(57)【要約】  本発明は、血栓溶解治療を意図した医薬組成物の調製におけるマトリックスメタロプロテイナーゼMMP-10の使用に関し、その組成物はプラスミノーゲンアクチベーターを含有することもできる。さらに、本発明は、血栓による障害を処置するための上述の医薬組成物に関する。
2010519327.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓溶解治療に有用な医薬の調製におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ-10（MMP-10）の使用。
【請求項２】
前記医薬がプラスミノーゲンアクチベーターも含むことを特徴とする、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
前記医薬の成分が、同時に、別個にまたは連続的に投与されることを特徴とする、請求項2に記載の使用。
【請求項４】
プラスミノーゲンアクチベーターが、tPA組織プラスミノーゲンアクチベーター、uPAウロキナーゼ型アクチベーター、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、およびプラスミノーゲンを活性化する能力を保持するそれらのプラスミノーゲンアクチベーターの誘導体またはフラグメントから選択されることを特徴とする、請求項2に記載の使用。
【請求項５】
プラスミノーゲンアクチベーターが、tPAまたはプラスミノーゲンを活性化する能力を保持するtPAの誘導体もしくはフラグメントから選択されることを特徴とする、請求項4に記載の使用。
【請求項６】
プラスミノーゲンアクチベーターがtPAであることを特徴とする、請求項5に記載の使用。
【請求項７】
プラスミノーゲンアクチベーターが、uPAまたはプラスミノーゲンを活性化する能力を保持するuPAの誘導体もしくはフラグメントから選択されることを特徴とする、請求項4に記載の使用。
【請求項８】
プラスミノーゲンアクチベーターがuPAであることを特徴とする、請求項7に記載の使用。
【請求項９】
マトリックスメタロプロテイナーゼ-10（MMP-10）およびプラスミノーゲンアクチベーターを製薬的に許容される賦形剤または媒体と混合して含むことを特徴とする、同時投与、別個の投与、または連続投与のための医薬的組み合わせ。
【請求項１０】
マトリックスメタロプロテイナーゼ-10 （MMP-10）およびプラスミノーゲンアクチベーターが、別個に存在する、または１つの同じ組成物中に存在することを特徴とする、請求項9に記載の医薬的組み合わせ。
【請求項１１】
プラスミノーゲンアクチベーターが、tPA組織プラスミノーゲンアクチベーター、uPAウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、またはプラスミノーゲンを活性化する能力を保持するそれらのプラスミノーゲンアクチベーターの誘導体もしくはフラグメントから選択されることを特徴とする、請求項9または10に記載の医薬的組み合わせ。
【請求項１２】
プラスミノーゲンアクチベーターが、tPAまたはプラスミノーゲンを活性化する能力を保持するtPAの誘導体もしくはフラグメントから選択されることを特徴とする、請求項11に記載の医薬的組み合わせ。
【請求項１３】
プラスミノーゲンアクチベーターがtPAであることを特徴とする、請求項12に記載の医薬的組み合わせ。
【請求項１４】
プラスミノーゲンアクチベーターが、uPAまたはプラスミノーゲンを活性化する能力を保持するuPAの誘導体もしくはフラグメントから選択されることを特徴とする、請求項11に記載の医薬的組み合わせ。
【請求項１５】
プラスミノーゲンアクチベーターがuPAであることを特徴とする、請求項14に記載の医薬的組み合わせ。
【請求項１６】
血栓溶解処置における同時投与、別個の投与、または連続投与のための医薬的組み合わせとして、マトリックスメタロプロテイナーゼ-10（MMP-10）およびプラスミノーゲンアクチベーターを含むことを特徴とするキット。
【請求項１７】
マトリックスメタロプロテイナーゼ-10（MMP-10）およびプラスミノーゲンアクチベーターが別個に存在する、または１つの同じ組成物中に存在することを特徴とする、請求項16に記載のキット。
【請求項１８】
プラスミノーゲンアクチベーターが、tPA組織プラスミノーゲンアクチベーター、uPAウロキナーゼ型アクチベーター、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼおよびプラスミノーゲンを活性化する能力を保持するそれらのプラスミノーゲンアクチベーターの誘導体もしくはフラグメントから選択されることを特徴とする、請求項16に記載のキット。
【請求項１９】
