(57)【要約】本発明は、一つまたは複数の可溶性CDId複合体、特に非特異的な可溶性CDId複合体を含んだ組成物を投与する段階を含む、動物において免疫反応を調節する方法を対象とする。可溶性CDId複合体は、可溶性CDIdポリペプチド、β2-ミクログロブリンポリペプチド、およびCDId抗原結合溝に結合されたセラミド様糖脂質抗原、ならびにある種の態様においては免疫原を含む。本発明の組成物の投与はCDId拘束性NKT細胞の活性に影響を及ぼし、かつ特に、CDId拘束性NKT細胞のアネルギーを引き起こさずに複数回の投与を可能にする。2010519255.tif 000027
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) (i) β2-ミクログロブリンと結合しかつセラミド様糖脂質抗原を結合するのに十分な単離された可溶性CD1dポリペプチド;
(ii) 該CD1dポリペプチドと結合したβ2-ミクログロブリンまたはその断片を含む単離されたポリペプチド; および
(iii) 該CD1dポリペプチドに結合したセラミド様糖脂質抗原
を含む、非特異的なCD1d複合体と、
(b) 担体と
を含む組成物を、免疫調節を必要としている動物に投与する段階
を含む、動物において免疫反応を調節する方法であって、
該非特異的なCD1d複合体が該動物においてNKT細胞の活性に影響を及ぼすのに十分な量で投与される、方法。
【請求項２】
(a) (i) β2-ミクログロブリンと結合しかつセラミド様糖脂質抗原を結合するのに十分な単離された可溶性CD1dポリペプチド;
(ii) 該CD1dポリペプチドと結合したβ2-ミクログロブリンまたはその断片を含む単離されたポリペプチド; および
(iii) 該CD1dポリペプチドに結合したセラミド様糖脂質抗原
を含む、非特異的なCD1d複合体と、
(b) 担体と
を含む組成物を、疾患を有する動物に投与する段階
を含む、動物において疾患を処置する方法であって、
該組成物が該疾患の進行を変化させるのに十分な量で投与される、方法。
【請求項３】
(a) β2-ミクログロブリンと結合しかつセラミド様糖脂質抗原を結合するのに十分な単離された可溶性CD1dポリペプチド;
(b) 該CD1dポリペプチドと結合したβ2-ミクログロブリンまたはその断片を含む単離されたポリペプチド; および
(c) 該CD1dポリペプチドに結合した該セラミド様糖脂質抗原
を含むCD1d複合体の一部としての該セラミド様糖脂質抗原で、NKT細胞を刺激する段階と、
該NKT細胞を該複合体で1回または複数回再刺激する段階と
を含む、NKT細胞活性に及ぼすセラミド様糖脂質抗原のアネルギー作用を阻害する方法であって、
該NKT細胞が該刺激に応じて活性化され、該NKT細胞が該複合体による該再刺激に応じて再活性化される、方法。
【請求項４】
(a) 免疫原と、
(b) (i) β2-ミクログロブリンと結合しかつセラミド様糖脂質抗原を結合するのに十分な単離された可溶性CD1dポリペプチド;
(ii) 該CD1dポリペプチドと結合したβ2-ミクログロブリンまたはその断片を含む単離されたポリペプチド; および
(iii) 該CD1dポリペプチドに結合したセラミド様糖脂質抗原
を含む、CD1d複合体と、
(c) 担体と
を含む組成物を、必要としている動物に投与する段階
を含む、動物において免疫原に対する免疫反応を調節する方法であって、
該CD1d複合体が該CD1d複合体の非存在下での該免疫原の投与に比べて該免疫原に対する免疫反応を調節するのに十分な量で投与される、方法。
【請求項５】
(a) 免疫原と、
(b) (i) β2-ミクログロブリンと結合しかつセラミド様糖脂質抗原を結合するのに十分な単離された可溶性CD1dポリペプチド;
(ii) 該CD1dポリペプチドと結合したβ2-ミクログロブリンまたはその断片を含む単離されたポリペプチド; および
(iii) 該CD1dポリペプチドに結合したセラミド様糖脂質抗原
を含む、CD1d複合体と、
(c) 担体と
を含む組成物を、必要としている動物に投与する段階
を含む、動物において疾患を処置する方法であって、
該免疫原に対する免疫反応が該疾患を処置するうえで有効であり、該CD1d複合体が該CD1d複合体の非存在下での該免疫原の投与に比べて該免疫原に対する免疫反応を調節するのに十分な量で投与される、方法。
【請求項６】
(a) 免疫原と、
(b) (i) β2-ミクログロブリンと結合しかつセラミド様糖脂質抗原を結合するのに十分な単離された可溶性CD1dポリペプチド;
(ii) 該CD1dポリペプチドと結合したβ2-ミクログロブリンまたはその断片を含む単離されたポリペプチド; および
(iii) 該CD1dポリペプチドに結合したセラミド様糖脂質抗原
を含む、CD1d複合体と、
(c) 担体と
を含む組成物を、必要としている動物に投与する段階
を含む、動物において疾患を予防する方法であって、
該免疫原に対する免疫反応が該疾患を処置するうえで有効であり、該CD1d複合体が該CD1d複合体の非存在下での該免疫原の投与に比べて該免疫原に対する免疫反応を調節するのに十分な量で投与される、方法。
【請求項７】
組成物がアジュバントをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
アジュバントが、モノホスホリル脂質A (MPL)、CpG、およびBCGからなる群より選択されるToll様受容体(TLR)アゴニストである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
アジュバントがMPLである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
可溶性CD1dポリペプチドがSEQ ID NO:1のアミノ酸21〜295に少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
可溶性CD1dポリペプチドがSEQ ID NO:1のアミノ酸21〜295に少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
可溶性CD1dポリペプチドがSEQ ID NO:1のアミノ酸21〜295を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
可溶性CD1dポリペプチドがSEQ ID NO:1のアミノ酸1〜295を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
可溶性CD1dポリペプチドが、少なくとも1個ただし10個未満の保存的アミノ酸置換を除き、SEQ ID NO:1のアミノ酸20〜295を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
可溶性CD1dポリペプチドが異種ポリペプチドをさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
β2-ミクログロブリンポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸21〜113に少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
β2-ミクログロブリンポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸21〜113を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
β2-ミクログロブリンポリペプチドがSEQ ID NO:2のアミノ酸1〜119を含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
β2-ミクログロブリンポリペプチドが、少なくとも1個ただし5個未満の保存的アミノ酸置換を除き、SEQ ID NO:2のアミノ酸21〜113を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
β2-ミクログロブリンポリペプチドが異種ポリペプチドをさらに含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
β2-ミクログロブリンポリペプチドが通常のジスルフィド結合を介して可溶性CD1dポリペプチドと結合される、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
β2-ミクログロブリンポリペプチドが融合ポリペプチドとして可溶性CD1dポリペプチドに付着される、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
β2-ミクログロブリンポリペプチドが可溶性CD1dポリペプチドのN末端に位置する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
β2-ミクログロブリンポリペプチドおよび可溶性CD1dポリペプチドがペプチドリンカーによって分離される、請求項22または23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
二つまたはそれ以上の可溶性CD1d複合体が多価可溶性CD1d複合体としてともに結合される、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
セラミド様糖脂質抗原が、α-ガラクトシルセラミドおよびα-グリコシルセラミドからなる群より選択される化合物を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
セラミド様糖脂質抗原がα-ガラクトシルセラミドを含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
α-ガラクトシルセラミドが下記式を含む、請求項27記載の方法:
2010519255.tif 000025
式中
R1は、少なくとも一つのC=C結合を有する直鎖状もしくは分枝状C1〜C27アルケンであるが、-CH2)7CH=CH(CH2)7CH3ではなく、またはR1はC(OH)-R3であり、ここでR3は、少なくとも一つのC=C結合を有する直鎖状もしくは分枝状C1〜C26アルケンであり; および
R2は以下(a)〜(e):
(a) -CH2(CH2)XCH3、
(b) -CH(OH)(CH2)XCH3、
(C) -CH(OH)(CH2)XCH(CH3)2、
(d) -CH=CH(CH2)XCH3、
(e) -CH(OH)(CH2)XCH(CH3)CH2CH3、
のうちの一つであり、
式中、Xは5〜17の範囲の整数である。
【請求項２９】
セラミド様糖脂質抗原が、下記構造:
2010519255.tif 000026
を有する、(2S,3S,4R)-1-O-(α-ガラクトピラノシル)-N-ヘキサコサノイル-2-アミノ-1,3,4-オクタデカントリオール(KRN7000、(2S,3S,4R)-1-(α-D-ガラクトピラノシルオキシ)-2-ヘキサコサノイルアミノ-3,4-オクタ-デカンジオール)を含む、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
セラミド様糖脂質抗原が短縮した長鎖スフィンゴシン塩基(C5 vs. C14)およびアシル鎖(C24 vs. C26)を持つように修飾される、請求項1〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
修飾セラミド様糖脂質抗原が、C14からC5に短縮した長鎖スフィンゴシン塩基およびC26からC24に短縮したアシル鎖を有する-OCH類似体である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
組成物が共刺激分子をさらに含む、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
共刺激分子が、Toll様受容体およびB71からなる群より選択される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
組成物が、化学療法剤、抗体、および抗原からなる群より選択される作用物質をさらに含む、請求項1〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
免疫反応が誘発される、請求項1および4〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
免疫反応が増強される、請求項1および4〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
免疫反応がサイトカインの放出を含む、請求項1および4〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
サイトカインが、IFN-ガンマ、TNF-アルファ、および両方のサイトカインからなる群より選択される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
サイトカインが、IL-4、IL-10、IL-5、IL-13、および該サイトカインの組み合わせからなる群より選択される、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
免疫反応が、NK細胞、CTL、Bリンパ球、樹状細胞、マクロファージ、好中球、および該細胞の二つまたはそれ以上の組み合わせからなる群より選択される細胞の動員を含む、請求項1および4〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
免疫反応が阻害される、請求項1および4〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
免疫反応が炎症である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
免疫反応が自己免疫である、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
NKT細胞活性が、細胞増殖、サイトカインの産生、NKT以外の免疫系細胞の動員もしくは活性化からなる群より選択される、または該活性の二つもしくはそれ以上の組み合わせである、請求項1、3および10〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
動物が脊椎動物である、請求項1〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
脊椎動物が哺乳類である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
哺乳類がヒトである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
非特異的なCD1d複合体1 μg〜約30 mgを動物に投与する段階を含む、請求項1〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
NKT細胞の活性化が、NKT細胞増殖、サイトカインの産生、NKT以外の免疫系細胞の動員もしくは活性化からなる群より選択される効果、または該効果の二つもしくはそれ以上の組み合わせを含む、請求項3記載の方法。
【請求項５０】
NKT細胞の活性化がNKT細胞増殖を含む、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
NKT細胞の活性化がサイトカインの産生を含む、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
サイトカインが、インターフェロン-ガンマ、TNF-アルファ、IL-4、IL-2、IL-1β、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-23、TNF-β/LT、MCP-2、オンコスタチン-M、RANTES、および該サイトカインの二つまたはそれ以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
NKT細胞の活性化がNKT以外の免疫系細胞の動員または活性化を含む、請求項51記載の方法。
【請求項５４】
NKT以外の免疫系細胞が、NK細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、B細胞、樹状細胞、および該細胞の二つまたはそれ以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項49記載の方法。
【請求項５５】
NKT細胞の再活性化が、NKT細胞増殖、サイトカインの産生、NKT以外の免疫系細胞の動員もしくは活性化からなる群より選択される効果、または該効果の二つもしくはそれ以上の組み合わせを含む、請求項3記載の方法。
【請求項５６】
NKT細胞の再活性化がNKT細胞増殖を含む、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
NKT細胞の再活性化がサイトカインの産生を含む、請求項55記載の方法。
【請求項５８】
サイトカインが、インターフェロン-ガンマ、TNF-アルファ、IL-4、IL-2、IFNガンマ、IL-4、IL-5、IL-10およびIL-13、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-23、TNF-β/LT、MCP-2、オンコスタチン-M、RANTES、ならびに該サイトカインの二つまたはそれ以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
NKT細胞の再活性化がNKT以外の免疫系細胞の動員または活性化を含む、請求項55記載の方法。
【請求項６０】
NKT以外の免疫系細胞が、NK細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、樹状細胞、マクロファージ、好中球、および該細胞の二つまたはそれ以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
CD1d複合体が非特異的である、請求項3および6〜60のいずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
CD1d複合体が、可溶性CD1dポリペプチドと結合された標的化抗体またはその断片をさらに含み、該抗体またはその断片が細胞表面マーカーに特異的である、請求項3および6〜60のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
抗体またはその断片がscFv断片である、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
抗体またはその断片がF(ab)断片である、請求項62記載の方法。
【請求項６５】
抗体またはその断片がF(ab')2断片である、請求項59記載の方法。
【請求項６６】
抗体またはその断片が完全長の抗体である、請求項62記載の方法。
【請求項６７】
細胞表面マーカーが腫瘍細胞の細胞表面マーカーである、請求項62記載の方法。
【請求項６８】
細胞表面マーカーが樹状細胞の細胞表面マーカーである、請求項62記載の方法。
【請求項６９】
細胞表面マーカーが自己免疫疾患または炎症性疾患の標的の細胞表面マーカーである、請求項62記載の方法。
【請求項７０】
細胞表面マーカーが、感染した細胞または組織の細胞表面マーカーである、請求項62記載の方法。
【請求項７１】
免疫原が、細菌ポリペプチド；真菌ポリペプチド；寄生虫ポリペプチド；アレルゲン性ポリペプチド；腫瘍特異的ポリペプチド；該ポリペプチドのいずれかの断片、変異体、誘導体；膜脂質；糖脂質；グリコシルセラミド；および該免疫原の二つまたはそれ以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項4〜69のいずれか一項記載の方法。
【請求項７２】
疾患が感染性物質と関連する、請求項2、5および6〜70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７３】
疾患が異常な細胞増殖と関連する、請求項2、5および6〜70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
疾患が自己免疫疾患である、請求項2、5および6〜70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７５】
疾患が炎症性疾患である、請求項2、5および6〜70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７６】
処置が、治癒、疾患の進行の変化、生存期間の延長、症状の軽減、または疾患と関連する症状の阻止を含む、請求項2、5および10〜74のいずれか一項記載の方法。
【請求項７７】
投与が、筋肉内経路、静脈内経路、気管内経路、鼻腔内経路、経皮経路、皮膚間(interdermally)経路、皮下経路、眼内経路、膣経路、直腸経路、腹腔内経路、腸内経路、吸入による経路からなる群より選択される経路による、または該経路の二つまたはそれ以上の組み合わせによるものである、請求項1〜76のいずれか一項記載の方法。
【請求項７８】
(a) 免疫原と、
(b) (i) β2-ミクログロブリンと結合しかつセラミド様糖脂質抗原を結合するのに十分な単離された可溶性CD1dポリペプチド;
(ii) 該CD1dポリペプチドと結合したβ2-ミクログロブリンまたはその断片を含む単離されたポリペプチド; および
(iii) 該CD1dポリペプチドに結合したセラミド様糖脂質抗原
を含む、CD1d複合体と、
(c) 担体と
を含む、組成物。
【請求項７９】
アジュバントをさらに含む、請求項78記載の組成物。
【請求項８０】
アジュバントが、MPL、CpG、およびBCGからなる群より選択されるTLRアゴニストである、請求項79記載の組成物。
【請求項８１】
アジュバントがMPLである、請求項80記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は全体として免疫学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然の免疫系は、外来病原体に対する非常に攻撃的な防御免疫反応と正常組織に対する寛容を維持する必要性の複雑なバランスをとっている。最近では多くの異なる細胞型の間の相互作用がこのバランスの維持に寄与しているという認識が高まっている。そのような相互作用は、例えば、TH1型T細胞による炎症促進性サイトカイン(例えば、インターフェロン-ガンマ)の産生またはTH1活性を抑制するTH2型T細胞によるインターロイキン-4 (IL-4)の産生のいずれかでの偏った反応をもたらすことができる。いくつかの異なる動物モデルにおいて、TH1へのT細胞の偏向は腫瘍または感染性病原体に対する防御免疫に有利に働くことが明らかにされている一方で、TH2へのT細胞の偏向は細胞媒介性自己免疫疾患の発症の予防における重要な要因でありうる。免疫刺激が攻撃的な細胞媒介性免疫をもたらすか、またはそのような反応の下方制御をもたらすかを決める条件は、異なる免疫反応に有利に働くように相互作用する抗原提示細胞(APC)およびリンパ球系統の特有のセットから各組織が構成されるという意味で高度に局部的である。例えば、最適な条件の下で、正常組織に局在する樹状細胞(DC)は、寛容原性の相互作用に有利に働く、かつ細胞媒介性自己免疫に対する障壁としての機能を果たす成熟の系統および段階を主として示すことができる一方で、腫瘍または感染部位は、強力な細胞媒介性免疫反応を刺激する成熟骨髄樹状細胞を誘引するであろう。
【０００３】
CD1d拘束性NKT細胞は、局所環境での免疫刺激の結果を明確にするうえで重要な役割を果たすように思われる独特なクラスの非従来型T細胞である。それらはT細胞系統およびナチュラルキラー(NK)細胞系統の両方のマーカーの発現をさらに大きなクラスのNKT細胞と共有している。したがって、NKT細胞はNK細胞のように先天性免疫の一部と考えられ、ヒトにおいて健常個体でのその頻度は全Tリンパ球の2.0%にもなりうる(Gumperz et al., 2002. J Exp Med 195:625; Lee et al., 2002. J Exp Med 195:637)。
【０００４】
CD1d拘束性NKT細胞は、単形性MHCクラスIb分子CD1dにより提示される脂質および糖脂質抗原に対するその特異性で他のNKT細胞と区別される(Kawano et al., Science 278 (1997), pp. 1626-1629)。CD1dは、β2-ミクログロブリンと結合する非MHCコード分子であり、古典的MHCクラスI分子に構造的に関連する。CD1dは、脂質尾部または疎水性ペプチドの炭化水素鎖を結合するために特殊化された疎水性の抗原結合ポケットを有する(Zeng et al., Science 277 (1997), pp. 339-345)。CD1dは海綿由来のα-グリコシル化スフィンゴ脂質、α-ガラクトシルセラミド(α-GalCer)、およびα-結合ガラクトースまたはグルコースを有するがマンノースを有しないセラミド様糖脂質抗原のような関連分子を結合することが知られている(Kawano et al., Science 278 (1997), pp. 1626-1629; およびZeng et al., Science 277 (1997), pp. 339-345)。以下で論じられるように、抗原提示細胞のCD1dに結合されたα-GalCerまたは関連分子での刺激によってCD1d拘束性NKT細胞を活性化する能力は、この非従来型のT細胞サブセットの機能解析を大いに促進している。炎症がない場合、CD1d拘束性NKT細胞は胸腺、肝臓および骨髄のような、ある種の組織に選択的に局在することが明らかにされており(Wilson et al., 2002. Trends Mol Med 8:225)、NKT細胞の抗腫瘍活性はマウス肝転移において主に調べられている。
【０００５】
NKT細胞はTH1サイトカインもTH2サイトカインもともに分泌する珍しい能力を持っており、調節機能のほかに強力な細胞障害機能も炎症、自己免疫および腫瘍免疫で実証されている(Bendelac et al., (1995) Science 268:863; Chen and Paul. 1997. J Immunol 159:2240; およびExley et al., 1997. J Exp Med 186:109)。
【０００６】
CD1d拘束性NKT細胞のなかには、高度に保存されたαβT細胞受容体(TCR)を発現する、本明細書において「iNKT細胞」といわれる、サブセットがある。ヒトにおいてこのインバリアントTCRはVβ11と結合したVα24Jα15から構成されるのに対し、マウスにおいてこの受容体は高度に相同性のVα14Jα18およびVβ8.2を含む。他のCD1d拘束性NKT細胞は、より可変性のTCRを発現する。CD1d拘束性T細胞のTCRインバリアントクラスもTCRバリアントクラスもともに、α-GalCerを負荷したCD1d-四量体の結合によって検出することができる(Benlagha et al., J Exp Med 191 (2000), pp. 1895-1903; Matsuda et al., J Exp Med 192 (2000), pp. 741-754; およびKaradimitris et al., Proc Natl Acad Sci USA 98 (2001), pp. 3294-3298)。本出願において定義のCD1d拘束性NKT細胞(CD1d拘束性NKT)は、インバリアントTCRまたはバリアントTCRを発現し、かつ、α-GalCerを負荷した、または関連するセラミド様糖脂質抗原を負荷したCD1dを結合するまたはそれによって活性化される細胞を含む。本出願において定義のCD1d拘束性NKT細胞(CD1d-NKT)は、インバリアントTCRまたはバリアントTCRを発現し、かつ、α-GalCerを負荷した、またはα-GalCerとは短縮した長鎖スフィンゴシン塩基(C5 vs. C14)およびアシル鎖(C24 vs. C26)を持つことによって異なる、OCHのような分子を含むα-結合ガラクトースもしくはグルコースを持った関連するスフィンゴ脂質(Miyamoto et al., Nature 2001 413:531-4)を負荷したCD1dを結合するまたはそれによって活性化される細胞を含む。
【０００７】
CD1d拘束性NKTは、CD1dを発現する標的に対する直接的な細胞障害活性を有することが明らかにされている。しかしながら、免疫反応に及ぼすCD1d拘束性NKTの効果は、直接的な相互作用によるまたは、恐らくさらに重要なことには、DCとの相互作用を通じた間接的な動員による、他のリンパ球の動員を通じて増幅される可能性が高い。CD1d拘束性NKTは、免疫反応早期に多量のIL-4およびIFN-γを分泌する独特の能力を有する。IFN-γの分泌は、インターロイキン-12 (IL-12)を産生するDCの活性化を誘導する。IL-12は、NKT細胞によってIFN-γ分泌をさらに刺激し、より多くのIFN-γを分泌するNK細胞の活性化も引き起こす。
【０００８】
CD1d拘束性NKTは多量のIL-4もIFN-γもともに素早く分泌することができるので、免疫反応の偏向は、炎症促進性IFN-γサイトカインの効果が優勢かまたは抗炎症性IL-4サイトカインの効果が優勢かに依存するであろう。これは一つには、CD1d拘束性NKTの異なるサブセットの相対頻度によることが報告されている。これらのサブセットは、(i) CD4もCD8もともに陰性である、かつ、炎症促進性IFN-γおよびTNF-αの分泌を含め主にTH1型反応をもたらすインバリアントCD1d拘束性NKT集団、ならびに(ii) CD4+である、かつ、抗炎症性のTh2型サイトカインIL-4、IL-5、IL-10およびIL-13の分泌を含めTH1型反応もTH2型反応もともにもたらすCD1d拘束性NKTの別個の集団を含む(Lee et al., J Exp Med 2002; 195 :637-41; およびGumperz et al., J Exp Med 2002; 195 :625-36)。さらに、NKT細胞活性は、CD1dに結合された特定のセラミド様糖脂質に依存することによって差別的に調節される(例えば、米国特許出願公開第2006/0052316号を参照のこと)。CD1d拘束性NKTサブセットの活性化に影響を及ぼす局所因子には、サイトカイン環境および、重要なのは、その環境に動員されるDCが含まれる。
【０００９】
いくつかの間接的な機構がCD1d拘束性NKT細胞の保護効果に寄与する。インビボでのα-GalCerの投与によるNKT細胞の活性化は、NK細胞の同時活性化を引き起こす(Eberl and MacDonald, Eur. J. Immunol. 30 (2000), pp. 985-992; およびCarnaud et al., J. Immunol. 163 (1999), pp. 4647-4650)。NKT細胞が欠損しているマウスでは、α-GalCerはNK細胞による細胞障害活性を誘導することができない。NKT細胞は古典的なMHCクラスI拘束性細胞障害性T細胞の誘導も増強する(Nishimura et al., Int Immunol 2000; 12 :987-94; およびStober et al., J Immunol 2003; 170:2540-8)。
