(57)【要約】  血管新生と関連する状態を治療する方法であって、カテプシンＳに特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しない抗体分子の投与を含む方法が記載される。こうした方法で用いる抗体分子もまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一群の細胞、組織、又は臓器における血管新生を阻害する方法であって、前記細胞、組織、又は臓器に対する抗体分子、又は抗体分子をコードする核酸の投与を含み、前記抗体分子がカテプシンＳに特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しない、方法。
【請求項２】
その治療を必要とする患者におけるカテプシンＳ活性と関連する状態を治療する方法であって、前記患者に対する抗体分子、又は抗体分子をコードする核酸の投与を含み、前記抗体分子がカテプシンＳに特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しない、方法。
【請求項３】
前記状態がカテプシンＳの異常発現と関連する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記状態が血管新生と関連する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記状態が癌である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記状態が炎症状態である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記状態が眼疾患である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記状態がアテローム性動脈硬化である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１と少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチド配列からなる単離ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１として示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列からなる、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
カテプシンＳに特異的に結合し、血管新生を阻害するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しない抗体分子。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載のポリペプチドに対する結合特異性を有する、請求項１１に記載の抗体分子。
【請求項１３】
前記抗体分子が、請求項１２に記載の抗体分子である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１１又は１２に記載の抗体分子、又は該抗体分子をコードする核酸の医薬への使用。
【請求項１５】
カテプシンＳの活性と関連する状態の治療用薬剤の調製における抗体分子、又は前記抗体分子をコードする核酸の使用であって、前記抗体分子がカテプシンＳに特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しない、使用。
【請求項１６】
前記抗体分子が、請求項１１又は１２に記載の抗体分子である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記状態がカテプシンＳの異常な発現と関連する、請求項１５又は１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記状態が血管新生と関連する、請求項１５又は１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記状態が癌である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記状態が炎症状態である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
前記状態が眼疾患である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
前記状態がアテローム性動脈硬化である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２３】
請求項１１又は１２に記載の抗体分子を含む医薬組成物。
【請求項２４】
ＶＥＧＦ阻害剤をさらに含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記阻害剤が、抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ＥＧＦ受容体阻害剤をさらに含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記阻害剤が、抗ＥＧＦ受容体抗体である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
生物試料中におけるカテプシンＳの存在を判定する方法であって、生物試料を請求項１１又は１２に記載の抗体と接触させること、該抗体分子及び生物試料の結合を判定することを含み、対照と比較した、抗体分子と生物試料の結合が、カテプシンＳの存在を示す方法。
【請求項２９】
対象における腫瘍を検出するアッセイ方法であって、
（ａ）対象由来の生物試料を提供すること、
（ｂ）生物試料を請求項１１又は１２に記載の抗体分子と接触させること、
（ｂ）抗体と生物試料の結合レベルを決定すること、
を含み、対照試料と比較した、抗体と生物試料の結合レベルの上昇が、腫瘍の存在を示す、アッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本出願は、血管新生に関連する状態及び疾患の治療法、並びにこうした方法で用いる組成物に関する。
【０００２】
［発明の背景］
血管新生という微小血管系の発生は、正常な発生及び創傷の治癒など多くの正常な生理的過程内における不可欠の過程である。血管新生は、初期血管を形成する内皮細胞の刺激を特徴とし、内皮細胞、周囲の微小環境、並びに各種の血管新生促進因子及び血管新生阻害因子の間に解明されていない複雑な相互作用が存在する。しかし、制御されない、又は不適切な血管新生は、腫瘍の進行及び眼疾患を含む広範な疾患の病理に対する基礎的な因子として認められている。
【０００３】
［眼内における病的な新血管形成］
眼内における調節されない血管新生は、角膜移植拒絶、外傷又は感染後の新血管形成、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症、及び新血管性緑内障を含む、広範な状態において、失明の主要原因と考えられている。
【０００４】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの分子は、血管新生の促進を助ける役割を果たすことが示されており、実際、抗体を用いたこの分子の隔離は、病的な血管新生を予防する治療戦略として確立されている。
【０００５】
しかし、カテプシンＳなどの他のタンパク質もまた、血管新生部位において上方調節されることが示されている。
【０００６】
カテプシンＳ（ＣａｔＳ）は、リソソーマルシステインプロテアーゼのパパインスーパーファミリーのメンバーである。現在のところ、１１のヒトカテプシンが同定されているが、各々のｉｎ  ｖｉｖｏにおける特異的な役割は、いまだ決定されていない（Ｋａｔｕｎｕｍａら，２００３年）。カテプシンＢ、Ｌ、Ｈ、Ｆ、０、Ｘ、及びＣが大半の細胞内で発現されることは、タンパク質の代謝回転を調節することにおける潜在的な役割を示唆する一方、カテプシンＳ、Ｋ、Ｗ、及びＶが特定の細胞及び組織に限定されることは、これらがより特異的な役割を有し得ることを示す（Ｋｏｓら，２００１年；Ｂｅｒｄｏｗｓｋａ，２００４年）。
【０００７】
ＣａｔＳは、最初にウシのリンパ節及び脾臓から同定され、ヒト型は、ヒトマクロファージｃＤＮＡライブラリーからクローン化された（Ｓｈｉら，１９９２年）。ＣａｔＳをコードする遺伝子は、ヒト染色体ｌｑ２１上に位置している。ＣａｔＳ遺伝子によりコードされる９９６塩基対の転写物は、まず、３７．５ｋＤａの分子量を有する、プロセシングされていない前駆体タンパク質に翻訳される。プロセシングされていないタンパク質は、３３１アミノ酸；１５アミノ酸のシグナルペプチド、９９アミノ酸のプロペプチド配列、及び２１７アミノ酸のペプチドからなる。ＣａｔＳは、まず、小胞体の内腔に入った後に除去されるシグナルペプチドとともに発現される。プロペプチド配列は、プロテアーゼの活性部位に結合し、酸性のエンドソーム区画に輸送されるまでプロテアーゼを不活性化しており、その後、プロペプチド配列が除去されて、プロテアーゼが活性化される（Ｂａｋｅｒら，２００３年）。
【０００８】
ＣａｔＳは、抗原ロード前におけるインバリアント鎖の切断により、主要組織適合抗原複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）を介する抗原提示における重要な酵素として同定されている。ＣａｔＳを欠損するマウスは、ＡＰＣにより外因性タンパク質を提示する能力が損傷されていることを示す研究がある（Ｎａｋａｇａｗａら，１９９９年）。インバリアント鎖ＩｉのプロセシングにおけるＣａｔＳの特異性は、喘息及び自己免疫疾患などの状態の治療におけるＣａｔＳ特異的な治療薬を可能とする（Ｃｈａｐｍａｎら，１９９７年）。
【０００９】
［ＣａｔＳの病理的関連］
プロテアーゼ制御の変化は、多くのヒトにおける病理過程の基礎となることが多い。リソソーマルシステインプロテアーゼであるカテプシンＳの調節されない発現及び活性は、神経変性疾患、自己免疫疾患、及び一部の悪性腫瘍を含む各種の状態と関連している。
【００１０】
ＣａｔＳの上方調節は、複数の神経変性疾患と関連している。それは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からのβペプチド（Ａβ）の産生において役割を有すると考えられており（Ｍｕｎｇｅｒら，１９９５年）、その発現は、アルツハイマー病及びダウン症のいずれにおいても上方調節されることが示されている（Ｌｅｍｅｒｅら，１９９５年）。ＣａｔＳは、また、多発性硬化症の病変形成に伴う潜在的な自己抗原である、ミエリン塩基性タンパク質を分解するＣａｔＳの能力を介して、多発性硬化症においても役割を有する可能性があり（Ｂｅｃｋら，２００１年）、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）患者において、ＣａｔＳの発現は、４倍を超えて上昇することが示されている（Ｂａｋｅｒら，２００２年）。
【００１１】
