(57)【要約】本発明は、SEQ ID NO:01を含むポリペプチドおよびその断片の群より選択される第1のポリペプチド、ならびに抗融合性ペプチドの群より選択される第2のポリペプチドを含む、ポリペプチド結合体を報告する。2010520868.tif 000008
2010520868.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むことを特徴とする、ポリペプチド結合体:
a)SEQ ID NO:01を含むポリペプチドおよびその断片の群より選択される第1のポリペプチド、
b) 抗融合性(antifusogenic)ペプチドの群より選択される第2のポリペプチド。
【請求項２】
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが、以下の順序群:
N末端-第1のポリペプチド-第2のポリペプチド-C末端、または
N末端-第2のポリペプチド-第1のポリペプチド-C末端、
より選択される順序を有することを特徴とする、請求項1記載の結合体。
【請求項３】
第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの間にリンカーポリペプチドを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の結合体。
【請求項４】
a)SEQ ID NO:01を含むポリペプチドおよびその断片の群より選択される第1のポリペプチド(1st pp)、
b)抗融合性ペプチドの群より選択される第2のポリペプチド(2nd pp)、
c)抗CCR5抗体の抗原結合性断片の群、または抗HIV-1抗体の抗原結合性断片、または抗CD4抗体の抗原結合性断片の群より選択される任意の第3のポリペプチド(3rd pp)、
d)該第1のポリペプチド、該第2のポリペプチド、および/または該第3のポリペプチドを接続する、任意のリンカーポリペプチド(link pp)
を含むことを特徴とする、ポリペプチド結合体であって、
該ポリペプチド結合体のポリペプチドが、N末端からC末端に向かって、
[1st pp] a-[link pp] m-[2nd pp] b-[link pp] n-[3rd pp] c-[link pp] o-[1st pp] d-[link pp] p-[2nd pp] e-[link pp] q-[3rd pp] f-[link pp] r-[1st pp] g
の順序を有し、
式中、a、b、c、d、e、f、g、m、n、o、p、q、rは全て0または1の値の整数であり、
a+d+g=1、
b+e=1、
c+f=0または1であり、
m、n、o、p、q、rは互いに独立して0または1のいずれかであり、
0は存在しないことを示し、かつ1は、該結合体の対応する位置に、対応するポリペプチドが存在することを示す、ポリペプチド結合体。
【請求項５】
リンカーポリペプチドが、SEQ ID NO:20〜SEQ ID NO:48を含むポリペプチドの群より選択されることを特徴とする、請求項3または4記載の結合体。
【請求項６】
第2のポリペプチドが、SEQ ID NO:08〜SEQ ID NO:19を含む抗融合性ペプチドの群より選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の結合体。
【請求項７】
請求項1または4記載のポリペプチド結合体を生成する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法:
a)請求項1または4記載のポリペプチド結合体をコードする核酸を含む宿主細胞を、ポリペプチド結合体の発現に適した条件下で培養する工程、および
b)細胞または培地からポリペプチド結合体を回収する工程。
【請求項８】
請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチド結合体または薬学的に許容されるその塩を、薬学的に許容される賦形剤または担体と共に含有する、薬学的組成物。
【請求項９】
ウイルス感染治療用の医用薬剤を製造するための、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチド結合体の使用。
【請求項１０】
ウイルス感染がHIV感染であることを特徴とする、請求項9記載の使用。
【請求項１１】
抗ウイルス治療を必要とする患者を治療するための、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチド結合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗融合性(antifusogenic)ペプチドおよび補体因子C1q球状ヘッド(globular head)由来ポリペプチドの結合体を報告する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞へのHIVウイルスの感染は、感染される細胞の膜とウイルス膜が融合するプロセスによって起こる。このプロセスの一般スキームが提案されている。ウイルスエンベロープ糖タンパク複合体(gp120/gp41)が、感染される細胞の膜上にある細胞表面受容体と相互作用する。gp120が、例えば、CD4受容体と、CCR-5またはCXCR-4などのコレセプターに結合すると、gp120/gp41複合体のコンホメーションが変化する。このコンホメーション変化の結果、gp41タンパク質は標的細胞の膜内に挿入することができる。この挿入は膜融合プロセスの始まりである。
【０００３】
gp41タンパク質のアミノ酸配列は、天然の多型のために、異なるHIV株間で異なることが分かっている。しかし、同じドメイン構造、正確には、(N末端からC末端方向に向かって)融合シグナル、2個のヘプタッド(heptad)反復ドメイン(HR1、HR2)、および膜貫通ドメインが認められる。融合(または融合性)ドメインは、細胞膜への挿入および細胞膜の崩壊に関与していることが示唆されている。HR領域は、7個のアミノ酸(「ヘプタッド」)からなる複数の配列から構築される(例えば、Shu, W.,et al., Biochemistry 38 (1999) 5378-5385(非特許文献1)を参照されたい)。ヘプタッドの他に、1つまたは複数のロイシンジッパー様モチーフが存在する。この組成は、gp41タンパク質のコイルドコイル構造が形成される理由を説明しており、これらのドメインに由来するペプチドが形成される理由も説明している。コイルドコイルは、一般的に、2個またはそれ以上の相互作用へリックスからなるオリゴマーである。
【０００４】
gp41のHR1ドメインまたはHR2ドメインから推定されるアミノ酸配列を有するペプチドは、インビトロおよびインビボにおいてHIVが細胞に取り込まれるのを阻害する有効な薬剤である(例えば、ペプチド、例えば、US5,464,933(特許文献1)、US5,656,480(特許文献2)、US6,258,782（特許文献3）、US6,348,568(特許文献4)、またはUS6,656,906(特許文献5)を参照されたい)。例えば、T20(DP178、Fuzeon(登録商標)、HR2ペプチドとしても知られる)およびT651(US6,479,055(特許文献6))は、非常に強力なHIV感染阻害薬である。例えば、アミノ酸置換または化学的架橋により、HR2由来ペプチドの効力を増強することが試みられている(Sia, S. K., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 14664-14669(非特許文献2); Otaka, A., et al, Angew. Chem. Int. Ed. 41 (2002) 2937-2940(非特許文献3))。
【０００５】
ヒトの先天性免疫は補体経路を含む。この経路は、C1補体因子の認識サブユニットであるC1qと免疫標的が結合することによって活性化される。完全なC1q分子は、C1qA、C1qB、およびC1qCと表される3種類のモノマー基本要素からなるコピーを6個含むヘテロマー分子である。各モノマー単位は、N末端領域(3〜9残基)、コラーゲン様ドメイン(約81残基に及ぶ)、および球状ドメイン(球状ヘッド;約135残基に及ぶ)を含む(Sellar, G. C., et al. Biochem.J. 274 (1991) 481-490(非特許文献4))。
【０００６】
Moirらは、HIV-1が補体経路の活性化を介してB細胞に感染することを報告している(Moir, S., et al., J. Exp. Med. 192 (2000) 637-646(非特許文献5))。ヒト補体経路の活性化は、gp41の免疫優性領域(gp160の位置590-620;Ratner, L., et al., Nature 313 (1985) 277-284(非特許文献6))による番号付け)と補体因子C1qが結合することにより現れる(Ebenbichler, C.F., J. Exp. Med. 174 (1991) 1417-1424(非特許文献7))。Thielensらは、ヒトC1のC1q小成分とHIV-1の膜貫通エンベロープ糖タンパク質gp41が、gp160のアミノ酸位置590-613の領域において相互作用することを報告している。この相互作用は、gp160のアミノ酸601-613を含み、ジスルフィド結合によってCys605とCys611が接続されているペプチドによって阻害することができる(Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 151 (1993) 6583-6592(非特許文献8))。  
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】US5,464,933
【特許文献２】US5,656,480
【特許文献３】US6,258,782
【特許文献４】US6,348,568
【特許文献５】US6,656,906
【特許文献６】US6,479,055
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Shu, W.,et al., Biochemistry 38 (1999) 5378-5385
【非特許文献２】Sia, S. K., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 14664-14669
【非特許文献３】Otaka, A., et al, Angew. Chem. Int. Ed. 41 (2002) 2937-2940
【非特許文献４】Sellar, G. C., et al. Biochem.J. 274 (1991) 481-490
【非特許文献５】Moir, S., et al., J. Exp. Med. 192 (2000) 637-646
【非特許文献６】Ratner, L., et al., Nature 313 (1985) 277-284
【非特許文献７】Ebenbichler, C.F., J. Exp. Med. 174 (1991) 1417-1424
【非特許文献８】Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 151 (1993) 6583-6592
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、SEQ ID NO:01を含むポリペプチドおよびその断片の群より選択される第1のポリペプチド、ならびに抗融合性ペプチドの群より選択される第2のポリペプチドを含む、ポリペプチド結合体を含む。
【００１０】
1つの態様において、本発明の結合体は、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを、以下の順序群:
