(57)【要約】抗腫瘍活性を有する５−置換カンプトテシン誘導体、それらの製造方法、抗腫瘍薬としてのそれらの使用およびそれらを含む医薬組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
【化３】
2010500971.tif 000027
（式中、
Ｒは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−Ｎ３、ＮＨ２、−ＮＲ’Ｒ”、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＮＨＲ’”−ＮＲ’Ｒ”（ここで、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’”は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルであることができる）であり；
Ｒ１は、アルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、ニトリル、アルコキシミノ、アリールオキシミノ、シリルアルキルであり；
Ｒ２は、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノアルキルであり；
Ｒ３は、水素、場合により保護されているヒドロキシル、アルコキシ、アミノアルキルであり；
ここで、アルキル、アシル、アルコキシ、アミノアルキルまたはアルコキシミノ基は、直鎖状または分岐鎖状の、１〜８個、好ましくは１〜４個の炭素原子を含むことができ、アリールおよびアリールオキシ基は、５〜１０個の炭素原子を含むことができる）
の化合物、その薬学的に許容しうる塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、および対応する混合物。
【請求項２】
ａ）５−Ｆ−カンプトテシン；
ｂ）５−Ｎ３−カンプトテシン；
ｃ）５−ＮＨ２−カンプトテシン；
ｄ）５−ジ−ｔｅｒｔブトキシカルボニルヒドラジノカンプトテシン；
ｅ）５−ジ−ベンジルオキシカルボニルヒドラジノカンプトテシン；
よりなる群から選択される、請求項１記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
実質的に、以下のスキームで示される工程：
ａ）前駆体ヒドロキシ基の保護；
ｂ）カルバニオンの生成と求電子試薬との反応による５での誘導体化；
ｃ）ヒドロキシ基の脱保護；
【化４】
2010500971.tif 000028
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上記の意味を有し、ＰＧは、ＯＨ保護基である）
を含む、式（Ｉ）の化合物の合成方法。
【請求項４】
、式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容しうる担体および賦形剤と一緒に含む医薬組成物。
【請求項５】
経口投与または非経口投与に適した形態にある、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
腫瘍の処置用の薬剤を製造するための、請求項１〜２に記載の化合物または請求項４〜５に記載の組成物の使用。
【請求項７】
その薬剤が、固形腫瘍および白血病、特に肺、卵巣、乳房、胃、肝臓、前立腺、軟組織肉腫、食道、膵臓、頭部および頸部、神経膠芽細胞腫、慢性および急性白血病の腫瘍の処置に使用される、請求項６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍活性を有する新規なカンプトテシン誘導体、それらの製造方法、抗腫瘍薬としてのそれらの使用およびそれらを含む医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
カンプトテシンは、１９６６年にWallおよびWaniにより最初に記述された（J. Am. Chem. Soc. 1966, 88, 3888-3890）、カンレンボク（Camptotheca acuminata（ヌマミズキ科（Nyssaceae）））から抽出されるアルカロイドである。カンプトテシンは、特に結腸腫瘍および他の固形腫瘍ならびに白血病に対する広いスペクトルの抗腫瘍活性を有するにもかかわらず、その高い毒性のために治療には使用されておらず、その毒性は、出血性膀胱炎、胃腸毒性および骨髄抑制の形で現れる。
【０００３】
低毒性および高溶解性を有する化合物を得るために、多くのカンプトテシン類似体が合成されている。現在、２種の薬剤、すなわちＣＰＴ−１１およびトポテカンが臨床に使用されている。他の誘導体、例えばベロテカン、ルビテカン、エクサテカン、ギマテカン、ペガモテカン、ルルトテカン（Lurtotecan）、カレニテシン、アフェレテカン、ホモカンプトテシン、ジフロモテカン、および多くの他のものが、臨床試験中である。化合物ＣＰＴ−１１は、多くの固形腫瘍および腹水症（結腸直腸、皮膚、胃、肺、子宮頸管、卵巣、非ホジキンリンパ腫）の処置に承認されている、１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシン（ＳＮ−３８として一般に知られている）の高溶解性プロドラッグである。
【０００４】
