(57)【要約】  本発明は、細胞におけるＩｃｒａｃ活性の根底にあるＣＲＡＣＭ相同体のアイデンティティを決定するための方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１の寄与を決定するためのアッセイであって、前記細胞のＩｃｒａｃ活性の不活性化動態、活性化動態、およびカルシウム流入を測定することを含むアッセイ。
【請求項２】
Ｉｃｒａｃ活性の遅いカルシウム依存性不活性化が前記細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１の寄与を示す、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
３５±７秒の最大半量活性化時間（±s.e.m.）を有する活性化動態が、前記細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１の寄与を示す、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
細胞におけるＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ２の寄与を決定するためのアッセイであって、前記細胞のＩｃｒａｃ活性の不活性化動態、活性化動態、およびカルシウム流入を測定することを含むアッセイ。
【請求項５】
２１±３秒の最大半量活性化時間（±s.e.m.）を有する活性化動態が、前記細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ２の寄与を示す、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項６】
カルシウム非依存性不活性化が前記細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ２の寄与を示す、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項７】
細胞におけるＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ３の寄与を決定するためのアッセイであって、前記細胞のＩｃｒａｃ活性の不活性化動態、活性化動態、およびカルシウム流入を測定することを含むアッセイ。
【請求項８】
６３±７秒の最大半量活性化時間（±s.e.m.）を有する活性化動態が、前記細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ３の寄与を示す、請求項６に記載のアッセイ。
【請求項９】
不活性化動態を測定することが、前記不活性化動態のカルシウム依存性を測定することを含む、請求項６に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記不活性化動態のカルシウム依存性が前記細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ３の寄与を示す、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項１１】
細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２、およびＣＲＡＣＭ３の寄与を決定するためのアッセイであって、前記Ｉｃｒａｃ活性のイオン選択性を測定することを含むアッセイ。
【請求項１２】
細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２、およびＣＲＡＣＭ３の寄与を決定するためのアッセイであって、２−ＡＰＢの存在下においてＩｃｒａｃ活性を測定することを含むアッセイ。
【請求項１３】
５０μＭ以上の濃度の２−ＡＰＢの存在下におけるＩｃｒａｃ電流の増強が、前記Ｉｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ３の寄与を示す、請求項１２に記載のアッセイ。
【請求項１４】
５μＭ以下の濃度の２−ＡＰＢにおけるＩｃｒａｃ電流の増強、および１０μＭ以上の２−ＡＰＢの存在下におけるＩｃｒａｃ電流の抑制が、前記Ｉｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１の寄与を示す、請求項１２に記載のアッセイ。
【請求項１５】
前記増強がストア枯渇の非存在下において起こる、請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項１６】
細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２、および／またはＣＲＡＣＭ３の寄与を決定するためのアッセイであって、Ｉｃｒａｃ活性の活性化動態、不活性化動態、イオン透過、薬理学、およびイオン選択性を測定することを含み、前記細胞が、免疫不全症の対象由来である、アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本出願は、すべての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられている、２００７年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／８９６，５７２号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
[0002]  本発明は、一般的に、ＣＲＡＣＭ相同体および細胞におけるＩｃｒａｃ活性に関する。特に、本発明は、細胞におけるＩｃｒａｃ活性に寄与するＣＲＡＣＭ相同体のアイデンティティを決定するための方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  多くの細胞型において、ストア作動性Ｃａ２＋流入は、細胞内ストアからのＣａ２＋のＩＰ３媒介性放出に続く細胞内Ｃａ２＋の長時間持続上昇の根底にある主要な（それだけではないとすれば）機構を表す。以前の研究によって、ＥＲ内腔Ｃａ２＋濃度のセンサーとしてのＳＴＩＭ１、および形質膜におけるカルシウム放出活性化カルシウム（CRAC）チャネルとしてのＣＲＡＣＭ１（またはOrai1）が同定されている。Ｃａ２＋ストア枯渇によって、ＳＴＩＭ１は、形質膜下の小胞構造（点状構造）へと転位置し、そこで、ＣＲＡＣＭ１の多量体集合物に結合して、それを活性化する可能性がある。個々にではなく、一緒に過剰発現した場合、ＳＴＩＭ１およびＣＲＡＣＭ１は、大きなＣＲＡＣ電流を再構成する。以下の３つの哺乳動物相同性ＣＲＡＣチャネルタンパク質がある：ＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２、およびＣＲＡＣＭ３。ＣＲＡＣＭ２は、ＳＴＩＭ１と共発現した場合、ストア作動性Ｃａ２＋流入を増強し、大きなＣＲＡＣ電流を生じることが示されている。同じ研究により、ＣＲＡＣＭ３がストア作動性Ｃａ２＋流入を増強せず、電流が観察されなかったことが見出されたが、ＣＲＡＣＭ１がｓｉＲＮＡによってノックダウンされた場合、明らかに、そのタンパク質は、ストア作動性Ｃａ２＋流入を正常レベルまで回復させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
[0004]  ストア作動性カルシウム流入は、細胞機能の遍在性要素であり、ＣＲＡＣチャネルは、幅広い種類の細胞過程にとって重要である。ＣＲＡＣチャネル相同体は、別々の電気生理学的および薬理学的特性を示し、したがって、異なる細胞におけるＩｃｒａｃ活性に寄与するＣＲＡＣチャネルのアイデンティティを決定するための方法およびアッセイの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
[0005]  したがって、本発明は、細胞におけるＩｃｒａｃ活性への異なるＣＲＡＣＭチャネルの寄与を決定するためのアッセイ、組成物、および方法を提供する。
【０００６】
[0006]  一態様において、本発明は、細胞におけるＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１の寄与を決定するためのアッセイを提供する。アッセイは、前記細胞のＩｃｒａｃ活性の不活性化動態（不活性化速度論）、活性化動態（活性化速度論）、およびカルシウム流入の測定を含む。本発明の一実施形態において、Ｉｃｒａｃ不活性化動態の遅い不活性化相のカルシウム依存性抑制は、前記細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１の寄与を示す。
【０００７】
[0007]  別の態様において、本発明は、細胞におけるＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ２の寄与を決定するためのアッセイを提供する。アッセイは、前記細胞のＩｃｒａｃ活性の不活性化動態、活性化動態、およびカルシウム流入の測定を含む。本発明の一実施形態において、Ｉｃｒａｃ不活性化動態の遅い不活性化相のカルシウム依存性抑制は、前記細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ２の寄与を示す。
