(57)【要約】一実施形態において、薬物耐性と関連している１種類以上のＨＩＶ配列バリアントの低頻度存在を検出するための方法であって、ＨＩＶ試料集団のＲＮＡ分子からｃＤＮＡ種を作製すること；該ｃＤＮＡ種から第１のアンプリコンを増幅させること、ここで、各アンプリコンは増幅コピーを含み、遺伝子座を規定する１対の核酸プライマーで増幅される；該第１のアンプリコンの増幅コピーをクローン増幅させ、第１のアンプリコンの増幅コピーの１つと実質的に同一のコピーの固定化集団を含む第２のアンプリコンを得ること；該固定化集団の少なくとも１００個の核酸配列組成を単一の機器においてパラレルで決定すること；該少なくとも１００個の固定化集団の核酸配列組成において、５％以下の頻度で存在する１つ以上の配列バリアントを検出すること；および検出された配列バリアントを、ＨＩＶ薬物耐性と関連している変異と相関させることを含む方法を記載する。
2010521156.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  ＨＩＶ試料集団の各ＲＮＡ分子から複数のｃＤＮＡ種を作製する工程；
（ｂ）  該ｃＤＮＡ種から複数の第１のアンプリコンを増幅させる工程であって、ここで、該第１のアンプリコンは各々、複数の増幅コピーを含み、該第１のアンプリコンの遺伝子座を規定する１対の核酸プライマーで増幅される、工程；
（ｂ）該第１のアンプリコンの増幅コピーをクローン増幅させ、複数の第２のアンプリコンを得る工程であって、ここで、該複数の第２のアンプリコンは、第１のアンプリコンの増幅コピーの１つと実質的に同一のコピーの固定化集団を含む、工程；
（ｃ）該固定化集団の少なくとも１００個からの実質的に同一のコピーの核酸配列組成を、単一の機器においてパラレルで決定する工程；および
（ｄ）該少なくとも１００個の固定化集団の核酸配列組成において、５％以下の頻度で存在する１つ以上の配列バリアントを検出する工程；および
（ｅ）検出された配列バリアントを、ＨＩＶ薬物耐性と関連している変異と相関させる工程、
を含む、薬物耐性と関連している１つ以上のＨＩＶ配列バリアントの低頻度存在の検出方法。
【請求項２】
ＨＩＶ薬物耐性と関連している変異が、特定の薬物クラスまたは薬物と関連していることがわかっている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨＩＶ薬物クラスが、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオチド／ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、および非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該複数のｃＤＮＡ種が３種類のｃＤＮＡ種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
３種類のｃＤＮＡ種の各々が、少なくとも１つの隣接ｃＤＮＡ種とオーバーラップする配列組成を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＨＩＶ試料集団が１人の患者に由来するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１人の患者が薬物未処置の患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１人の患者が、以前にＨＩＶ抗レトロウイルス剤療法に曝露された患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該複数の第１のアンプリコンが８種類のアンプリコンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第１のアンプリコンの該１対のプライマーが、突然変異頻度が低い領域を標的化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第１のアンプリコンのための該１対のプライマーが、クレイドＢおよびクレイドＣからなる群より選択されるＨＩＶクレイドに特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
クレイドＢに特異的な第１のアンプリコンのための該１対のプライマーが、Ｂ−ＡＣＦ−１（配列番号：３９）とＢ−ＡＲ（配列番号：３６）；Ｂ−ＡＣＦ−２（配列番号：４０）とＢ−ＡＲ（配列番号：３６）；Ｂ−ＢＦ（配列番号：３５）とＢ−ＢＲ（配列番号：３８）；Ｂ−ＡＣＦ−１（配列番号：３９）とＢ−ＣＲ（配列番号：３７）；Ｂ−ＡＣＦ−２（配列番号：４０）とＢ−ＣＲ（配列番号：３７）；Ｂ−１Ｆ（配列番号：４２）とＢ−１Ｒ−１（配列番号：４４）；Ｂ−１Ｆ（配列番号：４２）とＢ−１Ｒ−２（配列番号：４５）；Ｂ−２Ｆ（配列番号：４３）とＢ−２Ｒ（配列番号：４９）；Ｂ−３Ｆ（配列番号：５０）とＢ−３Ｒ（配列番号：５１）；Ｂ−４Ｆ（配列番号：４１）とＢ−４Ｒ−１（配列番号：４６）；Ｂ−４Ｆ（配列番号：４１）とＢ−４Ｒ−２（配列番号：４７）；Ｂ−５Ｆ（配列番号：４８）とＢ−５Ｒ−１（配列番号：５２）；およびＢ−５Ｆ（配列番号：４８）とＢ−５Ｒ−２（配列番号：５３）からなる群より選択されるプライマー対の群を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
クレイドＣに特異的な第１のアンプリコンのための該１対のプライマーが、Ｃ−ＡＣＦ−１（配列番号：５４）とＣ−ＡＲ−１（配列番号：５８）；Ｃ−ＡＣＦ−１（配列番号：５４）とＣ−ＡＲ−２（配列番号：５９）；Ｃ−ＡＣＦ−２（配列番号：５５）とＣ−ＡＲ−１（配列番号：５８）；Ｃ−ＡＣＦ−２（配列番号：５５）とＣ−ＡＲ−２（配列番号：５９）；Ｃ−ＢＦ−１（配列番号：５６）とＣ−ＢＲ（配列番号：６１）；Ｃ−ＢＦ−２（配列番号：５７）ミックスとＣ−ＢＲ（配列番号：６１）；Ｃ−ＡＣＦ−１（配列番号：５４）とＣ−ＣＲ（配列番号：６０）；Ｃ−ＡＣＦ−２（配列番号：５５）とＣ−ＣＲ（配列番号：６０）；Ｃ−１Ｆ−１（配列番号：６３）とＣ−１Ｒ−１（配列番号：６５）；Ｃ−１Ｆ−１（配列番号：６３）とＣ−１Ｒ−２（配列番号：６６）；Ｃ−１Ｆ−２（配列番号：６４）とＣ−１Ｒ−１（配列番号：６５）；Ｃ−１Ｆ−２（配列番号：６４）とＣ−１Ｒ−２（配列番号：６６）；Ｃ−２Ｆ−１（配列番号：６７）とＣ−２Ｒ（配列番号：７３）；Ｃ−２Ｆ−２（配列番号：６８）とＣ−２Ｒ（配列番号：７３）；Ｃ−３Ｆ−１（配列番号：７４）とＣ−３Ｒ（配列番号：７８）；Ｃ−３Ｆ−２（配列番号：７５）とＣ−３Ｒ（配列番号：７８）；Ｃ−３Ｆ−３（配列番号：７６）とＣ−３Ｒ（配列番号：７８）；Ｃ−３Ｆ−４（配列番号：７７）とＣ−３Ｒ（配列番号：７８）；Ｃ−４Ｆ（配列番号：６２）とＣ−４Ｒ−１（配列番号：６９）；Ｃ−４Ｆ（配列番号：６２）とＣ−４Ｒ−２（配列番号：７０）；Ｃ−５Ｆ−１（配列番号：７１）とＣ−５Ｒ（配列番号：７９）；およびＣ−５Ｆ−２（配列番号：７２）とＣ−５Ｒ（配列番号：７９）からなる群より選択されるプライマー対の群を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
第１のアンプリコンの遺伝子座が、プロテアーゼと関連しているＨＩＶの領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
第１のアンプリコンの遺伝子座が、逆転写酵素と関連しているＨＩＶの領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
第２のアンプリコンが、１対の一般的なプライマーを用いて増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
各配列バリアントが信頼度９９％レベルで検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも４００個の固定化集団で実質的に同一のコピーの核酸組成が決定され、検出された各配列バリアントが１．２５％以下の頻度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１００００個の固定化集団で実質的に同一のコピーの核酸組成が決定され、検出された各配列バリアントが０．０５０％以下の頻度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも２０００００個の固定化集団で実質的に同一のコピーの核酸組成が決定され、検出された各配列バリアントが０．００３％以下の頻度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
単一の機器が、複数の反応部位を含む単一の基質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
単一の機器が、複数の配列決定反応から生成されるシグナルを検出できる単一の検出デバイスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｂ−ＡＣＦ−１（配列番号：３９）とＢ−ＡＲ（配列番号：３６）；Ｂ−ＡＣＦ−２（配列番号：４０）とＢ−ＡＲ（配列番号：３６）；Ｂ−ＢＦ（配列番号：３５）とＢ−ＢＲ（配列番号：３８）；Ｂ−ＡＣＦ−１（配列番号：３９）とＢ−ＣＲ（配列番号：３７）；Ｂ−ＡＣＦ−２（配列番号：４０）とＢ−ＣＲ（配列番号：３７）；Ｂ−１Ｆ（配列番号：４２）とＢ−ｌＲ−１（配列番号：４４）；Ｂ−１Ｆ（配列番号：４２）とＢ−１Ｒ−２（配列番号：４５）；Ｂ−２Ｆ（配列番号：４３）とＢ−２Ｒ（配列番号：４９）；Ｂ−３Ｆ（配列番号：５０）とＢ−３Ｒ（配列番号：５１）；Ｂ−４Ｆ（配列番号：４１）とＢ−４Ｒ−１（配列番号：４６）；Ｂ−４Ｆ（配列番号：４１）とＢ−４Ｒ−２（配列番号：４７）；Ｂ−５Ｆ（配列番号：４８）とＢ−５Ｒ−１（配列番号：５２）；およびＢ−５Ｆ（配列番号：４８）とＢ−５Ｒ−２（配列番号：５３）からなる群より選択される１組以上のＨＩＶクレイドＢに特異的なプライマー対を含む、請求項１に記載の方法を行なうためのキット。
【請求項２４】
Ｃ−ＡＣＦ−１（配列番号：５４）とＣ−ＡＲ−１（配列番号：５８）；Ｃ−ＡＣＦ−１（配列番号：５４）とＣ−ＡＲ−２（配列番号：５９）；Ｃ−ＡＣＦ−２（配列番号：５５）とＣ−ＡＲ−１（配列番号：５８）；Ｃ−ＡＣＦ−２（配列番号：５５）とＣ−ＡＲ−２（配列番号：５９）；Ｃ−ＢＦ−１（配列番号：５６）とＣ−ＢＲ（配列番号：６１）；Ｃ−ＢＦ−２（配列番号：５７）ミックスとＣ−ＢＲ（配列番号：６１）；Ｃ−ＡＣＦ−１（配列番号：５４）とＣ−ＣＲ（配列番号：６０）；Ｃ−ＡＣＦ−２（配列番号：５５）とＣ−ＣＲ（配列番号：６０）；Ｃ−１Ｆ−１（配列番号：６３）とＣ−１Ｒ−１（配列番号：６５）；Ｃ−１Ｆ−１（配列番号：６３）とＣ−１Ｒ−２（配列番号：６６）；Ｃ−１Ｆ−２（配列番号：６４）とＣ−１Ｒ−１（配列番号：６５）；Ｃ−１Ｆ−２（配列番号：６４）とＣ−１Ｒ−２（配列番号：６６）；Ｃ−２Ｆ−１（配列番号：６７）とＣ−２Ｒ（配列番号：７３）；Ｃ−２Ｆ−２（配列番号：６８）とＣ−２Ｒ（配列番号：７３）；Ｃ−３Ｆ−１（配列番号：７４）とＣ−３Ｒ（配列番号：７８）；Ｃ−３Ｆ−２（配列番号：７５）とＣ−３Ｒ（配列番号：７８）；Ｃ−３Ｆ−３（配列番号：７６）とＣ−３Ｒ（配列番号：７８）；Ｃ−３Ｆ−４（配列番号：７７）とＣ−３Ｒ（配列番号：７８）；Ｃ−４Ｆ（配列番号：６２）とＣ−４Ｒ−１（配列番号：６９）；Ｃ−４Ｆ（配列番号：６２）とＣ−４Ｒ−２（配列番号：７０）；Ｃ−５Ｆ−１（配列番号：７１）とＣ−５Ｒ（配列番号：７９）；およびＣ−５Ｆ−２（配列番号：７２）とＣ−５Ｒ（配列番号：７９）からなる群より選択される１組以上のＨＩＶクレイドＣに特異的なプライマー対を含む、請求項１に記載の方法を行なうためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
本願は、２００７年３月１６日に出願された、「Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ＦｏｒＤｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＨＩＶ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｐｅｃｉｅｓ」と題する米国仮特許出願第６０／９１８，４４０号；および２００７年９月１４日に出願された、「Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＨＩＶ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｐｅｃｉｅｓ」と題する米国仮特許出願第６０／９７２，３８７号からの優先権を主張する。本願はまた、２００５年４月１２日に出願された、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｕｌｔｒａ−ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」と題する米国特許出願第１１／１０４，７８１号の一部継続出願である。米国仮特許出願第６０／９１８，４４０号、米国仮特許出願第６０／９７２，３８７号および米国特許出願第１１／１０４，７８１号のそれぞれは、その全体が全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、ＨＩＶ−ＩクレイドＢおよびクレイドＣ内の薬物耐性と関連した配列バリアントであって、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、挿入／欠失バリアント（「インデル（ｉｎｄｅｌ）」と称される）および対立遺伝子頻度を含むものであり得る配列バリアントを、標的ポリヌクレオチド集団においてパラレルで検出および解析するための方法、試薬およびシステムを提供する。本発明はまた、既知配列と未知配列の両方の突然変異および多型の特定のために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって複製させた核酸を、ピロリン酸塩系パラレル配列決定によって調べる方法に関する。本発明は、標的ＨＩＶ核酸集団において薬物耐性配列バリアント（疑似種とも称される）を含むことが疑われる核酸を増幅させて個々のアンプリコンを得るために、低い突然変異率を有するＨＩＶ  ＲＮＡまたはその相補ＤＮＡのプロテアーゼ領域および逆転写酵素領域に対して特異的に設計された核酸プライマーの使用を伴う。数千個の個々のＨＩＶアンプリコンが、大規模でパラレルな効率的かつコスト効率のよい様式で配列決定され、アンプリコン集団において見られる配列バリアントの、これまで使用されてきた方法よりも高い検出感度を可能にする分布が得られる。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ゲノムＤＮＡは、同一同胞以外、個体毎に有意に異なる。多くのヒト疾患は、ゲノムの変異により生じる。ヒトおよび他の生命体間の遺伝的多様性により、疾患易罹患性において観察される遺伝性変異が説明される。かかる遺伝的変異により生じる疾患としては、ハンティングトン病、嚢胞性線維症、デュシェーヌ筋ジストロフィ、およびある種の形態の乳癌が挙げられる。このような疾患は各々、単一遺伝子の突然変異と関連している。多発性硬化症、糖尿病、パーキンソン病、アルツハイマー病、および高血圧などの疾患は、ずっとより複雑である。このような疾患は、多遺伝子性（多数の遺伝子の影響）または多因子性（多数の遺伝子の影響および環境の影響）の原因によるものであり得る。ゲノム内の変異の多くは、疾患形質をもたらさない。しかしながら、上記のように、単一の突然変異によって疾患形質がもたらされることがあり得る。さらに、多くのウイルスゲノムは非常に多様であること、および変異によってある種の形質がウイルスに付与されることがあり得る高度突然変異原性であることはよく知られており、このことにより疾患の進行または処置レジメンが変更される。ヒトまたはウイルスのゲノムをスキャンしてかかる疾患の病理の基礎となる、または該病理と関連する遺伝子または特定の突然変異の位置を特定できることは、医学およびヒト生物学において非常に強力なツールとなる。
【０００３】
いくつかの型の配列変異、例えば、挿入および欠失（インデル）、反復配列の数の違い、および単一の塩基対の違い（ＳＮＰ）は、ゲノムの多様性をもたらす。単一の塩基対の違いは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）と称され、ヒトゲノムにおいて最も頻度の高い変異の型である（ほぼ１０３塩基に１塩基で存在）。ＳＮＰは、集団において少なくとも２つ以上の択一的ヌクレオチド対立遺伝子が比較的高い頻度（１％より高い）で存在するゲノムの位置である。また、ＳＮＰは単一塩基（または数個の塩基）の挿入／欠失バリアント（「インデル」と称される）であり得る。ＳＮＰは、比較的安定であるため（すなわち、低い突然変異率を示す）、ならびに単一のヌクレオチドの変異（例えば、挿入および欠失）が遺伝形質の原因であり得るため、配列変異の研究に適切である。上記において、用語ＳＮＰはまた「インデル」（後で定義）にも適用可能であることが意図されることは理解されよう。
【０００４】
例えば、マイクロサテライトによる解析を用いて確認された多型は、さまざまな目的に使用されている。単一のメンデル因子の位置を特定するための遺伝子連鎖ストラテジーの使用は、多くの場合で好成績である（非特許文献１；非特許文献２）。癌抑制遺伝子の染色体上の位置の特定は、一般的に、ヒト腫瘍におけるヘテロ接合性の減少を試験することにより行なわれている（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６）。さらに、Ｉ型糖尿病などの複雑な形質に寄与する遺伝子の染色体上の位置を推測するための遺伝子マーカーの使用（非特許文献７；非特許文献８）は、ヒト遺伝学における研究の中心となっている。
【０００５】
多くのヒト疾患の原因遺伝子の特定は相当進歩したが、この情報がもたらされるのに使用された現在の方法論は、大きな試料集団から遺伝子型情報を得るのに必要とされる莫大なコストと多大な作業量により制限される。このような制限のため、糖尿病などの障害に寄与する複雑な遺伝子突然変異の確認が極めて困難となっている。ヒトゲノムをスキャンし、疾患過程に関与している遺伝子の位置を特定する手法は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析の使用により、１９８０年代初期に始まった（非特許文献９；非特許文献１０）。ＲＦＬＰ解析は、サザンブロッティングおよび他の手法を伴う。サザンブロッティングは、多数の試料（特定の表現型と関連する複雑な遺伝子型を特定するのに必要とされるものなど）で行なった場合、費用がかかるとともに時間もかかる。このような問題の一部は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくマイクロサテライトマーカー解析の開発によって回避された。マイクロサテライトマーカーは、ジ−、トリ−、およびテトラ−ヌクレオチドリピートからなる単純な配列長多型（ＳＳＬＰ）である。
【０００６】
他の型のゲノムの解析は、多対立遺伝的変異および高ヘテロ接合性を有するＤＮＡの超可変領域とハイブリダイズするマーカーの使用に基づくものである。ゲノムＤＮＡのフィンガープリントに有用な可変領域は、ミニサテライトと称される短い配列のタンデムリピートである。多型は、有糸分裂もしくは減数分裂の不等交換の結果生じ得る、または複製中のＤＮＡスリップ（ｓｌｉｐｐａｇｅ）によって生じ得るリピート数における対立遺伝子間の差によるものである。
【０００７】
これらの現行の各方法は、時間がかかるが分離能が限定的であるため、重大な欠点を有する。ＤＮＡの配列決定は最も高い分離能をもたらすが、これはまた、バリアントの測定に最も費用がかかる方法でもある。例えば、１０００例の異なる試料の集団におけるＳＮＰ頻度の測定は、上記の方法を用いると非常に費用がかかり、１００，０００例の試料の集団におけるＳＮＰ頻度の測定では莫大である。ヒト免疫不全ウイルス（一般的に、ＨＩＶと称される）は、ＤＮＡ配列決定によってもたらされる感度が大きな影響を有し得る疾患である。これは、集団において各薬物耐性株の頻度が比較的低い処置の初期に、ＤＮＡ配列決定によって薬物耐性ＨＩＶ株の高感度検出がもたらされ得る場合、特に明白である。
【０００８】
ＨＩＶは、非常に多くの化合物が処置に承認されているにもかかわらず、依然として世界的に大きな問題のままである。現在、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、融合阻害剤の一種、ケモカイン受容体阻害剤の一種、およびインテグラーゼ阻害剤の一種を含む６つの類型の薬物がある。これらは、ＨＩＶのライフサイクルの４つの段階：ビリオンＲＮＡのＤＮＡへの逆転写、宿主ゲノム内へのプロウイルスＤＮＡの組込み、ウイルス遺伝子のポリペプチド産物の機能性タンパク質への切断、および細胞表面でのウイルス侵入を標的化するものである。ＨＩＶおよびＡＩＤＳに対する対処法における大きな問題は、薬物耐性突然変異体の発生である。国際エイズ学会では、現在、突然変異が薬物耐性と関連する７３個のアミノ酸残基（プロテアーゼ部に３７個、逆転写酵素部に２７個、エンベロープ部に７個、およびインテグラーゼ部に２個）が認められている（非特許文献１１、これは引用によりその全体が、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）。そのリストは、少なくとも１年に１回更新されている。これらの突然変異の一部は、ある種の薬物に特異的であるが、一部は、単独または組合せのいずれかで薬物クラス耐性をもたらす。