ＣａｔＳの異常な発現は、また、アテローム性動脈硬化症とも関連している。正常な動脈において、ＣａｔＳの発現は無視し得るが、ヒトアテロームは、強力な免疫反応性を示す（Ｓｕｋｈｏｖａら，１９９８年）。ＣａｔＳ及びＬＤＬ受容体が共に欠損するノックアウトマウスを用いたさらなる研究では、アテローム性動脈硬化の発症が著明に低下することが示されている（Ｓｕｋｈｏｖａら，２００３年）。さらなる研究は、ＣａｔＳの発現を、炎症性筋疾患及び関節リウマチと関連付けている。炎症性筋疾患を有する患者由来の筋生検標本は、対照筋切片と比較して、ＣａｔＳの発現が１０倍上昇し（Ｗｉｅｎｄｌら，２００３年）、関節リウマチを有する患者由来の滑液では、変形性関節症を有する患者と比較して、ＣａｔＳの発現レベルが著明に高かった（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００１年）。
【００１２】
ＣａｔＳの血管新生との関連は、ＣａｔＳ欠損内皮細胞を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて初めて示された（Ｓｈｉら，２００３年）。微小血管内皮細胞（ＥＣｓ）は、プロテアーゼを分泌することにより、血管基底膜の他、間質の細胞外マトリックスへの貫入を可能とすることが示されている。培養したＥＣｓを、炎症性サイトカイン又は血管新生因子により処置すると、ＣａｔＳの発現が刺激され、それを阻害すると、微小管の形成が低下した。ＣａｔＳ−／−マウスは、野生型の対照と比較して、創傷修復時において、微小血管発生の欠損を示した（Ｓｈｉら，２００３年）。
【００１３】
血管新生及び腫瘍増殖におけるＣａｔＳの役割に対するさらなる検討が、膵島細胞癌のトランスジェニックマウスモデルにおいてなされた。ＣａｔＳ−／−マウスでは、ＣａｔＳ＋／＋対照マウスと比較して、著明に小さい腫瘍及び著明に少ない血管新生性膵島を生じることが見出された（Ｇｏｃｈｅｖａら，２００６年）。その後、ＣａｔＳは、血管新生阻害ペプチドを切断及び不活性化し、活性血管新生促進フラグメントの産生を促進することができるという証拠により、この表現型を裏付ける分子機構に対する洞察がもたらされた（Ｗａｎｇら，２００６年）。
【００１４】
最後に、悪性腫瘍及び血管新生におけるＣａｔＳの役割もまた、肝細胞癌のマウスモデルにおいて検討されている。正常ＥＣｓ及び腫瘍モデルから抽出したＥＣｓに対するマイクロアレイ解析は、腫瘍ＥＣｓでは、正常細胞と比較して、ＣａｔＳ遺伝子発現が７４倍上昇することを示した（Ｒｙｓｃｈｉｃｈら，２００６年）。
【００１５】
ＣａｔＳのタンパク質分解活性を特異的に標的化する阻害剤の生成は、このプロテアーゼの活性と関連する症状を軽減する治療薬としての可能性を有する。
【００１６】
［ＣａｔＳの阻害］
プロテアーゼが過剰発現される場合、治療戦略は、これらの酵素の活性を遮断する阻害剤の開発に焦点を当ててきた。カテプシンに対する特異的な小分子阻害剤の生成は、選択性及び特異性に関する問題のために、過去においては困難であることが分かった。ＣａｔＳに対する強力な可逆性阻害剤としてＷａｌｋｅｒらにより開発されたジペプチドであるα−ケト−β−アルデヒドは、ＣａｔＢ及びＬの阻害能を有したが有効性が低く（Ｗａｌｋｅｒら，２０００年）、ＣａｔＳ阻害剤である４−モルホリン尿素−Ｌｅｕ−ホモＰｈｅ−ビニルスルホン（ＬＨＶＳ）も、高濃度で用いると、他のカテプシンを阻害することが示されている（Ｐａｌｍｅｒら，１９９５年）。
【００１７】
２００６年４月１０日に出願され、本出願と発明者を共有する、同時係属の出願であるＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１３１４号明細書は、カテプシンＳのタンパク質分解活性を強力に阻害する、カテプシンＳに対する特異性を有するモノクローナル抗体について記載している。この抗体は、腫瘍細胞浸潤及び血管新生を阻害することが示された。ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１３１４号明細書は、これが、カテプシンＳのプロテアーゼ活性を直接に阻害するカテプシンＳ特異抗体に対する最初の実証であり、したがって、広範な適用を有する活性治療薬としてのこうした抗体の使用を独自に可能とすることを教示する。
【００１８】
ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１３１４号明細書に記載される以外では、実証可能な治療可能性を有する抗カテプシンＳ抗体に関する報告は存在していない。特に、ある特定のタンパク質に結合する抗体には、特定のタンパク質の正常な活性に対してある効果を有することが示されている抗体もあるが、このことは、カテプシンＳに結合するどの抗体についても、これまでのところ示されていない。実際、ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１３１４号明細書では、カテプシンＳに結合するが、タンパク質分解活性には影響しない対照抗体は、腫瘍細胞浸潤に対して効果を及ぼさなかったことが示されている。
【００１９】
［発明の概要］
本発明者らは、多数の疾患モデルに対する、多数のカテプシンＳ抗体の効果について調べた。
【００２０】
本発明者らは、カテプシンＳに対する特異性を有するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しない抗体が、それにもかかわらず、強力な血管新生阻害剤として作用することを初めて示した。これは、ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１３１４号明細書において教示される通り、カテプシンＳ活性が調節されない病理的効果に対抗するには、カテプシンＳのタンパク質分解作用を阻害する戦略が必要であると考えられていたことを踏まえるならば、本発明者にとって特に驚くべきことであった。さらに、タンパク質を隔離する抗体の使用が、あるタンパク質、例えばＶＥＧＦ、に対する治療戦略として示唆されているが、こうした戦略は、現在までのところ、カテプシンＳ活性と関連する疾患の治療に適当であるとは考えられていない。
【００２１】
したがって、第１の態様において、本発明は、その治療を必要とする患者における血管新生と関連する状態を治療する方法であって、前記患者に対する抗体分子、又は前記抗体分子をコードする核酸の投与を含み、前記抗体分子がカテプシンＳに特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しない方法を提供する。
【００２２】
本発明の第２の態様では、血管新生に関連する状態の治療用薬剤の調製における抗体分子、又は前記抗体分子をコードする核酸の使用であって、前記抗体分子がカテプシンＳに特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しない使用が提供される。
【００２３】
血管新生が疾患の病理において役割を果たす、任意の疾患又は状態の治療に本発明を用いることができる。こうした状態及び疾患は、癌、炎症状態、例えば、炎症性筋疾患、関節リウマチ、及び喘息、眼疾患、アテローム性動脈硬化、並びに癌を含むがこれらに限定されない。
【００２４】
さらに、カテプシンＳに特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しない抗体分子が、それにもかかわらず血管新生を阻害することの実証から、カテプシンＳと関連する他の状態の治療におけるこうした抗体分子の使用が可能となる。
【００２５】
第３の態様では、その治療を必要とする患者におけるカテプシンＳ活性と関連する状態を治療する方法であって、前記患者に対する抗体分子、又は抗体分子をコードする核酸の投与を含み、前記抗体分子がカテプシンＳに特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しない方法が提供される。
【００２６】
また、第４の態様としては、カテプシンＳの異常な活性又は発現と関連する状態の治療用薬剤の調製における抗体分子、又は抗体分子をコードする核酸の使用であって、前記抗体分子がカテプシンＳに特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しない使用も提供される。
【００２７】
カテプシンＳの異常な活性が関連する、特に、カテプシンＳの発現と関連する任意の状態の治療で本発明を用いることができる。例えば、本発明を用いることができる状態は、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病及び多発性硬化症、自己免疫疾患、並びに、過剰な、調節されない、又は不適切な血管新生と関連する他の疾患を含むがこれらに限定されない。
【００２８】
本発明では、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しないが、血管新生を阻害する、任意の適切な抗カテプシンＳ抗体分子を用いてよい。
【００２９】
こうした抗体分子、及び、こうした抗体分子をコードする核酸が、本発明の第５の独立の態様を構成する。
【００３０】
実施例に記載の通り、本発明者らは、１Ｅ４抗体が特異的に結合するカテプシンＳにおける結合領域を同定した。結合領域は、配列番号１：
ＥＬＰＹＧＲＥＤＶＬＫＥＡＶＡＮＫＧＰＶＳＶＧＶＤＡＲＨＰ（配列番号１）
として示されるアミノ酸配列を有する。
【００３１】
したがって、本発明の第６の態様では、配列番号１と少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチド配列からなる単離ポリペプチドが提供される。一実施形態において、該ポリペプチド配列は、配列番号１として示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド配列からなる。
【００３２】
したがって、本発明の第５の態様の一実施形態において、抗体分子は、本発明の第６の態様のポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体分子である。
【００３３】
本発明の一実施形態において、該抗体分子は、１Ｅ４抗体又はそのフラグメント若しくはその変異体である。
【００３４】
抗体分子は、抗体、例えば、全抗体であり得る。代替的な一実施形態において、抗体分子は、ｓｃＦｖなどの抗体フラグメントであり得る。
【００３５】
血管新生は阻害するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害せず、場合によっては、同様かそれを上回る結合特異性を有する関連の抗体分子もまた、本発明における抗体分子として用い得る。
【００３６】
こうした抗体分子は、１Ｅ４抗体のＶＨ鎖の少なくとも１つのＣＤＲ、及び／又は、少なくとも１つのＣＤＲにおいて、５カ所以下、例えば、４カ所、３カ所、２カ所、若しくは１カ所のアミノ酸置換がなされ、血管新生の阻害能を保持するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性の阻害能は有さない、１Ｅ４抗体のＶＨ鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含み得る。
【００３７】
本発明の一実施形態において、本発明の抗体分子、及び本発明で用いる抗体分子は、腫瘍細胞浸潤の阻害能を有する。
【００３８】
本発明のさらなる態様では、医療に用いる、カテプシンＳに特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害しない抗体分子、又は該抗体分子をコードする核酸が提供される。
【００３９】
