(57)【要約】患者における、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）に対する血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）の濃度の比を利用する線維化関連障害の治療のための組成物および方法が提供される。その方法は、ＦｃγＲＩＩＡのＲ１３１／Ｈ１３１多型を決定するステップをさらに含んでもよい。診断法もまた提供される。本発明はまた、患者における線維化関連障害を治療し、予防し、またはその重症度を低下させるための方法をさらに提供する。ＣＲＰおよびＳＡＰの濃度を生物学的サンプルから測定して、ＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者が線維化関連障害を発症する危険性を決定する方法であって、
（ｉ）該患者の生物学的サンプルにおけるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）の濃度を測定してＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するステップと、
（ｉｉ）１つまたは複数の基準ＳＡＰ対ＣＲＰ比と、ステップ（ｉ）から決定されたＳＡＰ対ＣＲＰ比を比較するステップと、
（ｉｉｉ）該１つまたは複数の基準比よりも少なくとも１０％低いＳＡＰ対ＣＲＰを、該患者が線維化関連障害の危険性にさらされている指標と解釈するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子のＲ１３１／Ｈ１３１多型について該患者の第２の生物学的サンプルをアッセイするステップをさらに含み、該ステップは、前記患者の両方のＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子における１３１位のアミノ酸残基を決定するステップを含み、１つまたは複数の基準比よりも少なくとも５％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比が、該患者の一方または両方の該対立遺伝子がＲ１３１である場合に該患者が線維化関連障害の危険性にさらされている指標と解釈される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者における線維化関連障害の状態を診断する方法であって、
（ｉ）該患者から生物学的サンプルを得るステップと、
（ｉｉ）該生物学的サンプルのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）の濃度を測定するステップと、
（ｉｉｉ）該生物学的サンプルにおけるＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するステップと、
（ｉｖ）１つまたは複数の基準ＳＡＰ対ＣＲＰ比と、ステップ（ｉ）から決定されたＳＡＰ対ＣＲＰ比を比較するステップと、
（ｖ）該１つまたは複数の基準比よりも少なくとも２０％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有する患者において線維化関連障害を診断するステップと
を含む方法。
【請求項４】
患者における線維化関連障害を治療し、予防し、またはその重症度を低下させるための方法であって、
（ｉ）該患者の生物学的サンプルにおけるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）の濃度を測定してＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するステップと、
（ｉｉ）１つまたは複数の基準ＳＡＰ対ＣＲＰ比と、ステップ（ｉ）から決定されたＳＡＰ対ＣＲＰ比を比較するステップと、
（ｉｉｉ）該１つまたは複数の基準比よりも少なくとも１０％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有する該患者に抗線維化療法を施すステップと
を含む方法。
【請求項５】
前記患者の両方のＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子における１３１位のアミノ酸残基を決定するステップを含む、ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子のＲ１３１／Ｈ１３１多型について該患者の第２の生物学的サンプルをアッセイするステップをさらに含み、１つまたは複数の基準比よりも少なくとも５％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比が、該患者の一方または両方の該対立遺伝子がＲ１３１である場合に該患者が線維化関連障害の危険性にさらされている指標と解釈される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
患者における線維化関連障害の治療を調整するための方法であって、
（ｉ）該患者の生物学的サンプルにおけるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）の濃度を測定してＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するステップと、
（ｉｉ）決定されたＳＡＰ対ＣＲＰ比を１つまたは複数の基準ＣＲＰ対ＳＡＰ比と比較するステップと、
（ｉｉｉ）該１つまたは複数の基準比よりも低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有する該患者に抗線維化療法を施すステップと、
（ｉｖ）該患者の生物学的サンプルにおけるＣＲＰおよびＳＡＰの濃度を測定して第２のＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するステップと、
（ｖ）該線維化関連障害を治療するための目標比以上のＳＡＰ対ＣＲＰ比を達成するために、該抗線維化療法の投薬の投薬量または頻度を調整するステップと
を含む方法。
【請求項７】
ステップ（ｉｖ）および（ｖ）が、少なくとも１回、２回、３回、またはそれ以上繰り返される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記基準比が、約５〜約６０の間にある、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
測定されたＣＲＰおよびＳＡＰの濃度が、ＣＲＰおよびＳＡＰの遊離濃度である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的サンプルが、血清または血漿である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗線維化療法が、１つまたは複数のＳＡＰアゴニスト、ＣＲＰアンタゴニスト、またはその組合せの投与を含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
患者における線維化関連障害を治療し、予防し、またはその重症度を低下させるための方法であって、該障害を治療し、予防し、またはその重症度を低下させる必要のある患者に、治療有効量の１つまたは複数のＣＲＰアンタゴニストおよび１つまたは複数のＳＡＰアゴニストを一緒に投与するステップを含む方法。
【請求項１３】
前記ＳＡＰアゴニストが、ＳＡＰシグナル伝達を増加させる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＳＡＰアゴニストが、ＳＡＰシグナル伝達を模倣する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＳＡＰアゴニストが、ＳＡＰ活性を増加させる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳＡＰアゴニストが、ＳＡＰ発現を増加させる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＳＡＰアゴニストが、血清ＳＡＰレベルを増加させる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＳＡＰアゴニストが、小分子、核酸、またはポリペプチドから選択される、請求項１１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＳＡＰアゴニストが、ＳＡＰポリペプチドから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＳＡＰアゴニストが、抗ＦｃγＲＩ抗体、抗ＦｃｇＲＩＩＡ抗体、抗ＦｃｇＲＩＩＩ抗体、架橋抗ＦｃｇＲ抗体、凝集ＩｇＧ抗体、または架橋ＩｇＧ抗体から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
患者における線維化関連障害を治療し、予防し、またはその重症度を低下させるための方法であって、
（ｉ）線維化関連障害に罹患した患者を同定するステップと、
（ｉｉ）該患者の生物学的サンプルにおけるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度を測定するステップと、
（ｉｉｉ）１つまたは複数の基準値よりも少なくとも１０％高いＣＲＰ濃度を有する患者に１つまたは複数のＣＲＰアンタゴニストを投与するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子のＲ１３１／Ｈ１３１多型について前記患者の第２の生物学的サンプルをアッセイするステップをさらに含み、該ステップが、該患者の両方のＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子における１３１位のアミノ酸残基を決定するステップを含み、抗線維化療法が、該患者の一方または両方の対立遺伝子がＲ１３１である場合に１つまたは複数の基準値よりも少なくとも５％高いＣＲＰ濃度を有する患者に施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記基準値が、０．１μｇ／ｍｌ〜３μｇ／ｍｌの間にある、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
測定されたＣＲＰの濃度が、ＣＲＰの遊離濃度である、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物学的サンプルが、血清または血漿である、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記線維化関連障害が、アテローム性動脈硬化症ではない、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、ＣＲＰシグナル伝達を減少させる、請求項１１、１２、または２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩに結合するＣＲＰを減少させる、請求項１１、１２、または２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、ＣＲＰ発現を減少させる、請求項１１、１２、または２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、ＣＲＰの血清レベルを低下させる、請求項１１、１２、または２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、ＣＲＰの活性を低下させる、請求項１１、１２、または２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、小分子、核酸、またはポリペプチドから選択される、請求項１１、１２、２１、または２７から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、ＩＬ−１０の産生を減少させる、請求項１１、１２、２１、または２７から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、ＴＧＦβの産生を減少させる、請求項１１、１２、２１、または２７から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、抗血小板薬、スタチン、コレステロール吸収の阻害剤、抗高脂血症薬、ナイアシン、抗糖尿病薬、β−アドレナリン受容体アンタゴニスト、酸化防止剤、ＡＣＥ阻害剤、ＩＬ−６阻害剤、１１−ベータヒドロキシラーゼ阻害剤、およびアンギオテンシン受容体遮断薬から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、抗ＣＲＰ抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、抗ＦｃγＲＩ抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
患者における線維化関連障害の治療を提供するためのキットであって、（ｉ）１つまたは複数のＣＲＰアンタゴニストおよび（ｉｉ）１つまたは複数のＳＡＰアゴニストを含み、（ｉ）および（ｉｉ）が、一緒に投与されるように製剤されるキット。
【請求項４１】
前記ＳＡＰアゴニストが、ＳＡＰシグナル伝達を増加させる、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記ＳＡＰアゴニストが、ＳＡＰシグナル伝達を模倣する、請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
前記ＳＡＰアゴニストが、ＳＡＰ活性を増加させる、請求項４０に記載のキット。
【請求項４４】
前記ＳＡＰアゴニストが、ＳＡＰ発現を増加させる、請求項４０に記載のキット。
【請求項４５】
前記ＳＡＰアゴニストが、血清ＳＡＰレベルを増加させる、請求項４０に記載のキット。
【請求項４６】
前記ＳＡＰアゴニストが、小分子、核酸、またはポリペプチドから選択される、請求項４０から４５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４７】
前記ＳＡＰアゴニストが、ＳＡＰポリペプチドまたはその変異体から選択される、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記ＳＡＰアゴニストが、抗ＦｃγＲＩ抗体、抗ＦｃｇＲＩＩ抗体、抗ＦｃｇＲＩＩＩ抗体、架橋抗ＦｃγＲ抗体、凝集ＩｇＧ抗体、または架橋ＩｇＧ抗体から選択される、請求項４６に記載のキット。
【請求項４９】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、ＣＲＰ発現を減少させる、請求項４０に記載のキット。
【請求項５０】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、ＣＲＰの血清レベルを低下させる、請求項４０に記載のキット。
【請求項５１】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、ＣＲＰ活性を低下させる、請求項４０に記載のキット。
【請求項５２】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、ＣＲＰシグナル伝達を低下させる、請求項４０に記載のキット。
【請求項５３】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩに結合するＣＲＰを低下させる、請求項４０に記載のキット。
【請求項５４】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、ＩＬ−１０の産生を減少させる、請求項４０に記載のキット。
【請求項５５】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、ＴＧＦβの産生を減少させる、請求項４０に記載のキット。
【請求項５６】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、小分子、核酸、またはポリペプチドから選択される、請求項４０から５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５７】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、抗血小板薬、スタチン、コレステロール吸収の阻害剤、抗高脂血症薬、ナイアシン、抗糖尿病薬、β−アドレナリン受容体アンタゴニスト、酸化防止剤、ＡＣＥ阻害剤、およびアンギオテンシン受容体遮断薬から選択される、請求項４０に記載のキット。
【請求項５８】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、抗ＣＲＰ抗体である、請求項４０に記載のキット。
【請求項５９】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、抗ＦｃγＲＩ抗体である、請求項４０に記載のキット。
【請求項６０】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、抗ＦｃγＲＩＩ抗体である、請求項４０に記載のキット。
【請求項６１】
前記ＣＲＰアンタゴニストが、抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体である、請求項４０に記載のキット。
【請求項６２】
線維化関連障害を治療し、予防し、またはその重症度を低下させる必要性のある患者において、該障害を治療し、予防し、またはその重症度を低下させるための方法であって、（ａ）該患者の両方のＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子における１３１位のアミノ酸残基を決定することによって、ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子のＲ１３１／Ｈ１３１多型について該患者の生物学的サンプルを分析するステップと、（ｂ）該患者に最も有効な治療計画を選択するステップとを含む方法。
【請求項６３】
前記治療計画が、ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子の一方または両方において１３１位にヒスチジンを有する患者におけるＳＡＰアゴニストの投与を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記治療計画が、ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子の一方または両方において１３１位にアルギニンを有する患者におけるＣＲＰアンタゴニスト、ＳＡＰもしくはＳＡＰアゴニスト、またはその組合せの投与を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
投与されるＳＡＰまたはＳＡＰアゴニストの量が、患者におけるＣＲＰのレベルに依存する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
診断業務を行うための方法であって、
（ｉ）生物学的サンプルを受け取るステップと、
（ｉｉ）前記生物学的サンプルにおいて、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）の濃度を測定するステップと、
（ｉｉ）該生物学的サンプルにおけるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）の濃度の報告書を作成するステップと
を含む方法。
【請求項６７】
測定されたＳＡＰおよびＣＲＰの濃度が、ＳＡＰおよびＣＲＰの遊離濃度である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記生物学的サンプルが、血清または血漿である、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
ＳＡＰ対ＣＲＰの比を決定するステップをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記報告書が、ＳＡＰ対ＣＲＰの比を含有する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
患者が線維化関連障害を発症する危険性の評価に有用なデータを決定するための方法であって、
（ｉ）該患者から生物学的サンプルを得るステップと、
（ｉｉ）該生物学的サンプルのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の濃度を測定するステップと、
（ｉｉｉ）両方のＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子における１３１位のアミノ酸残基を決定するステップを含む、ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子のＲ１３１／Ｈ１３１多型を決定するステップと
を含む方法。
【請求項７２】
前記生物学的サンプルのＳＡＰの濃度を測定するステップをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
測定されたＳＡＰおよびＣＲＰの濃度が、ＳＡＰおよびＣＲＰの遊離濃度である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記生物学的サンプルが、血清または血漿である、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７５】
ＳＡＰ対ＣＲＰの比を決定するステップをさらに含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
ＰＢＭまたは単球細胞において、ＣＲＰに対する応答性を決定するための方法であって、
（ｉ）ある濃度のＣＲＰとＰＢＭまたは単球細胞をインキュベートするステップと、
（ｉｉ）ＣＲＰが該細胞の線維細胞分化を活性化するかどうかを決定するステップと
を含み、線維細胞増殖の刺激が、該細胞がＣＲＰに応答性であることを示す方法。
【請求項７７】
ＣＲＰアンタゴニストの抗線維化作用に対する患者の応答性を決定するための方法であって、
（ｉ）患者からＰＢＭまたは単球細胞を得るステップと、
（ｉｉ）１つまたは複数の濃度のＣＲＰと、ＰＢＭまたは単球細胞をインキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）ＰＢＭまたは単球細胞における線維細胞分化のＣＲＰ誘発の程度を決定するステップと
を含み、線維細胞分化の誘発の程度が、ＣＲＰアンタゴニストに対する該患者の応答性を示す方法。
【請求項７８】
患者における、線維細胞分化を防止する最小ＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定する方法であって、
（ｉ）患者からＰＢＭＣまたは単球を得るステップと、
（ｉｉ）線維細胞分化の最大の刺激をもたらすのに必要な、ＣＲＰの最小濃度を決定するステップと、
（ｉｉｉ）線維細胞分化の量を＞９０％低下させるために、ステップ（ｉｉ）によって決定されるＣＲＰの濃度において必要なＳＡＰの濃度を決定するステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）において決定されるＳＡＰ濃度を、ステップ（ｉｉｉ）において決定されるＣＲＰ濃度で割ることによって、患者における線維細胞分化を防止するのに有効なＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、「ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ  ＡＮＤ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＦＩＢＲＯＳＩＳ  ＲＥＬＡＴＥＤ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題された、２００８年６月２７日に出願された実用出願の継続出願であり、この実用出願は、２００７年７月６日に出願された米国仮特許出願第６０／９５８，６３４号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。本願はまた、２００７年７月６日に出願された米国仮特許出願第６０／９５８，６３４号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
創傷治癒の一部としての組織修復のプロセスは、２つの段階を含む。第１段階は、再生段階であり、傷害細胞が、同じ型の細胞と交換される。第２段階は、線維増殖または線維化とも呼ばれる線維組織の形成であり、結合組織が、正常な実質組織に取って代わる。組織修復プロセスは、線維化段階が抑制されないままである場合、病原性のものとなり得、広範囲の組織リモデリングおよび永久的な瘢痕組織の形成に至る。
【０００３】
米国における、４５％までの死亡は、線維増殖性疾患に起因し得ることが推定されており、これは、多くの組織および器官系に影響を与え得る。主な器官線維性疾患は、肺炎症および線維化によって特徴づけられる間質性肺疾患（ＩＬＤ）を含む。ＩＬＤは、サルコイドーシス、珪肺症、コラーゲン血管疾患、および全身性強皮症などのいくつかの原因を有することが知られている。しかしながら、ＩＬＤの一般的な型である特発性肺線維症は、原因が知られていない。他の器官線維性障害は、肝硬変、Ｂ型またはＣ型慢性肝炎感染から結果として生じる肝線維症、腎疾患、心疾患、ならびに黄斑変性症ならびに網膜および硝子体の網膜症を含む眼疾患を含む。線維増殖性障害はまた、全身性および局所性の強皮症、ケロイド、および肥厚性瘢痕、アテローム性動脈硬化症、ならびに再狭窄を含む。さらなる線維増殖性疾患は、外科手術、化学療法剤誘発性の線維化、放射線誘発性の線維化、ならびに傷害およびやけどから結果として生じる過剰瘢痕を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、コルチコステロイドなどの一般的な免疫抑制剤および他の抗炎症性治療を含む治療が、線維性障害に利用可能である。しかしながら、線維化の調節に関与するメカニズムは、炎症のメカニズムから明確に区別できるように思われ、抗炎症性療法は、線維化を低下させるまたは予防するのにほとんど有効ではない。したがって、線維化を低下させ、予防しかつ線維性障害をコントロールするための治療を開発する必要が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本出願は、患者が線維化関連障害を発症する危険性を決定するための方法を提供する。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）の濃度を生物学的サンプルから測定して、ＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定する。この比を、１つまたは複数のＳＡＰ対ＣＲＰ基準比と比較する。１つまたは複数の基準比より少なくとも１０％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比は、患者が、線維化関連障害を発症する危険性にさらされている指標である。いくつかの実施形態において、患者の第２の生物学的サンプルをアッセイして、多型ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子の配列を決定する。Ｒ１３１多型の一方または両方の対立遺伝子および基準比よりも少なくとも５％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有する患者は、線維化関連障害を発症する危険性にさらされていることが示される。
【０００６】
本出願は、患者における線維化関連障害を診断する方法をさらに提供する。ＣＲＰおよびＳＡＰの濃度を生物学的サンプルから測定して、ＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定する。比を、１つまたは複数のＳＡＰ対ＣＲＰ基準比と比較される。１つまたは複数の基準比より少なくとも２０％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比は、患者が、線維化関連障害を発症する危険性にさらされている指標である。
【０００７】
本出願は、患者における線維化関連障害を治療し、予防し、またはその重症度を低下させるための方法をさらに提供する。ＣＲＰおよびＳＡＰの濃度を生物学的サンプルから測定して、ＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定する。比を、１つまたは複数のＳＡＰ対ＣＲＰ基準比と比較する。基準比よりも少なくとも１０％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有する患者に、抗線維化療法を施す。いくつかの実施形態において、患者の第２の生物学的サンプルをアッセイして、多型ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子の配列を決定する。Ｒ１３１多型の一方または両方の対立遺伝子および基準比よりも少なくとも５％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有する患者に、抗線維化療法を施す。
【０００８】
本出願は、患者における線維化関連障害の治療を調整するための方法をさらに提供する。患者のＣＲＰおよびＳＡＰの濃度を測定して、ＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定する。比を、１つまたは複数の基準ＳＡＰ対ＣＲＰ比と比較する。基準比よりも低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有する患者に、抗線維化療法を施す。患者のＣＲＰおよびＳＡＰの濃度を再度測定して、それに続く比を決定する。目標ＳＡＰ対ＣＲＰ比を達成するために、抗線維化療法の投薬の投薬量または頻度を調整する。
【０００９】
ＣＲＰおよびＳＡＰの濃度は、血清、血漿、健常組織、または線維性組織から測定することができ、ＣＲＰタンパク質またはＳＡＰタンパク質の総濃度としてまたは遊離濃度もしくは非結合濃度として測定することができる。測定は、線維化関連障害の治療を調整するためのプロセスにおいて繰り返し成されてもよい。基準比は、線維性組織と比較する場合、患者の健常組織のものであってもよい。基準比はまた、患者と同じ年齢および性別の対象のコホートから得ることができる。ＳＡＰ対ＣＲＰ比は、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５であってもよい。抗線維化療法は、ＣＲＰアンタゴニストおよび／またはＳＡＰアゴニストを含んでもよく、ＳＡＰアゴニストおよびＣＲＰアンタゴニストは、個々にまたは一緒に投与することができる。
【００１０】
本出願は、治療有効量の１つまたは複数のＣＲＰアンタゴニストおよび１つまたは複数のＳＡＰアゴニストを一緒に投与することによって、患者における線維化関連障害を治療し、予防し、またはその重症度を低下させるための方法をさらに提供する。
