(57)【要約】 試料中の核酸を検出する為の方法及びキット。分析される試料には、該標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズするプライマー、標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズする第一領域及び検出可能標識を有する第二領域を含むハイブリダイゼーションプローブ、ハイブリダイズしたプライマーを伸長させるポリメラーゼ、及び、ハイブリダイズしたプローブを開裂させ、それによって該プローブの第二領域及び標識を含むプローブ断片を生成させるエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含むことが出来る。該ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも一部分は該ハイブリダイゼーションプローブの別の部分とハイブリダイズし、それによって折り畳み構造を形成する。方法は、試料を融解させ、該試料の温度を低下させてプライマーとハイブリダイゼーションプローブの夫々を該試料中の標的核酸の一本鎖の少なくとも一部とハイブリダイズせしめ、プライマーを伸長し、標識プローブ断片を遊離させることを含む。該試料は該標識プローブ断片とハイブリダイズする一つ又はそれ以上の捕捉プローブを有する固体支持体の表面と接触される。そして該標識が検出される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズするプライマー、
第一領域及び第二領域を含むハイブリダイゼーションプローブ（ここで、該第一領域は該標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズし、第二領域は該標的核酸とハイブリダイズせずに検出可能標識を有する）、及び
ポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（ここで、ポリメラーゼはハイブリダイズした該プライマーをハイブリダイズした該プローブ方向に伸長させ、該酵素のエキソヌクレアーゼ活性によってハイブリダイズした該プローブを開裂させ、それによって該プローブの第二領域及び該検出可能標識を含むプローブ断片を遊離させる）を含む試料を第一の温度まで加熱することによって該試料を融解させ（ここで、第一の温度は該プライマー及び該試料中に存在する二重鎖核酸のTmより高い）；
次に、温度を第一の温度より低い第二の温度まで低下させることによって該試料をアニーリングさせ、該プライマーと該ハイブリダイゼーションプローブの夫々を該試料中の標的核酸の一本鎖部分とハイブリダイズせしめ；
次に、第三の温度にて、該標的核酸にハイブリダイズした該プライマーをポリメラーゼによって延長させることによって該プライマーを伸長し；
次に、該酵素のエキソヌクレアーゼ活性によって該ハイブリダイゼーションプローブを開裂してプローブ断片を遊離させ；
適宜、融解、アニーリング、及び伸長を少なくとも一回繰り返し；
該試料を、該プローブ断片の第二領域の少なくとも一部分とハイブリダイズする一つ又はそれ以上の捕捉プローブを有する固体支持体の表面と接触させ；
該捕捉プローブを、第二及び第三の温度より低い第四の温度にて、該試料中に存在する該プローブ断片の少なくとも一部とハイブリダイズさせ；及び
該固体支持体表面の標識を検出することから成る、試料中の標的核酸の検出方法であって、
該ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも一部分は該ハイブリダイゼーションプローブの別の部分とハイブリダイズし、それによって折り畳み構造を形成し、該折り畳み構造の融解温度（Tm）は第三の温度より低くて第四の温度より高い、前記方法。
【請求項２】
ポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が同じ分子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
折り畳み構造の融解温度（Tm）が４１℃と６６℃の間である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
折り畳み構造の融解温度（Tm）が５８℃と６３℃の間である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
捕捉プローブがハイブリダイズするプローブ断片の第二領域が、対応する折り畳み構造において捕捉プローブに実質的に接近できない、請求１記載の方法。
【請求項６】
第三の温度が第二の温度に等しいか又はそれより高く、且つ、第一の温度より低い、請求項１記載の方法。
【請求項７】
第二の温度と第三の温度が等しい、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ハイブリダイゼーションプローブが更に、第一領域に隣接し、第二領域の反対側に第三領域を有し、該第三領域は標的核酸とハイブリダイズしない、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ハイブリダイゼーションプローブの第二領域及び第三領域の両方の少なくとも一部が該ハイブリダイゼーションプローブの別の部分とハイブリダイズして折り畳み構造を形成する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
第三領域の少なくとも一部が第二領域の少なくとも一部とハイブリダイズして折り畳み構造を形成する、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ハイブリダイゼーションプローブの第二領域の少なくとも一部が該ハイブリダイゼーションプローブの別の部分とハイブリダイズして折り畳み構造を形成する、請求項５記載の方法。
【請求項１２】
ポリメラーゼが熱安定性酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
熱安定性酵素がTaqポリメラーゼである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
固体支持表面に電極があり、検出可能標識が電子を該電極から又は該電極に移動することが出来る、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
検出可能標識がフェロセン基である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
固体支持表面に金がある、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
固体支持表面がフローチャンネルを形成する複数の相互嵌合プレートを有し、該プレート表面の少なくともある部分に捕捉プローブがあり、該試料と該固体支持表面との接触により該試料が該フローチャンネルを流れる、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
