(57)【要約】  本発明は、糖尿病および肥満を含む疾患の処置のための、Ｐａｒ−１ｂキナーゼ活性の阻害に関する。本発明はまた、Ｐａｒ−１ｂタンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物または組成物であって、糖尿病および肥満の処置に有用な前記化合物または組成物のスクリーニングに関し、ならびに糖尿病および肥満の処置のための化合物の製造に関する。
2010521157.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病または肥満の処置のための薬剤として有用な化合物または組成物を同定するための方法であって、
Ｐａｒ−１ｂポリペプチドを候補薬剤と接触させること、および
接触したＰａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性を決定することを含み、ここで候補薬剤と接触したＰａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性の、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性の対照量と比較しての減少が、候補薬剤が糖尿病または肥満の処置において有用であることを示す、前記方法。
【請求項２】
候補薬剤の不在下でのＰａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性の第２の量を決定すること、および該Ｐａｒ−１ｂポリペプチドの活性の第２の量を、活性の対照量として用いることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｐａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性を、タウ、Ｄｖ１、Ｐａｒ−３、Ｃｄｃ２５Ｃ、ＭＡＰ２もしくはＭＡＰ４タンパク質、またはタウ、Ｄｖ１、Ｐａｒ−３、Ｃｄｃ２５Ｃ、ＭＡＰ２もしくはＭＡＰ４タンパク質のリン酸化部位を含むペプチドのリン酸化により測定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
リン酸化を、リン特異的抗体またはその抗原結合断片により測定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｐａｒ−１ｂポリペプチドが細胞内に含まれており、該細胞を候補薬剤と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
インスリン反応性の低下または肥満を特徴とする疾患を有するか、有することが疑われる対象を処置する方法であって、
かかる処置を必要とする対象に、該疾患の処置として、該対象のＰａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性を低下させる化合物または組成物の有効量を投与すること、
を含む、前記方法。
【請求項７】
インスリン反応性の低下を特徴とする疾患が、２型糖尿病である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
化合物または組成物が、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドの量を低下させる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
Ｐａｒ−１ｂポリペプチドの量を低下させる化合物または組成物が、ｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉ分子またはアンチセンス核酸分子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉ分子が、ヌクレオチド配列
【数１】
2010521157.tif 000011
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
インスリン反応性の低下または肥満を特徴とする疾患の処置のための薬物を製造する方法であって、
Ｐａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性を低下させる化合物または組成物を同定すること、および
該化合物または組成物を、かかる処置が必要な対象への投与のために製剤化すること、
を含む、前記方法。
【請求項１２】
インスリン反応性の低下を特徴とする疾患が、２型糖尿病である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｐａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性を低下させる化合物または組成物が、請求項１〜５のいずれかに記載の方法により同定される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援
本発明は、部分的に、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）からの認可番号P50 CA94056、RO1 GM56203およびR01 DK40936に基づく政府支援によってなされた。政府は、本発明についてある種の権利を有し得る。
【０００２】
発明の分野
本発明は、糖尿病および肥満を含む疾患を処置するためのＰａｒ−１ｂ活性の阻害に関する。本発明はまた、糖尿病および肥満の処置に有用な、Ｐａｒ−１ｂタンパク質の活性を阻害する剤のスクリーニングに関し、さらに、糖尿病および肥満の処置のための化合物の製造に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
インスリン抵抗性および肥満は、２型糖尿病の発症に重要な２つの生理学的摂動である。推定１５７０万人の米国人が糖尿病を有し、成人発症２型糖尿病は糖尿病全体の９０〜９５％を占める。米国の全糖尿病患者のほぼ３分の１がこの疾患を有していることを自覚せず、気付かれずコントロールされていない糖尿病は、例えば、失明、心疾患、神経疾患および肝臓疾患などの重篤な副作用を有し得る。臨床的リスクの増加に加えて、２型糖尿病はまた、罹患した人々の生活の質の低下ももたらし得る。
【０００４】
肥満もまた、世界的に増加しつつある状態である。先進国においては、医療費全体の２〜７％が肥満に起因する（Hossain et al., New Engl J Med. 2007 Jan 18. 356:213-215）。米国のみでは、肥満による直接および間接的費用の合計は、２００１年に１２３０億ドルと推定された（Hossain et al., 2007）。肥満は、ヒトに数種の経路により影響を及ぼす；最も顕著には、糖尿病および高血圧症例の増加に寄与する。いくつかの報告によれば、２型糖尿病の約９０％は、過剰な体重によるとされている（Hossain et al., 2007）。
２型糖尿病および肥満は、健康および生活の質に重大な結果をもたらす、現代社会における主要な疾患であるため、より少ないおよび／または低度の低い副作用で、糖尿病および肥満のより優れた処置を提供するために、改善された処置方法が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
インスリン感受性と糖取込みの調節に関与する遺伝子の同定および特徴付けは、２型糖尿病および肥満の新しい薬物療法の設計および開発に重要である。本研究において、極性キナーゼＰａｒ−１ｂ／ＭＡＲＫ２が、in vivoで糖代謝を調節するのに必要であることを示す。Ｐａｒ−１ｂのないマウスはやせており、インスリンに高感受性であり、高脂肪食誘発性体重増加に抵抗性であり、代謝亢進性である。１８Ｆ−ＦＲＤＧｍｉｃｒｏＰＥＴおよび高インスリン−正常血糖クランプ解析により、野生型対照と比べてＰａｒ−１ｂヌルマウスにおいて、糖取込みは、白色および褐色脂肪組織へは増加するが、骨格筋へは増加しないことが実証された。これらを合せると、このデータは、Ｐａｒ−１ｂが、動物全体の糖代謝および過脂肪の新規な調節物質であり、したがって２型糖尿病および肥満の両方の処置のための貴重な薬剤標的であることを示す。
【０００６】
本発明の１つの側面により、糖尿病または肥満の処置のための薬剤として有用な化合物または組成物を同定するための方法が提供される。該方法は、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドを候補薬剤と接触させること、および、接触したＰａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性を決定することを含む。候補薬剤と接触したＰａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性の、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性の対照量と比較しての減少が、候補薬剤が、糖尿病または肥満の処置において有用であることを示す。
いくつかの態様において、方法はまた、候補薬剤の不在下でのＰａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性の第２の量を決定すること、および該Ｐａｒ−１ｂポリペプチドの活性の第２の量を、活性の対照量として用いることを含む。
【０００７】
ある好ましい態様において、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性を、タウ、Ｄｖ１、Ｐａｒ−３、Ｃｄｃ２５Ｃ、ＭＡＰ２もしくはＭＡＰ４タンパク質、またはタウ、Ｄｖ１、Ｐａｒ−３、Ｃｄｃ２５Ｃ、ＭＡＰ２もしくはＭＡＰ４タンパク質のリン酸化部位を含むペプチドのリン酸化により測定する。好ましくは、リン酸化を、リン特異的抗体またはその抗原結合断片により測定する。
他の好ましい態様においては、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドは細胞内に含まれており、該細胞を候補薬剤と接触させる。
本発明の他の態様により、インスリン反応性の低下または肥満を特徴とする疾患を有するか、有することが疑われる対象を処置する方法が提供される。該方法は、かかる処置を必要とする対象に、該疾患の処置として、該対象のＰａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性を低下させる化合物または組成物の有効量を投与することを含む。
【０００８】
いくつかの態様において、インスリン反応性の低下を特徴とする疾患は、２型糖尿病である。
他の態様において、化合物または組成物は、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドの量を低下させる。好ましくは、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドの量を低下させる化合物または組成物は、ｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉ分子またはアンチセンス核酸分子である；より好ましくは、ｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉ分子は、ヌクレオチド配列
【数１】
2010521157.tif 000003
を含む。
本発明の他の側面により、インスリン反応性の低下または肥満を特徴とする疾患の処置のための薬物を製造する方法が提供される。該方法は、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性を低下させる化合物または組成物を同定すること、および該化合物または組成物を、かかる処置が必要な対象への投与のために製剤化することを含む。
【０００９】
いくつかの態様において、インスリン反応性の低下を特徴とする疾患は、２型糖尿病である。
他の態様において、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドのキナーゼ活性を低下させる化合物または組成物は、糖尿病または肥満の処置のための薬剤として有用な化合物または組成物を同定するための、前述の任意の方法により同定される。
他の側面において、本発明は、前述の剤、化合物および分子の、医薬、特に２型糖尿病や肥満などの、インスリン反応性の低下の処置のための医薬の製造における使用を提供する。
本発明のこれらおよび他の側面は、以下にさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスが発育遅延であり、過脂肪の不均等な減少を有することを示すグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスが発育遅延であり、過脂肪の不均等な減少を有することを示す図である。
【図２】図２は、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスが体重増加に抵抗性であり、高脂肪食に代謝亢進性であることを示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスにおけるインスリン感受性および耐糖能の増加を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスにおけるインスリン感受性および耐糖能の増加を示すグラフである。
【図４】図４は、Ｐａｒ−１ｂ＋／＋およびＰａｒ−１ｂ−／−マウスにおける１８Ｆ−ＦＤＧ取込みのマイクロポジトロン放出断層撮影（ｍｉｃｒｏＰＥＴ）解析を示す図である。
【図５】図５は、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスにおける肝脂肪症に対する耐性を示す図である。
【図６】図６は、脂肪組織への糖取込みの増加による、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスにおける末梢インスリン過感受性（hypersensitivity）を示すグラフである。
【図７】図７は、１８Ｆ−ＦＤＧ取込みのグラフによる解析を示すグラフである。
【図８】図８は、Ｐａｒ−１ｂがＢＡＴ、ＷＡＴ、肝臓および脳において発現されるが、骨格筋には発現されないことを示す図である。
【図９】図９は、Ｐａｒ−１ｂの欠失が、褐色脂肪組織においてＰＰＡＲγ、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４の発現レベルの変化をもたらさないことを示す図である。
【図１０】図１０は、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスにおいて近接するインスリンシグナルが変化しないことを示す図である。
【００１１】
図１  Ｐａｒ−１ｂヌルマウスは発育遅延であり、過脂肪の不均等な減少を有する。
（Ａ）交尾後１３．５〜１８．５日（ｄ．ｐ．ｃ．）の胎児の体重（１時点・１遺伝子型当たりｎ＝５〜１３）。（Ｂ）出生〜３週齢のマウスの体重（１時点・１遺伝子型当たりｎ＝４〜１９）。（Ｃ）１歳齢における、Ｐａｒ−１ｂ野生型マウス（Ｐａｒ−１ｂ＋／＋、黒色棒グラフ）、異型接合マウス（Ｐａｒ−１ｂ＋／−、赤色棒グラフ）またはヌルマウス（Ｐａｒ−１ｂ−／−、灰色棒グラフ）の体重（性別・１遺伝子型当たりｎ＝７〜１３）。（Ｄ）Ｐａｒ−１ｂ野生型およびヌルマウスの、鼠径部（Ｉ）および副睾丸（Ｅ）の脂肪体の比較。（Ｅ）１０〜１２週齢の雄Ｐａｒ−１ｂ野生型マウスおよびヌルマウスの過脂肪の散布図であって、１Ｈ−ＭＲＳにより決定された脂肪量の体重に対する比率で表わしたもの。各遺伝子型の個々のマウスは平均値で示し、ｐ値も示した（遺伝子型当たりｎ＝１８〜２０）。（Ｆ）Ｐａｒ−１ｂ野生型マウスおよびヌルマウスの褐色および白色脂肪組織（ＢＡＴおよびＷＡＴ）のヘマトキシリン・エオジン染色。全ての値は平均値±標準誤差で示す。スチューデントｔ検定により群間の比較を行った。ｐ値は以下のとおりである：＊＊＊＊（ｐ＜０．０５）、＊＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊（ｐ＜０．００５）、＊（ｐ＜０．００１）。
【００１２】
図２  Ｐａｒ−１ｂヌルマウスは体重増加に抵抗性であり、高脂肪食に代謝亢進性である。
雄のＰａｒ−１ｂ野生型マウスおよびヌルマウス（遺伝子型当たりｎ＝５）に、高脂肪食を１６週間、３週齢時から開始して与えた。（Ａ）高脂肪食の期間中のＰａｒ−１ｂ野生型マウスおよびヌルマウスの体重。平均値は±標準誤差と共に示す。全てのデータ点は、ｐ＜０．０５で野生型とヌルマウスの間の統計的有意差を示す。独立した実験において、雄のＰａｒ−１ヌルマウス（紫色棒グラフ）および野生型マウス（白抜き棒グラフ）（遺伝子型当たりｎ＝１８〜２０）に高脂肪食を８週間与えて分析した。Ｐａｒ−１ヌルマウスは、高脂肪食により、代謝率の増加（Ｂ）、エネルギー消費の増加（Ｃ）、および食物の摂取の増加（Ｄ）を示す。Ｐａｒ−１ヌルマウスの呼吸指数（ＶＣＯ２／ＶＯ２）は、野生型対照（Ｅ）と統計的な差はない。スチューデントｔ検定のｐ値はパネル内に示す。
