(57)【要約】  4Eレギュロン活性の特性、診断及び観察のための、そして4Eレギュロン活性を調節する作用物質の発見のための方法及び組成物を提供する。本方法、組成物及び作用物質は単独で用いても、あるいは、細胞肥大症、癌、及び虚血再潅流を含む4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の検出及び処置のための他の治療法と組み合わせて、又は連関させて用いてもよい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を診断する方法であって：
（ａ）対象の生物学的試料中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性を判定するステップと、
（ｂ）前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性を、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を有する対象において4Eレギュロン活性が機能不全である疾患に関連付けられた少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性と比較するステップであって、この場合、前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分の同様なレベル、リン酸化状態、又は活性は、前記対象が4Eレギュロン活性が機能不全である疾患又はその少なくとも一つの症状を有するか、あるいは発症する可能性があることの指標である、ステップ
とを含む方法。
【請求項２】
4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を予後する又はその段階を判定する方法であって：
（ａ）対象の生物学的試料中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性を判定するステップと、
（ｂ）前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性を、対象において4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の程度又は重篤度又は段階に関連付けられた前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル又は活性と比較するステップであって、この場合、前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分の同様なレベル、リン酸化状態、又は活性は、 前記対象が4Eレギュロン活性が機能不全である疾患のその程度、重篤度又は段階を有することの指標である、ステップと
を含む方法。
【請求項３】
4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の発症を予測する方法であって：
（ａ）対象の生物学的試料中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性を判定するステップと、
（ｂ）前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性を、対象において4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の発症の可能性と関連付けられた前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル又は活性と比較するステップであって、この場合、前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分の同様なレベル、リン酸化状態、又は活性は、前記対象が4Eレギュロン活性が機能不全である疾患又はその症状の一つを有する、又は発症する可能性が高いことの指標である、ステップと
を含む方法。
【請求項４】
前記試料が血漿、血液、尿、唾液及び組織から成る群より選択される、上記請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
4Eレギュロン活性が機能不全である前記疾患が細胞肥大症、癌、及び虚血再潅流から成る群より選択される、上記請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記少なくともなくとも一種の4Eレギュロン成分が eIF4E； サイクリン D1；NBS/ニブリン；Pim-1；サイクリン B1；サイクリン A2；ODC；VEGF; Skp2； サイクリン E1；c-myc； FGF2； MMP-9； mdm2；カスパーゼ-9； bcl2； bcl/xL； Fbox1； CGGbp1； P54nrb/NONO.1；セレノタンパク質 S； eIF4E-BP1； Akt1； PI3K； GSK3B； HuR；及び mTOR/FRAP1から成る群より選択される、上記請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分が4E、NBS/ニブリン、Pim-1、VEGF、サイクリン D1、サイクリン A2、4E-BP1、ODC 及びHuRから成る群より選択される、上記請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
少なくとも二つの4Eレギュロン成分の前記対象レベル、リン酸化状態、又は活性が判定及び比較される、上記請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
少なくとも一つの非4Eレギュロン成分の前記対象レベル、リン酸化状態、又は活性が判定及び比較される、上記請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも一つの非4Eレギュロン成分がER、PR、EGFR 及び Her2/neuから成る群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記4Eレギュロン成分のレベルが、ガスクロマトグラフィ、HPLC、液体クロマトグラフィ又は薄層クロマトグラフィと組み合わされた質量分析法により判定される、上記請求項１乃至３又は８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記4Eレギュロン成分の活性が、その4Eレギュロン成分に特異的な免疫検定法又は検定により判定される、上記請求項１乃至３又は８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を診断する方法であって、
（ａ）対象の細胞内で少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを判定するステップと
（ｂ）前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを、 4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を有する対象において4Eレギュロン活性が機能不全である疾患に関連付けられた前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物
の発現レベルと比較するステップであって、前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の同様な発現レベルは、前記対象が4Eレギュロン活性が機能不全である疾患又は少なくとも一つのその症状を有する、あるいは発症する可能性が高いことの指標であるステップと
を含む方法。
【請求項１４】
4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を予後する又はその段階を判定する方法であって、
（ａ）対象の細胞内で少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを判定するステップと、
（ｂ）前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを、対象において4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の程度、重篤度又は段階と関連付けられた少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルと比較するステップであって、前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の同様な発現レベルは、前記対象が4Eレギュロン活性が機能不全である疾患のその程度、重篤度又は段階を有することの指標である、ステップと
を含む方法。
【請求項１５】
4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の発症を予測する方法であって、
（ａ）対象の細胞内において少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを判定するステップと
（ｂ）前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを、対象において4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の発症の可能性と関連付けられた少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルと比較するステップであって、少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の同様な発現レベルは、前記対象が4Eレギュロン活性が機能不全である疾患又はその少なくとも一つの症状を有する、あるいは発症する可能性が高いことの指標である、ステップと
を含む方法。
【請求項１６】
4Eレギュロン活性が機能不全である疾患が細胞肥大症、癌、及び虚血再潅流から成る群より選択される、上記請求項１１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分がeIF4E；サイクリン D1；NBS/ニブリン；Pim-1；サイクリン B1；サイクリン A2；ODC；VEGF；Skp2；サイクリン E1；c-myc；FGF2；MMP-9；mdm2；カスパーゼ-9；bcl2；bcl/xL；Fbox1；CGGbp1；P54nrb/NONO.1；セレノタンパク質 S；eIF4E-BP1；Akt1；PI3K；GSK3B；HuR；及び mTOR/FRAP1から成る群より選択される、上記請求項１１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分4E、NBS/ニブリン、Pim-1、VEGF、サイクリン D1、サイクリン A2、eIF4E-BP1、ODC 及び HuRから成る群より選択される、上記請求項１１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも二つの4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の対象発現レベルが判定及び比較される、上記請求項１１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも一つの非4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の対象発現レベルが判定及び比較される、上記請求項１１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも一つの非レギュロン成分がER、PR、EGFR、Her2/neu、及びEts 発癌遺伝子から成る群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルが、前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子の発現レベルを判定することにより判定される、上記請求項１１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルが、細胞内の前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の量を判定することにより判定される、上記請求項１１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルが、細胞内の前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分をコードするmRNAの量を判定することにより判定される、上記請求項１１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルが、前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物のAQUATMスコアを判定することにより判定される、上記請求項１１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物のAQUATMスコアがAQUATM 自動化病理システムを用いて判定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルがマイクロアレイを用いて判定される、上記請求項１１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記マイクロアレイが、前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物にハイブリダイズすることのできる核酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記マイクロアレイが、前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子の遺伝子産物にハイブリダイズすることのできる核酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記マイクロアレイが、前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物を検出することのできるポリペプチドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が組織試料を含む、上記請求項１１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記組織試料がマイクロアレイ上に存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
4Eレギュロン成分又はその一フラグメントに特異的な抗体。
【請求項３４】
4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を処置するための少なくとも一つの候補治療薬を同定する方法であって、
（ａ）細胞を少なくとも一つの候補治療薬に接触させるステップと、
（ｂ）前記少なくとも一つの候補治療薬への接触前及び接触後の細胞内で、少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性を判定するステップであって、前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性の調節は、少なくとも一つの候補治療薬が、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を処置する又は防ぐための治療薬であろうことの指標である、ステップと
を含む方法。
【請求項３５】
4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を処置するための少なくとも一つの候補治療薬を同定する方法であって、
（ａ）細胞を少なくとも一つの候補治療薬に接触させるステップと、
（ｂ）前記少なくとも一つの候補治療薬への接触前及び接触後の細胞内で、少なくとも一種の4Eレギュロン遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを判定するステップであって、前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルの調節は、少なくとも一つの候補治療薬が、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を処置する又は防ぐための治療薬であろうことの指標である、ステップと
を含む方法。.
【請求項３６】
4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を処置するための少なくとも一つの候補治療薬を同定する方法であって、
（ａ）少なくとも一つの細胞を少なくとも一つの候補治療薬と接触させるステップと、
（ｂ）前記少なくとも一つの候補治療薬への接触前及び接触後の前記少なくとも一つの細胞内で細胞アポトーシスが回復したかどうかを判定するステップであって、細胞アポトーシスの回復は、前記少なくとも一つの候補治療薬が、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を処置する又は防ぐための治療薬であろうことの指標である、ステップと
を含む方法。
【請求項３７】
前記疾患が増殖性疾患又は癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を処置するための少なくとも一つの候補治療薬を同定する方法であって、
（ａ）少なくとも一つの細胞を少なくとも一つの候補治療薬と接触させるステップと、
（ｂ）前記少なくとも一つの候補治療薬への接触前及び接触後の前記少なくとも一つの細胞内で細胞アポトーシスが阻害されたかどうかを判定するステップであって、細胞アポトーシスの阻害は、前記少なくとも一つの候補治療薬が、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を処置する又は防ぐための治療薬であろうことの指標である、ステップと
を含む方法。
【請求項３９】
前記疾患が虚血再潅流損傷である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも一つの候補治療薬が候補治療薬のライブラリ中にある、上記請求項３４乃至３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記ライブラリがコンビナトリアル合成法を用いて作製される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
二つの候補治療薬が上昇させられ、この場合の一つの候補治療薬が、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患のための公知の治療薬である、上記請求項３４乃至３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を有する患者のための治療法を選択する方法であって、
患者においてその発現が4Eレギュロン活性が機能不全である疾患に特徴的な少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルに対応する少なくとも一つのクエリ値を提供するステップと、
患者においてその発現が4Eレギュロン活性が機能不全である疾患に特徴的な少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルに対応する複数の組の基準値を提供するステップであって、各基準値がある一つの治療法に関連付けられている、ステップと、
前記クエリ値に最も近い基準値を選択することで、前記患者のための治療法を選択するステップと
を含む方法。
【請求項４４】
前記選択するステップが更に、各基準値に関連付けられた重み値を用いて、前記基準値のための比較値に重みを付けるステップを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
患者に前記治療法を施与するステップを更に含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記クエリ値及び組の基準値が発現プロファイルである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を有する患者のための治療法を選択する方法であって、
患者においてその発現が4Eレギュロン活性が機能不全である疾患に特徴的な少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性に対応する少なくとも一つのクエリ値を提供するステップと、
患者においてその発現が4Eレギュロン活性が機能不全である疾患に特徴的な少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性に対応する複数の組の基準値を提供するステップであって、各基準値がある一つの治療法に関連付けられている、ステップと、
前記クエリ値に最も近い基準値を選択することで、前記患者のための治療法を選択するステップと
を含む方法。
【請求項４８】
上記請求項１乃至３２又は請求項３４乃至３７のいずれかに記載の方法の実施のための試薬を含むキット。
【請求項４９】
使用に関する指示を更に含む、請求項４８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
政府による支援
本発明は、NIHにより付与される援助金番号CA 88991、PO1 AI44236-01、S10 RRO 9145、CA 80728 及びCA 98571と、NSFにより付与される援助金番号
DBI-9724504 による米国政府からの支援を一部受けてなされた。したがって、米国政府は本発明において特定の権利を有するものである。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、引用をもって全文をここに援用することとする２００６年９月２９日に提出された米国仮特許出願第60/848,583 号、２００６年１０月２５日に提出された第60/854,404 号、そして２００７年６月８日に提出された第60/942,884 号に基づく優先権を主張する。
【０００３】
真核生物翻訳開始因子 eIF4E (「4E」) は細胞成長の調節に関与している。4Eが中程度に過剰発現すると成長の調節不全や悪性形質転換が引き起こされる。4Eの核内及び細胞質側機能の両者が、細胞を形質転換させるその能力に寄与している。4E がin vivo で過剰発現すると明白な腫瘍形成が起こり、この腫瘍形成開始は、4Eの過剰発現をmycマウスのバックグラウンドの関係で行わせると大きく亢進したことから、やはり、4Eは腫瘍性転化を促進する他の腫瘍遺伝子と協調して作用することが示唆される。4Eは、癌で上方調節したときに転移性疾患の予測因子となる７つの遺伝子のうちの一つを表すと考えられる。多種の研究が行われ、切除縁内に4E活性の上昇が在ると予後因子がよくないことが実証されてきた。
【０００４】
参考文献
ここで言及した全公報及び特許は、下に列挙した参考文献を含め、各個々の公報又は特許を具体的かつ個別に引用をもって援用したのと同様に、それらの全文を引用をもってここに援用したものである。矛盾があれば、ここでのいずれかの定義を含め、本出願を上位とする。
【０００５】
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【００１０】
核内では、4Eは細胞周期進行のほぼ各段階に影響を与えるRNAレギュロン内の重要な節である。具体的には、4Eは、細胞周期進行に関与する複数の遺伝子のmRNAの輸出を調和的に促進し、場合によってはその翻訳をも、促進する。例えば4EはサイクリンD1及びオルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）という少なくとも二種のmRNAの核内から細胞質への輸出を促進する働きはしながらも、GAPDH又はアクチンmRNAの核内から細胞質側への輸送については何の影響も持たない。更に、4EのmRNA輸出機能がその発癌性の形質転換活性に関係しているという証拠がある。
【００１１】
悪性の表現型を維持及び亢進する腫瘍サプレッサ及び癌遺伝子の発現調節不全が解説されてきた。これらの分子の中には、p53、Rb、及びAPCなどの腫瘍サプレッサや、myc、サイクリンD1 及び4Eなどの癌遺伝子がある。それらの相互作用は、主要な因子の不活性化が新生物性表現型の逆転や、時には持続的な消失にも繋がり得るような自己強化型フィードバック・ループのネットワークを構成している。
【００１２】
4Eは乳房、結腸、頭部及び頚部、甲状腺、肺、非ホジキンリンパ腫、前立腺、子宮頚部、膀胱並びに慢性及び急性の骨髄性白血病を含め、多種の悪性細胞種及び原発ヒト腫瘍で過剰発現している。これと合致するように、げっ歯類細胞では4Eが中程度に過剰発現するだけでも、増殖が調節不全となり悪性形質転換が起きる。
【００１３】
5’7−メチルグアノシンmRNAキャップ構造とのその特異的相互作用の結果、cap依存型翻訳の重要な段階で作用し、転写産物をリボゾームに動員することで、真核生物の成長及び生存に必須であるにも関わらず、4Eの上方調節によって全てのcap依存型転写産物の翻訳が増加するという訳でなく、4E感受性転写産物という特異的な下位集団の翻訳が増加するだけである。
【００１４】
4Eの70%もが哺乳動物細胞の核内に存在し、そこでそれは酵母、アフリカツメガエル及びヒトを含む多種の生物において核小体と結合する。ここで、4EはサイクリンD1などの特定の下位集団の転写産物のmRNAの輸送は促進するが、B−アクチン及びGAPDHなどのハウスキーピング遺伝子のmRNAの輸送は促進しない。遺伝子発現において4E媒介型mRNA輸送及び翻訳のレベルでの転写後調節は様々な遺伝子特異性を示し、いくつかの遺伝子（例えばサイクリンD1）は輸送のレベルで調節を受けるが、転写のレベルで調節を受けるもの（VEGF）も、両方のレベルで調節を受けるもの（ODC）も、そしていずれのレベルでも調節を受けないもの（GAPDH）もある。m7Gキャップに結合することが、4EによるmRNA輸送及び翻訳の両者について必要であるが、その両者とも、細胞を形質転換するその能力に寄与する。
【００１５】
4Eは他の配列特異的な特徴に関係なく全てのmRNA上に見られるm7Gキャップに結合するという伝統的な観点から見たら、4EがサイクリンD1とGAPDHを識別できる能力は驚くべきものであることを、過去の観察は示唆している。このように、この機能的な識別は、核内で4E がmRNAを認識するという我々の理解の点から、ある難問を呈している。
【００１６】
4E活性の上昇が、細胞、組織、器官内で発現した全mRNA集団のうちの下位集団の翻訳（しかし転写には関係しない）を選択的に媒介することが観察されている。具体的には、4E活性が上昇したレベルで見られる細胞、腫瘍及び／又は癌内では、複雑な5’UTR領域を持つmRNA転写産物の翻訳が選択的に上方調節されるのである。4E活性の上昇がある状況でその翻訳が上方調節されるような遺伝子のレパートリーは、細胞周期、血管新生、増殖等の調節に関与していることが知られている遺伝子の顔ぶれである。しかしながら、4E輸送を調節する分子機序や、このようなプロセスを調節するには4E活性の調節をどのように利用できるかは、余り特徴付けられていない。
【発明の概要】
【００１７】
発明が解決しようとする課題
概要
現在の診断、分節、及び層形成法では、4Eレギュロン活性の検出、分析及び治療上の観察の改良は提供されない。また現在の方法では、4Eレギュロン活性を調節する治療法や臨床処置範例の特定も提供されない。更に、4Eレギュロン活性の低分子阻害剤は存在しない。
【００１８】
ここで解説する調節機序は、正常及び癌性細胞種内の4E活性の調節統一に調和的に資するものである。我々の研究はこれらのプロセスへの洞察を提供すると共に、ヒト癌の処置にとって治療的に有利に用いることのできる、4E活性の第二世代治療用調節物質を同定するために用いることのできる検定及び／又はスクリーンを提供するものである。更に、4E（絶対的差異又は比）及びここで発見された因子の相対的な核内／細胞質内局在を比較すると、eIF4E阻害剤の使用（直接的／間接的）が治療上の利益をもたらすであろう診断基準が提供される。更に、ヒト組織試料／生検／組織アレイを直接、又は、スライドに載せられた生検材料からの腫瘍材料のレーザ捕獲顕微鏡切除後に、調和／多重分析することは、4Eタンパク質及び／又は活性の相対的及び絶対的レベルの両方や、4Eレギュロン因子のレベル及び4E、4E−BP1等の絶対的レベル及びリン酸化状態を通じて、4Eが機能不全に調節されるヒト条件を特定する手段となる。血漿ベース又は組織ベースのアプローチのいずれであっても、上記の手法により、関連する4Eレギュロン媒介型疾患を診断することや、eIF4E及びeIF4Eレギュロン活性を調節する治療法に対する個人の治療上の応答を追跡する有用な機序を提供することの両方が可能になると想像できる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
従って、4Eレギュロン活性を識別、診断及び観察するため、そして4Eレギュロン活性を調節する作用物質を発見するための方法及び組成物を提供する。本方法、組成物及び作用物質は、単独で用いても、細胞肥大、癌、及び虚血再潅流を含め、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の検出及び処置のための他の治療法と組み合わせて、又は関連させて用いてもよい。
【００２０】
更にここでは、とりわけ、4Eレギュロン活性が機能不全的に調節されている状態及び臨床指標を同定するために役立つ診断用、指標分節及び層形成、治療用及び疾患観察用の組成物及び方法を提供する。4E及び4Eレギュロン活性を調節する作用物質の検出、同定及び特徴付けのための更なる方法及び組成物も提供する。
【００２１】
4Eレギュロン活性やそれらによる治療的作用物質の調節を同定、検出及び観察するために、診断用組成物及び方法は、単独で用いても、又は組み合わせて用いてもよい。更に、4Eレギュロン成分活性の調節を含め、しかしこれに限らず、4Eレギュロン活性を調節する化合物及び作用物質を同定及び特徴付けるために、組成物及び方法を単独で用いても、又は組み合わせて用いてもよい。
【００２２】
更に、4E活性及び4Eレギュロン活性の治療的調節が4E、特に4Eレギュロン活性を上昇させるために役立つような態様又は方法で行なわれる条件で、4Eレギュロン活性を同定、検出及び観察するための方法及び組成物も提供する。このような条件には、限定はしないが、虚血再潅流等の条件がある。
【００２３】
更に、例えば4Eレギュロン活性の上昇があるなどの細胞、組織及び腫瘍を撮像及び視覚化する優れた組成物及び方法も提供する。このような優れた撮像及び視覚化組成物及び方法は、例えば4E上昇状態の検出などのために用いてよい。4E上昇状態の検出は、低分子治療薬を単独で投与、又は、ここで解説する付加的な処置及び／又は作用物質との併用投与前、投与中及び投与後の診断、観察の方法として用いても、あるいは、手術前、手術中及び手術後の観察の方法として、そして治療効験の臨床経過や疾患の進行／退行を追跡する方法として用いてもよい。
【００２４】
本方法の実施のためのキットもここで解説する。
【００２５】
本発明のこれらの実施態様、他の実施態様、並びにそれらの特長及び特徴は、以下の説明、図面及び請求の範囲から明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】Rib4C以外のリバビリンはm7G mRNAキャップと同じ親和性で4Eの機能的m7Gキャップ結合部位に結合する。（ａ）標準化補正後のトリプトファン蛍光強度の停止と、リバビリン対4E 野生型（塗りつぶした四角）、W73A（白抜きの四角）、W56A （星印）、 Rib4C 対野生型4E （塗りつぶした三角）、 RTP 対野生型 4E （塗りつぶしたダイアモンド）、及び m7GTP 対野生型 4E （白抜きダイヤモンド）の、結合に関する適合値。（ｂ）ヌクレオシド／ヌクレオチド:4E結合に関するマイクロモルでの見掛け上の解離定数。（ｃ）多様な濃度のm7GTP 又は RTPと競合させたときにm7G−セファロースに結合したままの4Eのウェスタン・ブロット。（ｄ）m7GTP 及びRTPの両者とも、ほぼ1μmの濃度で結合を50%、低下させる。（ｄ）ケト型のm7G、リバビリン、及びRib4Cヌクレオシドの化学構造。注： +、正の電荷；R、リボース。
【図２】リバビリンは細胞レベル下の4E器質化を特異的に破壊する。（ａ）リバビリン処置NIH 3T3細胞をDAPI（クロマチン）、Nopp140 （カハール体及び核小体）、Sc35（スプライシングのスペックル（原語：speckles）、及び4E （4E 核果粒及び細胞質内 4E）で染色したときの共焦点免疫蛍光顕微鏡写真。（ｂ）リバビリン処置済みNIH 3T3細胞の核内（N）及び細胞質内（C）画分のタンパク質抽出物を、核内及び細胞質内4Eについて、及び主に核内のSc35について、そして分画及び充填のコントロールとして主に細胞質側にあるβ−アクチンについてプローブした場合のウェスタン・ブロット。リバビリン処置により、0.1−1 m MのEC50で核内4E体が特異的に破壊され、細胞質内では4Eが保持される。
【図３】リバビリンは4E:mRNA 結合を特異的に阻害し、核−細胞質間mRNA 輸送を阻害し、輸送調節型のタンパク質のレベルを枯渇させる。（ａ）提示したようにプローブされたリバビリン処置済NIH 3T3細胞の核内及び細胞質内画分のRNA抽出物のノーザン・ブロット。U6 小型の核内 RNA 及び tRNALysを画分の質のコントロールとして役立てる。リバビリンはサイクリンD1の核−細胞質間mRNA輸送を阻害するが、β−アクチンのものは阻害せず、棒グラフによる定量で判断したところほぼ1μＭの見掛けのEC50 を有する（上側の列）。N、核内；C、細胞質内。この効果は定量的リアルタイムPCR （図４ｂ）を用いて確認された。（ｂ）リバビリン処置細胞の全抽出物のノーザン及びウェスタン・ブロットであり、転写、mRNAの安定性、及びタンパク質合成に影響することなく、サイクリンD1が枯渇したことを示した。（ｃ）サイクリンD1についてプローブしたRib4C処置細胞の全タンパク質抽出物のウェスタン・ブロット。（ｄ）リバビリン処置細胞の核から精製された4Eが含有していたサイクリンD1mRNAの準定量的RT−PCR。コントロール試料は4E（+）に特異的な抗体の代わりにIgG抗体（−）を用いて精製された。細胞抽出物からのVEGFの準定量的PCRは上述の通りに免疫精製された。
【図４】（ａ）リボソーム精製画分のRNAプロファイル(A260/A280) と、定量的RT−PCRを用いて測定され閾値周期（CT）を用いて表した場合のそれらのサイクリンD1、GAPDH、ODC、及びVEGF mRNA 含有量。誤差棒は三つの独立した実験の± 1s を表す。1μMのリバビリンによる細胞の処置は、サイクリンD1及びGAPDH mRNAのリボソーム装荷及びmRNAの翻訳開始に対して有意な影響を持たない。CT 値が低いことはmRNA発現量が高いことを示す。nのCT の差は、濃度でn2−倍の差に等価である。サイクリンD1 mRNAの細胞質内レベルはリバビリン処置で低下するが、モノソームに比較してポリソームへのその装荷の効率は影響を受けず、ポリソームへの装荷がモノソームへの装荷に比較して有意に減少するODC及びVEGF mRNAとは対照的であることに注目されたい。（ｂ）定量的リアルタイムPCRを用いて測定したときの、多様な濃度のリバビリンで処置されたNIH 3T3 細胞のサイクリンD1 (赤) 及びVEGF (緑) の核対細胞質（左側）の標準化後の比と全（右側）mRNAレベル。サイクリンD1 mRNAの２倍の核内保持が 0.1 m M のリバビリンで明らかであることに注目されたい。
【図５】4Eについてプローブした、トランスフェクトされたNIH 3T3細胞のタンパク質抽出物のウェスタン・ブロット。（ｂ）焦点形成検定と同じ時間の長さの間、リバビリン処置した場合の、FACSを用いて測定した非透過化NIH3T3 細胞のうちのアネキシンVに結合した（アポトーシス ）ものと、ヨウ化プロピジウムを取り込んだ（ネクローシス）ものの比率（左側の軸）と、フォルマザンの光学密度（OD）を用いて測定したテトラゾリウム染料還元（代謝）の効率（右側の軸）（実施例を参照されたい）。誤差棒は三つの独立した実験の ± 1s を表す。生存度及び代謝に対する有意な効果が観察されたのはリバビリン濃度が100 m M以上であるときであり、これらの高いミリモル濃度でのみ起きる、mRNAの取り込みミスなどのグアノシン経路に対するその有害作用と一致する。（ｃ）透過化NIH 3T3 細胞（左側の軸）のヨウ化プロピジウム結合を用いて測定したDNA含有量のヒストグラムと、非処置細胞（青）及び0.1μMのリバビリン（赤）で処置した細胞の累積確率分散（右側の軸）。 リバビリン処置により、G1相に制限された細胞の比率が58%から91%に増加する。4Eで媒介されるNIH 3T3細胞の発癌性形質転換はリバビリンにより特異的に抑制され、見かけのEC50 は0.1−1 m M となり、G1 細胞周期停止と相関する。
【図６】リバビリンは4E媒介型発癌性形質転換を抑制する。（ａ）（左側）リバビリンで処置し、空のベクタ（黒の点線）、4EWT（青の線）、4E W56A （赤の線）をトランスフェクトしたNIH3T3細胞と、 Rib4C で処置し、4E WT（黒の実線）をトランスフェクトした細胞の固定源依存的焦点形成。誤差棒は三つの個別の実験の +/− 1 シグマを表す。焦点形成の確率（Pfocus）を、形成された焦点数を、プレートした細胞数で除算したものと定義する。（右側）4Eで形質転換させたリバビリン処置細胞のギムザ染色皿の写真。（ｂ）リバビリン濃度の関数とした、AML患者から分離した初代ヒトCD34+骨髄前駆細胞のコロニー形成（M1、実線の丸；M5、実線の四角）及び正常骨髄（BM、白抜きの丸）。リバビリンは4E依存的AML−M5 のコロニー形成をほぼ1μMの見かけのIC50 で減少させるが、この濃度ではM1及び正常骨髄前駆細胞には何の影響もない。データは内部標準化されており、AML骨髄前駆細胞の絶対的コロニー形成効率は BMのそれ（データは図示せず）よりも高いことに留意されたい。誤差棒は四回の独立した実験の +/− 1シグマを表す。（ｃ）（左側）１日当たり１ｋｇ当り40ugの用量で、毎日1uMのリバビリンによる経口処置の関数とした、下咽頭4E依存的腫瘍由来の細胞を移植したヌードマウスにおける平均腫瘍体積（実線の四角）。誤差棒は１０匹のマウスの  +/− 1 シグマを表す。（右側）処置から２０日目語に切除した腫瘍の写真。
【図７】リバビリン及び7G mRNA キャップは4Eによって同様に認識される。（ａ）飽和濃度のm7Gヌクレオシドの非存在下（黒）及び存在下（赤）における4Eの 1H、15N HSQC NMRスペクトル。当該コンストラクトの273残基のうち、207 の共鳴が観察されることに注目されたい。（ｂ）飽和濃度のm7G（赤）及びリバビリンヌクレオシド（青）の存在下での 4Eの1H、15N HSQC NMR スペクトル。（ｃ）リバビリン及びm7GmRNAキャップの結合時の 15N HSQC NMR 化学的シフト摂動を示す（赤）及び示さない（青）4E 骨格残基。ここで観察されるマウス4Eのキャップ結合時と、酵母4Eについて報告されたものとのコンホメーション再編成の違いは、マウス及び酵母タンパク質の違いや、酵母4Eへのミセル結合が原因であろう。
【図８】リバビリンは7−メチルグアノシン（m7G）の物理的模倣体である。減少していく電気陽性及び増加していく電気陰性ポテンシャルに対応した青から赤への色勾配による、グアノシン、m7G、リバビリン, Rib4C、及びチアゾフリン塩基のイソコントア（原語：isocontour）静電的ポテンシャル分子表面及びそれらの化学構造。矢印は芳香環中の７位を示す。R、リボース。
【図９】In vitroでのリバビリンの組換え4Eへの見かけの結合は方法及び条件依存的である。（ａ）以前に公開された通り、20 uL の m7GTP−セファロース （アマーシャム社製）を、0.1 mM GTP を加えた1 ugの 4Eに緩衝液 B (0.3M NaCl、pH 7.5の0.1 M リン酸ナトリウム、10uM の無プロテアーゼBSA [UBS]、0.1% NP−40) に３０分間、室温で混合した。 洗浄後のビーズ（75 ベッド容で３回）を 、示した通りの50 uM の化合物と一緒に３０分間、室温でインキュベートした。ビーズを（75ベッド容で三回）洗浄して解離した 4Eを取り除き、ビーズに結合したままの4EをSDS−PAGEを用いて再溶解させ、ウェスタン・ブロット法及び化学発光法を用いて視覚化した。ここでm7E：4E結合に対するリハビリン競合の特異性を強調するために緩衝液が0.1 mM GTP を含んでいることに注目されたい。さらに、ここで我々は Gerhard Wagner （ハーバード・メディカル・スクール、マサチューセッツ州ボストン）からご厚誼により提供いただいたマウス4EとプロテインGのB1ドメインとの融合体（G4E）を Zhou et al. (2001) 及び Kentsis et al. (2004)に解説された通りに用いたことに注目されたい。（ｂ）Yan et al. (2005)が解説した通り、1 ug の 4E を20 uL の m7GTP−セファロース （アマーシャム社製） に、10 uM 無プロテアーゼ BSA (UBS)、0.1% NP−40、及び0.1 mMGTPを補った５０ベッド容の LCB緩衝液 （pH 8.0の10 mM HEPES、100 mM KCl、pH 8.0の0.2 mM EDTA）に２０分間、実験温度は記載されていないためにおそらくは4oCで、混合した (Yan et al. 2005)。洗浄後のビーズ （50 ベッド容のLCB緩衝液で５回）を、示す通りの５ベッド容の50 uM の化合物と一緒に２０分間、4oCでインキュベートした。次に、解離した4Eを含有する20 uL の上清を新しい試験管に移し、結合した4Eを含有する微量のビーズを除去し、SDS−PAGEを用いて再溶解させ、ウェスタン・ブロット法及び化学発光法を用いて視覚化した。
【図１０】In vitroにおける精製済み4Eへのリバビリンの特異的結合の直接的観察。陽イオンモードで作動させた、アジラント・テクノロジー（原語：Agilent Technologies）1100 LC/MSD を一体化した液体クロマトグラフィ単一四重極子電気スプレー・スペクトロメータ (ES−MS) を用いて質量スペクトルを記録した。20 uM の精製済み G4E (Zhou et al. 2001; Kentsis et al. 2004) の溶液を、80 uM リバビリン（カルバイオケム社）及び80 uM GTP （シグマ社）を 5% 水性アセトニトリル、20mM 酢酸アンモニウム（pH 6.5）に加えた混合液と一緒にして１分間、室温でインキュベートした。この溶液を、20 psiのネブライザ圧、200oC及び 10 L/分の乾燥窒素ガス、4.5 kVの毛管圧を用いて直接、200 mL/分で電気スプレーした。  （ａ）質量／電荷の比の関数とした場合の、上記の混合物20uL中のイオン発現量のES−MS スペクトル・プロッティング。ほぼ 1740 amu/z のイオンが標識されており、apo−G4E （高い方のピーク）及びリバビリンのG4E （低い方のピーク）との複合体の+18プロトン化状態に相当する。（ｂ）上記のスペクトルのハイパーマス（原語：Hypermass）再構築を標準的な方法 (De Hoffmann and Stroobant 2001) に従って行うと、31,402及び31,649 Daという二種の集団重量平均分子量を含有しており、それぞれ1:1の分子化学量論でリバビリン（243Da)に結合したapo−G4E 及びG4E に相当する。リガンド結合は折り畳まれた形の、より天然に近い、従ってイオン化可能性の低い状態で起きる(De Hoffmann and Stroobant 2001)という、apo− 結合型及びリガンド結合型種のイオン化効率に違いがあるために、総イオン化4Eの僅かに一部しかリバビリンに結合しなかったようであることに注目されたい。このように、質量分析データから親和性を得ることには、イオン化におけるこれらの違いが混戦してくる。比較のために、4E-リバビリンには 8.4uM 、そして 4E-RTPには 0.13 uMというK’dを、m7−グアノシン及びm7GTP について以前に観察されたそれらの違いと平行する蛍光分光法(Kentsis et al. 2004)を用いて得た。
【図１１】4Eは、U2OS 又は HEK293T 細胞の核内画分のサイクリンD1 mRNAとは結合するが、GAPDHmRNA とは結び付かない。（ａ）U2OS全細胞ライセートを、コントロールとして4E 抗体又はマウス免疫グロブリン(IgG) で免疫沈降（IP）させた。RNAを示した通りの RT−PCR で検出した。Tot は投入したRNAの0.5%を表す。（ｂ）U2OS 核ライセートを4E (mAb 4E)、PML (mAb PG−M3)、又はマウスIgGに対する抗体を用いて免疫沈降させた。RNase A は陰性コントロールとしてIP前の処置を示す。Total及び核 (nc) は RNA 投入量の5%を表す。（ｃ） U2OS核ライセートを、4EWT− GST及び変異 (W56A 及びW73A) 融合タンパク質によるSNAAP 分析にかけた。GSTのみは陰性コントロールとして用いられた。結合したRNAをRT−PCRで検出した。Nc は示した通り、投入量のパーセンテージを表す。A-C についてのRT−PCRは臭化エチジウム染色で検出された。（ｄ）キャップ依存的に関するコントロールとして、50 uM の7GpppG キャップ類似体又は50 uM GpppG 陰性コントロールの添加による4E結合をめぐる競合能をHEK293T 細胞の核内画分中で調べた。示した通りの処置後のサイクリンD1及びGAPDH mRNA の4E免疫沈降能は、準定量PCRで観察された（ｅ）Ａ-Ｃでの実験に対する平行RT−PCR法により、4EがサイクリンD1にキャップ依存的態様で選択的に結合することを示した上記の結果が裏付けられた。相対的な倍数値はサイクリンD1及びGAPDH mRNAの両方に関する物質及び方法で解説する通りに計算された。（ｆ）K562 核ライセートを4E (mAb 4E)、CBC (pAbCBP80)、又はマウス IgGに対する抗体を用いて免疫沈降させた； nc はRNA投入量の5% を表す。（ｇ）4E 及び CBP 抗体又はマウスIgG による免疫沈降で出たタンパク質をウェスタン・ブロット法 (WB)で分析した。白線は介在するレーンがスプライスで切り出されたことを示す。
【図１２】サイクリンD1は4E 核小体の下位集団と共局在するがGAPDH mRNAはする。（ａ）サイクリンD1 mRNA のPML 及び4Eタンパク質の共局在をU2OS又は NIH3T3 細胞で分析した。サイクリンD1 mRNA をin situ ハイブリダイゼーションにより、サイクリンD1に対して、ジゴキシゲニン標識した、ニック翻訳プローブ（赤）で検出した。その後、細胞を、FITC に直接結合させた4E mAb （緑）及びPML mAb 5E10 （青）を用いて免疫染色した。（ｂ）Ａと同じに、しかし例外としてGAPDHに対するジゴキシゲニン・ニック翻訳プローブをin situ ハイブリダイゼーションに用いた。これらのパネル内で、同じ顕微鏡写真の中の異なる組合せを重ねたものを示すことで、サイクリン D1 mRNAの 4E核小体との局在を強調している（矢印を参照されたい）。（ｃ） サイクリン D1 mRNAのin situハイブリダイゼーション及びサイクリン D1−/− 細胞内の4Eタンパク質の免疫染色を上述した通りに行った。（ｄ） HEK293T 細胞は、他の細胞種で観察されるのと同様なサイズ、数及び形態の4E小体を含有する。細胞を4Eに対するpAbで染色した(Morleyand Pain, 1995)。 mAb 4E で染色すると同一の結果が出た（図示せず）。全てのパネルについて、共焦点顕微鏡写真は細胞の平面を通る単一の光切片を表す。
【図１３】4Eはサイクリン D1 RNAの核−細胞質輸送を促進した。（ａ）核（n）及び細胞質（c）画分を、4E WT、4E 変異体（W56A 及びW73A）又はPMLを安定にトランスフェクトしたNIH3T3細胞から単離し、RNAをノーザン・ブロット（NB）で示した通りに検出した。U6snRNA(核) 及び tRNALys (細胞質) を分画の質のマーカとして用いた。（ｂ）Aの通りにトランスフェクトしたNIH3T3細胞から単離された全RNAのノーザン・ブロット分析。A及びBにおける臭化エチジウム染色ゲルは単離されたRNAの品質を実証するものである。（ｃ）4EでmRNA輸送が促進されると対応するmRNAのタンパク質レベルが上方調節される。提示したようにトランスフェクトしたNIH3T3 細胞からの全細胞ライセートをウェスタン・ブロット法（WB）によりタンパク質含有量について分析した。（ｄ）準定量的PCRは、4Eの過剰発現はサイクリンD1 mRNAの 安定性を変えないことを示す。Act Dは、アクチノマイシン処理の時間を示す。右側のパネルは RT−PCR で用いられたRNA量が次第に減少していることを表しており、条件が準定量的であることを示している。（ｅ）変異型及び野生型 4E タンパク質はそれでも尚、核小体を形成する。Xpress−タグ付き4E 野生型 又は W73A 変異体を発現するNIH3T3細胞を抗Xpress 抗体で染色して外因性4E(赤) を検出するか、あるいはFITC(緑)に直接結合させた mAb 4E で染色して内因性及び外因性の両方のタンパク質を検出した。共焦点顕微鏡写真は細胞を通る単一の光切片を表す。
【図１４】4EはサイクリンD1の 3’UTR からの4ESEと特異的に結合する。（ａ）この研究で用いたキメラ・コンストラクトの概略図。ヒトサイクリン D1mRNA完全 5’ 及び 3’UTR 並びに異なる部分の3’UTRをそれぞれLacZの上流又は下流にクローニングした。数字はサイクリン D1 mRNA中のUTR断片の位置を表す。（ｂ）NIH3T3 細胞にUTR−LacZ、LacZ−3’UTRを含有するキメラLacZコンストラクト、あるいは、サイクリン D1 3’UTRの様々な部分のを持つLacZコンストラクトを一時的にトランスフェクトした。トランスフェクト後の細胞の核内画分をmAb 4Eで、又はコントロールのためにマウスIgG で免疫沈降させた。LacZ 及び B−アクチンを準定量的RT−PCR及び臭化エチジウム染色法（左側）で検出した。Nc はIP前の核内画分を指し、そして核mRNAの5%の投入量である。RT−PCR法（右側）については、相対的な倍数値濃縮がIP 4E 画分対IP IgG 画分について示されており、 LacZの濃縮がIPの4Eの3’UTRにあるのが分かる。）（ｃ） ClustalW (Thompson et al., 1994)からの サイクリン D1 4E−SE の配列アライメント。GenBank/EMBL/DDBJ登録番号は：ヒトgi: 16950654、マウス gi:6680867 及びラット gi: 31377522である。ニワトリのGenBank/EMBL/DDBJ 登録番号はEnsembl データベースによればgallus Gallus|5.14792937−14795000 及び gi: U40844である。
【図１５】4E−SEは4E−媒介型mRNA輸送にとって充分である。4E−2Flag 及びキメラ LacZ コンストラクト（示した通り）を同時トランスフェクトしたNIH3T3細胞の 核（n）及び細胞質（c）から精製したPolyA RNAを（ａ）準定量的 RT−PCR 及び臭化エチジウム染色法（左側）又は（ｂ）ノーザン・ブロット法（NB）で分析した。（ｃ及びｄ）4E又は W56A 4E とキメラLacZ コンストラクト（示した通り）を同時トランスフェクトしたHEK293T細胞からの核（n）及び細胞質（c）画分から精製されたpolyARNAのノーザン・ブロット分析。polyA RNA精製前に採取された対応するアリクォートは分画の質を示す。
【図１６】4E−SE の存在は LacZ タンパク質レベルの増加と相関する。（ａ）4E−2Flag コンストラクト及び示したキメラLacZ コンストラクト又はPML、4E−2Flag、及びキメラ LacZ コンストラクトを一時的にトランスフェクトしたHEK293T細胞からの全細胞ライセートのウェスタン・ブロット（WB）によりタンパク質レベルを分析した。HEK293T 細胞が4E 核小体を有することに注目されたい（図１３ｃ）。（ｂ）提示したように同時トランスフェクトしたHEK293T細胞の全RNAのノーザン・ブロット（NB）分析。全RNAのいずれも、いずれのトランスフェクションでも変化しないことに注目されたい。（ｃ）準−Q PCR 分析は、4E−SE が存在しても LacZ mRNAの安定性が検出可能なほどには変化しないことを示す。Act DはアクチノマイシンDで処置後の時間を示す。GAPDHを充填コントロールとして示した。
【図１７】4E−SE は4E 媒介型の発癌性形質転換に寄与する。（ａ） サイクリン D1−/− 細胞に4Eを安定にトランスフェクトするか、あるいは、3'UTRのないサイクリン D1コンストラクトのコーディング領域（cycTrunc）、完全長3'UTRのあるサイクリン D1のコーディング領域（cycFull）、及び、100 nt 4E−SEだけのあるサイクリンD1のコーディング領域(cyc4E−SE)のいずれかと一緒に同時トランスフェクトし、固定源依存的焦点形成検定について分析した。三つの個別の実験が三重にして行われ、誤差棒は+/− SDを指す。焦点の数は100%に設定したベクタ・コントロールに対して相対的な数値である。（ｂ）提示した通りに安定にトランスフェクトしたサイクリン D1−/− 細胞から採った全細胞ライセートのウェスタン・ブロット分析（WB）は、3’UTR配列を欠く切断型に比較して完全長3’UTR 又は 4E−SE を含有するコンストラクトをトランスフェクトした細胞におけるサイクリンD1タンパク質レベルの増加を示している。（ｃ）サイクリン D1−/−細胞において内因性4Eを用いた定量的RT−PCR実験の結果。核(N)/細胞質 (C) サイクリン D1 mRNA の相対比は、相対的標準曲線法によるRT−PCR を用いて判定された。数値はその比率を任意に1に設定することにより CycFull に標準化された。標準的な方法を用いてこれらの実験からのSDを伝播した。
【図１８】mRNA輸送の促進は 4E感受性ターゲットのタンパク質レベル上昇に対応する。（ａ）核内Eに結合したmRNAの相対的な倍数値による差。 mRNAを未処置ライセート又はm7GpppG 又は GpppG (50mM)で処置したものから免疫沈降させた。数値は相対的な倍数±sd （1に設定した未処置IP IgGに対して標準化したもの）を表す。倍数の計算は相対標準曲線法を用いて行われた（ユーザ会報#2ABI Prism 7700）。標的mRNA=10[C(t)−b]/a の相対量が各PCR反応毎に判定された。平均値±sdを三重試験の各組毎に計算した。IPについて得られた平均値（即ち、IP−された標的RNAの平均相対量）を、5%の核内投入量について得られた数値（即ち、IPに用いた核抽出物の量の5%中に存在する標的mRNAの平均相対量）で除算した。得られた数値±sd（即ち、 avIP/av5%核）を、「未処置IgG IP」 値を1に設定することにより標準化した。Ｂ＆Ｃ）4E によるmRNA輸送の促進があると対応するmRNAのタンパク質レベルの上方調節がある。提示した通りにトランスフェクトしたU937 (b) 又は NIH3T3 (c) 細胞から採った全細胞ライセートを、ウェスタン・ブロット法によりタンパク質含有量について分析した。ヒトPMLを過剰発現させたパネルcでは、 5E10 mAb PML 抗体はヒトPMLのみを認識し、内因性マウスPMLは認識しないことに注目されたい。