【００１１】
ＳＡＰアゴニストは、小分子、核酸、またはポリペプチドから選択することができる。ＳＡＰアゴニストは、ＳＡＰシグナル伝達を増加させることができ、ＳＡＰシグナル伝達を模倣することができ、ＳＡＰ活性を増加させることができ、ＳＡＰ発現を増加させることができ、または血清ＳＡＰレベルを増加させることができる。いくつかの実施形態において、ＳＡＰアゴニストは、ＳＡＰポリペプチド、ＦｃγＲ抗体（抗ＦｃγＲＩ、抗ＦｃγＲＩＩＡ、もしくは抗ＦｃγＲＩＩＩ）、架橋抗ＦｃγＲ抗体（抗ＦｃγＲＩ、抗ＦｃγＲＩＩＡ、もしくは抗ＦｃγＲＩＩＩ）、凝集ＩｇＧ抗体、または架橋ＩｇＧ抗体であってもよい。
【００１２】
本出願は、生物学的サンプルにおけるＣＲＰの濃度を決定することによって、患者における線維化関連障害を治療し、予防し、またはその重症度を低下させるための方法をさらに提供する。生物学的サンプルにおけるＣＲＰの濃度は、１つまたは複数のＣＲＰ基準値と比較される。１つまたは複数の基準値よりも少なくとも１０％高いＣＲＰ濃度には、１つまたは複数のＣＲＰアンタゴニストが投与される。いくつかの実施形態において、患者の第２の生物学的サンプルは、多型ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子の配列を決定するためにアッセイされる。Ｒ１３１多型の一方または両方の対立遺伝子および基準比よりも少なくとも５％高いＣＲＰ濃度を有する患者は、抗線維化療法を施される。いくつかの実施形態において、線維化関連障害は、アテローム性動脈硬化症ではない。
【００１３】
ＣＲＰの濃度は、血清、血漿、健常組織、または線維性組織から測定することができ、ＣＲＰタンパク質の総濃度としてまたは遊離濃度もしくは非結合濃度として測定することができる。測定は、線維化関連障害の治療を調整するためのプロセスにおいて繰り返し成されてもよい。基準比は、線維性組織と比較する場合、患者の健常組織のものであってもよい。基準比はまた、患者と同じ年齢および性別の対象のコホートから得ることができる。ＣＲＰ基準値は、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、または２０μｇ／ｍｌであってもよい。抗線維化療法は、ＣＲＰアンタゴニストおよび／またはＳＡＰアゴニストを含んでもよく、ＳＡＰアゴニスト、ＣＲＰアンタゴニストは、個々にまたは一緒に投与することができる。
【００１４】
ＣＲＰアンタゴニストは、小分子、核酸、またはポリペプチドから選択することができる。ＣＲＰアンタゴニストは、ＣＲＰシグナル伝達を減少させることができ、ＣＲＰ活性を減少させることができ、ＣＲＰ発現を減少させることができ、血清ＣＲＰレベルを減少させることができ、ＩＬ−１０の産生を減少させることができ、ＴＧＦ−βの産生を減少させることができ、またはＦｃγＲＩもしくはＦｃγＲＩＩＡもしくはＦｃγＲＩＩＩへのＣＲＰ結合を減少させることができる。いくつかの実施形態において、ＣＲＰアンタゴニストは、抗ＣＲＰ抗体、抗ＦｃγＲＩ抗体、抗ＦｃγＲＩＩ抗体、または抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、ＣＲＰアンタゴニストは、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、抗血小板薬、スタチン、コレステロール吸収の阻害剤、抗高脂血症薬、ナイアシン、抗糖尿病薬、β−アドレナリン受容体アンタゴニスト、酸化防止剤、ＡＣＥ阻害剤、ＩＬ−６阻害剤、１１−ベータヒドロキシラーゼ阻害剤、およびアンギオテンシン受容体遮断薬から選択することができる。
【００１５】
本出願は、患者における線維化関連障害の治療のためのキットをさらに提供する。キットは、一緒に投与されるように製剤することができる１つまたは複数のＣＲＰアンタゴニストおよび１つまたは複数のＳＡＰアゴニストを含む。キットにおけるＳＡＰアゴニストは、小分子、核酸、またはポリペプチドから選択することができる。キットにおけるＳＡＰアゴニストは、ＳＡＰシグナル伝達を増加させることができ、ＳＡＰシグナル伝達を模倣することができ、ＳＡＰ活性を増加させることができ、ＳＡＰ発現を増加させることができ、血清ＳＡＰレベルを増加させることができる。いくつかの実施形態において、キットにおけるＳＡＰアゴニストは、ＳＡＰポリペプチド、ＦｃγＲ抗体（抗ＦｃγＲＩ、抗ＦｃγＲＩＩＡ、もしくは抗ＦｃγＲＩＩＩ）、架橋抗ＦｃγＲ抗体（抗ＦｃγＲＩ、抗ＦｃγＲＩＩＡ、もしくは抗ＦｃγＲＩＩＩ）、凝集ＩｇＧ抗体、または架橋ＩｇＧ抗体であってもよい。キットにおけるＣＲＰアンタゴニストは、小分子、核酸、またはポリペプチドから選択することができる。キットにおけるＣＲＰアンタゴニストは、ＣＲＰシグナル伝達を減少させることができ、ＣＲＰ活性を減少させることができ、ＣＲＰ発現を減少させることができ、血清ＣＲＰレベルを減少させることができ、ＩＬ−１０の産生を減少させることができ、ＴＧＦ−βの産生を減少させることができ、またはＦｃγＲＩもしくはＦｃγＲＩＩＡもしくはＦｃγＲＩＩＩへのＣＲＰ結合を減少させることができる。いくつかの実施形態において、キットにおけるＣＲＰアンタゴニストは、抗ＣＲＰ抗体、抗ＦｃγＲＩ抗体、抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体、または抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、キットにおけるＣＲＰアンタゴニストは、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、抗血小板薬、スタチン、コレステロール吸収の阻害剤、抗高脂血症薬、ナイアシン、抗糖尿病薬、β−アドレナリン受容体アンタゴニスト、酸化防止剤、ＡＣＥ阻害剤、ＩＬ−６阻害剤、１１−ベータヒドロキシラーゼ阻害剤、およびアンギオテンシン受容体遮断薬から選択することができる。
【００１６】
本出願は、多型ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子の配列を決定し、前記データを使用して患者に最も有効な治療計画を選択することによって、患者における線維化関連障害を治療し、予防し、またはその重症度を低下させるための方法をさらに提供する。治療計画は、ＳＡＰアゴニストまたはＣＲＰアンタゴニストまたはその組合せの投与を含んでもよい。一方または両方のＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子の１３１位にヒスチジンを有する患者に、１つもしくは複数のＳＡＰアゴニスト、１つもしくは複数のＣＲＰアンタゴニスト、またはその組合せを投与することができる。一方または両方のＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子の１３１位にアルギニンを有する患者は、Ｈ１３１対立遺伝子についてホモ接合性の患者よりも高用量のＳＡＰアゴニストを必要とし得る。
【００１７】
本出願は、診断業務を行うための方法をさらに提供する。その方法は、生物学的サンプルを受け取るステップと、生物学的サンプルにおけるＣＲＰおよびＳＡＰの濃度を測定するステップと、ＣＲＰおよびＳＡＰの濃度の報告書を作成するステップとを含む。ＣＲＰおよびＳＡＰの濃度は、血漿、健常組織、または線維性組織から測定することができ、ＣＲＰタンパク質またはＳＡＰタンパク質の総濃度としてまたは遊離濃度、つまり非結合濃度として測定することができる。いくつかの実施形態において、その方法は、ＳＡＰ対ＣＲＰの比を決定するステップと、前記比を報告するステップとをさらに含む。
【００１８】
本出願は、患者が線維化関連障害を発症する危険性の評価に有用なデータを決定するための方法をさらに提供する。危険性の評価は、生物学的サンプルにおけるＣＲＰの濃度の測定に基づくものである。患者の第２の生物学的サンプルをアッセイして、多型ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子の配列を決定する。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルをＳＡＰの濃度について測定する。ＣＲＰおよびＳＡＰの濃度は、血清、血漿、健常組織、または線維性組織から測定することができ、ＣＲＰタンパク質またはＳＡＰタンパク質の総濃度としてまたは遊離濃度、つまり非結合濃度として測定することができる。いくつかの実施形態において、ＳＡＰ対ＣＲＰの比を決定する。
【００１９】
本出願は、ＰＢＭＣまたは単球細胞における、ＣＲＰに対する応答性を決定するための方法をさらに提供する。その方法は、１つまたは複数の濃度のＣＲＰと共に、ＰＢＭＣまたは単球を培養するステップと、線維細胞分化のＣＲＰ誘発の程度を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＰ濃度は、０．００１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、または５００μｇ／ｍｌである。線維細胞分化の程度は、ＣＲＰに対する細胞の応答性を示す。
【００２０】
本出願は、ＣＲＰアンタゴニストの抗線維化作用に対する患者の応答性を決定するための方法をさらに提供する。その方法は、患者からＰＢＭＣまたは単球細胞を得るステップと、１つまたは複数の濃度のＣＲＰと共にこれらの細胞をインキュベートするステップと、線維細胞分化のＣＲＰ誘発の程度を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＰ濃度は、０．００１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、または５００μｇ／ｍｌである。線維細胞分化の程度は、ＣＲＰに対する患者の応答性を示す。
【００２１】
本出願は、患者における線維細胞分化を防止する最小ＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するための方法をさらに提供する。その方法は、患者からＰＢＭＣまたは単球細胞を得るステップと、１つまたは複数の濃度のＣＲＰと共にこれらの細胞を培養して、線維細胞分化の最大の刺激をもたらす最小ＣＲＰ濃度を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＰ濃度は、０．００１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ  ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、または５００μｇ／ｍｌである。その方法は、線維細胞分化の最大の刺激をもたらす最小ＣＲＰ濃度の存在下において、線維細胞分化を少なくとも９０％低下させる、ＳＡＰの最小濃度を決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＳＡＰの濃度は、０．００１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、または１００μｇ／ｍｌである。次いで、示されたＳＡＰ濃度は、示されたＣＲＰ濃度で割り、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて線維細胞分化を防止する最小ＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定する。
【００２２】
本明細書において記載される方法のいくつかの実施形態において、線維化関連障害は、アテローム性動脈硬化症ではない。
【００２３】
本明細書において記載される方法のいくつかの実施形態において、第１および第２の生物学的サンプルは、同じである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ヒト（配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１６３０のアミノ酸２０〜２２３）、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ（配列番号２、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０３４６５３のアミノ酸２０〜２２７）、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ（配列番号３、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＩ０２６２４のアミノ酸２０〜２２４）、およびＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉｕｓ（配列番号４、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＢ２８７２６のアミノ酸２０〜２２３）の血清アミロイドＰポリペプチド（シグナル配列表さず）のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。ヒトＳＡＰと同一のアミノ酸は網掛けする。
【図２】ｈＭＣＳＦを用いる線維細胞分化アッセイ治療を示す図である。Ｘ軸は、ドナー単球と共にインキュベートされるｈＭＣＳＦの濃度を示す。Ｙ軸は、５．０×１０４細胞当たりの線維細胞の計数によって測定される、５日目の線維細胞増殖の量を示す。
【図３】ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて線維細胞分化を防止するために有効なＳＡＰ／ＣＲＰ比を決定するための線維細胞分化アッセイを示す図である。（Ａ）Ｘ軸は、ドナー単球と共にインキュベートされるｈＳＡＰの濃度を示す。Ｙ軸は、５．０×１０４細胞当たりの線維細胞の計数によって測定される、５日目の線維細胞増殖の量を示す。（Ｂ）Ｘ軸は、２５ｎｇ／ｍｌ  ｈＭＣＳＦおよび２μｇ／ｍｌ  ｈＳＡＰを含む培地中であらかじめ懸濁したドナー単球と共にインキュベートされるＣＲＰの濃度を示す。Ｙ軸は、５．０×１０４細胞当たりの線維細胞の計数によって測定される、線維細胞増殖の量を示す。
【図４】ｓＦｃγＲＩＩＩＢへのＳＡＰ結合を示す図である。データは、ｓＦｃγＲＩＩＩＢへのＳＡＰ結合の代表的なセンサーグラムであり、５つの異なる受容体濃度での結合段階または接触段階および解離段階を示す。グラフの上部に、アッセイの間の送達の時間に対するｓＦｃγＲＩＩＩＢ濃度を示す。図のＹ軸は、表面プラズマ共鳴ユニット（ＲＵ）を示し、Ｘ軸は、時間を示す。データは、時間に対する、細胞表面の質量の変化として図示される。
【図５】図５Ａは、ｓＦｃγＲＩへのＣＲＰ結合を示す図である。データは、ｓＦｃγＲＩへのＣＲＰ結合の代表的なセンサーグラムであり、ＣＲＰの結合のオン速度およびオフ速度を示す。図のＹ軸は、表面プラズマ共鳴ユニット（ＲＵ）を示し、Ｘ軸は、時間を示す。データは、時間に対する、細胞表面の質量の変化として図示される。グラフ上の情報は、ｓＦｃγＲＩおよび緩衝液の注入の時間を示し、アッセイされる受容体の異なる濃度を示す。図５Ｂは、ｓＦｃγＲＩＩＩＢへのＣＲＰ結合を示す図である。データは、ｓＦｃγＲＩＩＩＢへのＣＲＰ結合の代表的なセンサーグラムであり、ＣＲＰの結合のオン速度およびオフ速度を示す。図のＹ軸は、表面プラズマ共鳴ユニット（ＲＵ）を示し、Ｘ軸は、時間を示す。データは、時間に対する、細胞表面の質量の変化として図示される。グラフ上の情報は、ｓＦｃγＲＩおよび緩衝液の注入の時間を示し、アッセイされる受容体の異なる濃度を示す。
【図６】図６Ａは、ＦｃγＲＩへのＣＲＰ結合の親和性を示す図である。図のＹ軸は、表面プラズマ共鳴ユニットによって測定される、ＣＲＰへのＦｃγＲＩの結合の平衡時の応答を示し、Ｘ軸は、ＦｃγＲＩの濃度を示す。図６Ｂは、ＦｃγＲＩＩＩＢへのＣＲＰ結合の親和性を示す図である。図のＹ軸は、表面プラズマ共鳴ユニットによって測定される、ＦｃγＲＩＩＩＢへのＣＲＰの結合の平衡時の応答を示し、Ｘ軸は、ＦｃγＲＩＩＩＢの濃度を示す。
【図７】ＦｃγＲＩＩ対立遺伝子のＰＣＲ遺伝子型同定を示す図である。ゲノムＤＮＡは、ヒトＰＢＭＣから抽出し、２５３ｂｐ産物を産生する、ＦｃγＲＩＩの第２の細胞外ドメインにおける異なるヌクレオチドに従って設計した特異的なセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを使用して遺伝子型を同定した。増幅ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル上で分離した。群１は、Ｒ１３１ホモ接合性ドナーの遺伝子型を示し、群２は、Ｈ１３１ホモ接合性ドナーの遺伝子型を示し、群３は、Ｒ１３１／Ｈ１３１ヘテロ接合性ドナーの遺伝子型を示す。
【図８Ａ】Ｒ１３１ホモ接合性ドナー単球を用いる線維細胞分化アッセイを示す図である。Ｘ軸は、２μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのいずれかのＳＡＰを含有する培地中に懸濁したドナー単球と共にインキュベートされるＣＲＰの濃度を示す。Ｙ軸は、５．０×１０４細胞当たりの線維細胞の計数によって測定される、線維細胞増殖の量を示す。
【図８Ｂ】Ｈ１３１ホモ接合性ドナー単球を用いる線維細胞分化アッセイを示す図である。Ｘ軸は、２５ｎｇ／ｍｌ  ｈＭＣＳＦ＋２μｇ／ｍｌのｈＳＡＰまたは培地のみのいずれかを含有する培地中に懸濁したドナー単球と共にインキュベートされるＣＲＰの濃度を示す。Ｙ軸は、５．０×１０４細胞当たりの線維細胞の計数によって測定される、線維細胞増殖の量を示す。
【図８Ｃ】Ｒ１３１／Ｈ１３１ヘテロ接合性ドナー単球を用いる線維細胞分化アッセイを示す図である。Ｘ軸は、培地のみに懸濁したドナー単球と共にインキュベートされるＣＲＰの濃度を示す。Ｙ軸は、５．０×１０４細胞当たりの線維細胞の計数によって測定される、線維細胞増殖の量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
概要
線維化に至る創傷治癒および調節不全事象では、共に、線維芽細胞が増殖および分化し、細胞外マトリックスが沈着する。線維細胞、線維細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、および造血単球前駆体は、血管新生および創傷治癒を促進するために組織傷害の部位に入る、末梢血単球に由来する線維芽細胞様細胞の別個の集団を構成する。近年、血清または血漿の非存在下において培養されたＣＤ１４＋末梢血単球は、７２時間以内に線維細胞に分化するが、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）は、血漿において見つけられるレベルと同様のレベルで、線維細胞、線維細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、および／または造血単球前駆体の分化を阻害することができたことが報告された。対照的に、ＳＡＰを欠乏させると、血漿が、線維細胞、線維細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、および／または造血単球前駆体の分化を阻害する能力を低下させる。健常な個人および関節リウマチを有する対象の血清と比較すると、２つの全身性線維性疾患、強皮症および混合性結合組織疾患を有する対象の血清は、線維細胞、線維細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、および／または造血単球前駆体の分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてそれほど阻害することができず、相応して、ＳＡＰの、より低い血清レベルを有した。これらの結果は、異常に低いレベルのＳＡＰが、したがって、線維化に至る病的プロセスを増大させる可能性があることを示唆する。これらのデータはまた、慢性の炎症性の状態における線維化を阻害するまたは反対に、創傷治癒を促進するためのメカニズムをも示唆する。
【００２６】
ＳＡＰが、免疫グロブリンＧに対するＦｃ受容体に結合する（ＩｇＧ；ＦｃγＲ）とともに、ＦｃγＲ活性化は、続いて、線維細胞、線維細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、および／または造血単球前駆体の分化に対する阻害シグナルとなることが実証された。ＦｃγＲは、凝集ＩｇＧによって活性化され、凝集しているが、単量体ではないヒトＩｇＧは、ヒト線維細胞、線維細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、および／または造血単球前駆体の分化を阻害することが示された。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）またはＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）に結合するモノクローナル抗体もまた、線維細胞、線維細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、および／または造血単球前駆体の分化を阻害する。Ｆｃドメインを欠く凝集ＩｇＧまたは凝集ＩｇＡ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭは、線維細胞、線維細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、および／または造血単球前駆体の分化を阻害しない。凝集ＩｇＧとの単球のインキュベーションは、ＳＡＰのように、線維細胞、線維細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、および／または造血単球前駆体の分化を阻害した。プロテインキナーゼ酵素の阻害剤を使用すると、Ｓｙｋ関連チロシンキナーゼおよびＳｒｃ関連チロシンキナーゼは、線維細胞、線維細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、および／または造血単球前駆体の分化の阻害に参加することもまた示された。これらの観察は、線維細胞、線維細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、および／または造血単球前駆体の分化が、止血の回復の後など、ＳＡＰおよび凝集ＩｇＧのレベルが低い状況において生じ得ることを示唆する。
【００２７】
血清アミロイドＰ（「ＳＡＰ」）は、ディスク状の分子中で非共有結合した５つの同一のサブユニットまたはプロトマーから構成される、哺乳動物における自然発生血清タンパク質である。ＳＡＰは、５つの非共有結合２５，０００ダルトンプロトマーから構成される１２５，０００ダルトン五量体糖タンパク質である。ＳＡＰは、この環状の五量体構造によって特徴づけられる、タンパク質のペントラキシンスーパーファミリーに属する。古典的な短いペントラキシンは、ＳＡＰおよびＣ反応性タンパク質を含む（Ｏｓｍａｎｄ，  Ａ．  Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、７４巻：７３９〜７４３頁（１９７７年））。それは、肝臓において合成され、ヒトＳＡＰの生理学的半減期は２４時間である。ヒトＳＡＰサブユニットの配列は、配列番号１に表される（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１６３０のアミノ酸２０〜２２３、シグナル配列表さず）。
【００２８】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰおよびＰＴＸ１としても知られている）は、多種多様の炎症性サイトカインに応じて、肝臓において産生される必須のヒト急性期反応物である。血漿ＣＲＰレベルは、感染、虚血、外傷、やけど、および炎症性の状態に応じて１，０００倍増加する。ＣＲＰタンパク質は、カルシウム依存性の様式において、ホスホコリン、フィブロネクチン、クロマチン、ヒストン、およびリボ核タンパク質などの広範囲の細胞性物質に結合する（Ｓｚａｌａｉら、Ｉｍｍｕｎｏ．  Ｒｅｓ．、１９９７年、１６巻、１２７〜１３６頁）。それは、食作用性白血球上の特異的受容体に対するリガンドであり、単球およびマクロファージ上の活性化反応を媒介し、補体を活性化する（Ｓｚａｌａｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．、１９９７年、１６巻、１２７〜１３６頁）。
【００２９】
ＣＲＰの機能は、先天性の免疫系におけるその役割に関連する。ＩｇＧと同様に、それは、補体を活性化し、Ｆｃ受容体に結合し、様々な病原体に対するオプソニンとして作用する。Ｆｃ受容体とのＣＲＰの相互作用は、炎症反応を抑制する抗炎症性サイトカインの生成に至る。
【００３０】
当技術分野内の現在の従事者らは、血漿または組織におけるＣＲＰまたはＳＡＰの絶対的なレベルおよび炎症性疾患プロセスまたは線維性疾患プロセスに影響を与えるそれらの個々の役割に注目した。対照的に、本出願は、ＣＲＰおよびＳＡＰが、炎症および線維化に対する互いの効果を釣り合わせるように機能することを開示する。血漿または組織におけるＳＡＰ対ＣＲＰの低い比は、ＦｃγＲに結合したＳＡＰ対ＣＲＰの、より低い比、それによって、傷害の部位での、ＴＧＦβならびに他の線維形成促進性のサイトカインおよびケモカインの産生の増加をもたらし、線維化を促進するであろう。ＣＲＰレベルを減少させるもしくはＳＡＰレベルを増加させるまたはＦｃγＲに結合しているＣＲＰを減少させるもしくはＦｃγＲに結合しているＳＡＰを増加させることによってこの比を増加させる作用物質は、線維性疾患の進行を遅らせるまたは線維性疾患を逆戻りさせるのに有効な治療薬となるであろう。同じく、個々の集団内のＳＡＰ対ＣＲＰの比のモニターにより、線維化関連障害を発症する危険性にさらされ、かつそのため、予防的療法をより必要とする集団が同定されるはずである。
【００３１】
本出願の一態様は、部分的に、ＦｃγＲＩＩＡへのＣＲＰの結合に影響を与えるＦｃγＲＩＩＡの多型もまた、線維性疾患の進行に影響を与えるという驚くべき発見に関する。細胞上のＦｃγＲＩＩＡ受容体へのＩｇＧ２およびＣＲＰの結合ならびにそれに続くシグナル伝達に影響を与えるヒトＦｃγＲＩＩＡ遺伝子座の遺伝的多型は、同定されている（ＮＣＢＩ  ｒｅｆＳＮＰ  ｒｓ  １８０１２７４）。Ｒ１３１／Ｈ１３１対立遺伝子として本明細書において知られている多型は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿０６７６７４（配列番号６）によって定義されるように、ＦｃγＲＩＩＡの第２のＩｇ様ドメインにおけるアミノ酸１６６にある。ＩｇＧ２結合については、アルギニンがこの位置にある場合（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０２１６４２（配列番号５）によって定義されるように、ｍＲＮＡ配列の５３５位のコドンにおける２番目の位置のＧのために）、受容体はＩｇＧ２に非常に弱くしか結合しないのに対して、ヒスチジンがこの位置にある場合（ｍＲＮＡ配列の５３５位のコドンにおける２番目の位置のＡのために）、受容体はＩｇＧに効率的に結合する。
【００３２】
ＣＲＰは、オプソニン化、Ｃ１ｑに結合することによる補体活性化、およびＦｃγＲへの結合を含む、いくつかの機能活性をＩｇＧと共有する。ＣＲＰは、宿主防御、炎症の調節、および自己免疫疾患の調整に関与する。しかしながら、ＦｃγＲＩＩＡへのＣＲＰ結合は、Ｒ１３１対立遺伝子についてのみ効率的であるように思われ、Ｈ１３１対立遺伝子にほとんど結合せず、これは、ＩｇＧ２結合と正反対である。この表現型についてヘテロ接合性の個人は、中間の表現型を示す。Ｒ１３１対立遺伝子へのＣＲＰ結合は、Ｃａ２＋シグナル伝達事象の開始をもたらす。
【００３３】
炎症性の部位でのＰＭＮおよび単球の活性化は、ヒトＦｃγＲＩＩＡのＲ１３１対立遺伝子に対するＣＲＰの選択性に影響を与えない。ＦｃγＲＩＩＡのＲ１３１対立遺伝子についてホモ接合性の個人は、ＣＲＰオプソニン化細菌に応答する時に、Ｈ１３１ホモ接合性である個人よりも効率的であり、これは、これらの場合において、感染に対する初期の保護的サイトカイン応答を増強すると思われる。ＣＲＰ媒介性の食作用は、ＦｃγＲＩＩＡがＦｃγＲＩと同時発現する場合に生じ得ることおよびこれは、ＦｃγＲＩＩＡ  Ｈ１３１よりもＦｃγＲＩＩＡ  Ｒ１３１でより効率的であることが報告されている（Ｂｏｄｍａｎ−Ｓｍｉｔｈら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１０７巻：２５２〜２６０頁）。
【００３４】
ループス腎炎の関連において、腎炎がより進行し、極度のＩｇＧ２沈着を有する個人においてＦｃγＲＩＩＡ  Ｒ１３１の発現が増加している。ＣＲＰは、これらの患者の腎免疫沈着物中に見つけられた。ＦｃγＲＩＩＡ  Ｒ１３１は、循環免疫複合体の除去の障害の一因となる可能性があり、これらの患者における糸球体内で食細胞活性化および炎症媒介物質の放出を有効に誘発する可能性がある。したがって、ＦｃγＲＩＩＡにおけるアミノ酸１３１位（配列番号６の残基１６６）の遺伝的多型はどのように個人がＦｃγＲを通してＣＲＰ効果をシグナル伝達するかならびにこれらの差異が、宿主防御、炎症の調節、および自己免疫疾患の調整に影響する可能性を有する異なる応答に至り得るかに影響を与える。
【００３５】
ＦｃγＲはまた、関連するペントラキシンＳＡＰに対する受容体でもあり、ＳＡＰレベルは、線維化の生物学的現象に影響を与える。ＰＢＭ細胞へのＳＡＰ結合は、線維促進性の線維細胞に分化するためのそれらの能力を遮断する。ＰＢＭ細胞へのＣＲＰ結合は、線維細胞分化に影響を与えるように先に記載されていない。本出願は、ＣＲＰが、濃度依存性の様式において、ＰＢＭ細胞からの線維細胞分化を活性化することおよびＣＲＰがこの効果を媒介する能力が、ＦｃγＲＩＩＡのＲ１３１対立遺伝子に依存することを提供する。アミノ酸１３１位（配列番号６の残基１６６）のＦｃγＲＩＩＡのハプロタイプは、そのため、ＦｃγＲシグナル伝達へのＣＲＰおよびＳＡＰの寄与に影響を与えることならびに結果的に、線維化に対して特異な効果を及ぼすことが期待されるであろう。ｒｓ１８０１２７４に関するＮＣＢＩ  ＳＮＰデータベース（ｒｅｆＳＮＰ）における情報は、ＦｃγＲＩＩＡのＲ１３１対立遺伝子が、ヒト集団において著しく代表されることを示す。Ｒ１３１およびＨ１３１は本質的に共優性である。ＮＣＢＩデータベース（広範囲の民族からの数百人の個人の遺伝子型についてのデータを提供する）において立証される遺伝子型分布は、Ｒ／Ｒホモ接合体については約２１％であり、Ｒ／Ｈヘテロ接合体については４７％であり、Ｈ／Ｈホモ接合体については３２％である。集団として、日本／中国からのアジア民族は、他の民族よりもＨ／Ｈ遺伝子型がより代表的である。そのため、この遺伝子座のＦｃγＲＩＩＡのハプロタイプは、線維化に影響することおよびこのヒト集団内で抗線維化療法に著しく応答することが期待されるであろう。
【００３６】
定義