【００１３】
図３  Ｐａｒ−１ｂヌルマウスにおけるインスリン感受性および耐糖能の増加。
（Ａ）食餌を与えられたかまたは絶食（１２時間）のＰａｒ−１ｂ＋／＋マウス（白抜き棒グラフ）およびＰａｒ−１ｂ−／−マウス（紫色棒グラフ）から、後方眼窩出血を得て、血清インスリン濃度をラジオイムノアッセイにより測定した（遺伝子型当たりｎ＝１８マウス）。（Ｂ）食餌を与えられたかまたは絶食のマウスについて、血糖値を決定した（遺伝子型当たりｎ＝１８マウス）。（Ｃ）インスリン耐性試験（ＩＴＴ）を、Ｐａｒ−１ｂ＋／＋（黒線、菱形印）およびＰａｒ−１ｂ−／−（紫色線、丸印）の同腹子に、０．３０ＩＵ／ｋｇのインスリンを腹腔内注射して行った（遺伝子型当たりｎ＝１４マウス）。尾から出血を得て、血糖値を、インスリン注射後に１５分間隔でモニタリングした。データは、注射前の０時点に対する血糖値％としてプロットした。（Ｄ）耐糖能試験を、Ｐａｒ−１ｂ＋／＋およびＰａｒ−１ｂ−／−の同腹子に、Ｄブドウ糖を１ｍｇ／体重１ｇで腹腔内注射して行った（遺伝子型当たりｎ＝１０）。尾から出血を得て、血糖値を、ブドウ糖注射後に２０分間隔でモニタリングした。データを、注射前の０時点に対する血糖値％としてプロットした。パネルＡ〜Ｄにおいて、全ての値に対し標準誤差をｙ軸上にプロットした。２群間の比較についてはスチューデントｔ検定を行った。ｐ値は以下のとおりである：＊＊＊＊（ｐ＜０．０５）、＊＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊（ｐ＜０．００５）、＊（ｐ＜０．００１）。
【００１４】
図４  Ｐａｒ−１ｂ＋／＋およびＰａｒ−１ｂ−／−マウスにおける１８Ｆ−ＦＤＧ取込みのマイクロポジトロン放出断層撮影（ｍｉｃｒｏＰＥＴ）解析。
Ｐａｒ−１ｂ＋／＋およびＰａｒ−１ｂ−／−マウスの１８Ｆ−ＦＤＧ注射の１時間後の、代表的な冠状断面図である。Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスは、肩甲骨内褐色脂肪（ＢＡＴ）パッドにおける取込みの、定常的な上昇レベルを示す。
図５  Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスにおける肝臓脂肪症に対する耐性。
（Ａ）および（Ｂ）：ヘマトキシリン・エオジン染色肝臓切片の低倍率の図は、野生型において、小葉の強調を有する脂肪症を示し、一方、ヌルマウスからの切片は、正常な肝臓の実質組織を示す（スケールバー：１ｍｍ）。（Ｃ）肝小葉内での脂肪の分散（点線）は主に小葉中心性である；肝腺房のゾーン３内（直線）。（スケールバー：５００ｍｍ）。（Ｄ）小葉中心性脂肪症は、ヌルマウスからの切片には存在しない（スケールバー：５００ｍｍ）。（Ｅ）および（Ｆ）：それぞれ、野生型（Ｅ）およびＫＯマウス（Ｆ）からの新鮮凍結肝組織オイルレッドＯ染色。挿入図は、野生型でのマイクロ小嚢およびマクロ小嚢であって、Ｆにおいては最小の活性のみが見られる。
【００１５】
図６  脂肪組織への糖取込みの増加による、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスにおける末梢インスリン過感受性。
高インスリン−正常血糖クランプ実験に続いて、Ｐａｒ−１ｂ＋／＋マウス（白色棒グラフ）およびＰａｒ−１ｂ−／−マウス（紫色棒グラフ）からの白色脂肪組織（Ａ）、褐色脂肪組織（Ｂ）、および骨格筋（腓腹筋）への放射標識ブドウ糖取込みの定量化を行った。平均値は、遺伝子型当たりｎ＝８〜９を用いて、±標準誤差と共にプロットする。
【００１６】
図７
Ｐａｒ−１ｂ＋／＋マウス（白抜き棒グラフ、ｎ＝４）およびＰａｒ−１ｂ−／−マウス（黒色棒グラフ、ｎ＝４）の肩甲骨内褐色脂肪パッド、骨格筋、脳および心臓における、１８Ｆ−ＦＤＧ注射の１時間後の示された条件下での、１８Ｆ−ＦＤＧ取込みのグラフによる解析を示す。１８Ｆ−ＦＤＧ取込みのデータは、平均標準取込み値（ＳＵＶ）として表わす。誤差バーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。
図８  Ｐａｒ−１ｂはＢＡＴ、ＷＡＴ、肝臓および脳において発現されるが、骨格筋には発現されない。
組織を、そのβ−ガラクトシダーゼ活性について、β−ガラクトシダーゼカセットを担持しその発現が内因性のＰａｒ−１ｂプロモータにより駆動されるマウスを用いて解析した。
【００１７】
図９  Ｐａｒ−１ｂの欠失は、褐色脂肪組織においてＰＰＡＲγ、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４の発現レベルの変化をもたらさない。
褐色脂肪組織を均一化し、全細胞抽出物からの５０μｇのタンパク質を、示された抗体を用いる免疫ブロット法により解析した。
図１０  インスリン刺激ＢＡＴ解析は、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスにおいて近接するインスリンシグナルが変化しないことを示す。
野生型およびＰａｒ−１ｂ−／−マウスに、インスリンの準最大用量（０．３Ｕ／体重１ｋｇ）を（腹腔内）注射した。２０分後組織を収集し、褐色脂肪組織（上図）からＩＲＳ−１を免疫沈降させた。全細胞溶解産物（５０μｇ）も、示された抗体を用いる免疫ブロット法により解析した（下図）。
【００１８】
発明の詳細な説明
現在用いられている２型糖尿病の治療剤は、それらの開発において分子的または生化学的に標的化されておらず、その治療的成功（限定的ではあるが）の理由は知られていない。そのため、Ｐａｒ−１ｂシグナル伝達の直接阻害剤は、その治療的可能性においてより強力であることが期待される。Ｐａｒ−１ｂシグナル伝達を直接阻害することにより、糖尿病の組織においてインスリンのシグナル伝達を最大に回復でき、より強力で長期に有効な治療法をもたらす可能性がある。これに基づき、我々は、Ｐａｒ−１ｂの化学的直接阻害剤をスクリーニングして、潜在的治療化合物を同定することを提言する。かかる化合物は、２型糖尿病またはインスリン反応性の低下から生じる任意の臨床状態の処置に有用である。
【００１９】
Ｐａｒ−１ｂポリペプチドの触媒活性を、診断、予後判断、および治療の目的で決定することは、本発明の１つの側面である。Ｐａｒ−１ｂポリペプチドの触媒活性を決定し、候補薬剤を、Ｐａｒ−１ｂ触媒活性、例えばキナーゼ活性を低下させるそれらの能力について、試験することができる。化合物がＰａｒ−１ｂ触媒活性を低下させるとの決定は、化合物が、２型糖尿病や肥満などのインスリン反応性の低下が関与する疾患を処置する剤として有用である可能性があることを示す。例えば、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドを、ポリペプチドの基質と接触させて、Ｐａｒ−１ｂのキナーゼ活性をモニタリングおよび決定し、次にＰａｒ−１ｂポリペプチドを候補剤と接触させて、このポリペプチドのキナーゼ活性を基質と接触させて決定できる。かかるアッセイは、細胞ベースのアッセイまたはin vitroアッセイであってよく、細胞またはヒトを含む動物におけるＰａｒ−１ｂ触媒活性の阻害剤の、in vivoでの投与の効果をモニタリングするのにも有用である。in vitroアッセイは、例えばポリペプチドに基づくアッセイであることができる。
【００２０】
Ｐａｒ−１ｂはまた、ＭＡＲＫ２（ＭＡＰ／微小管親和性の調節キナーゼ２）；ＥＭＫ１；およびＭＧＣ９９６１９としても知られている。当分野で知られたＰａｒ−１ｂの数種のスプライス変異体があり、それらの各々を、本方法において、Ｐａｒ−１ｂ活性を一般に阻害する化合物および組成物を同定するために、または１もしくは２種以上の特定のＰａｒ−１ｂスプライス変異体の活性のみを阻害するために用いることができる。ヒトＰａｒ−１ｂ遺伝子の長い変異体（転写物変異体１）の配列アクセッション番号は、ＮＭ＿０１７４９０である。
【００２１】
本発明はまた部分的に、例えばこれらのポリペプチドの阻害剤をスクリーニングするための、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドの活性を決定するために用いるアッセイに関する。Ｐａｒ−１ｂポリペプチドを表面に付着させて、次に基質分子に接触させ、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドまたはその断片の触媒活性のレベルをモニタリングし、標準法を用いて定量化することができる。前述のアッセイは限定を意図しない。触媒活性のアッセイは、溶液中の化合物について、当分野で認識された種々の検出方法、および／または当業者に知られている他のキナーゼアッセイ方法を用いて行ってもよく、これらのいくつかは本明細書に以下に記載される。典型的には、これらは当分野に周知のキナーゼアッセイである；ある例示の方法を、以下の実施例に提供する。
本発明はさらに、Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させるのに有用な薬剤または剤のためのリード化合物を同定する、効率的な方法を提供する。一般に、スクリーニング法には、基質のリン酸化を低下させる（すなわち、阻害する）化合物のためのアッセイが関与する。かかる方法は、化合物の自動化高スループットスクリーニングに適合させることができる。
【００２２】
薬剤のための広範囲のアッセイが提供されており、それらは標識in vitroキナーゼリン酸化アッセイ、細胞ベースのリン酸化アッセイ、相互作用タンパク質の親和性を決定するアッセイ（例えば免疫沈降法、２ハイブリッドアッセイ）などである。例えば、in vitroキナーゼリン酸化アッセイを用いて、候補薬剤の、基質のリン酸化への影響を、例えばＰａｒ−１ｂまたはその断片などにより、迅速に試験する。
候補薬剤は、例えば、組合せペプチドライブラリ、小分子ライブラリ、または天然産物ライブラリなどに由来するものであってよい。
【００２３】
一般に、本発明のアッセイ法で用いる基質を、単離された分子としてアッセイ混合物に加える。Ｐａｒ−１ｂ用の基質は、タウ、Ｄｖ１、Ｐａｒ−３、Ｃｄｃ２５Ｃ、ＭＡＰ２もしくはＭＡＰ４タンパク質を含む。Ｐａｒ−１ｂキナーゼ用の他の基質も、当業者には知られている。アッセイ混合物は、検出可能なリン酸化合物（例えば３２Ｐまたは３３Ｐ）を含むことができ、これにより、Ｐａｒ−１ｂによってリン酸化されたタンパク質基質が容易に検出可能である。代替的に、基質に対するＰａｒ−１ｂ活性を、他の検出手段、例えば特定のリン酸化ポリペプチドの抗体捕捉、クロマトグラフィ法、および当分野の他の標準法などを用いて測定することができる。
【００２４】
キナーゼ活性を測定するための典型的なアッセイ混合物は、Ｐａｒ−１ｂキナーゼのタンパク質基質、または基質のリン酸化部位モチーフを有するペプチド、および候補薬剤を含む。一般に、複数のアッセイ混合物を、異なる薬剤濃度で平行して走らせて、種々の濃度に対して異なる反応を得る。一般にこれらの濃度の１つが、陰性対照として、すなわち剤のゼロ濃度またはアッセイ検出限界より下の濃度として作用する。
【００２５】
候補剤は、多数の化学クラスを包含するが、典型的にはこれらは有機化合物である。好ましくは、候補薬剤は小有機化合物、すなわち、５０より大で約２５００未満の分子量を有するものである。候補剤は、ポリペプチドとの構造的相互反応に必要な化学官能基（例えばキナーゼ部位）を含み、典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含み、好ましくは少なくとも２つの化学官能基、およびさらに好ましくは少なくとも３つの化学官能基を含む。候補剤は、１または２以上の上記で同定した官能基により置換されている、環式炭素もしくは複素環構造、および／または芳香族もしくはポリ芳香族構造を含むことができる。候補剤はまた生体分子、例えばペプチド、単糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上記のものの誘導体または構造類似体、またはそれらの込み合わせなどであってよい。剤が核酸（すなわち、アプタマー）の場合、剤は典型的にはＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、ただし、非天然の結合またはサブユニットを有する修飾核酸もまた意図される。
Ｐａｒ−１ｂ阻害剤はまた、構造に基づく合理的な方法を用いて、例えばPCT/US98/10876およびこれに記載の参照文献に記載されている方法などにより、設計することもできる。
【００２６】
候補剤は、合成または天然化合物のライブラリを含む、広範囲の給源から得る。例えば、広範囲の有機化合物および生体分子のランダムおよび定方向合成のための多数の方法が利用可能であって、当業者に知られており、これらには以下が含まれる：ランダム化オリゴヌクレオチドの発現、ランダムまたは非ランダムペプチドライブラリ、合成有機組合せライブラリ、ランダムペプチドのファージ提示ライブラリなど。代替的に、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態での天然化合物のライブラリが利用可能であり、容易に作製できる。さらに、天然および合成で作製されたライブラリおよび化合物を、従来の化学的、物理的および生化学的手段により容易に修飾可能である。さらに、既知の薬剤を、アクリル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの定方向的またランダム化学修飾に供して、剤の構造的類似体を作製してもよい。
【００２７】
種々の他の試薬もまた混合物に含むことができる。これらには、塩、緩衝液、中性タンパク質（例えばアルブミン）、界面活性剤などの試薬であって、最適なタンパク質活性を促進するために用いてよいものを含む。かかる試薬も、反応成分の非特異的または背景的相互作用を低下させることができる。アッセイの効率を改善する他の試薬、例えばヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤なども用いてよい。
【００２８】
上述のアッセイ材料の混合物を、Ｐａｒ−１ｂがポリペプチドを一定レベル（すなわち、対照レベル）にリン酸化するような条件下で、ただし候補薬剤の存在のもとで、インキュベートする。構成成分の添加の順序、インキュベーション温度、インキュベーション時間、およびアッセイの他のパラメータは、容易に決定することができる。かかる実験には、アッセイパラメータの最適化のみが必要であり、アッセイの基本的な組成は必要ではない。インキュベーション温度は一般に４℃〜４０℃の間である。インキュベーション時間は、迅速で高スループットスクリーニングを促進するために最小化するのが好ましく、一般に１秒〜１時間の間である。
【００２９】
インキュベーション後、基質のリン酸化、または基質の結合の有無を、ユーザーが利用可能な任意の従来法により検出する。細胞フリーアッセイについては、分離ステップを用いて、非結合成分から結合成分を分離することができる。分離ステップは、種々の方法で実現してよい。好都合には少なくとも１つの成分を固体基質上で不動化し、これから非結合成分を容易に分離できる。固体基質は、広く種々の材料から広く種々の形態において作製でき、例えばマイクロタイタープレート、マイクロビーズ、計深棒、樹脂粒子などからである。基質は、信号対ノイズ比を最大化するように、第一に背景結合を最小化するように、また分離の容易さおよびコストについて選択するのが好ましい。
【００３０】
分離は、例えば、マイクロタイタープレートのウェルなどのリザーバからビーズまたは計深棒を取り除き、リザーバを空にするかまたは希釈して、ビーズ、粒子、クロマトグラフィ用カラムもしくはフィルタを洗浄溶液または溶媒ですすぐことにより、有効化することができる。分離ステップは、好ましくは、複数回のすすぎまたは洗浄を含む。例えば、固体基質がマイクロタイタープレートである場合、ウェルを数回洗浄溶液で洗浄し、この洗浄溶液は一般に、特定の結合または相互作用に関与しないインキュベーション混合物の成分を含み、例えば、塩、緩衝液、界面活性剤、非特異的タンパク質などである。固体基質が磁気ビーズの場合、ビーズは１または２回以上、洗浄溶液で洗浄してよく、磁石を用いて分離する。
【００３１】
検出は、任意の便利な方法を用いて有効化してよい。例えばリン酸化は、直接または間接的に、例えばリン酸化基質などの検出可能な産物を生成する。他のアッセイにおいて、成分の１つは通常、検出可能な標識を含むか、またはこれに結合している。広範囲の標識を用いることができ、例えば、直接検出を提供するもの（例えば放射活性、ルミネセンス、蛍光、光学または電子密度等）、または間接的検出を提供するもの（ＦＬＡＧ、Ｖ５もしくはｍｙｃエピトープなどのエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼなどの酵素タグ、転写産物など）である。標識は、基質に、アッセイに用いるタンパク質に、または候補薬剤に、結合してよい。リン酸化基質はまた、ＩＭＡＰ技術（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を用いてアッセイすることができ、これは、金属（ＭＩＩＩ）配位錯体の、リン酸基への、高塩濃度における特異的結合および、蛍光極性読取りを用いるものである。
