(57)【要約】間葉系幹細胞亜集団および破骨細胞のマーカ、抗体、および組換えｓｃＦｖ。本発明は、間葉系幹細胞および前破骨細胞により発現される表面膜結合糖タンパク質の特異的エピトープに関し、特定のエピトープに対して産生された単クローン抗体および組換えｓｃＦｖまたはそのフラグメント等の抗体と、骨髄における「間質前駆細胞」（ＳＰＣ）と呼ばれるもの等の間葉系幹細胞亜集団の同定、単離および特徴づけ、および末梢血における前破骨細胞の同定、単離および特徴づけにおける、それらの使用に関する。細胞表面上の特異的エピトープに対する結合により、従来の細胞選別方法によるｌｉｍｂｉｎ／ＥＶＣ―２検出および分離が促進される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１またはこれと実質的に相同の配列を含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２またはこれと実質的に相同の配列を含む、核酸配列。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項２に記載のＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドに対して産生された、抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
配列番号３のアミノ酸配列または配列番号４によりコードされるアミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項５】
請求項１、３または４のいずれか一つに記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項６】
配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０またはこれと実質的に相同の配列を含む群より選択される配列を含む、核酸分子。
【請求項７】
配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９またはこれと実質的に相同の配列を含む群より選択される配列を含む、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項２、５または６のいずれか一つに記載の核酸分子を含む、ベクター発現系。
【請求項９】
請求項２、５または６のいずれか一つに記載の核酸でトランスフェクションされるか、または請求項８に記載のベクター系を含む、細胞。
【請求項１０】
間葉系幹細胞または破骨細胞に対する抗体または抗体フラグメントを生成するための、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項２に記載のヌクレオチド配列の使用。
【請求項１１】
間葉系幹細胞または破骨細胞を同定するための、請求項１または７に記載のポリペプチド、請求項３または４に記載の抗体、請求項２、５または６のいずれか一つに記載の核酸、請求項８に記載のベクター発現系または請求項９に記載の細胞の使用。
【請求項１２】
前記細胞集団がＳＰＣ集団である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
変性疾患、心血管疾患、炎症性疾患、または自己免疫疾患の治療のための薬物の製剤における、請求項１または７に記載のポリペプチド、請求項３または４に記載の抗体、請求項２、５または６のいずれか一つに記載の核酸、請求項８に記載のベクター発現系または請求項９に記載の細胞の使用。
【請求項１４】
前記変性疾患、心血管疾患、炎症性疾患、または自己免疫疾患が、パーキンソン病またはアルツハイマー病を含む群より選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
成体組織からＭＳＣを、または血液から前破骨細胞を濃縮、精製または単離する方法であり、該方法は、
（ｉ）細胞の混合集団を、請求項３に記載の抗体もしくは抗体フラグメント、または請求項９に記載の使用により作製される抗体もしくは抗体フラグメントで処理する工程と；
（ｉｉ）該抗体と反応する同定された細胞を、ＭＳＣまたは破骨細胞であるものとして、単離する工程と
を含む、方法。
【請求項１６】
前記ＭＳＣがＳＰＣである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法にしたがって濃縮、精製または単離された、ＭＳＣ集団。
【請求項１８】
ＭＳＣ集団の単離、選択または濃縮のさらなる方法を同定するための、請求項１７に記載のＭＳＣ集団の使用。
【請求項１９】
請求項１５または１６に記載の方法により単離される細胞、または請求項１７に記載の集団で、患者を治療する工程を含む、損傷組織を修復する方法。
【請求項２０】
請求項１５または１６に記載の方法により単離される幹細胞、または請求項１７に記載の幹細胞を、治療的に有効な量含む、医薬組成物。
【請求項２１】
ＭＳＣの部位への標的遺伝子治療を可能にするために、遺伝子送達系と接合された、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項３、４または７のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチド、または請求項３、４または７に記載の抗体を含む、遺伝子送達系。
【請求項２３】
ＭＳＣを傷害部位に結合するために、医療デバイスをコートするための、請求項１に記載のポリペプチド、または請求項３、４または７に記載の抗体の使用。
【請求項２４】
請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項３、４または７に記載の抗体でコートされた、医療デバイス。
【請求項２５】
縫合糸、ステント、組織足場、骨インプラント、または創傷被覆材より選択される、請求項２４に記載の医療デバイス。
【請求項２６】
配列番号１１〜１８からなる群より選択される、核酸配列。
【請求項２７】
癌診断の方法における、配列番号１〜１８のいずれかの使用。
【請求項２８】
配列番号３、５、７または９のヒト化バージョンである、ヒト化抗体。
【請求項２９】
骨粗鬆症の診断法における、配列番号１〜１８のいずれかの使用。
【請求項３０】
添付の図面、表、配列および付属物に関して本明細書に実質的に説明される、ポリペプチド、核酸分子、抗体、ベクター発現系、細胞または細胞集団、医薬組成物、使用、医療デバイス、遺伝子送達系または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞および前破骨細胞により発現される表面膜結合糖タンパク質の特異的エピトープに関し、特定のエピトープに対して産生された単クローン抗体および組換えｓｃＦｖまたはそのフラグメント等の抗体と、骨髄における「間質前駆細胞」（ＳＰＣ）と呼ばれるもの等の間葉系幹細胞亜集団の同定、単離および特徴づけ、および末梢血における前破骨細胞の同定、単離および特徴づけにおける、それらの使用に関する。細胞表面上の特異的エピトープに対する結合により、従来の細胞選別方法によるｌｉｍｂｉｎ／ＥＶＣ―２検出および分離が促進される。本発明はさらに、間葉系幹細胞亜集団および前破骨細胞の表面上に存在するタンパク質に対する、多数の他の抗体およびｓｃＦｖに関する。本発明は、骨髄試料（および他の成体組織）に見つけられる幹細胞集団、および末梢血試料等に見つけられる前破骨細胞の、ワンステップ精製プロセスにおける本発明の用途のキット、およびそのような精製プロセスにも関する。
【背景技術】
【０００２】
成体幹細胞療法は、神経、筋肉および心血管組織、および軟骨等の間葉系ソースから得られるその他の組織を含む、多数の組織タイプの再生による、損傷組織修復に非常に有望である［１―６］。成体幹細胞ベースの療法は、胚幹細胞よりも規制の心配や世論の逆風がずっと少ない。再生医療および組織工学の分野では、骨髄から得られる非造血幹細胞の治療上の可能性に高い関心がある。
【０００３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、多くの理由から特に関心が高い。患者自身の骨髄からの細胞の使用が、拒絶反応が生じる問題を防ぎ、損傷組織をはるかに健康な状態に戻す。さらに、成人骨髄または末梢成人血液から得られるＭＳＣの使用が、幹細胞採取のための胎生細胞の使用に関する倫理的問題を防ぐ。ＭＳＣおよび破骨細胞の両者は、近い関係にあり、癌転移に関係し、したがって抗転移癌療法の標的を提供すると考えられる［５６―５８］。
【０００４】
間葉系幹細胞は、非造血組織の前駆体である多能性幹細胞である。培養ＭＳＣは、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞または脂肪細胞に分化する能力を維持する［１、３、７―９］。ＭＳＣは、血清を伴わずにトランスフォーメーション成長因子（ＴＧＦ）の存在下で培養されると、軟骨細胞に分化し、血清中でアスコルビン酸およびデキサメサゾンを伴って培養されると、骨細胞に分化する［１０―１８］。このような分化決定された培養細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおかれると、損傷組織（例えば軟骨）に分化する［１９］。一定の条件下で、ＭＳＣが、神経細胞に分化できることも観察されている［２０］。
【０００５】
現時点では、いわゆる「プレーティング法」によりＭＳＣを精製する既存の方法は、骨髄穿刺液の遠心分離、細胞の細胞培養培地への再懸濁、およびその後の細胞培養フラスコへの細胞の播種を伴う。またはドナーの腸骨稜から得られた骨髄穿刺液のパーコール分画が粗製であり、形態学的および表現型的に異種のＭＳＣを濃縮する［１、３、７、９、２１、２２］。幹細胞を、その表現型的に可視の特徴にもとづいて、同定するのは不可能である。ＭＳＣを同定し、濃縮するために、現在の幹細胞マーカ技術が用いられる。全ての幹細胞は、標識分子、例えば抗体に選択的に結合または付着する能力を有するために生物学的マーカとして働く、幹細胞糖タンパク質レセプターでコートされる。シグナル分子に対する様々な親和性を有する、多くのタイプのマーカがある。各幹細胞型が、特定の組み合わせのレセプターを有し、細胞を互いに識別可能にする。抗体は、幹細胞特異的レセプターに結合でき、結合する抗体または抗体の組み合わせが、幹細胞型に特徴的な特定のプロフィールを生成する。現在では、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣｓ）等の分子生物学的技術を用いて、標識細胞が単離および特徴づけされる。ダイレクトプレーティングまたは現在の市販抗体により単離される、培養ＭＳＣの抗原プロフィールは、ユニークでない。培養ＭＳＣにより発現されることが報告される細胞マーカには、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、ＣＤ４９ａ、ＣＤ６１、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０９、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６４、ＣＤ１６６、ＣＤ１７２ａが含まれるが、これらは全て発現パターンが普遍的である［２、３、７、９、２２―２５］。培養間葉系幹細胞は、系統に向かって分化する前に抗体を結合／マーカを発現する。間葉系幹細胞が完全に分化した後は、レッドオイルＯ染色等の他のアッセイが使用される。しかし、多くの他の細胞型がマーカの多くを発現するため、これらの抗体を結合する。必要な抗体のカクテルの使用は、ＭＳＣを特徴づけするための、高価で、非効率的で時間がかかる方法である。