【００１０】
CD1d拘束性NKT細胞を特異的に活性化するために利用できる、定義済の抗原、例えば、α-GalCerおよび関連抗原の有効性により、種々の免疫反応におけるこれらの非従来型T細胞の役割を調べることが可能になった。
【００１１】
実際に、α-GalCerは治療薬またはアジュバントとしてかなり有望である。例えば、α-GalCer投与はネズミマラリア、真菌感染およびB型肝炎ウイルス感染における保護効果を含め、いくつかの異なる細菌感染に劇的な効果を及ぼす(Kakimi et al, J Exp Med 192 (2000), pp. 921-930; Gonzalez-Aseguinolaza et al., Proc Natl Acad Sci USA 97 (2000), pp. 8461-8466; およびKawakami et al., Infect Immun 69 (2001), pp. 213-220)。α-GalCerの投与の劇的な効果は腫瘍免疫の動物モデルにおいても観察されている。例えば、α-GalCerによる刺激はNKT依存的に肺転移および肝転移を抑制する(Smyth et al., 2002. Blood 99:1259)。さらに、α-GalCerは1型糖尿病および実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE、多発性硬化症の周知のモデル系)を含め、ある種の自己免疫疾患に対する保護効果を有することが明らかにされている(Hong S, et al. Nat. Med. 2001;7:1052-1056およびMiyamoto K. et al. Nature. 2001;413:531-534)。
【００１２】
しかしながら、NKT細胞は、α-GalCerによる再刺激によって、無反応になる、例えば、増殖する、サイトカインを産生する、他の細胞型をトランス活性化するおよび腫瘍転移を阻止するその能力が低減するようになる。Parekh, VV, et al. J. Clin. Invest. 115:2572-2583 (2005)。したがって、NKT細胞を無反応とさせずに複数回NKT細胞を刺激する方法が当技術分野において依然として必要である。
【発明の概要】
【００１３】
一つの態様において、本発明は、動物において免疫反応を調節する方法を対象とし、本方法は、免疫調節を必要としている動物に、(a) (i) β2-ミクログロブリンと結合しかつセラミド様糖脂質抗原を結合するのに十分な単離された可溶性CD1dポリペプチド; (ii) CD1dポリペプチドと結合したβ2-ミクログロブリンまたはその断片を含む単離されたポリペプチド; および(iii) CD1dポリペプチドに結合したセラミド様糖脂質抗原を含む、非特異的なCD1d複合体と、(b) 担体とを含んだ組成物を投与する段階を含み、この非特異的なCD1d複合体は動物においてNKT細胞の活性に影響を及ぼすのに十分な量で投与される。
【００１４】
別の態様において、本発明は、動物において疾患を処置する方法を対象とし、本方法は、疾患を有する動物に、(a) (i) β2-ミクログロブリンと結合しかつセラミド様糖脂質抗原を結合するのに十分な単離された可溶性CD1dポリペプチド; (ii) CD1dポリペプチドと結合したβ2-ミクログロブリンまたはその断片を含む単離されたポリペプチド; および(iii) CD1dポリペプチドに結合したセラミド様糖脂質抗原を含む、非特異的なCD1d複合体と、(b) 担体とを含んだ組成物を投与する段階を含み、該組成物は疾患の進行を変化させるのに十分な量で投与される。
【００１５】
別の態様において、本発明は、NKT細胞活性に及ぼすセラミド様糖脂質抗原のアネルギー作用を阻害する方法を対象とし、本方法は、(a) β2-ミクログロブリンと結合しかつセラミド様糖脂質抗原を結合するのに十分な単離された可溶性CD1dポリペプチド; (b) CD1dポリペプチドと結合したβ2-ミクログロブリンまたはその断片を含む単離されたポリペプチド; および(c) CD1dポリペプチドに結合したセラミド様糖脂質抗原を含むCD1d複合体の一部としてのセラミド様糖脂質抗原で、NKT細胞を刺激する段階と、該NKT細胞を該複合体で1回または複数回再刺激する段階とを含み、該NKT細胞は該刺激に応じて活性化され、該NKT細胞は該複合体による該再刺激に応じて再活性化される。
【００１６】
別の態様において、本発明は、動物において免疫原に対する免疫反応を調節する方法を対象とし、本方法は、それを必要としている動物に、(a) 免疫原と、 (b) (i) β2-ミクログロブリンと結合しかつセラミド様糖脂質抗原を結合するのに十分な単離された可溶性CD1dポリペプチド; (ii) CD1dポリペプチドと結合したβ2-ミクログロブリンまたはその断片を含む単離されたポリペプチド; および(iii) CD1dポリペプチドに結合したセラミド様糖脂質抗原を含む、CD1d複合体と、(c) 担体とを含んだ組成物を投与する段階を含み、このCD1d複合体はCD1d複合体の非存在下での免疫原の投与に比べて免疫原に対する免疫反応を調節するのに十分な量で投与される。
【００１７】
別の態様において、本発明は、動物において疾患を処置する方法を対象とし、本方法は、それを必要としている動物に、(a) 免疫原と、 (b) (i) β2-ミクログロブリンと結合しかつセラミド様糖脂質抗原を結合するのに十分な単離された可溶性CD1dポリペプチド; (ii) CD1dポリペプチドと結合したβ2-ミクログロブリンまたはその断片を含む単離されたポリペプチド; および(iii) CD1dポリペプチドに結合したセラミド様糖脂質抗原を含む、CD1d複合体と、(c) 担体とを含んだ組成物を投与する段階を含み、免疫原に対する免疫反応が疾患を処置するうえで有効であり、このCD1d複合体はCD1d複合体の非存在下での免疫原の投与に比べて免疫原に対する免疫反応を調節するのに十分な量で投与される。
【００１８】
別の態様において、本発明は、動物において疾患を予防する方法を対象とし、本方法は、それを必要としている動物に、(a) 免疫原と、 (b) (i) β2-ミクログロブリンと結合しかつセラミド様糖脂質抗原を結合するのに十分な単離された可溶性CD1dポリペプチド; (ii) CD1dポリペプチドと結合したβ2-ミクログロブリンまたはその断片を含む単離されたポリペプチド; および(iii) CD1dポリペプチドに結合したセラミド様糖脂質抗原を含む、CD1d複合体と、(c) 担体とを含んだ組成物を投与する段階を含み、免疫原に対する免疫反応が疾患を処置するうえで有効であり、このCD1d複合体はCD1d複合体の非存在下での免疫原の投与に比べて免疫原に対する免疫反応を調節するのに十分な量で投与される。
【００１９】
本発明は、本明細書に記載するいずれかのCD1d複合体を含んだ組成物をさらに対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】PBS (対照)、αGalCer 5 μg、あるいはαGalCer/sCD1d 20 μgまたはαGalCer/CD1d-抗-HER2融合体40 μg (負荷もしくは非負荷)の腹腔内(i.p.)注射から20時間後の肝臓iNKT細胞の一過性消失によって示されるαGalCer-負荷sCD1dおよびCD1d-抗HER2融合タンパク質のインビボでの生物学的活性。CD1d-四量体-エクストラアビジン(Extravidin)-PEおよび抗CD3 FITCを用いてフローサイトメトリーによりiNKT細胞の発生頻度を測定した。
【図２】a CD1d/抗-HER2融合体の数回注射後の肝臓および脾臓iNKT細胞による持続的IFNγ産生。肝臓および脾臓リンパ球をPBS (対照、白色棒)、αGalCer 0.4 μg (灰色棒)またはαGalCer/CD1d-抗-HER2融合タンパク質40 μg (黒色棒)のいずれかの6回目の注射から20分後に単離し、Golgi Plug試薬の存在下で1時間培養した。次いでNKT細胞を抗NK1.1-PE抗体および抗CD3-FITC抗体で染色し、固定化し、抗IFNγ-APCで細胞内IFNγを染色した。グラフは(NK1.1+ CD3+ 細胞にゲートされた)IFNγ産生NKT細胞の割合を示す。b αGalCerまたはαGalCer負荷組換えCD1d分子での数回の静脈内(i.v.)注射およびインビトロ再抗原投与後の肝臓NKT細胞による持続的IFNγ産生。肝臓リンパ球をPBS (対照)、αGalCer、αGalCer/CD1d-抗-HER2融合タンパク質(融合体)またはαGalCer/sCD1d (sCD1d)のいずれかの5回の静脈内(i.v.)注射後に単離し、図のようにGolgi Plugの存在下で6時間インビトロにおいて刺激した(PBS、白色; αGalCer、薄灰色; αGalCer/CD1d-抗-HER2融合体、黒色; αGalCer/sCD1d、濃灰色)。細胞をaに記載したようにFACS解析のために染色した。
【図３】αGalCer負荷組換えCD1d分子による全身処置中の血中iNKT増殖。PBS (対照)、αGalCer (0.4 μg)、αGalCer/CD1d-抗-Her2融合タンパク質(融合体、40 μg)またはαGalCer/sCD1d (sCD1d、20 μg)のいずれかの3回目の注射後にマウスを採血した。CD1d-四量体-PEおよび抗CD3 FITC抗体を用いPBMCにおいてNKT細胞を染色した。a 各群のマウス1匹の代表的なドットプロット(dot blot)。b 全PBMCの割合としてのCD1d四量体陽性およびCD3+細胞として表現された1群あたりマウス数匹に相当するグラフ。
【図４】αGalCer/sCD1dの反復注射によるインビボでの持続的iNKT活性化は肺転移の形成を阻止する。マウスをPBS (対照、白色)、αGalCer (0.4 μg、薄灰色)またはαGalCer/sCD1d (sCD1d、20 μg、黒色)で5回処置し、次に各処置の同時注射に加えて700,000個のB16野生型細胞を移植した。前処置を受けておらず、腫瘍細胞移植 + それぞれαGalCer (縞模様の灰色)またはαGalCer/sCD1d (sCD1d、縞模様の濃灰色)の同時注射だけを受けた2つの未処置群を含めた。肺転移の形成を移植から2週間後にImageJ k-平均法クラスタリングプログラムで解析し、結果を全肺表面に対する黒色転移表面の割合として表現している。対照に比べてαGalCer/sCD1d前処置群および未処置 + αGalCer群のP値 ＊P < 0.04、ならびにαGalCer前処置群に比べてαGalCer/sCD1d前処置群および未処置 + αGalCer群のP値 ＊P < 0.02。
【図５】プレコーティング実験。B16-HER2細胞(a)およびB16野生型(B16 wt)細胞(b)を0.4 μg/ml αGalCer、40 μg/ml αGalCer/CD1d-Her2融合タンパク質(融合体)、10 μg/mlハーセプチン(Herceptin)または20 μg/ml αGalCer/sCD1d (sCD1d)で1時間プレコーティングし、予洗ありまたはなしで、細胞を静脈内(i.v.)注射した。肺転移を移植から3週間後にImageJ k-平均法クラスタリングプログラムで解析し、結果を全肺表面に対する黒色転移表面の割合として表現している。＊ PBS対照に比べてP < 0.005。
【図６】インビボ抗腫瘍活性 - 全身処置。a 700.000個のB16-HER2細胞をマウスの静脈内に(i.v.)移植し、静脈内(i.v.)処置を48時間後に開始した。PBS (対照)、αGalCer (0.4 μg)、αGalCer/sCD1d (sCD1d、25 μg)またはαGalCer/CD1d-抗-HER2融合体(融合体、40 μg)を2〜3日ごとに5回マウスの静脈内に(i.v.)注射した。肺転移を移植から3週間後にImageJ k-平均法クラスタリングプログラムで解析し、全肺表面に対する転移表面の割合として表現した。αGalCer/CD1d-抗-HER2融合タンパク質による処置は、転移形成を顕著に阻害した。＊ P < 0.005 vs 対照、＊ P < 0.06 vs αGalCer。b 処置を移植から6日後に開始した。700,000個のB16-HER2細胞をマウスの静脈内に(i.v.)注射し、PBS (対照)、αGalCer、またはαGalCer/CD1d-抗-HER2融合タンパク質(融合体)での処置を移植から6日後に開始した。2〜3日ごとにマウスを3回静脈内(i.v.)処置し、上記のように3週後に肺転移を解析した。CD1d-抗HER2融合タンパク質による処置だけが転移増殖を顕著に低減した。＊ P < 0.01 vs 対照。
【図７】αGalCer/sCD1dまたはαGalCer/CD1d-抗-HER2融合タンパク質によるNK細胞、DC細胞およびT細胞のトランス活性化は、iNKT細胞を活性化した。a PBS (対照、白色棒)、5 μg αGalCer (薄灰色棒)、または20 μg αGalCer負荷sCD1dもしくは40 μg αGalCer/CD1d-抗-HER2融合タンパク質(それぞれ、αGalCer-sCD1d、濃灰色棒およびαGalCer-融合体、黒色棒)のいずれかによる腹腔内(i.p.)処置から20時間後の肝臓NK細胞数の増加。細胞を、抗NK1.1-PEおよび抗CD3-FITCで染色し、フローサイトメトリーにより解析した。NK細胞をNK1.1陽性/CD3陰性の集団として報告している。b c αGalCer/sCD1dによるDC成熟およびT細胞増殖の誘導は、インビボにおいてNKT細胞を活性化した。脾細胞をPBS (対照)、αGalCerまたはαGalCer/sCD1dのいずれかでの5回の静脈内(i.v.)処置後に単離し、GM-CSFとともに4日間、次いでPBS (対照、白色棒)、αGalCer (灰色棒)またはαGalCer/sCD1d (sCD1d、黒色棒)のいずれかとともにさらに3日間培養した。次いで細胞を、抗CD11c-FITCならびにビオチン化抗CD40およびストレプトアビジン-PEで染色してフローサイトメトリーにより二重陽性の成熟DCを検出し(c)、または抗NK1.1-PEおよび抗CD3-FITCで染色してフローサイトメトリーによりCD3単陽性T細胞を検出した(d)。
【図８】αGalCer負荷sCD1dは能動免疫化によって抗原特異的T細胞の増殖のための強力なアジュバントとして作用する。a H-2Kb/0VA特異的CTLの増殖の動態。マウスをオボアルブミン200 μgによりそれ自体(静脈内(i.v.))で、あるいはモンタニド(Montanide)アジュバント(比率3:7、皮下(s.c.))とともにまたはaGalCer 1 μgもしくはaGalCer/sCD1d 20 μg (静脈内(i.v.))とともに初回抗原刺激した。マウスを5〜7日ごとに採血し、PBMCをH-2Kb/OVA四量体+抗-CD8で染色した。結果を全CD8+ T細胞の割合としての四量体+およびCD8+ NKT細胞として表現している。初回免疫の場合と同じアジュバントおよび注射経路を利用して22日目に、マウスにOVAペプチド(20 μg)を追加免疫した。b 10日後に、マウスを殺処理し、脾細胞を刺激なしで、またはインビボ追加免疫の場合と同じ刺激およびアジュバントとともにもう5日間培養した。OVA特異的T細胞の発生頻度をaと同様に測定した。c bにおけるのと同じ培養物中の成熟DCの存在を、抗CD11c抗体および抗CD40抗体での表面染色により解析した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、免疫反応を調節する、すなわち、誘発する、阻害する、または刺激するのに有用である組成物および方法を提供する。本化合物は、ベータ-2ミクログロブリンと結合された可溶性CD1dポリペプチド断片に結合されたセラミド様糖脂質抗原を含んだ一つまたは複数のCD1d複合体を含む。ある種の態様において、本発明の可溶性CD1d複合体は非特異的である、すなわち、それらは任意の特定の組織、細胞または細胞表面マーカーに標的化されない。本発明の方法で用いる可溶性CD1d複合体は、CD1d拘束性ナチュラルキラーT (「NKT」)細胞の活性に影響を及ぼすことによって免疫反応を調節する。本明細書において記載の可溶性CD1d複合体は、望ましい免疫反応、例えば、感染性因子もしくはがんに対する免疫反応を刺激するのに有用であり、またはアレルギー反応、同種移植片拒絶および自己免疫疾患のような、望ましくない免疫反応を阻害するのに有用である。ある種の態様において、本発明の可溶性CD1d複合体は、免疫原とともに投与され、例えば、免疫原に対する免疫反応を増大するまたは調節することによりアジュバントとして機能する。
【００２２】
定義
用語「一つの(a)」または「一つの(an)」実体はその実体の一つまたは複数をいうことに留意されたい。例えば「ベクター(a vector)」は一つまたは複数のベクターを表すものと理解される。したがって「一つの(a) (または一つの(an))」、「一つまたは複数の」および「少なくとも一つの」という用語は本明細書において同じ意味で用いることができる。
【００２３】
本明細書において用いられる場合、「ポリペプチド」という用語は単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含するよう意図され、アミド結合(ペプチド結合としても知られる)によって直線的に連結された単量体(アミノ酸)で構成された分子をいう。「ポリペプチド」という用語は、二つまたはそれ以上のアミノ酸の任意の鎖をいい、特定の長さの産物をいうものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または二つもしくはそれ以上のアミノ酸の鎖をいうために用いられるその他任意の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語はこれらの用語のいずれかに代えて、またはこれらの用語のいずれかと同じ意味で用いることができる。「ポリペプチド」という用語は同様に、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非天然のアミノ酸による修飾を非限定的に含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物をいうよう意図される。ポリペプチドは天然の生物学的供給源に由来してもまたは組換え技術により産生されてもよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。ポリペプチドは化学合成によるなどの、いかなる方法によって作出されてもよい。
【００２４】
本発明のポリペプチドは約3個もしくはそれ以上、5個もしくはそれ以上、10個もしくはそれ以上、20個もしくはそれ以上、25個もしくはそれ以上、50個もしくはそれ以上、75個もしくはそれ以上、100個もしくはそれ以上、200個もしくはそれ以上、500個もしくはそれ以上、1,000個もしくはそれ以上または2,000個もしくはそれ以上のアミノ酸のサイズのものであってよい。ポリペプチドは規定の三次元構造を持ちうるが、それらは必ずしもそのような構造を持つわけではない。規定の三次元構造を有するポリペプチドは折り畳まれているといわれ、規定の三次元構造を保有しないが、むしろ多数の異なる高次構造をとることが可能であるポリペプチドは、折り畳まれていないといわれる。本明細書において用いられる場合、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に付着された少なくとも一つの糖質成分と共役しているタンパク質をいう。
【００２５】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体とは、その天然の環境にはないポリペプチドを意図する。特定の精製度は必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドはその天然のまたは自然の環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現された組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適当な技術により分離され、分画され、または部分的にもしくは実質的に精製された天然のまたは組換えポリペプチドと同様、本発明の目的では単離されたとみなされる。
【００２６】
本発明のポリペプチドとして同様に含まれるのは先述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体または変異体、およびその任意の組み合わせである。「断片」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、本発明のポリペプチドをいう場合、対応する天然のポリペプチドの少なくともいくらかの生物学的特性、抗原特性または免疫原特性を保持している任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片は、本明細書の他の部分に論じられている他の特定の断片に加えて、タンパク質分解断片、および欠失断片を含む。本発明のポリペプチドの変異体は上記の断片、および同様にアミノ酸の置換、欠失または挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。変異体は天然に存在することもあり、天然に存在しないこともある。天然に存在しない変異体は当技術分野において公知の突然変異誘発技術を用いて産生することができる。変異体ポリペプチドは保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。本発明のポリペプチドの誘導体は、天然のポリペプチドには見られないさらなる特徴を示すように改変されているポリペプチドである。例としては融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドは本明細書において「ポリペプチド類似体」といわれることもある。本明細書において用いられる場合、ポリペプチドの「誘導体」とは、官能側鎖基の反応によって化学的に誘導体化された一つまたは複数の残基を有する本ポリペプチドをいう。「誘導体」として同様に含まれるのは、20種の標準アミノ酸の一つまたは複数の天然アミノ酸誘導体を含有するペプチドである。例えば、4-ヒドロキシプロリンをプロリンに代えて用いることができ、5-ヒドロキシリジンをリジンに代えて用いることができ、3-メチルヒスチジンをヒスチジンに代えて用いることができ、ホモセリンをセリンに代えて用いることができ、およびオルニチンをリジンに代えて用いることができる。
【００２７】
「ポリヌクレオチド」という用語は単数の核酸および複数の核酸を包含するよう意図され、単離された核酸分子または構築体、例えば、伝令RNA (mRNA)、ウイルスに由来するRNA、またはプラスミドDNA (pDNA)をいう。ポリヌクレオチドは従来的なホスホジエステル結合または非従来的な結合(例えば、ペプチド核酸(PNA)に見られるような、アミド結合)を含むことができる。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する任意の一つまたは複数の核酸セグメント、例えば、DNAまたはRNA断片をいう。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然の環境から取り出されている核酸分子、DNAまたはRNAを意図する。例えば、ベクターに含まれた治療用ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞において保持されている組換えポリヌクレオチド、または溶液中の(部分的にもしくは実質的に)精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたRNA分子は、本発明のインビボまたはインビトロのRNA転写産物のほかに、本明細書において開示されるペスチウイルスベクターの、プラスおよびマイナス鎖形態、ならびに二本鎖形態を含む。
【００２８】
本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成により産生されたそのような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーターのような調節要素であってもよく、またはそれらを含んでもよい。
【００２９】
本明細書において用いられる場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分である。「終結コドン」(TAG、TGAまたはTAA)はアミノ酸に翻訳されないとはいえ、コード領域の一部であるとみなすことができるが、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5'および3'非翻訳領域などは、もし存在すれば、コード領域の一部ではない。本発明の二つまたはそれ以上のコード領域が単一のポリヌクレオチド構築体中に、例えば、単一のベクター上に、または別個のポリヌクレオチド構築体中に、例えば、別個の(異なる)ベクター上に存在することができる。さらに、どのベクターも単一のコード領域を含んでもよく、または二つもしくはそれ以上のコード領域を含んでもよく、例えば、本発明のベクターは、タンパク質分解的切断を介して最終のタンパク質に翻訳後にまたは翻訳と同時に分離される一つまたは複数のポリタンパク質をコードしてもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明のポリペプチド、またはその変異体もしくは誘導体をコードする第一または第二の核酸に融合されているか、または融合されていないかのいずれかの、異種のコード領域をコードしてもよい。異種のコード領域は分泌シグナルペプチドまたは異種の機能ドメインのような、特化された要素またはモチーフを非限定的に含む。
【００３０】
ある種の態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸はDNAである。DNAの場合、ポリペプチドをコードする、核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、一つまたは複数のコード領域と機能的に結合されたプロモーターおよび/または他の転写もしくは翻訳制御要素を含むことができる。機能的な結合は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響または制御の下に置くように一つまたは複数の調節配列と結合される場合である。二つのDNA断片(ポリペプチドコード領域およびそれに結合しているプロモーターのような)は、プロモーター機能の誘導によって所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写が生じるなら、および二つのDNA断片間の連結の性質が遺伝子産物の発現を指令する発現調節配列の能力を妨げないか、または転写されるDNA鋳型の能力を妨げないなら「機能的に結合」されている。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができるなら、ポリペプチドをコードする核酸と機能的に結合されていることになる。プロモーターは、所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を指令する細胞特異的なプロモーターとすることができる。プロモーターに加え、他の転写制御要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルをポリヌクレオチドと機能的に結合して、細胞特異的な転写を指令することができる。適当なプロモーターおよび他の転写制御領域は、本明細書において開示されている。
【００３１】
さまざまな転写制御領域が当業者に公知である。これらは、非限定的に、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、以下に限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメント(例えば、イントロン-Aと併せて、前初期プロモーター)、シミアンウイルス40由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメント(例えば、初期プロモーター)ならびにレトロウイルス(例えば、ラウス肉腫ウイルスのような)由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントを含む。他の転写制御領域はアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ-グロビンのような脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞において遺伝子発現を制御できる他の配列を含む。さらなる適当な転写制御領域は組織特異的なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター(例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導できるプロモーター)を含む。
【００３２】
同様に、さまざまな翻訳制御要素が当業者に公知である。これらはリボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにウイルス系に由来する要素(詳しくはCITE配列ともいわれる、内部リボソーム侵入部位またはIRES)を含むが、これらに限定されることはない。
【００３３】
他の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、伝令RNA (mRNA)の形態のRNAである。本発明のRNAは一本鎖または二本鎖であってよい。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指令する、分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合されてもよい。シグナル仮説によれば、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を越えて成長中のタンパク質鎖の輸送が開始されると、成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは一般に、ポリペプチドのN末端に融合されたシグナルペプチドを有しており、これは完全なまたは「完全長の」ポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌型または「成熟」型を生じることを当業者は承知している。ある種の態様において、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖シグナルペプチド、またはそれと機能的に結合されたポリペプチドの分泌を指令する能力を保持しているその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種の哺乳類シグナルペプチドまたはその機能的誘導体が使用されてもよい。例えば、野生型リーダー配列をヒト組織プラスミノゲン活性化因子(TPA)またはマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列と置換することができる。
