(57)【要約】  ＲＮＡの二次構造を実質的に除去する重硫酸塩などの作用物質でＲＮＡを処理することと、処理したＲＮＡの存在または量を測定して遺伝子発現の指標を得ることとを含む遺伝子発現のアッセイ。本発明は、そのアッセイにおけるオリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＩＮＡプローブの使用も含む。
2010521142.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡをＲＮＡの二次構造を実質的に除去する作用物質で処理することと、
処理したＲＮＡの存在または量を測定して遺伝子発現の指標を得ることと
を含む遺伝子発現のアッセイ。
【請求項２】
オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＩＮＡプローブを使用して前記ＲＮＡを測定する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記プローブが塩基Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）およびＣ（シトシン）を実質的に含む、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記プローブがＩＮＡプローブである、請求項２または３に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１から４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記ＲＮＡが動物、植物、微生物、細胞、細胞群または細胞集団由来である、請求項１から４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記微生物がウイルスまたは細菌である、請求項６に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記作用物質が、亜硫酸水素塩、ヒドロキシルアミン、酢酸塩またはクエン酸塩から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記作用物質が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項１０】
ＲＮＡの二次構造を実質的に除去する作用物質でＲＮＡを処理することと、
ＲＮＡの相補配列と結合することができるプライマーを使用してＲＮＡを逆転写および増幅することと、
処理および増幅したＲＮＡの存在または量を測定して遺伝子発現の指標を得ることと
を含む遺伝子発現のアッセイ。
【請求項１１】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１０に記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記ＲＮＡが動物、植物、微生物、細胞、細胞群または細胞集団由来である、請求項１１に記載のアッセイ。
【請求項１３】
前記微生物がウイルスまたは細菌である、請求項１２に記載のアッセイ。
【請求項１４】
前記作用物質が、亜硫酸水素塩、ヒドロキシルアミン、酢酸塩またはクエン酸塩から選択される、請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項１５】
前記作用物質が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１６】
ＲＮＡの二次構造を実質的に除去する作用物質を用いる遺伝子発現のアッセイにおけるオリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＩＮＡプローブの使用。
【請求項１７】
前記プローブが塩基Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）およびＣ（シトシン）を実質的に含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記プローブがＧ（グアニン）を実質的に含まない、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記作用物質が、亜硫酸水素塩、ヒドロキシルアミン、酢酸塩またはクエン酸塩から選択される、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記作用物質が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡへのＲＮＡの転換を必ずしも必要としない遺伝子発現のアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
チップを使用するマイクロアレイ発現プロファイリング（Schena et al、1995、Science270:467-470;Chee et al、1996、Science274:610-614）などの細胞集団中のＲＮＡ産出量の測定によって、または遺伝子発現の連続分析ＳＡＧＥ（Velculescu et al、1995、Science270:484-487）によって、または全遺伝子発現分析ＴＯＧＡ（Sutcliffe et al、2000、Proc NatlAcad Sci USA97:1976-1981）によって、またはランダムに並んだ位置特定可能な高密度光学センサーアレイ（Michael et al、1998、Anal Chem70:1242-1248）によって、またはマイクロビーズアレイ上での超並列シグネチャー配列決定ＭＰＳＳ（Brenner et al、2000、Nature Biotechnology18:630-634）によって遺伝子発現を推測するための現在使用されている方法は、遺伝子発現の真の程度または量に関する正確な情報を必ずしも与えることができるわけではない。使用されている方法の多くは、まず対応するｃＤＮＡ分子へのＲＮＡの逆転写仲介転換、次いでｃＤＮＡ集団の増幅および標識を必要とするので間接的である。良くて、このような現在の方法は遺伝子発現の指標のみをもたらすが、対象の特定遺伝子の発現の正確な測定値はもたらさない。
【０００３】
これらの難点は今や非常に明らかである。例えば、ＳＡＧＥ技術（Stollberg et al、2000、Genome Research10:1241-1248）、チップ（Chudin et al、2001、Gene Biology3:0005.1-0005.10;Kothapalli et al、2002、BMC Bioinformatics3:1-10;Workman et al、2002、Genome Biology3:0048.1-0048.16）における偏り（bias）が記載されている。より一般的に、現在の方法における問題点が記載されている（Martin and Pardee、2000、Proc Natl Acad Sci USA 97:3789-3791;Wang et al、2000、Proc Natl Acad Sci USA97:4162-4167）。
【０００４】
以前の変性ＲＮＡ分子に自然かつ迅速に形成する安定した二次構造のために、適切な特異的プローブとの直接的なハイブリダイゼーションによってＲＮＡをアッセイすることは困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は現在、生物、細胞集団または組織サンプル中の遺伝子発現のより正確な推測を与えることができる改善されたアッセイを開発した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第一の態様において、本発明は、
（ａ）ＲＮＡの二次構造を実質的に除去する作用物質でＲＮＡを処理することと、
（ｂ）処理したＲＮＡの存在または量を測定して遺伝子発現の指標を得ることと
を含む遺伝子発現のアッセイを提供する。
【０００７】
第二の態様において、本発明は、遺伝子発現を推測または測定するアッセイにおける、ＲＮＡの二次構造を実質的に除去しＲＮＡを安定化させる作用物質の使用を提供する。
【０００８】
第三の態様において、本発明は、ＲＮＡ検出により遺伝子発現をアッセイするための、選択した化学組成を有するプローブの使用を提供する。
【０００９】
プローブは塩基Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）およびＣ（シトシン）から実質的に構成され、相当量のＧ（グアニン）は含まないことが好ましい。プローブは、Ｇ（グアニン）を実質的に含まないことが好ましい。
【００１０】
本発明は、ＲＮＡの二次構造を実質的に除去する作用物質を利用する遺伝子発現のアッセイにおけるオリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＩＮＡプローブの使用も含む。
【００１１】
第四の態様において、本発明は、
（ａ）ＲＮＡの二次構造を実質的に除去する作用物質でＲＮＡを処理することと、
（ｂ）ＲＮＡの相補配列と結合することができるプライマーを使用してＲＮＡを逆転写および増幅することと、
（ｃ）処理および増幅したＲＮＡの存在または量を測定して遺伝子発現の指標を得ることと
を含む遺伝子発現のアッセイを提供する。
【００１２】
好ましい形では、ＲＮＡは、微生物、細胞、細胞群または細胞集団を含む、真核生物または原核生物由来である。
【００１３】
好ましい形では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。
【００１４】
好ましい形では、ＲＮＡは微生物由来である。
【００１５】
微生物、細胞または細胞集団または他の組織または生物源からＲＮＡを単離するのに適した任意の方法によって、ＲＮＡを得ることができる。このような方法は当技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ、「Molecular Cloning、A Laboratory Manual」ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９を参照。例として、オリゴ−ｄＴコーティング磁気ビーズまたは樹脂があるが、これらだけには限られない。ＲＮＡ結合樹脂の具体例には、以下のＲＮｅａｓｙ（商標）およびＯｌｉｇｏｔｅｘ（商標）（Qiagen）、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ（商標）トータル（Stratagene）、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ（商標）（Clontech）、ＲＮＡｇｅｎｔｓ（商標）およびＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ（商標）システム（Promega）などがある。密度勾配遠心分離技法を使用してＲＮＡを単離することもできる。
【００１６】
ＲＮＡは、真核生物由来でもよく、または細菌などの原核生物およびウイルス由来でもよい。薬物治療、ウイルス量、サンプル中の様々なウイルスの発現アレイなどをモニタリングするためにアッセイを使用することができる。
【００１７】
ＲＮＡはシトシン塩基を修飾することができる作用物質で処理して、ＲＮＡの相補領域間の結合強度を弱めることが好ましいが、これは、シトシンの除去がＣ：Ｇ塩基対形成の消失をもたらすからである。生じる修飾は二次構造を除去し、一本鎖実体としてＲＮＡを実質的に安定させる。作用物質は、亜硫酸水素塩、ヒドロキシルアミン、酢酸塩またはクエン酸塩から選択されることが好ましい。作用物質は、亜硫酸水素塩または酢酸塩試薬であることがより好ましい。作用物質は、水の存在下でシトシンをウラシルに修飾する試薬である亜硫酸水素ナトリウムであることが最も好ましい。
【００１８】
亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）はシトシンの５，６−二重結合と容易に反応して、脱アミノ化の影響を受けやすく水の存在下で亜硫酸ウラシルを生成するスルホン化シトシンの反応中間体を形成する。必要な場合、亜硫酸基を適度なアルカリ条件下で除去して、ウラシルの形成をもたらすことができる。したがって、潜在的には全てのシトシンがウラシルに転換される。ウラシル塩基は、シトシンが形成し得る３つの水素結合ではなく、任意の相補塩基との２つの水素結合のみを形成することができるので、複雑な二次構造を再形成するＲＮＡの傾向は大幅に低下する。次いで、こうして処理した修飾型ＲＮＡは、妨げられることなく特定の相補的プローブとの相互作用に利用可能である。