【００３２】
標識の性質および他のアッセイ成分に応じて、種々の方法を用いて標識を検出することができる。例えば、標識は、固体基質に結合しているものを検出するか、または固体基質から分離した後に検出することができる。標識は、光学または電子密度、放射活性放出、非放射性エネルギー伝達などを介して直接検出してもよく、または、抗体複合体、ストレプトアビジン−ビオチン複合体などを用いて間接的に検出してもよい。標識を検出する方法は、当分野に周知である。
【００３３】
したがって、本発明は、基質のリン酸化を増加させる能力を有する組成物を、直接または間接的に同定するための、自動薬剤スクリーニングアッセイを含む。自動化された方法は、試薬溶液を容器の複数の所定の区画に送達し、所定の区画において検出可能な分子の変化を測定することができる装置内で行うのが好ましい。例示の方法は、以下のステップを含む。第１に、１または２以上の区画を有する分割された容器であって、この区画は基質を含有しており、これをＰａｒ−１ｂに暴露した場合に検出可能な変化を示す、前記容器を提供する。Ｐａｒ−１ｂは、区画の細胞内、溶液内にあるか、または区画内に不動化されていてもよい。次に、１または２以上の所定の区画を、所定位置に整列させ（例えば、自動ピペットの流体出口に揃える）、Ｐａｒ−１ｂキナーゼ活性を低下させる能力について試験する化合物または化合物の混合物を含有する溶液のアリコートを、所定区画（単数または複数）に、自動ピペットで送達する。基質もまた、化合物と共に、または化合物の添加の後に、加えることができる。最後に、基質が放出する検出可能なシグナルを、所定の時間、好ましくは細胞含有区画を検出器と揃えることにより、測定する。好ましくは、シグナルを、化合物を区画に加える前にも測定して、例えば背景および／またはベースライン（対照）値を確立する。競合アッセイについては、化合物を、基質もしくは阻害剤をＰａｒ−１ｂポリペプチド含有区画に加えるのと同時に、またはその後に、加えることができる。当業者は容易に、特定のアッセイ用にアッセイ成分を加える、適切な順序を決定可能である。
【００３４】
反応成分添加後の適切な時点で、プレートを必要に応じて移動させて、アッセイウェルをシグナル測定用に配置する。シグナルの変化は、試験化合物添加後の最初の数秒間に始まる可能性があるため、アッセイウェルをシグナル検出器とできるだけ早く揃えることが望ましく、約２秒以下であるのが望ましい。本発明の好ましい態様においては、装置がウェルの底を通して検出するよう構成されており、化合物をウェルの上から添加する場合には、プレートを試薬添加用に動かす必要がないため、読取りは実質的に連続して行うことができる。ウェルおよび検出装置は、シグナル変化の測定と記録に適切な所定の時間、整列されたまま留められていなければならない。
【００３５】
本発明の装置は、所定の第１ウェル（またはウェルの行または列）でアッセイのステップを開始して、所定の経路でウェル番号ｎまで、順番にプレートの行を渡り列を下って進行するように、プログラム可能である。同じ化合物で処理される複製ウェルからのデータを収集して記録し（例えばコンピュータのメモリ内に保存し）、シグナルを計算するのが好ましい。
【００３６】
迅速に化合物を加えて、迅速に反応を読み取るために、検出器は、自動ピペッターを取り付け、また検出器と自動ピペッターの両方の正確なコンピュータ制御を実現するためのソフトウェアプログラムを開発することにより、改良することができる。蛍光測定器および自動ピペッターの組合せを統合することにより、またマイクロコンピュータを用いて検出器および自動ピペッターへのコマンドを制御することにより、試薬添加と検出器読取りの間の遅延時間を、大幅に減少することができる。さらに、手動による試薬添加と比べて、より高い再現性および高い信号対ノイズ比の両方を実現でき、これは、コンピュータが手順を正確に何度でも繰り返すからである。さらにこの配置は、複数のアッセイを同時に、オペレータの介入なしで行うことを可能とする。このように、自動的な試薬の送達と続く複数シグナルの測定により、アッセイの信頼性と１日に実行可能なアッセイの数が、有利に増加される。
【００３７】
同様のアッセイを用いて、Ｐａｒ−１ｂ活性を増加させる化合物を同定でき、これは、対照として、または疾患の動物モデルの作製に有用であり得る。
本明細書に記載の方法により同定される、Ｐａｒ−１ｂポリペプチド活性（例えばキナーゼ活性）の阻害剤は、Ｐａｒ−１ｂポリペプチド活性の増加または過剰による疾患または状態を処置するのに有用であり、これには、インスリン反応性の損失（またはその減少）を特徴とする疾患（例えば２型糖尿病）および肥満を含む。かかる状態の処置のために、Ｐａｒ−１ｂポリペプチド活性阻害剤の有効量を、対象に投与する。
【００３８】
本明細書において、「対照」とは、所定の値を意味することができ、これは種々の形態をとることができる。これは、単一のカットオフ値、例えば中央値または平均値であってよい。これは、比較群に基いて確立することができ、正常量の循環インスリンを有する群と異常量の循環インスリンを有する群などである。他の比較群は、特定の疾患、状態または症状を有する群と、疾患、状態または症状を有さない群であり、例えば、２型糖尿病と診断された個人と、２型糖尿病のない個人である。比較群の別の例は、状態の家族歴を有する群と、かかる家族歴を有さない群である。所定値は、例えば、試験集団を等分（または非等分）に分けて配置することができ、例えば低リスク群、中リスク群、および高リスク群、または４分割、５分割にすることができる。
【００３９】
所定値は当然、選択された特定の集団に依存する。例えば、明らかに健康な集団は、Ｐａｒ−１ｂ活性の増加に関連する状態を有することが知られている集団、またはインスリン反応性の低下を特徴とする疾患を有することが知られている集団とは、異なる「正常」範囲を有するであろう。したがって、選択される所定値は、個人が属するカテゴリーを考慮することができる。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者により通常の実験の範囲内で、選択可能である。異常とは、選択された対照と比較して、統計的に有意な差を意味する。典型的には、対照は、適切な年齢範囲の、明確に健康で正常な個人に基づく。
【００４０】
いくつかの態様において、対照試料は、Ｐａｒ−１ｂ活性に関連する疾患、インスリン反応性の低下を特徴とする疾患または肥満を有さない、細胞、組織、または対象からのものである。他の態様において、対照試料は、候補剤により処置されない試料である。例えば、候補剤の効果は、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドの触媒活性（例えばキナーゼ活性）を、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドを剤と接触させる前に測定し、次にＰａｒ−１ｂポリペプチドを剤と接触させた後に再度測定することにより、決定することができ、この場合、最初に測定された触媒活性または結合のレベルが、接触後の触媒活性または結合のレベルを比較するための対照レベルとして機能する。かかるアッセイにおいて、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドの給源は、インスリン反応性の低下を特徴とする疾患（例えば２型糖尿病）を有さないことが知られた対象からの生体試料であるか、またはインスリン反応性の低下を特徴とする既知の疾患を有する対象からの細胞または組織からの試料であり、各々の場合、触媒活性の接触前測定は、触媒活性の接触後測定に対する対照となり得る。
【００４１】
対象の生検組織からの生体試料を得るための方法の例は、吸引法、マスの巨視的配分（gross apportioning of mass）、顕微解剖、レーザーベースの顕微解剖、または当分野で知られている他の細胞分離法を含む。液体生体試料は、当分野に周知の標準法を用いて対象から収集される。
【００４２】
組織生検材料における細胞種類の多様性のために、および用いる診断方法の感受性の多様性のために、分析に必要な試料のサイズは、１、１０、５０、１００、２００、３００、５００、１０００、５０００、１０，０００、〜５０，０００、またはそれ以上の細胞である。適切な試料のサイズは、細胞組成および生検の条件に基づき決定することができ、本発明において用いる、この測定と続く試料の断片（例えばポリペプチド、核酸）の単離のための標準の調製ステップは、当業者に周知である。その例として、限定を意図するものではないが、いくつかの場合において、生検からの試料は増幅無しでもＲＮＡ発現の評価に十分であるが、しかし他の場合においては、小さな生検領域内での好適な細胞数の不足は、ＲＮＡ変換および／または増幅法または核酸分子の解像度を増強するための他の方法の使用を必要とする場合もある。限定された生検材料の使用を可能とするかかる方法は当業者に周知であり、これには、限定することなく、直接ＲＮＡ増幅、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ｃＤＮＡの増幅、または放射標識核酸の産生を含む。
【００４３】
Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させる任意の方法が、前述のインスリン反応性の低下を特徴とする疾患（例えば２型糖尿病）の処置において有用である。Ｐａｒ−１ｂ活性は、酵素活性またはタンパク質発現の薬理学的阻害剤により低下可能である。好ましい阻害剤は、Ｐａｒ−１ｂタンパク質に直接結合するものである。
Ｐａｒ−１ｂの発現を低下させる剤（例えば、内因性遺伝子の発現を減少させることにより）もまた、これらの目的に用いることができる。かかる剤は、アンチセンス核酸分子およびＳｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子を含む。本発明にしたがって用いることのできる既知のＰａｒ−１ｂ阻害剤は、ｓｉＲＮＡ配列ＡＡＧ ＡＣＵ ＣＡＡ ＣＵＧ ＡＡＣ ＵＣＣ ＵＣＣ（配列番号１）を含み、これらはＰａｒ−１ｂのコードヌクレオチド２５６〜２７６（参考文献２２参照）、またはTang et al. PNAS. 2006, 103:2087-92において用いられる配列に対応する。
【００４４】
前述の組成物および方法の態様の１セットは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ）を介して遺伝子の発現を減少させる、アンチセンス分子または核酸分子の使用を含む。本発明の方法におけるアンチセンス、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡの使用の１例は、それらの、１または２以上のセラミド生合成経路酵素の発現のレベルを低下させるための使用である。この目的のために用いるアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ核酸分子は、「天然の」デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこれらの任意の組合せから構成されてよい。すなわち、１つの天然のヌクレオチドの５’末端と、他の天然のヌクレオチドの３’末端を、天然の系におけるようにホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して、共有結合することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、当分野で認識された方法により調製することができ、これは、手動により、または自動合成装置により、行うことができる。これらはまた、ベクターにより組換え的に作製することもできる。
【００４５】
本発明のいくつかの態様において、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドはまた、「改変」オリゴヌクレオチドを含んでよい。すなわち、オリゴヌクレオチドは多数の方法により改変でき、改変はこれらがその標的にハイブリダイズすることを妨害しないが、しかしその安定性または標的化を増強し、またはその治療的有効性を別の方法で強化する。
本明細書で用いる用語「改変オリゴヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドであって、ここで（１）少なくとも２つのそのヌクレオチドが、合成ヌクレオシド間結合（すなわち、１つのヌクレオチドの５’末端と他のヌクレオチドの３’末端の間の、ホスホジエステル結合以外の結合）を介して共有結合されているか、および／または（２）通常は核酸と関連しない化学基が、オリゴヌクレオチドに共有結合している、前記オリゴヌクレオチドを言う。好ましい合成ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバミン酸塩、炭酸塩、リン酸トリエステル、アセトアミド、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
【００４６】
用語「改変オリゴヌクレオチド」はまた、共有結合的に修飾された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドも包含する。例えば、改変オリゴヌクレオチドは、３’位におけるヒドロキシル基および５’位におけるリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合している糖骨格を有する、オリゴヌクレオチドを含む。したがって、改変オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含んでよい。さらに、改変オリゴヌクレオチドは、リボースの代わりにアラビノースなどの糖を含んでよい。本発明はしたがって、生理学的条件下において、本発明のタンパク質をコードする核酸分子に相補的であり、これにハイブリダイズすることができる改変アンチセンス分子を、薬学的に許容し得る担体と共に含む医薬製剤を意図する。
【００４７】
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を、遺伝子発現をブロックするために用いることを含む。（Sui, G, et al, Proc Natl. Acad. Sci U.S.A. 99:5515-5520,2002を参照）。ＲＮＡｉ戦略を本発明の態様において適用する方法は、当業者に理解されるであろう。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を用いることによりＰａｒ−１ｂの発現を低下させる方法を用いてもよい。１つの側面において、細胞をｓｉＲＮＡ分子に接触させて、１または２以上の前述の遺伝子の発現を低減させるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を作製する。ｓｉＲＮＡ分子は、関連するポリペプチド（例えば、非翻訳および翻訳領域を含むＲＮＡ転写物）をコードする核酸に対するものである。ウェスタンブロット法などの周知の方法を用いて、タンパク質発現のレベルを決定でき、ノーザンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲを用いて、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物のレベルを決定することができる。
【００４８】
本明細書において、「ｓｉＲＮＡ分子」とは、センスおよびアンチセンス鎖からなる二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、センス鎖に相補的である（Tuschl, T. et al., 1999, Genes & Dev., 13:3191-3197；Elbashir, S.M. et al., 2001, EMBO J., 20:6877-6888；本明細書に参照として組み込まれる）。１つの態様において、アンチセンス鎖の３’末端における最後のヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであってよく、標的遺伝子の領域に相補的である必要はない。ｓｉＲＮＡ分子は好ましくは１９〜２３ヌクレオチド長であり、ヘアピン構造を形成していてもよい。１つの好ましい態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、２つのヌクレオチド３’オーバーハングをセンス鎖に含む。第２の好ましい態様において、２つのヌクレオチドオーバーハングは、チミジン−チミジン（ＴＴ）である。ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子の少なくとも一部に対応する。１つの態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、開始コドンの５０〜１００ヌクレオチド下流から始まるｃＤＮＡ標的遺伝子から選択される領域に対応する。好ましい態様において、ｓｉＲＮＡ分子の第１ヌクレオチドはプリンである。
