(57)【要約】  本発明は肝障害、特にＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）関連肝障害の治療方法に関する。本発明はまた、肝障害の治療における使用のための組成物およびキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造におけるＩＬ−８遮断薬の使用。
【請求項２】
該薬剤がＴＲＡＩＬ遮断薬を含まない、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該薬剤がＴＲＡＩＬ遮断薬を追加的に含む、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
肝炎の治療および／または予防のための薬剤の製造におけるＴＲＡＩＬ遮断薬の使用。
【請求項５】
該薬剤がＩＬ−８遮断薬を追加的に含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
肝疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造における、ＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸分子の使用。
【請求項７】
該薬剤がＴＲＡＩＬ遮断薬またはＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする核酸分子を含まない、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
該薬剤がＴＲＡＩＬ遮断薬またはＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする核酸を追加的に含む、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
肝炎の治療および／または予防のための薬剤の製造における、ＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする１以上の核酸分子の使用。
【請求項１０】
該ＩＬ−８遮断薬が肝細胞上にＴＲＡＩＬ−Ｒ２の発現を誘導するＩＬ−８活性を遮断する、請求項１〜３および請求項５〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
該ＩＬ−８遮断薬が、可溶性ＩＬ−８レセプターおよびＩＬ−８に親和性を有する抗体分子からなる群より選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
該ＴＲＡＩＬ遮断薬がＴＲＡＩＬリガンドとＴＲＡＩＬ死誘導レセプターとの相互作用を阻止する、請求項３〜５ならびに請求項８および９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
該ＴＲＡＩＬ遮断薬が、可溶性ＴＲＡＩＬレセプターおよびＴＲＡＩＬリガンドまたはＴＲＡＩＬ死誘導レセプターに親和性を有する抗体分子からなる群より選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
該肝疾患がＨＢＶ感染に関連する、請求項１〜３および請求項６〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
該肝疾患が慢性ＨＢＶ感染である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
該肝疾患がｅＡｇ−ＣＨＢ感染である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
該肝疾患が肝炎を呈する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
該薬剤が、ＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤、またはＩＦＮ−αをコードする核酸分子もしくは抗ウィルス逆転写酵素剤を追加的に含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
該薬剤が肝疾患の治療および／または予防を補助する追加成分を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
該追加成分がＨＢＶ抗ウィルス剤である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
該薬剤の各成分が同時、連続的、または別々の送達のためである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
該薬剤がヒトにおける疾患の治療および／または予防のためである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
該薬剤が肝障害および／または炎症の程度を減少させる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
ＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬をコードする発現ベクター。
【請求項２５】
ＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸分子により形質転換された宿主細胞。
【請求項２６】
有効量のＩＬ−８遮断薬を個体へ送達することを含む、肝疾患を有する個体の治療および／または予防のための方法。
【請求項２７】
ＴＲＡＩＬ遮断薬を個体へ送達することを含まない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＴＲＡＩＬ遮断薬を個体へ送達することを追加的に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
有効量のＴＲＡＩＬ遮断薬を個体へ送達することを含む、肝炎を有する個体の治療および／または予防する方法。
【請求項３０】
ＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸分子の有効量を個体へ送達することを含む、肝疾患を有する個体の治療および／または予防する方法。
【請求項３１】
ＴＲＡＩＬ遮断薬またはＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする核酸を個体へ送達することを含まない、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＲＡＩＬ遮断薬またはＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする核酸を個体へ送達することを追加的に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする１以上の核酸分子の有効量を個体へ送達することを含む、肝炎を有する個体の治療および／または予防する方法。
【請求項３４】
有効量のＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤、またはＩＦＮ−αをコードする核酸もしくは抗ウィルス逆転写酵素剤を個体へ送達することを追加的に含む、請求項２６〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬、またはＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸を１以上の薬理学的に許容される賦形剤と共に含む、薬理学的に許容される組成物。
【請求項３６】
ＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤、またはＩＦＮ−αをコードする核酸分子
もしくは抗ウィルス逆転写酵素剤を追加的に含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
ＴＲＡＩＬ遮断薬と、ＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤との組み合わせ、またはＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする１以上の核酸分子およびＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤を１以上の薬理学的に許容される賦形剤と共に含む、薬理学的に許容される組成物。
【請求項３８】
ＩＬ−８遮断薬と、ＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤との組み合わせ、またはＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸分子およびＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤を１以上の薬理学的に許容される賦形剤と共に含む、薬理学的に許容される組成物。
【請求項３９】
ＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬、またはＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸を含む、肝疾患を治療するためのキット。
【請求項４０】
ＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤、またはＩＦＮ−αをコードする核酸分子もしくは抗ウィルス逆転写酵素剤を追加的に含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
ＴＲＡＩＬ遮断薬と、ＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤との組み合わせ、またはＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする１以上の核酸分子およびＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤を含む、肝炎を治療するためのキット。
【請求項４２】
ＩＬ−８遮断薬と、ＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤との組み合わせ、またはＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸分子およびＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤を含む、肝疾患を治療するためのキット。
【請求項４３】
肝疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造におけるＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬の使用。
【請求項４４】
肝疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造における、ＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸分子の使用。
【請求項４５】
有効量のＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬を個体へ送達することを含む、肝疾患を有する個体の治療および／または予防のための方法。
【請求項４６】
ＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸分子の有効量を個体へ送達することを含む、肝疾患を有する個体の治療および／または予防のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肝障害、特にＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）関連肝障害の治療方法に関する。本発明はまた、肝障害の治療に用いるための組成物およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓指向性のＤＮＡウィルスであるＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）による慢性感染は、世界的な肝疾患の主原因である。３億５千万人を超える人々が持続的に感染しており、肝硬変および肝細胞癌をもたらす慢性肝炎にかかる危険性がある。世界保健機関は、毎年少なくとも１００万人の死亡がＨＢＶ関連の肝疾患に直接起因していると推定する。多くの国でみられる慢性疾患の比率の増大は、「ｅ抗原」の発現を欠如するものの活発なウィルス複製および肝疾患に関連する、ｅ抗原陰性慢性Ｂ型肝炎（ｅＡｇ−ＣＨＢ）と名付けられたウィルス変異株の発生が原因である（非特許文献１）。ｅＡｇ−ＣＨＢをもつ患者は肝炎において、大きな、説明できない変動により特徴付けられる、反復性、自発性の「肝炎」を起こしやすく、かつ重篤な肝繊維症へと迅速に進行する傾向にある（非特許文献２）。これらの肝炎は、凝縮された時間枠にわたって、ウィルス量および肝炎の動的変化に関連する機序を研究するための格好の機会を提供する。ＨＢＶは細胞壊死性ではないことから肝障害は免疫を介すると考えられているが、ヒトＨＢＶ感染において肝細胞死を導く分子経路はよく分かっていない。ＨＢＶ感染による肝障害に寄与する免疫反応の種々の構成要素において方法を分析することへの差し迫った必要性があり、このことが肝炎を制限または阻止する一方で、ウィルス制御を増強する免疫治療戦略の合理的な発展を可能にし得る。
【０００３】
ＨＢＶに感染した患者における免疫介在性の肝障害は従来、ウィルス特異的なＣＤ８Ｔ細胞による、感染肝細胞の細胞溶解性の死滅に起因すると考えられた。しかしながらこの仮説は、肝炎のいずれの形跡も無くＨＢＶ感染を制御している患者の肝臓に、活性化ＨＢＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞が高頻度で存在することを示す以前の研究により異議を唱えられた。その代わりに、ＨＢＶ関連慢性肝疾患を有する患者と有さない患者を区別する特徴は、前グループの肝臓内に大きな、非抗原特異的リンパ球性浸潤物が存在することであった（非特許文献３）。この非特異的な炎症性浸潤物の動員および活性化をもたらす機序については、ＨＢＶのトランスジェニックマウスモデルにおいて調査された。このモデルでは、非特異的細胞性浸潤物の阻害によって肝障害の重症度を減少させることが可能であり（非特許文献４、５）、ウィルス特異的ＣＤ８により開始される肝炎がその他のリンパ球によって増幅されるという概念が強固にされた（非特許文献６）。
【０００４】
ＨＢＶトランスジェニックマウスにおけるリンパ球性浸潤物の最大の構成物の一つは、炎症性浸潤物中での数が基本的水準に比べて１０−１２倍に増加しているＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋ＣＤ３−）である（非特許文献４、５）。ＮＫ細胞（ＣＤ３-ＣＤ５６+）はヒト肝臓内でも同様に、全肝臓内リンパ球の３０−４０％を構成する、細胞性浸潤物の主要な構成要素である（非特許文献７）。ＨＢＶ感染の潜伏段階（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）における循環ＮＫ細胞の早期の増加が実証されており、これらがこの設定での初期のウィルス封じ込めに寄与しているかもしれないことを示唆している。（非特許文献８）。慢性ＨＢＶ感染患者のＮＫ細胞の、抗ウィルスおよび病原性の可能性についてはこれまでに取り組まれていない。
【０００５】
ＮＫ細胞を介する抗ウィルス細胞毒性を通した機序は臓器依存性であると思われる（非特許文献９）。現在のところパーフォリン／グランザイムを通したＮＫ細胞毒性は、標的
肝細胞がこの経路を通した溶解に対して比較的抵抗性であることから、肝臓の環境下での関連性は少ないと考えられている（非特許文献９、１０）。肝障害においては、ＴＮＦスーパーファミリーに属するリガンド／レセプター対を通したレセプター介在性の細胞死がさらに重要な役割を果たしていると思われる（非特許文献１１、１２）。このような経路の一つは浸潤リンパ球上に発現するＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）（非特許文献１３）を介しており、これは肝細胞上のＴＲＡＩＬ死誘導レセプター（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）（非特許文献１４）と相互作用する。このことはマウスのリステリアおよびコンカナバリン−Ａ誘導性の肝炎における、ｉｎ  ｖｉｖｏでの肝障害の決定的な樹序として示された（非特許文献１５）。肝臓のＴＲＡＩＬ介在性アポトーシスにおけるＮＫ細胞の必須の役割は、腫瘍転移調査の設定において強調された（非特許文献１６）。正常ヒト肝細胞もまたＴＲＡＩＬ介在性アポトーシスに感受性のあることが示されており（非特許文献１７、１８）、この経路に対する感受性はウィルス性肝炎の間に増大する可能性のあることが示唆された（非特許文献１９、２０）。本発明者らはＴＲＡＩＬを発現したＮＫが、慢性ＨＢＶ感染における肝障害の非抗原特異的媒介に役割を果たす可能性があると仮定した。
【０００６】
Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献４８）では、ＨＢＶトランスジェニックマウスにおける肝炎および肝細胞死を減少させるため、ＴＲＡＩＬの機能を遮断する可溶性ＴＲＡＩＬレセプターの使用が示された。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献５６）では、ＴＲＡＩＬの機能を遮断するためにヒト可溶性デスレセプター５が使用され、ＨＢＶを導入した肝細胞のアポトーシスの減少が示された。
【０００７】
ＮＫ細胞のエフェクター機能はその活性化および抑制性レセプターを通したシグナルのバランスの結果であり、このバランスは局所的なサイトカイン環境により影響される。さらに、ＮＫ細胞はあるサイトカインにより抗ウィルス活性へと直接活性化でき、ＩＦＮ−α促進性細胞毒性（非特許文献２１）およびＴＲＡＩＬの発現（非特許文献２２）、ならびにＩＬ−１２によるＩＦＮ−γの産生（非特許文献２１）を示す。ＩＦＮ−αの産生は急性ウィルス感染の初期段階を特徴付けるが、その放出が慢性ＨＢＶ感染にみられる持続的な高レベルの抗原刺激の背景で起こるウィルス量の変動によってもまた引き起こされるかどうかは不明である。産生されたＩＦＮ−αのいずれの下流の効果も、抗原活性化細胞中では減弱するか（非特許文献２３、２４）、またはＩＬ−１β（非特許文献２５）およびＩＬ−８（非特許文献２６、２７）のようなその他のサイトカインの上昇により修飾される可能性がある。
【０００８】
肝障害、特にＨＢＶ感染が原因となる肝障害の有効な治療が必要とされている。ＨＢＶ感染に関連する肝炎の有効な治療もまた必要とされている。特に進行型の肝疾患を有する個体において、ＩＦＮ−αの有害な影響、すなわち肝細胞死を克服することもまた必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bonino, F., and M.R. Brunette et al, J Hepatol 39 Suppl, 1, S 160-163, 2003.
【非特許文献２】Brunetto, M.R. et al, J Hepatol, 36, 263-270, 2002.
【非特許文献３】Maini, M.K. et al, J Exp Med, 191, 1269-1280, 2000.
【非特許文献４】Kakimi, K. et al, J Exp Med, 194, 1755-1766, 2001.
【非特許文献５】Sitia, G. et al, J Clin Invest, Hl, 1158-1167, 2004.
【非特許文献６】Ando, K. et al, J Exp Med, 178, 1541-1554, 1993.
【非特許文献７】Norris, S et al, J Hepatol, 28, 84-90, 1998.
【非特許文献８】Webster, GJ. et al, Hepatology, 32, 1117-1124, 2000.
【非特許文献９】Tay, C.H., and R.M. Welsh. J et al, Virol, 71, 267-275, 1997.
【非特許文献１０】Kafrouni, M.I. et al, J Immunol, 167, 1566-1574, 2001.
【非特許文献１１】Galle, P.R. et al, J Exp Med, 182, 1223-1230, 1995.
【非特許文献１２】Balkow, S. et al, J Virol, 75, 8781-8791, 2001.