プラスミノーゲンアクチベーターが、tPAまたはプラスミノーゲンを活性化する能力を保持するtPAの誘導体もしくはフラグメントから選択されることを特徴とする、請求項18に記載のキット。
【請求項２０】
プラスミノーゲンアクチベーターがtPAであることを特徴とする、請求項19に記載のキット。
【請求項２１】
プラスミノーゲンアクチベーターが、uPAまたはプラスミノーゲンを活性化する能力を保持するuPAの誘導体もしくはフラグメントから選択されることを特徴とする、請求項18に記載のキット。
【請求項２２】
プラスミノーゲンアクチベーターがuPAであることを特徴とする、請求項21に記載のキット。
【請求項２３】
血栓溶解治療のための、請求項9〜15のいずれかに記載の医薬的組み合わせ、または請求項16〜22のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテイナーゼ-10（MMP10）、より具体的には、MMP-10とプラスミノーゲンアクチベーターの組合せを含む医薬組成物、および血栓溶解治療および処置のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
止血系は、循環流を維持し、また血管への攻撃に応答して出血を防止することを担当する系である。生理学的な止血は、凝固およびフィブリン（線維素）形成を促進する機構、およびその分解または線維素溶解を支持する機構の両方によって制御されている。凝固の過剰な活性化または線維素溶解の欠陥は、血管をブロックする血餅の形成（血管内血栓形成）を引き起こし、虚血および壊死の原因となる。しかし、一般的な線溶亢進の状況は、出血を開始する方向に働くであろう。
【０００３】
アテローム血栓性の心臓脈管疾患は今日、罹患、死亡の主な原因である。このグループの疾患において、血栓形成過程は、臨床的に重要な主な急性の心臓脈管事象、例えば、急性心筋梗塞（MI）または脳血管発作（卒中）を引き起こす主な機構である。
【０００４】
それ故に、一般に脳血管発作および血栓事象を処置するための戦略はすべて、必然的に、組織への血流を回復し、そうしてより大きな被害を防ぐために、血餅によりブロックされた動脈の通路の再開通を素早く促進しなければならない。これは血栓溶解治療として一般に知られるものである。
【０００５】
線維素溶解は血栓溶解の生化学的な過程の基礎をなすことから、血栓溶解治療は、何よりもまず、一緒になって血餅を維持するフィブリンネットワークの分解を支持することを目指す。
【０００６】
プラスミンはフィブリンの溶解および分解を触媒する酵素であることから、血餅の素早い溶解を達成するためのはじめの目標は、プラスミンの生成を最大化することである。
【０００７】
この目的において、プラスミノーゲン（不活性な酵素前駆体）の活性なプラスミンへの転換を活性化することができるプラスミノーゲンアクチベーター：組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（uPA）または他の同様の物質の使用が、1980年から導入された。
【０００８】
Baker（Clin. Appl. Thrombosis/Hemostasis, 2002；8:291-314）は、血栓溶解治療における最新技術および使用されているまたは開発中の血栓溶解剤、それらの臨床応用、ならびに利点と欠点のレビューをまとめている。この文献において、Bakerはまた、理想的な血栓溶解剤が有するべき特徴を列挙している：1）動脈流または静脈流の素早い回復のための、即効性の血栓溶解；2）線維素溶解が急性の血栓症の領域に限定され、減少した全身的な線維素溶解を示す、フィブリン特異性；3）長期間持続する作用；4）フィブリノゲン、凝固に関与する他のタンパク質に作用することを防ぎ、一次止血を改変させないようにするための、血餅特異性；5）副作用がないこと；および6）低コストであること。
【０００９】
急性心筋梗塞および急性脳血管虚血（卒中）の場合、血栓溶解処置が成功すると、患者の生存が増加し、虚血組織の機能のより良い回復が増大する（White HD et al.; N. Engl. J. Med., 1987; 317:850-855；Suwanwela N and Koroshetz WJ; Annu. Rev. Med., 2007; 58:89-106）。残念なことに、線維素溶解処置には失敗や副作用がある。
【００１０】
急性心筋梗塞に罹患した患者のほぼ40％は、線維素溶解処置に応答せず、血栓によりブロックされた動脈の最適な再開通が達成されない（Armstrong PW and Collen D; Circulation, 2001; 103:2862-2866）。
【００１１】
