(57)【要約】本発明は、繊維状食用構造物を調製する方法に関する。特に、この方法は、架橋と一緒の整列化技術を用いる。さらに、食物組成物中において又は食物組成物として用いられうる、ゆるく且つ構造化された繊維構造物が記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
食用タンパク質懸濁物を、単純せん断流動及びせん断の間に酵素的架橋に付すことを含む、階層的な繊維状食物構造物を調製する方法。
【請求項２】
該食用タンパク質が、カゼイン、油脂性種子由来の（脱風味した）大豆及び他の植物性タンパク質、一般の植物性タンパク質、ホエータンパク質濃厚物、ホエー透過液、乳タンパク質、ポテトタンパク質及び／又はオボアルブミンである、又はそれらに基づく、請求項１の方法。
【請求項３】
該食用タンパク質がカゼインに基づく、及び好ましくはカルシウムカゼイネートである、請求項１又は請求項２の方法。
【請求項４】
該酵素的架橋が、トランスグルタミナーゼを用いて実施される、請求項３の方法。
【請求項５】
脂肪が、好ましくは最大で３０重量％の量で、より好ましくは最大で２０重量％の量で、該懸濁物中に存在する、請求項１〜４のいずれか１項の方法。
【請求項６】
多糖、好ましくはキサンタン、カラギーナン、ガラクトマンナン、グアーガム、タラガム、キャロブビーンガム、アラビアガム、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロールを含むセルロース、並びに加工デンプンを含むデンプンからなる群から選ばれる多糖を該懸濁物に添加することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項の方法。
【請求項７】
該懸濁物が、０．１〜１０重量％、好ましくは０．１〜４重量％の、乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及び、カルシウム結合の為の同程度の親和性を有する他の塩から選ばれる塩をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項の方法。
【請求項８】
該塩が、安息香酸ナトリウム、Ｄ−乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、及びポリリン酸三ナトリウムからなる群から選ばれる、請求項７の方法。
【請求項９】
ミクロスケール及びマクロスケールでの異方性を有する、繊維状の階層的食用タンパク質構造物。
【請求項１０】
ミクロスケールでの異方性繊維形態を有するゆるい繊維状粒子。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項の方法により得られる、請求項９又は１０の繊維状構造物。
【請求項１２】
トランスグルタミナーゼにより架橋されたカゼイネートに基づく、請求項９〜１１のいずれか１項の繊維状構造物。
【請求項１３】
少なくとも６、好ましくは少なくとも７、及び最も好ましくは少なくとも８の降伏応力比σ平行／σ垂直を有する、請求項９〜１２のいずれか１項の繊維状構造物。
【請求項１４】
食物の製造において、請求項９〜１３のいずれか１項の構造物を使用する方法。
【請求項１５】
該階層的構造物が、肉又は魚様構造物を形成する為に用いられる、請求項１４の方法。
【請求項１６】
該ゆるい繊維状粒子が、該食物の粘性及び／又はチクソトロピー性及び／又は流動挙動を調節する為に用いられる、請求項１４又は１５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繊維状材料に関し、及び特には、繊維状食物材料、その製造方法、及び該繊維状材料の使用方法に関する。重要な局面において、本発明は、代替的タンパク質源由来の肉又は魚代用製品を提供することを目的とする。他の局面において、ゆるい繊維状粒子が、適用の種々の用途を有する成分として用いられる。
【背景技術】
【０００２】
過去２０年間、繊維状食物テクスチャーの形成は、産業から並びに食物科学者から大きな関心を受けてきた。特に重要な挑戦は、肉製品を、代替的タンパク源由来の製品により置き換えることであった。一般的に、これは、非肉タンパク質に基づく材料により、肉様の構造的及び感覚的特性を形成することを示唆する；すなわち、非肉タンパク質に基づく源から出発し、種々の長さスケールで及び種々の濃度処方計画での異方性構造物が目的とされた。
【０００３】
繊維状タンパク質材料について実施された該研究は、おおまかに、フィブリルへのタンパク質の自己会合及び繊維状組織（texture）へのタンパク質の強制的会合へと分けられうる。
【０００４】
種々のタンパク質、例えばβ−ラクトグロブリン、オボアルブミン及びウシ血清アルブミンタンパク質などの繊維の自己会合は、厳格なｐＨ及び温度条件下で、希釈された及び半希釈された処方計画において達成された（例えば、Veerman et al., J. Rheol. 49(2) (2005) 355-368を参照されたい）。製造された該繊維は、ｎｍの太さ及びμｍの長さのオーダーであった。
【０００５】
自己会合の特別な場合が、κ−カゼインのアミロイド繊維形成について報告された（Thorn et al., Biochemistry 44(51) (2005) 17027）。
【０００６】
自己会合とは対照的に、より濃くされた処方計画におけるタンパク質溶液（＞１０％ｗ／ｗタンパク質）の強制的会合が、押出又は紡績技術を用いて伝統的に試みられてきたが、他の技術も記載された。
【０００７】
押出調理は、種々の源、例えば大豆粉、コムギ及び乳タンパク質などからのタンパク質を組織化するために用いられてきた。タンパク質の可塑化、融解及び崩壊は押出機バレルにおいて起こり、そして、繊維状きめ（texture）が、長い冷却ダイス中においてタンパク質の整列化に起因して形成されうる。この点において、例えばAguilera & Stanley, Food Rev. Int. 9(4) (1993) 527-550及びCheftel et al., Food Rev. Int. 8(2) (1992) 235-275を参照されたい。
【０００８】
これらの実施態様において、引っ張りに対する縦方向及び横方向の抵抗の比の値は、Thiebaudら（Food Science And Technology-lebensmittel-Wissenschaft & Technologie 29(5-6) (1996) 526-535）に従い、繊維品質の指標となる。引張りに対する縦方向及び横方向の抵抗の典型的な比の値は、バレル温度及びｐＨに依存して、脱脂大豆粉由来の繊維状押出物について１〜５（前記のCheftel et al.,）；及び切断により測定されたときに脱脂大豆粉及び豚肉の押出物について１〜２（Liu et al., Food Sc. Techn. Int. 11(6) (2005) 463-470）である。
【０００９】
２つの前の段落において言及された研究は、動物及び植物の源の混合が許容可能な程度の繊維質を得るために必要とされることを示す。
【００１０】
Tolstoguzov（J.A.O.C.S., 70(4) (1993) 417-424において）は、押出の間に異方性構造物を形成する為に、非相容性のバイオポリマーが要求されることを強調した。
【００１１】
米国特許出願公開第４，１１８，５２０号明細書において、カゼイン及び少なくとも１つの熱硬化性タンパク質を含むタンパク質繊維が、カルシウムイオン及びホスフェートイオンを含む水性タンパク質混合物の、該タンパク質混合物のゲル化点より低い温度での乾式紡糸、及び続く該得られた繊維の乾燥により、調製される。
【００１２】
米国特許出願公開第２，８３０，９０２号明細書及びその一部継続出願第２，８７９，１６３号明細書は、タンパク質に富む原料の懸濁物が熱の影響下で凝固されてタンパク質ゲルを形成し、このゲルが、マカロニ押出機を用いた押出により成形されることを記載する。
【００１３】
一般に、押出技術は多くの欠点を有する。例えばタンパク質変性の為の高温の使用は制御できない化学反応を誘発する；及び、押出の間の高いせん断力の使用は、分子のレベルでさえの（Van den Einde et al., Polymer Degradation And Stability, 85(1) (2004) 589-594、を参照されたい）、構造的要素の破壊をもたらしうる（例えば、Peighambardoust et al., J. Cereal Sc. 43 (2006) 183-197を参照されたい）。さらに、多くの他の混合又は混練装置におけるように押出機では、物理的及び／又は化学的処理についての種々の効果が、該装置内の位置に依存して得られる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
よく定義された繊維状製品を得る為に、構造的要素における破壊と組織誘発との間の微妙な相互作用があるべきことが明白である。本発明は、よく定義された繊維状製品を得ることを許す方法を提供することを目的とする。
【００１５】
さらに、押出調理により調製された製品は一般的に、１００℃超の温度で加熱される。そのような製品は加熱されることができるが、焼き及び揚げのような技術（これは魚及び肉によっても得られる効果に至るだろう）を用いてキッチンで処理されることができない。
【００１６】
本明細書上記で言及された他の技術、すなわちバイオポリマーの紡糸は、紡糸口金における及び凝固の間のせん断及び延伸的な流動に起因した、マクロ分子の整列化に基づく（例えば、Gallant et al., Food Microstructure 3 (1984) 175-183）。典型的には、得られた繊維（約１００μｍ）は、酸及び塩溶液を含む浴中で凝固され、その後洗浄される。親水コロイド、例えばカラギーナン（Downey & Burgess, J. Food Techn.  14(1) (1979) 21-31; Downey & Burgess, J. Food Techn. 14(1) (1979) 33-40)及びアルギネート（Antonov et al., Die Nahrung 29(1) (1985) 39; Suchkov et al., Nahrung-Food 24(9) (1980) 893-897）、又は植物タンパク質、例えば大豆（Suchkov et al., Nahrung-Food 32(7)(1988) 669-678）又はソラマメ（field bean）タンパク質（Suchkov et  al., Nahrung-Food 32(7)(1988) 679-689）が、製造されたカゼインベースの繊維の水中における溶解度を減少するために、二相混合においてカゼインとの組合せで用いられた。
【００１７】
米国特許出願公開第２，６８２，４６６号明細書は、湿式紡糸方法により作られる食用タンパク質繊維を記載する。タンパク質に富む未加工の原料が、アルカリ溶媒中に溶解され、そして次に、酸性塩浴へ細いジェットの形で押出され、該浴中で該繊維が凝固する。
【００１８】
この紡糸方法の不利点は、該凝固及び洗浄浴からの大量の水廃棄流を残すことである。さらに、低いｐＨ及び高い塩濃度の必要、並びに該繊維の凝固の為の化学的添加物の必要が、消費のために適当な繊維の製造の為の方法及び装置の設計を複雑な問題にする。さらに、もし実行可能だとしても、繊維状構造物への紡糸を通じて得られた繊維の組合せは複雑である。
【００１９】
蘭国特許出願第１０１９８１６号明細書において製品が調製され、該製品は肉及び魚を置換することを目的とし、及び焼かれることができる。これらの製品はカード（curd）から調製され、これはアルギネート及び／又はホスフェートと水中で混合され、塩溶液中で該混合物は乳化され及びその後激しく攪拌される。その後、該得られた繊維状製品は洗浄され、及び追加的に該水が除去される。該記載された方法は、前記の紡糸方法と同様の不利点を有する。
【００２０】
国際公開第２００５／００４６２４号パンフレット及び国際公開第２００５／００４６２５号パンフレットにおいても、タンパク質（夫々、乳及び植物タンパク質）と、少なくとも＋２の価を有する金属イオンとの接触に付されたときに沈殿する親水コロイドとの混合物が、そのような金属イオンを含む溶液との接触に付されて、食物製品を含む成形された繊維を形成する。
【００２１】
２つの前の段落の方法において得られた製品は、ゲル化親水コロイドに基づく構造を得る。
【００２２】
さらに、背景技術は、種々の用途のためのタンパク質製品を得る為の、タンパク質のトランスグルタミナーゼによる架橋を含むが、肉又は魚置換の為の繊維状テクスチャーは含まない。トランスグルタミナーゼを用いてタンパク質を部分的に架橋する方法に関する欧州特許出願公開第１  ０８５  ０２３号明細書が言及される。その目的は、増粘剤又は結合剤としての、食材において有用な架橋されたタンパク質を提供することである。該材料は、連続的に攪拌される反応器又は固定床反応器から得られ、後者が好ましい。ペースト食品及び乳化食品において有用な乳清タンパク質含有粉に関する欧州特許出願公開第０  ８２１  ８８１号明細書も言及される。該乳清タンパク質はトランスグルタミナーゼにより溶液中で反応される。
【００２３】
他の背景技術は、タンパク質微小繊維構造物を包含し、例えば欧州特許出願公開第０  ３４０  ０３５号明細書などである。ここにおいて記載された方法は、微小繊維を得る為に、キサンタン／タンパク質複合繊維を挽くこと及び高いせん断に該挽かれた繊維を付すことを含む。該得られた製品は、例えば肉成分に基づき、食材で用いられうる。それは、それ自体では、肉又は魚置換構造を有さない。
【００２４】
欧州特許出願公開第０  ４２０  １６５号明細書は、根本的に異なるタイプの肉又は魚置換、すなわち粉砕された肉又は魚タンパク質に基づき、該タンパク質を筋肉様構造へと再構築する方法を含む、を言及する。このタイプの置換は、非肉タンパク質源を使用することが望まれるところでは、明らかに適当でない。さらに、球状タンパク質及びカゼイン以外の、本明細書において用いられる最初の肉タンパク質は、それ自体が繊維状タンパク質である。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明の目的は、繊維状食物構造及びテクスチュアを調製する方法を提供することであり、ここで本明細書上記において述べられた問題が解決された。
【００２６】
肉及び魚と同様の外見及び挙動を有する製品、特にはやわらかい固形製品を調製することが本発明の更なる目的である。特に、階層的繊維状構造を含む組成物が望ましい。
【００２７】
この点では、階層的構造物は、組織のさらにより高い水準の構造物が、所望の特性及び機能が達成されるまで、該分子からマクロスケールへと次第にまとめられることを含意する。J.M. Aguilera, S.W. Stanley, (1999), Microstructural principles of food processing and engineering, 2nd ed, Aspen Publishing, Inc, Gaithersburg, Maryland, (ISBN 0-8342-1256-0), page 186-187：から採用された。
【００２８】
