したＤＮＡを使用することも可能である。
【０００３】
上記方法は、この方法のために必要とされるＤＮＡの調製が非常に厄介であるという不都合な点を有する。さらに、その後、ＤＮＡを検出できるようにするために、ＤＮＡを水相に移すことも厄介である。
【０００４】
メチル化ＤＮＡの場合には、これは、例えば、その一端にビオチン分子を配置し、その結果、ＤＮＡがストレプトアビジンによって結合され得、それによって単離され得るようにすることによって行われ得る。疎水性のハプテンに結合したＤＮＡの場合、ＤＮＡは、ハプテンに特異的な抗体によって単離され得る。
【０００５】
特許文献２は、水不溶性媒体中にリボ核酸を混合するための方法を開示する。この文献の場合、水不溶性媒体がまず溶媒中に溶解され、次いで、水中に溶解させた核酸と混合される。例えば、水不溶性媒体はポリスチレンであり得、そして、溶媒はクロロホルムであり得る。クロロホルム中に溶解させたポリスチレンを、水中に溶解させた核酸と混合する前に、９５％エタノールおよびアセトンの中間溶液が、水中に溶解させた核酸に加えられる。混合により得られたポリスチレン溶液は核酸を含み、そして、製品の偽造防止の標識として使用され得る。この方法の不都合な点は、この方法が比較的厄介であり、そして、この方法のためにポリマーが必要とされることである。さらに、特許文献２は、ポリマー中に存在する核酸が、いかにして再度除去され得、その結果、検出され得るかを開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，６６５，５３８号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第１  ３９４  ５４４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
その方法を用いることで荷電した核酸が水不混和性の有機液体中に溶解され得るという、有益かつ厄介でない方法を示すことが、本発明の目的の一つである。さらに、荷電した核酸が溶解された水不混和性の有機液体、およびこの液体の使用を示すことも意図される。核酸は、困難を伴うことなく有機液体から除去され得るような方法で溶解されるべきである。例えば、薬学的組成物におけるこのような液体の使用、および、食品を分析するための方法の提供もまた同様に、本発明の目的の一部である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
荷電した核酸とは、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡの場合のように、ヌクレオチドがホスホジエステル結合によって互いに結合され、このホスホジエステル結合に関与しているリン酸残基が負に帯電しているような核酸を意味する。通常、核酸は、その電荷に起因して水易溶性であるが、炭化水素のような水不混和性の有機液体中には易溶性でない。水不混和性の有機液体とは、１ｍｌを溶解させるために１リットルを超える水（好ましくは１０リットルを超える水）が必要とされる有機液体を意味する。この液体は、この文脈においては、一般に、生物学的起源のものである。この液体は、例えば、植物、鉱物または動物起源の、溶融状態の油または油脂または蝋であり得る。この液体はまた、通常、室温では固体の形態の、溶融物質であり得る。熱分解による核酸の破壊の可能性に起因して、液体の温度は、１２０℃（好ましくは、１００℃、特に、８０℃）を超えないことが望ましい。核酸は、１５０００×ｇで５分間の遠心分離によって遠心分離され得ない場合に、本発明の文脈において溶解されたものとみなされる。
【０００９】
問題は、請求項１、２、２３、４１、４４および４６〜４８の特徴によって解決される。適切な実施形態は、請求項３〜２２、２４〜４０および４２、４３、ならびに４５の特徴に由来する。
【００１０】
本発明は、水不混和性の液体に荷電した核酸を溶解させるための方法に関し、この方法は、両親媒性の液体中に錯体形成因子と共に存在している核酸を、水不混和性の液体と混合する工程を包含する。
【００１１】
さらなる実施形態は、水不混和性の有機の第一液体中に荷電した核酸を溶解させるための方法を提供し、この方法は、以下の工程：
ａ）水性の第二液体中に核酸の溶液を提供する工程、
ｂ）第二液体中で核酸と不溶性の錯体を形成する錯体形成因子を第二液体に加えることによって、核酸を沈殿させる工程、
ｃ）第二液体から錯体を取り出す工程、