N末端-第1のポリペプチド-第2のポリペプチド-C末端、
N末端-第2のポリペプチド-第1のポリペプチド-C末端
より選択される順序で含む。
【００１１】
別の態様において、本発明の結合体は、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの間にリンカーポリペプチドを含む。
【００１２】
さらに、本発明は、
a)SEQ ID NO:01を含むポリペプチドおよびその断片の群より選択される第1のポリペプチド(1st pp)、
b)抗融合性ペプチドの群より選択される第2のポリペプチド(2nd pp)、
c)抗原結合性抗CCR5抗体鎖、抗原結合性抗CD4抗体鎖、中和抗HIV-1抗体鎖、およびその断片の群より選択される任意の第3のポリペプチド(3rd pp)、
d)第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、および/または第3のポリペプチドを接続する、任意のリンカーポリペプチド(link pp)
を含む、ポリペプチド結合体を報告する。
【００１３】
このポリペプチド結合体において、構成ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
[1st pp] a-[link pp] m-[2nd pp] b-[link pp] n-[3rd pp] c-[link pp] o-[1st pp] d-[link pp] p-[2nd pp] e-[link pp] q-[3rd pp] f-[link pp] r-[1st pp] gの順序を有し、
式中、a、b、c、d、e、f、g、m、n、o、p、q、rは全て0または1の整数であり、
a+d+g=1、
b+e=1、
c+f=0または1であり、
m、n、o、p、q、rは互いに独立して0または1のいずれかである。
【００１４】
0の値は、対応するポリペプチドが、対応する位置に存在しないことを示し、かつ1の値は、対応するポリペプチドが、ポリペプチド結合体の対応する位置に存在することを示す。
【００１５】
1つの態様において、任意の第3のポリペプチドは、抗原結合性抗CCR5抗体鎖およびその断片の群より選択される。
【００１６】
別の態様において、任意の第3のポリペプチドは、抗原結合性抗CD4抗体鎖およびその断片より選択される。
【００１７】
別の抗HIV-1態様において、任意の第3のポリペプチドは、抗原結合性抗HIV-1抗体鎖およびその断片より選択される。
【００１８】
1つの態様において、リンカーポリペプチドは、SEQ ID NO:20〜SEQ ID NO:48を含むポリペプチドの群より選択される。
【００１９】
別の態様において、第2のポリペプチドは、SEQ ID NO: 08〜SEQ ID NO:19を含む抗融合性ペプチドの群より選択される。
【００２０】
本発明の別の局面は、本発明のポリペプチド結合をコードする核酸および本発明の核酸を含む真核細胞である。
【００２１】
さらに、本発明は、以下の工程:
a)本発明のポリペプチド結合体をコードする核酸を含む細胞を、ポリペプチド結合体の発現に適した条件下で培養する工程、および
b)細胞または培地からポリペプチド結合体を回収する工程
を含む、本発明のポリペプチド結合体を生成する方法を含む。
【００２２】
本発明はまた、本発明のポリペプチド結合体または薬学的に許容されるその塩を、薬学的に許容される賦形剤または担体と共に含有する、薬学的組成物も含む。
【００２３】
本発明には、ウイルス感染治療用、好ましくは、HIV感染治療用の医用薬剤を製造するための、本発明のポリペプチド結合体の使用も包含される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】pQE80_C1qAの注釈付きのプラスミド地図を示す。
【図２】pQE80_Rob1(融合タンパク質T1357-C1qA)の注釈付きのプラスミド地図を示す。
【図３】pQE80_Rob 2(融合タンパク質C1qA-T1357)の注釈付きのプラスミド地図を示す。
【図４】精製タンパク質の16％トリシンSDS-PAGE  a1)非還元、a2)還元(レーン1 IB調製RobI、レーン2 IB調製RobII、レーン3 洗浄RobI、レーン4 洗浄RobII、レーン5 バイオマスRobI、レーン6 バイオマスRobII);b)レーン7、8、および9 IB調製C1qA還元、レーン10および12 バイオマスC1qA還元、レーン13、14、および15 IB調製C1qA非還元)を示す。
【図５】gp41 アミノ酸位置593-621を含むペプチドを用いたウエスタンブロットを示す。
【図６】融合阻害アッセイにおけるROBIIおよびT-1249の活性の解析。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、SEQ ID NO:01を含むポリペプチドおよびその断片の群より選択される第1のポリペプチド、ならびに抗融合性ペプチドの群より選択される第2のポリペプチドを含む、ポリペプチド結合体を含む。さらに、本発明は、SEQ ID NO:01を含むポリペプチドおよびその断片の群より選択される第1のポリペプチド(1st pp)、ならびに抗融合性ペプチドの群より選択される第2のポリペプチド(2nd pp)、ならびに抗CCR5抗体の抗原結合性断片、抗HIV-1抗体の中和断片、および抗CD4抗体の抗原結合性断片を含む群より選択される任意の第3のポリペプチド(3rd pp)、ならびに第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、および/または第3のポリペプチドを接続する、任意のリンカーポリペプチド(link pp)を含む、ポリペプチド結合体を含む。このポリペプチド結合体において、個々のポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
[1st pp] a-[link pp] m-[2nd pp] b-[link pp] n-[3rd pp] c-[link pp] o-[1st pp] d-[link pp] p-[2nd pp] e-[link pp] q-[3rd pp] f-[link pp] r-[1st pp] g
の順序を有し、
式中、a、b、c、d、e、f、g、m、n、o、p、q、rは全て0〜1の整数であり、但し、
a+d+g=1、
b+e=1、
c+f=0または1であり、
m、n、o、p、q、rは互いに独立して0または1のいずれかであり、
0の値は、対応するポリペプチドが、対応する位置に存在しないことを示し、かつ1の値は、対応するポリペプチドが、ポリペプチド結合体の対応する位置に存在することを示す。
【００２６】
本発明の実施に有用な方法および技法は当業者に公知であり、例えば、Thielens, N. M., et al., J. Immunol. 151 (1993) 6583-6592; Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997)、およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。当業者に公知なように、組換えDNA技術を用いると、核酸および/またはポリペプチドの非常に多くの誘導体を生成することができる。例えば、このような誘導体は、置換、変化、交換、欠失、または挿入により1つの位置またはいくつかの位置で改変されてもよい。改変または誘導体化は、例えば、部位特異的変異誘発によって行うことができる。このような改変は当業者によって容易に行うことができる(例えば、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USAを参照されたい)。組換え技術を用いると、当業者は様々な宿主細胞を1つまたは複数の異種核酸で形質転換することができる。異なる細胞の転写および翻訳の機構すなわち発現機構は同じ要素を用いるが、異なる種に属する細胞は、特に、異なる、いわゆるコドン使用頻度を有することがある。これにより、(アミノ酸配列に関して)同一のポリペプチドが異なる核酸によってコードされることがある。また、遺伝暗号の縮重のために、異なる核酸が同じポリペプチドをコードすることがある。
【００２７】
本明細書で使用する「核酸」は、個々のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド分子、例えば、DNA、RNA、またはその改変を指す。このポリヌクレオチド分子は、天然のポリヌクレオチド分子、または合成ポリヌクレオチド分子、または1つもしくは複数の天然のポリヌクレオチド分子と1つもしくは複数の合成ポリヌクレオチド分子の組み合わせでもよい。この定義には、1つまたは複数のヌクレオチドが変化している、例えば、変異誘発、欠失、または付加によって変化している天然のポリヌクレオチド分子も包含される。核酸は単離されていてもよく、別の核酸、例えば、発現カセット、プラスミド、または宿主細胞ゲノムの中に組み込まれていてもよい。核酸は、個々のヌクレオチドからなる核酸配列によって特徴付けられる。アミノ酸配列、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列を、そのアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換するための手順および方法は当業者に周知である。従って、核酸は、個々のヌクレオチドからなる核酸配列によって特徴付けられ、同様に、その核酸配列がコードするポリペプチドのアミノ酸配列によって特徴付けられる。
【００２８】
本明細書で使用する「核酸」は、組換えにより生成することができるポリペプチドをコードする、天然の核酸または部分的もしくは完全に非天然の核酸を指す。核酸は、単離されたDNA断片または化学的手段により合成されたDNA断片で構成されてもよい。核酸は、別の核酸、例えば、発現プラスミドまたは真核宿主細胞のゲノム/染色体に組み込まれてもよい。プラスミドには、シャトルプラスミドおよび発現プラスミドが含まれる。典型的には、プラスミドは原核生物増殖単位も含み、原核生物増殖単位は、原核生物におけるプラスミドの複製のための複製起点(例えば、ColE1複製起点)、および原核生物におけるプラスミドの選択のための選択マーカー(例えば、アンピシリン耐性遺伝子またはテトラサイクリン耐性遺伝子)を含む。
【００２９】
「発現カセット」は、少なくとも、含有される構造遺伝子を、細胞において発現および分泌させるのに必要なエレメントを含有する核酸を指す。
【００３０】
「遺伝子」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現に必要なセグメント、例えば、染色体上またはプラスミド上にあるセグメントを指す。コード領域の他に、遺伝子は、プロモーター、イントロン、ターミネーターを含む他の機能エレメントを含む。
【００３１】
「構造遺伝子」は、シグナル配列を有さない、遺伝子のコード領域を指す。
【００３２】
