(57)【要約】本発明は、Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物および該極性有機抽出物から得られるフラクションを含む組成物であって、クアシノイド類、クマリン類、ならびにその配糖体、類似体および誘導体を含み、男性の精子生産ならびに形質および運動性に関する精子の質を改善し、テストステロンの合成および細胞からの放出を増加させる生物活性を示す組成物を提供する。前記極性有機抽出物を製造するためのＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ植物の抽出方法、およびこれに続く、クアシノイド類、クマリン類、その配糖体、類似体および誘導体を含む極性有機抽出物のフラクションを製造するための精製、ならびに不妊症治療用製剤の製造のための使用も提供される。クアシノイド類、クマリン類、その配糖体、類似体および誘導体を含む極性有機抽出物のフラクションは、複数の投与経路による医薬用途に製剤される。【選択図】図１
2010500342.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物を含む組成物であって、前記抽出物の重量パーセントが５％以下であり、かつクアシノイド類、クマリン類、それらの配糖体、類似体および誘導体を含む、組成物。
【請求項２】
前記極性有機抽出物が、精子数を増加させ、精子の運動性を上昇させ、かつテストステロンの合成および細胞からの放出を増加させる生物活性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションを含む組成物であって、前記フラクションが、前記極性有機抽出物の１０％〜２５％重量パーセントであり、かつ前記フラクションが：
ユーリコマノン、１３α,２１-ジヒドロユーリコマノン、１３(２１)-エポキシユーリコマノン、ユーリコマノールおよびその配糖体、ユーリコマオシドおよびそのアグリコン、ならびにこれら全ての類似体および誘導体を含むクアシノイド類；および
６-メトキシクマリン-７-Ｏ-α-Ｄ-グリコピラノシド、ならびにその別の配糖体、類似体および誘導体を含むクマリン類、
を含む、組成物。
【請求項４】
前記フラクションが、精子数を増加させ、精子の運動性を上昇させ、かつテストステロンの合成および細胞からの放出を増加させる生物活性を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａから生物活性成分を単離する方法であって、
（ｉ）Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ植物材料から極性有機抽出物を調製する工程；
（ｉｉ）前記極性有機抽出物を、スチレン-ジビニルベンゼン合成樹脂又はデキストラン合成樹脂に通して分画し、水、水と有機溶媒との混合溶液、および有機溶媒を順に用いて溶離することで、Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションを得る工程；および
（ｉｉｉ）分配法、クロマトグラフィー法および再結晶化法により、生物活性成分を単離して精製する工程、
を含む、前記単離する方法。
【請求項６】
前記工程（ｉ）により得られる前記極性有機抽出物の重量パーセントが、５％以下であり、かつクアシノイド類、クマリン類、ならびにその配糖体、類似体および誘導体を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｉｉ）により得られる前記極性有機抽出物のフラクションが、１０％〜２５％の重量パーセントであり、かつ前記フラクションが：
ユーリコマノン、１３α,２１-ジヒドロユーリコマノン、１３(２１)-エポキシユーリコマノン、ユーリコマノールおよびその配糖体、ユーリコマオシドおよびそのアグリコン、ならびにこれら全ての類似体および誘導体を含むクアシノイド類；および
６-メトキシクマリン-７-Ｏ-α-Ｄ-グリコピラノシド、ならびにその別の配糖体、類似体および誘導体を含むクマリン類、
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記生物活性が、精子数を増加させること、精子の運動性を上昇させること、ならびにテストステロンの合成および細胞からの放出を増加させることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｉ）が、粉砕されたＥｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの根、樹脂又は茎に対して、有機溶媒又は水と有機溶媒との混合溶液を用いた抽出を行なうことを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｉｉ）の前記吸着樹脂が充填されたクロマトグラフィー用カラムが、スチレン-ジビニルベンゼン合成樹脂又はデキストラン合成樹脂である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機溶媒が、低級アルコール又は極性有機溶媒である、請求項５又は９に記載の方法。
【請求項１２】
前記低級アルコール又は前記極性有機溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールおよびアセトンから成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト又は動物の性機能障害又は男性不妊症の治療用医薬の製造における、請求項１〜２に記載のＥｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物を含む組成物の使用。
【請求項１４】
ヒト又は動物の性機能障害又は男性不妊症の治療用医薬の製造における、請求項３〜４に記載のＥｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションを含む組成物の使用。
【請求項１５】
医薬的に許容可能な担体と共に、ヒト又は動物の性機能障害又は男性不妊症の治療に有効な治療量の請求項１〜２に記載の組成物を有効成分として含む、医薬製剤。
【請求項１６】
