(57)【要約】本発明は、哺乳動物に、Ａｘｌ遺伝子発現のインヒビターまたはＡｘｌタンパク質活性のインヒビターを投与することを含む、骨障害および軟骨障害の処置または予防するための方法を提供する。本発明は、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成異常症、変形性関節症、オステオミエローマ（ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｏｍａ）、骨折、パジェット病、骨形成不全症、骨硬化症、形成不全性（ａｐｌａｓｔｉｃ）骨障害、体液性高カルシウム血症性骨髄腫、多発性骨髄腫、転移後の骨菲薄化（ｔｈｉｎｎｉｎｇ）、高カルシウム血症、慢性腎疾患、腎臓透析、原発性副甲状腺機能亢進症、続発性副甲状腺機能亢進症、炎症性腸疾患、クローン病、コルチコステロイドの長期使用、または性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニストもしくはアンタゴニストの長期使用などの骨障害の処置におけるＡｘｌモジュレーターの治療的使用に関する。
2010532360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物にＡｘｌ遺伝子発現のインヒビターを投与することを含む、哺乳動物の骨障害を処置または予防する方法。
【請求項２】
哺乳動物にＡｘｌタンパク質活性のインヒビターを投与することを含む、哺乳動物の骨障害を処置または予防する方法。
【請求項３】
Ａｘｌタンパク質活性がＡｘｌキナーゼ活性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該インヒビターが骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）タンパク質ではない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該インヒビターが、構造式（Ｉ）：
【化３】
2010532360.tif 000010
を有するもの、またはその塩、水和物、溶媒和物もしくはＮ−オキシドであり、式中、
Ｂは、
【化４】
2010532360.tif 000011
であり、
式中、Ｒ５およびＲ６は一緒になって、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換された、３〜４個の原子の飽和もしくは不飽和アルキレンまたは飽和もしくは不飽和ヘテロアルキレン鎖を形成しており；
Ｒ２は、１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された（Ｃ６〜Ｃ２０）アリール、１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された５〜２０員のヘテロアリール、１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された（Ｃ７〜Ｃ２８）アリールアルキル、および１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された６〜２８員のヘテロアリールアルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、合計３〜１６個の環内炭素原子を含み、Ｒ７基で置換されている飽和もしくは不飽和の架橋もしくは非架橋シクロアルキルであり、ただし、Ｒ４が不飽和の非架橋シクロアルキル、または飽和の架橋シクロアルキルである場合、このＲ７置換基は任意選択的であるものとし、式中、Ｒ４は、さらに、１つ以上のＲｆで任意選択的に置換され；
Ｒ７は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｄＲｄ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｄＯＲｄ、または−Ｃ（Ｏ）ＮＲｄＮＲｄＲｄからなる群より選択され；
各Ｒ８基は、他のものと独立して、水溶性化基、Ｒａ、Ｒｂ、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ８アルキル、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキル、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換された３〜１２個の環内原子を含むヘテロシクロアルキル、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ８アルコキシ、ならびに−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−Ｒｂ（式中、ｘは１〜６である）からなる群より選択され；
各Ｒａは、他のものと独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、架橋もしくは非架橋Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、３〜１２個の環内原子を含む架橋もしくは非架橋ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール、および（Ｃ７〜Ｃ２０）アリールアルキルからなる群より選択され、ここで、Ｒａは、１つ以上のＲｆで任意選択的に置換されており；
各Ｒｂは、他のものと独立して、＝Ｏ、−ＯＲａ、（Ｃ１〜Ｃ３）ハロアルキルオキシ、＝Ｓ、−ＳＲａ、＝ＮＲａ、＝ＮＯＲａ、−ＮＲｃＲｃ、ハロゲン、−Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−Ｓ（Ｏ）Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲａ、−Ｓ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｃＲｃ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲａ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＯＲａ、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（ＮＲａ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（ＮＯＨ）Ｒａ、−Ｃ（ＮＯＨ）ＮＲｃＲｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＲｃＲｃおよび−ＯＣ（ＮＲａ）ＮＲｃＲｃからなる群より選択される適当な基であり；各Ｒｃは、他のものと独立してＲａであるか、または同じ窒素原子に結合している２つのＲｃが、これら両方が結合している該窒素原子と一緒になって、５〜８個の環内原子を含むヘテロシクロアルキル基を形成しており、該ヘテロシクロアルキル基は、任意選択で、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｒａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）Ｒａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｓ（Ｏ）２ＯＲａ）−および−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲａ）−（式中、ｙは０〜６である）からなる群より選択される１〜３個のさらなるヘテロ原子基を含み、該ヘテロシクロアルキルは、１つ以上のＲｆで任意選択的に置換されており；
各Ｒｄは、他のものと独立して、Ｒａ、Ｒｃおよびキラル補助基からなる群より選択され；ならびに
各Ｒｆは、独立して、−Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シアノ、ニトロ、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）アミノ、フェニル、ベンジル、オキソ、もしくはハロゲンであるか、
または隣接する原子に結合している任意の２つのＲｆが、これらが各々結合している該原子と一緒になって、５〜８個の環内原子を含む飽和もしくは不飽和の縮合シクロアルキルまたは飽和もしくは不飽和ヘテロシクロ縮合アルキル基を形成しており、ここで、形成されたシクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、各々独立してハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキルおよびフェニルから選択される１つ以上の基で任意選択的に置換されている、
請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
骨障害が、骨減少症、骨軟化症、骨粗鬆症、変形性関節症、オステオミエローマ、骨形成異常症、パジェット病、骨形成不全症、骨硬化症、形成不全性骨障害、体液性高カルシウム血症性骨髄腫、多発性骨髄腫、または転移後の骨菲薄化である、請求項１〜５のいずれか１項以上に記載の方法。
【請求項７】
該障害が骨粗鬆症である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
骨粗鬆症が、閉経後、ステロイド誘導性、老人性、またはサイロキシン使用誘導性である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
骨障害が、高カルシウム血症、慢性腎疾患、腎臓透析、原発性副甲状腺機能亢進症、続発性副甲状腺機能亢進症、炎症性腸疾患、クローン病、コルチコステロイドの長期使用、または性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニストもしくはアンタゴニストの長期使用の少なくとも１つによって引き起こされたものである、請求項１〜８のいずれか１項以上に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物にＡｘｌ遺伝子発現のインヒビターを、哺乳動物において骨芽細胞の数または骨芽細胞の活性を増大させるのに充分な量および期間で投与することを含む、哺乳動物において骨芽細胞の数または骨芽細胞の活性を増大させる方法。
【請求項１１】
該インヒビターがＢＭＰ２ではない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該インヒビターが、構造式（Ｉ）：
【化５】
2010532360.tif 000012
を有するもの、またはその塩、水和物、溶媒和物もしくはＮ−オキシドであり、式中、
Ｂは、
【化６】
2010532360.tif 000013
であり、
式中、Ｒ５およびＲ６は一緒になって、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換された、３〜４個の原子の飽和もしくは不飽和アルキレンまたは飽和もしくは不飽和ヘテロアルキレン鎖を形成しており；
Ｒ２は、１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された（Ｃ６〜Ｃ２０）アリール、１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された５〜２０員のヘテロアリール、１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された（Ｃ７〜Ｃ２８）アリールアルキル、および１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された６〜２８員のヘテロアリールアルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、合計３〜１６個の環内炭素原子を含み、Ｒ７基で置換されている飽和もしくは不飽和の架橋もしくは非架橋シクロアルキルであり、ただし、Ｒ４が不飽和の非架橋シクロアルキル、または飽和の架橋シクロアルキルである場合、このＲ７置換基は任意選択的であるものとし、式中、Ｒ４は、さらに、１つ以上のＲｆで任意選択的に置換され；
Ｒ７は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｄＲｄ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｄＯＲｄ、または−Ｃ（Ｏ）ＮＲｄＮＲｄＲｄからなる群より選択され；
各Ｒ８基は、他のものと独立して、水溶性化基、Ｒａ、Ｒｂ、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ８アルキル、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキル、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換された３〜１２個の環内原子を含むヘテロシクロアルキル、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ８アルコキシ、ならびに−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−Ｒｂ（式中、ｘは１〜６である）からなる群より選択され；
各Ｒａは、他のものと独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、架橋もしくは非架橋Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、３〜１２個の環内原子を含む架橋もしくは非架橋ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール、および（Ｃ７〜Ｃ２０）アリールアルキルからなる群より選択され、ここで、Ｒａは、１つ以上のＲｆで任意選択的に置換されており；
各Ｒｂは、他のものと独立して、＝Ｏ、−ＯＲａ、（Ｃ１〜Ｃ３）ハロアルキルオキシ、＝Ｓ、−ＳＲａ、＝ＮＲａ、＝ＮＯＲａ、−ＮＲｃＲｃ、ハロゲン、−Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−Ｓ（Ｏ）Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲａ、−Ｓ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｃＲｃ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲａ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＯＲａ、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（ＮＲａ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（ＮＯＨ）Ｒａ、−Ｃ（ＮＯＨ）ＮＲｃＲｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＲｃＲｃおよび−ＯＣ（ＮＲａ）Ｎ−ＲｃＲｃからなる群より選択される適当な基であり；各Ｒｃは、他のものと独立してＲａであるか、または同じ窒素原子に結合している２つのＲｃが、これら両方が結合している該窒素原子と一緒になって、５〜８個の環内原子を含むヘテロシクロアルキル基を形成しており、該ヘテロシクロアルキル基は、任意選択で、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｒａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）Ｒａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｓ（Ｏ）２ＯＲａ）-および−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲａ）−（式中、ｙは０〜６である）からなる群より選択される１〜３個のさらなるヘテロ原子基を含み、該ヘテロシクロアルキルは、１つ以上のＲｆで任意選択的に置換されており；
各Ｒｄは、他のものと独立して、Ｒａ、Ｒｃおよびキラル補助基からなる群より選択され；ならびに
各Ｒｆは、独立して、−Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シアノ、ニトロ、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）アミノ、フェニル、ベンジル、オキソ、もしくはハロゲンであるか、
または隣接する原子に結合している任意の２つのＲｆが、これらが各々結合している該原子と一緒になって、５〜８個の環内原子を含む飽和もしくは不飽和縮合シクロアルキルまたは飽和もしくは不飽和のヘテロシクロ縮合アルキル基を形成しており、ここで、形成されたシクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、各々独立してハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキルおよびフェニルから選択される１つ以上の基で任意選択的に置換されている、
請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
骨芽細胞の数または活性の増大により、骨芽細胞マーカーの発現の増大がもたらされる、請求項１０〜１２のいずれか１項以上に記載の方法。
【請求項１４】
骨芽細胞マーカーが、オステオカルシン、アルカリホスファターゼ、またはＩ型コラーゲンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
骨芽細胞の数または骨芽細胞の活性の増大により、骨老化のレベル、骨量の減少、骨塩量の減少、骨質の変質、または骨微細構造の完全性の変質の少なくとも１つが低下する、請求項１０〜１４のいずれか１項以上に記載の方法。
【請求項１６】
該インヒビターが、化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー、またはポリヌクレオチドである、請求項１〜１５のいずれか１項以上に記載の方法。
【請求項１７】
該インヒビターが、Ａｘｌ遺伝子の転写を抑制または低減させるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
該インヒビターが、Ａｘｌメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の翻訳を抑制または低減させるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
該インヒビターがポリヌクレオチドである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
該ポリヌクレオチドがリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該ＲＮＡがアンチセンスである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該ＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
該ＲＮＡが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該ｓｉＲＮＡが約１５〜約４０ヌクレオチド長である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列が、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、または配列番号：６である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該ｓｉＲＮＡがマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の配列を含む、請求項２３〜２５のいずれか１項以上に記載の方法。
【請求項２７】
該ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
該ＤＮＡがアンチセンスＤＮＡである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
哺乳動物にＡｘｌタンパク質活性のインヒビターを、哺乳動物において骨芽細胞の数または骨芽細胞の活性を増大させるのに充分な量および期間で投与することを含む、哺乳動物において骨芽細胞の数または骨芽細胞の活性を増大させる方法。
【請求項３０】
骨芽細胞の数または活性の増大により、骨芽細胞マーカーの発現の増大がもたらされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
骨芽細胞マーカーが、オステオカルシン、アルカリホスファターゼ、またはＩ型コラーゲンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
骨芽細胞の数または骨芽細胞の活性の増大により、骨老化のレベル、骨量の減少、骨塩量の減少、骨質の変質、または骨微細構造の完全性の変質の少なくとも１つが低下する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
該インヒビターが、化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー、またはポリヌクレオチドである、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
該インヒビターが、Ａｘｌタンパク質のチロシンキナーゼ活性を低下させるものである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
該インヒビターが、構造式（Ｉ）：
【化７】
2010532360.tif 000014
を有するもの、またはその塩、水和物、溶媒和物もしくはＮ−オキシドであり、式中、
Ｂは、
【化８】
2010532360.tif 000015
であり、
式中、Ｒ５およびＲ６は一緒になって、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換された、３〜４個の原子の飽和もしくは不飽和アルキレンまたは飽和もしくは不飽和ヘテロアルキレン鎖を形成しており；
Ｒ２は、１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された（Ｃ６〜Ｃ２０）アリール、１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された５〜２０員のヘテロアリール、１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された（Ｃ７〜Ｃ２８）アリールアルキル、および１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された６〜２８員のヘテロアリールアルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、合計３〜１６個の環内炭素原子を含み、Ｒ７基で置換されている飽和もしくは不飽和の架橋もしくは非架橋シクロアルキルであり、ただし、Ｒ４が不飽和の非架橋シクロアルキル、または飽和の架橋シクロアルキルである場合、このＲ７置換基は任意選択的であるものとし、式中、Ｒ４は、さらに、１つ以上のＲｆで任意選択的に置換され；
Ｒ７は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｄＲｄ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｄＯＲｄ、または−Ｃ（Ｏ）ＮＲｄＮＲｄＲｄからなる群より選択され；
各Ｒ８基は、他のものと独立して、水溶性化基、Ｒａ、Ｒｂ、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ８アルキル、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキル、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換された３〜１２個の環内原子を含むヘテロシクロアルキル、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ８アルコキシ、ならびに−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−Ｒｂ（式中、ｘは１〜６である）からなる群より選択され；
各Ｒａは、他のものと独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、架橋もしくは非架橋Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、３〜１２個の環内原子を含む架橋もしくは非架橋ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール、および（Ｃ７〜Ｃ２０）アリールアルキルからなる群より選択され、ここで、Ｒａは、１つ以上のＲｆで任意選択的に置換されており；
各Ｒｂは、他のものと独立して、＝Ｏ、−ＯＲａ、（Ｃ１〜Ｃ３）ハロアルキルオキシ、＝Ｓ、−ＳＲａ、＝ＮＲａ、＝ＮＯＲａ、−ＮＲｃＲｃ、ハロゲン、−Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−Ｓ（Ｏ）Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲａ、−Ｓ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｃＲｃ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲａ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＯＲａ、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（ＮＲａ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（ＮＯＨ）Ｒａ、−Ｃ（ＮＯＨ）ＮＲｃＲｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＲｃＲｃおよび−ＯＣ（ＮＲａ）ＮＲｃＲｃからなる群より選択される適当な基であり；各Ｒｃは、他のものと独立してＲａであるか、または同じ窒素原子に結合している２つのＲｃが、これら両方が結合している該窒素原子と一緒になって、５〜８個の環内原子を含むヘテロシクロアルキル基を形成しており、該ヘテロシクロアルキル基は、任意選択で、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｒａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）Ｒａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｓ（Ｏ）２ＯＲａ）-および−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲａ）−（式中、ｙは０〜６である）からなる群より選択される１〜３個のさらなるヘテロ原子基を含み、該ヘテロシクロアルキルは、１つ以上のＲｆで任意選択的に置換されており；
各Ｒｄは、他のものと独立して、Ｒａ、Ｒｃおよびキラル補助基からなる群より選択され；ならびに
各Ｒｆは、独立して、−Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シアノ、ニトロ、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）アミノ、フェニル、ベンジル、オキソ、もしくはハロゲンであるか、
または隣接する原子に結合している任意の２つのＲｆが、これらが各々結合している該原子と一緒になって、５〜８個の環内原子を含む飽和もしくは不飽和の縮合シクロアルキルまたは飽和もしくは不飽和ヘテロシクロ縮合アルキル基を形成しており、ここで、形成されたシクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、各々独立してハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキルおよびフェニルから選択される１つ以上の基で任意選択的に置換されている、
請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
該インヒビターが、Ａｘｌタンパク質と少なくとも１つのＡｘｌタンパク質リガンドとの相互作用を阻害するものである、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
該インヒビターが、Ａｘｌタンパク質と、増殖停止特異的６（Ｇａｓ６）タンパク質；プロテインＳ；ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｓｏｌ）３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質のｐ８５αサブユニット、ＰＩ３Ｋタンパク質のｐ８５βサブユニット；ホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）タンパク質、増殖因子受容体結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）；ｃ−Ｓｒｃタンパク質；Ｒａｓタンパク質；Ａｋｔタンパク質；ＥＲＫ／ＭＡＰＫタンパク質；ＮＦ−κＢタンパク質；ＧＳＫ３タンパク質；ＩＬ−１５受容体αサブユニットタンパク質；またはｍＴＯＲタンパク質の少なくとも１つとの相互作用を阻害するものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
該インヒビターが、Ｇａｓ６タンパク質によるＡｘｌタンパク質の活性化を抑制するものである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