【００１９】
重要なことに、特定の実施形態では、標的配列のその含有量に関してサンプルをアッセイする前に、現在実施されているようなＲＮＡを対応する相補的ＤＮＡ（cDNA）に転換する必要がない。逆転写酵素またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅工程のいずれも必要とされないので、本発明による方法は簡潔でより直接的であり、したがって、標準的手順で用いられる酵素の配列コピーの偏りによって引き起こされる誤差が起こりにくい。
【００２０】
存在する標的（修飾型）ＲＮＡの量は、任意の適切な手段によって測定することができる。例えば、標的ＲＮＡを対象とする特異的プローブは、対象の対応する転写単位の一部または全部から誘導することができる。あるいは、プローブは、適切な配列の適切な抗体または抗体断片または単一ドメイン抗体、オリゴヌクレオチド、またはペプチド核酸（PNA）、固定化核酸(locked nucleic acid）（LNA）または挿入核酸（intercalating nucleic acid）（INA）プローブなどの塩基−配列特異性を示す任意の他の実体から誘導することができる。
【００２１】
本発明のプローブは、試験するＲＮＡと「実質的に」相補的であるように設計することができる。プローブが事実上ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはＩＮＡであるとき、それらはＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、またはＣ（シトシン）塩基のみを含み得るが、これは、修飾型ＲＮＡが非修飾Ｃ残基を実質的に含まないからである。
【００２２】
プローブは、オリゴヌクレオチドプローブまたはＰＮＡ、ＬＮＡまたはＩＮＡプローブなどの任意の適切なリガンドであってよい。例えば、全ての処理済みＲＮＡと結合し得るポリ−ＴＤＮＡまたはポリ−ＴＰＮＡまたはＬＮＡプローブまたはポリＴＩＮＡプローブを使用することができ、これらはいずれも細胞由来のポリＡ「テイル」を有し、細胞、細胞集団または組織中の全遺伝子発現の測定を可能にする。あるいは、対象のＲＮＡを対象とする特異的プローブを使用して、所与の細胞または組織中の特異的遺伝子発現を測定することが可能である。
【００２３】
ＲＮＡにおけるランダムな二次構造形成を不安定にするための、シトシンとウラシル、またはその亜硫酸塩付加物の置換も、特異的オリゴ−、ＰＮＡ、ＬＮＡ、またはＩＮＡプローブと修飾型ＲＮＡの結合の強度を有意に低下させ得る。ＩＮＡ分子は、末端位置に限り挿入基（intercalating group）を用いて適切に設計するとき、相補的配列構造のＲＮＡに対して高い結合性を有する。これをさらに補うために、プローブ中のアデニン塩基の代わりに、任意の相補的ＲＮＡ鎖中の３つの水素結合を形成する２，６−ジアミノプリン（AP）を（アデニンが形成し得る２つに対する）チミンと置換し、これによってプローブとＲＮＡの間の結合を強化することが好ましい。
【００２４】
ＩＮＡプローブは、その塩基配列において相補性を示すＤＮＡまたはＲＮＡの隣接塩基間に挿入することができる挿入分子を、「正常」または「修飾型」ヌクレオチドの配列中の様々な場所に結合させることによって構築する。このようなＤＮＡ分子によって、このような挿入部分の存在は、挿入基をＩＮＡプローブ中のどこに結合させようとも、プローブと標的核酸分子の間の相互作用を大幅に安定化させる。ＩＮＡの注目すべき性質は以下に記載する。
【００２５】
ＲＮＡ分子と結合するように設計したＩＮＡプローブの場合、挿入基をＩＮＡの末端または末端付近に配置して、結合を高めることが好ましい。驚くべきことに、挿入基を内部に配置することはＲＮＡと相補的ＤＮＡのハイブリダイゼーションに悪影響を与える可能性があり、かつハイブリッド構造を安定化させずに不安定化し得る。ＩＮＡプローブを構築するための方法は以下に記載する。
【００２６】
本発明の重要性は、処理して全てのそのシトシン残基がウラシル残基に転換された標的ＲＮＡ種と非常に特異的かつ非常に強く結合する、個々の構築体のＩＮＡプローブの驚くべき能力に関する。結果として、本発明は、現在使用されている方法の多くの間接工程によって導かれる誤りまたは偏りを回避することができる方法に関する。
【００２７】
示すように、幾つかの他の特異的プローブを本アッセイ中で使用することができるが、それらの使用の詳細な説明から明らかとなる理由で、ＩＮＡプローブを使用することが好ましい。
【００２８】
ＲＮＡの増幅は、ＲＮＡの相補配列と結合することができるＩＮＡプライマーを使用して実施することが好ましい。増幅は、典型的には逆転写酵素ＰＣＲベースの方法を使用して実施される。
【００２９】
高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができるか本発明中で利用する核酸分子と高い配列類似性を有することができる同等な配列に関して、「高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、当技術分野でよく知られている用語である「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」と同義であり得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、「Molecular Cloning、A Laboratory Manual」ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９；「Nucleic Acid Hybridisation、A Practical Approach」、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５を参照。
【００３０】
本発明の利点は、ｃＤＮＡへのＲＮＡの転換を必要とせずに、ＲＮＡの直接測定を実施することができることである。本発明のアッセイは、ｃＤＮＡへのＲＮＡの転換または増幅を必要とする現在の方法による潜在的な誤りを導かずに、細胞集団中の遺伝子活性の真の測定を可能にする。
【００３１】
ＰＮＡまたはオリゴヌクレオチドプローブは、当業者に知られている任意の適切な方法を使用して調製することができる。ＩＮＡプローブは、当業者に知られている任意の適切な方法によって調製することができる。
【００３２】
適切なプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ前にＩＮＡプライマーを使用して、処理したＲＮＡを少量から増幅することもできる。
【００３３】
本発明は、チップなどの現在のアレイ技術中、またはランダムに位置特定可能な高密度光学アレイ中で使用するのに適しており、したがって多数の遺伝子を迅速にアッセイすることができる。この形では、何万もの遺伝子の活性を１回の試験で測定またはアッセイすることができる。本発明は、例えばビーズ技術を使用する、少数の遺伝子を対象とするアッセイにも適応可能である。修飾ＲＮＡ種はアレイの形で適切な支持体にスポットするまたはつけることが可能であり、アレイは様々なプローブによって測定することができる。
【００３４】
１つの好ましい形では、本発明は、ＰＮＡ分子は正味の電荷を有していないが、一方ＲＮＡ分子は、それらのリン酸骨格のために、強く負に帯電しているという事実を特に利用する。結合ＰＮＡプローブの検出は、正に帯電した蛍光色素などの単分子、その長さに比例して核酸と特異的に結合し直接検出することができる複数の分子を利用することができる。多くのこのような適切な蛍光色素が知られている。
【００３５】
検出系は、核酸と選択的に結合し酵素アッセイを使用して検出することができる正に帯電した領域を有する酵素、または捕捉された核酸分子と選択的に結合する正に帯電した放射性分子であってもよい。ナノ結晶も使用することができることは理解されよう。
【００３６】
他の適切な検出系は量子ドットバイオコンジュゲートの使用である（Chan and Nie 1998 Science 282:2016-2018）。
【００３７】
あるいは、配列特異的プローブおよび幾つかの蛍光色素分子が結合するミクロスフェアを利用することができる。ミクロスフェアは、特定のＲＮＡ種を標的化するプローブに直接、またはそのポリアデニンテイルなどのＲＮＡの第二の非特異的構成部分を介して結合させることが可能である。この後者の場合、ミクロスフェアシグナル検出系の結合は、ＩＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはオリゴヌクレオチド部分としてのポリＴ配列を介した結合であり得る。
【００３８】
蛍光色素マーカーを有するミクロスフェアには様々な色またはスペクトルがあるので、１回の実験で、単細胞サンプル中に存在する幾つかの異なるＲＮＡ種のそれぞれの量を測定することが可能である。さらに、そのように標識した一種のミクロスフェアを、容易に目に見える状態にして計数することができ、したがって異なるＲＮＡ種間の発現のわずかな違いを相当な精度で決定することができる。
【００３９】
基質と反応して着色産物を形成することができる適切な放射性化合物または酵素を用いた標識などの、標的修飾ＲＮＡと結合するリガンドを検出するための他の方法を、捕捉ＲＮＡまたはプローブまたは基質のいずれかに直接結合させる個々の適用例に使用することもできる。
【００４０】
この手順中でのリガンドの１つとしてのＩＮＡまたはＰＮＡまたは他のオリゴヌクレオチドプローブの使用には、オリゴヌクレオチドプローブの使用に優る非常に有意な利点がある。ＩＮＡまたはＰＮＡの結合はより速く平衡に達し、より高い配列特異性を示す。ＰＮＡ分子は非帯電性であり、従来のオリゴヌクレオチドプローブより高い結合係数で標的修飾ＲＮＡ分子と結合することができる。特に、ＩＮＡプローブはＡ−Ｔ−とＡ−Ｕ塩基間の結合を高める。処理してシトシン塩基がウラシル塩基に転換された二次構造を除去したＲＮＡの場合、これは重要である。ＲＮＡ処理の結果として、少数のＧ−Ｃ塩基間相互作用および対応するＡ−ＴおよびＡ−Ｕ塩基間相互作用の数が増大する。
【００４１】
本発明は直接的な検出法を使用することができるので、アッセイはサンプル中の標的ＲＮＡの量の真の正確な測定値を与えることができる。本発明のアッセイは、ＰＣＲなどのプロセスにおけるシグナル増幅に依存する方法に固有の潜在的偏りによって混乱することはなく、この場合、このような手順中で一般的に使用される酵素は、異なる配列の増幅率の差によって組織的偏りを導き得る。
【００４２】
本発明は、疾患状態の検出、幹細胞および派生細胞集団の分化状態、遺伝子発現または細胞機能に対する薬剤の影響の検出または測定、およびＣ型肝炎ウイルス（HCV）およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）などのウイルスに感染した患者のための正確な薬物計画の決定に役立つウイルス量モニタリングなどの、遺伝子発現の正確な指標が有用である任意の他の状況に特に適している。
【００４３】
本明細書を通じて、文脈で他に必要とならない限り、語句「comprise」、または「comprises」もしくは「comprising」などの変形は、言及する要素、整数または工程、または要素群、複数の整数または工程の包含を意味するが、任意の他の要素、整数または工程、または要素群、複数の整数または工程の除外は意味しないことは理解されよう。
【００４４】
本明細書中に含まれている文献、作用、物質、装置、物品などの任意の論述は、本発明の文脈を与える目的のものに過ぎない。これらの事項のいずれかまたは全てが従来技術の土台の一部を形成する、または本発明と関係がある分野の共通の一般知識であったことは当然のこととして解釈すべきでないが、これは、それが本発明の優先日前にオーストラリアに存在したからである。
【００４５】