ｄ）両親媒性化合物から構成されるか、または、両親媒性化合物を含む第三液体中に、錯体を溶解させる工程、および
ｅ）第三液体を第一液体と混合する工程
を包含する。
【００１２】
本発明の方法は、非常に単純かつ費用効率の高いやり方で、水不混和性の有機の第一液体中で荷電した核酸の溶液を調製することを可能にする。核酸は、さらに、第一液体中に非常に高濃度で溶解され得る。錯体を両親媒性化合物と接触させることが、この目的のためには必須である。両親媒性化合物を用いない場合、第一液体中に比較的少量の錯体形成した核酸のみを溶解させることが可能である。
【００１３】
本発明の方法は、偽造防止の識別のためにＤＮＡで第一液体を標識することを可能にする。例えば、石油または石油製品は、特定のＤＮＡを用いて標識され得、そして、石油または石油製品のサンプルからＤＮＡを同定することにより、その輸送経路が監視され得る。第一液体または第三液体中に高濃度でＤＮＡを溶解させる可能性は、大量の石油または石油製品（例えば、タンカーの積荷）を標識するのに適切な、高濃度のストック溶液を調製することを可能にする。本発明の方法はさらに、化学反応のため、または、水不混和性の有機液体中での保存のための核酸を、特に高濃度で提供することを可能にする。例えば、油中でのＤＮＡの化学反応を可能にすることも可能である。さらに、核酸は、冷却することなく、水不混和性の有機液体中で貯蔵され得、それゆえ、より高次の錯体形成を伴うことも、分解（特に、酵素による分解）を受けることもなく、長距離を輸送される得る。この理由はおそらく、核酸分解酵素が、その機能のために水性の環境を必要とするためである。
【００１４】
さらに、例えば薬学的用途のための核酸（例えば、ｓｉＤＮＡ）を、例えば軟膏として処方することも可能である。このような処方物は、非常に長い貯蔵寿命の利点を有する。
【００１５】
したがって、本発明はまた、本発明に従って錯体形成因子を用いて錯体形成され、そして、両親媒性化合物中に存在する核酸を含む薬学的組成物に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明に従う水不混和性の有機液体を含む薬学的組成物に関する。
【００１７】
さらに好ましい実施形態では、核酸は、ＲＮＡであり、特に好ましくはｓｉＲＮＡである。
【００１８】
薬学的組成物は、核酸を適切な形態で投与するために使用される。本発明の組成物は、例えば、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、挫剤、注射剤、エマルジョン、懸濁剤または液剤の形態であり得る。本発明の組成物は、種々のタイプの投与のために（例えば、局所投与、経口投与、バッカル投与、舌下投与、経粘膜投与、直腸投与、皮下投与、クモ膜下腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経鼻投与、眼内投与または心室内投与のために）処方され得る。
【００１９】
好ましい実施形態では、薬学的組成物は、局所適用のために設計される。特に好ましい実施形態では、本発明の錯体形成された核酸を含む薬学的組成物は、軟膏の形態である。
【００２０】
第一液体から核酸を回収するために、核酸は、例えば、振ることによって、高濃度の塩が存在する水混和性溶媒を用いて抽出され得る。例えば、酢酸ナトリウム−飽和エタノール、またはＳＤＳ−飽和エタノールもしくはブタノールをこの目的のために使用することが可能である。この場合、核酸は、水混和性溶媒中に沈殿し、そして、例えば遠心分離によって水混和性溶媒を除いた後に、水中に取り上げられて、例えばＰＣＲによって検出され得る。
【００２１】
本発明のさらなる局面は、したがって、水不混和性の液体から核酸を単離するための方法に関する。
【００２２】
第一の実施形態では、水不混和性の液体から核酸を単離するための方法は、以下の工程：
ａ）水混和性の溶媒を用いて液体から核酸を抽出する工程であって、この工程は、水不混和性の液体を水混和性の溶媒と接触させることによってなされ、そして、この水混和性の溶媒は、１以上の塩を含む、工程；
ｂ）水混和性の溶媒を、水不混和性の液体から分離する工程；および
ｃ）水混和性の溶媒から核酸を単離する工程
を包含する。
【００２３】
第二の実施形態では、水不混和性の液体から核酸を単離するための方法は、この液体を、１以上の塩を含みかつ水混和性の液体中に溶解する溶媒と混合することにより、核酸を沈殿させる工程を包含する。
【００２４】
