(57)【要約】  本発明は、癌の治療において使用するのに適した抗原結合化合物を調製する方法、抗原結合化合物、およびそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療で使用するのに適した抗原結合化合物を生成する方法であって、
ｉ）ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する抗原結合化合物を提供し；
ｉｉ）前記抗原結合化合物をＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞に対するアポトーシス促進活性について試験し；
ｉｉｉ）前記抗原結合化合物がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞に対するアポトーシス促進活性を有すると判定された場合、それを選択し；次いで
ｉｖ）選択された抗原結合化合物を多量に生成すること
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記抗原結合化合物を、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞のＡＤＣＣ活性を誘導する能力について試験し、次いで、前記抗原結合化合物がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞のＡＤＣＣ活性を誘導する能力を有すると判定された場合、前記抗原結合化合物を選択することを含む工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原結合化合物をヒトへの投与のために調製する工程をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ヒトへの投与のために調製する工程が、前記化合物を薬学的に許容できる担体と配合する工程を含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞が腫瘍細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍細胞が１人またはそれ以上の癌にかかっている患者から採取される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が脂質ラフト中でＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰを発現する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現するように作製された組み換え細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞がＳＯＪ−６細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｉｉ）が免疫エフェクター細胞の不在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫エフェクター細胞がＮＫ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｉｉ）が、前記抗原結合化合物が前記ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞においてアポトーシスまたは細胞増殖調節タンパク質の活性またはレベルを調節するかどうかを判定する工程を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記調節タンパク質がカスパーゼまたはＢｃｌ−２ファミリーメンバーである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｉｖ）が、前記抗原結合化合物を産生する宿主細胞を適切な培地中で培養し、次いで前記抗原結合化合物を回収することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原結合化合物が抗体であり、前記宿主細胞が前記抗体を産生するハイブリドーマである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗原結合化合物が、放射性同位体、毒性ポリペプチド、または毒性小分子のごとき細胞毒性薬物を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原結合化合物が、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗原結合化合物が、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドとの結合について抗体１６Ｄ１０と競合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体がＩｇＧアイソタイプの重鎖定常部を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＩｇＧアイソタイプがヒトＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が、抗体１６Ｄ１０の可変部、またはＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドとの結合について抗体１６Ｄ１０と競合する別の抗体の可変部を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体が抗体１６Ｄ１０のキメラ組み換え形態であって、抗体１６Ｄ１０の重鎖定常部のＣμ２、Ｃμ３、およびＣμ４領域がヒトＩｇＧ１配列により置換されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が二価の抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞により実質的に内部移行されない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導できる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞による前記抗体の内部移行を評価し、前記抗体が前記細胞によって実質的に内部移行されないことを見出すことが、前記抗体が癌の治療で使用するのに適することを確認するさらなる工程をさらに含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力を評価し、前記抗体が前記細胞の前記細胞介在性傷害を誘導できることを見出すことが、前記抗体が癌の治療で使用するのに適することを確認するさらなる工程をさらに含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法に従って生成される、抗原結合化合物。
【請求項３０】
前記抗原結合化合物が、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドとの結合について抗体１６Ｄ１０と競合する、請求項２９に記載の抗原結合化合物。
【請求項３１】
前記化合物が抗体１６Ｄ１０以外の抗体である、請求項２９に記載の抗原結合化合物。
【請求項３２】
請求項２９に記載の抗原結合化合物および薬学的に許容できる担体を含んでなる、医薬組成物。
【請求項３３】
ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに結合し、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞のアポトーシスを誘導または増殖を阻害できる抗体であって、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドとの結合について抗体１６Ｄ１０と競合する抗体であって、１６Ｄ１０以外の抗体である抗体。
【請求項３４】
抗体が二価である、請求項３３に記載の抗体。
【請求項３５】
前記抗体がＩｇＧアイソタイプの重鎖定常部を有する、請求項３３または３４に記載の抗体。
【請求項３６】
前記抗体がヒトＩｇＧアイソタイプの重鎖定常部を有する、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
前記抗体がＦｃ受容体に結合できる重鎖定常部を有する、請求項３５または３６に記載の抗体。
【請求項３８】
前記抗体がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導できる、請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
２つの重鎖および２つの軽鎖からなる二価の抗体であって、重鎖がＦｃ受容体に結合できるＩｇＧ重鎖定常部を含んでなる抗体であって、
（ａ）ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞のアポトーシスを誘導または増殖を阻害でき、
（ｂ）ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導でき、
（ｃ）ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドとの結合について抗体１６Ｄ１０と競合する、抗体。
【請求項４０】
（ａ）ヒトＩｇＧ鎖定常部に融合した配列番号７のアミノ酸配列に由来する１つまたはそれ以上のＣＤＲを含んでなる可変部を含んでなる重鎖；および（ｂ）任意選択的にヒトカッパ鎖定常部に融合した配列番号８のアミノ酸配列に由来する１つまたはそれ以上のＣＤＲを含んでなる可変部を含んでなる軽鎖：を含んでなる二価の抗体。
【請求項４１】
重鎖が、配列番号７のアミノ酸配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなり、軽鎖が、配列番号８のアミノ酸配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる、請求項３３〜４０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４２】
重鎖が配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
軽鎖が配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる、請求項４１または４２に記載の抗体。
【請求項４４】
前記抗体が配列番号１を含んでなる核酸配列から生成される、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４５】
前記抗体が配列番号２を含んでなる核酸配列から生成される、請求項４３に記載の抗体。
【請求項４６】
前記重鎖定常部またはＩｇＧアイソタイプが、ヒトＩｇＧ１である、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４７】
前記重鎖定常部またはＩｇＧアイソタイプが、非ヒトＩｇＧアイソタイプである、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４８】
重鎖定常部が、配列番号１５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項４６に記載の抗体。
【請求項４９】
軽鎖定常部が、配列番号１６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５０】
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含んでなる重鎖；および（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列に由来する１つまたはそれ以上のＣＤＲを含んでなる軽鎖：を含んでなる、二価の抗体。
【請求項５１】
前記抗体が、放射性同位体、毒性ポリペプチド、および毒性小分子からなる群から選択される細胞毒性薬物を含まない、請求項３３〜５０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５２】
前記抗体が、膵臓腫瘍細胞のアポトーシスを誘導または増殖を阻害できる、請求項３３〜５１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５３】
前記抗体が、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞においてアポトーシスまたは細胞増殖調節タンパク質の活性またはレベルを調節する、請求項５２に記載の抗体。
【請求項５４】
前記調節タンパク質が、カスパーゼまたはＢｃｌ−２ファミリーメンバーである、請求項５３に記載の抗体。
【請求項５５】
前記抗体が、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞により実質的に内部移行されない、請求項３３〜５４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５６】
前記抗体が、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項３３〜５５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５７】
前記抗体が、少なくとも８０分の半減期でＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞に結合する、請求項３３〜５６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５８】
前記ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞が、ＳＯＪ−６細胞である、請求項５７に記載の抗体。
【請求項５９】
前記抗体が、１０ナノモル濃度未満のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰエピトープに対する結合親和力を有する、請求項３３〜５８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６０】
前記抗体が、Ｆｃ受容体への結合が増加されるように修飾されているＩｇＧ１領域を含んでなる、請求項３３〜５９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６１】
前記抗体が低フコシル化される、請求項３３〜５９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６２】
請求項３３〜６１のいずれか一項に記載の抗体、および薬学的に許容できる担体を含んでなる、医薬組成物。
【請求項６３】
請求項６２に記載の抗体、および膵臓癌の治療における前記抗体の使用に関する説明書を含んでなるキット。
【請求項６４】
医薬の製造のための請求項２９〜６２のいずれか一項に記載の抗体または医薬組成物の使用。
【請求項６５】
１０ナノモル濃度未満のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰエピトープに対する結合親和力を有し、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドとの結合について抗体１６Ｄ１０と競合する、二価の抗体。
【請求項６６】
前記抗体が、ＩｇＧアイソタイプの重鎖定常部を有する、請求項６５に記載の抗体。
【請求項６７】
前記ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞が、ＳＯＪ−６細胞である、請求項４３に記載の抗体。
【請求項６８】
請求項２９〜３１、３３〜６１または６５〜６７のいずれか一項に記載の抗体および検出可能なマーカーを含んでなる、抱合体。
【請求項６９】
前記検出可能なマーカーが、放射性同位体、蛍光色素、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに対する抗体以外の抗原−抗体ペアのメンバー、レクチン−炭水化物ペアのメンバー、アビジン、ビオチン、受容体−リガンドペアのメンバー、または分子的に刷り込まれたポリマー−プリント分子システムのメンバーから選択される、請求項６８に記載の抱合体。
【請求項７０】
請求項３３〜６１または６５〜６７のいずれか一項に記載の抗体を発現する宿主細胞。
【請求項７１】
請求項２９〜３１、３３〜６１または６５〜６７のいずれか一項に記載の抗体、および前記抗体を膵臓癌の診断で使用するための説明書を含んでなるキット。
【請求項７２】
ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞を検出するための請求項２９〜３１、３３〜６１または６５〜６７のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項７３】
細胞が膵臓癌細胞である、請求項７２に記載の使用。
【請求項７４】
膵臓癌を診断する方法における、請求項２９〜３１、３３〜６１または６５〜６７のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項７５】
癌細胞のアポトーシスを誘導するか、または増殖を阻害するか、あるいは癌にかかっている患者を治療する方法であって、前記方法が、
ａ）前記癌または癌細胞がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現し、アポトーシス促進剤または抗細胞増殖剤を用いた治療に適するかどうかを判定し；次いで
ｂ）前記癌または癌細胞がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現し、アポトーシス促進剤または抗細胞増殖剤を用いた治療に適するという陽性判定の場合、前記癌または癌細胞を請求項２９〜３１または３３〜６１のいずれか一項に記載の抗原結合化合物の有効量と接触させる工程
を含んでなる、方法。
【請求項７６】
前記癌または癌細胞を接触させる前記工程が、薬学的有効量の前記抗原結合化合物を前記患者に投与することを含んでなる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記薬学的有効量が、前記患者において癌細胞のアポトーシスを誘導または増殖を阻害するのに十分な量である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記接触させる工程が、免疫エフェクター細胞の不在下または相対的不足下である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記免疫エフェクター細胞がＮＫ細胞である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
せいｂ
前記接触させる工程がインビトロで行われる、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記患者に化学療法剤を投与することをさらに含んでなる、請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
前記患者が免疫不全である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８３】
前記抗原結合化合物が抗体である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８４】
前記抗体が二価のＩｇＧ抗体である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞による前記抗体の内部移行、またはＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する前記抗体の能力が、評価される工程をさらに含んでなり、前記抗体が、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞によって実質的に内部移行されず、またはその細胞介在性傷害を誘導できるという知見が、前記抗体が前記患者の治療で使用するのに適することを示す、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記癌または癌細胞が、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの調節不全を有する、請求項７５に記載の方法。
【請求項８７】
前記Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの調節不全が、Ｂｃｌ−２の過剰発現またはＢａｘの発現低下である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記癌または癌細胞が、化学療法剤に対して抵抗性である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８９】
前記癌または癌細胞が膵臓癌である、請求項７５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓構造物に由来するグリコペプチド、抗体、および診断と治療におけるその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
消化管癌の２０％超を占める膵外分泌部癌は、最も悪性度が高い癌形態の１つである。例えば、フランスでは、毎年４，０００件の新しい症例が診断されている。さらに、その発生頻度は世界の多くの地域で著しく上昇している。生存率は１年目で２０％を超えず、５年目には３％であり、診断後の平均生存は３〜４ヶ月である。この低生存率は、腫瘍の深い解剖学的位置、敏感で特異的な初期の生物学的マーカーの不在、およびその無症候性の性質が、実質的に常に遅い診断をもたらすという事実をはじめとする、多数の原因に由来する。さらに膵臓癌は、主に腹膜および肝臓転移の形成を通じて非常に迅速に進行する。目下、膵臓癌の治療のためには不十分な治療上の選択肢しかない。
【０００３】
膵臓癌の治療のために、化学放射線治療および免疫療法の２つの異なるアプローチが研究されている。化学放射線治療の臨床試験としては、標準化学放射線治療計画へのゲムシタビンの追加が挙げられ、これは患者の全ての生存率をわずかに改善することが示されている。ゲムシタビンへのエルロチニブの追加はわずかな改善を提供する。一般に化学放射線療法はいくらかの肯定的結果を示しながらも、依然として芳しくない治療的選択肢である。
【０００４】
免疫療法の臨床試験としては、膵臓癌細胞全体、可溶性ＶＥＧＦまたはＥＧＦＲ、ＭＵＣｌ、ガストリン、およびメソテリンに由来するペプチドを用いる直接的なワクチン接種が挙げられる。例えば、ＶＥＧＦ（ベバシズマブ）またはＥＧＦＲ（セツキシマブ）に対する抗体を、ゲムシタビン、チロシンキナーゼ阻害剤（エルロチニブ）、微小管不安定化剤（タキソテール）、またはシクロホスファミド（シトキサン）などの薬剤と組み合わせることによる間接的免疫療法アプローチもまた試みられた。このような試行は進行中である。
【０００５】
有用な診断および治療マーカー（例えばＳｐａｎ−１、Ｄｕ−Ｐａｎ−２、ＣＡ１９−９、ＣＡＲ−３、ＣＡ２４２、およびＣＯ−ＴＬ１）を同定する努力において、悪性の膵臓上皮細胞に対する多数のモノクローナル抗体が作り出されているが、ごく僅かなもののみが真に膵臓腫瘍細胞に対して特異的であり、それらの反応性は患者の遺伝子型に左右されることが多い（例えば、非特許文献１を参照）。したがってこのタイプのほとんどのマーカーは、膵外分泌部癌の効果的な診断または治療のための実質的利点を提供できなかった。
【０００６】
以前の研究では、ヒト膵臓腫瘍細胞は、胆汁酸塩依存リパーゼ（ＢＳＤＬ）の癌胎児性形態であるＦｅｔｏ−Ａｃｉｎａｒ膵臓タンパク質（ＦＡＰＰ）を過剰に発現することが示されており、これは１６Ｄ１０およびＪ２８グリコトープなどのいくつかのグリコトープの特異的発現をもたらすグリコシル化の変化と関連付けられている。膵臓腫瘍ＳＯＪ−６細胞の細胞膜に、モノクローナル抗体ｍＡｂ１６Ｄ１０によって認識されるグリコトープに結合ずる３２ｋＤａのペプチドがあることもまた示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kawa et al. (1994) Pancreas; 9:692-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって当該技術分野で、膵外分泌部およびその他の形態の癌を治療するための新しいアプローチおよびツールに対する高い必要性がある。本発明は、これらおよびその他の必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、とりわけＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに結合する抗原結合化合物が、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する腫瘍細胞のアポトーシスを誘導でき、および／または増殖を遅らせることができ、細胞死をもたらし、またはそれらの成長および増殖を停止させるという驚くべき発見の結果である（本明細書全体を通して「ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ」という語句は排他的でなく、すなわち、それは「ＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰ」または「ＢＳＤＬおよびＦＡＰＰ」もまた意味できるものとする）。アポトーシスがＢＳＤＬまたはＦＡＰＰに結合する抗体によって始動されると、結果として生じるプログラム化された細胞死は、少なくともカスパーゼ−３、カスパーゼ−９、カスパーゼ−８活性化および／またはポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断により介在される。さらに、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２の減少は、Ｂａｘタンパク質の増加と関連付けられており、カスパーゼ活性化がタンパク質のＢｃｌ−２ファミリーによって制御されることを示す。したがって、本発明の化合物は、特に、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現し、またはアポトーシスに感受性である（例えばカスパーゼ−３、−９、−８、ＰＡＲＰなどを発現する）、癌細胞のアポトーシスを誘導すること、および癌細胞を含んでなる癌にかかっている患者を治療することに有用である。本発明の化合物が細胞増殖を阻害する際、それは、例えば、ＧＳＫ−３βを活性化することにより、例えばｐ５３活性を増加させ、サイクリンＤ１レベルを低下させることにより、少なくともＧ１／Ｓで細胞をブロックすることによって生じる。したがって、本発明の化合物は、特に、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現し、ｐ５３またはＧＳＫ−３β介在Ｇ１／Ｓ細胞周期停止に感受性である、癌細胞の増殖を停止すること、または癌細胞を含んでなる癌にかかっている患者を治療することに有用である。
【００１０】
重要なことに、本発明の化合物は、腫瘍細胞、特に、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現膵臓腫瘍細胞を直接標的にし、アポトーシスを介してそれらの死を引き起こし、および／またはそれらの増殖を止めることができる。有意なことに、これらの効果は、化合物とＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドとの相互作用のみに依存するため、それらは「裸」の化合物（特に、抗体）、すなわち、毒性化合物で修飾または誘導体化されていない化合物についても生じることができる。さらに、化合物が抗体である場合、それらは、腫瘍細胞の免疫細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）に依存せずに効果的に腫瘍細胞を標的にできる（しかしながら、ＡＤＣＣは多くの箇所でも起こり、治療の有効性をさらに高めることが強調されるべきではある）。したがって、本化合物は、例えば、ＡＩＤＳにかかっている患者、化学療法を受けている患者、または免疫抑制剤投与を受けている患者などの免疫系が損なわれている患者にとって特に有用である。
【００１１】
本発明の化合物は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞に特異的に結合し、それによりそれらのアポトーシスを誘導し、またはそれらの成長および増殖を阻害できる、いずれのタイプの分子（例えばポリペプチド、小分子）でありうるが、本発明の好ましい化合物は抗体である。二価のＩｇＧ抗体は、典型的にアポトーシスまたは細胞増殖阻害によって標的細胞数を直接減少させるだけでなく、Ｆｃ末端もまた含んでなり、十分な結合親和力を有してＡＤＣＣを介した細胞死を誘導できることから、特に好ましい抗体は二価のＩｇＧ抗体である。さらに、特定の抗ＢＳＤＬまたは抗ＦＡＰＰ抗体、特にＩｇＭ抗体などの多量体抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞によって迅速に内部移行される傾向にあり、それによりＡＤＣＣを誘導する上で有効ではないことが知見されている。したがって、適切な抗体（ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ、最も好ましくは、抗体１６Ｄ１０によって認識されるＦＡＰＰエピトープを標的にする二価のＩｇＧ抗体）を選択することで、２つの独立した機序（アポトーシス誘導／細胞周期阻害およびＡＤＣＣ）を介することにより、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現腫瘍細胞を標的とすることができる。したがって、これらの知見は、合わせて、とりわけ所望のアポトーシス促進または抗細胞増殖の特性、ならびに典型的にＡＤＣＣ誘導効果を有する、特に有効な抗原結合化合物、最も好まくは抗体を生成するのに予想外の方法を提供する。かかる抗原結合化合物、ならびに典型的な抗原結合化合物を生成し、使用する方法が記載される。
【００１２】
