(57)【要約】  本発明は、尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するためのSPE−LC−MS−MS法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法であって:
ａ）内部標準溶液を尿サンプルに添加すること；
ｂ）尿サンプルを、メタノールでコンディショニングされているオアシス HLBカートリッジにかけること；
ｃ）カートリッジを水中約１％ (v／v)TEA及びメタノール中約１％ (v／v)ギ酸で洗浄すること；
ｄ）リセドロネートを、少なくとも１回、約３mM EDTAを含有する約60％(v／v)メタノールと約40％(v／v)水との混合物で真空下溶離すること；
ｅ）溶離した溶液をエバポレートし、そして10％(v／v)メタノールと90％(v／v)0.05M NH4Ac−NH4OH緩衝液との混合物で再構成して、リセドロネートと内部標準とのサンプル混合物を得ること；及び
ｆ）サンプル混合物をLC−MS／MSシステムで分析すること；
を含む、方法。
【請求項２】
尿サンプルがマウス又はラットの尿サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
内部標準がデオキシ−リセドロネートである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
内部標準が、水溶液として添加されるデオキシ−リセドロネートである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
内部標準が、約10μg／mLの水溶液として添加されるデオキシ−リセドロネートである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
オアシス HLBカートリッジが30mg オアシス HLBカートリッジである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
尿サンプルの量が約0.4mLである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
カートリッジが約１mLのメタノールでプレコンディショニングされている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
カートリッジが、約１mLのメタノール、続いて水中１％(v／v)TEA約0.5mLでプレコンディショニングされている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
カートリッジが、水中約１％ (v／v)TEA約0.5mL及びメタノール中約１％(v／v)ギ酸約0.5mLで洗浄される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
約３mM EDTAを含有する約60％(v／v)メタノールと約40％(v／v)水との混合物の量が約1.5mLである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
リセドロネートを、約３mM EDTAを含有する約60％(v／v)メタノールと約40％(v／v)水との混合物約0.75mLで２回溶離する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
10％(v／v)メタノールと90％(v／v) 0.05M NH4Ac−NH4OH緩衝液との混合物の量が約100μLである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
内部標準がデオキシ−リセドロネートであり、そしてサンプル混合物をLC−MS／MSシステムで分析することが、リセドロネートとデオキシ−リセドロネートとをイナートシルフェニル−3 HPLCカラム上で溶液Ａ及び溶液Ｂの混合物を用いるグラジエント溶離によるHPLCにより分離することを含み、ここで溶液Ａの量を約10％(v／v)から約95％(v／v)に増加させ、そして溶液Ａは水中約90％(v／v)メタノールであり、そして溶液Ｂは２％(v／v)トリエチルアミンを含有する約10mM 酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
マウス又はラットの尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法であって:
ａ）約10μg／mLデオキシ−リセドロネート水溶液約100μLをマウス又はラットの尿サンプル約0.4mLに添加すること；
ｂ）マウス又はラットの尿サンプルを、メタノール約１mL、続いて水中１％(v／v)TEA約0.5mLでプレコンディショニングされている30mg オアシス HLBカートリッジにかけること；
ｃ）カートリッジを水中１％(v／v)TEA約0.5mL及びメタノール中１％(v／v)ギ酸約0.5mLで洗浄すること；
ｄ）リセドロネートを、約３mM EDTAを含有する約60％(v／v)メタノールと約40％(v／v)水との混合物約1.5mLで溶離すること；
ｅ）溶離した溶液をエバポレートし、そして約10％ (v／v)のメタノールと約90％(v／v)の約0.05M NH4Ac−NH4OH緩衝液との混合物約100μLで再構成してリセドロネート及びデオキシ−リセドロネートのサンプル混合物を得ること；及び