【０００８】
[0008]  さらに別の態様において、本発明は、細胞におけるＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ３の寄与を決定するためのアッセイを提供する。アッセイは、前記細胞のＩｃｒａｃ活性の不活性化動態、活性化動態、およびカルシウム流入の測定を含む。本発明の一実施形態において、Ｉｃｒａｃ不活性化動態の遅い不活性化相のカルシウム依存性抑制は、前記細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ３の寄与を示す。
【０００９】
[0009]  一態様において、本発明は、細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２、およびＣＲＡＣＭ３の寄与を決定するためのアッセイであって、前記Ｉｃｒａｃ活性のイオン選択性を測定することを含むアッセイを提供する。
【００１０】
[0010]  別の態様において、本発明は、細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２、およびＣＲＡＣＭ３の寄与を決定するためのアッセイであって、２−ＡＰＢの存在下においてＩｃｒａｃ活性を測定することを含むアッセイを提供する。
【００１１】
[0011]  好ましい態様において、細胞におけるＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２、およびＣＲＡＣＭ３の寄与は、表Ｉに記載されているように、Ｉｃｒａｃ活性の機能特性の組合せの測定を用いて決定される。
【００１２】
【表１】
2010521975.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】[0012]（Ａ）ＣＲＡＣＭ１（「１」で示す）、ＣＲＡＣＭ２（「２」で示す）、およびＣＲＡＣＭ３（「３」で示す）を一過性に過剰発現するＳＴＩＭ１安定発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＩＰ３（２０μＭ）によって誘導される−８０ｍＶでの平均ＣＲＡＣ電流密度を示すグラフである。白丸は、３つの相同体の野生型構築物＋ＣＲＡＣＭ１のドミナントネガティブなＥ１０６Ｑ突然変異体（CRACM1-E106Q+CRACM1 n=6+CRACM2 n=6+CRACM3 n=7）を同時トランスフェクトされた細胞を表す。［Ｃａ２＋］ｉは、２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡでほぼゼロに固定された。（Ｂ）１２０秒時点で得られる、パネルＡに示された代表的なＨＥＫ２９３細胞から抽出されたＣＲＡＣ電流の平均電流電圧（I/V）関係を示すグラフである。データは、ＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２、およびＣＲＡＣＭ３に対応する、−１５０ｍＶから＋１５０ｍＶへの５０ｍ秒間ランプ電位によって誘起された、漏洩を引き算した電流密度（pA/pF）を表す。点線は、ＣＲＡＣＭ２  Ｉ／ＶおよびＣＲＡＣＭ３  Ｉ／Ｖに対応するが、−１４０ｍＶでのＣＲＡＣＭ１振幅に一致するようにスケーリングされている。（Ｃ）ＣＲＡＣＭ１（「１」で示す）、ＣＲＡＣＭ２（「２」で示す）、およびＣＲＡＣＭ３（「３」で示す）を発現する細胞における、２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡを用い、かつＩＰ３を取り除いての受動的ストア枯渇後の平均ＣＲＡＣ電流密度を示すグラフである。電流は、パネルＡのように分析された。（Ｄ）実験における３００秒時点での、パネルＣに示された代表的なＨＥＫ２９３細胞から抽出された平均Ｉ／Ｖトレースを示すグラフである。トレースは、ＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２、およびＣＲＡＣＭ３に対応する。
【図２】[0013]（Ａ）ＣＲＡＣＭ１；（Ｂ）ＣＲＡＣＭ２；（Ｃ）ＣＲＡＣＭ３を一過性に過剰発現するＳＴＩＭ１安定発現ＨＥＫ２９３細胞における、１０ｍＭ  ＥＧＴＡと共にＩＰ３（２０μＭ）によって誘導された−８０ｍＶでの平均ＣＲＡＣ電流密度を示すグラフである。（Ｄ）発現する細胞において−２０ｍＶ、−４０ｍＶ、−６０ｍＶ、および−８０ｍＶへのステップパルス（２秒間持続）によって誘起された平均ＣＲＡＣ電流を示すグラフである。各パルスの初めにおいて、残存する容量性アーチファクトを排除するために２．５ｍ秒間を削除してブランクとした。（Ｅ）ＣＲＡＣＭ２を発現する細胞において−２０ｍＶから−８０ｍＶまでのステップパルスによって誘起された平均ＣＲＡＣ電流を示すグラフである。（Ｆ）ＣＲＡＣＭ３を発現する細胞において−２０ｍＶから−８０ｍＶまでのステップパルスによって誘起された平均ＣＲＡＣ電流を示すグラフである。
【図３】[0014]（Ａ）ＣＲＡＣＭ１発現細胞；（Ｂ）ＣＲＡＣＭ２発現細胞；（Ｃ）ＣＲＡＣＭ３発現細胞を一過性に過剰発現するＳＴＩＭ１安定発現ＨＥＫ２９３細胞においてＩＰ３（２０μＭ）によって誘導された−８０ｍＶでの平均ＣＲＡＣ電流密度を示すグラフである。（Ｄ）パネルＡ〜Ｃに示された細胞から１２０秒（CRACM3については１５０秒）時点で抽出されて、［Ｃａ２＋］ｉに対してプロットされた、−８０ｍＶにおけるＣＲＡＣＭ１（黒色）、ＣＲＡＣＭ２（青色）、およびＣＲＡＣＭ３（赤色）の平均電流密度を示すグラフである。（Ｅ）［Ｃａ２＋］ｉに対してプロットされた、ＣＲＡＣＭ１（「１」で示す）、ＣＲＡＣＭ２（「２」で示す）、およびＣＲＡＣＭ３（「３」で示す）の最大半量活性化時間を示すグラフである。データは、パネルＡ〜Ｃに示された細胞から導かれた。（Ｆ）空ベクターをトランスフェクトされた（緑色、n=14）、またはＣＲＡＣＭ１（「１」で示す）、ＣＲＡＣＭ２（「２」で示す）、もしくはＣＲＡＣＭ３（「３」で示す）を一過性に過剰発現する、ＳＴＩＭ１安定発現ＨＥＫ２９３細胞においてストア枯渇によって誘導された［Ｃａ２＋］ｉの平均変化を示すグラフである。矢印は、ストア枯渇を誘導するためのＣａ２＋を含まない溶液におけるタプシガルジン（２μＭ）の投与、およびＣａ２＋流入を探索するための２ｍＭ  Ｃａ２＋の再進入を示す。挿入図は、四角形で囲まれたトレース区域を微分することによって得られる［Ｃａ２＋］ｉの速度を表す。
【図４】[0015]（Ａ）ＣＲＡＣＭ１（「１」で示す）、ＣＲＡＣＭ２（「２」で示す）、またはＣＲＡＣＭ３（「３」で示す）を一過性に過剰発現するＳＴＩＭ１安定発現ＨＥＫ２９３細胞においてＩＰ３（２０μＭ）によって誘導された−８０ｍＶでの平均正規化ＣＲＡＣ電流を示すグラフである。個々の細胞の電流は、１２０秒時点での溶液変化前の電流に対して正規化された（I/I120s）。［Ｃａ２＋］ｉは、２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡでほぼゼロに固定された。バーは、名目上Ｃａ２＋を含まない外液の投与を示す。（Ｂ）１２０秒および１８０秒時点で得られるパネルＡに示された代表的な細胞から抽出されたＣＲＡＣＭ２電流の平均Ｉ／Ｖ関係（n=7）を示すグラフである。データは、−１５０ｍＶから＋１５０ｍＶへの５０ｍ秒間ランプ電位によって誘起された、漏洩を引き算した電流密度（ｐＡ／ｐＦ）を表す。（Ｃ）実験における１２０秒および１８０秒時点でのパネルＡに示された代表的な細胞から抽出されたＣＲＡＣＭ３電流の平均Ｉ／Ｖ関係（n=9）を示すグラフである。（Ｄ）ＣＲＡＣＭ１（「１」で示す）、ＣＲＡＣＭ２（「２」で示す）、またはＣＲＡＣＭ３（「３」で示す）を一過性に過剰発現するＳＴＩＭ１安定発現ＨＥＫ２９３細胞においてＩＰ３（２０μＭ）によって誘導された−８０ｍＶでの平均正規化ＣＲＡＣ電流（I/I120s）を示すグラフである。バーは、Ｎａ＋の存在下で１０ｍＭ  Ｂａ２＋を含む外液の投与を示す。（Ｅ）ＣＲＡＣＭ１（「１」で示す）、ＣＲＡＣＭ２（「２」で示す）、またはＣＲＡＣＭ３（「３」で示す）を一過性に過剰発現するＳＴＩＭ１安定発現ＨＥＫ２９３細胞においてＩＰ３（２０μＭ）によって誘導された−８０ｍＶでの平均正規化ＣＲＡＣ電流（I/I120s）を示すグラフである。バーは、外部Ｎａ＋がＴＥＡ＋に置換されている、１０ｍＭ  Ｂａ２＋を含む外液の投与を示す。（Ｆ）ＣＲＡＣＭ１（「１」で示す）、ＣＲＡＣＭ２（「２」で示す）、またはＣＲＡＣＭ３（「３」で示す）を一過性に過剰発現するＳＴＩＭ１安定発現ＨＥＫ２９３細胞においてＩＰ３（２０μＭ）によって誘導された−８０ｍＶでの平均正規化ＣＲＡＣ電流（I/I120s）を示すグラフである。バーは、二価を含まない外液の投与を示す。（Ｇ）ＣＲＡＣＭ１（「１」で示す）、ＣＲＡＣＭ２（「２」で示す）、またはＣＲＡＣＭ３（「３」で示す）を一過性に過剰発現するＳＴＩＭ１安定発現ＨＥＫ２９３細胞においてＩＰ３（２０μＭ）によって誘導された−８０ｍＶでの平均正規化ＣＲＡＣ電流（I/I120s）を示すグラフである。バーは、５０μＭ  ２−ＡＰＢを含む外液の投与を示す。
