(57)【要約】  本発明は、酵素的に活性なコバラミン性メチオニンシンターゼ及びそれらの機能的断片であって、それぞれの野生型酵素と比較して、前記酵素がメチオニンによる低減された生成物阻害を示すように改変されたものをコードするヌクレオチド配列に関する。また、本発明は、かかるヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド及びかかるヌクレオチド配列を含む宿主細胞に関する。更に、本発明は、かかるヌクレオチド配列を使用することにより、宿主生物においてメチオニンを製造する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチオニンによる低減された生成物阻害の特性を有する酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片である少なくとも１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項２】
請求項１に記載のヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが、そのアミノ酸配列において野生型アミノ酸配列と比較して少なくとも１つの突然変異を有することで、前記の酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくは前記の機能的断片の酵素活性が、メチオニンによって、野生型のアミノ酸配列を有する酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくは機能的断片の酵素活性よりも低い程度まで阻害される、ヌクレオチド配列。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のヌクレオチド配列であって、メチオニンによる低減された生成物阻害の特性を有する前記の酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片が、そのホモシステイン結合ドメイン中に突然変異を有する、ヌクレオチド配列。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項に記載のＤＮＡ配列であって、以下のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）：
ａ）配列番号１における少なくとも１つの突然変異を有するメチオニンによる低減された生成物阻害の特性を有する少なくとも１つの酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列、
ｂ）配列番号２３における突然変異を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列、
ｃ）ＤＮＡ配列ａ）もしくはｂ）と、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるＤＮＡ配列、
ｄ）ヌクレオチド配列ａ）、ｂ）もしくはｃ）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列もしくはその少なくとも一部
からなるＤＮＡ配列の群から選択される、ＤＮＡ配列。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項に記載のＤＮＡ配列であって、以下のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）：
ａ）配列番号２における少なくとも１つの突然変異を有するメチオニンによる低減された生成物阻害の特性を有する少なくとも１つの酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列、
ｂ）配列番号２４における突然変異を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列、
ｃ）ＤＮＡ配列ａ）もしくはｂ）と、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるＤＮＡ配列、
ｄ）ヌクレオチド配列ａ）、ｂ）もしくはｃ）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列もしくはその少なくとも一部
からなる群から選択される、ＤＮＡ配列。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか１項に記載のＤＮＡ配列であって、配列番号３〜１８の群から選択される配列における少なくとも１つの突然変異を有する、メチオニンによる低減された生成物阻害の特性を有する少なくとも１つの酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片をコードする、ＤＮＡ配列。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか１項に記載のＤＮＡ配列であって、配列番号１のＭ３３、Ｆ８６もしくはＳ１３４に相当する位置において少なくとも１つの突然変異を有する、少なくとも１つの酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片をコードする、ＤＮＡ配列。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡ配列であって、Ｍ３３もしくは相応のアミノ酸が、ＧもしくはＡに突然変異されており、Ｆ８６もしくは相応のアミノ酸が、Ｌに突然変異されており、かつＳ１３４もしくは相応のアミノ酸が、Ｎに突然変異されている、ＤＮＡ配列。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡ配列であって、配列番号１９、２０、２１もしくは２２によるポリペプチドをコードする、ＤＮＡ配列。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか１項に記載のＤＮＡ配列であって、コードされる、メチオニンによる低減された生成物阻害の特性を有する酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片の酵素活性が、メチオニンの存在下で、相応する野生型のコバラミン依存性メチオニンシンターゼと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％低く阻害され、好ましくは少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍もしくは１０００倍低く阻害される、ＤＮＡ配列。
【請求項１１】
５′−３′方向で：
ａ）宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現のために機能的なプロモーター、
ｂ）そこに作動的に結合された請求項１から９までのいずれか１項に記載のヌクレオチド配列、
ｃ）終結配列、
を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１から１０までのいずれか１項に記載のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１から１１までのいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞が、好ましくはＣ．グルタミクム、Ｅ．コリ、Ｓ．コエル及びＴ．マリチマからなる群から選択される微生物である、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の宿主細胞であって、微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ １３０３２）、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ １５８０６）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）（ＡＴＣＣ １３８７０）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）、コリネバクテリウム・メラッセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）（ＡＴＣＣ １７９６５）、コリネバクテリウム・グルタミクム（ＫＦＣＣ １００６５）、コリネバクテリウム・グルタミクム（ＤＳＭ １７３２２）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）（ＹＳ−３１４）及びコリネバクテリウム・グルタミクム（ＡＴＣＣ２１６０８）からなる群から選択される、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１３から１５までのいずれか１項に記載の宿主細胞であって、１種以上のコバラミン依存性メチオニンシンターゼに関する１種以上の内因性遺伝子が、欠失もしくは機能的に破壊されている、宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１３から１６までのいずれか１項に記載の宿主細胞であって、以下の少なくとも１つのヌクレオチド配列：
・  アスパラギン酸キナーゼｌｙｓＣをコードするヌクレオチド配列
・  グリセリンアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｇａｐをコードするヌクレオチド配列
・  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼｐｇｋをコードするヌクレオチド配列
・  ピルビン酸カルボキシラーゼｐｙｃをコードするヌクレオチド配列
・  トリオースリン酸イソメラーゼｔｐｉをコードするヌクレオチド配列
・  ホモセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼｍｅｔＡをコードするヌクレオチド配列
・  シスタチオン−ガンマ−シンターゼｍｅｔＢをコードするヌクレオチド配列
・  シスタチオン−ガンマ−リアーゼｍｅｔＣをコードするヌクレオチド配列
・  セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼｇｌｙＡをコードするヌクレオチド配列
・  Ｏ−アセチルホモセリン−スルフヒドリラーゼｍｅｔＹをコードするヌクレオチド配列
・  ホスホセリンアミノトランスフェラーゼｓｅｒＣをコードするヌクレオチド配列
・  ホスホセリンホスファターゼｓｅｒＢをコードするヌクレオチド配列
・  セリンアセチルトランスフェラーゼｃｙｓＥをコードするヌクレオチド配列
・  ホモセリンデヒドロゲナーゼｈｏｍをコードするヌクレオチド配列
・  メチオニンシンターゼｍｅｔＥをコードするヌクレオチド配列
・  ホスホアデノシンホスホ硫酸レダクターゼｃｙｓＨをコードするヌクレオチド配列
・  硫酸アデニリルトランスフェラーゼ−サブユニット１をコードするヌクレオチド配列
・  ＣｙｓＮ−硫酸アデニリルトランスフェラーゼ−サブユニット２をコードするヌクレオチド配列
・  フェレドキシンＮＡＤＰレダクターゼをコードするヌクレオチド配列
・  フェレドキシンをコードするヌクレオチド配列
・  グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列
及び／又は
・  フルクトース−１−６−ビスホスファターゼをコードするヌクレオチド配列
の量及び／又は活性が、相応する初期の宿主生物と比較して高められている、宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１３から１７までのいずれか１項に記載の宿主細胞であって、以下の少なくとも１つのヌクレオチド配列：
・  ホモセリンキナーゼｔｈｒＢをコードするヌクレオチド配列
・  トレオニンデヒドラターゼｉｌｖＡをコードするヌクレオチド配列
・  トレオニンシンターゼｔｈｒＣをコードするヌクレオチド配列
・  メソジアミノピメリン酸−Ｄ−デヒドロゲナーゼｄｄｈをコードするヌクレオチド配列
・  ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼｐｃｋをコードするヌクレオチド配列
・  グルコース−６−リン酸−６−イソメラーゼｐｇｉをコードするヌクレオチド配列
・  ピルビン酸オキシダーゼｐｏｘＢをコードするヌクレオチド配列
・  ジヒドロジピコリン酸シンターゼｄａｐＡをコードするヌクレオチド配列
・  ジヒドロジピコリン酸レダクターゼｄａｐＢをコードするヌクレオチド配列
・  ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼｌｙｓＡをコードするヌクレオチド配列
・  グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列
及び／又は
・  乳酸ヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列
の量及び／又は活性が、相応する初期の宿主生物と比較して低減されている、宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１３から１８までのいずれか１項に記載の宿主細胞であって、メチオニン産生の効率が、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の配列が発現されない初期の宿主細胞と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％だけ、好ましくは少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍もしくは１０００倍だけ高められている、宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１から１１までのいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を宿主生物中で発現させる、宿主生物においてメチオニンを製造する方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、宿主生物が、好ましくはＣ．グルタミクム、Ｅ．コリ、Ｓ．コエル及びＴ．マリチマからなる群から選択される微生物である、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクム（ＡＴＣＣ １３０３２）、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（ＡＴＣＣ １５８０６）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（ＡＴＣＣ １３８７０）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）、コリネバクテリウム・メラッセコラ（ＡＴＣＣ １７９６５）、コリネバクテリウム・グルタミクム（ＫＦＣＣ １００６５）、コリネバクテリウム・グルタミクム（ＤＳＭ １７３２２）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（ＹＳ−３１４）及びコリネバクテリウム・グルタミクム（ＡＴＣＣ２１６０８）からなる群から選択される、方法。
【請求項２３】
請求項２０から２２までのいずれか１項に記載の方法であって、以下の工程：
ａ）請求項１０に記載のベクターを宿主細胞にトランスフェクションさせる工程と、
ｂ）該宿主細胞を培養する工程と、場合により
ｃ）メチオニンを回収する工程と、
を含む、方法。
【請求項２４】
請求項２０から２３までのいずれか１項に記載の方法であって、１種以上のコバラミン依存性メチオニンシンターゼに関する１種以上の内因性遺伝子が、欠失もしくは機能的に破壊されている、方法。
【請求項２５】
請求項２０から２４までのいずれか１項に記載の方法であって、以下の少なくとも１つのヌクレオチド配列：
・  アスパラギン酸キナーゼｌｙｓＣをコードするヌクレオチド配列
・  グリセリンアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｇａｐをコードするヌクレオチド配列
・  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼｐｇｋをコードするヌクレオチド配列
・  ピルビン酸カルボキシラーゼｐｙｃをコードするヌクレオチド配列
・  トリオースリン酸イソメラーゼｔｐｉをコードするヌクレオチド配列
・  ホモセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼｍｅｔＡをコードするヌクレオチド配列
・  シスタチオン−ガンマ−シンターゼｍｅｔＢをコードするヌクレオチド配列
・  シスタチオン−ガンマ−リアーゼｍｅｔＣをコードするヌクレオチド配列
・  セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼｇｌｙＡをコードするヌクレオチド配列
・  Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼｍｅｔＹをコードするヌクレオチド配列
・  ホスホセリンアミノトランスフェラーゼｓｅｒＣをコードするヌクレオチド配列
・  ホスホセリンホスファターゼｓｅｒＢをコードするヌクレオチド配列
・  セリンアセチルトランスフェラーゼｃｙｓＥをコードするヌクレオチド配列
・  ホモセリンデヒドロゲナーゼｈｏｍをコードするヌクレオチド配列
・  メチオニンシンターゼｍｅｔＥをコードするヌクレオチド配列
・  ホスホアデノシンホスホ硫酸レダクターゼｃｙｓＨをコードするヌクレオチド配列
・  硫酸アデニリルトランスフェラーゼ−サブユニット１をコードするヌクレオチド配列
・  ＣｙｓＮ−硫酸アデニリルトランスフェラーゼ−サブユニット２をコードするヌクレオチド配列
・  フェレドキシンＮＡＤＰレダクターゼをコードするヌクレオチド配列
・  フェレドキシンをコードするヌクレオチド配列
・  グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列
及び／又は
・  フルクトース−１−６−ビスホスファターゼをコードするヌクレオチド配列
の量及び／又は活性が、相応する初期の宿主生物と比較して高められている、方法。
【請求項２６】
請求項２０から２５までのいずれか１項に記載の方法であって、以下の少なくとも１つのヌクレオチド配列：
・  ホモセリンキナーゼｔｈｒＢをコードするヌクレオチド配列
・  トレオニンデヒドラターゼｉｌｖＡをコードするヌクレオチド配列
・  トレオニンシンターゼｔｈｒＣをコードするヌクレオチド配列
・  メソジアミノピメリン酸−Ｄ−デヒドロゲナーゼｄｄｈをコードするヌクレオチド配列
・  ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼｐｃｋをコードするヌクレオチド配列
・  グルコース−６−リン酸−６−イソメラーゼｐｇｉをコードするヌクレオチド配列
・  ピルビン酸オキシダーゼｐｏｘＢをコードするヌクレオチド配列
・  ジヒドロジピコリン酸シンターゼｄａｐＡをコードするヌクレオチド配列
・  ジヒドロジピコリン酸レダクターゼｄａｐＢをコードするヌクレオチド配列
・  ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼｌｙｓＡをコードするヌクレオチド配列
・  グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列
及び／又は
・  乳酸ヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列
の量及び／又は活性が、相応する初期の宿主生物と比較して低減されている、方法。
【請求項２７】
請求項１から１１までのいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を、メチオニンの製造のために用いる使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素的に活性なコバラミン性メチオニンシンターゼ及びそれらの機能的断片であって、それぞれの野生型酵素と比較して、前記酵素がメチオニンによる低減された生成物阻害を示すように改変されたものをコードするヌクレオチド配列に関する。また、本発明は、かかるヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド及びかかるヌクレオチド配列を含む宿主細胞に関する。更に、本発明は、かかるヌクレオチド及びアミノ酸配列を使用することにより、宿主生物においてメチオニンを製造する方法に関する。
【０００２】
技術背景
近年、メチオニンの世界的年間生産量は、約５０００００トンである。メチオニンは、家畜もしくは家禽の飼料中の第一制限アミノ酸であり、このため主に飼料サプリメントとして適用される。他の工業的アミノ酸に対して、メチオニンは、ほとんど専ら、化学合成によって製造されたラセミ体として適用される。動物は、メチオニンの両方の立体異性体を代謝できるので、化学的に製造されたラセミ混合物の直接的な給餌が可能である（Ｄ′Ｍｅｌｌｏ ａｎｄ Ｌｅｗｉｓ，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｉｎ Ａｎｉｍａｌｓ：Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｒｅｃｈｇｉｇｌ（Ｅｄ．），ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｏｄ，４４１−４９０，１９７８）。
【０００３】
しかしながら、依然として、現存の化学的生産を生物工学的方法によって置き換えることに大きな関心が寄せられている。これは、より低レベルの供給で、Ｌ−メチオニンは、Ｄ−メチオニンよりも良好な硫黄アミノ酸源であるという事実によるものである（Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．，５４５：１６６７−７４）。更に、化学的方法は、どちらかと言えば有害な化学薬品を使用し、実質的な廃棄物流をもたらす。これらの化学的生産の全ての欠点は、生物工学的方法によって回避することができた。