本明細書において定義されるとおり、やわらかい固形食物製品は、低い弾性係数又は小さい降伏応力のいずれかに起因して、応力を適用した際に弾性変形（弾性変形：Ｇ’＞Ｇ’’）を主として示し、及び実質的な変形を得る為に比較的小さい応力が必要とされる食物製品である。やわらかい固形食物製品についてのさらなる詳細は：P. Walstra (2003) Physical Chemistry of Foods; Chapter 17: Soft-solids; Marcel Dekker, New York、に記載されており、その章は、やわらかい固形食物製品のさらなる説明のために本詳細な説明に、引用することにより組み込まれる。
【００２９】
肉及び魚と類似の外見及び／又は挙動は、好ましくは、揚げ及びいためを含む調理の間の処理の能力及び消費の両方に関係する。特には、本発明の構造物は、加熱の間に短くなるであろう。これは、鶏肉において起こるものと類似の挙動を与える。
【００３０】
さらに、味及び香りの化合物、例えばハーブ及び調味料化合物など、にとって良い吸収及び吸着特性を有する繊維状食物材料を提供することが望ましい。
【００３１】
本発明の他の目的は、実施例を含む本詳細な説明の残りを読んだ後に現れるであろう。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の目的は、濃厚なタンパク質における及び最も好ましくは濃厚なカルシウムカゼイネート（calcium  caseinate）組成物における異方性繊維状構造を誘発するための、凝固浴の必要が無く及び高い温度又は高いせん断力を適用する必要が無く、単純せん断流動及び同時の酵素的架橋の適用に基づく技術の使用により満たされる。さらに、洗浄工程の数が非常に減少されることができ、及びしばしば、洗浄工程は全く要求されない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１ａ】シアーセル（shear  cell）装置を示す図である。
【図１ｂ】該シアーセル装置のせん断領域の概略図である。該シアーセルは、レオメーターコンセプト及びパイロットスケールシアーセルに基づく。円錐角＝１００°；円錐及び平板の間の角度（せん断領域）＝２．５°；Ｒ平板＝０．０８５０８ｍ；Ｒ平板、投影された＝０．０６７５０ｍ；Ｒ円錐＝０．０７６３８ｍ；Ｒ円錐、投影された＝０．０５８５１ｍ。静止円錐と回転平板が水により加熱／冷却された。
【図２Ａ】引張試験後のせん断され且つ架橋された３０％Ｃａ−カゼイネートの写真を示す図である。
【図２Ｂ】塩水中での１日間の同じ試料の懸濁後のはっきりとした繊維を示す図である。該測定の間の伸長後に視認できるようになった繊維に注目されたい。脱塩水中での１日間の同じ試料の懸濁後、はっきりとした繊維が見られた。
【図３】５０℃及び５０ｒｐｍで３５分間せん断された３０％Ｃａ−カゼイネート及びＴＧＡ（Ｅ：Ｐ＝１：２０）の、該シアーセル装置中でかけられた該せん断流動に対して平行（左欄；速度勾配−せん断流動平面）及び垂直（右欄；速度勾配−渦度面）な破壊された表面のＳＥＭ画像を示す（Ｃ＋ＴＧ−せん断）図である。Ａ３及びＢ３中のスケールバーは１μｍを示す。
【図４】５０℃及び５０ｒｐｍで３５分間せん断された３０％Ｃａ−カゼイネートの、該シアーセル装置中でかけられた該せん断流動に対して平行（左欄；速度勾配−せん断流動平面）及び垂直（右欄；速度勾配−渦度面）な破壊された表面のＳＥＭ画像を示す（Ｃ−せん断）図である。
【図５】５０℃で静止条件下でＴＧＡ（Ｅ：Ｐ＝１：２０）により架橋された３０％Ｃａ−カゼイネートの該シアーセル装置中でかけられた該せん断流動に対して平行（左欄；速度勾配−せん断流動平面）及び垂直（右欄；速度勾配−渦度面）な破壊された表面のＳＥＭ画像を示す（Ｃ＋ＴＧ−静止）図である。
【図６】５０℃及び５０ｒｐｍで３５分間、ミキサー中で混合された、３０％Ｃａ−カゼイネート及びＴＧＡ（Ｅ：Ｐ＝１：２０）の、仮想の「平行」（左欄）及び「垂直」（右欄）方向における、破壊された表面のＳＥＭ画像を示す（Ｃ＋ＴＧ−混合）図である。
【図７】種々の３０％Ｃａ−カゼイネート構造物の９５％信頼区間による、Ｇ’（Ａ）及びｔａｎδ（Ｂ）のＬＶＥ特性を示す図である。Ｃ＝Ｃａ−カゼイネート；ＴＧ＝ＴＧＡ；（非）せん断＝シアーセル装置中でせん断された（せん断されていない）；混合＝ミキサー中で混合された。
【図８】せん断流動に対して平行及び垂直方向において伸長された、５０℃及び５０ｒｐｍで３５分間せん断された３０％Ｃａ−カゼイネート及びＴＧＡ（Ｅ：Ｐ＝１：２０）の典型的な応力歪み曲線（Ｃ＋ＴＧ−せん断）を示す図である。
【図９】種々の３０％Ｃａ−カゼイネート物質の９５％信頼区間を有する、引張特性、降伏応力σ、降伏歪みε及びヤング係数Ｅを示す図である。Ｃ＝Ｃａ−カゼイネート；ＴＧ＝ＴＧＡ；（非）せん断＝シアーセル装置でせん断された（せん断されていない）；混合＝ミキサー中での混合。
【図１０】濃いＣａ−カゼイネート中におけるせん断により及び酵素により誘発された異方性の模式的外観を示す：Ｃａ−カゼイネート（Ａ）のせん断後に観察された層状構造及びＴＧＡの存在下でのＣａ−カゼイネートのせん断後に観察された繊維状構造を示す図である。
【図１１Ａ】せん断され及び架橋された３０％Ｃａ−カゼイネート、１５％パーム油及びＴＧＡ（１：２０）のマクロ構造物を示す図である。Ａ．１２０ｓ−１での３０分間のせん断後に得られた繊維状マクロ構造物である。
【図１１Ｂ】せん断され及び架橋された３０％Ｃａ−カゼイネート、１５％パーム油及びＴＧＡ（１：２０）のマクロ構造物を示す図である。Ｂ．１２０ｓ−１での６０分間のせん断後に得られた損傷したマクロ構造物である。
【図１２】３０％Ｃａ−カゼイネート及びＴＧＡ（１：２０）（左）並びに２５％Ｃａ−カゼイネート及びＴＧＡ（１：１７）（右）についての、該シアーセル装置におけるせん断の間のトルクに対するせん断時間の効果を示す図である。全ての試料は１５％パーム油を含んだ。アスタリスク（＊）は、せん断後に繊維状でなかった材料を示す。「ＴＧ無し」は、ＴＧＡ無しでの３０％Ｃａ−カゼイネート試料を示す。
【図１３】ＴＧＡ（１：２０）により架橋された３０％Ｃａ−カゼイネート及び１５％パーム油の、該シアーセル中でかけられたせん断流動に対して平行（左欄；速度勾配−せん断流動平面）及び垂直（右欄；速度勾配−渦度面）な破壊された表面のＳＥＭ画像を示す図である。
【図１４Ａ】１２０ｓ−１での種々のせん断時間でのせん断後に得られた、せん断され且つ架橋された２５％及び３０％Ｃａ−カゼイネート並びに１５％パーム油材料（夫々ＴＧＡ１：１７及び１：２０）の選択されたＣＳＬＭ画像を示す図である。架橋されていない３０％Ｃａ−カゼイネート−油物質も同様に示されている該画像は、速度−せん断流動平面からとられる。
【図１４Ｂ】１０×の倍率での少なくとも６の画像を用いた画像分析により決定された、選択されたＣａ−カゼイネート−油試料の油滴直径の平均累積頻度及び変形パラメーターＤを示す図である。
【図１５】３０％Ｃａ−カゼイネート及びＴＧＡ（１：２０）、２５％Ｃａ−カゼイネート及びＴＧＡ（１：１７）並びにＴＧＡ無しの３０％Ｃａ−カゼイネートの９５％信頼区間によるＬＶＥ特性Ｇ’及びｔａｎδについてのせん断時間の効果を示す図である。全ての試料は、１５％パーム油を含んでいた。塗りつぶしていない記号は、せん断後に繊維状でなかった試料を示す。
【図１６】３０％Ｃａ−カゼイネート、１５％パーム油及びＴＧＡ（１：２０）から成る材料の歪み振幅掃引により測定されたときの、歪みγの関数としての線形粘弾（ＬＶＥ）領域におけるＧ’値により正規化されたＧ’値に対する、せん断時間（Ａ．）及びせん断速度（Ｂ．）の効果を示す図である。正規化されたカーブは、複数回測定の平均である。「ＴＧ無し」と示された試料は、ＴＧＡにより架橋されなかった。塗りつぶしていない記号は、せん断後に繊維状でなかった試料を示す。
【図１７】種々のせん断処理後に得られた、２５％及び３０％Ｃａ−カゼイネート、１５％パーム油及びＴＧＡ（夫々１：１７及び１：２０）の、測定されたクリープ曲線（データ点）を示す図である。該線は、６因子Ｂｕｒｇｅｒｓモデルにより適合された曲線を表す。該挿入されたグラフは、非架橋のせん断されたＣａ−カゼイネート−油を示す。非繊維状試料がアスタリスクにより示される。
【図１８】２５％Ｃａ−カゼイネート及びＴＧＡ（１：１７）、３０％Ｃａ−カゼイネート及びＴＧＡ（１：２０）又はＴＧＡ無し（ＴＧ無し）の、９５％信頼区間による、引張特性、降伏応力σ、降伏歪みε及びヤング係数Ｅに対するせん断時間の効果を示す図である。全ての試料は１５％パーム油を含んだ。該引張特性は、該シアーセル装置中でかけられた該せん断流動に対して平行及び垂直に測定された。
【図１９】３０％Ｃａ−カゼイネート及びＴＧＡ（１：２０）についての該シアーセル装置中でのせん断の間の時間の関数としての、トルクに対するせん断速度の効果を示す図である。アスタリスク（＊）は、せん断後に繊維状でなかった材料を示す。
【図２０】３０％Ｃａ−カゼイネートとＴＧＡ（１：２０）あり及びＴＧＡ無し（ＴＧ無し）との９５％信頼区間による引張特性、降伏応力σ、降伏歪みε及びヤング係数Ｅに対するせん断速度の効果を示す図である。全ての試料は１５％パーム油を含んだ。
【図２１】処理時間の関数としての、凝固速度及びせん断速度の比に基づくダイアグラムを示す図である。線ａ、ｂ及びｃは、４つの構造領域への遷移を表す：すなわち、（１）等方性液体物質（Ｉｌ）、（２）繊維状物質（Ｆ）、（３）等方性固体物質（Ｉｓ）及び（４）損傷した「顆粒状」物質（Ｇ）。丸、三角及び四角は、種々の処理条件で得られた３０％Ｃａ−カゼイネート、１５％パーム油及びＴＧＡ（１：２０）に基づく、繊維状、顆粒状及び等方性の物質を夫々表す。
【図２２】せん断され且つ架橋された２０％Ｃａ−カゼイネート及び０．５％キサンタン（トランスグルタミナーゼ  １：２０、５０ｒｐｍ、５０℃で３４分）の写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
第１の局面において、本発明は、階層的繊維状食物構造物の調製の方法であって、食用タンパク質懸濁物を単純せん断流動及び酵素的架橋に付すことを含む上記方法に関する。該酵素的架橋は、単純せん断流動操作と同時に実施される。
【００３５】
本発明の方法は、単純せん断である、特定の種の変形に依存する。語「単純せん断」は、当技術分野でよく知られており、そして、材料平面が１方向にだけ互いに滑り合うことを意味する。これに関して、C.W. Macosko, "Rheology, Principles, Measurements and Applications", VCH Publishers Inc., New York (1994)、特には２７〜２９、４０及び７０〜７５頁が言及される；この参考文献は該「単純せん断」概念を定義する目的のために引用することにより本詳細な説明中に組み込まれる。
【００３６】
上記で同定された先行文献方法の多くは、タンパク質及び多糖の相分離した系であって、一の相における整列化が、他の相により課され又はむしろ保持されるものに関するが、本発明は、タンパク質／水混合物中のタンパク質物質の整列化を包含する。すなわち、整列化及び繊維状構造形成は、本発明に従い、一つの同じ相内で起こる。本発明により得られた構造物は、ゲル化に基づく先行文献方法が行うような別のマトリックス中での固定化を要求しない。
【００３７】
本発明の方法において、タンパク質懸濁物は、単純線形せん断プロファイルに付され、これは例えば平板（plate）及び円錐（cone）の間；円錐及び円錐の間；又はクエットにおいては円錐及び平板反応器中において、確立されうる。適当な装置の例は、図１に描かれており、ここで図１ａは、実験室規模のセル装置の写真を示し、図１ｂは該装置のせん断区域の模式図である。特に、該ポリマーは、図１の実施態様において、平板及び円錐を用いることにより、単純線形せん断プロファイルに付されてよく、ここで角度α平板は例えば約１０５°であり、及びα円錐は例えば１００°である。図１の該シアーセル装置は、約７０ｍｌの容積を有する。回転平板及び固定された円錐は水により加熱される（又は冷却される）。物質の温度は、該円錐内に置かれた熱電対により測定される。該装置は、Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ  Ｄｏ−Ｃｏｒｄｅｒ  ３３０（Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ  ＯＨＧ、デュイスブルグ、ドイツ）に取付けられて、せん断速度制御、並びにトルク及び温度読み取りを可能にする。図１の装置は、Journal of Cereal Science. 42(1) (2005) 59-68においてPeighambardoustらにより記載された装置に基づき、該文献は本発明における使用のために適当な装置のさらなる定義のために、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００３８】
せん断の間に適用される応力は、該タンパク質の破壊をもたらさないべきである。一般的に、該適用される応力は、（該平板の投影された半径に基づき計算される）２５ｋＰａを超えるべきでなく、好ましくは２０ｋＰａを超えるべきでない。
【００３９】
この方法において、該単純せん断流動は、該タンパク質の整列化をもたらし、一方で酵素的架橋は凝固をもたらす。
【００４０】
もちろん、繊維状材料をなお与える、単純せん断流動プロファイル（profile）の小さな変動も、本発明により包含される。
【００４１】
本発明の知識に基づき、「非せん断装置」、すなわちせん断を適用する為に通常は用いられない装置、例えばミキサーなど、における単純せん断プロファイルを実現することが考えられるが、ただし好ましくはない。そのような装置において、実際に単純せん断が起こる処理ドメインが存在する。もしそのようなことが行われるならば、例えば該非せん断装置内の該単純せん断ドメインに付された該材料のそれらのタンパク質だけを、例えば攪拌された装置の壁から得るように注意すべきである。また、もしミキサーのような非せん断装置が用いられるならば、該成分を添加する順序が、繊維状構造物の形成のためにより重要であろう。そのような装置において、該液体相（水、油）、及び該酵素的架橋剤は、該タンパク質に先立ち添加されるべきである。いくつかの用途について、一部分だけが異方性である（及び例えば等方性マトリックスに含まれている）材料が十分でありうるだろうことが考えられる。
【００４２】
単純せん断処理工程は好ましくは、変性温度を有さないタンパク質材料、例えばカルシウムカゼイネートなど（本明細書の下記も参照されたい）を用いて実施され、又は好ましくはタンパク質材料の該変性温度より低い温度で実施される。該単純せん断それ自体については、該タンパク質溶液又は分散物が流動できる限り、該温度の下限は重要ではない。効果的に、穏やかな加熱工程はより速い整列化をもたらす。該同時の酵素的架橋についての温度要求はより重要であり得る。実際に、本発明の方法は、約１５〜６０℃、好ましくは環境温度、すなわち２０〜２５℃から、５５℃まで、より好ましくは３５〜５０℃の温度範囲で、適当に実施される。
【００４３】
