(57)【要約】本発明は、イオンチャネルタンパク質を過剰発現する組み換え細胞株も検出標識も使用することなくイオンチャネルのモジュレータを識別する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオンチャネルのアンタゴニストまたはアゴニストを識別する方法であって、
（ａ）比色共鳴反射光バイオセンサの表面上の第一の位置と第二の位置に細胞を適用すること；
（ｂ）試験試薬を前記第一の位置に適用すること；
（ｃ）前記第二の位置に細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストを適用すること；及び
（ｄ）前記第一の位置に関しては比色共鳴反射光第一ピーク波長値（ｐｅａｋ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｖａｌｕｅ：ＰＷＶ）と、前記第二の位置に関しては第二のＰＷＶを検出すること、
を含み、
ここで第一及び第二のＰＷＶが同一または類似であれば、試験試薬はイオンチャネルのアンタゴニストまたはアゴニストであり；第一及び第二のＰＷＶが実質的に異なれば、試験試薬はアンタゴニストでもアゴニストでもない、前記方法。
【請求項２】
前記第一の位置に細胞を適用後；前記第一の位置に試験試薬を適用後；前記第二の位置に細胞を適用後；既知のイオンチャネルアンタゴニスト若しくはアゴニストを前記第二の位置に適用後；またはこれらの組み合わせの後、前記細胞を一定期間インキュベートする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＷＶは、約２マイクロメートル〜約２００マイクロメートルの下限ピクセルサイズをもつレンズを備えたスキャナを使用して検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記比色共鳴反射光バイオセンサ表面上の前記第一の位置と第二の位置は、マイクロタイターウェル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿、ミクロフルイドチャネル及びマイクロアレイからなる群から選択される容器の内部表面である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞、試験試薬及びイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストは、検出標識を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
約２５、３０または３７℃の温度で前記方法を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
イオンチャネルのモジュレータを識別する方法であって、
（ａ）比色共鳴反射光バイオセンサの表面上の第一の位置に細胞、試験試薬及び細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストを適用すること；
（ｂ）前記第一の位置に関して第一のＰＷＶを検出すること；
（ｃ）比色共鳴反射光バイオセンサ表面上の第二の位置に、細胞と細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストを適用すること；及び
（ｄ）前記第二の位置に関して第二のＰＷＶを検出すること；
を、含み、
ここで第一及び第二のＰＷＶが異なっていれば、試験試薬はイオンチャネルのモジュレータであり；第一及び第二のＰＷＶが同一または類似であれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータではない、前記方法。
【請求項８】
前記第一の位置に細胞を適用後；前記第一の位置に試験試薬を適用後；前記第一の位置に既知のイオンチャネルアンタゴニスト若しくはアゴニストを適用後；前記第二の位置に細胞を適用後；前記第二の位置に既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストを適用後；またはこれらの組み合わせの後、前記細胞を一定期間インキュベートする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＷＶは、約２マイクロメートル〜約２００マイクロメートルの下限ピクセルサイズをもつレンズを備えたスキャナを使用して検出する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
比色共鳴反射光バイオセンサ表面上の前記第一の位置と第二の位置は、マイクロタイターウェル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿、ミクロフルイドチャネル及びマイクロアレイからなる群から選択される容器の内部表面である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞、試験試薬及びイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストは、検出標識を含まない、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
約２５、３０または３７℃の温度で前記方法を実施する、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、本明細書中、その全体が参照として含まれる、２００７年７月１１日出願の米国シリアル番号第６０／９４９，１４２号の恩典を主張する。
【０００２】
技術分野
イオンチャンネルは、薬学及び生命工学業界、特に心臓、肺及び胃腸の健康分野での最も大きな種類の治療標的の一つを構成する。細胞の内外へイオン流動を制御する際に関与するタンパク質の治療的標的化（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）は患者の健康に劇的な効果がある。イオンチャンネル標的を調節するその能力に関して化合物を試験するのは困難であり、時間の浪費となることがある。パッチクランプアッセイ（ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ  ａｓｓａｙ）は、イオンチャンネルモジュレータの生物学的作用の非常に高感度の測定法である。しかしながらパッチクランプ法は複雑であり、試験化合物の処理量が少ない。
【０００３】
イオンチャンネル活性を分析する他の方法では、細胞内のイオンチャンネルまたはその一部の組み換え発現及び／または蛍光若しくは放射性標識の使用が必要である。有用ではあるが、これらの試みはチャンネル機能のごく一部だけを標的とする薬剤の利用に限られている。さらに組み換えイオンチャンネルは、体内細胞内と同じようには機能しないかもしれない。
【０００４】
本発明の方法は、薬剤として有用かもしれない試験化合物に対する特異的な応答に関し細胞を操作することなく、親（非組み換え）細胞系の効率的な高処理量、標識を含まないスクリーニングを可能にする。
【発明の概要】
【０００５】
一態様において、本発明はイオンチャンネルのアンタゴニストまたはアゴニストを識別する方法を提供する。本方法は、比色共鳴反射光バイオセンサ（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）の表面上の第一の位置と第二の位置に細胞を適用すること、及び試験試薬を前記第一の位置に適用することを含む。細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストを前記第二の位置に適用する。前記第一の位置に関しては比色共鳴反射光第一ピーク波長値（ｐｅａｋ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｖａｌｕｅ：ＰＷＶ）と、前記第二の位置に関しては第二のＰＷＶを検出する。もし第一と第二のＰＷＶが同一または類似であれば、試験試薬はイオンチャネルのアンタゴニストまたはアゴニストである。もし第一と第二のＰＷＶが異なれば、試験試薬はアンタゴニストでもアゴニストでもない。前記細胞は、第一の位置に適用された後；前記第一の位置に試験試薬を適用後；前記第二の位置に細胞を適用後；既知のイオンチャネルアンタゴニスト若しくはアゴニストを第二の位置に適用後、またはこれらの組み合わせの後、一定期間インキュベートすることができる。ＰＷＶは、約２マイクロメートル〜約２００マイクロメートルの下限ピクセルサイズをもつレンズを備えたスキャナを使用して検出することができる。比色共鳴反射光バイオセンサ表面上の前記第一の位置と第二の位置は、マイクロタイターウェル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿、ミクロフルイドチャネル及びマイクロアレイからなる群から選択される容器の内部表面であり得る。前記細胞、試験試薬及びイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストは、検出標識を含まなくてもよい。本方法は、約２５、３０または３７℃の温度で実施することができる。