本明細書において使用されるように、用語「治療」、「治療すること」などは、所望の薬理的および／または生理的効果を得ることを指す。効果は、その障害もしくは症状を完全にもしくは部分的に予防する点から、予防的なものであってもよく、ならびに／または線維性障害もしくは線維増殖性障害および／またはその障害に起因する悪影響に対する部分的なまたは完全な治癒の点から治療的なものであってもよい。「治療」は、本明細書において使用されるように、哺乳動物における、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）生存時間を増加させること、（ｂ）疾患による死亡の危険性を減少させること、（ｃ）疾患にかかりやすい可能性があるが、それを有すると今までに診断されたことがない対象において疾患が生じることを予防すること、（ｄ）疾患を阻害すること、つまり、その発症を抑止すること（たとえば、疾患進行の速度を低下させること）、および（ｅ）疾患を軽減すること、つまり疾患の後退を引き起こすことを含む。
【００３７】
本明細書において使用されるように、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計的サンプルにおいて、未治療コントロールサンプルと比較して、治療サンプルにおける障害もしくは状態の発生を低下させるまたは未治療コントロールサンプルと比較して、障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発症を遅らせるもしくはその重症度を低下させる化合物である。
【００３８】
本明細書において使用されるように、用語「対象」および「患者」は、ヒトを含む哺乳動物を含む動物を指す。用語「哺乳動物」は、霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットを含む家畜動物、動物園の動物などの捕獲動物、および野生動物を含む。本明細書において使用されるように、用語「組織」は、器官または皮膚組織、肺組織、腎組織、および他の型の細胞などの特殊化した細胞のセットを指す。
【００３９】
用語「治療有効量」は、所望の治療効果を容易にするのに有効な、治療剤の量またはそのような治療剤の送達の速度を意味する。厳密な所望の治療効果は、治療される線維性の状態または線維増殖性の状態、投与される製剤、および当業者らによって十分に理解される多種多様の他の因子に従って変動するであろう。
【００４０】
本明細書において使用されるように、線維化関連障害という用語は、１つまたは複数の組織における線維化を含む状態を指す。本明細書において使用されるように、用語「線維化」は、器官または組織の正常な構成要素としてではなく、修復プロセスまたは反応プロセスとして線維組織の形成を指す。線維化は、任意の特定の組織における正常な沈着を超過した線維芽細胞蓄積およびコラーゲン沈着によって特徴づけられる。本明細書において使用されるように、用語「線維化」は、「線維芽細胞蓄積およびコラーゲン沈着」と同義的に使用される。線維芽細胞は、結合組織細胞であり、これらは、体の全体にわたって結合組織中に分散している。線維芽細胞は、Ｉ型および／またはＩＩＩ型コラーゲンを含有する柔軟な細胞外マトリックスを分泌する。組織に対する傷害に応じて、近くの線維芽細胞は、傷に移動し、増殖し、大量のコラーゲン性細胞外マトリックスを産生する。コラーゲンは、細胞外マトリックスおよび結合組織、軟骨、ならびに骨の主な構成成分である、グリシンおよびプロリンが豊富な繊維状タンパク質である。コラーゲン分子は、α鎖と呼ばれる三重鎖ヘリックス構造であり、これらは、ロープ状ヘリックスで互いに巻きついている。コラーゲンは、いくつかの形態または型で存在し、これらのうち、Ｉ型は、最も一般的であり、皮膚、腱、および骨中に見つけられ、ＩＩＩ型は、皮膚、血管、および内臓器官中に見つけられる。
【００４１】
「強皮症」は、皮膚および他の器官における線維芽細胞による新しいコラーゲンの産生過剰によって引き起こされる皮膚の肥厚および硬化によって特徴づけられる線維化関連障害である。強皮症は、局所性または全身性疾患として得る。全身性強皮症は、いくつかの器官に影響を与える可能性がある。全身性硬化症は、特に手および顔の皮膚の肥厚および下にある組織への癒着と共に、ヒアリン化コラーゲン性線維組織および肥厚コラーゲン性線維組織の形成によって特徴づけられる。疾患はまた、蠕動の損失および食道の粘膜下の線維化による嚥下障害、肺線維症による呼吸困難、心筋線維症、ならびに腎血管変化によって特徴づけられてもよい。肺線維症は、強皮症患者の３０〜７０％に影響を与えて、拘束性肺疾患をもたらすことが多い。
【００４２】
「特発性肺線維症」は、慢性で、進行性の、普通の場合、致命的な肺障害であり、慢性の炎症性のプロセスの結果であると考えられる。
【００４３】
治療方法
本出願の一態様は、線維化関連障害を治療し、予防し、またはその重症度を低下させるための方法であって、患者の生物学的サンプルにおけるＣＲＰおよびＳＡＰの濃度を測定してＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するステップを含む方法を提供する。決定された比を、１つまたは複数のＳＡＰ対ＣＲＰ基準比と比較し、抗線維化療法を、１つまたは複数の基準比よりも低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有する患者に施す。
【００４４】
いくつかの実施形態において、患者の生物学的サンプルは、健常対象からの生物学的サンプルから決定されるＳＡＰ対ＣＲＰ基準比または健常対象の集団の平均比から決定される基準比と比較される。いくつかの実施形態において、基準比は、年齢および性別などの同様の患者特徴を有する対象の集団の平均比から決定される。いくつかの実施形態において、抗線維化療法は、基準比よりも少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、７０、または１００％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有する患者に施される。いくつかの実施形態において、抗線維化療法は、２５、２０、１５、１０、または５未満であるＳＡＰ対ＣＲＰ比を有する患者に施される。いくつかの実施形態において、ＳＡＰ対ＣＲＰ基準比は、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５である。患者のＳＡＰ対ＣＲＰ比についての知識を有する医師は、個々の患者にとって適切なレベルに、ＳＡＰまたは他の抗線維化療法の投薬量をより正確に調整することができるであろう。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＳＡＰおよびＣＲＰの濃度は、同じ型の組織または細胞性材料からの生物学的サンプルから決定される。ある実施形態において、患者の線維性組織から得られる生物学的サンプルから決定されるＳＡＰ対ＣＲＰ比は、同じ患者の非線維性生物学的サンプルと比較される。いくつかの実施形態において、非線維性生物学的サンプルは、線維性生物学的サンプルと同じ組織由来のものである。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、血清または血漿である。
【００４６】
ＳＡＰの血漿濃度は、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７１巻のＰｉｌｌｉｎｇ，  Ｄ．  Ｊ：５５３７〜５５４６頁（２００３年）において記載されるように、たとえば、市販で入手可能なＳＡＰ抗体（たとえばＡｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｔ  ＃  ＳＡＰ１２−Ｓ）を使用して、血清に対してＥＬＩＳＡアッセイを実行することによって決定することができる。ＣＲＰの血漿濃度は、Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｔ  ＃  １０００およびＣｈｅｍｉｃｏｎ  Ｃａｔ  ＃  ＣＹＴ２９８からのヒトＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）ＥＬＩＳＡキットを含む、市販で入手可能なキットを使用して決定することができる。さらに、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）ベースのサイトメトリックビーズアレイアッセイは、ＳＡＰおよびＣＲＰについて開発されており、Ｒｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（商標）によって提供される。健常対象におけるＳＡＰの平均的血漿濃度は、２０〜４０μｇ／ｍｌの間である。健常対象におけるＣＲＰの平均的血漿濃度は、０〜２μｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態において、測定されたＳＡＰおよびＣＲＰの濃度は、「遊離濃度」またはむしろ非結合ＳＡＰおよび非結合ＣＲＰの濃度である。ＳＡＰおよびＣＲＰの遊離濃度の決定は、たとえばサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して実行することができる。たとえば、ＳＡＰのＦｃγＲ結合部位を認識する第１の抗体は、生物学的サンプルのＳＡＰを捕捉するために使用される。次いで、ＳＡＰのリガンド結合部位を認識する第２の抗体は、サンプル中のＳＡＰの遊離濃度を検出するために使用される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、その方法は、第２の生物学的サンプルをアッセイして、ＦｃγＩＩＡの１３１対立遺伝子のアミノ酸を決定するステップをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、抗線維化療法は、基準比よりも少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７０、または１００％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有するＲ１３１ホモ接合性患者に施される。いくつかの実施形態において、ＳＡＰ対ＣＲＰ基準比は、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５である。いくつかの実施形態において、抗線維化療法は、２５、２０、１５、１０、または５よりも低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有するＲ１３１ホモ接合性患者に施される。いくつかの実施形態において、抗線維化療法は、基準比よりも少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７０、または１００％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有するＨ１３１ホモ接合性患者に施される。いくつかの実施形態において、ＳＡＰ対ＣＲＰ基準比は、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５である。いくつかの実施形態において、抗線維化療法は、２５、２０、１５、１０、または５よりも低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有するＨ１３１ホモ接合性患者に施される。いくつかの実施形態において、抗線維化療法は、基準比よりも少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７０、または１００％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有するＨ１３１／Ｒ１３１ヘテロ接合性患者に施される。いくつかの実施形態において、ＳＡＰ対ＣＲＰ基準比は、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５である。いくつかの実施形態において、抗線維化療法は、２５、２０、１５、１０、または５よりも低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有するＨ１３１／Ｒ１３１ヘテロ接合性患者に施される。
【００４８】
理論によって拘束されることを望むものではないが、ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子の根底にある遺伝的多型は、ＳＡＰ／ＣＲＰ比が抗線維化療法応答を正確に予測する能力に影響を与えるであろう。ＦｃγＲＩＩＡのＨ１３１対立遺伝子についてホモ接合性の個人は、ＣＲＰにそれほど応答性ではないことが予測されるであろう。そのため、ＣＲＰは、ＳＡＰの抗線維化作用をあまり緩和しないであろう。そのため、Ｈ１３１ホモ接合性の個人は、ＳＡＰまたはＳＡＰアゴニストの抗線維化作用に対してより感受性であり、ＣＲＰ阻害メカニズムを通して機能する他の作用物質またはＣＲＰアンタゴニストの抗線維化作用に対してそれほど感受性ではない可能性がある。Ｒ１３１ホモ接合性の個人はまた、ＳＡＰに対して感受性であるが、ＳＡＰまたはＳＡＰアゴニストの有効治療投薬量は、ＣＲＰレベルに依存するであろう。ＳＡＰまたはＳＡＰアゴニストの投薬量は、Ｒ１３１ホモ接合性であり、高いＣＲＰレベルを有する患者における有効な治療のために増加させる必要があるであろう。
【００４９】
いくつかの実施形態において、個々の患者におけるＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子パターンを決定するための方法は、たとえば、１）適切な免疫細胞の表面上に存在するＦｃγＲＩＩＡポリペプチドの１つもしくは複数の対立形質の免疫学的検出、つまり「表現型の特徴づけ」または２）たとえば、核酸の増幅もしくは配列決定ありもしくはなしで核酸プローブを使用する、１つもしくは複数のＦｃγＲＩＩＡ対立形質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの分子検出、つまり「遺伝子型の特徴づけ」を含んでもよい。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ＦｃγＲＩＩＡ多型の同定と組み合わせたＳＡＰ対ＣＲＰ比の決定またはＣＲＰレベルの測定は、抗線維化療法および投薬を選択するための診断ツールとして使用されるであろう。患者のＳＡＰ対ＣＲＰ比およびＦｃγＲＩＩＡの両方の１３１対立遺伝子についての知識を有する医師は、個々の患者にとって適切なレベルに、ＳＡＰまたは他の抗線維化療法の投薬量をより正確に調整することができるであろう。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ＦｃγＲＩＩＡの多型対立遺伝子を決定するために使用される第２の生物学的サンプルは、ＳＡＰおよび／またはＣＲＰの濃度をアッセイするために使用される第１の生物学的サンプルと同じであるまたは異なる。生物学的サンプルは、細胞、ＦｃγＲＩＩＡタンパク質、および／または核酸（ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）を抽出することができる血清、血漿、健常組織、または線維性組織由来のものであってもよい。
【００５２】
本出願の他の態様は、患者における線維化関連障害の治療を調整するための方法であって、患者におけるＣＲＰおよびＳＡＰの濃度を測定してＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するステップと、その比を、１つまたは複数のＳＡＰ対ＣＲＰ基準比と比較するステップと、１つまたは複数の基準比よりも低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有する患者に抗線維化療法を施すステップと、患者におけるＣＲＰおよびＳＡＰの濃度をさらに測定して第２のＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するステップとを含む方法を提供する。抗線維化療法は、第２のＳＡＰ対ＣＲＰ比に基づいて調整される。
【００５３】
患者におけるＣＲＰおよびＳＡＰの濃度のそれに続く測定は、抗線維化療法の開始の後の任意の時間に行われてもよい。その測定は、抗線維化療法コースの間にまたはその完了の後に実行されてもよい。治療スケジュールの全体にわたっておよび経過観察ケアの一部として治療の後に、ＣＲＰおよびＳＡＰの濃度は、複数回、決定されてもよく、比は、計算されてもよい。
【００５４】
ＳＡＰ対ＣＲＰの目標比は、患者の性別および疾患状態を含む、多種多様の因子に依存するであろう。個々の患者の目標比を決定することは、本開示を考慮して当業者の範囲内にある。いくつかの実施形態において、ＳＡＰ対ＣＲＰ目標比は、少なくとも２、５、７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、またはそれ以上である。
【００５５】
抗線維化療法は、たとえば投薬量、投薬の頻度によって、または投与される抗線維化作用物質を変えることによって調整することができる。たとえば、当業者は、ＳＡＰ対ＣＲＰ目標比に達した患者における投薬量を低下させてもよいが、ＳＡＰ対ＣＲＰ比が著しく増加しなかった患者の投薬量を増加させることができる。そのため、ＳＡＰ対ＣＲＰ比は、患者の治療に対する応答の客観的な指標を医者に提供する。いくつかの実施形態において、当業者は、患者のＳＡＰ対ＣＲＰ比に基づいて、肉眼的な線維性症状をもはや示さない患者に抗線維化療法を施し続けてもよい。
【００５６】
本出願の他の態様は、患者が線維化関連障害を発症する危険性にさらされているかどうかを決定する方法であって、患者におけるＣＲＰおよびＳＡＰの濃度を測定してＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するステップと、決定されたＳＡＰ対ＣＲＰ比を１つまたは複数の基準比と比較するステップと、１つまたは複数の基準比よりも低いＳＡＰ対ＣＲＰを、患者が線維化関連障害の危険性にさらされている指標と解釈するステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、その方法は、第２の生物学的サンプルをアッセイしてＦｃγＩＩＡの１３１対立遺伝子のアミノ酸を決定するステップをさらに含んでもよい。
【００５７】
典型的に、基準比の比からの、個々の患者における比の偏差が大きいほど、線維化関連障害の発症の危険性が大きくなる。いくつかの実施形態において、基準比よりも少なくとも５、１０、２０、４０、６０、８０、または１００％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比は、患者が危険性にさらされている指標である。いくつかの実施形態において、２５、２０、１５、１０、または５よりも低いＳＡＰ対ＣＲＰ比は、患者が危険性にさらされている指標である。いくつかの実施形態において、ＳＡＰ対ＣＲＰ基準比は、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５である。
【００５８】
一度、患者が、危険性にさらされているとして同定されたら、適した、抗線維化療法を用いる治療を始めるなど、防止的で予防的な測定が行われてもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態において、患者は、化学療法、放射線治療、および様々な傷害またはやけどからの苦痛を含む線維化関連障害のさらなる危険性を示し得る。これらの場合において、基準比のＳＡＰ対ＣＲＰ比からの個人のＳＡＰ対ＣＲＰ比のわずかに小さな偏差は、さらなる危険因子の存在と組み合わせて、患者が、線維化関連障害を発症する危険性が高いということを示し得る。いくつかの実施形態において、基準比よりも少なくとも２、５、１０、２０、４０、６０、８０、または１００％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比は、１つまたは複数のさらなる危険因子を有する患者が危険性にさらされている指標である。
【００６０】
そのようなさらなる１つの危険因子は、ＦｃγＲＩＩＡ多型の一方または両方の対立遺伝子のアミノ酸１３１位（配列番号６の１６６位）のアルギニンの存在である。いくつかの実施形態において、Ｒ１３１対立遺伝子の存在は、患者が線維化関連障害を発症する危険性を増加させる。いくつかの実施形態において、ＦｃγＲＩＩＡ多型の同定は、患者の最も適切な抗線維化療法を決定するであろう。
【００６１】
本出願の他の態様は、線維化関連障害を診断する方法であって、患者におけるＣＲＰおよびＳＡＰの濃度を測定してＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するステップと、決定されたＳＡＰ対ＣＲＰ比を１つまたは複数の基準比と比較するステップと、基準比よりも低いＳＡＰ対ＣＲＰ比を有する患者において線維化関連障害を診断するステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、基準比よりも少なくとも５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、または１５０％低いＳＡＰ対ＣＲＰ比は、線維化関連障害に対する陽性診断として解釈される。いくつかの実施形態において、ＳＡＰ対ＣＲＰ基準比は、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５である。
【００６２】
本出願の他の態様は、１つまたは複数のＣＲＰアンタゴニストおよび１つまたは複数のＳＡＰアゴニストの一緒の投与によって線維化関連障害を治療するための方法を提供する。本明細書において使用されるように、句「一緒の投与」は、先に投与された治療化合物が体内でまだ有効である間に、第２の化合物が投与されるような、２つ以上の異なる治療化合物の投与の任意の形態を指す（たとえば、２つの化合物は、患者において同時に有効であり、これは、２つの化合物の相乗効果を含んでもよい）。たとえば、異なる治療化合物は、同じ製剤または別々の製剤において、併用してまたは経時的に投与することができる。したがって、そのような治療を受ける個人は、異なる治療化合物の組み合わせた効果から利益を得ることができる。
【００６３】
本出願の他の態様は、１つまたは複数のＣＲＰアンタゴニストおよび１つまたは複数のＳＡＰアゴニストを含む、線維化関連障害を治療するためのキットを提供する。アンタゴニストおよびアゴニストは、一緒に投与するために製剤される。化合物は、別々にまたは組み合わせた製剤で投与することができる。化合物はまた、同時にまたは異なる投薬スケジュールで投与することができる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、キットにおけるＳＡＰアゴニストは、小分子、核酸、またはポリペプチドから選択される。キットにおけるＳＡＰアゴニストは、ＳＡＰシグナル伝達を増加させることができ、ＳＡＰシグナル伝達を模倣することができ、ＳＡＰ活性を増加させることができ、ＳＡＰ発現を増加させることができ、または血清ＳＡＰレベルを増加させることができる。ある実施形態において、キットにおけるＳＡＰアゴニストは、ＳＡＰポリペプチド、ＦｃγＲ抗体（抗ＦｃγＲＩ、抗ＦｃγＲＩＩＡ、もしくは抗ＦｃγＲＩＩＩ）、架橋抗ＦｃγＲ抗体（抗ＦｃγＲＩ、抗ＦｃγＲＩＩＡ、もしくは抗ＦｃγＲＩＩＩ）、凝集ＩｇＧ抗体、または架橋ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、キットにおけるＣＲＰアンタゴニストは、小分子、核酸、またはポリペプチドから選択することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、キットにおけるＣＲＰアンタゴニストは、ＣＲＰシグナル伝達を減少させることができ、ＣＲＰ活性を減少させることができ、ＣＲＰ発現を減少させることができ、血清ＣＲＰレベルを減少させることができ、ＩＬ−１０の産生を減少させることができ、ＴＧＦ−βの産生を減少させることができ、またはＦｃγＲＩもしくはＦｃγＲＩＩＡもしくはＦｃγＲＩＩＩへのＣＲＰ結合を減少させることができる。ある実施形態において、キットにおけるＣＲＰアンタゴニストは、抗ＣＲＰ抗体、抗ＦｃγＲＩ抗体、抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体、または抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体である。ある実施形態において、キットにおけるＣＲＰアンタゴニストは、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、抗血小板薬、スタチン、コレステロール吸収の阻害剤、抗高脂血症薬、ナイアシン、抗糖尿病薬、β−アドレナリン受容体アンタゴニスト、酸化防止剤、ＡＣＥ阻害剤、ＩＬ−６阻害剤、１１−ベータヒドロキシラーゼ阻害剤、およびアンギオテンシン受容体遮断薬から選択される。
【００６６】
本出願の他の態様は、線維化関連障害を治療するための方法であって、線維化関連障害に罹患した患者を同定するステップと、患者の生物学的サンプルにおけるＣＲＰ濃度を測定するステップと、濃度が、１つまたは複数の基準値よりも高いかどうかを決定するステップと、基準値よりも高いＣＲＰ濃度を有する患者にＣＲＰアンタゴニストを投与するステップとを含む方法を提供する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、測定されたＣＲＰの濃度は、「遊離濃度」またはむしろ非結合ＣＲＰの濃度である。ある実施形態において、患者の生物学的サンプルは、健常対象からの生物学的サンプルから決定されるＣＲＰ基準値または健常対象の集団に由来する基準値と比較される。ある実施形態において、基準値は、年齢および性別などの同様の患者特徴を有する対象の集団に由来する。いくつかの実施形態において、ＣＲＰ基準値は、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、または２０μｇ／ｍｌである。
【００６８】
本出願の他の態様は、診断業務を行うための方法を提供する。その方法は、生物学的サンプルを受け取るステップと、生物学的サンプルのＣＲＰおよび／またはＳＡＰの濃度を測定するステップと、ＣＲＰおよび／またはＳＡＰの濃度の報告書を作成するステップとを含む。ＣＲＰおよびＳＡＰの濃度は、血清、血漿、健常組織、または線維性組織から測定することができ、ＣＲＰタンパク質またはＳＡＰタンパク質の総濃度としてまたは遊離濃度もしくは非結合濃度として測定することができる。作成された報告書は、患者または医療提供者に送られてもよい。用語「医療提供者」は、人、コミュニティーなどに医療サービスを提供する個人または団体を指す。「医療提供者」の例は、医者、病院、高齢者継続ケアコミュニティー、高度看護施設、亜急性ケア施設、クリニック、多専門クリニック、独立外来センター、家庭医療機関、およびＨＭＯを含む。いくつかの実施形態において、その方法は、生物学的サンプルにおけるＳＡＰ対ＣＲＰの比を決定および報告するステップをさらに含む。
【００６９】
本出願の他の態様は、患者が線維化関連障害を発症する危険性の評価に有用なデータを決定するための方法であって、患者から生物学的サンプルを得るステップと、生物学的サンプルにおけるＣＲＰの濃度を測定するステップと、ＦｃγＲＩＩＡ多型の両方の対立遺伝子の１３１位（配列番号６の１６６位）のアミノ酸を決定するステップとを含む方法を提供する。生物学的サンプルは、細胞、ＦｃγＲＩＩＡタンパク質、および／または核酸（ＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）を抽出することができる血清、血漿、健常組織、または線維性組織由来のものであってもよい。いくつかの実施形態において、その方法は、生物学的サンプルにおけるＳＡＰの濃度を決定するステップをさらに含む。ＣＲＰおよびＳＡＰの濃度は、血漿、健常組織、または線維性組織から測定することができ、ＣＲＰタンパク質またはＳＡＰタンパク質の総濃度としてまたは遊離濃度もしくは非結合濃度として測定することができる。いくつかの実施形態において、ＳＡＰおよびＣＲＰの濃度は、ＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するために使用されるであろう。このデータは、患者が線維性障害を発症する危険性の客観的な指標を医者に提供し、抗線維化治療に対する、患者の応答の指標となる。いくつかの実施形態において、当業者は、この危険性評価に基づいて患者に施すための最も適切な抗線維化療法を決定することができる。
【００７０】
本出願の他の態様は、線維化関連障害を治療し、予防し、またはその重症度を低下させるための方法であって、ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子の多型について患者の生物学的サンプルを分析するステップを含む方法を提供する。その方法は、患者の両方のＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子における１３１位多型のアミノ酸残基（配列番号６の１６６位）を決定するステップと、患者に最も有効な治療計画を選択するステップとを含む。一方または両方のＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子の１３１位にヒスチジンを有する患者に、１つまたは複数のＳＡＰアゴニストを投与することができる。一方または両方のＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子の１３１位にアルギニンを有する患者に、１つもしくは複数のＳＡＰアゴニスト、１つもしくは複数のＣＲＰアンタゴニスト、またはその組合せを投与することができる。一方または両方のＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子の１３１位にアルギニンを有する患者は、Ｈ１３１対立遺伝子についてホモ接合性の患者よりも高用量のＳＡＰアゴニストの投与を必要とし得る。ＳＡＰアゴニストの投薬量は、患者におけるＣＲＰ濃度に依存するであろう。高レベルの血漿ＣＲＰを有する、Ｒ１３１についてホモ接合性の患者は、有効な治療のために、より高用量のＳＡＰアゴニストを投与される。
【００７１】
本明細書において記載されるＦｃγＲＩＩＡ多型はまた、抗線維化治療の薬剤開発プロセスの多くの異なる側面を改善するのに有用でもある。たとえば、本発明の態様は、ＦｃγＲＩＩＡ  １３１多型に基づいて、臨床試験のための個人を選択することを含む。たとえば、少なくとも１つのＨ１３１対立遺伝子を有する個人は、彼／彼女らが、おそらく、ＳＡＰポリペプチドまたはＳＡＰアゴニストに陽性に応答するであろうということおよびＳＡＰ治療の効果を評価する試験に含むことができることを示す。その代わりに、少なくとも１つのＲ１３１対立遺伝子を有する個人もまたＳＡＰベースの臨床試験に含まれていてもよいが、その個人らは、より高用量のＳＡＰを必要とする可能性がある。
【００７２】