ｆ）サンプル混合物をLC−MS／MSシステムで分析すること；
を含み、ここでリセドロネートとデオキシ−リセドロネートとをイナートシルフェニル−3 HPLCカラム上で溶液Ａ及び溶液Ｂの混合物を用いるグラジエント溶離によるHPLCにより分離し、ここで溶液Ａの量を約10％(v／v)から約95％(v／v)に増加させ、そして溶液Ａは水中約90％(v／v)メタノールであり、そして溶液Ｂは２％(v／v)トリエチルアミンを含有する約10mM 酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液である、方法。
【請求項１６】
マウス又はラットの尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法であって:
ａ）約10μg／mL デオキシ−リセドロネート水溶液約100μLを、マウス又はラットの尿サンプル約0.4mLに添加すること；
ｂ）マウス又はラットの尿サンプルを、メタノール約１mL、続いて水中１％(v／v)TEA約0.5mLでプレコンディショニングされている30mg オアシス HLBカートリッジにかけること；
ｃ）カートリッジを水中１％(v／v)TEA約0.5mL及びメタノール中１％(v／v)ギ酸約0.5mLで洗浄すること；
ｄ）リセドロネートを、約３mM EDTAを含有する約60％(v／v)メタノールと約40％(v／v)水との混合物約0.75mLで２回溶離すること；
ｅ）溶離した溶液をエバポレートし、そして約10％ (v／v)のメタノールと約90％(v／v)の約0.05M NH4Ac−NH4OH緩衝液との混合物約100μLで再構成してリセドロネート及びデオキシ−リセドロネートのサンプル混合物を得ること；及び
ｆ）サンプル混合物をLC−MS／MSシステムで分析すること；
を含み、ここでリセドロネートとデオキシ−リセドロネートとをイナートシルフェニル−3 HPLCカラム上で溶液Ａ及び溶液Ｂの混合物を用いるグラジエント溶離によるHPLCにより分離し、ここで溶液Ａの量を約10％(v／v)から約95％(v／v)に増加させ、そして溶液Ａは水中約90％(v／v)メタノールであり、そして溶液Ｂは２％(v／v)トリエチルアミンを含有する約10mM 酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するためのSPE−LC−MS−MS法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビスホスホネート類は骨吸収を抑制し、そして骨粗しょう症及びパジェット病を含む代謝性骨疾患に対して効果的な治療である(非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４)。骨吸収の防止は、成熟破骨細胞の機能に対する抑制作用に起因する。いくつかの生物分析法がビスホスホネート類について発表されている。一般にこれらの方法は、UV、蛍光(カラム前又はカラム後誘導体化を伴う)、伝導度、炎光光度リン選択的（flame photometric phosphorus selective）、屈折率及び探査型（explorative）光散乱検出を用いるイオン交換及びイオン対クロマトグラフィーに主に基づく(非特許文献５；  非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０)。
【０００３】
アシル化及びシリル化と組み合わせたGC−MSの技術は、ヒト尿中のリセドロネートを測定するために用いられている(非特許文献１１)。ヒト尿中のリセドロネートの分析のためのより感度のよい方法が、酵素結合免疫測定法(ELISA)を使用して達成されている (非特許文献１２)。UV検出を用いるカラムスイッチングイオン対HPLCもまた、ヒト尿中のリセドロネートを定量すると報告されている (非特許文献１３)。これらの方法のいくつかは非常に高い感度を示したが、これらは全て非常に複雑で時間がかかる。
【０００４】
近年、抽出後又はカートリッジでの誘導体化を用いるリセドロネートのためのLC／MS／MS法の開発により一層の努力が払われている (非特許文献１４； 非特許文献１５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】I. Elomaa, C. Blomqvist, L. Porkka, T.Holmstrom, T.Taube, C.Lamberg−Allardt, G.H. Borgstrom. Lancet 1985； i:1155
【非特許文献２】J.P. Kosonen, J. Pharm Biomed Anal. 1992； 10:881
【非特許文献３】J.A. Cantril, H.M. Buckler, D.C. Anderson,  Ann. Rheumatol. Dis. 1986； 45:1012
【非特許文献４】H.Fleisch, Horm. Metab. Res. 1997； 29:145
【非特許文献５】V. Virtanen, L.H.J. Lajunen, J. Chromatogr. 1993； 617:291
【非特許文献６】V. Virtanem, L.H.J. Lajunen, Talanta 1993； 40: 661
【非特許文献７】S.E. Meek, D.J. Pietrzyk  Anal. Chem. 1988； 60:1397