【０００６】
本発明の別の態様では、イオンチャンネルのモジュレータを識別する方法を提供する。本方法は、比色共鳴反射光バイオセンサの表面上の第一の位置に細胞を適用すること、及び試験試薬と細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストを前記第一の位置に適用することを含む。第一のＰＷＶを前記第一の位置に関して測定する。細胞を比色共鳴反射光バイオセンサの表面の第二の位置に適用し、細胞の既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを第二の位置に適用する。第二のＰＷＶを第二の位置に関して測定する。もし第一及び第二のＰＷＶが異なれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータである。第一及び第二のＰＷＶが同一または類似であれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータではない。前記細胞は、第一の位置に適用された後；前記第一の位置に試験試薬を適用後；細胞を前記第二の位置に適用後、前記第二の位置に既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストを適用後、またはこれらの組み合わせの後、一定期間インキュベートすることができる。ＰＷＶは、約２マイクロメートル〜約２００マイクロメートルの下限ピクセルサイズをもつレンズを備えたスキャナを使用して検出することができる。比色共鳴反射光バイオセンサ表面上の前記第一の位置と第二の位置は、マイクロタイターウェル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿、ミクロフルイドチャネル及びマイクロアレイからなる群から選択される容器の内部表面であり得る。前記細胞、試験試薬及びイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストは、検出標識を含まなくてもよい。本方法は、約２５、３０または３７℃の温度で実施することができる。
【０００７】
本発明のさらに別の態様では、イオンチャンネルのモジュレータを識別する方法を提供する。本方法は、比色共鳴反射光バイオセンサの表面上の第一の位置に細胞を適用すること、及び前記第一の位置に関してＰＷＶを検出することを含む。試験試薬は第一の位置に適用する。第二のＰＷＶは第一の位置に関して検出する。第一の値を測定し、ここで前記第一の値は、前記第一のＰＷＶと第二のＰＷＶとの間の差である。前記第一の値は対照試験と比較し、ここで対照試験は、比色共鳴反射光バイオセンサの表面の第二の位置に細胞を適用し、第二の位置に関して第三のＰＷＶを検出することを含む。細胞の既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを第二の位置に適用する。第二の位置に関して第四のＰＷＶを測定する。第二の値を決定し、ここで前記第二の値は、第二の位置の第三のＰＷＶと第四のＰＷＶとの差である。もし第一及び第二の値が同一または類似であれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータである。第一及び第二の値が異なっていれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータではない。
【０００８】
本発明のさらに別の態様では、イオンチャンネルのモジュレータを識別する方法を提供する。本方法は、比色共鳴反射光バイオセンサの表面上の第一の位置に細胞を適用すること、及び前記第一の位置に試験試薬に適用することを含む。第一のＰＷＶを前記第一の位置に関して測定する。細胞の既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを第一の位置に適用する。第二のＰＷＶを第一の位置に関して測定する。第一の値を決定し、ここで前記第一の値は第一のＰＷＶと第二のＰＷＶとの差である。細胞を比色共鳴反射光センサ表面の第二の位置に適用し、第三のＰＷＶを第二の位置に関して測定する。細胞の既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを第二の位置に適用する。第二の位置に関して第四のＰＷＶを測定する。第二の値を決定し、ここで第二の値は、第三のＰＷＶと第四のＰＷＶとの差である。もし第一及び第二の値が異なれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータである。第一及び第二の値が同一または類似であれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータではない。
【０００９】
本発明のさらに別の態様では、試験試薬がイオンチャンネルのモジュレータであるかを確認する方法を提供する。本方法は、比色共鳴反射光バイオセンサの表面上の第一の位置に細胞を適用すること、及び前記第一の位置に関して第一のＰＷＶを測定することを含む。細胞の既知のイオンチャンネルアゴニストまたはアンタゴニストと試験試薬を第一の位置に適用する。第二のＰＷＶを第一の位置に関して測定する。第一の値を決定し、ここで前記第一の値は第一のＰＷＶと第二のＰＷＶとの差である。細胞を比色共鳴反射光バイオセンサ表面の第二の位置に適用し、第三のＰＷＶを第二の位置に関して測定する。細胞の既知のイオンチャンネルアゴニストまたはアンタゴニストを第二の位置に適用し、第二の位置に関して第四のＰＷＶを測定する。第二の値を決定し、ここで第二の値は、第三のＰＷＶと第四のＰＷＶとの差である。もし第一及び第二の値が異なれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータであると確認される。第一及び第二の値が同一または類似であれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータではない。
【００１０】
本発明のさらに別の態様では、試験試薬がイオンチャンネルのモジュレータであることを確認する方法を提供する。本方法は、比色共鳴反射光バイオセンサの表面上の第一の位置に細胞を適用すること、及び前記第一の位置に細胞の既知のイオンチャンネルアゴニストまたはアンタゴニストと試験試薬を適用することを含む。第一のＰＷＶを前記第一の位置に関して測定する。細胞を比色共鳴反射光バイオセンサの表面上の第二の位置に適用し、細胞の既知のイオンチャンネルアゴニストまたはアンタゴニストを第二の位置に適用する。第二のＰＷＶを第二の位置に関して測定する。もし第一及び第二のＰＷＶが異なれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータであると確認される。
【００１１】
従って本発明は、イオンチャネルタンパク質を過剰発現する組み換え細胞株も、検出標識も使用することなくイオンチャネルのモジュレータを識別且つ確認する方法を提供する。
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
電位依存型ナトリウムチャンネル、電位依存型カルシウムチャンネル、カリウムチャンネル（たとえば内向き整流カリウムチャンネル、カルシウム−依存性カリウムチャンネル、電位依存型カリウムチャンネル及び、２細孔ドメイン（ｔｗｏ  ｐｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ）カリウムチャンネル）、一過性受容器電位チャンネル、精子のカチオンチャンネル、サイクリックヌクレオチド感受性チャンネル（ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ）（たとえば、サイクリックヌクレオチド感受性チャンネル及び過分極活性化サイクリックヌクレオチド感受性チャンネル）、２細孔チャンネル、リガンド依存性チャンネル及び、光依存性チャンネルなどのイオンチャンネルの幾つかの種類が知られている。