本出願の他の態様は、線維細胞分化についての、ＣＲＰに対する、ＰＢＭＣまたは単球細胞の応答性を決定するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、様々な組織培養系から得ることができる。いくつかの実施形態において、その方法は、ＰＢＭＣまたは単球細胞を含有する、患者の生物学的サンプルを得るステップを含む。生物学的サンプルは血清、血漿、健常組織、または線維性組織由来のものであってもよい。細胞は、線維細胞分化の程度を決定するために、様々な濃度のＣＲＰを有する培地中で培養される。ＣＲＰの濃度は、０．０００１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌまで及び得、いくつかの実施形態において、０．００１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、または５００μｇ／ｍｌである。このアッセイのいくつかの実施形態において、培地は１〜１００ｎｇ／ｍｌのｈＭＣＳＦを補充してもよく、ｈＭＣＳＦの好ましい濃度は２５ｎｇ／ｍｌである。ＰＢＭＣおよび単球が線維細胞に分化したという指標は、当業者によって決定することができる。一般に、線維細胞は、細長い紡錘形を有し、楕円形の核が存在する接着細胞として形態学的に定義される。このアッセイのいくつかの実施形態において、細胞は、固定され、倒立顕微鏡を使用する直接的な集計によって線維細胞を数える前に、Ｈｅｍａ  ３染色を用いて染色される。線維細胞分化の量は、ＣＲＰに対する、細胞の応答性の指標として当業者によって解釈される。線維細胞分化の量が大きいほど、より大きな程度のＣＲＰ応答性を示す。
【００７３】
本出願の他の態様は、ＣＲＰアンタゴニストの抗線維化作用に対する患者の応答性を決定するための方法を提供する。その方法は、ＰＢＭＣまたは単球細胞を含有する、患者の生物学的サンプルを得るステップを含む。生物学的サンプルは血清、血漿、健常組織、または線維性組織由来のものであってもよい。細胞は、線維細胞分化の程度を決定するために、様々な濃度のＣＲＰを有する培地中で培養される。ＣＲＰの濃度は、０．０００１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌまで及び得、いくつかの実施形態において、０．００１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、または５００μｇ／ｍｌである。このアッセイのいくつかの実施形態において、培地は１〜１００ｎｇ／ｍｌのｈＭＣＳＦを補充してもよく、ｈＭＣＳＦの好ましい濃度は２５ｎｇ／ｍｌである。ＰＢＭＣおよび単球が線維細胞に分化したという指標は、当業者によって決定される。一般に、線維細胞は、細長い紡錘形を有し、楕円形の核が存在する接着細胞として形態学的に定義される。このアッセイのいくつかの実施形態において、細胞は、固定され、倒立顕微鏡を使用する直接的な集計によって線維細胞を数える前に、Ｈｅｍａ  ３染色を用いて染色される。線維細胞分化の量は、ＣＲＰに対する、患者の応答性の指標として当業者によって解釈される。線維細胞分化の量が大きいほど、患者における、より大きな程度のＣＲＰ応答性を示す。
【００７４】
本出願の他の態様は、患者における線維細胞分化を防止する最小ＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するための方法を提供する。その方法は、ＰＢＭＣまたは単球細胞を含有する、患者の生物学的サンプルを得るステップを含む。生物学的サンプルは血清、血漿、健常組織、または線維性組織由来のものであってもよい。細胞は、線維細胞分化の最大の誘発を提供する、ＣＲＰの最小濃度を決定するために、様々な濃度のＣＲＰを有する培地中で培養される。ＣＲＰの濃度は、０．０００１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌまで及び得、いくつかの実施形態において、０．００１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、または５００μｇ／ｍｌである。次いで、患者から得られたさらなるＰＢＭＣまたは単球細胞は、この最小濃度のＣＲＰおよび様々な濃度のＳＡＰを補充した培地中で培養される。ＣＲＰの濃度は、０．０００１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌまで及び得、いくつかの実施形態において、０．００１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、または５００μｇ／ｍｌである。このアッセイにおいて、細胞は、ＣＲＰの存在下において、線維細胞分化を少なくとも９０％低下させるのに必要なＳＡＰの最小濃度を決定するためにモニターされる。次いで、示されたＳＡＰ濃度は、示されたＣＲＰ濃度で割り、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて線維細胞分化を防止する最小ＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定する。このアッセイのいくつかの実施形態において、培地に１〜１００ｎｇ／ｍｌのｈＭＣＳＦを補充し、ｈＭＣＳＦの好ましい濃度は２５ｎｇ／ｍｌである。ＰＢＭＣおよび単球が線維細胞に分化したという指標は、当業者によって決定することができる。一般に、線維細胞は、細長い紡錘形を有し、楕円形の核が存在する接着細胞として形態学的に定義される。このアッセイのいくつかの実施形態において、細胞は、固定され、倒立顕微鏡を使用する直接的な集計によって線維細胞を数える前に、Ｈｅｍａ  ３染色を用いて染色される。
【００７５】
Ｆｃ受容体
免疫グロブリンの受容体（Ｆｃ受容体またはＦｃＲ）は、免疫系の全体にわたって広く発現される。抗体Ｆｃ部分に結合することによって、それらは、適応免疫系の特異性および先天性免疫エフェクター細胞によって誘発されるエフェクター機能の間のつながりを提供する。同じ細胞上での活性化ＦｃＲおよび阻害ＦｃＲの同時発現は、免疫複合体（エピトープと、そのエピトープに対して向けられる抗体の組合せ）による免疫細胞活性化に対する閾値を定める。免疫応答の遠心性の段階へのそれらの関与に加えて、それらはまた、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）の活性化を調節することによって適応免疫応答を調整するのに重要である。ＤＣ上のＦｃＲによる免疫複合体の取り込みならびに活性化シグナル伝達経路および阻害シグナル伝達経路を同時に誘発することは、開始されるＴ細胞応答の強さを決定するであろう。この釣り合いのとれたシグナル伝達の損失は、健常組織の損傷および最終的に、自己免疫プロセスの開始に至り得る無制御応答をもたらす。
【００７６】
ＦｃＲは、免疫系の細胞上に広く発現され、内皮細胞、メサンギウム細胞、および破骨細胞などの他の細胞型を選択し、顕著なＦｃＲ発現を示さない少数の造血細胞型のうちの１つは、Ｔ細胞である。異なる４つのクラスのＦｃＲがげっ歯動物において同定されている：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶ。ＦｃγＲは、異なる哺乳動物間で十分に保存されており、これらのげっ歯動物受容体に対するオルソログなタンパク質は、ほとんどの種において見つけられた。対応するヒトタンパク質は、ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩＢと呼ばれる。ＦｃγＲＩＩＡの細胞外部分は、マウスＦｃγＲＩＩＩに高度に相同であるが、細胞内部分は著しく異なる。ＦｃγＲＩＢおよびＦｃγＲＩＣなどの他のヒトＦｃＲ遺伝子は、オープンリーディングフレームの破壊により機能的タンパク質をコードしない。さらに、好中球上に選択的に発現されるＧＰＩアンカー型ＦｃＲであるＦｃγＲＩＩＩＢは、マウスにおいて見つけられていない。
【００７７】
機能レベルでは、ＦｃＲは、２つの方法で分類することができる：第１は、それらのリガンドに対する親和性に基づくもの、第２は、ＦｃＲ架橋で開始されるシグナル伝達経路の型に基づくものである。ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶならびにそれらの対応するヒト対応物ＦｃγＲＩＩＡ／Ｂ／ＣおよびＦｃγＲＩＩＩＡ／Ｂを含む大多数のＦｃＲは、マイクロモル濃度の範囲（１０−５〜１０−７）の、ＩｇＧ  Ｆｃ部分に対する低い親和性を有する。ＦｃγＲＩのみが、より高い親和性（１０８〜１０９Ｍ−１）を示し、単量体の抗体への著しい結合を可能にする。他のすべてのＦｃＲは、免疫複合体の形態の抗体と選択的に相互作用し、これらは、普通の場合、それらの標的抗原に結合した多数の抗体から成る。ＦｃＲは、それらが開始するシグナル伝達経路に関して異なる。活性化受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＡ）は、それらの細胞質側領域またはそれらの関連するシグナル伝達領域において、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。それらは、免疫エフェクター細胞活性化／増殖、炎症媒介物質の放出、酸化バースト、食作用、および抗原提示を刺激する。阻害受容体（ＦｃγＲＩＩＢ１およびＦｃγＲＩＩＢ２）は、それらの細胞質側尾部において、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。両受容体クラスを発現する細胞において、免疫応答は、活性化受容体および阻害受容体の間の比、したがって、サイトカイン環境に依存する。Ｔｈ１およびＴｈ２のサイトカインは、活性化受容体および阻害受容体の発現をそれぞれアップレギュレートする。
【００７８】
これらの「活性化」ＦｃＲはすべて、キナーゼのＳｒｃファミリーのメンバーによってチロシンリン酸化されるようになる、それらの細胞質ゾル部分におけるＩＴＡＭを含有する。ＩＴＡＭ配列のリン酸化により、Ｓｙｋキナーゼのドッキングおよび活性化のためのＳＨ２部位が作り出される。細胞型および個々のＦｃＲに依存して、関与するＳｒｃキナーゼファミリーメンバーは変動してもよい。たとえば、Ｌｙｎは、肥満細胞におけるＦｃγＲＩ経路と関連するのに対して、Ｌｃｋは、ＮＫ細胞におけるＦｃγＲＩＩＩＡと関連する。マクロファージにおいて、これらのキナーゼの両方およびＨｃｋは、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＡと関連する（Ｔａｋａｉ、２００２年）。ＩＴＡＭモチーフのリン酸化に続いて、ＰＩ３Ｋ、Ｂｔｋ、および他のＴｅｃファミリーキナーゼ、ホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣγ）、ならびにＳＬＰ−７６およびＢＬＮＫなどのアダプタータンパク質を含む多種多様の細胞内基質の動員に至る、Ｓｙｋキナーゼの動員および活性化が結果として起こる。さらに、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰキナーゼ経路は、Ｓｈｃのリン酸化に対して動員されるＧｒｂ２に結合したＳｏｓを通して活性化される。他の重大なステップは、ＳｙｋによるＰＩ３Ｋの活性化であり、これは、ホスファチジル−イノシトール−３−リン酸の生成をもたらす。これは、それらのプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインでＰＩＰ３を認識するＢｔｋおよびＰＬＣγの動員に至り、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に至り、これは、細胞内カルシウムの動員およびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化にとって重大である。このシグナル伝達カスケードは、免疫エフェクター細胞の炎症活性、細胞溶解活性、および食作用活性を開始する。
【００７９】
阻害受容体シグナル伝達の役割は、ＰＩＰ３などの重要な中間体の生成に干渉することによって、これらの活性化経路を抑えることである。これは、ＳＨ２ドメイン含有イノシトールホスファターゼ（ＳＨＩＰ）の動員および活性化に至る、ＬｙｎによるＦｃγＲＩＩＢの細胞質ゾル部分のＩＴＩＭモチーフのリン酸化によって開始される。活性化ＳＨＩＰの重要な機能は、ＰＩＰ３などのホスファチジルイノシトール中間体を加水分解し、それによって、ＢｔｋおよびＰＬＣγの膜動員に干渉し、したがって、ＩＴＡＭシグナル伝達媒介性カルシウム放出ならびにＡＤＣＣ、食作用、サイトカイン分泌、および炎症媒介物質の放出などの下流のエフェクター機能を抑えることである。Ｒａｓ経路はまた、チロシンリン酸化ＳＨＩＰへのＳｈｃおよびＤＯＫの動員によって阻害され、これは、細胞増殖を阻害する。
【００８０】
ＦｃγＲＩＩＡの多型Ｒ１３１／Ｈ１３１
第２の細胞外ドメインの１３１位のアルギニン（Ｒ）からヒスチジン（Ｈ）へのアミノ酸変化をもたらす、エキソン４のコード領域のヌクレオチド４９４での、アデニン（Ａ）へのグアニン（Ｇ）の単一塩基置換から成る、ヒトＦｃγＲＩＩ（ＦｃγＲＩＩＡ）遺伝子の対立遺伝子多型は（Ｓｔｕａｒｔら、１８８７年；Ｂｒｏｏｋｓら、１９８９年；Ｓｅｋｉ、１９８９年）、先に記載されている（Ｃｌａｒｋら、１９８９年；Ｗａｒｍｅｒｄａｍら、１９９０年；Ｔａｔｅら１９９２年）。本明細書において使用されるように、ヒトＦｃγＲＩＩＡの「１３１」位での多型は、未成熟タンパク質（配列番号６）における１６６位および成熟タンパク質における１３３位を指す。歴史上、さらなる解明を必要とするこのＦｃγＲＩＩＡ多型のアミノ酸位置に関して矛盾する命名法があった。ＮＰ＿０６７６７４の下でＮＣＢＩデータベースにおいて記録されるタンパク質配列は、ＦｃγＲＩＩＡの未成熟形態を示し、これは、細胞表面への受容体タンパク質の輸送の間に次いで切り離されるシグナルペプチド配列と共に合成される（配列番号６）。細胞表面の最終タンパク質受容体は、成熟タンパク質として知られている。ヒトＦｃγＲＩＩＡについてのシグナル配列は、受入番号Ｐ１２３１８を有するＮＣＢＩデータベース配列中の未成熟タンパク質の最初の３３アミノ酸として記載される。シグナル配列の除去により、未成熟タンパク質（配列番号６を参照）の１６６のＡｒｇ／Ｈｉｓのアミノ酸位置が成熟機能的タンパク質における１３３のＡｒｇ／Ｈｉｓに変わる。成熟ＦｃγＲＩＩＡは、成熟タンパク質配列のアミノ酸１および未成熟タンパク質配列のアミノ酸３４として最初に同定された（修正は、Ｐｏｗｅｌｌら、１９９９年において確立）。Ｒ１３１／Ｈ１３１多型の同定および命名は、ヒトＦｃγＲＩＩの正確なＮ末端におけるこの修正が成される前の期間の間に行われた（Ｗａｒｍｅｒｄａｍら、１９９０年）。定義されるＮＭ＿０２１６４２（配列番号５）におけるように、Ｒ１３１／Ｈ１３１多型がｍＲＮＡ  ５３５位で生じる検証はまた、Ｆｌｅｓｃｈら１９９８年に対する参照によって得ることもできる。この学術論文は、対立遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲを使用する、Ｒ１３１／Ｈ１３１ヒトＦｃγＲＩＩＡ多型の急速なタイピングのための方法を定義する。この多型はまた、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号ＳＮＰ  ｒｅ１８０１２７４（配列番号７）において記載されるＳＮＰによって定義することができ、アンチセンス鎖の３０１位のヌクレオチドは、ＣまたはＴとなり得る。アンチセンス鎖は、多型が、ＦｃγＲＩＩＡリーディングフレームにおいてＡまたはＧとなるであろうコード鎖を解釈するために使用することができることが当業者に知られている。出願人らは、アルギニン／ヒスチジン多型を指す場合、命名法１３１位を使用する。
【００８１】
１３１多型は、少なくとも３つのＩｇＧサブクラス、すなわちマウス（ｍ）ＩｇＧ１、ヒト（ｈ）ＩｇＧ２、およびｈＩｇＧ３についての受容体の親和性を変える。多型は、Ｔ細胞有糸分裂誘発アッセイにおける、ヒト単球のＦｃγＲＩＩへのｍＩｇＧ１抗ＣＤ３  ｍＡｂの結合における差異によって当初、定義された。アミノ酸１３１にＲを有する対立形質は、ｍＩｇＧ１に対する高い親和性を発現したのに対して、Ｈ１３１を有する形態は、低い親和性を示し、それぞれ、高いおよび低い機能的応答を与えた。ヘテロ接合性の細胞は、完全にまたは不定に応答性であることが報告された。形質移入体において発現される受容体についてのそれに続く試験で、Ｈ１３１形態が、ｈＩｇＧ２に対する高い親和性を示したのに対して、Ｒ１３１遺伝子型形態は、ｈＩｇＧ２にほとんどまたは全く結合しなかったことが分かった。単球を使用する結合アッセイにより、この結果を確認し、Ｈ１３１形態が、ＦｃγＲＩＩＡのＲ１３１形態よりも著しくよりｈＩｇＧ３に結合したことをさらに示した。
【００８２】
近年のデータは、この多型が、健康および疾患において、とりわけ、抗炭水化物免疫応答においてなど、ｈＩｇＧ２が、産生される主な抗体サブクラスである状況においてＦｃγＲＩＩ機能に関連する可能性があることを示唆する（ＩｎｓｅｌおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９８８年）。Ｈ１３１についてホモ接合性の多形核好中球（ＰＭＮ）は、Ｒ１３１についてホモ接合性のＰＭＮが示すよりも、ｈｌｇＧ２を用いてオプソニン化された細菌または赤血球を貪食するための優れた性能を示す（Ｓａｌｍｏｎら、１９９２年；Ｓａｎｄｅｒｓら１９９４年）。この多型はまた、血小板ＦｃγＲＩＩを密集させて、誘発する抗血小板ヘパリン依存性抗体と関連する障害であるヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）に対する感受性にも関係する可能性がある（Ｃｉｎｅｓら１９８０年；Ｃｈｏｎｇら、１９８２年、Ｉｓｅｎｈａｒｔら、１９９４年；Ｋｅｌｔｏｎら１９８８年；Ｃｈｏｎｇら、１９８９年）。さらに、Ｈ１３１についてホモ接合性の個人の頻度は、再発性細菌感染症を有する患者の群においておよび髄膜炎菌性疾患にかかりやすい群において少ないように思われる（Ｓａｎｄｅｒｓら１９９４年；Ｆｉｊｅｎら１９９３年）。さらに、循環ｈＩｇＧ２のレベルは、Ｒ／Ｒ１３１遺伝子型を有する個人と比較して、Ｈ／Ｈ１３１個人において著しく低い（Ｐａｒｒｅｎら、１９９２年）。
【００８３】
本明細書において使用されるような「多型」は、個人における遺伝子のヌクレオチド配列における変異を意味する。多型の結果として異なるヌクレオチド配列を有する遺伝子は、「対立遺伝子」である。「多型位置」は、配列内の、所定のヌクレオチド位置である。いくつかの場合において、遺伝的多型は、アミノ酸配列変異によって反映され、したがって、多型位置は、ポリペプチドの配列における所定の位置のアミノ酸配列の多型の位置をもたらし得る。特定の多型について「ホモ接合性の」個人は、遺伝子の両方のコピーが多型位置で同じ配列を含有する個人である。特定の多型について「ヘテロ接合性の」個人は、遺伝子の２つのコピーが多型位置の異なる配列を含有する個人である。
【００８４】
生物学的サンプルにおけるＲ１３１／Ｈ１３１  ＦｃγＲＩＩＡ多型の同定
本出願は、ヒトＦｃγＲＩＩＡ受容体アイソフォームをコードする遺伝子における１３１多型が、線維性疾患の危険性、進行、および／または治療に対する効果を有するという発見に部分的に基づく。いくつかの実施形態において、本出願は、ヒト患者において、ＦｃγＲＩＩＡ遺伝子の対立遺伝子パターンを決定するための方法を提供する。その方法は、ハイブリダイゼーションプローブとしてのおよび／またはＤＮＡ増幅のためのプライマーとしての対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの使用ならびに直接的なＤＮＡ配列決定の使用を包含する。受容体対立遺伝子の同定はまた、細胞表面上にＦｃγＲＩＩＡ受容体を発現する血液細胞を、異なる多型形態の受容体を区別する抗体と接触させることによって、免疫学的に達成されてもよい。
【００８５】
いくつかの実施形態において、白血球またはそのサブセットは、たとえば勾配遠心分離法および／または免疫吸着法などの、当技術分野において十分に知られている方法を使用して、試験されることとなる患者から単離される。次いで、異なる対立形質のＦｃγＲＩＩＡを区別することができる抗体は、それぞれの対立形質の存在および相対量を決定するために、単離細胞にかける。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよく、好ましくはモノクローナルである。細胞に結合する特異的抗体の測定は、限定を伴うことなく、定量的フローサイトメトリーまたは酵素結合イムノアッセイもしくは蛍光結合イムノアッセイを含む、任意の知られている方法によって行うことができる。特定の対立遺伝子の存在または非存在および対立遺伝子パターン（つまりホモ接合性対ヘテロ接合性）はまた、遺伝子型が知られている患者の集団から定められる平均と患者から得られる値を比較することによっても決定される。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、患者から得られ、特定のＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子に対応するＤＮＡ配列の存在は決定される。ＤＮＡは、任意の細胞源または体液から得ることができる。臨床業務において入手可能な細胞源の非限定的な例は、血液細胞、頬の細胞、頚腟部の細胞、尿からの上皮細胞、胎児細胞、または生検によって得られる組織中に存在する任意の細胞を含む。体液は、感染、炎症、または線維化の部位の血液、尿、脳脊髄液、および組織滲出液を含む。ＤＮＡは、当技術分野において標準的な多数の方法のうちのいずれかを使用して、細胞源または体液から抽出される。ＤＮＡを抽出するために使用される特定の方法は、供給源の性質に依存することが理解されるであろう。
【００８７】
一度抽出されたら、ＤＮＡは、さらなる操作を伴うことなく使用することができる。その代わりに、ＦｃγＲＩＩＡのすべてまたは一部に対応するＤＮＡ領域は、当技術分野において知られているＰＣＲまたは他の増幅方法によって増幅することができる。この場合において、増幅領域は、プライマーとしての使用のための特定のフランキング配列の選択によって特定される。このステップでの増幅は、ＦｃγＲＩＩＡ  ＤＮＡ配列の濃度を増加させるという利点を提供する。増幅することができるＤＮＡ配列の長さは、８０ｂｐ〜３０ｋｂｐまで及ぶ。好ましくは、異なる対立形質の受容体間で異なる配列を含有する比較的短いセグメントを確定するプライマーが、使用される。
【００８８】
ＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子特異的ＤＮＡ配列の存在は、限定を伴うことなく、直接的なＤＮＡ配列決定、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、および一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）を含む、任意の知られている方法によって決定されてもよい。直接的な配列決定は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法を使用する化学的配列決定によってまたはＳａｎｇｅｒ法を使用する酵素的配列決定によって行うことができる。後者の場合において、特異的オリゴヌクレオチドは、標準的な方法を使用して合成され、ジデオキシヌクレオチド配列決定反応のためのプライマーとして使用される。患者においてＦｃγＲＩＩＡ対立遺伝子を決定するための代替方法は、１３１多型を特異に認識するＰＣＲプライマーを使用する。この方法は、実施例５において詳細に記載され、ＤＮＡを配列決することなく、Ｈ１３１／Ｒ１３１対立遺伝子を区別するために使用することができる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ＦｃγＲＩＩＡを発現する細胞は、免疫吸着法によって単離され、ＲＮＡは、グアニジウムチオシアネートフェノールクロロホルム抽出などの十分に知られている方法を使用して免疫精製細胞から単離される（Ｃｈｏｍｏｃｙｚｎｓｋｉら、１９８７年、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２巻：１５６頁）。次いで、単離ＲＮＡは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、共役逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応による増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）にかける。プライマーアニーリングのための条件は、特異的な逆転写および増幅を確実にするために選ばれ、したがって、増幅産物の出現は、用いられる特定のプライマーによって特定される対立遺伝子の存在の診断となる。他の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＡをコードするＲＮＡは、逆転写され、対立遺伝子非依存性の様式において増幅され、この後に、増幅ＦｃγＲコードｃＤＮＡは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによってまたは直接的なＤＮＡ配列決定によって同定される。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本出願は、個人において、ＦｃγＲＩＩＡ遺伝子内の１３１位の配列の決定のためのキットを提供する。キットは、多型位置の配列を決定するのに有用な試薬を含み、多型パターンの分析のためのデータを任意選択で含んでもよい。配列決定のための試薬は、適した核酸ベースの免疫学的試薬を含んでもよい。好ましくは、キットはまた、適した緩衝液、適切な場合にはコントロール試薬、および多型位置の配列を決定するための指示をも含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、本出願は、患者におけるＳＡＰおよびＣＲＰの濃度レベルを決定するための試薬をさらに含むキットを提供する。ＳＡＰの血漿濃度は、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７１巻のＰｉｌｌｉｎｇ，  Ｄ．  Ｊ：５５３７〜５５４６頁（２００３年）において記載されるように、たとえば、市販で入手可能なＳＡＰ抗体（たとえばＡｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｔ  ＃  ＳＡＰ１２−Ｓ）を使用して、血清に対してＥＬＩＳＡアッセイを実行することによって決定することができる。ＣＲＰの血漿濃度は、Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｔ  ＃  １０００およびＣｈｅｍｉｃｏｎ  Ｃａｔ  ＃  ＣＹＴ２９８からのヒトＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）ＥＬＩＳＡキットを含む、市販で入手可能なキットを使用して決定することができる。さらに、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）ベースのサイトメトリックビーズアレイアッセイは、ＳＡＰおよびＣＲＰについて開発されており、Ｒｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（商標）によって提供される。健常対象におけるＳＡＰの平均的血漿濃度は、２０〜４０μｇ／ｍｌの間である。健常対象におけるＣＲＰの平均的血漿濃度は、０〜２μｇ／ｍｌの間である。いくつかの実施形態において、測定されたＳＡＰおよびＣＲＰの濃度は、「遊離濃度」またはむしろ非結合ＳＡＰおよび非結合ＣＲＰの濃度である。ＳＡＰおよびＣＲＰの遊離濃度の決定は、たとえばサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して実行することができる。たとえば、ＳＡＰのＦｃγＲ結合部位を認識する第１の抗体は、生物学的サンプルのＳＡＰを捕捉するために使用される。次いで、ＳＡＰのリガンド結合部位を認識する第２の抗体は、サンプル中のＳＡＰの遊離濃度を検出するために使用される。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルのＳＡＰおよびＣＲＰの濃度の決定は、ＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するために使用することができる。当業者は、ＳＡＰまたは他の抗線維化療法の投薬量を個々の患者にとって適切なレベルにより正確に調整するために、ＳＡＰ対ＣＲＰ比を使用することができるであろう。
【００９２】
抗線維化療法
線維化関連障害のための様々な治療は、当業者らに知られている。治療は、抗炎症性作用物質、コルチコステロイド、ペニシラミン、およびコルヒチンを含む。たとえばＢｅｅｒｓ，  ＭＨおよびＢｅｒｋｏｗ，  Ｒ編Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ．  ７ｔｈ  ｅｄ．  Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１９９９年を参照されたい。いくつかの実施形態において、抗線維化療法は、線維促進性因子アンタゴニストおよび／または抗線維化作用物質の投与を含む。
【００９３】
線維促進性因子アンタゴニスト
抗線維化療法は、線維性組織の形成および維持に関与する、１つまたは複数の成長因子またはサイトカインをアンタゴナイズする作用物質などの、線維促進性因子を阻害するまたはアンタゴナイズする作用物質を包含する。このように、抗線維化療法は、線維細胞、線維細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、および／または造血単球前駆体の分化ならびに線維性組織形成および維持を標的とする。
【００９４】
本発明の療法の一部としての、アンタゴニストを用いて標的とされてもよい線維促進性因子は、限定を伴うことなく、形質転換成長因子β型（ＴＧＦ−β１５を含むＴＧＦ−β）、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ、インターロイキンファミリーのメンバー（たとえばＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１３）、腫瘍壊死因子アルファ型（ＴＮＦ−α）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、単球走化性タンパク質１型（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症タンパク質（たとえばＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−２）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、エンドセリン−１、アンギオテンシン−ＩＩ、レンニン、レプチン、ケモカイン（たとえばＣＣＬ２、ＣＣＬ１２、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７）、ＳＬＣ／ＣＣＬ２１、ならびに線維性組織の形成、成長、または維持を促進するまたはそれに関連することが知られている他の因子を含む。本発明は、１つまたは複数の前述の因子およびサイトカインを標的とする組成物または方法を含んでもよい。
【００９５】