【０００９】
ウイルス逆転写酵素のエラープローン性および高いウイルスターンオーバー（ｔ１／２＝１〜３日間）のため、ＨＩＶゲノムは非常に急激に変異する。逆転写酵素は、平均すると、９．７Ｋｂのゲノムの複製１回あたり１回の突然変異が生じると推定されるが、これはウイルスの増殖能に劇的な影響を及ぼさない。これは、多くの異なる変異型が動的関係で存在する「疑似種」の形成をもたらす。
【００１０】
ＨＩＶ患者は、生存期間が延びるという点で抗ウイルス処置の恩恵を受けているが、多くの患者は、ある種の薬物または薬物の組合せに対して耐性が発現されると、いわゆるウイルス学的治療失敗（ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ）エピソードを何度か経験する。ウイルス学的治療失敗は、生存の可能性を劇的に減少させる（非特許文献１２、これは引用によりその全体が、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）。
【００１１】
処置開始前の単一の患者に見られる疑似種のサブセットに耐性付与突然変異が存在することによって、耐性ウイルスの出現およびその後のウイルス学的治療失敗がもたらされるという仮説がたられている（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）、これは引用によりその全体が、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）。これが正しければ、処置の決定が行なわれる前に、低頻度で存在する突然変異を検出することは非常に有益となり得る。多くの研究所で、オリゴヌクレオチドアレイまたはリアルタイムＰＣＲアッセイなどの専門的な手法が開発されているが、これらは、予め選択したヌクレオチド位置のウイルス遺伝子型の決定に対して限界があり、新たな耐性突然変異が認められるたびに調整が必要である。直接配列決定は、ある種のヌクレオチド種／残基に偏らず、また、新たな薬物耐性関連突然変異を確認できるという点で優れている。現在、従来のサンガー配列決定に基づいたキットが薬物耐性突然変異の検出に利用可能であるが、このようなシステムは、まずウイルス種をサブクローニングしないと、頻度が２５％未満の突然変異の信頼性のある検出を行なうことができない。サブクローン種の配列決定により、１人の患者に由来するウイルス集団内に低頻度耐性突然変異が実際に存在すること、およびこれらの多くは、標準的なバルク配列決定では見逃されていることが明白に示された（非特許文献１３、これは引用によりその全体が、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）。また、さらなる研究により、薬物未処置の慢性ＨＩＶ感染患者のおよそ１０％が耐性突然変異を有することが示された（非特許文献１４、これは引用によりその全体が、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）。このような低頻度の持続性耐性関連突然変異が処置開始前に存在しており、処置の転帰に影響を及ぼすと想定することは、非常に妥当である。
【００１２】
したがって、配列決定によるこのような突然変異の効率的な検出によって、該疾患の知識および初期検出による処置可能性における想到な進歩が可能になる。さらに、ハイスループット配列決定手法の実施形態により、「大規模でパラレルな（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ）」と称され得る処理法が、これまでの配列決定手法よりもかなりより強力な解析、感度およびスループット特性を有することが可能となった。例えば、本明細書に記載の発明のＨＩＶ特異的プライマーを用いるハイスループット配列決定技術は、集団において１％以下の頻度の対立遺伝子バリアントを含む低アバンダンス対立遺伝子が検出される感度が得られ得るものである。上記のように、このことは、ＨＩＶバリアントの検出との関連において重要であり、、特に、高い感度によって重要な早期検出機構がもたらされ、相当な治療的有益性がもたらされる薬物耐性バリアントの検出との関連において重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｂｅｎｏｍａｒら（１９９５），Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，１０：８４−８
【非特許文献２】Ｂｌａｎｔｏｎら（１９９１），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１１：８５７−６９
【非特許文献３】Ｃａｖｅｎｅｅら（１９８３），Ｎａｔｕｒｅ，３０５：７７９−７８４
【非特許文献４】Ｃｏｌｌｉｎｓら（１９９６），Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，９３：１４７７１−１４７７５
【非特許文献５】Ｋｏｕｆｏｓら（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ，３０９：１７０−１７２
【非特許文献６】Ｌｅｇｉｕｓら（１９９３），Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，３：１２２−１２６
【非特許文献７】Ｄａｖｉｓら（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ，３７１：１３０−１３６
【非特許文献８】Ｔｏｄｄら（１９９５），Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，９２：８５６０−８５６５
【非特許文献９】Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９８０），Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．，３２：３１４−３１
【非特許文献１０】Ｎａｋａｍｕｒａら（１９８７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１６１６−２２
【非特許文献１１】Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  ＨＩＶ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００７），１５：１１９
【非特許文献１２】Ｈｅｎｎｅｓｓｅｙら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（２０００），１６：１０３
【非特許文献１３】Ｐａｌｍｅｒら，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００５），４３：４０６
【非特許文献１４】Ｎｏｖａｋら，Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．（２００５），４０：４６８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の簡単な概要
本発明は、特定のＤＮＡの確認による、ＨＩＶ薬物耐性におけるいくつかの低頻度配列バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント、単一ヌクレオチド多型バリアント、インデルバリアント）の診断方法に関する。現在の手法では、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＳＮＰ検出可能である。しかしながら、ＰＣＲによるＳＮＰ検出には、ＳＮＰのある型にはハイブリダイズするがＳＮＰの別の型にはハイブリダイズしない特別なＰＣＲプライマーの設計が必要とされる。さらに、ＰＣＲは強力な手法であるが、対立遺伝子の特異的ＰＣＲには、ＳＮＰの性質（配列）、ならびに対立遺伝子頻度を測定するための多重ＰＣＲの実行およびゲル電気泳動での解析の予備知識が必要とされる。例えば、５％の対立遺伝子頻度（すなわち、２０個中１個）には、その検出に最低２０回のＰＣＲ反応が必要とされ得る。対立遺伝子頻度を検出するのに必要とされるＰＣＲとゲル電気泳動の量は、対立遺伝子頻度が減少すると（例えば、４％、３％、２％または１％以下まで）、劇的に上昇する。
【００１５】
現行の方法で、特定のＤＮＡ配列の確認によるＳＮＰ（例えば、低アバンダンスのＳＮＰ）の簡単かつ迅速な検出方法はは提供されていない。
【００１６】
本発明者らは、ピロリン酸塩系の新規な配列決定手法と合わせた、薬物耐性と関連していることがわかっているＨＩＶの領域を標的化する２段階ＰＣＲ手法により、迅速で信頼性があり、かつコスト効率よい様式で、低頻度ＨＩＶ配列バリアント（ＳＮＰ、インデルおよび他のＤＮＡ多型）の検出が可能となり得ることを見出した。さらに、本発明の方法により、ＨＩＶ試料中に非化学量論的対立遺伝子量で存在する配列バリアント（例えば、５０％未満、２５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満などで存在するＨＩＶバリアント）が検出され得る。
該手法は、簡便に「ウルトラディープ（ｕｌｔｒａｄｅｅｐ）シークエンシング」と称されることがあり得る。
【００１７】
本発明によれば、核酸試料中の多種類の対立遺伝子の特異的増幅および配列決定によって配列バリアント（対立遺伝子頻度、ＳＮＰ頻度、インデル頻度など）を診断するための方法が提供される。核酸を、まず、ＨＩＶ薬物耐性と関連していることがわかっている領域を含む対象領域の周囲の領域が増幅されるように設計された１対のＰＣＲプライマーによる増幅に供する。続いて、各ＰＣＲ反応産物（アンプリコン）を、別の反応槽内で、ＥＢＣＡ（乳液系クローン増幅（Ｅｍｕｌｓｉｏｎ  Ｂａｓｅｄ  Ｃｌｏｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））を用いて個々にさらに増幅させる。ＥＢＣＡアンプリコン（本明細書では、第２のアンプリコンと称する）を配列決定し、種々の乳液型ＰＣＲアンプリコンの配列の集合体を用いて、対立遺伝子頻度を測定する。
【００１８】
本発明の一実施形態において、薬物耐性と関連している１種類以上のＨＩＶ配列バリアントの低頻度存在を検出するための方法であって、ＨＩＶ試料集団の各ＲＮＡ分子から複数のｃＤＮＡ種を作製する工程；該ｃＤＮＡ種から複数の第１のアンプリコンを増幅させる工程、ここで、第１のアンプリコンは各々、複数の増幅コピーを含み、該第１のアンプリコンの遺伝子座を規定する１対の核酸プライマーで増幅される；該第１のアンプリコンの増幅コピーをクローン増幅させ、複数の第２のアンプリコンを得る工程、ここで、該複数の第２のアンプリコンは、第１のアンプリコンの増幅コピーの１つと実質的に同一のコピーの固定化集団を含む；該固定化集団の少なくとも１００個の実質的に同一のコピーの核酸配列組成を、単一の機器においてパラレルで決定する工程；該少なくとも１００個の固定化集団の核酸配列組成において、５％以下の頻度で存在する１つ以上の配列バリアントを検出する工程；および検出された配列バリアントを、ＨＩＶ薬物耐性と関連している変異と相関させる工程で構成される方法を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ビーズ乳液型増幅プロセスの一実施形態の概略図を示す。
【図２】ウルトラディープシークエンシングの概略図を示す。
【図３】プライマー対ＳＡＤ１Ｆ／Ｒ−ＤＤ１４（パネルＡ）、ＳＡＤ１Ｆ／Ｒ−ＤＥ１５（パネルＢ）およびＳＡＤ１Ｆ／Ｒ−Ｆ５（パネルＣ）を用いて生成されたアンプリコンの品質評価を示す。解析は、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡ  １０００  ＢｉｏＣｈｉｐにおいて行ない、中心ピークはＰＣＲ産物を表し、両側のピークは参照サイズマーカーを表す。各ピークは、理論サイズ（１５６〜１８１塩基対の範囲である）の５ｂｐ以内となるように測定した。
【図４】ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座内の２つの異なる対立遺伝子を表すアンプリコンにおけるヌクレオチド頻度（非マッチング頻度）を示す。ほぼ１：５００（Ａ）および１：１０００（Ｂ）の比（Ｔ対立遺伝子に対するＣ対立遺伝子）、またはＴ対立遺伝子のみ（Ａ）で混合し、クローン増幅し、および４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの配列決定プラットホームにおいて配列決定した。各バーは、コンセンサス配列からの偏差の頻度を表し、得られた塩基置換に応じて色分けしている（赤＝Ａ；緑＝Ｃ；青＝Ｇ；黄色＝Ｔ）。
【図５】図４Ｂと４Ｃに示したものと同じデータを示すが、図４Ａに示したＴ対立遺伝子のみの試料を用いてバックグラウンドを差し引いた後である。
【図６】ＤＤ１４  ＨＬＡ遺伝子座のＴ対立遺伝子に対するＣ対立遺伝子の種々の比を示す。混合し、４５４プラットホームにおいて配列決定してダイナミックレンジを決定する。実験で観察された比を対象とする比（横軸）に対してプロットしている。各データ点での配列決定読み取り（ｒｅａｄ）の実際の数は、表１にまとめている。
【図７】図７Ａは、１．６Ｋｂの１６Ｓ遺伝子断片に対する読み取りマッピング位置を示すグラフ表示であり、１６Ｓ遺伝子の最初の１００塩基へのほぼ１２，０００の読み取りマッピングを示す。図７Ｂは、ほぼ塩基１０００個の領域にマッピングされたＶ３プライマー以外は、図７Ａと同様の結果を示す。図７Ｃは、Ｖ１プライマーとＶ３プライマーの両方が使用された読み取りの位置を示す。
【図８】２００個の配列のうち１個以外すべてにおいてＶ１（図の左側の短い長さ）とＶ３（図の右側の長い長さ）の配列が明白に識別されている系統樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｔｉｃ  ｔｒｅｅ）を示す。
【図９】ＨＩＶ−ＩクレイドＢコンセンサス配列（配列番号：１３３）と、突然変異が起こりやすいことがわかっている領域の一実施形態を示す。
【図１０】図９のクレイドＢ配列（配列番号：１３３）と、クレイドＢプライマーセットの設計のために標的化した配列領域の一実施形態を示す。
【図１１】突然変異が起こりやすいことがわかっている領域と、クレイドＣプライマーセットの設計のために標的化した配列領域とを含むＨＩＶ−ＩクレイドＢ  コンセンサス配列（配列番号：１３３）の一実施形態を示す。
【図１２】プロテアーゼ領域から逆転写酵素領域にわたって存在するＨＩＶ  ＲＮＡから得られたｃＤＮＡ分子、および得られたアンプリコンのオーバーラップ配列の一実施形態を示す。
【図１３】ＲＮＡの処理および低頻度配列バリアントの確認のための方法の一実施形態を示す。
【図１４】ＨＩＶ被検体から測定されたＨＩＶ疑似種バリアントのミックスの一実施形態を示す。
【図１５】ＨＩＶ被検体試料において３．７％の頻度で確認された、プロテアーゼ阻害剤耐性と関連しているＨＩＶ疑似種バリアント（配列番号：１３２）の一実施形態を示す。
【図１６】ＨＩＶ被検体試料において１．０％の頻度で確認された、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤耐性と関連しているＨＩＶ疑似種バリアントの一実施形態を示す。
【図１７】ヌクレオチド／ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤耐性と関連しているＨＩＶ疑似種バリアントの一実施形態を示す。
【図１８−１】ＨＩＶクレイドＢ（配列番号：１３３）とクレイドＣ（配列番号：１３４）配列とのヌクレオチド配列アラインメントを示す。
【図１８−２】ＨＩＶクレイドＢ（配列番号：１３３）とクレイドＣ（配列番号：１３４）配列とのヌクレオチド配列アラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、試料集団において数千個の特異的核酸の配列組成を特定することによる、ＨＩＶ薬物耐性株に特異的な１つ以上の配列バリアントの高感度検出方法に関する。配列バリアントには、２つの核酸分子間の任意の配列の違いが包含される。したがって、配列バリアントはまた、少なくとも、単一ヌクレオチド多型、挿入／欠失（インデル）、対立遺伝子頻度およびヌクレオチド頻度をいう、すなわち、これらの用語は互換的であると理解されたい。本明細書全体を通して具体的な実施例を用いて種々の検出手法について論考しているが、本発明の方法は、任意の配列バリアントの検出に対して等しく適用可能であることは理解されよう。例えば、本開示におけるＳＮＰの検出方法の論考は、インデルまたはヌクレオチド頻度の検出方法にも適用可能である。
【００２１】
本発明のこの方法は、標的化された特異的鋳型（ゲノム、組織試料、不均一系細胞集団または環境試料中に見られるものなど）を増幅し、配列決定するために使用され得る。このようなものとしては、例えば、ＰＣＲ産物、候補遺伝子、突然変異ホットスポット、進化的または医学的に重要な可変領域が挙げられ得る。また、該方法は、全ゲノム増幅（続いて、可変または縮重増幅プライマーを使用することによる全ゲノム配列決定を伴う）などの用途にも使用され得る。
【００２２】
これまで、配列決定を目的とした鋳型には、対象ゲノム全体の調製および配列決定、または対象領域の事前のＰＣＲ増幅および該領域の配列決定が必要とされていた。本発明の方法により、既存の手法によって現在もたらされるものよりも相当大きな深度（ｄｅｐｔｈ）で、ＳＮＰ配列決定を実施することが可能になる。本開示において、「単一ヌクレオチド多型」（「ＳＮＰ」）は、少なくとも２つのバリアントにおいて存在するＳＮＰであって、最も一般的でないバリアントが、その集団の少なくとも１％に存在するＳＮＰと定義され得る（Ｗａｎｇら，１９９８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１０７７−１０８２）。集団において１％未満で存在する変異は、典型的には「突然変異」と称される。本開示の方法が「インデル」に適用され得ることは理解されよう。したがって、本開示ではＳＮＰに対して言及しているが、任意の箇所で用語「ＳＮＰ」を用語「インデル」で置き換えると、本開示が等しく適用可能であることは理解されよう。
【００２３】
本明細書で用いる場合、用語「インデル」は、関連核酸配列と比較される核酸配列内への１つ以上のヌクレオチドの挿入または欠失の存在を意味するものとする。したがって、挿入または欠失には、１つの核酸配列における特異なヌクレオチド（１つまたは複数）の存在または非存在（該核酸配列は、隣接するヌクレオチド位置において、該存在または非存在以外は同一の核酸配列と比較される）が包含される。挿入および欠失としては、関連参照配列と比べたときの任意の特定の位置の、例えば、単一のヌクレオチド、数個のヌクレオチドまたは多くのヌクレオチド（例えば、５、１０、２０、５０、１００個もしくはそれ以上のヌクレオチド）が挙げられ得る。また、該用語は、関連配列と比べたときの核酸配列内の１つより多くの挿入または欠失も包含することは理解されよう。
【００２４】
最近の核酸配列決定技術における発達により、多くの標的核酸分子がパラレルで、以前の手法よりも非常に少ないコストで配列決定されることによって、スループットが劇的に増大した。このような技術の発達により、本明細書に記載の発明の高感度検出が可能
になり、調製方法および／または配列決定方法と関連する１つ以上の工程または操作が自動化された機器類を用いて行なわれ得る。例えば、一部の機器では、ウェルを有するプレートなどの反応基材要素、または各ウェルもしくはチャンバにおいて同時に反応を行なうことができる他の型のマルチチャンバ型構成が使用される。一部のある実施形態において、配列決定のための反応基材は、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ（登録商標）アレイと称される（ＰＴＰ（登録商標）プレートとも称される）ものを含むものであり得、該アレイは、光ファイバーフェースプレートで形成されており、酸でのエッチングによって数十万個の非常に小さいウェルが設けられ、各ウェル内に実質的に同一の鋳型分子集団が保持されることが可能になっている。ハイスループット配列決定手法ならびに大規模でパラレルな配列決定のためのシステムおよび方法の例は、米国特許第６，２７４，３２０号；同第６，２５８，５６８号；同第６，２１０，８９１号；同第７，２１１，３９０号；同第７，２４４，５５９号；および同第７，３２３，３０５号（これらは各々、引用によりその全体が、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）；ならびに米国特許出願第１０／２９９，１８０号；同第１０／２２２，２９８号；同第１０／２２２，５９２号；および同第１１／１９５，２５４号（これらは各々、引用によりその全体が、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００２５】