【図５】[0016]（Ａ）ＣＲＡＣＭ３を一過性に過剰発現するＳＴＩＭ１安定発現ＨＥＫ２９３細胞において１０ｍＭ  ＥＧＴＡと共にＩＰ３（２０μＭ）によって誘導された−８０ｍＶでの平均ＣＲＡＣ電流密度（n=3）を示すグラフである。０．５Ｈｚのペースで送達される５０ｍ秒間かけて−１００ｍＶ〜＋１００ｍＶに及ぶランプ電位によるＣＲＡＣ電流が、連続的にモニターされた。ＣＲＡＣ電流が完全に活性化された後（１２０秒）、２秒間持続の矩形電圧パルスを−８０ｍＶへと送達した（パネルＢ参照）。その後、細胞を、二価を含まない細胞外液に曝露し、別の電圧パルスを印加した。（Ｂ）１０ｍＭ  Ｃａ２＋の存在下（黒色）、およびＤＶＦ溶液中において−８０ｍＶへのステップパルス（２秒間持続）によって誘起された平均ＣＲＡＣ電流（n=3、パネルＡと同じ細胞）を示すグラフである。ＤＶＦ溶液中における不活性化の減少に注目されたい。
【図６】[0017]ＣＲＡＣＭ３のストア非依存性およびＳＴＩＭ非依存性活性化を示すグラフである。（Ａ）ＣＲＡＣＭ３のみ（STIM1なし）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において測定されたＣＲＡＣ電流の正規化平均時間経過。個々の細胞の電流については、−８０ｍＶおよび＋８０ｍＶにおいて測定し、細胞静電容量によって正規化し、平均し、時間に対してプロットした（n=6±S.E.M.）。細胞質カルシウムについては、２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡおよび２０μＭ  ＩＰ３でほぼゼロに固定した。（Ｂ）ＣＲＡＣＭ３のストア非依存性およびＳＴＩＭ非依存性活性化を示すグラフである。実験における１８０秒時点でのパネルＡに示された代表的なＨＥＫ２９３細胞から抽出されたＣＲＡＣ電流の平均電流電圧（I/V）関係。データは、細胞静電容量（ｐＦ）に対して正規化された、−１５０ｍＶから＋１５０ｍＶへの５０ｍ秒間ランプ電位によって誘起された、漏洩を引き算した電流を表す。
【図７】[0018]ＣＲＡＣＭ１ポア突然変異体を介する２−ＡＰＢ誘導性電流を示すグラフである。（Ａ）ＣＲＡＣＭ１−Ｅ１０６Ｄを一過性に過剰発現するＨＥＫ２９３野生型細胞における−８０ｍＶ（黒色）、＋８０ｍＶ（白丸）、および＋１３０ｍＶ（赤色）での平均正規化ＣＲＡＣ電流。内液は、１５０ｎＭ  Ｃａ２＋に緩衝された。バーは、５０μＭ  ２−ＡＰＢを含む外液の投与を示す（n=5）。（Ｂ）ＣＲＡＣＭ１ポア突然変異体を介する２−ＡＰＢ誘導性電流を示すグラフである。２−ＡＰＢ投与前およびＣＲＡＣ再活性化中のパネルＡに示されたデータセットについての例のＩ／Ｖ曲線。（Ｃ）ＣＲＡＣＭ１ポア突然変異体を介する２−ＡＰＢ誘導性電流を示すグラフである。ＳＴＩＭ１を安定に発現し、かつＣＲＡＣＭ１−Ｅ１９０Ａを一過性に過剰発現するＨＥＫ２９３における−８０ｍＶ（黒色）、＋８０ｍＶ（白丸）、および＋１３０ｍＶ（赤色）での平均正規化ＣＲＡＣ電流。内液は、２０μＭ  ＩＰ３を含んだ。バーは、５０μＭ  ２−ＡＰＢを含む外液の投与を示す（n=9）。（Ｄ）ＣＲＡＣＭ１ポア突然変異体を介する２−ＡＰＢ誘導性電流を示すグラフである。２−ＡＰＢ投与前およびＣＲＡＣ電流促進のピークにおけるパネルＣに示されたデータセットについての例のＩ／Ｖ曲線。（Ｅ）ＣＲＡＣＭ１ポア突然変異体を介する２−ＡＰＢ誘導性電流を示すグラフである。ＣＲＡＣＭ１−Ｅ１９０Ａを一過性に過剰発現するＨＥＫ２９３野生型細胞における−８０ｍＶ（黒色）、＋８０ｍＶ（白丸）、および＋１３０ｍＶ（赤色）での平均正規化ＣＲＡＣ電流。内液は、１５０ｎＭ  Ｃａ２＋に緩衝された。バーは、５０μＭ  ２−ＡＰＢを含む外液の投与を示す（n=8）。（Ｆ）ＣＲＡＣＭ１ポア突然変異体を介する２−ＡＰＢ誘導性電流を示すグラフである。２−ＡＰＢ投与前およびＣＲＡＣ電流促進のピークにおけるパネルＡに示されたデータセットについての例のＩ／Ｖ曲線。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
略語
[0019]  「２−ＡＰＢ」は、２−アミノエトキシジフェニルボレートを表す。
【００１５】
[0020]  「ＩＰ３」は、イノシトール１，４，５−三リン酸を表す。
【００１６】
[0021]  「ＳＴＩＭ１」は、ストローマ相互作用分子１を表す。同様に、「ＳＴＩＭ２」はストローマ相互作用分子２を表す。
【００１７】
[0022]  「ＣＲＡＣチャネル」は、カルシウム放出活性化Ｃａ２＋チャネルを表す。
【００１８】
定義
[0023]  単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈上明らかに他の意味を示す場合を除き、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「１つの薬物（a drug）」を送達するための組成物への言及は、１つ、２つ、またはそれ以上の薬物への言及を含む。
【００１９】
[0024]  用語「Ｉｃｒａｃ活性」は、カルシウム放出活性化電流活性を表し、電気生理学およびカルシウムイメージングを含む、当技術分野において知られている方法を用いて測定することができる。Ｉｃｒａｃ活性は、細胞における１つまたは複数のＣＲＡＣチャネル相同体の活性に起因する可能性がある。
【００２０】
[0025]  ＣＲＡＣＭ相同体活性に「影響すること」という用語は、一般的に、相同体のゲーティング、透過性、選択性、および／または発現への任意の変化を表すために、本明細書で用いられる。
【００２１】
導入
[0026]  ＣＲＡＣチャネルタンパク質は、すべての細胞型の遍在性特徴であり、異なる細胞におけるＩｃｒａｃ活性の根底にあるＣＲＡＣチャネル相同体を同定する能力は、細胞内カルシウム制御の研究のための診断ツールを提供するだろう。したがって、本発明は、細胞におけるＩｃｒａｃ活性の根底にあるＣＲＡＣＭ相同体の機能同定のためのアッセイおよび方法を提供する。
【００２２】
[0027]  ＣＲＡＣＭチャネルは、例えばＩＰ３の投与による急速なＣａ２＋ストア枯渇により、および、例えばＢＡＰＴＡなどのキレート剤、またはタプシガルジンなどの筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（SERCA）阻害剤の投与による受動的ストア枯渇により、活性化することができる。これらのチャネル相同体による、活性化および不活性化の動態、ならびにカルシウム流入の調節は、電気生理学およびカルシウムイメージングなどの当技術分野において知られている技術を用いてモニターおよび測定することができる。
【００２３】
ＣＲＡＣＭ相同体の活性化動態および不活性化動態
[0028]  例えばＩＰ３の投与による、急速なカルシウムストア枯渇に反応して活性化されるＣＲＡＣ電流は、典型的には、内向き整流性電流電圧関係を示す。これらの電流の活性化の動態の測定を本発明に従って用いて、Ｉｃｒａｃ活性への異なるＣＲＡＣＭ相同体の寄与を識別することができる。
【００２４】
[0029]  ＨＥＫ２９３細胞において異種性に発現する場合、−８０ｍＶにおけるＣＲＡＣＭ２およびＣＲＡＣＭ３の平均電流振幅は、対応するＣＲＡＣＭ１の振幅の約３分の１であるが、それでもなお、ＨＥＫ２９３細胞における自然ＣＲＡＣ電流の約２０倍である。ＣＲＡＣＭ相同体の活性化動態は、明瞭な差異を示し、ＣＲＡＣＭ１の最大半量活性化時間（±s.e.m）＝３５±７秒（n=12）、ＣＲＡＣＭ２＝２１±３秒（n=8）、およびＣＲＡＣＭ３＝６３±７秒（n=9）である（図３Ｅも参照）。したがって、本発明によれば、細胞におけるＩｃｒａｃ活性の活性化動態の測定は、１つまたは複数のＣＲＡＣＭ相同体の寄与を決定するために用いることができる。
【００２５】
[0030]  ＣＲＡＣ電流は、一般的に、２相の不活性化動態を示し、その２相とは、何十秒間もかけて起こる「遅い不活性化」相と、ミリ秒範囲で起こる「速い不活性化」相である。そのような動態は、細胞内カルシウムのレベルに依存しうる。例えば、過分極パルスが、完全に活性化されたＣＲＡＣチャネルに印加されると、電流振幅の速い降下が、ＣＲＡＣＭ２およびＣＲＡＣＭ３などのいくつかの相同体で見られ、それは、速い不活性化によるものである。一連の過分極パルスが印加された場合には、ＣＲＡＣＭ１の電流振幅は、ある程度、遅い不活性化過程のせいもあって、何十秒間もかけて、ゆっくり減衰し、ゆっくり回復するが（図３参照）、ＣＲＡＣＭ２およびＣＲＡＣＭ３の電流振幅はそうではない。ＣＲＡＣＭ１の場合、一連の過分極パルスから生じる遅い不活性化は、約１００秒間かけてＣＲＡＣ電流の５０％低下を生じうる。しかしながら、ＣＲＡＣＭ２またはＣＲＡＣＭ３を発現する細胞においての同様の実験プロトコールは、ＣＲＡＣＭ１で見られた遅い不活性化動態を誘発せず、ある程度の速い不活性化相だけが明白である。したがって、本発明は、不活性化動態および不活性化動態のカルシウム依存性の測定に基づいて、細胞におけるＩｃｒａｃ活性への異なるＣＲＡＣＭ相同体の寄与を同定するためのアッセイおよび方法を提供する。