本発明の方法は、好ましくは水又は少なくとも水性（他の非変性性溶媒も用いられうる）の系における、むしろ濃いタンパク質溶液又は分散物を要求する。好ましくは、該タンパク質の濃度は、該溶液又は分散物全体の重量に対し、少なくとも５重量％、好ましくは少なくとも１０重量％、より好ましくは少なくとも１５重量％、及びさらにより好ましくは少なくとも２０重量％であり、発見された最良の形態では、さらに好ましくは少なくとも２５重量％、及びより好ましくは３０重量％以上のタンパク質が用いられる。該タンパク質濃度の上限は、該タンパク質材料が該媒体中で整列化される為に十分移動可能でなければならないという要件により支配される。これは、本出願に基づき当技術分野の当業者により容易に決定されうる。実際には、タンパク質含有量は、約６０重量％より高くなく、及び好ましくは５０重量％より高くないであろう。
【００４４】
本発明の好ましい局面において、該食用タンパク質は、カゼイン、及び特には牛乳カゼインに基づく。牛乳カゼインは主に、αＳ１−、αＳ２−、β−及びκ−カゼインから、４：４：２：１の比で成る。α−及びβ−カゼインのセリン及びスレオニルホスフェートが、カルシウム（Ｃａ２＋）並びに他の２価及び３価イオンと相互作用することができる。この相互作用に起因して、カルシウムカゼイネート分散物が、乳中のカゼインミセル（約（〜）１００〜３００ｎｍ）と類似するタンパク質凝集物を含む；ナトリウムカゼイネートは、より開放的な三次構造を有し且つ約５０ｎｍのタンパク質凝集物を形成する。
【００４５】
消費の為に安全であらねばならない陽イオンである２以上の価の陽イオンを含む、及びより好ましくはカルシウムイオンを含むカゼイネート分散物中のより大きなタンパク質凝集物の故に、２以上の価の陽イオン型のカゼイネートは、本発明における使用にとって特に好ましい。しかしながら、油性の種から誘導されうる（風味除去された）大豆及び他の植物タンパク質；一般には植物タンパク質、乳清タンパク質濃厚物（ＷＰＣ粉）、乳清透過液、乳タンパク質、カゼイン、ポテトタンパク質、オボアルブミン及びそのようなタンパク質の混合物が用いられうる。
【００４６】
タンパク質架橋のために、比較的多数の種類の酵素、例えばプロテインジスルフィドイソメラーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リジルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、マッシュルームチロシナーゼ、リポキシゲナーゼ及びグルコースオキシダーゼなどが原理的に適格である。該言及された酵素は種々の反応を触媒し、そして、出発製品中に存在する整列化されるべきタンパク質に依存して、当業者は適当な酵素を選択することができる。トランスグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼは、とりわけそれらの利用可能性の故に、非常に適当である。
【００４７】
好ましい実施態様において、トランスグルタミナーゼが、タンパク質架橋酵素として用いられる。２種類のトランスグルタミナーゼが知られている：動物の及び微生物のものである。動物トランスグルタミナーゼとは対照的に、微生物により製造されたトランスグルタミナーゼの活性は、カルシウムイオンの存在に依存しない。該酵素トランスグルタミナーゼは、タンパク質間の特定の架橋反応を触媒する。より特には、タンパク質分子のグルタミン基が、共有結合を介して、タンパク質分子のリジン基と結合され、それにより分子間結合が形成されうる。
【００４８】
述べられたとおり、本発明の方法において用いられるべき好ましいタンパク質は、カゼインに基づき、より好ましくはカルシウムカゼイネートである。カゼインは、トランスグルタミナーゼにとって適当な基質を形成する。この酵素のさらなる説明については、Lorenzen及びSchlimmeによる、Bulletin of the IDF 332, pages 47-53、Kieler Milchwirtschaftliche Forschungsberichte 49(3) 221-227 (1997)、及びNahrung-Food 42(3-4) (1998) 151-154における論文、Nonaka et al., J. Food Sc. 57(5) (1992) 1214、及び欧州特許出願公開第０  ６１０  ６４９号明細書が言及される。トランスグルタミナーゼは、市販入手可能であり、とりわけ味の素株式会社、東京、日本、から市販入手可能である。
【００４９】
架橋酵素を用いる凝固は、本発明者らにより、所望の異方性構造物形成を得る為に必須であることが発見された。本発明の方法により得られる繊維状物質は、それぞれ走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）及び機械的解析により夫々測定されうる、ミクロスケール及びマクロスケールの両方について異方性を示した。
【００５０】
ＳＥＭは、約１００〜２００ｎｍの直径を有するタンパク質繊維を明らかにした一方、視覚的には最大で１ｍｍの繊維が観察された。
【００５１】
単純せん断及び架橋酵素、好ましくはトランスグルタミナーゼ、の両方が、大きな程度で該繊維の強化に影響した一方で、該せん断流動に対して垂直方向における機械的特性は一定のままであった。
【００５２】
該レオロジー特性は等方性であり、そして、該架橋酵素により影響されただけであった。
【００５３】
トランスグルタミナーゼ無しでＣａ−カゼイネートをせん断した後、わずかに異方性の層状構造が見られたが、繊維は形成されなかった。せん断の不在下における架橋、及び混合の間の架橋の両方とも、何らの整列化も無いＣａ−カゼイネートゲルを結果した。
【００５４】
このように、本発明は、単純せん断と酵素による架橋との組み合わせの適用により得られる相乗効果に基づく。この効果は、本明細書の以下の、単純せん断及びトランスグルタミナーゼ（ＴＧＡ；ＴＧａｓｅともいわれる）を用いた、Ｃａ−カゼイネートについての実施例１の表２に示される。引張特性の値が得られ、せん断の効果（静止条件下での架橋されたＣａ−カゼイネートにより正規化された、せん断され且つ架橋されたＣａ−カゼイネート）及びＴＧＡの効果（ＴＧＡ無しのせん断されたＣａ−カゼイネートにより正規化された、せん断され且つ架橋されたＣａ−カゼイネート）が推定されるように、Ｃａ−カゼイネート試料の相当する値により正規化された。せん断及びＴＧＡは両方とも、平行方向における、すなわち異方性微小構造の方向における引張特性に大きな程度で影響した。さらに、正規化された降伏応力値を考慮すると、（ＴＧＡの存在下における）せん断の強化効果はＴＧＡだけの効果の約２倍であった。
【００５５】
本発明の方法において、層状構造が形成される。特に、単純せん断の間の該酵素的架橋が、タンパク質凝集体の形態を繊維に変える。
【００５６】
第二の主な局面において、本発明はそれ故に、ミクロスケールにおける異方性（すなわち、ＳＥＭを用いて該形態を研究したときに、方向付けられた構造を有する）及びマクロスケールにおける異方性（すなわち、視覚的に該形態を研究したときに、方向付けられた構造を有する）を有する、繊維状階層的食用タンパク質構造物に関する。マクロスケールにおける異方性も引張強度試験を用いて決定されてよく；マクロスケールの異方性について、異なる引張強度が、異なる方向において試験片を測定したときに得られる。
【００５７】
これらのタンパク質構造物は、肉のように振る舞い、及び、焼いたときに褐色化を示しさえする。この褐色化をより明確にする為に、少量の還元糖、好ましくはラクトースが添加されうる。
【００５８】
第三の主な局面において、本発明は、食品用途の為の成分として用いられるのに適当な異方性繊維形態を有するゆるい繊維状粒子に関する。該粒子状特徴の故に、これらの粒子は粘度を増加する効果を有する。これらの粒子は、まさに液体からほとんど固体の製品までを含む広い範囲にわたり、製品の粘度を制御することを許す。
【００５９】
加えて、該繊維状粒子は、（粘稠な）液体産物の流動挙動に影響しうる。該粒子の該異方性特徴は、そのような繊維が用いられるところの該系の慣性の増加に追加の効果を与える。同様の効果が、降伏挙動を有するより硬い系に適用される。該タンパク質の該構造の細かいチューニングにより；すなわち、ミクロ又はマクロスケールにおけるより多い又はより少ない量の異方性を構造物に備えることにより、該同じタンパク質含有量を有し、全く異なる粘度及び／又は流動挙動を有する製品が調製されうる。
【００６０】
該分散した相の該異方性特徴は、せん断希釈化挙動及び、任意的に、製品への降伏挙動を提供する機会も与えうる。すなわち、粘稠な製品がせん断に付されたときに、該産物の該粘度が減少する。粘稠な製品は流動可能に又はスプーンで食べられるようになりうるし、及びその後、再度粘稠になりうる。
【００６１】
「非せん断装置」に関して上記で言及されたとおり、いくつかの適用のために、異方性部分が等方性マトリックス中に含まれる物質を得ることが考えられる。この例は、ゆるい繊維、すなわち階層的構造の必ずしも部分ではないがマトリックスにより互いから大きく離れている繊維、を調製する為の方法でもある。そのようなゆるい繊維を調製する為に、せん断されるべき該懸濁物中に存在する追加の相を有することが必須であると思われる。特に、化学的な結合に参加しないであろう多糖又はタンパク質がゆるい繊維を形成しうる。存在するこの追加の相を有することにより、最終的にはゆるい繊維となる、階層的組織中のよりゆるい関係が生じうる。このゆえに、該懸濁物に存在する追加の相の該存在に依存して及び処理パラメータに依存して、階層的構造物若しくはゆるい繊維又はゆるい繊維と階層的構造物の間の中間領域が得られうる。この点において、本明細書以下の実施例３を参照されたい。
【００６２】
この方法において用いられるべき適当な多糖はキサンタン、カラギーナン、ガラクトマンナン、グアーガム、タラガム、キャロブビーンガム、アラビアガム、ペクチン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）及びヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を含むセルロース、及び、加工デンプンを含むデンプンである。
【００６３】
該多糖は、本発明に従い処理されるべき該懸濁物中のタンパク質含有量を減少することを許し及び／又は該繊維のまとまり及び組織形成能力における変化を許し、及び、最終的にはゆるい繊維の形成をもたらしうる。
【００６４】
該懸濁物に添加されるべきそのようなタンパク質又は多糖の適当な量は一般に、０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜３重量％、より好ましくは０．１〜１．５重量％であり、及び／又は、追加のタンパク質又は多糖の（重量における）量は、整列されるべきタンパク質の重量に対して、１：１０００〜１：５、好ましくは１：５００〜１：８、より好ましくは１：１００〜１：１０である。
【００６５】
好ましい実施態様において、これらの繊維状構造物は本発明の方法により得られる。
【００６６】
トランスグルタミナーゼにより架橋されたカゼイネートに基づく繊維状構造物が非常に好ましい。
【００６７】
本発明の異方性繊維状試料は、垂直方向と比較して平行方向において非常に強い。これは特に、降伏応力比により反映されることができる。好ましい実施態様において、本発明の繊維状構造物は、少なくとも６、好ましくは少なくとも７、及び最も好ましくは少なくとも８の降伏応力比σ平行／σ垂直を有する。カルシウムカゼイネートについては、該降伏応力比σ平行／σ垂直は適当には、約９でありうる。
【００６８】
せん断及び酵素により誘発された異方性構造物の形成は、該整列されたタンパク質凝集物のせん断及び同時の凝固に起因した、タンパク質凝集物の増強された層分離により説明された。
【００６９】
単純せん断及び酵素的架橋を用いたカルシウムカゼイネートの酵素的ゲル化は、新規の繊維状タンパク質構造物を誘発する。該得られたミクロ構造的特性がＳＥＭ分析により研究された。小さい及び大きい変形を伴う、所望の線形粘弾性特性及び所望の機械的特性をもたらす構造的特徴が明らかにされ、これは本明細書以下においてトランスグルタミナーゼにより架橋されたカルシウムカゼイネート構造物についてより詳細に説明されるであろう。
【００７０】
実際に、第１に、適当な溶媒、好ましくは水性溶媒中におけるタンパク質の溶液又は分散物がプレミックスとして作られる。このプレミックスはシアーセルに移され、そして好ましくは３５〜５０℃の温度に加熱される。架橋酵素は、該せん断セル中に導入され又は好ましくは該プレミックスへと既に導入されており、そして該混合物は、単純せん断に付される。最適な結果のために、すなわち良く規定されたせん断場の為に、該シアーセルの完全な充填が要求される。該せん断は、該タンパク質材料の整列化に影響するのに十分高くあらねばならないが、該構造物が壊れうるので高すぎてはならない。
【００７１】
本発明に従い、異方性繊維状タンパク質構造物、好ましくは異方性Ｃａ−カゼイネート構造物が、せん断により誘発された構造物形成及び同時の凝固に基づく技術を用いて形成された。せん断をする間の酵素の架橋は、該異方性構造物形成にとって必須であるとみえる。得られた該高い異方性と組み合わせられた該方法の簡単さは、新規の食物構造物及び適用にとって、該技術の高い潜在能力を示す。
【００７２】
せん断の間の該架橋が必須であるので、用いられる特定のタンパク質についての酵素種類及び活性、せん断速度及び処理時間の調節は、該特定のタンパク質に依存する。２５〜３０重量％カルシウムカゼイネートを含有する水性媒体について、例えば、トランスグルタミナーゼ（ＴＧＡ）を用いた図１（本明細書以下を参照されたい）に示される該装置における最小せん断速度は、２４ｓ−１であり、該処理時間は３００〜３６００秒である。該最適温度は、該用いられる酵素により決定される。ＴＧＡについて、これは約５０℃である。
【００７３】
本明細書以下の実施例において、ＴＧＡとの組合せにおけるカルシウムカゼイネートは、本発明についてモデル系として用いられる。せん断及びＴＧＡを用いる酵素的架橋の後、異方性繊維状構造物が、マクロ及びミクロスケールについて濃厚なＣａ−カゼイネートマトリックス中に形成された。最大で１ｍｍの線維が視覚的に観察されたが、ＳＥＭ画像は、約５０〜２００ｎｍの直径を有するタンパク質繊維を明らかにし、これは鎖状のタンパク質ドメインから構成された。
【００７４】
ＴＧＡの不在下において、層状の且つわずかに異方性の構造物が観察されたが、繊維は形成されなかった。せん断の不在下における架橋は、何らの整列化の無い強いＣａ−カゼイネートゲルを結果した。ＬＶＥ特性は、ＴＧＡの添加に起因するＧ’の増加及びｔａｎδの減少を示した。これらの特性は等方性であった（すなわち歪みの方向に依存しなかった）。
【００７５】
対照的に、引張特性は、特には該適用されたせん断流動と比較して、平行及び垂直方向における該降伏応力値の間の大きな違いに基づき、異方性構造の存在を確認した（本明細書以下を参照されたい）。せん断は大きな程度で該異方性繊維の強化に影響したが、垂直方向における特性は変わらないままであった。ＴＧＡも有意に該せん断方向における構造形成に影響した。
【００７６】
