(57)【要約】ＤＥＡＥ基を有する大きな細孔を有するビニル重合体タイプの樹脂から成るイオン交換クロマトグラフィ担体と、クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液との、ヒトのフォンビルブラント因子を含む血漿由来溶液中のＡＤＡＭＴＳ１３の量を減らすための使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＥＡＥ基を有する大きな細孔を有するビニル重合体タイプの樹脂から成るイオン交換クロマトグラフィ担体と、クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液との、ヒトのフォンビルブラント因子を含む血漿由来溶液中のＡＤＡＭＴＳ１３の量を減らすための使用。
【請求項２】
イオン交換クロマトグラフィ担体がＤＥＡＥ-フラクトゲル（Fractogel、登録商標）カラムである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
クロマトグラフィ用緩衝液が0.01Mのクエン酸トリナトリウム、0.001 Mの塩化カルシウム、0.12Mのグリシンおよび0.016Mのリシンおよび0.11M〜0.17Mの塩化ナトリウムから成る請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
クロマトグラフィ担体上に吸着された画分を緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を0.14〜0.17Mへ上げで溶出する請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
緩衝液のｐＨ値が6.9〜7.1にする請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
上記イオン交換クロマトグラフィ担体と上記緩衝液とを使用してＡＤＡＭＴＳ１３を２回の連続したクロマトグラフ分離階段で除去する請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
初期の血漿中に含まれるＡＤＡＭＴＳ１３量と比較してＡＤＡＭＴＳ１３量の減少率が200倍以上である請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
初期の血漿中に含まれるＡＤＡＭＴＳ１３量と比較してＡＤＡＭＴＳ１３量の減少率が500倍以上である請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液中で、ＤＥＡＥ基を有する大きな細孔を有するビニル重合体タイプの樹脂上でイオン交換クロマトグラフ分離を行なう段階を有する、ヒトのＶＷＦ-含有血漿由来の溶液中のＡＤＡＭＴＳ１３量を減らすための方法。
【請求項１０】
イオン交換クロマトグラフィ担体がＤＥＡＥ‐フラクトゲル（Fractogel、登録商標）である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
クロマトグラフィ用緩衝液が0.01Mのクエン酸トリナトリウム、0.001Mの塩化カルシウム、0.12Mのグリシンおよび0.016Mのリシンおよび0.11M〜0.17Mの塩化ナトリウムから成る請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
クロマトグラフィ担体上に吸着された画分を緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を0.14〜0.17Mへ上げて溶出する請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
緩衝液のpH値が6.9〜7.1である請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
上記イオン交換クロマトグラフィ担体と上記緩衝液とを使用してＡＤＡＭＴＳ１３を２回の連続したクロマトグラフ分離階段で除去する請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＤＡＭＴＳ１３量の減少率が初期の血漿中に含まれるＡＤＡＭＴＳ１３量に比べて200倍以上である請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＡＤＡＭＴＳ１３量の減少率が初期の血漿中に含まれるＡＤＡＭＴＳ１３量に比べて500倍以上である請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパクの精製方法に関するものである。
