(57)【要約】  本発明は、神経変性障害又は神経炎症障害を有する哺乳動物の治療に対する応答をモニタリングする方法に関する。本発明の好ましい実施の形態によれば、当該方法は、ａ）放射標識PBRリガンドを使用して該哺乳動物を画像化する工程と、ｂ）該哺乳動物に、少なくとも１つの抗アミロイド剤又は抗神経炎症剤を投与する工程と、ｃ）放射標識PBRリガンドを使用して工程b）の該哺乳動物を画像化する工程と、ｄ）該放射標識ＰＢＲリガンドからのシグナルによって中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症のレベルを決定する工程とを含む。
2010521651.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性障害又は神経炎症障害を有する哺乳動物の治療に対する応答をモニターする方法であって、
ａ）放射標識PBRリガンドを使用して該哺乳動物を画像化する工程と、
ｂ）該哺乳動物に、少なくとも１つの抗アミロイド剤又は抗神経炎症剤を投与する工程と、
ｃ）放射標識PBRリガンドを使用して工程b）の該哺乳動物を画像化する工程と、
ｄ）該放射標識ＰＢＲリガンドからのシグナルによって中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症のレベルを決定する工程とを含む、方法。
【請求項２】
ａ）、ｂ）及び／又はｃ）の工程を必要に応じて繰り返す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
神経変性障害又は神経炎症障害を有する哺乳動物に対する神経変性障害又は神経炎症障害のための治療に対する応答をモニターする方法であって、
ａ）該治療前に放射標識ＰＢＲリガンドを使用して該哺乳動物を画像化する工程と、
ｂ）該治療後に放射標識ＰＢＲリガンドを使用して工程a)の該哺乳動物を画像化する工程と、
ｃ）該放射標識末端ＰＢＲリガンドからのシグナルを使用して中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症のレベルを決定する工程とを含む、方法。
【請求項４】
ａ）及び／又はｂ）の工程を必要に応じて繰り返す、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
神経変性障害又は神経炎症障害を有する哺乳動物の神経変性障害又は神経炎症障害のための治療に対する応答をモニターする方法であって、
ａ）該哺乳動物に放射標識ＰＢＲリガンドを投与して該哺乳動物を画像化する工程と、
ｂ）該放射標識ＰＢＲリガンドからのシグナルを使用して中枢神経系の神経炎症のレベルを決定する工程とを含む、方法。
【請求項６】
ａ）の工程を必要に応じて繰り返す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記シグナルを相互に比較する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記放射標識ＰＢＲリガンドが、Ｎ−（５−フルオロ−２−フェノキシフェニル）−N−（２−［18F］フルオロエトキシ−５−メトキシベンジル）アセトアミド（以下 [18F]FE-DAA1106という）である、請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患は、アルツハイマー病である、請求項１から８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患が、多発性硬化症である、請求項１から８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
放射標識した末梢性ベンゾジアゼピン受容体リガンドの、神経変性障害又は神経炎症障害の治療に対する応答をモニターするための組成物を調製するための使用。
【請求項１２】
前記疾患は、アルツハイマー病又は多発性硬化症である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記[18F]FE-DAA1106である、請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項１４】
神経変性障害又は神経炎症障害の治療に対する応答をモニターするための、放射標識ＰＢＲリガンド又は該リガンドを含む組成物。
【請求項１５】
前記疾患は、アルツハイマー病又は多発性硬化症である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
前記放射標識ＰＢＲリガンドが、[18F]FE-DAA1106である、請求項１４又は１５に記載のリガンド又は組成物。
【請求項１７】
神経変性障害又は神経炎症障害の治療をモニターするための、放射標識ＰＢＲリガンドを含むキット又はシステム。
【請求項１８】
前記疾患は、アルツハイマー病又は多発性硬化症である、請求項１７に記載のキット又はシステム。
【請求項１９】
前記放射標識ＰＢＲリガンドが、[18F]FE-DAA1106である、請求項１７又は１８に記載のキット又はシステム。
【請求項２０】
凝集アミロイドに関連する疾患を有する哺乳動物を治療するのに有用な物質を同定する方法であって、
ａ）関心のある物質を非ヒト哺乳類に投与する工程と、
ｂ）該非ヒト哺乳類を、放射標識ＰＢＲリガンドで画像化する工程と、
ｃ）必要に応じて工程ａ）及びｂ）を繰り返す工程と、
ｄ）該放射標識ＰＢＲリガンドからのシグナルに基づき、該哺乳動物の神経炎症状態を改善する物質を選択する工程とを含む、方法。
【請求項２１】
前記疾患は、アルツハイマー病である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記放射標識ＰＢＲリガンドが、[18F]FE-DAA1106である、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２０から２２の何れか１項に記載の方法によって同定された物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願No.US60/906183の優先権を主張するものであり、その内容を参照により本願に取り込む。