【０００６】
現在は、同種のＭＳＣ集団をヒト骨髄から直接特異的に単離する、組換えｓｃＦｖ（単鎖可変フラグメント）は販売されていない。ＭＳＣを特徴づけするために、二つの抗体のみが利用されている：単鎖抗体Ｃ１５、およびマウスＩｇＭ抗体ＳＴＲＯ―１であり、ハイブリドーマ技術を用いて開発されている［２６―２８］。しかし、Ｃ１５およびＳＴＲＯ―１に関連する問題には、高度に保存されたタンパク質に対するマウス免疫反応における乏しい免疫原性およびメモリー不足の結果として、一般に免疫寛容により生じる、フローサイトメトリによる非特異的結合が含まれる［２９―３２］。ヒトとマウスの進化的関係は、ヒトとニワトリの関係より近い。ゲノムの遺伝分析により、鳥類と哺乳類の進化的分岐が、マウスとヒトの進化的分岐より以前に生じることが明らかとなった。したがって、マウスがヒトタンパク質／抗原で免疫されると、最適未満の抗体が生成される。マウス宿主は、種間の進化的距離がより近いために認識の程度がより高いことから、「似ている」ため、ヒト配列に対する寛容性がより高いと考えられる。頻繁に使用されるアミノ酸ストレッチに大きな変化を生じさせるための進化の時間がより長いため、ヒトタンパク質はニワトリにおいて認識されにくい。これにより、ニワトリにおいては、より高い免疫原性反応が観察される。
【０００７】
ＳＴＲＯ―１は、バックグラウンド結合が非常に高いため、ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）ベースのアッセイにおいてあまり有効でない。ＳＴＲＯ―１は、ＭＳＣに特異的でない。さらに、ＭＳＣに結合するときにも、蛍光強度に十分な変化を与えない。実際、得られるシグナルは、アッセイのバックグラウンドノイズを少し上回るだけである。現在は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＭＳＣにより発現される他の公知のマーカがほとんどない。その結果、ＭＳＣは、ＭＳＣに特異的でなく、これらのマーカ、例えばＳＴＲＯ―１を発現する細胞だけを濃縮する抗体を用いたＦＡＣｓ分取、およびＭｉｌｔｅｎｙｉにより供給されるおよびＬＮＧＦＲ  ＭＡＣｓキットにより、哺乳類骨髄からルーチン的に単離される。これらの抗体または抗体の組み合わせは、間質前駆細胞（ＳＰＣ）と呼ばれるＭＳＣ亜集団を精製するための、我々のワンステップ「ＴＭＳＣ３」特徴づけ方法で置き換えられうる。ＴＭＳＣ１、２または４が、ＭＳＣ単離のための追加的選択肢を提供し、これらのｓｃＦｖの各々が、認識される特異的細胞表面マーカに基づいて、研究者により選択されうる。
【０００８】
あるいは、ＭＳＣは、プラスチックに付着するそれらの傾向により単離されうる［７］。それらは、培養においてプラスチックに容易に接着し、非接着造血細胞集団の大半を除去する長期細胞培養により単離され、一方で任意の最終分化接着細胞は、徐々に死ぬ。しかし、結果として得られた亜集団が光および蛍光顕微鏡法により検査されると、異なるサイズの小円形単細胞および多形性細胞に加えて、繊維芽細胞様細胞からなる、異種の集団を示す。さらに、培養に残る変異した最終分化細胞は、偽陽性集団を生じうる［３３―３５］。
【０００９】
現在は、骨髄からＭＳＣを単離するために用いられる抗体カクテルがなく、現在の「ダイレクトプレーティング」、および市販の骨髄由来ＭＳＣの単離および特徴づけのための方法は、同種集団を提供せず、異なる幹性をもつ分化決定されていない前駆体および分化決定された前駆体の取り合わせからなる。
【００１０】
現在のフローサイトメトリまたは磁気細胞選別戦略は、ＭＳＣを限られた様式でのみ濃縮する、マウスまたはラット抗体を使用する［３６―４４］。現在の市販抗体により検出される細胞表面マーカの多くが、様々な他の細胞に発現されるため、不要な細胞の選択が生じ、ＭＳＣの純度が損なわれる。さらに、従来の抗体の一部は、望ましくない特性を有する。例えばＩｇＭは、扱いが非常に困難であり、アッセイにおいて大きなバックグラウンドを生じ、標的レセプターに対する高い親和性をもたないことが多い［２６、２９、３０］。
【００１１】
現在、ヒト骨髄から直接に同種のＭＳＣを特異的に標識し精製することを可能にする、市販の抗体、単クローン抗体、組み換えｓｃＦｖまたはｓｃＦＶフラグメントまたは方法はない。新しい細胞表面抗原の同定は、ＭＳＣの同定、単離およびさらなる特徴づけにおいて非常に大きな価値をもつ。本発明は、同種のＭＳＣ集団の、より優れた特徴づけおよび精製を提供し、それにより、再生医療用の、治療的に有効な製剤の改良をもたらす。ＴＭＳＣ１、２、３または４抗体の各々が、亜集団のワンステップ精製を提供する。ＭＳＣ結合のより高い特異性により、フローサイトメトリ実験において蛍光強度のより高いシフトが生じ、したがってより高感度なアッセイをもたらす。本発明の組換えｓｃＦｖおよびそのフラグメントは、ＴＭＳＣ３またはＴＭＳＣ１、２および４の対応する細胞マーカの場合において、Ｌｉｍｂｉｎレセプターと特異的相互作用により結合することにより、ＭＳＣに対するより高い特異性をもつため、従来使用される抗体より優れている。
【００１２】
高度に進歩した細胞ベース療法の将来の開発は、従来のＭＳＣ製剤において見られるような、汚染された治療上無効な細胞を増幅する材料および研究時間等の資源の無駄を制限しながら、可能な限り治療効果のある細胞を入手し増殖させる能力に大きく依存する。
【００１３】
現在の細胞ベースの病気の治療、たとえば骨関節炎および心臓血管疾患の治療の一部は、有効な細胞が製剤全体のわずかにすぎず、そのために治療的可能性が限られているために失敗すると考えられる。もし改良されたＭＳＣの製剤を実現できれば、それらはＭＳＣベースの療法の大きな進歩につながる。
【００１４】
特許文献１は、軟骨生成細胞に分化決定されたＭＳＣにより発現されるインテグリンアルファ１０鎖糖タンパク質の細胞外Ｉ―ドメインに特異的な、新規な抗体およびその関連フラグメント抗体を生成するハイブリドーマ細胞株に関する。抗体を用いて、ＭＳＣ、軟骨細胞および胚幹細胞の集団が単離されるが、そのいずれもインテグリンアルファ１０ベータ１を発現する。
【００１５】
特許文献２は、体性幹細胞の同定および単離のための方法であり、これらの幹細胞マーカの抗原に対して産生された抗体を用いて、その中の定義された配列のいずれか、またはアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、またはそのフラグメントを検出することによる、方法を開示する。
【００１６】
特許文献３は、間葉または造血幹細胞からの原始前間葉、前造血前駆幹細胞の同定および選別における、Ｏｓｆ２  ＲＮＡまたは分子マーカとしての発現Ｏｓｆ２ポリペプチドの発現および使用を開示する。しかし、これらの抗体はいずれも、ＭＳＣに特異的でない。
【００１７】
Ｌｉｍｂｉｎは、ＥＶＣ２（エリスバンクレベルト症候群２）遺伝子の発現産物であることが知られる。本発明の技術は、ｌｉｍｂｉｎが間葉系幹細胞の細胞表面に発現されることを、初めて決定した。本発明は、Ｌｉｍｂｉｎを用いて、間葉系幹細胞を選択的に単離し、特徴づけできるという、予想外の結果を提供する。Ｌｉｍｂｉｎに対応するアミノ酸配列および核酸配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＹ１８５２１０の下に蓄積される。
【００１８】
現在の文献は、ウシにおける、エリスバンクレベルト症候群および小人症におけるＬｉｍｂｉｎの役割を示唆する。このタンパク質の正確な機能は知られていないが、正常な成長および発達に重要であると思われる。ＥＶＣ２遺伝子は、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、および運動に使われる筋肉（骨格筋）を含む、出生前のいくつかの臓器および組織において活性である。ＥＶＣ２遺伝子の変化が、Ｗｅｙｅｒｓ骨形成不全と呼ばれる骨格障害を引き起こすとも考えられる。この状態の人は、軽度の低身長を有しうるが、多くの場合は平均的身長である。他の特徴には、余分の指および足指（多指症）、爪の異常形成、および歯の異常が含まれる。一つのＥＶＣ２突然変異だけが、Ｗｅｙｅｒｓ骨形成不全と関連付けられている。Ｌｉｍｂｉｎは、骨のＣＤ１４＋ｖｅ破骨細胞により発現されることも報告される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０１２７３９８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／００８８８９０号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／０１５７０７８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的
本発明は、ＭＳＣ特異的エピトープの同定、およびＭＳＣエピトープに結合可能な単クローン抗体、組換えｓｃＦｖおよびｓｃＦｖフラグメント等の抗体の提供により、間葉系幹細胞を特徴づけおよび単離する改良された方法の提供を目的とする。さらなる目的は、ＳＰＣを単離するために特に適する方法を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、間葉系（ｍｅｓｃｈｅｎｙｍａｌ）幹細胞、特にＳＰＣを同定および精製するために使用できる、ワンステップの信頼性が高い検出キットを提供することである。
【００２２】
さらなる目的は、ＭＳＣまたはＳＰＣ研究において現在使用される抗体、単クローン抗体または抗体の組み合わせの代わりに使用できる、組換えｓｃＦｖおよびｓｃＦｖフラグメントを提供することである。
【００２３】
本発明の目的は、従来のＭＳＣ製剤にしばしば見られる「汚染した」治療上無効な細胞を増幅する培地、時間、細胞培養インキュベータスペース等の、研究資源の無駄を最小限にしながら、最も治療効果のある間葉系細胞を単離および成長させることである。
【００２４】
本発明の目的は、間葉系幹細胞の精製におけるツールとして使用でき、細胞を分析する手段として使用できる、単クローン抗体、組換えｓｃＦｖおよびｓｃＦｖフラグメント、等の抗体を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、心筋梗塞、骨関節炎および脊髄損傷等の、変性組織要素を含む状態を治療する方法を提供することである。このような方法は、患者および／または患者に移植するための細胞を、本発明の細胞、ベクター、タンパク質、ポリペプチド、組換えｓｃＦｖ、組換えｓｃＦｖフラグメント、および核酸配列の一つ以上により、処置することを伴う。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、ｌｉｍｂｉｎエピトープに結合し、標的薬物送達を促進する化学化合物に対する組換えｓｃＦｖの結合により、標的薬物送達を促進するために使用できるエピトープを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明によれば、アミノ酸配列、配列番号１：ＤＬＶＥＫＶＲＧＥ、およびｌｉｍｂｉｎエピトープペプチドに対応する配列番号１と実質的に相同の配列を含む群より選択されるポリペプチドが提供される（実質的に相同とは、ストリンジェントな条件下で、当該配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を有することを意味する）。