本発明の別の態様は、カテプシンＳに特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害しない抗体分子、又は該抗体分子をコードする核酸を含む医薬組成物である。
【００４０】
本発明の各態様の好ましい代替的な特徴は、文脈による別段の要請がない限り、必要な変更を加えて、他の各態様にも関する。
【００４１】
［詳細な説明］
［抗体分子］
本発明の文脈において、抗体分子（又は特異的な結合メンバー）とは、別の分子、特に、カテプシンＳに対する結合特異性を有する分子である。該抗体分子は、抗体又はそのフラグメントであり得る。
【００４２】
抗体とは、免疫グロブリン若しくはその一部、又は抗体結合ドメインであるか、若しくはこれと相同である結合ドメインを含む任意のポリペプチドを指すことを理解されたい。特異的な抗体分子は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体、及びこれらのフラグメント、並びに、別のポリペプチドと融合した免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ抗体を含むがこれらに限定されない。抗体の模倣体もまた、抗体分子に包含される。
【００４３】
完全な（全）抗体は、各々が、それぞれ、ＶＨ及びＶＬと称する可変領域を有する、重鎖及び軽鎖からなる免疫グロブリン分子を含む。可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ、超可変領域としても知られる）、及び４つのフレームワーク領域（ＦＲ）又は骨格からなる。ＣＤＲは、抗原分子と相補的な立体構造を形成し、抗体の特異性を決定する。
【００４４】
抗体のフラグメントは、完全な抗体の結合能を保持し得るので、完全な抗体の代わりに用いることができる。したがって、本発明の目的では、文脈による別段の要請がない限り、「抗体分子」という用語は、抗体フラグメントを包含すると理解すべきである。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、及びＦｖフラグメント、ｓｃＦｖｓ、二重特異性ｓｃＦｖｓ、ダイアボディ、直鎖抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書、実施例２；Ｚａｐａｔａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，第８巻，第１０号，１０５７〜１０６２頁，１９９５年を参照されたい）；単鎖抗体分子；及び、抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含む。
【００４５】
Ｆａｂフラグメントは、ＶＨ及びＣＨ１と共に、全Ｌ鎖（ＶＬ及びＣＬ）からなる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ又は複数のシステインを含む、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における付加的な少数の残基を有することにより、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つのジスルフィド結合により連結されたＦａｂフラグメントを含む。
【００４６】
Ｆｄフラグメントは、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなる。
【００４７】
Ｆｖフラグメントは、単一の抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインからなる。
【００４８】
単鎖Ｆｖフラグメントは、ｓｃＦｖが抗原結合部位を形成することを可能とするリンカーにより連結されるＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む抗体フラグメントである（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１１３巻，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，ニューヨーク，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社，２６９〜３１５頁，１９９４年を参照されたい）。
【００４９】
ダイアボディとは、Ｖドメインの鎖間対形成は達成するが鎖内対形成は達成しないよう、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間で、短いリンカー（約５〜１０残基）によりｓｃＦｖフラグメント（前出の段落を参照されたい）を構築することにより調製され、多価フラグメント、即ち、２つの抗原結合部位を有するフラグメントをもたらす小さな抗体フラグメントである（例えば、欧州特許第４０４  ０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；及び、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９０巻，６４４４〜６４４８頁，１９９３年を参照されたい）。
【００５０】
個別のＣＤＲｓが、フラグメントにさらに包含される。
【００５１】
上述の通り、本発明の抗体分子、及び本発明で用いる抗体分子は、１Ｅ４抗体に限定されず、血管新生の阻害能を維持するが、ＣａｔＳのタンパク質分解活性は阻害しない他の抗体までも拡張する。したがって、１つ又は複数のアミノ酸残基が改変されるこうした抗体のＣＤＲアミノ酸配列もまた、ＣＤＲ配列として用いてよい。ＣＤＲ変異体のアミノ酸配列中における改変されたアミノ酸残基は、全ＣＤＲの好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、最も好ましくは１０％以下である。こうした変異体は、本出願の教示及び当技術分野で知られる技法を用いて提供することができる。ＣＤＲｓは、抗体の重鎖配列若しくは軽鎖配列又はその一部を含む、フレームワーク構造中に含有され得る。好ましくは、こうしたＣＤＲｓは、自然発生するＶＨドメイン及びＶＬドメインのＣＤＲ（ｓ）の位置に対応する場所に位置する。こうしたＣＤＲｓの位置は、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，米国保健社会福祉省，公衆衛生局，国立衛生研究所，ＮＩＨ公刊第９１−３２４２号，１９９１年、及び、ｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ、ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ．のオンラインページに記載される通りに決定することができる。
【００５２】
さらに、可変領域のフレームワーク領域に、代替的又は付加的な改変を行ってよい。フレームワーク領域におけるこうした変更は、抗体の安定性を改善し、抗体の免疫原性を低下させることができる。
【００５３】
本明細書において、本発明の抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか又は相同である一方で、該鎖の残余が、別の種に由来するか、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体の他、それが所望の生物活性を示す限りにおける、こうした抗体のフラグメントを含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；及び、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第８１巻，６８５１〜６８５５頁，１９８４年を参照されたい）。本明細書における対象キメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒトの定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。
【００５４】
［抗体の産生］
本発明の抗体分子、及び本発明で用いる抗体分子は、天然又は合成のいずれか任意の適切な方法で産生することができる。こうした方法は、例えば、従来のハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５年，Ｎａｔｕｒｅ，第２５６巻，４９５〜４９９頁）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）、又は抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ法（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，１９９１年，Ｎａｔｕｒｅ，第３５２巻，６２４〜６２８頁、及びＭａｒｋｓら，１９９２年，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１０巻，７７９〜７８３頁を参照されたい）を含み得る。他の抗体産生法は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社，１９８８年に説明されている。
【００５５】
従来のハイブリドーマ法は、抗原に結合する能力を有するリンパ球の産生を誘発するために、抗原によるマウス又は他の動物の免疫化を伴うことが通例である。リンパ球は、単離され、骨髄腫細胞株と融合されてハイブリドーマ細胞を形成し、次いで、親骨髄腫細胞の増殖は阻害するが、抗体産生細胞の増殖は許容する条件において培養される。ハイブリドーマは、遺伝子変異を受けることがあり、これが、産生される抗体の結合特異性を変化させることもあり、変化させないこともある。合成抗体は、当技術分野で知られる技法（例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０００年，第２９６巻，５７〜８６頁、及びＫｒｅｂｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２００１年，第２１５４号，６７〜８４頁を参照されたい）を用いて作製することができる。
【００５６】
改変は、当技術分野で知られる任意の適切な技法を用いて、抗体分子のＶＨ、ＶＬ、若しくはＣＤＲｓ、又は実際にＦＲｓにおいて行うことができる。例えば、可変ＶＨ及び／又はＶＬドメインは、ＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ３を、こうしたＣＤＲを欠くＶＨ又はＶＬドメインに導入することにより産生し得る。Ｍａｒｋｓら，１９９２年，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１０巻，７７９〜７８３頁は、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを産生し、次いで、特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせて新規のＶＨ領域を産生する、シャフリング技法について説明している。類似の技法を用いて、本発明のＣＤＲに由来する配列を含む新規のＶＨ及びＶＬドメインを産生し得る。
【００５７】