該インヒビターが、Ａｘｌタンパク質のＧａｓ６主結合部位に結合するものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該インヒビターがＡｘｌに対するＧａｓ６の結合を抑制するものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
該インヒビターがタンパク質である、請求項２９〜４０いずれかに記載の方法。
【請求項４２】
該タンパク質がプロテアーゼである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
該タンパク質が、可溶性Ａｘｌタンパク質またはその断片、変異型Ａｘｌタンパク質またはその断片、Ａｘｌタンパク質リガンドまたはその断片である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
該タンパク質が変異型Ａｘｌタンパク質である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
変異型Ａｘｌタンパク質が、配列番号：２のアミノ酸５６７位のリシンに対してアルギニン置換を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
該インヒビターが抗体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
該インヒビターが、スモール・モジュラー・イムノファーマシューティカル（ＳＭＩＰ）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
該抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
該抗体がＡｘｌタンパク質に特異的に結合するものである、請求項４６または請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
該抗体がＡｘｌタンパク質のＧａｓ６主結合部位に結合するものである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該抗体がＧａｓ６以外のＡｘｌタンパク質リガンドに特異的に結合するものである、請求項４６または請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
哺乳動物がヒトである、請求項１〜５１いずれかに記載の方法。
【請求項５３】
該インヒビターが全身投与される、請求項１〜５２いずれかに記載の方法。
【請求項５４】
該インヒビターが、少なくとも２週間の期間にわたって繰り返し投与される、請求項１〜５３いずれかに記載の方法。
【請求項５５】
該インヒビターが損傷部位に投与される、請求項１〜５４いずれかに記載の方法。
【請求項５６】
さらに、哺乳動物に、ビスホスホネート、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、カルシトニン、エストロゲン、選択的エストロゲン受容体インヒビター、副甲状腺ホルモン、ビタミン、ＲＡＮＫＬインヒビター、カテプシンＫインヒビター、スクレロスチンインヒビター、ラネリック酸ストロンチウムからなる群より選択される少なくとも１種類の薬剤を投与することを含む、請求項１〜５５いずれかに記載の方法。
【請求項５７】
該薬剤がビスホスホネートである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
該薬剤がＢＭＰである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
該ＢＭＰが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、またはそのヘテロ二量体である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
該ＢＭＰがＢＭＰ２／ＢＭＰ６ヘテロ二量体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
哺乳動物にＡｘｌタンパク質活性のアゴニストを投与することを含む、哺乳動物において骨芽細胞の数の増加または骨芽細胞の活性の増大と関連している骨障害を処置または予防する方法。
【請求項６２】
哺乳動物にＡｘｌ遺伝子発現のアゴニストを投与することを含む、哺乳動物において骨芽細胞の数の増加または骨芽細胞の活性の増大と関連している骨障害を処置または予防する方法。
【請求項６３】
該障害が、硬化性骨異形成症、骨格系骨異形成症、骨内性骨増殖症、カムラチ・エンゲルマン病、ファン・ブッヘム病、硬結性骨化症、常染色体優性骨硬化症、常染色体優性大理石骨病Ｉ型、ワース病、および進行性骨化性線維形成異常症から選択される、請求項６１または請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ａ．細胞を試験化合物と接触させること、および
ｂ．該細胞内のＡｘｌ遺伝子発現が該化合物によって変化させられているかどうかを調べること
を含み、ここで、Ａｘｌ遺伝子発現の変化は、試験化合物が骨成長をモジュレートするものであることを示す、
骨成長をモジュレートする化合物の同定方法。
【請求項６５】
該細胞が骨芽細胞または骨芽細胞前駆細胞である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
試験化合物がＡｘｌ遺伝子発現を阻害するものである、請求項６４または請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
試験化合物がＡｘｌ遺伝子発現のアゴニストである、請求項６４または請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
ａ）細胞を試験化合物と接触させること、および
ａ．該細胞のＡｘｌタンパク質活性が該化合物によって変化させられているかどうかを調べること
を含み、ここで、Ａｘｌタンパク質活性の変化は、試験化合物が骨成長をモジュレートするものであることを示す、
骨成長をモジュレートする化合物の同定方法。
【請求項６９】
該細胞が、骨芽細胞、骨芽細胞前駆細胞、間葉幹細胞、骨髄由来の骨芽前駆細胞、または血中に循環している骨芽前駆細胞である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
試験化合物がＡｘｌタンパク質活性を低下させるものである、請求項６８または請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
試験化合物がＡｘｌタンパク質活性を増大（ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｏｆ）させるものである、請求項６８または請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
Ａｘｌタンパク質活性がＡｘｌキナーゼ活性である、請求項６８〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
ａ）キナーゼ活性を有するＡｘｌポリペプチドを準備すること；
ｂ）Ａｘｌポリペプチドの存在下でリン酸化される基質を準備すること；
ｃ）Ａｘｌポリペプチドを該基質と、該基質のリン酸化が可能な条件下で混合すること；
ｄ）ｃ）の混合物を化合物と接触させること；および
ｅ）該化合物によってＡｘｌキナーゼ活性がモジュレートされているか否かを判定すること
を含む、Ａｘｌタンパク質キナーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法。
【請求項７４】
Ａｘｌポリペプチドが、配列番号：１３、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、または配列番号：４２のアミノ酸配列を有する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
Ａｘｌポリペプチドが、配列番号：１３、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、または配列番号：４２のアミノ酸配列を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
Ａｘｌポリペプチドが、配列番号：１３、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：４３のアミノ酸配列を有する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
Ａｘｌポリペプチドが、配列番号：１３、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：４３のアミノ酸配列を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
該基質が、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：３５、または配列番号：３６のアミノ酸配列を含む、請求項７３または請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
該基質が、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：３５、または配列番号：３６のアミノ酸配列を有する、請求項７３または請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
ａ．被検体から試験試料を採取すること；
ｂ．該試験試料中のＡｘｌ遺伝子の発現レベルを測定すること；
ｃ．該試験試料中のＡｘｌ遺伝子の発現レベルを対照試料中のＡｘｌ遺伝子の発現レベルと比較すること
を含み、ここで、対照試料中のＡｘｌ遺伝子の発現レベルと比べて試験試料中のＡｘｌ遺伝子発現レベルが変化させられていることは骨密度の変化を示す、
被検体における骨密度の変化のスクリーニング方法。
【請求項８１】
試験試料中のＡｘｌ遺伝子の発現レベルが対照試料と比べて増大している、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
試験試料中のＡｘｌ遺伝子の発現レベルが対照試料と比べて減少している、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
ａ）被検体から試験試料を採取すること；
ｂ）該試験試料中のＡｘｌタンパク質の活性レベルを測定すること；
ｃ）試験試料中のＡｘｌタンパク質の活性レベルを対照試料中のＡｘｌタンパク質の活性レベルと比較すること
を含み、ここで、対照試料中のＡｘｌタンパク質の活性レベルと比べて試験試料中のＡｘｌタンパク質の活性レベルが変化させられていることは骨密度の変化を示す、
被検体における骨密度の変化のスクリーニング方法。
【請求項８４】
試験試料中のＡｘｌタンパク質の活性レベルが対照試料と比べて増大している、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
試験試料中のＡｘｌタンパク質の活性レベルが対照試料と比べて減少している、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
Ａｘｌタンパク質の活性レベルが、Ａｘｌタンパク質に特異的に結合する捕捉試薬を用いて測定される、請求項８１〜８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
Ａｘｌ捕捉試薬が抗体である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８８】
該抗体が、検出可能な標識を用いて検出される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
検出可能な標識が、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、比色化合物、または化学発光化合物である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
少なくとも１種類のＡｘｌポリペプチドに特異的に結合する捕捉試薬、バッファー、および少なくとも１種類のＡｘｌポリペプチドに対する該捕捉試薬の結合を検出するための試薬を備えるキット。
【請求項９１】
該捕捉試薬が、検出可能な標識を含む、請求項８８に記載のキット。
【請求項９２】
該捕捉試薬が抗体である、請求項８８または８９に記載のキット。
【請求項９３】
被検体由来の試験試料において、Ａｘｌをコードするポリヌクレオチド内の少なくとも１つの変異の存在を調べること
を含み、ここで、Ａｘｌをコードするポリヌクレオチド内の前記少なくとも１つの変異の存在は、該被検体における骨密度の変化、骨量の変化、骨質の変化、または骨形成の変化を示す、
被検体の骨塩量レベルの変化、骨量の変化、骨質の変化、骨形成の変化、または骨微細構造の完全性の変化のスクリーニング方法。
【請求項９４】
Ａｘｌをコードするポリヌクレオチド内の少なくとも１つの変異の存在または非存在が、試料を、Ａｘｌをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させることにより検出される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
該オリゴヌクレオチドプローブが、Ａｘｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチドを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
該ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡからなる群より選択される、請求項９１〜９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９７】
該ポリヌクレオチドが変異型Ａｘｌタンパク質をコードするものである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
変異型Ａｘｌタンパク質が、配列番号：２のアミノ酸５６７位のリシンに対してアルギニン置換を有する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１００】
配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年７月２日に出願された米国仮特許出願第６０／９５８，２７０号および２００７年７月３日に出願された米国仮特許出願第６０／９５８，３１６号の利益を主張する。これらの出願の全ての内容は、その全体が参考により本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成異常症、変形性関節症、オステオミエローマ（ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｏｍａ）、骨折、パジェット病、骨形成不全症、骨硬化症、形成不全性（ａｐｌａｓｔｉｃ）骨障害、体液性高カルシウム血症性骨髄腫、多発性骨髄腫、転移後の骨菲薄化（ｔｈｉｎｎｉｎｇ）、高カルシウム血症、慢性腎疾患、腎臓透析、原発性副甲状腺機能亢進症、続発性副甲状腺機能亢進症、炎症性腸疾患、クローン病、コルチコステロイドの長期使用、または性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニストもしくはアンタゴニストの長期使用などの骨障害の処置におけるＡｘｌモジュレーターの治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
受容体型チロシンキナーゼ（「ＲＴＫ」）は、細胞外環境からのシグナルの伝達に関与している。かかるシグナルによって、多種多様な細胞応答、例えば、増殖、分化、遊走、および代謝が誘導される。配列の類似性に基づき、既知のＲＴＫは、１０種類を超える異なるサブファミリーに分類されている。Ｍｅｒ受容体サブファミリーには、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、およびＭｅｒが含まれる。Ａｘｌはまた、数ある中でＵｆｏ、Ｔｙｒｏ７およびＡｒｋとしても知られているが、本明細書では「Ａｘｌ」と称する。新規なＡｘｌ相同ＲＴＫとしてクローニングされたＴｙｒｏ３は、数ある中でＲｓｅ、ＢｒｔおよびＳｋｙとしても知られているが、本明細書では「Ｔｙｒｏ３」と称する。ヒト（単球ならびに上皮組織および生殖系組織）で最初に報告された発現パターンにちなんで命名されたＭｅｒは、ニワトリｃ−ｅｙｋの哺乳動物の推定ホモログである。この受容体は、２つの免疫グロブリン様ドメイン、２つのフィブロネクチンＩＩＩ型反復配列、膜貫通ドメイン、および保存された触媒性キナーゼ領域を含む細胞質ドメインを含む細胞外ドメインを特徴とする個々に異なる構造を共有している（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００４】
単一分子のリガンドである増殖停止特異的遺伝子６（Ｇａｓ６）は、Ｍｅｒ受容体サブファミリーのチロシンキナーゼ活性を活性化する（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。Ｇａｓ６は、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３およびＭｅｒにナノモルの親和性で結合するビタミンＫ依存性タンパク質をコードしている（非特許文献６）。Ａｘｌ、ＭｅｒおよびＴｙｒｏ３三重ノックアウトマウスは、リンパ球増殖および自己免疫表現型を示すが、Ａｘｌのみが欠損したマウスは免疫表現型を示さず、これは、これらの３つの関連するキナーゼが協調して機能していることを示す（非特許文献７）。Ａｘｌに対するＧａｓ６の結合により細胞接着、増殖および凝集が調節され、この結合は、一部の癌、例えば、慢性骨髄性白血病、大腸癌、および黒色腫に関与している。Ａｘｌの役割は、多種多様な生理学的プロセス、例えば、精子形成、血管の細胞機能、２型糖尿病の進行、および神経の発生において示唆されている。また、Ａｘｌは、例えば、アテローム性動脈硬化性病変と関連する異所性石灰化時、周皮細胞において発現されるため、心血管の障害にも関与している（非特許文献８）。
【０００５】
Ａｘｌは、骨芽前駆細胞を含む集団である骨髄間質細胞で発現される（非特許文献９）。また、Ａｘｌの発現は骨芽前駆細胞株でも見られるが、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）を添加するとＡｘｌ  ｍＲＮＡの発現が阻害された（特許文献１；特許文献２）。しかしながら、この観察結果にもかかわらず、骨の発生中にＡｘｌが何らかの直接的な役割を果たしているのか、またはＡｘｌの阻害は単にＢＭＰ２の活性の結果であるのかは、依然として不明なままである。
【０００６】
骨粗鬆症は、米国で最も多く見られる骨障害であり、現在、推定２０００万人が罹患しており、さらに３４００万人の米国人が、将来的に骨粗鬆症になる高リスクにさらされるのに充分に低い骨量を有する。毎年１５０万例の骨折の原因は骨粗鬆症であり、その骨折のうちほぼ８５％は、患者の股関節部、脊柱または手首で起こっている。男女両方とも骨粗鬆症になるが、閉経後の女性に最も高頻度に観察されている。また、骨量および／または骨塩量（ＢＭＤ）の減少は、慢性グルココルチコイド療法、早期性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ不足、不充分なカルシウム摂取、続発性副甲状腺機能亢進症、または神経性食欲不振に起因することがあり得る。
【０００７】
したがって、特にヒト用の、骨粗鬆症および変形性関節症などの骨障害の新規な治療剤を開発する必要性が継続して存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０２／０８１７４５号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６００３０５４１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｅｉｒｉｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６０５２−６０５８（２００４）
【非特許文献２】Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３００２２−３００２７（１９９６）
【非特許文献３】Ｖａｒｎｕｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：６２３−６２６（１９９５）
【非特許文献４】Ｍａｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９７８５−９７８９（１９９６）
【非特許文献５】Ｃｈｅｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０３３−２０３９（１９９７）
【非特許文献６】Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９７８５−９７８９（１９９６）
【非特許文献７】Ｌｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：３０６−３１１（２００１）
【非特許文献８】Ｃｏｌｌｅｔｔら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９２：１１２３−１１２９（２００３）
【非特許文献９】Ｓａｔｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７７：４２６−４３８（１９９８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
一実施形態において、本発明は、哺乳動物に、Ａｘｌ遺伝子発現のインヒビターまたはＡｘｌタンパク質活性のインヒビターを投与することを含む、哺乳動物の骨障害を処置または予防する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、該インヒビターが骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）ではない方法を提供する。一実施形態において、該インヒビターは、Ａｘｌタンパク質のチロシンキナーゼ活性を低下させるものである。一実施形態において、本発明は、Ａｘｌタンパク質活性のインヒビターが構造式（Ｉ）：
【００１１】
【化１】
2010532360.tif 000003
を有するもの、またはその塩、水和物、溶媒和物もしくはＮ−オキシドである方法であって、式中、
Ｂは、
【００１２】
【化２】
2010532360.tif 000004
であり、
式中、Ｒ５およびＲ６は一緒になって、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換された、３〜４個の原子の飽和もしくは不飽和アルキレンまたは飽和もしくは不飽和ヘテロアルキレン鎖を形成しており；Ｒ２は、１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された（Ｃ６〜Ｃ２０）アリール、１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された５〜２０員のヘテロアリール、１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された（Ｃ７〜Ｃ２８）アリールアルキル、および１つ以上のＲ８で任意選択的に置換された６〜２８員のヘテロアリールアルキルからなる群より選択され；Ｒ４は、合計３〜１６個の環内炭素原子を含み、Ｒ７基で置換されている飽和もしくは不飽和の架橋されたもしくは非架橋シクロアルキルである、ただし、Ｒ４が不飽和の非架橋シクロアルキル、または飽和の架橋シクロアルキルである場合、このＲ７置換基は任意選択的であるものとし、式中、Ｒ４は、さらに、１つ以上のＲｆで任意選択的に置換され；Ｒ７は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｄ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｄＲｄ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｄＯＲｄ、または−Ｃ（Ｏ）ＮＲｄＮＲｄＲｄからなる群より選択され；各Ｒ８基は、他のものと独立して、水溶性化基、Ｒａ、Ｒｂ、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ８アルキル、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキル、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換された３〜１２個の環内原子を含むヘテロシクロアルキル、１つ以上のＲａおよび／またはＲｂで任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ８アルコキシ、ならびに−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ−Ｒｂ（式中、ｘは１〜６である）からなる群より選択され；各Ｒａは、他のものと独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、架橋もしくは非架橋Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、３〜１２個の環内原子を含む架橋もしくは非架橋ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール、および（Ｃ７〜Ｃ２０）アリールアルキルからなる群より選択され、ここで、Ｒａは、１つ以上のＲｆで任意選択的に置換されており；各Ｒｂは、他のものと独立して、＝Ｏ、−ＯＲａ、（Ｃ１〜Ｃ３）ハロアルキルオキシ、＝Ｓ、−ＳＲａ、＝ＮＲａ、＝ＮＯＲａ、−ＮＲｃＲｃ、ハロゲン、−Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−Ｓ（Ｏ）Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲａ、−Ｓ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｃＲｃ、−ＯＳ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒａ、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲａ、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＯＲａ、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（ＮＲａ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（ＮＯＨ）Ｒａ、−Ｃ（ＮＯＨ）ＮＲｃＲｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲａ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＲｃＲｃおよび−ＯＣ（ＮＲａ）Ｎ−ＲｃＲｃからなる群より選択される適当な基であり；各Ｒｃは、他のものと独立してＲａであるか、または同じ窒素原子に結合している２つのＲｃが、これら両方が結合している該窒素原子と一緒になって、５〜８個の環内原子を含むヘテロシクロアルキル基を形成しており、該ヘテロシクロアルキル基は、任意選択で、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｒａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）Ｒａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ）−、−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ）−、−Ｎ（ｖ（ＣＨ２）ｙ−Ｓ（Ｏ）２ＯＲａ）-および−Ｎ（−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲａ）−（式中、ｙは０〜６である）からなる群より選択される１〜３個のさらなるヘテロ原子基を含み、該ヘテロシクロアルキルは、１つ以上のＲｆで任意選択的に置換されており；各Ｒｄは、他のものと独立して、Ｒａ、Ｒｃおよびキラル補助基からなる群より選択され；ならびに各Ｒｆは、独立して、−Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、シアノ、ニトロ、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）アミノ、フェニル、ベンジル、オキソ、もしくはハロゲンであるか、または隣接する原子に結合している任意の２つのＲｆが、これらが各々結合している該原子と一緒になって、５〜８個の環内原子を含む飽和もしくは不飽和の縮合シクロアルキルまたは飽和もしくは不飽和ヘテロシクロ縮合アルキル基を形成しており、ここで、形成されたシクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、各々独立してハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキルおよびフェニルから選択される１つ以上の基で任意選択的に置換されている方法を提供する。式Ｉの化合物は、ＰＣＴ特許公開公報ＷＯ２００７０７０８７２Ａ１および米国特許公開公報第２００７０１４２４０２号に記載および規定されている。
【００１３】
一実施形態において、骨障害は、骨減少症（ｓｔｅｏｐｅｎｉａ）、骨軟化症、骨粗鬆症、変形性関節症、オステオミエローマ、骨形成異常症、パジェット病、骨形成不全症、骨硬化症、形成不全性骨障害、体液性高カルシウム血症性骨髄腫、多発性骨髄腫、または転移後の骨菲薄化の１つ以上を含む。一実施形態において、本発明は、骨粗鬆症が、閉経後、ステロイド誘導性、老人性、またはサイロキシン使用誘導性である方法を提供する。
【００１４】