さらなる実施形態は、水不混和性の液体から核酸を単離するための方法に関し、この方法において、１以上の塩がこの液体に加えられ、そのことによって核酸が沈殿する。
【００２５】
適切な塩の例は、臭化ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）または酢酸ナトリウムである。
【００２６】
塩は、５０％、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、特に好ましくは８０％、そして最も好ましくは９０％の飽和溶解度に対応する量、すなわち、選択された溶媒を用いて飽和溶液を生じるために、標準的な条件下で用いられなければならない塩の量に対応する量で用いられる。この量は、当業者によって容易に確認され得る。
【００２７】
さらに好ましい実施形態では、溶液は、飽和溶液の形態で用いられる。
【００２８】
したがって、上記の第一の実施形態において用いられ得る水混和性溶媒は、例えば、水と完全に混和性のアルコール中にある飽和塩溶液（例えば、エタノール中の飽和ＮａＢｒ溶液）である。
【００２９】
水不混和性の液体からの核酸の単離は、食品を分析するために、本発明のさらなる実施形態において用いられ得る。このようにして、非常に少量であっても食品から核酸を単離し、それによって、その食品の成分の起源を決定することが可能となる。したがって、例えば、種々のタイプの油は、その油中に見られる核酸に基づいて同定され得る。
【００３０】
驚くべきことに、核酸はまた、いかなる核酸をも含まないと推定される食品サンプルからも単離され得ることが分かった。したがって、本発明の文脈においては、例えば、核酸は、菜種油、オリーブ油、ヒマワリ油、カボチャの種の油、ゴマ油、ブドウの種の油、クルミ油、ベニバナ油およびヤシ油のような、従来の食用油中に見出される。
【００３１】
これらの核酸を増幅することによって、どんな成分が食品中に存在したかを決定することが可能である。このようにして、例えば、高級の食用油（例えば、オリーブ油）は、低級の油と区別され得る。
【００３２】
したがって、本発明はまた、食品を分析するための方法に関し、この方法は、以下の工程：
ａ）上記方法のうちの一つを用いて、食品の１以上の水不混和性成分から核酸を単離する工程；および
ｂ）核酸を分析する工程
を包含する。
【００３３】
好ましい実施形態では、核酸は、ＰＣＲにより分析される。
【００３４】
錯体形成因子は、好ましくは、カチオン性界面活性剤または有機アミン、特に、第四級アミンである。第四級アミンは、好ましくは、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）である。ＣＴＡＢは、意図される錯体形成に非常に適しており、そして、非常に価格が手ごろである。
【００３５】
錯体形成因子は、好ましくは、工程ｂ）の第二液体に、溶解した形態で加えられる。これにより、溶解していない錯体形成因子を加えるときよりも早く沈殿させることが可能となる。
【００３６】
核酸は、好ましくは、合成により調製された、既知配列を有する核酸である。これにより、偽造防止の標識化のために、実質的に無制限の数の符号化を提供することが可能となる。はっきり限定して標識のために機能する核酸が、配列決定によって検出され得ないように、識別のために使用される核酸が、第一液体中に溶解される多数のさらなる核酸中に「隠される」場合が、この目的のためには、特に好ましい。このさらなる核酸は、例えば、ニシンの精子ＤＮＡを用いることによって提供され得る。
【００３７】
核酸は、各々、５〜１００ヌクレオチドの鎖長、好ましくは、１０〜８０ヌクレオチドの鎖長、特に好ましくは、１５〜６０ヌクレオチドの鎖長を有し得る。核酸は、ＤＮＡ（特に、アンチセンスＤＮＡ）またはＲＮＡ（特に、ｓｉＲＮＡ）であり得る。核酸がヒト遺伝子の配列の少なくとも一部を含む場合、これは、治療用途には特に有益である。
【００３８】
核酸は、一本鎖または二本鎖の形状を有し得る。二本鎖の形状を持つ核酸は、２つの別個の一本鎖の形状で、または、ヘアピンループ構造として存在し得る。
【００３９】
工程ｃ）における錯体を取り除く工程が、好ましくは、遠心分離または濾過によってなされる。これらの方法は、沈殿した錯体を取り除く、特に単純かつ有効な方法を代表するものである。
【００４０】
両親媒性化合物は、好ましくは、有機溶媒である。両親媒性化合物は、好ましくは、少なくとも１つのエーテル基および／または少なくとも１つのヒドロキシル基を含む。
【００４１】