本発明は特に、フォンビルブラント因子（facteur von Willebrand、ＶＷＦ）の溶液中に存在するＡＤＡＭＴＳ１３の量を減少させる方法と、サンプル中に存在するＡＤＡＭＴＳ１３の量を減らすためのクロマトグラフィ担体および緩衝液の使用とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）は血漿中を循環する最も大きい分子であるということは知られている。ＶＷＦはジスルフィド架橋で結合された複数のマルティマー（multimeres）から成り、その基礎要素は約250キロダルトン（KDa）の分子量を有する。血漿中で最も小さいＶＷＦの形は500KDaのダイマーであり、最も大きい形は上記ダイマーのマルティマーで、その分子量は2000万ダルトンに達する。マルティマーのサブユニットの集合は細胞生産に特異的である。ＶＷＦは巨核球中および血管内皮細胞中で合成され、重合される。
【０００３】
この因子は２つの異なる機能によって止血に大きな役割を演ずる。すなわち、接着タンパクとして血小板を血管内皮下層に接着、凝集させ（従って、損傷した血管中で生じる止血プロセスの主役となり）、また、ファクターVIII（FVIII）の安定化と循環血液の運搬を保証する。
【０００４】
ＶＷＦ先天的な欠失（量的な欠失）またはこのファクターの構造的な異形（質的な欠失）でフォンウィルブラント病気となり、皮膚-粘膜の出血となって現れる。この病気は極めて異質な臨床的発現をし、外科手術時に非常に問題となる。フォンウィルブラント病気の治療は主止血（出血時）および凝集（活性化部分トロンボプラスチン時間およびFVIII、FVIII：C)の凝固活性）の異常を正す点にあることは論争の余地がない。
【０００５】
この病気はＶＷＦ-エンリッチなヒト血漿誘導体（例えば、血漿を低温沈殿画分、ＶＷＦの含有量が充分なFVlIl濃縮物（FVIII/ＶＷＦ濃縮物）またはＶＷＦ濃縮物（無FVIII）を使用した置換治療で治療される。
【０００６】
フォンウィルブラント病気はタンパク不在か質的異常かによってFVIII欠失が付随する場合とない場合がある。一般に、これらの両方の凝固因子の欠失に苦しむ患者はFVIII／ＶＷＦ濃縮物で治療される。反対に、ＶＷＦ-欠損患者が一般にFVIIIを発現し、FVIIIのないＶＷＦ濃縮物を使用するのが好ましい。この患者の場合、上記濃縮物を使用することでＶＷＦ-欠損のみが補正し、FVIII過剰を避けることができる。FVIII過剰になると重大な合併症、例えば静脈血栓症や肺塞栓症が生じることがある。
【０００７】
しかし、ＶＷＦがＡＤＡＭＴＳ１３のようなタンパクタンパク分解酵素によって変性されると、ＶＷＦ濃縮物は溶液中で一般に非常に不安定になる。
【０００８】
ＡＤＡＭＴＳ１３は天然ではヒトの血漿中にできるメタロプロテアーゼファミリのプロテアーゼである。その機能はＶＷＦのハイパーアクティヴな長いマルティマーをより小さくより活性の低いマルティマーに転換することにある。ＡＤＡＭＴＳ１３はインビボおよびインビトロ例えば、ＶＷＦ濃縮物またはFVIII/ＶＷＦ濃縮物のような血漿由来のＶＷＦ-含有溶液中でＶＷＦを変性する。これらの血漿誘導体は一般に凍結乾燥粉末にして長年保存できるが、ＡＤＡＭＴＳ１３が存在するため凍結乾燥粉末の溶解時にＶＷＦの安定度は変化する。このＶＷＦの安定性の問題のためにいくらかの治療処置、例えば数日間の連続または不連続な注射処置注入液処理はできない。この治療はＶＷＦの定数循環レベルを維持でき、従って不連続注射投与を行なった時に治療ウインドウ外のレベルになることを防ぐことができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者は、ＶＷＦ-含有血漿由来の組成物中に存在するＡＤＡＭＴＳ１３タンパクの量を減らして、長時間にわたってその安定性を改善するための効率的な手段を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の対象は、ＤＥＡＥ基を有する大きな細孔（pore）を有するビニル重合体タイプの樹脂から成るイオン交換クロマトグラフィ担体と、クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液との、ヒトのフォンビルブラント因子を含む血漿由来溶液中のＡＤＡＭＴＳ１３の量を減らすための使用にある。