【００２６】
[0031]  一態様において、本発明は、細胞におけるＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ２の寄与を決定するためのアッセイを提供する。アッセイは、前記細胞のＩｃｒａｃ活性の不活性化動態、活性化動態、および／またはカルシウム流入の測定を含む。本発明の一実施形態において、Ｉｃｒａｃ動態（Ｉｃｒａｃ速度論）の中程度の速いカルシウム依存性不活性化は、前記細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ２の寄与を示す。本明細書に用いられる場合、中程度の速い不活性化とは、約４０％から約５０％までの電流振幅の低下を生じる速い不活性化を表す。本発明の好ましい実施形態において、遅いカルシウム誘導性不活性化の欠如および中程度の速い不活性化は、前記細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ２の寄与を示す。
【００２７】
[0032]  別の態様において、本発明は、細胞におけるＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ３の寄与を決定するためのアッセイを提供する。アッセイは、前記細胞のＩｃｒａｃ活性の不活性化動態、活性化動態、およびカルシウム流入の測定を含む。本発明の一実施形態において、Ｉｃｒａｃ不活性化動態の強度の速いカルシウム依存性不活性化相は、前記細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ３の寄与を示す。本発明のさらなる実施形態において、不活性化動態を測定することは、前記不活性化動態のカルシウム依存性を測定することを含み、遅いカルシウム誘導性不活性化の欠如、および強度の速い不活性化は、前記細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ３の寄与を示す。本明細書に用いられる場合、強度の速い不活性化とは、約７０％から約８０％までの電流振幅の低下を生じる速い不活性化を表す。別の実施形態において、本発明は、ＳＴＩＭ１の非存在下における細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ３の寄与を決定するためのアッセイを提供する。
【００２８】
ＣＲＡＣＭ相同体のイオン選択性
[0033]  突然変異分析により、膜貫通セグメント１におけるグルタミン酸残基１０６位および膜貫通セグメント３におけるグルタミン酸残基１９０位を含む、ＣＲＡＣ電流の選択性を決定するＣＲＡＣＭ１におけるいくつかの重要なアミノ酸があることが示されている。これらの残基は、チャネルのポアを裏打ちする負荷電アミノ酸の環を形成すると考えられており、グルタミン酸１０６位および１９０位は両方とも、すべての３つのＣＲＡＣＭ相同体に保存されている。
【００２９】
[0034]  膜貫通セグメント１と膜貫通セグメント２の間のループにおける別の領域もまた、ＣＲＡＣＭ１のイオン選択性に影響する。この領域は、負電荷の第２の環を形成して、ポアにおいて第２のＣａ２＋イオンを配位する可能性がある３つの重要なアスパラギン酸残基（D110/D112/D114）を有する。これらの残基は、３つの相同体間で異なっており、ＣＲＡＣＭ２はＥ１１０／Ｑ１１２／Ｑ１１４を有し、ＣＲＡＣＭ３はＥ１１０／Ｄ１１２／Ｅ１１４を有する。これらの差異は、相同体の選択性プロフィールの差異の基礎をなす可能性がある。３つの相同体は、Ｎａ＋と比較したＣａ２＋について類似したカルシウム選択性を示すが、すべての二価陽イオンが除去された場合、３つの相同体は、電荷担体としてのＮａ＋に対するそれらの透過性に差異を示す。すべての陽イオンが除去され、さらに、１０ｍＭ  ＥＤＴＡが、残留するいかなる陽イオンもキレート化するために投与された場合、ＣＲＡＣチャネルは、Ｎａ＋に対して透過性になり、典型的には、ＣＲＡＣＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、内向き電流の２倍の増加を生じる。同じ実験プロトコールにより、わずかに大きいＣＲＡＣＭ２電流が生じ、ＣＲＡＣＭ３は、有意により大きい一価電流を発生する。
【００３０】
[0035]  一態様において、本発明は、細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２、およびＣＲＡＣＭ３の寄与を決定するためのアッセイであって、前記Ｉｃｒａｃ活性のイオン選択性を測定することを含むアッセイを提供する。好ましい実施形態において、Ｎａ＋が電荷担体である場合のＩｃｒａｃ活性のレベルは、前記Ｉｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２、ＣＲＡＣＭ３、またはそれらのいくつかの組合せの寄与のレベルを示す。
【００３１】
ＣＲＡＣＭ相同体のヘテロ多量体
[0036]  ＣＲＡＣＭ１は、多量体チャネル複合体を形成することが示されている。ＣＲＡＣＭ１の非導電性ポア突然変異（E106Q）は、天然ＣＲＡＣチャネルにドミナントネガティブな表現型を与え、他のＣＲＡＣＭ相同体がＣＲＡＣＭ１と多量体を形成することができるかどうかを確立するために用いることができる。過剰発現のＣＲＡＣＭ１−Ｅ１０６Ｑを等量で野生型ＣＲＡＣＭ２およびＣＲＡＣＭ３と組み合わせることが、いずれのＣＲＡＣＭ相同体に運ばれるＣＲＡＣ電流も本質的に消失させ、チャネル相同体がヘテロ多量体を形成することができることを示唆する。（図１参照）。これらのヘテロ多量体の動態（速度論）およびカルシウム流入活性は、本発明に従って用いて、細胞におけるＩｃｒａｃ活性への異なるＣＲＡＣＭ相同体およびＣＲＡＣＭヘテロ多量体の寄与を同定することができる。一実施形態において、本発明のアッセイは、天然細胞におけるＩｃｒａｃ活性の根底にある異なるＣＲＡＣＭ相同体の寄与を決定するために、天然細胞におけるＩｃｒａｃ活性に対する、細胞系で異種性に発現したＣＲＡＣＭヘテロ多量体の活性の比較を含む。さらなる実施形態において、このアッセイは、異種性に発現したＣＲＡＣＭ相同体とヘテロ多量体との間でのイオン選択性、ゲーティング、薬理学、および透過性の比較、ならびに天然細胞におけるＩｃｒａｃ活性を含む。
【００３２】
ＣＲＡＣＭ相同体の薬理学
[0037]  細胞におけるＩｃｒａｃ活性への異なるＣＲＡＣＭ相同体の寄与を同定および分析するための１つの方法は、薬理学を利用することである。本発明の一態様において、異なる相同体に異なる様式で影響する薬理学的物質は、細胞におけるＩｃｒａｃ活性への１つまたは複数の相同体の影響を決定するために用いることができる。
【００３３】
[0038]  一態様において、２−アミノエトキシジフェニルボレート（２−ＡＰＢ）を、細胞におけるＩｃｒａｃ活性への異なるＣＲＡＣＭ相同体の寄与を同定および分析するためのツールとして用いる。２−ＡＰＢは、低用量（≦５μＭ）でＣＲＡＣＭ１電流に促進効果を生じるが、高用量（≧１０μＭ）でそれらを抑制する化合物であり、５０μＭ  ２−ＡＰＢでＣＲＡＣＭ１の完全な抑制が見られる。しかしながら、ＣＲＡＣＭ２は、２−ＡＰＢ媒介性抑制に対して有意に感受性が低く、ＣＲＡＣＭ３は、同じ範囲の２−ＡＰＢ濃度に関して２−ＡＰＢによって驚くほど大きく増強される。
【００３４】
[0039]  一態様において、本発明は、２−ＡＰＢの存在下においてＩｃｒａｃ活性を測定することを含む、細胞のＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２、およびＣＲＡＣＭ３の寄与を決定するためのアッセイを提供する。２−ＡＰＢの存在下におけるＩｃｒａｃ電流の増強は、前記Ｉｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ３の寄与を示す。本発明の一実施形態において、５μＭ以下の濃度の２−ＡＰＢにおけるＩｃｒａｃ電流の増強および１０μＭ以上の２−ＡＰＢの存在下におけるＩｃｒａｃ電流の抑制は、前記Ｉｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１の寄与を示す。
【００３５】
[0040]  ＳＴＩＭ１過剰発現がない場合、ＣＲＡＣ電流は、ストアが枯渇した場合でさえも、典型的には１ｐＡ／ｐＦ未満である。しかしながら、５０μＭ  ２−ＡＰＢは、ＣＲＡＣＭ３チャネルを直接活性化することによって大きなＣＲＡＣ電流を活性化することができる。ＩＰ３の非存在下で、かつストア枯渇を避けるために細胞内Ｃａ２＋を１５０ｎＭに緩衝している場合、同様の反応を誘起することができる（n=6、データは示さず）。このゆえに、２−ＡＰＢ誘導性電流は、ストア非依存性およびＳＴＩＭ非依存性である。この機構を利用して、ＳＴＩＭ過剰発現なしにＣＲＡＣＭ３を活性化すること、および薬物スクリーニングを目的として電流またはＣａ２＋シグナルを測定することができる。
【００３６】