プレート表面に電極がある、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
交互のプレート表面に捕捉プローブがある、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
折り畳み構造が分子内三重鎖構造である、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
一連のサイクルにおいて、融解、アニーリング、及び伸長が複数行なわれる、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
最後の融解、アニーリング、及び伸長サイクルの後に、固体支持表面の標識を検出する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
融解、アニーリング、及び伸長の間、該試料が該固体支持表面と接触しており、該方法の間、及び/又は、最後の融解、アニーリング、及び伸長サイクルの後に、複数回の検出が行なわれる、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズする第一領域及び検出可能標識を有する第二領域を含むハイブリダイゼーションプローブ（ここで、該第二領域は該標的核酸とハイブリダイズせず、エキソヌクレアーゼ酵素が該標的核酸にハイブリダイズしたハイブリダイゼーションプローブを開裂することが出来、それによって該プローブの第二領域及び該検出可能標識を含むプローブ断片を生じさせる）；
該プローブ断片の第二領域とハイブリダイズする捕捉プローブをその表面に有する固体支持体；
任意に、該標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズするプライマー；及び、
任意に、ポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（ここで、ポリメラーゼはハイブリダイズした該プライマーをハイブリダイズした該プローブ方向に伸長させ、該酵素のエキソヌクレアーゼ活性によってハイブリダイズした該プローブを開裂させ、それによって該プローブの第二領域及び該検出可能標識を含むプローブ断片を遊離させる）
を含む試料中の標的核酸の検出用キットであって、
該ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも一部分は該ハイブリダイゼーションプローブの別の部分とハイブリダイズし、それによって折り畳み構造を形成し、該折り畳み構造の融解温度（Tm）は該ハイブリダイゼーションプローブが該標的核酸とハイブリダイズしたときに形成される二重鎖の融解温度より低く、該プローブ断片が該捕捉プローブとハイブリダイズしたときに形成される二重鎖の融解温度より高い、前記キット。
【請求項２５】
固体支持体表面に電極があり、検出可能標識が電子を該電極から又は該電極に移動することが出来る、請求項２４記載のキット。
【請求項２６】
検出可能標識が電気的活性なフェロセン基である、請求項２５記載のキット。
【請求項２７】
固体支持表面に金がある、請求項２５記載のキット。
【請求項２８】
ポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含む、請求項２４記載のキット。
【請求項２９】
ポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が同じ分子である、請求項２５記載のキット。
【請求項３０】
ポリメラーゼが熱安定性酵素である、請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、2006年12月29日出願の米国仮出願第60/877,611に基づく優先権を主張するものであり、その全内容は本明細書に含まれる。本発明は、一般的に、生体分子の検出方法及びシステムに関し、試料中の核酸の検出方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
様々なアッセイに関連して核酸の増幅が行なわれる。このようなアッセイは、例えば、生物試料を評価するために用いられるときは定性的であり得る。しかしながら、煩わしいブロット技術を必要とすることなく、又は、典型的には光学的方法に必要とされる高価で複雑な装置を必要とせずに、標的核酸の増幅を検出することが可能であれば、広範囲な生物学的用途が改良されることになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、試料中の核酸を検出する為の改良方法に対する要請が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
即ち、本発明の第一の態様によれば、
標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズするプライマー、
第一領域及び第二領域を含むハイブリダイゼーションプローブ（ここで、該第一領域は該標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズし、第二領域は該標的核酸とハイブリダイズせずに検出可能標識を有する）、及び
ポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（ここで、ポリメラーゼはハイブリダイズしたプライマーをハイブリダイズしたプローブ方向に伸長させ、該酵素のエキソヌクレアーゼ活性によってハイブリダイズしたプローブを開裂させ、それによって該プローブの第二領域及び該検出可能標識を含むプローブ断片を遊離させる）を含む試料を第一の温度まで加熱することによって該試料を融解させ（ここで、第一の温度は該プライマー及び該試料中に存在する二重鎖核酸のTmより高い）；
次に、温度を第一の温度より低い第二の温度まで低下させることによって該試料をアニーリングさせ、プライマーとハイブリダイゼーションプローブの夫々を該試料中の標的核酸の一本鎖部分とハイブリダイズせしめ；
次に、第三の温度にて、該標的核酸にハイブリダイズしたプライマーをポリメラーゼによって延長させることによって該プライマーを伸長し；
次に、該酵素のエキソヌクレアーゼ活性によって該ハイブリダイゼーションプローブを開裂してプローブ断片を遊離させ；
適宜、融解、アニーリング、及び伸長を少なくとも一回繰り返し；
該試料を、該プローブ断片の第二領域の少なくとも一部分とハイブリダイズする一つ又はそれ以上の捕捉プローブを有する固体支持体の表面と接触させ；
該捕捉プローブを、第二及び第三の温度より低い第四の温度にて、該試料中に存在する該プローブ断片の少なくとも一部とハイブリダイズさせ；及び
該固体支持体表面の標識を検出することから成る、試料中の標的核酸の検出方法であって、
該ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも一部分は該ハイブリダイゼーションプローブの別の部分とハイブリダイズし、それによって折り畳み構造を形成し、該折り畳み構造の融解温度（Tm）は第三の温度より低くて第四の温度より高い、前記方法が提供される。