一実施形態において、骨障害は、高カルシウム血症、慢性腎疾患、腎臓透析、原発性副甲状腺機能亢進症、続発性副甲状腺機能亢進症、炎症性腸疾患、クローン病、コルチコステロイドの長期使用、または性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニストもしくはアンタゴニストの長期使用の少なくとも１つによって引き起こされたものである。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、哺乳動物にＡｘｌ遺伝子発現のインヒビターを、哺乳動物において骨芽細胞の数または骨芽細胞の活性を増大させるのに充分な量および期間で投与することを含む、哺乳動物において骨芽細胞の数または骨芽細胞の活性を増大させる方法を提供する。一実施形態において、本発明は、骨芽細胞の数または骨芽細胞の活性の増大により、骨老化のレベル、骨量の減少、骨塩量の減少、骨質の変質、および骨微細構造の完全性の変質の少なくとも１つが低下する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、該インヒビターがＢＭＰ２タンパク質ではない方法を提供する。一実施形態において、本発明は、骨芽細胞の数または活性の増大により、骨芽細胞マーカーの発現の増大がもたらされる方法を提供する。一実施形態において、骨芽細胞マーカーは、オステオカルシン、アルカリホスファターゼ、またはＩ型コラーゲンである。
【００１６】
一実施形態において、Ａｘｌ遺伝子発現のインヒビターは、化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー、またはポリヌクレオチドである。一実施形態において、Ａｘｌ遺伝子発現のインヒビターは、Ａｘｌ遺伝子の転写を抑制または低減させるものである。一実施形態において、Ａｘｌ遺伝子発現のインヒビターは、Ａｘｌメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の翻訳を抑制または低減させるものである。
【００１７】
一実施形態において、Ａｘｌ遺伝子発現のインヒビターはポリヌクレオチドである。一実施形態において、ポリヌクレオチドはリボ核酸（ＲＮＡ）である。一実施形態において、ポリヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。一実施形態において、ＲＮＡまたはＤＮＡはアンチセンスである。一実施形態において、ＲＮＡは二本鎖ＲＮＡである。一実施形態において、二本鎖ＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは約１５〜約４０ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６から選択されるヌクレオチド配列を有する。一実施形態において、ｓｉＲＮＡはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列を含む。
【００１８】
一実施形態において、本発明は、哺乳動物にＡｘｌタンパク質活性のインヒビターを、哺乳動物において骨芽細胞の数または骨芽細胞の活性を増大させるのに充分な量および期間で投与することを含む、哺乳動物において骨芽細胞の数または骨芽細胞の活性を増大させる方法を提供する。一実施形態において、骨芽細胞の数または骨芽細胞の活性の増大により、骨老化のレベル、骨量の減少、骨塩量の減少、骨質の変質、および骨微細構造の完全性の変質の少なくとも１つが低下する。
【００１９】
一部のある実施形態において、Ａｘｌタンパク質活性のインヒビターは、化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー、スモール・モジュラー（ｍｏｌｅｃｕｌｅ）・イムノファーマシューティカル（ＳＭＩＰ（商標））、またはポリヌクレオチドである。一実施形態において、該インヒビターは、Ａｘｌタンパク質のチロシンキナーゼ活性を低下させるものである。一実施形態において、該インヒビターは、Ａｘｌタンパク質と少なくとも１つのＡｘｌタンパク質リガンドとの相互作用を阻害するものである。一実施形態において、Ａｘｌタンパク質リガンドは、増殖停止特異的６（Ｇａｓ６）タンパク質；プロテインＳ；ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｓｏｌ）３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質のｐ８５５αもしくはｐ８５βサブユニット；ホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）タンパク質、増殖因子受容体結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）；ｃ−Ｓｒｃタンパク質；Ｒａｓタンパク質；Ａｋｔタンパク質；ＥＲＫ／ＭＡＰＫタンパク質；ＮＦ−κＢタンパク質；ＧＳＫ３タンパク質；ＩＬ−１５受容体αサブユニットタンパク質；またはｍＴＯＲタンパク質である。一実施形態において、該インヒビターは、Ｇａｓ６タンパク質によるＡｘｌタンパク質の活性化を抑制するものである。一実施形態において、該インヒビターは、Ａｘｌタンパク質のＧａｓ６主結合部位に結合するものである。
【００２０】
一部のある実施形態において、Ａｘｌタンパク質活性のインヒビターは、可溶性Ａｘｌタンパク質もしくはその断片、変異型Ａｘｌタンパク質もしくはその断片、またはＡｘｌタンパク質リガンドもしくはその断片である。一実施形態において、該変異型タンパク質は変異型Ａｘｌタンパク質である。一実施形態において、変異型Ａｘｌタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸５６７位のリシンに対してアルギニン置換を有するものである。
【００２１】
一部のある実施形態において、Ａｘｌタンパク質活性のインヒビターは抗体である。該抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。一部のある実施形態において、該抗体は、Ａｘｌタンパク質、Ｇａｓ６以外のＡｘｌタンパク質リガンド、Ａｘｌタンパク質のＧａｓ６主結合部位、またはＡｘｌ上へのＧａｓ６の結合を妨げる任意の他の部位に特異的に結合するものであり得る。
【００２２】
一部のある実施形態において、本発明は、哺乳動物がヒトである本明細書において上記の方法のいずれか１つ以上を提供する。一実施形態において、本発明は、Ａｘｌ遺伝子発現のインヒビターまたはＡｘｌタンパク質活性のインヒビターが全身投与されるものであり得る本明細書に記載の方法を提供する。Ａｘｌ遺伝子発現またはＡｘｌタンパク質活性のインヒビターは、少なくとも２週間の期間にわたって繰り返し投与されるものであり得る。他の実施形態において、Ａｘｌ遺伝子発現またはＡｘｌタンパク質活性のインヒビターは、局所投与されるものであり得る。該インヒビターは、マトリックスとともにインサイチュで適用されるものであり得る。
【００２３】
一部のある実施形態において、本発明は、さらに、哺乳動物に、ビスホスホネート、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、カルシトニン、エストロゲン、選択的エストロゲン受容体インヒビター、副甲状腺ホルモン、ビタミン、ＲＡＮＫＬインヒビター、カテプシンＫインヒビター、スクレロスチンインヒビター、ラネリック酸ストロンチウムからなる群より選択される少なくとも１種類の薬剤を投与することを含む、本明細書において上記の方法のいずれか１つ以上を提供する。ＢＭＰは、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、またはそのヘテロ二量体であり得る。
【００２４】
一部のある実施形態において、本発明は、哺乳動物にＡｘｌタンパク質活性のアゴニストまたはＡｘｌ遺伝子発現のアゴニストを投与することを含む、哺乳動物において骨芽細胞の数の増加または骨芽細胞の活性の増大と関連している骨障害を処置または予防する方法を提供する。一実施形態において、該障害は、例えば、硬化性骨異形成症、骨格系骨異形成症、骨内性骨増殖症、カムラチ・エンゲルマン病、ファン・ブッヘム病、硬結性骨化症、常染色体優性骨硬化症、常染色体優性大理石骨病Ｉ型、ワース（Ｗｏｒｔｈ）病、または進行性骨化性線維形成異常症であり得る。
【００２５】
一部のある実施形態において、本発明は、細胞を試験化合物と接触させること、および該細胞のＡｘｌ遺伝子発現またはＡｘｌタンパク質活性が該化合物によって変化させられているかどうかを調べることを含み、ここで、Ａｘｌ遺伝子発現またはＡｘｌタンパク質活性の変化は、試験化合物が骨成長をモジュレートするものであることを示す、骨成長をモジュレートする化合物の同定方法を提供する。一実施形態において、該細胞は、例えば、骨芽細胞または骨芽細胞前駆細胞であり得る。一実施形態において、試験化合物はＡｘｌ遺伝子発現を阻害するものである。一実施形態において、試験化合物はＡｘｌ遺伝子発現を増大させるものである。一実施形態において、試験化合物はＡｘｌタンパク質活性を阻害するものである。一実施形態において、試験化合物はＡｘｌタンパク質活性を増大させるものである。
【００２６】
一部のある実施形態において、本発明は、キナーゼ活性を有するＡｘｌポリペプチドを準備すること；Ａｘｌポリペプチドの存在下でリン酸化される基質を準備すること；該ポリペプチドと該基質を化合物と接触させること、および該ポリペプチドによってＡｘｌキナーゼ活性がモジュレートされているか否かを調べることを含む、Ａｘｌタンパク質キナーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法を提供する。一部のある実施形態において、Ａｘｌキナーゼ活性のモジュレーターの同定方法は、キナーゼ活性を有するＡｘｌポリペプチドを準備すること；Ａｘｌポリペプチドの存在下でリン酸化される基質を準備すること；Ａｘｌポリペプチドを該基質と、該基質のリン酸化が可能な条件下で混合すること；該混合物を化合物と接触させること；および該化合物によってＡｘｌキナーゼ活性がモジュレートされているか否かを判定することを含む。一部のある実施形態において、Ａｘｌポリペプチドは、配列番号：１３、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、または配列番号：４２に示すアミノ酸配列を有する。一部のある実施形態において、Ａｘｌポリペプチドは、配列番号：１３、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、または配列番号：４３に示すアミノ酸配列を有する。一部のある実施形態において、該基質は、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：３５、または配列番号：３６に示すアミノ酸配列を有する。
【００２７】
一部のある実施形態において、本発明は、被検体から試験試料を採取すること；試験試料中のＡｘｌ遺伝子の発現レベルまたはＡｘｌタンパク質の活性レベルを測定すること；および試験試料中のＡｘｌ遺伝子の発現レベルまたはＡｘｌタンパク質の活性レベルをＡｘｌ遺伝子の発現レベルまたは対照試料中のＡｘｌタンパク質の活性レベルと比較することを含み、ここで、対照試料中のＡｘｌ遺伝子の発現またはタンパク質活性のレベルと比べてＡｘｌ遺伝子発現またはＡｘｌタンパク質活性のレベルが変化させられていることは骨密度の変化を示す、被検体における骨密度の変化のスクリーニングまたは検出方法を提供する。一部のある実施形態において、試験試料中のＡｘｌ遺伝子の発現またはＡｘｌタンパク質活性のレベルは、対照試料と比べて増大している。一部のある実施形態において、試験試料中のＡｘｌ遺伝子の発現またはＡｘｌタンパク質活性のレベルは、対照試料と比べて減少している。
【００２８】
一実施形態において、本発明は、Ａｘｌタンパク質の活性レベルが、Ａｘｌタンパク質に特異的に結合する捕捉試薬を用いて測定される、被検体における骨密度の変化のスクリーニングまたは検出方法を提供する。一実施形態において、Ａｘｌ捕捉試薬は抗体である。一実施形態において、該抗体は、検出可能な標識を用いて検出される。一実施形態において、該検出可能な標識は、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物および化学発光化合物からなる群より選択される。
【００２９】
一実施形態において、本発明は、少なくとも１種類のＡｘｌポリペプチドに特異的に結合する捕捉試薬、バッファー、および少なくとも１種類のＡｘｌポリペプチドに対する該捕捉試薬の結合を検出するための試薬を備えるキットを提供する。一実施形態において、キットの捕捉試薬は、検出可能な標識を含む。一実施形態において、キットの捕捉試薬は抗体である。本発明のキットは、択一的または追加的に、Ａｘｌ遺伝子に特異的な核酸プローブまたはプライマーを含むものであってもよい。
【００３０】
一実施形態において、本発明は、被検体由来の試験試料において、Ａｘｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド内の少なくとも１つの変異の存在を調べることを含み、ここで、Ａｘｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド内の前記少なくとも１つの変異の存在は、該被検体における骨密度の変化、骨量の変化、骨質の変化、または骨形成の変化を示す、被検体の骨塩量レベルの変化、骨量の変化、骨質の変化、骨形成の変化、または骨微細構造の完全性の変化のスクリーニング方法を提供する。
【００３１】
一実施形態において、Ａｘｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド内の少なくとも１つの変異の存在または非存在は、該試料を、Ａｘｌをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと接触させることにより検出される。一実施形態において、該オリゴヌクレオチドプローブは、Ａｘｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチドを含む。一実施形態において、該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡからなる群より選択される。一実施形態において、該ポリヌクレオチドは変異型Ａｘｌタンパク質をコードするものである。一実施形態において、変異型Ａｘｌタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸５６７位のリシンに対してアルギニン置換を有する。
【００３２】
配列の簡単な説明
以下の配列の説明および添付の配列表は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．．§．１．８２１  １．８２５に示された特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示の規約に従うものである。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用した記号および形式は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§  １．８２２に示された規則に従うものである。
【００３３】
配列番号：１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１９１３で入手されるヒトＡｘｌ遺伝子のヌクレオチド配列である。ヌクレオチド残基４５９〜３１４３は、配列番号：２をコードしている。
【００３４】
配列番号：２は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６８７１３で入手される完全長ヒトＡｘｌのアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号：３は、ｓｉＲＮＡ  Ａｘｌ  １のヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号：４は、ｓｉＲＮＡ  Ａｘｌ  ２のヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号：５は、ｓｉＲＮＡ  Ａｘｌ  ３のヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号：６は、ｓｉＲＮＡ  Ａｘｌ４のヌクレオチド配列である。
配列番号：７は、非特異的スクランブルｓｉＲＮＡ対照であるＮＳＰのヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号：８は、ｓｉＲＮＡ  Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１のヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号：９〜１１は、オステオカルシンの検出に使用したプライマーのヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号：１２は、プロテアーゼ切断部位を含むＡｘｌ由来のペプチドのアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号：１３は、Ａｘｌキナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号：１４〜１５は、自己リン酸化部位を含むＡｘｌペプチドのアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号：１６〜１７は、スクリーニング方法に使用され得るＡｘｌペプチドのアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号：１８は、ヒトＡｘｌ  ｓｈＲＮＡ構築物ｈＡｘｌ  ３６３のヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号：１９は、ヒトＡｘｌ  ｓｈＲＮＡ構築物ｈＡｘｌ  １１０７のヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号：２０は、ヒトＡｘｌ  ｓｈＲＮＡ構築物ｈＡｘｌ  １７４８のヌクレオチド配列である。
【００４８】
配列番号：２１は、ヒトＡｘｌ  ｓｈＲＮＡ構築物ｈＡｘｌ  １９８８のヌクレオチド配列である。
【００４９】
配列番号：２２は、ヒトＡｘｌ  ｓｈＲＮＡ構築物ｈＡｘｌ  ２４４８のヌクレオチド配列である。
【００５０】
配列番号：２２は、ヒトＡｘｌ  ｓｈＲＮＡ構築物ｈＡｘｌ  ２４４８のヌクレオチド配列である。
【００５１】
配列番号：２３は、マウスＡｘｌ  ｓｈＲＮＡ構築物ｍＡｘｌ  １８７のヌクレオチド配列である。
【００５２】
配列番号：２４は、マウスＡｘｌ  ｓｈＲＮＡ構築物ｍＡｘｌ  １０７９のヌクレオチド配列である。
【００５３】
配列番号：２５は、マウスＡｘｌ  ｓｈＲＮＡ構築物ｍＡｘｌ  １４７７のヌクレオチド配列である。
【００５４】
配列番号：２６は、マウスＡｘｌ  ｓｈＲＮＡ構築物ｍＡｘｌ  １８５０のヌクレオチド配列である。
【００５５】
配列番号：２７は、マウスＡｘｌ  ｓｈＲＮＡ構築物ｍＡｘｌ  ２２６９のヌクレオチド配列である。
【００５６】
配列番号：２８〜３０は、Ｌ９２９亜株においてＡｘｌ発現をノックダウンし、ＴＮＦαに対する感受性を回復させるために使用したｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
【００５７】
配列番号３１および３２は、Ａｘｌをノックダウンするため、およびＡｘｌがエキソビボ血管新生に必要であることをマウスモデルにおいて示すために使用したｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列である。
【００５８】
配列番号：３３は、Ａｘｌ上へのＧａｓ６の主結合部位であるＩＧ１のアミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号：３４は、Ａｘｌ上へのＧａｓ６の副結合部位であるＩＧ２のアミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号：３５および配列番号：３６は、スクリーニング方法に使用され得るペプチドのアミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号：３７〜配列番号：４２は、スクリーニング方法に使用したキナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００６２】
配列番号：４３は、キナーゼ活性を有し、スクリーニング方法に使用したポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、ＢＭＰ２タンパク質がＡｘｌ遺伝子発現を２４時間以内に下方調節することを示すグラフである。
【図２】図２は、Ａｘｌノックダウンにより、クローン１４細胞内のＡｘｌ  ｍＲＮＡのレベルが低下することを示すグラフである。
【図３】図３は、Ａｘｌノックダウンにより、クローン１４細胞内のオステオカルシンの発現が、外因性ＢＭＰ２タンパク質の存在下および非存在下の両方で促進されることを示すグラフである。
【図４】図４は、Ａｘｌノックダウンにより、ＢＭＰ２タンパク質を添加するとクローン１４細胞においてアルカリホスファターゼ活性が誘導されることを示すグラフである。
【図５】図５は、Ａｘｌ過剰発現によりオステオカルシンｍＲＮＡのレベルが抑制され、この効果がＢＭＰ２タンパク質の添加によって増強されることを示すグラフである。
【図６】図６は、Ａｘｌ／Ｆｃキメラを用いたＡｘｌ／Ｇａｓ６結合の一過性阻害により、エキソビボマウス頭蓋冠器官培養モデルにおいて、総骨領域および骨芽細胞の数の増大がもたらされることを示すグラフである。
【図７Ａ】図７は、Ａｘｌの「キナーゼ死（ｄｅａｄ）」変異型は、クローン１４細胞においてオステオカルシンの発現を抑制しないことを示す。
【図７Ｂ】図７は、Ａｘｌの「キナーゼ死（ｄｅａｄ）」変異型は、クローン１４細胞においてオステオカルシンの発現を抑制しないことを示す。
【図８Ａ】図８は、２６週齢のＡｘｌ雄および雌ノックアウトマウスが、総海綿骨量および総皮質骨量の増大を有することを示す。
【図８Ｂ】図８は、２６週齢のＡｘｌ雄および雌ノックアウトマウスが、総海綿骨量および総皮質骨量の増大を有することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
詳細説明
本発明の方法は、骨または軟骨の障害を、その処置を必要とする任意の哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、サル、齧歯類、ヒツジ、ウサギ、イヌ、モルモット、ウマ、ウシ、およびネコなど）において処置または予防するために使用され得る。
【００６５】
本発明は、骨または軟骨の変性障害を処置または予防するために投与されるＡｘｌインヒビターを提供する。Ａｘｌインヒビターの投与によって処置または予防される障害としては、例えば、骨減少症、骨軟化症、変形性関節症、骨粗鬆症（例えば、閉経後、ステロイド誘導性、老人性、またはサイロキシン使用誘導性）、オステオミエローマ、骨形成異常症、パジェット病、骨形成不全症、体液性高カルシウム血症性骨髄腫、多発性骨髄腫、および転移後の骨菲薄化が挙げられる。さらに、処置または予防される障害としては、高カルシウム血症、慢性腎疾患、原発性または続発性副甲状腺機能亢進症、炎症性腸疾患、クローン（Ｋｒｏｈｎ’ｓ）病、コルチコステロイドまたは性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニストもしくはアンタゴニストの長期使用、および栄養不足と関連している骨変性障害が挙げられる。
【００６６】
本発明は、哺乳動物にＡｘｌのインヒビターを、骨変性障害を処置または予防；骨老化を遅延；失われた骨を回復；新たな骨形成を刺激；および／または骨（骨量および／または骨質）を維持するに有効な量で投与する方法を提供する。
【００６７】
本発明は、海綿骨および皮質骨の微小欠損部を処置するための方法を提供する。骨質は、例えば、骨の微細構造の完全性を評価することにより測定され得る。
【００６８】
本発明は、閉経後女性の骨変性障害を処置または予防するための方法を提供する。本発明は、男性の骨変性障害を処置または予防するための方法を提供する。本発明は、ステロイド誘導性骨粗鬆症の個体の骨変性障害を処置または予防するための方法を提供する。本発明は、個体の老人性骨粗鬆症を処置または予防するための方法を提供する。本発明は、個体のサイロキシン使用誘導性またはグルココルチコイド使用誘導性の骨粗鬆症を処置または予防するための方法を提供する。
本発明は、過剰な骨成長または骨格の過成長を特徴とする骨障害を処置または予防するために投与されるＡｘｌアゴニストを提供する。例えば、過剰な骨成長または骨格の過成長を特徴とする骨障害としては、限定されないが、例えば、硬化性骨異形成症（「硬結性骨化症」とも称される）；骨格系骨異形成症（骨硬化症、大理石骨病、および骨内性骨増殖症など）；カムラチ・エンゲルマン病；ファン・ブッヘム病および硬結性骨化症；常染色体優性骨硬化症；常染色体優性大理石骨病Ｉ型；ワース病；ならびに進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）が挙げられる。例えば、Ｗｅｓｅｎｂｅｃｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ．７２：７６３−７７１（２００３）およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと。過剰な骨成長の他の形態としては、人工股関節置換術、外傷、火傷、または脊髄損傷後の骨の病的増殖、ならびに転移性の前立腺癌または骨肉腫と関連している過剰な骨成長が挙げられる。
【００６９】
本発明は、ＢＭＰ２とＡｘｌのインヒビターを哺乳動物に共投与することにより、哺乳動物においてＢＭＰ２媒介性応答を増強するための方法を提供する。ＢＭＰ２は、骨欠損および軟骨欠損を示す患者の処置に有用である強力な骨形成性因子である（例えば、米国特許第５，１６６，０５８号および同第６，１５０，３２８号を参照のこと）。したがって、本発明は、上記の骨変性障害のいずれか、例えば、骨減少症、骨軟化症、変形性関節症、骨粗鬆症、オステオミエローマ、骨形成異常症、パジェット病、骨形成不全症、体液性高カルシウム血症性骨髄腫、多発性骨髄腫、および転移後の骨菲薄化、ならびに高カルシウム血症、慢性腎疾患、原発性または続発性副甲状腺機能亢進症、炎症性腸疾患、クローン病およびコルチコステロイドの長期使用と関連している骨変性障害などを処置または予防するためにＢＭＰ２とＡｘｌインヒビターを共投与する方法を提供する。また、本発明は、ＢＭＰ２によって処置または予防される任意のさらなる病状を処置または予防するためにＢＭＰ２とＡｘｌインヒビターを共投与する方法を提供する。該方法は、骨折のＢＭＰ２処置および脊椎固定の増強を含む。
【００７０】
骨老化に関連する転帰（１つまたは複数）は、海綿骨の減損（骨小柱板の穿孔）；（骨幹端）皮質骨の減損；海綿骨の減損；骨塩量の減少；骨無機質の低下；骨リモデリングの低減；血清アルカリホスファターゼおよび酸ホスファターゼのレベルの増加；オステオカルシンの発現；骨脆弱性（骨折率の増大）；ならびに骨折治癒の減退に関するＡｘｌモジュレーターの特異的効果によって評価され得る。このような転帰の評価方法を以下に詳細に示す。骨老化および／または骨量増大は、密度測定画像化、例えば、Ｘ線撮影、二重エネルギーＸ線吸光光度分析法（ＤＸＡ）または定量的コンピュータ連動断層撮影（ＱＣＴ）を用いてインビボで評価され得る。骨質は、骨微細構造に関する詳細な情報をもたらす高解像度密度測定画像化法、例えば、マイクロコンピュータ連動断層撮影（マイクロＣＴ）、または骨折抵抗性を調べるための骨のバイオメカニカル試験などを用いてエキソビボで測定され得る。
【００７１】
本発明のさらなる適用としては、骨結合性を促進させるために、骨埋入物、マトリックスおよびデポー系をコーティングするため、またはこれらに組み込むためのＡｘｌモジュレーターの使用が挙げられる。かかる埋入物の例としては、歯科用インプラント、関節置換用埋入物および骨移植片置換体が挙げられる。
【００７２】
また、製剤には、例えば、該組成物の送達および／または支持のため、および／または骨および／または軟骨の形成用の表面を提供するための適切なマトリックスが含まれ得る。マトリックスは、Ａｘｌ遺伝子発現のインヒビターもしくはＡｘｌタンパク質活性のインヒビターまたは製剤の他の軟骨／骨タンパク質もしくは他の要素の低速放出をもたらすもの、および／または本発明の製剤の提示に適切な環境をもたらすものであってもよい。骨および／または軟骨の形成のため、組成物に、該組成物を使用が意図される部位に送達することができるマトリックスが含まれることがあり得る。かかるマトリックスは、現在、他の医療用埋入適用に使用されている材料で形成されたものであり得る。
【００７３】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外観および界面特性の１つ以上に基づく。該組成物用に可能なマトリックスは、生分解性で化学的に規定される硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物ならびにサンゴであり得る。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス成分で構成されたものである。他の可能なマトリックスは、非生分解性で化学的に規定される、例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックなどである。マトリックスは、上記の型の材料の任意のものの組合せ（ポリ乳酸とヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンとリン酸三カルシウムなど）で構成されたものであってもよい。生体セラミックは、組成（カルシウム−アルミン酸−リン酸）が改変され得、細孔径、粒径、粒子形状および生分解性が改変されるように処理され得る。
【００７４】