トポテカンは、生理食塩水に可溶性で、肺、胃、肝臓、卵巣、乳房、前立腺、食道、直腸、軟組織肉腫、頭部および頸部、神経膠芽細胞腫、慢性および急性白血病の腫瘍に対して活性な化合物である。しかしながら、トポテカンは、好中球減少および血小板減少等の重大な副作用を示す。
【０００５】
ルルトテカンは、頚部、卵巣、乳房、結腸−直腸、および肺微小細胞腫の腫瘍に活性を有する、より可溶性の誘導体である。しかしながら、ルルトテカンは、血液毒性をも有する。
【０００６】
ルビテカンは、膵臓、卵巣および乳房の腫瘍に対して有効な、経口使用のためのプロドラッグである。
【０００７】
カンプトテシンおよびその類似体は、全てのトポイソメラーゼＩ阻害剤と同様に、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤を含む慣用の薬剤に耐性の腫瘍に対して有効であり；細胞周期全体に亘って、高いトポイソメラーゼレベルを維持し；多剤耐性（ＰｇｏまたはＭＲＰ）または酵素が仲介する解毒代謝を引き起こさない。
【０００８】
ここに、現在使用されている薬剤よりも低い毒性を有するトポイソメラーゼＩの新規な阻害剤に研究の焦点が当てられる。
【０００９】
開環型カンプトテシン誘導体は、高いタンパク質結合性（特にアルブミンとの）および腫瘍組織における低い分布を示す。その結果、その生成物は体内に蓄積され、腫瘍には、不十分にしか影響を与えない。
【００１０】
逆に、ラクトン型の高い親油性は、カンプトテシン誘導体の細胞膜、特に赤血球への接着を促進し、組織／血漿分布比率に影響を与える。この理由から、研究は、２つの選択的アプローチ：ａ）依然として良好な溶解性を有する低いタンパク質結合性の生成物の設計；ｂ）極めて低い投与量でさえも治療効果を有する効力の高い生成物の設計に焦点が当てられている。
【００１１】
７位、９位、１０位および１１位での修飾は、通常、その錯体形成が化合物の抗腫瘍活性をもたらす、ＤＮＡ−トポイソメラーゼＩ−カンプトテシン３元系錯体の安定性に影響を与えずに、十分に許容されることが判明した。
【００１２】
２０Ｒ立体配置を有する生成物は、不活性であるか、あるいは天然の立体配置と一致する２０Ｓ立体配置を有する生成物よりも非常に低い活性であるかのいずれかであることが判明した。
【００１３】
概して、５位での修飾は、３元系錯体の形成に好ましくないと考えられ、一方、ピリドン環ＤおよびＥでの修飾は、生成物の活性に有害であることが報告されている。
【００１４】
発明の開示
第一の態様において、本発明は、一般式Ｉ：
【００１５】
【化１】
2010500971.tif 000002
【００１６】
（式中、
Ｒは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−Ｎ３、ＮＨ２、−ＮＲ’Ｒ”、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＮＨＲ’”−ＮＲ’Ｒ”（ここで、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’”は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルであることができる）であり；
Ｒ１は、アルキル、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、ニトリル、アルコキシミノ、アリールオキシミノ、シリルアルキルであり；
Ｒ２は、水素、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノアルキルであり；
Ｒ３は、水素、場合により保護されているヒドロキシル、アルコキシ、アミノアルキルであり；
ここで、アルキル、アシル、アルコキシ、アミノアルキルまたはアルコキシミノ基は、直鎖状または分岐鎖状の、１〜８個、好ましくは１〜４個の炭素原子を含むことができ、アリールおよびアリールオキシ基は、５〜１０個の炭素原子を含むことができる）
のカンプトテシン誘導体、その薬学的に許容しうる塩、異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、および対応する混合物に関する。
【００１７】
本発明の化合物は、低いタンパク質結合性を示し、良好な溶解性および非常に低い投与量でさえも高い効力を有する。
【００１８】
本発明の化合物を製造するための好ましい合成経路は、スキームに示されており、以下の工程：
ａ）前駆体ヒドロキシ基の保護；
ｂ）カルバニオンの生成と求電子試薬との反応による５での誘導体化；
ｃ）ヒドロキシ基の脱保護；
を含む。
【００１９】
【化２】
2010500971.tif 000003
【００２０】
スキーム中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上記の意味を有し、ＰＧは、ヒドロキシ保護基である。
【００２１】
前駆体は、市販されているか、あるいは文献に記載されているようにして得ることができる。
【００２２】
５でのカルバニオンは、前駆体を強有機塩基、好ましくはＬｉＨＭＤＳで処理することにより得ることができる。
【００２３】
カルバニオンは、その場で、求電子試薬、例えばハロゲン源またはアゾジカルボキシレート、イソシアネート、クロロカルボニル誘導体、トシルアジドと反応させる。