【０００５】
即ち、本発明の第二の態様によれば、
標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズする第一領域及び検出可能標識を有する第二領域を含むハイブリダイゼーションプローブ（ここで、該第二領域は該標的核酸とハイブリダイズせず、エキソヌクレアーゼ酵素が該標的核酸にハイブリダイズしたハイブリダイゼーションプローブを開裂することが出来、それによって該プローブの第二領域及び該検出可能標識を含むプローブ断片を生じさせる）；
該プローブ断片の第二領域とハイブリダイズする捕捉プローブをその表面に有する固体支持体；
任意に、該標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズするプライマー；及び、
任意に、ポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（ここで、ポリメラーゼはハイブリダイズしたプライマーをハイブリダイズしたプローブ方向に伸長させ、該酵素のエキソヌクレアーゼ活性によってハイブリダイズしたプローブを開裂させ、それによって該プローブの第二領域及び該検出可能標識を含むプローブ断片を遊離させる）
を含む試料中の標的核酸の検出用キットであって、
該ハイブリダイゼーションプローブの少なくとも一部分は該ハイブリダイゼーションプローブの別の部分とハイブリダイズし、それによって折り畳み構造を形成し、該折り畳み構造の融解温度（Tm）は該ハイブリダイゼーションプローブが該標的核酸とハイブリダイズしたときに形成される二重鎖の融解温度より低く、該プローブ断片が捕捉プローブとハイブリダイズしたときに形成される二重鎖の融解温度より高い、前記キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
当業者は、以下の図面は説明の為だけの目的であることが理解されよう。これら図面は本発明の範囲を如何なる意味でも限定するものではない。
【０００７】
【図１Ａ】折り畳み構造を形成可能なハイブリダイゼーションプローブを用いるアッセイの工程及び構成成分の設計を模式的に示す。ハイブリダイゼーションプローブは標的核酸にハイブリダイズし、ハイブリダイズしたプローブの一部が開裂されて標識プローブ断片を形成し、該標識プローブ断片は表面で捕捉され検出される（例えば、電極表面を使用する）。
【図１Ｂ】推定Tｍが６１．７℃のハイブリダイゼーションプローブの推定折り畳み構造を示す説明図である。
【図２】図１Ｂに示したヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブにより、様々な時間及び温度でのポリメラーゼ鎖反応（PCR）の４０回のサイクル後に生成された電気化学的シグナルを示す棒グラフである。
【図３Ａ】推定Tｍが４３．９℃のハイブリダイゼーションプローブの推定折り畳み構造を示す説明図である。
【図３Ｂ】図３Ａで説明されたヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブによって生成された電気化学的シグナルを示す棒グラフである。
【図４】推定Tｍが３４．２℃のハイブリダイゼーションプローブの推定折り畳み構造を示す説明図である。このハイブリダイゼーションプローブは図３Ａで説明されたハイブリダイゼーションプローブから６個の３’ヌクレオチドが除去されている点が異なる。
【図５Ａ】図３Ａで説明されたヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブによって生成された電気化学的シグナルを示す棒グラフである。
【図５Ｂ】図４で説明されたヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブによって生成された電気化学的シグナルを示す棒グラフである。
【図６Ａ】推定Tｍが５３．１℃のハイブリダイゼーションプローブの推定折り畳み構造を示す説明図である。このハイブリダイゼーションプローブは、図３Ａで説明されたハイブリダイゼーションプローブが３’の６個の塩基から成る推定二重鎖とは対照的に、３’の９個の塩基から成る推定二重鎖を有している。
【図６Ｂ】図３Ａで説明されたヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブによって生成された電気化学的シグナルを示す棒グラフである。
【図６Ｃ】図６Ａで説明されたヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブによって生成された電気化学的シグナルを示す棒グラフである。
【図７Ａ】以下の配列番号５のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブによって生成された電気化学的シグナルを示す棒グラフであり、標的核酸の標的配列に非相補的な１９個のヌクレオチド配列を有する。
【０００８】
2010514450.tif 000003
【０００９】
【図７Ｂ】以下の配列番号６のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブによって生成された電気化学的シグナルを示す棒グラフであり、標的核酸の標的配列に非相補的な１５個のヌクレオチド配列を有する。
【００１０】
2010514450.tif 000004
【００１１】
【図７Ｃ】以下の配列番号７のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブによって生成された電気化学的シグナルを示す棒グラフであり、標的核酸の標的配列に非相補的な１３個のヌクレオチド配列を有する。
【００１２】
2010514450.tif 000005
【００１３】
【図８Ａ】推定Tｍが４４．０℃の鳥インフルエンザ用のハイブリダイゼーションプローブの推定折り畳み構造を示す説明図である。
【図８Ｂ】図８Ａで説明されたヌクレオチド配列を有する鳥インフルエンザＤＮＡ ハイブリダイゼーションプローブによって生成され、ＰＣＲ後の電気化学的シグナルを示す棒グラフである。
【図９Ａ】推定Tｍが４５．３℃の鳥インフルエンザ用のハイブリダイゼーションプローブの推定折り畳み構造を示す説明図である。
【図９Ｂ】図９Ａで説明されたヌクレオチド配列を有する鳥インフルエンザＤＮＡ ハイブリダイゼーションプローブによって生成され、ＰＣＲ後の電気化学的シグナルを示す棒グラフである。
【図１０】折り畳み構造が分子内三重鎖である、ハイブリダイゼーションプローブを模式的に示す。
【図１１Ａ】三重鎖がプロトン化シトシン（C+）核酸塩基と形成されるときに生じる塩基対の構造を示す。
【図１１Ｂ】プロトン化シトシン（C+）の代わりに疑似シトシン（「J」または「J塩基」と称する）と三重鎖が形成されるときに生じる塩基対の構造を示す。