「選択マーカー」は、その遺伝子を保有する細胞が、対応する「選択薬剤」の存在下で特異的に選択されることを可能にする遺伝子である。有用な正の選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。この選択マーカーを用いると、その遺伝子で形質転換された宿主細胞を、対応する抗生物質、例えば、選択薬剤の存在下で正選択することができる。形質転換されていない宿主細胞は、選択的培養条件下、選択薬剤の存在下で増殖または生存することができない。選択マーカーは、正、負、または二機能性でもよい。正の選択マーカーはマーカーを保有する細胞を選択できるのに対して、負の選択マーカーはマーカーを保有する細胞を選択的に排除することができる。典型的には、選択マーカーは薬物耐性を付与するか、宿主細胞の代謝欠損または異化欠損を補う。真核細胞と共に有用な選択マーカーには、例えば、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(APH)、例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hyg)、ネオマイシンおよびG418 APH、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ(tk)、グルタミン合成酵素(GS)、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素(インドール)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ヒスチジノールD)の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、Zeocin、およびミコフェノール酸に対する耐性をもたらす遺伝子が含まれる。さらなる選択マーカー遺伝子は、WO92/08796およびWO94/28143に記載されている。
【００３３】
本明細書で使用する「調節エレメント」は、関心対象のポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子の転写および/または翻訳に必要な、シスに存在するヌクレオチド配列を指す。転写調節エレメントは、通常、発現される構造遺伝子の上流にあるプロモーター、転写開始部位および転写終結部位、ならびにポリアデニル化シグナル配列を含む。「転写開始部位」という用語は、一次転写物、すなわち、mRNA前駆体に組み込まれている最初のヌクレオチドに対応する、遺伝子内のヌクレオチドまたはより正確には核酸塩基を指す。転写開始部位はプロモーター配列と重複することがある。「転写終結部位」という用語は、転写される関心対象の遺伝子の3'末端に通常存在し、RNAポリメラーゼによる転写を終結させるヌクレオチド配列を指す。ポリアデニル化シグナルヌクレオチド配列、すなわちポリA付加グナルは、真核生物mRNA 3'末端の特定の部位で切断し、切断された3'末端に約100〜200アデニンヌクレオチドの配列(ポリAテール)を核内で転写後付加するシグナルを提供する。ポリアデニル化シグナル配列は、切断部位から約10〜30ヌクレオチド上流に位置するコンセンサス配列AATAAAを含むことがある。
【００３４】
分泌型ポリペプチドを生成するためには、関心対象の構造遺伝子は、「シグナル配列」または「リーダーペプチド」をコードするDNAセグメントを含む。シグナル配列は、新たに合成されたポリペプチドを小胞体 (ER)の膜におよび小胞体の膜を通過するように向ける。小胞体において、ポリペプチドを分泌するように追い出すことができる。シグナル配列は、タンパク質がER膜を横断する間にシグナルペプチダーゼによって切断される。シグナル配列の機能に関しては、宿主細胞の分泌機構による認識が必要不可欠である。従って、使用されるシグナル配列は、宿主細胞の分泌機構のタンパク質および酵素により認識されなければならない。
【００３５】
翻訳調節エレメントには、翻訳開始コドン(AUG)および翻訳停止コドン(TAA、TAG、またはTGA)が含まれる。構築物によっては、配列内リボソーム進入部位(IRES)が含まれることがある。
【００３６】
「プロモーター」は、機能的に連結された遺伝子/構造遺伝子または核酸配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合および転写開始のためのシグナルを含む。使用されるプロモーターは、選択された核酸配列の発現が意図される細胞タイプの宿主細胞において機能する。多種多様な供給源に由来する構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および抑制可能なプロモーターを含む多数のプロモーターが当技術分野において周知であり(かつGenBankなどのデータベースにおいて特定され)、(例えば、ATCCなどの寄託機関ならびに他の商業的または個人的な供給源から)クローニングされたポリヌクレオチドとして利用可能であるか、またはクローニングされたポリヌクレオチドの中にある。「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指向するヌクレオチド配列を含む。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位の近くにある、遺伝子の5'非コード領域または非翻訳領域に位置する。転写開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられることが多い。これらのプロモーターエレメントには、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント(DSEs; McGehee, R.E., et al., Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551-560)、サイクリックAMP応答エレメント(CREs)、血清応答エレメント(SREs; Treisman, R., Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47-58)、グルココルチコイド応答エレメント(GREs)、ならびに他の転写因子、例えば、CRE/ATF(O'Reilly, M.A., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938-19943)、AP2(Ye, J., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728)、SP1、cAMP応答エレメント結合タンパク質(CREB; Loeken, M.R., Gene Expr. 3 (1993) 253-264)、およびオクタマー因子の結合部位が含まれる(概要については、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)、およびLemaigre, F.P. and Rousseau, G. G., Biochem. J. 303 (1994) 1-14を参照されたい)。プロモーターが誘導性プロモーターであれば、転写速度は誘導剤に反応して上がる。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターであれば、転写速度は誘導剤によって調節されない。抑制可能なプロモーターも公知である。例えば、c-fosプロモーターは、成長ホルモンがその細胞表面受容体に結合すると特異的に活性化される。テトラサイクリン(tet)調節性発現は、人工ハイブリッドプロモーターによって、例えば、CMVプロモーターとそれに続く2つのTetオペレーター部位からなる人工ハイブリッドプロモーターによって達成することができる。Tetリプレッサーは2つのTetオペレーター部位に結合し、転写をブロックする。誘導物質テトラサイクリンが添加されると、TetリプレッサーはTetオペレーター部位から放出され、転写が進行する(Gossen, M. and Bujard, H. PNAS 89 (1992) 5547-5551)。メタロチオネインプロモーターおよび熱ショックプロモーターを含む他の誘導性プロモーターについては、例えば、 Sambrook et al. (前記)およびGossen, M., et al., Curr. Opin. Biotech. 5 (1994) 516-520を参照されたい。高レベル発現用の強力なプロモーターとして特定されている真核生物プロモーターの中には、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン-Iプロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列、チャイニーズハムス���ー伸長因子1α(CHEF-1、例えば、US5,888,809を参照されたい)、ヒトEF-1α、ユビキチン、およびヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター(CMV IE)がある。「プロモーター」は構成的プロモーターでもよく、誘導性プロモーターでもよい。エンハンサー(すなわち、転写を増大させるようにプロモーター上で作用するシス作用DNAエレメント)は、プロモーター単独で得られる発現レベルを高めるために、プロモーターと共に機能することが必要でもよく、転写調節エレメントとして含まれてもよい。多くの場合、プロモーターを含有するポリヌクレオチドセグメントは、エンハンサー配列(例えば、CMVまたはSV40)も含む。
【００３７】
本明細書で使用する「エンハンサー」は、エンハンサーが機能的に連結されている遺伝子またはコード配列の転写を増強するポリヌクレオチド配列を指す。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、比較的、方向および位置に依存せず、転写単位の5'側または3'側(Lusky, M., et al., Mol. Cell Bio., 3 (1983) 1108-1122)、イントロン内(Banerji, J., et al., Cell, 33 (1983) 729-740)、ならびにコード配列自体の中(Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio., 4 (1984) 1293-1305)に見出されている。従って、エンハンサーは、転写開始部位の上流もしくは下流に、またはプロモーターからかなり離れて配置されてもよいが、実際には、物理的および機能的にプロモーターと重複することがある。多種多様な供給源に由来する多数のエンハンサーが当技術分野において周知であり(かつGenBankなどのデータベースにおいて特定され)、(例えば、ATCCなどの寄託機関ならびに他の商業的または個人的な供給源から)クローニングされたポリヌクレオチドとして利用可能であるか、またはクローニングされたポリヌクレオチドの中にある。プロモーター配列(例えば、一般に用いられるCMVプロモーター)を含む多数のポリヌクレオチドは、エンハンサー配列も含む。例えば、前記で列挙した強力なプロモーターは全て強力なエンハンサーも含有してよい(例えば、Bendig, M.M., Genetic Engineering, 7 (Academic Press, 1988) 91-127を参照されたい)。
【００３８】
「配列内リボソーム進入部位」または「IRES」は、IRESの5'側にある遺伝子とは独立して翻訳開始を機能的に促進し、動物細胞内で1本の転写物から2個のシストロン(オープンリーディングフレーム)が翻訳されるのを可能にする配列について述べている。IRESは、IRESのすぐ下流にあるオープンリーディングフレームを翻訳するための、独立したリボソーム進入部位を提供する(下流は本明細書では3'と同義に用いられる)。多シストロン性、すなわち、mRNAから連続して翻訳される数種類のポリペプチドをコードし得る細菌mRNAとは異なり、動物細胞のほとんどのmRNAは単シストロン性であり、1種類だけのポリペプチドまたはタンパク質の合成をコードする。真核細胞内に多シストロン性転写物があると、翻訳は最も5'側の翻訳開始部位から開始し、最初の停止コドンで終結し、転写物がリボソームから放出されるので、mRNAの中の最初にコードされるポリペプチドだけが翻訳される。真核細胞において、転写物の中で、第2のオープンリーディングフレームおよびその後のオープンリーディングフレームにIRESが機能的に連結されている多シストロン性転写物があると、下流オープンリーディングフレームが連続して翻訳されて、同じ転写物によってコードされている2種類またはそれ以上のポリペプチドが生成される。ベクター構築におけるIRESエレメントの使用は以前に述べられている。例えば、Pelletier, J., et al., Nature 334 (1988) 320-325; Jang, S.K., et al., J. Virol. 63 (1989) 1651-1660; Davies, M.V., et al., J. Virol. 66 (1992) 1924-1932; Adam, M.A., et al. J. Virol. 65 (1991) 4985-4990; Morgan, R.A., et al. Nucl. Acids Res. 20 (1992) 1293-1299; Sugimoto, Y, et al. Biotechnology 12 (1994) 694-698; Ramesh, N., et al. Nucl. Acids Res. 24 (1996) 2697-2700;およびMosser, D.D. et al, BioTechniques 22 (1997) 150-161)を参照されたい。
