(57)【要約】本発明は、ＧＰ７３抗原と反応する対象における自己抗体を検出する方法を提供する。ＧＰ７３抗原に結合する、対象由来のサンプル中のＧＰ７３特異的自己抗体のレベルの増加は、対象における肝臓疾患の指標である。
2010520987.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ＧＰ７３タンパク質抗原を調製するステップと、
ｂ．前記抗原を対象からの生物学的サンプルと反応させるステップと、
ｃ．前記サンプル中の抗ＧＰ７３抗体を検出するステップ
とを含む、対象における抗ＧＰ７３抗体を検出する方法。
【請求項２】
対象におけるＧＰ７３特異的抗体のレベルを検出するための第１アッセイであって、
ａ．ＧＰ７３タンパク質由来のエピトープを有するポリペプチドを含む抗原を調製するステップと、
ｂ．前記抗原を前記対象からの生物学的サンプルと反応させるステップと、
ｃ．ＧＰ７３抗原に結合するサンプル中の前記抗体を検出するステップ
とを含む第１アッセイと；
第２の生物学的マーカーのレベルを検出するための第２アッセイ
とを含む、肝臓疾患を有することが疑われる対象を診断するための２つ以上の生物学的マーカーを検出するパネル分析法。
【請求項３】
前記第２アッセイが、サンプル中のＣＯＭＰのレベルを測定するためのＣＯＭＰアッセイである、請求項２に記載のパネル分析法。
【請求項４】
前記第２アッセイが、サンプル中のＧＰ７３抗原のレベルを測定するためのＧＰ７３抗原アッセイである、請求項２に記載のパネル分析法。
【請求項５】
前記第２アッセイが、サンプル中のＡＦＰのレベルを測定するためのＡＦＰアッセイである、請求項２に記載のパネル分析法。
【請求項６】
サンプル中のＧＰ７３抗原のレベルを測定するＧＰ７３抗原アッセイをさらに含む、請求項３に記載のパネル分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫の技術分野に属し、対象における肝臓疾患を診断およびモニタリングするためのＧＰ７３特異的自己抗体の検出および定量に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は肝臓の原発性悪性腫瘍であり、アメリカ合衆国および他の西欧先進諸国において発症率が増加しているようである。世界中のＨＣＣの有病率はウイルス性肝炎の有病率に匹敵し、大部分の症例はＢ型肝炎（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎（ＨＣＶ）と関連している。Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、もしくは遺伝性ヘモクロマトーシスを有する、長年に渡る慢性肝炎または肝硬変に罹患している患者は、ＨＣＣを発病するリスクが非常に高いことが認識されてきた。長年に渡るアルコール性肝硬変に罹患している患者もまた、このタイプの悪性腫瘍を発病するリスクがある。
【０００３】
しかしながら、ＨＣＣを発病する患者のほとんどは、長年に渡る肝臓疾患に関連する症状以外の症状を示さないので、肝細胞癌の診断は極めて難しい。腹部の痛み、体重減少、早期満腹感、黄疸、および上腹部の触診できる塊などの症状が一旦発生すると、ＨＣＣは、有効な治療を行うには遅すぎる段階にまで進行している可能性が非常に高い。その結果、現在の診断後の生存期間中央値は、およそ６〜２０ヶ月に過ぎない。
【０００４】
現在の臨床方法は、いくつかの点で、ＨＣＣの早期診断には効果的ではない。ほとんどのＨＣＣは、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴ）スキャンまたは超音波スキャンを画像化した結果に基づいて、まず疑われる。しかしながら、肝臓の画像は、感度および確度が低いために、無病誤診率が高い。したがって、診断は多くの場合、侵襲的な針生検を実施することにより確定されなければならない。
【０００５】
一般的に用いられている別の診断方法は、胎児の肝細胞により合成される正常な血清タンパク質である、アルファ‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血中レベルに基づく。これは多くの場合、慢性Ｂ型肝炎または慢性Ｃ型肝炎および肝硬変に罹患した患者のスクリーニングの一部として測定される。ＡＦＰレベルの増加とＨＣＣの発症との間には十分な相関関係があるので、ＡＦＰレベルの測定は多くの場合、この病気の血清マーカーとして含まれている。しかしながら、ＡＦＰレベルの増加はＨＣＣに特異的ではないので、ＨＣＣの単独指標としてのＡＦＰは多くの場合、ＨＣＣを診断するには有用性が非常に限定されている。すべてのＨＣＣ患者がＡＰＦレベルの増加を示すわけではないという事実によって、事態はさらに複雑になる。実際、ＨＣＣに罹患した患者の約７０％のみがＡＦＰレベルの増加を示すことが示された。
【０００６】
このように、ＨＣＣの早期検出のための改善された診断アッセイに対する必要性が存在する。したがって、本発明は、ＧＰ７３特異的自己抗体とＨＣＣとの間の強い相関関係を示すアッセイに関し、これは、ＨＣＣのモニタリングおよび診断のための生物学的マーカーとして用いることができる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＧＰ７３特異的自己抗体を検出する方法を提供する。１つの実施形態において、本方法は、ＧＰ７３タンパク質に由来するエピトープを有するポリペプチドを含むＧＰ７３抗原を調製するステップと、ＧＰ７３抗原を対象からのサンプルと反応させるステップと、ＧＰ７３抗原に結合するサンプル中のＧＰ７３特異的自己抗体を検出するステップとを含む。本方法は、肝臓疾患、特にＨＣＣに罹患していることが疑われる対象の診断を補助するために用いられ得る。本方法はまた、より良い治療のために、ＨＣＣに罹患している対象の状態をモニタリングするのに用いられ得る。
【０００８】
代替の実施形態において、対象において肝臓疾患を診断する方法は、（ａ）肝臓疾患が疑われる対象からサンプルを入手するステップと、（ｂ）ＧＰ７３抗原をサンプルと共にインキュベーションするステップと、（ｃ）サンプル中のＧＰ７３抗原との自己抗体の反応性を検出するステップとを含む。自己抗体の反応性は、免疫測定法(immunometric assays)または競合アッセイなどの免疫分析法(immunoassays)により測定することができる。
【０００９】
本発明はまた、自己抗体を含むことが疑われる対象サンプル中のＧＰ７３特異的自己抗体を検出するためのアッセイを提供する。１つの実施形態において、本アッセイは免疫測定法であって、（ａ）ＧＰ７３抗原を固体支持体に固定するステップと、（ｂ）ＧＰ７３特異的自己抗体を含むことが疑われるサンプルを、固体支持体に結合したＧＰ７３抗原と接触させるステップと、（ｃ）標識された抗体を固体支持体に添加するステップ（ここで、標識された抗体は、ＧＰ７３特異的自己抗体を認識し、また、シグナル発生システムの一部である）と、（ｄ）遊離の標識化抗体を結合した抗体から分離するステップと、（ｅ）固体支持体を含む溶液から発生するシグナルを測定するステップとを含む。対象がヒトである場合には、標識された抗体は抗ヒト免疫グロブリンである。
