(57)【要約】  本発明は、例えば、アルツハイマー病及び関連症状の診断、治療及び予防において使用され得る結合タンパク質、特に、ヒト化抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイド−β（２０−４２）球状凝集体に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質（該抗原結合ドメインは、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含み、
ＣＤＲ−ＶＨ１。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号５）（式中、
Ｘ１は、Ｔ又はＳであり；
Ｘ２は、Ｆ又はＹであり；
Ｘ３は、Ｙ又はＡであり；
Ｘ４は、Ｉ又はＭであり；及び
Ｘ５は、Ｈ又はＳである。）
ＣＤＲ−ＶＨ２。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７（配列番号６）（式中、
Ｘ１は、Ｍ又はＳであり；
Ｘ２は、Ｉであり；
Ｘ３は、Ｇ又はＨであり；
Ｘ４は、Ｐ又はＮであり；
Ｘ５は、Ｇ又はＲであり；
Ｘ６は、Ｓ又はＧであり；
Ｘ７は、Ｇ又はＴであり；
Ｘ８は、Ｎ又はＩであり；
Ｘ９は、Ｔ又はＦであり；
Ｘ１０は、Ｙであり；
Ｘ１１は、Ｙ又はＬであり；
Ｘ１２は、Ｎ又はＤであり；
Ｘ１３は、Ｅ又はＳであり；
Ｘ１４は、Ｍ又はＶであり；
Ｘ１５は、Ｆ又はＫであり；
Ｘ１６は、Ｋ又はＧであり；及び
Ｘ１７はＤであり、又は存在しない）。
ＣＤＲ−ＶＨ３。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３（配列番号７）（式中、
Ｘ１は、Ａ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｋ又はＲであり；
Ｘ３は、Ｓであり；
Ｘ４は、Ａ又はＮであり；
Ｘ５は、Ｒ又はＳであり；
Ｘ６は、Ａ又はＹであり；
Ｘ７は、Ａであり；
Ｘ８は、Ｗ又はＭであり；
Ｘ９は、Ｆ又はＤであり；
Ｘ１０は、Ａ又はＹであり；及び
Ｘ１１はＹであり、又は存在しない）。
ＣＤＲ−ＶＬ１。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ８−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６（配列番号８）（式中、
Ｘ１は、Ｒであり；
Ｘ２は、Ｓであり；
Ｘ３は、Ｓ又はＴであり；
Ｘ４は、Ｑであり；
Ｘ５は、Ｓ又はＴであり；
Ｘ６は、Ｖ又はＬであり；
Ｘ７は、Ｖであり；
Ｘ８は、Ｑ又はＨであり；
Ｘ９は、Ｓ又はＲであり；
Ｘ１０は、Ｎであり；
Ｘ１１は、Ｇであり；
Ｘ１２は、Ｎ又はＤであり；
Ｘ１３は、Ｔであり；
Ｘ１４は、Ｙであり；
Ｘ１５は、Ｎ又はＬであり、及び
Ｘ１６は、Ｅである。）
ＣＤＲ−ＶＬ２。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号９）（式中、
Ｘ１は、Ｋであり；
Ｘ２は、Ｖであり；
Ｘ３は、Ｓであり；
Ｘ４は、Ｎであり；
Ｘ５は、Ｒであり；
Ｘ６は、Ｆであり；及び
Ｘ７は、Ｓである。）
及び
ＣＤＲ−ＶＬ３。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号１０）（式中、
Ｘ１は、Ｆであり；
Ｘ２は、Ｑであり；
Ｘ３は、Ｇであり；
Ｘ４は、Ｓであり；
Ｘ５は、Ｈであり；
Ｘ６は、Ｖであり；
Ｘ７は、Ｐであり；
Ｘ８は、Ｐ又はＹであり；及び
Ｘ９は、Ｔである。）
前記結合タンパク質は、アミロイドβ（１−４２）球状凝集体、アミロイドβ（１２−４２）球状凝集体、ｓ−アミロイド前駆体タンパク質、アミロイドβ（１−４０）単量体、アミロイドβ（１−４２）単量体及びアミロイドβ（１−４２）原繊維からなる群から選択される少なくとも１つのアミロイドβペプチド又はタンパク質より、アミロイドβ（２０−４２）球状凝集体に対して、より大きな結合親和性を有する。）
【請求項２】
前記少なくとも１つのＣＤＲが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号６５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項３】
少なくとも３つのＣＤＲを含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項４】
少なくとも３つのＣＤＲが、次のものからなる可変ドメインＣＤＲセットから選択される、請求項３に記載の結合タンパク質。
【表１】
2010530740.tif 000012
【請求項５】
少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲセットを含む、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
前記少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲセットが
ＶＨ  ７Ｃ６  ＣＤＲセットとＶＬ  ７Ｃ６  ＣＤＲセット及び
ＶＨ  ５Ｆ７  ＣＤＲセット及びＶＬ  ５Ｆ７  ＣＤＲセット
からなる群から選択される、請求項５に記載の結合タンパク質。
【請求項７】
ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項９】
ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項５に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
前記結合タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変ドメインを含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
前記結合タンパク質が、２つの可変ドメインを含み、該２つの可変ドメインが、
配列番号１及び配列番号２並びに
配列番号３及び配列番号４
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の結合タンパク質。
【請求項１７】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、キーとなる残基において少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、該キーとなる残基が、
ＣＤＲに隣接する残基；
グリコシル化部位残基；
希少残基；
Ａβ（２０−４２）球状凝集体と相互作用することができる残基；
ＣＤＲと相互作用することができる残基；
カノニカル（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ）残基；
重鎖可変領域及と軽鎖可変領域との間の接触残基；
バーニアゾーン内の残基；及び
コチア定義の可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義の第一の重鎖フレームワークとの間で重複する領域における残基
からなる群から選択される、請求項に７記載の結合タンパク質。
【請求項１８】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、キーとなる残基において少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、該キーとなる残基が、
ＣＤＲに隣接する残基；
グリコシル化部位残基；
希少残基；
Ａβ（２０−４２）球状凝集体と相互作用することができる残基；
ＣＤＲと相互作用することができる残基；
カノニカル（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ）残基；
重鎖可変領域及と軽鎖可変領域との間の接触残基；
バーニアゾーン内の残基；及び
コチア定義の可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義の第一の重鎖フレームワークとの間で重複する領域における残基
からなる群から選択される、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１９】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、キーとなる残基において少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、該キーとなる残基が、
ＣＤＲに隣接する残基；
グリコシル化部位残基；
希少残基；
Ａβ（２０−４２）球状凝集体と相互作用することができる残基；
ＣＤＲと相互作用することができる残基；
カノニカル（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ）残基；
重鎖可変領域及と軽鎖可変領域との間の接触残基；
バーニアゾーン内の残基；及び
コチア定義の可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義の第一の重鎖フレームワークとの間で重複する領域における残基
からなる群から選択される、請求項１６に記載の結合タンパク質。
【請求項２０】
結合タンパク質がコンセンサスヒト可変ドメインである、請求項１７に記載の結合タンパク質。
【請求項２１】
結合タンパク質がコンセンサスヒト可変ドメインである、請求項１８に記載の結合タンパク質。
【請求項２２】
結合タンパク質がコンセンサスヒト可変ドメインである、請求項１９に記載の結合タンパク質。
【請求項２３】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列が、該ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、及び該ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも７０個のアミノ酸残基を含む、請求項７に記載の結合タンパク質。
【請求項２４】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列が、該ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、及び該ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも７０個のアミノ酸残基を含む、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項２５】
前記ヒトアクセプターフレームワークが、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列が該ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、及び該ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも７０個のアミノ酸残基を含む、請求項１６に記載の結合タンパク質。
【請求項２６】
前記結合タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変ドメインを含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項２７】
２つの可変ドメイン（該２つの可変ドメインは、（配列番号１及び配列番号２）及び（配列番号３及び配列番号４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。）を含む、請求項２６に記載の結合タンパク質。
【請求項２８】
結合タンパク質がＡβ（２０−４２）球状凝集体を結合する、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項２９】
結合タンパク質がＡβ（２０−４２）球状凝集体を結合する、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項３０】
結合タンパク質がＡβ（２０−４２）球状凝集体を結合する、請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項３１】
結合タンパク質がＡβ（２０−４２）球状凝集体を結合する、請求項７に記載の結合タンパク質。
【請求項３２】
結合タンパク質がＡβ（２０−４２）球状凝集体を結合する、請求項１１に記載の結合タンパク質。
【請求項３３】
結合タンパク質がＡβ（２０−４２）球状凝集体を結合する、請求項１５に記載の結合タンパク質。
【請求項３４】
結合タンパク質がＡβ（２０−４２）球状凝集体を結合する、請求項１７に記載の結合タンパク質。
【請求項３５】
結合タンパク質がＡβ（２０−４２）球状凝集体を結合する、請求項２３に記載の結合タンパク質。
【請求項３６】
結合タンパク質がＡβ（２０−４２）球状凝集体を結合する、請求項２６に記載の結合タンパク質。
【請求項３７】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体の生物学的機能を調節する、請求項２８に記載の結合タンパク質。
【請求項３８】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体の生物学的機能を調節する、請求項３３に記載の結合タンパク質。
【請求項３９】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体の生物学的機能を調節する、請求項３６に記載の結合タンパク質。
【請求項４０】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体を中和する、請求項２８に記載の結合タンパク質。
【請求項４１】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体を中和する、請求項３３に記載の結合タンパク質。
【請求項４２】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体を中和する、請求項３６に記載の結合タンパク質。
【請求項４３】
最大で約１０−６Ｍ、最大で約１０−７Ｍ、最大で約１０−８Ｍ、最大で約１０−９Ｍ、最大で約１０−１０Ｍ、最大で約１０−１１Ｍ及び最大で約１０−１２Ｍからなる群から選択される前記標的への解離定数（ＫＤ）を有する、請求項２８に記載の結合タンパク質。
【請求項４４】
最大で約１０−６Ｍ、最大で約１０−７Ｍ、最大で約１０−８Ｍ、最大で約１０−９Ｍ、最大で約１０−１０Ｍ、最大で約１０−１１Ｍ及び最大で約１０−１２Ｍからなる群から選択される前記標的への解離定数（ＫＤ）を有する、請求項３３に記載の結合タンパク質。
【請求項４５】
最大で約１０−６Ｍ、最大で約１０−７Ｍ、最大で約１０−８Ｍ、最大で約１０−９Ｍ、最大で約１０−１０Ｍ、最大で約１０−１１Ｍ及び最大で約１０−１２Ｍからなる群から選択される前記標的への解離定数（ＫＤ）を有する、請求項３５に記載の結合タンパク質。
【請求項４６】
最大で約１０−６Ｍ、最大で約１０−７Ｍ、最大で約１０−８Ｍ、最大で約１０−９Ｍ、最大で約１０−１０Ｍ、最大で約１０−１１Ｍ及び最大で約１０−１２Ｍからなる群から選択される前記標的への解離定数（ＫＤ）を有する、請求項３６に記載の結合タンパク質。
【請求項４７】
請求項１に記載の１つの前記結合タンパク質を含む、抗体コンストラクト（該抗体コンストラクトは、リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む。）。
【請求項４８】
前記結合タンパク質が、
免疫グロブリン分子、
モノクローナル抗体、
キメラ抗体、
ＣＤＲグラフト抗体、
ヒト化抗体、
Ｆａｂ、
Ｆａｂ’、
Ｆ（ａｂ’）２、
Ｆｖ、
ジスルフィド結合Ｆｖ、
ｓｃＦｖ、
単一ドメイン抗体、
ダイアボディ、
多特異性抗体、
二重特異性抗体、及び
二特異的抗体
からなる群から選択される、請求項４７に記載の抗体コンストラクト。
【請求項４９】
前記結合タンパク質が、
ヒトＩｇＭ定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、
ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、
ヒトＩｇＥ定常ドメイン及び
ヒトＩｇＡ定常ドメイン
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項４７に記載の抗体コンストラクト。
【請求項５０】
配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０及び配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項４７に記載の抗体コンストラクト。
【請求項５１】
免疫接着分子、造影剤、治療薬及び細胞毒性薬からなる群から選択される物質をさらに含む、請求項４７から請求項５０の何れか１項に記載の抗体コンストラクトを含む抗体連結体。
【請求項５２】
前記物質が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁性標識及びビオチンからなる群から選択される造影剤である、請求項５１に記載の抗体連結体。
【請求項５３】
前記放射性標識が、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ及び１５３Ｓｍからなる群から選択される、請求項５２に記載の抗体連結体。
【請求項５４】
前記物質が、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、毒素及びアポトーシス剤からなる群から選択される治療薬又は細胞毒性薬である、請求項５１に記載の抗体連結体。
【請求項５５】
前記結合タンパク質がヒトグリコシル化パターンを有する、請求項４９に記載の抗体コンストラクト。
【請求項５６】
前記結合タンパク質がヒトグリコシル化パターンを有する、請求項５１に記載の抗体連結体。
【請求項５７】
結晶として存在する、請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項５８】
結晶として存在する、請求項４７に記載の抗体コンストラクト。
【請求項５９】
前記抗体コンストラクトが結晶として存在する、請求項５１に記載の抗体連結体。
【請求項６０】
前記結晶が担体不含医薬制御放出結晶である、請求項５７に記載の結合タンパク質。
【請求項６１】
前記結晶が担体不含医薬制御放出結晶である、請求項５８に記載の抗体コンストラクト。
【請求項６２】
前記結晶が担体不含医薬制御放出結晶である、請求項５９に記載の抗体連結体。
【請求項６３】
その結合タンパク質の可溶性対応物よりもインビボで長い半減期を有する、請求項５７に記載の結合タンパク質。
【請求項６４】
その抗体コンストラクトの可溶性対応物よりもインビボでより長い半減期を有する、請求項５８に記載の抗体コンストラクト。
【請求項６５】
その抗体連結体の可溶性対応物よりもインビボでより長い半減期を有する、請求項５９に記載の抗体連結体。
【請求項６６】
生物学的活性を保持する、請求項５７に記載の結合タンパク質。
【請求項６７】
生物学的活性を保持する、請求項５８に記載の抗体コンストラクト。
【請求項６８】
生物学的活性を保持する、請求項５９に記載の抗体連結体。
【請求項６９】
結合タンパク質（該結合タンパク質の前記可変重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有する。）をコードする単離核酸分子。
【請求項７０】
前記結合タンパク質の前記軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項６９に記載の単離核酸分子。
【請求項７１】
結合タンパク質（該結合タンパク質の可変重鎖のアミノ酸配列は、配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有する。）をコードする単離核酸分子。
【請求項７２】
前記結合タンパク質の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号４と少なくとも７０％の同一性を有する、請求項７１に記載の単離核酸分子。
【請求項７３】
請求項６９から請求項７２の何れか１項に記載の前記単離核酸分子を含むベクター。
【請求項７４】
請求項７３に記載の前記ベクターを含む単離宿主細胞。
【請求項７５】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体に結合することができる結合タンパク質を生成させるのに十分な時間及び条件下で、請求項７４に記載の宿主細胞を培養することを含む、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に結合することができるタンパク質を生成させる方法。
【請求項７６】
請求項７５に記載の方法に従い産生される単離タンパク質。
【請求項７７】
（ａ）製剤（該製剤は、請求項５７から請求項５９のいずれか１項に記載の結晶及び成分を含む。）と、及び
（ｂ）少なくとも１つのポリマー性担体と、
を含む、結合タンパク質の放出のための組成物。
【請求項７８】
前記ポリマー性担体が、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）又はＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシブトリエート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（有機）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫酸化多糖類、これらの混合物及びコポリマーからなる群から選択される少なくとも１つのポリマーである、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
前記成分が、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項７７に記載の組成物。
【請求項８０】
治療を実施するために十分な量で請求項７７に記載の前記組成物を哺乳動物に投与することを含む、アミロイドーシスを有する疑いのある哺乳動物を治療するための方法。
【請求項８１】
請求項１に記載の結合タンパク質と及び医薬的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項８２】
前記医薬的に許容可能な担体が、前記結合タンパク質の吸収又は分散を向上させるのに有用なアジュバントとして機能する、請求項８１に記載の医薬組成物。
【請求項８３】
前記アジュバントがヒアルロニダーゼである、請求項８２に記載の医薬組成物。
【請求項８４】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体の存在が有害である疾患を治療するための少なくとも１つのさらなる治療薬をさらに含む、請求項８１に記載の医薬組成物。
【請求項８５】
前記治療薬が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、コレステリナーゼ阻害剤、部分的ＮＭＤＡ受容体ブロッカー、グリコサミノグリカン模倣物、γセクレターゼの阻害剤又はアロステリック調節物質、黄体形成ホルモン遮断ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体アンタゴニスト、キレート剤、神経選択的Ｌ型カルシウムチャネルブロッカー、免疫調節物質、アミロイド原線維形成阻害剤又はアミロイドタンパク質沈着阻害剤、５−ＨＴ１ａ受容体アンタゴニスト、ＰＤＥ４阻害剤、ヒスタミンアゴニスト、糖化最終産物に対する受容体タンパク質、ＰＡＲＰ刺激物質、セロトニン６−受容体アンタゴニスト、５−ＨＴ４受容体アゴニスト、ヒトステロイド、神経代謝を促進するグルコース取り込み刺激剤、選択的ＣＢ１アンタゴニスト、ベンゾジアゼピン受容体における部分的アゴニスト、アミロイドβ産生アンタゴニスト又は阻害剤、アミロイドβ沈着阻害剤、ＮＮＲα−７部分アンタゴニスト、治療標的ＰＤＥ４、ＲＮＡ翻訳阻害剤、ムスカリン性アゴニスト、神経成長因子受容体アゴニスト、ＮＧＦ受容体アゴニスト及び遺伝子治療調節物質からなる群から選択される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体活性が低下するように請求項１に記載の結合タンパク質とＡβ（２０−４２）球状凝集体を接触させることを含む、Ａβ（２０−４２）球状凝集体活性を低下させるための方法。
【請求項８７】
ヒト対象におけるヒトＡβ（２０−４２）球状凝集体活性が低下するように請求項１に記載の結合タンパク質をヒト対象に投与することを含む、Ａβ（２０−４２）球状凝集体が有害である疾患に罹患しているヒト対象においてヒトＡβ（２０−４２）球状凝集体活性を低下させるための方法。
【請求項８８】
治療を実施するのに十分な量で請求項１に記載の結合タンパク質を対象に投与することによって、Ａβ（２０−４２）球状凝集体活性が有害である疾病又は疾患に対して対象を治療するための方法。
【請求項８９】
前記疾患が、α１−アンチトリプシン欠損症、Ｃ１−阻害剤欠損血管性浮腫、アンチトロンビン欠乏血栓塞栓症、クールー、クロイツフェルトヤコブ病／スクレイピー、牛海綿状脳症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、ハンチントン病、脊髄小脳失調、マカド−ジョセフ変性症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、前頭側頭型痴呆、鎌型血球病、不安定ヘモグロビン封入体溶血、薬物誘発性封入体溶血、パーキンソン病、全身性ＡＬアミロイドーシス、結節性ＡＬアミロイドーシス、全身性ＡＡアミロイドーシス、前立腺アミロイド、血液透析アミロイドーシス、遺伝性（アイスランド型）脳血管症、ハンチントン病、家族性臓器アミロイド、家族性臓器多発性神経炎、家族性臓器アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドニューロパシー、家族性心臓アミロイド、アルツハイマー病、ダウン症、甲状腺髄様癌及び２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）からなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
少なくとも１つの第二の物質の投与の前に、それと同時に、又はその後に請求項１に記載の結合タンパク質を投与する段階を含む、Ａβ（２０−４２）球状凝集体が有害である疾患に罹患している患者を治療する方法（該少なくとも１つの第二の物質は、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、ポリクローナル抗体、コレステリナーゼ阻害剤及び部分的ＮＭＤＡ受容体ブロッカーからなる群から選択される。）。
【請求項９１】
前記コレステリナーゼ阻害剤が、タクリン、ドネペジル、リバスチグミン及びガランタミンからなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記部分ＮＭＤＡ受容体ブロッカーがメマンチンである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
対象への前記投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心臓周囲内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口内、舌下、鼻内及び経皮からなる群選択される少なくとも１つの様式による、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
ａ）患者から生体試料を単離する工程；
ｂ）球状凝集体／結合タンパク質複合体の形成に十分な時間及び条件下で請求項１に記載の前記結合タンパク質と該生体試料を接触させる工程；及び
該試料中の該球状凝集体／結合タンパク質複合体の存在を検出する工程（該複合体の存在は、該患者におけるアルツハイマー病の診断を示す。）、
を含む、アルツハイマー病を有する疑いがある患者においてアルツハイマー病を診断する方法。
【請求項９５】
ａ）患者から生体試料を単離する工程；
ｂ）球状凝集体／結合タンパク質複合体の形成に十分な時間及び条件下で請求項１に記載の前記結合タンパク質と該生体試料を接触させる工程；
ｃ）結合した結合タンパク質に連結体が結合するのを可能にするために十分な時間及び条件下で、得られた球状凝集体／結合タンパク質複合体に連結体を添加する工程（該連結体は、検出可能なシグナルを生成させることができるシグナル生成化合物に連結される抗体を含む。）、並びに
ｄ）該シグナル生成化合物により生成されるシグナルを検出することにより該生体試料において存在し得る該結合タンパク質の存在を検出する工程（該シグナルは、該患者におけるアルツハイマー病の診断を示す。）、
段階を含む、アルツハイマー病を有する疑いがある患者においてアルツハイマー病を診断する方法。
【請求項９６】
ａ）患者から生体試料を単離する工程；
ｂ）抗結合タンパク質／結合タンパク質複合体の形成を可能とするのに十分な時間及び条件下で前記試料中の結合タンパク質に対して特異的な抗結合タンパク質と前記生体試料を接触させる工程；
ｃ）結合した結合タンパク質に連結体が結合するのを可能にするのに十分な時間及び条件下で、得られた抗結合タンパク質／結合タンパク質複合体に連結体を添加する工程（該連結体は、検出可能なシグナルを生成させることができるシグナル生成化合物に連結された球状凝集体を含む。）、並びに
ｄ）該シグナル生成化合物により生成されるシグナルを検出する工程（該シグナルは、前記患者におけるアルツハイマー病の診断を示す。）、
含む、アルツハイマー病を有する疑いがある患者においてアルツハイマー病を診断する方法。
【請求項９７】
請求項１に記載の前記結合タンパク質と及び医薬的に許容可能な佐剤とを含むワクチン。
【請求項９８】
ａ）患者から生体試料を単離する工程；
ｂ）変異体抗原／結合タンパク質複合体の形成に十分な時間及び条件下で前記生体試料中を請求項１に記載の前記結合タンパク質と接触させる工程；
ｃ）前記変異体抗原／結合タンパク質複合体の存在を検出する工程（前記複合体は、前記患者が変異体アミロイドβペプチド配列を有し、従って、アルツハイマー病を有することを示す。）
を含む、アルツハイマー病を有する疑いがある患者において、変異体アミロイドβペプチド配列を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
共同研究契約に対する参照
本願の内容は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ．とＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓとの間で２００６年８月３１日に締結された共同研究契約書に基づくものであり、ヒト化アミロイドβ抗体に関する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、例えばアルツハイマー病及び関連症状の診断、治療及び予防において使用され得る抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性の認知能力喪失及び脳のいくつかの領域での、アミロイド沈着、神経原線維のもつれ及びニューロン欠損を含む特徴的な神経病理学的特性を特徴とする神経変性疾患である（Ｈａｒｄｙ及びＳｅｌｋｏｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７、３５３（２００２）；Ｍａｔｔｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ４３１、７００４（２００４）参照）。アミロイド沈着の主要な構成因子はアミロイドベータペプチド（Ａβ）であり、４２アミノ酸長型Ａβ（１−４２）が最も顕著である。
【０００４】
特に、アミロイドβ（１−４２）タンパク質は、タンパク質分解性プロセシングによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）由来の４２アミノ酸を有するポリペプチドである。これにはまた、ヒト変異型に加え、ヒト以外の生物（特にその他の哺乳動物、とりわけラット）に存在するアミロイドβ（１−４２）タンパク質のアイソフォームも含まれる。このタンパク質は、水性の環境で重合する傾向があり、非常に様々な分子形態で存在し得る。
【０００５】
例えばアルツハイマー病などの認知症の発症又は進行と不溶性タンパク質の沈着との単純な相互関係は疑わしいことが分かっている（Ｔｅｒｒｙら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３０．５７２−５８０（１９９１）；Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １６、２８５−２９８（１９９５））。一方、シナプス欠損及び知的知覚は、Ａβ（１−４２）の可溶型とより相関すると思われる（Ｌｕｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５、８５３−８６２（１９９９）；ＭｃＬｅａｎら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６、８６０−８６６（１９９９））。
【０００６】
過去にポリクローナル及びモノクローナル抗体がＡβ（１−４２）に対して作製されてきたが、動物及び／又はヒトにおいて重篤な副作用も起こさずに所望の治療効果をもたらすことが証明されているものはない。例えば、５ヵ月間、週に１回、Ｎ−末端特異的抗−Ａβ（１−４２）抗体の投与を受けた老齢ＡＰＰ２３マウスでの前臨床研究からの受動免疫付与の結果から、治療に関連のある副作用が示される。特に、これらのマウスは、食塩水処置マウスと比較して、微小出血の数及び重症度が上昇した（Ｐｆｅｉｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２  ２９８：１３７９）。同様の出血の増加は、最近、老齢（＞２４ヵ月）Ｔｇ２５７６及びＰＤＡＰＰマウスに対しても報告された（Ｗｉｌｃｏｃｋら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３、２３：３７４５−５１；Ｒａｃｋｅら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５、２５：６２９−６３６）。両系統において、抗−Ａβ（１−４２）の注射の結果、微小出血が顕著に増加した。このように、ヒトの身体において望ましくない潜在的な致死的影響を誘発することなく疾患の進行を予防又は遅らせる生物製剤の開発に対して非常に大きい治療ニーズがある。一般集団の寿命が長くなっており、この長寿化とともに、アルツハイマー病又は関連疾患と診断される年間患者数が上昇しているという観点において、このようなニーズは特に明白である。さらに、このような抗体により、アルツハイマー病の症状があった患者においてアルツハイマー病の適切な診断が可能となろう（この診断は現在、剖検でのみ確認することができる。）。さらに、このような抗体により、本タンパク質の生物学的特性及びこの衰弱性疾患に関与するその他の生物学的因子を解明することが可能となろう。
【０００７】
本明細書中で参照される全ての特許及び刊行物は、参照によりその全体において本明細書中に組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈａｒｄｙ及びＳｅｌｋｏｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、２００２年、ｐｐ．３５３
【非特許文献２】Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、４３１、２００４年、ｐｐ．７００４
【非特許文献３】Ｔｅｒｒｙ他、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ、３０、１９９１年、ｐｐ．５７２−５８０
【非特許文献４】Ｄｉｃｋｓｏｎ他、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ、１６、１９９５年、ｐｐ．２８５−２９８
【非特許文献５】Ｌｕｅ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ、１５５、１９９９年、ｐｐ．８５３−８６２
【非特許文献６】ＭｃＬｅａｎ他、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ、４６、１９９９年、ｐｐ．８６０−８６６
【非特許文献７】Ｐｆｅｉｆｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８、２００２年、ｐｐ．１３７９
【非特許文献８】Ｗｉｌｃｏｃｋ他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２３、２００３年、ｐｐ．３７４５−５１
【非特許文献９】Ｒａｃｋｅ他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２５、２００５年、ｐｐ．６２９−６３６
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、結合タンパク質、特に、可溶性オリゴマー、例えばアルツハイマー病の患者の脳内に存在するＡβ（２０−４２）球状凝集体、に結合することができるヒト化抗体（例えば、本明細書において、野生型ＩｇＧ１定常領域を有するヒト化７Ｃ６抗体に対する「ヒト化７Ｃ６」又は「７Ｃ６ｈｕｍ７ｗｔ」と互換的に表記されるもの及び変異されたＩｇＧ１定常領域を有するヒト化７Ｃ６抗体に対する「７Ｃ６ｈｕｍ７ｍｕｔ」と表記されるもの並びに本明細書において、野生型ＩｇＧ１定常領域を有するヒト化７Ｃ６抗体に対する「ヒト化５Ｆ７」及び「５Ｆ７ｈｕｍ８」と互換的に表記されるもの及び「５Ｆ７ｈｕｍ８ｍｕｔ」）に関する。本発明の抗体は本明細書中に記載されているＡβ球状凝集体以外のＡβ形態とも反応し得る（すなわち、結合し得る）ことが注目される。これらの抗原は、オリゴマー若しくは球状凝集体であってもよく、又はオリゴマー若しくは球状凝集体でなくてもよい。従って、本発明の抗体が結合する抗原には、本発明の抗体が反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆるＡβ形態が含まれる。このようなＡβ形態には、Ａβ（２０−４２）、Ａβ（２０−４０）、Ａβ（１２−４２）、Ａβ（１２−４０）、Ａβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）形態などの末端切断された及び末端切断されていないＡβ（Ｘ−Ｙ）形態（Ｘ及びＹは、上に定義されている。）が含まれるが、但し、前記形態は、球状凝集体エピトープを含む。さらに、本発明はまた、これらの結合タンパク質又はそれらの一部を産生し使用する方法も提供する。
【００１０】
特に、本発明は、アミロイドβ（２０−４２）球状凝集体に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質を包含し、前記抗原結合ドメインは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００１１】
ＣＤＲ−ＶＨ１。Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号５）（式中、
Ｘ１は、Ｔ又はＳであり；
Ｘ２は、Ｆ又はＹであり；
Ｘ３は、Ｙ又はＡであり；
Ｘ４は、Ｉ又はＭであり；及び
Ｘ５は、Ｈ又はＳである。）
ＣＤＲ−ＶＨ２。（Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７（配列番号６）（式中、
Ｘ１は、Ｍ又はＳであり；
Ｘ２は、Ｉであり；
Ｘ３は、Ｇ又はＨであり；
Ｘ４は、Ｐ又はＮであり；
Ｘ５は、Ｇ又はＲであり；
Ｘ６は、Ｓ又はＧであり；
Ｘ７は、Ｇ又はＴであり；
Ｘ８は、Ｎ又はＩであり；
Ｘ９は、Ｔ又はＦであり；
Ｘ１０は、Ｙであり；
Ｘ１１は、Ｙ又はＬであり；
Ｘ１２は、Ｎ又はＤであり；
Ｘ１３は、Ｅ又はＳであり；
Ｘ１４は、Ｍ又はＶであり；
Ｘ１５は、Ｆ又はＫであり；
Ｘ１６は、Ｋ又はＧであり；及び
Ｘ１７はＤであり、又は存在しない）。
【００１２】
ＣＤＲ−ＶＨ３。（Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３（配列番号７）（式中、
Ｘ１は、Ａ又はＧであり；
Ｘ２は、Ｋ又はＲであり；
Ｘ３は、Ｓであり；
Ｘ４は、Ａ又はＮであり；
Ｘ５は、Ｒ又はＳであり；
Ｘ６は、Ａ又はＹであり；
Ｘ７は、Ａであり；
Ｘ８は、Ｗ又はＭであり；
Ｘ９は、Ｆ又はＤであり；
Ｘ１０は、Ａ又はＹであり；及び
Ｘ１１はＹであり、又は存在しない）。
【００１３】
ＣＤＲ−ＶＬ１。（Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ８−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６（配列番号８）（式中、
Ｘ１は、Ｒであり；
Ｘ２は、Ｓであり；
Ｘ３は、Ｓ又はＴであり；
Ｘ４は、Ｑであり；
Ｘ５は、Ｓ又はＴであり；
Ｘ６は、Ｖ又はＬであり；
Ｘ７は、Ｖであり；
Ｘ８は、Ｑ又はＨであり；
Ｘ９は、Ｓ又はＲであり；
Ｘ１０は、Ｎであり；
Ｘ１１は、Ｇであり；
Ｘ１２は、Ｎ又はＤであり；
Ｘ１３は、Ｔであり；
Ｘ１４は、Ｙであり；
Ｘ１５は、Ｎ又はＬであり、及び
Ｘ１６は、Ｅである。）
ＣＤＲ−ＶＬ２。  Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号９）（式中、
Ｘ１は、Ｋであり；
Ｘ２は、Ｖであり；
Ｘ３は、Ｓであり；
Ｘ４は、Ｎであり；
Ｘ５は、Ｒであり；
Ｘ６は、Ｆであり；及び
Ｘ７は、Ｓである。）
及び
ＣＤＲ−ＶＬ３。  Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９  （配列番号１０）（式中、
Ｘ１は、Ｆであり；
Ｘ２は、Ｑであり；
Ｘ３は、Ｇであり；
Ｘ４は、Ｓであり；
Ｘ５は、Ｈであり；
Ｘ６は、Ｖであり；
Ｘ７は、Ｐであり；
Ｘ８は、Ｐ又はＹであり；及び
Ｘ９は、Ｔである。）