本発明は、PETで実施される、凝集アミロイドに関連する疾患、特にアルツハイマー病を有する対象における、神経炎症、および抗アミロイド療法の経時的定量評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（AD）の診断は、神経病理医が剖検脳を調べてAD特有のアミロイド病変をスコア化しなければ、確定しない。AD特有のアミロイド病変としては老人斑と神経原線維変化が知られており、機序的に神経変性過程と関連があると考えられている。
【０００３】
アミロイド線維と反応し得るイメージング剤を開発することにより、ポジトロン断層撮影（PET）を用いてヒト脳のアミロイド沈着を非侵襲的に画像化する試みが行われてきた（Sair et al., 2004; Nichols et al., 2006）。このようなイメージング剤の中ではN-[11C]メチル-2-(4'-メチルアミノフェニル)-6-ヒドロキシベンゾチアゾール（Pittsburgh Compound-Bとしても知られている [11C]6-OH-BTA-1）がヒトPET試験において最も重点的に評価されている（Klunk et al., 2004; Price et al., 2005; Mintun et al., 2006; Engler et al., 2006）。軽度認知障害（MCI）患者（Price et al., 2005）および認知障害のない集団（Mintun et al., 2006）における [11C]6-OH-BTA-1のアミロイド検出能から、このプローブでADが臨床発現する前にその病変を特定できる可能性が示唆された。しかし、上記の文献で提示された証拠から研究者は、アミロイド病変に関する生前の病期分類への [11C]6-OH-BTA-1の適用可能性とMCI患者およびAD患者での疾患改善候補治療薬評価への適用可能性に疑問を持つようにもなった。それは、疾患の初期で放射性トレーサーの蓄積量が飽和状態に達しうる(appear to plateau)からである（Price et al., 2005; Engler et al., 2006）。加えて、ヒト脳でのアミロイドと関連のない幾つかの領域においてこのトレーサー及び他のアミロイドトレーサーが著明に蓄積したことから（Klunk et al., 2004; Shoghi-Jadid et al., 2002; Verhoeff et al., 2004）、神経変性病変に対するこのイメージング法の特異性については議論の余地がある。
【０００４】
初期から感度が高い脳アミロイド症マーカーや、AD進行における神経病理学的重症度の客観的測定に適した放射性リガンドを効率よく開発するには、in vivoシステムを用いた候補化合物の前臨床スクリーニングが大いに求められる。このようなシステムが、神経毒性アミロイド凝集を抑制し得る新規治療法のコンセプト検証（proof-of-concept）試験（Scarpini et al., 2003）を促進する可能性もある。
【０００５】
家族性ADを引き起こすヒト変異型アミロイド前駆体蛋白（APP）を過剰発現し、AD脳の斑病変を再現するトランスジェニック（Tg）マウスには、さまざまな系統がある（Hsiao et al., 1996; Sturchler-Pierrat et al., 1997）。
【０００６】
種々の研究が示すように（Bacskai et al., 2003; Hintersteiner et al., 2005; Higuchi et al., 2005）、蛍光プローブ及びMRIプローブは、これらの動物で脳アミロイドを検出できる方法を提供する。しかし、光学的トレーサーおよびMRIトレーサーは、PETスキャンで必要な用量（0.1〜1nmol）よりはるかに多い0.1〜1 mmolの用量で投与する必要があるため、特に経時的に複数回スキャンを実施する実験においてアミロイド病態の経過に影響を及ぼす可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bacskai BJ, Hickey GA, Skoch J, Kajdasz ST, Wang Y, Huang GF, Mathis CA, Klunk WE, Hyman BT (2003) Four-dimensional multiphoton imaging of brain entry, amyloid binding, and clearance of an amyloid-beta ligand in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 100:12462-12467.
【非特許文献２】Cummings JL, Cole G (2002) Alzheimer disease. JAMA 287:2335-2338.
【非特許文献３】Dodel RC, Hampel H, Du Y (2003) Immunotherapy for Alzheimer's disease. Lancet Neurol 2:215-220.
【非特許文献４】Engler H, Forsberg A, Almkvist O, Blomquist G, Larsson E, Savitcheva I, Wall A, Ringheim A, Langstrom B, Nordberg A (2006) Two-year follow-up of amyloid deposition in patients with Alzheimer's disease. Brain 129:2856-2866.
【非特許文献５】Higuchi M, Iwata N, Matsuba Y, Sato K, Sasamoto K, Saido TC (2005) 19F and 1H MRI detection of amyloid b plaques in vivo. Nat Neurosci 8:527-533.