ある実施形態において、抗線維化療法は、１つまたは複数の線維促進性因子に対する抗体を含んでもよい。そのような抗体は、精製される、精製されない、または部分的に精製される。抗体は、マウス、ウサギ、ラット、ヒト、ウマ、ヤギ、ウシなどなどの任意の適した動物源に由来するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。そのような抗体は、抗体断片、単鎖抗体、重合抗体、および／または抗体断片などを含んでもよい。
【００９６】
ある実施形態において、抗線維化療法は、１つまたは複数の線維促進性因子の対応する受容体のアンタゴニストを含んでもよい。そのようなアンタゴニストは、その断片などの、１つまたは複数の線維促進性因子および／またはサイトカインの不活性形態を含んでもよい。適した濃度のそのような形態は、その対応する線維促進性因子および／またはサイトカインとその受容体への結合について競合してもよい。同様に、受容体に対するある抗体は、対応する線維促進性因子および／またはサイトカインが受容体に結合することに干渉するまたはそれを予防するために使用することができる。
【００９７】
他の選択される実施形態において、抗線維化療法は、可溶性受容体が、その対応する天然細胞受容体と標的リガンドについて競合するように、１つまたは複数の線維促進性因子および／またはサイトカインの受容体の可溶性形態を含んでもよい。
【００９８】
他の選択される実施形態において、組成物の適した構成成分は、１つまたは複数の線維促進性因子および／またはサイトカインの、その受容体との結合と競合するまたはその他の形でそれに干渉する化合物を含んでもよい。たとえば、プロテオグリカンであるデコリンは、ＴＧＦ−βに結合することが知られており、それによって、その受容体への結合についてのその利用可能性を低下させる。マンノース−６−リン酸もまた、その対応する受容体への結合についてＴＧＦ−βと競合することが知られている。ＴＧＦ−βの他の知られている結合阻害剤は、潜在型形質転換因子−β結合タンパク質（ＬＴＢＰ）および潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）を含み、両者とも、ＴＧＦ−βの細胞内前駆体に自然に結合する。
【００９９】
ある実施形態において、抗線維化療法は、１つまたは複数の線維促進性因子および／またはサイトカインに対してアンチセンスである少なくとも１つの配列を含有する１つまたは複数のオリゴリボヌクレオチドを含んでもよい。そのような構成成分はまた、アンチセンス配列を産出する、適した転写コントロール配列を有する１つまたは複数の発現プラスミドを含んでもよい。他の選択される実施形態において、抗線維化療法は、ＲＮＡ干渉を介して、１つまたは複数の線維促進性因子および／またはサイトカインの転写物を分解するのに適している、１つまたは複数の二本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはそれをコードする発現プラスミドを含んでもよい。他の選択される実施形態において、抗線維化療法は、それらの同起源の受容体への線維促進性因子の結合を阻害するまたはそれに干渉するのに適している、１つまたは複数の一本鎖オリゴヌクレオチドアプタマーまたはそれをコードする発現プラスミドを含んでもよい。
【０１００】
適した線維促進性因子アンタゴニストは、その対応する受容体への結合に際して１つまたは複数の線維促進性因子によって活性化される細胞内シグナル伝達経路の１つまたは複数の構成成分を阻害する、減衰させる、またはそれに干渉することが知られている構成成分を含んでもよい。
【０１０１】
たとえば、抗線維化療法は、ＳＭＡＤファミリーメンバーおよびＳＡＲＡなどの、下流のシグナル経路分子を阻害するまたは減衰させる構成成分を含んでもよい。
【０１０２】
適した抗線維化療法は、線維化に必要とされる細胞の癒着を阻害するまたはそれに干渉するのに適している１つまたは複数の分子を含んでもよい。たとえば、適した構成成分は、ＩＣＡＭ−１および／またはＣＤ１１分子、ＣＤ４９分子、もしくはＣＤ１８分子に干渉する抗体を含み、それによって、それらの間の癒着相互作用に干渉してもよい。
【０１０３】
他の選択される実施形態において、適した線維促進性因子アンタゴニストは、コラーゲン前駆体の翻訳後処理に干渉するプロリン類似体などの、コラーゲン合成の阻害剤を含んでもよい。ピルフェニドンは、たとえば、コラーゲン合成を阻害し、多数のサイトカインの産生をダウンレギュレートし、かつ線維芽細胞増殖を遮断する可能性がある経口的に活性の小分子薬である。
【０１０４】
ＴＧＦ−βアンタゴニスト
形質転換成長因子（ＴＧＦ）ベータファミリーのサイトカインは、創傷治癒および組織修復において中心的な役割を果たし、すべての組織において見つけられる。ＴＧＦ−βは、多くの実質細胞型ならびにリンパ細胞、単球／マクロファージ、および血小板などの浸潤細胞によって産生される。創傷または炎症に続いて、そのような細胞は、ＴＧＦ−βの供給源となる可能性がある。一般に、ＴＧＦ−βは、様々な細胞外マトリックスタンパク質の産生を刺激し、これらのマトリックスタンパク質の分解を阻害し、組織線維化を促進する。これらはすべて、患部組織の修復および回復に寄与する。多くの疾患において、過剰ＴＧＦ−βは、正常な器官機能を損ない得る組織線維化の病理的過剰の一因となる。
【０１０５】
用語「ＴＧＦ−β」は、本明細書において使用されるように、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、およびＴＧＦ−β５を含む。同様の特性を有する他の関連するタンパク質もまた含まれる。
【０１０６】
本明細書において使用されるように、「ＴＧＦ−βアンタゴニスト」は、細胞内のまたは生理学的システム内のいずれかにおいてＴＧＦ−βの量または活性を減少させることができる任意の分子である。好ましくは、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、ＴＧＦ−β１、２、または３の量または活性を減少させるように作用する。たとえば、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、転写、翻訳、処理、または輸送のレベルで、ＴＧＦ−βの発現を阻害する分子であってもよく、それは、ＴＧＦ−βの安定性または活性成熟形態への前駆体分子の変換に影響を与えてもよい、それは、１つもしくは複数の細胞受容体（たとえばＩ、ＩＩ、もしくはＩＩＩ型）に結合するＴＧＦ−βの能力に影響を与えてもよい、またはそれは、ＴＧＦ−βシグナル伝達に干渉してもよい。
【０１０７】
多種多様のＴＧＦ−βアンタゴニストおよび産生のための方法は、当技術分野において知られており、さらに多くのものが現在、開発中である。用いられる特異的なＴＧＦ−βアンタゴニストは、限定的な特徴ではなく、本明細書において定義されるような任意の有効なＴＧＦ−βアンタゴニストが、本発明の方法および組成物において有用である可能性がある。好ましくは、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、またはＴＧＦ−β３のアンタゴニストである。最も好ましくは、アンタゴニストは、ＴＧＦ−β１アンタゴニストである。
【０１０８】
ＴＧＦ−βアンタゴニストの例は、ＴＧＦ−βの１つまたは複数のアイソフォームに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（Ｄａｓｃｈら、米国特許第５，５７１，７１４号；国際公開第９７／１３８４４号および国際公開第００／６６６３１号もまた参照されたい）、ＴＧＦ−β受容体、そのような受容体の可溶性形態（好ましくは可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体）、またはＴＧＦ−β受容体に対して向けられる抗体（Ｓｅｇａｒｉｎｉら、米国特許第５，６９３，６０７号、Ｌｉｎら、米国特許第６，００１，９６９号、米国特許第６，０１０，８７２号、米国特許第６，０８６，８６７号、米国特許第６，２０１，１０８号；国際公開第９８／４８０２４号；国際公開第９５／１０６１０号；国際公開第９３／０９２２８号；国際公開第９２／００３３０号）、潜在性関連ペプチド（国際公開第９１／０８２９１号）、大きな潜在型ＴＧＦ−β（国際公開第９４／０９８１２号）、フェチュイン（米国特許第５，８２１，２２７号）、デコリンならびにバイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、およびエンドグリンなどの他のプロテオグリカン（国際公開第９１／１０７２７号；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら、米国特許第５，６５４，２７０号、米国特許第５，７０５，６０９号、米国特許第５，７２６，１４９号；Ｂｏｒｄｅｒ、米国特許第５，８２４，６５５号；国際公開第９１／０４７４８号；Ｌｅｔａｒｔｅら、米国特許第５，８３０，８４７号、米国特許第６，０１５，６９３号；国際公開第９１／１０７２７号；国際公開第９３／０９８００号；および国際公開第９４／１０１８７号）、ソマトスタチン（国際公開第９８／０８５２９号）、マンノース−６−リン酸またはマンノース−１−リン酸（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、米国特許第５，５２０，９２６号）、プロラクチン（国際公開第９７／４０８４８号）、インスリン様成長因子ＩＩ（国際公開第９８／１７３０４号）、ＩＰ−１０（国際公開第９７／００６９１号）、ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ含有ペプチド（Ｐｆｅｆｆｅｒ、米国特許第５，９５８，４１１号；国際公開第９３／１０８０８号）、植物、菌類、および細菌の抽出物（ＥＰ−Ａ−８１３８７５；日本特許第８１１９９８４号；およびＭａｔｓｕｎａｇａら、米国特許第５，６９３，６１０号）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｃｈｕｎｇ、米国特許第５，６８３，９８８号；Ｆａｋｈｒａｉら、米国特許第５，７７２，９９５号；Ｄｚａｕ、米国特許第５，８２１，２３４号、米国特許第５，８６９，４６２号；および国際公開第９４／２５５８８号）、ＳＭＡＤおよびＭＡＤを含む、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与するタンパク質（ＥＰ−Ａ−８７４  ０４６；国際公開第９７／３１０２０号；国際公開第９７／３８７２９号；国際公開第９８／０３６６３号；国際公開第９８／０７７３５号；国際公開第９８／０７８４９号；国際公開第９８／４５４６７号；国際公開第９８／５３０６８号；国際公開第９８／５５５１２号；国際公開第９８／５６９１３号；国際公開第９８／５３８３０号；国際公開第９９／５０２９６号；Ｆａｌｂ、米国特許第５，８３４，２４８号；Ｆａｌｂら、米国特許第５，８０７，７０８号；およびＧｉｍｅｎｏら、米国特許第５，９４８，６３��号）、ＳｋｉおよびＳｎｏ（Ｖｏｇｅｌ、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６巻：６６５頁；およびＳｔｒｏｓｃｈｅｉｎら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６巻：７７１〜７７４頁）、その同起源の受容体へのＴＧＦβの結合を阻害するまたはそれに干渉するのに適している、１つまたは複数の一本鎖オリゴヌクレオチドアプタマーまたはそれをコードする発現プラスミド、ならびにＴＧＦ−βの活性を阻害する能力を保持する、上記に同定される分子の任意の突然変異体、断片、または誘導体を含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
ある好ましい実施形態において、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、その受容体へのＴＧＦ−β結合を遮断するヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体（またはＦ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体、およびＴＧＦ−βに結合する能力を保持する抗体の他の形態もしくは断片などのその断片）である。好ましいモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ１Ｄ１１．１６（Ｄａｓｃｈら、米国特許第５，７８３，１８５号において記載されるＡＴＣＣ受入番号ＨＢ  ９８４９）から得られるマウスモノクローナル抗体のヒト形態またはヒト化形態である。
【０１１０】
ＴＧＦ−β受容体およびＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合断片、とりわけ、可溶性断片は、本発明の方法における有用なＴＧＦ−βアンタゴニストである。ある実施形態において、ＴＧＦ−β機能の好ましい阻害剤は、可溶性ＴＧＦ−β受容体、とりわけ、たとえば、ＴＧＦＢＩＩＲまたはＴＧＦＢＩＩＩＲの細胞外ドメイン、最も好ましくは組換え可溶性ＴＧＦ−β受容体（ｒｓＴＧＦＢＩＩＲまたはｒｓＴＧＦＢＩＩＩＲ）を含む、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体（ＴＧＦＢＩＩＲ）またはＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体（ＴＧＦＢＩＩＩＲもしくはベータグリカン）である。ＴＧＦ−β受容体およびＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合断片、とりわけ、可溶性断片は、本発明の方法における有用なＴＧＦ−βアンタゴニストである。ＴＧＦ−β受容体およびそれらをコードする核酸は、当技術分野において十分に知られている。ＴＧＦ−β１型受容体をコードする核酸配列は、ＧＥＮＢａｎｋ受入番号Ｌ１５４３６およびＤｏｎａｈｏｅらの米国特許第５，５３８，８９２号において開示される。ＴＧＦ−β２型受容体の核酸配列は、ＧＥＮＢａｎｋ受入番号ＡＷ２３６００１、ＡＩ３５７９０、ＡＩ２７９８７２、ＡＩ０７４７０６、およびＡＡ８０８２５５の下で公的に入手可能である。ＴＧＦ−β３型受容体の核酸配列もまた、ＧＥＮＢａｎｋ受入番号ＮＭ  ００３２４３、ＡＩ８８７８５２、ＡＩ８１７２９５、およびＡＩ６８１５９９の下で公的に入手可能である。
【０１１１】
本発明における使用のための適したＴＧＦ−βアンタゴニストはまた、ＴＧＦ−βの量または活性を阻害するそれらの能力が保持される限り、前述のＴＧＦ−βアンタゴニストの機能的突然変異体、変異体、誘導体、および類似体をも含むであろう。本明細書において使用されるように、「突然変異体、変異体、誘導体、および類似体」は、親化合物に対して同様の形または構造を有し、ＴＧＦ−βアンタゴニストとして作用する能力を保持する分子を指す。たとえば、本明細書において開示されるＴＧＦ−βアンタゴニストのいずれも、結晶化されてもよく、有用な類似体は、（１つまたは複数の）活性部位の形のための担う座標に基づいて合理的に設計されてもよい。その代わりに、当業者は、不必要な実験を伴うことなく、知られているアンタゴニストの官能基を修飾してもよく、活性、半減期、生物学的利用能、または他の望ましい特徴の増加についてそのような修飾分子をスクリーニングしてもよい。ＴＧＦ−βアンタゴニストがポリペプチドである場合、ポリペプチドの断片および修飾体は、送達の容易さ、活性、半減期などを増加させるために産生されてもよい（たとえば、上記に議論されるようなヒト化抗体または機能的抗体断片）。合成および組換えポリペプチドの産生の当技術分野における技術のレベルを考慮すれば、そのような修飾体は、不必要な実験を伴うことなく、達成される可能性がある。当業者らはまた、本明細書において記載されるＴＧＦ−β阻害剤の結晶構造および／または活性部位についての知識に基づいて新規な阻害剤を設計してもよい。
【０１１２】
可溶性ＴＧＦ−β受容体などのポリペプチド阻害剤はまた、遺伝子移入を介して有効に導入されてもよい。したがって、本発明の方法のある実施形態は、ＴＧＦ−β受容体または結合パートナー、好ましくは可溶性受容体または可溶性結合パートナーの発現のための適したベクターの使用を含む。ある好ましい実施形態において、可溶性ＴＧＦ−βアンタゴニストの投与は、可溶性アンタゴニストをコードするｃＤＮＡ、最も好ましくは、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体（ｒｓＴＧＦＢＩＩＲ）またはＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体（ｒｓＴＧＦＢＩＩＩＲ）の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを含むベクターを使用する遺伝子移入によって達成することができ、このベクターは、ベクターを用いて形質移入される器官の細胞中で可溶性ＴＧＦ−βアンタゴニストのｉｎ  ｓｉｔｕ発現を引き起こすために、ドナー器官に、好ましくは局所的に投与される。そのようなｉｎ  ｓｉｔｕ発現は、ＴＧＦ−βの活性を阻害し、ＴＧＦ−β媒介性の線維形成を抑制する。任意の適したベクターを使用することができる。好ましいベクターは、遺伝子移入の目的で開発されたアデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、およびレトロウイルスベクターを含む。遺伝子移入の他の非ベクター方法、たとえば脂質／ＤＮＡ複合体、タンパク質／ＤＮＡ抱合体、裸のＤＮＡの移入方法などもまた使用することができる。
【０１１３】
アデノウイルス遺伝子移入を介しての送達のために開発されたさらなる適したＴＧＦ−βアンタゴニストは、Ｉｇ  Ｆｃドメインに融合された、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体の細胞外ドメインをコードするキメラｃＤＮＡ（Ｉｓａｋａら、１９９９年、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、５５巻：４６５〜４７５頁）、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体のドミナントネガティブ突然変異体のアデノウイルス遺伝子移入ベクター（Ｚｈａｏら、１９９８年、Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．、７２巻：８９〜１００頁）、およびＴＧＦ−β結合プロテオグリカンであるデコリンのアデノウイルス遺伝子移入ベクター（Ｚｈａｏら、１９９９年、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７７巻：Ｌ４１２〜Ｌ４２２頁）を含むが、これらに限定されない。アデノウイルス媒介性の遺伝子移入は、他の遺伝子送達様式と比較して、効率が非常に高い。
【０１１４】
抗線維化作用物質
ある実施形態において、線維促進性因子アンタゴニストは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、またはＢＭＰ−７（ＯＰ−１）などの、抗線維化作用を有することが知られているサイトカインと交換することができ、またはそれを用いて増大させることができる。
【０１１５】
ＩＦＮ−γポリペプチドをコードする核酸配列は、公的データベース、たとえばＧｅｎｂａｎｋ、雑誌刊行物などから入手することができる。様々な哺乳動物ＩＦＮ−γポリペプチドがヒト疾患の治療のために興味深いが、一般に、ヒトタンパク質が使用されるであろう。ヒトＩＦＮ−γコード配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｐ０１５７９およびＣＡＡ００３７５において見つけられてもよい。対応するゲノム配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｊ００２１９、Ｍ３７２６５、およびＶ００５３６において見つけられてもよい。たとえばＧｒａｙら（１９８２年）Ｎａｔｕｒｅ２９５巻：５０１頁（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｘ１３２７４）；およびＲｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔら（１９８４年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２５９巻：６７９０頁を参照されたい。
【０１１６】
ＩＦＮ−γ１ｂ（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（登録商標）；ヒトインターフェロン）は、１４０アミノ酸の単鎖ポリペプチドである。それは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換えで作製され、グリコシル化されていない。Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔら（１９８４年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２５９巻：６７９０〜６７９７頁。
【０１１７】
抗線維化療法において使用されることとなるＩＦＮ−γは、それらがＩＦＮ−γ活性、特にヒトＩＦＮ−γ活性を有する限り、天然ＩＦＮ−γ、組換えＩＦＮ−γ、およびその誘導体のいずれかであってもよい。ＩＦＮ−γは、上記に提供されるような配列に基づくが、タンパク質の産生およびタンパク質分解処理によりその処理変異体をもたらすことができる。Ｇｒａｙら、前掲によって提供される未処理配列は、１６６アミノ酸（ａａ）から成る。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生される組換えＩＦＮ−γは、１４６アミノ酸（アミノ酸２０で始まる）であると当初考えられたが、天然ヒトＩＦＮ−γは、残基２３の後で切断され、１４３ａａタンパク質または細菌における発現に必要とされるように、末端メチオニンが存在する場合、１４４ａａを産生することが続いて分かった。精製の間に、成熟タンパク質は、さらに、残基１６２の後のＣ末端で切断され（Ｇｒａｙらの配列を参照されたい）、１３９アミノ酸または最初のメチオニンが存在する場合、たとえば、細菌の発現に必要とされる場合、１４０アミノ酸のタンパク質をもたらすことができる。Ｎ末端メチオニンは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現の特定の場合において処理されない、ｍＲＮＡ翻訳「開始」シグナルＡＵＧによってコードされる人工物である。他の微生物系または真核生物発現系において、メチオニンは除去されてもよい。
【０１１８】
本発明の方法における使用のために、抗線維性活性を有していてもよい天然ＩＦＮ−γペプチド、その修飾体、および変異体のいずれもまたは１つまたは複数のペプチドの組合せを使用することができる。対象とするＩＦＮ−γペプチドは、断片を含み、完全な配列と比較して、カルボキシ末端の端末で様々に切断することができる。そのような断片は、アミノ酸２４〜約１４９（未処理ポリペプチドの残基からナンバリング）が存在する限り、ヒトガンマインターフェロンの特徴的な特性を示し続ける。外来の配列は、活性の損失を伴うことなく、アミノ酸１５５に続くアミノ酸配列の代わりに用いることができる。たとえば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，６９０，９２５号を参照されたい。天然ＩＦＮ−γ部分は、アミノ酸残基２４〜１５０、２４〜１５１、２４〜１５２、２４〜１５３、２４〜１５５、および２４〜１５７からの、様々に及ぶ分子を含む。これらの変異体および当技術分野において知られており、ＩＦＮ−γ活性を有する他の変異体のいずれも、本発明の方法において使用することができる。
【０１１９】
ＩＦＮ−γポリペプチドの配列は、配列中で標的とされる変化を生成するために、当技術分野において知られている様々な方法において変えられてもよい。変異ポリペプチドは、普通の場合、本明細書において提供される配列に実質的に同様である、つまり、少なくとも１つのアミノ酸が異なるであろう、また、少なくとも２つであるが、約１０個以下のアミノ酸が異なっていてもよい。配列の変化は、置換、挿入、または削除としてもよい。アラニンまたは他の残基を系統的に導入する突然変異のスキャンは、重要なアミノ酸を決定するために使用することができる。対象とする特異的なアミノ酸置換は、保存的および非保存的変化を含む。保存的アミノ酸置換は、以下の群内の置換を典型的に含む：（グリシン、アラニン）、（バリン、イソロイシン、ロイシン）、（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（アスパラギン、グルタミン）、（セリン、トレオニン）、（リシン、アルギニン）、または（フェニルアラニン、チロシン）。
【０１２０】
一次アミノ酸配列を変える可能性があるまたは変えない可能性がある対象とする修飾は、ポリペプチドの化学的誘導、たとえば、アセチル化またはカルボキシル化、グリコシル化部位を導入するまたは除去する、アミノ酸配列中の変化、タンパク質がＰＥＧ化を受けやすくさせる、アミノ酸配列中の変化などを含む。ある実施形態において、本発明は、国際公開第０１／３６００１号において記載されるＩＦＮ−γポリペプチド変異体などの、血清クリアランスが低下したグリコシル誘導ポリペプチドおよび／またはＰＥＧ誘導ポリペプチドを提供するために操作される１つまたは複数の非自然発生グリコシル化部位および／またはペグ化部位を有するＩＦＮ−γ変異体の使用を企図する。グリコシル化の修飾体、たとえば、その合成および処理の間にまたはさらなる処理ステップにおいてポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって、たとえば、哺乳動物のグリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響を与える酵素にポリペプチドをさらすことによって作製される修飾体もまた含まれる。リン酸化アミノ酸残基、たとえばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンを有する配列もまた包含される。
【０１２１】
他の実施形態において、抗線維化作用物質は、ベラパミルなどのカルシウムチャネル遮断薬とすることができる。そのような作用物質は、コラーゲンＩ型の合成を減らすそれらの能力だけではなく、結果としての、コラーゲンＩ型線維の分解の刺激による抗線維化作用を有し得る。線維芽細胞についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、コラーゲンの細胞外輸送が、カルシウムの存在に依存することを示す。カルシウムチャネル遮断薬であるベラパミルは、細胞内カルシウム濃度を低下させて、コラゲナーゼ活性を増加させる。それはまた、線維芽細胞の増殖を阻害する。
【０１２２】
本出願のいくつかの実施形態において、抗線維化療法は１つもしくは複数のＳＡＰアゴニスト、１つもしくは複数のＣＲＰアンタゴニスト、またはその組合せを含む。
【０１２３】
ＳＡＰアゴニスト
本出願の一態様は、様々な障害の治療において有用なＳＡＰアゴニストを提供する。ＳＡＰアゴニストは、ＳＡＰ活性を増加させる化合物を含む、内在性ＳＡＰシグナル伝達を増加させるまたはその他の形で模倣する化合物および組成物をすべて包含する。
【０１２４】
（ｉ）ヒト血清アミロイドＰ
ある実施形態において、ＳＡＰシグナル伝達アゴニストは、ＳＡＰポリペプチドまたはその変異体である。ある実施形態において、ＳＡＰポリペプチドは、５つのヒトＳＡＰプロトマー（配列番号１）を含むＳＡＰである。用語「ＳＡＰプロトマー」は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズムに基づいて、ＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定されるように（Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐ．  Ｂｉｏｓｃｉ．、６巻：２３７〜２４５頁（１９９０年））、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％、ヒトＳＡＰプロトマーに同一であるポリペプチドを指すように意図される。特定の実施形態において、アミノ酸アラインメントの同一性パーセントおよび類似性パーセントを計算するために用いられるパラメーターは、Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ  １５０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、およびＧａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５を含む。用語「ＳＡＰプロトマー」は、先のもののいずれかを含む機能的断片および融合タンパク質を包含する。一般に、ＳＡＰプロトマーは、生物学的に適切な温度、ｐＨレベル、および浸透圧の水溶液中で可溶性となるように設計されるであろう。相互に非共有結合して、ＳＡＰを形成するプロトマーは、同一のアミノ酸配列および／もしくは翻訳後修飾を有していてもよく、またはその代わりに、個々のプロトマーは、異なる配列および／もしくは修飾を有していてもよい。
【０１２５】
本発明のいくつかの態様は、ポリペプチドを提供するまたはそれらのポリペプチドを用いるための治療方法を提供し、前記ポリペプチドは、参照配列に対して、少なくとも部分的に定義される。したがって、そのようなポリペプチドは、参照配列に同一ではないある割合のアミノ酸残基を有していてもよい。いくつかの実施形態において、非同一残基は、それらが同一ではない残基と同様の化学的特性を有する。同様の特性を有する群は、以下のアミノ酸を含む：Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｑ；Ｈ、Ｋ、Ｒ；Ｙ、Ｆ、およびＷ；Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｃ、Ａ；ならびにＳ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ａ。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、同一ではない残基は、同じ目内の種においてなど、少なくとも１つの進化的に関連する種において、参照配列およびオルソログ配列の間で進化的に保存されていない残基である。脊椎動物参照配列の場合には、好ましい実施形態において突然変異させてもよいアミノ酸は、他の脊椎動物種において、参照配列およびオルソログ配列の間で保存されていないアミノ酸である。たとえば、本発明の方法において使用されるポリペプチドが、ヒトＳＡＰ（配列番号１）に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むと表現される場合、前記ポリペプチドは、ヒトＳＡＰおよび他の脊椎動物のＳＡＰが異なるそれらの位置に非同一残基を有していてもよい。図１は、２つの哺乳動物ＳＡＰ配列および１つのトリＳＡＰ配列に対してアラインさせたヒトＳＡＰを表す。網掛けされていない残基は、ヒトＳＡＰ配列と異なる残基を示す。
【０１２７】