本発明の他の対象は、クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液中で、ＤＥＡＥ基を有する大きな細孔を有するビニル重合体タイプの樹脂上でイオン交換クロマトグラフ分離を行なう段階を有する、ヒトのＶＷＦ-含有血漿由来の溶液中のＡＤＡＭＴＳ１３量を減らすための方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】はＶＷＦ濃縮物中のＲＣｏ活性の安定性に対するアッセイを示す図で、この図１はカセット中または注射器中に保存したＡＤＡＭＴＳ１３を含まないＶＷＦ濃縮物でのＶＷＦ：ＲＣｏ濃度物対時間の関係を示すダイアグラムである。
【図１（１）】は［図１］の続きである。
【図１（２）】は［図１］の続きである。
【図２】はＶＷＦ濃縮物中のＶＷＦ抗原の安定性に対するアッセイを示す図で、この図２はカセット中または注射器中に保存したＡＤＡＭＴＳ１３を含まないＶＷＦ濃縮物でのＶＷＦ：Ag濃度対時間の関係を示すダイアグラムである。
【図２（１）】は［図２］の続きである。
【図２（２）】は［図２］の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
驚くことに、タイプのイオン交換クロマトグラフィ担体を特定の条件下で使用することでＶＷＦを豊富に含む組成物中に存在するＡＤＡＭＴＳ１３タンパク分子を除去、または、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパクの量を効率的に減らすことができるということを本発明者は発見した。
【００１３】
従って、本発明はＤＥＡＥ（ジエチル・アミノエチル）基を有する大きな細孔（pore）を有するビニル重合体タイプの樹脂から成るイオン交換クロマトグラフィ担体と、クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液との、ヒトのフォンビルブラント因子を含む血漿由来溶液中のＡＤＡＭＴＳ１３の量を減らすための使用に関するものである。
【００１４】
本発明はさらに、クエン酸トリナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンおよびリシンから成る緩衝液中で、ＤＥＡＥ基を有する大きな細孔を有するビニル重合体タイプの樹脂上でイオン交換クロマトグラフ分離を行なう段階を有する、ヒトのＶＷＦ-含有血漿由来の溶液中のＡＤＡＭＴＳ１３量を減らすための方法に関するものである。
【００１５】
イオン交換クロマトグラフィ担体は０．０１Ｍのクエン酸トリナトリウム、０．１１Ｍの塩化ナトリウム、０．００１Ｍの塩化カルシウム、０．１２Ｍのグリシンおよび０．０１６Ｍのリシンから成る平衡化緩衝液でｐＨ７±０．１に平衡させたＤＥＡＥ-フラクトゲル（Fractogel、登録商標）ＴＳＫ６５０の樹脂（ＤＥＡＥ-トーヨーパール、Toyopearl 650ともよばれる）であるのが有利である。
【００１６】
ＤＥＡＥ-フラクトゲル（Fractogel、登録商標）ＴＳＫ６５０は合成親水性ゲルである。この担体はＤＥＡＥ基、例えば−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2Ｎ+（Ｃ2Ｈ5）2ＨＣｌがグラフトしたオリゴエチレングリコール、グリシジンメタクリレートおよびペンタエリスリトールジメタクリレートのコポリマーで、わずかにアルカリ性のアニオン交換樹脂である。このＤＥＡＥ-フラクトゲル（Fractogel、登録商標）ＴＳＫ６５０は２つの粒度（再水和後）：タイプＳ（０．０２５〜０．０５０ｍｍ）およびタイプＭ（０．０４５〜０．０９０ｍｍ）で入手でき、本発明ではこれら両方のタイプを使用できる。
【００１７】
本発明の血漿由来の溶液には血漿誘導体、例えば低温沈殿画分（非精製画分）と精製された凍結沈降誘導体が含まれる。本発明は特にＶＷＦを含む血漿由来の溶液に関するものである。
【００１８】
本発明の好ましい実施例では、血漿の予備精製済み低温沈殿画分を必要に応じてウィルス失活処理してから平衡化したイオン交換クロマトカラムに導入する。次いで、緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を０．１４〜０．１５Ｍまで上げることで保持された画分を溶出される。この階段で初期の血漿サンプル中に存在していたＡＤＡＭＴＳ１３量に対してＡＤＡＭＴＳ１３量を５００倍以上に減らすことができる（［表１］参照）。
【００１９】
本発明の一つの実施例では、上記緩衝液を上記のように平衡化した条件下で、２回の連続したイオン交換クロマトグラフ階段を実行することで、フォンビルブラント因子を含む血漿由来溶液中に存在するＡＤＡＭＴＳ１３の量を減少させる。