【００１０】
別の実施形態において、本アッセイは競合免疫測定法であって、（ａ）ＧＰ７３抗原に結合する標識化抗体を、ＧＰ７３特異的自己抗体を含むことが疑われる対象のサンプルと共にインキュベーションすることにより反応混合物を調製するステップ（ここで、標識化抗体は、シグナル発生システムの一部である）と、（ｂ）結合した標識化抗体を遊離の抗体から分離するステップと、（ｃ）標識化抗体から発生するシグナルを測定するステップとを含む。
【００１１】
さらに別の実施形態において、本アッセイは競合免疫測定法であって、（ａ）ＧＰ７３抗原に結合する第１抗体を、ＧＰ７３特異的自己抗体を含むことが疑われる対象サンプルと共にインキュベーションすることにより反応混合物を調製するステップと、（ｂ）反応混合物に第２抗体を添加するステップ（ここで、第２抗体は第１抗体を認識し、かつ、第２抗体は標識され、シグナル発生システムの一部である）と、（ｃ）遊離の標識化された第２抗体を、結合した抗体から分離するステップと、（ｄ）反応混合物中の第２抗体から発生するシグナルを測定するステップとを含む。
【００１２】
抗体が酵素標識されているいくつかの実施形態において、ＧＰ７３抗原とＧＰ７３特異的自己抗体との複合体に基質を添加して、酵素標識された抗体と反応させ、その後インキュベーションするさらなるステップは、発生するシグナルを測定する前に実施される。
【００１３】
本発明は、自己抗体を含むことが疑われる対象のサンプル中のＧＰ７３特異的自己抗体を検出するための診断キットをさらに提供する。１つの実施形態において、本診断キットは、サンプル中のＧＰ７３特異的自己抗体を検出するための１以上の試薬を含む。試薬には、本明細書において上述したもののいくつか、例えばＧＰ７３抗原、および標識化抗ヒト免疫グロブリンなどの標識化抗体が含まれる。別の実施形態において、本診断キットは、対象におけるＧＰ７３特異的自己抗体のレベルを示す陽性対照をさらに含む。さらに別の実施形態において、本診断キットは、ＧＰ７３特異的自己抗体のレベルを検出するためのキットの使用についての指示書をさらに含む。指示書は、少なくとも部分的にＧＰ７３特異的自己抗体のレベルに基づいて、対象における肝臓疾患を診断および／またはモニタリングするためのものである。指示書はまた、in vitro診断キットについてアメリカ合衆国食品医薬品局により要求される指示書であり得る。
【００１４】
本発明はまた、肝臓疾患の診断のためのパネル分析法(panel assay)を提供し、これは、２つ以上の生物学的マーカーを検出するための２つ以上のアッセイを含む。１つの実施形態において、本パネル分析法は、２つの生物学的マーカーを検出することができる。第１の生物学的マーカーはＧＰ７３特異的自己抗体であり、第２の生物学的マーカーはＧＰ７３抗原、ＣＯＭＰ、またはＡＦＰである。別の実施形態において、本パネル分析法は、３つの生物学的マーカーを検出することができる。第１の生物学的マーカーはＧＰ７３特異的自己抗体であり、第２および第３の生物学的マーカーは、ＧＰ７３抗原、ＣＯＭＰ、およびＡＦＰからなる群より独立に選択される。
【００１５】
本発明の他の態様は、本明細書全体において記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、正常な対象と比較した、３つの肝臓疾患（肝硬変、ＨＣＣ、およびＨＣＶ）におけるＧＰ７３特異的自己抗体のレベルに基づいて同定された陽性の割合を示す。
【００１７】
【図２】図２は、３つの肝臓疾患（肝硬変、ＨＣＣ、およびＨＣＶ）におけるＧＰ７３特異的自己抗体のレベルの分布をしめす。
【００１８】
【図３】図３は、肝硬変に罹患していない９１人の患者と肝硬変に罹患している９６人の患者とからなる１８７人の患者の分析における、３つの方法（軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の検出、ＧＰ７３抗原の検出、およびＧＰ７３抗体の検出）の比較を示す。
【００１９】
【図４】図４は、３つの診断試験に対する陽性反応による患者の分布を示す。
【００２０】
【図５】図５は、各々の患者についての３つの診断試験に対する陽性反応の数による患者の分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、部分的に、ＧＰ７３特異的自己抗体を検出する方法に関する。１つの実施形態において、本方法は、ＧＰ７３タンパク質に由来するエピトープを有するポリペプチドなどのＧＰ７３抗原を調製するステップと、ＧＰ７３抗原を対象からのサンプルと反応させるステップと、ＧＰ７３抗原に結合するサンプル中のＧＰ７３特異的自己抗体を検出するステップとを含む。本方法は、肝臓疾患、特にＨＣＣに罹患していることが疑われる対象の診断を補助するために用いられ得る。本方法はまた、治療中において、ＨＣＣに罹患している対象の状態をモニタリングするのに用いられ得る。
【００２２】
下記の記載において、分子生物学、免疫学、および医学の分野において用いられる多くの用語が広く用いられる。本明細書および特許請求の範囲を明確かつ首尾一貫して理解するために、このような用語に与えられる範囲を含めて、下記の非限定的な定義が提供される。
【００２３】
本開示において「one」、「a」、または「an」が用いられる場合、他に指示されなければ、これらは「少なくとも１つ」または「１以上」を意味する。
【００２４】
用語「抗体」は、エピトープまたは抗原決定基に結合することができる分子を指す。用語「抗体」には、抗体全体およびその抗原結合断片が含まれ、一本鎖抗体が含まれる。このような抗体には、ヒト抗原結合抗体および抗体断片が含まれ、これには、Fab、Fab'、およびF(ab')2、Fd、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、およびVLドメインまたはVHドメインのいずれかを含む断片が含まれるが、これらに限定されない。抗体は、鳥類、ならびに例えばヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマなどの哺乳動物を含む動物に由来するものであって良い。
【００２５】
用語「抗原」は、抗体、またはＭＨＣ分子によって提示されている場合にはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が結合できる分子を指す。抗原はさらに、免疫系によって認識されることができ、ならびに／または、体液性免疫反応および／もしくは細胞性免疫を誘導し、Ｂリンパ球および／もしくはＴリンパ球を活性化することができるものであって良い。抗原は、１以上のエピトープ（Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープ）を有しても良い。本明細書において用いられる抗原はまた、いくつかの個々の抗原の混合物であっても良い。
