(57)【要約】  スペクトリンに結合する抗体を測定することで体液中の自己抗体を測定することにより、多発性硬化症を診断およびモニタリングするための方法および試験キットについて述べる。典型的なスペクトリンは、α−ホドリンである。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中の自己抗体を測定することにより、多発性硬化症を診断およびモニタリングする方法であって、スペクトリンに結合する抗体が測定されることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記スペクトリンはホドリンであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記抗体はα型に対して向けられることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、前記抗体は、１００〜１４０ｋＤａの大きさのスペクトリン断片に対して向けられることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記抗体は、１２０ｋＤａの大きさを有し、カスパーゼ−３により開裂可能である新抗原に対して向けられることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、前記自己抗体は、ＩｇＡおよびＩｇＧ自己抗体として測定されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、サブタイプ２および／または３の多発性硬化症が測定されることを特徴とする方法。
【請求項８】
多発性硬化症を診断およびモニタリングするための試験キットであって、
ａ）スペクトリン抗原、および
ｂ）自己抗体に対して特異的なレセプター
を含んでなるキットの使用。
【請求項９】
請求項８に記載の使用であって、前記スペクトリン抗原はα−ホドリン抗原であり、前記レセプターはＩｇＡまたはＩｇＧ特異的なレセプターであることを特徴とする使用。
【請求項１０】
請求項９に記載の使用であって、前記試験試薬（ａ）または（ｂ）の１つが結合した、または結合可能である固相を含んでなることを特徴とする使用。
【請求項１１】
請求項１０に記載の使用であって、前記試験試薬（ａ）または（ｂ）の１つに結合した、または結合可能である標識基を含んでなることを特徴とする使用。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の使用であって、前記キットは、少なくとも１の付加的な抗体クラス特異的な試験試薬を含んでなることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、多発性硬化症を診断する、特に、切迫したまたは初期の炎症性の再発の進行を診断およびモニタリングするための方法、ならびにそれらの試験キットの使用に関する。
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）（encephalomyelitis disseminataとも呼ばれる）は、中枢神経系の原発性の炎症性疾患である。しかしながら、前記疾患は均一な形態ではなく、非常に不定の臨床経過を伴う中枢神経系の炎症性脱髄性疾患の１つの群として述べられる。同時に、前記臨床経過は、単一の事象またはわずかな再発および能力障害の最小のリスクのみを伴う前記疾患の良性の経過から、２次的な慢性の進行性の臨床形態を伴うもしくは伴わない古典的な再発性の寛解の形態へと変化し得る。
【０００３】
発症は、２０〜５０歳であることが多く、女性は男性の２倍の頻度で発症する。ＨＬＡ抗原、特にＨＬＡ−ＤＲ２ならびにＨＬＡ−ＤＷ２との会合も生じる。多発性硬化症は、自己免疫疾患であり、体自身の免疫防御がシュヴァン細胞または神経線維の周りのミエリン鞘を攻撃および破壊する。結果として、神経刺激の伝導が障害される。これは、前記疾患のさらなる過程の間、知覚神経ならびに運動神経の無能さの増大を引き起こし、多発性硬化症に典型的な感覚の障害、痙性麻痺、嚥下障害および筋系麻痺を生じるようにそれらの機能を維持する。多くの場合（約８０％）、前記疾患の初期の形態は、再発を切り抜けた後、一般的にいくらか退行した症状を伴う再発を含む。しかしながら、前記疾患の経過は、通常、致死的な病因を一般的に伴う慢性進行性である。
【０００４】
多発性硬化症（ＭＳ）は、異なる形態で生じ、例えば、中枢神経系における病変または脳の病変の脱髄パターンにより区別されてよいが、生検またはその免疫学的なメカニズム、すなわち、マクロファージに媒介される炎症、抗体により媒介される症状、白質に対する化学的なダメージを伴うオリゴデントログリア部分（小血管の脈管炎による）ならびに２次的な脱髄によってのみ可能である。
【０００５】