【００１３】
特定の薬品及び遺伝的疾患は、正常なイオンチャンネル機能に干渉し、疾患及び病気を引き起こす。イオンチャンネル機能を混乱させる薬品としては、たとえばリドカイン、ノボカイン、デドロトキシン、コノトキシン、サキシトキシン、テトロドトキシンが挙げられる。遺伝的疾患を制御するタンパク質またはイオンチャンネルサブユニットでの変異により生じる遺伝的疾患としては、幼児期の交代性片麻痺、バーター症候群、ブルガダ症候群、先天性インスリン過剰症、嚢胞性線維症、一過性運動失調、肢先端紅痛症、熱性発作を伴う全身発作、高カリウム性周期性四肢麻痺、低カリウム性周期性四肢麻痺、ＱＴ延長症候群、悪性高体温症、偏頭痛、重症筋無力症、先天性ミオトニー、神経ミオトニー、非症候性難聴、先天性パラミオトニア、周期性四肢麻痺、網膜色素変性症、ロマノ・ワード症候群、ＱＴ短縮性症候群、及びチモシー症候群が挙げられる。従って、イオンチャンネルを調節し得る試薬を発見することは、研究者にとって非常に重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一態様により、細胞変化がリアルタイムで起きる時に、比色共鳴反射バイオセンサを使用して、放射分析標識、比色標識も蛍光標識も含める必要なく、イオンチャンネルレギュレータに対する応答で細胞変化を直接検出することができる。細胞は試験試薬、アゴニスト及びアンタゴニストでプローブされるので、細胞における変化を検出することができる。次いで細胞変化は、ＢＩＮＤ  Ｓｃａｎｎｅｒ（商標）（即ち、比色共鳴反射バイオセンサシステム）などの高速装置及び、データを定量化するための対応するアルゴリズムを使用してリアルタイムで検出することができる。たとえば米国特許第６，９５１，７１５号及び米国特許公開（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｐｕｂｌ．）第２００４／０１５１６２６号参照されたい。この方法論、器具類及びコンピューター分析を組み合わせることによって、細胞変化はリアルタイムで、標識を使用しない方法で適切にモニターすることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
バイオセンサ
本発明のバイオセンサは比色共鳴反射バイオセンサである。たとえばＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら、“Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｓａｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ、第８１巻、３１６−３２８頁、２００２年１月５日；米国特許公開（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｐｕｂｌ．）第２００４／００９１３９７号を参照されたい。比色共鳴バイオセンサは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサではない。ＳＰＲバイオセンサは、銀、金、銅、アルミニウム、ナトリウム及びインジウムなどの薄い金属層をもつ。この金属は、好適な波長で光と共鳴し得る伝導帯電子を持たねばならない。光に暴露されたＳＰＲバイオセンサ表面は純粋な金属でなければならない。酸化物、硫化物及び他のフィルムはＳＰＲと干渉する。比色共鳴バイオセンサは金属層を持たない。むしろこれらはＴｉＯ2などの高屈折率材料の誘電体コーティングを有する。
【００１６】
格子ベースの導波管バイオセンサ（ｇｒａｔｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）は、たとえば米国特許第５，７３８，８２５号に記載されている。格子ベースの導波管バイオセンサは、導波フィルム（ｗａｖｅｇｕｉｄｉｎｇ  ｆｉｌｍ）と、回折した光野（ｌｉｇｈｔ  ｆｉｅｌｄ）を発生させるために入射光野を導波フィルムにインカップル（ｉｎｃｏｕｐｌｅ）する回折格子を含む。導波フィルムにおける有効屈折率の変化を検出する。デバイス内でかなりの距離を波が移動しなければならないデバイス、たとえば格子ベースの導波管バイオセンサは、本発明の空間分解能（ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）が不足している。
【００１７】
比色共鳴反射バイオセンサは、蛍光タグ、比色標識（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｌａｂｅｌ）も他のどんな種類の検出タグも検出標識も使用することなく、バイオセンサ表面で生化学的相互作用を測定することができる。バイオセンサ表面は、コリメート光及び／または白色光を照らすと、狭い波長帯だけを反射するように設計されている（共鳴回折作用：ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｇｒａｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）光学構造体を含む。この狭い波長帯は、波長「ピーク」と記載される。「ピーク波長値：ｐｅａｋ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｖａｌｕｅ」（ＰＷＶ）は、生物学的材料などの材料がバイオセンサ表面に付着またはここから除去されると変わる。読み取り装置を使用して、コリメート光及び／または白色光でバイオセンサ表面上の別個の位置を照らし、反射光を集める。集めた光は、ＰＷＶの検出用波長分光計に集める。
【００１８】
バイオセンサは、底部のないマイクロタイタープレートカートリッジの底部に構造体（バイオセンサを上にして）を結合させることによって、マイクロタイタープレートなどの標準的なディスポーザブル・ラボアイテム（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｔｅｍ）に組み込むことができる。一般的なラボフォーマットカートリッジにバイオセンサを組み込むことは、ミキサー、インキュベータ及び液体分配装置などの現行のマイクロタイタープレート取り扱い装置との互換性に関して望ましい。比色共鳴反射バイオセンサも、マイクロ流体、マクロ流体またはマイクロアレイ装置などに組み込むことができる（たとえば、米国特許第７，０３３，８１９号；同第７，０３３，８２１号参照）。比色共鳴反射バイオセンサは、従来（たとえば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｎ−Ｌｉｎ  Ｇｕａｎ編、第２９４号、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ参照）における周知の方法論を使用して、一つ以上の細胞外試薬に暴露したときにこれらの変化がないこと、または細胞の挙動上の変化をモニターすることができる。
【００１９】