【非特許文献１３】Wiley, S.R. et al, Immunity, 3, 673-682, 1995.
【非特許文献１４】Sheridan, J.P. et al, Science, 277, 818-821, 1997.
【非特許文献１５】Zheng, SJ. et al, J Clin Invest, Ul, 58-64, 2004.
【非特許文献１６】Takeda, K. et al, Nat Med, 7, 94- 100, 2001.
【非特許文献１７】Jo, M. et al, Nat Med, 6, 564-567, 2000.
【非特許文献１８】Lawrence, D. et al, Nat Med, 7, 383-385, 2001.
【非特許文献１９】Mundt, B. et al, Faseb J, J7, 94-96, 2003.
【非特許文献２０】Saitou, Y. et al, Hum Pathol, 36, 1066-1073, 2005.
【非特許文献２１】Nguyen, K.B. et al, J Immunol, 169, 4279-4287, 2002.
【非特許文献２２】Sato, K. et al, Eur J Immunol, 31, 3138-3146, 2001.
【非特許文献２３】Marrack, P., J. Kappler, and T. Mitchell et al, J Exp Med, 189, 521-530, 1999.
【非特許文献２４】Dondi, E. et al, J Immunol, 170, 749-756, 2003.
【非特許文献２５】Tian, Z. et al, X. J Immunol, 165, 3959-3965, 2000.
【非特許文献２６】Khabar, K.S. et al, J Exp Med, 186, 1077-1085, 1997.
【非特許文献２７】Polyak, SJ. et al, J Virol, 75, 6209-6211, 2001.
【非特許文献２８】Guidotti, L.G. et al, Science 284, 825-829, 1999.
【非特許文献２９】Myers, R.P. et al, J Hepatol, 39, 222-23O5 2003.
【非特許文献３０】Kashii, Y. et al, J Immunol, 163, 5358-5366, 1999.
【非特許文献３１】Mirandola, P. et al, Blood, 104, 2418-2424, 2004.
【非特許文献３２】Ishiyama, K. et al, Hepatology, 43, 362-372, 2006.
【非特許文献３３】Cooper, M.A. et al, Trends Immunol, 22, 633-640, 2001.
【非特許文献３４】Sprengers, D. et al, J Med Virol, 78, 561-568, 2006.
【非特許文献３５】Ichikawa, K. et al, Nat Med, 7, 954-960, 2001.
【非特許文献３６】Clancy, L. et al, Proc Natl Acad Sci U S A5 102, 18099-18104, 2005.
【非特許文献３７】Rossol, S. et al, J Clin Invest, 99, 3025-3033, 1997.
【非特許文献３８】Tsai, S.L. et al, J Clin Invest, 89, 87-96, 1992.
【非特許文献３９】Lohr, H.F. et al, Hepatology, 22, 61-68, 1995．
【非特許文献４０】Sato, K. et al, J Exp Me, 203, 239-250, 2006.
【非特許文献４１】Herbeuval, J.P. et al, Blood, 106, 3524-3531, 2005.
【非特許文献４２】Radaeva, S. et al, Gastroenterology, 130, 435-452, 2006.
【非特許文献４３】Ashkenazi, A. et al, J Clin Invest, 104, 55-162, 1999.
【非特許文献４４】Walczak, H. et al, Nat Med, 5, 157-163, 1999.
【非特許文献４５】Schneider, P. et al, J Exp Med, 187, 1205-1213, 1998.
【非特許文献４６】Higuchi, H. et al, J Biol Chem, 276, 38610-38618, 2001．
【非特許文献４７】Janssen, H.L. et al, J Hepatol, 39, 414-420, 2003.
【非特許文献４８】Liang, X. et al, J Immunol, 178, 503-510, 2007.
【非特許文献４９】Mahe, Y. et al, J Biol Chem, 266, 13759-13763, 1991.
【非特許文献５０】Campbell, JJ. et al, J Immunol, 166, 6477-6482, 2001.
【非特許文献５１】Salazar-Mather, T.P. et al, J Clin Invest, JJO, 321-330, 2002.
【非特許文献５２】Kakimi, K. et al, J Exp Med, 192, 921-930, 2000.
【非特許文献５３】Kayagaki, N. et al, J Exp Med, 189, 1451-1460, 1999.
【非特許文献５４】Reynolds, G.M. et al, Br J Haematol, 118, 195-201, 2002.
【非特許文献５５】Afford, S.C. et al, J Exp Med, 189, 441-446, 1999.
【非特許文献５６】Liu, Yu-Gang et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 352, 329-334, 2007.
【発明の概要】
【００１０】
本発明の第一の態様によれば、肝疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造におけるＩＬ−８遮断薬の使用が提供される。
【００１１】
驚くべきことにＩＬ−８遮断薬は、ＴＲＡＩＬ遮断薬非存在下での肝疾患の治療および予防に有効であることが見出された。
【００１２】
本発明の第一の態様の特定の実施形態において、該薬剤はＴＲＡＩＬ遮断薬を含まない。
【００１３】
本発明の第一の態様の別の特定の実施形態において、該薬剤はＴＲＡＩＬ遮断薬を追加的に含む。
【００１４】
ＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬の使用は、肝疾患の治療および予防において特に有効であることが見出された。特に両遮断薬の組み合わせは、ＴＲＡＩＬ遮断薬の単独使用よりもさらに有効であることが見出された。
【００１５】
本明細書において「ＩＬ−８遮断薬」という用語は、ＩＬ−８活性、特に肝細胞上のＴＲＡＩＬ−Ｒ２の発現を誘導するＩＬ−８活性および／またはＮＫ細胞を化学遊走させるＩＬ−８活性を遮断できるいずれの薬剤をも指す。適切な遮断薬は、可溶性ＩＬ−８レセプター、ＩＬ−８またはそのレセプターに親和性を有する抗体分子、ＩＬ−８またはそのレセプターに親和性を有するその他の分子（例えばアフィボディ）、小分子などを含む。
【００１６】
本明細書において「抗体分子」という用語は、いずれかのアイソタイプのポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2断片および単鎖Ｆｖ断片を指す。抗体分子はキメラ抗体分子、ＣＤＲ接合抗体分子、またはその抗原結合断片のような組み換え抗体分子であってよい。このような抗体およびその産生方法は周知である。抗体分子はいずれの適切な方法、例えばハイブリドーマまたはファージ技術を用いて産生できる。当業者であれば、望まれる親和性を有する抗体をどのように産生するかを知り得るであろう。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｅｄｓ．  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  １９８８を参照のこと。抗体分子はいずれの適切な生物、例えばヒツジ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ラクダ、ラマもしくはサメから、または分子生物学技術を通して作製された特異的ライブラリーから産生できる。
【００１７】
ＩＬ−８遮断薬は、ＩＬ−８またはそのレセプターに親和性を有する抗体分子であることが特に好ましい。ＩＬ−８に親和性を有する幾つかの抗体が知られている（例えばＡＢＸ−ＩＬ−８（Ｍａｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｓｔ，  １２６，  ９２６−３４，  ２００４））。
【００１８】
本明細書において「ＴＲＡＩＬ遮断薬」という用語は、ＴＲＡＩＬ介在性アポトーシスを阻止できるいずれの薬剤をも指す。該遮断薬は、好ましくはＴＲＡＩＬリガンドとＴＲ
ＡＩＬ死誘導レセプター（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２）との相互作用を阻止する。適切な遮断薬は、可溶性ＴＲＡＩＬレセプター（例えば可溶性デスレセプター（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（非特許文献５６）およびＬｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（非特許文献４８）を参照のこと））、ＴＲＡＩＬリガンドまたはレセプターに親和性を有する抗体分子、ＴＲＡＩＬリガンドまたはレセプターに親和性を有するその他の分子（例えばアフィボディ）、小分子などを含む。
【００１９】
ＴＲＡＩＬ遮断薬は、ＴＲＡＩＬリガンドまたはレセプターに親和性を有する抗体分子であることが特に好ましい。
【００２０】
ＴＲＡＩＬ死誘導レセプターに親和性を有する抗体（例えばｍＡｂ３７５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ＰＥおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、アビンドン、英国））と同様に、ＴＲＡＩＬリガンドに親和性を有する幾つかの抗体（例えばＴＲＡＩＬ−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カウリー、英国））が知られている。
【００２１】
肝疾患の治療および／または予防には、ＩＬ−８遮断薬の単独使用、またはＴＲＡＩＬ遮断薬とＩＬ−８遮断薬との併用が特に有効であることが見出された。
【００２２】
本発明の第一の態様の特に好ましい実施形態では、肝疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造におけるＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬の使用が提供される。
【００２３】
本明細書において「肝疾患」という用語は、ＴＲＡＩＬ経路が肝細胞のアポトーシスを導くいずれの肝疾患にも適用される。肝疾患はＨＢＶもしくはＨＣＶ感染、ＨＢＶもしくはＨＣＶのＨＩＶとの同時感染、または脂肪酸肝疾患（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）であってよい。好ましくは、肝疾患はＨＢＶ感染に関連する。肝疾患は慢性ＨＢＶ感染、好ましくはｅＡｇ−ＣＨＢ感染であることがさらに好ましい。肝疾患は、慢性ＨＢＶ感染に関連し、肝炎における大きな増大により特徴付けられる肝炎に関連することがさらになお好ましい。
【００２４】
本発明の第一の態様による使用においては、該薬剤はＩＦＮ−αを追加的に含んでよい。ＩＦＮ−αはＮＫ細胞を細胞障害性となるように促進することから、しばしばウィルス感染の治療に用いられる。従って本発明者らは、ＩＦＮ−α活性化ＮＫ細胞はウィルス制御および肝障害において二重の役割を持つと考える。さらに、ＨＢＶ感染の治療におけるＩＦＮ−αの外来性の使用は、特に進行型の肝疾患を有する個体において肝炎およびそれによる肝障害の原因となる傾向のため、しばしば制限される。従って、ＩＦＮ−αをＩＬ−８遮断薬および／またはＴＲＡＩＬ遮断薬と共に投与することにより、ＩＦＮ−αの有害な影響（すなわち肝障害）を減少できる。抗ウィルス薬としての作用を提供するいずれの形のＩＦＮ−αも使用できる。好ましくは、ＩＦＮ−αはペグ化されている。
【００２５】
本発明の第一の態様によるさらなる使用において、該薬剤は抗ウィルス逆転写酵素剤（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ）を追加的に含んでよい。抗ウィルス逆転写酵素剤はしばしばウィルス感染の治療に使用され、その使用は肝炎に関連している。ＨＢＶ感染の治療における抗ウィルス逆転写酵素剤の外来性の使用は、特に進行型の肝疾患を有する個体において、肝炎およびそれによる肝障害を導く、薬剤耐性の発生に起因するウィルス抑制の喪失によりしばしば制限される。従ってＩＬ−８遮断薬および／またはＴＲＡＩＬ遮断薬は、抗ウィルス逆転写酵素剤に対する薬剤耐性の発生に起因するウィルス抑制の喪失により形成される、肝炎を予防するために使用されてよい。さらに、抗ウィルス逆転写酵素剤をＩＬ−８遮断薬および／またはＴＲＡＩＬ遮断薬と共に投与することにより、抗ウィルス逆転写酵素剤の有害な影響（すなわち肝障害）を減
少できる。ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、クレブジン、テノホビルおよびこれらの組み合わせを含むいずれの抗ウィルス逆転写酵素剤も、ＨＢＶ感染の治療のために使用できる。
【００２６】
本発明の第一の態様による使用において、該薬剤はＩＦＮ−αまたは抗ウィルス逆転写酵素剤を投与されている個体の肝疾患の治療のために使用されてよい。ＩＦＮ−αおよび抗ウィルス逆転写酵素剤の使用は肝炎の発生に関連する傾向があることから、該薬剤は特にＩＦＮ−αまたは抗ウィルス逆転写酵素剤を投与されている個体における肝炎の予防または減少に有用であろう。
【００２７】