配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有するポリペプチドは、相違するこれらのエリアにおいて保存的置換を有するポリペプチドを含む。互いに、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間の交換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の交換が保存的置換と典型的に見なされる。どのアミノ酸変化がおそらく、表現型的に無変化となるかに関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７巻：１３０６〜１３１０頁（１９９０年）において見つけることができる。
【０１２８】
少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％配列番号１に同一のポリマーを含むＳＡＰポリペプチドは、好ましくは、線維化を阻害する。
【０１２９】
ある実施形態において、ＳＡＰシグナル伝達アゴニストは、ＳＡＰ変異体である。用語「ＳＡＰ変異体」は、ヒトＳＡＰ五量体と比較して、１つまたは複数の以下の特徴を実証する、２〜５つのＳＡＰプロトマーを含むタンパク質を指すように意図される：血漿半減期の増加、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性の増加、またはヒトＳＡＰと比較したｉｎ  ｖｉｖｏ安定性の増加。
【０１３０】
本発明の特定の実施形態において、ＳＡＰ、ＳＡＰ変異体、またはＳＡＰ機能的断片を含有する組成物は、少なくとも０．５μｇ／ｍｌで、標的位置におけるＳＡＰ濃度を上昇させるのに調節可能であってもよい。ヒトにおいて、Ｉ１２５放射標識ＳＡＰが、アミロイドーシスを有する患者を試験するために以前に投与された。治療において、約６００μｇのＳＡＰが、成人のヒトに投与された。したがって、全身的に成人のヒトへの、約６００μｇのＳＡＰの投与は、安全である。より高い投薬量もまた、適切な条件下で安全である可能性がある。
【０１３１】
（ｉｉ）ＳＡＰアゴニストとしての抗ＦｃγＲ抗体
本発明の一態様において、ＳＡＰシグナル伝達を模倣する１つまたは複数の化合物が提供される。いくつかの実施形態において、ＳＡＰシグナル伝達アゴニストは、抗ＦｃγＲ抗体であり、抗体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、またはＦｃγＲＩＩＩのいずれかにそれぞれ結合することができる抗ＦｃγＲＩ、抗ＦｃγＲＩＩＡ、および抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体のクラスから選択される。抗ＦｃγＲ抗体は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に対する受容体（ＦｃγＲ）に結合するＩｇＧ抗体である。抗ＦｃγＲ抗体は、それらの定常（Ｆｃ）領域を通してではなく、それらの可変領域を通して結合する。抗ＦｃγＲ抗体は、抗体の任意のアイソタイプを含んでもよい。抗ＦｃγＲ抗体は、さらなる抗体または他の手段を用いてまたは用いないで、さらに架橋されてもよく、または凝集されてもよい。このプロセスは、ＦｃγＲ活性化と一致する細胞内シグナル伝達事象を開始する。
【０１３２】
抗ＦｃγＲＩ抗体、抗ＦｃγＲＩＩ抗体、および／または抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を含有する組成物は、線維化性障害および慢性の炎症性の状態において、不適切な位置における線維細胞の分化を抑制するために使用することができる。
【０１３３】
特定の実施形態において、約１．０μｇ／ｍｌ抗ＦｃγＲ抗体を含有する組成物は、線維細胞分化を約５０％阻害するのに有効である可能性がある。他の実施形態において、組成物は、標的組織に１．０μｇ／ｍｌ抗ＦｃγＲ抗体を送達するのに十分な量を含有していてもよい。
【０１３４】
抗ＦｃγＲ抗体は、患者における、望ましくない量の細胞死を引き起こすことなく、約１．０μｇ／ｍｌの用量で、１．０μｇ／ｍｌ抗ＦｃγＲ抗体を標的組織に送達するのに十分な量で、または線維細胞分化を阻害するのに十分な他の用量で投与することができる。
【０１３５】
（ｉｉｉ）凝集ＦｃドメインおよびＦｃ含有抗体
いくつかの実施形態において、ＳＡＰシグナル伝達アゴニストは、架橋ＩｇＧまたは凝集ＩｇＧである。適切な供給源由来のＩｇＧ（たとえばヒト受容体に対するヒトＩｇＧ）は、通常、そのＦｃ領域を通してＦｃγＲに結合することができる。架橋ＩｇＧまたは凝集ＩｇＧは、少なくとも２つのそのようなＩｇＧ抗体が互いに物理的に連結されるという条件で、そのＦｃ領域を通して、標的ＦｃγＲに結合することができる任意のＩｇＧを含んでもよい。
【０１３６】
両方の型の抗体は、全抗体またはその部分、好ましくは、線維細胞分化の抑制において機能的な部分を含んでもよい。たとえば、それらは、ＦｃγＲを架橋することができる任意の抗体部分を含んでもよい。これは、凝集されたまたは架橋された全抗体、Ｆ（ａｂ’）２断片、および可能性として考えられるＦｃ断片などの、凝集されたまたは架橋された抗体またはその断片を含んでもよい。
【０１３７】
抗体の凝集または架橋は、熱による凝集または化学的凝集などの、任意の知られている方法によって行うことができる。凝集の増加が、線維細胞抑制の増加をもたらす可能性があるが、任意のレベルの凝集または架橋で、十分である可能性がある。抗体はハイブリドーマ細胞から産生される抗体などの、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。組成物および方法は、類似のまたは異なる抗体に架橋されてもよく、または凝集されてもよい、多数のモノクローナル抗体の混合物などの、抗体の混合物を用いてもよい。
【０１３８】
架橋ＩｇＧまたは凝集ＩｇＧを含有する組成物は、とりわけ、不適切な位置においてならびに線維化性障害および慢性の炎症性の状態において、線維細胞の分化を抑制するために使用することができる。
【０１３９】
他の特定の実施形態において、組成物は、わずか０．１μｇ  ｍｌの架橋ＩｇＧまたは凝集ＩｇＧを含有していてもよい。凝集ＩｇＧまたは架橋ＩｇＧは、患者における、望ましくない量の細胞死を引き起こすことなく、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ  ＩｇＧを標的組織に送達するのに十分な量でまたは線維細胞分化を阻害するのに十分な他の用量で投与することができる。
【０１４０】
（ｉｖ）ＳＡＰペプチド模倣薬
ある実施形態において、ＳＡＰアゴニストは、ペプチド模倣薬を含む。本明細書において使用されるように、用語「ペプチド模倣薬」は、非自然発生のアミノ酸、ペプトイドなどを含有する、化学的に修飾されたペプチドおよびペプチド様分子を含む。ペプチド模倣薬は、対象に投与された場合の、安定性の増強を含む、ペプチドに対する様々な利点を提供する。ペプチド模倣薬を同定するための方法は、当技術分野において十分に知られており、可能性のあるペプチド模倣薬のライブラリーを含有するデータベースのスクリーニングを含む。たとえば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅは、結晶構造が知られている３００，０００個を超える化合物のコレクションを含有する（Ａｌｌｅｎら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ、３５巻：２３３１頁（１９７９年））。標的分子の結晶構造が入手可能でない場合に、構造は、たとえば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤを使用して生成することができる（Ｒｕｓｉｎｋｏら、Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｆ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｓｃｉ．２９巻：２５１頁（１９８９年））。他のデータベース、Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ  Ｃａｌｉｆ．）は、市販で入手可能であり、ＳＡＰポリペプチドの可能性のあるペプチド模倣薬を同定するために検索することもできる、約１００，０００個の化合物を含有する。
【０１４１】
（ｖ）ＳＡＰ活性の増加
いくつかの実施形態において、ＳＡＰアゴニストは、ＳＡＰ活性を増加させる。ＳＡＰ活性は、ＳＡＰの濃度を増加させることによって、たとえば、ＳＡＰ転写を増加させる、翻訳を増加させる、ＳＡＰ分泌増加させる、ＳＡＰ  ＲＮＡ安定性を増加させる、ＳＡＰタンパク質安定性を増加させる、またはＳＡＰタンパク質分解を減少させることによって増加させることができる。ＳＡＰ活性はまた、たとえばＳＡＰ内在性結合パートナーを減少させることによって、ＳＡＰの「遊離濃度」またはむしろ非結合形態を特異的に増加させることによって、増加させることもできる。
【０１４２】
（ｉｖ）ＦｃγＲ架橋剤
いくつかの実施形態において、フィブロネクチンベースの足場ドメインタンパク質は、ＦｃγＲを架橋するためにＳＡＰアゴニストとして使用することができる。フィブロネクチンベースの足場ドメインタンパク質は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Ｆｎ３）、特に、フィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）を含んでもよい。
【０１４３】
ＦｃγＲを架橋するために、米国特許第７，１１５，３９６号において記載されるように、ＦｃγＲ結合Ｆｎ３ドメインのマルチマーが生成されてもよい。
【０１４４】
フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順番に、ベータ鎖またはベータ様鎖、Ａ；ループ、ＡＢ；ベータ鎖またはベータ様鎖、Ｂ；ループ、ＢＣ；ベータ鎖またはベータ様鎖、Ｃ；ループＣＤ；ベータ鎖またはベータ様鎖、Ｄ；ループＤＥ；ベータ鎖またはベータ様鎖、Ｅ；ループ、ＥＦ；ベータ鎖またはベータ様鎖Ｆ；ループＦＧ；およびベータ鎖またはベータ様鎖Ｇを含む。ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、共に、免疫グロブリンからの相補性決定領域（ＣＤＲ）に構造的におよび機能的に類似している。Ｆｎ３ドメインは、１つまたは複数のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧのループの配列を変えることによって、ほとんどのあらゆる化合物に結合するように設計することができる。特異的な結合剤を生成するための方法は、高親和性ＴＮＦα結合剤を開示する米国特許第７，１１５，３９６号および高親和性ＶＥＧＦＲ２結合剤を開示する米国特許出願公開第２００７／０１４８１２６号において記載されている。フィブロネクチンベースの足場タンパク質の例は、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（商標）（Ａｄｎｅｘｕｓ、ａ  Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｒ＆Ｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）である。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、ＳＡＰアゴニストは、アプタマーである。ＦｃγＲを架橋するために、ＦｃγＲ結合アプタマーのマルチマーが生成されてもよい。
【０１４６】
アプタマーは、合成または天然のものであり得、タンパク質または代謝物質などの特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドである。典型的に、結合は、古典的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対以外の相互作用を通してのものである。アプタマーは、現在、臨床前開発および臨床開発における有望なクラスの治療剤を代表するものである。生物製剤、たとえばペプチドまたはモノクローナル抗体のように、アプタマーは、分子標的に特異的に結合することができ、結合を通して標的機能を阻害することができる。典型的なアプタマーは、サイズが１０〜１５ｋＤａ（つまり３０〜４５ヌクレオチド）であり、ナノモル以下の親和性でその標的に結合し、密接に関連する標的を区別する（たとえば、同じ遺伝子ファミリーからの他のタンパク質に典型的に結合しないであろう）（Ｇｒｉｆｆｉｎら（１９９３年）、Ｇｅｎｅ１３７巻（１号）：２５〜３１頁；Ｊｅｎｉｓｏｎら（１９９８年）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．８巻（４号）：２６５〜７９頁；Ｂｅｌｌら（１９９９年）、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  Ａｎｉｍ．３５巻（９号）：５３３〜４２頁；Ｗａｔｓｏｎら（２０００年）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０巻（２号）：６３〜７５頁；Ｄａｎｉｅｌｓら（２００２年）、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０５巻（２号）：２１４〜２６頁；Ｃｈｅｎら（２００３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．１００巻（１６号）：９２２６〜３１頁；Ｋｈａｔｉら（２００３年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７７巻（２３号）：１２６９２〜８頁；Ｖａｉｓｈら（２００３年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４２巻（２９号）：８８４２〜５１頁）。
【０１４７】
アプタマーは、米国特許第５，４７５，０９６号および第５，２７０，１６３号において記載されるように、ランダム配列オリゴヌクレオチドのライブラリーから、完全にｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択プロセス（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ、つまりＳＥＬＥＸ（登録商標））によって作り出すことができる。アプタマーは、成長因子、酵素、免疫グロブリン、および受容体を含む、治療的に対象とする多数のタンパク質に対して生成されてきた（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０年）、Ｎａｔｕｒｅ３４６巻（６２８７号）：８１８〜２２頁；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９巻（４９６８号）：５０５〜５１０頁）。
【０１４８】
アプタマーは、治療薬としての使用のためのいくつかの魅力的な特徴を有する。高標的親和性および特異性に加えて、アプタマーは、標準的なアッセイにおいて毒性または免疫性をほとんどまたは全く示していない（Ｗｌｏｔｚｋａら（２００２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．９９巻（１３号）：８８９８〜９０２頁）。実際に、いくつかの治療アプタマーは、薬物動態学的分析、細胞モデルおよび動物疾患モデルにおける生物学的効力の特徴づけ、ならびに予備的安全薬理学評価を含む、臨床前開発の様々な段階を通して最適化され、進歩してきた。（ＲｅｙｄｅｒｍａｎおよびＳｔａｖｃｈａｎｓｋｙ（１９９８年）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１５巻（６号）：９０４〜１０頁；Ｔｕｃｋｅｒら、（１９９９年）、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．７３２巻：２０３〜２１２頁；Ｗａｔｓｏｎら（２０００年）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０巻（２号）：６３〜７５頁）。
【０１４９】
対象とする標的に対するアプタマーを生成するための適した方法は、「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」（「ＳＥＬＥＸ（商標）」）と題されるプロセスを用いるものである。ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスは、標的分子への高度に特異的な結合を有する核酸分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化のための方法であり、たとえば、１９９０年年６月１１日に出願された米国特許出願第０７／５３６，４２８号、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」と題される、現在の放棄されている米国特許第５，４７５，０９６号、および「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」と題される、米国特許第５，２７０，１６３号（国際公開第９１／１９８１３もまた参照されたい）において記載される。それぞれの、ＳＥＬＥＸ（商標）で同定された核酸リガンドは、所与の標的化合物または標的分子の特異的なリガンドである。ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスは、核酸が、多種多様の二次元および三次元構造を形成するための十分な性能ならびに単量体またはポリマーにかかわらず、事実上、あらゆる化学物質と、リガンドとして作用する（特異的な結合対を形成する）ための、それらの単量体の範囲内で利用可能な十分な化学的多用途性を有するというユニークな見識に基づくものである。任意のサイズまたは組成の分子が標的として役立ち得る。高親和性結合の利用のために適用されるＳＥＬＥＸ（商標）法は、結合親和性および選択性のあらゆる所望の判断基準を事実上達成するために、同じ一般的な選択系を使用する、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択ならびに結合、分離、および増幅の段階的反復を含む。ランダム化配列のセグメントを好ましくは含む、核酸の混合物から始めて、ＳＥＬＥＸ（商標）法は、結合に好都合な条件下で標的と混合物を接触させるステップ、標的分子に特異的に結合した核酸から非結合核酸を分離するステップ、核酸標的複合体を解離するステップ、核酸標的複合体から解離した核酸を増幅して、リガンドが豊富な、核酸の混合物を産出するステップ、次いで、所望される回数のサイクルを通して、結合、分離、解離、および、増幅のステップを反復して、標的分子に対する高度に特異的な高親和性核酸リガンドを産出するステップを含む。Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ、「ＳＥＬＥＸ（商標）」は、たとえば、米国特許第５，４７５，０９６号および第５，２７０，１６３号ならびにＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０７８において記載されるように、あらゆる所望の標的に対する核酸リガンドを作製するための方法であり、これらのそれぞれは、参照によって本明細書に具体的に組み込まれる。
【０１５０】
ＣＲＰアンタゴニスト
本出願の一態様は、様々な障害の治療において有用なＣＲＰアンタゴニストを提供する。ＣＲＰアンタゴニストは、ＣＲＰシグナル伝達を減少させ、遮断し、または阻害するすべての化合物および組成物を包含する。いくつかの実施形態において、方法に有用なＣＲＰシグナル伝達アンタゴニストは、小分子、ポリペプチド（抗体を含む）、または核酸（アンチセンス核酸、アプタマー、リボザイム、および低分子干渉ＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡを含む）を含む。ＣＲＰシグナル伝達アンタゴニストは、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、９９、または１００％、ＣＲＰの活性を調整する、影響を与える、変える、阻害する、または低下させる任意の組成物を包含する。
【０１５１】
（ｉ）ＣＲＰ発現レベルの減少
いくつかの実施形態において、ＣＲＰシグナル伝達アンタゴニストは、ＣＲＰ発現レベルを阻害する。ＣＲＰ発現レベルは、ＲＮＡまたはタンパク質のレベルで減少してもよい。
【０１５２】
ある実施形態において、１つまたは複数のＣＲＰシグナル伝達アンタゴニストは、ＣＲＰの発現を標的とするアンチセンス核酸である。「アンチセンス核酸」によって、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸）の相互作用の手段によって、標的核酸に結合し、標的核酸の活性を変える非酵素核酸化合物が意味される（概説については、ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、１９９３年  Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１巻、１００４頁およびＷｏｏｌｆら、米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい）。典型的に、アンチセンス分子は、アンチセンス分子の単一の隣接配列に沿って標的配列に相補的である。しかしながら、ある実施形態において、アンチセンス分子は、ループを形成することができ、ループを形成する基質核酸に結合する。したがって、アンチセンス分子は、２つ（もしくはそれ以上）の非隣接基質配列に相補的となり得るまたはアンチセンス分子の２つ（またはそれ以上）の非隣接配列部分は標的配列に相補的となり得るまたは両方に相補的になり得るまたはその両方である。現在のアンチセンス戦略の概説については、Ｓｃｈｍａｊｕｋら、１９９９年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７４巻、２１７８３〜２１７８９頁、Ｄｅｌｉｈａｓら、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ、１５巻、７５１〜７５３頁、Ｓｔｅｉｎら、１９９７年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎ．  Ａ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、７巻、１５１頁、Ｃｒｏｏｋｅ、２０００年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３１３巻、３〜４５頁；Ｃｒｏｏｋｅ、１９９８年、Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｅｎｇ．  Ｒｅｖ．、１５巻、１２１〜１５７頁、Ｃｒｏｏｋｅ、１９９７年、Ａｄ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４０巻、１〜４９頁を参照されたい。
【０１５３】
他の実施形態において、ＣＲＰシグナル伝達アンタゴニストは、ｓｉＲＮＡであってもよい。用語「小分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」または「小分子干渉核酸」は、細胞によって適切に処理された場合にＲＮＡｉまたは遺伝子サイレンシングを媒介することができる任意の核酸化合物を指す。たとえば、ｓｉＲＮＡは、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子とすることができ、アンチセンス領域は、標的核酸化合物（たとえばＣＲＰ）に対する相補性を含む。ｓｉＲＮＡは、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有する一本鎖ヘアピンポリヌクレオチドとすることができ、アンチセンス領域は、標的核酸化合物に対する相補性を含む。ｓｉＲＮＡは、２つ以上のループ構造ならびに自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドとすることができ、アンチセンス領域は、標的核酸化合物に対する相補性を含み、環状ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介することができる活性ｓｉＲＮＡを生成するために、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて処理することができる。ｓｉＲＮＡはまた、標的核酸化合物に対する相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含むことができ、一本鎖ポリヌクレオチドは、５’−リン酸などの末端リン酸基（たとえばＭａｒｔｉｎｅｚら、２００２年、Ｃｅｌｌ．、１１０巻、５６３〜５７４頁を参照されたい）または５’，３’−二リン酸をさらに含むことができる。
【０１５４】
本明細書において記載されるように、本発明のｓｉＲＮＡは、長さが約１９〜３０ヌクレオチドである、さらにより好ましくは、長さが２１〜２３ヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体を動員し、特異的な配列と対になることによってこの複合体を標的ｍＲＮＡに導くことが分かっている。その結果として、標的ｍＲＮＡは、タンパク質複合体中のヌクレアーゼによって分解される。特定の実施形態において、２１〜２３ヌクレオチドｓｉＲＮＡ分子は、３’ヒドロキシル基を含む。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡ構築物は、たとえば酵素ダイサーの存在下において、より長い二本鎖ＲＮＡを処理することによって生成することができる。ある実施形態において、ショウジョウバエｉｎ  ｖｉｔｒｏ系が使用される。この実施形態において、ｄｓＲＮＡはショウジョウバエ胚に由来する可溶性抽出物と組み合わせられ、それによって化合物を産生する。化合物は、ｄｓＲＮＡが、約２１〜約２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子に処理される条件下で維持される。ｓｉＲＮＡ分子は、当業者らに知られているいくつかの技術を使用して精製することができる。たとえば、ゲル電気泳動法は、ｓｉＲＮＡを精製するために使用することができる。その代わりに、非変性カラムクロマトグラフィーなどの非変性方法は、ｓｉＲＮＡを精製するために使用することができる。さらに、クロマトグラフィー（たとえば分子ふるいクロマトグラフィー）、グリセリン勾配遠心分離法、抗体を用いる親和性精製は、ｓｉＲＮＡを精製するために使用することができる。
【０１５５】
本発明のｓｉＲＮＡの産生は、化学的合成方法または組換え核酸技術によって実行することができる。処理細胞の内在性ＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて転写を媒介してもよく、またはクローニングＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写に使用することができる。本明細書において使用されるように、開示のｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有するそれらの分子に限定する必要はないが、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。たとえば、ｄｓＲＮＡは、たとえば、細胞のヌクレアーゼに対する感受性を低下させる、生物学的利用能を改善する、製剤の特徴を改善する、および／または他の薬物動態学的特性を変えるために、リン酸−糖主鎖またはヌクレオシドのいずれかに対する修飾を含んでもよい。例証として、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素または硫黄のヘテロ原子の少なくとも１つを含むように修飾されてもよい。ＲＮＡ構造における修飾は、ｄｓＲＮＡに対する一般的な応答を回避しながら、特異的な遺伝子阻害を可能にするように適合させてもよい。同じく、塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断するように修飾されてもよい。ｄｓＲＮＡは、酵素によってまたは部分的な／完全な有機合成によって産生されてもよく、あらゆる修飾リボヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける酵素合成または有機合成によって導入することができる。ＲＮＡ分子を化学的に修飾するための方法は、ｄｓＲＮＡの修飾に適応させることができる（たとえば、Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２５巻：７７６〜７８０頁；Ｗｉｌｓｏｎら（１９９４年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇ７巻：８９〜９８頁；Ｃｈｅｎら（１９９５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ２３巻：２６６１〜２６６８頁；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎら（１９９７年）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ７巻：５５〜６１頁を参照されたい）。単なる例証として、ｄｓＲＮＡの主鎖は、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホジチオエート、キメラメチルホスホネート−ホスホジエステル、ペプチド核酸、５−プロピニル−ピリミジンを含有するオリゴマー、または糖修飾（たとえば２’−置換リボヌクレオシド、ａ−配置）を用いて修飾することができる。ある場合において、開示のｄｓＲＮＡは、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠く。
【０１５６】
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖は、長さが約１〜約６のヌクレオチドの３’オーバーハングを有するが、長さが２〜４ヌクレオチドであってもよい。より好ましくは、３’オーバーハングは、長さが１〜３ヌクレオチドである。ある実施形態において、一方の鎖は、３’オーバーハングを有し、他方の鎖は、平滑端末であるまたはそれもまたオーバーハングを有する。オーバーハングの長さは、それぞれの鎖について同じであってもよく、または異なっていてもよい。ｓｉＲＮＡの安定性をさらに増強するために、３’オーバーハングは、分解に対して安定させることができる。ある実施形態において、ＲＮＡは、アデノシンヌクレオチドまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含むことによって安定させる。その代わりに、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、たとえば、２’−デオキシチミジンによるウリジンヌクレオチド３’オーバーハングの置換は、許容され、ＲＮＡｉの効率に影響を与えない。２’ヒドロキシルが存在しないと、組織培養培地中でオーバーハングのヌクレアーゼ抵抗性が著しく増強し、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて有益である可能性がある。
