(57)【要約】  本発明は、Ｌ−スレオニンの生産能を有した微生物であって、前記微生物によるＬ−スレオニンの生合成経路において、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性をコーディングする遺伝子ｕｓｇの発現を増加させて、Ｌ−スレオニンの生産効率が増加されたことを特徴とする微生物、及びこれを用いたＬ−スレオニンの生産方法に関する。【代表図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−スレオニンの生産能を有した微生物であって、前記微生物によるＬ−スレオニンの生合成経路において、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性が増加され、Ｌ−スレオニンの生産効率が増加されたことを特徴とする微生物。 
【請求項２】
前記微生物はメチオニン要求性、イソロイシンリーキー型、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、２−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性、及びＬ−アゼチジン−２−カルボキシ酸耐性を有する大腸菌であることを特徴とする、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、遺伝子ｕｓｇ(配列番号５)によりコーディングされることを特徴とする、請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
前記微生物は、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子ｕｓｇを含む組み換えベクターにより形質転換されたことを特徴とする、請求項３に記載の微生物。 
【請求項５】
前記形質転換されたＬ−スレオニン生産微生物は、大腸菌ＴＦ６４２１２(受託番号：KCCM-10768)であることを特徴とする、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物を培養する段階を含むことを特徴とする、Ｌ−スレオニンを生産する方法。    
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物情報学を利用して、従来その機能が知られなかった大腸菌の遺伝子ｕｓｇの機能を明かして、ｕｓｇ遺伝子の発現が増加されたＬ−スレオニンを生産する微生物及びこれを用いたＬ−スレオニンの生産方法に関する。より詳細には、本発明は、生物情報学を利用して、大腸菌の機能が明かされていない遺伝子ｕｓｇの塩基配列に対する類似性検索を行って、Ｌ−スレオニン生合成経路に関与するアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼとアミノ酸配列上の有意な類似性を有するという結果から、遺伝子ｕｓｇの発現量を増加させてＬ−スレオニンを高収率で生産する微生物を製作して、これを用いてＬ−スレオニンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−スレオニンは、必須アミノ酸の一種であって、飼料及び食品添加剤として広く使用されて、医薬用として輸液剤及び医薬品の合成原料としても使用されている。Ｌ−スレオニンは、主に微生物発酵法により製造されて、大腸菌(Escherichia coli)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、セラチア(Serratia)属またはプロビデンシア(Providencia)属微生物の野生株から誘導された人工変異株などがその生産菌株として利用されている。日本特開平２−２１９５８２号には、プロビデンシア(Providencia)属に属し、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸、Ｌ−メチオニン、チアイソロイシン(thiaisoleucine)、オキシチアミン(oxythiamine)及びスルファグアニジン(sulfaguanidine)耐性を有して、Ｌ−ロイシン要求性、Ｌ−イソロイシンリーキー(leaky)型要求性微生物を利用する方法が記述されており、大韓民国登録特許第５８２８６号には、Ｌ−メチオニン類似体に対する耐性を有して、メチオニン栄養要求性、Ｌ−スレオニン類似体に対する耐性、イソロイシンリーキー型要求性、Ｌ−リシン類似体に対する耐性及びα−アミノブチル酸に対する耐性を有して、Ｌ−スレオニンを生産できる大腸菌(Escherichia coli)について記述されている。
【０００３】
上述のような先行技術の方法は、無作為で遺伝子を変形して、有効な微生物を選別した。しかしながら、このような人工変異による微生物開発方法を利用する場合、変形された微生物の特性を正確に把握することができないだけでなく、変形された微生物が微生物の成長を阻害する変異を有する可能性もある。したがって、所望の特性のみを改善するか、抑制できるより正確に制御可能な微生物の開発方法が要求される。
【０００４】
最近は、大腸菌などの全体遺伝体の配列が確認されて、多様な生物情報学資料が蓄積され、以前までは知らなかった遺伝子の機能に関する研究が可能になった。