最近の検証では、異なる形態のＭＳには異なる治療が必要であることも示されている：http://de.wikipedia.org/wiki/multiple sclerosis。
【０００６】
核スピン共鳴断層撮影法（ＭＲＴ）は、神経末端の軸索に対する障害が、不可逆的な神経障害の発達における重要なステップを意味することを示した。しかしながら、今日まで、個々に進行する免疫反応は、その相互関係について完全には理解されていなかった。今日まで、診断は、神経学的な試験、例えば、遅延性の神経伝導、腰椎穿刺による脳腰椎液の検査または上述した炎症および脳における瘢痕組織を可視化することが可能な磁気共鳴断層撮影法により行われる。今日における実験室的な化学検査は、抗ＭＯＧ抗体（ミエリンオリゴデントロサイト糖タンパク質）および抗ＭＢＰ抗体（ミエリン細胞（シュヴァン細胞）の膜の内側に見られるタンパク質に対応）を決定することにより行われる（T.Berger in “Antimyelin antibodies as a predictor of clinically definite multiple sclerosis in patients with an initial manifestation of MS”, “New Horizons” (4), 2003, pp.6-7）（http://www.gfmk.de）。
【０００７】
これまで、ＭＳの確立した診断を行うためには、２つの別々の疾患の再発の相を診断し、および／または脳または脊髄の２つの異なる領域における炎症性の病巣の形跡を見つける必要があった。同時に、磁気共鳴断層撮影法（ＭＲＴ）は、特に、その価値を見出されていなかった。この方法を用いることで、現在は、ある一定の解像度および１ｍｍの大きさまで病変を示すことが可能である。
【０００８】
適切な治療手段を開始するために、多発性硬化症を初期または再発の悪化の始めに検出することができる試験は、今日においては利用可能でない。さらに、治療方法の効果をチェックすることができるモニタリングに対する必要性も存在する。
【０００９】
それ故、本発明の目的は、そのような方法を提供することにある。この目的は、特許請求の範囲に記載された方法ならびに該方法において使用される試験キットを通して達成され得る。
【００１０】
本発明によると、多発性硬化症は、スペクトリンに対して向けられる抗体の増大を伴うことが見出された。これらの抗体は、体液中に検出される。
【００１１】
スペクトリンは、Ｆ−アクチンに結合するタンパク質であり、アクチンのゲル化（gelification）を促進する。細胞の細胞骨格において見られ、細胞の形を安定化する。スペクトリン自体は、２６０ｋＤａの大きさのαスペクトリンと２２５ｋＤａの大きさのβスペクトリンからなるヘテロテトラマーの４量体として生じる（α２β２）。スペクトリンと同様のタンパク質として述べられている亜型は、ホドリンである。ホドリンは、隣接するアクチンフィラメントと相互に結合する。好ましい実施形態において、本発明によると、ホドリンに対する抗体が決定される。
【００１２】
ホドリン自体は、消化管腫瘍に対する識別マーカーとしていくらか前から既知である（M.Younes et al., Am.J.Pathol, Vol.135 (1989), 1197-1212）。
【００１３】
本発明による特定の好ましい実施形態において、抗体は、α−ホドリンに対して向けられることが決定され、１００〜１４０ｋＤａまたは１１０〜１３０ｋＤａの大きさ、特に約１２０ｋＤａのα−ホドリンの新抗原に向けられる抗体が特に好ましい。例えばそのような新抗原は、アポトーシスの間に、プロテアーゼ、特にカスパーゼにより開裂される。典型的なカスパーゼは、アスパラギン酸のＣ末端におけるペプチド結合を切断し、Ｃ−Ａｓｐ−ａｓｅとも呼ばれる所以である。α−ホドリンの１２０ｋＤａ断片の開裂は、カスパーゼ３により体内で起こる。スペクトリン、特にホドリンに対する自己抗体は、全てＭＳの形態で見出されるが、それらは特に、サブタイプ３および２に特有である。
【００１４】
原理的には、α−ホドリンに対するＩｇＡおよびＩｇＧ自己抗体の出現は、エリテマトーデスならびにシェーグレン症候群において既知である。例えば、ＷＯ０１／１４８７７では、シェーグレン症候群に対して特異的なマーカーとしてα−ホドリンに対する自己抗体を測定するための試験キットについて述べられている。本発明は、それ故、ＭＳを診断およびモニタリグするため、ならびにサブタイプ３（主にアポトーシス）および特に２（抗体媒介）の測定のためのそのような試験の使用にも関する。
【００１５】
α−ホドリンに対するＩｇＡ自己抗体の有意な量の出現は、ＭＳ、特にサブタイプ３ならびに２の存在を検出する典型的な方法である。
【００１６】
同時に、前記試験の感度は、上述したスペクトリン、特にα−ホドリンに対するＩｇＡおよびＩｇＧならびにＩｇＭを付加的に測定することにより増大し得る。ＩｇＧ自己抗体のみの付加的な測定は、感度を約１０〜２０％増大させる。