[0041]  さらなる態様において、２−ＡＰＢは、ＣＲＡＣチャネルの選択性を変化させることによってＩｃｒａｃの活性およびその構成要素ＣＲＡＣＭ相同体を評価するために用いることができる。一実施形態において、２−ＡＰＢの投与は、ＣＲＡＣＭ３の選択性を変化させる（図６参照）。本発明の一態様において、２−ＡＰＢを用いてＣＲＡＣＭ相同体の選択性を変化させることにより、Ｎａ＋指示薬または電位感受性色素を用いて、細胞におけるＩｃｒａｃ活性への異なるＣＲＡＣＭ相同体の寄与をさらに同定することが可能になる。例えば、２−ＡＰＢ誘起性ＣＲＡＣＭ３電流は、＋３０ｍＶの逆転電位で、負および正の膜電位において強い整流を示す（図６Ｄ参照）。通常、ＣＲＡＣ電流は、Ｃａ２＋選択性が高く、かつＫ＋またはＣｓ＋に対する透過性が低く、その結果として、正の逆転電位を生じる。しかしながら、細胞が２−ＡＰＢに曝露された場合にＣＲＡＣＭ３で観察される外向き電流は、一価Ｃｓ＋透過の有意な増加および逆転電位の大きなシフトを示す。
【００３７】
[0042]  さらなる態様において、本発明は、２−ＡＰＢの類似体に反応してのＣＲＡＣＭ相同体活性についてのアッセイを提供する。そのような類似体は、当技術分野において知られており、例えば、オキサザボロリジン環への置換基（メチル、ジメチル、tert-ブチル、フェニル、メチルフェニル、およびピリジル）に変化を有する類似体、およびオキサザボロリジン環のサイズが７員環および９員環に増加している類似体がある。本発明に従って用いることができる他の類似体２−ＡＰＢには、フェノールフタレインおよびフェノールフタレイン誘導体などの構造類似体が挙げられる。
【００３８】
ＣＲＡＣチャネルおよび疾患
[0043]  限定されるわけではないが、免疫不全症、神経学的疾患、および心血管疾患を含むいくつかの疾患は、ＣＲＡＣチャネルにおける突然変異と関連している。例えば、ＣＲＡＣチャネルの重要な構成要素における突然変異がＴリンパ球機能障害および重症複合型免疫不全症（SCID）を引き起こすという遺伝的欠陥が記載されている。（Partisetiら、J Biol. Chem.（1994）269:32327-35; Feskeら、Nature（2006）441:179-85）。これらの疾患および他のＣＲＡＣ関連疾患の研究、診断、および処置における強力なツールは、（１）これらの疾患状態においてのＩｃｒａｃ活性の根底にあるＣＲＡＣチャネル相同体、および（２）そのようなＣＲＡＣチャネルを調節する作用物質を同定する能力である。
【００３９】
[0044]  本発明によれば、疾患に関連した細胞におけるＩｃｒａｃ活性へのＣＲＡＣＭ１、ＣＲＡＣＭ２、および／またはＣＲＡＣＭ３の寄与を同定することができるアッセイが提供される。好ましい実施形態において、アッセイは、Ｉｃｒａｃ活性、特に、活性化動態、不活性化動態、カルシウム流入、イオン選択性、および透過を測定することを含む。さらなる実施形態において、アッセイは、相同体への２−ＡＰＢの示差的な薬理学的効果を測定することを含む。
【００４０】
[0045]  本発明は、以下の非限定的実施例を参照することによって、よりよく理解することができ、その実施例は、本発明の例示として提供される。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に説明するために提示されるが、決して、本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４１】
実施例Ｉ  ＣＲＡＣＭ相同体の異種性発現
[0046]  ＣＲＡＣＭタンパク質の機能特性を評価するために、すべての３つのＣＲＡＣＭ種をＨＥＫ２９３細胞に過剰発現させた。２０μＭ  イノシトール１，４，５−三リン酸（IP3）による急速なＣａ２＋ストア枯渇に反応してのＣＲＡＣ電流、およびストアからのＣａ２＋漏洩に依存するより遅いストア枯渇を生じる、細胞の２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡでの灌流による受動的ストア枯渇後のＣＲＡＣ電流を測定した。完全長ヒトＣＲＡＣＭ１（アクセッション番号ＮＭ＿０３２７９０）およびＣＲＡＣＭ１−Ｅ１０６Ｑを記載されているようにサブクローン化した。完全長ヒトＣＲＡＣＭ２（アクセッション番号ＮＭ＿０３２８３１）およびＣＲＡＣＭ３（アクセッション番号ＮＭ＿１５２２８８）を、高忠実性Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Stratagene）を用いてｃＤＮＡ（Origeneから購入）から増幅し、ｐＣＡＧＧＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターへサブクローン化した。リボソーム結合部位ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣおよびＨＡ−タグを、ＣＲＡＣＭ２  ｃＤＮＡおよびＣＲＡＣＭ３  ｃＤＮＡの開始コドンの５’側すぐにインフレームで導入し、引き続いて、緑色蛍光タンパク質（GFP）と共にＣＲＡＣＭ２およびＣＲＡＣＭ３の一過性のジシストロニックな発現としてｐＣＡＧＧＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰへクローン化した。リポフェクタミン２０００（Invitrogen）を用いて、ＳＴＩＭ１を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞にＣＲＡＣＭタンパク質を過剰発現させ、ＧＦＰ発現細胞を蛍光によって選択した。
【００４２】
[0047]  パッチクランプ実験を、２１〜２５℃において、密封ホールセル記録で行った。ＥＰＣ−９（HEKA）を用いて高分解能電流記録が得られた。０ｍＶの保持電位から、−１５０ｍＶ〜＋１５０ｍＶの範囲に及ぶ５０ｍ秒間持続のランプ電位を１００〜３００秒間にわたり０．５Ｈｚのペースで送達した。すべての電位を、１０ｍＶの液界電位に対して補正した。電流を２．９ｋＨｚでフィルタリングし、１００μ秒間隔でデジタル化した。容量性電流を決定し、各ランプ電位の前に補正した。個々のランプ電流記録から−８０ｍＶにおける電流振幅を抽出することによって、電流の低分解能時間的推移を評価した。適用可能な場合には、平均データの統計誤差を、ｎ個の測定値に関して平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として与える。標準外液は以下のとおりであった（ｍＭで）：１２０  ＮａＣｌ、２  ＭｇＣｌ２、１０  ＣａＣｌ２、１０  ＴＥＡ−Ｃｌ、１０  ＨＥＰＥＳ、１０  グルコース、ｐＨ７．２（ＮａＯＨで調整）、３００  ｍＯｓｍ。一部の実験において、Ｎａ＋を含まない溶液を投与し、その溶液においては、ＮａＣｌを等モルで塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ−Ｃｌ）に置換した。Ｃａ２＋を含まない外液について、ＣａＣｌ２を取り除いたが、Ｍｇ２＋を保持した。二価を含まない外液（DVF）は、標準外液に基づいていたが、ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２の非存在下で、かつ追加として１０ｍＭ  ＥＤＴＡが補充された。二価置換溶液は、標準外液に基づいていたが、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２が１０ｍＭ  ＢａＣｌ２に置換された。一部の実験において、２−アミノエチルジフェニルボレート（２−ＡＰＢ）を標準外液に５０μＭの最終濃度で加えた。標準内液は、以下のとおりであった（ｍＭで）：１２０  Ｃｓ−グルタミン酸、２０  Ｃｓ−ＢＡＰＴＡ、３  ＭｇＣｌ２、１０  ＨＥＰＥＳ、０．０２  ＩＰ３、ｐＨ７．２（ＣｓＯＨで調整）、３００  ｍＯｓｍ。図２の実験においては、１０ｍＭ  ＥＧＴＡが用いられ、図３においては、２０ｍＭ  Ｃｓ−ＢＡＰＴＡおよびＷｅｂＭａｘＣで計算された適切な濃度のＣａＣｌ２を用いて、［Ｃａ２＋］ｉが規定レベルに緩衝された。受動的枯渇実験については、ＩＰ３が内液から取り除かれた。すべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．から購入された。
【００４３】
[0048]  野生型ＨＥＫ２９３細胞は、通常、約０．５ｐＡ／ｐＦの自然ＣＲＡＣ電流を示し、典型的な内向き整流性電流電圧（I/V）関係を有する。野生型ＨＥＫ細胞におけるＣＲＡＣＭ２またはＣＲＡＣＭ３の単純な過剰発現は、内因性ＣＲＡＣ電流に有意な効果を生じず、増幅したＣＲＡＣ電流を発生させるためにはさらにＳＴＩＭ１が必要であるということに一致した。ＳＴＩＭ１細胞を安定に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＣＲＡＣＭ２またはＣＲＡＣＭ３の一過性過剰発現は、ＩＰ３でのストア枯渇により、ＣＲＡＣＭ２発現細胞およびＣＲＡＣＭ３発現細胞の両方において大きな膜電流を生じ（図１Ａ）、Ｉｃｒａｃに特徴的な内向き整流性電流電圧（I/V）関係を有した（図１Ｂ）。