【図１２】昇温測定に使用することが出来る密封電気化学的チャンバーの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書の解釈の目的で、以下の定義は適用され、適当なときにはいつでも、単数形は複数形も意味し、その逆も然りである。以下のいずれかの定義が他の如何なる文書、例えば、参照文献として本明細書中で引用している文献、におけるその用語の用法と異なる場合には、以下の定義が本明細書の解釈の目的では常に優先し、他の意味が明確に意図されている（例えば、当該用語が元々使用されている文献を理解する為）場合以外は、以下の定義が請求項に関連する。他に説明がない限り、又は、「及び/又は」が明らかに不適切である場合以外は、「又は」は「及び/又は」を意味する。「〜を含む」及び「〜を含んでいる」等の使用は限定的ではないことを意図している。更に、一つ又はそれ以上の態様で「含む」等が使用されている場合には、当業者においては、幾つかの具体例では、代わりに、「〜から実質的に成る」及び/又は「〜から成る」と記載できることが理解されよう。
【００１５】
本明細書において、「捕捉プローブ」とは、表面に結合する核酸塩基（ヌクレオ塩基）を意味する。捕捉プローブは核酸（例えば、DNA又はRNA）、核酸アナログ（例えば、ロックド核酸（LNA）、核酸ミミック（例えば、ペプチド核酸（PNA））又はキメラであり得る。
【００１６】
本明細書において「キメラ」とは、異なるサブユニットのクラスから選択された２つ以上の結合されたサブユニットを含む核酸塩基ポリマーのことである。例えば、PNA/DNAキメラは少なくとも一つの２’デオキシリボ核酸サブユニットに結合した少なくとも一つのPNAサブユニットを含む（例えば、PNA/DNAキメラ調製に関する方法及び組成物はWO96/40709を参照）。キメラの構成成分サブユニットの例は、PNAサブユニット、天然アミノ酸サブユニット、DNAサブユニット、RNAサブユニット、LNAサブユニット、及び、他の核酸アナログ又はミミックのサブユニットからなる群から選択される。
【００１７】
本明細書において「フラップ」とは、ハイブリダイゼーションプローブがそれを検出すべく設計された標的核酸に非相補的な該プローブの一部のことである。
【００１８】
本明細書において「ハイブリダイゼーションプローブ」とは、該プローブが相補鎖にハイブリダイズした部位においてエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によって開裂させることが出来、試料中の目的とする標的核酸の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を含むものと指す。該ハイブリダイゼーションプローブは、エキソヌクレアーゼ活性によって開裂させることが出来る限り、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアナログ、又はキメラであっても良い。幾つかの態様においては、核酸塩基ポリマーは一つのLNAサブユニット以外の全てのDNAサブユニットを含むキメラであり得る。幾つかの態様においては、核酸塩基ポリマーは、標的核酸にハイブリダイズすべく設計されたハイブリダイゼーションプローブのその部分の５’末端から（３’末端方向へ）一つのサブユニット離れた単独のLNAを含むものである。
【００１９】
本明細書において「核酸（ヌクレオ）塩基」とは、サブユニットを含む一連の核酸塩基が連結したポリマーを指す。このようなポリマーの非限定的例には、オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ペプチド核酸、核酸アナログ、核酸ミミック、及びキメラがある。
【００２０】
本明細書において「ペプチド核酸」または「PNA」とは、２つ以上のPNAサブユニットを含むポリ核酸塩基鎖又はそのセグメントを指し、非限定的に、米国特許第5,539,082; 5,527,675; 5,623,049; 5,714,331;5,718,262; 5,736,336; 5,773,571; 5,766,855; 5,786,461; 5,837,459; 5,891,625;5,972,610; 5,986,053, 6,107,470 及び6,357,163にペプチド核酸として記載又はクレームされている、ポリ核酸鎖又はそのセグメントを挙げることが出来る。疑いを避ける為に、PNAは核酸ミミックであり、核酸又は核酸アナログではない。PNAはヌクレオチドから形成されるのではないので、核酸ではない。疑いを避ける為に、PNAオリゴマーは骨格に結合した一つ又はそれ以上のアミノ酸側鎖を含むポリマーを含むものである。
【００２１】
本明細書において「支持体」、「固体支持体」、又は「固体キャリア」は任意の固相物質を意味する。固体支持体には、「樹脂」、「合成支持体」、「固相」、「表面」、「膜」、及び/又は「支持体」が含まれる。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、及び、ポリアクリルアミドのような有機ポリマー、及び、コポリマー並びにそれらのグラフトから構成され得る。固体支持体は、又、ガラス、シリカ、調節孔ガラス（CPG）、又は逆相シリカのような無機物質でも良い。固体支持体の形態は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜、又は表面であり得る。表面は平面、実質的な平面、又は、非平面であり得る。固体支持体は多孔質、非多孔質であり、膨張性又は非膨張性である。固体支持体は、ウェル、凹部、管、チャンネル、シリンダー若しくは他の容器、ベッセル、機構、又は、特性の形態をとり得る。
【００２２】
本明細書において「標的核酸」とは、目的の核酸分子を指す。試料には一種類以上の標的核酸分子が含まれていても良い。
【００２３】
PCR産物の電気化学的アッセイは、本願と同日に出願（代理人整理番号No.70043.0036USP1）された米国仮出願No.60/877,610に開示されている。このアッセイは、例えば、標的核酸には非相補的だが電極に限定された捕捉プローブには相補的である１５マー５’フラップを有するハイブリダイゼーションプローブから成る。この５’フラップは電気化学的標識を含む。PCRプロセスの間、該５’フラップを含むプローブ断片は、Taqポリメラーゼのようなエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によって開裂される。その後、該プローブ断片は電極に限定された捕捉プローブにハイブリダイズし、信号（シグナル）を発生することが出来る。元（未開裂）のハイブリダイゼーションプローブはプローブ断片のように効率的には捕捉プローブにハイブリダイズすることはなかった。この現象によって、プローブ断片を元（未開裂）のハイブリダイゼーションプローブから分離することなく、一回（one pot）のアッセイでPCRをモニターすることが可能となる。
【００２４】