上記のように、多くの核酸鋳型がパラレルで配列決定されることにより、本明細書に記載の発明に必要な感度がもたらされる。例えば、ポアソン統計により、充分に負荷された６０ｍｍ×６０ｍｍのＰＴＰプレート（２×１０６個の高品質塩基、２００，０００×１００塩基読み取りで構成）の検出下限（すなわち、１事象未満）は、９５％検出信頼度で３事象および９９％検出信頼度で５事象であることが示される（表１参照）。これは、読み取りの数値に直接対応するため、１０，０００個の読み取り、１０００個の読み取り、または１００個の読み取りにおいて、同じ検出限界値が３事象または５事象に対してあてはまる。用語「読み取り」は、本明細書で用いる場合、一般的に、単一の核酸鋳型分子または鋳型核酸分子の複数の実質的に同一のコピー集団から得られた配列組成を含むデータをいう。ＤＮＡ読み取りの実際の量は、上記の例で得られる２００，０００個よりも大きいため、アッセイの感度が高いことにより、実際の検出下限はさらに低い点であると予測される。比較のため、ピロリン酸塩系配列決定法によるＳＮＰ検出により、最も低頻度で存在する対立遺伝子の比率が集団の１０％以上であれば、四倍体ゲノム上の別の対立遺伝子状態の検出が報告された（Ｒｉｃｋｅｒｔら，２００２  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  ３２：５９２−６０３）。慣用的な蛍光ＤＮＡ配列決定法は感度がさらに低く、５０／５０（すなわち、５０％）ヘテロ接合型対立遺伝子の分離能に問題が生じる（Ａｈｍａｄｉａｎら、２０００  Ａｎａｌ．  ＢｉｏＣｈｅｍ．  ２８０：１０３−１１０）。
【００２６】
【表１】
2010521156.tif 000003
その結果、単一のバリアントを検出するのに６０×６０ｍｍのＰＴＰプレート全体を用いると、集団の０．００２％のみに存在するバリアントを信頼度９５％で、または集団の０．００３％に存在するバリアントを信頼度９９％での検出が可能になる。当然、多重解析は、この検出深度よりも適用可能性が大きく、表２に、単一のＰＴＰプレートにおいて同時にスクリーニングされ得るバリアントの数を、９５％および９９％の信頼度で検出可能な最小対立遺伝子頻度とともに示す。
【００２７】
【表２】
2010521156.tif 000004
本発明の利点の１つは、いくつかの工程（通常、試料調製と関連するもの）（例えば、配列決定のための組織からのＤＮＡの抽出および単離）が、排除または簡素化され得ることである。例えば、該方法の感度により、組織の磨砕および化学的精製という従来の手法を用いて組織からＤＮＡを抽出することは必要でなくなる。代わりに、容量で１μＬの少量の組織試料を煮沸し、最初のＰＣＲ増幅に使用するとよい。この溶液型増幅の産物を、ｅｍＰＣＲ反応に直接添加する。したがって、本発明の方法により時間が短縮され、労力と産物のロス（人間の過失によるロスを含む）が低減される。
【００２８】
本発明の方法の別の利点は、該方法が高度に多重化し易いことである。後述するように、本発明の二部構成プライマーによって、多数の遺伝子に対するプライマーセットを、同一のピロリン酸塩系配列決定用プライマーセットと、１回の溶液型増幅において合わせることが可能になる。あるいはまた、複合調製物の産物を、１回の乳液型ＰＣＲ反応に入れてもよい。その結果、本発明の方法は、ハイスループット用途の大きな可能性を示す。
【００２９】
本発明の一実施形態は、ＨＩＶ薬物耐性バリアントの対立遺伝子頻度（ＳＮＰおよびインデル頻度を含む）の測定方法に関する。第１工程では、患者（「被検体」とも称する）由来のＨＩＶ  ＲＮＡを鋳型として用い、ｃＤＮＡ分子を作製する。次に、１つ以上の標的特異的プライマーセットを用いたＰＣＲによって、解析対象の遺伝子座を含む１つ以上の核酸集団を増幅させ、第１のアンプリコン集団を得る。各遺伝子座は、複数の対立遺伝子（例えば、２、４、１０、１５もしくは２０個など、またはそれ以上の対立遺伝子）を含むものであり得る。第１のアンプリコンは、任意の大きさであり得、例えば、５０〜１００ｂｐ、１００ｂｐ〜２００ｂｐ、または２００ｂｐ〜１ｋｂであり得る。この方法の利点の１つは、２つのプライマー間の核酸配列の知識が必要とされないことである。
【００３０】
次の工程では、第１のアンプリコン集団を、水性マイクロリアクター内に油中水型乳液状態で、複数の水性マイクロリアクターが（１）単一の鋳型またはアンプリコンによって支配される増幅反応が開始されるのに充分なＤＮＡ、（２）１個のビーズ、および（３）核酸増幅が行なわれるのに必要な試薬を含む増幅反応溶液（後述のＥＢＣＡ（乳液系クローン増幅）に関する論考を参照のこと）を含むように送達する。本発明者らは、マイクロリアクター内に２種類以上の鋳型が存在する場合であっても、単一の鋳型またはアンプリコンに支配される増幅反応がなされ得ることを見出した。したがって、１種類より多くの鋳型を含む水性マイクロリアクターもまた、本発明で想定される。好ましい実施形態では、各水性マイクロリアクターが増幅用ＤＮＡ鋳型の単一コピーを有する。
【００３１】
送達工程後、第１のアンプリコン集団をマイクロリアクター内で増幅させ、第２のアンプリコンを形成する。増幅は、例えば、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）内でＥＢＣＡ（これはＰＣＲを伴う）を用いて行なわれ、第２のアンプリコンが生成され得る。ＥＢＣＡ後、第２のアンプリコンをマイクロリアクター内のビーズに結合させる。ビーズを、第２のアンプリコンが結合した状態で平らな表面上の反応チャンバのアレイ（例えば、少なくとも１０，０００個の反応チャンバのアレイ）に送達する。この送達は、複数の反応チャンバが１つ以下のビーズを含むように調整する。これは、例えば、反応チャンバがビーズを１個だけ収容するように充分に小さいアレイを使用することによりなされ得る。
【００３２】
配列決定反応は、該複数の反応チャンバにおいて同時に行なわれ、前記複数の対立遺伝子に対応する複数の核酸配列が決定される。反応チャンバを用いたパラレルでのパラレル配列決定法は、上記の別のセクションおよび実施例に開示している。配列決定後、核酸の標的集団の配列を解析することにより、少なくとも２つの対立遺伝子に対する対立遺伝子頻度が測定され得る。一例として、１００００個の配列が決定され、９９００個の配列読み取りが「ａａａ」であり、１００個の配列読み取りが「ａａｇ」である場合、「ａａａ」対立遺伝子は頻度９０％を有すると言え、「ａａｇ」対立遺伝子は頻度１０％を有すると言え得る。これについては、後述の説明および実施例でより詳細に記載する。
【００３３】
本発明の方法の利点の１つは、ＨＩＶ配列変異に関して、これまで達成されていたものよりも高いレベルの感度が可能になることである。ＰＴＰプレートを使用した場合、本発明の方法により、ピコタイタープレート１つあたり１００，０００個より多く、または３００，０００個より多くの異なる対立遺伝子コピーが配列決定され得る。この検出感度により、被検体試料において、１％以下の対立遺伝子バリアントで示され得る低アバンダンス対立遺伝子の検出が可能になる。本発明の方法の別の利点は、配列決定反応により、解析された領域の配列組成もまた提供されることである。すなわち、解析する遺伝子座の配列の予備知識をもつ必要がない。
【００３４】
好ましい実施形態において、本発明の方法により、１０％未満、５％未満、または２％未満である対立遺伝子頻度が検出され得る。より好ましい実施形態では、該方法により、１％未満（０．５％未満または０．２％未満など）の対立遺伝子頻度が検出され得る。典型的な検出感度範囲は、０．１％〜１００％、０．１％〜５０％、０．１％〜１０％（０．２％〜５％など）であり得る。
【００３５】
種々の実施形態において、標的核酸集団は、いくつかの供給源に由来のものであり得る。例えば、ＨＩＶ試料の供給源は、ＨＩＶ感染を受け易い患者／被検体、または他の生物体由来の組織または体液であり得る。また、他の型の試料供給源としては、任意の生物体、例えば哺乳動物が挙げられ得る。哺乳動物は、ヒトまたは商業的価値のある家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどであり得る。また、記載の方法により、植物の組織試料や液試料の解析が可能になる。あらゆる植物が記載の方法によって解析され得るが、好ましい植物としては、商業的価値のある作物種、例えば、単子葉植物および双子葉植物が挙げられる。特定の一実施形態において、標的核酸集団は、穀物または食物に由来するものであり、遺伝子型、対立遺伝子、または該穀物もしくは食物を構成する種の原型および分布が測定され得る。かかる作物としては、例えば、トウモロコシ、スイートコーン、カボチャ、メロン、キュウリ、サトウキビ、ヒマワリ、コメ、綿花、ナタネ、サツマイモ、マメ、ササゲ、タバコ、ダイズ、アルファファ、コムギなどが挙げられる。
【００３６】
また、一部のある実施形態において、核酸試料は、多数の生物体から採取されたものであり得る。例えば、１０００個体の集団の対立遺伝子頻度が、１０００個体に由来する混合ＤＮＡ試料を解析する１つの実験で測定され得る。当然、集団の対立遺伝子頻度を表す混合ＤＮＡ試料では、該集団の各構成員（各個体）は、試料プールに対して、同じ（またはほぼ同じ）量の核酸（同じ対立遺伝子コピー数）に寄与しているはずである。例えば、ゲノムの対立遺伝子頻度の解析において、各個体は、ＤＮＡ試料プールに対しておよそ１．０×１０６個の細胞からのＤＮＡに寄与し得る。
【００３７】
別の実施形態では、単一の個体における多型が測定され得る。すなわち、標的核酸は単一の個体から単離されたものであり得る。例えば、１人の個体の多数の組織試料に由来する核酸プールが、多型およびヌクレオチド頻度について検査され得る。これは、例えば、個体の腫瘍または腫瘍を含むことが疑われる組織における多型の測定に有用であり得る。本発明の方法は、例えば、個体の組織試料（または多数の組織試料をプールしたＤＮＡ）における活性化癌遺伝子頻度を測定するために使用され得る。この例において、活性化癌遺伝子の５０％以上の対立遺伝子頻度は、この腫瘍がモノクローナルであることを示し得る。５０％未満の活性化癌遺伝子の存在は、この腫瘍がポリクローナルであること、または組織試料が腫瘍組織と正常（非腫瘍）組織の組合せを含むことを示し得る。さらに、疑わしい組織の生検材料において、例えば１％の活性化癌遺伝子の存在は、新生腫瘍の存在、または悪性腫瘍の浸潤の存在を示し得る。
【００３８】
標的核酸集団は、任意の核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡならびにかかるＤＮＡおよびＲＮＡの種々の形態、例えば、プラスミド、コスミド、ＤＮＡウイルスゲノム、ＲＮＡウイルスゲノム、細菌ゲノム、ミトコンドリアＤＮＡ、哺乳動物のゲノム、植物のゲノムであり得る。核酸は、組織試料またはインビトロ培養物から単離されたものであり得る。ゲノムＤＮＡは、組織試料、完全体の生物体、または細胞試料から単離され得る。所望により、標的核酸集団は、該集団に寄与した各個体からの等量の対立遺伝子を含むように標準化してもよい。
【００３９】
本発明の利点の１つは、ゲノムＤＮＡが、さらに処理することなく直接使用され得ることである。しかしながら、好ましい実施形態において、ゲノムＤＮＡは、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションプロセスを妨げるタンパク質を実質的に含まないものであるのがよく、また、ＤＮＡを損傷するタンパク質（ヌクレアーゼなど）も実質的に含まないものであるのがよい。また、好ましくは、単離したゲノムも、ポリメラーゼ機能の非タンパク質阻害剤（例えば、重金属）およびＰＣＲを妨げ得るハイブリダイゼーションの非タンパク質阻害剤を含まないものである。タンパク質は、単離したゲノムから当該技術分野で知られた多くの方法によって除去され得る。例えば、タンパク質は、プロテアーゼ（プロテイナーゼＫまたはプロナーゼなど）を用いて、強力な界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）もしくは単離したゲノムを得た細胞を溶解させるラウリルサルコシン酸ナトリウム（ＳＬＳ）または両方）を使用することにより除去され得る。溶解細胞をフェノールとクロロホルムで抽出すると、核酸（例えば、単離したゲノム）を含有する水相が得られ得、該核酸はエタノールで沈殿させ得る。
【００４０】
標的核酸集団は、ＤＮＡの起源が未知の供給源、例えば、土壌試料、食品試料などに由来するものであってもよい。例えば、食品試料由来の核酸試料中の病原体内に見られる対立遺伝子の配列決定により、該食品への病原体混入の存在の測定が可能となり得る。さらに、本発明の方法により、食品中の病原性対立遺伝子の分布の測定が可能となり得る。例えば、本発明の方法により、環境試料（土壌試料（実施例５参照）など）または海水試料中の特定の生物体（例えば、細菌、ウイルス、病原体）の株（種）または株（種）の分布が測定され得る。
【００４１】
この方法の利点の１つは、該方法に対する変異の予備知識（ｐｒｉｏｒｉ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ）が必要でないことである。この方法は核酸配列決定に基づくものであるため、１つの位置のすべての変異が検出され得る。さらに、配列決定のためにクローニングは必要でない。ＤＮＡ試料は、クローニング、サブクローニング、およびクローニングしたＤＮＡの培養の必要なく、配列決定される一連の工程で増幅される。
【００４２】
低頻度変異の検出に関する上記の態様は、本明細書に記載の発明のこの状況において、特に有用である。例えば、より詳細に後述するように、本発明は、薬物耐性と関連しているあらゆるＨＩＶバリアントの検出と定量、特に、ウイルス試料中に低頻度で存在するバリアントの検出と定量を提供する。このようなウイルス試料としては、本実施例において、ＨＩＶウイルス単離物が挙げられ得る。本明細書に記載の発明の一部のある好ましい実施形態において、「標的集団」、「試料集団」、または「被検体集団」は、検出可能な力価のウイルスを含むＨＩＶ  ＲＮＡ供給源に由来するものであり得る。典型的な実施形態では、供給源は、ＨＩＶ感染患者から採取された組織試料または体液試料を含むヒト被検体由来試料を含むものであり得、ＨＩＶ感染患者は、薬物処置レジメンに曝露されたことがある患者でもよく、曝露されたことがない患者でもよい（すなわち、患者は「薬物未処置」であってもよく、そうでなくてもよい）。また、本明細書に記載の本発明の方法により、試料中において、逆転写酵素領域および／またはプロテアーゼ領域内に低頻度で変異が存在するかどうかが測定され得、このとき、該変異は、既知の薬物耐性株または新たに確認された耐性株と相関させ得る。該方法はまた、試料集団における各バリアントの頻度の尺度を提供し、該尺度を用いて治療レジメンが決定または変更され得る（例えば、確認されたＨＩＶバリアント株（１つまたは複数）によって付与される耐性のためほとんど治療的有益性がない１種類以上の薬物、薬物クラス、または薬物組合せの回避などが挙げられる）。
【００４３】
記載の方法の他の適用用途としては、配列バリアントの集団試験が挙げられる。ＤＮＡ試料は、生物体の集団から採取されたものであってもよく、併合して、１つの実験で解析して対立遺伝子頻度を測定する。生物体の集団としては、例えば、ヒト集団、家畜集団、収穫された穀物集団などが挙げられ得る。他の使用としては、腫瘍と正常細胞の混合集団を含む生検材料由来の腫瘍生検材料（例えば、肺癌や結腸直腸癌）における体細胞突然変異の検出および定量が挙げられる。本発明の方法はまた、臨床的に関連性のある易罹患性遺伝子（例えば、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌および膵臓癌、黒色腫）の高信頼度での再配列決定に使用され得る。
【００４４】
記載の方法の別の使用は、複数の相違するゲノムと関連している多型の確認を伴うものである。相違するゲノムは、一部の表現型の特徴、家族性起源、身体的近接性、人種、綱などによって関連している集団から単離されたものであり得る。他の場合において、該ゲノムは集団から、同じ集団から選択されること以外は互いに何の関係もないように無作為に選択されたものである。好ましい一実施形態では、該方法を用いて、特定の表現型の特徴（遺伝性疾患または他の形質など）を有する被検体の遺伝子型（例えば、ＳＮＰ含量）が決定される。
【００４５】
また、記載の方法を用いて、ヘテロ接合性の減少について試験することにより腫瘍の遺伝子構造が特徴付けされ得るか、または特定のＳＮＰの対立遺伝子頻度が測定され得る。さらに、該方法を用いて、ゲノム内の一群のＳＮＰの存在または非存在を確認することによりゲノムのゲノム分類コードが作成され得、ＳＮＰの対立遺伝子頻度が測定され得る。このような各使用は、本明細書においてより詳細に論考する。
【００４６】
本発明の好ましい使用は、ハイスループット遺伝子型分類法におけるものである。「遺伝子型分類は、ゲノムＤＮＡ内における特定のゲノム配列の存在または非存在を確認するプロセスである。相違するゲノムは、表現型、家族、地域、人種、綱などと相関している多型（例えば、複数の相違するゲノムと関連したもの）が確認されるように、一部の表現型の特徴、家族性起源、身体的近接性、人種、綱などによって関連している集団の個体から単離されたものであり得る。あるいはまた、相違するゲノムは集団から、集団におけるその起源以外は互いに何の関係もないように無作為に単離されたものであり得る。かかるゲノムにおける多型の確認は、該集団全体として多型の存在または非存在を示すが、必ずしも特定の表現型と相関していない。ゲノムは長いＤＮＡ領域にわたって存在し得、多数の染色体を伴うことがあり得るため、本発明の遺伝子型検出方法では、遺伝子型が９９．９９％の信頼性で検出されるように、多数の位置の複数の配列バリアントを解析する必要があり得る。
【００４７】
遺伝子型分類は、多くの場合、特定の表現型形質と関連している多型を確認するために使用されるが、この相関性は必要でない。遺伝子型分類に必要とされることは、多型（これは、コード領域に存在していても、そうでなくてもよい）が存在していることだけである。遺伝子型分類を用いて表現型の特徴を特定する場合、特徴付けする表現型形質が多型によって影響を受けることが推定される。表現型は、所望されるもの、有害なもの、または場合によっては中性のものであり得る。本発明の方法によって確認される多型は、表現型に寄与するものであり得る。一部の多型はタンパク質コード配列内に存在し、したがって、そのタンパク質の構造に影響を及ぼし得、それが、観察される表現型の原因または寄与因子となり得る。一部の他の多型は、タンパク質コード配列の外側に存在するが、その遺伝子の発現には影響しない。また他の多型は、対象遺伝子の近傍に存在しているだけであり、該遺伝子のマーカーとして有用である。単一の多型が１つより多くの表現型の特徴の原因または寄与因子となることがあり得、同様に、単一の表現型の特徴が、１つより多くの多型によるものである場合がある。一般に、１つの遺伝子内に存在する多数の多型が同じ表現型と相関している。さらに、個体が特定の多型に関してヘテロ接合型であるかホモ接合型であるかは、特定の表現型形質の存在または非存在に影響し得る。
【００４８】
表現型相関性は、表現型の特徴を示す被検体の実験集団と、該表現型の特徴を示さない対照集団を特定することにより調べる。表現型の特徴を共有する被検体の実験集団に存在し、対照集団には存在しない多型は、表現型形質と相関している多型と言える。多型が表現型形質と相関していると確認されたら、ある表現型の形質または特徴を発現する可能性を有する被検体が、最終的に該表現型の特徴を発現することがあり得るか否かを確立するために、該被検体のゲノムをスクリーニングすると、被検体のゲノムにおける多型の存在または非存在が測定され得る。このような型の解析は、特定の障害（ハンティングトン病または乳癌など）を発症するリスクのある被検体において行なわれ得る。
【００４９】
記載の方法の一実施形態は、表現型形質をＳＮＰと関連させる方法に関する。表現型形質には、被検体においてその存在もしくは非存在が陽性と決定され得る任意の型の遺伝性の疾患、病状または特徴が包含される。遺伝性の疾患または病状である表現型形質としては、その成分が遺伝性であり得る（例えば、被検体におけるＳＮＰの存在のため）多因子性疾患、およびかかる疾患に対する素因が挙げられる。このような疾患としては、限定されないが、喘息、癌、自己免疫疾患、炎症、盲目、潰瘍、心臓または心臓血管の疾患、神経系の障害、および病原性の微生物またはウイルスによる感染に対する易感染性などが挙げられる。自己免疫疾患としては、限定されないが、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ，ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）およびグレーヴズ病が挙げられる。癌としては、限定されないが、膀胱、脳、乳房、結腸、食道、腎臓、造血系（例えば、白血病）、肝臓、肺、口腔、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃および子宮の癌が挙げられる。また、表現型形質としては、薬物または他の治療処置に対する感受性、外観、身長（高さ）、色（例えば、顕花植物の）、強度、速度（例えば、競走馬の）、毛髪の色などが挙げられ得る。遺伝的変異と関連している表現型形質の多くの例が報告されており、例えば、米国特許第５，９０８，９７８号（ここでは、ある種の植物における疾患耐性と遺伝的変異との関連が確認されている）および米国特許第５，９４２，３９２号（これには、アルツハイマー病の発症と関連する遺伝子マーカーが記載されている）を参照されたい。
【００５０】
遺伝的変異（例えば、ＳＮＰの存在）と表現型形質との関連性の確認は、多くの目的に有用である。例えば、被検体におけるＳＮＰ対立遺伝子の存在と、最終的に被検体が疾患を発症することとの相関性の確認は、早期処置剤の投与、またはライフスタイルの変更の策定（例えば、心臓血管の疾患を回避するため、かかる疾患に対して正常より高い素因を有する被検体においてコレステロールまたは脂肪性食品を低減する）、または癌もしくは他の疾患の発症に関する患者の綿密なモニタリングに特に有用である。また、相関性の確認は、胎児が重篤な疾患に罹患しているか否か、または重篤な疾患を発症する素因を有するか否かを特定するための出生前スクリーニングに有用であり得る。さらに、このタイプの情報は、所望の特性を向上または発現させる目的で交配させる動物または植物のスクリーニングに有用である。