【０１５７】
他の特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡはまた、長い二本鎖ＲＮＡの形態とすることもできる。たとえば、ｄｓＲＮＡは、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、または４００塩基である。いくつかの場合において、ｄｓＲＮＡは、長さが４００〜８００塩基である。任意選択で、ｄｓＲＮＡは、たとえば、細胞中でｓｉＲＮＡ配列を産生するために、細胞内で消化される。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける長い二本鎖ＲＮＡの使用は、おそらく、配列非依存性のｄｓＲＮＡ応答によって引き起こされる可能性がある有害な効果のために、必ずしも実用的だとは限らない。そのような実施形態において、局所性送達系および／またはインターフェロンもしくはＰＫＲの効果を低下させる作用物質の使用は好ましい。
【０１５８】
さらなる特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ヘアピン構造（ヘアピンＲＮＡまたは低分子ヘアピンＲＮＡと名付けられる）の形態をしている。ヘアピンＲＮＡは、外因的に合成することができ、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから転写することによって形成することができる。たとえば、哺乳動物細胞中での遺伝子サイレンシングのためにそのようなヘアピンＲＮＡを作製するおよび使用する例は、たとえばＰａｄｄｉｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００２年、１６巻：９４８〜５８頁；ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、４１８巻：３８〜９頁；ＭｃＭａｎｕｓら、ＲＮＡ、２００２年、８巻：８４２〜５０頁；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００２年、９９巻：６０４７〜５２頁）において記載されている。好ましくは、そのようなヘアピンＲＮＡは、所望の遺伝子の継続的で安定性の抑制を確実にするために、細胞中でまたは動物において操作される。ｓｉＲＮＡは、細胞中でヘアピンＲＮＡを処理することによって産生することができることが当技術分野において知られている。
【０１５９】
ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）を用いる修飾を含み、２’−ヒドロキシル基は、糖環の４’炭素原子に連結され、それによって、２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン結合を形成し、それによって、二環式糖部分を形成する。結合は、好ましくは、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋するメチレン（――ＣＨ２――）基であり、ｎは、１または２である（Ｓｉｎｇｈら、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９８年、４巻、４５５〜４５６頁）。ＬＮＡおよびＬＮＡ類似体は、相補ＤＮＡおよび相補ＲＮＡとの非常に高い二重鎖熱的安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０Ｃ）、３’−エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、ならびに好適な可溶特性を示す。ＬＮＡを含有する強力で、無毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドは記載されている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００年、９７巻、５６３３〜５６３８頁）。
【０１６０】
それらのオリゴマー形成に加えた、ＬＮＡ単量体アデニン、シトシン、グアニン、５−メチルシトシン、チミン、およびウラシルの合成および調製ならびに核酸認識特性は記載されている（Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８年、５４巻、３６０７〜３６３０頁）。ＬＮＡおよびその調製はまた、国際公開第９８／３９３５２号および国際公開第９９／１４２２６号においても記載されている。
【０１６１】
ある実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、たとえば、ｓｉＲＮＡ分子の５’−端末、３’−端末、５’および３’−端末の両方、またはその任意の組合せで１つまたは複数の（たとえば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。
【０１６２】
ＰＣＴ特許出願国際公開第０１／７７３５０号は、真核細胞中で同じ導入遺伝子のセンスＲＮＡ転写物およびアンチセンスＲＮＡ転写物の両方を産出するための、導入遺伝子の双方向性の転写のための例示的なベクターを記載する。したがって、ある実施形態において、本開示は、以下のユニークな特徴を有する組換えベクターを提供する：それは、反対の向きに配置され、対象とするｄｓＲＮＡのための導入遺伝子の側面に位置する、２つのオーバーラップする転写単位を有するウイルスのレプリコンを含み、２つのオーバーラップする転写単位は、宿主細胞中で、同じ導入遺伝子断片からセンスＲＮＡ転写物およびアンチセンスＲＮＡ転写物の両方を産出する。
【０１６３】
他の実施形態において、１つまたは複数のＣＲＰシグナル伝達アンタゴニストは、酵素核酸であってもよい。「酵素核酸」によって、特定される標的遺伝子に対して基質結合領域中で相補性を有し、標的核酸を特異的に切断するのに活性である酵素活性をも有する核酸が意味される。酵素核酸は、核酸を分子間で切断することができ、それによって、標的核酸を不活性化することができることが理解される。これらの相補的領域は、標的核酸への酵素核酸の十分なハイブリダイゼーションを可能にし、したがって、切断を可能にする。１００パーセントの相補性（同一性）が好ましいが、５０〜７５％ほどの低い相補性もまた有用となり得る（たとえばＷｅｒｎｅｒおよびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３巻、２０９２〜２０９６頁；Ｈａｍｍａｎｎら、１９９９年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、９巻、２５〜３１頁を参照されたい）。酵素核酸は、塩基、糖、および／またはリン酸基で修飾することができる。本明細書において記載されるように、用語「酵素核酸」は、リボザイム、触媒ＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、触媒ＤＮＡ、アプタザイムもしくはアプタマー結合リボザイム、調節可能なリボザイム、触媒オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム、リードザイム、オリゴザイム、またはＤＮＡ酵素などの句と区別なく使用される。これらの術語はすべて、酵素活性を有する核酸について記載する。本明細書において記載される特定の酵素核酸は、限定的なものとなるようには意味されず、当業者らは、酵素核酸において重要なのは、それが、１つまたは複数の標的核酸領域に相補的である特異的な基質結合部位を有し、それが、その基質結合部位内にまたはそのまわりに、分子に対する核酸切断活性および／またはライゲーション活性を与えるヌクレオチド配列を有することであるということを認識するであろう（Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；Ｃｅｃｈら、１９８８年、２６０巻  ＪＡＭＡ  ３０３０頁）。ある実施形態において、酵素核酸は、ｍＲＮＡの翻訳を予防するためにｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されるリボザイムである（たとえば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ特許出願国際公開第９０／１１３６４頁；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７巻：１２２２〜１２２５頁；および米国特許第５，０９３，２４６号を参照されたい）。他の実施形態において、酵素核酸は、ＤＮＡ酵素である。ＤＮＡ酵素を作製するおよび投与するための方法は、たとえば米国特許第６，１１０，４６２号において見つけることができる。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、ＣＲＰアンタゴニストは、米国特許第６，９６４，９５０号において記載されるようなアンチセンス化合物である。
【０１６５】
（ｉｉ）ＣＲＰ血漿レベルの減少
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＣＲＰシグナル伝達アンタゴニストは、ＣＲＰの血清レベルを減少させる（Ｐｒａｓａｄ，  Ｋ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖｉｅｗ２１巻：３３〜５０頁（２００６年））。ＣＲＰ低下剤は、アスピリンならびにロフェコキシブおよびセレコキシブなどのシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤などの抗炎症性薬；クロピドグレルなどの抗血小板剤；アトルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、およびセリバスタチンを含むスタチン、エゼチミブ、フェノフィブラート、ならびにナイアシン（ビタミンＢ３）などの脂質低下剤；チアゾリジンジオンおよびロシグリタゾンなどの抗糖尿病薬；ＤＩＯ−９０２（ＤｉＯｂｅｘ）などの１１−ベータヒドロキシラーゼ阻害剤；カルベジロールなどのβ−アドレナリン受容体アンタゴニスト；α−トコフェロール、ビタミンＥ、およびビタミンＣなどの酸化防止剤；ラミプリル、ホシノプリル、およびカプトプリルなどのアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；バルサルタン、ロサルタン、テルミサルタン、イルベサルタン、およびオルメサルタンなどのアンギオテンシン受容体遮断薬を含む。
【０１６６】
（ｉｉｉ）ＣＲＰシグナル伝達の減少
ある実施形態において、１つまたは複数のＣＲＰシグナル伝達アンタゴニストは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ、Ｅｖｉｂｏｄｙ、Ａｎｋｙｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、Ｍｉｃｒｏｂｏｄｙ、ＡｄＮｅｃｔｉｎ、Ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ、Ｍａｘｉｂｏｄｙ、Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ、Ａｆｆｉｌｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ、ｉＭａｂｓ、およびＭｏｎｏｂｏｄｙなどの足場ベースの結合タンパク質である。（Ｈｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００５年、２３巻：５１４〜５２２頁；Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００５年、２３巻：１２５７〜１２６８頁；Ｈｏｓｓｅ，  Ｒ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５巻：１４〜２７頁（２００６年））。ある実施形態において、タンパク質ディスプレイ足場は、フィブロネクチンベースの「アドレス指定可能な」治療結合分子である。フィブロネクチンドメインＩＩＩ（ＦｎＩＩＩ）ループは、有用な治療ツールを開発するために、ランダム突然変異ならびに標的結合、選択、およびさらなる突然変異のラウンドを繰り返す定方向進化系にかけられてもよい領域を含む。フィブロネクチンベースのタンパク質治療薬の例示的な実施形態は、ＰＣＴ出願国際公開第００／３４７８４号、国際公開第０１／６４９４２号、および国際公開第０２／０３２９２５号において記載されるようなＡｄｎｅｃｔｉｎｓ（商標）である。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＣＲＰシグナル伝達アンタゴニストは、ＣＲＰまたはＣＲＰリガンドタンパク質に結合する抗体または抗原結合断片を含む。抗体は、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、操作された抗体（キメラ抗体、単鎖抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および人為的に選択された抗体を含む）、ならびにファージディスプレイまたは代替技術を使用して産生される合成抗体または半合成抗体を含むことが理解される。
【０１６８】
本出願のいくつかの実施形態において、提供される抗体断片は、切断鎖（カルボキシル端末で切断）である。ある実施形態において、これらの切断鎖は、１つまたは複数の免疫グロブリン活性（たとえば補体固定活性）を持つ。切断鎖の例は、Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１のドメインから成る）；Ｆｄ断片（ＶＨおよびＣＨ１のドメインから成る）；Ｆｖ断片（抗体の単鎖のＶＬおよびＶＨのドメインから成る）；ｄａｂ断片（ＶＨドメインから成る）；単離ＣＤＲ領域；二価断片である（Ｆａｂ’）２断片（ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む）を含むが、これらに限定されない。切断鎖は、酵素切断または組換えＤＮＡ技術などの従来の生化学的技術によって産生することができ、これらのそれぞれは当技術分野において知られている。これらのポリペプチド断片は、当技術分野において十分に知られている方法によってまたはＦａｂ断片を産生するためにＣＨ１の後にもしくは（Ｆａｂ’）２断片を産生するためにヒンジ領域の後になど、部位特異的突然変異誘発を使用して、ベクター中の所望の位置に終止コドンを挿入することによって、完全抗体のタンパク質分解切断によって産生されてもよい。単鎖抗体は、ＶＬタンパク質断片およびＶＨタンパク質断片を連結するペプチドリンカーをコードするＤＮＡとＶＬコード領域およびＶＨコード領域をつなぐことによって産生されてもよい。
【０１６９】
本出願はまた、抗ＣＲＰ抗体の断片をも提供し、これは、たとえば、完全な抗体の抗原結合領域または可変領域などの、完全な抗体の一部を含んでもよい。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖの断片；二重特異性抗体；線状抗体（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９９５年；８巻（１０号）：１０５７〜１０６２頁）；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。抗体のパパイン消化により、それぞれ、単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片およびその名称が容易に結晶化するその能力を反映する、残りの「Ｆｃ」断片が産生される。抗体のペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原に架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片が産出される。「Ｆｖ」は、普通の場合、完全抗原認識部位および完全抗原結合部位を含有する最小抗体断片を指す。この領域は、密接に非共有結合した１つの重鎖可変領域および１つの軽鎖可変領域の二量体から成る。ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を確定するためにそれぞれの可変領域の３つのＣＤＲが相互作用するのはこの配置においてである。共同して、ＣＤＲは、抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、おそらく、全結合部位よりも低い親和性であろうが、単一の可変領域（または抗原に対して特異的な３つのＣＤＲを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【０１７０】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端の少数の残基の追加により、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆａｂ’に対する本明細書における命名であり、定常ドメインの（１つまたは複数の）システイン残基が遊離チオール基を持つ。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、それらの間にヒンジシステインを有する、Ｆａｂ’断片の対として当初、産生された。抗体断片の他の化学的共役もまた知られている。
【０１７１】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬのドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖で存在する。ある実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが、抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨおよびＶＬのドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４年）、２６９〜３１５頁を参照されたい。
【０１７２】
ＳＭＩＰは、標的結合領域ならびにエフェクタードメイン（ＣＨ２およびＣＨ３のドメイン）を含むように操作された単鎖ペプチドのクラスである。たとえば、米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号を参照されたい。標的結合領域は、抗体、たとえば本出願の抗ＥｐｈＢ４抗体の可変領域またはＣＤＲに由来してもよい。その代わりに、標的結合領域は、ＥｐｈＢ４に結合するタンパク質に由来する。
【０１７３】
用語「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖において、軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。短すぎて、同じ鎖上の２つのドメインの間で対になることができないリンカーを使用することによって、ドメインは、他の鎖の相補的なドメインと対になり、２つの抗原結合部位を作り出すように強いられる。二重特異性抗体は、たとえば欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）に、より十分に記載される。
【０１７４】
Ｆｃ領域を有する、抗体の分子（または病原体）への結合が、分子（または病原体）の処理およびクリアランスを助けることは十分に知られている。抗体のＦｃ部分は、免疫エフェクター細胞によって発現される、特殊化した受容体によって認識される。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３の抗体のＦｃ部分は、マクロファージおよび好中球などの食細胞の表面上に存在するＦｃ受容体によって認識され、これらは、それによって、これらのアイソタイプの抗体でコーティングされた分子または病原体に結合し、それらを貪食することができる（Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、１４７頁、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１年））。
【０１７５】
本出願の抗ＣＲＰ抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプを含むすべての型の定常領域を有する抗体を含む。抗体の軽鎖は、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖とすることができる。
【０１７６】
ある実施形態において、単鎖抗体ならびに異なる種に由来する部分を含むキメラ、ヒト化、または霊長類化（ＣＤＲ移植）抗体およびキメラ単鎖抗体またはＣＤＲ移植単鎖抗体もまた、抗体の抗原結合断片として本開示によって包含される。これらの抗体の様々な部分は、従来の技術によって相互に化学的につなぐことができ、または遺伝子工学技術を使用して、隣接タンパク質として調製することができる。たとえば、キメラ鎖またはヒト化鎖をコードする核酸は、隣接タンパク質を産生するために発現させることができる。たとえば米国特許第４，８１６，５６７号および第６，３３１，４１５号；米国特許第４，８１６，３９７号；欧州特許第０，１２０，６９４号；国際公開第８６／０１５３３号；欧州特許第０，１９４，２７６  Ｂ１号；米国特許第５，２２５，５３９号；ならびに欧州特許第０，２３９，４００  Ｂ１号を参照されたい。霊長類化抗体に関するＮｅｗｍａｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１４５５〜１４６０頁（１９９２年）もまた参照されたい。たとえば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号；および単鎖抗体に関するＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁（１９８８年））を参照されたい。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、ＣＲＰシグナル伝達アンタゴニストは、アプタマーである。アプタマーは、それらの同起源の受容体への線維促進性因子の結合を阻害するまたはそれに干渉するのに適している可能性がある。いくつかの実施形態において、アプタマーは、その同起源の受容体へのＴＧＦβの結合を阻害してもよい。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、ＣＲＰシグナル伝達アンタゴニストは、小分子である。いくつかの実施形態において、小分子は、Ｐｅｐｙｓ，  ＭＢ．、Ｎａｔｕｒｅ、４４０巻：１２１７〜１２２１頁（２００６年）において記載されるようなビス（ホスホコリン）ヘキサン化合物である。ある実施形態において、小分子は、１，４−ビス（ホスホコリン）−ヘキサン、１，５−ビス（ホスホコリン）−ヘキサン、１，６−ビス（ホスホコリン）−ヘキサン、または１，７−ビス（ホスホコリン）−ヘキサンから選択される。いくつかの実施形態において、小分子は、米国特許出願第２００６／００１９９３０号において開示されるＣＲＰ阻害剤である。いくつかの実施形態において、小分子は、ホスホコリン−ヘキサン−ホスホコリン（ＰＣＨＰＣ）またはその誘導体である。
【０１７９】
本発明の一態様において、ＣＲＰシグナル伝達をアンタゴナイズする１つまたは複数の化合物が提供される。いくつかの実施形態において、ＣＲＰシグナル伝達アンタゴニストは、抗ＦｃγＲ抗体であり、抗体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、またはＦｃγＲＩＩＩのいずれかにそれぞれ結合することができる抗ＦｃγＲＩ、抗ＦｃγＲＩＩＡ、および抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体のクラスから選択される。抗ＦｃγＲ抗体は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に対する受容体（ＦｃγＲ）に結合するＩｇＧ抗体である。抗ＦｃγＲ抗体は、それらの定常（Ｆｃ）領域を通してではなく、それらの可変領域を通して結合する。抗ＦｃγＲ抗体は、抗体の任意のアイソタイプを含んでもよい。抗ＦｃγＲ抗体は、さらなる抗体または他の手段を用いてまたは用いないで、さらに架橋されてもよく、または凝集されてもよい。このプロセスは、ＦｃγＲ活性化と一致する細胞内シグナル伝達事象を開始する。
【０１８０】
抗ＦｃγＲＩ抗体、抗ＦｃγＲＩＩ抗体、および／または抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を含有する組成物は、線維化性障害および慢性の炎症性の状態において、不適切な位置における線維細胞の分化を抑制するために使用することができる。
【０１８１】
特定の実施形態において、約１．０μｇ／ｍｌ抗ＦｃγＲ抗体を含有する組成物は、線維細胞分化を約５０％阻害するのに有効である可能性がある。他の実施形態において、組成物は、標的組織に１．０μｇ／ｍｌ抗ＦｃγＲ抗体を送達するのに十分な量を含有していてもよい。
【０１８２】
抗ＦｃγＲ抗体は、患者における、望ましくない量の細胞死を引き起こすことなく、約１．０μｇ／ｍｌの用量で、１．０μｇ／ｍｌ抗ＦｃγＲ抗体を標的組織に送達するのに十分な量で、または線維細胞分化を阻害するのに十分な他の用量で投与することができる。
【０１８３】
線維化関連障害
線維化は、コラーゲン性結合組織の病理的または過剰な蓄積によって一般に特徴づけられる。本発明の方法を用いる治療に適用可能である可能性がある線維化関連障害は、コラーゲン病、間質性肺疾患、ヒト線維性肺疾患（たとえば閉塞性細気管支炎、特発性肺線維症、知られている病因からの肺線維症、肺疾患における腫瘍間質、肺に影響を与える全身性硬化症、Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ症候群、石炭労働者の塵肺症、石綿肺、珪肺症、慢性肺高血圧症、ＡＩＤＳ関連肺高血圧症、サルコイドーシス、中から重度の喘息など）、線維性血管疾患、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、静脈瘤症、冠状動脈梗塞症、脳梗塞、心筋線維症、筋骨格線維症、手術後の癒着、ヒト腎疾患（たとえば腎炎症候群、Ａｌｐｏｒｔ症候群、ＨＩＶ関連腎症、多発性嚢胞腎疾患、Ｆａｂｒｙ病、糖尿病腎症、慢性糸球体腎炎、全身性ループスと関連する腎炎など）、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、肝線維症、肝硬変、腎線維症、肺線維症、嚢胞性線維症、慢性移植片対宿主疾患、強皮症（局所性および全身性）、Ｇｒａｖｅ眼症、糖尿病網膜症、緑内障、Ｐｅｙｒｏｎｉｅ病、陰茎線維症、膀胱鏡の後の尿道狭窄症、外科手術の後の内部癒着、瘢痕、骨髄線維症、特発性後腹膜線維症、知られている病因からの腹膜線維症、薬剤誘発性麦角中毒、良性または悪性の癌に対する線維化事変、微生物感染（たとえばウイルス、細菌、寄生虫、菌類など）に対する線維化事変、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病、炎症性腸疾患に対する線維化事変（Ｃｒｏｈｎ病および顕微鏡的大腸炎における狭窄形成を含む）、間質細胞腫瘍、粘膜炎、化学的か環境的侵襲によって誘発される線維症（たとえば癌化学療法、殺虫剤、放射線（たとえば癌放射線療法）など）などを含むが、これらに限定されない。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、線維化関連障害は、全身性または局所性の強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺炎症および線維症、特発性肺線維症、肝硬変、Ｂ型またはＣ型慢性肝炎感染から結果として生じる線維症、腎疾患、瘢痕組織から結果として生じる心疾患、黄斑変性症、ならびに網膜および硝子体の網膜症から選択される。いくつかの実施形態において、線維化関連障害は、化学療法剤、放射線誘発性の線維化、ならびに傷害およびやけどから結果として生じる。
【０１８５】
抗線維化療法組成物は、局所的にまたは全身的に適用されてもよい。組成物はまた、組み合わせてまたは補助因子と共に提供されてもよい。組成物は、組成物が標的位置に通常存在する場合、正常なレベルを回復させるのに十分な量で投与することができ、または標的位置において、正常なレベルより上にレベルを上昇させる量で投与することができる。
【０１８６】
抗線維化療法組成物は、外因性の供給源から標的位置に提供されてもよく、またはそれらは、標的位置における細胞または標的位置と同じ組織体中の細胞によってｉｎ  ｖｉｖｏにおいて作製されてもよい。
【０１８７】
抗線維化療法組成物は、任意の生理学的に適切な製剤中のものとしてもよい。それらは、注入によって、局所的に、吸入によって、経口的に、または他の有効な手段によって組織体に投与することができる。
【０１８８】
過剰な線維化の形成および維持を抑制するまたは阻害するための、上記に記載される同じ組成物および方法論はまた、不適切な線維化の形成を抑制するまたは阻害するために使用することができる。たとえば、それらは、肝臓、腎臓、肺、心臓および心膜、目、皮膚、口、膵臓、胃腸管、脳、乳房、骨髄、骨、尿生殖器、腫瘍、または傷において生じる状態を治療してもよく、または予防してもよい。
【０１８９】
一般に、それらは、関節リウマチ、ループス、病原性の線維化、線維化性疾患、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ感染の後に形成されたものなどの線維性病変、放射線損傷、自己免疫疾患、Ｌｙｍｅ病、化学療法誘発性の線維化、ＨＩＶ誘発性のまたは感染誘発性の巣状硬化症、脊髄の外科手術瘢痕による腰椎術後疼痛症候群（ｆａｉｌｅｄ  ｂａｃｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、外科手術瘢痕後の腹部癒着、および線維嚢胞形成を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化関連障害を治療してもよく、または予防してもよい。
【０１９０】
具体的に、肝臓において、それらは、アルコール、薬剤、および／または化学的誘発性の肝硬変、虚血再灌流、肝臓の移植の後の傷害、壊死性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、ならびに原発性硬化性胆管炎を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化を治療してもよく、または予防してもよい。
【０１９１】
腎臓に関して、それらは、増殖性糸球体腎炎および硬化性糸球体腎炎、腎性線維化性皮膚症、糖尿病性腎症、腎尿細管間質性線維症、ならびに巣状分節性糸球体硬化症を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化を治療してもよく、または予防してもよい。