医薬的に許容可能な担体と共に、ヒト又は動物の性機能障害又は男性不妊症の治療に有効な治療量の請求項３〜４に記載の組成物を有効成分として含む、医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生薬の技術分野、特に男性の不妊症又は性機能障害の治療用の薬草医薬製剤に関する。より具体的には、本発明は、男性の精子形成を向上させる活性を有するＥｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物およびそのフラクション、不妊治療用製剤の製造のためのその使用、ならびにその抽出方法および精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝統的にトンカットアリ（ｔｏｎｇｋａｔ ａｌｉ）、ペナワールパヒト（ｐｅｎａｗａｒ ｐａｈｉｔ）、ベダラパヒト（ｂｅｄａｒａ ｐａｈｉｔ）、トンカットバギンダ（ｔｏｎｇｋａｔ ｂａｇｉｎｄａ）、ペタラブミ（ｐｅｔａｌａ ｂｕｍｉ）、ペサクブミ（ｐａｓａｋ ｂｕｍｉ）、セツンジャングブミ（ｓｅｔｕｎｊａｎｇ ｂｕｍｉ）、カイバビン（ｃａｙ ｂａ ｂｉｎｈ）およびプラーライプエアク（ｐｌａａ-ｌａｉ-ｐｕｅａｋ）としても知られる Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ（Ｊａｃｋ）の根又は茎は、単一の薬草として、又は複数の薬草成分の一部として、赤痢、発熱、マラリアおよび男性不妊症等の生殖障害の治療に、伝統的な民間医薬として用いられてきた。数多くの科学論文により、この植物の抽出物から得られるクアシノイド（ｑｕａｓｓｉｎｏｉｄｓ）が、抗マラリア活性（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ., １９８６; Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ., ２００４; Ｊｉｗａｊｉｎｄａ ｅｔ ａｌ., ２００２; Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ., ２００４）、抗住血吸虫活性（Ｊｉｗａｊｉｎｄａ ｅｔ ａｌ., ２００２）、抗潰瘍活性（Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ., １９９１）、解熱活性（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ., １９９５）、細胞毒性（Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ. １９９３; Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ., ２００４）、抗腫瘍促進活性（Ｊｉｗａｊｉｎｄａ ｅｔ ａｌ., ２００２）および性欲促進活性（Ａｎｇ ａｎｄ Ｓｉｍ, １９９８）を有することが報告されている。
【０００３】
夫婦間（ｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｓ）の不妊症は、１年を超える避妊を行わない性交の後にも女性が妊娠できないこととして定義されており、真剣に子供を持つこと望む夫婦において重要な問題である。ＷＨＯによれば（２００３年）、１億８６００万を超える夫婦の約１０〜１５％が不妊症に悩まされており、このうち、男性が、この問題の原因となる場合が約３０〜４０％であり（Ｒｏｙｌｅ ａｎｄ Ｗａｌｓｈ, １９９２）、調査時では、２０〜３０％が、夫婦の両者の組合せによる可能性があった。
【０００４】
男性不妊症は、精液中の精子の欠如、精子の変形又は構造異常、女性の卵子を受精させる運動性の欠如、遺伝的障害又は内分泌障害が原因となる場合がある。これまで、男性不妊症の９０％超は、精子数の少なさ又は精子の質の低さに起因するものであった（Ｗｉｎｓｔｏｎ, １９８６）。
【０００５】
妊娠に必要なのは実際には１個の精子で十分なのだが、精液サンプル中に運動能力のある精子が２０００万個未満の場合には、妊娠のチャンスは低下する。男性不妊症のいくつかのケースでは、単に精子の数を増加させることで問題が解決する可能性がある。現状では、精子数を増加させる公知の方法は存在しない。従って、不妊症の男性の少ない精子数を増加させるような製品は、その男性の受精能力を高める可能性があり、不妊状態にある夫婦に多大な恩恵をもたらすであろう。
【０００６】
Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ（Ｊａｃｋ）は、男性の生殖能力を高めるマレー地方の伝統的な治療薬としての評判を有し、性欲促進特性を示すことが報告されている（Ｚａｋａｒｉａ ａｎｄ Ａｌｉ Ｍｏｈｄ, １９９４）
【０００７】
米国特許出願第２００４００８７４９３号（Ｓａｍｂａｎｄａｎ ｅｔ ａｌ., ２００４）では、分子量が４,３００ダルトンであり、かつ３０個〜３９個のアミノ酸と糖残基とを有する糖ペプチドを含むＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの水性抽出物が、テストステロン合成の活性を増加させ、細胞からのテストステロンの放出を増加させ、精子数を増加させ、かつ精子の運動性を上昇させることが、幅広くクレームされている。また、この抽出物の組成物も、性機能不全又は男性不妊症の治療用にクレームされている。
【０００８】
上記先行技術とは異なり、本発明の利点は、クアシノイド類、クマリン類、それら配糖体、類似体および誘導体の組成物を含有し、男性の精子生産を増加させ、精子の運動性を高め、そしてテストステロン合成と細胞からの放出を増大させる、Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物およびそのフラクションを提供することである。また、不妊症治療用製剤の製造における前記組成物の使用、抽出物およびフラクションの作製方法、ならびに化学成分の単離と同定も、本発明により提供される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物およびこの極性有機抽出物から得られるフラクションの組成物を広く開示し、前記組成物は、クアシノイド類、クマリン類、それらの配糖体、類似体および誘導体を含み、男性の精子生産ならびに形質および運動性に関する精子の質を増加させ、テストステロンの合成と細胞からの放出を増加させる生物活性を示す。前記極性有機抽出物を製造するためのＥ．ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ植物の抽出方法、およびこれに続く、クアシノイド類、クマリン類、それらの配糖体、類似体および誘導体を含む極性有機抽出物のフラクションを製造するための精製、ならびに、不妊症治療用製剤の製造におけるこれらの使用も提供される。クアシノイド類、クマリン類、それらの配糖体、類似体および誘導体を含む極性有機抽出物のフラクションは、複数の投与経路による医薬用途に製剤される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一つの態様によれば、Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物を含む組成物であって、前記抽出物の重量パーセントが５％以下であり、かつクアシノイド類、クマリン類、それらの配糖体、類似体および誘導体を含む、組成物が提供される。