この結合タンパク質は、アミロイドβ（１−４２）球状凝集体、アミロイドβ（１２−４２）球状凝集体、β−アミロイド前駆体タンパク質、アミロイドβ（１−４０）単量体、アミロイドβ（１−４２）単量体及びアミロイドβ（１−４２）原繊維からなる群から選択される少なくとも１つのアミロイドβペプチド又はタンパク質より、アミロイドβ（２０−４２）球状凝集体に対して、より大きな結合親和性を有する。
【００１４】
本発明の一態様は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態に結合することができる抗原結合ドメインを含む結合タンパク質（例えば、抗体）に関する。一実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号１の残基３０−３５（すなわち、ＴＦＹＩＨ（配列番号１１）；５Ｆ７  ＶＨ  ＣＤＲ１）；配列番号１の残基５０−６６（すなわち、ＭＩＧＰＧＳＧＮＴＹＹＮＥＭＦＫＤ（配列番号１２）；５Ｆ７  ＶＨ  ＣＤＲ２）；配列番号１の残基９８−１０８（すなわち、ＡＫＳＡＲＡＡＷＦＡＹ（配列番号１３）；５Ｆ７  ＶＨ  ＣＤＲ３）配列番号２の残基２４−３９（すなわち、ＲＳＳＱＳＶＶＱＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１４）；５Ｆ７  ＶＬ  ＣＤＲ１）；配列番号２の残基５５−６１（すなわち、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１５）；５Ｆ７  ＶＬ  ＣＤＲ２）；配列番号２の残基９４−１０２（すなわち、ＦＱＧＳＨＶＰＰＴ（配列番号６５）；５Ｆ７  ＶＬ  ＣＤＲ３）；配列番号３の残基３１−３５（すなわち、ＳＹＡＭＳ（配列番号１６）；７Ｃ６  ＶＨ  ＣＤＲ１）；配列番号３の残基５０−６５（すなわち、ＳＩＨＮＲＧＴＩＦＹＬＤＳＶＫＧ（配列番号１７）；７Ｃ６  ＶＨ  ＣＤＲ２）；配列番号３の残基９８−１０７（すなわち、ＧＲＳＮＳＹＡＭＤＹ（配列番号１８）；７Ｃ６  ＶＨ  ＣＤＲ３）；配列番号４の残基２４−３９（すなわち、ＲＳＴＱＴＬＶＨＲＮＧＤＴＹＬＥ（配列番号１９）；７Ｃ６  ＶＬ  ＣＤＲ１）；配列番号４の残基５５−６１（すなわち、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号２０）；７Ｃ６  ＶＬ  ＣＤＲ２）；配列番号４の残基９４−１０２（すなわち、ＦＱＧＳＨＶＰＹＴ（配列番号２１）；７Ｃ６  ＶＬ  ＣＤＲ３）。好ましい実施形態において、結合タンパク質は、上記で開示される配列からなる群から選択される少なくとも３つのＣＤＲを含む。より好ましくは、選択される３つのＣＤＲは、以下からなる群から選択される可変ドメインＣＤＲのセットからのものである：
【００１５】
【表１】
2010530740.tif 000002
【００１６】
ある実施形態において、本発明の結合タンパク質は、少なくとも２つの可変ドメインＣＤＲセットを含む。より好ましくは、２つの可変ドメインＣＤＲセットは、ＶＨ  ５Ｆ７  ＣＤＲセットとＶＬ  ５Ｆ７  ＣＤＲセット及びＶＨ  ７Ｃ６  ＣＤＲセットとＶＬ  ７Ｃ６  ＣＤＲセットからなる群から選択される。
【００１７】
別の実施形態において、上記で開示される結合タンパク質は、ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む。好ましくは、ヒトアクセプターフレームワークは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ（配列番号２２）；ＷＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ（配列番号２３）；ＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２４）；ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２５）；ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣ配列番号２６）；ＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹ（配列番号２７）；ＧＶＰＤＲＦＳＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣ（配列番号２８）；ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２９）；ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号３０）；ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（配列番号３１）；ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３２）；ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３３）；ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣ（配列番号３４）；ＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹ（配列番号３５）；ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣ（配列番号３６）及びＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ配列番号３７）。
【００１９】
好ましい実施形態において、結合タンパク質は、Aβ（２０−４２）球状凝集体又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆるAβ形態に結合することができるヒト化抗体又はその抗原結合部分である。好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、上記で開示される１つ又はそれ以上のＣＤＲを含む（下表５を参照）。より好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変ドメインを含む。最も好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、上記で開示される群から選択される２つの可変ドメインを含む。好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、ヒトアクセプターフレームワークを含む。より好ましくは、ヒトアクセプターフレームワークは、上記で開示されているヒトアクセプターフレームワークの何れか１つである。
【００２０】
好ましい実施形態において、結合タンパク質は、Aβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆるＡβ形態に結合することができるヒト化抗体又はその抗原結合部分である。好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、ヒトアクセプターフレームワークのヒト抗体可変ドメイン中に取り込まれた上に開示されている１つ又はそれ以上のＣＤＲを含む。好ましくは、ヒト抗体可変ドメインは、コンセンサスヒト可変ドメインである。より好ましくは、ヒトアクセプターフレームワークは、キーとなる残基における少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含む（このキーとなる残基は、ＣＤＲに隣接する残基；グリコシル化部位残基；希少残基；Ａβ（２０−４２）球状凝集体と相互作用することができる残基；ＣＤＲと相互作用することができる残基；カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）残基；重鎖可変領域及と軽鎖可変領域との間の接触残基；バーニアゾーン内の残基；及びコチア定義の可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義の第一の重鎖フレームワークとの間で重複する領域における残基からなる群から選択される。好ましくは、ヒトアクセプターフレームワークヒトアクセプターフレームワークは、少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、このフレームワークのアミノ酸配列は、前記ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも６５％同一であり、前記ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも７０個のアミノ酸残基を含む。
【００２１】
好ましい実施形態において、結合タンパク質は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆるAβ形態に結合することができるヒト化抗体又はその抗原結合部分である。
【００２２】
本発明の抗体は、本明細書中に記載されているＡβ球状凝集体以外のＡβ形態とも反応性を有し得る（すなわち、結合し得る）ことが再び注目される。これらの抗原は、オリゴマー若しくは球状凝集体であってもよく、又はオリゴマー若しくは球状凝集体でなくてもよい。従って、本発明の抗体が結合する抗原には、本発明の抗体が反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆるＡβ形態が含まれる。このようなＡβ形態には、Ａβ（２０−４２）、Ａβ（２０−４０）、Ａβ（１２−４２）、Ａβ（１２−４０）、Ａβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）形態などの末端切断された及び末端切断されていないＡβ（Ｘ−Ｙ）形態（Ｘ及びＹは、上に定義されている。）が含まれるが、但し、これらの形態は、球状凝集体エピトープを含む。
【００２３】
好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、上記で開示される１つ又はそれ以上のＣＤＲを含む。より好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、上記で開示される３つ又はそれ以上のＣＤＲを含む。最も好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、上記で開示される６つのＣＤＲを含む。
【００２４】
特許請求の範囲に記載されている本発明の別の実施形態において、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変ドメインを含む。配列番号１（５Ｆ７  ＶＬ）に関して、Ｋａｂａｔ付番に基づいて、アミノ酸位置１はＥ又はＱであり得；５位はＶ又はＫであり得；Ｖ又はＫであり得；１１位は、Ｖ又はＬであり得；１２位は、Ｋ又はＶであり得；１３位は、Ｋ又はＲであり得；１６位は、Ａ又はＴであり得；２０位は、Ｖ又はＭであり得；３８位は、Ｒ又はＫであり得；４０位は、Ａ又はＲであり得；７５位は、Ｔ又はＳであり得；８１位は、Ｅ又はＱであり得；８３位は、Ｒ又はＴであり得；８７位は、Ｔ又はＳであり得；及び９１位は、Ｙ又はＦであり得る。配列番号２（５Ｆ７  ＶＨ）に関して、Ｋａｂａｔ付番に基づき、アミノ酸２位は、Ｉ又はＶであり得；３位は、Ｖ又はＬであり得；７位は、Ｓ又はＴであり得；１４位は、Ｔ又はＳであり得；１５位は、Ｐ又はＬであり得；１７位は、Ｅ又はＤであり得；１８位は、Ｐ又はＱであり得；４５位は、Ｑ又はＫであり得；及び８３位は、Ｖ又はＬであり得る。配列番号３（７Ｃ６  ＶＨ）に関して、アミノ酸１９位は、Ｒ又はＫであり得；４０位は、Ａ又はＴであり得；４２位は、Ｇ又はＡであり得；４４位は、Ｇ又はＲであり得；８２Ａ位は、Ｎ又はＳであり得；８４位は、Ｌ又はＳであり得；及び８９位は、Ｖ又はＩであり得る。配列番号４（７Ｃ６  ＶＬ）に関して、Ｋａｂａｔ付番に基づき、アミノ酸１４位は、Ｔ又はＲであり得；１５位は、Ｐ又はＬであり得；１７位は、Ｅ又はＤであり得；１８位は、Ｐ又はＱであり得；４５位は、Ｑ又はＫであり；及び８３位は、Ｖ又はＬであり得る。 より好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は、上に開示されている群から選択される２つの可変ドメインを含む。最も好ましくは、ヒト化抗体又はその抗原結合部分は２つの可変ドメインを含み、前記２つの可変ドメインは（配列番号1及び配列番号２）及び（配列番号３及び配列番号４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２５】
好ましい実施形態において、上記で開示される結合タンパク質は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン及びヒトＩｇＡ定常ドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。より好ましくは、結合タンパク質は、配列番号38、配列番号39、配列番号40及び配列番号４１を含む。
【００２６】
より好ましい実施形態において、上記で開示される結合タンパク質は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン及びヒトＩｇＡ定常ドメインからなる群から選択される変異された重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。エフェクター機能又は抗体の半減期を調節する重鎖定常領域の変異は、本分野において十分に認知されている（Ｂｏｒｉｓ，追加参考文献）。
【００２７】
さらにより好ましい実施形態において、上記で開示される結合タンパク質は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン及びヒトＩｇＡ定常ドメイン及びλ又はκ軽鎖からなる群から選択される野生型又は変異された重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。
【００２８】
さらにより好ましい実施形態において、上記で開示される結合タンパク質は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン及びヒトＩｇＡ定常ドメイン及びκ軽鎖からなる群から選択される野生型又は変異された重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。本発明の結合タンパク質は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体を結合することができ、本発明の抗体と反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆるＡβ形態も結合し得る。好ましくは、結合タンパク質は、Ａβ（20−４２）球状凝集体の生物学的機能を調節することができる。より好ましくは、結合タンパク質は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体を中和することができる。
【００２９】
別の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、１ｘ１０−６Ｍから１ｘ１０−１２の範囲の、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に対する解離定数（ＫＤ）を有する。好ましくは、抗体は、高い親和性で、例えば、約１ｘ１０−７若しくはそれ以上のＫＤで、約１ｘ１０−８若しくはそれ以上のＫＤで、約１ｘ１０−９若しくはそれ以上のＫＤで、約１ｘ１０−１０若しくはそれ以上のＫＤで、又は約１ｘ１０−１１若しくはそれ以上のＫＤで、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に結合する。
【００３０】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体への抗体の結合親和性は、Ａβ（１２−４２）球状凝集体への又はＡβ（１−４２）球状凝集体への抗体の結合親和性より、少なくとも２倍（例えば、少なくとも３又は少なくとも５倍）、好ましくは、少なくとも１０倍（例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍又は少なくとも５０倍）、より好ましくは、少なくとも１００倍（例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍又は少なくとも５００倍）、さらにより好ましくは、少なくとも１０００倍（例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍又は少なくとも５０００倍）、さらにより好ましくは、少なくとも１０，０００倍（例えば、少なくとも２０，０００倍、少なくとも３０，０００倍又は少なくとも５０，０００倍）、最も好ましくは、少なくとも１００，０００倍大きいことが好ましい。さらに、Ａβ（２０−４２）球状凝集体への抗体の親和性は、Ａβ（１−４０）単量体及びＡβ（１−４０）単量体の両方に対するその親和性を上回るべきである。
【００３１】
本発明のある実施形態は、上記で開示される結合タンパク質の何れか１つ及びリンカーポリペプチド又は免疫グロブリンを含む抗体コンストラクトを提供する。好ましい実施形態において、抗体コンストラクトは、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、二重特異性抗体（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）又は二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合分子からなる群から選択される。好ましい実施形態において、抗体コンストラクトは、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン及びヒトＩｇＡ定常ドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。より好ましくは、抗体コンストラクトは、（配列番号３８及び配列番号３９）又は（配列番号４０及び配列番号４１）を含む。別の実施形態において、本発明は、上記で開示される抗体コンストラクト及び、免疫接着分子、造影剤、治療薬及び細胞毒性薬からなる群から選択される物質を含む抗体連結体を提供する。好ましい実施形態において、造影剤は、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁性標識及びビオチンからなる群から選択される。より好ましくは、造影剤は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ及び１５３Ｓｍからなる群から選択される放射性標識である。好ましい実施形態において、治療薬又は細胞毒性薬は、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、毒素及びアポトーシス剤からなる群から選択される。
【００３２】
別の実施形態において、抗体コンストラクトはグリコシル化されている。好ましくは、グリコシル化はヒトグリコシル化パターンである。
【００３３】
別の実施形態において、上記で開示される結合タンパク質、抗体コンストラクト又は抗体連結体は結晶として存在する。好ましくは、結晶は担体不含医薬制御放出結晶である。好ましい実施形態において、結晶化結合タンパク質、結晶化抗体コンストラクト又は結晶化抗体連結体は、その可溶性形態よりもインビボで長い半減期を有する。別の好ましい実施形態において、結晶化結合タンパク質、結晶化抗体コンストラクト又は結晶化抗体連結体は、結晶化後、生物学的活性を保持する。
【００３４】
本発明のある態様は、上記で開示される、結合タンパク質、抗体コンストラクト又は抗体連結体をコードする単離核酸分子に関する。さらなる実施形態は、上記で開示される単離核酸を含むベクターを提供する（該ベクターは、ｐｃＤＮＡ；ｐＴＴ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２、Ｖｏｌ．３０、Ｎｏ．２）；ｐＴＴ３（さらなる多重クローニング部位を有するｐＴＴ；ｐＥＦＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ、Ｓ．及びＮａｇａｔａ、Ｓ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．１８、Ｎｏ．１７）；ｐＢＶ；ｐＪＶ；及びｐＢＪからなる群から選択される。）。
【００３５】
別の態様において、宿主細胞は、上に開示されているベクターで形質転換されている。好ましくは、宿主細胞は原核細胞である。より好ましくは、宿主細胞はイー・コリである。関連する実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。好ましくは、真核細胞は、原生細胞、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される。より好ましくは、宿主細胞は、以下に限定されないが、ＣＨＯ及びＣＯＳを含む哺乳動物細胞；又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの真菌細胞；又はＳｆ９などの昆虫細胞である。
【００３６】
本発明の別の態様は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態を結合する結合タンパク質を作製するのに十分な条件下及び時間で、上に開示されている宿主細胞の何れか１つを培地中において培養することを含む、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態を結合する結合タンパク質を作製する方法を提供する。別の実施形態は、上に開示されている方法に従って産生された結合タンパク質及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態を提供する。
【００３７】
ある実施形態は、本明細書中で定義されるような結合タンパク質の放出のための組成物を提供する（この組成物は、順に上記で開示されるような結晶化結合タンパク質、結晶化抗体コンストラクト又は結晶化抗体連結体及び成分と；少なくとも１つのポリマー性担体と、を含む製剤を含む。好ましくは、ポリマー性担体は、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）又はＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシブトリエート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（有機）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン、硫酸化多糖類、これらの混合物及びコポリマーからなる群の１つ又はそれ以上から選択されるポリマーである。好ましくは、成分は、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールからなる群から選択される。別の実施形態は、上記で開示される組成物の有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物を治療するための方法を提供する。
【００３８】
本発明はまた、上記で開示されるような、結合タンパク質、抗体コンストラクト又は抗体連結体と医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物も提供する。さらなる実施形態において、医薬組成物は、活性が有害である疾患を治療するための少なくとも１つのさらなる治療薬を含む。好ましくは、さらなる治療薬は、モノクローナル抗体（例えば、例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ及びＨｕｍｉｒａ（Ｒ）などのＴＮＦアンタゴニスト）、ＴＮＦ受容体融合タンパク質（例えば、Ｅｎｂｒｅｌ）、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、コレステリナーゼ阻害剤、部分的ＮＭＤＡ受容体ブロッカー、グリコサミノグリカン模倣物、γセクレターゼの阻害剤又はアロステリック調節物質、黄体形成ホルモン遮断ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体アンタゴニスト、キレート剤、神経選択的Ｌ型カルシウムチャネルブロッカー、免疫調節物質、アミロイド原線維形成阻害剤又はアミロイドタンパク質沈着阻害剤、５−ＨＴ１ａ受容体アンタゴニスト、ＰＤＥ４阻害剤、ヒスタミンアゴニスト、糖化最終産物に対する受容体タンパク質、ＰＡＲＰ刺激物質、セロトニン６−受容体アンタゴニスト、５−ＨＴ４受容体アゴニスト、ヒトステロイド、神経代謝を促進するグルコース取り込み刺激剤、選択的ＣＢ１アンタゴニスト、ベンゾジアゼピン受容体における部分的アゴニスト、アミロイドβ産生アンタゴニスト又は阻害剤、アミロイドβ沈着阻害剤、ＮＮＲα−７部分アンタゴニスト、治療標的ＰＤＥ４、ＲＮＡ翻訳阻害剤、ムスカリン性アゴニスト、神経成長因子受容体アゴニスト、ＮＧＦ受容体アゴニスト及び遺伝子治療調節物質からなる群から選択される。
【００３９】
別の態様において、本発明は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体活性（又は他のアミロイドβタンパク質形態）が阻害されるように、適宜、Ａβ（２０−４２）球状凝集体（又は抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のＡβ形態）を、上に開示されている結合タンパク質と接触させることを含む、Ａβ（２０−４２）球状凝集体（又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態）の活性を阻害するための方法を提供する。関連する態様において、ヒト対象中のＡβ（２０−４２）球状凝集体活性（又は抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のＡβ形態の活性）が阻害され、及び治療が達成されるように、上に開示されている結合タンパク質をヒト対象に投与することを含む、Ａβ（２０−４２）球状凝集体活性（又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のＡβ形態の活性）が有害である疾患に罹患しているヒト患者中において、ヒトＡβ（２０−４２）球状凝集体活性（又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態）を阻害する方法を提供する。好ましくは、疾患は、例えば、アルツハイマー病又はダウン症などのアミロイドーシスから選択される。
【００４０】
別の態様において、本発明は、上記のように、第二の薬剤の投与の前に、それと同時に、又はその後に、上記で開示される結合タンパク質の何れか１つを投与する段階を含む、Ａβ（２０−４２）球状凝集体（又は抗体と反応する球状凝集体エピトープを含む他の有害なＡβ形態）が有害である疾患に罹患している患者を治療する方法を提供する。好ましい実施形態において、第二の薬剤は、上に列記されているような小分子又は生物薬からなる群から選択される。
【００４１】
好ましい実施形態において、上記で開示される医薬組成物は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心臓周囲内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口内、舌下、鼻内及び経皮から選択される少なくとも１つの方式により、対象に投与される。
【００４２】
本発明の一態様は、本発明の少なくとも１つのＡβ（２０−４２）球状凝集体結合タンパク質及び／又は本発明の抗体と反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆる他のＡβに対する少なくとも１つのＡβ（２０−４２）球状凝集体抗イディオタイプ抗体を提供する。抗イディオタイプ抗体は、以下に限定されないが、重鎖もしくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）又はそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域又は本発明の結合タンパク質に組み込まれ得るこれらの団のあらゆる１つのあらゆる一部などの、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む分子を含有する何らかのタンパク質又はペプチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】（Ａ）は、ヒト化抗体５Ｆ７の可変重鎖（すなわち、５Ｆ７  ＶＨ（ｈｕｍ８）のヌクレオチド配列（配列番号４２）を示し、（Ｂ）は、ヒト化抗体５Ｆ７の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。（Ｃ）は、ヒト化抗体５Ｆ７の可変軽鎖（すなわち、５Ｆ７  ＶＬ（ｈｕｍ８）のヌクレオチド配列（配列番号４３）を示し、（Ｄ）は、このヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。（図中、全てのＣＤＲ領域に下線が付されている。）
【図２】（Ａ）は、ヒト化抗体７Ｃ６の可変重鎖（すなわち、７Ｃ６  ＶＨ（ｈｕｍ７）のヌクレオチド配列（配列番号４４）を示し、（Ｂ）は、ヒト化抗体７Ｃ６の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。（Ｃ）は、ヒト化抗体７Ｃ６の可変軽鎖（すなわち、７Ｃ６  ＶＬ（ｈｕｍ７）のヌクレオチド配列（配列番号４５）を示し、（Ｄ）は、このヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号４）を示す。（図中、全てのＣＤＲ領域に下線が付されている。）
【図３】末端切断された２０−４２球状凝集体へのビオチン化マウス５Ｆ７の結合を示す。特に、非標識マウス５Ｆ７（「ＨＹＢ」）又はヒト化抗体５Ｆ７（「ＨＵＭ８」）の量を増加させることにより、ビオチン化マウス５Ｆ７抗体の結合が阻害される。
【図４】末端切断された２０−４２球状凝集体へのビオチン化マウス７Ｃ６の結合を示す。非標識マウス抗体７Ｃ６（「ＨＹＢ」）及びヒト化抗体７Ｃ６ｈｕｍ７（「ＨＵＭ７」）の量を増加させることによって、ビオチン化マウス７Ｃ６抗体の結合が阻害される。
【図５】（Ａ）は、標準タンパク質のＳＤＳＰＡＧＥ（分子マーカータンパク質、レーン１）；Ａβ（１−４２）原線維調製物；対照（レーン２）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ５Ｆ７ｈｕｍ８、２０時間、３７℃、上清（レーン３）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ５Ｆ７ｈｕｍ８、２０時間、３７℃、ペレット（レーン４）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ７Ｃ６ｈｕｍ７ｍｕｔ、２０時間、３７℃、上清（レーン５）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ７Ｃ６ｈｕｍ７ｍｕｔ、２０時間、３７℃、ペレット（レーン６）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ７Ｃ６ｈｕｍ７ｗｔ、２０時間、３７℃、上清（レーン７）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ７Ｃ６ｈｕｍ７ｗｔ、２０時間、３７℃、ペレット（レーン８）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ６Ｅ１０、２０時間、３７℃、上清（レーン９）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ６Ｅ１０、２０時間、３７℃、ペレット（レーン１０）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ＩｇＧ２ａ、２０時間、３７℃、上清（レーン１１）；Ａβ（１−４２）原線維調製物＋ｍＡｂ  ＩｇＧ２ａ、２０時間、３７℃、ペレット（レーン１２）を示し、（Ｂ）は、総抗体の％でのＡβ−原線維に結合するｍＡｂの定量分析の結果を示す。
【図６】（Ａ）は、異なる抗Ａβ抗体（６Ｅ１０、５Ｆ７ｈｕｍ８、７Ｃ６ｈｕｍ７ｗｔ、７Ｃ６ｈｕｍ７ｍｕｔ）の特異性のドットブロット分析を示している。ここで検査されているモノクローナル抗体は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体でのマウスの能動免疫化に続く、融合されたハイブリドーマ細胞の選択とその後のヒト化によって得られた（市販のマウスモノクローナル抗体６Ｅ１０、ＳｉｇｎｅｔＮｏ９３２０を除く。）。各Ａβ形態を系列希釈で適用し、免疫反応のために、各モノクローナル抗体とともに温置した。  １．Ａβ（１−４２）単量体、０．１％ＮＨ４ＯＨ  ２．Ａβ（１−４０）単量体、０．１％ＮＨ４ＯＨ  ３．Ａβ（１−４２）単量体、０．１％ＮａＯＨ  ４．Ａβ（１−４０）単量体、０．１％ＮａＯＨ  ５．Ａβ（１−４２）球状凝集体  ６．Ａβ（１２−４２）球状凝集体  ７．Ａβ（２０−４２）球状凝集体  ８．Ａβ（１−４２）原繊維調製物  ９．ｓＡＰＰα（Ｓｉｇｍａ）（第一のドット：１ｐｍｏｌ）  （Ｂ）は、強度の濃度測定分析を使用して、定量的評価が実施されたときに得られた結果を示している。各Ａβ形態に関し、最低の抗原濃度に相当するドットのみを評価し、ただし、前記濃度は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体の光学的に明確に同定された最後のドットの相対密度（閾値）の２０％を超える相対密度を有した。全てのドットブロットに対して独立して、この閾値を決定した。前記値は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体の認識と付与された抗体に関する個々のＡβ形態との間の関係を示す。
【図７】５Ｆ７ＶＨ領域アミノ酸配列のアラインメントを示す。５Ｆ７ＶＨ（配列番号６８）、Ｈｕ５Ｆ７ＶＨ（配列番号６９）及びヒトＭＵＣ１−１’ＣＬ（配列番号７０）及びＪＨ４セグメントのアミノ酸配列を一文字表記で示す。マウス５Ｆ７ＶＨ配列において、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）の定義に基づくＣＤＲ配列に下線を付す。アクセプターヒトＶＨセグメントにおけるＣＤＲ配列は図面では省略する。Ｈｕ５Ｆ７ＶＨ配列中の一重線を付したアミノ酸は、ＣＤＲ配列と接触することが予想され、従って、これは、対応するマウス残基で置換されている。Ｈｕ５Ｆ７ＶＨ配列中の二重線を付したアミノ酸は、免疫原性の可能性を排除するために、同じヒトＶＨサブグループのコンセンサスアミノ酸に変更されている。
【図８】５Ｆ７ＶＬ領域アミノ酸配列のアラインメントを示す。５Ｆ７ＶＬ（配列番号７１）、Ｈｕ５Ｆ７ＶＬ（配列番号７２）及びヒトＴＲ１．３７’ＣＬ（配列番号７３）及びＪＫ４セグメントのアミノ酸配列を一文字表記で示す。マウス５Ｆ７ＶＬ配列において、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）の定義に基づくＣＤＲ配列に下線を付す。アクセプターヒトＶＬセグメントにおけるＣＤＲ配列は図面では省略する。Ｈｕ５Ｆ７ＶＬ配列で一重線を付したアミノ酸は、ＣＤＲ配列に接触することが予想され、従って、対応するマウス残基で置換されている。Ｈｕ５Ｆ７ＶＬ配列で二重線を付したアミノ酸は、免疫原性の可能性を排除するために、同じヒトＶＬサブグループのコンセンサスアミノ酸に変更されている。
【図９Ａ】２人のアルツハイマー病患者並びに１９月齢のＡＰＰトランスジェニックＴｇ２５７６マウス及び１７月齢のＡＰＰ／Ｌｏマウスの剖検新皮質の横断切片への異なる抗体の結合を示す。０．７μｇ／ｍＬの濃度でのＡβの実質沈着（アミロイドプラーク；黒い矢印）及び血管アミロイド沈着（脳アミロイド血管症、ＣＡＡ；白い矢印）の染色は、６Ｅ１０及び４Ｇ８を用いた場合にのみ起こり、ｈ７Ｃ６ｗｔ及びｈ７Ｃ６ｍｕｔを用いた場合には起こらない。
【図９Ｂ】組織学的画像分析による、０．７μｇ／ｍＬの濃度での、アルツハイマー病患者ＲＺ１６の新皮質中の抗体によるＡβプラーク染色の分析の定量。光学密度の値（０％＝周囲のバックグラウンド染色）は、灰色スケール値から計算し、抗体間の差を統計学的に評価した（ＡＮＯＶＡ、Ｆ（３，５９）＝２０７．７；Ｐ＜０．０００１；その後、後知恵Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉのｔ検定）：６Ｅ１０及び４Ｇ８は他の全ての抗体と異なっていたのに対して（Ｐ＜０．００１）、ｈ７Ｃ６ｗｔ及びｈ７Ｃ６ｍｕｔは全く染色を示さなかった。
【図９Ｃ】組織学的画像分析による、０．７μｇ／ｍＬの濃度での、アルツハイマー病患者ＲＺ５５の新皮質中の抗体によるＡβプラーク染色の分析の定量。光学密度の値（０％＝周囲のバックグラウンド染色）は、灰色スケール値から計算し、抗体間の差を統計学的に評価した（ＡＮＯＶＡ、Ｆ（３．５９）＝１８２．６；Ｐ＜０．０００１；その後、後知恵Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉのｔ検定）：６Ｅ１０及び４Ｇ８は他の全ての抗体と異なっていたのに対して（Ｐ＜０．００１）、ｈ７Ｃ６ｗｔ及びｈ７Ｃ６ｍｕｔは全く染色を示さなかった。
【図９Ｄ】組織学的画像分析による、数個の濃度での、ヒトＡＰＰスウェーデントランスジェニックマウス系統（Ｔｇ２５７６）の新皮質中の抗体によるＡβプラーク染色の分析の定量。光学密度の値（０％＝周囲のバックグラウンド染色）は、灰色スケール値から計算し、０．７μｇ／ｍＬでの抗体間の差を統計学的に評価した（ＡＮＯＶＡ、Ｆ（３，５９）＝２９０．９；Ｐ＜０．０００１；その後、後知恵Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉのｔ検定）：６Ｅ１０及び４Ｇ８はｈ７Ｃ６抗体と異なっていたのに対して（Ｐ＜０．００１）、ｈ７Ｃ６ｗｔ及びｈ７Ｃ６ｍｕｔは全く染色を示さなかった。
【図９Ｅ】組織学的画像分析による、数個の濃度での、ヒトＡＰＰロンドントランスジェニックマウス系統（ＡＰＰ／Ｌｏ）の新皮質中の抗体によるＡβプラーク染色の分析の定量。光学密度の値（０％＝周囲のバックグラウンド染色）は、灰色スケール値から計算し、０．７μｇ／ｍＬでの抗体間の差を統計学的に評価した（ＡＮＯＶＡ、Ｆ（３，５０）＝１４５．６；Ｐ＜０．０００１；その後、後知恵Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉのｔ検定）：６Ｅ１０及び４Ｇ８はｈ７Ｃ６抗体と異なっていたのに対して（Ｐ＜０．００１）、ｈ７Ｃ６ｗｔ及びｈ７Ｃ６ｍｕｔは全く染色を示さなかった。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本明細書中で別段の定義がない限り、本発明に関して使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有する。これらの用語の意味及び範囲は明確であるが、しかし、何らかの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書中で提供される定義が、あらゆる辞書又は付帯的な定義よりも優先される。さらに、内容により必要とされない限り、単数形である語は、複数性を含み、複数形の語は単数性を含む。本願において、「又は」の使用は、別段の断りがない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などのその他の形態の使用は限定ではない。また、別段の断りがない限り、「要素」又は「成分」などの用語は、１単位を含む要素及び成分及び複数のサブユニットを含む要素及び成分の両方を包含する。
【００４５】
一般に、本明細書中に記載の、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質及び核酸化学及びハイブリッド形成と関連して使用される命名法及びそれらの技術は当技術分野で周知であり一般に使用されるものである。本発明の方法及び技術は、一般に、別段の指示がない限り、当技術分野で周知の従来法に従い、本願を通じて引用され考察される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載のように、行われる。酵素反応及び精製技術は、当技術分野で一般に完遂されるように又は本明細書中に記載のように、製造者の仕様書に従い行われる。本明細書中に記載の、分析化学、合成有機化学及び医学及び製薬化学と関連して使用される命名法及びそれらの検査法及び技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用される。化学合成、化学分析、医薬調製、処方及び送達ならびに患者の治療に対して標準的技術が使用される。
【００４６】
特に、本発明は、Ａβ球状凝集体の末端切断された形態に対して高い親和性を有する球状凝集体特異的抗体を提供する。これらの抗体は、Ａβペプチドの他の形態、特に単量体及び原繊維のみならず、Ａβ球状凝集体の末端切断されていない形態も識別することができる。従って、本発明は、Ａβ（１−４２）球状凝集体に対する本抗体の結合親和性より大きい、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に対する結合親和性を有する抗体に関する。
【００４７】
さらに、本発明は、Ａβ（12−４２）球状凝集体に対する本抗体の結合親和性より大きい、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に対する結合親和性を有する抗体に関する。
【００４８】
特定の実施形態によれば、従って、本発明は、Ａβ（１−４２）球状凝集体及びＡβ（１２−４２）球状凝集体の両方に対する抗体の結合親和性より大きい、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に対する結合親和性を有する抗体に関する。
【００４９】