【００２６】
用語「抗原決定基」は、Ｂリンパ球またはＴリンパ球のいずれかによって特異的に認識される抗原の部分を指す。抗原決定基またはエピトープは、抗体によって、またはＭＨＣとの関連ではＴ細胞受容体によって認識される抗原の部分である。抗原決定基は、１つ以上のエピトープを含む。
【００２７】
用語「自己抗体」は、自己のタンパク質、炭水化物、または核酸を指向する抗体を指す。
【００２８】
用語「エピトープ」は、抗体（例えば自己抗体）、Ｂリンパ球、またはＴリンパ球などの免疫系によって認識される抗原の部分であり、したがって、抗体、Ｂリンパ球、またはＴリンパ球が結合する特定のドメイン、領域、または分子構造を指す。
【００２９】
用語「野生型」は、天然源から単離される遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型の遺伝子は、集団(population)において最も頻繁に観察される遺伝子であり、したがって、任意に「正常」型または「野生」型の遺伝子ならびに遺伝子産物を示す。これに対し、用語「修飾型」または「変異型」は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、配列および／または機能特性において変更（例えば低メチル化）を示す遺伝子ならびに遺伝子産物を指す。野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、天然の突然変異体が物理的特性および生物学的特性などの特徴を変化させたという事実によって、天然の突然変異体が単離・同定され得ることに注意すべきである。「野生型」の遺伝子産物はまた、一般的に「天然タンパク質」と称される。
【００３０】
用語「部分」は、タンパク質に関して使用される場合、そのタンパク質の断片を指す。断片は、大きさがアミノ酸残基２つのものから全アミノ酸配列よりアミノ酸が１つ少ないものにまで及び得る。
【００３１】
用語「対象」は動物を指し、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、齧歯類、または霊長類（例えばヒト）を含むが、これらに限定されない。一般的に用語「対象」および「患者」は、本明細書において、例えば哺乳動物対象、特にヒト対象に関して互換的に用いられる。
【００３２】
用語「サンプル」は、最も広い意味において用いられる。１つの意味においては、任意の起源から得られる試料または培養物、ならびに生物学的サンプルおよび環境サンプルを意味する。生物学的サンプルは、動物（ヒトを含む）から得ることができ、その動物中に見出される、骨髄、血液、血清、細胞、血漿、間質液、尿、脳脊髄液、核酸、ＤＮＡ、組織、およびそれらの精製または濾過された形態を含むが、これらに限定されない生物学的材料または組成物を意味する。環境サンプルには、表層物質(surface matter)、土壌、水、結晶、および工業的サンプルなどの環境材料が含まれる。
【００３３】
用語「対照」または「対照サンプル」は、問題となっている決定基（例えば抗原または抗体）について陰性であると判定された少なくとも１つの個体から採取された、血清サンプルなどの１以上のサンプルを指す。例えば、ＧＰ７３特異的自己抗体の存在について検査するための対照は、ＨＣＣまたは他の肝臓疾患に罹患していない対象から採取され得る。
【００３４】
ＧＰ７３抗原
種々のＧＰ７３タンパク質、ポリペプチド、および化学的類似体が、ＧＰ７３特異的自己抗体の検出のためのＧＰ７３抗原として本発明において用いるのに適している。１つの態様において、ＧＰ７３抗原は、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、齧歯類、または霊長類（例えばヒト）を含むが、これらに限定されない任意の種に由来するＧＰ７３タンパク質またはその断片である。ＧＰ７３タンパク質は、天然源から精製されても良く、あるいは、タンパク質工学技術を用いて作製されても良いが、これは、天然源からのタンパク質と比較して、異なる翻訳後修飾を有し得る。本発明において、組換えＧＰ７３タンパク質は、当業者によく知られた標準的な分子生物学プロトコールを用いて作製される。
【００３５】
天然型ＧＰ７３タンパク質は、見かけの分子量がおよそ７３ｋＤａの、４００アミノ酸からなるＩＩ型ゴルジ膜タンパク質である。天然型ＧＰ７３のヌクレオチド配列およびこれに由来するアミノ酸配列は、Kladneyら(2000)およびGenBankのデータ（寄託番号AF236056）に開示されている。完全長ＧＰ７３ ｃＤＮＡは、3042塩基対を含み、1200塩基対からなる単一のオープンリーディングフレームを含む。
【００３６】
本発明において有用なＧＰ７３タンパク質はまた、野生型タンパク質の変異体であって良い。特に指示がなければ、用語「ＧＰ７３」は、天然型ＧＰ７３タンパク質ならびにその変異体の両方を指す。本明細書において使用される場合、ＧＰ７３変異体は、天然型ＧＰ７３タンパク質のアミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸置換、欠失、ならびに／または付加（例えば内部付加および／もしくはＧＰ７３融合タンパク質）を有するアミノ酸配列を含むが、それにもかかわらずＧＰ７３の免疫活性を保持しているＧＰ７３タンパク質である。このような機能的または免疫学的に等価の変異体は、天然の生物学的変異体（例えばＧＰ７３ポリペプチド対立遺伝子変異体、ＧＰ７３ポリペプチド オーソログ、およびＧＰ７３ポリペプチド スプライシング変異体）として生じ得るものであり、あるいは、例えば化学合成もしくは化学修飾、または突然変異誘発（例えば部位特異的突然変異誘発もしくはランダム突然変異誘発）によるなど、既知の技術を用いて調製することができる。したがって、例えば、アミノ酸は、ＧＰ７３タンパク質またはそのエピトープの物理化学的特徴（例えば電荷密度、親水性／疎水性、大きさ、および立体配置に関して）を保存し、それ故に免疫学的構造を保持する別のアミノ酸で置換され得る。「付加」変異体は、Ｎ末端またはＣ末端融合、ならびに単一アミノ酸または多重アミノ酸の配列内挿入を含み得る。欠失は、配列内であっても良いし、Ｎ末端またはＣ末端からの切断であっても良い。
【００３７】
変異体は、１個から３個まで、５個まで、１０個まで、１５個まで、２０個まで、２５個まで、５０個まで、７５個まで、もしくは１００個まで、または１００個より多いアミノ酸置換、挿入、付加、および／または欠失を有して良く、ここで置換は、保存的もしくは非保存的、またはその組合せであって良い。また、本発明のＧＰ７３タンパク質は、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも５０個の天然型ＧＰ７３タンパク質の連続アミノ酸残基を含み得る。このような変異体は好ましくは、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも９５％、天然型ＧＰ７３タンパク質と同一である。さらに、ＧＰ７３変異体は、天然型タンパク質の免疫活性の約１％を超える、約１０％を超える、約２５％を超える、約５０％を超える、約６０％を超える、約７０％を超える、約８０％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、または約１００％を超える活性の免疫活性を保持し得る。