【００３５】
「構築体」という用語は遺伝子操作されたベクターをいう。
【００３６】
「人工の」という用語は、合成によるまたは非宿主細胞に由来する組成物、例えば、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをいう。
【００３７】
以下でさらに詳細に論じられるように、CD1dサブユニットもβ-2ミクログロブリンサブユニットもともに含む、CD1dポリペプチドの機能的な抗原負荷可溶性断片は、本明細書において「可溶性CD1d複合体」といわれる。CD1dポリペプチドに負荷される抗原は糖脂質、典型的にはセラミド様糖脂質、例えば、α-ガラクトシルセラミド、例えば、α-GalCerである。本明細書においていわれる「セラミド様糖脂質」は、α-結合ガラクトースまたはグルコースを有する糖脂質を含む。CD1dに結合する糖脂質抗原の例は、Porcelli、米国特許出願公開第2006/0052316号、Tsuji、米国特許出願公開第2006/0211856号、Jiang、米国特許出願公開第2006/0116331号、Hirokazuら、米国特許出願公開第2006/0074235号、Tsujiら、米国特許出願公開第2005/0192248号、Tsuji、米国特許出願第2004/0127429号、およびTsujiら、米国特許出願第2003/0157135号のなかで見出され、これらは全てその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００３８】
「非特異的な可溶性CD1d複合体」という用語は、任意の特定の臓器、組織、細胞または細胞表面分子を標的とするように遺伝子操作されていない可溶性CD1d複合体をいう。しかしながら、「非特異的な可溶性CD1d複合体」は、細胞表面に発現されたCD1d分子が、抗原を負荷される場合に、相互作用しうるのと同じような形でNKT細胞と相互作用することができる。「非特異的な可溶性CD1d複合体」とは対照的なのが、抗体または他の結合分子に融合または結合されており、したがって特定の臓器、組織、細胞または細胞表面マーカーに複合体を標的化する「標的化CD1d複合体」である。標的化CD1d複合体はその効果をNKT細胞に局所的に、例えば、腫瘍の近くで及ぼす。例えば、全体が参照により本明細書に組み入れられるBrunoら、米国特許出願公開第2006/0269540号を参照されたい。
【００３９】
抗体は一つの、またはいくつかの、単位から構成されており、それらの単位の各々が二本の重(H)ポリペプチド鎖および二本の軽(L)ポリペプチド鎖からなる。HおよびL鎖は一連のドメインで構成されている。L鎖は、そのなかに二つの主要なタイプ(κおよびλ)があるが、二つのドメインからなる。H鎖はμ、δ、ならびにγ(そのなかにいくつかのサブクラスがある)、αおよびεを含め、いくつかのタイプのものである。ヒトでは、8種の遺伝的にかつ構造的に同定された、抗体の、クラスおよび重鎖アイソタイプによって規定されるサブクラス: IgM、IgD、IgG3、IgG1、IgG2、IgG4、IgEおよびIgAがある。さらに、例えば、「IgG」はGクラスの抗体を意味し、その上、「IgG1」はGクラスのサブクラス1のIgG分子をいう。IgG1抗体は、IgGクラスの全ての抗体と同じように、4つのドメインで構成されており、そのドメインのうちの1つが可変であり、他の3つが定常である。Fab抗体断片は、一つが可変および一つが定常の、二つのドメインをそれぞれが含んだ、インタクトな軽鎖および切断型の重鎖で構成される。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗体」(MAb)という用語は、細胞表面マーカーに特異的に結合できる、インタクトな分子のほかに抗体の部分(例えばFabおよびF(ab')2部分ならびにFv断片のような)も含むよう意図される。そのような部分は、通常、パパイン(Fab部分を産生するため)またはペプシン(F(ab')2部分を産生するため)のような酵素を用いて、タンパク質分解的切断により産生される。本発明の化合物において特に好ましいのはFab部分である。あるいは、抗原結合部分は組換えDNA技術の適用を通じて産生されてもよい。
【００４１】
さらに、免疫グロブリンは一本鎖抗体(「SCA」)であってよい。これらは可変軽鎖(「V[L]」)ドメインおよび可変重鎖(「V[H]」)ドメインがペプチド架橋によりまたはジスルフィド結合により連結された一本鎖Fv断片(「scFv」)からなることができる。同様に、免疫グロブリンは、抗原結合活性を保有する単一のV[H]ドメイン(dAbs)からなることができる。例えば、G. Winter and C. Milstein, Nature 349:295 (1991); R. Glockshuber et al., Biochemistry 29:1362 (1990); およびE. S. Ward et al., Nature 341:544 (1989)を参照されたい。
【００４２】
本発明で用いるのに同様に好ましいのはキメラモノクローナル抗体、好ましくは腫瘍関連表面膜抗原、自己免疫疾患の影響を受ける組織もしくは臓器の表面膜抗原、または病原体感染細胞の抗原に対する特異性を有するキメラ抗体である。この例において用いられる場合、「キメラ抗体」という用語は、組換えDNA技術によって通常調製される、一つの供給源または種由来の可変領域、すなわち結合領域および異なる供給源または種に由来する少なくとも定常領域の部分を含むモノクローナル抗体をいう。
【００４３】
「キメラ抗体」という用語によって包含されるのは「ヒト化抗体」、つまりフレームワークまたは「相補性」決定領域(「CDR」)が親の免疫グロブリンの特異性と比べて異なる特異性の免疫グロブリンのCDRを含むように改変されている抗体という概念である。ある種の態様において、マウスCDRをヒト抗体のフレームワーク領域に結び付けて「ヒト化抗体」を調製する。例えば、L. Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); M. S. Neuberger et al., Nature 314:268 (1985)を参照されたい。
【００４４】
ある種の態様において、完全ヒト抗体またはその断片、好ましくは腫瘍関連表面膜抗原、自己免疫疾患の影響を受ける組織もしくは臓器の表面膜抗原、または病原体感染細胞の抗原に対する特異性を有する完全ヒト抗体が、本発明の組成物および方法において使用される。ファージにおいて構築され細菌において発現されたまたは哺乳類細胞における発現用の哺乳類ウイルス発現ベクターにおいて構築されたヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーからの、およびヒトハイブリドーマ細胞からの、ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスにおける完全ヒト抗体の選択のためにいくつかの方法が記載されている。ワクシニアウイルスにおいて構築されたヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーからの完全ヒト抗体の選択のための方法が2001年10月4日付で公開の、Zauderer, M. et al. WO 01/72995に記載されており、この開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００４５】
ある種の態様において、本発明の標的化CD1d複合体は、抗体の代わりにまたはほかに、特異的な結合分子、例えば、標的細胞の細胞表面に発現された適合するまたは対応するリガンドまたは受容体を有する受容体またはリガンドを含む。これらの態様において、標的化CD1d複合体は、細胞表面マーカーに特異的なリガンドまたは受容体を含む。例としては、HIV感染細胞との相互作用のためCD1dと共役しているCD4、DCサブセットとの相互作用のためCD1dと共役しているケモカインもしくはケモカイン受容体、またはErbB2陽性腫瘍細胞との相互作用のためCD1dと共役しているヘレグリンが挙げられる。
【００４６】
一つの態様において、抗体は腫瘍細胞の細胞表面マーカーに特異的である。別の態様において、抗体はCD1d拘束性NKT細胞の細胞表面マーカーに特異的である。別の態様において、抗体は自己免疫疾患または炎症反応の標的組織の細胞表面マーカーに特異的である。別の態様において、抗体は感染性因子または感染細胞もしくは組織の細胞表面マーカーに特異的である。
【００４７】
別の態様において、抗体はプロフェッショナル抗原提示細胞、例えば、樹状細胞の細胞表面マーカーに特異的である。
【００４８】
本明細書において用いられる「抗原」という用語および「抗原の」という関連用語は、抗体にまたはT細胞受容体に特異的に結合する物質をいう。
【００４９】
本明細書において用いられる「免疫原」という用語および「免疫原の」という関連用語は、動物、好ましくは哺乳類において抗体および/または細胞免疫応答を含め、免疫応答を誘導する能力をいう。免疫原は抗原性でもあるが、「抗原」はそのサイズまたは高次構造のため、必ずしも「免疫原」にはなりえないという可能性がかなり高い。「免疫原組成物」は被験体において免疫反応、例えば、その「免疫原組成物」のなかに含まれる一つまたは複数の抗原を特異的に認識する抗体を誘導する。
【００５０】
「免疫反応」という用語は抗原または免疫原に応じた免疫系の細胞の任意の活性を含むよう意図される。そのような活性は、抗体の産生、細胞障害、リンパ球増殖、サイトカインの放出、炎症、食作用、抗原提示などを含むが、これらに限定されることはない。所与の抗原または免疫原に高度に特異的である免疫反応、例えば、特異的抗体の産生または特異的Tリンパ球の産生は、本明細書において「適応性免疫反応」といわれる。所与の抗原に特異的でない免疫反応、例えば、NKおよびNKT細胞によるサイトカインの放出は、本明細書において「先天性免疫反応」といわれる。免疫反応の例としては抗体反応または細胞反応、例えば、細胞障害性T細胞反応が挙げられる。
【００５１】
「防御的免疫反応」または「治療的免疫反応」という用語は、疾患の症状、副作用または進行を何らかの形で阻止するまたは少なくとも部分的に抑止する免疫原に対する免疫反応をいう。「防御的」とは、疾患にかかっていない被験体動物において免疫反応が誘導され、動物が後にその疾患にかかったまたはかかりやすくなったとしてもこの免疫反応が疾患の症状を軽減する、低減する、緩和するまたは、場合によって完全に阻止することを意味する。「治療的」とは、疾患を有している被験体動物において免疫反応が誘導され、この免疫反応が疾患の症状を軽減する、低減する、緩和するまたは、場合によって完全に取り除くことを意味する。
【００５２】
「免疫反応を調節する」という用語は、所与の免疫反応が組成物または処置により、その組成物または処置なしでの免疫反応に比べて増加する、減少するまたは変化する何らかの方法をいうよう意図される。例えば、抗原に対する免疫反応を高めるアジュバントの使用は、その免疫反応の調節と考えられる。免疫反応の減少、例えば、自己免疫の阻止も調節である。さらに、免疫反応を、例えば、TH2反応からTH1反応に変えることも免疫反応の調節である。
【００５３】
「アネルギー」という用語は、免疫系のある種の細胞が抗原刺激に対して反応しなくなる、特定の種類の免疫調節をいう。一例としては動物への複数回投与によって、その動物のNKT細胞を刺激に反応しなくする、例えば、増殖できなくするまたはサイトカインを産生できなくする遊離α-GalCerの能力であろう。
【００５４】
「アジュバント」という用語は、(1) 特定の抗原に対する免疫反応を変えるもしくは高めるまたは(2) 薬理作用のある物質の効果を高めるもしくは助ける能力を有する任意の材料をいう。ある種の態様において、本発明の可溶性CD1d複合体、例えば、非特異的な可溶性CD1d複合体は、免疫原との投与によりアジュバントとして機能する。他の適当なアジュバントはサイトカインおよび増殖因子; 細菌成分(例えば、内毒素、特に超抗原、外毒素および細胞壁構成成分); アルミニウムに基づく塩; カルシウムに基づく塩; シリカ; ポリヌクレオチド; 類毒素; 血清タンパク質、ウイルスおよびウイルスに由来する材料、毒、毒液、イミダゾキノリン化合物、ポロキサマー、ならびに陽イオン性脂質を含むが、これらに限定されることはない。
【００５５】
多種多様の材料はさまざまな機構を通じてアジュバント活性を有することが示されている。ポリペプチドの発現、抗原性または免疫原性を高めうる化合物はどれも潜在的なアジュバントである。潜在的なアジュバントはミョウバン、ベントナイト、ラテックスおよびアクリル粒子のような不活性担体; TiterMax(登録商標) (ブロック共重合体CRL-8941、スクアレン(代謝性油)および微粒子シリカ安定剤)のようなプルロニックブロック重合体、フロイントアジュバントのようなデポー形成剤、サポニン、リゾレシチン、レチナール、クイルA、リポソームおよびプルロニック重合体製剤のような表面活性物質; 細菌性リポ多糖のようなマクロファージ刺激因子; インスリン、ザイモサン、内毒素およびレバミゾールのような第二経路補体活性化因子; ならびにポロキサマー、ポリ(オキシエチレン)-ポリ(オキシプロピレン)三ブロック共重合体のような非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されることはない。
【００５６】
ある種の態様において、アジュバントはサイトカインである。本発明の組成物は一つまたは複数のサイトカイン、ケモカイン、またはサイトカインおよびケモカインの産生を誘導する化合物を含むことができる。例としては顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、コロニー刺激因子(CSF)、エリスロポエチン(EPO)、インターロイキン2 (IL-2)、インターロイキン-3 (IL-3)、インターロイキン4 (IL-4)、インターロイキン5 (IL-5)、インターロイキン6 (IL-6)、インターロイキン7 (IL-7)、インターロイキン8 (IL-8)、インターロイキン10 (IL-10)、インターロイキン12 (IL-12)、インターロイキン15 (IL-15)、インターロイキン18 (IL-18)、インターフェロンアルファ(IFNα)、インターフェロンベータ(IFNβ)、インターフェロンガンマ(IFNγ)、インターフェロンオメガ(IFNω)、インターフェロンタウ(IFNτ)、因子Iを誘導するインターフェロンガンマ(IGIF)、形質転換増殖因子ベータ(TGF-β)、RANTES (活性時に調節される、発現および恐らく分泌された正常T細胞; regulated upon activation、normal T-cell expressed and presumably secreted)、マクロファージ炎症性タンパク質(例えば、MIP-1アルファおよびMIP-1ベータ)、Leishmania伸長開始因子(Leishmania elongation initiating factor; LEIF)、ならびにFlt-3リガンドが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００５７】
「脊椎動物」という用語は、単数の「脊椎動物」および複数の「脊椎動物」を包含するよう意図され、哺乳類および鳥類、ならびに魚類、爬虫類および両生類を含む。
【００５８】
「哺乳類」という用語は、単数の「哺乳類」および複数の「哺乳類」を包含するよう意図され、ヒト; 類人猿、サル(例えば、ヨザル、リスザル、オマキザル、アカゲザル、アフリカグリーンサル、パタスザル、カニクイザルおよびオナガザル)、オランウータン、ヒヒ、テナガザルならびにチンパンジーのような霊長類; イヌおよびオオカミのようなイヌ科; ネコ、ライオンおよびトラのようなネコ科; ウマ、ロバおよびシマウマのようなウマ科、ウシ、ブタおよびヒツジのような食用動物; シカおよびキリンのような有蹄類; クマのようなクマ科; ならびにウサギ、マウス、フェレット、アザラシ、クジラのような他の動物を含むが、これらに限定されることはない。特に、哺乳類はヒト被験体、食用動物または伴侶動物であってよい。
【００５９】
「鳥類」という用語は、単数の「鳥」および複数の「鳥」を包含するよう意図され、アヒル、ガチョウ、アジサシ、ミズナギドリおよびカモメのような野生水鳥; ならびにシチメンチョウ、ニワトリ、ウズラ、キジ、ガチョウおよびアヒルのような家畜鳥類を含むが、これらに限定されることはない。「鳥類」という用語は、ムクドリおよびセキセイインコのようなスズメ目の鳥類も包含する。
【００６０】
可溶性CD1d複合体
上記のように、本発明の可溶性CD1d複合体を用いて、疾患を予防することも、また疾患を治療的に処置することもできる。疾患に既に苦しんでいる個体では、本発明を用いて動物の免疫系をさらに刺激または調節し、それによってその疾患または障害に関連する症状を低減または除去する。本明細書において定義される場合、「処置」とは、動物において所与の疾患症状の重症度を予防する、治癒する、遅延するもしくは低減するための、および/または疾患に既にかかっており、したがって治療を必要としている動物において特定の期間に渡り疾患の悪化をもたらさないための、本発明の一つまたは複数の組成物の使用をいう。「予防」という用語は、疾患にまだかかっていない動物において免疫をもたらし、それによって、脊椎動物が後にその疾患を発症する傾向があったとしても疾患症状を阻止するまたは低減するための本発明の一つまたは複数の組成物の使用をいう。それゆえ、本発明の方法は、治療的方法または予防的(preventative or prophylactic)方法ということができる。本発明のいかなる組成物も、病因物質に対する完全な免疫を提供したり、または全ての疾患症状を完全に治癒もしくは除去したりする必要はない。本明細書において用いられる場合、「治療的および/または予防的免疫を必要としている動物」とは、ある種の疾患症状の重症度を処置する、すなわち、予防する、治癒する、遅延するもしくは低減する、および/または特定の期間に渡り疾患の悪化をもたらさないことが望ましい個体をいう。
【００６１】
本発明は、CD1d拘束性NKT細胞の活性と相互作用することによってその活性に影響を及ぼす抗原負荷可溶性CD1d分子を含んだ組成物を、動物に投与する段階を含む、免疫反応を調節する方法を提供する。単形性CD1d分子は全種における広範囲のCD1d拘束性NKTの活性化に適している。CD1dサブユニットもβ-2ミクログロブリンサブユニットもともに含む可溶性CD1d分子に、セラミド様糖脂質抗原、例えばα-GalCerを負荷して、可溶性CD1d複合体を作出する。本発明の可溶性CD1d複合体、例えば、非特異的な可溶性CD1d複合体は、例えばがんの処置のため、本発明の組成物のなかで主要なまたは唯一活性な成分であってよい。他の態様において、本発明の可溶性CD1d複合体を特異的な免疫原との組み合わせでアジュバントとして使用し、それによって、可溶性CD1d複合体なしでの免疫原の投与に比べて、その免疫原に対する免疫反応を刺激する、高める、調節する、または別の方法で変えることができる。本発明は、免疫原および可溶性CD1d複合体アジュバントを含む薬学的組成物をさらに包含する。
【００６２】
さらに、本発明の可溶性CD1d複合体をがんおよび感染病のためにのみならず、細胞性免疫反応を下方調節できないことから生じる大規模クラスの自己免疫性および炎症性疾患のためにも診断薬または治療薬として使用することができる。
【００６３】
本発明の方法で用いられる可溶性CD1d複合体は、β2-ミクログロブリンもセラミド様糖脂質抗原も結合するのに十分なCD1dポリペプチドの可溶性断片、β2-ミクログロブリンポリペプチドおよびセラミド様糖脂質抗原、例えば、α-GalCerを含む。セラミド様糖脂質抗原はCD1d分子の抗原結合溝の中に結合されている。
【００６４】
1999年12月16日付で公開された、かつ参照により本明細書に組み入れられるWO 9964597によって教示されるように、アッセンブリを促進するためにおよび融合タンパク質におけるCD1d複合体の安定性を増大するために、クラスI重鎖に対する親和性を増大する突然変異を、β2-ミクログロブリンの中に導入することが可能である。ある種の態様において、可溶性CD1dポリペプチドは、融合タンパク質としてβ2-ミクログロブリンに連結される。ある種の態様において、β2-ミクログロブリンポリペプチドは、そのC末端を介して可溶性CD1dポリペプチドのN末端に連結される。そのような融合構築体は、従来の組換え核酸技術を用いて作出することができる。融合は、直接的であってよく、またはスペーサーを含有してもよい。短いリンカーアミノ酸配列を、CD1dポリペプチドとβ2-ミクログロブリンポリペプチドとの間に挿入することができる。リンカー配列が含まれるなら、この配列は少なくとも3アミノ酸および多くて30アミノ酸を含有することが好ましいであろう。より好ましくは、リンカーは、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、または25アミノ酸長である。一般に、リンカーは、短いグリシン/セリンスペーサーからなるが、任意の公知のアミノ酸が使用されてもよい。当業者に公知のリンカーの例としては(Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:3)および(Gly4Ser)2Gly3AlaSer (SEQ ID NO:4)が挙げられる。
【００６５】
あるいは、CD1dおよびβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、化学的に連結されてもよい。タンパク質を架橋結合できるいくつかの試薬が、当技術分野において公知であり、例示的な実体としては、アジドベンゾイルヒドラジド、N-[4-(p-アジドサリチルアミノ)ブチル]-3'-[2'-ピリジルジチオ]プロピオンアミド)、ビス-スルホスクシンイミジルスベリン酸、ジメチルアジピン酸、ジスクシンイミジル酒石酸、N-γ-マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、N-ヒドロキシスルホスクシンイミジル-4-アジドベンゾエート、N-スクシンイミジル[4-アジドフェニル]-1,3'-ジチオプロピオネート、N-スクシンイミジル[4-ヨードアセチル]アミノベンゾエート、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドおよびスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレートが挙げられる。
【００６６】
ある種の態様において、複数のCD1d複合体が、多価化合物を通じてともに連結される。CD1d複合体は、任意の部位を通じて多価化合物に連結され得る。好ましい態様において、可溶性CD1dポリペプチドが、CD1dカルボキシル末端を通じて多価化合物に連結される。これらの化合物は、典型的には、2つまたはそれ以上のCD1d複合体を含む。化合物は2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のCD1d複合体を含むことができる。
【００６７】
多価化合物の例は、ビオチン化CD1d複合体が結合されるニワトリアビジンもしくはストレプトアビジン(Shin, S.U. et al., J. Immunology 158: 4797-4804 (1997)) (Altman, J. et al, Science 274:94-96 (1996); Boniface, J.J. et al., Immunity 9:459-66 (1998)); またはロイシンジッパー系である。
【００６８】
あるいは、CD1dおよびβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、CysまたはHisのような、化学的に反応性の側鎖を有するアミノ酸残基をコードする配列を含めることによって、遺伝的に改変されてもよい。化学的に反応性の側鎖を有するそのようなアミノ酸を、CD1dおよびβ2-ミクログロブリンポリペプチド上のさまざまな位置に、好ましくは、β2-ミクログロブリンおよびCD1dが相互作用する位置の遠位に、位置付けることができる。適当な側鎖を用いて、二つまたはそれ以上のアッセンブルCD1d複合体を、適当なデンドリマー粒子に化学的に連結することができる。デンドリマーは、その表面にいくつかの異なる官能基のうちのいずれか一つを持ちうる合成化学重合体である(D. Tomalia, Aldrichimica Acta 26:91:101 (1993))。本発明によって用いられる例示的なデンドリマーのなかには、例えば、E9スターバーストポリアミンデンドリマー(E9 starburst polyamine dendrimer)およびE9コームバーストポリアミンデンドリマー(E9 combburst polyamine dendrimer)があり、これらはシステイン残基を連結することができる。CD1dおよび/またはβ2-ミクログロブリンポリペプチドを修飾して、システイン残基をカルボキシル末端に導入する。真核細胞における合成の後、完全なシステイン修飾CD1d複合体がインビトロにおいてアッセンブルされる。システイン修飾されたCD1dおよび/またはβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、CD1d二量体、三量体、および四量体の形成のための二つ、三つ、または四つの修飾リジン残基を有する種々のペプチド骨格上のマレイミド基と反応するであろう。
【００６９】
Cochran, J.R. et al., Immunity 12:241-50 (2000)は、修飾リジン残基に加えてグリシン、セリン、およびグルタミン酸を含有する8〜19残基の柔軟性ペプチド中のリジン側鎖に、二つまたはそれ以上のチオール反応性マレイミド基が連結されている、化学的に合成されたペプチドに基づく架橋試薬の使用について記載している。単離されたCD1dおよび/またはβ2-ミクログロブリンポリペプチドを修飾して、システイン残基をカルボキシル末端に導入する。システイン修飾されたCD1dおよび/またはβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、二量体、三量体、および四量体の形成のための二つ、三つ、または四つの修飾リジン残基を有する種々のペプチド骨格上のマレイミド基と反応する。
【００７０】
高分子CD1d複合体をアッセンブルする別の手段は、GCN4ロイシンジッパー二量体化ドメインにおける規定のアミノ酸置換が、合成ペプチドの高度に安定な三量体および四量体構造の形成を引き起こすという所見(Harbury, P.B. et al., Science 262:1401-7 (1993))を活用することである。例えば、多価CD1d複合体は、修飾されたGCN4ジッパーを可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドのカルボキシル末端に付着することによって、構築される。四価CD1d複合体は、修飾されたGCN4ジッパーモチーフに各々が別々に融合されているCD1d複合体の混合物からアッセンブルすることができよう。
【００７１】
多価化合物との結合のための可溶性CD1d複合体上の付着部位は、天然に存在するものであってよく、または遺伝子操作を通じて導入されてもよい。その部位は特異的結合対の成員、または修飾されて特異的結合対の成員を供与し、そこで相補的な対が非常に多数の特異的結合部位を有するものであろう。相補的な結合成員との結合は、化学反応、エピトープと受容体との結合、またはサブユニット鎖に連結されているハプテンと受容体との結合であってよい。
【００７２】
好ましい態様において、CD1dおよび/またはβ2ミクログロブリンは、修飾酵素に対する認識部位であるアミノ酸配列を含有する。修飾酵素は、BirA、種々のグリコシラーゼ、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ、およびタンパク質キナーゼを含む。修飾酵素によって導入される基、例えば、ビオチン、糖、リン酸基、ファルネシル基などが、相補的な結合対の成員、または相補的な結合対の成員を供与しうる化学的架橋、ビオチン化などのような、さらなる修飾のための特異部位を供与する。
【００７３】
例えば、CD1d分子を遺伝子操作して、ビオチン化のための部位、例えばBirA依存的な部位を含めることができる。多価化合物はアビジンであってよく、または直接的にもしくは間接的にアビジンに連結されてもよい。
【００７４】
本発明において有用な可溶性のCD1dポリペプチドもβ2-ミクログロブリンポリペプチドもともに、任意の哺乳類または鳥類種、例えば、霊長類(特にヒト)、げっ歯類、ウサギ、ウマ科、ウシ科、イヌ科、ネコ科などにとって自家性でありうる。β2-ミクログロブリンは、典型的には、インビボにおいて炎症性ではない。しかしながら、異種免疫反応のリスクを低減するように、処置されるのと同じ種に由来するβ2-ミクログロブリンを利用することが好ましい。
【００７５】
可溶性CD1dポリペプチド
ある種の態様において、β2-ミクログロブリンと結合し、かつ抗原、例えばセラミド様糖脂質を結合する非特異的なCD1d複合体は、可溶性CD1dポリペプチドおよびポリペプチド断片を含む。CD1d分子は、β2-ミクログロブリンと結合し、かつ皮質胸腺細胞、B細胞、樹状細胞、皮膚中のランゲルハンス細胞、および胃腸上皮細胞の表面に発現される、主要組織適合性複合体(MN+HC)抗原様の糖タンパク質のファミリーの一員である。CD1dは、樹状細胞または胃腸管の上皮細胞に主に発現される。CD1ファミリーの成員は、抗原としての糖脂質の提示に関与している。特に、CD1dは、異なるTリンパ球サブセット、すなわち、IL-4およびINF-γを分泌するNK1 T細胞の活性化を通じて、サイトカインの正常な状態(tone)を調節する。CD1糖タンパク質の全てが、クローニングされ解析されている。CD1糖タンパク質、および特にCD1dの詳細な論議の場合、例えば、Balk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:252-256 (1989); Kojo et al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 276:107-111 (2000); Kojo et al., J. Rheumatology 30:2524-2528 (2003); Kang and Cresswell, Nature Immunology 5:175-181 (2004); Im et al., J. Biol. Chem. 279:299-310 (2004); Dutronc and Porcelli, Tissue Antigens 60:337-353 (2002)を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００７６】