【００２０】
この実施例では第１カラムの使用後に得られる溶出画分を第１カラムと同一の第２クロマトカラムに第１カラムと同じ条件下で再び導入できるが、濾過液を取出した後に平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、クロマトグラフィ担体上に吸着したタンパクを緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を０．１５〜０．１７Ｍに上げて溶出させる。この追加のクロマトグラフで最初の血漿サンプル中に存在する最初のＡＤＡＭＴＳ１３量と比べてＡＤＡＭＳＴ１３の量を２０００倍以上減らすことができる（［表１］参照）。
【００２１】
本発明では最初の血漿サンプル中に存在するＡＤＡＭＴＳ１３の量と比較したＡＤＡＭＴＳ１３量の減少度は２００倍以上、３００倍以上、４００倍以上、５００倍以上、６００倍以上、好ましくは７００倍以上、８００倍以上、９００倍以上、１０００倍以上、１５００倍以上、２０００倍以上、２５００倍以上になる。
【００２２】
本発明の関連実施例では、ＶＷＦが豊富な組成物を成形するために、イオン交換クロマトグラフィ担体からまたは第２の階段で使用したイオン交換クロマトグラフィ担体から溶出した画分をイオン交換クロマトグラフィ段階を実行するのに使用したのと同様な平衡化した平衡化緩衝液の存在下でのゼラチン‐セファロース担体のアフィニティークロマトグラフィ階段に送ることができる。このゼラチン‐セファロースクロマトグラフィ担体はフィブロネクチン分子を含む残留物を保持することができる。この後のクロマトグラフィ階段の実行にはゼラチンとゲル担体タイプとを組合せたものを選択することは重要ではない。アフィニティークロマトグラフィの担体はゼラチン-ウルトゲル（Ultrogel、登録商標）、ゼラチン‐スフェロデックス（Spherodex、登録商標）およびゼラチン‐フラクトゲル（Fractogel、登録商標）から選択できる。ゼラチン‐スフェロデックス（Spherodex、登録商標）担体を使用するのが好ましい。
【００２３】
インビトロ試験では、ＶＷＦ-含有濃縮物を溶解した時に、得られたＶＷＦ-含有濃縮物の安定性が確認された（実施例３）。
【００２４】
本発明のＡＤＡＭＴＳ１３タンパクの量を減らす方法を実行することによって、多様な血漿、特にヒトの血漿に由来する溶液からＡＤＡＭＴＳ１３タンパクの量が減少し、ＶＷＦを豊富に含む組成物が得られる。この組成物はＶＷＦの安定性が長時間維持されるので、ＶＷＦの静脈内投与を実行する医療で液体の形で利用できる。
【００２５】
本発明はさらに、生物活性なＶＷＦ‐欠損に関連する病気の予防または治療用医薬品の製造での、本発明に定義の方法によって得られる、ＶＷＦがリッチでＡＤＡＭＴＳ１３タンパク含有量が減った液体組成物の使用にも関するものである。この医薬品は静脈内投与にに適した形をしているのが有利である。一つの実施例では、この医薬品は凍結乾燥した形でそれに適切な量の滅菌したパイロージェンフリーな水を加えて静脈内投与に適した液体組成物にする。他の実施例では静脈内投与に直接使用可能な液体の形の医薬品にする。
【００２６】
本発明はさらに、本発明定義の方法に従って得られるＶＷＦが豊富でＡＤＡＭＴＳ１３タンパクを除いた組成物を、患者に投与する階段を有することを特徴とする、生物学的に活性なＶＷＦ‐欠損に関連疾患を予防または治療方法に関するものである。
【００２７】
上記予防または治療方法での組成物の投与階段は静脈内投与階段にするのが有利である。静脈内投与階段は連続した注射階段すなわち少なくとも８時間から200時間の連続した時間から成るのが好ましい。この階段の継続時間は患者に応じて変える。
【００２８】
連続注射投与階段は一般に少なくとも８時間から120時間までで、通常は24時間までである。
【００２９】
本発明の有利な実施例では、本発明の方法に従って得られるＶＷＦを豊富に含み、ＡＤＡＭＴＳ１３を除いた組成物を充填した単一のコンテナ（容器）またはフラスコを用いて連続注射投与階段を実行する。連続注入投与階段の全継続時間にわたって単一組成物のバッチを収容した単一コンテナを使用できるのは本発明のＶＷＦ組成物が高い安定性を有するおかげである。
【００３０】
フォンビルブラント因子がリッチな組成物の投与階段を有する治療方法自体は公知で、例えば下記文献に記載されている。