【００３８】
一般的に、ＧＰ７３タンパク質のアミノ酸配列に対する保存的修飾によって、もともとのＧＰ７３タンパク質と同様の機能的及び化学的特徴を有するポリペプチドが作製される。これに対し、ＧＰ７３タンパク質の機能的および／または化学的特徴の実質的な変更は、（ａ）置換領域の構造（二次、三次、および／もしくは四次）または（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性を維持することに対する効果が著しく異なる、ＧＰ７３タンパク質のアミノ酸配列における置換を選択することにより達成することができる。アミノ酸配列の変更は、当技術分野でよく知られている化学的および生物学的なペプチドおよびタンパク質の合成方法により達成することができる。
【００３９】
所望のアミノ酸置換（保存的であるか、または非保存的である）は、そのような置換が必要な時に当業者によって決定され得る。例えば、アミノ酸置換は、重要な残基を特定するために、ＧＰ７３タンパク質の生物学的活性（例えばＧＰ７３特異的自己抗体との結合相互作用）を調節するために、またはサンプル中の他の分子との望ましくない非特異的な結合相互作用を低減するために、用いることができる。適切なアミノ酸置換には、AlaのVal、Leu、またはIleへの置換；ArgのLys、Gln、またはAsnへの置換、AsnのGlnへの置換；AspのGluへの置換；CysのSerまたはAlaへの置換；GlnのAsnへの置換；GluのAspへの置換；HisのAsn、Gln、Lys、またはArgへの置換；IleのLeu、Val、Met、Ala、Phe、またはノルロイシンへの置換；Leuのノルロイシン、Ile、Val、Met、Ala、またはPheへの置換；LysのArg、1,4-ジアミノ酪酸、Gln、またはAsnへの置換；MetのLeu、Phe、またはIleへの置換；PheのLeu、Val、Ile、Ala、またはTyrへの置換；ProのAlaへの置換；SerのThr、Ala、またはCysへの置換；ThrのSerへの置換；TrpのTyrまたはPheへの置換；TyrのTrp、Phe、Thr、またはSerへの置換；およびValのIle、Met、Leu、Phe、Ala、またはノルロイシンへの置換が含まれるが、これらに限定されない。置換のためのアミノ酸の選択はまた、その疎水性親水性指標および／または親水性により指針を得ることができる。
【００４０】
また、ＧＰ７３ポリペプチドは、相同ポリペプチドに融合してホモダイマーを形成しても良く、非相同ポリペプチドに融合してヘテロダイマーを形成しても良い。非相同ポリペプチドには、ＧＰ７３融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ（例えば、精製し易くするための、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかにおけるポリヒスチジン(polyhistine)）；触媒活性を有する酵素またはその部分；オリゴマー化を促進するポリペプチド（例えば、ロイシンジッパー ドメイン）；および安定性を向上させるポリペプチド（例えば、免疫グロブリンの定常領域）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
融合は、ＧＰ７３ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて起こり得る。融合は、リンカーまたはアダプター分子なしで直接でも良いし、リンカーまたはアダプター分子を介しても良い。リンカーまたはアダプター分子は、１以上のアミノ酸残基、一般的には約２０から約５０のアミノ酸残基であって良い。リンカーまたはアダプター分子はまた、融合部分の分離を可能にするプロテアーゼのための開裂部位を有するように設計され得る。一旦構築されると、融合ポリペプチドは、本明細書に記載される方法に従ってさらに誘導体化できることが認識されよう。
【００４２】
本発明のＧＰ７３タンパク質はまた、化学的または生物学的に修飾されたＧＰ７３タンパク質であるＧＰ７３誘導体であって良く、例えばアシル化（すなわちアセチル化またはホルミル化）、ビオチン化、カルボキシル化、脱アミノ化、グルタチオン化、グリコシル化、脂質化（すなわちファルネシル化、ゲラニルゲラニル化、プレニル化、ミリストイル化、パルミトイル化、またはステアロイル化）、メチル化、リン酸化、硫酸化、フコシル化、およびユビキチン化などのタンパク質の翻訳後修飾が含まれる。特に指示がなければ、用語「ＧＰ７３タンパク質」は、天然型ＧＰ７３タンパク質、ならびにその変異体および誘導体の両方を指す。ＧＰ７３誘導体は、天然においてポリペプチドに結合している翻訳後修飾基の種類、数、または位置とは異なるように修飾され得る。例えば、ＧＰ７３誘導体は、天然型ＧＰ７３タンパク質とは異なる数および／または種類のグリコシル化を有し得る。結果として得られるＧＰ７３誘導体は、天然型タンパク質よりも多いかまたは少ない数のＮ末端結合グリコシル化部位を含み得る。
【００４３】
ＧＰ７３ポリペプチドはまた、１以上のポリマーが共有結合することにより修飾され得る。一般的に、選択されるポリマーは水溶性であるため、それが結合するタンパク質は、生理学的環境などの水性環境において沈澱しない。ポリマーは、任意の分子量であって良く、分岐鎖状または非分岐鎖状であって良い。一般的に、ポリマーはそれぞれ、約１ｋＤａから約１００ｋＤａの見かけの分子量を有する。
【００４４】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物には、ポリアルキレングリコール（例えばモノ-(C1-C10)アルコキシ-、アリールオキシ-ポリエチレングリコール、ポリ（Ｎ-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール ホモポリマー、またはポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド コポリマー）、炭水化物ポリマー（例えばデキストランまたはセルロース）、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールが含まれるが、これらに限定されない。ＧＰ７３ポリペプチドの共有結合性多量体を調製するのに用いられ得る二官能性架橋分子もまた、本発明に含まれる。
【００４５】