本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）」という用語は、Ｘ及びＹの両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙまでのアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡＴ（配列番号６４）（アミノ酸１から４３に相当）又はその天然に存在するバリアントの何れかのアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙまでのアミノ酸配列、特には位置Ｘ及び位置Ｙの両方又はいずれも球状凝集体形成を妨害し得ない３個以下の別のアミノ酸置換を有し、好ましくはアミノ酸１２又はＸ（いずれか数値の高い方）からアミノ酸４２ま又はＹ（いずれか数値の低い方）の部分中にさらなるアミノ酸置換がなく、より好ましくはアミノ酸２０又はＸ（いずれか数値の高い方）からアミノ酸４２又はＹ（いずれか数値の低い方）の部分に追加のアミノ酸置換がなく、最も好ましくはアミノ酸２０又はＸ（いずれか数値の高い方）からアミノ酸４０又はＹ（いずれか数値の低い方）の部分に追加のアミノ酸置換がない配列（ここで、「追加の」アミノ酸置換とは、自然には認められない、標準的な配列からのあらゆる逸脱である）を含むＡ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオア」）、Ａ４２Ｔ及びＡ４２Ｖ（数値は、Ａβペプチドの開始に関係するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するものを指す。
【００５０】
より具体的には、本明細書における「Ａβ（１−４２）」という用語は、１及び４２の両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置１からアミノ酸位置４２のアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡ（配列番号４６）又はその天然バリアントの何れか、特にはＡ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオア」）、Ａ４２Ｔ及びＡ４２Ｖ（数字は１及び４２の両方を含むＡβペプチドの開始に関するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するもの又はいずれも球状凝集体形成を妨害しない３個以下の追加のアミノ酸置換を有し、好ましくはアミノ酸２０からアミノ酸４２の部分に追加のアミノ酸置換を持たない配列を指す。同様に、本明細書における「Ａβ（１−４０）」という用語は、１及び４０の両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置１からアミノ酸位置４０のアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号４７）又はその天然バリアントの何れか、特にはＡ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）及びＤ２３Ｎ（「アイオア」）（数字は１及び４０の両方を含むＡβペプチドの開始に関するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するもの又はいずれも球状凝集体形成を妨害しない３個以下の追加のアミノ酸置換を有し、好ましくはアミノ酸２０からアミノ酸４０の部分に別のアミノ酸置換を持たない配列を指す。
【００５１】
より具体的には、本明細書における「Ａβ（12−４２）」という用語は、12及び４２の両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置12からアミノ酸位置４２のアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列ＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡ（配列番号６６）又はその天然バリアント、特には、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオア」）、Ａ４２Ｔ及びＡ４２Ｖ（数字は12及び４２の両方を含むＡβペプチドの開始に関するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するもの又はいずれも球状凝集体形成を妨害しない３個以下の追加のアミノ酸置換を有し、好ましくはアミノ酸２０からアミノ酸４２の部分に追加のアミノ酸置換を持たない配列を指す。
【００５２】
より具体的には、本明細書における「Ａβ（20−４２）」という用語は、20及び４２の両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置20からアミノ酸位置４２のアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列Ｆ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡ（配列番号67）又はそのバリアントの何れか、特には、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオア」）、Ａ４２Ｔ及びＡ４２Ｖ（数字は２０及び４２の両方を含むＡβペプチドの開始に関するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するもの又はいずれも球状凝集体形成を妨害しない３個以下の追加のアミノ酸置換を有し、好ましくはさらなるアミノ酸置換を一切持たない配列を指す。
【００５３】
「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体」（「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状オリゴマー」）という用語は、本明細書中で、上記で定義されるように、均一性及び別個の物理的特性を有する、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの可溶性の球状の非共有会合体を指す。一態様によれば、Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体は、陰イオン性界面活性剤とともに温置することにより得られるＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの安定な非原線維性のオリゴマー集合体である。単量体及び原線維とは異なり、これらの球状凝集体は、サブユニットの定められた集合体数を特徴とする（例えば、国際出願公開ＷＯ０４／０６７５６１に記載のように、初期集合形態、ｎ＝４−６、「オリゴマーＡ」及び後期集合形態、ｎ＝１２−１４、「オリゴマーＢ」。）。球状凝集体は、３次元球状型構造を有する（「モルテングロビュール」、Ｂａｒｇｈｏｒｎら、２００５、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、９５、８３４−８４７参照）。これらはさらに、次の特性の１つ又はそれ以上をさらに特徴とし得る。
【００５４】
−球状凝集体の末端切断された形態を生じさせる広域プロテアーゼ（サーモリシン又はエンドプロテイナーゼＧｌｕＣなど）でのＮ−末端アミノ酸Ｘ−２３の切断可能性；
−広域プロテアーゼ及び抗体とのＣ末端アミノ酸２４−Ｙの非近接性；
−これらの球状凝集体の末端切断された形態は、その球状凝集体配座におけるコアエピトープＡβ（２０−Ｙ）の近接性がより良好である球状凝集体の３次元コア構造を維持する。
【００５５】
本発明によると、及び、特に、本発明の抗体の結合親和性を評価する目的のために、「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体」という用語は、本明細書中で、国際特許公開ＷＯ２００４／０６７５６１（本明細書中に参照により組み込まれる。）に記載のようなプロセスにより得られる生成物を特に指す。このプロセスは、天然、組み換えもしくは合成Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチド又はその誘導体を変性（アンフォールディング）させること；変性（アンフォールディング）させたＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチド又はその誘導体を界面活性剤に少なくとも部分的に曝露し、その界面活性剤作用を低下させ、温置を続けることを含む。
ペプチドの変性（アンフォールディング）のために、例えばヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）などの水素結合破壊剤をタンパク質に対して作用させ得る。作用温度が約２０から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、数分、例えば１０から６０分の作用時間で十分である。蒸発乾固した残渣を、好ましくは濃縮形態で、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの水性緩衝剤と混ざり合う適切な有機溶媒中で続いて溶解することにより、結果として、その後に使用され得る、少なくとも部分的に変性（アンフォールディング）したペプチド又はその誘導体の懸濁液が得られる。必要に応じて、保存用懸濁液を低温、例えば約−２０℃でしばらくの間保存し得る。
【００５６】
あるいは、弱酸性の、好ましくは水性の、溶液、例えば約１０ｍＭ  ＨＣｌ水溶液中で、ペプチド又はその誘導体を溶解させ得る。通常数分間温置した後、不溶性成分を遠心により除去する。１０，０００ｇで数分が好都合である。好ましくはこれらの方法の段階を室温、即ち２０から３０℃の範囲の温度で行う。遠心後に得られる上清は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチド又はその誘導体を含有し、低温、例えば約−２０℃でしばらくの間保存し得る。
【００５７】
界面活性剤への続く曝露は、ペプチド又はその誘導体のオリゴマー化に関連し、オリゴマーの中間型（ＷＯ２００４／０６７５６１、オリゴマーＡと呼ばれる。）が得られる。このために、十分な中間体オリゴマーが生じるまで、場合によっては少なくとも部分的に変性（アンフォールディング）したペプチド又はその誘導体に対して界面活性剤を作用させる。イオン性界面活性剤、特に陰イオン性界面活性剤を用いることが好ましい。
特定の実施形態によると、式（Ｉ）：
Ｒ−Ｘ
の界面活性剤が使用される（式中、基Ｒは、６から２０、好ましくは１０から１４個の炭素原子を有する非分枝もしくは分枝アルキル又は６から２０、好ましくは１０から１４個の炭素原子を有する非分枝もしくは分枝アルケニルであり、基Ｘは酸性基又はその塩であり、Ｘは好ましくは−ＣＯＯ−Ｍ＋、−ＳＯ３−Ｍ＋の中から選択され、特に−ＯＳＯ３−Ｍ＋であり、Ｍ＋は、水素陽イオン又は無機もしくは有機陽イオンであり、好ましくは、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類金属陽イオン及びアンモニウム陽イオンから選択される。）。最も有利であるのは、特に、Ｒが非分枝アルキルである（そのアルキル（ａｌｋ−ｌ−ｙｌ）基に言及しなければならない。）、式（Ｉ）の界面活性剤である。特に好ましいのは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。ラウリン酸及びオレイン酸も有利に使用できる。界面活性剤ラウロイルサルコシンのナトリウム塩（サルコシルＮＬ−３０又はＧａｒｄｏｌ（Ｒ）としても知られている。）もまた特に有利である。界面活性剤作用時間は、特に、変性（アンフォールディング）しているならば、オリゴマー化に供されるペプチド又はその誘導体がどの程度まで変性（アンフォールディング）しているかに依存する。変性（アンフォールディング）段階に従い、ペプチド又はその誘導体が水素結合破壊剤で、即ち、特にヘキサフルオロイソプロパノールで、既に処理されているならば、作用温度が約２０から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、数時間の範囲の作用時間、有利には約１から２０、特に約２から１０時間で十分である。変性（アンフォールディング）の程度が小さいか又は基本的に変性（アンフォールディング）されていないペプチド又はその誘導体が出発点である場合、相応して、作用時間が長い方が好都合である。例えばＨＦＩＰ処理に代わる手段として上記手順に従いペプチドもしくはその誘導体が前処理されているか、又は該ペプチドもしくはその誘導体がオリゴマー化に直接供されるならば、作用温度が約２０から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、約５から３０時間、特に約１０から２０時間の作用時間で十分である。温置後、有利に不溶性成分を遠心により除去する。１０，０００ｇで数分間が好都合である。
【００５８】
選択すべき界面活性剤濃度は使用される界面活性剤に依存する。ＳＤＳを使用する場合、０．０１から１重量％、好ましくは、０．０５から０．５重量％の範囲、例えば、約０．２重量％の濃度が好都合と分かる。ラウリン酸又はオレイン酸が使用される場合、例えば、０．０５から２重量％、好ましくは０．１から０．５重量％の範囲、例えば約０．５重量％の、幾分高い濃度が好都合である。
【００５９】
界面活性剤作用は、生理的範囲前後の塩濃度となるはずである。従って、特に５０から５００ｍＭ、好ましくは１００から２００ｍＭの範囲、より具体的には約１４０ｍＭのＮａＣｌ濃度が好都合である。続く界面活性剤作用の低下及び温置の継続は、さらなるオリゴマー化に関連し、本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体（国際出願公開ＷＯ０４／０６７５６１において、オリゴマーＢと呼ばれる。）が得られる。前段階から得られる組成物は通常、界面活性剤及び生理的範囲の塩濃度を含有するので、界面活性剤作用を低下させ、好ましくは塩濃度も低下させることが好都合である。例えば、水又は低塩濃度の緩衝液（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．３）で好都合に希釈することにより界面活性剤及び塩の濃度を低下させることによって、これを行い得る。約２から１０の範囲、有利には、約３から８の範囲、特に約４の、希釈係数が適切であることが分かっている。前記界面活性剤作用を中和することができる物質を添加することによっても、界面活性剤作用の低下を達成し得る。界面活性剤作用の低減は、前記界面活性剤作用を中和し得る物質を加えることによっても達成できる。これらの例には、一連の精製及び抽出方法において細胞を安定化させることができる物質のような界面活性剤を錯化させることができる物質（例えば、特定のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー、特に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（Ｒ）Ｆ６８の商標名のブロックコポリマー）が含まれる。特定の臨界ミセル濃度前後又はそれ以上の濃度範囲の、アルコキシル化及び、特に、エトキシル化アルキルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ（Ｒ）Ｘシリーズのエトキシル化ｔ−オクチルフェノール、特にＴｒｉｔｏｎ（Ｒ）Ｘ１００、３−（３−コラミドプロピルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ（Ｒ））など）又はアルコキシル化及び特にエトキシル化ソルビタン脂肪エステル（Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）シリーズのものなど、特にＴｗｅｅｎ（Ｒ）２０）も同様に使用され得る。続いて、本発明の十分なＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体が生成されるまでこの溶液を温置する。作用温度が約２０から５０℃、特に約３５から４０℃である場合、数時間の範囲、好ましくは約１０から３０時間、特に約１５から２５時間の範囲の作用時間で十分である。次にこの溶液を濃縮し得、得られる残渣を遠心により除去し得る。繰り返すが、１０，０００ｇで数分間が好都合であることが分かっている。遠心後に得られる上清は、本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体を含有する。
【００６０】
例えば超遠心、透析、沈殿又は遠心により、それ自体公知の様式で、本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体を最終的に回収することができる。変性条件下でのＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体の電気泳動による（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）分離によって２重のバンドが得られれば（例えば、Ａβ（１−４２）に対して３８／４８ｋＤａの見かけの分子量を有する。）、特に好ましくは、分離前に球状凝集体のグルタルアルデヒド処理においてこれらの２本のバンドが１本にまとまればさらに好ましい。球状凝集体のサイズ排除クロマトグラフィーによって単一ピーク（例えば、それぞれ、Ａβ（１−４２）球状凝集体の場合には約１００ｋＤａ又はグルタルアルデヒドによって架橋されたＡβ（１−４２）球状凝集体の場合には約６０ｋＤａの分子量に相当）となることも好ましい。Ａβ（１−４２）ペプチド、Ａβ（１２−４２）ペプチド及びＡβ（２０−４２）ペプチドから出発すると、前記プロセスは、Ａβ（１−４２）球状凝集体、Ａβ（１２−４２）球状凝集体及びＡβ（２０−４２）球状凝集体を得る上で特に好適である。
【００６１】
本発明の特定の実施形態において、Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体（Ｘは、数字２．．２４からなる群から選択され、及びＹは上記定義のとおりである。）は、Ａβ（１−Ｙ）球状凝集体（Ｘは、数字２．．２４からなる群から選択され、Ｘは、好ましくは２０又は１２であり、及びＹは上記定義のとおりである。）をより短い形態へ末端切断することによって取得されるものであり、これは、適切なプロテアーゼでの処理によって達成することが可能である。例えば、Ａβ（２０−４２）球状凝集体は、Ａβ（１−４２）球状凝集体をサーモリシンタンパク質分解へ供することによって取得することが可能であり、Ａβ（１２−４２）球状凝集体は、Ａβ（１−４２）球状凝集体をエンドプロテイナーゼＧｌｕＣタンパク質分解へ供することによって取得することが可能である。タンパク質分解の所望される程度に達した時点で、プロテアーゼは、一般的に知られている様式で不活化される。次いで、本明細書に既に記載されている操作に従って、得られた球状凝集体を単離し、必要であれば、さらなる作業及び精製工程によって、さらに加工し得る。前記プロセスの詳しい記述は、参照により、本明細書に組み込まれる国際特許公開ＷＯ２００４／０６７５６１に開示されている。
【００６２】
本発明において、Ａβ（１−４２）球状凝集体は、特に、以下の実施例１ｂに記載されているＡβ（１−４２）球状凝集体であり、Ａβ（２０−４２）球状凝集体は、特に、本明細書の実施例１ａに記載されているＡβ（２０−４２）球状凝集体であり、及びＡβ（１２−４２）球状凝集体は、特に、本明細書の実施例１ｃに記載されているＡβ（１２−４２）球状凝集体である。好ましくは、球状凝集体は、神経細胞に対して親和性を示す。好ましくは、球状凝集体は、神経調節効果も示す。本発明の別の態様によれば、球状凝集体は、１１から１６、最も好ましくは、１２から１４のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドからなる。
【００６３】
本発明の別の態様によれば、本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体」という用語は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）サブユニットから実質的になる球状凝集体を表し、１２のサブユニットのうち、平均、少なくとも１１のサブユニットが、Ａβ（Ｘ−Ｙ）型であれば好ましく、球状凝集体の１０％未満が何れかの非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドを含めば、より好ましく、最も好ましくは、非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの含量が検出閾値を下回っている。より具体的には、本明細書において「Ａβ（１−４２）球状凝集体」という用語は、上記定義のＡβ（１−４２）単位から実質的になる球状凝集体を表し、本明細書において「Ａβ（１２−４２）球状凝集体」という用語は、上記定義のＡβ（１２−４２）単位から実質的になる球状凝集体を表し、本明細書において「Ａβ（２０−４２）球状凝集体」という用語は、上記定義のＡβ（２０−４２）単位から実質的になる球状凝集体を表す。
【００６４】
本明細書において、「架橋されたＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体」という用語は、球状凝集体の構成単位の架橋によって、好ましくは化学的な架橋によって、より好ましくはアルデヒド架橋によって、最も好ましくは、グルタルジアルデヒド架橋によって、上述のようなＡβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体から取得可能な分子を表す。本発明の別の態様において、架橋された球状凝集体は、実質的に、前記単位が非共有的相互作用のみによって互いに固定されるのではなく、少なくとも部分的に共有結合によって連結されている球状凝集体である。本発明において、架橋されたＡβ（１−４２）球状凝集体は、特に、本明細書の実施例１ｄに記載されている架橋されたＡβ（１−４２）オリゴマーである。
【００６５】
本明細書において、「Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状凝集体誘導体」という用語は、特に、検出を容易にする基に共有結合されることによって標識されている球状凝集体、好ましくは、蛍光色素分子、例えば、フルオレセイン・イソチオシアナート、フィコエリトリン、エコーレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）蛍光タンパク質、ディクチオソーマ（Ｄｉｃｔｙｏｓｏｍａ）蛍光タンパク質又はこれらのあらゆる組み合わせ又は蛍光活性誘導体；発色団；化学発色団、例えば、ルシフェラーゼ、好ましくは、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ルシフェラーゼ又はこれらのあらゆる組み合わせ若しくは化学発光活性誘導体；酵素的に活性な基、例えば、ペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又は酵素的に活性なこれらの何れかの誘導体；電子密度が高い基、例えば、重金属含有基、例えば、金含有基；ハプテン、例えば、フェノールに由来するハプテン；強く抗原性の構造、例えば、抗原性であると予測されるペプチド配列、例えば、Ｋｏｌａｓｋａｒ及びＴｏｎｇａｏｎｋａｒのアルゴリズムによって、抗原性であると予測されるペプチド配列；別の分子に対するアプタマー；キレート基、例えば、ヘキサヒスチジニル；更なる特定のタンパク質−タンパク質相互作用を媒介する天然の又は天然由来のタンパク質構造、例えば、ｆｏｓ／ｊｕｎ対の要素；磁性基、例えば、強磁性基；又は放射性基、例えば、１Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ若しくは１２５Ｉ若しくはこれらのあらゆる組み合わせを含む基；又は共有結合によって、若しくは非共有高親和性相互作用によってフラッグ標識されている球状凝集体、好ましくは、不活化、隔離、分解及び／又は沈殿を促進する基に共有結合されている球状凝集体、好ましくは、インビボ分解を促進する基、より好ましくはユビキチンでフラッグ標識されている球状凝集体（この場合、このフラッグ標識されたオリゴマーがインビボで組み立てられるのであれば、特に好ましい。）、又は上記のあらゆる組み合わせによって修飾された球状凝集体を表す。このような標識及びフラッグ標識基並びにタンパク質にこれらを付着させるための方法は、本分野において公知である。標識及び／又はフラッグ標識は、球状凝集体化の前、間又は後に実施し得る。本発明の別の態様において、球状凝集体誘導体は、標識及び／又はフラッグ標識反応によって、球状凝集体から取得可能な分子である。
【００６６】
対応して、本明細書において、「Ａβ（Ｘ−Ｙ）単量体誘導体」という用語は、特に、球状凝集体に対して記載されているように標識又はフラッグ標識されているＡβ単量体を表す。
【００６７】
都合よく、本発明の抗体は、１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍの範囲のＫＤで、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に結合する。好ましくは、抗体は、高い親和性で、例えば、１×１０−７ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、例えば、３×１０−８ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、１×１０−８ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、例えば、３×１０−９ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、１×１０−９ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、例えば、３×１０−１０ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、１×１０−１０ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、例えば、３×１０−１１ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、又は１×１０−１１ＭのＫＤ若しくはそれ以上の親和性で、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に結合する。
【００６８】
本明細書において「より大きい親和性」という用語は、一方で結合していない抗体及び結合していない球状凝集体と他方で抗体−球状凝集体複合体との間の平衡が、さらに、抗体−球状凝集体複合体の方に傾く相互作用の程度を表す。同様に、本明細書において「より小さい親和性」という用語は、一方で結合していない抗体及び結合していない球状凝集体と他方で抗体−球状凝集体複合体との間の平衡が、さらに、結合していない抗体及び結合していない球状凝集体の方に傾く相互作用の程度を表す。「より大きい親和性」という用語は、「より高い親和性」という用語と同義であり、「より小さい親和性」という用語は「より低い親和性」という用語と同義である。
【００６９】
特定の実施形態によれば、本発明は、１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍの範囲のＫＤでＡβ（２０−４２）球状凝集体に、１０−１２Ｍ又はそれより小さい親和性のＫＤでＡβ（１−４２）球状凝集体に結合し、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に対する結合親和性がＡβ（１−４２）球状凝集体に対する結合親和性より大きい抗体に関する。
【００７０】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体への本発明の抗体の結合親和性は、Ａβ（１−４２）球状凝集体への抗体の結合親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍又は少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍又は少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍又は少なくとも５００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍又は少なくとも５０００倍、より好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍又は少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きいことが好ましい。
【００７１】
特定の実施形態によれば、本発明は、１０−１２Ｍ又はそれより小さい親和性のＫＤでＡβ（１２−４２）球状凝集体に結合し、Ａβ（２０−４２）球状凝集体への結合親和性がＡβ（１２−４２）球状凝集体への結合親和性より大きい抗体に関する。
【００７２】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体への本発明の抗体の結合親和性は、Ａβ（12−４２）球状凝集体への抗体の結合親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍又は少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍又は少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍又は少なくとも５００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍又は少なくとも５０００倍、より好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍又は少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きいことも好ましい。
【００７３】
好ましくは、本発明の抗体は、上記定義のように、少なくとも１つのＡβ球状凝集体に結合し、Ａβの少なくとも１つの非球状凝集体形態に対して比較的より小さい親和性を有する。
【００７４】
少なくとも１つのＡβ球状凝集体に対するよりＡβの少なくとも１つの非球状凝集体形態に対して比較的より小さい親和性を有する本発明の抗体には、Ａβ（１−４２）単量体に対する結合親和性より大きいＡβ（２０−４２）球状凝集体への結合親和性を有する抗体が含まれる。さらに、これに代えて又はこれに加えて、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に対する抗体の結合親和性が、Ａβ（１−４０）単量体に対する抗体の結合親和性より大きいことが好ましい。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態において、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に対する抗体の親和性は、Ａβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）単量体の両方に対する抗体の親和性より大きい。
【００７６】
本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）単量体」という用語は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの単離型、好ましくは本質的に非共有結合的相互作用で他のＡβペプチドと係合していないＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの一形態を指す。特に、Ａβ（Ｘ−Ｙ）単量体は通常、水溶液の形態で提供される。本発明の特に好ましい実施形態において、水系単量体溶液は、０．０５％から０．２％、より好ましくは約０．１％のＮＨ４ＯＨを含有する。本発明の別の特に好ましい実施形態において、水系単量体溶液は、０．０５％から０．２％、より好ましくは約０．１％のＮａＯＨを含有する。使用される場合（例えば、本発明の抗体の結合親和性を測定するため）、前記溶液を適切な様式で希釈することが都合良い可能性がある。さらに通常は、前記溶液は、その調製後の２時間以内、特には１時間以内、特別には３０分以内に使用することが良い。 
より具体的には、本明細書において「Ａβ（１−４０）単量体」という用語は、本明細書に記載されているＡβ（１−４０）単量体調製物を表し、本明細書において「Ａβ（１−４２）単量体」という用語は、本明細書に記載されているＡβ（１−４２）単量体調製物を表す。
【００７７】
都合よく、本発明の抗体は、低い親和性で、最も好ましくは１×１０−８ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、例えば、３×１０−８ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、１×１０−７ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、例えば、３×１０−７ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、又は１×１０−６ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、例えば、３×１０−５ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、又は１×１０−５ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、一方の、又はより好ましくは両方の単量体に結合する。
【００７８】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体への本発明の抗体の結合親和性は、一方、又は、より好ましくは両方の単量体への抗体の結合親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍又は少なくとも５倍、好ましくは少なくも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍又は少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍又は少なくとも５００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍又は少なくとも５０００倍、より好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍又は少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きいことが特に好ましい。
【００７９】
少なくとも１つのＡβ球状凝集体に対するよりＡβの少なくとも１つの非球状凝集体形態に対して比較的より小さい親和性を有する本発明の抗体には、Ａβ（１−４２）原繊維に対する結合親和性より大きいＡβ（２０−４２）球状凝集体への結合親和性を有する抗体がさらに含まれる。さらに、これに代えて又はこれに加えて、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に対する抗体の結合親和性が、Ａβ（１−４０）原繊維に対する抗体の結合親和性より大きいことが好ましい。本明細書において、「原繊維」という用語は、電子顕微鏡中で繊維性構造を示し、コンゴーレッドを結合し、次いで、偏光下で複屈折を示し、そのＸ線回折パターンがクロス−β構造である非共有的に会合された各Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの集合物を含む分子構造を表す。
【００８０】
本発明の別の態様において、原繊維は、界面活性剤の不存在下で、例えば、０．１ＭＨＣｌ中で、適切なＡβペプチドの自己誘導された重合体凝集物を含む方法によって取得可能な分子構造であり、２４超、好ましくは１００単位超の凝集物の形成が得られる。この方法は、本分野において周知である。都合よく、Ａβ（Ｘ−Ｙ）原繊維は、水溶液の形態で使用される。本発明の特に好ましい実施形態において、水性原繊維溶液は、０．１％ＮＨ４ＯＨ中にＡβペプチドを溶解し、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で１：４にこれを希釈した後に、ｐＨを７．４に再調整し、３７℃で２０時間溶液を温置した後、１００００ｇでの１０分間の遠心及び２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に再懸濁することによって作製される。
【００８１】
「Ａβ（Ｘ−Ｙ）原繊維」という用語は、本明細書において、Ａβ（Ｘ−Ｙ）サブユニットを含む原繊維も表し、サブユニットの少なくとも９０％が、平均、Ａβ（Ｘ−Ｙ）型であれば好ましく、サブユニットの少なくとも９８％が、Ａβ（Ｘ−Ｙ）型であればより好ましく、非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの含量が検出閾値を下回っていれば、最も好ましい。より具体的には、「Ａβ（１−４２）原繊維」という用語は、本明細書において、実施例ＩＶ．２．８に記載されているようにＡβ（１−４２）原繊維調製物を表す。
【００８２】
都合よく、本発明の抗体は、低い親和性で、最も好ましくは１×１０−８ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、例えば、３×１０−８ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、１×１０−７ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、例えば、３×１０−７ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、又は１×１０−６ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、例えば、３×１０−５ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、又は１×１０−５ＭのＫＤ若しくはそれより小さい親和性で、一方の、又はより好ましくは両方の原繊維に結合する。
【００８３】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体への本発明の抗体の結合親和性は、一方、又は、より好ましくは両方の原繊維への抗体の結合親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍又は少なくとも５倍、好ましくは少なくも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍又は少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍又は少なくとも５００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍又は少なくとも５０００倍、より好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍又は少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きいことが特に好ましい。
【００８４】
１つの特定の実施形態によれば、本発明は、Ａβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）原繊維の両方に対するその結合親和性より大きい、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に対する結合親和性を有する抗体に関する。
【００８５】
特定の好ましい実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのＡβ球状凝集体、特にＡβ（２０−４２）球状凝集体に対する親和性より、Ａβの単量体及び繊維性形態の両方に対して比較的より小さな親和性を有する抗体に関する。これらの抗体は、以下、球状凝集体特異的な抗体と称される。
【００８６】
本発明の抗体は本明細書中に記載されているＡβ球状凝集体以外のＡβ形態とも反応し得る、すなわち、結合し得ることが注目される。これらの抗原は、オリゴマー若しくは球状凝集体であってもよく、又はオリゴマー若しくは球状凝集体でなくてもよい。従って、本発明の抗体が結合する抗原には、本発明の抗体が反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆるＡβ形態が含まれる。このようなＡβ形態には、Ａβ（２０−４２）、Ａβ（２０−４０）、Ａβ（１２−４２）、Ａβ（１２−４０）、Ａβ（１−４２）及びＡβ（１−４０）形態などの末端切断された及び末端切断されていないＡβ（Ｘ−Ｙ）形態（Ｘ及びＹは、上に定義されている。）が含まれるが、但し、前記形態は、球状凝集体エピトープを含む。
【００８７】
ヒト化抗体７Ｃ６及び５Ｆ７に戻ると、例えば、ｍ２６６及び３Ｄ６などの競合抗体とは異なり、これらのＡβ（２０−４２）球状凝集体特異的抗体は、主にＡβ（２０−４２）球状凝集体形態を認識し、Ａβ（１−４０）単量体、Ａβ（１−４２）単量体、Ａβ原繊維又はｓＡＰＰ（すなわち、Ａβ前駆体）の標準的調製物を認識しない。例えば８Ｆ５などの球状凝集体選択的抗体によってＡβの球状凝集体型を特異的に標的とすることにより、１）不溶性アミロイド沈着を標的とすることが回避され（これに結合することは、不溶性Ａβで免疫付与する際に観察される炎症性の副作用の原因となり得る。）；２）予知的な生理的機能を有することが報告されているＡβ単量体及びＡＰＰを使用せず（Ｐｌａｎら、Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２３：５５３１−５５３５（２００３）；及び３）不溶性沈着への大量の結合により隠蔽されたり又は接近不可能とならないため、抗体のバイオアベイラビリティーが向上するので、球状凝集体に対するこのような特異性は重要である。
【００８８】