【００１１】
前記極性有機抽出物は、男性の精子数を増加させること、精子の運動性を上昇させること、ならびにテストステロンの合成および細胞からの放出を増加させることを含む生物活性を有する。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションを含む組成物であって、前記フラクションが、前記極性有機抽出物の１０％〜２５％の重量パーセントであり；
ユーリコマノン（ｅｕｒｙｃｏｍａｎｏｎｅ）、１３α,２１-ジヒドロユーリコマノン（１３α，２１−ｄｉｈｙｄｒｏｅｕｒｙｃｏｍａｎｏｎｅ）、１３(２１)-エポキシユーリコマノン（１３（２１）−ｅｐｏｘｙｅｕｒｙｃｏｍａｎｏｎｅ）、ユーリコマノール（ｅｕｒｙｃｏｍａｎｏｌ）およびその配糖体、ユーリコマオシド（ｅｕｒｙｃｏｍａｏｓｉｄｅ）およびそのアグリコン、ならびにこれら全ての類似体および誘導体を含むクアシノイド類；ならびに
６-メトキシクマリン-７-Ｏ-α-Ｄ-グリコピラノシド、その別の配糖体（ｏｔｈｅｒ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）、類似体および誘導体を含むクマリン類、
を含む組成物が提供される。
【００１３】
前記Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションは、男性の精子数を増加させること、精子の運動性を上昇させること、ならびにテストステロンの合成および細胞からの放出を増加させることを含む生物活性を有する。
【００１４】
本発明の更に別の態様によれば、Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａから生物活性成分を単離する方法が提供され、該方法は、
Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ植物材料から極性有機抽出物を調製すること；
前記極性有機抽出物を、スチレン-ジビニルベンゼン合成樹脂又はデキストラン合成樹脂に通して分画し、水、水と有機溶媒との混合溶液、および有機溶媒を順に用いて溶離することにより、Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションを得ること；および
分配（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）法、クロマトグラフィー法および再結晶化法により、生物活性成分を単離して精製すること、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明のＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションの抽出を示すフローチャートである。
【図２】図２は、本発明のＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクショから抽出される種々の成分の単離スキームを示すフローチャートである。
【図３】図３は、本発明のＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションによる生殖能を評価するための４２日間に渡る処置による動物試験の実験計画を示すフローチャートである。
【図４】図４は、本発明のＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションによる生殖能を評価するための４２日間に渡る無処置および処置による動物試験の実験計画を示すフローチャートである。
【図５】図５は、２５.５１ ｍｇ/ｋｇ のＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクション（Ｅ）、１２５ ｍｇ/ｋｇのＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａの抽出物（ＨＢ）およびコントロール（Ｃ）を４２日間に渡って毎日経口投与し、続いて、更に４２日間ＨＢ+Ｅの同時投与を行った後の、ラットの精子数に対する効果を示すグラフである。ＷＨＢとＷＥは、それぞれ、第２の４２日間でＨＢおよびＥを投与されなかったグループである。
【図６】図６は、２５.５１ ｍｇ/ｋｇ のＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクション（Ｅ）、１２５ ｍｇ/ｋｇのＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａの抽出物（ＨＢ）およびコントロール（Ｃ）を４２日間経口投与し、続いて、更に４２日間ＨＢ+Ｅの同時投与を行った後の、精子形体に対する効果を示すグラフである。ＷＨＢとＷＥは、それぞれ、第２の４２日間でＨＢおよびＥを投与されなかったグループである。
【図７】図７は、２５.５１ ｍｇ/ｋｇ のＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクション（Ｅ）、１２５ ｍｇ/ｋｇのＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａの抽出物（ＨＢ）およびコントロール（Ｃ）を４２日間経口投与し、続いて、更に４２日間ＨＢ+Ｅの同時投与を行った後の、精子の運動性に対する効果を示すグラフである。ＷＨＢとＷＥは、それぞれ、第２の４２日間でＨＢおよびＥを投与されなかったグループである。
【図８】図８は、２５.５１ ｍｇ/ｋｇ のＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクション（Ｅ）、１２５ ｍｇ/ｋｇのＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａの抽出物（ＨＢ）およびコントロール（Ｃ）を４２日間経口投与し、続いて、更に４２日間ＨＢ+Ｅの同時投与を行った後の精巣の単位重量当たりのテストステロンレベルに対する効果を示すグラフである。ＷＨＢとＷＥは、それぞれ、第２の４２日間でＨＢおよびＥを投与されなかったグループである。