溶媒として特に適切な両親媒性化合物は、式ＨＯ−Ｒ１−Ｏ−Ｒ２によって記述され得、ここで、Ｒ１およびＲ２が、各場合において、１〜１００個の炭素原子を有する炭化水素残基である。両親媒性化合物は、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、または、エチレングリコールモノメチルエーテルであり得る。
【００４２】
錯体は、好ましくは、第三液体中で、０．１ｍｇ／ｍｌより高い、特に、１ｍｇ／ｍｌより高い、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌより高い核酸の濃度が生じるような量で、第三液体中に溶解される。第一液体は、植物性または動物性の油または油脂であり得る。第一液体は、２０℃において、固体の形態の液体であり得る。これは、例えば、蝋であり得る。
【００４３】
第一液体はまた、内燃機関のための燃料であり得る。第一液体は、鉱物油脂、鉱物油、または、鉱物油の蒸留液、もしくは、蒸留液の残留物、特に、ディーゼル燃料、軽油、重油、トルエン、ベンゼンまたはガソリンであり得る。
【００４４】
本発明はさらに、荷電した核酸と、両親媒性化合物とが内部に溶解された水不混和性の有機液体に関する。この場合、核酸は、合成により調製された、既知配列を有する核酸である。このような液体は、本発明の方法により調製され得る。液体は、核酸を検出して液体を同定するための方法を行うのに特に適している。液体の同定は、核酸の予め知られた配列が確認される場合、特に信頼性が高い。
【００４５】
本発明の有益な実施形態は、以下の例示的な実施形態から明らかである。
【実施例】
【００４６】
そうでないと示さない限り、全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｅｓｃｈｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ５，８２０２４  Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。
【００４７】
（１．錯体形成因子としてＣＴＡＢを用いた、ＤＮＡの沈殿）
１０ｇのニシン精子ＤＮＡ（ＨＳ−ＤＮＡ）を、１ＬのＴＥ（脱イオン水中、１０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に溶解させた。撹拌しながら、１００ｍｌのＣＴＡＢ溶液（脱イオン水中１００ｍｍｏｌ／ｌのＣＴＡＢ）を加えた。形成した沈殿物（ＣＴＡＢ−ＨＳ−ＤＮＡ）を、遠心分離により沈降させ、そして、室温で乾燥させた。
【００４８】
さらに、１μｍｏｌ（約２０ｍｇに等価）の合成により調製した一本鎖ＤＮＡ（６２ヌクレオチド長であり、添付の配列表の配列番号１に対応する）（標識用ＤＮＡ、Ｌ−ＤＮＡ）を、１ｍｌのＴＥに溶解させた。撹拌しながら、１００μｌのＣＴＡＢ溶液を加えた。形成した沈殿物（ＣＴＡＢ−Ｌ−ＤＮＡ）を、遠心分離により沈降させ、そして、室温で乾燥させた。
【００４９】
ＨＳ−ＤＮＡおよびＬ−ＤＮＡの両方を含む沈殿物を調製するために１ｇのＨＳ−ＤＮＡおよび１μｍｏｌのＬ−ＤＮＡを、１００ｍｌのＴＥに溶解させた。撹拌しながら、１０ｍｌのＣＴＡＢ溶液を加えた。形成した沈殿物（ＣＴＡＢ−ＨＳ−Ｌ−ＤＮＡ）を、遠心分離により沈降させ、そして、室温で乾燥させた。
【００５０】
（２．水不混和性の液体中での、ＣＴＡＢを用いて錯体形成させたＤＮＡの溶解性）
約１ｍｇのＣＴＡＢ−ＨＳ−ＤＮＡを、１．４ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ反応容器に移した。１ｍｌのガソリン（プレミアムガソリン、ＢＰ）、ディーゼル燃料（ＢＰ）、鉱油、ヒマワリ油（スーパーマーケット）、菜種油（スーパーマーケット）、麦芽油（スーパーマーケット）またはオリーブ油（スーパーマーケット）を、各Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ反応容器に加えた。次いで、これらの反応容器を激しく振り、その後、１５０００×ｇで５分間遠心分離した。全ての反応容器中で沈殿物が観察された。
【００５１】
（３．錯体形成させたＤＮＡをアルコール中に予め溶解させた後の、水不混和性の液体中での、ＣＴＡＢを用いて錯体形成させたＤＮＡの溶解性）