この問題を解決するために、最近は、薬理学的な血栓溶解の代わりに、死亡率、再梗塞および出血を減少させる観点から血栓溶解処置よりも効果的な血流再開処置として、初回（primary）経皮血管形成術が用いられている。しかしながら、多くの場合（血行動態研究施設が利用不可能な場合または地理的距離が想定範囲を超える場合）、血管形成術を用いることは可能ではなく、その場合、血栓溶解処置が行われる。それ故に、血栓溶解処置、例えば、病院前の線維素溶解処置、新たな血栓溶解剤（テネクテプラーゼ（tenecteplase））または新たな薬物の組み合わせ（すなわち、線維素溶解剤を半分の用量に減らし、GP IIb/IIIa血小板受容体ブロッカーを加える）（Brouwer MA et al., Heart, 2004; 90:581-588）の有効性を改善することを可能にする新たな処置戦略を開発することが望まれる。また、出血性合併症；特に、2％-14％の発生率を有する中枢神経系の出血および大出血のために、線維素溶解処置に関連してかなりの死亡率が生じる。
【００１２】
急性脳血管虚血の場合、症状の発症後のはじめの３時間以内に組換えtPAにより血栓溶解処置を行うことは、それ自体は多少効果的であることが示されている唯一のスキームである。残念なことに、その場合の25％-30％は、処置は失敗に終わり、血餅は溶解せず、ブロックされた動脈は透過できるようにはならない。さらに、tPAによる処置には、高確率にて出血性合併症が伴い（5％までが症候性出血を伴う）、多くの医師はこの合併症を恐れている。この理由のために、この処置から利益を得る可能性のある大多数の患者は、その処置を受けることはない。tPAの投与に関連する、大量出血の危険性よりも潜在的に深刻な別の問題は、中枢神経系に対する毒性であり、治療の失敗の原因となることが多くある（Cheng T. et al., Nat. Med., 2006; 12:1278-1285）。それ故に、tPAの投与による大量出血の危険性を減じることは、この薬物の安全性の認知を変え、その使用を増加させ得る。それ故に、卒中の処置に必要な用量を低減することにより、直接または間接的にtPAの毒性を減少させることを可能にするであろう治療剤および組み合わせを選択する必要性は未だ持続している。
【００１３】
フィブリノゲンおよびフィブリンを直接分解することができる、プラスミンとは異なる酵素が存在することから、血栓溶解処置のためのそれらの可能性ある使用の研究も行われている。これらの酵素には、白血球に内在するプロテアーゼ（エラスターゼおよびカテプシンG）、ヘビ毒またはヒルのプロテアーゼまたは一部の細菌からのプロテアーゼなどがある。
【００１４】
欧州特許出願公開第1060747号明細書に、線維素溶解マトリックスメタロプロテイナーゼの使用が記載されており、フィブリンおよびフィブリノゲンのタンパク質分解的な切断、分解において有意な活性を示している。これらの線維素溶解メタロプロテイナーゼは、MMP-2（ゼラチナーゼA）、MMP-3（ストロメライシン1）、MMP-7（マトリライシン）、MMP-9および特に膜型マトリックスメタロプロテイナーゼMMP-MT1を含む。数ヶ月後、Biniらは、これらの同じ発見を集め、さらに詳述した（Biochemistry, 1999; 38: 13928-13936）。しかしながら、これらの研究においても後の他の研究においても、血栓を形成するフィブリンの溶解および分解における、より素早い血餅溶解の達成についての、またはむしろ全身的なフィブリノゲンのうち血餅中のフィブリンの分解に対して、より高い選択性を提供することについての、これらの線維素溶解剤すなわちマトリックスメタロプロテイナーゼの有効性に関するデータは提供されていない。
【００１５】
本発明の目的は、フィブリンの選択的分解による血餅の溶解を支持するであろう、そして他の血栓溶解処置に関連する有害作用（出血、毒性など）を最小化するのに役立つであろう、血栓溶解処置のための新たな治療組成物および組み合わせを提供することである。
【発明の概要】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、まず第一に、血栓溶解治療および処置のための医薬の調製におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ-10（MMP-10）の使用または利用化に関する。
【００１７】
MMP-10またはストロメライシン-2は、第11染色体に位置し、種々の細胞型、例えば、内皮細胞、単球および線維芽細胞により発現される（Madlener M and Werner S; Gene, 1997; 202:75-81）。MMP-10は、プラスミン、カリクレイン、トリプターゼ、エラスターゼおよびカテプシンGにより活性化できること、および細胞外マトリックス、例えば、アグリカン、エラスチン、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニン、テネイシンC、ビトロネクチンおよびII型、III型、IV型、IX型、X型およびXI型コラーゲンの広範な基質を分解できることが知られている。さらに、MMP-10は、他のマトリックスメタロプロテイナーゼ、例えば、プロMMP-1、-3、-7、-8および-9を活性化できる（Nakamura H et al., Eur. J. Biochem., 1998; 253: 67-75）。