CD1dのドメイン
完全長のCD1dはシグナル配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインからなる。完全長のCD1dポリペプチドは、長さが335アミノ酸である。
【００７７】
以下のポリペプチド配列は、ヒトCD1d配列として報告されており、Genbankでのアクセッション番号NP_001757を有する。
【００７８】
完全長のヒトCD1d (SEQ ID NO:1):
2010519255.tif 000002
【００７９】
ヒトCD1dの変異体は、以下の突然変異: T64Sを有するポリペプチドを含むが、これに限定されることはない。
【００８０】
マウスCD1dの配列は、以下のアクセッション番号: NP_031665でGenbankにて見出すことができる。ラットCD1dの配列は、以下のアクセッション番号: NP_058775でGenbankにて見出すことができる。ヒツジCD1dの配列は、以下のアクセッション番号: O62848およびQ29422でGenbankにて見出すことができる。チンパンジーCD1dの配列は、以下のアクセッション番号: NP_001065272でGenbankにて見出すことができる。ウサギCD1dの配列は、以下のアクセッション番号: P23043でGenbankにて見出すことができる。上記のGenbankアクセッション番号の全てが、参照により本明細書に組み入れられる。
【００８１】
GenbankにおいてマウスCD1d: NP_031665としてアクセッション番号が報告されている。
【００８２】
CD1dの細胞外ドメインは、三つのドメイン: α1ドメイン、α2ドメイン、およびα3ドメインからなる。α1およびα2ドメインは、抗原結合部位を含む。α3ドメインは、β2-ミクログロブリン結合部位を含む。
【００８３】
本明細書において用いられるCD1dドメインの指定は、以下のように定義される。
【００８４】
(表１) CD1dドメイン
2010519255.tif 000003
【００８５】
当業者なら理解しているように、上記ドメインの開始および終了残基は、使われるコンピュータモデリングプログラムまたはドメインを判定するのに使われる方法に応じて変わりうる。
【００８６】
本発明のいくつかの態様では、可溶性CD1dポリペプチドまたはポリペプチド断片を含むCD1d複合体、例えば、非特異的なCD1d複合体を提供する。特に、本発明の可溶性CD1dポリペプチドは、可溶性CD1dポリペプチドの断片、変異体、またはその誘導体を含む。上記の表1は、CD1dポリペプチドの各種ドメインについて記載している。本発明の可溶性CD1dポリペプチドは一般に、α1、α2、およびα3ドメインを含め、ポリペプチドの細胞外ドメインの一部または全部を含む。可溶性CD1dポリペプチドは一般に、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの一部または全部を欠く。当業者なら理解しているように、CD1dの全細胞外ドメインは、細胞外ドメインポリペプチドのC末端またはN末端のいずれかに、追加のまたは少数のアミノ酸を含むことができる。
【００８７】
本発明の方法で用いる可溶性ヒトCD1dポリペプチドは、最大で20個までのアミノ酸置換を除いて、参照アミノ酸配列に同一のアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になる、またはそのアミノ酸配列からなる、可溶性CD1dポリペプチドを含むが、これに限定されることはなく、前記参照アミノ酸配列がSEQ ID NO:1のアミノ酸a〜295、SEQ ID NO:1のアミノ酸21〜b、およびSEQ ID NO:1のa〜bからなる群より選択され、このaは1〜100の任意の整数であり、このbは201〜301の任意の整数であり、前記可溶性CD1dポリペプチドはβ2-ミクログロブリンと結合し、かつセラミド様糖脂質抗原を結合する。一つの態様において、可溶性CD1dポリペプチドは、SEQ ID NO:1のアミノ酸21〜295を含む。別の態様において、可溶性CD1dポリペプチドはSEQ ID NO:1のアミノ酸20〜295、20〜296、20〜297、20〜298、20〜299、20〜300および20〜301を含む。
【００８８】
「参照アミノ酸配列」とは、任意のアミノ酸置換の導入されていない特定の配列を意味する。当業者なら理解しているように、置換がない場合、本発明の「単離されたポリペプチド」は、参照アミノ酸配列に同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８９】
本明細書に記載する可溶性CD1dポリペプチドは、置換、挿入、または欠失のような種々の変化を持ちうる。ポリペプチドにおいて置換されうる例示的なアミノ酸は、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香性側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。
【００９０】
本明細書に記載するポリペプチドおよび参照ポリペプチドに、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%または95%同一の可溶性CD1dポリペプチドの対応する断片も企図される。
【００９１】
当技術分野において公知のように、二つのポリペプチド間の「配列同一性」は一つのポリペプチドのアミノ酸配列をもう一つのポリペプチドの配列と比較することによって決定される。本明細書において論じられる場合、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドに対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%または95%同一であるかどうかは、以下に限定されないが、BESTFITプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)のような当技術分野において公知の方法およびコンピュータプログラム/ソフトウェアを用いて決定することができる。BESTFITでは、二つの配列間で最良の相同性セグメントを見つけるため、Smith and Watermanの局所相同性アルゴリズム、Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)を用いる。BESTFITまたはその他任意の配列アライメントプログラムを用いて、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列に対して95%同一であるかどうかを判定する場合、パラメータは、もちろん、同一性の割合が参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算されるように、および参照配列中のアミノ酸の総数の最大で5%までの相同性のギャップが許容されるように設定される。
【００９２】
本発明の方法において、本発明の可溶性CD1dポリペプチドまたはポリペプチド断片は、予め形成されたポリペプチドとして直接的に投与することができる。しかしながら、ある種の態様において、可溶性CD1dポリペプチドまたはその断片はβ2-ミクログロブリンと結合しており、セラミド様糖脂質抗原に結合されている。
【００９３】
β2-ミクログロブリンポリペプチド
ある種の態様において、本発明のCD1d複合体は、可溶性CD1dポリペプチドまたはポリペプチド断片と結合する、β2-ミクログロブリンポリペプチドを含む。β2-ミクログロブリンは全ての有核細胞の表面に主要組織適合性複合体(MHC)クラスI分子の細胞外小サブユニットとして存在し、免疫反応に積極的に関与している。β2-ミクログロブリンの詳細な論議の場合、例えば、Peterson et al., Adv. Cancer Res. 24:115-163 (1977); Sege et al., Biochemistry 20:4523-4530 (1981)を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００９４】
β2-ミクログロブリンドメイン
完全長のβ2-ミクログロブリンは、シグナル配列およびIg様ドメインを含む分泌タンパク質である。完全長のCD1dポリペプチドは長さが119アミノ酸である。
【００９５】
以下のポリペプチド配列はヒトβ2-ミクログロブリン配列として報告されており、Genbankアクセッション番号NP_004039を有する。
【００９６】
完全長のヒトβ2-ミクログロブリン(SEQ ID NO:2):
2010519255.tif 000004
【００９７】
ヒトβ2-ミクログロブリンの変異体は、以下の突然変異: A20G、P52Q、S55VおよびY86YSの一つまたは複数を有するポリペプチドを含むが、これらに限定されることはない。
【００９８】
マウスβ2-ミクログロブリンの配列は以下のアクセッション番号: NP_033865でGenbankにて見出すことができる。ブタβ2-ミクログロブリンの配列は以下のアクセッション番号: NP_999143でGenbankにて見出すことができる。ラットβ2-ミクログロブリンの配列は以下のアクセッション番号: NP_036644でGenbankにて見出すことができる。チンパンジーβ2-ミクログロブリンの配列は以下のアクセッション番号: NP_001009066でGenbankにて見出すことができる。ウサギβ2-ミクログロブリンの配列は以下のアクセッション番号: P01885でGenbankにて見出すことができる。ヒツジβ2-ミクログロブリンの配列は以下のアクセッション番号: NP_001009284でGenbankにて見出すことができる。
【００９９】
本明細書において用いられるβ2-ミクログロブリンドメインの指定は、表2にあるように定義される。
【０１００】
(表２) β2-ミクログロブリンドメイン
2010519255.tif 000005
【０１０１】
当業者なら理解しているように、上記ドメインの開始および終了残基は、使われるコンピュータモデリングプログラムまたはドメインを判定するのに使われる方法に応じて変わりうる。
【０１０２】
本発明のいくつかの態様ではβ2-ミクログロブリンポリペプチドまたはポリペプチド断片を含むCD1d複合体、例えば、非特異的なCD1d複合体を提供する。本発明のβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、β2-ミクログロブリンポリペプチドの断片、変異体、またはその誘導体を含む。上記の表2はβ2-ミクログロブリンポリペプチドの各種ドメインについて記載している。本発明のβ2-ミクログロブリンポリペプチドは一般に、ポリペプチドの分泌部分の一部または全部を含む。
【０１０３】
本発明の方法で用いるヒトβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、最大で20個までのアミノ酸置換を除いて、参照アミノ酸配列に同一のアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になるβ2またはそのアミノ酸配列からなるβ2-ミクログロブリンポリペプチドを含むが、これに限定されることはなく、前記参照アミノ酸配列がSEQ ID NO:2のアミノ酸a〜119、SEQ ID NO:2のアミノ酸21〜b、およびSEQ ID NO:2のa〜bからなる群より選択され、このaは15〜25の任意の整数であり、このbは100〜119の任意の整数であり、前記β2-ミクログロブリンポリペプチドがCD1dと結合し、かつセラミド様糖脂質抗原の結合を支持する。一つの態様において、β2-ミクログロブリンポリペプチドは、SEQ ID NO:2のアミノ酸21〜113を含む。一つの態様において、β2-ミクログロブリンポリペプチドはSEQ ID NO:2のアミノ酸21〜119を含む。
【０１０４】
「参照アミノ酸配列」とは、任意のアミノ酸置換の導入されていない特定の配列を意味する。当業者なら理解しているように、置換がない場合、本発明の「単離されたポリペプチド」は、参照アミノ酸配列に同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
本明細書に記載するβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、置換、挿入、または欠失のような種々の変化を持ちうる。ポリペプチドにおいて置換されうる例示的なアミノ酸は、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香性側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。
【０１０６】
本明細書に記載するポリペプチドおよび参照ポリペプチドに、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、または95%同一のβ2-ミクログロブリンポリペプチドの対応する断片も企図される。
【０１０７】
本発明の方法において、本発明のβ2-ミクログロブリンポリペプチドまたはポリペプチド断片は、典型的には、予め形成されたポリペプチドとして直接的に投与される。ある種の態様において、β2-ミクログロブリンポリペプチドまたはその断片は、可溶性CD1dポリペプチドと結合されている。
【０１０８】
可溶性CD1dポリペプチドは、ポリペプチドが水溶液、例えば、生理溶液の中で依然として可溶性のままでありうるという条件で、膜貫通ドメインのアミノ酸の一部または全部を含有することができる。膜貫通ドメインの、多くて約20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1個のアミノ酸が含まれる、および好ましくは膜貫通ドメインのアミノ酸が含まれないことが好ましいであろう。
【０１０９】
さらに、β2-ミクログロブリンの断片も本発明において有用である。本発明において有用であるには、β2-ミクログロブリンの断片は、CD1d分子と結合する能力を保持しなければならないであろう。β2-ミクログロブリンの多くて約20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1個のアミノ酸が欠失される、および好ましくはβ2-ミクログロブリンのアミノ酸が欠失されないことが好ましいであろう。
【０１１０】
可溶性CD1dポリペプチドまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドのいずれかのポリペプチド末端に、少数のアミノ酸、通常は多くて20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1個のアミノ酸を導入することが望ましい場合がある。アミノ酸の欠失または挿入は、通常、構築の必要性、つまり好都合な制限部位の供与、プロセッシングシグナルの付加、操作の簡便性、発現レベルの改善などの結果としてであろう。さらに、同じような理由から一つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換すること、通常は、いずれか一つのドメインにおいて約10、9、8、7、6、5、4、3、2または1個を超えるアミノ酸を置換しないことが望ましい場合もある。
【０１１１】
可溶性CD1dポリペプチドおよびβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、別々に産生され、結合して安定なヘテロ二量体複合体を形成することが可能とされてもよく、またはこれらのサブユニットの両方とも単一の細胞中で発現されてもよい。
【０１１２】
本発明の方法および組成物で用いられる可溶性CD1dポリペプチドおよびβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、当業者に公知のさまざまな技術を用いて非常に多数の細胞、例えば、形質転換細胞株JY、BM92、WIN、MOCおよびMG、ならびにCHOから単離することができる。
【０１１３】
さらに、さまざまな種由来のCD1dおよびβ2-ミクログロブリンのアミノ酸配列が公知であり、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがクローニングされており、それゆえ、それらのポリペプチドを組換え法によって産生することができる。CD1dおよびβ2ミクログロブリン鎖またはその融合産物のコード領域を発現ベクターに挿入し、大腸菌(E. coli)、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞、または他の適当な細胞のような適切な宿主において別々に発現させ、得られた組換えタンパク質をセラミド様糖脂質抗原(例えばα-GalCer)の存在下で組み換える。
【０１１４】
融合タンパク質、修飾タンパク質、および共役ポリペプチド
本発明のいくつかの態様は、融合タンパク質を形成するために異種ポリペプチド成分に融合された可溶性CD1dポリペプチドおよび/またはβ2-ミクログロブリンポリペプチドの使用を含む。そのような融合タンパク質を用いて、種々の目的、例えば血清中半減期の増大、生体利用性の改善、特定の臓器または組織型へのインビボ標的化、組換え発現効率の改善、宿主細胞分泌の改善、精製の簡便性、およびいっそう高い結合活性を達成することができる。達成される目的に応じて、異種成分は、不活性でも生物学的に活性でもよい。同様に、異種成分は、インビトロもしくはインビボにおいて、本発明の可溶性CD1dポリペプチドもしくはβ2-ミクログロブリンポリペプチドに安定的に融合されるように、または切断可能であるように、選択されてもよい。これらの他の目的を達成するための異種成分は、当技術分野において公知である。
【０１１５】
融合タンパク質の発現に代わる手段として、選択した異種成分を予め形成し、本発明の可溶性CD1dポリペプチドまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドに化学的に共役してもよい。ほとんどの場合、選択した異種成分は、可溶性CD1dポリペプチドまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドに融合されるか共役されるかにかかわらず、同じように機能するであろう。それゆえ、異種アミノ酸配列に関する以下の論議において、特に断りのない限り、異種配列は、融合タンパク質の形態でまたは化学的共役体として、可溶性CD1dポリペプチドまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドに連結されうることが理解されるべきである。
【０１１６】
本明細書において開示される処置方法で用いられる可溶性CD1dポリペプチドまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、すなわち、可溶性CD1dポリペプチドおよびβ2-ミクログロブリンポリペプチドが結合し抗原を結合して、CD1d複合体、例えば非特異的なCD1d複合体を形成することが、共有結合により阻止されないような、任意のタイプの分子の共有結合によって修飾される誘導体を含む。限定するものではないが、例えば、本発明の可溶性CD1dポリペプチドおよび/またはβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスフィル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との結合などによって、修飾することができる。多数の化学的修飾のどれも、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない公知の技術によって、行うことができる。さらに、誘導体は一つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
【０１１７】
本明細書において開示される処置方法で用いられる可溶性CD1dポリペプチドまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチド同配体によって、相互に連結されたアミノ酸から構成され得、遺伝子によってコードされる20種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有してもよい。可溶性CD1dポリペプチドおよび/またはβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、翻訳後プロセッシングのような自然過程によって、または当技術分野において周知である化学的修飾技術によって、修飾されてもよい。そのような修飾は、基本的なテキストにおよびさらに詳しい研究論文に、ならびに膨大な研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端もしくはカルボキシル末端を含む可溶性CD1dポリペプチドもしくはβ2-ミクログロブリンポリペプチドのどこで行われてもよく、または糖質のような成分にて行われてもよい。所与の可溶性CD1dポリペプチドまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドにおいて、いくつかの部位に同一のまたは種々の程度で、同じタイプの修飾が存在してもよいことを理解されたい。また、所与の可溶性CD1dポリペプチドまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含有してもよい。可溶性CD1dポリペプチドまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として、分枝していてもよく、それらは枝分かれの有無にかかわらず、環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝環状の可溶性CD1dポリペプチドまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、翻訳後の自然過程に起因してもよく、または合成法によって作出されてもよい。修飾は、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化のような、転移RNAを介したタンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化を含む(例えば、Proteins-Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)を参照のこと)。
【０１１８】
可溶性CD1dポリペプチドまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドが融合される異種ポリペプチドは、治療的に有用であり、または可溶性CD1dポリペプチドおよび/もしくはβ2-ミクログロブリンポリペプチドを標的化するのに有用でありうる。可溶性CD1d融合ポリペプチドおよび/またはβ2-ミクログロブリン融合タンパク質を用いて、種々の目的、例えば血清中半減期の増大、生体利用性の改善、特定の臓器または組織型へのインビボ標的化、組換え発現効率の改善、宿主細胞分泌の改善、精製の簡便性、およびいっそう高い結合活性を達成することができる。達成される目的に応じて、異種成分は、不活性でも生物学的に活性でもよい。同様に、異種成分は、インビトロもしくはインビボにおいて、可溶性CD1dポリペプチドもしくはβ2-ミクログロブリンポリペプチドに安定的に融合されるように、または切断可能であるように選択されてもよい。これらの種々の目的を達成するための異種成分は、当技術分野において公知である。
【０１１９】
治療用ポリペプチドのインビボ安定性、すなわち、血清中半減期を増大するためのさまざまな異種アミノ酸配列、すなわち、ポリペプチド成分または「担体」が公知である。例としては、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)またはヒト血清アルブミン(HSA)のような血清アルブミンが挙げられる。
【０１２０】
本質的に完全長のヒト血清アルブミン(HSA)またはHSA断片は、その長い半減期、広範なインビボ分布、および酵素的または免疫学的機能の欠如により、異種成分としてよく使われる。Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1904-08 (1992)およびSyed et al., Blood 89:3243-52 (1997)において教示されているものなどの方法および材料の適用により、HSAを用いて、CD1d複合体、例えば本発明の非特異的なCD1d複合体の薬理学的活性を示す融合タンパク質またはポリペプチド共役体を形成することができ、これは一方で著しく増大した、例えば10倍〜100倍高いインビボ安定性を示す。HSAのC末端は、可溶性CD1dポリペプチドまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチド成分のN末端に融合することができる。HSAは天然に分泌されるタンパク質であるので、融合タンパク質が真核生物の、例えば哺乳類の発現系において産生される場合、HSAシグナル配列を活用して細胞培地への融合タンパク質の分泌を得ることができる。
【０１２１】
本発明のいくつかの態様では、ヒンジ領域およびFc領域、すなわち、免疫グロブリン重鎖定常領域のC末端部分に融合された可溶性CD1dポリペプチドまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチド成分を利用する。
【０１２２】
可溶性CD1dポリペプチド-Fc融合体またはβ2-ミクログロブリンポリペプチド-Fc融合体の潜在的利点は、溶解性、インビボ安定性、および多価性、例えば二量体化を含む。使用されるFc領域は、IgA、IgD、またはIgG Fc領域(ヒンジ領域-CH2-CH3)であってよい。あるいはそれは、IgEまたはIgM Fc領域(ヒンジ領域-CH2-CH3-CH4)であってもよい。IgG Fc領域、例えばIgG1 Fc領域またはIgG4 Fc領域が一般に使用される。Fc融合体をコードするDNAを構築および発現するための材料および方法は、当技術分野において公知であり、過度の実験なしに融合体を得るように適用することができる。本発明のいくつかの態様では、Caponら、米国特許第5,428,130号および同第5,565,335号に記載されているものなどの、融合タンパク質を利用する。
【０１２３】
完全にインタクトな野生型Fc領域は、本発明の方法において使用されるFc融合タンパク質において通常は不必要であり、かつ望ましくないエフェクタ機能を示す。それゆえ典型的には、分泌カセットの構築の過程で、ある種の結合部位をFc領域から欠失させる。例えば、軽鎖との同時発現は不必要であるため、重鎖結合タンパク質Bip (Hendershot et al., Immunol. Today 8:111-14 (1987))の結合部位をIgEのFc領域のCH2ドメインから欠失させることにより、この部位が免疫融合(immunofusion)の効率的な分泌を妨げないようにする。IgMに存在するものなどの、膜貫通ドメイン配列も一般に欠失される。
【０１２４】
IgG1 Fc領域は最もよく使われる。あるいは、免疫グロブリンガンマの他のサブクラス(ガンマ-2、ガンマ-3、およびガンマ-4)のFc領域が、分泌カセット中で使われてもよい。免疫グロブリンガンマ-1のIgG1 Fc領域は、分泌カセット中で一般に使われ、少なくともヒンジ領域の部分、CH2領域およびCH3領域を含む。いくつかの態様において、免疫グロブリンガンマ-1のFc領域はCH2欠失Fcであり、これはヒンジ領域の部分およびCH3領域を含むが、CH2領域を含まない。CH2欠失Fcは、Gillies et al., Hum. Antibod. Hybridomas 1:47 (1990)によって記載されている。いくつかの態様において、IgA、IgD、IgE、またはIgMのうちの一つのFc領域が使われる。
【０１２５】
可溶性CD1dポリペプチド-Fc融合タンパク質またはβ2-ミクログロブリンポリペプチド成分-Fc融合タンパク質は、いくつかの異なる立体配置で構築することができる。一つの立体配置では、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチド成分のC末端を、Fcヒンジ成分のN末端に直接融合する。わずかに異なる立体配置では、短いポリペプチド、例えば2〜10アミノ酸を、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチド成分のN末端とFc成分のC末端との間で、融合体に組み入れる。別の立体配置では、短いポリペプチドを、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチド成分のC末端とFc成分のN末端との間で、融合体に組み入れる。そのようなリンカーは配座柔軟性をもたらし、これは状況によって生物学的活性を改善することができる。ヒンジ領域の十分な部分がFc成分中に保持されていれば、可溶性CD1dポリペプチド-Fc融合体またはβ2-ミクログロブリンポリペプチド成分-Fc融合体は二量体化し、したがって二価の分子を形成するであろう。単量体Fc融合体の均質な集団は、単一特異的な二価の二量体をもたらすであろう。異なる特異性を各々が有する二つの単量体Fc融合体の混合物は、二重特異的な二価の二量体をもたらすであろう。
【０１２６】
本発明の可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、ポリペプチドタグに融合することができる。本明細書において用いられる「ポリペプチドタグ」という用語は、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドに付着、接続、または連結でき、かつ可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドを同定、精製、濃縮、または単離するために使用できるアミノ酸の任意の配列を意味するよう意図される。可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドへのポリペプチドタグの付着は、例えば、(a) ポリペプチドタグをコードする核酸配列と、(b) 可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドをコードする核酸配列とを含んだ核酸分子を構築することによって行うことができる。例示的なポリペプチドタグは、例えば、翻訳後に修飾され得るアミノ酸配列、例えばビオチニル化されるアミノ酸配列を含む。他の例示的なポリペプチドタグは、例えば、抗体(もしくはその断片)または他の特異的結合試薬により認識されるおよび/または結合され得るアミノ酸配列を含む。抗体(もしくはその断片)または他の特異的結合試薬により認識され得るポリペプチドタグは、例えば、当技術分野において「エピトープタグ」として公知であるものを含む。エピトープタグは、天然または人工のエピトープタグであってよい。天然および人工のエピトープタグは、例えば、FLAG、Strep、またはポリヒスチジンペプチドのような人工のエピトープを含め、当技術分野において公知である。FLAGペプチドは、配列