本発明がより明確に理解できるように、好ましい形態を以下の図面および実施例を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】典型的なマイクロアレイベースのアッセイの説明を示す図であり、この場合、暗色点は特定のＲＮＡ集団中でアップレギュレーションされる遺伝子を示し、かつ淡色点は同じ集団中でダウンレギュレーションされる遺伝子を示す。暗色および淡色の矢印は、従来系中の検出分子がそれらの標的と結合するのを妨げる二次構造のため、従来の方法ではなく亜硫酸水素塩処理ＲＮＡにおいて、それぞれアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされるとして検出される遺伝子を示す。
【図１Ｂ】図１Ａと同様のマイクロアレイベースのアッセイを示す図であるが、暗色および淡色の矢印は、発現分析前の酵素によるＲＮＡの操作中に生じＲＮＡ発現レベルの不正確な決定をもたらす偏りのため、従来の方法ではなく亜硫酸水素塩処理ＲＮＡにおいて、それぞれアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされるとして検出される遺伝子を示す。酵素による操作は誤解を与える結果を引き起こし、特定の遺伝子は、それらが実際そのように制御されないときにアップまたはダウンレギュレーションされることを示し得る。
【図１Ｃ】図１Ａと同様のマイクロアレイベースのアッセイを示す図であるが、暗色および淡色の矢印は、検出分子の改善された特異性のため、従来の方法ではなく亜硫酸水素塩処理ＲＮＡにおいて、それぞれアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされるとして検出される遺伝子を示す。検出分子の特異的結合強度の増大は、特異性の欠如のため従来の方法を使用して検出することができないＲＮＡ種の検出をもたらす。
【図２】亜硫酸水素塩処理ＲＮＡからのＰＣＲ増幅のゲル分離の結果を示す図である。分離ウエル：Ｍ、１００〜１０００ｂｐマーカー；レーン５野生型アクチンプライマーエクソン３ａ〜３ｂ；レーン６野生型アクチンプライマーエクソン３ａ〜４；レーン７亜硫酸水素塩転換型アクチンプライマーエクソン３ａ〜３ｂ；レーン８野生型アクチンプライマーエクソン３ａ〜４。
【図３】（図３Ａ）亜硫酸水素塩処理転換型アクチンＲＮＡ（配列番号１）の配列分析を示す図である。    （図３Ｂ）野生型アクチンＲＮＡ（配列番号２）の配列分析を示す図である。
【図４】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に関する直線性のゲルベースの読み出し値を示す図である。
【図５】リアルタイムＰＣＲ定量化の報告−Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）ＲＮＡに関する直線性パネルを示す図である。
【図６】リアルタイムＰＣＲ定量化の報告−Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に関するダイナミックレンジを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
定義
核酸
用語「核酸」は、天然に存在する核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。用語「核酸類似体」は、天然に存在する核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡの誘導体、および天然に存在する核酸の合成類似体を包含する。合成類似体は１つまたは複数のヌクレオチド類似体を含む。用語ヌクレオチド類似体は、天然に存在するヌクレオチドとほぼ同様の、核酸骨格に取り込むことができ特異的な塩基対形成することができる（以下参照）全てのヌクレオチド類似体を含む。
【００４８】
したがって用語「核酸」または「核酸類似体」は、複数のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体および／またはインターカレーター擬ヌクレオチドから本質的になる任意の分子を指す。本発明に有用な核酸または核酸類似体は、異なる骨格のモノマー単位を有する幾つかの異なるヌクレオチドを含むことができる。
【００４９】
核酸または核酸類似体の一本鎖は、実質的に相補的な一本鎖核酸および／または核酸類似体とハイブリダイズして、二本鎖核酸または核酸類似体を形成することができることが好ましい。このような二本鎖類似体は、二重らせんを形成することができることがより好ましい。二重らせんは水素結合によって形成されることが好ましく、二重らせんは、Ａ型、Ｂ型、Ｚ型およびそれらの中間体の二重らせんからなる群から選択される二重らせんであることがより好ましい。
【００５０】
したがって、本発明に有用な核酸および核酸類似体には、それだけに限らないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡおよびそれらの混合物およびそれらのハイブリッド、ならびにそれだけに限らないが、ホスホロチオエート、メチルホスホレート、ホスホラミデート、ホスホロジチエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステルおよびホスホボラノエートなどのそれらのリン原子修飾体がある。さらに、それだけに限らないが、メチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテートおよびアミド含有結合基などの非リン含有化合物をヌクレオチドとの結合に使用することができる。特に、核酸および核酸類似体は、１つまたは複数のインターカレーター擬ヌクレオチドを含むことができる。
【００５１】
本文脈内では「混合物」は、異なる種類のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む核酸および核酸類似体鎖を包含することを意味する。さらに、本文脈内では「ハイブリッド」は、１つまたは複数の種類の骨格を有するヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む１本の鎖、および異なる種類の骨格を有するヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む他の鎖を含む、核酸または核酸類似体を包含することを意味する。
【００５２】
ＨＮＡによって、例えばＶａｎ  Ａｅｔｓｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５によって記載されたのと同様の核酸を意味する。ＭＮＡによって、Ｈｏｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ、１９９８によって記載されたのと同様の核酸を意味する。ＡＮＡはＡｌｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ、１９９９によって記載された核酸を指す。ＬＮＡはＷＯ９９／１４２２６（Exiqon）中に記載されたのと同様の任意のＬＮＡ分子であってよく、ＬＮＡはＷＯ９９／１４２２６の要約書中で示された分子から選択されることが好ましい。ＬＮＡは、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ、１９９８、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ、１９９８またはＯｂｉｋａ  ｅｔ  ａｌ、１９９７中に記載されたのと同様の核酸であることがより好ましい。ＰＮＡは例えばＮｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ、１９９１によって記載されたのと同様のペプチド核酸を指す。
【００５３】
用語ヌクレオチドは核酸または核酸類似体の構成単位を指し、かつ用語ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドおよびそれらの誘導体、ならびに天然に存在するヌクレオチドおよびそれらの誘導体とほぼ同じ機能を果たすことができるヌクレオチドを包含する。天然に存在するヌクレオチドは、４つの主な核酸塩基アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）の１つを含むデオキシリボヌクレオチド、および４つの核酸塩基アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）の１つを含むリボヌクレオチドを含む。
【００５４】
ヌクレオチド類似体は、核酸骨格に取り込むことができ特異的な塩基対形成することができる、任意のヌクレオチド様分子であってよい。
【００５５】
天然に存在しないヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、バイシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−バイシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−バイシクロ−ＤＮＡ、α−バイシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、バイシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、バイシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、バイシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキシオピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡまたはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ内に含まれるヌクレオチドがあるが、これらだけには限られない。
【００５６】
ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体の機能は、相補的ヌクレオチドの核酸塩基の水素結合を介して相補的ヌクレオチドと特異的に相互作用することができること、および核酸または核酸類似体に取り込まれることができることである。天然に存在するヌクレオチド、および幾つかのヌクレオチド類似体は、酵素によって、例えばＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼによって、核酸または核酸類似体に取り込まれることができる。しかしながら、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、化学的に核酸または核酸類似体に取り込まれることもできる。
【００５７】
さらに核酸または核酸類似体は、２つの小さな核酸または核酸類似体を互いに結合させることによって調製することができ、例えばこれはリガーゼによって酵素的に行うことができ、またはそれは化学的に行うことができる。
【００５８】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、骨格モノマー単位および核酸塩基を含む。核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基、またはほぼ同じ機能を果たすことができるその誘導体もしくはその類似体であってよい。核酸塩基の機能は、水素結合を介して１つまたは複数の他の核酸塩基と特異的に結合することができることである。したがって、それは１つまたは少数の他の核酸塩基のみと安定した水素結合を結合することができるが、それは通常それ自体に含まれる大部分の他の核酸塩基とは安定した水素結合を結合することができないことは、核酸塩基の１つの重要な特徴である。１つの核酸塩基と他の核酸塩基の特異的相互作用は、一般に「塩基対形成」と呼ばれる。
【００５９】
塩基対形成は、所定のヌクレオチドと相補的ヌクレオチドの間の特異的ハイブリダイゼーションをもたらす。相補的ヌクレオチドは、塩基対形成することができる核酸塩基を含むヌクレオチドである。
【００６０】
一般的な天然に存在する核酸塩基の中で、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）と塩基対形成し、かつグアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と塩基対形成する。したがって、Ａを含むヌクレオチドはＴまたはＵのいずれかを含むヌクレオチドと相補的であり、かつＧを含むヌクレオチドはＣを含むヌクレオチドと相補的である。