本発明は、骨変性障害の処置に対するＡｘｌモジュレーターの有効性を評価するためのアッセイを含む。かかるアッセイは、該モジュレーターを繰り返し哺乳動物（例えば、ＯＶＸラット）に、少なくとも２、４、６または８週間の期間投与すること；および骨に対する該モジュレーターの効果を調べることを含み、ここで、該モジュレーターによる骨老化（例えば、骨量および／または骨質）の低速化あるいは骨形成の増大は、該モジュレーターが骨変性障害の処置または予防に有効であることを示し、該モジュレーターによる骨密度の減少は、該モジュレーターが、硬化性骨異形成症または骨量が不適切に増加する障害の処置に有効であることを示す。
【００７５】
骨に対するＡｘｌモジュレーターの効果を測定するためのアッセイ
骨構造および骨形成の種々の側面に対するＡｘｌモジュレーターの効果は、限定されないが、骨格表現型決定アッセイ（これは、骨量、骨質、骨密度、骨形成、および骨老化を評価する）；骨障害の動物モデル；ならびにインビトロ試験、例えば、新たに形成された骨（例えば、カルセイン標識）、オステオカルシン遺伝子の発現、ならびにアルカリホスファターゼ活性のアッセイなどの方法によって測定され得る。
【００７６】
本明細書で用いる場合、「骨格表現型決定」は、骨量（例えば、骨塩量および／または骨質）を評価する１つ以上のアッセイを使用することによる骨（１つまたは複数）の特性評価をいう。かかるアッセイにより、海綿骨（骨小柱板の穿孔）；（骨幹端）皮質骨の減損；海綿骨の減損；骨塩量の減少；骨無機質の低下；骨リモデリングの低減；血清アルカリホスファターゼおよび酸ホスファターゼのレベルの増加；骨脆弱性（骨折率の増大）；ならびに骨折治癒の減退が測定され得る。また、このようなアッセイにより、同化作用による骨形成による骨量の増加、例えば、海綿骨の数または海綿骨の厚みの増大、皮質骨の増加、骨塩量の増加、血清オステオカルシンおよびアルカリホスファターゼレベルの増加、機械的完全性の改善、ならびに骨折治癒の増大または加速が測定され得る。
【００７７】
本発明は、骨量および骨質、例えば、骨塩量（ＢＭＤ）に対するＡｘｌモジュレーターの効果を測定するための方法を提供する。骨量および骨質を評価するための方法は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｘ線回折、ＤＸＡ、ｐＤＸＡ、ＤＥＱＣＴ、μＣＴ、ｐＱＣＴ、化学分析、密度分画、組織測光法（ｈｉｓｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）、組織形態測定法、および組織化学分析（例えば、Ｌａｎｅら，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１８：２１０５−２１１５（２００３）に記載されている）が挙げられる。
【００７８】
骨塩量に対するＡｘｌモジュレーターの効果を測定するための方法の一例は、二重エネルギーｘ線吸光光度分析法（ＤＸＡ）および／または末梢骨（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ）ＤＸＡ（ｐＤＸＡ）である。これは、任意の骨格部位の測定に使用され得るが、臨床的判定は、通常、腰椎棘および寛骨（ｈｉｐ）で行なわれる。かかと（踵骨）、前腕（橈骨および尺骨）、または指（指趾節骨）を測定するポータブルＤＸＡ機が開発されている。また、ＤＸＡは、身体組成を測定するためにも使用され得る。ＤＸＡ手法では、２つのｘ線エネルギーを用いて石灰化組織の面積を推定し、塩類含量をこの面積で除算し、これにより体格を一部補正する。しかしながら、この補正は、ＤＸＡが２次元スキャニング手法であり、骨の深さ、すなわち背腹長さを推定することができないため、部分的にすぎない。したがって、小柄な人は、平均より低い骨塩量（ＢＭＤ）を有する傾向にある。より厳密にＢＭＤが測定されるさらに新しいＤＸＡ手法が、現在、開発中である。変形性関節症に高頻度に見られる骨棘は、脊柱の骨密度を誤って増加させる傾向にある。ＤＸＡ計測器は、いくつかの異なる製造業者から供給されているため、絶対項の出力値が異なる。その結果、個々の結果を、人種と性別は適合しているが年齢は適合していない若年集団のものとを比較するＴ−スコアを用いて結果を「正常」値と関連づけることが標準実務となっている。あるいはまた、Ｚ−スコアにより、個々の結果を、人種も性別も適合した年齢が適合した集団のものと比較する。したがって、−１（年齢の平均より１標準偏差（ＳＤ）小さい）のＺ−スコアを有する６０歳の女性は、−２．５（若年対照群の平均より２．５ＳＤ小さい）Ｔ−スコアを有する可能性がある。ｐＤＸＡはまた、実験用動物（ラットおよびマウスなど）におけるＢＭＤの測定にも有用である。
【００７９】
マイクロコンピュータ連動断層撮影（μＣＴまたはマイクロＣＴ）を用いて骨微細構造に対するＡｘｌモジュレーターの効果を測定するための方法は、当該技術分野で知られている。マイクロＣＴは、対象物にＸ線を照射しながら装置を回転させることにより、対象物に関する３６０°のＸ線透視画像データを得る方法である。次いで、このデータを用いて完全に３次元の画像データセットを作成し、これにより、海綿骨および皮質骨容積が測定され得る。空間的解像度が卓越しているため、μＣＴでは、ＤＸＡまたはｐＤＸＡでは観測され得ない骨の海綿骨構造の変化が検出される。このアッセイは、ＤＸＡおよびｐＤＸＡによって定量されるＢＭＤに依存するだけでなく、μＣＴによって測定され得る海綿骨内の小柱の空間的配置にも依存するものであるため、骨の機械的特性におけるさらなる病識が得られ得る。
【００８０】
末梢骨定量的コンピュータ連動断層撮影（ｐＱＣＴ）を用いてＢＭＤに対するＡｘｌモジュレーターの効果を測定するための方法が利用可能である。ｐＱＣＴ法では、例えば、近位脛骨（これに限定されない）の体積測定ＢＭＤ（ｖＢＭＤ、ｍｇ／ｃｍ３）が、麻酔したラットにおいて、ＸＣＴ−９６０Ｍ装置（ＸＣＴ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ，Ｐｆｏｒｚｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて評価され得る。脛骨の近位端の３．４ｍｍ遠位から採取した１ｍｍ厚のｐＱＣＴ切片を使用し、近位脛骨の骨幹端の全海綿骨密度をコンピュータ計算する。断層撮影切片は、０．１４０ｍｍの面内（ｉｎ−ｐｌａｎｅ）ボクセル（３次元ピクセル）サイズを有する。画像は取得後にディスプレイ表示し、脛骨を含み腓骨を除いた対象の領域の輪郭を描く。反復アルゴリズムを用いて軟組織を自動的に削除し、切片内の骨全体の密度（総密度、ｍｇ／ｃｍ３）を調べる。海綿骨密度の測定では、次いで、骨切片の外側５５％を同心らせん状に除き、海綿骨密度の値を単位：ｍｇ／ｃｍ３で報告する。
【００８１】
骨形成に対するＡｘｌモジュレーターの効果は、例えば、カルセイン標識を用いて測定され得る。例えば、マウスにカルセイン（例えば、１５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｌ／マウス、ｓ．ｃ．）を注射した後、２日後および９日後に組織が採取され得る。骨組織は、大腿骨、脛骨ならびに脊柱のいずれかから採取され得る。骨試料の組織学的統制評価では、カルセイン標識された石灰化骨層間の間隔を測定し、骨形成の評価に使用する。
【００８２】
本発明は、骨障害（例えば、骨変性障害）の１種類以上の動物モデルおよび／またはヒトにおいてＡｘｌモジュレーターの効果を評価するための方法を提供する。骨減少症は、例えば、固定化、低カルシウムの食事、高リン性の食事、コルチコステロイドの長期使用、または性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）のアゴニストもしくはアンタゴニスト、卵巣機能の停止、または加齢によって誘導され得る。例えば、卵巣摘出（ＯＶＸ）誘導性骨減少症は、ヒトの閉経後骨粗鬆症の充分に確立された動物モデルである。別の充分に実証されたモデルは、コルチコステロイドの投与が関与するものである。かかる動物モデルとしては、カニクイザル、イヌ、ラット、マウス、ウサギ、フェレット、モルモット、ミニブタ、およびヒツジが挙げられる。骨粗鬆症の種々の動物モデルの概説については、例えば、Ｔｕｒｎｅｒ、Ｅｕｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍａｔｅｒ．１：６６−８１（２００１）を参照のこと。
【００８３】
培養状態の骨芽細胞に対する効果（コラーゲン合成およびオステオカルシンの発現に対する効果、またはアルカリホスファターゼおよびｃＡＭＰ誘導のレベルに対する効果など）の評価のための適切なインビボおよびインビトロ試験は、例えば、米国特許第６，３３３，３１２号に記載されている。
【００８４】
本発明の開発に有用な細胞としては、骨芽細胞および骨芽細胞前駆細胞が挙げられる。具体的には、このような細胞として、間葉幹細胞、骨髄由来の骨芽前駆細胞、および血中に循環している骨芽前駆細胞が挙げられ得る。本発明の方法の実施には、骨格の骨細胞、例えば、骨芽前駆細胞、骨内層細胞、骨芽細胞、骨細胞が有用である。同様に使用され得る細胞型としては、胚性線維芽細胞、筋芽細胞前駆細胞または脂肪細胞系統（これには、前駆脂肪細胞が含まれる場合があり得る）が挙げられる。不死化細胞または形質転換細胞は、Ａｘｌの遺伝子発現またはタンパク質活性のモジュレーターとしての化合物または治療用薬剤の活性を評価するために、該化合物または治療用薬剤をインビボ（ｖｉｖｏ）動物モデルで試験する前にインビトロで使用され得る。
【００８５】
骨特異的アルカリホスファターゼは、細胞表面の外側に存在する膜結合型酵素である。これは、骨形成初期と関連している骨芽細胞の活性の骨芽細胞系統特異的マーカーである。アルカリホスファターゼ活性は、ナフトールＡＳ−ＭＸリン酸とファストブルーＢＢ塩の混合物での組織化学的染色によって定量的に検査され得る。染色の結果は、明視野顕微鏡検査、青色染色細胞の観察または骨芽細胞系統細胞を示すコロニーを用いて記録され得る。アルカリホスファターゼ活性は、比色酵素的アッセイによって定量的に測定され得る。該活性は、細胞溶解物において基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いてアッセイされ、４０５ｎｍにおける吸光度の読み値を得ることにより測定される。吸光度のデータを適切な対照と比較し、標準化し、試料単離物間のタンパク質収率の差を明らかにする。アルカリホスファターゼのレベルは、既知量のアルカリホスファターゼ酵素を用いて作成された標準曲線をもとに測定される。次いで、値を全細胞タンパク質に対して標準化し、試料間で比較する。これらのアッセイの変形型、ならびにさらなるアルカリホスファターゼ活性の測定方法は、充分当業者の知識の範囲内である（例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．８５：１５４４−１５５２（２００３）を参照のこと）。
【００８６】
オステオカルシンは、骨内に最も豊富に存在している非コラーゲン質タンパク質であり、成熟骨芽細胞によって特異的に産生される。オステオカルシンは、分化後期における骨芽細胞特異的活性のマーカーとして使用される。したがって、Ａｘｌ遺伝子発現モジュレーターまたはＡｘｌタンパク質活性モジュレーターにより、オステオカルシンのレベルがモジュレートされ得る。オステオカルシン遺伝子の発現は、ノザンブロッティング（以下に詳細に記載）によって測定され得る。オステオカルシン遺伝子の発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定され得るか、または広く入手可能なラジオイムノアッセイキット（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、ＭＡ）を用いてアッセイされ得る。オステオカルシン遺伝子の発現の他の検出方法および定量方法は、当業者には公知である（例えば、Ｔｈｉｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３０：１３１８−１３２４（１９９２）を参照のこと）。
【００８７】
マトリックスの石灰化は、最終的な分化骨芽細胞と関連している。石灰化のアッセイの前に、間葉幹細胞およびまたは骨芽前駆細胞を、まず培地中で培養し、任意選択で、骨形成性因子（例えば、ＢＭＰ）で処理する。細胞の石灰化は、カルシウム同位体の蓄積、組織化学的染色、または当業者には公知である他の方法によって評価され得る。細胞は、０．５μＣｉ／ｍｌの４５ＣａＣｌ２（播種後、種々の時点で添加）を含有する培地中で、４８時間インキュベートされ得る。次いで、ＰＢＳ（洗浄１回あたり１ｍｌ使用）で細胞単層を２回洗浄する。次に、細胞を回収し、０．１Ｎ  ＮａＯＨ中で消化させ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ５５００シンチレーションカウンターを用いた液体シンチレーション計数によって、アリコートを計数する。活発に石灰化している培養物中の石灰化結節を、アリザリン−レッド−Ｓでの細胞単層の染色によって可視化する。細胞培養物をＰＢＳで２回洗浄し、５０％エタノール中で１０分間固定し、１ｍｌの蒸留水で５分間再水和させ、次いで、アリザリンレッドＳの１％（ｗ／ｖ）水溶液２００μＬで１〜３分間染色する。次いで、この単層を蒸留水で洗浄し、石灰化結節の存在を光学顕微鏡検査によって調べる。光学顕微鏡検査で赤色に染色された細胞コロニーの存在は、石灰化を示す。
【００８８】
Ａｘｌモジュレーター
本発明の方法は、軟骨障害および骨障害を処置または予防するための、Ａｘｌの遺伝子発現またはＡｘｌタンパク質活性のモジュレーターの投与を含む。このようなモジュレーターは、Ａｘｌ遺伝子発現またはＡｘｌタンパク質活性を増大させるもの、または減少させるものであり得る。
【００８９】
Ａｘｌ
Ａｘｌ受容体型チロシンキナーゼは、原発性ヒト白血病細胞由来のトランスホーミング遺伝子にコードされたタンパク質として同定された（Ｏ’Ｂｒｙａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５０１６−５０３１（１９９１）；Ｊａｎｓｓｅｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：２１１３−２１２０（１９９１）；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ７６１２５）。Ａｘｌ受容体型チロシンキナーゼは、１８アミノ酸のシグナルペプチドを含む８８７アミノ酸ポリペプチドとして合成される（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ３０５３０）。完全長の膜貫通結合型ヒトＡｘｌ受容体タンパク質は１４０ｋＤａである。また、Ａｘｌタンパク質は、膜貫通ドメインに隣接したＮ末端側の１４アミノ酸領域内での切断による翻訳後プロセッシングを受け、８０ｋＤａの可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（可溶性Ａｘｌ（ｓＡｘｌ）とも称される）と、５５ｋＤａの膜結合型キナーゼドメインが生成され得る（Ｏ’Ｂｒｙａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：５５１−５５７（１９９５））。Ａｘｌならびにそのリガンドの構造的および機能的側面は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｈｅｉｒｉｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６９５２−６９５８（２００４）；Ｂｕｄａｇｉａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：９３２４−９３３９（２００５）を参照のこと）。
【００９０】
用語「Ａｘｌ遺伝子」は、本明細書で用いる場合、Ａｘｌタンパク質の１種類以上のアイソフォーム（Ａｘｌタンパク質活性を有する断片を含む）をコードする任意の遺伝子をいう。Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１９１３のヌクレオチド配列は、完全長ヒトＡｘｌタンパク質アイソフォーム１をコードする５０１４ｂｐのｍＲＮＡである。Ａｘｌタンパク質アイソフォーム２をコードする４９８７ｂｐのｍＲＮＡであるポリヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１６９９からわかる。
【００９１】
用語「Ａｘｌタンパク質」または「Ａｘｌポリペプチド」は、本明細書で用いる場合、任意の１種類以上のアイソフォーム（Ａｘｌタンパク質の機能活性を有するタンパク質分解切断生成物および断片を含む）をいう。完全長Ａｘｌタンパク質（アイソフォーム１とも称される）の８９４アミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６８７１３からわかる。Ａｘｌアイソフォーム２は、８８５アミノ酸のタンパク質であり（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１６９０）、エキソン１０にコードされた９個の内部アミノ酸（プロテアーゼ切断部位に隣接したＮ末端側に存在）が欠損している（Ｏ’Ｂｒｙａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：５５１−５５７（１９９５）を参照のこと）。この２種類のＡｘｌタンパク質アイソフォームの他、ヒトＡｘｌタンパク質およびマウスＡｘｌタンパク質は、ともに膜貫通ドメイン付近でタンパク質分解性プロセッシングを受け、該タンパク質の可溶性形態が生じる（上記）（Ｏ’Ｂｒｙａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：５５１−５５７（１９９５）；Ｃｏｓｔａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６８：７３７−７４４（１９９６）；Ｂｕｄａｇｉａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：９３２４−９３３９（２００５））。したがって、本明細書で用いる場合、用語「Ａｘｌタンパク質」は、完全長膜貫通結合型Ａｘｌ受容体、ならびに翻訳後切断によって生じる形態をいう。本明細書で用いる場合、用語「ｓＡｘｌタンパク質」は、可溶性Ａｘｌとしても知られており、細胞外ドメインの切断生成物をいう。用語「膜結合型キナーゼドメイン」は、膜結合型の切断生成物をいう。用語「Ａｘｌ−ＥＣＤ」は、本明細書で用いる場合、Ａｘｌ細胞外ドメインをいう。
【００９２】
Ａｘｌタンパク質（そのアイソフォームを含む）は、単量体、ホモ二量体、または例えばＡｘｌリガンド（Ｇａｓ６など）とのヘテロ二量体として存在しているものであり得る。二量体としては、完全長膜結合型タンパク質のホモ二量体ならびにｓＡｘｌ−ｓＡｘｌホモ二量体、Ａｘｌ−ｓＡｘｌヘテロ二量体、Ａｘｌ−Ｇａｓ６ヘテロ二量体、およびｓＡｘｌ−Ｇａｓ６ヘテロ二量体が挙げられる。条件によっては、成熟Ａｘｌタンパク質において、これらの異なる形態のいずれかまたは全部の間に平衡が成立していることがあり得る。また、「Ａｘｌタンパク質」または「Ａｘｌポリペプチド」は、Ａｘｌタンパク質の生物学的に活性な形態、例えば、Ａｘｌタンパク質に関する少なくとも一部の生物学的活性を維持している任意の断片およびバリアントをいう。例えば、Ａｘｌタンパク質としては、キナーゼ活性をもたらすのに必要とされる最小限のアミノ酸配列を有するペプチド断片が挙げられ得る。本発明は、あらゆる脊椎動物種（例えば、ヒト、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、ヒヒ、および魚類など）に由来するＡｘｌタンパク質に関する。
【００９３】
用語「Ａｘｌリガンド」は、特に記載のない限り、少なくとも１種類のＡｘｌタンパク質アイソフォームに結合する任意のリガンドをいう。Ａｘｌリガンドの一例は、増殖停止特異的遺伝子６（Ｇａｓ６）タンパク質である（Ｓｔｉｔｔら、Ｃｅｌｌ  ８０：６６１−６７０（１９９５）；Ｖａｒｎｕｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：６２３−６２６（１９９５）；米国特許第５，５３８，８６１号）。Ｇａｓ６は、ヒトプロテインＳと４４％配列同一性を有するビタミンＫ依存性タンパク質である。Ｇａｓ６は、γ−カルボキシグルタミン酸高含有領域、４上皮増殖因子様反復配列、およびカルボキシ末端推定ステロイド結合ドメインを有する（Ｍａｎｆｉｏｌｅｔｔｉら、Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：４９７６−４９８５（１９９３））。Ａｘｌタンパク質に加え、Ｇａｓ６は、Ｍｅｒ受容体ファミリーのその他の構成員であるであるＴｙｒｏ３およびＭｅｒに結合する（Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３００２２−３００２７（１９９６）；Ｃｒｏｓｓｉｅｒら、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２９：１３１−１３５（１９９７））。ファミリー構成員Ｔｙｒｏ３の結晶構造、配列相同性、および保存された残基のマッピングに基づくと、Ｇａｓ６は、おそらくＡｘｌの最初の２つの免疫グロブリンドメイン、特に、ドメイン間境界面に近接したドメイン２上の保存された表面の一部に結合する（Ｈｅｉｒｉｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６９５２−６９５８（２００４））。
【００９４】
Ａｘｌ活性のアッセイ
用語「Ａｘｌタンパク質活性」または「活性Ａｘｌタンパク質」は、活性Ａｘｌタンパク質に関連する１つ以上の生物学的活性をいう。Ａｘｌタンパク質活性としては、例えば、チロシンキナーゼ活性、ＧＡＳ６に対する結合、他のＡｘｌ分子自体の活性化または該分子に対する結合、他の下流の標的への結合が挙げられる。本明細書で用いる場合、用語「チロシンキナーゼ活性」（Ａｘｌのチロシンキナーゼ活性などの場合）は、ＡＴＰからタンパク質基質内のチロシン残基へのリン酸基の転移をいう。本明細書において上記のように、また、Ａｘｌは、骨成長に対するその効果に関連する筋骨格活性を有する。
【００９５】
Ａｘｌタンパク質活性（例えば、チロシンキナーゼ活性）をインビボおよびインビトロで測定するためのアッセイは、当該技術分野で知られている。非常に高頻度に使用されているバイオアッセイの一部の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
【００９６】
Ａｘｌ受容体型チロシンキナーゼ活性のスクリーニング
キナーゼアクチベータまたはインヒビターを同定するために使用され得る、当該技術分野で知られたキナーゼ酵素アッセイ基本型は数多く存在する。Ａｘｌキナーゼ活性に関するキナーゼ酵素アッセイの例としては、時間分解蛍光エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）方法論、例えば、Ｌａｎｔｈａｓｃｒｅｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌａｎｃｅ、およびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ  ＭＡ）アッセイの利用が挙げられ得る。一例において、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートを使用し、Ａｘｌ自己リン酸化ペプチド（５−ＦＡＭ−ＤＣＬＤＧＬＹＡＬＭＳＲＣ（配列番号：１６）または５−ＦＡＭ−ＫＫＩＹＮＧＤＹＹＲＱＧ（配列番号：１７））または非特異的ペプチド（ポリＧｌｕ：Ｔｙｒ（４：１）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＰＶ３６１０）のいずれか１つを含むものであり得る基質ペプチドを、４０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）および７．２ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するアッセイバッファーに添加する。次いで、ＡＴＰおよびＡｘｌ（キナーゼドメインを含む断片、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、０．０１％Ｂｒｉｊ−３５、５％グリセロール、０．１％β−メルカプトエタノール中）を、ペプチド５０ｎＭ、ＡＴＰ  ５０μＭおよびＡｘｌ  ５ｎＭの終濃度まで添加する。室温で１時間インキュベーション後、６０ｍＭのＥＤＴＡの添加により反応を停止させる。抗ホスホチロシン抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号ＰＶ３５５２）を、反応混合物に２．５ｎＭの終濃度で添加する。さらに３０分間、室温でインキュベーション後、３４０ｎＭで励起後（テルビウムドナーの励起波長）、プレートの読み取りを行なう。テルビウムから干渉なしでのフルオレセインへのエネルギー転移は、５２０ｎｍフィルターを用いた２つのテルビウムピーク間のサイレント領域における放射を測定することにより達成される。次いで、この放射を、典型的には、４９５ｎｍフィルターを用いた第１テルビウムピークの放射と照らし合わせる。このアッセイでは、ＦＲＥＴ値の減少（アンタゴニスト）によって示されるリン酸化生成物の形成を依存的に低減させるか、またはＦＲＥＴ値を増大させるか（アゴニスト）のいずれかである化合物が同定される。別の例では、９６または３８４ウェルプレートを使用し、ＬＡＮＣＥ  ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイが、以下のようにして行なわれる。ビオチンに結合させた基質ペプチドＡＧＡＧＧＰＱＤＩＹＤＶＰＰＶＲ（配列番号：３６に示す）を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１μＭのＢＳＡ、０．０２３ｍＭのＢｒｉｊ３５および１１％のグリセロールを含有するアッセイバッファーに添加する。次いで、ＡＴＰおよびＡｘｌ酵素（キナーゼドメイン）を、ＡＴＰ  ５００μＭ、Ａｘｌ  １０ｎＭおよび基質ペプチド２５０ｎＭの終濃度まで添加する。次いで、反応液を２３℃で４５分間インキュベートした後、ＥＤＴＡ含有アッセイバッファーを１２ｍＭの終濃度まで添加することにより、反応を停止させる。次いで、２ｎＭのユーロピウム標識ＰＴ６６抗ホスホチロシン抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および５０ｎＭのストレプトアビジン−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）を添加し、混合物を室温で９０〜１００分間インキュベートした後、リン酸化された基質の量を、適当なプレートリーダー（例えば、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ，Ｖｉｅｗ  Ｌｕｘ，Ｖｉｃｔｏｒ）を用いて測定する。ストレプトアビジン−ＡＰＣは、該基質のビオチン部分に結合する。ユーロピウム標識抗体が基質のリン酸化されたチロシンに結合した場合、ユーロピウムは、ＡＰＣに近接していることになる。このような状況下では、３４０ｎｍでの該複合体の励起によりユーロピウムが励起され、次いで、ピーク波長６１５ｎｍの光が放射される。このことにより、充分に近接しているＡＰＣ（すなわち、同じ基質分子に結合しているため）が励起され、波長６６５ｎｍの光が放射される。したがって、６６５ｎｍの光の放射により、リン酸化された基質の測定値が得られる。この値を、非結合抗体の６１５ｎｍシグナルに対して標準化する（単純な比で）。阻害性（アンタゴニスト）化合物は、該化合物の非存在で生じたものと比べて６６５／６１５ｎｍシグナルの量の減少をもたらし、これは、阻害パーセントまたはＩＣ５０として用量応答形式のいずれかで表示され得る。一方、刺激性化合物（アゴニスト）は、６６５／６１５ｎｍシグナルの増大をもたらし、これは、刺激パーセントまたはＥＣ５０で表示され得る。
【００９７】
間接的ＴＲ−ＦＲＥＴに基づくアプローチは、ＢｅｌｌＢｒｏｏｋ研究所によって開発されたＴｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ  Ｋｉｎａｓｅアッセイを使用するものであり得、該アッセイは、キナーゼ反応において生成したＡＤＰのレベルを測定するものである。このアッセイでは、ＡＤＰを検出するように開発された抗体をテルビウムで標識する。フルオレセイン標識ＡＤＰトレーサー（ＡＤＰ抗体−テルビウムに結合すると、高いＦＲＥＴシグナルがもたらされる）を使用し、基質がリン酸化されているため、非標識ＡＤＰのレベルが増加して抗体からＡＤＰ−トレーサーが外れ、ＦＲＥＴシグナルの減少がもたらされる。したがって、このアッセイでは、キナーゼインヒビターはＦＲＥＴシグナルを用量依存的に増大させるが、アゴニストは、ＦＲＥＴシグナルの減少をもたらすであろうと予測される。あるいはまた、キナーゼ活性は、Ｐ３３標識ＡＴＰの消費によって測定され得る。この方法では、ＡｘｌまたはＡｘｌキナーゼドメインを含む断片を、ＭｇＣｌ２、Ｐ３３標識ＡＴＰ、および０．２μｍフィルターに結合させた基質と合わせる。放射性標識されたリン酸基のＡｘｌによるフィルター結合基質への転移により、検出可能なフィルターに結合している放射能が生じ、これは基質のリン酸化レベルを反映する。
【００９８】