上記のアッセイにおいて、元（未開裂）のハイブリダイゼーションプローブは、該元のハイブリダイゼーションプローブが標的核酸とハイブリダイズしたときに形成される二重鎖の融解温度より低く、且つ、該プローブ断片が捕捉プローブとハイブリダイズしたときに形成される二重鎖の融解温度より高いような溶解温度（Tm）を有する折り畳み構造を形成することが出来る。如何なる理論にも拘束されるものではないが、プローブ断片が捕捉プローブとハイブリダイズできるような温度以下において、折り畳み構造によって該元のハイブリダイゼーションプローブが電極上の捕捉プローブとハイブリダイズするのが妨げられ、それによってアッセイの信号/雑音比が向上するものと考えられる。
【００２５】
１．５’フラップを有するハイブリダイゼーションプローブによるPCRアッセイ
図１Ａは、折り畳み構造を形成可能なハイブリダイゼーションプローブを用いるアッセイの工程及び構成成分の設計を模式的に示す。ハイブリダイゼーションプローブは標的核酸にハイブリダイズし、ハイブリダイズしたプローブの一部が開裂されて標識プローブ断片を形成し、該標識プローブ断片は表面で捕捉され検出される（例えば、電極表面を使用する）。このアッセイ様式を念頭において、様々な推定Tm値（例えば、８３．５℃、６１．７℃、５４．３℃、又は４６℃）を有する折り畳み構造用のプローブが設計され評価された。最高Tm値（８３．５℃）を有するハイブリダイゼーションプローブは該プローブの５’フラップの１５マー領域とそれ以外の領域との完全な対合（マッチ）に対応する。その他のプローブにはミスマッチがあり、その結果、より低いTm値となる。2006年7月17日出願の米国特許出願No.11/488,439に記載のように、PCRにおけるこれらプローブの開裂の効率を開裂及び元のプローブをHPLCにより分離することによって評価した。Waters Corp.製のHPLCカラムXTerroMSC18(2.5mm x 50mm)を7% ACN+93% TEAA で７分間平衡化した。勾配溶出(0.3 ml/min, 60℃)を以下の３段階、段階１：7% ACN+93% TEAA, 7 min.；段階２：10% ACN+90% TEAA, 10 min.；段階３：35% ACN+65% TEAA, 10 min.(ACN-アクリロニトリル、TEAA- 0.1Mトリエタノールアミン-酢酸、pH6.8)で実施した。折り畳み構造に対するTm値（６１．７℃）を有するハイブリダイゼーションプローブは３０％の開裂効率を示し、PCRの電気化学的検出用に選択した。
【００２６】
図１Ｂは、推定Tｍが６１．７℃のハイブリダイゼーションプローブの推定折り畳み構造を示す説明図である。このハイブリダイゼーションプローブは、図１Ａで説明したアッセイによって、Listeria monocytogenesis hlyA遺伝子を測定するのに適している。図１Ｂに示されたハイブリダイゼーションプローブは以下の配列番号１の配列を有している：
【００２７】
2010514450.tif 000006
【００２８】
太字で示された核酸塩基は５’フラップを表し、記号「▼」はエキソヌクレアーゼ活性による開裂が優勢となる部位を示す。
【００２９】
図１Ａで説明したアッセイにおいてオスミウム電気化学的タグを５’に有するハイブリダイゼーションプローブを用いて、Listeria monocytogenesis hlyA遺伝子（標的核酸）のPCRを実施した。PCR反応は、９５℃で１０分間の後、6 mMのMgCl2添加のPCR緩衝液Ａ（Applied Biosystems, Catalog No.N808-0228）中で（９５℃で１５秒間、６３℃で１分間）ｘ４０サイクルであった。プライマー及びプローブの濃度は、夫々、200 nM及び400nMであった。このハイブリダイゼーションプローブは、該プローブの内部と部分的に相補的な１９マーの５’フラップを有する（図１Ｂ）。PCRのアニーリング−伸長温度（即ち、６６℃）においては、アッセイ温度が折り畳み構造の推定Tmより高いので、ハイブリダイゼーションプローブは実質的に折り畳まれていない。これによって、該ハイブリダイゼーションプローブが標的核酸とハイブリダイズすることが可能となる。一旦、ハイブリダイズしたら、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が該ハイブリダイゼーションプローブを開裂してPCR反応においてプローブ断片が生じる。PCR完了後に、試料の温度を４１℃に低下させ、プローブ断片を捕捉プローブとハイブリダイズさせる。このような条件下で、未だ試料中に残っている元（未開裂）のハイブリダイゼーションプローブは、図１Ｂに示される５’フラップが表面に結合した捕捉プローブに実質的に接近できないような推定折り畳み構造を形成する。
【００３０】
このアッセイの電気化学的測定の結果を図２Ａに示す。４０回のＰＣＲサイクル後、陽性(pos)及び鋳型なし対照(ntc)の両方の反応混合物を二つの加熱板に挟まれた電気化学的セル内に入れた。本実験に使用した電気化学的セルは１２に示す。図１２が示すように、このセルは直径２ｍｍの作用電極（ＷＥ）及び対極（ＣＥ）を有する。白金対極（ＣＥ）はＣｒ接着層を有するシリコンウェハー上に2000オングストローム厚の白金層をスパッターコーティングして作製された。金対極（ＣＥ）はＣｒ接着層を有するシリコンウェハー上に2000オングストローム厚の金層をスパッターコーティングして作製された。参照電極は０．５ｍｍ直径のＡｇ／ＡｇＣｌワイアーであった。図２の結果が示すように、元のハイブリダイゼーションプローブは開裂したプローブ断片の２０〜３０分の一の効率でしかハイブリダイズしなかった。
【００３１】
２．元の５’及び３’フラップを有するハイブリダイゼーションプローブによるPCRアッセイ
鳥インフルエンザウイルスＲＮＡの測定に使用できる、相補的な５’及び３’フラップを有するハイブリダイゼーションプローブは以下の配列番号２を有する：
【００３２】
2010514450.tif 000007
【００３３】
ここで、太字で示された核酸塩基は５’ 及び３’フラップを表し、記号「▼」はエキソヌクレアーゼ活性による開裂が優勢となる部位を示す。本プローブの折り畳み構造の推定Ｔｍは４３．９℃である。図３Ａはこのハイブリダイゼーションプローブの折り畳み構造を示す。
【００３４】
このハイブリダイゼーションプローブを用いて、PCRアッセイを実施した。環境マスターミックスにおける４０サイクルのＰＣＲ（伸長及びアニーリング温度６０℃）の後、温度を２８℃にシフトした。環境マスターミックスは100mM KCl, 100mM Tris pH8, 8mM MgCl2, 100μM dntps 及び0.3 units/μL金ampliaqを含んでいた。この温度で、ハイブリダイズしたハイブリダイゼーションプローブに対するエキソヌクレアーゼ活性により生じたプローブ断片が表面に結合した捕捉プローブにアニーリングする（Ｔｍ＝３２℃）ことができる。このような条件下で、未だ試料中に残っている元（未開裂）のハイブリダイゼーションプローブは、図３Ａに示される５’フラップが表面に結合した捕捉プローブに実質的に接近できないような推定折り畳み構造（Ｔｍ＝４３．９℃）を形成する。
【００３５】