【００４９】
ｓｉＲＮＡ分子は、プラスミドベースであることができる。好ましい方法において、前述の遺伝子の１つの配列をコードするポリペプチドを、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の周知の技法を用いて増幅する。配列をコードするポリペプチド全体の使用は必要ではない；当分野でよく知られているように、配列をコードするポリペプチドの一部が、ＲＮＡ干渉には十分である。ＰＣＲ断片をベクターに、当業者に周知の決められた技法を用いて挿入する。前述の組合せを、細胞に導入した単一ベクターまたは複数ベクターから発現させることができる。
【００５０】
本発明の１つの側面において、本発明の任意のヌクレオチドコード配列を含む哺乳類ベクターが提供される。哺乳類ベクターは、限定はしないが、ｐＳＵＰＥＲ ＲＮＡｉベクターを含む（(Brummelkamp, T.R. et al., 2002, Science, 296:550-553；本明細書に参照として組み込まれる）。１つの態様において、ヌクレオチドコード配列を、哺乳類ベクターに、制限部位を用いて挿入することができ、これによりステムループ構造を作製する。第２の態様において、哺乳類ベクターは、ポリメラーゼＩＩＩ Ｈ１−ＲＮＡ遺伝子プロモータを含んでよい。ポリメラーゼＩＩＩ Ｈ１−ＲＮＡプロモータは、ポリアデノシン尾部を欠いたＲＮＡ転写物を作製し、５つのチミジン（Ｔ５）の列からなる、よく定義された転写開始および終止シグナルを有する。終止部位での転写物の切断は、第２ウリジンの後に生じ、２つの３’オーバーハングＴまたはＵヌクレオチドを含有する合成ｓｉＲＮＡの末端に似た転写物を産生する。ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、標的遺伝子のｍＲＮＡの対応する領域にハイブリダイズする。
【００５１】
哺乳類細胞におけるｍＲＮＡ発現のための好ましい系は、Brummelkamp et al. （2002, Science, 296:550-553）に記載されているような、ｐＳＵＰＥＲ ＲＮＡｉ系などである。他の例としては、限定はしないが、ｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ、ｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ＋ｇｆｐ、ｐＳＵＰＥＲ．ｐｕｒｏ、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ Ｔ７−ＴＯＰＯリンカー、ｐｃＤＮＡ１．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ、ｐＥＮＴＲ／Ｕ６、ｐＬｅｎｔｉ６−ＧＷ／Ｕ６laminshrna、およびｐＬｅｎｔｉ６／ＢＬＯＣＫ−ｉＴ−ＤＥＳＴを含む。これらのベクターはInvitrogenなどの供給業者から入手可能であり、また当業者はこれを得ることができ、使うことができる。
【００５２】
インスリン反応性の低下から生じる疾患の処置には、限定はしないが、食餌療法および薬物療法を含んでよい。いくつかの態様において、処置は、Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させる薬剤の投与を含んでよい。Ｐａｒ−１ｂ活性の阻害剤を、かかる疾患の処置用に知られている他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、２型糖尿病の処置において、インスリン増感剤、インスリン分泌促進剤、インスリン等の他の治療薬を、Ｐａｒ−１ｂ活性または発現を低下させる治療薬と組み合わせて（同時にまたは順番に）投与することができる。肥満の処置のために、肥満手術を、本発明の化合物または組成物と組み合わせて用いることができる。同様に、他の肥満治療薬、例えばシブトラミン（Meridia；Abbott Laboratories）およびオーリスタット（Xenical；Roche）などを、Ｐａｒ−１ｂ活性または発現を低下させる治療薬と組み合わせて（同時にまたは順番に）投与することができる。
【００５３】
本明細書において、対象は好ましくはヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはげっ歯類である。全ての態様において、ヒト対象が好ましい。いくつかの態様において、対象は、異常に増加したＰａｒ−１ｂ活性（健康な個人と比較して）と関連する疾患であって、インスリン反応性の低下をもたらすか、またはこれから生じる前記疾患、例えばＩＩ型糖尿病を有することが疑われるものである。
異常に増加したＰａｒ−１ｂ活性に関連する疾患、インスリン反応性の低下を特徴とする疾患、または肥満を有するか、またはこれを有することが疑われる対象を同定するための方法は、以下を含むがこれに限定されない：健康診断、対象の病歴の解析、対象の家族歴の解析、血液検査、目視による検査、平均体重評価、および／または体重評価。インスリン反応性の低下を特徴とする疾患を有するか、またはこれを有することが疑われる対象を同定するための診断方法は、医学分野の当業者に周知であるが、Ｐａｒ−１ｂ活性の増加に必ずしも関連する必要はない。
本明細書において、生体試料は組織、細胞、または体液（例えば血液またはリンパ節液）を含むが、これには限定しない。液体試料は、細胞および／または液体を含んでよい。組織および細胞は、対象から得るか、または培養物中で増殖させてもよい（例えば、細胞株から）。本発明のいくつかの態様において、生体試料は対照試料である。
【００５４】
Ｐａｒ−１ｂポリペプチドとして本明細書で同定されたアミノ酸配列、およびそれをコードするヌクレオチド配列は、当業者に知られたGenBankなどのデータベースに寄託された配列である。これらの既知のＰａｒ−１ｂ配列の、医薬スクリーニングアッセイ、薬剤の決定、および例えば２型糖尿病などのインスリン反応性の低下から生じる疾患に対する診断アッセイにおける、本明細書に記載されたような使用は、新規である。Ｐａｒ−１ｂ核酸配列およびポリペプチド配列の相同体、対立遺伝子、オルソログおよび他の変異体もまた、必要に応じて、当業者に知られているように、用いることができる。一般に、相同体、対立遺伝子、および他の変異体は、Ｐａｒ−１ｂ核酸およびポリペプチドの配列に対して、それぞれ一般には少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を、および／または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、いくつかの場合においては、少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を、および／または少なくとも９７％のアミノ酸同一性を有し、および他の場合においては、少なくとも９７％のヌクレオチド同一性を、および／または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有する。相同性は、ＮＣＢＩ（Bethesda, Maryland）により開発された種々の公的に利用可能なソフトウェアツールを用いて計算でき、これは、インターネットを通して、または種々の市場で入手可能なソフトウェアパッケージを用いて入手することができる。例示のツールとしては、国立衛生研究所の全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴシステムを含む。
【００５５】
インスリン反応性の低下が関与する生理学的障害に関連するＰａｒ−１ｂポリペプチドの、本明細書による同定はまた、当業者に、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドの発現を特徴とする疾患、および好ましくはＰａｒ−１ｂポリペプチドの機能的活性の変化を特徴とする疾患を診断することを可能とする。
したがって、本発明はまた、対象におけるＰａｒ−１ｂ活性の増加または過剰に関連する疾患の発症、進行、または後退を、例えば、対象から順次試料を得ること、かかる試料をＰａｒ−１ｂ核酸分子の発現レベル、Ｐａｒ−１ｂポリペプチド分子の発現レベル、および／またはＰａｒ−１ｂポリペプチドの活性レベル（例えば、キナーゼ活性）についてアッセイすることによりモニタリングする方法も含む。対象は、Ｐａｒ−１ｂ活性の増加または過剰に関連する疾患を有することが疑われるものであってよく、またはかかる疾患を有さないと考えられるものであってよく、後者の場合は、試料の発現または活性レベルは、続く試料との比較用の対照として機能することができる。
【００５６】
状態の発症は、対象における状態に関連する変化の開始である。かかる変化は、生理学的症状により実証されてもよく、または臨床的には無症状であってもよい。例えば、Ｐａｒ−１ｂ活性の増加または過剰に関連する疾患の発症に続いて、対象において生理学的変化が生じる期間があり、この間、臨床的症状は明らかではないこともある。状態の進行が発症に続き、これは、状態の生理学的要素の進行であり、これは、臨床的症状の増大を特徴としてもしなくてもよい。発症および進行は、両者ともに細胞または対象における疾患の特徴の増加を示す点において類似であり（例えば、Ｐａｒ−１ｂ分子の発現または活性）、発症はこの疾患の開始を表わし、進行は既に存在する状態の悪化を表わす。発症および進行とは対照的に、状態の後退は、状態の生理学的特徴における低減であり、おそらく、症状における低減と平行しており、処置から生じるか、または状態における自然の逆転である場合もある。
【００５７】
Ｐａｒ−１ｂ活性の増加または過剰に関連する疾患のマーカーは、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドの触媒活性のレベルまたは量、Ｐａｒ−１ｂ基質の特定のリン酸化のレベルまたは量、またはＰａｒ−１ｂ核酸またはポリペプチドの発現レベルである。
本発明はまた、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドまたはかかるポリペプチドの基質に結合する、ポリペプチドなどの剤の使用も含む。かかる結合剤は、例えば、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドまたはその基質の有無を検出するためのスクリーニングアッセイにおいて、および、Ｐａｒ−１ｂ、その基質またはＰａｒ−１ｂポリペプチドとそれらの基質の複合体を単離する精製プロトコルにおいて、用いることができる。
【００５８】
したがって、本発明は、ペプチド結合剤であってよく、例えば、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドまたはその基質に選択的に結合する能力を有する抗体または抗体断片であってよい。抗体は、従来方法にしたがって調製されるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。本明細書において、Ｐａｒ−１ｂ抗体は、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドに特異的に結合する抗体である。
【００５９】
重要なのは、当分野でよく知られているように、抗体分子の小さな部分であるパラトープのみが、抗体のそのエピトープへの結合に関与することである（一般に、Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York；Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照）。例えばｐＦｃ’およびＦｃ領域は相補的カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断された抗体、またはｐＦｃ’領域なしで作製された抗体は、Ｆ（ａｂ’）２断片と呼ばれるが、無傷の抗体分子の両方の抗原結合部位を保持している。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断された抗体、またはＦｃ領域なしで作製された抗体は、Ｆａｂ断片と呼ばれるが、無傷の抗体分子の１つの抗原結合部位を保持している。さらに、Ｆａｂ断片は、共有結合抗体軽鎖と、Ｆｄと呼ばれる抗体重鎖の一部からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主要な決定基であり（１つのＦｄ断片は、抗体特異性を変化させることなく、１０個までの異なる軽鎖と結合することができる）、およびＦｄ断片は単離されてエピトープ結合能力を保持している。
【００６０】
抗体の抗原結合部分内には、当分野で知られているように、抗原のエピトープと直接相互作用する相補的決定領域（ＣＤＲ）および、パラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）がある（一般的に、Clark, 1986; Roitt, 1991参照）。Ｆｄ断片の重鎖およびＩｇＧ免疫グロブリンの軽鎖の両方において、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）があり、これらはそれぞれ、３つの相補的決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）により分離されている。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域は、およびより特定的には重鎖ＣＤＲ３は、抗体特異性に大きく関与している。
【００６１】
当分野において現在確立されているように、哺乳類抗体の非ＣＤＲ領域を、同種または異種の抗体の類似の領域で置き換え、同時に元の抗体のエピトープ特異性を保持することができる。これは「ヒト化」抗体の開発および使用において最も明白に示され、ヒト化抗体においては、非ヒトＣＤＲをヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合して、機能抗体が作製される。例えば、米国特許4,816,567、5,225,539、5,585,089、5,693,762および5,859,205を参照のこと。
完全なヒトモノクローナル抗体もまた、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の座の大部分について遺伝子導入されたマウスを免疫化することにより作製できる。これらマウス（例えば、XenoMouse (Abgenix)、HuMAbマウス(Medarex/GenPharm)）の免疫化に続き、モノクローナル抗体を、標準のハイブリドーマ技術にしたがって調製可能である。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、したがってヒトに投与された場合に、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を引き起こさない。
【００６２】
したがって、当業者に明らかであるように、本発明はまた、以下を提供する：Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄ断片；Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域を、相同なヒトまたは非ヒト配列で置き換えた、キメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域を、相同なヒトまたは非ヒト配列で置き換えた、キメラＦ（ａｂ’）２断片抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域を、相同なヒトまたは非ヒト配列で置き換えた、キメラＦａｂ断片抗体；およびＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域を、相同なヒトまたは非ヒト配列で置き換えた、キメラＦｄ断片抗体。本発明はまた、いわゆる単鎖抗体も含む。
【００６３】
したがって、本発明は、多くのサイズおよび種類のポリペプチドであって、特異的にＰａｒ−１ｂポリペプチド、その基質ならびにＰａｒ−１ｂポリペプチドおよびその基質両方の複合体に結合するものを含む。これらのポリペプチドは、抗体技術以外の給源に由来してもよい。例えば、かかるポリペプチド結合剤は、溶液中に、不動化形態で、またはファージ提示ライブラリとして容易に調製できる、変性ペプチドライブラリにより提供可能である。組合せライブラリもまた、１または２以上のアミノ酸を含有するペプチドから合成可能である。ライブラリはさらに、ペプチドおよび非ペプチド合成部分から合成可能である。
【００６４】