【００３９】
「機能的に連結された」は2つまたはそれ以上の成分の近位を指し、ここで、このように述べられる成分は、意図されたやり方で機能する関係にある。例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサーは、連結されている配列の転写を制御または調節するようにシス作用すれば、コード配列に機能的に連結されている。一般的なものであり、必ずしもそうとは限らないが、「機能的に連結された」DNA配列は連続しており、2つのタンパク質コード領域をつなげるのに必要な場合、例えば、分泌リーダーとポリペプチドまたは2つのポリペプチドをつなげるのに必要な場合、連続しかつ読み枠の中にある。しかしながら、機能的に連結されたプロモーターは、一般的に、コード配列の上流に位置するが、必ずしもコード配列と連続しているとは限らない。エンハンサーは連続している必要はない。エンハンサーは、コード配列の転写を高めれば、コード配列に機能的に連結されている。機能的に連結されているエンハンサーは、コード配列の上流、コード配列内、またはコード配列の下流に、かつプロモーターとはかなり離れて配置されてもよい。ポリアデニル化部位は、転写がコード配列からポリアデニル化配列に進むようにコード配列の下流末端(3'末端)に配置されていれば、コード配列に機能的に連結されている。連結は、当技術分野において公知の組換え法によって、例えば、PCR法を用いて、および/または便利な制限部位での連結によって達成される。便利な制限部位が存在しなければ、慣行と一致して合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが用いられる。
【００４０】
本明細書で使用する「発現」という用語は、細胞内、例えば、組換えポリペプチドを産生する宿主細胞の中で生じる転写および/または翻訳を指す。宿主細胞における望ましい産物の転写レベルは、細胞に存在する対応するmRNAの量に基づいて決定することができる。例えば、配列から転写されるmRNAは、PCRまたはノザンハイブリダイゼーションによって定量することができる(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)を参照されたい)。核酸または構造遺伝子によってコードされるタンパク質は、様々な方法によって、例えば、ELISAによって、タンパク質の生物学的活性をアッセイすることによって、またはこのような活性とは無関係のアッセイ、例えば、タンパク質を認識および結合する抗体を用いたウェスタンブロッティングもしくはラジオイムノアッセイを使用することによって定量することができる(Sambrook et al., 1989, 前記を参照されたい)。
【００４１】
「宿主細胞」は、発現または増幅しようとする核酸が導入された細胞を意味する。「宿主細胞」という用語には、プラスミドの増殖に用いられる原核細胞、および核酸の発現に用いられる真核細胞の両方が含まれる。好ましくは、原核細胞は大腸菌(E.coli)細胞である。好ましくは、真核細胞は哺乳動物細胞である。好ましくは、哺乳動物細胞は、CHO細胞(例えば、CHO K1またはCHO DG44)、BHK細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6(登録商標)細胞、およびCOS細胞を含む哺乳動物細胞の群より選択される。本明細書で使用する「細胞」という表現は、対象細胞およびその子孫を含む。従って、「形質転換体」、「形質転換細胞」、「トランスフェクタント」、および「トランスフェクト細胞」という単語は、導入の回数に関係なく、初代対象細胞およびそれから得られる培養物を含む。全ての子孫は、故意による、または故意でない変異によりDNA内容物が正確に同一でなくてもよいことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。
【００４２】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によってつながったアミノ酸残基からなる天然または合成の重合体である。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドが「ペプチド」と呼ばれることがある。「タンパク質」は、1本または複数のポリペプチド鎖を含み、少なくとも1本の鎖の長さが100 アミノ酸またはそれ以上である、ポリペプチドである。タンパク質はまた、炭水化物基などの非ペプチド成分を含んでもよい。炭水化物置換基および他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞によってタンパク質に付加されてもよく、細胞タイプによって異なってもよい。タンパク質は、これらのアミノ酸主鎖構造によって本明細書において規定にされる。炭水化物基などの付加は、一般的に、明記されないが、それにもかかわらず存在してもよい。
【００４３】
「異種DNA」または「異種ポリペプチド」は、ある特定の宿主細胞の中で天然に存在しない、DNA分子もしくはポリペプチド、またはDNA分子の集団、またはポリペプチドの集団を指す。ある特定の宿主細胞に対して異種のDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA(すなわち外因性DNA)と組み合わされている限り、宿主細胞種に由来するDNA(すなわち内因性DNA)を含有してもよい。例えば、プロモーターを含む宿主DNAセグメントに機能的に連結された、ポリペプチドをコードする非宿主DNAセグメントを含有するDNA分子は、異種DNA分子とみなされる。逆に、異種DNA分子は、外因性プロモーターと機能的に連結された内因性構造遺伝子を含んでもよい。非宿主DNA分子によってコードされるポリペプチドは、「異種」ポリペプチドである。
【００４４】
「クローニングプラスミド」は、宿主細胞において自己複製することができる核酸、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド(phageimid)、または細菌人工染色体(BAC)である。クローニングプラスミドは、典型的には、プラスミドの必須の生物学的機能を失うことなく、決定できるやり方で核酸の挿入を可能にする1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングプラスミドで形質転換された細胞の特定および選択における使用に適した選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含有する。耐性遺伝子は、典型的には、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性、またはネオマイシン耐性をもたらす遺伝子を含む。
【００４５】
「発現プラスミド」は、宿主細胞において発現させようとするポリペプチドをコードする核酸である。典型的には、発現プラスミドは、複製起点を含む、原核生物用、例えば、大腸菌用のプラスミド増殖単位、および選択マーカー、真核生物用選択マーカー、および関心対象の構造遺伝子発現用の1つまたは複数の発現カセットを含む。それぞれの発現カセットは、プロモーター、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーター制御下にあり、このような構造遺伝子は、プロモーターに「機能的に連結されている」といわれる。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節すれば、機能的に連結されている。
【００４６】
「単離されたポリペプチド」は、炭水化物、脂質、または天然でポリペプチドと関連する他のタンパク質不純物などの汚染性細胞成分を本質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に精製された形の、すなわち、少なくとも約80％の純度、少なくとも約90％の純度、少なくとも約95％の純度、95％超の純度、または99％超の純度のポリペプチドを含有する。ある特定のタンパク質調製物が、単離されたポリペプチドを含有することを示す方法の1つは、タンパク質調製物をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲルをクーマシーブリリアントブルー染色した後に、単一バンドが出現することによって示す方法である。しかしながら、「単離された」という用語は、同じポリペプチドが、二量体またはグリコシル化型もしくは誘導体化型などの別の物理的形態で存在することを排除しない。
【００４７】
「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。免疫グロブリンを構成する異なるポリペプチドは、その重量に応じて、軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドと呼ばれる。認められている免疫グロブリン遺伝子には、異なる定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。免疫グロブリンは、例えば、1本の重鎖および軽鎖、Fv、Fab、およびF(ab) 2、ならびに単鎖(scFv)を含む様々な形式で存在してもよい(例えば、Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426;概要については、Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984)、およびHunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16)。
【００４８】
免疫グロブリンは、一般的に、2本のポリペプチド軽鎖および2本のポリペプチド重鎖を含む。ポリペプチド重鎖およびポリペプチド軽鎖はそれぞれ、抗原と相互作用する能力を有する結合ドメインを含有する可変領域(ポリペプチド鎖のアミノ末端部)を含有する。ポリペプチド重鎖およびポリペプチド軽鎖はそれぞれ、定常領域(ポリペプチド鎖のカルボキシル末端部)を含む。重鎖の定常領域は、抗体が、i)Fcγ受容体(FcγR)を有する細胞、例えば、食細胞、またはii)Brambell受容体とも知られる新生児(neonatal)Fc受容体(FcRn)を有する細胞に結合するのを媒介する。次に、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、異なるセグメント、すなわち、4つのフレームワーク領域(FR)および3つの超可変領域(CDR)を含む。
【００４９】