本発明はまた、ヒト化抗体７Ｃ６又はヒト化５Ｆ７の可変軽鎖及び重鎖をコードする単離ヌクレオチド配列（又はその断片）ならびに、これらのコードヌクレオチド配列と少なくとも約７０％（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％又は７９％）、好ましくは少なくとも約８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％又は８９％）及びより好ましくは少なくとも約９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一であるものを、含むか、これらに対応するか、これらと同一であるか、これらとハイブリッド形成するか、又はこれらと相補的である、配列を有するヌクレオチド配列（又はその断片）も含む。（７０％と１００％との間及びこれらを含む全ての整数（及びその一部）は、％同一性に関して本発明の範囲内であるとみなされる。）。このような配列は、あらゆる源由来であり得る（例えば、天然源から単離されるか、半合成経路を介して産生されるか、又はデノボ合成される。）。特に、実施例に記載のもの以外の源からこのような配列を単離し得るか、又は、このような配列は実施例に記載のもの以外の源由来であり得る（例えば、細菌、真菌、藻類、マウス又はヒト）。
【００８９】
上述のヌクレオチド配列に加えて、本発明はまた、ヒト化抗体７Ｃ６及びヒト化抗体５Ｆ７の可変軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列（又はこれらのアミノ酸配列の断片）も含む。さらに、本発明はまた、本発明のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約７０％（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％又は７９％）、好ましくは少なくとも約８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％又は８９％）及びより好ましくは少なくとも約９０％同一（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）であるものを含むか、これらに相当するか、これらと、同一であるか又は相補的である、アミノ酸配列（又はその断片）も含む。（繰り返すが、７０％と１００％との間及びこれらを含む全ての整数（及びその一部）も（上記のヌクレオチド配列同一性に関連して引用される場合）、％同一性に関して本発明の範囲内であるとみなされる。）。
【００９０】
本発明の目的に対して、ヌクレオチド配列の「断片」は、特定のヌクレオチド配列の領域に相当する、およそ少なくとも６、好ましくは少なくとも約８、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドの連続する配列として定義される。
【００９１】
「同一性」という用語は、特定の比較枠又はセグメントにわたる、ヌクレオチドごとの２つの配列の関連性を指す。従って、同一性は、２つのＤＮＡセグメント（又は２つのアミノ酸配列）の同じ鎖（センス又はアンチセンスの何れか）間の、同一である程度、対応性の程度又は同等性の程度として定義される。「配列同一性の％」は、特定の領域にわたり２つの最適に並べられた（アラインされた）配列を比較し、一致する位置の数を得るために両配列において同一の塩基又はアミノ酸がある位置の数を調べ、このような位置の数を比較セグメント中の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けることにより計算される。Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の方法により、及び、関連するアルゴリズムを実行するコンピュータプログラムにより（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｍａｃａｗ  Ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／１１Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５１−１５３（１９８９））、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：３３８９−３４０２（１９９７））、ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）又はＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、配列の最適アラインメントを行い得る。（米国特許第５，９１２，１２０号参照）。
【００９２】
本発明の目的に対して、「相補性」は、２つのＤＮＡセグメント間の関連性の程度として定義される。これは、二重らせんを形成させるために、適切な条件下で、一方のＤＮＡセグメントのセンス鎖が他方のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリッド形成する能力を測定することにより決定される。「相補的」とは、規範的（カノニカル）な塩基対形成規則に基づきある一定の配列に対して対形成する配列として定義される。例えば、あるヌクレオチド鎖中の配列Ａ−Ｇ−Ｔは、他方の鎖のＴ−Ｃ−Ａに対して「相補的」である。
【００９３】
二重らせんにおいて、アデニンが一方の鎖に現れ、チミンが他方の鎖に現れる。同様に、グアニンが一方の鎖で見られる場合は常に、他方でシトシンが見られる。２つのＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連性が大きいほど、２つのＤＮＡセグメントの鎖間でのハイブリッド二本鎖形成能が大きくなる。
【００９４】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、一連の同一ならびに保存的アミノ酸残基が両配列において存在することとして定義される。２つのアミノ酸配列間の類似性の程度が高いほど、２つの配列の、対応性、同一性又は同等性が高くなる。（２つのアミノ酸配列の間の「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、一連の正確に等しい又は不変のアミノ酸残基が両配列において存在することとして定義される。）。「相補性」、「同一性」及び「類似性」の定義は、当業者にとって周知である。
【００９５】
「によりコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、このポリペプチド配列又はその一部は、その核酸配列によりコードされるポリペプチド由来の、少なくとも３アミノ酸、より好ましくは少なくとも８アミノ酸及びさらにより好ましくは少なくとも１５アミノ酸のアミノ酸配列を含有する。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、「生物活性」とは、球状凝集体のＡβ（２−４２）領域の全ての固有の生物学的特性を指す。このような特性には、例えば、本明細書中に記載のヒト化７Ｃ６又はヒト化５Ｆ７抗体に結合する能力が含まれる。
【００９７】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、何らかのアミノ酸のポリマー鎖を指す。「ペプチド」及び「タンパク質」という用語はポリペプチドという用語と互換的に使用され、また、アミノ酸のポリマー鎖も指す。「ポリペプチド」という用語は、ネイティブ又は人工タンパク質、タンパク質断片及びタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは単量体性又はポリマー性であり得る。
【００９８】
「単離タンパク質」又は「単離ポリペプチド」という用語は、派生物のその起源又は源に基づいて、そのネイティブの状態においてそれに付随する天然に結合される成分と会合していないタンパク質又はポリペプチドであり；同じ種由来のその他のタンパク質を実質的に含まず；異なる種由来の細胞により発現され；又は天然では生じないものである。このようにして、化学的に合成される、又はそれが天然に由来する細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、天然で会合するその成分から「単離」されている。タンパク質はまた、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって、天然で会合する成分を実質的に含まないようにされているものであり得る。
【００９９】
「回収する」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えば当技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって、ポリペプチドなどの化学種が、天然に会合する成分を実質的に含まないようにされるプロセスを指す。
【０１００】
「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、本明細書中で使用される場合、第二の化学種との、抗体、タンパク質又はペプチドの相互作用に関連して、相互作用が、化学種における特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味し；例えば、抗体は、全般的にタンパク質へというよりも、特異的タンパク質構造を認識し、これに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識された「Ａ」及び抗体を含有する反応中にエピトープＡ（又は遊離の、非標識Ａ）を含有する分子が存在すると、抗体に結合する標識されたＡの量が減少する。
【０１０１】
「抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、広く、４本のペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖からなる何らかの免疫グロブリン（Ｉｇ）分子又は、それらの何らかの機能的断片、突然変異体、変異体又は誘導体を指し、これは、Ｉｇ分子の基本的なエピトープ結合特性を保持する。このような突然変異体、変異体又は誘導体抗体型は、当技術分野で公知である。この非限定実施形態は下記で考察する。
【０１０２】
全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中で略してＨＣＶＲ又はＶＨと呼ぶ。）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中で略してＬＣＶＲ又はＶＬと呼ぶ。）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに区分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端で次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で構築される、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。免疫グロブリン分子は、何らかのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであり得る。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えばＡβ（２０−４２）球状凝集体）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又はそれ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の１つ又はそれ以上の断片によって発揮され得ることが示されている。このような抗体実施形態はまた、２以上の様々な抗原に特異的に結合する、二特異性、二重特異性又は多特異性形態でもあり得る。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む２価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の１本のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ｄＡｂ断片（参照により本明細書中に組み込まれる、Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６、Ｗｉｎｔｅｒら、国際出願公開ＷＯ９０／０５１４４Ａ１）（これは１つの可変ドメインを含有する。）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。
【０１０４】
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によりコードされるが、これらは、組み換え法を使用して、それらをＶＬ及びＶＨ領域が対になって１価の分子を形成する単一のタンパク質鎖にすることができる合成リンカーにより連結することができる（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照。）。このような１本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される。１本鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディなどもこの範囲内に包含される。ダイアボディは、２価で、二特異性の抗体であり、ＶＨ及びＶＬのドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、使用されるリンカーが短すぎるため、同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成できず、それによりドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成せざるを得ず、２つの抗原結合性部位が生じる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。このような抗体結合部分は当技術分野で公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０ｐｐ．（ＩＳＢＮ３−５４０−４１３５４−５）。
【０１０５】
「抗体コンストラクト」という用語は、本明細書中で使用される場合、リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインに連結される本発明の１つ又はそれ以上の抗原結合部分を含むポリペプチドを指す。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合により連結される２以上のアミノ酸残基を含み、１つ又はそれ以上の抗原結合部分を連結するために使用される。このようなリンカーポリペプチドは当技術分野で周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖又は軽鎖定常ドメインを指す。ヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は当技術分野で公知であり、表２で示される。
【０１０６】
【表２】
2010530740.tif 000003
2010530740.tif 000004
【０１０７】
またさらに、抗体又はその抗原結合部分は、１つ又はそれ以上のその他のタンパク質又はペプチドと抗体又は抗体部分の共有又は非共有結合により形成されているより大きな免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）及び二価及びビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するための、システイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が含まれる。全抗体の、それぞれパパイン又はペプシン消化などの従来技術を用いて、全抗体から、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体の一部を調製することができる。さらに本明細書中に記載のように、標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて、抗体、抗体部分及び免疫接着分子を得ることができる。
【０１０８】
さらに、本明細書中に記載のように、標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて、抗体、抗体部分及び免疫接着分子を得ることができる。
【０１０９】
「単離抗体」は、本明細書中で使用される場合、異なる抗原特性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指すものとする（例えば、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体が反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態を結合し、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体が反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない。）。しかしながら、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に特異的に結合する単離抗体は、その他の種からのＡβ（２０−４２）球状凝集体分子などのその他の抗原に対して交差反応性を有する。さらに、単離抗体は、その他の細胞性物質及び／又は化学物質及び／又は本発明の抗体が反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態を実質的に含まないものであり得る。
【０１１０】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでの無作為又は部位特異的突然変異誘発により、又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、別の哺乳動物種（例えばマウスなど）の生殖細胞系列由来であるＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含まないものとする。
【０１１１】
本明細書中で使用される場合、「組み換えヒト抗体」という用語は、組み換え手段によって調製、発現、作製又は単離される全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞中に遺伝子移入される組み換え発現ベクターを使用して発現される抗体（下記）、組み換え体から単離される抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．、（１９９７）ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．１５：６２−７０；Ａｚｚａｚｙ  Ｈ．及びＨｉｇｈｓｍｉｔｈ  Ｗ．Ｅ．、（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５−４４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ．Ｖ．及びＬａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８−１４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．及びＣｈａｍｅｓ  Ｐ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７８）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離される抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ、Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０、６２８７−６２９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｓ−Ａ．及びＧｒｅｅｎ  Ｌ．Ｌ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５９３−５９７；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０参照）又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む何らかのその他の手段によって調製、発現、作製又は単離される抗体を含むものとする。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する。しかし、ある実施形態において、このような組み換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックである動物を使用する場合は、インビボ体細胞突然変異誘発）が起こりやすく、従って組み換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ及びＶＬ配列由来であり、これらと関連している一方で、天然ではインビボのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に存在し得ない配列である。
【０１１２】
「キメラ抗体」という用語は、ある種からの重鎖及び軽鎖可変領域配列及び別の種からの定常領域配列を含む抗体、例えば、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、を指す。
【０１１３】
「ＣＤＲグラフト抗体」という用語は、ある種からの重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、この中でＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１つ又はそれ以上の配列が、別の種のＣＤＲ配列で置換された抗体、例えば、マウスＣＤＲの１つ又はそれ以上（例えばＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列で置換されているマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、を指す。
【０１１４】
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えばマウス）由来の重及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部がより「ヒト様」となるように改変されている、即ちヒト生殖細胞系列可変配列により類似している抗体を指す。ヒト化抗体のあるタイプはＣＤＲグラフト抗体であり、この場合、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置換するために、ヒトＣＤＲ配列が非ヒトＶＨ及びＶＬ配列に導入されている。
【０１１５】
「Ｋａｂａｔ付番」、「Ｋａｂａｔ定義」及び「Ｋａｂａｔラベリング」という用語は本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、当技術分野で認識されており、抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域における他のアミノ酸残基よりもより可変性がある（即ち超可変性）アミノ酸残基を付番する系を指す（Ｋａｂａｔら（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１及びＫａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ９１−３２４２）。重鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対してアミノ酸位置３１から３５の範囲であり、ＣＤＲ２に対してアミノ酸位置５０から６５であり、ＣＤＲ３に対してアミノ酸位置９５から１０２の範囲である。軽鎖可変領域の場合、超可変領域は、ＣＤＲ１に対してアミノ酸位置２４から３４であり、ＣＤＲ２に対してアミノ酸位置５０から５６であり、ＣＤＲ３に対してアミノ酸位置８９から９７である。
【０１１６】
本明細書中で使用される場合、「アクセプター」及び「アクセプター抗体」という用語は、フレームワーク領域の１つ又はそれ以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％をもたらすか又はコードする抗体又は核酸配列を指す。ある実施形態において、「アクセプター」という用語は、定常領域をもたらすか又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。さらに別の実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域及び定常領域の１つ又はそれ以上をもたらすか又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。具体的な実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域の１つ又はそれ以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％をもたらすか又はコードするヒト抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。この実施形態によると、アクセプターは、ヒト抗体の１つ又はそれ以上の特異的位置で生じない、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５又は少なくとも１０個のアミノ酸残基を含有し得る。アクセプターフレームワーク領域及び／又はアクセプター定常領域は、例えば、生殖細胞系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、当技術分野で周知の抗体、開発中の抗体又は市販の抗体）由来であり得るか又はそれらから得ることができる。
【０１１７】
本明細書中で使用される場合、「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれに３個のＣＤＲがあり、これらは、可変領域のそれぞれに対して、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれる。「ＣＤＲセット」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原に結合することができる１つの可変領域で生じる３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正しい境界は、システムが異なると異なって定義される。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９８７）及び（１９９１））により記載されるシステムは、抗体のあらゆる可変領域に適用可能である明確な残基付番システムを提供するだけでなく、３個のＣＤＲを定義する明確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと呼ばれる得る。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者ら（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）及びＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３（１９８９））は、アミノ酸配列のレベルで非常に多様であるにもかかわらず、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ内のある一定のサブポーション（ｓｕｂｐｏｒｔｉｏｎ）がほぼ同一のペプチド骨格構造をとることを見出した。これらのサブポーションは、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３又はＨ１、Ｈ２及びＨ３と名付けられた（ここで、「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ軽鎖及び重鎖領域とする。）。これらの領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲと呼ばれ得、これらは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する境界を有する。ＫａｂａｔＣＤＲと重複するＣＤＲを定義するその他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９（１９９５））及びＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−４５（１９９６））により記載されている。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記のシステムの１つに正確には従わない可能性があるが、特定の残基又は残基群又はＣＤＲ全体でさえも抗原結合に重大な影響を与えないという予想又は実験的知見を考慮すると、それらが短くされ得るか又は長くされ得るかにかかわらず、それでもなお、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する。本明細書中で使用される方法は、これらのシステムの何れかに従い定義されるＣＤＲを使用し得るが、好ましい実施形態は、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａで定義されるＣＤＲを使用する。
【０１１８】
本明細書中で使用される場合、「カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」残基という用語は、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９０７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９（１９９２）、両者とも参照により本明細書中に組み込まれる。）により定義されるような、特定の標準的なＣＤＲ構造を定義する、ＣＤＲ又はフレームワークにおける残基を指す。Ｃｈｏｔｈｉａらによると、多くの抗体のＣＤＲの重要な部分は、アミノ酸配列のレベルでは非常に多様であるにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格構造を有する。規範的（カノニカル）な各構造は、主に、ループを形成するアミノ酸残基の隣接セグメントに対するペプチド骨格ねじれ角のセットを指す。
【０１１９】
本明細書中で使用される場合、「ドナー」及び「ドナー抗体」という用語は、１つ又はそれ以上のＣＤＲを提供する抗体を指す。好ましい実施形態において、ドナー抗体は、フレームワーク領域が得られるか又はそれが由来する抗体とは異なる種由来の抗体である。ヒト化抗体に関して、「ドナー抗体」という用語は、１つ又はそれ以上のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を指す。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」という用語は、ＣＤＲを差し引いた可変領域の残存配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は異なるシステムにより決定され得るので、フレームワーク配列の意味は、相応して異なる解釈に従う。６個のＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２及び−Ｌ３及び重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２及び−Ｈ３）もまた、軽鎖及び重鎖においてフレームワーク領域を各鎖で４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分け、ここで、ＣＤＲ１は、ＦＲ１とＦＲ２との間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３との間に位置し、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４との間に位置する。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４として特定のサブ領域を指定することなく、フレームワーク領域は、その他により指定される場合、１本の天然の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わせられたＦＲ’を表す。本明細書中で使用される場合、ＦＲ（単数形）は４つのサブ領域の１つを表し、ＦＲ（複数形）は、フレームワーク領域を構成する４つのサブ領域の２つ又はそれ以上を表す。
【０１２１】
ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は当技術分野で公知である。本発明のある実施形態において、ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は、下記に記載の配列から選択される。
【０１２２】
【表３】
2010530740.tif 000005
【０１２３】
【表４】
2010530740.tif 000006
【０１２４】
本明細書中で使用される場合、「生殖細胞系列抗体遺伝子」又は「遺伝子断片」という用語は、特定の免疫グロブリンの発現に対して遺伝子再配列及び突然変異をもたらす成熟プロセスが行われていない非リンパ系細胞によりコードされる免疫グロブリン配列を指す（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１８３−２００（２００２）；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．４８４：１３−３０（２００１）参照）。本発明の様々な実施形態により提供される長所の１つは、生殖細胞系列抗体遺伝子が、成熟抗体遺伝子よりも、種における個体の必須のアミノ酸配列構造の特徴を保存する可能性が高いが、その種において治療用に使用される場合、外来源由来のものとして認識される可能性が低いという認識によるものである。本明細書中で使用される場合、「キーとなる」残基という用語は、抗体の、特にヒト化抗体の、結合特異性及び／又は親和性においてより影響がある可変領域内のある一定の残基を指す。キーとなる残基には、以下に限定されないが、次のものの１つ又はそれ以上が含まれる：ＣＤＲに隣接する残基、潜在的グリコシル化部位（Ｎ−又はＯ−グリコシル化部位の何れかであり得る。）、希少残基、抗原と相互作用することができる残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、カノニカル残基、重鎖可変領域及と軽鎖可変領域との間の接触残基、バーニアゾーン内の残基及び可変重鎖ＣＤＲ１のコチア定義と第一の重鎖フレームワークのＫａｂａｔ定義との間で重複する領域における残基。
【０１２５】
本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、関心のある抗原に免疫特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域及び非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体又は、それらの変異体、誘導体、類似体もしくは断片である。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、ＣＤＲに関して、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％及び最も好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的に全てを含み、ここでＣＤＲ領域の全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリン（即ちドナー抗体）のものに相当し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。好ましくは、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン（通常はヒト免疫グロブリンの）定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。ある実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖ならびに、少なくとも重鎖の可変ドメインの両方を含有する。本抗体はまた、重鎖の、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４領域も含み得る。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含有する。ある実施形態において、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメイン及び／又はヒト化重鎖のみを含有する。
【０１２７】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥ及び何らかのアイソタイプ（以下に限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。）を含む、免疫グロブリンの何らかのクラスから選択することができる。ヒト化抗体は、複数のクラス又はアイソタイプからの配列を含み得、当技術分野で周知である技術を用いて、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択し得る。
【０１２８】
ヒト化抗体の、フレームワーク及びＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応する必要はなく、例えば、その部位でＣＤＲ又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークの何れかに相当しないように、少なくとも１つのアミノ酸残基の、置換、挿入及び／又は欠失により、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークに対して突然変異誘発を行い得る。しかし、好ましい実施形態において、このような突然変異は大規模ではない。通常、ヒト化抗体残基の、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が親ＦＲ及びＣＤＲ配列のものに相当する。本明細書中で使用される場合、「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列のフレームワーク領域を指す。本明細書中で使用される場合、「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連免疫グロブリン配列のファミリーにおいて最も高頻度に現れるアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７参照）。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列の各位置には、そのファミリーのその位置で最も高頻度に現れるアミノ酸がある。２種類のアミノ酸が同等の頻度で現れる場合、何れかをコンセンサス配列に含めることができる。
【０１２９】
本明細書中で使用される場合、「ベルニア」ゾーンは、Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒ（１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９、参照により本明細書中に組み込まれる。）により記載されるように、ＣＤＲ構造を調整し得、抗原への合致を細かく調整し得るフレームワーク残基のサブセットを指す。バーニアゾーン残基は、ＣＤＲの基礎をなす層を形成し、ＣＤＲの構造及び抗体の親和性に影響を及ぼし得る。
【０１３０】
本明細書中で使用される場合、「中和する」という用語は、結合タンパク質が球状凝集体に特異的に結合する場合、球状凝集体の生物学的活性の中和を指す。好ましくは、結合タンパク質を中和することは、球状凝集体のＡβ（２０−４２）アミノ酸領域及び／又は本発明の抗体が反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態への結合の結果、球状凝集体の生物学的活性の阻害が起こる抗体を中和することである。好ましくは、中和結合タンパク質は、球状凝集体のＡβ（１−４２）領域及び／又は本発明の抗体が反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態に結合し、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％以上、球状凝集体の活性を生物学的に低下させる。中和結合タンパク質による球状凝集体の生物学的活性の阻害は、当技術分野で周知の球状凝集体の生物学的活性の１つ又はそれ以上の指標を測定することにより評価され得る。
【０１３１】
「活性」という用語は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体（及び／若しくは本発明の抗体が反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態）に結合する抗体（例えば、抗Ａβ（２０−４２）抗体又は本発明の抗体が反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態に対する抗体）の抗原に対する結合特異性／親和性並びに／又は抗体（例えば、Ａβ（２０−４２）へのその結合が球状凝集体及び／若しくは本発明の抗体が反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の生物学的活性を阻害する抗Ａβ（２０−４２）抗体）の中和能などの活性を含む。