【０００４】
グルタミン酸塩などの他のアミノ酸については、発酵生産法が知られている。これらの目的のためには、エシェリキア・コリ（Ｅ．コリ）及びコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．グルタミクム）などの一定の微生物が、特に適していることが判明している。また、発酵によるアミノ酸の産生は、Ｌ−アミノ酸のみが産生されるという特定の利点を有する。更に、溶剤などの化学合成で使用される環境的に問題のある化学薬品は回避される。しかしながら、微生物によるメチオニンの発酵的産生は、それが化学的産生と同等の価格で産業規模でメチオニンの産生を可能にする場合にのみ、化学合成の代替となる。
【０００５】
従って、Ｌ−メチオニンの産生であって、この分子を多量に産生しかつ分泌するように開発された細菌の大規模培養によるものが望ましい目標である。該方法の改良は、撹拌及び酸素の供給、又は栄養培地の組成、例えば発酵の間の糖濃度、又は例えばイオン交換クロマトグラフィーによる生成物の後処理、又は微生物それ自体の固有の産出特性などの発酵パラメータに関連しうる。
【０００６】
突然変異誘発及び突然変異体選択の方法は、また、これらのメチオニン産生微生物の産出特性の改善のために使用される。代謝拮抗物質に対して耐性な高生産菌株又は調節に重要な代謝物に栄養要求性の高生産菌株は、このようにして得られる。
【０００７】
組み換えＤＮＡ技術は、また、数年にわたり、Ｌ−アミノ酸を産生する微生物株を、個々のアミノ酸生合成遺伝子の増幅により改善するためと、該アミノ酸産生に対する効果を調査するために使用されている。
【０００８】
Ｒｕｅｃｋｅｒｔ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００３），１０４：２１３−２２８）は、コリネバクテリウム・グルタミクムにおけるＬ−メチオニン生合成経路の分析を提供している。ＭｅｔＺ（ＭｅｔＹとしても知られる）及びＭｅｔＢの公知の機能を確認でき、かつＭｅｔＣ（ＡｅｃＤとしても知られる）がシスタチオニン−β−リアーゼであることが判明した。更に、ＭｅｔＥ及びＭｅｔＨは、Ｌ−ホモシステインをＬ−メチオニンに転化するのを触媒するが、それらはこの研究において同定された。
【０００９】
ＷＯ０２／０９７０９６号は、コリネフォルム細菌由来のヌクレオチド配列であって、ＭｃｂＲリプレッサー遺伝子（ＭｅｔＤとしても知られる）をコードするヌクレオチド配列と、このＭｃｂＲリプレッサー遺伝子が減衰された細菌を使用するアミノ酸の製造方法を開示している。ＷＯ０２／０９７０９６号によれば、転写調節因子であるＭｃｂＲの減衰は、コリネフォルム細菌におけるＬ−メチオニンの産生を向上させる。更に、ＷＯ０２／０９７０９６号においては、ＭｃｂＲリプレッサー遺伝子の減衰に加えて、シスタチオニン−γ−シンターゼをコードするＭｅｔＢ遺伝子の増強もしくは過剰発現は、Ｌ−メチオニンの製造に好ましいことが記載されている。
【００１０】
特定の分子の産生について向上された菌株の選択は、時間のかかる困難な過程である。従って、依然として、Ｌ−メチオニンを効果的に産生し、かつ／又はメチオニンを得るために利用できるＬ−メチオニンの大きく高められた含有率を有する微生物に大きな要求がある。
【００１１】
発明の要旨
本発明の課題は、メチオニンによる低減された生成物阻害の特性を有する、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を提供することである。かかるヌクレオチド配列は、好ましくは酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片であって、それぞれの野生型アミノ酸配列と比較して、それらのアミノ酸配列において、少なくとも１つの突然変異を有することで、これらの酵素がメチオニンによる低減された生成物阻害を示すもの、すなわち該酵素活性が、野生型酵素及びポリペプチドに関するよりも低い程度でメチオニンにより阻害されるものをコードする。かかるヌクレオチド配列は、例えばＤＮＡ配列及び／又はＲＮＡ配列であってよく、好ましくはＤＮＡ配列である。
【００１２】
本発明の更なる課題は、かかるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド及び好ましくはタンパク質を提供することである。
【００１３】
本発明の更なるもう一つの課題は、かかるヌクレオチド配列を含み、かつかかるヌクレオチド配列及びポリペプチドの発現のために宿主細胞において使用することができるベクターを提供することである。
【００１４】
本発明のもう一つの課題は、上述のヌクレオチド及びポリペプチド配列を発現する宿主細胞に関する。
【００１５】
本発明の更なるもう一つの課題は、かかるヌクレオチド及びポリペプチド配列を、メチオニンの産生のために、及び／又は宿主生物におけるメチオニン産生の効率を高めるために用いる使用に関する。
【００１６】
また、本発明は、前記のヌクレオチド及びポリペプチド配列を宿主生物において発現させることによってメチオニンを製造する方法に関する。
【００１７】
本発明の一実施態様によれば、メチオニンによる低減された生成物阻害の特性を有する、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片をコードするヌクレオチド及び有利にはＤＮＡ配列が提供される。一実施態様においては、かかるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列は、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片であって、それぞれの野生型アミノ酸配列と比較して、それらのアミノ酸配列において、少なくとも１つの突然変異を有することで、前記の酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくは前記の機能的断片の酵素活性が、その少なくとも１つの突然変異の結果として、低減された生成物阻害を示すものをコードする。これは、突然変異した酵素もしくはその機能的断片の酵素活性が、それぞれの野生型配列と比較してより低い程度でメチオニンにより阻害されることを意味する。
【００１８】
かかるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列は、また、好ましくは多量の所望の分子、すなわちＬ−メチオニンを産生及び分泌する宿主生物の構築をも可能にしうる。
【００１９】
本発明の更なる一実施態様において、かかるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列は、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片であって、配列番号１において少なくとも１つの突然変異を有することで、コードされたポリペプチドが、それぞれの野生型ポリペプチドと比較して低減された生成物阻害を示すものをコードする。
【００２０】
本発明の更なるもう一つの実施態様は、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片であってそのホモシステイン結合ドメインにおいて少なくとも１つの突然変異を有することで、これらのポリペプチドがメチオニンによる低減された生成物阻害を示すものをコードするヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列に関する。典型的なホモシステイン結合ドメインは、Ｃ．グルタミクムのＭｅｔＨのそれである。相応のＤＮＡ配列は配列番号２４であり、一方、アミノ酸配列は配列番号２である。
【００２１】
本発明の更なるもう一つの実施態様においては、ヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列は、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片であって配列番号３〜１８において少なくとも１つの突然変異を有することで、これらのポリペプチドがメチオニンによる低減された生成物阻害を示すものをコードする。
【００２２】
本発明の一実施態様は、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片であってＣ．グルタミクムのコバラミン依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＨのＭ３３、Ｆ８６もしくはＳ１３４に相当する位置において少なくとも１つの突然変異を有するものをコードするヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列に関する。Ｃ．グルタミクムのＭｅｔＨのＤＮＡ配列は、配列番号２３の配列である。Ｃ．グルタミクムのＭｅｔＨのアミノ酸配列は、配列番号１の配列である。
【００２３】
本発明は、一実施態様において、また、上述のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列であって、野生型配列と比較して、これらの配列において少なくとも１つの突然変異を有することで、得られる酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片が、メチオニンによる低減された生成物阻害を示すものに関する。
【００２４】
このように、本発明は、一実施態様において、配列番号１〜１８のいずれかによってコードされるポリペプチドと、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列であるが、これらのポリペプチドが、これらの配列において少なくとも１つの突然変異を有することで、得られる酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片が、メチオニンによる低減された生成物阻害を示すものに関する。
【００２５】
本発明の更なるもう一つの実施態様は、上述のヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列と、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列に関する。
【００２６】
このように、一実施態様において、本発明は、例えば配列番号２３もしくは配列番号２４と、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列であるが、該ヌクレオチド配列が、付加的に、少なくとも１つの突然変異を有することで、得られる酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片が、メチオニンによる低減された生成物阻害を示すものに関する。
【００２７】
好ましい実施態様において、これらのヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列は、単離されたもしくは組み換えのヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列である。
【００２８】
本発明のもう一つの実施態様は、ストリンジェントな条件下で上述のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列に関する。
【００２９】
本発明の他の実施態様は、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片をコードするヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列であって、相応の野生型配列に対して少なくとも１つの突然変異を有し、その酵素活性が、２０ｍＭのメチオニンの存在下で、それぞれの野生型コバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片での阻害と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％低く、かつ好ましくは２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍もしくは１０００倍低いものに関する。
【００３０】
本発明は、また、上述のヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列を、これらのヌクレオチド配列が宿主生物で発現できるようにプロモーター及び終結配列と作動的に結合されて有するベクターに関する。
【００３１】
本発明の他の実施態様は、上述のヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドに関する。
【００３２】
本発明の更なるもう一つの実施態様は、上述のヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列を含む宿主細胞に関する。
【００３３】
本発明の一実施態様においては、かかる宿主細胞は、上述のヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列を、好ましくは上述のベクターの１つから発現する。
【００３４】
本発明の更なる実施態様によれば、かかる宿主細胞は、微生物及び酵母から選択される。一実施態様においては、微生物は、例えばコリネ型細菌、ミクロバクテリア、ストレプトマイセス科、サルモネラ、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、Ｓ．コエル（Ｓ．ｃｏｅｌ）もしくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）からなる群から選択される。
【００３５】
如何なる宿主細胞もしくは宿主生物も、本発明によれば、メチオニンによる低減された生成物阻害を有する酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片をコードする上述のヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列を含まねばならないが、本発明の一実施態様は、１つ以上のコバラミン依存性メチオニンシンターゼについての１つ以上の内因性遺伝子が欠失もしくは機能的に破壊されている宿主細胞に関する。
【００３６】
本発明の他の実施態様は、本発明による少なくとも１つのヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列が発現され、かつ以下のヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの量及び／又は活性が、相応する初期の宿主生物と比較して高められている宿主細胞及び宿主生物に関する：
・  アスパラギン酸キナーゼｌｙｓＣをコードするヌクレオチド配列
・  グリセリンアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｇａｐをコードするヌクレオチド配列
・  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼｐｇｋをコードするヌクレオチド配列
・  ピルビン酸カルボキシラーゼｐｙｃをコードするヌクレオチド配列
・  トリオースリン酸イソメラーゼｔｐｉをコードするヌクレオチド配列
・  ホモセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼｍｅｔＡをコードするヌクレオチド配列
・  シスタチオン−ガンマ−シンターゼｍｅｔＢをコードするヌクレオチド配列
・  シスタチオン−ガンマ−リアーゼｍｅｔＣをコードするヌクレオチド配列
・  セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼｇｌｙＡをコードするヌクレオチド配列
・  Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼｍｅｔＹをコードするヌクレオチド配列
・  ホスホセリンアミノトランスフェラーゼｓｅｒＣをコードするヌクレオチド配列
・  ホスホセリンホスファターゼｓｅｒＢをコードするヌクレオチド配列
・  セリンアセチルトランスフェラーゼｃｙｓＥをコードするヌクレオチド配列
・  ホモセリンデヒドロゲナーゼｈｏｍをコードするヌクレオチド配列
・  メチオニンシンターゼｍｅｔＥをコードするヌクレオチド配列
・  ホスホアデノシンホスホ硫酸レダクターゼｃｙｓＨをコードするヌクレオチド配列
・  硫酸アデニリルトランスフェラーゼ−サブユニット１をコードするヌクレオチド配列
・  ＣｙｓＮ−硫酸アデニリルトランスフェラーゼ−サブユニット２をコードするヌクレオチド配列
・  フェレドキシンＮＡＤＰレダクターゼをコードするヌクレオチド配列
・  フェレドキシンをコードするヌクレオチド配列
・  グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列
及び／又は
・  フルクトース−１−６−ビスホスファターゼをコードするヌクレオチド配列
【００３７】
本発明のもう一つの実施態様は、本発明による１つのヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列が発現され、かつ以下のヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの量及び／又は活性が、相応する初期の生物に対して低減されている宿主細胞及び宿主生物に関する：
・  ホモセリンキナーゼｔｈｒＢをコードするヌクレオチド配列
・  トレオニンデヒドラターゼｉｌｖＡをコードするヌクレオチド配列
・  トレオニンシンターゼｔｈｒＣをコードするヌクレオチド配列
・  メソジアミノピメリン酸−Ｄ−デヒドロゲナーゼｄｄｈをコードするヌクレオチド配列
・  ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼｐｃｋをコードするヌクレオチド配列
・  グルコース−６−リン酸−６−イソメラーゼｐｇｉをコードするヌクレオチド配列
・  ピルビン酸オキシダーゼｐｏｘＢをコードするヌクレオチド配列
・  ジヒドロジピコリン酸シンターゼｄａｐＡをコードするヌクレオチド配列
・  ジヒドロジピコリン酸レダクターゼｄａｐＢをコードするヌクレオチド配列
・  ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼｌｙｓＡをコードするヌクレオチド配列
・  グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列
及び／又は
・  乳酸ヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列
【００３８】
本発明のもう一つの態様は、メチオニン産生の効率及び／又は収率及び／又は量が、本発明によるヌクレオチド配列が発現されていない宿主細胞もしくは宿主生物と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％だけ、好ましくは少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍もしくは１００倍だけ高められている宿主細胞及び宿主生物に関する。
【００３９】
本発明の他の実施態様は、宿主細胞もしくは宿主生物においてメチオニンを製造する方法であって、本発明によるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡもしくはポリペプチド配列を該宿主細胞において発現させるメチオニンを製造する方法に関する。本発明の他の実施態様は、メチオニンを製造する方法であって、上述の宿主細胞の１つを使用するメチオニンを製造する方法に関する。
【００４０】
本発明の一態様は、メチオニンの製造方法であって、上述の宿主細胞の１つを培養し、メチオニンを引き続き単離するメチオニンを製造する方法に関する。本発明は、また、上述の宿主細胞を、メチオニンの製造のために用いる使用に関し、かつ本発明によるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列を、メチオニンを製造するために用いる使用及びメチオニン製造に有用な宿主細胞の製造のために用いる使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、Ｃ．グルタミクムなどの微生物におけるＬ−メチオニン生合成に関する経路のモデルである。関与する酵素は、ＭｅｔＡ（ホモセリントランスアセチラーゼ）、ＭｅｔＢ（シスタチオン−ガンマ−シンターゼ）、ＭｅｔＺ（Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドロラーゼ）、ＭｅｔＣ（シスタチオン−ベータ−リアーゼ）、ｃｏｂ（Ｉ）アラミン非依存性メチオニンシンターゼＩＩ（ＭｅｔＥ）である。
【図２】図２は、Ｃ．グルタミクム、Ｓ．コエル、Ｅ．コリ及びサーモトガ・マリチマのｃｏｂ（Ｉ）アラミン依存性メチオニンシンターゼの配列アラインメントを示す。
【図３】図３は、Ｃ．グルタミクムのｃｏｂ（Ｉ）アラミン依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＨのアミノ酸配列（配列番号１、ａ））及びＤＮＡ配列（配列番号２３、ｂ））を示す。
【図４】図４は、Ｃ．グルタミクムのｃｏｂ（Ｉ）アラミン依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＨのアミノ酸１〜２４４を含むホモシステイン結合ドメインのアミノ酸配列（配列番号２、ｂ））及びＤＮＡ配列（配列番号２４、ｂ））を示す。
【図５】図５は、Ｃ．グルタミクム、Ｓ．コエル、Ｅ．コリ及びサーモトガ・マリチマのｃｏｂ（Ｉ）アラミン依存性メチオニンシンターゼのホモシステイン結合ドメイン内の保存領域のアミノ酸配列（配列番号３〜１８）を示す。
【図６】図６は、Ｃ．グルタミクムのｃｏｂ（Ｉ）アラミン依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＨのＭ３３Ａ突然変異を有するアミノ酸配列（配列番号１９、ａ））及びＤＮＡ配列（配列番号２５、ｂ））を示す。