本発明は、抗原結合化合物を使用する方法を提供し、例えば、本発明は、細胞死を誘導するか、または細胞増殖を阻害するための方法であって、細胞を誘導するか、または細胞増殖を阻害するのに有効な量におけるＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに結合する抗原結合化合物に、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する癌細胞などの細胞を曝露することを含んでなる方法を提供する。本発明の目的では、「細胞増殖」は、細胞の成長または増殖のいずれの態様、例えば、細胞成長、細胞分裂、または細胞周期のいずれの態様を意味しうる。細胞は、細胞培養中、または例えば癌を患っている哺乳類などの哺乳類中のものであってもよい。本発明はまた、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害する方法であって、細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害するのに有効な量の本明細書に記載されるごときＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに結合する抗原結合化合物（例えば、外因性抗体）に、細胞を曝露することを含んでなる方法を提供する。したがって、本発明は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドの発現によって特徴づけられる病状、例えば、膵臓癌にかかっている哺乳類を治療するための方法であって、本明細書で開示される抗原結合化合物の薬学的有効量を哺乳類に投与することを含んでなる方法を提供する。好ましい実施態様において、化合物は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞によって実質的に内部移行されず、それにより細胞のＡＤＣＣを誘導するのに有効である抗体、例えば、二価のＩｇＧ抗体である。好ましい実施態様では、抗体は、例えば、ＳＯＪ−６細胞などのＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞の細胞表面に対して、少なくとも４０、６０、８０、１００、１２０分以上の結合半減期を有する。その他の好ましい実施態様では、抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰエピトープ、好ましくは、１６Ｄ１０により特異的に認識されるエピトープに対して、５０、４０、３０、２０、１０、５、１、またはそれより低いナノモル濃度の結合親和力を有する。
【００１３】
本発明は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合し、膵臓癌の治療に有用である、抗原結合化合物、特に、抗体を生成する方法を提供する。本方法を使用して生成される抗原結合化合物は、膵臓腫瘍細胞、またはＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現するその他のいずれの細胞、特に、抗体１６Ｄ１０によって認識されるＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰポリペプチド上のエピトープを特異的に標的とすることができる。抗原結合化合物は、細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を抑制することにより、ならびに、場合により結合のみにより広がった細胞の影響を中和することにより、免疫系による（例えばＡＤＣＣを介した）破壊のためにそれらを標的とすることにより、および／または細胞を放射性同位体、毒素、または薬剤などの細胞毒性薬物と接触させることで直接傷害することにより、細胞増殖の病理学的影響を制限できる。ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する癌（またはＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現と関連付けられているその他の病状）の治療のために抗原結合化合物を使用する方法もまた、提供される。好ましい実施態様では、抗体は、例えば、ＳＯＪ−６細胞などのＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞の細胞表面に対して、少なくとも４０、６０、８０、１００、１２０分以上の結合の半減期を有する。その他の好ましい実施態様では、抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰエピトープ、好ましくは、１６Ｄ１０により特異的に認識されるエピトープに対して、５０、４０、３０、２０、１０、５、１またはそれより低いナノモル濃度の結合親和力を有する。その他の好ましい実施態様では、抗体は１６Ｄ１０以外の抗体である。
【００１４】
別の実施態様では、抗原結合化合物は、腫瘍細胞の死滅を誘導し、および／またはそれらの成長を停止できるため、例えば、膵臓癌などの腫瘍の容積を低下させ、または制限するために、例えば、外科的に切除または減量できる、またはできない腫瘍中で、または腫瘍が樹立し、または広がった膵臓癌中で、例えば、膵臓癌が少なくともＩ期癌に分類され、および／または膵臓中の腫瘍サイズがいずれの方向で２ｃｍ以下である、または膵臓癌が少なくともＩＩ期癌に分類され、および／または膵臓中の腫瘍サイズがいずれの方向で２ｃｍを超える、膵臓癌がＩＩ期癌に分類され、および／または癌が膵臓周辺の近傍組織内で成長し始めているが、近傍リンパ節内では成長していない、膵臓癌がＩＩＩ期癌に分類され、および／または膵臓周囲の組織内に向かって伸びているかもしれない、または膵臓癌がＩＶ期癌に分類され、および／または近傍臓器内に向かって伸びているような樹立した腫瘍中で、ＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰポリペプチドと結合する化合物を使用できる。膵臓癌はかなり進んだ進行段階で診断されることが多いため、上皮内癌を超えて進行した腫瘍中の腫瘍細胞を傷害し、または成長を止める能力は、かかる癌において顕著である。
【００１５】
意義深いことに、特定の実施態様において、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに結合する抗原結合化合物は、特に、抗体が使用される場合、免疫細胞介在性細胞傷害（例えば、ＡＤＣＣ）のみに依存しないため、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに結合する抗原結合化合物は、不完全なまたは抑制された免疫系を有する患者において効果的に使用でき、および／または追加的抗腫瘍剤、特に免疫系に悪影響を及ぼすことが知られている治療薬と組み合わせて効果的に使用できることが予想される。例えば、免疫不全患者（例えば、ＨＩＶ感染にかかっている）、免疫抑制薬を服用している患者（例えば、臓器移植後、または自己免疫障害の治療として）、または化学療法剤を服用している患者は、特にこのような化合物を用いた治療法の良好な候補である。
【００１６】
さらに、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに結合し、アポトーシス促進または抗細胞増殖特性を有する本発明の抗原結合化合物は、膵臓腫瘍細胞の成長を根絶または停止できるため、それぞれのアポトーシス促進または抗細胞増殖活性が高められないように、アポトーシス促進化合物によっても、例えば、細胞が最初に成長停止を被り、次いで根絶されうるように、本明細書で提供されるインビトロおよびインビボの方法において、本明細書で開示される抗原結合化合物と、その他の抗細胞増殖および／またはアポトーシス促進剤とを併用することが所望されてもよい。
【００１７】
したがって、本発明は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドと特異的に結合し、膵臓腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するか、または増殖を阻害することができる抗原結合化合物を提供する。好ましくは、抗原結合化合物は、抗体１６Ｄ１０と同一のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチド上のエピトープに結合する。一実施態様では、抗原結合化合物は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドとの（例えば、単離されたグリコペプチドまたはそれを発現する細胞との）結合について、抗体１６Ｄ１０と競合する。一実施態様では、化合物は、抗体１６Ｄ１０以外の抗体である。
【００１８】
本発明の方法の一実施態様では、抗原結合化合物により認識されるＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドは、ＢＤＳＬのＣ末端ペプチドである。別の実施態様では、抗原結合化合物は、配列Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  ＶａＩ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒを有する７個のアミノ酸とグリコシル化部位を有する一般的な不変部分を含んでなる、１つまたは複数の１１個のアミノ酸の反復Ｃ末端ペプチド配列を含んでなり、またはからなるＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する。前記一般的な不変部分は、任意選択的に、いずれかの側にグルタミン酸によって置換されることが多いグリシンが隣接し、アミノ酸ＡｓｐおよびＳｅｒをＮ末端側に含有する。
【００１９】
好ましい実施態様では、抗原結合化合物は「裸」であり、放射性同位体、毒性ペプチドまたは毒性小分子で官能性が付与されていない（例えば「裸」の抗体）。別の実施態様では、抗原結合化合物は、細胞毒性抗原結合化合物であり、放射性同位体、毒性ペプチド、および毒性小分子からなる群から選択されるエレメントを含んでなる。別の実施態様では、抗原結合化合物は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。別の実施態様では、放射性同位体、毒性ペプチド、または毒性小分子は、抗原結合化合物に直接結合する。
【００２０】
別の実施態様では、抗原結合化合物は、例えば、二価のキメラまたはヒト化抗体などの抗体である。このような一実施態様では、抗体は、抗体１６Ｄ１０の可変（抗原結合）領域を含んでなる。好ましい実施態様では、抗体はＦｃ末端を含んでなる。その他の好ましい実施態様では、抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞、例えば、ＳＯＪ−６細胞の細胞表面に対して、少なくとも４０、６０、８０、１００、１２０分以上の結合半減期を有する。その他の好ましい実施態様では、抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰエピトープ、好ましくは、１６Ｄ１０によって特異的に認識されるエピトープに対して、５０、４０、３０、２０、１０、５、１ナノモル濃度以下の結合親和力を有する。別の好ましい実施態様では、抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞、例えば、ＳＯＪ−６細胞によって実質的に内部移行されないため、標的（ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現）細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導できる。別の好ましい実施態様では、抗体は低フコシル化される。
【００２１】
したがって、本発明は、膵臓癌にかかっている患者を治療する方法であって、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する本発明に記載される抗原結合化合物の薬学的有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、患者を治療する方法であって、ａ）患者内の膵臓癌を評価する工程と、ｂ）癌が、例えば、癌が樹立され、外科的に治療でき、外科的に治療できず、上皮内癌を超えて進行しており、および／または少なくとも２ｃｍの直径を有し、および／または少なくともＩ期に分類されるような、癌細胞の傷害、細胞のアポトーシス誘導、または癌細胞の成長または増殖の阻害が必要である段階にあると判定された場合、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドと特異的に結合して膵臓腫瘍細胞のアポトーシスを誘導できるか、または成長または増殖を阻害できる抗原結合化合物（例えば、抗体）を患者に投与する工程を含んでなる方法を提供する。一実施態様では、化合物は、抗体、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞によって実質的に内部移行されず、細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導できる二価のＩｇＧ抗体（好ましくは、本実施態様およびその他の実施態様において、Ｆｃ末端を含んでなる）抗体である。
【００２２】
一実施態様では、本発明は、ｉ）ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する抗原結合化合物を提供する工程と、ｉｉ）アポトーシス促進または抗細胞増殖活性について抗原結合化合物の能力を試験する工程と、ｉｉｉ）抗原結合化合物がアポトーシス促進または抗細胞増殖活性を有すると判定された場合、抗原結合化合物を選択する工程と、場合によりｉｖ）選択された抗原結合化合物を多量に生成する工程を含んでなる、癌の治療で使用するのに適する抗原結合化合物を生成する方法を提供する。一実施態様では、工程ｉｉｉ）で選択される化合物は、抗体であり、例えば、ヒト化またはキメラ化することにより、工程ｉｖ）の前にヒト投与に適するように作成される。場合により、複数の抗原結合化合物が工程ｉ）で提供され、それらは、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害するそれらの能力について、工程ｉｉ）でそれぞれ試験される。典型的に、工程ｉｉ）は、細胞、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞、好ましくは、ＳＯＪ−６細胞または膵臓癌にかかっている患者から採取された細胞のごとき腫瘍細胞が化合物が接触され、細胞の増殖または生存が評価され、標準的なアッセイに関し、公知のアポトーシスまたは細胞増殖／周期調節遺伝子の活性の解析も同時に行われることが多い。
【００２３】
別の実施態様では、本発明は、ｉ）ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する工程と、ｉｉ）アポトーシス促進または抗細胞増殖活性について抗体を試験する工程と、ｉｉｉ）細胞、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する腫瘍細胞の免疫細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力について抗体を試験する工程と、ｉｖ）抗原結合化合物がアポトーシス促進または抗細胞増殖活性を有し、細胞、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する腫瘍細胞のＡＤＣＣを誘導できると判定された場合、抗体を選択する工程と、場合によりｖ）選択された抗原結合化合物を多量に提供する工程を含んでなる、癌の治療で使用するのに適する抗体を生成する方法を提供する。一実施態様では、工程ｉｖ）で選択される抗体は、例えば、ヒト化またはキメラ化することにより、工程ｖ）の前にヒト投与に適するように作成される。場合により、複数の抗原結合化合物が工程ｉ）で提供され、それらはＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害するそれらの能力について、工程ｉｉ）でそれぞれ試験される。好ましい実施態様では、抗体はＩｇＧである。さらに、抗体は、好ましくは、二価である。別の好ましい実施態様では、抗体は、扁桃、唾液腺、末梢神経、リンパ節、眼、骨髄、卵巣、卵管、副甲状腺、前立腺、脾臓、腎臓、副腎、精巣、胸腺、尿管、子宮、および膀胱からなる群から選択される非腫瘍組織と交差反応しない。
【００２４】
別の実施態様では、本発明は、癌の治療における使用に適する抗体を生成する方法であって、ｉ）ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する工程と、ｉｉ）アポトーシス促進または抗細胞増殖活性について抗体を試験する工程と、ｉｉｉ）細胞、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する腫瘍細胞による抗体の内部移行について試験する工程と、ｉｖ）抗原結合化合物がアポトーシス促進または抗細胞増殖活性を有し、細胞、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する腫瘍細胞によって実質的に内部移行されないと判定された場合、抗体を選択する工程と、場合によりｖ）選択された抗原結合化合物を多量に生成する工程を含んでなる方法を提供する。一実施態様では、工程ｉｖ）で選択される抗体は、例えば、ヒト化またはキメラ化することにより、工程ｖ）の前にヒト投与に適するように作成される。場合により、複数の抗原結合化合物が工程ｉ）で提供され、それらはＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害するそれらの能力について、工程ｉｉ）でそれぞれ試験される。好ましい実施態様では、抗体はＩｇＧである。さらに、抗体は、好ましくは二価である（Ｆｃ末端を含んでなる）。別の好ましい実施態様では、抗体は、扁桃、唾液腺、末梢神経、リンパ節、眼、骨髄、卵巣、卵管、副甲状腺、前立腺、脾臓、腎臓、副腎、精巣、胸腺、尿管、子宮、および膀胱からなる群から選択される非腫瘍組織と交差反応しない。好ましい実施態様では、抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞、例えば、ＳＯＪ−６細胞の細胞表面に対して、少なくとも４０、６０、８０、１００、１２０分以上の結合半減期を有する。その他の好ましい実施態様では、抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰエピトープ、好ましくは、１６Ｄ１０により特異的に認識されるエピトープに対して、５０、４０、３０、２０、１０、５、１またはそれより低いナノモル濃度の結合親和力を有する。その他の好ましい実施態様では、抗体は低フコシル化される。
【００２５】
別の実施態様では、本発明は、癌の治療で使用するのに適する抗原結合化合物を生成する方法であって、ｉ）多量のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する抗原結合化合物を生成する工程と、ｉｉ）前記多量の抗原結合化合物からのサンプルをアポトーシス促進または抗細胞増殖活性について試験する工程と、ｉｉｉ）抗原結合化合物がアポトーシス促進または抗細胞増殖活性を有すると判定された場合、医薬および／または医薬の製造における使用のための量を選択する工程と、場合によりｉｖ）ヒトへの投与のための量を調製し、場合により多量の選択された抗原結合化合物を薬学的に許容できる担体と一緒に配合する工程とを含んでなる方法を提供する。
【００２６】
別の実施態様では、本発明は、癌の治療で使用するのに適する抗原結合化合物を生成する方法であって、ｉ）ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する複数の抗原結合化合物を提供する工程と、ｉｉ）アポトーシス促進または抗細胞増殖活性能力について各抗原結合化合物を試験する工程と、ｉｉｉ）前記細胞のアポトーシスを誘導できるか、または増殖を阻害できる抗原結合化合物を選択する工程と、ｉｖ）場合により抗原結合化合物をヒト投与に適するようにする工程と、および／または場合によりｖ）選択された抗原結合化合物を多量に生成する工程を含んでなる方法を提供する。一実施態様では、前記方法は、化合物が抗体であり、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する細胞による抗体の内部移行が評価される追加的工程を含んでなり、工程ｉｉｉ）で選択された抗体が、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する細胞によって実質的に内部移行されないことを見いだすことで、癌の治療で使用するためのその適合性が確認される。別の実施態様では、前記方法は、化合物が抗体であり、細胞、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する腫瘍細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する抗体の能力が評価される追加的工程を含んでなり、当該工程中、工程ｉｉｉ）で選択される抗体が、細胞、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する腫瘍細胞のＡＤＣＣを誘導できることを見いだすことで、癌の治療で使用するためのその適合性が確認される。
【００２７】
別の実施態様では、本発明は、抗原結合化合物を生成する方法であって、ｉ）１人またはそれ以上の膵臓癌にかかっている患者から採取されたＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する腫瘍細胞に特異的に結合する抗原結合化合物を提供する工程と、ｉｉ）１人またはそれ以上の膵臓癌にかかっている患者から採取された腫瘍細胞に対するアポトーシス促進または抗細胞増殖活性について抗原結合化合物を試験する工程と、ｉｉｉ）抗原結合化合物が、１人またはそれ以上の患者から採取された腫瘍細胞の相当数のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害する場合、抗原結合化合物をヒトへの投与に適するようにする工程と、ｉｖ）場合によりヒトに適する抗原結合化合物を多量に生成する工程を含んでなる方法を提供する。一実施態様では、前記方法は、化合物が抗体であり、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する細胞による抗体の内部移行が評価される追加的工程を含んでなり、当該工程中、工程ｉｉｉ）で使用される抗体がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する細胞によって実質的に内部移行されないことを見いだすことで、膵臓癌の治療での使用するためのその適合性が確認される。別の実施態様では、前記方法は、化合物が抗体であり、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する腫瘍細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する抗体の能力が評価される追加的工程を含んでなり、当該工程中、工程ｉｉｉ）で使用される抗体がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する腫瘍細胞のＡＤＣＣを誘導できることを見いだすことで、膵臓癌の治療での使用するためのその適合性が確認される。
【００２８】
本発明のいずれかの方法の一実施態様では、方法は、工程ｉ）の前に、非ヒト哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒトＩｇ遺伝子導入マウス）をＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドで免疫する工程を含んでなってもよい。別の実施態様では、前記方法は、工程ｉ）の前に、（例えば、ファージディスプレイ方法およびこの類似方法を介して）抗原結合化合物のライブラリーを作成し、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに結合する抗原結合化合物を選択する工程を含んでなる。
【００２９】
本発明のいずれかの方法の一実施態様では、工程ｉ）および／または工程ｉｉ）の抗原結合化合物または抗体は、放射性同位体、毒性ポリペプチド、または毒性小分子などの細胞毒性薬物を含まない。
【００３０】
各抗原結合化合物または抗体が細胞のアポトーシスを誘導し、またはその増殖を阻害する能力を試験する工程は、多様な利用できるいずれかの方法に従って実施できる。例えば、前記試験する工程は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞、ＳＯＪ−６細胞、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞）の死滅を検出し、核断片化を検出し、（例えばｍカスパーゼ活性化などの）活性を検出し、またはアポトーシスに関与するタンパク質レベルの増加および／または低下を検出する工程を含んでなってもよいが、これらに限定されるものではない。同様に、細胞の成長または増殖に影響を与える化合物を試験する工程は、例えば、細胞数、密度、ＤＮＡ複製、分裂指数の計測、細胞成長または増殖に関与するタンパク質またはその他の分子のレベルの測定、または細胞成長または増殖のいずれのその他の測定などの多様な利用できる方法のいずれかに従って実施できる。
【００３１】
本発明のいずれかの方法の一実施態様では、アポトーシス促進または抗細胞増殖活性を試験する工程は、抗原結合化合物がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞のアポトーシスを誘導し、または成長または増殖を阻害するかどうかを判定する工程を含んでなる。場合により、細胞は、脂質ラフト中でＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する。場合により、細胞は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現するようにされる。場合により、細胞は腫瘍細胞系である。場合により、細胞は膵臓癌細胞であり、場合により、ＳＯＪ−６細胞である。場合により、細胞は、例えば、膵外分泌部癌などの癌がある患者から採取された腫瘍細胞である。
【００３２】
本発明のいずれかの方法の一実施態様では、抗原結合化合物がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害するかどうか判断する工程を免疫エフェクター細胞、特にＮＫ細胞の不在下で実施できる。
【００３３】
本発明のいずれかの方法の一実施態様では、アポトーシス促進または抗細胞成長または増殖活性を試験する工程は、抗原結合化合物が、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞内で、アポトーシスまたは細胞増殖調節タンパク質またはマーカーの活性またはレベルを調節するどうかを判定する工程を含んでなる。好ましくは、アポトーシスについては、調節タンパク質はカスパーゼまたはＢｃｌ−２ファミリーメンバーである。細胞成長または増殖については、調節タンパク質またはマーカーは、例えば、ＰＣＮＡ、Ｋｉ−６７、サイクリンＤ（例えば、サイクリンＤ１）などのサイクリン、Ｅ２Ｆ、Ｒｂ、ｐ５３、ＭＣＭ６、ＧＳＫ−３β、Ｂｃｌ１０またはＢｒｄＵ組み込みである。
【００３４】
本発明のいずれかの方法の一実施態様では、抗原結合化合物をヒトへの投与に適するようにする工程は、抗ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ抗体をキメラ、ヒト、またはヒト化する工程を含んでなる。化合物をヒトへの投与に適するようにする工程はまた、化合物を薬学的に許容できる担体と共に処方する工程を含んでなることもできる。
【００３５】
本発明のいずれかの方法の一実施態様では、多量の抗原結合化合物を生成する工程は、適切な培地中で抗原結合化合物を発現する細胞を培養し、抗原結合化合物を回収する工程を含んでなる。場合により、細胞は、抗原結合化合物を発現するように作成された組み換え宿主細胞である。一実施態様では、化合物はモノクローナル抗体であり、細胞はハイブリドーマである。
【００３６】
本発明のいずれかの方法の一実施態様では、抗原結合化合物、特に、本方法によって生成された抗原結合化合物は、放射性同位体、毒性ポリペプチド、または毒性小分子などの細胞毒性薬物を含まない。一実施態様では、抗原結合化合物はＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する抗体である。本発明のいずれかの方法の一実施態様では、抗原結合化合物はＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドとの結合について抗体１６Ｄ１０と競合する。本発明のいずれかの方法の一実施態様では、化合物は、１６Ｄ１０以外の抗体である。本発明のいずれかの方法の別の実施態様では、化合物は、抗体１６Ｄ１０のキメラ、ヒト、またはヒト化バージョンである。
【００３７】
本発明のいずれかの方法の一実施態様では、抗原結合化合物、好ましくは、抗体は、Ｆｃ受容体結合部分、好ましくは、ＩｇＧアイソタイプの重鎖定常部、場合により、ヒトＩｇＧアイソタイプの重鎖定常部を有する。好ましい実施態様では、抗体はＩｇＧ１抗体である。本発明はまた、（例えば、それは親の抗体と同一の抗原に結合できる）実質的に同一の抗原特異性および活性を有する抗体の断片および誘導体も包含する。このような断片としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’２断片、ＣＤＲ、およびＳｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されるものではない。化合物が抗体である場合、抗体は、典型的に、例えば、キメラ、ヒト化またはヒト抗体である。一の好ましい実施態様では、抗体は、組み換えキメラ抗体である。一のかかる実施態様では、抗ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ抗体、例えば、１６Ｄ１０のマウス重鎖の領域Ｃｕ２、Ｃｕ３、およびＣｕ４は、ヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１により置換される。別の好ましい実施態様では、抗体は、マウス抗ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ抗体、例えば、１６Ｄ１０の定常部が、重鎖および軽鎖の両方についてヒトＩｇＧ１定常部により置換されるキメラ抗体である。
【００３８】