【００４４】
実施例ＩＩ  ＣＲＡＣＭ相同体の活性化動態および電位依存性挙動
[0049]  ＳＴＩＭ１と共発現した場合、−８０ｍＶにおけるＣＲＡＣＭ２およびＣＲＡＣＭ３の平均電流振幅は、対応するＣＲＡＣＭ１の振幅の約３分の１であったが、それでもなお、ＨＥＫ２９３細胞における自然ＣＲＡＣ電流の約２０倍であった。ＣＲＡＣＭ相同体の活性化動態は明らかに異なり、ＣＲＡＣＭ１の最大半量活性化時間（±s.e.m）＝３５±７秒（n=12）、ＣＲＡＣＭ２＝２１±３秒（n=8）、およびＣＲＡＣＭ３＝６３±７秒（n=9）であった（図３Ｅも参照）。−１４０ｍＶで一致するようにスケーリングした場合の３つのチャネルの平均Ｉ／Ｖ関係（図１Ｂにおける点線）は、整流にわずかな差異を示し、ＣＲＡＣＭ３は最も顕著な曲線を描き、それは、それの非常に顕著な、速いＣａ２＋依存性不活性化によるものである（図２参照）。
【００４５】
[0050]  ＩＰ３の非存在下における２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡでの受動的ストア枯渇によるＣＲＡＣＭチャネル活性化を調べた。すべての３つのＣＲＡＣＭ種は、漏洩経路を通して受動的にストアを枯渇させるのに必要な時間を反映する特徴的な遅延を有するＣＲＡＣ様電流を生じた。Ｉ／Ｖ関係（図１Ｄ）は、これらの電流がＣＲＡＣ電流に特徴的な形をもつことを確信させる。総合すれば、これらの結果は、ＳＴＩＭ１と共発現する場合、すべての３つのＣＲＡＣＭ相同体が、能動的または受動的ストア枯渇によって、増幅したストア作動性ＣＲＡＣ電流を発生させる能力があることを実証している。
【００４６】
実施例ＩＩＩ  ＣＲＡＣＭヘテロ多量体
[0051]  ストア作動性チャネルを生じたすべての３つの相同体とＣＲＡＣＭ１が多量体チャネル複合体を形成することが示されているとして、ＣＲＡＣＭ１がＣＲＡＣＭ２および／またはＣＲＡＣＭ３と集合して、ヘテロマーのチャネル複合体を構築するかどうかを評価するために、天然ＣＲＡＣチャネルにドミナントネガティブな表現型を与えるＣＲＡＣＭ１の非導電性ポア突然変異（E106Q）を用いた。図１Ａは、過剰発現のＣＲＡＣＭ１−Ｅ１０６Ｑを等量で野生型ＣＲＡＣＭタンパク質と組み合わせることが、いずれのＣＲＡＣＭ相同体によって運ばれるＣＲＡＣ電流も本質的に消失させたことを示し、ＣＲＡＣＭ１ポア突然変異体が実際、ドミナントネガティブな効果を与えることを示唆する。ＣＲＡＣＭ１−Ｅ１０６Ｑと共発現した３つの相同体についての１００〜１２０秒時点で、かつ−８０ｍＶにおける平均電流振幅は以下であった：ＣＲＡＣＭ１  ０．１５±０．１５ｐＡ／ｐＦ（n=6）、ＣＲＡＣＭ２  ０．１９±０．１３ｐＡ／ｐＦ（n=6）、およびＣＲＡＣＭ３  ０．３３±０．２８ｐＡ／ｐＦ（n=7）、これらのすべては、ＳＴＩＭ１発現ＨＥＫ２９３細胞における内因性ＣＲＡＣ電流（０．６９±０．２７ｐＡ／ｐＦ（n=14））より低い。これらの結果は、ＣＲＡＣＭ１が、その相同体のどちらともヘテロマーのチャネルを形成することができることを示す。
【００４７】
実施例ＩＶ  ＣＲＡＣＭ相同体の不活性化動態
[0052]  自然ＣＲＡＣ電流は、［Ｃａ２＋］ｉによって制御され、速いＣａ２＋依存性不活性化および遅いＣａ２＋依存性不活性化の両方を受けやすい。ミリ秒範囲で起こる速い不活性化は、チャネル自体へのＣａ２＋の結合に起因すると考えられているのに対して、何十秒間もかけての遅い不活性化は、ストア補給および／またはチャネルへの細胞フィードバック機構による制御機構に起因する可能性がある。図１Ｂに見られるＣＲＡＣＭ相同体の内向き整流における差異は、様々な相同体についての速い不活性化動態における差異を示す。図２は、３つの相同体によって運ばれるＣＲＡＣ電流が、１０ｍＭ  ＥＧＴＡを含む細胞内液を用いて、２０μＭ  ＩＰ３によって誘導された実験を示す。このキレート剤は、ＢＡＰＴＡより、Ｃａ２＋をキレート化するのが遅く、それゆえに、速いＣａ２＋依存性不活性化を抑制するのに効率が悪い。十分なＣａ２＋が細胞内に蓄積している場合には、ＥＧＴＡの緩衝能力は圧倒されて、遅いＣａ２＋依存性過程が露呈する。
【００４８】
[0053]  ０．５Ｈｚのペースで送達される５０ｍ秒かけて−１００ｍＶ〜＋１００ｍＶに及ぶランプ電位によるＣＲＡＣ電流を連続してモニターした。ＣＲＡＣ電流が完全に活性化した後、２秒間持続の矩形電圧パルスおよび増加性負電位を、Ｃａ２＋流入を増加させるために送達した。図２のパネルＡ〜Ｃは、各過分極パルスが、ＣＲＡＣＭ１電流振幅の速い降下を引き起こし、次のパルスが送達される前に、完全にではないが、ゆっくり回復したことを示す。電流の速い降下は、速い不活性化によるものであり、回復は、速い不活性化からのチャネルの回復と、何十秒間もかけて進行する遅い不活性化という２つの拮抗作用の正味の結果である可能性が高い（図３も参照）。ＣＲＡＣＭ１の場合、５回の過分極パルスの結果として生じた遅い不活性化は、約１００秒間かけてＣＲＡＣ電流の約５０％低下をもたらした。好対照として、ＣＲＡＣＭ２またはＣＲＡＣＭ３を発現する細胞で行われた同じ実験プロトコールにより、有意な遅い不活性化はなく、電流の速い不活性化のみが明らかにされた（図２、ＢおよびＣ）。ＣＲＡＣＭ２は、概して、Ｃａ２＋誘導性不活性化に対してかなり抵抗性であるように思われ、速い不活性化をわずかに示しただけだが、ＣＲＡＣＭ３は、はるかに大きい程度の速い不活性化を示した。両方の場合において、速い不活性化からの回復は、２０秒以内に本質的に完全であった。
【００４９】
[0054]  図２のパネルＤ〜Ｆは、パネルＡ〜Ｃにおける過分極パルスによって生じた高分解能ＣＲＡＣ電流の平均を示し、３つの相同体の速いＣａ２＋依存性不活性化の程度を明らかにしている。ＣＲＡＣＭ３電流は、−８０ｍＶにおける支配的な指数関数的減衰によって特徴づけられる著しいＣａ２＋依存性不活性化を示し、τ＝１７ｍ秒および非常にわずかな遅い成分τ２＝１３０ｍ秒の時定数を有する。このＣＲＡＣＭ３の劇的な不活性化は主に、Ｃａ２＋によるものである。図２Ｃと同様のプロトコールに続いて、１０ｍＭ  Ｃａ２＋の存在下で、かつＤＶＦ溶液に切り換えた後、−８０ｍＶへの過分極電圧パルスを送達する実験において、Ｃａ２＋が存在するのに電流の急速な不活性化、および二価陽イオンが存在しないときの電流の不活性化されない持続が明らかにされた（図５参照）。ＣＲＡＣＭ２は、中程度の速いＣａ２＋依存性不活性化を示し、τ１＝８０ｍ秒およびτ２＝９００ｍ秒の２つの時定数で減衰し、その２つはどちらも速い不活性化全体に対しておよそ等量で寄与する。ＣＲＡＣＭ１は、３つのＣａ２＋依存性フィードバック効果を反映している可能性がある複雑な挙動を示し、それゆえに、容易には時定数による定量的評価を行うことができない。ＣＲＡＣＭ１電流の遅い不活性化は、それが何十秒間もかけて起こるため、図２Ｄに示された記録では明らかではない（図２Ａ参照）。しかしながら、遅い不活性化は、負パルスによって得られる全体的な電流振幅の低下によって反映されており、なぜなら、それらは内向き整流性Ｉ／Ｖから予測されるものより小さいからである。
【００５０】
[0055]  ＣＲＡＣ電流の遅いＣａ２＋依存性不活性化を評価するために、遊離［Ｃａ２＋］ｉが０μＭから１μＭの間の規定レベルに固定されるように、２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡおよび適切な量のＣａＣｌ２で細胞を灌流した。ＣＲＡＣ電流をＩＰ３によって誘導し、ランプ電位によるＣＲＡＣ電流をモニターした。図３Ａに示された結果は、増加性［Ｃａ２＋］ｉが、ＣＲＡＣＭ１電流を用量依存的に抑制したが、ＣＲＡＣＭ２またはＣＲＡＣＭ３への有意な効果をほとんど生じなかったことを示す（図３、ＢおよびＣ）。ＣＲＡＣＭ２またはＣＲＡＣＭ３に関して見られる有意な遅い不活性化の欠如は、生理学的関連においてかなり重要である可能性が高く、なぜなら、生理学的に発生する中間の［Ｃａ２＋］ｉレベル（３００〜５００ｎＭ）は、ＣＲＡＣＭ２チャネルおよびＣＲＡＣＭ３チャネルの活性を維持する傾向にあると考えられるが、ＣＲＡＣＭ１電流は有意に低下すると考えられるからである。１μＭ［Ｃａ２＋］ｉにおいてのみ、ＣＲＡＣＭ２電流およびＣＲＡＣＭ３電流が、ＣＲＡＣＭ１によって運ばれる電流とほとんど同じくらいの強さで抑制された。
【００５１】
実施例Ｖ  ＣＲＡＣＭ相同体動態（ＣＲＡＣＭ相同体速度論）のカルシウム依存性およびカルシウム流入の調節
[0056]  ＣＲＡＣ電流活性化の動態（速度論）への［Ｃａ２＋］ｉの効果を、最大半量活性化までの時間（t1/2）を決定することにより調べた。このパラメーターは、概して、ＣＲＡＣＭ２およびＣＲＡＣＭ１について［Ｃａ２＋］ｉに依存せず、ＣＲＡＣＭ２およびＣＲＡＣＭ１のどちらも類似して速い活性化動態を有していた（図３Ｅ）。低［Ｃａ２＋］ｉレベルにおいて、ＣＲＡＣＭ３電流は、他の相同体の電流より有意に遅く活性化されたが、１５０〜３００ｎＭの中間［Ｃａ２＋］ｉにおいて加速された（図３Ｅ）。ＣＲＡＣＭ相同体間での速いＣａ２＋依存性不活性化および遅いＣａ２＋依存性不活性化の動態（速度論）の差異および程度は、それらを自然に発現する細胞においてＣＲＡＣＭ種を同定するのに有用でありうる。