【００２８】
本発明は、核酸配列番号２、およびｌｉｍｂｉｎエピトープＤＮＡ配列に対応する、配列番号２と実質的に相同の配列にも関する（実質的に相同とは、ストリンジェントな条件下で、当該配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を有することを意味する）。
【００２９】
本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドまたはヌクレオチド配列の使用により、間葉系幹細胞に対する抗体または抗体フラグメントを生成する方法を提供する。
【００３０】
本発明は、本明細書に記載の群ｌｉｍｂｉｎエピトープ、ｌｉｍｂｉｎポリペプチドフラグメント、および関連の配列番号およびその対応する相同配列のいずれかに対して産生された、単クローン抗体および組換えｓｃＦｖまたは組換えｓｃＦｖのフラグメント等の抗体も提供する（実質的に相同とは、ストリンジェントな条件下で、当該配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を有することを意味する）。
【００３１】
本発明の抗体、単クローン抗体または組換えｓｃＦｖまたはそのフラグメントは、本発明の配列番号１または配列番号２のポリペプチド産物および相同／相補配列の一つ以上を含む群のいずれかに対して産生されうる（実質的に相同とは、ストリンジェントな条件下での、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を意味する）。抗体は、ｌｉｍｂｉｎタンパク質／ポリペプチドまたはｌｉｍｂｉｎエピトープに対応するファージディスプレイポリペプチド配列を用いて、または他の従来技術により、産生されうる。
【００３２】
本発明は、本明細書に記載される配列番号に対して、ストリンジェントな条件下で少なくとも７０％の相同性を有する、他の核酸、アミノ酸およびペプチド配列、抗体およびｓｃＦｖに関する。相同性は、少なくとも８０％または少なくとも９０％でもよい。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明は、単クローン抗体または組換えｓｃＦｖまたはそのｓｃＦＶフラグメント等の抗体を提供するが、これらは配列番号１または実質的に相同のポリペプチド配列に対して、または配列番号２の核酸配列または実質的に相同／相補的な核酸配列によりコードされるポリペプチドに、産生されうる（実質的に相同とは、ストリンジェント条件下での、当該配列に対する少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を意味する）。別の態様は、本明細書に記載のｌｉｍｂｉｎエピトープまたはｌｉｍｂｉｎポリペプチドフラグメント、または関連の配列番号またはその実質的に相同／相補的な配列の一つ以上に対して産生される、組換えｓｃＦｖまたはｓｃＦＶフラグメントを提供する。本発明の抗体は、配列番号１または実質的に相同のポリペプチド配列に対して、または配列番号２の核酸配列または実質的に相同／相補的な核酸配列によりコードされるポリペプチドの一つ以上に対して産生されうる（実質的に相同とは、ストリンジェントな条件下での、当該配列に対する少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を意味する）。したがって、本発明の別の態様は、配列番号３（ｌｉｍｂｉｎ―標的化組換えｓｃＦｖ  ＴＭＳＣ３ペプチドに対応する）、配列番号５（組換えｓｃＦｖ  ＴＭＳＣ１ペプチドに対応する）に、配列番号７（組換えｓｃＦｖ  ＴＭＳＣ２ペプチドに対応する）、および配列番号９（組換えｓｃＦｖ  ＴＭＳＣ４ペプチドに対応する）にを含む群より選択されるポリペプチドに実質的に相同のポリペプチドを含む、単クローン抗体、組換えｓｃＦｖまたはそのフラグメント等の抗体を提供する。ここで実質的に相同とは、ストリンジェントな条件下での、当該配列に対する少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を意味する。
【００３４】
本発明は、配列番号４（組換えｓｃＦｖ  ＴＭＳＣ３  ＤＮＡ配列に対応する）、配列番号６（組換えｓｃＦｖ  ＴＭＳＣ１  ＤＮＡ配列に対応する）、配列番号８（組換えｓｃＦｖ  ＴＭＳＣ２  ＤＮＡ配列に対応する）、および配列番号１０（組換えｓｃＦｖ  ＴＭＳＣ４  ＤＮＡ配列に対応する）を含む群より選択される核酸に対して実質的に相補的または実質的に相同の配列を含む抗体またはそのフラグメントをコードする核酸も提供する。ここで実質的に相同／相補的とは、ストリンジェントな条件下での、当該配列に対する少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を意味する。
【００３５】
本発明の抗体、単クローン抗体または組換えｓｃＦｖまたはそのフラグメントは、配列番号１または実質的に相同のポリペプチド配列の一つ以上に対して、または配列番号２の核酸によりコードされるポリペプチドに、またはその実質的に相同／相補的配列に、産生されうる。
【００３６】
本発明の抗体は、一つ以上の配列番号１または実質的に相同のポリペプチド配列の一つ以上に対して、または配列番号２の核酸によりコードされるポリペプチドに、またはその実質的に相同／相補的な配列に、産生されうる。ここで実質的に相同／相補的とは、ストリンジェントな条件下での、当該配列に対する少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を意味する。
【００３７】
特定の実施形態では、本発明の方法により産生される抗体は、配列番号５、配列番号７または配列番号９または配列番号１１により特徴づけられる配列またはこれと実質的に相同の配列を含む群より選択されうる。
【００３８】
さらなる実施形態においては、本発明は、本発明の核酸分子、または本発明の単クローン抗体、組換えｓｃＦｖ、組換えｓｃＦｖフラグメント、またはポリペプチド等の抗体を発現可能な核酸分子の一つ以上を含む、ベクター発現系も提供する。適切なベクター系には、発現系および組換えｓｃＦｖディスプレイベクターとしてのｐｃｏｍｂ３ＸＳＳおよびバクテリオファージＶＣＳＭ  １３等の発現系が含まれるがこれに限られない。
【００３９】
本発明は、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２の核酸配列またはこれと実質的に相同の配列を含む群より選択される核酸でトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。ここで実質的に相同／相補的とは、ストリンジェントな条件下での、当該配列に対する少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を意味する。
【００４０】
宿主細胞が、上述のベクター系を使用して、目的の遺伝物質により形質転換される。
【００４１】
本発明は、本発明の抗体を使用して、間質前駆細胞を含む間葉系幹細胞を同定する方法を提供する。本発明のエピトープおよび／またはタンパク質を発現する間葉系幹細胞が、本明細書に記載の方法により産生される対応する抗体により同定されうる。本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたはヌクレオチド配列およびベクター発現系および細胞を用いて、このような細胞に対する抗体または抗体フラグメントを生成することにより、間質前駆細胞を含む間葉系幹細胞を同定する方法を提供する。
【００４２】
本発明は、本発明の細胞、ベクター、タンパク質、ポリペプチド、単クローン抗体、組換えｓｃＦｖまたは組換えｓｃＦｖフラグメント等の抗体、および核酸配列の一つ以上、またはその組み合わせを使用する工程を含む、ＭＳＣを同定する方法を提供する。本発明のいくつかの態様においては、ＭＳＣおよび前破骨細胞の同定には、幹細胞糖タンパク質レセプター標的エピトープに結合するように産生されている、単クローン抗体、組換えｓｃＦｖまたはそのフラグメントｓｃＦｖ等の抗体の使用が含まれうる。目的の細胞を同定し、標準的な分子生物学的分離技術を用いた細胞の分離を促進するために、単クローン抗体、組換えｓｃＦｖまたはそのｓｃＦｖフラグメント等の抗体、および特に核酸が、分子標識として使用されうる。フローサイトメトリおよびＭＡＣｓ技術等の細胞選別技術を用いて、標識された細胞が単離および特徴づけされうる。
【００４３】
特定の実施形態では、本発明の抗体が、組換えｓｃＦｖおよびそのフラグメントが特異的である本発明のタンパク質の一つ以上を発現する成体幹細胞の精製および特徴づけを促進する、診断用マーカとして用いられうる。
【００４４】
本発明の別の態様は、特に、ＳＰＣおよび前破骨細胞が成熟する際、およびＳＰＣの場合には他の細胞型に分化する際の、さらなる操作および観察の間に細胞をモニタするための、目的の細胞の分子マーキングの方法を提供する。
【００４５】
本発明は、本発明の抗体、ポリペプチド、および核酸分子の一つ以上を使用する工程を含む、ＳＰＣを同定する方法を提供する。本発明の方法により得られた濃縮されたＭＳＣが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、骨形成、軟骨生成、脂肪生成の一つ以上に分化されうる（方法下記）。このような細胞が、損傷組織を修復するために、患者に移植されうる。ある条件下では、細胞が、元々細胞を供給した同じ患者に再移植されうる。
【００４６】
単クローン抗体、組換えｓｃＦｖまたはそのｓｃＦｖフラグメント等の抗体は、たくさんの有利な用途を有する。
（ｉ）  新世代の治療剤および遺伝的に改変された幹細胞に役立つＭＳＣ亜集団に対する、ベクター／遺伝子送達系の特異的標的化。例えば、ＴＭＳＣ１、２、３または４が、ウィルス、ポリマーに接合されるか、治療ＤＮＡ分子に直接付着されうる。ＴＭＳＣ３―接合体が、ＴＭＳＣ３：Ｌｉｍｂｉｎ／ＥＶＣ―２の標的を発現する細胞に、遺伝子または薬物を特異的に送達すると考えられる。
（ｉｉ）  再生医療用の、遺伝的に改変されたＭＳＣに対する遺伝子治療アプローチにおける標的化デバイス。組換えｓｃＦｖは、ＭＳＣを特異的に検出し、無関係な細胞系統に対する低いバックグラウンド結合を有するため、標的化デバイスとして役立つ。
（ｉｉｉ）  ＭＳＣを傷害部位に結合し、骨関節炎患者における軟骨修復（股関節および関節置換など）、または心血管疾患（例えば梗塞形成後の損傷心臓組織の再生）等の損傷組織の修復を助けるために、補綴インプラントを、例えばｓｃＦｖ  ＴＭＳＣ１、２、３または４でコートする。
(ｉｖ)  心疾患の治療選択肢としての、コートされたステント（例えばアテローム性動脈硬化の治療およびステント再狭窄の防止のための先進治療）。
（ｖ）  例えば新規な組換えｓｃＦｖ  ＴＭＳＣ１、２、３または４による、縫合糸のコーティング。これにより、ＭＳＣが縫合糸に付着して創傷治癒の改善を促進することができる。
（ｖｉ）  適切な試料から同種のＭＳＣを単離および精製すること。ＴＭＳＣ１、２、３または４が、再懸濁後にヒト骨髄細胞とともにインキュベートされる凍結乾燥抗体製剤として供給されうる。抗ＨＡ標識二次抗体を使用して、標的ＭＳＣが結合および検出され、従来のＦＡＣＳ  ＳＯＲＴＥＲｓを用いてＭＳＣが選別される。