【非特許文献８】M.J. Lovdahl, D.J. Pietrzyk, J. Chromatogr. A 1999； 850:143
【非特許文献９】R. Niemi, H. Taipale, M. Ahlmark, J. Vepsalainen, T. Jarvinen, J. Chromatogr. B  1997； 701:97
【非特許文献１０】T.L. Chester, Anal. Chem. 1980； 52:1621
【非特許文献１１】D.Y. Mitchell, R.A. Eusebio, L.E. Dunlap, K.A. Pallone, J.D. Nesbitt, D.A. Russell, M.E. Clay, P.J. Bekker, Pharm. Res. 1998； 15:228
【非特許文献１２】D.Y. Mitchell, M.A. Heise, K.A. Pallone, J.D. Nesbilt, M.E. Clay, J.D. Nesbitt, D.A. Russell, C.W. Melson, J. Clin. Pharmacol. 1999； 48:536
【非特許文献１３】P.T. Vallano, S.B. Shugars, W.F. Kline, E.J. Woolf, B.K. Matuszewski, J. Chromatogr. B 1003； 794:23
【非特許文献１４】L.S. Zhu, V.N. Lapko, J.W. Lee, Y.J. Basir, C. Kafonek, R. Olsen, C. Briscoe, Rapid commun. Mass Spectrom. 2006, 20: 3421
【非特許文献１５】S.Turcotte, J. Couture, F. Vallee, AAPS PharmSci Vol. 5, No. 4, Abstract M1357 (2003)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法であって、該方法は:
ａ）内部標準を尿サンプルに添加すること；
ｂ）尿サンプルを、メタノールでコンディショニングされているオアシスHLB（Oasis HLB）カートリッジにかけること；
ｃ）カートリッジを水中約１％ (v／v)TEA及びメタノール中約１％ (v／v)ギ酸で洗浄すること；
ｄ）リセドロネートを、少なくとも１回、約３mM EDTAを含有する約60％(v／v)メタノールと約40％(v／v)水との混合物で真空下溶離すること；
ｅ）溶離した溶液をエバポレートし、そして10％(v／v)メタノールと90％(v／v)0.05M NH4Ac−NH4OH緩衝液との混合物で再構成して、リセドロネートと内部標準とのサンプル混合物を得ること；及び
ｆ）サンプル混合物をLC−MS／MSシステムで分析すること；
を含む、方法に関する。
【０００７】
尿サンプル中のリセドロネートの定量的測定のための前述のSPE−LC−MS−MS法は、比較的単純で感度が良く、正確でかつ精密であり、そして以下の図面及び以下の詳細な説明を用いてより十分に考察される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】リセドロネートのESI−MSスペクトル図である。
【図２】デオキシ−リセドロネートのESI−MSスペクトル図である。
【図３】マウス尿中のリセドロネートのクロマトグラムであり(LLOQ 10ng／mL)、ここで保持2.27分におけるピーク強度は、ブランクマウス尿サンプルのHPLCスペクトルにおける同じピークの強度の３倍より大きい。このことは、マウス尿中10ng／mLのリセドロネート濃度を定量できることを意味する。
【図４】マウスコントロール尿のクロマトグラムである。
【図５】リセドロネート及びデオキシ−リセドロネートの典型的なクロマトグラムである。
【図６】マウス尿中のリセドロネートの典型的な較正曲線である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義及び略語
上で使用されるように、そして本発明の記載全体を通して、以下の略語は、別に指示がなければ、以下の意味を有すると理解されるものとする:
amu       原子質量単位
Cps       カウント毎秒
CV％      パーセント変動係数
Diff％    理論濃度と実測濃度との間の差のパーセンテージ
EDTA      エチレンジアミン四酢酸
ESI       エレクトロスプレーイオン化
HPLC      高圧液体クロマトグラフィー
LC−MS    高圧液体クロマトグラフィー−質量分析
LLOQ      定量下限
MRM       多反応モニタリング
MS        質量分析
m／z      質量／電荷
NH4Ac     酢酸アンモニウム
NH4OH     水酸化アンモニウム
SD        標準偏差
SPE       固相抽出
TEA       トリエチルアミン
v／v      体積／体積
【００１０】
上で使用されるように、そして本発明の記載全体を通して、以下の用語は、別に指示がなければ、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００１１】
「デオキシ−リセドロネート」は、以下の化学構造：
【化１】
2010520489.tif 000003
を有する(1−ホスホノ−2−ピリジン−3−イル−エチル)−ホスホン酸を意味する。
【００１２】