一般的に、化学的誘導体化は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させることにより、適切な条件下で実施することができる。ポリペプチドの化学的誘導体の調製方法は、（ａ）ＧＰ７３タンパク質が１以上のポリマー分子と結合する条件下において、ポリペプチドを活性化ポリマー分子（例えば、ポリマー分子の活性エステル誘導体または活性アルデヒド誘導体）と反応させるステップと、（ｂ）反応産物を得るステップとを含むものである。最適の反応条件は、選択されるＧＰ７３タンパク質および使用される化学試薬によって変更され得るものであり、一般的に経験的に決定される。ポリペプチドのＰＥＧ化は、アシル化、アルキル化、またはマイケル付加を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られている任意のＰＥＧ化反応を用いて実施されうる。
【００４６】
診断アッセイ
本発明で用いるのに適する多くの異なる種類の免疫分析法が存在する。例えば酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、蛍光免疫吸着検定法(fluorescent immunosorbent assay; FIA)、化学結合免疫吸着検定法(chemical linked immunosorbent assay; CLIA)、放射線免疫測定法(RIA)、免疫ブロット法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、in situ免疫分析法（例えば、金コロイド、酵素標識、または放射性同位体標識を用いる）、ウエスタンブロット法、沈降反応、凝集法（例えば、ゲル凝集法、赤血球凝集法など）、補体結合法、免疫蛍光測定法、プロテインA測定法(protein A assays)、および免疫電気泳動法などの、よく知られている免疫分析法のいずれもが、ＧＰ７３抗原と反応するサンプル中のＧＰ７３特異的自己抗体のレベルを検出するのに適合され得る。使用され得る異なる免疫分析法を概観するためには、The Immunoassay Handbook（David Wild編, Stockton Press, New York, 1994）を参照されたい。固相分離または抗体試験についての免疫定量法を伴う競合的免疫分析法は、本発明で使用するのに特に適している。The Immunoassay Handbookの第２章を参照されたい。
【００４７】
本発明の１つの例示的な実施形態において、診断アッセイは、サンプル中のＧＰ７３特異的自己抗体のレベルを検出するための免疫定量法である。免疫定量法において、ＧＰ７３抗原は、直接的に、または例えば抗ＧＰ７３抗体などの捕捉剤を介して間接的に、固体支持体に固定される。例えば血清サンプルなどの対象からのサンプルの分液は、固体支持体に添加し、固相上のＧＰ７３抗原と共にインキュベーションする。ＧＰ７３抗原と反応したサンプル中に存在する自己抗体の定常領域を認識する２次抗体が添加される。対象がヒトである場合、この２次抗体は、抗ヒト免疫グロブリンである。ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＭの重鎖定常領域に特異的な２次抗体が用いられ得る。液相から固体支持体を分離した後、支持相は、検出可能なシグナルについて検査される。固体支持体におけるシグナルの存在は、サンプル中に存在する天然型ＧＰ７３タンパク質に対する自己抗体が、固体支持体上のＧＰ７３抗原に結合したことを示す。正常な対象からの対照サンプルと比較した場合の、光学密度または放射性同位体標識シグナルの増加は、対象におけるＨＣＣの診断と関連する。
【００４８】
固体支持体は、当業者に知られており、反応トレイのウェルの壁（例えばマイクロタイタープレート）、試験管、ポリスチレン ビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロース ストリップ、膜、微粒子（例えばラテックス粒子）、ガラスまたはシリコンチップ、ヒツジ（または他の動物）の赤血球、デュラサイト(duracytes)などを含む。固相に核酸を固定するための適切な方法には、イオン間相互作用、疎水相互作用、共有結合性相互作用などが含まれる。本明細書において使用される固体支持体は、任意の不溶性物質を指し、あるいは、その後の反応によって不溶性にすることができる。固体支持体は、それに固有の、捕捉剤を誘引し固定する能力について選択することができる。あるいは、固相は、捕捉剤を誘引し固定する能力を有するさらなる分子を保持することができる。このさらなる分子には、捕捉剤自体に関して、または捕捉剤に結合する帯電物質に関して、逆に帯電している帯電物質が含まれ得る。さらに別の代替として、分子は、固体支持体上に固定され（固体支持体に結合し）、かつ特定の結合反応によってＧＰ７３抗原を固定する能力を有する、任意の特定の結合要素であり得る。この分子は、アッセイを実施する前またはアッセイの実施中に、固体支持材料にＧＰ７３抗原を間接的に結合させることができる。
【００４９】
シグナル発生システムは１以上の構成要素からなり、その少なくとも１つは、結合標識および／または非結合標識の量（すなわち、ＧＰ７３抗原に結合する標識または結合しない標識の量）に関連する検出可能なシグナルを発生する標識である。標識は、シグナルを発生する分子であるか、またはシグナルの発生を誘導し得る分子である。標識の例には、蛍光剤、酵素、化学発光剤、光増感剤、または懸濁粒子が含まれる。シグナルは、酵素活性、発光、または光吸収を検出することにより検出され、測定され得る。放射性標識もまた使用され、シンチレーションカウンターを用いて、放射活性レベルが検出および測定され得る。
【００５０】
抗ヒト免疫グロブリンを標識するのに用いられ得る酵素の例には、β-D-ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）が含まれる。抗ヒト免疫グロブリンを標識するのに用いられ得る蛍光剤の例には、フルオレセイン、イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒド(o-phthaldehyde)、フルオレスカミン、ならびにAlexa Fluor（登録商標）色素（すなわち、スルホン化クマリン(courmarin)、ローダミン、キサンテン、およびシアニン色素）が含まれる。化学発光剤には、例えばイソルミノールが含まれる。例えば、抗ヒト免疫グロブリンは、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのいずれかを用いて酵素標識され得る。
【００５１】
酵素は、よく知られた方法を用いて、本発明の方法において使用するために、ＧＰ７３抗原反応性抗体に共有結合され得る。よく知られた多くの結合方法が存在する。例えば、アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼは、グルタルアルデヒドを用いて抗体に結合され得る。ホースラディッシュペルオキシダーゼはまた、過ヨウ素酸法を用いて結合され得る。酵素結合抗体のための市販のキットは、広く利用可能である。酵素結合抗ヒトおよび抗マウス免疫グロブリン特異的抗体は、多数の市販源から入手可能である。
【００５２】