【図７】図７は、Ｃ．グルタミクムのｃｏｂ（Ｉ）アラミン依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＨのＭ３３Ｌ突然変異を有するアミノ酸配列（配列番号２０、ａ））及びＤＮＡ配列（配列番号２６、ｂ））を示す。
【図８】図８は、Ｃ．グルタミクムのｃｏｂ（Ｉ）アラミン依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＨのＦ８６Ｌ突然変異を有するアミノ酸配列（配列番号２１、ａ））及びＤＮＡ配列（配列番号２７、ｂ））を示す。
【図９】図９は、Ｃ．グルタミクムのｃｏｂ（Ｉ）アラミン依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＨのＳ１３４Ｎ突然変異を有するアミノ酸配列（配列番号２２、ａ））及びＤＮＡ配列（配列番号２８、ｂ））を示す。
【００４２】
例示される実施態様の詳細な説明
本発明の例示される実施態様を詳細に説明する前に、以下の定義を定める。
【００４３】
用語"本発明によるヌクレオチド配列"及び"本発明によるＤＮＡ配列"は、上述の相応の配列であって、メチオニンによる低減された生成物阻害を示す、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはそれらの機能的断片であるポリペプチドをコードするものを指す。用語"メチオニンによる低減された生成物阻害"は、更に以下のように定義される。用語"ポリペプチド"は、タンパク質を含むことを意味し、一般に２０アミノ酸より多いポリペプチドに関する。
【００４４】
用語"メチオニン合成の効率"は、メチオニンの炭素収率を記載している。この効率は、炭素基質の形で系内に入るエネルギー入力のパーセンテージとして計算される。本発明によるスループットの値は、特に記載がない限り、（（メチオニンのモル数）（炭素基質のモル数）-1・１００）のパーセント値で与えられる。本発明による好ましい炭素源は、糖類、例えば単糖類、二糖類もしくは多糖類である。例えばグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンもしくはセルロースからなる群から選択される糖類は、特に好ましい炭素源としての役割を果たしうる。
【００４５】
用語"メチオニン合成の高められた効率"は、本発明によるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列を発現するように遺伝的に改変された宿主細胞である生物と本発明によるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列を発現しない初期の生物と比較してメチオニン合成のより高い効率を有する生物との間の比較に関連する。
【００４６】
本発明によるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列を発現しない初期の生物は、野生型生物であってよい。選択的に、既にメチオニン産生のために最適化されており、こうしてメチオニン合成経路の一定の遺伝子を過剰発現する生物であってよい。選択的に、既にメチオニン産生のために最適化されている初期の生物は、メチオニン経路の一定の酵素について低減された発現を示すことがある。
【００４７】
用語"メチオニン経路"及び"メチオニン生合成経路"は、当該技術分野で認識されるものであり、かつ野生型生物で行われ、Ｌ−メチオニンの生合成に導く一連の反応を記載している。これらの経路は、生物ごとに様々であってよい。生物特異的な経路の詳細は、インターネットウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．ｈｔｍｌにある教科書及び科学文献から知ることが出来る。特に、本発明の意味の範囲内でのメチオニン経路は、図１に示されている。
【００４８】
用語"メチオニンの収率"は、細胞塊質量あたりで得られるメチオニンの量として計算されるメチオニンの収率を記載している。
【００４９】
本発明の目的のための用語"生物"、"宿主生物"、"宿主細胞"もしくは"微生物"は、メチオニンなどのアミノ酸を製造するために通常使用される任意の生物を指す。特に、これらの用語は、原核生物、低級真核生物及び菌類に関連する。上述の生物の好ましいグループは、アクチノバクテリア、シアノバクテリア、プロテオバクテリア、クロロフレクサス・アウランチアクス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、ピレルラ種１（Ｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｓｐ．１）、ハロバクテリア及び／又はメタノコッキ、好ましくはコリネ型細菌、マイコバクテリア、ストレプトマイセス、サルモネラ、エシェリキア・コリ、シゲラ、シュードモナス、Ｓ．コエルもしくはサーモトガ・マリチマを含む。
【００５０】
特に好ましい微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム、エシェリキア・コリ、バシラス属の微生物、特にバシラス・サチリス、ストレプトマイセス属の微生物又はサーモトガ属の微生物、特にサーモトガ・マリチマから選択される。
【００５１】
しかしながら、本発明の生物は、また、酵母、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベもしくはＳ．セレビシエ及びピチア・パストリスをも含んでよい。
【００５２】
本発明の目的のための用語"Ｌ−メチオニン過剰産生生物"、"メチオニン過剰産生生物"もしくは"メチオニン産生生物"は、本発明によるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列を発現しない初期の生物と比較して、メチオニン産生の効率及び／又は収率及び／又は量が、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％だけ又は少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍及び１０００倍超だけ高められている"生物"、"宿主生物"もしくは"微生物"を指す。
【００５３】
用語"代謝物"は、前駆体、中間体及び／又は最終生成物として生物の代謝経路で使用される化学的化合物を指す。かかる代謝物は、化学的構成単位としての役割を果たすだけでなく、酵素に対する調節活性及びそれらの触媒活性を発揮させることもある。かかる代謝物が酵素の活性を阻害もしくは刺激しうることは文献から公知である（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９９５）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ & Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００５４】
本発明の目的のために、用語"外部代謝物"は、基質、例えばグルコース、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、アンモニア、酸素などを含む。
【００５５】
本発明の範囲において、ヌクレオチド配列の含有率又は該ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの含有率に参照がなされる場合に、これは、かかるヌクレオチド配列もしくはポリペプチドを含むそれぞれの宿主生物について測定できる、核酸及びかかる核酸配列によってコードされるポリペプチドの量を指す。
【００５６】
ヌクレオチド配列の活性に参照がなされる場合には、これは、一般に、本発明の目的のためには、かかるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドもしくはタンパク質の活性を含むことを意味する。
【００５７】
本発明の範囲においては、ヌクレオチド配列の量が、野生型もしくは初期の生物に対して高められている場合に、これは、前記のヌクレオチド配列の量及び該核酸によってコードされるポリペプチドの量が、この特定のヌクレオチド配列もしくはポリペプチドに対して遺伝子操作されていない生物と比較して高められていることを意味する。これは、相応の外因性のヌクレオチド配列を宿主生物に導入することによって達成でき、その際、比較は、該ヌクレオチド配列を発現する宿主生物と、該ヌクレオチド配列が導入されていない初期の生物との比較を指す。選択的に、ヌクレオチド配列の量は、生物内での他の調節配列もしくは内因性の配列の操作によって高めることができる。
【００５８】
このように、ヌクレオチド配列の量の増加は、それぞれのヌクレオチド配列の発現のレベルの役割を担う外因性の配列を導入するかもしくは内因性の配列を操作することによって達成できる。
【００５９】
本発明の範囲内で、ヌクレオチド配列の活性が、初期の生物に対して高められていることが示されている場合に、これは、一般に、このヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの活性が初期の生物と比較して高められている状況を指す。活性の増大は、該ヌクレオチド配列の量の増大によって、及び／又は高められた活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中の突然変異を導入することによって達成できる。
【００６０】
このように、ヌクレオチド配列及びそれによりコードされるポリペプチドの活性の増加は、外因性のヌクレオチド配列を導入するか及び／又は関心のある配列を発現する役割を担う内因性の配列の調節配列及びコーディング配列中に突然変異を導入することによって達成できる。
【００６１】
本発明の範囲において、ヌクレオチド配列及び結果的にこれによってコードされるポリペプチドの含有率（量）及び／又は活性が初期の生物と比較して低減されていることが示される場合に、前記の定義が、必要な変更を加えて適用されるべきである。
【００６２】
用語"発現する"、"発現している"、"発現された"及び"発現"は、遺伝子産物（例えば定義された本願に記載される経路の遺伝子の生合成酵素）又はヌクレオチド配列の発現を指す。発現は、例えば初期の出発生物として使用される微生物の遺伝的変更によって行うことができる。幾つかの実施態様において、微生物は、ポリペプチドなどの遺伝子産物を、初期の微生物によって又は変更されていない同等の微生物において生産されるものと比較して高められたレベルで発現するように遺伝的に変更され（例えば遺伝子操作され）ていてよい。遺伝的変更は、それらに制限されないが、特定の遺伝子の発現に関与する調節配列もしくは調節部位の変更もしくは改変（例えば強力なプロモーター、誘導可能なプロモーターもしくは多重プロモーターを付加することによって又は発現が構成的になるように調節配列を除去することによって）、特定の遺伝子の染色体座の改変、リボソーム結合部位もしくは転写終結因子などの特定の遺伝子に隣接した核酸配列を変更すること、特定の遺伝子のコピー数を高めること、特定の遺伝子の転写及び／又は特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性因子など）を改変すること、又は当該技術分野で通常の方法を用いた特定の遺伝子の発現を脱調節する任意の他の慣用の手段（それらに制限されないが、アンチセンス核酸分子を使用すること、例えばリプレッサータンパク質の発現の遮断のために）を含む。
【００６３】
用語"過剰発現する"、"過剰発現している"、"過剰発現される"及び"過剰発現"は、遺伝子産物（本願に定義かつ説明される例えばメチオニン生合成酵素又は遺伝子もしくは経路又は反応）又はヌクレオチド配列の、初期の微生物の遺伝的変更の前に存在したよりも高いレベルでの発現を指す。幾つかの実施態様において、微生物は、遺伝子産物もしくはヌクレオチド配列を、初期の微生物によって産生されるものに対して高められたレベルで発現するように遺伝的に変更（例えば遺伝子操作）されていてよい。遺伝的変更は、それらに制限されないが、特定の遺伝子の発現に関与する調節配列もしくは調節部位の変更もしくは改変（例えば強力なプロモーター、誘導可能なプロモーターもしくは多重プロモーターを付加することによって又は発現が構成的になるように調節配列を除去することによって）、特定の遺伝子の染色体座の改変、リボソーム結合部位もしくは転写終結因子などの特定の遺伝子に隣接した核酸配列を変更すること、特定の遺伝子のコピー数を高めること、特定の遺伝子の転写及び／又は特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性因子など）を改変すること、又は当該技術分野で通常の方法を用いた特定の遺伝子の発現を脱調節する任意の他の慣用の手段（それらに制限されないが、アンチセンス核酸分子を使用すること、例えばリプレッサータンパク質の発現の遮断のために）を含む。Ｃ．グルタミクムなどの生物における遺伝子の過剰発現のための例は、Ｅｉｋｍａｎｎｓ他（Ｇｅｎｅ．（１９９１）１０２，９３−８）に見受けられる。
【００６４】
幾つかの実施態様において、微生物は、遺伝子産物もしくはヌクレオチド配列を、初期の微生物による遺伝子産物もしくはヌクレオチド配列の発現のレベルに対して高められた又はより低いレベルで発現するように物理的にもしくは環境的に変更することができる。例えば、微生物は、転写及び／又は翻訳が増強され又は高められるように特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は特定のぬクレチド配列の翻訳を高めることが知られている又は想定されている剤で処理するか又はその存在下で培養することができる。選択的に、微生物は、転写及び／又は翻訳が増強され又は高められるように特定のヌクレオチド配列もしくは遺伝子の転写及び／又は特定のヌクレオチド配列もしくは遺伝子産物の翻訳を高めるように選択された温度で培養することができる。
【００６５】
用語"破壊する"、"破壊された"、"破壊"、"脱調節する"、"脱調節された"及び"脱調節"は、例えば微生物中での少なくとも１つの遺伝子もしくはヌクレオチド配列の変更もしくは改変であって、該変更もしくは改変が、該微生物におけるメチオニン産生の効率もしくは収率を、該変更もしくは改変の不在でのメチオニン産生に対して増大させるものを指す。幾つかの実施態様において、変更もしくは改変された遺伝子もしくはヌクレオチド配列は、微生物中の生合成酵素のレベルもしくは活性が変更もしくは改変されるように、生合成経路における酵素をコードしている。幾つかの実施態様において、生合成経路における酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、該酵素のレベルもしくは活性が、未変更もしくは野生型遺伝子の存在でのレベルに対して増強もしくは高められるように変更もしくは改変されている。幾つかの実施態様において、生合成経路は、メチオニン生合成経路である。脱調節は、また、例えばフィードバック耐性の酵素又はより高いもしくはより低い比活性を有する酵素を得るための１つ以上の遺伝子のコーディング領域の変更を含む。また、脱調節は、更に、メチオニン生合成経路及び／又はシステイン生合成経路における遺伝子の発現を調節する転写因子（例えばアクチベーター、リプレッサー）をコードする遺伝子の遺伝的変更を含む。
【００６６】
表現"脱調節された経路もしくは反応"は、生合成経路もしくは反応における酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が変更もしくは改変されて、少なくとも１つの生合成酵素のレベルもしくは活性が変更もしくは改変された生合成経路もしくは反応を指す。表現"脱調節された経路"は、１つより多くの遺伝子が変更もしくは改変され、それにより相応の遺伝子産物／酵素のレベル及び／又は活性を変更する生合成経路を含む。幾つかの場合に、微生物における経路を"脱調節"する（例えば所定の生合成経路における１つより多くの遺伝子を同時に脱調節する）能力は、１つより多くの酵素（例えば２もしくは３つの生合成酵素）が遺伝子材料の隣接部分で互いに隣接して存在する遺伝子によってコードされる微生物の"オペロン"と呼ばれる特定の現象から生ずる。他の場合に、経路の脱調節のためには、遺伝子の数は、一連の連続的な操作工程において脱調節しなければならない。
【００６７】
用語"オペロン"は、１つ以上、有利には少なくとも２つの構造遺伝子（例えば酵素、例えば生合成酵素をコードする遺伝子）と関連するプロモーターあるいは調節エレメントを含む遺伝子材料の協調的単位を指す。構造遺伝子の発現は、例えば調節エレメントに結合する調節タンパク質によって又は転写の終結に対抗することによって協調的に調節することができる。構造遺伝子は、転写されることで、全ての構造タンパク質をコードする単独のｍＲＮＡを得ることができる。オペロンに含まれる遺伝子の協調的制御のため、単独のプロモーター及び／又は調節エレメントの変更もしくは改変は、オペロンによってコードされる各遺伝子産物の変更もしくは改変をもたらしうる。調節エレメントの変更もしくは改変は、それらに制限されないが、内因性のプロモーター及び／又は調節エレメントの除去、強力なプロモーター、誘導可能なプロモーターもしくは多重プロモーターを付加することによってもしくは調節配列を除去することで遺伝子産物の発現を変更すること、オペロンの染色体座の改変、リボソーム結合部位などのオペロンに隣接するもしくはオペロン内の核酸配列を変更すること、コドン利用、オペロンのコピー数を高めること、オペロンの転写及び／又はオペロンの遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性因子など）を改変すること、又は当該技術分野で通常の方法を用いた特定の遺伝子の発現を脱調節する任意の他の慣用の手段（それらに制限されないが、アンチセンス核酸分子を使用すること、例えばリプレッサータンパク質の発現の遮断のために）を含む。
【００６８】
幾つかの実施態様において、本願に記載される組み換え微生物は、細菌由来の遺伝子もしくは遺伝子産物を過剰発現するように遺伝子操作されている。用語"細菌由来"及び"細菌に由来する"は、細菌に天然に見出される遺伝子又は該細菌性遺伝子によってコードされる遺伝子産物を指す。
【００６９】
アミノ酸は、全てのタンパク質の基本構造単位を含み、そのものが生物における通常の細胞機能に必須である。用語"アミノ酸"は、当該技術分野でよく知られている。タンパク質原性のアミノ酸であってそのうち２０種があるものは、タンパク質の構造単位としての役割を果たし、それらはペプチド結合によって結合されるが、一方で、非タンパク質原性のアミノ酸は、通常は、タンパク質中で見られない（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．Ａ２，第５７−９７ページ，ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９８５）を参照）。アミノ酸は、Ｄ光学立体配置もしくはＬ光学立体配置であってよいが、Ｌ−アミノ酸は、一般に、天然産生タンパク質中に見られる唯一の型である。２０種のタンパク質原性のアミノ酸それぞれの生合成経路及び分解経路は、原核細胞と真核細胞の両方でよく特徴付けられている（例えばＳｔｒｙｅｒ，Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，第５７８−５９０ページ（１９８８）を参照）。
【００７０】
必須アミノ酸、すなわちヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン及びバリンは、一般にそれらの生合成の複雑性のために栄養に要求されるが、それらは、簡単な生合成経路によって、容易に、残りの１１種の非必須アミノ酸、すなわちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン及びチロシンへと変換される。
【００７１】
高等動物は、これらのアミノ酸の幾つかを合成する能力を備えるが、必須アミノ酸は、通常のタンパク質合成を生ずるために食料から供給せねばならない。タンパク質生合成におけるそれらの機能とは別に、これらのアミノ酸は、それ自身関心の持たれる化学物質であり、多くのものは、食品、餌、化学薬品、化粧品、農産業及び医薬品産業において様々な用途を有することが見出されている。
【００７２】
リジンは、ヒトだけでなく、単胃動物、例えば家禽及びブタにおいても栄養における重要なアミノ酸である。グルタミン酸は、フレーバー添加物として最も通常に使用され、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン及びシステインのように食品産業で広く使用されている。グリシン、Ｌ−メチオニン及びトリプトファンは、全て医薬品産業で利用される。グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、アルギニン、プロリン、セリン及びアラニンは、医薬品産業と化粧品産業の両方で使用される。トレオニン、トリプトファン及びＤ／Ｌ−メチオニンは、通常の餌用添加剤である（Ｒｅｈｍ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第６巻、第１４ａ章，ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ中のＬｅｕｃｈｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｗ．（１９９６），Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ − ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ，ｐ．４６６−５０２）。付加的に、これらのアミノ酸は、合成アミノ酸及びタンパク質、例えばＮ−アセチルシステイン、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン、（Ｓ）−５−ヒドロキシトリプトファン及び他のものの合成のための前駆物質として有用であると判明しており、それはＵｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．Ａ２，ｐ．５７−９７，ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９８５に記載されている。