濃厚なタンパク質分散物をせん断する場合に、層状構造物が形成され、これは図１０において図式的に描かれる。せん断の間の酵素的架橋はタンパク質の形態を繊維へと変えた。何らかの特定の理論にとらわれることを望まないが、本発明の方法において、せん断に起因する分子レベルでのタンパク質凝集物の相分離が、せん断及び酵素により誘発された異方性構造物をもたらすことが仮定される。酵素的架橋は、該整列されたタンパク質凝集物を凝固する為に必要とされ、凝固剤が存在しない場合にせん断を静止するとおそらく緩まるだろう。
【００７７】
本明細書以下の実施例において、カゼイネートの非常に濃厚な系であって、該カゼイン凝集物が密に詰め込まれた又は押し込められた状態のものが用いられる。静止状態での該系に存在しうるかもしれない、低い界面張力によるタンパク質に富む相及びタンパク質に乏しい相への局所的な相分離が、せん断により促進され、これらの相の整列化を結果した。ＴＧＡの不在下において、せん断とＣａ２＋相互作用の一緒にされた効果が層状のＣａ−カゼイネートマクロ構造をもたらし、これは該引張試験の間の異方性挙動を示した。対照的に、該ミクロ構造はせん断によりほとんど影響されなかった。これは、図１０Ａにおいて描かれるのと同様に、層状の構造物を結果するだろう。相分離及びせん断に起因して、ミクロスケールでのＣａ−カゼイネートにおける整列化が存在していそうであったが、採用された凝固方法、すなわち冷却のタイムスケールは該整列化されたタンパク質集合体の緩和時間よりもはるかに長かったようである。それ故に、せん断されたＣａ−カゼイネートは、繊維状構造を結果しなかった。ＴＧＡの存在下において、架橋はたぶんＣａ−カゼイネート凝集物のサイズを増加し、それらをせん断による整列化にさらにより感受性にする。さらに、相分離したタンパク質に富む相において、ＴＧＡは該流動の方向における共有結合を誘発した。凝固は緩和よりも短いタイムスケールで生じるので、該繊維状ミクロ及びマクロ構造がせん断の静止後も保存された。
【００７８】
Ｃａ−カゼイネート及びＮａ−カゼイネートは、異なる物理的特性を有し、そしてそれ故に、異方性構造物を得る為に異なる処方計画（regime）を要求する。以下の枠組みが、濃いカゼイネート分散物の、せん断により誘発された構造形成における差異のために考慮される。
【００７９】
我々は、該濃いカゼイネート分散物を、コロイド状の密に詰まったやわらかい球を含む系として及び時間とせん断流動に依存して形成され及び破壊されることができる絡み合い（entanglement）を有する準希薄ポリマー様系として考える。せん断は、もしその効果がこれらの系の可動性により補われ得ないならば、該系における構造を誘発することができるだけである。これは、Ｃａ−カゼイネートの固有の物理的特性が、我々が調査したタイムスケールでせん断誘発構造物形成が好ましいようなものであることを示唆する。
【００８０】
Ｃａ−カゼイネートに基づきえられた結果を参照すると、当技術分野の当業者に、類似する、新規であり且つ有用な異方性繊維状構造物が、他の食用タンパク質に基づきどのように得られるかが明白であろう。特定の条件は該タンパク質により様々でありうるが、当業者は要求された異方性を生成する為に、選択された条件が適合するかどうかを評価することができるであろう。
【００８１】
任意の或る食用タンパク質を用いて本発明に取り組むときに考慮されるべき条件は、せん断速度、せん断期間、温度、せん断粘度、対イオン、タンパク質濃度、タンパク質粒子サイズ、相互に引き合う相互作用の強度、非単調の流動挙動、有意な法線応力を含む。
【００８２】
理論に拘束されると考えられることなしに、本発明の知識により、理論的なモデルが、処理条件を決定する為に適用されうることが注目される。これは、Ｎａ−カゼイネートを参照して説明される。
【００８３】
一般に、せん断流動は、流体力学的力（hydrodynamic  force）がブラウン運動を支配する場合、該せん断流動方向に向かって構造的要素を整列する傾向を有するであろう。これは、ペクレ数により表される。Macosko, C. W. (1994). Rheology: Principles, measurements, and applications. New York: Wiley-VCH:
2010505412.tif 000002
【００８４】
該構造的要素の半径はαにより示され、
2010505412.tif 000003
はせん断速度であり、ηは該溶液の（せん断）粘度、κはボルツマン定数であり及びＴは温度である。該ペクレ数は、粒子のせん断誘発整列化（shear  induced  alignment）に、又はこの場合はミセルタンパク質に関する主要パラメーター（すなわち粒子サイズ及びせん断速度）をまとめる。ペクレ数が、Ｃａ−及びＮａ−カゼイネートについてのスケール則（scaling  rule）として適用される場合、せん断流動によりＮａ−カゼイネートが影響されるであろうところのせん断速度が予測されることができる：
2010505412.tif 000004
【００８５】
Ｎａ−カゼイネート凝集物のサイズαＮＡがＣａ−カゼイネート凝集物のサイズαＣＡより５倍小さいこと（αＮＡは約２５ｎｍ及びαＣＡは約１２５ｎｍと仮定する（De Kruif, C. G. (1998). Supra-aggregates of casein micelles as a prelude to coagulation. Journal Of Dairy Science, 81(11), 3019-3028. Lucey, J. A., Srinivasan, M., Singh, H & Munro, P. A. (2000). Characterization of commercial and experimental sodium caseinates by multiangle laser light scattering and size-exclusion chromatography. Journal Of Agricultural And Food Chemisry, 48(5), 1610-1616. Dickinson, E., Semenova, M. G., Belyakova, L. E., Antipova, A. S., Il'in, M. M., Tsapkina, E. N. & Ritzoulis, C. (2001). Analysis of light scattering data on the calcium ion sensitivity of caseinate solution thermodynamics: Relationship to emulsion flocculation. Journal Of Colloid And Interface Science, 239(1), 87-97)、及びせん断粘度ηに関して約２倍の違いがあること（約１２０ｓ−１のせん断速度で
2010505412.tif 000005
）を仮定すると、Ｎａ−カゼイネートにおける整列化を誘発する為に必要とされるせん断速度は、Ｃａ−カゼイネートと比較して約２．５・１０２倍大きいことが推定されうる。
【００８６】
せん断により誘発された整列化に関する他の基準は、デボラ数（Ｄｅ）、すなわちτとせん断速度との積に基づき、これは
2010505412.tif 000006
の値（＞＞１）を超えるべきである（Forster, S., Konrad, M. & Lindner, P. (2005). Shear thinning and orientational ordering of wormlike micelles. Physical Review letters, 94(1), 17803-17801-17804）。相互作用を含む以下のスケール則が次に適用可能である：
2010505412.tif 000007
【００８７】
Ｃａ−及びＮａ−カゼイネートについてのスケール則としてデボラ数を用いて、Ｎａ−カゼイネートにおける整列化を誘発する為に必要なせん断速度もまた、Ｃａ−カゼイネートについて必要とされるせん断速度と比較して、２桁大きい（１０２）と結論付けられることができ、これはペクレ数に基づく予測と一致する。ペクレ数及びデボラ数の両方とも、せん断により誘発された構造形成にとって重要である因子、例えばせん断速度、せん断粘度、粒子サイズ及びタンパク質相互作用などを、示唆する。これらの因子は、成分特性及び処理の両方により影響され、当業者にとってのカゼイネートの構造形成の為にこれらの局面を調和させることの重要性を強調する。さらに、これらの無次元数の使用は、一方では密に詰まった球として及び他方ではからみあったポリマーネットワークとしてのカゼイネート系の機構的アプローチ（mechanistic  approach）と一致する。
【００８８】
当技術分野の当業者は、産業的に関連のある材料における、せん断により誘発された構造形成に関する或る要素の重要性に気付くであろう：
１．せん断及び酵素的架橋に起因する繊維形成は、例えば異方性構造物を得るための存在する対イオン及びタンパク質濃度（これらは大きな程度でレオロジー挙動に影響する）により影響される。
２．せん断により誘発された構造物形成は、もし出発材料がせん断による秩序化にとって感受性であるならば、最も発生しそうである。Ｎａ−カゼイネートと比較したＣａ−カゼイネートにおけるより大きなミセル状構造要素及び顕著な引力相互作用は、構造形成において発見される違いを説明する。一般に、本発明の知識により、該タンパク質に依存して、イオン濃度（例えばカルシウムカゼイネートの場合はカルシウムなど）も、得られる異方性を決定するであろうことは当技術分野の当業者に明白であろう。
３．産業的に関連のあるタンパク質混合物は、せん断により誘発される構造形成、例えば構造物の種類及びレオロジー挙動などを研究する為にしばしば用いられるモデル材料との類似性を示すと思われる。後者の挙動において観察される主な類似性は、非単調の流動挙動、有意な法線応力、及び引力相互作用であった。それとともに、レオロジー測定が、タンパク質の構造物形成能力を分析するのに有用であることを示す。本発明の知識により、緩和時間及びシアーシニング（shear  thinning）又はシアーシックニング（shear  thickening）のようなパラメータが、過度の実験無く、本発明に従う階層的繊維状構造物を得る為のタンパク質懸濁物の潜在的適合性を評価する為に用いられることができることが理解されるであろう。
【００８９】
本発明の繊維状食物材料は添加物を含みうる。すなわち、該混合物は、１以上の添加物、特には香料、追加的栄養成分、健康に益する成分、及び着色剤からなる群から選ばれる１以上の添加物を含みうる。１以上の適切な香料及び／又は着色剤を添加することにより、所望の味及び／又は外観が得られうる。
【００９０】
他の添加物は、例えば保存料などであり、それに関して安息香酸ナトリウムがよく知られた例である。
【００９１】
本発明により、安息香酸ナトリウムは、所望のとおりに繊維の形成を容易にするためにも好ましい成分である。結合されるべきと考えられる理論無く、添加された塩、例えば安息香酸ナトリウムなどは、タンパク質溶液のイオン強度を増加することにより、タンパク質−タンパク質相互作用に影響する能力を有すること、これが該系の熱力学に影響すること、が本発明者らの現在の考えである。特に、カルシウムカゼイネートの場合、適当なイオン強度の塩は、カルシウム結合に関してカゼイネートと競合することができる。すなわち、そのカルシウム結合のいくつかを失うことにより、該カゼイネート構造は、内部の密着を失うと考えられ、そしてそれ故に、せん断に対してより受容的になり且つ整列されることがよりできるようになる。やはり、当技術分野の当業者は、適当に簡単な様式で、添加された塩と一緒に又は塩無しでタンパク質の或る系について、選択された条件が、要求される異方性を単純せん断により得る為に十分であるかどうかを決定することができるであろう。
【００９２】
好ましくは該塩は、１価陽イオン及び食品グレード２価陰イオンを含む。例は、該タンパク質中に結合したカルシウムと競合するために、プロセスチーズの製造から知られるような塩、例えば乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びリン酸ナトリウム並びに、カルシウム結合の為の同等の親和性を有する他の塩などを含む。
【００９３】
Ｄ−乳酸ナトリウム及びトリポリリン酸ナトリウムが特に適当である。これらの塩は、一般に、０．１〜１０重量％、好ましくは０．１〜４重量％及びより好ましくは０．１〜２．５重量％の範囲で用いられることができる。ナトリウムカゼイネートも同様に用いられることができ、典型的には、１〜４０重量％のより高い濃度で用いられることができる。
【００９４】
本発明のさらなる局面において、該方法は、油の追加的存在を使用する。該方法において用いられる組成物中に脂肪が存在する場合、タンパク質−水系においてすでに存在したミクロ及びマクロスケールでの異方性に加えて、該脂肪はメソスケール水準での構造を誘発する。脂肪は、３０重量％までの量で該懸濁物中に存在してよく、及びときどきはより高くありうる。好ましくは、脂肪の量は、２５重量％未満であり、より好ましくは２０重量％未満である。
【００９５】
適当な脂肪は、植物及び動物脂肪の全ての種類を含む。好ましい動物脂肪は、乳脂肪及び特には牛の乳脂肪を含む。好ましい植物脂肪は、ヒマワリ脂肪、大豆脂肪、ナタネ脂肪、コーン及びトウモロコシ脂肪並びにそれらの混合物を含む。好ましい実施態様において、脂肪は、乳の脂肪と比べて、増加したポリ不飽和脂肪対飽和脂肪（ｐｕｆａ／ｓａｆａ）比を有する脂肪が用いられる。用いられる該脂肪は、処理の間じゅう液体であらねばならない。第２相として脂肪を用いることは、単独の相タンパク質と比較して、階層的なタンパク質−脂肪材料における追加的な長さスケールでの構造化を許す。トランスグルタミナーゼ（ＴＧＡ）を用いる同時の酵素的架橋は、せん断により誘発された構造物の固化を許す。実施例において、せん断速度、せん断時間及びタンパク質濃度の効果は、単純せん断とＴＧＡを用いる酵素的架橋とを適用することにより、Ｃａ−カゼイネート及びパーム脂肪に基づく異方性構造物の形成について示される。該Ｃａ−カゼイネート−脂肪構造物は、共焦点走査型レーザー顕微鏡（ＣＳＬＭ）及び走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により調査された。小さな及び大きな変形は、独特のＣａ−カゼイネート−脂肪材料の線形粘弾（ＬＶＥ）特性（クリープ挙動を含む）及び引張特性の夫々における洞察を与えた。
【００９６】
より詳細には、カルシウムカゼイネート分散物及びパーム脂肪に基づく該試験系について、階層的繊維状材料は、酵素的架橋後に明確な（well-defined）変形下で形成される。延長されたせん断時間は、繊維状材料からのシネレシスを伴う損傷した構造物への移行に影響した。
【００９７】