2010519255.tif 000006
を含む。Strepエピトープは、配列
2010519255.tif 000007
を有する。VSV-Gエピトープを使用することもでき、VSV-Gエピトープは、配列
2010519255.tif 000008
を有する。別の人工エピトープは、6個のヒスチジン残基を有するポリHis配列
2010519255.tif 000009
である。天然に存在するエピトープは、モノクローナル抗体12CA5によって認識されるインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)配列
2010519255.tif 000010
(Murray et al., Anal. Biochem. 229:170-179 (1995))、およびモノクローナル抗体9E10によって認識されるヒトc-myc (Myc)由来の11個のアミノ酸配列
2010519255.tif 000011
を含む。別の有用なエピトープは、モノクローナル抗体YL 1/2によって認識されるトリペプチドGlu-Glu-Pheである。(Stammers et al. FEBS Lett. 283:298-302 (1991))。
【０１２７】
ある種の態様において、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドおよびポリペプチドタグは、連結アミノ酸配列を介して接続されてもよい。本明細書において用いられる場合、「連結アミノ酸配列」とは、一つまたは複数のプロテアーゼによって認識および/または切断され得るアミノ酸配列であってよい。一つまたは複数のプロテアーゼによって認識および/または切断され得るアミノ酸配列は、当技術分野において公知である。例示的なアミノ酸配列としては、以下のプロテアーゼ: 第VIIa因子、第IXa因子、第Xa因子、APC、t-PA、u-PA、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、ペプシン、カテプシンB、H、L、S、D、カテプシンG、レニン、アンギオテンシン変換酵素、マトリックスメタロプロテアーゼ(コラゲナーゼ、ストロメライシン、ゼラチナーゼ)、マクロファージエラスターゼ、CirおよびCisによって認識されるものが挙げられるが、これらに限定されることはない。上記のプロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列は、当技術分野において公知である。ある種のプロテアーゼによって認識される例示的な配列は、例えば、米国特許第5,811,252号に見出すことができる。
【０１２８】
ポリペプチドタグは、市販のクロマトグラフィー媒体による精製を容易にすることができる。
【０１２９】
適当な融合パートナーのアミノおよびカルボキシ末端に、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチド成分を融合することにより、本発明の可溶性CD1dもしくはβ2-ミクログロブリンポリペプチドまたはポリペプチド断片の二価または四価の形態を得ることができる。例えば、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチド成分を、Ig成分のアミノおよびカルボキシ末端に融合して、二つの可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチド成分を含有する二価の単量体ポリペプチドを作出することができる。Ig成分により、これらの単量体のうちの二つが二量体化することで、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドの四価の形態が得られる。そのような多価の形態を用いて、標的に対する結合親和性の増大を達成することができる。本発明の可溶性CD1dもしくはβ2-ミクログロブリンポリペプチドまたはポリペプチド断片の多価の形態も、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチド成分を直列に配置して、単独で利用されてもまたはIgもしくはHSAのような融合パートナーに融合されてもよいコンカタマーを形成させることにより、得ることができる。
【０１３０】
共役重合体(ポリペプチド以外)
本発明のいくつかの態様には、一つまたは複数の重合体が可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドに共役されている(共有結合的に連結されている)、本発明の可溶性CD1dもしくはβ2-ミクログロブリンポリペプチドまたはポリペプチド断片が含まれる。そのような共役に適した重合体の例としては、ポリペプチド(上記)、糖重合体およびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。必須ではないが、典型的には、溶解性、安定性、または生体利用性の一つまたは複数を改善する目的で、重合体が、本発明の可溶性CD1dもしくはβ2-ミクログロブリンポリペプチドまたはポリペプチド断片に共役される。
【０１３１】
本発明の可溶性CD1dもしくはβ2-ミクログロブリンポリペプチドまたはポリペプチド断片への共役のために一般的に使われる重合体のクラスは、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール(PEG)が最もよく使われる。PEG成分、例えば、1、2、3、4、または5個のPEG重合体を、各可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドに共役し、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチド単独に比べて、血清中半減期を増大することができる。PEG成分は非抗原性であり、本質的には生物学的に不活性である。本発明の実践において使用されるPEG成分は、分枝していても分枝していなくてもよい。
【０１３２】
可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドに付着されるPEG成分の数および個々のPEG鎖の分子量は変化してよい。一般的に、重合体の分子量が高くなるほど、ポリペプチドに付着される重合体鎖は少なくなる。通常、可溶性CD1dもしくはβ2-ミクログロブリンポリペプチドまたはポリペプチド断片に付着される全重合体質量は、20 kDa〜40 kDaである。したがって、一本の重合体鎖が付着されるなら、鎖の分子量は一般に20〜40 kDaである。二本の鎖が付着されるなら、各鎖の分子量は一般に10〜20 kDaである。三本の鎖が付着されるなら、分子量は一般に7〜14 kDaである。
【０１３３】
重合体、例えばPEGは、ポリペプチド上に曝露される任意の適当な反応基を通じて、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドに連結することができる。曝露される反応基は、例えば、N末端アミノ基もしくは内部リジン残基のイプシロンアミノ基、またはその両方であってよい。活性化された重合体は、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチド上の任意の遊離アミノ基の位置で反応し、共有結合的に連結しうる。可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドの遊離カルボン酸基、適当に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化された糖質成分およびメルカプト基(利用可能なら)を、重合体の付着のための反応基として使用することもできる。
【０１３４】
共役反応では、ポリペプチド濃度に応じて、ポリペプチド1モルあたり活性化重合体約1.0〜約10モルが、典型的に利用される。通常、選択される比は、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチド成分の所望の薬理学的活性を損なう可能性のある副反応(非特異的である場合が多い)を最小限にしながらも、共役反応を最大限にするバランスを表す。好ましくは、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドの(例えば、本明細書において記載のまたは当技術分野において公知のアッセイ法のいずれかで実証されているように)生物学的活性の少なくとも50%が保持され、最も好ましくはほぼ100%が保持される。
【０１３５】
重合体は、従来の化学的性質を用いて、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドに共役することができる。例えば、ポリアルキレングリコール成分を、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドのリジンイプシロンアミノ基にカップリングすることができる。リジン側鎖への連結は、PEGコハク酸スクシンイミジル(SS-PEG)およびプロピオン酸スクシンイミジル(SPA-PEG)のようなN-ヒドロキシルスクシンイミド(NHS)活性エステルを用いて行うことができる。適当なポリアルキレングリコール成分は、例えば、カルボキシメチル-NHSおよびノルロイシン-NHS、SCを含む。これらの試薬は市販されている。さらなるアミン反応性PEGリンカーを、スクシンイミジル成分の代わりに用いることができる。これらは、例えばイソチオシアネート、ニトロフェニルカーボネート(PNP)、エポキシド、ベンゾトリアゾールカーボネート、SC-PEG、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール、およびPNPカーボネートを含む。条件は、通常、反応の選択性および程度を最大限とするように最適化される。そのような反応条件最適化は当業者の知る通りである。
【０１３６】
PEG化は、当技術分野において公知のPEG化反応のいずれかによって行うことができる。例えば、Focus on Growth Factors, 3: 4-10, 1992ならびに欧州特許出願EP 0 154 316およびEP 0 401 384を参照されたい。PEG化は、反応性のポリエチレングリコール分子(または類似した反応性の水溶性重合体)とのアシル化反応またはアルキル化反応を用いて行うことができる。
【０１３７】
アシル化によるPEG化では一般に、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体を反応させることを伴う。任意の反応性PEG分子を、PEG化において利用することができる。N-ヒドロキシルスクシンイミド(NHS)にエステル化されたPEGが、よく使われる活性化PEGエステルである。本明細書において用いられる場合、「アシル化」とは、非限定的に、治療用タンパク質とPEGのような水溶性重合体の間の以下のタイプの連結部: アミド、カーバメート、ウレタンなどを含む。例えば、Bioconjugate Chem. 5: 133-140, 1994を参照されたい。反応パラメータは一般に、可溶性CD1dまたはB2-ミクログロブリンポリペプチドを損傷または不活性化しうる温度、溶媒、およびpH条件を回避するように選択される。
【０１３８】
一般的に、接続する連結部はアミドであり、典型的には、得られる生成物の少なくとも95%が、モノ-、ジ-、またはトリ-PEG化される。しかしながら、より高度なPEG化を有する物質種のなかには、使われる特定の反応条件に応じた量で形成されるものもある。任意で、精製PEG化物質種は、混合物、特に未反応の物質種から、例えば透析、塩析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性交換クロマトグラフィー、および電気泳動を含む、従来の精製方法によって分離されてもよい。
【０１３９】
アルキル化によるPEG化では一般に、還元剤の存在下においてPEGの末端アルデヒド誘導体を、本発明の可溶性CD1dもしくはβ2-ミクログロブリンポリペプチドまたはポリペプチド断片と反応させることを伴う。さらに、PEG化を、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドのN末端アミノ基でのみ実質的に支持するように、すなわちモノ-PEG化タンパク質を支持するように、反応条件を操作することもできる。モノ-PEG化またはポリ-PEG化のどちらの場合でも、PEG基は典型的に、-CH2-NH-基を介してタンパク質に付着される。-CH2-基に特に関連して、このタイプの連結部は「アルキル」連結部として公知である。
【０１４０】
N末端標的化モノ-PEG化生成物を作出するための還元的アルキル化を介した誘導体化では、誘導体化に利用可能な異なるタイプの第一級アミノ基の異なる反応性(リジン vs N末端)を利用する。反応は、リジン残基のイプシロンアミノ基とタンパク質のN末端アミノ基のそれとの間のpKa差を利用することを可能にするpHで行われる。そのような選択的誘導体化により、アルデヒドのような、反応基を含有する水溶性重合体のタンパク質への付着が制御され: 重合体との共役は、タンパク質のN末端で優先的に起こり、リジン側鎖アミノ基のような、他の反応基の有意な修飾は起こらない。
【０１４１】
アシル化およびアルキル化の両手法において使われる重合体分子は、水溶性重合体の中から選択される。選択される重合体は、典型的には、重合度が本発明の方法において規定されている通りに制御され得るように、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドのような、単一の反応基を有するように修飾される。例示的な反応性PEGアルデヒドは、水安定性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノC1〜C10アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である(例えば、Harrisら、米国特許第5,252,714号を参照のこと)。重合体は分枝していても分枝していなくてもよい。アシル化反応の場合、選択される重合体は、典型的には、単一の反応性エステル基を有する。還元的アルキル化の場合、選択される重合体は、典型的には、単一の反応性アルデヒド基を有する。一般的に、水溶性重合体は、これらが通常は哺乳類組換え発現系によっていっそう好都合に作出されるので、天然に存在するグリコシル残基からは選択されないであろう。
【０１４２】
本発明のPEG化可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドを調製するための方法は一般に、(a) 分子が一つまたは複数のPEG基に付着されるようになる条件下で、本発明の可溶性CD1dもしくはB2-ミクログロブリンポリペプチドまたはポリペプチド断片を、ポリエチレングリコール(PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体のような)と反応させる段階と、(b) 反応生成物を得る段階とを含む。一般的に、アシル化反応に最適な反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて個別に決定されるであろう。例えば、PEGのタンパク質に対する比が大きくなるほど、一般的に、ポリ-PEG化生成物の割合は高くなる。
【０１４３】
モノ重合体/可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドの実質的に均質な集団を作出するための還元的アルキル化は一般に、(a) 可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンのN末端アミノ基の選択的修飾を可能とするのに適したpHで、還元的アルキル化条件下で、反応性PEG分子と本発明の可溶性CD1dもしくはβ2-ミクログロブリンポリペプチドまたはポリペプチド断片を反応させる段階と、(b) 反応生成物を得る段階とを含む。
【０１４４】
モノ重合体/可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドの実質的に均質な集団の場合、還元的アルキル化反応条件は、本発明の可溶性CD1dもしくはβ2-ミクログロブリンポリペプチドまたはポリペプチド断片のN末端への水溶性重合体成分の選択的付着を可能にするものである。そのような反応条件は一般的に、リジン側鎖アミノ基とN末端アミノ基の間のpKa差をもたらす。本発明の目的で、pHは一般に3〜9、典型的には3〜6の範囲である。
【０１４５】
いくつかの態様において、ポリアルキレングリコール成分は、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドのシステイン基にカップリングされる。カップリングは、例えばマレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、またはチオール基を用いて行うことができる。
【０１４６】
任意で、可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドは、不安定な結合を通じてポリエチレングリコール成分に共役されてもよい。不安定な結合は、例えば生化学的加水分解、タンパク質分解、またはスルフヒドリル切断において切断することができる。例えば結合は、インビボ(生理学的)条件下で切断することができる。
【０１４７】
反応は、反応基がN末端のアルファアミノ基上にあれば、生物学的に活性な材料を不活性な重合体と反応させるために使われる任意の適当な方法により、一般的にpH約5〜8、例えばpH 5、6、7、または8で行うことができる。一般的に、その過程は、活性化重合体を調製すること、その後、タンパク質を活性化重合体と反応させて製剤に適した可溶性タンパク質を作出することを伴う。
【０１４８】
ベクター
可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドをコードする核酸を含んだベクターを用いて、本発明の方法で用いられるCD1d複合体、例えば、非特異的なCD1d複合体を産生することができる。ベクターおよびそのような核酸が機能的に連結される発現制御配列の選択は、所望の機能的特性、例えば、タンパク質発現および形質転換される宿主細胞に依る。
【０１４９】
機能的に連結されたコード配列の発現を調節するのに有用な発現制御要素は、当技術分野において公知である。例としては誘導性プロモーター、構成性プロモーター、分泌シグナル、および他の調節要素が挙げられるが、これらに限定されることはない。誘導性プロモーターが使用される場合、これは、例えば、宿主細胞培地中での栄養状態の変化または温度の変化により制御することができる。
【０１５０】
ベクターは、原核生物レプリコン、すなわち細菌宿主細胞において染色体外で組換えDNA分子の自律的複製および維持を指令する能力を有するDNA配列を含むことができる。そのようなレプリコンは当技術分野において周知である。さらに、原核生物レプリコンを含むベクターは、遺伝子の発現が薬剤耐性のような検出可能なマーカーをもたらす遺伝子を含むこともできる。細菌の薬剤耐性遺伝子の例は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
【０１５１】
原核生物レプリコンを含むベクターは、細菌宿主細胞においてコード遺伝子配列の発現を指令するための原核生物プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターを含むこともできる。細菌宿主に適合するプロモーター配列は、典型的には、発現されるDNAセグメントの挿入のために好都合な制限部位を含有するプラスミドベクター中に提供される。そのようなプラスミドベクターの例は、pUC8、pUC9、pBR322およびpBR329 (BioRad(登録商標) Laboratories)、pPLならびにpKK223 (Pharmacia)である。任意の適当な原核生物宿主を用いて、本発明の方法において使用されるタンパク質をコードする組換えDNA分子を発現することができる。
【０１５２】
本発明の目的で、多数の発現ベクター系を利用することができる。例えば、一つのクラスのベクターでは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス(RSV、MMTVもしくはMOMLV)、またはSV40ウイルスのような動物ウイルスに由来するDNA要素を利用する。その他では、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロン系の使用を含む。さらに、DNAを染色体に組み込んだ細胞を、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする一つまたは複数のマーカーを導入することにより選択することもできる。マーカーは栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤(例えば、抗生物質)耐性、または銅のような重金属に対する耐性を与えてよい。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるDNA配列に直接連結されても、または同時形質転換により同一細胞に導入されてもよい。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子は、選択可能なマーカー遺伝子の一例である(Southern et al., J. Mol. Anal. Genet. 1:327-341 (1982))。さらなる要素がmRNAの最適な合成に必要になることもある。これらの要素は、シグナル配列、スプライス配列、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含むことができる。
【０１５３】
もちろん、真核生物細胞において発現を誘発できる任意の発現ベクターを本発明において使用することができる。適当なベクターの例としては、プラスミドpcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、およびpZeoSV2 (Invitrogen, San Diego, CAから入手できる)、ならびにプラスミドpCI (Promega, Madison, WIから入手できる)が挙げられるが、これらに限定されることはない。さらなる真核生物細胞発現ベクターが当技術分野において公知であり、市販されている。典型的には、そのようなベクターは、所望のDNAセグメントの挿入に好都合な制限部位を含有する。例示的なベクターとしては、pSVLおよびpKSV-10 (Pharmacia)、pBPV-1、pml2d (International Biotechnologies)、pTDT1 (ATCC 31255)、レトロウイルス発現ベクターpMIGおよびpLL3.7、アデノウイルスシャトルベクターpDC315、ならびにAAVベクターが挙げられる。その他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第6,413,777号に開示されている。
【０１５４】
一般的に、多数の形質転換細胞を、適当に高いレベルの可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドを発現するものを求めてスクリーニングすることは、例えば、ロボットシステムにより実行できる日常的な実験である。
【０１５５】
哺乳類宿主細胞発現によく使われる調節配列は、レトロウイルスLTR、サイトメガロウイルス(CMV) (CMVプロモーター/エンハンサーなどの)、シミアンウイルス40 (SV40) (SV40プロモーター/エンハンサーなどの)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdmlP))、ポリオーマに由来するプロモーターおよびエンハンサーのような、哺乳類細胞中での高レベルのタンパク質発現を指令するウイルス要素、ならびに天然の免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターなどの強力な哺乳類プロモーターを含む。ウイルス調節要素およびその配列に関するさらなる記載については、例えば、Stinski、米国特許第5,168,062号; Bell、米国特許第4,510,245号; およびSchaffner、米国特許第4,968,615号を参照されたい。
【０１５６】
組換え発現ベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を調節する配列(例えば、複製起点)および選択可能なマーカー遺伝子を保有することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする(例えば、Axel、米国特許第4,399,216号; 同第4,634,665号、および同第5,179,017号を参照のこと)。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、G418、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートのような薬剤に対する耐性を、ベクターが導入されている宿主細胞に与える。よく使われる選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子(メトトレキサート選択/増幅とともにdhfr-宿主細胞で用いられる)およびneo遺伝子(G418選択のため)を含む。
【０１５７】
可溶性CD1dまたはβ2-ミクログロブリンポリペプチドをコードするベクターを、適当な宿主細胞の形質転換に使用することができる。形質転換は、任意の適当な方法によることができる。哺乳類細胞への外因性DNAの導入のための方法は、当技術分野において周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中でのポリヌクレオチドの封入、および核へのDNAの直接的マイクロインジェクションを含む。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターにより哺乳類細胞に導入することもできる。
【０１５８】
宿主細胞の形質転換は、利用されるベクターおよび宿主細胞に適した従来の方法によって達成することができる。原核生物宿主細胞の形質転換の場合、エレクトロポレーションおよび塩処理法を利用することができる(Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110-14 (1972))。脊椎動物細胞の形質転換の場合、エレクトロポレーション、カチオン性脂質、または塩処理法を利用することができる。例えば、Graham et al., Virology 52:456-467 (1973); Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-76 (1979)を参照されたい。
【０１５９】
タンパク質発現のために使用されるる宿主細胞株は、哺乳類由来のものであってよく; 当業者は、所望の遺伝子産物を内部発現させるのに最適な特定の宿主細胞株を決定することができると思われる。例示的な宿主細胞株としては、NSO、SP2細胞、ベビーハムスター腎(BHK)細胞、サル腎細胞(COS)、ヒト肝細胞がん細胞(例えば、HepG2)、A549細胞DG44およびDUXB11 (チャイニーズハムスター卵巣細胞株、DHFRマイナス)、HELA (ヒト頚部がん腫)、CVI (サル腎細胞株)、COS (SV40 T抗原を有するCVIの派生株)、R1610 (チャイニーズハムスター線維芽細胞)、BALBC/3T3 (マウス線維芽細胞)、HAK (ハムスター腎細胞株)、SP2/O (マウス骨髄腫)、P3x63-Ag3.653 (マウス骨髄腫)、BFA-1c1BPT (ウシ内皮細胞)、RAJI (ヒトリンパ球)、ならびに293 (ヒト腎)が挙げられるが、これらに限定されることはない。宿主細胞株は、典型的には、商業サービス、アメリカン・ティッシュ・カルチャー・コレクション(American Tissue Culture Collection)よりまたは既刊文献より入手可能である。
【０１６０】
産生細胞株からのポリペプチドの発現は、公知の技術を用いて増強することができる。例えば、グルタミン合成酵素(GS)系がある種の条件下で発現を増強するのによく使われる。例えば、欧州特許第0 216 846号、同第0 256 055号、および同第0 323 997号、ならびに欧州特許出願第89303964.4号を参照されたい。
【０１６１】
セラミド様糖脂質抗原
本発明において有用なセラミド様糖脂質抗原は、CD1d分子と併せて与えられる場合に、動物において免疫反応を調節できる任意のものを含む。抗原は、外来抗原に由来してもまたは自己抗原に由来してもよい。さらに、抗原は合成によってもよい。適当な抗原は、例えば、Porcelli、米国特許出願公開第2006/0052316号、Tsuji、米国特許出願公開第2006/0211856号、Jiang、米国特許出願公開第2006/0116331号、Hirokazuら、米国特許出願公開第2006/0074235号、Tsujiら、米国特許出願公開第2005/0192248号、Tsuji、米国特許出願第2004/0127429号、およびTsujiら、米国特許出願第2003/0157135号に開示されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。ある種の態様において、セラミド様糖脂質抗原はα-GalCerである。
【０１６２】
本発明で用いられる他のセラミド様糖脂質抗原は、表3中の抗原を含むが、それらに限定されることはない。
【０１６３】
【表３】
2010519255.tif 000012
2010519255.tif 000013
2010519255.tif 000014
2010519255.tif 000015
2010519255.tif 000016
2010519255.tif 000017
2010519255.tif 000018
【０１６４】
セラミド様糖脂質抗原は、当業者に公知の標準的な方法により、可溶性CD1dポリペプチドと結合または会合される。例えば、精製CD1dタンパク質(CD1dサブユニットもβ2-ミクログロブリンサブユニットもともに含む)の調製物を、2.5モル過剰のα-GalCerと混合し、すべてのCD1dタンパク質が抗原と結合されることを確実にする。その後、例えば、クロマトグラフィー法、例えばサイズ排除FPLCにより、過剰のα-GalCerを除去する。
【０１６５】