ビオチン標識抗体は、酵素結合抗体の代わりとして用いられ得る。このような場合において、結合した抗体は、市販で入手可能な、ストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムを用いて検出されるであろう。
【００５３】
酵素標識抗体は、基質に応じて異なるシグナル源を生じる。シグナル発生は、基質を反応混合物に加えることを必要とする。一般的なペルオキシダーゼの基質には、ABTS(2,2'-アジノ-ビス(エチルベンゾチアゾリン-6-スルホナート))、OPD(o-フェニレンジアミン)、およびTMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)が含まれる。これらの基質は、過酸化水素の存在を必要とする。p-ニトロフェニルリン酸は、一般的に用いられるアルカリホスファターゼの基質である。インキュベーション時間の間、酵素は、基質の一部分をその最終生成物へと徐々に変換する。インキュベーション時間の終了時に、酵素活性を停止する停止剤が添加される。シグナル強度は通常、分光光度測定器を用いて、光学密度を測定することにより測定される。
【００５４】
アルカリホスファターゼ標識抗体はまた、蛍光定量法により測定され得る。したがって、本発明の免疫分析法においては、基質である4-メチルウンベリフェリルリン酸(4-MUP)が用いられ得る。アルカリホスファターゼは、4-MUPを脱リン酸化して、フルオロフォアである4-メチルウンベリフェロン(4-MU)を産生した。入射光は３６５ｎｍであり、放射光は４４８ｎｍである。
【００５５】
（使用されるシグナル発生システムに応じて）反応中に存在する色素、蛍光、化学発光、または放射活性の量は、ＧＰ７３抗原と反応するサンプル中の自己抗体の量に比例する。光学密度の定量は、分光光度定量法または蛍光定量法（フローサイトメーターを含む）を用いて実施することができる。放射性標識シグナルの定量は、シンチレーション計数を用いて実施することができる。
【００５６】
別の例示的な実施形態では、アッセイは、ＧＰ７３特異的自己抗体と同じエピトープに結合する１以上のＧＰ７３特異的抗体を用いる、競合的免疫分析法である。このアッセイでは、サンプル中のＧＰ７３特異的抗体およびＧＰ７３特異的自己抗体は、ＧＰ７３抗原に対する結合に関して競合する。一般的には、ＧＰ７３抗原に結合することが知られている一定量の標識化抗体を、対象からの様々な濃度のサンプルと共にインキュベーションする。ＧＰ７３特異的抗体は、モノクローナルであっても良いし、ポリクローナルであっても良い。
【００５７】
本明細書において上述したように、ＧＰ７３特異的抗体は、蛍光剤、酵素、化学発光剤、光増感剤、懸濁粒子、または放射性同位体を用いて標識され得る。インキュベーションした後、標識化抗体は、遊離の抗体から分離される。使用されるシグナル発生システムに応じて、かつ必要であれば、標識化抗体が反応する適切な基質を添加し、インキュベーションする。その後、サンプルによって生じるシグナルを測定する。血清サンプル添加の前および後、または実験サンプルと対照サンプルとの間における光学密度または放射活性の減少は、サンプル中の自己抗体がＧＰ７３抗原に結合したことを示す。正常な対象からの対照サンプルと比較した場合の、光学密度または放射性標識シグナルの減少は、対象におけるＨＣＣの診断と関連する。
【００５８】
競合的免疫分析法の代替となる例示的な実施形態では、２つの抗体を用いる間接方法が提供される。第１抗体は、標識化されていないことを除けば、上記の段落において記載したＧＰ７３抗原特異的抗体である。第１抗体は、対象からの様々な濃度のサンプルと共にインキュベーションする。その後、一定量の第２抗体を、サンプルと第１抗体との混合物に添加する。第２抗体は、第１抗体の重鎖定常領域を認識する。例えば、ＧＰ７３抗原（抗マウス免疫グロブリン）と反応したマウス免疫グロブリンの重鎖定常領域を認識する抗体であって良い。第２抗体は、上述のように、フルオロフォア、ケミロフォア(chemilophore)、または放射性同位体で標識することができる。遊離の標識化第２抗体は、結合した抗体から分離される。酵素標識抗体が用いられる場合、酵素標識が反応する適切な基質を添加し、インキュベーションする。血清サンプル添加の前および後における、対照サンプルと比較した光学密度または放射活性の減少は、血清サンプル中の自己抗体がＧＰ７３抗原に結合したことを示す。正常な対象からの対照サンプルと比較した場合の、光学密度または放射活性の減少は、対象におけるＨＣＣの診断と関連する。
【００５９】
いくつかの実施形態において、自動化検出アッセイが利用される。免疫分析法の自動化のための方法は、米国特許No. 5,885,530、No. 4,981,785、No. 6,159,750、およびNo. 5,358,691に記載されたものを含み、これらの各文献は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、結果の分析および提示もまた自動化される。例えば、いくつかの実施形態において、自己免疫性炎症性疾患または慢性炎症性疾患のマーカーに相当する一連のタンパク質の存在または不存在に基づいて予測するソフトウェアが利用される。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ＧＰ７３特異的自己抗体のレベルは、ＨＣＣ診断のためのパネル調査(panel)として、他の生物学的マーカーとともに用いられ得る。パネル調査は、ＨＣＣを含む肝臓疾患に関連する多数のマーカーの同時分析を可能にする。例えば、パネル調査は、所与の治療に応答する可能性があるかまたは可能性がない対象における、ＨＢＶ、ＨＣＶ、または肝硬変と関連すると同定されたマーカーを含み得る。患者に応じて、パネル調査は、可能な限りの最善の診断および予後を提供するために、単独でまたは組み合わせて分析され得る。パネル調査に含めるマーカーは、下記の例示的な実施例において記載される方法を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法を用いて、その適中度をスクリーニングすることにより選択される。
【００６１】
本発明の診断アッセイは自己抗体の検出のために用いられるので、抗体は任意のＧＰ７３エピトープを指向し得ることが理解されるべきである。したがって、本発明を実施するために、任意の特定のＧＰ７３エピトープについて特徴付ける必要はない。同様に、自己抗体は、本明細書の他の部分に記載されている任意の種類ものもであってよい。
【００６２】
データ分析
本発明において、コンピューター支援分析プログラムはまた、検出アッセイによって生じた生データを、臨床医にとって予測価値のあるデータに変換するのに用いられ得る。臨床医は、任意の適切な手段を用いて、予測データに容易にアクセスすることができる。臨床医はその後、対象の治療を最適化するために、その情報を直ちに利用することができる。
【００６３】