【非特許文献１】Martinowitz and aI. (1997, Transfusion Medicine Review, Vol. 11: 56-63) and Martinowitz and aI. (1994, Internationar Daynal of Pediatric Hematology/Oncology, Vol. 1: 471-478
【００３１】
一般に、ＶＷＦが豊富でＡＤＡＭＴＳ１３タンパクを除去した組成物を、フォンウィルブラントファクターが２０〜２００ＶＷＦ：ＲＣｏＩＵ／ｋｇ／２４時となるように、患者に連続注射する。
本発明方法で得られる組成物は直接または間接的に用い、ＶＷＦ含有量は１０〜２５０ＩＵ／ｍｌ、例えば１００ＩＵ／ｍｌにする。
【００３２】
以下の本発明の実施例を示すが、本発明が下記実施例に限定すると解釈してはならない。
【実施例】
【００３３】
実施例１
ＡＤＡＭＴＳ１３を含まないＶＷＦ濃縮物の製造
出発材料
クエン酸ナトリウム（４％）または抗凝固ＣＰＤ溶液（シトラート、リン酸塩、デキストロース）の存在下に血液を採取し、試料採集の後少なくとも６時間凍結した。遠心分離して血漿を得た後、−６０℃で凍結し、−３５℃で保存した。１８００〜２０００リットルを含むバッチをプールし、本発明方法を実行する一回分の量の各４０００リットルの血漿にした。血漿を少なくとも12時間−７℃のチャンバー内に放置してゆっくりと規則的に温めて解かし、一定撹拌下に恒温室中で０〜２℃の温度で解凍した。コールド遠心分離で凍結沈降物（約９ｇ／リットル血漿に対応）を回収した。
【００３４】
遠心後、回収した凍結沈降物を再溶解し、主たる汚染菌すなわちプロトロンビン複合体（特にファクタVII）（ファクタXII）成分を除去するために水酸化アルミニウム上に吸着させた。次いで、上澄を15℃に冷却した（フィブリノーゲンの一部とフィブロネクチンの除去）。
【００３５】
ウイルス失活処理
ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ‐含有溶液に対してリピド・エンベロープ・ウィルスに対して効率的なことに知られている溶剤‐洗浄処理し（Horowitz、et al.（1985）, Transfusion、25、516-522）、0.3％のトリ-n-ブチルリン酸（TnBP）と１％のTween80の存在下で25℃で８時間の培養した。
【００３６】
クロマトグラフ分離方法
最初のクロマトグラフはＤＥＡＥ‐フラクトゲル（Fractogel（Ｍ）ＴＳＫ６５０のカラム（Merk）で実行した。平衡化緩衝液はクエン酸トリナトリウム（０．０１Ｍ）、塩化カルシウム（０．００１Ｍ）、塩化ナトリウム（０．１１Ｍ）、グリシン（０．１２Ｍ）およびＬ−リシン（０、０１６Ｍ）を含んでいる。ＶＷＦ、ＦＶＩＩＩおよびフィブロネクチンは、カラムの上へ保持され、汚染菌タンパク類（主としてフィブリノーゲンおよび免疫グロブリンＧ）はカラムにほとんど固定されないか、固定されず、ウィルスの失活処理残渣は同じ緩衝液を使用した複数回の連続洗浄で除去された。
【００３７】
カラムは１００ｃｍ／時の線形流速で運転した。カラムに吸着されたＶＷＦ−含有画分は緩衝液中のＮａＣｌ濃度を０．１５Ｍまで上げて溶出させた。
【００３８】
この最初のカラムから溶出したＶＷＦ含有画分を第２カラムに再注入した。第２カラムは最初のものと類似し、類似条件下で、平衡化緩衝液でわずかに希釈した後、ＶＷＦ画分のイオン強度を０．１１Ｍ塩化ナトリウムの当量に調節した。
【００３９】
カラムに吸着されたＶＷＦ含有画分は緩衝液中のＮａＣｌ濃度を０．１５Ｍまで上げて溶出させた。溶出液を電気泳動分析した結果、フィブロネクチンおよびインターαトリプシンインヒビター（ＩＴＩ）の汚染は小さいことがわかった。
【００４０】
この第２溶出液を第３の精製階段へ送った。この第３の精製階段では上記カラムの溶出緩衝液で平衡させたゼラチン‐セファロースＣＬ４Ｂカラム（Pharmacia）でフィブロネクチンを除去した。このアフィニティークロマトグラフィゲルのフィブロネクチン保持能力は＞５ｍｇ／ｍｌで、画分中の汚染菌を検知限界値（＜４mg）まで下げることができる。
【００４１】
この最後の階段からの濾過液中にＡＤＡＭＴＳ１３を含まないＶＷＦ濃縮物を回収した。これは凍結乾燥せずに直接治療できる。最後的に得られた濾液は安定化剤の添加は全く必要としない。
【００４２】
実施例２
ＶＷＦ濃縮物中のＡＤＡＭＴＳ１３の減少量の測定
この実施例の目的は実施例1で製造したＶＷＦ濃縮物中に存在するＡＤＡＭＴＳ１３量の減少ファクタを測定することにある。
【００４３】
出発材料