【図１９】4E核小体のジップコード（原語：zipcode）として作用する4E−SEの普通の二次構造。（ａ）RNaseマッピング実験で判定した場合の サイクリン D1 4E−SE (c4E−SE) 及びPim−1 4E−SE (p4E−SE) の二次構造。 A 及びU ヌクレオチドの保存された組(UX2UX2A) を黄色で強調した。（ｂ）は試料ゲルを示す。（ｃ）p4E−SEのマッピング：p4E−SE は 4E で免疫沈降する（上側のパネル）；4E は模倣p4E−SEを含有するLacZ mRNA の輸出を促進する（下側のパネル）。細胞質／核 (c/n) 数値は1に設定したLacZ コントロールに標準化した相対倍数±sdを表す。（ｄ） LacZ−p4E−SE、LacZ−c4E−SE 又は LacZ 転写産物の PML 及び 4E タンパク質との共局在をLacZ/LacZ−4E−SEをトランスフェクトしたU2OS細胞で調べた。LacZ mRNAは、LacZに対するビオチン標識済みニック翻訳プローブ（赤）によるin situ ハイブリダイゼーションを用いて検出された。次に細胞を、FITC（緑）に直接結合させた4EmAb及びPML mAb 5E10 （青）を用いて免疫染色した。重要なことに、サイクリン D1 又はPim−1 のいずれかを由来とする4E−SEを含有するLacZ mRNAは4E核小体に共局在した（矢印を参照されたい）。内因性サイクリン D1 mRNAについて我々が以前に示したように、4E核小体には、LacZ mRNAと共局在するものと、 PMLと共局在するものという、二つの集団がある。倍率は 100X 及び 3x ( LacZ 及び c4ESE) 又は 4x (p4ESE) デジタル・ズームである。スケール棒 = 10mM。
【図２０】4E−SE は4E依存的複合体の形成に必要である。（ａ）及び（ｂ）EMSA 分析は、サイクリン D1 4E−SE (c4E−SE) 又はPim−1 4E−SE (p4E−SE) のいずれかを含有するLacZ転写産物は核ライセート(nc)の存在下で高分子量の複合体を形成したことを示す。4E−SEのないLacZ 転写産物（コントロール）はこれらの複合体を形成しなかった。精製済みマウス 4E を6kDの可溶性タグ (m4E) 又はタグの付いていないヒト4E (h4E) と一緒に添加すると、ncライセートで観察されるシフトに対する相対的な部分的シフトが起きる。4Eを免疫枯渇させた核ライセート（dpl nc）では、ゲルのシフトは観察されなかった。これらの複合体は抗4E抗体によりスーパーシフトしたのかも知れない (nc+a4E)。（ｃ）Pim−1 4E−SE (p4E−SE) を変異させるとゲル・シフトの効果が低下する。（ｄ）ＵＶ架橋研究では、75−90kD 質量範囲の特異的な複合体の形成が示された（矢印で示す）。これらの複合体は過剰量の m7GpppGcap (cap) の存在下か、あるいはライセートから4Eが免疫枯渇している場合(dpl nc)には、特異的に枯渇する。* はキャップであり、かつ4E−SE独立である複合体を指す。（ｅ）p4E−SE複合体に対応するリボ−オリゴヌクレオチドを核ライセートの存在下で添加すると、この要素は複合体形成をめぐって効率的に競合することができることを示す。転写産物はすべてキャップされており、3’末端が標識されている。
【図２１】4E−SE 含有mRNAの輸出は、続行中のRNA及びタンパク質合成からは独立であり、この経路は過剰量の4E−SEで飽和する。（ａ）4E過剰発現細胞におけるLacZ−c4E−SE 及びLacZ のmRNA輸出の定量的リアルタイム PCR 分析を示す。細胞質／核(c/n) 値は、1に設定されたLacZ未処置コントロールに標準化した相対的な倍数±sdを表す。処置：アクチノマイシンD(10mg/ml)を１時間；シクロヘキシミド (100mg/ml) を１時間。（ｂ）及び（ｃ） LacZ mRNA 輸出を、時間と、ドキシサイクリンにより誘導されたLacZ転写産物−/+ 4E−SEの発現、の両方の関数として観察した。時間の関数としての発現を示す。平行して、輸出の程度を各場合についてc/n mRNA の比率として観察した。実線はLacZ−c4E−SEを発現している細胞での傾向を表す；点線は LacZ−p4E−SEを発現している細胞についてである。同じ試料を由来とする内因性mRNAも調べた。サイクリン D1mRNA輸出はLacZ−c4E−SE 又は LacZ−p4E−SEのいずれかを発現している細胞で減少していた。重要なことに、4E−SEを含有しないVEGFはいずれの場合でもその輸出に影響を受けていなかった。明らかに、細胞内で4E−SE含有mRNAの量が増すにつれ（C）、これらを輸出する能力は減少する。なぜなら4E−SE 依存的輸出が飽和したからである（ｂ）。c/n値は各時点についてのみLacZを標準化した、相対的な倍数±sdを表す。全RNAの場合、数値は、1に設定された、各転写産物の初回の誘導時点（４時間）について標準化した、相対的な倍数±sdを表す。各時点について得られたLacZ mRNA の平均値は、同じ試料について得られたGAPDH mRNA 値により正規化された。
【図２２】4E依存的な輸出はNXF1独立的及びCRM1依存的である。（ａ）NXF1IP 画分内のLacZ mRNAの比較。細胞にFlagNXF1/Flagp15 及びLacZ 又は LacZ−c4E−SEを同時トランスフェクトした。抗Flag抗体で免疫沈降を行った。LacZ/LacZ−c4E−SE mRNA をリアルタイムPCR で観察し、IgGコントロールに正規化した（図１８ａで解説した通り）。（ｂ）NXF1 siRNA 処置（７２時間）により、LacZ の輸出は阻害されるが、LacZ−c4E−SE含有RNAの輸出は阻害されない。4Eを過剰発現する LacZ 又は LacZ−c4E−SE mRNAのc/N比をsiRNA 処置の関数としたものを示す。C/N値は、1設定された、LacZ 未処置コントロールに正規化した相対的な倍数±sdを表す。 LacZ mRNAレベルを、そのc/n比がNXF1 siRNA の影響を受けない18S rRNAに正規化した。（ｃ）ウェスタン・ブロット（WB）分析は、 NXF1 タンパク質レベルが siRNA処置では減少するがスクランブルしたコントロール(DS (−コントロール))では減少しないことを示している。eIF4G のWBを陰性コントロールとして示す。LacZ タンパク質レベルはパネルbに示すmRNA輸出中の変化に対応する。（ｄ）レプトマイシンB(LMB)に対する4E−SE輸出の依存度。4E過剰発現U2OS 細胞中のLacZ−c4E−SE mRNA は、4E−SE 輸出は LMB (10ng/mlを４時間)に対しては感受性であるが、LacZ はあまりそうでなかったことを示した。18S rRNA 輸出は予想通りLMBによって阻害されたが、β−アクチンmRNA 輸出は予想通り、LMB 処置の影響を受けなかった。C/N値は、1に設定した、LacZ 未処置コントロールに正規化した相対的な倍数±sdを表す。全てのRNAを GAPDH mRNAに正規化した。
【図２３】様々なクラスのRNAの輸出機序の概略図。CRM1又はNXF1/p15 経路を通じたmRNAの特徴的な線形輸出の概観を 4E 媒介型のmRNA輸出の特徴と一緒に示す。
【図２４】4E RNAレギュロンのモデル。（ａ）核内コンパートメントは灰色の陰を付けてある。核の両方のキャップ結合タンパク質で、4E 及びキャップ結合複合体CBC を示す。バルクmRNA輸出はCBCに結合したmRNAにより描かれており、NXF1 依存的経路で核を出るところである。mRNAは黒線で描かれており、黒色の球は5’ m7Gキャップを表す。4E−SE（緑色で）の付いたmRNAはCRM1 依存的態様で輸出され得る。いったん細胞質内に入ると、高度な構造を持つ5’ UTR （赤で示す） の付いたmRNAは4E 依存的な態様で優先的に翻訳される。着色した四角は部分Bで示した制御レベルに相当する。（ｂ）レギュロンの概略図であり、正しいUSERコードの存在に応じて、mRNA輸出及び翻訳に対して4Eが影響を与えることを示している。各調節レベルについてRNA例を示す。その下に、細胞調節物質例を示す。最後に、レギュロン内のあるステップを調節する化合物を示す。多くのRNAが各カテゴリーに入り、また多くの他の調節物質及び化合物が各制御ステップに存在するであろうが、明晰性のために例を挙げるのみにした。更に、この図中の調節物質及び化合物の位置は、これらが細胞内で有するかもしれない他の無関係な活性を除外するわけではなく、4Eレギュロンにおける現在公知のそれらの役割に単に言及したものである。
【図２５】図２５は、エストロゲン受容体（ER）、プロゲステロン受容体（PR）、上皮成長因子受容体（EGFR）、Her2、及び4EについてAQUAスコアを用いて行われた、乳癌におけるタンパク質発現レベルの教師なし階層的クラスタ分析を示す。更なる詳細については、実施例５を参照されたい。
【図２６】図２６は、141体の初代乳癌から抽出されたバルク腫瘍RNAに対し、AffymetrixU133 プラス 2.0 アレイ （アンドレア・リチャードソン・ダナ−ファーバー・カンサー・インスティテュート）で行われた発現解析を示す。本解析は dChipソフトウェアの階層的クラスタ機能を用いて 行われた。表示された遺伝子は、4Eを高度に発現させた腫瘍（平均より２倍を越えて高い）と低度に発現させたもの（平均の２分の１よりも下）の間で示差的発現を見せた（信頼度90%で少なくとも１．５倍）ものである。
【図２７】図２７は、4Eの発現上昇があるとAkt1や下流のエフェクタの活性が変化することを示す。（A）4E wt過剰発現MEF Akt1 wt での変異細胞、及び −/− 株からの全細胞抽出物のウェスタン・ブロット分析。検出されたタンパク質は示した通りである。β−アクチンはタンパク充填コントロールとして示した。（Ｂ）PI3K 阻害剤、LY294002 (LY; 50μM を１時間)で処置したMEF Akt1 wt 由来細胞からの全細胞抽出物のウェスタン・ブロット分析。検出されたタンパク質は示した通りである。GAPDH をタンパク質充填コントロールとして示した。
【図２８】図２８は、Akt 1 が血清枯渇細胞の4E媒介型アポトーシス救出に必要であることを示す。図示のパネルは MEF Akt1 wt 及び−/− 株を由来とする4E過剰発現細胞のTUNEL実験（青-DAPI （生命力あり）、赤-アポトーシス性；材料及び方法の項を参照されたい）からの代表的フィールドである。尺度棒は50μmに設定されている。グラフは、提示した細胞のアネキシンＶ（Ann.V）及びヨウ化プロピジウム（PI） 染色を用いたアポトーシスのフロー・サイトメトリによる定量的測定を表す（材料及び方法の項を参照されたい）。棒の色は以下の通りである：Ann.V− / PI− (青)、Ann.V+ / PI− (黄)、Ann.V+ / PI+ (赤)、Ann.V−/PI+ (黒)。5% 以内の誤差（データは図示せず）。 NC-正常な条件、SS-血清枯渇。
【図２９】図２９は、Akt1が存在しなくとも、報告された感受性RNAターゲットの4E依存型核−細胞質輸送は妨げられないことを示す。（Ａ）MEF Akt1 wt 及びAkt1−/− 由来細胞で得た平行リアルタイムＰＣＲ実験からのRNA定量により、NBS1、サイクリン D1 （4E依存型 mRNA 輸送の陽性コントロール） 及び VEGF （陰性コントロール）mRNAsの細胞質／核比の相対的な倍数増加（y−軸）を示す。下の示すのは、試料画分 (U6 SnRNA- 核、tRNAlys-細胞質)のコントロールである。（Ｂ）NBS1、サイクリン D1 又は VEGF RNAの総レベルを示すコントロール実験であり、下に示すウェスタン分析では、タンパク質発現レベルの変化を示している。棒による表現は提示した通りである。細胞質 / 核比は相対的な倍数差を表す。1に設定されたベクタ・コントロールに正規化したSD。分析した全てのmRNAの平均値をGAPDH mRNA 値に正規化した。
【図３０】図３０は、4EによるAkt1経路の上方調節にはNBS1発現が必要であることを示す。（Ａ）siRNA処置 MEF Akt wt 由来細胞からの全細胞抽出物のウェスタン・ブロット分析；scram = スクランブルしたコントロール、siNBS1 = NBS1の siRNA で処置した細胞からの抽出物。検出されたタンパク質は提示した通りである。β−アクチンをタンパク質充填コントロールとして示した。（Ｂ）siNBS1 処置Akt1 wt 由来細胞（ベクタ対 4E）のアポトーシス検定(Ann.V− / PI−)からの生存細胞の定量。誤差は10%以内だった。NC-正常条件、SS-血清枯渇。（Ｃ）TUNEL実験からのsiNBS1 処置Akt1 wt 由来細胞（提示した通り）アポトーシスの視覚的確認（パネル: 青-DAPI （生存）、赤-アポトーシス）。尺度は50μmに設定されている。
【図３１】図３１は、4E阻害剤であるPMLが過剰発現すると4E-Akt1 経路が破壊されるが、他方、PML RING 変異体はこれらの4E依存的活性を阻害しないことを示す。（Ａ）4E wt/W73A 及び／又は PML/RINGを過剰発現している安定にトランスフェクトしNIH3T3細胞からの全細胞抽出物のウェスタン・ブロット分析。検出されたタンパク質は提示した通りである。PML 検出に用いた抗体のみが外因性PMLに結合することに留意されたい。β−アクチンをタンパク質充填コントロールとして示す。（Ｂ）NIH3T3 由来細胞からの4EターゲットmRNAの細胞質／核比の相対的な倍数増加（y−軸）を示す平衡qPCR実験。棒の表現は提示した通りである。
【図３２】図３２は、4E阻害剤であるPMLが4E依存的アポトーシス救出からPMLのRINGドメインを通じて細胞を抜け出させることを示す。（Ａ）棒グラフは、提示したNIH3T3由来細胞のアネキシンＶ（Ann.V）及びヨウ化プロピジウム（PI）染色を用いた、アポトーシスの定量的測定を表す。棒の色は以下の通りである：Ann.V− / PI− (青)、Ann.V+ / PI− (黄)、Ann.V+ / PI+ (赤)、Ann.V−/PI+ (黒)。誤差は5%以内だった（データは図示せず）。NC-正常条件、SS-血清枯渇。（Ｂ）TUNEL実験からのアポトーシスの視覚的確認（パネル：青-DAPI、赤-アポトーシス）。尺度棒は50μmに設定されている。
【図３３】図３３は、4EがPI3K-AKT 経路の下流である（左側）だけでなく、このPI3K-Akt 軸をNBS1を通じて調節できること（右側）をまとめた比較モデルを示す。更に、Aktのいくつかの下流ターゲット（例えばサイクリン A2、B1、D1、E；Mdm2、及びc−Myc) はmRNA輸送レベルで4E調節のターゲットでもあり、推定上のフィードバック・ループが考えられる。簡略化するために、矢印は下流の効果（例えばリン酸化）を示すものであり、従って矢印は必ずしも単一ステップのプロセスを示すものではない。黄色の四角で囲んだものは、Akt経路でやはり役割を果たす4E輸送活性に対して感受性のある公知の下位集団のmRNAのうちのいくつかである。
【図３４】図３４は4Eレギュロンの成分を示す。
【図３５】図３５及び３６は、Aktのリン酸化がAktの活性に必要であることを示す。リバビリンはAktリン酸化を阻害するが、他方ラパマイシンはAktリン酸化を増加させる。
【図３６】図３５及び３６は、Aktのリン酸化がAktの活性に必要であることを示す。リバビリンはAktリン酸化を阻害するが、他方ラパマイシンはAktリン酸化を増加させる。
【図３７】図３７は、リバビリンは4E媒介型アポトーシス救出を遮断すること、そしてラパマイシンは4E媒介型アポトーシス救出に対するリバビリン効果を部分的に阻害することを示す。
【図３８】図３８は、培養で成長させ、タンパク質抽出物の調製及びウェスタン・ブロット分析の４８時間前にリバビリンで処置したFaDu細胞上の4E、アクチン、NBS1、サイクリン D1及びODCのたんぱく質レベルに対するリバビリンの効果を示す。
【００２７】
詳細な説明
Ａ．  定義
便宜上、本明細書、実施例、及び付属の請求項で用いたいくつか用語をここに集める。そうでないと定義しない限り、ここで用いられた全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。
【００２８】
用語「4Eレギュロン活性」又は「4Eレギュロン成分活性」又は「4Eレギュロン成分の活性」とは、4Eレギュロンの媒介物質のとしての4E活性を言い、その中には、4Eレギュロン成分の4Eレギュロン活性化、発現、輸送及び／又は活性も含まれる。
【００２９】
用語「4Eレギュロン成分」とは、4E、そのレギュロンの成分のいずれか、及び、HuRなど、レギュロンのいずれかの修飾物質を言う。4Eレギュロンを図２４及び３４に描写する。4Eレギュロン因子の例には：
eIF4E (gi: 54873625)； サイクリン D1 (gi: 77628152； NBS/ニブリン (gi: 67189763)；Pim−1 (gi: 31543400)；サイクリン B1 (gi:
34304372)；サイクリン A2 (gi: 16950653)；ODC (gi: 4505488)；VEGF (gi: 71051577)；Skp2 (gi: 16306594, 16306593)；サイクリン E1 (gi: 17318558)；c−myc (gi: 71774082)；FGF2 (gi: 153285460)；MMP−9 (gi:
74272286)；mdm2 (gi: 46488903)；カスパーゼ−9 (gi: 14790123, 14790127)；bcl2 (gi: 72198188, 72198345)；Bcl/xL (gi: 20336334)；Fbox1 (gi: 16306583)；CGGbp1 (gi: 56550052)；P54nrb/NONO.1 (gi: 34932413)；セレノプロテインS (gi: 45439347)；eIF4E−BP1 (gi: 117938308)；Akt1 (gi: 62241012, 62241010, 62241014)；PI3K (gi: 54792081, 212377724)；GSK3B (gi: 21361339)；HuR (gi: 38201713)；及びmTOR/FRAP1 (gi: 19924298)がある。以下に記載の方法のいくつかで用いるのに好適な4Eレギュロン成分（因子）は 4E、4E−BP1、NBS/ニブリン、Pim−1、VEGF、サイクリン D1、サイクリン A2、ODC 及び HuRである。「レギュロン」とは、そのスプライシング、輸出、安定性、局在及び／又は翻訳を調和及び制御する一種以上のmRNAにより配列特異的な態様で調和的に調整される複数のmRNAの一ファミリーである。冠詞「一つの（原語：”a”）」及び「一つの（原語：”an”）」は、ここでは、その冠詞の文法上の目的語の一つ又は二つ以上（即ち少なくとも一つ）を言うために用いられている。例を挙げると、「一つの因子」とは一つの因子又は二つ以上の因子を意味する。
【００３０】
ここで用いられる場合の用語「アゴニスト」とは、あるタンパク質の生物活性を模倣又は上方調節する（例えば増強する又は補充する）作用物質を言うことが意図されている。アゴニストは、野生型タンパク質であっても、又は、野生型タンパク質の少なくとも一つの生物活性を有するその誘導体であってもよい。更にアゴニストは、ある遺伝子の発現を上方調節する、あるいは、あるタンパク質の少なくとも一つの生物活性を増す、化合物であってもよい。またアゴニストは、あるポリペプチドの別の分子、例えば標的ペプチド又は核酸など、との相互作用を増す化合物であってもよい。
【００３１】
ここで用いられる場合の「アンタゴニスト」とは、あるタンパク質の少なくとも一つの生物活性を下方調節する（例えば抑制する又は阻害する）作用物質を言うことが意図されている。アンタゴニストは、タンパク質と、例えば標的ペプチド又は酵素基質など、別の分子との間の相互作用を阻害する又は減少させる化合物であってもよい。更にアゴニストは、ある遺伝子の発現を下方調節する、又は、現存する発現タンパク質の量を減少させる、化合物であってもよい。
【００３２】
ここで用いられる場合の用語「抗体」には、例えばいずれかのアイソタイプ(IgG、IgA、IgM、IgE、等)などの全抗体が含まれるものと意図されており、その中には、哺乳動物などの脊椎動物のタンパク質と特異的に反応性である断片が含まれる。抗体は従来技術を用いて断片化することができ、この断片を、全抗体について上述したのと同じ態様で実用性についてスクリーニングすることができる。このように、この用語には、特定のタンパク質と選択的に反応することができる抗体分子の、タンパク質分解させた、あるいは組換えにより調製された、部分のセグメントが含まれる。このようなタンパク質分解による、及び／又は組換えによる断片の非限定的な例には、Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、及び、V[L] 及び／又は V[H] ドメインをペプチド・リンカにより接合して含有する一本鎖抗体（scFv）が含まれる。scFvのものを共有結合により、又は非共有結合により連結して、二つ以上の結合部位を有する抗体を形成してもよい。当該の発明には、抗体及び組換え抗体のポリクローナル、モノクローナル、又は他の精製済み製剤が含まれる。
【００３３】
用語「結合する」とは、例えば生理条件下の静電的、疎水的、イオン的及び／又は水素結合相互作用により本発明のポリペプチドと結合相手との間など、2つの分子間の安定な結合であってもよい結合を言う。
【００３４】
交換可能に用いられている「生物活性」又は「対生物活性」又は「活性」又は「生物学的機能」とは、あるポリペプチド（天然又は変性したコンホメーションであるかに関係なく）又はそのいずれかの下位配列によって直接又は間接的に行われるエフェクタ又は抗原性機能を言う。生物活性には、ポリペプチドへの結合、他のタンパク質もしくは分子への結合、DNA結合タンパク質としての活性、転写調節物質としての活性、損傷したDNAへの結合能、リン酸化状態等、が含まれる。対生物活性は、当該のポリペプチドに直接影響を与えることにより、調節され得る。代替的には、対生物活性は、例えば対応する遺伝子の発現を調節するなど、当該タンパク質のレベルを調節することによっても、変更し得る。
【００３５】
ここで用いられる場合の用語「生物試料」又は「試料」とは、生物から、又は生物の成分（例えば細胞）から、得られる試料を言う。試料はいずれの生物組織又は流体のものであってもよい。しばしば、試料は、患者を由来とする試料である「臨床試料」であろう。このような試料には、限定はしないが、痰、血液、血球（例えば白血球）、組織又は精針生検試料、尿、腹腔液、及び胸膜液、又はこれら由来の細胞がある。生物試料には、更に組織学的目的に採取された凍結切片など、組織切片も含まれよう。
【００３６】
「コンビナトリアル・ライブラリ」又は「ライブラリ」とは、「メンバー」と呼ばれることもある複数の化合物であり、当該ライブラリ中の各反応において同じ又は異なる反応物質又は反応条件を用いることで一種以上の開始材料から合成又は調製されるものである。概略的には、ライブラリのメンバーは少なくとも何らかの構造上の多様性を示し、その結果しばしば化学的多様性も生じている。ライブラリは、２種の異なるメンバーから約108種のメンバー以上まで、をどこかに有するであろう。いくつかの実施態様では、本発明のライブラリは約12種、50 種及び90 種のメンバーを有する。本発明のいくつかの実施態様では、開始材料及び反応物質のうちのいくつかは同じであり、このようなライブラリの化学的多様性は、ライブラリの調製中、反応物質又は反応条件の少なくとも一つを変更することにより、達成される。本発明のコンビナトリアル・ライブラリは溶液中に調製されても、又は固相上に調製されてもよい。
【００３７】
用語「癌」とは、一般的に、悪性の腫瘍又は細胞の自発的成長もしくは増殖を言う。ここで用いられる場合のこの用語は、完全に発達した悪性の腫瘍や、前悪性の病変の両者を包含するものである。例えば「癌」を有する対象は、腫瘍、あるいは白血病などの白血球増殖を有するかも知れない。いくつかの実施態様では、癌を有する対象は充実腫瘍などの腫瘍を有する対象である。癌には、限定はしないが、非小細胞肺癌（NSCLC）、精巣癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚管癌、膵臓癌、結腸直腸癌(CRC)、乳癌、前立腺癌、胃癌、皮膚癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、脳の癌、胆道癌、横紋筋肉腫、頭部及び頚部の癌、結節硬化症、並びに、限定はしないが非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性骨髄性白血病 (AML) 及び慢性骨髄性白血病 (bc−CML)のブラスト・クライシス（原語：blast
crisis）を含む血液の癌がある。
【００３８】
用語「化学療法薬」とは、腫瘍細胞など、外来細胞又は悪性細胞などにより引き起こされる疾患を治療するために用いられるいずれかの低分子又は組成物を言う。化学療法薬の非限定的な例には、DNA合成を破壊する物質が含まれ、トポイソメラーゼの阻害剤であり、アルキル化剤である、あるいは植物アルカロイドである。用語「DNA合成を破壊する物質」とは、DNA合成のプロセスを減少させる又は阻害することのできるいずれかの分子又は化合物を言う。DNA合成を破壊する物質の例には、限定はしないが、例えばピリミジン又はプリン類似体などのヌクレオシド類似体、その中には、限定はしないが、ゲムシタビン又は代替的にはアントラサイクリン化合物があり、その中には、限定はしないがアドリアマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、及びイダムビシン並びにエトポシド及びテニポシドなどのエピポドフィロトキシンがある。用語「トポイソメラーゼＩ阻害剤」とは、トポイソメラーゼＩ酵素の生物活性を阻害する又は減少させる分子又は化合物を言う。その中には、限定はしないが、カンプトサール（原語：camptosar）がある。用語「アルキル化剤」とは、タンパク質又は核酸などの別の分子の求核性基（例えばアミン、アルコール、フェノール、有機及び無機酸）と反応することでアルキル基（例えばエチル又はメチル基）をそれに加えることができるいずれかの分子又は化合物を言う。化学療法薬として用いられるアルキル化剤の例には、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イフォスファミド、メクロレタミン、メルファラン、チオテパ、多種のニトロソウレア化合物、並びにシスプラチン及びカルボプラチンなどのプラチナ化合物がある。用語「植物アルカロイド」とは、生物学的に活性かつ細胞毒性な植物由来含窒素分子である、アルカリの一ファミリーに属する化合物を言う。植物アルカロイドの例には、限定はしないが、タキソール、ドセタキセル及びパクリタキセルなどのタキサン類や、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビンなどのビンカ類がある。
【００３９】
用語「含む（原語：comprirse）」及び「含む（原語：comprising）」は包含的な開いた意味で用いられており、付加的な要素が含まれるであろうことを意味する。
【００４０】
用語「診断する」とは、ある患者のある疾患の存在を判定することを言う。
【００４１】
「4Eレギュロン活性が非機能的である疾患」とは、4Eレギュロン成分の発現レベル、活性、量、又はリン酸化状態が非罹患対象で観察されるものとは統計学的に有意に異なるような、対象におけるいずれかの状態を言う。4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の例には、癌、増殖障害、虚血再潅流及び過栄養がある。
【００４２】
用語「有効量」とは、限定はしないが、例えばin
vitro又はin vivoにおいて腫瘍の体積を低下させることを含め、所望の結果を起こすのに十分な、化合物、材料、又は、本発明の化合物を含む組成物、の量を言う。本発明の医薬組成物の有効量は、限定はしないが、例えば患者における癌の発達を改善する、安定化させる、妨げる又は遅らせることを含め、所望の臨床上の結果を得るのに充分である、当該医薬組成物の量である。いずれの場合も、本発明の化合物の有効量を、一回以上の投与で投与することができる。これら上記の指標の検出及び測定は、限定はしないが腫瘍負荷の減少、腫瘍の大きさの阻害や、二次腫瘍の増殖、腫瘍組織での遺伝子発現、バイオマーカの存在、リンパ節関与、組織学的等級、及び核医学的等充の低下を含め、当業者に公知である。
【００４３】
「遺伝子」又は「組換え遺伝子」とは、オープンリーディングフレームを含み、また少なくとも一つのエキソン及び（選択に応じて）イントロン配列を含む、核酸分子を言う。「イントロン」とは、mRNA成熟中にスプライシングで切り出される、任意の遺伝子中に存在するDNA配列を言う。
【００４４】
「遺伝子産物」により、ある遺伝子の転写の結果として産生される分子が意味される。遺伝子産物には、ある遺伝子から転写されるRNA分子や、このような転写産物から翻訳されるタンパク質がある。
【００４５】
用語「過栄養」とは、身体部分又は臓器の異常な肥大を一般的に言う。
【００４６】
は、
用語「含む」は、「限定しないが含む」を意味するために用いられている。「含む」及び「限定しないが含む」は交換可能に用いられている。
【００４７】
用語「虚血再潅流」とは、ある虚血期間後に血液提供が組織に戻ったときに起きる、組織に対する損傷を一般的には言う。「虚血」とは、通常、組織中の低酸素症に至るような動脈血液提供の閉塞又は血流不足を原因とする低酸素状態を言う。
【００４８】
用語「標識」又は「標識された」とは、ポリペプチド、特に抗体など、ある分子内に検出可能なマーカを導入又は付着させること、選択的に共有結合的又は非共有結合的に導入又は付着させることを言う。ポリペプチドを標識する多様な方法が当業で公知であり、用いてよい。ポリペプチドのための標識の例には、限定はしないが、以下のものが含まれる：放射性同位体、蛍光標識、重原子、酵素標識又は受容体遺伝子、化学発光基、ビオチニル基、二次レポータにより認識される所定のポリペプチド・エピトープ（例えばロイシン・ジッパー・ペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ等）。このような標識の例及び使用は以下に詳述されている。いくつかの実施態様では、潜在的な立体障害を減らすために、標識を多様な長さのスペーサ原子により付着させる。本発明で用いてもよい標識の具体的な例には、フルオレセイン、ローダミン、ダンジル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、NADPH、アルファ−ベータ−ガラクトシダーゼ及び西洋わさびペルオキシダーゼがある。
【００４９】
「細胞内の遺伝子発現レベル」又は「遺伝子発現レベル」とは、細胞内の遺伝子にコードされた、mRNAやプレ−mRNA新生転写産物、転写産物プロセッシング中間体、成熟mRNA及び分解産物がある。
【００５０】
機能上の特性又は生物学的活性もしくはプロセス（例えば酵素活性又は受容体結合）に関して用いられる用語「調節」とは、このような特性、活性又はプロセスを上方調節する（例えば活性化する又は刺激する）、下方調節する（例えば阻害する又は抑制する）あるいはその質を変える能力を言う。いくつかの場合、このような調節は、例えばシグナル伝達経路の活性化など、特異的事象発生に対して偶発的なものでもよく、及び／又は、特定の細胞種のみに現れるものであってもよい。
【００５１】
用語「調節物質」とは、調節を起こすことができると考えられるポリペプチド、核酸、巨大分子、複合体、分子、低分子、化合物、種等（天然発生型又は非天然発生型）、あるいは、細菌、植物、真菌、又は動物細胞もしくは組織など、生物材料から作製された抽出物を言う。調節物質は、機能上の特性、生物学的活性もしくはプロセス、又はこれらの組合せの阻害剤又は活性化剤（例えばアゴニスト、部分的アンタゴニスト、部分的アゴニスト、逆転アゴニスト、アンタゴニスト、抗菌剤、細菌感染又は増殖の阻害剤等）としての潜在的活性について、検定に含めることにより、評価できよう。このような検定においては、数多くの調節物質を一度にスクリーニングしてもよい。調節物質の活性は公知であっても、未知であっても、又は部分的に公知であるものでもよい。
【００５２】
ここで用いられる場合の用語「核酸」とは、デオキシリボ核酸 (DNA)、及び適当な場合にはリボ核酸
(RNA)などのポリヌクレオチドを言う。更にこの用語には、均等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたRNA又はDNAの類似体や、解説しようとする実施態様に適用できる場合には、一本鎖（センス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチドも含まれるものと理解されねばならない。EST、染色体、 cDNA、mRNA、及びrRNAは、核酸と言及してもよい分子の代表的な例である。
【００５３】
「患者」又は「対照」又は「ホスト」とは、ヒト又は非ヒト動物のいずれかを言う。
【００５４】
「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、コーディング配列にコードされているなど、遺伝子産物を言う場合には、ここでは交換可能に用いられている。「遺伝子産物」によって、ある遺伝子の転写の結果産生される分子を意味する。遺伝子産物には、遺伝子から転写されるRNA 分子や、このような転写産物から翻訳されるタンパク質が含まれる。
【００５５】
用語「予後する」とは、症例の性質及び症状を指標とする、疾患の攻撃による予想される結果、あるいは、ある疾患からの回復に関する見通し、を判定することを言う。
【００５６】
「低分子」は当業で公知の用語である。いくつかの実施態様では、この用語は約 2000 amu未満、又は約1000 amu未満、そして更には約500 amu未満の分子量を有する分子を言う。
【００５７】
用語「段階を決定する」とは、対象において疾患が進行した程度を判定することを言う。
【００５８】
「治療薬」又は「治療剤」とは、ホストに対して所望の生物学的効果を有することができる作用物質を言う。化学療法薬及び遺伝子毒性物質は、それぞれ、生物学的ではなく起源が化学的なものであることが広く公知の、あるいは、特定の作用機序による治療効果を起こすことが広く公知の、治療的作用物質の例である。生物学的起源の治療的作用物質の例には、成長因子、ホルモン、及びサイトカインがある。多種の治療的作用物質が当業で公知であり、それらの効果により同定できよう。いくつかの治療的作用物質は赤血球の増殖及び分化を調節することができる。例には、化学治療的なヌクレオチド、薬物、ホルモン、非特異的（非抗体）タンパク質、オリゴヌクレオチド（例えば標的核酸配列（例えばmRNA配列）に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ペプチド、及びペプチドミメティックスがある。
【００５９】
用語「治療上有効量」とは、このような処置を必要とする対象に投与された場合に処置を実効させるのに充分な、調節物質、薬物又は他の分子の量を言う。治療上有効量は、当業者であれば用意に判定することのできる、処置しようとする対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重篤度、投与の態様等に応じて様々であろう。
【００６０】
用語「治療する」とは、ここで用いられる場合、いずれかの状態又は疾患の少なくとも一つの症状を治癒させたり、改善したりすることを包含するものと、意図されている。
【００６１】
Ｂ．  4Eレギュロン成分の診断及び予後上の用途
１．  生物試料の使用を含む診断法
いくつかの実施態様では、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を診断する、観察する、予後する又はその段階を判定する、又はその結果を予測する、あるいは、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を発症する可能性を予測する、方法が提供され、本方法は、対象の生物学的試料中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性を検出するステップを含む。ある例示的な実施態様では、4Eレギュロン成分のレベル又は活性を、対象由来の尿、唾液、血液又は血漿試料中で判定してもよい。
【００６２】
本方法は、対象の生物学的試料中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性を検出するステップと、そのレベルをコントロールに比較するステップとを含んでもよい。非特異的なコントロールは、例えばGADPH 又はアクチンのレベル又は活性であってよい。少なくとも一種の4Eレギュロン成分のコントロールのレベル、リン酸化状態、又は活性からのいずれかの逸脱を、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患に罹患した対象、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の特定の段階を有する対象、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を発症するところである対象等の指標であろう。4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の程度又は重篤度は、コントロールに比較したときの、ある対象における少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性の逸脱程度に基づいて判定できよう。例えば、コントロールに比較したときに、少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性により大きな逸脱を示す対象は、当該対象が、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患に対してより易罹患性である、又は、より重篤な症例に罹患している、ことの指標かも知れない。
【００６３】
診断、スクリーニング及び観察用途について4Eレギュロン成分の使用を解説した方法のいくつかの実施態様では、少なくとも一種の非4Eレギュロン成分の発現レベル、レベル／量、リン酸化状態、又は活性を判定し、また同様に比較してもよい。例えば、前記少なくとも一種の非4Eレギュロン成分を：ER (ER
(アルファ) gi: 62821793；ER (ベータ) gis: 94538327、94538324、94538323)、PR (gi: 110611913)、EGFR (gi: 41327737)、HER2/neu (gi: 54792097, 54792095)、及びTMPRSS2:ETS 遺伝子融合体（Rubin, MA
and Chinnaiyan, AM (2006) Lab Invest
86:1099）から成る群より選択してもよい。
【００６４】
少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性を、当業で公知の方法を用いて判定してもよい。前記少なくとも一種の4Eレギュロン成分がタンパク質又はタンパク質の一領域に相当するペプチドである実施態様では、このタンパク質又はペプチドのレベルを直接、評価してもよい。例えば、少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベルを、イムノアッセイを用いて判定してもよい。少なくとも一種の4Eレギュロン成分の活性を、その少なくとも一種の4Eレギュロン成分の活性に特異的な検定を用いて評価してもよい。
【００６５】
生物試料中の4Eレギュロン成分のレベル又は活性を検出する他の方法を、下記の項Ｄに更に解説する。
【００６６】
対象における少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性を、定量的又は定性的にコントロールに比較してもよい。例えば、定量的（又は無単位）比較は、対象における少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性がより高い、低い、又はコントロールとほぼ同じであるかを判定することにより、行われてもよい。選択的には、例えば２倍の変化、50%の変化等々、定量的比較を用いて、対象における少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性をコントロールに比較したときの違いの大きさを推定してもよい。例えば、対象における少なくとも一種の4Eレギュロン成分の量をコントロールでの量に比較し、このとき当該の質が何らかの付属する単位（例えばmgのタンパク質、ゲル中のスポット／バンドの体積、ホスホイメージャ上のスポットの輝度又はオートラジオグラムの露出、クロマトグラフィ・プレート上のスポットの体積等）を有するものとして判定することにより、定量的比較を行ってもよい。
【００６７】
別の実施態様では、対象の生物試料中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性を用いて、対象に見られる少なくとも一種の4Eレギュロン成分の生理的濃度を計算してもよい。対象での当該の少なくとも一種の4Eレギュロン成分の生理的濃度を、次に、選択に応じてコントロールに比較してもよい。
【００６８】
いくつかの実施態様では、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の診断、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の段階判定、又は、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の段階又は発生の観察を目的として、対象を、少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性について定期的（又は一定の間隔で）スクリーニングしてもよい。ある実施態様では、4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性についてのスクリーニングを、毎月ほぼ一回、３週毎に一回、２週毎に一回、１０日毎に一回、毎週一回、又は144時間、120時間、96時間、72時間、48時間、24、又は12 時間毎に一回、行ってもよい。
【００６９】
対象における少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性の観察に加え、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の症状を観察することが好ましいかも知れない。
【００７０】
２．  細胞及び組織ベースの診断薬
いくつかの実施態様では、対象由来の細胞又は組織中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分の発現を評価する方法は、少なくとも一種の4Eレギュロン成分の発現レベルを細胞内で判定するステップを含むであろう。他の実施態様では、それは、少なくとも一種の4Eレギュロン成分タンパク質又はmRNA（即ち遺伝子産物）のレベル、リン酸化状態、又は活性を判定するステップを含むであろう。
【００７１】
遺伝子発現及びタンパク質活性を評価する方法は当業で公知である。少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現、あるいは、少なくとも一種の4Eレギュロン成分の活性、レベル、又はリン酸化状態を評価する例示的な方法を更に下記の項Dで解説する。
【００７２】
上記の方法は、更に、ｂ）少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の、判定された発現レベルを、少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルの少なくとも一つの基準設定値と比較するステップを含んでもよく、この場合、基準設定値は、少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の特定の発現レベルに関連する細胞の状態を示すものである。
【００７３】
基準設定値又はプロファイルへの比較は、それらを、例えば対象の4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を診断及び予後する、並びにその発症を予測する方法や、あるいは、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を処置する上での効験について候補治療薬をスクリーニングする方法で用いられる場合など、上記の方法での用途において特に有用である。
【００７４】
例えば、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を診断する、予後する、又は段階判定する、あるいはその発症を予測する方法は、（ａ）少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを対象の細胞内で判定するステップを含むであろう。それにより得られた少なくとも一種の4Eレギュロン成分の発現レベルを、更に、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の多様な状態と関連する少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルの基準設定値と比較してもよい。
【００７５】
例えば 4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を有する対象の罹患細胞内、又は、正常な相対細胞内での発現レベルなど、基準発現レベルに対する少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の比較は、好ましくは、コンピュータ・システムを用いて行われるとよい。ある実施態様では、発現レベルを２つの細胞で得、これらの２つの組の発現レベルを比較に向けてコンピュータ・システムに導入する。ある好適な実施態様では、一組の発現レベルを、そのコンピュータ・システム内に既に存在する数値との比較に向けて、コンピュータ・システムに入力するか、あるいは、コンピュータで読み取り可能な形での数値との比較に向けて入力し、該数値をその後コンピュータ・システムに入力する。
【００７６】
ある実施態様では、本発明は、コンピュータで読み取り可能な形の、本発明の遺伝子発現プロファイル・データあるいは少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルに相当する数値を提供するものである。前記数値は、例えばmRNA発現レベル又はAQUATM
スコアであってよい。前記数値はまた、mRNAレベル、AQUATM スコア、又は、その発現が数多くの細胞で数多くの条件下で一定であるような基準遺伝子に対して正規化させた他の遺伝子発現測定値であってもよい。
【００７７】
他の実施態様では、コンピュータ内の数値は、異なる試料中の正規化された、又は正規化されていないレベルの比、又は差である。
【００７８】
遺伝子発現プロファイル・データは、エクセル（Excel）表などの表の形であってもよい。データは単独であっても、又はそれは、例えば他の発現プロファイルを含むなど、より大型のデータベースの一部分であってもよい。例えば本発明の発現プロファイル・データは公共データベースの一部であってもよい。当該のコンピュータ読み取り可能な形はコンピュータ内にあってもよい。別の実施態様では、本発明は、遺伝子発現プロファイル・データを表示するコンピュータを提供するものである。
【００７９】
ある実施態様では、本発明は、対象の細胞などの第一細胞中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルと、第二細胞中のそれとの間の類似性を判定する方法を提供するものであり、本方法は、第一細胞中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを得るステップと、これらの数値を、第二細胞中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルに相当する数値を含む記録を含むデータベースと、コンピュータ内に保存されたデータとの比較を目的とした一つ以上の数値の選択を受け取ることのできる、ユーザ・インターフェースなどのプロセッサ命令とを含むコンピュータに入力するステップとを含む。本コンピュータは、前記比較データを図又はチャート又は他の種類の出力に変換する手段を更に含んでもよい。
【００８０】
別の実施態様では、少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを表す少なくとも一つの数値を、二つ以上の細胞から得られた基準発現レベルを持つ一つ以上のデータベースを含むコンピュータ・システムに入力する。例えば、コンピュータは罹患及び正常細胞の発現データを含んでいてもよい。命令が該コンピュータに提供され、該コンピュータは入力されたデータを、コンピュータ内のデータと比較することで、入力されたデータが正常細胞のそれにより類似であるか、又は罹患細胞のそれにより類似であるかを判定することができる。
【００８１】
別の実施態様では、前記コンピュータは、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の異なる段階の対象の細胞内の発現レベルの数値を含み、前記コンピュータは、前記コンピュータに入力された発現データを、保存されたデータと比較することができ、対象の4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の段階を判定するべく、コンピュータ内の発現プロファイルのどれに対し、入力されたものが最も類似であるかを指し示す結果を生成する。
【００８２】
更に別の実施態様では、コンピュータ内の基準発現プロファイルは、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を有する一人以上の対象を由来とする細胞であって、in vivo 又は in vitro で4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の治療に用いられる薬物で処置を受けた細胞からの発現プロファイルである。in vitro 又は in vivo で前記薬物の処置を受けた、対象の細胞の発現データを入力すると、当該コンピュータは、該コンピュータに入力されたデータに該データを比較し、該コンピュータに入力された発現データが、当該薬物に応答性の対象細胞のそれにより類似であるか、あるいは、当該薬物に応答性でない対象細胞のそれに類似であるかを指し示す結果を提供されるように命令を受ける。このように、当該の結果は、対象が当該薬物による処置に応答する可能性が高い、又は、それに応答しない可能性が高いかを指し示すものである。
【００８３】
ある実施態様では、本発明は、一つ又は複数の遺伝子に関する遺伝子発現データを受け取る手段と；前記一つ又は複数の遺伝子からの遺伝子発現データを共通の基準フレームに比較する手段と；前記比較の結果を提示する手段とを含むシステムを提供するものである。システムは前記データをクラスタ化する手段を更に含んでもよい。
【００８４】
別の実施態様では、本発明は、（ａ）少なくとも一つの遺伝子に関する遺伝子発現データを入力として受け取るコンピュータ・コードと：（ｂ）各遺伝子からの前記遺伝子発現データを共通の基準フレームに比較するコンピュータ・コードとを含む遺伝子発現データを解析するコンピュータ・プログラムを提供するものである。
【００８５】
更に本発明は、以下のステップ：（ａ）クエリ細胞（原語：query cell）中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルに相当する少なくとも一つの数値を、一つ以上の基準細胞の基準発現又は発現プロファイル・データ及び細胞種のアノテーションを含む記録を含むデータベースと比較するステップと：（ｂ）発現プロファイルの類似性に基づくと前記クエリ細胞がどの細胞に最も類似であるかを指し示すステップ：を行うためのプログラム命令を含む機械読み取り可能な又はコンピュータ読み取り可能な媒体を提供するものである。前記基準細胞は、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の様々な段階にある対象を由来とする細胞であってよい。また前記基準細胞は特定の薬物処置に対して応答性の、又は非応答性の対象を由来とし、選択的には
in vitro 又は in vivo で当該薬物と一緒にインキュベートされた細胞であってもよい。
【００８６】
また基準細胞は複数の異なる処置に対して応答性の、又は非応答性の対象を由来とする細胞であってよく、当該コンピュータ・システムはこの対象にとっての好適な処置を示すものである。従って本発明は、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を有する患者のための治療法を選択する方法を提供するものであり、本方法は（ａ）前記患者の罹患細胞中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを提供するステップと；（ｂ）それぞれがある治療法に関する複数の基準プロファイルを提供するステップと；（ｃ）対象発現プロファイルに最も類似の基準プロファイルを選択することで、前記患者のための治療法を選択するステップとを含む。ある好適な実施態様では、ステップ（ｃ）はコンピュータにより行われる。最も類似の基準プロファイルは、前記複数の比較値を、対応する発現データに関連する重み値を用いて重みを付けることで選択してもよい。
【００８７】
コンピュータ読み取り可能な媒体は、4Eレギュロン活性 が機能不全である疾患の段階の記述子に対する、又は、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の処置に対するポインタを含んでもよい。
【００８８】
作用時、前記遺伝子発現データを受け取る手段、前記遺伝子発現データを比較する手段、前記提示する手段、前記正規化する手段、及び、前記本発明のシステムの文脈内でクラスタ化する手段は、ここで解説された各機能を持ち、ハードウェアか、又は、ハードウェア及びソフトウェアで実施されるプログラムされたコンピュータ；ここで具体的に特定され、コンピュータ・プログラムにより命令されるオペレーションを行う、プログラムされたコンピュータの論理回路又は他のコンポーネント；あるいは、コンピュータをここで解説された特定の態様で機能させ得るコンピュータ・プログラムを表現する実行可能な指示で暗号化されたコンピュータ・メモリ、を含んでもよい。
【００８９】
当業者であれば、本発明のシステム及び方法をIBM(R)-互換性パーソナル・コンピュータで作動するMS-DOS（登録商標）又はマイクロソフト・ウィンドウズ（登録商標）を含め、多種のシステムに応用できると思われることは理解されよう。ある例示的な実施態様では、発現プロファイルを米国特許第6,203,987号に解説された方法を用いて比較する。ユーザはまずは発現プロファイル・データをコンピュータ・システムにロードする。Geneset プロファイル定義を保存媒体又は遠隔コンピュータから、好ましくは動的 genesetデータベース・システムから、ネットワークを通じてメモリにロードする。次に、ユーザは、発現プロファイルを投影発現プロファイルに変換するステップを行う投影ソフトウェアを実行させる。こうして投影発現プロファイルを表示する。
【００９０】
更に別の例示的な実施態様では、ユーザはまず、投影プロファイルをメモリにリードする。次にユーザは基準プロファイルをメモリにロードさせる。次にユーザは、プロファイルを客観的に比較するステップを行う比較ソフトウェアを実行させる。
【００９１】
上記の方法を含む診断ツール及び検定の例を下に記載する。
【００９２】
ある実施態様では、本発明は、例えば4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の発症を予測するなど、ある対象に4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を有するかどうか、又は発症する可能性が高いかどうかを判定する方法を提供するものであり、本方法は、対象の細胞中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを判定するステップと、これらの発現レベルを、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を有することが既知の対象の罹患細胞中の前記遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルと比較するステップとを含み、その結果、前記遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルが類似であることは、前記対象が、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患又はその少なくとも一つの症状を有する、又は発症する可能性が高いことの指標となるものである。ある好適な実施態様では、当該細胞は、対象中で罹患しているのと基本的に同じ種類のものである。