１ｇのＣＴＡＢ−ＨＳ−ＤＮＡを、５０ｍｌの１−ブタノールに溶解させた。１００μｌの溶液を、１．４ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ反応容器に移した。１ｍｌのガソリン、ディーゼル、鉱油、ヒマワリ油、菜種油、麦芽油またはオリーブ油を、各Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ反応容器に加えた。次いで、これらの反応容器を激しく振り、その後、１５０００×ｇで５分間遠心分離した。全ての反応容器中で沈殿物が観察された。
【００５２】
（４．両親媒性化合物中での、ＣＴＡＢを用いて錯体形成させたＤＮＡの溶解性）
約２０ｍｇのＣＴＡＢ−ＨＳ−ＤＮＡを、１．４ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ反応容器に移した。１０００μｌ、５００μｌ、２００μｌ、１００μｌ、５０μｌまたは２０μｌのエチレングリコールモノブチルエーテル（ＥＧＥ）を、各Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ反応容器に加えた。次いで、これらの反応容器を激しく振り、その後、１５０００×ｇで５分間遠心分離した。いずれの反応容器においても沈殿物が観察されなかった。ＣＴＡＢ−ＨＳ−ＤＮＡは完全に溶解された。
【００５３】
（５．錯体形成させたＤＮＡを両親媒性化合物中に予め溶解させた後の、水不混和性の液体中での、ＣＴＡＢを用いて錯体形成させたＤＮＡの溶解性）
２ｇのＣＴＡＢ−ＨＳ−ＤＮＡを、５０ｍｌのＥＧＥに溶解させた。１００μｌおよび５００μｌの溶液を、２ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ反応容器に移した。それぞれ、９００μｌおよび５００μｌのガソリン、ディーゼル、鉱油、ヒマワリ油、菜種油、麦芽油またはオリーブ油を、各Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ反応容器に加えた。次いで、これらの反応容器を激しく振り、その後、１５０００×ｇで５分間遠心分離した。いずれの反応容器においても沈殿物が観察されなかった。ＣＴＡＢ−ＨＳ−ＤＮＡは完全に溶解された。
【００５４】
（６．水不混和性の液体中に溶解させたＤＮＡの抽出）
２０ｍｇのＣＴＡＢ−ＨＳ−Ｌ−ＤＮＡを、１ｍｌのＥＧＥに溶解させた。そのうち１００μｌを、１００ｍｌのガソリン、ディーゼル、鉱油、ヒマワリ油または菜種油に溶解させた。ＤＮＡを抽出するために、得られた溶液のうち１ｍｌを、１．４ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ反応容器に移した。そこに、５０μｌのＳＤＳ−飽和エタノールを加え、激しく振り、１５０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を捨てた。生じたペレットに１ｍｌのハプテンを加えた。次いで、反応容器を激しく振り、再度、１５０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、そして、ペレットを１ｍｌの０．１  ＴＥ（ＴＥ１部、脱イオン水９部）中に取った。
【００５５】
このようにして得られたＨＳ−ＤＮＡおよびＬ−ＤＮＡの水溶液のうち２．５μｌを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。この目的のために、合成により調製したＬ−ＤＮＡ特異的なプライマー１および２（添付の配列表の配列番号２および３に対応）を使用した。ＰＣＲは、Ｐｅｑｌａｂ（Ｃａｒｌ−Ｔｈｉｅｒｓｃｈ−Ｓｔｒ．２ｂ，９１０５２  Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のキット（ｐｅｑＧＯＬＤ  ＰＣＲ−Ｍａｓｔｅｒ−Ｍｉｘ  Ｓ）を用い、２５μｌの総容量にて行った。プライマーの濃度は、各場合、プライマー毎に２００ｎＭであり、そして、５５℃のアニーリング温度を用い、３０サイクルを行った。解析は、１０％（ｗ／ｖ）のポリアクリルアミドゲル上でのゲル電気泳動と、その後の銀染色により行った。全サンプルにおいてＬ−ＤＮＡが検出された。ＤＮＡを加えなかった、ガソリン、ディーゼル、鉱油、ヒマワリ油および菜種油からの抽出物をコントロールとして用いた。コントロールにおいては、Ｌ−ＤＮＡは検出されなかった。
【００５６】
（７．水不混和性の液体中に溶解させたＤＮＡの安定性）