【００５１】
複数のゲノムと関連しているＳＮＰまたは複数のＳＮＰを調べる方法の一例は、形質を有する生物体に由来する複数のゲノム試料におけるＳＮＰの存在または非存在に関するスクリーニングである。どのＳＮＰが特定の表現型形質に関連しているのかを調べるため、ゲノム試料を、該特定の表現型形質を示す一群の個体から単離し、試料を一般的なＳＮＰの存在について解析する。各個体から得たゲノム試料を合わせ、ゲノム試料プールを構成してもよい。次いで、本発明の方法を用いて、各ＳＮＰについて対立遺伝子頻度を測定する。ゲノム試料プールは、ＳＮＰの群を用いて本発明のハイスループット法においてスクリーニングし、特定のＳＮＰ（対立遺伝子）の存在または非存在が表現型と関連しているか否かを調べる。場合によっては、特定の被検体が関連表現型を発現する尤度を予測することが可能であり得る。特定の表現型の対立遺伝子がアルツハイマー病を発症している個体の３０％に存在しているが、集団においては１％のみに存在するならば、該対立遺伝子を有する個体は、アルツハイマー病を発症する尤度が高い。また、尤度は、いくつかの要素、例えば、アルツハイマー病を患っていない個体がこの対立遺伝子を有するか否か、および他の要素がアルツハイマー病の発症と関連しているか否かなどに依存し得る。この型の解析は、特定の表現型が発現される確率を調べるのに有用であり得る。この型の解析の予測能を増大させるためには、特定の表現型と関連している多数のＳＮＰが解析され得、相関値が特定される。
【００５２】
また、特定の疾患により分離されるＳＮＰを確認することも可能である。多数の表現型部位を検出して調べると、該部位間またはマーカー（ＳＮＰ）と表現型との物理的関係が確認され得る。これを用いると、表現型形質と連鎖または関連している遺伝子の遺伝子座が、染色体上の位置にマッピングされ得、それにより該表現型形質と関連している１つ以上の遺伝子が明らかになり得る。２つの表現型部位が無作為に分離されている場合、これらは、別々の染色体上に存在するか、または同時分離しないで同じ染色体上で互いに対して充分遠位に存在するかのいずれかである。２つの部位が有意な頻度同時分離している場合、これらは、同じ染色体上で互いに連鎖している。このような型の連鎖解析は遺伝子マップの作成に有用であり、表現型（疾患遺伝子型を含む）に重要なゲノム領域が画定され得る。
【００５３】
連鎖解析は、高い割合で特定の表現型または特定の疾患を示すファミリー構成員において行なわれ得る。生物学的試料を、表現型形質を示すファミリー構成員ならびに該表現型形質を示さない被検体から単離する。これらの各試料を用いて、個々のＳＮＰ対立遺伝子頻度を得る。データを解析すると、該種々のＳＮＰが該表現型形質と関連しているか否か、および任意のＳＮＰが表現型形質により分離されているか否かが判定され得る。
【００５４】
連鎖データの解析方法は、多くの参考文献、例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＆  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（第５版），Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９１；およびＳｔｒａｃｈａｎ，“Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ”ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ（Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ）第４章に記載されており、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．によるＰＣＴ特許出願公開公報ＷＯ９８／１８９６７に要約が示されている。対数オッズ値（ＬＯＤ値）の計算を伴う連鎖解析により、マーカーと遺伝子座が連鎖していない場合の値と比較した場合の、ある組換え比での該マーカーと遺伝子座との連鎖の尤度が示される。組換え比は、マーカーが連鎖している尤度を示す。それぞれ、異なる組換え比の値のＬＯＤスコアを計算するため、および特定のＬＯＤスコアに基づいて組換え比を求めるためのコンピュータプログラムおよび数表が開発されている。例えば、Ｌａｔｈｒｏｐ，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ  ８１，３４４３−３４４６（１９８４）；Ｓｍｉｔｈら，Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｔａｂｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｗｏｒｋｅｒｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９６１）；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３２，１２７−１５００（１９６８）を参照のこと。表現型形質の遺伝子マッピングのためのＬＯＤ値の使用は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．によるＰＣＴ特許出願公開公報ＷＯ９８／１８９６７に記載されている。一般に、正のＬＯＤスコア値は、２つの遺伝子座が連鎖していることを示し、＋３以上のＬＯＤスコアは、２つの遺伝子座が連鎖していることの強力な証拠である。負の値は、連鎖の可能性が低いことを示す。
【００５５】
また、本発明の方法は、腫瘍におけるヘテロ接合性の減少の評価にも有用である。腫瘍におけるヘテロ接合性の減少は、腫瘍の状態、例えば、腫瘍が浸潤性であるのか、転移性腫瘍であるのかを調べるのに有用である。該方法は、同じ型の腫瘍を有する腫瘍試料、ならびに同じ被検体から得た正常（すなわち、非癌性）組織からゲノムＤＮＡを単離することにより行なわれ得る（ｉｓ  ｃａｎ  ｂｅ）。これらのゲノムＤＮＡ試料は、本発明のＳＮＰ検出方法に使用される。正常組織で得られたＳＮＰ対立遺伝子と比較したときの腫瘍でのＳＮＰ対立遺伝子の非存在は、ヘテロ接合性の減少が生じたかどうかを示す。ＳＮＰ対立遺伝子が癌の転移性状態と関連している場合、ＳＮＰ対立遺伝子の非存在が、非転移性腫瘍試料または正常組織試料におけるその存在または非存在と比較され得る。正常組織および腫瘍組織に存在するＳＮＰのデータベースを作成し、診断または予後の目的で、患者の試料におけるＳＮＰの存在を該データベースと比較することができる。
【００５６】
転移性腫瘍から非転移性原発腫瘍に分化させることが可能なことは、転移が癌患者の処置失敗の主な原因であるため、有用である。転移を早期に検出することができれば、該疾患の進行を遅滞させるために積極的に処置することができる。転移は、原発腫瘍からの細胞の剥離、循環系を介した該細胞の移動、および結果としての局所または遠位組織部位での腫瘍細胞の転移増殖を伴う複雑なプロセスである。さらに、モニタリングおよび早期処置が開始され得るように、特定の癌の発症に対する素因を検出することが可能なことが望ましい。多くの癌および腫瘍は、遺伝子の改変と関連している。
【００５７】
充実性腫瘍は、腫瘍形成から転移性病期を経由して、いくつかの遺伝子異常が起こり得る病期に進行する。例えば、Ｓｍｉｔｈら，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｔｅｒａｔ．，１８  Ｓｕｐｐｌ．  １，Ｓ５−１４，１９９１。遺伝子異常は、腫瘍を、次の病期に進行し得るように、すなわち、増殖性の利点、薬物耐性を発現する能力もしくは血管新生の増強、タンパク質分解、または転移能を付与することにより改変すると考えられている。このような遺伝子異常は、「ヘテロ接合性の減少」と称される。ヘテロ接合性の減少は欠失または組換えによって引き起こされ得、腫瘍の進行に役割を果たす遺伝子の突然変異がもたらされ得る。癌抑制遺伝子のヘテロ接合性の減少は、腫瘍の進行に役割を果たすと考えられている。例えば、染色体１３ｑ１４に存在する網膜芽腫の癌抑制遺伝子における突然変異は、網膜芽腫、骨肉腫、小細胞肺癌、および乳癌の進行を引き起こすと考えられている。同様に、第３染色体の短腕は、小細胞肺癌、腎癌および卵巣癌などの癌と関連していることが示されている。例えば、潰瘍性大腸炎は、おそらく遺伝子変化の蓄積が関与した多段階進行を伴う癌の高リスクと関連している疾患である（米国特許第５，８１４，４４４号）。長期間潰瘍性大腸炎を患っている患者は癌の高リスクを示すこと、および初期マーカーの１つは、第８染色体の短腕遠位の一領域のヘテロ接合性の減少であることが示されている。この領域は、前立腺癌および乳癌に関与している思われる推定癌抑制遺伝子部位である。ヘテロ接合性の減少は、潰瘍性大腸炎を患う患者において常套的に本発明の方法を実施することにより容易に検出され得る。同様の解析が、ヘテロ接合性の減少と関連していることがわかっている、または関連していると考えられる他の腫瘍から得た試料を用いて行なわれ得る。本発明の方法は、数千個の腫瘍試料が同時にスクリーニングされ得るため、ヘテロ接合性の減少の試験に特に好都合である。
【００５８】
記載の方法のある実施形態は、対立遺伝子頻度を測定するために核酸の処理を伴うものである。該方法は、以下の３つの工程：（１）試料調製（第１のアンプリコンの調製）；（２）ビーズ乳液型ＰＣＲ（第２のアンプリコンの調製）（３）合成による配列決定（第２のアンプリコンの多数の配列の決定により対立遺伝子頻度が測定）において広く規定され得る。これらの各工程は、より詳細に後述し、実施例のセクションに記載する。
【００５９】
本明細書に記載の発明の好ましい実施形態は、すぐ上に記載した方法工程を、ＨＩＶの多数のウイルス種を含む試料において高頻度および低頻度両方の突然変異の検出を可能にする特異的に設計したプライマーセットを用いて使用することを含むものである。例えば、ＨＩＶ−ＩクレイドＢおよびクレイドＣの試料における少数派バリアントの検出は、従来の（ジデオキシヌクレオチドターミネータ）配列決定法では、これまで検出不可能であった。このような少数派バリアントは、かかる突然変異によって抗レトロウイルス薬に対する耐性が付与される場合、重要である。１組以上のプライマーセットの使用、および続くオーバーサンプリングの配列決定により、既知の耐性突然変異およびこれまで未確認の耐性突然変異の両方が、偏りの少ない様式で検出され得る（すなわち、該方法は、既に開発されたほとんどの感度のよい検出アッセイのように、既知の突然変異だけに焦点をあてるものではなく、対象の位置のすぐ横に結合しているプライマーに依存的でない）。用語「オーバーサンプリングの配列決定」は、本明細書で用いる場合、一般的に、異なる供給源（すなわち、異なるウイルス粒子）の同じ領域（すなわち、アンプリコン領域の場合と同様）を、該領域に対して試料集団において配列バリアントの高感度のレベルの検出をもたらす頻度で配列決定することをいう。
【００６０】
一部のある実施形態において、本明細書に記載のプライマーセットは、高感度の配列決定法、例えば（ｓｕｃｈ）、集団に１％未満の頻度で存在する配列バリアントを検出する感度が得られ得る上記の標的特異的アンプリコン（「ウルトラディープ」とも称される）方法に使用され得る。場合によっては、この感度は、集団において０．０１％の頻度を検出できるものである。
【００６１】
本明細書に記載の発明において、プライマーセットは、当業者に知られた方法によって多くの既知ＨＩＶ配列のアラインメントを用いて設計した。例えば、数多くの配列アラインメント法、アルゴリズム、およびアプリケーションが、当該技術分野において利用可能であり、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ＴＦ，Ｗａｔｅｒｍａｎ  ＭＳ（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４７：１９５−１９７（これは引用によりその全体が、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，ＤＪ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．”Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０（これは引用によりその全体が、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）、およびＣｌｕｓｔａｌ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ，Ｇｉｂｓｏｎ  ＴＪ，Ｐｌｅｗｎｉａｋ  Ｆ，Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ  Ｆ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ（１９９７）．Ｔｈｅ  ＣｌｕｓｔａｌＸ  ｗｉｎｄｏｗｓ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｔｒａｔｅｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｉｄｅｄ  ｂｙ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：４８７６−４８８２（これは引用によりその全体が、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）が挙げられる。本発明の実施例では、上記のアラインメントアルゴリズムの任意の１つを用いて、同じ一般配列領域の配列の多重アラインメントが行なわれされ得る。かかる配列は、一般的に、種々の公的リソース、例えば、よく知られたＧｅｎＢａｎｋデータベースなどにおいて入手可能であるか、または本発明のＨＩＶの場合では、配列は、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに保存されたＨＩＶ配列データベースから入手され得る。また、本発明の実施例では、任意のクレイドと関連しているＨＩＶ  ＰＯＬ領域の配列は、アラインメントのために特異的に選択され得る。当業者には認識されるように、ＨＩＶは、感染がウイルスの特定のクレイド（サブタイプとも称される）と関連したものであり得る途方もない量の遺伝的多様性を有する。現在、Ａ〜Ｋの文字で指定される９つのクレイドが確認されており、一部のクレイド型は、特定の地理的領域と関連している。例えば、ＨＩＶクレイドＢは、一般的に北米および欧州で見られるが、クレイドＣは、一般的に南アフリカおよびインドで見られる。
【００６２】
図９は、ＰＯＬ領域内の６０００を超えるＨＩＶクレイドＢ配列のアラインメントの結果の一例の実例を示す。図９に示されるように、数千個の異なるＨＩＶ配列集団を単一の「コンセンサス」配列にアラインメントすることにより、ＨＩＶ配列集団の各配列位置における最も高頻度の核酸種の確認の表示、ならびに各位置における変異性の程度または突然変異頻度の尺度が得られる。かかる突然変異頻度の尺度は、図９の実施例にバーが配列表示部より突き出ることで示されており、特定の配列位置（１つまたは複数）と関連している。また、バーは、クレイドによる突然変異頻度などの他の特徴を提示するための色（もしくは例えばハッシュマークなどの他のグラフ表示）などの一定の特徴の他のグラフ上での確認因子も含み得、また、バーの高さは頻度の尺度の程度を示す。また、図９は、配列領域を示すコンセンサス配列の下部に位置する小さい四角を用いて、薬物耐性と関連している突然変異に感受性であることがわかっている対象領域を示し、この場合も、四角の色は、薬物クラスまたは特定の対象薬物などのさらなる情報を示し得る。かかる薬物クラスおよび治療剤としては、限定されないが、高度に活性な抗レトロウイルス療法剤（ＨＡＡＲＴとも称される）；プロテアーゼ阻害剤（ＰＩとも称される）；ヌクレオチド／ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩとも称される）；および非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）が挙げられ得る。
【００６３】
次いで、図９のコンセンサス配列内の、突然変異が起こり易いことがわかっている領域よりも保存された（すなわち、変異が起こりにくい）領域に対するプライマーセットを設計した。プライマー設計で低い突然変異率配列領域が標的化される利点としては、プライマーを結合不可能にし得る標的領域の突然変異による失敗の実質的なリスクなく、設計されプライマーを高信頼性で使用できること、ならびに、同じプライマーセットを多種類のクレイドに対して使用できる可能性が挙げられる。図１０は、方向を示す矢印（プライマー設計の相対方向性を示す）を伴う陰影を付けた四角で示したクレイドＢ配列をインテロゲート（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）するプライマー設計に選択した領域の実例の１つを示す。
【００６４】
図１０に示したクレイドＢプライマー設計の例としては、
【００６５】
【化１】
2010521156.tif 000005
が挙げられる。
【００６６】
記載のプライマーはすべて、５’−３’方向である。また、セット内のあるプライマーは、１つ以上の配列内位置における配列の縮重のため、１つより多くの種を有するものであり得ることは認識されよう。例えば、Ｂ−ＡＣＦ−１とＢ−ＡＣＦ−２は、図１０に示すＡＣＦプライマー種を表し、これらは、プライマー配列内の同じ塩基位置のヌクレオチド種ＡとＧの違いで互いに異なる。
【００６７】
さらに、図１１は、クレイドＢプライマーとクレイドＣプライマーの違いの実例の１つを示し、方向を示す矢印（プライマー設計の相対方向性を示す）を伴う陰影を付けた四角で示したクレイドＣ配列をインテロゲートするために選択されたクレイドＢプライマー設計の修飾領域を示す。また、上記のように、一部のプライマーセットは、１つより多くの種を有するプライマーを有する。例えば、クレイドＢプライマー配列と同様、Ｃ−ＡＣＦ−１とＣ−ＡＣＦ−２のプライマー配列は、同じ塩基位置の同じヌクレオチド種ＡとＧの違いで異なる。
【００６８】
図１１に示したクレイドＣプライマー設計の例としては、
【００６９】
【化２】
2010521156.tif 000006
【００７０】
【化３】
2010521156.tif 000007
が挙げられる。
【００７１】
当業者には、プライマーセットの配列組成に、ある程度の変異性が存在することは認識されよう。これは、主に、設計したプライマー対に対してより広い有用性（より広範なさまざまなクレイドサブクラスでの使用など）を可能にする一部の配列位置における「配列の縮重」によるものである。用語「配列の縮重」は、本明細書で用いる場合、一般的に、配列組成全体におけるわずかな差に適合した１つ以上の配列位置における核酸種の置換をいう。また、該プライマーセットの標的領域はわずかにシフトされることがあり得、したがって、プライマー配列組成にある程度の差が予測される。また、標的領域の配列組成においてわずかな違いを示すコンセンサス配列に対する改良を行なってもよく、同様に、プライマー配列組成にある程度の差が予測される。
【００７２】
配列決定のための配列特異的アンプリコンの作製の記載関して上記のように、プライマー種のセットを用いて、逆転写酵素領域、プロテアーゼ領域、およびインテグラーゼ領域を含むＨＩＶの領域に関するオーバーラップアンプリコンが得られ得る。図１２は、プライマー種のセット使用の実施の実例の１つを示す。図１２の実施例では、３種類の別々のｃＤＮＡ種をＨＩＶ  ＲＮＡから、プライマーＢＲ、４Ｒ−１／４Ｒ−２ミックスおよび５Ｒを用いて作製しており、それぞれの相対的な位置関係を、互いにオーバーラップする領域を有するように示している。これらの３種類のｃＤＮＡから、以下のプライマーセットによって８種類のアンプリコンが得られた。
【００７３】
クレイドＢ：
ｃＤＮＡ  ＢＲ：アンプリコンＡ  （ＰＲ）：Ｂ−ＡＣＦ−１／Ｂ−ＡＣＦ−２ミックス＋Ｂ−ＡＲ
ｃＤＮＡ  ＢＲ：アンプリコンＢ  （ＰＲ）：Ｂ−ＢＦ                    ＋Ｂ−ＢＲ
ｃＤＮＡ  ＢＲ：アンプリコンＣ  （ＰＲ）：Ｂ−ＡＣＦ−１／Ｂ−ＡＣＦ−２ミックス＋Ｂ−ＣＲ
ｃＤＮＡ  ４Ｒ：アンプリコン１  （ＲＴ）：Ｂ−１Ｆ                    ＋Ｂ−１Ｒ−１／Ｂ−１Ｒ−２ミックス
ｃＤＮＡ  ５Ｒ：アンプリコン２  （ＲＴ）：Ｂ−２Ｆ                      ＋Ｂ−２Ｒ
ｃＤＮＡ  ５Ｒ：アンプリコン３  （ＲＴ）：Ｂ−３Ｆ                      ＋Ｂ−３Ｒ
ｃＤＮＡ  ４Ｒ：アンプリコン４  （ＲＴ）：Ｂ−４Ｆ                      ＋Ｂ−４Ｒ−１／Ｂ−４Ｒ−２ミックス
ｃＤＮＡ  ５Ｒ：アンプリコン５  （ＲＴ）：Ｂ−５Ｆ                      ＋Ｂ−５Ｒ−１／Ｂ−５Ｒ−２ミックス
クレイドＣ：
ｃＤＮＡ  ＢＲ：アンプリコンＡ  （ＰＲ）：Ｃ−ＡＣＦ−１／Ｃ−ＡＣＦ−２ミックス＋Ｃ−ＡＲ−１／Ｃ−ＡＲ−２ミックス
ｃＤＮＡ  ＢＲ：アンプリコンＢ  （ＰＲ）：Ｃ−ＢＦ−１／Ｃ−ＢＦ−２ミックス＋Ｃ−ＢＲ