「免疫グロブリン断片」は、完全な免疫グロブリンと同じ抗原に結合する能力を保持している、完全な免疫グロブリンの断片を指す。「完全な免疫グロブリン」は、2本のポリペプチド軽鎖および2本のポリペプチド重鎖からなる免疫グロブリンである。ポリペプチド軽鎖およびポリペプチド重鎖はそれぞれ、可変領域および定常領域を含む。「免疫グロブリン結合体」は、免疫グロブリンとさらなる非免疫グロブリンポリペプチドの結合体を指す。さらなるポリペプチドに結合することによって、抗原の結合は損なわれない。
【００５０】
本願の中で示される「転写ターミネーター」は、RNAポリメラーゼにmRNA合成の終結シグナルを与える、長さが50〜750塩基対のDNA配列である。特に、強力なプロモーターを使用した場合に、RNAポリメラーゼが読み過ごさないようにするためには、非常に効率的な(強力な)ターミネーターが発現カセットの3'末端にあることが得策である。非効率的な転写ターミネーターは、望ましくない遺伝子発現、例えば、プラスミドによってコードされる遺伝子の発現の理由となり得る、オペロン様mRNAの形成につながることがある。
【００５１】
本願の中で用いられる「リンカーポリペプチド」という用語は、天然および/または合成由来のペプチド性リンカーポリペプチドを指す。リンカーポリペプチドは、20種類の天然アミノ酸が単量体基本要素であるアミノ酸直鎖を含む。この鎖の長さは、1〜50アミノ酸、好ましくは、3〜25アミノ酸である。リンカーポリペプチドは、天然ポリペプチドの反復アミノ酸配列、例えば、ヒンジ機能を有するポリペプチドを含有してもよい。リンカーポリペプチドは、ペプチドの正しい折り畳みおよび適切な提示を可能にすることによって、別のポリペプチドに結合されたポリペプチドが結合特性を確実に保持できるようにする機能を有する。リンカーポリペプチドは、好ましくは、グリシン残基、グルタミン残基、および/またはセリン残基に富むと指定されたポリペプチドである。これらの残基は、例えば、5アミノ酸までの小さな反復単位、例えば、GGGGS、QQQQG、またはSSSSGで並べられる。この小さな反復単位は、多量体単位を形成するように2〜5回繰り返されてもよい。多量体単位のアミノ末端および/またはカルボキシ末端では、6個までのさらなる任意の天然アミノ酸が付加されてもよい。他の合成ペプチドリンカーは、10〜20回繰り返される1種類のアミノ酸、例えば、リンカー SSSSSSSSSSSSSSS の中のセリンからなる。アミノ末端および/またはカルボキシ末端のそれぞれには、6個までのさらなる任意の天然アミノ酸が存在してもよい。
【００５２】
本願の中で用いられる「アミノ酸」という用語は、核酸によってコードすることができるカルボキシα-アミノ酸のグループを指す。これらは、アラニン(三文字表記:ala,一文字表記:A)、アルギニン(arg,R)、アスパラギン(asn,N)、アスパラギン酸(asp,D)、システイン(cys,C)、グルタミン(gln,Q)、グルタミン酸(glu,E)、グリシン(gly,G)、ヒスチジン(his,H)、イソロイシン(ile,I)、ロイシン(leu,L)、リジン(lys,K)、メチオニン(met,M)、フェニルアラニン(phe,F)、プロリン(pro,P)、セリン(ser,S)、スレオニン(thr,T)、トリプトファン(trp,W)、チロシン(tyr,Y)、およびバリン(val,V)を含む。
【００５３】
「抗融合性ペプチド」は、膜融合と関連する事象または膜融合事象それ自体を阻害する、特に、膜融合により非感染細胞がウイルスに感染するのを阻害する、ペプチドである。これらの抗融合性ペプチドは、好ましくは、線状ペプチドである。例えば、抗融合性ペプチドは、gp41外部ドメイン、例えば、DP107またはDP178に由来してもよい。このようなペプチドの例は、US5,464,933、US5,656,480、US6,013,263、US6,017,536、US6,020,459、US6,093,794、US6,060,065、US6,258,782、US6,348,568、US6,479,055、US6,656,906、WO1996/19495、WO1996/40191、WO1999/59615、WO2000/69902、およびWO2005/067960において見られる。例えば、このようなペプチドのアミノ酸配列は、US5,464,933のSEQ ID NO:1〜10;US5,656,480のSEQ ID NO:1〜15;US6,013,263のSEQ ID NO:1〜10および16〜83;US6,017,536のSEQ ID NO:1〜10、20〜83、および139〜149;US6,093,794のSEQ ID NO:1〜10、17〜83、および210〜214;US6,060,065のSEQ ID NO:1〜10、16〜83、および210〜211;US6,258,782のSEQ ID NO:1286および1310;US6,348,568のSEQ ID NO:1129、1278〜1309、1311、および1433;US6,479,055のSEQ ID NO:1〜10および210〜238;US6,656,906のSEQ ID NO:1〜171、173〜216、218〜219、222〜228、231、233〜366、372〜398、400〜456、458〜498、500〜570、572〜620、622〜651、653〜736、739〜785、787〜811、813〜815、816〜823、825、827〜863、865〜875、877〜883、885、887〜890、892〜981、986〜999、1001〜1003、1006〜1018、1022〜1024、1026〜1028、1030〜1032、1037〜1076、1078〜1079、1082〜1117、1120〜1176、1179〜1213、1218〜1223、1227〜1237、1244〜1245、1256〜1268、1271〜1275、1277、1345〜1348、1350〜1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374〜1376、1378〜1379、1381〜1385、1412〜1417、1421〜1426、1428〜1430、1432、1439〜1542、1670〜1682、1684〜1709、1712〜1719、1721〜1753、1755〜1757;またはWO2005/067960のSEQ ID NO:5〜95を含む。抗融合性ペプチドは、5〜100アミノ酸、好ましくは、10〜75アミノ酸、より好ましくは、15〜50アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。
【００５４】
「CCR5」は、ヒトCCR5、例えば、Oppermann, M., Cell Signal. 16 (2004) 1201-1210、およびSwissProt P51681に記載のヒトCCR5を意味する。「抗CCR5抗体」という用語は、CCR5に特異的に結合し、任意で、HIVと標的細胞との融合を阻害する抗体示す。結合は、細胞に基づくインビトロELISAアッセイ(CCR5発現CHO細胞)において試験することができる。抗体が、100ng/mlの抗体濃度で、5またはそれ以上、好ましくは10またはそれ以上のS/N(シグナル/ノイズ)比を引き起こせば、結合が見出される。「HIVと標的細胞との融合を阻害する」という用語は、ウイルスと標的細胞(例えば、PBMC)との膜融合を阻害するのに有効な濃度の抗体の存在下で、標的細胞とウイルスを接触させる工程、および、例えば、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性またはHIV p24抗原濃度を測定する工程を含むアッセイにおいて測定された、HIVと標的細胞との融合の阻害を指す。「膜融合」という用語は、CCR5およびCD4ポリペプチドを共発現する第1の細胞と、HIV envタンパク質を発現する第2の細胞またはウイルスとの融合を指す。膜融合は、遺伝子操作された細胞および/またはウイルスによって、レポーター遺伝子アッセイ(例えば、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ)により確かめられる。
【００５５】
好ましい抗CCR5抗体は、US2004/0043033、US6,610,834、US2003/0228306、US2003/0195348、US2003/0166870、US2003/0166024、US2003/0165988、US2003/0152913、US2003/0100058、US2003/0099645、US2003/0049251、US2003/0044411、US2003/0003440、US6,528,625、US2002/0147147、US2002/0146415、US2002/0106374、US2002/0061834、US2002/0048786、US2001/0000241、EP1322332、EP1263791、EP1207202、EP1161456、EP1144006、WO2003/072766、WO2003/066830、WO2003/033666、WO2002/083172、WO02/22077、WO01/58916、WO01/58915、WO01/43779、WO01/42308、およびWO2006/103100において述べられている。特に好ましい抗CCR5抗体はWO2006/103100に記載されている。
【００５６】
「CD4」は、ヒトCD4、例えば、Brady, R.L. and Barclay, A.N., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 205 (1996) 1-18およびSwissProt PO1730に記載のヒトCD4を意味する。「抗CD4抗体」という用語は、CD4に特異的に結合し、好ましくは、HIVと標的細胞との融合を阻害する抗体を示す。結合は、細胞に基づくインビトロELISAアッセイ(CD4発現CHO細胞)において試験することができる。抗体が、100ng/mlの抗体濃度で、5またはそれ以上、好ましくは10またはそれ以上のS/N(シグナル/ノイズ)比を引き起こせば、結合が見出される。「HIVと標的細胞との融合を阻害する」という用語は、ウイルスと標的細胞(例えば、PBMC)との膜融合を阻害するのに有効な濃度の、問題となっている抗体の存在下で、標的細胞とウイルスを接触させる工程、および、例えば、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性またはHIV p24抗原濃度を測定する工程を含むアッセイにおいて測定された、HIVと標的細胞との融合の阻害を指す。「膜融合」という用語は、CD4ポリペプチドを発現する第1の細胞と、HIV envタンパク質を発現する第2の細胞またはウイルスとの融合を指す。膜融合は、遺伝子操作された細胞および/またはウイルスによって、レポーター遺伝子アッセイ(例えば、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ)により確かめられる。
【００５７】
好ましい抗CD4抗体は、例えば、Reimann, K.A., et al., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943、EP0512112、US5,871,732、EP0840618、EP0854885、EP1266965、US2006/0051346、WO97/46697、WO01/43779、US6,136,310、WO91/009966において述べられている。特に好ましい抗CD4抗体は、US5,871,732、およびReimann, K.A., et al., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943、およびWO91/009966に記載されている。特に好ましい抗CD4抗体は、ヒトに投与された時に、非免疫抑制性または非枯渇性(non-depleting)の抗体であり、また、HIV gp120とヒトCD4との結合をブロックしないことを特徴とする。