本発明の第一の態様による使用において該薬剤はまた、肝疾患の治療および／または予防を補助するいずれの追加成分も含むことができる。適切な追加成分は、肝疾患がウィルス感染（例えばＨＢＶ感染、またはＨＢＶおよびＨＩＶの同時感染）に関連する際には抗ウィルス剤を含む。適切な抗ＨＢＶおよび抗ＨＩＶ剤はヌクレオシド系阻害剤を含む。
【００２８】
薬剤の各成分は、免疫反応を起こすことのできる動物へ同時に、連続的に、または別々に送達できる。好ましくは、各成分は同時に投与される。組成物は反復投与できる。
【００２９】
本発明の第一の態様による使用において、該薬剤はヒト、家畜または愛玩動物のようないずれの適切な動物における肝疾患の治療のためにある。好ましくは、該動物は哺乳類または鳥類である。特に、該動物はヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジおよび鳥類を含む群から選択されてよい。該動物はヒトであることが特に好ましい。
【００３０】
本明細書において「治療」という用語は、血清トランスアミナーゼのような肝炎および肝障害の測定値のいずれの低下、または生検における肝炎の減少に適用される。
【００３１】
本明細書において「予防」という用語は、肝炎および肝障害の程度を阻止、遅延または減弱することに適用される。
【００３２】
当業者により理解されるように、ＩＬ−８遮断薬および／またはＴＲＡＩＬ遮断薬は、一種または複数種の該遮断薬をコードする１以上の核酸の形で投与できる。従って本発明の第一の態様の別の実施形態では、肝疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造における、ＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸分子の使用が提供される。該薬剤は、好ましくはＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする１以上の核酸もまた含む。
【００３３】
一種または複数種の該遮断薬を望まれる場へ送達するための１以上の核酸の使用は、肝疾患治療のための別の方法である。ＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬の両方が１以上の核酸によりコードされる際、これらは単一の核酸分子または別々の核酸分子によりコードできる。
【００３４】
本発明の１以上の核酸は、周知の方法により得られる。例えば天然配列は、適切な細胞株から、またはヒトもしくはマウスのような生物の組織から直接由来する、ＤＮＡまたはｃＤＮＡからのゲノムクローニングまたはｃＤＮＡクローニングにより得られてよい。あるいは、配列はホスホラミダイト法のような標準的な合成法を用いて合成できる。
【００３５】
合成またはクローニング法により得られた核酸配列を改変するために、多数の技術が用いられてよい。このような技術は当業者に周知である。例えばＤＮＡ配列を改変するために、部位特異的変異誘発、またはオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発およびＰＣＲ技術が用いられてよい。このような技術は当業者に周知であり、かつ公知の文献の大部分に記載されている。
【００３６】
該１以上の核酸分子は、好ましくは発現ベクターである。発現ベクターは、哺乳類細胞を含む様々な異なる生物に核酸を発現することがよく知られている。本発明の発現ベクターは、好ましくはプロモーターおよび１以上の阻害剤をコードする機能的に連結した核酸分子を含む。さらに該ベクターは、核酸分子の発現を得るために必要とされるいずれのその他の制御配列を含むことが好ましい。
【００３７】
適切な制御配列は、核酸配列が体内の望まれる部位、すなわち肝臓に発現することが確実となり得る配列を含む。
【００３８】
本発明は、ＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬をコードする発現ベクターを提供する。
【００３９】
本発明はまた、ＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸分子により形質転換された宿主細胞も提供する。該遮断薬は、単一の核酸分子または別々の核酸分子によりコードできる。
【００４０】
「形質転換」という用語は、外来性の核酸分子を宿主細胞中に挿入することに適用され、挿入に用いられた方法、例えば直接の取り込み、形質導入、ｆ−接合またはエレクトロポレーションは問わない。外来性の核酸は非組み込み型のベクター（エピソーム）として得られるか、または宿主ゲノムへ取り込まれてよい。
【００４１】
好ましくは、宿主細胞は真核細胞、さらに好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＰＭＣ、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＨｅｐＧ２細胞のような肝臓由来の細胞、およびミエローマもしくはハイブリドーマ細胞株のような哺乳類細胞である。好ましくは、宿主細胞は肝臓由来である。
【００４２】
第二の態様によれば本発明は、有効量のＩＬ−８遮断薬を個体へ送達することを含む、肝疾患を有する個体の治療および／または予防のための方法を提供する。
【００４３】
本発明の第二の態様の特定の実施形態において、該方法はＴＲＡＩＬ遮断薬を個体へ送達することを含まない。
【００４４】
本発明の第二の態様の別の特定の実施形態において、該方法は有効量のＴＲＡＩＬ遮断薬を個体へ送達することを追加的に含む。
【００４５】
本発明の第二の態様の特に好ましい実施形態において、有効量のＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬を個体へ送達することを含む、肝疾患を有する個体の治療および／または予防のための方法が提供される。
【００４６】
本発明の第二の態様による方法は、有効量のＩＦＮ−αを個体へ送達することを追加的に含んでよい。ＩＦＮ−αの有効量とは、ＨＢＶの複製を抑制する量である。
【００４７】
本発明の第二の態様による方法はまた、有効量の抗ウィルス逆転写酵素剤を個体へ送達することも追加的に含んでよい。抗ウィルス逆転写酵素剤の有効量とは、ＨＢＶの複製を抑制する量である。
【００４８】
本発明の第二の態様による方法においては、肝疾患の治療および／または予防を補助するいずれの追加成分もまた個体へ送達できる。適切な追加成分は、本発明の第一の態様に関して上に述べられている。
【００４９】
本発明の第二の態様による方法は、ＩＦＮ−αまたは抗ウィルス逆転写酵素剤を投与されている個体の肝疾患を治療するために用いられてよい。ＩＦＮ−αおよび抗ウィルス逆転写酵素剤は肝炎をもたらす傾向があることから、該方法は特にＩＦＮ−αまたは抗ウィルス逆転写酵素剤を投与されている個体における肝炎の予防または減少に有用であろう。
【００５０】
本発明の第一の態様について上に示すように、ＩＬ−８遮断薬および／またはＴＲＡＩＬ遮断薬は、一種または複数種の該遮断薬をコードする１以上の核酸の形で投与できる。従って本発明の第二の態様の別の実施形態において、ＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸分子の有効量を個体へ送達することを含む、肝疾患を有する個体の治療および／または予防のための方法が提供される。好ましくは、該方法はＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする１以上の核酸の有効量を個体へ送達することを追加的に含む。
【００５１】
ＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬の両方が１以上の核酸によりコードされる際、これらは単一の核酸分子または別々の核酸分子によりコードできる。
【００５２】
本発明の第三の態様によれば、肝炎の治療および／または予防のための薬剤の製造における、ＴＲＡＩＬ遮断薬の使用が提供される。
【００５３】
驚くべきことにＴＲＡＩＬ遮断薬は、肝炎の減少および予防に有効であることが見出された。
【００５４】
肝炎は、増大した肝炎の急性の症状発現である。このような肝炎は、アルコール乱用またはウィルス感染に関連し得る。「肝炎」という用語は、好ましくはＨＢＶ感染、またはＨＢＶおよびＨＩＶの同時感染により起こる肝炎に適用される。ＨＢＶ感染は、好ましくはｅＡｇ−ＣＨＢ感染である。好ましくは、肝炎はｅＡｇ−ＣＨＢ感染により起こる。
【００５５】
本発明の第三の態様の使用において、該薬剤は１以上のＩＬ−８遮断薬、ＩＦＮ−α、または抗ウィルス逆転写酵素剤を追加的に含んでよい。このような追加薬剤の存在により、肝炎の治療および／または予防を改善できる。
【００５６】
本発明の第三の態様の使用において該薬剤はまた、肝炎の治療および／または予防を補助するいずれの追加成分も含むことができる。適切な追加成分は、本発明の第一の態様に関して上に述べられている。
【００５７】
本発明の第三の態様による使用において、該薬剤はＩＦＮ−αまたは抗ウィルス逆転写酵素剤を投与されている個体の肝炎の治療のために使用されてよい。ＩＦＮ−αおよび抗ウィルス逆転写酵素剤は肝炎をもたらす傾向があることから、該薬剤は特にＩＦＮ−αまたは抗ウィルス逆転写酵素剤を投与されている個体における肝炎の予防または減少に有用であろう。
【００５８】
当業者は、ＴＲＡＩＬ遮断薬が、該ＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする１以上の核酸の形で投与できることを理解するであろう。従って本発明の第三の態様の別の実施形態において、肝炎を治療するための薬剤の製造における、ＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする１以上の核酸分子の使用が提供される。
【００５９】
第四の態様によれば本発明は、有効量のＴＲＡＩＬ遮断薬を個体へ送達することを含む、肝炎を有する個体の治療および／または予防のための方法を提供する。
【００６０】
該方法は、有効量の１以上のＩＬ−８遮断薬、ＩＦＮ−α、または抗ウィルス逆転写酵
素剤を個体へ送達することを追加的に含んでよい。
【００６１】
本発明の第四の態様による方法においては、肝炎の治療および／または予防を補助するいずれの追加成分も個体へ送達できる。適切な追加成分は、本発明の第一の態様に関して上に述べられている。
【００６２】
本発明の第四の態様による方法は、ＩＦＮ−αまたは抗ウィルス逆転写酵素剤を投与されている個体の肝炎の治療のために使用されてよい。ＩＦＮ−αおよび抗ウィルス逆転写酵素剤は肝炎を起こす傾向を持つことから、該方法は特にＩＦＮ−αまたは抗ウィルス逆転写酵素剤を投与されている個体における肝炎の予防または減少に有用であろう。
【００６３】
当業者は、ＴＲＡＩＬ遮断薬が、該ＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする１以上の核酸の形で投与できることを理解するであろう。従って本発明の第四の態様の別の実施形態において、ＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする１以上の核酸分子の有効量を個体へ送達することを含む、肝炎を有する個体の治療および／または予防のための方法が提供される。
【００６４】
本発明はまた、ＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬、またはＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸を１以上の薬理学的に許容される賦形剤と共に含む、薬理学的に許容される組成物も提供する。該組成物は、ＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤、またはＩＦＮ−αをコードする核酸分子もしくは抗ウィルス逆転写酵素剤を追加的に含んでよい。
【００６５】
本発明はまた、ＴＲＡＩＬ遮断薬と、ＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤との組み合わせ、またはＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする１以上の核酸分子およびＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤を１以上の薬理学的に許容される賦形剤と共に含む、薬理学的に許容される組成物も提供する。
【００６６】
本発明はまた、ＩＬ−８遮断薬と、ＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤との組み合わせ、またはＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸分子と、ＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤を１以上の薬理学的に許容される賦形剤と共に含む、薬理学的に許容される組成物も提供する。
【００６７】
適切な賦形剤は当業者に周知である。
【００６８】
本発明の薬理学的に許容される組成物の各成分の具体的な量は標準的な方法論を用いて、かつ以下の実施例の項で用いられた具体的な値からの推定により決定できる。用いられる具体的な量は、治療される動物の大きさおよび代謝を含む幾つかの要因に依存し得る。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、経口、非経口、または埋め込み型リザーバー経由を含むいずれの適切な方法で投与されてよい。好ましくは、該医薬組成物は経口または注射により投与される。
【００７０】
該医薬組成物は、例えば水性または油性の無菌注射用懸濁液のような、無菌注射用製剤の形であってよい。この懸濁液は当該技術分野で公知の方法により、適切な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）および懸濁剤を用いて処方されてよい。該無菌注射用製剤はまた、無毒性の非経口投与可能な希釈剤または溶媒、例えば１，３−ブタンジオール溶液としての無菌注射用溶液または懸濁液であってよい。許容されるビヒクルおよび溶媒のうちで使用されてよいものは、マンニトール、水、リンゲル液および生理食塩水である。さらに、従来から、無菌の固定油が溶媒または懸濁化剤として使用されている。この目的のため、合成モノ−またはジグリセリドを含む、いずれの無菌性固定油も使用されて