本発明の変異抗体を産生する代替的な技法は、例えば、エラープローンＰＣＲ（Ｇｒａｍら，１９９２年、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，第８９巻，３５７６〜３５８０頁を参照されたい）を用いて、ＶＨ又はＶＬドメインをコードする、（１つ又は複数の）遺伝子のランダムな突然変異誘発を伴い得る。加えて、又は代替的に、ＣＤＲｓは、例えば、Ｂａｒｂａｓら，１９９１年，ＰＮＡＳ，３８０９〜３８１３頁、及びＳｃｉｅｒ，１９９６年，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，第２６３巻，５５１〜５６７頁、により説明される分子進化の手法を用いて、突然変異誘発の標的とし得る。
【００５８】
こうした変異体を産生したら、抗体及びフラグメントを、ＣａｔＳに対する結合、及び、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害する能力について調べることができる。
【００５９】
本明細書に記載の通り、本発明者らは、本発明による抗体分子が、抗血管新生効果を有することを示した。したがって、これは、活性治療薬としての本発明の抗体分子の使用を可能とする。
【００６０】
したがって、本発明の一実施形態において、抗体分子は、「裸の」抗体分子である。「裸の」抗体分子とは、「活性治療薬」と抱合していない抗体分子である。
【００６１】
本出願の文脈において、「活性治療薬」とは、抗体部分（抗体フラグメント、ＣＤＲｓなどを含む）に抱合して抱合体を生成する分子又は原子である。こうした「活性治療薬」の例は、薬剤、毒素、放射性同位元素、免疫調節物質、キレート化剤、ホウ素化合物、染料、ナノ粒子などを含む。
【００６２】
本発明の別の実施形態において、抗体分子は、「活性治療薬」に抱合した抗体フラグメントを含む、免疫抱合体の形態である。
【００６３】
免疫抱合体を産生する方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第５，０５７，３１３号明細書、Ｓｈｉｈら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，第４１巻，８３２〜８３９頁，１９８８年；Ｓｈｉｈら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，第４６巻，１１０１〜１１０６頁，１９９０年；Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ社，１９９１年）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら，「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈら（編），１８７〜２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ社，１９９５年）；Ｐｒｉｃｅ，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒら（編），６０〜８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ社，１９９５年）を参照されたい。
【００６４】
本発明の抗体分子、及び本発明で用いる抗体分子は、さらなる改変を含み得る。例えば、抗体は、グリコシル化、ＰＥＧ化、又はアルブミン若しくは非タンパク質性ポリマーに連結することができる。抗体分子は、免疫抱合体の形態であり得る。
【００６５】
本発明の抗体は、標識化し得る。用い得る標識は、放射性標識、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はビオチンなどの酵素標識を含む。
【００６６】
上記で注目した通り、本発明の抗体、及び本発明の方法で用いる抗体は、カテプシンＳのタンパク質分解作用を阻害しない。抗体分子がカテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害する能力は、任意の適切な方法を用いて調べることができる。例えば、抗体分子がカテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害する能力は、蛍光分析法を用いて調べることができる。こうしたアッセイでは、任意の適切な蛍光発生基質、例えば、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣを用いてよい。抗体分子が、カテプシンＳのタンパク質分解活性を著明量阻害する能力を有する場合、それは、該活性を阻害すると考えられる。例えば、一実施形態において、抗体分子によるタンパク質分解活性の阻害が、カテプシンＳのタンパク質分解作用を阻害することが知られる適切な対照抗体と比較して、１０％を超えない、例えば、２％を超えないなど、５％を超えない、例えば、０％など、１％未満であれば、該抗体は、該活性を阻害しないと考えられる。
【００６７】
抗体分子が血管新生を阻害する能力は、当技術分野で知られた任意の適切なアッセイを用いて調べることができる。当技術分野では、多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが知られる。これらは、マトリゲルプラグアッセイ及び角膜血管新生アッセイ、ｉｎ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ、並びに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞（増殖、移動、管形成）アッセイ及び臓器型（大動脈リング）アッセイ、ニワトリ大動脈弓アッセイ及びマトリゲルスポンジアッセイを含む。こうしたアッセイのさらなる詳細は、例えば、Ａｕｅｒｂａｃｈら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４９巻，３２〜４０頁，２００３年；１０．１３７３／４９．１．３２において見出し得る。さらなる詳細は、また、実施例においても提供される。
【００６８】
抗体分子が腫瘍細胞浸潤を阻害する能力は、当技術分野で知られた任意の適切な浸潤アッセイを用いて調べることができる。例えば、こうした能力は、実施例に記載の改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを用いて調べることができる。抗体分子は、任意の適切な腫瘍細胞株、例えば、前立腺癌細胞株、例えば、ＰＣ３、星状細胞腫の細胞株、例えば、Ｕ２５１ｍｇ、結腸直腸癌細胞株、例えば、ＨＣＴ１１６、又は乳癌細胞株、例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１若しくはＭＣＦ７を用いて調べることができる。抗体分子が、腫瘍細胞の浸潤を統計学的な有意量阻害する能力を有する場合、それは、浸潤を阻害すると考えられる。例えば、一実施形態において、抗体分子は、適切な対照抗体と比較して、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％浸潤を阻害することができる。
【００６９】
本発明の一実施形態において、本発明で用いる抗体分子は、抗体１Ｅ４の阻害効力の少なくとも２５％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０％の効力を有する阻害活性（例えば、血管新生を阻害する）を有し得る。
【００７０】
［ポリペプチド］
上述の通り、本発明者らは、１Ｅ４抗体が結合する結合領域を同定した。したがって、本発明は、配列番号１と少なくとも６０％の相同性、例えば、少なくとも７０％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも９０％の相同性、又は少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列からなる単離ポリペプチドまで拡張する。一実施形態において、該ポリペプチド配列は、配列番号１：
ＥＬＰＹＧＲＥＤＶＬＫＥＡＶＡＮＫＧＰＶＳＶＧＶＤＡＲＨＰ（配列番号１）
として示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド配列からなる。
【００７１】
したがって、本発明による変異ペプチドは、配列番号１として示した配列内において、単一のアミノ酸変化、又は２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、若しくは９カ所の変化、又は約１０カ所、１５カ所の変化を含み得る。示されたアミノ酸配列内における１つ又は複数の変化に加えて、変異ポリペプチドは、Ｃ末端及び／又はＮ末端において、さらなるアミノ酸を含み得る。
【００７２】
相同性（即ち、類似性又は同一性）は、ＦＡＳＴＡ及びＦＡＳＴＰ（Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，１９８８年，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８３巻，６３９８頁を参照されたい）を用いてなされる配列比較を用いて定義することができる。パラメータは、デフォルトのマトリックスを用いて、
Ｇａｐｏｐｅｎ（ギャップ内の最初の残基に対するペナルティ）：タンパク質に対して−１２／ＤＮＡに対して−１６
Ｇａｐｅｘｔ（ギャップ内のさらなる残基に対するペナルティ）：タンパク質に対して−２／ＤＮＡに対して−４
ＫＴＵＰワード長：タンパク質に対して２／ＤＮＡに対して６
のように設定することが好ましい。相同性は、ヌクレオチド配列のレベル及び／又はコードされたアミノ酸配列のレベルであり得る。
【００７３】
当然ながら、核酸変異体に関して、コードされたポリペプチドが異ならない（即ち、「縮重的に同等な」）核酸における変化は、本発明の範囲内に含まれる。
【００７４】
配列への変化は、コードされたポリペプチド中の１つ又は複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失、又は置換をもたらす、核酸における１つ又は複数のヌクレオチドの１つ又は複数の付加、挿入、欠失、又は置換によるものであり得る。変化は、保存的変異、即ち、イソロイシン、バリン、ロイシン、若しくはメチオニンなどの１つの疎水性残基の別の残基への置換、又はアルギニンのリシンへの、グルタミン酸のアスパラギン酸への、若しくは、グルタミンのアスパラギンヘのなど、１つの極性残基の別の残基への置換によるものであり得る。当業者によく知られる通り、保存的置換によりポリペプチドの一次構造を変化させると、該配列中に挿入されるアミノ酸側鎖が、置換されたアミノ酸側鎖と同様の結合及び接触を形成することができるので、該ペプチドの活性を大きく変え得ない。これは、置換が、ペプチドの立体構造を決定するのに重要となる領域にある場合にも当てはまる。
【００７５】
非保存的置換を有する変異体もまた含まれる。当業者によく知られる通り、その立体構造を決定するのに重要でないペプチド領域に対する置換は、ペプチドの三次元的構造を大きく変えないので、その活性に大きな影響を及ぼし得ない。
【００７６】
ペプチドの立体構造又は活性を決定するのに重要な領域において、こうした変化は、ポリペプチドに対して有利な特性を付与し得る。実際、上述の場合などの変化は、ペプチドに若干有利な特性、例えば、安定性又は特異性の改良を付与し得る。
【００７７】
［核酸］
本発明の核酸、及び本発明で用いる核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。それは、組換え的に、合成的に、又は標準的な技法を用いるクローニングを含む、当業者に用いられる任意の手段により産生することができる。