実施例１の各クロマトグラフィ階段の前後の溶液／濃縮物に対応する４つの画分と、最初の血漿画分とを回収した。各画分で１mLのサンプル（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）を採取した。
Ａ：最初の血漿
Ｂ：溶剤／洗剤と最初のＤＥＡＥクロマトグラフィとの間の凍結沈降物
Ｃ：最初のＤＥＡＥクロマトグラフィからの溶出液
Ｄ：第２回目のＤＥＡＥクロマトグラフィからの溶出液
Ｅ：ＶＷＦ−含有ゼラチン−セファロースカラムの画分
【００４４】
ＡＤＡＭＴＳ１３タンパクアッセイ
各サンプル中のＡＤＡＭＴＳ濃度をウサギ抗ヒトＡＤＡＭＴＳ１３抗体を使用してIMUBINDR ADAMTS13 ELISAキット (American Diagnostica）で測定した。同時に、ＶＷＦ：ＲＣｏ濃度も測定した（実施例３のアッセイプロトコル参照）。
【００４５】
結果
各アッセイの結果は［表１］に示してある。
【００４６】
【表１】
2010532337.tif 000002
【００４７】
結論
最初のクロマトグラフィ後のＡＤＡＭＴＳ１３の減少ファクタは700以上である。第２回クロマトグラフィ後の減少ファクタは約2500である。一方、第３回クロマトグラフィではＡＤＡＭＴＳ１３量は減らなかった。この実施例は上記クロマトグラフィカラムと緩衝液とを使用したときのＡＤＡＭＴＳ１３タンパクの除去効率が高いことを表している。
【００４８】
実施例３
ＡＤＡＭＴＳ１３を含まないＶＷＦ濃縮物の安定性
この実施例の目的は、実施例１に従った製造されたＡＤＡＭＴＳ１３を含まないＶＷＦ凍結乾燥濃縮物を注射器すなわちバッチで所定投与量に分割する時または注入ポンプを使用して連続注入で製品を投与する時のルーチン条件下で各種コンテナ中に再構築した後の生物学的製剤の安定性を評価することにある。
【００４９】
材料
テストした医薬：
下記の３つの異なるＶＷＦ濃縮物のバッチをテストした：
バッチ＃１：ＶＷＦ：ＲＣo  1010 IU/10mlフラスコ
バッチ＃２：ＶＷＦ：ＲＣo  1080 IU/10mlフラスコ
バッチ＃３：ＶＷＦ：ＲＣo  1000 IU/10mlフラスコ
使用した注入材料：
注入液ポンプCADD PRIZM（登録商標）VIP（（SIMS Deltec、Inc. St.Paul,.MN, USA）
ポリ塩化ビニールのMEDICATION カセット（登録商標） 50ml貯蔵器、
ポンプ用サイホン防止弁付ポリ塩化ビニールのデルタ延長コード114cm／45
ポリプロピレンの3P Plastipak lOmｌLuer Lock H810LL
自動注入装置：
リストセチン・コファクタ活性アッセイ（ＶＷＦ：ＲＣｏ）用およびＶＷＦテスト・アッセイ（ＶＷＦ：Ag）用ＢＣＳアナライザー（Dade Behring, Marbug GmbH)。
リストセチン・コファクタ活性アッセイ（ＶＷＦ：ＲＣｏ）
（１）BCフォン・ウィルブラント試薬（Dade Behring Marburg社）
（２）サンプル希釈用NaCI
（３）サンプル希釈：最少「ウシ血清」98％
（４）アルブミン（ウシ血清）は予め生理的食塩水（NaCI 0.9％）中に希釈。
【００５０】
ＶＷＦ抗原アッセイ（ＶＷＦ：Ag）
（１）ＶＷＦ試薬：下記から成るAg Dade Behring（Dade Behring Marburg）：
１フラスコＶＷＦ：ラテックス試薬用Ag希釈剤4m1：ラテックス希釈用のグリシンを含む溶液
１フラスコＶＷＦ：Agラテックス試薬2ml：（ウサギ）抗ヒトＶＷＦ抗体で被覆された小径ポリスチレン粒子の懸濁液
１フラスコＶＷＦ：Ag緩衝液5m1：グリシン緩衝液
（２）再構築後の貯蔵：＋2/＋8℃で15日
（３）サンプル希釈用Owren Kroller緩衝液
（４）サンプル希釈：最少ウシ血清98％
アルブミン（ウシ血清）は予め食塩水で希釈（NaCl 0.9％）。
【００５１】
マルティマー・アッセイ
試薬と緩衝液は下記のもの：
緩衝液TBS 50mM（pH 7.4）
（１）  5％脱脂乳＝飽和緩衝液
（２）  0.05％ Tween200＝洗浄用緩衝液
アルカリホスファターゼ634.0052に結合した抗ＶＷＦポリクローナル抗体
顕色キット−バイオレッド（-20℃で保存）
標準血漿および品質管理
ヒト標準血漿（Dade Behring Marburg）：OMS 97/586標準品で較正。
対照：
（１）ＶＥＱ  Ａ（ノーマル対照）（Dade Behring Marburg）：標的値：ＲＣｏ：71％（64〜79）およびAg：90％ (83〜97)
（２）ＶＥＱ  Ｂ（異常対照）（Dade Behring Marburg）標的値：ＲＣｏ：22％（17〜27）およびAg：33％ (30〜35)
研究技術条件