【００１８】
同様に、MMP-10は種々の生理学的過程、例えば、骨成長または創傷治癒に関与することが知られている。MMP-10は、糖尿病性網膜症を有する患者の角膜において過剰発現していることも発見され、いくつかのタイプの細胞腫ならびにリンパ系腫瘍に関連していた。様々なイン・ビトロ研究において、ケラチノサイト培養物において、MMP-10の発現は、両方の増殖因子（ケラチノサイトの上皮増殖因子またはTGFベータ）により、ならびに炎症促進性サイトカイン（TNFアルファ、IL-1ベータ）により誘導することができることが示されている（Rechardt O et al., J. Invest. Dermatol., 2000; 115:778-787；Li de Q et al.; Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003; 44: 2928-2936）。
【００１９】
本発明より前の刊行物においても、MMP-10は：
−血管リスクの炎症性のバイオマーカーであり得る（Montero I et al.; J. Am. Coll. Cardiol., 2006; 47:1369-1378）（Orbe J et al.; J. Thromb. Haemost.; 2007; 5: 91-97）；
−3Dコラーゲン基質において毛細血管を形成している内皮細胞において誘導され、MMP-1の活性化による毛細血管の形成の退行に関与する（Saunders WB et al.; J. Cell. Sci., 2005; 118: 2325-2340）；および
−血管新生および再構築過程において血管の完全性を保つ細胞内結合を維持する基礎的な役割を有する（Chang S et al.; Cell, 2006; 126:321-334）
ことが記載されている。
【００２０】
本発明において、MMP-10およびMMP-3の、ヒト血漿における血餅の形成および溶解ならびに重合化したフィブリンの分解の他のイン・ビトロモデルに対する効果を試験した。
【００２１】
本発明者らは、MMP-10は直接的な血栓溶解活性を何も有さないこと、およびフィブリノゲンまたはフィブリンを単独で分解することができないことを証明することができた。驚いたことに、本発明者らは、血栓溶解活性化剤、特にプラスミノーゲンアクチベーターの存在下において、MMP-10は、フィブリン血餅の溶解を支持し、溶解時間を短縮することも証明した。それ故に、MMP-10は他の血栓溶解アクチベーターの血栓溶解作用の促進剤またはアジュバントの役目をする。
【００２２】
反対に、フィブリンおよびフィブリノゲンに対して直接的なタンパク質分解活性を有する線維素溶解マトリックスメタロプロテイナーゼ、例えばMMP-3は、血栓溶解アクチベーター単独により得られる血餅溶解時間を短縮しない。
【００２３】
本発明の文脈において、「血栓溶解治療」は、血栓の起源の虚血の臨床的症状において、循環を遮断し、器官の機能を危険にさらしている血餅の溶解（lysis）または素早い溶解（dissolving）により、血流の再開または回復を行おうとする治療であると理解される。これらの臨床的症状には、特に、急性心筋梗塞、脳血栓症（特に急性脳梗塞または卒中）、ならびに他の静脈血栓塞栓症（すなわち肺塞栓症または深部静脈血栓症）および末梢動脈血栓症における血栓溶解治療が含まれる。
【００２４】
本発明は、より具体的には、同時投与、別個の投与または連続投与による血栓溶解治療および処置のための医薬または医薬組成物の調製におけるMMP-10およびプラスミノーゲンアクチベーターの使用または利用に関する。
【００２５】
本発明の文脈において、プラスミノーゲンアクチベーターは、プラスミノーゲンのArg560とVal1561の間のペプチド結合の切断による、不活性なプラスミノーゲンのプラスミンへの転換を活性化する化合物である。特に、これらのプラスミノーゲンアクチベーターには以下が含まれる：ウロキナーゼ（uPA）、 組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、ストレプトキナーゼおよびスタフィロキナーゼ。
【００２６】
本発明の特定の一実施態様において、プラスミノーゲンアクチベーターはtPAである。
【００２７】
特定の別の実施態様において、プラスミノーゲンアクチベーターはuPAである。
【００２８】