【図９】図９は、１２.７６ ｍｇ/ｋｇ、２５.５１ ｍｇ/ｋｇおよび５１.０２ ｍｇ/ｋｇ のＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションを３０日間経口投与した後の、ラットの血漿ホモジェネートおよび精巣ホモジェネート中のテストステロンレベルに対する効果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、１０体積％のプロピレングリコール水溶液で処置したコントロールラット（Ｃ）由来の精巣の組織構造示す図である（ヘマトキシリンエオジン染色（Ｈ＆Ｅ）、×１００）。
【図１１】図１１は、２５.５１ ｍｇ/ｋｇのＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションで処置したラット由来の精巣の組織構造示す図である（ヘマトキシリンエオジン染色（Ｈ＆Ｅ）、×１００）。Ｌ、ライディヒ細胞；１、生殖細胞；２、精子細胞（ｓｐｅｒｍａｔｉｄｉｃ ｃｅｌｌ）。
【図１２】図１２は、１２５ ｍｇ/ｋｇのＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａ抽出物で処置したラット由来の精巣の組織構造を示す図である（ヘマトキシリンエオジン染色（Ｈ＆Ｅ）、×１００）。３、精母細胞の退縮；４、精細管の管腔。
【図１３】図１３は、Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションおよびＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａの抽出物で処置したラット由来の精巣の組織構造を示す図である（ヘマトキシリンエオジン染色、×２００）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
前記極性有機抽出物は、Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの根、樹脂又は茎を粉砕して、これを有機溶媒又は水と有機溶媒との混合溶液で抽出することにより調製される。
【００１７】
前記極性有機抽出物を選択されたフラクションに分画するために用いられる吸着樹脂が充填されたクロマトグラフィー用カラムは、スチレン-ジビニルベンゼン合成樹脂又はデキストラン合成樹脂であることが好ましい。
【００１８】
また、前記有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールおよびアセトンから成る群から選択され得る低級アルコール又は極性有機溶媒であることが、更に好ましい。
【００１９】
本発明の方法により得られるＥｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションは、ユーリコマノン、１３α,２１-ジヒドロユーリコマノン、１３(２１)-エポキシユーリコマノン、ユーリコマノールおよびその配糖体、ユーリコマオシドおよびそのアグリコン、ならびにこれら全ての類似体および誘導体を含むクアシノイド類；ならびに、６-メトキシクマリン-７-Ｏ-α-Ｄ-グリコピラノシド、その別の配糖体、類似体および誘導体を含むクマリン類を含み、男性の精子数を増加させ、精子の運動性を上昇させ、かつテストステロンの合成および細胞からの放出を増加させる生物活性を示す。
【００２０】
本発明は、男性の精子数を増加させ、精子の運動性を上昇させ、かつテストステロンの合成および細胞からの放出を増加させるための、ユーリコマノン、１３α,２１-ジヒドロユーリコマノン、１３(２１)-エポキシユーリコマノン、ユーリコマノールおよびその配糖体、ユーリコマオシドおよびそのアグリコン、これら全ての類似体および誘導体を含むクアシノイド類；ならびに、６-メトキシクマリン-７-Ｏ-α-Ｄ-グリコピラノシド、その別の配糖体、類似体および誘導体を含むクマリン類、を含む、Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションの成分の単離および同定を含む。これらクアシノイド類およびクマリン類ならびにその類似体および誘導体は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含むクロマトグラフィー法および質量分析（ＭＳ）により分析され、紫外線、赤外線、質量分析、核磁気共鳴およびＸ線回折解析により同定される。
【００２１】
本発明のさらに別の態様によれば、医薬製剤が提供される。この製剤は、医薬的に許容可能な担体と共に、精子形成の改善により性機能障害又は男性不妊症の治療に有効な治療量の前記Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物および/又はこの極性有機抽出物から得られるフラクションから成る組成物を含み、男性の精子数を増加させ、精子の運動性を上昇させ、かつテストステロンの合成および細胞からの放出を増加させる。
【００２２】
本発明の更なる態様によれば、男性の精子生産又は精子数を増加させ、精子の運動性を上昇させ、テストステロン合成および細胞からのテストステロンの放出を増加させることによる、ヒト又は動物の男性不妊症又は性機能障害の治療のための医薬の製造における、前記Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物および/又はこの極性有機抽出物から得られるフラクションから成る組成物の使用が提供される。
【００２３】
前記Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物および/又はこの極性有機抽出物から得られるフラクションから成る組成物は、標準的な方法により、極性有機抽出物および/又はそのフラクションを含有する、ソフトゲルカプセルを含むカプセル、錠剤、ガレン製薬（ｇａｌｅｎｉｃａｌｓ）、粉末、顆粒、水性医薬、注射等の臨床使用のための種々の医薬製剤へ製剤可能である。ここで、前記極性有機抽出物および／又はフラクションは、有効成分として、その効能と毒性に基づく治療有効量で、単体又は他の化学物質との組み合わせで、経口、舌下、静脈内、筋内等の種々の投与経路を通じて投与可能である。有効量とは、精子数を増加させ、形体および運動性において精子の質を高め、かつテストステロンレベルおよび細胞からのテストステロン放出を増加させるのに十分な量である。男性の精子形成を改善するのに有効な量は、治療する症状の重症度；年齢、健康状態、身長（ｓｉｚｅ）および体重を含む患者個人のパラメーター；併用される療法と薬物の相互作用：治療頻度；および投与方法に応じることとなる。