また、Ａｘｌ活性のモジュレーションは、細胞内でもアッセイすることができる。かかるアッセイとしては、中でも特に、ホスホ−ブロットにおけるＡｘｌ自己リン酸化の測定；Ａｘｌの下流標的のリン酸化の測定；およびＡｘｌキナーゼ活性に依存性となるように操作された細胞における細胞増殖の測定が挙げられる。例えば、Ａｘｌ自己リン酸化は、Ａｘｌ含有細胞（ヒト膠芽細胞腫細胞株  Ａ１７２など）のＧＡＳ６刺激後に、ＥＬＩＳＡ（キットＤＹＣ２２２８，Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）またはホスホ−ブロット（これは、抗Ａｘｌ抗体での免疫沈降後に、リン酸化されたＡｘｌを、抗ホスホチロシン抗体を用いたウエスタンブロットによって検出するもの）などの手法を用いて検出され得る。Ａｘｌ阻害性化合物（アンタゴニスト）はリン酸化Ａｘｌのレベルの減少をもたらし、一方、Ａｘｌ刺激因子（アゴニスト）はレベルの上昇をもたらす。また、Ａｘｌキナーゼ活性は、Ａｘｌ活性に影響されるタンパク質標的に対する効果を直接または間接的に測定することによりアッセイされ得る。かかるものの一例はＡｋｔであり、これは、Ａｘｌ／Ｇａｓ６／ＰＩ３Ｋｉｎａｓｅ／Ａｋｔ  ｓｕｒｉｖｉｖａｌ経路においてＡｘｌの下流である（Ｗｅｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ａｐｒｉｌ  １４電子公開（２００８））。Ａｋｔは、ＡｘｌのＧＡＳ６刺激後にリン酸化される（Ｓｈａｎｋａｒら  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６：５６３８−５６４８（２００６））。細胞内でのＡｋｔリン酸化は、ホスホ−ブロットまたはアルファスクリーニング（ＳｕｒｅＦｉｒｅ（商標）アッセイ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）のいずれかによって、ホスホ−Ｔｈｒ３０８  Ａｋｔまたはホスホ−Ｓｅｒ４７３  Ａｋｔに対する抗体を用いて検出され得る。Ａｘｌ阻害性化合物（アンタゴニスト）はリン酸化Ａｋｔのレベルの減少をもたらし、一方、Ａｘｌ刺激因子（アゴニスト）はリン酸化Ａｋｔのレベルの上昇をもたらす。また、細胞は、その増殖に関してＡｘｌキナーゼ活性（ｅａｃｔｉｖｉｔｙ）に依存性となるように操作され得る。例えば、増殖に関して通常ＩＬ−３に依存性である３２Ｄ細胞は、ＩＬ−３ではなくＡｘｌキナーゼ活性に依存性となるように操作され得る。これは、３２Ｄ細胞を、ＡｘｌのキナーゼドメインおよびＧＦＰマーカータンパク質に対してスプライシングされたトランスホーミングｖ−Ｓｒｃ  Ｎ末端配列（ｖ−ｓｒｃのユニークＳＨ２およびＳＨ３ドメインを含む）を含むベクターでトランスフェクトすることによりなされる。次いで、この細胞をＩＬ−３の非存在下で培養する。ＩＬ−３の非存在下で増殖し続けるＧＦＰ陽性細胞は、その増殖に関してＡｘｌキナーゼ活性に依存性である。培養は、標準的な方法（例えば、細胞内ＡＴＰを測定するＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて容易にアッセイされ得る。Ａｘｌ阻害性化合物（アンタゴニスト）は３２Ｄ細胞の増殖のレベルの減少、したがってＡＴＰのレベルの減少をもたらし、一方、Ａｘｌ刺激因子（アゴニスト）は、増殖のレベルの増加、したがってＡＴＰのレベルの増加をもたらす。また、細胞系アッセイを使用し、Ａｘｌの分子作用によって誘発される細胞内変化を利用することによってＡｘｌ活性が測定され得る。例えば、Ｂｕｄａｇｉａｎら（ＥＭＢＯ  Ｊ．２４：４２６０−４２７０（２００５））により、Ａｘｌタンパク質が、マウスＬ２９２細胞を腫瘍壊死因子α（インターロイキン−１５受容体αサブユニット（ＩＬ−１５Ｒα）との相互作用によるＴＮＦα誘導性細胞死）から保護することが実証された。したがって、細胞系アッセイは、Ｌ２９２細胞死を測定することにより、Ａｘｌキナーゼ活性をモジュレートする化合物が同定されるように開発され得る。具体的には、Ａｘｌを安定に過剰発現するＬ２９２細胞が、例えばＡｘｌキナーゼの小分子アンタゴニストの存在下、ＴＮＦαで処理され得る。これにより、細胞数の用量依存的減少（細胞死の増大）がもたらされ得る。細胞数および／または細胞死は、細胞内ＡＴＰを測定する市販のアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なものなど）（細胞数の間接的測定−ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ）を用いて、または細胞死を示す細胞内ＬＤＨの放出（ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｏｎｅ（商標）アッセイ）によって測定され得る。血管平滑筋細胞のＧａｓ６誘導性Ａｘｌ媒介性化学走性（Ｆｒｉｄｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７１２３−７１２６（１９９８））または３２Ｄ骨髄性細胞のＧａｓ６誘導性Ａｘｌ媒介性凝集（ＭｃＣｌｏｓｋｅｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：２３２８５−２３２９１（１９９７））を利用し、同様の細胞機能アッセイを開発することができる。
【００９９】
Ａｘｌ：Ｇａｓ６相互作用をモジュレートする分子を同定するためのアッセイ
Ａｘｌと相互作用する分子またはＡｘｌに対するＧａｓ６の結合をモジュレートし得る分子を同定するために使用され得るアッセイとしては、限定されないが、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイ、共免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）アッセイおよびＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイが挙げられる。当業者は、これらのアッセイについて熟知している。具体的には、ＥＬＩＳＡ系の方法は、Ａｘｌタンパク質（もしくはその断片）またはＧａｓ６タンパク質のいずれかを、固相支持体、例えば、ナイロン、ニトロセルロース膜、シリコンチップ、ガラススライド、ビーズまたは特別に設計されたアッセイプレートに固定化することを伴う。１つのタンパク質（例えば、Ａｘｌ）が結合された状態で、リガンド（例えば、Ｇａｓ６）を、医薬用分子（小分子、抗体、ペプチドなど）の存在下または非存在下で添加し、相互作用が可能となる時間インキュベートする。次いで、プレートを洗浄して非結合Ｇａｓ６タンパク質を除去し、残留しているタンパク質を、Ｇａｓ６が標識されている場合（例えば、蛍光、放射能、もしくはアルカリホスファターゼあるいはビオチンなどの酵素とのコンジュゲーションにより）は直接、またはＧａｓ６特異的抗体を用いて間接的に、のいずれかで検出する。医薬用分子によって増強されるか、または阻害されるかのいずれかである相互作用は、典型的には、比色による読み出し情報または蛍光定量的エンドポイントによって定量される。ＩＬ−１５ＲαとのＡｘｌの相互作用を示すため、Ｂｕｄａｇｉａｎら（ＥＭＢＯ  Ｊ．２４：４２６０−４２７０（２００５））により報告された同様のアッセイが使用された。また、液相アッセイ（共免疫沈降）も、ビオチン化タンパク質、エピトープタグ化タンパク質（Ｖ５、ｆｌａｇ、ＧＳＴ、Ｆｃなど）に対する抗体、またはタンパク質特異的抗体のいずれかを用いて行なうことができ、その場合、タンパク質／抗体複合体は、例えば、プロテインＡもしくはプロテインＧ（これは抗体に結合する）を用いて捕捉されるか、または、ビオチン化タンパク質の場合は、アビジンコンジュゲートセファロースビーズが使用され得る。相互作用性タンパク質があれば、これは、続いて該複合体内に引き込まれ、相互作用性タンパク質が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いてウエスタンブロッティングによって同定される。Ａｘｌに関する同様のプロトコルが、Ｎａｇａｔａら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３００２２−３００２７，１９９６およびＧｏｒｕｐｐｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：４４４２−４４５３，１９９７によって報告されている。
【０１００】
Ａｘｌタンパク質（またはその断片）とＧａｓ６との相互作用をモジュレートし得る治療用化合物の同定は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）製のものなどの装置を用いたプラズモン共鳴分光法の観察結果によって行なわれ得る。この方法では、タンパク質（例えば、Ａｘｌ）をセンサーチップに結合させ、試験化合物を添加する。第２のタンパク質（例えば、Ｇａｓ６）を、この２つのタンパク質の相互作用を可能にする条件下で添加する。装置の出力シグナルにより、試験化合物が２つのタンパク質（例えば、ＡｘｌとＧａｓ６）の相互作用に対して及ぼした影響（あれば）の表示が提供される。Ａｘｌに関する同様のプロトコルが、Ｎａｇａｔａら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３００２２−３００２７，１９９６によって報告されている。
【０１０１】
また、細胞系結合アッセイも一般的に使用されており、当該技術分野で知られている。具体的には、Ａｘｌ結合アッセイは、Ａｘｌタンパク質を一過的に過剰発現させること、または例えば、内在性Ａｘｌを発現するがＴｙｒｏ３およびＭｅｒ受容体型チロシンキナーゼの発現は最小限であるマウスＬ９２９細胞を用いて、安定な細胞株を開発することにより開発され得る。ほぼ４０，０００細胞／反応をアッセイバッファー（ＤＭＥＭ高グルコース、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１μｇ／ｍｌのヘパリン、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））で２回洗浄する。適切な容量の非標識Ｇａｓ６タンパク質を、［１２５Ｉ］Ｇａｓ６の１００倍過剰でアッセイバッファー（ＮＳＢ）に添加し、次いで、医薬用分子（例えば、小分子、ペプチドまたは抗体）を、適切なウェル内の処理バッファーまたはビヒクルバッファーに添加する。次いで、適切な容量の［１２５Ｉ］Ｇａｓ６をすべてのウェルに添加し、細胞を室温（２２℃）で３時間インキュベートする。細胞をアッセイバッファーで、反転させることによって２回洗浄し、１００μｌの０．５％ＳＤＳ含有ＰＢＳを添加して細胞を溶解させる。次いで、細胞溶解物を回収し、放射線をγ線計数装置にて測定する。総結合値から非標識Ｇａｓ６の存在下で得られた結合を差し引くことにより、特異的結合を計算する。
【０１０２】
Ａｘｌタンパク質モジュレーター
本発明の方法における使用のためのＡｘｌタンパク質モジュレーターは、Ａｘｌの生物学的活性をモジュレートし、骨に対して所望の効果を有するものである。該モジュレーターは、Ａｘｌのインヒビタータンパク質であり得、骨密度、骨量、骨質、および／または骨形成を増大させる。モジュレーターは、Ａｘｌタンパク質のアゴニストであってもよく、骨密度、骨量、骨質、および／または骨形成を低減させる。Ａｘｌタンパク質の発現に対するモジュレーターの効果は、遺伝子発現を測定するための当該技術分野で知られた方法（その一部は後述している）のいずれかによって測定され得る。Ａｘｌのチロシンキナーゼ活性に対するモジュレーターの効果は、上記のアッセイのいずれかを用いて測定され得る。Ａｘｌの筋骨格活性に対するモジュレーターの効果（骨密度、骨量、骨質、および／または骨形成に対する効果など）は、上記のアッセイのいずれかを用いて測定され得る。
【０１０３】
用語「Ａｘｌインヒビター」、「アンタゴニスト」、「中和」および「下方調節」は、同じインヒビターのその非存在下での活性と比較すると、Ａｘｌのインヒビターとして作用する化合物（または、適宜その性質）をいう。用語「直接Ａｘｌインヒビター」は、一般的に、Ａｘｌ遺伝子、Ａｘｌ転写物、Ａｘｌタンパク質、またはＡｘｌリガンドと相互作用することにより、Ａｘｌの生物学的活性を直接下方調節する任意の化合物をいう。本明細書で用いる場合、用語「Ａｘｌの生物学的活性の阻害」は、Ａｘｌの生物学的活性が少なくとも約１５パーセント、好ましくは少なくとも５０パーセント、より好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９９パーセント低減される条件（例えば、本発明のインヒビターの添加）をいう。生物学的活性は、任意の適当な方法、例えば限定されないが、上記の方法を用いて測定され得る。
【０１０４】
用語「Ａｘｌアゴニスト」、「増加（増大）」および「上方調節」は、Ａｘｌタンパク質の生物学的活性のアゴニストとして作用する化合物（または、適宜その性質）をいう。本明細書で用いる場合、用語「Ａｘｌのチロシンキナーゼ活性の増大」は、Ａｘｌタンパク質のチロシンキナーゼ活性が少なくとも約１５パーセント、好ましくは少なくとも５０パーセント、より好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９９パーセント増大される条件（例えば、本発明のアゴニストの添加）をいう。
【０１０５】
用語「キナーゼ死」Ａｘｌは、ＡＴＰ結合部位内の保存されているリシンが、アミノ酸５６７位のリシンに対するアルギニン置換によって変異されており、キナーゼの酵素的活性が不活化されているＡｘｌタンパク質をいう。
【０１０６】
Ａｘｌタンパク質（ｐｔｒｏｔｅｉｎ）インヒビターは、例えば、少なくとも以下：（１）Ａｘｌのキナーゼ活性の阻害；（２）Ａｘｌ発現レベルの低減；（３）膜貫通Ａｘｌ受容体もしくは可溶性Ａｘｌの安定性に対する影響；（４）完全長膜貫通結合型Ａｘｌから可溶性Ａｘｌへの切断に対する影響；（５）Ａｘｌに対するＡｘｌタンパク質リガンド（Ｇａｓ６など）の結合の妨害；（６）Ａｘｌの二量体化の妨害；または（７）Ａｘｌ受容体の細胞内シグナル伝達の妨害のいずれかによってＡｘｌを阻害するものであり得る。
【０１０７】
Ａｘｌタンパク質インヒビターはＡｘｌチロシンキナーゼインヒビターであってもよく、これは、初期の自己リン酸化事象を阻害すること、および／またはタンパク質基質のリン酸化を阻害すること（例えば、タンパク質基質もしくはＡＴＰと、Ａｘｌとの立体的結合に関して競合することにより）作用するものであり得る。また、Ａｘｌタンパク質インヒビターは、これらの機構の１つより多くによって作用するものであってもよい。
【０１０８】
Ａｘｌモジュレーターとしては、非タンパク質性モジュレーター、例えば、小分子および核酸（干渉ＲＮＡなど）、ならびにペプチド、抗体、および他のタンパク質（Ａｘｌに結合するものなど）、ならびに修飾された形態またはその断片、プロペプチド、ペプチド、ならびにこのようなあらゆるモジュレーターの模倣物が挙げられる。
【０１０９】
小分子
軟骨障害および骨障害を処置または予防するための本発明の方法に有用なＡｘｌタンパク質活性のモジュレーターとしては、小分子および化合物が挙げられる。Ａｘｌタンパク質活性の小分子インヒビターは、基質結合部位および／またはＡＴＰ結合部位と結合することにより、高度に保存されたキナーゼドメインとの物理的相互作用によってチロシンリン酸化を直接阻害するものであり得る。ＡＴＰ結合部位とタンパク質基質結合部位の両方に結合する化合物は、競合的二基質インヒビターと称されることもある。該小分子としては、合成のＡｘｌタンパク質活性モジュレーター、および精製された天然のＡｘｌタンパク質活性モジュレーターが挙げられる。該小分子は、模倣物または分泌促進物質であってもよい。Ａｘｌタンパク質キナーゼ活性を阻害する小分子は、例えば、米国特許出願公開公報第２００７／０１４２４０２号に記載されている。
【０１１０】
核酸
骨障害を処置または予防するための本発明の方法に有用なＡｘｌモジュレーターとしては、核酸が挙げられる。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および適宜リボ核酸（ＲＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）をいう。また、該用語は、ヌクレオチド類縁体、および単鎖または二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）も包含すると理解されたい。ポリヌクレオチドの例としては、限定されないが、プラスミドＤＮＡまたはその断片、ウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡ、ＲＮＡｉなどが挙げられる。
【０１１１】
Ａｘｌタンパク質活性をブロックし得る核酸は、本発明において有用である。かかるインヒビターは、Ａｘｌタンパク質自体と相互作用するタンパク質をコードするものであり得る。あるいはまた、かかるインヒビターは、Ａｘｌタンパク質と相互作用するタンパク質（Ｇａｓ６など）と相互作用し得るタンパク質をコードするものであり得る。また、インヒビターは、Ａｘｌと相互作用性タンパク質の両方と相互作用するタンパク質をコードするものであり得る。
【０１１２】
本発明の方法には、Ａｘｌの発現を低減させるためのＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）の使用が含まれ得る。ＲＮＡｉは、核酸分子、例えば、合成の低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）またはＲＮＡ干渉剤を導入し、標的遺伝子の発現を阻害またはサイレンス化することにより起こすことができる。例えば、米国特許公開公報第２００３０１５３５１９号、ならびに米国特許第６，５０６，５５９号、同第６，５７３，０９９号および同第７，１４４，７０６号を参照のこと。
【０１１３】
「ＲＮＡ干渉剤」または「ＲＮＡｉ」は、本明細書で用いる場合、ＲＮＡ干渉によって標的遺伝子またはゲノム配列の発現を妨害ならびに阻害する任意の薬剤である。かかるＲＮＡ干渉剤としては、限定されないが、標的遺伝子もしくはゲノム配列に相同なＲＮＡ分子またはその断片、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびＲＮＡ干渉によって標的遺伝子の発現を妨害または阻害する小分子が挙げられる。
【０１１４】
本明細書で用いる場合、「標的遺伝子の発現の阻害」は、標的遺伝子の発現レベルまたは標的遺伝子にコードされたタンパク質のレベルの任意の減少を包含する。この減少は、ＲＮＡ干渉剤で標的化しなかった標的遺伝子の発現または標的遺伝子にコードされたタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上であり得る。
【０１１５】
ｓｉＲＮＡは、充分に規定された構造を有する。これは、通常、いずれか一方の末端に２−ｎｔの３’突出端を有する短鎖ＲＮＡ二本鎖（ｄｓＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは、化学合成されたもの、インビトロ転写によって生成されたもの、または宿主細胞内で産生させたものであり得る。典型的には、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１５〜５０ヌクレオチド長（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０ヌクレオチド長）、または該範囲の任意の整数値である。ｓｉＲＮＡは、約１５〜約４０ヌクレオチド長、例えば、約１５〜約２８ヌクレオチド長（約１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド長など）の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、各鎖に約０、１、２、３、４、５または６ヌクレオチド長の３’および／または５’突出端を含むものであり得る。ｓｉＲＮＡは、転写のサイレンス化によって標的遺伝子を阻害するものであり得る。ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡの分解または特異的転写後遺伝子サイレンス化（ＰＴＧＳ）によってＲＮＡ干渉を促進し得るものであり得る。
【０１１６】
また、本発明の方法に有用なＲＮＡとして、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。ｓｈＲＮＡは、短鎖（例えば、約１９〜約２５ヌクレオチド）のアンチセンス鎖、続いて約５〜約９ヌクレオチドのヌクレオチドループ、および相似センス鎖で構成されている。あるいはまた、センス鎖がヌクレオチドループ構造の前に存在していることもあり、センス鎖の後にアンチセンス鎖が存在している場合もあり得る。このようなｓｈＲＮＡは、プラスミドまたはウイルスベクター内に含有され得る。
【０１１７】
本発明のｓｉＲＮＡ分子の標的化対象領域は、所与の標的配列から選択され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、開始コドンの約２５〜１００ヌクレオチド下流から始まるものであり得る。ヌクレオチド配列は、５’または３’非翻訳領域、ならびに開始コドン近傍の領域を含むものであり得る。ｓｉＲＮＡ分子の設計および調製のための方法は、当該技術分野でよく知られており、ＲＮＡｉ試薬としての配列を選択するためのさまざまな規則が挙げられる（例えば、Ｂｏｅｓｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３９２：７３−９６（２００５）を参照のこと）。
【０１１８】
ｓｉＲＮＡは、Ｈａｎｎｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４１８：２４４−２５１（２００２）；ＭｃＭａｎｕｓら、Ｎａｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，３：７３７−７４７（２００２）；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４３：２０９−２１４（２００２）；Ｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０８：６４１−６４４（２００１）；およびＺａｍｏｒｅ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，８：７４６−７５０（２００１）に記載されているような標準的な手法を用いて作製され得る。好ましいｓｉＲＮＡは、５−プライムリン酸化型である。かかるｓｉＲＮＡは、多くのウェブサイトからカスタム開発されるもの、例えば限定されないが、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、およびＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）などの企業から供給されるものであり得る。本明細書に示したｓｉＲＮＡ配列（配列番号：３、４、５、および６）は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入したものである。
【０１１９】
さらなるＲＮＡｉ構築物を、標準的な手法を用いて内部開発した。開発した構築物としては、ヒト特異的ｓｈＲＮＡであるｈＡｘｌ  ３６３、ｈＡｘｌ  １１０７、ｈＡｘｌ  １７４８、ｈＡｘｌ  １９８８、およびｈＡｘｌ  ２４４８、ならびにマウス特異的ｓｈＲＮＡであるｍＡｘｌ  １８７、ｍＡｘｌ  １０７９、ｍＡｘｌ  １４７７、ｍＡｘｌ  １８５０、およびｍＡｘｌ  ２２６９が挙げられる。これらのｓｈＲＮＡは、配列番号：１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７に示すＤＮＡ配列を含み、Ｕ６プロモーターによって駆動されるプラスミドを用いて作製した。
【０１２０】
配列番号：１８に示すヌクレオチド配列は、ｈＡｘｌ  ３６３を含み、以下に示すものである。
【０１２１】
５’−ＣＧＧＡＣＡＴＣＡＧＡＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＡＣＡＣＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＴＧＴＣＣ−３’
配列番号：１９に示すヌクレオチド配列は、ｈＡｘｌ  １１０７を含み、以下に示すものである。
【０１２２】
５’−ＣＧＣＧＴＡＴＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＴＡＣＧＣ−３’
配列番号：２０に示すヌクレオチド配列は、ｈＡｘｌ  １７４８を含み、以下に示すものである。
【０１２３】
５’−ＣＧＡＧＴＧＡＡＧＣＧＧＴＣＴＧＣＡＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴＣＡＣＴＣ−３’
配列番号：２１に示すヌクレオチド配列は、ｈＡｘｌ  １９８８を含み、以下に示すものである。
【０１２４】
５’−ＣＧＡＧＴＡＣＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＡＣＴＣ−３’
配列番号：２２に示すヌクレオチド配列は、ｈＡｘｌ  ２４４８を含み、以下に示すものである。
【０１２５】
５’−ＣＧＡＣＧＡＡＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＣ−３’
配列番号：２３に示すヌクレオチド配列は、ｍＡｘｌ  １８７を含み、以下に示すものである。
【０１２６】
５’−ＣＧＧＣＴＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＡＴＣＴＧＴＣＣＡＴＣＴＣＧＡＡＧＣＣ−３’
配列番号：２４に示すヌクレオチド配列は、ｍＡｘｌ  １０７９を含み、以下に示すものである。
【０１２７】
５’−ＣＧＴＡＣＣＧＧＣＴＧＧＣＡＴＡＴＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＣＧＡＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＧＧＴＡＣ−３’、
配列番号：２５に示すヌクレオチド配列は、ｍＡｘｌ  １４７７を含み、以下に示すものである。
【０１２８】
５’−ＣＧＴＧＴＣＣＧＡＡＡＧＴＣＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＴＡＧＧＡＣＴＴＴＣＧＧＡＣＡＣ−３’
配列番号：２６に示すヌクレオチド配列は、ｍＡｘｌ  １８５０を含み、以下に示すものである。
５’−ＣＧＡＡＡＣＡＣＧＧＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＧＴＡＧＧＴＣＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣ−３’
配列番号：２７に示すヌクレオチド配列は、ｍＡｘｌ  ２２６９を含み、以下に示すものである。
【０１２９】
５’−ＣＧＴＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＧＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＴＴＣＡＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＴＴＧＡＣ−３’
Ａｘｌ遺伝子の発現は、ｓｉＲＮＡインヒビターを用いて標的化した。４つのＡｘｌ特異的ｓｉＲＮＡの配列を配列番号：３〜６に示す。他のＡｘｌ  ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、文献に報告されている。ＴＮＦα誘導性細胞死に対して抵抗性であるＬ９２９亜株におけるＡｘｌ発現のノックダウンによってＴＮＦαに対する感受性が回復され得るかどうかを試験するため、Ｂｕｄａｇｉａｎらは、ｓｉＲＮＡを用いてＡｘｌ  ｍＲＮＡおよびＡｘｌタンパク質のレベルを低下させた（ＥＭＢＯ  Ｊ．，２４：４２６０−４２７０（２００５））。Ｂｕｄａｇｉａｎらが使用したｓｉＲＮＡは、本明細書に配列番号：２８、配列番号：２９、および配列番号：３０で示す配列を有し、これを以下に示す。
【０１３０】
配列番号：２８    ５’−ＵＡＵＣＡＣＡＧＧＵＧＣＣＡＧＡＧＧＡ−３’
配列番号：２９    ５’−ＡＡＧＡＣＡＵＣＣＵＣＵＵＵＣＵＣＣＵＧＣ−３’
配列番号：３０    ５’−ＡＡＧＡＵＵＵＧＧＡＧＡＡＣＡＣＡＣＵＧＡ−３’
ＡｘｌのノックダウンのためにｓｈＲＮＡを使用し、Ｈｏｌｌａｎｄら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：９２９４−９３０３（２００５））は、マウスモデルにおいて、Ａｘｌがエキソビボ血管新生に必要であることを示した。Ｈｏｌｌａｎｄらによって報告されたｓｈＲＮＡは、配列番号：３１および配列番号：３２に示す配列を有し、これを以下に示す。
【０１３１】
配列番号：３１：
５’−ＧＡＣＡＴＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＣＧＡＡＧＣＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＴＧＴＣ−３’
配列番号：３２：
５’−ＧＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＴＣＡＧＴＧＴＧＴＴＣＴＣＣＡＡＡＴＣ−３’
Ｓｈｉｅｈら，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ７：１０５８−１０６４（２００５）には、Ａｘｌ  ｓｉＲＮＡを用いた試験が記載されているが、使用されたｓｉＲＮＡの配列は示されていない。この刊行物では、プールされた４種類のｓｉＲＮＡ二本鎖を用いたＣｌ１−５細胞株のトランスフェクションにより、Ａｘｌ  ＲＮＡおよびＡｘｌタンパク質のノックダウンがもたらされた（ＰＣＲおよびウエスタンブロット解析によって示された）。
【０１３２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ａｘｌの発現を低減させるために使用され得る。「アンチセンス」は、本明細書で用いる場合、配列相補性のため、ｍＲＮＡのコードおよび／または非コード領域の一部分にハイブリダイズし、それによりｍＲＮＡからの翻訳を妨げることができる核酸をいう。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片のいずれかであり得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第１版，Ｃｒｏｏｋｅ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（２００１）に記載のような標準的な手法を用いて作製され得る。
【０１３３】
核酸は、症状の重症度および障害の進行に応じて約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与され得る。適切な有効用量は、処置医によって以下の範囲：約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、および約５００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇから選択される。核酸インヒビターは、経局所、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下または経皮手段によって投与され得る。
【０１３４】