【００９３】
別の実施態様では、本発明のパネル中の遺伝子又は遺伝子産物の発現プロファイルを用いて、4Eレギュロン活性が機能不全であるある特定の種類の疾患を対象が有すること、特に、その対象が関連する疾患、又は類似の症状を持つ疾患を有さないことを確認してもよい。これは、特に対象にとって最適な治療計画をデザインする上で重要であろう。当業においては、発現プロファイルを用いると、ある一つの種類の疾患を類似の疾患から区別できることが述べられている。例えば一方が現在の治療法に応答性であり、他方が応答しないような２つのサブタイプの非ホジキンリンパ腫は、びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫に罹患した患者の標本から１７，５８６種の遺伝子を調査すれば区別できるであろう (Alizadeh et al. Nature
(2000) 405:503)。同様に、皮膚黒色腫のサブタイプが８１５０種の遺伝子のプロファイルに基づいて予測された (Bittner et al. Nature (2000)
406:536)。この場合、攻撃性の高い転移性の黒色腫の特徴が認識された。癌細胞及び正常細胞の発現プロファイルを比較する数多くの他の研究が解説されており、その中には転移性の高い癌及び低い癌を区別する発現プロファイルを述べた研究や、新しい腫瘍型など、新しい疾患サブタイプを述べた研究がある（例えば Perou et al. (1999) PNAS 96: 9212; Perou et al. (2000) Nature
606:747; Clark et al. (2000) Nature 406:532; Alon et al. (1999) PNAS 96:6745;
Golub et al. (1999) Science 286:531を参照されたい）。このような区別は当業において「弁別的診断」として公知である。
【００９４】
更に別の実施態様では、本発明は、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の段階を判定する方法を提供するものである。少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルは疾患の段階と共に変化すると考えられる。このことは、例えば 4Eレギュロン活性が様々な段階で機能不全である疾患を有する対象中の当該遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを分析することにより、常法で確認することができよう。例えば、疾患の様々な段階にある対象中の罹患細胞の発現プロファイルをここで解説するように判定してもよい。その後、対象における4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の段階を判定するために、疾患の段階で異なる少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを判定する。
ある対象と、特定の疾患段階の基準プロファイルとの間で少なくとも一種の4Eレギュロン成分の発現レベルが類似であることは、その対象がその特定の段階にあることの指標となる。
【００９５】
同様に、本方法を用いて、治療中の対象における疾患の段階を判定することでその治療法が有効であるかどうかを判定してもよい。従って、ある実施態様では、少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを、処置前及び処置中の複数の時点の対象で判定する。例えばRNA試料を対象から治療の開始前と、治療中１２時間ごと、２４時間ごと、又は７２時間ごとに得てもよい。また試料を１週間に一回、又は一ヶ月に１回、分析してもよい。経時的、並びに罹患細胞及び正常細胞で相対的な遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルの変化は、その治療法が有効であるかどうかの指標となるであろう。
【００９６】
更に別の実施態様では、本発明は、4Eレギュロン活性 が機能不全である疾患を有する対象において、ある特定の治療法の成功の可能性を判定する方法を提供するものである。ある実施態様では、対象にある特定の治療法を開始し、その治療法の有効性は、例えばその対象の細胞中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを判定するなどにより、判定する。遺伝子の発現レベルの正規化、即ち、遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルが、非罹患細胞のそれにより類似するような変化
があれば、処置がその対象において有効に違いないことの指標となる。
【００９７】
対象における処置の結果の予測をin vitroで行ってもよい。ある実施態様では、処置に対する応答性を評価しようとする対象から細胞を得、in vitro で治療用薬物と一緒にインキュベートする。次に、少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物
の発現レベルを当該細胞で測定し、それらの数値を、罹患細胞の正常な総たち物である細胞における少なくとも一種の4Eレギュロン成分の発現レベルと比較する。更にこの発現レベルを正常細胞でのそれとに比較してもよい。比較的分析は好ましくは、上述した発現プロファイルのデータベースを含むコンピュータを用いて行われるとよい。薬物とインキュベートした後の対象の細胞における少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルが正常細胞の発現レベルと類似しており、罹患細胞のそれと異なっていることは、対象がその薬物による処置に対して正の応答をする可能性が高いことの指標である。反対に、薬物による処置後の対象の細胞中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルが罹患細胞での発現レベルに類似しており、正常細胞のそれとは異なることは、対象がその薬物による処置には正の応答をしない可能性が高いことの指標である。
【００９８】
薬物が罹患細胞に直接作用せずに例えば代謝されるか、あるいは、罹患細胞に効果をもたらす因子を分泌する別の細胞に作用するという可能性もあるため、上記の検定法は、罹患細胞以外の細胞を含有する、対象の組織試料中で行われてもよい。例えば罹患細胞を含む組織試料を対象から得；この組織試料を潜在的な薬物と一緒にインキュベートし；選択的には一種以上の罹患細胞をこの組織試料から例えば顕微解剖又はレーザ・キャプチャー・マイクロディセクション（原語：Laser Capture Microdissection） (LCM、上記参照)などにより分離し；そして少なくとも一種の4Eレギュロン成分の発現レベルを調べる。
【００９９】
更に本発明は、複数の異なる処置の選択肢から、レギュロン活性が機能不全である疾患のための治療法を選択する方法を提供するであろう。4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を有する特定の対象は、ある種類の治療法よりも別の種類の治療法の方により良好に応答するかも知れない。ある好適な実施態様では、本方法は、患者における少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを、in vitro 又は in vivo で複数の治療用薬物のうちの一つで処置された対象であって、前記治療用薬物のうちの一つに対して応答性又は非応答性である対象の細胞におけるそれと比較するステップと、患者のそれに対して最も類似の少なくとも一種の4Eレギュロン成分の発現レベルを有する細胞を特定することにより、当該患者のための治療法を特定するステップとを含む。更に本方法は、特定された治療法を対象に投与するステップを含んでもよい。
【０１００】
当業者であれば、上述の方法のいずれも、遺伝子発現レベルと同じ態様で4Eレギュロン成分タンパク質のレベル、活性、又はリン酸化状態を用いて同様な目的を達成するべく変更できると思われることは理解されよう。
【０１０１】
Ｃ．  治療薬を特定する方法
１．  治療的作用物質のスクリーニング
更に本発明は、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を処置する際に使用する候補治療的作用物質をスクリーニングする方法における少なくとも一種の4Eレギュロン成分の使用に関する。候補治療薬を以下のクラスの化合物から選択してよい：核酸、低分子、ポリペプチド、タンパク質、ペプチドミメティック、又は核酸類似体。いくつかの実施態様では、候補治療薬は化合物のライブラリ中にあってよい。これらのライブラリを、コンビナトリアル合成法を用いて作製してもよい。本発明のいくつかの実施態様では、標的タンパク質に対する前記候補治療薬の結合能を
in vitro 検定で評価してもよい。いくつかの実施態様では、化合物又は生物製剤の組合せを、4Eレギュロン成分発現又は活性に対するそれらの効果についてスクリーニングして、潜在的な同時治療薬又は併用療法を特定してもよい。例えば、リバビリン又はその類似体もしくはプロドラッグを、インターフェロン、gmcsf、gcsf、il-12、il-2、チロシンキナーゼ活性を阻害又は下方調節する化合物、プラチナ化合物及び上の定義で解説した他のものなどの化学療法薬、生物製剤及び細胞毒等と共にスクリーニングして、併せて記載した通りの細胞増殖、細胞分裂、及び／又は、遺伝子発現の測定を行ってもよい。
【０１０２】
生物製剤には、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造又は腫瘍基質の標的化可能成分に結合する抗体又はその抗原結合部分が含まれよう。腫瘍細胞、腫瘍脈管構造又は腫瘍間質の「標的化可能成分」は、好ましくは、表面に発現した、表面で到達可能な、又は表面に局在した成分であるが、サイトゾル性及び／又は核腫瘍細胞抗原を含め、壊死性又は損傷した腫瘍細胞又は血管内皮細胞から放出された成分も標的としてよいであろう。
【０１０３】
生物製剤には、更に、抗腫瘍細胞イムノトキシン又はコアギュリガンド、 B3 (ATCC HB 10573)、260F9 (ATCC HB 8488)、D612 (ATCC HB 9796) 及びKS1/4から成る群を例とする抗体などがあり、前記KS1/4 抗体はベクタpGKC2310
(NRRL B-18356) 又はベクタ pG2A52
(NRRL B-18357)を含む細胞から得られるものである。生物製剤は抗腫瘍間質イムノトキシン又はコアギュリガンドであってよく、例としてはフィブリン、RIBS 又はLIBSへの結合を例証とする、例えば、結合組織成分、基底膜成分又は活性化血小板成分に結合する抗体である。
【０１０４】
抗腫瘍脈管構造イムノトキシン又はコアギュリガンドなどの生物製剤は、更に、脈管化腫瘍の血液輸送血管、好ましくは腫瘍内血管の表面に発現した、表面で到達可能な、又は表面に局在した、成分に結合するリガンド、抗体、又はそのフラグメントを含んでもよい。このような抗体には、アミノホスホリピド自体を含め、脈管化腫瘍の腫瘍内血管の表面に発現した成分や、エンドグリン (TEC-4 及びTEC-11 抗体)、TGF.ベータ受容体、E-セレクチン、P-セレクチン、VCAM-1、ICAM-1、PSMA、VEGF/VPF受容体、FGF 受容体、TIE、アルファ.sub.v.ベータ.sub.3インテグリン、プレイオトロピン、エンドシアリン、及びMHC クラス II タンパク質などの腫瘍内脈管形成細胞表面受容体に結合するものがある。また抗体は、腫瘍内血管のサイトカイン誘導性又は凝血薬誘導性成分に結合するものでもよい。
【０１０５】
他の抗腫瘍脈管構造イムノトキシン又はコアギュリガンドは、腫瘍内脈管構造細胞表面受容体に結合するリガンド又は成長因子に結合する抗体又はそのフラグメントを含むものであろう。このような抗体には、VEGF/VPF (GV39 及び GV97 抗体)、FGF、TGF.beta.に結合するもの、TIE、腫瘍関連フィブロネクチン・アイソフォーム、散乱係数／肝細胞成長因子 (HGF)、血小板因子 4 (PF4)、PDGF及びTIMPに結合するリガンドがある。当該の抗体又はそのフラグメントは、リガンド：受容体の複合体又は成長因子：受容体の複合体には結合するが、当該のリガンド又は成長因子又は受容体がリガンド：受容体又は成長因子：受容体の複合体にないときには、リガンド又は成長因子又は受容体に結合しないものでもよい。
【０１０６】
植物-、真菌-又は細菌-由来の毒素（イムノトキシン）、リシンＡ鎖、脱グリコシル化リシンＡ鎖、ゲロニン及びアンジオポエチンなどの細胞毒性物質も、併用療法で用いてよい。
【０１０７】
いくつかの実施態様では、候補治療的作用物質又は「治療薬」を、少なくとも一種の4Eレギュロン成分へのそれらの結合能について評価する。他の実施態様では、候補治療薬を、少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物へのそれらの結合能について評価する。遺伝子又はタンパク質への候補治療薬の結合能は
in vitro 検定で評価してもよい。いずれの実施態様においても、結合検定は
in vivoであってもよい。
【０１０８】
更に他の実施態様では、少なくとも一種の4Eレギュロン成分を標的化する治療的作用物質を、対象において 4Eレギュロン活性 が機能不全である疾患の症状を観察することにより評価してもよく、このとき、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患の改善又は防止は、当該治療的作用物質が処置として有用と考えられることの指標である。
【０１０９】
更に本発明は、少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子の発現を調節する上での候補治療的作用物質の調節能を、前記候補治療的作用物質に対象の細胞を接触させることにより評価する方法を提供するものである。いくつかの実施態様では、当該の候補治療薬は少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを正規化する上でのその能力について評価されるであろう。この実施態様では、候補治療薬が遺伝子発現を正規化した結果4Eレギュロン活性が機能不全である疾患が改善する、阻害される、又は防止されることがあれば、それは4Eレギュロン活性が機能不全である疾患のための候補治療薬と考えられよう。候補治療的作用物質は、例えば以下のクラスの化合物から選択されよう：リバビリン又はリバビリン類似体、アンチセンス核酸、RNAi、低分子、ポリペプチド、抗体を含むタンパク質、ペプチドミメティック、又は核酸類似体。
【０１１０】
代替的には、候補治療的作用物質を、少なくとも一種の4Eレギュロン成分タンパク質のレベル、リン酸化状態、又は活性を阻害するそれらの能力を、前記候補治療的作用物質に対象の細胞を接触させることにより評価してもよい。いくつかの実施態様では、候補治療薬を、少なくとも一種の4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性を阻害するその能力について、評価してもよい。この実施態様では、当該タンパク質の活性の調節能を示す候補治療的作用物質は、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を処置するための候補治療薬とみなされるであろう。
【０１１１】
更に、候補治療薬を、少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子にコードされたタンパク質のターンオーバー・レベルの正規化するその能力について評価してもよい。別の実施態様では、候補治療薬を、少なくとも一種の4Eレギュロン成分にコードされたタンパク質の翻訳を正規化するその能力について、評価してもよい。更に別の実施態様では、候補治療薬を、本発明のパネルの中の少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子にコードされたmRNAのターンオーバー・レベルを正規化するその能力について評価してもよい。
【０１１２】
本発明の別の実施態様では、合理的な薬物デザインにより薬物が開発されるが、即ちそれは、コンピュータ読み取り可能な形で保存され、かつアルゴリズムで解析された情報に基づいてデザイン又は同定される。発現プロファイルのデータベースは現在、次々と確立されつつあり、その数多くが公共に入手可能である。罹患細胞の遺伝子発現プロファイルから、罹患細胞に対応する正常細胞のそれへとという変化に類似した態様で少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子の発現に影響する薬物を求めてこのようなデータベースをスクリーニングすることにより、罹患細胞で遺伝子発現を正規化する化合物を特定できよう。その後、このような化合物の誘導体及び類似体を合成して、この化合物の活性を最適化し、上述したように検査及び最適化してもよい。
【０１１３】
２．  治療的作用物質のスクリーニング検定
上述の方法で用いるのに適した検定や検定開発法は当業者に公知であり、本発明の方法で適当な場合にはその使用が考察されるところである。前記候補治療薬の標的への結合能は、当業者に公知の多種の適した検定を用いて判定できよう。本発明のいくつかの実施態様では、候補治療薬の標的タンパク質、他の遺伝子産物又は遺伝子への結合能をin vitro 検定で評価してもよい。いずれの実施態様でも、結合検定はin vivo 検定であってもよい。検定は、遺伝子又は遺伝子産物の発現又は活性を調節する分子を特定するために行われてもよい。代替的には、ある遺伝子又は遺伝子産物にコードされたタンパク質の活性を調節する分子を特定するために検定を行ってもよい。
【０１１４】
本発明での使用が考えられる検定の例には、限定はしないが、競合的結合検定、直接的結合検定、２種ハイブリッド検定、細胞増殖検定、キナーゼ検定、ホスファターゼ検定、核内ホルモン輸送体検定、蛍光活性化細胞スクリーニング（FACS）検定、コロニー形成／プラーク検定、及びポリメラーゼ連鎖反応検定がある。このような検定は当業者に公知であり、ごく慣例的な実験により、本発明での方法に適合させられよう。
【０１１５】
上記のスクリーニング法のいずれも、多種の検定フォーマットを用いて達成され得よう。本開示を鑑みると、ここで明示していないものも公知であり、当業者の知るところであろう。当該検定により、少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子又は遺伝子産物の発現、少なくとも一種の4Eレギュロン成分のタンパク質対タンパク質又はタンパク質対基質の相互作用、あるいは少なくとも一種の4Eレギュロン成分遺伝子産物の正常又は異常な細胞生理、増殖、及び／又は分化並びにそれに関する障害の病理における役割の、例えばアゴニスト又はアンタゴニストなどである薬物を特定できよう。タンパク質複合体又はタンパク質−核酸複合体の形成、酵素活性、及び更には特異的シグナリング経路などの条件に近い検定フォーマットは多くの様々な形で作成し得るが、その中には、限定はしないが、無細胞系、例えば精製済みタンパク質又は細胞ライセートに基づく検定や、インタクト細胞を用いる細胞ベースの検定がある。
【０１１６】
３．  治療的作用物質の効験のスクリーニング
本発明の方法を用いて特定された候補治療薬の効験は、例えば、ａ）対象の細胞を候補治療薬に接触させるステップと、ｂ）対象において4Eレギュロン活性が機能不全である疾患又はその症状を改善する、阻害する、又は防止するその能力を判定するステップとにより、評価し得る。代替的には、候補治療薬の効験は、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を有する対象の細胞における少なくとも一種の4Eレギュロン成分 遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを正常細胞のそれと比較することにより、評価できよう。ある実施態様では、遺伝子又は遺伝子産物の発現レベルを、マイクロアレイ又は他のRNA定量法を用いるか、あるいは、候補治療薬で処置した細胞の遺伝子発現プロファイルを正常細胞の遺伝子発現プロファイルと比較することにより、判定できよう。
【０１１７】
次に、該化合物の効験を付加的な in vitro 検定で、及び動物研究などの in vivoで、検査してもよい。更に4Eレギュロン成分の発現を検査化合物の動物への投与前及び投与後に測定してもよい。4Eレギュロン成分の発現の正規化は、動物において4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を処置する化合物の効験の指標である。同様に、4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性を、動物への検査化合物の投与前及び投与後に測定してもよい。4Eレギュロン成分のレベル、リン酸化状態、又は活性の正規化は、動物において4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を処置する当該化合物の効験の指標である。
【０１１８】
効験をin vivoで検査するいくつかの実施態様では、候補治療的作用物質に応答した4Eレギュロン成分活性の変化をPBMCで観察する。他の実施態様では、候補治療的作用物質に応答した4Eレギュロン成分レベル、例えばVEGFなど、の流体ベースの解析を用いる。
【０１１９】
Ｄ．  4Eレギュロン成分遺伝子及びタンパク質の発現、レベル又は活性を評価する方法
4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を、少なくとも一種の4Eレギュロン成分 の発現レベル及び／又はリン酸化レベル、又は活性を評価することにより診断及び予後する方法や、上述の少なくとも一種の4Eレギュロン成分の発現及び／又はレベル、リン酸化状態、又は活性を調節する候補治療的作用物質をスクリーニングする方法は、少なくとも一種の4Eレギュロン成分の発現レベル及び／又はレベル、リン酸化状態、又は活性を判定するステップを含む。ある遺伝子の発現レベル、並びに、ある遺伝子又はタンパク質のレベル、リン酸化状態、又は活性を判定する方法は当業で公知である。例えば、4Eレギュロン成分遺伝子の発現レベルは逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)；ドット・ブロット解析；ノーザン・ブロット解析及びin situ ハイブリダイゼーションにより、判定することができる。代替的には、4Eレギュロン成分のレベルを適した抗体を用いて分析することができる。いくつかの実施態様では、4Eレギュロン成分の量を4Eレギュロン成分に対する抗体を用いて判定する。
【０１２０】
いくつかの実施態様では、4Eレギュロン成分の発現レベルを AQUATM 自動化病理システムを用いるなどにより、そのAQUATMスコアを判定することにより、判定する。AQUA（登録商標） （オートメイテッド・クォンティタティブ・アナリシス（原語： Automated Quantitative Analysis）の略）とは、タンパク質発現のin situでの絶対的測定の分析法である。この方法では、タンパク質発現の測定が細胞レベル下の区画内で可能であるため、単位面積当たりに発現した分子数に直接比例した数になる。例えば、核内エストロゲン受容体(ER)を測定するために、組織を一つのチャンネルでケラチンを用いて「マスク」することで腫瘍の面積を正規化すると共に、間質及び他の非腫瘍物質を分析から取り除く。次に、画像をDAPIを用いて撮り、核内区画を定義する。マスク内及びDAPIで定義された区画内のピクセルを核と定義する。その後、ERの発現の輝度を三番目のチャンネルを用いて測定する。その下位集団のピクセルの輝度をピクセル数で除算（して点から点までの面積を正規化）したものが AQUA（登録商標） スコアとなる。このスコアは、既知のレベルのERタンパク質発現を持つ細胞株の標準曲線で評価した場合の、腫瘍の面積当たりのERの分子数に直接比例する。焦点外れ光減算画像法の詳細を含むこの方法は、両者とも言及をもって全文をここに援用することとするネイチャー・メディシン・ペイパー（原語：Nature Medicine paper ）(Camp, R. L., Chung, G. G. & Rimm, D. L. Automated subcellular
localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nat Med 8, 1323-7 (2002))や ２００２年２月１日出願のU.S.S.N.
10/062,308, に詳細に解説されている。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、レポータ遺伝子検定を用いて4Eレギュロン成分の発現レベルを検出するか、又は、4Eレギュロン成分相互作用が妨害されているかどうかを判定する。この観点で有用であろうレポータ系には、限定はしないが、生成物に変換される、比色的に標識された基質、4E活性の変化に応答性のレポータ遺伝子、及び、相互作用成分の相互の結合を損なう作用物質を検出するための当業で公知の結合検定、例えばツーハイブリッド又は相互作用トラップ検定 (更に米国特許第5,283,317号； Zervos et
al. (1993) Cell 72:223-232;
Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993)  Biotechniques
14:920-924; and Iwabuchi et al. (1993)
Oncogene 8:1693-1696を参照されたい)がある。
【０１２２】
いくつかの実施態様では、質量分析法を用いてタンパク質のレベル又はタンパク質のリン酸化状態を評価する。質量分析法によるタンパク質の特徴付けには、まずタンパク質の単離が必要であり、その後タンパク質をより小さなペプチドフラグメントに化学的又は酵素消化する必要があり、このペプチドフラグメントを質量分析法により分析するとペプチド・マップが得られよう。液体クロマトグラフィを質量分析法と共に用いてもよい。更に質量分析法はポリペプチドの翻訳後修飾（例えばリン酸化等）を特定するためにも用いられよう。多用な質量分析計を本発明内で用いてよい。代表的な例には：三重項質量分析計、扇形磁気装置（磁気タンデム質量分析計、マサチューセッツ州ピーボディ、JEOL）、イオンスプレー質量分析計（Bruins
et al., Anal Chem. 59:2642-2647, 1987）、電気スプレー質量分析計（タンデム、ナノ-、及びナノ-電気スプレータンデムを含む）(Fenn et al., Science 246:64-71,
1989)、レーザー吐出飛行時間質量分析計 (Karas
and Hillenkamp, Anal. Chem. 60:2299-2301, 1988)、及びフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（マサチューセッツ州ピッツバーグ、Extrel Corp）がある。
【０１２３】
当業で公知のいずれか他の方法を用いてリン酸化を測定してもよい。典型的には、リン酸化を測定する方法は放射活性検出法に基づく。これらの方法では、目的のタンパク質を含有する試料を活性化剤及び基質と一緒に
g-32P-ATP 又は g-32P-GTPの存在下でインキュベートする。しばしば、ヒストン又はカゼインなどの一般的で安価な基質を用いる。適したインキュベート時間後、反応を停止させ、リン酸化した基質（又はタンパク質）を遊離リン酸から、ゲル電気泳動法か、あるいは基質又はタンパク質をフィルタに結合させ、余分な放射標識済み遊離ATPを洗い落とすことにより、分離する。基質又はタンパク質に取り込まれた放射標識されたリン酸の量はシンチレーション計数又はホスホイメージャ分析により測定できよう。代替的には、基質又はタンパク質のリン酸化を、ホスホセリン、ホスホスレオニン、又はホスホチロシン残基に特異的な抗体（例えば抗ホスホセリン、Sigma #P3430；抗ホスホスレオニン、Sigma
#P3555；及び抗ホスホチロシン、Sigma
#P3300)を用いた免疫蛍光法により検出してもよい。 
【０１２４】
他の実施態様では、4Eレギュロン成分の発現レベルを検出する方法はマイクロアレイの使用を含むであろう。アレイはしばしばマイクロアレイ及びマクロアレイに分けられるが、この場合、マイクロアレイは、遥かに高い密度の、面積当たりの個々のプローブ種を有する。マイクロアレイは 1000 又はそれ以上の異なるプローブを1
cm2 面積に有する場合がある。マイクロ-及びマクロアレイ間の違いの境界となるような具体的なカットオフはなく、両者の種類のアレイが本発明での使用に考えられる。
【０１２５】
マイクロアレイは当業で公知であり、一般的には、遺伝子産物（例えばcDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド）に配列上対応するプローブが既知の位置で結合する表面から成る。ある実施態様では、マイクロアレイは、各位置が、ある遺伝子にコードされた一産物（例えばタンパク質又はRNA）の個別の結合部位を表し、そしてこの場合結合部位は、その生物のゲノムの遺伝子の大半又はほとんど全ての産物に存在するようなアレイ（例えばマトリックス）である。いくつかの実施態様では、結合部位又は部位は、ある特定のコグネートcDNAが特異的にハイブリダイズできる相手である核酸又は核酸類似体である。結合部位の核酸又は類似体は、例えば合成オリゴマ、完全長cDNA、完全長より短いcDNA、又は遺伝子断片であってもよい。
【０１２６】
いくつかの実施態様では、マイクロアレイは標的生物のゲノム中の全部又はほとんど全部の遺伝子の産物にとっての結合部位を含有するが、このような包括性は必ずしも必要とされる訳ではない。通常、マイクロアレイは少なくとも100、500、1000、4000の遺伝子又はそれ以上に対応する結合部位を有するであろう。いくつかの実施態様では、アレイは 50、60、70、80、90程度、又は更には、ある代表となった特定の生物の95%を越える遺伝子を有するであろう。マイクロアレイは典型的には目的の生物学的ネットワーク・モデルの検査及び確認に関する遺伝子にとっての結合部位を有する。いくつかの例示的なヒトマイクロアレイが公共で入手可能である。
【０１２７】
アレイに固定するプローブは典型的にはポリヌクレオチドである。これらのDNAは、例えばゲノムDNA、cDNA （例えばRT-PCRにより）、又はクローニングされた配列の中の遺伝子配列のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅などにより得ることができる。PCRプライマは当該遺伝子又はcDNAの既知の配列に基づいて選択され、その結果、固有の断片（マイクロアレイ上のいずれか他の断片に対して１０塩基を超える連続した同一配列を持たない断片など）が増幅されることとなる。必要な特異性及び至適な増幅特性を持つプライマのデザインにはコンピュータ・プログラムが有用である。例えばOligo pl バージョン5.0 （ナショナル・バイオサイエンセズ）を参照されたい。ある代替的な実施態様では、結合（ハイブリダイゼーション）部位は遺伝子、 cDNA（例えば発現する配列タグ）、又はこれらを由来とするインサート (Nguyen et al., 1995, Genomics 29:207-209)のプラスミド又はファージ・クローンから作製される。
【０１２８】
アレイを構成する固体の支持体に核酸又は類似体を固定する多くの方法が当業で公知である (Schena et al., 1995, Science 270:467-470; DeRisi et al.,
1996, Nature Genetics 14:457-460; Shalon et al., 1996, Genome Res.
6:639-645; and Schena et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:10539-11286)。
【０１２９】
マイクロアレイを作製するもう一つの方法は高密度オリゴヌクレオチド・アレイを作製する方法である (Fodor et al., 1991, Science 251:767-773; Pease et al.,
1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026; Lockhart et al., 1996, Nature
Biotech 14:1675; 米国特許第 5,578,832号；第5,556,752号；及び第5,510,270号；Blanchard et
al., 1996, 11: 687-90)。
【０１３０】
マスキング (Maskos and
Southern, 1992, Nuc. Acids Res. 20:1679-1684)などによる他のマイクロアレイ作製法も用いてよい。原則的には、当業者が認識するところであろうが、例えばいずれかの種類のアレイ、ナイロンのハイブリダイゼーション膜上へのドット・ブロット（Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol.
1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい）が用いられよう。 
【０１３１】
マイクロアレイと接触させようとする核酸は多種の方法で調製でき、またその中には本発明のヌクレオチドを含めてよい。このような核酸はしばしば蛍光標識される。核酸のハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、標識された核酸の集団が、マトリックスに固定してある適した相補的な核酸に特異的にハイブリダイズすることとなるように選ばれる。標識された核酸のアレイへの非特異的結合は、アレイを大量の非特異的DNAで処置すること、所謂「ブロッキング」ステップにより減少させることができる。
【０１３２】
蛍光標識したプローブを用いる場合、転写産物アレイの各位部位における蛍光放出をスキャンニング共焦点レーザ顕微鏡法で検出してもよい。２つの蛍光体を用いる場合、適した励起線を用いた別々のスキャンを、用いた２つの蛍光体のそれぞれについて行う。蛍光マイクロアレイ・スキャナがアフィメトリックス社、パッカード・バイオチップ・テクノロジーズ社、バイオロボティックス社及び他の多くの業者から市販されている。シグナルを記録し、定量し、多種のコンピュータ・ソフトウェアを用いて解析する。
【０１３３】
本発明の方法によれば、２つの細胞又は細胞株中のmRNAの相対的発現量を、判定された摂動及びその規模（即ち、発現量は検査したmRNAの２つの源で異なる）か、あるいは摂動なし（即ち、相対的発現量が同じである）として採点する。ここで用いられる場合、２つの源のRNAの間で少なくとも約25% (一方の源からのRNA fromが他方の源よりも25%豊富である)、より通常では約 50%、更なる頻度では約２の因数（発現量が２倍）、３の因数（発現量が三倍）又は５の因数（発現量が５倍）の違いがあることを摂動として採点する。本検出法により、約２倍乃至約５倍のオーダーの違いの信頼性ある検出が可能であるが、より感受性の高い方法が開発されると予測される。
【０１３４】
摂動を正又は負として特定することに加え、摂動の規模を判定すると有利である。これは上述したように異なる示差的な標識付けに用いた２つの蛍光体の放出比を計算するか、あるいは、当業者には容易に明白であろう類似の方法により、行うことができる。
【０１３５】
いくつかの実施態様では、このような実験で得られるデータは、マイクロアレイで表される各遺伝子の相対的発現を反映するものである。こうして、様々な試料及び条件での発現レベルを多種の統計学的方法を用いて比較してよい。
【０１３６】
いくつかの実施態様では、当該の細胞は組織試料を含むが、この組織試料は組織マイクロアレイ上に存在してよい。例えばパラフィン包埋され、ホルマリン固定された標本を調製し、この標本の別々の区域からパンチ「生検」コアを採取してもよい。各コアを別々のレシピエント・ブロックに並べ、切片を切り出し、例えば以前にKonenen, J. et al., Tissue microarrays for high-throughput molecular
profiling of tumor specimens, (1987) Nat. Med. 4:844-7 及び Chung, G.G. et al., Clin. Cancer Res.
(In Press)に解説された通りに切片を切り出し、加工してもよい。
【０１３７】
他の実施態様では、当該の細胞は細胞培養ペレットを含むが、この細胞培養ペレットは細胞培養ペレット・マイクロアレイ上に存在してもよい。
【０１３８】
いくつかの実施態様では、数百又は数千の遺伝子ではなく、一種又は僅かに２、３種の遺伝子の発現を判定すれば充分である。マイクロアレイをこれらの実施例で用いてもよいが、多用な他の遺伝子発現検出法が利用できる。この項では、mRNAと、それにコードされたポリペプチドを検出及び定量する２、３の方法例を解説する。本方法の一番目のステップが細胞からのmRNAの単離を含む場合、このステップは上述のように行われてもよい。一種以上の核酸の標識付けは上述したように行われてよい。
【０１３９】
ある実施態様では、試料から得られたmRNAを逆転写により第一cDNA鎖にし、RT-PCRなどのPCRにかける。その発現にばらつきのないハウスキーピング遺伝子などの遺伝子を内部コントロール及び実験全体のコントロールとして用いてよい。PCR反応後、増幅後の反応物を電気泳動法で分離し、検出してもよい。定量的PCRを用いることにより、増幅後の産物のレベルは試料中に存在するRNAのレベルと相関することになるであろう。また増幅後の試料をアガロース又はポリアクリルアミドゲル上で分離し、フィルタに移し、このフィルタを、目的の遺伝子に特異的なプローブでハイブリダイズしてもよい。マルチプレックスPCRなどにより並行PCR増幅法を行うことにより、数多くの試料を同時に分析してもよい。
【０１４０】
「ドット・ブロット」ハイブリダイゼーションは広く用いられるようになり、多くのバージョンが開発された（例えばM. L. M. Anderson and B. D. Young, in Nucleic Acid
Hybridization-A Practical Approach, B. D. Hames and S. J. Higgins, Eds.,
IRL Press, Washington D.C., Chapter 4, pp. 73-111, 1985を参照されたい）。
【０１４１】
別の実施態様では、mRNA レベルをドット・ブロット分析及び関連する方法で判定する（例えば G. A. Beltz et
al., in Methods in Enzymology, Vol. 100, Part B, R. Wu, L. Grossmam, K.
Moldave, Eds., Academic Press, New York, Chapter 19, pp. 266-308, 1985を参照されたい）。
ある実施態様では、細胞から抽出された特定の量のRNAをフィルタにブロットし（即ち非共有結合させ）、このフィルタを目的に遺伝子のプローブとハイブリダイズさせる。一個のブロットが複数のRNAスポットを含むために多数のRNA試料を同時に分析できよう。ハイブリダイゼーションは、プローブの標識の種類に応じた方法を用いて検出される。別のドット・ブロット法では、ある一つの4Eレギュロン成分について一つ以上のプローブを メンブレンに付着させ、このメンブレンを、対象の細胞又は組織のRNAから得られた、そして選択的には同RNAを由来とする標識済み核酸と一緒にインキュベートする。このようなドット・ブロットは基本的にはマイクロアレイよりも少ない数のプローブを含むアレイである。
【０１４２】
所謂「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションと呼ばれる別のフォーマットは、オリゴヌクレオチド・プローブを固体の支持体に共有結合させ、それらを用いて核酸標的を捕獲及び検出するものである（例えばM. Ranki et al. (1983) Gene, 21:77-85; A. M. Palva, et al, in
UK Patent Application GB 2156074A, Oct. 2, 1985; １９８６年１月７日発行の米国特許第4,563,419号中のT. M. Ranki
and H. E. Soderlund ；１９８６年７月３日のPCT
WO 86/03782の A. D. B. Malcolm and
J. A. Langdale；１９８８年１月１４日発行の米国特許第4,751,177号中のY. Stabinsky；１９９０年２月２２日発行のPCT WO 90/01564中のT. H. Adams et al.； R. B. Wallace et al. (1979) Nucleic Acid
Res. 6,11:3543; and B. J. Connor et al. (1983) PNAS  80:278-282)。これらのフォーマットのマルチプレックス・バージョンは「逆ドット・ブロット」と呼ばれる。
【０１４３】
mRNAレベルはまたノーザン・ブロットでも判定できよう。特定の量のRNA をゲル電気泳動法で分離し、フィルタに移し、次にこのフィルタを目的の遺伝子に対応するプローブにハイブリダイズさせる。この方法は多数の試料及び遺伝子を分析しようとする場合には負荷が大きくなるが、大変正確であるという利点がもたらされる。
【０１４４】
遺伝子発現を高スループットで分析するもう一つの方法は、Velculescu et al. (1995) Science
270, 484-487で初めて解説された遺伝子発現の連続分析（SAGE）技術である。SAGEの利点の中には、ある細胞種で発現したすべての遺伝子の検出を提供するという可能性を有すると共に、このような遺伝子の相対的発現に関する定量的情報を提供し、２つの細胞中の遺伝子の遺伝子発現を容易に比較でき、検出された遺伝子を同定するために用いることのできる配列情報を生成するという点がある。これまでのところ、SAGE法は、多種の細胞種で調節下の、そして非調節下の遺伝子の発現を高い信頼性で検出できることが立証されている(Velculescu et al. (1997) Cell
88, 243-251; Zhang et al. (1997) Science
276, 1268-1272 and Velculescu et al. (1999) Nat.
Genet. 23, 387-388)。
【０１４５】
核酸を作製し、プローブする技術は、更に、例えばSambrook
et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)に解説されている。
【０１４６】
代替的には、4Eレギュロン成分の発現レベルをin situ ハイブリダイゼーションで判定する。ある実施態様では、組織試料を対象から得、該組織試料をスライスし、そしてin situ ハイブリダイゼーションを当業で公知の方法に従って行って、4Eレギュロン成分の発現レベルを判定する。
【０１４７】
他の方法では、4Eレギュロン成分の発現レベルを、4Eレギュロン成分にコードされたタンパク質のレベルを測定することにより、検出する。これは、例えば免疫沈降法、ELISA、又は免疫組織化学法を、当該遺伝子にコードされたタンパク質を特異的に検出する抗体などの作用物質を用いて行えよう。他の技術にはウェスタン・ブロット分析法がある。イムノアッセイは通常、細胞試料中のタンパク質レベルを定量するために用いられるが、他の多くのイムノアッセイ技術が当業で公知である。本発明は、特定の検定手法に限定されないため、同種及び異種の手法の両方を包含することを意図している。本発明に従って行えそうなイムノアッセイの例には、蛍光分極イムノアッセイ(FPIA)、蛍光イムノアッセイ (FIA)、酵素イムノアッセイ(EIA)、混濁阻害イムノアッセイ(NIA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、及びラジオイムノアッセイ (RIA)がある。指標部分又は標識基は当該の抗体に付着させてよく、利用できる検定装置や適合するイムノアッセイ法がしばしば決定要因となる多様な使用法の要件に合致するように選択される。上記の多用なイムノアッセイを行うために用いてもよい一般的な技術は当業者に公知である。
【０１４８】
細胞から分泌されるポリペプチドの場合、これらのポリペプチドの発現レベルを生物流体中で測定してもよい。
【０１４９】
上記の方法は、細胞培養で成長させた細胞を用いて行っても、あるいは、対象由来の細胞もしくは組織標本を用いて行ってもよい。
【０１５０】
標本は「観血的」又は「非観血的」試料採取手段のいずれかを用いて、検査対象の個体から得てよい。試料採取手段は、それが（特にマウス、ヒト、ヒツジ、馬、ウシ、ブタ、イヌ又はネコ科の動物を含む）動物の皮膚又は器官内から核酸を収集することを含めば「観血的」と言われる。観血的方法の例には、血液採集、精液採集、針バイオプシー、胸膜吸引、臍帯生検等がある。このような方法の例は Kim, C. H. et al. (1992) J. Virol. 66:3879-3882; Biswas, B.
et al. (1990) Annals NY Acad. Sci. 590:582-583; Biswas, B. et al. (1991)
J. Clin. Microbiol. 29:2228-2233に論じられている。更に、対象から細胞試料を得、それを所望の細胞種に濃縮することも可能である。例えば、所望の細胞種の細胞表面上のエピトープに結合する抗体による分離など、細胞を他の細胞から多種の技術を用いて分離してもよい。
【０１５１】
いくつかの実施態様では、一個の細胞を分析で用いる。また、対象から細胞を得、例えばRNAを抽出するもとのより大型の細胞集団を得るなどのためにこの細胞を in vitroで培養することもできる。非形質転換細胞の培養株、即ち初代細胞培養株、を樹立する方法は当業で公知である。
【０１５２】
個体を由来とする組織試料又は細胞から分析する場合、組織又は細胞を対象から摘出した後で遺伝子発現に更なる変化が起きないように防止することが重要であろう。発現レベルの変化は、例えば熱ショック又はリポ多糖（LPS）又は他の試薬による活性化など、摂動後の急速に変化することが知られている。加えて、組織及び細胞中のRNA及びタンパク質は急速に分解し易い。従って、ある好適な実施態様では、対象から得た細胞をできるだけ早く急速凍結させる。
【０１５３】
Ｅ．  4Eレギュロン成分に結合する作用物質
更に、4Eレギュロン成分に結合する作用物質も提供する。好ましくは、このような作用物質は常法に従って調製された、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む4Eレギュロン成分抗体又はその抗原結合フラグメントであるとよい。4Eレギュロン成分に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントは4Eレギュロン成分レベルを判定するために有用である。
【０１５４】
4Eレギュロン成分に結合すると共に4Eレギュロン成分レベルを判定するために有用である抗体及びその抗原結合フラグメントには、限定はしないが：4Eレギュロン成分又はそのフラグメントもしくは類似体に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントが含まれる。
【０１５５】
注目すべきことに、当業で公知であるように、ある抗体分子のうちのごく小さな部分であるパラトロープが抗体のエピトープへの結合に関与している（概略的にはClark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modem
Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York;
Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th
Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照されたい）。例えばpFc' 及び Fc 領域は補体カスケードのエフェクタであるが、抗原結合には関与していない。pFc' 領域を酵素切断してある抗体、又は、 pFc' 領域なしで作製された、F(ab')sub.2フラグメントと呼ばれる抗体は、インタクト抗体の抗原結合部位の両方を保持している。同様に、
Fc 領域を酵素切断してある抗体、又は、Fc 領域なしで作製された、Fabフラグメントと呼ばれる抗体は、インタクト抗体分子に抗原結合部位の一方を保持している。更に加工すると、Fab フラグメントは、共有結合した抗体軽鎖と、Fdと呼ばれる抗体重鎖の一部分とから成る。このFdフラグメントは抗体特異性の主要な決定基であり（一個のFd フラグメントは抗体特異性を変えることなる最高１０個の異なる軽鎖に繋げることができる）、Fd フラグメントは分離時でもエピトープ結合能を保持する。
【０１５６】
当業で公知であるように、ある一個の抗体の抗原結合部分内には、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（CDR）と、パラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（Fr）とがある（概略的にはClark,
W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modem Immunology, Wiley &
Sons, Inc., New York; Roitt, I.
(1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照されたい）。IgG免疫グロブリンの重鎖Fd フラグメント及び軽鎖の両方には、それぞれ三つの相補性決定領域（CDR1乃至CDR3）で分離された４つのフレームワーク領域（FR1乃至FR4）がある。CDR、特にCDR3 領域、より具体的には重鎖CDR3は抗体特異性を概ね担っている。
【０１５７】
今では、哺乳動物抗体の非CDR領域は、元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら同種又は異種抗体の同様な領域に置換できることが当業でよく確立されている。これが最もはっきり証明されたのは、非ヒトCDRをヒトFR及び／又はFc/pFc' 領域に共有結合させて機能的抗体を作製したヒト化抗体の開発及び利用である。例えば米国特許第4,816,567号、第5,225,539号、第5,585,089号、第5,693,762 号及び第5,859,205号を参照されたい。
【０１５８】
更に完全ヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックであるマウスを免疫することでも調製することができる。これらのマウス（例えばXenoMouse （Abgenix社）、HuMAb マウス（Medarex/GenPharm社））の免疫後、標準的なハイブリドーマ技術に従ってモノクローナル抗体を調製することができる。これらのモノクローナル抗体はヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有するため、ヒトに投与された場合でもヒト抗マウス抗体 (HAMA) 応答を惹起しないであろう。
【０１５９】
このように、当業者には明白であるように、本発明は、F(ab').sub、Fab、Fv 及びFd フラグメント；Fc 及び／又はFR 及び／又はCDR1 及び／又はCDR2 及び／又は軽鎖CDR3 領域が同種のヒト又は非ヒト配列に置換されたキメラ抗体；FR及び／又はCDR1 及び／又は CDR2 及び／又は
軽鎖CDR3領域が同種のヒト又は非ヒト配列に置換されたキメラ F(ab').sub.2 フラグメント抗体；FR 及び／又は CDR1 及び／又は CDR2 及び／又は軽鎖CDR3領域が同種のヒト又は非ヒト配列に置換されたキメラFab フラグメント抗体；及び FR 及び／又は CDR1 及び／又は CDR2 領域が同種のヒト又は非ヒト配列に置換されたキメラFd フラグメント抗体を提供するものである。更に本発明は所謂一本鎖抗体も含む。
【０１６０】
このように、本発明は4Eレギュロン成分ポリペプチド及び核酸に特異的に結合する数多くのサイズ及び種類のポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは抗体技術以外のソースからも得られよう。例えばこのようなポリペプチド結合性作用物質は、溶液中に、固定した形で、あるいはファージ・ディスプレイ・ライブラリとして容易に調製できる縮重ペプチド・ライブラリにより提供することができる。コンビナトリアル・ライブラリも、一種以上のアミノ酸を含有するペプチドから合成することができる。更にライブラリはペプトイド及び非ペプチド合成部分から合成することもできる。
【０１６１】
ファージ・ディスプレイは、本発明で有用な結合性ペプチドを特定する上で特に有効であろう。簡単に説明すると、４個乃至約８０個のアミノ酸残基のインサートを表示するファージ・ライブラリ（例えばm13、fd、又はラムダ・ファージを用いる）を調製する。このインサートは、例えば完全に縮重した又はバイアスのかかったアレイであってもよい。次に、4Eレギュロン成分分子に結合するファージ担持インサートを選択することができる。このプロセスは4Eレギュロン成分分子に結合するファージを複数回再選択するサイクルを通じて繰り返すことができる。反復することで特定の配列を担持するファージが濃縮される。DNA配列解析を行うことで、発現したポリペプチドの配列を特定することができる。4Eレギュロン成分分子に結合する配列の最小の直線部分を判定することができる。この最小直線部分の一部又は全部と、その上流又は下流の一つ以上の付加的な縮重残基とを含有するインサートを含有するバイアスのかかったライブラリを用いてこの手法を繰り返すことができる。酵母二種ハイブリッドスクリーニング法を用いても、4Eレギュロン成分分子に結合するポリペプチドを特定できよう。このように、4Eレギュロン成分分子を用いれば、ファージ・ディスプレイ・ライブラリを含むペプチド・ライブラリをスクリーニングすることで、4Eレギュロン成分分子のペプチド結合パートナーを特定及び選択することができる。
【０１６２】
ここで詳述するように、前述の抗体及び他の結合分子は、例えば組織試料中でのその発現を検出するためなど、4Eレギュロン成分を単離及び特定するなどのために用いられよう。抗体を、タンパク質又はそのフラグメントの撮像のために特異的診断用標識剤に結合させてもよい。標識の例には、限定はしないが、4Eレギュロン成分分子に融合させたときに、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)、強調緑色蛍光タンパク質(EGFP)、レニラ-レニフォルミス（原語：Renilla reniformis ）緑色蛍光タンパク質、GFPmut2、GFPuv4、強調黄色蛍光タンパク質、(EYFP)、強調シアン蛍光タンパク質
(ECFP)、強調青色蛍光タンパク質 (EBFP)、ジスコソマ（原語：discosoma）由来シトリン及び赤色蛍光タンパク質(dsRED)を含む、検出可能な蛍光シグナルを生ずる標識がある。 別の実施態様では、4Eレギュロン成分ポリペプチドを蛍光又は色素産生性標識に結合させる。多種の蛍光標識が、オレゴン州ユージーン、モラキュラー・プローブズ社のHandbook of Fluorescent
Probes and Research Products 8th Ed.