【０１３２】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体と特異的に結合することができる何らかのポリペプチド決定基を含む。ある実施形態においては、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面配置を含み、ある実施形態においては、特定の３次元構造的特徴及び／又は特定の電荷的特徴を有し得る。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。ある実施形態において、抗体は、タンパク質及び／又は巨大分子の複雑な混合物中でその標的抗原を選択的に認識した際に抗原に特異的に結合すると言われる。
【０１３３】
本明細書中で使用される場合、「表面プラズモン共鳴」という用語は、（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化の検出による、リアルタイムの生体特異性相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。さらなる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ  Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、Ｂ．ら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ、Ｂ．ら（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８、２６８−２７７を参照のこと。
【０１３４】
本明細書中で使用される場合、「Ｋｏｎ」という用語は、当技術分野で公知のように、抗体／抗原複合体を形成するための抗原への抗体の会合に対する会合速度定数を指すものとする。
【０１３５】
本明細書中で使用される場合、「Ｋｏｆｆ」という用語は、当技術分野で公知のように、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に対する解離速度定数を指すものとする。
【０１３６】
本明細書中で使用される場合、「Ｋｄ」という用語は、当技術分野で公知のように、特定の抗体−抗原相互作用の「解離定数」を指すものとする。
【０１３７】
「標識結合タンパク質」という用語は、本明細書中で使用される場合、結合タンパク質の同定を可能にする標識が組み込まれたタンパク質を指す。好ましくは、この標識は、例えば、放射性標識アミノ酸の組み込み又は標識化アビジンにより検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの結合など、検出可能マーカーである（例えば、光学的方法又は比色法により検出することができる蛍光マーカー又は酵素活性を含有するストレプトアビジン）。ポリペプチドに対する標識の例には、以下に限定されないが、次のものが含まれる：放射性同位元素又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ又は１５３Ｓｍ）；蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ又はアルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチニル基；第二のレポーターにより認識される予め定められたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）；及びガドリニウムキレートなどの磁性物質。
【０１３８】
「抗体連結体」という用語は、治療薬又は細胞毒性薬などの第二の化学部分に化学的に連結された抗体などの、結合タンパク質を指す。「薬剤（ａｇｅｎｔ）」という用語は、本明細書中で、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的巨大分子又は生体物質から調製された抽出物を指すために使用される。好ましくは、治療薬又は細胞毒性薬には、以下に限定されないが、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びプロマイシン、ならびにそれらの類似物又はホモローグが含まれる。
【０１３９】
「結晶」及び「結晶化」という用語は、本明細書中で使用される場合、結晶の形態で存在する、抗体又はその抗原結合部分を指す。結晶は物質の固体状態の一形態であり、非晶質固体状態又は液晶状態などのその他の形態とは異なる。結晶は、原子、イオン、分子（例えば抗体などのタンパク質）又は分子集合体（例えば抗原／抗体連結体）の、規則的な繰り返しの３次元配列から構成される。これらの３次元配列は、その分野でよく理解されている具体的な数学的関係に従い配置される。結晶において繰り返される基本単位又は構成要素は、非対称ユニットと呼ばれる。ある一定の明確な結晶学的対称性に従う配置における非対称ユニットの繰り返しによって、結晶の「単位格子」がもたらされる。全ての３つの次元での規則正しい並進による単位格子の繰り返しによって結晶がもたらされる。Ｇｉｅｇｅ、Ｒ．及び及びＤｕｃｒｕｌｘ、Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、ｐｐ．２０１−１６、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）」を参照のこと。
【０１４０】
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で述べられる場合、２以上のヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドの何れか）又は何れかのタイプのヌクレオチドの修飾型のポリマー形態を意味する。この用語には、ＤＮＡの１本鎖及び２本鎖形態が含まれるが、好ましくは、２本鎖ＤＮＡである。
【０１４１】
「単離ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、その起源ゆえに、「単離ポリヌクレオチド」が天然で一緒に見出されるポリヌクレオチドの全て又は一部と会合していないか；天然ではそれが連結されないポリヌクレオチドに操作可能に連結されているか；又はより大きな配列の一部として天然では生じない、ポリヌクレオチド（例えば、ゲノムの、ｃＤＮＡの、又は合成起源の又はそれらのある組み合わせの）を意味する。
【０１４２】
「ベクター」という用語は、本明細書中で使用される場合、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すものとする。ベクターのあるタイプは「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の２本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、この場合、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み入れられ得、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが操作可能に連結される遺伝子の発現を支配することができる。このようなベクターは、本明細書中で「組み換え発現ベクター」（又は単純に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用である発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本願において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）などの発現ベクターのこのようなその他の形態を含むものとする。
【０１４３】
「操作可能に連結される」という用語は、記載の成分が、それらの所望の様式でそれらを機能させる関係にある並置状態を指す。コード配列に「操作可能に連結される」制御配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように連結される。「操作可能に連結される」配列には、関心のある遺伝子と隣接する発現制御配列と、関心のある遺伝子を制御するためにトランスで又は離れた位置で作用する発現制御配列と、の両方が含まれる。「発現制御配列」という用語は、本明細書中で使用される場合、それらが連結されるコード配列の発現及びプロセシングをもたらすのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；有効なＲＮＡプロセシングシグナル（スプライシング及びポリアデニル化シグナルなど）；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を促進する配列（即ちコザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を促進する配列；及び必要に応じて、タンパク質分泌を促進する配列が含まれる。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なり；原核生物では、このような制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含み；真核生物では、一般に、このような制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現及びプロセシングに必須である成分を含むものとし、これにはまた、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列などの、存在すると有利であるさらなる成分も含まれ得る。
【０１４４】
本明細書中で定義される場合、「形質転換」は、外来ＤＮＡが宿主細胞に入る何らかのプロセスを指す。形質転換は、当技術分野で周知の様々な方法を用いて、天然又は人工的条件下で起こり得る。形質転換は、原核又は真核宿主細胞への外来核酸配列の挿入のための何らかの公知の方法に依存し得る。その方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、この方法には、以下に限定されないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション及び微粒子銃が含まれる。このような「形質転換された」細胞には、挿入ＤＮＡが自己複製プラスミドとして又は宿主染色体の一部としての何れかで複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。これらにはまた、限られた時間、挿入ＤＮＡ又はＲＮＡを一時的に発現する細胞も含まれる。
【０１４５】
「組み換え宿主細胞」（又は単純に「宿主細胞」）という用語は、本明細書中で使用される場合、外来ＤＮＡが導入されている細胞を指すものとする。このような用語が、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も指すものであることを理解されたい。突然変異又は環境的影響の何れかにより後世においてある種の修飾が起こり得るので、このような子孫は、実際に、その親細胞と非同一であり得るが、本明細書中で使用される場合の「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。好ましくは、宿主細胞には、生物界の何れかから選択される原核及び真核細胞が含まれる。好ましい真核細胞には、原生細胞、真菌細胞、植物細胞及び動物細胞が含まれる。最も好ましくは、宿主細胞には、以下に限定されないが、原核細胞株Ｅ．コリ（大腸菌）；哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ；昆虫細胞株Ｓｆ９；及び真菌細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロミセス・セレビシエ）が含まれる。
【０１４６】
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成及び組織培養及び形質転換に対して標準的技術を使用し得る（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）。製造者の説明書に従い、又は当技術分野で一般に遂行されるように、又は本明細書中に記載のように、酵素反応及び精製技術を行い得る。当技術分野で周知の従来法に従い、及び本願を通じて引用され考察される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載のように、先述の技術及び手段を一般的に行い得る。例えば、あらゆる目的に対して参照により本明細書中に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。
【０１４７】
当技術分野で公知のように、及び本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック生物」は、トランス遺伝子を含有する細胞を有する生物を指し、この場合、生物（又はその生物の祖先）に導入されるトランス遺伝子は、その生物において天然では発現されないポリペプチドを発現する。「トランス遺伝子」は、ＤＮＡコンストラクトであり、トランスジェニック生物が発生する細胞のゲノムに安定的に操作可能に組み入れられ、１つ又はそれ以上の細胞タイプ又はトランスジェニック生物の組織においてコードされる遺伝子産物の発現を支配する。
【０１４８】
「制御する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）」及び「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は交換可能に使用され、本明細書中で使用される場合、関心のある分子の活性における変化又は変更を指す（例えば、Ａβ（２０−４２）球状凝集体の生物学的活性）。調節は、関心のある分子のある種の活性又は機能の大きさの向上又は低下であり得る。分子の代表的な活性及び機能には、以下に限定されないが、結合特性、酵素活性、細胞受容体活性化及びシグナル伝達が含まれる。
【０１４９】
相応して、「調節物質」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある分子の活性又は機能を変化又は変更させることができる化合物である（例えば、Ａβ（２０−４２）球状凝集体の生物学的活性）。例えば、調節物質は、その調節物質の非存在下で観察される活性又は機能の大きさと比較して、分子のある種の活性又は機能の大きさを向上又は低下をさせ得る。ある種の実施形態において、調節物質は阻害剤であり、これは、分子の少なくとも１つの活性又は機能の大きさを低下させる。代表的な阻害剤には、以下に限定されないが、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、炭水化物又は小さな有機分子が含まれる。ペプチボディは例えば国際出願公開ＷＯ０１／８３５２５に記載されている。
【０１５０】
「アゴニスト」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある分子と接触した場合に、アゴニストの非存在下で観察される活性又は機能の大きさと比較して、分子のある種の活性又は機能の大きさを向上させる調節物質を指す。関心のある特定のアゴニストには、以下に限定されないが、Ａβ（２０−４２）球状凝集体ポリペプチド又は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に結合する、ポリペプチド、核酸、炭化水素又は何らかのその他の分子が含まれ得る。
【０１５１】
「アンタゴニスト」又は「阻害剤」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある分子と接触した場合に、アンタゴニストの非存在下で観察される活性又は機能の大きさと比較して、分子のある種の活性又は機能の大きさを低下させる調節物質を指す。関心のある特定のアンタゴニストには、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体が反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の生物学的活性を阻止又は調節するものが含まれる。Ａβ（２０−４２）球状凝集体のアンタゴニスト及び阻害剤には、以下に限定されないが、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体が反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態に結合する、タンパク質、核酸、炭化水素又は何らかのその他の分子が含まれ得る。
【０１５２】
本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、疾患又はその１つ又はそれ以上の症候の、重症度及び／又は持続時間を低下させるか又は改善する、疾患の進行を予防するか、疾患の軽減を引き起こすか、疾患に付随する１つ又はそれ以上の症候の再発、発現、発症もしくは進行を予防するか、疾患を検出するか、又は別の治療薬（例えば、予防薬又は治療薬）の予防的もしくは治療的効果を促進もしくは向上させるのに十分である治療薬の量を指す。
【０１５３】
「試料」という用語は、本明細書中で使用される場合、その最も広い意味で使用される。「生体試料」とは、本明細書中で使用される場合、以下に限定されないが、生物由来の又は死亡した生物由来の物質の何らかの量が含まれる。このような生物には、以下に限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギ及びその他の哺乳動物又は非哺乳動物が含まれる。このような物質には、以下に限定されないが、血液、血清、尿、滑液、細胞、臓器、組織（例えば脳）、骨髄、リンパ節、脳脊髄液及び脾臓が含まれる。
【０１５４】
Ｉ．Ａβ（２０−４２）球状凝集体に結合する抗体
本発明のある態様は、高い親和性で、遅い解離速度で、高い中和能を有してＡβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態と結合する、単離マウスモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【０１５５】
本発明の第二の態様は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態に結合するキメラ抗体を提供する。本発明の第三の態様は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態に結合するＣＤＲグラフト抗体又はその抗原結合部分を提供する。本発明の第四の態様は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態に結合するヒト化抗体又はその抗原結合部分を提供する。好ましくは、この抗体又はその一部は単離抗体である。好ましくは、本発明の抗体は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態を中和する。
【０１５６】
抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗体を作製する方法
本発明の抗体は、当技術分野で公知の多くの技術の何れかにより調製され得る。
【０１５７】
１．ハイブリドーマ技術を用いた抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体モノクローナル抗体
ハイブリドーマ、組み換え及びファージディスプレイ技術又はそれらの組み合わせの使用を含む当技術分野で公知の多岐にわたる技術を用いて、モノクローナル抗体を調製することができる。例えば、当技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．１９８１）（これらの参考文献は、それらの全体において参照により組み込まれる。）で教示されるものを含むハイブリドーマ技術を用いて、モノクローナル抗体を作製することができる。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、ハイブリドーマ技術を通じて作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、何らかの真核、原核又はファージクローンを含む単一クローン由来の抗体を指し、それが作製される方法ではない。
【０１５８】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を作製し、これについてスクリーニングするための方法は通常のものであり当技術分野で周知である。ある実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体を作製する方法ならびに、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む方法により産生される抗体を提供するが、この場合、好ましくはハイブリドーマは、本発明の抗原を免疫付与されたマウスから単離される脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させ、次いで本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンに対する融合の結果得られるハイブリドーマをスクリーニングすることにより作製される。簡潔に述べると、Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗原によりマウスに免疫付与することができる。好ましい実施形態において、免疫反応を刺激するためにアジュバントとともに抗原が投与される。このようなアジュバントには、フロインドの完全又は不完全アジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）又はＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）が含まれる。このようなアジュバントは、局所沈着においてそれを封鎖することにより急速にポリペプチドが分散しないようにし得るか又はこれらは、マクロファージ及び免疫系のその他の成分に対して化学走性がある因子を分泌するように宿主を刺激する物質を含有し得る。好ましくは、ポリペプチドが投与されている場合、免疫付与スケジュールには、数週間にわたる２回以上のポリペプチドの投与が含まれる。
【０１５９】
Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗原での動物の免疫付与後、抗体及び／又は抗体産生細胞をその動物から得ることができる。動物から採血するか又は屠殺することにより、動物から抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗体含有血清を得る。この血清を動物から得られるままに使用し得るか、免疫グロブリン画分を血清から得ることができるか又は抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗体を血清から精製し得る。このようにして得られる血清又は免疫グロブリンはポリクローナルであり、従って、異なる一連の特性を有する。
【０１６０】
免疫反応が検出されたら、例えば、マウス血清中で抗原Ａβ（２０−４２）球状凝集体に対して特異的な抗体を検出し、マウス脾臓を摘出し、脾臓細胞を単離する。次に、脾臓細胞を周知の技術により何らかの適切な骨髄腫細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によりクローニングする。次に、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に結合することができる抗体を分泌する細胞について、当技術分野で公知の方法によりハイブリドーマクローンをアッセイする。陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスに免疫付与することによって、通常高レベルの抗体を含有する腹水を産生させることができる。
【０１６１】
別の実施形態において、免疫付与動物から、抗体産生不死化ハイブリドーマを調製し得る。免疫付与後、動物を屠殺し、当技術分野で周知であるように脾臓Ｂ細胞を不死化骨髄腫細胞に融合させる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、上出参照。好ましい実施形態において、骨髄腫細胞は免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌細胞株）。融合及び抗生物質選択後、Ａβ（２０−４２）球状凝集体もしくはその一部又はＡβ（２０−４２）球状凝集体を発現する細胞を用いてハイブリドーマをスクリーニングする。好ましい実施形態において、最初のスクリーニングは、酵素連結免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）を用いて行う（好ましくはＥＬＩＳＡ）。ＥＬＩＳＡスクリーニングの例は、国際出願公開ＷＯ００／３７５０４で提供される（これは参照により本明細書中に組み込まれる。）。
【０１６２】
下記でさらに考察するように、抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗体産生ハイブリドーマを選択し、クローニングし、さらに、ロバストなハイブリドーマ増殖、高抗体産生及び所望の抗体特性を含む所望の特性についてスクリーニングする。ハイブリドーマを培養し、インビボで同系動物において、免疫系を欠損している動物（例えばヌードマウス）において、又はインビトロで細胞培養において、増殖させ得る。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、増殖させる方法は当業者にとって周知である。
【０１６３】
好ましい実施形態において、上述のように、ハイブリドーマはマウスハイブリドーマである。別の好ましい実施形態において、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ又はウマなどの、非ヒト、非マウス種で産生される。別の実施形態において、ハイブリドーマは、ヒト非分泌骨髄腫が抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗体を発現するヒト細胞と融合させられているヒトハイブリドーマである。
【０１６４】
特異的エピトープを認識する抗体断片を公知の技術により作製することができる。例えば、（Ｆａｂ断片を作製するための）パパイン又は（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するための）ペプシンなどの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって、本発明のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を作製することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨＩドメインを含有する。
【０１６５】
２．ＳＬＡＭを用いた抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体モノクローナル抗体
本発明の別の態様において、米国特許第５，６２７，０５２号、国際出願公開ＷＯ９２／０２５５１及びＢａｂｃｏｃｋ、Ｊ．Ｓ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−７８４８に記載のような、当技術分野で選択的リンパ球抗体法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｔｈｏｄ、（ＳＬＡＭ））と呼ばれる手順を用いて、単一の単離リンパ球から組み換え抗体を作製する。この方法において、抗原特異的溶血プラークアッセイを用いて、関心のある抗体を分泌する単一細胞（例えば、セクション１に記載の免疫付与動物の何れか１つ由来のリンパ球）をスクリーニンするが、ここで、抗原Ａβ（２０−４２）球状凝集体、Ａβ（２０−４２）球状凝集体のサブユニット又はその断片は、ビオチンなどのリンカーを用いてヒツジ赤血球細胞にカップリングされており、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に対する特異性を有する抗体を分泌する単一の細胞を同定するために使用される。関心のある抗体分泌細胞の同定後、逆転写酵素−ＰＣＲにより重鎖及び軽鎖可変領域ｃＤＮＡを細胞からレスキューし、次いで、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞において、適切な免疫グロブリン定常領域（例えばヒト定常領域）の下で、これらの可変領域を発現させることができる。次に、例えばＡβ（２０−４２）球状凝集体に対する抗体を発現する細胞を単離するために遺伝子移入された細胞を掬いだすことにより、インビボ選択リンパ球由来の増幅免疫グロブリン配列を遺伝子移入された宿主細胞をインビトロでさらに分析及び選択することができる。国際出願公開ＷＯ９７／２９１３１及び国際出願公開ＷＯ００／５６７７２に記載のものなどのインビトロ親和性成熟法などによって、増幅免疫グロブリン配列をインビトロでさらに操作することができる。
【０１６６】
３．トランスジェニック動物を用いた抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体モノクローナル抗体
本発明の別の実施形態において、Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗原でヒト免疫グロブリン遺伝子座のいくつか又は全てを含む非ヒト動物に免疫付与することによって抗体を作製する。好ましい実施形態において、非ヒト動物は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウス、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きな断片を含み、マウス抗体産生欠損である、改変マウス系列である。例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）及び米国特許第５，９１６，７７１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，９８５，６１５号、同第５，９９８，２０９号、同第６，０７５，１８１号、同第６，０９１，００１号、同第６，１１４，５９８号及び同第６，１３０，３６４号を参照のこと。また、国際特許公開ＷＯ９１／１０７４１（１９９１年７月２５日公開）、ＷＯ９４／０２６０２（１９９４年２月３日公開）、ＷＯ９６／３４０９６及びＷＯ９６／３３７３５（両方とも１９９６年１０月３１日公開）、ＷＯ９８／１６６５４（１９９８年４月２３日公開）、ＷＯ９８／２４８９３（１９９８年６月１１日公開）、ＷＯ９８／５０４３３（１９９８年１１月１２日公開）、ＷＯ９９／４５０３１（１９９９年９月１０日公開）、ＷＯ９９／５３０４９（１９９９年１０月２１日公開）、ＷＯ００／０９５６０（２０００年２月２４日公開）及びＷＯ００／０３７５０４（２０００年６月２９日公開）も参照のこと。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原−特異的ヒトＭａｂを産生する。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座及びｘ軽鎖遺伝子座の、メガベースの大きさの生殖細胞系列構造ＹＡＣ断片の導入を通じて、ヒト抗体レパートリーのおよそ８０％を含有する。Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）、Ｇｒｅｅｎｅ及びＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）を参照のこと（これらの開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。）。
【０１６７】
４．組み換え抗体ライブラリを用いた抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体モノクローナル抗体
本発明の抗体を作製するために、インビトロ法を使用することもでき、この場合、所望の結合特異性を有する抗体を同定するために、抗体ライブラリをスクリーニングする。組み換え抗体ライブラリのこのようなスクリーニングのための方法は、当技術分野で周知であり、これには、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、国際出願公開ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、国際出願公開ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒら、国際出願公開ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら、国際出願公開ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、国際出願公開ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、国際出願公開ＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；及びＢａｒｂａｓら（１９９１）、ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２、米国出願公開第２００３０１８６３７４及び国際出願公開ＷＯ９７／２９１３１（これらのそれぞれの内容は参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載の方法が含まれる。
【０１６８】
組み換え抗体ライブラリは、Ａβ（２０−４２）球状凝集体又はＡβ（２０−４２）球状凝集体の一部で免疫付与された対象由来であり得る。あるいは、組み換え抗体ライブラリは、ナイーブの対象、即ちＡβ（２０−４２）球状凝集体で免疫付与されていない対象由来であり得、例えば、ヒトＡβ（２０−４２）球状凝集体で免疫付与されていないヒト対象からのヒト抗体ライブラリなどである。ヒトＡβ（２０−４２）球状凝集体を含むペプチドを用いて組み換え抗体ライブラリをスクリーニングし、それによりＡβ（２０−４２）球状凝集体を認識し、Ａβ（１−４２）球状凝集体、Ａβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）単量体、Ａβ原繊維及びｓＡＰＰαを識別する抗体を選択することにより、本発明の抗体を選択する。このようなスクリーニング及び選択を行うための方法は、先行する段落における参考文献に記載のものなど、当技術分野で周知である。特定のｋＯｆｆ速度定数でヒトＡβ（２０−４２）球状凝集体から解離するものなど、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に対する特定の結合親和性を有し、Ａβ（１−４２）球状凝集体、Ａβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）単量体、Ａβ原繊維及びｓＡＰＰαを識別する本発明の抗体を選択するために、当技術分野で公知のドットブロットの方法を使用して、所望のｋＯｆｆ速度定数を有する抗体を選択することができる。特定のＩＣ５０を有するものなど、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に対する特定の中和活性を有し、Ａβ（１−４２）球状凝集体、Ａβ（１−４０）及びＡβ（２０−４２）単量体、Ａβ原繊維及びｓＡＰＰαを識別する本発明の抗体を選択するために、ヒトＡβ（２０−４２）球状凝集体活性の阻害を評価するための当技術分野で公知の標準的方法を使用し得る。
【０１６９】
ある態様において、本発明は、ヒトＡβ（２０−４２）球状凝集体に結合し、Ａβ（１−４２）球状凝集体、Ａβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）単量体、Ａβ原繊維及びｓＡＰＰαを識別する単離抗体又はその抗原結合部分に関する。好ましくは、本抗体は中和抗体である。様々な実施形態において、本抗体は組み換え抗体又はモノクローナル抗体である。
【０１７０】
例えば、本発明の抗体はまた、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を担うファージ粒子の表面上で機能的抗体ドメインを提示する。特に、このようなファージは、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えばヒト又はマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために使用することができる。抗原により、例えば標識抗原又は固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉される抗原を用いて、関心のある抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを選択するか又は同定することができる。これらの方法において使用されるファージは、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質の何れかに組み換え融合される、Ｆａｂ、Ｆｖ又はジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインとともにファージから発現されるｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む線状ファージである。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；国際出願公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；及び米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３及び同第５，９６９，１０８号（これらはそれぞれ、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）で開示されるのものが含まれる。
【０１７１】
上記参考文献に記載のように、例えば下記で詳述するように、ヒト抗体又は何らかのその他の所望の抗原結合断片を含み、何らかの所望の宿主（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む。）において発現される全抗体を生成させるために、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離し、使用することができる。例えば、国際出願公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；及びＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；及びＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（これらの参考文献は、それらの全体において参照により組み込まれる。）で開示されているものなどの当技術分野で公知の方法を用いて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片を組み換え作製するための技術を使用することもできる。１本鎖Ｆｖ及び抗体を作製するために使用することができる技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；及びＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載のものが含まれる。
【０１７２】
ファージディスプレイによる組み換え抗体ライブラリのスクリーニングの代わりに、大型のコンビナトリアルライブラリをスクリーニングするための当技術分野で公知のその他の方法を、本発明の２重特異性抗体の同定に適用することができる。あるタイプの代替的な発現系は、Ｓｚｏｓｔａｋ及びＲｏｂｅｒｔｓによる国際出願公開ＷＯ９８／３１７００及びＲｏｂｅｒｔｓ、Ｒ．Ｗ．及びＳｚｏｓｔａｋ、Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２に記載のような、組み換え抗体ライブラリがＲＮＡ−タンパク質融合物として発現されているものである。この系において、その３’末端にプロマイシン、ペプチジルアクセプター抗生物質を有する合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳により、ｍＲＮＡとそれがコードするペプチド又はタンパク質との間で、共有結合融合が生じる。このようにして、コードされるペプチド又はタンパク質、例えば抗体又はその一部の特性（二重特異性抗原への、抗体又はその一部の結合など）に基づき、ｍＲＮＡの複合体混合物（例えばコンビナトリアルライブラリ）から、特異的ｍＲＮＡを濃縮することができる。上記のような組み換え手順によって、このようなライブラリのスクリーニングから回収される抗体又はその一部をコードする核酸配列を発現させることができ（例えば哺乳動物宿主細胞において）、さらに、上述のような、元来選択された配列へと突然変異が導入されているｍＲＮＡ−ペプチド融合物のスクリーニングのさらなるラウンドによるか又は組み換え抗体のインビトロでの親和性成熟のためのその他の方法によるかの何れかで、さらなる親和性成熟に供することができる。
【０１７３】
別のアプローチにおいて、本発明の抗体はまた、当技術分野で公知の酵母ディスプレイ法を用いて作製することもできる。酵母ディスプレイ法において、酵母細胞壁に抗体ドメインをつなぎとめ、酵母の表面上にそれらを提示するために遺伝学的方法を使用する。特に、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えばヒト又はマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために、このような酵母を使用することができる。本発明の抗体を作製するために使用することができる酵母ディスプレイ法の例には、参照により本明細書中に組み込まれる、Ｗｉｔｔｒｕｐら、米国特許第６，６９９，６５８号で開示されるものが含まれる。
【０１７４】
Ｂ．組み換えＡβ（２０−４２）球状凝集体抗体の作製