核酸は、その天然環境から、実質的に純粋または均一な形態で採取、単離および／または精製され得る。核酸操作（例えば、さまざまな異なる宿主細胞および系でのクローニングおよび遺伝子発現）のための系は、よく知られており、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，第５版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（２００２）に詳細に記載されている。適切な調節配列を含む好適なベクターは、当該技術分野でよく知られた方法を用いて選択または構築され得る。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）を参照のこと。
【０１３５】
核酸は、さらなるポリペプチド配列、例えば、マーカーまたはレポーターとしての機能を果たす配列をコードする他の配列に融合させてもよい。マーカーまたはレポーター遺伝子の例としては、ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性を担う）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（ガラクトシダーゼをコード）、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ルシフェラーゼ、および当該技術分野で知られた他の多くのものが挙げられる。
【０１３６】
タンパク質モジュレーター
Ａｘｌに結合してその活性を変化させるタンパク質は、本発明の方法における使用のための許容され得るモジュレーターである。
【０１３７】
ペプチド
Ａｘｌの細胞内基質結合領域と相互作用し、そのチロシンキナーゼ活性を阻害する非リン酸化型ペプチドは、本発明の方法においてインヒビターとして使用され得る。かかるペプチドは、は基質インヒビターまたは偽基質と称されることもあり、基質のチロシン部分の一次配列を模倣するように設計され、および典型的には、チロシン部分が非リン酸化型チロシン類縁体（フェニルアラニン、チラミン、またはヨードチロシン）で置き換えて設計された短鎖のペプチドである。例えば、配列番号：１４および配列番号：１５に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、Ａｘｌ自己リン酸化部位として同定されており（すなわち、これらはＡｘｌ基質）、基質インヒビターまたは偽基質を作製するための基本部分を提供し得るものである。これらのＡｘｌ特異的基質は、密接に関連しているＡｘｌファミリー構成員Ｍｅｒ内の推定自己リン酸化部位との相同性に基づいて同定された（Ｌｉｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１８３５５−６２（１９９６））。配列番号：１４および配列番号：１５で示すアミノ酸配列を以下に示す。
【０１３８】
配列番号：１４：  ＫＱＰＡＤＣＬＤＧＬＹＡＬＭＳＲＣＷＥＬＮ
配列番号：１５  ＦＧＬＳＫＫＩＹＮＧＤＹＹＲＱＧＲＩＡＫ
抗体
Ａｘｌタンパク質の活性を調節する抗体は、本発明の方法において使用され得る。
【０１３９】
用語「抗体」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリンまたはその一部分をいい、供給源、起源の種、作製方法、および特性に関係なく、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。非限定的な例として、用語「抗体」には、ヒト、オランウータン、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、およびニワトリ抗体が含まれる。該用語には、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異的、多重特異的、非特異的、ヒト化、単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異型、およびＣＤＲグラフト抗体、ならびに細胞内抗体が含まれる。本発明の解釈上、特に記載のない限り、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂなど）、および抗原結合機能を保持している他の抗体断片も含まれる。
【０１４０】
上記の方法によれば、Ａｘｌタンパク質自体に特異的に結合する抗体が生成され得る。上記のように、Ａｘｌのアミノ酸配列は、配列番号：２ならびにＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６８７１３で示されるものである。Ａｘｌアイソフォーム２のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１６９０からわかる。本発明において最も有効な抗体は、Ａｘｌタンパク質に対して特異的に結合する性質を有するものである。具体的には、ＧＡＳ６：Ａｘｌのその相互作用に関する結晶構造情報（Ｓａｓａｋｉら  ＥＭＢＯ  Ｊ．２５：８０−８７（２００６））により、Ａｘｌ分子の細胞外領域のＩＧ１およびＩＧ２と表示される２つのＩＧドメインは、ともにＧａｓ６相互作用に関与していることが示された。しかしながら、ＧＡＳ６とＡｘｌとの接触は主にＩＧ１領域（配列番号：３３に示すアミノ酸配列を有する）で見られ、これを、本明細書では「主結合部位」と称する。ＩＧ２領域には非主要接触部位（配列番号：３４に示すアミノ酸配列を有する）が存在し、本明細書では「副結合部位」と称する。ＡｘｌのＩＧ１領域およびＩＧ２領域の配列を示す。Ｇａｓ６接触部位を太字および下線で示す。
【０１４１】
配列番号：３３：
ＴＬＲＣＱＬＱＶＱＧＥＰＰＥＶＨＷＬＲＤＧＱＩＬＥＬＡＤＳＴＱＴＱＶＰＬＧＥＤＥＱＤＤＷＩＶＶＳＱＬＲＩＴＳＬＱＬＳＤＴＧＱＹＱＣＬＶＦＬＧＨＱＴＦＶＳＱＰＧＹＶＧＬＥ
配列番号：３４
ＧＬＰＹＦＬＥＥＰＥＤＲＴＶＡＡＮＴＰＦＮＬＳＣＱＡＱＧＰＰＥＰＶＤＬＬＷＬＱＤＡＶＰＬＡＴＡＰＧＨＧＰＱＲＳＬＨＶＰＧＬＮＫＴＳＳＦＳＣＥＡＨＮＡＫＧＶＴＴＳＲＴＡＴＩＴ
重要なことに、Ｇａｓ６によるＡｘｌタンパク質活性化には、主結合部位と副結合部位の両方における相互作用が必要とされるため、ＡｘｌとＧａｓ６の相互作用のブロックには、一方の部位に対する抗体で充分であり得る。ＲＴＫ上におけるＧａｓ６の副結合部位であるＩＧ２のアミノ酸配列は、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３およびＭｅｒ間で高度に保存されているが、ＲＴＫにおけるＧａｓ６の主結合部位であるＩＧ１のアミノ酸配列の保存の程度は低い。したがって、標的化するＡｘｌヌクレオチド配列は、Ａｘｌタンパク質のＩＧ１ドメイン内のＧａｓ６の接触点（および／または隣接配列）であり得る。
【０１４２】
抗体は、該受容体タンパク質全体に対して、または細胞外ドメインのみに対して生成させたものであり得る。また、抗体は、Ａｘｌの細胞内エピトープ（例えば、キナーゼドメイン）に対して生成させたものであり得る。抗体は、Ａｘｌのバリアントおよび断片に対して生成させたものであってもよい。抗体は、Ａｘｌの細胞外ドメインの可溶性二量体形態に対して生成させたものであり得る（米国特許公開公報第２００５０１４７６１２号）。
【０１４３】
かかる抗体は、Ａｘｌに高親和性で結合し得るものであり得、単量体形態、ホモ二量体形態および／またはヘテロ二量体形態の成熟タンパク質に結合するものであり得る。このような抗体は、Ａｘｌの活性を阻害するものであれば、本発明において有効である。Ａｘｌへの抗体の結合により、Ａｘｌ受容体のキナーゼ活性がブロックされ得る。また、Ａｘｌへの抗体の結合により、Ａｘｌのそのリガンド（Ｇａｓ６など）への結合がブロックされ得、また、かかる抗体によりＡｘｌキナーゼ活性もまたブロックされ得る。Ａｘｌへの抗体の結合により、その二量体化がブロックされ得る。上記のように、Ａｘｌ二量体としては、完全長膜結合型タンパク質のホモ二量体ならびにｓＡｘｌ−ｓＡｘｌホモ二量体、Ａｘｌ−ｓＡｘｌヘテロ二量体、Ａｘｌ−Ｇａｓ６ヘテロ二量体、およびｓＡｘｌ−Ｇａｓ６ヘテロ二量体が挙げられる。
【０１４４】
Ａｘｌに対する抗体は当該技術分野で報告されており、本発明における使用が想定される。かかる抗体の例としては、限定されないが、例えば、米国特許第６，１９１，２６１号；およびＯ’Ｂｒｙａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：５５１−５５７（１９９５））に示された抗体が挙げられる。また、市販の抗体、例えば、ヒトポリクローナル抗体およびいくつかのマウスモノクローナル抗体（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）も利用可能である。
【０１４５】
本発明は、Ａｘｌに対する中和抗体を提供する。用語「中和抗体」は、本明細書で用いる場合、特定の受容体に対する抗原結合部位を有し、Ａｘｌ受容体を介する活性またはシグナル伝達を低減または阻害（すなわち、ブロック）し得る抗体をいう。かかる抗体は、典型的には、Ａｘｌのリガンド依存性活性化および／または構成的リガンド非依存的活性化をブロックするものである。Ａｘｌに対する中和抗体は当該技術分野で報告されており、本発明における使用が想定され、市販のヤギ抗ヒトＡｘｌポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製（カタログ番号ＡＦ１５４））が挙げられる。
【０１４６】
スモール・モジュラー・イムノファーマシューティカル（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）製剤（ＳＭＩＰ（商標）製剤）は、モノクローナルや組換え抗体よりも増強された薬物特性を有する高度にモジュール的な化合物の一類型である。ＳＭＩＰ（商標）製剤は、例えば、抗体可変ドメインを基本とする標的特異的結合ドメインを、所望の種類のエフェクター細胞（例えば、マクロファージやナチュラルキラー（ＮＫ）細胞など）の特異的漸増および／または補体媒介性殺作用の漸増を可能にする可変ＦＣ領域と合わせて含む単一のポリペプチド鎖で構成されたものである。標的およびヒンジ領域の選択に応じて、ＳＭＩＰ（商標）製剤は、細胞表面受容体を経由するシグナル伝達を実施またはブロックするものであり得る。
【０１４７】
修飾型Ａｘｌ受容体
非修飾型Ａｘｌ受容体の活性を阻害する修飾型Ａｘｌタンパク質は、本発明の方法に使用され得る。かかる修飾型受容体は、このバリアントが同じ細胞内の通常の野生型遺伝子産物に有害な影響を及ぼすため、ドミナントネガティブ受容体と称されることもある。修飾型Ａｘｌ受容体は、Ａｘｌリガンドと相互作用して該リガンドの活性またはその受容体（すなわち、非修飾型Ａｘｌ受容体）への結合を阻害するものであり得る。あるいはまた、修飾型Ａｘｌ受容体は、Ａｘｌ受容体（すなわち、非修飾型Ａｘｌ受容体）と直接相互作用するものであり得る。かかる修飾型Ａｘｌ受容体は、単量体形態、ホモ二量体形態および／またはヘテロ二量体形態のＡｘｌと結合し得る。修飾型Ａｘｌ受容体は、もちろん、Ａｘｌリガンドおよびその受容体の両方と相互作用するものであってもよい。修飾型Ａｘｌ受容体としては、可溶性Ａｘｌ受容体、ドミナントネガティブＡｘｌ受容体、およびキナーゼ死Ａｘｌ受容体が挙げられる。
【０１４８】
修飾型可溶性Ａｘｌ受容体は、本発明の方法に使用され得る。可溶性受容体は、Ａｘｌの細胞外ドメイン（エクトドメインとも称される）の全部または一部を含むものであり得る。修飾型可溶性受容体は、Ａｘｌリガンド（例えば、Ｇａｓ６）に結合してＡｘｌリガンドが体内のその天然の受容体（１種類または複数種）に結合する能力を低下させる。修飾型可溶性受容体は、非修飾型Ａｘｌの二量体化をブロックするものであり得る。可溶性受容体は、組換えにより、またはインタクトな受容体の化学的もしくは酵素的切断によって作製され得る。
【０１４９】
いくつかの修飾型可溶性Ａｘｌ受容体が報告されている。例えば、Ｎａｇａｔａらには、５アミノ酸リンカーによってヒトＩｇＧ１のアミノ酸２１６〜４４３に融合されたＡｘｌの最初の４３８個のアミノ酸を含む切断型Ａｘｌ受容体が記載されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４７）：３００２２−３００２７（１９９６））。Ａｘｌを阻害し、配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙを有するスペーサーに融合されたＡｘｌエクトドメイン、それに続くヒトＩｇＧ１のヒンジＣＨ２およびＣＨ３領域からなるＡｘｌ細胞外ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質が、Ｓｈａｎｋａｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：４２０８−４２１８（２００３）に示されている。米国特許公開公報第２００５０１８６５７１号には、Ａｘｌ細胞外ドメインを含む切断型Ａｘｌタンパク質（ドミナントネガティブバリアントと称されている）が記載されており、これは、そのｃＤＮＡ配列の１．５ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＦｓｐＩ断片のサブクローニングによって作製されたものである。
【０１５０】
ヒトＡｘｌ／Ｆｃ融合タンパク質は、Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から市販されている。このＡｘｌ／Ｆｃキメラは、７アミノ酸リンカーによってヒトＩｇＧ１のカルボキシ末端６×ヒスチジンタグ化Ｆｃ領域に融合されたヒトＡｘｌの細胞外ドメイン（アミノ酸１〜４４２）を含むものである。組換え成熟ヒトＡｘｌ／Ｆｃは、ジスルフィド結合によるホモ二量体タンパク質である。Ｎ末端配列決定法に基づくと、該タンパク質はＧｌｕ２６で始まる。縮小型ヒトＡｘｌ／Ｆｃ単量体は、７２．３ｋＤａの計算値分子量を有する。グリコシル化の結果、組換えＡｘｌ単量体は、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてほぼ１００〜１１０ｋＤａのタンパク質として移動する。
【０１５１】
マウスＡｘｌ／Ｆｃ融合タンパク質もまた、Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から市販されている。このＡｘｌ／Ｆｃキメラは、６アミノ酸リンカーによってヒトＩｇＧ１のカルボキシ末端６×ヒスチジンタグ化Ｆｃ領域に融合されたマウスＡｘｌの細胞外ドメイン（アミノ酸１〜４４３）を含む（ｈａｓ  ｃｏｎｔａｉｎｓ）ものである。組換え成熟ヒトＡｘｌ／Ｆｃはジスルフィド結合によるホモ二量体タンパク質である。Ｎ末端配列決定法に基づくと、該タンパク質はＨｉｓ２０で始まる。縮小型ヒトＡｘｌ／Ｆｃ単量体は、７３．８ｋＤａの計算値分子量を有する。グリコシル化の結果、組換えＡｘｌ単量体は、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてほぼ１００〜１１０ｋＤａのタンパク質として移動する。
【０１５２】
不活性なキナーゼドメインを有する修飾型Ａｘｌタンパク質は、本発明の方法に使用され得る；このようなバリアントは、「キナーゼ死」Ａｘｌ受容体とも称される。キナーゼ死Ａｘｌ受容体を作製するためには、キナーゼ活性に必須の残基に影響を及ぼす（例えば、チロシンキナーゼドメイン内の保存されたＡＴＰ結合リシン残基を除去する）ための点変異が導入され得、基質のリン酸化能力の喪失がもたらされる。例えば、アミノ酸５６７位のＬｙｓに対してＡｒｇ置換を有するキナーゼ死Ａｘｌ受容体が報告されている（ＭｃＣｌｏｓｋｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２３２８５−２３２９１（１９９７）；Ｆｒｉｄｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７１２３−７１２６（１９９８））。
【０１５３】
Ａｘｌプロテアーゼは、本発明の方法に使用され得る。Ａｘｌ活性は、Ａｘｌ受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を切断するプロテアーゼの投与によって下方調節され得る。この切断は、２つのレベルでＧａｓ６機能がモジュレートされるインビボ現象である（Ｏ’Ｂｒｙａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：５５１−５５７（１９９５））。放出されたＡｘｌ−ＥＣＤは、Ｇａｓ６に結合してＧａｓ６のシグナル伝達を妨げる。Ａｘｌの膜結合型細胞内ドメインは、キナーゼ活性を保持しているが、急速に分解される。Ａｘｌ配列内のこの切断部位は、膜貫通領域に対してアミノ末端側である１４アミノ酸（ＶＫＥＰＳＴＰＡＦＳＷＰＷＷ（配列番号：１２）のペプチドにマッピングされている。高用量では、細胞からそのＡｘｌ−ＥＣＤが除去され、したがってＧａｓ６タンパク質の一部が除かれ、Ａｘｌ受容体が分解される。
【０１５４】
Ａｘｌタンパク質性インヒビターは、任意選択で、グリコシル化、ペグ化、または別の非タンパク質性ポリマーに連結される。Ａｘｌのインヒビターは、グリコシル化パターンの改変（すなわち、元の、または天然のグリコシル化パターンからの改変）を有するように修飾され得る。本明細書で用いる場合、「グリコシル化パターンの改変」は、元のインヒビターと比較したとき、１つ以上の糖質部分の付加もしくは欠失を有すること、および／または１つ以上のグリコシル化部位の付加もしくは欠失を有することを意味する。該インヒビターに対するグリコシル化部位の付加は、当該技術分野でよく知られたグリコシル化部位のコンセンサス配列を含むようにアミノ酸配列を改変することによって行なわれ得る。糖質部分の数を増やす別の手段は、該インヒビターのアミノ酸残基にグリコシドの化学的または酵素的カップリングによるものである。このような方法は、ＷＯ８７／０５３３０、およびＡｐｌｉｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：２５９−３０６（１９８１）に記載されている。受容体上に存在している任意の糖質部分の除去は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  Ｓｏｊａｒら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２−５７（１９８７）；Ｅｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１−１３７（１９８１）；およびＴｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０−３５９（１９８７）に記載のようにして化学的または酵素的に行なわれ得る。
【０１５５】
また、本発明の方法に有用なＡｘｌインヒビターは、検出可能な標識または機能性標識でタグ化されたものであり得る。検出可能な標識としては、１２５Ｉ、１３１Ｉまたは９９Ｔｃなどの放射性標識が挙げられ、これらは、当該技術分野で知られた慣用的な化学反応を用いて該インヒビターに結合され得る。また、標識としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素標識も挙げられる。さらに、標識として、対応する特異的な検出可能な部分（例えば、標識されたアビジン）への結合によって検出され得る化学的部分（ビオチンなど）が挙げられる。
【０１５６】
Ａｘｌに結合する任意のタンパク質が、別のタンパク質または別のタンパク質の一部分との融合によってより安定に作製され得る。安定性の増大は、治療剤の場合、低用量または低頻度頻度間隔での投与が可能なため好都合である。免疫グロブリンの少なくとも一部分、例えば、抗体の定常領域、任意選択で免疫グロブリンのＦｃ断片との融合により、該タンパク質安定性の増大がもたらされ得る。かかる融合タンパク質の作製は、当該技術分野でよく知られており、容易に行なうことができる。例えば、Ｓｐｉｅｋｅｒｍａｎｎら  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９６：３０３−３１０（２００２）。
【０１５７】
Ａｘｌインヒビター、例えば、ペプチドインヒビター、抗体および他のタンパク質インヒビターの模倣物が、本発明の方法に使用され得る。このようなＡｘｌインヒビターの任意の合成類縁体、特に、改善されたインビトロ特性を有するもの（長い半減期を有するもの、消化器系によって容易に分解されにくいもの）が有用である。模倣物は、Ａｘｌの活性をブロックするものである場合、本発明の方法に有効である。本発明において最も有効な模倣物は、Ａｘｌに特異的に結合する性質を有するものであり、Ａｘｌ活性をインビトロおよびインビボで阻害するものであり得る。
【０１５８】
Ａｘｌモジュレーターの同定方法
本発明は、細胞を試験化合物と接触させること、および試験化合物の存在の結果、該細胞によるＡｘｌの筋骨格活性または発現が変化しているかどうかを調べることにより、骨成長をモジュレートする化合物を同定するための任意の１つ以上の方法を提供する。Ａｘｌの筋骨格活性または発現の増大は、該化合物が骨成長に負の影響を及ぼすこと；かかる化合物が過剰な骨を特徴とする障害の予防または処置に有用であることを示す。Ａｘｌの筋骨格活性または発現の低減は、該化合物が骨成長に正の影響を及ぼすこと；かかる化合物が骨変性障害の予防または処置に有用であることを示す。試験化合物は、Ａｘｌのチロシンキナーゼ活性を変化させるかどうかを調べるために予備スクリーニングされる。
【０１５９】
小分子またはペプチドとＡｘｌとの相互作用は、Ｂｉａｃｏｒｅ系の手法（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてリアルタイムで解析され得る。また、本発明では、例えば上記において詳述したアッセイを使用し、骨細胞の分化と機能および骨密度に対するかかる分子の効果をさらに特定するため、さらなるスクリーニングアッセイ（例えば、二次および三次アッセイ）の使用が想定される。
【０１６０】
細胞
Ａｘｌを発現する任意の細胞が、骨成長をモジュレートする試験化合物を同定するためのアッセイにおいて使用され得る。例えば、有用な細胞としては、限定されないが、骨芽細胞、骨芽細胞前駆細胞、間葉幹細胞、骨髄由来の骨芽前駆細胞、および血中に循環している骨芽前駆細胞が挙げられる。本発明の方法の実施には、骨格の骨細胞、例えば、骨芽前駆細胞、骨内層細胞、骨芽細胞、骨細胞が有用である。同様に使用され得る細胞型としては、胚性線維芽細胞、筋芽細胞前駆細胞または脂肪細胞系統（これには、前駆脂肪細胞が含まれる場合があり得る）が挙げられる。不死化細胞または形質転換細胞は、Ａｘｌの遺伝子発現またはタンパク質活性のモジュレーターとしての化合物または治療用薬剤の活性を評価するために、該化合物または治療用薬剤をインビボ動物モデルで試験する前にインビトロで使用され得る。また、有用な細胞として、マウス肢芽由来の軟骨内骨格の前駆細胞であって「クローン１４」と称される細胞株が挙げられる。Ｒｏｓｅｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９：１７５９−１７６８（１９９４）を参照のこと。また、有用な細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手され得、中でも特に、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、胚性線維芽細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ1/2細胞など）筋芽細胞前駆細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞など）、および前駆脂肪細胞（３Ｔ３−ＬＩなど）が挙げられる。他の適当な細胞株は、当業者には公知である。別の例において、該方法では、哺乳動物、例えば限定されないが、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジーおよびモルモットなどの適当な動物が使用される。特定の例において、動物は、齧歯類、例えばマウスである。
【０１６１】
試験化合物
本発明の方法およびアッセイは、一群の試験化合物をスクリーニングするため、または既知の骨成長モジュレーターの阻害活性もしくは刺激活性を確認するために使用され得る。試験化合物は、対象化合物のライブラリーの一部であってもよく、構造的に関連している化合物のライブラリーの一部であってもよい。該化合物の構造は既知であったも未知であってもよい。試験化合物は、既知の機能または構造によって予備決定されたものであってもよい。例えば、試験化合物は、Ａｘｌまたは別の受容体型チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を発揮するという理由で選択され得る。同様に、試験化合物は、既知のＡｘｌモジュレーターと相同性であるという理由で選択され得る。あるいはまた、試験化合物の選択は自由裁量によるものであり得る。非限定的な例において、試験化合物は、ペプチド、タンパク質またはタンパク質断片、有機小分子、化学物質の組成物、核酸、アプタマー、または抗体であり得る。試験化合物の適切性を評価するためのよく知られた方法が、いくつか存在する。
【０１６２】
試験化合物は、化合物の大規模スクリーニングの一部であってもよい。試験化合物は、Ａｘｌのチロシンキナーゼ活性を変化させる試験化合物を同定するために、予備選択または予備スクリーニングされ得る。上記のように、Ａｘｌの小分子インヒビターは、細胞内キナーゼドメイン内の基質結合部位および／またはＡＴＰ結合部位に結合することにより、チロシンリン酸化を直接阻害するものであり得る。受容体型チロシンキナーゼの小分子チロシンキナーゼインヒビター（ＴＫＩ）の同定方法は、よく知られており、一般的に、以下のストラテジー：既知の天然キナーゼインヒビターの構造の模倣、該キナーゼドメインの分子モデル設計、および大規模スクリーニング方法のうちの１つを用いて同定されている。米国特許出願公開公報第２００７０１４２４０２号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）には、Ａｘｌキナーゼ活性を阻害する小分子化合物の同定および使用が記載されている。かかる化合物は、本明細書に記載の本発明の方法に使用され得る。
【０１６３】
キナーゼ
Ａｘｌキナーゼ活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片は、本発明の方法に有用である。かかるポリペプチドとしては、配列番号：１３（以下に示す）に示すアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
【０１６４】
【数１】
2010532360.tif 000005
Ａｘｌキナーゼ活性を示す他のポリペプチドとしては、アミノ酸配列が配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、および配列番号：４２（以下に示す）に示されたものが挙げられる。
【０１６５】
【数２】
2010532360.tif 000006
【０１６６】
【数３】
2010532360.tif 000007
Ａｘｌキナーゼ活性を示す別のポリペプチドは、配列番号：４３（以下に示す）に示すアミノ酸配列を有するものである。
【０１６７】
【数４】
2010532360.tif 000008
Ａｘｌのチロシンキナーゼ活性を変化させる試験化合物を同定するための予備スクリーニングに特に適したキナーゼ活性アッセイとしては、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイ、例えば、Ｌａｎｔｈａｓｃｒｅｅｎ（商標）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、またはＬａｎｃｅ（商標）型アッセイが挙げられる。Ｌａｎｔｈａｓｃｒｅｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、Ａｘｌキナーゼドメインが基質をリン酸化する能力を直接測定するために使用され得る。このアッセイでは、テルビウムで標識された抗ホスホチロシン抗体（ドナー）を用いて、フルオレセイン標識基質（アクセプター）のリン酸化が検出される。これらの２つの標識が近接すると（すなわち、抗体がリン酸化された基質を認識した場合）、蛍光エネルギー転移が起こり、アクセプター蛍光の増大およびドナー蛍光の減少がもたらされる。Ｌａｎｔｈａｓｃｒｅｅｎ（商標）アッセイに使用され得るペプチドの例としては、５−ＦＡＭ−ＤＣＬＤＧＬＹＡＬＭＳＲＣ（配列番号：１６に示されたアミノ酸配列）および５−ＦＡＭ−ＫＫＩＹＮＧＤＹＹＲＱＧ（配列番号：１７に示されたアミノ酸配列）が挙げられる。「５−ＦＡＭ」は、ペプチドのアミノ末端への５−カルボキシフルオレセインのコンジュゲーションをいう。かかるコンジュゲーションを行なうための方法および試薬は市販されている（例えば、ＡｎａＴａｇ（商標）５−ＦＡＭタンパク質標識キット、ＡｎａＳｐｅｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。使用され得る他のペプチドとしては、ＡＧＡＧＧＧＴＤＥＧＩＹＤＶＰＬＬ（配列番号：３５に示されたアミノ酸配列）およびＡＧＡＧＧＰＱＤＩＹＤＶＰＰＶＲ（配列番号：３６に示されたアミノ酸配列）が挙げられる。
【０１６８】
Ａｘｌのチロシンキナーゼ活性を変化させる試験化合物を同定するための予備スクリーニングに使用され得る別のＦＲＥＴ系アッセイは、増幅発光近接ホモジニアスアッセイ（「ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）」（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）としても知られている）。このアッセイでは、Ａｘｌペプチドを第１のドナービーズ集団にカップリングさせ、第２のアクセプタービーズ集団にカップリングさせた集団内の相互作用性分子を同定するために使用する。かかるアッセイにおける使用のためのＡｘｌペプチドとしては、細胞内キナーゼドメイン内のＡＴＰおよび／または基質結合部位に相当するペプチドが挙げられる。より具体的には、Ａｘｌペプチドとしては、ＤＣＬＤＧＬＹＡＬＭＳＲＣ（配列番号：１６）およびＫＫＩＹＮＧＤＹＹＲＱＧ（配列番号：１７）が挙げられる。Ａｘｌと相互作用する他のペプチドもまた、スクリーニングアッセイに使用され得る。
【０１６９】
Ａｘｌの筋骨格活性および発現のアッセイ