【非特許文献６】Hintersteiner M, Enz A, Frey P, Jaton AL, Kinzy W, Kneuer R, Neumann U, Rudin M, Staufenbiel M, Stoeckli M, Wiederhold KH, Gremlich HU (2005) In vivo detection of amyloid-beta deposits by near-infrared imaging using an oxazine-derivative probe. Nat Biotechnol 23:577-583.
【非特許文献７】Hsiao K, Chapman P, Nilsen S, Eckman C, Harigaya Y, Younkin S, Yang F, Cole G. (1996) Correlative memory deficits, Aβ elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science 274:99-102.
【非特許文献８】Ichise M, Liow JS, Lu JQ, Takano A, Model K, Toyama H, Suhara T, Suzuki K, Innis RB, Carson RE (2003) Linearized reference tissue parametric imaging methods: application to [11C]DASB positron emission tomography studies of the serotonin transporter in human brain. J Cereb Blood Flow Metab 23:1096-1112.
【非特許文献９】Klunk WE, Engler H, Nordberg A, Wang Y, Blomqvist G, Holt DP, Bergstrom M, Savitcheva I, Huang GF, Estrada S, Ausen B, Debnath ML, Barletta J, Price JC, Sandell J, Lopresti BJ, Wall A, Koivisto P, Antoni G, Mathis CA, Langstrom B (2004) Imaging brain amyloid in Alzheimer's disease with Pittsburgh Compound-B. Ann Neurol 55:306-319.
【非特許文献１０】Klunk WE, Lopresti BJ, Ikonomovic MD, Lefterov IM, Koldamova RP, Abrahamson EE, Debnath ML, Holt DP, Huang GF, Shao L, DeKosky ST, Price JC, Mathis CA (2005) Binding of the positron emission tomography tracer Pittsburghcompound-B reflects the amount of amyloid-β in Alzheimer's disease brain but not in transgenic mouse brain. J Neurosci 25:10598-10606.
【非特許文献１１】Lammertsma AA, Bench CJ, Hume SP, Osman S, Gunn K, Brooks DJ, Frackowiak RS (1996) Comparison of methods for analysis of clinical [11C]raclopride studies. J Cereb Blood Flow Metab 16:42-52.
【非特許文献１２】Lee VM (2002) Amyloid binding ligands as Alzheimer's disease therapies. Neurobiol Aging 23:1039-1042.
【非特許文献１３】Lockhart A, Ye L, Judd DB, Merritt AT, Lowe PN, Morgenstern JL, Hong G, Gee AD, Brown J (2005) Evidence for the presence of three distinct binding sites for the thioflavin T class of Alzheimer's disease PET imaging agents on β-amyloid peptide fibrils. J Biol Chem 280:7677-7684.
【非特許文献１４】Masuda M, Suzuki N, Taniguchi S, Oikawa T, Nonaka T, Iwatsubo T, Hisanaga S, Goedert M, Hasegawa M (2006) Small molecule inhibitors of α-synuclein filament assembly. Biochemistry 45:6085-6094.
【非特許文献１５】Mintun MA, Larossa GN, Sheline YI, Dence CS, Lee SY, Mach RH, Klunk WE, Mathis CA, DeKosky ST, Morris JC (2006) [11C]PIB in a nondemented population: potential antecedent marker of Alzheimer disease. Neurology 67:446-452.
【非特許文献１６】Nichols L, Pike VW, Cai L, Innis RB (2006) Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease? Biol Psychiatry 59:940-947.
【非特許文献１７】Nicoll JA, Wilkinson D, Holmes C, Steart P, Markham H, Weller RO (2003) Neuropathology of human Alzheimer disease after immunization with amyloid-β peptide: a case report. Nat Med 9:448-452.
【非特許文献１８】Noguchi J, Suzuki K (2003) Automated synthesis of the ultra high specific activity of [11C]Ro15-4513 and its application in an extremely low concentration region to an ARG study. Nucl Med Biol 30:335-343.
【非特許文献１９】Orgogozo JM, Gilman S, Dartigues JF, Laurent B, Puel M, Kirby LC, Jouanny P, Dubois B, Eisner L, Flitman S, Michel BF, Boada M, Frank A, Hock C. (2003) Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Aβ42 immunization. Neurology 61:46-54.
【非特許文献２０】Price JC, Klunk WE, Lopresti BJ, Lu X, Hoge JA, Ziolko SK, Holt DP, Meltzer CC, DeKosky ST, Mathis CA (2005) Kinetic modeling of amyloid binding in humans using PET imaging and Pittsburgh Compound-B. J Cereb Blood Flow Metab 25:1528-1547.