ファージ提示は、本発明により有用な結合ペプチドの同定に特に有効である。簡潔に述べると、ファージライブラリを調製し（例えばｍ１３、ｆｄ、またはλファージを用いて）、従来の手順を用いて、４〜約８０個のアミノ酸残基のインサートを提示する。インサートは、例えば、完全な変性またはバイアスアレイを提示することができる。次に、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドに結合する、ファージを有するインサートを選択することができる。このプロセスを、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドに結合するファージの再選択の数サイクルを通して、繰り返すことができる。繰り返しのラウンドにより、特定配列を有するファージの富化がもたらされる。ＤＮＡ配列解析を行って、発現されたポリペプチドの配列を同定することができる。Ｐａｒ−１ｂポリペプチドに結合する配列の、最小の直線部分を決定することができる。最小直線部分の一部または全てに、その上流または下流にある１または２以上の追加の変性残基を含有するインサートを含むバイアスライブラリを用いて、この手順を繰り返すことができる。酵母の２ハイブリッドスクリーニング法を用いて、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドに結合するポリペプチドを同定してもよい。
【００６５】
本発明はまた、部分的に、異常に増加したＰａｒ−１ｂ活性と関連する疾患の処置の方法に関し、この疾患は、例えば２型糖尿病などのインスリン反応性の低下および肥満を含む。薬物療法の「有効量」とは、Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させるか、あるいは、それのみでかまたは他の用量と共に所望の反応を生成する、例えば２型糖尿病、またはインスリン反応性の低下に関連する他の疾患、または肥満の症状を軽減する、剤の量である。
【００６６】
特定の疾患または状態を処置する場合、望ましい反応は、該疾患または状態の進行の抑制である。これには、疾患の進行を一時的に遅くすることのみを含み、ただしより好ましくは、疾患の進行を永久に停止することを含む。これは、任意の特定の疾患について、当業者に知られている日常の診断法によりモニタリングすることができる。疾患または状態の処置に対する所望の反応はまた、疾患または状態の発症を遅延させるか、またはこれを防ぐこと、または疾患の生理学的効果を逆転させることであり得る。
【００６７】
かかる量は、当然ながら、処置する特定の状態、状態の重篤度、個々の患者のパラメータであって年齢、健康状態、サイズおよび体重等、処置の期間、併用される治療の特質（存在する場合）、投与の特定の経路などに依存し、これらの因子は医療関係者の知識および専門技術の範囲内である。これらの因子は当業者に周知であり、日常的な実験内で対処することができる。一般に、Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させる剤の最大用量（それのみで、または他の治療剤と組み合わせて）を用いるのが好ましく、健全な医学的判断による最大安全用量である。しかし当業者は、患者が医学的理由、精神的理由または実質的に任意の他の理由により、より低い用量または耐容用量を主張してよいことを理解する。
【００６８】
前述の方法で用いる医薬組成物は、好ましくは無菌であり、所望の反応を生成するためにＰａｒ−１ｂ活性を低下させる剤の有効量を、患者への投与の好適な単位重量または容量内に含有する。
患者に投与してＰａｒ−１ｂ活性を低下させる剤の用量は、異なるパラメータに応じて選択することができ、特に、用いる投与の方法および患者の状態に応じて選択できる。他の要因としては、処置の所望の期間を含む。対象における応答が、適用された最初の用量では不十分な場合には、より高い用量（または、より局所的な異なる送達経路による、より有効な高い用量）を、患者の耐容性が許す範囲で用いてもよい。
【００６９】
種々の投与方法が当業者に知られており、これらは、Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させる剤を、所望の組織、細胞または体液に効果的に送達する。投与は、局所的、静脈内、経口、腔内、髄腔内、滑液嚢内、口腔内、舌下、鼻腔内、経皮、硝子体内、皮下、筋肉内、および皮内投与を含む。本発明は、本明細書に記載の特定の投与方法に限定されない。当分野の標準の参考文献（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990）は、投与方法および医薬担体中の種々の医薬調製物および製剤を送達するための処方を提供する。Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させる剤の投与に有用な他のプロトコルは、当業者に知られており、そこでは、用量、投与のスケジュール、投与部位、投与方法（例えば器官内）などは、本明細書に示されているものと異なる。
【００７０】
ヒト以外の哺乳類への、Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させる剤の投与、例えば、試験目的または獣医学の治療目的については、上述と実質的に同じ条件下で行う。当業者には、本発明は、Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させる剤により処置できる、ヒトおよび動物の疾患の両方に適用可能であることが理解される。したがって本発明は、畜産および獣医学およびヒトの治療において用いることを意図する。
【００７１】
一般に、Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させる剤の治療有効量は、典型的には、約０．０１ｎｇ／ｋｇ〜約１０００μｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｎｇ／ｋｇ〜約２００μｇ／ｋｇ、および最も好ましくは約０．２ｎｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇの範囲で、毎日１または２以上の用量の投与を、１日または２日以上続ける。これより少ないかまたは多い量も、治療的に有効であることが見出され可能性があり、本発明により有用である。疾患の処置のために、Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させる剤の用量は、Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させる剤の０．２ｍｇ〜５０００ｍｇの範囲の用量で製剤化し、投与されるのが好ましい。より好ましくは、有効量は、当分野の任意の標準法にしたがって、Ｐａｒ−１ｂ活性を上昇させる剤の０．５ｍｇ〜５００ｍｇの範囲である。Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させる組成物の剤のヒト以外の哺乳類への、例えば試験目的または獣医学の治療目的での投与は、上述と実質的に同じ条件下で行う。
【００７２】
本発明の医薬製剤は、それのみで、またはＰａｒ−１ｂ活性の変化に関連する疾患のための、例えば２型糖尿病またはインスリン反応性の低下（すなわち、これの低下または完全な消滅）、および肥満のための、標準の１または２以上の処置と組み合わせて投与してよい。例えば、本発明の薬剤による２型糖尿病の処置は、当分野に知られ実施されている糖尿病の処置と平行して行ってよい。例えば、かかる処置は、メトホルミン、ピオグリタゾン、および／またはロシグリタゾンの投与を含むが、これに限定しない。２型糖尿病に対する他の既知の処置は、インスリン放出を増加する薬剤を含み、これには、スルホニル尿素、ナテグリニドおよびレパグリニドを含んでよいが、これに限定しない。いくつかの処置法において、スルホニル尿素は、グリベンクラミド（グリブリド）、グリクラジドおよびグリメピリドを含むが、これに限定しない。本発明のいくつかの態様において、インスリンを、本発明の処置法と組み合わせて投与してもよい。
【００７３】
投与された場合、本発明の医薬製剤は、薬学的に許容し得る量で、薬学的に許容し得る組成物において適用する。用語「薬学的に許容し得る」とは、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性物質を意味する。かかる製剤は、通常、塩類、緩衝液、保存剤、適合性の担体、および任意に他の治療剤を含む。医薬において用いる場合、塩類は薬学的に許容し得るものであるべきで、ただし非薬学的に許容し得る塩類も、これら薬学的に許容し得る塩類を調製するために便利に用いてよく、本発明の範囲から除外されない。かかる薬理学的および薬学的に許容し得る塩類としては、以下の酸から調製されるものを含むが、これに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、薬学的に許容し得る塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩として、例えばナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として調製してもよい。組成物の好ましい成分は、本発明のＰａｒ−１ｂ活性を低下させる剤の説明と関連して上述されている。
【００７４】
Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させる剤は、必要に応じて、薬学的に許容し得る担体と組み合わせてもよい。本明細書で用いる用語「薬学的に許容し得る担体」とは、ヒトへの投与に好適な、１または２以上の適合性の固体または液体増量剤、希釈剤または封入物質を意味する。用語「担体」とは、有機または無機の成分であって、天然または合成の、活性成分と組み合わされて適用を促進するものを指す。医薬組成物の成分はまた、所望の薬学的有効性を実質的に損なう相互作用がないような様式において、Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させる剤と、およびお互いに、共に混ぜ合わされることができる。
医薬組成物は、上述のように好適な緩衝剤を含有してよく、以下を含む：酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、グリシン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、水酸化物（および他の塩基）および前述の化合物の薬学的に許容し得る塩類。
【００７５】
医薬組成物はまた、任意に、好適な保存剤、例えば塩化ベンズアルコニウム；クロロブタノール；パラベンおよびチメロサールなどを含んでもよい。
医薬組成物は、単一用量形態において便利に提供されてよく、薬学の分野で周知の任意の方法により調製されてよい。全ての方法は、活性成分を、１または２以上の補助的成分を構成する担体と関連させるステップを含む。一般に組成物は、活性化合物を液体担体、微細に分割された固体担体、またはこれらの両方と均一かつ緊密に関連させ、次に必要に応じて製品に形成することにより、製造される。
【００７６】
経口投与に好適な組成物は、分割された単位、例えば、各々が活性化合物の所定量を含有するカプセル、錠剤、ロゼンジなどとして提供してよい。他の組成物としては、水性液体または非水性液体中の懸濁液、例えばシロップ、エリキシル剤または乳濁液を含む。
非経口投与に好適な組成物は、Ｐａｒ−１ｂ活性を低下させる剤を便利に含有する。この製剤は、既知の方法により、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて製剤化されてよい。無菌の注射製剤も、非毒性の非経口的に許容し得る希釈剤または溶媒などにおける、無菌の注射溶液または懸濁液であってよく、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液とされる。用いることのできる許容し得るビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー溶液、および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として便利に用いられる。この目的に対して、任意の無刺激性固定油を用いてよく、合成のモノ−またはジ−グリセリドを含む。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射物の調製に用いてもよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に好適な担体処方は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PAに見出すことができる。
【００７７】
長期の持続性放出移植片もまた、薬剤組成物の投与に用いてよい。本明細書において「長期」放出とは、移植片が治療レベルの活性成分を少なくとも３０日間、好ましくは６０日間送達するよう、構成および配置されていることを意味する。長期の持続性放出移植片は当業者に周知であり、上記の放出システムのいくつかを含む。かかる移植片は、Ｐａｒ−１ｂ活性を特徴とする状態の処置において、該移植片をかかる活性に影響を受ける部分の近くに配置し、それにより本発明の化合物の局所的な高用量を有効にすることにより、特に有用であり得る。
【００７８】
本発明はまた、試験化合物がＰａｒ−１ｂポリペプチド活性を低下させるかどうかを決定するための、Ｐａｒ−１ｂポリペプチドの活性レベル（例えばキナーゼ活性）を測定するためのキットを含む。本発明のかかるキットの１例は、本発明のＰａｒ−１ｂポリペプチドの活性レベルを、キナーゼアッセイを用いて決定するのに必要な成分を提供するキットである。前記成分は、適切な基質分子および必要な補足因子および他の成分（例えば緩衝液、放射活性分子）を含むことができる。
本発明のキットの他の例は、本発明のＰａｒ−１ｂ核酸分子の発現レベルを決定するのに必要な成分を提供するキットである。かかる成分は、Ｐａｒ−１ｂ核酸分子の増幅に有用なプライマー、および／またはＰＣＲ増幅のための他の化学物質を含むことができる。
前述のキットは、キットを、診断目的または化合物スクリーニングの目的のために、キットの種々の成分をどのようにして用いるかについての、指示書または他の印刷物を含むことができる。
【００７９】
例
緒言
Ｐａｒ−１ｂ／ＭＡＲＫ２／Ｅｍｋ遺伝子産物は、細胞極性の生成および／または維持を含む多数の細胞過程の調節に関与する。もともと線虫（Caenorhabdhitis elegans）において初期胚性極性の重要なプレーヤーとして同定されたＰａｒ−１は、酵母、ショウジョウバエ、アフリカツメガエルおよびいくつかの哺乳類細胞型（１〜１３）における細胞極性を調節することが見出されている。Ｐａｒ−１は、Ｗｎｔシグナル経路である、微小管安定性の調節物質であり、また小胞性輸送（vesicular trafficking）（２、８、１２、１４〜１９）において役割を果たす。２つの重要な調節物質であるＰａｒ−１、ＬＫＢ１（Ｐａｒ−４）および異型ＰＫＣζ／λ（ａＰＫＣ）は、複数の系において同定された。ＬＫＢ１は、Ｐａｒ−１のキナーゼドメインの活性化ループＴｈｒ残基のリン酸化を触媒し、一方ａＰＫＣは、Ｐａｒ−１キナーゼの「スペーサー」ドメイン（２０〜２２）の保存Ｔｈｒ残基をリン酸化する。ＬＫＢ１により触媒されたリン酸化の活性化とは対照的に、ａＰＫＣは、Ｐａｒ−１の局在化および活性を負に調節する（２２〜２５）。
【００８０】
哺乳類において、４つのＰａｒ−１ファミリーのメンバーが存在し（Ｐａｒ−１ｂ／ＭＡＲＫ２／Ｅｍｋ、Ｐａｒ−１ａ／Ｃ−ＴＡＫ１／ＭＡＲＫ３、Ｐａｒ−１ｃ／ＭＡＲＫ１、Ｐａｒ−１ｄ／ＭＡＲＫ４／ＭＡＲＫＬ１）、それぞれが異なる遺伝子によりコードされ、それぞれが複数組織で選択的に発現される（２６〜２９）。これらの遺伝子の１つ、Ｐａｒ−１ｂ／ＭＡＲＫ２／Ｅｍｋがヌルであるマウスの発生と特徴付けについての２つの研究が発表された（３０、３１）。Bessone et al.（３０）は、成長および受精能の障害を明らかにし、一方我々は以前に、免疫系の恒常性（ホメオスタシス）におけるＰａｒ−１ｂの役割を報告した（Hurov et al., 2001）。ここで、我々はＰａｒ−１ｂヌルマウスが、多数の特筆すべき代謝疾患を示すことを実証する。これらは、過脂肪の減少、低インスリン血症、インスリン過感受性、高脂肪食誘発性の体重増加への抵抗性、および白色および褐色脂肪組織への糖取込みの増加を含む。これらの所見は、ブドウ糖恒常性とエネルギーバランスの両方の調節における、Ｐａｒ−１ｂの新規な役割を明らかにし、このキナーゼが、２型糖尿病および肥満の処置に対する有用な標的となり得ることを示唆する。
【００８１】
結果
Ｐａｒ−１ｂヌルマウスは、体重減少および過脂肪の減少を有する