本発明の方法は、Ａｘｌの筋骨格活性または発現をモジュレートする化合物の同定をもたらす。Ａｘｌの筋骨格活性のアッセイは、上記において説明しており、限定されないが、アルカリホスファターゼ活性を測定するアッセイ、オステオカルシン遺伝子の発現を測定するアッセイ、骨石灰化を測定するアッセイ、および骨格表現型決定アッセイが挙げられ、これらにより、骨量（例えば、骨塩量）ならびに骨の微細構造および生体力学的特性がキャラクタライズされる。
【０１７０】
Ａｘｌ発現のアッセイは、当該技術分野でよく知られており、Ａｘｌ  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現の検出が挙げられる。Ａｘｌ  ｍＲＮＡの発現は、ＤＮＡマイクロアレイを用いた転写プロファイリングによって細胞内の全ｍＲＮＡの発現を調べることにより測定され得る。ＤＮＡマイクロアレイは、発現された配列タグ、デオキシオリゴヌクレオチド、または既知遺伝子または推定遺伝子に由来するＰＣＲ産物を内包する。（例えば、Ｂｏｗｔｅｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．Ｓｕｐｐ．２１：２５−３２（１９９９）を参照のこと）。また、Ａｘｌ  ｍＲＮＡの発現は、ノザンブロッティングによって測定され得る。Ａｘｌ  ｍＲＮＡの発現はまた、蛍光系リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によっても測定され得る。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）、または分子ビーコンによって検出され得る。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡの転写物レベルを検出および定量するためのさらなるストラテジーは、当業者には公知である（例えば、Ｂｕｓｔｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２９：２３−３９（２００２）を参照のこと）。
【０１７１】
Ａｘｌタンパク質レベルは、いくつかの様式で測定され得る。細胞または組織を培養液または生きた生物体から、試験化合物で処理した後のさまざまな時点で回収し、細胞溶解物を調製する。次いで、Ａｘｌタンパク質のレベルが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクマシーブルーまたは硝酸銀での染色によって評価され得る。また、Ａｘｌタンパク質のレベルは、Ａｘｌに特異的な抗体を用いたウエスタンブロット解析によっても評価され得る。タンパク質レベルは、いくつかの機能アッセイの任意の１つ、例えば、サンドイッチもしくは競合的ＥＬＩＳＡ、または当業者には公知の他の細胞系アッセイを使用することによって測定され得る。
【０１７２】
医薬組成物および投与方法
医薬組成物の投与方法は当該技術分野で知られている。「投与」は、任意の特定の送達系に限定されず、限定されないが、非経口（皮下、静脈内、髄内、関節内、筋肉内、腔内、もしくは腹腔内注射など）、経直腸、局所、経皮、または経口（例えば、カプセル剤、懸濁剤、または錠剤にて）が挙げられ得る。個体への投与は、単回用量または連続的もしくは断続的な反復用量で、および任意のさまざまな生理学的に許容され得る塩の形態で、および／または医薬組成物の一部としての許容され得る医薬用担体および／または添加剤（前述）とともに行なわれ得る。
【０１７３】
Ａｘｌのモジュレーターは、医薬組成物として製剤化され得る。生理学的に許容され得る塩の形態および標準的な医薬製剤化手法および賦形剤は、当業者によく知られている（例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）２００３，第５７版，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，（２００２）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｎａｄｏら編、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２０００）を参照のこと）。
【０１７４】
本発明の方法に有用なモジュレーターは、症状の重症度および疾患の進行に応じて約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与され得る。適切な有効用量は、処置医によって以下の範囲：例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、および約５００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇから選択される。
【０１７５】
本発明の方法に使用される組成物には、さらに、薬学的に許容され得る賦形剤が含まれる。本明細書で用いる場合、語句「薬学的に許容され得る賦形剤」は、医薬の投与に適合性である任意のあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などをいう。医薬活性物質用のかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野でよく知られている。また、該組成物には、補足的機能、付加的機能、または治療増強機能をもたらす他の活性化合物も含まれることがあり得る。また、医薬組成物は、投与に関する使用説明書とともに容器、パックまたはディスペンサーに内包され得る。
【０１７６】
医薬組成物は、意図される投与経路に適合性であるように製剤化される。かかる組成物の例としては、そのままで、または生分解性ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ＰＬＧＡ）と組み合せて提供される結晶性タンパク質製剤が挙げられる。
【０１７７】
本明細書で用いる場合、「モジュレーター」は、インヒビターとアクチベータを包含する。本発明の方法では、Ａｘｌ遺伝子発現のモジュレーターおよびＡｘｌタンパク質活性のモジュレーターが包含される。Ａｘｌ遺伝子発現のインヒビターは、Ａｘｌ遺伝子の転写および／または翻訳を阻害するものである。Ａｘｌタンパク質活性のインヒビターは、例えば、Ａｘｌの膜結合、Ａｘｌのキナーゼ活性、および／またはリガンドに対するＡｘｌタンパク質の結合を阻害するものである。
【０１７８】
本発明のモジュレーターは、担体ゲル、マトリックス、賦形剤、または骨再生および／または骨置換を誘導するために使用される他の組成物と併せて医薬組成物として投与され得る。かかるマトリックスの例としては、合成のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンおよびフィブリン系マトリックス、ティシール（ｔｉｓｓｅｅｌ）フィブリン接着剤などが挙げられる。賦形剤としては、薬学的に許容され得る塩、多糖類、ペプチド、タンパク質、アミノ酸、合成ポリマー、天然ポリマー、および界面活性剤が挙げられ得る。
【０１７９】
Ａｘｌモジュレーターは、注射用または埋入用組成物としての送達のために製剤化される。該組成物は、注射または固形状態で体内に埋入するのに適した円柱形ロッドの形態であり得る。注射用製剤は、インヒビターと、ヒアルロン酸エステル（これは、米国特許公開公報第２００５０２８７１３５号（引用により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている）を含むものである。例えば、Ｈｙａｆｆ１１ｐ６５がヒアルロン酸として使用され得る。注射用製剤は、モジュレーターと、リン酸カルシウム物質（非晶質アパタイト系リン酸カルシウム、結晶性が不充分なアパタイト系リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、フルオロアパタイトなど、およびその組合せ）（これらは、米国特許公開公報第２００５００８９５７９号（引用により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている）を含むものである。
【０１８０】
Ａｘｌのインヒビターは、１種類以上の骨形成性タンパク質、例えば限定されないが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＭＰ５２、またはそのヘテロ二量体とともに共投与され得る。
【０１８１】
Ａｘｌインヒビターは、他の治療用化合物、例えば、ビスホスホネート（窒素含有および非窒素含有）、アポミン（ａｐｏｍｉｎｅ）、テストステロン、エストロゲン、フッ化ナトリウム、ラネリック酸ストロンチウム、ビタミンＤおよびその類縁化合物、カルシトニン、カルシウム補給物、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ、例えば、ラロキシフェン）、骨形成性タンパク質（例えば、ＢＭＰ２）、スタチン、ＲＡＮＫＬインヒビター、カテプシン（ｃａｔｈｅｓｐｉｎ）Ｋインヒビター、Ｗｎｔ経路モジュレーター、例えば、スクレロスチン抗体、核内転写制御を介さない（ｎｏｎ−ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｃ）エストロゲン様シグナル伝達アクチベータ（ＡＮＧＥＬＳ）、および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（アポミンは、新規な１，１ビスホスホネートエステルであり、ｆａｒｎｅｉｏｎ  Ｘ活性化型受容体を活性化し、ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼの分解を加速させる（例えば、米国特許公開公報第２００３００３６５３７号およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）などと組み合わせて、または同時に投与され得る。Ａｘｌのインヒビターは、ビスホスホネート、例えば限定されないが、アレンドロネート、シマドロネート（ｃｉｍａｄｒｏｎａｔｅ）、クロドロネート、ＥＢ−１０５３、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、リセドロネート、チルドロネート、ＹＨ  ５２９、ゾレドロネート（ｚｏｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）、ならびにその薬学的に許容され得る塩、エステル、酸および混合物とともに共投与される。
【０１８２】
本発明の方法による個体への治療剤の投与はまた、遺伝子療法によるものであり得、この場合、該モジュレーターをコードする核酸配列は、インビボで患者に投与されるか、またはインビトロで細胞に投与され、次いで該細胞が患者に導入される。具体的な遺伝子療法プロトコルについては、Ｍｏｒｇａｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第２版，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照のこと。
【０１８３】
スクリーニング方法および診断方法
本発明は、遺伝的に骨密度の変化を有する素因があるか、または現在骨密度の変化を有する被検体を特定するために使用され得る。骨密度の変化についてスクリーニングおよび／または該変化を診断するため、被検体由来の試験試料中および対照試料中のＡｘｌのレベルを比較する。試験試料中のＡｘｌのレベルの変化の存在は、被検体における骨密度の変化および／または骨密度の変化が発生する素因を示す。本発明は、野生型核酸配列を有する被検体と比較して、核酸含有試料におけるＡｘｌバリアント核酸配列の存在の検出方法を提供する。
【０１８４】
対照試料と比べて被検体のＡｘｌのレベルが上昇していると、被検体は、骨密度の減少を有するか、または骨密度の減少が発生するリスクが高い。対照試料と比べて被検体のＡｘｌのレベルが減少していると、被検体は、骨密度の増大を有するか、または骨密度の増大が発生する尤度が高い。
【０１８５】
抗Ａｘｌ特異的抗体または抗Ａｘｌバリアント特異的抗体は、試料中のそれぞれのタンパク質のレベルを測定するために使用され得る。本発明は、抗Ａｘｌ抗体を細胞またはタンパク質と接触させること、および該抗体への結合を検出することを含む、スクリーニングまたは診断対象の被検体においてＡｘｌまたはそのバリアントを検出するための方法を提供する。該抗体は、その抗原への結合の検出を可能にする化合物または検出可能な標識で直接標識されたものであってもよい。種々の標識および標識方法は、当業者にわかるであろう。本発明において使用され得る標識の型の例としては、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド状金属、化学発光化合物、リン光性化合物、および生物発光化合物が挙げられる。Ａｘｌのレベルは、体液および組織から単離された試料において検出され得る。検出可能な量の抗原を含有する任意の被検物質が使用され得る。本発明の方法における試料は骨組織である。被検体由来の試験試料中のＡｘｌの遺伝子発現またはタンパク質活性のレベルは、正常細胞のＡｘｌの遺伝子発現またはタンパク質活性のレベルと比較され、被検体に骨密度の変化の素因があるかどうかが判定され得る。
【０１８６】
本発明の抗体は、例えば、イムノアッセイ（液相または固相担体への結合を含む）における使用に適したものである。抗体が使用されるイムノアッセイとしては、直接的または間接的いずれかの形式での形態の競合的および非競合的イムノアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（免疫測定的）アッセイなどが挙げられる。また、抗体は、生理学的試料に対して免疫組織化学的アッセイを用いてＡｘｌを検出するためにも使用され得る。
【０１８７】
本発明は、野生型核酸配列を有する対照試料と比較したとき、被検体から単離された核酸含有試験試料においてＡｘｌバリアント核酸配列の存在を検出するための方法を提供する。Ａｘｌ「バリアント」は、本明細書で用いる場合、Ａｘｌバリアント核酸およびＡｘｌバリアントタンパク質を包含する。Ａｘｌバリアント核酸は、野生型Ａｘｌ核酸配列に対応しない任意のＡｘｌ核酸配列をいう。Ａｘｌバリアントタンパク質は、野生型Ａｘｌアミノ酸配列に対応しない任意のＡｘｌアミノ酸配列をいう。本発明の方法は、野生型Ａｘｌ配列の対応するセグメントと配列同一性を共有しないＡｘｌのセグメントバリアントを包含する。本発明の方法およびアッセイに有用なバリアントは、変異、制限断片長多型、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、核酸欠失、または天然に存在する核酸置換もしくは意図的に操作された核酸置換によって生じた変化を含むものである。また、バリアントとしては、タンパク質主鎖内への置換、欠失または挿入を含み、元のタンパク質の対応する部分において７０％相同性がなお残っているペプチドまたは完全長タンパク質が挙げられる。
【０１８８】
用語「単離ポリヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、他の核酸、タンパク質、脂質、糖質または天然状態では会合している他の物質を実質的に含まないポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチド配列は、ＡｘｌバリアントをコードするＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列を包含する。Ａｘｌバリアント全部または一部をコードするあらゆるポリヌクレオチド、例えば、天然、合成および意図的に操作されたポリヌクレオチドなどもまた本明細書において包含されることは理解されよう。本発明の方法およびアッセイに有用なポリヌクレオチドは、遺伝コードの結果として縮重した配列を含むものである。相補配列は、アンチセンスヌクレオチドを含むものであり得る。また、バリアント核酸のＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることを可能にするのに充分な少なくとも１０〜１５塩基長である上記の核酸配列の断片（一部分）も包含される。
【０１８９】
本発明の方法およびアッセイに有用な核酸配列は、当該技術分野で知られた任意の方法によって得られ得る。例えば、ＤＮＡは、ゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーと、相同なヌクレオチド配列を検出するプローブとのハイブリダイゼーション、目的のＤＮＡ配列にアニーリングすることができるプライマーを用いたゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または構造的特徴を共有するクローニングされたＤＮＡ断片を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングによって単離され得る。
【０１９０】
Ａｘｌまたはそのバリアントをコードする特異的ＤＮＡ配列の開発はまた、ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離；目的のポリペプチドの必要なコドンを得るためのＤＮＡ配列の化学的製造；または真核生物ドナー細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のインビトロ合成によって得られ得る。後者の場合、ｃＤＮＡと称されるｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補鎖を形成する。
【０１９１】
本発明は、正常な骨密度を有する被検体および野生型Ａｘｌ核酸配列と比較して、骨密度の変化を有する被検体から単離された試料中において標的Ａｘｌバリアント核酸配列の存在を検出することによる、骨密度の変化と関連している核酸バリアントの任意の１つ以上の同定方法を提供する。
【０１９２】
本発明は、被検体において対立遺伝子バリアントを同定するための方法を含む。被検体は、Ａｘｌバリアントに関してホモ接合性であってもヘテロ接合性であってもよい。本明細書で用いる場合、「対立遺伝子」は、ゲノム内に１つより多くの形態（異なる配列）で存在する遺伝子またはヌクレオチド配列（単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）など）である。本発明による「ホモ接合性」は、遺伝子またはＳＮＰの２つのコピーが他方の対立遺伝子と配列が同一であることを示す。例えば、野生型Ａｘｌ遺伝子に関してホモ接合性の被検体は、少なくとも２コピーのＡｘｌ野生型配列を含む。かかる被検体は、おそらく骨密度の変化の素因がない。
【０１９３】
「ヘテロ接合性」は、本明細書で用いる場合、ゲノム内に２つの異なるコピーの対立遺伝子が存在すること、例えば、１コピーの野生型対立遺伝子と１コピーのバリアント対立遺伝子が存在することを示す。また、「ヘテロ接合性」は、Ａｘｌ対立遺伝子内に２つの異なる変異を有する被検体を包含する。
【０１９４】
本発明は、Ａｘｌ遺伝子に関する被検体の対立遺伝子プロフィールを作成するための方法を提供する。「対立遺伝子プロフィール」は、本明細書で用いる場合、Ａｘｌ対立遺伝子またはそのバリアントの存在または非存在およびコピー数に関する被検体のゲノムの組成物の測定である。
【０１９５】
本発明は、骨密度の変化に対する被検体の素因の判定方法を提供する。該方法は、Ａｘｌ配列を含む被検体由来核酸被検物質を単離することにより被検体のＡｘｌ対立遺伝子プロフィールを調べること、およびＡｘｌ核酸配列内の変異の存在または非存在を調べることを含む。また、本発明は、被検体から核酸試料を単離すること、および該核酸を、標的配列にハイブリダイズするプライマーを用いて増幅させることを含む、被検体のＡｘｌ対立遺伝子プロフィールを調べるための診断方法または予後方法を提供する。
【０１９６】
対立遺伝子バリアントが検出される任意の方法が使用され得る。例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、かかるバリアントを同定するためのプローブとして使用され得る。ＡＳＯプローブは、目的の配列の検出に適した任意の長さであり得る。好ましくは、かかるプローブは１０〜５０ヌクレオチド長であり、同位体による方法または同位体によらない方法によって検出可能に標識されている。標的配列は、サザンブロッティングによる固定化の前に、任意選択で増幅され、ゲル電気泳動によって分離され得る。あるいはまた、非増幅核酸を含有する抽出物をニトロセルロースに移し、ドットブロットとして直接プローブ結合させてもよい。
【０１９７】
また、対立遺伝子特異的変化は、同時制限（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔａｌ）部位変化によって同定され得る。変異により、場合によっては制限酵素切断部位が変化させされ、あるいはまた、これまで存在していなかった制限部位が導入される。制限酵素認識部位の変化または付加を用いて、特定のバリアントが同定され得る。
【０１９８】
本発明の方法に使用されるプライマーとしては、該プライマーが使用される反応に対してストリンジェンシーな条件下で、標的核酸を含む有意な数の核酸分子の重合が特異的に開始されるのに充分な長さおよび適切な配列のオリゴヌクレオチドが挙げられる。このようにして、目的の核酸を含む特定の標的核酸配列を選択的に増幅させることが可能である。具体的には、用語「プライマー」は、本明細書で用いる場合、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む配列をいう。プライマーは約少なくとも８ヌクレオチドであり得、その配列は、標的核酸鎖に実質的に相補的なプライマー伸長生成物の合成を開始できるものである。オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、１５〜２２またはそれ以上のヌクレオチドを含むものであるが、プライマーが本質的に、具体的な所望の標的ヌクレオチド配列の増幅のみを可能にするのに充分な特異性のものである（すなわち、プライマーが実質的に相補的である）限り、これより少ないヌクレオチドを含むものであってもよい。
【０１９９】
本発明の方法に従って使用されるプライマーは、増幅対象の各変異型ヌクレオチド配列鎖に「実質的に」相補的となるように設計される。実質的に相補的とは、プライマーがそのそれぞれの鎖と、重合用の薬剤が機能を果たすのを可能にする条件下でハイブリダイズするのに充分に相補的であるはずであることを意味する。換言すると、プライマーは、ハイブリダイズするフランキング配列と充分に相補的であり、変異型ヌクレオチド配列の増幅を可能にするものであるのがよい。好ましくは、伸長されるプライマーの３’末端は、相補フランキング鎖と完璧な塩基対合を有する。
【０２００】
オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸の量の増大をもたらす任意の増幅プロセス（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）において使用され得る。典型的には、一方のプライマーは、変異型ヌクレオチド配列のマイナス（−）鎖に相補的であり、他方はプラス（＋）鎖に相補的である。変性核酸へのプライマーのアニーリング、続いて、酵素（ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの大きな断片およびヌクレオチドまたはリガーゼなど）を用いた伸長により、標的核酸を含む新たに合成された＋鎖および−鎖がもたらされる。このような新たに合成された核酸もまた鋳型となるため、変性、プライマーアニーリングおよび伸長の反復サイクルにより、プライマーによって規定される領域（すなわち、標的変異型ヌクレオチド配列）の指数関数的生成がもたらされる。増幅反応生成物は、使用した特異的プライマーの両端に対応する両端を有する個々の核酸二本鎖である。当業者なら、標的核酸のコピー数を増加させるために同様に使用され得る他の増幅方法論がわかるであろう。
【０２０１】
任意の組織被検物質に由来する核酸が、精製形態または非精製形態で出発核酸（１つまたは複数）として使用され得るが、核酸は、標的核酸を含む特定の核酸配列を含むもの、または含むことが予測されるものであるものとする。したがって、該プロセスでは、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））が使用され得、この場合、ＤＮＡまたはＲＮＡは単鎖であっても二本鎖であってもよい。ＲＮＡが鋳型として使用される場合、鋳型のＤＮＡへの逆転写に最適な酵素および／または条件が使用され得る。また、各々の一方の鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが使用されることがあり得る。また、核酸混合物が使用されることもあり得、あるいは、同じまたは異なるプライマーを用いて本明細書における先の増幅反応で生成された核酸がそのように使用されることもあり得る。増幅対象の変異型ヌクレオチド配列は、大きな分子の一画分であってもよく、該特定の配列が核酸全体を構成するように最初から独立した分子として存在しているものであってもよい。増幅対象の配列が最初から純粋な形態で存在している必要はなく、複雑な混合物の微量画分（ヒトまたは動物の全ＤＮＡ内に含有されているものなど）であってもよい。
【０２０２】
増幅産物は、放射性プローブを使用せずに、サザンブロット解析によって検出され得る。かかるプロセスでは、例えば、非常に低レベルの変異型ヌクレオチド配列を含有する少量のＤＮＡ試料が増幅され、サザンブロッティング手法によって解析される。高レベル増幅シグナルにより、非放射性のプローブまたは標識の使用が助長される。
【０２０３】
標的核酸が増幅されない場合、適切なハイブリダイゼーションプローブを用いた検出が、分離させた核酸上で直接行なわれ得る。標的核酸が増幅される場合は、適切なハイブリダイゼーションプローブを用いた検出が、増幅後に行われ得る。
【０２０４】
本発明のプローブは、検出された特異的断片の分布、ならびに強い特異的結合（ハイブリダイズ）配列の存在を調べるためのプローブ結合の定量的（相対的）程度を調べるために使用され得る。
【０２０５】
本発明のプローブは、原子または無機ラジカル（最も一般的には放射性核種が使用されるが、重金属も使用され得る）で検出可能に標識され得る。充分なシグナルをもたらし、充分な半減期を有する任意の放射性標識が使用され得る。他の標識としては、標識リガンドに対して特異的結合対構成員としての機能を果たし得るリガンドなどが挙げられる。イムノアッセイに常套的に使用されている多種多様な標識が使用され得る。蛍光化合物としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。化学発光物質としては、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン（例えば、ルミノール）が挙げられる。
【０２０６】
本発明の方法によって検出されるＡｘｌバリアントを有する核酸は、溶液中または固相支持体への結合後のいずれかで、特異的ＤＮＡ配列の検出に通常適用される任意の方法によって、例えば、ＰＣＲ、オリゴマー制限（Ｓａｉｋｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：１００８−１０１２，１９８５）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ解析（Ｃｏｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２７８，１９８３）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７，１９８８）などによって、さらに評価、検出、クローニング、配列決定などがなされ得る。
【０２０７】
本発明は、Ａｘｌのレベルの変化または差異を検出するためのキットを提供する。かかるキットは、検出可能に標識された、または検出可能に標識され得るプローブを備えたものであり得る。かかるプローブは、それぞれ、標的タンパク質もしくはその断片、または標的核酸もしくはその断片に特異的な抗体またはヌクレオチドであり得、このとき、標的は、Ａｘｌまたはそのバリアントの存在を示すか、または該存在と相関しているものである。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、キット内に含められ、Ａｘｌバリアントの存在、ならびに強い特異的結合（ハイブリダイズ）配列の存在を調べるためのプローブ結合の定量的（相対的）程度を調べ、したがって、被検体が骨密度の変化を有する尤度または有する素因がある尤度を示すために使用され得る。
【０２０８】
本発明は、核酸ハイブリダイゼーションを用いて標的核酸を検出するためのキットを提供する。キットはまた、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチド（１つまたは複数）が内包された容器を有するものであり得る。標的核酸配列（バリアント核酸配列など）を増幅することが望ましい場合、これは、増幅用プライマーであるオリゴヌクレオチド（１つまたは複数）を用いて行なわれ得る。
【０２０９】
キットは、標的タンパク質もしくはその断片、またはかかるタンパク質もしくはその断片のバリアントに結合する抗体が内包された容器を提供する。したがって、キットは、野生型Ａｘｌまたはそのバリアントに結合する抗体を含むものであり得る。かかる抗体は、被検物質において特定のＡｘｌバリアントの存在またはかかるバリアントの発現レベルを識別するために使用され得る。
【０２１０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文中でそうでないと明白に記載していない限り、複数形に対する言及も包含する。したがって、例えば、「抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」に対する言及は、複数のかかる組成物、すなわち「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」を包含する。
【０２１１】
以下の実施例は、本発明の例示的な実施形態を示すものである。当業者には、本発明の精神および範囲を変更することなく行なわれ得る数多くの修正例および変形例が認識されよう。修正例および変形例は、本発明の範囲に包含される。本実施例は、なんら本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０２１２】
実施例
実施例１：ＢＭＰ２はＡｘｌを下方調節する