【００２４】
好ましくは、極性有機抽出物のフラクションの成人用投与量は、１日当たり約０.２〜２.０ ｍｇ/ｋｇである。１日に１回又は複数回の投与により、６０ ｋｇの成人につき１０〜１００ ｍｇの範囲の投与量を経口投与することで、所望の結果が得られることが期待される。極性有機抽出物の場合、成人の経口投与量は、１日当たり５０〜５００ ｍｇ/ｋｇの範囲であり得る。このような投与量において対象の反応が不十分な場合には、患者の許容量の範囲で、これを超える投与量（又はより局所的な別の送達経路による、より大量の有効投与量）を用いてもよい。投与量の範囲は、個々の患者の治療に必要な場合には、治療する特定の症状に応じて調節してもよい。化合物の適切な全身濃度を達成するために、１日に複数回投与することも予期される。治療期間は、短期間を基本とし、好ましくは、６か月以下である。
【発明の詳細な説明】
【００２５】
本発明の種々の特徴および態様を、以下の実施例において更に説明する。これらの実施例は、本発明の範囲内で操作する方法を当業者に示すために提示されるが、これら実施例は、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明の範囲は、請求項によってのみ定義される。
【実施例１】
【００２６】
実施例１
極性有機抽出物の調製
抽出用に選択される植物部位としては、Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ（Ｊａｃｋ）（ニガキ科（Ｓｉｍａｒｏｕｂａｃｅａｅ））の根、樹皮又は茎を用いることができる。抽出前に、各植物部位を乾燥させ、小片へと細断し、そして粉砕機にかけた。
【００２７】
本発明の極性有機抽出物は、上記の植物部位を、メタノール、エタノールおよびアセトンを含む水和性有機溶媒又は水とこれら有機溶媒との混合溶液を用いて抽出することにより得られる。抽出温度は、各抽出毎に、５０〜７０℃の範囲に調節し、６〜８時間かける。抽出懸濁液をろ過し、残渣を、前記と同一の新たな溶媒で再抽出した。例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン又は水とこれら有機溶媒との混合溶液であり得る有機溶媒の、乾燥植物部位に対する相対量は、１：１０〜１：１００である。一つにまとめたろ液を、部分真空下で、２４〜２７℃の室温で蒸発乾固させて、２重量％〜５重量％の粗抽出物を得た。
【実施例２】
【００２８】
実施例２
極性有機抽出物のフラクションの調製
Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションは、上述の粗抽出物をクロマトグラフィー技術により分離精製することで得られる。極性有機抽出物を、スチレン-ジビニルベンゼン合成樹脂又はデキストラン合成樹脂に吸着させ、次いで、水、水と有機溶媒との混合溶液、およびその後に有機溶媒をこの順番で用いて溶離する。この有機溶媒は、例えば、メタノール、エタノール、アセトンおよびイソプロピルアルコール等の低級アルコール又は極性有機溶媒であり得る。
【００２９】
或る好ましい実施形態では、樹脂に吸着した極性有機抽出物のフラクションの成分は、スチレン-ジビニルベンゼン合成樹脂又はデキストラン合成樹脂を充填したカラムに極性有機抽出物を通過させることにより得られる。非吸着成分は、水で洗い流され、樹脂に吸着した成分は、水と有機溶媒との混合溶液、およびその後に有機溶媒のみを用いて溶離される。
【００３０】
前記極性有機溶媒を部分真空下で濃縮乾固することで、１０〜２５重量％のＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの所望のフラクションが得られた。Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションの単離を図１により示す。
【実施例３】
【００３１】
実施例３
極性有機抽出物のフラクションから抽出された成分の同定
Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションから抽出された成分は、２００グラムの抽出物乾燥残渣をシリカゲルを充填したカラムに注入し、その後、クロロホルムとメタノールの混合溶液で、極性を高めながら溶離することにより同定した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で同程度のＲｆ値を示す種々のサブフラクションを、図２に示すように、Ｆ１〜Ｆ５として集めてまとめた。
【００３２】
サブフラクションＦ-１およびＦ-２を、メタノール再結晶を繰り返すことで更に精製すると、それぞれユーリコマノール（[α]27D：＋８５.６°）(ｃ ０.３１、ピリジン)およびユーリコマノール-２-Ｏ-β-グルコピラノシド（[α]27D：＋７８.０°）(ｃ １.００、ピリジン)が得られた。
【００３３】
クロロホルムおよび濃度を増加させながらメタノールを用いた遠心ＴＬＣによりサブフラクションＦ-３を更に分画すると、６-メトキシクマリン-７-Ｏ-α-Ｄ-グリコピラノシドが得られた。
【００３４】
サブフラクションＦ-４は、準分取（ｓｅｍｉ-ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）用Ｐａｒｔｉｓｉｌ １０ ＯＤＳ-３  ５μカラム（２５０×７.６ ｍｍ）を用いたＨＰＬＣにより更に精製した。アセトニトリル：水（１:９）の移動相による１.６ ｍｌ/分での溶離および２１０ｎｍでの検出により、ユーリコマノン（[α]27D：＋３４.２°）(ｃ ０.３２、ピリジン)および １３α(２１)-エポキシユーリコマノン（[α]27D：＋３２.１°）(ｃ ０.１１、ＭｅＯＨ)が得られた。
【００３５】
酢酸エチルとメタノールとの混合溶媒（メタノールの濃度を増加させながら用いる）と、続いてクロロホルムとメタノールとの混合溶媒（メタノールの濃度を増加させながら用いる）を用いた遠心ＴＬＣによるサブフラクションＦ-５の分画により、ユーリコマオシドアグリコン（[α]27D：＋１６.４°）(ｃ ０.３０、ＭｅＯＨ)および１３,２１-ジヒドロユーリコマノン（[α]27D：＋４６.９°）(ｃ ０.１１、ＭｅＯＨ)が得られた。
【００３６】