ｃＤＮＡ  ＢＲ：アンプリコンＣ  （ＰＲ）：Ｃ−ＡＣＦ−１／Ｃ−ＡＣＦ−２ミックス＋Ｃ−ＣＲ
ｃＤＮＡ  ４Ｒ：アンプリコン１  （ＲＴ）：Ｃ−１Ｆ−ｌ／Ｃ−１Ｆ−２ミックス＋Ｃ−１Ｒ−１／Ｃ−１Ｒ−２ミックス
ｃＤＮＡ  ５Ｒ：アンプリコン２  （ＲＴ）：Ｃ−２Ｆ−１／Ｃ−２Ｆ−２ミックス＋Ｃ−２Ｒ
ｃＤＮＡ  ５Ｒ：アンプリコン３  （ＲＴ）：Ｃ−３Ｆ−１／Ｃ−３Ｆ−２／Ｃ−３Ｆ−３／Ｃ−３Ｆ−４ミックス＋Ｃ−３Ｒ
ｃＤＮＡ  ４Ｒ：アンプリコン４  （ＲＴ）：Ｃ−４Ｆ                ＋Ｃ−４Ｒ−１／Ｃ−４Ｒ−２ミックス
ｃＤＮＡ  ５Ｒ：アンプリコン５  （ＲＴ）：Ｃ−５Ｆ−１／Ｃ−５Ｆ−２ミックス＋Ｃ−５Ｒ
ｃＤＮＡの表示と同様、図１２は、アンプリコンの位置関係をオーバーラップ領域を有するように示す。本発明の実施例において、アンプリコンは、各原試料について混合して複合試料とし、上記の配列決定法および機器類を用いて配列決定される。
【００７４】
図１３は、ＨＩＶ亜種（「疑似種」とも称される）における低頻度変異の確認方法の一実施形態の実例の１つを示し、該方法は、初期ＲＮＡ品質管理評価のための工程１３０３を含む。一部のある実施形態において、ＲＮＡ  Ｑｃは、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡ  Ｐｉｃｏチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）を用いて行なわれ、続いて、チューブ１本あたり３５ｎｇ（１回の配列決定の実行に充分）のアリコートが採取される。また、一般的に、各アリコートにはバーコードを付け、ＨＩＶ  ＲＮＡ試料ごとに個々に採取することが好ましい。３５ｎｇ未満のＲＮＡ（担体＋ウイルス）の試料または明らかにＲＮＡが分解された試料はいずれも除外される。次に、ＱｃされたＲＮＡは、工程１３０５に示したようにして処理され、ＨＩＶ試料集団から１種類以上のｃＤＮＡ鋳型が得られる。好ましい実施形態において、各試料は、３種類の遺伝子特異的プライマーを使用するｃＤＮＡ合成において、バーコード付きの９６ウェルプレート形式の３つの別個の反応で使用される。続いて、ｃＤＮＡは、後続のＰＣＲ成績が改善されるようにＲＮＡｓｅ  Ｈで処理され得る。
【００７５】
続いて、工程１３１０に示すように、領域特異的プライマー対を用いて、工程１３０５で得られたｃＤＮＡ鋳型から標的領域を増幅させる。各アンプリコンＰＣＲ反応には３μＬの当該ｃＤＮＡが使用される。バーコード付きの９６ウェルプレート形式での４０サイクルのＰＣＲにより、１試料あたり８種類のアンプリコンが得られる。工程１３１０で得られたアンプリコンは、一部のある実施形態では、次いで、関連技術分野で知られた固相可逆的固定化（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（ＳＰＲＩとも称される）またはサイズ選択のためのゲル切り出し法のいずれかを用いて取り出され得る。例えば、アンプリコンは、ＳＰＲＩビーズを用いて個々に精製され、ｄｓＤＮＡ結合蛍光色素（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて定量される。続いて、各試料から得られたこの８種類のアンプリコンは、等モル比で混合され得る。次に、工程１３１５に示すように、アンプリコンの核酸鎖は、本明細書中のどこかに記載したようにして乳液滴中に導入され、増幅される。一部のある実施形態において、患者試料１例あたり２種類の乳液が設定され得、１つはアンプリコンＡキットで使用、１つはアンプリコンＢキット（ともに、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）で使用される。異なる実施形態では、異なる数の乳液および／または異なるキットが使用され得ることは認識されよう。
【００７６】
増幅後、乳液を破壊し、固定化された増幅核酸集団を有するビーズを、工程１３２０に示すように富化させる。例えば、ＤＮＡ含有ビーズは、本明細書中のどこかに記載したようにして富化させ得る。
【００７７】
富化させたビーズは次いで、工程１３３０に示すように、配列決定される。一部のある実施形態では、各試料は、本明細書中のどこかに記載したようにして配列決定される。続いて、工程１３４０に示すように、配列データ出力が解析される。一部のある実施形態では、高品質に関してフィルター処理されたフローグラムデータを含むＳＦＦファイルが、特異的アンプリコンソフトウェアを用いて処理され、該データは、６０００＋ＨＩＶ−１クレイドＢ  ＰＯＬ領域の配列のアラインメントから誘導されたコンセンサス配列に関する差について解析される。用語「フローグラム」または「パイログラム」は、本明細書において互換的に使用され得、一般的に、本明細書に記載の配列決定法によって得られた配列データのグラフ表示をいう。また、データ解析には、配列データにおいて確認された変異と、薬物耐性と関連していることがわかっている以前に確認されたバリアントとの関連性が含まれるか、または該変異は、薬物耐性と相関する「新たな」バリアントとして確認され得る。
【００７８】
上記の工程は、例示の目的のためのものにすぎず、限定を意図するものではないこと、さらに、該工程の一部または全部は、種々の実施形態において種々の組合せで使用され得ることは理解されよう。
【００７９】
１．  核酸鋳型の調製
核酸鋳型
鋳型核酸は、任意の核酸供給源、例えば、任意の細胞、組織または生物体から構築され得、任意の当該技術分野で認められた方法によって作製され得る。あるいはまた、ＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーを作製することにより、鋳型ライブラリーが作製され得る。試料の調製方法は、米国特許第７，３２３，３０５号および同時係属中のＰＣＴ出願ＵＳ０４／０２５７０号を見るとよく、また、ＷＯ／０４０７０００７（すべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）にも公開されている。
【００８０】
核酸鋳型調製方法の好ましい一例は、試料においてＰＣＲを行ない、対立遺伝子または対立対象遺伝子を含む領域を増幅させることである。ＰＣＲ手法は、互いに間隔をあけたオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、任意の核酸試料（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ）に適用され得る。プライマーは、二本鎖ＤＮＡ分子の反対側の鎖に相補的であり、典型的には、約５０〜４５０ヌクレオチドまたはそれ以上（通常、２０００ヌクレオチド以下）離れている。ＰＣＲ法は、いくつかの刊行物、例えば、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３５０−１３５４；Ｓａｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２４：１６３−１６６；およびＳｃｈａｒｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３：１０７６−１０７８に記載されている。また、米国特許第４，６８３，１９４号；同第４，６８３，１９５号；および同第４，６８３，２０２号（各特許の本文は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。さらなるＰＣＲ増幅法は、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＨＡ  Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ，Ｇｅｌｆｌａｎｄ，ＳｎｉｓｋｙおよびＷｈｉｔｅ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ，Ｋ．Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９９１）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７ならびに；ＰＣＲ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ＱｕｉｒｋｅｓおよびＴａｙｌｏｒ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（これらは、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００８１】
２．  核酸鋳型の増幅
核酸鋳型（すなわち、第１工程のＰＣＲ法によって得られたアンプリコン）が本発明の方法に従って配列決定されるためには、コピー数は、２回目に、光検出手段によって検出可能なシグナルが生成されるのに充分なコピー数の各鋳型が得られるように増幅させなければならない。任意の適当な核酸増幅手段が使用され得る。好ましい実施形態において、ＥＢＣＡ（乳液系クローン増幅またはビーズ乳液型増幅）と称する本明細書の新規な増幅システムが、この第２の増幅の実施に使用される。
【００８２】
ＥＢＣＡは、増幅対象の鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ）を、固相（好ましくは、おおむね球形のビーズの形態のもの）に結合させることにより行なわれる。本発明の試料調製法に従って調製される単鎖鋳型ＤＮＡのライブラリーは、この増幅方法における使用のためのビーズに結合させる出発核酸鋳型ライブラリーの好適な供給源の一例である。
【００８３】
ビーズは、鋳型ＤＮＡの一領域に相補的な多数の単一のプライマー種（すなわち、図１のプライマーＢ）に結合させる。鋳型ＤＮＡを、ビーズ結合プライマーにアニーリングさせる。ビーズを水性反応混合物中に懸濁させ、次いで、油中水型乳液中に封入させる。この乳液は、熱安定性油相によって囲まれた直径がおよそ６０〜２００ｕｍの個々の水相微小液滴で構成されたものである。各微小液滴は、好ましくは、増幅反応溶液（すなわち、核酸増幅に必要な試薬）を含むものである。増幅物の一例は、ＰＣＲ反応ミックス（ポリメラーゼ、塩、ｄＮＴＰ）ならびに１対のＰＣＲプライマー（プライマーＡおよびプライマーＢ）であり得る。図１Ａ参照。また、微小液滴集団の小集団は、ＤＮＡ鋳型を含むＤＮＡビーズを含むものである。この微小液滴の小集団が増幅の基礎となる。この小集団内にないマイクロカプセルは、鋳型ＤＮＡを有さず、増幅に参与しない。一実施形態において、増幅手法はＰＣＲであり、ＰＣＲプライマーは、８：１または１６：１の比（すなわち、第２プライマー１つに対して８個または１６個の第１プライマー）で存在させ、非対称ＰＣＲを行なう。
【００８４】
この概説において、ＤＮＡは、ビーズに固定化させたオリゴヌクレオチド（プライマーＢ）にアニーリングさせる。サーモサイクリング中（図１Ｂ）、単鎖ＤＮＡ鋳型とビーズ上に固定化されたＢプライマー間の結合を破壊させ、鋳型を、周囲のマイクロカプセル封入溶液中に放出させる。増幅溶液（この場合、ＰＣＲ溶液）は、付加用液相プライマーＡおよびプライマーＢを含むものである。液相Ｂプライマーは、結合反応速度論が、固定化されプライマーよりも液相プライマーで高速であるため、鋳型の相補的なｂ’領域に容易に結合する。ＰＣＲ初期では、Ａ鎖およびＢ鎖はともに等しく良好に増幅される（図１Ｃ）。
【００８５】
ＰＣＲ中期（すなわち、１０〜３０サイクル）までに、Ｂプライマーは枯渇され、指数増幅が停止する。次いで、反応は非対称増幅に入り、アンプリコン集団は、Ａ鎖に支配されるようになる（図１Ｄ）。３０〜４０サイクル後のＰＣＲ後期（図１Ｅ）では、非対称増幅により溶液中のＡ鎖の濃度が増大する。過剰のＡ鎖は、ビーズに固定化されたＢプライマーにアニーリングし始める。次いで、熱安定性ポリメラーゼは、Ａ鎖を鋳型として使用し、アンプリコンの固定化されたビーズ結合Ｂ鎖を合成する。
【００８６】
ＰＣＲ最終期では（図１Ｆ）、継続的な熱サイクリングにより、ビーズ結合プライマーに対するさらなるアニーリングが押し進められる。液相増幅は、この段階において最小限となり得るが、固定化Ｂ鎖の濃度は増大する。次いで、乳液を破壊し、固定化された産物を変性によって（熱、ｐＨなどによって）単鎖にすると、相補Ａ鎖の方に移動する。Ａプライマーは、固定化された鎖のＡ’領域にアニーリングされ、固定化された鎖には、配列決定用酵素および任意の必要なアクセサリータンパク質が負荷される。次いで、ビーズは、認められたピロリン酸塩系手法（例えば、米国特許第６，２７４，３２０号、同第６２５８，５６８号および同第６，２１０，８９１号（引用により全体が本明細書に組み込まれる）に記載）を用いて配列決定される。
【００８７】
好ましい実施形態において、増幅に使用されるプライマーは、５’部分と３’部分を含む二部構成である。プライマーの３’部分は、標的特異的配列（図２参照）を含み、ＰＣＲプライマーの機能を発揮した。プライマーの５’部分は、配列決定法または固定化法に有用な配列を含む。例えば、図２において、増幅に使用された２つのプライマーの５’部分は、ビーズ上のプライマーまたは配列決定用プライマーに相補的な配列（４５４フォワードおよび４５４リバースと表示）を含む。すなわち、５’部分がフォワードまたはリバース配列を含むことにより、アンプリコンが、フォワードまたはリバース配列に相補的な固定化オリゴ配列を含むビーズに結合することが可能になる。さらに、配列決定反応は、フォワード配列およびリバースプライマー配列に相補的な配列決定用プライマーを用いて開始され得る。したがって、二部構成プライマーの５’部分に相補的な配列を含む１組のビーズは、全反応において使用され得る。同様に、二部構成プライマーの５’部分に相補的な配列を含む１組の配列決定用プライマーを用いて、二部構成プライマーを用いて作製された任意のアンプリコンが配列決定され得る。最も好ましい実施形態において、増幅に使用される二部構成プライマーセットはすべて、同じ組の５’部分を有するものであり得る（図２に示した４５４フォワードプライマーと４５４リバースプライマーなど）。この場合、すべてのアンプリコンは、該５’部分に相補的なオリゴ配列でコートされた標準的なビーズを用いて解析され得る。同じオリゴ配列（ビーズ上に固定化または固定化されていない）を、配列決定用オリゴ配列として使用してもよい。
【００８８】
乳液の破壊およびビーズの回収
鋳型の増幅後、乳液を「破壊」する（当該技術分野において「解乳化」とも称される）。乳液の破壊には多くの方法があり（例えば、米国特許第５，９８９，８９２号およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）、当業者であれば、適正な方法を選択することができよう。好ましい乳液破壊方法の一例を、実施例のセクションにより詳細に記載する。
【００８９】
乳液を破壊した後、増幅させた鋳型含有ビーズは、次いで、例えば、既知の手法による配列決定反応における使用のための水溶液に再懸濁され得る（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７５，５４６３−５４６７（１９７７）；Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．＆Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７４，５６０−５６４  （１９７７）；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，３６３，３６５（１９９８）；Ｌｙｓｏｖ，Ｉ．ら，Ｄｏｋｌ  Ａｋａｄ  Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ  ３０３，１５０８−１５１１（１９８８）；Ｂａｉｎｓ  Ｗ．＆Ｓｍｉｔｈ  Ｇ．Ｃ．  Ｊ．ＴｈｅｏｒＢｉｏｌ  １３５，３０３−３０７（１９８８）；Ｄｒｎａｎａｃ，Ｒ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，１１４−１２８（１９８９）；Ｋｈｒａｐｋｏ，Ｋ．Ｒ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２５６．  １１８−１２２（１９８９）；Ｐｅｖｚｎｅｒ  Ｐ．Ａ．  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｄｙｎ  ７，６３−７３（１９８９）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３，１００８−１０１７（１９９２）を参照のこと）。ビーズが、ピロリン酸塩系配列決定反応（例えば、米国特許第６，２７４，３２０号、同第６２５８，５６８号および同第６，２１０，８９１号（引用により全体が本明細書に組み込まれる）に記載）において使用される場合、ＰＣＲ産物の第２鎖を除き、配列決定用プライマーを、ビーズに結合された単鎖鋳型にアニーリングさせることが必要である。
【００９０】
この時点で、ビーズ上の増幅ＤＮＡは、ビーズ上で直接または異なる反応槽でのいずれかで配列決定され得る。本発明の一実施形態において、該ＤＮＡは、ビーズを反応槽に移し、該ＤＮＡを配列決定反応（例えば、ピロリン酸塩系またはサンガー配列決定法）に供することにより、ビーズ上で直接配列決定される。あるいはまた、ビーズを単離して該ＤＮＡを各ビーズから取り出し、配列決定してもよい。いずれの場合も、配列決定工程は個々の各ビーズ上で行なわれ得る。
【００９１】
３．  核酸の配列決定法
配列決定法の一例は、ピロリン酸塩系配列決定法である。ピロリン酸塩系配列決定法では、試料ＤＮＡ配列および伸長プライマーが、ヌクレオチド三リン酸の存在下で、ポリメラーゼ反応に供され、ここで、ヌクレオチド三リン酸は、組み込まれた状態であるにすぎず、標的位置の塩基に相補的である場合にピロリン酸塩（ＰＰｉ）を放出し、ヌクレオチド三リン酸は、試料−プライマー混合物の別々のアリコートに添加されるか、または同じ試料−プライマー混合物に連続して添加されるかのいずれかである。次いで、どのヌクレオチドが組み込まれたかを示すＰＰｉの放出が検出される。
【００９２】
一実施形態において、配列産物の一領域は、配列決定用プライマーが鋳型核酸の一領域にアニーリングさせ、次いで、配列決定用プライマーを、ＤＮＡポリメラーゼと既知のヌクレオチド三リン酸（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはこれらのヌクレオチドの１つの類縁体）と接触させることにより決定される。配列は、配列反応副生成物を検出することにより決定され得る（後述）。
【００９３】
配列決定用プライマーは、増幅された核酸鋳型の一領域に特異的にアニーリングできる限り、任意の長さまたは塩基組成であり得る。配列決定用プライマーには、増幅された鋳型核酸の一領域に特異的にプライミングできる限り、特別な構造は必要とされない。好ましくは、配列決定用プライマーは、特徴付けする配列とアンカープライマーにハイブリダイズ可能な配列の間の鋳型の領域に相補的である。配列決定用プライマーはＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、配列産物が形成される。伸長は、１種類以上の型のヌクレオチド三リン酸、および所望により、補助結合タンパク質の存在下で行なわれる。ｄＮＴＰの組込みは、好ましくは、配列決定副生成物の存在についてアッセイすることにより測定される。好ましい実施形態において、配列決定産物のヌクレオチド配列は、伸長された配列決定用プライマー内にｄＮＭＰが組み込まれるとヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）から遊離される無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）を測定することにより決定される。この配列決定法は、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（商標）手法（ＰｙｒｏＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＡＢ，ストックホルム、スウェーデン）と称され、溶液状（液相）または固相手法として行なわれ得る。ＰＰｉによる配列決定法は、例えば、ＷＯ９８１３５２３Ａ１、Ｒｏｎａｇｈｉら，１９９６．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４２：８４−８９、Ｒｏｎａｇｈｉら，１９９８．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：３６３−３６５（１９９８）およびＵＳＳＮ  ２００１／００２４７９０に一般的に記載されている。これらのＰＰｉ配列決定法の開示内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、例えば、米国特許第６，２１０，８９１号および同第６，２５８，５６８号（各々は、引用により本明細書に完全に組み込まれる）も参照のこと。
【００９４】
好ましい実施形態において、ＤＮＡ配列決定は、４５４  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）配列決定用の装置および方法（これらは、米国特許第７，３２３，３０５号ならびに同時係属中の特許出願ＵＳＳＮ：１０／７６８，７２９、ＵＳＳＮ：１０／７６７，８９９およびＵＳＳＮ：１０／７６７，８９４（これらはすべて、２００４年１月２８日に出願）に開示）を用いて行なわれる。
【００９５】