【００６１】
追加の分子体を含むようにヌクレオチドをさらに誘導体化することができる。ヌクレオチドは、核酸塩基または骨格モノマー単位で誘導体化することができる。塩基上の好ましい誘導体化部位には、アデニンの８−位置、ウラシルの５−位置、シトシンの５−または６−位置、およびグアニンの７−位置がある。複素環修飾は３つの構造クラス、強化型塩基スタッキング（enhanced base stacking）、追加の水素結合、およびこれらのクラスの組合せに分けることができる。平面系のπ−電子雲を拡大することによって塩基スタッキングを強化する修飾は、ピリミジンの５−位置および７−デアザ−プリンの７−位置における共役した親油性修飾によって表される。ピリミジン修飾の５−位置における置換にはプロピン、ヘキシン、チアゾールおよび単にメチル基があり、かつ７−デアザ−プリンの７−位置における置換にはヨード、プロピニル、およびシアノ基がある。プロピンから５員複素環および三環系縮合系までシトシンの５−位置を修飾することもでき、これらは４−および５−位置（シトシンクランプ）から生じる。第二の型の複素環修飾は２−アミノ−アデニンによって表され、この場合、追加のアミノ基が、Ｇ−Ｃ塩基対における３個の水素結合と類似した他の水素結合をＡ−Ｔ塩基対において与える。組合せの影響を与える複素環修飾は、ヘテロ二本鎖のエトキシアミノ官能基を有する２−アミノ−７−デアザ−７−修飾アデニンおよび三環系シトシン類似体によって表される。さらに、Ｎ２−修飾２−アミノアデニン修飾オリゴヌクレオチドは特に一般的な修飾体である。リボースまたはデオキシリボース部分上の誘導体化の好ましい部位は、非結合炭素位置Ｃ−２’およびＣ−４’の修飾、結合炭素Ｃ−１’、Ｃ−３’およびＣ−５’の修飾、糖の酸素、Ｏ−４’の置換、（立体配座が固定された）無水糖の修飾、（立体配座が固定された）環糖の修飾、リボフラノシル環の大きさの変化、結合部位−糖と糖、（Ｃ−３’とＣ−５’／Ｃ−２’とＣ−５’）、ヘテロ原子環−修飾糖、および前述の修飾の組合せである。しかしながら、核酸または核酸類似体の全体的な塩基対形成の特異性が妨害されない限り、他の部位を誘導体化することができる。最後に、骨格モノマー単位がリン酸基を含むとき、幾つかの骨格モノマー単位のリン酸を誘導体化することができる。
【００６２】
本明細書で使用するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体および／またはインターカレーター擬ヌクレオチドの配列から本質的になる分子である。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、５〜１００個の個別のヌクレオチドを含むことが好ましい。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ＰＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡおよびこれらの混合物、ならびに任意の他のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体および／またはインターカレーター擬ヌクレオチドを含むことができる。
【００６３】
ＲＮＡ
本明細書で使用するＲＮＡは、細胞などの任意の供給源由来のメッセンジャーＲＮＡ（mRNA）未熟ｍＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ（tRNA）、リボソームＲＮＡ（rRNA）およびミクロＲＮＡ（miRNA）、ウイルスまたは他の微生物由来のゲノムＲＮＡ、ＤＮＡから転写されたＲＮＡ、対応するＤＮＡのＲＮＡコピーなどを含む。
【００６４】
対応する核酸
核酸、核酸類似体、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、それらがハイブリダイズすることができるとき対応すると考えられる。対応する核酸、核酸類似体、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができることが好ましく、対応する核酸、核酸類似体、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができることがより好ましく、対応する核酸、核酸類似体、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができることがより好ましい。
【００６５】
本明細書で使用する高ストリンジェンシー条件は、例えばＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｅ．Ｍ．、１９７５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７によって記載されたサザンブロッティングおよびのハイブリダイゼーションに関して通常適用されるストリンジェンシーを示すものとする。このような目的のために、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの工程を含めることは通常業務である。このような工程は通常、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９によって「Molecular Cloning/A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor）中に記載されたように、６×ＳＳＰＥ、５％のＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、１００μｇ／ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡを含む溶液を使用し（４２℃で１８時間インキュベーション）、次に２×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳで洗浄し（室温および３７℃）、０．１×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳで洗浄して（３０分間６８℃でインキュベーション）実施する。
【００６６】
本明細書で使用する中ストリンジェンシー条件は、ｐＨ７．０において１ｍＭのＥＤＴＡ，１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４Ｈ２Ｏ、１４０ｍＭのＮａＣｌを含むバッファー中でのハイブリダイゼーションを示すものとする。約１．５μＭのそれぞれの核酸または核酸類似体鎖を与えることが好ましい。あるいは中ストリンジェンシーは、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ９，０）、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭのＭｇＣｌ２を含むバッファー中でのハイブリダイゼーションを示すことができる。
【００６７】
低ストリンジェンシー条件は、ｐＨ７．０において１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａ３ＰＯ４で構成されるバッファー中でのハイブリダイゼーションを示す。
【００６８】
あるいは、対応する核酸、核酸類似体、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、核酸類似体、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、所与の配列で互いに実質的に相補的、７０％を超えて相補的など、例えば７５％を超えて相補的、８０％を超えて相補的など、例えば８５％を超えて相補的、９０％を超えて相補的など、例えば９２％を超えて相補的、９４％を超えて相補的など、例えば９５％を超えて相補的、９６％を超えて相補的など、例えば９７％を超えて相補的である。
【００６９】
所与の配列は少なくとも１０ヌクレオチド長、少なくとも１５ヌクレオチドなど、例えば少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドなど、例えば少なくとも３０ヌクレオチド、１０ヌクレオチドと５００ヌクレオチドの間など、例えば１０ヌクレオチド長と１００ヌクレオチド長の間、１０ヌクレオチド長と５０ヌクレオチド長の間であることが好ましい。対応するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、それらの全長で実質的に相補的であることがより好ましい。
【００７０】
クロスハイブリダイゼーション
クロスハイブリダイゼーションとの用語は、少なくとも２つの核酸または核酸類似体間の意図しないハイブリダイゼーションを包含する。したがって、クロスハイブリダイゼーションとの用語を使用して、例えば核酸プローブまたは核酸類似体プローブ配列と、その意図する標的配列以外の他の核酸配列または核酸類似体配列のハイブリダイゼーションを記載することができる。
【００７１】
クロスハイブリダイゼーションはプローブと１つまたは複数の対応する非標的配列の間で起こることが多いが、しかしながらこれらは、プローブおよびその対応する標的配列より低度の相補性を有する。この望ましくない影響は、標的に対して大幅に過剰なプローブおよび／または急速なアニーリング動態が原因であり得る。クロスハイブリダイゼーションは、数個の核酸塩基対間、例えばＰＣＲ反応中のプライマー間の水素結合によっても起こり、プライマー二量体形成および／または非特異的ＰＣＲ産物の形成をもたらす。
【００７２】
同じ型のヌクレオチド類似体に対して高い親和性を有する１つまたは複数のヌクレオチド類似体を含む核酸は、塩基対形成に基づいて二量体またはさらに高次の複合体を形成する傾向がある。それだけに限らないが、ＬＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡおよびＰＮＡなどのヌクレオチド類似体を含むプローブは、同じ型の骨格モノマー単位を含む他のオリゴヌクレオチド類似体とのハイブリダイズに対する高い親和性を一般に有する。したがって、個々のプローブ分子は低度の相補性のみを有するが、それらはハイブリダイズする傾向がある。
【００７３】
自己ハイブリダイゼーション（self-hybridisation)
自己ハイブリダイゼーションとの用語は、核酸または核酸類似体分子が自身で折り畳まることにより自身にアニーリングし、例えばヘアピン構造のような二次構造を生成するプロセスを包含する。大部分の適用例において、自己ハイブリダイゼーションを避けることは重要である。二次構造の生成は、望ましい核酸標的配列とのハイブリダイゼーションを阻害し得る。例えば核酸または核酸類似体をＰＣＲ反応におけるプライマーとして、またはエクソヌクレアーゼアッセイ用のフルオロフォア／消光標識プローブとして使用するとき、大部分のアッセイにおいてこれは望ましくない。両方のアッセイにおいて、自己ハイブリダイゼーションは標的核酸配列とのハイブリダイゼーションを阻害し、さらにエクソヌクレアーゼアッセイにおけるフルオロフォアの消光の程度が低下する。
【００７４】
同じ型のヌクレオチド類似体に対して高い親和性を有する１つまたは複数のヌクレオチド類似体を含む核酸は、自己ハイブリダイズする傾向がある。それだけに限らないが、ＬＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡおよびＰＮＡなどのヌクレオチド類似体を含むプローブは、自己ハイブリダイズに対する高い親和性を一般に有する。したがって、個々のプローブ分子は低度の相補性のみを有するが、それらは自己ハイブリダイズする傾向がある。
【００７５】
融解温度
核酸の融解は、二本鎖核酸分子の２本の鎖の分離を指す。融解温度（Ｔｍ）は、５０％のらせん（ハイブリダイズ）対コイル（非ハイブリダイズ）形が存在する摂氏温度を示す。
【００７６】
高い融解温度は安定した複合体、したがって個々の鎖の間の高い親和性を示す。同様に、低い融解温度は個々の鎖の間の比較的低い親和性を示す。したがって、通常２本の鎖の間の強い水素結合は高い融解温度をもたらす。
【００７７】
さらに、二本鎖核酸の核酸塩基間へのインターカレーターの挿入も二本鎖核酸を安定化させ、したがって高い融解温度をもたらす可能性がある。
【００７８】
さらに、融解温度は周囲の物理的／化学的状態に依存する。例えば、融解温度は塩濃度およびｐＨに依存する。