特定の実施態様では、本発明の化合物は、多量体（すなわち架橋）ＩｇＧ抗体である。好ましい実施態様では、抗体は、四量体（２つの重鎖および２つの軽鎖）であり、それにより二価である。特に好ましい実施態様では、抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する腫瘍細胞のアポトーシスを誘導できるか、または増殖を阻害できる。特に好ましい実施態様では、抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する腫瘍細胞のアポトーシスを誘導できるか、または増殖を阻害でき、あるいはＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する細胞によって実質的に内部移行されない。その他の特に好ましい実施態様では、抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する腫瘍細胞のアポトーシスを誘導できるか、または増殖を阻害でき、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰを発現する細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）もまた誘導できる。別の特に好ましい実施態様では、抗体は、扁桃、唾液腺、末梢神経、眼、骨髄、卵巣、卵管、副甲状腺、前立腺、脾臓、腎臓、副腎、精巣、胸腺、尿管、子宮、および膀胱からなる群から選択される組織と交差反応しない。その他の好ましい実施態様では、抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞、例えば、ＳＯＪ−６細胞の表面に対して、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１５０、２００分以上の結合半減期を有する。その他の好ましい実施態様では、抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰエピトープ（例えば、１６Ｄ１０によって認識されるエピトープ）に対して５０、４０、３０、２０、１０、５、１またはそれより低いナノモル濃度の結合親和力を有する。
【００３９】
別の実施態様では、本発明は、本発明のいずれかの方法に従って生成された抗原結合化合物を包含する。
【００４０】
本発明はまた、抗原結合化合物のいずれかを含んでなる医薬製剤も包含し、特に本発明の抗体のいずれかと薬学的に許容できる担体とがキットとして提供される。キットは、例えば、膵臓癌の治療におけるその使用に関する説明書および化合物を含んでなってもよい。キットは、化合物および担体を含んでなってもよく、キットは製造された（例えば、ガラス、プラスチックなどの）容器中に化合物を含んでなってもよい。抗体を発現する細胞、例えば、ハイブリドーマもまた包含される。
【００４１】
一実施態様では、本発明の抗原結合化合物または抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドとの結合について抗体１６Ｄ１０と競合する。本発明はまた、抗体１６Ｄ１０と実質的に同じ抗原特異性および活性を有する抗体の断片および誘導体も包含する（例えば、親の抗体と同一の抗原に結合できる）。このような断片としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’２断片、ＣＤＲ、およびＳｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
一実施態様では、本発明の組成物および／または方法は、抗体１６Ｄ１０、特に、２００４年３月１６日にパリの国立培養微生物コレクション（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ））に番号Ｉ−３１８８の下に寄託された細胞によって産生されるＩｇＭ抗体１６Ｄ１０を特異的に除外する。
【００４３】
したがって、別の実施態様では、本発明は、抗体、好ましくは、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに結合し、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞のアポトーシスを誘導できるか、または増殖を阻害できる単離された抗体を提供し、前記抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドとの結合について抗体１６Ｄ１０と競合し、抗体は１６Ｄ１０ではない。
【００４４】
別の実施態様では、本発明は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含んでなる二価の抗体を提供し、重鎖は、Ｆｃ受容体に結合できるＩｇＧ重鎖定常部を含んでなり、抗体は、（ａ）ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞のアポトーシスを誘導できるか、または増殖を阻害でき；（ｂ）ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導でき；（ｃ）ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドとの結合について抗体１６Ｄ１０と競合する。
【００４５】
別の実施態様では、本発明は、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列に由来して、ヒトＩｇＧ鎖定常部と融合する１つ以上のＣＤＲを含んでなる可変部を含んでなる重鎖、および（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列に由来して、場合によりヒトカッパ鎖定常部と融合する１つ以上のＣＤＲを含んでなる可変部を含んでなる軽鎖を含んでなる、二価の抗体を提供する。
【００４６】
場合により、本明細書での抗体のいずれかは、さらに、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞によって実質的に内部移行されないことにより特徴づけられる。別の実施態様では、本明細書での抗体のいずれかは、さらに、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導できることにより特徴づけられる。本明細書での抗体のいずれかは、さらに、放射性同位体、毒性ポリペプチド、または毒性小分子などの細胞毒性薬物を含まないことにより特徴づけられる。本明細書での抗体のいずれかは、さらに、膵臓腫瘍細胞のアポトーシスを誘導できるか、または増殖を阻害できることにより特徴づけられる。本明細書での抗体のいずれかは、さらに、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞中で、アポトーシス調節タンパク質の活性またはレベルを調節できることにより特徴づけられる。別の実施態様では、本明細書での抗体のいずれかは、さらに、カスパーゼまたはＢｃｌ−２ファミリーメンバーの活性またはレベルを調節できることにより特徴づけられる。別の実施態様では、抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞中で、細胞増殖または成長調節タンパク質の活性またはレベルを調節する。別の実施態様では、抗体は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞において、ＧＳＫ−３β、サイクリンＤ１、およびｐ５３からなる群から選択される細胞増殖または成長調節タンパク質の活性またはレベルを調節する。別の実施態様では、本明細書での抗体のいずれかは、さらに、ＩｇＧアイソタイプ、場合によりヒトＩｇＧまたはＩｇＧ１アイソタイプの重鎖定常部を有することにより特徴づけられる。別の実施態様では、本明細書での抗体のいずれかは、さらに、四量体であることにより特徴づけられる。別の実施態様では、本明細書での抗体のいずれかは、さらに、二価であることにより特徴づけられる。別の実施態様では、本明細書での抗体のいずれかは、さらに、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体であることにより特徴づけられる。別の実施態様では、本明細書での抗体のいずれかは、さらに、低フコシル化されることにより特徴づけられる。
【００４７】
本明細書で述べられている抗体のいずれかの一実施態様では、抗体は、少なくとも４０、６０、８０、１００、１２０、１８０、２４０分以上の半減期で、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞の表面に結合する。別の実施態様では、抗体は、少なくとも５０、４０、３０、２０、１０、５、または１ナノモル濃度の結合親和力でＢＳＤＬまたはＦＡＰＰエピトープに結合する。
【００４８】
本発明はまた、本明細書で述べられている抗原結合化合物または抗体のいずれかと、薬学的に許容できる担体とを含んでなる医薬組成物も包含する。他の態様では、本発明は、本発明の抗原結合化合物または抗体と、膵臓病変またはＦＡＰＰまたはＢＳＤＬを発現する病変、例えば、膵臓癌の治療または診断における前記抗原結合化合物または抗体の使用のための説明書とを含んでなるキットを包含する。別の実施態様では、細胞、例えば、ハイブリドーマもまた提供される。
【００４９】
その他の態様では、癌細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害し、および／または癌にかかっている患者または個体を治療する方法であって、ａ）癌または癌細胞がアポトーシス促進剤または抗細胞増殖剤を用いた治療に適するかどうかを判定する工程と、およびｂ）癌または癌細胞がアポトーシス促進剤または抗細胞増殖剤を用いた治療に適するという陽性判定の場合、癌細胞を有効量の本発明の抗原結合化合物のいずれかに接触させる工程を含んでなる方法が提供される。なお別の態様では、本発明は、癌細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害し、および／または癌にかかっている患者を治療する方法であって、ａ）癌または癌細胞がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現するかどうかを判定する工程と、ｂ）癌または癌細胞がＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰポリペプチドを発現するという陽性判定の場合、癌細胞を有効量の上記請求項のいずれか１つに記載の抗原結合化合物に接触させる工程を含んでなる方法を提供する。場合により、これらの方法では、癌細胞を接触させる工程は、薬学的有効量の本発明の抗原結合化合物を患者に投与する工程を含んでなる。好ましくは、薬学的有効量は、患者において癌細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害するのに効果的な量である。場合により、これらの方法では、化合物は、抗体であり、方法は、抗体のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞による内部移行が評価され、または抗体がＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力が評価される追加的工程を含み、当該工程中、抗体が実質的に内部移行されず、またはＢＳＤＬ−および／またはＦＡＰＰ−発現細胞の細胞介在性傷害を誘導できるという判定が、抗体が工程ｂ）における使用に適することを示す。特定の実施態様では、接触させる工程は、例えば、このような方法が生体外で実施される場合、またはそれらが免疫不全にかかっている患者（例えば、ＡＩＤＳなどの病状、ＮＫ細胞レベルを低下させる病状、化学療法剤の投与、または例えば組織移植手順または自己免疫障害の治療に併用される免疫抑制剤の使用に起因する）において実施される場合、免疫エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞の不在または相対的不足下で実施される。
【００５０】
他の態様では、本発明は、患者において腫瘍容積を低下させる方法であって、薬学的有効量の本発明の抗原結合化合物を患者に投与する工程を含んでなる方法を提供する。
【００５１】
他の態様では、本発明は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチド発現細胞、場合により腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害する方法であって、細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害するのに有効量で、細胞を本発明の抗原結合化合物に接触させる工程を含んでなる方法を提供する。場合により、前記接触させる工程は、免疫エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞の不在または相対的不足下で、および／または生体外で実施される。場合により、前記方法は、抗原結合化合物が細胞のアポトーシスを誘導できるか、または増殖を阻害できるかどうかを判定する工程をさらに含んでなる。場合により、化合物は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞によって実質的に内部移行されず、および／またはＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導できる抗体であり、上記接触させる工程は免疫エフェクター（例えばＮＫ）細胞の存在下で実施される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、ｍＡｂ  １６Ｄ１０がＳＯＪ−６細胞のアポトーシス細胞死を刺激する能力を実証する（ＲＰＭＩおよびマウスＩｇＭとの比較；ｙ軸はアポトーシス細胞数／ｃｍ２を表す）。
【図２】図２は、カスパーゼ阻害剤（カスパーゼ９：Ｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋ、カスパーゼ８：Ｚ−ＩＥＤＴ−ｆｍｋ、カスパーゼ３：Ｚ−ＤＥＶＥＤ−ｆｍｋ、およびカスパーゼミックス：Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）ありまたはなしで前処理され、次にｍＡｂ  １６Ｄ１０を用いて処理された膵臓ＳＯＪ−６細胞について、ＣａｓｐＡｃｅ  ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ｆｍｋを用いて測定された１６Ｄ１０によるアポトーシス誘導を示す。ｍＡｂ  １６Ｄ１０は、カスパーゼ−３、カスパーゼ−８、およびカスパーゼ−９を通じてアポトーシスを刺激する。
【図３】図３は、ＤＡＰＩ染色により観察されるｍＡｂ  １６Ｄ１０によって誘導されるＳＯＪ−６細胞のアポトーシスを示す。ＲＰＭＩは細胞にアポトーシスを誘導せず、シスプラチンは低レベルのアポトーシスを誘導し、抗体１６Ｄ１０は顕著なレベルのアポトーシスを誘導した。
【図４】図４は、１６Ｄ１０による細胞処理が、Ｂａｘタンパク質の増加と関連付けられている、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２減少を誘導することを実証するゲル上の結果を示し、カスパーゼの活性化がＢｃｌ−２ファミリータンパク質によって制御されていることを示す。実験はまた、１６Ｄ１０の誘導するアポトーシスが、カスパーゼ８および９、およびポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断を通じて介在されることも実証した。左端のレーンはＲＰＭＩ中のＳＯＪ−６細胞を表し、中央のレーンは抗体１６Ｄ１０と共にインキュベートされたＳＯＪ−６細胞を表し、右端のレーンはシスプラチンと共にインキュベートされたＳＯＪ−６細胞を表す。
【図５】図５は、ヒトＢＤＳＬ／ＦＡＰＰを認識するポリクローナル抗体ｐＡｂＬ６４の濃度増加によるＳＯＪ−６膵臓腫瘍細胞の処理を伴う、ＭＴＴアッセイの結果を示す。ｐＡｂＬ６４は細胞の成長または数の低下を引き起こせない（ｘ軸はｍＡｂ濃度、ｙ軸は細胞の％成長である）。
【図６】図６は、ヒトＢＤＳＬ／ＦＡＰＰを認識するが、本発明者らによって抗体１６Ｄ１０からのＢＤＳＬ／ＦＡＰＰ上の異なるエピトープに結合することが実証されている、ポリクローナル抗体Ｊ２８の濃度増加によるＳＯＪ−６膵臓腫瘍細胞の処理を伴うＭＴＴアッセイの結果を示す。Ｊ２８は細胞の成長または数の低下を引き起こすことができる（ｘ軸はｍＡｂ濃度、ｙ軸は細胞の％成長である）。
【図７】図７は、ヒトＢＤＳＬ／ＦＡＰＰを認識するポリクローナル抗体１６Ｄ１０（ＩｇＭ）の濃度増加によるＳＯＪ−６またはＰＡＮＣ−１膵臓腫瘍細胞の処理を伴うＭＴＴアッセイの結果を示す。図７は、１６Ｄ１０が１６Ｄ１０抗原を発現しないＰＡＮＣ−１細胞の成長または数の低下を引き起こせないが、ＦＡＰＰを発現するＳＯＪ−６細胞の低下を引き起こすことを示す（ｘ軸はｍＡｂ濃度、ｙ軸は細胞の％成長である）。
【図８】図８は、対照ＩｇＭ抗体がＰＡＮＣ−１またはＳＯＪ−６細胞のどちらの成長または数の低下も引き起こせないことを示す、対照ＩｇＭ抗体の濃度増加によるＳＯＪ−６またはＰＡＮＣ−１膵臓腫瘍細胞の処理を伴うＭＴＴアッセイの結果を示す（ｘ軸はｍＡｂ濃度、ｙ軸は細胞の％成長である）。
【図９】図９は、１６Ｄ１０が細胞の減少を引き起こすのに対し、対照ＩｇＭ抗体は引き起こさないことを実証する、抗体１６Ｄ１０または対照ＩｇＭ抗体どちらかの濃度増加によるＳＯＪ−６膵臓腫瘍細胞の処理を伴うＭＴＴアッセイの結果を示す（ｘ軸はｍＡｂ濃度、ｙ軸は細胞の％成長である）。
【図１０】図１０は、１６Ｄ１０または対照ＩｇＭ抗体のどちらかの抗体の濃度増加、および抗体１６Ｄ１０なしまたはありの様々な濃度のメチル−ｂ−シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）によるＳＯＪ−６膵臓腫瘍細胞の処理を伴うＭＴＴアッセイの結果を示す。ＭＢＣＤは１６Ｄ１０と組み合わせて使用すると、抗体１６Ｄ１０の細胞成長阻害活性を低下させまたは無効にする。このデータは、アポトーシス細胞死を刺激するｍＡｂ  １６Ｄ１０の能力が、膜脂質ラフトミクロドメイン中の１６Ｄ１０抗原の局在性に依存することを示唆する。
【図１１】図１１：ｍＡｂ  １６Ｄ１０はＧ１／Ｓ相において細胞周期進行を停止させ、ｐ５３、サイクリンＤ１、およびＧＳＫ−３βの発現を制御する。等量の細胞溶解産物（５０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに装填し、ニトロセルロースに転写して、ｍＡｂ  １６Ｄ１０による処理後、特異的抗体（ｐ５３、サイクリンＤ１、ホスホ−ＧＳＫ−３β、およびＧＳＫ−３β）でプローブした。内部対照としてβ−アクチンを使用した。各実験は三連で実施した。
【図１２】図１２：膜ラフト構造の解体は、ｍＡｂ  １６Ｄ１０の効果を低下させる。ＳＯＪ−６細胞を８０００細胞／ウェルで接種して、一晩成育させた。培地を６時間にわたり、メチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）またはフィリピン（Ａ）またはスフィンゴ糖脂質生合成の代謝阻害剤（Ｂ）を含有する新鮮な培地によって置換し、次に抗体と共に含有される不活性化ＦＢＳがある新鮮な培地によって置換した。細胞生存度をＭＴＴアッセイによって判定した。結果を３つの独立した実験の平均±ＳＤで表す。
【図１３】図１３：ＳＯＪ−６およびＰＡＮＣ−１細胞中のＥ−カドヘリン／β−カテニン複合体に対するｍＡｂ  １６Ｄ１０処理の効果。ＳＯＪ−６細胞を２５μｇ／ｍｌのｍＡｂ  １６Ｄ１０ありまたはなしで２４時間にわたり処理した。等量の細胞溶解産物（５０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに転写して、特異的抗体（抗ホスホ−β−カテニン、抗β−カテニン、抗Ｅ−カドヘリン、および抗β−アクチン）でプローブした。
【図１４】図１４は、抗体１６Ｄ１０がＳＯＪ−６細胞上に見られる抗原に結合することが判明したことを実証するフローサイトメトリーの結果を示す。ｘ軸は蛍光強度を示し、ｙ軸はカウントを示す。
【図１５】図１５は、抗体１６Ｄ１０がＰＡＮＣ−１細胞上に見られる抗原に結合しなかったことを実証するフローサイトメトリーの結果を示す。ｘ軸は蛍光強度を示し、ｙ軸はカウントを示す。
【図１６】図１６は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中における二価の１６Ｄ１０キメラ抗体生成で使用されるストラテジーを示す。
【図１７】図１７は、ＶＨ、ＣＨ１、ＩｇＧ１−Ｆｃ、およびＶＬおよびＣｋ配列を表示する、１６Ｄ１０  ＶＨおよびＶＬクローニングストラテジーを示す。
【図１８】図１８は、ＳＯＪ−６細胞増殖に対する１６Ｄ１０およびＲｅｃ１６Ｄ１０処理の効果を示す。
【図１９】図１９は、Ｒｅｃ１６Ｄ１０介在ＮＫ細胞活性化を試験するのに使用されるストラテジーを示す。
【図２０】図２０は、Ｒｅｃ１６Ｄ１０によるＮＫ細胞に対するＣＤ１０７動員の誘導を示す。
【図２１】図２１は、Ｒｅｃ１６Ｄ１０によるＮＫ細胞に対するＩＦＮ−γ分泌の誘導を示す。
【図２２】図２２は、Ｒｅｃ１６Ｄ１０とその他の抗体を使用した組織交差反応研究の結果を示す。
【図２３】図２３は、ネキシンＶおよびＶ／ＰＩ染色により観察される、組み換えキメラＩｇＧ１  １６Ｄ１０抗体によって誘導されるＳＯＪ−６細胞のアポトーシスを示す。細胞はそれだけでは低いまたは皆無のアポトーシスを被り、ツニカマイシン、ＩｇＭ抗体１６Ｄ１０、およびＩｇＧ１抗体１６Ｄ１０のそれぞれは顕著なレベルのアポトーシスを誘導する。
【図２４】図２４は、ＶＨ−１６Ｄ１０−ＨｕＩｇＧ１およびＶＬ１６Ｄ１０−ＨｕＩｇＬカッパの配列をそれぞれ示す。ＣＤＲ１、２、および３は、各配列について太字で示す。可変部配列は各配列について下線で示し、残りの配列はそれぞれヒトＩｇＧ１およびカッパタイプの定常部配列に相当する。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
定義
本明細書で用いられるように、以下の用語は、特に断りのない限り、それらに与えられた意味を有する。
【００５４】
「抗体」という用語は、本明細書で用いられるように、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体をいう。重鎖中の定常ドメインのタイプ次第で、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要クラスの１つに配される。これらのいくつかは、さらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのサブクラスまたはアイソタイプに分割される。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含んでなる。各四量体は２つの同一ペアのポリペプチド鎖から構成され、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。したがって、四量体、例えば、ＩｇＧ四量体は、２つの抗原認識部位を有するので「二価」である。このような二価の四量体、特にＩｇＧ四量体は、（抗体がＦｃ末端を含み、それによりＦｃ受容体に結合できさえすれば）抗増殖／アポトーシス促進活性の両方を有して、標的細胞のＡＤＣＣを誘導できるので本発明において好ましい。各鎖のＮ末端は、主として抗原認識の役割を担う、アミノ酸約１００〜１１０個またはそれ以上の可変部を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖をいう。異なるクラスの免疫グロブリンに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ「α」、「δ」、「ε」、「γ」、および「μ」と称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置についてはよく知られている。ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは本発明で用いられる好ましいクラスの抗体であり、ＩｇＧが生理学的状況において最も一般的な抗体であり、実験室環境で最も容易に作製されることからＩｇＧが特に好ましい。さらに、ＩｇＭ抗体などの多量体抗体は、ＩｇＧ四量体などの四量体形態よりも迅速に内部移行されることが知見されており、それにより腫瘍細胞の（ＡＤＣＣを介した）免疫細胞介在性の標的化を誘導する効果が弱い。ＩｇＧ四量体はより特異的でもあり、すなわち多量体ＩｇＭ抗体よりも非特異結合が少ない。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。特に好ましいのは、ヒト化、キメラ、ヒト抗体、あるいはヒトに適する抗体である。「抗体」はまた、本明細書で述べられている抗体のいずれの断片または誘導体を含む。
【００５５】
「特異的に結合する」という用語は、組み換え形態のタンパク質、その中のエピトープ、または関連する標的細胞（例えば、腫瘍細胞、ＳＯＪ−６細胞など）の表面に存在する天然タンパク質のいずれかを用いて評価されるごとく、抗原結合化合物または抗体が、好ましくは、競合的結合アッセイにおいて、結合パートナー、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドと結合できることを意味する。特異的な結合を判定するための競合的結合アッセイおよびその他の方法については、以下でさらに詳しく述べられ、当該技術分野でよく知られている。
【００５６】
「ヒトに適する」抗体とは、例えば、本明細書で述べられる治療方法のために、ヒトにおいて安全に使用できる、いずれの抗体、誘導体化抗体、または抗体断片をいう。ヒトに適する抗体としては、全てのタイプのヒト化、キメラ、または完全ヒト抗体と、あるいは、少なくとも抗体の一部がヒトに由来するか、または天然の非ヒト抗体が使用される場合に一般に誘導される免疫応答を回避するように改変されたいずれかの抗体とが挙げられる。
【００５７】
「毒性」または「細胞毒性」ペプチドまたは小分子は、細胞増殖を減速、停止、または逆転でき、あらゆる検出可能な様式でそれらの活性を低下させることができ、または直接または間接的にそれらを傷害するいずれの化合物を包含する。好ましくは、毒性または細胞毒性化合物は、細胞を直接傷害することにより、アポトーシスを誘導することにより、または別の方法により作用する。本明細書で用いられるように、毒性「ペプチド」は、非天然アミノ酸または修飾結合を有するペプチド−またはポリペプチド−誘導体を含む、あらゆるペプチド、ポリペプチド、またはそれらの誘導体が挙げられる。毒性「小分子」としては、好ましくは１０ｋＤ、５ｋＤ、１ｋＤ、７５０Ｄ、６００Ｄ、５００Ｄ、４００Ｄ、３００Ｄ、またはより小さなサイズのあらゆる毒性化合物またはエレメントが挙げられる。
【００５８】
「免疫原性断片」とは、本明細書では、（ｉ）膜結合受容体およびそれに由来する変異体をはじめとする、前記断片に結合する抗体、および／または前記断片を含んでなるあらゆる形態の分子に結合する抗体の作成、（ｉｉ）ＭＨＣ分子と前記断片に由来するペプチドとを含んでなる二分子複合体と反応するＴ細胞に関するＴ細胞応答の刺激、（ｉｉｉ）哺乳類の免疫グロブリンをコードする遺伝子を発現するバクテリオファージまたは細菌などの形質移入されたビヒクルの結合などの免疫応答を誘導できるいずれのポリペプチド断片またはペプチド断片を意味する。代替的に、免疫原性断片はまた、共有カップリングによってキャリアタンパク質に抱合されたペプチド断片、前記ペプチド断片をそのアミノ酸配列中に含んでなるキメラ組み換えポリペプチド構築物、および配列が前記断片をコードする部分を含んでなるｃＤＮＡで形質移入された細胞を含む、上で定義される免疫応答を誘導できるいずれの構築物もいう。
【００５９】
本発明のために、「ヒト化」抗体とは、１つまたはそれ以上のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が、動物免疫グロブリンの結合領域、例えば、ＣＤＲと融合される抗体をいう。かかるヒト化抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性が維持されるが、非ヒト抗体に対する免疫反応が回避されるように設計される。
【００６０】
「キメラ抗体」とは、（ａ）抗原結合部位（可変部）が、異なるまたは改変されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常部と、またはキメラ抗体、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤などに新しい特性を付与する全く異なる分子と結合するように、定常部またはその一部が改変、置換または交換されている抗体分子、または（ｂ）可変部またはその一部が、異なるまたは改変された抗原特異性を有する可変部で改変、置換または交換されている抗体分子である。
【００６１】
「ヒト」抗体とは、抗原投与に応じて特定のヒト抗体を産生するように「改変された」遺伝子導入マウスまたはその他の動物から得られる抗体である（例えば、出典明示により全体を本明細書に援用するGreen et al. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856；Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579を参照のこと）。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体のトランスフェクション法、ならびにファージディスプレイ技術によっても構築でき、それらは全て当該技術分野で知られている（例えばMcCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553を参照のこと）。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞によっても作り出される（例えば、出典明示により全体を本明細書に援用するU. S. Pat. Nos. 5,567,610および5,229,275を参照のこと）。
【００６２】
「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態に見出されるように、通常、それに付随する構成要素を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。純度および均質性は、典型的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して調べられる。調製物中に存在する主な化学種であるタンパク質が実質的に精製される。
【００６３】
「生物学的サンプル」という用語は、本明細書で用いられるように、生物学的な液体（例えば、血清、リンパ液、血液）、細胞サンプルまたは組織サンプル（例えば、骨髄または膵臓生検）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーをいう。前記用語は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工化学模倣剤であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。
【００６５】
「組み換え」という用語は、例えば細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関連して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種の核酸またはタンパク質の導入または天然核酸またはタンパク質の改変によって修飾されていること、または細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。それゆえ、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）形態内では見出されない遺伝子を発現し、または異常に発現され、過小発現され、または全く発現されない天然遺伝子を発現する。