【００７３】
これらの天然アミノ酸をそれらを産生しうる生物、例えば細菌中で行われる生合成は、よく特徴付けられている（細菌によるアミノ酸生合成とその調節のレビューについてはＵｍｂａｒｇｅｒ Ｈ．Ｅ．（１９７８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：５３３−６０６を参照）。グルタミン酸は、クエン酸サイクル中の中間物質であるα−ケトグルタレートの還元的アミノ化によって合成される。グルタミン、プロリン及びアルギニンは、それぞれ引き続きグルタミン酸から製造される。セリンの生合成は、３−ホスホグリセレート（解糖における中間体）から始まって、酸化、アミノ基転移、そして加水分解工程の後に前記アミノ酸が得られる三段階法である。システインとグリシンの両者とも、セリンから製造される；前者はホモシステインとセリンとの縮合によって、後者は、テトラヒドロフォレートへの側鎖Ｒ炭素原子の転移によって、セリントランスヒドロキシメチラーゼにより触媒される反応において製造される。フェニルアラニンとチロシンは、解糖経路及びペントースリン酸経路の前駆体であるエリスロース−４−リン酸及びホスホエノールピルベートから、プレフェン酸合成後に最後の２工程でのみ異なる九段階の生合成経路で合成される。トリプトファンは、また、これらの２つの初期分子から製造されるが、その合成は１１工程経路である。チロシンは、また、フェニルアラニンから、フェニルアラニンヒドロキシラーゼにより触媒される反応において合成することもできる。アラニン、バリン及びロイシンは、全て解糖の最終生成物のピルベートの生合成産物である。アスパラギン酸は、クエン酸回路の中間生成物であるオキサロ酢酸から形成される。アスパラギン、メチオニン、トレオニン及びリジンは、それぞれアスパラギン酸の変換によって製造される。イソロイシンは、トレオニンから形成されうる。複雑な９工程経路は、５−ホスホリボシル−１−ピロホスフェート（活性化糖）からヒスチジンの産生をもたらす。
【００７４】
タンパク質合成で必要とされる過剰のアミノ酸については、細胞は貯蔵できず、その代わりに分解することで、細胞の主要な代謝経路のための中間体を提供する（レビューについては、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，第２１章"Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｒｅａ ｃｙｃｌｅ"，第４９５−５１６ページ（１９８８）を参照）。細胞は不所望なアミノ酸を有用な代謝中間体に変換できるが、アミノ酸製造は、その合成に必要なエネルギー、前駆体分子及び酵素の点で費用がかかる。
【００７５】
アミノ酸生合成は、フィードバック阻害によって調節することができ、その際、特定のアミノ酸の存在は、それ自身の生産の遅延もしくは完全な停止をさせる役割を果たす（アミノ酸生合成経路におけるフィードバック機構の概略については、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，第２４章："Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｈｅｍｅ"，第５７５−６００ページ（１９８８）を参照）。このフィードバック阻害が調節される反応もしくは経路の産物を形成するアミノ酸によって媒介される場合には、一般に"生成物阻害"と呼ばれる。このように、任意の特定のアミノ酸の産出量は、細胞中に存在するそのアミノ酸の量によって制限される。
【００７６】
グラム陽性の土壌細菌であるコリネバクテリウム・グルタミクムは、種々のアミノ酸の工業的製造のために広く使用される。リジン及びグルタミン酸といった主要な工業的生成物の生合成が長年にわたり研究されている一方で、メチオニン生合成経路の調節についての知識は限られている。
【００７７】
しかしながら、少なくとも該経路の主要な酵素は知られている（図１を参照）。Ｃ．グルタミクムは、ホモセリンを、ホモセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＡ）（ＥＣ２．３．１．３１）によるアセチル化によって活性化する。更に、硫黄転移反応と直接的なスルフヒドリル化の両方をホモセリンの製造に使用されることが示された（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．，１８４５：１２７７−８６）。硫黄転移反応は、シスタチオン−γ−シンターゼ（ＭｅｔＢ）（ＥＣ２．５．１．４８）によって触媒される（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌｓ，９３：３００−８）。この反応において、システインとＯ−アセチル−ホモセリンが化合してシスタチオンとなり、それはシスタチオン−β−リアーゼ（ＡｅｃＤとしても知られるＭｅｔＣ）（ＥＣ４．４．１．８）（Ｋｉｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，１１２：２２０−５，Ｒｕｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００３），上記参照）によって加水分解され、アセチルホモセリン及びスルフィドをホモセリンとアセテートに変換する。最後に、Ｃ．グルタミクムは、ホモシステインをＳ−メチル化してメチオニンを得るための２つの異なる酵素（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６２５−６，４５９，６７；Ｒｕｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００３），上記参照）、すなわちｃｏｂ（Ｉ）アラミン依存性メチオニンシンターゼＩ（ＭｅｔＨ）（ＥＣ２．１．１．１３）及びｃｏｂ（Ｉ）アラミン非依存性メチオニンシンターゼＩＩ（ＭｅｔＥ）（ＥＣ２．１．１．１４）を有する。メチル供与体として、前者は、５−メチルテトラヒドロフォレートを使用し、後者は、５−メチルテトラヒドロプテロイルトリ−Ｌ−グルタメートを使用する。
【００７８】
近年、ＴｅｔＲファミリーの推定される転写調節タンパク質が見出された（Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０３：５１−６５）。この調節因子は、メチオニン及び硫黄の代謝に属する幾つかの遺伝子の転写を抑制することが示された。調節因子タンパク質の遺伝子ノックアウトは、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするｈｏｍ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドロラーゼをコードするｍｅｔＺ、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）シンターゼ（ＥＣ２．５．１．６）をコードするｍｅｔＫ、システインシンターゼ（ＥＣ２．５．１．４７）をコードするｃｙｓＫ、推定されるＮＡＤＰＨ依存性亜硫酸レダクターゼをコードするｃｙｓＩ、そして最後に推定されるアルカンスルホン酸モノオキシゲナーゼをコードするｓｓｕＤの高められた発現をもたらす。Ｒｅｙ他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００５，５６，８７１−８８７）は、また、ｍｅｔＢ遺伝子がｍｃｂＲマイナス株で大きく誘導されることを見出した。
【００７９】
本発明の目的のためには、コバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはＭｅｔＨとも呼称されるｃｏｂ（Ｉ）アラミン依存性メチオニンシンターゼに関しては、この酵素の活性が、その生成物、すなわちメチオニンによって阻害されることが示されている（Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：１１１０１−１１０９）。
【００８０】
メチオニンの前記のいわゆる"生成物阻害"は、恐らく、１分子のメチオニンあたり７モルのＡＴＰと８モルのＮＡＤＰＨのエネルギー入力を必要とすることが計算された高いメチオニン産生の要求を主因とする（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）。このように、メチオニンは、細胞が最も多いエネルギーを提供する必要がある一つのアミノ酸である。
【００８１】
その結果として、メチオニン産生生物は、メチオニン合成の速度と量に関して厳密な制御下にある代謝経路を進化させた（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ（１９９６）Ｅ．ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）。これらの調節機序は、例えばフィードバック制御機構、例えばコバラミン依存性メチオニンシンターゼの活性の上述の生成物阻害を含む。
【００８２】
コバラミン依存性メチオニンシンターゼの生成物阻害は、メチオニン過剰産生微生物を製造する場合の特定のボトルネックとなる。それというのも、この酵素は、メチオニン生合成経路の最後の工程を触媒するからである。このように、メチオニン生合成経路に関連する他の酵素の発現に関して最適化された微生物は、効果的なメチオニン産生のために利用できないと最終的に判明することがある。それというのも、例えば高められた量のホモシステインがこれらの微生物中に蓄積されるとしても、ホモシステインは、細胞が十分なメチオニンが製造された場合にこの酵素段階を閉じるため、効果的にメチル化してメチオニンとすることができないからである。
【００８３】
図１から見受けられるように、ホモシステインのメチオニンへのメチル化は、２種類の酵素によって触媒される。コバラミン非依存性メチオニンシンターゼは、低いターンオーバー数の点でＭｅｔＥとも呼称されるが、それはむしろ限られた触媒能力を有する（Ｇｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３１：６０４５−６０５６）。しかしながら、コバラミン依存性シンターゼは、約１５００分-1のターンオーバー数を示すこのアプローチのためのかなり良好な候補であると思われる（Ｇｏｎｚａｌｅｓ他（１９９２）、上記参照）。
【００８４】
本発明の課題の一つは、生物における非化学的なメチオニン製造の制限を無くすことにある。以下の説明から明らかになる前記課題及び他の課題は、独立形式請求項によって解決される。好ましい実施態様は、従属形式請求項に記載される。
【００８５】
本発明の骨子は、生成物であるメチオニンによる酵素活性の阻害が大きく低減されたコバラミン依存性メチオニンシンターゼの突然変異体を製造できるという驚くべき知見に基づく。
【００８６】
低減された生成物阻害を示すこれらの突然変異体は、こうして、微生物がこの最終工程の酵素活性をダウンレギュレートするであろうメチオニンレベルに達した場合でさえも、コバラミン依存性の様式で、ホモシステインをメチオニンへとメチル化することを効果的に触媒し続ける。これらの突然変異体はコバラミン依存性メチオニンシンターゼの酵素活性と、生成物阻害のフィードバック制御機構とを分断するので、メチオニンを連続的かつ効果的に産生する宿主生物の構築を可能にする。
【００８７】
かかる酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼ突然変異体は、Ｃ．グルタミクムのＭｅｔＨ酵素のために特別に単離されているが、相応の突然変異体は、Ｅ．コリ、Ｓ．コエル及びＴ．マリチマなどの他の生物におけるコバラミン依存性メチオニンシンターゼのために存在すると見なすのがもっともである。このことは、コバラミン依存性メチオニンシンターゼのＥ．コリ、Ｓ．コエル、Ｃ．グルタミクム、サーモトガ・マリチマ由来のものが高い程度の配列類似性、特に本発明によって、Ｃ．グルタミクムにおけるコバラミン依存性メチオニンシンターゼの生成物阻害を低減する突然変異の導入に最も適していると認められた領域であるホモシステイン結合ドメインにおける配列類似性の度合いを示すという事実によって裏付けられる。
【００８８】
特定の好ましいコバラミン依存性メチオニンシンターゼ突然変異体をより詳細に記載する前に、コバラミン依存性メチオニンシンターゼの特性について一般的な概要を示す。
【００８９】
コバラミン依存性メチオニンシンターゼは、メチルテトラヒドロフォレートからホモシステインへのメチル基の転移を触媒して、テトラヒドロフォレート及びメチオニンを生成する（Ｂａｎｅｒｊｅｅ（１９９０）上記参照）。Ｅ．コリ由来のＭｅｔＨ遺伝子並びにＴ．マリチマ、Ｓ．コエル及びＣ．グルタミクムを含む他の生物由来のＭｅｔＨ遺伝子は、クローニングされており、幾つかの場合には特徴付けられている（Ｂａｎｅｒｊｅｅ（１９９０）上記参照；Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６６：２６９−３１３；Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７４：３３５７１−３３５７６；Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０１：３７２９−３７３６）。
【００９０】
該酵素は、非共有結合されたコバラミン配合団を有し、それはメチルトランスフェラーゼ反応における中間体として機能する。触媒反応の間に、該酵素は、Ｅ−メチルコバラミンとＥ−ｃｏｂ（Ｉ）アラミンの状態を往復し、その際、選択的にホモシステインにより脱メチル化され、かつメチルテトラヒドロフォレートによって再メチル化される。
【００９１】
メチオニンシンターゼの活性を測定するアッセイは、文献（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２８：３２３−３２９）に記載されている。この参考資料は、特に、コバラミン依存性メチオニンシンターゼの特徴付けのためのアッセイを記載する場合には、参照をもって開示されたものとする。このように、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ他の参考資料の第３２４頁の右欄（"材料と方法"）から始まり第３２６頁左欄（"結果"）までの一節は、コバラミン依存性メチオニンシンターゼの特徴付けのための非放射活性アッセイが考慮される場合に、本願の開示の一部を形成する。Ｄｒｕｍｍｏｎｄ他によって記載されたアッセイは、上述のＢａｎｅｒｊｅｅ他（１９９０）の上述の参考資料によって、放射活性アッセイについては、第１１１０２頁左欄（"実験手順"）ないし第１１１０３左欄（"結果"）までと、第１１１０３右欄（"生成物阻害データ"）ないし第１１１０４頁左欄（"触媒反応の定常状態前キネティック分析"）までと、Ｂａｎｅｒｊｅｅ他の参考資料の表ＩＩに記載されるのと同じ方針に沿って、コバラミン依存性メチオニンシンターゼの酵素活性に対する生成物のメチオニンの影響を測定するために使用することができる。後者の参考資料から見受けられるように、コバラミン依存性メチオニンシンターゼは、非競合的様式でメチオニンによって阻害される。
【００９２】
生物、例えばＣ．グルタミクムなど由来の他のコバラミン依存性メチオニンシンターゼについての代表であるＥ．コリのコバラミン依存性メチオニンシンターゼは、種々のドメインからなるモジュラータンパク質である。
【００９３】
Ｅ．コリ酵素の最初の３５２残基は、ホモシステイン結合領域を含む。残基３５３〜６４９は、メチルテトラヒドロフォレートの結合に関与しており、一方で、残基６５０〜８９６は、コバラミン補因子を結合する。カルボキシ末端残基８９７〜１２２７は、酸化されたｃｏｂ（Ｉ）アラミンの再活性化と、アデノシルシルメチルの結合に必要とされる。残基２〜６４９を含む７１ｋＤａ断片は、ホモシステイン及びメチルテトラヒドロフォレートの結合ドメインを有し、外因性のコバラミンへの及び外因性のコバラミンからのメチル転移を触媒する。該９８ｋＤａ断片は、前記の基質結合領域とコバラミン結合ドメインの両方を含み、かつ内因性のコバラミン補因子を使用した酵素ターンオーバーが可能である。
【００９４】
本発明はその骨子で、メチオニンによる低減された生成物阻害を有する、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片に関する。
【００９５】
上述のように、本発明は、一実施態様において、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片であってそれぞれの野生型配列と比較して少なくとも１つの突然変異を有するものであって、その突然変異の結果として、突然変異された酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその断片がメチオニンによる低減された生成物阻害を示すものに関する。
【００９６】
用語"機能的断片"は、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼの野生型の全長版の断片であって、ホモシステインをメチオニンへとコバラミン依存性の様式でメチル化することを触媒し、更に、メチオニンによる低減された生成物阻害に影響するそのアミノ酸配列に少なくとも１つの突然変異を有する断片を指す。
【００９７】
従って、本発明によるコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片は、好ましくは、ホモシステインの酵素によるメチルテトラヒドロフォレートを用いたメチル化の非競合阻害が、それぞれの野生型のコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片についてよりも低い程度でメチオニンによって影響される場合に、低減され減退した生成物阻害を示すものと見なされる。
【００９８】
本発明によれば、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片は、特に、アミノ酸配列中の突然変異の結果として、メチオニンによる活性の阻害及び好ましくは約２０ｍＭのメチオニンによる活性の阻害が、それぞれの野生型酵素もしくは機能的断片の酵素活性と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％だけ、好ましくは少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍超だけ低減される場合に、メチオニンによる低減された生成物阻害を示すものと見なされる。
【００９９】
野生型のコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片の酵素活性を１００％として定義する場合に、本発明による低減されたメチオニンによる生成物阻害を有するコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片は、メチオニンの存在下で、好ましくは約２０ｍＭのメチオニンの存在下で、それぞれの野生型酵素もしくは機能的断片の酵素活性と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の高められた活性を示し、好ましくは３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍超だけ高められた活性を示す。
【０１００】
野生型の酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくは機能的断片と本発明による低減された生成物阻害を有する酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくは機能的断片のいずれかの活性に対するメチオニン、好ましくは約２０ｍＭのメチオニンの影響は、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ他によって記載されたアッセイ（上記参照）によって測定することができる。
【０１０１】
例として、コバラミン依存性メチオニンシンターゼは、Ｃ．グルタミクムのＭｅｔＨであってよく、配列番号１のアミノ酸配列を有する。配列番号１のＭｅｔＨ版であって付加的に少なくとも１つの突然変異を有するものが、前記の試験条件下で前記の酵素の活性に対するメチオニンの低減された影響、好ましくは約２０ｍＭのメチオニンの低減された影響を示す場合に、それを、本発明による低減された生成物阻害を有するコバラミン依存性メチオニンシンターゼと見なす。同じことは、ＭｅｔＨの機能的断片についても適用される。
【０１０２】
従って、他の生物、例えばＥ．コリ、Ｔ．マリチマ、Ｂ．サチリス、Ｓ．コエルのコバラミン依存性メチオニンシンターゼであってＣ．グルタミクムの野生型のＭｅｔＨ酵素と大きな相同性を示し、かつ付加的にそれぞれの野生型酵素と比較して前記の試験条件下でこれらの酵素の生成物阻害を低減する突然変異を有するものは、また、本発明による低減された生成物阻害を有するコバラミン依存性メチオニンシンターゼと見なされる。
【０１０３】
本発明によれば、２つの核酸分子もしくは２つのポリペプチドの間の大きな配列相同性は、一般に、例えばＤＮＡ分子もしくはタンパク質のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列が、それぞれ、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、また好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一であることを示すものと解される。付加的に、用語"大きな配列相同性"は、例えば９０％同一のヌクレオチド配列が、同じ機能を有するポリペプチド、例えばコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片をコードすることを要求しうる。
【０１０４】