【００５８】
「HIV-1」は、ヒト免疫不全症ウイルス1型gp120を示す。「中和抗HIV-1抗体」という用語は、HIV-1 gp120の複数のコンホメーションエピトープに特異的に結合し、gp120結合能を中和し、任意で、HIVと細胞との融合を阻害する抗体を示す。例示的な「中和抗HIV-1抗体」は、B12および4KG5である。これらのモノクローナル抗体は、HIV gp120に位置するコンホメーションエピトープに対して作られている。例えば、B12抗体のエピトープは、gp120の4個のペプチドセグメント(残基V254-T257、D368-F376、E381-Y384、およびI420-I424)からなると予想され、これらのペプチドセグメントはCD4結合部位の周辺部に位置する(Bublil, E.M., et al, FASEB J. 20(2006) 1762-1774; Zwick, M.B., et al., J. Virol. 77 (2003) 6965-6978)。B12抗体は、正常組織に存在するエピトープの認識を回避するように再設計することができる。
【００５９】
本発明は、
a)SEQ ID NO:01を含むポリペプチドおよびその断片の群より選択される第1のポリペプチド、
b)抗融合性ペプチドの群より選択される第2のポリペプチド
を含む、ポリペプチド結合体を報告する。
【００６０】
本発明のポリペプチド結合体に含まれる第1のポリペプチドは、SEQ ID NO:01を含むポリペプチドおよびその断片の群より選択される。
【００６１】
第1のポリペプチドは、ヒト補体因子C1qのAサブユニットまたはその断片である。ヒト補体因子C1qのAサブユニットは、以下、C1qAと示され、アミノ酸配列はSEQ ID NO:01で示される。C1qAの断片は、SEQ ID NO:01の少なくとも12個の連続したアミノ酸残基、SEQ ID NO:01の少なくとも15個の連続したアミノ酸残基、またはSEQ ID NO:01の少なくとも18個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を示す。SEQ ID NO:01の例示的な断片は、
2010520868.tif 000003
を含む。
【００６２】
1つの態様において、第1のポリペプチドは、SEQ ID NO:06を含むポリペプチドおよびその断片の群より選択される。SEQ ID NO:06は、C1qAの球状ヘッドを示す。C1qAの球状ヘッドの断片は、SEQ ID NO:06の少なくとも12個の連続したアミノ酸残基、SEQ ID NO:06の少なくとも15個の連続したアミノ酸残基、またはSEQ ID NO:06の少なくとも18個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を示す。
【００６３】
第2のポリペプチドは、抗融合性ペプチドの群より選択される。例えば、抗融合性ペプチドは、HIV-1 gp41タンパク質(SEQ ID NO:07)に由来する。これらの抗融合性ペプチドは、好ましくは、線状ペプチドである。例示的な抗融合性ペプチドは、DP107、DP178、C-34、N-36、T-20、T-651、T-1249、T-1357、T-1357変異体、T-2635、HIV-1 gp41外部ドメイン変異体  単一変異:I568P、およびHIV-1 gp41外部ドメイン変異体  四重変異:I568P、L550E、L566E、I580Eである。いくつかの抗融合性ペプチドのアミノ酸配列を表1に示す。
【００６４】
（表１）抗融合性ペプチドのアミノ酸配列
2010520868.tif 000004
【００６５】
アミノ酸配列および位置の番号付けは、BH8参考株(Locus HIVH3BH8;フランスからのHIV-1分離株LAI/IIIBクローンBH8; Ratner, L. et al., Nature 313 (1985) 277-284)と同様である。このような抗融合性ペプチドのさらなる例は、US5,464,933、US5,656,480、US6,013,263、US6,017,536、US6,020,459、US6,093,794、US6,060,065、US6,258,782、US6,348,568、US6,479,055、US6,656,906、WO1996/19495、WO1996/40191、WO1999/59615、WO2000/69902、およびWO2005/067960において見られる。抗融合性ペプチドは、5〜100アミノ酸、10〜75アミノ酸、好ましくは、15〜50アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。特に好ましい抗融合性ペプチドは、C-34、T-20、T-1249、T-1357、T-651、T-2635、N-36(Root, M.J., et al., Curr. Pharm. Des. 10 (2004) 1805-1825)、DP-107(Wild, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 12676-12680)、DP-178、HIV-1 gp41外部ドメイン変異体  単一変異:I568P、および/またはHIV-1 gp41外部ドメイン変異体  四重変異:I568P、L550E、L566E、I580Eである。
【００６６】
本発明の結合体は複数のポリペプチドを含む。従って、あるポリペプチドが結合体のN末端を形成し、あるポリペプチドが結合体のC末端を形成する。N末端からC末端への、これらのポリペプチドの順序は任意である。これにより、どの結合ポリペプチドもN末端にあってよく、どの結合ポリペプチドもC末端にあってよい。但し、各ポリペプチドは結合体の中で1個しか存在しない。
【００６７】
1つの態様において、本発明の結合体は、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを、以下の順序:
N末端-第1のポリペプチド-第2のポリペプチド-C末端、または
N末端-第2のポリペプチド-第1のポリペプチド-C末端
より選択される順序で含む。
【００６８】
本発明の結合体は、さらなる追加のポリペプチドであるリンカーポリペプチドを含んでもよい。従って、1つの態様において、本発明の結合体は、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの間にリンカーポリペプチドを含む。好ましいリンカーポリペプチドを表2に示した。
【００６９】
（表２）リンカーポリペプチド
2010520868.tif 000005
【００７０】
リンカーポリペプチド[GQ4] 3GNN(SEQ ID NO:24)、LSLSPGK(SEQ ID NO:20)、LSPNRGEC(SEQ ID NO:21)、LSLSGG(SEQ ID NO:45)、LSLSPGG(SEQ ID NO:46)、[G3S] 5 (SEQ ID NO:47)、および[G3S] 5GGG(SEQ ID NO:48)が特に好ましい。全てのリンカーポリペプチドは核酸分子によってコードすることができ、従って、組換え発現することができる。リンカーポリペプチドはそれ自体がペプチドであるので、ポリペプチドリンカーに接続されるポリペプチドは、2つのアミノ酸間で形成されるペプチド結合を介して接続される。従って、本発明のポリペプチド結合体は、タンパク質発現によって組換えにより生成することができる。
【００７１】
本発明は、別の態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドに加えて、さらなる第3のポリペプチドが結合されたポリペプチド結合体を含む。
【００７２】
第1のポリペプチドは、前記のように、ヒト補体因子C1qのAサブユニットまたはその断片である。第2のポリペプチドは、前記のように、抗融合性ペプチドの群より選択されるポリペプチドである。第3のポリペプチドは、抗CCR5抗体、または抗CD4抗体、または抗HIV-1抗体の抗原結合性断片である。
【００７３】
本願の中で使用する「抗原結合性」という用語は、抗体、または抗原に結合する抗体断片を示す。抗CCR5抗体の場合、結合は、CCR5受容体への結合であり、抗CD4抗体の場合、結合は、CD4受容体への結合であり、抗HIV-1抗体の場合、結合は、HIV gp120への結合である。KD値で示される結合親和性は、10-5mol/1もしくはそれ以下(例えば、10-8mol/l)であり、KD値は10-7mol/lもしくはそれ以下であり、またはKD値は10-9mol/lもしくはそれ以下である。結合親和性は、表面プラズモン共鳴法(BIAcore(登録商標))などの標準的な結合アッセイを用いて確かめられる。この結合親和性値は厳密な値として扱われる必要はなく、単なる評価の基準にすぎない。これは、確認および/または選択のために、例えば、免疫グロブリンに典型的な、CCR5受容体抗原への特異的標的結合を示し、従って、治療活性を有する、抗CCR5抗体またはその断片を確認および/または選択するのに用いられる。このことは、抗CD4抗体および抗HIV-1抗体にも同様に当てはまる。
【００７４】
本願の中で使用する「抗CCR5抗体の抗原結合性断片の群」という用語は、抗原結合能を保持している、抗CCR5抗体の任意の断片を示す。このような断片は、一般的に、抗CCR5抗体の軽鎖または重鎖の可変ドメインの少なくとも一部を含む。このような断片は、例えば、1本の重鎖または軽鎖、Fv断片、Fab断片、およびF(ab) 2断片、ならびに単鎖抗体(scFv)でもよい。
【００７５】
好ましい抗CCR5抗体は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germanyに寄託され、表3に列挙したハイブリドーマ細胞株により発現されたものであり、抗CCR5抗体の断片は本発明の結合体において有用である。
【００７６】
（表３）抗CCR5抗体を発現するハイブリドーマ細胞株
2010520868.tif 000006
【００７７】
好ましい抗HIV-1抗体はB12および4KG5であり、抗HIV-1抗体の断片は本発明の結合体において有用である。
【００７８】
好ましい抗CD4抗体は、US5,871,732、Reimann, K.A., et al., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943、およびWO91/009966に記載されている。
【００７９】
第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、第3のポリペプチドを含むポリペプチド結合体において、N末端(N末端はNH2と示した)からC末端(C末端はCOOHと示した)への順序は6通り可能である。この順序群は、
(1)NH2-第1のポリペプチド-第2のポリペプチド-第3のポリペプチド-COOH、
(2)NH2-第1のポリペプチド-第3のポリペプチド-第2のポリペプチド-COOH、
(3)NH2-第2のポリペプチド-第1のポリペプチド-第3のポリペプチド-COOH、
(4)NH2-第2のポリペプチド-第3のポリペプチド-第1のポリペプチド-COOH、
(5)NH2-第3のポリペプチド-第1のポリペプチド-第2のポリペプチド-COOH、
(6)NH2-第3のポリペプチド-第2のポリペプチド-第1のポリペプチド-COOH
を含む。
【００８０】
任意で、それぞれの結合ポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含めることができる。この場合、例えば、1個のリンカーポリペプチドをさらに含む順序(1)は、4通りの順序