【００６６】
抗原結合化合物を生成する一般法
「抗原結合化合物」という用語は、その他の化合物よりも高い親和性で、および／または非ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを超える特異性または選択性で、抗原、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチド（または本明細書で定義されるような糖鎖変異体（ｇｌｙｃｏｖａｒｉａｎｔ）またはその他の変異体またはその誘導体）に特異的に結合する分子、好ましくはタンパク様分子をいう。抗原結合化合物は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドと優先的に結合する、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または小分子量化合物であってもよい。好ましい実施態様では、本発明による特異的な結合薬剤は、単独で、または公知技術により供されるその他のアミノ酸配列と組み合わせた、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、多特異性抗体、二重特異性抗体、触媒抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、「裸」抗体、ならびにそれらの断片、変異型または誘導体である。
【００６７】
ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する抗原結合化合物は、いずれかの適切な方法を使用して得ることができる。ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに対するそれらの結合は、一般に、アポトーシスを誘導するか、または細胞増殖を阻害するそれらの能力（例えば、直接的な細胞傷害、アポトーシス調節経路を介したシグナル伝達、核断片化、細胞増殖の阻害、細胞周期の阻害）を評価する前に試験されるが、試験は、例えば、アッセイおよび関連する抗原結合化合物の性質による都合に応じて、あらゆる適切な順序で実施できるものと理解される。本発明の化合物は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ結合活性について、またはアポトーシス促進または抗細胞増殖活性について、あらゆる適切な手段を用いて、例えば、多数の分子をスクリーンするハイスループットスクリーニングを用いて、同定することができる。代案としては、例えば、所望の特性を有する既知の化合物に関連する化合物の小数のグループまたはその誘導体などのより少数の分子または個々の分子でさえも調製して試験できる。
【００６８】
化合物の活性試験
抗原結合化合物が得られると、一般に、標的細胞と反応し、その活性に影響し、および／またはそのアポトーシスを誘導し、またはその増殖を阻害するその能力について、評価する。抗原結合化合物が標的細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害する能力を評価することは、方法のあらゆる適切な段階で実施でき、実施例が本明細書で提供される。このアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害する能力の評価は、治療に使用するための抗体（またはその他の化合物）の同定、生成および／または開発に関わる様々な１つまたはそれ以上の工程において有用でありうる。例えば、アポトーシス促進または抗細胞成長／増殖の活性は、候補の抗原結合化合物を同定するスクリーニング法の中で評価されてもよく、あるいは、抗原結合化合物が選択され、ヒトに適するようにし（例えば、抗体の場合、キメラまたはヒト化する）、抗原結合化合物を発現する細胞（例えば、組み換え抗原結合化合物を発現する宿主細胞）が得られ、機能的な抗体（またはその他の化合物）を産生するその能力について評価し、および／または多量の抗原結合化合物が生成され、（例えば、製品のバッチまたはロットを試験するための）活性について評価する方法において評価されてもよい。一般に、抗原結合化合物は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合することが知られている。工程は、アポトーシス促進または抗細胞増殖活性について、複数の（例えば、ハイスループットスクリーニング法に用いる極めて多数またはより少数の）抗原結合化合物を試験し、または（例えば、ＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰポリペプチドに結合する単一抗体が提供される場合、）単一化合物を試験する工程を含んでもよい。
【００６９】
それゆえ、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドへの結合に加えて、標的細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害する抗原結合化合物の能力が評価されうる。一実施態様では、ＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞は、プレート、例えば、９６ウェルプレート内に取り込まれ、様々な量の適当な化合物（例えば、抗体）に曝される。生体用色素、すなわち、アラマーブルー（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ）（米国、カリフォルニア州、カマリロのバイオソース・インターナショナル（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））のごとき無傷細胞によって取り込まれる色素を添加し、洗浄して過剰な色素を除去することにより、光学濃度によって生存細胞数を測定できる（より多くの細胞が抗体により傷害されるか、または阻害されると、光学濃度がより低下する）。（例えば、出典明示により全体を本明細書に援用するConnolly et al. (2001) J Pharm Exp Ther 298:25-33を参照のこと）。別の例は、核断片化を検出する染色の使用であり、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）がＤＮＡに結合するのに用いられてもよく、次いで蛍光を検出することにより断片化を可視化できる。細胞増殖または成長を測定するために、細胞数または密度を判定する、分裂指数を判定するなどのいずれの適切な方法、または細胞周期中の細胞数またはそれらの局在を判定するいずれのその他の方法が使用できる。細胞増殖または生存を測定するアッセイ、または細胞活性を検出するアッセイなどのいずれのその他の適切なインビトロアポトーシスアッセイが等しく使用でき、例えば、標的細胞を含有するマウスなどの動物モデルに抗体を投与して、標的細胞の生存または活性に対する抗体投与の効果を経時的に検出するなどの生体内アッセイについても同様である。
【００７０】
抗原結合化合物がアポトーシス促進活性を有するかどうかを判定するのに使用できるアッセイとしては、細胞性アポトーシス機構の構成要素に対する化合物の効果を判定するアッセイもまた挙げられる。例えば、本明細書の実施例で提供されるように、アポトーシスに関与するタンパク質の増加または減少を検出するアッセイが使用できる。一例では、細胞（例えば、ＳＯＪ−６細胞またはその他のＢＤＳＬおよび／またはＦＡＰＰ−発現細胞）が抗原結合化合物に曝され、例えば、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーメンバー（例えばＢｃｌ−２、Ｂａｘ、Ｂａｃ、Ｂａｄなど）、またはカスパーゼ（例えば、カスパーゼ３、７、８および／または９）などのアポトーシス促進および／または抗アポトーシスタンパク質のレベルまたは活性が測定される。１６Ｄ１０抗原を発現しない細胞（例えば、ＰＡＮＣ−１細胞）は、場合により対照として使用できる。インビトロまたはインビボで腫瘍の増殖を検出可能な程度に停止させ、または逆転できるか、または腫瘍細胞を傷害し、またはその増殖を停止できる、いずれの抗原結合化合物、好ましくは、ヒトに適切な抗体が本方法で用いられうる。好ましくは、抗原結合化合物は、増殖を傷害し、または停止でき（例えば、インビトロまたはインビボで標的細胞数の増加を妨げる）、最も好ましくは、抗原結合化合物は、このような標的細胞の死を誘導し、このような細胞の総数の低下をもたらすことができる。特定の実施態様では、抗体は、標的細胞数または標的細胞増殖を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％低下させることができる。標的細胞は、例えばＢＤＳＬまたはＦＡＰＰ−発現細胞、１６Ｄ１０によって認識されるＢＤＳＬまたはＦＡＰＰエピトープを発現する癌細胞、膵臓癌細胞、および／またはＳＯＪ−６細胞であってもよい。
【００７１】
したがって、好ましい一実施態様では、本発明は、膵臓癌などのＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチド発現増殖性障害の治療で使用するのに適する抗原結合化合物を生成する方法であって、ａ）ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する複数の抗原結合化合物を提供する工程と、ｂ）抗原結合化合物が結合して相当数の標的細胞のアポトーシスを直接誘導し、または増殖を阻害する能力を試験する工程と、ｃ）標的細胞のアポトーシスを直接誘導し、または増殖を阻害できる前記複数の抗原結合化合物から、抗原結合化合物を選択および／または生成する工程を含んでなる方法を提供する。本方法のいずれにおいても、「相当数」は、例えば、細胞の３０％、４０％、５０％、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％以上の百分率を意味できる。
【００７２】
抗原結合化合物が得られれば、一般に、ＡＤＣＣを誘導する能力について評価される。抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を試験する工程は、典型的に、結合する抗ＦＡＰＰ／ＢＳＤＬ抗体を有するＦＡＰＰ／ＢＳＤＬ発現標的細胞（例えば、ＳＯＪ−６細胞またはその他のＢＤＳＬまたはＦＡＰＰ−発現細胞）が、Ｆｃ受容体を保有するエフェクター細胞によって認識され、後に補体の関与を必要とせずに溶解される細胞介在細胞毒性反応を評価する工程に関する。１６Ｄ１０抗原を発現しない細胞（例えば、ＰＡＮＣ−１細胞）は、場合により対照として使用できる。典型的なＡＤＣＣアッセイは、本明細書の実施例セクションに記載される。ＡＤＣＣを誘導する能力は、抗原結合化合物が標的細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害する能力を有するかどうかについて試験しても試験しなくとも試験することができる。抗原結合化合物が、（ａ）ＡＤＣＣを誘導し、（ｂ）標的細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害するその能力の両方について試験される場合、（ａ）および（ｂ）のアッセイはいずれの順序で実施できる。
【００７３】
一の好ましい実施態様では、本発明は、膵臓癌などのＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチド発現増殖性障害の治療で使用するのに適する、抗原結合化合物を生成する方法であって、ａ）ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する複数の抗原結合化合物を提供する工程と、ｂ）抗原結合化合物が結合して相当数の標的細胞のＡＤＣＣを誘導する能力を試験する工程と、ｃ）前記複数抗原結合化合物から標的細胞のＡＤＣＣを直接誘導できる抗原結合化合物を選択および／または生成する工程を含んでなる方法を提供する。本方法のいずれにおいても、「相当数」は、例えば、細胞の３０％、４０％、５０％、好ましくは、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の百分率を意味できる。
【００７４】
抗体またはその他の本発明の化合物はまた、典型的に、単にＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ抗原に対するそれらの特異性に関して評価されるだけでなく、癌細胞、例えば、膵臓癌細胞に対するそれらの特異性についても評価される。一般的な方法を用いて、動物におけるインビボ法（例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕ免疫染色法）および単離された細胞または細胞系を使用するインビトロ法（例えば、ウエスタンブロッティング）を含む、異なる細胞または組織中において化合物または抗体の交差反応性を試験することができる。好ましい実施態様では、本発明の抗体は、扁桃、唾液腺、末梢神経、リンパ節、眼、骨髄、卵巣、卵管、副甲状腺、前立腺、脾臓、腎臓、副腎、精巣、胸腺、尿管、子宮、および膀胱からなる群から選択される非腫瘍組織と交差反応しない。
【００７５】
ＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰポリペプチドの生成
本明細書で述べられるように、特定の実施態様では、抗原結合化合物を得る工程（例えば、マウスの免疫化）および／または抗原結合化合物を評価する（例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドとの結合を評価する）工程は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドの使用に関していてもよい。ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドは、当該技術分野で知られているいずれの適切な様式で調製できる。ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドおよびそれらを調製する例示的な方法は、例えば、出典明示により全体を本明細書に援用するWO2005/095594において提供される。ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドは、全長ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドまたはその一部であってもよい。ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドは、場合により、第２のポリペプチド、タグ、ポリマー、またはいずれのその他の適切な分子を含むが、これらに限らない別のエレメントに連結されていてもよい。ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドは、一般にグリコペプチドである。一例では、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドは、正常な膵臓の分泌物中に存在する消化脂肪分解酵素であるＢＳＤＬの反復Ｃ末端配列を含んでなり、またはそれに由来する、グリコペプチドを含んでなり、またはそれからなる。別の例では、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドは、膵臓の病変の特異的マーカーであるＦＡＰＰ（ＢＳＤＬの癌胎児性形態）の反復Ｃ末端配列を含んでなり、またはそれに由来する、グリコペプチドを含んでなり、またはそれからなる。特定の実施態様では、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドは、配列Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  ＶａＩ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒを有するアミノ酸７個の一般に不変の部分とグリコシル化部位とを含んでなる、アミノ酸１１個の反復Ｃ末端ペプチド配列を含んでなる。前記一般に不変の部分は、グルタミン酸によって頻繁に置換されるグリシンがいずれかの側に位置し、アミノ酸ＡｓｐおよびＳｅｒをＮ末端側に含有する。WO2005/095594に示されるように、グリコペプチド構造を有するこのようなポリペプチドは、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来する宿主細胞による発現および分泌によって調製でき、Ｃ末端ペプチドの１つまたはそれ以上の反復配列をコードするＤＮＡ分子を含む遺伝子構築物、特に、ＢＳＤＬの組み換え体、例えば、１６反復配列の全部または一部を含んでなり、また、グリコシル基転移酵素活性を有する少なくとも１つの酵素をコードするＤＮＡ分子などの遺伝子構築物、特にＣｏｒｅ  ２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニル基転移酵素、α（１−３）およびα（１−４）フコシル基転移酵素活性を有するフコシル基転移酵素ＦＵＴ３、またはα（１−３）フコシル基転移酵素活性のみを有するフコシル基転移酵素ＦＵＴ７からなる群から選択され、前記膵臓癌の特異的マーカーを構成するものを含んでなる。一例では、WO2005/095594は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰのアミノ酸１１個から構成される１〜４０の反復Ｃ末端ポリペプチドを含んでなる、好ましくは組み換えされ、場合により単離され、または精製されたグリコペプチドを提供し、前記ポリペプチドがグリコシル化され、グリコシル化されたエピトープを保有し、場合によりタイプＩ糖尿病にかかっ��いる患者において、誘導された抗体との特異的免疫学的反応を引き起こし、ヒトまたは動物の生物学的な液体から精製され、または組み換えられるかのいずれかである。組み換えポリペプチドは、グリコシル化を開始するのに必要とされる酵素機構を含んでなる従来の宿主細胞における発現によって生成でき、前記宿主細胞は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子と、グリコシル基転移酵素から、特にＣｏｒｅ  ２β（１−６）Ｎ−アセチルグルコサミニル基転移酵素（Ｃ２ＧｎＴと略記される）、α（１−３）ガラクトシル基転移酵素、フコシル基転移酵素３（ＦＵＴ３と略記される）、およびフコシル基転移酵素７（ＦＵＴ７と略記される）から選択される１つ以上の酵素をコードする遺伝子とを含んでなるように遺伝学的に改変される。
【００７６】
ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体の生成
本発明は、ヒトで使用するのに適し、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを標的とする、抗体、抗体断片、または抗体誘導体の生成、同定および／または使用に関する。本発明の抗体は、当該技術分野で知られている多様な技術のいずれかによって生成されてもよい。典型的に、それらはＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを含んでなる免疫原を用いて、非ヒト動物、好ましくはマウスの免疫化によって生成される。ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドは、細胞全体または細胞膜、単離されたＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチド、またはＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドの断片または誘導体、典型的には免疫原性断片、すなわち、ポリペプチド発現細胞の表面に露出したエピトープを含んでなるポリペプチドの一部を含んでなってもよい。このような断片は、典型的に、成熟ポリペプチド配列の少なくとも７個の連続アミノ酸、なおより好ましくは、その少なくとも１０個の連続アミノ酸を含有する。いずれのまたは全ての患者において、腫瘍細胞表面の全てのまたは一部分に時折または常に存在するいずれのその他のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰタンパク質が、抗体の作成に使用できるものと理解される。一例では、免疫原は、ＳＯＪ−６細胞である。好ましい実施態様では、抗体を生じさせるのに使用されるＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドは、ヒトグリコペプチドである。
【００７７】
本抗体は、全長の抗体または抗体断片または誘導体でありうる。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体；単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；重鎖部分を伴わずに、軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する、１つの軽鎖可変領域のみを含有する単一鎖ポリペプチドまたはその断片；軽鎖部分を伴わずに、重鎖可変部の３つのＣＤＲを含有する、１つの重鎖可変部のみを含有する単一鎖ポリペプチドまたはその断片；抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。このような断片および誘導体、およびそれらを調製する方法については当該技術分野でよく知られている。例えば、ペプシンを使用してヒンジ領域中のジスルフィド結合より下の抗体を消化し、それ自体はジスルフィド結合でＶＨ−ＣＨＩに連結する軽鎖であるＦａｂ二量体のＦ（ａｂ）’２を生成できる。Ｆ（ａｂ）’２を穏やかな条件下で還元してヒンジ領域中のジスルフィド結合を切断し，それによりＦ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’モノマーに変換してもよい。Ｆａｂ’単量体は、本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993)参照）。様々な抗体断片が、無傷の抗体の消化の観点から定義されるが、当業者は、このような断片が、化学的か、または組み換えＤＮＡ技術のいずれかを用いて新規に合成されうることを理解する。
【００７８】
好ましい実施態様では、本発明の抗体は、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１抗体であり、四量体（二価）である。このような二価のＩｇＧ抗体は、調製および使用が比較的簡単であり、様々な特性を兼ね備えてＢＳＤＬ／ＦＡＰＰ発現腫瘍細胞を最大限標的とすることが可能であることからそれらが好ましい。特に、それらは、ＢＳＤＬ／ＦＡＰＰ発現腫瘍細胞に対して十分な結合親和力を有する（例えば、一価の形態よりも優れており、一般に、ナノモル濃度レベル、例えば、１０〜１ナノモル濃度の結合親和性を有する）ため、それらは、効果的に細胞のアポトーシスを誘導できるか、または増殖を阻害できる。さらに、それらはＦｃ末端を含有するため、（ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞を直接標的とする能力のためにこの特徴はそれらの有効性のためには必須でないものと理解されるが）標的細胞の免疫細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を効果的に誘導できる。さらに、（多量体、例えばＩｇＭの形態と対照的に）二価の抗ＦＡＰＰ／ＢＳＤＬ  ＩｇＧ抗体は、標的細胞によって実質的に内部移行され、それらのＡＤＣＣ介在特性を高めることはない。したがって、本発明の二価の抗ＢＳＤＬ／ＦＡＰＰ抗体は、これらの所望の特徴の全てを効果的に桑見合わせると、それらは、（ＢＳＤＬ／ＦＡＰＰ発現標的細胞を傷害するなお別のメカニズムを導入するであろうかかる改変形態も用いられ、本発明の範囲内であるが）「裸」、すなわち、細胞毒性ペプチドまたは放射性同位体などの付着部分なしに使用できる。
【００７９】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製については、当該技術分野でよく知られており、多数の利用できる技術のいずれでも使用できる（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)を参照のこと）。単一鎖抗体を生成する技術（U.S. Pat. No. 4,946,778）は、所望のポリペプチド、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに対する抗体を生成するのに用いられうる。また、トランスジェニックマウス、またはその他の哺乳類などのその他の生物を使用して、ヒト化、キメラ、または同様に修飾された抗体が発現されてもよい。代案としては、ファージディスプレイ技術を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂ断片を同定できる（例えば，McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)を参照）。一実施態様では、方法は、ライブラリーまたはレパートリーから、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドと交差反応するモノクローナル抗体あるいはその断片または誘導体を選択する工程を含んでなる。例えば、レパートリーは、場合により、いずれの適する構造物（例えば、ファージ、細菌、合成複合体）により提示される、抗体またはその断片のいずれの（組み換え）レパートリーであってもよい。
【００８０】
抗原を用いて非ヒト哺乳類を免疫する工程は、当該技術分野でよく知られているいずれの様式で実施されてもよい（例えば、E. Harlowand D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照のこと）。一般に、免疫原は、緩衝液中に、場合により、完全フロイントアジュバントなどのアジュバントと共に、懸濁または溶解される。免疫原の量、緩衝液のタイプ、およびアジュバントの量を判定する方法は、当業者によく知られており、本発明ではどのようにも制限されない。
【００８１】
同様に、抗体の生成を刺激するのに十分な免疫化の位置および頻度についてもまた、当該技術分野でよく知られている。典型的な免疫化プロトコールでは、非ヒト動物に、１日目および約１週間後に抗原を腹腔内注射する。これに、２０日目前後に、場合により不完全なフロイントアジュバントなどのアジュバントと共に、抗原の復活注射（ｒｅｃａｌｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）が続く。復活注射（ｒｅｃａｌｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）は静脈内で実施され、連続して数日間繰り返してもよい。これに、４０日目に、典型的には、アジュバントなしで、静脈内または腹腔内のいずれかのさらなる免疫注射が続く。このプロトコールは、約４０日後に、抗原特異的抗体産生Ｂ細胞の生成をもたらす。免疫化で使用された抗原に対する抗体を発現するＢ細胞の生成を生じさえすれば、その他のプロトコールが利用されてもよい。
【００８２】
別の実施態様では、免疫されていない非ヒト哺乳類からリンパ球が単離され、インビトロで増殖され、次いで細胞培養で免疫原に曝される。次に、リンパ球が収集され、下記の融合工程が実施される。
【００８３】
本発明のために好ましいモノクローナル抗体においては、次の工程は、免疫された非ヒト哺乳類から細胞、例えばリンパ球、脾細胞、またはＢ細胞を単離する工程と、次いで、抗体産生ハイブリドーマを形成するために、これらの脾細胞、またはＢ細胞、またはリンパ球を不死化細胞と融合させる工程である。したがって、「免疫された動物から抗体を調製する」という用語は、本明細書で用いられるように、免疫された動物からＢ細胞／脾細胞／リンパ球を得ること、これらの細胞を使用して抗体を発現するハイブリドーマを生成すること、ならびに免疫された動物の血清から抗体を直接得ることを含む。例えば、非ヒト哺乳類からの脾細胞の単離は、当該技術分野でよく知られており、例えば、麻酔された非ヒト哺乳類から脾臓を取り出し、それを小片に切断し、脾膜から脾細胞を圧搾して細胞ストレーナーのナイロンメッシュを通して適切な緩衝液に単細胞懸濁液を生じるように入れることに関する。細胞が緩衝液で洗浄され、遠心分離され、次いで再懸濁されていずれの赤血球に溶解される。溶液が再度遠心分離され、ペレット中に残ったリンパ球が最終的に新鮮な緩衝液に再懸濁される。
【００８４】
単離され、単一細胞懸濁液中に存在すると、抗体産生細胞は不死細胞系と融合される。これは、ハイブリドーマの作製に有用な多数のその他の不死細胞系が当該技術分野で知られているが、典型的にはマウス骨髄腫細胞系である。好ましいマウスの骨髄腫系統としては、米国カリフォルニア州サンディエゴのソーク研究所細胞配布センター（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．Ｕ．Ｓ．Ａ．））から入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、および米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ａ．）の米国微生物系統保存機関から入手できるＸ６３  Ａｇ８６５３、およびＳＰ−２細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。融合は、ポリエチレングリコールなどを使用して達成される。次に、得られたハイブリドーマは、融合しなかった親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つまたはそれ以上の物質を含有する選択培地で培養される。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシル基転移酵素（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠乏する場合、ハイブリドーマのための培地は、典型的に、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げる物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含む。
【００８５】
ハイブリドーマは、マクロファージの支持細胞層上で増殖されうる。マクロファージは、好ましくは、脾細胞を単離するのに使用された非ヒト哺乳類の同腹子からのものであり、典型的には、ハイブリドーマの播種の数日前に不完全フロイントアジュバントなどを用いて予備刺激される。融合方法については、例えば、出典明示により本明細書に援用する（Goding, “Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,” pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）で述べられている。
【００８６】