２つのヌクレオチド配列もしくはポリペプチドの同一性は、ヌクレオチド配列もしくはポリペプチドそれぞれの各々の全長にわたるヌクレオチドもしくはアミノ酸の同一性であると解される。同一性及び相同性は、ＤＮＡ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＵＳＡ）製のｌａｓｅｒ ｇｅｎｅソフトウェアを用いてＣＬＵＳＴＡＬ法を適用して計算することができる（Ｈｉｇｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｉ．，５（２）：１５１）。アミノ酸及び核酸配列についての相同性及び同一性は、また、Ｎｉｅｄｅｌｍａｎｎ及びＷｕｎｓｃｈ又はＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎによるアルゴリズムを基礎とするアルゴリズムを用いて計算することができる。これらの目的のために使用できるソフトウェアは、プログラムＰｉｌ Ａｕｐａ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（１９８７），２５，３５１−３６０；Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃａｂｇｏｓ，５：１５１）又はプログラムＧａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔ（Ｎｉｅｄｅｌｍａｎｎ ｕｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４４３−４５３及びＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２，４８２−４８９）である。２つの配列の同一性を測定する目的のために、前記ソフトウェアプログラムのデフォルトパラメータが使用される。
【０１０５】
異なる生物のコバラミン依存性メチオニンシンターゼの大きな配列相同性を測定する一例は、図２の配列アラインメントによって提供される。
【０１０６】
本発明の一実施態様において、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片の低減された生成物阻害をもたらす突然変異は、タンパク質のホモシステイン結合領域に位置する。Ｅ．コリのコバラミン依存性メチオニンシンターゼに関しては、この領域は、アミノ酸１〜２５１にマッピングされた。
【０１０７】
Ｅ．コリ酵素に関連するタンパク質中の相応のドメインを同定することは、当業者の一般的な知識の範囲内である。図２において、Ｃ．グルタミクム、Ｅ．コリ、Ｓ．コエル及びＴ．マリチマに関する野生型配列を有するコバラミン依存性メチオニンシンターゼについて配列アラインメントが示されている。比較から、Ｅ．コリ酵素がＣ．グルタミクム酵素のアミノ酸１〜２４４に相当し、Ｔ．マリチマ酵素のアミノ酸１〜２１２に相当し、そしてＳ．コエル酵素のアミノ酸１〜２４３に相当することを理解できる。
【０１０８】
従って、本発明の一実施態様は、配列番号１に大きな相同性を有し、かつ低減された生成物阻害を提供する配列中の突然変異を有するコバラミン依存性メチオニンシンターゼに関する。本発明の他の実施態様においては、本発明による低減された生成物阻害を有するコバラミン依存性メチオニンシンターゼは、以下の配列の少なくとも１つに少なくとも１つの突然変異を有する：
配列番号３：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＬＸ8Ｘ9Ｘ10
式中、Ｘ1＝Ｓ，Ｖ，Ｒ；Ｘ2＝Ｓ，Ｅ，Ｒ；Ｘ3＝Ｅ，Ａ，Ｑ；Ｘ4＝Ｆ，Ｌ，Ｖ；Ｘ5＝Ｌ，Ｒ，Ｓ；Ｘ6＝Ｄ，Ｅ，Ａ，Ｋ；Ｘ7＝Ａ，Ｑ，Ｌ；Ｘ8＝Ａ，Ｎ，Ｓ；Ｘ9＝Ｎ，Ｔ，Ｅ；Ｘ10＝Ｈ，Ｒ
配列番号４：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＤＧＸ5Ｘ6ＧＴＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11
式中、Ｘ1＝Ｖ，Ｉ；Ｘ2＝Ｖ，Ｌ；Ｘ3＝Ｉ，Ｖ，Ｌ；Ｘ4＝ｇ、Ａ，Ｌ；Ｘ5＝Ａ，Ｇ；Ｘ6＝Ｍ，Ｙ；Ｘ7＝Ｑ，Ｍ，Ｅ；Ｘ8＝Ｌ，Ｉ，Ｆ；Ｘ9＝Ｑ，Ｍ；Ｘ10＝Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｋ；Ｘ11＝Ｆ，Ｑ，Ｙ
配列番号５：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15
式中、Ｘ1＝Ｌ，Ｐ，Ｙ；Ｘ2＝Ｄ，Ｔ，Ｎ；Ｘ3＝Ｖ，Ｌ，Ｄ，Ｅ；Ｘ4＝Ｅ，Ｄ，Ａ，Ｌ；Ｘ5＝Ｋ，Ｄ，Ｐ；Ｘ6＝Ｆ（Ｔ．マリーナ（ｍａｒｉｎａ）、Ｃ．グルタミクム、Ｓ．コエル中を除く）；Ｘ7＝Ｒ（Ｔ．マリーナ、Ｃ．グルタミクム、Ｓ．コエル中を除く）；Ｘ8＝Ｇ（Ｔ．マリーナ、Ｃ．グルタミクム、Ｓ．コエル中を除く）；Ｘ9＝Ｅ（Ｔ．マリーナ、Ｃ．グルタミクム、Ｓ．コエル中を除く）；Ｘ10＝Ｒ（Ｔ．マリーナ、Ｃ．グルタミクム、Ｓ．コエル中を除く）；Ｘ11＝Ｆ（Ｔ．マリーナ、Ｃ．グルタミクム、Ｓ．コエル中を除く）；Ｘ12＝Ａ（Ｔ．マリーナ、Ｃ．グルタミクム、Ｓ．コエル中を除く）；Ｘ13＝Ｄ（Ｔ．マリーナ、Ｃ．グルタミクム、Ｓ．コエル中を除く）；Ｘ14＝Ｄ，Ｗ（Ｔ．マリーナ中を除く）；Ｘ15＝Ｆ，Ｐ（Ｔ．マリーナ中を除く）
配列番号６：
ＬＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＰＸ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10ＨＸ11Ｘ12ＹＸ13
式中、Ｘ1＝Ｎ，Ｖ；Ｘ2＝Ｄ，Ｌ，Ｉ；Ｘ3＝Ｔ，Ｓ，Ｋ；Ｘ4＝Ｒ，Ｋ，Ａ；Ｘ5＝Ｄ，Ｅ；Ｘ6＝Ｖ，Ｉ；Ｘ7＝Ｌ，Ｖ，Ｉ；Ｘ8＝Ｒ，Ａ，Ｌ；Ｘ9＝Ｑ，Ｓ，Ａ，Ｋ；Ｘ10＝Ｉ，Ｖ；Ｘ11＝Ｒ，Ｅ，Ｎ；Ｘ12＝Ａ，Ｅ，Ｓ；Ｘ13＝Ｆ，Ｉ
配列番号７：
Ｘ1Ｘ2ＧＸ3ＤＸ4Ｘ5Ｘ6ＴＮＴＦＸ7Ｘ8Ｘ9
式中、Ｘ1＝Ｅ，Ａ；Ｘ2＝Ａ，Ｓ；Ｘ3＝Ａ，Ｖ，Ｓ；Ｘ4＝Ｌ，Ｃ，Ｉ，Ｖ；Ｘ5＝Ｖ，Ｉ；Ｘ6＝Ｅ，Ｌ；Ｘ7＝Ｇ，Ｎ；Ｘ8＝Ｃ，Ａ，Ｓ；Ｘ9＝Ｎ，Ｔ
配列番号８：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9
式中、Ｘ1＝Ｌ，Ｈ，Ｔ，Ｒ；Ｘ2＝Ｐ，Ｓ，Ｉ，Ｍ；Ｘ3＝Ｎ，Ａ，Ｋ；Ｘ4＝Ｌ，Ｍ；Ｘ5＝Ａ，Ｇ，Ｒ；Ｘ6＝Ｄ，Ｅ，Ｋ；Ｘ7＝Ｙ，Ｈ；Ｘ8＝Ｄ，Ｑ，Ｇ；Ｘ9＝Ｉ，Ｍ，Ｌ
配列番号９：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14ＡＲＸ15Ｘ16ＡＸ17ＥＸ18
式中、Ｘ1＝Ａ，Ｐ，Ｅ；Ｘ2＝Ｄ，Ｅ，Ｓ；Ｘ3＝Ｒ，Ｌ，Ｋ；Ｘ4＝Ｃ，Ｖ，Ｓ，Ｌ；Ｘ5＝Ｒ，Ｈ，Ａ，Ｄ；Ｘ6＝Ｅ，Ｐ；Ｘ7＝Ｌ，Ｉ；Ｘ8＝Ａ，Ｓ，Ｎ，Ｖ；Ｘ9＝Ｙ，Ｅ，ｆ，Ｒ；Ｘ10＝Ｋ，Ａ，Ｎ；Ｘ11＝Ｇ，Ａ；Ｘ12＝Ｔ，Ａ，Ｖ；Ｘ13＝Ａ，Ｒ，Ｋ；Ｘ14＝Ｖ，Ｌ，Ｉ；Ｘ15＝Ｅ，Ａ，Ｒ；Ｘ16＝Ｖ，Ｃ，Ａ；Ｘ17＝Ｄ，Ｅ；Ｘ18＝Ｆ，Ｍ，Ｗ，Ｋ
配列番号１０：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＲＸ7
式中、Ｘ1＝Ｇ（Ｔ．マリーナ中を除く）、Ａ，Ｒ（Ｔ．マリーナ中を除く）；Ｘ2＝Ｒ，Ｔ（Ｔ．マリーナ中を除く）；Ｘ3＝Ｎ，Ｄ，Ｐ（Ｔ．マリーナ中を除く）；Ｘ4＝Ｇ，Ｇ，Ｅ（Ｔ．マリーナ中を除く）；Ｘ5＝Ｍ，Ｒ，Ｋ（Ｔ．マリーナ中を除く）；Ｘ6＝Ｒ，Ｑ，Ｐ（Ｔ．マリーナ中を除く）；Ｘ7＝Ｆ，Ｗ，Ｙ（Ｔ．マリーナ中を除く）
配列番号１１：
ＶＸ1ＧＸ2Ｘ3ＧＰＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9
式中、Ｘ1＝Ｖ，Ｌ，Ａ，Ｆ；Ｘ2＝Ｓ，Ｖ，Ｄ；Ｘ3＝Ｌ，Ｍ，Ｉ；Ｘ4＝Ｇ，Ｔ；Ｘ5＝Ｔ，Ｎ，Ｇ；Ｘ6＝Ｋ，Ｒ，Ｅ；Ｘ7＝Ｌ，Ｔ；Ｘ8＝Ｐ，Ａ；Ｘ9＝Ｓ，Ｔ，Ｙ
配列番号１２：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＧＸ19
式中、Ｘ1＝Ｆ，Ｙ；Ｘ2＝＞、Ｔ，Ｄ，Ｅ；Ｘ3＝Ｄ，Ｖ，Ｇ，Ｅ；Ｘ4＝Ｌ，Ｆ；Ｘ5＝Ｒ，Ｖ，Ｙ；Ｘ6＝Ｇ，Ｄ，Ａ，Ｅ；Ｘ7＝Ｈ，Ａ，Ｎ；Ｘ8＝Ｙ，Ｅ；Ｘ9＝Ｋ，Ｑ，Ｒ；Ｘ10＝Ｅ，Ｒ；Ｘ11＝Ａ，Ｎ，Ｓ，Ｔ；Ｘ12＝Ａ，Ｔ，Ｖ；Ｘ13＝Ｌ，Ｅ，Ｋ；Ｘ14＝Ｇ，Ａ，Ｉ；Ｘ15＝Ｉ，Ｌ，Ｍ；Ｘ16＝Ｉ，Ｖ；Ｘ17＝Ｅ，Ａ，Ｅ；Ｘ18＝Ｇ，Ｅ；Ｘ19＝Ｇ，Ａ，Ｖ
配列番号１３：
ＤＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＥＴ
式中、Ｘ1＝Ａ，Ｌ、Ｇ；Ｘ2＝Ｆ，Ｌ，Ｉ；Ｘ3＝Ｌ，Ｉ；Ｘ4＝Ｉ，Ｖ，Ｆ
配列番号１４：
Ｘ1ＤＸ2ＬＸ3Ｘ4ＫＡＸ5ＶＸ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9
式中、Ｘ1＝Ｑ，Ｆ，Ｓ；Ｘ2＝Ｌ，Ｔ，Ｉ；Ｘ3＝Ｑ，Ｎ，Ｅ；Ｘ4＝Ｖ，Ｔ，Ａ，Ｌ；Ｘ5＝Ａ，Ｓ；Ｘ6＝Ｈ，Ｌ，Ｆ；Ｘ7＝Ｇ，Ａ；Ｘ8＝Ｖ，Ａ；Ｘ9＝Ｑ，Ｒ，Ｋ
配列番号１５：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｔ
式中、Ｘ1＝Ｌ，Ｖ；Ｘ2＝Ｄ，Ｇ，Ｓ；Ｘ3＝Ｔ，Ｌ，Ｖ，Ｒ；Ｘ4＝Ｆ，Ｄ，Ｅ；Ｘ5＝Ｌ，Ｖ；Ｘ6＝Ｐ，Ｆ；Ｘ7＝Ｉ，Ｌ；Ｘ8＝Ｉ，Ｍ；Ｘ9＝Ｃ，Ｖ，Ｉ，Ａ；Ｘ10＝Ｈ，Ｓ；Ｘ11＝Ｖ，Ｇ，Ｍ
配列番号１６：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＬＸ9ＧＸ10Ｘ11
式中、Ｘ1＝Ｖ，Ｉ，Ｆ；Ｘ2＝Ｅ，Ｔ，Ｄ；Ｘ3＝Ｔ，Ｄ，Ｅ；Ｘ4＝Ｔ，Ａ，Ｋ；Ｘ5＝Ｇ，Ｓ；Ｘ6＝Ｇ（Ｔ．マリーナ、Ｃ．グルタミクム、Ｓ．コエル中を除く）；Ｘ7＝Ｔ，Ｒ；Ｘ8＝Ｍ，Ｔ，Ｓ；Ｘ9＝Ｍ，Ｌ，Ｓ，Ｔ；Ｘ10＝Ｓ，Ｑ，Ｔ；Ｘ11＝Ｅ，Ｔ，Ｄ
配列番号１７：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7
式中、Ｘ1＝Ｇ，Ｅ，Ａ；Ｘ2＝Ａ，Ｎ；Ｘ3＝Ａ，Ｆ；Ｘ4＝Ｌ，Ｙ，Ａ；Ｘ5＝Ｔ，Ｎ，Ｉ；Ｘ6＝Ａ，Ｓ，Ｔ；Ｘ7＝Ｌ，Ｆ
配列番号１８：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＧＸ8ＮＣＸ9Ｘ10ＧＰＸ11Ｅ
式中、Ｘ1＝Ｐ，Ｈ，Ｅ；Ｘ2＝Ｌ，Ａ；Ｘ3＝Ｇ，Ｅ，Ｄ；Ｘ4＝Ｉ，Ａ；Ｘ5＝Ｄ，Ｌ；Ｘ6＝Ｍ，Ｔ，Ａ；Ｘ7＝Ｉ，Ｆ，Ｌ；Ｘ8＝Ｌ，Ｉ；Ｘ9＝Ａ，Ｓ；Ｘ10＝Ｔ，Ｌ；Ｘ11＝Ｄ，Ａ，Ｅ
【０１０９】
本発明の範囲において、アミノ酸配列に関する用語"突然変異"は、コバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片の野生型配列中のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失であって、その突然変異が酵素活性を変化させても、得られたポリペプチドが依然としてメチルテトラヒドロフォレートからホモシステインへとコバラミン依存性の様式でメチル基を転移することを触媒でき、突然変異された酵素もしくはその機能的断片が前記のようなメチオニンによる低減された生成物阻害を有するという要求を満たすものに関連する。
【０１１０】
当業者は、例えば上述のアミノ酸配列の配列番号１〜１８中に突然変異を導入することができ、かつ、例えば前記のアッセイに応じて、得られたポリペプチドが酵素的に活性であるかと、メチオニンの存在下で低減された生成物阻害を示すかどうかを測定することができる。
【０１１１】
かかる突然変異に関して、当業者は、特に非保存的なアミノ酸置換を考慮する。それは、野生型アミノ酸が、異なる物理化学的特性のアミノ酸と置き換えられることを意味する。例えば、野生型配列がアスパラギン酸などの荷電アミノ酸を含む場合に、非保存的置換は、アスパラギン酸を、リジンなどの正に荷電したアミノ酸で置換することを含む。選択的に、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの負に荷電したアミノ酸を、グルタミン、アルギニンもしくはメチオニンなどの中性アミノ酸によって置き換えることもできる。当業者は、もちろん、保存的アミノ酸置換も考慮する。すなわち同等の物理化学的特性を有するアミノ酸による交換も考慮する。一例は、バリンのロイシンによる置き換えである。
【０１１２】
それぞれの野生型配列と比較して突然変異を有する酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片は、それが前記の試験により測定できるメチオニンによる低減された生成物阻害を示さない場合には、本発明によるポリペプチドであると考慮されない。また突然変異されたポリペプチドは、それらが酵素的に活性でなければ本発明の一部を形成するものと考慮されない。これはまた、かかるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列についても適用される。
【０１１３】
本願明細書を通してアミノ酸について使用される命名法は、通常の一文字記号である。
【０１１４】
配列番号３〜１８に関しては、アミノ酸置換の場合の"突然変異"は、特定の位置のアミノ酸が、この特定の位置について特定されない任意のアミノ酸と交換できることを意味する。例えば、配列番号３については、Ｘ1は、Ｓ、ＶもしくはＲであると特定される。従って、突然変異は、Ｓ、Ｖ、Ｒではない任意のアミノ酸置換を含む。同様に、配列番号４のＧ、Ａ、Ｌである残基Ｘ4は、Ｇ、Ａ、Ｌではない任意のアミノ酸によって置き換えることができる。
【０１１５】
当業者は、任意の種類のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入に関して、得られたポリペプチドが（ｉ）酵素的に活性であるかと、（ｉｉ）メチオニンの存在下で酵素活性の低減された生成物阻害を示すかを決定する必要があることをよく認識している。
【０１１６】
アミノ酸配列について示される用語"突然変異"の前記の説明は、相応して、かかるポリペプチドをコードするヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列について適用される。
【０１１７】
Ｃ．グルタミクムのコバラミン依存性メチオニンシンターゼＭｅｔＨの場合の本発明の特定の実施態様は、位置３３、８６及び１３４に突然変異を含み、その際、野生型配列の残基は、それぞれ、メチオニン、フェニルアラニン及びセリンである。
【０１１８】
位置３３の場合に、メチオニンは、グリシンもしくはアラニンに変更することができる。８６位のフェニルアラニンの場合に、フェニルアラニンはロイシンに変更することができる。位置１３４のセリン残基の場合に、該残基は、アスパラギンに変更することができる。相応のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９〜２２に示されており、一方で、相応のＤＮＡ配列は、配列番号２５〜２８に示されている。
【０１１９】
当業者は、相応の突然変異を、例えばＳ．コエル酵素のメチオニン残基３４、Ｅ．コリ酵素のメチオニン残基２２及びサーモトガ酵素の位置２２のチロシン残基痛に導入することができると確信している。Ｃ．グルタミクム酵素のフェニルアラニン８６位に関しては、Ｅ．コリ系中の相応の突然変異は、フェニルアラニン残基９１に位置しており、Ｓ．コエル酵素においてはフェニルアラニン残基８６に位置し、そしてサーモトガ・マリチマ酵素においてはフェニルアラニン残基７６に位置する。
【０１２０】
Ｃ．グルタミクム酵素におけるセリン１３４残基に関しては、Ｓ．コエル酵素における相応の突然変異は、セリン１３４に位置しており、Ｅ．コリ酵素においてはバリン残基１３１に位置しており、かつサーモトガ酵素においてはアスパラギン酸残基１２４に位置している。
【０１２１】
これらの場合において、相応の残基は、メチオニン／チロシン残基についてはグリシン及びアラニンへと突然変異でき、フェニルアラニン残基についてはロイシンへと突然変異でき、かつセリン、バリンもしくはアスパラギン酸残基についてはアスパラギンへと突然変異できる。
【０１２２】
相応して、アミノ酸置換の代わりに、本発明による低減された生成物阻害を有するコバラミン依存性メチオニンシンターゼは、前記の位置に欠失を有してよく、又は追加の挿入を有してよい。
【０１２３】
本発明の他の実施態様は、前記のポリペプチド及びタンパク質をコードするヌクレオチド及び特にＤＮＡ配列である。本発明の幾つかの実施態様は、単離された形でのかかるＤＮＡ配列に関する。
【０１２４】
本発明の他の実施態様は、５′−３′方向において：
ａ）宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現について機能的なプロモーター配列と、
ｂ）そこに作動的に結合されて、本発明によるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列と、
ｃ）そこに作動的に結合されて、終結配列と
を含むベクターに関する。
【０１２５】
本発明によれば、プロモーターと、本発明によるヌクレオチド配列と、終結配列との作動的な結合は、本発明によるヌクレオチド配列が、宿主細胞において、宿主細胞が、前記のようなメチオニンによる低減された生成物阻害を示す酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片を発現するように発現されうることを意味する。
【０１２６】
好ましい一実施態様においては、これらのベクターは、一定のプロモーターと、場合によりエンハンサーエレメントとを含み、例えば前記のポリペプチド及びタンパク質をコードするＤＮＡ配列の過剰発現を可能にする。ＤＮＡ配列の発現及び過剰発現についての特定の実施態様を以下に説明する。
【０１２７】
従って、本発明のもう一つの実施態様は、前記のようなヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列もしくはベクターを含む宿主細胞に関する。
【０１２８】
本発明により生物を遺伝的に変更することによって、メチオニン合成の効率及び／又は収率及び／又は量は、これらのメチオニン過剰産生生物が、メチオニンを、本発明によるヌクレオチド配列を発現しない初期の生物と比較して好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％の高められた効率及び／又は高められた収率及び／又は高められた量で産生することが特徴付けられるように高めることができる。
【０１２９】
かかる初期の宿主生物と比較して、本発明によるメチオニン産生宿主生物中のメチオニン産生の効率及び／又は収率及び／又は量は、好ましくは２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、７０倍、１００倍、２００倍、５００倍もしくは少なくとも１０００倍だけ高めることができる。
【０１３０】
本発明による宿主生物は、コリネ型細菌、マイコバクテリア、ストレプトマイセス科、サルモネラ、エシェリキア・コリ、シゲラ、バシラス、セラチア、シュードモナス、Ｓ．コエルもしくはＴ．マリチマからなる群から選択することができる。
【０１３１】
本発明の生物は、好ましくは、コリネバクテリウム属の微生物、特にコリネバクテリウム・アセトアシドフィルム、Ｃ．アセトグルタミクム、Ｃ．アセトフィルム、Ｃ．アンモニアゲネス、Ｃ．グルタミクム、Ｃ．リリウム、Ｃ．ニトリロフィルスもしくはコリネバクテリウム種を含んでよい。
【０１３２】
また、本発明による生物は、ブレビバクテリウム属の一員、例えばブレビバクテリウム・ハルモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ボタニクム、Ｂ．ジバラチクム、Ｂ．フラバム、Ｂ．ヘアリル、Ｂ．ケトグルタミクム、Ｂ．ケトソレダクツム、Ｂ．ラクトフェルメンツム、Ｂ．リネンス、Ｂ．パラフィノリチクム及びブレビバクテリウム種を含む。
【０１３３】
本発明による生物は、また、Ｓ．コエルをも含む。
【０１３４】
本発明による生物は、また、サーモトガ属の一員、例えばＴ．マリチメを含む。
【０１３５】
特に、コリネバクテリウム微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム（ＡＴＣＣ １３０３２）、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（ＡＴＣＣ １５８０６）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（ＡＴＣＣ １３８７０）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）、コリネバクテリウム・メラッセコラ（ＡＴＣＣ １７９６５）、コリネバクテリウム・グルタミクム（ＫＦＣＣ １００６５）、コリネバクテリウム・グルタミクム（ＤＳＭ １７３２２）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（ＹＳ−３１４）及びコリネバクテリウム・グルタミクム（ＡＴＣＣ２１６０８）からなる群から選択されうる。
【０１３６】
特に、菌株コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２及びその全ての誘導体が好ましい。リジンを産生することが知られる菌株ＡＴＣＣ １３２８６、ＡＴＣＣ １３２８７、ＡＴＣＣ ２１０８６、ＡＴＣＣ ２１１２７、ＡＴＣＣ ２１１２８、ＡＴＣＣ ２１１２９、ＡＴＣＣ ２１２５３、ＡＴＣＣ ２１２９９、ＡＴＣＣ ２１３００、ＡＴＣＣ ２１４７４、ＡＴＣＣ ２１４７５、ＡＴＣＣ ２１４８８、ＡＴＣＣ ２１４９２、ＡＴＣＣ ２１５１３、ＡＴＣＣ ２１５１４、ＡＴＣＣ ２１５１５、ＡＴＣＣ ２１５１６、ＡＴＣＣ ２１５１７、ＡＴＣＣ ２１５１８、ＡＴＣＣ ２１５２８、ＡＴＣＣ ２１５４３、ＡＴＣＣ ２１５４４、ＡＴＣＣ ２１６４９、ＡＴＣＣ ２１６５０、ＡＴＣＣ ２１７９２、ＡＴＣＣ ２１７９３、ＡＴＣＣ ２１７９８、ＡＴＣＣ ２１７９９、ＡＴＣＣ ２１８００、ＡＴＣＣ ２１８０１、ＡＴＣＣ ７００２３９、ＡＴＣＣ ２１５２９、ＡＴＣＣ ２１５２７、ＡＴＣＣ ３１２６９及びＡＴＣＣ ２１５２６も好ましくは使用することができる。他の前記の菌株を使用することもできる。
【０１３７】
略語ＫＦＣＣは、勧告微生物保存センターを意味し、一方で、略語ＡＴＣＣは、米国タイプ培養株コレクションを意味する。略語ＤＳＭは、ドイツ微生物菌株保存機構を意味する。
【０１３８】
エシェリキア属の微生物は、エシェリキア・コリを含む群から選択することができる。サルモネラ属の微生物は、サルモネラ・タイフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む群から選択することができる。
【０１３９】
かかる宿主生物は、本発明による外因性のヌクレオチド配列を、例えばベクターの形で導入することによって操作することができる。
【０１４０】