よい。オレイン酸のような脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、オリーブオイルまたはヒマシ油のような天然の薬理学的に許容される油、特にこれらのポリオキシエチル化された形として、注射液の製剤に有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、Ｐｈ．Ｈｅｌｖまたは類似アルコールのような長鎖アルコール希釈液または分散剤を含んでよい。
【００７１】
本発明の医薬組成物は、カプセル、錠剤、および水性懸濁液および溶液を含むがこれらに限定されない、いずれの経口に使用可能な剤形により経口投与されてよい。経口使用のための錠剤の場合、一般に用いられる担体はラクトースおよびコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤もまた、典型的に添加される。カプセルの形による経口投与のための有用な希釈剤は、ラクトースおよび乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁液を経口投与する場合、有効成分は乳化剤および懸濁剤と組み合わされる。必要に応じ、特定の甘味料および／または香料および／または着色料が添加されてよい。
【００７２】
本発明はまた、治療、特に肝疾患の治療における使用のため、本発明の医薬組成物のいずれか一種も提供する。
【００７３】
本発明はまた、ＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬、またはＴＲＡＩＬ遮断薬およびＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸を含む、肝疾患を治療するためのキットも提供する。該キットは、ＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤、またはＩＦＮ−αをコードする核酸分子もしくは抗ウィルス逆転写酵素剤を追加的に含んでよい。
【００７４】
本発明はまた、ＴＲＡＩＬ遮断薬と、ＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤との組み合わせ、またはＴＲＡＩＬ遮断薬をコードする１以上の核酸分子およびＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤を含む、肝炎を治療するためのキットも提供する。
【００７５】
本発明はまた、ＩＬ−８遮断薬と、ＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤との組み合わせ、またはＩＬ−８遮断薬をコードする１以上の核酸分子およびＩＦＮ−αもしくは抗ウィルス逆転写酵素剤を含む、肝疾患を治療するためのキットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
これより本発明を例としてのみの目的により、以下の図を参照して記述する。
【００７７】
【図１−１】肝炎を有するＣＨＢ患者血清中における、ＩＬ−８およびＩＦＮ−α濃度の上昇を示す。（ａ）代表的な患者（患者１）から採取された長期的な血清サンプル中に、ＣＢＡ（ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ、ＩＬ−１２ｐ７０）およびサンドイッチＥＬＩＳＡ（ＩＦＮ−α）アッセイにより検出された複数のサイトカインの循環濃度。炎症性サイトカインの濃度は、ＣＢＡソフトウェアまたはＰｒｉｓｍにより決定した。
【図１−２】肝炎を有するＣＨＢ患者血清中における、ＩＬ−８およびＩＦＮ−α濃度の上昇を示す。（ｂ）アッセイした１４人の患者のうちの４人の代表的な患者における、血清ＩＬ−８およびＩＦＮ−α濃度、ならびに肝炎（ＡＬＴ）およびウィルス量（ＨＢＶ−ＤＮＡ）の時間的な関連性。
【図１−３】肝炎を有するＣＨＢ患者血清中における、ＩＬ−８およびＩＦＮ−α濃度の上昇を示す。健常ドナー、低ＡＬＴ（昨年に対し、ＡＬＴ＜６０ＩＵ／ｌ）を有するＨＢＶ患者、および上昇したＡＬＴ（サンプル採取時に、ＡＬＴ＞６０ＩＵ／Ｌ）を有するＨＢＶ患者においてサンドイッチＥＬＩＳＡにより定量したＩＬ−８（ｃ）およびＩＦＮ−α（ｄ）濃度の横断的な比較。有意性検定はＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  検定を用いて行なった。
【図２−１】ＣＨＢ患者におけるＮＫ細胞のＴＲＡＩＬ発現と肝炎の，ｅｘ  ｖｉｖｏでの直接の相互関係を示す。（ａ）ＣＤ３、ＣＤ５６およびＴＲＡＩＬに対するｍＡｂで染色し、ＣＤ３-細胞にゲートをかけた、ＣＨＢ患者由来の代表的なフローサイトメトリードットプロット。パーセンテージは、ＴＲＡＩＬで染色した、新しく単離したＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫ細胞の比率を示す。
【図２−２】ＣＨＢ患者におけるＮＫ細胞のＴＲＡＩＬ発現と肝炎の，ｅｘ  ｖｉｖｏでの直接の相互関係を示す。（ｂ）上のパネル：ｅＡｇ−ＣＨＢを有する患者由来のＰＢＭＣをｅｘ  ｖｉｖｏで染色した。フローサイトメトリーにおいてＴＲＡＩＬを発現するＮＫ（ＣＤ３-ＣＤ５６+）のパーセンテージはＡＬＴと相関していた。ＣＤ６９＋ＮＫ細胞は全リンパ球のパーセントとして示す。下のパネル：全ＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫ細胞のうちの、ＣＤ５６brightＮＫ細胞のパーセント。ＴＲＡＩＬ陽性であったこれらＣＤ５６brightＮＫ細胞のパーセントをＡＬＴに対してプロットした。
【図２−３】ＣＨＢ患者におけるＮＫ細胞のＴＲＡＩＬ発現と肝炎の，ｅｘ  ｖｉｖｏでの直接の相互関係を示す。（ｃ）健常ドナー、低ＡＬＴ（昨年に対し、ＡＬＴ＜６０ＩＵ／ｌ）を有するＨＢＶ患者、および上昇したＡＬＴ（サンプル採取時に、ＡＬＴ＞６０ＩＵ／Ｌ）を有するＨＢＶ患者由来のＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫ細胞における、ｅｘ  ｖｉｖｏ表面ＴＲＡＩＬ発現の横断的な分析。有意性検定はＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  検定を用いて行なった。
【図３】末梢に比較して豊富な、肝臓内でのＮＫ細胞の数、ＴＲＡＩＬ発現および活性化を示す。（ａ）代表的なＣＨＢ患者の末梢および肝臓由来の単核細胞をＣＤ３およびＣＤ５６に対する抗体で染色し、ＣＤ３+Ｔ細胞、ＣＤ３+ＣＤ５６+ＮＫＴ細胞およびＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫ細胞の割合（四角で強調）をフローサイトメトリーにより決定した。慢性的にＨＢＶに感染した５人の患者由来の肝浸潤リンパ球（ＩＨＬ）および循環リンパ球（ＰＢＬ）由来のＮＫ細胞（ＣＤ３-ＣＤ５６+）のＣＤ６９発現（ｂ）およびＴＲＡＩＬ発現（ｄ）を、ｅｘ  ｖｉｖｏで評価した。Ｐ値はＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  検定により決定した。（ｃ）ＣＤ５６brightおよびＣＤ５６dimＮＫ細胞サブセットにおいて肝臓内ＮＫ細胞の活性化を比較した、代表的なＣＨＢ患者のフローサイトメトリードットプロット分析。（ｅ）肝臓より分離されたＣＤ５６brightおよびＣＤ５６dimＮＫ細胞サブセットおよびＣＤ３+Ｔ細胞のＴＲＡＩＬ発現を比較したヒストグラム。（ｆ）７人のＨＢＶ患者から採取したパラフィン包埋肝臓切片を、抗ＴＲＡＩＬｍＡｂにより染色した。左パネルの四角で囲んだ領域は、右パネルの視界を示す。ＴＲＡＩＬ陽性細胞は茶色に染色され、黒の矢印で強調している。
【図４】患者血清中に観察されるＩＦＮ−αの濃度による、ＣＨＢ患者から分離されたＮＫ細胞の増大した表面ＴＲＡＩＬ発現および活性化の誘導を示す。健常ドナー（白棒）およびＣＨＢ患者（黒棒）由来のＰＢＭＣを、ＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−８（５ｎｇ／ｍＬ）、またはＩＦＮ−αおよびＩＬ−８と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間培養した。この培養のＴＲＡＩＬ発現（ａ）およびＮＫ細胞活性化（ｂ）の効果をフローサイトメトリーにより評価した。ＮＫ細胞はＣＤ３-ＣＤ５６+として同定した。グラフは、未処理のコントロールに観察されるＣＤ６９またはＴＲＡＩＬの基本的な量を、サイトカイン処理した後に観察されるそれらから差し引くことによりプロットした。
【図５】ＨＢＶに感染した肝細胞のＴＲＡＩＬレセプター発現を示す。（ａ）ＨＢＶ感染（左パネル）および健常コントロール（右パネル）肝臓由来のパラフィン包埋切片を、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ｍＡｂにより染色した。膜局在型（矢印）および細胞質（*）ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の発現を、茶色の色素原反応性（ｂｒｏｗｎ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）により示す。（ｂ）未処理およびアイソタイプコントロールと比較した、ＩＬ−８培養後（１０ｎｇ／ｍＬで２４時間）のＨｅｐＧ２ＴＲＡＩＬ−Ｒ２量のＭＦＩ。（ｃ）未処理およびアイソタイプコントロールと比較した、２４時間のＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍＬ）後のＨｅｐＧ２ＴＲＡＩＬ−Ｒ２量のＭＦＩ。これらは別々の５回の実験の代表例である。
【図６−１】ＣＨＢ患者由来のＩＦＮ−α活性化ＮＫ細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導性肝細胞アポトーシスを仲介し得ることを示す。（ａ）ＨｅｐＧ２細胞を、ＩＬ−８（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で２４時間培養した。同時に、ＰＢＭＣをＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍＬ）の存在下または非存在下で２４時間培養した。上のパネル：その後ＰＢＭＣをＨｅｐＧ２細胞に１０：１のＥ：Ｔ比で加え、４時間後にカスパーゼ活性化をフルオレセイン標識Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋにより可視化し、フローサイトメトリーで検出して平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した。下のパネル：ＴＲＡＩＬ遮断抗体（１０ｎｇ／ｍＬ）の添加以外は上記の通りである実験手順。（ｂ）健常ドナー、低ＡＬＴを有するＣＨＢ患者、および高ＡＬＴを有するＣＨＢ患者由来のＰＢＭＣをＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍＬ）と共に２４時間培養し、その後上記のようにＩＬ−８処理ＨｅｐＧ２のカスパーゼ活性化を評価した代表的な結果。
【図６−２】ＣＨＢ患者由来のＩＦＮ−α活性化ＮＫ細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導性肝細胞アポトーシスを仲介し得ることを示す。（ｃ）高ＡＬＴのＨＢＶ患者由来のｅｘ  ｖｉｖｏＰＢＭＣによるＨｅｐＧ２カスパーゼ誘導、およびそのＴＲＡＩＬ遮断ｍＡｂの添加による減少の代表例。（ｄ）健常ドナー、低ＡＬＴを有するＣＨＢ患者、および高ＡＬＴを有するＣＨＢ患者からｅｘ  ｖｉｖｏで直接採取したＰＢＭＣの添加による、ＨｅｐＧ２カスパーゼ誘導の代表例。（ｅ）肝傷害を有するＨＢＶ患者（高ＡＬＴ患者、ｎ＝６）からｅｘ  ｖｉｖｏで直接採取したＰＢＭＣを用いたＨｅｐＧ２カスパーゼ誘導の程度を、コントロール（上昇したＡＬＴを有さないＨＢＶ患者  ｎ＝３、および健常コントロール  ｎ＝３）由来のＰＢＭＣと比較した概要（ｐ＝０．０３、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  検定）。
【図７】ＣＨＢ患者由来のＮＫ細胞が、初代ヒト肝細胞においてＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを仲介し得ることを示す。初代ヒト肝細胞はＩＬ−８（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加して４８時間培養し、最後の２４時間にはＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍＬ）を添加した。同時に、３人の健常ドナー、３人の低ＡＬＴを有するＣＨＢ患者、および４人の高ＡＬＴを有するＣＨＢ患者由来のＰＢＭＣを、ＩＦＮ−αの存在下または非存在下で３７℃において２４時間培養した。肝細胞およびＰＢＭＣは、１０：１のＥ：Ｔ比で、インターフェロン処理ウェル内においてＴＲＡＩＬ遮断抗体の存在下または非存在下で１８時間共培養した。アポトーシスの程度は、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡ末端標識法（ＩＳＥＬ）によるＤＮＡ断片化の検出により決定した。（ａ）ＰＢＭＣ非存在下で培養したコントロール肝細胞の代表的イメージ。（ｂ）高ＡＬＴを有するＣＨＢ患者由来のＰＢＭＣと共に１８時間培養した後の肝細胞の代表的イメージ。矢印はＩＳＥＬ陽性肝細胞を表す。（ｃ）高ＡＬＴの患者（ｎ＝４）由来のＰＢＭＣを用いた％ＩＳＥＬ陽性肝細胞のコントロール（低ＡＬＴ患者ｎ＝３、および健常ドナーｎ＝３）に対する要約データ。ＩＦＮ−α処理無（白棒）または有（黒棒）、ならびにＩＦＮ−α処理ウェルのＴＲＡＩＬ遮断有（斜線棒）。結果は、ＰＢＭＣの添加なしでみられる１４％の肝細胞アポトーシスを平均基本的な量として差し引いた後に示し、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  検定による有意性検定を行なった。