比色共鳴反射バイオセンサは、サブ波長構造化表面（ｓｕｂｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ：ＳＷＳ）を含み、薄膜コーティングの作用を模倣し得る回折光学素子の新しい種類（ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｔｙｐｅ）である。（Ｐｅｎｇ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓ，“Ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｒａｔｉｎｇｓ，“Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ａ，第１３巻、第５号、９９３頁、１９９６年５月；Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、＆Ｗａｎｇ，”Ｎｅｗ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｉｌｔｅｒｓ，“Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，６１巻、第９号、１０２２頁、１９９２年８月；Ｐｅｎｇ＆Ｍｏｒｒｉｓ，”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｏｎａｎｔ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｒａｔｉｎｇｓ，“Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，第２１巻、第８号、５４９頁、１９９６年４月）。ＳＷＳ構造は、一次元、二次元または三次元格子を含み、ここで格子周期は入射光の波長と比較して小さいので、反射及び透過したゼロ次以外の回折次数は伝搬できない。横方向の導波モードの伝搬はサポートされない。むしろ、導波モード共鳴効果は、任意の光子がバイオセンサ構造内に入る点から約３ミクロンの非常に局在化した領域にわたって起こる。
【００２０】
比色共鳴反射バイオセンサの反射光または透過光は、特異的結合物質または結合パートナーまたはその両方などの分子をバイオセンサの上部表面に添加することによって調節することができる。添加された分子は、構造の中の入射放射光の光路長を拡大するので、最大反射または透過が起きる波長を変更する。
【００２１】
一態様において、白色光及び／またはコリメート光を照射したとき、比色共鳴反射光バイオセンサは、単一波長または狭い波長帯（共鳴格子効果：ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｇｒａｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）を反射するように設計されている。光は、上部または底部からバイオセンサを照射することができる。バイオセンサ表面上に物質が置かれていると、反射波長は、バイオセンサ上に示されている光の光路変化によりシフトする。
【００２２】
検出システムは、たとえば、ファイバー光学プローブなどを通って垂直入射（ｎｏｒｍａｌ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ）でバイオセンサの小さなスポットを照らす光源と、また垂直入射で第二のファイバー光学プローブなどを通って反射光を集める分光計とからなる。励起／検出系とバイオセンサ表面との間には全く物理的接触は起きないので、特別な結合プリズムは必要ではなく、バイオセンサは容易にマイクロタイタープレートなどの任意の一般的に使用されるアッセイプラットフォームに適合することができる。一回の分光計の読み取りは数ミリ秒で実施可能なので、バイオセンサ表面で平行して起きる多くの分子間相互作用を迅速に測定し、且つリアルタイムで反応速度をモニターすることが可能である。
【００２３】
比色共鳴反射バイオセンサは、たとえば高屈折率材料で構成される光回折格子、格子を支持する基板層と、場合により基板層と反対側の回折表面に固定化された一つ以上の特異的結合物質またはリンカーを含む。高屈折率材料は、基板層よりも高い屈折率を有する。たとえば米国特許第７，０９４，５９５号及び同第７，０７０，９８７号を参照されたい。場合によりカバー層は格子表面を覆う。一態様において、光回折格子の屈折率は、光学カバー層の屈折率よりも低くなり得る。光回折格子は、たとえば硫化亜鉛、二酸化チタン、酸化タンタル、窒化ケイ素及び二酸化ケイ素などの材料から構成され得る高屈折率誘電体膜でコーティングされる。光学的特徴を持つ格子の断面プロフィールは、「方形波」などの任意の周期的に繰り返す機能を含み得る。光回折格子はまた、線（一次元）、正方形、円、楕円（ｅｌｌｉｐｓｅ）、三角形、台形、正弦波、長円（ｏｖａｌ）、長方形及び六角形からなる群から選択される形状の繰り返しパターンを含むことができる。本発明の比色共鳴屈折率バイオセンサは、高屈折率材料でコーティングされているプラスチックまたはエポキシなどから構成される光回折格子も含み得る。層の厚さ（即ち、カバー層、生物学的材料、または光回折格子）は、上部表面上の追加の分子に対する共鳴波長感度を達成するために選択される。格子周期は、所望の波長における共鳴を達成するために選択される。
【００２４】
線形格子（即ち、一次元格子）は、照明光偏光が格子周期に対して垂直に配向される場合に共鳴特徴を有する。比色共鳴反射バイオセンサは、たとえば孔または正方形の六角形アレイなどの二次元格子も含むことができる。他の形状も同様に使用することができる。線形格子は同一ピッチ（即ち、高屈折率領域と低屈折率領域との間の距離）、周期、層の厚さ、及び六角形アレイ格子としての材料特性をもつ。しかしながら光は、光学構造体に共鳴的に結合するために、格子線に対して垂直に偏光させなければならない。従って、線形格子に対して垂直のその偏光軸で配向した偏光フィルターを照明光源とバイオセンサ表面との間に挿入しなければならない。照射光源のほんの一部だけが正確に偏光されるので、六角形格子（ｈｅｘａｇｏｎａｌ  ｇｒａｔｉｎｇ）と比較して等価量の共鳴反射光を集めるには、より長い積分時間が必要である。
【００２５】
光回折格子はまた、たとえば単一の一定高さの高屈折率領域がより低い屈折率カバー層に埋め込まれている「階段状（ｓｔｅｐｐｅｄ）」プロフィールも含むことができる。高い屈折率と低い屈折率との交互の領域により、バイオセンサの上部表面に平行な光学導波管を提供する。
【００２６】
本発明の比色共鳴反射バイオセンサはさらに、基板層と反対側の光回折格子の表面にカバー層を含むことができる。カバー層が存在する場合、一つ以上の特異的結合物質を格子の反対側のカバー層の表面に固定化する。好ましくは、カバー層は格子を含む材料よりも低い屈折率をもつ材料を含む。カバー層は、たとえばガラス（スピン−オンガラス（ＳＯＧ）を含む）、エポキシまたはプラスチックから構成することができる。
【００２７】
たとえば、バイオセンサの屈折率要件を満たす種々のポリマーは、カバー層に使用できる。ＳＯＧはその好ましい屈折率、取り扱い易さ、多様なガラス表面活性化法を使用して特異的結合物質で活性させ易いため、使用することができる。バイオセンサ表面の平面性が特定のシステム構築にとって問題ではない場合、ＳｉＮ／ガラスの格子構造は検出表面として直接使用することができ、ガラス表面上と同じ手段を使用してその活性化を実施することができる。
【００２８】
共鳴反射は、光回折格子上に平坦化カバー層を使用せずに得ることもできる。たとえば、バイオセンサは高屈折率材料の構造化された薄いフィルム層でコーティングされた基板だけを含むことができる。平坦化カバー層を使用することなく、周囲媒体（たとえば空気または水）は格子を充填する。従って、特異的結合物質は、上部表面だけではなく、特異的結合物質に暴露された光回折格子の全表面上でバイオセンサに固定される。
【００２９】
通常、本発明の比色共鳴反射バイオセンサは、全ての偏光角の光を含む白色光及び／またはコリメート光で照射する。バイオセンサ回折格子における反復特徴（ｒｅｐｅａｔｉｎｇ  ｆｅａｔｕｒｅ）に関する偏光角の配向は、共鳴波長を決定する。たとえば、反復する線及び空間のセットからなる「線形格子」（即ち、一次元格子）バイオセンサは、別々の共鳴反射を生み出し得る二つの光学偏光をもつだろう。線に対して垂直に偏光された光は、「ｓ−偏光」と呼ばれ、線に対して平行に偏光された光は「ｐ−偏光」と呼ばれる。入射光のｓ成分とｐ成分はいずれもフィルターを通していない照射ビーム中に同時に存在し、それぞれが個別の共鳴シグナルを発生する。バイオセンサは通常、たった一つの偏光（ｓ−偏光）の特性を最適化するために設計することができ、最適化されていない偏光は偏光フィルターで容易に除去される。
【００３０】
偏光依存性を除去するために、全ての偏光角が同一共鳴反射スペクトルを生成するように、同心円状のリングセット（ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｒｉｎｇｓ）からなる交互バイオセンサ構造体を使用することができる。この構造において、それぞれの同心円状のリングの内径と外径との差は、格子周期の約半分と等しい。それぞれ連続するリングは、前のリングの内径よりも約１格子周期分大きい内径をもつ。同心円状のリングパターンは一つのセンサ位置−たとえばアレイスポット（ｓｐｏｔ）またはマイクロタイタープレートウェルを覆うように伸張する。それぞれ個別のマイクロアレイスポットまたはマイクロタイタープレートウェルは、その中を中心とする個別の同心円状のリングパターンをもつ。そのような構造の全ての偏光方向は同一断面プロフィールをもつ。同心円状のリング構造は、偏光非依存性を維持するために正確に中心に照射しなければならない。同心円状のリング構造体の格子周期は、共鳴反射光の波長よりも小さい。格子周期は約０．０１ミクロン〜約１ミクロンである。格子深度（ｇｒａｔｉｎｇ  ｄｅｐｔｈ）は約０．０１〜約１ミクロンである。