細胞は、コロニー形成および抗体産生のために十分な時間選択培地中で増殖させられる。これは、通常７〜１４日間である。次に、ハイブリドーマのコロニーは、所望の基質、例えば、ＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰポリペプチドを特異的に認識する抗体産生についてアッセイされる。アッセイは、典型的には、比色分析ＥＬＩＳＡ−タイプのアッセイであるが、ハイブリドーマが増殖されるウェルに適応できるいずれのアッセイを用いてもよい。
【００８７】
その他のアッセイとしては、免疫沈降法および放射免疫測定法が挙げられる。所望の抗体産生について陽性のウェルは、１個またそれ以上の異なるコロニーが存在するかどうかを判定するために検査される。１個よりも多いコロニーが存在する場合、細胞を再度クローン化されて増殖され、１個の細胞のみが所望の抗体を産生するコロニーを生じることを確実にされてもよい。単一の明らかなコロニーを有する陽性のウェルは、典型的には、再度クローン化され、再度アッセイされることにより、１個のモノクローナル抗体のみが検出され、生成されることが確実にされる。
【００８８】
次に、アポトーシスを誘導できるか細胞周期を阻害できる抗体産生について、ハイブリドーマまたはハイブリドーマコロニーがアッセイされうる。このアッセイは、一般に、抗体が得られ、インビトロアッセイで評価することができれば、工程のあらゆる段階で実施されうる。しかし、最も好ましくは、ＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰポリペプチドを特異的に認識する抗体が同定されると、それは、細胞（例えば、腫瘍細胞、ＳＯＪ−６細胞、その表面にＢＳＤＬおよび／またはＦＡＰＰポリペプチドを発現するいずれの細胞など）のアポトーシスを誘導するか、または成長または増殖を阻害する能力について試験できる。抗体はまた、（例えば、ＮＫ細胞活性化による；実施例参照）ＡＤＣＣを誘導するそれらの能力についても試験できる。
【００８９】
次に、本発明のモノクローナル抗体を産生することが確認されるハイブリドーマは、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０などの適切な培地中で大量に成育される。代案としては、ハイブリドーマ細胞は、動物内の腹水腫瘍としてインビボで増殖されうる。
【００９０】
所望のモノクローナル抗体を産生するのに十分な増殖後、モノクローナル抗体を含有する増殖培地（または腹水）が分離され、その中に存在するモノクローナル抗体が精製される。精製は、典型的には、ゲル電気泳動法、透析、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ−セファロースまたはアガロースまたはセファロースビーズなどの固体担体に結合している抗マウスＩｇを使用したクロマトグラフィーによって達成される（例えば、出典明示により本明細書に援用するAntibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, publication No. 18-1037-46, Edition ACで全て述べられている）。結合した抗体は、典型的には、低ｐＨ緩衝液（ｐＨ３．０以下のグリシンまたは酢酸緩衝液）を使用してタンパク質Ａ／タンパク質Ｇカラムから溶出され、抗体含有画分が即時に中和される。これらの画分をプールして透析し、必要に応じて濃縮する。
【００９１】
好ましい実施態様では、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチド上に存在する決定因子と結合する抗体をコードするＤＮＡがハイブリドーマから単離され、適切な宿主中への形質移入に適切な発現ベクター中に組み込まれる。次に、宿主は、抗体、その変異型、その活性断片、あるいは抗体の抗原認識部分を含んでなるヒト化またはキメラ抗体の組み換え生産のために用いられる。特定の実施態様に応じて、宿主細胞によって産生される抗体は、場合により、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害する、またはＮＫ細胞および（ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現）標的細胞の存在下でＡＤＣＣを誘導する（例えばＮＫ細胞活性化）それらの能力について評価できる。
【００９２】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは容易に単離でき、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）配列決定される。単離されると、ＤＮＡを発現ベクター中に組み込むことができ、次に、それをさもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞に形質移入して、組み換え宿主細胞中においてモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡの細菌中における組み換え発現は当該技術分野でよく知られている（例えば、Skerra et al. (1993) Curr. Op. Immunol. 5:256;およびPluckthun (1992) Immunol. Revs. 130:151を参照のこと）。抗体はまた、例えば、Ward et al. (1989) Nature 341:544で開示されるごとく、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択によって生成されてもよい。
【００９３】
特定の実施態様では、抗体は本質的にモノクローナル抗体１６Ｄ１０と同一のエピトープまたは決定因子に結合する（例えば、その開示全体を参照によって本明細書に援用するWO2005/095594を参照のこと）。ＩｇＭ抗体１６Ｄ１０を産生する細胞は、２００４年３月１６日にパリの国立培養微生物コレクション（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ））に番号Ｉ−３１８８の下に寄託された。特定の実施態様では、抗体は１６Ｄ１０以外の抗体である。
【００９４】
モノクローナル抗体ｘ「と実質的に同一のエピトープまたは決定因子に結合する」という用語は、抗体がｘと「競合できる」ことを意味し、ｘは１６Ｄ１０などである。そのモノクローナル抗体と実質的に同一のエピトープと結合する１つまたはそれ以上の抗体の同定は、抗体競合を評価できる様々な免疫学的スクリーニングアッセイのいずれか１つを使用して容易に判定できる。このようなアッセイは当該技術分野で通常である（例えば、参照によって本明細書に援用するU.S. Pat. No. 5,660,827を参照されたい）。抗体が結合するエピトープを実際に特定することは、そのモノクローナル抗体と同一のまたは実質的に同一のエピトープに結合する抗体を同定するのに、決して必須ではないものと理解される。
【００９５】
例えば、調べられる試験抗体が異なる起源の動物から得られる場合、または異なるＩｇアイソタイプである場合でさえ、単純競合アッセイが用いられてもよく、このアッセイにおいて、対照（例えば、１６Ｄ１０）および試験抗体が予備混合（または予備吸着）され、エピトープ含有タンパク質を含有するサンプル、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに適用される。ＥＬＩＳＡ、放射免疫測定法、ウエスタンブロット、およびＢＩＡＣＯＲＥの使用に基づくプロトコールは、（例えば、実施例セクションで述べられるように）このような単純競合アッセイ研究で使用するのに適し、当該技術分野でよく知られている。
【００９６】
特定の実施態様では、対照抗体（例えば、１６Ｄ１０）と試験抗体の各種量（例えば１：１０または１：１００）で抗原（例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチド）含有サンプルに適用する前に一定時間予備混合する。別の実施態様では、対照と各種量の試験抗体は、抗原サンプルへの曝露中に単純に予備混合されうる。（例えば、分離または洗浄技術を用いて非結合抗体を除去することにより）結合抗体を遊離抗体から、（例えば、化学種またはアイソタイプ特異的二次抗体を使用して、または検出可能な標識を用いて対照抗体を特異的に標識して）対照抗体を試験抗体から区別できさえすれば、試験抗体が対照抗体と抗原の結合を低下させるかどうかを判定し、試験抗体が実質的に対照と同一のエピトープを認識することを示すことができるであろう。完全に無関係な抗体の不在下における（標識）対照抗体の結合は、対照の高い値を生じることになる。対照の低い値は、標識対照抗体（例えば１６Ｄ１０）を全く同じタイプの未標識抗体（例えば、１６Ｄ１０）と共にインキュベートして、競合させ、標識抗体の結合を低下させて得られる。試験アッセイでは、試験抗体の存在下における標識抗体の反応性の顕著な低下は、同一エピトープを認識する試験抗体、すなわち、標識対照抗体と「交差反応する」ものの指標である。約１：１０〜約１：１００のあらゆる対照：試験抗体比率で、標識対照と各抗原との結合を少なくとも５０％以上、好ましくは７０％低下させるあらゆる試験抗体は、対照と実質的に同一のエピトープまたは決定因子に結合する抗体であると見なされる。好ましくは、このような試験抗体は、対照と抗原との結合を少なくとも９０％低下させる。
【００９７】
一実施態様では、競合は、フローサイトメトリー試験によって評価できる。所与の活性化受容体を保有する細胞を最初に受容体に特異的に結合することが知られている対照抗体（例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞、および１６Ｄ１０抗体）と共に、次に、例えば、蛍光色素またはビオチンで標識された試験抗体と共にインキュベートする。飽和量の対照抗体と共にプレインキュベーションして得られる結合が、対照とのプレインキュベーションなしの抗体によって得られる結合（蛍光の平均値）の８０％、好ましくは、５０、４０またはそれ以下であれば、試験抗体は対照と競合するとされる。代案としては、飽和量の試験抗体と共にプレインキュベートされた細胞上で標識対照（蛍光色素またはビオチンによる）を用いて得られる結合が、抗体とのプレインキュベーションなしで得られる結合の８０％、好ましくは５０％、４０％またはそれ以下であれば、試験抗体は対照と競合するとされる。
【００９８】
好ましい一例では、例えば、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドなどの抗体の結合基質、または１６Ｄ１０によって結合されることが知られているそのエピトープ含有部分が固定化された表面に、試験抗体が予備吸着されて飽和濃度で適用される、単純な競合アッセイを用いてもよい。表面は、好ましくはビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）チップである。次に、対照抗体（例えば、１６Ｄ１０）を基質飽和濃度で表面に接触させ、基質表面と対照抗体との結合を測定する。この対照抗体の結合を、試験抗体不在下における基質含有表面と対照抗体との結合と比較する。試験アッセイでは、試験抗体存在下における対照抗体による基質含有表面の結合の顕著な低下は、同一エピトープを認識する試験抗体、すなわち対照抗体と「交差反応」するものの指標である。対照抗体と抗原含有基質との結合を少なくとも３０％またはより好ましくは４０％低下させるあらゆる試験抗体は、対照抗体と実質的に同一のエピトープまたは決定因子に結合する抗体であると見なされる。好ましくはこのような試験抗体は、対照抗体と基質との結合を少なくとも５０％低下させる。対照と試験抗体の順序は逆転でき、すなわち、最初に対照抗体を表面に結合させ、その後試験抗体を表面に接触させることができるものと理解される。第２の抗体（抗体が交差反応していると仮定して）で見られる結合の低下は、より規模が大きいことが予期されるので、好ましくは基質抗原に対してより高い親和性を有する抗体が、基質含有表面に最初に結合する。このようなアッセイのさらなる例は、その開示を参照によって本明細書に援用するSaunal et al. (1995) J. Immunol. Meth 183: 33-41の実施例で提供される。
【００９９】
ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを特異的に認識する抗体が同定されると、標準法を使用して、ＳＯＪ−６細胞系、または膵臓癌などの癌がある患者から採取されたいずれのその他の細胞などの腫瘍細胞に結合するその能力について、および同細胞のアポトーシスを誘導するか、または増殖を阻害するその能力について、それを試験できる。ＮＫ細胞を活性化し、またはＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現標的細胞のＡＤＣＣを誘導する細胞の能力についてもまた評価できる。
【０１００】
ヒトでの使用に適する抗体の生成
一般に非ヒト動物において、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドと特異的に結合できるモノクローナル抗体が得られると、抗体はヒトでの治療的用途に適するように、一般に修飾される。例えば、それらは、ヒト化、キメラ化されてもよく、または当該技術分野でよく知られている方法を使用して、ヒト抗体のライブラリーから選択されてもよい。このようなヒトに適切な抗体は、本治療法で直接使用でき、またはさらに誘導体化することができる。本明細書でもまた、特定の本発明の実施態様に応じて、抗体をヒトにおける治療用途に適するようにする前および／または後に、それらをアポトーシス促進または抗細胞増殖活性について試験できる。
【０１０１】
好ましい一実施態様では、例えば、相同的な非ヒト配列に代えてヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することにより（例えば、Morrison et al. (1984) PNAS 81:6851）、または免疫グロブリンのコード配列を非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部と共有結合させることにより、例えば、抗体１６Ｄ１０と同一のエピトープに結合する抗体などの本発明の抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡを発現ベクターへの挿入前に修飾できる。このようにして元の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。典型的に、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換される。特に好ましい一実施態様では、本発明の抗体はヒト化される。本発明による抗体の「ヒト化」形態は、マウスまたはその他の非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体のその他の抗原結合部分配列など）である。主として、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（受容抗体）であり、元の抗体の所望の特異性、親和性、および能力を維持しながら、受容抗体の相補的決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、元の抗体（供与抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されている。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基によって置換されてもよい。さらに、ヒト化抗体は、受容抗体または移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにも見られない残基を含んでなることができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には、２つの可変領域を実質的に全てに含んでなり、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが元の抗体のＣＤＲ領域に対応して、ＦＲ領域の全て、または実質的に全てがヒト免疫グロブリン共通配列のＦＲ領域である。さらに詳しくは、その各内容を参照によって本明細書に援用するJones et al. (1986) Nature 321: 522；Reichmann et al. (1988) Nature 332: 323；Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534 (1988)；Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593を参照のこと。
【０１０２】
ヒト化抗体を作製するのに使用される軽鎖および重鎖の両方のヒト可変領域の選択は、抗原性を低下させる上で非常に重要である。いわゆる「ベストフィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法に従って、本発明の抗体の可変領域の配列は、公知のヒト可変領域配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次に、マウスの配列と最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れられる（Sims et al. (1993) J. Immun.,151: 2296; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の部分集団の全てのヒト抗体の共通配列からの特定のフレームワークを用いる。同一のフレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体に使用できる（Carter et al. (1992) PNAS 89: 4285; Presta et al. (1993) J. Immunol. 51:1993)）。
【０１０３】
ＦＡＰＰ／ＢＳＤＬ、好ましくは、ヒトＦＡＰＰ／ＢＳＤＬ、最も好ましくは、１６Ｄ１０により特異的に認識されるエピトープ（例えば、１６Ｄ１０との結合についてエピトープと競合できる抗体）に対する高親和性、およびその他の好ましい生物学的特性を維持しながら抗体をヒト化することがさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法により、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて親配列および様々な概念的なヒト化生成物の解析方法により調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元立体構造を図解して表示するコンピュータプログラムが利用できる。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析を可能にする。この方法において、ＦＲ残基は、標的抗原に対する親和性増加などの所望の抗体の特徴が達成されるように、共通かつ移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響において直接的かつ最も実質的に関与する。
【０１０４】
ヒト抗体はまた、免疫化のために、ヒト抗体レパートリーを発現するように改変されたその他の遺伝子導入動物を使用するなどの様々なその他の技術により生成されてもよい。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内在性の重鎖および軽鎖の遺伝子座の標的破壊によりマウスまたはその他の動物に導入される（例えば、その開示全体を参照によって本明細書に援用するJakobovitz et al. (1993) Nature 362:255；Green et al. (1994) Nature Genet. 7: 13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856；Taylor et al. (1994) Int. Immun. 6:579を参照のこと）。代案としては、ヒト抗体は、遺伝子または染色体の形質移入法によって、またはファージディスプレイ法を使用した抗体レパートリー選択を通じて構築できる。この技術では、抗体可変領域遺伝子は、繊維状バクテリオファージの主要またはマイナー被膜タンパク質遺伝子のいずれかの中にインフレームでクローン化され、ファージ粒子表面に機能性抗体断片として提示される。繊維状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能特性に基づく選択もまた、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。この方法において、ファージは、Ｂ細胞特性のいくつかを模倣する（例えば、その開示全体を参照によって本明細書に援用するJohnson et al. (1993) Curr Op Struct Biol 3:5564-571；McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553を参照のこと）。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞によっても作り出される（例えば、その全体を参照によって援用するU.S. Pat. Nos. 5,567,610および5,229,275を参照のこと）。
【０１０５】
一実施態様では、「ヒト化」モノクローナル抗体は、カリフォルニア州フレモントのアブジェニックス（Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）からの免疫化のためのゼノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）（登録商標）などの動物を使用して作られる。ゼノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）は、その免疫グロブリン遺伝子が機能性ヒト免疫グロブリン遺伝子によって置換されているマウス宿主である。それゆえ、このマウスにより、またはこのマウスのＢ細胞から作成されたハイブリドーマにおいて生成される抗体は、既にヒト化されている。ゼノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）については、その全体を参照によって本明細書に援用するUnited States Patent No. 6,162,963で述べられている。同様の方法は、ＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ）を用いて達成されうる。
【０１０６】
本発明の抗体はまた、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）に誘導体化されてもよく、ここで、前記抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が元の抗体中の対応する配列と同一または相同的であり、一方で、それらが所望の生物学的活性を示す限り、鎖の残りが、別の種に由来する、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体ならびにこのような抗体の断片中の対応する配列と同一または相同的である（例えば、Morrison et al. (1984) PNAS 81:6851； U. S. Pat. No. 4,816,567を参照のこと）。
【０１０７】
組み換え１６Ｄ１０抗体の構造特性
好ましい一実施態様では、本発明の抗体は、１６Ｄ１０抗体（または１６Ｄ１０と同一エピトープに結合する別の抗体）の可変領域配列（例えば、可変領域全体、その一部、またはＣＤＲ）を使用して調製されるキメラまたはヒト化ＩｇＧ抗体である。例えば、抗体は、Ｒｅｃ１６ｄ１０または同等の抗体、１６Ｄ１０のマウス重鎖定常部のＣｕ２、Ｃｕ３、およびＣｕ４領域がヒトＩｇＧ１  Ｆｃによって置換されているキメラ抗体でありうる。別の好ましい実施態様では、抗体は、１６Ｄ１０などの抗ＦＡＰＰ／ＢＳＤＬ抗体のＶＨおよびＶＬが、重鎖および軽鎖の両方についてヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）定常部によって置換されているキメラ抗体である。
【０１０８】
本発明の好ましい抗体は、生成され、単離され、構造的および機能的に特徴づけられ、本明細書で述べられるごとく、１６Ｄ１０の可変部またはＣＤＲを含んでなる二価のモノクローナル抗体である。一例では、抗体は、実施例９で述べられているキメラ抗体（ｒｅｃ１６Ｄ１０）であり、別の例では、抗体は、ヒトＩｇＧ１定常部と融合した１６Ｄ１０の重鎖可変部を含んでなる（２本の）重鎖と、ヒトＩｇＬカッパ定常部と融合した１６Ｄ１０の軽鎖可変部を含んでなる（２本の）軽鎖とからなる代替的な二価キメラ抗体である。これらの抗体の全長、変量、およびＣＤＲ配列を表１に示す。
【０１０９】
【表１】
2010532976.tif 000002
【０１１０】
したがって、一態様では、本発明は、（ａ）配列番号３、５、７、および９〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＶＨ領域、および（ｂ）配列番号４、６、８、および１２〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＶＬ領域を含んでなり、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。好ましい重鎖および軽鎖の組み合わせとしては、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含んでなる重鎖と（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖、（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含んでなる重鎖と（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖、および（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変部と（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変部が挙げられる。
【０１１１】
他の態様では、本発明は、１６Ｄ１０の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３またはそれらの組み合わせを含んでなる抗体を提供する。ＣＤＲ領域は、カバット（Ｋａｂａｔ）システム（Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）を使用して記述される。１６Ｄ１０の重鎖ＣＤＲは、配列番号７中のアミノ酸位置３１〜３５（ＣＤＲ１；ＣＤＲ１のコチア（Ｃｈｏｔｉａ）番号は２６〜３５）、位置５０〜６７（ＣＤＲ２）、および位置９７〜１０６（ＣＤＲ３）に位置する。１６Ｄ１０の軽鎖ＣＤＲは、配列番号８中のアミノ酸位置２４〜４０（ＣＤＲ１）、位置５６〜６２（ＣＤＲ２）、および位置９５〜１０２（ＣＤＲ３）に位置する。
【０１１２】
したがって、他の態様では、本発明は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ  ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ  ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ  ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１３のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ  ＣＤＲ３を含んでなり、ＦＡＰＰまたはＢＳＤＬに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部位を提供する。好ましくは、前記抗体は、ヒトＩｇＧ鎖定常部と融合したＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含んでなる重鎖可変部、およびヒトカッパ鎖定常部と融合したＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含んでなる軽鎖可変部を含んでなる。好ましくは、前記ヒトＩｇＧ鎖定常部は、配列番号１５のアミノ酸配列またはその一部、または少なくともそれと８０％、９０％または９５％同一の配列を含んでなる。好ましくは、前記ヒトカッパ鎖定常部は、配列番号１６のアミノ酸配列またはその一部、または少なくともそれと８０％、９０％または９５％同一の配列を含んでなる。好ましくは、抗体は、２つの前記重鎖および２つの前記軽鎖を含んでなる四量体である。
【０１１３】
特定の実施態様では、本発明の抗体は、ＶＨ  Ｊ５５８．４８マウス生殖細胞系Ｈ鎖免疫グロブリン遺伝子からのＶＨ領域および／またはＶＫ  ８−２７マウス生殖細胞系Ｌ鎖免疫グロブリン遺伝子からのＶＬ領域を含んでなる。
【０１１４】
一態様では、本発明は、（ａ）本明細書で述べられるＶＨ領域（例えば、可変部、その一部、または本明細書で述べられるＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含んでなる可変部）と融合したヒトＩｇＧ鎖定常部、および（ｂ）本明細書で述べられるＶＬ領域（すなわち、可変部、その一部、または本明細書で述べられるＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含んでなる可変部）と融合したヒトカッパ鎖定常部を含んでなり、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部位を提供する。例示的なＩｇＧ鎖定常部としては、抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、カリフォルニア州のジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））から得られる配列番号１５の配列を有する定常部、またはその一部が挙げられる。例示的なヒトカッパ鎖定常部としては、抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、カリフォルニア州のジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））から得られる配列番号１６の配列を有する定常部、またはその一部が挙げられる。
【０１１５】