(1)NH2-第1のポリペプチド-第2のポリペプチド-第3のポリペプチド-COOH、
(1a)NH2-第1のポリペプチド-リンカーポリペプチド-第2のポリペプチド-第3のポリペプチド-COOH、
(1b)NH2-第1のポリペプチド-第2のポリペプチド-リンカーポリペプチド-第3のポリペプチド-COOH、
(1c)NH2-第1のポリペプチド-リンカーポリペプチド-第2のポリペプチド-リンカーポリペプチド-第3のポリペプチド-COOH
を含む。
【００８１】
従って、任意のリンカーポリペプチドが全て存在する場合、24通りの順序が可能である。
【００８２】
本発明のポリペプチド結合体は、リンカーポリペプチドを3個まで含めることができることを除けば、各ポリペプチドを最大1個含む。
【００８３】
従って、本発明は、
a)SEQ ID NO:01を含むポリペプチドおよびその断片の群より選択される、第1のポリペプチド(1st pp)、
b)抗融合性ペプチドの群より選択される、第2のポリペプチド(2nd pp)、
c)抗CCR5抗体の抗原結合性断片の群または抗CD4抗体の抗原結合性断片の群より選択される、任意の第3のポリペプチド(3rd pp)、
d)第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、および/または第3のポリペプチドを接続する、任意のリンカーポリペプチド(link pp)
を含む、ポリペプチド結合体を含む。ここで、前記ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
[1st pp] a-[link pp] m-[2nd pp] b-[link pp] n-[3rd pp] c-[link pp] o-[1st pp] d-[link pp] p-[2nd pp] e-[link pp] q-[3rd pp] f-[link pp] r-[1st pp] g
の順序を有し、
式中、a、b、c、d、e、f、g、m、n、o、p、q、rは全て0または1の値の整数であり、
a+d+g=1、
b+e=1、
c+f=0または1であり、
m、n、o、p、q、rは互いに独立して0または1のいずれかであり、
0は存在しないことを示し、かつ1は、前記結合体の指定された位置に、対応するポリペプチドが存在することを示す。
【００８４】
好ましい態様において、ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
[3rd pp] c-[link pp] o-[1st pp] d-[link pp] p-[2nd pp] e-[link pp] q -[1st pp] g
の順序を有し、
式中、c、d、e、g、o、p、qは全て0または1の値の整数であり、
c=1
d+g=1、
e=1、
o、p、qは互いに独立して0または1であり、
0は存在しないことを示し、1は、前記結合体の対応する位置に、対応するポリペプチドが存在することを示す。
【００８５】
本発明はまた、本発明のポリペプチド結合体をコードする核酸も含む。本発明の別の局面は、本発明のポリペプチド結合体をコードする核酸を含む細胞株である。
【００８６】
本発明はまた、本発明のポリペプチド結合体を生成する方法も含む。前記方法は、
a)本発明のポリペプチド結合体をコードする核酸を含む宿主細胞を、ポリペプチド結合体の発現に適した条件下で培養する工程、および
b)細胞または培地からポリペプチド結合体を回収する工程
を含む。
【００８７】
「ポリペプチド結合体の発現に適した条件下で」という用語は、異種ポリペプチドを発現する細胞の培養に用いられ、当業者に公知の、または当業者によって容易に決定することのできる条件を示す。これらの条件は、培養される細胞タイプおよび発現されるポリペプチドのタイプに応じて異なってもよいことも当業者に公知である。一般的に、細胞は、ポリペプチド結合体を効果的に生成するのに十分な温度で、例えば、20℃〜40℃で、かつポリペプチド結合体を効果的に生成するのに十分な期間、例えば、4〜28日間、培養される。1つの態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。
【００８８】
本発明は、本発明のポリペプチド結合体または薬学的に許容されるその塩を、薬学的に許容される賦形剤または担体と共に含有する、薬学的組成物をさらに含む。
【００８９】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収/再吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は注射または注入に適している。薬学的に許容される担体には、滅菌した水溶液または分散液、および滅菌した注射液または分散液を調製するための滅菌した散剤が含まれる。薬学的に活性な物質のための、このような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において公知である。水に加えて、担体は、例えば、等張性緩衝生理食塩溶液でもよい。
【００９０】
選択された投与経路に関係なく、本発明の化合物および/または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に処方される。本発明の化合物は適切な水和した形で用いられてもよい。
【００９１】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与量レベルは、患者への毒性が無く、特定の患者、組成物、および投与方法に対して望ましい治療反応を達成するのに有効な活性成分量を得るように変更することができる。選択された投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、使用される特定の組成物と併用される他の薬物、化合物、および/または材料、治療を受けている患者の年齢、性別、体重、状態、身体全体の健康、および以前の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の要因を含む、様々な薬物動態学的要因によって決まる。
【００９２】
さらに、本発明は、ウイルス感染治療用の医用薬剤を製造するための、本発明のポリペプチド結合体の使用を含む。好ましくは、ウイルス感染はHIV感染である。本発明はまた、抗ウイルス治療を必要とする患者を治療するための、本発明のポリペプチド結合体の使用も含む。本発明はまた、AIDSなどの免疫不全症候群に罹患している患者を治療するための、本発明の結合体の使用も含む。
【００９３】
以下の実施例、配列表、および図面は本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示された手順に変更を加えることができることが理解される。
【００９４】
実施例1
材料および方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に示されている。抗体鎖のアミノ酸の番号は、EUナンバリング(Edelman, G. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))に従って付けた。
【００９５】
組換えDNA法
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載のように、DNAを操作するために標準的な方法を用いた。分子生物学的試薬は製造業者の指示書に従って使用した。
【００９６】
遺伝子合成
化学合成によって作製したオリゴヌクレオチドから、所望の遺伝子セグメントを調製した。PCR増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結によって、特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接する100〜600bp長の遺伝子セグメントを組み立て、その後に、EcoR1/HindIII制限部位を介してpQE80Lベクター(Qiagen, Hilden, Germany)にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列をDNA塩基配列決定法により確認した。
【００９７】
タンパク質の測定
結合体のタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、280nmでの光学密度(OD)を測定することにより求めた。
【００９８】
実施例2
発現プラスミドの構築
T5 RNAポリメラーゼに基づく細菌用pQE80発現ベクターは、Qiagen(Hilden, Germany)から購入した。
【００９９】
C1qA(SEQ ID NO:6)をコードする核酸配列を挿入して、発現プラスミドpQE80_ClqAを作製するために、EcoRIおよびHindIII制限部位を使用した(注釈付きのプラスミド地図については、図1を参照されたい)。N末端からC末端への方向に、抗融合性ペプチドT-1357およびC1qAを含む結合体(SEQ ID NO:49、50)をコードする配列を挿入して、発現プラスミドpQE80_RobIを作製するために、EcoRIおよびHindIII制限部位を使用した(注釈付きのプラスミド地図については、図2を参照されたい)。N末端からC末端への方向に、C1qAおよびT-1357を含む結合体 (SEQ ID NO:51)をコードする配列を挿入して、発現プラスミドpQE80_Rob2を作製するために、EcoRIおよびHindIII制限部位を使用した(注釈付きのプラスミド地図については、図3を参照されたい)。
【０１００】
実施例3
ポリペプチド結合体の生成および精製
大腸菌細胞を、実施例2において得た発現プラスミドで形質転換した。形質転換した細菌をアンピシリン耐性によって選択した。ODが0.1 OD/mLの出発培養物を接種した。0.5μg/mlのアンピシリンを添加したSB培地(32gのペプトン、20gの酵母抽出物、5gのNaClおよび5mLの1MのNaOHに、水 1Lを加える)において、培養物を37℃で増殖させた。OD600nmが0.8〜1.0を超えた後に、培養を終えた。培養ブロスを遠心分離し、ペレットの中の細胞を、12.11g/lのTRIS-ヒドロキシメチルアミノメタン(TRIS)、1mMのMgSO4を含有し、pHを25％(w/v)HClで7.0に調節した緩衝液中で、高い圧力で破壊した。バイオマス100mgにつき500mlの緩衝液を使用した。細胞を破壊した後、懸濁液を遠心分離した。200ml/lの30％(w/v)Brij、1.5MのNaCl、および60mMのEDTAを含有し、pHを7.0に調節した溶液を用いて、ペレットを洗浄した。2回目の遠心分離段階の後に、IBを、100mMのTRIS、20mMのEDTA、pH6.5で洗浄した。最後の遠心分離段階の後、IBを遠心分離し、-20℃で保存した。試料の均一性はSDS-PAGEで確認した。さらなる精製段階は必要なかった。
【０１０１】
IBを、pH 11.5〜12.0の30mMのKOH中で、室温で30分間攪拌しながら可溶化した。試料を完全に可溶化した後に復元を行い、その後に、ソルビリセート(solubilisate)を50mMのホウ酸緩衝液、pH8.5に、最大濃度0.3mg/mlまで加えた。
【０１０２】
実施例4
SDS PAGEを用いた発現解析
復元した結合体を、Schagger, H., and von Jagow, G., Anal Biochem. 166 (1997) 368-379に従って、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって処理した。
【０１０３】
SDS-PAGE