【００３１】
別の態様では、孔またはポストのアレイは、照射ビームを任意の特定のグリッド位置に集中させる必要なく、上記の同心円状の円構造体（ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｃｉｒｃｌｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）に密接に近づけるように配置される。そのようなアレイパターンは等しい角度で三つの方向から表面上に入射される三つのレーザービームの光学干渉により自動的に発生する。このパターンにおいて、孔（またはポスト）は密接に充填された六角形アレイの角を中心とする。孔またはポストもそれぞれの六角形の中心にある。そのような孔またはポストの六角形グリッド（ｈｅｘａｇｏｎａｌ  ｇｒｉｄ）は、同一断面プロフィールを「見る」三つの偏光方向をもつ。従って、六角形グリッド構造は、全ての偏光角の光を使用する等しい共鳴反射スペクトルを提供する。従って、不都合な反射信号成分を除去するのに偏光フィルターは必要ない。孔またはポストの周期は約０．０１ミクロン〜約１ミクロンであり得、深度または高さは約０．０１ミクロン〜約１ミクロンであり得る。
【００３２】
検出システムは、比色共鳴反射バイオセンサと、前記比色反射バイオセンサに光を向ける光源と、バイオセンサから反射した光を検出する検出器とを含み得る。一態様において、所定の閾値を超える肯定的な結果だけが検出を誘発するように、フィルターを適用して読み取り器具を単純化することは可能である。
【００３３】
本発明の比色共鳴反射バイオセンサのそれぞれの個別の位置（ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）における共鳴波長のシフトを測定することによって、どの個別の位置がその上に置かれた生物学的材料などをもつかを決定することが可能である。シフトの大きさを利用して、一つ以上の特異的結合物質と試験サンプルの結合パートナーとの間の化学的親和性と試験サンプル中の結合パートナー量などを決定することができる。
【００３４】
比色共鳴反射バイオセンサは二回以上照射することができる。一回目の測定では、バイオセンサ上に全く生物学的材料のないものを使用して、または表面上に細胞のあるものを使用するなど、バイオセンサの一つ以上の個別の位置の反射スペクトルを決定することができる。たとえば一つ以上の細胞、試験試薬、イオンチャンネルアゴニスト若しくはイオンチャンネルアンタゴニストをバイオセンサに適用後、またはインキュベーション期間若しくは洗浄段階後、第二、第三、第四または追加の測定で反射スペクトルを決定することができる。二回以上の測定間のピーク波長における差を使用して、たとえばバイオセンサ上の細胞の存在若しくは細胞の量、または細胞上の試験試薬、イオンチャンネルアゴニスト、若しくはイオンチャンネルアンタゴニストの活性を決定することができる。さらに、この照射法は、ピーク共鳴波長における僅かな変動をもつ領域となり得るバイオセンサ表面の小さな欠陥を制御することができる。本方法はまた、バイオセンサ上の細胞物質の濃度または密度を変動させることに関して制御することができる。
【００３５】
バイオセンサの表面
たとえば、物理的吸着または化学的結合により、一つ以上の細胞をバイオセンサ上に固定化することができる。細胞は非粘着性細胞でも粘着性細胞であってもよい。細胞は生来、一つ以上のイオンチャンネルまたは一つ以上のチャンネル成分を発現することができる。あるいは細胞は、組み換え的に一つ以上のイオンチャンネルまたはイオンチャンネル成分を発現することができる。細胞は哺乳類細胞、たとえばヒト細胞であり得る。
【００３６】
細胞は、特異的結合物質、たとえば核酸、ペプチド、タンパク質溶液、ペプチド溶液、コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリー由来の化合物を含む溶液、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｖフラグメント、小さな有機分子、ウイルス、ポリマー若しくは生物学的サンプルなどを介してバイオセンサ表面上に特異的に結合することができ、ここで前記特異的結合物質はバイオセンサ表面に固定化され、結合パートナーは細胞の表面上にある。あるいは、細胞は、細胞種が通常粘着性か非粘着性にかかわらず、バイオセンサ表面上で成長または場合により付着することができるので、必ずしもバイオセンサ表面に直接固定化する必要はない。
【００３７】
細胞はバイオセンサ表面の一つ以上の個別位置のアレイに配列することができ、前記表面はマルチウェルプレートの一つ以上のウェル内に存在し、マルチウェルプレートまたはマイクロアレイの一つ以上の表面を含む。セルのアレイは、表面が一つ以上の個別の位置を含み、それぞれが異なる細胞または異なる細胞量をもつように、マイクロウェルプレート内のバイオセンサ表面上に一つ以上の細胞を含む。たとえばアレイは、１、１０、１００、１，０００、１０，０００または１００，０００またはそれ以上の個別の位置を含み得る。かくして、マイクロウェルプレートまたはマイクロアレイの各ウェルは、その中にマルチウェルプレートの他のウェルから離れた一つ以上の個別の位置のアレイを含むことができ、これにより複数の異なるサンプルを一つのマイクロウェルプレート上で処理することができる。任意の一つのウェルの中の単数または複数種類のアレイは、同一マイクロタイタープレートの任意の他のマイクロタイターウェルに見いだされる単数または複数のアレイと同一でも異なっていてもよい。
【００３８】
細胞をバイオセンサ表面に固定化することは、たとえば以下の機能的リンカー：ニッケル基、アミン基、アルデヒド基、酸基、アルカン基、アルケン基、アルキン基、芳香族基、アルコール基、エーテル基、ケトン基、エステル基、アミド基、アミノ酸基、ニトロ基、ニトリル基、炭水化物基、チオール基、有機リン基、脂質基、リン脂質基またはステロイド基に結合することによって影響を受け得る。さらに、細胞は、物理的吸着、化学的結合、電気化学的結合、静電気的結合、受動的接着（ｐａｓｓｉｖｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）若しくは動的接着（ａｃｔｉｖｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）分子、疎水性結合若しくは親水性結合、及びイムノキャプチャー（ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ）法によりバイオセンサ表面に固定化することができる。表面を細胞付着及び／または成長させ易くするためにコーティングする方法は、細胞培養分野の当業者に公知であり、材料またはその誘導体、たとえばこれらに限定されないが、ポリ−Ｄ−リジン、フィブロネクチン、アクチン、インテグリン、アドヘリン（ａｄｈｅｒｉｎ）、カドヘリン、コラーゲン、ヒト血清、ウシ胎児血清、子牛血清、ラミニンまたは他の材料でバイオセンサをコーティングすることを含み得る。
【００３９】
本発明の一態様において、バイオセンサは、ニッケル基、アミン基、アルデヒド基、酸基、アルカン基、アルケン基、アルキン基、芳香族基、アルコール基、エーテル基、ケトン基、エステル基、アミド基、アミノ酸基、ニトロ基、ニトリル基、炭水化物基、チオール基、有機リン基、脂質基、リン脂質基またはステロイド基などのリンカーでコーティングすることができる。たとえば、アミン表面を使用して数種のリンカー分子を付着させることができるが、アルデヒド表面は、追加のリンカーを使用することなくタンパク質を直接結合させることができる。ニッケル表面を使用して、取り込まれたヒスチジン（ｈｉｓ）タグをも分子を結合することができる。ニッケル活性化表面をもつ「ｈｉｓ−タグ化」分子の検出は、当業界で公知である（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６８巻，４９０頁、１９９６年）。