【００７９】
融解温度は幾つかのアッセイにより決定することができ、例えばＵＶスペクトルを使用してハイブリダイゼーションの形成および分解（融解）を決定することによって、融解温度を決定することができる。
【００８０】
ＩＮＡ／ＩＰＮの定義
挿入核酸（INA）は特有なクラスのＤＮＡ結合分子である。ＩＮＡは、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体およびインターカレーター擬ヌクレオチド（IPN）モノマーからなる。ＩＮＡは、内部に位置するＩＰＮに関して１０℃までおよび末端位置ＩＰＮに関して１１℃まで安定状態である相補的ＤＮＡに対して、非常に高い親和性を有する。正確に設計した場合、ＩＮＡ自体が、相補的ＲＮＡよりＤＮＡとのハイブリダイズを好む選択的分子となり得る。ＩＰＮを分子内部に配置した場合、ＩＮＡはオリゴヌクレオチドプライマーの約２５分の１の効率でＲＮＡに結合することが示されている。一方、従来のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体およびＰＮＡは、ＲＮＡとＤＮＡの両方に対して等しい親和性を有する。したがってＩＮＡは、第一の真に選択的なＤＮＡ結合剤である。さらにＩＮＡは、他の天然ＤＮＡ分子より相補的ＤＮＡに対して高い特異性および親和性を有する。
【００８１】
さらに、ＩＰＮはＡＴに富む環境においてＤＮＡを最も安定化させ、これによってＩＰＮはエピゲノミクス研究の分野で特に有用となる。ＩＰＮは、典型的には隆起または末端挿入物としてＩＮＡ分子内に置く。ＩＰＮは本質的に、核酸二本鎖中の核酸塩基と共にスタッキングすることができる平面状（ヘテロ）多環芳香族化合物である。
【００８２】
ＩＮＡ分子は、エクソヌクレアーゼによる攻撃に耐性があることも示されている。これによって、これらの分子は、ｐｈｉ２９などの酵素を使用する増幅用のプライマーとして特に有用となる。ｐｈｉ２９は固有のエクソヌクレアーゼ活性を有するので、増幅用の鋳型として使用するプライマーは、特にそれらの３’末端において修飾して酵素による分解を妨げなければならない。しかしながらＩＮＡ分子は、さらなる修飾なしで加えることができる。
【００８３】
ＩＮＡは従来のＰＣＲ増幅反応において使用することができ、従来型プライマーとして挙動する。しかしながら、ＩＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型に対して高い特異性を有し、鋳型が制限的であり反応の感度が重要である状況における使用にＩＮＡは理想的となる。ＩＮＡはＡＴに富む環境においてＤＮＡを最も安定化させ、これによってＩＮＡは亜硫酸水素塩処理ＤＮＡ配列の増幅に特に有用となる。これは、亜硫酸水素塩による転換後、全てのシトシン残基はウラシルに、次にＰＣＲまたは他の増幅後チミンに転換される事実に原因がある。したがって亜硫酸水素塩処理ＤＮＡは非常にＴに富む。ＩＮＡ中のＩＰＮ分子の数の増大は、ＩＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の増大した安定性をもたらす。ＩＮＡ中のＩＰＮが増大するほど、ＤＮＡ／ＩＮＡ二本鎖の融解温度は高くなる。
【００８４】
本出願人は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体に取り込まれた際に、挿入核酸（INA）を形成し（ＷＯ０３／０５１９０１、ＷＯ０３／０５２１３２、ＷＯ０３／０５２１３３およびＷＯ０３／０５２１３４）、オリゴヌクレオチドのサプリメントまたは置換体として新規かつ有用な性質を有するクラスのインターカレーター擬ヌクレオチドを以前に開発している。
【００８５】
インターカレーター擬ヌクレオチドは、１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールの複数のホスホラミダイトから選択されることが好ましい。インターカレーター擬ヌクレオチドは、（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトまたは（Ｒ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホラミダイトから選択されることが好ましい。
【００８６】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、固定核酸（LNA）、ペプチド核酸（PNA）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ANA）、ヘキシトール核酸（HNA）、挿入核酸（INA）、シクロヘキサニル核酸（CNA）、およびそれらの混合物およびそれらのハイブリッド、ならびにそれだけに限らないが、ホスホロチオエート、メチルホスホレート、ホスホラミデート、ホスホロジチエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステルおよびホスホボラノエートなどのそれらのリン原子修飾体から選択することができる。天然に存在しないヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、バイシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−バイシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−バイシクロ−ＤＮＡ、α−バイシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、バイシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、バイシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、バイシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキシオピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡまたはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ内に含まれるヌクレオチドがあるが、これらだけには限られない。さらに、それだけに限らないが、メチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテートおよびアミド含有結合基などの非リン含有化合物をヌクレオチドとの結合に使用することができる。特に、核酸および核酸類似体は、１つまたは複数のインターカレーター擬ヌクレオチドを含むことができる。
【００８７】
ＩＰＮがメチル化部位の特異的検出用にＩＮＡ分子内に位置するとき、本発明者は、潜在的ＣｐＧ部位間にＩＰＮを位置させることは避けることが有用であることを見出している。これは、ＩＰＮを使用してＣｐＧ部位を隔てると、生成するＩＮＡの特異性が低下するという事実によるものである。
【００８８】
ペプチド核酸（PNA）
ペプチド核酸は、配列特異性を有する核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）とハイブリダイズすることができる天然に存在しないポリアミドである（米国特許第５，５３９，０８２号およびEgholm et al.、Nature（1993）365、566-568参照）。ＰＮＡはプローブベースのハイブリダイゼーションアッセイにおける核酸プローブに対する代替／代用としての候補であるが、これは、ＰＮＡが幾つかの望ましい性質を示すからである。ＰＮＡは、核酸とハイブリダイズして、対応する核酸／核酸複合体より熱力学的に安定したハイブリッドを形成するアキラルポリマーである。天然に存在しない分子であるので、それらはペプチドまたは核酸を分解することが知られている酵素の基質であることは知られていない。したがって、ＰＮＡは生物サンプル中で安定状態であり、かつ長期の保存寿命を有するはずである。イオン強度に非常に依存する核酸ハイブリダイゼーションとは異なり、ＰＮＡと核酸のハイブリダイゼーションはイオン強度にほとんど依存せず、核酸と核酸のハイブリダイゼーションを強く嫌う条件下において低いイオン強度を好む。ＰＮＡ複合体の安定性および立体配座に対するイオン強度の影響は、広範囲で調べられている。配列識別は、ＤＮＡ認識ＤＮＡよりＰＮＡ認識ＤＮＡまたはＲＮＡに有効である。しかしながら、ハイブリダイゼーションアッセイにおける、ＤＮＡプローブと比較した１塩基の変化、ｉｎｄｅｌ、またはＰＮＡプローブを用いた多型識別の利点は、幾分配列依存的であるようである。追加の利点として、ＰＮＡは平行方向と逆平行方向の両方で核酸とハイブリダイズするが、逆平行方向が好ましい。
【００８９】
ＰＮＡは、現在市販されている形式での標準的なペプチド合成手順の適合によって合成する（ＰＮＡモノマーおよびオリゴマーの調製の一般評論に関しては、Dueholm et al.、New J.Chem.（1997）、21、19-31またはHyrup et. al.、Bioorganic & Med.Chem.（1996）4、5-23を参照頂きたい）。標識および非標識ＰＮＡオリゴマーは購入することができ（PerSeptive Biosystems Promotional Literature:BioConcepts、Publication No.NL612、Practical PNA、Review and Practical PNA、Vol.1、Iss.2を参照）、または市販の製品を使用して調製することができる。
【００９０】
実際、ＰＮＡプローブと標準的な核酸プローブの間に多くの差異が存在する。これらの差異は、生物学的、構造的、および物理化学的差異に都合良く分けることができる。上記および以下で論じるように、これらの生物学的、構造的、および物理化学的差異は、核酸が典型的に利用されている適用例においてＰＮＡプローブの使用を試みるとき、予期せぬ結果をもたらし得る。異なる組成物のこの非同等性は、化学分野においてしばしば観察される。
【００９１】
生物学的差異に関して、核酸は、遺伝的伝達および発現の作用物質として、生存種の寿命において中心的役割を果たす生物学的物質である。それらのｉｎ  ｖｉｖｏでの性質はほぼ十分に理解されている。しかしながらＰＮＡは、近年開発された完全に人工的な分子であり、化学者の発想で考え出され、合成有機化学を使用して作製される。それは知られている生物学的機能は有していない。
【００９２】
構造上、ＰＮＡは核酸とも劇的に異なる。両者は一般的な核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ）を利用することができるが、これらの分子の骨格は構造上多様である。ＲＮＡおよびＤＮＡの骨格は、反復リン酸ジエステルリボースおよび２−デオキシリボース単位からなる。対照的に、ＰＮＡの骨格はＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなる。さらにＰＮＡ中では、核酸塩基は他のメチレンカルボニル単位によって骨格と結合している。
【００９３】
その名称にもかかわらず、ＰＮＡは酸ではなく、かつＤＮＡおよびＲＮＡ中に存在する基などの帯電した酸性基は含まない。ＰＮＡは形式電荷を欠くので、ＰＮＡは一般にそれらの同等な核酸分子より疎水性が高い。ＰＮＡの疎水特性は、核酸では観察されない非特異的（疎水性／疎水性相互作用）相互作用の可能性を与える。さらに、それがその同等な立体配座がＲＮＡ／ＤＮＡ領域に存在しない構造立体配座をとる能力を有するという条件で、ＰＮＡはアキラルである。
【００９４】
ＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡの間の物理的／化学的差異も相当にある。ＰＮＡは、同じ標的配列と結合する核酸プローブより速く、その相補的核酸と結合する。この挙動は、少なくとも一部分は、ＰＮＡはその骨格に電荷を欠くという事実が原因であると考えられる。さらに、近年の刊行物は、ＰＮＡ中への正に帯電した基の取り込みは、ハイブリダイゼーションの動態を改善することを実証する。それは骨格に電荷を欠くので、ＰＮＡ／核酸複合体の安定性は、類似のＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の安定性より高い。特定の状況において、ＰＮＡは非常に安定した三重らせん複合体を形成するか、または「鎖置換」と呼ばれるプロセスによって小さなループを形成し得る。同等な鎖置換プロセスまたは構造は、ＤＮＡ／ＲＮＡ分野では知られていない。