さらに別の実施態様では、本発明の抗体は、本明細書で述べられる好ましい抗体のアミノ酸配列と相同的なアミノ酸配列を含んでなる重鎖および軽鎖可変部を含んでなり、抗体は、本発明の抗ＦＡＰＰ／ＢＳＤＬ抗体の所望の機能特性を保持する。例えば、本発明は、重鎖可変部および軽鎖可変部を含んでなる単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部位を提供し、（ａ）ＶＨ領域は、配列番号３、５、７、および９〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでなり、（ｂ）ＶＬ領域は、配列番号４、６、８、および１２〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでなり、（ｃ）抗体はＦＡＰＰまたはＢＳＤＬポリペプチドと特異的に結合して、本明細書で述べられる機能特性の少なくとも１つ、好ましくは、本明細書で述べられる機能特性のいくつかを示す。
【０１１６】
別の実施態様では、ＣＤＲ、ＶＨおよび／またはＶＬ、または定常部アミノ酸配列は、上で述べた配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってもよい。ＣＤＲ、ＶＨおよび／またはＶＬ、または上で述べた配列の定常部領域と高い（すなわち、８０％またはそれ以上の）同一性を有するＣＤＲ、ＶＨおよび／またはＶＬ領域を有する抗体は、配列番号３〜１４のＣＤＲ、ＶＨおよび／またはＶＬまたは配列番号１５および１６の定常部をコードする核酸分子の変異誘導（例えば、部位特異的またはＰＣＲ介在変異誘導）と、次いでコードされた改変抗体を、維持された機能（例えば、ＦＡＰＰ／ＢＳＤＬ結合親和力、腫瘍細胞のアポトーシス誘導または増殖減速、ＡＤＣＣの誘導）について試験することによって得ることができる。
【０１１７】
２つの配列間の％同一性は、２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップ数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列により共有される同一の位置数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置数／位置総数×１００）。２つの配列間の配列比較および％同一性の判定は、配列分析ソフトウェアの数学的アルゴリズムを使用して達成できる。タンパク質分析ソフトウェアは、保存アミノ酸置換をはじめとする様々な置換、欠失、およびその他の修飾に割り当てられた類似性の測定を用いて類似の配列を適合する。
【０１１８】
２つのアミノ酸配列間の％同一性は、例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手できる）に組み込まれている、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔおよび１、２、３、４、５、または６のｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔを使用して判定できる。
【０１１９】
ポリペプチド配列はまた、ＦＡＳＴＡを使用して、デフォルトまたは推奨パラメーターを適用して比較できる。ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムであるＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリーおよび検索配列間の最良重複の領域のアラインメントおよび％配列同一性を提供する（Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98；Pearson, Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219）。
【０１２０】
２つのアミノ酸配列間の％同一性はまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、Ｅ．メイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）およびＷ．ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（Comput. Appl. Biosci., 1988;11-17）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ、ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ  １２、およびｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  ４を使用して判定できる。
【０１２１】
配列をデータベース中に含有されるその他の配列と比較するための別のアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用した、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐである。例えば、それぞれ参照によって本明細書に援用する、Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990;215 403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997)を参照されたい。そこでは本発明のタンパク質配列を「クエリー配列」として使用して、公表データベースに対する検索を実施して、例えば関連配列を同定できる。このような検索は、Altschul, et al., 1990（前出）のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施できる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索はｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３でＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて、本発明の抗体分子と相同的なアミノ酸配列を得て実施できる。比較のためにギャップドアラインメント（ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を得るために、Altschul et al., 1997（前出）で述べられるようにギャップド（Ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴが利用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップド（Ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴプログラムを使用する際、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターを使用できる（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【０１２２】
特定の実施態様では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含んでなるＶＨ領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含んでなるＶＬ領域とを含んでなり、これらのＣＤＲまたは可変部配列の１つまたはそれ以上は、本明細書で述べられる好ましい抗体に基づいて定義されるアミノ酸配列（例えば、１６Ｄ１０および配列番号３〜１４のいずれか）またはその保存的な修飾を含んでなり、抗体は、本発明の抗ＦＡＰＰ／ＢＳＤＬ抗体の所望の機能特性を保持する。保存的な配列の修飾は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に顕著に影響を及ぼさず、またはそれを変更しないあらゆるアミノ酸修飾でありうる。このような保存的な修飾としては、アミノ酸置換、付加、および欠失が挙げられる。修飾は、部位特異的変異誘導およびＰＣＲ介在変異誘導などの当該技術分野で知られている一般的な技術によって本発明の抗体に導入できる。「保存的」アミノ酸置換は、典型的にアミノ酸残基が、類似した物理化学的特性がある側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されているものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーについて、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のあるアミノ酸が挙げられる。
【０１２３】
したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を同一側鎖ファミリーからのその他のアミノ酸残基により置換でき、改変された抗体を本明細書で述べられる機能性アッセイを使用して、保持される機能（すなわち上の（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）で述べられる機能）について試験できる。
【０１２４】
１６Ｄ１０抗体の重鎖および軽鎖可変部をコードする核酸配列をそれぞれ配列番号１および２に示す。一実施態様では、本発明は、配列番号１またはその断片（例えば、１６Ｄ１０  ＶＨ領域の配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３をコードする）を含んでなるヌクレオチド配列から転写され、翻訳された１６Ｄ１０の可変重鎖領域と、配列番号２またはその断片（例えば、１６Ｄ１０  ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３をコードする配列）を含んでなるヌクレオチド配列から転写され、翻訳された１６Ｄ１０の可変軽鎖領域を含んでなる、二価のモノクローナル抗体を提供する。さらに別の好ましい実施態様では、二価の抗体は、その重鎖中に、２００４年３月１６日にパリの国立培養微生物コレクション（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ））に番号Ｉ−３１８８の下に寄託された抗体１６Ｄ１０中に存在する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３または重鎖可変部を含んでなり、軽鎖中に、２００４年３月１６日にパリの国立培養微生物コレクション（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ））に番号Ｉ−３１８８の下に寄託された前記抗体１６Ｄ１０中に存在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３または軽鎖可変部を含んでなる。
【０１２５】
定常部の最適化
ＦＡＰＰまたはＢＳＤＬポリペプチドを発現する細胞のＡＤＣＣを誘導する本発明の抗体の能力を考慮して、本発明の抗体はまた、ＡＤＣＣを誘導するそれらの能力を増加させる修飾と共に作製できる。典型的な修飾としては、少なくとも１つのアミノ酸の修飾（例えば置換、欠失、挿入）および／またはグリコシル化の改変タイプ、例えば、低フコシル化を含んでなる、修飾ヒトＩｇＧ１定常部が挙げられる。このような修飾は、例えば、エフェクター（例えば、ＮＫ）細胞上のＦｃｙＲＩＩＩａへの結合を増加できる。
【０１２６】
抗体のＡＤＣＣ能力を増加させる、定常部中の特定の改変グリコシル化パターンが実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞中において、抗体を発現することで達成できる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞については当該技術分野で述べられており、本発明の組み換え抗体を発現させる宿主細胞として使用でき、それにより改変されたグリコシル化を有する抗体が生成される。例えば、それぞれその全体を参照によって本明細書に援用する、Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1ならびにEuropean Patent No: EP 1,176,195; PCT Publications WO 06/133148; WO 03/035835; WO 99/5434280を参照されたい。
【０１２７】
一般に、改変されたグリコシル化を有するこのような抗体は、特定の望ましい特性を生じる特有のＮ−グリカン構造を有し、それらは、マウス骨髄腫ＮＳＯおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Chuand Robinson, Current Opinion Biotechnol. 2001, 12: 180-7）、本明細書で実施例セクションにおいて生成されるようなＨＥＫ２９３Ｔ発現抗体、または組み換え治療抗体を生成するのに一般に使用されるその他の哺乳類の宿主細胞系によって産生される、非修飾抗体または天然定常部を有する抗体と比較して、改善されたＡＤＣＣおよびエフェクター細胞受容体結合活性を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２８】
哺乳類の宿主細胞中で産生されるモノクローナル抗体は、各重鎖のＡｓｎ２９７にＮ結合グリコシル化部位を含有する。抗体におけるグリカンは、典型的に、非常に低いか、または皆無の二分Ｎ−アセチルグルコサミン（二分ＧｌｃＮＡｃ）および高いレベルのコアフコシル化を有する複合二分岐構造物である。グリカン末端は、非常に低いか、または皆無の末端シアル酸、および可変量のガラクトースを含有する。抗体機能のグリコシル化の総説については、例えば、Wright & Morrison, Trend Biotechnol. 15:26-31 (1997)を参照されたい。相当数の研究が、抗体グリカン構造の糖組成に対する変化がＦｃエフェクター機能を改変できることを示す。抗体活性に寄与する重要な炭水化物の構造は、α−１，６結合を介してＦｃ領域Ｎ結合オリゴ糖類の最内側のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌａｃＮＡｃ）残基に付着するフコース残基であると考えられる（Shields et al., 2002）。ＦｃγＲ結合は、Ｆｃ領域中の保存されたＡｓｎ２９７の共有結合で付着するオリゴ糖類の存在を必要とする。非フコシル化の構造は、近年、インビトロＡＤＣＣ活性の劇的な増加と関連付けられている。
【０１２９】
歴史的に、ＣＨＯ細胞中で産生される抗体は、集団中にフコシル化されていないものを約２〜６％含有する。ＹＢ２／０（ラット骨髄腫）およびＬｅｃｌ３細胞系（欠損ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼを有するＣＨＯ系統のレクチン変異体であって、α６−フコシル基転移酵素の基質であるＧＤＰ−フコースまたはＧＤＰ糖中間体の欠乏症を生じる）が、７８〜９８％の非フコシル化化学種を有する抗体を産生することが報告されている。その他の例では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはノックアウト技術を用いて、ＦＵＴ８ｍ  ＲＮＡ転写物レベルを低下させ、または遺伝子発現を完全にノックアウトさせるように細胞を操作することができ、このような抗体は、７０％までの非フコシル化グリカンを含有することが報告されている。その他の例では、抗体を産生する細胞系は、グリコシル化阻害剤で処理されうる。Zhou et al. Biotech and Bioengin. 99: 652-665 (2008)は、アルファ−マンノシダーゼＩ阻害剤、キフネンシンを用いるＣＨＯ細胞の処理が、非フコシル化オリゴマンノース−Ｎ型−グルカンを有する抗体の産生をもたらすことを述べている。
【０１３０】
したがって、本発明の一実施態様では、抗体は、ＦｃｙＲＩＩＩａおよび／またはＡＤＣＣへの抗体結合を改善する、Ｆｃ領域中の少なくとも１つのアミノ酸改変を含んでなる定常部を含んでなる。別の態様では、本発明の抗体組成物は、本明細書で述べられるキメラ、ヒトまたはヒト化抗体を含んでなり、組成物中の抗体の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７５、８５または９５％は、フコースを欠くコア炭水化物構造を含んでなる定常部を有する。
【０１３１】
定常部中に修飾を含むＦｃｙＲＩＩＩａへの抗体結合および／またはＡＤＣＣが改善されている、特に、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３タイプの非誘導体化または無修飾形態である抗体、または非誘導体化抗体は、膵臓癌にかかっている患者からのものなどのＦＡＰＰまたはＢＤＳＬポリペプチド発現腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、および／または増殖を阻害することが予想される一方で、誘導体化抗体を調製してそれらを細胞毒性にすることもまた可能である。このような誘導体化抗体の二価のＩｇＧ形態が使用される場合、それにより、それらは、少なくとも３つの異なる方法：ＡＤＣＣにより（例えば、抗体が結合Ｆｃ受容体を含んでなる場合、例えば、それらの定常部を介して）、アポトーシスの誘導または細胞増殖阻害により、ならびに細胞毒性部分を介して細胞を傷害することにより、腫瘍細胞を標的とすることができる。一実施態様では、抗体の１つが単離され、ヒトでの使用に適するようにされると、それらは誘導体化されて細胞にとって毒性となる。この方法において、抗体の癌にかかっている患者への投与は、抗体のＦＡＰＰおよび／またはＢＤＳＬポリペプチド発現癌細胞への相対的に特異的な結合を生じ、それにより細胞を直接傷害し、または阻害するための追加的手段を提供する。
【０１３２】
治療における化合物の使用
本方法を使用して生成される抗体は、膵臓癌および／またはＢＤＳＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する腫瘍（例えば、乳癌）を治療するのに特に効果的である。
【０１３３】
一態様では、本発明を実施する場合、患者の癌が特徴付けられるか、または評価されうる。これは、癌が本発明により有利に治療されうるかどうかを判定するのに有用でありうる。例えば、本発明の抗原結合化合物は、アポトーシス促進および抗細胞増殖活性を有するため、それらは、腫瘍細胞を直接傷害し、および／または腫瘍容積を低下させるか、または制限するのに用いられてもよい。抗原結合化合物は、上皮内癌を超えて広がり、いずれの方向で２ｃｍ未満のサイズを有するＢＤＳＬまたはＦＡＰＰポリペプチド発現腫瘍の治療において、ならびに／あるいは転移および／または転移性腫瘍の治療において、特定の有利な特性を有していてもよい。
【０１３４】
本発明の化合物は、膵臓癌を治療するのによく適し、それは腫瘍細胞死を誘導し、またはそれらの成長または増殖を減速させるのに有用および／または必要である。これは、例えば、膵臓癌が少なくともＩ期癌に分類されおよび／または膵臓中の腫瘍サイズがいずれの方向で２ｃｍまたはそれ以下である、または膵臓癌が少なくともＩＩ期癌に分類され、および／または膵臓中の腫瘍サイズがいずれの方向で２ｃｍを超える、膵臓癌がＩＩ期癌に分類され、および／または癌が膵臓周辺の近傍組織内で成長し始めているが、近傍リンパ節内では成長していない、膵臓癌がＩＩＩ期癌に分類され、および／または膵臓周囲の組織内に向かって伸びているかもしれない、または膵臓癌がＩＶ期癌に分類され、および／または近傍臓器内に向かって伸びているような腫瘍が樹立し、または広がり、癌が上皮内癌を超えて進行した膵臓癌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。膵臓癌は、かなり進んだ進行段階で診断されることが多いため、上皮内癌を超えて進行した腫瘍中の腫瘍細胞を傷害し、または成長を止める能力は、このような癌において顕著である。
【０１３５】
一般的に実施される方法のいずれか１つまたはそれ以上を使用して、膵臓癌が評価され、または特徴付けられる。膵臓癌は、通常、膵臓とその周辺の画像を生じる試験および手順を用いて診断される。癌細胞が膵臓内および周囲に広がっているかどうかを見いだすのに使用される方法は、病期分類と称される。膵臓癌を検出、診断、および病期分類する試験と手順は、通常、同時に行われる。疾患の病期、および膵臓癌が外科手術によって除去できるかどうかは、胸部Ｘ線、理学的検査および病歴、ＣＴスキャン（ＣＡＴスキャン）、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）、ＰＥＴスキャン（陽電子放射型断層撮影法スキャン）、超音波内視鏡（ＥＵＳ）、腹腔鏡検査、内視鏡的逆行性胆膵管造影（ＥＲＣＰ）、経皮経肝胆管造影（ＰＴＣ）などの手順によって、および／または生検によって評価できる。生検では、病理学者がそれらを顕微鏡下で観察し、癌の指標、および／または場合によりＢＤＳＬまたはＦＡＰＰポリペプチドの発現について検査できるように、細胞または組織が採取される。
【０１３６】
本明細書で論じるように、発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを使用して、１６Ｄ１０による細胞の処理が、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２の低下、ならびにアポトーシス促進Ｂａｘタンパク質の増加を誘導することを実証した。抗体がｐ５３およびＧＳＫ−３β活性を増加させ、サイクリンＤ１レベルを低下させることもまた実証された。したがって、本発明の抗原結合化合物および方法は、細胞中でＢｃｌ−２ファミリーメンバータンパク質活性を調節し、好ましくは、細胞中でＢｃｌ−２ファミリーメンバータンパク質レベルを調節し、好ましくは、Ｂｃｌ−２タンパク質発現を低下させ、および／またはＢａｘタンパク質発現を増加させる方法において有利に使用できる。同様に、本発明の抗原結合化合物および方法はまた、細胞中の細胞周期活性を調節し、および／またはＧ１／Ｓ移行において細胞をブロックし、好ましくは、ｐ５３またはＧＳＫ−３β活性を増加させ、またはおよび／またはサイクリンＤ１レベルを低下させる方法においても有利に使用できる。細胞は、ＢＤＳＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現するいずれの細胞、好ましくは、腫瘍細胞（例えば、膵臓腫瘍細胞）、好ましくは、脂質ラフト中にＢＤＳＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞であってもよい。細胞は、１つまたはそれ以上のＢｃｌ−２ファミリーメンバーの活性（またはｐ５３、サイクリンＤ１、またはＧＳＫ−３β）（例えば、生物学的活性および／またはタンパク質発現）が調節不全であり、すなわち、正常な細胞（例えば、非腫瘍細胞）と比較して活性が増加または低下しており、および／またはその他のアポトーシス促進または抗アポトーシスまたは細胞周期促進または抗細胞周期タンパク質と比較して不均衡によって特徴づけられる、細胞（例えば、腫瘍細胞）であってもよい。
【０１３７】
ヒトＢｃｌ−２ファミリーのメンバーは、Ｂｃｌ−２相同性（ＢＨ）領域と称される４つの特徴的な相同性領域（ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、およびＢＨ４と命名される）の１つまたはそれ以上を共有する。ＢＨ領域は、機能に重要であることが知られており、分子クローニングを介したこれらの領域の欠失は、生存／アポトーシス率に影響を与える。Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬなどの抗アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質は、４つのＢＨ領域を全て保存する。ＢＨ領域はまた、アポトーシス促進Ｂｃｌ−２タンパク質を、いくつかのＢＨ領域を有するタンパク質（例えばＢａｘ、Ｂｃｌ−ｘＳ、およびＢａｋ）またはＢＨ３領域のみを有するタンパク質（例えばＢｉｄ、Ｂｉｍ  ａｎｄ  Ｂａｄ）に細分する役割を果たす。
【０１３８】
Ｂｃｌ−２は、細胞死過程の開始を抑制するため、アポトーシス過程に必須である。免疫組織化学染色は、典型的には、腫瘍中のＢｃｌ−２ファミリーメンバーの発現レベルを検出するのに使用されている。場合によっては、膵臓の腫瘍がＢｃｌ−２を過剰に発現しうることが見出され、これらの腫瘍細胞は、アポトーシスに抵抗性を示すことが予想される。膵臓の腫瘍の約５０％が抗アポトーシスＢｃｌ−ｘＬを過剰発現し、Ｂｃｌ−ｘＬの高まった発現が患者のより短い生存に関連する一方で、Ｂａｘの上方制御はより長い生存と関連付けられていることもまた示されている。
【０１３９】
一態様では、本発明は、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー調節不全を有するＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチド発現細胞を処理し、または傷害する方法であって、細胞を本発明の抗原結合化合物に接触させる工程を含んでなる方法を提供する。別の態様では、本発明は、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの調節不全を有する腫瘍を有する患者を治療する方法であって、薬学的有効量の本発明の抗原結合化合物を患者に投与する工程を含んでなる方法を提供する。
【０１４０】
一態様では、本発明は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチド発現細胞を処理し、または傷害する方法であって、（ａ）細胞がＢｃｌ−２ファミリーメンバー調節不全によって特徴づけられるかどうかを判定する工程と、（ｂ）細胞がＢｃｌ−２ファミリーメンバー調節不全によって特徴づけられる場合、細胞を本発明の抗原結合化合物に接触させる工程を含んでなる方法を提供する。他の態様では、本発明は、腫瘍を有する患者を治療する方法であって、（ａ）患者がＢｃｌ−２ファミリーメンバー調節不全によって特徴づけられる腫瘍を有するかどうかを判定する工程と、（ｂ）腫瘍がＢｃｌ−２ファミリーメンバー調節不全によって特徴づけられる場合、薬学的有効量の本発明の抗原結合化合物を患者に投与する工程を含んでなる方法を提供する。
【０１４１】
別の実施態様では、本発明は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞を処理し、または傷害する方法であって、ａ）細胞がサイクリンＤ１の過剰発現またはｐ５３またはＧＳＫ−３β活性の欠如によって特徴づけられるかどうかを判定する工程と、ｂ）細胞がサイクリンＤ１の過剰発現またはｐ５３またはＧＳＫ−３β活性の欠如によって特徴づけられる場合、細胞を本発明の抗原結合化合物に接触させる工程を含んでなる方法を提供する。一方法では、細胞は、癌、例えば、膵臓癌にかかっている患者に存在する腫瘍細胞であり、方法は患者を治療するために使用される。
【０１４２】
腫瘍または細胞がＢｃｌ−２ファミリーメンバー調節不全（または改変されたサイクリンＤ１またはｐ５３またはＧＳＫ−３β活性またはレベル）を有するかどうかの判定は、いずれかの適切な方法、例えば、免疫組織化学または核酸プローブまたはプライマーに基づいたアプローチによって実施でき、例えば、腫瘍または細胞が、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー調節不全（または改変されたサイクリンＤ１またはｐ５３またはＧＳＫ−３β活性またはレベル）、変異Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー（またはサイクリンＤ１またはｐ５３またはＧＳＫ−３β）、（例えば、タンパク質レベルおよび／または転写物を判定することによる）Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー（またはサイクリンＤ１またはｐ５３またはＧＳＫ−３β）の発現増加または低下を引き起こす変異を有するかどうかを判定するなどのいくつかのパラメーターのいずれを検出してもよい。一態様では、調節不全は、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバー（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ）の活性増加および／またはアポトーシス促進Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー（例えば、Ｂａｘなど）の活性低下を含んでなる。
【０１４３】
Giovannetti et al. (2006) Mol. Cancer. Ther. 5 (6): 1387-1395で要約されるように、アポトーシス経路の調節は、膵臓癌が抗癌化学療法に対して限定された感受性のみを示す理由の１つでありうると考えられる。Fahy et al. (British Journal of Cancer (2003) 89, 391-397)は、化学増感におけるＢｃｌ−２およびＢａｘの調節を調べた。セリン／スレオニンキナーゼＡＫＴの活性化は、膵臓癌において一般的であり、その阻害は、細胞を化学療法のアポトーシス効果に対して感作させる。Fahy et al.は、膵臓癌細胞におけるＮＦ−ｋＢ転写因子の活性化、続いてＢＣＬ−２遺伝子ファミリーの転写調節について調べた。ホスファチジルイノシトール−３キナーゼまたはＡＫＴのいずれかの阻害は、Ｂｃｌ−２のタンパク質レベルの低下およびＢａｘのタンパク質レベルの増加を生じた。さらに、ＡＫＴの阻害は、Ｂｃｌ−２遺伝子の転写調節ができるＮＦ−ｋＢの機能を低下させた。この経路の阻害は、膵臓癌細胞中のアポトーシスの基底レベルに対してほとんど影響を示されなかったが、化学療法のアポトーシス効果を増加させた。
【０１４４】
したがって、本発明の抗原結合化合物を有利に使用して、ＢＤＳＬまたはＦＡＰＰポリペプチド発現細胞、特に、腫瘍細胞（例えば、膵臓腫瘍細胞）を化学療法剤による治療に対して感作させることができる。薬剤は、一般に、効果的であるために、細胞がアポトーシスを経ることができる細胞を要するいずれの薬剤であってもよい。好ましい実施態様では、薬剤は、膵臓腫瘍または腫瘍細胞が、それに対して部分的または完全に抵抗性であるか、または抵抗性になることが知られている薬剤である。一実施態様では、本発明の抗原結合化合物を使用して、化学療法抵抗性のＢＤＳＬまたはＦＡＰＰポリペプチド発現腫瘍を有する患者を治療できる。別の実施態様では、一般に作用機序の一環として、細胞標的がアポトーシスを経ることができる（またはアポトーシスに対して抵抗性でない）ことを要する薬剤である化学療法剤との併用で、本発明の抗原結合化合物を使用して、ＢＤＳＬおよび／またはＦＡＰＰポリペプチド発現腫瘍を有する患者を治療できる。場合により腫瘍または患者は化学療法剤によって前処理されており、および／または（すなわち、本発明の抗原結合化合物との共同治療の不在下で）腫瘍は化学療法剤による治療に対して抵抗性である。一例では、特に膵臓癌の治療のためには、薬剤は、ヌクレオシド類似体（例えば、ゲムシタビン）である。別の例では、薬剤は、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルおよびそれらの類似薬剤）である。別の例では、薬剤は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、細胞毒性抗生物質またはトポイソメラーゼ阻害剤である。本発明の抗原結合化合物および化学療法剤は、別々に投与されることが多いと理解されるが、本発明の抗原結合化合物および化学療法剤を含んでなる組成物もまた包含される。このような組成物は、本明細書で述べられる方法のいずれかで使用できる。