特定のさらに別の実施態様において、プラスミノーゲンを切断し活性化する能力を保持する、上述のプラスミノーゲンアクチベーターの誘導体またはフラグメントは、MMP-10の促進効果が有効なプラスミノーゲンアクチベーターとして用いることができる。当分野の専門家であればこの効果を、例えばイン・ビトロ血餅形成および溶解試験、例えば本発明の実施例1〜4に記載されている試験によって、彼自身により容易に確認することができる。LongstaffとThelwell（FEBS Letters, 2005; 579: 3303-3309）は、現在用いられている、または開発中であるいくつかのプラスミノーゲンアクチベーターのレビューをまとめており、専門家であれば、その中から本発明によってMMP-10と組合せて用いるためのアクチベーターを選択できる。
【００２９】
有利なことに、MMP-10は、循環しているフィブリノゲン／フィブリンと相互作用せずに、プラスミノーゲンアクチベーターの作用を促進することができるために、高い発生率の大量出血に関連する合併症を引き起こし得る全身的な線維素溶解を誘導しないが、血餅を溶解させる血栓溶解剤の有効性を維持することにより、血栓溶解剤の用量を減少させることを可能にし得る。同様に、MMP-10は、薬物、例えばtPAによる血栓溶解処置から生じる毒性を減少させることを可能にし得る。
【００３０】
別の局面によると、本発明はまた、MMP-10およびプラスミノーゲンアクチベーターを、製薬的に許容される賦形剤または媒体と混合して、別個に、または１つの同じ組成物中に含む医薬的組み合わせに関する。その組合せにおいてプラスミノーゲンアクチベーターは、上述のいずれかであり得る。
【００３１】
前述の組み合わせは、哺乳類、特にヒトにおいて、上述のいずれかの臨床的症状における血栓溶解治療および処置に有用である。
【００３２】
医薬的組み合わせ中のMMP-10およびプラスミノーゲンアクチベーターの起源は、本発明の決定的に重要な面ではない。活性成分は、組換え技術または遺伝子工学的手法または他のいずれかの従来技術によって、生体液または組織から抽出および精製することによって得られうる。
【００３３】
それぞれの場合において通例の薬理試験および臨床試験によって決定されるであろう状況に応じて、医薬的組み合わせの活性成分は、同時に、別個に、または連続的に投与することができる。
【００３４】
本発明の一実施態様によると、活性成分（MMP-10およびプラスミノーゲンアクチベーター）は、１つの同じ医薬組成物中に含有させることができる。他の場合において、活性成分は別個の医薬組成物に含有させることができ、それらはそれぞれ、それらのコンテナー内において製薬的に許容される賦形剤または媒体と混合されている。
【００３５】
活性成分を含む医薬組成物は、１つであってもそれ以上であっても、固体形態（すなわち後に適切な溶液中にて再構成するためのバイアル中の凍結乾燥形態）または液体形態の両方にて製剤化することができる。
【００３６】
特定の一実施態様において、これらの活性成分を含む組成物は、血栓溶解治療または処置のためのキットの構成要素であり、キットは他の要素、例えば：活性成分を再構成するための溶液を含むコンテナー、カニューレ、静脈内に適用するための生理学的血清を含む点滴バッグおよび使用説明書などを必要に応じて含み得る。
【００３７】
活性成分を含む医薬組成物は、いずれかの適切な経路により、例えば、経口的に、非経口的に、直腸にまたは局所的に投与し得、そのために所望の投与形態の製剤に必要な製薬的に許容される賦形剤および媒体を含むであろう。
【００３８】
特定の一実施態様において、投与は非経口、例えば静脈内注射によるものであり、または、血餅の近傍にインサイチュ投与するためにカテーテル法により局所的に投与される。
【００３９】
医薬的組み合わせが別個に投与される場合、両方の活性成分を異なる経路による投与に適する医薬組成物に含有させてもよい。
【００４０】
本発明により提供される医薬的組み合わせの組成物中に存在し得るMMP-10およびプラスミノーゲンアクチベーターの量は、広範に変動し得るが、常に治療的に有効な量である。
【００４１】
本発明の医薬的組み合わせの組成物を用いるそれぞれの血栓溶解処置プロトコルにおける用量は、患者の年齢、症状、処置すべき臨床的症状の重症度、投与経路および頻度、およびそれぞれの場合において投与しようとするプラスミノーゲンアクチベーターを含む多くの因子に依拠するであろう。
【００４２】
典型的な一実施態様において、プラスミノーゲンアクチベーターの量および用量は、MMP-10が治療の組合せに含まれない場合に、同じプラスミノーゲンアクチベーターについて用いられ得る量および用量よりも少ないであろう。一方、MMP-10の量は、達成したい効果の観点から調整するであろう：プラスミノーゲンアクチベーターの用量を維持することにより血栓溶解効果をより高くする；または血栓溶解効果を維持しながらプラスミノーゲンアクチベーターの用量を減少させる。