【００９５】
要約すると、ＰＮＡは配列特異性を有する核酸とハイブリダイズするので、ＰＮＡはプローブベースのアッセイを開発するのに有用な候補である。重要なことに、ＰＮＡプローブは核酸プローブと同等なプローブではない。それにもかかわらず、最もストリンジェントな条件下でさえ、正確な標的配列と密接に関連した配列（例えば、単一点突然変異（一塩基対のミスマッチ）を有する非標的配列）の両方が、標識核酸または標識ＰＮＡプローブとの検出可能な相互作用をしばしば示し得る。密接に関連した非標的配列との任意のハイブリダイゼーションが、望ましくないバックグラウンドシグナルの発生をもたらし得る。配列は非常に密接に関連しているので、複数の点突然変異は、プローブベースのアッセイを使用して検出するのが最も難しい全核酸修飾の一部である。鎌状赤血球貧血および嚢胞性線維症などの多数の疾患は、ゲノム核酸の単一点突然変異によって時折引き起こされる。したがって、プローブベースのアッセイの特異性、感度および信頼性を改善し得る任意の方法、キットまたは組成物が、ＤＮＡ含有サンプルの検出、分析および定量化において有用であろう。
【００９６】
亜硫酸水素ナトリウム
亜硫酸水素ナトリウムで核酸を処理するための方法は、Frommer et al 1992、Proc Natl Acad Sci89:1827-1831;Grigg and Clark 1994 BioAssays 16:431-436;Shapiro et al 1970、J Amer Chem Soc 92:422-423;Wataya and Hayatsu 1972、Biochemistry 11:3583-3588を含む幾つかの参照文献中で見ることができる。
【００９７】
核酸の亜硫酸水素塩処理の成功の改善または向上のための複数の方法は、本出願人によっても開発されている。
【００９８】
核酸の有効な亜硫酸水素塩処理のための例示的なプロトコルを以下に述べる。このプロトコルによって、実質的に全てのＤＮＡが処理された状態となる。この方法は、本明細書ではヒト遺伝子シグネチャー（HGS）方法とも呼ぶ。サンプルまたは試薬の体積または量は変えることができることは理解されよう。
【００９９】
亜硫酸水素塩処理に好ましい方法は、ＵＳ  １０／４２８３１０またはＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００５４９中で見ることができる。
【０１００】
そう望む場合適切な制限酵素で予め消化することができる２μｇのＤＮＡに、２μｌ（１／１０体積）の３ＭのＮａＯＨ（６ｇ、５０ｍｌ水中、新たに作製）を、２０μｌの最終体積で加えた。この工程は二本鎖ＤＮＡ分子を一本鎖形に変性させるが、これは、亜硫酸水素塩試薬が一本鎖分子と優先的に反応するからである。混合物は３７℃で１５分間インキュベートした。室温を超える温度でのインキュベーションを使用して、変性の効率を改善することができる。
【０１０１】
インキュベーション後、２０８μｌの２Ｍメタ重亜硫酸ナトリウム（７．６ｇ、２０ｍｌ水および４１６ｍｌ１０ＮＮａＯＨ中；ＢＤＨ  ＡｎａｌａＲ＃１０３５６．４Ｄ；新たに作製）および１２μｌの１０ｍＭキノール（０．０５５ｇ、５０ｍｌ水中、ＢＤＨ  ＡｎａＩＲ  ＃１０３１２２Ｅ；新たに作製）を連続して加えた。キノールは還元剤であり、試薬の酸化の還元を手助けする。他の還元剤、例えばジチオスレイトール（DTT）、メルカプトエタノール、キノン（ヒドロキノン）、または他の適切な還元剤を使用することもできる。サンプルには２００μｌのミネラルオイルを重層した。ミネラルオイルの重層は試薬の蒸発および酸化を防ぐが、必須ではない。次いでサンプルを５５℃で一晩インキュベートした。あるいはサンプルは、サーマルサイクラーにおいて以下のサイクルにかけることが可能である：約４時間または一晩以下のようにインキュベートする：工程１、５５℃／２時間サイクル、ＰＣＲ機器中；工程２、９５℃／２分間。工程１は約３７℃〜約９０℃の任意の温度で実施することができ、かつ５分〜８時間まで長さを変えることができる。工程２は約７０℃〜約９９℃の任意の温度で実施することができ、かつ約１秒〜６０分、またはそれより長くまで長さを変えることができる。
【０１０２】
メタ重亜硫酸ナトリウムでの処理後、オイルを除去し、ＤＮＡ濃度が低かった場合、１μｌのｔＲＮＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）または２μｌのグリコーゲンを加えた。これらの添加剤は任意選択であり、特にＤＮＡが低い濃度で存在するとき、これらを使用して標的ＤＮＡとの共沈によって得られるＤＮＡの収率を改善することができる。核酸のより有効な沈殿のための担体としての添加剤の使用は、核酸の量が＜０．５μｇであるとき一般に望ましい。
【０１０３】
イソプロパノール浄化処理を以下のように実施した：８００μｌの水をサンプルに加え、混合し、次いで１ｍｌのイソプロパノールを加えた。水またはバッファーは、塩が対象の標的核酸と共に沈殿しないレベルまで、反応容器中の亜硫酸水素塩の濃度を低下させる。本明細書で開示する所望の範囲以下に塩濃度を希釈する限り、希釈は一般に約１／４〜１／１０００である。
【０１０４】
サンプルを再度混合し、少なくとも５分間４℃に放置した。サンプルは微量遠心管中で１０〜１５分間回転させ、ペレットは７０％ＥＴＯＨで２回洗浄し、毎回ボルテックスした。この洗浄処理によって、核酸と共に沈殿した任意の残留塩を除去する。
【０１０５】
ペレットは放置乾燥させ、次いで５０μｌなどの適切な体積のＴ／Ｅ（１０ｍＭトリス／０．１ｍＭＥＤＴＡ）ｐＨ７．０〜１２．５中に再懸濁した。ｐＨ１０．５でのバッファーは特に有効であることが分かっている。核酸を懸濁することが必要であったとき、サンプルは３７℃〜９５℃で１分間〜９６時間インキュベートした。
【０１０６】
ＲＮＡの二次構造を実質的に除去する作用物質
本発明に適した作用物質は、亜硫酸水素塩、ヒドロキシルアミン、酢酸塩またはクエン酸塩を含む。ＷＯ２００５０５４５０２中に記載されたように、亜硫酸水素塩試薬が好ましく、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸水素グアニジウムを含む。この関連で、グアニジウムイオンおよび亜硫酸イオンを含む溶液の調製および後のＲＮＡ処理に亜硫酸水素グアニジウムを使用する、ＲＮＡ処理を実施することができる。
【０１０７】
細胞系
【０１０８】
【表１】
2010521142.tif 000003
【０１０９】
細胞からのＲＮＡ抽出
Ｉ．培地の除去後、１ｍｌのトリゾールを細胞（９０％融合）に直接加えた。
ＩＩ．サンプルをよく混合し、室温で５分間放置して核タンパク質複合体を解離させた。
ＩＩＩ．０．５ｍｌをクリーンなＲＮａｓｅを含まない１．５ｍｌの遠心管に除去した。
ＩＶ．次いでサンプルを１２，０００×ｇで１０分間４℃において回転させて、高分子量ＤＮＡおよび他の混入物を除去した。
Ｖ．上清をクリーンチューブに除去し、１００μｌの１００％クロロホルムを加え、サンプルは１５秒間手作業によって激しく混合し、次いで２〜３分間室温でインキュベートした。
ＶＩ．次いでサンプルを１２，０００×ｇで１０分間４℃において回転させて相を分離した。
ＶＩＩ．上部水相をクリーンチューブに除去し、ピペットの先端が界面から離れた状態に保たれることを確実にし、１μｌの２０ｍｇ／ｍｌのグリコーゲンを加え、サンプルをボルテックスした。
ＶＩＩＩ．等体積の１００％イソプロパノール（０．２５ｍｌ）を加え、チューブをボルテックスし、次いで室温で１０分間放置した。
ＩＸ．次いでサンプルを１２，０００×ｇで１０分間４℃において回転させてＲＮＡをペレット状にした。
Ｘ．上清を除去し、ペレットを０．７５ｍｌの８０％エタノールで洗浄して、ｃＤＮＡ合成反応の阻害剤を除去し、軽くボルテックスし、次いで７，５００×ｇで５分間４℃において回転させてＲＮＡをペレット状にした。
ＸＩ．工程Ｘをさらに１回繰り返した。
ＸＩＩ．次いでペレットを微量遠心管中で１０秒間回転させ、残留エタノールを除去し、ペレットは即座に２５μｌのＲＮａｓｅを含まない水中に再懸濁した。ＮＢ。ペレットが乾燥する場合、したがってＲＮＡを再懸濁することは非常に困難であり、２６０／２８０の比は１．６未満であり得る。
ＸＩＩＩ．次いでＯＤ２６０／２８０／３１０を記録し、必要となるまでＲＮＡは−７０℃で保存した。
【０１１０】
ＲＮＡの調製
望ましい細胞または組織からの抽出後、２０μｌのヌクレアーゼを含まない水中にＲＮＡサンプルを再懸濁した。
【０１１１】
サンプルは６０〜１００℃で２〜３分間加熱し二次構造を分解して、亜硫酸水素塩の反応において即座に使用した。
【０１１２】
亜硫酸水素塩処理
本発明によるＲＮＡの亜硫酸水素塩処理の有効性を実証する例示的なプロトコルを以下に述べる。このプロトコルによって首尾よく、実質的に全てのＲＮＡが処理された状態となった。本発明のこの方法は、本明細書ではヒト遺伝子シグネチャー（HGS）方法とも呼ぶ。サンプルまたは試薬の体積または量は変えることができることは理解されよう。
【０１１３】
２μｇのＲＮＡを合計２０μｌのＲＮａｓｅを含まない水中に再懸濁する。次いでサンプルを６５℃で２分間インキュベートして、二次構造を除去した。インキュベーション後、２０８μｌの２Ｍメタ重亜硫酸ナトリウムｐＨ５．０（７．６ｇ、２０ｍｌ水または１０ｍＭトリス／１ｍＭＥＤＴＡと４１６ｍｌ１０ＮＮａＯＨ中；ＢＤＨ  ＡｎａｌａＲ＃１０３５６．４Ｄ；新たに作製）を連続して加えた。製造者の説明書に従い、ＲＮａｓｅＯＵＴ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０７７７−０１９）などのＲＮａｓｅ阻害剤もこの時点で加えることができる。サンプルには２００μｌのミネラルオイルを重層した。ミネラルオイルの重層は試薬の蒸発および酸化を防ぐが、必須ではない。次いでサンプルは５５℃で一晩インキュベートした。このインキュベーションは約３７℃〜約９０℃の任意の温度で実施することができ、かつ５分〜１６時間まで長さを変えることができる。
【０１１４】
メタ重亜硫酸ナトリウムでの処理後、オイルを除去し、特にＤＮＡ濃度が低かった場合、１μｌのグリコーゲン（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。この添加剤は任意選択であり、特にＲＮＡが低い濃度で存在するとき、これらを使用して標的ＲＮＡとの共沈によって得られるＲＮＡの収率を改善することができる。核酸のより有効な沈殿のための担体としての添加剤の使用は、核酸の量が＜０．５μｇであるとき一般に望ましい。
【０１１５】
イソプロパノール浄化処理を以下のように実施した：８００μｌのＲＮａｓｅを含まない水をサンプルに加え、混合し、次いで１ｍｌのイソプロパノールを加えた。水またはバッファーは、塩が対象の標的核酸と共に沈殿しないレベルまで、反応容器中の亜硫酸水素塩の濃度を低下させる。本明細書で開示する所望の範囲以下に塩濃度を希釈する限り、希釈は一般に約１／４〜１／１０００である。
【０１１６】
サンプルは再度混合し、６０分まで可能であるが、最短で５分間４℃に放置した。サンプルは微量遠心管中で１０〜１５分間回転させ、ペレットは８０％ＥＴＯＨで２回洗浄した。この洗浄処理によって、核酸と共に沈殿した任意の残留塩を除去する。
【０１１７】
ペレットは軽く放置乾燥させて残留エタノールを除去した、ただしこれによって最終的なＲＮＡ収率が低下する可能性があるので、ペレットが完全には乾燥しないことを確実にし、次いで５０μｌなどの適切な体積のＴ／Ｅ（１０ｍＭトリス／０．１ｍＭＥＤＴＡ）ｐＨ７．０〜１２．５中に再懸濁した。製造者の説明書に従い、ＲＮａｓｅＯＵＴ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０７７７−０１９）などのＲＮａｓｅ阻害剤もこの時点で加えることができる。ｐＨ１０．５でのバッファーは特に有効であることが分かっている。核酸を懸濁することが必要であったとき、サンプルは３７℃〜９５℃で１分間〜９６時間インキュベートした。
【０１１８】
ｃＤＮＡ合成
以下の試薬を、薄壁０．５ｍｌのＲＮａｓｅを含まないチューブ中でのそれぞれのｃＤＮＡ合成反応用に調製した。
ＲＮＡ（１μｇ）                    ３．５μｌ