特に規定のない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。一般的に理解されている定義としては、ＵＳＳＮ：６０／４７６，６０２（２００３年６月６日出願）；ＵＳＳＮ：６０／４７６，５０４（２００３年６月６日出願）；ＵＳＳＮ：６０／４４３，４７１（２００３年１月２９日出願）；ＵＳＳＮ：６０／４７６，３１３（２００３年６月６日出願）；ＵＳＳＮ：６０／４７６，５９２（２００３年６月６日出願）；ＵＳＳＮ：６０／４６５，０７１（２００３年４月２３日出願）；ＵＳＳＮ：６０／４９７，９８５（２００３年８月２５日出願）；米国特許第７，３２３，３０５号（２００４年１月２８日出願）；１０／７６７，８９９（２００４年１月２８日出願）；ＵＳＳＮ：１０／７６７，８９４（２００４年１月２８日出願）に定義されたものが挙げられ得る。本出願に挙げたすべての特許、特許出願および参考文献は、引用により本明細書に完全に組み込まれる。
【実施例】
【００９６】
実施例１  ＨＬＡ遺伝子座の配列決定
５組のＰＣＲプライマー対を、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座内の既知の公に開示されたＳＮＰにまたがるように設計した。プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、入力として標的領域を含むおよそ２００塩基対長のゲノム配列を用いて設計した。各プライマーは、２０〜２４塩基長の範囲の遺伝子座特異的３’部分と、４塩基のキー（太字で強調）を含む１９塩基固定の５’部分（小文字で表示）からなるものであった。プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。
【００９７】
【化４】
2010521156.tif 000008
４例の個体由来のヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）を、２６０ｎｍでの光学密度に基づいて定量し、１００ｎｇ（およそ１５，０００個のハプロイドゲノム相当量）を、各ＰＣＲ増幅反応の鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は、標準的な反応条件下（６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ８．９、１８ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４）、２．５ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのｄＮＴＰ、０．６２５ｕＭの各プライマー、４．５単位のＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、以下の温度プロフィール：９４℃で３分間；９４℃で３０秒間、５７℃で４５秒間、７２℃で１分間を３０サイクル；７２℃で３分間で行なった。増幅産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製し、その予測サイズ（１５６〜１８１塩基対）を、５００  ＤＮＡ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）が使用された２１００  Ｂｉｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ微小流体工学機器において確認した。この精製アンプリコンを、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて定量し、１０７コピー／μＬに希釈した。
【００９８】
ＥＢＣＡ（乳液系クローン増幅）を、０．５アンプリコン／ビーズを使用し、増幅プライマーＳＡＤ１Ｆ（ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＧＣＧ  ＣＣＡ（配列番号：１１））およびＳＡＤ１Ｒならびにセファロース捕捉ビーズをＳＡＤＲ１（ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＣＧＣ（配列番号：１２））捕捉プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）とともに用いて上記のようにして行なった。乳液の破壊およびＰｉｃｏＴｉｔｅｒプレートでの配列決定を含むさらなる操作はすべて、上記のようにして行なった。
【００９９】
実施例２  感受性突然変異の検出
現行のシステム（すなわち、４５４プラットホーム）の低アバンダンスの配列バリアントの検出能、特に、単一塩基置換の検出能を実証するため、種々の比で混合した既知対立遺伝子を配列決定する実験を設計した。
【０１００】
上記の６組のプライマー対を増幅効率について試験し、ＳＡＤ１Ｆ／Ｒ−ＤＤ１４、ＳＡＤ１Ｆ／Ｒ−ＤＥ１５およびＳＡＤ１Ｆ／Ｒ−Ｆ５のペア（これらはすべて、異なる増幅産物をもたらす）（図３）を用いて、さらなる解析を行なった。合計８例のヒトゲノムＤＮＡ試料を増幅させ、４５４プラットホームにおいて配列決定し、各遺伝子座について遺伝子型を決定した。実験設備を単純化するため、さらなる解析はすべて、プライマー対ＳＡＤ１Ｆ／Ｒ−ＤＤ１４（図３Ａ）と、特定の遺伝子座のＣまたはＴいすれかの対立遺伝子に対してホモ接合型であることが示された２つの試料を用いて行なった。
【０１０１】
各試料の第１のアンプリコンを定量し、１０：９０〜１：１０００までの範囲の特定の比で、典型的にはＴ対立遺伝子過剰で混合した。混合後、試料を２×１０６コピー／μＬの作業濃度まで希釈し、ＥＢＣＡに供し、４５４プラットホームにおいて配列決定した。図２は、Ｃ対立遺伝子をほぼ１：５００および１：１０００の比でＴ対立遺伝子に混合することにより得られた配列決定データを示す。どちらの場合も、ほぼ１０，０００個の高品質の配列決定読み取りが得られ、Ｂｌａｓｔ解析に供すると、参照配列（この場合、Ｔ対立遺伝子を有する配列）に対するヌクレオチド置換を確認した。結果の視覚化のため、置換頻度を、参照配列に対して色分けしてプロットする。このデータは、両方の試料で低頻度の単一塩基置換が容易に確認されたことことを示す（図４Ａ〜４Ｃ）。さらに、バックグラウンドは、試料間で比較的一貫しており、バックグラウンドを差し引くことが可能なことがわかった。これにより、典型的には、１：１０００対立遺伝子であっても１０より大きい信号雑音比がもたらされた（図５Ａおよび５Ｂ）。既知遺伝子型の試料を用いたさらなる実験手法によって、少なくとも０．１％アバンダンスレベルに至るまで単一ヌクレオチド置換検出能が確認された。低アバンダンス変化におけるさらなる信頼性は、両方向で鋳型を配列決定することにより得られ得る。典型的には、２つの独立した両方向のデータセットの頻度間の差は、１％アバンダンスレベルに至るまで２０％以内である。
【０１０２】
広範囲の対立遺伝子比にわたる線形応答を実証するため、ＤＤ１４  ＨＬＡ遺伝子座のＴ対立遺伝子およびＣ対立遺伝子を提示するアンプリコンを１：１０、１：２０、１：５０および１：２００（１０％、５％、２％および０．５％）の比で混合し、ＥＢＣＡにより増幅させ、配列決定した。図６は、この範囲全体において、低頻度対立遺伝子の相対数の線形増大が観察されたことを示す（Ｒ２＝０．９９２７）。この記録された絶対頻度は、意図された比からいくぶん外れており（以下の表を参照）、原因は、少量のＤＮＡを正確に定量し、等分し、混合しようと試みる際に一般に観察される困難さであった。
【０１０３】
【表３】
2010521156.tif 000009
実施例３  細菌１６Ｓプロジェクト−細菌集団を調べるための方法
細菌集団の調査は、医療、環境および農業の研究に加えて、産業プロセス制御などの多くの分野にとって基幹的な適用である。一般的な方法の一例は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列を用いて細菌種を識別するものである（Ｊｏｎａｓｓｏｎ，Ｏｌｏｆｓｓｏｎら，２００２；Ｇｒａｈｎ，Ｏｌｏｆｓｓｏｎら，２００３）。別の方法は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子と２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の間の介在配列を、同様にして調べるものである（Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｂｅｓｃｏｓら，２００１）。しかしながら、研究者のほとんどは、現在利用可能な試料調製および配列決定手法を用いて、複雑な細菌集団の完全な個体数調査を行なうは不可能であると考えている；かかるプロジェクトに対する作業要件は、莫大に費用がかかるか、または集団の劇的な二段抽出が強制されるかのいずれかである。
【０１０４】
現在、細菌集団を調べるのに、ハイスループット法は常套的には使用されていない。一般的な実務では、ユニバーサルプライマー（１つまたは複数）を用いて１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（または該遺伝子内の領域）を増幅し、続いて、該遺伝子をベクター内にサブクローニングし、配列決定する。多くの場合、同一の制限パターンを示すベクターを排除することにより配列決定の負荷を軽減する目的で、該ベクターにおいて制限消化（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｄｉｇｅｓｔｓ）が行なわれる。得られた配列を、種々の生物体の既知遺伝子のデータベースと比較し、集団組成の推定は、種−または属−特異的遺伝子の配列の存在から導かれる。本開示の方法は、クローニングおよび制限消化工程の排除によって作業コストを劇的に削減することにより、これまでは取得不可能な亜株分化が可能になる１６Ｓ（および場合によっては遺伝子間および２３Ｓ）ＲＮＡ領域の完全な配列を提供することによって情報出力を増大させることにより、ならびに配列オーバーサンプリングを相対アバンダンスに変換することによって種の密度の推定値が得られる可能性があることにより、細菌集団の試験に革命をもたらす可能性を有する。
【０１０５】
好ましい核酸配列決定法の一例は、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって開発されたピロリン酸塩系配列決定法である。本発明の方法を、大量パラレル型４５４手法（その一部を、本明細書において開示している）のあらゆる態様と合わせて用いると、スループットが大きく増大され、集団（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）特定のコストが大きく削減され得る。４５４手法では、多数の個々のＰＣＲ産物をクローニングする必要がないとともに、小サイズの１６Ｓ遺伝子（１．４ｋｂ）で、何十万という試料を同時に処理することが可能である。このプロセスは、概要を後述する様式で好成績が実証された。
【０１０６】
最初に、ＰＣＲ２．１ベクターで形質転換し、ＬＢ／アンピシリンプレート（５０μｇ／ｍＬ）上で平板培養し、３７℃で一晩インキュベートした大腸菌ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）から、大腸菌１６Ｓ  ＤＮＡを採取した。単一のコロニーを選出し、３ｍＬのＬＢ／アンピシリン培養液中に播種し、２５０ＲＰＭで６時間３７℃にて振とうした。この溶液１μＬを、１６Ｓ配列のＶ１およびＶ３領域を増幅させるための鋳型として使用した。
【０１０７】
二部構成ＰＣＲプライマーを、Ｖ１およびＶ３で表示される１６Ｓ遺伝子内の２つの可変領域のために、Ｍｏｎｓｔｅｉｎら（Ｍｏｎｓｔｅｉｎ，Ｎｉｋｐｏｕｒ−Ｂａｄｒら２００１）に記載のようにして設計した。４５４特異的な１９塩基（１５塩基の増幅プライマーに続いて３’に４塩基（ＴＣＧＡ）キー）のフォワードまたはリバースプライマーで構成された５種類のプライミングタグを、Ｖ１およびＶ３可変領域に隣接する領域特異的フォワードおよびリバースプライマーに融合させた。これは、５’−（１５塩基フォワードまたはリバース増幅プライマー）−（４塩基キー）−（フォワードまたはリバースＶ１またはＶ３プライマー）−３’と表示され得る。１６Ｓアンプリコンを得るために用いたプライマーは以下の配列を含むものであり、該配列において、大文字はＶ１またはＶ３特異的プライマーを表し、太字の４つの塩基により該キーを特定し、小文字の塩基は４５４増幅プライマーを示す。
【０１０８】
【化５】
2010521156.tif 000010
Ｖ１およびＶ３アンプリコンは、以下の試薬：１×ＨｉＦｉバッファー、２．５ｍＭのＭｇＳＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭのｄＮＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ，ミルウォーキー，ＷＬ）、Ｖ１またはＶ３領域いずれかに対する１μＭの各フォワードおよびリバース二部構成プライマー（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）、０．１５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  ＨｉＦｉ  Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含めたＰＣＲ反応において別々に作製した。１μＬの大腸菌ＬＢ／アンピシリン培養液を反応混合物に添加し、ＰＣＲを３５サイクル行なった（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および６８℃で１５０秒間とし、最終サイクルの後、１０℃で「ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ｈｏｌｄ」状態した）。続いて、１μＬの増幅反応ミックスを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）において泳動させて最終産物の濃度を推定し、適正な大きさの産物（Ｖ１は１５５ｂｐ、Ｖ３は１４５ｂｐ）が得られることを確実にした。
【０１０９】
次いで、Ｖ１産物およびＶ３産物を合わせ、０．５〜１０鋳型分子／ＤＮＡ捕捉ビーズの範囲の鋳型濃度で乳化させ、ＥＢＣＡ（乳液系クローン増幅）法（以下のＥＢＣＡプロトコルのセクションに概略を記載）によって増幅させた。得られたクローン増幅ビーズを、続いて、４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ  ＣＴ）で配列決定した。
【０１１０】
増幅させたビーズから得られた配列を大腸菌１６Ｓ遺伝子配列（Ｅｎｔｒｅｚ  ｇｉｌ７４３７５）に対してアラインメントした。許容され得る（または「マッピングされた」）アラインメントを、各配列のアラインメントスコアを計算することにより、却下された（または「アンマッピングされた」）アラインメントと区別した。スコアは、観察されたシグナルが予測したホモポリマーに相当する確率の平均対数、すなわち：
Ｓ  ＝  Σ  ｌｎ［Ｐ（ｓ｜ｈ）］／Ｎ
（式中、Ｓは、コンピュータ計算されたアラインメントスコアであり、Ｐは、特定のフローでの確率であり、ｓは、該フローで測定されたシグナルであり、ｈは、該フローで予測される参照ホモポリマーの長さであり、Ｎは、アラインメントされたフローの総数である）とする。次いで、各配列のアラインメントスコアを、Ｍａｘｉｍｕｍ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ＳｃｏｒｅすなわちＭＡＳと比較した。ＭＡＳより小さいアラインメントスコアリングを「リアル」とみなし、出力ファイルにプリントした。このプロジェクトでは、１．０（ほぼ９５％同一性に相当）のＭＡＳを使用した。
【０１１１】
Ｖ１特異的プライマーを用いて生成した配列では、生成された１３７０２の配列のうち、８７．７５％すなわち１１９７３個の読み取りがゲノムに、１．０未満のアラインメントスコアおよび２１塩基より大きい解読長でマッピングされた。１．６Ｋｂの１６Ｓ遺伝子断片への読み取りマッピングの位置を示すグラフ表示を図７Ａに示す。これは、１６Ｓ遺伝子の最初の１００塩基へのほぼ１２，０００個の読み取りマッピングを示す。
【０１１２】
非修飾コンセンサス配列のＢＬＡＳＴ実行
１６Ｓデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ）に対する
【０１１３】
【化６】
2010521156.tif 000011
は、第１の既知生物体としての大腸菌にマッチした
【０１１４】
【化７−１】
2010521156.tif 000012
Ｖ１コンセンサス配列は、過度に低い信頼度スコアに基づき、ホモポリマー鎖の９位の４つ目の「Ｔ」（太字でマーク、下線）を検討し、除去したため、
【０１１５】
【化７−２】
2010521156.tif 000013
に修正された。修正されたＶ１配列のＢＬＡＳＴの結果により、大腸菌１６Ｓ遺伝子に対するヒットの改善が示された。
【０１１６】
【化８−１】
2010521156.tif 000014
同様の結果がＶ３特異的プライマーでも得られた。１７３２９個の読み取りのうち７１．００％が、上記のＶ１鋳型で用いたものと同一の解析条件下で、１６Ｓ参照ゲノムにマッピングされた。これは、マッピングされたＶ１読み取り８７．７５％よりも小さい数値であり、これは、Ｖ３試料と参照配列間での逸脱が、Ｖ１試料と参照配列間よりも大きいことを明らかにするものであり得る。コンセンサス配列：
【０１１７】
【化８−２】
2010521156.tif 000015
は、図７Ｂに示されるように、参照ゲノムの９６６〜１０６７の領域にマッピングされた。
【０１１８】
Ｖ１配列とは異なり、非修飾コンセンサス配列によるＢＬＡＳＴの結果は、第１の既知生物体としての大腸菌にマッチせず、むしろ第２の生物体としてマッチした。
【０１１９】
【化９−１】
2010521156.tif 000016
信頼度スコアに基づいてコンセンサス配列を検討し、
【０１２０】
【化９−２】
2010521156.tif 000017
（２つの塩基が除去）に修正し、ＢＬＡＳＴを再実行した。ＢＬＡＳＴにより、大腸菌に対して最も高いランクのヒットの存在が得られた。
【０１２１】
【化１０】
2010521156.tif 000018
第２の実験は、未処理細菌細胞に対して混合ＰＣＲプライマーを使用できることを示すために行なった。ここでは、大腸菌細胞を飽和まで培養し、この細菌培養液の１：１０００希釈液１μＬを、鋳型の代わりにＥＢＣＡ反応ミックスに添加した。ＥＢＣＡ反応に使用したプライマーは、各々０．０４μＭのＶ１−およびＶ３−特異的二部構成プライマー、ならびにそれぞれ０．６２５および０．０４μＭのフォワードおよびリバース４５４増幅プライマーからなるものとした。あるいは、概要を後述するＥＢＣＡプロトコルに従った。
【０１２２】
このデータにより、Ｖ１およびＶ３領域は、未処理細菌細胞プールから同時に成功裡に増幅され、配列決定され、識別され得ることが示された。１５４８４個の読み取りのうち、８７．６６％が１６Ｓ参照ゲノムにマッピングされ、それぞれＶ１およびＶ３の位置に存在する配列を図７Ｃに示す。
【０１２３】
Ｖ１配列とＶ３配列を識別する能力を、Ｖ１配列とＶ３配列両方の１００個の読み取りプールし、未加工のシグナルデータをバイナリ列に変換することにより評価した。ここで、「１」は、所与のフローにおいて塩基が存在したことを示し、「０」は存在しなかったことを示す。ホモポリマー鎖を単一の正の値にコラプス（ｃｏｌｌａｐｓｅ）し、その結果、「Ａ」、「ＡＡ」および「ＡＡＡＡＡ」（配列番号：２９）はすべて、同一のスコア「１」を得た。このコラプスされたバイナリ列を、次いで、Ｒ統計パッケージ（Ｔｅａｍ  ２００４）内のＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ｏｒｄｅｒｅｄ  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌａｐｓｉｎｇ  Ｈｙｂｒｉｄ（ＨＯＰＡＣＨ）方法論（Ｐｏｌｌａｒｄ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ  ２００５）によってクラスター化した。得られた系統樹（図８に図示）では、２００個の配列のうち１個以外すべてにおいてＶ１（短い長さの赤ラベル）とＶ３（長い長さの青ラベル）の配列が明白に識別されている。
【０１２４】
同じ生物体の同じ遺伝子に由来する２つの類似した領域をこのように明白に識別できることは、この手法により、異なる生物体に由来する可変領域間の識別において熟練性（ａｄｅｐｔ）が示されるはずであり、価値のある診断用ツールが提供されることを示す。
【０１２５】
実施例４  ＥＢＣＡプロトコル
４．１    ＤＮＡ捕捉ビーズの調整