【００５２】
[0057]  Ｃａ２＋測定について、ｆｕｒａ−２  ＡＭ（Molecular Probes、Eugene、OR、USA）を負荷された細胞（１μＭ／６０分／３７℃）を、以下を含む細胞外生理食塩水に保持した（ｍＭで）：１４０  ＮａＣｌ、２．８  ＫＣｌ、２  ＭｇＣｌ２、１０  グルコース、１０  ＨＥＰＥＳ・ＮａＯＨ、ｐＨ７．２。２μＭタプシガルジンをバスへ加えることによってストア枯渇を誘導し、ストア作動性Ｃａ２＋流入を評価するために、２ｍＭ  Ｃａ２＋を加えた。二重励起蛍光イメージングシステムを備え、４０×  Ｐｌａｎ  ＮｅｏＦｌｕａｒ対物レンズを用いるＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １００蛍光顕微鏡（TILL-Photonics、Grafelfingen、Germany）で実験を行った。データ取得および計算については、ＴＩＬＬｖｉｓＩＯＮソフトウェアによって管理した。モノクロメータ（Polychrome IV）により発生した３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの波長によって色素負荷細胞を励起した。いくつかの単細胞ボディーの蛍光放出を、光学４４０ｎｍロングパスフィルターを用いるビデオカメラ（TILL-Photonics Imago）で同時に記録した。シグナルを０．５Ｈｚでサンプリングし、異なる波長（３４０／３８０ｎｍ）における蛍光強度の相対比単位へと算出した。結果は、パッチピペットにおけるｆｕｒａ−２と組み合わされた規定Ｃａ２＋濃度でのパッチクランプ実験で行われたインビボのＣａ２＋較正を用いて、３４０／３８０ｎｍ蛍光値から計算された近似［Ｃａ２＋］ｉとして示されている。
【００５３】
[0058]  遅いＣａ２＋依存性不活性化が、上記の様式でＣＲＡＣＭ１電流に影響するならば、［Ｃａ２＋］ｉがＣＲＡＣチャネル活性により増加する無傷細胞において観察される、Ｃａ２＋流入の量に少なくとも部分的に影響することが予想されるだろう。様々なＣＲＡＣＭタンパク質を過剰発現する細胞においてｆｕｒａ−２シグナルをモニターした。ストア枯渇を細胞外Ｃａ２＋の非存在下でタプシガルジンによって誘導する標準プロトコールに細胞を供し、続いて、ストア作動性Ｃａ２＋流入を探索するために２ｍＭ  Ｃａ２＋を再進入させた（図３Ｆ）。空ベクターをトランスフェクトされた細胞において、Ｃａ２＋再進入は、内因性ＣＲＡＣチャネルを通してのストア作動性流入により［Ｃａ２＋］ｉの中程度の増加を引き起こした。ＣＲＡＣＭ相同体を過剰発現する細胞は、ｆｕｒａ−２シグナルを識別することによってＣａ２＋流入の速度を分析すると、よりいっそう印象的である［Ｃａ２＋］ｉの有意により大きい変化を生じた（図３Ｆの挿入図を参照）。ＣＲＡＣＭ１は、［Ｃａ２＋］ｉがほぼゼロに緩衝されている場合、ＣＲＡＣＭ２またはＣＲＡＣＭ３と比較して３倍の電流を発生する能力があるが（図１Ａ参照）、すべての３つの相同体は、無傷細胞においてｆｕｒａ−２によって評価される場合、類似した、［Ｃａ２＋］ｉの絶対的レベルおよびＣａ２＋流入の初速度を達成する。この理由はおそらく、より顕著な遅いＣａ２＋依存性不活性化によると思われ、それがＣＲＡＣＭ１についてのＣａ２＋流入の速度を制限し、［Ｃａ２＋］ｉのより大きな増加を妨げる。このように、全体的な［Ｃａ２＋］ｉが３００〜５００ｎＭの範囲へ増加する無傷細胞において得られる［Ｃａ２＋］ｉシグナルは、全体的な［Ｃａ２＋］ｉをその範囲の規定レベルへ固定した場合に観察されるＣＲＡＣ電流の振幅に匹敵する（図３Ｄ参照）。
【００５４】
実施例Ｖ  ＣＲＡＣＭ相同体のイオン選択性
[0059]  ＣＲＡＣＭ１に関する以前の研究は、チャネルの選択性に影響する、そのタンパク質の３つの領域における重要な残基を同定している。膜貫通（TM）セグメント１におけるグルタミン酸残基１０６位およびＴＭ３におけるグルタミン酸残基１９０位は、チャネルのポアを裏打ちする負荷電アミノ酸の環を形成すると考えられている。これらの残基の両方とも、すべての３つのＣＲＡＣＭ相同体において同様に保存されており、それゆえに、３つの相同体間の示差的な選択性の原因となる可能性は低い。しかしながら、ＴＭ１とＴＭ２の間のループに位置する第３領域もまた、ＣＲＡＣＭ１の選択性に影響する。この領域は、ＣＲＡＣＭ１ポアに第２のＣａ２＋イオンを配位する負電荷の第２環を形成する可能性がある、３つの重要なアスパラギン酸残基（D110/D112/D114）を有し、それらの残基は、３つの相同体によって異なる（CRACM2はE110/Q112/Q114を有し、CRACM3はE110/D112/E114を有する）。
【００５５】
[0060]  Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、およびＮａ＋透過に関するすべての３つのタンパク質の選択性プロフィールを調べた（図４）。１０ｍＭ細胞外Ｃａ２＋の存在下で３つの相同体によって運ばれるＣＲＡＣ電流を記録すると、すべての３つの相同体は、−８０ｍＶにおいて大きな内向き電流を発生させ（図４Ａ）、類似した内向き整流性Ｉ／Ｖ関係を示した（図４、ＢおよびＣ）。細胞外Ｃａ２＋を除去したとき、内向き電流は、３つのチャネル種において同じ程度で抑制され（図４、Ａ〜Ｃ）、それらが同様に高いＣａ２＋選択性を共有し、Ｍｇ２＋イオン（２ｍＭ）が存在する限り、Ｎａ＋イオンを冷遇することを示した。
【００５６】
[0061]  Ｂａ２＋イオンについてのＣＲＡＣＭ相同体の選択性もまた調べた。図４Ｄは、等モル置換がＣＲＡＣＭ１において内向き電流を大幅に低下させることを示し、このタンパク質がＢａ２＋に対してＣａ２＋イオンを優遇することができることを示唆する。ＣＲＡＣＭ２またはＣＲＡＣＭ３を過剰発現する細胞において、Ｂａ２＋が電荷担体として用いられる場合、有意により大きい内向き電流があるままであり、一見したところ、より高いＢａ２＋透過を示すと思われる。しかしながら、Ｎａ＋イオンは細胞外溶液に存在したままであるので、Ｂａ２＋が存在するときに、Ｎａ＋が内向き電流に寄与するという可能性もまたある。図４Ｄと同じ実験であるが、ただし、追加として、Ｎａ＋をＴＥＡに置換して行った場合、すべての３つの相同体を通しての内向き電流は、今度は本質的に消失し（図４Ｅ）、Ｂａ２＋よりむしろＮａ＋イオンが、図４Ｄに見られた追加の電流を運んでいる可能性があることを示す。ＣＲＡＣＭチャネルの選択性をさらに評価するために、Ｎａ＋透過における可能性のある差異を、すべての二価陽イオンの完全な非存在下において、かつ追加として、いかなる残留する二価陽イオンもキレート化するために１０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えて、評価した。これらの条件下で、ＣＲＡＣチャネルは、Ｎａ＋に対して透過性になり、典型的には、ＣＲＡＣＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において内向き電流の２倍の増加を生じる（図４Ｆ）。同じ実験プロトコールによって、わずかに大きいＣＲＡＣＭ２電流が生じ、ＣＲＡＣＭ３は、有意により大きい一価電流を発生させ、この場合もやはり、３つのＣＲＡＣＭ相同体がＮａ＋イオンについてわずかに異なる選択性を示すことを示唆する。
【００５７】
実施例Ｖ  ＣＲＡＣＭ相同体の薬理学
[0062]  ２−ＡＰＢは、低濃度（≦５μＭ）でＣＲＡＣ電流を増強し、かつ高濃度（≧１０μＭ）でそれらを抑制することによって、ＣＲＡＣＭ１チャネルに影響することが以前に見出されている。ＣＲＡＣＭ１は、５０μＭ  ２−ＡＰＢによって完全に抑制される（図４Ｇ参照）。しかしながら、ＣＲＡＣＭ２は、同じ濃度で電流を約５０％だけ低下させた点から、２−ＡＰＢ媒介性抑制に対する感受性が有意により低いように思われる。しかしながら、最も著しい効果は、ＣＲＡＣＭ３に関して観察され、ＣＲＡＣＭ３は、２−ＡＰＢによって抑制されず、それどころか、大幅に増強された。
【００５８】
実施例ＶＩ  ２−ＡＰＢに反応してのＣＲＡＣＭ３における選択性の変化
[0063]  ストア枯渇を防ぐためにＣａ２＋濃度が約１５０ｎＭに固定され、かつ２−ＡＰＢが細胞内に投与されたときチャネルを活性化できるかどうかを評価するために、追加として５０μＭ  ２−ＡＰＢを含むピペット溶液を用いて、ＣＲＡＣＭ３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞をパッチクランプした。これらの条件下で、ストア作動性または２−ＡＰＢ誘導性電流は誘発されなかったが、５０μＭ  ２−ＡＰＢが外側から投与されたとき、それは、ＣＲＡＣＭ３によって運ばれるＣＲＡＣ電流を容易に活性化した（図６Ａ）。これは、２−ＡＰＢの促進効果がそのタンパク質上の細胞外部位を通して媒介されることか、または２−ＡＰＢが膜内で作用するが、細胞内空間からその作用部位にアクセスすることができないことのいずれかを示唆すると考えられる。
【００５９】