【００４３】
別の態様において、本発明は、血栓溶解治療について上述したような、本発明の医薬的組み合わせまたはキットに関する。
【００４４】
別のさらなる局面において、本発明はまた、治療的有効量のMMP-10を患者に投与することからなる血栓溶解処置および治療の方法に関する。特定の一実施態様において、その方法も、同時の、別個の、または連続的な投与により、プラスミノーゲンアクチベーターを投与することからなる。上述のいずれかの医薬組成物および組み合わせを、この方法に用い得る。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】時間に対する405 nmにおける吸光度値としての再石灰化血漿比濁法試験。実験は数分間にわたる。A：グラフは、血漿単独（対照）の、または、MMP-10（200 nM）またはMMP-3（200 nM）の存在下における血餅形成（最大吸光度）の差異を示す。B：グラフは、tPAプラスミノーゲンアクチベーター（30 U /ml）およびuPA（135 U/ml）のみ、またはMMP-10（200 nM）との組み合わせの存在下における、ならびに等しい用量のMMP-3（200 nM）とtPA（30 U/ml）の組み合わせの存在下における再石灰化血漿のフィブリン血餅の形成および溶解を示す。
【図２】tPA（1 U/ ml）およびMMP-10（200 nM）のそれぞれ単独により生じた、または互いを組合せて加えることにより生じた溶解領域を示す、重合化フィブリンのプレート。
【図３】種々の用量のtPA（20、25および30 U/ml）におけるフィブリン血餅の溶解時間の差異を示す、比濁法試験。MMP-10（200 nM）とtPA（20 U/ml）の組合せは、アクチベーター単独と比較して溶解時間を短縮する。
【図４】ストロメライシンの蛍光性基質を用いるMMP-10（100 nM）活性の試験。MMP-10血漿活性を阻害するモノクローナル抗体（MAb）濃度を、基質形成の勾配における減少により測定した。対照として、IgGアイソタイプの対照抗体を用いた。
【図５】MMP-10の活性を阻害するモノクローナル抗体（MAb）およびアイソタイプ（IgG）対照抗体の存在下または非存在下における、MMP-10（200 nM）により再石灰化された血漿の比濁法試験。
【図６】MMP-10の活性を阻害するモノクローナル抗体（MAb）およびアイソタイプ対照抗体（IgG）の存在下または非存在下における、tPA（1 U/ml）およびMMP-10（200 nM）により生じた溶解領域の差異を示す、フィブリンプレート。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下の実施例は本発明を例証するものであり、本発明の範囲を限定するものと考えてはならない。
【００４７】
実施例
実施例は、MMP-10およびMMP-3マトリックスメタロプロテイナーゼの線維素溶解および血栓溶解活性に対する直接の効果、またはいくつかのプラスミノーゲンアクチベーター：ウロキナーゼ（uPA）および組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）と組み合わせた効果を例証する。
【００４８】
実施例において以下を用いた：
−組換えMMP-10：58 kDa酵素と20％-30％の成熟48 kDa酵素として得（R＆D Systems、910-MP、Abingdon、UK）、TCNB緩衝液（50 mMトリス-HCl、pH 7.5、10 nM CaCl2、150mM NaCl、0.05％ Brij35）により再構成した。
−組換えMMP-3：52 kDa酵素として得（R＆D Systems、513-MP、Abingdon、UK）、12.5 nMトリス、5 nM CaCl2、0.025％ Brij35および50％グリセリンを含む溶液に供した。
−ウロキナーゼ（uPA)（Vedim Pharma SA；628602、Barcelona、Spain）。
−組換えプラスミノーゲン組織アクチベーター（tPA）（Boerhinger Ingelheim；985937 Actilyse（登録商標）、Ingelheim、Germany）。
【００４９】
血栓溶解活性を評価するために、比濁法を用いて、von dern Borneらにより先に報告されたプロトコルに従って（Blood, 1995; 86:3035-3042）、血漿サンプル上のフィブリン血餅の形成および溶解をモニターした。
【００５０】
一方、フィブリン溶解に対する活性を評価するために、Edwardにより報告された手順に従って（J. Clin. Path., 1972; 25: 335-337）、フィブリンプレート上にて試験を行った。
【００５１】
実施例1：MMP-10およびMMP-3の血餅形成および溶解に対する効果