(2001)や他の多のメーカから入手可能であり、また広汎に解説されている。
【０１６３】
他の実施態様では、限定はしないがルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、分泌性胎盤性アルカリホスファターゼ、β-ラクタマーゼ、ヒト成長ホルモン、及び他の分泌性酵素受容体を含む、その存在又は活性により容易に検出可能である分子に4Eレギュロン成分を融合させる。
【０１６４】
Ｆ．  キット
本発明は上述の方法のいずれかの実施のためのキットを提供する。いくつかの実施態様では、キットは4Eレギュロン成分に対する抗体を含むであろう。他の実施態様では、キットは対象の細胞中のタンパク質のレベルを判定する適した試薬を含むであろう。
【０１６５】
更に他の実施態様では、キットは4Eレギュロン成分遺伝子のプローブを含むマイクロアレイを含むであろう。あるキットは4Eレギュロン成分の発現レベルを検出するための一つ以上のプローブ又はプライマ、及び／又は、プローブを上に付着させた固体の支持体であって 4Eレギュロン成分の発現を検出するために用いてもよい固体の支持体を含むであろう。あるキットは更にコントロール、緩衝液と、使用に関する指示とを含むであろう。
【０１６６】
キットはまた、例えば基準セットなど、多様な細胞又は疾患の状態と関連させた4Eレギュロン成分遺伝子発現レベルのライブラリを含むであろう。該キットは、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患を発症する傾向にある対象を特定したり、4Eレギュロン活性が機能不全である疾患のための治療薬を特定し、バリデートしたりするために有用であろう。ある実施態様では、該キットは、多様な細胞又は疾患の状態と関連させた一つ以上の遺伝子発現パターン、あるいは、少なくとも多様な細胞又は疾患の状態における4Eレギュロン成分の発現レベルを表す数値、を上に保存したコンピュータ読み取り可能な媒体を含む。該キットは、コンピュータ・システムのメモリにロードすることのできる発現プロファイル解析ソフトウェアを含んでもよい。
【０１６７】
キット成分を、前述の方法を手動又は部分的もしくは全部自動化して実施できるように梱包してもよい。キットに関係する他の実施態様では、本発明は、本発明の組成物と、選択的にそれらの使用に関する指示とを含むキットを考察するものである。このようなキットは、例えば撮像、診断、治療法、及び他の用途を含め、多種の用途を有するであろう。
【０１６８】
実施例
更に本発明を以下の実施例により描写することとするが、以下の実施例は何ら限定的なものと捉えられてはならない。本出願全体を通じて引用された文献、発行済み特許、公開済みもしくは非公開の特許出願を含むすべての参考文献の内容を、引用をもってここに援用することとする。本発明の実施にあたっては、そうでないと明示しない限り、当業者の技術範囲内にある、従来の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、顕微鏡学、組み換えDNA、及び免疫学の技術を用いることになるであろう。このような技術は文献に十二分に説明されている。（例えばMolecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor
Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover
ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al.
U.S. Patent No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames &
S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames
& S. J. Higgins eds. 1984);  (R.
I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL
Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984);
the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene
Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds.,
1987, Cold Spring Harbor Laboratory); , Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical
Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic
Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV
(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986) (Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986を参照されたい)。
【０１６９】
実施例１         リバビリンは4E-媒介性発癌性形質転換を7-メチルグアノシンmRNA キャップを物理的に模倣することにより抑制する 
真核性翻訳開始因子4Eは数多くのヒト癌では機能不全になっており、細胞でのその過剰発現は悪性の形質転換につながる。4Eの発癌性はmRNAの5'末端の7-メチルグアノシンへのその結合能に直接関係している。ここで我々は、抗ウィルス性グアノシン類似体であるリバビリンが4Eにマイクロモルの親和性で7-メチルグアノシンmRNA キャップが用いる機能的部位で結合し、4E:mRNA 結合に競合し、低マイクロモル濃度では、4Eの細胞レベル下での構造と、4Eが転写後調節するmRNAの輸送及び翻訳とを選択的に破壊することで、サイクリン D1などの腫瘍遺伝子のレベルを下げることを観察する。リバビリンはin vitroでのマウス細胞、in vivoでの4E依存的ヒト扁平細胞癌のマウスモデルの腫瘍成長、そしてヒト患者を由来とする4E依存的急性骨髄性白血病細胞のコロニー形成、の4E媒介性発癌性形質転換を潜在的に抑制する。これらの発見はリバビリンの特異的で強力、かつまだ人の目に触れたとこのない機序を解説するものである。量子力学及びNMR構造研究で、優れた細胞増殖抑制性及び抗ウィルス特性を持つ誘導体の開発に対して方向が示される。まとめると、リバビリンの4Eとの関係は、ヒト癌における新生物形成及び腫瘍性を維持及び亢進する転写後ネットワークの破壊のための薬理学的手段を提供するであろう。
【０１７０】
概略的方法
試薬．  試薬はすべて、トリス-カルボキシエチルホスフィン（ピアース社）、Nonidet P-40 （ICN社)、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（ラブ・サイエンティフィック社）、及びリバビリン（カルビオケム社）を除き、シグマ−アルドリッチ社のACS級のものだった。市販で入手できるリバビリン（データは図示せず）には毒性の高い混入物質が存在するため、リバビリン及び7-メチルグアノシン(m7G)
を逆相高性能液体クロマトグラフィ（ウォーターズ社）で半分離用C8 カラム（Vydac社） 及び0.1% (vol/vol) 水性トリフルオロ酢酸中で線形アセトニトリル勾配にして精製し、凍結乾燥させ、使用時まで乾燥器中で−20°Cにして保管した。これにより、酸化アルミニウムシリカ上で47:3 ジクロロメタン：メタノールでの薄層クロマトグラフィと、電気スプレーイオン化MS （データは図示せず）で測定したところ>99.99%の純度が得られた。Rib4C
(1-β-D-リボフラノシル-1,2,3-トリアゾール-4-カルボキサミド) は 99.98% の純度であり、 Zhi Hong (ICN社)氏よりご厚誼で得られた。リバビリン-5' トリホスフェート (RTP) はジェナ・バイオサイエンス社から得られた。
【０１７１】
タンパク質発現．  蛍光滴定に向けて、４つの非保存アミノ酸分でヒト4Eとは異なるマウス4Eを解説された通りに作製した。NMR分光法には、マウス4E をプロテインＧ（G4E、マサチューセッツ州ケンブリッジハーヴァード大学、ゲルハルド・ワグナー氏のご厚誼）のB1ドメインとの融合体としてBL21
(DE-3) 細胞で、18℃の0.8 mM イソプロピル-β-D-チオガラクトシド と一緒に２０時間、単独の窒素源として1 g/l 15NH4Cl を含有するM9 最小培地（ケンブリッジ・アイソトープ社）中でインキュベートすることにより誘導して発現させた。細胞を4℃で0.1 M NaCl/50 mM Tris・HCl (pH 7.5/0.5 mM EDTA/.5% (vol/vol) Nonidet
P-40/10 mM 2-メルカプトエタノール/1 mM
PMSF中で音波破砕することにより溶解させた。ライセートを 30,000 ´ gで遠心分離して清澄させ、m7G
ジホスフェート結合アガロース（アマーシャム・ファルマシア社製）に吸着させ、4℃の0.1 M NaCl/20 mM Tris・HCl (pH 7.5)/0.5 mM EDTA （緩衝液Ａ）でよく洗浄した。次に、ビーズを0.1 mM GTPの緩衝液Ａ溶液 で洗浄し、 G4E を 5 mM m7G の緩衝液Ａ溶液中に溶離させた。溶離物を 20 mM Na2PO4
(pH 7.5) で希釈してNaCl 濃度を50 mMに減らし、セファロース Q 陰イオン交換カラム（アマーシャム・ファルマシア社製）に施し、NaCl を線形勾配にして4℃の20 mM Na2PO4 (pH 7.5) に入れたもので溶離させた。溶離物を4℃の 0.1 M NaCl/50 mM Na2PO4
(pH 6.5)/5 mM DTT でよく透析してapo-G4Eを生成させ、これをNMR分光法及び蛍光滴定で確認した。G4Eの純度及び正体は
SDS/PAGE及び電気スプレーイオン化MSで確認した。タンパク質をアミコン濃縮器（ミリポア社製）を用いて濃縮した。
【０１７２】
蛍光分光法．  解説された通りに手製の蛍光計を用いて蛍光測定を行なった。滴定はすべて、 0.3 M NaCl/10 mM Na2PO4 (pH 7.5)/1 m M 亜鉛を0.3 × 0.3 cm2 蛍光キュベット（ヘルマ社製）に入れたものの中で2 m Mの4E濃度で行った。収集した発光スペクトルを300 乃至450 で積分し、それぞれリバビリン及びRib4Cの265nmでの励起係数740 及び 970 M-1cm-1
を用いることで（データは図示せず）添加リガンドの固有蛍光を減算して、4E のスペクトル貢献度を判定し、内側のフィルタ効果と、滴定の過程で蛍光体希釈の結果起きるシグナルの小さな減衰とについて補正した。補正後の相対的蛍光輝度を正規化し、蛍光停止曲線を発見的単一部位結合発現に合わせた：
I/I0
= Kdn/(xn + Kdn)
但し式中、x はリガンド濃度であり、Kd は見かけの解離定数であり、そしてn はヒル係数である。
【０１７３】
m7G-セファロース・アフィニティ・クロマトグラフィ．  m7G-セファロース・ビーズ（アマーシャム・ファルマシア社製、20-m l のスラリ）を1.5 ml の 2 m M G4Eに結合させ、上述したように0.3
M NaCl/0.1 M リン酸ナトリウム (pH
7.5)/10 m M 無プロテアーゼBSA
(USB)/0.1% Nonidet P-40 （緩衝液Ｂ）中で３０分間、室温で精製した。ビーズを緩衝液Ｂで３回、洗浄し、緩衝液Ｂに入れた多様な濃度の RTP 又はm7GTP
と一緒に３０分間、室温でインキュベートした。下に説明するように、放出されたG4Eを緩衝液Ｂで３回、洗った後、m7G-セファロース に結合したままのG4Eをラエムリ緩衝液 (10% グリセロール/2% SDS/100 mM DTT/80 mM Tris・HCl/0.06% ブロモフェノール・ブルー、pH
6.8)中で沸騰させ、SDS/PAGEにかけ、ウェスタン・ブロット法を用いて視覚化した。見かけの阻害定数をKi = IC50 ・ Kd / (P + Kd)（但し式中、IC50 は見かけの50% 阻害性ヌクレオチド濃度であり、P は有効タンパク質濃度であり、そしてKd は見かけの解離定数である）を用いて判定した。
【０１７４】
細胞培養．  NIH 3T3 マウス線維芽細胞を37℃のDMEM (GIBCO/BRL)/10% (vol/vol) FBS/2 mM グルタミン酸／0.1 mg/ml ペニシリン-ストレプトマイシン中でコンフルエント以下濃度に5% CO2中で維持した。細胞処置に向けて、薬物を PBS (pH 7.4) に溶解させ、ろ過滅菌した。非処置細胞にはろ過滅菌したPBSを加えた。
【０１７５】
レーザ・スキャニング共焦点免疫蛍光顕微鏡法．  細胞をPBSで洗浄し、-20℃のメタノールで２０分間、固定し、PBS、10% (vol/vol) FBS、及び 0.1% (vol/vol) Tween 20 で３０分間、室温で遮断した。遮断した細胞を遮断溶液に入れたNopp140 [1:50 (2)],
Sc35 (1:50、ベクトン・ディッキンソン社)、及び 4E (1:50、トランスダクション・ライブラリーズ社) に対する一次抗体で３時間、室温で染色した。PBSで洗浄した後、細胞を遮断溶液に入れた二次抗体で３０分間、染色した：適宜、FITC結合ロバ抗ウサギ抗体（ジャクソン。イムノリサーチ社）、テキサスレッド結合ロバ抗マウス抗体、及びFITC結合ウサギ抗マウス抗体。次に、細胞をPBS で洗浄し、DAPI （ベクター・ラボラトリーズ社）を補ったVectashieldに載せた。Leica TCS-SP c共焦点顕微鏡を用いて100´ の光学倍率及び2´ のデジタル・ズームにし、488、568、又は351/364 nmの励起波長を用いて蛍光を観察した。チャンネルは全て、観察可能なクロストークもなく、別々に検出された。顕微鏡写真は300 nmの厚さの単一の光学切片を表し、１００個の細胞の代表である。
【０１７６】
細胞の画分．  細胞をPBSで洗浄し、4℃の0.14 M NaCl/10 mM Tris・HCl (pH 8.4)/1.5 mM MgCl2/0.5% (vol/vol) Nonidet P-40/1
mM DTT/100 単位/ml RNasin（プロメガ社製）中でゆっくりピペットしながら溶解させた。溶解後の懸濁液を 1,000 ´ g で３分間、4℃で遠心分離し、その上清を細胞質画分としてとって置いた。核ペレットを溶解緩衝液中に再懸濁させ、3.3% (wt/vol) デオキシコール酸ナトリウム及び6.6%
(vol/vol) Tween 40のうちの １０分の１容をゆっくりボルテックスさせながら加え、4℃で５分間、インキュベートした。 1,000 ´ g で３分間、4℃で遠心分離することで核を沈降させ、その上清（核後画分）を細胞質画分に加えた。この結果、光学顕微鏡で観察したところ細胞質の混入がほとんどないインタクト核が得られ、それはtRNALys 及びβ-アクチン含有量を用いても評価された。分画後の細胞質には核の混入がなく、U6 snRNA 及びSc35がないことでも示された。
【０１７７】
ノーザン分析．  全細胞又は核もしくは細胞質画分由来のRNAを、メーカの指示（GIBCO社）に従ったトリゾールを用いて抽出した。単離されたRNAを無RNaseの DNase I （プロメガ社）で処理し、5-m gアリクォートを1% ホルムアルデヒド・アガロースゲル上で溶解させ、正に帯電したナイロン・メンブレン（ニュージャージー州ナトリー、ロシュ社）に移した。メンブレンをULTRAhyb 緩衝液（アンビオン社）中で予備ハイブリダイズさせ、20 pM サイクリン D1 cDNA プローブ、5 pM β-アクチン cDNA プローブ、30 pM ビオチン化 tRNALys アンチセンス・オリゴプローブ、及び30 pM ビオチン化U6 小型核内 RNA アンチセンス・オリゴプローブでプローブした。cDNA プローブをBrightStar ソラーレン-ビオチンを用いてビオチン化し、CDP Star 化学発光法をメーカの指示（アンビオン社）に従って用いて観察した。バンド輝度及びフィルム応答をNIH IMAGEを用いて定量した。
【０１７８】
ウェスタン分析．  全細胞及び細胞質画分由来のタンパク質を0.15 M NaCl/50 mM Tris・HCl (pH 7.4)/1% (vol/vol) Nonidet P-40/0.25% (wt/vol) デオキシコール酸ナトリウム/1 mM EDTA/1 mM PMSFを用いて３０分間、4℃でインキュベートすることにより、抽出した。ビチンコニン酸（原語：bicinchoninic acid）−銅還元（ピアース社）
によりタンパク質濃度を判定し、20-m gのアリクォートをSDS/PAGEを用いて溶解させ、Immobilon-P メンブレン（ミリポア社）に移し、遮断し、4E (1:5000、トランスダクション・ライブラリーズ社)、サイクリン D1 (1:500、ベクトン・ディッキンソン社)、β-アクチン (1:5000、シグマ社)、c-myc (1:1000、ベクトン・ディッキンソン社)、及びSc35 （1:5000、サンタ・クルズ・バイオテクノロジー社）に対する一次抗体を用いてプローブした。結合した抗体を西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体（アマーシャム・ファルマシア社）及びSuperSignal West Pico 試薬をメーカの指示（ピアス社）に従って用いて化学発光により検出した。
【０１７９】
4Eの免疫精製及び準定量的RT-PCR．  3 ´ 107 個の細胞から単離した核を 0.3 M NaCl/50 mM Tris・HCl (pH 7.4)/0.05% (vol/vol) Nonidet P-40
(NET-2 buffer)に懸濁させ、手動ホモジナイザを用いて機械的に破砕し、4℃で１時間、インキュベートし、10,000 ´ gで遠心分離して沈降させた。セファロース結合プロテインＧ（アマーシャム・ファルマシア社） を３０分間、4℃で用いることで可溶性の核抽出物を予備清澄させ、 10 m g のマウス抗4E抗体（トランスダクション・ライブラリーズ社）と一緒に９０分間、4℃でインキュベートし、その後 0.5 mg 酵母 tRNA （シグマ−アルドリッチ社）、200 単位/ml RNasin （アンビオン社）、及びセファロース結合プロテインGを加えた後に一晩、4℃でインキュベートした。結合したセファロースを1 mg/ml ヘパリン（シグマ-アルドリッチ社）を添加した4℃のNFT-2緩衝液で一回、NET-2 緩衝液のみで６回、洗浄し、100 mM Tris・HCl (pH 6.8)/4% (wt/vol) SDS/20% (vol/vol) グリセロール/12% (vol/vol) 2-メルカプトエタノールに懸濁させ、98℃で５分間、インキュベートした。25:24:1 フェノール：クロロホルム：イソプロパノールで一回、クロロホルム：イソプロパノールで2回、RNAを抽出し、2.5 容の絶対エタノール、 0.1 容の5 M酢酸ナトリウム (pH 5.2)、及び20 m g のグリコーゲン（シグマ-アルドリッチ社）で-20℃で一晩沈降させ、 75%
(vol/vol) エタノールで洗浄し、水中に再懸濁させた。サイクリン D1のメッセンジャーRNAをProStar ファースト・ストランドRT-PCR 系をメーカの指示（ストラタジーン社）通りに用い、正方向 5'- TCTACACTGACAACTCTATCCG-3' (SEQ ID NO:2) 及び逆方向 5'- TAGCAGGAGAGGAAGTTGTTGG-3' (SEQ ID
NO: 3) プライマを用いて増幅した。リバビリンは核内の4Eのレベルを枯渇させるが、4E はそれでも尚、IP内（データは図示せず）に容易に検出され、重要なことに、同じ量のmRNAをRT-PCRに、用いたリバビリン濃度とは独立に用いた。このように、核内画分由来の4E-RNA結合を評価することができた。
【０１８０】
リボゾームの精製及び定量的RT-PCR．  細胞ペレット (500 mg) を、プロテアーゼ阻害剤 （無EDTA-コンプリート、ロシュ社）及び400 単位/ml の SUPERasine (アンビオン社)を添加した1 ml の氷温の溶解緩衝液 (20 mM Hepes/10 mM 酢酸マグネシウム/100 mM p酢酸カリウム、pH 7.5) に均質化し、時折ボルテックスしながら氷上で３０分間、インキュベートした。ライセートを4℃、１０分間の3,000 ´ g で沈降させて核及び細胞破片をペレットにした。上清を4℃２０分間の12,000 ´ g で沈降させてミトコンドリアをペレットにした。次に、清澄した上清を4℃、５０分間の 50,000 rpm (SW 50.1 ロータ、ベックマン社) で沈降させてリボゾームをペレットにした。リボゾームのペレットを200 m l の氷温の溶解緩衝液に再懸濁させ、溶解緩衝液で緩衝した 10-40% ショ糖勾配の上に積層させ、
50,000 rpm で4℃で８０分間、遠心分離した。画分のRNA含有量を260:280 nmの吸光比を用いて確認した。Trizol をメーカ（GIBCO社）に指示通りに用いてRNAを単離した。各画分由来のRNAを分光法で定量し、Sensiscript
逆転写キット（カリフォルニア州バレンシア、キアゲン社）を用いることで40 ng を cDNAに変換した。Opticon熱サイクラー（マサチューセッツ州ウォルサム、MJリサーチ社）でQuantiTect
SYBR グリーン・リアルタイム PCR キット（キアゲン社）を用いることで、定量的リアルタイムPCRを三重にして行った。以下の遺伝子特異的プライマを用いた：正方向5'-
ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (SEQ ID NO: 4) 及び逆方向5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (GAPDH, SEQ ID NO: 5)、正方向 5'-CCTGACACCAATCTCCTCAACG-3' (SEQ ID NO:
6) 及び逆方向 5'-
TCTTCGCACTTCTGCTCCTCAC-3' (サイクリン D1, SEQ ID
NO:7)、正方向5'-
TGCCAAGTGGTCCCAGGCTG-3' (SEQ ID NO: 8) 及び逆方向 5'-CGGCTTGAAGATGTACTCTAT-3' (VEGF, SEQ ID NO: 9)、及び正方向5'- GCATCAGCTTTCACGCTTG-3' (SEQ ID NO:
10) 及び逆方向5'-
TCACCCACATGCATTTCAGG-3' (ODC, SEQ ID NO: 11)。得られたリアルタイムPCRプロファイルをOpticon ソフトウェア（MJリサーチ社）を用いて解析した。
【０１８１】
形質転換検定．  細胞に5 m g の pMV、pMV-4E、又は pMV-4E 変異体GeneJammer 試薬をメーカ（ストラタジーン社）の指示通りに用いてトランスフェクトし、1 mg/ml G418 スルフェートを４８時間用いて選抜した。選抜された形質転換体を100-mm2 の皿１枚当たり20,000個の細胞密度でプレートし、1
mg/ml G418 スルフェートの存在下で１０日間、維持した。皿をPBSで洗浄し、メタノールで固定し、ギムザで染色した。焦点を手で計数し、実験を個別に３回、繰り返した。焦点形成の確率を、光回折の減少を有すると共に>50個未満である細胞の数を20,000で除算した焦点数で表す（100-mm2 皿一枚当り）。
【０１８２】
蛍光活性化細胞スキャニング．  ネクローシス及びアポトーシスの評価に向けて、細胞をPBSで２回、洗浄し、4℃の0.14 M NaCl/10 mM Na-Hepes (pH 7.4/2.5 mM
CaCl2 に1ml当り 106 個の細胞密度になるように懸濁させ、 5 m g/ml ヨウ化プロピジウム及びFITC結合アネキシンＶ（ベクトン・ディッキンソン社）で１５分間、室温で染色した。その直後、細胞を洗浄し、FACSCalibur 蛍光活性化細胞スキャナ（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて分析した。細胞周期プロファイルの評価に向け、細胞をPBSで洗浄し、固定し、70%
(vol/vol) エタノールで３０分間、4℃で透過可能にし、10 m g/ml ヨウ化プロピジウム及び30 単位/ml RNase A を含有する37℃のPBS中で３０分間、インキュベートした。
両方の測定について、検出装置のゲイン及び補償設定値は未染色の細胞の自己蛍光及びチャンネル・クロストークを抑えるように調節した。細胞周期分析については、ヨウ化プロピジウム・チャンネルを光散乱に基づいてゲート開口させて、観察される蛍光輝度を人為的に歪めかねない塊になった細胞を排除した。
【０１８３】
テトラゾリウム染料還元．  細胞をウェル一つ当り 5,000 個の細胞になるように播種し、９６ウェルプレートのウェル１つ当り100 m l に維持した。試薬を37°Cまで温めた後、5 ml のナトリウム3'-[1-(フェニルアミノ-カルボニル)-3,4-テトラゾリウム]-ビス (4-メトキシ-6-ニトロ) ベンゼンスルホン酸ヒドレート
(XTT、ロシュ社)を 1 mg/mlになるように RPMI 培地1640 にフェノールレッド (GIBCO社)なしで溶解させたものを 0.1 ml の N-メチル ジベンゾピラジンメチルスルフェート (PMS, Roche) を0.38 mg/mlになるようにPBSに溶解させたものに混合した。混合直後、50 m l のXTT-PBS 溶液を各ウェルに加え、細胞を２乃至４時間、37℃でインキュベートした。ホルマザンの生成を、m Quant プレート・リーダ
(Bio-Tek インスツルメンツ社)を用い、50 m l の RPMI 培地 1640 をフェノール・レッドなしで含有する試料の吸光度の違いを参照しつつ、492 及び690 nmでの吸光度の違いを観察することで定量した。実験はすべて３回、繰り返された。
【０１８４】
初代ヒト白血病患者細胞を用いることによるコロニー形成性検定．  急性骨髄性白血病（AML）M1、M5、及び正常な骨髄の標本を患者から分離し、記載するように処理した。初代AML 細胞をケンタッキー大学医療センターのマーキー癌センター（ケンタッキー州レキシントン）の患者の末梢血から得た。正常な骨髄を病理分析、外科的骨髄採取、又はナショナル・ディジーズ・リサーチ・インターチェンジ（フィラデルフィア）の後の廃棄材料として得た。組織はすべて、インスティテューショナル・レビュー・ボードの認可及び適したインフォームド・コンセントの下で得られた。凍結させたCD34+ 前駆細胞を、10%
(vol/vol) FBSを添加したイスコーブの改良ダルベッコ (IMD) 培地で解凍した。Trypanブルー排除を用いて生存細胞を計数し、10% (vol/vol) BIT 9500 （ステム・セル・リサーチ社）、2 mM グルタミン（シグマ社）、 50 m g/ml 低密度リポタンパク質（シグマ社）、及び50 m M 2-メルカプトエタノールを添加した1% (vol/vol) H4100 メチルセルロース IMD 培地（ステム・セル・リサーチ社）に再懸濁させた。細胞を 35mmの皿１枚当り2,000 生存細胞／1.1 ml の培地になるようにプレートし、多様な濃度のリバビリンの存在下で１４日間、培養した。20 個を越える細胞があるコロニーを手で計数し、実験を４回、繰り返した。
【０１８５】
ヒト扁平細胞癌のマウスモデル．  メスの５乃至７週齢の無胸腺NCr-nu/nu マウスをタコニック農場から得た。下咽頭扁平細胞癌由来のヒトFaDu 細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得た。マウスの右側の腹に0.5 ´ 106 個の細胞を50 m l PBSに入れたものを皮下接種し、それぞれ１０匹のマウスから成るグループに無作為に分類した。移植から１週間後に処置を各日、40 m g/kg リバビリンの用量にして施与した。腫瘍の大きさを腫瘍の直径を測定することで確認し、統計学的有意さペアードt検定を用いて確認した。
【０１８６】
静電特性の計算．  グアノシン、m7G、リバビリン (1-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド)、Rib4C (1-β-D-リボフラノシル-1,2,3-トリアゾール- 4-カルボキサミド)、ICN3297 (1-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキシレート)、及びチアゾフリン (2-β-D-リボフラノシル-4-チアゾールカルボキサミド)の分子ジオメトリを
AMBER94を用い、INSIGHT 2000 （サンディエゴ、アクセルリース社）で実施し、Moller-Plesset
(MP2) 摂動理論を6−31G+(d) 軌道基礎設定値として用いて至適化し、真空中での点電荷適合によりパラメータ化し、Gaussian 03 (ゴーシアン社)で実施して作製した。水溶液中の静電電位はポワゾン−ボルツマンの近似法を誘電定数を80にし、GRASPで実施して用いて計算された。
【０１８７】
NMR分光法．  1H、15N 異核単一量子相関 (HSQC) スペクトルを 500 MHz
Bruker DRX 分光計を 0.1 M NaCl/50 mM Na2PO4
(pH 6.5)/5 mM DTT/5% (vol/vol) D2Oで、288 及び298 Kで用い、0.8 mMのタンパク質濃度を用いて記録した。G4Eの主鎖の1H、15N 共鳴 G4E を、ヒト4Eの1H, 13C, 15N 共鳴割り当てから、1H
及び15N の寸法中でそれぞれ0.02 及び0.2 ppmの許容差に対する直接的スペクトル結合により得、 4E構造に広く分布した、64のくっきりした共鳴がG4Eに割り当てられた。HSQC 滴定を m7G
及びリバビリン の0.1 M NaCl/50 mM Na2PO4 (pH 6.5)/5 mM DTT/5%
(vol/vol) D2O溶液と、0.3:1 乃至 5:1という範囲のリガンド：タンパク質比とを用いて行った。リバビリン結合の構造パラメータ
は15N−編集あり、 15N−フィルタあり、及び二重 15N−編集あり、 1Hフィルタありの 1H NOESY 分光法を用いて判定された。観察される核オーバーハウザー効果強度に対するスピン散乱の寄与度が50 乃至250 msecの範囲の混合時間を用いて評価されたが、混合時間に対する核オーバーハウザー効果移動の線形依存性から評価すると、180msの混合時間を用いたスピン散乱には有意な寄与度はなかった。NMRPIPE/NMRDRAW を用いてスペクトルを処理し、NMRVIEWを用いて解析した。
【０１８８】
結果及び議論
m7G mRNA キャップの哺乳動物4Eへの高親和結合は、メチル化した、ひいては正に帯電した第四級アミンm7Gbase を、陽イオン−pi及びpi−piの相互作用の結果として芳香族の積層を形成する2つの保存されたトリプトファンW56 及びW102が特異的に認識することによる。
【０１８９】
無電荷の第三級網のグアノシンの4Eへの結合は５０００分の１を超えて弱い。1,2,4−トリアゾールのpKa値は１２より大きいため、それらは生理的ｐＨではプロトン化し、従って正の電荷を持つため、我々は4Eが推定上陽イオン性のリバビリンの1,2,4−トリアゾール−3−カルボキサミドに結合するかどうかを調べた（図１）。In vitroにおいて4E のその核内リガンドに対する親和性は、リガンドが結合すると、それに積層したトリプトファンの蛍光を消光するトリプトファン蛍光発光分光法を用いることにより、測定することができる。m7G ヌクレオシドのそれと同様に、リバビリンは4E に8.4 uMの見かけのKdで結合する（図１ａ及び１ｂ）。キャップ結合部位のうちでトリプトファンの一つ、W56A、が変異すると、親和性が１４分の１に低下するが、キャップ結合部位から離れた、4Eの背中側表面にあるW73Aが変異してもリバビリン親和性には何の有意な効果もない（図１ａ及び１ｂ）。同様な結果がm7Gを用いて得られる。更に、抗ウィルス性及び細胞効果の低下を示すと共に、pKaがより低い無電荷の1,2,3−トリアゾールを含有する、リバビリン類似体である1−B−D−リボフラノシル−1,2,3−トリアゾール−4−カルボキサミド(Rib4C)は4Eに結合できない。リバビリンは細胞内ではほぼ完全にRTPに変換されるため、我々は4E のRTPへの親和性を測定した。4E はRTP 及びm7GTP に、約0.1 uMという同等な見かけの解離定数で結合する（図１ａ及び１ｂ）。m7G−セファロース・アフィニティ・クロマトグラフィを用いることにより、我々は RTPが 4E:m7G 結合に見かけの阻害定数 (Ki) 約 0.3 uMという、m7GTP 自体とはほぼ区別のつかない程度、結合することを観察する（図１ｃ）。全てにおいて、これらの結果はリバビリンが4Eに高親和性で、キャップ結合性トリプトファンとの陽イオン性相互作用の結果、5’ m7G mRNA キャップが用いる機能的部位で結合することを示しており、リバビリン が細胞内でm7G 5’ mRNA キャップの4Eへの結合と競合することを示唆している。
【０１９０】
哺乳動物細胞においては、4Eの機能はその細胞レベル下構造に依存する。細胞質内では、4Eはリボゾームに結合しており、m7G キャップ依存的mRNA翻訳で機能する。4Eを上方調節すると、感受性mRNAのうちで特異的な集団、mRNA翻訳のレベルで4Eにより転写後調節されるもの、の翻訳が増加する。核内では4Eは、4E核小体と呼ばれる多タンパク質構造を形成し、mRNA転写産物の特異的集団の核−細胞質mRNA輸送における役割を果たす。これらの構造の形成及び機能は4Eの mRNAキャップ結合に関係している。なぜなら、透過性にした細胞を過剰量のm7Gキャップ類似体で処置すると、4E核小体は破壊されるが、他の亜核構造は破壊されないからである。これと合致するように、4E体を破壊すると核−細胞質4E依存的mRNA輸送が妨げられる。
【０１９１】
リバビリンはin vitro では4Eに高い親和性で結合して 4E:m7G 結合と競合するため、我々はそれが細胞内の4Eの細胞レベル下構造に影響を与えるかどうかを調べた。このように、我々はNIH 3T3 線維芽細胞を多様な濃度のリバビリンで４８時間、処置し、共焦点顕微鏡法と共に免疫蛍光法を用いることでそれらの細胞レベル下構造を観察した。
【０１９２】
リバビリン処置はクロマチン構造（DAPI）、核及びカハール体の構造（核小体タンパク質Nopp140）、スプライシングのスペックルの構造 (Sc35 ドメイン)、及び細胞の形態（図２ａ）には何の明白な効果も有さない。対照的に、リバビリン処置により4E核小体が破壊されるが、この効果は1
uMで明らかとなり、10 uMではほぼ完全となる（図２ａ）。この効果を確認するために、我々は細胞を分画し、核及び細胞質画分中の相対的タンパク質発現量をウェスタン・ブロット法を用いることにより調べた。上記の顕微鏡研究と合致するように、リバビリン処置の結果、4Eが再分布するが、主に核内のSc35
及び細胞質側のB−アクチンの分布には影響がない（図２ｂ）。重要なことに、リバビリン処置では4Eの総タンパク質レベルには変化がないが、該タンパク質の大半が細胞質へ再局在化する。このように、リバビリンは、4Eにより転写後調節を受ける遺伝子のmRNA輸送及び翻訳に干渉すると考えられる。
【０１９３】
この可能性を直接検査するために、我々はリバビリンで処置された細胞を分画し、核及び細胞質画分のサイクリン D1 mRNAレベルを、細胞レベル下分画及びノーザン・ブロット法を用いるか、あるいは個別に定量的PCR法を用いることにより観察することで、核−細胞質mRNA輸送に対する効果を評価した。リバビリン処置はサイクリン D1 mRNAの核−細胞質輸送 をほぼ1uMの見かけのEC50で妨げ、100uMではほぼ完全な核内保持がある。
【０１９４】
他方、Ｂ−アクチン及びVEGF mRNA の核−細胞質輸送は 100 uMでも影響を受けず（図３ａ及び４ｂ）、それらの輸送に4E活性に対する非感受性と合致する。リバビリン処置はプレ−mRNAのスプライシング及び5'側キャッピングには影響を与えないようである。なぜなら、共転写キャッピングがプレ−mRNAスプライシングには必要だからであり、サイクリン D1 及びB−アクチン mRNAの両者とも、正しくスプライシングされたからである。（図３ａ）。更に、リバビリンは、メチルホスフェート・キャップ構造のついた核内RNA、例えばU字小型核内RNAなど、の発現又は局在化に影響しないようである。なぜなら、U6 小型核内RNAのレベル及び分布は影響を受けないからである（図３ａ）。同様に、リバビリン処置はmRNAの転写及び安定性には何の影響も有さない。なぜなら、サイクリン D1、VEGF、及びB−アクチンmRNAの合計定常状態レベルは影響を受けないからである（図３ｂ及び４）。
【０１９５】
我々は我々の研究を拡張し、4Eにより翻訳上調節されるmRNAのポリソーム装荷を観察することにより、細胞質内でのmRNA翻訳に対するリバビリンの効果を調べた。ポリソーム画分を調製し、mRNA 含有量をリアルタイムPCRを用いることで評価した。リバビリン処置は、サイクリン D1 mRNAのポリソーム装荷プロファイルには何の有意な効果も有さず（図４ａ）、翻訳レベルでのサイクリン
D1 レベルの4Eによる調節不在と合致する。対照的に、リバビリン処置の結果、VEGF 及びODC mRNAがより重いポリソームから、翻訳効率のより低い軽いモノソーム画分へと移行する。ポリソーム装荷量の減少は１０００分の１を超え（図４ａ）、4EによるVEGF 及び ODC レベルの翻訳調節と合致する。このように、リバビリン
に対する遺伝子の見かけの感受性は、どの遺伝子が影響を受け、調節レベルが影響を受けるかという点で、4Eによる調節に対するそれらの感受性と並行する。多くの遺伝子が4Eにより転写後調節されるため、我々はモデル転写産物としてサイクリン D1 に焦点を当てた。なぜなら4EのそのmRNA転写産物調節能はよく特徴付けられているからである。
【０１９６】
リバビリン処置の結果、サイクリン D1タンパク質のレベルは0.1-1 uMという見かけのEC50で減少する（図３ｂ）が、これは、ほぼ1uMのEC50で核−細胞質サイクリン D1 mRNA 輸送をそれが阻害することと合致する（図３ａ及び４）。対照的に、in vitroで4Eに結合しないRib4Cによる処置（図１）は細胞内でのサイクリン D1タンパク質産生を抑制することができない（図３ｃ）。さらに、4Eによる転写後調節を受けないB−アクチン及び4Eタンパク質のレベル （図３ａ）はリバビリン処置で減少することはない（図３ｂ）。このように、リバビリンの4Eとの特異的相互作用が、サイクリンD1の4E依存的mRNA 輸送を抑制するというリバビリンの能力には必要なのである。
【０１９７】
我々は、4Eが4E依存的mRNA輸送に対して感受性の転写産物（例えばサイクリンD1）と、そして翻訳レベル（例えばVEGF）で、一緒になってリボ核タンパク質を形成する4Eの能力を直接変化させるリバビリンの能力を検査した。このように、我々はリバビリン処置細胞の核から4Eを免疫精製し、そのmRNA含有量を準定量的RT−PCR を用いて評価した（図３ｄ）。  リバビリン処置により、細胞内での 4Eのサイクリン D1 mRNAへの結合が、ほぼ1uMという見かけのEC50で阻害される（図３ｄ）が、このEC50はin vitroにおけるそのトリホスフェートの4Eへの結合のKd（図１）と、そして細胞内での核−細胞質サイクリン D1 mRNA輸送の阻害、及びサイクリン D1
タンパク質の枯渇と同様である（図３）。同様に、細胞質内4E:VEGF mRNA 複合体は1uM のリバビリンによってですら部分的に損なわれ（図３ｄ）、リバビリンのポリソーム装荷における観察される変化と合致する（図４）。
【０１９８】
重要なことに、細胞質内4E:アクチンmRNA複合体は、100 uM のリバビリンによっても破壊されず、アクチンタンパク質レベルのリバビリンに対する非感受性と一致する。リバビリンの効果は’サイクリン D1 mRNA 輸送及びVEGF mRNA翻訳の4E媒介性調節に限られない可能性が高く、4Eにより転写後調節される他の遺伝子も含まれるであろう。
【０１９９】
4Eは過剰発現すると細胞の悪性形質転換を引き起こす。変異原性研究では、その腫瘍形成特性は、少なくとも部分的には、腫瘍遺伝子及びサイクリンD1などの成長調節性遺伝子のmRNAの輸送調節不全が原因であることが示唆される。従って我々は、リバビリン処置と、それによる4E依存的なmRNA輸送及び翻訳の阻害が4E媒介性発癌性形質転換を抑制するかどうかを調べた。我々はNIH 3T3 細胞で4Eを過剰発現させ、接触成長阻害の消失の結果としての焦点形成を観察することにより、形質転換を検定した。トランスフェクト細胞における4Eレベルはコントロール細胞での内因性レベルの１０倍であり（図５ａ）、焦点形成における形質転換及び有意な増加が導かれる（図６ａ）。4E W56A キャップ結合変異体を過剰発現させても細胞は形質転換させられず（図６ａ）、野生型4Eと同様なレベルで発現はしたが、先の研究と一致した。リバビリンはという見かけのEC50で4E媒介性形質転換を抑制する（図３ａ及び３ｂ）。対照的に、Rib4C を添加しても、たとえ100 uMという量であっても形成される焦点数を減少させられず（図３ａ）、それがin vitro では4Eに結合できず、また細胞内ではmRNA輸送及び翻訳の4E媒介性調節も阻害できないことと合致する（図１及び３ｃ）。形質転換で観察される抑制は代謝毒性又は細胞死といった非特異的効果が原因ではない（図５ｂ）。更に、低マイクロモル濃度のリバビリンはG1細胞周期停止を誘導する（図５ｃ）が、これはリバビリンによるサイクリンD1の下方調節と一致する（図３ｂ）。
【０２００】
in vivo におけるリバビリンの腫瘍成長に対する効果を調べるために、我々は、急性骨髄性白血病）（AML）患者由来の初代骨髄前駆細胞と正常な骨髄を由来とする匹敵する細胞の標本を得た。以前の研究では、AMPの下位集団が大変高いレベルの核内4Eを有すること、そしてサイクリン D1 mRNA 輸送はこれらの細胞では実質的に上方調節されていること、が示されている。核内4Eレベルの減少の結果、サイクリン D1 mRNA 輸送は正常なレベルまで減少した。このように、我々はリバビリン がこのAML下位集団の成長を特異的に変化させるかどうかを調べた。分離されたCD34+ 前駆細胞をメチルセルロース培地に再懸濁させ、多様な濃度のリバビリンの存在下で１４日間、培養してそれらのコロニー形成能を評価した。リバビリンは初代AML−M5 （フランス−アメリカ−英国分類）前駆細胞のコロニー形成を、ほぼ1 uM の見かけのEC50で強力に抑制し（図６ｂ）、それらによる4Eの過剰発現及び調節不全と合致した。
【０２０１】
対照的に、同様な濃度のリバビリンはAML−M1 前駆細胞のコロニー形成を抑制できず（図６ｂ）、これらの細胞において4Eレベルが上方調節されないこと、そしてサイクリン D1 mRNA 輸送が調節不全とならないことと合致した。このようなマイクロモル濃度でのリバビリンの腫瘍抑制効果は、ミリモル濃度時の正常な骨髄の骨髄様前駆細胞のコロニー形成に対する効果不在でも明白ないように、ミリモル濃度でのその細胞毒性（図５ｂ）とは異なる（図６ｂ）。リバビリン処置により、ヒト扁平細胞癌のマウスモデルでは腫瘍成長に著しい抑制が起きた（図５ｃ）。我々は下咽頭扁平細胞癌由来のFaDu 細胞を用いたが、それはなぜならこれらが4Eを過剰発現すると共に、非悪性上皮細胞に比較して、ヌードマウスで腫瘍を形成するからである。
【０２０２】
重要なことに、アンチセンスRNAを用いて4Eのレベルを非悪性レベルまで減少させるとこれらの細胞は著しく低発癌性となる。従って、ヌードマウスに4E−依存的FaDu 細胞を皮下注射することにより移植して、40 ug/kg リバビリン で各日経口処置することで、ほぼ1uMという平均体内濃度にした。リバビリン処置から２０日後には処置群の動物の平均腫瘍体積は未処置のコントロール群のそれの６分の１だった（P = 0.023, n = 10; 図６ｃ）。この低濃度では、リバビリンは明らかによく寛容されており、毒性も最小限であり、そのことは処置に付随する死亡数がないこと、そして体重に対する効果がないことでも示唆された（データは図示せず）。このように、低マイクロモル濃度でのリバビリンの4E阻害はin vitro 及び in vivoでの4E媒介性発癌性形質転換及び腫瘍抑制の阻害と相関する。
【０２０３】
4Eによる m7G mRNA キャップの結合は、その核−細胞質mRNA輸送、細胞質内翻訳、及び発癌性形質転換に必要である。4Eによるm7G キャップの高親和結合は、陽イオン性のメチル化塩基の特異的認識の結果、達成される。その中性の類似体であるRib4Cにはできないが、リバビリンは4Eにin vitroでm7Gキャップと同じ見かけの親和性で結合し、4Eの対mRNA’結合能と、細胞内のmRNA輸送及び翻訳で働く能力を阻害することから、我々は、4Eによるリバビリン及びm7G
mRNA キャップの同一性の程度及び分子的認識を評価した。従って我々は4Eの1H、15N 異核単一量子相関NMR 分光 (HSQC NMR) 滴定をm7G及びリバビリンを用いて行った。1H, 15N HSQC NMR 分光法では、ポリペプチド骨格の個々の15NH アミドの化学的環境について報告を行うことで、リガンド結合の感受性プローブと、付随するコンホメーション上の転位を提供する。
【０２０４】
溶液中では、 4Eは低及び高親和性のコンホメーションで存在し、CD分光滴定を用いても観察されるように、その相互転化はPMLなどのパートナータンパク質や m7G mRNA キャップなどのリガンドの結合によって調節を受ける。ここで我々が、HSQC NMR 滴定を用いることでapo− からm7G結合型4Eへの転化時の同様な現象を観察すると、4E中の217個の残基のうちで取り上げられた、当該構造全体に分布する６４の残基のうちの１９個の構造形成又は再構築（図７ａ）があることが分かり（図７ｃ）、CD測定とも一致する。これらの残基には、m7Gbaseに積層し、W102やリボースと配位するK106を持つS7/S8 ループがある（図７ｃ）。 他方、S1/S2 ループはapo−4E内で高い親和性のコンホメーションで予備構築しており、そのW56は、キャップ結合時にも、共鳴強度又は化学シフトに何ら有意な変化は示さな（図７ａ）。驚くべきことに、apo−4E のリバビリン結合型4Eへの転化には、ほぼ同一のコンホメーション上の転位が伴っており、S1/S2 lループ及びW56には摂動はほとんどなく、S7/S8 ループ及びW102 には有意な構造形成があり（図７ｂ）、このことは4Eのキャップ−及びリバビリン結合型スペクトルがほぼ正確に重なることでも示される（図７ｂ）。これらのデータは、W56A変異体でのリバビリン親和性低下と、4Eへの結合をめぐってm7Gと効率的に競合するリバビリンの能力と合致するものである（図１）。
【０２０５】
ヌクレオシド飽和型4Eの二重 15N−編集あり、フィルタありの1H, 1H NOESY スペクトルで、分子間NOE移動の結果、ヌクレオシドに近い(<5 オングストローム)ところで4Eの15NH 基が特異的に特定されることは、リバビリン
及びm7G の結合部位が重複することと合致する（データは図示せず）。このように、4Eはm7Gキャップと同様な態様でリバビリンに結合及びリバビリンを認識し、このことはそれらの結合活性が似ていることと合致する（図１）。m7Gのリバビリンによる模倣の生理的起源を評価するために、我々はアブ・イニシオ量子機械的及び連続静電法を用いることにより、グアノシン及びリバビリン類似体の静電特性を計算した。m7G及びリバビリンのみがそれらの芳香環で著しい電気陽性特徴を示す（図８）。他のヌクレオシド塩基は、多様な程度及びパターンの電気陰性を示し、その中には、生理的ｐＨでは1,2,3−トリアゾールのためにプロトン化しておらず無電荷になっている不活性のリバビリン類似体Rib4Cや、その酸化カルボキサミドのために中性である不活性のリバビリン代謝産物 ICN3297（データは図示せず）、そのチアゾールのために中性であるグアノシン類似体及びイノシンモノホスフェート脱水素酵素阻害剤チアゾフリン、そして無電荷のグアノシン自体がある（図７）。このように、リバビリンはm7Gの物理的模倣体なのである。
【０２０６】
細胞内には、4Eとキャップ結合複合体（CBC）という二つの主要なキャップ結合性タンパク質がある。両方のタンパク質ともm7Gに２つの芳香残基間で割り込むが、CBCのm7GpppGキャップに対する親和性は4E（Kdはほぼ200 nM）に比較して実質的により高く（Kd はほぼ10 nM）、なぜなら、CBCはメチル化塩基とより広汎に相互作用するからであり、4Eに比較して隣接するピロホスフェートヌクレオチドとも相互作用するからである。リバビリンのトリアゾール環はCBCとのこれらの付加的な接触の多くを欠いていると考えられ、また隣接する塩基も欠いているために、ここで観察された通り、リバビリン4Eの機能のみに干渉し、CBCのものとは干渉しない（図３）。
【０２０７】
結論
広く研究されてはいるが、リバビリンの細胞内作用の機序及び／又はその抗ウィルス効果の起源は謎のままである。グアノシンへのその類似性があるために、リバビリンはグアニリルトランスフェラーゼをめぐってグアノシンと競合することにより5’ mRNA キャッピングを阻害すること、イノシモノホスフェート脱水素酵素との相互作用についてグアノシンを方法することでグアノシン生合成を阻害すること、そしてRNAポリメラーゼによるmRNA取り込みをめぐってグアノシンと競合することにより、変異原となること、が示唆されている。実際、ミリモル濃度ではこのような効果が起き、例えばポリオウィルスの致命的な変異誘発が起き（EC50 はほぼ0.2 mM）、そして細胞内のグアノシンプールが枯渇する（EC50 はほぼ0.1 mM)。重要なことに、より低マイクロモル濃度では、リバビリンはグアノシン代謝に参与しないようであるが、これはおそらく関連するタンパク質のm7G 及び／又は グアノシン結合部位にある構造上及びエネルギー上の違いが原因であろう。リバビリンは、代謝毒性がないことでも示唆されるように（図５）、グアノシンプールの生理的枯渇を引き起こさないと思われ、また細胞死がないことや、産生タンパク質の生合成及び安定性が影響を受けないことからも示唆されるように、明らかに変異原性ではない（図３及び５）。ここで、我々はリバビリンが、4E:m7G mRNAキャップ結合に拮抗すると共に細胞レベル下4E構造を破壊することで、4EがmRNA 輸送と4E感受性転写産物の翻訳を促進する能力を阻害することを観察する。4Eの過剰発現はタンパク質レベルを全体的に増加させることはなく、サイクリン D1、ODC、及びVEGFなど、ここで研究したものを含む、4E感受性と定義される下位集団の転写産物の発現に影響を与えるのである。
【０２０８】
この研究の主要な目的はリバビリンの作用機序を解明すること、そしてその潜在的な抗癌作用を特徴付けることであったが、我々の発見は、mRNAへの関与も有するものである。我々はリバビリンによる4E阻害の選択性が、特異的集団の4E感受性転写産物の4Eによる転写後調節という観点で、4Eの活性自体の選択性から生ずることを示す。従って、4Eの過剰発現がタンパク質翻訳を全体的に増すものではないのとちょうど同じように、リバビリンは全体的な阻害剤ではない。4Eに対する感受性は対応する転写産物のUTRの複雑性とは逆の関係にあるようである。こうして、4Eのリバビリン誘導性阻害は、VEGF、c−myc、及びODCなど、数多くの癌原性mRNAを含め、長く、かつ高度に構造化された5'UTRを含有する転写産物の翻訳を特異的に減少させる。反対に、リバビリンは、GAPDHなど、短い、構造性のない5’
UTRを持つハウスキーピングmRNAの翻訳速度には影響を与えない。グアノシン関連ヌクレオシドの静電特性は細胞内グアノシン代謝におけるそれらの作用点と直接、相関する。例えばチアゾフリンは、リバビリンと同じ分子ジオメトリを有するにも拘わらず、電子的にはグアノシンと類似であり（図８）、結果的に、強力なイノシンモノホスフェート脱水素酵素阻害剤であり、イノシンモノホスフェート脱水素酵素のグアノシン・アロステリックなエフェクタ部位に結合する。同様に、Rib4C は中性であり（図８）、4Eに結合も阻害もしない。他方、リバビリンは生理的ｐＨでは正に帯電しており、その電子構造のために（図８）、結果的には4Eによるm7G mRNA キャップ結合に拮抗する。リバビリン及びその誘導体は新生物形成及び悪性を維持及び亢進する腫瘍サプレッサ及び腫瘍遺伝子のネットワークに割り込む薬理学的な手段を提供する。例えば、4Eに調節不全があるとサイクリン
D1 及びmycなどの腫瘍遺伝子の調節不全が起き、 ひいては4Eが更に調節不全となる。4Eは有糸分裂刺激のターゲットであり、mycの直接的な転写ターゲットである。このような自己補強挙動と合致するように、mycの失活は骨源性肉腫のトランスジェニック・マウス・モデルにおいて腫瘍の分化及び持続的退行につながる。同様に、アンチセンスサイクリン D1はヒト癌細胞の表現型を正常に向けて逆転させ、マウスにおいて腫瘍形成を妨げる。補完的に、ラパマイシンはマウスリンパ腫モデルで化学療法抵抗性を抑制するが、この効果は4Eの調節不全により反転させられる。ここで我々は、同様な効果は、4E依存的核−細胞質 mRNA輸送及び翻訳を阻害することにより薬理学的に達成することができることを実証する。遺伝子発現の転写後調節は真核生物における成長及び発達の調節で最高峰の役割を果たし、この調節レベルの破壊は多種のヒト癌に寄与していることが、次第に明らかになっている。
【０２０９】
我々の発見は、リバビリンは以前には予想もつかなかった態様で転写後の成長調節遺伝子の4E媒介性調節のレベルに作用することを示している。in vitro 及びin vivo
における4E媒介性発癌性形質転換のリバビリンによる抑制の見かけの効力には、腫瘍遺伝子の、ここで調べたモデル転写産物であるサイクリンD1との組合せの下方調節が関与している可能性が高い。リバビリン作用のまだ見られない機序の更なる特徴付けと、優れた抗ウィルス及び細胞増殖抑制特性を持つ誘導体の開発は、将来の研究に向けた重要な方向性である。
【０２１０】
実施例２  4Eはキャップ結合部位を用いてリバビリンに特異的に結合する
リバビリン （ヴィラゾール）、トリアゾールカルボキシアミドリボヌクレオシドの作用機序は、１９７０年代初頭のその発見以来、謎のままである。混乱の多くは、一見無関係の多種のウィルスに対するその見かけの活性や、濃度の依存した多面発現性の細胞効果から生じた。リバビリン及びグアノシンの水素結合基の配置における類似性に基づき、リバビリンはグアノシン類似体であると考えられた。この観点は、ミリモル濃度のリバビリンのグアニリルトランスフェラーゼ、イノシンモノホスフェート脱水素酵素、及びRNA依存的RNAポリメラーゼへの効果と合致する。
【０２１１】
前の実施例では、これらの特異的効果の性質の同定することで、リバビリンの特異的作用機序を定義しようと試みた。アブイニシオ量子力学を用い、我々は多種のグアノシン類似体の物理的特性を特徴付け、リバビリン及び 7−メチルグアノシンの電子構造に驚くべき類似性をみとめた。我々はトリプトファン発光蛍光分光法及びヌクレオチド・アフィニティ・クロマトグラフィを用い、リバビリン
及び7−メチルグアノシン (m7G) 結合性タンパク質4Eの解離及び阻害定数が低いマイクロモル範囲にあること測定した。我々は蛍光顕微鏡法、細胞分画、ノーザン及びウェスタン分析、並びに定量的PCRを用い、リバビリンによる細胞レベル下4Eの破壊、核内及び細胞質内4E:mRNA結合の破壊、核−細胞質4E−感受性 mRNA 輸送の阻害、そして生きた細胞内での 4E−感受性mRNA 翻訳の阻害、を、全て同様な低マイクロモル濃度で観察した。我々はフローサイトメトリ、コロニー形成及び腫瘍成長検定を用い、in vitro 及び in vivoにおける4E依存的癌モデルや、ヒトの患者から分離された4E過剰発現性白血病性芽球を用いて、リバビリンの細胞増殖抑制性及び腫瘍抑制性効果をやはり低マイクロモル濃度で観察した。リバビリンは7−メチルグアノシンのものに類似の物理特性を示したが、それを環状に並べ替えた化学的類似体Rib4C は示さず、4Eにも結合できず、mRNA輸送、翻訳、及び発癌性におけるその機能を阻害することもできなかった。このことから、リバビリンは7−メチルグアノシン mRNA キャップの物理的模倣体であるという結論が導かれた。
【０２１２】
最近の RNAの発行物では Yan et al. (2005) 及び Westman et al. (2005) がこの結論を論じた発見を紹介している。それらの結果には二要素ある：リバビリンin vitroで組換え4Eに結合しないこと、そしてリバビリンは、細胞から調製された抽出物中の外因性mRNAのキャップ依存的翻訳を阻害しないこと、である。我々はこれらの実験がリバビリンの効果を引き出すことに失敗したと考え、著者と同様に、考え得るその理由を論じたい。第一に、m7G キャップの4Eへの結合は溶液条件に高度に依存することがよく確立されている。数桁（ナノモル乃至マイクロモル）の規模の差異が、イオン強度、ｐＨ、及び温度での変化の結果、起きることがある。これはおそらくは、それ自体が溶液中でapo−4Eが採ることが知られている多様な構造上の亜状態から成る相対的集団に依存する、これらの条件下でのapo型の4Eのキャップ結合部位の物理的特性及び正確なジオメトリ（データは図示せず）に依存するであろう。リバビリン
は4Eのキャップ結合部位に結合することを考えると、4Eに対するその見かけの親和性も条件依存的であろう。更に、リバビリン’のトリアゾールカルボキサミドは、7−メチルグアノシンに比較した場合、4Eに対してより少ない数の原子接触を行うことを考えると、4Eに対するリバビリンの高親和結合はより狭い範囲の溶液条件で起きると予測できるであろう。
【０２１３】
これを念頭に置き、我々は Yan et al.