「イナートシルフェニル（Inertsil Phenyl）−3 HPLCカラム」は、バリアン社（Varian, Inc.）により製造販売されている。
【００１３】
「内部標準」は、分析においてサンプル、ブランク及び較正標準に一定量添加される、化学物質である。この化学物質は、内部標準シグナルに対する検体シグナルの比を、これらの標準の検体濃度の関数としてプロットすることにより較正のために使用される。これは、サンプル調製又はサンプル導入の間の検体損失について測定及び補正するために行われる。特に、内部標準は、検体の化学構造と類似するが同一ではない化合物である。
【００１４】
「オアシスHLB（Oasis HLB）カーリッジ」は、ウォーターズ社（Waters Corporation）により製造販売されている。尿サンプルが有するカートリッジのサイズは尿中のリセドロネート濃度に依存する。リセドロネート濃度が低いほど、より大きいサイズのカートリッジ、より大きい体積の尿サンプル及びカートリッジを洗浄してリセドロネートを溶離するための溶液を使用すべきである。
【００１５】
「リセドロネート」は、以下の化学構造：
【化２】
2010520489.tif 000004
を有する(1−ヒドロキシ−1−ホスホノ−2−ピリジン−3−イル−エチル)−ホスホン酸を意味する。
【００１６】
「尿サンプル」は、ヒト尿サンプルを含む哺乳動物尿サンプルを意味する。
【００１７】
本発明の特定の実施態様
本発明の１つの特定の実施態様は、尿サンプルがマウス又はラットの尿サンプルである、尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法である。
【００１８】
本発明の別の特定の実施態様は、内部標準がデオキシ−リセドロネートである、尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法である。
【００１９】
本発明の別の特定の実施態様は、オアシスHLB（Oasis HLB）カートリッジが30mg オアシスHLB（Oasis HLB）カートリッジである、尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法である。
【００２０】
本発明の別の特定の実施態様は、内部標準が、水溶液として；より詳細には約10μg／mL水溶液として添加されるデオキシ−リセドロネートである、尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法である。
【００２１】
本発明の別の特定の実施態様は、尿サンプルの量が約0.4mLである、尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法である。
【００２２】
本発明の別の特定の実施態様は、カートリッジが約１mLのメタノールでプレコンディショニングされている、尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法である。
【００２３】
本発明の別の特定の実施態様は、カートリッジが約１mLのメタノール、続いて水中１％(v／v)TEA約0.5mLでプレコンディショニングされている尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法である。
【００２４】
本発明の別の特定の実施態様は、カートリッジが水中約１％ (v／v)TEA約0.5mL及びメタノール中約１％(v／v)ギ酸約0.5mLで洗浄される、尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法である。
【００２５】
本発明の別の特定の実施態様は、約３mM EDTAを含有する約60％(v／v)メタノールと約40％(v／v)水との混合物の量が約1.5mLである、尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法である。
【００２６】
本発明の別の特定の実施態様は、リセドロネートを、約３mM EDTAを含有する約60％(v／v)メタノールと約40％(v／v)水との混合物約0.75mLで２回溶離する、尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法である。
【００２７】
本発明の別の特定の実施態様は、10％(v／v)メタノールと90％(v／v) 0.05M NH4Ac−NH4OH緩衝液との混合物の量が約100μLである、尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法である。
【００２８】
本発明の別の特定の実施態様は、内部標準がデオキシ−リセドロネートであり、そしてサンプル混合物をLC−MS／MSシステムで分析することが、リセドロネート（risedroante）とデオキシ−リセドロネートとをイナートシルフェニル（Inertsil Phenyl）−3 HPLCカラム上で溶液Ａ及び溶液Ｂの混合物を用いるグラジエント溶離によるHPLCにより分離することを含み、ここで溶液Ａの量を約10％(v／v)から約95％(v／v)に増加させ、そして溶液Ａは水中約90％(v／v)メタノールであり、そして溶液Ｂは２％(v／v)トリエチルアミンを含有する約10mM 酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液である、尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法である。