【００２４】
シリル類およびカーバメート類またはそれらの組み合わせが、ヒドロキシ保護基として好ましい。
【００２５】
本発明の化合物は、広い範囲の腫瘍細胞について細胞毒性アッセイで試験した。例として、カンプトテシンおよび薬剤トポテカンとＳＮ−３８を参照として用いて、式（Ｉ）の２つの化合物に関してＮＣＩ−Ｈ４６０細胞系（ＮＳＣＬ癌）についての細胞毒性データを報告する：
【００２６】
【表１】
2010500971.tif 000004
2010500971.tif 000005
【００２７】
最も活性な化合物は、活性濃度および損傷持続性を測定するＤＮＡ開裂アッセイで評価した（「実施例」の項参照）。式（Ｉ）の誘導体は、驚くことに、参照標準（特に、トポテカンおよびカンプトテシン）よりも、ＤＮＡ複製の阻止においてより高い持続性を示す一方、有効な細胞毒性活性を維持している。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容しうる担体および賦形剤と一緒に含む医薬組成物に関する。化合物（Ｉ）の経口投与または非経口投与に適した形態は、固形剤、好ましくは、カプセル剤、錠剤および顆粒剤、または液剤、好ましくは、注射可能な溶液もしくは注入溶液であることができる。
【００２９】
本発明の好適に製剤化された化合物は、固形腫瘍および白血病、特に肺、卵巣、乳房、胃、肝臓、前立腺、軟組織肉腫、頭部および頸部、食道、膵臓、結腸、直腸、神経膠芽細胞腫、慢性および急性白血病の腫瘍の処置に使用することができる。
【００３０】
実施例
実施例Ｉ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシン
カンプトテシン（０．１００ｇ、０．２８７ミリモル）を不活性雰囲気下で、無水ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中に懸濁し、得られた懸濁液に、イミダゾール（０．９８０ｇ、１．４４ミリモル）を加えた。混合物を１０分間撹拌し、その後、塩化トリエチルシリル（ＴＥＳ−Ｃｌ）（０．１９３ｍＬ、１．１５ミリモル）をその中に滴下し、次いで、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．０４０ｇ、０．２８７ミリモル）を加えた。４６ｈ後、反応混合物を真空下でエバポレートした（試薬の完全な消失をＴＬＣで管理、溶離液ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝３０／１）。その後、固体をＣＨ２Ｃｌ２に再溶解し、Ｈ２Ｏと飽和ＮＨ４Ｃｌで洗浄した。水相をＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ１０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮して、所望の生成物（０．１３３ｇ、０．２８７ミリモル）を淡黄色固体として得た。
【００３１】
【表２】
2010500971.tif 000006
【００３２】
実施例ＩＩ−２０−ＯＴＥＳ  ＳＮ−３８
ＳＮ−３８（０．１００ｇ、０．２５５ミリモル）を不活性雰囲気下で、無水ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中に懸濁し、得られた懸濁液に、イミダゾール（０．０８７ｇ、１．２８ミリモル）を加えた。混合物を１０分間撹拌し、その後、塩化トリエチルシリル（ＴＥＳ−Ｃｌ）（０．１７１ｍＬ、１．０２ミリモル）をその中に滴下し、次いで、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．０３１ｇ、０．２５５ミリモル）を加えた。５２ｈ後、試薬の完全な消失をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝１０／１）でモニターし、反応混合物を真空下でエバポレートした。その後、固体をＣＨ２Ｃｌ２に再溶解し、Ｈ２Ｏと飽和ＮＨ４Ｃｌで洗浄した。水相をＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ１０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮して、所望の生成物（０．１２１ｇ、０．２４０ミリモル、９４％）を淡黄色固体として得た。
【００３３】
【表３】
2010500971.tif 000007
【００３４】
実施例ＩＩＩ−１０−ＯＴＢＤＭＳ  ＳＮ−３８
２０−ＯＴＥＳ  ＳＮ−３８（０．１２１ｇ、０．２４０ミリモル）を不活性雰囲気下で、ＣＨ２Ｃｌ２／ＴＨＦ＝１：１（８ｍＬ）の無水混合物中に溶解した。そこに、イミダゾール（０．０８１ｇ、１．２０ミリモル）を加え、１０分後に、塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ）（０．１４４ｍｇ、０．９５７ミリモル）、次いで、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．０２９ｇ、０．２４０ミリモル）を加えた。１８ｈ後、試薬の消失をＴＬＣ（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１）でモニターし、反応混合物を真空下でエバポレートした。その後、固体をＣＨ２Ｃｌ２に再溶解し、Ｈ２Ｏと飽和ＮＨ４Ｃｌで洗浄した。水相をＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ１０ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１）で精製して、所望の生成物（０．１２７ｇ、０．２０５ミリモル、８５％）を淡黄色固体として得た。