【図８】ＩＬ−８の非存在下で２４時間培養した肝細胞ＨｅｐＧ２細胞のアポトーシスを阻止するための、抗ＩＬ−８抗体と抗ＴＲＡＩＬ抗体を組み合わせた使用の結果を示す。２人の異なるドナー（（ａ）ＮＢ８４；（ｂ）ＧＥ８３））由来のＰＢＭＣをＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍＬ）の存在下で同時に２４時間培養した。その後、１μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−８モノクローナル抗体および／または抗ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、ＰＢＭＣをＨｅｐＧ２細胞に１０：１のＥ：Ｔ比で加え、４時間後にカスパーゼ活性化をフルオレセイン標識Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋにより可視化し、フローサイトメトリーで検出して平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した。
【図９】ＨＢＶに感染している患者の肝臓由来の肝細胞の増大したＩＬ−８染色を、ＨＢＶに感染していない肝臓由来の肝細胞との比較において示す。
【図１０】ＨＢＶに感染した個体の、ＮＫ細胞のＣＤ５６brightサブセットを含むＮＫ細胞が、高アフィニティーＩＬ−８レセプター（ＣＸＣＲ１）を発現することを示す。
【図１１】機能的走化性アッセイの結果を示す。（Ａ）アッセイのセットアップを示す。（Ｂ）ＩＬ−８によって化学遊走したＮＫ細胞による肝細胞のアポトーシス誘導の量（ケモカインの添加なしに遊走したＮＫ細胞による誘導に対して）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
実施例
ＮＫ細胞活性に影響するサイトカイン環境を理解するため、本発明者らは慢性ＨＢＶ感染を有する患者において、ＩＦＮ−α、ならびにその他の鍵となる幾つかの炎症性および免疫調節性サイトカインを定量した。本発明者らは、血清サイトカイン濃度の鋭敏な測定を肝炎の変化と関連させるため、複数の肝炎の前、その間、およびその後に繰り返し採取され、よく特徴付けられたｅＡｇ−ＣＨＢを有する患者のコホートを利用した。本発明者らは、肝炎に関連した、血清ＩＦＮ−αおよびＩＬ−８濃度の大きな変動を観察した。肝炎を有するＣＨＢ患者における循環ＩＦＮ−αおよびＩＬ−８の増大は、ＮＫ細胞の活性化およびｅｘ  ｖｉｖｏで直接測定した表面ＴＲＡＩＬ発現の増大を伴っていた。そこで本発明者らは、結果としての肝障害を説明し得る、これらｅｘ  ｖｉｖｏでの観察の根底にある機序を探索した。本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏで産生されたＩＦＮ−αおよびＩＬ−８の濃度が、ＮＫ細胞による死滅のＴＲＡＩＬ経路を、リガンドおよびレセプター両方への作用において促進することを確立した。本発明者らは、このサイトカインの組み合わせにおいて、慢性ＨＢＶ感染を有する患者由来のＮＫ細胞がＴＲＡＩＬの仲介により肝細胞を死滅させられることを確認した。
【００７９】
材料および方法
患者およびコントロール
慢性ＨＢＶ感染（ＨＢｓＡｇ陽性）を有する７２人の患者を完全な倫理的承認および説明と同意により採用した。そのうち１１人の患者はＨＢｅＡｇ陽性であり、残りはＨＢｅＡｇ陰性および抗ＨＢｅＡｂ陽性であった（Ｍｕｒｅｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ダートフォード、英国）から市販されている酵素免疫アッセイキットにより測定した）。ＨＢＶ−ＤＮＡウィルス量を、Ｒｏｃｈｅ  Ａｍｐｌｉｃｏｒモニターアッセイ（Ｒｏｃｈｅ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により定量した。患者は、Ｃ型肝炎ウィルスおよびデルタ肝炎ウィルスに対する抗体、ならびにＨＩＶ−１および２に対する抗体は陰性であった（Ｏｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｕｒｅｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。この研究に含まれる患者のいずれも、抗ウィルス療法または免疫抑制剤を受けていなかった。５３人の患者から血清を得て直ちに凍結した。４６人の患者からＰＢＭＣを、２０人の患者から肝生検／外植片またはパラフィン包埋切片を得た。１４人のＨＢｅＡｇ陰性ＣＨＢ患者のサブセットを、複数の血清およびＰＢＭＣサンプルの採取により長期的な分析に供与した（表２）。血清サンプルは平行して分析し、ＰＢＭＣは直接ｅｘ  ｖｉｖｏで分析した。
【００８０】
コントロールサンプルは、１４および１３人の健常ドナーそれぞれからの血清およびＰＢＭＣ、ならびに４人の健常ドナーおよび４人のアルコール性肝炎を有する患者からのパラフィン包埋肝切片により構成された。
【００８１】
抗体および試薬
抗体ＣＤ３−Ｃｙ５．５／ＰｅｒＣＰ、ＣＤ５６−ＦＩＴＣ、ＴＲＡＩＬ−ＰＥ、ＣＤ６９−ＡＰＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カウリー、英国）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１−ＰＥ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＰＥ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３−ＰＥ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４−ＰＥ、抗ＩＬ８およびＣＤ５６−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、アビンドン、英国）は、他に記載のない限り製造者の推奨する濃度においてフローサイトメトリー分析に使用した。生物活性を中和するための抗ＴＲＡＩＬ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、１０ｎｇ／ｍＬの濃度において使用した。組み換えヒトＩＦＮ−α２ａ（ｒｈＩＦＮ−α；ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国）および組み換えヒトＩＬ−８（ｒｈＩＬ−８；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）は各実験に対して記載された濃度で使用した。
【００８２】
血清サイトカイン濃度の決定
Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造者のプロトコルに従って使用し、血清サイトカイン濃度を確認した。簡単に述べると、５０μＬの患者血清または標準組み換えタンパク質の希釈を、サイトカイン（ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ、ＩＬ−１２ｐ７０）のパネルに対するｍＡｂをコーティングした捕獲ビーズおよびＰＥを結合した検出試薬の混合物に加えた。３時間後、捕獲ビーズを洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において取得した。組み換え標準物質および供給されたＢＤ  ＣＢＡソフトウェアを用いて、サイトカイン濃度を各血清サンプルにつき定量した。血清ＩＦＮ−αは標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてアッセイした。製造者の高感度プロトコルに従い、５０μＬの患者血清を分析した。
【００８３】
ＮＫ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ染色
ＨＢＶ患者および健常ドナーから新しく単離したＰＢＭＣ、または以前に記載された通りに（非特許文献３）ＨＢＶ患者から単離した肝臓内リンパ球を、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ６９およびＴＲＡＩＬに対する抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＭＣはＰＢＳ＋１％ＦＣＳで２回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーターにおいて取得した。ＣＤ６９およびＴＲＡＩＬ特異的ｍＡｂで染色された陽性集団を限定するため、アイソタイプの一致したコントロールｍＡｂを使用した。
【００８４】
ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬレセプターに対する肝臓サンプルの免疫組織化学
１５例のＣＨＢ、４例のアルコール性肝疾患症例および４人の健常ドナー由来の保存されたパラフィンブロックを、ＴＲＡＩＬレセプター１および２の発現について染色した。７人のｅＡｇ−ＣＨＢ患者からの連続切片を、ＴＲＡＩＬの発現について染色した。切片（４μｍ）を、荷電スライド（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ、英国）上に切り出し、６０℃で１時間加熱した。脱パラフィンおよび再水和の後、内在性のペルオキシダーゼ活性を遮断するため、０．３％Ｈ2Ｏ2水溶液で処理した。抗原の回収は、以前に記載された通りに（非特許文献５４）ＡＬＴＥＲ技術を用いて行なった。水中での短い洗浄に続き、切片をＳｅｑｕｅｎｚａ（Ｓｈａｎｄｏｎ、英国）上に置き、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ｐＨ７．６で洗浄した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ１に対するモノクローナル抗体（１：１００希釈、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対するモノクローナル抗体（１：５０希釈、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を室温で４０分間適用した。切片をＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で洗浄し、抗体をＤａｋｏ  Ｃｈｅｍａｔｅ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ西洋わさびペルオキシダーゼキット（Ｄａｋｏ、英国）を用いて検出した。切片を水中で洗浄、ヘマトキシリンで対比染色、脱水、キシレン中に置き、ＤＰＸ中にマウントした。
【００８５】
サイトカイン誘導性のＮＫ細胞活性化およびＴＲＡＩＬ発現の上方調節
ＰＢＭＣを、補足されたＲＰＭＩ  １０％ＦＣＳに再浮遊し、丸底９６ウェル組織培養プレートに３ｘ１０5細胞／ウェルにてまき、ｒｈＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍＬ）、ｒｈＩＬ−８（５ｎｇ／ｍＬ）あるいはＩＦＮ−αおよびＩＬ−８と共に３７℃で２４時間培養した。サイトカイン誘導性のＮＫ活性化およびＴＲＡＩＬ発現の増加の程度は、基本的水準のＣＤ６９またはＴＲＡＩＬ発現を、サイトカイン処理後に観察されたそれらから差し引くことにより決定した。
【００８６】
ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞株におけるＴＲＡＩＬ−Ｒ発現のサイトカイン誘導性の変化
ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞を７５ｃｍ2フラスコからトリプシン処理し、４８ウェル平底組織培養プレートに２ｘ１０5細胞／ウェルにてまいた。細胞を５時間接着させ、ｒｈ
ＩＬ−８（１０ｎｇ／ｍＬ）またはｒｈＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍＬ）を添加して３７℃で２４時間培養した。ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、氷上で５ｍＭ  ＥＤＴＡと共に４５分間インキュベートした。このようなプレートからの穏やかな剥離は、表面ＴＲＡＩＬ−Ｒ発現の損失を防いだ。次いで、細胞をＰＢＳ＋１％ＦＣＳで２回洗浄してＥＤＴＡを除いた後、４種の膜結合型ＴＲＡＩＬ−Ｒに対するｍＡｂと共に４℃で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーターにおいて取得した。
【００８７】
ＴＲＡＩＬを発現したＮＫ細胞により仲介される、ＨｅｐＧ２細胞株のアポトーシス
ＨｅｐＧ２を７５ｃｍ3フラスコからトリプシン処理し、４８ウェル平底組織培養プレートに１ｘ１０5細胞／ウェルにてまき、接着させた。接着した細胞は、ＩＬ−８（１０ｎｇ／ｍＬ）またはＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍＬ）の存在下および非存在下で、３７℃において２４時間培養した。慢性ＨＢＶ患者由来のＰＢＭＣ（または、純化したＮＫ細胞もしくはＮＫを除いたＰＢＭＣ）もまた、ＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍＬ）の存在下および非存在下で、３７℃において２４時間培養した。この培養後、ＴＲＡＩＬ遮断抗体および／またはＩＬ−８遮断抗体を関連するウェルに添加し、１時間後にＰＢＭＣをＨｅｐＧ２のウェルに１０：１（ＰＢＭＣ：ＨｅｐＧ２）の割合で加えた。４時間後、カスパーゼ活性化の程度をカルボキシフルオレセイン−ＦＬＩＣＡアポトーシス検出キット（Ｓｅｒｏｔｅｃ、キドリントン、オックスフォード、英国）を用い、フローサイトメトリーによる検出のための製造者のプロトコルを用いて決定した。
【００８８】
ＴＲＡＩＬを発現したＮＫ細胞により仲介される、初代ヒト肝細胞のアポトーシス