【非特許文献２１】Sair HI, Doraiswamy PM, Petrella JR (2004) In vivo amyloid imaging in Alzheimer's disease. Neuroradiology 46:93-104.
【非特許文献２２】Sato K, Higuchi M, Iwata N, Saido TC, Sasamoto K (2004) Fluoro-substituted and 13C-labeled styrylbenzene derivatives for detecting brain amyloid plaques. Eur J Med Chem 39:573-578.
【非特許文献２３】Scarpini E, Scheltens P, Feldman H (2003) Treatment of Alzheimer's disease: current status and new perspectives. Lancet Neurol 2:539-547.
【非特許文献２４】Shoghi-Jadid K, Small GW, Agdeppa ED, Kepe V, Ercoli LM, Siddarth P, Read S, Satyamurthy N, Petric A, Huang SC, Barrio JR (2002) Localization of neurofibrillary tangles and beta-amyloid plaques in the brains of living patients with Alzheimer disease. Am J Geriatr Psychiatry 10:24-35.
【非特許文献２５】Sturchler-Pierrat C, Abramowski D, Duke M, Wiederhold KH, Mistl C, Rothacher S, Ledermann B, Burki K, Frey P, Paganetti PA, Waridel C, Calhoun ME, Jucker M, Probst A, Staufenbiel M, Sommer B (1997) Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proc Natl Acad Sci U S A 94:13287-13292.
【非特許文献２６】Suzuki K, Inoue O, Hashimoto K, Yamasaki T, Kuchiki M, Tamate K (1985) Computer-controlled large scale production of high specific activity [11C]RO 15-1788 for PET studies of benzodiazepine receptors. Int J Appl Radiat Isot 36:971-976.
【非特許文献２７】Tai YC, Ruangma A, Rowland D, Siegel S, Newport DF, Chow PL, Laforest R (2005) Performance evaluation of the microPET focus: a third-generation microPET scanner dedicated to animal imaging. J Nucl Med 46:455-463.
【非特許文献２８】Toyama H, Ye D, Ichise M, Liow JS, Cai L, Jacobowitz D, Musachio JL, Hong J, Crescenzo M, Tipre D, Lu JQ, Zoghbi S, Vines DC, Seidel J, Katada K, Green MV, Pike VW, Cohen RM, Innis RB (2005) PET imaging of brain with the β-amyloid probe, [11C]6-OH-BTA-1, in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Eur J Nucl Med Mol Imaging 32:593-600.
【非特許文献２９】Verhoeff NP, Wilson AA, Takeshita S, Trop L, Hussey D, Singh K, Kung HF, Kung MP, Houle S (2004) In-vivo imaging of Alzheimer disease β-amyloid with [11C]SB-13 PET. Am J Geriatr Psychiatry 12:584-595.
【非特許文献３０】Wilcock DM, DiCarlo G, Henderson D, Jackson J, Clarke K, Ugen KE, Gordon MN, Morgan D (2003) Intracranially administered anti-Aβ antibodies reduce β-amyloid deposition by mechanisms both independent of and associated with microglial activation. J Neurosci 23:3745-3751.
【非特許文献３１】Ye L, Morgenstern JL, Gee AD, Hong G, Brown J, Lockhart A (2005) Delineation of positron emission tomography imaging agent binding sites on β-amyloid peptide fibrils. J Biol Chem 280:23599-23604.
【非特許文献３２】Yoshiyama Y, Higuchi M, Zhang B, Huang SM, Iwata N, Saido TC, Maeda J, Suhara T, Trojanowski JQ, Lee VM (2007) Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron 53:337-351.
【非特許文献３３】Zhang MR, Maeda J, Ogawa M, Noguchi J, Ito T, Yoshida Y, Okauchi T, Obayashi S, Suhara T, Suzuki K (2004) Development of a new radioligand, N-(5-fluoro-2-phenoxyphenyl)-N-(2-[18F]fluoroethyl-5-methoxybenzyl)acetamide, for pet imaging of peripheral benzodiazepine receptor in primate brain. J Med Chem 47:2228-2235.