ある種の態様において、本発明の方法で用いられる組成物は、別の成分、例えば、免疫学的活性を有するポリペプチドをさらに含む。好ましくは、免疫学的活性を有するタンパク質は、サポニン、toll様受容体(「TLR」)、B7.1またはB7.2のような、共刺激分子である。「B7」は、B7.1またはB7.2のいずれかを一般的にいうように本明細書において用いられる。一つの態様において、本発明で用いられる可溶性CD1d複合体の構造中に組み入れられるβ2-ミクログロブリンとのアミノ末端融合体として、T細胞およびNK細胞上のCD28と相互作用する共刺激分子、例えば、B7-1 (CD80)またはB7-2 (CD86)の細胞外ドメインを投与する。例えば、1999年12月16日付で公開されたWO 9964597を参照されたい。あるいは、共刺激分子をCD1d重鎖とのアミノ末端融合体として投与する。ある種の態様において、本発明の組成物に、共刺激分子、例えばB7シグナル伝達分子を組み入れることにより、可溶性CD1d複合体によるCD1d拘束性NKT細胞のいっそう効果的かつ持続的な活性化が可能となる。
【０１６６】
他の態様において、本発明の方法で用いられる組成物は、アジュバント成分、例えば、Toll様受容体(TLR)アゴニストをさらに含む。有効でありうるTLRアゴニストアジュバントの例としては、N-アセチルムラミル-L-アラニン-D-イソグルタミン(MDP)、リポ多糖(LPS)、遺伝子操作されたおよび/または分解されたLPS、ミョウバン、グルカン、コロニー刺激因子(例えば、EPO、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、PEG化G-CSF、SCF、IL-3、IL6、PIXY 321)、インターフェロン(例えば、γ-インターフェロン、α-インターフェロン)、インターロイキン(例えば、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18)、サポニン(例えば、QS21)、モノホスホリル脂質A (MPL)、3脱-O-アシル化モノホスホリル脂質A (3D-MPL)、非メチル化CpG配列、1-メチルトリプトファン、アルギナーゼ阻害剤、シクロホスファミド、免疫抑制機能を遮断する抗体(例えば、抗CTLA4抗体)、脂質(パルミチン酸残基のような)、トリパルミトイル-S-グリセリルシステインリセリル-セリン(P3 CSS)、ならびにフロイントアジュバントが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１６７】
あるいはまたはさらに、本発明の組成物は、インターロイキンIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18のような免疫細胞活性化を調節するリンホカインまたはサイトカイン; 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）; 形質転換増殖因子(TGF、例えば、TGFαおよびTGFβ); αインターフェロン(例えばIFNα); βインターフェロン(例えばIFNβ); γインターフェロン(例えばIFNγ)またはLFA-1もしくはLFA-3のような、リンパ球機能関連タンパク質; あるいはICAM-1またはICAM-2のような細胞間接着分子をさらに含むことができる。
【０１６８】
本発明の組成物は、抗原および/または共刺激分子の均質または不均質な集団を含有することができる。つまり、組成物中の各可溶性CD1dポリペプチドは、同じセラミド様糖脂質抗原に連結されてもよく、または可溶性CD1dポリペプチドは、異なる抗原に連結されてもよい。同様に、種々の可溶性CD1d複合体は、同じ共刺激分子または異なる共刺激分子と結合されてもよい。
【０１６９】
本発明の可溶性CD1d複合体、またはそれを含む組成物は、直接的に検出可能であるように標識されてもよく、または例えば、検出目的でもしくは診断目的で、その化合物を特異的に結合する第二の標識免疫試薬と併せて用いる。関心対象の標識は、色素、酵素、化学発光物質(chemiluminescers)、粒子、放射性同位体、または他の直接的にもしくは間接的に検出可能な作用物質を含むことができる。あるいは、第二段階の標識、例えば、本発明の化合物の構成要素のうちの一つに向けられる標識抗体が使用されてもよい。
【０１７０】
適当な酵素標識の例としてはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ-グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
【０１７１】
適当な放射性同位体標識の例としては、3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pdなどが挙げられる。適当な非放射性同位体標識の例としては、157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、および56Feが挙げられる。
【０１７２】
適切な蛍光標識の例としては、152Eu標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、o-フタルアルデヒド標識、およびフルオレスカミン標識が挙げられる。
【０１７３】
適当な毒素標識の例としては、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素が挙げられる。
【０１７４】
化学発光標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識が挙げられる。
【０１７５】
核磁気共鳴造影剤の例としては、Gd、Mn、および鉄のような重金属核が挙げられる。
【０１７６】
上記の標識をポリペプチドに結合するための典型的な技術は、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1-31 (1976)、およびSchurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1-40 (1977)により示されている。後者で述べられているカップリング技術は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、ジマレイミド法、m-マレイミドベンジル-N-ヒドロキシ-スクシンイミドエステル法であり、これらの全てが参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７７】
免疫原性分子および治療用分子
「免疫原性ポリペプチド」とは、エピトープまたはエピトープの組み合わせを有するポリアミノ酸材料を含む任意の抗原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドを包含するよう意図される。本明細書において用いられる場合、免疫原性ポリペプチドは、脊椎動物に導入された場合に、脊椎動物の免疫系分子と反応する、すなわち抗原性を示す、および/または脊椎動物において免疫反応を誘導する、すなわち免疫原性を示すポリペプチドである。免疫原性ポリペプチドは、抗原性でもあるという可能性がかなり高いが、抗原性ポリペプチドは、そのサイズまたは高次構造のため、必ずしも免疫原性である必要はない。抗原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチドの例としては、細菌、ウイルス、寄生虫、または真菌のような感染性因子、ペットの鱗屑、植物、ほこり、および他の環境供給源由来のものなど、アレルゲン由来のポリペプチド、ならびにある種の自己ポリペプチド、例えば腫瘍関連抗原が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１７８】
本発明の抗原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチドを用いて、ウイルス性、細菌性、真菌性、および寄生性感染症の重篤性を予防するもしくは処置する、すなわち治癒する、改善する、緩和する、またはウイルス性、細菌性、真菌性、および寄生性感染症の感染を予防するもしくは軽減する、ならびにアレルギーを処置することができる。
【０１７９】
さらに、本発明の抗原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチドを用いて、口腔および咽頭(すなわち、舌、口、咽頭)のがん、消化器系(すなわち、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肛門、肛門管、肛門直腸、肝臓、胆嚢、膵臓)のがん、呼吸器系(すなわち、喉頭、肺)のがん、骨がん、関節がん、軟組織(心臓を含む)がん、皮膚がん、黒色腫、乳がん、生殖器官(すなわち、頸部、子宮内膜、卵巣、外陰、膣、前立腺、睾丸、陰茎)のがん、泌尿器系(すなわち、膀胱、腎臓、尿管、および他の泌尿器)のがん、眼がん、脳腫瘍、内分泌系(すなわち、甲状腺および他の内分泌腺)のがん、リンパ腫(すなわち、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫)、多発性骨髄腫、白血病(すなわち、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病)を含むが、これらに限定されない、がんの重篤性を予防するまたは処置する、すなわち治癒する、改善する、または緩和することができる。
【０１８０】
ウイルス性の抗原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチドの例としては、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド、例えば、カリシウイルスカプシド抗原、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス(AE)ポリペプチド、例えば、B型肝炎のコア抗原または表面抗原、ヘルペスウイルスポリペプチド、例えば、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質または水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質、免疫不全ウイルスポリペプチド、例えば、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープまたはプロテアーゼ、感染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、インフルエンザウイルスポリペプチド、例えば、A型インフルエンザの赤血球凝集素、ノイラミニダーゼまたは核タンパク質、白血病ウイルスポリペプチド、マールブルグウイルスポリペプチド、オルトミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド、例えば、赤血球凝集素/ノイラミニダーゼ、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド、例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド、ポックスウイルスポリペプチド、例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド、狂犬病ウイルスポリペプチド、例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質G、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、ならびにロタウイルスポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１８１】
細菌性の抗原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチドの例としては、アクチノマイセス(Actinomyces)ポリペプチド、バチルス(Bacillus)ポリペプチド、例えば、炭疽菌(Bacillus anthracis)由来の免疫原性ポリペプチド、バクテロイデス(Bacteroides)ポリペプチド、ボルデテラ(Bordetella)ポリペプチド、バルトネラ(Bartonella)ポリペプチド、ボレリア(Borrelia)ポリペプチド、例えば、ライム病ボレリア(B. burgdorferi) OspA、ブルセラ(Brucella)ポリペプチド、カンピロバクター(Campylobacter)ポリペプチド、カプノシトファガ(Capnocytophaga)ポリペプチド、クラミジア(Chlamydia)ポリペプチド、クロストリジウム(Clostridium)ポリペプチド、コリネバクテリウム(Corynebacterium)ポリペプチド、コクシエラ(Coxiella)ポリペプチド、デルマトフィルス(Dermatophilus)ポリペプチド、エンテロコッカス(Enterococcus)ポリペプチド、エールリヒア(Ehrlichia)ポリペプチド、エシェリキア(Escherichia)ポリペプチド、フランシセラ(Francisella)ポリペプチド、フソバクテリウム(Fusobacterium)ポリペプチド、ヘモバルトネラ(Haemobartonella)ポリペプチド、ヘモフィルス(Haemophilus)ポリペプチド、例えば、インフルエンザ菌(H. influenzae) b型外膜タンパク質、ヘリコバクター(Helicobacter)ポリペプチド、クレブシエラ(Klebsiella)ポリペプチド、L型菌ポリペプチド、レプトスピラ(Leptospira)ポリペプチド、リステリア(Listeria)ポリペプチド、マイコバクテリア(Mycobacteria)ポリペプチド、マイコプラズマ(Mycoplasma)ポリペプチド、ナイセリア(Neisseria)ポリペプチド、ネオリケッチア(Neorickettsia)ポリペプチド、ノカルジア(Nocardia)ポリペプチド、パスツレラ(Pasteurella)ポリペプチド、ペプトコッカス(Peptococcus)ポリペプチド、ペプトストレプトコッカス(Peptostreptococcus)ポリペプチド、ニューモコッカス(Pneumococcus)ポリペプチド、プロテウス(Proteus)ポリペプチド、シュードモナス(Pseudomonas)ポリペプチド、リケッチア(Rickettsia)ポリペプチド、ロシャリメア(Rochalimaea)ポリペプチド、サルモネラ(Salmonella)ポリペプチド、シゲラ(Shigella)ポリペプチド、スタフィロコッカス(Staphylococcus)ポリペプチド、ストレプトコッカス(Streptococcus)ポリペプチド、例えば、化膿連鎖球菌(S. pyogenes) Mタンパク質、トレポネーマ(Treponema)ポリペプチド、およびエルシニア(Yersinia)ポリペプチド、例えば、ペスト菌(Y. pestis) F1およびV抗原が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１８２】
腫瘍関連性の抗原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチドの例としては、腫瘍特異的免疫グロブリン可変領域、GM2、Tn、sTn、Thompson-Friedenreich抗原(TF)、Globo H、Le(y)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、がん胎児抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβ鎖(hCGβ)、C35、HER2/neu、CD20、PSMA、EGFRvIII、KSA、PSA、PSCA、GP100、MAGE 1、MAGE 2、TRP 1、TRP 2、チロシナーゼ、MART-1、PAP、CEA、BAGE、MAGE、RAGE、および関連タンパク質が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１８３】
本発明の組成物は、他の治療薬をさらに含むことができる。治療薬は、可溶性CD1d複合体と連結されてもまたは別の方法で結合されてもよい。治療薬の例としては、代謝拮抗剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、および抗有糸分裂剤が挙げられるが、これらに限定されることはない。代謝拮抗剤は、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジンを含む。アルキル化剤は、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、ならびにシス-ジクロロジアミン白金(II) (DDP)シスプラチンを含む。アントラサイクリンは、ダウノルビシン(以前はダウノマイシン)およびドキソルビシン(本明細書においてアドリアマイシンともいわれる)を含む。さらなる例としては、ミトザントロンおよびビサントレンが挙げられる。抗生物質は、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC)を含む。抗有糸分裂剤は、ビンクリスチンおよびビンブラスチン(これらは一般にビンカアルカロイドといわれる)を含む。他の細胞障害薬は、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、ミトタン(O,P'-(DDD))、インターフェロンを含む。細胞障害薬のさらなる例としては、リシン、ドキソルビシン、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エトポシド、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、1-デヒドロテストステロン、およびグルココルチコイドが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１８４】
そのような治療薬および細胞障害薬の類似体および相同体は、本発明によって包含される。例えば、化学療法剤アミノプテリンには、相関関係にある改良類似体、すなわちメトトレキサートがある。さらに、ドキソルビシンの改良類似体は、Fe-キレートである。また、1-メチルニトロソウレアの改良類似体は、ロムスチンである。さらに、ビンブラスチンの改良類似体は、ビンクリスチンである。また、メクロレタミンの改良類似体は、シクロホスファミドである。
【０１８５】
NKT活性アッセイ法
免疫反応を調節する本発明の組成物の能力は、インビトロアッセイ法によって容易に判定することができる。このアッセイで用いられるNKT細胞は、形質転換されたNKT細胞株、または哺乳類から、例えばヒトからもしくはマウスのようなげっ歯類から単離されるNKT細胞を含む。NKT細胞は、CD1d:α-GalCer四量体を結合する細胞を選別することにより哺乳類から単離することができる。例えば、Benlagha et al., J Exp Med 191 (2000), pp. 1895-1903; Matsuda et al., J Exp Med 192 (2000), pp. 741-754; およびKaradimitris et al., Proc Natl Acad Sci USA 98 (2001), pp. 3294-3298を参照されたい。本発明の化合物がNKT細胞の活性を調節できるかどうかを判定するのに適したアッセイ法は、NKT細胞および抗原提示細胞を共培養し、抗原提示細胞またはNKT細胞のいずれかを直接的に標的化する関心対象の特定の化合物を培地に添加し、IL-4またはIFN-γ産生を測定することにより行われる。本発明の化合物の非存在下での、または、好ましくは非標的化抗体を有する本発明の化合物の存在下での、その細胞共培養の間のIL-4またはIFN-γ産生の顕著な増加または減少は、NKT細胞の刺激または阻害を示す。
【０１８６】
アッセイ法において利用されるNKT細胞を、増殖に適した条件下でインキュベートする。例えば、NKT細胞ハイブリドーマを、完全培地(10% FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、L-グルタミン、および5×10-5 M 2-メルカプトエタノールを補充したRPMI 1640)中にて、およそ37℃および5% CO2で、適当にインキュベートする。化合物の連続希釈液を、NKT細胞培地に添加することができる。NKT細胞に添加される化合物の適当な濃度は、典型的には、10-12〜10-6 Mの範囲内であろう。わずかに最大下のNKT細胞活性化を与える抗原用量およびAPC数の使用は、本発明の化合物によるNKT細胞反応の刺激または阻害を検出するのに好ましい。
【０１８７】
あるいは、NKT細胞活性化の調節は、IL-4またはIFN-γのような発現タンパク質の測定よりも、当技術分野において認識されるような放射標識技術によって測定される抗原依存性T細胞増殖の変化によって判定されてもよい。例えば、標識化(例えば、トリチウム化)ヌクレオチドを、アッセイ培地に導入することができる。DNAへのそのようなタグ付ヌクレオチドの組み込みは、T細胞増殖の一つの指標として役立つ。このアッセイ法は、増殖のために抗原提示を必要としないNKT細胞、例えば、NKT細胞ハイブリドーマには適していない。本発明の化合物との接触後のT細胞増殖レベルの差異は、複合体がT細胞の活性を調節することを示す。例えば、NKT細胞増殖の減少は、本化合物が免疫反応を抑制できることを示す。NKT細胞増殖の増大は、本化合物が免疫反応を刺激できることを示す。
【０１８８】
さらに、以下に記載する51Cr放出アッセイ法を用いて、細胞障害活性を判定することができる。
【０１８９】
これらのインビトロアッセイ法を利用して、免疫反応を調節できる可溶性CD1d複合体およびそれを含む組成物を、選択および同定することができる。上記のアッセイ、例えばIL-4もしくはIFN-γ産生またはNKT細胞増殖の測定を利用して、化合物との接触がT細胞活性化を調節するかどうかを判定する。
【０１９０】
同様に、インビボアッセイ法を適当に利用して、NKT細胞の活性を調節する本発明の組成物の能力を判定することもできる。例えば、関心対象の組成物を、NKT細胞活性化を刺激するまたは腫瘍増殖を阻害するその能力についてアッセイすることができる。例えば、本発明の組成物を、腫瘍形成用量の形質転換細胞での攻撃の前または後に、マウスなどの哺乳類に投与することができ、増大している腫瘍の存在またはサイズを、モニターすることができる。
【０１９１】
本発明の組成物は適当な担体をさらに含む。そのような組成物は、治療上有効量の可溶性CD1d複合体と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。そのような担体は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されることはない。製剤は投与方法に適合するべきである。
【０１９２】
処置の方法
本発明は同様に、本明細書に記載のセラミド様糖脂質抗原を負荷した可溶性CD1d複合体を含んだ組成物の有効量を動物に投与する段階を含む、免疫反応を調節する、すなわち刺激するまたは阻害する方法を含む。
【０１９３】
本発明は、動物における疾患を処置する方法を提供し、本方法は、その疾患を有するまたはその疾患にかかりやすい動物に、本明細書に記載のセラミド様糖脂質抗原を負荷した可溶性CD1d複合体を含んだ組成物を投与する段階を含む。
【０１９４】
これらの方法によれば、本発明の組成物は、その疾患の進行を変化させるのに十分な量で投与される。
【０１９５】
本発明のある種の態様は、単独で投与され、したがって細胞に結合したCD1dとの関連でNKT細胞に提示されるセラミド様糖脂質抗原の複数回投与に対するNKT細胞のアネルギー反応を減らすまたは排除する方法を含む。単独で投与したα-GalCerの複数回投与は、NKT細胞を長期間にわたって不応性とすることが明らかにされている。α-GalCerのような糖脂質が可溶性CD1d複合体の一部として投与される本発明では、抗原に応じたアネルギーからNKT細胞を保護し、複数回の投与による持続的反応を可能にする。したがって、本発明のセラミド様糖脂質抗原を負荷した可溶性CD1d複合体での刺激に応じてNKT細胞を活性化し、さらに、本発明のセラミド様糖脂質抗原を負荷した可溶性CD1d複合体による再刺激に応じてNKT細胞を再活性化することができる。
【０１９６】
ある種の態様において、本明細書に記載する方法で用いられる可溶性CD1d複合体は「非特異的な」可溶性CD1d複合体であり、すなわちそれらは特定の臓器、組織、細胞、または細胞表面マーカーに標的化されるのではなく、むしろそれらは全身的に投与される。
【０１９７】
本発明の方法によれば、可溶性CD1d複合体を含む組成物は、動物、例えば脊椎動物、例えば哺乳類、例えばヒトにおいて免疫反応を調節するために投与される。ある種の態様において、本発明の方法は、例えば、可溶性CD1d複合体の前に、可溶性CD1d複合体の後に、または可溶性CD1d複合体と同時に送達される免疫原に対する免疫反応の増強をもたらす。本発明の可溶性CD1d複合体を、例えば免疫原とともに投与することで、典型的には、免疫細胞、例えばNKT細胞またはNK細胞からのサイトカインの放出をもたらすことができる。本発明の組成物の投与に応じて放出されるサイトカインは、TH1型の免疫反応と関連するもの、例えば、インターフェロンガンマおよびTNF-アルファであり得る。あるいは、またはさらに、本発明の組成物の投与は、TH2型の免疫反応と関連するサイトカイン、例えば、IL-4、IL-5、IL-10、またはIL-13の放出をもたらすこともできる。あるいは、またはさらに、本発明の組成物の投与は、他のサイトカイン、例えば、IL-2、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-23、TNF-β/LT、MCP-2、オンコスタチン-M、およびRANTESの放出をもたらすこともできる。放出されるサイトカインのタイプを調節する方法は、可溶性CD1d複合体のセラミド様糖脂質抗原を変化させることを含む。種々のセラミド様糖脂質抗原を、NKTまたは他の免疫細胞からのサイトカインの放出に及ぼすその効果について選択および試験することは、本明細書の他の部分、およびPorcelli、米国特許出願公開第2006/0052316号に記載されているインビトロアッセイ法を用いて、ならびに当業者により周知のさらなる方法によって行うことができる。本発明の可溶性CD1d複合体およびそれを含む組成物の投与は、NKT細胞の増殖を誘導することにより、および同様にNK細胞、CTL、他のTリンパ球、例えばCD8+またはCD4+ Tリンパ球、樹状細胞、Bリンパ球などを含むがこれらに限定されない他の免疫細胞の動員およびまたは活性化を誘導することにより、免疫反応をさらに調節することができる。
【０１９８】
ある種の態様において、本発明の可溶性CD1d複合体およびそれを含む組成物の投与は、望ましくない免疫反応、例えば、炎症または自己免疫の抑制または阻害をもたらす。
【０１９９】
ある種の態様において、本発明の可溶性CD1d複合体およびそれを含む組成物の投与は、以下に限定されないが、細胞増殖、一つもしくは複数のサイトカインの産生、またはNK細胞、CTL、他のTリンパ球、例えば、CD8+もしくはCD4+ Tリンパ球、樹状細胞、Bリンパ球などを含むが、これらに限定されないNKT以外の免疫系細胞の動員および/もしくは活性化のような一つまたは複数のNKT細胞活性に影響を及ぼす。
【０２００】
本発明のある種の態様は、アジュバントとして、すなわち特定の免疫原に対する免疫反応を調節するための、本発明の可溶性CD1d複合体の使用を伴う。したがって、本発明は、動物において免疫原に対する免疫反応を調節する方法を提供し、この方法は、そのような調節を必要としている動物に、免疫原と、本明細書の他の部分に記載のセラミド様糖脂質抗原を負荷した可溶性CD1d複合体と、適当な担体とを含む組成物を投与する段階を含む。この態様によれば、可溶性CD1d複合体は、可溶性CD1d複合体なしでの免疫原の投与に比べて、免疫原に対する免疫反応を調節するのに十分な量で投与される。本明細書において記載のアジュバントとして用いるための可溶性CD1d複合体は、ある種の態様において、非特異的な可溶性CD1d複合体であり得る。他の態様において、アジュバントとして用いるための可溶性CD1d複合体は、例えばBrunoら、米国特許出願公開第2006/0269540号に記載のように、特定の臓器、組織、細胞、または細胞表面マーカーに標的化され得る。
【０２０１】
ある種の態様において、本発明の可溶性CD1d複合体およびそれを含む組成物は、例えば、がんのような疾患に既に苦しんでいる動物に治療ワクチンとしての免疫原とともに投与される。これらの方法によれば、免疫原/アジュバント組成物によって誘発される免疫反応は、症状を軽減することまたは疾患の重篤性を緩和することによって、処置に、例えば疾患の転帰に影響を及ぼすのに有効であり、非特異的なCD1d複合体が、非特異的な可溶性CD1d複合体の非存在下での免疫原の投与に比べて免疫原に対する免疫反応を調節するのに十分な量で投与される。あるいは、本発明の可溶性CD1d複合体およびそれを含む組成物は、予防ワクチンとしての、すなわち将来的に動物がかかりうる感染症のような疾患に対する症状を予防するまたは軽減するための、免疫原とともに投与される。これらの方法によれば、免疫原/アジュバント組成物によって誘発される免疫反応は、症状を軽減することまたは疾患の重篤性を緩和することによって、予防に、例えば疾患の転帰に影響を及ぼすのに有効であり、非特異的なCD1d複合体が、非特異的な可溶性CD1d複合体の非存在下での免疫原の投与に比べて免疫原に対する免疫反応を調節するのに十分な量で投与される。
【０２０２】
本発明は同様に、本明細書に記載する方法で用いられる免疫原/アジュバント組成物を提供する。そのような組成物は、免疫原および本明細書の他の部分に記載の可溶性CD1d複合体を含む。本発明の免疫原/アジュバント組成物は、典型的には、非特異的な可溶性CD1d複合体を含むが、ある種の態様において、標的化された可溶性CD1d複合体を含むことができる。
【０２０３】
本明細書において記載の方法および組成物は、免疫反応を上昇させかつ過剰増殖性障害を処置するのに有用である。本発明の化合物によって処置できる過剰増殖性障害の例としては、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺(副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺)、眼、頭部および頸部、神経(中枢および末梢)、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および泌尿生殖器に局在する新生物が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０２０４】
同様に、その他の過剰増殖性障害を本発明の化合物によって処置することもできる。そのような過剰増殖性障害の例としては、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖性疾患、異常タンパク血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、および新生物に加えて上記の臓器系に局在するその他任意の過剰増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０２０５】