図３Ｂは、図３Ａで説明したようなハイブリダイゼーションプローブに対するＰＣＲ後の様々な時間において電極表面に生じた電気化学的シグナルを示す棒グラフである。ＰＣＲは標的核酸の10000コピーの存在下、又は、標的核酸の非存在下（非標的核酸対照、ＮＴＣ）で実施した。図３Ｂに示される電気化学的データによれば、これら２つのアッセイのハイブリダイゼーション効率には約１００倍の相違がみられた。
【００３６】
このアッセイを以下の核酸塩基配列（配列番号３）を有する別のもう一つのプローブを用いて繰り返した：
【００３７】
2010514450.tif 000008
【００３８】
ここで、太字で示された核酸塩基は５’フラップを表し、記号「▼」はエキソヌクレアーゼ活性による開裂が優勢となる部位を示す。図４はこのハイブリダイゼーションプローブの折り畳み構造を示す。本プローブの折り畳み構造の推定Ｔｍは３４．２℃である。全てのＴｍ及びｍＦｏｌd分析は、環境マスターミックスのイオン強度に相当する5mM MgCl2媒体に対して実施した。
【００３９】
ＰＣＲを実施し、図３Ａに示されたハイブリダイゼーションプローブを使用した電気化学的検出の効率を、図４で示されたハイブリダイゼーションプローブを使用した検出の効率を比較した。図５Ａは、図３Ａで説明されたヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブを使用したＰＣＲアッセイにおける電気化学的シグナルを示す棒グラフである。図５Ｂは図４で説明されたヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブを使用したＰＣＲアッセイにおける電気化学的シグナルを示す棒グラフである。図５Ａにおける結果は、図４に示したハイブリダイゼーションプローブと比較して、図３Ａに示されたハイブリダイゼーションプローブが約２〜３倍良い相違を示す。
【００４０】
３．３’フラップ長の影響
３’フラップ長が折り畳み構造に与える影響を評価するために追加実験を行なった。この実験に使用したハイブリダイゼーションプローブは図３に示した、６つの核酸塩基の３’フラップを有するプローブ及び同様に９つの核酸塩基の３’フラップを有するハイブリダイゼーションプローブである。９つの核酸塩基の３’フラップを有するプローブは以下の配列番号４で示す構造を有する：
【００４１】
2010514450.tif 000009
【００４２】
このハイブリダイゼーションプローブは図６Ａに示される推定折り畳み構造を有し、その推定Ｔｍは５３．１℃である。ここで、太字で示された核酸塩基は５’及び３’フラップを表し、記号「▼」はエキソヌクレアーゼ活性による開裂が優勢となる部位を示す。このハイブリダイゼーションプローブにおいて、開裂部位に隣接する下線が付されたＣ核酸塩基はLNAサブユニットである。ハイブリダイゼーションプローブの他の全てのサブユニットはDNAである。
【００４３】
９つの核酸塩基の３’フラップを有するハイブリダイゼーションプローブの推定Ｔｍは５３．１℃であり、一方、６つの核酸塩基の３’フラップを有するハイブリダイゼーションプローブの推定Ｔｍは４３．９℃である。PCRアッセイ後の図３Ａ及び図６Ａに示されるハイブリダイゼーションプローブを用いた電気化学的検出の結果を、夫々、図６Ｂ及び図６Ｃに示す。PCRハイブリダイゼーション後の電気化学的分析は金表面上で３２℃で実施した。３’フラップ長が増大することによって、９つの核酸塩基の３’フラップを有するハイブリダイゼーションプローブはより安定した構造（即ち、より高い折り畳みＴｍ）を有し、その結果、より良好な識別能力が得られた。
【００４４】
４．５’フラップ長の影響
５’フラップ長が折り畳み構造に与える影響を評価するために追加実験を行なった。この実験の為に、鳥インフルエンザウイルス用の１９マー、１５マー、及び１３マーの５’フラップを有するプローブを評価した。これらのプローブは３’フラップを含まない。これらプローブは以下の配列番号５，６及び７で示す構造を有する：
【００４５】
2010514450.tif 000010
【００４６】
2010514450.tif 000011
【００４７】
2010514450.tif 000012
【００４８】
ここで、太字で示された核酸塩基は５’フラップを表し、記号「▼」はエキソヌクレアーゼ活性による開裂が優勢となる部位を示す。このハイブリダイゼーションプローブにおいて、開裂部位に隣接する下線が付されたＣ核酸塩基はLNAサブユニットである。ハイブリダイゼーションプローブの他の全てのサブユニットはDNAである。
【００４９】
PCRアッセイ後のこれらの１９マー、１５マー、及び１３マーの５’フラップを有するハイブリダイゼーションプローブを用いた電気化学的検出の結果を、夫々、図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃに示す。PCRアッセイ後のミックスは金電極上で、１９マー、１５マー、及び１３マーの５’フラップに対して、夫々、４１℃、３５℃、及び３１℃で（即ち、各推定折り畳み構造の推定Ｔｍより８℃低い温度でハイブリダイズした。これらの結果が示すように、１３マーの５’フラップを有するハイブリダイゼーションプローブは１９マー及び１５マーの５’フラップに較べて優れたアッセイ性能を示した。
【００５０】
５．追加の鳥インフルエンザPCRアッセイ
鳥インフルエンザウイルスのヘマグルチニン遺伝子の異なる二つの領域に関する、追加の２つの鳥インフルエンザPCRアッセイを実施した。折り畳み構造の推定Ｔｍが約４４−４５℃であるような３’フラップを有するハイブリダイゼーションプローブを設計した。これら２つのプローブの推定折り畳み構造を図８Ａ及び図９Ａに示す。これらアッセイにおける標的核酸の鋳型としては、約１００塩基長の合成DNAを使用した。PCR後のハイブリダイゼーション/検出は、プローブ断片/捕捉プローブハイブリッドの推定Ｔｍより１０〜１４℃低い温度で、環境マスターミックスを用いて金電極上で実施した。
【００５１】
これらの実験に使用した第一のハイブリダイゼーションプローブの核酸配列（配列番号８）は以下の通りである：
【００５２】
2010514450.tif 000013
【００５３】
このハイブリダイゼーションプローブは折り畳み構造に対する推定Ｔｍは４４．０℃であった。推定折り畳み構造は図８Ａに示す。このプローブとともに使用した捕捉プローブは以下の構造（配列番号９）を有する１５マーオリゴマーである：
【００５４】
2010514450.tif 000014
【００５５】
これらの実験に使用した第二のハイブリダイゼーションプローブの核酸配列（配列番号１０）は以下の通りである：
【００５６】
2010514450.tif 000015
【００５７】
このハイブリダイゼーションプローブは折り畳み構造に対する推定Ｔｍは４５．２℃であった。推定折り畳み構造は図９Ａに示す。このプローブとともに使用した捕捉プローブは以下の構造（配列番号１１）を有する：
【００５８】
2010514450.tif 000016
【００５９】