初代ヒト肝細胞は非疾患の肝外植片組織からコラゲナーゼ灌流（非特許文献５５）を用いて分離し、ハイドロコルチゾン、インスリン、グルタミンを含むＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地に再浮遊させ、４８ウェル平底培養プレートに１ｘ１０5細胞／ウェルにてまき、２時間接着させた。培地を交換して細胞を２４時間静止させ、その後ＩＬ−８（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍＬ）により、３７℃において２４時間刺激した。ＣＨＢまたは健常ドナー由来のＰＢＭＣを、ＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍＬ）の存在下または非存在下で、３７℃において２４時間培養した。この後、ＴＲＡＩＬ遮断抗体（１０ｎｇ／ｍＬ）を関連するウェルに添加し、２時間後にＰＢＭＣを肝細胞のウェルに１０：１（ＰＢＭＣ：肝細胞）の割合で加え、３７℃においてさらに１８時間培養した後、メタノールで固定した。アポトーシスの程度は、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡ末端標識法（ＩＳＥＬ）によるＤＮＡ断片化の検出により決定した（非特許文献５５）。簡単に述べると、固定した細胞をＩＳＥＬ混合物（５ｍＭ  ＭｇＣｌを加えたＴＢＳ  ｐＨ７．６、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、２０ユニットＫｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、ロンドン、英国）０．０１ＭヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペーズリー、英国）、およびジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））と共に３７℃において１時間インキュベートした。その後切片を蒸留水で洗浄し、ヒツジ抗ジゴキシゲニンアルカリフォスファターゼ結合Ｆａｂ断片（１：２００希釈；Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に室温にて１時間インキュベートした。ＴＢＳ  ｐＨ７．６によるさらなる洗浄の後、切片をアルカリフォスファターゼ基質と共に１５分間インキュベートし、マイヤーのヘマトキシリンで対比染色した後、４℃においてメタノールで再固定した。アポトーシスの誘導は、この研究計画について知らされていない無関係の観察者により定量され、この観察者は各ウェル中に少なくとも２００の肝細胞を計数した。
【００８９】
結果
慢性ＨＢＶ感染における肝疾患の再燃の間の、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−８の循環濃度の大きな変動
ｅＡｇ陰性の慢性Ｂ型肝炎（ｅＡｇ−ＣＨＢ）を有する患者は、ウィルス量の迅速な変化に関連する、肝炎の自発性の「再燃」にかかりやすい。これらの再燃は、長期的な標本
抽出によって捉えることが十分に予測可能な、動的な変動期間の間のＨＢＶ関連肝障害の機序を研究する機会を提供する。以前に反復性の肝炎を起こしやすいことが確認された１４人のｅＡｇ−ＣＨＢ患者のコホートを採用し、長期的に研究した（非特許文献２）。頻繁なサンプル採取を通し、この研究において血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）が基本的な値の２倍を超え、かつ正常値上限の３倍を超える（女性では＜３５ＩＵ／Ｌ、男性では＜５０ＩＵ／Ｌ）急激な上昇として定義された１以上の再燃の前、その間、およびその後に血清を得た。血清ＡＬＴは、これがＨＢＶに感染したチンパンジー（非特許文献２８）およびヒト（非特許文献２９）における研究で肝炎の組織学的所見を正確に予見することが示されたことから、肝障害の代用マーカーとして使用された。含まれる全ての患者は、少なくとも１年の臨床モニターによる十分に特徴付けられた疾患の経過、および通常１−２ヶ月の間隔をとった、研究に使用できる４ないし１０の連続したサンプルを有していた（表２）。Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）キットおよび酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）技術を用い、少量の血清から同時に複数のサイトカインを定量することが可能であった。分析したサイトカインは、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ−１２ｐ７０およびインターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）であった。試験した７種のサイトカインのうち、ＩＬ−８およびＩＦＮ−αのみが一貫して検出され、患者におけるピーク濃度は他の５種のサイトカインに観察されたそれをはるかに超過しており、かつ健常コントロールよりも著しく高かった（表１）。これら２種のサイトカインの血清濃度は、複数の再燃を有する症例において反復性の大きな変動を起こすことが観察され（図１ａ）、これらの患者はアッセイされた炎症現象の間中に実質的に倍の変化を一貫して示した（表２）。このような一定の大きな変動は、測定したその他のサイトカインには観察されなかった（図１ａ）。
【００９０】
このコホート内でのこれらの患者は、再燃の絶頂において、著しい程度の肝炎（最大のＡＬＴとして示す。表２）および高いウィルス量（最大ウィルス量を参照のこと。表２）を有していた。血清中のＩＦＮ−αおよびＩＬ−８の量は、ＡＬＴおよびＨＢＶ−ＤＮＡの変動と時間的な関連を示した（図１ｂ）。大部分の患者（１０／１４）にとって、ＩＬ−８の血清濃度のピークは肝炎の発症に先行しており（ＡＬＴのピークに少しだけ先立つサンプル）、ウィルス量の急な増大と同時かまたはその直後であった（図１ｂおよび表２）。ＩＦＮ−αの最大の血清濃度は肝炎のピークと同時に起こり（図１ｂおよび表２、ＩＦＮ−αのピークとＡＬＴのピークの間隔の中央値＝０）、このときＩＬ−８の濃度は減少しているが、健常コントロールに比べて高く上昇していた（図１ａおよび図１ｂ）。
【００９１】
ＩＬ−８およびＩＦＮ−αの上昇した濃度が活動期の疾患を有するＨＢＶ患者に限定されるのか、または肝炎の無い状態でも見出されるのかということを確立するため、本発明者らは大規模な横断的研究を行なった。ＨＢＶに感染していないコントロール、肝炎の証明の無い慢性ＨＢＶ感染の患者（サンプル採取時点でＡＬＴ＜６０ＩＵ／Ｌ、および前年中にＡＬＴ＞６０ＩＵ／Ｌが記録されなかった）、および肝炎を有するＨＢＶ感染患者（サンプル採取時点でＡＬＴ＞６０ＩＵ／Ｌ）において、血清ＩＦＮ−αおよびＩＬ−８濃度を比較した。肝炎を有するＨＢＶ患者は、コントロール群に比べＩＬ−８（図１ｃ）およびＩＦＮ−α（図１ｄ）の両方において濃度が著しく上昇していた。一方、健常ドナーのこれら２種のサイトカインは一貫して低濃度または検出できない濃度であり、肝炎の証明の無い慢性ＨＢＶ患者では、健常ドナーに比べＩＬ−８およびＩＦＮ−αは有意に増大しなかった（図１ｃ、ｄ）。これらのデータのさらなる分析は、上昇したＩＬ−８濃度と高ＨＢＶウィルス量との同様の相関を明らかにし（データ未提示）、このことはＩＬ−８濃度の変動がＨＢＶ−ＤＮＡのそれを反映しているという最初の観察を支持している（図１ｂ）。
【００９２】
アポトーシス促進性のリガンドであるＴＲＡＩＬのＮＫ細胞による発現と、ＨＢＶ関連肝
炎の、ｅｘ  ｖｉｖｏでの直接の関連性
ＩＦＮ−αにより活性化されたＮＫ細胞の細胞毒性の大部分は、肝障害のマウスモデルにおける主要なエフェクターとして最近同定された（非特許文献１５）、アポトーシス促進性リガンドのＴＲＡＩＬを介している（非特許文献２２）。ＩＦＮ−αおよびＩＬ−８が再燃の間の優位なサイトカインとして確立され、本発明者らはＮＫ細胞のＴＲＡＩＬ経路がこれに関連して活性化されるかどうかについて調べた。ヒトＮＫ細胞は、健常ドナー血液から新しく分離したときには、その表面にＴＲＡＩＬリガンドを少量発現しているかまたは発現していないことが報告された（非特許文献３０−３２）。しかしながら幾つかのＮＫ細胞のＴＲＡＩＬは、透過処理によって検出可能になり（非特許文献３０）、かつ培養での活性化によってそれを増加できる（非特許文献３１、３２）。一方、反復性の再燃を有するｅＡｇ−ＣＨＢ患者由来のＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫ細胞は、直接ｅｘ  ｖｉｖｏで抗ＴＲＡＩＬｍＡｂによって表面が共染色される明らかな集団を有することが見出された（図２ａ）。表面ＴＲＡＩＬを発現するＮＫ細胞の割合は、ＡＬＴが上昇しているときにはさらに増大していた（図２ａ）。
【００９３】
再燃の前、その間、およびその後の連続的なＰＢＭＣが入手可能である、ｅＡｇ−ＣＨＢ患者の長期的コホートからの５人の患者のサブセットにおいて、本発明者らはＮＫ細胞活性化およびＴＲＡＩＬ発現の時間的分析を行なうことができた。図２ｂに２人の代表的患者について例証したように、ＮＫ細胞の表面ＴＲＡＩＬ発現は、ｅｘ  ｖｉｖｏで肝炎に一致した大きな変動を示した（図２ｂの上のパネルを参照のこと）。活性化マーカーであるＣＤ６９のＮＫ細胞による発現もまた、肝炎と密接に相関しており、活性化のピークはＡＬＴの最大値（図２ｂの上のパネル）、ならびにＩＬ−８およびＩＦＮ−αの上昇した濃度と一致していた（表２）。
【００９４】
大部分のＴＲＡＩＬは、ＮＫ細胞のパーフォリン仲介性の細胞毒性の原因である比較的大きなＣＤ５６dimサブセット（非特許文献３３）よりも、ＣＤ５６brightサブセット上にあることが注目された（図２ａの代表的サンプルを参照のこと）。再燃の間のＮＫ細胞によるＴＲＡＩＬ発現の全体的な増大は、ＮＫ細胞のうちのＣＤ５６brightサブセットのパーセントの増大、およびＴＲＡＩＬを発現するこれらＣＤ５６brightＮＫ細胞の割合の増大（図２ｂの下のパネル）によることが注目された。
【００９５】
その後本発明者らは、肝炎を有するかまたは有さない、健常ドナーおよびＨＢＶ患者の比較的大きな横断的コホートにおいて、ＮＫ細胞による表面ＴＲＡＩＬ発現量を比較した。直接ｅｘ  ｖｉｖｏで表面にＴＲＡＩＬを発現するＮＫ細胞のパーセンテージは、正常ＡＬＴ（ｐ＜０．００１）を有するＨＢＶ患者または健常ドナー（ｐ＜０．０００１）に比較し、肝炎を有する患者で４倍を超えて増大していた（図２ｃ）。肝炎を有さない患者に比較し、有する患者において増大したＴＲＡＩＬ発現もまた、ＣＤ５６brightサブセット内に観察された（ｐ＜０．０００５；データ未提示）。
【００９６】
注目すべきことに、ＨＢＶ患者の長期的および横断的分析において、肝炎の程度に関わらず、ＣＤ３+Ｔ細胞上に発現したＴＲＡＩＬの量は低いままであった（データ未提示）。さらに、ＨＢＶのコアおよび表面抗原に対するＴ細胞の増殖量は、このパラメーターを長期的に調べた３人の患者において、再燃時期の周辺での増大を示さなかった。
【００９７】
ＴＲＡＩＬを発現する活性化されたＮＫ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの増加を示すこれらのデータは、ＨＢＶ誘導性肝疾患の病原性においてこの経路を利用するＮＫ細胞の役割を示唆する。
【００９８】
高度に活性化された、高い量のＴＲＡＩＬを発現する肝臓内ＮＫ細胞
次に本発明者らは、ＮＫ細胞のＴＲＡＩＬ経路が、ＨＢＶの活発な複製の場である肝臓
内で機能するかどうかについて調べた。既に、健康な肝臓内では末梢に比較してＮＫ細胞が濃縮されていることは十分に確立されている（７）。ＣＨＢ患者の肝臓内でＮＫ細胞の数が同様に増加しているかを確認するため、ＨＢＶに感染した肝臓（３例の肝硬変および２例の再燃）から肝臓内単核球を分離し、ＣＤ３+Ｔ細胞、ＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫ細胞、およびＣＤ３+ＣＤ５６+ＮＫＴ細胞の比率をフローサイトメトリーにより決定した。図３ａに示すように、ＮＫおよびＮＫＴ細胞の両方が、ＨＢＶ感染患者の末梢に比較して肝臓内に濃縮されており、ＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫ細胞が典型的に全肝臓内リンパ球の４０％までを構成していた。このことはＮＫ細胞が、ウィルス量、ＡＬＴまたは組織像に関わらず、ＨＢＶ患者の肝臓内リンパ球の３０−４０％を構成する（健常コントロールと同じように）ことを示している最近のデータ（非特許文献３４）に適合する。
【００９９】
これら肝臓内ＮＫ細胞の活性化状態を評価した際、比較的大きな割合の肝臓内ＮＫ細胞が、同患者からの末梢ＮＫ細胞よりも増加したＣＤ６９を有していた（図３ｂ）。注目すべきことに、肝臓内の最も高度に活性化されたＮＫ細胞サブセットは、肝臓内に優先的に濃縮されている（データ未提示）ＣＤ５６brightサブセットであった（図３ｃ）。
【０１００】
Ｉｓｈｉｙａｍａらによる最近の論文は、生体移植の際の健常肝臓から抽出されたＮＫ細胞にＴＲＡＩＬが検出されなかったことを示した（非特許文献３２）。一方、本発明者らはこれらのＨＢＶに感染した肝臓から分離した肝臓内ＮＫ細胞が、同患者の末梢にみられるよりもさらに高めの量において、直接ｅｘ  ｖｉｖｏでＴＲＡＩＬを発現することを見出した（図３ｄ）。末梢と同様、ＴＲＡＩＬは優先的に活性化されたＣＤ５６brightＮＫサブセットに主に発現し、かつ肝臓内ＣＤ３+Ｔ細胞は少量のＴＲＡＩＬを発現していた（図３ｅ）。
【０１０１】
肝臓内ＮＫのＴＲＡＩＬ量と肝炎の関連性をさらに調べるため、本発明者らは、組織学的にｅＡｇ−ＣＨＢが証明された患者のＡＬＴ再燃時期の周辺に採取された５例の生検を、正常ＡＬＴおよび組織像によって非活動性疾患が確認されたＨＢＶ患者由来の２例の生検と比較した。免疫組織化学により、５例のｅＡｇ−ＣＨＢ切片のうち４例をＴＲＡＩＬ陽性リンパ球（これらは末梢または肝臓において著しいＴＲＡＩＬを発現する唯一の集団であったことからＮＫ細胞と推定された）と同定した（図３ｆ）。一方、非活動性ＨＢＶ感染を有する２人の患者由来の切片は、同定できるＴＲＡＩＬ発現リンパ球をもたない健常肝臓の報告（非特許文献３２）に類似していた。この結果は、肝臓内ＮＫ細胞によるＴＲＡＩＬ発現はＨＢＶに関連する肝炎と相関することを示唆する。
【０１０２】
慢性ＨＢＶ感染患者由来のＮＫ細胞は、肝炎の間に見出されるサイトカイン濃度により活性化され、かつＴＲＡＩＬ発現を誘導される
本発明者らは次に、ＡＬＴが上昇した患者におけるｅｘ  ｖｉｖｏでの発見である、ＩＦＮ−α、ＩＬ−８の増大とＴＲＡＩＬを発現したＮＫとの可能な機構的関連を探索することを考えた。ＨＢＶに関連した炎症の間に高濃度が観察されるこれら２種のサイトカインは、ＮＫ細胞およびＴＲＡＩＬ経路における免疫調節効果による肝障害に寄与し得る。ＩＦＮ−αはＮＫ細胞機能の修飾因子であるが、その抗ウィルス効力の阻害因子であるＩＬ−８によりどのように影響されるかは不明であった（非特許文献２６、２７）。さらに、長期的なＨＢＶ関連性の炎症を有するこれらの患者にありがちな反復性の刺激の後で、ＮＫ細胞がＩＦＮ−αを介する調節に抵抗性になることは可能であった。これについて調べるため、健常志願者および慢性ＨＢＶ患者由来のＰＢＭＣまたは純化したＮＫ細胞を、ＩＦＮ−αもしくはＩＬ−８単独、または組み合わせと共にｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間、肝炎の間に観察された濃度において培養した。ＰＢＭＣまたは純化したＮＫ細胞は、ＩＦＮ−αと共に培養することにより、ＴＲＡＩＬを発現するＮＫ細胞のパーセンテージの実質的な増加を示した（図４ａ）。ＩＬ−８はＴＲＡＩＬ発現を増加させるＩＦＮ−αの能力への直接の効果を持たず、また阻害もしなかった。再燃を起こしている患者を含んだ