【００４０】
リンカー及び特異的結合物質は、それぞれのウェルがその中に固定された同一リンカー及び／または特異的結合物質をもつように、バイオセンサ表面に固定化することができる。あるいは、それぞれのウェルは、リンカー及び／または特異的結合物質の異なる組み合わせを含むことができる。
【００４１】
細胞はバイオセンサ表面に固定化されたリンカーまたは特異的結合物質に特異的または非特異的に結合することができる。あるいは、バイオセンサ表面はリンカーも特異的結合物質ももたず、細胞は非特異的にバイオセンサ表面に結合することができる。
【００４２】
バイオセンサ上への一種以上の特異的結合物質またはリンカーの固定化は、特異的結合物質またはリンカーが濯ぎ手順によって洗い流されないように、且つ試験サンプルにおける細胞へのその結合がバイオセンサ表面により邪魔されないように実施する。種々のタイプのマイクロアレイ及びバイオセンサで使用するためにガラスまたはポリマーなどに特異的結合物質を共有結合するために、数種の異なる種類の表面化学方法論を実施した。一種以上の特異的結合部位を結合させるための正確な官能基を含むように、バイオセンサの表面調製は、バイオセンサ製造プロセスの不可欠な部分である。
【００４３】
一種以上の特異的細胞は、物理的吸着（即ち化学的リンカーを使用しない）によりまたは化学的結合（即ち、化学的リンカーを使用する）並びに電気化学的結合、静電気的結合、疎水性結合及び親水性結合によりバイオセンサ表面に付着させることができる。化学的結合によりバイオセンサ表面上に特異的な結合物質がより強固に付着し、表面に結合した分子の所定の配向及びコンフォメーションを提供することができる。
【００４４】
特異的結合物質のプラスチック、エポキシまたは高屈折率材料への固定化は、ガラスに対する固定化について本質的に記載したとおりに実施することができる。しかしながら、酸洗浄段階などの処理が、特異的結合物質が固定化されている材料に損傷を与えるような場合には、酸洗浄段階は削除することができる。
【００４５】
バイオセンサの使用法
本発明の一態様では、イオンチャンネルのモジュレータの識別法を提供する。イオンチャンネルのモジュレータは、イオンチャンネルの機能活性に影響を与える。機能活性における影響としては、イオンチャンネル活性の遮断または抑制が挙げられる。遮断または抑制は、イオンチャンネルの刺激剤の存在下、またはこれに応答して起きることができる。あるいはモジュレータは、イオンチャンネルの機能活性を促進または増進することができる。促進は、イオンチャンネルを遮断する分子の存在下で、またはこれに応答して起きることができる。本発明の方法は組み換え細胞と共に使用することができるが、イオンチャンネルタンパク質またはサブユニットを組み換え的に過剰発現する細胞は、本発明の方法で要求されていない。細胞は、比色共鳴反射光バイオセンサ表面の第一の位置に適用することができる。細胞はバイオセンサに固定化できるか、またはこれらは単にバイオセンサ表面上で成長することができる。場合により、細胞は、約１、５、１０、３０分若しくはそれ以上、または約１、２、５、２４、４８、３６時間若しくはそれ以上の間、本発明の方法の任意の段階でバイオセンサ表面でインキュベートすることができる。アッセイは、約２５、３０または３７℃の温度（または約２５〜３７℃の間の任意の範囲の温度）で実施することができる。
【００４６】
本発明の一態様において、イオンチャンネルのアンタゴニストまたはアゴニストを識別する方法を提供する。本方法は、比色共鳴反射光バイオセンサ表面上の第一の位置と第二の位置に細胞を適用することを含む。細胞は、第一の位置に細胞の第一のセットを適用したのと同時に、またはそれ以前若しくはそれ以後に、第二の位置に適用することができる。これらの細胞は、第一の位置に適用した細胞のセットと同一または異なる種類の細胞であり得る。試験試薬は、細胞を前記第一の位置に適用する前、細胞を前記第一の位置に適用するのと同時に、または細胞を前記第一の位置に適用した後に第一の位置に添加する。細胞の既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを第二の位置に加える。既知のイオンチャンネルアゴニストまたはアンタゴニストは、細胞を第二の位置に適用する前、細胞を第二の位置に適用するのと同時に、または細胞を第二の位置に適用した後に第二の位置に添加する。第一の位置に関して比色共鳴反射光第一のピーク波長値（ＰＷＶ）を検出し、及び第二の位置に関して比色反射光第二のＰＷＶを検出し、もし第一と第二のＰＷＶが同一または類似（ｓｉｍｉｌａｒ：ほぼ同一）であれば、試験試薬はイオンチャンネルのアンタゴニストまたはアゴニストである。第一の値及び第二の値が互いに約１ｎｍ以下であるとき、これらは同一または類似である。第一及び第二のＰＷＶが実質的に異なる（即ち、第一及び第二のＰＷＶが約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍを超えて異なる）場合、試験試薬はアンタゴニストでもアゴニストでもない。さらに追加のＰＷＶの一つは、本方法の段階または追加の前後で測定し、任意の他のＰＷＶと比較することができる。
【００４７】
本発明の別の態様では、イオンチャンネルのアンタゴニストまたはアゴニストの識別法を提供する。本方法は細胞を第一の位置に適用することを含む。ＰＷＶを第一の位置に関して測定することができる。試験試薬は第一の位置に適用する。細胞及び試験試薬は、所望により一定時間、インキュベートすることができる。第一の位置に関する第二のＰＷＶを測定することができる。第一の値を計算することができ、ここで第一の値は、前記第一のＰＷＶと第二のＰＷＶとの差である。第一の値は、対照試験と比較することができる。対照試験は、細胞を比色共鳴反射光バイオセンサ表面上の第二の位置に適用することを含み得る。細胞は所望により一定時間、インキュベートすることができる。これらの細胞は、細胞の第一のセットを前記第一の位置に適用するのと同時に、またはそれ以前若しくはそれ以後に、第二の位置に適用することができる。これらの細胞は、細胞のセットを第一の位置に適用するのと同一種の細胞または異なる細胞であり得る。第二の位置に関して第三のＰＷＶを測定することができる。細胞の既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを第二の位置に適用する。細胞は所望により一定時間、インキュベートすることができる。第二の位置に関して、第四のＰＷＶを測定することができる。第二の値を決定し、ここで第二の値は、第二の位置の第三のＰＷＶと第四のＰＷＶとの差であり得る。第一及び第二の値が同一または類似であれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータである。第一及び第二の値が互いに約１ｎｍ以下であれば、これらは同一または類似である。第一及び第二のＰＷＶが実質的に異なる（即ち、第一及び第二のＰＷＶが約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍを超えて異なる）場合、試験試薬はアンタゴニストでもアゴニストでもない。細胞から直接情報を得る標識を使用しない（ｌａｂｅｌ  ｆｒｅｅ）バイオセンサ法は、細胞を破壊しないので、細胞は数分、数時間または数日にわたって差を求めるために二回以上処理することができる。
【００４８】
当業界には多くの既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストがある。少数の例としては、カルシウムチャンネル遮断薬（たとえばニソルジピン（ｎｉｓｏｌｄｉｐｉｎｅ）、ニフェジピン（ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）、ニカルジピン（ｎｉｃａｒｄｉｐｉｎｅ）、ベプリジル（ｂｅｐｉｄｉｌ）、イスラジピン（ｉｓｒａｄｉｐｉｎｅ）、ニモジピン（ｎｉｍｏｄｉｐｉｎｅ）、フェロジピン（ｆｅｌｏｄｉｐｉｎｅ）、アンロジピネ（ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ）、ジルチアゼム（ｄｉｌｔｉａｚｅｍ）及びベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ））、カルシウムイオンチャンネルのモジュレータ（たとえば米国特許第２００５０２６７０８９号参照）、Ｎａ+イオンチャンネル調節化合物（米国特許第６，５７６，７９１号参照）、米国特許第７，１０１，８７７号；同第７，０５７，０５３号；同第２００７０００４７１８号；同第２００６０１９９８４８号；同第２００６１３５５３６号；同第２００５０１９２２０８号；同第２００５００２６９９３号；同第２００４００２９９３７号及び同第２００３０００８９０６号が挙げられる。