【００３５】
【表４】
2010500971.tif 000008
【００３６】
実施例ＩＶ−２０−ＯＴＥＳ  トポテカン
トポテカン（０．１００ｇ、０．２３８ミリモル）を不活性雰囲気下で、無水ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中に懸濁し、得られた懸濁液に、イミダゾール（０．０８１ｇ、１．１９ミリモル）を加えた。混合物を１０分間撹拌し、その後、塩化トリエチルシリル（ＴＥＳ−Ｃｌ）（０．１６０ｍＬ、０．９５２ミリモル）をその中に滴下し、次いで、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．０２９ｇ、０．２３８ミリモル）を加えた。５２ｈ後、試薬の完全な消失をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝１０／１）でモニターし、反応混合物を真空下でエバポレートした。その後、固体をＣＨＣｌ３およびＨ２Ｏと飽和ＮＨ４Ｃｌに再溶解し、水相をＣＨＣｌ３（２Ｘ１５ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮して、所望の生成物（０．１２０ｇ、０．２２４ミリモル、９４％）を淡黄色固体として得た。
【００３７】
【表５】
2010500971.tif 000009
【００３８】
実施例Ｖ−１０−ＯＴＢＤＭＳ  ２０−ＯＴＥＳ  トポテカン
２０−ＯＴＥＳ  トポテカン（０．１２０ｇ、０．２２４ミリモル）を不活性雰囲気下で、ＣＨ２Ｃｌ２／ＴＨＦ＝１：１の無水混合物（８ｍＬ）中に溶解した。イミダゾール（０．０７６ｇ、１．１２ミリモル）を加え、１０分後に、塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ）（０．１３５ｍｇ、０．８９６ミリモル）、次いで、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．０２７ｇ、０．２２４ミリモル）を加えた。２１ｈ後、試薬の消失をＴＬＣ（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１）でモニターし、反応混合物を真空下でエバポレートした。その後、固体をＣＨＣｌ３およびＨ２Ｏと飽和ＮＨ４Ｃｌに再溶解し、水相をＣＨＣｌ３（２Ｘ１５ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１）で精製して、所望の生成物（０．１１６ｇ、０．１７９ミリモル、８０％）を淡黄色固体として得た。
【００３９】
【表６】
2010500971.tif 000010
【００４０】
実施例ＶＩ−２０−ＯＴＥＳ  １０−ヒドロキシカンプトテシン
１０−ヒドロキシカンプトテシン（０．１００ｇ、０．２７５ミリモル）を不活性雰囲気下で、無水ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中に懸濁し、得られた懸濁液に、イミダゾール（０．２２５ｇ、３．３１ミリモル）を加えた。混合物を１０分間撹拌し、その後、塩化トリエチルシリル（ＴＥＳ−Ｃｌ）（０．４６０ｍＬ、２．７５ミリモル）をその中に滴下し、次いで、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．０６８ｇ、０．５５０ミリモル）を加えた。２４ｈ後、試薬の完全な消失をＴＬＣでモニターし（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝２０／１）、反応混合物を真空下でエバポレートした。その後、固体をＣＨ２Ｃｌ２に再溶解し、Ｈ２Ｏと飽和ＮＨ４Ｃｌで洗浄した。水相をＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ１０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮して、所望の生成物（０．１２４ｇ、０．２５９ミリモル、９４％）を淡黄色固体として得た。
【００４１】
【表７】
2010500971.tif 000011
【００４２】
実施例ＶＩＩ−１０−ＯＴＢＤＭＳ−２０−ＯＴＥＳ  カンプトテシン