Ｐａｒ−１ｂキナーゼヌルマウス（Ｐａｒ−１ｂ−／−）の作製については前に記載した（３１）。Ｐａｒ−１ｂ−／−マウス（雄および雌）は、胎児期および出生後の成長の両方の間、その野生型同腹子より〜２０％軽い（１１８±１２ｍｇ対１５０±１６ｍｇ、交尾後１３．５日、ｐ＜０．００５）（図１Ａ〜Ｃ）。Ｐａｒ−１ｂヘテロ接合体（Ｐａｒ−１ｂ＋／−）も、１歳齢において統計的に有意な体重減少を示す。１歳齢における鼻から肛門までの長さは、ヌルの雄（Ｐａｒ−１ｂ−／−９．３５ｃｍ±０．５７対Ｐａｒ−ｂ＋／＋１０．１０ｃｍ±０．４２、ｐ＝０．０４）および、雌（Ｐａｒ−１ｂ−／−９．０８±０．３５対Ｐａｒ−１ｂ＋／＋９．７５±０．３２、ｐ＝０．０１）において有意に減少していた（〜８％）。
【００８２】
Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスはＩＧＦ−１血清濃度の低下を有することが報告されている（３０）。出生前および出生後両方の成長遅延がＩＦＧ−１の欠乏から生じ得るため、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスおよび野生型マウスの７週齢におけるＩＧＦ−１濃度を測定した。Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスは、７週齢において、低下したＩＧＦ−１血清濃度（野生に比べてＰａｒ−１ｂ−／−において〜２５％の低下）を有した（Ｐａｒ−１ｂ−／−５３５．５ｎｇ／ｍｌ対Ｐａｒ−１ｂ＋／＋６８２．０ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０１５）。出生後に、ＩＧＦ−１転写は主に成長ホルモンにより駆動される。そこで我々は、血清の成長ホルモン濃度を７週齢において定量化したが（遺伝子型当たりｎ＝１０マウス）、単一時点での測定においては有意な差を見出さなかった（Ｐａｒ−１ｂ−／−９３．５±１１７ｎｇ／ｍｌ対Ｐａｒ−１ｂ＋／＋５６．２±１１１ｎｇ／ｍｌの、ｐ＝０．４６４）。このデータは、成長ホルモンは拍動性の様式で放出され、単一時点での測定は１日平均の成長ホルモン濃度の特に正確な読取り値ではない可能性があるという警告と共に、考慮すべきである。
【００８３】
前に報告されているように（３０）、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスの器官の重量の測定は、器官の重量の減少が体重の減少と整合していることを示す（データ示されず）。しかし、陽子磁気共鳴分光学（１Ｈ−ＭＲＳ）および脂肪組織の解剖により、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスは、野生型マウスと比べて脂肪重量の不均等な減少（Ｐａｒ−１ｂ−／−において２．４７ｇ対Ｐａｒ−１ｂ＋／＋において６．８５ｇ、副睾丸脂肪パッド、ｐ＜０．０００１）を１２週齢時点で有することを示した（図１Ｄ）。同様に、肩甲骨内蓄積所からの褐色脂肪組織の定量化は、Ｐａｒ−１ｂ−／−において０．１７±０．０５ｇ対Ｐａｒ−１ｂ＋／＋において０．４４±０．１４ｇ、ｎ＝１０マウス／遺伝子型、ｐ＜０．０００１を示す。脂肪重量の減少は、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスにおける〜１４％の体脂肪対、野生型同腹子における〜２３％の体脂肪に対応する（ｐ＜０．０００１）（図１Ｅ）。脂肪組織の組織学的分析は、脂肪細胞のサイズ（白色および褐色脂肪組織、ＷＡＴおよびＢＡＴ）は、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスおよび野生型マウスにおいて類似していることを示す（図１Ｆ）。白色脂肪組織の複数の独立試料からの、脂肪細胞数の計測は、Ｐａｒ−１ｂ野生型およびヌルＷＡＴからの視野毎の脂肪細胞数に、差がないことを示す（Ｐａｒ−１ｂ＋／＋において７２．４±３．７脂肪細胞対Ｐａｒ−１ｂ−／−において７２．２±２．２、それぞれｎ＝５および９、ｐ＝０．９６）。したがって、観察されたＰａｒ−１ｂ−／−マウスの過脂肪の減少は、全脂肪細胞数の減少のためであり、細胞の大きさによるものではない。
【００８４】
Ｐａｒ−１ｂヌルマウスは食餌誘発性肥満に抵抗性であり、代謝亢進状態である。
Ｐａｒ−１ｂヌルマウスは不均等にやせているとの所見に基づき、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスが、高脂肪食を与えられた場合に体重増加に抵抗性であるかどうかを決定することを試みた。Ｐａｒ−１ｂヌルマウスおよび野生型マウスを、高脂肪食（カロリー含量で４２％脂肪）に１６週間供し、体重変化および食物摂取についてモニタリングした。Ｐａｒ−１ｂ−／−雄マウスは、野生型対照と比べて体重増加に抵抗性であった（２０週目においてＰａｒ−１ｂ−／−２１．３７ｇ対Ｐａｒ−１ｂ＋／＋３８．２５ｇ、ｐ＝０．００５、図２Ａ）。雌のＰａｒ−１ｂヌルマウスは、高脂肪食誘発性の体重増加に対して抵抗性を示さないが（データ示されず）、ただし雌Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスも、雄のＰａｒ−１ｂ−／−マウス同様、通常の固形飼料でやせていた（データ示されず）。インスリン、レプチン、アディポネクチン、遊離脂肪酸、トリグリセリド、およびコレステロールの血清濃度を測定し、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスが高脂肪食誘発性の体重増加に抵抗性である潜在的メカニズムを明らかすることを試みた（表１）。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
脂肪細胞分泌ホルモンであるレプチンは、摂食反応を低下させ、インスリン反応性およびエネルギー消費を増加させることが知られている（３２）。Ｐａｒ−１ｂヌルマウスは、高脂肪食を与えた後に、野生型マウスに比べて５倍低いレプチンの濃度を示す（Ｐａｒ−１ｂ−／−６．９４ｎｇ／ｍｌ対Ｐａｒ−１ｂ＋／＋３４．７５ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０１２）。レプチン濃度のこの低下は、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスにおける過脂肪の減少と整合する。血清インスリン濃度の５倍の低下が観察され（Ｐａｒ−１ｂ−／−０．７５ｎｇ／ｍｌ対Ｐａｒ−１ｂ＋／＋３．８０ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０５７）、一方で、トリグリセリド濃度（Ｐａｒ−１ｂ−／−７６．５０ｍｇ／ｄｌ対Ｐａｒ−１ｂ＋／＋１１７．８０ｍｇ／ｄｌ、ｐ＝０．０５７）およびコレステロール濃度（Ｐａｒ−１ｂ−／−１４１．６ｍｇ／ｄｌ対Ｐａｒ−１ｂ＋／＋２０６．６ｍｇ／ｄｌ、ｐ＝０．０１９）も、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスにおいて低かった。レプチンとは異なり、アディポネクチンの濃度は、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスにおいて統計的に有意には異なっておらず、しかしＰａｒ−１ｂヌルマウスのアディポネクチンの濃度は低い傾向がみられた（Ｐａｒ−１ｂ−／−１２．８９ｕｇ／ｍｌ対Ｐａｒ−１ｂ＋／＋１７．３８ｕｇ／ｍｌ、ｐ＝０．４４７）。高齢のマウス（６月齢の雄、通常の固形飼料）の組織学的分析もまた、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスは、野生型同腹子において観察される肝臓狭窄症の発症に、抵抗性であることを示す（図５）。Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスにおける肝臓脂肪蓄積のこの欠如は、それらの、高脂肪食誘発性肥満への抵抗性および白色および褐色脂肪蓄積物の減少と整合している。
【００８７】
過脂肪の減少および体重増加への抵抗性は、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスが代謝率およびエネルギー消費において変化を示す可能性を示唆した。高脂肪食を与えた雄マウスの１日の総エネルギー消費量（ＥＥ）、総代謝率（ＭＲ）および呼吸商（ＲＱ）を測定した。Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスは、野生型同腹子より、高いＭＲ（７％増加）、１日のＥＥ（２７％増加）、および食物摂取（２倍の増加）を示す（図２Ｂ〜Ｅ）。Ｐａｒ−１ｂヌルマウスの呼吸商（ＲＱ＝ＶＣＯ２／ＶＯ２）は、野生型マウスのそれと異なっておらず、これらのマウスが代謝亢進状態であるにも関わらず、これらは食物エネルギーとして炭水化物および脂肪を同じ割合で用いることを示唆する（図２Ｅ）。Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスは、野生型マウスよりも有意に活動的でも非活動的でもない（Ｐａｒ−１ｂ＋／＋８９．５±３０．０対Ｐａｒ−１ｂ−／−８３．５±２０．７の活性カウント）。Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスの体温は、野生型同腹子のそれよりわずかに高く、ただし、この差は統計的に有意ではない（Ｐａｒ−１ｂ＋／＋９６．４℃対Ｐａｒ−１ｂ−／−９６．９℃、ｎ＝１０マウス／遺伝子型）。
【００８８】
Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスの脂肪組織におけるインスリン感受性およびブドウ糖摂取の増強。
Ｐａｒ−１ｂヌルマウスはやせており、代謝亢進性であり、高脂肪食を与えられると血清インスリン濃度の低下を有するため、これらのマウスは、インスリンに対する感受性が増強されているとの仮説をたてた。高脂肪食を与えられたマウスにおける測定値と整合し（表１）、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスの血清インスリン濃度は、標準の固定食餌を与えられたかまたは絶食条件下の野生型の同腹子より、有意に低かった（図３Ａ）。低インスリン血症であるにも関わらず、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスは絶食条件下で正常血糖性であり、給餌条件下で軽度に低血糖症であった（図３Ｂ）。インスリン抵抗性試験により、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスは、実際にそれらの野生型同腹子よりインスリンに対して感受性が高いことが示された（図３Ｃ）。Ｐａｒ−１ｂヌルマウスはまた、ブドウ糖負荷試験により評価されたように、増強された耐糖能を示し（図３Ｄ）、膵β細胞の機能が、外在的に供給されたブドウ糖ボーラスに対処するのに十分であることを示す。Ｐａｒ−１ｂヌルマウスにおけるインスリン感受性をさらに解析するために、高インスリン−正常血糖クランプ試験を記載のようにして行った（３３）。
【００８９】
インスリンの定常的注入（２．５ｍＵ／ｋｇ／分）の存在のもとで、正常血糖を維持するのに必要なブドウ糖注入速度は、野生型同腹子よりＰａｒ−１ｂヌルマウスにおいて３５％高かった（Ｐ＝０．０２８４）（表２）。したがって、インスリン刺激性の全身でのブドウ糖ターンオーバーは、ＷＴマウスに比べてＰａｒ−１ｂヌルマウスにおいて増加した（Ｐ＝０．０３６４）。これらの実験は、ＩＴＴ解析（図３Ｃ）を確認し、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスは増強された末梢インスリン感受性を示すことを示唆する。基底およびクランプ肝臓ブドウ糖産生は、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスにおいて大幅には異なっていなかった。インスリンのクランプは両群のマウスの肝臓ブドウ糖産生を完全に抑制したため、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスにおける、低用量のインスリンクランプの肝臓ブドウ糖産生への影響の可能性は、除外できない。
【００９０】
【表２】
2010521157.tif 000005
【００９１】
インスリン感受性の観察された増加に役割を果たす、１または２以上の組織を同定するために、高インスリン−正常血糖クランプ実験の間のインスリン反応性組織への糖取込みを定量化した。副睾丸白色脂肪組織でのインスリン刺激性の糖取込みは、約４倍増加した（Ｐａｒ−１ｂ−／−において６６±２１ｎｍｏｌ／ｇ／分対Ｐａｒ−１ｂ＋／＋において１７±２ｎｍｏｌ／ｇ／分、Ｐ＝０．０３１２）。（図６Ａ）。褐色脂肪での取込みの増加傾向も観察された（図６Ｂ）。対照的に、骨格筋（腓腹筋）におけるインスリン刺激性糖取込みは、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスとＷＴマウスの間で有意な差はなかった（図６Ｃ）。
【００９２】
高インスリン−正常血糖クランプアプローチの、２−１４Ｃデオキシグルコース取込み決定のための使用は、野生型マウスと比べた、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスのＷＡＴでの取込みの劇的な増加を示したが、ＢＡＴへは取込みの増加傾向のみであった。試験された全マウスでの、ＢＡＴでの糖取込みレベルは、クランプ実験中、ＷＡＴおよび骨格筋の両方に比べて高かったため、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスでのＢＡＴ取込みでの少量の増加は、インスリン感受性への大きな寄与を生む可能性があると推論した。そのため、雄マウスにおけるＢＡＴ取込みを代替的方法を用いて評価し、クランプ実験中のＰａｒ−１ｂヌルマウスのＢＡＴでの糖取込みの増加傾向を、確認するか、または否定するかした。図４に示すように、１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）のｍｉｃｒｏＰＥＴ解析により、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスの肩甲骨内褐色組織（ＢＡＴ）での、野生型マウスと比べて顕著に増加した取込みを明らかにした。Ｐａｒ−１ｂヌルＢＡＴへの糖取込みの定量化により、絶食および非絶食条件下における野生型マウスに比べて、統計的に有意な２倍の増加を示した（ＡＮＯＶＡのｐ値＜＜０．０００１）（図７）。このＰａｒ−１ｂヌルマウスのＢＡＴへの糖取込みの増加は、脂肪組織がこれらのマウスにおける糖代謝の変化において重要な役割を果たすことの、さらなる証拠を提供した。
【００９３】
さらに、ｍｉｃｒｏＰＥＴ画像化で観察された差は、急性のインスリンチャレンジ不在において観察されたものであり、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスのＢＡＴにおいて、糖取込みの構造的な増加が存在することを示す。ＷＡＴは、非侵襲的ｍｉｃｒｏＰＥＴ画像化では解析できず、特にやせたＰａｒ−１ｂヌルマウスでは不可能であるため、ＷＡＴはこれらの解析には含めなかった。ＡＮＯＶＡ（ｐ＝０．０１）により、Ｐａｒ−１ｂヌルマウス全体で骨格筋での糖取込みに統計的に有意な増加がみられた。しかし、高インスリン−正常血糖クランプ実験と整合して、これは、急性のインスリンチャレンジの不在または存在下の両方での個別の条件内で、統計的な有意性には達しなかった（ｐ≧０．１）。対照的に、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスの脳および心臓組織は、ｍｉｃｒｏＰＥＴにより、基底糖取込みの全体的な減少を示した（ＡＮＯＶＡのｐ値；それぞれ０．０３および０．００５）。脳において、これはインスリンチャレンジまたは絶食とは独立していた。絶食時の心臓において、糖取込みは野生型およびＰａｒ−１ｂヌルマウスの両方で、非絶食時の心臓より低く、これは、脂肪酸代謝への変換と整合している。Ｐａｒ−１ｂヌル心臓組織は、インスリンに非反応性であるように見え、したがって、対照と比較したＰａｒ−１ｂヌル心臓組織での糖取込みは、急性インスリンチャレンジにより増強され、統計的有意性に到達した（ｐ＝０．０５）。
【００９４】
Ｐａｒ−１ｂヌル脂肪細胞におけるタンパク質発現およびインスリンシグナル伝達の解析。
Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスにおける脂肪細胞媒介性糖取込みの、観察された増加は、いくつかの可能性のあるメカニズムにより説明できる可能性がある（考察参照）。我々は、インスリン感受性組織におけるＰａｒ−１ｂ発現を、内因性Ｐａｒ−１ｂプロモータ（図８）が駆動するβ−ガラクトシダーゼリポーターおよびウェスタンブロット解析を用いて評価した（データ示さず）。Ｐａｒ−１ｂは、ＢＡＴ、ＷＡＴおよび肝臓において高度に発現され、骨格筋においては顕著な発現はみられない。この発現パターンに基づくと、Ｐａｒ−１ｂは糖取込みを、脂肪細胞自律的メカニズムを介して調節するようである。Ｐａｒ−１ｂ−／−およびＰａｒ−１ｂ＋／＋マウスの脂肪組織からのいくつかの代謝調節物質の発現をモニタリングした。ウェスタンブロット解析は、ＢＡＴ（図９）またはＷＡＴ（データ示さず）のＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＰＰＡＲγまたはＧＬＵＴ４タンパク質レベルにおける、いかなる一貫した差も示さなかった。