【００２９】
本発明の別の特定の実施態様は、マウス又はラットの尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法であって、該方法は:
ａ）約10μg／mLデオキシ−リセドロネート水溶液約100μLをマウス又はラットの尿サンプル約0.4mLに添加すること；
ｂ）マウス又はラットの尿サンプルを、メタノール約１mL、続いて水中１％(v／v)TEA約0.5mLでプレコンディショニングされている30mg オアシスHLB（Oasis HLB）カートリッジにかけること；
ｃ）カートリッジを水中１％(v／v)TEA約0.5mL及びメタノール中１％(v／v)ギ酸約0.5mLで洗浄すること；
ｄ）リセドロネートを、約３mM EDTAを含有する約60％(v／v)メタノールと約40％(v／v)水との混合物約1.5mLで真空下溶離すること；
ｅ）溶離した溶液をエバポレートし、そして約10％ (v／v)のメタノールと約90％(v／v)の約0.05M NH4Ac−NH4OH緩衝液との混合物約100μLで再構成してリセドロネート及びデオキシ−リセドロネートのサンプル混合物を得ること；及び
ｆ）サンプル混合物をLC−MS／MSシステムで分析すること；を含み、ここでリセドロネートとデオキシ−リセドロネートとをイナートシルフェニル（Inertsil Phenyl）−3 HPLCカラム上で溶液Ａ及び溶液Ｂの混合物を用いるグラジエント溶離によるHPLCにより分離し、そしてここで溶液Ａの量を約10％(v／v)から約95％(v／v)に増加させ、そして溶液Ａは水中約90％(v／v)メタノールであり、そして溶液Ｂは２％(v／v)トリエチルアミンを含有する約10mM 酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液である、方法である。
【００３０】
本発明の別の特定の実施態様は、マウス又はラットの尿サンプル中のリセドロネートを定量的に測定するための方法であって、該方法は:
ａ）約10μg／mL デオキシ（dexoy）−リセドロネート水溶液約100μLを、マウス又はラットの尿サンプル約0.4mLに添加すること；
ｂ）マウス又はラットの尿サンプルを、メタノール約１mL、続いて水中１％(v／v)TEA約0.5mLでプレコンディショニングされている30mg オアシスHLB（Oasis HLB）カートリッジにかけること；
ｃ）カートリッジを水中１％(v／v)TEA約0.5mL及びメタノール中１％(v／v)ギ酸約0.5mLで洗浄すること；
ｄ）リセドロネートを、約３mM EDTAを含有する約60％(v／v)メタノールと約40％(v／v)水との混合物約0.75mLで真空下２回溶離すること；
ｅ）溶離した溶液をエバポレートし、そして約10％ (v／v)のメタノールと約90％(v／v)の約0.05M NH4Ac−NH4OH緩衝液との混合物約100μLで再構成してリセドロネート及びデオキシ（dexoy）−リセドロネートのサンプル混合物を得ること；及び
ｆ）サンプル混合物をLC−MS／MSシステムで分析すること；を含み、ここでリセドロネートとデオキシ（dexoy）−リセドロネートとをイナートシルフェニル（Inertsil Phenyl）−3 HPLCカラム上で溶液Ａ及び溶液Ｂの混合物を用いるグラジエント溶離によるHPLCにより分離し、そしてここで溶液Ａの量を約10％(v／v)から約95％(v／v)に増加させ、そして溶液Ａは水中約90％(v／v)メタノールであり、そして溶液Ｂは２％(v／v)トリエチルアミンを含有する約10mM 酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液である、方法である。
【００３１】
当然ながら、本発明は、言及される特定の実施態様の全ての適切な組み合わせを包含する。
【００３２】
例証としてのみ示され、本発明をその範囲に限定するとみなされるべきではない以下の実施例から、本発明はより明確となる。
【実施例】
【００３３】
工程１: マウス又はラットの尿中のリセドロネート尿標準の調製
１mg／mL リセドロネートストック溶液を、リセドロネートをHPCL等級の水に溶解することにより調製した。250μg／mL、100μg／mL及び50μg／mLのリセドロネート標準溶液を、250μL、100μL及び50μLの１mg／mLリセドロネートストック溶液をHPLC等級の水でそれぞれ希釈して１mLにすることにより調製した。250μg／mL、100μg／mL及び50μg／mLのリセドロネート標準溶液の適切な希釈を行って、25μg／mL、10μg／mL、５μg／mL、2.5μg／mL及び１μg／mLのリセドロネート使用溶液（working solutions）を得た。リセドロネート（Riseronate）尿標準（10ng／mLから2500ng／mLの範囲）を、４μLの各使用溶液を0.4mLのマウス又はラットコントロール尿(すなわち、リセドロネートを投与されないマウスまたはラットからの尿)中に添加することにより調製した。
【００３４】
工程２: サンプル調製
リセドロネートを投与されているマウス又はラットから採取した0.4mL尿サンプルを、10×75mmガラス培養チューブに移した。100μLのストック内部標準溶液、すなわち10μg／mL デオキシ−リセドロネート水溶液、及び100μLの５％TEA水溶液を全てのリセドロネート尿標準及び尿サンプルにそれぞれ添加した。