構造形成に対する脂肪の効果に関して、脂肪を含むせん断され且つ架橋された繊維状Ｃａ−カゼイネート構造物が、ＳＥＭ画像に基づき、脂肪無しの繊維状構造物との違いをほとんど示さなかったことが強調される。見積もられた繊維厚さはおおよそ同様であった（約１００〜２００ｎｍ）、これはカゼインミセルの範囲である。しかしながら、ＣＳＬＭにより、タンパク質−脂肪材料の追加的長さスケール（additional  length  scale）が観察され、ここでタンパク質束及び引き伸ばされ又は変形された脂肪構造物が視認できた。せん断流動の方向にだけ結合が形成され、これはせん断により誘発されたタンパク質整列化によりすでに促進されているようである。脂肪の存在は、該流動に対して垂直方向の共有結合の形成を阻害し、それによりおそらく該材料の繊維状特徴を増強する。脂肪を含む該繊維状試料の機械的特性の値は、脂肪無しの繊維状タンパク質試料と比較してわずかにより高く、これは固形の脂肪相による該構造物の強化を示唆する。該せん断流動に対して平行及び垂直に測定された機械的特性の比は、脂肪無しの繊維状試料と同様であり、いずれも約８〜９の高い降伏応力比を有した。ＴＧＡの不在下において、該脂肪滴は、ＴＧＡを含む繊維状構造物に存在する脂肪液摘と比較して、該等方性Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料においてより大きく且つより少なく変形された。ＴＧＡの存在下において、該マトリックスにおける粘度は、せん断時間の増加と伴に増加するであろうし、大きな粘性力及び結果として滴破壊をもたらすであろう。しかしながら、マトリックス弾力性の増加は、該分散層の引き伸ばしを増強するであろうし、及び同時に該流動方向に向けての方向性さえも増強するであろう。該層の粘度比は明確な（well-defined）変形の間の構造形成にも影響する：該分散した相の粘度が該マトリックス相の粘度よりも低いとき（これはＣａ−カゼイネート及び脂肪をせん断し且つ架橋する間の場合にありそうである）、滴はせんだんの間じゅう引き伸ばされるであろう。構造物形成に対するタンパク質濃度の効果に関して、Ｃａ−カゼイネート分散物は、乳中のカゼインミセル（約１００〜３００ｎｍ）と類似するタンパク質凝集物を含むことが注目される。これらの構造的要素は、流体力が支配する場合に、せん断による整列化に感受性でありそうである。ＴＧＡは、該タンパク質相における共有結合を誘発し、それにより該カゼインクラスターのサイズを増加し、これはせん断により整列する為のそれらの感受性を増強するであろう。２４ｓ−１でのせん断後に等方性材料が形成されたという事実に基づき、適用されたせん断速度は、比較的高い速度で架橋された該構造的要素、すなわちカゼイン分子又はよりよいもの：カゼインミセル、を整列化するには低すぎたことが推測される。比較的高いせん断速度（＞１２０Ｓ−１）でのせん断は、整列化及び繊維の形成にとって必要とされた。該せん断速度が低すぎるときに、該タンパク質マトリックスは、シアシニング（shear  thinning）挙動に起因してより粘性である。それ故に、より不規則な共有結合ネットワークが形成されているようであり、これは迅速に浸透した状態に達するであろう。高いせん断速度（２４０ｓ−１）でのせん断は、該機械的特性によ��反映されるとおりの増加した繊維状状態（fibrousness）を結果した。これは、該高いせん断速度（より多くの繊維をもたらす）及び薄い層内の小さな脂肪滴の存在に起因するミクロ相分離における増加により説明されることができる。要約すると、該せん断速度は、Ｃａ−カゼイネート及び脂肪に基づく繊維状材料の繊維状状態の形成及び程度に影響する為に必須の手段であるように見える。
【００９８】
本発明に従い、架橋速度とせん断速度との間の相互作用が、繊維状構造物の形成を決定する。その結果が、得られうる構造の種類の概観を提供する為に、ダイアグラム（図２１）にまとめられる。ｙ軸に、凝固速度（ｒｓ）及びせん断速度（降伏（yielding）／ｒｓ／ｊｓ）が、処理時間の関数としてプロットされる。酵素的架橋の場合、πｓは［Ｅ／Ｐ］に対応する一方で、該せん断速度は整列化の尺度として解釈される。３０％Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料についての全ての実験データ点が、［Ｅ／Ｐ］に影響するタンパク質濃度効果だけでなく粘度も排除するために２５％Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料を除き、該ダイアグラムに示される。該後者の効果は、非常に非線形であると予測され、そしてさらなる調査を要求する。該実験データ及び理論的考慮に基づき、４つの構造領域が該ダイアグラム中に構築されることができる：（１）Ｆにより示される繊維状構造、（２）Ｇにより示される、過剰せん断後のの損傷した及び破壊された構造である「顆粒」構造、（３）Ｉｓにより示される、固形物へと架橋されているが整列されていない等方性固形材料、及び（４）Ｉｌにより示される、出発材料と同じ粘稠度（consistency）を含む材料である等方性液体材料。６・１０−４より小さい固定された［Ｅ／Ｐ］／γ比で、３つの構造的移行が、増加した処理時間に伴い発生しうる。第１に、等方性の液体が、γ→∞又は［Ｅ／Ｐ］→０のいずれかの場合に、短い処理時間で形成される。流体力が支配する場合にせん断整列する傾向にある構造的要素が、高いせん断速度で整列するであろうが、凝固が適用されない場合にそれらの方向性を緩めるであろう。しかしながら、非常に低い凝固速度では、該方向性は、より長い時間スケールで固定され、繊維状材料を結果するであろう。この移行は、線ａにより示される。より長い処理時間でさえ、該整列した構造が破壊されるであろうし、シネレシスを伴う「顆粒」構造を結果し、これは時間依存的移行の線ｂにより示される。該凝固速度が該せん断速度を支配する場合の或る点（［Ｅ／Ｐ］／γ＞約８．１０−４）で、繊維状材料から等方性固形物への時間非依存的移行が生じる、これは線ｃにより描かれる。γ→０又は［Ｅ／Ｐ］→∞の場合、３つの時間依存的移行が同様に存在する。非常に短い時間スケールで、等方性液体が形成され、これは迅速に、不規則な非常に浸透したネットワークを有する等方性固形物へと変形する（線ａ）。該ネットワーク強度が処理時間と伴に増加するので、該顆粒領域への移行（線ｂ）は、該構造の破壊に起因すると予測されうる。増加した凝固速度により、等方性固形物から顆粒材料への該移行は、より短い時間で生じるであろう、これは線ｂの漸近的挙動を説明する。同様に、線ａは、ｙ軸に対する漸近線でもある。［Ｅ／Ｐ］／γの値が調査下では、該系に対し任意的であり且つ特異的であることが注目されるべきである。しかしながら、４つの異なる領域（このうち該繊維状領域は最もせまいものである）へと構造ダイアグラムを分割する２つの時間依存的移行（ａ、ｂ）及び１の時間非依存的移行（ｃ）の存在は、特定の（well-defined）流動及び凝固に基づく構造化処理方法にとって一般的であると予測される。該ダイアグラムは、なぜ特定��（well-defined）流動方法以外の構造化処理が非常に整列され且つ繊維状の構造物を結果しないのかの説明を与える。混合の間、バイオポリマーが比較的低いせん断速度及び時々高いピークせん断速度に付される。混合の間に内在する該動きに起因して、該マクロ分子が連続的に再度方向付けされ、及び最終的に該全ての材料がこれらの高いピーク応力で処理されるであろう（これは構造物の破壊を結果することができる）。それ故に、混合の間、該材料は、該繊維状領域に至ることは決してないであろうが、等方性固形物（領域Ｉｓ）、又は顆粒構造物（領域Ｇ）さえが迅速に形成されるであろう。他の構造化処理は押出であり、この間、層流に起因してスリットダイにおいてバイオポリマーが整列化する傾向にあり、一方で該構造は冷却の間にジスルフィド結合及び疎水性相互作用により固定化されうる。繊維状の程度は該冷却速度及び該スリットダイの長さ（該凝固時間及び処理時間にそれぞれ相当する）により主に決定される。分子スケールでの整列化は、タンパク質に基づく押出された繊維状材料について報告されていなかった。高温との組合せにおける該ダイを通じて材料を押出すために必要とされる該高圧は、該押出機の内側の該材料に高いせん断応力をもたらし、深刻なタンパク質損傷及びシネレシスのリスクを結果する。
【００９９】
特定の（well-defined）せん断流動及び酵素的架橋に基づく本発明の新規構造化方法は、濃いＣａ−カゼイネート分散物中におけるマクロ及びミクロスケールの高度に繊維状の構造物をもたらす。脂肪の存在は、メソスケールレベルの追加的長さスケールを誘発したが、タンパク質繊維（約１００〜２００ｎｍ）の束（約４０μｍ）は、脂肪の層及び変形した脂肪滴（約１０μｍ）により分離された。せん断時間及びせん断速度の両方が、繊維状構造物の形成に非常に影響する。３０％Ｃａ−カゼイネートについて、繊維状構造物は、１２０ｓ−１でのせん断の５分後にすでに観察されたが、繊維状構造の破壊が、６０分間の延長されたせん断後に観察された。２５％Ｃａ−カゼイネートの場合、破壊は、該相対的な架橋速度がこの系において増加したときにすぐに観察された。低いせん断速度（２４ｓ−１）は、等方性構造を産出したが、高いせん断速度（２４０ｓ−１）でのせん断はより高い程度の繊維状状態を結果した。該ＬＶＥ特性及びクリープ挙動は、構造物形成の間の該酵素により誘発された共有結合の効果における洞察を、それらの方向に関係なく、提供した。引張試験は、共有結合が該せん断流動方向において形成されたことを示した。
【０１００】
繊維状構造物は、初期生成物（これはせん断により整列化される傾向にある構造的要素を要求する）及び特定の（well-defined）処理条件の組合せに起因して形成され、線形せん断流動及び整列化された構造物の凝固を含意する。
【０１０１】
本発明は、以下の非限定的な実施例及び図面を参照しながら、より詳細に説明されるであろう。
【０１０２】
実施例において、百分率は、組成物の全重量に対して表された重量による百分率である。
【０１０３】
これらの実施例において、以下の化合物が用いられる：
【０１０４】
トランスグルタミナーゼ（本明細書以下、ＴＧＡ）：製造者の仕様書に従い８１〜１３５ユニット・ｇ−１の活性を有する、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍ  ｍｏｂｅｒａｎｓａｅに由来する微生物のＣａ２＋非依存性トランスグルタミナーゼ（タンパク質−グルタミン：アミン  γーグルタミル−トランスフェラーゼ、ＥＣ２．３．２．１３）（１％ＴＧＡ、９９％マルトデキストリン、味の素株式会社、東京、日本、から）。２０％（ｗ／ｗ、脱塩水中において）ＴＧＡ溶液が、室温で１時間の機械的攪拌による実験実施に先立ち新鮮に調製された。
【０１０５】
カルシウムカゼイネート（Ｃａ−カゼイネート）：製造者の仕様書に従い少なくとも８８％タンパク質を含んだ（ＤＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、フェフヘル、オランダ、から）。
【０１０６】
パーム油は、Ｂａｒｅｎｔｚ  Ｒａｗ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ホーフトドルプ、オランダ）から取得された。２０〜３７℃の融解曲線を有し、該脂肪は処理（５０℃）の間じゅう液体であったこと及びさらなる分析（２０℃）の間じゅう固体であったことを示す。
【０１０７】
Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ（７２４８５、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、共焦点レーザー走査型顕微鏡についての脂肪についての蛍光染料、は０．１ｇ・Ｌ−１の濃度で融解したパーム油に添加された。
【０１０８】
ＳＥＭについての資料の調製の為に用いられたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びエタノールは分析グレードのものであった（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ツビンドレヒト、オランダ、から）。
【０１０９】
実施例において、試験データは、以下の方法を用いて得られた：
【０１１０】
走査型電子顕微鏡：該Ｃａ−カゼイネート材料のミクロ及びナノ構造的局面が、電界放出走査型電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）により、室温で観察された。乾燥試料が、Ｍｕｌｌｅｒらにより、Scanning 22 (2000) 295-303において記載された修正された方法に従い調製された。せん断されたＣａ−カゼイネート試料は注意深く、正方形（＜１０×１０ｍｍ）に切り取られ、及びＤＭＳＯ（濃度範囲１５％、３０％及び５０％ｖ／ｖ、脱塩水中において）中にそれぞれ６０分間浸された。５０％ＤＭＳＯの過剰が、ろ紙により該試料から除去された。該試料のゆっくりとした冷凍が、液体窒素上の冷たい気体の窒素中で実施された。その後、該試料は該液体窒素中にもたらされ、そしてかみそりの刃（片刃炭素鋼、ＥＭＳ、ワシントン、米国）及びハンマーにより真ちゅうテーブル上で冷凍破壊された。冷凍破壊は、該シアーセル装置において該試料に対してかけられた該せん断流動に対して（せん断流動−渦度面に基づき）平行に及び垂直に実施された。得られた破壊面は夫々、速度勾配−せん断流動平面及び速度勾配−渦度面であった。本明細書以下において、これらの方向及び得られた破壊面は夫々、平行及び垂直として定義される。明白なせん断方向を有さない該混合された試料は、仮想上の平行及び垂直方向の定義後に同様に処理された。全てのカゼイネート試料は、脆弱な破壊を示した。破壊後、試料は６０分超の間、５０％ＤＭＳＯ中で解凍され、そしてその後、逆にしたＤＭＳＯ濃度範囲（夫々６０分）により水に再水和された。該試料は、段階的なエタノール系列（１０％、３０％、５０％、７０％、９０％ｖ／ｖ）において１００％エタノールへと（それぞれ２０分）脱水された。１００％エタノール中の試料は、二酸化炭素により臨界点乾燥され（ＣＰＤ  ０２０、Ｂａｌｚｅｒｓ、リヒテンシュタイン、から）、及び該破壊面を同定するために実体顕微鏡により観察された。その後、該試料は、導電性カーボンセメント（Ｌｅｉｔ−Ｃ、Ｎｅｕｂａｕｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｉｅｎ、ドイツ、から）を用いて試料ホルダー上に接着され、そして２０ｎｍの白金（ＪＦＣ  １２００、ＪＥＯＬ、日本、から）によりスパッタ被覆された。該破壊された表面は、ＦＥＳＥＭ（ＪＥＯＬ６３００Ｆ、東京、日本）により、室温で、８ｍｍの作動距離で、３．５〜５ｋＶでのＳＥ検出により、分析された。全ての画像は、２５２８×２０３０のサイズ、８ビットで、１００秒のスキャン速度（フルフレーム）で、デジタル的に記録された（Ｏｒｉｏｎ、６Ｅ．Ｌ．Ｉ  ｓｐｒｌ．、ベルギー）。該画像のノイズリダクション及びリサイズは、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳにより行われた。
【０１１１】