(2005)の実験をもとに、独立したオペレータ及び新しい試薬を並べて用いて、我々の新しいアフィニティ・クロマトグラフィ実験を再現した。我々は、我々が公開した通りの実験条件（0.3 M NaCl、0.1 M リン酸ナトリウム、0.1% Nonidet P−40、pH7.5の10 mM BSA 、室温）と、Yan et al. (2005)のもの（0.1 M KCl、10 mM HEPES−KOH、pH8.0の0.2 mM EDTA、推定4℃）を再現した。我々が報告した発見 (Kentsis et al. 2004)と合致して、マイクロモル濃度のリバビリントリホスフェート (RTP) は、m7GTP 自体のそれ（図９ａ）と同様に、4E:m7Gの結合と競合する。対照的に、
Yan et al. (2005)のプロトコルを用いるとRTPが m7G 結合と見掛け上、競合できなくなる（図９ｂ）。多様な条件下での4Eの熱力学的メタ安定性は文献（Matsuo
et al. 1997; McGuire et al. 1998; Kentsis et al. 2001, 2004）によく記載されていることから、特に Yan et al. (2005)の実験でのようにマトリックスに固定したタンパク質を用いる場合には、リガンドの見掛けの結合に凝集及び連結効果が紛れ込む（Fletcher and Wagner 1998; Cohen et al. 2001）ことが導かれる。加えて、apo−4E の構造は NMR 化学シフト摂動法で評価したところ、7,5乃至8の間のｐＨの違いに感受性である（データは図示せず）。このように、Yan et al. (2005)が報告した、in vitroでのリバビリンの4Eへの結合失敗は、少なくとも部分的に、異なる溶液条件を用いたことが原因であるようである。
【０２１４】
リバビリンの4Eへの結合を結局は観察できなかった Yan et al. (2005)とは対照的に、Westman et al. (2005) はリバビリン が組換え4Eにin
vitroで結合することを観察したが、我々の測定したものよりも２乃至４桁低い親和性でであった(Kentsis et al. 2004; Westman et al. 2005)。蛍光発光の消光を用いたリガンド結合の測定には、しばしば、加えられたリガンドの固有の蛍光及びその内側フィルタ効果の補正が必要である (Lakowicz 1999)が、そのいずれも、
Westman et al. （Niedzwiecka et
al. 2002; Westman et al. 2005）を我々が読んだ結果では考察されていないようである。ヌクレオチドの蛍光量子収量はアミノ酸のそれよりも低い一方で、それらは上記の研究で用いられた濃度では有意と成り得、それはおそらくは、特にリバビリンの消光効率が7−メチルグアノシンのそれよりも、この二つの化合物の違いのために２分の１である場合に、結合時のタンパク質蛍光の消光を補償するからである。 (Kentsis et al. 2001, 2004)。これに加え、ヌクレオチドを滴定すると、おそらくは蛍光の見掛けの発光を減らすであろう、入射光及び／又は放出光の吸収が導かれる。リバビリンを7−メチルグアノシンに比較したときの低い吸光係数
(295nmでそれぞれ740 対 1600 M−1 cm−1 ) もまた、見掛けの消光での違いに寄与しているかも知れない (Kentsis et al.
2001, 2004)。
【０２１５】
残念ながら、直接的な方法比較は7−メチルグアノシンに直接結合するものも含め、トリプトファンの蛍光発光の我々の観察
(Kentsis et al. 2001, 2004)からは除外されたが、Westman
et al. は、優先的に消光するであろう（それぞれ295
nm 及び280 nmの励起波長）トリプトファン及びチロシンの両者の発光を測定した (Niedzwiecka et
al. 2002; Westman et al. 2005)。加えて、溶液条件の違いも、観察される結合親和性の違いに寄与しているかも知れない。Westman et al. (2005)が示唆したように、これらの方法上の違いは、測定される親和性の見掛けの違いを説明するものかも知れない。
【０２１６】
にもかかわらず、競合アフィニティ・クロマトグラフィ及び蛍光消光といった結合の間接的又は曖昧なプローブを含まないものである、リバビリンの4Eへの結合を決定的に実証するために、我々は電気スプレー質量分析法を用いることでリバビリン及び 4Eの結合を調べた。20 mM 精製済み組換え4E 及び４倍過剰量のリバビリン及びGTPの両者 の混合物を直接電気スプレーし、その質量／イオン化スペクトルを測定した。記録されたスペクトルを図１０ａに示すが、二つの組の多価イオンを含有し、その一方は apo−G4Eに相当する31,402 Daという集団重みを付けて平均分子量であり (Zhou et al. 2001; Kentsis et al. 2004)、そしてもう一方は 31,649 Da だった（図１０ｂ）。247 Da というこの質量シフトはリバビリン(243 Da)の特異的結合が原因であって、GTP (523 Da)のものではない。我々の公開済み研究では、リバビリンの4Eに対する結合特異性を、それによる7−メチルグアノシンキャップの結合の破壊と同様に、リバビリンの結合を破壊するがこタンパク質のフォールディングは損なわないキャップ結合部位 W56Aの変異を用いて立証したのだった
(Kentsis et al. 2004)。
【０２１７】
リバビリンを環状に並べ替えた形であるRib4Cは化学的には同一であるが、正の電荷を持たず、4Eに結合できなかった。そして最後に、リバビリンの結合により、7−メチルグアノシン・キャップの結合で誘導されるものと類似の4Eのコンホメーション上の転位が、 NMR分光法を用いて観察されるように起き、リバビリンの結合がキャップ結合部位で起きることと合致する
(Kentsis et al. 2004)。リガンド誘導性のコンホメーション変化は更にVolpon, et al. (2006) EMBO J.
25(21):5138−49. Epub 2006 Oct 12が報告した無キャップの結晶構造でも示唆されている。付加的な特異性制御はKentsis et
al. (2004)に解説されている。このように、4E はリバビリンにキャップ結合部位を用いて特異的に結合すし、この相互作用を観察できなかった実験上の失敗は、用いた特定の技術の課題が原因であろう。
【０２１８】
Yan et al. (2005) 及びWestman et al. (2005) が調べたもう一つの疑問は、4E機能に対するリバビリンの効果であった。両者のグループとも
in vitro, での機能上の効果を調べたが、他方我々は リバビリン’の in vivo での機能に興味を持った(Kentsis et
al. 2004)。in vitro における外因性mRNAの翻訳のための細胞抽出物は、それらに固有の特性が知られており、区画化及び分子構造が維持され、かつ、複合体としてのプロセスにとって最高の重要性を持ち、mRNA翻訳時に調節を受ける生存細胞のそれと比較すると、組成、化学両論的組成、及び活性が変化している。このような抽出物は翻訳因子の発見についてはかなりの成功を収めつつ用いられてきたが、翻訳機所の特徴付けのためのそれらの意義は以前、議論を呼んでいる。この観点で、4E活性を、7−メチルグアノシンキャップ駆動型、及び内側のリボゾーム結合部位（IRES）駆動型の転写産物間の翻訳効率の違いにより評価することは、数多くの理由から問題がある。各抽出物の活性は、外因性のmRNAの特定の特徴の翻訳上寄与を最大限にするために、経験的に至適化されるが、これは、リバビリンのそれなど、新規な活性の特徴付けに絶対的に必要である全体的な機構的及び機能的信憑性を必ずしも保証するプロセスではない。
【０２１９】
例えばYan et al. (2005) 及び Westman et al. (2005) の両者とも細胞抽出物を用いているが、別々の細胞から調製され、また別々の修飾があり、50−キャップ乃至30−poly(A) mRNA因子の間の翻訳相乗作用を最大限にするために慎重に至適化(Bergamini et al. 2000; Svitkin and Sonenberg 2004)されているが、これは4Eの活性のみに依存するわけでも、また特異的に依存するわけでもない特徴である。この見掛けの相乗作用は、4E、poly(A) 結合性タンパク質 (PABPs)、及びリボゾーム (Michel et al. 2000)に同時に結合することで、それぞれ50−キャップ及び30−poly(A) の尾に対する4E及びPABPの親和性を結合してしまうeIF4Gのスカフォールディング活性が原因である。それでも尚、poly(A) の尾のみが存在するだけでもin vitro ではIRESからの翻訳を刺激することができる(Svitkin
et al. 2001)、そして4Eはキャップ結合の不在下でもリボゾームを動員することができる (De Gregorio et
al. 2001)。このように、Westman et al.
(2005)の実験では、m7GpppG 及びm7GTP との競合はキャップ駆動型の翻訳をほぼ 0.1 mM という類似濃度で阻害するが、他方、RpppG は阻害せず、この違いの特異性及びその機構的な解釈は、m7GpppGキャップ型転写産物の濃度がほぼ
1nM （100,000倍を越える）であることを考えると決定的ではない(Westman et al. 2005)。
【０２２０】
Yan et al. (2005)の発見の解釈は、律速翻訳因子をめぐって競合する結果起きる効率の相対的違いを抑える、50−キャップ及びIRESの両方を含有する二シストロン性のコンストラクトをそれらが用いていることで、更に複雑になっている (Yan et al. 2005)。このように、1 mM m7GDP で処理すると、キャップ駆動型ホタルルシフェラーゼの活性がほぼ0.8 x から 2 x 10^5 光単位まで減少する：４分効果があり、1,000,000分の１を越えるという、mRNAに対してモル過剰量のキャップ類似体とは相当に取るに足らない数値である (mRNA 濃度は5 mg/mL) (Yan
et al. 2005)。同様に用いた細胞抽出物中の4Eの濃度がほぼ400 nM (Rau et al. 1996)であると推定されると考えると、このような高いキャップ類似体濃度の必要性は、調べられたプロセスが、mRNA翻訳中の4E活性に厳密には依存していないことを示唆するものである。
【０２２１】
リバビリンが50−mRNAキャップにミリモル濃度で誤って取り込まれたかも知れないと論じるわけではないが、Yan et al. (2005)によるウィルス産生の測定や、Westman
et al. (2005)によるキャップ構造の慎重な解析に基づき、我々は in vitro におけるキャップ駆動型及びIRES駆動型のコンストラクト間の翻訳効率で観察される違いの特異性や、リバビリンの作用機序やそれによるin vivoでの4E感受性翻訳の阻害という我々の発見に関するそれらの機構上の解釈を疑問とした。この文脈で、Yan et al. (2005) 及びWestman et al. (2005)の研究ではリバビリンは  in vitro でキャップ依存的翻訳を阻害できなかったが、このように効果がなかったことは、現在の細胞抽出物が4E活性に対して感受性がないことと何かの関係があるかも知れない。この点で、キャップ感受性及び4E感受性の翻訳間の区別は最も大きな意義を有するであろう。5’ 7−メチルグアノシンキャップの4Eとの相互作用がキャップ依存的mRNAの翻訳には必要であるが、細胞内の4Eを上方調節しても、キャップ依存型転写産物のから産生される全タンパク質のレベルが増加するわけでなく、サイクリン D1 及びVEGFを含む特異的な下位集団のレベルは増加するが、例えばb−アクチン及びGAPDHのレベルは増加しない (De Benedetti and Graff 2004)。この効果は、いくつかのmRNAにとっては核−細胞質輸送のレベルで起き、他のものにとっては翻訳のレベルで起き、そして中には両方のレベルで起きるものがある (Rousseau et al. 1996)。このように、4Eの上方調節が細胞内タンパク質翻訳を全体的に増加させるわけでないのと全く同じように、リバビリンは全体的な阻害剤ではない。このような、細胞内での翻訳に及ぼされるリバビリン効果の特異性は、サイクリン D1、GAPDH、VEGF、及びODC のmRNAのポリソーム装荷の我々の測定で精確に観察された(Kentsis et al. 2004)。
【０２２２】
要約すると、 7−メチルグアノシンキャップのそれと全く同じように、リバビリンの4Eへの結合は溶液条件に依存的ではあるが、強固かつ特異的に起きるのである（図９及び１０）。in vitro で評価された相互作用の生理的関連性を判定するためには、それらのin vivoでの機能性を評価することが重要である。従って我々は
細胞内におけるリバビリンの4Eへの結合の生理的関連性を動物モデルやヒト患者から分離された組織で評価した(Kentsis et al. 2004)。これらの系のすべてにおいて、リバビリンは4E感受性mRNAの輸送及び翻訳における4E機能に、in vitroで精製済み4Eからそれが解離するのと同様な低マイクロモル濃度で拮抗した。
我々は、将来、共同研究が続行され、この化学的にはかなり簡単であるが生理的に複雑な薬物の特異的機序及び細胞内効果が定義されんことを望むものである。
【０２２３】
実施例３    このmRNAを核内の4Eに感作させ、4E媒介性細胞形質転換に関与するサイクリン D1
3’UTR からの100ntの配列の同定
要約
真核性翻訳開始因子4Eは細胞成長にとって重要なモジュレータであり、核内及び細胞質内で機能する。細胞質内では、全てのmRNAにある5’ m7 G キャップ部分の認識があれば、それらが4Eと機能的に相互作用するには充分である。対照的に、我々は、核内では4Eはサイクリン D1に結合し、その核内輸送を促進するが、GAPDH 又はアクチンmRNAではしないことを示した。我々は、この弁別的な相互作用の基礎は、我々が4E感受性因子（4E−SE）と呼ぶサイクリン D1 mRNAの3’側非翻訳領域（UTR）中の100−ntの配列であると判定した。我々は、サイクリン D1 mRNAは4E核小体内では濃縮していることを見出し、これらは特異的リボ核タンパク質の構造のための機能的部位であることを示唆した。4E−SE は、4Eが効率的に細胞を形質転換させるために必要であり、従ってこの因子の認識が4E媒介性発癌性形質転換に結び付けられる。我々の研究は、これまで特徴付けられていなかった、核及び細胞質区画間の4E−mRNA認識の基本的な違いや、さらには細胞増殖の新規な調節レベルを実証するものである。
【０２２４】
導入
真核性翻訳開始因子4Eは細胞成長の調節に関与している。4Eがほどほどに過剰発現すると、成長の調節不全及び悪性形質転換につながる。4Eのレベルは骨髄性白血病及び乳癌の下位集団を含め、複数のヒト悪性腫瘍で上昇している。重要なことに、4Eの核内及び細胞質内の両方での機能がその細胞形質転換能に寄与している。細胞質内では、4E はキャップ依存的翻訳という、酵母からヒトまで高度に保存されたプロセスに必要である。ここで4EはmRNAの5'側末端に存在するメチル 7−グアノシン (m7G) キャップ部分に結合し、その後、mRNAをリボゾームに動員する。
【０２２５】
核内では、4Eはサイクリン D1 及びオルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）という少なくとも２つの報告されたmRNAの核から細胞質への輸出は促進するよう働くが、GAPDH 又はアクチン mRNA の輸出は変化させない。１２年前に4Eの核内局在が最初に報告されて以来、研究により、細胞内の4Eのうちの68%が核内にあり、そこでそれは核小体に結び付いていることが、酵母、ドゥロソフィラ、キセノパス及びヒトを含む多種の生物で示されている。これらの小体はNIH3T3、HEK293T、U2OS、K562、及びU937など、多様な系譜からのほぼ３０種の細胞株及び初代細胞を含む全ての報告された細胞種で見られる。哺乳動物細胞では、4E核小体の大型の下位集団が、前骨髄球白血病タンパク質PMLに関係するものと一致する。PMLは、4E依存的mRNA輸送の最初に同定された調節物質である。PMLの RING ドメインは4Eの背側表面に直接結合し、 m7G キャップに対するその親和性を１００分の１未満に減らす。キャップ結合活性のこのような消失はmRNA輸送機能の消失と形質転換活性の消失に相関するものである。
【０２２６】
4EのmRNA輸出機能はその発癌性形質転換活性に関係している証拠がある。初代ヒト骨髄性白血病標本中の下位集団で、4E依存的サイクリン D1 mRNA
輸出が実質的に上方調節されている。加えて、変異型の4Eである W73Aは核内に入り、内因性の4E核小体と共局在し、サイクリン D1 mRNAの細胞質への輸送を亢進し、その後、不死化した細胞を形質転換させる。これは、W73A 4EはeIF4Gに結合できず、従って翻訳で作用し得ないという事実にも拘わらず、起きる。
【０２２７】
我々のグループ及びゾーネンベーグ研究室が行った、4Eはサイクリン D1 及びGAPDH mRNAを機能的に区別するという観察は驚くべきものである。なぜなら、伝統的な見方は、4Eは他の配列特異的な特徴に関係なく、全てのmRNA上に見られるm7Gキャップに結合するというものだったからである。このように、この機能的区別は、核内での4E
mRNA 認識の我々の理解という点で難問を投げ掛ける。
【０２２８】
核内でのmRNAの4E認識は細胞質内とは基本的に異なるのではないかという可能性を我々は調べた。ここで我々は、核内でこのmRNAを4Eに対して感作させ、4E媒介性細胞形質転換に関与しているサイクリン D1 3’UTR から100−ntの配列を特定する。
【０２２９】
材料及び方法
コンストラクト．  UTR−LacZ融合コンストラクトはすべて、 pcDNA3.1LacZ ベクタ（インビトロジェン社）で作製され、適宜LacZのコーディング領域の5’ 又は 3’ 側に配置した。サイクリン D1 3’UTRのクローニングには、NotI制限部位を pD1−1 コンストラクト（pGEM7Zf中のヒトサイクリン D1 遺伝子）中の停止コドンから150 bp 上流に in vitro 変異誘発法 （クイックチェンジ・キット；ストラタジーン社） で作り、完全長 3’UTR を NotI 及び XbaI をLacZの下流で用いてクローニングした（ここで LacZ−3’UTRFullと言及する）。サイクリン D1 3’UTR の一番目の部分を含有するフラグメントをNotI 及び EcoRIを用いて作製し、サイクリン D1 3’UTR の二番目の部分をEcoRI 及び XbaI を用いて作製し（ヒトサイクリン D1 cDNAの位置2,824bpにEcoRI部位があることに注目されたい）、LacZ (LacZ 3’UTRA 及び LacZ 3’UTRB)の下流のNotI-XbaI 及び EcoI-XbaI下にクローニングした。個々の配列を、NotI 又は XbaI 制限部位をそれらの 5’ 側末端LacZに含有する特異的プライマを用いて増幅した。
【０２３０】
3’UTR2/3 はサイクリン D1 mRNAを由来とするセグメント2,091-2,459を含有し、LacZ 3’UTR
3 は配列2,361-2,459 bpを含有し、 LacZ3/4 はセグメント2,361-2,565を含有し、そしてLacZ
3’UTR4はヒトcDNA由来の配列2,481-2,565 bp を含有する。5’UTRをサイクリン D1 cDNA (ATCC MGC−2316) から増幅し、HindIII 部位をAUG コドンの上流に Xpress タグのために用いてクローニングした。pcDNA2Flag-4E コンストラクトは4E cDNA をEcoRI-NotI 部位 (pcDNA2F ベクタはカリフォルニア州ラホーラ、バーミンガム・インスティテュート、Z. Ronai氏より贈与)に挿入することで作製された。pcDNA2Flag中の4E 変異体は in vitro 変異誘発法（クイックチェンジ・キット；ストラタジーン社）を用いて作製された。pMV ベクタ、pMV−4E 野生型 （カナダ、ケベック州、モントリオール、マクギル・ユニバーシティ、N. Sonenberg氏より贈与）又は変異体pLINKSV40-PML 及び細菌性発現ベクタは前に解説されている。完全長3’UTR (ATCC MGC-2316) のないヒトサイクリン D1 cDNAをpMVベクタ内に、EcoRI 及びHindIII （サイクリン D1 切断済み）を用いてクローニングした。サイクリン D1 完全コンストラクトは、pCDNALacZ-3’TR
由来で平滑末端にしてあるHindIII-XbaI
フラグメントを用いて作製され、pMV-サイクリン D1Trunc （ヒトサイクリン D1 cDNA にはHindIII 部位が位置1,206 bpにあることに注目されたい）中の HindIIIにクローニングされた。サイクリン
D1 3’TR由来の4E-SE-4 をPCR増幅し、平滑末端にし、pMV−サイクリン D1Trunc中の HindIII下にクローニングした（cycD14E−SE）。
【０２３１】
抗体及びウェスタン分析．  PMLに対して用いられた抗体は以前に解説されている（英国、ロンドン、インペリアル・カレッジ、P.
Freemont氏及びオランダ、アムステルダム、ユニバーシティ・オブ・アムステルダムL. de Jong氏より贈与）。用いられた付加的な抗体には、マウスモノクローナル抗−4E Ab （BD トランスダクション・ラボラトリーズ社）、ポリクローナル抗−IF4E Ab (英国、ブライトン、ユニバーシティ・オブ・サセックス、S. Morley氏より贈与)、マウスモノクローナル抗サイクリン D1 Ab (BDバイオサイエンセズ社)、マウスモノクローナル抗Xpress Ab （インビトロジェン社）、マウス モノクローナル抗GAPDH 抗体 (MAB374; CHEMICONインターナショナル社)、抗CBP80 pAb (ニューヨーク州ロチェスター、ユニバーシティ・オブ・ロチェスターL. Maquat氏より贈与；Ishigaki
et al., 2001) 抗CBP−20（ドイツ、ハイデルベルグ、EMBL、E. Izaurralde氏より贈与）が含まれる。ウェスタン分析は以前に解説された通りに行われた（Topisirovic
et al., 2002, 2003）。
【０２３２】
細胞培養及びトランスフェクション．  NIH3T3、U2OS、HEK293T、及びNlog （ユニバーシティ・オブ・ロチェスター、H. Land氏より贈与； サイクリン D1−/− Perez−Roger et al.,
1999) 細胞を37℃の5% CO2 中で、10% FBS、100 U/ml ペニシリン、及び100 U/ml ストレプトマイシンを添加したDME（GIBCO BRL; ライフ・テクノロジーズ社）に維持した。4E 及びPML を安定にトランスフェクトしたNIH3T3 を以前に解説された通りに作製した (Topisirovic et al., 2002,
2003a)。NIH3T3の一過性のトランスフェクションをGeneJammer トランスフェクション試薬（ストラタジーン社） 又はリポフェクタミン・プラス試薬（インビトロジェン社）のいずれかをメーカの指示に従って用いて行った。HEK293T 細胞の一過性のトランスフェクションはリン酸カルシウムトランスフェクション・キット（インビトロジェン社）を用いて行われた。サイクリン D1−/− 細胞の安定なトランスフェクションFugene 6
トランスフェクション試薬（ロシュ社）をメーカの指示に従って用いて行った。固定依存的焦点形成検定法は以前に解説された通りに行われた (Cohen et al., 2001; Topisirovic et al., 2003a)。
【０２３３】
4Eの免疫精製、4Eに結合したRNAの単離及びRT−PCR.  核を適宜アリクォートされた3 x 10^9 HEK293T 細胞から以前に解説された通りに単離し(Topisirovic et al., 2002)、 氷温のNET−2 緩衝液 (50 mM Tris−HCL、pH 7.4、300 mM NaCl、0.5% [vol/vol]
NP−40, 1x 完全プロテアーゼ阻害剤 [ロシュ社]、200 U/ml SUPERasein [アンビオン社])中に再懸濁させ、氷上のダウンス（原語：dounce）ホモジナイザ（Ｂ型）で機械的に破砕した。得られた核抽出物を16,000 g で２０分間、4℃で遠心分離することで清澄させた。上清のうちの 1/20を二つに分け、それぞれ核RNA及びタンパク質を得るために用いた。 19/20は三つのアリクォートに分け、文脈で示された場合にはそのうちの二つを 50 uM m7GpppG 及び50 uM GpppG
(NEB)を入れたNET−2 緩衝液と一緒に３０分間、4℃でインキュベートした。上述のアリクォートのうちのそれぞれを二つに分け、前に解説された通りに免疫沈降させた (Ishigaki et al., 2001) が、以下の変更点があった：10 u の抗4E マウス mAb (トランスダクション・ラボラトリーズ社) 又は 10 u of マウス IgG （カルビオバイオケム社）を反応毎に用い、免疫沈降後にビーズを、1 mg/ml のヘパリン（シグマ・アルドリッチ社）を加えたNFT−2緩衝液で一回、洗浄した。得られたRNAを無RNase のDNase (プロメガ社) でメーカの指示に従って処理した。RNA をcDNA にSensiscript リバース・トランスクリプション・キット（キアゲン社）を用いて変換した。RT−PCR を三重にしてQuantiTect SYBR グリーン RT−PCR キット（キアゲン社）を入れたOpticon
熱サイクラ（MJR社）で行った。得られたRT−PCR データをOpticon ソフトウェア（MJR社）で解析した。サイクリン D1 RT−PCR に用いたプライマは cycF,5’cagcgagcagcagagtccgc−3’ (SEQ ID NO: 12)及びcycR,5’−acaggagctggtgttccatggc−3’ (SEQ ID NO: 13); そして GAPDH 増幅には GAPDHF, 5’−accacagtccatgccatcac−3’ (SEQ ID NO: 14) 及びGAPDHR 5’−tccaccacccgttgctgta−3’ (SEQ ID NO: 15)だった。RT−PCR 法では、計算はアプライド・バイオシステムズ社が解説する通りに行われた。準定量的PCRには、３０サイクルを用い、そしてRT−PCRには、標準的な方法を用いた。GAPDHの準定量的増幅に用いたプライマは  RT−PCRのものと同じであり、そしてサイクリン D1 及びアクチンの増幅には以下のプライマを用いた： cycHMF, 5’−cacttcctctccaaaatgcca−3’ (SEQ ID NO: 16); cycHMR, 5’−cctggcgcaggcttgactc−3’ (SEQ ID NO: 17); ActF, 5’−atctggcaccacaccttctacaatgagctgcg−3’ (SEQ ID NO: 18); 及びActR, 5’−cgtcatactcctgcttgctgatccacatctgc−3’ (SEQ ID NO: 19)。
【０２３４】
免疫沈降及び分画の品質に関するコントロール．  複数のステップを取って、実験間のばらつきが原因で偽の陽性又は偽の陰性結果が確実に出ないようにした。免疫沈降済みの試料を検査して、ウェスタン・ブロット法で判定したところ、4E自体が免疫沈降したこと、そしてIgGは4Eに結合しなかったことを確認した。この免疫沈降の特異性を核内画分の4Eについての既知の陽性及び陰性コントロールを用いて判定した。このように、4E抗体がCBP80 （図１１ｇ） 又は RNA ポリメラーゼ II でなく4Eを免疫沈降させる能力を判定した（Lai
and Borden, 2000)。これらの結果は、4Eの核内画分はこれらのタンパク質と結び付かないことを示したMaquat 及び我々の研究室での知見と合致する。更に、4Eとの相互作用に関する陽性コントロールは、何度も報告されたようにPMLタンパク質との結合能を含む  (Cohen et al., 2001; Topisirovic et al.,
2003a,b)。加えて我々は、ここで用いられた、4Eに対するトランスダクション研究用抗体が他の研究室(Topisirovic et al.,
2004)で作製された4E抗体と共局在することを実証し、当該抗体が強固かつ信頼性あることを示す。重要なことに、これらの実験により、多様なmRNAの4Eとの結合の違いは実験間の免疫沈降効率の違いの結果でも、分画品質の違いの結果でもないことが確認される。
【０２３５】
分画のコントロールについては、各核及び細胞質画分の品質を、我々が以前に報告し、本文全体を通じて示すように、U6snRNA（核内）及びtRNALys （細胞質）の細胞レベル下分布を観察することにより、評価した。各画分について行われた付加的なコントロールには、核マーカ (Sc35) として役立てたスプライシングのスペックルタンパク質と、細胞質マーカとして役立てたB−アクチンのウェスタン分析が含まれる (Topisirovic
et al., 2003 a,b)。付加的な画分コントロールは充分な材料が得られる場合に行われた (Topisirovic et al., 2003 a,b)。SNAAPプロトコルを以前に解説された通りに行った (Trifillis et al., 1999) が以下の変更が行われた。予め清澄させた250 ug の核抽出物を50 ug のGST−タンパク質ビーズを入れた0.5% NP−40を含有する500 ul RBB緩衝液に加え、３０分間、4℃でインキュベートしたのち、500 ug の酵母 tRNA を反応毎に加え、一晩、4℃でインキュベートした。ビーズの洗浄はすべて、
0.25% Triton X−100 及び0.5% NP−40を含有するRBB中で行われた。
【０２３６】
細胞画分及びノーザン分析．  分画及びRNA分離は以前に解説されている
(Lai and Borden, 2000; Topisirovic et al., 2002)。LacZについては、PolyA RNA を分画後のRNA からOligotex mRNA ミニ・キット (キアゲン社)を用いて精製した。サイクリン D1、GAPDH、U6、及び tRNALys のノーザンブロット分析用のプローブも以前に解説されている (Topisirovic et al., 2002)。LacZ プローブはPCR増幅法によりプライマLacZF, 5’−cggtcgctaccattaccagtt−3’ (SEQ ID NO: 20) 及びLacZR, 5’−gacgttgtaaaacgacgggat−3’ (SEQ ID NO: 21)を用いて作製され、BrightStar ソラーレン−ビオチン・キット（アンビオン社）を用いて標識された。
【０２３７】
免疫蛍光、in situ ハイブリダイゼーション、及びレーザ・スキャニング共焦点顕微鏡法．  免疫蛍光法は以前に解説された通りである (Cohen et al., 2001;
Topisirovic et al., 2002)。そうでないと明示しない限り、蛍光は100倍の光学倍率及び2 倍のデジタル・ズームを、488、568、又は 351/364 nm
(at RT)で励起した倒立レーザ・スキャニング共焦点顕微鏡（モデルTCS−SP (UV); Leica)上に用いて観察した。チャンネルはすべて別々に検出され、チャンネル間のクロストークは観察されなかった。顕微鏡写真は厚さがほぼ300 nmの細胞平面を通る単一切片を表す。実験は、各試料中に５００細胞を越える細胞にして３回、繰り返された。in situ ハイブリダイゼーションはSpector et al. (1998)に従い、ニック翻訳型DIG−11−dUTP-標識 (ニック・トランスレーション・キット；ロシュ社) サイクリン D1 及びGAPDH PCR−増幅フラグメント (サイクリン D1 特異的 5SA, 5’−catggaacaccagctcctgt−3’ (SEQ ID NO: 22) 及び3SA, 5’−cgcagccaccacgctccc−3’ (SEQ ID NO: 23); 及び GAPDH 特異的 GAPDHHF, 5’−accacagtccatgccatcac−3’ (SEQ ID NO: 24) 及び GAPDHMR, 5’−tccaccaccctgttgctgggg−3’ (SEQ ID NO: 25)) を用いて行われ、DIG Fab フラグメント（ロシュ社）、続いてロバ抗ヒツジテキサス・レッド（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社）を用いて検出された。PML は5E10 mAb (U2OS細胞の場合) 、続いて Alexa Fluor 350結合ヤギ抗マウス Ab (モラキュラー・プローブズ社) 又はウサギポリクローナル抗PML Ab ( NIH 3T3 細胞の場合)、続いてAlexa Flour 350結合抗ウサギ Ab (モラキュラー・プローブズ社)を用いて検出された。4E はFITC結合マウス モノクローナル抗4E Ab (BD トランスダクション・ラボラトリーズ社)を用いて検出された。細胞を、DAPI (ベクタ・ラボラトリーズ社)を加えたベクタ・シールド上に載せた。画像はTCS−SP ソフトウェアを用いて得られ、Adobe フォトショップCS 8.0を用いて表示された。
【０２３８】
結果
4E は核内のサイクリン D1 mRNAと物理的に結合する
mRNA 輸出の促進に対する4Eの効果の特異性の下にある基礎を理解するために、我々は、4Eが核内の特異的mRNAにのみ物理的に結合するのではないかという新規な可能性を調べた。この方法において、サイクリン D1
mRNAの輸出の4E依存的促進はこの mRNAの核内の4E との特異的な物理的相互作用を通じて起きるのかも知れない。第一に、我々は4E がサイクリン D1 と一緒に免疫沈降するか、あるいはGAPDH 及びアクチン mRNAなどのハウスキーピング遺伝子と一緒に免疫沈降するかを、全細胞ライセート中で、そして次に核及び細胞質画分中でU2OS、NIH3T3、K562、U937、及びHEK293T 細胞を含む多様な細胞株を用いて調べた。結果は細胞株を通じて同じだったため、代表的な結果のみをここでは示す（図１１）。ここで調べられたmRNAの両者及び4Eは内因性である。RNAは各実験毎に個別に、定量的RT−PCR及び準定量的PCRを含む複数のPCR戦略を用いて検出された。常に一致する結果が、これらの異なる方法を用いて得られた。
【０２３９】
免疫沈降研究では、予測通り、全細胞ライセート中において、4E はサイクリン D1 及びGAPDH mRNAの両者に結合したことが示された。なぜならこれらのmRNAにはキャップがあるからである（図１１ａ）。核内画分中では、4Eはサイクリン D1 mRNA の容易に検出可能な画分に物理的に結合する（図１１ｂ）。それでも、 核内画分中の 4E 及びGAPDH mRNA 又はアクチン mRNA 間には何の検出可能な結合は観察されず、全細胞ライセート又は細胞質画分とは対照的である（図１１ａ及び図なし）。これらの結果は、我々の準定量的及び個別のRT−PCR 分析で確認される（図１１ｂ、ｄ、及びe）。やはり、特異的プライマ及びRT−PCRを用いて観察された通り、4E は核内のプロセッシング済みのサイクリン D1 mRNAとのみ、結合する（図示せず）。重要なことに、4E のGAPDH 又はサイクリン D1 mRNAへの結合能は、同じ4E 免疫沈降由来材料を用いて観察された。このように、GAPDH 及びサイクリン D1 間での結合親和性の違いは、実験間の免疫沈降効率の違いや、分画の品質の違いの結果ではない。これらの免疫沈降及び分画の品質についてのコントロールを以下に紹介し、材料及び方法の項で論じる。
【０２４０】
上記の発見により、核内の4E−mRNA認識は細胞質内でのそれとは実質的に異なるかも知れないことが示唆された。特に、核内での4E−mRNA認識にとってキャップ結合の重要性を確立することが重要だった。従って我々は4E のどの特徴が核内画分中のサイクリン D1 mRNA との相互作用に必要であるかを、タンパク質と結合する特異的核酸と呼ばれるGST プルダウン法を用いて調べた (SNAAP; Trifillis et al., 1999)。ここで、核ライセートをグルタチオン・セファロースに結合させた野生型又は変異型の4EGST 又は GST と一緒にインキュベートした（図１１ｃ）。免疫沈降での発見と合致して、野生型 4E はサイクリン D1 には結合したがGAPDH mRNAには結合しなかった。いずれのmRNAについても、GST （図１１ｃ）又は無関係の mRNA結合性タンパク質アルファ−CP1−GST （図示せず）との結合は観察されなかった。キャップに結合しないW56A 4E 変異体はサイクリン D1に結合しないことから、4Eはやはり核内画分のmRNAに結合するのにそのキャップ結合活性を必要とすることが分かる（図１１ｃ）。我々はこれらの研究を拡張して背側表面変異体であるW73Aがそれでも核内の, サイクリン D1 mRNAに結合できるかどうかを調べた。なぜなら、この変異体は発現した場合のサイクリン D1 の輸送を容易に亢進するからである（Topisirovic et al., 2002, 2003a)。重要なことに、W73A変異体は翻訳では欠乏しているが、輸送ではしていない。このような変異は野生型に比較した場合にもサイクリン D1 mRNAへの結合を検出可能なほどには減少させない（図１１ｃ）。これまでの生物物理研究では、W56A及びW73A 変異体は野生型 4Eから区別できない構造を有することが示されていることに留意されたい(Kentsis et al., 2001)。このように、核内の 4Eのサイクリン D1 mRNAへの結合能と、4EのこれらのmRNAの輸送亢進能との間には相関があるようである。
【０２４１】
我々はこれらの発見を拡張して、核内における4EとのmRNAの結合にとってのm7Gキャップの要件を更に実証した（図１１ｄ及びｅ）。我々は m7G キャップ 類似体 (m7GpppG) がmRNA 結合をめぐって競合する能力を準定量的PCR そして個別に、定量的RT−PCR法を用いて観察した。W56A 変異体を用いた上記の結果と合致して、キャップ類似体はサイクリン D1 mRNAの4Eとの結合を成功裡に破壊する。対照的に、4Eに結合しない GpppGは、それのサイクリン D1との結合を破壊しない。いずれの場合でも、4E はGAPDH mRNAには結合しない。まとめると、これらの発見は、4E には、核内の特異的mRNAと結合するためには m7G キャップが必要であることを示すものである。m7GpppG 又はGpppGによる処置はこれらの反応において4E 抗体により免疫沈降する4E量を変えないことに注目されたい（未公開データ）。
【０２４２】
興味深いことに、細胞の細胞質画分を4E−GSTと一緒にインキュベートした場合、全てのmRNAが結合し、全ライセート又は細胞質画分を用いた免疫沈降実験で我々が観察した結果と同様であった（未公開データ）。我々が核ライセートを組換え4E と一緒に SNAAP検定でインキュベートした場合ですら、GAPDH mRNA との結合を観察しないことは興味深い（図１１ｃ）。このことから、キャップ結合があればこれらの相互作用を媒介するのに充分である細胞質にはない他の調節因子により、核ライセート中の4E-mRNA 認識は制限されている可能性が持ち上がる。 陽性コントロールとして、我々は我々の実験を拡張して GAPDH 及び サイクリン D1 mRNA の両者が、一緒になってキャップ結合複合体（CBC）を形成する他の核内キャップ結合性タンパク質 CBP 80 及び CBP 20 に結合するかどうかを判定した。概略的には、CBCは全ての転写産物と共転写的に結合する（Visa et al., 1996）。免疫沈降はCBP80に対する抗体を用いて行われた。結果はRT−PCR法をにより準定量的かつ個別に観察された。並行実験を4E 抗体で同じ核内画分を用いて行った。予想通り、CBC は サイクリン D1 及び GAPDH 転写産物の両者と結合したが、他方、4E はサイクリン D1 mRNA にのみ、結合した（図１１ｆ）。我々は更に CBC が4Eに結合するかどうかを判定した。我々は免疫沈降（図１１ａ）及び別々に免疫蛍光法（図示せず）を用いて、CBC 及び4E間の結合がないことを観察した。これらの発見は、CBC及び4E 間に共免疫沈降がないことを示したこれまでの報告と一致するものである(Ishigaki et al., 2001; Lejeune et al., 2002)。しかしながら、我々は、我々がこれらの方法で検出できないような、 CBC 及び4E間の一過性の相互作用の可能性を度外視することはできない。まとめると、これらのデータは、4E-サイクリン D1 mRNA 及び CBC-サイクリン D1 mRNA 複合体は核内の別個の複合体であることを示唆している。
【０２４３】
核内で4Eが結合するのは、RT−PCR法の検出限界を超えた低レベルのGAPDH
mRNAに結合するという可能性を我々は度外視できない。これが本当だとしても、両方の画分中でGAPDH が遥かにより豊富なmRNAであるという発現量の相対的な違いにも拘わらず、GAPDHに対してサイクリンD1の最高１，０００倍までの濃縮を我々は容易に検出する（図１１ｃ及び図１３ｂを参照されたい）このように、免疫沈降及びSNAAPという2つの個別の方法を用い、我々は、4E が核内画分中の特異的mRNAと物理的に結合することを実証するものである。更に、4E はこの結合にとってそのキャップ結合活性を必要とするが、背側表面のW73はそうではない。別の研究室による最近の発見は、4Eは核内画分中のすべてのmRNAに結合することを示唆している (Lejeune et al., 2002)が、他方、我々がここで紹介するデータは、4EはサイクリンD1には結合するが、 核内画分中のGAPDHにも、又はアクチンmRNAにも結合しないことを明確に示している。この食い違いを説明する最も可能性の高い理由は実験法の違いである。主な違いの一つは、我々は４Ｅと、内因性だが過剰発現していないmRNAとの結合を観察していることである（図１１）。過剰発現は内因性RNPとは異なるRNPの形成につながり得る。このように、我々は我々の研究を内因性4Eや内因性mRNAで開始した。免疫沈降した画分中の結合型mRNAの検出もまた、これらの実験の最適な解釈にとって重要である。我々は、mRNAのバックグラウンド結合を実際の結合に勘違いしないために、我々の結果を定量的RT−PCR法で裏付けた。更に我々は、異なる4E抗体を用いても、又は、4E−GSTとの複合体を再構築しても、同じ結果を得る。明らかに我々の特異性は、4Eの過剰発現はサイクリンD1を上方調節するが、GAPDH 又はアクチンmRNA の輸送は上方調節せず、対応してサイクリン D1 タンパク質レベルは上方調節するが、GAPDH 及びアクチンタンパク質レベルは上方調節しないという、我々のグループ及びゾーネンバーグのグループによる前の観察と良好に相関するものである。
【０２４４】
サイクリン D1 mRNAは4E核小体の下位集団に局在する
4Eは核内でサイクリン D1 mRNA に特異的に結合するため、我々はサイクリン D1 mRNA が4E核小体と特異的に結合するかどうかを調べた。この方法では、4E 核小体は特異的RNPの集合部位又は機能的保管部位であろう。研究はU2OS 及びNIH3T3 細胞で行われた。サイクリン D1 又はGAPDH mRNAの位置特定はin situ ハイブリダイゼーションを用いて行われ、4Eや核小体のもう一つの成分であるPMLの位置特定は免疫蛍光法を用いて判定された。結果は共焦点顕微鏡を用いて観察された。同様な結果がU2OS
及びNIH3T3 細胞の両方で観察される（図１２ａ及びｂ）。これらの研究で、サイクリン D1 mRNAs (赤) は細胞質及び核質全体を通じて見られるが、核内の小体では更に濃縮されていることが明らかになった。これらの局所的な濃縮部位は4E核小体（緑）の下位集団と同時局在している。4E核小体及びサイクリン D1
mRNAの同時局在部位を黄色で示し、複数のこのような部位のうちの二つを矢印で印す（図１２）。図１２における全実験の対物レンズは１００倍であり、以下のように更に拡大したことに留意されたい： A-Cは２倍；そして Dは１．５倍。これらの研究の現在の分解能では、サイクリン D1 mRNAが表面上に見られるか、又は4E小体内にみられるかを区別することはできない。以前の研究と合致して
(Lai and Borden, 2000; Cohen et al., 2001)、PMLを含有するものと、含有しないものという２つの4E核小体集団がある。4E (緑) 及びPML (青) の大半は同じ核小体（明るい青）に同時局在しており、多くの細胞について以前観察されたように、更なる4E小体もある（図１２ａ、緑；Lai
and Borden, 2000; Cohen et al., 2001)。
【０２４５】
重要なことに、mRNAは、RNAがPML核小体と局在していなかったことを示す以前の研究と合致して、PML核小体と局在していることは決して観察されなかった(Boisvert et al., 2000)。このように、サイクリン D1 mRNAは、PMLを含有しない4E核小体の下位集団に局在する。予想通り、GADPH mRNAはPML 又は4E 小体のいずれとも局在しない（図１２ｂ）。これらの結果は、核内GAPDH mRNAが4Eとは物理的に結び付かず、そして4E過剰発現によりそれらの輸出が調節されることはないという観察と合致する