本発明は、アッセイ、情報提供、医療従事者、および対象の管理を行う研究所に行き来する情報の受け取り、処理、ならびに伝達をすることができる任意の方法を企図する。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、サンプル（例えば生検サンプル、または血清サンプルもしくは尿サンプル）は対象から得られ、世界中の任意の場所（例えば対象が居住する国または情報が最終的に利用される国とは異なる国）に位置するプロファイリング分析サービス（例えば医療施設の臨床研究室、ゲノムプロファイリングビジネスなど）に提出され、生データが得られる。サンプルが組織または他の生物学的サンプルを含む場合、対象は、サンプルを入手してプロファイリングセンターに送付するために医療センターを訪れても良いし、あるいは、対象が自らサンプル（例えば尿サンプル）を採集してそれを直接プロファイリングセンターに送付しても良い。サンプルが以前に測定された生物学的情報を含む場合、その情報は対象によって直接プロファイリングセンターに送付されても良い（例えば、情報を含む情報カードをコンピューターでスキャンし、そのデータを、電子通信システムを用いてプロファイリングセンターのコンピューターに送信しても良い）。一旦プロファイリングセンターによって受け取られると、サンプルは分析され、対象にとって所望される診断情報または予後情報に関して具体的に説明するプロファイルが作成される。
【００６４】
プロファイリングデータはその後、治療する臨床医による解釈に適するフォーマットで作製される。例えば、生の表示データを提供するよりはむしろ、作製されたフォーマットが、特定の治療選択肢についての推奨と共に、患者についての診断またはリスク評価（例えば、ＨＣＣなどの肝臓疾患が特定の治療法に応答する可能性）を示し得る。データは、任意の適切な方法により臨床医に提示され得る。例えば、いくつかの実施形態では、プロファイリングサービスが、（例えば治療の際に）臨床医用に印刷できるか、またはコンピューター モニター上で臨床医に表示することができる報告書を作成する。
【００６５】
いくつかの実施形態において、情報はまず、治療時または地域の施設において分析される。生データはその後、さらなる分析のために、および／または、生データを臨床医もしくは患者にとって有用な情報に変換するために、中央の処理施設に送付される。中央の処理施設は、データ解析に関するプライバシー尊重（すべてのデータは、統一されたセキュリティ プロトコルを用いて、中央の施設に保管されている）、データ解析の速度、およびデータ解析の均一性を提供する。中央処理施設はその後、対象の治療後におけるデータの結果を管理することができる。例えば、電子通信システムを用いて、中央施設は、臨床医、対象、または研究者にデータを提供することができる。
【００６６】
いくつかの実施形態において、対象は、電子通信システムを用いて直接データにアクセスすることができる。対象は、その結果に基づいてさらなる治療処置またはカウンセリングを選択し得る。いくつかの実施形態において、データは、研究目的で使用される。例えば、データは、特定の病状または病気の重篤度を示す有用な指標としてマーカーを含めるかまたは除外するかについてさらに最適化するために用いられ得る。
【００６７】
パネル分析法
ＧＰ７３特異的自己抗体の存在のみを測定することに加えて、本発明はまた、１以上の他の検体（例えばＧＰ７３抗原、および／またはＣＯＭＰなど）と共にＧＰ７３特異的自己抗体を測定する「パネル分析法」を企図する。このようなパネル分析法は、２以上の別々のアッセイプラットフォームを含むキットとして提供されても良く、あるいは、例えば免疫分析ストリップまたはＥＬＩＳＡプレートなどの単一のプラットフォーム上に組み合わされても良い。
【実施例】
【００６８】
材料および方法
ＧＰ７３タンパク質
誘導性ＧＰ７３発現プラスミド(St. Louis University, St. Louis, MOから入手されるBACG81)を標準的な方法で増殖させた。手短に、グリセロール ストックをLB/amp(Luria-Bertaniブロス/アンピシリン)寒天プレート上に画線した。単一コロニーを選択し、LBブロスに接種した。所望の細胞密度が得られるまで、細胞を培養および増殖させた。IPTG(イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド)を添加し、細胞をおよそ４時間インキュベーションした。その後、細胞を遠心分離により回収した。回収された細胞ペレット中のＧＰ７３の存在は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析により確認された。組換えＨｉｓタグ付加ＧＰ７３は、標準的な方法を用いて単離された。基本的に、ＧＰ７３は変性条件下でペレットにより抽出され、ＧＰ７３タンパク質は、ニッケルカラムを通すことにより溶解物から精製された。タンパク質は、イミダゾール緩衝溶液を用いてカラムから溶出された。精製された組換えＧＰ７３タンパク質は、十分に透析することにより、イミダゾールから遊離した。
【００６９】
試料
臨床上の記載が様々な肝臓疾患（ウイルス性肝炎および非ウイルス性肝炎を含む）に罹患している個体からの血清が、ＧＰ７３特異的自己抗体、ならびにＧＰ７３抗原、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）、および肝臓疾患の他のマーカーの存在について試験された。
【００７０】
アッセイ
ＣＯＭＰは、AnaMar Medical（Uppsala, Sweden）から販売されている市販のキットを用いて分析された。ＧＰ７３抗原は、捕捉ＥＬＩＳＡ法により検出された。ＧＰ７３特異的自己抗体は、ＧＰ７３自己抗体ＥＬＩＳＡを用いて測定された。
【００７１】
ＧＰ７３抗原の測定のために、ウサギ抗ＧＰ７３抗体を、炭酸緩衝液中のポリスチレン マイクロタイタープレートのウェル上にコーティングした。患者の血清は、希釈バッファー中で１：１０１に希釈し、室温で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄バッファーで洗浄した。その後、マウス抗ＧＰ７３モノクローナル抗体を添加し、室温で３０分間インキュベーションした。インキュベーションの終了時に、プレートを洗浄バッファーで洗浄し、ヤギ抗マウス ホースラディッシュペルオキシダーゼを添加した。３０分間のインキュベーションの後、ＴＭＢ基質を添加して３０分間インキュベーションし、ＥＬＩＳＡ反応停止バッファーを用いて反応を停止させ、分光光度測定器を用いて４９５ｎｍにおいてＯ．Ｄ．を測定した。
【００７２】