【００４９】
比色共鳴反射光バイオセンサ表面上の第一の位置及び第二の位置は、マイクロタイターウェル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿、ミクロ流体チャンネル及びマイクロアレイからなる群から選択される容器の内部表面であり得る。細胞、試験試薬及びイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストは、本発明のアッセイで検出標識を含む必要がない。
【００５０】
本発明の別の態様は、イオンチャンネルのモジュレータの識別法を提供する。細胞は、比色共鳴反射光バイオセンサ表面上の第一の位置に適用することができる。試験試薬及び細胞の既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを第一の位置に適用する。細胞、試験試薬及び細胞の既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを任意の順または同時にセンサ表面に添加することができる。第一の位置に関して第一のＰＷＶを検出することができる。細胞は、比色共鳴反射光バイオセンサ表面上の第二の位置に適用することができる。細胞は、第一のセットの細胞を第一の位置に適用するのと同時に、またはそれ以前若しくはそれ以後に、第二の位置に適用することができる。これらの細胞は、第一の位置に適用した細胞セットと同一または異なる細胞種であり得る。細胞の既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを第二の位置に適用する。細胞及び細胞の既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを任意の順または同時にバイオセンサ表面に適用することができる。第二の位置に関して、第二のＰＷＶを検出することができる。第一及び第二のＰＷＶが異なれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータである。第一及び第二の値が約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍを超えて離れている場合、これらの値は異なっている。第一及び第二のＰＷＶが同一または類似であれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータではない。第一及び第二の値が互いに約１ｎｍ以下であれば、これらの値は同一または類似である。
【００５１】
本発明の別の態様において、イオンチャンネルのモジュレータの識別法を提供する。本方法は、細胞を比色共鳴反射光バイオセンサ表面上の第一の位置に適用し、試験試薬を前記第一の位置に適用し、前記第一の位置に関して第一のＰＷＶを検出することを含む。細胞及び試験試薬は、任意の順または同時に第一の位置に適用することができる。細胞の既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを第一の位置に適用し、第一の位置に関して第二のＰＷＶを検出することができる。第一の値を決定し、ここで第一の値は第一のＰＷＶと第二のＰＷＶの差である。
【００５２】
本方法は、あるいは、比色共鳴反射光バイオセンサ表面上の第一の位置に細胞を適用し、細胞の既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを第一の位置に適用し、第一の位置に関して第一のＰＷＶを検出することを含む。細胞及び細胞の既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを任意の順または同時に第一の位置に適用することができる。次いで試験試薬を第一の位置に適用し、第一の位置に関して第二のＰＷＶを検出することができる。第一の値を決定し、ここで第一の値は、第一のＰＷＶと第二のＰＷＶとの差である。
【００５３】
細胞は、比色共鳴反射光バイオセンサ表面の第二の位置に適用する。これらの細胞は、細胞の第一のセットを第一の位置に適用するのと同時またはそれ以前若しくはそれ以後に、第二の位置に適用することができる。これらの細胞は、第一の位置に適用した細胞のセットと同一タイプまたは異なる細胞であり得る。第二の位置に関して第三のＰＷＶを検出することができる。細胞の既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを第二の位置に適用する。第二の位置に関して第四のＰＷＶを測定することができる。第二の値を決定し、ここで前記第二の値は第三のＰＷＶと第四のＰＷＶとの差である。第一の値と第二の値が異なれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータである。第一の値と第二の値が約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍまたはそれ以上離れていれば、これらの値は異なっている。第一の値と第二の値が同一または類似であれば、試験試薬はイオンチャンネルのモジュレータではない。第一の値と第二の値が互いに約１ｎｍ以内であれば、これらの値は同一または類似である。
【００５４】
細胞は、細胞を第一の位置に適用した後、試験試薬を第一の位置に適用した後、既知のイオンチャンネルアゴニスト若しくはアンタゴニストを第一の位置に適用した後、細胞を第二の位置に適用した後、既知のイオンチャンネルアンタゴニストまたはアゴニストを第二の位置に適用した後または、アッセイの間の任意の他の時点、またはこれらの組み合わせの後、一定期間インキュベートすることができる。
【００５５】
場合により、細胞は、比色共鳴反射光バイオセンサ表面上に細胞を適用した後；試験試薬を適用した後；イオンチャンネルアゴニスト若しくはアンタゴニストを適用した後；またはアッセイの間の任意の他の時点、またはそれらの組み合わせの後、一定期間インキュベートする。細胞を調べる標識を含まないバイオセンサ法は細胞を壊さないので、細胞は、数分、数時間、または数日にわたって差を求めるために二回以上処理することもできる。
【００５６】
本発明の別の態様は、試験試薬がイオンチャンネルのモジュレータであるかを確認する方法であって、細胞を比色共鳴反射光バイオセンサ表面上の第一の位置に適用し、場合により第一の位置に関して第一のＰＷＶを検出することを含む、前記方法を提供する。細胞の既知のイオンチャンネルアゴニスト若しくはアンタゴニストを第一の位置に適用し、試験試薬を第一の位置に適用する。既知のイオンチャンネルアゴニストまたはアンタゴニストと試験試薬とを、同時に第一の位置に適用することができるか、一方を他方の前に第一の位置に適用してもよい。第一の位置に関して第二のＰＷＶを検出することができる。第一の値を決定することができ、ここで第一の値は第一のＰＷＶと第二のＰＷＶとの差である。細胞を比色共鳴反射光バイオセンサ表面上の第二の位置に適用する。これらの細胞は、第一のセットの細胞を第一の位置に適用するのと同時に、またはそれ以前若しくはそれ以後に第二の位置に適用することができる。これらの細胞は、第一の位置に適用した細胞のセットと同種の細胞または異なる細胞であり得る。第二の位置に関して、第三のＰＷＶを決定することができる。細胞の既知のイオンチャンネルアゴニストまたはアンタゴニストを第二の位置に適用し、第二の位置に関して第四のＰＷＶを測定することができる。既知のイオンチャンネルアゴニストまたはアンタゴニストは、第一の位置で使用されたものと同一であるか、異なる既知のイオンチャンネルアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。第二の値を決定することができ、ここで第二の値は第三のＰＷＶと第四のＰＷＶとの差である。第一の値と第二の値が異なれば、試験試薬は、イオンチャンネルのモジュレータであると確認される。第一の値と第二の値が約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍまたはそれ以上離れていれば、これらの値は異なっている。