【非特許文献３４】Zhang MR, Suzuki K (2005) Sources of carbon which decrease the specific activity of [11C]CH3I synthesized by the single pass I2 method. Appl Radiat Isot 62:447-450.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらの方法の感受性を増強するために検出装置とイメージング剤の両方について改良が試みられているが、PETによるマウスのアミロイド関連病変の画像化により、生体脳におけるアミロイド沈着の動的状態を最低限の侵襲(interference)でモニタリングする新しい道が開かれるだろう。
【０００９】
また、PETイメージングは、特定目的のためのイメージングプローブを柔軟に設計できるという追加の利点をもたらし、それによって、同一個体内の種々の生体分子を標的とすることができるようになる。これは、アミロイドβペプチド（Aβ）免疫および関連のあるその他の抗アミロイド療法（Dodel et al., 2003）の機序を評価する上でもっとも重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
我々は、グリア細胞活性を追跡するために我々が最近開発した、末梢性ベンゾジアゼピン受容体（PBR）のPETリガンド（Zhang et al., 2004）、より具体的にはＮ−（５−フルオロ−２−フェノキシフェニル）−N−（２−［18F］フルオロエトキシ−５−メトキシベンジル）アセトアミド（いわゆる [18F]fluoroethyl(FE)-DAA1106）を使用して、好ましくはアミロイドプローブと併用して、治療効果および有害効果に対する神経炎症の関与を経時的に評価できることを見出した。
【００１１】
従って、本発明の一の実施の形態によれば、神経変性障害又は神経炎症障害を有する哺乳動物の治療をモニターする方法であって、
ａ）放射標識ＰＢＲリガンドを使用して当該哺乳動物を画像化する工程と、
ｂ）少なくとも１つの抗アミロイド剤又は抗神経炎症剤を、当該哺乳動物に投与する工程と、
ｃ）ステップｂ）の哺乳動物を、放射標識ＰＢＲリガンドを使用して画像化する工程と、
ｄ）当該放射標識ＰＢＲリガンドからのシグナルによって中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症のレベルを決定する工程とを含む、方法が提供される。
【００１２】
ａ）、ｂ）及び／又はｃ）の工程は必要に応じて繰り返すことができる。
【００１３】
本発明の他の実施の形態によれば、神経変性障害又は神経炎症障害を有し、神経変性障害又は神経炎症障害のための治療を受ける又は受けた哺乳動物の治療に対する応答をモニターする方法であって、
ａ）治療前に放射標識ＰＢＲリガンドを使用して当該哺乳動物を画像化する工程と、
ｂ）放射標識ＰＢＲリガンドを使用して工程a)の哺乳動物を画像化する工程と、
ｃ）当該放射標識ＰＢＲリガンドによって得られるシグナルを使用して中枢神経系の神経炎症のレベルを比較する工程とを含む、方法が提供される。
【００１４】
ａ）、ｂ）及び／又はｃ）の工程は必要に応じて繰り返すことができる。
本発明の他の実施の形態によれば、神経変性障害又は神経炎症障害を有する哺乳動物の神経変性障害又は神経炎症障害のための治療に対する応答をモニターする方法であって、
ａ）当該哺乳動物に放射標識ＰＢＲリガンドを投与して当該哺乳動物を画像化する工程と、
ｂ）当該放射標識ＰＢＲリガンドからのシグナルを使用して中枢神経系の神経炎症のレベルを決定する工程とを含む、方法が提供される。
【００１５】
ａ）の工程は必要に応じて繰り返すことができ、放射標識末梢性ベンゾアゼピン受容体からのシグナルを、相互に比較してもよい。
【００１６】
本発明の他の実施の形態は、放射標識ＰＢＲリガンド、好ましくは[18F]FE-DAA1106の、神経変性障害又は神経炎症障害の治療をモニターするために患者に投与するのに有用な組成物を調製するための使用に関する。
【００１７】
本発明のさらに他の実施の形態は、神経変性障害又は神経炎症障害の治療に対する応答をモニターするための、放射標識ＰＢＲリガンド又は当該リガンドを含む組成物、或いは当該リガンドを含むキット又はシステムに関する。
【００１８】
好ましい実施の形態によれば、疾患は、アルツハイマー病、多発性硬化症[18F]FE-DAA1106である。哺乳動物は、ヒトで有り得る。
【００１９】
本発明のさらに他の実施の形態は、凝集アミロイドに関連する疾患を有する哺乳動物を治療するのに有用な物質を同定する方法であって、
ａ）関心のある物質を非ヒト哺乳類に投与する工程と、
ｂ）当該非ヒト哺乳類を、放射標識ＰＢＲリガンド、好ましくは、[18F]FE-DAA1106で画像化する工程と、
ｃ）必要に応じて工程ａ）及びｂ）を繰り返す工程と、