(ｖｉｉ）  ヒトとニワトリの間の進化的差異のため、ＴＭＳＣ１、２、３および４は、哺乳類種間で保存されたエピトープを認識しうる。したがって、ＴＭＳＣ１、２、３および４を用いて、マウス、ラット、ウサギおよびウマを含む他の哺乳類ソースからＭＳＣを精製し、様々な動物の病気モデルにおけるＭＳＣの治療効果の調査を促進しうる。
【００４７】
別の態様においては、本発明は、本発明の一つ以上の抗体またはそのフラグメントを含むキットを提供する。キットは、磁気ビーズをさらに含みうる。抗体、組換えｓｃＦｖまたはそのフラグメントが、磁気ビーズ／粒子に連結されうる。固定されたｓｃＦｖビーズが、ヒト骨髄と混合され、例えばＭｉｌｔｅｎｙｉのＣｌｉｎｉＭＡＣｓ単離システムを使用して、標的ＭＳＣが単離されうる。キットは、抗体またはそのフラグメントをコードする核酸、またはその抗体を発現するようにトランスフェクションされた細胞、または本発明の抗体またはそのフラグメントを発現させるために細胞にトランスフェクションするのに適切なベクターを含みうる。
【００４８】
本発明は、変性疾患、心血管疾患、炎症性疾患、または自己免疫疾患の治療のための薬物の製剤において使用されうる、本発明のポリペプチド、抗体、核酸、ベクター発現系および／または細胞の使用を提供する。このような障害には、パーキンソン病およびアルツハイマー病が含まれるがこれらの状態に限られない。
【００４９】
本発明は、癌診断における、ＴＭＳＣ１、ＴＭＳＣ２、ＴＭＳＣ３、およびＴＭＳＣ４の使用にも関する。本発明は、抗癌転移療法に使用するための、これらの抗体のヒト化にも関する。
【００５０】
さらなる態様において、本発明は、骨粗鬆症の診断ツールとしての、ＴＭＳＣ１、ＴＭＳＣ２、ＴＭＳＣ３、およびＴＭＳＣ４の一つ以上の使用を提供する。
【００５１】
実際、本発明の組成物および方法は、骨粗鬆症および癌、および癌転移等の、Ｌｉｍｂｉｎを標的とする任意の治療戦略に使用を見いだしうる。
【００５２】
別の態様においては、本発明は、単独または、注射または他の投与方法のための適切な医薬バッファーおよび担体と組み合わせた、本発明の単クローン抗体、組換えｓｃＦｖまたはそのｓｃＦｖフラグメント等の抗体、ＭＳＣ、ペプチド、核酸、細胞またはベクターの一つ以上を、治療的に有効な量含む、医薬組成物を提供する。
【００５３】
さらに別の態様においては、本発明は、分化決定していない間葉系幹細胞の分化能の成熟中のモニタリングにおける、本発明の単クローン抗体、組換えｓｃＦｖまたはそのｓｃＦｖフラグメント等の抗体の使用に関する。本発明は、心疾患および他の状態等の医学的状態の治療において治療剤として使用するための医薬物質としての、単クローン抗体、組換えｓｃＦｖまたはそのｓｃＦｖフラグメント等の新規な抗体の使用にも関する。抗体、単クローン抗体、組換えｓｃＦｖおよびそのｓｃＦｖフラグメントが、一定の医学的状態の治療において、医療デバイス上に使用するコーティングとして使用されうる。単クローン抗体、組換えｓｃＦｖまたはそのｓｃＦｖフラグメント等の抗体は、成体幹細胞の精製、特徴づけおよび濃縮を促進する、診断用マーカとしても使用されうる。
【００５４】
本発明は、ＭＳＣを濃縮、精製および／または単離する方法であり、
（ｉ）  細胞の混合集団を（本明細書に記載のアミノ酸／ポリペプチド配列のいずれかに対して産生された、または本明細書の核酸配列のいずれかから生成された場合）抗体または抗体フラグメントで処置する工程と、
（ｉｉ）  抗体と反応する同定された細胞を、ＭＳＣであるものとして単離する工程と
を含む方法を提供する。
【００５５】
したがって本発明は、このようにして濃縮、精製および／または単離されたＭＳＣ集団を提供する。したがって本発明は、配列番号１またはこれと実質的に相同の配列、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１およびこれと実質的に相同の配列を含む群より選択されるポリペプチドを、ＭＳＣを傷害部位に結合するために、医療デバイスのコーティングに用いるために使用することを可能にする。したがって本発明は、当該ポリペプチドの一つまたは一つ以上でコートされたこのような医療デバイスを準備する方法を提供する。好適な医療デバイスには、縫合糸、組織足場、骨インプラントまたは創傷被覆材等が含まれる。本発明は、このようにして、このような集団が、損傷組織を修復するために特定のエリアに局所化されるのを可能にする。このような方法により、単離ＭＳＣによる患者の治療が可能となる。
【００５６】
本発明は、このような集団の使用により、ＭＳＣ集団の単離、選択および／または濃縮のさらなる方法を特定することを可能にする。本発明の方法により得られた、精製された集団が、ＭＳＣの第二集団の純度をチェックするタイプの標準またはコントロールとして使用されうる。この場合には、例えば損傷組織の再生および修復を助けるために、ＭＳＣが局所組織に集められる。本発明は、本発明の方法により単離された幹細胞を治療的に有効な量含む医薬組成物の製造における、このような集団の使用も提供する。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、ＭＳＣの部位への標的遺伝子治療を可能にするために、遺伝子送達システムと接合されうる。このような遺伝子送達システムには、配列番号１またはこれと実質的に相同の配列、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１またはこれと実質的に相同の配列を含む群より選択されるポリペプチドを含む。
【００５８】
例
本発明の一実施形態では、ニワトリがｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養ヒトＭＳＣで免疫される従来法を使用して、四つのｓｃＦｖが産生され、細胞ニワトリ免疫ファージディスプレイライブラリから単離された。ニワトリの脾臓および骨髄からｍＲＮＡを抽出し、組換え法によりゲノムｍＲＮＡライブラリからｃＤＮＡライブラリを生成することにより、ヒトＭＳＣライブラリが作られ、ｃＤＮＡがＰＣＲにより増幅され、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現を促進する領域内でファージミド発現ベクターにサブクローニングされた。ファージミドライブラリが、エレクトロポレーションによりＥ．ｃｏｌｉに形質転換され、ヘルプファージの追加によりレスキューされ、ｓｃＦｖを発現するファージが得られた。三ラウンドのバイオパンニングにより、ＭＳＣ特異的結合剤を選択するために、ｓｃＦｖを発現するファージがヒトＭＳＣに加えられた。パンニングの最終ラウンドからのヒトＭＳＣが採取され、ファージを用いてＥ．ｃｏｌｉがインフェクションされ、これがプレートされ、成長させられて組換えｓｃＦｖが生成された。これらのプレートからのコロニーが選択され、標準のＰＣＲ技術を用いて、ｓｃＦｖインサートにつき分析された。ユニークなｓｃＦｖ配列を生成するクローンを同定するために、各ＰＣＲ反応物のＡＬＵＩによる消化も行われた。この方法で得られた組換えｓｃＦｖが、配列番号３により特徴づけられる。この様式で産出および特徴づけされた組換えｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ（短鎖可変フラグメント）ＴＭＳＣ３と示されている。短鎖可変フラグメントは、抗体の抗原結合特異性を保持する任意のフラグメントを意味すると理解される。当業者には当然のことながら、アミノ酸配列、配列番号：３、５、７または９のいずれか一つまたは核酸配列、配列番号：４、６、８または１０によりコードされるポリペプチド、および同に対して実質的相同性／相補性を有する配列を用いて、間葉系幹細胞のためのｓｃＦｖを生成できる。
【００５９】
本発明は、同種のＭＳＣ集団の、より良好な特徴づけおよび精製を提供し、それにより、再生医療用の治療的に有効な製剤の改良につながる。ＴＭＳＣ１、２、３または４の方法は、同種のＭＳＣのワンステップ精製を提供する。ＭＳＣ結合のより高い特異性が、フローサイトメトリ実験において蛍光強度のより高いシフトを生み、したがって、より高感度なアッセイをもたらす。ＴＭＳＣ１〜４は、ＳＰＣの同定に特に有用である。
【００６０】
本発明の組換えｓｃＦｖおよびそのフラグメントは、ｌｉｍｂｉｎレセプターと特異的相互作用により結合することにより、間質前駆細胞として知られるＭＳＣ亜集団に対する特異性をもつため、従来使用される抗体より優れている。
【００６１】
ライブラリがニワトリで産出されたため、密接に関連する種における抗体生成に関係する従来の免疫寛容の問題が、かなり克服される［１―２、６］。ニワトリの使用からより良好な免疫反応が生じ、ニワトリにおける免疫グロブリン遺伝子の数が少ないことによりライブラリを作るのがより容易であり、大きな市販のライブラリを購入するよりもライブラリがより安価で有効である。本発明のライブラリからのＴＭＳＣ３  ｓｃＦｖは、フローサイトメトリによるルーチン精製および分析のための上清に機能的ｓｃＦｖを分泌する。
【００６２】
従来法に対する、ＴＭＳＣ３を用いた本発明の追加的な利点は、マウスおよびラットＭＡｂｓが使用されるときには、細胞に対するＭＡｂの非特異的結合を防止するために、ｆｃ―遮断剤を用いることが必須であるという事実に関する。本発明においては、ニワトリ由来のｓｃＦｖが使われるため、その必要はない。
【００６３】
ヒトとニワトリの間の進化的差異のため、ＴＭＳＣ３が、哺乳類種間で保存されたエピトープを認識しうることが予期される。したがって、マウス、ラットおよびウサギからＳＰＣを精製するためにＴＭＳＣ３を用いて、様々な動物の病気モデルにおけるＳＰＣの治療効果の調査を促進しうる。マウス、ラットおよびウサギから前破骨細胞を精製するためにＴＭＳＣ３を用いて、様々な動物の骨修復および骨粗鬆症モデルにおける前破骨細胞の調査を促進することもできる。
【００６４】
新規な組換えｓｃＦｖは、再生医療用にＳＰＣを遺伝的に改変するために、遺伝子治療アプローチにおける標的化デバイスとして使用することもでき、ＳＰＣを傷害部位に結合し、損傷組織の修復を助けるために、補綴インプラントまたは縫合糸をコートするために使用することもできる。
【００６５】
本発明のポリペプチド、ペプチド、抗体、そのフラグメントおよびタンパク質の一つ以上に実質的に相同であるものとして本明細書に記載される、ポリペプチド、抗体、単クローン抗体、組換えｓｃＦｖまたはそのｓｃＦＶフラグメントおよびタンパク質には、変異体、誘導体、および代替物、特に保存的置換を含むものも含まれるものと理解されるものとする。
【００６６】
保存的置換は、ポリペプチドの三次構造を大幅に変更しないか、ポリペプチドの活性を大幅に変更しないか、標的部位における分子の電荷または疎水性を大幅に変更しないか、または標的部位側鎖領域のバルクを大幅に変更し、またはこれを欠かない、置換として定義されうる。
【００６７】