室温：23±2℃
光源から離す。
層流空気流下で再構築（クラスA、ISO 5）、管理環境ルーム（クラスC、ISO 7）（よい製造プラクティスで実行：特別ガイドライン：滅菌医薬品生産、Official Bulletin N .degree. 2007/1 bis）。
【００５２】
方法
サンプルの調整−研究技術条件
全体で６つの調合剤をテストした：各バッチは注射器およびカセット中でテストした。
ＡＤＡＭＴＳ１３を含まないＶＷＦの凍結乾燥濃縮物は粉末で、水を用いて注射可能な医薬調節物へ再構成した。
注射器：
Ｔ０で、製品を所定溶剤（注射用水）および材料（殺菌濾過器とエッジ−タイプ濾過器とを有するベント管を備えた移送システム）で再構成し、層状気流フード下（クラスＡ）、制御された気圧ルーム（クラスＣ）で注射器中に入れた。研究は静的状態下で３日（７２時間）実行した。調合品は室温で光源から離して保存した。
【００５３】
カセット：
Ｔ０で、製品を注射器の場合と類似の条件下で再構成した。第１階段は静的状態下で０〜48時間実行した。第２階段は動的状態下で48〜120時間の間実行した。ポンプ第２日に動かし、研究の最終日（l2O時間）まで低速（0.1ml/時間）を維持した。調合品は室温で、光源から離して保存した。
サンプルの調整：
ＶＷＦ：ＲＣｏおよびＶＷＦ：Agアッセイ用サンプルを再構築直後（Ｔ０）に採取し、その後は下記時点で採取した：
（１）注射器中に再構築後Ｔ12、24、36、48、60、72時間、
（２）カセット中に再構築後Ｔ12、24、36、48、60、72、84、96、108、120時間
各ポイントで３組のサンプル（250μｌ）を番号を付きグラジュエートエッペンドルフマイクロチューブ中に採取し、直ちに凍結した（−80℃）。マルティマーアッセイ用サンプルは下記で行なった：
（１）注射器の場合  Ｔ０、７２時間）
（２）カセットの場合  Ｔ０、６０、１２０時間
サンプルは-80℃で直ちに凍結した。
【００５４】
標準血漿および対照
ＶＥＱＡ、ＶＥＱＢ対照および標準血漿を１ｍｌの冷えていない蒸留水で再構成し、１時間安定させた。ＶＷＦ：ＲＣｏ活性アッセイのためにアッセイと同じ日に標準範囲で実行した。較正はＢＣＳデバイスを用いて標準品をOwren Koller緩衝液で自動希釈して行なった。ＶＥＱＡおよびＶＥＱＢ対照の解析で較正を確認した。注射器に対応するサンプル解析の終わりに対照を再度流した。その後、カセットに対応するサンプル解析を行ない、血小板試薬の新しい再構築を確認した。フォン・ウィルブラント・テスト・アッセイのための標準範囲はＶＥＱＡおよびＶＥＱＢ対照の解析で確認した。
【００５５】
ＶＷＦ：ＲＣｏアッセイ
アッセイ原則：
リストセチン（抗生剤）の存在下でサンプル中に存在するＶＷＦはフォン・ウィルブラントＢＣ試薬に含まれる安定化した血小板のアグルチネーションを導く。アグルチネーションプロセスは反応液の濁度を低下させる。凝固アナライザ（Dade Behring BSC）は光学濃度の変化を測定し、ノーマルに対するサンプル中のリストセチンコファクタ活性を自動的にパーセントで計算する。１０〜１５０％の標準の血漿から６ポイント範囲をセットアップする（１０、２０、４０、６０、１００、１５０％）。
方法：
ＶＷＦ ＢＣ試薬は凍結乾燥した形の安定化された血小板と、リストセチンと、ＥＤＴＡとから成る。４ｍｌの蒸留水で再構築した後に、フォン・ウィルブラントＢＣ試薬で１５分間撹拌なしで安定させる。その後、ボルテックスを用いて５秒間二回非常にゆっくりと撹拌してからＢＣＳデバイスに導入する。ＢＣＳデバイスは３０分毎に撹拌しなければならない。サンプルの希釈用に使用するＮａＣｌをＢＣＳデバイスに導入する。
【００５６】
ＶＷＦ：Agアッセイ
アッセイ原則：
フォン・ウィルブラント抗原を含むサンプル中へ試薬を添加して共有結合した特異抗体（ウサギAb）で被覆された小径のポリスチレン粒子をアグルチネーションさせる。このアグルチネーションをＢＣＳデバイス上の比濁分析で測定する。この比濁分析値はサンプルのＶＷＦ Agレベルに正比例する。10％から180％の標準血漿から５点範囲をセットアップする（10、40、70、150、180％）。
方法：
全部の希釈剤フラスコをラテックス試薬フラスコ中へ注ぎ、気泡の発生を避けながら撹拌する。15分間室温に置いた後、混合液を自動デバイスに導入した。
【００５７】
サンプル処理
サンプルを３７℃で５分間解凍し、ボルテックスで撹拌し、ウシ血清で１／１００に希釈する、最低９８％（予め生理的食塩水で希釈）。ボルテックスで撹拌後、サンプルをＢＣＳデバイスに導入する。
マルチマー