ｄ）当該放射標識ＰＢＲリガンドからのシグナルに基づき、当該哺乳動物の神経炎症状態を改善する物質を選択する工程とを含む、方法に関する。
【００２０】
本発明のさらに他の実施の形態は、上述した方法によって同定された物質に関する。
【００２１】
化合物を投与するとは、当業者に知られている如何なるルートを介する投与も意味し、非制限的に、経口投与、注入による投与を含む。注入は、静脈投与(intravenously)、非経口投与(parenteral)又は皮下投与で有り得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１（Ａ）〜（Ｉ）は写真である。経時的ＰＥＴスキャンによって可視化された抗アミロイド治療の過程におけるアミロイドの除去及びグリア細胞の活性化を示す。（Ａ及びＢ）０〜６０分の動的データを平均化することにより作成され、ＭＲＩテンプレートに重ね合わせた、月齢２０ヶ月のAPP Tgマウス（Tg No.3）における[18F] FE-DAA1106のＰＥＴ画像（B）。イメージは、受動的Ａβ免疫の前（ＰＲＥ；左側のパネル）、１週間後（真中のパネル）及び２週間後（右側のパネル）に得た。賦形剤単独及び抗Ａβ抗体を、それぞれ左と右の海馬に注入した。（D）抗体を注入した海馬における（放射性トレーサーの投与後０〜６０分での）[18F] FE-DAA1106由来の放射能と、賦形剤を注入した海馬における[18F] FE-DAA1106由来の放射能の比は、抗体によって神経炎症応答の増加が誘発されること（左のパネル；繰返しのある２元配置分散分析(repeated-measures ANOVA)における時間の主効果についてF(2,4)= 16.7、p<0.05）、並びに処置後１及び２週間後での神経炎症とアミロイドとの間に緊密な相関があることを示した。実線は回帰直線を表す。（E-H）Tgマウス（Tg No.1）の免疫後２週間での左側（E及びG）及び右側（F及びH）の海馬における、２重蛍光標識したアミロイド（FSB;E及びF）及びミクログリア（Iba-1;G及びH）。（I）海馬でのFSB 陽性アミロイドの量は、左右で顕著な相違を示した（t検定によりp<0.05）。グラフの横線は平均値を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本試験の目的は、アミロイド形成を追跡する点および新規の抗アミロイド療法を評価する点での動物用PETの有用性(power)を証明することである。独立した2つの研究グループにより、大量のプラーク病変を発現したマウスの脳における[11C]6-OH-BTA-1-PETデータは、野生型（WT）マウスの脳のデータとほとんど差異がないことが実証されている（Klunk et al., 2005; Toyama et al., 2005）。マウスアミロイドを追跡する際にPETイメージングが感受性を示さないのは、AD脳と比較した場合、APP Tgマウスモデル脳では当該放射性リガンドに高い親和性を示す結合部位が少ないからかもしれない（Klunk et al., 2005）。このため、我々は、特殊なPBR放射性リガンド、[18F] FE-DAA1106を使用することにより、アミロイドに密接に関連する神経炎症変化を可視化して、この問題を克服した。
【００２４】
さらに、アミロイド放射性リガンドおよび[18F]FE-DAA1106を用いた計測法を併用してAβ免疫の経過を追跡することにより、生体 PETによるアミロイド測定の利点を強化した。
以下に述べる実施例によって、本発明を詳細に説明するが、本発明は、これら実施例によって限定されるべきではない。
【実施例１】
【００２５】
１．材料と方法
動物
動物は、米国衛生研究所の勧告および独立行政法人放射線医学総合研究所の施設ガイドラインに準拠して管理し、取り扱った。本試験で実施したすべての動物実験は、独立行政法人放射線医学総合研究所の動物実験倫理委員会の承認を受けた。
【００２６】
Sturchler-Pierrat et al., 1997に詳細に記述されているように、神経特異的Thy-1プロモーターエレメント制御下でスウェーデン型2重変異APP751を過剰発現するTgマウス（APP23マウスと称する）が作製された。この系統はC57BL/6Jの遺伝的背景（Background）が維持されており、実験では雌マウスを使用した。また、WT対照群として、雌の非Tgの同腹仔を使用した。
【００２７】
MRIテンプレートの作製
月齢12カ月のC57BL/6Jマウスを、致死量のペントバルビタールで麻酔した。Higuchi et al., 2005に記載されているように、マウス頭部を3%アガロース(aqueous agarose)で包埋し、9.4-Tesla Bruker AVANCE 400WBイメージング装置（Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany）を用いてスキャンした。以下のイメージングパラメータによる3D高速スピンエコー法を用いて、冠状断のT2強調MR画像を撮影した。パラメータは、TE = 5.5 ms、TR = 3,000 ms、RAREファクター= 32、撮像視野 (FOV) = 20 ´ 20 ´ 25 mm3、マトリクスのピクセル数(matrix dimensions) = 256 ´ 512 ´ 60、計算上の解像度 = 78 mm ´ 39 mm ´ 417 mmとした。MRIデータは、その後のPET試験用の解剖学的テンプレートとして使用した。