共焦点走査型レーザー顕微鏡（ＣＳＬＭ）：該処理されたＣａ−カゼイネート−脂肪材料の該メソ構造（ミクロ長スケール及びマクロ長スケールの間の構造として定義される）が、該渦度−せん断流動平面においてＣＳＬＭにより観察された。４℃での保蔵後、該シアーセルの中間部分からとられたタンパク質−脂肪試料が注意深く切断され、２ウェルのチャンバーカバーガラス（2-well  chambered  coverglass）（Ｎｕｎｃ、ネイパービル、イリノイ州、米国、から）へ移され、そして、倒立型ＬＳＭ５１０（Ｚｅｉｓｓ、オーバーコッヘン、ドイツ、から）により分析された。アルゴンイオンレーザー（４８８ｎｍ）及びＨｅＮｅレーザー（５４３ｎｍ）が、該試料を励起するために用いられた。該タンパク質相について、５０５〜５３０ｎｍの放出フィルター（emission  filter）が適用された一方で、６００〜６５０ｎｍフィルターが該脂肪相について用いられた。画像は、１０×乾燥対象（開口数０．３、ズーム  ２×及び４×）及び４０×油浸対象（開口数１．３）によりデジタル的に記録された。該脂肪相の該未加工のデータ画像（５１２×５１２ピクセル）の画像分析は、Ｍａｔｌａｂ  ７．０（Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．，ナティック、マサチューセッツ州、米国、から）のＩｍａｇｅ  Ｔｏｏｌｂｏｘを用いて実施された。１０×倍率で得られた、１試料当たり少なくとも６の画像が、画素面積に基づく直径サイズを決定する為に用いられた
2010505412.tif 000008
。また、変形パラメーターＤが、楕円体の最大軸長（Ｌｍａｘ）及び最小軸長（Ｌｍｉｎ）から計算された：Ｄ＝（Ｌｍａｘ−Ｌｍｉｎ）／（Ｌｍａｘ＋Ｌｍｉｎ）。脂肪滴直径及びＤの累積分布に基づき、平均累積分布が構築された。
【０１１２】
レオロジー特性：線形粘弾（ＬＶＥ）特性（Ｇ’及びｔａｎδ）が、２回、動的振動歪み振幅試験により、応力制御型Ｂｏｈｌｉｎ  ＣＶＯ（Ｂｏｈｌｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．、サイレンセスター、英国、から）により、１Ｈｚの一定周波数で且つ２０℃の温度で、測定された。シングル周波数掃引（０．０１〜１００Ｈｚ）が、一定歪みで、ＬＶＥ領域内で、２０℃で実施された。クリープ試験は、２回、２０℃で、ＬＶＥ領域内（＜３５０Ｐａ）で、安定した応力水準で実施された。該クリープ時間は２０００秒であった。鋸歯状の平行平板（直径２５ｍｍ、すき間２ｍｍ）が、スリップを防ぐ為に用いられた。該試料を覆うチャンバーが、蒸発を防ぐ為に用いられた。測定の前に、試料は、５〜１５分間、試料装填により誘発された応力の緩和を許す為に、静止された。得られた機械的スペクトル（mechanical  spectra）は、Ｇ’−周波数曲線に適合したべき乗則（power  law）により分析された
2010505412.tif 000009
。クリープ曲線は、６要素Ｂｕｒｇｅｒｓモデルにより分析され、これはやわらかい固体材料の粘弾性特性を説明する為に適当であると証明されている（Edwards et al., Rheologica Acta. 40 (2001) 142-153を参照されたい）。該モデルは、マックスウェル要素と２つのＫｅｌｖｉｎ−Ｖｏｉｇｔ要素とを、順次含む：
2010505412.tif 000010
瞬間コンプライアンスＪ１は１／Ｇ１に等しく、粘性流動は、ｔ／η１により表され、及び、該等式の残り（２つのＫｅｌｖｉｎ−Ｖｏｉｇｔ要素）は遅延（retarded）コンプライアンスを表す。実施例において、本発明者らは、種々のせん断され且つ架橋された材料の間を区別する為に、Ｊ、η１及び遅延時間τ２（＝Ｇ２／η２）及びτ３（＝Ｇ３／η３）に注目した。
【０１１３】
機械的特性：Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｔ２（Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．、サリー州、英国、から）が、大変形試験の為に用いられた。単軸引張試験は、３ｍｍ・ｓ−１の一定の変形速度により、室温で、該Ｃａ−カゼイネート材料を形成後２時間以内に、実施された。試料は、（夫々個々の試料について測定された）３〜５ｍｍの厚さを有する長方形型（３０×１２ｍｍ）に切り取られた。伸長されるべき部分の長さは１５．２ｍｍであった。少なくとも３の測定が、それぞれの方向（（せん断流動−渦度面（vorticity  plane）に基づく、すなわち得られた破壊面はＳＥＭによりみられたときと同じ平面であった）せん断流動に対して平行及び垂直）における繊維状タンパク質試料について実施された。該試料の繊維状特徴に起因して、破壊は、ときどきすぐに発生し、及びときどき多段階的様式で発生し、測定の間の変動をもたらした。ヘンキー歪み（ε）、引張降伏応力（σ）、及びヤング係数（Ｅ）が、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ＆  Ａｋ（(2003)Cheese Rheology and Texture, CRC press）により記載されたとおりに計算された。見かけ歪み硬化係数ｎ歪みは、３０〜１００％の該測定されたε範囲において、該σ−ε曲線に対してべき乗則適合
2010505412.tif 000011
を適用することにより決定された。ｎ歪みが１の値を超えるとき、該試料は歪み硬化を示す。
【実施例１】
【０１１４】
３０％ｗ／ｗ  Ｃａ−カゼイネート、ＴＧＡ（酵素−タンパク質（Ｅ：Ｐ）比は、重量に基づき１：２０）及び脱塩水からなるタンパク質プレミックス（ｐＨ６．８〜７．０）が、処理に先立ち、低速で且つ室温でキッチンミキサー中で調製された。保存の為に、１％（ｗ／ｗ）安息香酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ツビンドレヒト、オランダ、から）が添加された。
【０１１５】
キッチンミキサー中で調製された該タンパク質プレミックスが、５０℃の一定温度で維持された、予め加熱された該シアーセル（図１に示され、そして、本明細書上記の記載において詳細に説明された）へ移された。該シアーセルの装填後、該混合物が以下のせん断処理に付された：５ｒｐｍで４分（１２ｓ−１）、次に１分で５から５０ｒｐｍへ（１２から１２０ｓ−１へ）の増加、及び５０ｒｐｍでの３０分（１２０ｓ−１）。静止処理の場合、該混合物は３０秒間、５ｒｐｍに付され、そしてその後、該シアーセルは３５分間停止された（０ｒｐｍ）。
【０１１６】
さらに、Ｃａ−カゼイネート試料が、該シアーセル装置中で該せん断された試料を調製したときに、同じ回転速度で、二重反転（counter  rotating）エレメント（これは、Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ  ＤｏＣｏｒｄｅｒに取り付けられた）を有するミキシングボウル（Ｗ−５０）中で調製された。
【０１１７】
（該処理された試料のタンパク質含有量は、ＮＡ２１００窒素及びタンパク質分析器（ＣＥ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ミラノ、イタリア、から）を用いてＤｕｍａｓ法により測定された。該窒素−タンパク質変換係数は６．３８であった（Grappin  &  Lefier,  Proc.  Int.  Dairy  Fed.  Seminar  (1993),  Cork;  and  Guo  et  al.,  Int.  Dairy  J.  6(5)  (1996)  473-483を参照されたい）。平均の測定されたタンパク質含有量は、９５％信頼区間内で２８．４３％±１．１２％であり、これは目的としたタンパク質含有量の３０％に一致した。該混合され且つ架橋されたＣａ−カゼイネート試料は、３５．３９％のタンパク質含有量を有し、これはシネレシスに起因した。）
【０１１８】
処理後、該材料は、該動かないシアーセル内で、約１２℃へと、約１０分で水浴により、冷却された。
【０１１９】
該混合された材料は冷却されなかったが、試料は５０℃ですぐに取られた。
【０１２０】
該処理された材料は、２の正方形平行プレート（１００×１００ｍｍ）からなる型に移され、これは３ｍｍの制御された試料高さを提供した。該材料の一部は、２時間以内に、さらなる分析（引張試験及びＳＥＭの為の試料調製）の為に用いられ、そして一部は、さらなる分析（タンパク質含有量及びＬＶＥ測定）まで４℃で冷蔵庫内で保蔵された。
【０１２１】
マクロ構造の局面に関して、せん断の間のＴＧＡによる該架橋が、該せん断流動の方向に沿って引き裂かれうる真の繊維状マクロ構造物をもたらしたことが注目される。該得られた構造物は、白く且つ光沢があった。図２は、該シアーセル中の該せん断流に対して平行の方向において実施された引張試験後の、せん断され且つ架橋されたタンパク質試料を示す。１ｍｍ未満の典型的サイズを有すると見積もられる個々の肉眼で見える繊維が、脱塩水中での１日間の試料片の分散後に観察されることができた（図２Ｂに示される）。
【０１２２】
ＴＧＡの無い３０％Ｃａ−カゼイネートのせん断は、わずかな異方性特徴を有する著しく層状の構造を結果した。該タンパク質マトリックス単独のせん断後、不透明な白い構造が、ｃｍのオーダーにおける長さスケールを超えて、せん断流動の方向において、はがされ得た。静止条件下で架橋されたＣａ−カゼイネートは、何らの観察可能な整列化無く、堅いタンパク質ゲルを結果した。
【０１２３】
最終的に、３５分間のＣａ−カゼイネート及びＴＧＡの通常の混合は、シネレシスをもたらし及び密に詰まったタンパク質ゲルを結果した。シネレシス後、該残りの試料のタンパク質含有量は、該添加された３０％の変わりに、３５％であった。マクロ構造的観察に基づき、せん断及びＴＧＡによる架橋は、異方性繊維状Ｃａ−カゼイネート構造を形成する為に必須であるとみえた。
【０１２４】
該ミクロ構造に対するせん断及び架橋の効果について、以下が注目される。該処理されたＣａ−カゼイネート材料のミクロ及びナノスケール構造物が、ＳＥＭにより研究された。図３Ａは、せん断された及びせん断されていない架橋されたＣａ−カゼイネートのＳＥＭ画像を示す。せん断により誘発された整列化が、該せん断流動と平行なミクロ構造において見られる。せん断されていない架橋タンパク質構造の多くは、非常に密に詰まっており、そして明白な整列化を見せなかった。
【０１２５】
該せん断され且つ架橋されたタンパク質構造物はまた、オープンスペース及び気泡も含有し、これは明白な方向性を有する繊維を見ることを可能とする。
【０１２６】
図３Ａ．３は、気泡の表面での繊維の例である。いくつかの場合、該繊維方向は、該せん断方向からそれる。明らかに、ＳＥＭにより見られた繊維は、マクロ構造において視覚的に観察された繊維とは全く異なるスケールであり、すなわちｎｍ対ｍｍスケールであり、これは階層的繊維状構造を示唆する。該せん断流動に対し垂直に、２種類のミクロ構造物が観察され、夫々密なタンパク質の球状ドメイン（これは繊維の末端を表しうる）及びやはり整列化されたタンパク質構造物である（図３Ｂ）。後者の整列化は、連結したタンパク質粒子により引き起こされうるか、又は、観察された速度勾配−渦度面の光学的にだます投影により引き起こされうる。しかしながら、この平面における整列化は、マクロスケールについて観察されなかった。
【０１２７】
該画像に基づき、約１００〜２００ｎｍの典型的な繊維直径が推定されることができた。
【０１２８】
ＴＧＡの使用なくせん断されたカルシウムカゼイネートのミクロ構造は、該せん断され且つ同時に架橋されたタンパク質ミクロ構造物と比較して大きな違いを示した。マクロスケールについて、わずかな視認されなかったが、はがされ得る層状構造が形成された。ミクロスケールでは、微妙な方向性が、該せん断流動と平行の平面から推定されることができ（図４Ａ）、これは該せん断流動と垂直の平面についてはより明白でなかった（図４Ｂ）。該タンパク質ネットワークは、該架橋されたタンパク質ネットワークと比べてより多孔性にみえ、これは、それらの孔に自由水が置かれたこと又は繊維の縮みが該架橋された材料において起こったことを示唆しうる。該タンパク質ドメインのサイズは、該架橋されたタンパク質ネットワーク（約１００〜２００ｎｍ）に存在する該球のサイズに匹敵した。
【０１２９】
図５は、静止条件下の架橋されたＣａ−カゼイネートのＳＥＭ画像を示す。仮想のせん断流動に対して平行の（図５Ａ）及び垂直の（図５Ｂ）の該破壊表面のミクロ構造は互いに似ていた。タンパク質ドメインを含む、より密に詰まっていない領域により囲まれた密に詰まっている領域（約０．５μｍ）を観察できる。ＴＧＡは、これらの密に詰まった領域に存在しうるであったろうし、及び架橋は自由水を追い出すことを伴うそのような緊密さ（密に詰まった状態）をもたらしうるであったろうし、該密に詰まった領域の間においてわずかに膨張した及び多孔性のタンパク質構造をもたらす。
【０１３０】
最終的に、混合され且つ架橋されたＣａ−カゼイネートは、約１００ｎｍのタンパク質球からなる密に詰まったミクロ構造を産出した（図６に示される）。該緊密さは、混合の間に発生する該シネレシスにより説明されることができる。不規則に選択された「平行」方向、及び対応する垂直方向の間に違いは観察されなかった。
【０１３１】
要約すると、ＴＧＡの存在下において、単純せん断は、マクロスケールでの強い異方性を誘発した。ミクロスケールの整列化も観察されたが、せん断流動の方向と必ずしも一致しなかった。せん断とＴＧＡとの組み合わせの作用だけが、異方性Ｃａ−カゼイネート構造物を産出した。
【０１３２】
測定されたとおりの該せん断され且つ架橋されたＣａ−カゼイネート構造物の材料特性は、粘弾的及び機械的特性であった。後者は、該処理されたタンパク質材料の異方性特性を明らかにした。
【０１３３】
図７は、種々のＣａ−カゼイネート試料のＬＶＥ領域内のＧ’及びｔａｎδを示す。酵素的架橋はＧ’を増加したがｔａｎδは減少された、これは共有結合が誘発されるところの構造物に典型的である。架橋されたＣａ−カゼイネートのせん断及び静止処理の間のＧ’及びｔａｎδにおける違いはみられなかった。すなわち、せん断は、共有結合の形成に影響しなかった。該混合され且つ架橋されたＣａ−カゼイネート試料は、より大きなＧ’及びわずかにより小さいｔａｎδ値を示し、これは有効なより高いタンパク質濃度により説明されうる。該せん断され且つ架橋されたＣａ−カゼイネート試料の異方性挙動は、ＬＶＥ特性において見られなかった。ＴＧＡの存在だけが、Ｇ’及びｔａｎδにおける明確な違いを結果した。それ故に、該異方性繊維は、小変形により調べられる該長さスケールでの等方性連続体として振舞ったことが、結論付けられうる。
【０１３４】
図８は、処理の間に該試料に対して適用されたせん断流動と比較した、２方向における、せん断され且つ架橋されたＣａ−カゼイネートの引張挙動の典型的な応力−歪み曲線を描く。平行方向における、すなわち該繊維の方向における該降伏（最大）応力及び降伏歪みの両方が、垂直方向における値と比較してはるかに大きいことが直ちに明白である。さらに、該平行方向において伸長された試料についての応力−歪み曲線の曲率は、歪み硬化挙動を示したが、これは他の方向において伸長された試料についての場合ではそうではなかった。
【０１３５】
図９は引張特性を示す：破壊まで伸長された種々のＣａ−カゼイネート試料についての降伏応力σ、降伏歪みε及びヤング係数Ｅ。これらの引張特性に基づき、架橋され且つせん断されたＣａ−カゼイネートが、該せん断流動に対し平行及び垂直の方向において測定された特性の間での大きな違いの故の、異方性の有意な程度を示した。
【０１３６】
せん断されたＣａ−カゼイネートは異方性に振舞った、これはσ及びεにおける違いにより明白である（Ｅにおける違いは有意でなかった）。