LDS試料緩衝液、4倍濃縮液(4x):4gのグリセロール、0.682gのTRIS-Base、0.666gのTRIS-塩酸塩、0.8gのLDS(ドデシル硫酸リチウム)、0.006gのEDTA(エチレンジアミン四酢酸)、0.75mlの1重量％(w/w)のServa Blue G250水溶液、0.75mlの1重量％(w/w)のフェノールレッド溶液に、総体積が10mlとなるように水を加えた。
【０１０４】
復元したポリペプチド結合体を遠心分離して、細片を除去した。清澄した上清のアリコートを、1/4体積(v/v)の4xLDS試料緩衝液および1/10体積(v/v)の0.5Mの1,4-ジチオスレイトール(DTT)と混合した。次いで、試料を70℃で10分間インキュベートし、タンパク質をSDS-PAGEで分離した。NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を、製造業者の指示書に従って使用した。特に、10％ NuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis-TRIS Pre-Castゲル(pH6.4)およびNuPAGE(登録商標)MOPSランニング緩衝液を使用した。
【０１０５】
実施例5
発現プラスミドの構築
T5 RNAポリメラーゼに基づく細菌pQE80発現ベクターは、Qiagen(Hilden, Germany)から購入した。
【０１０６】
抗CCR5抗体軽鎖-C1qA-T-1249結合体をコードする核酸配列を挿入して、発現プラスミドpQE80_Rob3を作製するために、EcoRIおよびHindIII制限部位を使用した。
【０１０７】
実施例6
細胞間融合アッセイ
ヒト免疫不全症ウイルス1型(HIV-1)の中和を評価するための、細胞株に基づくアッセイについて述べる。このアッセイは、CD4およびCXCR4コレセプターの内因性の発現を補うために、HIV-1コレセプターCCR5を発現するようにトランスフェクトされた、CEM.NKR細胞に基づいている。結果として生じたCEM.NKR-CCR5細胞は、R5表現型およびX4表現型の両方の初代HIV-1分離株を効率的に複製する。HIV-1感染個体からの血清または特異的抗HIV-1モノクローナル抗体を用いた中和アッセイにおいて、CEM.NKR-CCR5細胞とマイトジェン活性化末梢血単核細胞(PBMC)を比較すると、この2つの細胞タイプのHIV-1中和の感受性は類似していることが分かる。
【０１０８】
1日目に、gp160を発現しているHeLa細胞(2x104細胞/50μl/ウェル)を、白色の96マイクロタイタープレート中の、10％のFCSおよび2μg/mlのドキシサイクリンを添加したDMEM培地に播種する。2日目に、1ウェル当たり100μlの上清試料または抗体対照を、透明な96マイクロタイタープレートに加える。次いで、8x104CEM-NKr-Luc懸濁細胞を含む培地100μlを加え、37℃で30分間インキュベートする。HeLa細胞培地を96ウェルプレートから吸引し、200μlの抗体/CEM-NKr-Luc混合物から100μlを加え、37℃で一晩インキュベートする。3日目に、100μl/ウェルのBright-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイ基質(1,4-ジチオスレイトールおよび亜ジチオン酸ナトリウム; Promega Corp., USA)を加え、室温で最低15分間インキュベートした後に、発光を測定する。
【０１０９】
材料
HeLa-R5-16細胞(ドキシサイクリンによって誘導されるとHIV gp160を発現する細胞株)を、栄養分ならびに10％のFCSと400μg/mlのG418および200μg/mlのハイグロマイシンBを含有するDMEM培地において培養する。CEM.NKR-CCR5-Luc(カタログ番号:5198, NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USAから入手可能なT細胞株)。細胞タイプ:CEM.NKR-CCR5(カタログ番号4376)は、HIV-2 LTRの転写制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発現するようにトランスフェクトされ(エレクトロポレーション)、10％の胎仔ウシ血清、4mMのグルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン(100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン)、および0.8mg/mlの硫酸ゲニチシン(geniticin)(G418)を含有するRPMI 1640において増殖している。増殖特性:円形のリンパ系細胞、形態はあまり変化しない。細胞は単一の細胞として懸濁状態で成長し、小さな凝集塊を形成し得る。週に2回、1:10に分ける。特別な特性:HIV-2 LTRがトランス活性化(transactivation)された後に、ルシフェラーゼ活性を発現する。初代HIV分離株による感染、中和および薬物感受性のアッセイに適している(Spenlehauer, C., et al., Virology 280 (2001) 292-300; Trkola, A., et al., J. Virol. 73 (1999) 8966-8974)。この細胞株は、NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIHを通じて、John Moore博士およびCatherine Spenlehauer博士から入手した。Bright-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイ緩衝液(Promega Corp. USA, Part No E2264B)、Bright-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイ基質(Promega Corp. USA, part No EE26B)。
【０１１０】
実施例7
ポリペプチドの結合親和性の決定
HIV-1 gp41タンパク質のHR1-HR2相互作用(HR、ヘプタッド反復領域1および2)に基づくポリペプチドの結合親和性を、BIAcore(登録商標)3000機器(Pharmacia, Uppsala, Sweden)を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)によって25℃で測定した。
【０１１１】
BIAcore(登録商標)システムは分子相互作用の研究に対して十分に確立されている。BIAcore(登録商標)システムを用いると、リガンド/分析物の結合を連続してリアルタイムでモニタリングすることができ、従って、結合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)、および平衡定数(KD)を求めることができる。SPR技術は、金でコーティングされたバイオセンサーチップの表面の近くで屈折率を測定することに基づいている。屈折率の変化から、固定化されているリガンドと、溶解状態で注入された分析物との相互作用によって引き起こされる、表面上の質量変化が分かる。表面上に固定化されているリガンドに分子が結合すれば質量は増加し、解離する場合には質量は減少する。
【０１１２】
結合アッセイ
50mMのNaOHに溶解した1MのNaClの注入を1分間、3回連続して行うことによって、センサーチップSA(SA、ストレプトアビジン)を予め洗浄した。次いで、ビオチン化したHR1ペプチドビオチン-T-2324(SEQ ID NO:52)を、SAでコーティングされたセンサーチップ上に固定化した。物質移動の制限を避けるために、HBS-P緩衝液(10mMのHEPES、pH7.4、150mMのNaCl、0.005％(v/v)のSurfactant P20)に溶解した、可能性のある最も低い値(約200RU,共鳴単位)のHR1ペプチドを、SAチップにロードした。測定を開始する前には、最初に、0.5％(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を流速50μL/minで1分間加えることで、チップを再生した。
【０１１３】
解析しようとするポリペプチド結合体を、まず最初に、約1mg/mLの濃度で、50mM NaHCO3,pH9に溶解し、次いで、25〜1.95nMの範囲の様々な濃度までHPS-P緩衝液で希釈した。試料接触時間は5分であった(結合期)。その後に、チップ表面をHBS-Pで5分間洗浄した(解離期)。全ての相互作用は、正確に25℃(標準的な温度)で行った。測定サイクルの間、試料を12℃で保存した。シグナルは、1秒当たり1シグナルの検出速度で検出した。試料は、HR1結合バイオセンサー素子上に、流速50μL/min、漸増濃度で注入した。表面は、0.5％(w/v)SDS溶液を流速50μL/minで1分間洗浄することによって再生した。
【０１１４】
数種類の異なる濃度で得られたセンサーグラム(seonsorgram)曲線を、BIAevaluation 4.1ソフトウェアパッケージを用いて解析することによって、ka/kdとして定義される平衡定数(KD)を求めた。HR2-HR1相互作用の値から、HR2を含むポリペプチドと遊離ストレプトアビジン表面との相互作用の応答値を差し引くことによって、非特異的結合を補正した。データのフィッティングは、1:1ラングミュア(Langmuir)結合モデルに従った。
【０１１５】
（表５）HR1領域への結合のBIAcore(登録商標) 解析
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【０１１６】
実施例8
ウエスタンブロット解析
以下の試料(各15μl=1〜5μg)を、還元条件下で10％ Bis-TRIS NuPAGE-Gelに移した。
レーン1 - マルチマーカー
レーン2 - ホウ酸緩衝液
レーン3 - T-1249(約5kDa)
レーン4 - RobI(26kDa)
レーン5 - RobII(25kDa)
レーン6 - C1qA(28kDa)
レーン7 - 空
レーン8-magic Mark
トランスファーバッファー:192mMのグリシン、25mMのTRIS、20％のメタノール(v/v)。
【０１１７】
SDS-PAGEの後に、分離した結合体を、Burnetteの「セミドライブロッティング法」(Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203)に従って、電気泳動(25V,1時間)によりPVDFフィルター膜(孔径:0.45μm, Invitrogen Corp.)に移した。
【０１１８】
ブロットの後に、膜を、5％の膜ブロッキング剤(Amersham Biosciences)を含む、TBST(150mMのNaCl、1mlのTween(登録商標)20を添加し、pH7.5に調節した、1l の10mM のTRIS緩衝液)に振盪しながら室温で約30分間浸漬し、その後、4℃で一晩浸漬した。ブロッキング段階の後に、膜をTBSTで3回洗浄した。
【０１１９】
検出のために、ブロックされた膜を、5μg/mlのTBST、0.15mMのCaCl2、および12mMのMgCl2を用いて3時間振盪しながら、ビオチン化したペプチドHIV-gp41P2(593-621)-Biとインキュベートした。
【０１２０】
現像段階の後に、膜をTBSTで洗浄し、Lumi-LightPLUSウェスタンブロッティング基質とインキュベートし、その後に現像した(SDSゲルについては図4、およびウエスタンブロットについては図5を参照されたい)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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