(Topisirovic et al., 2002, 2003a)。陰性コントロールとして、サイクリン D1 −/− 細胞でのin situ ハイブリダイゼーションのためのサイクリン D1のプローブは、これらのプローブがサイクリン D1に特異的であることを示すシグナルは何ら露呈しなかった（図１２ｃ）。更に、RNase処置により、シグナルは完全に損なわれる（図示せず）。上記の結果から予測された通り、PML 抗体を用いた免疫沈降研究では、サイクリン D1 又はGAPDH mRNAのいずれとも、結合は示されない。これらのデータは、PML は4Eのm7G キャップに対する親和性を１００分の１を超えて低下させ(Kentsis et al., 2001)ることで、RNA結合を不可能にするという我々の前の発見と合致する。 4E はそのキャップ結合活性をサイクリン D1との相互作用に要する（図１１ｄ及びｅ）ため、サイクリン D1 mRNAが、4E小体を含有するPML には見られないということは辻褄が合う。
【０２４６】
要約すると、サイクリン D1 mRNAは4E核小体の下位集団に局在する。mRNAの小体への局在は特異的であると共に、それらがその後細胞質へ輸送されるには機能上重要である可能性が高い。このようにして、4E核小体は、細胞質への輸送を促進することができる特異的4E−RNPにとっての集合部位かも知れない。更に、核内では、観察される4Eの特異性をもたらす、結合型mRNAに特定の特徴があるに違いない。
【０２４７】
4EのmRNAとの物理的結合はmRNA輸送の亢進と相関する
上で我々は野生型 4E 及びW73A 変異型の両者は核内画分中のサイクリン D1 mRNAと物理的に結合するが、キャップ結合に欠陥があるW56A 変異体は結合しないことを実証する（図１１ｃ）。結合及びmRNA輸送間に輸送があるかどうかを判定するために、我々は、これらの変異体のサイクリン D1 mRNA輸送促進能を評価した。変異型又は野生型タンパク質を発現する、安定にトランスフェクトしたNIH3T3細胞を分画し、mRNAをノーザン分析で以前に解説された通り(Topisirovic et al., 2002)に観察した（図１３ａ及び表Ｉ）。U6snRNA 及び tRNALys は分画コントロールとして役立つ。予想通り、GAPDHはいずれの場合でも変化しない。更に、該変異型タンパク質は同様なレベル（図１３ｃ）発現し、サイクリン D1 mRNA の総レベルはコンストラクトのいずれによっても変化しない（図１３ｂ）。更に、サイクリン D1 転写産物の安定性は4Eの影響を受けない（図１３ｄ及び表ＩＩ）。
【０２４８】
重要なことに、4E 及びW73A 変異体はサイクリン D1 mRNA 輸送を促進するが、このとき、ベクタよりも多くのサイクリン D1 転写産物が細胞質画分内にはっきりと見える。重要なことに、W56A 変異体はサイクリン D1
mRNA 転写産物の細胞レベル下分布を変化させない（図１３ａ及び表Ｉ）。4E依存的mRNA 転写産物の結果の一つは、細胞内のこれらのmRNA濃度が高いこと、ひいては翻訳機序に利用できるこれらのmRNA量が多くなっていることを原因とするタンパク質レベルの上昇である。上記の分画研究と合致して、サイクリン D1 タンパク質レベルは野生型及びW73A変異型実験では上昇しているが、W56A変異体が過剰発現した場合には上昇はない。このように、サイクリン D1 mRNAの核内画分の4Eとの物理的結合は、核から細胞質へというサイクリン D1 mRNA の輸送の亢進と強く相関する。
【０２４９】
PML 過剰発現はサイクリン D1 の核内保持につながるが、GAPDH mRNAの核内保持にはつながらず（図１３ａ）、またサイクリン D1 の低下にはつながるがGAPDH 又はアクチンタンパク質レベルの低下にはつながらない（図１３ｃ）。このことは、PML は4E-サイクリン D1 mRNA複合体の形成を阻害するという、免疫沈降及びin situ 研究の結果と合致する（図１１ｂ及び図１２ａ）。これにより、やはり、
4E のRNAとの物理的相互作用能がmRNA輸送促進能に結び付けられる。以前の研究では、4Eは4Eトランスポータタンパク質との相互作用により核内に進入できることが実証された(4ET;
Dostie et al., 2000)。ここで、背側表面(W73A) を変異させると4ETとの結合が損なわれ、ひいては核内進入が損なわれた(Dostie et al., 2000)。このように我々は実験を行って、W73A 変異体がそれでも尚、核内に進入して核小体を形成することを確認した（図１３ｅ）。共焦点顕微鏡を用い、我々は過剰発現型4E 又はW73A変異体の細胞レベル下分布を Xpressエピトープ・タグと、付加的に、内因性及び過剰発現方タンパク質の両者を認識する抗4E抗体とを用いて調べた。
【０２５０】
共焦点顕微鏡写真から、W73A 変異体は核内に容易に検出可能であり、内因性4E核小体と結合することが明白である（図１３ｅ）。このように、W73A変異体を過剰発現させると、それは代替的なルートを用いるか、あるいは4ETに対する弱い結合を克服することができ、核内へ輸送されて核小体と結合することができるように思われる（図１３ｅ）。W56A変異体を用いた同様な研究では、野生型に比較しても細胞レベル下分布に何の変化も見られなかった（図示せず）。加えて、野生型及び変異型の4Eは同様なレベル、発現する（図１３ｃ）。4E レベルは同様なレベル、発現する（図１３ｃ）。これらの顕微鏡の対物レンズは１００倍であり、更に１．５倍に拡大したことに留意されたい。
【０２５１】
【表１】
2010505123.tif 000002
【０２５２】
a − サイクリン D1 mRNA レベルは GAPDH
mRNAに正規化された；
+/− 値は個々の実験からのSDを表す。
【０２５３】
【表２】
2010505123.tif 000003
【０２５４】
a − サイクリン D1 mRNA レベルはGAPDH
mRNAに正規化された；
+/− 値は個々の実験からのSDを表す。
【０２５５】
核区画中で4E感受性を媒介するRNA構造因子の同定
核内でのmRNA の4Eとの結合と、4E依存的mRNA輸送が何らかの特異的 mRNA 配列を通じて媒介されるのかどうかを判定するために、我々は我々のモデル mRNA サイクリン D1由来の3’ 及び5’ UTRを分析した。LacZ のコーディング領域をサイクリンD1の5’ 又は3’ UTRに融合することで一連のキメラ・コンストラクトを作製した（図１４ａ）。我々は、キメラmRNAが核内の内因性4Eに結合でき、その後、その輸送の調節を受けるにはこれらの配列が必要充分であるかどうかを評価した。NIH3T3 及び HEK293T 細胞で実験を行ったが同一の結果が出た。HEK293T細胞は、大きさ及び形態共にNIH3T3 細胞で観察されるものに同様な核小体を形成する（図１２ｄ）。最初の準定量的PCR結果を定量的RT−PCR法により、標準曲線を用いて確認した（図１４ｂ）。我々は、4E の核内画分のこれらのmRNAに対する結合能をPCRと併用した免疫沈降法を用いて観察した（図１４ｂ）。重要なことに、4E はLacZ mRNAと免疫沈降せず、Lac Z−サイクリン D1 5’ UTR キメラmRNAと沈降しないが、サイクリン D1の3’UTR全体を含有するキメラLacZ
mRNAとは結合する。我々は、サイクリン D1 cDNAの3'UTRの中央に配置されたEcoRI 部位を用いて、3'UTRの２つの異なる部分を持つキメラLaczコンストラクトを更に作製し、サイクリン D1 3’ UTR (3’ UTRA) の一番目の部分を含有するキメラRNAは核内4Eと免疫沈降するが、二番目の部分 (3’ UTRB) はしないことを示した。
【０２５６】
サイクリン D1 3’ UTRの一番目の部分由来の様々な因子を含有する付加的なキメラ・コンストラクトを分析すると、サイクリン D1の3’UTR由来の100−bpの配列（ヒトサイクリン D1
cDNAでは2,471-2,565 bpに位置する）が、4Eとの結合には必要充分であることが明らかになったため、我々はそれを4E−感受性因子(4E−SE)と呼ぶ。重要なことに、この因子はヒト、マウス、ラット、及びニワトリ配列で高度に保存されている（図１４ｃ）。実際、ヒト及びニワトリ間の4E−SEは 94% の保存度でほぼ同一であるが、他方、3’UTRの残りは59%の類似性しかない。
【０２５７】
哺乳動物及び鳥類に 4E−SEが存在することは、それが進化上保存されていることを示している。キメラmRNAの4Eとの相互作用が機能的かどうかを評価するために、我々は4E発現がそれらの輸送に及ぼす効果を調べた（図１５）。mRNA輸出は、細胞レベル下分画を準定量的 RT PCR （図１５ａ）、ノーザン法（図１５ｂ乃至１５ｄ）（表ＩＩＩ）と併せて用いて観察された。 4E は、4E−SE を含有しないLacZ又はLacZキメラの輸送を調節せず（図１５及び表ＩＩＩ）、このことは4EがこれらのmRNAに結合しないという観察と合致する（図１４ｂ）。同じトランスフェクト細胞から判定された全mRNA
レベルは、LacZ mRNAレベルは調節されず（図１６ｂ）またそれらの安定性も調節されなかった（図１６ｃ）ことを示していた。このように、4EがこれらのmRNAの3’UTRに（直接又は間接的に）結合する能力と、それらの輸送を促進する能力との間には強い相関がある。4E−SEが存在するときのLacZ mRNAの輸出増加、ひいては高レベルの細胞質内mRNAは、高レベルのLacZ タンパク質と相関関係にある（図１６ａ）。我々の先の観察と合致して、W56A 変異体の過剰発現は、野生型4Eに比較してLacZ 又はLacZ−4E−SE のいずれの輸送も変化させず、また W56A 変異体は、いずれのLacZ コンストラクトのタンパク質産生も変化させない（図１５ｄ及び図１６ａ；表ＩＩＩ）。このように、
mRNAはそれらのキャップ依存性を保持する。更に、キメラコンストラクトの全てが同様なレベルの全mRNAを有していたことから、タンパク質レベルで観察される違いは転写後のものであり、そして4Eとの結合の及び輸送の違いはコンストラクトの発現の違いが原因ではないことが示された（図１６ｂ）。重要なことに、LacZ−4E−SE輸送は、我々が内因性サイクリン D1 mRNA に関して観察した（図１３ａ乃至ｃ）ように、PMLにより負の調節を受ける（図１６ａ）。まとめると、これらの結果は、4E−SE 及びm7G キャップの両者が、4EがこれらのmRNAの輸送を亢進するには必要であることを示すものである。
【０２５８】
【表３】
2010505123.tif 000004
【０２５９】
a − LacZ mRNA レベルは GAPDH mRNAに正規化された
+/− 値は個別の実験からのSDを表す。
【０２６０】
4E−SEは4E 媒介性発癌性形質転換に寄与する
我々はこれらの研究を拡張して、4E−SE が4Eの生理学的活性に寄与するかどうかを確立することで、このRNA因子の機能的有意性を評価した（図１７）。我々の以前の研究では、サイクリン D1 mRNA 輸出の4E依存的促進を、4Eの形質転換活性と相関付けたため、我々は4E−SEのこの活性への寄与を調べた。形質転換活性は、サイクリン D1 −/− 線維芽細胞株内で4Eが過剰発現したときに形成される焦点数を観察することにより、評価された。4E核小体の分布は他の細胞種に比較してもサイクリン D1 −/− で変化していないことに留意されたい（図１２ｃ）。まず、我々は4E形質転換サイクリン D1 −/− 細胞をベクタ・コントロールと相対的に判定した。完全長3’UTR (cycFull) を含有する サイクリン D1コンストラクトを再導入すると、4Eのみをトランスフェクトした細胞よりも焦点が実質的に多くなった（図１７ａ）。しかしながら、3’UTR
(cycTrunc)は 4E過剰発現細胞のみと同じであるため、4Eの形質転換活性はサイクリン D1の導入によって強められなかった。重要なことに、100 nt 4E−SE (cyc4E−SE)のみを持つ4E 及びサイクリン D1を導入すると細胞は形質転換し、完全長3’UTRを含有するコンストラクトでも同様だった。このように、サイクリン D1−/− 細胞の文脈では、4Eの形質転換活性は4E−SEが存在する場合には サイクリン D1を再導入しさえすれば、増加する。合致するように、サイクリン D1−3’UTR (cycFull) 又はサイクリン D1−4E−SE (cyc4E−SE) をトランスフェクトした細胞だけがサイクリン D1 タンパク質レベルの増加を示し、ベクタ・コントロール又は切断型3'UTR (cyc−Trunc; 図１７ｂ)を持つサイクリンD1でトランスフェクトした細胞とは対照的だった。
【０２６１】
このように、4E−SEの存在はサイクリン D1輸出能及びその後の効率的な細胞形質転換能と密接に結び付いている。これらの効果は内因性4Eにまで拡張することができる。過剰発現方4Eがなくとも、cycFull 又はcyc4E−SEを発現する細胞は、切断型のサイクリンD1を発現する細胞よりも多くのサイクリン D1 タンパク質を産生する（図１７ｂ）。我々はこれがmRNA輸送レベルで起きることを分画及びRT−PCR法により確認する（図１７ｃ）。我々は、核内対細胞質内サイクリン D1 mRNA の比がcycTrunc コンストラクトを発現するサイクリン D1−/− 細胞での方が、cycFull 又は cyc4E−SE コンストラクトを発現するものよりも最高２５０倍高いことを実証する。従って、cycTrunc は cycFull及びcyc4E−SE コンストラクトほど効率的には細胞質へ輸送されることはない。重要なことに、GAPDHの分布はこれらコンストラクトのいずれによっても変化しなかった（未公開データ）。ノーザン分析によりこれらの発見が裏付けられ、また画分が清浄であったことが示された（未公開データ）。このように、4E−SEが存在することにより、内因性又は外因性の4Eを用いた allows more efficient export of サイクリン D1 mRNA のより効率的な輸出が可能になるのである。
【０２６２】
議論
これらの研究から、 4E は細胞質内mRNAと基本的に異なる態様で核内mRNAと結合し、これを調節することが明らかである。キャップ結合があればmRNAとのその機能的な相互作用には充分である細胞質内画分の4Eとは違い、核内では、4Eは、4E−SEを欠くmRNAとのその結合を制限する調節因子と結び付くようである。4E は m7G キャップに結合するため、我々は、他の因子が3'UTR内の4E−SEと直接結合し、4Eとの物理的結合を通じて、この下位集団のmRNAに対するその親和性を増すという仮説を立てる（図１８）。4Eのキャップ結合は、4E−SEとの直接的接触で未知の機序を通じて安定化するというmRNA ルーピング・モデルは別の可能性である（図１８）。サイクリン D1だけでなく、数多くの他のmRNAもこの方法で調節される（未公開データ）ことは、特にODCもその輸送がこの態様で調節されることを考えると、可能性が高いであろう (Rousseau
et al., 1996)。我々の研究及び最近の報告では、4EはCBCとは結合せず、またスプライシングのないmRNAとも結合しないことが示されている
(Ishigaki et al., 2001; Lejeune et al., 2002)。これらの研究は、キャップの付いたサイクリン D1 mRNA 転写産物のCBCから4E への輸送はスプライシング後、そしてサイクリン D1 mRNA が核から輸出される前、に起きることを示唆している。4E及びCBCは共免疫沈降も、同時局在もしないため、この相互作用は一過性のものである可能性が高い。我々は、サイクリン D1 mRNAのキャップが、CBC RNP を出て4Eに結合する間、何らかの未知の手段により保護される完全に新規な機序がある可能性を度外視することはできない。これは将来的な調査分野である。
【０２６３】
4E依存的態様で輸出されるmRNAは何らかの代替的な4E依存的種類のmRNA品質監視を受けるのであろう
以前の研究では、4Eの核内画分がmRNA品質監視の一部として低レベルの核内翻訳に関与しているかも知れないことが示唆されていた (Iborra et al., 2001)。しかしながら、W73A 変異体を用いた我々の研究は、核内翻訳は、観察される輸送機能には必要ではないことを示している。なぜならこの変異体は輸送では活性であるが、翻訳では、eIF4G に結合できないために活性でないからである(Sonenberg and Gingras, 1998; Gingras et al., 1999。サイクリン D1などの成長促進性mRNAの輸送や、PMLなどの因子によるこのプロセスの制御の特化した経路は、遺伝子発現を細胞増殖と調和させるために進化したのかも知れない。4E核小体は、mRNA輸出時に作用するためにはインタクトでなければならない。なぜならそれらの破壊は輸出活性の消失と相関するからである (Topisirovic et al., 2003a; Kentsis et al., 2004)。我々のデータは、4E輸送RNPの集合は4E小体の中又は周囲で起きることを示唆している。サイクリン D1 mRNAの PML−陰性4E 核小体との同時局在は、これらの部位が、特異的サブタイプのRNPの集合区域であり、こうしてこの限定された下位集団のmRNAが細胞質により効率的に輸出されるのだということを示唆している。このようにして、これらの標的化されたmRNAの発現は極めて素早く調節され得るのであろう。mRNAの輸出の促進に関与する核内4E
RNPは、翻訳で機能的なものとは異なるようである。なぜならW73A変異体は輸送でも活性だからである(Cohen
et al., 2001; Topisirovic et al., 2003a)。合致するように、4E は核内のeIF4Gに結合しないようだが (McKendrick et al., 2001) 、eIF4Gは細胞質内では 4E RNP と一体の一部である
(Sonenberg and Gingras, 1998)。これらの結果は明らかに対応する核内及び細胞質内の4E RNPの大きな機能性上の違いを示唆している。mRNA輸出の4E依存的促進は、細胞が転写上の再プログラミング前にストレス及び／又は成長条件に応答する即座の応答系を提供するものかも知れない。
【０２６４】
我々はこのプロセスがサイクリン D1 mRNA だけに限られるものでなく、ODC及び多くの他のもの（未公開データ）も含め、成長調節に関与する他のmRNAがこの方法で調節されているかも知れないと考えた(Rousseau et al., 1996)。サイクリン D1など、成長促進性mRNAの輸出を促進する4Eの能力により、
それは細胞成長促進プログラムにスイッチを入れることができ、こうして4Eは成長調節ネットワークにおいて重要なノードに置かれている。PML（本文献） などの4E調節性タンパク質や、PRHなどの核内ホメオドメインタンパク質(Topisirovic et al., 2003a) は、4Eの上流で作用するのに良い位置に置かれている。しかし、このネットワークは4E結合性タンパク質による翻訳の重要な調節も含む (4EBP; Sonenberg and Gingras, 1998)が、我々の発見は、これらの輸送及び翻訳ネットワークは完全に重なっているわけではないことを示唆している。例えばサイクリン D1 mRNA は輸送レベルでは4Eに対して感受性であるが、翻訳レベルではそうではない (Rousseau et al.,
1996)。対照的に、 ODC mRNA は両方のレベルで4Eに対して感受性である (Rousseau et al., 1996)。ODC mRNAは サイクリン D1 mRNAと同様に 4E−SE因子を含有する（未公開データ）。PMLはこの核内ネットワークの重要な負の調節物質であることで、多種の成長促進性タンパク質の産生を同時にシャットダウンし、ひいては4E媒介性成長及び形質転換を阻害すると思われる。これらの活性は4E RNA 認識にm7G キャップ及び4E−Sを通じて依拠するものである。特異的mRNAの輸出の4E 促進は細胞内の成長調節について心躍る新しい観点であり、調節不全に陥った場合にはヒト癌にも寄与しかねない新規な調節経路を表す。
【０２６５】
実施例４．  4Eは細胞増殖を支配するRNAレギュロンの中心的ノードである
要約
真核性翻訳開始因子4E は、細胞周期進行のほぼすべての段階に影響するRNAレギュロンの中の重要なノードである。具体的には、4E は細胞周期進行に関与する複数の遺伝子のmRNAを、そして場合によっては翻訳も、調和的に促進する。これらのmRNAに共通の特徴は、4E感受性因子(4E−SE)と呼ばれる、3’UTR中の構造上保存された最高50個のヌクレオチド因子である。この因子はキャップのあるmRNAの4E核小体への局在、核内での4E特異的RNPの形成、及び4E依存的mRNA輸出にとって充分である。これらの研究では、翻訳及びmRNA輸出時の役割は別々であり、mRNA中の異なる配列因子と別個のRNPの形成とに依拠していることが示されている。更に、4E依存的mRNA輸出は進行中のRNA又はタンパク質合成からは独立である。NXF1依存的であるバルクmRNAの輸出とは異なり、4E依存的mRNA輸出は CRM1媒介性である。これらのデータは、4Eの増殖性及び発癌性の分子機序に対する新規な見通しを提供する。
【０２６６】
導入
RNA レギュロンは真核細胞が遺伝子発現を調和させる手段として提案されてきた。遺伝子の調和ある発現がゲノムの構成により達成される原核生物とは対照的に、真核生物は同じ生物学的プロセスに関与するmRNAの下位集団の調節を、RNPの個別の下位集団の組成及び活性を操作することにより、転写後レベルで調和させる。RNA局在に関するジップコード（原語：zipcode）と同様に、「調節のため非翻訳配列因子」（USERコード）と呼ばれる関連RNA配列は、さまざまなレベルの転写後調節に関与する多種の調節性タンパク質との特異的結合に用いられると考えられてきた。mRNA核外輸出はこの方法で調和させられていると考えられるレベルの制御の一つである。当初、mRNAの輸出は、全てのmRNAが核から細胞質へと、配列特異的特長とは無関係に輸送される一般的なプロセスだと考えられていた。より最近の発見は、mRNA輸出はRNA代謝における他の事象、特に転写及びスプライシング、と調和させることができる、ひいては転写産物の核内での歴史は、標的化されたmRNAの細胞質内での運命を調節することができることを示唆している。この方法で、核からの輸出は、mRNP構成を介した区画化を通じて調和させることができ、こうして、調和させられた機能上のクラスのmRNAの輸出は、増殖、分化及び発生といった生物プロセスにおけるそれらの機能と結び付けられる。
【０２６７】
真核性翻訳開始因子4Eを用いた研究では、mRNAの下位集団の発現を示差的に行わせる因子の一例を提供する。それは共通の5’ メチル−7−グアノシン (m7G) キャップ構造を通じて全ての転写産物に、結合するが、数多くのグループが、4Eの過剰発現はタンパク質発現における全体的な増加にはつながらないことを示した。細胞質内では、4E感受性となったmRNAはそれらのタンパク質レベルを、他のmRNAよりもより調節される。この感受性はこれらの転写産物中の5’UTRの複雑性に起因する。4Eの最高 68% が、酵母からヒトにいたるまで幅広い種の核内に見られる。ここで4Eの過剰発現により、サイクリン
D1の輸出が増加するが、 GAPDH mRNAはそうではない。核内におけるサイクリン D1 mRNAとの4Eの特異的な結合には、m7G キャップと、4E感受性因子（4E−SE）と呼ばれるその3’UTR中の小さな因子とが必要である。
【０２６８】
4Eの過剰発現は、組織培養物、動物モデル中のがん、そして予後の悪い数多くのヒト癌で発癌性形質転換と相関している。いくつかの系列の証拠から、4EのmRNA輸出機能がその発癌性に寄与していることが示されている。例えばサイクリン D1 mRNA の輸出は特定のサブタイプのヒト白血病では上方調節されている。これらの標本は異常に高レベルの4Eを含有し、その大半は核内に位置する。更に、4E 依存的mRNA 輸出の阻害剤である前骨髄球性白血病タンパク質（PML）及びホメオタンパク質PRHは核内で4Eに結合し、4E依存的なmRNA輸出及び4E媒介性発癌性形質転換を阻害する。更に、変異誘発研究により、mRNA輸出における4Eの活性と、細胞を発癌性形質転換させるその能力とが強く結び付けられている。
【０２６９】
サイクリン D1 は、4Eの増殖特性及びそのmRNA輸出機能を結びつける細胞周期において鍵となる役割を果たすが、4E は、その増殖可能性を駆動するために、いくつか他の成長促進性mRNAの発現も調和的に変化させている可能性もある。この研究では、細胞周期進行に関与する複数のmRNAも4E依存的mRNA輸出のターゲットであること、そして4E依存的mRNA輸出のレベル調節されるmRNAの下位集団が、細胞質内で優先的に翻訳されるものとは異なることを示す。我々は4E感受性転写産物の輸出の基盤にあるUSERコードを特定した。このコードは、これらのRNAの核レベル下分布や、関係する4E RNPの形成に必要である。興味深いことに、4E−SE USER コードは配列ベースのものでなく、構造上保存された因子である。4E依存的なmRNA輸出は翻訳から切り離され得る。最後に、 4E 依存的mRNA 輸出はバルクmRNAではなく、代替的なmRNA輸出経路を通じて起きる。これらの結果は、4E媒介性腫瘍形成に関する新規なパラダイムの基礎を提供するものである。
【０２７０】
材料及び方法
試薬及びコンストラクト．   pcDNA3.1LacZ ベクタ（インビトロジェン社）中のキメラ・コンストラクトはLacZのコーディング領域の3'側に位置させた。サイクリン D1最小4E−SE (c4E−SE) を EcoRI 又は XbaI 制限部位を5’ 末端に含有するプライマと、LacZ3’UTR
コンストラクトをテンプレートとして用いて増幅した
(Culjkovic et al, 2005)。同じアプローチをPim−1 コンストラクトのクローニングに用い、このとき pRBK−Pim−1 （ナンシー・マグナソン氏より贈与(Hoover et al., 1997) をテンプレートとして用いた。プライマ配列は補助表１で得られる。TetON系については、キメラ LacZ コンストラクトを pTREMyc ベクタ（クロンテック社）中に EcoRI 及びXbaIを用いてクローニングした。 pcDNA2Flag−4E、pMV、pMV−4E 野生型 又は変異体、pLINKSV40−PML、MSCV、MSCV−4E WT 又は変異体並びに細菌性発現コンストラクトは以前に解説されていた (Cohen et al., 2001; Culjkovic et al., 2005; Topisirovic and
Borden, 2005; Topisirovic et al., 2003b)。用いた試薬はすべて、そうでないと言及しない限り、シグマ社からの分析用等級だった。
【０２７１】
抗体．  免疫ブロット法用の抗体： mAb抗PML (5E10 (Stuurman et al., 1992))、mAb抗4E (BD ファーミンジェン社)、 mAb抗サイクリンD1 (BD ファーミンジェン社)、mAb抗Xpress (インビトロジェン社)、ウサギ pAb抗サイクリン E1 (M20、サンタ・クルズ・バイオテクノロジー社)、mAb抗GAPDH (MAB374, ケミコン社)、mAb抗c−Myc (9E10 サンタ・クルズ・バイオテクノロジー社)、ウサギpAb抗サイクリン A (C−19, サンタ・クルズ)、ウサギ pAb抗ニブリン（セル・シグナリング社）、mAb抗Pim−1 (19F7 サンタ・クルズ) 及びmAb サイクリン−B1 (GNS1サンタ・クルズ)。
【０２７２】
細胞培養及びトランスフェクション．  4E 及びPMLを安定にトランスフェクトしたNIH3T3 及びU937 細胞は解説された通りだった (Topisirovic et al., 2002;
Topisirovic et al., 2003a)。U937細胞を用いて、NIH3T3細胞では発現されない内因性Pim1を分析した。 2Flag−4E 有り又は無しのLacZ/LacZ−4E−SEや TetON LacZ 系をU2OS細胞に安定にトランスフェクトした。NXF1枯渇に関しては、U2OS細胞にリポフェクタミン2000 及び10nM siRNA 二重鎖 HSC.RNAI.N006362.1.3 (IDT) をメーカの指示に従ってトランスフェクトした。細胞はトランスフェクションから７２時間後に分析した。アクチノマイシン D、シクロヘキシミド及びレプトマイシンＢは全て細胞培養等級のものだった（シグマ社）。
【０２７３】
4E の免疫精製及びRT−PCR.  免疫精製法は以前に公開されている(Culjkovic et al., 2005)。リアルタイムPCR 分析をSybr Green PCR マスター・ミックス (ABI) をMx3000PTM 熱サいくら（ストラタジーン社）で用いて行い、データはMxPro ソフトウェア（ストラタジーン社）で解析した。条件はすべて以前に解説されていた (Culjkovic et al., 2005)。計算はすべて、  亜プライド・バイオシステムズ・ユーザ・ブルティン #2に解説された相対的標準曲線法を用いて行われた。
【０２７４】
免疫精製後のRNAの示差的表示をRNAimageTM kit (GeneHunter コーポレーション社)をメーカの指示に従って用いて行った。
【０２７５】
示差的表示に用いられるSNAAP プロトコルは解説された通りに行われた (Trifillis et al., 1999)。
【０２７６】
ウェスタン・ブロット法は解説された通りに行われた (Topisirovic et al.,
2002; Topisirovic et al., 2003a)。
【０２７７】
細胞の分画及びノーザン分析．  分画及びRNA分離は解説された通りだった (Lai and Borden, 2000;
Topisirovic et al., 2002)。U6用のプローブと、ノーザン・ブロット分析用のtRNAlysは以前に解説されている (Topisirovic et al., 2002)。
【０２７８】
免疫蛍光及びレーザ・スキャニング共焦点顕微鏡法．  実験は解説された通りである
(Cohen et al., 2001; Topisirovic et al., 2002)。蛍光は１００倍の光学倍率及び３又は４倍のデジタル・ズームを示した通りに、488、543 又は405 nm (室温で)励起したLSM 510 Meta (Carl
Zeiss Jena) 倒立レーザ・スキャニング共焦点顕微鏡で用いて観察された。チャンネルはすべて、別々に検出され、チャンネル間のクロストークは観察されなかった。共焦点顕微鏡写真は細胞の平面を通る単一の光学切片を表す。
【０２７９】
in situ ハイブリダイゼーションは以前に解説された通り(Culjkovic et al., 2005)
であり、ニック翻訳ビオチン−11−dUTP−標識プローブ（ニック翻訳キット、ロシュ社）を用いた。プローブは Cy3 IgG 画分マウス mAb抗ビオチン (1:100; ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社)を用いて検出された。
【０２８０】
EMSA 分析は公開されたとおりに行われた (Wein et al., 2003) が、以下の変更をした：20−50mg の核ライセートを 32P− 3’ 末端標識 LacZ、LacZ−c4E−SE 又はLacZ−p4E−SE 転写産物 (~50000 cpm) を、5mg 酵母 tRNA (シグマ社) 及び3mM MgCl2 を加えた25ml NET−2 緩衝液に入れたものと一緒に３０分間、室温で、そして2mg/mlのヘパリンを加えた後で更に１５分間、インキュベートした。競合研究のために、未標識の競合剤RNAを１０分間、核ライセートと一緒に予備インキュベートしてから、標識済みRNAを加えた。スーパーシフト実験には、核ライセートをmAb抗4E (BD ファーミンジェン社) と一緒に１５分間、予備インキュベートしてから、標識済みRNAを加えた。免疫枯渇させたライセートはウサギpAb抗4E（アブカム社）とのIPからだった。全ての mRNAを in vitro でmMessage mMachineTM T7 キット （アンビオン社）を用いて転写させ、3’ 末端を [32P]pCp
及びT4 RNA リガーゼ（アマーシャム社）を用いて標識した。試料を電気泳動により 5% 天然 (19:1) ポリアクリルアミドゲル上で２時間、 250V で、1倍の Tris−ホウ酸−EDTA 緩衝液を用いて分離した。
【０２８１】
ＵＶ架橋．  50mg の核ライセートを放射性標識済みプローブ (1−2x105cpm) と一緒に、EMSAと同じ条件でインキュベートした。ヘパリンとのインキュベーション後、試料を氷上に配置し、Stratalinker UV 1800 （ストラタジーン社）で１５分間、紫外線照射した。架橋したRNA：タンパク質複合体を10U
RNase A 及び10U RNase T1 で１５分間、37℃で処理した。30ml 2xSDS 試料緩衝液を加え、95℃で１０分間、加熱することにより、反応を停止させた。試料を10 又は 12% SDSポリアクリルアミドゲル
に充填し、50V で１６時間、室温で分離した。
【０２８２】
RNaseマッピング解析は解説された通り(Clever et al., 1995) 及びメーカの指示（アンビオン社）に従って行われた。簡単に説明すると、0,5−1x105 cpm 32P−5’末端標識済みの c4ESE 又は p4ESE RNAオリゴプローブ (IDT) を 3mg 酵母tRNA と混合し、 1、0.1 又は 0.01U RNase
V1 （アンビオン社）と一緒に１５分間、室温で； 1、0.1又は 0.01U RNase A （アンビオン社）と一緒に５分間、室温で；  1、0.1 又は 0.01U RNase T1 (シグマ社) と一緒に１５分間、室温で；1、0.1 又は 0.01U RNase
T2（インビトロジェン社）と一緒に５分間、室温で、又はアルカリ緩衝液と一緒に１、２又は５分間、９５℃（アルカリ加水分解）でインキュベートした。反応はEtOH/NaAc 沈降液で停止させた。試料を、1xTris/Borate/EDTA
緩衝液に入れた6% ポリアクリルアミドゲル−8M 尿素ゲル上で分解した。
【０２８３】
結果及び議論
4Eは幅広い転写産物のmRNA輸送を変化させる
4E依存的mRNA輸出は、それにより4Eが遺伝子発現を制御し、ひいては成長及び増殖を調節するという基礎の広い機序である可能性がある。我々はサイクリン D1 以外のmRNAが4E依存的態様で調節されるのかどうかを判定しようとした。我々は、核ライセートを用い、内因性4Eに関連するmRNAを、免疫沈降法又はGSTプルダウン・ベース法（(Trifillis et al., 1999) のSNAAP法）の組換え4Eにより、単離し、それらを示差的表示により同定した。同定された遺伝子の多くは細胞周期進行に関与するため、4E免疫沈降画分は更に、このプロセスに関与することが既知の他の遺伝子や、成長阻害性mRNAについても検査した（表ＩＶ）。標的の同定は全て、4E免疫沈降法及び定量的もしくは準定量的RT−PCR分析で確認した（図１８ａ）。重要なことだが、表ＩＶに挙げたリストは完全に包含的なものでなく、標的mRNA集団の試料採取を代表させることを意図している。なぜなら、示差的表示データから出る結果は、数百のmRNAはこの態様で調節を受けている可能性が高いからである。ここで我々は、これらのうちのごく下位集団を同定した（データは図示せず）。
【０２８４】
核内画分の4Eと物理的に関係するmRNAの多くは、細胞周期進行及び生存で作用する遺伝子産物をコードしており、4Eに関連する生理機能と合致する（表ＩＶを参照されたい）。重要なことに、4Eは検査した全てのmRNAに結合するわけではない（表ＩＶ）。例えば4EはPML 又は p53などの負の成長調節因子や、GAPDH、β−アクチン又はα−チューブリンなどのハウスキーピング遺伝子に対応するmRNAとは結合しない。更に、この特異性は翻訳レベルでの調節に向けたmRNAの感受性の簡単な反映ではない。なぜなら、翻訳レベルのみで感受性のmRNA（例えばVEGF (Clemens and Bommer, 1999)) は核内画分には関係ないからである（表ＩＶ）。4E免疫沈降画分には見られなかったmRNAが我々の核ライセートで容易に検出されたことに注目することが重要である（表ＩＶ）。抗4E
mAb によるIPの推定効率は最高で 80%であることに注目されたい。
【０２８５】
4EはmRNA のm7G キャップと結合するため、我々はこれが核内におけるmRNAとの4Eの結合に必要であるかどうかを調べた（図１８ａ）。4Eを核内画分から免疫沈降させ、mRNAを過剰量のm7GpppG か、又は、4Eに結合しない類自体であるGpppGで処理した。検査したmRNAは全て、4Eにキャップ依存的な態様で結合し、即ち m7GpppGは結合をめぐって競合するが、他方GpppG はしない。これらのデータは、核内での4E のmRNAsとの結合は m7G キャップ依存的であることを示すものである。
【０２８６】
4EのmRNAとの物理的結合はmRNA輸出の亢進と相関する
核内画分中での4EのmRNA結合能と、4E過剰発現の4E依存的mRNA輸出亢進能との間に相関関係があるかどうかを検査するために、同定されたmRNAの4E過剰発現の関数としての細胞レベル下分布を分析した（表Ｖ）。4Eを過剰発現するU937 及びNIH3T3細胞又は適当な変異体を分画し、mRNAレベルをリアルタイムPCR又はノーザン分析で観察した。4Eが過剰発現すると、細胞質画分内の4E感受性mRNA量がベクタ・コントロールに比べて増加する（表Ｖ）。反対に、核内画分中で4Eに結合しない転写産物は、4Eが過剰発現してもそれらの輸出に変化はない（表Ｖ）。予想通り、β−アクチン、GAPDH、U6snRNA 及びtRNALys の細胞レベル下分布は影響を受けなかった（表Ｖ）。総mRNAレベルには何の変化もない（データは図示せず）。合致するように、4Eがそのキャップ結合部位（W56A）の変異のためにこれらのmRNAに結合できないと、これらのmRNAの細胞レベル下分布は変わらない（表Ｖ）。 更に、翻訳時には作用しないが、サイクリン D1 mRNA 輸出を促進する (Sonenberg and Gingras, 1998;
Topisirovic et al., 2002) 背側表面変異W73Aも、他の4E感受性mRNAの輸出を促進する（表Ｖ）。このように、全ての感受性mRNAには、それが核内で4Eと相互作用するには、4Eの m7G キャップ結合活性が必要であるが、背側表面上の w73 は必要ではない可能性が高い。重要なことに、円形二色研究では、W73A 及びW56A 変異体の両者とも、野生型 4E と区別できない構造を有することが示されている(Kentsis et al., 2001)。
【０２８７】
mRNA輸出の4E依存的促進の結果の一つは、これらのmRNAの翻訳機構にとっての利用可能性が高まり、こうしてタンパク質レベルの増加につながることである。従って我々は、同定された遺伝子の下位集団のタンパク質レベルが4Eにより上昇するかどうかを調べた。mRNA輸出の亢進と合致して、野生型 4E又はW73A 変異体が過剰発現すると、調べた遺伝子の下位集団のタンパク質レベルが増加したが（図１８ｂ）、他方、キャップ結合変異型（W56A）を過剰発現させた場合には、タンパク質レベルには何の増加もない。重要なことに、野生型 4E並びに W73A 及びW56A変異体は全ての実験で同様なレベルまで発現した（図１８ｂ）。
【０２８８】
これらのmRNAが同じ機序を通じて調節されるのかどうかを判定するためには、PML、即ち4E依存的サイクリン D1 mRNA 輸出の阻害剤(Cohen et al., 2001; Topisirovic et al.,
2002)が標的mRNAの輸出に及ぼす効果を調べることが重要だった。我々はPMLを過剰発現する細胞で、 ODC、c−Myc、サイクリン D1 及びサイクリン E1 mRNA（データは図示せず）の輸出減少（データは図示せず）、及びタンパク質レベルの低下を観察した。PMLを過剰発現させた場合も、やはりPMLは4E、β−アクチン又は GAPDHタンパク質のレベルを減少させず（図１８ｃ）、これらの転写産物のいずれにも、前mRNAレベルには何の変化もなかった（データは図示せず）。このように、PMLは4E依存的 mRNA輸出の阻害剤として作用し、サイクリン D1 mRNA 輸出の阻害剤としては作用しない。
【０２８９】
要約すると、mRNAと4Eの核内画分との物理的結合は、それらの核外輸出の亢進と強い相関関係にある。細胞質内では、これらのmRNAは翻訳レベルでは4Eによる調節の対象であったり（即ちODC）、又はなかったり（即ち サイクリン D1）する。このように、核内レベルでの4E媒介性調節 は細胞質レベルでのこのような調節を除外するものでも、又は必要とするものでもない。
【０２９０】
4E依存的mRNA輸出のためのRNAのUSERコード
以前に我々は、サイクリンD1及び対応するキメラLacZコンストラクトを、mRNA輸出レベルでの4Eによる調節に向けて感作する100ヌクレオチドの4E感受性因子（4E−3E）をサイクリンD1の3'側UTR中特定していたため(Culjkovic
et al., 2005)、我々は広範なバイオインフォマティクス解析を行って4E−SE様因子を、表ＩＶで同定された他の標的RNA中に同定した。配列解析では、4E−SE がサイクリン D1 転写産物中には良好に保存されて（鳥類からヒトにいたるまで） (Culjkovic et
al., 2005)いることが示されたが、ここで同定されたサイクリン
D1 及び他の4E 感受性転写産物を比較しても、いずれの共通の配列ホモロジーも明らかにできなかった。従って我々は、4E−SE因子が構造上保存された因子である可能性を調べた。
【０２９１】
標的mRNA中の共通の因子をもっともよく同定するために、我々はサイクリン D1の 4E−SEを、新たに同定されたmRNAのうちの一つであるPim−1 の4E−SE に比較することに決めた（我々はPim−1 3’UTR の領域を機能的4E−SEにマッピングした、図１９ｃ）。我々はサイクリン D1の4E−SEと、Pim−1 の 4E−SE を最小の最高ヌクレオチド領域にマッピングした（図１９ａ）。これらの最小ドメインを異種の
LacZ mRNAに融合させると、4Eと一緒に免疫沈降し、それらのr mRNA 輸出は4E により促進された（図１９ｃ）。このように我々は、これらの最小の最高50ヌクレオチドの因子の両者とも機能的 4E−SEであることを示す。観察される配列ホモロジーはなかったものの、両者の因子とも、二つの予測される隣接ステム・ループ・ペアを含有する。
【０２９２】
我々はヌクレアーゼ消化法を用いてこの二つの機能的4E−SEが、予測されるステム・ループ構造などの保存された二次構造特徴を有するかを判定した。重要なことに、これらの研究から、両者の因子とも同様な二次構造に折りたたまれることが判明した。我々はこの因子を隣接ステム・ループ・ペアと呼ぶ（図１９ａ及び１９ｂ）。合致するように、生物物理学的分析では、Pim−1 及びサイクリン D1 4E−SEは同様な生物物理的特性を有することが示される。例えばサイクリン D1 及びPim−1 4E−SEのための精製済みRNAを用いた熱溶融曲線の円形二色解析では、Tmの異なる複数の構造因子の存在と合致する多相挙動が明らかになった (Topisirovic
et al., 準備中)。このように、Pim−1 及びサイクリン D1 4E−SEの両者とも、二つの隣接するステム・ループ因子から成る同様な二次構造を有する。
【０２９３】
これらの研究で我々が直面した当初の問題は、ステム・ループ因子の存在がサイクリン D1 及び Pim−1の3’UTRに共通である点である。サイクリン D1単独では、PatSearch プログラム (Grillo et al., 2003) は１０個の潜在的なステム・ループ構造ペアを予測していたが、我々の以前の研究ではサイクリン D1 3’UTR のうちで4E感受性を与えることのできる部分のみが上に定義した 4E−SEであることが示されている(Culjkovic et al., 2005)。同様に、 Pim−1 3’ UTR は二つの予測される隣接ステム・ループ・ペアを含有するが、一つのみが機能的 4E−SEである。従って我々はPim−1 及び サイクリン D1 4E−SEの二次構造を比較して、他のステム・ループ・ペアから機能的4E−SEを我々が区別できるような特徴を判定した。二次構造の視覚的に診ると一組の A 及びUヌクレオチドが保存されているのが明らかになる (UX2UX2A、図１９ａで強調)。重要なことに、このようなヌクレオチドのパターンはサイクリン D1 又は Pim−1 3’UTRに見られる他のステム・ループ・ペアのいずれにも見られない。このように、機能的な4E−SEを、同様な二次構造に折りたたまれる可能性を有する他の因子から区別するために用いることのできる特徴がある。
【０２９４】
更なる分析では、保存されたヌクレオチド・パターンを持つステム・ループ・ペア構造はここで同定された他の4E感受性標的の全てに存在することが示された。重要なことに、4E感受性でないmRNAはいずれも、機能的4E−SEで見られる保存されたヌクレオチド・パターンを含有しない。要約すると、我々は4E感受性をもたらす二つの隣接ステム・ループ・ペアから成る構造モチーフを特定したのである。重要なことに、このモチーフ配列内には、他のペアになったステム・ループ構造から機能的4E−SEを区別するために用いることのできる4E−SEの特徴が存在する。
【０２９５】
4E−SEは4E核小体との局在に充分である
4E−SE が4E 核小体にとってのRNAジップコード（原語：zipcode）として作用するかどうかを判定するために、Pim−1 又は サイクリン D1 4E−SE のいずれかを持つLacZキメラ・コンストラクトをU2OS