【０１３７】
視覚的に及びＳＥＭにより観察されるとおり（図５）、静止条件下で架橋されたＣａ−カゼイネートは異方性でなかった。σ、ε及びＥの平均値（図９）は、架橋され且つせん断されたＣａ−カゼイネートの垂直の値と一致し、これはせん断の間の架橋が、該せん断流動に対して垂直の方向においても生じたことを示唆する。
【０１３８】
混合され且つ架橋されたＣａ−カゼイネートは、平行方向及び垂直方向において伸長された試料の、測定された応力−歪み曲線において違いを示さなかった。それ故に、σ、ε及びＥの平均値は、該材料が非常に弾性であり（高いＥ値）且つ延性である（高いσ値）ことを示す。
【０１３９】
表１は、該せん断流動に対し平行及び垂直の方向において測定された引張特性の間の比を要約する。既に示されたとおり、該異方性繊維状試料は、垂直方向と比較して平行方向においてはるかに強力であり、これは特に降伏応力比σ平行／σ垂直（すなわち約９）により反映される。降伏応力及びヤング係数の比は、異方性Ｃａ−カゼイネート構造物について約２〜３であった。該引張特性の比の値に基づき、ＴＧＡの不在下においてせん断されたＣａ−カゼイネートはわずかな異方性を示した。
【０１４０】
表１（該せん断流動に対し平行及び垂直に測定された引張特性  降伏応力σ、降伏歪みε及びヤング係数Ｅの比。異方性３０％Ｃａ−カゼイネート試料は：せん断され且つ架橋されたＣａ−カゼイネート（Ｃ＋ＴＧ−せん断）及びせん断されたＣａ−カゼイネート（Ｃ−せん断）。）
比  平行／垂直
2010505412.tif 000012
【０１４１】
表２は、引張特性の値を表にし、せん断の効果（静止条件下で架橋されたＣａカゼイネートにより正規化されたせん断され且つ架橋されたＣａ−カゼイネート）及びＴＧＡの効果（ＴＧＡ無しでせん断されたＣａ−カゼイネートにより正規化されたせん断され且つ架橋されたＣａ−カゼイネート）が推測されうるように、Ｃａ−カゼイネート試料の対応する値により正規化された。せん断とＴＧＡとの両方が平行方向において、すなわち異方性のミクロ構造物の方向において、大きな程度で該引張特性に影響した。さらに、該正規化された降伏応力値を考慮すると、（ＴＧＡの存在下における）せん断の強化効果は、ＴＧＡだけの効果のおおよそ２倍であった。これは、せん断及びＴＧＡの相乗効果により説明されうる。
【０１４２】
残念ながら、架橋されていないＣａ−カゼイネートにおけるせん断の効果は決定されることができなかった。なぜなら、せん断及び架橋無しのＣａ−カゼイネートの機械的特性は、その弱い構造に起因して測定されることができなかったからである。せん断及びＴＧＡの両方の効果は、垂直方向における正規化された引張特性について無視できた。なぜなら、該正規化された値は１に近かったからである。
【０１４３】
表２（測定された平行及び垂直方向についての正規化された引張特性  降伏応力σ、降伏歪みε及びヤング係数Ｅ。該せん断され且つ架橋されたＣａ−カゼイネート試料（Ｃ＋ＴＧ−せん断）は、静止条件下で架橋されたＣａ−カゼイネート（Ｃ＋ＴＧ−せん断無し）により正規化され及びせん断されたＣａ−カゼイネート（Ｃ−せん断）により正規化され、夫々せん断及びＴＧＡの効果をもたらす。）
2010505412.tif 000013
【０１４４】
表３は、ＴＧＡを伴う又は伴わない、せん断、混合又は静止の処理後の、該論じられたＣａ−カゼイネート構造物の最も重要なマクロ構造的、ミクロ構造的及び機械的特徴の概観を提供する。せん断及び酵素的架橋の両方が、繊維状Ｃａ−カゼイネート材料の形成にとって必須であったことがわかる。表３において、マクロ構造的、ミクロ構造的及び機械的局面が、「マクロ」、「ミクロ」及び「機械的」により示される。
2010505412.tif 000014
【実施例２】
【０１４５】
タンパク質含有溶液又は分散物が、実施例１に記載の方法に従い調製され、該タンパク質プレミックスは２５％又は３０％（ｗ／ｗ）のいずれかのＣａ−カゼイネートを含みうるものである。酵素の絶対濃度[Ｅ０]は、両方のＣａ−カゼイネート濃度について等しく、それぞれ３０％及び２５％Ｃａ−カゼイネート溶液について、１：２０及び１：１７の酵素：タンパク質比（Ｅ：Ｐ）をもたらした。
【０１４６】
処理（５０℃）の間、ナイルレッド（７２４８５、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）（共焦点レーザー走査型顕微鏡についての脂肪についての蛍光染料）、が０．１ｇ・Ｌ−１の濃度で、融解したパーム油に添加された。この希釈されていない溶液のうち、１５％ｖ／ｖが、該タンパク質−脂肪混合物を該シアーセル装置へ移す前に、該タンパク質プレミックスの適当な量と、手で簡単に混合された。
【０１４７】
該一緒にされたタンパク質−脂肪プレミックスが、該予め加熱された（５０℃）シアーセル装置へ移された。該シアーセルの装填後、該混合物が、該以下のせん断処理に付された：５ｒｐｍ（１２ｓ−１）で４分、次に１分で５ｒｐｍから、指定持続期間についての所望のｒｐｍ値（１０、５０又は１００ｒｐｍ、これはそれぞれ２４、１２０及び２４０ｓ−１に相当する）への増加。この指定持続期間は、せん断時間といわれるであろう。処理後、該材料は該動かないシアーセル中で、約１２℃へと約１０分で冷却された。該測定されたトルク曲線は、ｔ＝０で測定されたトルク値に従い調整された。
【０１４８】
該処理された材料は、２つの正方形平行プレート（１００×１００ｍｍ）からなる型に移され、これは３〜５ｍｍの制御された試料高さを与えた。該材料の一部は、さらなる分析（引張試験及びＳＥＭについての試料調製）のために２時間以内に用いられ、そして更なる分析（ＣＳＬＭ、ＬＶＥ及びクリープ測定）に先立ち４℃で保蔵された。
【０１４９】
該処理条件及び材料組成は、Ｃａ−カゼイネート及び脂肪からの繊維状材料が形成されたかどうかを決定した。それ故に、せん断速度、せん断時間及びたんぱく質濃度の効果が、種々の長さスケールでの処理局面及び結果的な構造的特性の観点で考察されるであろう。
【０１５０】
Ｃａ−カゼイネート−脂肪構造物についてのせん断時間及びタンパク質濃度の効果に関して、せん断との組合せにおける酵素的架橋だけが繊維状Ｃａ−カゼイネート−脂肪構造物をもたらしたことが注目される。該脂肪の存在が該構造物における追加的長さスケールでの異方性を誘発し、それにより、階層的タンパク質−脂肪構造物を産出した。繊維状構造物の形成は時間依存的であり、或るせん断速度を超えたときに、繊維状構造から、シネレシスを伴う損傷した構造への徐々の移行を示す。
【０１５１】
固定されたせん断速度及びせん断時間（１２０ｓ−１及び３０分）でのＴＧＡの存在下における３０％Ｃａ−カゼイネート及び１５％脂肪のせん断は、図１１Ａにおいて示されるとおりの繊維状マクロ構造を結果した。該繊維状材料は手で容易に分離されることができた（繊維＜１ｍｍ）。対照的に、ＴＧＡの不在下でＣａ−カゼイネート及び脂肪がせん断された場合、均一なマクロ構造が、該せん断流動により誘発される何らの方向性無く観察された。
【０１５２】
図１２は、該シアーセル装置中でのＣａ−カゼイネート及び脂肪のせん断の間の（合計）せん断時間の関数としての典型的なトルク曲線を示す。ＴＧＡの存在は、該タンパク質相における共有結合の形成に起因して、該トルク応答を増加した。２５％Ｃａ−カゼイネートについての測定されたトルクは、３０％Ｃａ−カゼイネートと比較してわずかにより低かった。該架橋された試料の組成が類似したとしても（３０％Ｃａ−カゼイネート、１５％脂肪及び（１：２０）ＴＧＡ）、該トルク曲線はいくらか変動を示す。それにもかかわらず、明白な傾向が観察された：比較的一定のトルク値後、３０％及び２５％Ｃａ−カゼイネートの両方についてそれぞれ４５分及び３０分（合計せん断時間）の後、該トルクは突然増加し、これは産物特性における激烈な変化を示唆する。図１１Ｂにおいて示されるとおり、これらの曲線と一致する試料は損傷した構造物であり及び排出された液体（シネレシス）が存在した。一見したところでは、該構造物は繊維状にみえなかったが、注意深い観察後、いくつかの繊維状片がなお観察されることができた。繊維から損傷した構造への移行は、制御できない過程である。２５％Ｃａ−カゼイネート−脂肪の３０分間の１２０ｓ−１でのせん断の二回の処理は、明白な繊維状部分を有し及びいくばくかのシネレシスだけを有する、より損傷していないマクロ構造を結果した。
【０１５３】
結論を出すと、特定のせん断時間条件でだけ、該タンパク質濃度に依存して、繊維状構造物が得られることができた。
【０１５４】
該ミクロ構造に関して、図１３におけるＳＥＭ画像は、ＴＧＡ（１：２０）を用いたせん断及び架橋後の３０％Ｃａ−カゼイネート及び脂肪のミクロ構造を示す。該せん断流動に対して平行（図１３．Ａ１〜Ａ２）及び垂直（図１３．Ｂ１〜２）の平面の間の違いは、同時にせん断され且つ架橋された材料と非常に異なる。密に詰まった繊維が、約１００〜２００ｎｍの典型的な繊維サイズとともに、該せん断流動と平行の方向において形成された。該構造内のオープンスペースで又は気泡の内側表面において、該繊維はより区別されることができた。図１３．Ａ２に示されるとおり、気泡の内側表面における繊維の方向がときどき該せん断方向と異なり、これは該せん断流動の局所的な乱れを示す。該せん断流動と垂直に、いくつかのタンパク質粒子及びいくつかの「融解した」構造物（図１３．Ｂ２）が観察され、ここでは該タンパク質が該脂肪相により覆われているように見えた。いくつかの脂肪球が該構造中に見られたが、全体としては、脂肪の少量だけがＳＥＭにより見られることができ、これは（採用された倍率に依存して）ＳＥＭにより観察された長さスケールに起因しうる。加えて、有機的液体（ＤＭＳＯ、エタノール）中にカゼイネート−脂肪構造物を浸すなどの、ＳＥＭについての該試料の調製方法は、脂肪のあり得る損失を引き起こした。
【０１５５】
メソ構造的レベルについて、せん断され且つ架橋された３０％Ｃａ−カゼイネートのＣＳＬＭ画像は、該脂肪相の存在が追加的な長さスケールでの異方性を誘発し、該構造物をさらにより階層的にすることを明らかにする。図１４．Ａ３は、１２０ｓ−１での３０分のせん断後に得られた３０％Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料における脂肪構造物の２種類を区別した。比較的小さい及び大きい分散した脂肪滴が、該せん断方向に伸長された脂肪相と同様に、観察された。いくつかの独立に処理された試料に基づき、脂肪はたいてい滴形態で存在したが、変形パラメーター（Ｄ）値に基づく変形した状態でも存在したことが観察されることができた（図１４．Ｂ３〜４）。非常に小さい脂肪滴は、該せん断方向に平行又は傾いた方向性を有する、該タンパク質相中のある程度の構造を引き起こした。約４０μｍの典型的なタンパク質層厚さ（すなわち約２００の単独タンパク質繊維からなる）、及び約１０μｍの脂肪相厚さが見積もられうる。
【０１５６】
図１４．Ａ１は、分散した脂肪滴を有する連続的タンパク質相からなる、ＴＧＡの無しで、せん断された３０％Ｃａ−カゼイネート及び脂肪の等方性メソ構造を示す。該脂肪滴直径及び変形パラメーターＤの（最大）平均累積分布は、ＴＧＡ無しで、該脂肪滴は、ＴＧＡを含む該繊維状構造物と比較してサイズにおいてより大きく及びより変形していなかったことを示唆する（図１４．Ｂ２〜４）。
【０１５７】
３０％Ｃａ−カゼイネートについて、１２０ｓ−１の一定のせん断速度でのせん断時間（１５及び３０分）の効果が図１４．Ａ２〜３に示される。３０％Ｃａ−カゼイネート及び脂肪の５及び１５分のせん断後、繊維状マクロ構造物が、目によりすでに観察された。しかしながら、いくつかの脂肪滴方向を除き、これは、３０分間せん断された参考試料と比較して、１５分のせん断について示されるとおりＣＳＬＭ画像からは明らかでない。１５分のせん断後に得られたＣＳＬＭ画像における黒い領域は、この試料に存在する空気含有を示し、これは５分のせん断についても観察された。該脂肪滴直径は、増加したせん断時間と伴に減少したが、Ｄはほとんど変動を示さなかった（図１４．Ｂ１〜３）。
【０１５８】
該タンパク質含有量を２５％に減少した場合（Ｅ：Ｐは１：１７まで増加した）、１７分のせん断後ですでに、繊維状マクロ構造が形成されており、これは図１４．Ａ４において示されるとおり細かく分散した脂肪滴の整列化を示した。該滴は、より高いタンパク質含有量を有する該構造物における滴と比較してより小さく（図１４．Ｂ１）、そして脂肪相は観察されなかった。結論付けると、該メソスケール脂肪構造物の該発達は、３０％Ｃａ−カゼイネートについての、狭いせん断時間枠の間、すなわち１５〜６０分の間で、発達する。タンパク質濃度における減少は、繊維状構造物を得る為の、せん断のこの処理時間枠を減少しさえする。
【０１５９】
該Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料の該ＬＶＥ特性（Ｇ’及びｔａｎδ）が、せん断時間の関数として図１５にプロットされる。繊維状３０％Ｃａ−カゼイネート−脂肪構造物について、Ｇ’の穏やかな増加が、せん断時間、すなわち架橋反応時間の関数として測定された。Ｇ’の該増加は、共有結合の増加により説明されることができる。２５％Ｃａ−カゼイネートへのタンパク質含有量の減少は、１７分のせん断後に、２５％Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料のＧ’のわずかにより低い値を結果した。
【０１６０】
均一な分散した構造を結果した、ＴＧＡの不在下における該せん断されたＣａ−カゼイネート−脂肪構造物は、ＴＧＡにより架橋された該試料と比較して、より低いＧ’及びより高いｔａｎδ値を示す。ｔａｎδが５分のせん断後ですでに、連続したせん断の際に一定のままであった値に減少したことが顕著である。これは、Ｇ’’が５分のせん断内で迅速に増加したこと、及びさらにＧ’と同じ傾向に従うことを示唆する。
【０１６１】
表４は、全ての試料のＧ’−周波数曲線に適合したべき乗則から得られたｎ値をまとめる。
【０１６２】
表４：種々の条件で処理されたＣａ−カゼイネート試料についてのＲ２値による周波数の関数としてのＧ’にフィットされたべき乗則
2010505412.tif 000015
から抽出されたｎの値。非繊維状試料はアスタリスクにより示される。
2010505412.tif 000016
【０１６３】
ｎ値に関する機械的スペクトルは、せん断時間又はせん断速度によりほとんど影響されず、そして、該材料の該組成にだけ依存するようにみえた。該材料における共有結合の存在は、該架橋された試料を非架橋の３０％Ｃａ−カゼイネート試料と比較する場合にｌｏｇ−ｌｏｇプロットの傾きに影響し、これはより固体材料のように振舞わなかった。ＴＧＡの存在下における５分のせん断がすでに、非架橋の材料と比較して、Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料のｎ値における最も大きな変化を誘発した。
【０１６４】
図１６Ａは、３０％Ｃａ−カゼイネート−脂肪試料についてのＬＶＥ領域から、相当するＧ’値により正規化された、応力の関数としての正規化されたＧ’曲線に対するせん断時間の効果を描く。３０％Ｃａ−カゼイネートに基づく該繊維状試料について、せん断時間の関数としての該ＬＶＥ領域の限界について明白な傾向は推定されえなかった。架橋されていない均一な３０％Ｃａ−カゼイネート試料は、該繊維状試料と比較して、非線形における、より急勾配の減少を示し、これは、より弱い非共有結合の存在に起因するかもしれない、高い歪み値で、より急激に影響されたことを示唆する。