【０００５】
大腸菌のような多数の細菌の全体遺伝体の配列が確認され、これらの一部は、まだその機能が把握されていない。塩基配列やアミノ酸配列が、それによりコーディングされるタンパク質の機能や構造と相関関係を有するため、既に明かされた配列間の相同性を調べて、その機能を把握する研究が活発になされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本特開平２−２１９５８２号公報
【特許文献２】大韓民国登録特許第５８２８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、大腸菌遺伝子ｕｓｇの発現量を増加させて、Ｌ−スレオニンの生産能が増加された組み換え微生物を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記Ｌ−スレオニンの生産能が増加された組み換え微生物を培養して、Ｌ−スレオニンを生産する方法を提供することである。
【０００９】
上記のような目的を達成するために、本発明はＬ−スレオニンの生産能を有した微生物であって、前記微生物によるＬ−スレオニンの生合成経路において、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性が増加され、Ｌ−スレオニンの生産効率が増加されたことを特徴とする微生物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、微生物によるＬ−スレオニン生産の効率性を増加させるための研究を行った結果、大腸菌において配列は明かされたものの、その機能が確認されていない遺伝子ｕｓｇ(NCBI GI: 16130524:配列番号5)によりコーディングされるタンパク質が、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼとアミノ酸配列上の有意な類似性を有することを確認し、これに基づいてｕｓｇ遺伝子の発現量を増加させることにより、Ｌ−スレオニン生産性を増加させるといった本発明を完成するようになった。
【００１１】
本発明の一様態によると、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、大腸菌由来の遺伝子ｕｓｇによりコーディングされる。
【００１２】
本発明の一様態によると、Ｌ−スレオニンの生産能を有した微生物は、遺伝子ｕｓｇを含む組み換えベクターにより形質転換された微生物である。
【００１３】
本発明のＬ−スレオニン生産用微生物は、大腸菌、コリネ型細菌、セラチア属細菌、プロビデンシア細菌などのように、Ｌ−スレオニンを生産できるものならいかなる微生物でも可能であり、好ましくは、大腸菌である。より好ましくは、前記Ｌ−スレオニン生産用微生物は、メチオニン要求性、イソロイシンリーキー型要求性、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、２−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性及びＬ−アゼチジン−２−カルボキシ酸耐性を有する大腸菌ＴＦ５０１５(Global Analyses of Transcriptomes and Proteomes of a Parent Strain and an L-Threonine-Overproducing Mutant Strain, Jin-Ho Lee, Dong-Eun Lee, Bheong-Uk Lee, and Hak-Sung Kim, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept.2003, p.5442-5451)である。
【００１４】
遺伝子ｕｓｇは大腸菌の遺伝体上に存在して、その配列は明かされているが、機能は把握されていない遺伝子であった(NCBIGI: 16130254)。本発明では、生物情報学的技法を利用して、遺伝子ｕｓｇの配列をＬ−スレオニン生合成経路に関与する酵素の配列と比較した結果、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と有意な相同性を有することを見出した。また、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、大腸菌のＬ−スレオニン生合成経路(図２)において、速度決定段階を担当すると考えられる。したがって、遺伝子ｕｓｇの発現を増加させて、Ｌ−スレオニン生産可能微生物のＬ−スレオニン生産性を増加させることができる。
【００１５】
本発明の一様態では、対象となる遺伝子の発現を増加させるために、遺伝子を多複製数(multicopy  number)のベクターを利用して宿主細胞に導入し、発現量を増加させる方法を使用する。通常使用されるベクターの例としては、天然状態あるいは組み換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。好ましくは、エシェリキア(Escherichia)属の細菌で自律的に増殖できるコピー数が少ないｐＣＬ１９２０プラスミドベクターを使用することができる。
【００１６】