加えて、又は選択的に、前記の低減された生成物阻害をもたらす突然変異は、コバラミン依存性メチオニンシンターゼについての内因性のコーディング配列中に導入することができる。
【０１４１】
本発明の更なる一実施態様は、酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片であってメチオニンの存在下に低減された生成物阻害を有するものをコードする本発明によるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列もしくはベクター配列が発現され、かつ付加的に１つ以上のコバラミン依存性メチオニンシンターゼについての１つ以上の内因性遺伝子が欠失もしくは機能的に破壊されている宿主細胞に関する。
【０１４２】
用語"欠失された"又は"機能的な破壊"は、本発明の目的のためには、宿主生物の内因性遺伝子によってコードされるコバラミン依存性メチオニンシンターゼの含有率及び／又は活性が低減されるという表現に相当する。
【０１４３】
コバラミン依存性メチオニンシンターゼについてのこれらの内因性遺伝子の含有率及び／又は活性の低減及び相応して欠失及び／又は機能的破壊は、以下に記載されるように達成することができる。
【０１４４】
本発明の他の実施態様は、本発明によるＤＮＡ配列もしくはベクター配列、すなわちメチオニンの存在下で低減された生成物阻害を有するコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその断片をコードするＤＮＡ配列が発現され、かつ以下のグループＩのヌクレオチド配列の少なくとも１つの含有率及び／又は活性が、それぞれの初期の生物と比較して高められている宿主細胞に関する：
・  アスパラギン酸キナーゼｌｙｓＣをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ配列番号２８１）
・  アスパラギン酸半アルデヒドデヒドロゲナーゼａｓｄをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ配列番号２８２）
・  グリセリンアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｇａｐをコードするヌクレオチド配列（Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９２），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７４：６０７６−６０８６）
・  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼｐｇｋをコードするヌクレオチド配列（Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９２），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７４：６０７６−６０８６）
・  ピルビン酸カルボキシラーゼｐｙｃをコードするヌクレオチド配列（Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９２），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７４：６０７６−６０８６）
・  トリオースリン酸イソメラーゼｔｐｉをコードするヌクレオチド配列（Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９２），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７４：６０７６−６０８６）
・  ホモセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼｍｅｔＡをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号７２５）
・  シスタチオンガンマシンターゼｍｅｔＢをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号３４９１）
・  シスタチオンガンマリアーゼｍｅｔＣをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号３０６１）
・  セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼｇｌｙＡをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号１１１０）
・  Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼｍｅｔＹをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号７２６）
・  メチレンテトラヒドロフォレートレダクターゼｍｅｔＦをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号２３７９）
・  ホスホセリンアミノトランスフェラーゼｓｅｒＣをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号９２８）
・  ホスホセリンホスファターゼｓｅｒＢをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号３３４、ＤＮＡ配列番号４６７、ＤＮＡ配列番号２７６７）
・  セリンアセチルトランスフェラーゼｃｙｓＥをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号２８１８）
・  ホモセリンデヒドロゲナーゼｈｏｍをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号１３０６）
・  メチオニンシンターゼｍｅｔＥをコードするヌクレオチド配列（ジーンバンクアクセッション番号ＮＣｇｌ１０９４）
・  システインシンターゼをコードするヌクレオチド配列（ジーンバンクアクセッション番号ＮＰ＿６０１７６０、ＮＰ＿６０１３３７、ＮＣｇｌ２４７３、ＮＣｇｌ２０５５）
・  亜硫酸レダクターゼをコードするヌクレオチド配列（ジーンバンクアクセッション番号ＮＰ＿６０２００８、ＮＣｇｌ２７１８）
・  ホスホアデノシンホスホ硫酸レダクターゼをコードするヌクレオチド配列（ジーンバンクアクセッション番号ＮＰ＿６０２００７、ＮＣｇｌ２７１７）
・  硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット１をコードするヌクレオチド配列（ジーンバンクアクセッション番号ＮＰ＿６０２００５、ＮＣｇｌ２７１５）
・  ＣｙｓＮ−硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット２をコードするヌクレオチド配列（ジーンバンクアクセッション番号ＮＰ＿６０２００６、ＮＣｇｌ２７１６）
・  フェレドキシンＮＡＤＰレダクターゼをコードするヌクレオチド配列（ジーンバンクアクセッション番号ＮＰ＿６０２００９、ＮＣｇｌ２７１９）
・  フェレドキシンをコードするヌクレオチド配列（ジーンバンクアクセッション番号ＮＰ＿６０２０１０、ＮＣｇｌ２７２０）
・  グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列（ジーンバンクアクセッション番号ＮＰ＿６００７９０、ＮＣｇｌ１５１４）
及び／又は
・  フルクトース−１−６−ビスホスファターゼをコードするヌクレオチド配列（ジーンバンクアクセッション番号ＮＰ＿６０１２９４、ＮＣｇｌ２０１４）
【０１４５】
もちろん、かかる宿主生物は、上述のヌクレオチド配列のいずれかについて前記に定義した大きな相同性を示すヌクレオチド配列の高められた含有率及び／又は活性を示してよい。改めて、用語"大きな配列相同性"は、これらのヌクレオチド配列が、それぞれの酵素活性を有するポリペプチドをコードすることを要求する。
【０１４６】
本発明の他の実施態様において、宿主生物は、本発明によるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列であって、メチオニンの存在下で低減された生成物阻害を有するコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその活性断片をコードし、かつ付加的に以下のグループＩＩのヌクレオチド配列の少なくとも１つの低減された含有率及び／又は活性を提供する配列を含んでよい：
・  ホモセリンキナーゼｔｈｒＢをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号３４５３）
・  トレオニンデヒドロゲナーゼｉｌｖＡをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号２３２８）
・  トレオニンシンターゼｔｈｒＣをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号３４８６）
・  メソジアミノピメリン酸−Ｄ−デヒドロゲナーゼｄｄｈをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号３４９４）
・  ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼｐｃｋをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号３１５７）
・  グルコース−６−リン酸−６−イソメラーゼｐｇｉをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号９５０）
・  ピルビン酸オキシダーゼｐｏｘＢをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号２８７３）
・  ジヒドロジピコリン酸シンターゼｄａｐＡをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号３４７６）
・  ジヒドロジピコリン酸レダクターゼｄａｐＢをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号；ＤＮＡ配列番号３４７７）
・  ジアミノピコリン酸−デカルボキシラーゼｌｙｓＡをコードするヌクレオチド配列（ＥＰ１１０８７９０号Ａ２；ＤＮＡ配列番号３４５１）
・  グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（ジーンバンクアクセッション番号ＮＰ＿６００３４５及びＮＣｇｌ１０７２）
及び／又は
・  乳酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列（ジーンバンクアクセッション番号ＮＰ＿６０２１０７、ＮＣｇｌ２８１７）
【０１４７】
それぞれの野生型もしくは初期の生物と比較した、前記のグループＩ及びＩＩのヌクレオチド配列の含有率及び／又は活性の増加及び／又は減少は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％であってよい。かかる初期の宿主生物と比較して、本発明によるグループＩ及びＩＩの前記のヌクレオチド配列の含有率及び／又は活性の増加及び／又は減少は、また、好ましくは少なくとも、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、７０倍、１００倍、２００倍、５００倍もしくは少なくとも１０００倍だけであってよい。
【０１４８】
このように、本発明による全ての宿主細胞及び生物は、それらが、メチオニンの存在下で低減された生成物阻害を示す酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片であるタンパク質もしくはポリペプチドをコードする本発明による少なくとも１つのヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列を含む、好ましくは過剰発現することを特徴とする。これらのポリペプチドもしくはタンパク質は、通常は、そのアミノ酸配列中に、メチオニンによる低減された生成物阻害の役割を担うそれぞれの野生型アミノ酸配列と比較して少なくとも１つの突然変異を有する。加えて、これらの宿主細胞は、グループＩ及びグループＩＩについて前記に特定されたヌクレオチド配列のいずれかの含有率及び／又は活性における増大及び／又は減少を示すことがある。
【０１４９】
選択的に、又は付加的に、これらの宿主細胞は、野生型コバラミン依存性メチオニンシンターゼをコードする内因性遺伝子の欠失もしくは機能的破壊を示すことがある。かかる宿主細胞は、前記特定の生物から選択することができ、かつ以下に記載される方法に従って製造することができる。
【０１５０】
本発明の他の実施態様は、宿主細胞中でメチオニンを製造する方法において、本発明による少なくとも１つのヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列、すなわちアミノ酸配列の突然変異の結果としてメチオニンの存在下で低減された生成物阻害を有する酵素的に活性なコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片であるポリペプチドもしくはタンパク質をコードする配列を宿主生物中で発現させる、メチオニンを製造する方法に関する。かかる宿主生物は、好適な条件下で培養することができ、製造されたメチオニンは回収することができる。かかる方法は、また、それぞれの出発生物と比較して、高められた効率及び／又はメチオニンの収率を提供することもある。
【０１５１】
本発明の他の実施態様は、本発明によるヌクレオチド及び好ましくはＤＮＡ配列及び本発明による宿主細胞を、メチオニンの製造のために、及び／又はメチオニン製造の効率及び／又は収率を高めるために用いる使用に関する。
【０１５２】
ヌクレオチド配列及びそれによってコードされるポリペプチドの量及び／又は活性を増大もしくは減少させることに関して、当該技術分野において前記の生物などの宿主においてヌクレオチド配列及び／又はポリペプチドの量及び／又は活性を増大もしくは減少させるために知られる全ての方法を使用することができる。これらの方法を、更に以下に詳細に記載する。これらの方法は、また、本発明によるＤＮＡ配列、すなわちアミノ酸配列中の突然変異の結果としてメチオニンの存在下に低減された生成物阻害を有するコバラミン依存性メチオニンシンターゼをコードするＤＮＡ配列を発現するために使用することもできる。
【０１５３】
本発明による及びグループＩのヌクレオチド配列及び／又はポリペプチドの量及び／又は活性の増大もしくは導入
量の増大に関しては、２つの基本的なシナリオに分けることができる。第一のシナリオにおいては、ポリペプチドの量は、外因性のそれぞれのヌクレオチド配列の発現によって高められる。他のシナリオにおいては、内因性ポリペプチドの発現は、プロモーター及び／又はエンハンサーエレメントの活性及び／又は転写、翻訳もしくは翻訳後のレベルのいずれかでそれぞれのポリペプチドの活性を調節する他の調節活性、例えばリン酸化、スモイル化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）、ユビキチン化などに影響を及ぼすことによって増大される。
【０１５４】
例えば上述のヌクレオチド配列の量を簡単に高める他に、例えばグループＩのポリペプチドの活性は、該酵素の高められた活性を可能にする特定の突然変異を有する酵素を使用することによって高めることができる。かかる突然変異は、例えばフィードバック阻害の役割を担う酵素の領域を不活性化することができる。これらを、例えば非保存的突然変異の導入により突然変異させることによって、該酵素は、フィードバック調節をもはや提供せず、こうして該酵素の活性は、より多くの生成物が産生された場合にダウンレギュレートされない。該突然変異は、酵素の内因性コピー中に導入することができるか、又は外因性酵素の相応の突然変異形を過剰発現させることによって提供することができる。かかる突然変異は、点突然変異、欠失もしくは挿入を含んでよい。点突然変異は、保存的もしくは非保存的であってよい。更に、欠失は、２もしくは３つのアミノ酸だけからそれぞれのタンパク質の完全なドメインまでを含んでよい。もちろん、本発明によるポリペプチド、すなわち低減された生成物阻害を有するコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはそれらの機能的断片は、相応の外因性のヌクレオチド配列の発現又は内因性遺伝子中の低減された生成物阻害をもたらす突然変異の導入によって発現されてよい。
【０１５５】
このように、ポリペプチドの活性及び量の増大は、種々の経路を介して、例えば転写、翻訳及びタンパク質レベルでの阻害的調節機構をスイッチオフにすることによるか、又は出発生物と比較してこれらのタンパク質をコードする核酸の遺伝子発現を高めることによって、例えば内因性遺伝子の操作によって又は該ポリペプチドをコードする核酸を導入することによって達成することができる。
【０１５６】
一実施態様においては、それぞれのポリペプチドの活性及び量の、初期の生物と比較した増大は、かかるポリペプチドをコードする核酸の発現における増大によって達成される。配列は、それぞれのデータベース、例えばＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ）もしくはＥｘｐａｓｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）から得られる。
【０１５７】
更なる一実施態様において、前記のポリペプチドの量及び／又は活性の増大は、相応の核酸を、生物、好ましくはＣ．グルタミクム、Ｅ．コリ、Ｓ．コエルもしくはＴ．マリチマ中に導入することによって達成される。
【０１５８】
原則的に、前記のポリペプチドの酵素活性を有する種々の生物のあらゆるタンパク質を使用することができる。イントロンを含む真核生物由来のかかる酵素のゲノム性核酸に関しては、宿主生物が相応のｍＲＮＡのスプライシングが可能でない場合又は可能にすることができない場合には、既にプロセシングされた相応のｃＤＮＡのような核酸配列が使用されるべきである。全ての発明の詳細な説明に挙げられた核酸は、例えばＲＮＡ、ＤＮＡもしくはｃＤＮＡ配列であってよい。
【０１５９】
本発明によるメチオニンの製造のための一つの方法において、メチオニンによる低減された生成物阻害を有する前記のコバラミン依存性メチオニンシンターゼもしくはその機能的断片の１つをコードする核酸配列を、微生物、例えばＣ．グルタミクム、Ｅ．コリ、Ｓ．コエルもしくはＴ．マリチマのそれぞれに移入される。この移入は、突然変異された酵素の発現に増大をもたらし、相応して高められたメチオニン合成をもたらす。
【０１６０】
本発明によれば、ポリペプチドの量及び／又は活性の増大及び／又は導入は、一般に以下の工程：
ａ）５′−３′方向において以下の核酸配列：
−  本発明の生物中で機能的なプロモーター配列
−  そこに作動的に結合されて、本発明によるＤＮＡ配列
−  本発明の生物中で機能的な終結配列
、好ましくはＤＮＡ配列を含むベクターを作成することと、
ｂ）工程ａ）からのベクターをＣ．グルタミクム、Ｅ．コリ、Ｓ．コエルもしくはＴ．マリチマなどの本発明の生物に移入し、場合によりそれぞれのゲノム中に組み込むことと、
を含む。
【０１６１】
プロモーター及び終結配列などの調節配列を含むかかるベクターの使用は、当業者に公知である。更に、当業者は、どのようにして工程ａ）からのベクターをＣ．グルタミクム、Ｅ．コリ、Ｓ．コエルもしくはＴ．マリチマなどの生物に移入できるかと、どのような特性をベクターがそのゲノムへの組み込みを可能にするために有さねばならないかを認識している。
【０１６２】
Ｃ．グルタミクムなどの生物中の酵素含有率を、例えばＥ．コリなどの他の生物由来のポリペプチドをコードする核酸の移入により高めるのであれば、例えばＥ．コリ由来の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を、遺伝子コードに従ってポリペプチド配列の逆翻訳によって、生物特異的なコドン利用のためより頻繁に使用されるこれらのコドンを主に含む核酸配列とすることによって移入することが推奨される。該コドン利用は、関連生物の他の公知の遺伝子のコンピュータ評価によって決定することができる。
【０１６３】
本発明によれば、それぞれの本発明による核酸配列の遺伝子発現及び活性の増大は、また、特にＣ．グルタミクム、Ｅ．コリ、Ｓ．コエルもしくはＴ．マルチマの生物の内因性あるいは外因性の酵素の発現の操作であると解される。これは、例えば低減された生成物阻害を有するコバラミン依存性メチオニンシンターゼを例えばコードする遺伝子に関するプロモーターＤＮＡ配列を変更することによって達成できる。かかる変更は、これらの突然変異された酵素の変更された、好ましくは増大された発現率をもたらすが、それは、ＤＮＡ配列の欠失もしくは挿入によって達成することができる。もちろん、これは、低減された生成物阻害の役割を担う突然変異が内因性遺伝子中に導入されていることを要求する。
【０１６４】
かかる突然変異された内因性遺伝子のプロモーター配列の変更は、通常は、遺伝子の発現される量の変更を引き起こし、従ってまた、細胞もしくは生物において検出できる活性の変更を引き起こす。
【０１６５】
更に、それぞれの内因性遺伝子の変更された及び高められた発現は、形質転換された生物中に存在せず、かつこれらの遺伝子のプロモーターと相互作用する調節タンパク質によって達成することができる。かかる調節因子は、例えばＷＯ９６／０６１６６号に記載されるようなＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインとからなるキメラタンパク質であってよい。
【０１６６】
内因性遺伝子の活性及び含有率の増大のための更なる可能性は、内因性遺伝子の転写に関与する転写因子を、例えば過剰発現によってアップレギュレートすることである。転写因子の過剰発現の措置は、当業者に公知である。
【０１６７】
更に、内因性遺伝子の活性の変更は、内因性遺伝子のコピーの狙いを定めた突然変異誘発によって達成することができる。
【０１６８】