２０ｍｇのＣＴＡＢ−ＨＳ−Ｌ−ＤＮＡを、１ｍｌのＥＧＥに溶解させた。そのうち１００μｌを、１００ｍｌのディーゼル燃料、鉱油、ヒマワリ油または菜種油に溶解させた。各サンプル１ｍｌを取り、４℃、室温、４０℃および８０℃にて２４時間インキュベートした。ＤＮＡを抽出するために、５０μｌのＳＤＳ−飽和エタノールをサンプルに加え、激しく振り、そして、１５０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を捨てた。生じたペレットに１ｍｌのハプテンを加え、激しく振り、そして、１５０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、そして、ペレットを１ｍｌの０．１  ＴＥ中に取った。このようにして得られたＨＳ−ＤＮＡおよびＬ−ＤＮＡの水溶液のうち２．５μｌを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。この目的のために、合成により調製したＬ−ＤＮＡ特異的なプライマー１および２を使用した。ＰＣＲは、上述のＰｅｑｌａｂ製のキットを用い、２５μｌの総容量にて行った。プライマーの濃度は、各場合、プライマー毎に２００ｎＭであり、そして、５５℃のアニーリング温度を用い、３０サイクルを行った。解析は、１０％（ｗ／ｖ）のポリアクリルアミドゲル上でのゲル電気泳動と、その後の銀染色により行った。全サンプルにおいてＬ−ＤＮＡが検出された。ＤＮＡを加えなかった、ガソリン、ディーゼル、鉱油、ヒマワリ油および菜種油からの抽出物をコントロールとして用いた。コントロールにおいては、Ｌ−ＤＮＡは検出されなかった。この実験は、水不混和性の液体に溶解させたＤＮＡが、冷却することなく、さらに、高温の場合でさえも、長期間にわたり安定であることを示す。
【００５７】
（８．ＣＴＡＢにより錯体形成させ、ＥＧＥ中に予め溶解させたＤＮＡの、固体中への導入）
１０ｇのココナッツ油脂（スーパーマーケット）を、加熱により液化させた。約５０℃まで冷却させた後、１００μｌのＥＧＥ中２％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ−ＨＳ−Ｌ−ＤＮＡを加え、そして混合した。この油脂を、４℃まで冷却することにより固化させた。
【００５８】
（９．ＤＮＡ添加なしの、ディーゼル／ガソリン／菜種油／ヒマワリ油からのＤＮＡの抽出）
１００μｌのＳＤＳ−飽和エタノールを、室温にて、１．４ｍｌプラスチック製反応チューブ内の、１ｍｌのディーゼル、ガソリン、菜種油およびヒマワリ油の各々２サンプルに加え、そして、これらのサンプルを３０秒間振り、次いで、４℃にて１時間インキュベートした。相を分離させるために、サンプルを４℃、最高加速度（約１６０００×ｇ）にて１５分間遠心分離した。全サンプルにおいて、わずかなペレットが確認された。液相を除き、そして、ペレットを、１ｍｌのｎ−ヘプタンと混合した。サンプルを約２０〜３０秒間混合し、次いで、４℃、最高加速度（約１６０００×ｇ）にて２分間遠心分離した。上清を除いて捨てた。反応チューブを逆さにして、約１０〜２０分間静置させて、ペレットを乾燥させた。ペレットを、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０を含む１００μｌの０．１×ＴＥに溶解させた。サンプル中のＤＮＡ含量を、λＤＮＡ検量プロットを用い、製造業者の情報に従って行ったＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，カタログ番号Ｐ１１４９６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ  Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｅｍｍｙ−Ｎｏｅｔｈｅｒ  Ｓｔｒａｓｓｅ  １０，７６１３１  Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）によって決定した。全てのサンプルにおいて核酸が検出された、濃度は、１ｎｇ／ｍｌ〜７ｎｇ／ｍｌの間であった（表１を参照のこと）。
【００５９】
【表１】
2010500874.tif 000002
【配列表】
2010500874000001.app
【国際調査報告】
2010500874.tif 000003
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