ランダムヘキサマー（１０μＭ）      １μｌ
脱イオン水                          ２．５μｌ
【０１１９】
含有物を混合し、微量遠心管中で軽く回転させた。
【０１２０】
サンプルは７０℃で３分間インキュベートして、ＲＮＡを変性させた。
【０１２１】
ＲＮＡを変性させていた一方で、以下のマスター混合物を調製した：
Ｐｅｒ  ｒｘｎ
５×第一鎖用バッファー      ２μｌ
ＤＴＴ（２０ｍＭ）          １μｌ
５０×ｄＮＴＰ混合物        １μｌ        
合計体積                    ４μｌ
【０１２２】
チューブをＰＣＲ機器から除去し、氷上で２分間冷却し、次いで軽く回転させて含有物を回収した。
【０１２３】
次いでサンプルを４２℃で２分間インキュベートした。
【０１２４】
０．５μｌのＰｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素を反応混合物（１．７５μｌ）当たりに加え、マスター混合物はピペッティングによってよく混合した。
【０１２５】
４．５μｌの完全なマスター混合物をそれぞれのサンプルおよび対照チューブに加え、次いでサンプルを４２℃で６０分間インキュベートし、次いでサンプルを氷上に移した。
【０１２６】
４０μｌの１０ｍＭのトリス／１ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ７．６をそれぞれのサンプルに加えた。
【０１２７】
チューブは７２℃で７分間加熱し、次いで必要となるまで−７０℃で保存した。
【０１２８】
ＰＣＲ増幅
ＰＣＲ増幅は１μｌの亜硫酸水素塩処理ＲＮＡで実施し、ＰＣＲ増幅は、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＰＣＲマスター混合物、６ｎｇ／μｌのそれぞれのプライマーを使用して、１μｌの亜硫酸水素塩処理ゲノムＤＮＡを含む２５μｌの反応混合物で実施した。
【０１２９】
第１ラウンドの増幅の１μｌを第２ラウンドの増幅の反応混合物に移した。ＰＣＲ産物のサンプルは、Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ中に記載された条件下において、ＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ  ＰＸ２サーマルサイクラーで増幅した。
【０１３０】
【表２】
2010521142.tif 000004
【０１３１】
アガロースゲル（２％）は、５０ｍｌのアガロース当たり１滴の臭化エチジウムを含む１％ＴＡＥ（ＣＬＰ＃５４５０）で調製した。５μｌのＰＣＲ由来産物を１μｌの５×アガロースローディングバッファーと混合し、水中水平型電気泳動用タンクを使用して×１ＴＡＥ中で１２５ｍＡにおいて電気泳動にかけた。マーカーは低１００〜１０００ｂｐ型であった。Ｋｏｄａｋ  ＵＶｌｄｏｃ  ＥＤＡＳ２９０系を使用してＵＶ照射下で、ゲルを目に見える状態にした。
【０１３２】
ビーズを使用する検出系
磁気ビーズのコーティング
磁気ビーズとの結合に使用するＩＮＡは、幾つかの方法で修飾することができる。この例では、ＥＤＣなどのヘテロ二官能性リンカーを使用するビーズとＩＮＡの共有結合用に５’または３’アミノ基のいずれかをＩＮＡは含んでいた。しかしながら、ＩＮＡはビオチンなどの５’基で修飾することも可能であり、次いでこれはアビジンまたはステプトアビジン（Steptavidin）基で修飾された磁気ビーズと受動的に結合し得る。
【０１３３】
１０μｌのカルボキシレート修飾Ｍａｇｎａｂｉｎｄ（商標）ビーズ（Pierce）または１００μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ストレプトアビジン（Dynal）をクリーンな１．５ｍｌのチューブに移し、９０μｌのＰＢＳ溶液を加えた。
【０１３４】
ビーズは混合し次いで磁化し、上清は捨てた。ビーズは洗浄１回当たり１００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、最後に９０μｌの５０ｍＭＭＥＳバッファーｐＨ４．５、または製造者の仕様書によって決定した他のバッファー中に再懸濁した。
【０１３５】
１μｌの２５０μＭＩＮＡ（オリゴハイブリダイゼーションの実験により決定した選択ＩＮＡの特異的活性に依存する濃度）をサンプルに加え、チューブをボルテックスし室温で１０〜２０分間放置した。
【０１３６】
１０μｌの新たに調製した１０ｍｇ／ｍｌＥＤＣ溶液（Pierce/Sigma）を次いで加え、サンプルをボルテックスし、室温または４℃のいずれかにおいて６０分までインキュベートする。
【０１３７】
次いでサンプルを磁化し上清を捨て、１０分間０．２５ＭのＮａＯＨまたは０．５ＭのトリスｐＨ８．０のいずれかを１００μｌ加えることによってビーズを阻害することができる。
【０１３８】
次いでビーズをＰＢＳ溶液で２回洗浄し、最後に１００μｌのＰＢＳ溶液中に再懸濁した。
【０１３９】
磁気ビーズを使用するハイブリダイゼーション
１０μｌのＩＮＡコーティングＭａｇｎａｂｉｎｄ（商標）ビーズをクリーンチューブに移し、４０μｌの非希釈または蒸留水に１：１希釈のＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（商標）バッファー（Clontech）、または非希釈または蒸留水に１：１／１：２または１：４希釈のＵｌｔｒａｈｙｂ（商標）バッファー（Ambion）のいずれか、または室内用ハイブリダイゼーションバッファーを加えた。バッファーは、知られている濃度のカチオン性／アニオン性または両性洗浄剤のいずれか、またはヘパリンおよびポリアミノ酸などの他の添加剤を含むこともできる。
【０１４０】
次いでサンプルＲＮＡ１〜５μｌを前述の溶液に加え、チューブをボルテックスし、２０〜６０分間選択したＩＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの融解温度に応じて、５５℃または他の温度で次いでインキュベートした。
【０１４１】
サンプルを磁化し、上清は捨て、ビーズは洗浄１回当たり５分間の初期工程から、ハイブリダイゼーション温度において０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄し、洗浄の間にサンプルを磁化した。
【０１４２】
放射標識した検出用球体の調製
ＩＮＡまたはオリゴ分子は、アミン基、チオール基またはビオチンなどの分子で３’または５’のいずれかを標識することができる。
【０１４３】
標識分子は、第１標識に対して分子の逆末端に取り込まれたＰ３２またはＩ１２５などの第２標識を有することもできる。
【０１４４】
この二重標識検出用分子は現在、ＥＤＣなどのヘテロ二官能性リンカーを使用して、知られている大きさのカルボキシレートまたは修飾ラテックスビーズと共有結合させることが可能である。
【０１４５】
次いで非結合分子を洗浄によって除去することができ、多数の特異的検出用／シグナル増幅分子でコーティングされたビーズを切り離すことができる。
【０１４６】
次いでこれらのビーズを対象の核酸サンプルとハイブリダイズさせて、シグナル増幅をもたらすことが可能である。
【０１４７】
蛍光標識した検出用球体の調製
ＩＮＡまたはオリゴ分子は、アミン基、チオール基またはビオチンなどの分子で３’または５’のいずれかを標識することができる。
【０１４８】
標識分子は、第１標識に対して分子の逆末端に取り込まれたＣｙ−３、Ｃｙ−５、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡまたは任意の他の適切な蛍光分子などの第２標識を有することもできる。
【０１４９】
この二重標識検出用分子は現在、ＥＤＣなどのヘテロ二官能性リンカーを使用して、知られている大きさのカルボキシレートまたは修飾ラテックスビーズと共有結合させることが可能である。
【０１５０】
次いで非結合分子を洗浄によって除去することができ、多数の特異的検出用／シグナル増幅分子でコーティングされたビーズを切り離すことができる。
【０１５１】
次いでこれらのビーズを対象のＲＮＡサンプルとハイブリダイズさせて、シグナル増幅をもたらすことが可能である。
【０１５２】
酵素標識した検出用球体の調製
ＩＮＡまたはオリゴ分子は、アミン基またはチオール基などの分子で３’または５’のいずれかを標識することができる。
【０１５３】
標識分子は、第１標識に対して分子の逆末端に、ヘテロ二官能性リンカーによって結合したビオチンまたはホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの他の分子などの第２標識を有することもできる。
【０１５４】
この二重標識検出用分子は現在、ＥＤＣなどのヘテロ二官能性リンカーを使用して、知られている大きさのカルボキシレートまたは修飾ラテックスビーズと共有結合させることが可能である。
【０１５５】
次いで非結合分子を洗浄によって除去することができ、多数の特異的検出用／シグナル増幅分子でコーティングされたビーズを切り離すことができる。
【０１５６】
次いでこれらのビーズを対象の核酸サンプルとハイブリダイズさせて、シグナル増幅をもたらすことが可能である。
【０１５７】
次いで、シグナル増幅は、ストレプトアビジンなどの分子の結合または発色基質が関与する酵素反応によって実施することができる。
【０１５８】
ＩＮＡオリゴマーの組合せ
初期ハイブリダイゼーション事象では、対象のＲＮＡと相補的なＩＮＡでコーティングされた磁気ビーズを使用することが好ましい。
【０１５９】
必要とされる場合、第二のハイブリダイゼーション事象は、前述の検出法のいずれかを含むことができる。
【０１６０】
このハイブリダイゼーション反応は、対象の核酸と相補的な第二のＩＮＡ、または対象のＲＮＡと相補的なオリゴもしくは修飾オリゴのいずれかを用いて行うことができる。
【０１６１】
デンドリマーおよびアプタマー
デンドリマーは、特異的分子で標識した多層を生成することができるように調節した方法で化学的に合成することができる、枝分かれした樹状の分子である。デンドリマーは中心から末端に、またはその逆に段階的に合成した。
【０１６２】
デンドリマーの構造およびその生成に影響を与える最も重要なパラメーターの１つは、それぞれの工程で生成する枝の数であり、これが所望の分子を構築するのに必要とされる反復工程の数を決定する。
【０１６３】
Ｉ１２５またはＰ３２などの放射標識、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡまたは任意の他の適切な蛍光分子などの蛍光標識を含むデンドリマーを合成して、シグナル増幅を促進することができる。
【０１６４】
あるいは、修飾ＩＮＡまたはＤＮＡ分子と結合させるために使用することができるカルボキシレート基または任意の他の反応基を含む、デンドリマーを合成することができる。
【０１６５】
アレイを使用する検出系
処理したＲＮＡを任意の適切な支持体につけて、対象の遺伝子または発現単位の活性に関してスクリーニングすることができるマイクロアレイなどのアレイを形成することができる。当業者は、適切なアレイを作製するのに適した技法に精通しているはずである。
【実施例】
【０１６６】
図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃは、本発明（亜硫酸水素塩処理ＲＮＡ）と典型的なマイクロアレイベースのアッセイを使用する従来技術の比較を示す。図１Ａは、典型的なマイクロアレイベースのアッセイの説明を示すが、この場合暗色点は特定のＲＮＡ集団中でアップレギュレーションされる遺伝子を示し、かつ淡色点は同じ集団中でダウンレギュレーションされる遺伝子を示す。暗色および淡色の矢印は、従来系中の検出分子がそれらの標的と結合するのを妨げる二次構造のため、従来の方法ではなく亜硫酸水素塩処理ＲＮＡにおいて、それぞれアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされるとして検出される遺伝子を示す。
【０１６７】
図１Ｂは、図１Ａと同様のマイクロアレイベースのアッセイを示すが、暗色および淡色の矢印は、発現分析前の酵素によるＲＮＡの操作中に生じＲＮＡ発現レベルの不正確な決定をもたらす偏りのため、従来の方法ではなく亜硫酸水素塩処理ＲＮＡにおいて、それぞれアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされるとして検出される遺伝子を示す。酵素による操作は誤解を与える結果を引き起こし、特定の遺伝子は、それらが実際そのように制御されないときにアップまたはダウンレギュレーションされることを示し得る。