例えばグループＩの酵素をコードする内因性遺伝子の変更は、また、酵素の翻訳後修飾に影響を及ぼすことによって達成することができる。これは、例えばキナーゼもしくはホスファターゼなどの酵素の翻訳後修飾に関与する酵素の活性を、相応の過剰発現もしくは遺伝子サイレンシングなどの措置によって調節することによって行うことができる。
【０１６９】
もう一つの実施態様においては、例えばグループＩのポリペプチドは、効率の点で改善でき、又はそのアロステリック制御領域は、化合物の製造のフィードバック阻害が抑制されるように破壊される。同様に、分解酵素は、置換、欠失もしくは付加によって欠失もしくは修飾されて、その分解活性が、所望のポリペプチド又は本発明のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドについて細胞の生命力を損なうことなく低減されうる。それぞれの場合に、メチオニンの製造の全体の収率もしくは速度は、高めることができる。
【０１７０】
また、かかるポリペプチド及びヌクレオチド分子における変更は、システインもしくはグルタチオンなどの他の硫黄含有化合物などの他のファインケミカル、他のアミノ酸、ビタミン類、補因子、栄養素、ヌクレオチド、ヌクレオシド及びトレハロースの製造を改善することができる。任意の１つの化合物の代謝は、細胞内で他の生合成経路及び分解経路と絡み合っており、必要な補因子、中間物質もしくは基質は、一つの経路においては、別のかかる経路によって供給されもしくは制限される。従って、本発明のポリペプチドの活性及び／又は例えばグループＩのポリペプチドの活性を調節することによって、メチオニンをもたらす経路以外の別のファインケミカル生合成もしくは分解経路の生産量及び／又は効率に影響が及ぼされることがある。
【０１７１】
酵素発現及び機能は、また、異なる代謝プロセスからの化合物の細胞レベルに基づき調節でき、かつ基本的な成長に必要な分子、例えばアミノ酸及びヌクレオチドの細胞内レベルは、決定的に、大規模培養において微生物の生命力に影響を及ぼしうる。このように、例えばリジン生合成経路のアミノ酸生合成酵素を、それらがもはやフィードバック阻害の役割を担わず又はそれらが効率もしくはターンオーバーの点で改善されるように調節することで、より良好なメチオニン産生がもたらされることがある。該ポリペプチド及びヌクレオチド配列の量及び／又は活性を増大もしくは導入するための上述のストラテジーは、制限することを意味するものではない；これらのストラテジーに対する変更は、当業者には明らかである。
【０１７２】
内因性コバラミン依存性メチオニンシンターゼをコードする及びグループＩＩのヌクレオチド配列及び／又はポリペプチドの量及び／又は活性の低減
ヌクレオチド配列及びそれによりコードされるポリペプチドの量及び／又は活性を低減するために、種々のストラテジーを利用することもできる。
【０１７３】
例えばグループＩＩの内因性酵素の発現は、例えば該遺伝子のプロモーター配列に特異的に結合するアプタマーの発現を介して調節することができる。結合することでプロモーター領域を刺激もしくは抑制するアプタマーに応じて、かかる酵素の量、従ってこの場合には活性は、高められるか又は低減される。
【０１７４】
アプタマーは、また、酵素自体に特異的に結合するように設計することもでき、又はそれぞれの酵素の触媒中心に例えば結合することによって該酵素の活性を低減させるように設計することもできる。アプタマーの発現は、通常は、ベクターを基礎とした過剰発現（前記参照）によって達成され、それはアプタマーの設計及び選択と同様に、当業者によく知られている（Ｆａｍｕｌｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４３，１２３−３６）。
【０１７５】
更に、例えばＭｅｔＨの又はグループＩＩの内因性酵素の内因性遺伝子の量及び活性の減少は、当業者によく知られている種々の実験措置によって達成することができる。これらの措置は、通常は、用語"遺伝子サイレンシング"として要約される。例えば、内因性遺伝子の発現は、該酵素もしくはその部分をアンチセンス順序でコードするＤＮＡ配列を有する前記のベクターをＣ．グルタミクム及びＥ．コリなどの生物に移入することによってサイレンシングすることができる。これは、かかるベクターの細胞内での転写が、内因性遺伝子によって転写されるｍＲＮＡとハイブリダイズでき、従ってその翻訳を抑制するＲＮＡをもたらすという事実に基づく。
【０１７６】
アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動的に結合された調節配列は、様々な細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子、例えばウイルスプロモーター及び／又はエンハンサーの連続的な発現に関して選択することができ、もしくは調節配列は、構成的な、組織特異的なもしくは細胞型特異的なアンチセンスＲＮＡに関して選択することができる。該アンチセンス発現ベクターは、組み換えプラスミド、ファージミドもしくは弱毒ウイルスであって、アンチセンス核酸が高い効率の調節領域下で産生される形であってよく、その際、その活性がベクターは導入される細胞型によって決定できる。アンチセンス遺伝子を使用した遺伝子発現の調節の議論のためには、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照のこと。
【０１７７】
原理的には、アンチセンスストラテジーは、リボザイム法と組み合わせることができる。リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡ配列であって、それは、アンチセンス配列に結合されると、ターゲット配列は触媒的に開裂される（Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．２３（３），２５７−７５）。これは、アンチセンスストラテジーの効率を増強することができる。
【０１７８】
更なる方法は、ナンセンス突然変異を内因性遺伝子へと、ＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドの生物への導入によって導入すること（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（５），５５５−５５８）又は相同組み換えによってノックアウト突然変異を作成することである（Ｈｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６，８３２１−８３２３）。
【０１７９】
相同組み換え微生物を作成するために、例えばグループＩＩの酵素をコードする遺伝子又は内因性のＭｅｔＨ遺伝子の少なくとも一部を含み、そこに欠失、付加もしくは置換が導入されて、それにより、内因性遺伝子を変更、例えば機能的に破壊したベクターが製造される。
【０１８０】
好ましくは、この内因性遺伝子は、Ｃ．グルタミクムもしくはＥ．コリ遺伝子であるが、それは関連の細菌由来の相同体であってよく、又は酵母もしくは植物起源の相同体であってさえもよい。一実施態様においては、該ベクターは、相同組み換え後に、内因性遺伝子を機能的に破壊することで設計される（すなわち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；また"ノックアウト"ベクターとも呼称される）。選択的に、該ベクターは、相同組み換え後に、内因性遺伝子を突然変異させるか又はそれどころか変更するが、依然として機能的タンパク質（例えば上流調節領域を変更して、それにより、例えばグループ２の内因性酵素の発現を変更することができる）をコードするように設計できる。相同組み換えベクターにおいて、内因性遺伝子の変更された部分は、内因性遺伝子の付加的な核酸によってその５′末端と３′末端で隣接されて、相同組み換えが、（微）生物中でベクターによって運ばれる外因性遺伝子と内因性遺伝子との間で生じうる。付加的な隣接する内因性の核酸は、内因性の遺伝子との効果的な相同組み換えのために十分な長さである。一般に、隣接するＤＮＡ（５′末端と３′末端の両方で）の数キロベースは、該ベクターに含まれる（例えば相同組み換えベクターの記載についてはＴｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．，ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照）。
【０１８１】
該ベクターは、微生物中に（例えばエレクトロポレーションによって）導入され、かつ導入された内因性遺伝子が内因性酵素と相同組み換えされて有する細胞は、当該技術分野で公知の技術を用いて選択される。
【０１８２】
もう一つの実施態様においては、宿主細胞中の内因性遺伝子は、そのタンパク質産物の発現が生じないように破壊される（例えば相同組み換えによって又は当該技術分野において公知の他の遺伝的手段によって）。もう一つの実施態様においては、宿主細胞における内因性遺伝子もしくは導入された遺伝子は、１つ以上の点突然変異、欠失もしくは逆位によって変更されているが、依然として機能的酵素をコードする。更なるもう一つの実施態様において、（微）生物における内因性遺伝子の１つ以上の調節領域（例えばプロモーター、リプレッサーもしくはインデューサー）は、該内因性遺伝子の発現が調節されるように変更されている（例えば欠失、欠損、逆位もしくは点突然変異によって）。当業者は、例えばグループＩＩの酵素及びタンパク質修飾をコードする１つより多くの遺伝子を含む宿主細胞が、本発明の方法を使用して容易に製造でき、かつそれが本発明に含まれることを意味すると考える。
【０１８３】
更に、遺伝子抑制（しかしまた遺伝子過剰発現も）は、また、特異的なＤＮＡ結合因子、例えば亜鉛フィンガー型転写因子によって可能である。更に、標的タンパク質を阻害する因子自体を、細胞に導入することができる。タンパク質結合因子は、例えば上記のアプタマーであってよい（Ｆａｍｕｌｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４３，１２３−３６）。
【０１８４】
生物中での発現により、例えばグループＩＩの酵素の量及び／又は活性の低減が引き起こされる更なるタンパク質結合因子としては、酵素特異的抗体が考慮されうる。モノクローナル、ポリクローナルもしくは組み換えの酵素特異的抗体の製造は、標準的なプロトコールに従う（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２，ｐｐ．６６３−６７９（１９９０），Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ｅｄ．）。抗体の発現は、また文献から公知である（Ｆｉｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３，２０５−２１６；Ｍａｙｎａｒｄ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２，３３９−７６）。
【０１８５】
上述の技術は当業者によく知られている。従って、当業者は、また、例えばアンチセンス法のために使用される核酸構築物がどのようなサイズを有さねばならないかと、それぞれの核酸配列がどのような相補性、相同性もしくは同一性を有さねばならないかを認識している。相補性、相同性及び同一性という用語は、当業者に公知である。
【０１８６】
相補性という用語は、核酸分子が他の核酸分子と、２つの相補性塩基の間の水素結合によりハイブリダイズする能力を説明している。当業者は、２つの核酸分子は、互いにハイブリダイズしうるためには、１００％の相補性を有する必要はないことを認識している。他の核酸配列とハイブリダイズすべき核酸配列は、それぞれ前記の他の核酸配列と、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８０％、また特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％もしくは１００％だけ相補性であることが好ましい。
【０１８７】
核酸分子は、それらが同一の５′−３′順序で同じヌクレオチドを有する場合には同一である。
【０１８８】
アンチセンス配列と内因性のｍＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションは、一般に、細胞条件下でインビボでもしくはインビトロで生ずる。本発明によれば、ハイブリダイゼーションは、特異的なハイブリダイゼーションが保証されるほど十分にストリンジェントな条件下でインビボでもしくはインビトロで行われる。
【０１８９】
ストリンジェントなインビトロハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知であり、かつ文献（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照）から引き出すことができる。用語"特異的ハイブリダイゼーション"は、ある分子が優勢的にある一定の核酸配列に、この核酸配列が、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ分子の複雑な混合物の部分である場合に、ストリンジェントな条件下で結合する場合を指す。
【０１９０】
従って、用語"ストリンジェントな条件"は、核酸配列が優勢的に標的配列に結合するが、他の配列に対しては、全く結合しないかもしくは少なくとも大きく低減された程度までだけ結合する条件を指す。
【０１９１】
ストリンジェントな条件は、環境に依存する。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション温度が、定義されたイオン濃度と定義されたｐＨ値で特定の配列の融点（Ｔｍ）の約５℃低い温度であるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的な分子の５０％が前記標的配列とハイブリダイズする温度（定義されたｐＨ値、定義されたイオン濃度及び定義された核酸濃度で）である。一般に、ストリンジェントな条件は、０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（もしくは他の塩のイオン）の塩濃度及び７．０〜８．３のｐＨ値を含む。前記温度は、短い分子については（例えば、１０〜５０ヌクレオチドを含むかかる分子については）少なくとも３０℃である。更に、ストリンジェントな条件は、例えばホルムアミドなどの脱安定剤の添加を含むことがある。一般的なハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄バッファーは、以下の組成を有する。
【０１９２】
【表１】
2010514431.tif 000002
【０１９３】
典型的なハイブリダイゼーション手順は、以下のとおりである：
【表２】
2010514431.tif 000003
【０１９４】
これらのストリンジェントな条件が、また特許請求の範囲が、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列に関連する限りは適用される。
【０１９５】
用語"センス"及び"アンチセンス"並びに"アンチセンス方向"は、当業者に公知である。更に、当業者は、アンチセンス法のために使用されるべき核酸分子がどれ程の長さであるべきであるかと、それらが標的配列に関してどれほどの相同性もしくは相補性を有さねばならないかを認識している。
【０１９６】
従って、当業者は、遺伝子サイレンシング方法に使用される核酸分子がどれ程の長さでなければならないかを認識している。アンチセンス目的のためには、１００ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド及び２０ヌクレオチドの配列長にわたる相補性が十分なことがある。より長いヌクレオチド長さももちろん十分である。前記の方法の組み合わせた適用も考えられる。
【０１９７】
本発明によれば、５′−３′方向で、該生物中で活性なプロモーターに作動的に結合されたＤＮＡ配列が使用されるのであれば、一般にベクターを構築してよく、前記ベクターは、生物細胞に移入した後に、コーディング配列の過剰発現を可能にするか、又は内因性核酸配列及びそこから発現されるタンパク質のそれぞれの抑制もしくは競合及び遮断を引き起こす。
【０１９８】
特定の酵素の活性は、また生物中でのその非機能的突然変異体を過剰発現させることによって低減させることができる。このように、当該反応を触媒できないが、例えば基質もしくは補因子と結合できる非機能的突然変異体は、過剰発現によって、内因性酵素と競合し、従って該反応を阻害することができる。宿主細胞中の酵素の量及び／又は活性を低減させるための更なる方法は、当業者によく知られている。
【０１９９】
ベクター及び宿主細胞
本発明のもう一つの態様は、本発明によるヌクレオチド配列（もしくはその一部）又はそれらの組み合わせを含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本願で使用する場合に、用語"ベクター"は、結合されている他の核酸を輸送できる核酸分子を指す。
【０２００】
ベクターの一つの型は、"プラスミド"であり、それは、付加的なＤＮＡセグメントをライゲーションできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう一つの型は、ウイルスベクターであり、その際、そのウイルスゲノム中には付加的なＤＮＡセグメントがライゲーションされていてよい。
【０２０１】
一定のベクターは、導入される宿主細胞（例えば細菌性の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）中で自己複製することができる。他のベクターは、宿主細胞への導入後に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによりこの宿主ゲノムに沿って複製される。更に、一定のベクターは、作動的に結合された遺伝子の発現に向けることができる。
【０２０２】
かかるベクターは、本願では"発現ベクター"と呼称される。
【０２０３】
一般に、組み換えＤＮＡ技術において利用される発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。本願明細書では、"プラスミド"及び"ベクター"は、プラスミドがベクターの最も通常使用される形状なので互換的に使用することができる。
【０２０４】
本発明の組み換え発現ベクターは、本発明による及び／又はグループＩの酵素をコードする核酸を、宿主細胞中のそれぞれの核酸の発現に適した形で有してよく、それはつまり、該組み換え発現ベクターは、発現されるべき核酸配列に作動的に結合された発現に使用されるべき宿主細胞を基礎として選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味する。
【０２０５】
組み換え発現ベクターにおいては、"作動的に結合された"は、関連のヌクレオチド配列が、調節配列へと、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（例えばインビトロ転写／翻訳系で、又は宿主細胞にベクターが導入される場合に宿主細胞において）結合されていることを意味することを意図している。用語"調節配列"は、プロモーター、リプレッサー結合部位、アクチベーター結合部位、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えばターミネーター、ポリアデニル化シグナル又は他のｍＲＮＡ二次構造のエレメント）を含むことを意図している。かかる調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ （１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の構成的な発現に関する配列と、一定の宿主細胞においてのみのヌクレオチド配列の発現に関する配列とを含む。好ましい調節配列は、例えばプロモーター、例えばｃｏｓ−、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌｐｐｌａｃ−、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−、ａｒａ−、ＳＰ６−、ａｒｎｙ、ＳＰ０２、ｅ−Ｐｐ−もしくはｅＰＬ−であり、それらは好ましくは細菌において使用される。付加的な調節配列は、例えば酵母及び菌類由来のプロモーター、例えばＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ、植物由来のプロモーター、例えばＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓもしくはウビキチンもしくはファセオリンプロモーターである。また、人工プロモーターを使用することもできる。当業者によれば、発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要素に依存しうるものと認識される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入して、それにより本発明による核酸によってコードされる融合タンパク質もしくはペプチドを含むタンパク質もしくはペプチドを産生することができる。
【０２０６】
本発明の組み換え発現ベクターは、本発明によるポリペプチドの発現のために原核細胞もしくは真核細胞において設計できる。例えば、グループＩの酵素に関する遺伝子は、細菌細胞、例えばＣ．グルタミクム及びＥ．コリ、昆虫細胞（バキュウロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母及び他の菌類細胞（Ｒｏｍａｎｅｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８；ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）ｉｎ：Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ，Ｊ．Ｗ．Ｂｅｎｎｅｔ & Ｌ．Ｌ．Ｌａｓｕｒｅ，ｅｄｓ．，ｐ．３９６−４２８：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；及びｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ． & Ｐｕｎｔ，Ｐ．Ｊ．（１９９１）ｉｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ，Ｐｅｂｅｒｄｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐ．１−２８，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅを参照）、藻類及び多細胞植物細胞（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．：５８３−５８６を参照）中で発現させることができる。好適な宿主細胞は、更にＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ （１９９０）で議論されている。選択的に、該組み換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列及びＴ７プロモーターを使用してインビトロで転写及び翻訳させることができる。