【００９５】
ＧＬＵＴ１レベルは、野生型と比べて、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスにおいてわずかに高いようである（図９）。さらに、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスでのインスリンシグナル伝達経路を、野生型およびヌルマウスに対して腹腔内に０．４Ｕ／ｋｇのインスリンを注射することにより評価した（図１０）。ＩＲＳ−１チロシンリン酸化、ＩＲＳ−１関連ＰＩ−３キナーゼ、ＡＫＴ活性化またはＧＳＫ−３活性化の増加は検出されず、近接するインスリンシグナル伝達経路はＰａｒ−１ｂ欠損によりほとんど影響されないことを示唆する（図１０およびデータ示さず）。Ｐａｒ−１ｂはＡＭＰ活性化キナーゼ（ＡＭＰＫ）サブファミリーのメンバーであるため、ホスホ−ＡＭＰＫおよびホスホ−アセチルＣｏＡカルボキシラーゼレベルもモニタリングしたが、これらのいずれも、Ｐａｒ−１ｂの不在下において変化しなかった（図９およびデータ示さず）。
【００９６】
考察
この研究において、Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質キナーゼであるＰａｒ−１ｂ／ＭＡＲＫ２／Ｅｍｋは、過脂肪、インスリン感受性および糖代謝の新規な調節物質であることを、Ｐａｒ−１ｂがヌルであるマウスを用いて示した。Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスは、胚形成の間（交尾後１３．５日間）および出生後、成長が遅延する。出生後、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスは、全体的に器官サイズの〜２０％の減少を示し、ただし例外は白色および褐色脂肪組織である（１０週齢において野生型と比較して４０％の減少）。これらの器官質量および過脂肪の減少には、血清ＩＧＦ−１濃度における２５％の減少が伴う。ＩＧＦ−１シグナル伝達は、胚成長および出生後の成長に重要である（３４、３５）。ＩＧＦ−１受容体ハイポモルフおよびＩＧＦ−１の肝臓特異的欠失のマウスモデルもまた、脂肪組織における不均等な減少と共に、全体的成長の遅延を示す（３６、３７）。ＩＧＦ−１シグナル伝達はまた、in vitroにおける脂肪細胞の増殖および分化に重要であることが示されている（３８）。これらを考慮すると、我々のデータは、Ｐａｒ−１ｂがＩＧＦ−１媒介性の成長に非常に重要であり、ＩＧＦ−１駆動の脂肪生成における欠損によって、過脂肪の減少をもたらす可能性があることを示唆する。Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスと対照的に、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達が欠損したヒトおよびマウス両方は、インスリン抵抗性を示す。結果として、ＩＧＦ−１欠損のみに基づいて、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスのインスリン過感受性を説明することは困難である。成長ホルモン受容体（ＧＨＲ−／−）欠損マウスは、Ｐａｒ−１ｂヌルと同様、インスリン感受性の増加および成長の遅延を示す。しかし、Ｐａｒ−１ｂヌルマウスと異なり、ＧＨＲ−／−マウスは、年齢と共に過脂肪の増加、食餌誘発性の肥満の起こしやすさ、体温の低下および正常な胚成長の減少（３９〜４１）も示す。これらのデータは、本明細書に記載のＰａｒ−１ｂ−／−代謝性表現型は、ＧＨ媒介性効果の結果のみによるものではないらしいことを示す。
【００９７】
脂肪組織（ＷＡＴおよびＢＡＴ）への糖取込みの増加に伴う、高脂肪食および過食による体重増加に対する抵抗性は、代謝性非結合障害（metabolic uncoupling defect）の指標である。ＵＣＰ１、ＵＣＰ２またはＰＰＡＲγのタンパク質レベルの変化は検出していないが、正常な代謝機能に重要なこれらおよび／または他のタンパク質の活性は、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスにおいて変化し得る。Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスの平均体温はわずかに高く、エネルギー消費の増加は主に熱生成の増加を介して分散されることを示唆する。ＢＡＴ媒介性の熱産生における生理学的に正常な増加（より小さな身体のサイズおよび過脂肪の減少のため）は、ＢＡＴにおける糖取込みの増加をもたらす可能性があるが、この場合にはあてはまらないように見られ、その理由は、Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスは体温の低下を示さないからである。最近の研究により、β−アドレナリン作動性活性における摂動と、その結果のＢＡＴ媒介性熱産生は、マウスにおける食餌誘発性肥満およびインスリン感受性を調節することができる（４２、４３）ことが示された。これらの研究は、Ｐａｒ−１ｂのβ−アドレナリン作動性活性および／またはＢＡＴ媒介性熱産生への直接の効果は、本明細書に記載されたいくつかの表現型を説明可能であることを示唆する。
【００９８】
インスリンで処理したＰａｒ−１ｂ−／−脂肪組織において、ＩＲＳ−１、ＡＫＴまたはＧＳＫ３のリン酸化における顕著な増加は検出されず、脂肪組織への糖取込みの増加は、近接するインスリンシグナル伝達の増強のためではないことを示唆する。Ｐａｒ−１ｂ−／−マウスのＦＤＧ−ｍｉｃｒｏＰＥＴ画像は、ＢＡＴでの糖取込みの増加は、急性インスリンチャレンジの不在において、絶食後に観察できることを示す。この所見は、ＢＡＴ媒介性の糖取込みにおける、インスリン独立性の障害を示唆する。Ｐａｒ−１ｂはブドウ糖輸送においてＡＫＴ活性化の下流で作用する可能性がある。興味深いことには、Ｐａｒ−１ｂ、ｋｉｎ１、およびｋｉｎ２の酵母相同体は、エクソシスト複合体との相互作用を介した小胞性輸送において役割を果たすことが示され、哺乳類のＰａｒ−１ｂはシンタキシン−４と相互作用することが示唆された（２）。エクソシストおよびシンタキシン−４は、ＧＬＵＴ４輸送にも関与している（４４〜４９）。さらに、Ｐａｒ−１ｂの直接の下流標的であるＰａｒ−３／ＡＳＩＰは、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞での糖取込みを阻害することが、過剰発現の研究によって示された（５０）。ＬＫＢ１および異型ＰＫＣの両方は、Ｐａｒ−１の２つの上流調節物質であり、また糖代謝の調節においても役割を果たしていることが示された（２０、５２、５３）。
【００９９】
ＡＭＰＫおよびＰａｒ−１ｂは、これらのキナーゼドメイン内で重要な相同性を共有しており、１３のメンバーを含むキナーゼの大きなサブファミリーの一部であり、該メンバーの多くは少なくとも部分的にＬＫＢ１により調節されているようである。実際、我々のデータがＰａｒ−１ｂについて示唆しているように、ＡＭＰＫは糖取込みをホスファチジルイノシトール３−キナーゼ非依存性のメカニズムにより調節する（５４）。Ｐａｒ−１ｂおよびＡＭＰＫはまた、ペプチドライブラリのスクリーニングにより決定されたように、ほとんど同一のリン酸化共通塩基配列を共有する（非公開の結果、Reuben Shaw, Ben Turk and Lewis Cantley）。ＧＬＵＴ４媒介性の輸送における、Ｐａｒ−１ｂの役割への反論としては、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞において行われた、最近のＲＮＡｉスクリーニングがある（５１）。この研究により、Ｐａｒ−１ｂ／ＭＡＲＫ２またはＣ−ＴＡＫ１／ＭＡＲＫ３のどちらかのノックダウンが、基底状態またはインスリンへの反応のどちらかにおいて、２-デオキシ糖取込みに対して重要な効果を及ぼさないことが示された。これら２つのタンパク質のＲＮＡｉノックダウンの有効性がその機能をブロックするのに十分であると仮定すると、このデータは、Ｐａｒ−１ｂがＧＬＵＴ４媒介性糖取込みに直接の役割を持たないことを主張し、糖取込みにおけるＰａｒ−１ｂについての脂肪細胞自律性の機能に反論する。Ｐａｒ−１ｂが糖取込みを調節するメカニズム（単数または複数）についての結論の決定にはさらなる解析が、特にＰａｒ−１ｂの組織特異的欠失についての解析が必要である。
【０１００】
Ｐａｒ−１ｂが糖代謝および過脂肪を調節するとの所見は、Ｐａｒ−１ｂキナーゼ阻害剤がインスリン感受性の改善および／または肥満の改善に用いられるかも知れないという、刺激的な可能性を提供する。Ｐａｒ−１ｂは小分子による標的となりやすく、このキナーゼの阻害は、２型糖尿病に付随するいくつかの症状を改善すると予想されている。
【０１０１】
材料および方法
動物の処置
全ての動物の処置は、ワシントン大学のSchool of Medicine Animal Studies Committeeにより承認された。Ｐａｒ−１ｂヌルマウスの作製は、前に記載されている（３１）。株背景Ｃ５７Ｂ１／６；１２９Ｘ１ＳｖＪのヘテロ接合Ｐａｒ−１ｂマウスを異種交配して、本研究で用いるマウスを作製した。Ｐａｒ−１ｂ遺伝子のβガラクトシダーゼをコードするマウスは、M. Darmonの好意により提供された（３０）。他の記載がない限り、マウスには標準の固形飼料を与えた（脂肪４．５％、炭水化物５５％、タンパク質２０％、繊維４．７％を含むLab Diet 5053, Purina Mills）。
【０１０２】
動物の体重測定
異種交配から作製した胚および仔の体重を測り、遺伝子型決定を尾切断（tail clipping）のＰＣＲ解析により行った。指定された時点において、胚を収集し、ＰＢＳですすぎ、Mettler AE50秤（Mettler Toledo AG, New Jersey, USA）を用いて計量した。プラグ（plug）の観察は、交尾後（ｄｐｃ）０．５日に記録した。出生後の成長曲線は、指定時点でOhaus Scout秤（Ohaus Corp., New Jersey, USA）を用いてマウスを計量して得た。各時点での平均体重を、各遺伝子型毎に５〜１３個の胚または４〜１９匹のマウスから計算した。
【０１０３】
組織学的解析
組織学的検討については、組織を１０％中性緩衝ホルマリン中に固定し、ＰＢＳですすぎ、７０％エタノール中に保存した。固定した組織を標準の手法によりパラフィンに包埋した。ブロックを切片化し（５μｍ）、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。白色脂肪細胞数および大きさを、複数の独立した視野で３０倍率でOlympus BX60顕微鏡を用いて計測した。
【０１０４】
組織解剖およびＸ−ｇａｌ染色
３〜５月齢のマウスの脳、褐色脂肪、白色脂肪、心臓、ヒラメ筋、膵臓および肝臓を解剖した。ｍＰａｒ−１ｂマウスについては記載されている（３０）。ホールマウント組織を解剖して数個の３〜６ｍｍ切片にし、ＰＢＳで３回洗浄し、１％のホルムアルデヒド、０．２％のグルタールアルデヒド、０．０２％のＮＰ４０、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳに４℃で固定した。固定後、組織をＰＢＳで３回洗浄し、ＤＭＦ中１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ、ＰＢＳ中の２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、５ｍＭのフェロシアン化カリウム、１００ｍＭのＤガラクトースを用いて、３７℃で一晩染色した。組織をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで後固定し、加工し、パラフィン化して、顕微鏡観察用に切片化した。
【０１０５】
高脂肪食の検討
４週齢において、Ｐａｒ−１ｂＫＯおよびＷＴマウスを計量し、それらの標準のげっ歯類用固形飼料を、Harlan Teklad (88137)からのAdjusted Calories Diet（４２％脂肪）に置き換えた。高脂肪固形飼料の重量を記録し、食物消費およびマウスの体重を、個別のマウスについて１週間に１回の割合で１６週間測定した。
高インスリン−正常血糖クランプ試験
雄のＰａｒ−１ｂヌルマウスと野生型同腹子（ｎ＝１９〜２２）をNIH-Yale Mouse Metabolic Phenotyping Centerにおいて試験し、in vivoでの組織特異的インスリン作用および糖代謝における変化を評価した。Yaleの施設における１ヶ月の環境順化（続いて高脂肪食検討のために８週間の高脂肪食投与）の後に、全体脂肪重量および除脂肪体重を覚醒マウスにおいて、前に記載のように１Ｈ−ＭＲＳ（Bruker Mini-spec Analyzer, Echo Medical Systems, Houston, TX）を用いて測定した（３３）。プロトコルの詳細については、補足の資料および方法を参照のこと。
【０１０６】
代謝測定
活動性、食物および水消費量、およびエネルギー消費量を含む広範囲の代謝測定の検討のために、総合的動物代謝モニタリングシステム（CLAMS: Columbus instruments, Columbus, OH, USA）を用いた。データ解析に際し、エネルギー消費量、摂食および飲水は、体重に関して正規化する。エネルギー消費および呼吸商（ＲＱ）は、前に収集したガス変換データから計算した：ＲＱはＶＣＯ２のＶＯ２に対する比率として、Ｈｅａｔ＝（３．８１５＋１．２３２＊ＲＱ）＊ＶＯ２。活動性は、ｘおよびｚ軸上で赤外線を用いて特定の測定期間中に赤外線が遮られた回数を計測して測定した。摂食は、１時点から次の時点までの、Center-Feederの秤量における差を記録して測定した。飲水は、飲水容量モニターを通して測定した。
【０１０７】
ブドウ糖およびインスリン抵抗性試験
ランダムに餌を与えるかまたは絶食させた（１２時間）マウスを、記載のようにして解析した。血清インスリン濃度は、放射性免疫測定法により、ラットのインスリンを標準としてＥＬＩＳＡ（R&D Systems、製造業者の指示による）を用いて決定した。血糖値はＢ−ブドウ糖光度計およびＢ−ブドウ糖キュベット（HemoCue AB, Angelholm, Sweden）を用いて決定した。インスリン抵抗性試験（ＩＴＴ）は、絶食（６時間）した８〜１０週齢のマウスで行った。血糖値は、インスリン（０．３０ＩＵ/ｋｇ、HumulinR, Eli Lilly and Company, Indianapolis, USA）の腹腔内注射の直前およびその後１５分間隔で測定した。ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）は、絶食（１２時間）した１２週齢のマウスで行った。マウスに、Ｄ−ブドウ糖（２０％溶液；１ｇ／体重１ｋｇ）を腹腔内注射し、血糖値を注射後の指定時点において測定した。
【０１０８】
血清因子定量化
インスリン、トリグリセリド、アディポネクチン、レプチン、遊離脂肪酸およびコレステロールの血清濃度を、Ani Lytics Incorporated（Gaithersburg, MD）により決定した。血清ＩＧＦ−１（R&D Systems, Minneapolis, MN）および成長ホルモン（Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster, TX）の濃度を、ＥＬＩＳＡにより、製造業者の指示に従って測定した。
【０１０９】
ｍｉｃｒｏＰＥＴ試験
ｍｉｃｒｏＰＥＴ画像化のために、８週齢の雄の野生型およびＰａｒ−１ｂヌルマウスのコホートを、週１回、連続して４週間、各回に異なる条件下で、繰り返し画像化した。マウスは、一晩絶食させるか、または標準のげっ歯類用固形飼料に自由にアクセス可能とした（非絶食）。翌朝、０．５ＩＵ／ｋｇのインスリン（Humulin N）または生理食塩水のどちらかをマウスにＩＰ注射で投与した。ＩＰ注射の３０分後、マウスにイソフルランで軽度の麻酔を施し、続いて１８Ｆ−ＦＤＧ
【数２】