上記の抽出された種々の成分の単離スキームを図２に示す。これらの成分の構造は、ＮＭＲ、ＭＳ、ＵＶおよびＩＲのスペクトルを報告値（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ., １９８６; Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ., １９９０; Ｋａｒｄｏｎｏ ｅｔ ａｌ., １９９１）と比較することにより確認した。
【実施例４】
【００３７】
実施例４
極性有機抽出物のフラクションによる生殖能の評価
Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションによる生殖能の評価を行うため、体重が約２２０〜２５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットをセインズマレーシア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉ  Ｓａｉｎｓ  Ｍａｌａｙｓｉａ）の動物舎から購入し、周囲室温で１２時間の明暗周期の下に維持した。動物を一晩絶食させ、実験開始前に水を採ることを許可した。実験プロトコルは、セインズマレーシア大学の動物倫理委員会に提出し、承認された。
【００３８】
５４匹のラットを、それぞれ１８匹の動物から成る３種類の処置グループへと振り分けた。コントロールグループ（Ｃ）の動物には、水中に１０体積％のプロピレングリコールを含むベヒクルのみを与えた。グループＥの動物には、１０％プロピレングリコール中に含まれるＥｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａの極性有機抽出物のフラクションを２５.５１ ｍｇ/ｋｇの投与量で摂取させた。グループＨＢの動物には、Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａの抽出物を１２５ ｍｇ/ｋｇの投与量（２５ ｍｇ/ｋｇのアンドログラフォリド（ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ）を含有）で摂取させた。全ての処置は、４２日間の継続的な経口投与により行った。続いて、各グループの１２匹の動物について、各オスを個別に２匹のメスラットと共に５日間、この期間内に発情周期が１回経過するように収容することを含む、オスの生殖試験を行った(Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ｅｌ-Ｔａｗｉｌ, ２００３）。交尾が成功したことを確実なものとするため、全てのメスラットの膣を綿棒で洗浄した。妊娠期間には、メスラットの体重評価を妊娠の指標として用いた。生後は、授乳期間中に子供の体重を、４日目、７日目、１１日目、１４日目、１７日目および２１日目に記録した。受精と繁殖の指数も測定した（Ｅｃｏｂｉｃｈｏｎ, １９９５）。各グループの他の６匹の動物は、精子分析、血漿テストステロン測定および組織学的試験に付した。上記の実験計画を図３に示す。
【００３９】
オスの生殖試験の後、Ｃ、ＥおよびＨＢの各グループの前記１２匹の動物については、さらに４２日間の試験を連続して行った（図４参照）。グループＥ（ｎ＝１２）については、ウォッシュアウト期間（ＷＥ）として、４２日間Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ抽出物の経口投与を中止した。グループＨＢ（ｎ = １２）については、６匹の動物に、Ａ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａ抽出物を１２５ ｍｇ/ｋｇの投与量で毎日連続的に摂取させ、Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａのフラクションも２５.５１ ｍｇ/ｋｇの投与量で４２日間連続して同時投与し（ＨＢ+Ｅ）、他の６匹の動物（ＷＨＢ）には、４２日間のウォッシュアウト期間を経過させた。ウォッシュアウト期間中は、動物は、水および食料を自由に摂取させた。試験の終了時に、Ｃ、 ＷＥ、ＨＢ+ＥおよびＷＨＢの各グループの６匹の動物を、オスの生殖試験、精子分析およびテストステロン測定に付した。上記の実験計画を図４に示す。
【実施例５】
【００４０】
実施例５
テストステロンおよびクアシノイドの分析
２４匹のオスのＳＤラットを、４つのグループに振り分けた。コントロールグループの動物には、ベヒクルとして、１０体積％のプロピレングリコールを含む水与えた。その他のグループの動物には、Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａのフラクションを、それぞれ１２.７６、２５.５１および５１.０２ ｍｇ/ｋｇの投与量で摂取させた。全ての処置は、３０日間の継続的な経口投与により行った。最後の処置から２４時間後に、全ての動物をジエチルエーテルで麻酔し、血漿テストステロン分析用に、心穿刺により３.０ ｍｌの血液を回収した。次いで、これらの動物を、ジエチルエーテルの過剰投与により屠殺した。精巣ホモジェネート中のテストステロンおよびクアシノイドの分析のため、精巣を精巣摘除術（Ｒｅｍｉｅ, ２０００）により取り出した。
【実施例６】
【００４１】
実施例６
結果
（ｉ）精子分析
Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａのフラクションを経口投与したラット（Ｅ）では、最初の４２日間の処置の後、コントロールＣ（Ｐ＜０.０１）およびＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａ抽出物（ＨＢ）（Ｐ＜０.００１）のラットと比較した場合に、精子数の有意な増加が見られた（図５）。Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａフラクションおよびＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａ抽出物による処置を中止した場合、ＷＥおよびＷＨＢの動物の精子数は、コントロール（Ｃ）と同程度のレベルに戻った。Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａフラクション（２５.５１ ｍｇ/ｋｇ）とＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａ抽出物（１２５ ｍｇ/ｋｇ）とを同時投与した動物（ＨＢ+Ｅ）は、Ａ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａ抽出物のみを与えた動物（ＨＢ）と比較して１３３.