一般に、保存的置換は、以下の群の各々の中で行われうる：疎水性：Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；長い疎水性：Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；短い疎水性：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ；中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；ヒドロキシル基をもつ：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；正電荷残基：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；正電荷、非環状性残基：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；三次構造に大きく影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ；および芳香族残基：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００６８】
本明細書において核酸に適用される実質的に相同または実質的に賞賛的という用語は、約３７℃で、正常細胞内塩分濃度で適切にアンチセンスまたはセンス鎖に結合するために十分に相同である、任意の核酸をさす。用語は、コドン利用における重複変化を含む核酸も含みうる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】クローンＴＭＳＣ１、ＴＭＳＣ２、ＴＭＳＣ３およびＴＭＳＣ４を同定する、第三ラウンドのクローンのパンニングからの、ｓｃＦｖインサートのＰＣＲ増幅である。
【図２】ＴＭＳＣ１、２、３、および４ＰＣＲ産物の制限消化から、特徴的指紋、クローンごとに異なるユニークなバンドのパターンが生じる。
【図３】ＴＭＳＣ  ｓｃＦｖの代表的な精製。（ａ）ＴＭＳＣ  ｓｃＦｖが、平衡化されたＮｉ―ＮＴＡカラムに結合され、１Ｍイミダゾール濃度の段階的増加により溶出される。（ｂ）溶出ＴＭＳＣ３の純度が、銀染色およびウェスタンブロットの両方により確認され、約２５ＫｋＤａの分子量のバンドが生成された。
【図４】Ｐ０およびＰ１  ｈＭＳＣ標的細胞に対するＴＭＳＣ  ｓｃＦｖの結合が、抗ＨＡ  ｆｉｔｃ二次を用いて、フローサイトメトリにより評価され、コントロール細胞は、抗―ＨＡ  ｆｉｔｃのみでインキュベートされた。ＴＭＳＣ  ｓｖＦｖが、接着Ｐ０  ｈＭＳＣの亜集団に結合した（８日）。Ｐ１（１５日）では、陽性細胞の割合が、比較的一定にとどまったか（ＴＭＳＣ１および４）、数が増加し（ＴＭＳＣ２および３）、これらの細胞が増殖していることを示した。しかし、リード抗体ＴＭＳＣ３による、後期複数継代細胞のその後の染色は、マーカシグナルの減少を示した。
【図５】ヒト骨髄細胞に対するＴＭＳＣ  ｓｃＦｖの代表的な結合。ヒト骨髄細胞が、ＴＭＳＣ１、２、３または４のいずれかとともにインキュベートされ、抗ＨＡ  ｆｉｔｃにより検出され、Ｔ細胞、単球、Ｂ細胞、ＨＳＣｓ、白血球、ＮＫ細胞および赤血球前駆体の検出のために、礼儀正しくＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、またはＣＤ２３５ａのいずれかで共染色された。ＴＭＳＣ＋ｖｅ細胞の大部分は、系統陰性およびＣＤ４５＋ｖｅである。ＴＭＳＣ１、２、３、および４は、同系統―ｖｅ  ＣＤ４５＋ｖｅ細胞集団に異なる成長段階で結合する。ＣＤ４５＋ｖｅ  ＣＤ１４＋ｖｅ単球の非常に小さなサブセットも、ＴＭＳＣ１、２、３および４を結合する。これらは、前破骨細胞として同定されている。
【図６】ヒト骨髄からのＴＭＳＣ標的細胞のＭＡＣｓ単離。抗ＨＡミクロビーズのみを使用した単離により可視のコロニーはなかった。これに対して、各ＴＭＳＣ  ｓｃＦｖを使用してＣＦＵｓが得られ、単離後２０日目に撮影された。
【図７】三人の異なる骨髄ドナー（ｉ，ｉｉおよびｉｉｉ）からの、ＴＭＳＣ３  ＭＡＣｓ単離細胞の形態、表面表現型および分化能が、「直接プレートされた」ｈＭＳＣと比較された。（ａ）Ｐ３では、ＴＭＳＣ３＋ｖｅ細胞が、典型的なＭＳＣ様の線維芽細胞形態およびＣＤ１４−ｖｅ、ＣＤ４５−ｖｅ、ＣＤ７３＋ｖｅおよびＣＤ１０５＋ｖｅのＦＡＣｓプロフィールを有した。培養で増殖したＴＭＳＣ３＋ｖｅ細胞は、ＣＤ１４−ｖｅであり、速やかに増殖するＳＰＣの存在下で、共単離された前破骨細胞が増殖せず、細胞死することを示す。（ｂ）代表的画像が、未処置の培養と比較した、脂肪生成補助剤で処置された培養における、オイルレッドＯ陽性空胞の沈着による陽性の脂肪生成を示す。コントロールｈＭＳＣおよびＴＭＳＣ３単離培養の両方において、骨形成誘導培地に応答して、アルカリホスファターゼが特異的にアップレギュレートされた。（ｃ）コントロールｈＭＳＣ培養と比較した、三人の異なるドナーからのＴＭＳＣ３―単離細胞の軟骨生成表現型への分化が、無血清軟骨生成培地においてＴＧＦ―β３に曝露された凝集培養の細胞外マトリクスにおける、硫酸プロテオグリカン（ＧＡＧ）の存在により決定された。
【図８】ＴＭＳＣ３の代表的フローサイトメトリ解析が、ヒト末梢血における前破骨細胞に対する結合を示す。（ａ）単球を同定するためにＣＤ１４で染色された全血。（ｂ）ＭＣＳＦおよびＴＭＳＣ３による共染色が、全ＴＭＳＣ３＋ｖｅ細胞が、ＭＣＳＦ＋ｖｅであることを示した。（ｃ）ＣＤ５１／ＣＤ６１およびＴＭＳＣ３による共染色が、全ＴＭＳＣ３＋ｖｅ細胞がＣＤ５１／ＣＤ６１＋ｖｅであることを示した。前破骨細胞は、ＣＤ１４＋ｖｅ  ＭＣＳＦ＋ｖｅおよびＣＤ５１／ＣＤ６１＋ｖｅであり、したがってヒト骨髄および血液におけるＣＤ１４＋ｖｅ  ＴＭＳＣ３＋ｖｅ細胞は、前破骨細胞である。
【図９】マウス骨髄細胞に対する、ＴＭＳＣ  ｓｃＦｖの代表的結合。マウス骨髄細胞が、ＴＭＳＣ１、２、３または４のいずれかとともにインキュベートされ、抗ＨＡ  ｆｉｔｃにより検出され、ＣＤ４４で共染色された。ＴＭＳＣ  ｓｃＦｖが、マウス骨髄におけるＣＤ４４＋ｖｅ細胞サブセットに結合する。
【図１０】ウマ骨髄細胞に対する、ＴＭＳＣ  ｓｃＦｖの代表的結合。ウマ骨髄細胞が、ＴＭＳＣ１、２、３または４のいずれかとともにインキュベートされ、抗ＨＡ  ｆｉｔｃにより検出された。ＴＭＳＣ  ｓｃＦｖが、ウマ骨髄における細胞サブセットに結合する。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
標準的な分子生物学および組換え生物工学の方法を用いて、成体ヒト骨髄から単離された、培養ヒト間葉系幹細胞により免疫されたニワトリの脾臓および骨髄からｓｃＦｖファージライブラリがつくられた。ｓｃＦｖがファージの表面に発現され、培養ヒトＭＳＣに対する特異性につきスクリーニングされた。ヒト幹細胞によるニワトリの免疫により実質的および特異的免疫反応が生じるため、ニワトリが、ファージディスプレイｓｃＦｖライブラリの開発のために選択された。ヒト、ニワトリの進化的分離、およびニワトリによるヒト抗原の免疫寛容の欠如により、ニワトリがｓｃＦｖファージディスプレイライブラリの産生のための優れた選択肢となる。ニワトリの使用により、高度に保存された表面膜タンパク質に対するより優れた免疫反応が生じ、ニワトリにおける免疫グロブリン遺伝子の数が少ないため、ライブラリをより容易に作製でき、大きな市販のライブラリを買うよりライブラリが安価で有効である。
【００７１】
材料
ＳＡ茶ニワトリが、Ａｇｒｏ―Ｂｉｏ（商標）（Ｌａ  Ｆｅｒｔｅ  Ｓｔ．Ａｕｂｉｎ，Ｆｒａｎｃｅ）から得られた；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのＴＲＩ試薬およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｓｉｇｍａ（商標）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのクロロホルム、２―プロパノール、エタノール、アガロースおよび分子生物学等級の水；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＰｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐ（商標）Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎｕｐ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（商標）（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からのＸＬＩ  ｂｌｕｅおよびＱｕｉｃｋ―Ｐｉｋ（商標）電気泳動溶出カプセル；Ｐｉｅｒｃｅ（商標）（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）からの抗ＩｇＹおよびウサギ抗ニワトリＦＩＴＣ結合体；ＣＬＰ  ｄｉｒｅｃｔ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのＲＮＡｓｅ除去溶液「Ｍｅｒｃｕｒｙ」；Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ（商標）（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）からの酵素フリー細胞解離溶液およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（商標）（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）からの分子生物学消耗品。Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＸＬｌ  ｂｌｕｅ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（商標）；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；Ｓｉｇｍａ（商標）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのトリプシン、ウシ血清アルブミン、塩化ナトリウム、ＰＥＧ８０００、グリシン、トリエチルアミン、スーパーブロス培地およびＰＢＳタブレット；Ｒｏｃｈｅ（商標）（Ｂａｓｅｌ；Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からの抗生物質；Ｃａｍｂｒｅｘ（商標）（Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）からのＥＢＭ―２；Ｍｉｃｒｏｐｕｌｓｅｒ（商標）（Ｂｉｏｒａｄ（商標）；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）；シークエンシングプライマは、ＭＷＧ（商標）（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られた。
【００７２】
免疫のためのヒトＭＳＣの単離および増殖のための方法
インフォームドコンセントが与えられた後、正常なドナーの腸骨稜から骨髄穿刺液が得られた。パーコール分画の後、またはダイレクトプレーティングにより、前述のようにＭＳＣが単離され、培養において増殖された［７，４８］。
【００７３】