上記のように、本発明の抗体は、当技術分野で公知の技術の多くの何れかにより作製され得る。例えば、宿主細胞からの発現（重及び軽鎖をコードする発現ベクターは標準的技術により宿主細胞に遺伝子移入される。）。「遺伝子移入（トランスフェクション）」という用語の様々な形態は、原核又は真核宿主細胞への外来ＤＮＡの導入のために一般に使用される多岐にわたる技術を包含するものとする（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン遺伝子移入など）。原核又は真核宿主細胞の何れかにおいて本発明の抗体を発現することが可能であるが、真核細胞（及び特に哺乳動物細胞）は、原核細胞よりも、正しく折り畳まれた免疫学的活性のある抗体を構築して分泌する可能性が高いので、真核細胞での抗体の発現が好ましく、哺乳動物宿主細胞中での発現が最も好ましい。
【０１７５】
本発明の組み換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ及びＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載のような、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用されるＵｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１：４２１６−４２２０に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、宿主細胞での抗体の発現を可能にするか又はより好ましくは、宿主細胞が増殖させられる培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間にわたり宿主細胞を培養することによって、抗体が産生される。標準的タンパク質精製法を用いて培地から抗体を回収することができる。
【０１７６】
Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子などの機能的抗体断片を生成させるために宿主細胞を使用することもできる。上記手順における変化が本発明の範囲内であることを理解されたい。例えば、本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖の何れかの機能的断片をコードするＤＮＡを宿主細胞に遺伝子移入することが望ましいものであり得る。関心のある抗原への結合に必要ではない軽鎖及び重鎖の何れか又は両方をコードするＤＮＡのいくつか又は全てを除去するために、組み換えＤＮＡ技術を使用することもできる。このような短縮ＤＮＡ分子から発現される分子もまた本発明の抗体により包含される。さらに、標準的化学架橋法により第二の抗体へ本発明の抗体を架橋することによって、１つの重鎖及び１つの軽鎖が本発明の抗体であり、その他の重鎖及び軽鎖が、関心のある抗原以外の抗原に特異的である２機能性抗体を作製し得る。
【０１７７】
本発明の抗体又はその抗原結合部分の組み換え発現のための好ましい系において、リン酸カルシウムが介在する遺伝子移入によって、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組み換え発現ベクターをｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組み換え発現ベクター内で、抗体重及び軽鎖遺伝子は、遺伝子の高レベル転写を推進するために、それぞれＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントに操作可能に連結される。組み換え発現ベクターはまた、ＤＨＦＲ遺伝子も有し、これにより、メトトレキセート選択／増幅を用いてベクターが遺伝子移入されているＣＨＯ細胞の選択が可能になる。抗体重鎖及び軽鎖の発現を可能にするために、選択された形質転換宿主細胞を培養し、インタクトな抗体を培地から回収する。組み換え発現ベクターを調製し、宿主細胞に遺伝子移入し、形質転換体について選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収するために、標準的分子生物学技術を使用する。またさらに、本発明は、本発明の組み換え抗体が合成されるまで、適切な培地中で本発明の宿主細胞を培養することにより、本発明の組み換え抗体を合成する方法を提供する。この方法はさらに、培地から組み換え抗体を単離することを含む。
【０１７８】
１．抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗体
下表５は、本発明の好ましい抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体ヒト化抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列のリストを含む。本明細書中に記載の単離抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗体ＣＤＲ配列は、本発明に従い単離され、本明細書中に列挙されているＣＤＲ配列を含むポリペプチドを含む、Ａβ（２０−４２）球状凝集体（及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態）結合タンパク質の新規ファミリーを確立する。
【０１７９】
好ましいＡβ（２０−４２）球状凝集体結合を有し及び／又はＡβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態に関する活性を中和する本発明のＣＤＲを作製し、選択するために、以下に限定されないが、本明細書中に具体的に記載されるものを含む、本発明の結合タンパク質を作製し、Ａβ（２０−４２）球状凝集体（及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態）結合を評価し、及び／又はこれらの結合タンパク質の特性を中和するための、当技術分野で公知の標準的方法を使用することができる。
【０１８０】
２．抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体キメラ抗体
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体など、抗体の異なる部分が異なる動物種由来である分子である。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知であり、本明細書中で詳細に考察される。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；及び４，８１６，３９７号（これらはそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）を参照のこと。さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに適切な抗原特異性のマウス抗体分子から遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（これらはそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）を使用することができる。
【０１８１】
ある実施形態において、本発明のキメラ抗体は、２００６年１１月３０日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６１４８号に記載されているマウスモノクローナル抗ヒトＡβ（２０−４２）球状凝集体抗体５Ｆ７及び７Ｃ６の重鎖定常領域をヒトＩｇＧ１定常領域で置換することにより、作製される。具体的な実施形態において、本発明のキメラ抗体は、配列番号１１、１２及び１３のアミノ酸配列を含む５Ｆ７重鎖可変領域（ＶＨ）並びに配列番号１４、１５及び１５Ａのアミノ酸配列を含む５Ｆ７軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。あるいは、本発明の別の実施形態において、キメラ抗体は、配列番号１６、１７及び１８のアミノ酸配列を含む７Ｃ６重鎖可変領域（ＶＨ）並びに配列番号１９、２０及び２１のアミノ酸配列を含む７Ｃ６軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１８２】
３．抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体ＣＤＲグラフト抗体
本発明のＣＤＲグラフト抗体は、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１つ又はそれ以上が本発明のマウス抗体のＣＤＲ配列で置換されるヒト抗体からの重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む。何らかのヒト抗体からのフレームワーク配列は、ＣＤＲグラフトのための鋳型となり得る。しかし、このようなフレームワーク上への直鎖置換により、抗原に対する結合親和性がある程度喪失されることが多い。オリジナルのマウス抗体に対してヒト抗体が相同であるほど、マウスＣＤＲをヒトフレームワークと組み合わせることにより、親和性を低下させ得るＣＤＲでゆがみが導入される可能性は低くなる。従って、ＣＤＲ抜きのマウス可変フレームワークを置換するために選択されるヒト可変フレームワークは、マウス抗体可変領域フレームワークと少なくとも６５％配列同一性があることが好ましい。より好ましくは、ＣＤＲ抜きのヒト及びマウス可変領域は少なくとも７０％の配列同一性を有する。さらにより好ましくは、ＣＤＲ抜きのヒト及びマウス可変領域は少なくとも７５％の配列同一性を有する。最も好ましくは、ＣＤＲ抜きのヒト及びマウス可変領域は少なくとも８０％の配列同一性を有する。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知であり、本明細書中で詳細に考察される（ＥＰ２３９，４００；国際出願公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；及び同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）又はリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））及び鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３５２号）。
【０１８３】
４．抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体ヒト化抗体
ヒト化抗体は、ヒト以外の種由来の１つ又はそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原を結合するヒト以外の種由来の抗体分子である。
【０１８４】
下表５は、本発明の好ましいヒト化配列及びその中に含有されるＣＤＲを示している。
【０１８５】
【表５】
2010530740.tif 000007
2010530740.tif 000008
2010530740.tif 000009
【０１８６】
【化１】
2010530740.tif 000010
2010530740.tif 000011
それぞれ全体的に参照により本明細書中に組み込まれる。免疫原性を低下させるか又は、当技術分野で公知のような、結合、親和性、会合速度、解離速度、結合力、特異性、半減期又は何らかのその他の適切な特性を低下、促進又は変化させるために、このようなインポート（取り込まれる）配列を使用することができる。
【０１８７】
ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変化させる、好ましくは向上させるために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換され得る。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用のモデリング及び抗原結合及び特定の位置での通常はないフレームワーク残基を同定するための配列比較によって、同定される。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）（これらは、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）参照）。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を示し、提示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの提示の検討により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンのその抗原への結合能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性向上などの所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基を選択し、コンセンサス及びインポート配列から組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、直接的に、及び最も実質的に、抗原結合に影響を与えることに関与する。抗体は、以下に限定されないが、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４）；国際出願公開ＷＯ９１／０９９６７、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５；ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９２４６、ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６、ＥＰ２３９，４００、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，９７６，８６２号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１７，４８３号、同第５，８１４，４７６号、同第５，７６３，１９２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５２号、同第６，２０４，０２３号、同第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５，５３９号；��第４，８１６，５６７号、（それぞれ、全体的に、そこで引用される参考文献を含め、参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載のものなど、当技術分野で公知の様々な技術を用いて、ヒト化され得る。
【０１８８】
Ｃ．抗体の作製及び抗体産生細胞株
上記のように、好ましくは、本発明の抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗体又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態に対する抗体、例えば、当技術分野で公知のいくつかのインビトロ及びインビボアッセイの何れか１つにより評価したとき、Ａβ（２０−４２）球状凝集体（及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態）活性を低下させるか又は中和する高い能力を示す（例えば、下記の実施例参照）。
【０１８９】
ある種の実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域を含む。好ましくは、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域である。さらに、本抗体は、軽鎖定常領域、κ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域の何れか、を含み得る。好ましくは、本抗体はκ軽鎖定常領域を含む。あるいは、抗体部分は、例えば、Ｆａｂ断片又は１本鎖Ｆｖ断片であり得る。
【０１９０】
抗体エフェクター機能を変化させるためのＦｃ部分におけるアミノ酸残基の置換は当技術分野で公知である（Ｗｉｎｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２６０号及び同第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃ部分は、例えば、抗体及び抗原−抗体連結体の、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び半減期／クリアランス速度などのいくつかの重要なエフェクター機能を媒介する。いくつかの場合において、これらのエフェクター機能は、治療用抗体に対して好ましいが、その他の場合においては、治療目的によっては、不要であり得るか又は有害であり得る。ある種のヒトＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、それぞれＦｃγＲ及び補体Ｃ１ｑへの結合を介してＡＤＣＣ及びＣＤＣを媒介する。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する重要な成分である。さらに別の実施形態において、抗体のエフェクター機能が変更されるように、抗体の定常領域、例えば抗体のＦｃ領域において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換される。
【０１９１】
ある実施形態は、本発明の抗体又は抗体部分が誘導体化されるか又は別の機能分子（例えば別のペプチド又はタンパク質）に連結される、標識された結合タンパク質を提供する。例えば、本発明の抗体又は抗体部分を機能的に連結することにより（化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合又はその他により）、１つ又はそれ以上のその他の分子部分へ、例えば、別の分子（ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど）との抗体又は抗体部分の会合を媒介することができる、別の抗体（例えば、二特異的抗体又はダイアボディ）、検出可能な試薬、細胞毒性薬、医薬品及び／又はタンパク質又はペプチドへ、本発明の標識された結合タンパク質を誘導体化することができる。
【０１９２】
本発明の抗体又は抗体部分が誘導体化され得る有用な検出可能な試薬には、蛍光化合物が含まれる。代表的な蛍光性の検出可能試薬には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリンなどが含まれる。抗体はまた、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素で誘導体化され得る。抗体が検出可能な酵素で誘導体化される場合、検出可能な反応産物を生成させるために酵素が使用するさらなる試薬を添加することによりこれが検出される。例えば、検出可能な試薬ホースラディッシュペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素及びジアミノベンジジンの添加により、検出可能である有色の反応産物がもたらされる。ビオチンで抗体を誘導体化し、アビジン又はストレプトアビジン結合の間接的測定を通じて検出し得る。
【０１９３】
本発明の別の実施形態は、結晶化結合タンパク質を提供する。好ましくは、本発明は、本明細書中で開示されるような抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体全抗体及びその断片の結晶及び、このような結晶を含む製剤及び組成物に関する。ある実施形態において、結晶化結合タンパク質は、結合タンパク質の可溶性形態よりもインビボでの半減期が長い。別の実施形態において、本結合タンパク質は、結晶化後、生物学的活性を保持する。
【０１９４】
本発明の結晶化結合タンパク質は、当技術分野で公知の方法に従い、及び参照により本明細書中に組み込まれる国際出願公開ＷＯ０２／０７２６３６で開示されるように、調製され得る。
【０１９５】
本発明の別の実施形態は、抗体又はその抗原結合部分が１つ又はそれ以上の炭水化物残基を含むグリコシル化結合タンパク質を提供する。新生インビボタンパク質産生は、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセシングを受け得る。特に、糖（グリコシル）残基を酵素により添加し得るが、これは、グリコシル化として知られるプロセスである。結果として得られる、共有結合されるオリゴ糖側鎖を有するタンパク質は、グリコシル化タンパク質又は糖タンパク質として知られる。抗体は、Ｆｃドメインならびに可変ドメインにおいて１つ又はそれ以上の炭水化物残基を有する糖タンパク質である。Ｆｃドメインにおける炭水化物残基は、抗体の抗原結合又は半減期における影響が最小限であるＦｃドメインのエフェクター機能に重要な影響を及ぼす（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１（２００５）、ｐｐ．１１−１６）。一方、可変ドメインのグリコシル化は、抗体の抗原結合活性に影響を及ぼし得る。可変ドメインにおけるグリコシル化は、おそらく立体障害のために、抗体結合親和性に負の影響を及ぼし得るか（Ｃｏ、Ｍ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）３０：１３６１−１３６７）、又は結果として、抗原に対する親和性を向上させ得る（Ｗａｌｌｉｃｋ、Ｓ．Ｃ．ら、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８）１６８：１０９９−１１０９；Ｗｒｉｇｈｔ、Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９１）１０：２７１７−２７２３）。
【０１９６】
本発明のある態様は、結合タンパク質のＯ−又はＮ−結合グリコシル化部位が突然変異させられているグリコシル化部位突然変異体を生じさせることに関する。当業者は、標準的な周知の技術を用いて、このような突然変異体を生じさせることができる。生物学的活性を保持するが結合活性が向上しているか又は低下しているグリコシル化部位突然変異体の作製は、本発明の別の目的である。
【０１９７】
さらに別の実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合部分のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（即ちこの抗体はグリコシル化を欠く。）。例えば抗原に対する抗体の親和性を向上させるために、グリコシル化を変化させることができる。例えば抗体配列内のグリコシル化の１つ又はそれ以上の部位を変化させることにより、このような糖修飾を行うことができる。例えば、結果として１つ又はそれ以上の可変領域グリコシル化部位が除去され、それによりその部位のグリコシル化が除去される、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を行うことができる。このような非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性を向上させ得る。このようなアプローチは、国際出願公開ＷＯ０３／０１６４６６Ａ２及び米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号（これらのそれぞれが、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）でさらに詳しく記載されている。
【０１９８】
これに加えて又はこれに代えて、フコシル残基の量が少なくなった低フコシル化抗体又は分岐ＧｌｃＮＡｃ構造が増加した抗体など、グリコシル化のタイプが変化した本発明の修飾抗体を作製することができる。このような改変グリコシル化パターンにより、抗体のＡＤＣＣ能が向上することが明らかになっている。例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞において抗体を発現させることにより、このような糖修飾を行うことができる。グリコシル化機構が変化した細胞は、当技術分野で記載されており、本発明の組み換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が改変された抗体を産生させるために、宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１ならびに欧州特許第ＥＰ１，１７６，１９５号；国際出願公開ＷＯ０３／０３５８３５号及びＷＯ９９／５４３４２８０号（これらのそれぞれは、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）を参照のこと。
【０１９９】
タンパク質グリコシル化は、関心のあるタンパク質のアミノ酸配列ならびにそのタンパク質が発現される宿主細胞に依存する。生物によってグリコシル化酵素が異なり得（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ）、利用可能な基質が異なり得る（ヌクレオチド糖）。このような因子のために、タンパク質グリコシル化パターン及びグリコシル残基の組成は、特定のタンパク質が発現される宿主系に依存して異なり得る。本発明において有用なグリコシル残基には、以下に限定されないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミン及びシアル酸が含まれ得る。好ましくはグリコシル化結合タンパク質は、グリコシル化パターンがヒトであるようにグリコシル残基を含む。
【０２００】
様々なタンパク質グリコシル化の結果、タンパク質の特徴が異なり得ることは当業者にとって公知である。例えば、酵母などの微生物宿主で産生され、酵母内在性経路を使用してグリコシル化される治療用タンパク質の効率は、ＣＨＯ細胞株などの哺乳動物細胞中で発現される同じタンパク質の効率と比較して低下している可能性がある。このような糖タンパク質はまた、ヒトにおいて免疫原性があり得、投与後のインビボでの半減期が短い可能性がある。ヒト及びその他の動物における特異的受容体は、特異的グリコシル残基を認識し、血流からのタンパク質の急速なクリアランスを促進し得る。その他の有害事象には、タンパク質折り畳み、溶解性、プロテアーゼに対する感受性、トラフィッキング、輸送、区画化、分泌、その他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性又はアレルギー誘発性の変化が含まれ得る。従って、実施者は、特異的組成及びグリコシル化パターン、例えば、ヒト細胞又は意図される対象動物の種特異的細胞において産生されるものと同一であるか又は少なくとも類似のグリコシル化組成及びパターンを有する治療用タンパク質を好み得る。宿主細胞のものとは異なるグリコシル化タンパク質の発現は、異種グリコシル化酵素を発現させるために宿主細胞を遺伝子操作することにより達成され得る。当技術分野で公知の技術を用いて、実施者は、ヒトタンパク質グリコシル化を示す抗体又はその抗原結合部分を生成させ得る。例えば、酵母株は、これらの酵母株において産生されるグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）が動物細胞、特にヒト細胞のものと同一のタンパク質グリコシル化を示すように非天然のグリコシル化酵素を発現させるために遺伝子操作されている（米国特許出願公開２００４００１８５９０及び２００２０１３７１３４及び国際出願公開ＷＯ０５／１００５８４Ａ２）。
【０２０１】
「多価結合タンパク質」という用語は、２つ又はそれ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を示すために本願で使用される。多価結合タンパク質は、好ましくは３つ又はそれ以上の抗原結合部位を有するように改変され、通常は天然抗体ではない。「多特異的結合タンパク質」という用語は、２つ又はそれ以上の関連又は非関連標的に結合することができる結合タンパク質を指す。二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質は、本明細書中で使用される場合、２以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質であり、３価又は多価結合タンパク質である。このようなＤＶＤは単一特異的、即ち１つの抗原に結合することができるか、又は多特異的、即ち２以上の抗原に結合することができる。２つの重鎖ＤＶＤポリペプチド及び２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合タンパク質は、ＤＶＤＩｇを指す。ＤＶＤＩｇの各半分は、重鎖ＤＶＤポリペプチド及び軽鎖ＤＶＤポリペプチド及び２つの抗原結合部位を含む。各結合部位は、抗原結合部位ごとに抗原結合に関与する全部で６つのＣＤＲを有する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。ＤＶＤ結合タンパク質及びＤＶＤ結合タンパク質を作製する方法は、米国特許出願１１／５０７，０５０で開示されており、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０２０２】
本発明のある態様は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に結合することができる結合タンパク質を含むＤＶＤ結合タンパク質に関する。好ましくは、ＤＶＤ結合タンパク質は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態並びに第二の標識に結合することができる。
【０２０３】
結合タンパク質に加えて、本発明はまた、本発明のこのような結合タンパク質に対して特異的な抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体にも関する。
【０２０４】
抗Ｉｄ抗体は、通常は別の抗体の抗原結合領域と会合するユニークな決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄは、結合タンパク質又はそのＣＤＲ含有領域で動物に免疫付与することにより調製することができる。免疫付与された動物は、免疫付与抗体のイディオタイプ決定基を認識し、それに対して反応し、抗Ｉｄ抗体を産生する。抗Ｉｄ抗体はまた、また別の動物において免疫反応を誘導するために、「免疫原」としても使用され得、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生する。
【０２０５】
さらに、当業者にとって当然のことながら、ライブラリのメンバー宿主細胞が変異グリコシル化パターンを有する関心のあるタンパク質を産生するように、様々なグリコシル化酵素を発現するよう遺伝子操作された宿主細胞のライブラリを用いて関心のあるタンパク質を発現させ得る。次いで、実施者は、特定の新規グリコシル化パターンを有する関心のあるタンパク質を選択し、単離し得る。好ましくは、特に選択された新規グリコシル化パターンを有するタンパク質は、生物学的特性が向上するか又は変化する。
【０２０６】
Ｄ．抗Ａβ（１−４２）抗体の使用
Ａβ（２０−４２）球状凝集体に結合するそれらの能力を考えると、酵素免疫測定吸着法アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）又は組織免疫組織化学などの従来の免疫アッセイを用いて、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態を（例えば、血清、全血、ＣＳＦ、脳組織又は血漿などの生体試料中で）検出するために、本発明の抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗体若しくは本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆるＡβ形態に対する抗体又はこれらの一部を使用することができる。従って、本発明は、本発明の抗体又は抗体部分と生体試料を接触させ、Ａβ（２０−４２）球状凝集体（及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態）に結合する抗体（又は抗体部分）又は非結合抗体（又は抗体部分）の何れかを検出し、それにより生体試料中のＡβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態を検出することを含む、生体試料中のＡβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態を検出するための方法を提供する。本抗体は、結合又は非結合抗体の検出を促進するための検出可能な物質で直接又は間接的に標識される。適切な検出可能物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質及び放射性物質が含まれる。適切な酵素の例にはホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリスリンが含まれ；発光物質の例にはルミノールが含まれ；適切な放射性物質の例には、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ又は１５３Ｓｍが含まれる。
【０２０７】
抗体を標識する代わりに、検出可能な物質で標識された組み換えＡβ（２０−４２）球状凝集体標準物質及び非標識抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗体を用いる競合免疫アッセイにより、体液中のＡβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態をアッセイすることができる。このアッセイにおいて、生体試料、標識した組み換えＡβ（２０−４２）球状凝集体標準物質及び抗Ａβ（２−４２）球状凝集体抗体を組み合わせ、非標識抗体に結合した標識組み換えＡβ（２０−４２）球状凝集体標準物質の量を調べる。生体試料中のＡβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の量は、抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗体に結合したｒＡβ（２０−４２）球状凝集体標準物質の量と反比例する。
【０２０８】
本発明の抗体及び抗体部分は、好ましくは、インビトロ及びインビボの両方で、Ａβ（２０−４２）球状凝集体活性及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の活性を中和することができる。従って、本発明のこのような抗体及び抗体部分は、例えば、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態を含有する細胞培養において、ヒト対象において、又は本発明の抗体が交差反応するＡβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態を有するその他の哺乳動物対象において、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の活性を阻害するために使用することができる。ある実施形態において、本発明は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体活性及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の活性が阻害されるように、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態を本発明の抗体又は抗体部分と接触させることを含む、Ａβ（１−４２）球状凝集体活性及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の活性を阻害するための方法を提供する。例えば、Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態を含有し又は含有する疑いのある細胞培養において、培養中でＡβ（２０−４２）球状凝集体活性及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の活性を阻害するために、本発明の抗体又は抗体部分を培地に添加することができる。
【０２０９】
別の実施形態において、本発明は、対象において、有利に、Ａβ（２０−４２）球状凝集体活性が有害である及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の活性が有害である疾病又は疾患（例えばアルツハイマー病などのアミロイドーシス）に罹患している患者から、Ａβ（２０−４２）球状凝集体活性を低下させるための及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の活性を低下させる方法を提供する。従って、本発明は、このような疾病又は疾患に罹患している対象においてＡβ（２０−４２）球状凝集体活性及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の活性を低下させるための方法を提供し、この方法は、対象におけるＡβ（２０−４２）球状凝集体活性及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の活性が低下させられるように、本発明の抗体又は抗体部分を対象に投与することを含む。好ましくは、Ａβ（２０−４２）球状凝集体はヒトＡβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるヒトＡβ形態であり、対象はヒト対象である。あるいは、対象は、本発明の抗体が結合することができるＡＰＰｐｒ（Ａβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の生成をもたらすあらゆるＡβ形態）を発現する哺乳動物であり得る。またさらに、対象は、（例えば、Ａβ（２０−４２）球状凝集体の投与によって、又はＡＰＰ若しくはＡβ（２０−４２）球状凝集体及び／若しくは本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の生成をもたらす他のあらゆるＡβ形態の発現によって）、Ａβ（２０−４２）球状凝集体（及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態）がその中に導入されている哺乳動物であり得る。本発明の抗体は治療目的のためにヒト対象に投与され得る。さらに、本発明の抗体は、獣医学の目的のために、又はヒト疾患の動物モデルとして、Ａβ（２０−４２）球状凝集体（及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態）の生成をもたらし、及び／又は抗体が結合することができるＡＰＰ又はあらゆるＡβ形態が発現されている非ヒト哺乳動物に投与され得る。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性を評価するために有用であり得る（例えば、投与量及び投与の時間的経過の試験）。
【０２１０】
本明細書中で使用される場合、「Ａβ（２０−４２）球状凝集体活性及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態が有害である疾患」という用語は、その疾患に罹患している対象におけるＡβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態の存在が、その疾患の病態生理学又はその疾患の悪化に関与する因子の何れかに関与することが示されているか又はその疑いがある、疾病及びその他の疾患を含むものとする。従って、Ａβ（２０−４２）球状凝集体活性及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆるＡβ形態の活性が有害である疾患は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体活性及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆるＡβ形態の活性の低下により、その疾患の症候及び／又は進行の一部又は全てが緩和されることが予想される疾患である。このような疾患は例えばその疾患に罹患している対象の体液中のＡβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆるＡβ形態の濃度の上昇（例えば、対象の、血清、脳組織、血漿、脳脊髄液中などのＡβ（２０−４２）球状凝集体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆるＡβ形態）の濃度の上昇）によって明らかとなり得、これらは、例えば、上述のような抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗体及び／又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態に対する抗体又は本発明の抗体が反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆるＡβ形態に対するあらゆる抗体を使用して検出することができる。本発明の抗体で治療することができる疾患の非限定例には、本発明の抗体の医薬組成物に関連する下記セクションで考察される疾患が含まれる。
【０２１１】
Ｄ．医薬組成物
本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合部分及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物も提供する。本発明の抗体を含む医薬組成物は、以下に限定されないが、疾患の診断、検出又は監視における、疾患又はその１つ又はそれ以上の症候の予防、治療、管理又は改善における、及び／又は研究における、使用のためのものである。具体的な実施形態において、組成物は１つ又はそれ以上の本発明の抗体を含む。別の実施形態において、本医薬組成物は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体活性が有害である又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含むあらゆるＡβ形態の活性が有害である疾患を治療するための本発明の抗体以外の１つ又はそれ以上の本発明の抗体及び１つ又は以上の予防薬又は治療薬を含む。好ましくは、疾患又はその１つ又はそれ以上の症候の予防、治療、管理又は改善に有用であることが知られているか又はそれにおいて使用されてきたか又は現在使用されている予防薬又は治療薬である。これらの実施形態によると、組成物は、担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含み得る。