【００５７】
細胞は、バイオセンサに適用した後、試験試薬を適用した後、既知のイオンチャンネルアゴニスト若しくはアンタゴニストを適用した後、またはアッセイの任意の他の時点で、またはそれらの組み合わせの後で一定期間インキュベートすることができる。
【００５８】
化合物がいかなる方法でもイオンチャンネルを調節しないことを確認するために化合物をスクリーニングすることも有用である。イオンチャンネルに対する薬剤には、意図しない、不都合な作用が多くある。数種の薬剤は、その作用のため市場から排除された（たとえば、リズリン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）、ロロネックス（Ｌｏｒｏｎｅｘ）、プロプルシド（Ｐｒｏｐｕｌｓｉｄ）、レダックス（Ｒｅｄｕｘ）、ポンジミン（Ｐｏｎｄｉｍｉｎ）、ヒスマナル（Ｈｉｓｍａｎａｌ）、ポシコール（Ｐｏｓｉｃｏｒ）及びセルダン（Ｓｅｌｄａｎｅ））。従って、本発明の方法は、イオンチャンネルの非モジュレータ並びにイオンチャンネルのモジュレータを識別するのに有用である。
【００５９】
本発明の態様を用いて、イオンチャンネルの調整またはイオンチャンネルの不足が起きるときにその調整または不足を検出することができるので、評価するために放射分析、比色、蛍光標識または顕微鏡検査を組み込む必要性を回避できる。イオンチャンネルの調整により起きる細胞内の変化は、ラベルを用いない方法でリアルタイムで好都合にモニターすることができる。リアルタイムで検出すべき細胞変化に関しては、ＢＩＮＤ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（商標）、ＢＩＮＤ  Ｒｅａｄｅｒ（商標）及びＢＩＮＤ  Ｓｃａｎｎｅｒ（商標）（たとえば比色共鳴反射バイオセンサシステム）が設計され、データを定量化するために対応するアルゴリズムが開発された（米国特許第６，９５１，７１５号、米国特許出願公開（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌ．  Ｐｕｂｌ．）第２００４／０１５１６２６号参照）。
【００６０】
本発明の方法は、顕微鏡検査または比色／蛍光分析評価用に細胞も試薬も標識化する必要がなく、リアルタイムで同一集団の細胞で連続的で、複数の独立した読み取りが可能であり、迅速であり、最小の試薬使用（量及び種類の両方）しか必要でなく、組み換え細胞株の必要がなく、細胞の機械的操作が必要なく、及び計測装置内に細胞を流す必要がないので、好都合である。
【００６１】
標識を含まないバイオセンサ法は、細胞を破壊しないので、細胞または細胞のセットは、既知または試験化合物の処理の有無に関わらず、長期間連続的にまたは不連続的にモニターすることができる。本発明の方法により、数日間にわたってリアルタイムで同一集団の細胞の連続的モニタリングまたは複数の独立した読み取りが可能である。細胞の変化は、通常の培養環境（適切な媒体で静的）中、長時間にわたって適切にまたは客観的に定量することができる。本発明の方法はまた、それぞれの細胞または細胞集団から追加の細胞内データを得るために蛍光標識で相乗的に使用することが可能である。
【００６２】
細胞変化は、数回の時間周期にわたって一つの場所に関してＰＷＶを取得することによってモニターできる。あるいは細胞を保持する容器、たとえばマイクロタイタープレートウェルのスキャンは、数回の時間周期で実施することができる。本発明の一態様において、試験試薬は、経時で既知のイオンチャンネルモジュレータとそのＰＷＶパターンを比較することによって潜在的なイオンチャンネルモジュレータとして識別することができる。あるイオンチャンネルレギュレータを特定の細胞集団に添加すると、経時でＰＷＶは特定のパターンを示す。たとえばイオンチャンネルモジュレータを細胞に添加した後、ＰＷＶは特定の時間上昇して、次いで低下するかもしれない。経時でＰＷＶ値の同一パターンを示す試験試薬は、潜在的なイオンチャンネルレギュレータまたはモジュレータと識別することができる。
【００６３】
一つ以上の細胞をある場所、たとえば比色共鳴反射光バイオセンサ表面上のマイクロタイターウェルなどに適用することができる。容器（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）は一つの容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を指し、マイクロウェルプレートなどの容器の集合体ではない。所定の場所に関する比色共鳴反射光ピーク波長値（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｐｅａｋ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｖａｌｕｅ：ＰＷＶ）を検出する。一つ以上の細胞は、一定期間（たとえば１秒、３０秒、１、２、５、１０、２０、３０、４５分、１、２、５、１０時間以上）インキュベートすることができる。インキュベーション前またはインキュベーション後、またはインキュベーション前で且つインキュベーション後、一種以上の試験試薬、イオンチャンネルアゴニスト、及び／またはイオンチャンネルアンタゴニストを一つ以上の細胞に適用することができる。所定の場所に関する比色共鳴反射光波長ＰＷＶを二回目に検出することができる。細胞内の変化が起きるなら、光の反射波長は、全く変化が起きない場合の状況と比較してシフトする。第一のＰＷＶを第二のＰＷＶと比較することができる。ＰＷＶの変化は細胞内の変化を示すことができる。数回の時間周期にわたってＰＷＶを測定し、比較することができる。
【００６４】
バイオセンサ位置での細胞変化は、バイオセンサ表面のＰＷＶによって検出することができるか、または通常、顕微鏡、デジタルカメラ、慣用のカメラ、若しくはレンズベースの光学器械若しくは電子ベースの電荷結合素子（ＣＣＤ）法を使用する拡大若しくは非拡大する他の可視化装置を使用してモニターすることができる。
【００６５】
ＰＷＶにおける変化は、ＢＩＮＤ  Ｒｅａｄｅｒ（登録商標）、スキャナーまたはカートリッジスキャナを使用して測定することができる。ＢＩＮＤ  Ｒｅａｄｅｒ（登録商標）及びカートリッジスキャナの場合には、アッセイは約０．０００５〜８時間で完了することができる。
【００６６】
好ましくは、ＰＷＶを測定するスキャナのレンズ解像度は、約２〜約２００、約２〜約５０、または約２〜約１５マイクロメートルピクセルサイズである。本発明のアッセイは、約０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７または８時間未満で完了することができる。即ち、たとえば添加した試薬に応答する細胞変化は、時間的に効率よく測定することができる。
【００６７】
本明細書中に参照した全ての特許、特許出願及び他の化学的または技術的文書はその全体が参照として含まれる。本明細書中、説明的に記載された発明は、本明細書中に明確に開示されていない任意の単数若しくは複数の成分、単数若しくは複数の限定の非存在下でも好適に実施することができる。かくしてたとえば、本発明のそれぞれの場合において、「〜を含む」、「〜から本質的になる」及び「〜から本質的になる」なる用語はいずれも、その通常の意味を保持しつつ他の二つの用語のいずれかと置き換えることができる。使用された用語及び表現は説明の用語であり、限定するものではなく、そのような用語及び記載の使用において示され記載された全ての等価物またはその一部を除外する意図はないが、請求された本発明の範囲内で種々の変更が可能であることは理解される。従って本発明は、態様によって明確に開示されてきたが、本明細書中で開示された任意選択の特徴、変更及び概念の変形には当業者により再分類されることができ、そのような変更及び変形は、記載及び付記請求の範囲によって定義されるように本発明の範囲内であるとみなされる。さらに本発明の特徴または側面がマーカッシュグループまたは他の代替分類に関して記載される場合、当業者は、本発明がマーカッシュグループまたは他のグループの任意の個別のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されることを理解するだろう。
【国際調査報告】
2010532998.tif 000002