また、本発明の組み換えベクターは、公知の通常の方法により製造できる。例えば、発現のためのプロモーターとターミネーターがある適切なベクターに、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩなどの制限酵素を使用して、前記生物情報学的分析により機能が確認された遺伝子をライゲーションさせることにより製造できる。発現のためのプロモーターとしては、ｔｒｃ、ｔａｃ、ｌａｃまたは大腸菌ａｒｏＦ遺伝子のプロモーターなどが使用でき、さらに、効果的な発現のためにターミネーターを使用することができる。
【００１７】
本発明の一様態によると、組み換えベクターにより形質転換されたＬ−スレオニンの生産能を有した微生物は、大腸菌ＴＦ６４２１２(受託番号：KCCM-10768)である。
【００１８】
具体的に、本発明の形質転換細胞は、前記組み換えベクターを使用し、通常の方法により宿主細胞を形質転換させて製造できる。宿主細胞は、Ｌ−スレオニン生成用微生物であり、好ましくは、グラム陰性バクテリアに属する微生物であって、より好ましくは、エシェリキア(Escherichia)属に属する微生物である。本発明の一具体例では、前記組み換えベクター(pCL-ParoF-usg)で大腸菌(Escherichia coli)ＴＦ５０１５(Global Analyses of Transcriptomes and Proteomes of a Parent Strain and an L-Threonine-Overproducing Mutant Strain, Jin-Ho Lee, Dong-Eun Lee, Bheong-Uk Lee, and Hak-Sung Kim, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept. 2003, p.5442-5451)を形質転換させて、大腸菌ＴＦ６４２１２を製造した。前記大腸菌ＴＦ６４２１２をＫＣＣＭ(Korean Culture center of Microorganism、EulimBuld., Hongje-1-Dong, Seodaemun-Ku,Seoul, 361-221, Korea)に２００６年７月２４日付にてＫＣＣＭ−１０７６８号として寄託した。
【００１９】
上記のようなＬ−スレオニン生産用組み換え微生物は、生物情報学により、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するとその機能が確認された大腸菌ｕｓｇ遺伝子の発現量を増加させて、Ｌ−スレオニンの生産量が変異前のＬ−スレオニン生産量より増加されるため、Ｌ−スレオニンを高濃度で生産することができる。
【００２０】
他の様態として、本発明は、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増加されて、Ｌ−スレオニンの生産効率が増加されたＬ−スレオニン生成用組み換え微生物からＬ−スレオニンを生産する方法を提供する。本発明の組み換え微生物からＬ−スレオニンを大量生産するために、その微生物を培養して、その培養物から目的とするＬ−スレオニンを分離する全ての工程は、本分野によく知られている。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】組み換えベクターｐＣＬ−ＰａｒｏＦ−ｕｓｇの製作過程を示す図面である。
【図２】Ｌ−スレオニンの生合成経路を示す図面である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、実施例を通じて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
生物情報学を利用した大腸菌遺伝子ｕｓｇの機能確認
大腸菌の全体遺伝体配列が明かされた以後、機能の明かされてない仮想タンパク質(Hypotheticalprotein)の機能を予測するための数々の生物情報学的な技法が開発された。本発明で利用された生物情報学的分析は、遺伝子の塩基配列や遺伝子の転写と翻訳過程を経て得られたタンパク質のアミノ酸配列を利用して遺伝子の機能を予測する技法である。
【００２４】
本実施例では大腸菌においてその機能が明かされていない遺伝子ｕｓｇの塩基配列を利用して、生物情報学的技法によりＢＬＡＳＴサーチを通じて、配列上類似性を有する知られた機能の酵素を検索した。その結果、遺伝子ｕｓｇによりコーディングされるＵＳＧタンパク質は、下記のようにアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼと２８％のアミノ酸配列上の類似性を有することが確認された。
【表Ａ】
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【００２５】
遺伝子ｕｓｇと相当な類似性を示すアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、図２に示されたように、Ｌ−スレオニンの生合成において、アスパルテートセミアルデヒドをＬ−アスパルチル−４−ホスフェートに転換させる酵素である。また、大腸菌のＬ−スレオニン生合成経路において速度決定段階は、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼにより触媒される。したがって、遺伝子ｕｓｇの発現量を増加させる場合、Ｌ−スレオニンの生産能を増加させることができると予測された。