【０２１２】
本発明の抗体及び抗体部分は、対象への投与に適切な医薬組成物に組み込まれ得る。通常、医薬組成物は、本発明の抗体又は抗体部分及び医薬的に許容可能な担体を含む。本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能な担体」には、生理学的に適合性である、あらゆる及び全ての、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。医薬的に許容可能な担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにこれらの組合せの１つ又はそれ以上が含まれる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど又は塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。医薬的に許容可能な担体には、抗体又は抗体部分の貯蔵期間又は有効性を高める、湿潤剤又は乳化剤、保存料又は緩衝剤などの、湿潤化物質又は少量の補助物質などもさらに含まれ得る。
【０２１３】
１つ又はそれ以上の本発明の抗体又は１つ又はそれ以上の本発明の抗体の組み合わせ及び、疾患又はその１つ又はそれ以上の症候の予防、管理、治療又は改善に有用な予防薬又は治療薬を投与するために、様々な送達系が知られており、使用することができる（例えば、リポソーム中での封入、微粒子、マイクロカプセル、抗体又は抗体断片を発現させることができる組み換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ及びＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）参照）、レトロウイルス又はその他のベクターなどの一部としての核酸の構築物。）。本発明の予防薬又は治療薬を投与する方法には、以下に限定されないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与及び粘膜投与（例えば、鼻内及び口腔経路）が含まれる。さらに、例えば、吸入器又はネブライザーの使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺内投与を使用し得る。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号及び同第４，８８０，０７８号；及び国際出願公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６及びＷＯ９９／６６９０３（これらのそれぞれは、それらの全体において、参照により本明細書中に組み込まれる。）を参照のこと。ある実施形態において、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（Ｒ）肺内薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて、本発明の抗体、併用療法又は本発明の組成物を投与する。具体的な実施形態において、筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、鼻内、肺内又は皮下により本発明の予防薬又は治療薬を投与する。何らかの従来経路により、例えば、点滴又はボーラス注射により、上皮又は皮膚粘膜内層を通じた吸収（例えば、経口粘膜、直腸及び小腸粘膜など）により、予防薬又は治療薬を投与し得、その他の生物学的活性のある薬物とともに投与し得る。投与は全身性又は局所性であり得る。
【０２１４】
具体的な実施形態において、治療の必要がある領域に局所的に本発明の予防薬又は治療薬を投与することは望ましいものであり得；これは、例えば、限定するものではないが、局所点滴により、注射により、又は移植手段により（該移植片は、膜及びマトリクスを含む多孔性又無孔性材料、例えば、サイラスティック膜、ポリマー、繊維状マトリクス（例えばＴｉｓｓｕｅｌ（Ｒ））又はコラーゲンマトリクスなど、である。）、達成され得る。ある実施形態において、本発明の１つ又はそれ以上の抗体の有効量アンタゴニストは、疾患又はその症候を予防、治療、管理及び／又は改善するために、対象の病変部に局所的に投与される。別の実施形態において、１つ又はそれ以上の本発明の抗体の有効量は、疾患又は１つ又はそれ以上のその症候を予防、治療、管理及び／又は改善するために、本発明の抗体以外の１つ又はそれ以上の治療薬（例えば１つ又はそれ以上の予防薬又は治療薬）の有効量と組み合わせて、病変部に局所的に投与される。
【０２１５】
別の実施形態において、制御放出又は持続放出系で予防薬又は治療薬を送達させることができる。ある実施形態において、制御放出又は持続放出を行うためにポンプを使用し得る（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４）。別の実施形態において、本発明の治療薬の制御放出又は持続放出を行うためにポリマー性材料を使用することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ及びＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｓｍｏｌｅｎ及びＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ及びＰｅｐｐａｓ、１９８３、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１参照；また、Ｌｅｖｙら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５）；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；国際出願公開ＷＯ９９／１５１５４；及び国際出願公開ＷＯ９９／２０２５３も参照）。持続放出製剤で使用されるポリマーの例には、以下に限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステルが含まれる。好ましい実施形態において、持続放出製剤で使用されるポリマーは、不活性で、滲出不純物不含であり、保管時に安定であり、滅菌されており、生体分解性である。さらに別の実施形態において、制御又は持続放出系は、予防又は治療標的の隣接して置かれ得、従って、必要とされるのは全身的用量のうちわずかである（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、前出、ｖｏｌ．２、ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）参照）。
【０２１６】
制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）により概説で考察されている。本発明の１つ又はそれ以上の治療薬を含む持続放出製剤を調製するために、当業者にとって公知の何らかの技術を使用することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、国際出願公開ＷＯ９１／０５５４８、国際出願公開ＷＯ９６／２０６９８、Ｎｉｎｇら、１９９６、「Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ」、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３９：１７９−１８９、Ｓｏｎｇら、１９９５、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」、ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０：３７２−３９７、Ｃｌｅｅｋら、１９９７、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３−８５４及びＬａｍら、１９９７、「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９−７６０（これらのそれぞれは、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）参照。
【０２１７】
具体的な実施形態において、本発明の組成物が、予防薬又は治療薬をコードする核酸である場合、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、細胞内に入るようにそれを投与することによって、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）又は直接注入によって又は微粒子銃の使用によって（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）、又は脂質もしくは細胞表面受容体もしくは遺伝子移入剤でのコーティングによって又は核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結してそれを投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８参照）、そのコードされる予防薬又は治療薬の発現を促進するためにインビボで核酸を投与することができる。あるいは、核酸を細胞内にを導入し、相同組み換えによる発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０２１８】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように処方される。投与経路の例には、以下に限定されないが、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口、鼻内（例えば吸入）、経皮（例えば局所）、経粘膜及び直腸投与が含まれる。具体的な実施形態において、本組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻内又は局所投与に適している医薬組成物としての通常の手順に従い処方される。通常、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤及び局所麻酔薬（例えば、注射部位の疼痛を緩和するためのリドカインなど）も含み得る。
【０２１９】
本発明の組成物が局所投与されるべき場合、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョン又はその他の当業者にとって周知の形態で本組成物を処方することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９５）参照。噴霧用ではない局所投与形態の場合、局所塗布に適合し、好ましくは水よりも動的粘性が高い担体又は１つ又はそれ以上の賦形剤を含む粘着性から半固体状又は固体形態が通常は使用される。適切な製剤には、以下に限定されないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、塗布薬、軟膏（ｓａｌｖｅ）などが含まれ、必要に応じて、それらは滅菌されているか又は例えば浸透圧などの様々な特性に影響を与えるための助剤（例えば、保存料、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤又は塩）と混合される。その他の適切な局所投与形態には、好ましくは、固体又は液体不活性担体と組み合わせられた活性成分が加圧揮発剤（ｐｒｅｓｓｕｒｉｚｅｄ  ｖｏｌａｔｉｌｅ）（例えばフレオンなどのガス噴射剤）との混合物中又は搾り出しボトル中に封入される、噴霧用エアロゾル製剤が含まれる。モイスチャライザー又は保湿剤も必要に応じて医薬組成物及び投与形態に添加され得る。このようなさらなる成分の例は当技術分野で周知である。
【０２２０】
本発明の方法が、組成物の鼻内投与を含む場合、エアロゾル形態、スプレー、ミスト又はドロップの形態で組成物を処方することができる。特に、本発明に従う使用のための予防薬又は治療薬は、都合よく、適切な推進薬（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の適切な気体）の使用とともに、加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達させることができる。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、定量を送達するための値を与えることにより決定され得る。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ又はｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）での使用のためのカプセル及びカートリッジ（例えばゼラチンからなる。）は、本化合物と、ラクトース又はデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末混合物を含有して処方され得る。
【０２２１】
本発明の方法が経口投与を含む場合、錠剤、カプセル、カプセル（ｃａｃｈｅｔｓ）、ジェルキャップ、溶液、懸濁液などの形態で組成物を経口用に処方することができる。結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬的に許容可能な賦形剤とともに従来の手法により錠剤又はカプセルを調製することができる。当技術分野で周知の方法により錠剤を被覆し得る。経口投与用の液体製剤は、以下に限定されないが、溶液、シロップ又は懸濁液の形態をとり得るか、又はそれらは、使用前に水又はその他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として与えられ得る。懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化された食用脂）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分別された植物油）；及び保存料（例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）などの医薬的に許容可能な添加物とともに、従来の手順により、このような液体製剤を調製し得る。本製剤はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味料、色素及び甘味料も含有し得る。経口投与のための製剤は、予防薬又は治療薬の、徐放、制御放出又は持続放出のために適切に処方され得る。
【０２２２】
本発明の方法は、例えば、エアロゾル化剤とともに処方される組成物の吸入器又はネブライザーの使用による、複数の投与を含み得る。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号及び同第４，８８０，０７８号；及び国際出願公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６及びＷＯ９９／６６９０３（これらのそれぞれは、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。）参照。具体的な実施形態において、本発明の抗体、併用療法及び／又は本発明の組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（Ｒ）肺内薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて投与される。
【０２２３】
本発明の方法は、注射による（例えば、ボーラス注射又は連続的点滴による）非経口投与のために処方される組成物の投与を含み得る。注射用の製剤は、保存料を添加された単位投与形態（例えば、アンプル又は複数回使用容器中）で与えられ得る。本組成物は、懸濁液、溶液又は油中エマルジョン又は水性ビヒクルなどの形態をとり得、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調剤に必要な薬剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）も含有し得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば滅菌発熱物質不含水）での構成のための粉末形態であり得る。本発明の方法は、さらに、デポー製剤として処方される組成物の投与を含み得る。このような長時間作用製剤は、移植（例えば、皮下又は筋肉内）により又は筋肉内注射により投与され得る。従って、例えば、本組成物は、適切なポリマー性又は疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂とともに、又は難溶性誘導体として（例えば難溶性の塩として）、処方され得る。
【０２２４】
本発明の方法は、中性又は塩形態として処方される組成物の投与を包含する。医薬的に許容可能な塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸由来のものなどの陰イオンとともに形成されるものなど、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど由来のものなどの陽イオンとともに形成されるものが含まれる。
【０２２５】
一般に、組成物の成分は、個別に又は単位投与形態で一緒に混合されて、例えば、活性物質の量を表示するアンプル又はサシェなどの密封容器中の凍結乾燥粉末又は水不含濃縮物として、供給される。投与方式が点滴である場合、滅菌された医薬グレードの水又は塩水を含有する点滴瓶とともに組成物を調剤することができる。投与方式が注射によるものである場合、注射のための滅菌水又は塩水のアンプルは、投与前に成分が混合され得るように提供され得る。
【０２２６】
特に、本発明はまた、予防薬又は治療薬又は本発明の医薬組成物の１つ又はそれ以上が、薬物の量を表示するアンプル又はサシェなどの密封容器中に封入されることも提供する。ある実施形態において、予防薬又は治療薬の１つ又はそれ以上又は本発明の医薬組成物は、密封容器中で乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は水不含の濃縮物として供給され、対象への投与のために、（例えば水又は塩水で）適切な濃度に再構成され得る。好ましくは、予防薬又は治療薬又は本発明の医薬組成物の１つ又はそれ以上は、少なくとも５ｍｇ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ又は少なくとも１００ｍｇの単位投与量で、密封容器中で乾燥した滅菌凍結乾燥粉末として供給される。凍結乾燥された予防薬又は治療薬又は本発明の医薬組成物は、その元の容器中で２℃から８℃の間で保管すべきであり、予防薬又は治療薬又は本発明の医薬組成物は、再構成後、１週間以内、好ましくは５日間以内、７２時間以内、４８時間以内、２４時間以内、１２時間以内、６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与すべきである。代替的な実施形態において、予防薬又は治療薬又は本発明の医薬組成物の１つ又はそれ以上は、薬物の量及び濃度を表示する密封容器中で液体形態で供給される。好ましくは、投与される組成物の液体形態は、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ又は少なくとも１００ｍｇ／ｍＬで密封容器中で供給される。液体形態はその元の容器中で２℃から８℃の間で保管すべきである。
【０２２７】
本発明の抗体及び抗体部分は、非経口投与に適切な医薬組成物に組み込まれ得る。好ましくは、この抗体又は抗体部分は、０．１−２５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射用の溶液として調製される。注射用の溶液は、フリントガラス又はアンバーバイアル、アンプル又はプレフィルドシリンジ中で、液体又は凍結乾燥製剤の形態の何れかから構成され得る。緩衝液は、ｐＨ５．０から７．０（最適にはｐＨ６．０）のＬ−ヒスチジン（１−５０ｍＭ、最適には５−１０ｍＭ）であり得る。その他の適切な緩衝液には、以下に限定されないが、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムが含まれる。０−３００ｍＭの濃度（液体投与形態の場合、最適には１５０ｍＭ）で溶液の毒性を変化させるために、塩化ナトリウムを使用することができる。凍結乾燥製剤の場合、凍結保護剤、基本的には０−１０％スクロース（最適には０．５−１．０％）を含み得る。その他の適切な凍結保護剤には、トレハロース及びラクトースが含まれる。凍結乾燥投与形態の場合、充填剤、基本的には１−１０％マンニトール（最適には２−４％）を含み得る。安定化剤は、基本的には１−５０ｍＭ  Ｌ−メチオニン（最適には５−１０ｍＭ）を液体及び凍結乾燥投与形態の両方で使用することができる。その他の適切な充填剤には、グリシン及びアルギニンが含まれ、０−０．０５％ポリソルベート−８０（最適には０．００５−０．０１％）として含まれ得る。さらなる界面活性剤には、以下に限定されないが、ポリソルベート２０及びＢＲＩＪ界面活性剤が含まれる。非経口投与のための注射用の溶液として調製される本発明の抗体及び抗体部分を含む医薬組成物は、治療用タンパク質（例えば抗体）の吸収又は分散を促進するために使用されるものなどのアジュバントとして有用な物質をさらに含み得る。特に有用なアジュバントは、Ｈｙｌｅｎｅｘ（Ｒ）（組み換えヒトヒアルロニダーゼ）などのヒアルロニダーゼである。注射用溶液におけるヒアルロニダーゼの添加により、非経口投与、特に皮下投与後のヒトのバイオアベイラビリティーが向上する。これによりまた、疼痛及び不快感を軽減し、注入部位の反応の発生を最小限にしながら、注射部位の体積を大きくする（即ち１ｍＬ超）ことも可能になる（国際出願公開ＷＯ０４／０７８１４０及び米国特許出願公開ＵＳ２００６１０４９６８（参照により本明細書中に組み込まれる。）参照。）。
【０２２８】
本発明の組成物は様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体、半固体及び固体投与形態、例えば溶液（例えば、注射用及び点滴用溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム及び坐薬などが含まれる。好ましい形態は、意図する投与方法及び治療用途に依存する。通常の好ましい組成物は、注射用又は点滴用溶液の形態、例えば他の抗体によるヒトの受動免疫法のために使用されるものと類似の組成物など、である。好ましい投与方法は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態において、本抗体は静脈内点滴又は注射によって投与される。別の好ましい実施形態において、本抗体は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。
【０２２９】
治療用組成物は、通常、製造及び保管の条件下で無菌かつ安定でなければならない。本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム又はその他の高い薬物濃度に適した秩序構造として処方され得る。滅菌注射用溶液は、活性合物（即ち抗体又は抗体部分）を、必要な量で、適切な溶媒中に、必要に応じて上記で列挙した成分の１つ又はそれ以上の組合せと共に配合し、続いてろ過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒及び上記で列挙したものからの必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を配合することにより調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌凍結乾燥粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に何らかのさらなる所望の成分を加えた粉末を、予めろ過滅菌したこれらの溶液から得る、真空乾燥及び噴霧乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、及び、界面活性剤を使用することにより、維持し得る。組成物中に吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に含むことにより、注射用組成物を持続的に吸収させるようにすることができる。
【０２３０】
本発明の抗体及び抗体部分は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができるが、多くの治療用途に対して、好ましい投与の経路／方法は、皮下注射、静脈内注射又は点滴である。当業者にとって当然のことながら、投与の経路及び／又は方法は、所望の結果に依存して変化する。ある実施形態において、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル型送達系を含む制御放出製剤など、化合物を急速な放出から保護する担体を用いて活性化合物を調製し得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生体分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製のための多くの方法が特許取得されているか、又は当業者にとって一般に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８参照。
【０２３１】
ある実施形態において、例えば不活性希釈剤又は同化可能な可食担体と共に、本発明の抗体又は抗体部分を経口投与し得る。この化合物（及び必要に応じてその他の成分）を、硬殻又は軟殻のゼラチンカプセルに封入するか、錠剤に圧縮するか又は対象の食餌に直接混合することもできる。治療剤の経口投与の場合、賦形剤とともにこの化合物を配合し、経口摂取錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハースなどの形態で使用し得る。本発明の化合物を非経口投与以外によって投与するために、この化合物をその不活性化を阻止する物質で被覆するか、又はこの化合物をこれらと一緒に投与することが必要であり得る。
【０２３２】
補助的な活性物質を組成物中に配合することもできる。ある実施形態において、Ａβ（２０−４２）活性が有害である疾患を治療するのに有用な１つ又はそれ以上のさらなる治療薬と一緒に、本発明の抗体又は抗体部分を処方、及び／又は一緒に投与する。例えば、本発明の抗Ａβ（２０−４２）抗体の１つ又はその抗体部分を、その他の標的に結合する１つ又はそれ以上のさらなる抗体とともに共処方（ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）及び／又は同時投与し得る（例えばその他のサイトカインに結合するか又は細胞表面分子に結合する抗体）。さらに、１つ又はそれ以上の本発明の抗体は、先行する治療薬の２以上と組み合わせて使用され得る。このような併用療法は、有利に、投与される治療薬のより低い投与量を使用し得、従って、様々な単剤療法に付随する毒性又は合併症の可能性を回避する。
【０２３３】
ある実施形態において、Ａβ（２０−４２）に対する抗体又はその断片（又は本発明の抗体との反応性を有する球状凝集体エピトープを含む他のあらゆるＡβ形態に対する抗体）は、当技術分野で公知の半減期延長ビヒクルに連結される。このようなビヒクルには、以下に限定されないが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール及びデキストランが含まれる。このようなビヒクルは、例えば、米国特許出願第０９／４２８，０８２号及び公開国際特許出願ＷＯ９９／２５０４４（これらは、あらゆる目的に対して参照により本明細書により組み込まれる。）に記載されている。
【０２３４】
具体的な実施形態において、遺伝子治療により、疾患又はその１つ又はそれ以上の症候を治療、予防、管理又は改善するために、本発明の抗体又は本発明の別の予防薬又は治療薬をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列が投与される。遺伝子治療は、発現されるか又は発現可能な核酸の対象への投与により行われる治療を指す。本発明のこの実施形態において、この核酸は、それらのコードされる抗体又は予防もしくは治療効果を媒介する本発明の予防薬もしくは治療薬を生成させる。
【０２３５】
本発明に従い、当技術分野で利用可能な遺伝子治療のための何らかの方法を使用することができる。遺伝子治療の方法の一般的な概説に関しては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；Ｗｕ及びＷｕ、１９９１、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；及びＭｏｒｇａｎ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；１９９３年５月、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５を参照のこと。使用することができる組み換えＤＮＡ技術の技術分野で一般に公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；及びＫｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）に記載されている。遺伝子治療の様々な方法の詳細な記述は、米国特許出願公開ＵＳ２００５００４２６６４  Ａ１（参照により本明細書中に組み込まれる。）で開示されている。
【０２３６】
本発明の抗体又はその抗原結合部分は、アルツハイマー病、ダウン症候群、認知症、パーキンソン病又は脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積を伴う他のあらゆる疾病若しくは症状などの疾患を治療するために、本発明の抗体又はその抗原結合部分を単独で又は組み合わせて使用することができる。本発明の抗体は、「立体構造疾患（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）」を治療するために使用され得る。このような疾病は、構成成分タンパク質内の二次ないし三次構造の変化、これに続く、変化を受けたタンパク質の凝集に起因する（Ｈａｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＯＰ．Ｊ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  ２００５；６（４）：２８７−３０２）。特に、本発明の抗体又は結合タンパク質は、以下の立体構造疾患の１つ又はそれ以上を治療するために使用され得る。  α１−アンチトリプシン欠損症、Ｃ１−阻害剤欠損血管性浮腫、アンチトロンビン欠乏血栓塞栓症、クールー、クロイツフェルトヤコブ病／スクレイピー、牛海綿状脳症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、ハンチントン病、脊髄小脳失調、マカド−ジョセフ変性症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、前頭側頭型痴呆、鎌型血球病、不安定ヘモグロビン封入体溶血、薬物誘発性封入体溶血、パーキンソン病、全身性ＡＬアミロイドーシス、結節性ＡＬアミロイドーシス、全身性ＡＡアミロイドーシス、前立腺アミロイド、血液透析アミロイドーシス、遺伝性（アイスランド型）脳血管症、ハンチントン病、家族性臓器アミロイド、家族性臓器多発性神経炎、家族性臓器アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドニューロパシー、家族性心臓アミロイド、アルツハイマー病、ダウン症、甲状腺髄様癌及び２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）などの疾患を治療するために、本発明の抗体又はその抗原結合部分を単独で又は組み合わせて使用することができる。好ましくは、アミロイドーシス、例えばアルツハイマー病及びダウン症。
【０２３７】
本発明の抗体又はその抗原結合部分を単独で又は１つ又はそれ以上のさらなる薬剤、例えば、治療薬（例えば低分子分子又は生物学的）と組み合わせて使用することができ、このさらなる薬剤は、その意図される目的のために当業者により選択されることを理解されたい。例えば、さらなる薬剤は、コレステリナーゼ阻害剤（例えばタクトリン、ドネペジル、リバスチグミン又はガランタミン）、部分的ＮＭＤＡ受容体ブロッカー（例えばメマンチン）、グリコサミノグリカン模倣物（例えばアルツェメド（ａｌｚｈｅｍｅｄ））、γセクレターゼの阻害剤又はアロステリック調節物質（例えばＲ−フルルビプロフェン）、黄体形成ホルモン遮断ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（例えばリュープロレリン）、セロトニン５−ＨＴ１Ａ受容体アンタゴニスト、キレート剤、神経選択的Ｌ型カルシウムチャネルブロッカー、免疫調節物質、アミロイド原線維形成阻害剤又はアミロイドタンパク質沈着阻害剤（例えばＭ２６６）、別の抗体（例えばバピニューズマブ）、５−ＨＴ１ａ受容体アンタゴニスト、ＰＤＥ４阻害剤、ヒスタミンアゴニスト、糖化最終産物に対する受容体タンパク質、ＰＡＲＰ刺激物質、セロトニン６受容体アンタゴニスト、５−ＨＴ４受容体アゴニスト、ヒトステロイド、神経代謝を促進するグルコース取り込み刺激剤、選択的ＣＢ１アンタゴニスト、ベンゾジアゼピン受容体における部分的アゴニスト、アミロイドβ産生アンタゴニスト又は阻害剤、アミロイドβ沈着阻害剤、ＮＭＲα−７部分アンタゴニスト、治療標的ＰＤＥ４、ＲＮＡ翻訳阻害剤、ムスカリン性アゴニスト、神経成長因子受容体アゴニスト、ＮＧＦ受容体アゴニスト及び遺伝子治療調節物質（即ち、本発明の抗体により治療されている疾病又は状態を治療するのに有用であるものと現在認識されているか又は将来認識される薬剤）などの治療薬であり得る。さらなる薬剤はまた、治療組成物に有利な属性を与える薬剤、例えば、組成物の粘性をもたらす薬剤、でもあり得る。
【０２３８】
本発明内に含まれるべき組み合わせは、それらの用途に有用な組み合わせであることをさらに理解されたい。下記で述べられる物質は、説明のためのものであり、限定を意図するものではない。本発明の一部である組み合わせは、本発明の抗体及び下記リストから選択される少なくとも１つのさらなる薬剤であり得る。この組み合わせには、また、この組み合わせが、形成される組成物がその所望の機能を果たし得るようなものである場合、複数のさらなる薬剤、例えば２又は３のさらなる薬剤も含まれ得る。
【０２３９】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体又は抗体部分の「治療的有効量」又は「予防的有効量」を含み得る。「治療的有効量」とは、必要な投与量で、必要な期間、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。抗体又は抗体部分の治療的有効量は、当業者により決定され得、個体の、疾病のステ―ジ、年齢、性別及び体重、その個体において所望の反応を誘発するための抗体又は抗体部分の能力などの因子に従い変化し得る。治療的有効量はまた、治療上の有益な効果が抗体又は抗体部分の何らかの毒性又は有害な影響を上回るものでもある。「予防的有効量」とは、必要な投与量で、必要な期間、所望の予防結果を達成するのに有効な量を指す。通常、予防的用量は、対象において、疾患の前又は初期段階に使用されるので、予防的有効量は治療的有効量より少量となろう。
【０２４０】
最適の所望の反応（例えば、治療又は予防的反応）をもたらすために投薬計画を調整し得る。例えば、単回ボーラスを投与し得、何回かの分割用量をある時間にわたり投与し得るか、又は、治療状況の要件により指示されるように、用量を均等に減少させ得るか又は増加させ得る。投与を容易にするために及び投与を均一にするために、投与単位形態で非経口組成物を処方することは特に有利である。投与単位形態は、本明細書中で使用される場合、治療されるべき哺乳動物対象に対する単一の投与量として適切な物理的に分離された単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体を伴って所望の治療効果を発揮するために計算される活性化合物の所定の量を含有する。本発明の投与単位形態は、（ａ）活性化合物のユニークな特徴及び達成されるべき特定の治療又は予防効果及び（ｂ）個体における感受性の治療に対するこのような活性化合物を化合する技術分野に固有の制限により決定され、これらに直接依存する。
【０２４１】
本発明の抗体又は抗体部分の治療的又は予防的有効量の代表的な非限定範囲は、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１−１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は、緩和すべき状態のタイプ及び重症度により変化し得ることに注意されたい。あらゆる特定の対象に対して、個々のニーズ及び本組成物の投与を行うか又は投与を監督する者の専門的判断に従い、時間経過によって具体的投薬計画を調整すべきであり、本明細書中で述べられる投与範囲は単なる例示であり、主張される組成物の範囲又は実施を限定するものではないことをさらに理解されたい。
【０２４２】
当業者にとって当然のことながら、本明細書中に記載される本発明の方法のその他の適切な変更及び適合は明らかであり、本発明の範囲及び本明細書中で開示される実施形態から逸脱することなく、適切な同等物を用いて為し得る。
【０２４３】
本発明を詳細に説明してきたが、次の実施例（単なる説明のために含まれるものであり、本発明を限定するものではない。）を参照することにより本発明がより明確に理解されよう。
【実施例１】
【０２４４】
球状凝集体の調製
ａ）Ａβ（１−４２）球状凝集体：
Ａβ（１−４２）合成ペプチド（Ｈ−１３６８、Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を６ｍｇ／ｍＬで１００％の１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）中に懸濁し、完全な可溶化のために、３７℃で１．５時間、振盪下で温置した。ＨＦＩＰは、水素結合破壊剤として作用し、Ａβペプチド中にあらかじめ存在する構造的な不均質性を排除するために使用する。ＳｐｅｅｄＶａｃ中での蒸発によりＨＦＩＰを除去し、ジメチルスルホキシド中に５ｍＭ濃度でＡβ（１−４２）を再懸濁し、２０秒間音波処理した。ＨＦＩＰで前処理されたＡβ（１−４２）をリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で４００μＭに希釈し、（Ｈ２Ｏ中の）１／１０容積の２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加した（０．２％ＳＤＳの終濃度）。３７℃で６時間温置すると、１６／２０ｋＤａのＡβ（１−４２）球状凝集体（球状オリゴマーのための短い形態）の中間体が得られた。Ｈ２Ｏの３容積でさらに希釈し、３７℃で１８時間温置することによって、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）球状凝集体を生じた。３０００ｇで２０分間遠心分離した後、試料を限外濾過（３０ｋＤａカットオフ）により濃縮し、５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して透析し、１００００ｇで１０分間遠心分離し、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）球状凝集体を含む上清を回収した。透析に対する代替例として、氷冷メタノール／酢酸溶液（３３％メタノール、４％酢酸）の９倍過剰量（ｖ／ｖ）によって、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）球状凝集体を４℃で１時間沈殿させることも可能である。次に、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）球状凝集体をペレットにし（１６２００ｇで１０分間）、５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で再懸濁し、ｐＨを７．４に調整した。
【０２４５】
ｂ）Ａβ（２０−４２）球状凝集体
実施例１ａに従って調製されたＡβ（１−４２）球状凝集体調製物１．５９ｍＬを、緩衝液（５０ｍＭＭＥＳ／ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）３８ｍＬ及び水中の１ｍｇ／ｍＬサーモリシン溶液（Ｒｏｃｈｅ）２００μＬと混合した。反応混合物を室温で２０時間撹拌した。次に、水中の１００ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）８０μＬを添加し、１％強度のＳＤＳ溶液４００μＬで０．１％のＳＤＳ含有量へと混合物をさらに調整した。１５ｍＬの３０ｋＤａ遠心沈殿チューブを介して、反応混合物を約１ｍＬに濃縮した。濃縮物を緩衝液（５０ｍＭＭＥＳ／ＮａＯＨ、０．０２％ＳＤＳ、ｐＨ７．４）９ｍＬと混合し、１ｍＬに再度濃縮した。透析チューブ中で緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭＮａＣｌ）１Ｌに対して、濃縮物を６℃で１６時間透析した。水中の２％強度のＳＤＳ溶液で、透析物を０．１％のＳＤＳ含有量に調整した。試料を１００００ｇで１０分間遠心分離し、Ａβ（２０−４２）球状凝集体上清を回収した。
【０２４６】
ｄ）Ａβ（１２−４２）球状凝集体：