吸引液が、ダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水（Ｄ―ＰＢＳ）により洗浄された。細胞を含む画分が、パーコールクッション（１．０７３ｇ／ｍｌ）上へ１〜３ｘ１０８有核細胞／２５ｍｌの密度で穏やかに重層され、１，１００ｘｇで３０分間２０℃で遠心分離された。１．０７３ｇ／ｍｌの密度のインターフェイスの有核細胞画分が集められ、Ｄ―ＰＢＳにより一度洗浄され、ＭＳＣ培地（抗生物／抗真菌補助剤を伴う１．０ｇ／ｌグルコース（ＤＭＥＭ―ＬＧ）を含むダルベッコの変法イ―グル培地中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））に再懸濁された。細胞が、Ｔ―１７５フラスコ中に１．６×１０５細胞／ｃｍ２でプレートされた。培養は、加湿された大気および５％ＣＯ２中で、３７℃で維持された。Ｐ０の終わりに、付着したコロニーが、細胞スクラッピングにより分離され、細胞が、１０％ＤＭＳＯ／９０％ＦＢＳ中で使用まで冷凍保存された。
【００７４】
免疫ｓｃＦｖライブラリのレパートリの調製
ニワトリを免疫するための方法
冷凍保存された幹細胞が、３７℃の水槽で解凍され、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）デスクトップ遠心機で、５分間１０００ｒｐｍでスピンダウンされた。冷凍剤が吸引され、細胞が、合計１０ｍｌの完全添加細胞培養培地中に再懸濁され、３７℃の水槽中に４５分間おかれた。幹細胞が再びスピンダウンされ、ＰＢＳ溶液で洗浄された。洗浄工程が一度繰り返された。各細胞系統の５０，０００の細胞が、合計２００μｌの体積のＰＢＳに再懸濁され、ニワトリの翼下に皮内注射された。全てのニワトリが、免疫前に採血された。二羽のニワトリ（ｎｏ．２６１および２６２）に、間葉系幹細胞が注射され、免疫反応を高めるため、三週後に鳥に５０，０００の細胞の注射の第二ブーストを受けさせた。最終ブーストが、さらに三週後に行われた。ニワトリが３２日目に採血され、最終的免疫工程の３日後から卵が回収された。全ての鳥が、４９日目に殺され、脾臓および骨髄が採取され、ホモジナイズされ、ＴＲＩ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））中に貯蔵された。
【００７５】
脾臓および骨髄ホモジネートからのｍＲＮＡの調製のための方法
使用する全ての装置が、実験前にＲＮＡｓｅ除去溶液（ＣＬＰ  ｄｉｒｅｃｔ）で掃除された。ニワトリからのホモジナイズされた脾臓および骨髄試料が、３０℃の水槽で解凍され；１０ｍｌのＴＲＩ試薬が加えられ、完全に混合された。チューブが、２５００ｇで１０分間回転され、各上清１０ｍｌが、新しいポリプロピレン遠心分離チューブに移された。６ｍｌのクロロホルムが、ラミナーフローフード下で加えられ、チューブが数回逆さにされた。５分後、試料を再び混合し、５分間室温でインキュベートして、核タンパク質をＲＮＡから分離させ、１５分間１７，０００ｇで、４℃で回転させた。水相が新しいチューブに移され、７ｍｌのイソプロパノールが加えられ、ＲＮＡが、室温で２０分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離することにより沈殿された。上清が廃棄され、ペレットが７０％のエタノールで洗浄され、１０分間の１５，０００ｒｐｍでの遠心分離により再び沈殿された。精製ＲＮＡが水に溶解され、Ｓｈｉｍａｄｚｕ（商標）分光光度計において、収率および純度が検査された。
【００７６】
ニワトリｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成
第一鎖ｃＤＮＡ合成が、ＲＴ―ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ（商標）合成システムとともに含まれる、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）取扱説明書の指示にしたがって行われた。簡潔にいうと、２５μｇのニワトリｍＲＮＡが、ＤＥＰＣ水において、ｄＮＴＰ’ｓ、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）と混合され、５分間６５℃でインキュベートされた。試料が、１分間氷上で冷やされ、ＲＴバッファー、ＭｇＣｌ２、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、ＲＮＡｓｅ  Ｏｕｔ（商標）ＲＮＡｓｅ阻害剤と混合され、２分間４２℃でインキュベートされた。５μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（商標）リバーストランスクリプターゼが、チューブに加えられ、４２℃で５０分間インキュベートされた。全ての反応が、１５分間７０℃で終了され、氷上で冷やされ、３７℃で２０分間ＲＮＡｓｅ  Ｈとともにインキュベートされた。
【００７７】
ｓｃＦｖライブラリの構築
ＰＣＲを用いた標的ｃＤＮＡの増幅が、Ｃａｒｌｏｓ  Ｂａｒｂａｓ等による、“Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ―Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（６）に与えられる指示にしたがって行われた。簡単にいうと、ニワトリ２６１および２６２（試料がプールされた；ＭＳＣライブラリ）、２６３（７日ＥＰＣライブラリ）、２６４（増殖ライブラリ）、および２８４（コントロールライブラリ；ＰＢＳライブラリ）から得られた全ての試料につき、ニワトリＶＨドメインを増幅するためにプライマＣＳＣＶＨｏ―Ｆ（センス）（配列番号１１）およびＣＳＣＧ―Ｂ（配列番号１２）を用いて、短リンカーｓｃＦｖライブラリが生成された。同様に、プライマＣＳＣＶＫ（センス）（配列番号１３）およびＣＫＪｏ―Ｂ（リバース）（配列番号１４）が、Ｖλドメインを増幅するために利用された。
【００７８】
プライマ
ＣＳＣＶＨｏ―Ｆ：ニワトリＶＨドメインセンス：配列番号１１
ＣＳＣＧ―Ｂ：ニワトリＶＨドメインアンチセンス：配列番号１２
ＣＳＣＶＫ：ニワトリＶλドメインセンス：配列番号１３
ＣＫＪｏ―Ｂ：ニワトリＶλドメインアンチセンス：配列番号１４
ＰＣＲラウンド１
ｓｃＦｖライブラリの構築のためのニワトリＶＨ配列の第１ラウンドＰＣＲ増幅。
【００７９】
ニワトリｃＤＮＡからのＶＨセグメントを増幅するために、プライマＣＳＣＶＨｏ―Ｆ（短リンカー）が、ＣＳＣＧ―Ｂリバースプライマと組み合わされる。センスプライマは、重複伸長ＰＣＲにおいて使用されるリンカー配列に対応する配列テイルを有する。リバースプライマは、Ｓｆｉ  Ｉ部位を含む配列テイルを有する；このテイルが、第二ラウンドＰＣＲにおいて使用されるリバース伸長プライマにより認識される。
【００８０】
０．５μｇのｃＤＮＡが、各プライマ６０ｐｍｏｌを用いて、以下のプロトコルにしたがって３０ＰＣＲサイクルにおいて増幅された：最初のｃＤＮＡ変性をもたらした、５分間の９４℃の温度での初回サイクル。その後、９４℃の温度で１５秒間；５６℃の１５秒間、および７２℃の９０秒間の３０サイクルが行われた。７２℃の温度での１０分間の一度の最終伸長工程が、ＰＣＲプロトコルの最後に含まれた。そしてＰＣＲ産物が、エタノールおよび酢酸ナトリウムで沈殿され、−２０℃で６０分間貯蔵された後、１７，５００ｇで、４℃でスピンダウンされ、水に溶解され、２％アガロースゲル上で分析された。ＰＣＲ産物がゲルから取り出され、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｐｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐ（商標）Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎｕｐキットを用いて溶出された。
【００８１】
ｓｃＦｖライブラリの構築のためのニワトリＶλ配列の増幅。
【００８２】
ニワトリｃＤＮＡからのＶλ遺伝子セグメントを増幅するために、ＣＳＣＶＫセンスプライマが、ＣＫＪｏ―Ｂリバースプライマと組み合わされる。ＣＳＣＶＫは、Ｓｆｉ  Ｉ部位を含む５’配列テイルを有し、第二ラウンドＰＣＲにおいてセンス伸長プライマにより認識される。リバースプライマは、重複伸長において用いられるリンカー配列テイルを有する。
【００８３】
簡単にいうと、０．５μｇのｃＤＮＡが、各プライマ６０ｐｍｏｌを使用して、以下のプロトコルにしたがって、３４ＰＣＲサイクルにおいて増幅された：最初のｃＤＮＡ変性をもたらした、４分間の継続時間の９４℃の温度での初回サイクル。その後、９４℃の温度で４５秒間；５０℃で１分間、および７２℃で９０秒間の３４サイクルが行われた。７２℃の温度での１０分間の一度の最終伸長工程が、ＰＣＲプロトコルの最後に含まれた。ＰＣＲ産物が、エタノールおよび酢酸ナトリウムで沈殿され、−２０℃で６０分間貯蔵された後、１７，５００ｇ、４℃でスピンダウンされ、水に溶解され、２％アガロースゲル上で分析された。ＰＣＲ産物がゲルから取り出され、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ’ｓ  Ｐｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐ（商標）Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎｕｐキットを用いて溶出され、Ｓｈｉｍａｄｚｕ（商標）分光光度計において分析された。
【００８４】
重複伸長ＰＣＲ
完全長短リンカー単鎖抗体を生成するために、「重複伸長ＰＣＲ」が行われた。このＰＣＲは、ｓｃＦｖライブラリの構築のために、ニワトリＶＨおよびＶλフラグメントを組み合わせる。このＰＣＲの第二ラウンドにおいて使用されるセンスおよびリバース伸長プライマ（ＣＳＣ―Ｆ；配列番号５およびＣＳＣ―Ｂ；配列番号６）は、ＰＣＲの第一ラウンドにおいて生成された配列テイルを認識する。
【００８５】
簡単にいうと、１００ｎｇのＶＨおよびＶλＰＣＲ産物が、ＣＳＣ―ＦおよびＣＳＣ―Ｂプライマ６０ｐｍｏｌを用いて、以下のプロトコルにしたがって、２５ＰＣＲサイクルにおいて重複および増幅された：最初のｃＤＮＡ変性をもたらした、５分間の継続時間の９４℃の温度での初回サイクル。その後、９４℃の温度で１５秒間；５６℃で１５秒間、および７２℃で２分間の２５サイクルが行われた。７２℃の温度での１０分間の一度の最終伸長工程が、ＰＣＲプロトコルの最後に含まれた。ＰＣＲ産物が、エタノールおよび酢酸ナトリウムで沈殿され、−２０℃で６０分間貯蔵された後、１７，５００ｇ、４℃でスピンダウンされ、水に溶解され、２％アガロースゲル上で分析された。ＰＣＲ産物がゲルから取り出され、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ’ｓ  Ｐｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐ（商標）Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎｕｐキットを用いて溶出され、Ｓｈｉｍａｄｚｕ（商標）分光光度計において分析された。
【００８６】
ＭＳＣライブラリを含むＰＣＲ産物が、Ｓｆｉ  Ｉにより５０℃で５時間消化され、ファージミドベクターｐＣＯＭＢ３ＸＳＳにサブクローニングされた。
【００８７】
プライマ
ＣＳＣ―Ｆ（センスプライマ）：配列番号１５
ＣＳＣ―Ｂ（リバースプライマ）：配列番号１６
成体ヒト間葉系幹細胞に対する免疫ｓｃＦｖライブラリのレパートリの標的化