これらのハイブリダイゼーションプローブにおいて、太字で示された核酸塩基は５’ 及び３’フラップを表し、記号「▼」はエキソヌクレアーゼ活性による開裂が優勢となる部位を示す。このハイブリダイゼーションプローブにおいて、開裂部位に隣接する下線が付されたＡ核酸塩基（第一プローブ）及びＴ核酸塩基（第二プローブ）はLNAサブユニットである。ハイブリダイゼーションプローブの他の全てのサブユニットはDNAである。
【００６０】
これらのハイブリダイゼーションプローブ及び捕捉プローブは以下に説明するPCRアッセイで使用した。PCRアッセイ後の第一のハイブリダイゼーションプローブを用いた鳥インフルエンザDNAの電気化学的検出の結果を図８Ｂに示す。PCRアッセイ後の第二のハイブリダイゼーションプローブを用いた鳥インフルエンザDNAの電気化学的検出の結果を図９Ｂに示す。
【００６１】
ステムループ型の形態を採るハイブリダイゼーションプローブは上記に開示したが、他の形態を採るハイブリダイゼーションプローブも使用することが出来る。このような形態（構造）には、ヘアピン、内部ループ、ブルジ、分岐、クローバーリーフ、及びシュードノット（pseudoknot）構造が含まれる。本発明の方法及びキットで使用できる他の折り畳み構造は米国特許第7,118860B2に記載されている。
【００６２】
６．三重鎖構造を有するハイブリダイゼーションプローブ
幾つかの実験において、ハイブリダイゼーションプローブは分子内三重鎖構造をとり得る。このような分子内三重鎖構造をとり得るハイブリダイゼーションプローブの例として以下の配列（配列番号１２）を挙げる：
【００６３】
2010514450.tif 000017
【００６４】
上記の配列において、「Ｊ」は疑似（psuedo）イソシトシン核酸塩基であり、[Probe-Sequence]は標的核酸に特異的にハイブリダイズするように設計されたプローブの部分を表す。
【００６５】
この一般的な形態のハイブリダイゼーションプローブは、図１０に示されるように、折り畳み構造として分子内三重鎖構造をとることが出来る。図１０において、「--」はHoogsteen水素結合を示し、「・」はワトソン−クリック塩基対を示し、及び「Loop」は標的核酸とハイブリダイズするプローブの部分（例えば、「プローブ配列」）を含む。この型の三重鎖構造はPetrov et al., “The Triplex-Hairpin Transition in Cytosine-Rich DNA”, Biophysical Journal, Vol.87, 3954-3973 (December 2004)に開示されている。これらの構造には「Ｔ・Ａ--Ｔ」及び「Ｃ・Ｇ--Ｃ＋」三重鎖（Ｃ＋はN3位置がプロトン化しているシトシンを示す）の形成が含まれる。図１１及びEgholm et al., “Efficient pH-independent sequence-specific DNA binding by psuedoisocytosine-containing bis-PNA, Nucl. Acids Res., Vol.23, No.2, 217-222 (1995)を参照すると、疑似（psuedo）イソシトシンは置換され得、プロトン化されたシトシン核酸（Ｃ＋）は三重鎖を生成するのに必要である。このように三重鎖はｐH非依存的に形成される。
【００６６】
上記配列及び図１０に示された構造において、疑似（psuedo）イソシトシンはプロトン化されたシトシン核酸塩基と置換されている。その結果、指示された位置でのＣ＋に対するＪ塩基の置換により生理的ｐHにおける三重鎖の形成が可能となる。分子内三重鎖を形成するハイブリダイゼーションプローブは、表面に結合した捕捉プローブとの相互作用を阻止するような安定な折り畳み構造（三重鎖構造）を形成することが期待される。
【００６７】
７．標識、プローブ及びプライマー
ハイブリダイゼーションプローブの開裂断片上の標識として、任意の公知の電気化学的部分を使用することが出来る。電気化学的標識の例には、ビス（2,2’-ビピリジル）イミヂゾリルクロロオスミウム（II）[塩]がある。この標識はAg/AgClに対して良好なEo（0.165）を与え、合成及び精製に際して好適な溶解特性を有している。標識の他の例としては、フェロセン及び2006年７月17日に出願された米国特許出願第11/488,439に開示された標識を挙げることが出来る。更に、電気化学的標識は電極に又は電極から電子を伝達することが出来る任意の部分であり得る。電気化学的標識の例に遷移金属錯体がある。このような遷移金属錯体の例として、ルテニウム２＋（2,2’−ビピリジン）３（Ru(bpy) ３２＋）、ルテニウム２＋（4,4’-ジメチル−2,2’−ビピリジン）３（Ru(Me2-bpy) ３２＋）、ルテニウム２＋（5,6−ジメチル−1,10−フェナントロリン）３（Ru(Me2-phen) ３２＋）、鉄２＋（2,2’−ビピリジン）３（Fe(bpy) ３２＋）、鉄２＋（5’−クロロフェンナントロリン）３（Fe(5-Cl-phen) ３２＋）、オスミウム＋（5’−クロロフェンナントロリン）３（Os(5-Cl-phen) ３２＋）、オスミウム２＋（2,2’−ビピリジン）２（イミダゾリル）、ジオキソレニウム１＋ホスファイン、及び、ジオキソレニウム１＋ピリジン（ReO2(py) 41＋）がある。
【００６８】
メディエーターとして有用な陰イオン錯体としては、Ru(bpy) ((SO  ３)2-bpy) 2２-及びRu(bpy) ((CO 2)2 -bpy) 2２-、及び、メディエーターとして有用なある種の両性イオン錯体は、Ru(bpy) 2 ((SO ３)2 -bpy) 及びRu(bpy) 2 ((CO 2)2 -bpy)であり、ここで、(SO ３)2 -bpy2は4,4’-ジスルホナト-2,2’-ビピリジンであり、(CO 2)2 -bpy2は4,4’-ジカルボキシ-2,2’-ビピリジンである。ピリジン、ビピリジン及びフェナントロリン群の適当な置換誘導体も任意の上記金属錯体において使用できる。この適当な置換誘導体の非限定的な例として、４−アミノピリジン、４−ジメチルピリジン、４−アセチルピリジン、４−ニトロピリジン、４，４‘−ジアミノ−２，２’−ビピリジン、５，５‘−ジアミノ−２，２’−ビピリジン、６，６‘−ジアミノ−２，２’−ビピリジン、４，４‘−ジエチレンジアミン−２，２’−ビピリジン、５，５‘−ジエチレンジアミン−２，２’−ビピリジン、６，６‘−ジエチレンジアミン−２，２’−ビピリジン、４，４‘−ジヒドロキシ−２，２’−ビピリジン、５，５‘−ジヒドロキシ−２，２’−ビピリジン、６，６‘−ジヒドロキシ−２，２’−ビピリジン、４，４‘，４’‘−トリアミノ−２，２’ ，２‘’−ターピリジン、４，４‘，４’‘−トリエチレンジアミン−２，２’ ，２‘’−ターピリジン、４，４‘，４’‘−トリヒドロキシ−２，２’ ，２‘’−ターピリジン、４，４‘，４’‘−トリニトロ−２，２’ ，２‘’−ターピリジン、４，４‘，４’‘−トリフェニル−２，２’ ，２‘’−ターピリジン、４，７−ジアミノ−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジアミノ−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジエチレンジアミン−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジエチレンジアミン−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジヒドロキシ−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジヒドロキシ−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジニトロ−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジニトロ−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン、４，７−ジスペルアミン−１，１０−フェナントロリン、３，８−ジスペルアミン−１，１０−フェナントロリン、ジピリド［３，２−ａ：２‘，２’−ｃ］フェナジン、及び、６，６‘−ジクロロ−２，２’−ビピリジン等がある。
【００６９】
上記には電気化学的検出を例示したが、開示した方法は、蛍光検出のような他の検出技術による核酸の検出に適用することが可能である。更に、ハイブリダイゼーションプローブにおける検出標識は検出及び／又は定量化が出来る任意の部分（moiety）が可能である。標識の例として、電気化学的、発光（蛍光、ルミネッセント、又は、化学発光）及び発色標識が挙げられる。
【００７０】
本発明におけるプライマー及びプローブは任意の種類の長さ及び形態をとることが可能であえる。例えば、プライマーは１８から約３０サブユニットの長さ、又は、２０から約２５サブユニットの長さであり得る。プライマーはＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドに限定される必要はないが、ポリメラーゼによって伸長可能である必要がある。より長い又はより短いプライマーも使用することができる。
【００７１】
標的核酸に結合するハイブリダイゼーションプローブの領域の長さは１８から約３０サブユニットの長さであり、一方、標的核酸に結合しないハイブリダイゼーションプローブの領域（すなわち、５‘フラップ）の長さは２から約４０サブユニット又は８から約３０サブユニットの長さである。これら例示したものより長い又は短い領域を有するハイブリダイゼーションプローブも使用することができる。
【００７２】
ＰＣＲプライマーは所望の長さ、通常、少なくとも３０又は５０ヌクレオチドから２００，３００，５００，１０００又はそれ以上の長さのヌクレオチドを有する増幅産物を結合・生成すべく設計することができる。プローブ及びプライマーは任意の適当な濃度で供される。例えば、フォワード及びリバースプライマーは、典型的には２０ｎＭ〜５００ｎＭ，又は、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、１００ｎＭ〜５００ｎＭ、５０ｎＭ〜２００ｎＭのような５００ｎＭ以下の濃度で提供される。プローブは、典型的には２０ｎＭ〜５００ｎＭ，又は、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、１００ｎＭ〜５００ｎＭ、５０ｎＭ〜２００ｎＭのような１０００ｎＭ以下の濃度で提供される。ＮＴＰｓ、酵素、プローブ及びプライマーの濃度に関する条件の例は、全内容は本明細書に参照として含まれる米国特許第5,538,848号にも開示されており、或いは、市販の反応成分（例えば、Applied Biosystems, Foster City CAから購入可能な）を用いて達成することができる。
【００７３】
夫々が特徴的な配列を有する複数の相補的な捕捉プローブを  アレイ様式によって使用することができる。例えば、異なるハイブリダイゼーションプローブ断片にハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドのアレイを使用して、複数の別個の検出ゾーンにおいて個々のタグ配列を局在化し捕捉することが可能となる。
【００７４】
本明細書に記載の方法によって標的核酸をリアルタイムで検出することができる。例えば、核酸増幅が生起している溶液と固相支持体を接触させ、ＰＣＲの間プロセスをモニターする（即ち、リアルタイム反応）。或いは、ＰＣＲプロセスが完了した後に、固相支持体を上記溶液と接触させることも出来る（エンドポイント検出）。ある具体例では、ＰＣＲの間（リアルタイム）、及びそのプロセスが完了した後（エンドポイント）にＰＣＲアッセイをモニターすることが出来る。ＰＣＲアッセイは、通常のＰＣＲフォーマット、ファストＰＣＲフォーマット、非対称ＰＣＲフォーマット及び非同期ＰＣＲフォーマットを使用して実施することができる。
【００７５】
本発明方法によって、ハイブリダイゼーションプローブ断片の表面ハイブリダイゼーションの検出が試料中の標的核酸の存在を示すような均一ＰＣＲアッセイも行うことができる。
【００７６】
上記の明細書は本発明の原理を教示しているが、実施例は説明の目的で示されたので、当業者であれば、本明細書の開示に基づき、本発明の技術的範囲を逸脱せずに、多くの変形及び詳細を実施することが可能であることが理解されよう。
【図１Ａ】
2010514450.tif 000018
【図１Ｂ】
2010514450.tif 000019
【図２】
2010514450.tif 000020
【図３Ａ】
2010514450.tif 000021
【図３Ｂ】
2010514450.tif 000022
【図４】
2010514450.tif 000023
【図５Ａ】
2010514450.tif 000024
【図５Ｂ】
2010514450.tif 000025
【図６Ａ】
2010514450.tif 000026
【図６Ｂ】
2010514450.tif 000027
【図６Ｃ】
2010514450.tif 000028
【図７Ａ】
2010514450.tif 000029
【図７Ｂ】
2010514450.tif 000030
【図７Ｃ】
2010514450.tif 000031
【図８Ａ】
2010514450.tif 000032
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
2010514450.tif 000034
【図９Ｂ】
2010514450.tif 000035
【図１０】
2010514450.tif 000036
【図１１Ａ】
2010514450.tif 000037
【図１１Ｂ】
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【図１２】
2010514450.tif 000039
【国際調査報告】
2010514450.tif 000040
2010514450.tif 000041
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