【００２８】
Zhang et al., 2004に詳細に記載されているように、PET用のPBR(a PET ligand for PBR)リガンドである [18F]FE-DAA1106を、その脱メチル前駆体DAA 1123（大正製薬, 東京、日本が十分量を提供）を用いて放射合成した。合成終了時に、最終産物の放射化学的純度は95%を超え、比放射能は120±20.5 GBq/mmolであった。
【００２９】
小動物用PETイメージング
PETスキャンは総て、げっ歯類および小型サル用に設計されたmicroPET Focus 220 動物用スキャナー（Siemens Medical Solutions USA, Knoxville, TN）を用いて実施した。本スキャナーでは、0.815 mm（中心間距離）間隔で95枚の横断スライスが得られる。横断面のFOVは19.0 cm、軸方向のFOVは7.6 cmであった（Tai et al., 2005）。
【００３０】
スキャン前に、1.5%（v/v）イソフルランでマウスに麻酔を行った。吸収補正( attenuation correction)のため68Ge-68Gaの点線源を用いてトランスミッションスキャンを実施後、[11C]6-OH-BTA-1 (30.0±6.8 MBq) または [18F]FE-DAA1106 (15.3±4.6 MBq) の静注直後にエミッションスキャンを3Dのリストモードで、エネルギー幅350〜750 keVにて60分間行った。リストモード・データはすべて３次元シノグラムに変換し(sorted)、その後フーリエ法で２次元シノグラムに変換した（フレームは、10 ´ 1、8 ´ 5及び1 ´ 10分）。ダイナミック画像は、0.5 mmハニング・フィルターを用いてフィルター補正逆投影法で再構成した。PMOD（登録商標）画像解析ソフト（PMOD Group, Zurich, Switzerland）を用いて、MRIテンプレートを基準に関心領域（VOIs）を複数の脳領域に設定した。
【００３１】
抗アミロイド療法の効果をモニタリングするに当たって、本イメージングシステムの能力を評価するために、Aβ受動免疫治療の間の複数の時点で、Tgマウスをスキャンした。確立された手法（Wilcock et al., 2003）に基づき、抗Aβ抗体を海馬内に注入した。月齢20、21、および24カ月のTgマウス3匹を1.5%（v/v）イソフルランで麻酔し、定位脳固定装置( Stereotactic frame)（Narishige, Tokyo, Japan）で固定した。ハミルトン・シリンジ10 mlに接続した30ゲージ針を用いて、Aβのアミノ末端部分に対するマウスモノクローナル抗体1 ml（6E10; Signet Laboratories, Dedham, MA; 1 mg/ml）および賦形剤単独をそれぞれ右海馬および左海馬に2分かけて注入した（定位脳座標：十字縫合から前後方向に-2.8 mm、中外側に2.0 mm、背腹側に3.0 mmの位置）。その後針を1 mmだけ上げて、1 ml溶液の注入を繰り返した。[18F]FE-DAA1106を用いるPETスキャンを合計３回、抗体注入の1〜2週前と1〜2週後に各マウスに対し実施した。その後、マウス脳を切開し、FSBと、イオン化カルシウム結合アダプター分子1に対するウサギポリクローナル抗体（Iba-1; 和光純薬、大阪、日本）を用いて組織化学検査を実施し、ミクログリアを確認した。
【００３２】
統計解析
本試験の総ての統計的検討は、SPSSソフトウェア（SPSS, Chicago, IL）で実施した。部位間およびWTマウスとTgマウスとの間で放射性トレーサーの取り込みを比較するために、繰り返し測定による2元配置分散分析（ANOVA）を実施した。放射性トレーサーの取り込みの年齢及びアミロイド量との相関関係は、ｔ検定で試験した。
【００３３】
２．結果
抗アミロイド療法後に経時的にアミロイド量を評価する本画像化システムの有用性が、受動的Aβ免疫(Wilcock et al., 2003)の目的で抗Aβ抗体を海馬に注入する１、２週間前と１、２週間後におけるTｇマウスの複数回PETスキャンによって支持された。[18F]FE-DAA1106を用いてPETでモニタリングすることで、同じ個体のPETスキャンは注入した抗体によって際立った神経炎症が誘導されることが示された（図１B）。PBRレベルの左右の比は、抗体で処理した海馬におけるグリア細胞の際立った活性化を表した（図１Dの左パネル）。抗体注入に対する神経炎症応答の大きさは、アミロイドの存在量と有意な相関を示した（図１Dの右パネル）。Aβ免疫の治療効能は、直接的に、摘出脳の顕微鏡検査によって確認され、際立ったアミロイド量の減少（図１E,1F,1I）及び活性化した(hypertropic)ミクログリアの増加（図１G及び１H）が実証された。抗体注入した海馬と非処置の海馬との間でのアミロイド量の平均値の差は、２８．１％であった。