[0064]  ２−ＡＰＢ誘起性電流の電流電圧関係（図６Ｄ）は、＋３０ｍＶの逆転電位で、負および正の膜電位において有意な整流を示し、チャネルの選択性が変化したことを表している。通常、ＣＲＡＣ電流は、高いＣａ２＋選択性で、かつＫ＋またはＣｓ＋に対する透過性が低く、その結果として、正の逆転電位を生じる。しかしながら、細胞を２−ＡＰＢに曝露したときに観察される外向き電流は、一価Ｃｓ＋透過の有意な増加および逆転電位の大きなシフトを明らかにした。これは、追加としてＣＲＡＣＭ３をトランスフェクトされたＳＴＩＭ１発現細胞において、より定量的に評価され、主な一価陽イオン種としてＣｓ＋かまたはＫ＋のいずれかを含む細胞内溶液を用いて、ＩＰ３によって誘起されるＣＲＡＣ電流を測定した。これらの条件下で、２−ＡＰＢ投与前のＩＰ３誘導性ストア枯渇によるＣＲＡＣ電流が観察され、それらの平均逆転電位は、＋１００ｍＶであった（n=4）。２−ＡＰＢ投与は、Ｃｓ＋ベースの溶液およびＫ＋ベースの溶液の両方において大きな外向き電流を生じ、逆転電位をＣｓ＋について＋３１ｍＶへ（n=4）、Ｋ＋について２９ｍＶへシフトした。これらの細胞における平均２−ＡＰＢ媒介性電流は、ＳＴＩＭ１過剰発現なしのＣＲＡＣＭ３電流と比較して約２倍の大きさであった。
【００６０】
[0065]  ２−ＡＰＢがＣＲＡＣ電流の逆転電位をシフトしたが、それは正電位のままであり、チャネルがいくらかのＣａ２＋透過性を保持したことを示唆し、無傷細胞においてｆｕｒａ−２測定に観察されたＣａ２＋流入と一致する。一価対二価の陽イオン透過をイオン置換実験において調べ、その実験では、Ｃａ２＋が細胞外溶液から除去されたか、またはＮａ＋がＴＥＡに置換されたかのいずれかである。図６Ｃに示されているように、Ｃａ２＋を含まない細胞外溶液における２−ＡＰＢの投与は、Ｃａ２＋含有溶液と比較して、平均内向き電流を５３％、低下させたが、外向き電流をほぼ３倍にした。これは、＋９４ｍＶから＋１０ｍＶへの逆転電位のシフトを伴った。これは、Ｃａ２＋が内向き電流のかなりの部分に関与すること、およびそれがまた一価陽イオンの外向き運動を妨げることを示唆すると考えられる。同時に、通常、Ｃａ２＋を含まない溶液はＣＲＡＣチャネルを通してのいずれの内向き電流も完全に抑制するため、２−ＡＰＢの存在下において、ＣＲＡＣチャネルが、Ｎａ＋イオンに対する透過性が有意により高いことは明らかである。
【００６１】
[0066]  逆に、Ｎａ＋をＴＥＡ＋と置換することによってＮａ＋を細胞外溶液から除去することは、５０μＭ  ２−ＡＰＢにより誘導される内向き電流へも外向き電流へも有意な効果を生じなかった。これらのイオンのイオン濃度およびバランスを考慮すると、ＣＲＡＣチャネルは、Ｎａ＋に対してＣａ２＋の優先的な透過を保持する。図６Ｇにおける逆転電位のゴールドマン・ホジキン・カッツ分析により、Ｃａ２＋を含まない条件下でのＰＮａ／ＰＣｓ＝１．５（青色I/V、Erev=＋１０ｍＶ）およびＰＣａ／ＰＣｓ＝５０（赤色I/V、＋３０ｍＶ）の透過比が得られ、それはＰＣａ／ＰＮａ＝３３の値を示す。通常、ＣＲＡＣチャネルは１００倍を超えるＰＣａ／ＰＮａを特徴とするため、２−ＡＰＢがＣＲＡＣチャネル選択性の劇的な低下を引き起こすことは明らかである。
【００６２】
実施例ＶＩＩ  ＣＲＡＣＭ１ポア突然変異体への２−ＡＰＢの効果
[0067]  上記結果は、２−ＡＰＢがＣＲＡＣチャネルの選択性を変化させることを示し、２−ＡＰＢがＣＲＡＣＭ３チャネルをゲーティングする機構が、イオンがストア枯渇またはＳＴＩＭ１相互作用の必要なしに透過することができるように選択性フィルターを拡大することに結びつけられることは想像できる。ポア拡大の程度は、ＣＲＡＣチャネルサブタイプをゲーティングすることにおける２−ＡＰＢの効力を決定することができ、ＣＲＡＣＭ３が最も感受性が高く、ＣＲＡＣＭ１は辛うじて活性化可能であるが、ＣＲＡＣＭ２のポアは、ＳＴＩＭ１なしでイオンの通過を許すほど十分には２−ＡＰＢによって拡大されない。以前の研究では、膜貫通ドメインＴＭ１におけるグルタミン酸残基Ｅ１０６およびＴＭ３におけるＥ１９０をＣＲＡＣＭ１ポアの選択性の重要な決定因子であると同定している。
【００６３】
[0068]  ポア構造およびそれらの２−ＡＰＢに対する反応に変化を有するポア突然変異体を調べた。２−ＡＰＢ感受性を試験するために、２つのＣＲＡＣＭ１突然変異体（E106DおよびE190A）を選択した。ＣＲＡＣＭ１のＥ１０６Ｄ突然変異体は、通常の内向き整流性チャネルを外向き整流性へ変換し、その逆転電位を＋１６ｍＶへシフトするが、恒常的なチャネル活性をもたず、大きなＣＲＡＣ電流を生じるために追加のＳＴＩＭ１過剰発現およびストア枯渇を必要とし、ポア選択性の単純な変化はストア非依存性ゲーティングをもたらさないことを示唆する。
【００６４】
[0069]  ＣＲＡＣＭ１のＥ１０６Ｄ突然変異体のみを発現するＨＥＫ２９３は、恒常的なＣＲＡＣ電流を生じず、その後の５０μＭ  ２−ＡＰＢでの誘発により、典型的には、内向き電流の急速な増加、続いて、完全な遮断が生じるという複雑な反応が引き起こされ、２−ＡＰＢ投与後の遅い再活性化は保留された（図７Ａ）。２−ＡＰＢ投与を停止した後、２−ＡＰＢ分子は拡散して、局所濃度は減少するので、ＣＲＡＣチャネルは再活性化できる。再活性化された電流の大きさは、追加のＳＴＩＭ１過剰発現の非存在下でＣＲＡＣＭ１チャネルのみを発現する細胞において通常見られる電流の大きさを凌ぎ、それらがＣＲＡＣＭ１のストア非依存性およびＳＴＩＭ１非依存性のゲーティングに起因することを示す。再活性化された電流の電流電圧関係は、０ｍＶの逆転電位をもつ、本質的に線形であり（図７Ｂ）、２−ＡＰＢがＥ１０６Ｄ突然変異体の逆転電位を＋１６ｍＶから左へさらにシフトすることを示唆する。
【００６５】
[0070]  ＣＲＡＣチャネル選択性にとってまた重要であるＣＲＡＣＭ１のＥ１９０残基もまた評価した。このグルタミン酸残基がグルタミンに変異している場合（E190Q）、それは、電流の逆転電位を＋５０ｍＶへシフトし、Ｉ／Ｖ曲線は、内向きおよび外向きの両方の整流を示す。Ｅ１９０Ｑ突然変異体は、ＳＣＩＤ患者由来の欠陥Ｃａ２＋流入をもつＴ細胞においてＳＯＣＥを回復するのにわずかに効果があったが、Ｅ１９０ＡおよびＥ１９０Ｄ突然変異体は完全にＣａ２＋流入を回復した。図７Ｃは、Ｅ１９０Ａ突然変異体がＳＴＩＭ１と共発現する場合、それは、ＩＰ３が細胞へ灌流されたときの野生型ＣＲＡＣＭ１と同じように反応することを示す。ストア枯渇後、それは迅速に活性化し、そのＩ／Ｖ関係は、それが強い内向き整流を示した点において野生型チャネルのそれと類似したが（図７Ｄ）、その逆転電位は、Ｅ１９０Ｑ突然変異体と同様に、＋５５ｍＶへシフトされた。したがって、この突然変異体は、それもまたＣＲＡＣＭ１の選択性を変化させる点において中間表現型を有するように思われるが、Ｃｓ＋の外向き輸送は、Ｅ１９０Ｑ突然変異体に関して見られるものより有意に少ないように思われる。ＣＲＡＣ電流が完全に活性化した後、細胞を５０μＭ  ２−ＡＰＢに曝露すると、その化合物は大きな促進、続いて急速な抑制を誘起し（図７Ｃ）、それは定性的に野生型ＣＲＡＣＭ１と類似するが、より顕著な促進はない。促進された電流は、より大きな外向き電流および逆転電位における＋３３ｍＶへの左方向シフトによって特徴づけられ（図７Ｄ）、この場合もやはり、２−ＡＰＢがＣＲＡＣチャネルの選択性を低下させることを示した。
【００６６】
[0071]  野生型ＨＥＫ２９３細胞において、ＳＴＩＭ１なしで、単独で発現する場合のＥ１９０Ａ突然変異体への２−ＡＰＢの効果もまた分析した。これらの実験において、ＩＰ３をピペット溶液から取り除き、ストア枯渇を避けるために［Ｃａ２＋］ｉは約１５０ｎＭに緩衝された。これは、ホールセル記録の確立後、いかなる電流の発生も完全に抑制した（図７Ｅ）。しかしながら、５０μＭ  ２−ＡＰＢの投与は、内向きおよび外向きの両方の電流に大きな一過性増加を生じ、そのＩ／Ｖ関係（図７Ｆ）は、２−ＡＰＢが、ＳＴＩＭ１と共発現したストア作動性Ｅ１９０Ａチャネルを促進したという図７Ｄに観察されたものと類似した。総合すれば、これらのデータは、野生型ＣＲＡＣＭ１チャネルが、２−ＡＰＢによるストア非依存性およびＳＴＩＭ１非依存性ゲーティングに対して大いに抵抗性であるが、残基Ｅ１０６およびＥ１９０の改変は、チャネルを恒常的様式でゲーティングするには十分ではないとはいえ、チャネルがストア非依存性およびＳＴＩＭ１非依存性様式で開くように２−ＡＰＢがＣＲＡＣＭ１のポア構造をさらに改変するのを可能にすることを示唆する。結果はまた、このゲーティング様式が、２−ＡＰＢ投与の初めに構築される低い２−ＡＰＢ濃度において有利であることも示唆し、膜における濃度が増加するにつれて、もはやイオン輸送を許可しない状態へ移行する可能性がある。したがって、２−ＡＰＢは、ＳＴＩＭ１過剰発現を必要とせずに、直接的にＣＲＡＣチャネル機能を促進することと抑制することの両方を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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