ｓｃＦｖライブラリのＥ．ｃｏｌｉへの形質転換
Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＸＬ１  ｂｌｕｅ細菌が氷上で解凍され、氷上のキュベットにおいて組換えｓｃＦｖライブラリと混合された。２．５ＫＶ、２５μＦ、２００ΩでＭｉｃｒｏｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ（商標））により、エレクトロポレーションが行われた。細菌がキュベットからガラス管に移され、３７℃、２２０ｒｐｍで１時間インキュベートされた。
【００８８】
ファージの調製
アンピシリン（２５μｇ／ｍｌ）およびテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）が、形質転換細菌に加えられ、３７℃、２２０ｒｐｍでもう一時間インキュベートされ、１８３スーパーブロス培地、アンピシリンおよびテトラサイクリンを含む５００ｍｌフラスコに移された。２ｍｌのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージが加えられ、試料が２時間、３７℃、２２０ｒｐｍでインキュベートされた。カナマイシンが２５μｇ／ｍｌで加えられ、全ての培養が６時間、３７℃、２２０ｒｐｍでインキュベートされた。細菌が、１５分間３，０００ｒｐｍでスピンダウンされ、細菌ペレットが、将来のプラスミド調製のために−８０℃で貯蔵された。
【００８９】
ファージが、８ｇのＰＥＧ、６ｇのＮａＣｌの添加により、上清から沈殿された後、氷上での３０分間のインキュベートおよび４℃での１５分間の１５，０００ｇでの遠心分離が行われた。ファージペレットが、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで一度洗浄され、０．２μｍフィルタに通された。
【００９０】
ｓｃＦｖライブラリの多様性
元のインプットライブラリおよびスクリーニングされたライブラリのアリコートが、上述のように、ＸＬ１  ｂｌｕｅにエレクトロポレーションされた。トランスフォーマントの数は、５×１０８／ライブラリであった。２０のクローンが、スーパーブロス／カルベニシリンプレートからランダムに選択され、ｓｃＦｖがプライマｏｍｐｓｅｑ（配列番号７）およびｇｂａｃｋ（配列番号８）を用いたＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物が、ＡｌｕＩにより３７℃で４時間消化され、４％ゲル上でユニークな制限消化パターンにつき分析された。
【００９１】
培養間葉系幹細胞に対するファージライブラリのパンニング
ＭＳＣ表面上の抗原に対する反応性を有するｓｃＦｖの単離が、バイオパンニングの反復サイクルにより達成された。バイオパンニングは、ファージディスプレイされたｓｃＦｖのライブラリをプラスチックプレートまたは常磁性ビーズに固定された標的とともにインキュベートすることにより、典型的に実行される。ファージが、ＭＳＣ上の固定標的に結合され、その後、非結合ファージが洗浄除去され、結合した材料が溶出される。その後、溶出されたファージが再増幅され、所望の抗原標的に結合する能力を有するファージクローンを濃縮するために、結合および増幅の数回の追加的サイクルが行われる。
【００９２】
このＭＳＣ特異的ファージミドライブラリが、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換され、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージの添加によりレスキューされた。得られたファージ発現ｓｃＦｖが、パンニングとして知られるプロセスにおいてＭＳＣ特異的結合剤を選択するために、培養ヒトＭＳＣに加えられた。全部で三ラウンドのパンニングが、実行された。パンニングの第一ラウンドにおいては、ファージライブラリが、約２．５ｘ１０５の培養ヒトＭＳＣとともに、（非特異的ｓｃＦｖを除去するために）７ｘ１０６ＰＢＭＣｓの添加を伴って、インキュベートされた。その後、細胞およびファージが、１５０ｒｐｍで、４℃で３０分間インキュベートされた。非結合ファージおよびＰＢＭＣｓが、洗浄除去され、ＭＳＣに結合されたファージが、パンニングの次のラウンドのためにレスキューされた。約５ｘ１０４ヒトＭＳＣおよび３ｘ１０６ＰＢＭＣｓが、パンニングの第二ラウンドで使用された。そして、最後の最もストリンジェントなパンニングのラウンドでは、５ｘ１０３ＭＳＣおよび８ｘ１０６ＰＢＭＣｓが使用された。パンニングの最終ラウンドからのヒトＭＳＣが採取され、ファージを用いてＥ．ｃｏｌｉがインフェクションされ、これらがその後プレートされ、３７℃で一晩増殖させられた。これらのプレートからのコロニーが選択され、ＰＣＲを用いて、ｓｃＦｖインサートにつき分析された。ユニークなｓｃＦｖ配列を生成するクローンを同定するために、各ＰＣＲ反応物のＡＬＵＩによる消化も行われた。この様式で産出され、特徴づけされた組換えｓｃＦｖが、ＴＭＳＣ１、ＴＭＳＣ２、ＴＭＳＣ３およびＴＭＳＣ４と示されており、それぞれ配列番号：５、７、３および９により特徴づけられる。短鎖可変フラグメントは、抗体の抗原結合特異性を保持する任意のフラグメントを意味すると理解される。
【００９３】
プライマ
Ｏｍｐｓｅｑ：配列番号１７
Ｇｂａｃｋ：配列番号１８
これらの配列は、ライブラリ領域隣接配列のプライマである。Ｏｍｐｓｅｑが、ファージミドｐＣｏｍｂ３ＸＳＳにおけるｓｃＦｖの上流の配列を認識する一方、ｇｂａｃｋは、ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳにおけるｓｃＦｖの下流の配列に結合する。これらのプライマを用いて、ファージミドへのサブクローニングが良好に達成されていることが検証される（対して、サブクローニング前にニワトリ抗体を増幅するために用いられたプライマ１〜６）。
【００９４】
ユニークｓｃＦｖクローンの単離および発現
本発明のライブラリから同定されるユニーククローンは、ルーチン精製およびフローサイトメトリによる分析のための上清に、機能的ｓｃＦｖを分泌する。冷凍グリセロール保存されたユニークｓｃＦｖが、カルベニシリン（ｃａｒｂ）を含むスーパーブロス（ＳＢ）寒天プレートに接種するために用いられ、一晩３７℃でインキュベートされた。このプレートからの単一のコロニーが、２ｍｌの予熱されたＳＢ＋ｃａｒｂに接種するために用いられ、３７℃で８時間インキュベートされた。その後、２ｍｌの培養が、２５０ｍｌのＳＢ＋ｃａｒｂに接種するために用いられ、２５０ｒｐｍで３７℃で３時間インキュベートされた。ｓｃＦｖの発現が、培養への０．４ｍｌの０．５Ｍ  ＩＰＴＧの添加により誘導された。１１時間後に、培養が氷上に配置され、４℃で２０分間１１，０００ｒｐｍで遠心分離された。上清が、０．２μｍフィルタを用いてフィルタ殺菌された。タンパク質を精製させるために、６ｘヒスチジン（ＨＩＳ）残基がｓｃＦｖに標識され、ヘマグルチニン（ＨＡ）デカペプチド標識の存在が、抗ＨＡ抗体を使用したｓｃＦｖの検出を可能にする。六つのヒスチジン残基をタンデム発現するように操作されたタンパク質が、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）に共有結合により固定されたＮｉ２＋イオンを含む樹脂を使用して精製されうる。イムミダゾール（Ｉｍｍｉｄａｚｏｌｅ）およびＮａＣｌが、礼儀正しく１ｍＭおよび０．５Ｍの最終濃度まで培養上清に加えられ、その後、Ｎｉ―ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ（商標））に加えられ、４℃で一晩滴下された。カラムが、５ｍＭイミダゾールで洗浄され、結合ｓｃＦｖが０．２５Ｍのイミダゾールで溶出され、セントリコンろ過システムを使用して濃縮され、バッファーがＰＢＳと交換された。
【００９５】
ｓｃＦｖの特徴づけ
ｓｃＦｖ調製の質が、イムノブロッティングにより分析された。１０％のＳＤＳ―ＰＡＧＥが、ニトロセルロース膜上に移された（３０Ｖ、１時間）。膜が、３％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中で一晩ブロックされてから、１：１０００希釈の抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ（商標））中で、室温で１時間インキュベートされた。ｓｃＦｖ  ＴＭＳＣ３が、１：５０００希釈の抗ラットＨＲＰ抗体（Ｒｏｃｈｅ（商標））の添加により検出され、ＥＣＬ（商標）試薬を用いて検出された。銀染色により、Ｈｉｓ―標識精製が成功していることが確認された。
【００９６】
ｓｃＦｖのシークエンシング
ＭＷＧ（Ｇｅｒｍａｎｙ）により、プライマｏｍｐｓｅｑ（配列番号１７）およびｇｂａｃｋ（配列番号１８）を用いて、ｓｃＦｖクローンＴＭＳＣ１、２、３および４のシークエンシング分析が行われた。
【００９７】
細胞表面標的の同定
ＳｃＦｖ  ＴＭＳＣ３が、細胞表面抗原の同定のために、ＲＺＰＤ（商標）（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）に送られた。５０μｇのｓｃＦｖが、ヒト胎児脳ｃＤＮＡ発現ライブラリにおいて結合ドメイン候補を検出するために用いられた。このライブラリは、３８，０００の異なるタンパク質を含む。ウサギ抗ＨＡ抗体が、二次抗体として使用された。
【００９８】
Ｌｉｍｂｉｎは、ＥＶＣ２（エリスバンクレベルト症候群２）遺伝子の発現産物であることが分かっている［５０］。本発明の技術は、初めて、ｌｉｍｂｉｎが間葉系幹細胞の細胞表面に発現されると決定した。本発明は、ｌｉｍｂｉｎを用いて、間葉系幹細胞を選択的に単離および特徴づけできるという、予想外の結果を提供する。
【００９９】
現在の文献は、ウシにおける、エリスバンクレベルト症候群および小人症における、ｌｉｍｂｉｎの役割を示唆する［５１］。このタンパク質の正確な機能は知られていないが、正常な成長および発達に重要であると思われる［５０、５２―５５］。研究者は、ＥＶＣ２遺伝子が、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、および運動に使う筋肉（骨格筋）を含めて、出生前のいくつかの臓器および組織において活性であると決定している［５０、５１］。ＥＶＣ２遺伝子における変化が、Ｗｅｙｅｒｓ骨形成不全と呼ばれる骨格障害も引き起こすと考えられる［５４］。この状態をもつ人は、軽度に低身長でありうるが、多くの場合は平均身長である。他の特徴には、余分の指および足指（多指症）、爪の異常形成、および歯の異常が含まれる［５４］。一つのＥＶＣ２突然変異だけが、Ｗｅｙｅｒｓ骨形成不全と関連付けられている。当業者には当然のことながら、ｌｉｍｂｉｎタンパク質を用いて、間葉系幹細胞のためのｓｃＦｖを生成できる。
【０１００】
精製ＴＭＳＣ３を用いたヒトＭＳＣのＦＡＣＳ分析