慢性ＨＢＶ感染患者由来のＮＫ細胞は、ＩＦＮ−αの効果に対して抵抗性になるよりも、健常ドナー由来のＮＫ細胞に対するのと同様の量によってＴＲＡＩＬを増加した（図４ａ）。肝炎を有するＨＢＶ患者はそれ故、ＮＫ細胞がｅｘ  ｖｉｖｏで最初から高めのＴＲＡＩＬを発現している結果、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＦＮ−α処理の後に比較的高い全ＮＫ細胞のＴＲＡＩＬ量を達成した。
【０１０３】
慢性ＨＢＶ感染患者由来のＮＫ細胞はまた、ＩＦＮ−αにより健常ドナー由来のＮＫ細胞に見出されるのと同等量のＣＤ６９の増加を伴って活性化される能力を維持しており、かつ再びこの効果はＩＬ−８により阻害されなかった（図４ｂ）。ＩＦＮ−αは高度に純化したＮＫ細胞に同等量の活性化を誘導し、このサイトカインの直接効果を示している（データ未提示）。従って、ＮＫ細胞のＴＲＡＩＬおよびＣＤ６９の発現の増加のｉｎ  ｖｉｖｏでの観察は、肝炎を有するＣＨＢ患者における循環サイトカインの濃度と同等の濃度を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏに反映された。
【０１０４】
ＨＢＶ感染肝細胞におけるサイトカイン調節性のＴＲＡＩＬレセプター発現
ＴＲＡＩＬがレセプターを介する細胞死を誘導するためには、標的細胞上の死ドメインレセプターを会合することが必要である（非特許文献１４）。以前の研究は、健常肝臓におけるＴＲＡＩＬ死誘導レセプターの最少のタンパク質発現を示唆した（非特許文献１９、３５）。しかしながら死誘導レセプターであるＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２のｍＲＮＡがヒト肝細胞から単離されており（非特許文献１４、１７）、これは培養によってＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに感受性になることから（非特許文献１７）、増加の可能性を示唆している。ＨＢＶに感染した肝臓の肝細胞が、ＴＲＡＩＬを発現するＮＫにより会合できる死誘導レセプターを発現するかどうかを確認するため、ＨＢＶ感染およびコントロールからのパラフィン包埋肝切片をＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対して染色した。ＨＢＶ感染およびコントロールの肝臓にＴＲＡＩＬ−Ｒ１は検出されなかった（データ未提示）。しかしながら、染色した１３例のＨＢＶ感染の肝臓切片のうち１０例で、肝細胞によりＴＲＡＩＬ−Ｒ２が発現されていた（組織像が軽度から中度の炎症性浸潤または肝硬変を示している、ｅＡｇ−ＣＨＢの患者由来）。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の免疫染色は主に肝細胞の表面に局在しており（図５ａ、ｘ１０００の拡大率）、その範囲は３人の患者において強、２人において中、および６人において弱であった。肝疾患の段階との明らかな相関はみられなかった。しかしながら、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、正常ＡＬＴおよび非活動性疾患を有する２人のコントロールＨＢＶ患者由来の切片にはみられなかった。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の染色は脂肪肝を有するコントロールドナーには検出されたが、健常ドナーからの３例、アルコール性肝炎患者からの４例の、その他の試験されたコントロール肝切片には検出されなかった（図５ｂ）。
【０１０５】
本発明者らは、ＩＦＮ−αまたはＩＬ−８が、肝細胞死を促進するために、ＨＢＶに感染した炎症性の肝臓に観察されるこのような変化したＴＲＡＩＬ−Ｒの発現パターンを部分的に仲介している可能性があると仮定した。これについて調べるため、ＨｅｐＧ２肝細胞を患者の循環濃度と同じ濃度のＩＬ−８またはＩＦＮ−αと共に培養し、死誘導性（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１および−Ｒ２）ならびに阻害性（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３および−Ｒ４）ＴＲＡＩＬレセプターの量をフローサイトメトリーにより決定した。ＩＬ−８は、ＣＨＢ患者の肝細胞上での増加が観察される死ドメインレセプターであるＴＲＡＩＬ−Ｒ２（図５ａ）の発現をおおよそ倍に誘導することが一貫して見出された（図５ｃ）。ＩＬ−８との培養は、その他のいずれのＴＲＡＩＬ−Ｒの表面発現も変化させなかった（データ未提示）。ＩＦＮ−αはＴＲＡＩＬ−Ｒ２の発現に影響しなかったが（データ未提示）、デコイ／調節性レセプターであるＴＲＡＩＬ−Ｒ４の発現を再現性よく、かつ実質的に減少させた（図５ｄ）。ＴＲＡＩＬ−Ｒ４は、アポトーシス誘導を阻害するため、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２とリガンド非依存性の会合を形成することが最近示された（非特許文献３６）。まとめると、これらの結果は高濃度のＩＬ−８およびＩＦＮ−αの組み合わせが、死誘導レセプター
の増加および阻害性レセプターの減少の両方に作用できることを示唆し、従って肝細胞をＴＲＡＩＬの介在で至適に細胞死させやすくする。
【０１０６】
ＨＢＶの再燃の間に循環しているサイトカインは、ＮＫ細胞がＴＲＡＩＬリガンド／レセプター相互作用を通して肝細胞を死滅させられるようにできる
ＨＢＶ患者から分離したＮＫ細胞がＴＲＡＩＬを用いて肝細胞を死滅させられるかどうかをテストするため、本発明者らは、ＴＲＡＩＬにより利用されるカスパーゼカスケード経路を通じたレセプター介在性細胞死の程度を直接測定できるアッセイを利用した。患者由来のＰＢＭＣを、ＮＫ細胞上に最大のＴＲＡＩＬ発現を誘導するように、ＩＦＮ−αの存在下または非存在下においてオーバーナイトで培養した。同時に、ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞を、ＩＬ−８の存在下または非存在下においてオーバーナイトで前培養した。活性化されたＰＢＭＣをその後ＨｅｐＧ２細胞に加え、ＨｅｐＧ２細胞のカスパーゼ活性化の程度をフローサイトメトリーで評価した。ＨｅｐＧ２細胞またはＰＢＭＣがサイトカイン処理されていないとき、ＨｅｐＧ２細胞のバックグラウンドの量に比較してわずかなカスパーゼの活性化が存在した（データ未提示）。ＨｅｐＧ２細胞のＩＬ−８による前処理はＰＢＭＣを介したカスパーゼ活性化の量を増大し、これはＰＢＭＣをＩＦＮ−αと前培養したとき更に増大した（図６ａの上のパネル）。
【０１０７】
このＩＦＮ−αにより誘導されたカスパーゼ活性化がＴＲＡＩＬを介していることを確認するため、ＨｅｐＧ２細胞をＴＲＡＩＬに対する遮断抗体と共に前インキュベートした。図６ａの下のパネルにみられるように、ＴＲＡＩＬが遮断されたとき、ＩＦＮ−αにより誘導されたカスパーゼ活性化が抗体未処理の細胞に比較して減少した。このことは、ＴＲＡＩＬがＩＦＮ−αにより誘導されたカスパーゼ活性化に主要な役割を果たすことを示唆するが、これが関連する唯一の機序ではないかもしれない。ＩＦＮ−αにより誘導されたＴＲＡＩＬを介する死の増大は純化したＮＫ細胞を用いることで維持され、ＮＫ細胞を除去した分画では取り消された（データ未提示）。
【０１０８】
肝炎を有さないＨＢＶ患者または健常コントロール由来のＰＢＭＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＦＮ−α処理によるＮＫ細胞のＴＲＡＩＬの増加に続くカスパーゼカスケードの開始に少ない効果を示した（図６ｂ）。再燃患者由来のＩＦＮ−αにより活性化されたＰＢＭＣを用いると（図６ａおよびｂ）、健常ドナー由来（図６ｂ）に比較して２倍のカスパーゼ誘導がみられた。ＨＢＶ関連肝炎の患者由来のＰＢＭＣはまた、ｅｘ  ｖｉｖｏで直接ＨｅｐＧ２に加えたときアポトーシスを誘導することができ、これは全てのケースにおいてＴＲＡＩＬ遮断ｍＡｂの添加により部分的に遮断された（図６ｃ）。ＨＢＶ肝炎を有する患者（ｎ＝６）は、バックグラウンドを超えて平均２８％のカスパーゼ誘導を示し、これは正常ＡＬＴを有するＨＢＶ患者または健常コントロール（ｎ＝６）由来のＰＢＭＣの使用でみられたカスパーゼ誘導よりも著しく大きかった（図６ｄ、ｅ）。
【０１０９】
従ってこれらの実験は、ＨＢＶ再燃の間に誘導されたサイトカインの影響の下で、ＮＫ細胞はＴＲＡＩＬ経路を通したＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞の死を誘導できるようになることを確認した。
【０１１０】
上記の実験は反復したが、ＩＬ−８を添加する代わりに、本発明者らは抗ＩＬ−８遮断ｍＡｂにより内在性のＩＬ−８を遮断した。前記のように、ＩＦＮ−αを用いてＮＫ細胞がＴＲＡＩＬを発現するよう活性化させ、カスパーゼ活性化に対するＦＬＩＣＡアッセイを用いてアポトーシスを測定した。図８ａおよび８ｂは、２人のドナー由来のＰＢＭＣ細胞を用いて得られた結果を示す。両方のケースにおいて抗ＩＬ−８は内在性のＩＬ−８を遮断し、肝細胞のアポトーシスの減少をもたらした。１ケースで、抗ＩＬ−８および抗ＴＲＡＩＬの相加的効果がみられ、別のケースでは抗ＴＲＡＩＬよりも抗ＩＬ−８によって更に著明な肝細胞死の阻害がみられた。両方のケースで、抗ＩＬ−８および抗ＴＲＡＩＬ
の組み合わせは、抗ＴＲＡＩＬ単独での使用よりも優れていた。ＩＬ−８の濃度はｉｎ  ｖｉｔｒｏよりもｉｎ  ｖｉｖｏでかなり高いとみられることから、遮断ＩＬ−８あるいはＩＬ−８およびＴＲＡＩＬの効果はｉｎ  ｖｉｖｏにおいてさらに重要であろう。さらに、ＩＬ−８は主に肝細胞により産生されることから、遮断ＩＬ−８はＮＫ細胞の誘引におけるＩＬ−８の走化性効果を加えて阻止し得る。
【０１１１】
再燃を有するＨＢＶ患者由来のＮＫ細胞は、初代ヒト肝細胞のＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを惹起できる
ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞株はこの経路の活性化の機序の分析に好都合なモデルを提供したが、初代ヒト肝細胞もまたＮＫ  ＴＲＡＩＬを介したアポトーシスに感受性であることを確認することが重要であった。肝細胞を非疾患の肝外植片より灌流により分離し、４８時間培養した。ＴＲＡＩＬレセプターの発現を調節するため、最後の２４時間にはＩＦＮ−αおよびＩＬ−８を加えた。ＰＢＭＣを添加しない状態での肝細胞の生存率は良好であった（全てのウェルにおいて８０％を超えた）（図７ａ）。一方、再燃を有し、直接ｅｘ  ｖｉｖｏでＴＲＡＩＬを発現しているＮＫ細胞を有するＨＢＶ患者由来のＰＢＭＣと共に培養した肝細胞は、肝細胞アポトーシスの誘導を示した（図７ｂ）。肝炎発症の間、ＮＫ細胞にＴＲＡＩＬを発現している患者由来のＩＦＮ−αで処理したＰＢＭＣは、初代ヒト肝細胞のアポトーシスの誘導において、再燃を有さないＨＢＶ患者または健常ドナー由来のＰＢＭＣよりもさらに効果的であった（ｐ＝０．０２、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ
Ｕ  検定、図７ｃ）。高ＡＬＴ患者の４人のうち３人は、ＩＦＮ−αで処理したＰＢＭＣにより誘導されたアポトーシスが３０％を超えて、ＴＲＡＩＬを通して遮断できた（４人の患者において、平均２８％の遮断）。ＩＦＮ−αの非存在下で２４時間培養したＰＢＭＣによるアポトーシスの誘導は、あまり確実には誘発されなかった（肝疾患患者のバックグラウンド量を超える平均１５％の増加を示し（ｐ＝０．０４）、このグループでの量の増加はコントロールに比較して有意ではない傾向にあった。図７ｃ）。患者グループの間の違いを確認するためには、ＰＢＭＣを直接ｅｘ  ｖｉｖｏで用いる更に大規模な研究が必要とされるだろう。しかしながら本発明者らは、ＮＫ細胞がＴＲＡＩＬを発現している、肝炎を有するＨＢＶ患者由来のＰＢＭＣは初代ヒト肝細胞の死を仲介する能力があると結論できる。
【０１１２】
ＮＫ細胞のＨＢＶ肝臓への走化性におけるＩＬ−８の役割
本発明者らは既に、高レベルのＨＢＶ感染患者の循環中で、ＩＬ−８が低レベルキャリアまたは健常ドナーに比較して上昇していることを確認した（上記参照）。本発明者らはここで、ＨＢＶ感染肝臓がこのＩＬ−８の源であることを示した。本発明者らはこれを、肝外植片およびＨＢＶに関連した再燃または肝硬変患者由来の生検から得たヒト肝臓の１１切片を、ＩＬ−８特異的なモノクローナル（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で染色し、Ｄａｋｏ  Ｃｈｅｍａｔｅ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ西洋わさびペルオキシダーゼキットを用いて検出することにより行なった。免疫組織化学は、全てのＨＢＶ肝臓に、アルコール性肝炎を含むその他の肝疾患患者由来の８例のコントロール肝切片における弱いかまたは無の染色に比較して、強いＩＬ−８の染色を明らかにした（代表的染色を図９に示す）。
【０１１３】
本発明者らはＨＢＶ感染患者由来のＮＫ細胞が、それらのＩＬ−８シグナルへの反応を可能にする、ＩＬ−８に対する高アフィニティーレセプター（ＣＸＣＲ１）を発現するかどうかについて調べた。本発明者らは、低または高レベルのＨＢＶ感染を有する患者対健常コントロール由来のＰＢＭＣを、ＣＸＣＲ１に対するモノクローナルにより直接ｅｘ  ｖｉｖｏで染色し、ＮＫ細胞がＣＤ３陰性およびＣＤ５６陽性であることを確認した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからのモノクローナル）。本発明者らは、ＴＲＡＩＬを発現することが知られているＣＤ５６brightサブセットを含むＨＢＶ患者由来のＮＫ細胞上に、高レベルのＣＸＣＲ１の発現を見出した（図１０）。