【実施例２】
【００２６】
遺伝子ｕｓｇを含む組み換えベクターの製造
生物情報学を利用して、その機能が予測された遺伝子ｕｓｇの発現量増加によるＬ−スレオニン生産能の向上を確認するために、遺伝子ｕｓｇを大腸菌において、多複製数を有するプラスミドを利用して過多発現させる方法を使用した。
【００２７】
まず、発現に必要なプロモーターを、ベクターであるプラスミドｐＣＬ１９２０に挿入した。大腸菌の染色体に存在する遺伝子ａｒｏＦのプロモーターを使用するために、それぞれ配列番号１及び２を有する下記表１のプライマー１と２を製作した。大腸菌野生株Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型として、重合酵素連鎖反応法(ＰＣＲ法)[Sambrooket al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](ＰＣＲ条件：変性＝９５℃、３０秒/アニーリング＝５３℃、３０秒/重合＝７２℃、１分、３０回)により、約７００対のａｒｏＦ遺伝子のプロモーター部分を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩとＥｃｏＲＶの制限酵素で切断して、同一な制限酵素で切断されたｐＣＬ−プラスミドに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを利用してライゲーションし、ｐＣＬ−ＰａｒｏＦを製作した。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
また、大腸菌Ｗ３１１０から遺伝子ｕｓｇをクローニングするために、それぞれ配列番号３及び４を有する表２のようなプライマーを製作した。ｕｓｇ遺伝子(NCBI GI:1613054:配列番号5)の塩基配列は、既に文献に報告されている。 大腸菌野生株Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型として、重合酵素連鎖反応法(ＰＣＲ法)[Sambrooket al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](ＰＣＲ条件：変性＝９５℃、３０秒/アニーリング＝５３℃、３０秒/重合＝７２℃、１分、３０回)により、約１０１４塩基対のｕｓｇ遺伝子を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で切断して、同一な制限酵素で切断されたｐＣＬ−ＰａｒｏＦプラスミドに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを利用してライゲーションし、図１のような組み換えベクターｐＣＬ−ＰａｒｏＦ−ｕｓｇ を製作した。
【００３０】
【表２】
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【実施例３】
【００３１】
遺伝子ｕｓｇが過発現された組み換え微生物のスレオニン生産量の比較
本実施例では、実施例２で製作された組み換えベクター(ｐＣＬ−ＰａｒｏＦ−ｕｓｇ)でスレオニン生産能を有する大腸菌(Escherichia coli)ＴＦ５０１５を形質転換させた。得られた形質転換体ＴＦ６４２１２(KCCM-10768)を、表３のような組成を有するフラスコ力価培地を利用して培養し、培養液を遠心分離して得た上澄み液を液体クロマトグラフィーで分析し、スレオニン濃度を測定した。これにより、形質転換された大腸菌ＴＦ６４２１２で測定されたスレオニン濃度と大腸菌ＴＦ５０１５で測定されたスレオニン濃度を比較した。生産されたＬ−スレオニンの濃度は、３つのフラスコの結果の平均値を使用した。
【００３２】
【表３】
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【００３３】
その結果、表４に示されたように、力価を測定した形質転換された大腸菌ＴＦ６４２１２(受託番号：KCCM-10768)におけるＬ−スレオニン濃度が、大腸菌ＴＦ５０１５に比べ、２０．８％増加したことを確認した。
【００３４】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明により、生物情報学技法を利用して、大腸菌においてその機能が知られていないｕｓｇ遺伝子の機能を予測した結果、Ｌ−スレオニン生合成に関与するアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼと高いアミノ酸配列上の類似性を有することが確認でき、遺伝子ｕｓｇの発現量を増加させることにより、Ｌ−スレオニン生産性を増加させることができる。具体的には、Ｌ−スレオニン生産能大腸菌ＴＦ５０１５から、ｕｓｇ遺伝子を過多発現するように形質転換させた大腸菌ＴＦ６４２１２を製造して、これの培養を通じてＬ−スレオニンを生産し、その生産性を増加させることができる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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