従来法に対する、ｓｃＦｖを使用する本発明の追加的利点は、マウスおよびラットＭＡｂｓが使用されるときには、細胞に対するＭＡｂの非特異的結合を防止するためのｆｃ―遮断剤の使用が必須であるという事実に関する。本発明においては、ニワトリ由来のｓｃＦｖが使用されるため、その必要はない。培養ＭＳＣが、細胞スクラッピングにより採取され、ＦＡＣｓバッファーで洗浄された（ＤＭＥＭ培地＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．０２％アジ化ナトリウム）。合計５０μｌの、１０μｇ／ｍｌのカラム精製ｓｃＦｖが、試料あたり１ｘ１０６細胞に加えられ、氷上で３０分間インキュベートされた。細胞が、培地＋１％ＢＳＡで二度洗浄され、氷上の３０分間の１：５０希釈の抗ＨＡ  ＦＩＴＣ抗体５０μｌの添加により、細胞に対するｓｃＦｖの結合が検出された。試料が、ＦＡＣｓバッファーにおいて二回洗浄された。死細胞および残屑をゲートアウトするために、２００μｌ  ＤＭＥＭ＋ＤＡＰＩ（２００ｎＭ）に再懸濁された。Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ）を備えたＦＡＣＳ  ＡＲＩＡで、フローサイトメトリ分析が実行された。
【０１０１】
精製ＴＭＳＣ３を用いた骨髄のＦＡＣＳ分析。
【０１０２】
ヒト骨髄における成体幹細胞を結合する、ＴＭＳＣ１、２、３および４ｓｃＦｖの能力が、以下のように分析された：ヒト骨髄が、Ｃａｍｂｒｅｘにより供給された。１ｍｌのヒト骨髄が、４℃で、５分間３５０ｇで遠心分離され、１ｍｌの赤血球溶解バッファーを再懸濁し、９０秒間室温でインキュベートされた。細胞が遠心分離され、ＦＡＣＳバッファー（ＤＭＥＭ培地＋１％ＢＳＡ＋０．０２％アジ化ナトリウム）で洗浄され、ＦＡＣｓバッファー中２０％ヒト血清とともにインキュベートされ、３０分間氷上でインキュベートされた（これは、ＣＤマーカを使用する場合のＦｃブロッキング工程である）。その後、細胞が、５０μｌの１０μｇ／ｍｌ精製ｓｃＦｖとともに、氷上で３０分間インキュベートされた。細胞が、ＦＡＣｓバッファーで二回洗浄され、５０μｌの１：５０希釈のラット抗ＨＡ  ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）プラス１０μｌのＣＤ３  ＡＰＣ、ＣＤ１４  ＡＰＣ、ＣＤ１９  ＡＰＣ  Ｃｙ７、ＣＤ３４  ＡＰＣ、ＣＤ４５  ＰＥ  Ｃｙ７、ＣＤ５６  ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））、およびＣＤ２３５ａ  ＡＰＣ  Ｃｙ７のいずれかとともにインキュベートされ、暗所で、氷上で３０分間インキュベートされた。細胞が洗浄され、ＢＤ  ＦＡＣＳＡＲＩＡソーターで分析された。
【０１０３】
マウス骨髄のためにマウスが殺され、骨髄が採取された。ＲＢＣ溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ）を使用して赤血球細胞が溶解され、細胞がＦＡＣｓバッファー中に再懸濁された。その後、細胞（１ｘ１０６細胞）が、５０μｌの１０μｇ／ｍｌの精製ｓｃＦｖとともに氷上で３０分間インキュベートされた。細胞が、ＦＡＣｓバッファーにより二回洗浄され、５０μｌの１：５０希釈ラット抗ＨＡ  ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）プラス１０μｌのＣＤ４４  ＡＰＣとともにインキュベートされ、暗所で、氷上で３０分間インキュベートされた。細胞が洗浄され、ＢＤ  ＦＡＣＳＡＲＩＡソーターで分析された。
【０１０４】
ウマ骨髄が、赤血球溶解バッファー（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｌｙｓｅ）で処置され、ＦＡＣｓバッファー中に再懸濁された。その後、細胞（１ｘ１０６細胞）が、５０μｌの１０μｇ／ｍｌの精製ｓｃＦｖとともに氷上で３０分間インキュベートされた。細胞が、ＦＡＣｓバッファーにより二回洗浄され、５０μｌの１：５０希釈ラット抗ＨＡ  ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）とともにインキュベートされ、暗所で、氷上で３０分間インキュベートされた。細胞が洗浄され、ＢＤ  ＦＡＣＳＡＲＩＡソーターで分析された。
【０１０５】
ヒトＭＳＣの脂肪生成
単層培養のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、デキサメサゾン、インシュリン、３―メチルイソブチルキサンチン（ＭＩＸ）およびインドメタシンを含む脂肪生成培地の存在下で、脂肪生成分化を経る［４５］。脂肪生成分化は、脂質空胞の形成により決定される。
【０１０６】
方法：各アッセイにつき、２つのウェル（一つは「処置」、一つは「コントロール」）のｈＭＳＣが、６ウェルプレートのウェルあたり２ｘ１０５細胞で準備され（２〜３ｍｌの体積で）、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートされる。細胞がコンフルエントになるまで、ｈＭＳＣ培地が一週間あたり三回供給される。コンフルエンシー後、２．０ｍｌの適切な培地が各ウェルに加えられる。１日目（コンフルエンシー後）、処置ウェルにフィルタ滅菌された脂肪生成誘導培地（０．２ｍＬの１ｍＭデキサメサゾン溶液、０．４ｍＬの１００ｍＭインドメタシン溶液、２ｍｌの抗生物―抗真菌溶液、２０ｍｌのウシ胎児血清、２ｍｌの１ｍｇ／ｍｌインシュリン、０．２ｍｌの５００ｍＭのＭＩＸ、１７５．２ｍｌのＨＧ―ＤＭＥＭ）が供給され、「コントロール」ウェルには、ｈＭＳＣ増殖（２０ｍｌのウシ胎児血清、２ｍｌの抗生物―抗真菌溶液、１７８ｍｌの低グルコースＤＭＥＭ）が供給される。５および９日目、「処置」ウェルに脂肪生成誘導培地が供給され、コントロールウェルには、ｈＭＳＣ増殖培地が供給される。４、８、１２、１５、および１７日目には、処置ウェルに脂肪生成維持培地（２ｍｌの抗生物―抗真菌溶液２０ｍｌのウシ胎児血清、２ｍｌの１ｍｇ／ｍｌインシュリン、１７６ｍｌのＨＧ―ＤＭＥＭ）が供給され、コントロールウェルには、ｈＭＳＣ増殖培地が供給される。１９日目には、各ウェルを２ｍｌの滅菌ＤＰＢＳその後１０％のホルマリンですすぐことにより細胞が固定され、室温で３０分間インキュベートされ、１ｍｌのＤＰＢＳで細胞がすすがれ、２ｍｌのＤＰＢＳ中に再懸濁される。オイルレッドＯ染色を用いて、脂肪生成が定量されうる。簡単にいうと、オイルレッドＯの使用液（６パートのストックオイルレッドＯ（０．３ｇ／１００ｍｌイソプロパノール９９％）を４パートの蒸留水と混合）を、細胞の層がカバーされるまでピペットし、５分間置く。吸引液を除去し、水道水ですすぐ。ヘマトキシリンをプレート上にピペットし、１分間染色し、４分間暖かい水道水で洗浄し、顕微鏡で染色を観察する。染色された構造が、脂肪生成細胞に特徴的である脂質空胞を表す。イソプロパノールを使用してオイルレッドＯを抽出する。４９０ｎｍ〜５２０ｎｍで吸光度を読み取り可能な分光光度計または９６ウェルプレートリーダーを使用して、抽出された染色を定量する。
【０１０７】
ヒトＭＳＣの軟骨形成ペレット培養
方法：培養ＭＳＣがトリプシン処理され、計数され、各軟骨生成ペレットが１５ｍＬポリプロピレン円錐スクリュートップチューブに２ｘ１０５細胞を含むように、０．５ｍｌの完全軟骨生成培地（ＤＭＥＭ（高グルコース）＋６．２５μｇ／ｍＬウシインシュリン、伝達（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）、亜セレン酸、５．３３μｇ／ｍＬリノール酸、１．２５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１００ｍＭデキサメサゾン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸―２―リン酸塩、４０μｇ／ｍＬプロリン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１０，０００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２５０ｎｇ／ｍＬアンフォテリシンＢ＋ＴＧＦ―β３＠１０ｎｇ／ｍＬ）中に再懸濁され、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされた［４６］。２４時間後、各チューブの底の細胞が、１／２〜１ｍｍの直径のボールまたはディスクに収縮する。培地が一週間に３回変えられ、１〜２週で軟骨生成分化が始まる。四組のペレットが、０、１４および２１日目のアッセイの各時点に準備される。各時点での二つのペレットが、組織評価のために使用され、残りの二つが生化学的分析に使用される。
【０１０８】
軟骨形成が、定量されうる。簡単にいうと、ペレットが、パラフィン包埋により採取されるか、または冷凍切断または生化学的分析のための適切な溶液中に配置される（硫酸グリコサミノグリカン（Ｓ―ＧＡＧ）の分析のための、ペレットのパパイン消化）。高品質の薄い組織切片のために、採取されたペレットが直ちに、４％のパラホルムアルデヒドの等浸透液または１０％の緩衝ホルマリンにより、３０〜６０分間固定される。その後ペレットが、脱水、パラフィン包埋、セクショニング、染色のため、固定溶液から７０％のエタノール溶液に移される。細胞外基質へのＳ―ＧＡＧの輸出が、軟骨生成表現型の特質である。Ｓ―ＧＡＧ蓄積の測定は、Ｓ―ＧＡＧに合成されたときにジメチルメチレンブルーにより示される異染性変化と、これによる染料の吸収スペクトルのシフトとに依存する。簡単にいうと、ペレットがパパインにより消化され、ＤＭＭＢの溶液が消化物に加えられる。陽性反応により、５９５ｎｍでの吸光度の減少が生じる。得られた値が、既知量のコンドロイチン硫酸を用いて準備された標準曲線に対して比較される。
【０１０９】
ヒトＭＳＣの骨形成
方法：６ウェルプレートにウェルあたり３ｘ１０４細胞の密度でプレートされたヒトＭＳＣが、ｈＭＳＣ培地（１００ｍｌのウシ胎児血清、１０ｍｌの抗生物―抗真菌溶液、８９０ｍｌの低グルコースＤＭＥＭ）において、骨形成補助剤（０．１ｍｌの１ｍＭ  Ｄｅｘ溶液、１０ｍｌの１Ｍ  β―グリセロリン酸溶液および５ｍｌの１０ｍＭ  ＡｓＡＰ）の非存在下および存在下で１６日間成長させられる。毎週二回培地交換が行われ、培地体積はウェルあたり２ｍｌである［４７］。１６日目に石灰沈着を測定することにより、骨形成が定量されうる。
【０１１０】
【表１】
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参考文献
【０１１１】
【化１】
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【０１１２】
【化２】
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【０１１３】
【化３】
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【０１１４】
【化４】
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【０１１５】
【化５】
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【０１１６】
【化６】
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【０１１７】
【化７】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年10月27日(2009.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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