【００３４】
３．考察
本研究は、ヒトに適用してきたイメージング用プローブが、生体動物モデルにおいてアミロイドに関連した神経炎症を非侵襲的に画像化できるという明確な証拠を初めて提示している。これにより、同じ定量的指標を用いてヒトとマウスのアミロイド形成過程を比較評価することが可能になるため、両種におけるアミロイド病原性の機序を理解するのが支援される。さらに、年齢の関数として、および治療に対する応答において、アミロイド量の変化を定量的に評価する際の経時的PET試験の有用性を初めて立証し、特に前臨床用および臨床研究用の客観的診断基準および評価項目の探索の点で、今回の成果の技術的意義が証明された。
【００３５】
非放射性アプローチに比し、PET測定に必要なイメージング剤はごく少量であるため、われわれの方法はマウスの脳アミロイドをモニタリングするのに安全なツールと言え、明白な毒性は認められない。PET試験では、注入したアミロイド結合トレーサーのアミロイド形成に対する薬理学的影響が顕著でないと考えられるので（Lee, 2002; Masuda et al., 2006）、この長所は特に重要である。今回の観察結果は、アミロイドに関連する神経炎症のPETイメージングが、ADの病態的過程を変える治療戦略の前臨床評価を確実にし、これらの治療の臨床試験で定量的評価指標を提供する可能性があることを示唆する。
【００３６】
本書で証明されたように、同一個体におけるマルチスキャンPET試験は、統計的検出力が高いという利点を有し、実際に、Aβ免疫の炎症反応に及ぼす影響を統計的に検討するにはTgマウス3匹の解析で十分であった（図１C、１D）。さらに、免疫化後のグリア活性の程度はAβアミロイドの量と密接に関係している。Aβワクチンを受けたAD患者おける髄膜脳炎の発生症例（Orgogozo et al., 2003; Nicoll et al., 2003）で例示されるように、過度の神経炎症は神経毒性傷害を引き起こす可能性がある。さらに、神経原線維変化モデルマウスに関して、トリチウム標識DAA1106を用いて実施したわれわれの最近の研究では、ADおよびその他のタウオパチー脳におけるミクログリアの過度の活性化がタウ蛋白病理を加速し、神経死(neuronal loss)を促進することが示された（Yoshiyama et al., 2007）。したがって、今回の結果は、アミロイド病理が初期の段階で治療的介入を開始して有害作用を最小限にする必要性を示唆し、処置プロトコルを最適化する際に、[18F]FE-DAA1106とアミロイド放射リガンドとの併用が有用であることを裏付けている。
【００３７】
PETスキャナーの空間分解能（1.5 mm以下）など、さらに改良すべき技術的側面がいくつかあるが（Tai et al., 2005）、われわれの結果は、アミロイド沈着の分子制御因子を明らかにするため、及び治療的介入に対する新たなアプローチの機序的概念を立証するためのマイクロPETの有用性を合理的に説明する（Scarpini et al., 2003; Dodel et al., 2003）。この生体イメージングシステムは、前臨床段階において同一個体内で多数の候補アミロイドプローブの薬物動態的特性を比較するのに効率的な戦略ももたらす。このような試験では、高比放射能リガンドを使用して、マウス斑の親和性の高い構成要素を高感度に追跡することにより、ヒトおよびマウスにおけるアミロイド凝集体の性質の違いを克服し、マウスでの結果をヒトに外挿できるようになる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
我々は、生体アミロイド前駆体蛋白トランスジェニック（Tg）マウスにおけるアミロイドに関連した神経炎症を定量的に可視化する際の、高解像度ポジトロン断層撮影（PET）イメージングシステムの能力について最初の証拠を提示する。アミロイドβペプチドに対する抗体を用いた抗アミロイド処置によって誘導される神経炎症は、処置の経過に沿って[18F]FE-DAA1106を用いてPETスキャンすることによって成功裡にモニタリングすることができ、アミロイド量に密接に相関することが見出された。
【００３９】
我々の結果は、適切なTgモデルとの組み合わせにおいて、小動物用PETシステムが、モデルマウスにおけるアミロイド形成の機序特性を明らかにするだけでなく、アルツハイマー病に対する新たな診断的・治療的アプローチの前臨床試験にとっても役立つことを裏付けている。
【図１】
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【国際調査報告】
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