本明細書において記載の方法および組成物は同様に、感染性因子に対する免疫反応を上昇させるのに有用である。ウイルスは、本発明の化合物によって処置できる疾患または症状を引き起こしうる感染性因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のDNAおよびRNAウイルス科が挙げられるがこれらに限定されることはない: アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリチウイルス科、サーコウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科(肝炎)、ヘルペスウイルス科(例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹)、モノネガウイルス(例えば、パラミクソウイルス科、モルビリウイルス、ラブドウイルス科)、オルトミクソウイルス科(例えば、インフルエンザ)、パポーバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科(例えば、痘瘡またはワクシニア)、レオウイルス科(例えば、ロタウイルス)、レトロウイルス科(HTLV-I、HTLV-II、レンチウイルス)、およびトガウイルス科(例えば、ルビウイルス属)。これらの科内に入るウイルスは、関節炎、細気管支炎、脳炎、眼感染症(例えば、結膜炎、角膜炎)、慢性疲労症候群、肝炎(A型、B型、C型、E型、慢性活動性、デルタ)、髄膜炎、日和見感染症(例えば、AIDS)、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病(例えば、カポジ肉腫、いぼ)、およびウイルス血症を含むがこれらに限定されない、種々の疾患または症状を引き起こしうる。
【０２０６】
同様に、疾患または症状を引き起こしうる細菌性または真菌性因子を、本発明の方法および組成物により処置するまたは予防することもできる。これらは以下: 放線菌目(Actinomycetales) (例えばコリネバクテリウム属(Corynebacterium)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、ノカルジア属(Norcardia))、アスペルギルス症(Aspergillosis)、バチルス科(Bacillaceae) (例えば炭疽菌(Anthrax)、クロストリジウム属(Clostridium))、バクテロイデス科(Bacteroidaceae)、ブラストミセス症(Blastomycosis)、ボルデテラ属(Bordetella)、ボレリア属(Borrelia)、ブルセラ病(Brucellosis)、カンジダ症(Candidiasis)、カンピロバクター(Campylobacter)、コクシジオイデス症(Coccidioidomycosis)、クリプトコッカス症(Cryptococcosis)、皮膚真菌症(Dermatocycoses)、腸内細菌科(Enterobacteriaceae) (クレブシエラ属(Klebsiella)、サルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serratia)、エルシニア属(Yersinia))、エリジペロスリックス属(Erysipelothrix)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、レジオネラ症(Legionellosis)、レプトスピラ症(Leptospirosis)、リステリア菌(Listeria)、マイコプラズマ目(Mycoplasmatales)、ナイセリア科(Neisseriaceae) (例えばアシネトバクター属(Acinetobacter)、淋病(Gonorrhea)、髄膜炎(Menigococcal))、パスツレラ科感染症(Pasteurellacea Infections) (例えばアクチノバチルス属(Actinobacillus)、ヘモフィルス属(Heamophilus)、パスツレラ属(Pasteurella))、シュードモナス菌(Pseudomonas)、リケッチア科(Rickettsiaceae)、クラミジア科(Chlamydiaceae)、梅毒(Syphilis)、およびブドウ球菌(Staphylococcal)の、グラム陰性およびグラム陽性細菌科ならびに真菌を含むが、これらに限定されることはない。これらの細菌科または真菌科は以下: 菌血症、心内膜炎、眼感染症(結膜炎、結核、ブドウ膜炎)、歯肉炎、日和見感染症(例えば、AIDS関連感染症)、爪周囲炎、プロステーシス関連感染症、ライター病、百日咳または蓄膿症のような気道感染症、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ハンセン病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒症、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染症、皮膚疾患(例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症)、毒素血症、尿路感染症、創傷感染症を含むがこれらに限定されない、疾患または症状を引き起こしうる。
【０２０７】
さらに、本発明の方法および組成物を用いて、寄生性因子により引き起こされる疾患を処置するまたは予防することもできる。これらは、本発明の化合物によって処置できるものを含むがこれに限定されることはなく、アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症、媾疫、外部寄生虫症、ランブル鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス症の群を含むが、これらに限定されることはない。
【０２０８】
さらに、本発明の方法および組成物を用いて、自己免疫疾患を処置するまたは予防することもできる。自己免疫疾患は、罹病者の組織に対する免疫系による攻撃によって特徴付けられる。自己免疫疾患では、組織を「自己」として認識することが明らかに行われず、罹患している被験体の組織が侵入者として扱われる、すなわち、免疫系がこの推定される外来標的の破壊を始める。それゆえ、本発明の化合物は、例えば破壊的なHG1型の反応を避ける免疫偏向により、これらの自己抗原に対し免疫系を脱感作することによって自己免疫疾患を処置するのに有用である。
【０２０９】
本発明の化合物を用いて処置できる自己免疫疾患の例としては、アジソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、結膜炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多腺性内分泌障害、紫斑病、ライター病、スティフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎、ギランバレー症候群、インスリン依存性糖尿病、自己免疫性炎症性眼疾患、自己免疫性溶血、乾癬、若年性糖尿病、原発性特発性粘液水腫、自己免疫性喘息、強皮症、慢性肝炎、性腺機能低下症、悪性貧血、白斑、円形脱毛症、セリアック病、自己免疫性腸症候群、特発性血小板紫斑、後天性脾臓萎縮、特発性尿崩症、抗精子抗体による不妊症、突発性難聴、感音(sensoneural)難聴、多発性筋炎、自己免疫性脱髄疾患、横断性脊髄炎(traverse myelitis)、失調性硬化症、全身性進行性硬化症、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、特発性顔面神経麻痺、クリオグロブリン血症、炎症性腸疾患、橋本病、副腎炎、甲状腺機能低下症、および潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０２１０】
同様に、喘息(特にアレルギー性喘息)または他の呼吸障害のようなアレルギー反応および状態を、本発明の方法および組成物によって処置することもできる。一つの態様において、本発明は、減弱した免疫反応または免疫偏向をもたらすNKT細胞によってサイトカインの産生を阻害するまたは歪めるシグナルの、効果的な送達を提供する。例えば、本発明の方法および組成物を用いて、アナフィラキシー、抗原分子に対する過敏症、または血液型不適合性を処置することができる。
【０２１１】
本発明の方法および組成物を用いて、臓器拒絶または移植片対宿主病(GVHD)を処置するおよび/または予防することもできる。臓器拒絶は、宿主免疫細胞による免疫反応を通じた移植組織の破壊によって生じる。同様に、免疫反応はGVHDにも関与しているが、この場合には、外来の移植免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫反応の免疫偏向をもたらすまたは阻害する本発明の化合物の投与は、臓器拒絶またはGVHDを予防するうえで効果的な治療でありうる。
【０２１２】
投与によって免疫反応を阻害できる本明細書の他の部分に記載の本発明のある種の組成物も、アテローム性動脈硬化症; 耳炎(olitis); 限局性腸炎; 成人呼吸窮迫症候群; 皮膚炎などのような薬物反応の局所症状; 皮膚の炎症関連またはアレルギー性反応パターン; アトピー性皮膚炎および乳児湿疹; 接触皮膚炎; 乾癬; 扁平苔癬; アレルギー性腸症; アレルギー性鼻炎; 気管支喘息; 感染性因子に対する過敏症または破壊的反応; 連鎖球菌感染後疾患、例えばリウマチ熱の心臓症状などを、処置するおよび/または予防するのに有用である。
【０２１３】
開示された方法によれば、本発明の方法で用いられる組成物は、例えば、筋肉内(i.m.)経路、皮下(s.c.)経路、または肺内経路により投与することができる。他の適当な投与経路は、気管内投与、経皮投与、眼内投与、鼻腔内投与、吸入投与、腔内投与、静脈内(i.v.)投与、管内(例えば、膵臓への)投与および実質内(すなわち、任意の組織への)投与を含むが、これらに限定されることはない。経皮送達は、皮内(例えば、真皮または表皮への)投与、経皮(例えば、経皮的)投与、および経粘膜(すなわち、皮膚または粘膜組織へのまたは経由の)投与を含むが、これらに限定されることはない。腔内投与は、口腔、膣腔、直腸腔、鼻腔、腹腔または腸腔への投与、ならびにくも膜下腔内(すなわち、脊柱管への)投与、脳室内(すなわち、脳室または心室への)投与、心房内(すなわち、心房への)投与、およびくも膜下(すなわち、脳のくも膜下腔への)投与を含むが、これらに限定されることはない。
【０２１４】
薬学的組成物
本発明の可溶性CD1d複合体は、一つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、免疫原を含むかまたは含まないかのいずれかの薬学的組成物のなかで投与することができる。ヒト患者に投与する場合、本発明の薬学的組成物の1日の全使用量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されよう。任意の特定の患者に対する個別の治療上有効量レベルは、達成される反応のタイプおよび程度; もしあれば、利用される別の薬剤の具体的組成; 患者の年齢、体重、全般的健康、性別、および食生活; 投与の時間、投与の経路、および組成物の排泄の速度; 処置の持続時間; 特定の組成物と組み合わせてまたは同時に使用される(化学療法剤のような)薬物; ならびに医療分野において周知の因子などを含む、種々の要因に依存するであろう。当技術分野において公知の適当な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (latest edition), Mack Publishing Company, Easton, PAに見出すことができる。
【０２１５】
所与の治療的処置において使用される薬学的組成物は、個々の患者の臨床状態(とりわけ化合物だけでの処置の副作用)、化合物の送達の部位、投与の方法、投与の計画、および開業医に公知の他の要因を考慮に入れて、適正な医療行為に一致した形で製剤化され投薬されるであろう。したがって、本明細書における目的のための本発明の化合物の「有効量」は、このような考慮によって決定される。
【０２１６】
本発明の薬学的組成物は、経口的に、静脈内に、直腸内に、非経口的に、大槽内に、皮内に、腟内に、腹腔内に、局所的に(粉末、軟膏、ゲル、クリーム、ドロップ、もしくは経皮パッチのように)、頬内に、または経口スプレイもしくは鼻腔スプレイとして、投与することができる。本明細書において用いられる「非経口的な」という用語は、静脈内の、筋肉内の、腹腔内の、胸骨内の、皮下の、および関節内の、注射および注入を含む投与の方法をいう。
【０２１７】
薬学的組成物は、特定の適応症の処置および/または予防のために有効な量で投与される。ほとんどの場合、投与量は、投与の経路、症状などを考慮にいれて、1日あたり約1 μg/kg〜約30 mg/kg体重である。しかしながら、投与量は0.001 μg/kgほどに低いこともある。
【０２１８】
一般的な提案として、用量あたりの非経口的に投与される組成物の全薬学的有効量は、患者の体重の約1 μg/kg/日〜100 mg/kg/日の範囲内であるが、上記のように、これは治療的な判断に左右されるであろう。持続的に投与されるなら、組成物は典型的に、1日あたり1〜4回の注射により、または、例えばミニポンプを用いた連続皮下注入により、約1 μg/kg/時間〜約5 mg/kg/時間の用量速度で投与される。静脈内バッグ溶液または静脈内ボトル溶液を利用することもできる。
【０２１９】
本発明の組成物は持続放出系によって適当に投与することもできる。持続放出組成物の適当な例としては、成形品形態の半透性重合体マトリックス、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルが挙げられる。持続放出マトリックスは、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号、EP 58,481)、L-グルタミン酸およびガンマ-エチル-L-グルタメートの共重合体(U. Sidman et al., Biopolymers 22:547-556 (1983))、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート) (R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981)、およびR. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982))、エチレン酢酸ビニル(R. Langer et al., Id.)、またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(EP 133,988)を含む。持続放出組成物は、本発明のリポソーム内包組成物も含む。リポソームは、それ自体が公知の方法によって調製される: DE 3,218,121; Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 日本国特許出願第83-118008号; 米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号; ならびにEP 102,324。通常、リポソームは、脂質含有量が約30 molパーセントのコレステロールよりも大きな小型(約200〜800オングストローム)単層型のものであり、選択される割合は最適な治療のために調整される。
【０２２０】
非経口投与の場合、一つの態様において、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、すなわち利用される投与量および濃度で受容者に対して無毒性でありかつ製剤の他の成分と適合性であるものと、単位投与量の注射可能な形態(溶液、懸濁液、または乳濁液)において、所望の純度で、本組成物を混合することによって、一般的に製剤化される。例えば、製剤は、酸化剤およびポリペプチドに有害であることが知られている他の組成物を含まないことが好ましい。
【０２２１】
一般的に、製剤は、可溶性CD1d複合体および任意で本発明の免疫原を、液体担体もしくは微粉化した固体担体またはその両方と、均一かつ緊密に接触させることによって調製される。次いで、必要ならば、生成物を所望の製剤に成形する。好ましくは、担体は、非経口用担体、より好ましくは受容者の血液と等張な溶液である。このような担体媒体の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性媒体も、リポソームと同じように、本明細書において有用である。当技術分野において公知の適当な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (最新版), Mack Publishing Company, Easton, PAに見出すことができる。
【０２２２】
担体は、等張性および化学的安定性を増強する物質のような少量の添加剤を、適当に含有する。そのような材料は、利用される投与量および濃度で受容者に対して無毒性であり、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、および他の有機酸緩衝液、またはそれらの塩のような緩衝液; アスコルビン酸のような酸化防止剤; 低分子量(約10残基未満)のポリペプチド、例えばポリアルギニンまたはトリペプチド; 血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質; ポリビニルピロリドンのような親水性重合体; グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンのようなアミノ酸; セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の糖質; EDTAのようなキレート剤; マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール; ナトリウムのような対イオン; ならびに/あるいはポリソルベート、ポロキサマー、またはPEGのような非イオン性界面活性剤を含む。
【０２２３】
組成物は、典型的には、そのような媒体中にて、約3〜8のpHで、約0.01 μg/ml〜100 mg/ml、例えば約0.01 μg/ml〜10 mg/mlの非限定的な濃度で製剤化される。上記のある種の賦形剤、担体、または安定剤の使用は、塩の形成をもたらすことが理解されよう。
【０２２４】
治療的投与のために使用される組成物は無菌でなければならない。無菌状態は無菌ろ過膜(例えば、0.2ミクロンの膜)を通じたろ過によって容易に達成される。治療的組成物は一般に、無菌アクセス口(sterile access port)を有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルの中に入れられる。
【０２２５】
本発明の組成物は、通常、水溶液としてまたは再構成のために凍結乾燥された製剤として、単位用量または多用量の容器、例えば、密封されたアンプルまたはバイアルに保存される。凍結乾燥製剤の一例として、10 mlのバイアルに5 mlの滅菌ろ過1% (w/v)水溶液を満たし、得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液は、凍結乾燥された組成物を、静菌性の注射用水を用いて再構成することにより調製される。
【０２２６】
投与量は、例えば、RIA技術によって測定された場合、血中で所定の活性濃度を与えるように患者特有の様式で準備されてもよい。したがって患者投与量は、RIAによって測定された場合、およそ50〜1000 ng/ml、好ましくは150〜500 ng/mlで、規則的に持続するトラフ血中レベルを達成するように調整することができる。
【０２２７】
本発明の組成物は、任意の動物、好ましくは哺乳類(類人猿、ウシ、ウマ、ブタ、イノシシ、ヒツジ、げっ歯類、ヤギ、イヌ、ネコ、ニワトリ、サル、ウサギ、ケナガイタチ、クジラ、およびイルカなど)、より好ましくはヒトへの投与のために有用である。
【０２２８】
本発明は同様に、本発明の薬学的組成物の成分の一つまたは複数で満たされた一つまたは複数の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。そのような容器に付随するのは、医用薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制している政府機関によって定められた形式の通知であってよく、この通知はヒトへの投与のための製造、使用、または販売に関する政府機関による承認を反映する。さらに、本発明の組成物は、他の治療的組成物と組み合わせて利用されてもよい。
【０２２９】
本発明の組成物とともに投与するのに有用な他の治療的組成物は、細胞障害薬、特にがんの治療に使われるものを含む。そのような薬物は、一般に、アルキル化剤、抗増殖剤、チューブリン結合剤などを含む。好ましいクラスの細胞障害薬は、例えば、アントラサイクリンファミリーの薬物、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬物、ジイネン、およびポドフィロトキシンを含む。それらのクラスの特に有用な成員は、例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、マイトマイシンC、ポルフィロマイシン、5-フルオロウラシル、6-メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン、またはエトポシドもしくはリン酸エトポシドのようなポドフィロトキシン誘導体、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン、ビンデシン、ロイロシンなどを含む。先述のように、当業者は本発明の共役体を調製する目的で、所望の化合物の反応をより簡便とするために、その化合物に化学的修飾を加えることができる。
【０２３０】
本発明の組成物を用いて、ヒトを含めた腫瘍保持動物を処置し、腫瘍細胞に対する免疫反応を生じさせることができる。十分かつ適切な免疫反応の生成は、インビボでの腫瘍退縮をもたらす。そのような「ワクチン」は、腫瘍の処置のために単独で、または化学療法、放射線療法、外科手術、骨髄移植などを含むがこれらに限定されない他の治療計画との組み合わせで、使用することができる。例えば、外科技術または放射線技術を用いて腫瘍塊を減量させることが可能であり、その後、本発明のワクチン製剤を投与して、体内に残存する腫瘍塊または微小転移巣の退縮を確実にすることおよび進行を予防することができる。あるいは「ワクチン」の投与が、そのような外科処置、放射線処置、または化学療法処置に先行してもよい。
【０２３１】
あるいは、本発明の組成物を用いて、腫瘍のない被験体を免疫するまたは「ワクチン接種」して、腫瘍形成を予防してもよい。遺伝子検査の出現により、今では、ある種のがんに対する被験体の素因を予測することが可能である。それゆえ、腫瘍に由来する一つまたは複数の抗原リガンドを含む化合物を用いて、そのような被験体を免疫することができる。
【０２３２】
そのようなワクチンの適当な調製物は、注射物質を液体溶液または懸濁液のいずれかとして含み; 注射の前に液体に溶解または懸濁するのに適した固体形態を調製することもできる。この調製物は、乳化されてもよく、またはリポソームに封入されたポリペプチドであってもよい。活性な免疫原性成分は、多くの場合、薬学的に許容されかつ活性成分と適合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組み合わせである。さらに、必要に応じて、ワクチン調製物は、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、および/またはワクチンの有効性を増強するアジュバントのような、少量の補助物質を含むこともできる。
【０２３３】
可溶性CD1d複合体および免疫原を含む本発明の組成物は、さらなるアジュバントを含むことができる。有効でありうるアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン、GM-CSF、QS-21 (試験研究中の薬、Progenics Pharmaceuticals,Inc.)、DETOX (試験研究中の薬、Ribi Pharmaceuticals)、BCG、およびCpGリッチオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０２３４】
可溶性CD1d複合体および免疫原を含む本発明の組成物は、Toll様受容体(TLR)アゴニストでもあるさらなるアジュバントをさらに含むことができる。有効でありうるTLRアゴニストアジュバントの例としては、N-アセチルムラミル-L-アラニン-D-イソグルタミン(MDP)、リポ多糖(LPS)、遺伝子操作されたおよび/または分解されたLPS、ミョウバン、グルカン、コロニー刺激因子(例えば、EPO、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、PEG化G-CSF、SCF、IL-3、IL6、PIXY 321)、インターフェロン(例えば、γ-インターフェロン、α-インターフェロン)、インターロイキン(例えば、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18)、サポニン(例えば、QS21)、モノホスホリル脂質A (MPL)、3脱-O-アシル化モノホスホリル脂質A (3D-MPL)、非メチル化CpG配列、1-メチルトリプトファン、アルギナーゼ阻害剤、シクロホスファミド、免疫抑制機能を遮断する抗体(例えば、抗CTLA4抗体)、脂質(パルミチン酸残基のような)、トリパルミトイル-S-グリセリルシステインリセリル-セリン(P3 CSS)、ならびにフロイントアジュバントが挙げられるが、これらに限定されることはない。その他のアジュバントの例としては、イサトリビンおよびその誘導体(Anadys Pharmaceuticals)またはイミダゾキノリンアミン、例えばイミキモドおよびレシキモド(Dockrell & Kinghom, J. Antimicrob. Chemother., 48:751-755 (2001)およびHemmi et al., Nat. Immunol., 3:196-200 (2002))、グアニンリボヌクレオシド、例えばC8-置換またはN7、C-8-二置換グアニンリボヌクレオシド(Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:6646-6651 (2003))および特許公開番号JP-2005-089,334; WO99/32122; WO98/01448 WO05/092893; およびWO05/092892に開示されている化合物、ならびにLee et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103(6):1828-1833 (2006)に開示されているTLR-7アゴニストSM360320 (9-ベンジル-8-ヒドロキシ-2-(2-メトキシ-エトキシ)アデニン)のような化合物が挙げられる。
【０２３５】
イサトリビンに加えて、他のTLRアゴニストアジュバントは、9-ベンジル-8-ヒドロキシ-2-(2-メトキシエトキシ)アデニン(SM360320)、Actilon (商標) (Coley Pharmaceutical Group, Inc.)およびSumitmo Pharmaceutical Co, Ltd.による以下の化合物を含む。
2010519255.tif 000019
【０２３６】
本発明の組成物と併せて使用できるその他のアジュバントは、PCT公開番号WO 2005/000348、米国特許出願公開第2007/0292418号、および米国特許出願公開第2007/0287664号に開示されている。
【０２３７】
組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含有することもできる。組成物は、液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤、または粉末であり得る。経口製剤は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような、標準的な担体を含むことができる。
【０２３８】
代替の態様において、本発明の組成物は、患者と組織適合性であるNKTリンパ球の活性化のための養子免疫治療法において使用することができる。(養子免疫治療法については、例えば、1987年9月1日付で発行されたRosenbergの米国特許第4,690,915号; 1992年1月14日付で発行されたZarlingらの米国特許第5,081,029号を参照のこと)。そのようなNKTリンパ球は、患者または組織適合性の供与者から単離することができる。NKTリンパ球は、本発明の組成物への曝露によりインビトロにおいて活性化される。特定の抗原ペプチドに対するNKT細胞免疫を移入するために、活性化されたNKTリンパ球を増殖させ、患者に接種する。
【０２３９】
本発明の組成物は、免疫反応を調節する他の化合物、例えば、サイトカインをさらに含むことができる。「サイトカイン」という用語は、インターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、およびIL-18)、αインターフェロン(例えば、IFN-α)、βインターフェロン(IFN-β)、γインターフェロン(例えば、IFN-γ)、コロニー刺激因子(CSF、例えば、CSF-1、CSF-2およびCSF-3)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)、形質転換増殖因子(TGF、例えば、TGFαおよびTGFβ)、ならびにインスリン様増殖因子(IGF、例えば、IGF-IおよびIGF-II)を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドをいう。
【０２４０】
ある種の態様において、全身投与に有用な治療的組成物は、送達媒体に複合体形成された本発明の可溶性CD1d複合体を含む。全身投与で用いるのに適した送達媒体は、特定の部位に媒体を標的化するためのリガンド、例えば、関心対象の組織に媒体を標的化するためのリガンドを含んだリポソームを含む。他の組織および臓器のための標的化媒体は、当業者に周知である。他の態様において、本発明の可溶性CD1d複合体は非特異的である、すなわち、それらは任意の特定の組織、臓器、細胞、または細胞表面マーカーに標的化されない。
【０２４１】
全身投与の好ましい方法は、静脈内注射、エアロゾル、経口送達、および経皮的(局所的)送達を含む。静脈内注射は、当技術分野において標準的な方法を用いて行うことができる。当技術分野において標準的な方法を用いて、エアロゾル送達を行うこともできる(例えば、Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281, 1992を参照されたく、これは参照により本明細書に組み入れられる)。経口送達は、動物の腸内の消化酵素による分解に耐えうる担体に本発明のポリヌクレオチド構築体を複合体化させることによって行うことができる。そのような担体の例としては、当技術分野において公知のものなど、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられる。局所的送達は、皮膚の中に入りうる親油性試薬(例えば、DMSO)と、本発明のポリヌクレオチド構築体を混合することによって行うことができる。