【００３５】
サンプル抽出を、30mg オアシスHLB（Oasis HLB）カートリッジ（１mL、ウォーターズ社（Waters Corporation）により製造販売、カタログ番号: WAT094225）を用いて行った。カートリッジを、１mLメタノール、続いて水中１％ TEA 0.5mLでコンディショニングした。尿サンプルをカートリッジにかけた。このカートリッジを水中１％ TEA 0.5mL及びメタノール中１％ギ酸0.5mLで洗浄し、次いで検体及び内部標準を、３mM EDTAを含有する水中60％メタノールの混合物0.75mLを用いて２つの連続した溶離工程を使用して溶離した。サンプル抽出の間に、真空(5−15 Psi)を各工程で使用してカートリッジに液体を通した。溶離した溶液を窒素下37℃で70分間乾燥し、次いで残留物を100μLの10％メタノール／90％ 0.05 M NH4Ac−NH4OH緩衝液(pH 9.26)で再構成した。
【００３６】
工程３: LC−MS／MS分析
リセドロネートの分析を、シマズ（Shimadzu） LC−10ADポンプ、SCL−10A VPシステムコントローラ、リープテクノロジーズ（Leap Technologies） HTS PALオートサンプラー及びAPI 4000三連四重極質量分析計を含むAPI 4000 LC−MS／MSシステム（MDSサイエックス社(MDS Sciex)により販売）を使用して行った。
【００３７】
リセドロネート及び内部標準をイナートシルフェニル（Inertsil Phenyl）−3 HPLCカ
ラム（３μL、50×030mm、バリアン社（Varian, Inc.）により製造販売、カタログ番号: 0408−050×030）上で溶液Ａと溶液Ｂとの混合物で６分グラジエント溶離することにより分離し、ここで溶液Ａの量を10％から95％に増加させた。溶液Ａは水中90％メタノールであり、そして溶液Ｂは２％トリエチルアミンを含む10mM酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液(pH＝5.0)であった。流量を0.2mL／分で一定に維持した。サンプル(10μL 再構成)をHPLCカラム上に直接注入した。質量分析計を、リセドロネートについてネガティブモードで−58ボルトの衝突エネルギーにてトランジションm／z 281.9→63.1でモニタリングするようにプログラムした。m／z 265.8→79.2をデオキシ−リセドロネート内部標準を測定するために使用した。イオン源（source）温度を350℃に設定した。６分の分析実行時間を使用した。
【００３８】
結果
直線性（Linearity）
リセドロネートマウス又はラット尿標準についてのアッセイは、10ng／mLのLLOQで10から2500ng／mLまで直線であった。LLOQにおいて決定された真度（accuracy）は14.8％で精度（precision）は17.8％ (ｎ＝３）であった。バリデーションの間に得られた回帰パラメーターを表１に報告する。リセドロネートについて0.98又はそれ以上の相関係数を日間（day-to-day）の分析から得た。典型的な較正曲線を図６に示す。
【００３９】
【表１】
2010520489.tif 000005
【００４０】
特異性（specificity）
2.27の保持時間における小さなピークがマウスコントロール尿において見られたが、LLOQ(10ng／mL)のピーク高さはマウスコントロール尿におけるピーク強度の３倍より大きかった(図３及び図４を参照のこと)。従って、10ng／mLのリセドロネート濃度で定量することができる。
【００４１】
精度
精度は、研究の持続期間にわたって各コントロールレベルにおいて測定された濃度の変動のパーセント係数として表される。マウス尿におけるコントロールについての日内変動係数は2.2〜9.6％の範囲であった。３つの濃度レベルにおけるコントロールについての日間精度は5.2〜10.3％の範囲であった。標準についての日内及び日間の精度は0.3〜26％の範囲であった。
【００４２】
真度
アッセイ真度は、平均の測定された品質コントロール濃度と理論値との間のパーセント差として表される。
【００４３】
マウス尿コントロールについての日内アッセイ真度は−5.3〜4.4％の範囲であった。日間の真度は３つの濃度レベルのコントロールを使用して３日の分析日にわたって測定された。日内の真度は−4.0〜6.0％の範囲であった。マウス尿標準の逆算した濃度からの真度は±15％以内であった。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
【表３】
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【００４６】
回収率
希釈せずにスパイクして（with neat spiked）抽出したマウス尿ブランクと比較した場合の抽出されたマウス尿中のリセドロネートの回収率は約51.3％であった。
【００４７】
【表４】
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【００４８】
本発明は、その趣旨又は本質的な特性から逸脱することなく他の具体的な形態で具現化され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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