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の尾静脈注射を行った。放射性トレーサの注射直後に、マウスを背臥でｍｉｃｒｏＰＥＴスキャナー（R4, Concorde MicroSystems, Knoxville, TN）内に位置させて、画像を得た（〜１０分の取得時間；１ベッド体位；ＯＳＥＭ再構成；等方性画像解像度１．８ｍｍ＠１ｃｍ、２．６８ｍｍ＠２ｃｍ）。マウスを回復させ、次に麻酔して、放射性トレーサの注射の１時間および２時間後に再度画像化した。ｍｉｃｒｏＰＥＴ画像は崩壊（decay）については補正したが、減衰（attenuation）または散乱については補正せず、関連組織および器官の積み重ねられた関心領域（ＲＯＩ）をAnalyzerPC6.0ソフトウェアにより解析した。ｍｉｃｒｏＰＥＴ画像上の１８Ｆ−ＦＤＧの集積データは、標準取込み値（ＳＵＶ）として表わし、これは、組織１ｇ当たりの計測数を、動物の体重１ｇ当たりの注入された放射活性量で除した値である（５５、５６）。データは、平均値±ＳＥＭで表わす。群は一元配置ＮＯＶＡおよびスチューデントｔ検定（Microsoft Excel）により統計的に解析した。
【０１１０】
ウェスタンブロット解析
抗ＵＣＰ１および抗ＵＣＰ２はAlpha Diagnostic Intl. Inc.（San Antonio, Tx）より入手した；抗ＧＬＵＴ１および抗ＧＬＵＴ４はAbcam（Cambridge, MA）より入手した；抗ｐ１１０αはBD Biosciences（San Jose, CA）より入手した；抗ＰＰＡＲγ、抗ｐ８５および抗ＩＲＳ−１抗体は、Upstate（Lake Placid, NY）より入手した；抗ホスホ−ＡＭＰＫ、総ＡＭＰＫ、ホスホ−ＧＳＫ−３、ＧＳＫ−３α、ＧＳＫ−３βは、Cell Signaling Techonologies（Danvers, MA）より入手した；抗Ｐ−Ｔｙｒ（４Ｇ１０）は、Tom Roberts博士から贈られたものである。組織溶解産物は、（３１）に記載のように標準法により調製した。プロトコルの詳細については、補足資料および方法を参照のこと。
【０１１１】
補足資料および方法
動物の体重測定
異種交配から作製した胚および仔の体重を測り、遺伝子型決定を尾切断（tail clipping）ＰＣＲ解析により行った。指定された時点において、胚を収集し、ＰＢＳですすぎ、Mettler AE50秤（Mettler Toledo AG, New Jersey, USA）を用いて計量した。プラグ（plug）の観察は、交尾後（ｄｐｃ）０．５日に記録した。出生後の成長曲線は、指定時点でOhaus Scout秤（Ohaus Corp., New Jersey, USA）を用いてマウスを計量して得た。各時点での平均体重を、各遺伝子型毎に５〜１３個の胚または４〜１９匹のマウスから計算した。
【０１１２】
組織学的解析
組織学的検討については、組織を１０％中性緩衝ホルマリン中に固定し、ＰＢＳですすぎ、７０％エタノール中に保存した。固定した組織を標準の手法によりパラフィンに包埋した。ブロックを切片化し（５μｍ）、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。白色脂肪細胞数および大きさを、複数の独立した視野で３０倍率でOlympus BX60顕微鏡を用いて計測した。
【０１１３】
組織解体およびＸ−ｇａｌ染色
３〜５月齢のマウスの脳、褐色脂肪、白色脂肪、心臓、ヒラメ筋、膵臓および肝臓を解剖した。ｍＰａｒ−１ｂマウスについては記載されている（３０）。ホールマウント組織を解剖して数個の３〜６ｍｍ切片にし、ＰＢＳで３回洗浄し、１％のホルムアルデヒド、０．２％のグルタールアルデヒド、０．０２％のＮＰ４０、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳに４℃で固定した。固定後、組織をＰＢＳで３回洗浄し、ＤＭＦ中１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ、ＰＢＳ中の２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、５ｍＭのフェロシアン化カリウム、１００ｍＭのＤガラクトースを用いて、３７℃で一晩染色した。組織をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで後固定し、加工し、パラフィン化して、顕微鏡観察用に切片化した。
【０１１４】
ウェスタンブロット解析
抗ＵＣＰ１および抗ＵＣＰ２はAlpha Diagnostic Intl. Inc.（San Antonio, Tx）より入手した；抗ＧＬＵＴ１および抗ＧＬＵＴ４はAbcam（Cambridge, MA）より入手した；抗ｐ１１０αはBD Biosciences（San Jose, CA）より入手した；抗ＰＰＡＲγ、抗ｐ８５および抗ＩＲＳ−１抗体は、Upstate（Lake Placid, NY）より入手した；抗ホスホ−ＡＭＰＫ、総ＡＭＰＫ、ホスホ−ＧＳＫ−３、ＧＳＫ−３α、ＧＳＫ−３βは、Cell Signaling Techonologies（Danvers, MA）より入手した；抗Ｐ−Ｔｙｒ（４Ｇ１０）は、Tom Roberts博士から贈られたものである。組織溶解産物は、（３１）に記載のように標準法により調製した。免疫ブロット分析用の組織は、以下：５０ｍＭトリス［ｐＨ８．０］、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのジチオトレイトール［ＤＴＴ］、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１ｍＭのミクロシスチン、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍｌ当たり０．１５Ｕのアプロチニン、２０ｍＭのロイペプチン、２０ｍＭのペプスタチン、を含有する溶解緩衝液中での、４℃で２０分間の均質化により調製した。溶解産物は遠心分離により精製し、タンパク質濃度をBio-Radタンパク質アッセイキットを用いて決定した。ウェスタンブロット解析のために、５０μｇの総タンパクを、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（７％ポリアクリルアミド）により分解した。ＩＲＳ−１の免疫沈降を、１ｕｇの抗ＩＲＳ−１抗体を１ｍｇの総組織溶解産物で２時間インキュベートし、続いてタンパク質Ｇセファロースにより４℃で１時間インキュベートして、実施した。
【０１１５】
ブドウ糖およびインスリン抵抗性試験
ランダムに餌を与えるかまたは絶食させた（１２時間）マウスを、記載のようにして解析した。血清インスリン濃度は、放射性免疫測定法により、ラットのインスリンを標準としてＥＬＩＳＡ（R&D Systems、製造業者の指示による）を用いて決定した。血糖値はＢ−ブドウ糖光度計およびＢ−ブドウ糖キュベット（HemoCue AB, Angelholm, Sweden）を用いて決定した。インスリン抵抗性試験（ＩＴＴ）は、絶食（６時間）した８〜１０週齢のマウスで行った。血糖値は、インスリン（０．３０ＩＵ/ｋｇ、HumulinR, Eli Lilly and Company, Indianapolis, USA）の腹腔内注射の直前およびその後１５分間隔で測定した。ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）は、絶食した（１２時間）１２週齢のマウスで行った。マウスに、Ｄ−ブドウ糖（２０％溶液；１ｇ／体重１ｋｇ）を腹腔内注射し、血糖値を注射後の指定時点において測定した。
【０１１６】
血清因子定量化
インスリン、トリグリセリド、アディポネクチン、レプチン、遊離脂肪酸およびコレステロールの血清濃度を、Ani Lytics Incorporated（Gaithersburg, MD）により決定した。血清ＩＧＦ−１（R&D Systems, Minneapolis, MN）および成長ホルモン（Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster, TX）の濃度を、ＥＬＩＳＡにより、製造業者の指示に従って測定した。
【０１１７】
高インスリン−正常血糖クランプ試験
代謝実験の少なくとも４日前に、マウスを麻酔し、留置カテーテルを右内頸静脈に前に記載のようにして（３３）挿入した。全ての操作は、Yale University Animal Care and Use Committeeにより承認された。一晩の絶食後、２時間の高インスリン−正常血糖クランプを、覚醒したＰａｒ−１ｂヌルマウスおよび野生型同腹子で実施した。簡潔に述べると、インスリン（HumulinR insulin, Eli Lilly, Indianapolis, IN）をプライムし（１５０ｍＵ／体重１ｋｇ）、連続して１５ｐｍｏｌ／ｋｇ／分で注入し、次に２０％ブドウ糖を異なる割合で、ブドウ糖を基底濃度に維持するように注入した。基底およびインスリン刺激性の全身の糖代謝回転（turnover）を、連続した（３−３Ｈ）グルコース（PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Ind.）の注入により、クランプの２時間前（０．０５μＣｉ／分）および、クランプ中（０．１μＣｉ／分）においてそれぞれ推定した。個別組織におけるインスリン刺激性の糖取込みを推定するために、２−デオキシ−Ｄ−［１−１４Ｃ］グルコース（２−［１４Ｃ］ＤＧ）をボーラス（１０μＣｉ）で、クランプ開始の７５分後に投与した。
【０１１８】
クランプの終わりに、マウスを麻酔し、組織を生化学的分析用に収集した（３３）。基底肝臓ブドウ糖産生（ＨＧＰ）の割合およびインスリン刺激性全身糖取込みを、［３Ｈ］グルコース注入率（１分当たりの分解；ｄｐｍ／分）の、基底期間の終わりおよびクランプの最後の３０分間における、血漿ブドウ糖（ｄｐｍ／μｍｏｌ）の特異的活性に対する比率として決定した。クランプ中のインスリン刺激性のＨＧＰ率は、全身糖取込みからブドウ糖注入率を差し引いて決定した。全身解糖およびブドウ糖からのグリコーゲンプラス脂質合成を、前に記載のようにして推定した（３３）。２−デオキシグルコースは、リン酸化されているがさらに代謝されてはいないグルコース相同体であるため、個別組織におけるインスリン刺激性の糖取込みは、２−［１４Ｃ］ＤＧ−６−Ｐの組織含量を決定することにより推定可能である。これに基づき、個別組織における糖取込みを、血漿２−［１４Ｃ］ＤＧプロファイルおよび組織の２−［１４Ｃ］ＤＧ−６−Ｐ含量から、前に記載のようにして（３３）計算した。２つの独立した実験セットを実施した。最初の実験で用いたマウスは５〜６月齢であり、一方第２の実験で用いたマウスは４月齢であった。
【０１１９】
高インスリン−正常血糖クランプ試験
雄のＰａｒ−１ｂヌルマウスと野生型同腹子（ｎ＝１９〜２２）をNIH-Yale Mouse Metabolic Phenotyping Centerにおいて試験し、in vivoでの組織特異的インスリン作用および糖代謝における変化を評価した。Yaleの施設における１ヶ月の環境順化（続いて高脂肪食検討のために８週間の高脂肪食投与）の後に、全体脂肪重量および除脂肪体重を覚醒マウスにおいて、前に記載のように１Ｈ−ＭＲＳ（Bruker Mini-spec Analyzer, Echo Medical Systems, Houston, TX）を用いて測定した（３３）。
【０１２０】
代謝測定
活動性、食物および水消費量、およびエネルギー消費量を含む広範囲の代謝測定の検討のために、総合的動物代謝モニタリングシステム（CLAMS: Columbus instruments, Columbus, OH, USA）を用いた。データ解析に際し、エネルギー消費量、摂食および飲水は、体重に関して正規化する。エネルギー消費および呼吸商（ＲＱ）は、前に収集したガス変換データから計算した：ＲＱはＶＣＯ２のＶＯ２に対する比率として、Ｈｅａｔ＝（３．８１５＋１．２３２＊ＲＱ）＊ＶＯ２。活動性は、ｘおよびｚ軸上で赤外線を用いて特定の測定期間中に赤外線が遮られた回数を計測して測定した。摂食は、１時点から次の時点までの、Center-Feederの秤量における差を記録して測定した。飲水は、飲水容量モニターを通して測定した。
【０１２１】
参考文献
【表３】
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【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
【表５】
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【０１２４】
【表６】
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【０１２５】
例２：Ｐａｒ−１ｂの阻害剤を同定するための細胞ベースの高スループットアッセイ
細胞ベースの高スループットアッセイを、ホスホ−タウ、ホスホ−Ｄｖ１、ホスホ−Ｐａｒ−３、ホスホ−Ｃｄｃ２５Ｃ、ホスホ−ＭＡＰ２またはホスホ−ＭＡＰ４に対するリン酸化型特異的抗体を用いて、細胞株のスクリーニングにより、これらのタンパク質をＰａｒ−１ｂに対する基質として同定することに基づき実施した（Drewes et al., Cell. 1997 Apr 18;89(2):297-308; Ebneth et al., Cell Motil Cytoskeleton. 1999 Nov;44(3):209-24参照）。かかる抗体は、例えばUpstate Biotechnologyから市販されている。候補となる阻害化合物を、９６または３８４ウェルプレート内の細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞または３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞など）に加え、次に処置した細胞を、リン酸化たんぱく質について免疫細胞化学法によりスクリーニングした。Ｐａｒ−１ｂキナーゼ活性を、直接的に、または経路の上流のタンパク質に影響を及ぼすことにより阻害する候補阻害化合物は、リン酸化タンパク質シグナルを減少させるものである。かかる化合物がＰａｒ−１ｂに直接結合してこれを阻害するかどうかを、例えば例３に記載のin vitroアッセイを用いて確認する。
【０１２６】
例３：Ｐａｒ−１ｂの阻害剤を同定するためのin vitro高スループットアッセイ
さらに直接的なアッセイは、in vitroでＰａｒ−１ｂ阻害剤を直接スクリーニングすることである。これは、キナーゼ活性を測定する生化学的アッセイである。Ｐａｒ−１ｂのキナーゼ活性を決定するための、種々の検出可能な分子が利用可能である。Elbert et al. Mol Biol Cell. 2006 Aug;17:3345-3355に記載されている、Ｐａｒ−１ｂによるＤｖ１タンパク質のリン酸化をin vitroで測定するアッセイを用いることができる。
【０１２７】
代替的に、放射活性を必要とすることなく、定量的かつ高スループットな特性を高めるために、蛍光極性を用いて目的の（例えばＰａｒ−１ｂ）キナーゼ活性の量を定量化することができる。Ｐａｒ−１ｂ用の蛍光複合ペプチド基質（例えば、タウ、Ｄｖ１、Ｐａｒ−３、Ｃｄｃ２５Ｃ、ＭＡＰ２およびＭＡＰ４タンパク質における最適共通配列に由来するもの）を、Ｐａｒ−１ｂと、阻害剤ありまたはなしで混合して、アッセイ混合物を形成する。このアッセイにおいて、蛍光標識ペプチド基質をキナーゼによりリン酸化し、金属誘導体化ナノ粒子（「ＩＭＡＰ」、Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA）上に捕捉する。高い塩濃度において、３価金属カチオンはリン酸化ペプチドを結合し、リン酸化ペプチドを捕捉する。結合した蛍光リン酸化ペプチドの量は、結合産物の分子移動度の低下による生じる、蛍光極性シグナルの増加により測定する。（Turek-etienne, et al. (2003) Assay Drug Dev Technol., Aug;1(4):545-53）。
【０１２８】
候補阻害剤がＰａｒ−１ｂに特異的であり、関連のキナーゼには特異的でないことを決定することが、好ましい。特異性を試験するために、追加のキナーゼ、例えばキナーゼのＰａｒ−１ファミリーのものなどで、アッセイを繰り返す（または平行して行う）ことができる。特異性は、化合物がＰａｒ−１ｂに対して活性を有するが、他のキナーゼに対しては活性を有さないことを意味する必要はない。例えば、Ｐａｒ−１ｂを他のキナーゼより低いＩＣ５０で阻害する化合物は、Ｐａｒ−１ｂキナーゼ活性を特異的に低下させるのに有効な、十分な特異性を有する。類似のアッセイを、当分野に知られている、Ｐａｒ−１ｂの４種の異なるアイソフォームについて行うことができる（アイソフォームａ、ｂ、ｃ、ｄ）。
【０１２９】
本発明の他の側面は当業者には明白であり、ここで繰り返す必要はない。本明細書で引用した各文献は、その全体が参照として組み込まれる。
用いた用語および表現は、説明のための用語として用いたものであり、限定のためではなく、かかる用語および表現の使用において、ここに示され記載された特徴またはその一部の、任意の均等物を除外することは意図されず、本発明の範囲内で種々の修正が可能であることが認識される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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