細胞で発現させた。両方のキメラmRNAとも4E核小体と共局在する（図１９ｄ）。4E−SEがない場合には、LacZ 転写産物の 4E 核小体への局在は観察されない（図１９ｄ）。重要なことに、 LacZ−4E−SE は、負の調節物質であるPMLを含有する4E小体とは結合しない。これは、PMLと共局在するもの、そして内因性サイクリンD1 mRNAと共局在するものという、二つのクラスの4E核小体があることを示す我々の以前の研究と合致するものである。このように、内因性サイクリン
D1 mRNAは、PMLを含有しない4E核小体と共局在する (Culjkovic et al., 2005)。このように、LacZ−4E−SE 転写産物及び内因性 mRNAは同様な挙動をするのである。
【０２９６】
これらの実験は、4E−SE はmRNA配列の残りの部分とは関係なしに、キャップのあるmRNAを4E核小体内へ局在させるのに充分であることを実証している。更に、Pim−1 及びサイクリン D1 の4E−SEは局在活性という点で機能的に同等である。従って、4E−SEは4E核小体への局在のためのRNAジップコード（原語：zipcode）を提供するのである。
【０２９７】
4E-SEは4E依存的複合体を作る
4E-SE が単に局在シグナルとして機能するのかどうか、あるいはそれは4E依存的mRNPの形成で作用するのかどうかを確立するために、我々はEMSA検定を行った。研究は LacZ-サイクリン D1-4E-SE (c4E-SE) 及びLacZ-Pim-1-4E-SE (p4E-SE) の両方で行うことで、これらの複合体の集合が、いずれかの4E-SEに特異的な特徴ではなく、4E-SE自体に依存的であることを確認しようとした。 RNA プローブを 32P で3’ 末端標識し、m7G にはキャップを付けた。 6kDの可溶性タグを付けたマウス 4E （m4E）、又はタグのないヒト4E （h4E）のいずれかを添加すると、 両方のLacZ-4E-SE コンストラクトでよりゆっくり泳動する種が形成された（図２０ａ及び２０ｂ）。重要なことに、核ライセートを添加すると、著しくより高分子量の複合体が形成されたことから、4E以外のタンパク質が存在する可能性が高いことが示された。複合体のサイズは両方の4E-SEコンストラクトでほぼ同じだった。冷たい競合剤 4E-SE RNAを添加するとシグナルの低下が起き、4E-SE 因子が、標識済み4E-SE含有転写産物をめぐって競合していることと合致した（図２０ｅ）。核ライセートを、4E-SEを欠いたLacZ転写産物に添加してもこれらの複合体は形成されなかった（図２０ｂ）。
【０２９８】
核ライセートから形成された4E-SE 複合体が4E依存的であるかどうかを判定するために、EMSA検定を、4Eを枯渇させた核ライセートを用いた免疫沈降で行った。ライセートは少なくとも80%、4Eが枯渇していると推定した（データは図示せず）。4Eを免疫枯渇させたライセートは高分子量の複合体を生じなかった（図２０ｂ）。精製済みタグ有り4Eを免疫枯渇させたライセートに添加すると、複合体の部分的な回復がおきたが、これは予測できた通りであり、なぜなら抗4E免疫沈降中に枯渇させた他の因子でなく4Eのみが再導入されたからである。このように、4E及び関連する因子がこれらのRNPの形成には必要である。加えて、4Eに対する抗体は核ライセートから形成される複合体のスーパーシフトを引き起こす（図２０ｂ）。同一の結果は LacZ-p4E-SEでも観察される。最後に、p4E-SE中で一番目のステム・ループ(CACに変異させたG10C11G12 )を破壊する変異体は複合体形成において欠陥がある（図２０ｃ）。このように、4E-SE 因子は4Eと、4E-SEの構造とに依存的な複合体を形成するのである。
【０２９９】
これらの複合体を更に特徴付けるために、LacZ-4E-SEコンストラクトを紫外線で架橋した後、RNase 消化及びSDS-ゲル電気泳動法を行った（図２０ｄ）。EMSA 研究については、転写産物に m7G
キャップを付け、3’ 末端標識し、精製済み4E核ライセートの添加が架橋後の複合体のサイズに及ぼす効果を観察した。mRNAは3’ 末端標識してあるため、精製済み4Eのみによるキャップの結合はRNase 消化からRNAの残りの部分を保護するには充分ではなかった。核ライセートを添加すると、分子量に実質的なシフトが起きる。重要なことに、LacZ-c4E-SE 及びLacZ-p4E-SE はサイズの同様な複合体を形成する。75-90kD間で三つの別個の種が観察される（矢印で示す）。同じ複合体が、4Eを枯渇させた核ライセート中では存在しないことから、これらには形成するのに4Eが必要であることが示される。合致するように、核ライセートをm7GpppG
キャップ類似体（ncキャップ）で処理しても、やはり 75-90kD の範囲の複合体が破壊される。これらの種は、4E-SEのないLacZ コントロールでは存在しない。より低いバンドである64kD未満のものが、実験のすべてにあったことは、おそらく4E及び4E-SEに直接は関係していないいくつかの一般的なRNPの形成を示すものであろう。要約すると、二つの種類の複合体を観察する：4Eの非存在下で形成できると共にキャップがされており、4E-SE独立的であるもの（星印を参照されたい）と、4E、m7G キャップ及び構造上インタクトな4E-SEに依存する二番目の種類である。紫外線架橋研究をEMSAの結果と併せて見ると、4E-SE
はmRNAを局在化させるジップコード（原語：zipcode）（図１９ｄ）や、4E核内 mRNPのUSERコード（図２０）の両方として作用することが分かる。
【０３００】
4E依存的mRNA輸出は進行中のタンパク質又はRNA合成とは独立である
我々は4E依存的mRNA輸出にとっての新しいタンパク質合成及び転写の重要性を調べた。タンパク質合成を阻害するために、細胞を 100mg/ml シクロヘキシミドで１時間、処理した。（図２１ａ）。更に、内因性サイクリン D1 mRNAの輸出はシクロヘキシミド処理では調節されなかった（データは図示せず）。同様に、アクチノマイシン D 処理（10mg/ml）でもこれらのmRNAの輸出に影響はなかった（図２１ａ）。
シクロヘキシミド処理は輸出を調節することはなかったが、それでも尚、4E-SEはポリソーム装荷を4E依存的態様で調節できるかも知れない。従って我々は LacZ のポリソームプロファイルを、4E-SEの関数として、そして4E過剰発現の関数として、観察した。LacZ 及び LacZ-c4E-SEのプロファイルは区別できず、また4E過剰発現によって変化することはない（データは図示せず）。これは4Eが過剰発現してもサイクリン D1 mRNA ポリソーム装荷には変化はないという発見とも合致する（Rousseau et al.,
1996)。4E依存的mRNA 輸出が進行中のタンパク質合成とは独立であり、また4E-SEがポリソーム装荷に変化を与えないということから、mRNA輸出及び翻訳における4Eの機能は結びついてないようである。
【０３０１】
我々は以前にLacZ-c4E-SE 転写産物はLacZ 転写産物に比べても変わらない安定性を有するということをアクチノマイシン D を数時間の経過にわたって用いることで実証した (Culjkovic et al., 2005)。しかしながら、それでも尚、mRNAのターンオーバーが数時間より実質的に速いという可能性もある。従って我々はLacZ及びLacZ-4E-SE
TetON-誘導性細胞株を作成し、ドキシサイクリン添加直後のこれらのmRNAの安定性を調べた。4E-SEが存在する場合も、短期（数分）又は長期（数時間）のいずれでも、LacZ転写産物の安定性に実質的な変化はなかった（データは図示せず）。
【０３０２】
4E依存的mRNA輸出経路は過剰量の4E-SEで飽和する
もし4E-SEが輸出に必要であるなら、 LacZ-c4E-SE 又はLacZ-p4E-SE を過剰発現させると、4E-SE特異的輸出機序をめぐって競合することで、mRNAを含有する他の（内因性の）4E-SEの輸出が特異的に阻害されるはずであると推論した（図２１ｂ及び２１ｃ）。そこで我々は我々のTetON誘導性 LacZ、LacZ-p4E-SE 又はLacZ-c4E-SE コンストラクトを用いて、キメラmRNAの輸出を全mRNAレベルの関数として観察した。LacZ mRNAのレベルが低い早い時点で、4E-SE輸出はより効率的であり、細胞質内対核内のキメラmRNA比が高い。これらのmRNAのレベルが増すにつれ、4E-SE の輸出は飽和し、細胞質内対核内のキメラmRNAの比が減少する（図２１ｂ）。と同時に、内因性サイクリン D1 mRNA の輸出が4E-SEキメラ mRNAの発現の競合を受けた（損なわれた）（図２１ｂ）。更に、VEGF mRNA の輸出は影響を受けず、mRNA輸出レベルにおいてそれが4Eに対して非感受性であることと合致した（図２１ｂ）。このように、4E-SE 因子の過剰発現は4E-SE 特異的輸出機序をめぐる競合につながる。
【０３０３】
4E-SE媒介性輸出はNXF1からは独立であるがCRM1 依存的である
最も良く解説されば細胞内mRNA輸出経路は、バルクmRNA輸出を媒介するようであるNXF1/p15 ヘテロ二量体が関与するものである(Cullen,
2000; Cullen, 2003a)ため、4E-SE mRNA 輸出のNXF1への依存を調べた（データは図示せず）。以前の研究や我々自身の研究と合致して、4Eは細胞の核内画分中のNXF1 と一緒には免疫沈降しなかった ((Lejeune et al., 2002) 及びデータは図示せず)。しかしながら、このことは、4EがNFX1と物理的に結合することを必要のないNXF1依存的機序を排除するものではない。NXF1の4E-SE 輸出への関与を更に調査するために、フラグ・タグの付いたNXF1又はNXF1/p15 過剰発現細胞を抗Flag抗体と一緒に免疫沈降させ、LacZ 又は LacZ-c4E-SE
mRNAの存在をリアルタイムPCrにより観察した（図２２ａ）。NFX1画分中で濃縮されているLacZ mRNAとは対照的に、LacZ-c4E-SE mRNA はかなり除外されているようである。これらの結果は、p15の存在又は非存在からは独立である（データは図示せず）。
【０３０４】
我々はこれらの研究を拡張してNXF1 発現をノックダウンしたときに LacZ-c4E-SE 輸出に及ぼされる効果を調べた（図２１ｂ）。4Eを過剰発現させると、LacZ-c4E-SE転写産物の輸出が、 NXF1 レベルが実質的に低下している場合にすら亢進されることから、過剰発現した4Eの存在下におけるLacZ-c4E-SEの輸出はNFX1からは独立であることが示された。4E-SEの非存在時、LacZ mRNAの細胞質内／核内比は NXF1枯渇により実質的に減少した。LacZ タンパク質レベルを分析すると、上記の発見が裏付けられた（図２２ｃ）。予想通り、siRNA処置により、NXF1 レベルは減少したが、スクランブルしたコントロールによる処置では減少しなかった（図２２ｃ）。更に、eIF4G のレベルは変化しなかったことから、eIF4G レベルを減少させるには長時間のsiRNA処置（７２時間を越える）が必要であることを示す研究と合致した(Herold et al.,
2001)。このように、4E-SE含有転写産物の輸出はNXF1 経路からは独立である。このことは、4E-SE転写産物の下位集団はこの経路を通じて移動するだけであり、単に輸出されるのにこれらがこの経路を必要とするわけでないという可能性を除外するものではない。
【０３０５】
数多くのRNAはCRM1経路を通じて輸出され得るため、我々はこの可能性を、CRM1の即位的阻害剤であるレプトマイシンBを用いて調べた (Cullen, 2003a;
Cullen, 2003b)。 LacZ 又は LacZ-c4E-SE mRNAの過剰発現型4Eお呼びLMB処置の関数としての輸出をリアルタイムPCR法を用いて観察した（データは図示せず）。驚くべきことに、 LMBはLacZ-4E-SE コンストラクトの輸出を抑制したが、LacZ 又はβ-アクチン転写産物の輸出は抑制しなかった。LMB は18S rRNAの保持につながり（図２２ｃ）、リボゾームRNAの輸出にはCRM1が必要であることを示した以前の研究と合致する (Moy and Silver, 2002)。
【０３０６】
4E及び4E-SE含有mRNAが関与する新規な輸出経路
それが解説されて以来、4E依存的輸出の基礎にある機序は決定されていない (Rousseau et al., 1996)。4E媒介性輸出を、バルクmRNAに用いられる経路から差異化する複数の特徴的な特徴がある（図２３に要約する）：１）4E-SEは4E経路の輸出を飽和させるが、バルクmRNAの輸出には影響しない（図２１ｂ）；２）LMBは4E依存的輸出を阻害する（図２１ｄ）；３）m7Gキャップは4E活性に必要である（図１８ｂ、表Ｖ）。興味深いことに、4E経路とUsnRNA輸出との間には数多くの平行がある：両者ともCRM1依存的であり、両者ともに m7G キャップを要する。しかしながら、4E 経路とは対照的に、UsnRNA 輸出には、RNAがCBCに結合してPHAXとの複合体となり、CRM1のアダプターとして作用することが必要である(Cullen, 2000; Cullen, 2003a; Cullen, 2003b; Ishigaki et al., 2001;
Izaurralde et al., 1995)。
【０３０７】
概略的には、CRM1 媒介性mRNA輸出には、輸出されるRNAの種類、即ち大型rRNA、小型rRNA、5S rRNA 又はUsnRNA、に依存するコファクターが必要である (Cullen, 2003a; Cullen, 2003b)。我々の以前の研究では、4Eの過剰発現は、CRM1依存的である18S 又は28S rRNA、あるいはエクスポーチン-t受容体を用いて輸出されるtRNA、の輸出を調節しないことが示されている (Sarkar and Hopper, 1998)。従って我々は4E、又は 4E-SE RNPに関連する因子の何らかの下位集団には、4E依存的な経路に特異的なCRM1-アダプタータンパク質が必要であると仮定した。更に、これらのアダプターは限られた量見られ、高い4E-SEレベル又は4Eの免疫枯渇により、力価測定可能である。このようなアダプタータンパク質の同定は、集中的な将来の研究分布やとなるであろう。
【０３０８】
4E依存的mRNA輸出を理解する上での難問は、生理的4Eレベルでも尚、輸出され得るmRNAの輸出を4Eが刺激するという観察から来ている。このように、4E依存的mRNA輸出は、それにより細胞が、効率は低いにもかかわらず他の経路を通じて輸出され得るmRNAの輸出を刺激することで遺伝子発現を急速に上方調節する手段である。4Eレベルが低い場合、あるいはm7G キャップ又は4E-SEがない場合、転写産物は（おそらくは）NXF1経路を通じて輸出される。この考えは、NXF1 経路は、自身に伴う特別な特徴を何ら有さないようなmRNAにとってのデフォルトmRNA輸出経路であるという以前の示唆と合致する (Cullen, 2003b)。このようにして、4E レベルは「細胞内加減抵抗器」として作用することができる。レベルが増すにつれ、4E感受性のmRNAは遥かにより効率的、そして調和した態様で、ここに解説した4E依存的CRM1感受性経路を通じて輸出される。最近の報告では、CRM1依存的mRNA輸出はＴ細胞活性化中に起き得ることが示され、外部細胞シグナルはmRNA輸出経路に変化をもたらす可能性が示唆されている (Schutz et al., 2006)。
【０３０９】
4E-SE含有mRNA輸出における4Eの役割と、癌との関係
ここで報告した研究は、4Eに関連する増殖及び形質転換特性は、少なくとも部分的には、4E依存的mRNA輸出の調節不全の結果である可能性を示唆するものである。これらの研究は、細胞周期進行、増殖及び生存に関与する転写産物の輸出及び発現を調和させる上での4Eの役割を示唆している。重要なことに、4Eはそれ自体の負の調節物質、即ちPML、の発現は促進しない。更に4Eは、何らかの細胞成長条件において4Eの転写を上方調節する因子であるc-Mycの発現を促進する (Schmidt, 2004)。このように、4E は細胞周期進行の複数の時点で関与する多くの遺伝子の発現を調節する。
【０３１０】
4E-SE は、これらの転写産物を輸出に向けて標的とするUSERコードを4E感受性態様で提供する。他の転写産物は、翻訳レベルで、4E-SEとは異なるUSERコードを用いて4Eにより調節されるのかも知れない。更に、4E-SEは、まだ同定されていないRNPとして他のものとも結合するかも知れない。このようにして、4Eの効果及び4E-SE含有転写産物の調節は複雑かつ組み合わせ的である可能性が高い。例えば輸出感受性mRNAの翻訳は、4E-SEに依存せず、5'UTRの複雑性の方である。Pim-1 及びODCなどの転写産物(Hoover et al., 1997; Rousseau et al.,
1996) は遺伝子発現の調節用のUSERコードの組み合わせ使用の例として役立ち、このようなネットワークを使用する発想の裏づけとなる。合致するように、我々の研究では、4Eの翻訳及び輸出機能は3’ 及び 5’ UTRの組成に基づき、切り離すことができることが示されている（即ち、 4E はサイクリン D1の輸出は亢進するが、VEGFの翻訳を亢進する）。
【０３１１】
4E依存的mRNA輸出のいくつか鍵となる調節物質が同定されており (Cohen et al., 2001) 、その中には、PMLや、保存された4E結合部位を含有するいくつかのホメオドメインタンパク質 がある(Topisirovic et al., 2003a; Topisirovic et al., 2005)。これらの調節物質はRNA レギュロン全体を調節する位置にあり、細胞周期進行及び細胞生存を強力に調節する。我々の研究は、PML及びPRH はサイクリン D1 及び他の4E-SE含有転写産物の4E依存的輸出を妨げることを実証するものである ((Culjkovic et al.,
2005; Topisirovic et al., 2003a) 及びこの報告)。この成長レギュロンの刺激物質には、当該レギュロン内に遺伝子のmRNA輸出及び翻訳の両方を促進するHOXA9がある(Topisirovic et al., 2005)。これらの調節物質の幅広い活性、特に複数の4E機能を同時に調節するもの、は、このレギュロンの鍵となる関係である、それらの4E調節能にある可能性が高い。
【０３１２】
この調節の生理的重要性は明らかである。急性骨髄性白血病患者由来の初代標本中では、PRHには、下方調節と、4E核小体からの局在解放の両方が起きている(Topisirovic et al., 2003b)。と同時に、HOXA9 が上方調節され、核内及び細胞質内区画の両方で4Eに結合することになるため、4E 依存的mRNA輸出及び翻訳の両方の上方調節が起きる (Topisirovic et al., 2005)。
【０３１３】
まとめると、mRNA輸出の4E依存的調節は、それにより、転写の再プログラミングが起きる前に細胞が細胞外刺激に応答するという即時応答系を提供することができるのであろう。我々の結果は、mRNA輸出の調節が細胞増殖の調和ある調節を可能とすることを示しており、ヒト疾患に対して直接影響する位置にあるRNAレギュロンの一番目の例の一つを提供している。調和ある遺伝子発現を調節することで、増殖及び細胞生存経路に影響を与えるという4Eの能力により、その成長促進性にとって最大限の効率が確実になっている。これらの発見は間違いなく、他のレベルのmRNA代謝、特に翻訳及びmRNA安定性／滞留といったレベルでの、4Eによる遺伝子発現の重要な調節を除外するどころか、むしろ補完するものである。要約すると、我々は細胞周期進行及び生存を支配する遺伝子の調和ある発現に用いられる新規なmRNA輸出経路を定義するものである。
【０３１４】
治療薬ターゲットとしてのRNAレギュロン
ネットワーク中のノードを特定すると、このようなノードが、潜在的な薬物ターゲットかも知れない細胞内遺伝子発現回路中での位置として定義される（図２４）。
【０３１５】
最近の研究では、mTOR阻害剤であるラパマイシンが、4E結合性タンパク質（4Ebp又は4E-BP）のリン酸化を阻害することでこれらを相互作用可能にし、細胞質内の4E活性を阻害可能にすることにより部分的にタンパク質合成を下方調節する手段として注目を浴びている (Sarbassov, D. D., Ali, S. M. & Sabatini, D. M. (2005) Curr Opin Cell Biol 17:596-603)。しかしながら、これらの患者をラパマイシンで処置すると、彼らの腫瘍中の活性化Aktレベルが増加してしまうことから、ラパマイシンは単一薬剤の癌治療法としては使用が限られていることを示した臨床データが裏付けられている(O'Reilly, K. E. et al.
(2006) Cancer Res 66:1500-8。更に、4Eを過剰発現する細胞はラパマイシン及びこの薬物とドキソルビシンとの組合せに対して耐性が高いことを示す (Wendel, H. G. et al.
(2006) Cancer Res 66, 7639-46)。リバビリンは4E活性を標的とする代替的な戦略となっているが、それはそれがm7G キャップの模倣を通じて4Eを直接標的とするからである (Kentsis, A., et al. (2004) Proc
Natl Acad Sci USA; Kentsis, A. et al.
RNA 11:1762-6)。このように、それは4Eレギュロンを効率的に遮断する位置にある。
【０３１６】
【表４】
2010505123.tif 000005
【０３１７】
【表５】
2010505123.tif 000006
【０３１８】
細胞質内／核内（n/c）値比は、1に設定してあるベクタ・コントロール（MSCV）に正規化した相対的な倍数±sdを表す。平均値±sdは、三重にした各組について計算された。各試料の各画分について得られた全ての解析済みmRNAの平均値は、同じ画分／試料について得られたGAPDH mRNA 値で除算された。各試料の細胞質内値を核内値で除算した後、得たれたc/n 値±sdを、MSCV ベクタ・コントロールc/n 値を1に設定することにより、正規化した。
【０３１９】
実施例５．  乳癌の新規な治療法としてのリバビリンの前臨床及び臨床評価
乳癌は重要かつ生物学的に複雑なヒトの疾患であり、毎年新たに200,000人の個人が診断されており、米国内では年間40,000例を超える死亡例がある。過去数十年にわたって、臨床医は乳癌が簡単で均質な疾患ではなく、複数の臨床サブタイプに分けられることに気付くに至った。最近まで、サブタイプの指定は大まかな臨床ベースであったが、多重遺伝子発現及び組織マイクロアレイ技術の導入により、全体的な乳癌ミリューの中で新規な臨床サブタイプを同定する能力が著しく高まった。この実施例の目的のために、乳癌は、幅広く用いられている一組の生体マーカ[エストロゲン受容体 (ER)、プロゲステロン受容体
(PR)、erbB2/neu/HER2 受容体 (HER2)] 及び／又はそれらの病態等級（ＩからＩＩＩまで）に基づいて個別の臨床サブタイプに属すると考えられるであろう。これらの属性は、年齢、腫瘍サイズ及び補助的なリンパ節状態と共に、乳癌の臨床管理への重要な予後及び予測インプットとなる。例えばER/PR陽性状態は短期予後の向上と相関し、タモキシフェン療法に対する応答を予測するものであるが、他方HER2 増幅又は過剰発現は、節陽性患者における高再発率、腫瘍の浸潤性、高死亡率と相関し、トラスツズマブに対する応答の正の予測因子である。対照的に、基礎様のサブタイプ（三つのER/PR/HER2 受容体生体マーカが全てないために、別名「三重陰性」）に属する乳癌は他のクラス全てと異なると考えられ、一般的に予後が悪い。サブタイプ間のこれらの明確な違いにも関わらず、等級の高い腫瘍（予後が悪い）は: ER/PR 陽性（ほぼ 15% が全乳癌）、 HER2 陽性（ほぼ 20% が全乳癌）及び基礎様（ほぼ
20% が全乳癌）を含む三つの主要クラス全てに存在する。
【０３２０】
予後の悪い乳癌（基礎様、HER2陽性及び等級の高い腫瘍）のための有効な治療戦略の開発は、重要であるが未だ満たされていない医学的ニーズである。アントラサイクイリン、タモキサン、トラスツズバブ（原語：trastuzubab ）（HER2の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体）及びベヴァシズマブ（抗血管内皮成長因子モノクローナル抗体）及びこれらの組合せは、乳癌の処置に利用可能な確立された及び／又は調査的な療法の多くの代表である。たとえ臨床上有効であっても、それらの使用にはしばしば、著しい心臓及び神経毒性、好中球減少症や、ベヴァシズマブの場合には更には胃腸間の穿孔及び出血が伴う。関連する毒性が限られた／ないような有効な乳癌療法の開発は、もう一つの重要な、未だ満たされていない医学的ニーズである。
【０３２１】
乳癌を含むヒトの悪性腫瘍においては、4Eの過剰発現は転移性の亢進及び全体的な臨床上の予後の悪さと相関する。乳癌と関係するのは、4Eレベルが浸潤性癌血管化した悪性管路では著しく増加しているという発見や、乳癌患者の切除縁では4Eレベルの上昇が、節の状態とは独立な、疾患の再発率上昇と相関するという発見である。最近、 Li 氏及び共同研究者が、乳癌における4Eレベル上昇は高いVEGFレベル及び微小血管密度の上昇と相関すると判断している。更に、翻訳開始複合体eIF4F の4E依存的活性化が、ヒト乳腺上皮細胞中での悪性表現型の発生及び維持にとって必須であると判断されている。4E活性の増加は、ヒト乳癌における重要な予後上の役割を果たすのである。
【０３２２】
4E活性が乳癌では上昇しているという我々の全体的仮説にとって重要なのは、どの臨床サブタイプに4Eレベルの上昇があるかを我々が特定することであろう。多重遺伝子発現及び組織マイクロアレイ解析により、我々は乳癌4Eサブタイプを特定できるであろう。今日までのところ、患者ごとをベースにした他のサブタイプとの直接的な相関は得られていない。
【０３２３】
コホート解析された乳癌は１９６１年から１９８３年までの間にイェール大学病理学部保管庫で選択された浸潤性の腺管癌の６８８の試料から成り、そのほぼ半分が節陽性の標本であり、半分が節陰性の標本である。分析は、免疫蛍光染色と、そもそもはイェール大学のRobert Camp博士及びDavid Rimm博士 によって開発された蛍光顕微鏡技術（AQUA（登録商標） 分析）を利用したタンパク質発現の客観的in situ 定量を行う HistoRx’s ロバスト法を用いて行われた。AQUA（登録商標） システムにより、ヒト組織、動物組織、異種移植片及び細胞株の組織マイクロアレイ、全組織切片及びコア生検試料を、高スループットで定量的に高分解能解析することができる。数多くの自動化画像法とは対照的に、 AQUA（登録商標） 分析は形態ベースではなく、様々な抗体-又は染料-で定義される区画にタグを付けられた様々な蛍光体の分子的同時局在に基づく。二つの異なる解析アルゴリズムを用いることにより、結果であるAQUA（登録商標） スコアは客観的となり、ELISAに同等な継続的尺度で単位面積当たりの濃度に比例しており、他方、組織試料の重要な空間情報は維持している。
【０３２４】
4Eの発現を AQUAによりEpitomics抗4E 抗体 を1:500の希釈度で用いて評価した。サイトケラチンを腫瘍マーカとして、そしてDAPIを核マーカとして用いて4E発現を区画化した。PM1000を用いて適した画像を取り込んだ。AQUAは発現の区画化についてバリデートした。AQUAスコアを臨床データにリンクし、分析した。教師なしの階層クラスタ化分析（図１９、平均ベースのZ-スコアの平均連鎖）を、エストロゲン受容体 (ER)、プロゲステロン受容体 (PR)、上皮成長因子受容体 (EGFR)、Her2、及び 4EについてのAQUAスコアを用いて行った。高4Eは主に基礎（三重陰性腫瘍-ER/PR/Her2 陰性) 表現型にクラスタしており、それをここではBASAL/4E+と定義する。全ての基礎様腫瘍が4E発現の上昇を示したわけではないことから、4Eは基礎様腫瘍の特異的下位集団を規定する新規な生体マーカであるかも知れないことが示唆された。4E発現は、ある特定の基礎様下位表現型に最も近く関係していることが明らかであったがり、更にそれはより低い程度ではあるがHer2+ 分子表現型及び ER+/PR- 分子表現型にも関係している。
【０３２５】
図２５は、エストロゲン受容体（ER）、プロゲステロン受容体（PR）、上皮成長因子受容体（EGFR）、Her2、及び4EについてのAQUAスコアを用いて行われた、乳癌患者におけるタンパク質発現レベルの教師なしの階層クラスタ化分析を描いたものである。図２６は、141個の原発性乳癌から抽出されたバルク腫瘍RNAから行われ、Affymetrix U133 プラス 2.0 アレイ（アンドレア・リチャードソン・ダナ-ファーバー・カンサー・インスティテュート）上を泳動させた発現分析を描いたものである。この分析はdChipソフトウェアの階層クラスタ化機能を用いて行われた。4Eを高発現している腫瘍と、低発現しているものとを比較すると4Eが、染色体 4q 21-31 （右側の黒い棒で示す）由来の一組の遺伝子と一緒に同時過剰発現し、また他の細胞周期増殖遺伝子と同時過剰発現していることが分かる。
【０３２６】
高4Eは主に基礎（三重陰性腫瘍-ER/PR/Her2 陰性) 表現型（「BASAL/4E+」）にクラスタしていた。全ての基礎様腫瘍が4E発現の上昇を示したわけではないことから、4Eは基礎様腫瘍の特異的下位集団を規定する新規な生体マーカであるかも知れないことが示唆された。4E発現は、ある特定の基礎様下位表現型に最も近く関係していることが明らかではあったが、更にそれはより低い程度ではあるがHer2+ 分子表現型及び ER+/PR- 分子表現型にも関係している。我々の予備的な遺伝子発現及びAQUA分析に基づき、我々は4E活性の（リバビリンによる）臨床上の阻害は基礎様／4E＋乳癌並びに選択されたHER2/4E (+/+) 及びER/4E (+/+)癌を示す患者において最大の利益を示すであろうと結論する。
【０３２７】
実施例６：  4Eはその生存機能のためのAkt経路を調節する
この実施例で我々は、低分子を用いてRNA レギュロンを阻害することができることを実証する。具体的には我々は、リバビリンはeIF4Eに対するその阻害作用を通じて Akt生存シグナル伝達を阻害することができることを実証する。このようにして、リバビリンはAktの活性化及びAktの下流エフェクタの産生を妨げるのである。
【０３２８】
要約
転写後事象の調和ある調節は、生理的プロセスを調節する手段である。我々は真核生翻訳開始因子4Eが遺伝子発現、ひいては生物学的活性を、下位集団のmRNAの調和あるmRNA輸出及び翻訳を通じて調節すると考える。4Eは増殖を促進するだけでなく、細胞をアポトーシス性の刺激から救助する。ここで我々は血清を枯渇させた線維芽細胞の4E媒介性アポトーシス救助の分子的基礎を調べる。第一に、我々は4Eを過剰発現させるとAktの活性化につなげることにより生存シグナル伝達の亢進が起きることを実証する。次に我々は、線維芽細胞を救助するためにはAkt1の存在が4Eには必要であることを実証する。更に我々は、変異型の4EであるW73A 4Eは細胞を野生型 4Eと同じぐらい容易に救助することを示す。この変異型は4EのmRNA輸出機能を促進する上では活性であるが、その翻訳活性を促進する上ではそうでない。我々は4EがAktの活性化をPI3K/Akt 経路を活性化することが既知の因子であるNBS1の上方調節を通じて媒介することを示す。4E はNBS1の発現をmRNA輸出のレベルで調節し、Aktを活性化するため、そして細胞をアポトーシスから救助するためにはNBS1を必要とする。更に、4EはAkt経路の下流エフェクタの発現を調和的に上方調節することで、Aktの効果を増幅する。4Eの既知の調節物質である前骨髄球性白血病タンパク質PMLはNBS1輸出、Akt活性化、及びアポトーシス救助における4E媒介性の増加を阻害する。これらの研究は4E媒介性アポトーシス救助のための分子機序を提供するものである。
【０３２９】
導入
真核性翻訳開始因子4E（4E）のレベル上昇は、細胞培養では発現性形質転換と、マウスモデルでは腫瘍発生と、そしてヒト癌の有意な下位集団では予後の悪さと関連付けられている(Graff and Zimmer 2003)。4Eは増殖を促進し、血清枯渇を含む多種のアポトーシス性刺激から細胞を救助する (Polunovsky et al. 1996; Sonenberg and Gingras 1998; Tan et al.
2000; Graff and Zimmer 2003)。分子レベルでは、4EはmRNA翻訳及びmRNA核外輸出という二つの異なるレベルで遺伝子発現を調節する (Sonenberg and Gingras 1998; Culjkovic et al. 2005, Culjkovic et
al., 2006; Culjkovic et al. 2007)。これらのプロセスのいずれで作用するためにも、4EはmRNAの5'末端に見られるm7G キャップ部分に結合しなくてはならない (Sonenberg and Gingras 1998; Culjkovic et al. 2005, Culjkovic et
al., 2006; Culjkovic et al. 2007)。細胞質内で4EはmRNAをリボゾームに翻訳開始の重要なステップとして動員する (Sonenberg and
Gingras 1998)。4Eによって全ての転写産物が等しく影響を受けるわけではない (Sonenberg and
Gingras 1998; Culjkovic et al. 2005, Culjkovic et al., 2006; Culjkovic et al.
2007; Mamane et al. 2007)。例えば、複雑な5’UTRを持つ遺伝子の下位集団の翻訳は、短い、構造のないUTRをもつ転写産物よりも4Eレベルに対して感受性である（従って4E感受性と考えられる）。この場合、翻訳の亢進は、より重いポリソームとのこれらの転写産物の結合と定義される。核内では、4E は、4E感受性因子（4E-SE）として知られる50ヌクレオチドの因子をそれらの3'UTRに含有する成長促進性mRNAの実質的な下位集団のmRNA輸出を上方調節する(Rousseau
et al. 1996; Culjkovic et al. 2005, Culjkovic et al., 2006; Culjkovic et al.
2007)。対応する輸出感受性mRNAのタンパク質産生増加は二つの機序を通じておきる：１．細胞質内転写産物のレベル増加が、より多くのタンパク質が作られることを意味する濃縮効果、及び／又は
、２．これらの転写産物の下位集団がその後、より重いポリソームに、それらが4Eに対して翻訳上感受性であるために装荷される (Culjkovic et al. 2005,
Culjkovic et al., 2006; Culjkovic et al. 2007)。このように、4Eは複数のレベルで遺伝子発現に影響する。
【０３３０】
最近の研究では、細胞のプロテオソームとトランスクリプトソームとの間の相関関係は乏しいことが示されている(Lu et al. 2006)。このことは、転写後調節は遺伝子発現において重要な役割を果たすことで、その結果的な細胞の生理に影響を与えていることを意味している。Keene 氏及び共同研究者は、それにより転写後遺伝子調節を調和させることができるというRNA レギュロンモデルを提案した(Tenenbaum
et al. 2000; Keene and Tenenbaum 2002; Keene and Lager 2005)。このモデルでは、例えば細胞周期進行など、同じ生物学的経路で作用する転写産物の発現は、これらのmRNAの3’ 又は 5’ UTR にある因子の存在により、調和的に制御されている。これらのRNA因子はUSERコードと呼ばれる。例えば同じ生化学的経路に関与するタンパク質をコードする一組のmRNAは、それらのmRNA輸出を、4E-SEなどの共通のUSERコードをそれらの3'UTRに有することにより、調和させているのであろう。USER コードは、あるプロセスを促すために、前記プロセスに関与するタンパク質を対象となるRNAに動員することにより、作用する。このように、4E-SE USER コードを含有するmRNAは、適した輸出因子をRNAに動員して、輸出プロセスを促すのであろう。適切なUSERコードが存在する限り、いずれのレベルのRNA代謝であっても、この方法で調節され得るのであろう。
【０３３１】
我々の研究では、4Eは、細胞周期のほぼどのステップにも関与する多種の転写産物の輸出の組合せ調節により（少なくとも部分的には）、細胞周期の進行を支配しているRNAレギュロン中のノードであることが強く示唆されている。同様に、翻訳上感受性のmRNAは、それらの5'UTRにUSERコードを含有する可能性が高い (Mamane et al. 2007)。このようにして、mRNA輸出及び翻訳レベルでの制御が切り離されることができ、即ちmRNAには、両方のレベルで調節を受けるには、3’ 4E-SE 及び 5’ USER コードの両者が必要なのであろう。このような遺伝子発現モデルは、同じ生化学的プロセス、ひいては生物学的プロセスに関与するタンパク質をコードするmRNAの運命のネットワークレベルでの制御を提供するものである。これらのレギュロン中のノード（例えば4E）の制御は細胞の運命を決定するために重要である。
【０３３２】
ここで我々は、4Eが細胞生存を達成するためにこのようなネットワーク中の因子の発現を調和的に調節するこで細胞を救助するという可能性を調べる。我々は4EがAkt活性化を強めること、そしてこの活性が、血清枯渇誘導性のアポトーシスから細胞を救助するのその能力に必要であることを実証する。RNA レギュロンモデルは、4Eがどのように調和的かつ強力にAktシグナル伝達経路を活性化するかを理解する理論的文脈として役立つ。第一に、4Eの過剰発現は、Aktのリン酸化を媒介する因子であるNBS1の発現の上方調節につながる。第二に、4Eの過剰発現は、Aktの複数の下流エフェクタの調和あるmRNA輸出、ひいては上方調節につながる。更に、4Eの細胞内阻害剤である前骨髄急性白血病タンパク質PMLは4E依存的Akt活性化を阻害し、更にAktの下流エフェクタの下位集団の発現を減少させる。このようにして、4E 及びPML は、Akt経路を制御することで細胞生存を強力に調節するRNA レギュロンを調和的に調節する。
【０３３３】
結果
4Eの過剰発現はAkt活性化を促進する
我々は4E過剰発現がAktの活性化につながる可能性を調べた。Aktの活性化は、そのT308 及びS473でのリン酸化をホスホ特異的抗体と、不死化マウス胚性線維芽細胞（MEF）のウェスタン分析とを用いて観察することにより、評価された。これら二つの部位のリン酸化は、Akt活性化のよく特徴付けられた指標である (Alessi et al. 1996; Alessi et al. 1997; Stokoe et al. 1997;
Nicholson and Anderson 2002; Vivanco and Sawyers 2002; Song et al. 2005)。明らかに、4Eの過剰発現はAktの両方の部位でのリン酸化増加につながる（図２７Ａ）。重要なことに、4Eのm7G キャップ結合変異体 (W56A)は翻訳時及びmRNA輸出時には作用できないが
(Culjkovic et al. 2005, Culjkovic et al., 2006)、この効果を有さない。対照的に、mRNA輸出時には作用するが感受性mRNAの翻訳を促進することはない4E変異体(W73A) (Culjkovic et al. 2005, Culjkovic et al., 2006)もAktを活性化する。Akt 活性化と合致して、4E及びW73A 変異体の過剰発現はS6 及びBP1のリン酸化亢進につながるが、他方、不活性のW56A変異体はつながらない（図２７Ａ）。これらの活性の点で、他の細胞種（NIH 3T3、U2O及びU937） で同様な実験を行ったところ、同じパターン結果が示された（データは図示せず）。重要なことに、4Eの野生型又は変異型が過剰発現しても、総Aktレベルの調節にはつながらなかった。
【０３３４】
比較のために、我々はAkt1-/- 細胞における4Eの過剰発現の効果を調べた（図２７Ａ及びデータは図示せず）。これらの研究のために、我々は、優勢なAkt型であるAkt1をノックアウトしてあるMEF (Akt1-/- 細胞)を由来とする細胞株を用いた。上で用いた野生型線維芽細胞はこれらのAkt1-/- 細胞の同腹子コントロールである。用いたAkt 抗体はAktの三つの愛想フォーム全てを認識するため、これらのアイソフォームをAkt1-/- 細胞で見られる（図２７Ａ）。
【０３３５】
明らかに、4Eはこのタンパク質のノックアウトのためにAkt1のリン酸化を誘導しない。興味深いことに、Akt野生型 には Akt1-/- 細胞よりも多くのホスホBP1があるのが一般的である。これは以前に観察されており、予想通り、Aktが消失するとBP1のリン酸化減少につながるという事実が原因である可能性が高い。同様の結果はホスホ-S6でも観察された。更に、ベクタ・コントロールに比較してもノックアウト細胞でBP1 又はS6の総レベルには何の変化もない。興味深いことに、4Eはそれでも尚、ノックアウト細胞で（いずれのタンパク質の総レベルを変えることなく）BP1及びS6 リン酸化を上昇させることから、4Eは Akt2 又はAkt3 を用いてmTOR を活性化することで、これらのタンパク質のリン酸化を導くことができることが示唆された(Easton
et al. 2005; Skeen et al. 2006)。
【０３３６】
我々は4E媒介性Akt活性化がPI3K 依存的態様で起きるのかどうかを調べた。4E過剰発現細胞には、ベクタ・コントロールに比較してより多くのAktリン酸化がT308 及びS473 の両者にあることが明らかである。しかしながら、4E過剰発現細胞をPI3K阻害剤であるLY294002で処理(Yao and Cooper 1995)すると、両方の部位でAktリン酸化が劇的に減少した（図２７Ｂ）が、Akt タンパク質レベルに変化はなかった（図２７Ａ及び２７Ｂ）。更に、処理によっても、4E依存的mRNA輸出のターゲットであるNBS1の4E依存的な増加は妨げられなかった
(Culjkovic et al. 2006)。このように、LY294002 はこの4E活性を変化させなかった。予想通り、LY294002はS6 及びBP1のリン酸化を阻害した (Sanchez-Margalet et al. 1994; Gingras et al. 1998)。BP1リン酸化の4E調節の潜在的関係を議論の項で扱う。
【０３３７】
4Eにはその生存機能のためにAkt1が必要である
我々は4Eが確立した細胞生存における生理学的効果に対するAkt活性化の関係性を調べた。野生型又はAkt1-/-細胞を血清枯渇誘導性アポトーシスからの救助する4Eの能力を、アネキシンＶ／ヨウ化プロジジウム染色をフロー・サイトメトリと、別にTUNEL分析とを組み合わせて用いて観察した（図２８、データは図示せず）。比較のために、血清枯渇させていない細胞も示す。重要なことに、4E の過剰発現は野生型細胞 （最高80% の生存細胞）対ベクタ・コントロール（最高40% の生存細胞）を救助した。救助の程度は、4Eの生存機能を解説した最初の報告で示したものと同様である(Polunovsky et al. 1996)。
【０３３８】
興味深いことに、mRNA輸出コンピテントな変異型 (W73A) は野生型4E過剰発現細胞と同様な程度、細胞を救助した。このことは、4Eの救助機能は少なくとも部分的にはそのmRNA輸出機能が媒介していることを示すものである。対照的に、不活性のW56A 4E 変異体は細胞を救助せず、生存細胞の数はベクタ・コントロールと同様だった。
【０３３９】
Akt1-/- 細胞についてのベクタ・コントロールを野生型細胞と比較すると、Akt1-/- 細胞の血清枯渇は野生型細胞に比較して生存率がわずかに減少していることを示していた（~20% 対 ~40%）。生存率におけるこの減少は、これらの細胞の血清枯渇を含む他の研究でも観察されている (Chen et al. 2001)。驚くべきことに、野生型4E 又は W73A 変異体のいずれも、Akt1-/- 細胞をアポトーシスから救助しなかった。両者の場合において、生存細胞の数はほぼ20%であり、ベクタ・コントロールで見られたものと同じだった。Akt1-/- 細胞を救助することが可能なことの実証のためのコントロールとして、我々は抗アポトーシス因子であるBcl2（データは図示せず）がこれらの細胞を救助できるかどうかを調べた。実質的により多くの生存 Akt1-/- 細胞 (~80%) が、Bcl2を過剰発現させた場合には存在しており、これらの細胞を救助できることが示された。このように、血清枯渇の文脈の中での4Eの生存機能にはAkt1の存在が必要なのである。
【０３４０】
Akt1の消失は4EのmRNA輸出又は翻訳機能を損なわない
Akt1-/- 細胞での結果は、4Eの一つ以上の生化学活性がAktの消失により損なわれ得ること、あるいは、4E はAkt経路の活性化に関与する標的遺伝子の発現を調節すること、を示すものである。第一に、我々は4E依存的mRNA輸出が野生型コントロールに比較してAkt1-/- 細胞では損なわれているかどうかを調べた（図２９Ａ）。我々は、サイクリン D1 mRNAの核外mRNA輸出を、細胞質内対核内画分中のmRNA含有量を定量的リアルタイムPCR (qPCR) を我々が以前に解説したように用いることにより、観察した (Culjkovic et al.