【００１７】
本発明の方法は、生じた自己抗体の定性的な測定のみならず定量的な測定にも利用可能である。自己抗体の定量的な測定は、疾患の急性の状態またはその進行の重篤さを示す。さらに、反応がよい再発は、初期に早く進行することが確認されているため、この重篤な疾患のより効果的な治療が可能になる。結果として、不可逆的なダメージの出現を最小限にすることができ、完全に予防することすら可能になる。原理としては、定性的な測定の間、ある一定の極限値以上である抗体の濃度は陽性の結果として定義される。そのような極限値の決定は、健常人ならびに病気の患者からの血清を用いた試験系でキャリブレーションすることにより行われる。
【００１８】
本発明によると、抗体は、通常、体液中で測定される。典型的な体液は、ここでは、血液、血清および血漿であり、脳脊髄液が好ましい。
【００１９】
α−ホドリンまたは約１２０ｋＤａの大きさの新抗原に対するＩｇＡまたはＩｇＧ抗体の測定は、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡのような当業者に既知の技術により行われてよい。
【００２０】
本発明によると、バイオセンサー、例えば、電流滴定センサー、電位差測定、イオン選択的な電位差測定もしくは測光センサー、または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）、化学感受性電界効果トランジスタ（ＣＨＥＭＦＥＴ）、懸濁ゲート電界効果トランジスタ（ＳＧＦＥＴ）、もしくはイオン感受性電界効果トランジスタのような半導体電極を用いたものにより抗体濃度を測定することも可能になる。バイオセンサーの種類は、E.A.H.HallおよびG.Hummelにより、”Biosensors”, Apringer Verlag, Heidelberg, Germany, 1995に包括的に記載されている。イオン感受性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）または光学検出器の付加的な発展は、F.AberlおよびH.Wolfにより、”Aktuelle Trends in der Immunsensorik”, Labor 2000, pp.70-96(1993)その他に記載されている。圧電水晶共振器（piezoelectrical quartz resonator）および表面波成分により測定を行う本発明の方法は、適している；これらは、マイクロスケールで使用することができる。前記方法において、１次抗体（いわゆる「キャッチャー」）は、圧電基質上に固定され、分析されるＧＦＡＰに結合した後に測定される。そのようなセンサーは、例えば、A. Leidlらにより、”Proceedings of the Second international Symposium on Miniaturized Total Analysis System μTAS”, Basel, 1996に記載されている。C.Koslinger et al., Fresenlus J. Anal. Chem. (1994), 349: 349-354に記載されているような石英結晶ミクロスケールは、特に適している。
【００２１】
α−ホドリン抗原は、ヒト細胞株から得られる天然タンパク質、または異種性の宿主細胞、例えば、大腸菌のような細菌細胞または昆虫細胞のような真核宿主細胞における組み替えタンパク質発現を介して産生される組み換え抗体であってよい。天然のα−ホドリンまたはその一部、特にＮ末端部分の配列を含む組み換えα−ホドリン抗原は、好ましく使用される。組み換え抗原は、さらに、異種性のペプチドまたはポリペプチドドメイン、例えば発現後に精製を促進するポリ−Ｈｉｓ配列を含んでよい。
【００２２】
ＩｇＡ特異的なレセプターは、一般的に、他のクラスの免疫グロブリン、例えばＧおよび／またはＭの存在下で、クラスＡの免疫グロブリンを選択的に検出することができる抗体である。例えば、ヤギ、ラット、マウス、ウサギ等の試験動物を免疫化することにより得られるポリクローナル抗ＩｇＡ抗血清は、この目的に使用されてよい。対応するモノクローナル抗ＩｇＡ抗体が使用されてもよい。
【００２３】
既に述べたように、一般的な特定の試験構成は重要な意味を持たない。しかしながら、異種性の試験形態は、スペクトリン、特にα−ホドリン抗原、検出されるべきＩｇＡ自己抗体および固相に結合されたＩｇＡ特異的なレセプターからなる免疫複合体の使用である（サンドイッチ試験形態）。しかしながら、競合的な試験形態も選択されてよい。
【００２４】
異種性のサンドイッチ試験形態においては、
（ａ）α−ホドリン抗原のような固相に固定化されたスペクトリンおよび標識されたＩｇＡ特異的なレセプター、または