【０１４５】
したがって、一態様では、本発明は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチド発現細胞を化学療法剤に感作させる方法であって、細胞を本発明の抗原結合化合物に接触させる工程を含んでなる方法を提供する。一態様では、本発明は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチド発現細胞を処理し、または傷害する方法であって、細胞を本発明の抗原結合化合物および化学療法剤に接触させる工程を含んでなる方法を提供する。別の態様では、本発明は、腫瘍を有する患者を治療する方法であって、薬学的有効量の本発明の抗原結合化合物および化学療法剤を患者に共同で投与する工程を含んでなる方法を提供する。本明細書で用いられるように、「共同」、「併用」または「併用療法」という用語は同義的に使用されて、２種またはそれ以上の薬剤（例えば、本発明の抗原結合化合物および化学療法剤）が同一疾患の治療または予防に影響を及ぼす状況をいう。「共同」、「併用」または「併用療法」という用語の使用は、疾患にかかっている対象に薬剤を投与する順序を限定しない。第１の療法は、疾患にかかっている対象に、第２の療法施行前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）に、同時に、またはその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）に施行できる。
【０１４６】
さらに、本化合物は、単にそれらの細胞との結合により、すなわち、細胞毒性部分またはＡＤＣＣを誘導する必要なしに、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞を効果的に標的にできるため、それらは（免疫細胞または免疫機能の「相対的不足」を有すると言える）免疫不全患者を治療する上で特に有用である。このような患者としては、例えば、先天性または後天性免疫不全症障害、ＨＩＶ感染症、リンパ腫、白血病、慢性疲労免疫機能障害症候群、エプスタイン−バーウィルス感染症、ウイルス感染後疲労症候群などの、または例えば組織移植と併用される、自己免疫障害などの障害の治療のための免疫抑制化合物の投与、または癌の治療のための化学療法剤の使用に起因する、免疫系に影響を及ぼす疾患または病状があるものが挙げられる。したがって、本発明は、薬学的有効量の本発明の抗原結合化合物を患者に投与する工程を含んでなる、癌がある免疫不全患者を治療する方法を提供する。好ましい実施態様では、化合物は、抗体である。別の実施態様では、抗体は、細胞毒性部分によって誘導体化され、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞の直接傷害が高められる。特定の実施態様では、方法は、投与工程前に、癌細胞サンプルが患者から得られる工程と、化合物が細胞に結合し、および／またはそのアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害する能力が確認される工程を含んでなる。一実施態様では、薬学的有効量は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰ発現細胞、例えば、患者から採取される癌細胞のアポトーシスを誘導し、または増殖を阻害するのに十分な量である。
【０１４７】
本発明はまた、患者においてＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞の増殖または活性を阻害し、または傷害するのに効果的な量で、いずれの適切なビヒクル中に本化合物のいずれか、抗体、その断片および誘導体を含んでなる組成物、例えば、医薬組成物も提供する。組成物は、さらに、一般に薬学的に許容できる担体を含んでなる。抗体および組成物を患者に投与する本方法はまた、動物を治療すること、またはヒト疾患のための動物モデルにおいて、本明細書で述べられる方法または組成物のいずれかの有効性を試験することにも使用できるものと理解される。
【０１４８】
これらの組成物中で使用してもよい薬学的に許容できる担体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、硫酸プロタミンとリン酸水素二ナトリウムとリン酸水素カリウムと塩化ナトリウムと亜鉛塩などの塩または電解質、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール、およびが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４９】
別の実施態様に従って、本発明の抗体組成物は、さらに、抗体が投与されるため（例えば、膵臓癌）の特定の治療目的のために通常利用される薬剤を含む、１つまたはそれ以上のさらなる治療薬を含んでなってもよい。さらなる治療薬は、通常、治療される特定の疾患または病状のための単一剤療法中でその薬剤について典型的に用いられる量で組成物中に存在する。
【０１５０】
固形腫瘍治療との関連で、本発明は、外科手術、放射線療法、化学療法などの古典的アプローチと組み合わせて使用されてもよい。したがって、本発明は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに結合する化合物が、外科手術または放射線治療と同時に、その前または後に使用され、または患者に従来の化学療法剤、放射線治療または抗血管新生剤、または標的を定めた免疫毒素と共に、その前または後に投与される併用療法を提供する。ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに結合する化合物と抗癌剤は、単一組成物中で、または異なる投与経路を使用して２つの別々の組成物としてのいずれかで患者に同時に投与してもよい。
【０１５１】
１つまたはそれ以上の薬剤（例えば、抗癌剤）を本治療方法と組み合わせて使用する場合、合わせた結果が、各治療を別個に行った際に観察される相加的効果である必要はない。少なくとも相加効果が一般的に望ましいが、単一治療法の効果に優る腫瘍細胞の増殖効果のいずれの増加が有用である。また、併用治療が相乗効果を示す特別な必要性はないが、これは確かに可能性があり、有利である。ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに結合する化合物を用いた治療は、例えば、数分から数週間および数ヶ月にわたる間隔で、その他の抗膵臓癌剤治療に先行しても、またはそれに続いてもよい。
【０１５２】
本発明のＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドに結合する化合物は、ＢＳＤＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞に対して、免疫介在機序（例えば、ＡＤＣＣ）に主に依存するのではなく、直接にアポトーシスを誘導し、または細胞増殖を阻害するため、本発明の化合物は、免疫系に対して有害な、または抑制的な効果を有することが報告されている薬剤と併せて使用できることが考えられる。例えば、化学療法を使用して、膵臓癌を含む癌を治療してもよい。本明細書で開示される併用治療法において、多様な化学療法剤を使用してもよい。具体例として考えられる化学療法剤としては、ＤＮＡ複製、有糸分裂、および染色体分離を妨げる薬剤、およびポリヌクレオチド前駆物質の合成および忠実度を乱す薬剤が挙げられる。例えば、薬剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、細胞毒性抗生物質、ビンカアルカロイド、チロシンキナーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ、およびＣＯＸ−２阻害剤が挙げられる。チロシンキナーゼ阻害剤は、患者の生体内免疫応答に有害効果を有することが報告されており、メタロプロテイナーゼ阻害剤は、血液毒性を有することが報告されている。さらに、化合物は、ＡＩＤＳまたはその他の免疫疾患（例えばリンパ腫、白血病）にかかっている患者などの免疫不全患者において、または臓器移植と併せて、または乾癬、関節リウマチ、またはクローン病などの免疫障害の治療として、シクロスポリン、アザチオプリン（イムラン）、またはコルチコステロイドなどの免疫抑制薬を服用している患者において効果的に使用できる。
【０１５３】
診断または予後診断における化合物の使用
本明細書で実証されるように、抗体は二価の形態であれば、高親和性を有し、ＢＤＳＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現しない組織に対する非特異的染色がないため、本発明の二価の抗体は、ＢＤＳＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞（例えば、乳癌）を検出するのに特に効果的である。したがって、抗体は、膵臓癌、膵臓炎とＩ型糖尿病などの膵臓病変をはじめとし、乳癌および心血管疾患などのＢＤＳＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞が関与する病態の診断、予後診断および／または予測で使用するための利点を有する。例えば、患者中の膵臓（または乳）癌は、本発明の抗体を使用して特徴付けられ、または評価されうる。これは、ＢＤＳＬまたはＦＡＰＰポリペプチドを発現する細胞が関与する病態を患者が有するかどうかを判定するのに有用でありうる。方法はまた、このような病態を有する患者が、ＢＤＳＬまたはＦＡＰＰ発現細胞中で効果的な治療方法を用いて治療できるかどうかを判定するのに有用でありうる。例えば、方法は、ＢＤＳＬまたはＦＡＰＰに結合する抗原結合化合物（例えば、本発明のいずれの抗体）に患者が反応するかどうかを判定するのに使用できる。
【０１５４】
したがって、本明細書で述べられる抗体は、膵臓病変、特に、特定の膵臓癌の、好ましくは、インビトロにおける検出に使用できる。このような方法は、典型的には、患者からの生物学的サンプルを本発明による抗体に接触させ、抗体および生物学的サンプル間の免疫学的反応に起因する免疫学的複合体の形成を検出する工程を伴う。好ましくは、生物学的サンプルは、生検によって得られる膵臓組織（免疫組織化学アッセイのための組織切片）または生物学的な液体（例えば、血清、尿、膵液または乳）のサンプルである。複合体は、本発明に従った抗体を標識することにより直接検出でき、または本発明に従った抗体の存在を明らかにする分子（二次抗体、ストレプトアビジン／ビオチンタグなど）を添加することにより間接的に検出できる。例えば、標識は、抗体を放射性または蛍光性のタグとカップリングさせることで達成できる。これらの方法は、当業者によく知られている。癌を検出する場合、ＦＡＰＰまたはＢＤＳＬポリペプチドが生物学的サンプル中に存在するという陽性判定は、一般に患者が膵臓病変（例えば膵臓癌）について陽性であることを示す。したがって、本発明はまた、インビボまたはインビトロで膵臓病変を検出するのに使用できる診断用組成物を調製するための本発明による抗体の使用にも関する。
【０１５５】
本発明の抗体はまた、対象がＦＡＰＰまたはＢＳＤＬポリペプチドを発現する細胞に向けた治療薬を用いた治療、またはＦＡＰＰまたはＢＳＤＬポリペプチドそれ自体を対象とする治療に適するかどうかを判定するのに、または対象のそれに対する応答を予測するのにも有用である。好ましくは、治療薬は、ＦＡＰＰまたはＢＳＤＬポリペプチドに結合する抗原結合断片（例えば、抗体、本発明の抗体）である。
【０１５６】
本発明の抗体はまた、ＦＡＰＰまたはＢＳＤＬポリペプチドに結合する抗体を用いた治療に対する、癌を有する対象の応答を評価するのにも有用でもある。このような方法は、典型的には、患者が、本発明の抗体により結合されるＦＡＰＰまたはＢＳＤＬポリペプチドを発現する癌細胞を有するかどうかを評価する工程に関し、ＦＡＰＰまたはＢＳＤＬポリペプチドの発現が応答する対象の指標である。患者がＦＡＰＰまたはＢＤＳＬを発現する癌細胞を有するという陽性判定は、患者がＦＡＰＰまたはＢＳＤＬポリペプチドに結合する抗体（例えば本発明の抗体）を用いた治療に対して陽性応答者であることを示す。
【０１５７】
応答する対象の同定はまた、癌を有する対象を治療する方法を可能にする。患者が本発明の抗体により結合されるＦＡＰＰまたはＢＳＤＬポリペプチドを発現する癌細胞を有するかどうかを評価することが可能であり、発明の抗体により結合されるＦＡＰＰまたはＢＳＤＬポリペプチドの発現は、応答する対象の指標であり、癌細胞がＦＡＰＰまたはＢＳＤＬポリペプチドを発現する前記対象をＦＡＰＰまたはＢＳＤＬポリペプチドに結合する抗体（例えば、本発明の抗体）を用いて治療することが可能である。患者がＦＡＰＰまたはＢＳＤＬポリペプチドを発現する癌細胞を有するかどうかの評価は、例えば、患者から生物学的サンプルを得、サンプルを本発明に従った抗体と接触させ、前記抗体および前記生物学的サンプル間の免疫学的反応に起因する免疫学的複合体の形成を検出するなどの、本明細書で述べられる診断法を使用して実施できる。生物学的サンプルは、膵臓組織（生検）または生物学的な液体（例えば、血清、尿、膵液および乳）のサンプルであり得る。
【０１５８】
膵臓病変、特に、本発明に従った抗体を含んでなる膵臓癌のための診断または予後診断キットもまた包含される。場合により、キットは、診断または予後診断として使用するための本発明の抗体、および治療として使用するための本発明の抗体を含んでなる。前記キットは、生物学的サンプルおよび本発明の抗体間の免疫学的反応に起因する免疫学的複合体を検出する手段、特に、前記抗体を検出可能にする試薬をさらに含んでなることができる。
【０１５９】
当業者によって理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般に、臨床治療で用いられる量前後であり、化学療法剤は、単独で、またはその他の化学療法剤と組み合わせて投与される。
【０１６０】
本発明のさらなる態様と利点が以下の項目で開示されるが、それらは例証的であり、本明細書の範囲を制限するものではないものとする。
【実施例１】
【０１６１】
材料と方法
抗体およびその他の試薬
ＰＯＤ標識抗ウサギＩｇＧ、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ、およびウサギおよびマウス免疫グロブリンに対するその他の抗体を、ドイツ国マンハイムのロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、カリフォルニア州サンディエゴのカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））またはマサチューセッツ州ベバリーのセル・シグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））から得た。ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧおよび抗マウスＩｇＧを、それぞれセル・シグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびカリフォルニア州サンディエゴのカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））から得た。アクチンおよび無関連マウスカッパＩｇＭに対する抗体、プロテアーゼ阻害剤カクテル、ヨウ化プロピジウム、およびアフィジコリンを、ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ（ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ））から得た。Ｂｃｌ−２に対する抗体を、カリフォルニア州サンタクルーズのサンタクルーズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ））から得た。その他の抗体（切断カスパーゼ−３（Ａｓｐ１７５）、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７（Ａｓｐｌ７５）、カスパーゼ−７、切断カスパーゼ−９（Ａｓｐ３３０）、カスパーゼ−９、切断ＰＡＲＰ（Ａｓｐ２１４）、ＰＡＲＰ、およびＢｃｌ−２）を、マサチューセッツ州ベバリーのセル・シグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））から得た。ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ培地、ペニシリン、ストレプトマイシン、トリプシン−ＥＤＴＡおよび非酵素性細胞剥離液を、フランス国エムランビルのケンブレックス・バイオサイエンス（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅｍｅｒａｉｎｖｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ））またはフランス国ルヴァロワ・ペレのロンザ（Ｌｏｎｚａ（Ｌｅ  Ｖａｌｌｏｉｓ−Ｐｅｒｒｅｔ，Ｆｒａｎｃｅ））から購入した。カスパーゼ阻害剤を、カリフォルニア州サンディエゴのアレクシス（Ａｌｅｘｉｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））またはカリビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から得た。ＢａｘおよびＥ−カドヘリンに対する抗体を、カリフォルニア州サンタクルーズのサンタクルーズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ））から得た。β−カテニンに対する抗体を、英国ケンブリッジのアブカム（Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ））から得た。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抱合ヤギ抗マウスＩｇＭは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から得られた。Ａｌｅｘａ−抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧおよび抗マウスＩｇＧを、カリフォルニア州カールスバッドのモレキュラープローブス（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））から得た。フモニシンＢ１、フモニシンＢ２、Ｌ−シクロセリン、フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（ＰＤＭＰ）、メチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）、フィリピン、トリトンＸ−１００、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、およびアフィディコリンを、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から得た。プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤を、フランス国メイランのロシュ・ダイアグノスティック（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ（Ｍｅｙｌａｎ，Ｆｒａｎｃｅ））から得た。ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二塩酸塩）を、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））から得た。
【０１６２】
ペプチドを認識して胎児膵腺房性膵臓タンパク質（ＦＡＰＰ）のＯ−グリコシル化Ｃ末端領域を認識しうるモノクローナル抗体ｍＡｂ  １６Ｄ１０、膵臓胆汁酸塩依存リパーゼ（ＢＳＤＬ）の癌胎児性グリコアイソフォーム、およびヒトＢＳＤＬ（およびＦＡＰＰ）に対するポリクローナル抗体（ｐＡｂＬ６４）を、WO2005/095594で述べられるようにして本発明者らの実験室で作り出した。その他の全ての生成物は、最も良い利用可能な等級であった。
【０１６３】
細胞および試薬
ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、および１０％熱不活性化ＦＣＳ（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）および１０％熱不活性化ＦＣＳ（ＰＡＮ  ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中でＳＯＪ−６細胞を培養した。リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００試薬、トリゾール、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ逆転写酵素、およびｐｃＤＮＡ３．１ベクターを、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。
【０１６４】
細胞培養
細胞系（ＳＯＪ−６およびＰａｎｃ−１）はヒト膵臓（アデノ）癌腫が起源である。ＦＡＰＰを構成的に発現するＳＯＪ−６細胞を、１０％ＦＣＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、およびファンギゾン（０．１％）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中で３７℃で成育させた。ＦＡＰＰを発現しないＰＡＮＣ−１細胞を、１０％ＦＣＳ、グルタミン（２Ｍｍ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、およびファンギゾン（０．１％）を添加したＤＭＥＭ培地中で３７℃で成育させた。ｍＡｂ  １６Ｄ１０を発現する１６Ｄ１０ハイブリドーマを、１０％不活性化ＦＣＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、およびファンギゾン（０．１％）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中で３７℃で成育させた。
【０１６５】
細胞死分析
不活性化ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０中でのｍＡｂ  １６Ｄ１０またはシスプラチンによる処理後に、細胞を収集して氷冷ＰＢＳで洗浄し、暗所においてアイソフロー（ＩｓｏＦｌｏｗ）緩衝液中の冷ヨウ化プロピジウム溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）に、室温で１０分間再懸濁した。フローサイトメトリー分析を、クールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して実施した。
【０１６６】
細胞成長および増殖
細胞増殖を、以前述べられたようにして（Mosmann et al., 1983 J Immunol Methods, 65 (l-2): 55-63）ＭＴＴアッセイを使用して判定した。簡単に述べると、細胞を９６ウェル培養プレート内の１０％ＦＣＳを含有する適切な完全培地においてサブコンフルエンス（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で播種した。培地を、増加する濃度のＦＡＰＰに対する抗体（ｐＡｂＬ６４、ｍＡｂＪ２８、およびｍＡｂ  １６Ｄ１０）を含む１０％不活性化ＦＣＳ添加の新鮮な培地により２４時間で交換した。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、完全培地中で３時間、１００μｌのＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートしてＰＢＳで洗浄し、最後に、ＤＭＳＯと共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞成長を、ＭＲ  ５０００マイクロプレート分光光度計を使用して５５０ｎｍで吸光度を測定して判定した。全ての独立した判定を三連で行い、対照と比較した。
【０１６７】
ＣＤ１０７動員およびＩＦＮ−γ産生に関するフローサイトメトリーアッセイ
１００  ＵＩ／ｍＬのＩＬ−２を用いて一晩刺激したか、または刺激していない、融解し、精製したヒトＮＫ細胞を、ＳＯＪ−６またはＢ２２１細胞系と、単独で、またはｒｅｃ１６Ｄ１０（３０μｇ／ｍＬ）またはリツキサン（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で、１に等しいエフェクター／標的比で混合した。次いで、ＦＩＴＣ抱合型抗ＣＤ１０７  ｍＡｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびモネンシン（ｓｉｇｍａ）の存在下で、細胞を３７℃で４時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで洗浄し、細胞抱合を中断して、細胞外マーカーについて染色した（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）から購入したＰＣ５抱合抗ＣＤ５６およびＰＣ７抱合抗ＣＤ３）。次に、細胞を固定し、ＩｎｔｒａＰｒｅｐ試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して透過処理した。細胞内ＩＦＮ−γを、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）から購入されたＰＥ抱合抗ＩＦＮ−γを使用して明らかにした。次に、サンプルを、ＦＡＣＳｃａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で分析した。
【０１６８】
フローサイトメトリー
ＳＯＪ−６およびＰＡＮＣ−１細胞表面における抗原の検出を、次の条件下での間接的蛍光によって行った。細胞を、非酵素性細胞剥離液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて、３７℃で１５分間処理して培養プレートから剥離した。後の全工程を４℃で実施した。細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドで１５分間固定して、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１５分間洗浄した。抗原を、特異的抗体に２時間曝してＰＢＳで洗浄し、最後に、適切なＦＩＴＣ標識二次抗体と共に４５分間インキュベートした。次に、細胞を、アイソフロー（ＩｓｏＦｌｏｗ）緩衝液で洗浄して再懸濁し、クールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置上で分析した。
【０１６９】
細胞を、冷ＰＢＳ１×／ＢＳＡ  ０．２％／アジ化ナトリウム０．０５％緩衝液を使用して２回洗浄した。染色を、丸形９６ウェルプレート内でウェルあたり５×１０４個の細胞を使用し、異なる抗体を使用して４℃で１時間行った。次に、二次試薬と共にインキュベートする前に、細胞を２回洗浄した。２回の洗浄後、細胞を、ＰＢＳ１×／ホルムアルデヒド１％内への捕捉前に再懸濁した。染色を、ＦＡＣＳｃａｎ（カリフォルニア州サンノゼのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で得、結果をＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。次に、５μｇ／ｍｌのアフィディコリン（細胞周期を初期Ｓ相でブロックする真核生物核ＤＮＡ複製の可逆的阻害剤）で６時間前処理し、またはしていないＳＯＪ−６細胞を、ｍＡｂ  １６Ｄ１０、または陰性対照として使用した無関連ＩｇＭと共にインキュベートした。非酵素性細胞剥離液を用いて培養プレートから剥離した細胞を、ＰＢＳ＋／＋で洗浄し、−２０℃の７０％エタノールを用いて固定し、ＰＢＳ＋／＋で洗浄した。細胞を、既に述べられているようにして［Mi-Lian et al., 2004］、アイソフロー（ＩｓｏＦｌｏｗ）緩衝液中の４００μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム溶液に再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。細胞周期分布をフローサイトメトリーによって検出し、Ｍｏｄ  Ｆｉｔソフトウェアメイン州トプシャムのＶｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ，Ｉｎｃ．）によって分析した。単一事象の赤色蛍光を、それぞれ４８８ｎｍおよび６１０ｎｍにおける励起および発光を使用して記録し、ＤＮＡインデックスを測定した。
【０１７０】
１６Ｄ１０ハイブリドーマからのＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ調製
１６Ｄ１０ハイブリドーマ細胞（５×１０６細胞）を、１ｍｌのトリゾール試薬に再懸濁した。２００μｌのクロロホルムを添加してＲＮＡ抽出を行った。遠心分離（１５分間、１３，０００ｒｐｍ）後に、ＲＮＡを、５００μｌのイソプロパノールを用いて水相から沈殿させた。インキュベーション（１０分間、ＲＴ）および遠心分離（１０分間、１３，０００）後に、ＲＮＡを、７０％エタノールで洗浄し、再度遠心分離した（５分間、１３，０００ｒｐｍ）。ＲＮＡを、Ｈ２Ｏ（ＲＮＡ分解酵素を含まない水）に再懸濁した。２μｇの特異的ＲＮＡを使用し、製造業者の使用説明書に従って、スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを得た。５’ＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴ（配列番号１７）および３’ＣＴＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＴ（配列番号１８）オリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲ反応によってＧＡＰＤＨを増幅し、ｃＤＮＡの質をチェックした。
【０１７１】
１６Ｄ１０抗体のＶＨおよびＶＬ領域のクローニング