【０２０７】
原核生物におけるタンパク質の発現は、もっとも頻繁に、融合タンパク質もしくは非融合タンパク質のいずれかの発現に関連する構成的もしくは誘導的なプロモーターを含むベクターで実施される。
【０２０８】
融合ベクターは、幾つかのアミノ酸をそこにコードされるタンパク質へと付加し、通常は組み換えタンパク質のアミノ末端へではなく、Ｃ末端へと付加するか、又は該タンパク質中の好適な領域内で融合される。かかる融合ベクターは、一般に、３つの目的を果たす：１）組み換えタンパク質の発現の増大；２）組み換えタンパク質の可溶性の増大；並びに３）親和性精製においてリガンドとして作用することによる組み換えタンパク質の精製での補助。しばしば、融合発現ベクターにおいては、融合部の接合部分にタンパク質分解性の開裂部位が導入され、それは融合タンパク質の精製に引き続き融合部から組み換えタンパク質を分離することを可能にする。かかる酵素及びそれらの同種の認識配列は、Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼを含む。
【０２０９】
一般的な融合発現ベクターは、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含み、それらはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質又はタンパク質Ａをそれぞれ融合している。
【０２１０】
好適な誘導性の非融合Ｅ．コリ発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、ｅｇｔｉｌ、ｐＢｄＣｌ及びｐＰＥＴ ｌｌｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０−８９；及びＰｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８５）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＩＢＳＮ ０ ４４４ ９０４０１８）を含む。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ ｌｉｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現されるウイルス性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎｌ）により媒介されるＴ７ｇｎｌＯ−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルス性ポリメラーゼは、宿主菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）もしくはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって、Ｔ７ｇｎｌ遺伝子を有する在住ＸプロファージからｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で供給される。他の様々な細菌の形質転換のために、好適なベクターを選択できる。例えばプラスミドｐＩＪ０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２及びｐＩＪ３６１はストレプトマイセスの形質転換に有用であると知られており、一方で、プラスミドｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４もしくはｐＢＤ２１４は、バシラス種の形質転換のために適している。コリネバクテリウム中への遺伝情報の移入において使用される幾つかのプラスミドは、ｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１、ｐＳＡ７７もしくはｐＡＪ６６７（Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８５）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＩＢＳＮ ０ ４４４９０４０１８）を含む。
【０２１１】
組み換えタンパク質発現を最大限にする一つのストラテジーは、組み換えタンパク質のタンパク質分解的開裂の能力を欠損した宿主細菌中でタンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１１９−１２８）。もう一つのストラテジーは、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を、各アミノ酸についての個別のコドンが、Ｃ．グルタミクムなどの発現に選択された細菌に有利に使用されるものであるように変更することである（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のかかる変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実施することができる。
【０２１２】
好適なＣ．グルタミクム及びＥ．コリのシャトルベクターの例は、Ｅｉｋｍａｎｎｓ他（Ｇｅｎｅ．（１９９１）１０２，９３−８）に見出すことができる。
【０２１３】
もう一つの実施態様においては、タンパク質発現ベクターは、酵素発現ベクターである。酵母Ｓ．セレビシエ中での発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｅｍｂｏ Ｊ．６：２２９−２３４）、２ｉ、ｐＡＧ−１、Ｙｅｐ６、Ｙｅｐ１３、ｐＥＭＢＬＹｅ２３、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む。糸状菌などの他の菌類で使用するのに適したベクター及びベクターの構築のための方法は、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．& Ｐｕｎｔ，Ｐ．Ｊ．（１９９１）ｉｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ，Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｅｒｄｙ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐ．１−２８，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ及びＰｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８５）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ＩＢＳＮ ０ ４４４ ９０４０１８）に詳説されたものを含む。
【０２１４】
本発明の目的のためには、作動的結合とは、プロモーター、コーディング配列、ターミネーター、及び場合により更なる調節エレメントが、それぞれの調節エレメントがコーディング配列の発現に際してその決定に従ってその機能を満たしうるように順次配列されていると解される。
【０２１５】
原核細胞と真核細胞の両者のための他の好適な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００３の第１６章及び第１７章を参照のこと。
【０２１６】
本発明のもう一つの態様は、本発明の組み換え発現ベクターが導入されている生物もしくは宿主細胞に関する。用語"宿主細胞"及び"組み換え宿主細胞"は、本願では互換的に使用される。かかる用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、かかる細胞の子孫もしくは潜在的子孫を指すものと解される。一定の変更は、突然変異もしくは環境的影響のため後続世代に生ずることがあるので、かかる子孫は、事実、親細胞と同一でないことがあるが、依然として本願で使用される用語の範囲内に含まれる。
【０２１７】
ベクターＤＮＡは、原核細胞もしくは真核細胞へと慣用の形質転換もしくはトランスフェクション技術を解して導入することができる。本願で使用される場合に、用語"形質転換"及び"トランスフェクション"、"接合"及び"形質導入"は、異種の核酸（例えば直鎖状ＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば直鎖化されたベクターもしくはベクターを含まない遺伝子構築物単独））もしくはベクターの形の核酸（例えばプラスミド、ファージ、ファズミド、ファージミド、トランスポゾンもしくは他のＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な当該技術分野で認識される技術、例えばリン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、自然受容、化学薬品に媒介される移行もしくはエレクトロポレーションを指すことを意図する。宿主細胞の形質転換もしくはトランスフェクションのための好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００３）及び他の研究所マニュアルに見出すことができる。
【０２１８】
これらの要素を同定及び選択するために、選択可能なマーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子は、一般に、関心のある遺伝子と一緒に宿主細胞中に導入される。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキセートなどの薬剤に対する耐性を授けるものを含む。選択可能なマーカーをコードする核酸は、宿主細胞中に、本発明のポリペプチドをコードするものと同じベクター上で導入できるか、又は別のベクター上で導入できる。導入される核酸で安定的にトランスフェクションされた細胞は、薬剤選択によって同定することができる（例えば選択可能なマーカー遺伝子が導入された細胞は生き残るが、他の細胞は死滅する）。
【０２１９】
もう一つの実施態様において、組み換え微生物であって導入される遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含むものを製造することができる。例えば、本発明のヌクレオチド配列をベクター上でそれをｌａｃオペロンの制御下に置いて封入することによって、ＩＰＴＧの存在下でのみ該遺伝子の発現が可能となる。かかる調節系は、当該技術分野でよく知られている。
【０２２０】
一つの実施態様において、該方法は、本発明の生物（例えば本発明のポリペプチドをコードする組み換え発現ベクターが導入されているか、又はそのゲノム中に野生型もしくは改変された酵素をコードする遺伝子が導入されている）を、メチオニン産生に適した培地中で培養することを含む。もう一つの実施態様において、該方法は、更に前記媒体もしくは宿主細胞からメチオニンを単離することを含む。
【０２２１】
エシェリキア・コリ及びコリネバクテリウム・グルタミクムの増殖  −  培地及び培養条件
当業者は、Ｃ．グルタミクム及びＥ．コリなどの通常の微生物の培養に精通している。このように、Ｃ．グルタミクムの培養に関して以下に一般的な教示を行う。相応の情報は、Ｅ．コリの培養に関する標準的な教科書から取り出すことができる。
【０２２２】
Ｅ．コリ菌株は、ＭＢ及びＬＢブロスのそれぞれにおいて通常は増殖される（Ｆｏｌｌｅｔｔｉｅ，Ｍ．Ｔ．，Ｐｅｏｐｌｅｓ．Ｏ．，Ａｇｏｒｏｐｏｕｌｏｕ，Ｃ．，ａｎｄ Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ａ Ｊ．（１９９３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１７５，４０９６−４１０３）。Ｅ．コリ用の最少培地は、Ｍ９及び改変ＭＣＧＣ（Ｙｏｓｈｉｈａｍａ，Ｍ．，Ｈｉｇａｓｈｉｒｏ，Ｋ．，Ｒａｏ，Ｅ．Ａ．，Ａｋｅｄｏ，Ｍ．，Ｓｈａｎａｂｒｕｃｈ，Ｗ Ｇ．，Ｆｏｌｌｅｔｔｉｅ，Ｍ．Ｔ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｃ．，ａｎｄ Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．（１９８５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２，５９１−５０７）のそれぞれである。グルコースは、１％の最終濃度で添加することができる。抗生物質は、以下の量（ミリリットル当たりのマイクログラム数）で添加されてよい：アンピシリン、５０；カナマイシン、２５；ナリジキシン酸、２５。アミノ酸、ビタミン類及び他の供給物は、以下の量で添加されてよい：メチオニン、９．３ｍＭ；アルギニン、９．３ｍＭ；ヒスチジン、９．３ｍＭ；チアミン、０．０５ｍＭ。Ｅ．コリ細胞は、それぞれ３７℃で通常は増殖される。
【０２２３】
遺伝子改変されたコリネバクテリアは、一般に、合成もしくは天然の増殖培地中で培養される。コリネバクテリアのための幾つかの種々の増殖培地は両者ともよく知られ、容易に入手できる（Ｌｉｅｂ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２：２０５−２１０；ｖｏｎ ｄｅｒ Ｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１：１１−１６；特許ＤＥ４，１２０，８６７号；Ｌｉｅｂｌ（１９９２）Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅｓ，ＶｏｌｕｍｅＩＩ，Ｂａｌｏｗｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版）。
【０２２４】
これらの培地は、１種以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類及び微量元素からなる。好ましい炭素源は、糖類、例えば単糖類、二糖類もしくは多糖類である。例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リボース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンもしくはセルロースは、非常に良好な炭素源としてはたらく。
【０２２５】
また、該培地に、糖を、糖蜜もしくは糖精製からの他の副産物などの複合化合物を介して培地へと供給することもできる。また、種々の炭素源の混合物を供給することが好ましいことがある。他の可能な炭素源は、アルコール及び有機酸、例えばメタノール、エタノール、酢酸もしくは乳酸である。窒素源は、通常は、有機もしくは無機の窒素化合物又はこれらの化合物を含有する材料である。例としての窒素源は、アンモニアガスもしくはアンモニア塩、例えばＮＨ4Ｃｌもしくは（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＮＨ4ＯＨ、硝酸塩、尿素、アミノ酸もしくは複合窒素源、例えばコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキスなどを含む。
【０２２６】
メチオニンの過剰産生は、種々の硫黄源を使用することで可能である。硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩及びまたより還元された硫黄源、例えばＨ2Ｓ及び硫化物及び誘導体を使用することができる。メチルメルカプタン、チオグリコレート、チオシアネート及びチオ尿素などの有機硫黄源、システインなどの硫黄含有アミノ酸及び他の硫黄含有化合物も効率的なメチオニン産生の達成に使用することができる。ギ酸塩は、また、メタノールもしくはホルムアルデヒドなどの他のＣ１源と同じ供給物として可能である。特に適しているのは、メタンチオール及びその二量体のジメチルジスルフィドである。
【０２２７】
該培地に含まれてよい無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅及び鉄の塩化物、亜リン酸塩もしくは硫酸塩を含む。キレート化化合物は、金属イオンを溶解状態で保つために培地に添加されてよい。特に有用なキレート化化合物は、ジヒドロフェノール類、例えばカテコールもしくはプロトカテク酸塩、もしくはクエン酸などの有機酸を含む。培地は、また、他の増殖因子、例えばビタミン類もしくは増殖促進剤を含有することが一般的であり、その例は、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩及びピリドキシンを含む。増殖因子及び塩は、しばしば、酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合培地成分に由来する。培地の化合物の厳密な組成は、直接的な実験に強く依存し、個別に各特別な場合について決定される。培地最適化についての情報は、教科書"Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ"（Ｅｄｓ．Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）ｐｐ．５３−７３，ＩＳＢＮ ０ １９ ９６３５７７ ３）から入手できる。また、スタンダード１（Ｍｅｒｃｋ）もしくはＢＨＩ（ｇｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ＤＩＦＣＯ）などのような商業由来の増殖培地を選択することも可能である。
【０２２８】
全ての培地成分は、熱（１．５バール及び１２１℃で２０分間）またはろ過滅菌法のいずれかにより滅菌されることが望ましい。該成分は、一緒に、又は必要であれば、別々に滅菌することができる。
【０２２９】
全ての培地成分は、増殖開始時に存在させるか、又は場合により連続的にもしくは回分式に添加することができる。培養条件は各々の実験のために別個に定義される。
【０２３０】
その温度は、１５℃から４５℃の範囲であるべきである。温度は、一定に保つか、又は実験中に変えることができる。培地のｐＨは、５から８．５、好ましくは７．０前後の範囲であるべきであり、培地にバッファーを添加することでそのｐＨを保つことができる。この目的のためのバッファーの例は、リン酸カリウムバッファーである。ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＥＳその他の合成バッファーを、選択的にもしくは同時に使用することができる。増殖の間にＮａＯＨまたはＮＨ4ＯＨを添加することより一定の培養ｐＨを保つことも可能である。酵母エキスなどの複合培地成分が使用されるのであれば、多くの複合化合物は高い緩衝能力があるという事実により、追加のバッファーの必要性が低下しうる。微生物の培養に発酵槽が使用されるのであれば、そのｐＨはアンモニアガスにより制御することもできる。
【０２３１】
インキュベーション時間は、通常は、数時間から数日の範囲である。この時間は、ブロスの中に蓄積される最大の生成物量を可能にするように選択される。開示された増殖実験は、様々な容器、例えばマイクロタイタープレート、ガラス管、ガラスフラスコ又は種々のサイズのガラスもしくは金属製の発酵槽において実施することができる。多数のクローンのスクリーニングのために、該微生物を、マイクロタイタープレート、ガラス管もしくは、バッフルを有するかあるいは有さない振盪フラスコにおいて培養することが望ましい。好ましくは１００ｍｌの振盪フラスコを、必要な増殖培地１０％（容量）で満たして使用する。該フラスコを、１００〜３００ｒｐｍの速さの範囲を使用して、ロータリーシェーカー（ふり幅２５ｍｍ）で振盪することが望ましい。蒸発ロスは湿潤雰囲気中に保つことによって少なくすることができる；選択的に、蒸発ロスの数学的補正が行なわれることが望ましい。
【０２３２】
遺伝的に改変されたクローンが試験されるのであれば、改変されていないコントロールのクローン又は如何なる挿入物も有さない基礎プラスミドを含むコントロールのクローンも試験するべきである。該培地を、寒天プレート上、例えばＣＭプレート（１０ｇ／ｌのグルコース、２．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌの尿素、１０ｇ／ｌのポリペプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌの肉エキス、２２ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌの尿素、１０ｇ／ｌのポリペプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌの肉エキス、２２ｇ／ｌの寒天、２ＭのＮａＯＨでｐＨ６．８としたもの）上で３０℃でインキュベートして増殖された細胞を用いて０．５〜１．５のＯＤ600まで接種する。
【０２３３】
培地の接種は、ＣＭプレートからのＣ．グルタミクム細胞の生理食塩懸濁液の導入、又はこの細菌の液体前培養の添加のいずれかにより達成される。
【０２３４】
前記の培養条件及び培地条件は、また、Ｓ．コエル及びＴ．マリチマなどの他の宿主生物についても適用できる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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