実施例１ａに従って調製されたＡβ（１−４２）球状凝集体調製物２ｍＬを、３８ｍＬの緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）及び水中の１ｍｇ／ｍＬＧｌｕＣエンドプロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）１５０μＬと混合した。反応混合物を室温で６時間撹拌し、その後、水中の１ｍｇ／ｍＬ  ＧｌｕＣエンドプロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）１５０μＬをさらに添加した。反応混合物を室温でさらに１６時間撹拌した後、５ＭＤＩＦＰ溶液８μＬを添加した。１５ｍＬの３０ｋＤａ遠心沈殿チューブを介して、反応混合物を約１ｍＬに濃縮した。濃縮物を緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）９ｍＬと混合し、１ｍＬに再度濃縮した。透析チューブ中で緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭＮａＣｌ）１Ｌに対して、濃縮物を６℃で１６時間透析した。水中の１％強度のＳＤＳ溶液で、透析物を０．１％のＳＤＳ含有量に調整した。試料を１００００ｇで１０分間遠心分離し、Ａβ（１２−４２）球状凝集体上清を回収した。
【０２４７】
ｄ）架橋されたＡβ（１−４２）球状凝集体：
Ａβ（１−４２）合成ペプチド（Ｈ−１３６８、Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を６ｍｇ／ｍＬで１００％の１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）中に懸濁し、完全な可溶化のために、３７℃で１．５時間、振盪下で温置した。ＨＦＩＰは、水素結合破壊剤として作用し、Ａβペプチド中にあらかじめ存在する構造的な不均質性を排除するために使用した。ＳｐｅｅｄＶａｃによる蒸発によりＨＦＩＰを除去し、ジメチルスルホキシド中に、５ｍＭ濃度で、Ａβ（１２−４２）球状凝集体Ａβ（１−４２）を再懸濁し、２０秒間超音波処理した。ＨＦＩＰで前処理されたＡβ（１−４２）をＰＢＳ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で４００μＭに希釈し、（水中の）１／１０容積の２％ＳＤＳを添加した（０．２％ＳＤＳの終濃度）。３７℃で６時間温置すると、１６／２０ｋＤａのＡβ（１−４２）球状凝集体（球状オリゴマーのための短い形態）の中間体が得られた。水の３容積でさらに希釈し、３７℃で１８時間温置することによって、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）球状凝集体を生じた。１ｍＭグルタルアルデヒドとともに２１℃の室温で２時間温置した後、室温で３０分間エタノールアミン（５ｍＭ）処理することによって、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）球状凝集体の架橋をここで実施した。
【実施例２】
【０２４８】
ヒト化された抗Ａβ（２０−４２）の作製及び単離
球状凝集体モノクローナル抗体
ヒト化抗体の調製
５Ｆ７可変領域をヒト化するために、本発明中に記載されている一般的なアプローチに従った。まず、コンピュータプログラムＡＢＭＯＤ及びＥＮＣＡＤ（Ｌｅｖｉｔｔ、Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５−６２０（１９８３））の補助を得て、５Ｆ７可変領域の分子モデルを構築した。次に、ヒトＶ及びＪセグメント配列に対する相同性検索に基づいて、ＶＨセグメントＭＵＣ１−１’ＣＬ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３））及びＪセグメントＪＨ４（Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２７：５８３−５９１（１９８１））を選択して、Ｈｕ５Ｆ７重鎖可変領域に対するフレームワークを得た。Ｈｕ５Ｆ７軽鎖可変領域に対して、ＶＬセグメントＴＲ１．３７’ＣＬ（Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２８３９−２８５１（１９９３））及びＪセグメントＪＫ４（Ｈｉｅｔｅｒ，  Ｐ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１５１６−１５２２（１９８２））を使用した。５Ｆ７ＶＨとアクセプターヒトＭＵＣ１−１’ＣＬとＪＨ４セグメントとの間でのフレームワークアミノ酸の同一性は７８％であったのに対して、５Ｆ７ＶＬとアクセプターヒトＴＲ１．３７’ＣＬとＪＫ４セグメントとの間の同一性は８６％であった。
【０２４９】
コンピュータモデルからＣＤＲとの顕著な接触が示唆されるフレームワーク位置において、元のヒトフレームワークアミノ酸に対してマウスＶ領域からのアミノ酸で置換した。重鎖に対して残基４８、６７、６８、７０及び７２においてこれを行い（図７）、軽鎖に対して位置７においてこれを行った（図８）。対応するヒトＶ領域サブグループのそれらの個々の位置で稀にしか現れなかったフレームワーク残基をそれらの位置においてヒトコンセンサスアミノ酸で置換した。重鎖の残基７６（図７）で、及び軽鎖の残基１及び２で（図８）、これを行った。
【０２５０】
７Ｃ６に対するヒト化設計戦略は、重鎖に対して配列番号３の配列及び軽鎖に対して配列番号４をもたらす同様のアプローチに従った。
【０２５１】
ヒト化抗体ＶＨ及びＶＬ断片の構築
配列全体に及ぶ重複するオリゴヌクレオチドを徐冷することによって、５Ｆ７及び７Ｃ６ヒト化設計のためのＶＨ及びＶＬ遺伝子断片を構築した（５Ｆ７ｈｕｍ８に対して配列番号１及び２並びに７Ｃ６ｈｕｍ７に対して配列番号３及び４）。簡潔に述べると、ＶＨ又はＶＬ断片のコード鎖全体を一連の６０個のヌクレオチドオリゴに分割し、２つの対応するボトム鎖オリゴと３０個のヌクレオチド重複があるようにそれぞれを設計した。ボトム鎖オリゴの合計はまた配列全体に及んだ。統合すると、このオリゴヌクレオチドは完全な２本鎖ＤＮＡセグメントを満たした。
【０２５２】
手順の第一段階において、３７℃で３０分間、１００μＬの反応液中、各３ｎＭ濃度で７本のトップ鎖と７本のボトム鎖オリゴとを一緒に組み合わせることによって、オリゴヌクレオチドをキナーゼ処理（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  カタログ番号２０１Ｓ）した。次に、キナーゼ処理したオリゴをフェノール／クロロホルム抽出し、沈殿させ、ＮＥＢリガーゼ緩衝液１００μＬ中で再懸濁した。
【０２５３】
手順の第二段階において、９５℃に加熱し、次いでＰＣＲ機器の制御冷却ランプにより９０分間にわたりゆっくりと２０℃に冷却することによって、オリゴヌクレオチドを徐冷処理した。
【０２５４】
手順の第三段階において、徐冷処理したオリゴを一緒に連結させてＶＨ及びＶＬセグメントの鎖を形成させるために、徐冷処理されたオリゴにリガーゼ（ＮＥＢカタログ番号２０２Ｓ）１μＬを添加した。１０分間、６５℃に加熱することによってリガーゼを不活性化した。
【０２５５】
第四段階において、構築された断片の末端をＫｌｅｎｏｗ酵素（ＮＥＢカタログ番号２１２Ｓ）で埋め、ＤＮＡをゲルで精製した後、配列番号３８（「ｗｔ」コンストラクトに対して）及び配列番号３９（「ｍｕｔ」コンストラクトに対して）に係るペプチド配列をコードする重鎖定常領域配列又は、それぞれ、配列番号４０又は配列番号４１に係るペプチド配列をコードする軽鎖定常領域配列を既に含有するヒト重及び軽鎖カセットベクター中にクローニングした。
【実施例３】
【０２５６】
作製された抗体の性質決定
競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡアッセイを行うために、次のプロトコールを使用した。
【０２５７】
最初に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５μｇ／ｍＬの濃度のＡβ抗原（１−４２）でプレート（１実験あたり１プレート）を一晩被覆した。翌日、上清を捨て、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）３４０ｍＬで４５分間、プレートをブロッキング処理した。次に、プレートを空にして、ビオチン化７Ｃ６又は５Ｆ７マウス抗体を１μｇ／ｍＬ（体積＝１００μＬ）の濃度で添加した。２７μｇ／ｍＬから０．１１μｇ／ｍＬの範囲の濃度で、その他の抗体（マウス若しくはヒト化５Ｆ７又はマウス若しくはヒト化７Ｃ６）を添加した。（体積＝５０μＬ）。次に、プレートを２時間温置し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄した。２次試薬としてニュートラアビジンＨＲＰを添加した（希釈１：２０，０００；体積＝１００μＬ）。次に、プレートを３０分間温置し、５回洗浄した。次に、ＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加した（体積＝１００μＬ）。続いて、プレートを４分間温置した。次に、２Ｎ硫酸（体積＝１００μＬ）で反応を停止させた。分光光度法で４５０ｎｍの波長でプレートの読み取りを行った。結果を図３及び４で示す。
【０２５８】
特に、図３は、ビオチン化マウス抗体とのヒト化抗体５Ｆ７の競合能（及びビオチン化マウス抗体の結合シグナルの阻害能）に関して、ヒト化抗体５Ｆ７がマウス親抗体と同等であることを示す。従って、ヒト化抗体は、その結合能を保持していた。
【０２５９】
図４は、ビオチン化マウス抗体とのヒト化抗体７Ｃ６の競合能（及びビオチン化マウス抗体の結合シグナルの阻害能）に関して、ヒト化抗体７Ｃ６がマウス親抗体と同等であることを示す。この場合にも、ヒト化抗体は、その結合能を保持していた。
【実施例４】
【０２６０】
抗体のＡβ（２０−４２）球状凝集体選択性
実施例４．１：Ａβ（１−４２）原繊維に対するＡβ（２０−４２）球状凝集体選択的抗体の識別のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化された半定量的分析
Ａ）Ａβ（１−４２）原繊維調製物：
Ａβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ、カタログ番号Ｈ−１３６８）１ｍｇをＨ２Ｏ中の０．１％ＮＨ４ＯＨ５００μＬ中に溶解し、大気温で１分間撹拌した。試料を１００００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収した。上清中のＡβ（１−４２）濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に従って決定した。
【０２６１】
０．１％ＮＨ４ＯＨ中のＡβ（１−４２）１００μＬを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の３００μＬと混合し、２％ＨＣｌでｐＨ７．４に調整した。次に、試料を３７℃で２０時間温置した。その後、試料を１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、残渣を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の４００μＬと混合し、１分間激しく撹拌する（「渦巻き撹拌する」）ことによって再懸濁し、１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、残渣を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の４００μＬと混合し、１分間激しく撹拌する（「渦巻き撹拌する」）ことによって再懸濁し、１００００ｇで１０分間さらにもう１回遠心分離した。上清を廃棄した。残渣を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の３８０μＬ中で再懸濁し、激しい撹拌（「渦巻き撹拌」）によって促進した。
【０２６２】
Ｂ）Ａβ（１−４２）原繊維への抗Ａβ抗体の結合：
Ａβ（１−４２）原繊維調製物８０μＬを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％トゥイーン２０、ｐＨ７．４の３２０μＬで希釈し、周囲温度で５分撹拌した後、音波処理（２０秒）し、次いで、試料を１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、残渣を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％トゥイーン２０、ｐＨ７．４の１９０μＬ中に再懸濁した。再懸濁は、激しい撹拌（「渦巻き撹拌」）によって促進された。
【０２６３】
原繊維調製物１０μＬの一定分量を
ａ）１０μＬの２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４
ｂ）２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の５Ｆ７ｈｕｍ８の０．５μｇ／μＬの１０μＬ
ｃ）２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の７Ｃ６ｈｕｍ７ｍｕｔの０．５μｇ／μＬの１０μＬ
ｄ）２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の７Ｃ６ｈｕｍ７ｗｔの０．５μｇ／μＬの１０μＬ
ｅ）２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の６Ｅ１０(Ｓｉｇｎｅｔ番号：９３２０)の０．５μｇ／μＬの１０μＬ
ｆ）２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４中のＩｇＧ２ａ(すなわち、抗原としてのＫＬＨ（キーホール・リンペット・ヘモシアニン）に対して作製された抗体イソタイプ対照)の０．５μｇ／μＬの１０μＬ
と各々混合した。
【０２６４】
試料を３７℃で２０時間温置した後、１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液２０μＬと混合した。残渣を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０２５％トゥイーン２０、ｐＨ７．４の５０μＬと混合し、「渦巻き撹拌」によって再懸濁した後、試料を１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、残渣を２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０２５％トゥイーン２０、ｐＨ７．４の２０μＬと混合した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液２０μＬと混合した。試料を９８℃で５分間加熱し、電気泳動用の１８％トリス／グリシンゲルへ試料を適用した。
【０２６５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためのパラメータ：
ＳＤＳ試料緩衝液：０．３ｇ  ＳＤＳ
０．７７ｇ  ＤＴＴ
１Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ６．８）４ｍＬ
グリセリン８ｍＬ
エタノール中の１％ブロモフェノールブルー１ｍＬ
Ｈ２Ｏで充填及び
１８％トリス／グリシンゲル：（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＥＣ６５０５ＢＯＸ）５０ｍＬ
電気泳動緩衝液：７．５ｇトリス
３６ｇグリシン
２．５ｇ  ＳＤＳ
Ｈ２Ｏで２．５Ｌに充填
２０ｍＡの定常電流でゲルを泳動する。
【０２６６】
ゲルの染色：クーマシーブルーＲ２５０
結果を図５（Ａ）に示す。
【０２６７】
Ｃ）異なる抗Ａβ抗体の半定量的分析及びＡβ（１−４２）原繊維の識別
Ａβ（１−４２）原繊維及びＡβ（１−４２）単量体の抗体の位置をゲルの縁に標識する。それらの大きさにより、Ａβ（１−４２）原繊維は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルへ進入することが不可能であり、ゲルのスロット中に観察されることが可能である。
【０２６８】
１．マーカー
２．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；対照
３．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂ５Ｆ７ｈｕｍ８；２０時間、３７℃；上清
４．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂ５Ｆ７ｈｕｍ８；２０時間、３７℃；ペレット
５．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂ７Ｃ６ｈｕｍ７ｍｕｔ；２０時間、３７℃；上清
６．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂ７Ｃ６ｈｕｍ７ｍｕｔ；２０時間、３７℃；ペレット
７．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂ７Ｃ６ｈｕｍ７ｗｔ；２０時間、３７℃；上清
８．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂ７Ｃ６ｈｕｍ７ｗｔ；２０時間、３７℃；ペレット
９．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂ６Ｅ１０；２０時間、３７℃；上清
１０．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂ６Ｅ１０；２０時間、３７℃；ペレット
１１．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂＩｇＧ２ａ；２０時間、３７℃；上清
１２．Ａβ（１−４２）原繊維調製物；＋ｍＡｂＩｇＧ２ａ；２０時間、３７℃；ペレット
遠心分離後の原繊維に結合した画分（ペレット画分）及び上清画分中の抗体の重鎖から光学密度（ＯＤ）値を測定することによって、Ａβ型原繊維に対する相対的な結合をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から評価した。Ａβ原繊維へ結合した抗体は、Ａβ原繊維とともにペレットになり、従って、ペレット画分中に見出されるべきであるのに対し、Ａβ原繊維へ結合していない（遊離の）抗体は、上清中に見出される。Ａβ原繊維へ結合した抗体の割合を次式に従って算出した。
【０２６９】
Ａβ原繊維に結合した抗体の％＝ＯＤ原繊維画分×１００％／（ＯＤ原繊維画分＋ＯＤ上清画分）
ｍＡｂ６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ、カタログ番号９３２０）、５Ｆ７ｈｕｍ８、７Ｃ６ｈｕｍ７ｍｕｔ及び７Ｃ６ｈｕｍ７ｗｔ及びＩｇＧ２ａに関して、この手法を実施した。
【０２７０】
アルツハイマー病患者の脳において、Ａβ原繊維は、Ａβペプチドプール全体の主要成分である。抗Ａβ抗体によってこれらの原繊維を攻撃することによって、負の副作用の危険性は、Ａβの多量の遊離により上昇し、これがその後、微小出血の危険性を増大し得る。微小出血に関する危険性の増大は、Ａβペプチドの繊維状凝集体による能動免疫のアプローチにおいて観察された（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，２００５，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４，  １０−１２；Ｏｒｇｏｇｏｚｏ  Ｊ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００３，  ６１，  ４６−５４；Ｓｃｈｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌ，１６，  ５９９−６０６）。
【０２７１】
ＡＡ１−１７間で線形Ａβエピトープを認識する市販の抗体６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ  ９３２０）とは対照的に、（他のＡβ形態に比べて、Ａβ（２０−４２）球状凝集体に対して最小限の選択性を実際に有する）Ａβ（２０−４２）球状凝集体選択的抗体５Ｆ７ｈｕｍ８は、同時ペレット化実験においてＡβ（１−４２）原繊維に結合しない（図５（ｂ）参照）。これは、Ａβ（１−４２）原繊維との温置後の５Ｆ７ｈｕｍ８抗体が、ペレット化工程後に上清中に残留し、Ａβ（１−４２）原繊維に結合しているために同時ペレット化しないという事実によって示される。同じ結果が、７Ｃ６ｈｕｍ７ｗｔ及び７Ｃ６ｈｕｍ７ｍｕｔに対して見出された。非特異的結合及びこの方法の内在的バックグラウンドに対する基準として、非特異的抗体ＩｇＧ２ａを内部対照として使用した（ＩｇＧ２ａは、抗原としてのＫＬＨ（キーホール・リンペット・ヘモシアニン）に対して作製された。）。何れの形態のＡβペプチドに対しても誘導されないＩｇＧ２ａ抗体は、Ａβ原繊維に対するある種の非特異的結合を示す。
【０２７２】
（実施例４−２）
抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体ヒト化抗体の選択性のドットブロット特性
ヒト化モノクローナル抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗体の選択性を特徴付けるために、異なるＡβ形態で認識するためのプローブを前記抗体につけた。この目的のため、０．２ｍｇ／ｍＬＢＳＡを補充されたＰＢＳ中の１００ｐｍｏｌ／μＬから０．０１ｐｍｏｌ／μＬまでの範囲の個々のＡβ（１−４２）形態の連続希釈を作製した。各試料１μＬをニトロセルロースメンブレン上へ吸収転移させた。検出のため、対応する抗体を使用した（０．２μｇ／ｍＬ）。ペルオキシダーゼ連結型抗マウスＩｇＧ又は抗ヒトＩｇＧ及び染色試薬ＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、免疫染色を実施した。
【０２７３】
ドットブロットのためのＡβ標準物質：
１．Ａβ（１−４２）単量体、０．１％ＮＨ４ＯＨ
１ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を（新鮮に調製された）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮＨ４ＯＨ（＝２ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ中に溶解し、室温で即時３０秒間振盪し、透明な溶液を得た。さらなる使用のため、試料を−２０℃で保存した。
【０２７４】
２．Ａβ（１−４０）単量体、０．１％ＮＨ４ＯＨ
１ｍｇのＡβ（１−４０）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を（新鮮に調製された）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮＨ４ＯＨ（＝２ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ中に溶解し、室温で即時３０秒間振盪し、透明な溶液を得た。さらなる使用のため、試料を−２０℃で保存した。
【０２７５】
３．Ａβ（１−４２）単量体、０．１％ＮａＯＨ
２．５ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を（新鮮に調製された）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮａＯＨ（＝５ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ中に溶解し、室温で３０秒間直ちに振盪し、透明な溶液を得た。さらなる使用のため、試料を−２０℃で保存した。
【０２７６】
４．Ａβ（１−４０）単量体、０．１％ＮａＯＨ
２．５ｍｇのＡβ（１−４０）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を（新鮮に調製された）Ｈ２Ｏ中の０．１％ＮａＯＨ（＝５ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬ中に溶解し、室温で即時３０秒間振盪し、透明な溶液を得た。さらなる使用のため、試料を−２０℃で保存した。
【０２７７】
５．Ａβ（１−４２）球状凝集体
Ａβ（１−４２）球状凝集体の調製を実施例１ａに記載している。
【０２７８】
６．Ａβ（１２−４２）球状凝集体
Ａβ（１２−４２）球状凝集体の調製を実施例１ｃに記載している。
【０２７９】
７．Ａβ（２０−４２）球状凝集体
Ａβ（２０−４２）球状凝集体の調製を実施例１ｂに記載している。
【０２８０】
８．Ａβ（１−４２）原繊維
１ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．カタログ番号Ｈ−１３６８）を５００μＬの０．１％ＮＨ４ＯＨ水溶液（エッペンドルフチューブ）中に溶解し、試料を室温で１分間撹拌した。この新鮮に調製されたＡβ（１−４２）溶液１００μＬを３００μＬの２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で中和した。ｐＨを１％ＨＣｌでｐＨ７．４に調整した。試料を３７℃で２４時間温置し、（１００００ｇで１０分間）遠心分離した。上清を廃棄し、原繊維のペレットを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の４００μＬで、１分間の渦巻き撹拌により再懸濁した。
【０２８１】
９．ｓＡＰＰα
Ｓｉｇｍａによって供給された（カタログ番号Ｓ９５６４；２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．４中の２５μｇ）。２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌ；ｐＨ７．４、０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡでｓＡＰＰαを０．１ｍｇ／ｍＬ（＝１ｐｍｏｌ／μＬ）に希釈した。
【０２８２】
ドットブロットのための材料：
Ａβ標準物質：
２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ中のＡβ抗原の連続希釈物
１）１００ｐｍｏｌ／μＬ
２）１０ｐｍｏｌ／μＬ
３）１ｐｍｏｌ／μＬ
４）０．１ｐｍｏｌ／μＬ
５）０．０１ｐｍｏｌ／μＬ
６）０．００１ｐｍｏｌ／μＬ
ニトロセルロース：
Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ媒体、Ｐｕｒｅ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（０．４５μｍ）；ＢＩＯ−ＲＡＤ
抗マウスＰＯＤ：
カタログ番号７１５−０３５−１５０（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
抗ヒトＰＯＤ：
カタログ番号１０９−０３５−００３（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
検出試薬：
ＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ基質、沈殿物（Ｒｏｃｈｅ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：
カタログ番号Ａ−７８８８（ＳＩＧＭＡ）
ブロッキング試薬：
ＴＢＳ中の５％低脂肪乳
緩衝溶液：
ＴＢＳ
２５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５
＋１５０ｍＭＮａＣｌ
ＴＴＢＳ
２５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５
＋１５０ｍＭＮａＣｌ
＋０．０５％トゥイーン２０
ＰＢＳ＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４緩衝液ｐＨ７．４
＋１４０ｍＭＮａＣｌ
＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
抗体溶液Ｉ：
ＴＢＳ中の１％低脂肪乳２０ｍＬ中に希釈された０．２μｇ／ｍＬ抗体
抗体溶液ＩＩ：
１：５０００希釈
マウス抗体（すなわち、６Ｅ１０）については、ＴＢＳ中の１％低脂肪乳中の抗マウスＰＯＤ、又はヒト化抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体抗体（すなわち、５Ｆ７ｈｕｍ８、７Ｃ６ｈｕｍ７ｗｔ及び７Ｃ６ｈｕｍ７ｍｕｔ）については、ＴＢＳ中の１Ｒ低脂肪乳中の抗ヒトＰＯＤ
ドットブロット手法：
１）（６個の連続希釈物中の）異なるＡβ標準物質各１μＬを、互いに約１ｃｍの距離で、ニトロセルロースメンブレン上へ滴下した。
【０２８３】
２）Ａβ標準物質のドットをニトロセルロースメンブレン上で、室温（ＲＴ）で少なくとも１０分間空気乾燥させた（＝ドットブロット）。
【０２８４】
３）ブロッキング：
ドットブロットをＴＢＳ中の５％低脂肪乳３０ｍＬとともに、室温で１．５時間温置した。
【０２８５】
４）洗浄：
ブロッキング溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットを室温で１０分間振盪しながら温置した。
【０２８６】
５）抗体溶液Ｉ：
洗浄緩衝液を廃棄し、抗体溶液Ｉとともにドットブロットを室温で２時間温置した。
【０２８７】
６）洗浄：
抗体溶液Ｉを廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットを室温で１０分間振盪しながら温置した。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットを室温で１０分間振盪しながら温置した。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＢＳとともにドットブロットを室温で１０分間振盪しながら温置した。
【０２８８】
７）抗体溶液ＩＩ：
洗浄緩衝液を廃棄し、ドットブロットを抗体溶液ＩＩとともに室温で一晩温置した。
【０２８９】
８）洗浄：
抗体溶液ＩＩを廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットを室温で１０分間振盪しながら温置した。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＴＢＳとともにドットブロットを室温で１０分間振盪しながら温置した。洗浄溶液を廃棄し、２０ｍＬのＴＢＳとともにドットブロットを室温で１０分間振盪しながら温置した。
【０２９０】
９）発色：
洗浄溶液を廃棄した。ドットプロットをＢＭ  Ｂｌｕｅ  ＰＯＤ基質５ｍＬで１０分間発色させた。Ｈ２Ｏによるドットブロットの集中洗浄によって発色を停止させた。ドットの強度に関する濃度計分析（ＧＳ８００濃度計（ＢｉｏＲａｄ）及びソフトウェアパッケージであるＱｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ、第４．５．０版（ＢｉｏＲａｄ））を使用して、定量的評価を実施した。Ａβ（２０−４２）球状凝集体の最後の光学的に明確に同定されたドットの相対密度の２０％を超える相対密度を有するドットのみを評価した。全てのドットブロット対してに独立して、この閾値を決定した。算出された値は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体の認識と付与された抗体に関する個々のＡβ形態との間の関係を示す。
【０２９１】
結果を図６(Ａ)に示す。
【０２９２】
Ａβの異なる形態に対する異なる抗Ａβ抗体（マウスモノクローナル６Ｅ１０、５Ｆ７ｈｕｍ８、７Ｃ６ｈｕｍ７ｗｔ、７Ｃ６ｈｕｍ７ｍｕｔ）の特異性に関するドットブロット分析。Ａβ（２０−４２）球状凝集体によるマウスの能動免疫後の融合されたハイブリドーマ細胞の選択、及びその後のヒト化によって、検査されたヒト化モノクローナル抗体を得た（市販のマウスモノクローナル抗体６Ｅ１０を除く。）。個々のＡβ形態を連続希釈物中に適用し、免疫反応のため、個々の抗体とともに温置した。
【０２９３】
１．Ａβ（１−４２）単量体、０．１％ＮＨ４ＯＨ
２．Ａβ（１−４０）単量体、０．１％ＮＨ４ＯＨ
３．Ａβ（１−４２）単量体、０．１％ＮａＯＨ
４．Ａβ（１−４０）単量体、０．１％ＮａＯＨ
５．Ａβ（１−４２）球状凝集体
６．Ａβ（１２−４２）球状凝集体
７．Ａβ（２０−４２）球状凝集体
８．Ａβ（１−４２）原繊維調製物
９．ｓＡＰＰα（Ｓｉｇｍａ）；（第一ドット：１ｐｍｏｌ）
Ａβ（１−４２）球状凝集体及びＡβ（１２−４２）球状凝集体の識別に関して、抗Ａβ（２０−４２）球状凝集体選択的抗体を、３つのクラスに分割することが可能である。抗体及びそのヒト化された代表である５Ｆ７ｈｕｍ８を含む第一のクラスは、Ａβ（２０−４２）球状凝集体を優先的に認識し、ある程度Ａβ（１−４２）球状凝集体を（及びＡβ（１２−４２）球状凝集体も）認識する。第二のクラス（現在のところ、ヒト化抗体は存在せず、マウスモノクローナル抗体のみが入手可能）は、Ａβ（２０−４２）球状凝集体を優先的に認識し、Ａβ（１２−４２）球状凝集体も認識するが、その程度はより低く、Ａβ（１−４２）球状凝集体を有意には認識しない抗体を含む。抗体及びそのヒト化された代表である７Ｃ６ｈｕｍ７ｗｔ及び７Ｃ６ｈｕｍ７ｍｕｔを含むを含む第三のクラスは、Ａβ（２０−４２）球状凝集体を認識するが、その他の有意な認識を示さない。３つのクラスは全て、単量体Ａβ（１−４２）、単量体Ａβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）原繊維又はｓＡＰＰαを有意には認識しない。
【実施例５】
【０２９４】
老齢ＴＧ２５７６マウスにおけるＡβプラークの形態の繊維状Ａβペプチド及び髄膜血管中のＡβアミロイドに対する抗体Ｈ７Ｃ６ＷＴ及びＨ７Ｃ６ＭＵＴの特異的反応に関する生体内原位置での分析
これらの実験のために、１９ヶ月齢のＴｇ２５７６マウス（Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ；２７４（５２８４），９９−１０２）若しくは１７ヶ月齢のＡＰＰ／Ｌｏ１マウス（Ｍｏｅｃｈａｒｓ）の脳材料又は２名のアルツハイマー病患者の剖検材料（ＲＺ１６及びＲＺ５５；ＢｒａｉｎＮｅｔ，Ｍｕｎｉｃｈから入手）を使用した。マウスは、Ｔｇ２５７６の場合には、いわゆるスウェーデン変異（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）を有するヒトＡＰＰを、又はＡＰＰ／Ｌｏの場合には、いわゆるロンドン変異（Ｖ７１７Ｉ）を有するヒトＡＰＰを過剰発現し、形成されるβアミロイドは、約１１ヶ月齢で脳実質中に沈着し、βアミロイドは、約１５から１８ヶ月齢でより大きな脳血管中に沈着する（Ｔｇ２５７６）。動物を深麻酔し、０．１Ｍリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で経心的に灌流して血液を流した。次に、脳を頭蓋から摘出し、長軸方向に分割した。脳の一半球をショック凍結させ、もう半分を４％パラホルムアルデヒド中への浸漬により固定した。浸漬により固定された半球を、ＰＢＳ中の３０％ショ糖中に浸漬することによって凍結保護し、凍結しているミクロトーム上に載せた。前脳全体を４０μｍ切片に切り、ＰＢＳ中に回収して、その後の染色手法のために使用した。ヒト脳材料は、新皮質の深さ約１ｃｍ３の凍結ブロックであった。ブロックのわずかな部分を４％パラホルムアルデヒド中に浸漬固定し、マウス脳材料と同様さらに処理した。
【０２９５】
次のプロトコールに従って、各抗体の０．０７から７．０μｇ／ｍＬを含有する溶液とともに切片を温置することによって、染色を行った。
【０２９６】
材料：
−ＴＢＳＴ洗浄溶液（トゥイーン２０含有トリス緩衝塩類溶液；１０倍濃縮物；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ；Ｓ３３０６  Ａｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔ中の１：１０）
−メタノール中の０．３％Ｈ２Ｏ２
−ロバ血清（６Ｅ１０、４Ｇ８の場合）又はヤギ血清（ｈ７Ｃ６の場合；Ｓｅｒｏｔｅｃ）
−ＴＢＳＴ中に希釈されたモノクローナルヒト７Ｃ６ｗｔ及びｍｕｔ抗体／１％ヤギ血清
−モノクローナルマウス抗体６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ  Ｃｏｖａｎｃｅ；ＳＩＧ−３９３００）及び４Ｇ８（Ａｂｃａｍ；Ａｂ１９１０）
−二次抗体：
−６Ｅ１０及び４Ｇ８に関して、ビオチン化ロバ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ；７１５−０６５−１５０；ＴＢＳＴ／１％ロバ血清中に１：５００で希釈）
−ｈ７Ｃ６に関して、ビオチン化ヤギ抗ヒト抗体（Ａｂｃａｍ；Ａｂ７１５２、ＴＢＳＴ／１％ヤギ血清中に１：８０００で希釈）
−ＳｔｒｅｐｔＡＢＣｏｍｐｌｅｘ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ；Ｋ０３７７）
−ペルオキシダーゼ基質キットジアミノベンジジン（＝ＤＡＢ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ＳＫ−４１００）
−ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド及びカバーガラス
−キシロール非含有包埋媒体（Ｍｅｄｉｔｅ；Ｘ−ｔｒａ  Ｋｉｔｔ）
手法：
−氷冷０．３％Ｈ２Ｏ２中へ浮遊切片を転移させ、３０分間温置した。
【０２９７】
−次いで、ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄した。
【０２９８】
−続いて、ロバ血清／ＴＢＳＴとともに２０分間温置した。
【０２９９】
−次いで、一次抗体とともに室温で２４時間温置した。
【０３００】
−続いて、ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄した。
【０３０１】
−Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣペルオキシダーゼキットからのブロッキング血清とともに２０分間温置した。
【０３０２】
−続いて、ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄した。
【０３０３】
−次いで、二次抗体とともに大気温で６０分間温置した。
【０３０４】
−上記工程後、ＴＢＳＴ緩衝液中で切片を５分間洗浄した。
【０３０５】
−次いで、ＳｔｒｅｐｔＡＢＣｏｍｐｌｅｘとともに大気温で６０分間温置した。
【０３０６】
−続いて、ＴＢＳＴ緩衝液中で５分間洗浄した。
【０３０７】
−次いで、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣペルオキシダーゼキットからのＤＡＢとともに、試料を１０分間温置した。
【０３０８】
−次いで、スライド上に切片を載せ、空気乾燥させ、アルコールで脱水し、包埋した。
【０３０９】
脳実質及び血管中のアミロイド沈着染色を写真撮影した。次いで、ＩｍａｇｅＰｒｏ５．０画像分析システムを使用して組織学的画像から約１０個の無作為に選択されたプラークを切り取り、それらの平均グレースケール値を測定することによって、アミロイドプラーク染色をさらに定量化した。周囲のバックグランドから光学密度値を差し引くことによって、グレースケール値から光学密度値を算出し（０％−材料なし、対照＝染色されていない切片）を計算し、アミロイド沈着の特異的染色を得た。ＡＮＯＶＡ後の後知恵Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉのｔ検定を用いて、統計的な有意差に関して抗体間の差異を検査した。
【０３１０】
染色の結果を図９に示す。特に、パネルａ）は、ＡＤ患者又は１９月齢のトランスジェニックマウスの新皮質の横断切片中における、０．７μｇ／ｍＬの濃度の異なる抗体の結合を示している。実質Ａβ沈着（黒い矢印）は、６Ｅ１０及び４Ｇ８のみで染色され、ｈ７Ｃ６抗体では染色されなかった。血管のＡβ沈着（白い矢印）は、６Ｅ１０及び４Ｇ８のみで染色され、ｈ７Ｃ６抗体では染色されなかった。パネルｂ）−ｅ）は、ＡＤ患者又は老齢のトランスジェニックマウスの新皮質の横断切片中における、０．０７から７．０μｇ／ｍＬの濃度の異なる抗体の結合を示している。特に、結合は、６Ｅ１０及び４Ｇ８の漸増濃度を用いた場合にのみ見出され、ｈ７Ｃ６抗体では見いだされなかった。
【０３１１】
茶色のＤＡＢ沈着の評価は、Ａβ−非選択的抗体６Ｅ１０及び４Ｇ８はプラーク及び髄膜血管を染色したのに対して、球状凝集体選択的抗体ｈ７Ｃ６ｗｔ及びｈ７Ｃ６ｍｕｔは染色しなかったことを示した。この知見は、Ａβ原繊維又はアミロイド構造中に存在する他のＡβ種へのこれらの抗体がインビボで存在せず、又は著しく低下した結合が存在することを示している。この低下した結合は、プラークの迅速すぎる溶解及びその後の可溶性Ａβの増加又はプラークに結合した抗体の小神経膠細胞との相互作用に起因する神経炎症によって誘発される副作用の危険を低減させるはずである。
【０３１２】
参考文献：
Ｄｉｅｄｅｒ  Ｍｏｅｃｈａｒｓ，  Ｉｌｓｅ  Ｄｅｗａｃｈｔｅｒ，  Ｋｒｉｓｔｉｎ  Ｌｏｒｅｎｔ，  Ｄｅｌｐｈｉｎｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ，  Ｖｅｅｒｌｅ  Ｂａｅｋｅｌａｎｄｔ，  Ａｓｈａ  Ｎａｉｄｕ，  Ｉｎａ  Ｔｅｓｓｅｕｒ，  Ｋｕｒｔ  Ｓｐｉｔｔａｅｌｓ，  Ｃｈｒｉｓ  Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｈａｕｔｅ，  Ｆｒｅｄｅｒｉｃ  Ｃｈｅｃｌｅｒ，  Ｅｍｉｌｅ  Ｇｏｄａｕｘ，  Ｂａｒｂａｒａ  Ｃｏｒｄｅｌ，  ａｎｄ  Ｆｒｅｄ  Ｖａｎ  Ｌｅｕｖｅｎ  （１９９９），  “Ｅａｒｌｙ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ”，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：６４８３−６４９２。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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