【００７８】
核酸は、任意の適切なベクター内に挿入してよい。本発明の核酸を含むベクターは、本発明のさらなる態様を形成する。一実施形態において、ベクターは、発現ベクターであり、核酸は、宿主細胞中で核酸の発現を与えることのできる制御配列に作動的に連結される。各種のベクターを用いてよい。例えば、適切なベクターは、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなど）、酵母ベクター、ファージ、染色体、人工染色体、プラスミド、又はコスミドＤＮＡを含み得る。
【００７９】
ベクターを用いて、本発明の核酸を宿主細胞内に導入し得る。多種多様な宿主細胞を、本発明の核酸の発現に用い得る。本発明で用いる適切な宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。これらは、細菌、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む。用い得る哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞、サル及びヒトの細胞株、並びにこれらの派生物、並びに他の多くの細胞を含む。
【００８０】
遺伝子産物の発現を調節する、遺伝子産物を修飾する、及び／又は遺伝子産物を特異的にプロセシングする宿主細胞株を用いてよい。こうしたプロセシングは、グリコシル化、ユビキチン化、ジスルフィド結合形成、及び一般的な翻訳後修飾を含み得る。
【００８１】
したがって、本発明は、また、本発明の１つ若しくは複数の核酸、又はベクターを含む宿主細胞も提供する。
【００８２】
また、本発明の抗体分子の産生法であって、核酸からの抗体分子の発現が生じる条件下において、本発明の核酸を含む宿主細胞を培養すること、場合によって、抗体分子を単離及び／又は精製することを含む方法も、本発明に包含される。
【００８３】
核酸の操作について、例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、シーケンシング、細胞内へのＤＮＡの導入及び遺伝子の発現、並びにタンパク質の解析における既知の技法及びプロトコールに関するさらなる詳細については、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第５版，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社，２００５年、及び、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社，２００１年を参照されたい。
【００８４】
［治療］
本発明の抗体分子及び核酸は、多数の医学的状態の治療に用いることができる。
「治療」とは、ヒト又は非ヒト動物に利益を与え得る任意のレジメンを含む。治療は、既存の状態に関することもあり、又は、予防的（予防的処置）でもあり得る。治療は、治癒効果、緩和効果、又は予防効果を含み得る。
【００８５】
本発明の抗体分子及び核酸は、各種の状態及び障害の治療で用い得る。これらは、アテローム性動脈硬化及び新生物性疾患、神経変性疾患、自己免疫疾患、癌、炎症性疾患、喘息、並びにアテローム性動脈硬化、並びに疼痛を含む。
【００８６】
本発明の抗体分子、核酸、及び方法を用いて治療し得る神経変性疾患は、アルツハイマー病、多発性硬化症、及びクロイツフェルト−ヤコブ病を含むがこれらに限定されない。
【００８７】
本発明を用い得る自己免疫疾患は、炎症性筋疾患及び関節リウマチを含む。
【００８８】
本発明の抗体分子、核酸、及び方法は、また、癌の治療にも用い得る。
【００８９】
「癌の治療」とは、癌性増殖及び／又は血管新生により引き起こされる状態の治療を含み、新生物性増殖又は腫瘍の治療を含む。本発明を用いて治療することのできる腫瘍の例は、例えば、骨肉腫及び軟部組織肉腫を含む肉腫、癌腫、例えば、乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝癌、子宮癌、前立腺癌、子宮頸癌及び卵巣癌、非小細胞性肺癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、黒色腫、骨髄腫、ウィルムス腫瘍、並びに、急性リンパ芽球性白血病及び急性骨髄芽球性白血病を含む白血病、星状細胞腫、神経膠腫、及び網膜芽細胞腫である。
【００９０】
本発明は、既存の癌の治療、及び、初回治療又は手術後における癌再発の予防において特に有用であり得る。
【００９１】
本発明の抗体分子、核酸、及び組成物は、血管新生を介して、又は血管新生と関連する他の障害の治療にも用い得る。こうした状態は、例えば、腫瘍、各種の自己免疫疾患、遺伝的障害、眼障害を含む。
【００９２】
本発明の方法及び抗体分子を用いて治療し得る、血管新生と関連する特定の眼障害は、角膜移植拒絶、外傷又は感染後の新血管形成、ルベオーシス、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症及び新血管性緑内障、角膜疾患及び黄斑変性を含む。
【００９３】
本発明の方法は、血管腫、固形腫瘍、白血病、転移癌（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、毛細血管拡張症、乾癬、強皮症、化膿性肉芽腫、心筋血管新生、クローン病、プラーク血管新生、冠動脈側枝、脳脈側枝、動静脈奇形、虚血性四肢血管新生、角膜疾患、水晶体後線維増殖症、関節炎、糖尿病性血管新生、消化性潰瘍、ヘリコバクター属関連疾患、骨折、ケロイド、及び脈管形成を含む、他の血管新生に媒介される障害を治療するのに用い得る。
治療し得る特定の障害、並びに、本発明の方法で用いる化合物及び組成物は、以下においてより詳細に説明される。
【００９４】
［血管新生により媒介される眼障害］
各種の眼障害は、血管新生により媒介され、本明細書に記載の方法を用いて治療し得る。血管新生により媒介される疾患の一例は、眼構造内への新血管の浸潤を特徴とし、失明の最も一般的な原因である、眼内新血管性疾患である。年齢に関連する黄斑変性では、網膜色素上皮の下の線維血管性組織の増殖を伴う、ブルッフ膜における欠損を介する、脈絡叢毛細血管の内部成長により、関連する視覚の問題が引き起こされる。年齢に関連する黄斑変性の最重症形態（「湿性」ＡＲＭＤとして知られる）では、網膜下で異常な血管新生が生じ、視覚の不可逆的な喪失をもたらす。視覚の喪失は、新規の血管からの出血に続発する網膜の瘢痕化による。「湿性」ＡＲＭＤに対する現行の治療は、レーザーに基づく療法を用いて、原因血管を破壊する。しかし、レーザーは上部網膜を永久に瘢痕化する場合があり、原因血管は再成長することが多いので、この治療は理想的ではない。黄斑変性に対する代替的な治療戦略は、新規の血管形成、又は黄体変性に由来する最も重症の視覚喪失を引き起こす血管新生を阻害する、血管新生阻害剤の使用である。
【００９５】
本発明を用い得る血管新生性損傷と関連する、又はこれにより引き起こされる他の状態は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶、新血管性緑内障及び水晶体後線維増殖症、角膜血管新生に関連した疾患で、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、アトピー性角膜炎、上部辺縁系角膜炎、翼状片乾性角膜炎、及び放射状角膜切除術による類天疱瘡（ｐｅｒｉｐｈｉｇｏｉｄ）を含むがこれらに限定されない疾患、網膜／脈絡叢血管新生と関連する疾患で、黄斑変性、推定近視、視窩、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、外傷及びレーザー照射後合併症を含むがこれらに限定されない疾患を含む。本発明を用いて治療し得る他の疾患は、ルベオーシス（隅角の新血管形成）と関連する疾患、血管結合組織又は線維性組織の異常な増殖により引き起こされる疾患で、増殖性硝子体網膜症のすべての形態、新血管性緑内障、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、ブドウ膜炎、及び角膜移植による新血管形成、他の眼炎症性疾患、眼腫瘍を含む疾患、及び、脈絡叢血管新生又は虹彩血管新生と関連する疾患を含むが、これらに限定されない。
【００９６】
［炎症］
本発明の抗体分子及び方法は、炎症の治療で用い得る。ＣａｔＳ活性を遮断することにより、抗体分子は、「炎症を起こした」細胞における適正な抗原提示を妨げ、これにより、炎症作用を弱め得る。
【００９７】
こうした実施形態において、抗体は、細胞内に取り込まれてリソソームに入ることが理想的である。したがって、当技術分野で一般的な標的化の方法を用いてよい。実施例に示す通り、ｐＨ結合実験により、本発明者らは、抗体が、ｐＨ４．９においても結合することを示したが、これは、該抗体が、リソソーム内で有効であり得ることを示唆する。
【００９８】
本発明の方法は、また、関節リウマチ及び変形性関節症など、各形態の関節炎を含む、血管新生と関連する炎症を治療するのにも用いることができる。
【００９９】
さらに、これらの方法では、本明細書に記載の化合物の、障害を治療するのに有用な他の作用薬との組合せによる治療もまた提供される。こうした作用薬は、例えば、当業者によく知られるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤を含む。
【０１００】
関節の滑膜表層における血管は、血管新生を受けることがある。内皮細胞は、新規の血管ネットワークを形成し、パンヌスの成長及び軟骨の破壊をもたらす因子及び反応性酸素種を放出する。これらの因子は、関節リウマチに能動的に寄与し、また、変形性関節症にも能動的に寄与すると考えられる。血管新生に関連する因子による軟骨細胞の活性化は、関節の破壊に寄与し、また、新規の骨形成も促進する。本明細書に記載の方法は、骨破壊及び新規の骨形成を予防するための治療的介入として用いることができる。
【０１０１】
病的血管新生は、また、慢性炎症にも伴うと考えられる。本明細書に記載の方法を用いて治療し得る障害の例は、潰瘍性大腸炎、クローン病、バルトネラ症、及びアテローム性動脈硬化を含む。
【０１０２】
［医薬組成物］
抗体分子及び核酸は、医薬組成物として投与してよい。本発明による医薬組成物、及び、本発明に従い用いる医薬組成物は、活性成分に加え、医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝液安定剤、又は当業者によく知られる他の物質（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２１版，Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲら編，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ社，２００５年を参照されたい）を含み得る。こうした物質は、酢酸、トリス、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；抗酸化剤；防腐剤；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸；炭水化物；キレート化剤；等張化剤；及び界面活性剤を含み得る。
【０１０３】