５’ＡＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＧＣＴ（配列番号１９）および３’ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧ（配列番号２０）オリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲによってｃＤＮＡから１６Ｄ１０抗体のＶＬ−Ｃｋ領域を増幅した。ＴＡ−クローニングおよび配列決定後に、配列をＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位の間でｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローン化した。５’ＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣ（配列番号２１）および３’ＡＡＧＧＴＡＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣ（配列番号２２）オリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲによってｃＤＮＡから１６Ｄ１０抗体のＶＨ−ＣＨ１領域を増幅した。ＴＡ−クローニングおよび配列決定後に、配列をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ制限部位の間で９５８  ｃｏｓＦＣｌｉｎｋベクターにクローン化した。
【０１７２】
形質移入
形質移入の２４時間前に、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、７５ｃｍ２フラスコ（５×１０６細胞／フラスコ）内の抗生物質無添加ＤＭＥＭに播種した。１５μｇのｐｃＤＮＡ３．１／ＶＬ−Ｃｋ構築物および１５μｇの９５８  ｃｏｓＦＣｌｉｎｋ／ＶＨ−ＣＨ１構築物を使用して、製造業者の使用説明書に従って、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を使用して形質移入を実施した。形質移入のために、ＤＮＡ純度を確実にするため、Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ内毒素フリーキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。使用したリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）：ＤＮＡ比を、２：１に固定した。形質移入の４、８、および１２日後に培養上清物を収集した。
【０１７３】
抗体の精製
プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して上清物から１６Ｄ１０を精製した。４℃の回転下でバッチ精製を実施した。次に、ビーズを、カラム装填前に４℃で５分間１５００ｒｐｍで遠心分離した。１ＸＰＢＳ中での徹底的な洗浄後、グリシン０．１ＭｐＨ３緩衝液を使用して抗体を溶出し、１ＸＰＢＳ緩衝液に対して４℃で一晩透析した。
【０１７４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット
ＳＯＪ−６細胞を、６ウェル培養プレートにおいて、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で成育させた。密集度（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）において、培地を除去し、１０％不活性化ＦＣＳ添加の新鮮なＲＰＭＩ培地により２４時間で交換した。次に、ＳＯＪ−６細胞を、ｍＡｂ  １６Ｄ１０またはシスプラチンと共に２４時間インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を、氷冷ＰＢＳ（Ｎａ＋およびＭｇ＋＋含まない）で３回洗浄し、遠心分離によって収集し、ペレット化した。ペレットを、２回洗浄し、０．５ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭベンズアミジンおよびホスファターゼ阻害剤）中で４℃で溶解した。溶解後、ホモジェネートを、４℃において１０，０００ｇで１０分間遠心分離して透明化した。ビシンコニン酸アッセイ（イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ）を使用したタンパク質判定のために、アリコートを保存した。還元性ＳＤＳ緩衝液中のタンパク質（５０μｇ／レーン）を、（分離するタンパク質の分子量範囲に応じて）０．１％ＳＤＳ添加１０、１２、または１５％ポリアクリルアミド上に分離した。電気泳動後、タンパク質を銀染色した。代替的に、Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ電気泳動セル（カリフォルニア州ハーキリーズのＢｉｏＲａｄ）を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜上に転写し、適切な一次および二次抗体を使用して転写タンパク質を免役検出した。洗浄後、化学発光基質を用いて、製造業者の使用説明書（スイスのＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に従って膜を発色させた。各実験では、一次抗体を取り除くことにより、または非免疫性血清を使用することにより、対照を含めた。
【０１７５】
アポトーシスおよびカスパーゼ活性
製造業者の使用説明書に従って、プロメガからのＣａｓｐＡＣＥＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ｆｍｋ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  マーカー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を培地中１０μＭの最終濃度で添加する前に、８ウェルプレート（ポリスチレン容器、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ））内で増殖した細胞を、不活性化ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ中のｍＡｂ  １６Ｄ１０またはマウスＩｇＭで２４時間処理した。次に、細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、２％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、再び１回洗浄した。ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ｆｍｋにカスパーゼが作用するとアポトーシス細胞は蛍光性になり、蛍光顕微鏡下で無作為に試験した１０視野の集合物において蛍光性細胞数を三連で判定した。
【０１７６】
実施例１４のためのアポトーシスアッセイ（キメラ組み換え１６Ｄ１０によるアポトーシス）
実験を開始する７２時間前に、ＳＯＪ−６細胞（ウェルあたり２０×１０４細胞）を２４ウェルプレート上に播種した。細胞を、２０μｇ／ｍｌの１６Ｄ１０  ＩｇＭ、またはそれぞれ重鎖および軽鎖についてヒトＩｇＧ１定常部およびヒトカッパ軽鎖領域に連結し融合した１６Ｄ１０可変部を含有する２０μｇ／ｍｌのさらなる組み換え１６Ｄ１０  ＩｇＧ１抗体、２５μｇ／ｍｌツニカマイシンまたは５０μｇ／ｍｌツニカマイシンのいずれかと共にインキュベートした。培養２４時間後に、アネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キットＩ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して、製造業者の説明書に従ってアネキシンＶ／ＰＩ染色を実施した。ＦＡＣＳｃａｎ（カリフォルニア州サンノゼのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で染色を得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して結果を分析した。
【０１７７】
核染色
ｍＡｂ  １６Ｄ１０またはシスプラチンによる処理後、細胞を氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、固定して−２０℃において７０％エタノールで５分間透過処理し、ＰＢＳ中の希釈１／１０００  ＤＡＰＩ溶液を用いて室温で１分間染色した。次に細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞の核形態を蛍光顕微鏡によって調べた。
【０１７８】
統計学的分析
全てのデータを平均±ＳＤで示した。群間の有意差を、独立スチューデントｔ検定を使用して判定した。＊Ｐ＜０．０１の値は、統計学的に有意であると認められた。
【０１７９】
実施例１−ｍＡｂ  １６Ｄ１０で処理した膵臓ＳＯＪ−６細胞は、２４時間にわたりアポトーシスによる細胞死を経る
ＳＯＪ−６細胞のアポトーシス細胞死を刺激するｍＡｂ  １６Ｄ１０の能力を、本明細書で述べられるようにして調査した。抗体１６Ｄ１０がＳＯＪ−６細胞のアポトーシスをもたらすことを観察した（図１に示すように、ＲＰＭＩおよびマウスＩｇＭと比較して、ｙ軸はアポトーシス細胞数／ｃｍ２を表す）。
【０１８０】
実施例２−１６Ｄ１０誘導アポトーシスは、カスパーゼ−３、カスパーゼ−８、およびカスパーゼ−９活性化によって介在される
この実験では、１６Ｄ１０によって誘導されるアポトーシスを、カスパーゼ阻害剤（カスパーゼ９：Ｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋ、カスパーゼ８：Ｚ−ＩＥＤＴ−ｆｍｋ、カスパーゼ３：Ｚ−ＤＥＶＥＤ−ｆｍｋ、およびカスパーゼ混合物：Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）の存在下または不在下で前処理し、次に、ｍＡｂ  １６Ｄ１０で処理した膵臓のＳＯＪ−６細胞上でＣａｓｐＡｃｅＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ｆｍｋを用いて測定した。図２は、ｍＡｂ  １６Ｄ１０がカスパーゼ−３、カスパーゼ−８、およびカスパーゼ−９を介してアポトーシスを刺激することを示す。
【０１８１】
ｍＡｂ  １６Ｄ１０によって誘導されるＳＯＪ−６細胞のアポトーシスをＤＡＰＩ染色によっても観察した。結果を図３に示し、図３において核断片化に対応する細胞の軽度の着色によって観察されるように、ＲＰＭＩは細胞にアポトーシスを誘導せず、シスプラチンは低レベルのアポトーシスを誘導し、抗体１６Ｄ１０は顕著なレベルのアポトーシスを誘導する。
【０１８２】
実施例３−１６Ｄ１０はＢｃｌ−２ファミリーのタンパク質によって制御される
１６Ｄ１０による細胞の処理がＢａｘタンパク質の増加に付随する抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２の低下を誘導することを、本明細書で述べられるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを使用して観察することにより、カスパーゼ活性化がＢｃｌ−２ファミリーのタンパク質によって制御されることを示した。実験はまた、１６Ｄ１０の誘導するアポトーシスが、カスパーゼ８および９、およびポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断によって介在されることも実証した。図４は、ゲル上の結果を示し、左端のレーンはＲＰＭＩ中のＳＯＪ−６細胞を表し、中央のレーンは抗体１６Ｄ１０と共にインキュベートしたＳＯＪ−６細胞を表し、右端のレーンはシスプラチンと共にインキュベートしたＳＯＪ−６細胞を表す。
【０１８３】
実施例４−ｍＡｂ  １６Ｄ１０、抗体ｐＡｂＬ６４、およびｍＡｂＪ  ２８は、全てＢＤＳＬおよび／またはＦＡＰＰに対する抗体であるが、ｍＡｂ１６Ｄ１０のみが膵臓腫瘍細胞成長を阻害できる
本明細書で述べられるＭＴＴアッセイを使用して細胞成長を評価した。図５は、ヒトＢＤＳＬおよび／またはＦＡＰＰを認識する増加濃度のポリクローナル抗体ｐＡｂＬ６４を用いた、ＳＯＪ−６膵臓腫瘍細胞の処理を示す。図５は、ｐＡｂＬ６４が細胞の成長または数の低下を引き起こすことができないことを示す（ｘ軸はｍＡｂ濃度であり、ｙ軸は細胞の％成長である）。図６は、ヒトＢＤＳＬおよび／またはＦＡＰＰを認識するが、本発明者らによって抗体１６Ｄ１０からのＢＤＳＬおよび／またはＦＡＰＰの異なるエピトープに結合することが以前に実証されている、増加濃度のポリクローナル抗体Ｊ２８を用いた、ＳＯＪ−６膵臓腫瘍細胞の処理を示す。図６は、Ｊ２８が細胞の成長または数の低下を引き起こすことができないことを示す（ｘ軸はｍＡｂ濃度であり、ｙ軸は細胞の％成長である）。図７は、ヒトＢＤＳＬおよび／またはＦＡＰＰを認識する増加濃度のポリクローナル抗体１６Ｄ１０（ＩｇＭ）による、ＳＯＪ−６またはＰＡＮＣ−１膵臓腫瘍細胞の処理を示す。図７は、１６Ｄ１０が、１６Ｄ１０抗原を発現しないが、ＦＡＰＰを発現するＳＯＪ−６細胞の低下を引き起こすＰＡＮＣ−１細胞の成長または数の低下を引き起こすことができないことを示す（ｘ軸はｍＡｂ濃度であり、ｙ軸は細胞の％成長である）。図８は、増加濃度の対照ＩｇＭ抗体を用いたＳＯＪ−６またはＰＡＮＣ−１膵臓腫瘍細胞の処理は、対照ＩｇＭ抗体が、ＰＡＮＣ−１およびＳＯＪ−６細胞のいずれの成長または数の低下も引き起こすことができないことを示す（ｘ軸はｍＡｂ濃度であり、ｙ軸は細胞の％成長である）。図９は、増加濃度の抗体１６Ｄ１０または対照ＩｇＭ抗体のいずれかを用いたＳＯＪ−６膵臓腫瘍細胞の処理を示し、対照ＩｇＭ抗体が細胞の減少を引き起こすことができない一方で、１６Ｄ１０が細胞の減少を引き起こすことを実証する（ｘ軸はｍＡｂ濃度であり、ｙ軸は細胞の％成長である）。
【０１８４】
図１０は、増加濃度の抗体１６Ｄ１０または対照ＩｇＭ抗体のいずれか、および抗体１６Ｄ１０の存在下または不在下での様々な濃度のメチル−ｂ−シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）によるＳＯＪ−６膵臓腫瘍細胞の処理を示し、対照ＩｇＭ抗体が細胞の減少を引き起こさない一方で、１６Ｄ１０が細胞の減少を引き起こすことが実証する（ｘ軸はｍＡｂ濃度であり、ｙ軸は細胞の％成長である）。ＭＢＣＤを、１６Ｄ１０と組み合せて使用すると、抗体１６Ｄ１０の細胞成長阻害活性が低下または消失する。これらのデータは、アポトーシス性の細胞死を刺激するｍＡｂ  １６Ｄ１０の能力が、膜脂質ラフトミクロドメイン中の１６Ｄ１０抗原の局在に依存することを示す。
【０１８５】
実施例５−ｍＡｂ  １６Ｄ１０は、ＳＯＪ−６細胞の細胞周期および細胞周期調節タンパク質の発現を調節する
次に、出願人らは、ｍＡｂ  １６Ｄ１０誘導アポトーシスが、細胞周期の停止によるものかどうかを知ることを望んだ。ＳＯＪ−６細胞を、アフィディコリン不在または存在下による前処理後、ｍＡｂ  １６Ｄ１０不在または存在下による前処理後にＤＮＡプロフィルを観察することにより、処理後のＳＯＪ−６細胞の細胞周期分布を評価した。各実験を三連で実施した。本発明者らは、特異的ＤＮＡマーカーであるヨウ化プロピジウムを使用して、フローサイトメトリーによって細胞周期の異なる周期を判定した。ｍＡｂ  １６Ｄ１０によるＳＯＪ−６細胞の処理は、Ｇ１／Ｓ停止（Ｇ１／Ｓ：９６％）およびアポトーシス細胞の増加（６％）の両方をもたらす一方で、Ｇ２／Ｍ相中の細胞の百分率を減少した（４％）。これらの結果は、アフィディコリンによって細胞をＧ１／Ｓ期中で同期化した際に確認した。実際、Ｇ２／ＭからＧ１／Ｓ期へ、次いでＧ１／Ｓからアポトーシスへの細胞の移行もまた、アフィディコリン処理後に観察した。後者の場合、細胞はＧ１／Ｓ期でブロックされたため、Ｓ期からＧ０／Ｇ１期へ、次いでＧ０／Ｇ１期からアポトーシスへの移行が生じた。
【０１８６】
本発明者らは、ＰＡＮＣ−１細胞において同一実験を実施し、ｍＡｂ  １６Ｄ１０処理に際して細胞周期における効果がないことを観察した。次に、異なる細胞周期調節タンパク質、具体的にはｐ５３およびサイクリンＤ１の発現を分析した。予想したとおり、ｍＡｂ１６Ｄ１０による細胞処理はｐ５３の発現を増加させ、サイクリンＤ１の発現を低下させた（図１１）。サイクリンＤ１発現は、ＧＳＫ−３βによって直接調節されうるため（Diehl et al., 1998 Genes Dev. 12 (22):3499-511）、次に、本発明者らは、ｍＡｂ  １６Ｄ１０で一度チャレンジされた、ＳＯＪ−６細胞中の本キナーゼの発現レベルに着目した。総ＧＳＫ−３βの発現は一定であったが、ｍＡｂ  １６Ｄ１０とのインキュベーションによる細胞のインキュベーションにおいて、ホスホ−ＧＳＫ−３β（不活性形態）の減少を観察した（図１１）。同時に、これらの結果は、ｍＡｂ  １６Ｄ１０による細胞の処理がＧＳＫ−３βの活性化を誘導し、それがサイクリンＤ１の分解を導き、Ｇ１／Ｓ相中の細胞停止を生じることを示唆する。
【０１８７】
実施例６−膜ラフト構造の組織崩壊は、ｍＡｂ  １６Ｄ１０の抗増殖効果を低下させる
いくつかの研究は、ＢＳＤＬがヒト膵臓のＳＯＪ−６腫瘍細胞表面のラフト脂質ドメインと関連することを示している（Aubert-Jousset et al., 2004 Structure, 12 (8):1437-47）。多くのシステムにおいて、脂質ラフトの役割に対処するために、文書で十分に立証されている薬剤を用いた膜脂質ドメインの薬理学的操作が使用されている。この目的で、本発明者らは、それぞれ膜ラフト中のコレステロールを激減させ、またはコレステロールを抑制すると述べられている薬剤、メチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）およびフィリピンを使用した（Chen et al., 2002 J Biol Chem.;277（51）:49631-7）。図１２Ａで例証されるように、メチル−β−シクロデキストリンおよびフィリピン存在下において、ｍＡｂ  １６Ｄ１０の抗増殖性効果は低下した。
【０１８８】
スフィンゴ脂質もまたラフト構造に関与する。したがって、本発明者らは、（グリコ）スフィンゴ脂質生合成代謝阻害剤を使用した（Aubert-Jousset et al., 2004）。効果的な濃度（１０μＭ）で試験したが、Ｌ−シクロ−セリン（ＬＣＳ）（セリンパルミトイル基転移酵素の阻害剤）およびフモニシン１または２（どちらもジヒドロセラミドシンセターゼの阻害剤）のいずれもｍＡｂ  １６Ｄ１０の抗増殖性効果を妨げなかった（図１２Ｂ）。次に、本発明者らは、スフィンゴ脂質合成の最終段階に作用するスフィンゴ糖脂質合成の阻害剤であるフェニル−デカノイルイミノ−モルホリノ−プロパノール（ＰＤＭＰ）を試験した（Lefrancois et al., 2002, J Biol Chem. 277(19): 17188-99）。図１２Ｂに例証されるように、ＰＤＭＰは、ＳＯＪ−６細胞増殖に対するｍＡｂ  １６Ｄ１０の効果を損なった。これらの結果は、１６Ｄ１０抗原が、コレステロールに富むミクロドメインに局在しうること、この１６Ｄ１０抗原とこれらのラフトミクロドメインとのつながりがアポトーシスを誘導するのに必要でありうることを示す。しかし、これらのミクロドメインの新合成は、この経路に関連していないようであった。したがって、コレステロールに富むミクロドメインの完全性は、膵臓腫瘍細胞表面に１６Ｄ１０抗原が存在するための必要条件である。
【０１８９】
実施例７−ｍＡｂ  １６Ｄ１０は、Ｅ−カドヘリン発現およびＳＯＪ−６細胞中のβ−カテニン局在を調節する
Roitbak et al. (2005)は、β−カテニンおよびＥ−カドヘリン複合体が、ヒト腎臓上皮細胞中の脂質ラフトマーカー、カベオリン−１と関連することを示した。これらの分子は、これらの脂質ラフトドメインにシグナル伝達の役割を付与しうる。免疫ブロット法を実施して、膵臓腫瘍細胞によるＥ−カドヘリンおよびβ−カテニンの発現を調べた。図１３で例証されるように、ｍＡｂ  １６Ｄ１０で処理したＳＯＪ−６細胞からの溶解産物は、無関連ＩｇＭで処理した細胞とは対照的に、高いＥ−カドヘリンタンパク質発現を示す。ｍＡｂ  １６Ｄ１０処理に応じた、ＳＯＪ−６細胞の細胞膜におけるＥ−カドヘリンの過剰発現を免疫蛍光顕微鏡の観察により実証し、ＳＯＪ−６細胞を、ｍＡｂ  １６Ｄ１０存在下または不在下で２４時間処理し、洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定して、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡおよび０．０５％サポニンで飽和し、さらに、一次抗体（抗Ｅ−カドヘリン、抗β−カテニン、抗ホスホ−β−カテニン）、続いて二次抗体ＦＩＴＣ  ４８８ｎｍまたはＡｌｅｘａ  ５９４  ｎｍでインキュベートした。ｍＡｂ  １６Ｄ１０で処理したか、または処理していないＰＡＮＣ−１細胞は、それらの細胞膜にＥ−カドヘリンを発現しなかった（データ示さず）。この結果は、Ｅ−カドヘリンの過剰発現が、細胞表面における１６Ｄ１０抗原の存在、およびｍＡｂ  １６Ｄ１０での処理に依存することを示唆する。しかしながら、ｍＡｂ  １６Ｄ１０は、β−カテニンの発現に顕著な変化を誘導しなかった（図１３）。
【０１９０】
次に、ｍＡｂ  １６Ｄ１０を用いた処理がβ−カテニンの局在に影響するかどうかを判定するために、蛍光顕微鏡分析を実施した。ｍＡｂ  １６Ｄ１０によるＳＯＪ−６細胞の処理後には、β−カテニンは細胞質ゾル区画に見られたが、未処理細胞ではそれは細胞膜に局在した。いくつかの研究は、、Ｗｎｔシグナル伝達不在下では、β−カテニン残基のリン酸化が、このタンパク質をユビキチン依存性プロテアソーム経路による分解に向かわせることを示している（Aberle et al., 1997 EMBO J. 16 (13): 3797-804およびOrford et al., 1997 Biol Chem. 272(40): 24735-8）。実際に、β−カテニンはｍＡｂ  １６Ｄ１０で処理した細胞内でリン酸化され（図１３）、それはβ−カテニンが核に転位してサイクリンＤ１などの標的遺伝子を活性化することができず、代わりに分解されることを示唆する。さらに、β−カテニンは、ＧＳＫ−３βにより調節され、ｍＡｂ  １６Ｄ１０で処理されると、それ自体が細胞内で活性化されうる（図１１）。これらの結果は、本発明者らの以前の実験が、ｍＡｂ  １６Ｄ１０がＧ１／Ｓ期において細胞周期停止を引き起こすことを示すことを確認する。これらの結果は、ｍＡｂ  １６Ｄ１０が、ヒト膵臓腫瘍細胞中においてβ−カテニンを不活性化し、Ｅ−カドヘリンの発現を直接または間接的に回復することを示す。最後に、本発明者らは、ラフトミクロドメイン中のＥ−カドヘリン、β−カテニン、および１６Ｄ１０抗原の結合が、ｍＡｂ  １６Ｄ１０がアポトーシスを誘導するのに必要かどうかを調べることを所望した（図１３）。
【０１９１】
実施例８−ＳＯＪ−６は１６Ｄ１０によって認識される抗原を発現するが、ＰＡＮＣ−１細胞は発現しない
本明細書で実証されるように、抗体１６Ｄ１０は、ＳＯＪ−６細胞中で細胞成長を阻害できるが、ＰＡＮＣ−１細胞中では阻害できない。フローサイトメトリー実験を実施して、１６Ｄ１０によって認識される抗原が細胞表面に見られるかどうかを調査した。ＳＯＪ−６およびＰＡＮＣ−１細胞それぞれを表す図１４および１５に結果を示す。図１４において、抗体１６Ｄ１０はＳＯＪ−６細胞上に存在する抗原に結合することを見出し、図１５において、抗体１６Ｄ１０はＰＡＮＣ−１細胞上に存在する抗原に結合しなかった。各例において、１６Ｄ１０結合を陰性対照および対照マウスＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ）と比較した。ｘ軸は蛍光強度を示し、ｙ軸はカウントを示す。
【０１９２】
実施例９−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中における二価の１６Ｄ１０キメラ抗体の生成
マウス１６Ｄ１０抗体のＶＨおよびＶＬ鎖に対応するｃＤＮＡを、ハイブリドーマＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅によって得た。Ｈ：ＶＨおよびＣＨ１領域を増幅してクローン化し、配列決定してヒトＩｇＧ１−ＦｃとインフレームでＣＯＳ−ｆｃ−結合ベクターにサブクローン化した。Ｌ：ＶＬおよびＣｋ領域を増幅してクローンし、配列決定してｐｃＤＮＡ３発現ベクターにサブクローン化した。
【０１９３】
マウス１６Ｄ１０抗体の可変（Ｆａｂ２’様）領域、およびヒトＩｇＧ１抗体の定常（Ｆｃ）領域を含んでなるキメラ抗体を生成した。この抗体をｒｅｃ１６Ｄ１０と称する。抗体を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内において、（９５８ＣＯＳ−Ｆｃ−結合−ＶＨ−１６Ｄ１０およびｐｃＤＮＡ３−ＶＬ−１６Ｄ１０ベクターの同時形質移入によって）一過的に、または（ｐｃＤＮＡ６−Ｆｃ−ＶＨ−１６Ｄ１ＯおよびｐｃＤＮＡ３−ＶＬ−１６Ｄ１０ベクターを使用した同時形質移入によって）安定的に、生成した。生成した抗体の純度および収率を、Ｐｒｏｔ−Ａ精製後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認し、活性をＳＯＪ−６細胞におけるＦＡＣＳによって確認した。図１６、１７を参照されたい。
【０１９４】
ＩｇＭ  １６Ｄ１０抗体およびキメラｒｅｃ１６Ｄ１０をそれぞれトリプシンと共にインキュベートしてＳＯＪ−６細胞への結合に対するその効果を調査した。トリプシンが両方の抗体の細胞への結合を実質的に低下させることを見出した。
【０１９５】
実施例１０−ＩｇＭ  １６Ｄ１０の内部移行
共焦点顕微鏡を用いるパルスチェイス実験を使用して、培養液中におけるＩｇＭ  １６Ｄ１０抗体との生存細胞との相互作用を評価した（パルス：４℃で３０分；チェイス：培養液中３７℃で０または２時間）。実質的に全てのｍＡｂが２時間以内に内部移行したことを観察した。ｍＡｂのフラクションはＬＡＭＰ１と共に共局在した。
【０１９６】
実施例１１−細胞増殖に対する抗体の効果
ＩｇＭ抗体１６Ｄ１０およびキメラ抗体ｒｅｃ１６Ｄ１０のＳＯＪ−６細胞増殖に対する効果を調べた。細胞を抗体なし、様々な量の１６Ｄ１０またはｒｅｃ１６Ｄ１０抗体、または無関連ＩｇＧ抗体の培養中でインキュベートした。抗体１６Ｄ１０が、細胞増殖を、２５または５０μｇ／ｍｌのいずれかにおいて約５０％低下させたのに対し、ｒｅｃ１６Ｄ１０は、増殖を、２５および５０μｇ／ｍｌにおいて、それぞれ２０％より多く、および３５％より多く、低下させた（図１８）。したがって、Ｒｅｃ１６Ｄ１０および１６Ｄ１０ＩｇＭのいずれもＳＯＪ−６増殖における直接否定的な効果を及ぼした。
【０１９７】
実施例１２−ｒｅｃ１６Ｄ１０がＮＫ細胞（ＡＤＣＣ）を活性化する能力の試験
キメラ抗体ｒｅｃ１６Ｄ１０（３０μｇ／ｍｌ）を、標的ＳＯＪ−６細胞と、ＮＫ細胞と共に、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）（図１９）による一晩の処理の存否でインキュベートした。対照として、リツキサン抗体（１０μｇ／ｍｌ）を、標的Ｂ２２１細胞と共に使用した。エフェクター細胞および標的細胞を、１／１（１０００００ＮＫ／ウェル）の比率で使用した。２つのドナーに由来する溶解し、精製したＮＫ細胞（ＮＫ１およびＮＫ２）を、抗体および標的細胞と共にインキュベートした。ＣＤ１０７染色およびＩＦＮ−γ分泌によりＮＫ細胞の活性化を調べた。ＩＬ−２処理後、ＳＯＪ−６細胞存在下で、ｒｅｃ１６Ｄ１０は、（抗体なしまたはリツキサン存在の対照中の＜３０％および＜２０％に対して）それぞれおよそ５３％および４５％のＮＫ１およびＮＫ２細胞中でＣＤ１０７陽性染色を誘導した（図２０）。同様の条件下で、約３０％のＮＫ１およびＮＫ２細胞は、（それぞれ抗体の不在下またはリツキサンありのＮＫ１およびＮＫ２細胞中の１６％および１３％未満に対して）ＩＦＮ−γを分泌した（図２１）。これらの結果は、（ヒトＩｇＧのＦｃ部分を有する）二価の抗体ｒｅｃ１６Ｄ１０は標的細胞の存在下でＮＫ細胞を効果的に活性化でき、それにより標的細胞の細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）を誘導できることを実証する。
【０１９８】
実施例１３−ＩｇＭ  １６Ｄ１０およびＩｇＧ  ｒｅｃ１６Ｄ１０抗体の組織特異性
ＩｇＭ  １６Ｄ１０およびキメラＩｇＧ  ｒｅｃ１６Ｄ１０抗体の染色特異性を、様々な健康な組織のそれらの各染色を調べることにより評価した。ＩｇＭ抗体１６Ｄ１０は、扁桃、唾液腺、末梢神経、眼、骨髄、卵巣、卵管、副甲状腺、前立腺、脾臓、腎臓、副腎、精巣、胸腺、尿管、子宮、および膀胱をはじめとする多くの組織において陽性染色を示した。対照的に、キメラ抗体ｒｅｃ１６Ｄ１０を用いた染色は、これらの健康な各組織に対して陰性であった。したがって、キメラＩｇＧ抗体ｒｅｃ１６Ｄ１０は、非特異的交差反応性の欠如に関してＩｇＭ抗体１６Ｄ１０よりも優れている（図２２）。
【０１９９】
実施例１４−１６Ｄ１０およびｒｅｃ１６Ｄ１０の固定化したＳＯＪ−６細胞への結合
予備ＦＡＣＳ実験において、レギュラーの１６Ｄ１０ｍＡｂ染色は、固定化したＳＯＪ−６細胞において安定しているように見えることを観察し、このことはＩｇＭ形態が良好な結合活性で細胞表面抗原に結合することを示す。二価の１６Ｄ１０形態では、細胞表面結合は安定性がより低く、平均半減期は約８０分であった。これまでにイネイト・ファルマ（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）で研究されている抗体のほとんどが５×１０５〜５×１０６Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ結合速度定数を有することを考慮すると、組み換え１６Ｄ１０抗体二価の親和力は治療用抗体の工業開発に適合するナノモル濃度程度（例えば、１０〜１ｎＭ）であることを推定できる。
【０２００】
実施例１５−組み換え１６Ｄ１０  ＩｇＧ１を使用したＳＯＪ−６細胞アポトーシスの誘導
予備実験において、２時間の培養後のアネキシンＶおよびアネキシンＶ／ＰＩ染色により評価されるごとく、二価のキメラ組み換え１６Ｄ１０抗体がＳＯＪ−６細胞のアポトーシスを誘導できることを観察した。１６Ｄ１０のＩｇＧ１およびＩｇＭの形態のいずれもＳＯＪ−６細胞のアポトーシスを誘導した。２つの抗体のアポトーシス活性をツニカマイシン、および処理なしの対照と比較した。結果を図２３に示す。
【０２０１】
本明細書で引用した全ての公報および特許出願は、それぞれの各公報または特許出願が参照によって具体的に個々に援用されたとおり、その内容全体を参照によって本明細書に援用したものとする。
【０２０２】
前述の発明は、明確な理解のために例示および実施例によりある程度詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲の精神と範囲を逸脱することなく、それに特定の変更および修飾を加えてもよいことは、本発明の教示に照らして当業者には容易に明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年2月4日(2010.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010532976000001.app
【国際調査報告】
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