１ｍＬ容のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）活性化セファロースＨＰアフィニティカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の充填ビーズをカラムから取り出し、製品に関する資料（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａプロトコル番号７１７００６００ＡＰ）に記載のようにして活性化した。２５μＬの１ｍＭアミン標識ＨＥＧ捕捉プライマー（５’−アミン−３連続１８−原子ヘキサ−エチレングリコールスペーサーＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号：３０））（ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）を、２０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ８．０）中、ビーズに結合させた後、２５〜３６μｍのビーズを、３６および２５μｍの細孔フィルターメッシュセクション（Ｓｅｆａｒ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｄｅｐｅｗ，ＮＹ，ＵＳＡ）に連続通過させることによって選択した。最初のフィルターは通過したが２番目で保持されたＤＮＡ捕捉ビーズを、ビーズ保存バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ８）中に収集し、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ３  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  （Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，フラートン，ＣＡ、ＵＳＡ）で定量し、必要時まで４℃で保存した。
【０１２６】
４．２  ＤＮＡ捕捉ビーズへの鋳型種の結合
鋳型分子を、ＵＶ処理済層流フード内で、ＤＮＡ捕捉ビーズ上の相補プライマーにアニーリングさせた。ビーズ保存バッファー中に懸濁させた６０万個のＤＮＡ捕捉ビーズを、２００μＬ容のＰＣＲチューブに移し、ベンチトップ型ミニ遠心機内で１０秒遠心分離し、チューブを１８０°回転させ、さらに１０秒スピンさせて、ペレットが形成されるほど確実にした。次いで、上清みを除去し、ビーズを２００μＬのアニーリングバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５および５ｍＭの酢酸マグネシウム）で洗浄し、５秒間ボルテックスしてビーズを再懸濁させ、上記のようにしてペレット化させた。ビーズ上部のおよそ１０μＬ以外の上清みは全部除去し、さらに２００μＬのアニーリングバッファーを添加した。ビーズを５秒間再度ボルテックスし、１分間放置し、次いで、上記のようにしてペレット化させた。１０μＬ以外の上清みは全部廃棄し、０．４８μＬの２×１０７分子／μＬ鋳型ライブラリーをビーズに添加した。チューブを５秒間ボルテックスして内容物を混合した後、ＭＪサーモサイクラーで行なう制御された変性／アニーリングプログラムにおいて、鋳型をビーズにアニーリングさせた（８０℃で５分間の後、０．１℃／秒で７０℃に低下、７０℃で１分間、０．１℃／秒で６０℃に低下、６０℃で１分間保持、０．１℃／秒で５０℃に低下、５０℃で１分間保持、０．１℃／秒で２０℃に低下、２０℃で保持）。アニーリングプロセスの終了時、ビーズを必要時まで氷上で保存した。
【０１２７】
４．３  ＰＣＲミックスの調製および配合
混入物の可能性を低減させるため、ＰＣＲ反応ミックスを、ＰＣＲクリーンルーム内に存在するＵＶ処理済層流フード内で調製した。各６００，０００ビーズ乳液型ＰＣＲ反応に対して、２２５μＬの反応ミックス（１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＨｉＦｉ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭのｄＮＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）、２．５ｍＭのＭｇＳＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１％のアセチル化された分子生物学等級ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）、０．００３  Ｕ／μＬの熱安定性ピロリン酸塩（ＮＥＢ）、０．６２５μＭのフォワード（５’−ＣＧＴＴＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧ−３’（配列番号：３１））および０．０３９μＭのリバースプライマー（５’−ＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＧ  ＴＧＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号：３２））（ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ、ＵＳＡ）ならびに０．１５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｈｉ−Ｆｉ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を、１．５ｍＬ容のチューブ内で調製した。２５μＬの反応ミックスを取り出し、陰性対照としての使用のために、個々の２００μＬ容のＰＣＲチューブ内に保存した。反応ミックスおよび陰性対照は、ともに必要時まで氷上で保存した。さらに、２４０μＬの偽（ｍｏｃｋ）増幅ミックス（１×Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＨｉＦｉ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．５ｍＭのＭｇＳＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１％のＢＳＡ、０．０１％のＴｗｅｅｎ）を、乳液毎に１．５ｍＬ容のチューブ内で調製し、必要時まで室温で同様に保存した。
【０１２８】
４．４  乳化および増幅
乳化プロセスにより、およそ１０，０００個の個々のＰＣＲマイクロリアクター／μＬを有する熱安定性の油中水型乳液が生成され、該マイクロリアクターは、標的ライブラリーの個々の分子の単一分子のクローン増幅のためのマトリックスとしての機能を果たす。単一の反応用の反応混合物とＤＮＡ捕捉ビーズを、ＵＶ処理済層流フード内で以下のようにして乳化させ、２００μＬのＰＣＲ溶液を、６００，０００個のＤＮＡ捕捉ビーズの入ったチューブに添加した。ビーズをピペッティング動作の反復によって再懸濁させた後、ＰＣＲ−ビーズ混合物を室温で少なくとも２分間放置し、ビーズをＰＣＲ溶液で平衡化させた。その間、４００μＬのＥｍｕｌｓｉｏｎ  Ｏｉｌ（６０％の（ｗ／ｗ）ＤＣ  ５２２５Ｃ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ａｉｄ（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＯ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）、３０％の（ｗ／ｗ）ＤＣ  ７４９  Ｆｌｕｉｄ（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＯ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）、および３０％の（ｗ／ｗ）Ａｒ２０  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｏｉｌ（Ｓｉｇｍａ））を上部が平坦な２ｍＬ容の遠心チューブ（Ｄｏｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内に等分した。次いで、２４０μＬのｍｏｃｋ増幅ミックスを４００μＬの乳液油状物に添加し、チューブにしっかりキャップし、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＭＭ３００（Ｒｅｔｓｃｈ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ，Ｈａｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の２４ウェルＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  Ａｄａｐｔｏｒ（Ｑｉａｇｅｎ）内に配置した。
この乳液を２５振動／秒で５分間ホモジナイズすると、反応液にさらなる安定性を付与する極めて小さい乳液、すなわち「マイクロファイン液（ｍｉｃｒｏｆｉｎｅ）」が得られた。
【０１２９】
マイクロファイン液の形成中、１６０μＬのＰＣＲ増幅ミックスを、アニーリングさせた鋳型とＤＮＡ捕捉ビーズの混合物に添加した。ビーズとＰＣＲ反応ミックスの混合物を手短にボルテックスし、２分間平衡化させた。マイクロファイン液が形成された後、増幅ミックス、鋳型およびＤＮＡ捕捉ビーズを、該乳化物質に添加した。ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒの速度を１５振動／秒に低下させ、反応ミックスを５分間ホモジナイズした。ホモジネーション速度を低下させると、ＤＮＡ捕捉ビーズおよび増幅ミックスを内包するのに充分に大きい１００〜１５０μｍの平均直径を有する水滴を含有する油状ミックスが生成された。
【０１３０】
この乳液を７〜８個の別々のＰＣＲチューブ内に等分した（各々、８０μＬを含んだ）。チューブを密封し、ＭＪサーモサイクラー内に、事前に作製した２５μＬの陰性対照とともに配置した。以下のサイクル時間を使用した：１×（９４℃で４分間）−ホットスタート開始、４０×（９４℃で３０秒、５８℃で６０秒、６８℃で９０秒）−増幅、１３×（９４℃で３０秒、５８℃で３６０秒）−ハイブリダイゼーション伸長。ＰＣＲプログラムの終了時、反応液を取り出し、乳液は、すぐに破壊するか（後述のとおり）、または反応物を１６時間まで１０℃で保存後、破壊プロセスを開始するかのいずれかとした。
【０１３１】
４．５  乳液の破壊およびビーズの回収
５０μＬのイソプロピルアルコール（Ｆｉｓｈｅｒ）を、増幅物質の乳液を入れた各ＰＣＲチューブに添加し、１０秒ボルテックスして乳液の粘度を低下させた。チューブをマイクロ遠心機内で数秒間遠心分離し、チューブキャップ内に付着した乳化物質があれば除去した。乳液−イソプロピルアルコールミックスを、各チューブから、先の太い１６ゲージの先の太い針（Ｂｒｉｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ）を取り付けた１０ｍＬ容のＢＤ−Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｓｙｒｉｎｇｅ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内に抜き出した。さらに５０μＬのイソプロピルアルコールを、各ＰＣＲチューブに添加し、ボルテックスし、先のようにして遠心分離し、シリンジの内容物に添加した。シリンジ内部の容積をイソプロピルアルコールで９ｍＬに増大させた後、シリンジを反転させ、１ｍＬの空気をシリンジ内に吸引させ、イソプロパノールと乳液の混合を助長させた。該先の太い針を外し、１５μｍ細孔Ｎｉｔｅｘ  Ｓｉｅｖｉｎｇ  Ｆａｂｒｉｃ（Ｓｅｆａｒ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｄｅｐｅｗ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含む２５ｍｍのＳｗｉｎｌｏｃｋフィルターホルダー（Ｗｈａｔｍａｎ）をシリンジルアーに取り付け、該先の太い針をＳｗｉｎｌｏｃｋユニットの反対側に固定した。
【０１３２】
シリンジの内容物を、Ｓｗｉｎｌｏｃｋのフィルターユニットと針を介して静かに、だが完全に、漂白剤入りの廃物容器内に押し出した。６ミリリットルの新たなイソプロピルアルコールを、先の太い針およびＳｗｉｎｌｏｃｋフィルターユニットによってシリンジ内に再度吸引させ、シリンジを１０回反転させてイソプロピルアルコール、ビーズおよび残留乳液成分を混合した。シリンジの内容物を再度廃物容器内に押し出し、洗浄プロセスを２回（各洗浄において、６ｍＬのさらなるイソプロピルアルコール）繰り返した。洗浄工程を、６ｍＬの８０％のエタノール／１×アニーリングバッファー（８０％のエタノール、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５ｍＭの酢酸マグネシウム）を用いて繰り返した。次いで、ビーズを、０．１％のＴｗｅｅｎを含む６ｍＬの１×アニーリングバッファー（０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５ｍＭの酢酸マグネシウム）で洗浄した後、６ｍＬの２次純水（ｐｉｃｏｐｕｒｅ  ｗａｔｅｒ）で洗浄した。
【０１３３】
最終洗浄液を廃物容器内に押し出した後、１．５ｍＬの１ｍＭのＥＤＴＡをシリンジ内に吸引させ、Ｓｗｉｎｌｏｃｋフィルターユニットを外して横に置いた。シリンジの内容物を、連続的に１．５ｍＬ容の遠心チューブ内に移した。チューブを、ミニ遠心機内で定期的に２０秒間遠心分離してビーズをペレット化させ、上清みを除去した後、残留したシリンジの内容物を遠心チューブに添加した。Ｓｗｉｎｌｏｃｋユニットをフィルターに再度取り付け、１．５ｍＬのＥＤＴＡをシリンジ内に吸引させた。最後にＳｗｉｎｌｏｃｋフィルターを外し、ビーズとＥＤＴＡを遠心チューブに添加し、必要に応じてビーズをペレット化させ、上清みを除去した。
【０１３４】
４．６  第２鎖の除去
捕捉ビーズ上に固定化された増幅ＤＮＡを、塩基性融解溶液中でのインキュベーションによる第２鎖の除去によって単鎖にし、１ｍＬの新たに調製した融解溶液（０．１２５ＭのＮａＯＨ、０．２ＭのＮａＣｌ）をビーズに添加し、中程度の設定で２秒間のボルテックスによってペレットを再懸濁させ、チューブをＴｈｅｒｍｏｌｙｎｅ  ＬａｂＱｕａｋｅチューブロール内に３分間配置した。次いで、ビーズを上記のようにしてペレット化し、上清みを注意深く除去し、廃棄した。次いで、１ｍＬのアニーリングバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩、ｐＨ７．６、５ｍＭの酢酸マグネシウム）の添加によって残留融解溶液を希釈した後、ビーズを中速で２秒間ボルテックスし、ビーズをペレット化し、上清みを先のようにして除去した。アニーリングバッファー洗浄を繰り返したが、遠心分離後、アニーリングバッファーは８００μＬのみ除去した。ビーズおよび残留アニーリングバッファーを０．２ｍＬ容のＰＣＲチューブに移し、すぐに使用するか、または４℃で４８時間まで保存した後、続いて富化プロセスを継続するかのいずれかとした。
【０１３５】
４．７  ビーズの富化
この時点までで、ビーズ塊は、固定化された増幅ＤＮＡ鎖を有するビーズと、増幅産物を有しない無負荷（ｎｕｌｌ）ビーズの両方で構成されていた。富化プロセスを用いて、配列決定可能な量の鋳型ＤＮＡを有するビーズを選択的に捕捉するとともに無負荷ビーズを排除した。
【０１３６】
先の工程の単鎖ビーズを、ベンチトップ型ミニ遠心機内での１０秒間の遠心分離によってペレット化した後、チューブを１８０°回転させ、さらに１０秒スピンさせて、ペレットが形成されるほど確実にした。次いで、ビーズを撹乱させずにできるだけ多くの上清みを除去した。１５μＬのアニーリングバッファーをビーズに添加した後、２μＬの１００μＭビオチン化４０塩基ＨＥＧ富化プライマー（５’ビオチン−１８−原子ヘキサ−エチレングリコールスペーサー−ＣＧＴＴＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣ−３’（配列番号：３３）、ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ビーズ固定鋳型の３’末端の混合された増幅部位と配列決定部位（各々、２０塩基長）に相補的）。この溶液を、中程度の設定で２秒間のボルテックスによって混合し、富化プライマーを固定化されたＤＮＡ鎖に、ＭＪサーモサイクラーでの制御された変性／アニーリングプログラム（６５℃で３０秒、０．１℃／秒で５８℃に低下、５８℃で９０秒、および１０℃で保持）を用いてアニーリングさせた。
【０１３７】
プライマーをアニーリングさせている間、ＳｅｒａＭａｇ−３０磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎ，インディアナポリス，ＩＮ、ＵＳＡ）のストック溶液を、静かに旋回させることにより再懸濁させ、２０μＬのＳｅｒａＭａｇビーズを、１ｍＬの増強液（２ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）の入った１．５ｍＬ容マイクロ遠心チューブに添加した。ＳｅｒａＭａｇビーズミックスを５秒間ボルテックスし、チューブをＤｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｓ磁石内に配置し、常磁性のビーズをマイクロ遠心チューブの側面に対してペレット化した。ＳｅｒａＭａｇビーズを撹乱させずに上清みを注意深く除去して廃棄し、チューブを磁石から取り出し、１００μＬの増強液を添加した。チューブを３秒間ボルテックスしてビーズを再懸濁させ、チューブを必要時まで氷上で保存した。
【０１３８】
アニーリングプログラムが終了したら、１００μＬのアニーリングバッファーを、ＤＮＡ捕捉ビーズと富化プライマーの入ったＰＣＲチューブに添加し、チューブを５秒間ボルテックスし、内容物を新たな１．５ｍＬ容マイクロ遠心チューブに移した。富化プライマーを捕捉ビーズにアニーリングさせたＰＣＲチューブを２００μＬのアニーリングバッファーで１回洗浄し、この洗浄液を該１．５ｍＬ容チューブに添加した。ビーズを１ｍＬのアニーリングバッファーで３回洗浄し、２秒間ボルテックスし、先のようにしてペレット化し、上清みを注意深く除去した。３度目の洗浄後、ビーズを１ｍＬの氷冷増強液で２回洗浄し、ボルテックスし、ペレット化し、先のようにして上清みを除去した。次いで、ビーズを１５０μＬの氷冷増強液中に再懸濁させ、このビーズ溶液を洗浄したＳｅｒａＭａｇビーズに添加した。
【０１３９】
ビーズ混合物を３秒間ボルテックスし、ＬａｂＱｕａｋｅチューブロールにおいて室温で３分間インキュベートするとともに、ストレプトアビジンコートＳｅｒａＭａｇビーズ結合ビオチン化富化プライマーを、ＤＮＡ捕捉ビーズ上に固定化させた鋳型にアニーリングさせた。次いで、ビーズを２，０００ＲＰＭで３分間遠心分離した後、ビーズが再懸濁されるまでビーズを静かに「タッピング（ｆｌｉｃｋ）」した。次いで、再懸濁ビーズを氷上に５分間に配置した。氷上でのインキュベーション後、冷増強液をビーズに、最終容量１．５ｍＬまで添加した。チューブをＤｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｓ磁石内に挿入し、ビーズを撹乱させずに１２０秒放置してビーズを磁石に対してペレットさせた後、上清み（過剰のＳｅｒａＭａｇおよび無負荷ＤＮＡ捕捉ビーズを含む）を注意深く除去して廃棄した。
【０１４０】
チューブをＭＰＣ−Ｓ磁石から取り出し、１ｍＬの冷増強液をビーズに添加し、ビーズを静かにタッピングすることによって再懸濁させた。ボルテックスすると、ＳｅｒａＭａｇとＤＮＡ捕捉ビーズとの結合が破壊されることがあり得るため、ビーズをボルテックスしないことが不可欠であった。ビーズを磁石に戻し、上清みを除去した。この洗浄をさらに３回繰り返して、すべての無負荷捕捉ビーズが確実に除去されるようにした。アニーリングされた富化プライマーとＳｅｒａＭａｇビーズをＤＮＡ捕捉ビーズから除去するため、ビーズを１ｍＬの融解溶液中に再懸濁させ、５秒間ボルテックスし、磁石でペレット化させた。富化されたビーズを含む上清みを別の１．５ｍＬ容マイクロ遠心チューブに移し、ビーズをペレット化し、上清みを廃棄した。次いで、富化されたビーズを０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含む１×アニーリングバッファー中に再懸濁させた。ビーズをＭＰＣ上で再度ペレット化し、上清みを新たな１．５ｍＬ容チューブに移し、残留ＳｅｒａＭａｇビーズの最大限の除去を確実にした。ビーズを遠心分離した後、上清みを除去し、ビーズを１ｍＬの１×アニーリングバッファーで３回洗浄した。３度目の洗浄後、８００μＬの上清みを除去し、残留ビーズ溶液を０．２ｍＬ容ＰＣＲチューブに移した。
【０１４１】
富化プロセスの平均収率は、乳液に添加した最初のビーズの３３％、すなわち１９８，０００富化ビーズ／乳化反応であった。６０×６０ｍｍ  ＰＴＰ形式では９００，０００富化ビーズが必要とされるため、６０×６０ｍｍのＰＴＰ配列決定あたり、５つの６００，０００ビーズ乳液が処理された。
【０１４２】
４．８  配列決定用プライマーのアニーリング
富化されたビーズを２，０００ＲＰＭで３分間遠心分離し、上清みをデカントした後、１５μＬのアニーリングバッファーおよび３μＬの配列決定用プライマー（１００ｍＭのＳＡＤ１Ｆ（５’−ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＧＣＧ  ＣＣＡ−３’（配列番号：３４）、ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。次いで、チューブを５秒間ボルテックスし、以下の４段階アニーリングプログラム：６５℃で５分間、０．１℃／秒で５０℃に低下、５０℃で１分間、０．１℃／秒で４０℃に低下、４０℃で１分間保持、０．１℃／秒で１５℃に低下、１５℃で保持のためにＭＪサーモサイクラー内に配置した。