上述のように、von darn Borneらにより報告された手順によって、MMP-10およびMMP-3の止血系に対する効果の評価を行った。この方法において、血餅の形成および溶解過程における濁度／吸光度の変化を、これらの両方の過程の長さの指標として評価した。測光リーダー（本発明者らの場合、ELISAリーダー（Fluostar Optima、BMG Labtech）であった）を用いて、血餅形成および溶解過程における405 nmにおける吸光度を読み取ることによって濁度を測定した。濁度／吸光度の増加はフィブリン血餅の形成を示し、このパラメーターの減少は血餅の溶解を示す。
【００５２】
血餅の形成のために、クエン酸血漿75μl、HEPES緩衝液（25 mM HEPES、137 mM NaCl、3.5 mM KCl、6 mM CaCl2、1.2 mM MgCl2および0.1％BSA、pH 7.5）75μlおよび150 mM CaCl2 10μl をマイクロプレートのウェル中に混合した。プレートを37℃にインキュベートし、405 nMにおける吸光度を30秒毎に2時間測定した。
【００５３】
MMP-10の血餅形成に対する効果を調べるために、活性化MMP-10（50、100および200 nM）を血漿およびHEPES緩衝液の冒頭の混合物に加えた。MMP-10は実験に用いる前に、37℃にて1時間加熱処理して活性化した。
【００５４】
並行して行った試験において、MMP-3（200 nM）によっても血餅形成に対する効果を分析した。この場合、MMP-3は予め、1 mM p-アミノフェニル水銀アセタート（APMA、164610、EMD Biosciences、La Jolla、USA）により37℃にて24時間活性化させた。
【００５５】
図1Aに示すように、MMP-10は、用いたいずれの用量によっても、血餅形成の速度または到達した最大の濁度に、何ら変化をもたらさなかった（表1）。しかしながら、MMP-3は、おそらくフィブリノゲンに対する直接的なタンパク質分解作用のために、形成された血餅の最大吸光度／濁度において50％の減少を誘導した。
【００５６】
これらの結果は、MMP-10は、MMP-3についての記載とは異なり、フィブリノゲンに関して線維素溶解活性を何ら示さないために、血餅形成速度を変化させないことを示している。
【００５７】
その後、フィブリン血餅溶解速度の研究を行った。この目的のために、上述のすぐ前の部分におけるように、HEPES緩衝液中の再石灰化血漿を用い、この緩衝液に、比濁法の始めに、30 U/mlの組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）または135 U/mlウロキナーゼ（uPA）を選択するために、MMP-10（またはMMP-3、その場合がある時）と同時にプラスミノーゲンアクチベーターを加えた。
【００５８】
用いるべきtPAおよびuPAの濃度は先に用量反応実験において決定し、ここで選択した用量は２時間（2h）の期間内にフィブリン血餅を完全に溶解させる用量であった。
【００５９】
図1Bおよび表1に示すように、tPAおよびuPAの非存在下におけるMMP-10はフィブリン血餅の溶解を引き起こさず、tPAまたはuPAアクチベーターの存在下においては、フィブリン血餅溶解速度の有意な増加を誘導した。試験したMMP-10の最大用量（200 nM）において、tPAの存在下において溶解時間（半分の血餅が溶解する時間）の短縮は15分であった（68.3分に対して52.9分、p＜0.01）。uPAの存在下においては5分の短縮であった（47.5分に対して42分、p＜0.05）。この溶解時間の減少は、tPAの存在下においては20％の短縮を、uPAの存在下においては10％の短縮を意味する。
【００６０】
対照的に、MMP-3はtPAの存在下において血餅溶解速度を変化させなかった。
【００６１】
これらの知見は、MMP-10は、MMP-3とは異なり、フィブリンを消化することはできないが、プラスミノーゲンアクチベーター（tPAまたはuPA）の線維素溶解効果を高めることを示す。MMP-10は内因性の線維素溶解に対して作用する能力は有さないため、出血の開始を防ぎ得または減弱し得、このことがMMP-10を血栓溶解治療の補助剤（coadjuvant）として用いるための良好な候補物質にしている。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
実施例2：MMP-10のフィブリン分解に対する効果
上述のEdwardの手順に従って、重合化したフィブリンプレート上に生じるハローまたは溶解領域を測定することによりフィブリン溶解に対する効果を調べた。
【００６４】