医薬組成物は、また、本発明の抗体分子、核酸、又は組成物の活性に有害な影響を及ぼさない相補的な活性を好ましくは有する、治療される特定の徴候に対して、必要により選択される、１つ又は複数の活性化合物もさらに含有し得る。例えば、癌の治療において、本発明の抗ＣａｔＳ抗体分子に加え、製剤は、ＣａｔＳ上の異なるエピトープに結合するさらなる抗体、若しくは、例えば、特定の癌の増殖に影響を及ぼす増殖因子などの他の標的に対する抗体、及び／又は化学療法剤を含み得る。
【０１０４】
例えば、一実施形態において、本発明の特異的結合剤と、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を阻害する作用薬とを用いる併用療法を用いてよい。
【０１０５】
適切ならば、本発明の特異的結合剤と、ＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦβ、トロンビン、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦＲキナーゼ、線維芽細胞増殖因子、チューブリン、ＶＥＧＦ−Ａ、又は胎盤成長因子を阻害する作用薬とを用いる併用療法を用いてよい。
【０１０６】
特定の実施形態では、少なくとも、本発明の抗体分子と、２つ、３つ、又はそれ以上の作用薬との組み合わせを含む併用療法を用いてよい。
【０１０７】
特定の実施形態において、本発明の抗体分子と、Ｅｖｉｚｏｎ（商標）、ＰＴＫ７８７、Ｒｅｔａａｎｅ（商標）、ＡＧ−１３９５８、ＣＡＮＤ５、Ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ（商標）、又はＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ（商標）から選択される作用薬とを用いる併用療法を用いてよい。
【０１０８】
少なくとも２つの異なる経路又は機構を標的とする併用療法を用いることにより、有効性の改善、例えば、相乗効果を得ることができる。
【０１０９】
活性成分（例えば、抗体分子及び／又は化学療法剤）は、マイクロスフェア、マイクロカプセルリポソーム、他の微粒子送達システムを介して投与し得る。例えば、活性成分は、例えば、コアセルベーション法又は界面重合法により調製し得るマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンミクロカプセル、及びポリ−（メチルメタシレート）ミクロカプセル内に、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルジョン中に封入し得る。さらなる詳細については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２１版，Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲら編，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５年を参照されたい。
【０１１０】
活性作用薬の送達には、徐放製剤を用いてよい。徐放製剤の適切な例は、フィルム、坐薬、又はマイクロカプセルなど、成型品の形態である、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーによる半透性マトリックスを含む。徐放マトリックスの例は、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌグルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。
【０１１１】
上述の通り、治療法には、本発明の核酸もまた用いてよい。本発明の核酸は、当技術分野で知られる任意の適切な技法を用いて、対象細胞に送達し得る。核酸（場合によって、ベクター内に含有される）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの技法を用いて、患者の細胞に送達し得る。Ｉｎ  ｖｉｖｏ技法の場合、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルスなど）及び脂質ベースのシステム（遺伝子の脂質を介する導入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌ）によるトランスフェクションを用い得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２５６巻，８０８〜８１３頁，１９９２年を参照されたい。また、国際公開第９３／２５６７３号パンフレットも参照されたい）。
【０１１２】
ｅｘ  ｖｉｖｏ技法の場合、核酸は、直接に、又は例えば、患者に植え込まれる多孔質膜内に封入されて（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号明細書及び同第５，２８３，１８７号明細書を参照されたい）患者に投与される改変細胞により、患者の単離された細胞内に導入される。生細胞内に核酸を導入するのに用いられる技法は、レトロウイルスベクター、リポソーム、電気穿孔法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含み得る。
【０１１３】
抗体分子、作用薬、生成物、又は組成物は、腫瘍部位又は他の所望の部位に局所的な形で投与してもよく、又は、それが腫瘍又は他の細胞を標的とする形で送達してもよい。抗体又は細胞特異的リガンドなどの標的化システムの使用による標的化療法を用いて、活性作用薬をより特異的に特定の種類の細胞に送達することができる。標的化は、様々な理由、例えば、作用薬が許容できないほどに毒性である場合、又は別の方法では極めて高用量を要する場合、又は別の方法では標的細胞に侵入できない場合のために望ましいことがある。
【０１１４】
［用量］
本発明の抗体分子、核酸、又は組成物は、「治療的な有効量」で個体に投与することが好ましく、これは、個体に対する利益を示すのに十分である。実際の投与レジメンは、治療される状態、その重症度、治療される患者、用いられる作用薬を含む多数の因子に依存し、医師の裁量下にある。
【０１１５】
最適用量は、例えば、年齢、性、体重、治療される状態の重症度、投与される活性成分、及び投与経路を含む多数のパラメータに基づき、医師により決定され得る。
【０１１６】
大まかな指針として、抗体用量は、対患者体重比で１ｎｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの量で与えられうる。
【０１１７】
［アッセイ］
本発明の抗体分子をさらに診断的アッセイで用いて、生物試料中のカテプシン又はカテプシンＳを発現する細胞の存在を判定することができる。したがって、本発明はさらに、診断方法における本発明の抗体分子の使用まで拡張する。
【０１１８】
一実施形態において、本発明は、生物試料中における、カテプシンＳを発現する細胞の存在を判定する方法であって、生物試料を本発明の抗体分子と接触させること、及び抗体分子と生物試料の結合を判定することを含み、対照と比較した、抗体分子と生物試料の結合が、カテプシンＳの存在を示す方法を提供する。
【０１１９】
抗体分子は、また、カテプシンＳの発現又は活性と関連する各種の状態及び障害の診断においても用いることができる。こうした方法が、本発明の別の態様を形成する。
【０１２０】
一実施形態において、本発明は、対象におけるカテプシンＳに関連する状態又は疾患、例えば、癌を検出するアッセイ方法であって、
（ａ）対象由来の生物試料を提供すること、
（ｂ）生物試料を本発明の抗体分子と接触させること、
（ｂ）抗体と生物試料の結合レベルを決定すること、
を含み、対照試料と比較した、抗体と生物試料の結合レベルの上昇が、前記疾患の存在を示す、アッセイ方法を提供する。
【０１２１】
本発明を用いて、例えば、異なる時点における生検試料を用いて、疾患の進行をモニターし得る。こうした実施形態では、カテプシンＳの発現を、例えば、カテプシンＳの発現を増強していないことが知られている異なる組織由来の対照試料と比較する代わりに、カテプシンＳの発現を、より早期の時点、例えば、数日間、数週間、又は数カ月間早期における同じ組織から得られる生物試料と比較する。
【０１２２】
本発明では、任意の適切な生物試料を用いてよく、疾患又は状態の性質が、本発明の方法で用いるべき試料の性質を決定し得る。試料は、例えば、腫瘍組織生検、骨髄生検、又は例えば、血液中を循環する細胞由来の試料であり得る。或いは、例えば、該方法を消化器腫瘍の診断又はモニタリングに用いる場合、腫瘍細胞は糞便試料から単離してよい。生物試料の他の源泉は、血漿、血清、脳脊髄液、尿、間質液、腹水などを含み得る。
【０１２３】
例えば、固形腫瘍の試料は、抗生物質を伴う完全組織培養培地において採取され得る。細胞は、腫瘍標本から手作業ではがしてもよく、必要な場合は、コラゲナーゼ／ＤＮＡアーゼとのインキュベーションにより酵素的に脱凝集させ、例えば、ヒト血清又は動物血清を含有する適切な培地中に懸濁させてもよい。
【０１２４】
他の実施形態では、生検試料を単離し凍結するか、又はホルマリンなどの固定剤中で固定してよい。次いで、試料は、後の段階で遺伝子発現レベルについて調べることができる。
【０１２５】
本発明はさらに、カテプシンＳの検出に用いる診断用キットまで拡張する。したがって、一実施形態において、本発明は、カテプシンＳの存在の診断用キットであって、本発明の１つ若しくは複数の抗体分子、又は本発明の１つ若しくは複数のポリペプチドを含むキットへと拡張される。
【０１２６】
任意の適切なアッセイ法及びキットを用いてよい。これらは、ＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学法、電子顕微鏡法、ラテックス凝集法、ラテラルフローイムノアッセイ法、免疫ブロット法、及びディップスティック免疫検査法を含むがこれらに限定されない。
【０１２７】
本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例においてさらに説明される。以下の付随的な図面が参照される。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１ａ】図１は、媒体のみの対照、アイソタイプ対照、抗カテプシンＳ抗体（ｍＡｂ１）、又は抗カテプシンＳ抗体（ｍＡｂ２）中で培養したＨＭＥＣ細胞の写真である。
【図１ｂ】図１ｂは、１Ｅ１１（上パネル）又は１Ｅ４（下パネル）の存在下において観察された毛細血管細胞分岐の阻害を示すグラフである。
【図２ａ】図２ａは、対照抗体及び６０、３００、及び６００ｎＭの濃度における抗カテプシンＳ抗体１Ｅ１１の存在下において培養した大動脈切片の写真である。
【図２ｂ】図２ｂは、（上左）図２ａに示した血管長に対する抗体の効果をまとめるグラフである。図２ｂは、（上右）図２ａに示した血管数に対する抗体の効果をまとめるグラフである。図２ｂは、（下）図２ａに示した最大血管長に対する抗体の効果をまとめるグラフである。
【図３ａ（１）】図３ａは、対照抗体、並びに、１ｕｇ／ｍｌ、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、及び１００ｕｇ／ｍｌ、１ｕｇ／ｍｌの濃度における抗カテプシンＳ抗体ＩＥ１１の存在下で培養した大動脈切片の写真である。