【０２４２】
送達される物質の有効量の決定は、例えば、物質の化学構造および生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする詳細な状態およびその重篤性、ならびに投与経路を含むいくつかの要因に依存しうる。処置の頻度は、1用量あたりに投与されるポリヌクレオチド構築体の量、ならびに被験体の健康状態および病歴のような、いくつかの要因に依存する。用量の正確な量、回数、および投薬のタイミングは、主治医または獣医によって決定されるであろう。
【０２４３】
本発明の実践では、特に指定のない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、形質転換生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を利用し、これらは当技術分野の技術の範囲内である。そのような技術は文献にて十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I and II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullisらの米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N. Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer and Walker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1986); およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)中を参照されたい。
【０２４４】
抗体工学の一般的な原理は、Antibody Engineering, 2nd edition, C.A.K. Borrebaeck, Ed., Oxford Univ. Press (1995)に記載されている。タンパク質工学の一般的な原理は、Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., et al., Eds., IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng. (1995)に記載されている。抗体および抗体-ハプテン結合の一般的な原理は、Nisonoff, A., Molecular Immunology, 2nd ed., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); およびSteward, M.W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman and Hall, New York, NY (1984)に記載されている。さらに、当技術分野において公知のおよび明記されていない免疫学の標準的な方法は、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al. (eds) , Basic and Clinical -Immunology (8th ed.), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)およびMishell and Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., New York (1980)などで概ね理解される。
【０２４５】
免疫学の一般的な原理を記載している標準的な参考資料は、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Kennett, R., et al., eds., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980); Campbell, A., 「Monoclonal Antibody Technology」 in Burden, R., et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevere, Amsterdam (1984), Kuby Immunnology 4th ed. Ed. Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt and Barbara A. Osborne, H. Freemand & Co. (2000); Roitt, I., Brostoff, J. and Male D., Immunology 6th ed. London: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. and Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology Ed. 5, Elsevier Health Sciences Division (2005); Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer Verlan (2001); Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (2001); Lewin, Genes VIII, Prentice Hall (2003); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer Cold Spring Harbor Press (2003)を含む。
【０２４６】
上記に引用されている参考文献の全て、および本明細書において引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４７】
実施例
材料および方法
可溶性β2m-CD1d (「CD1d」)およびβ2m-CD1d-4D5 scFv融合(「CD1d融合」)タンパク質の構築。マウスベータ2-ミクログロブリン(β2m)、可溶性CD1、およびマウス抗HER2抗体一本鎖4D5 scFvをPCRによってクローニングした。RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて、CD1dトランスフェクトマウスRMA.S細胞株から総RNAを抽出した。抗HER2抗体部分の場合、マウス抗HER2抗体4D5に由来するscFv断片を含有するプラスミドpIG6-4D5を、鋳型として使用した(Worn, A., and Pluckthun, A. FEBS Lett: 427, 357-361 (1998))。手短に言えば、マウスβ2m全体を、引き続きPEAK 8発現ベクター(EdgeBioSystems, MD, USA)にクローニングするためのN末端のHind III部位で、および柔軟性のグリシン/セリンリッチペプチドリンカーをコードする配列
2010519255.tif 000020
を挿入したCD1dのa1ドメインのN末端配列にマウスβ2m全体をライゲーションするためのそのC末端のNhe I部位で、増幅した。このPCRに用いたプライマーは、
2010519255.tif 000021
および
2010519255.tif 000022
であった。可溶性CD1d断片のC末端を小さなリンカー(SSGSGG (SEQ ID NO:15))を介して6×Hisタグに直接的に融合する(可溶性β2m-CD1dの場合)か、上記のその柔軟性のリンカー(GGGGSGGSGSGGG (SEQ ID NO:12))およびNar I制限部位を介して4D5 scFv断片のN末端にライゲーションする(CD1d-4D5融合体の場合)かした。このPCRのプライマーは
2010519255.tif 000023
であった。抗HER2 4D5 scFvのDNA断片をそのC末端で小さなグリシン/セリンリッチリンカー(SSGSGG (SEQ ID NO:18)、続いて6×Hisタグ、停止コドンおよびサブクローニング用のNot I部位に融合した。このPCRプライマーは
2010519255.tif 000024
であった。Pwoポリメラーゼ(Roche)を用いてPCRを行い、増幅されたDNA断片をpCR(登録商標)-Bluntベクター(Invitrogen)にクローニングし、配列決定して、突然変異が導入されていないことを確実にした。記載の制限部位を用い2部または3部構成のライゲーション反応を行ってpEAK8発現ベクター(EdgeBiosystems)へのサブクローニングと同時に、β2mおよびリンカーを可溶性CD1dに連結し、融合の場合には、4D5 scFv DNA部分に連結した。
【０２４８】
一過性トランスフェクションによる組換えタンパク質の産生。ヒト細胞株HEK293EBNAを、回転式振盪機(Kuhner AG, Switzerland)に置いた1リットルのガラス瓶中、Excell(商標)-293培地(JRH Biosciences, Lexana, KS)での無血清浮遊増殖に適応させた。浮遊培養での大規模トランスフェクションのため、細胞を(25 mM Hepes, Cambrex Biosciences, Verviers, Belgiumを含む)無血清RPMI培地中に細胞2×106個/mlの密度で播種し、Baldi, L., et al. Biotechnol Prog 21:148-153 (2005)に記載されているように、直鎖状25 kDのポリエチレンイミンを用いてトランスフェクトした。1% (25 ng/mlに相当する) pEGFP-N1プラスミドDNA (Clontech, Palo Alto, CA)をDNA/PEI混合物に添加することにより、蛍光光学顕微鏡(Zeiss Axiovert)下でのトランスフェクション効率の直接的目測が可能になった。トランスフェクションから4時間後、1容量のPro-293s培地(Cambrex)を添加することによって培養物を希釈した。6日後、培養物を遠心分離し、タンパク質精製のために上清を取っておいた。
【０２４９】
CD1dに負荷する組換えタンパク質およびαGalCerの親和性精製。Hisタグ付の可溶性CD1dおよびCD1d-4D5融合タンパク質を、バッチ式のNi-NTA樹脂(Ni-NTA Superflow, QIAGEN)を用いてHEK293上清から精製し、結合したタンパク質を0.25 Mイミダゾールで溶出した。純度を10% SDS-PAGEにて分析した。バッチに依り、収量は純粋な可溶性または抗HER2 CD1d融合タンパク質の上清1 Lあたり10 mgにまで達することができた。精製後、CD1dに3倍モル過剰のαGalCerを終夜RTで負荷し、未結合の糖脂質をFPLC (Superdex(商標) 200またはSephacryl S100, Pharmacia Biotech)によって除去した。HER2腫瘍抗原との結合およびCD1dタンパク質の適切な折り畳みを、抗His mAbまたは抗CD1d mAb (BD Biosciences)のいずれかを用いたフローサイトメトリーによりB16-HER2およびSKBR3標的細胞株にて評価した。
【０２５０】
CD1d四量体の作出。このために、可溶性β2m-CD1d分子を、ヒスチジン残基のひと続きの後にシステインを付加することによりC末端で修飾した。30分間30℃での0.5 mM β-メルカプトエタノールによる温和な還元およびPD10脱塩カラムに対する精製の後、純粋な組換えタンパク質をシステイン残基にて、2 M過剰のビオチン-マレイミドリンカー(EZ-linked BM, Pierce)の化学的カップリングにより終夜RTでビオチン化した。Superdex S200カラム(Pharmacia Biotech)のゲルろ過により過剰のリンカーを除去した。ビオチン化CD1dに上記のようにαGalCerを負荷し、エクストラアビジン-PE (Sigma)にて四量体化し、得られた複合体をNKT細胞染色のために5 μg/mlで使用した。
【０２５１】
マウス、細胞株および抗体。6〜8週齢の雌性マウスC57BL/6をHarlan (Zeist, Holland)から購入した。B16-F10黒色腫細胞株(ATCC/CRL-6475)にヒトHER2抗原(Cesson, V., et al. Clin Cancer Res 12:7422-7430 (2006))を安定的にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を1.2 mg/ml G418で選択し、未処置マウスの静脈内に(i.v.)移植した。HER2高発現クローンを肺転移巣から樹立し、10% FCS、抗生物質および1.2 mg/ml G418を補充したDMEM中で増殖した。10 μg/mlのヒト化抗HER2モノクローナル抗体ハーセプチン(Herceptin) (トラスツズマブ(Trastuzumab), Hoffmann-La-Roche)およびヤギ抗ヒトIgG-FITC (Sigma)を用いたフローサイトメトリー(BD FACScan)により、HER2の発現をモニターした。その他全ての抗体は、特別の定めのない限り、Becton Dickinson (BD Biosciences)から得た。使用したソフトウェアはCell Quest (BD Biosciences)であった。
【０２５２】
肝臓、肺および脾臓リンパ球の単離。マウス肝臓および肺を100 μmのこし器でホモジナイズし、Percoll密度勾配(Amersham Biosciences)を用いてリンパ球を単離した。2回の洗浄の後、細胞を再曝露するか、蛍光サイトメトリーにより直接的に分析するかした。脾臓を70 μmのこし器でホモジナイズし、残屑を自然沈降によって取り除き、脾細胞を遠心分離によって回収した。それらを次いで、製造元(Myltenyi Biotec)の推奨にしたがい抗CD19 MACSマイクロビーズとのインキュベーションおよびLDカラムに対する溶出によりB細胞から枯渇させた。
【０２５３】
血清中サイトカイン。血清中TNFαをR&D Systems Inc. (Minneapolis, USA)のQuantikine免疫アッセイキットにより測定した。
【０２５４】
肺転移の定量化。ProgRes-C10plus Color Camera (Jenoptik, Jena, Germany)を備えたZeiss Stemi SV11解剖顕微鏡(Carl Zeiss Jena Germany)で撮影された、臓器全体の2560×1920ピクセルの写真にて転移小結節の表面積を測定した。k-平均法クラスタリングアルゴリズム(ij-plugins.sourceforge.netにて利用可能なプラグイン)を用いImageJプログラム(rsb.info.nih.gov/ij/)で各画像を解析した。画像を9つの区分(クラスタ許容値1×10-4、ランダム化の種: 48)に分割し、適切な区分を臓器の表面に達した転移の色に基づいて選択した。選択した色区分の合計の領域を肺によって占められる領域の割合として表現した。両側の肺を解析した。この方法では腫瘍小結節の数もサイズもともに考慮に入れている。小結節は不均質であることが多いので、転移性肺表面積の割合は腫瘍小結節を単に数えるよりも感度の高い腫瘍増殖の尺度である。
【０２５５】
実施例1
組換えαGalCer負荷CD1d分子の反復注射によるiNKT細胞の持続的活性化
本実施例は、αGalCerを負荷したCD1dの可溶性単量体型がインビトロにおいておよびインビボにおいてマウスiNKT細胞を十分に活性化できること、ならびにこの活性化が複合体それ自体によるものであり、インビボでのαGalCer放出によるものではないことを実証する。特に、本実施例は、αGalCer/sCD1dおよびαGalCer/CD1d-抗HER2 (抗Her2抗体のscFv断片に連結されたαGalCer/sCD1d)の反復注射後にiNKT細胞が反応性のままであることを明らかにする。これは、一回の注射後に無反応を誘導することが以前に明らかにされたαGalCerだけでの刺激とはかなり違っている。iNKT活性化のパラメータはinvTCR (NKT細胞のインバリアントT細胞受容体)の下方調節、IFNγの産生、全身処置中のiNKT増発および前処置後の腫瘍成長に対する耐性を含む。
【０２５６】
InvTCRの下方調節: 遊離αGalCer (5 μg)、αGalCerを負荷したまたは負荷していない、sCD1d (20 μg)およびCD1d-抗HER2融合体(40 μg)を6群のマウス5匹に腹腔内注射した。マウスを20時間後に殺処理した。肝臓リンパ球を上記のように調製し、FACSによる解析のためαGalCer/CD1d四量体 + 抗-CD3で染色した。図1は、inv TCRの下方調節が遊離αGalCerまたはαGalCerを負荷した組換えCD1d分子のいずれかの一回の注射後に起きたことを示している。以下の実験では、その二通りの刺激様式の効果(outcome)が異なるので、この結果がインビボでのαGalCer放出によるものではなく、複合体それ自体での直接刺激によるものであることを実証する。
【０２５７】
反復静脈内(i.v.)注射後のIFNγの持続的産生: サイトカインの産生を細胞内サイトカイン染色(ICCS)により試験した。処置マウス(3日ごとに静脈内(i.v.)注射5〜6回)由来の肝臓および脾臓リンパ球(2×106/ml)を200 ng/ml αGalCerによりまたはプラスチックにコーティングされた抗His抗体に結合しているαGalCer/CD1d-抗HER2融合体(10 μg/ml)により「インビトロにおいて」または「エクスビボにおいて」活性化した。Golgi Plug (BD)を1時間後に添加して分泌を遮断し、計6時間のインキュベーション後に、活性化リンパ球を異なる抗体の組み合わせで染色してNKT細胞をゲートオンした。抗CD3-FITCを、通常は、αGalCer-CD1d四量体-PEで試験しまたは、NKT TCRの下方調節の場合には、抗CD3-FITCをNK1.1-PerCPとともに用いた。固定化およびCytofix/Cytoperm (BD)による透過化の後、細胞内IFNγを、APC標識抗IFNγモノクローナル抗体で検出した。FACS Calibur (Cell Quest Software; BD)でのフローサイトメトリーによって細胞を解析した。静脈内(i.v.)注射後のエクスビボ測定の場合、手順は、6時間のインキュベーションを省いたこと以外は同様であった。図2はこれらの結果をまとめている。「エクスビボ」測定の場合、肝臓および脾臓細胞を解析し(図2a)、その一方で、「インビトロ」解析の場合、データは肝臓細胞だけを示している(図2b)。この二つの設定において、αGalCer/CD1d-抗HER2融合体および可溶性αGalCer/sCD1dはiNKTを刺激して、同じ材料でのインビボ反復刺激後にIFNγを産生したのに対し、遊離αGalCerは未処置(PBS対照)マウスにおいて活性なだけで、αGalCer処置マウスにおいてはそれほど効果がないことが結果から実証される。相当量のIL-4はどのマウスでも測定されず(データ不掲載)、これらの条件の下で、活性化iNKT細胞は、炎症促進性サイトカインの偏りを来たすことが示唆された。
【０２５８】
全身処置中のiNKT細胞の増発: 図3に示されるように通常、iNKT細胞はマウス末梢血において検出可能でない。対照的に、それらは組換えαGalCer/CD1d分子での全身処置によって明らかに検出可能となったが、αGalCerだけでは変化が認められなかった。図3aは、PBS、遊離αGalCer、αGalCer/CD1d-抗HER2またはαGalCer/sCD1dのいずれかの三回目の注射(1群あたりマウス5匹、3日ごとに静脈内(i.v.)注射)から3日後のPBMCに対するCD1d-四量体 + 抗-CD3でのFACS染色の代表的なドットプロットを示す。iNKTの割合を図3bに示す。
【０２５９】
前処置は腫瘍防御をもたらす: 組換えαGalCer/CD1d分子によるiNKT細胞の持続的活性化が以下の実験によってさらに実証された。αGalCer/sCD1dの5回連続の静脈内(i.v.)注射(3日ごとに5×25 μg)によるマウスの前処置では、それらを、αGalCer/sCD1d (25 μg)と同時に注射されたB16黒色腫細胞(細胞700,000個)に抵抗性とした(図4)。Parekh et al. Parekh, V.V. et al. J Clin Invest 115:2572-2583 (2005)によって既報のように、遊離αGalCer (5×0.4 μg)で前処置されたマウスでは、αGalCerを腫瘍細胞と同時に注射した場合、肺転移を遮断することができなかった。これは遊離αGalCerによって誘導されたiNKT細胞のアネルギー状態による可能性が最も高い。対照的に、未処置マウスでは、反対の結果が得られた。αGalCerだけの同時注射では腫瘍成長を完全に遮断したが、αGalCer/sCD1dの同時注射では効果がなかった。重要な所見は、αGalCerを負荷した組換えCD1d分子の複数回の事前注射では腫瘍成長に対する抵抗性が与えられるが、遊離αGalCerの複数回の事前注射では腫瘍成長に対する抵抗性が与えられないということである。これは、腫瘍細胞に対する細胞障害活性を直接的におよび/またはNK細胞のような他の細胞の活性化を通じて間接的に示すiNKT細胞の持続的活性化を支持している。
【０２６０】
実施例2
αGalCer/CD1d-抗HER2融合タンパク質は、HER2を発現している腫瘍に標的化される場合に抗腫瘍活性を有する
本実施例は、CD1dを抗腫瘍抗体断片に融合することにより、iNKT細胞の持続的活性化を腫瘍部位に方向転換できることを実証する。
【０２６１】
プレコーティング実験: 抗HER2 scFvに融合されているまたは融合されていないαGalCer/CD1dの抗腫瘍活性を試験するための最初のアプローチとして、野生型B16黒色腫またはヒトHER2抗原を安定的にトランスフェクトしたB16黒色腫を、未処置マウスに静脈内(i.v.)注射する前に、(i) αGalCerだけ; (ii) αGalCer/CD1d-抗HER2融合体; (iii) αGalCer/sCD1d; または(iv) インタクトな抗HER2 mAb (ハーセプチン)のいずれかとともにプレインキュベートした(図5a、b)。Kawano, T. et al. Science 278:1626-1629 (1997)によって既報のように、腫瘍細胞とαGalCerの同時注射では、腫瘍細胞がHER2抗原を発現していたかまたは発現していなかったかにかかわらず、腫瘍成長を完全に阻害した。この影響は腫瘍細胞表面とのαGalCerの一過性の結合により、または、遊離αGalCerの一過性の取り込みにより引き起こされ得る。対照的に、αGalCer/CD1d-抗HER2融合体は、HER2が腫瘍細胞に発現された場合にだけ腫瘍転移を阻害した。この効果は腫瘍細胞の数回の洗浄後でさえも維持されていたので、この抗腫瘍効果は特異的に結合された抗HER2融合タンパク質によるものであることが示唆された。インタクトな抗HER2 mAbはB16-HER2腫瘍細胞の肺転移を阻害することができなかったので、結合した融合タンパク質の抗腫瘍効果はNKT細胞媒介性であることが支持された。また、可溶性αGalCer/sCD1dは野生型B16黒色腫細胞の腫瘍増殖を遮断することができなかったので、組換えCD1d分子が転移発生を遮断するには腫瘍細胞に結合される必要のあることが確認された。これらのプレコーティングの設定において、CD1d-抗HER2の抗腫瘍活性は、腫瘍細胞と同時に注射した遊離αGalCerの既に最適な効果よりも優れてはいなかった。しかしながら、HER2結合に対する依存から、CD1d-抗HER2融合体はHER2発現がん細胞に効果的に標的化されることが可能であり、iNKT細胞を腫瘍部位に方向転換できることが示唆される。さらに、これらの結果は、HER2依存性の抗腫瘍活性がαGalCer/CD1d-抗HER2それ自体によるものであり、インビボでのαGalCer放出によるものではないことも実証している。
【０２６２】
全身処置: プレコーティング実験で得られた成功を考慮して、B16-HER2黒色腫細胞の注射後の異なる時点で全身処置を開始した。図6aは、B16-HER2腫瘍細胞を注射してから48時間後に処置を始めた場合に得られた結果を図示している。マウス5匹からなる各群における腫瘍転移の平均を、材料および方法に記載したように定量化された、メラニン負荷小結節により侵入された肺表面の割合として表現している。腫瘍移植から2日後に開始した一連の5回の注射で投与された遊離αGalCerでは、顕著な抗腫瘍効果がなかった。対照的に、同じ日程で投与されたαGalCer/CD1d-抗HER2融合タンパク質では、未処置動物での35%と比べ、メラニンにより侵入されたのは肺の平均7% (p<0.005)と、強力な抗転移効果があった。腫瘍細胞の注射から6日後に処置が開始された場合でさえ、αGalCer/CD1d-抗HER2融合タンパク質は依然として、未処置マウスまたは遊離αGalCer処置マウスにおけるよりも60%転移が低く(p<0.01)、顕著な抗腫瘍効果を及ぼした(図6b)。興味深いことに、αGalCer/sCD1dによる処置は、大きな標準偏差から明らかなようにマウス個体間で非常に変わりやすい抗腫瘍活性を有していた(図6a)。これは、NKT TCRの下方調節の実験によって、可溶性αGalCer/sCD1dがCD1d-抗HER2融合体と同程度に機能的であること(図1)が実証されたという事実にもかかわらずである。
【０２６３】
要するに、αGalCer/CD1d-抗HER2融合タンパク質で得られた効率的な抗腫瘍活性は、活性化iNKT細胞が、腫瘍部位に効率的に方向転換されうることを示唆している。最も重要なことに、これらの実験から、実施例1で説明されるように、NKT細胞は、この場合、抗HER2 scFvに連結された、CD1dに結び付けて投与されたαGalCerで繰り返し刺激され、同様に非標的化されうることがかさねて実証される。
【０２６４】
実施例3
組換えCD1d分子により活性化されたiNKTは、NK細胞、DCおよびTリンパ球をトランス活性化するその能力を保持している
特異的抗原がない場合: 遊離αGalCerまたはαGalCerパルス樹状細胞での活性化によってNK細胞、DC細胞およびT細胞をトランス活性化するiNKT細胞の能力は、これまでにいくつか報告されている(Nieda, M., et al. Blood 103:383-389 (2004); Hermans, I.F., et al. J Immunol 171:5140-5147 (2003); Smyth, M.J., et al. J Exp Med 201:1973-1985 (2005))。本実施例は、iNKTのこれらの調節特性が組換えαGalCer/sCD1d複合体でのその活性化によって保持されていたことを実証する。NK細胞に関して、その発生頻度は、NK1.1+ CD3-細胞集団の増加によって示されるように、遊離αGalCerのまたは抗HER2の有無にかかわらずαGalCer/sCD1dの一回の注射後に増加した(図7a)。DC成熟のマーカーをまた、実施例1に記載したように、全身処置の終了時に単離された脾細胞の5日間のインビトロ培養後に解析した。CD11c+ CD40+二重陽性細胞の割合はαGalCer/sCD1dによるインビトロ刺激後に増加し、活性化iNKT細胞がDC成熟を促進することが示唆された(図7b)。インビトロでのDCに及ぼすαGalCer/sCD1dのこのプラス効果は、αGalCerまたはαGalCer/sCD1d処置マウス由来の脾細胞において見られたが、αGalCerだけではどのマウスでも効果がなかった。CD1d四量体およびNK1.1が陰性のCD3+細胞の通常のT細胞集団を同一の脾細胞培養物において解析したところ、それは、組換えαGalCer/sCD1d複合体によるインビトロ刺激後に著しく増加したが、αGalCerだけでは有意な効果がなかった(図7c)。刺激なしの全脾臓細胞の7%から、CD3+細胞の割合は未処置マウス、αGalCer処置マウスおよびαGalCer/sCD1d処置マウスにおいてそれぞれ、17%、27%および30%に増加した。対照的に、αGalCerだけではどのマウスでも有意な効果がなかった(図7c)。
【０２６５】
活性なOVA免疫化とともに: アジュバント効果が遊離αGalCerにはあるものとこれまでに考えられており、ワクチン接種におけるその潜在的用途が提唱されている(Silk, J.D., et al. J Clin Invest 114:1800-1811 (2004))。本発明のデータは、遊離αGalCerに比べてαGalCer/sCD1dが優れたアジュバント特性を持ちうることを示唆する。これに関連して、オボアルブミンで免疫化されたC57 BL/6マウスモデルにおける抗原特異的T細胞の増殖に及ぼすアジュバント効果が調べられている(Hermans, I.F. , et al. J Immunol 171:5140-5147 (2003))。初回抗原刺激した後に、特異的なH-2Kb/OVA257-264四量体CD8二重陽性T細胞は、αGalCer/sCD1dとともにオボアルブミン200 μgを投与されたマウスにおいてのみ検出することができたが、H-2Kb/OVA257-264四量体CD8二重陽性T細胞は、アジュバントとしてモンタニドまたは遊離αGalCerとともに抗原の同一量で初回抗原刺激されたマウスでは検出することができなかった(図8a)。さらに、インビボにおいてこれらの同じマウスを同一アジュバント中のOVAペプチドで追加免疫し、次いでさらには刺激せずに5日間インビトロにおいて培養した後に、脾臓中のKb/OVA特異的CTLの発生頻度は、αGalCer/sCD1dとともにOVAペプチドの追加免疫を受けたマウスにおいて全CD8の45%までに達したが、ペプチドおよびαGalCerだけで追加免疫されたマウスでは発生頻度が12%であった(図8b)。さらなる増加は同じ各刺激によるインビトロでの再刺激によって得ることができ、特異的T細胞の発生頻度はαGalCer処置マウスにおいてもαGalCer/sCD1d処置マウスにおいてもともに70%近くに達した(図8b)。同じ培養物において、CD11c+CD40+ FACS染色によって示されるとおり、同様に、αGalCer/sCD1dでの再刺激後の成熟DCの発生頻度の増加が認められたが、遊離αGalCerでは認められなかった(図8c)。
【０２６６】
本明細書において引用される全ての刊行物(特許、特許出願、学術論文、実験室マニュアル、書籍、または他の書類を含む)の開示全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年10月23日(2009.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010519255000001.app
【国際調査報告】
2010519255.tif 000036
2010519255.tif 000037
2010519255.tif 000038