１０−ヒドロキシ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシン（０．１０５ｇ、０．２１９ミリモル）を不活性雰囲気下で、ＣＨ２Ｃｌ２／ＴＨＦ＝１：１の無水混合物（４ｍＬ）中に溶解した。イミダゾール（０．０９７ｇ、１．４２ミリモル）を加え、１０分後に、塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ）（０．１６４ｍｇ、１．１０ミリモル）、次いで、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．０４０ｇ、０．３２９ミリモル）を加えた。１８ｈ後、試薬の完全な消失をＴＬＣでモニターし（シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／３）、反応混合物を真空下でエバポレートした。その後、固体をＣＨ２Ｃｌ２に再溶解し、Ｈ２Ｏと飽和ＮＨ４Ｃｌで洗浄し、水相をＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ１０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／３）で精製して、所望の生成物（０．１１７ｇ、０．１９７ミリモル、９０％）を淡黄色固体として得た。
【００４３】
【表８】
2010500971.tif 000012
【００４４】
実施例ＶＩＩＩ−５−Ｆ−２０−ＯＴＥＳ  カンプトテシン
カンプトテシン２０−ＯＴＥＳ（０．１００ｇ、０．２１６ミリモル）を不活性雰囲気下で撹拌しながら、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中に溶解し、次いで、−７８℃の温度に冷却し、ＴＨＦ中の１．０Ｍ  ＬｉＨＭＤＳ溶液（０．２６０ｍＬ、０．２６０ミリモル）をその中に滴下した。２０’後、無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中のＮＦＳＩ（０．０８９ｇ、０．２８１ミリモル）を加えた。−７８℃で２ｈ後、温度が２５℃に上がるまで放置し、試薬の消失をＴＬＣ（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／２）でモニターした。２つのジアステレオマーの生成が認められた。室温で３ｈ後、反応を、飽和ＮＨ４Ｃｌを加えて停止させた。水相をＣＨ２Ｃｌ２（３Ｘ１５ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／１、次いで２／１、最後は１／１）で精製して、２つの異性体の混合物（０．１０１ｇ、０．２１０ミリモル、９７％）（１：１の異性体比）を淡黄色固体として得た。２つの異性体は、さらにクロマトグラフィーで分離した。溶出順に：
【００４５】
【表９】
2010500971.tif 000013
【００４６】
実施例ＩＸ−５−Ｆ−カンプトテシンの一番目のジアステレオマーの調製
５−Ｆ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシンの一番目のジアステレオマー（０．０２５ｇ、０．０５２ミリモル）を不活性雰囲気下で撹拌しながら、無水ＴＨＦ（５ｍＬ）中に溶解した。その後、Ｅｔ３Ｎ・３ＨＦ（０．０６０ｍＬ、０．３６８ミリモル）をその中に滴下した。反応混合物を室温で２８ｈ反応させ、試薬の消失をＴＬＣでモニターした（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／２）。溶媒を真空下でエバポレートし、残渣をクロマトグラフィーに付して（ＳｉＯ２、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１）、所望の生成物（０．０１９ｇ、０．０５１ミリモル、９８％）を淡黄色固体として得た。
【００４７】
【表１０】
2010500971.tif 000014
【００４８】
実施例Ｘ−５−Ｆ−カンプトテシンの二番目のジアステレオマーの調製
５−Ｆ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシンの二番目のジアステレオマー（０．０２５ｇ、０．０５２ミリモル）を不活性雰囲気下で撹拌しながら、無水ＴＨＦ（５ｍＬ）中に溶解し、その後、Ｅｔ３Ｎ・３ＨＦ（０．０６０ｍＬ、０．３６８ミリモル）をその中に滴下した。反応混合物を室温で２８ｈ反応させ、試薬の消失をＴＬＣでモニターした（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／２）。溶媒を真空下でエバポレートし、残渣をクロマトグラフィーに付して（ＳｉＯ２、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１）、所望の生成物（０．０１８ｇ、０．０５０ミリモル、９７％）を淡黄色固体として得た。
【００４９】
【表１１】
2010500971.tif 000015
【００５０】
実施例ＸＩ−５−Ｎ３−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシン
カンプトテシン２０−ＯＴＥＳ（０．１００ｇ、０．２１６ミリモル）を不活性雰囲気下で撹拌しながら、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中に溶解し、次いで、−７８℃の温度に冷却し、ＴＨＦ中の１．０Ｍ  ＬｉＨＭＤＳ溶液（０．２６０ｍＬ、０．２６０ミリモル）をその中に滴下した。２０分後、無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中のアジ化トシル（ＴｓＮ３）（０．０５５ｇ、０．２８１ミリモル）を加えた。−７８℃で２ｈ後、温度が２５℃に上がるまで放置し、試薬の消失をＴＬＣ（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝２／１）でモニターした。２つのジアステレオマーの生成が認められた。室温で２時間３０分後、反応を、飽和ＮＨ４Ｃｌを加えて停止させた。水相をＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ１５ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。２つのジアステレオマーよりなる残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／１、次いで２／１、最後は１／１）で精製して、２つの異性体の混合物（０．１０６ｇ、０．２１０ミリモル、９７％）（異性体の比１：１）を淡黄色固体として得た。２つの異性体は、さらにクロマトグラフィーで分離した。溶出順に：
【００５１】
【表１２】
2010500971.tif 000016
【００５２】
実施例ＸＩＩ−５−Ｎ３−カンプトテシンの一番目のジアステレオマーの調製
５−Ｎ３−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシンのジアステレオマー１（０．０７０ｇ、０．１３９ミリモル）を不活性雰囲気下で撹拌しながら、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中に溶解し、その後、Ｅｔ３Ｎ・３ＨＦ（０．１７０ｍＬ、１．０１６ミリモル）をその中に滴下した。反応混合物を室温で２６ｈ反応させ、試薬の消失をＴＬＣでモニターした（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１）。溶媒を真空下でエバポレートし、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１）で精製して、所望の生成物（０．０５３ｇ、０．１３６ミリモル、９８％）を淡黄色固体として得た。
【００５３】
【表１３】
2010500971.tif 000017
【００５４】
実施例ＸＩＩＩ−５−Ｎ３−カンプトテシンの二番目のジアステレオマーの調製
５−Ｎ３−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシンのジアステレオマー２（０．０５５ｇ、０．１０９ミリモル）を不活性雰囲気下で撹拌しながら、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中に溶解し、その後、Ｅｔ３Ｎ・３ＨＦ（０．１３５ｍＬ、０．８２０ミリモル）をその中に滴下した。反応混合物を室温で２６ｈ反応させ、試薬の消失をＴＬＣでモニターした（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１）。溶媒を真空下でエバポレートし、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１）で精製して、所望の生成物（０．０４２ｇ、０．１０７ミリモル、９８％）を淡黄色固体として得た。
【００５５】
【表１４】
2010500971.tif 000018
【００５６】
実施例ＸＩＶ−５−ＮＨ２−カンプトテシンの調製
５−Ｎ３−２０−ＯＨ−カンプトテシンのジアステレオマー２（０．０５０ｇ、０．１２９ミリモル）を不活性雰囲気下で撹拌しながら、無水ＴＨＦ（１．５ｍＬ）と無水ＭｅＯＨ（６ｍＬ）の混合物中に溶解し、その後、Ｐｄ／Ｃ（１４ｍｇ〜１０％）を加え、真空／Ｈ２（Ｈ２風船圧）の２つのサイクルを実施した。反応混合物を、試薬の消失をＴＬＣ（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／３）でモニターしながら、室温で３ｈ反応させ、次いで、セライトを通して濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｘ１５ｍＬ）で洗浄した。溶媒を真空下で留去した。反応粗生成物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル分析から、所望の生成物がＣ５位での２つのエピマーの１：１混合物として存在していることが判明した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝３５／１、次いで２５／１）により、２つのジアステレオマーの混合物（０．０４６ｇ、０．１２６ミリモル、９８％）が回収できた。
【００５７】
【表１５】
2010500971.tif 000019
【００５８】
実施例ＸＶ−５−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシン
カンプトテシン２０−ＯＴＥＳ（０．１００ｇ、０．２１６ミリモル）を不活性雰囲気下で撹拌しながら、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中に溶解し、次いで、−７８℃の温度に冷却し、ＴＨＦ中の１．０Ｍ  ＬｉＨＭＤＳ溶液（０．２８１ｍＬ、０．２８１ミリモル）をその中に滴下した。２０’後、無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルアゾジカルボキシレート（ＤＴＢＡＣ）（０．０７５ｇ、０．３２４ミリモル）を加えた。−７８℃で４ｈ後、試薬の消失をＴＬＣ（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／１）でモニターした。２つのジアステレオマーの生成が認められた。反応を、飽和ＮＨ４Ｃｌを加えて停止させた。水相をＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ１５ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／１）で精製して、２つの異性体の混合物（０．１４５ｇ、０．２１０ミリモル、９７％）を得た。２つの異性体は、さらにクロマトグラフィーで分離した。溶出順に：
【００５９】
【表１６】
2010500971.tif 000020
【００６０】
実施例ＸＶＩ−５−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ−カンプトテシンの一番目のジアステレオマーの調製
５−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシンの一番目のジアステレオマー（０．０５０ｇ、０．０７２ミリモル）を不活性雰囲気下で撹拌しながら、無水ＴＨＦ（４ｍＬ）中に溶解し、その後、Ｅｔ３Ｎ・３ＨＦ（０．０８８ｍＬ、０．５４２ミリモル）をその中に滴下した。反応混合物を室温で３５ｈ反応させ、試薬の消失をＴＬＣでモニターした（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／２）。溶媒を真空下で留去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／２）で精製し、所望の化合物（０．０４１ｇ、０．０７１ミリモル、９８％）を淡黄色固体として得た。
生成物を、ＣＨ２Ｃｌ２／ペンタン＝１／５０から結晶化することによりさらに精製した。
【００６１】
【表１７】
2010500971.tif 000021
【００６２】
実施例ＸＶＩＩ−５−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ−カンプトテシンの二番目のジアステレオマーの調製
５−ジ−ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシンの二番目のジアステレオマー（０．０５０ｇ、０．０７２ミリモル）を不活性雰囲気下で撹拌しながら、無水ＴＨＦ（４．５ｍＬ）中に溶解し、その後、Ｅｔ３Ｎ・３ＨＦ（０．０８８ｍＬ、０．５４２ミリモル）をその中に滴下した。反応混合物を室温で３５ｈ反応させ、試薬の消失をＴＬＣでモニターした（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／２）。溶媒を真空下で留去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／２）で精製し、所望の化合物（０．０４０ｇ、０．０６９ミリモル、９６％）を淡黄色固体として得た。生成物を、ＣＨ２Ｃｌ２／ペンタン＝１／５０から結晶化することによりさらに精製した。
【００６３】
【表１８】
2010500971.tif 000022
【００６４】
実施例ＸＶＩＩＩ−５−ジベンジルオキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシンの調製
カンプトテシン２０−ＯＴＥＳ（０．１００ｇ、０．２１６ミリモル）を不活性雰囲気下で撹拌しながら、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中に溶解し、次いで、−７８℃の温度に冷却し、ＴＨＦ中の１．０Ｍ  ＬｉＨＭＤＳ溶液（０．２８１ｍＬ、０．２８１ミリモル）をその中に滴下した。２０’後、無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中のジベンジルアゾジカルボキシレート（０．０９７ｇ、０．３２４ミリモル）を加えた。−７８℃で３ｈ後、温度が２５℃に上がるまで放置し、試薬の消失をＴＬＣ（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／１）でモニターした。２つのジアステレオマーの生成が認められた。室温で９０分後、反応を、飽和ＮＨ４Ｃｌを加えて停止させた。水相をＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ１５ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝４／１、次いで７／２）で精製して、淡黄色固体（０．１６１ｇ、０．２１２ミリモル、９８％）を得た。２つの異性体は、さらにクロマトグラフィーで分離した。溶出順に：
【００６５】
【表１９】
2010500971.tif 000023
【００６６】
実施例ＸＩＸ−５−ジベンジルオキシカルボニルヒドラジノ−カンプトテシンの一番目のジアステレオマーの調製