（ｂ）固相に結合されたＩｇＡ特異的なレセプターおよびα−ホドリン抗原のような標識されたスペクトリン
を使用することができる。
【００２５】
マイクロタイタープレート、ビーズ、バイオチップ等の反応容器が固相として使用されてよい。固相への抗原またはレセプターの固定化は、吸着性の相互作用、共有結合または高親和性の結合ペア（ストレプトアビジン／ビオチン、ハプテン／抗ハプテン抗体）による媒介により達成されてよい。固定化された試験試薬は、固相に既に結合された形態または試験の過程の間に固定化される形態で使用されてよい。
【００２６】
前記方法は、液体試験（例えば反応容器中で）または乾燥試験（例えば試験ストリップ（strip）上で）行われてよい。
【００２７】
標識された試験試薬は、それ自体、検出可能なもしくはシグナル放出の基を有するか（直接標識）、または検出可能な基と結合可能であってよい（間接標識）。標識基は、免疫学的な検出方法についての先行技術から既知の全ての標識基から選択可能であり、例えば、酵素、金属もしくはラテックス粒子、および発光もしくは蛍光基が挙げられる。標識基については、例えばペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素から選択されることが好ましく、前記方法はＥＬＩＳＡ形態で行われることが好ましい。
【００２８】
本発明は、
（ａ）スペクトリン抗原、特にα−ホドリン抗原、および
（ｂ）ＩｇＡ特異的なレセプター
を含んでなる、多発性硬化症の診断のための試験キットの使用にも関する。
【００２９】
前記試験キットは、さらに、（ｃ）前記試験試薬（ａ）もしくは（ｂ）が結合した、または結合することができる固相を含んでよい。前記試験キットは、さらに、好ましくは、（ｄ）前記試験試薬（ａ）もしくは（ｂ）の１つが結合した、または結合することができる標識基を含む。
【００３０】
さらに、前記試験キットは、他の免疫グロブリンクラスのα−ホドリン抗体も決定されるべき場合には、（ｅ）ＩｇＡ自己抗体以外の少なくとも１の他の抗体クラスに特異的な試験試薬を含んでよい。そのような抗体クラス特異的な試験試薬の例は、ＩｇＧ自己抗体の選択的な結合のための抗ＩｇＧ抗体またはプロテインＧ、ＩｇＭ自己抗体の選択的な結合のための抗ＩｇＭ抗体である。前記試験キットは、さらに、バッファー、基質および界面活性剤のような他の通常の試薬を含んでよい。
【００３１】
本発明はさらに、以下の実施例により説明される。
【実施例】
【００３２】
臨床的に安定なＭＳに罹患している９９人の患者ならびに急性の再発が検査され、高用量のステロイドを静脈内に投与されて治療された２７人の患者からの血清を用いた。この血清は、治療の前および後で採取した。治療されていない患者のみならず、インターフェロンＢまたは酢酸グラチラマーで治療された患者も試験に受け入れた。血清は−２０℃で凍結し、通常のＥＬＩＳＡによりＩｇＧおよびＩｇＡα−ホドリン抗体の存在について検査し（Aesku. Diagnostics, Wendeldheim, DEからのAESKULISA α−ホドリンＡ）、ならびにＨｅｐ−２細胞に由来する抗核抗体（ＡＮＡ）について試験した（Aesku. Diagnostics, Wendeldheim, DEからのAesku.スライド）。同時に、これらの抗体の濃度も測定され、実際にＩｇＧのみならずＩｇＡの値について、１５Ｕ／ｍＬの極限値を超える血清は陽性と判断された。
【００３３】
９９人の患者のうち６人（６．０６％）は、急性の再発を伴う２７人の患者のうち１０人（３７．０４％）と比較して上昇したＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗α−ホドリンレベルを示した（Ｐ＜０．００１）。ステロイドでの治療後、全ての患者において抗体のレベルが低下した。２６人の臨床的に安定な患者において、血清は、１年間に渡って繰り返し採取された（０、１、３、６および１２ヶ月後）。これらの患者における抗体レベルは同じに維持されるように見えた。ＭＳに罹患した７７人の患者において、ＡＮＡについての試験は、１：３２０以上の値を示し（２３．４％）、患者の４９．４％は、１：１６０以上の値を示した。抗α−ホドリンの力価とＡＮＡとの間の関係は、確認できなかった。α−ホドリンまたは１２０ｋＤａの大きさを有するその新抗原は、それ故、ＭＳ再発、特にサブタイプ３およびサブタイプ２の出現に対する重要な指標となる。
【表１】
2010503835.tif 000002
【国際調査報告】
2010503835.tif 000003
2010503835.tif 000004
2010503835.tif 000005
2010503835.tif 000006
2010503835.tif 000007
2010503835.tif 000008
2010503835.tif 000009
2010503835.tif 000010