【図３ａ（２）】図３ａは、対照抗体、並びに、１ｕｇ／ｍｌ、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、及び１００ｕｇ／ｍｌ、１ｕｇ／ｍｌの濃度における抗カテプシンＳ抗体ＩＥ１１の存在下で培養した大動脈切片の写真である。
【図３ｂ】図３ｂは、血管数、平均血管長、及び最大血管長に対する、図３ａに示した実験における抗体の効果をまとめるグラフである。
【図４】図４は、ＣａｔＳ  １Ｅ１１又は１Ｅ４で処置した場合のＨＣＴ１１６腫瘍浸潤の減弱を示す、浸潤アッセイの結果を示す。
【図５】図５は、対照で処置したＨＣＴ１１６腫瘍のＣＤ３４染色を示す。
【図６】図６は、ＣａｔＳ  １Ｅ１１で処置したＨＣＴ１１６腫瘍に対するＣＤ３４染色を示す。
【図７】図７は、白血病細胞株（ＨＥＬ、ＮＢ４、及びＵ９３７）中におけるＣａｔＳ  ＲＮＡ発現の解析を示す。４０サイクルのＰＣＲ後にＲＮＡレベルを解析して、標的発現を決定した。
【図８】図８は、白血病細胞株（ＨＥＬ、ＮＢ４、及びＵ９３７）中におけるＣａｔＳ発現のウェスタンブロット解析を示す。１Ｅ４抗ＣａｔＳを用いて、全細胞溶解物中において、タンパク質レベルを解析した。
【０１２９】
［方法］
［毛細血管様の管形成アッセイ］
内皮細胞による管形成に対するＣａｔＳ  ｍＡｂの効果を、以下の通りに評価した。あらかじめ冷却した４８ウェルプレートに、２００マイクロリットルのマトリゲル（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、４℃で１０分間にわたりインキュベートし、次いで、３７℃で１時間にわたり重合化させた。細胞を、２００ｎＭの適切な抗体を含有する、内皮増殖細胞培地ＭＶ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社製）中に懸濁させた。各ウェルに５００マイクロリットル（１×１０５細胞）を添加した。対照として、適量のＰＢＳを含有する媒体のみの対照培地と共に、細胞をインキュベートした。３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間にわたるインキュベーション後、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００型顕微鏡を用いて、細胞を観察した。
【０１３０】
［細胞の生存率アッセイ及び増殖アッセイ］
Ｕ２５１ｍｇ星状細胞腫細胞に対する、ＣａｔＳモノクローナル抗体の細胞毒性効果及び増殖効果は、既述の通りに調べることができる。略述すると、９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ社製）にウェル当たり１×１０４細胞／２００μｌの最終濃度で細胞を添加する。適切な濃度のモノクローナル抗体（１００ｎＭ）又は媒体のみの対照培地を添加する。３７℃及び５％ＣＯ２で、それぞれ、２４、４８、７２、及び９６時間にわたり、プレートをインキュベートする。インキュベーション後、１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴを添加し、３７℃及び５％ＣＯ２でさらに２時間にわたりインキュベートする。培地を注意深く除去し、１００μｌ／ウェルのＤＭＳＯ中にホルマザン結晶を溶解する。上記の通りに吸光度を測定し、結果は、各媒体のみの対照と比較した細胞の生存百分率及び増殖百分率として表す。すべての試験は、４回ずつ実施する。
【０１３１】
［創傷アッセイ］
これらの研究で用いられる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ移動アッセイは、Ａｓｈｔｏｎら（１９９９）により説明された方法の改変バージョンである。スライドガラス上の各チャンバー内にＨＭＥＣ−１を播種し、一晩にわたり９０％コンフルエンスまで増殖させる。培地を除去し、単層を創傷させる。単層に新鮮な培地を再補充し、必要量の抗体を添加して、必要な最終濃度を得る。
【０１３２】
完全な創傷の閉鎖まで、固定した時点においてスライドを除去し、次いで、４％ＰＢＳで緩衝したパラホルムアルデヒド中で固定する。「創傷」閉鎖の程度は、別個の研究者により盲検的に顕微鏡評価し、２０倍の拡大率における較正済み目盛（１ｍｍ／１００μｍ目盛）つき接眼レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、ＢＸ５０型）を用いて数値化する。抗体で処置したスライドにおける閉鎖の程度を、時間を合わせた擬似処置対照と比較し、時間を合わせた対照と比較した創傷閉鎖の阻害百分率を計算する。
【０１３３】
［ラット大動脈モデル］
雄のウィスターラットを安楽死させ、胸部大動脈を無菌的に除去し、１ｃｍ厚のリングに切片化する。無菌培地でリングを１０回洗浄して細菌を除去し、２４ウェルプレート上のマトリゲル内に埋め込む。ウェルに２ｍｌの培地と、濃度を上昇させた抗体とを補充する。プレートを８日間にわたりインキュベートし、インキュベーション後、マトリゲル及びリングを４％ＰＢＳで緩衝したパラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中に保管する。血管発生の程度は、別個の研究者により盲検的に顕微鏡評価し、２０倍の拡大率における較正済み目盛（１ｍｍ／１００μｍ目盛）つき接眼レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、ＢＸ５０型）を用いて数値化する。各視野における血管長、最大血管長、及び血管数の程度を測定し、時間を合わせた擬似対照と比較し、阻害百分率を計算する。
【０１３４】
［ＰＣＲ法］
ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｄ  ２サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。ＲＮＡは、製造元の指示書に従い、ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０試薬（米国、フレンズウッド、Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ社製）を用いて白血病細胞ペレットから採取し、１ｕｇのＲＮＡ及び逆転写キット（英国、ペイズリー、ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＲＴ−ＰＣＲ法に用いたプライマーセットは、ＣａｔＳ順方向プライマー５’−ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＧＴＧ  ＡＡＴ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  Ｇ−３’及びＣａｔＳ逆方向プライマー５’−ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＣＣＡ  ＴＣＣ  ＧＡＡ  ＴＡＴ  ＡＴＣ  Ｃ−３’であった。遺伝子発現は、２５ｕ１  Ｂｉｏｍｉｘを含有するｂｉｏｍｉｘ  ＰＣＲ混合液（英国、Ｂｉｏｌｉｎｅ社製）、１．５μｌの順方向プライマー、１．５μｌの逆方向プライマー、２μｌのｃＤＮＡ、２０μｌのｄＨ２Ｏを用いて解析した。ＰＣＲ法の条件は、９５℃で１０分間のイニシャル変性ステップ、その後９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で９０秒間の４０サイクルからなり、最後に７２℃で１０分間にわたり伸長を行った。５μｌの増幅産物を、１．５％アガロースゲル（０．００１％臭化エチジウム）にロードし、これを、ＵＶボックスでの解析前に、９０Ｖで４０分間にわたり泳動した。
【０１３５】
［ウェスタンブロット法］
細胞は、ＰＢＳ中で洗浄（１５００ｒｐｍで５分間にわたる遠心分離）した後、既述のプロテアーゼ阻害剤カクテル（英国、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を含有するＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。全細胞溶解物を、等濃度で１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードした。ゲルは、５０Ｖで一晩にわたり泳動した後、２０Ｖで４５分間にわたるニトロセルロース膜へセミドライ法により転写した（英国、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）。ニトロセルロース膜は、ＰＢＳ（３％ミルク粉末）中で〜１時間にわたりブロックし、ＰＢＳ（０．０１％Ｔｗｅｅｎ）で５分間ずつ３回にわたり洗浄した。次いで、膜を、ＰＢＳ（３％ミルク粉末）中で１：２００に希釈したＣａｔＳ  Ｍａｂ  １Ｅ４により、１時間にわたりプローブした。ＰＢＳ（０．０１％Ｔｗｅｅｎ）で１０分間ずつ３回にわたり膜を洗浄した後、ＰＢＳ（３％ミルク粉末）中で１：５０００に希釈したヤギ抗マウス−ＨＲＰ抱合二次抗体（英国、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を添加して１時間置いた。次いで、これを、ＰＢＳ（０．０１％Ｔｗｅｅｎ）中で各回１０分間ずつ３回にわたり洗浄した。膜を、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌキット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いてＥＣＬ（化学発光増強）法により「発光」させた。膜は、ＥＣＬ溶液中で５分間にわたりインキュベートした後、ｋｏｄａｋ  Ｇｅｌ  ｌｏｇｉｃ  １５００型イメージングシステム（Ｋｏｄａｋ社製）を用いて解析した。
【０１３６】
［免疫組織化学法］
既述の通りに、ホルマリンで固定した異種移植組織試料のパラフィン包埋を実施した。アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ法（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅキット）を用いて、免疫染色を実施した。
【０１３７】
略述すると、切片を、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒからアルコール、さらに流水へと通すことにより脱パラフィン処理した。次いで、切片を、クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０中で２２分間にわたり煮沸した。Ｈ２０２の３％メタノール溶液中での１３分間にわたるインキュベーションにより、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。１０％正常ウサギ血清ブロッキング溶液中におけるインキュベーションを、室温で１時間にわたり実施した。切片は、２ｕｇ／ｍｌの濃度のラット抗ヒトＣＤ３４一次抗体（Ａｂｃａｍ社製）と共に、４℃で一晩にわたりインキュベートした。適切なアイソタイプ対照を、一次抗体と同じ希釈率で用いた。
【０１３８】