フィブリンプレートは、ベロナール緩衝液（BioWhittaker、12-624E、Cambrex、MD、USA）中6 mg/mlヒトフィブリノゲン溶液（Sigma、F3879、Saint Louis、MO、USA）から37℃にて、濾過し、等量のCaCl2（50 mM）を加えて調製する。この溶液（6 ml）を1国際単位（NIH単位）のトロンビン（Enzyme Research Lab；HT1200a、Swansea、UK）と混合し、6時間重合させる。
【００６５】
線維素溶解能を評価するために、tPA（1 U/ml）、MMP-10（200 nM）またはそれら２つの組合せを異なるフィブリンプレートに加えた。
【００６６】
図2に示すように、MMP-10単独では重合化したフィブリン上に溶解は生じなかったが、tPAでは著しいハローが生じた。しかし、tPAとMMP-10の組合せは、重合化したフィブリンの溶解領域を顕著に増大させた（188.6％）。これは、線維素溶解剤としてのプラスミノーゲンアクチベーターと組み合わせたMMP-10が有する線維素溶解促進効果を確証する事実である。
【００６７】
実施例3：MMP-10と血栓溶解剤（tPAまたはuPA）の同時投与の血餅溶解に対する効果
tPAを含む溶解に対するMMP-10の効果から、tPA（出血および神経学的毒性に関連する問題を伴う）の用量を減少させることができるかどうか、および同じ血栓溶解効果を達成するために補助剤としてMMP-10を用いることができるかどうかを解明する課題が持ち上がった。
【００６８】
上記の実施例1に記載の手順に従って行った比濁法試験において、tPAと組合せてMMP-10（200 nM）が存在すると、同じ血餅溶解時間を達成しつつtPAの用量を33％（30から20 U/mlへ）減少させられることを見出した（図3、表1）。
【００６９】
この結果は、血栓溶解治療を必要とする対象において、MMP-10は、同時にtPAの用量を低減し、それ故に、この薬物により生じる出血の問題および毒性に関連する問題を最小化することにより、線維素溶解および血餅溶解を増大させる方法を提供することを示している。
【００７０】
実施例4： tPAと抗MMP-10抗体により誘導された線維素溶解および血餅溶解の阻害
実施例1および2の結果に照らして、MMP-10の活性を阻害するモノクローナル抗体（R＆D systems、MAB9101、Abingdon、UK）またはその抗体と同じ濃度のIgG2Bネズミアイソタイプ対照抗体（eBioscience、16-4732、San Diego、CA、USA）の存在下（1：2の比率）または非存在下において、tPAと同時に種々の用量の活性なMMP-10を加えることにより誘導された、血餅中のフィブリン溶解に対するMMP-10の効果の特異性を分析した。
【００７１】
抗MMP-10抗体（R＆D Systems、Clon110343）により被覆されたマイクロディッシュ上のMMP-10についての活性試験において、ストロメライシンの蛍光発生基質（MCA-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys-[DNP]-NH2）（R＆D Systems；ES002、Abingdon、UK）（Lombard et al.; Biochimie, 2005; 87:265-272）を用いて、酵素の活性をブロックする酵素：抗体比率を予め分析した。蛍光（320 nm励起および405 nM発光）を分光蛍光光度計上において（SpectraMAX GeminiXS、Molecular Devices、CA、USA）1時間測定し、1：2の比率によりその濃度の活性な酵素が完全に阻害されることを見出した（図4）。
【００７２】
結果は、抗MMP-10抗体の存在下において線維素溶解に対する補助効果が逆戻りすることから、その効果はMMP-10に特異的であることを示す。その抗体を加えて血漿MMP-10の内因性の活性をブロックする際のこの効果はかなり顕著である（図5）。結果から、血漿中にMMP-10が存在しないと、tPAまたはuPAの存在下であってもフィブリン血餅の溶解が妨げられることは明らかである（表1）。
【００７３】
これらの結果は、重合化フィブリンプレート試験において実証された。図6に示すように、抗MMP-10 抗体の存在下において、tPA：MMP-10の組合せにより生じた溶解領域は減少するが（188.6％に対して91.2％）、対照抗体では効果がない（184.6％）。このデータから、MMP-10を阻害する抗体を用いると、フィブリン血餅の薬理学的な溶解が阻止されることが確認される。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図６】
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【国際調査報告】
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