サンプルの調整：
サンプルをサンプル希釈用緩衝液＋ブロムフェノールブルーで1/10に希釈して、ＶＷＦ：Agレベルを約0.1  IU/mlに調節する。次いでサンプルを60℃で30分加熱する。
【００５８】
電気泳動：
30μLのサンプルをアガロースゲルウエルに入れる。電気泳動終了後直ぐにゲルを蒸留水を入れたビーカー中に浸し、少なくとも1時間穏やかな撹拌下に濯ぐ。次いで、ゲルを冷えた気流下で乾燥し、飽和緩衝液で１時間飽和させる。ゲルを穏やかな撹拌下に一晩培養し、50mM TBS緩衝液中でアルカリホスファターゼに結合されたポリクローン性抗ＶＷＦ抗体（抗ＶＷＦ-ＰＡ）の浴中に希釈する。希釈後、ゲルを少なくとも２時間、複数の洗浄緩衝液浴で撹拌下に培養する。１００ｍｌの０．１Ｍトリス、ｐＨ９．５、１ｍｌの溶液Ａ＋１ｍｌの溶液Ｂ（キット溶液）を加えて顕色溶液を作った。
【００５９】
発現および結果
ＶＷＦ：ＲＣｏおよびＶＷＦ：Ａｇの結果の解析：
線型回帰法を用いてゼロ次反応に対応する統計解析、すなわち最も単純な解析：ｙ＝ａ＋ｂｘを行なった。スチュデンドテストによるスロープとの大きな差はないことをチェックした。N-2 ddに対してt 0.05。
マルティマーの結果の解析：
各プレートをスキャンして各種マルティマーに対応するバンドの濃度プロット線を得る。各バンドで積分値を総面積のパーセントで表した。各バンドは重いものから最も軽いものへ１〜Ｘで識別した。
【００６０】
結果は下記の完全性に関するパーセントで与えられる：
（１）第１５番のバンド〜Ｘ番のバンドまでのマルティマー(?15-mers)
（２）第１０番のバンド〜Ｘ番のバンドまでのマルティマー(?10-mers)
（３）第５番のバンド〜Ｘ番のバンドまでのマルティマー(?５-mers)
結果
対照の結果：データは示していない。
アッセイ結果
10mlの水で注射可能な薬物調整品に再構築後のフラスコはリストセチンコファクタ活性1000ＩＵに対応する100 UI/mlのヒトフォンビルブラント因子を含む。この研究は再構築後の医薬品の安定性を評価する方法に関するＦＤＡ（ＱＩＤ）およびＥＭＥＡ（ＣＰＭＰ／ＩＣＨ／４２０／０２）の推薦方法に応じて実行した。
結果は生データを［表２］［表３］に示す。［図１］［図２］は安定性値とセチンコファクタ活性およびウィルブラント抗原に依存する時間との関係を示している。
【００６１】
【表２】
2010532337.tif 000003
【００６２】
【表３】
2010532337.tif 000004
【００６３】
回帰スロープテストはランダムかつ異常な変動の仮定下でほぼゼロである（α＝５％、ｐ＞０．０５）。これで、研究したパラメータは時間範囲（72〜120時間）内かつアッセイ条件下では実質的に劣化がないことが確認された（ＶＷＦ：ＲＣＯおよびＶＷＦ Ag）。
【００６４】
マルティマー結果
マルティマーの結果は［表４］に示してある。
【００６５】
【表４】
2010532337.tif 000005
【００６６】
異なるコンテナ（注射器およびカセット）の研究を通じて各マルティマー間（高分子量、中分子量および低分子量）で大きな違いは観測されなかった。
【００６７】
結論
我々の研究結果は、ＡＤＡＭＴＳ１３を含まないＶＷＦ凍結乾燥濃縮物を一定時間（注射器用は72時間、カセット用は120時間）後に所定操作条件下で再構成したものは生物学的安定性（質的および量的）があることを証明した。
この結果は注射器で分別投与量での投与（例えば定期的投与）が可能であることを示し、注入ポンプまたはフォンウィルブラント病気用連続注入で自動投与（血友病では既に実施されている）が実行できることを示している。
【図１】
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【図１（１）】
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【図１（２）】
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【図２】
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【図２（１）】
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【図２（２）】
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【国際調査報告】
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