０％の精子数増加を示したが（Ｐ＜０.０１）、ＷＨＢおよびＷＥの精子数に対しては有意差を示さなかった（図５）。４２日間のウォッシュアウト期間後のＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａ抽出物を与えなかった動物（ＷＨＢ）の精子数は、処置した動物（ＨＢ）と比較した場合に、僅かな回復を示した（図５）。ウォッシュアウト期間（ＷＥ）中に４２日間Ｅｕｒｙｃｏｍａ ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａフラクションを与えなかった動物（ＷＥ）の精子数は、Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａのフラクションを与えた動物（Ｅ）と比べて、有意に低下していた（Ｐ＜０.０５）。図６に示すように、試験において４２＋４２日間を通じて処置を行った動物の精子の形体は、コントロールグループの精子の形体に類似しており、正常であることが判明した。
【００４２】
図７を参照するに、Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａのフラクションで処置したラット（Ｅ）の精子の運動性は、４２日間の経口投与の後のＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａ抽出物を与えたラット（ＨＢ）（Ｐ＜０.００１）およびコントロールのラット（Ｐ＜０.０１）と比較した場合に、有意な増加を示していた。グループＷＥの精子の運動性は、ウォッシュアウト期間中に処置を４２日間中止した際にコントロールと同じレベルへと戻っていた。一方で、Ａ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａ抽出物とＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａのフラクションとを同時投与したラット（ＨＢ+Ｅ）では、ＨＢのラットよりも有意に高い精子運動を示した（Ｐ＜０.０５）。前記抽出物を与えた動物（Ｅ）の精子運動は、ＷＥのラットの精子運動よりも有意に高いものであった（Ｐ＜０.０１）。
【００４３】
（ｉｉ）テストステロン分析
図８を参照するに、Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａのフラクションを経口投与したラット（Ｅ）の精巣の単位重量当たりのテストステロンレベルは、４２日間の処置の後、コントロールのラット（Ｃ）と比較して増加を示したが、４２日間のウォッシュアウト期間の後のグループＷＥおよびコントロールのラットと比較した際には、有意差は認められなかった。しかしながら、グループＷＥの動物のホルモンレベルは、グループＥの動物のホルモンレベルよりも有意に高いものであった（Ｐ＜０.０５）。
【００４４】
図９は、Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ のフラクションを１２.７６、２５.５１および５１.０２ ｍｇ/ｋｇの量で３０日間に渡って経口投与した後に行なった、血漿および精巣中のテストステロンレベルの比較試験を示す。コントロールと処置動物との血漿テストステロンレベルに有意差は認められず、アンドロゲン上昇による典型的な用量-反応は観察されなかった。対照的に、Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａのフラクションを１２.７６、２５.５１および５１.０２ ｍｇ/ｋｇの投与量で摂取した動物の精巣ホモジェネートは、血漿と比べて有意に高いテストステロンレベル（Ｐ＜０.０１）を示したが、コントロール動物の血漿および精巣ホモジェネート中のアンドロゲンレベルの間には有意差は認められなかった。Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａフラクションを１２.７６、２５.５１および５１.０２ ｍｇ/ｋｇの投与量で増加させた場合の精巣ホモジェネート中のアンドロゲンレベルは上昇したが、互いに有意差は認められず、テストステロンの用量-反応上昇が認められないことが示された。５１.０２ ｍｇ/ｋｇの投与量では、テストステロンレベルは、２５.５１ ｍｇ/ｋｇの投与量の場合と比べて、有意ではないが低下を示しており、投与量が多いと、アンドロゲンレベルの逆転が観察されたかもしれないことを示していた。この結果は、Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａフラクションが、動物の精巣中のテストステロンの増加を通じて、精子形成を促進したことを示していた。
【００４５】
（ｉｉｉ）クアシノイド分析
Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａフラクションを１２.７６、２５.５１および５１.０２ ｍｇ/ｋｇの投与量で経口投与した動物の精巣ホモジェネートのＨＰＬＣ分析により、主要なクアシノイド類の一つである、ユーリコマノンが検出されたので、その量を定量した（表１）。単離した純粋なユーリコマノンを用いて検量曲線をプロットすると、ｒ2＝０.９９９で、Ｙ＝１２５０.３Ｘ＋４３.２の方程式が示された［Ｙ：ピークの高さ（ｍＶ）；Ｘ：ユーリコマノン（μｇ/ｍｌ）］。動物の精巣中に検出されたユーリコマノンの量は、Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａフラクションの投与量の増加とｒ2＝０.９７２の相関性を示した。ユーリコマノンの濃度は、精巣ホモジェネートのテストステロンレベルの上昇に寄与しているであろうが、血漿中のテストステロンレベルには影響しないものと思われる（図８および図９）。
【００４６】
表１
３０日間種々の投与量でＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａフラクションを経口投与した後のラット精巣ホモジェネート中に検出されたユーリコマノンの上昇量。結果は、６匹の動物の平均値±標準偏差として示す。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
（ｉｖ）組織学的試験
コントロールＣのラット精巣の組織構造を図１０に示す。精細管内の胚葉および精母細胞は、正常であるように見える。精細管の基底膜から管腔へと伸びた細胞質を有するセルトリ細胞が明確に観察される。
【００４９】