５−ジベンジルオキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシンの一番目のジアステレオマー（０．１４０ｇ、０．１８４ミリモル）を不活性雰囲気下で撹拌しながら、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中に溶解し、その後、Ｅｔ３Ｎ・３ＨＦ（０．２２５ｍＬ、１．３８０ミリモル）をその中に滴下した。反応混合物を室温で５２ｈ反応させ、試薬の消失をＴＬＣでモニターした（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／３）。溶媒を真空下で留去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１、次いで２／３）で精製し、（０．１１３ｇ、０．１７５ミリモル、９５％）を淡黄色固体として得た。生成物を、ＣＨ２Ｃｌ２／ペンタン＝１／５０から結晶化することによりさらに精製した。
【００６７】
【表２０】
2010500971.tif 000024
【００６８】
実施例ＸＸ−５−ジベンジルオキシカルボニルヒドラジノ−カンプトテシンの二番目のジアステレオマーの調製
５−ジベンジルオキシカルボニルヒドラジノ−２０−ＯＴＥＳ−カンプトテシンの二番目のジアステレオマー（０．１４０ｇ、０．１８４ミリモル）を不活性雰囲気下で撹拌しながら、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中に溶解し、その後、Ｅｔ３Ｎ・３ＨＦ（０．１５０ｍＬ、０．９２１ミリモル）をその中に滴下した。反応混合物を室温で５５ｈ反応させ、試薬の消失をＴＬＣでモニターした（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝３／２）。溶媒を真空下で留去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝１／１）で精製し、所望の化合物（０．１１３ｇ、０．１７５ミリモル、９５％）を淡黄色固体として得た。生成物を、ＣＨ２Ｃｌ２／ペンタン＝１／５０から結晶化することによりさらに精製した。
【００６９】
【表２１】
2010500971.tif 000025
【００７０】
実施例ＸＸＩ−細胞成長阻害アッセイ
ヒト大細胞型肺腫瘍からのＨ４６０細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。細胞感受性は、１〜７２ｈの薬剤暴露後の、細胞成長阻害アッセイにより決定した。対数増殖における細胞を収集し、６ウエルプレート中で重複して接種した。接種２４時間後、細胞を薬剤に暴露し、ＩＣ５０を決定するために、薬剤への暴露７２時間後に、コールターカウンターで計測した。ＩＣ５０は、非処理の対照の成長と比較して、細胞成長を５０％阻害する濃度として定義される。
【００７１】
実施例ＸＸＩ−トポイソメラーゼＩ依存性ＤＮＡ開裂アッセイ
ＤＮＡ開裂は、７５１ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ  ＳＶ４０精製ゲルを用いて決定した（Beretta GL, Binaschi M, Zagni AND, Capuani L, Capranico G. Tethering a type IB topoisomerase to a DNA site by enzyme fusion to a heterologous site-selective DNA-binding protein domain. Cancer Res 1999; 59:3689-97）。ＤＮＡフラグメントは、３’でのみ標識されていた。ＤＮＡ開裂反応（２０，０００ｃｐｍ／試料）は、１０ｍＭトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、０．１ｍＭチオトレイトール、およびヒト組換え酵素（完全長トップ１）の中で、３７℃で３０分間実施した。反応は、０．５％ＳＤＳおよび０．３ｍｇ／ｍＬのＫプロテイナーゼを用いて、４２℃で４５分間ブロックした。ＤＮＡ損傷持続性は、１０μＭの薬剤と共に３０分間インキュベートしたのち、０．６Ｍ  ＮａＣｌを加えたその時々に、試験した。沈殿後に、変性ゲル（ＴＢＥ緩衝液中の７％ポリアミド）中での接種前に、ＤＮＡを変性緩衝液（８０％ホルムアミド、１０ｍＭ  ＮａＯＨ、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡおよび１ｍｇ／ｍＬ染料）中に再懸濁した。ＤＮＡ開裂レベルの全てを、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ４２５型（Molecular Dynamics）を用いて測定した（Dallavalle S, Ferrari A, Biasotti B, et al. Novel 7-oxyiminomethyl camptothesin derivatives with potent in vitro and in vivo antitumor activity. J Med Chem 2001; 44:3264-74）。
【００７２】
【表２２】
2010500971.tif 000026
【国際調査報告】
2010500971.tif 000029
2010500971.tif 000030
2010500971.tif 000031