アニーリングプログラムが終了したら、ビーズをサーモサイクラーから取り出し、１０秒の遠心分離によってペレット化し、チューブを１８０°回転させ、さらに１０秒スピンさせた。上清みを廃棄し、２００μＬのアニーリングバッファーを添加した。ビーズを５秒間のボルテックスで再懸濁させ、ビーズを先のようにしてペレット化した。上清みを除去し、ビーズを１００μＬのアニーリングバッファー中に再懸濁させ、この時点でビーズをＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ３  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒで定量した。ビーズを４℃で保存すると、少なくとも１週間安定であった。
【０１４３】
４．９  Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントおよびＳＳＢタンパク質とのＤＮＡビーズのインキュベーション
ビーズ洗浄バッファー（１００ｍＬ）を、アピラーゼ（Ｂｉｏｔａｇｅ）（最終活性８．５単位／Ｌ）を０．１％のＢＳＡを含有する１×アッセイバッファーに添加することによって調製した。光ファイバースライドを２次純水から取り出し、ビーズ洗浄バッファー中でインキュベートした。９０万個の事前に調製したＤＮＡビーズを遠心分離し、上清みを注意深く除去した。次いで、ビーズを、１２９０μｌのビーズ洗浄バッファー（０．４ｍｇ／ｍＬのポリビニルピロリドン（ＭＷ３６０，０００）、１ｍＭのＤＴＴ、１７５μｇの大腸菌単鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）および７０００単位のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）含有）中でインキュベートした。ビーズは、回転体において室温で３０分間インキュベートした。
【０１４４】
４．１０  酵素ビーズおよび微粒子充填剤の調製
ＵｌｔｒａＧｌｏｗ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とＢｓｔ  ＡＴＰスルフリラーゼを、研究所内で、ビオチンカルボキシ担体タンパク質（ＢＣＣＰ）融合体として調製した。８７−アミノ酸ＢＣＣＰ領域は、大腸菌内での該融合タンパク質のインビボ発現中にビオチンが共有結合するリシン残基を含む。このビオチン化ルシフェラーゼ（１．２ｍｇ）とスルフリラーゼ（０．４ｍｇ）を、製造業者の使用説明書に従って予備混合し、２．０ｍＬのＤｙｎａｌ  Ｍ２８０常磁性のビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ、Ｄｙｎａｌ  ＳＡ，Ｎｏｒｗａｙ）に４℃で結合させた。酵素結合ビーズを、２０００μＬのビーズ洗浄バッファー中で３回洗浄し、２０００μＬのビーズ洗浄バッファー中に再懸濁させた。
【０１４５】
Ｓｅｒａｄｙｎ微粒子（Ｐｏｗｅｒｂｉｎｄ  ＳＡ、０．８μｍ、１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｅｒａｄｙｎ  Ｉｎｃ）を以下のとおりに調製した。１０５０μＬのストックを、０．１％のＢＳＡを含有する１０００μＬの１×アッセイバッファーで洗浄した。微粒子を９３００ｇで１０分間遠心分離し、上清みを除去した。洗浄をもう２回繰り返し、微粒子を０．１％のＢＳＡを含有する１０５０μＬの１×アッセイバッファー中に再懸濁させた。ビーズおよび微粒子は、使用時まで氷上で保存される。
【０１４６】
４．１１  ビーズの堆積
Ｄｙｎａｌ酵素ビーズおよびＳｅｒａｄｙｎ微粒子を１分間ボルテックスし、各々１０００μＬを新たなマイクロ遠心チューブ内で混合し、手短にボルテックスし、氷上で保存した。酵素／Ｓｅｒａｄｙｎビーズ（１９２０μｌ）をＤＮＡビーズ（１３００μｌ）と混合し、最終容量をビーズ洗浄バッファーで３４６０μＬに調整した。ビーズを順に層状に堆積させた。光ファイバースライドをビーズ洗浄バッファーおよび第１層から取り出し、ＤＮＡと酵素／Ｓｅｒａｄｙｎビーズの混合物を堆積させた。遠心分離後、第１層の上清みを、光ファイバースライドおよび第２層から吸引し、Ｄｙｎａｌ酵素ビーズを堆積させた。このセクションでは、どのようにして異なる層を遠心分離したかをより詳細に記載する。
【０１４７】
第１層．  ６０×６０ｍｍの光ファイバースライドの表面上に２つの３０×６０ｍｍの活性領域をもたらすガスケットを、ジグ上面に割り当てられたステンレス鋼ダウエルに注意深く取り付けた。光ファイバースライドをジグ内に、スライドのエッチングされていない平滑側面を下にして配置し、ジグ上面／ガスケットを、スライドのエッチングされた側面上に取り付けた。次いで、ジグ上面を、設けられたネジで、両端が手できつく締められるように締めることにより適正に固定した。ＤＮＡ−酵素ビーズ混合物を、ジグ上面に設けられた２つの供給ポートから光ファイバースライドに負荷した。ビーズ混合物の負荷中、気泡が最小限となるように細心の注意を払った。各堆積は、ピペットプランジャーの１回の静かな連続推進で終了した。ＧＨ  ３．８−Ａローターを有するＢｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕＬｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６遠心機内で、アセンブリ全体を２８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遠心分離後、ピペットで上清みを除去した。
【０１４８】
第２層．  先に記載のようにして、Ｄｙｎａｌ酵素ビーズ（９２０μＬ）を２７６０μＬのビーズ洗浄バッファーと混合し、３４００μＬの酵素−ビーズ懸濁液を光ファイバースライド上に負荷した。スライドアセンブリを２８００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清みをデカントした。光ファイバースライドをジグから取り出し、機器に負荷する用意ができるまでビーズ洗浄バッファーに保存する。
【０１４９】
４．１２  ４５４機器での配列決定
すべてのフロー試薬は、０．４ｍｇ／ｍＬのポリビニルピロリドン（ＭＷ  ３６０，０００）、１ｍＭのＤＴＴおよび０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含む１×アッセイバッファーにおいて調製した。基質（３００μＭのＤ−ルシフェリン（Ｒｅｇｉｓ）および２．５μＭのアデノシンホスホ硫酸（Ｓｉｇｍａ））は、０．４ｍｇ／ｍＬのポリビニルピロリドン（ＭＷ  ３６０，０００）、１ｍＭのＤＴＴおよび０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含む１×アッセイバッファーにおいて調製した。アピラーゼ洗浄液は、アピラーゼを最終活性８．５単位／Ｌまで、０．４ｍｇ／ｍＬのポリビニルピロリドン（ＭＷ  ３６０，０００）、１ｍＭのＤＴＴおよび０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含む１×アッセイバッファー中に添加することによって調製する。基質バッファー中、デオキシヌクレオチドｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、終濃度６．５μＭに調製し、α−チオデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰαＳ、Ｂｉｏｌｏｇ）およびピロリン酸塩ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）は、それぞれ、終濃度５０μＭのおよび０．１μＭに調製した。
【０１５０】
４５４配列決定機器は、３つの主なアセンブリ：流体工学サブシステム、光ファイバースライドカートリッジ／フローチャンバ、および画像形成サブシステムからなる。試薬供給ライン、マルチバルブマニホルド、および蠕動ポンプは、流体工学サブシステムの一部を構成する。個々の試薬は、適切な試薬供給ラインに接続されており、これにより、１回に１種類の試薬を予めプログラムされた流速および持続期間でフローチャンバ内に試薬送達することが可能となる。光ファイバースライドカートリッジ／フローチャンバは、スライドのエッチング側とフローチャンバの天井との間に２５０μｍの空間を有する。また、フローチャンバには、試薬および光ファイバースライドの温度制御手段、ならび遮光ハウジングを含めた。スライドの研磨（非エッチング）側を、直に画像形成システムと接触させて配置した。
【０１５１】
光ファイバースライドウェル内への配列決定用試薬の循環的送達、および該ウェルからの配列決定反応副生成物の洗浄は、流体工学システムの予めプログラムされた操作によって行なわれた。このプログラムは、各スクリプト工程の試薬名（Ｗａｓｈ、ｄＡＴＰαＳ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびＰＰｉ標準）、流速および持続期間を指定するインターフェース制御言語（ＩＣＬ）スクリプトの形態で作成されたものであった。流速は、すべての試薬で４ｍＬ／分に設定し、フローチャンバ内の線速度はおよそ１ｃｍ／秒とした。配列決定用試薬のフロー順はカーネルに組織化し、ここで、第１カーネルは、ＰＰｉフロー（２１秒）の後、１４秒間の基質フロー、２８秒間のアピラーゼ洗浄液および２１秒間の基質フローで構成した。第１ＰＰｉフローの後、２１サイクルのｄＮＴＰフロー（ｄＣ−基質−アピラーゼ洗浄液−基質ｄＡ−基質−アピラーゼ洗浄液−基質−ｄＧ−基質−アピラーゼ洗浄液−基質−ｄＴ−基質−アピラーゼ洗浄液−基質）とし、ここで、各ｄＮＴＰフローは４つの個々のカーネルで構成した。各カーネルは長さ８４秒間であり（ｄＮＴＰ−２１秒、基質フロー−１４秒、アピラーゼ洗浄液−２８秒、基質フロー−２１秒）；画像は、２１秒後および６３秒後に取得する。２１サイクルのｄＮＴＰフロー後、ＰＰｉカーネルを導入した後、次いで、さらに２１サイクルのｄＮＴＰフローを行なう。配列決定実行の終了後、第３ＰＰｉカーネルを導入した。総実行時間は２４４分間であった。この実行を終了するのに必要とされる試薬容量は、以下のとおり：５００ｍＬの各洗浄液、１００ｍＬの各ヌクレオチド溶液である。実行中、すべての試薬は室温で維持した。フローチャンバおよびフローチャンバ供給チュービングの温度は３０℃に制御し、フローチャンバに入れる試薬はすべて３０℃に予備加熱する。
【０１５２】
実施例５  土壌試料の解析
本発明の方法を用いた解析のため、核酸を土壌中生物体から抽出した。抽出は、ＤＮＡ抽出キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて製造業者の指示書に従って行なった。
【０１５３】
簡単には、５５０μＬのインヒビター除去樹脂を各空のスピンカラム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ製）に添加した。カラムを２０００×ｇで１分間遠心分離してカラムを充填した。フロースルー分を除去し、さらに５５０ｕＬのインヒビター除去樹脂を各カラムに添加した後、２０００×ｇで２分間の遠心分離を行なった。
【０１５４】
１００ｍｇの土壌を１．５ｍＬ容チューブ内に採取し、２５０ｕＬの土壌ＤＮＡ抽出バッファーを、２ｕＬのプロテイナーゼＫとともに添加した。この溶液をボルテックスし、５０ｕＬの土壌溶解バッファーを添加し、再度ボルテックスした。チューブを６５Ｃで１０分間インキュベートし、次いで、１０００×ｇで２分間遠心分離した。１８０μＬの上清みを新たなチューブに移し、６０ｕＬのタンパク質沈殿試薬を、チューブを反転させることによって混合することにより添加した。チューブを氷上で８分間インキュベートし、最大速度で８分間遠心分離した。１００〜１５０μＬの上清みを、調製済スピンカラム上に直接移し、カラムを１．５ｍＬ容チューブ内に２０００×ｇで２分間遠心分離した。カラムを廃棄し、溶出液を収集した。６ｕＬのＤＮＡ沈殿溶液を溶出液に添加し、手短なボルテックスによってチューブを混合した。室温で５分間のインキュベーション後、チューブを最大速度で５分間遠心分離した。上清みを除去し、ペレットを５００ｕＬのペレット洗浄液で洗浄した。チューブを反転させて溶液を混合し、次いで、この溶液を最大速度で３分間遠心分離した。上清みを除去し、洗浄工程を繰り返した。上清みを再度除去し、最終ペレットを３００ｕＬのＴＥバッファー中に再懸濁させた。
【０１５５】
得られたＤＮＡ試料は本発明の方法に使用され得、例えば、少なくとも、遺伝子座におけるヌクレオチド頻度の検出方法に使用され得る。
【０１５６】
実施例６  ＨＩＶクレイドＢプライマーの設計
ＨＩＶゲノムにおける高レベルの変異性のため、多数の配列のアラインメントをコンパイルした。Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに保存されたＨＩＶ配列データベースを、ＰＯＬ領域（これは、プロテアーゼ領域、逆転写酵素領域、およびインテグラーゼコード領域を含む）におけるデータを有するＨＩＶ−ＩクレイドＢ配列に関して検索した。６０００個を超える高品質の配列をアラインメントし、コンセンサス配列を得た。次いで、この配列をアプリケーションサーバーにアップロードし、標的配列として該コンセンサス配列を用いて突然変異プロットを作成した。このプロットから保存領域が特定され、該保存領域に対するプライマーを設計した。
【０１５７】
このプライマーを、まず、一群の４つの参照配列（１Ａ、４Ａ、８Ａおよび４Ｂ）予測サイズのアンプリコンを生成する能力について試験した。最終プライマーセットは、プロテアーゼ領域および逆転写酵素領域の対象領域すべてが多重にカバーされるように選択した。また、４種類のプライマーは、各々、プライマー結合および大部分（＞１０〜３０％）の配列の表現型に決定的と思われる１つのヌクレオチド位置が異なる２つの配列の混合物となるように設計した。このストラテジーにより、所与の配列において１つや２つのプライマーにミスがあっても、たいていの場合、完全にカバーすることが可能になる。プライマーおよびアンプリコンの位置は、図１２のこれらの概略図に示す。
【０１５８】
実施例７  アンプリコンストラテジーの試験
実施例６のアンプリコンストラテジーを、合計８種類の参照試料（１Ａ、４Ａ、８Ａ、４Ｂ、１４、１５、１７、および２５と表示）を配列決定することにより試験した。これらの参照試料は、ネステッドＰＣＲ法による１．４Ｋｂのアンプリコンの形態であった。アンプリコンは参照試料から、１５サイクルのＰＣＲによって生成させ、乳液は、アンプリコンＡキットおよびアンプリコンＢキットを用いて作製した。ある場合では、単一のアンプリコンを配列決定し、またある場合では、乳液工程の際に数種類を一緒に混合した。次いで、アンプリコンの配列決定を、ネブライズさせ、ランダムライブラリーとして配列決定した全く同じ１．４Ｋｂのアンプリコンの配列決定と比較した。ネブライズした試料は、各位置における実施のヌクレオチド組成の検出に関して偏りが最小限であると仮定した。すべての場合で、アンプリコンとライブラリーの突然変異プロットの配列決定間に優れた一致性が得られた。プライマー結合領域における唯一の問題は、縮重位置による突然変異の導入およびプライマーよりも突然変異の試料の明白な抑制のため起こった。これらの問題はともに、解析前に各アンプリコンからプライマー部位の配列自動的に除くアンプリコンデータ解析ソフトウェアを用いて解決される。
【０１５９】
１つの長鎖のｃＤＮＡ断片を作製し、次いで１．４Ｋｂのアンプリコン（合計７５サイクルのネステッドＰＣＲを使用）を増幅させて本発明者らの鋳型を得ることは、次善的であった。これは多数回のＰＣＲサイクルを伴うが、単一ｃＤＮＡストラテジーが、患者の被検物質中に存在するＲＮＡ疑似種プール全体を充分に反映しているかは明白ではない。したがって、多数のｃＤＮＡ断片、ここでは図１２に示すように３つ（１つはプロテアーゼおよび２つはＲＴ、配列をほぼ等しい３つの部分に分割）を作製するストラテジーを採用する。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＭＭＬＶ  ＲＴ由来）は合成中ＲＮＡをｃＤＮＡに置き換えず、したがって、混合反応物中では最も３’側の配列に偏りが導入されるため、反応は別々に行なわなければならない。
【０１６０】
平均収量がおよそ１５０ｎｇ／アンプリコンの４０サイクルのＰＣＲによって、一貫したアンプリコン増幅が達成される。高いウイルス負荷の試料では、より少ないサイクル数の増幅を使用することが可能である。
【０１６１】
実施例８  被検体のプロテアーゼ領域およびＲＴ領域におけるＨＩＶ変異
記載の本発明のアンプリコンストラテジーを、コンセンサス配列と比べるといくつかの配列バリアントを有するＨＩＶ陽性被検体において試験した。各変異の程度を含む配列バリアントの表示を図１４に示す。図１４において、「変異の頻度」は、対応する配列位置のバーの高さで示され、０（すなわち、ＨＩＶ被検体において０％の頻度）から１（すなわち、ＨＩＶ被検体において１００％の頻度）の範囲の階級で相対的である。また、被検体の対応する配列位置バリアントヌクレオチド種の特定は色で示される。図１４で明白なように、この特定の被検体は、プロテアーゼ領域と逆転写酵素領域に数多くのバリアントを有し、一部は高い頻度で存在し、少数の群が低頻度で存在する。すべてのバリアントが記載の薬物耐性などの有害な効果と関連しているわけではないことは認識されよう。
【０１６２】
実施例９  ＰＩ薬物耐性と関連しているバリアントの確認
記載の本発明のアンプリコンストラテジーを、ＨＩＶプロテアーゼの選択的非ペプチド阻害剤であるナルフィナビル（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．によってＶｉｒａｃｅｐｔ（登録商標）として市販）と称される薬物に対する耐性と関連している特異的配列バリアントを有するＨＩＶ陽性被検体において試験した。この特定の被検体における特定の変異の頻度は、図１５に示されるように、被検体から採取した試料中のウイルスＲＮＡ分子から、３．７％で存在すると確認された。また、図１５は、被検体試料から得られたアンプリコン配列の、Ｇヌクレオチド種からＡヌクレオチド種への変化（配列決定されたＲＮＡ分子の３．７％）を示すコンセンサス配列へのアラインメントの実例の１つを示す。図１５はまた、被検体試料において配列決定されたＲＮＡ分子の数のパーセンテージでの変異の程度の例示的なグラフを示す（「読み取り」の数で表示）。用語「読み取り」は、本明細書で用いる場合、一般的に、実質的に同一の鋳型核酸分子コピーのクローン集団を含む単一の核酸鋳型分子から得られた配列データ全体をいう。この例では、バリアントは、配列位置２４４における単一ヌクレオチド変化であり、これは、品質管理基準に合格した２０００個を超える配列読み取りの３．７％に存在することがわかった。
【０１６３】
実施例１０  ＮＮＲＴＩ薬物耐性と関連しているバリアントの確認
記載の本発明のアンプリコンストラテジーを、すべて非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）であるデラビルジン（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．によってＲｅｓｃｒｉｐｔｏｒ（登録商標）として市販）、ネビラピン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．によってＶｉｒａｍｕｎｅ（登録商標）として市販）、エファビレンツ（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂによってＳｕｓｔｉｖａ（登録商標）として市販）、およびエトラビリン（登録商標）（Ｔｉｂｏｔｅｃ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによってＩｎｔｅｌｅｎｃｅとして市販）と称される薬物に対する耐性と関連している特異的配列バリアントを有するＨＩＶ陽性被検体において試験した。この特定の被検体における特定の変異の頻度は、図１６に示されるように、被検体から採取した試料中のウイルスＲＮＡ分子から、１．０％で存在すると確認された。また、図１６は、被検体試料から得られたアンプリコン配列の、Ａヌクレオチド種からＧヌクレオチド種への変化（配列決定されたＲＮＡ分子の１．０％）を示すコンセンサス配列へのアラインメントの実例の１つを示す。図１６はまた、被検体試料において配列決定されたＲＮＡ分子の数のパーセンテージでの変異の程度の例示的なグラフを示す（「読み取り」の数で表示）。この例では、バリアントは、配列位置９９５における単一ヌクレオチド変化であり、これは、品質管理基準に合格した約５０００個の配列読み取りの１．０％に存在することがわかった。
【０１６４】
実施例１１  ＮＲＴＩ薬物耐性と関連しているバリアントの確認
記載の本発明のアンプリコンストラテジーを、特定のコドン内に、ヌクレオチド／ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）に対する以前の耐性と関連している配列バリアントを有するＨＩＶ陽性被検体において試験した。確認された変異は、図１７に示されるように、該コドンの最初の２つの位置に存在し、第１のバリアントはＡヌクレオチド種からＧヌクレオチド種への変化であり、第２はＣヌクレオチド種からＡヌクレオチド種の変化である。図１７の例において、第１および第２の位置における変化は、同じＲＮＡ配列内に存在するのではなく、各々、独立したＲＮＡ分子に存在することは明白である。
【０１６５】
【化１１】
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【０１６６】
【化１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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