Ａｘｌ遺伝子発現に対する骨誘導因子ＢＭＰ２の効果を、２種類のマウス間葉細胞株、Ｃ３Ｈ１０Ｔ1/2多能性間葉細胞およびクローン１４マウス肢芽前駆細胞においてアッセイした。簡単には、Ｃ３Ｈ１０Ｔ1/2またはクローン１４細胞を、１００ｎｇ／ｍｌまたは３２０ｎｇ／ｍｌいずれかのｒｈＢＭＰ２の存在下でインキュベートした。試料を、ｒｈＢＭＰ２の添加の２、６、および２４時間後に採取し、Ａｘｌの量を定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。図１に示されるように、Ａｘｌ発現は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ1/2およびクローン１４マウス間葉細胞株の両方で、処理の２４時間以内にほぼ２倍有意に下方調節された。Ｃ１４：クローン１４細胞；１０Ｔ1/2：Ｃ３Ｈ１０Ｔ1/2細胞。この結果は、ＡｘｌがＢＭＰ２によって調節されることを示す。
【０２１３】
実施例２：Ａｘｌ  ｓｉＲＮＡはＡｘｌ  ｍＲＮＡのレベルを低下させる
骨芽細胞の分化と活性におけるＡｘｌの役割を、クローン１４とＭＣ３Ｔ３−Ｅ１マウス細胞株において、ＲＮＡ遺伝子発現ノックダウン手法を用いて調べた。次に詳細に記載するように、この実験の結果は、Ａｘｌノックダウンが、骨芽前駆細胞からの骨芽細胞分化を促進させるとともに、骨芽細胞機能を増強することを示す。
【０２１４】
骨芽前駆細胞からの骨芽細胞分化におけるＡｘｌの役割は、マウスクローン１４細胞株においてＲＮＡ干渉を用いて調べた。この実験では、マウスＡｘｌに対するｓｉＲＮＡ試薬で、０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌいずれかのＢＭＰ２で処理した細胞をトランスフェクトした。確立された骨芽細胞マーカーであるオステオカルシン遺伝子の発現の誘導を測定し、処理およびトランスフェクションの開始の４日後に骨芽細胞分化を評価した。
【０２１５】
ｓｉＲＮＡの配列
ｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（ＬａＦａｙｅｔｔｅ，Ｃｏ）から購入したものであり、以下の配列を有する。
【０２１６】
【表１】
2010532360.tif 000009
Ａｘｌ  ｍＲＮＡのレベルの検出
クローン１４細胞を、２０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート内に播種し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％Ｌ−グルタミンを補給したＤＭＥＭ培地中で培養した。翌日、細胞を終濃度２０ｎＭのｓｉＲＮＡで、０．５％（最終）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて４時間トランスフェクトした。次いで、細胞を、１％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ中で培養した。一部の試料には、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ２を補給した培地を与えた。陰性対照として、細胞に対し、モックトランスフェクション（ｓｉＲＮＡなし）または非特異的スクランブルｓｉＲＮＡ配列（ＮＳＰ）を用いたトランスフェクションのいずれかを行なった。
【０２１７】
Ａｘｌ  ｍＲＮＡのノックダウンを、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってモニタリングした。Ａｘｌ  ＲＮＡｉ試薬の特異性は、最も密接に関連している２つのＡｘｌファミリー構成員：ＭｅｒとＴｙｒｏ３の転写物も同時にモニタリングすることによって確認した。培地を除去し、細胞をＰＢＳ中で洗浄した。全ＲＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ＳＶ９６  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡキット（カタログ番号Ｚ３５０５）を用いて精製した。ＲＮＡを最終容量１００μｌで溶出した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、１×ＱＲＴ−ＰＣＲマスターミックス（Ｅｕｒｏｇｅｎｅｔｅｃ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ；カタログ番号ＶＷＲ８１００２−５３０）中の反応液２５μｌあたり５μｌのＲＮＡを用いて行なった。プライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入し、終濃度１×Ａｘｌ（Ａｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ  Ｍｍ００４３７２２１＿ｍ１）、１×Ｍｅｒ（Ａｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ  Ｍｍ００４３４９２＿ｍ１）、および１×Ｔｙｒｏ３（Ａｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ  Ｍｍ００４４５４７＿ｍ１）で使用した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（ＡＢＩカタログ番号４３０８３１０；終濃度２００ｎＭのプローブ；終濃度１００ｎＭのプライマー）と比較して遺伝子発現をモニタリングした。
【０２１８】
Ａｘｌ  ｓｉＲＮＡのノックダウン後のＡｘｌ、ＭｅｒおよびＴｙｒｏ３の相対遺伝子発現レベルを図２に示す。グラフは、Ａｘｌ特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたクローン１４細胞において検出されたＡｘｌ、Ｔｙｒｏ３、およびＭｅｒのｍＲＮＡの相対レベルを示す。データは、非特異的スクランブルｓｉＲＮＡ（ＮＳＰ）でトランスフェクトした細胞において検出された発現レベルに対して標準化している。グラフは、ｍＲＮＡトランスフェクションなし（Ｍｏｃｋ）、個々のＡｘｌ特異的ｓｉＲＮＡ（Ａｘｌ−１、Ａｘｌ−２、Ａｘｌ−３、もしくはＡｘｌ−４）、または４種類のＡｘｌ特異的ｓｉＲＮＡの混合物（Ａｘｌ−プール）でトランスフェクトした（ｗｅｒｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）細胞におけるｍＲＮＡの相対レベルを示す。柱状部分は平均値であり、バーは±標準偏差を示す。アスタリスク（＊）は、対照との差が観察される可能性が０．０５未満、すなわち２０回に１回未満の可能性単独によるものであることを示す。データはすべて、非特異的スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞において検出された発現レベル（この場合のレベルを１に設定した）に対する変化倍数として示す（点線、図２）。陰性対照であるモックトランスフェクト細胞では、モニタリングした３つの遺伝子のいずれにおいても遺伝子発現に変化はなかった。４種類のＡｘｌ  ｓｉＲＮＡ試薬ならびに該プールすべてで、Ａｘｌ  ｍＲＮＡのレベルの有意な低下が示され、ｓｉＲＮＡの有効性が確認された（ｔ−検定でｐ＜０．０５；図２Ａ）。さらに、４種類のＡｘｌ  ｓｉＲＮＡ試薬ならびに該プールすべてで、Ａｘｌ転写物の標的化に対して特異性が示されたが、密接に関連している遺伝子Ｔｙｒｏ３とＭｅｒの遺伝子発現レベルは、Ａｘｌ  ｓｉＲＮＡトランスフェクション後、影響がなかった。このデータは、ｓｉＲＮＡ試薬が、クローン１４細胞においてＡｘｌ  ｍＲＮＡのレベルを特異的にノックダウンできる能力を有することを示す。
【０２１９】
実施例３：Ａｘｌ  ｓｉＲＮＡはオステオカルシンの発現を増大させる
骨芽細胞分化に対するＡｘｌノックダウンの影響を評価するため、オステオカルシンｍＲＮＡのレベルをモニタリングした。オステオカルシンは、骨芽細胞の分化後期の確立されたマーカーである。この試験では、まったく上記のとおりに、上記のＡｘｌ  ｓｉＲＮＡのプールでクローン１４細胞をトランスフェクトし、外因性ｒｈＢＭＰ２の存在下（１００ｎｇ／ｍｌ）または非存在下で４日間培養した。アッセイの陽性対照として、ＢＭＰ２シグナル伝達の既知の負の調節因子であるＳｍａｄ６に対するｓｉＲＮＡのプールを使用した（図３のＳｍａｄ６）。陰性対照としては、骨芽細胞分化の既知の正の調節因子であるＲｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１に対するｓｉＲＮＡを使用した。このｓｉＲＮＡの配列は、配列番号：８に示したものであり、以下に示す。
５’−  ＣＧＵＧＡＡＵＧＧＵＣＡＵＡＡＵＡＡＣＵ−３’
さらなる陰性対照は、上記のものと同じ非特異的スクランブルｓｉＲＮＡとした（ＮＳＰ）。オステオカルシンｍＲＮＡのレベルを、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１に示したものであり、以下に示すプライマー：
５’−ＣＧＧＣＣＣＴＧＡＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡ−３’（配列番号：９）；
５’−ＧＣＣＧＧＡＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＡＣＣＴＴ−３’（配列番号：１０）；
５’−ＣＣＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡ−３’（配列番号：１１）
を使用し、上記のようにしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってモニタリングした。
【０２２０】
図３は、クローン１４細胞における外因性ＢＭＰ２の存在下および非存在下での、オステオカルシンｍＲＮＡの変化倍数を示す。オステオカルシンｍＲＮＡのレベルは、非特異的スクランブルｓｉＲＮＡ（ＮＳＰ）でトランスフェクトした細胞においてモニタリングされたものと比較して示す。細胞は、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２の非存在下（左、薄い色のバー）または存在下（右、濃い色のバー）のいずれかでインキュベートした。非特異的スクランブルｓｉＲＮＡ（ＮＳＰ）、Ｓｍａｄ６特異的ｓｉＲＮＡ（Ｓｍａｄ６）のプール、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１特異的ｓｉＲＮＡ（Ｃｂｆａ１）、またはＡｘｌ特異的ｓｉＲＮＡ（Ａｘｌ）のプールでトランスフェクトした細胞におけるオステオカルシンの相対ｍＲＮＡのレベルを示している。柱状部分は平均値であり、バーは±標準偏差を示す。アスタリスク（＊）は、０．０５未満である確率を示す。値は平均＋／−ＳＤである；＊ｐ＜０．０５。
【０２２１】
予測どおり、Ｓｍａｄ６のノックダウンにより、オステオカルシンの発現が、外因性ＢＭＰ２の非存在で２倍より大きく、ＢＭＰ２の存在下で３倍より大きく刺激された（ｐ＜０．０５；図３）。逆に、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１のノックダウンにより、すべての試験条件でオステオカルシンｍＲＮＡの発現によってモニタリングしたとき、骨芽細胞分化が劇的に抑制された（ｐ＜０．０５；図３）。Ａｘｌ発現のノックダウンにより、ＢＭＰ２刺激後、オステオカルシンのレベルが、対照として使用した非特異的スクランブルｓｉＲＮＡと比べて２倍より大きく増大している（ｐ＜０．０５；図３）。さらに、外因性ＢＭＰ２刺激の非存在では、Ａｘｌのノックダウンにより、オステオカルシンｍＲＮＡの２倍の誘導がもたらされている（ｐ＜０．０５；図３）。このデータは、Ａｘｌの阻害により骨形成性分化が促進されること、また、かかる阻害によってＢＭＰ２の既知の骨形成性効果も増強され得ることを示す。
【０２２２】
実施例４：Ａｘｌ  ｓｉＲＮＡは、アルカリホスファターゼ活性を増大させる
クローン１４細胞を、２０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート内に播種し、１０％ＦＢＳおよび１％Ｌ−グルタミンを補給したＤＭＥＭ培地中で培養した。翌日、細胞を終濃度２０ｎＭのｓｉＲＮＡ（配列番号３、４、５または６）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）で、０．５％（最終）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて４時間トランスフェクトした。次いで、細胞を、１％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ中で培養した。一部の試料には、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ２を補給した培地を与えた。陰性対照として、細胞に対し、モックトランスフェクション（ｓｉＲＮＡなし）または配列番号：７に示すヌクレオチド配列：ＧＧＵＡＧＣＵＡＵＵＣＡＧＵＵＡＣＵＧ（配列番号７）を有する非特異的スクランブルｓｉＲＮＡでのトランスフェクションのいずれかを行なった。骨芽細胞分化に対するＡｘｌノックダウンの機能上の影響を、アルカリホスファターゼ活性によって評価した。細胞処理の４日後、培地をウェルから吸引し、ＰＢＳ（２００μｌｌ／ウェル）で２回洗浄した。ウェル１つあたり１００μｌの蒸留水を添加した。プレートを２回凍結／解凍して細胞を破壊および溶解させた。
５０μｌの溶解細胞を５０μｌのＡＬＰバッファーミックスに添加した。１０ｍｌのＡＬＰバッファーに対して：０．１Ｍのグリシン、ｐＨ１０．３、１６ｍｇのＭｇ  Ｃｌ２、８０μｌの１２．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４２ｍｇのｐ−ニトロフェニルホスフェート）。反応液を３７℃で３０分間インキュベートし、各ウェルに１００μｌの０．２ＭのＮａＯＨを添加することにより停止させた。マイクロプレートリーダーにおいて、４０５ｎｍで比色反応液の読み取りを行なった。
【０２２３】
図４は、Ａｘｌノックダウンによりアルカリホスファターゼ活性が誘導されること、およびこの効果が、ＢＭＰ２タンパク質の存在下でのインキュベーションによって増強されることを示すグラフである。グラフは、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２タンパク質の非存在下（薄い色のバー）または存在下（濃い色のバー）のいずれかでインキュベートした細胞におけるアルカリホスファターゼの相対活性を示す。結果を、非特異的スクランブルｓｉＲＮＡ（ＮＳＰ）でトランスフェクトした細胞における活性と比較して示す。Ｓｍａｄ６特異的ｓｉＲＮＡ（Ｓｍａｄ６）のプール、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１特異的ｓｉＲＮＡ（Ｃｂｆａ１）、またはＡｘｌ特異的ｓｉＲＮＡ（Ａｘｌ）のプールでトランスフェクトした細胞におけるアルカリホスファターゼの相対レベルを示している。柱状部分は平均値であり、バーは±標準偏差を示す。アスタリスク（＊）は、０．０５未満である確率を示す。値は平均＋／−ＳＤである；＊ｐ＜０．０５。
【０２２４】
実施例５：Ａｘｌの過剰発現によりオステオカルシンの発現が抑制される
クローン１４細胞を、２０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート内に播種し、１０％ＦＢＳおよび１％Ｌ−グルタミンを補給したＤＭＥＭ培地中で培養した。翌日、細胞を１００ｎｇ／ウェルの各プラスミドで、０．５％（最終）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて４時間トランスフェクトした。次いで、細胞を、１％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ中で培養した。一部の試料には、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ２を補給した培地を与えた。トランスフェクションの４日後にＲＮＡを単離した。オステオカルシンｍＲＮＡを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲならびに配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１に示したものであり、上記に示すプライマーによって測定した。Ａｘｌタンパク質の過剰発現は、ウエスタンブロット解析によって示された。
【０２２５】
図５は、Ａｘｌ過剰発現により、オステオカルシンｍＲＮＡのレベルが抑制されることを示す。図５は、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２タンパク質の非存在下（薄い色のバー）または存在下（濃い色のバー）のいずれかでインキュベートした細胞におけるオステオカルシンｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。結果を、非特異的ベクターでトランスフェクトした細胞においてモニタリングされたものと比較して示す。ベクター単独：非特異的ベクターでトランスフェクトした細胞；ＦＬ−Ａｘｌ：完全長Ａｘｌを発現するベクターでトランスフェクトした細胞。柱状部分は平均値であり、バーは±標準偏差を示す。アスタリスク（＊）は、０．０５未満である確率を示す。値は平均＋／−ＳＤである；＊ｐ＜０．０５。
【０２２６】
実施例６：Ａｘｌ  ｓｉＲＮＡにより石灰化結節の形成が促進される
さらなる実験により、ＲＮＡｉ手法を用いたＡｘｌ発現の一過性ノックダウン後のインビトロでの石灰化結節の形成で示される骨芽細胞の活性を評価した。
【０２２７】
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を５０，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、１％グルタミンおよび１０％ＦＢＳを補給したアルファー培地中で培養した。翌日、細胞を２０ｎＭ（終濃度）のｓｉＲＮＡで、０．４％（最終）のＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて４時間トランスフェクトした。この試験に用いたｓｉＲＮＡは、Ａｘｌ  ｓｉＲＮＡと上記のＣｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２  ｓｉＲＮＡのプールを含む。また、２つの対照処理：ｓｉＲＮＡを導入しないモックトランスフェクション、および非特異的スクランブルｓｉＲＮＡ（上記）を含めた。
【０２２８】
トランスフェクション後、細胞を、１％グルタミン、１０％ＦＢＳおよび１０ｍＭのβ−グリセロールリン酸（石灰化に必要な補因子）を補給し、他の骨形成性因子は含まないアルファー培地中に維持した。培地を３日毎に交換し、トランスフェクション後、第１７日目にアッセイを停止した。
【０２２９】
石灰化を調べるため、標準的なプロトコルを用いて、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、冷エタノール中で固定し、アリザリンレッドで染色した。石灰化の程度の半定量を、１０％塩化セチルピリジニウムを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム中、室温で１５分間、細胞を脱色することにより行なった。上清みを除去し、吸光度を５７０ｎｍで測定した。アリザリンレッドの既知希釈液の吸光度測定値の標準曲線（５０〜４００ｕＭの範囲）を得ることにより、濃度を測定した。赤く染色された結節の存在により石灰化を目視評価した。
【０２３０】
Ａｘｌノックダウンにより、非特異的スクランブルｓｉＲＮＡまたはモックトランスフェクト細胞のいずれかと比べて、石灰化の程度の定量的増大がもたらされた。アリザリンレッド染色の半定量により、Ａｘｌノックダウンによって石灰化結節の形成が対照と比べてほぼ２０％増大することが示された。対照的に、陰性対照Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１のノックダウンでは、石灰化の劇的な低減が示された。このデータは、Ａｘｌ阻害によってＢＭＰ２様骨形成性分化が増強され得、場合によっては該分化が生じる得ることを示唆する。
【０２３１】
実施例７：頭蓋冠器官培養アッセイ
エキソビボ頭蓋冠器官培養モデルを使用し、生理学的骨微小環境における骨芽細胞のＡｘｌ阻害に対する応答を評価した。可溶性ｍＡｘｌ細胞外ドメイン／Ｆｃキメラ（Ａｘｌ／ＦＣ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）は、リガンド結合を破壊し得るため、これをインヒビターとして使用した。４日齢の新生児ＩＣＲマウスの頭蓋冠を切開し、矢状縫合に沿って２つに切り分けた。無血清ＢＧＪ培地＋０．１％ＢＳＡ中で一晩インキュベーションした後、頭蓋冠を０．１μｇ／ｍｌのＡｘｌ／Ｆｃとともに１、２、４もしくは７日間インキュベートするか、またはＢＧＪ培地＋１％ＦＣＳ中で未処理のままにした（対照）。所定の時間後、Ａｘｌ／Ｆｃを培養培地から除去し、残りの７日間の培養期間、頭蓋冠をＢＧＪ培地＋１％ＦＣＳとともにインキュベートした。
【０２３２】
４匹の個々のマウスの頭蓋冠の片側を各実験条件に使用した。次いで、頭蓋冠を１０％中性リン酸緩衝ホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン中に包埋し、４μｍ切片を作製し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。総骨領域および骨芽細胞の数を、組織形態計測による手法を用いて定量した。
【０２３３】
図６に示されるように、２日間のＡｘｌ／Ｆｃへの短時間曝露によって、骨芽細胞の数および総骨領域の有意な増加がもたらされた。同様に、４日間のＡｘｌ／Ｆｃ処理では、総骨領域は増大したが、骨芽細胞の数は対照培養物と同等であった。両時間点において、骨芽細胞は活性化されるようであった（これは、該細胞の膨らんだ立方体様の形態によって示された）。要するに、Ａｘｌの阻害により、このエキソビボ頭蓋冠モデルにおいて、ＢＭＰ２での処理と同様に骨芽細胞の活性および新たな骨の形成が促進された。グラフは、相対総骨領域（左バー）、および骨芽細胞の数（右バー）を示す。値は平均＋／−ＳＥであり、＊＊ｐ＜０．０１、バー上部のアスタリスク（＊＊）は、骨芽細胞が活性化されたことを示す。
【０２３４】
予測どおり、Ｓｍａｄ６のノックダウンにより、オステオカルシンの発現が、外因性ＢＭＰ２の非存在で２倍より大きく、ＢＭＰ２の存在下で３倍より大きく刺激された（ｐ＜０．０５；図３）。逆に、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１のノックダウンにより、すべての試験条件でオステオカルシンｍＲＮＡの発現によってモニタリングしたとき、骨芽細胞分化が劇的に抑制された（ｐ＜０．０５；図３）。Ａｘｌ発現のノックダウンにより、ＢＭＰ２刺激後、オステオカルシンのレベルが、対照として使用した非特異的スクランブルｓｉＲＮＡと比べて２倍より大きく増大している（ｐ＜０．０５；図３）。さらに、外因性ＢＭＰ２刺激の非存在では、Ａｘｌのノックダウンにより、オステオカルシンｍＲＮＡの２倍の誘導がもたらされている（ｐ＜０．０５；図３）。このデータは、Ａｘｌの阻害により骨形成性分化が促進されること、また、かかる阻害によってＢＭＰ２の既知の骨形成性効果も増強され得ることを示す。
【０２３５】
実施例８：Ａｘｌ「キナーゼ死」によってオステオカルシンの発現は抑制されない
ＡＴＰ結合ポケット内の保存されたリシンを置き換えてキナーゼ活性の不活化をもたらした「キナーゼ死」Ａｘｌ変異型（Ｋ５７６Ｒ）を開発した。これにより、骨芽細胞生物学におけるＡｘｌのキナーゼ活性の役割の評価が可能になる。
【０２３６】
「キナーゼ死」変異型の発現を確認し、そのキナーゼ活性を調べるため、２９３Ａ細胞を、５×１０６細胞の密度で１０ｃｍ皿に平板培養した。細胞を一晩インキュベートし、１２μｇの対象のプラスミドで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて２０分間トランスフェクトした。培地交換を行ない、タンパク質発現を可能にするため、細胞をさらに４８時間インキュベートした。細胞を溶解させ、タンパク質をビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって測定した。Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｒｅｅｚｅ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて「キナーゼ死」Ａｘｌにキナーゼ活性があるか否かを調べた。細胞溶解物を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ、カタログ番号４９７７）から入手したＡｘｌ抗体（１：５０希釈）とともにインキュベートし、５％ＢＳＡを有する１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０中で、抗Ｖ５および抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびにホスホチロシンマウスモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号９４１１）とともに４℃で一晩インキュベートした。
【０２３７】
Ａｘｌ「キナーゼ死」によってオステオカルシンの発現が抑制されるか否かを調べるために、クローン１４細胞（マウス骨芽細胞）を使用した。クローン１４細胞を、１０％ＣＯ２を含む加湿大気中３７℃で、１０％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ、ＧＡ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地中に維持した。すべての処置に対し、細胞を、６ウェル培養プレート内に３×１０６細胞／ウェルの密度で平板培養し、一晩インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、４μｇのＡｘｌ  ＤＮＡ、Ａｘｌ「キナーゼ死」ＤＮＡまたは対照ＤＮＡのいずれかでトランスフェクト（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００）した。３時間後、培地を交換し、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２を添加した。１日後、全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて単離し、ＤＮアーゼＩ（１単位／５μｇ  ＲＮＡ）で室温にて３０分間処理した。骨芽細胞マーカー遺伝子のｍＲＮＡは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてリアルタイムＰＣＲによって検出し、ＧＡＰＤＨレベルに対して標準化した。
【０２３８】
図７（Ａ）に示されるように、野生型（ＷＴ）ＡｘｌまたはＡｘｌ「キナーゼ死」（ＫＤ）のいずれかでトランスフェクトし、次いで溶解させ、抗Ａｘｌ抗体により免疫沈降させた後、ウエスタンブロットにおいて抗Ｐ−Ｔｙｒ抗体とプローブ結合させた２９３Ａ細胞では、ＷＴ  Ａｘｌとは対照的に、Ａｘｌ  ＫＤが自身をリン酸化する能力をもたないことが示された。また、図７（Ｂ）に示されるように、ＷＴ  Ａｘｌでのクローン１４骨芽細胞のトランスフェクションでは、オステオカルシンの発現の低減がもたらされるが、Ａｘｌ  ＫＤのトランスフェクションではかかる効果はなく、これは、骨芽細胞分化に対するＡｘｌの効果にはＡｘｌのキナーゼ活性が必要とされることを示す。
【０２３９】
実施例９：Ａｘｌノックアウトマウスは骨量の増加を有する
Ａｘｌノックアウトマウス（「ｔ１４５３  Ａｘｌ」、本明細書ではＫＯと称する）を、Ｄｅｌｔａｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ，ＣＡ）から入手した。Ａｘｌ  ＫＯおよび年齢適合野生型（ＷＴ）マウスを、第２６週間の時点で骨格表現型について評価した。
【０２４０】
摘出した大腿骨を、末梢骨定量的コンピュータ連動断層撮影（ｐＱＣＴ）を用いて解析した。遠位端の２．５ｍｍ近位から採取した０．５ｍｍのｐＱＣＴ切片の１つを、全海綿骨密度のコンピュータ計算に使用し、遠位端の９ｍｍ近位（幹部領域内）から採取した別の０．５ｍｍ切片を、大腿骨の骨幹端の皮質骨密度の解析に使用した。Ａｘｌ−ＫＯおよび年齢適合ＷＴマウス群（ｎ＝８〜１０／群）の遠位大腿骨の全海綿骨と皮質骨の体積測定骨密度を、スチューデントのｔ−検定を用いて比較した。
【０２４１】
図８は、遠位大腿骨の体積測定密度（ｖＢＭＤ）のｐＱＣＴの測定値によって示されるように、２６週齢のＡｘｌ  ＫＯ雄および雌マウスが高骨量表現型を有することを示す。図８Ａは、野生型と比べて、雄マウスは、総ｖＢＭＤの１３％増加および海綿骨ｖＢＭＤの２３％増加を有し、一方、雌マウスは、総ｖＢＭＤの１１％増加および海綿骨ｖＢＭＤの３４％増加を有したことを示す。図８Ｂは、野生型と比べて、雄マウスは皮質骨ｖＢＭＤの１．５５％増加を有し、一方、雌マウスはｖＢＭＤの２．４０％増加を有したことを示す。
【０２４２】
本明細書中に引用した参考文献の教示に鑑みると、本明細書は非常によく理解されよう。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の例示を示すものであり、本発明の範囲を制限するものであると解釈されるべきでない。当業者には、多くの他の実施形態が本発明に包含されることが容易に認識されよう。本開示において引用した刊行物、特許、および生物学的配列はすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。引用により組み込まれる資料が本発明の明細書と矛盾するか、または整合しない場合、任意のかかる資料よりも本発明の明細書が優先される。本明細書における参考文献の引用はいずれも、かかる参考文献が本発明に対する先行技術であるという是認ではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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