ペルオキシダーゼ染色用に、切片を、ビオチン化したウサギ抗ラット二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）により、室温で３０分間にわたりインキュベートした後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）とともに、室温でさらに３０分間にわたるインキュベーションを行った。可視化のために、切片は、３，３’−ジアミノベンジジンで染色し、Ｇｉｌｌ’ｓ  ＩＩヘマトキシリン溶液により対染色した。切片は、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ型カメラを用いて解析した。
【０１３９】
［浸潤アッセイ］
１２μｍ孔の膜を伴う改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの浸潤アッセイを実施した。マトリゲル（１００μｇ／ｃｍ２）で膜の上面をコートし、層流フード内で一晩にわたり乾燥させた。所定の濃度の適切な抗体及び組換えタンパク質の存在下において、細胞を添加した（５００μｌの無血清培地中に５×１０５個の細胞）。下チャンバーに新鮮な完全培地を添加し（１．５ｍｌ）、上記の対応するウェルに加えたように同濃度の抗体又は組換えタンパク質を補充した。すべてのアッセイはトリプリケートで実施し、浸潤プレートは、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間にわたりインキュベートした。
【０１４０】
綿棒を用いるワイピングにより、膜の上面に残存する細胞を除去し、浸潤貫通していた細胞を、カルノワ固定液中で１５分間にわたり固定した。乾燥後、浸潤細胞の核を、ＰＢＳ中のヘキスト３３２５８（５０ｎｇ／ｍｌ）により、室温で３０分間にわたり染色した。チャンバーインサートをＰＢＳ中で２回洗浄し、ＰｅｒｍａＦｌｕｏｒ封入剤で封入し、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００型蛍光顕微鏡で浸潤細胞を観察した。Ｎｉｋｏｎ  ＤＸＭ１２００型デジタルカメラを用いて、２０倍の拡大率で、トリプリケートの膜のそれぞれから代表的視野のデジタル画像１０枚ずつを撮影した。結果は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＩｍａｇｉｎｇによりＬｕｃｉａ  ＧＦ  ４．６０を用いて解析し、対照と比較した浸潤細胞百分率として表した。
【０１４１】
［結果と考察］
［実施例１．ＣａｔＳ抗体はヒト内皮細胞中において管様形成を阻害し得る］
（Ｇｒａｎｔ  ＤＳ，Ｔａｓｈｉｒｏ  Ｋ，Ｓｅｇｕｉ−Ｒｅａｌ  Ｂ，Ｙａｍａｄａ  Ｙ，Ｍａｒｔｉｎ  ＧＲ，Ｋｌｅｉｎｍａｎ  ＨＫ，「Ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」，Ｃｅｌｌ，１９８９年９月８日，第５８巻，第５号，９３３〜９４３頁）により説明されるマトリゲル形態発生アッセイを用い、内皮細胞に、個々の細胞から拡張して隣接する内皮細胞との接触を形成する浸潤性出芽を伴う、管様構造を形成することを可能とする、マトリゲル上で培養されたヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣｓ）による毛細血管形成アッセイを実施した。図１ａは、２つのＣａｔＳ抗体（１Ｅ１１及び１Ｅ４）又はアイソタイプ対照の存在下でＨＭＥＣ細胞を培養したときの結果を示す。媒体のみの対照パネル及びアイソタイプ対照抗体（２００ｎＭ）パネル中では、広範な管様構造が明らかであるが、この管形成は、１Ｅ１１又は１Ｅ４抗体（２００ｎＭ）の存在下では、ほぼ完全に除去される。次いで、これらの結果は、図１ｂに示す通りに数値化された。
【０１４２】
両抗体共に、他のカテプシン、特に、ＣａｔＳに対する最大の相同性を有するカテプシンとの交差反応性なしに、ＣａｔＳに対して特異的に結合することが既に示されている。抗体１Ｅ１１及び１Ｅ４は、共に、ＣａｔＳの触媒活性を阻害する能力について特徴付けられており、１Ｅ１１がＣａｔＳ活性を特異的に阻害し得るのに対し、１Ｅ４は、識別可能な効果を有さない。したがって、毛細血管アッセイからの結果は、阻害性ＣａｔＳ  ｍＡｂ又は非阻害性ＣａｔＳ  ｍＡｂいずれかにより、内皮細胞から分泌される活性ＣａｔＳを隔離すれば、内皮細胞の管様構造への移動及び編成を防止するのに十分であることを示唆する。
【０１４３】
［実施例２．ＣａｔＳ抗体はラット大動脈弓ｅｘ  ｖｉｖｏモデルにおいて管様形成を阻害し得る］
血管新生におけるＣａｔＳの役割をさらに評価するため、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるラット大動脈弓アッセイを実施した。阻害性抗体及び適切な対照の存在下におけるマトリゲルの薄層内で、大動脈切片（１ｍｍ）を培養した。大動脈からの管様血管の形成をモニターし、７日後に、対照と比較した血管数、平均血管長、及び最大血管長の減少を測定することにより数値化した。
【０１４４】
図２は、ＣａｔＳ  １Ｅ１１抗体の存在下における管形成の著明な阻害を示す。図２ｂにまとめた結果と共に、図２ａにリングセグメントの写真を示す。最大６００ｎＭの１Ｅ１１を伴う、ラット大動脈リングセグメントのインキュベーションは、総血管数、平均血管長、及び最大血管長の８０％を超える減少をもたらした（図２ｂ）。
【０１４５】
図３は、ＣａｔＳ  １Ｅ１１抗体存在下での反復実験における管形成の著明な阻害を示す。図３ｃにまとめた結果と共に、図３ａ及び３ｂにリングセグメントの写真を示す。最大１０μｇ／ｍｌの１Ｅ１１を伴う、ラット大動脈リングセグメントのインキュベーションにより、総血管数が７０％減少し、平均血管長も最大血管長も６０％減少した。
【０１４６】
［実施例３］
腫瘍浸潤に対するＣａｔＳ抗体の効果を調査するため、ＨＣＴ１１６細胞を用いて、前記の通りに浸潤アッセイを実施した。図４に結果を示す。見られる通り、ＣａｔＳ  １Ｅ１１抗体により処置したＨＣＴ１１６細胞、及び１Ｅ４  ＣａｔＳ抗体により処置したＨＣＴ１１６細胞では、腫瘍浸潤が著明に減弱された。
【０１４７】
［実施例４  ＣａｔＳ抗体により処置したＨＣＴ１１６腫瘍血管系に対する処置効果］
ＣＤ３４を用いてＣａｔＳ  １Ｅ１１で処置したＨＣＴ１１６腫瘍を染色し、対照抗体で処置したＨＣＴ１１６腫瘍と比較することにより、ＣａｔＳ抗体により処置したＨＣＴ１１６腫瘍血管系に対する処置効果を調査した。図５及び図６に結果を示す。図５から見られる通り、対照の処置腫瘍では、腫瘍の縁辺部における血管系が明らかに注目された（Ａ〜Ｃ（４倍））。大多数の小型で機能的に制約された血管が存在し、いくつかの大型の血管も判定された（Ｄ〜Ｅ（２０倍））。しかし、図６に示す通り、ＣａｔＳ  １Ｅ１１で処置したＨＣＴ１１６腫瘍では、腫瘍縁辺部における血管系が大幅に減少し（Ａ〜Ｃ（４倍））、対照の処置腫瘍と比較して、存在する血管数が少なかった。
【０１４８】
［実施例５  ＣａｔＳ  １Ｅ４は白血病細胞株由来のＣａｔＳに結合する］
３つの異なる白血病細胞株及び陽性対照からＣａｔＳ  ＲＮＡを増幅した。４０サイクルのＰＣＲ後に、ＲＮＡレベルを解析し、標的発現を決定した。図７から見られる通り、ＣａｔＳ  ＲＮＡは、３つの白血病細胞系の各々により発現された。
【０１４９】
さらに、１ＥＡ抗体を用いて、３つの白血病細胞株の全細胞溶解物に対してウェスタンブロット法を実施した。図８に示す通り、ＣａｔＳ  １Ｅ４がＣａｔＳタンパク質に結合することは、これを白血病細胞中のＣａｔＳを標的化するのに用い得ることを示す。
【０１５０】
［実施例６  １Ｅ４抗体が特異的に結合するカテプシンＳ結合領域の同定］
ＣａｔＳ特異的プライマーは、５’側Ｔ７プロモーター領域及び５’側又は３’側いずれかのヘキサヒスチジンタグを含有するようデザインされた。アガロース電気泳動法による解析の前に、標準的な条件でこれらのプライマーを用いて、ＣａｔＳ  ＣＤＳの複数の異なる領域を増幅した。次いで、小麦胚芽無細胞溶解物の５０μｌアリコート（Ｒｏｃｈｅ社製、Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）に未精製の原ＰＣＲ産物を添加し、室温で一晩にわたりインキュベートした。次いで、標準的な技法を用いて、これらのタンパク質溶解物を電気泳動し、ウェスタンブロット法にかけた。
【０１５１】
ＰＢＳ中に３％のミルク粉末、ｐＨ７．４（ｗ／ｖ）によるブロッキング後、ＣａｔＳ抗体（ＰＢＳ中１：２００の希釈率）を、４℃で一晩にわたりインキュベートした。ブロットに対するＣａｔＳ抗体の特異的な結合は、洗浄、及び、標準的なプロトコールに従う、化学発光法による抗マウス二次抗体−ＨＲＰ抱合体を用いる検出により可視化した。発現したタンパク質の検証は、抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体−ＨＲＰ抱合体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いるこれらのブロットの再プロービングにより行った。
【０１５２】
複数の試料のいずれにＣａｔＳ抗体が結合するかを判定することにより、結合領域は、配列番号１：
ＥＬＰＹＧＲＥＤＶＬＫＥＡＶＡＮＫＧＰＶＳＶＧＶＤＡＲＨＰ
として示されるアミノ酸配列を有するものとして同定された。
【０１５３】
本明細書において参照されるすべての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の説明された実施形態に対する各種の変更及び改変は、本発明の範囲及び精神から逸脱しない限りにおいて、当業者には自明であろう。本発明を、特定の好ましい実施形態との関係で説明してきたが、特許請求に係る発明は、こうした特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、本発明を実施する説明された様態の、当業者には明らかな各種の変更は、本発明によって包含されるものとする。
【図１ａ】
2010505935.tif 000002
【図１ｂ】
2010505935.tif 000003
【図２ａ】
2010505935.tif 000004
【図２ｂ】
2010505935.tif 000005
【図３ａ（１）】
2010505935.tif 000006
【図３ａ（２）】
2010505935.tif 000007
【図３ｂ】
2010505935.tif 000008
【図４】
2010505935.tif 000009
【図５（Ａ）】
2010505935.tif 000010
【図５（Ｂ）】
2010505935.tif 000011
【図５（Ｃ）】
2010505935.tif 000012
【図５（Ｄ）】
2010505935.tif 000013
【図５（Ｅ）】
2010505935.tif 000014
【図５（Ｆ）】
2010505935.tif 000015
【図６（Ａ）】
2010505935.tif 000016
【図６（Ｂ）】
2010505935.tif 000017
【図６（Ｃ）】
2010505935.tif 000018
【図６（Ｄ）】
2010505935.tif 000019
【図６（Ｅ）】
2010505935.tif 000020
【図６（Ｆ）】
2010505935.tif 000021
【図７】
2010505935.tif 000022
【図８】
2010505935.tif 000023
【配列表】
2010505935000001.app
【国際調査報告】
2010505935.tif 000024
2010505935.tif 000025
2010505935.tif 000026
2010505935.tif 000027