【０１６８】
図１Ｃは、図１Ａと同様のマイクロアレイベースのアッセイを示すが、暗色および淡色の矢印は、検出分子の改善された特異性のため、従来の方法ではなく亜硫酸水素塩処理ＲＮＡにおいて、それぞれアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされるとして検出される遺伝子を示す。検出分子の特異的結合強度の増大は、特異性の欠如のため従来の方法を使用して検出することができないＲＮＡ種の検出をもたらす。
【０１６９】
アクチン
既に記載したように、ＲＮＡを抽出および精製し、次いで亜硫酸水素塩処理および増幅した。増幅後、製造者によって指示されたようにＭａｒｌｉｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットを使用してＰＣＲ産物を精製し、２０μｌの水中に再懸濁した。１００ｎｇの逆方向プライマーを１０μｌのＰＣＲ産物に加え、これらのサンプルはＤＮＡ塩基配列決定用にＳｕｐｅｒｍａｃ（Camperdown、Sydney）に送った。
【０１７０】
図２は、細胞系物質由来の亜硫酸水素塩修飾した全ＲＮＡを使用する逆転写酵素のＰＣＲを示す。この図から見ることができるように、アクチン遺伝子のエクソン３ａ〜４またはエクソン３ａ〜３ｂを対象とする野生型プライマー（非亜硫酸水素塩転換型）を使用すると、いずれの場合も増幅産物は得られない。これはＲＮＡの転換は非常に有効であることを示すが、これは、野生型配列を検出することができないからである。逆に、亜硫酸水素塩転換型プライマーを同じサンプルでエクソン３ａ〜４またはエクソン３ａ〜３ｂに使用する場合、異なるＰＣＲバンドが生成し、亜硫酸水素塩転換型物質から特定のｍＲＮＡを増幅することが可能であることを示す。
【０１７１】
図３は、亜硫酸水素塩転換型ＲＮＡから生成したＰＣＲ産物の直接的な塩基配列決定を示す。塩基配列決定プロファイルから見ることができるように、ＰＣＲ産物は混入ＤＮＡではなくＲＮＡに由来するが、これは、これらの産物の配列がエクソン３と４の間のスプライス部位にわたって続くからである。さらに、図３から見ることができるように、ＰＣＲ産物は完全に転換されているが、これは、サンプル中の元のＣ残基がここではＴ残基に転換されるからである。
【０１７２】
Ｃ型肝炎ウイルス
Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）のＲＮＡサンプルは、Ａｃｒｏｍｅｔｒｉｘ（ＯｐｔｉＱｕａｌ  ＨＣＶ高陽性対照）またはＢＢＩ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＨＣＶ  ＲＮＡ直線性パネル）から得て、製造者の説明に従いＵｌｔｒａｓｅｎｓウイルス精製キットを用いて精製した。サンプルは亜硫酸水素ナトリウムで処理し、転換型ＨＣＶのＲＮＡサンプルは以下のようにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）を用いて逆転写した：
１１μｌの転換型ＲＮＡ鋳型
１μｌのランダムプライマー（３００ｎｇ／μｌ）
１μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
【０１７３】
サンプルは６５℃で５分間加熱し、次いで少なくとも１分間氷上に即座に置き、その後以下の試薬を加えた：
４μｌの５×第一鎖用バッファー
１μｌのＲＮａｓｅＯＵＴ（４０Ｕ／μｌ）
１μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）
１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（２００Ｕ／μｌ）
【０１７４】
サンプルは以下の条件を使用して逆転写した：
２５℃、１２分間
２７℃、２分間
２９℃、２分間
３１℃、２分間
３３℃、２分間
３５℃、２分間
３７℃、３０分間
４５℃、１５分間
５０℃、５分間
７５℃、５分間
【０１７５】
次いで２μｌのｃＤＮＡを、ＨＣＶの５’ＮＴＲに特異的なプライマーおよびプローブを用いてＰＣＲで増幅した：
（順方向プライマー−ｔｔａｔｇｔａｇａａａｇｔｇｔｔｔａｇｔｔａｔｇｇｔｇｔ（配列番号９）；
逆方向プライマー−ａｃｃｃａａａｔｙｔｃｃａａａｙａｔｔａａａｃａａａｔ（配列番号１０）；
プローブ−ｔｃＣａｃＡａａＣｃａＣｔａＴａａＣｔｃＴｃｃ（配列番号１１）、
（前式で大文字はＬＮＡの存在を示す）、Ｃｏｒｂｅｔｔ  ６０００  Ｒｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅにおいて以下の試薬およびサイクル条件を使用した：
Ｓｉｇｍａ  Ｊｕｍｐｓｔａｒｔ  ２×マスター混合物  １２．５μｌ
順方向プライマー  ５０ｎｇ
逆方向プライマー  ５０ｎｇ
２５ｍＭのＭｇＣｌ２  ３．５μｌ
４００ｎＭのプローブ（最終濃度）  ×μｌ
２３μｌまでの水  ×μｌ
９５℃、１０分間
９５℃、１０秒間（５０×）
５３℃、９０秒間（５０×）
６０℃、３０秒間
【０１７６】
結果は図４中に示し、この場合図４から見ることができるアッセイに関する検出限界は約２．５ＩＵのウイルスである。
【０１７７】
【表３】
2010521142.tif 000005
【０１７８】
図４中に示したゲルの結果は、亜硫酸水素塩の方法を使用して、２．５ＩＵのＨＣＶまで低い広範囲の標的濃度におけるＨＣＶの発現レベルをモニタリングすることができることを示す。
ｎｃ＝陰性対照
【０１７９】
ＨＣＶに関する直線性パネルの滴定のリアルタイムｑＰＣＲによる結果は図５中に示す。このプロットに関する標準曲線は、０．９９９４７のＲ値および０．９９８９のＲ２値を有する直線であった。
【０１８０】
【表４】
2010521142.tif 000006
【０１８１】
ＨＣＶに関するダイナミックレンジの滴定に関する定量化の報告のリアルタイムｑＰＣＲによる結果は図６中に示す。このプロットに関する標準曲線は、０．９９８５６のＲ値および０．９９７１３のＲ２値を有する直線であった。
【０１８２】
【表５】
2010521142.tif 000007
【０１８３】
直線性パネルおよびダイナミックレンジのサンプルからの結果は、リアルタイムＰＣＲ中に作成した定量曲線を示す。曲線のラインが閾値と交差する地点はＣｔ値として知られ、サンプルの定量化に使用する。サンプルのそれぞれのセットに関して３桁を超える、一連の知られている濃度のウイルスを精製し、亜硫酸水素塩転換および増幅し、作成した標準曲線は、１に近いＲ２値によって例示されるように、反応効率は調べた濃度範囲で一定で直線的であることを示す。これらの結果および図４中に示した結果は、１５６２５０ＩＵから１．５ＩＵまでの範囲で、ウイルス特異的プローブを使用する終点ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲを使用すると、ＨＣＶウイルスＲＮＡの検出に関して優れた感度および特異性が存在することを実証し、このアッセイは、非常に広範囲の濃度でウイルス遺伝子の発現を検出することができることを示す。
【０１８４】
広く記載する本発明の精神または範囲から逸脱せずに、具体的な実施形態中に示すように本発明に対して多数の変形および／または変更をなすことができることは、当業者によって理解されよう。したがって、本発明の実施形態は全ての点で例示的であり、かつ制限的ではないとみなすべきである。
【図１Ａ】
2010521142.tif 000008
【図１Ｂ】
2010521142.tif 000009
【図１Ｃ】
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【図２】
2010521142.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2010521142000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月6日(2009.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をｍＲＮＡの二次構造を実質的に除去する条件下において亜硫酸水素塩作用物質で処理することと、
塩基Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、及びＣ（シトシン）を含み、かつ、Ｇ（グアニン）が実質的にないプローブを用いて処理したｍＲＮＡの存在または量を測定して遺伝子発現の指標を得ることと
を含む遺伝子発現のアッセイ。
【請求項２】
前記プローブがオリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＩＮＡプローブから選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記プローブがＩＮＡプローブである、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記ｍＲＮＡが動物、植物、微生物、細胞、細胞群または細胞集団由来である、請求項１から３のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記微生物がウイルスまたは細菌である、請求項４に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記動物がヒトである、請求項４に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記作用物質が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項１から６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項８】
ｍＲＮＡをｍＲＮＡの二次構造を実質的に除去する条件下において亜硫酸水素塩作用物質で処理することと、
ｍＲＮＡの相補配列と結合することができるプライマー（当該プライマーは、塩基Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、及びＣ（シトシン）を含み、かつ、Ｇ（グアニン）が実質的にない）を使用してｍＲＮＡを逆転写および増幅することと、
処理および増幅したｍＲＮＡの存在または量を測定して遺伝子発現の指標を得ることと
を含む遺伝子発現のアッセイ。
【請求項９】
前記ｍＲＮＡが動物、植物、微生物、細胞、細胞群または細胞集団由来である、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記微生物がウイルスまたは細菌である、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記動物がヒトである、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記作用物質が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項８から１１のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１３】
ｍＲＮＡの二次構造を実質的に除去する条件下において亜硫酸水素塩作用物質を用いる遺伝子発現のアッセイにおける、塩基Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、及びＣ（シトシン）を含み、かつ、Ｇ（グアニン）が実質的にないオリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＩＮＡプローブの使用。
【請求項１４】
前記プローブがＩＮＡプローブである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記作用物質が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項１３又は１４に記載の使用。
【国際調査報告】
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