ＧＰ７３特異的自己抗体の測定のために、ポリスチレン マイクロタイタープレートを、５℃で一晩、ＧＰ７３抗原でコーティングした。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄バッファーで洗浄した後、１００μＬのＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液を添加した。プレートを１時間ブロッキングした後、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファーで洗浄した。プレートを一晩乾燥させた。自己抗体は、希釈バッファー中で１：１０１に希釈された血清を添加することにより検出された。３０分のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ-ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体(conjugate)を添加した。３０分間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質を３０分間添加した。ＥＬＩＳＡ反応停止バッファーを添加することにより反応を停止させ、得られた色を、分光光度測定器を用いて４９５ｎｍにおいて測定した。
【００７３】
結果
ＧＰ７３自己抗体（抗ＧＰ７３）の検出の有用性は、３箇所の臨床センターからの血清について評価された。第１臨床群は、肝硬変に罹患している２２人の患者、ＨＣＣに罹患している１０人の患者、およびＨＣＶに罹患している９人の患者から構成され、St. Louis University（St. Louis, MO）から得られた。３９人の健康な対照もまた、評価された。図１および表１に示されるように、抗ＧＰ７３抗体は各群において検出され得るが、０．５ Ｏ．Ｄ．を上回る値の頻度は、健康な対照群におけるわずか３％の頻度と比較して、肝臓疾患血清中では２３〜４４％に渡っていた。
【表１】
2010520987.tif 000003
【００７４】
第２臨床群は、慢性肝炎、肝硬変、またはＨＣＣに罹患している患者からの約２７０の血清からなる十分に特徴付けされた一群であり、Ospedale Margiagall（Milan, Italy）から入手された。この群は、ＧＰ７３自己抗体について試験された。結果は、ＧＰ７３抗体についてのＯ．Ｄ．の中央値が、肝硬変または慢性肝炎に罹患している患者よりも明らかに高いことを示した。
【表２】
2010520987.tif 000004
【００７５】
第３群は、肝硬変に罹患していない９１人の患者と肝硬変に罹患している９６人の患者とから構成される１８７人からなる群であり、Kings College（London, England）から得られた（図３）。この群は、抗ＧＰ７３抗体の存在について試験された。さらに、これらの患者からの試料はまた、血清ＧＰ７３抗原およびＣＯＭＰについて試験された。結果は、ＧＰ７３自己抗体の頻度が、肝硬変に罹患していない患者（６６％）よりも、肝硬変に罹患している患者のほうがより高い（８４％）ことを示した（図４および図５）。
【００７６】
いくつかのパラメーターを試験し、患者を評価するために結果の組合せを利用する価値もまた、検討された。肝硬変患者の１４％がＧＰ７３自己抗体、ＧＰ７３抗原、およびＣＯＭＰについて陽性であった一方、３つのアッセイすべてについて、肝硬変に罹患していない患者のいずれもが陽性でなかったことが見出された。逆に言えば、肝硬変患者のわずか４％が３つのアッセイのすべてにおいて陰性であり、肝硬変に罹患していない患者の３０％が３つのアッセイのすべてについて陰性であることが見出された。また、３９人の健康な対照は、ＧＰ７３自己抗体およびＧＰ７３抗原のアッセイの両方について陰性であった。
【００７７】
上述した実施例は、当技術分野において通常の技術を有するものに対し、本発明の好ましい実施形態をどのように作製し使用するかということについて完全に開示及び記載するために提供されるものであり、本発明者らが本発明とみなす範囲を制限することを意図するものではない。本発明を実施するための上述した様式の当業者にとって自明の変更は、下記の特許請求の範囲に含まれることが意図される。本明細書に引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもこのような刊行物、特許、または特許出願の各々が明確かつ個別に参照によって本明細書に組み込まれるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
参考文献
1. Kladney, R. D.ら, "GP73, a novel Golgi-localized protein upregulated by viral infection" Gene 249, 53-65 (2000)
2. Iftikhar, R.ら, "Disease- and cell-specific expression of GP73 in human liver disease" Am. J. Gastroenterol. 99, 1087-95 (2004)
3. Kladney, R. D.ら, "Expression of GP73, a resident Golgi membrane protein, in viral and nonviral liver disease" Hepatology 35, 1431-40 (2002)
4. Block, T. M.ら, "Use of targeted glycoproteomics to identify serum glycoproteins that correlate with liver cancer in woodchucks and humans" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 779-84 (2005)
5. Kladney, R. D.ら, "Upregulation of the Golgi protein GP73 by adenovirus infection requires the ElA CtBP interaction domain" Virology 301, 236-46 (2002)
6. Marrero, J. A.ら, "GP73, a resident Golgi glycoprotein, is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma" J. Hepatol. 43, 1007-12 (2005)
【図１】
2010520987.tif 000005
【図２】
2010520987.tif 000006
【図３】
2010520987.tif 000007
【図４】
2010520987.tif 000008
【図５】
2010520987.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月20日(2010.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ゴルジ膜タンパク質７３（ＧＰ７３タンパク質）を準備するステップと、
ｂ）前記ＧＰ７３タンパク質を患者由来の血清または血漿サンプルと反応させるステップと、
ｃ）前記サンプル中のＧＰ７３自己抗体を検出するステップ
とを含む、患者中のＧＰ７３自己抗体を検出するための方法。
【国際調査報告】
2010520987.tif 000010