２５.５１ ｍｇ/ｋｇのＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａのフラクションで処置したラット（Ｅ）の精巣の組織構造を図１１に示す。精細管内の胚葉および精母細胞は、完全に無傷であり、コントロールＣの胚葉および精母細胞と比較した場合に密度が高く、生殖細胞１が増殖していることを示している。精子細胞（ｓｐｅｒｍａｔｉｄｉｃ ｃｅｌｌ）２の数が多いことは、精子数の増加に寄与する。ライディヒ細胞Ｌが、図１１中に明確に確認される。
【００５０】
図１２は、１２５ ｍｇ/ｋｇのＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａを４２日間経口投与したラット（ＨＢ）の精細管中の精母細胞の退縮３を示す。第二精母細胞および精子細胞の未熟な状態での分離と分断（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）が観察される。また、成熟精子細胞も、精細管の管腔４内で減少している。
【００５１】
図１３中の組織構造は、最初にＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａの抽出物を１２５ ｍｇ/ｋｇの量で４２日間経口投与し、続いて、更に４２日間２５.５１ ｍｇ/ｋｇの Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａのフラクション（Ｅ）で処置したラットの精巣を示している。図１２で示された精巣に対するＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａの負の影響は、Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａを用いた処置により覆された。この精巣は、コントロールラットのものに近似する組織構造を示した。
【００５２】
（ｖ）オスの生殖試験
Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａのフラクションで処置したオスラット（Ｅ）は５４.１７％の交尾指数を示し、コントロール（Ｃ）の３７.５０％およびＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａ抽出物を与えたグループ（ＨＢ）の３１.８２％と比べて最も高い値であった（表２）。コントロールおよび処置グループにて、偽妊娠（メスラット体内で、受胎が起きないまま、妊娠兆候を伴って月経が止まる状態として定義される）が観察された。コントロールグループでは５２匹の子供が生まれた。グループＥ（ｎ＝４０）およびＨＢ（ｎ＝２６）の全ての子供は、出産後に生存していた。グループＥの子供は、授乳期間の初期において、コントロールの子供よりも有意に体重が重かった。更に、Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａのフラクションで処置したラット（Ｅ）は、授乳期間および離乳期間を通じて、より活動的であった。コントロールの子供の性別の比率（２４匹のオス：２７匹のメス）およびＨＢグループの子供の性別の比率（１２匹のオス：１４匹のメス）と比較した場合に、Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａのフラクションで処置したグループ（Ｅ）では、約２６匹のオスおよび１４匹のメスの子供が誕生したことは興味深いことである。
【００５３】
表２
２５.５１ ｍｇ/ｋｇのＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａフラクション（Ｅ）；１２５ ｍｇ/ｋｇのＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａの抽出物（ＨＢ）、およびコントロール（Ｃ）の、４２日間の経口投与後のオスラットの生殖能に対する効果。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
数値は、胎児の体重の平均値±標準偏差で表されている。
＊  コントロールとの比較で、Ｐ＜０.０５で有意差を有する。
＊＊  コントロールとの比較で、Ｐ＜０.０１で有意差を有する。
＊＊＊  コントロールとの比較で、Ｐ＜０.００１で有意差を有する。
【００５６】
４２時間のＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａフラクションの退薬の後には、動物（ＷＥ）は、処置下にあった動物（Ｅ）（表２）と比べて、僅かに高い交尾率（５０.００％）およびオス生殖率（８３.３３％）を示した（表３）。コントロールおよび処置グループにおいて、メスラットの偽妊娠も観察された。ＨＢ+Ｅで処置した動物の子供の生後２１日目の体重は、コントロールの子供の体重と比べて有意に低いものであった（Ｐ＜０.０５）。ＷＥの子供の性別比（１４匹のオス：１３匹のメス）は、Ｅの子供の性別比（２６匹のオス：１４匹のメス、表２）と有意に異なっていた（Ｐ＜０.０５）。Ａ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａ抽出物による処置を４２日間中止していたにもかかわらず、ＷＨＢの動物では出産が認められなかった。グループＷＨＢの動物のオス生殖率は、表２のＨＢの６３.６３％と比べて、４０.００％に低下していた（表３）。
【００５７】
表３
更なる４２日間に渡る、Ａ. ｐａｎｉｃｕｌａｔｅ抽出物による処置の中止（ＷＨＢ）；Ｅ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａフラクションによる処置の中止（ＷＥ）、ならびにＡ. ｐａｎｉｃｕｌａｔａ抽出物（１２５ ｍｇ/ｋｇ）およびＥ. ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａフラクション（２５.５１ ｍｇ/ｋｇ）による処置の継続（ＨＢ+Ｅ）の後のオスの生殖能に対する効果。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
数値は、胎児の体重の平均値±標準偏差で表されている。
＊  コントロールとの比較で、Ｐ＜０.０５で有意差を有する。
＊＊  コントロールとの比較で、Ｐ＜０.０１で有意差を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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