【０１６５】
該Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料の、６要素Ｂｕｒｇｅｒｓモデルによるフィットを含む、クリープ曲線が、図１７に示され、これは粘弾性材料の典型的な形を示す。架橋時間における増加、すなわち共有結合における増加は、弾性コンプライアンスの減少を結果し、これは、弾性係数に反比例する。さらに、架橋されていないがせん断されたＣａ−カゼイネート及び脂肪は、該架橋された材料と比較してより粘性に挙動した（これは図１７における挿入において描かれる）。
【０１６６】
図５は、ＢｕｒｇｅｒｓモデルからのフィットされたパラメーターＪ１、η１及び遅延時間τ２及びτ３をまとめる。
【０１６７】
表５  ６要素Ｂｕｒｇｅｒｓモデルからの標準偏差を含む、フィットされたクリープパラメータ。該モデルは、ＬＶＥ領域内の２０℃で測定されたクリープ曲線にフィットされた。繊維状でない試料はアスタリスクにより示される：
2010505412.tif 000017
【０１６８】
架橋されていない材料と比較した、５分のせん断及び架橋後のＪ１及び遅延時間における大きな減少並びにη１の増加は、ＴＧＡの存在が、クリープパラメータに対する最も大きな影響を有したことを明白に示唆する。遅延時間における該急勾配の減少は、Ｃａ−カゼイネートマトリックスが、該酵素により多かれ少なかれ粘性のタンパク質マトリックスから弾性材料へと迅速に変形されたことを示唆する。共有結合の存在は、該構造物内のより可動的でない分子を結果し、及び、η１の上昇により反映されるより長い時間スケールでの流動に対するより大きな抵抗性を結果した。せん断（反応）時間のさらなる増加は、Ｊ１、τ２及びτ３に対するわずかな減少効果を有した。遅延時間を決定するパラメータＧ２、Ｇ３、τ２及びτ３が、増加するせん断時間に伴い増加したことが注目されねばならない。
【０１６９】
図１８は、繊維状の２５％及び３０％Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料についてのせん断時間の関数としての機械的特性（降伏応力σ、降伏歪みε、ヤング係数Ｅ及び見かけ歪み硬化係数ｎ）を示す。架橋されていない３０％Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料の機械的特性も、図１８に包含される。１２０ｓ−１での５分のせん断後ですでに、該繊維方向と平行及び垂直な機械的特性が違いを示したので、異方性が３０％Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料において観察された。さらに、該垂直方向において測定された機械的特性は、せん断時間の関数として多かれ少なかれ一定のままであった。これは、共有結合による該繊維状構造物の強化が、該流動方向において主に発生したことを示唆する。該平行方向における該降伏応力により特徴付けられる該異方性は、３０％Ｃａ−カゼイネート及び脂肪についてのせん断時間の増加に伴い、激烈に増加した。１７分間せん断された、２５％Ｃａ−カゼイネート及び脂肪の機械的特性は、１５分間せん断された３０％Ｃａ−カゼイネート試料の該特性と多かれ少なかれ類似であった。３０％Ｃａ−カゼイネート及び脂肪に基づく架橋されていない材料は、全ての引張パラメーターに関して等方性材料として振舞った。顕著に、該架橋されていない等方性材料の機械的特性は、該せん断流動と垂直に測定された該繊維状材料の機械的特性と多かれ少なかれ等しかった。これはやはり、共有結合が該せん断流動と垂直に形成されなかったことを含意する。該ヤング係数は、１５分のせん断後に増加し始めたが（３０％Ｃａ−カゼイネート）、該降伏歪み及び歪み硬化係数は、せん断の最初の１５分で増加し、そしてその後は一定のままであった。一般に、該繊維状３０％Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料はより延性になり、及び、繊維方向における歪み硬化を示したが（降伏応力及び降伏歪みにおける増加）、それらは該垂直方向においては脆性のままであった（低い降伏応力及び降伏歪み）。
【０１７０】
表６は、該繊維方向と平行及び垂直に測定された機械的特性の比に対するせん断時間の効果をまとめており、これは該繊維品質の尺度として解釈されうる。せん断時間の増加は、該繊維状３０％Ｃａ−カゼイネート材料の全ての４つの機械的パラメーターに正に影響し、このうち降伏応力が主に増加した。顕著に、最も大きな降伏応力比は、より低いタンパク質含有量（２５％Ｃａ−カゼイネート）を有する該繊維状構造物について見られた。
【０１７１】
表６：該シアーセル装置においてかけられた（１２０ｓ−１での）該せん断流動と平行及び垂直に測定された、繊維状及び非繊維状Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料の引張特性の比に対するせん断時間及びせん断速度の効果。非繊維状試料はアスタリスクにより示される。
2010505412.tif 000018
【０１７２】
一定のせん断速度でのせん断時間の効果の調査後、３０％Ｃａ−カゼイネート、１５％脂肪及びＴＧＡ（１：２０）に基づく繊維状構造物の形成に対する、３０分の固定されたせん断時間でのせん断速度の影響が調査された。該せん断速度は、繊維状構造物の形成及び繊維状の程度の両方を制御する為の処理パラメーターであるとみえた。
【０１７３】
図１９は、該シアーセル中で３０％Ｃａ−カゼイネート、脂肪及びＴＧＡを処理する間のせん断時間の関数としてのトルクに対する３つのせん断速度の効果を示す。せん断速度の増加は、より高いトルク応答を引き起こし、これは、最大で２５分の（合計）せん断時間に有効であった。しかしながら、２４ｓ−１で、該トルク曲線は、３０％及び２５％Ｃａ−カゼイネート−脂肪のそれぞれの１２０ｓ−１での３０分及び６０分せん断について以前に観察されたのと同様に、突然に増加した。該２つの後者の場合、損傷した構造物及びシネレシスが、繊維状構造の過剰せん断の結果であった。２４ｓ−１での３０分間のせん断後、いくらかの排出された脂肪及びわずかなシネレシスを伴う等方性マクロ構造が観察された。おそらく、破壊に先立つ低いせん断速度で、Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料において整列化は誘発されなかった。測定されたトルクプロファイルにおける該突然の増加は、せん断の間の、等方性構造物の崩壊又は形成を示唆し得、水又は脂肪−豊富相の排出を伴い得る。１２０ｓ−１（以前に議論された参照試料）及び２４０ｓ−１でのせん断の両方が、繊維状材料を結果し、このうち後者は、前者と比較して質的により繊維状であるようにみえた。低い及び中間のせん断速度を比較する場合、該低いせん断速度（２４ｓ−１）についての平均累積滴直径曲線は、該メソ構造におけるより小さいサイズの脂肪滴の存在を示唆したが、Ｄパラメーターの平均累積曲線は同じであった（図１４．Ｂ２〜４）。２４０ｓ−１の最も高いせん断速度で得られたメソ構造は、不規則な脂肪滴並びにせん断流動方向において層（約１０μｍ厚さ）内に整列された脂肪構造物を有する分散した構造物を示した。直径及びＤに対するせん断速度の明白な効果は、該調査されたせん断速度を全て考慮に入れた場合に、推定されることができなかった。該繊維状材料のＬＶＥ特性における変動は、ＴＧＡの反応時間として見られず、これは共有結合の数が夫々のせん断速度で等しいことを示唆する。低いせん断速度では、得られた該等方性材料は、わずかにより高いＧ’値を有し、これは、全ての架橋が該せん断流動方向において形成されなかった故の、より多くの相互連結されたタンパク質ネットワークの存在により説明されうる。歪みの関数としての正規化されたＧ’曲線を示す図１６Ｂは、非繊維状試料（２４ｓ−１）のＬＶＥ領域の限界が、繊維状試料（１２０及び２４０ｓ−１）のＬＶＥ限界と比較してはるかに高いことを示し、これは異方性の尺度として、ＬＶＥ領域を限定する該歪みが用いられうることを含意する。該せん断速度は、表５において示されるとおり、該クリープパラメーターにほとんど影響しなかった。
【０１７４】
図２０は、機械的特性に対するせん断速度の効果をまとめる。一般に、大きな９５％信頼区間が、特には該繊維方向に対して平行に、繊維状試料の段階的及び漸次的破壊により説明されることができる。該せん断流動に対し平行及び垂直に測定された機械的特性に基づき、低いせん断速度（２４ｓ−１）で得られた３０％Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料が、等方性材料として挙動したことが結論付けられうる。この試料の該ヤング係数は、該材料が、より高いせん断速度で形成された該繊維状材料と比較して非常に弾性であることを確認した。該繊維方向と平行に測定された降伏応力、降伏歪み及び見かけ歪み硬化係数は、せん断速度の増加に伴い増加したが、ヤング係数は減少した。該流動方向に垂直に測定された機械的特性は、等方性から異方性材料への移行における（すなわち２４と１２０ｓ−１との間）せん断速度の増加に伴いわずかに減少した。該移行後、該繊維方向と垂直に測定された異方性材料の機械的特性は、該せん断速度によりほとんど影響されなかった。
【０１７５】
全ての処理パラメーター（せん断速度及びせん断時間）を考慮した場合、該せん断流動と垂直に測定された該異方性繊維状材料の全ての機械的特性は類似であり且つ該処理から独立していたことが結論付けられる。さらに、これらの機械的特性は、等方性の、架橋されていない３０％Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料のものと等しかった。これは、共有結合が、該繊維状材料における渦度−せん断流動平面において形成されなかったことを確認し、これは脂肪の存在により部分的に阻害される。表７は、該繊維方向に平行及び垂直に測定された該繊維状材料の機械的特性の比をまとめる。これらの比に基づき、最も高いせん断速度（２４０ｓ−１）で形成された３０％Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料が最も繊維状であり、該せん断速度は、せん断され且つ架橋されたタンパク質−脂肪材料の繊維状態を制御する為に用いられうることを示唆する。
【０１７６】
表７：該シアーセル装置中で（３０分間）かけられた該せん断流動に平行及び垂直に測定された繊維状及び非繊維状３０％Ｃａ−カゼイネート−脂肪材料の引張特性の比に対するせん断速度の効果。非繊維状試料はアスタリスクにより示される。
2010505412.tif 000019
【実施例３】
【０１７７】
０．５％キサンタンを含む２０％Ｃａ−カゼイネートプレミックス（１００ｇ当たり７２ｇのＮａ−ベンゾエート含有脱塩水＋０．５ｇのキサンタン＋７．５ｇのＴＧＡ溶液＋２０ｇのＣａ−カゼイネートを含む）（＝試料１）が、最初に、キサンタンと１％Ｎａ−ベンゾエートとを脱塩水中で、約１０分間、３０〜４０℃で混合し及び次にさらに約５０分間、室温で混合することにより調製された。２０％ＴＧＡ溶液が次に、（１：２０の酵素対タンパク質（Ｅ：Ｐ）の最終比を得る為に）該キサンタン溶液に添加され、そして、この非常に粘性の分散物（溶解していないゲル様粒子をいくつか含んだ）を該タンパク質に添加する少し前に混合された。また、ＴＧＡのより低い量を有し（Ｅ：Ｐ＝１：４０）及びＮａ−ベンゾエートを除く３０％Ｃａ−カゼイネートプレミックス（＝試料２）が調製された。全ての成分は、キッチンミキサー中で低速で且つ室温で、該プレミックスを該予備加熱されたシアーセル（５０℃）へと移す前に混合された。両方の混合物は、以下のとおりにせん断された：５ｒｐｍで４分、該ｒｐｍが５から５０ｒｐｍへと増加するところの１分、及び５０ｒｐｍでの一定の持続時間、これは２０％Ｃａ−カゼイネート−キサンタン混合物については３４分であり、及び、３０％Ｃａ−カゼイネート試料については１５分であった。せん断後、該試料は、約１２℃の温度が達せられるまで、１５分間冷却された。該材料の分析は実施されなかった。
【０１７８】
２０％Ｃａ−カゼイネート−キサンタン（試料１）のせん断は、硬いテクスチャーを有する繊維状マクロ構造（図２２）を結果した。キサンタンの不在下における２０％Ｃａ−カゼイネート（ＴＧＡ１：１０及び１：２０を有し、及び脂肪の存在下である）のせん断は、繊維状材料をもたらさなかった。
【０１７９】
副成分Ｎａ−ベンゾエートの排除及びＴＧＡの減少（試料２）は、広範囲にわたるシネレシス（初期重量の約２５％）を示す等方性材料を産出した。該材料は非常に弾性であった。該黄色により、それは、処理後のＮａ−カゼイネートに類似する。Ｎａ−ベンゾエートの不在下におけるより高いＴＧＡ濃度（１：２０）は、類似の構造を結果した。
【実施例４】
【０１８０】
実施例１と同様に、Ｃａ−カゼイネート及びＮａ−カゼイネートの混合物が、単純せん断に付される。その結果は表８において与えられる。表８は、レオロジーを用いて及び該シアーセル中で分析されたときの、Ｎａ−ベンゾエート（１〜７０ｍＭ）を有するＣａ−カゼイネートとＮａ−カゼイネートとの混合物の概要を提供する。成功した、繊維状の試料について、その引張特性の比が与えられる。
2010505412.tif 000020
【図１ａ】
2010505412.tif 000021
【図１ｂ】
2010505412.tif 000022
【図２Ａ】
2010505412.tif 000023
【図２Ｂ】
2010505412.tif 000024
【図３】
2010505412.tif 000025
【図４】
2010505412.tif 000026
【図５】
2010505412.tif 000027
【図６】
2010505412.tif 000028
【図７】
2010505412.tif 000029
【図８】
2010505412.tif 000030
【図９】
2010505412.tif 000031
【図１０】
2010505412.tif 000032
【図１１Ａ】
2010505412.tif 000033
【図１１Ｂ】
2010505412.tif 000034
【図１２】
2010505412.tif 000035
【図１３】
2010505412.tif 000036
【図１４Ａ】
2010505412.tif 000037
【図１４Ｂ】
2010505412.tif 000038
【図１５】
2010505412.tif 000039
【図１６】
2010505412.tif 000040
【図１７】
2010505412.tif 000041
【図１８】
2010505412.tif 000042
【図１９】
2010505412.tif 000043
【図２０】
2010505412.tif 000044
【図２１】
2010505412.tif 000045
【図２２】
2010505412.tif 000046
【国際調査報告】
2010505412.tif 000047
2010505412.tif 000048
2010505412.tif 000049