2005, Culjkovic et al., 2006)。tRNAlys 及びU6snRNA は、我々が以前に報告した通り、それぞれ細胞質内及び核内画分の品質を観察するための分画コントロールとして示されている(Culjkovic et al. 2005, Culjkovic et al., 2006)（図２９Ａ）。細胞質内、対、核内のmRNAの比が図２９Ａに示されている。サイクリン D1 mRNAは、それが最も良く解説された4E依存的mRNA輸出ターゲットであるために選ばれた (Rousseau et al. 1996; Culjkovic et al. 2005, Culjkovic et al.,
2006)。我々の結果は、4E 又はW73A 輸出コンピテントな変異体の過剰発現は、サイクリン D1 mRNA輸出を野生型又はAkt1-/- 細胞のいずれでもベクタ・コントロールに比較して促進したことを示すものである。もう一つの4E依存的mRNA輸出ターゲットであるNBS1（Culjkovic et
al. 2005, Culjkovic et al., 2006）は同様な結果を出した。第二に我々は、Akt1の消失が4E感受性翻訳を損なった可能性を調べた。我々は4Eの良く確立された翻訳ターゲットであるVEGFタンパク質のレベルを調べた(Clemens and Bommer 1999)。明らかに、Akt1の消失は、ベクタ・コントロールに比較したときの、4EのVEGF翻訳促進能を損なわなかった（図２９Ｂ、底面）。VEGF mRNA 輸出は野生型又はAkt1-/-細胞のいずれにおいても4Eの過剰発現によって変化することはない （図２９Ａ）。更に、GAPDH及びアクチンの mRNA 輸出も変化がない（図２９Ｂ、データは図示せず）。これは、VEGF、GAPDH 及びアクチンは4Eの輸出ターゲットではないこと、そして VEGF は翻訳ターゲットであること、を示した以前の研究と合致する (Clemens and Bommer 1999; Culjkovic et al. 2006)。
【０３４１】
我々は4E mRNA 輸出活性の変化がサイクリン D1、NBS1 及びVEGF のタンパク質産生の増加につながるかどうかを、ウェスタン分析をAkt1-/- 細胞で用い、野生型コントロールと比較することで、調べた（図２９Ｂ、底面）。更に、（輸出ではコンピテントであるが翻訳を亢進することはない）W73A 変異体を過剰発現させるとサイクリン D1 及びNBS1 タンパク質レベルが増加することは、それらの核内mRNA輸出の亢進があっても、VEGFタンパク質レベルの産生亢進は起きないことと合致する。 4E又は変異型の過剰発現の関数としてqPCRで観察したところ、サイクリン D1、NBS1 又はVEGF mRNAの総レベルに変化はなかった（図２９Ｂ、最上部）。要約すると、Akt1の消失では、調べた4E感受性転写産物の4E 依存的 mRNA輸出又は翻訳 は損なわれないのである。このことから、4EのmRNAターゲットの一つ（又はそれ以上）がAkt活性化を増強できるのかも知れないという仮説を立てた。
【０３４２】
4E依存的mRNA輸出ターゲットであるNBS1は4E依存的Akt 活性化に必要である
我々の以前の研究では、多種の転写産物を調和的に調節するという4Eの能力はその増殖能に寄与するものだということが示されていた(Culjkovic et al. 2005, Culjkovic et al., 2006; Culjkovic et al.
2007)。これらのmRNAターゲットを調べると、Aktの4E媒介性活性化のための潜在的機序が明らかになった。4Eの過剰発現は、ナイメーヘン破壊タンパク質（NBS1）のmRNA輸出亢進につながった (Culjkovic et al. 2006)。従来、NBS1 はDNA二本鎖破壊の修復と関連付けられている (Karran 2000; Petrini 2000; Costanzo et al. 2001)。しかし、最近の研究では、NBS1が上昇するとPI3Kが活性化し、その後 Akt 及びS6を含むその下流のエフェクタが活性化することが判明した (Chen et al. 2005)が。合致するように、NBS1の過剰発現は細胞培養で発癌性の形質転換及び増殖に、そして異種移植マウスモデルでは腫瘍発生に関連付けられている (Chen et al. 2005; Yang et al. 2006; Yang et al. 2007)。従って我々は、4EのAkt活性化能が少なくとも部分的にはそのNBS1発現調節能に依存する可能性を調べた。4Eの過剰発現は、サイクリン D1
mRNAについて観察されたのと同様に、NBS1 mRNA
輸出の上方調節につながった （図２９Ｂ）
(Rousseau et al. 1996)。4EによるNBS1のmRNA輸出促進能と合致するように、4Eの過剰発現はNBS1タンパク質のレベル増加と相関したことから、これはAkt1が存在するか、しないかから独立であった（図２９Ｂ）。
【０３４３】
これらの研究から、我々はNBS1はAkt1の4E依存的活性化の重要なエフェクタであるという仮説を立てた。4EによるAkt活性化にはNBS1が必要であるかどうかを判定するために、NBS1をsiRNA法を用いてノックダウンした。ノックダウンはウェスタン・ブロット分析法により確認された（図３０Ａ）。重要なことに、NBS1をsiRNA処理しても4E又はAktの発現に変化はなく（図３０Ａ）、また4E mRNA 標的サイクリン D1又は VEGFにも変化はなかった（データは図示せず）。ウェスタン・ブロット分析法で観察したところ、NBS1についてsiRNA処理すると、4Eの過剰発現があっても、スクランブルしたsiRNAコントロールに比較してAktのリン酸化はT308 でも、又は S473でも増加しないことが観察される（図３０Ａ）。
【０３４４】
NBS1をノックダウンすると4EのmRNA輸出亢進能が調節されるということもあり得るため、4EのAkt活性化能を NBS1-PI3K-Akt 軸とは独立な何らかの態様で調節できないかと考えた。更に我々は、siRNA でNBS1について処理した4E過剰発現細胞 (siNBS1) 又はスクランブルしたコントロール（scram）におけるmRNA輸出を調べた。我々の結果は、サイクリン D1 mRNAの輸出は siNBS1 のノックダウンによって減少することはないことを明白に実証するものである（データは図示せず）。このように、サイクリン D1 mRNA 輸出は4E過剰発現細胞の方が、ベクタ・コントロールに比較して亢進されており、それはこれらの細胞がsiNBS1
で処理されているか、あるいはスクランブルされたコントロールであるかに関係なかった（データは図示せず）。合致するように、サイクリン D1タンパク質レベルは、siRNA処理に関係なく、コントロールに比較し4E過剰発現細胞で上方調節される。興味深いことに、その残りのNBS1 mRNA の輸出は 4E野生型 又はW73A 4E の過剰発現の存在下でも上昇していたことから、やはり、mRNA 輸出経路はsiNBS1について処理された細胞でもインタクトであることが示された（データは図示せず）。このように、NBS1のノックダウンはいずれの4E 依存的mRNA 輸出も損なわない。NBS1 がPI3K 活性化に及ぼす効果について以前に報告されたデータ (Chen et al. 2005) や、PI3K 阻害剤LY294002 によるこの4E活性阻害能（図２７Ｂ）と併せて捉えると、Aktの4E媒介性活性化におけるNBS1にとっての要件は、NBS1のPI3K活性化能（おそらくは間接的に）、ひいてはPI3KのAkt活性化能と関係しているようである。
【０３４５】
4Eは血清枯渇線維芽細胞をアポトーシスから救助するためにはNBS1を必要とする
我々は我々の研究を拡張して、4EのNBS1上方調節能が少なくとも部分的にそのアポトーシス救助機能にとって必要であるかどうかを調べた。Akt野生型細胞をsiRNAでNBS1 (siNBS1)について処理し、あるいはスクランブルしたコントロール（scram）、血清枯渇させたものを、4E過剰発現の関数としてアポトーシスについて観察した（図３０Ｂ及びＣ）。リポフェクタミンの導入を要する、スクランブルしたコントロールで安定な細胞株を処理すると細胞の生存率が、未処理のコントロールに比べ、血清枯渇（図２８、ここで観察された~40% 乃至~35% 、図３０Ｂ）及び正常条件（図２８では~80% 対 ~90% ）の両者で僅かに減少していた。NBS1 をノックダウンすると、血清枯渇させた細胞や血清枯渇させた細胞では生存率は更に減少した。これはNBS1が生存に必要であることをマウスモデルで示した以前の研究と合致する (Zhu et al. 2001; Dumon-Jones et al. 2003)。
【０３４６】
これらの研究で最も驚くべき結果は、NBS1をノックダウンすると4Eの生存活性が著しく損なわれたことである（図３０Ｂ及びＣ）。特に、スクランブルしたコントロールで処理した4E過剰発現細胞は、ほぼ~70%の生存率であり、~35%の生存率だったベクタ・コントロールとは対照的だった。これは大変驚くべき規模の救助であり、図２８で観察されたものとほぼ同じ規模の救助（２倍）である。しかしながら、siRNAでNBS1について処理した4E過剰発現細胞は僅かに ~20% の生存細胞しか有さず、スクランブルされたコントロールで処理された4E過剰発現細胞が~70%生存していたものの３分の１だった。4Eにはその救助機能のためにはAktが、そしてAkt活性化にはNBS1が必要であるという観察と一緒にすると、我々のデータは、この文脈では4Eの生存機能には、NBS1を通じたそのAkt活性化能が必要であることを強く示唆するものである。
【０３４７】
PMLはこの4E活性の負の調節物質である
明らかに、当該細胞は4Eの増殖及び生存機能を制御する機序を発生させていた。我々の以前の研究は、前骨髄性白血病タンパク質PML は4E依存的mRNA輸出の強力な阻害剤であることを示していた (Cohen et al. 2001; Topisirovic et al. 2003a; Culjkovic et al.
2005, Culjkovic et al., 2006; Culjkovic et al. 2007).。PMLのRINGドメインは4Eの背側表面（W73を含む）と直接、相互作用し、そしてコンホメーション変化を通じて、4Eのm7Gキャップに対する親和性を１００分の１未満に減少させる (Kentsis et al.
2001)。以前の研究では、RINGドメイン（RING）でのPMLの変異、あるいは、4Eの背側表面の変異（W73A）があるとPML-4E相互作用が損なわれ、4E依存的mRNA輸出のPML媒介性阻害が緩和されると示されている (Cohen et al. 2001; Kentsis et al. 2001; Culjkovic et al. 2005,
Culjkovic et al., 2006; Culjkovic et al. 2007)。従って我々は、PMLタンパク質がNBS1 mRNAの輸出を損なうことでAktの4E依存的活性を損なう可能性を調べた。更に我々は我々の変異体を用いてこれらの効果がPML-4E間の相互作用に依存するのかを判定した。
【０３４８】
PMLの過剰発現はNBS1のmRNA輸出をベクタ・コントロール又は4E過剰発現細胞に比較して抑制した（図３１）。合致するように、PML はサイクリン D1 mRNA の輸出をベクタ・コントロールに比較して（内因性4Eに作用することにより）、そして4E過剰発現細胞に比較して損なった（図３１Ｂ）。PML及び4Eの両方を発現する細胞で、PMLはNBS1及びサイクリン D1 mRNAの両者の輸出を、4Eのみ過剰発現する細胞に比べて明らかに減少させる。合致するように、NBS1 及びサイクリン D1 タンパク質レベルは4Eのみを過剰発現する細胞に比べて減少する（図３１Ａ）。次に我々はPMLが4E依存的 Akt 活性化を減少させるかどうかを調べた。PML 及び4Eを同時発現させたところ、AktのT308及びS473でのリン酸化が4Eのみを過剰発現する細胞に比べて減少した（図３１Ａ）。合致するように、PMLの過剰発現はS6 や BP-1 の、ベクタ又は4E過剰発現細胞に比べたリン酸化低下につながる。このように、PMLは4E依存的Akt 活性化、そしてその後の下流事象を損なう。
【０３４９】
これらのPMLの効果が実際にその4Eとの相互作用に依存することを実証するために、我々は4E結合（RING）に欠陥のあるPML変異体の効果を観察した。平行して我々は、PMLに結合することのできないW73A
4E 変異体を抑制する上でのPMLの能力を観察した。PMLの過剰発現は4E媒介性Akt活性化を損なうが、PML RINGは損なうことができない。更に、PMLはW73A 4E 変異体が媒介するAkt活性化は損なうことができない。予想通り、PML RING変異体はNBS1 又は サイクリン D1 mRNA のいずれの4E媒介性mRNA輸出も阻害することができなかった(PML
RING+4E 対 PML+4E；図３１Ｂ)。更に、野生型 PMLは W73A 4E 変異体を阻害することができなかった (PML+W73A 4E 対 W73A)。合致するように、NBS1 タンパク質レベルはPML+W73A
又は W73A 4E 発現細胞と同様な程度まで上昇した（図３１Ａ）。このように、PMLには、4E依存的NBS1 mRNA 輸出、そしてその後のNBS1タンパク質レベル及びAkt a活性化を損なうためには、4Eとの直接的結合能を必要とする。PML
RING及び 4E の同時発現、あるいは PML 及びW73A 4E の同時発現は、T308 及び S473 Akt 部位の両方についてのウェスタン・ブロットで観察した通り、4Eのみを発現する細胞に比べた4E媒介性Akt活性化につながらなかった（図３１Ａ）。重要なことに、PML 又は PMLRING の発現は、4E 又は Aktの発現に変化をもたらさなかった。更に、4E 又は W73A 4Eの発現は PML レベルを調節しなかった。
【０３５０】
我々はPMLが血清枯渇線維芽細胞の4E依存的救助を損なうに違いないと仮定した。我々は上述したようにアポトーシスを観察した。血清枯渇前ではPML及び4E の両者とも生存率に影響しないように思われる（図３２）。しかし、血清枯渇細胞においては、PML
を過剰発現させるとベクタ・コントロールに比較して生存率が低下し（２分の１、図３２Ａ）、我々の先の研究と合致する（Borden et al. 1997)）。4E過剰発現細胞の生存率はベクタ・コントロールに比べて（２倍）そしてPML過剰発現細胞に比べて（４倍）、向上した。PML 及び4Eを同時発現する細胞とは対照的で、生存率は4E過剰発現細胞に比べて実質的に低下していた（~40% 対 ~80%）。TUNEL 検定では合致する結果が出た（図３２Ｂ）。このように、PML は4E媒介性アポトーシス救助を血清枯渇条件下で損なうのである。
【０３５１】
4EはAkt発現に対して２階層効果を有する位置にある
4E が遺伝子発現を組合せ的に調節するという (Culjkovic et al. 2007)ことを背景に、我々は4E 依存的 mRNA 輸出及び 4E 感受性翻訳の他の既知のターゲットもAktシグナル伝達で作用するのかどうかを調査した。以前に報告された4E mRNA 輸出ターゲットを検査すると、これが実際に本当であること、即ち、4Eはサイクリン A2 (Heron-Milhavet et al. 2006)、B1(Lee et al. 2005)、及び E (Hlobilkova et al. 2006; Kim et al.
2006)、c-myc (Ahmed et al.
1997; Chen and Sytkowski 2001)、及びMdm2 (Mayo and Donner 2001; Gottlieb et al. 2002)や、サイクリン D1 (Muise-Helmericks et al. 1998;
Gille and Downward 1999; Takuwa et al. 1999) 及びNBS1 (Chen et al. 2005)を含む、Akt経路のエフェクタを調和的に上方調節していたことが実証された(図５、(Culjkovic et al.
2006))。これは包括的なリストではなく、より多くの4E
mRNA ターゲットが同定されているように、これらのうちの数多くがAkt経路の下流エフェクタでもあるという可能性が高い。このように、4EはAkt活性化及びAktの下流エフェクタの上方調節という二つのレベルでAkt経路を働かせる位置にあるのである。
【０３５２】
議論
我々は4EがPI3K/Akt シグナル伝達軸を調節し、その調節を調和させるという証拠をRNA レギュロン・モデルを通じて提供する（図３３）。これは、4Eは、当該プロセスに関与する遺伝子発現を調和的に調節することで細胞周期進行を支配するレギュロン中のノードであることを示した以前の研究と合致する(Culjkovic et al. 2005, Culjkovic et al., 2006)。ここで報告する研究は、4Eは、同じ戦略を用いて生存シグナル伝達を亢進できること、こうして4Eは不死化細胞株におけるアポトーシスを阻害しつつ増殖を駆動することができることを示す。また我々は、増殖及びアポトーシス救助という、4E過剰発現がもたらすこれら二つの生物学的効果がこのRNAレギュロンの調節を通じて内在的に関係していることも示唆する。
【０３５３】
このモデルでは、4E はAkt経路の影響を受けるタンパク質のmRNAを調和的に輸出することで、それらの産生亢進を可能にする（図３３）。調和あるmRNA 輸出はこれらのmRNAの3'UTRに共通な因子、4E-SE、によって達成される。今日までのところ、我々の結果は、4Eが少なくとも二つのレベルでAkt経路に影響することを示すものである。第一に、4EはAktのリン酸化レベルでNBS1タンパク質の産生亢進を通じて作用する。NBS1は他のグループによってPI3Kの上流活性化物質であることが示されている(Chen et al. 2005)。NBS1はまた、Atmキナーゼを活性化もし、こうしてそれは能動的な役割を果たし、Atmと直接結合すると考えられている
(Karran 2000; Petrini 2000; Viniegra et al. 2005)。NBS1 はPI3K 様結合ドメインを含有し、このドメインを用いてPI3K と間接的に相互作用すると考えられる(Cerosaletti et al. 2006)。しかしながら、NBS1 がPI3Kを活性化し、ひいてはAktを活性化する精確な機序は未知である。我々の報告は、NBS1活性化がPI3K 依存的であることを示した以前の研究と合致する。なぜならLY294002 はこの活性化を行うからである
(Chen et al. 2005)。興味深いことに、4E はODCの産生を mRNA輸出レベル及び翻訳レベルの両方で亢進する(Rousseau et al. 1996)。ODC の過剰発現は  PI3K とは独立にAkt活性化を引き起こすことができる(Hayes
et al. 2006)ことから、いくつかの文脈では、4Eは我々がここで解説するNBS1-PI3K-Akt軸とは独立にAktを活性化することができることが示される。第二に、4E の過剰発現はAktの複数の下流エフェクタのタンパク質レベル増加につながる（図１及び５、 (Culjkovic
et al. 2006))。こうして4EはAkt生存シグナル伝達経路の効果を増幅する位置にある。
【０３５４】
リンパ腫のトランスジェニック・マウスモデルでの4E過剰発現が、進行性の疾患や、ラパマイシン耐性の腫瘍の発生と相関する (Wendel et
al. 2006)。Aktシグナル伝達の前のモデルでは、4EがAktの下流であるとだけ考えられた状況では、ラパマイシン耐性がどのようにして発生するのかを理解するのは困難だった。ラパマイシンはmTOR を阻害し、ひいてはmTOR媒介性のBP1リン酸化を阻害する。実際のところ、mTORがAkt活性化上の負のフィードバック・ループの一部であるために、いくつかの細胞及び患者標本中では、mTOR
阻害はAkt 活性化につながらない (O'Reilly et al. 2006)。我々のデータは、4E媒介性ラパマイシン耐性の考え得る分子基礎を提供するものである。4Eは（mRNA輸出レベル及び翻訳レベルの両方で）Pim1のレベルを亢進することが知られており(Hoover et al. 1997; Clemens
and Bommer 1999; Culjkovic et al. 2006) 、Pim1 はAktとは独立にBP1を直接リン酸化することができる (Hammerman et al. 2005)。このように、4E は mTOR-ラパマイシンを媒介することができ、またBP1のpim1媒介性リン酸化の阻害を直接、緩和することができる。4Eがこの結果を達成することができる他の同様な手段が複数ある可能性が高い。
【０３５５】
BP1に対する4E過剰発現の効果は興味深く、また、4Eが正のフィードバック・ループに関与しており、そのループを通じて、超リン酸化BP1のレベルを上げるそのmRNA輸出活性を間接的に用いることにより、総BP1タンパク質レベルを変えることなく、その翻訳活性を活性化することができるのではないかということを示唆している。しかしながら、4E感受性mRNAの翻訳はBP1-/-、BP2-/- 又は BP1-/-/BP2-/-
細胞では有意には上昇していない
(Blackshear et al. 1997; Tsukiyama-Kohara et al. 2001; Banko et al. 2006; Le
Bacquer et al. 2007)。翻訳上活性な4E複合体の形成の亢進は測定誤差内（最大〜１．５倍）であると考えられ(Banko et al.
2006) 、4E 感受性 mRNAのポリローム装荷の亢進はこれらのノックアウト細胞のいずれでも報告されていない。これらの動物はそれらのサイズの点では正常であり、 BP1-/- 及び BP1-/-/BP2-/-
は脂質生成及びインシュリン応答において僅かに有意に欠陥を有するだけである (Le Bacquer et al. 2007)。興味深いことに、 BP1-/- 細胞は野生型コントロールと同じ程度、（成長停止という点で）ラパマイシンに応答する(Blackshear et al. 1997)。これらのマウスの表現型ははるかに著しいものだと予測されており、マウスは幅広い癌の対象であると想定された。これは本当ではない。これらの研究では、4Eを調節する因子に著しい重複があることが示唆されている。このように、BP1リン酸化は明らかにAkt活性化のマーカではあるが、BP1リン酸化単独がどの程度まで、4Eの翻訳活性を予測できるものなのかは 明らかではない。このように、我々の研究の場合、4E は確かにAkt活性化を通じてBP1リン酸化を刺激するが、4E活性に及ぼすこの効果単独の程度を解明するには更なる研究が必要であろう。しかしながら、これらの研究は、4E媒介性Akt活性化がS6 及びBP1について予測されるシグナル伝達事象につながることを間違いなく示している。
【０３５６】
細胞は明らかにRNA レギュロンを制御するためのマスター制御スイッチを、この場合はPMLの形で発達させたことで、4Eの効果を弱めた (Culjkovic et al. 2006; Culjkovic et al. 2007)。このように、細胞はPMLを用いることで、当該ネットワークのただ一部分、即ち4Eを直接標的にすることにより、この複雑な生存ネットワークをシャットダウンすることができる。PMLは4Eの強力な阻害剤であり、このときそれは4E依存的mRNA輸出を阻害するだけでなく、細胞質内にあるときにはキャップ依存的翻訳も阻害することができる(Kentsis et al. 2001)。更に、4E依存的救助の阻害を通じてアポトーシスを促進するというPMLの能力（図３２）は、PMLのアポトーシス促進能は進行中の転写からは独立であるという以前の観察（Quignon et
al. 1998）の初めての分子的説明となる。なぜなら、この研究の辞典では、PMLと4Eとの関係は知られていなかったからである。我々が提案するモデルがあることで、いまや、PMLが転写独立な態様でアポトーシスを刺激することができるかは明らかである。最後に、我々の結果は、Aktは同腹子コントロールでよりもPML-/- 細胞での方がより活性化しているという最近の研究と合致する (Trotman et al.
2006)。PMLによるAkt失活のもう一つの機序がTrotman氏及び共同研究者により提案されているが、我々の結果は、PMLが4Eレギュロンの阻害を通じて直接、及び／又は、間接的に、Aktの負の調節物質として作用するという可能性を除外するものではない。4Eのもう一つの負の調節物質であるPRH (Topisirovic et al. 2003a)が過剰発現しても、Aktのリン酸化は減少する（データは図示せず）。
【０３５７】
明らかに、En2、HoxA9 及び4E-BPなど、4E機能の他の細胞内調節物質も、レギュロンを強力に調節する位置にある(Sonenberg and
Gingras 1998; Topisirovic et al. 2003a; Brunet et al. 2005; Topisirovic and
Borden 2005)。HoxA9 などの調節物質は特に強力であり、HoxA9は 4E 依存的 mRNA 輸出及び4E 依存的翻訳の両者を刺激する (Topisirovic et al. 2005)。
【０３５８】
更に、このレギュロンには考えられるフィードバック・ループがある。例えばc-Mycは4EのmRNA 輸出及び翻訳ターゲットである(Clemens and Bommer 1999; Culjkovic et al. 2006)。興味深いことに、4E 及びNBS1の両者とも、c-myc の直接的な転写ターゲットである(Chiang et al. 2003; Schmidt
2004)。これはこれらのタンパク質とAkt活性化との間の興味深い正のフィードバック・ループに関するモデルを提供する。
【０３５９】
まとめると、これらの発見は、形質転換が悪性表現型の維持のために一つ又は２、３の遺伝子に依存しているという「腫瘍遺伝子嗜癖」の概念を切り開くものである(Jonkers and Berns 2004; Weinstein and Joe 2006)。4E は従ってこのような役割の適した候補かも知れない。なぜなら我々はそれが生存シグナル伝達性レギュロンにおいて中心的なノードであると考えるからである。このことから 4E は強力な治療上のターゲットと捉えられる。4Eの低分子阻害剤であるリバビリンは
m7Gキャップの物理的模倣体であり、この生存シグナル伝達ネットワークを阻害する位置にある。
【０３６０】
材料及び方法
コンストラクト．   pLINKSV40-PML、pcDNA 4E、MSCV-pgk-GFP-4E WT 又は変異型発現コンストラクトは以前に解説されている(Cohen et al. 2001;
Topisirovic et al. 2003b; Culjkovic et al. 2005; Topisirovic and Borden 2005)。PML RING 変異体（PMLの機能に必要な、PMLのRINGドメインに二重点変異）は以前に解説されている (Borden et al. 1998)。
【０３６１】
細胞培養及び処理  用いた細胞は、100単位／ml ペニシリンＧナトリウム及び100μg/ml 硫酸ストレプトマイシン（全てGibcoBRL社から）を加えたDMEM中に、更にMEF Akt1 wt 及び -/- 由来細胞には 10% 新生児ウシ血清を；Bosc-23 細胞には10% ウシ胎児血清を；そしてNIH3T3由来細胞には1mg/ml G418 (GibcoBR社)を10% ウシ血清及び1μg/ml ピューロマイシン（シグマ社） を添加した状態で維持された。4E
WT 並びにW56 及び W73 変異体レトロウィルス・ベクタをBosc-23 Eco パッケージング株 （Guy Sauvageau氏からご厚誼で贈与)に一時的にトランスフェクトし、レトロウィルスの上清を用いて MEF Akt1 wt 及びAkt1-/- 細胞 （Morris Birnbaum氏からご厚誼で贈与）を感染させた。 GFP+ 細胞をBD FACSAria セル・ソータを用いて分離した。4E及びPMLを安定にトランスフェクトしたNIH3T3細胞は解説された通りに作製された
(Topisirovic et al. 2002; Topisirovic et al. 2003a)。siRNA研究に向け、4E過剰発現MEF Akt1 wt 細胞にリポフェクタミン2000 (GibcoBRL) 及び20nM siRNA 二本鎖 MMS.RNAI.NO13752.2.2 (IDT) をメーカの指示に従ってトランスフェクトした。トランスフェクションから７２時間後に細胞を分析した。処理研究に用いたLY294002 (LY)は細胞培養等級（Sigma社）のものであり、 50μM にして１時間、用いられた。
【０３６２】
ウェスタン分析及び抗体．  ウェスタン分析は解説された通りに(Topisirovic et al. 2002; Topisirovic et al. 2003a)、改良溶解緩衝液 (40mM HEPES (pH 7.5)、120mM NaCl、1mM EDTA、10mM β-グリセロホスフェート、50mM NaF、0.5μM NaVO3、1% (v/v) Triton X100、に完全プロテアーゼ阻害剤(すべてSigma社製)を添加したもので行われた。加えて、免疫ホスホロタンパク質検出のためのブロットをBSA 遮断溶液 (2% (w/v) BSA (Sigma社)の TBST溶液)で遮断し、一次抗体をBSA 遮断溶液で遮断した。免疫ブロット法に用いられた抗体は、そうでないと言及しない限りCell Signaling社から得た：mAb抗4E (BD PharMingen社)；mAb抗PML (5E10  (Stuurman et al. 1992))；pAb抗NBS1；mAb抗サイクリンD1 (BD PharMingen)；pAb抗VEGF (Santa Cruz社)；pAbs抗Akt、抗Phospho Thr
308 Akt、及び mAb抗Phospho Ser 473 Akt；pAbs抗S6 及び抗Phospho S6 リボゾーマルタンパク質；pAbs抗4E-BP1 及び抗Phospho
4E-BP1；mAb抗GAPDH (MAB374, Chemicon社)；mAb抗β-アクチン (AC-15、Sigma社)。
【０３６３】
アポトーシス検定法．  MEF
Akt1 wt 及び - /-由来の指数関数的に成長中の細胞培養株、及び NIH3T3 細胞を0.1% 血清条件まで１８時間、シフトさせた。アネキシンVAPC (Ann. V、BD Biosciences社) 及びヨウ化プロピジウム (PI、Sigma社) 染色のために、細胞及び最初のPBS 洗浄液を回収し、メーカの指示に従って処理した (BD Biosciences社)。染色後の細胞をBD LSRII フローサイトメータで、初期のアポトーシス性細胞をアネキシンＶ陽性、PI 陰性と採点することでネクローシス性細胞を除外しながら分析した。検定は少なくとも三つの別々の機会に分けて三重にして行われた。TUNEL染色には、カバースリップに予め播種された細胞を血清枯渇させ、固定し、In situ Cell Death Detection キット、TMR レッド（Roche社) でメーカの指示に従って染色した後、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI; Vector Laboratories社)と一緒にVectorshieldに載せた。いくつかの視野からの蛍光を20倍 対物レンズをZeiss LSM 510 レーザ・スキャニング共焦点顕微鏡上で用いて観察した。
【０３６４】
細胞分画及びqPCR.   分画及びRNA単離は解説された通りだった
(Lai and Borden 2000; Topisirovic et al. 2002)。qPCR 分析はSybr Green
PCR マスター混合液 (ABI)を Mx3000PTM サーマル・サイクラ (Stratagene社)で用いて行われ、データはMxPro ソフトウェア (Stratagene社)で解析された。条件及びプライマの全ては以前に解説されていた (Culjkovic et al. 2005)。計算はすべて、アプライド・バイオシステムズ・ユーザ・ブルティン２号
に記載され、対応する図面説明により精確に解説されたた相対的標準曲線法を用いて行われた。
【０３６５】
実施例７：  リバビリンは4Eレギュロンの抗アポトーシス性活性を阻害し、ラパマイシンは4Eレギュロンを活性化する
正常な生理プロセスを通じた成長因子／サイトカインシグナル伝達経路、及び／又は、4Eレギュロン経路メンバーの発癌性活性化の結果、正のフィードバック・ループが起きるが、このループは癌の場合、癌細胞の生存及び増殖に供されてしまう。4E過剰発現は細胞をアポトーシスから救助するが、4Eによる細胞のアポトーシスからの救助はAktに依存する。なぜなら、Akt(-/-)
細胞は4Eによって救助され得ないからである。4E の増加はこのような事象を達成する方法の一つだが、 Akt-活性化、Pim-1 活性化及び／又は過剰発現、サイクリンD1過剰発現、VEGF/FGF2 過剰発現及び／又は過剰発現の多様な混合及び／又は4Eレギュロンの成分の活性化もそうである。4E活性を阻害すると、ここで記載するような、そして当初、リバビリンの構造の元となった文献で記載されたようなリバビリン及び関連化合物などの4E阻害剤で細胞、腫瘍及び／又は個体を処置したときに予測される治療上の利益が、反対の効果となって生じる。
【０３６６】
対照的に、当業で公知の／未知のラパマイシン及びラパマイシン類似体の適用を即することができる。なぜなら、これらはリン酸化を通じてAktを活性化することで（ｉ）ヒト癌の成長速度を増し、そして（ｉｉ）細胞生存を提供し、ひいては虚血再潅流損傷等、Amaravadi and Thompson (J Clin Invest 115 2618, 2005) に示唆されたものや Rosen氏及び共同研究者 (Cancer Research 66: 1500, 2006)が実証したものなど、4Eレギュロンの過剰活性化（即ち癌）とは直接対照的に、レギュロンの活性化が治療上有益であろう状況における臨床上の有益性を提供する機序を提供するからである。
【０３６７】
図３５及び３６に示すように、Aktのリン酸化はAktの活性化に必要である。リバビリンはAktリン酸化を阻害するが、ラパマイシンはAktリン酸化を増加させるという、4E成長／生存レギュロンを阻害する方法（リバビリン及び同様なレギュロン活性修飾活性を持つ化合物）及び刺激する（ラパマイシン及び同様のレギュロン活性修飾活性を持つ付加的な化合物）方法の両方が提供されている。図２７は、リバビリンが4E媒介性アポトーシス救助を遮断し、ラパマイシンは4E媒介性アポトーシス救助に対するリバビリン効果を阻害する。
【０３６８】
議論
4E活性の阻害は、アポトーシスに耐性になった細胞（例えば癌細胞）を救助することで、細胞のアポトーシスに対する感受性を回復することにより、治療計画（限定はしないが化学療法、細胞毒、放射線及び標的化治療薬）による治療効果の促進を提供することが予測される。更に、リバビリン、リバビリン類似体、あるいはリバビリンの構造がベースになった分子などの4E阻害剤を、放射線化学療法及び／又は標的化化学-生物治療薬と順次及び／又は同時に投与すると、優れた臨床上の利益がもたらされるであろう。
【０３６９】
対照的に、ラパマイシンを単独で、あるいは細胞生存を促進することが既知の付加的な作用物質と一緒に投与すると、虚血再潅流損傷等、細胞生存の促進が好ましいような場合に優れた臨床上の利益が提供されるであろう。
【０３７０】
更に、4Eレギュロンの成分の上昇を利用して、4Eレギュロンが活性化する又は失活する（それにより、それぞれ細胞生存及びアポトーシスを促進する）といった診断上の先見及び判断を提供することができる。そしてそのような状態では、リバビリンや、ここで前に指名した化合物、あるいは当業で公知のリバビリン類似体、あるいはリバビリンの構造が元々ベースとなった／考えられた分子による処置を、4E生存レギュロンを阻害し、ひいてはアポトーシスを促進するために用いることができる。対照的に、ラパマイシン、ラパマイシン類似体及びmTORの活性化剤による処置は、4E生存レギュロンを刺激し、ひいては上に記載した臨床状況とは反対の状況で臨床上有益であろう細胞生存の促進をするために用いることができる。
【０３７１】
4E 及び4E標的タンパク質及び／又は
活性化レベル（即ち、mRNA 輸送及び／又は翻訳レベル及び／又は
リン酸化で（直接的に／間接的に）調節される分子) の判定は、それぞれ単独又は組み合わされた状態で、4Eレギュロンの活性化状態に関する診断上の先見を提供することができる。リバビリン（等）又はラパマイシン（等）の投与が、それぞれ細胞のアポトーシス又は細胞アポトーシスの阻害を取り戻すのに役立つ場合を判定する。細胞アポトーシスの回復が臨床上の利益をもたらす条件には癌及び増殖性疾患や、4Eレギュロンが異常に活性化している疾患状態等がある。細胞アポトーシスを減少させると臨床上の利益がもたらされるであろう条件には虚血再潅流損傷等がある。
【０３７２】
現行の癌化学治療戦略は、しばしば、生物系の調和ある調節には役立たず、どころかそれらは単一のターゲットを活性化／阻害することで治療効果を得ようとするものである。対照的に、生物系の調和ある治療的調節は、ある一つの経路の成分全てが協調的に調節されるために、優れた治療法となる可能性が高い。生物系のこのような調和ある調節のためだけの道を提供する生物系はほとんどなく、また、このような系の調和ある治療的調節物質の開発を可能にするのに充分な詳細が記述されたことはほとんどない。
【０３７３】
現在の技術は4Eレギュロンを治療的に操作することでその調和ある調節を提供するものである。4E、4Eターゲット（mRNA輸送 及び／又は翻訳調節される分子）並びにキナーゼ活性は発癌プロセス及びヒト癌における重要な参与物質の代表である。4Eの高親和性阻害剤であるリバビリンは4Eレギュロンを調和的に阻害する。対照的に、ラパマイシンはこの経路を（少なくとも部分的）調和的に上方調節するようである。
【０３７４】
上述したように、4Eレギュロンの阻害及びその活性化の両者とも、 癌及び過剰増殖性状態／疾患の場合には治療上の利益、細胞成長及び生存の阻害／化学療法薬に対する耐性を；そして虚血再潅流損傷等の場合には細胞成長の活性化／生存、を提供する。マイクロモル濃度のリバビリン濃度の投与を通じてこの経路を調和的に調節する（即ち阻害する）という能力は、癌及び過剰増殖性状態、二つだけ名を挙げれば癌及び結節硬化症で幅広い治療効果を挙げるであろう。
【０３７５】
生物的ネットワークの単一点／メンバーを標的にする代替案は、より最近のマルチ-キナーゼ阻害剤開発である。これらの作用物質は、標的生物系のより大きな治療的網羅を提供しようという試みとして開発されてきた。数多くのキナーゼ活性を直接的／観察的に調和的かつ選択的に調節するというリバビリンの能力は、これまで開発された最も広いマルチ-キナーゼ阻害剤が提供してきた能力を超え、優れた作用特異性及び選択性を提供するものである。更に、リバビリンそれ自体及びそれ単独ではキナーゼ阻害剤ではなく、むしろそれによる4E活性の阻害を通じて、それはこれらの重要な調節性キナーゼ活性又はそれらの調節物質／活性化物質のいずれかをコードするmRNAの輸送及び／又は翻訳を阻害するものである。更にリバビリンは、図３４に示すように腫瘍の転移、血管新生及び対アポトーシス耐性をもたらす分子をコードするmRNAの輸送及び／又は翻訳を阻害する。
【０３７６】
明らかに、4Eレギュロンを調和的に阻害するというリバビリンの能力は優れた調節を提供し、ひいてはこのレギュロン活性が全部又は部分的に上昇しているような状態（癌及び過剰増殖性疾患）において治療上の利益を提供する。そこから、4Eが上昇した癌に加え、4E標的分子、4Eが活性化する分子及び4Eを活性化させる分子のうちの一つ以上のレベルが上昇した癌が腫瘍形成遺伝子の代表である（そして多くが以前にそのように特徴づけられている）ことも直接、導かれる。従って、4Eレギュロンのメンバーのうちの一つ以上が遺伝子発現、タンパク質合成又は活性のレベルで上昇しているような状態は、リバビリンの投与が治療上の利益を提供すると予測される状態の代表であろうことも予測される。これらには、4E活性は正常であるが4Eターゲット／活性化剤／エフェクターが上昇しているような癌が含まれる可能性が高い。例えば前立腺癌においては、Pim-1 キナーゼは進行した前立腺癌の大半では上昇している。Pim-1 は4Eで（mRNAの輸送及びmRNA翻訳の両方のレベルで）調節される分子だという事実のために、リバビリンをPim-1 陽性前立腺癌に投与すると、治療上の効果が上がる可能性が高いと思われる。同様に、4Eレギュロン成分が上昇している又は構成的に活性な形で存在しているような多様な癌における判定は、どの適応症が最も応答する可能性が高いか、そして低容量のリバビリン投与から治療的利益が得られるかを定義するのに役立つであろう。リバビリンは、重要な生存キナーゼ（Akt及びPim-1）の調節だけでなく、リバビリンAkt/Pim-1 標的エフェクター分子の治療的調節を含む調和のある、かつ、治療的なレギュロンの調節を（通常は細胞中に存在する標的タンパク質／エフェクター分子の量を抑えることを通じて）提供する。これにより、細胞成長、細胞生存、そして数多くの場合は癌性細胞及び／又は腫瘍におけるこれらのプロセスを調節する上で関与するこの中心的な調節機序に、優れた制御が提供される。
【０３７７】
実施例８：  4Eレギュロンの付加的な成分の研究
HuR は4E mRNAのレベルや、4Eタンパク質の活性を直接調節することにより4Eレギュロンを調節することができるのかも知れない
この項では、我々は4E mRNA安定性がHuRとの相互作用を通じて高められるという、4Eレベルの上方調節の新規な機序を開設する。HuRは複数の癌で過剰発現しており、細胞を形質転換させることができるため、この関係はいくつかの癌における4Eレベルの上昇と特に関係があるかも知れない。我々の研究で我々は、HuRタンパク質が4E mRNA と一緒に免疫沈降することを見出した（データは図示せず）。HuRタンパク質はサイクリン D1 mRNA 安定性をサイクリン D1 mRNA中のARE因子との相互作用を通じて調節することが知られている。このように、サイクリン D1はこれらの検定のための正のコントロールである。4E タンパク質はHuR mRNA と一緒には免疫沈降しないことに留意されたい（データは図示せず）。更に、4Eの過剰発現はHuR発現を変化させない（データは図示せず）。このように、HuRは4E mRNA 安定性を調節するが、4E はHuRの遺伝子発現は調節しないようである。
【０３７８】
HuR はそれらの3’UTR中にARE因子を持つ転写産物を安定化させることがよく確立されている。従って我々はHuRの過剰発現が4E mRNA レベルを調節するかどうかを調べた。ウェスタン・ブロット分析で観察された通り、HuRの過剰発現は内因性サイクリン D1タンパク質のレベル増加につながった。予想通り、HuR も内因性サイクリン D1 タンパク質レベルを増加させた。このことは、HuRがサイクリン D1 mRNAを安定化させることを示した以前の研究と合致する。合致するように、平行研究では、HuRのsiRNAノックダウンは4Eレベルの減少につながることが実証されている（データは図示せず）。
【０３７９】
我々はこの研究を拡張してHuR 過剰発現が内因性4E mRNA安定性に及ぼす効果をアクチノマイシン Dを用いて調べた。HuR の過剰発現はベクタ・コントロールに比べて実質的に4E mRNAを安定化させるがGAPDH（負のコントロール）はさせない。HuR は、やはり4E mRNA輸出の下流のターゲットである多くのmRNAにも結合するということをもとに、我々はHuRが4E-SEを含有するキメラIacZ コンストラクトに結合するかどうかを調べた。 4E-SEのないLacZをコントロールとして用いた。予想通り、HuRはLacZ4E-SE 又は LacZ mRNAのいずれとも結合しなかった（データは図示せず）。これはHuRがARE因子と結合するという以前の観察と合致する。これらの研究は、HuR感受性mRNA内のARE因子は4E-SEとは異なることを示唆している。このようにして、HuR及び4Eは（異なるUSERコードを用いて）同時に同じ転写産物に結合し、輸出及び安定性を調和的に調節するのかも知れない。
【０３８０】
我々は内因性タンパク質の免疫沈降により、HuRタンパク質は4Eタンパク質にRNA 依存的に結合することを示す（データは図示せず）。この相互作用は核内及び細胞質内画分の両方で観察されることから、HuR は4Eを感受性mRNAのmRNA輸出及び翻訳の両方において調節し得るのではないかということが示唆される。HuR 及び4Eタンパク質はそれでも尚、ヘパリンの存在下では免疫沈降するが、RNAseの存在下ではしないことに留意されたい。
このことは、特異的なRNA相互作用がHuR 4E タンパク質対タンパク質HuR相互作用を媒介していることを示すものである。 4E はそれ自身のmRNAを免疫沈降させず、従ってHuR 4Eタンパク質複合体はHuR-4E mRNA 複合体とは異なることに留意されたい。
【０３８１】
まとめると、HuRに関する我々の予備データは、HuRは4E mRNAのレベル及び4Eタンパク質の活性を直接、調節することにより、4Eレギュロンを調節するのかも知れないことを示している。更に、HuRは4Eの下流のターゲットであるサイクリン D1（及び他のもの、以下を参照されたい）の発現を刺激する。このように、HuR は4E活性を増幅する位置にある。従って以前に報告されたHuRの形質転換及び発癌性は、部分的には、その4E mRNA 及び4E タンパク質との相互作用を通じて媒介されていることも考え得る。これまでのところ、我々のデータは、HuRは 4E レベル及び活性を調節することができること、しかし4EはHuRの発現を調節することはないことを示している（データは図示せず）。実際、我々の以前のデータは、4Eの過剰発現はサイクリン D1、ODCなどの標的mRNA、あるいは、IacZ-4E-SE
（又は IacZ コントロール）などのモデルmRNAのmRNA安定性における変化にはつながらないことを示している。まとめると、これらのデータは、mRNAの下位集団はHuR及び4E タンパク質の両方と結合することを示している。これらのmRNAはARE （HuR用）及び4E-SE（4E用）という少なくとも二つの異なる非重複USERコードを含有する可能性が高い。このようにして、4E及びHuR は共通の一組の転写産物の発現を調節し、ひいては細胞成長に対するそれらの生物学的効果を媒介することができる。
【０３８２】
従って我々は、HuRがおそらくは三階層効果を4Eレギュロンに対して有することを提案する：１．  それは4Eのレベルを上昇させることによりレギュロンを増幅する、２．  それはこれらの転写産物を安定化させることを通じて4E RNA輸出ターゲットのレベルを増加させ、それにより4Eの有効性を増す、及び３．  それはHuR-4E
タンパク質対タンパク質間の相互作用を通じて4Eの機能を直接、調節する。HuR自体の過剰発現は細胞培養では発癌性形質転換に、異種移植片マウスモデルでは腫瘍につながることが公知であり、そしていくつかのヒト癌では上昇している。HuRの発癌性は少なくとも部分的にはその4Eレギュロン調節能から生じる可能性が高いようである。
【０３８３】
結論．  4E発現それ自体が制御される機序は余り注目されてこなかった主題である。我々の研究は、HuRは4E mRNAを安定化させることにより4E発現を亢進することを示すものである。これはこのような機序が4Eに対して提案された初めてのことであり、以前の研究では転写又は遺伝子増幅の亢進が癌細胞における4Eレベル上昇の基礎であるとして注目されてきたのである。
【０３８４】
実施例９：  ヒト頭部及び頸部SCC 細胞株実験
FaDu細胞を以前に解説された通りに培養して成長させ、リバビリンで４８時間、処理してからタンパク質抽出物を調製し、ウェスタン・ブロット分析を行った。アクチン及びeIF4E タンパク質はリバビリン処理後でも変わらないままである（図３８）。対照的に、NBS1、サイクリン D1 及びODC （そのmRNAが核内から細胞質への輸送レベルでeIF4Eの調節を受ける）タンパク質レベルはリバビリン処理で減少する（図３８）。
【０３８５】
均等物
当業者であれば、ごく慣例的な実験を用いるのみで、ここに記載された本発明の具体的な実施例の均等物を数多く認識され、又は確認できることであろう。本発明の具体的な実施例を論じてきたが、上記の明細書は描写的なものであり、限定的なものではない。本発明の数多くの変更が、この明細書を検討されれば当業者には明らかであろう。本発明の範囲全体は、請求項をそれらの均等物の範囲全体と併せて、そして前記明細書をこのような変更と併せて参照した上で、判断されねばならない。このような均等物は以下の請求の範囲の包含するところと意図されている。
【図１】
2010505123.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
2010505123.tif 000039
【図３４】
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【図３５】
2010505123.tif 000041
【図３６】
2010505123.tif 000042
【図３７】
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【図３８】
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【国際調査報告】
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