【０１１４】
本発明者らはまた、ＨＢＶ患者由来のＮＫ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−８リガンドへ遊走することを示すことによって、これらのレセプターが機能的であることを示した。これはトランスウェルシステム（ＮｅｕｒｏｐｒｏｂｅからのＣｈｅｍｏＴＸ）、およびＨＢＶ患者に見出された濃度の組み換えＩＬ−８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行なった。ＰＢＭＣを上のチャンバーに加え、組み換えＩＬ−８（濃度は５ないし５００ｎｇ／ｍｌ）を下のチャンバーに加えて３７℃において２時間培養した後、フローサイトメトリーにより遊走した細胞の構成をケモカインを用いなかったそれと比較した（上記のＮＫ細胞特異的なモノクローナルを用いた）。
【０１１５】
本発明者らはその後、これらの遊走したＮＫ細胞がヒト肝細胞を死滅させられることを示すためのアッセイを開発した。本発明者らは上記のトランスウェルシステムを、下のウェルにＨｅｐＧ２ヒトヘパトーマ細胞株を加えることにより（前記のようにＴＲＡＩＬレセプター発現のために最適化された、チャンバーあたり１０，０００細胞）改変した。本発明者らは、下のチャンバーにＩＬ−８、および上のチャンバーにＰＢＭＣを加えることにより、ＨｅｐＧ２細胞を死滅させられるＮＫ細胞の遊走の誘導が可能であることを示した。この死滅を、前記のようにカスパーゼ活性化についてＦＬＩＣＡアッセイを用いて測定した。図１１に、培地のみのバックグラウンドに比較した、５００ｎｇ／ｍｌの組み換えＩＬ−８によって誘導されたＰＢＭＣの遊走による、ＦＬＩＣＡ（肝細胞の死滅）における代表的な増大について示す。
【０１１６】
考察
慢性ＨＢＶ感染における肝疾患発生の遅延性で予測不可能な自然経過は、肝障害の免疫に関連した長期的な標本抽出を困難にする。慢性ＨＢＶの背景で起こる反復性の肝炎は、肝疾患およびウィルス量の迅速な変化に関連する免疫病理学的現象の圧縮されたバージョンの捕獲を可能にすることによってこの問題を克服する。以前の研究は、抗ＨＢｅ抗体陽転に対するｅＡｇに関連する再燃、ならびに血清ＩＬ−１２（非特許文献３７）およびＣＤ４Ｔ細胞反応性（非特許文献３７−３９）の増大を示す、治療中の患者に見出される再燃について調べた。この研究で本発明者らは最初、疾患の後期の再活性化を有する患者に見られる特徴的なタイプの再燃、いわゆるｅＡｇ−ＣＨＢに焦点を当てた。これらの患者は通常、高ウィルス量にもかかわらずｅＡｇの発現減少をもたらす基本コアプロモーター領域の変異または終止コドンを有し、繊維症および肝硬変へと進行する特に高いリスクにある（非特許文献１、２）。ｅＡｇ−ＣＨＢ患者のコホートを繰り返し標本抽出することにより、本発明者らは、再燃の間にＩＬ−８およびＩＦＮ−αの濃度が上昇、および高い変動を示すことを確認できた。ＣＤ６９およびアポトーシス誘導性ＴＲＡＩＬリガンドを直接ｅｘ  ｖｉｖｏで発現する活性化されたＮＫ細胞の割合もまた、肝炎に平行して変動していた。比較的大きな横断的研究は、活動性の肝炎を有するＨＢＶ感染患者の血清ＩＬ−８、ＩＦＮ−α、およびＮＫ細胞のＴＲＡＩＬの量が、健常ＨＢＶキャリアまたはコントロールに対して上昇していることの発見に及んだ。ＴＲＡＩＬを発現するＮＫ細胞は、ＨＢＶ患者の肝臓内では更に濃縮かつ活性化されているのに対し、健常コントロールにおいてｅｘ  ｖｉｖｏでの肝臓内ＴＲＡＩＬ発現はみられなかった（非特許文献３２）。これらのサイトカインの誘導とＮＫ細胞ＴＲＡＩＬ経路の誘導との可能な機能的関連についての研究は、ＩＬ−８がＴＲＡＩＬの死誘導レセプターを増加できることを明らかにし、その増加した発現がＣＨＢの肝臓において観察された。再燃の間の循環濃度のＩＦＮ−αは、ＴＲＡＩＬ経路を通した細胞死を、ＮＫ細胞上のリガンド発現の誘導および肝細胞上の調節性レセプターによる阻害の減少の両方によって促進できた。まとめると、これらはＴＲＡＩＬを通してＮＫ細胞が肝細胞を死滅させられるようにする。
【０１１７】
ＮＫ細胞は、健常ドナーおよびＨＢＶ患者の両方の肝臓に濃縮されており、主要な肝臓内リンパ球集団を構成するが、ＨＢＶ関連肝障害におけるその役割はよく定義されていない。ここで本発明者らは、ＮＫ細胞の活性化が肝炎の再燃と並行することおよびＨＢＶに
感染した肝臓において活性化ＮＫ細胞が豊富であることを示す、ＮＫ細胞のＨＢＶ関連肝障害に対する重要な貢献を支持するデータを提示する。ＣＤ５６dimサブセットは大部分のＮＫ細胞パーフォリンおよびグランザイムを発現するが、肝細胞はこれらの古典的な細胞溶解性エフェクター分子に対して比較的抵抗性である（非特許文献９、１０）。再燃の間に末梢に選択的に濃縮されており、肝臓内で優先的に濃縮かつ活性化されることが知られているＮＫ細胞のＣＤ５６brightサブセットは、ＩＦＮ−γのようなサイトカインの強力な源となる、その免疫調節性能力により知られている（非特許文献３３）。この研究で本発明者らは、これらＣＤ５６brightＮＫ細胞が、レセプターを介する肝細胞死を誘導するＴＲＡＩＬを利用した、別の細胞毒性経路を通して肝障害を仲介する可能性に集中した。ＴＲＡＩＬはマウス肝臓内に見出されたＮＫ細胞のサブセットにより内在的に発現することが示されたが（非特許文献１６）、これはヒトには当てはまらず、健常人の末梢および肝臓内ＮＫ細胞の両方はわずかな表面ＴＲＡＩＬ発現を示す（非特許文献３０−３２）。しかしながら、ヒトＮＫ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＬ−２（非特許文献３１、３２）またはＩＦＮ−α（非特許文献２２）の刺激によりＴＲＡＩＬ発現を増加させられることが報告されており、本発明者らはＮＫ細胞が、慢性ＨＢＶ感染を有するこれらの患者にみられる反復性の炎症の年数にかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方においてＴＲＡＩＬを増加させる能力を保持することを示す。ＮＫ細胞のＴＲＡＩＬが、肝炎を示すこれらのＨＢＶ患者においてのみ上昇するという事実（長期的および横断的研究の両方において）は、このリガンドの肝細胞障害における役割を支持する。
【０１１８】
ＴＲＡＩＬ経路は最初、形質転換細胞に限定され、ＴＲＡＩＬを発現するＮＫは肝臓内の環境で腫瘍に対し防御することが提唱された（非特許文献１６）。しかしながら最近のヒトでの研究は、急性冠不全症候群における動脈硬化プラークの、リンパ球を介するＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシス（非特許文献４０）、およびＨＩＶ感染におけるＣＤ４Ｔ細胞（非特許文献４１）により、腫瘍の文脈外でのこの経路の病原性の役割に焦点を当てた。肝疾患のモデルマウスでの研究は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの非悪性組織の障害を誘導するＴＲＡＩＬを発現するＮＫ細胞についての概念を強化し、ＴＲＡＩＬ依存性の肝細胞死（非特許文献１５）および肝星状細胞（非特許文献４２）を示した。ヒト肝細胞のＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスへの感受性は、可溶性ＴＲＡＩＬで処理したマウスおよび霊長類の肝臓毒性の欠如についての最初の報告（非特許文献４３、４４）に続き、論争の対象であった。しかしながら膜結合型ＴＮＦ関連リガンドは、その可溶性対応物よりも強いアポトーシス促進の可能性および肝臓毒性を有する（非特許文献３５、４５）。ヒト膜結合型ＴＲＡＩＬは、マウスにおいて、広範なアポトーシス、ネクローシスおよびリンパ球性浸潤をもたらし（非特許文献３５）、慢性ＨＢＶ肝炎の病理に適合する肝細胞アポトーシスを誘導する。さらに、正常ヒト肝細胞はＴＲＡＩＬに対する死誘導レセプターを発現する能力があり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに感受性である（非特許文献１７、１８）。死誘導レセプター対調節性レセプターの発現の比は、ＴＲＡＩＬ誘導死に対する感受性を繊細に調整するための手段を提供することが示された（非特許文献３６）。このバランスは、胆汁酸滞留（非特許文献４６）およびウィルス性肝炎のような肝炎の状況において死へと傾くことが既に示唆されている。後者の証明は、Ｃ型肝炎ウィルスに感染した肝臓の免疫染色（非特許文献２０）、および急性のＨＢＶを介した肝不全からの全肝臓抽出物のウェスタンブロット法（非特許文献１９）に由来する。本発明者らは、ＣＨＢ患者の肝細胞上で死誘導ＴＲＡＩＬレセプターの発現が増加している免疫染色によって示す。調節の一機序は、ＨＢＶによりコードされるＸ抗原が死誘導レセプターの一つを増加させ（非特許文献４７）、かつ細胞内Ｂａｘの調節を通してＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを起こしやすくする（非特許文献４８）というｉｎ  ｖｉｔｒｏでの観察に基づくと、ウィルスそれ自体による可能性がある。ここで本発明者らは、ＨＢＶの再燃の間に産生されたサイトカインは肝細胞のアポトーシスを最大にするため、死誘導ＴＲＡＩＬレセプターの増加、および調節性ＴＲＡＩＬレセプターの減少の両方に対し協調して作用し得るという、さらなる機序を示す。このデータは、肝細胞癌のような悪性腫瘍の治療におけ
る可溶性ＴＲＡＩＬの使用を支持する。これらは、ＨＢＶ感染および活動性肝炎の発症を同時に有する腫瘍患者は、このような治療アプローチ由来の肝臓毒性に対して更に感受性である可能性を示唆する。
【０１１９】
ケモカイン、リガンド／レセプターの対は、この大規模な殺到するＮＫ細胞の遊走をＨＢＶに感染した肝臓へ導くことが分析された。上に示すように、ＩＬ−８はＨＢＶ患者に見出される濃度と同じ濃度においてＮＫ細胞の走化性を誘導する。ＩＬ−８はその走化性の機能によりよく知られており、再燃の間の高濃度での循環は肝臓由来であると思われる。ここで研究した患者では、ＩＬ−８遺伝子をトランス活性化するＨＢＶの報告された能力（非特許文献４９）に従い、ＩＬ−８の濃度はＨＢＶＤＮＡの増加と共に典型的に増加した。ＮＫ細胞は高アフィニティーＩＬ−８レセプターであるＣＸＣＲ１を発現し、かつＩＬ−８に反応して遊走することが示された（非特許文献５０）。インターフェロンもまた、ＨＢＶトランスジェニックマウスにおけるインターフェロン−ガンマ誘導タンパク質（ＩＰ−１０）（非特許文献４）およびマウスＣＭＶ感染におけるＭＩＰ−１α（非特許文献５１）のようなケモカインの誘導により、ＮＫ細胞の肝臓への輸送を調節することが示された。本発明者らは、この研究で確認されたＩＦＮ−αの急増がどこに由来するのかを示していないが、考えられる源には、形質細胞様樹状細胞を含む肝浸潤白血球に加え、ウィルスに感染した肝細胞がある。本発明者らはＩＬ−８、および可能性としてＩＦＮ−αが、ＮＫ介在性肝細胞障害の経路の活性化に加え、活動性の炎症を発症する間のＨＢＶ肝臓へのＮＫ細胞の走化性に貢献することを示した。
【０１２０】
ＨＢＶ感染のトランスジェニックマウスモデルにおいて、ＮＫ細胞は強力な抗ウィルス効力を有し、この効果はタイプ１インターフェロンレセプター欠損マウスにおいては減弱している（非特許文献５２）。ＩＦＮ−αにより活性化されたＮＫ細胞は、ヒトＨＢＶ感染でもまた、ウィルスコントロールおよび肝障害において二重の役割を有していると考えられる（非特許文献５２）。ＮＫ細胞によるＨＢＶ感染肝細胞のＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスは幾らかのウィルス感染細胞を除去し、この過程は再燃の後にしばしば観察されるウィルス量の部分的な減少に貢献する可能性がある。しかしながら、この手段によるいずれのウィルス減少も常に肝障害という犠牲があり、それ故、治療的に進めるには危険な戦略である。事実、ＨＢＶに関連した肝硬変の治療における外来性ＩＦＮ−αの使用は、肝の代償不全を誘発するのに十分に重篤になり得る肝炎を起こす傾向があるため、しばしば制限される。ここに示すように、ＩＬ−８およびＴＲＡＩＬ経路を遮断することにより、肝疾患および／またはＩＦＮ−α治療に関連する肝細胞アポトーシスを制限することが可能となる。
【０１２１】
引用した全ての文献は参照によってここに取り込まれる。
【０１２２】
【表１】
2010520921.tif 000002
【０１２３】
［表１］
再燃を有するｅＡｇ−ＣＨＢ患者由来の血清中において、ＩＬ−８およびＩＦＮ−α濃度は高度に上昇している。中央値は、肝炎の再燃を起こしている１２人のＣＨＢ患者および１４人の健常コントロールドナーから得られた最大のサイトカイン濃度に関するものである。ｂｌｑ＝ｂｅｌｏｗ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（定量濃度未満）。有意性検定はＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  検定を用いて行ない、統計学的な有意性は太字で強調した。
【０１２４】
【表２】
2010520921.tif 000003
【０１２５】
［表２］
肝炎の間の、ＩＬ−８およびＩＦＮ−αの血清濃度の大きな増加。a最大倍率変化は、ＩＬ−８およびＩＦＮ−αの基本的な量からサイトカイン変動のピークまでの倍率変化。ｎａ−ｄａｔａ  ｎｏｔ  ａｖａｉｌａｂｌｅ（データ未取得）。
【図１−１】
2010520921.tif 000004
【図１−２】
2010520921.tif 000005
【図１−３】
2010520921.tif 000006
【図２−１】
2010520921.tif 000007
【図２−２】
2010520921.tif 000008
【図２−３】
2010520921.tif 000009
【図３】
2010520921.tif 000010
【図４】
2010520921.tif 000011
【図５】
2010520921.tif 000012
【図６−１】
2010520921.tif 000013
【図６−２】
2010520921.tif 000014
【図７】
2010520921.tif 000015
【図８】
2010520921.tif 000016
【図９】
2010520921.tif 000017
【図１０】
2010520921.tif 000018
【図１１】
2010520921.tif 000019
【国際調査報告】
2010520921.tif 000020
2010520921.tif 000021
2010520921.tif 000022