【０１９２】
肺に関して、それらは、肺間質性線維症、薬剤誘発性サルコイドーシス、肺線維症、特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、びまん性肺胞損傷疾患、肺高血圧症、新生児気管支肺異形成症、慢性喘息、および肺気腫を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化を治療してもよく、または予防してもよい。
【０１９３】
心臓および／または心膜に関して、それらは、心筋線維症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈再狭窄、鬱血性心筋症、心不全、および他の虚血後の状態を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化を治療してもよく、または予防してもよい。
【０１９４】
目に関して、それらは、Ｇｒａｖｅ病の眼球突出症、増殖性硝子体網膜症、前部カプセル白内障（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃａｐｓｕｌｅ  ｃａｔａｒａｃｔ）、角膜線維症、外科手術による角膜瘢痕、線維柱帯切除術誘発性の線維化、および他の目の線維化を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化を治療してもよく、または予防してもよい。
【０１９５】
皮膚に関して、それらは、Ｄｅｐｕｙｔｒｅｎ拘縮、強皮症、ケロイド瘢痕、乾癬、やけどによる肥大性瘢痕、および脊髄傷害によって引き起こされた偽性強皮症を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化を治療してもよく、または予防してもよい。
【０１９６】
口に関して、それらは、歯周疾患瘢痕および薬剤に伴う歯肉増殖症を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化を治療してもよく、または予防してもよい。
【０１９７】
膵臓に関して、それらは、膵線維症、間質リモデリング膵臓炎、および間質線維症を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化を治療してもよく、または予防してもよい。
【０１９８】
胃腸管に関して、それらは、コラーゲン蓄積大腸炎、絨毛萎縮、陰窩過形成、ポリープ形成、Ｃｒｏｈｎ病の線維化、および胃潰瘍治癒を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化を治療してもよく、または予防してもよい。
【０１９９】
脳に関して、それらは、グリア性瘢痕組織を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化を治療してもよく、または予防してもよい。
【０２００】
乳房に関して、それらは、線維嚢胞性疾患および乳癌に対する結合組織形成反応を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化を治療してもよく、または予防してもよい。
【０２０１】
骨髄に関して、それらは、脊髄形成異常症における線維化および新生物疾患を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化を治療してもよく、または予防してもよい。
【０２０２】
骨に関して、それらは、リウマチパンヌス形成を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化を治療してもよく、または予防してもよい。
【０２０３】
泌尿生殖組織に関して、それらは、子宮内膜症、子宮筋腫、および卵巣筋腫を含むが、これらに限定されない状態から結果として生じる線維化を治療してもよく、または予防してもよい。
【０２０４】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を実証するために含まれる。続く実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように、発明者らによって発見された技術を示すことが当業者らによって十分に理解されるべきである。しかしながら、当業者らは、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更を、開示される特定の実施形態において成すことができ、多くの変更によって、なお、類似のまたは同様の結果を得ることができることを十分に理解するべきである。
【０２０５】
医薬調製物および製剤
ある実施形態において、本明細書において記載される方法では、対象に抗線維化療法を施す。治療剤は、１つまたは複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して、従来の様式において製剤することができる。たとえば、治療剤ならびにそれらの生理学的に許容可能な塩および溶媒化合物は、たとえば注入（たとえばＳｕｂＱ、ＩＭ、ＩＰ）、吸入もしくは通気（口もしくは鼻のいずれかを通して）、または経口投与、頬側投与、舌下投与、経皮投与、経鼻投与、非経口投与、もしくは直腸投与による投与のために製剤することができる。ある実施形態において、治療剤は、標的細胞が存在する部位に、つまり特定の組織、器官、または体液（たとえば血液、脳脊髄液、腫瘤など）中に、局所的に投与することができる。
【０２０６】
治療剤は、全身投与、局所投与、および局部投与を含む、投与の多種多様のモードのために製剤することができる。技術および製剤は、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて見出され得る。非経口的投与については、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注入が好ましい。注入のために、化合物は、液体中に、好ましくは、Ｈａｎｋ溶液またはＲｉｎｇｅｒ溶液などの生理学的に適合性の緩衝液中に製剤することができる。さらに、化合物は、固体形態で製剤され、使用の直前に再溶解または懸濁してもよい。凍結乾燥形態もまた含まれる。
【０２０７】
経口投与については、医薬組成物は、たとえば、結合剤（たとえばあらかじめゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）などの薬学的に許容可能な賦形剤；増量剤（たとえばラクトース、結晶セルロース、もしくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（たとえばステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカ）；崩壊剤（たとえばデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（たとえばラウリル硫酸ナトリウム）を用いて、従来の手段によって調製される錠剤、ロゼンジ、またはカプセル剤の形態をとってもよい。錠剤は、当技術分野において十分に知られている方法によってコーティングされてもよい。経口投与のための液体調製物は、たとえば、水剤、シロップ剤、もしくは懸濁剤の形態をとってもよく、またはそれらは、使用の前に水または他の適した媒体と構成させるための乾燥産物として提供されてもよい。そのような液体調製物は、懸濁化剤（たとえばソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂）；乳化剤（たとえばレシチンまたはアカシア）；非水性媒体（たとえばアチオンド（ａｔｉｏｎｄ）油、油性エステル、エチルアルコール、または分留植物油）；および防腐剤（たとえばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸）などの薬学的に許容可能な添加剤を用いて、従来の手段によって調製されてもよい。調製物はまた、緩衝塩、香味料、着色料、および甘味料を必要に応じて含有してもよい。経口投与のための調製物は、活性化合物の放出制御を生じるように適宜、製剤することができる。
【０２０８】
吸入による投与については（たとえば肺の送達）、治療剤は、適した噴霧剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適した気体を使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で好都合に送達されてもよい。加圧エアロゾルの場合においては、投薬量ユニットは、計量された量を送達するように弁を提供することによって決定されてもよい。吸入器または通気器における使用のためのたとえばゼラチンのカプセル剤およびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適した粉末ベースの粉末ミックスを含有して製剤することができる。
【０２０９】
治療剤は、注入による、たとえばボーラス注入または持続輸液による非経口投与のために製剤することができる。注入のための製剤は、防腐剤を追加して、ユニット投薬量形態で、たとえば、アンプル中にまたは多用量容器中に提供されてもよい。組成物は、油性または水性の媒体中で、懸濁剤、水剤、または乳剤のような形態をとってもよく、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの、製剤に関する作用物質を含有してもよい。その代わりに、活性成分は、使用の前に、適した溶媒、たとえば無菌の発熱物質なしの水と構成させるための粉末形態であってもよい。
【０２１０】
さらに、治療剤はまた、デポー調製物として製剤することができる。そのような長期作用製剤は、移植（たとえば皮下にもしくは筋肉内に）または筋肉内注入によって投与することができる。したがって、たとえば、治療剤は、適したポリマーもしくは疎水性の材料（たとえば許容可能な油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂を用いてまたは難溶性の誘導体として、たとえば難溶性の塩として製剤することができる。放出制御の処方はまた、パッチをも含む。
【０２１１】
ある実施形態において、本明細書において記載される化合物は、中枢神経系（ＣＮＳ）への送達のために製剤することができる（Ｂｅｇｌｅｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ１０４巻：２９〜４５頁（２００４年）において概説される）。ＣＮＳへの薬剤送達のための従来のアプローチは、神経外科的戦略（たとえば脳内注入または脳室内輸液）；内在性輸送経路のＢＢＢのうちの１つを活用するための試みにおける、作用物質の分子操作（たとえば、それ自体、ＢＢＢを横断することができない作用物質と組み合わせた、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラ融合タンパク質の産生）；作用物質の脂質可溶性を増加させるために設計された薬理学的戦略（たとえば脂質またはコレステロールの担体への水溶性作用物質の抱合）；および高浸透圧破壊による完全なＢＢＢの一時的な破壊（頚動脈の中へのマンニトール溶液の輸液またはアンギオテンシンペプチドなどの生物学的に活性の作用物質の使用から結果として生じる）を含む。
【０２１２】
ある実施形態において、治療剤は、一般に、局所薬剤の投与に適した局所担体を含有し、当技術分野において知られているあらゆるそのような材料を含む局所製剤の中に組み込まれる。局所担体は、所望の形態で、たとえば、軟膏剤、ローション剤、クリーム、マイクロエマルション、ゲル、油、水剤などとして、組成物を提供するように選択することができ、自然発生の起源または合成起源の材料からなり得る。選択された担体が、局所製剤の活性作用物質または他の構成成分に悪影響を与えないことは好ましい。本明細書における使用に適した局所担体の例は、水、アルコール、および他の無毒性有機溶媒、グリセリン、鉱油、シリコーン、ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、ろうなどを含む。
【０２１３】
医薬組成物（化粧用調製物を含む）は、０．００１〜１０重量％または０．１重量％〜５重量％など、約０．００００１〜１００重量％の、本明細書において記載される１つまたは複数の治療剤を含んでもよい。ある局所製剤において、活性作用物質は、約０．２５重量％〜７５重量％の製剤の範囲の量で、好ましくは、約０．２５重量％〜３０重量％の製剤の範囲で、より好ましくは、約０．５重量％〜１５重量％の製剤の範囲で、および最も好ましくは、約１．０重量％〜１０重量％の製剤の範囲で存在する。
【０２１４】
目の状態は、たとえば、治療剤の全身、局所、眼内注入によって、または治療剤を放出する徐放性デバイスの挿入によって治療するまたは予防することができる。化合物が、目の角膜領域および内部領域、例として、前眼房、後眼房、硝子体、眼房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、レンズ、脈絡膜／網膜、および強膜に浸透することを可能にする十分な期間、化合物が眼球表面に接して維持されるように、治療剤は、薬学的に許容可能な点眼用の媒体中で送達されてもよい。薬学的に許容可能な点眼用の媒体は、たとえば、軟膏剤、植物油、または封入材料であってもよい。その代わりに、化合物は、硝子体および房水の中に直接、注入されてもよい。さらなる代替において、化合物は、目の治療のために、静脈内輸液または静脈内注入によってなど、全身的に投与することができる。
【０２１５】
本明細書において記載される治療剤は、当技術分野における方法に従って無酸素環境において保管されてもよい。
【０２１６】
核酸化合物を送達するための方法は、当技術分野において知られている（たとえばＡｋｈｔａｒら、１９９２年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．、２巻、１３９頁；およびＤｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ａｋｈｔａｒ編、１９９５年；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ国際公開第９４／０２５９５号を参照されたい）。これらのプロトコルは、事実上、任意の核酸化合物の送達のために利用することができる。核酸化合物は、リポソーム中への封入、イオン導入法によるもの、またはヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体接着マイクロスフェアなどの他の媒体の中への組み込みによるものを含むが、これらに限定されない、当業者らに知られている多種多様の方法によって細胞に投与することができる。その代わりに、核酸／媒体化合物は、直接的な注入によってまたは輸液ポンプの使用によって局所的に送達される。送達の他の経路は、経口送達（錠剤または丸剤の形態）および／または鞘内送達を含むが、これらに限定されない（Ｇｏｌｄ、１９９７年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、７６巻、１１５３〜１１５８頁）。他のアプローチは、たとえば抱合体および生分解性ポリマーの使用を通しての、様々な輸送系および担体系の使用を含む。薬剤送達戦略についての包括的な概説については、Ｈｏら、１９９９年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、１巻、３３６〜３４３頁およびＪａｉｎ、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ，  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、１９９８年およびＧｒｏｏｔｈｕｉｓら、１９９７年、Ｊ．  ＮｅｕｒｏＶｉｒｏｌ．、３巻、３８７〜４００頁を参照されたい。核酸送達および投与のより詳細な説明は、Ｓｕｌｌｉｖａｎら、前掲、Ｄｒａｐｅｒら、ＰＣＴ国際公開第９３／２３５６９号、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、ＰＣＴ国際公開第９９／０５０９４号、およびＫｌｉｍｕｋら、ＰＣＴ国際公開第９９／０４８１９号において提供される。
【０２１７】
ｓｉＲＮＡなどのアンチセンスヌクレオチドは、多種多様の方法を使用して、癌細胞に送達されてもよい。連結した「積荷」分子を細胞質ゾルの中に運ぶための能力を有する細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）を使用されてもよい（Ｊｕｌｉａｎｏ、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．２００６年１２月；１０８２巻：１８〜２６頁を参照されたい）。ある実施形態において、アテロコラーゲン媒介性のオリゴヌクレオチド送達系が使用される（ＨａｎａｉらＡｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．２００６年１２月；１０８２巻：９〜１７頁）。ＬＰＤ製剤（リポソーム−ポリカチオン−ＤＮＡ複合体）は、腫瘍細胞にｓｉＲＮＡを送達するために使用されてもよい（ＬｉらＡｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．２００６年１２月；１０８２巻：１〜８頁）。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とのｓｉＲＮＡの複合体形成もまた、細胞の中にｓｉＲＮＡを送達するために使用されてもよい（Ａｉｇｎｅｒ、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６年；２００６巻（４号）：７１６５９頁）。ｓｉＲＮＡはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために、キトサンコーティングポリイソヘキシルシアノアクリレート（ＰＩＨＣＡ）ナノ粒子と複合体を形成してもよい（Ｐｉｌｌｅら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６年１２月；１７巻（１０号）：１０１９〜２６頁）。
【実施例】
【０２１８】
（実施例１）単球分化を阻害するための目標ＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル
線維細胞分化アッセイ
単球は、当技術分野において標準的な負磁気ビーズ選択（たとえばＣＡＴ＃１１３〜４１Ｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、全血由来のＰＢＭＣから精製し、２５または５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを補充したＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｍｅｄｉａを含有する９６ウェル組織培養プレート中で三連で培養した。プレートは、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で９６時間、インキュベートした。次いで、細胞は、パラホルムアルデヒドを用いて固定し、Ｈｅｍａ  ３染色を用いて染色した（Ｃａｔ  ＃１２２−９１１、Ｈｅｍａ  ３  Ｓｔａｉｎ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈａｍｐｔｏｎ、ＮＨ）。ウェル当たりの線維細胞の数は、倒立顕微鏡を使用して、ウェル当たり、５つの異なるフィールドの集計を合計することによって決定した。線維細胞は、細長い紡錘形を有し、楕円形の核が存在する接着細胞として形態学的に定義した。データは、２５または５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦのいずれも、このドナーにおいて、約５０％、単球から分化する線維細胞の数を増加させるのに十分であることを示した（図２）。それに続く実験に、必要とされる、下記に定義されるような２５ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを補充したＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｍｅｄｉａを使用した。
【０２１９】
Ｆｉｂｒｏｌｉｆｅ  Ｍｅｄｉａ：（Ｃａｔ  ＃  ＬＭ−０００１、Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｃａｔ  ＃  Ｈ０８８７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１×非必須アミノ酸（Ｃａｔ  ＃  Ｍ７１４５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｃａｔ  ＃  Ｓ８６３６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭグルタミン（Ｃａｔ  ＃２５０３０−１４９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｃａｔ  ＃  Ｐ０７８１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ならびにＩＴＳ−３（Ｃａｔ  ＃  Ｉ２７７１、５００ｕｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１０ｕｇ／ｍｌインスリン、５ｕｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム、５ｕｇ／ｍｌリノール酸、ならびに５ｕｇ／ｍｌオレイン酸；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充。
【０２２０】
このアッセイの代替バージョンにおいて、ＰＢＭＣまたは単球を全血から精製し、様々な量のＳＡＰおよびＣＲＰを補充したＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｍｅｄｉａ中で三連で培養した。線維細胞の数は、あるドナーにおいて、ＣＲＰ濃度を増加させると増加し、すべてのドナーにおいて、ＳＡＰ濃度を増加させると減少する。
【０２２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける最小ＳＡＰ／ＣＲＰ比の計算
方法１：単球は、当技術分野において標準的な負磁気ビーズ選択（たとえばＣＡＴ＃１１３−４１Ｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、全血由来のＰＢＭＣから精製し、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｍｅｄｉａおよび様々な濃度のＳＡＰを含有する９６ウェル組織培養プレート中で三連で培養した。プレートは、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で９６時間、インキュベートした。次いで、細胞は、パラホルムアルデヒドを用いて固定し、Ｈｅｍａ  ３染色を用いて染色した（Ｃａｔ  ＃１２２−９１１、Ｈｅｍａ  ３  Ｓｔａｉｎ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈａｍｐｔｏｎ、ＮＨ）。ウェル当たりの線維細胞の数は、倒立顕微鏡を使用して、ウェル当たり、５つの異なるフィールドの集計を合計することによって決定した。線維細胞は、細長い紡錘形を有し、楕円形の核が存在する接着細胞として形態学的に定義した。この系において線維細胞分化の最大の阻害をもたらすのに必要なＳＡＰの最小濃度は、２ｕｇ／ｍｌであることが決定された（図３Ａ）。
【０２２２】
単球は、当技術分野において標準的な負磁気ビーズ選択（たとえばＣＡＴ＃１１３−４１Ｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、全血由来のＰＢＭＣから精製し、様々なｈＣＲＰ、２ｕｇ／ｍｌ  ｈＳＡＰ、および２５ｎｇ／ｍｌ  ｈＭＣＳＦを補充したＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｍｅｄｉａを含有する９６ウェル組織培養プレート中で三連で培養した。プレートは、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で９６時間、インキュベートした。次いで、細胞は、パラホルムアルデヒドを用いて固定し、Ｈｅｍａ  ３染色を用いて染色した（Ｃａｔ  ＃１２２−９１１、Ｈｅｍａ  ３  Ｓｔａｉｎ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈａｍｐｔｏｎ、ＮＨ）。ウェル当たりの線維細胞の数は、倒立顕微鏡を使用して、ウェル当たり、５つの異なるフィールドの集計を合計することによって決定した。線維細胞は、細長い紡錘形を有し、楕円形の核が存在する接着細胞として形態学的に定義した。ＣＲＰ濃度≧４０ｕｇ／ｍｌは、２ｕｇ／ｍｌのｈＳＡＰの効果を遮断するのに十分であった（図３Ｂ）。示すＳＡＰ濃度を、示すＣＲＰ濃度で割り、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて線維細胞分化を防止するはずである最小ＳＡＰ／ＣＲＰ比を決定した。これらのデータは、局所組織部位で生じる可能性があるように、ＳＡＰ／ＣＲＰ比≧０．０５が、無血清条件下で十分であろうということを示す。
【０２２３】
方法２．このアッセイの代替バージョンにおいて、有効なＳＡＰ／ＣＲＰ比は、線維細胞分化の最大の刺激をもたらすのに必要なＣＲＰの最小濃度を決定し、次いで、線維細胞分化の量を＞９０％低下させるために、ＣＲＰのその濃度に必要なＳＡＰの濃度を決定することによって、線維細胞分化のＣＲＰ刺激に応答性であるドナーから計算することができる。次いで、示すＳＡＰ濃度を、示すＣＲＰ濃度で割り、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて線維細胞分化を防止するはずである最小ＳＡＰ／ＣＲＰ比を決定する。目標ＳＡＰ対ＣＲＰ比は、ｉｎ  ｖｉｖｏ目標比を確認するために、様々なｉｎ  ｖｉｖｏ線維化モデルにおいて試験する。
【０２２４】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ移動アッセイ
代替アッセイにおいて、多孔性膜を、片面にコラーゲンＩＶでコーティングし、ＨＵＶＥＣ細胞を同じ面の単層中で培養する。次いで、ｔｒａｎｓｗｅｌｌを、ウェルプレート中の培地中に懸濁し、ＰＢＭＣを、ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上部に追加する。ＰＢＭＣは、ウェルの底部への、ＭＣＰ−１などのケモカインを追加することによって、ＨＵＶＥＣ層を横切って移動するように誘発する。細胞が移ると、それらは線維細胞に分化する。
【０２２５】
様々な量のＳＡＰおよびＣＲＰをｔｒａｎｓｗｅｌｌの上部に追加して、線維細胞への分化を阻害するＳＡＰ対ＣＲＰ比を決定する。以下の最終濃度を試験する。目標ＳＡＰ対ＣＲＰ比は、ｉｎ  ｖｉｖｏ目標比を確認するために、様々なｉｎ  ｖｉｖｏ線維化モデルにおいて試験する（表１）。
【０２２６】
【表１】
2010532872.tif 000002
（実施例２）例示的なｉｎ  ｖｉｖｏモデル系
（ｉ）ブレオマイシン誘発性の肺線維化
肺線維症を、重さが２００〜２５０グラムであるオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて生じさせる。０．６７ｍｌ／ｋｇの容量の、０．９％塩化ナトリウム中に溶解したブレオマイシンの２．５〜６．６７Ｕ／ｋｇの気管内用量（経口腔経路を介して）を、０日目に投与する。
【０２２７】
試験群１
試験１日目に、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方についての血清濃度を決定する。１日目に決定した比は、実施例１において確定した目標比に達するために必要とされるＳＡＰの用量を計算するために使用する。計算した用量を、２、４、６、８、および１０日目に投与する。治療群のラットに、２〜１０ｍｌ／ｋｇの薬用量のＳＡＰを尾部静脈を介して静脈内に投薬する。未治療ラットに、２〜１０ｍｌ／ｋｇの生理食塩水を投薬する。
【０２２８】
１４日目に、肺機能は、血液酸素飽和度（パルスオキシメトリー）および／またはＰＯ２（血液ガス測定装置）を測定することによって評価し、呼吸速度および心拍数もまた測定する。次いで、動物を屠殺し、左肺は、全コラーゲン含有量のために処理し（Ｓｉｒｃｏｌアッセイ）、右肺は、１０％ホルマリン中に固定し、切片にし、Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄおよびヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色して、コラーゲン沈着を評価する。
【０２２９】
試験群２：投薬量の調整
試験１日目に、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方についての血清濃度を決定する。１日目に決定した比は、実施例１において確定した目標比に達するために必要とされるＳＡＰの用量を計算するために使用する。計算した用量は、２日目に投与する。３日目に、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方についての血清濃度を決定する。投薬量は、２日目に決定した濃度に基づいて調整する。４日目に、調整した投薬量を投与する。これらのステップを繰り返す（５、７、および９日目に血清濃度を測定；６、８、および１０日目に、調整した投薬量を投与）。治療群のラットに、１．３ｍｌ／ｋｇの薬用量のＳＡＰを尾部静脈を介して静脈内に投薬する。未治療ラットに、１．３ｍＬ／ｋｇの生理食塩水を投薬する。１４日目に、肺機能は、血液酸素飽和度（パルスオキシメトリー）および／またはＰＯ２（血液ガス測定装置）を測定することによって評価し、呼吸速度および心拍数もまた測定する。次いで、動物を屠殺し、左肺は、全コラーゲン含有量のために処理し（Ｓｉｒｃｏｌアッセイ）、右肺は、１０％ホルマリン中に固定し、切片にし、Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄおよびヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色して、コラーゲン沈着を評価する。
【０２３０】
参照：
●  ＣｏｒｔｉｊｏらＡｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｏｒａｌ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎ  ｏｆ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ１７巻：１２２８〜１２３５頁、２００１年。
【０２３１】
（ｉｉ）肝線維症、四塩化炭素投与
肝線維症を、重さが２００〜２２５グラムであるオスＷｉｓｔａｒラットにおいて生じさせる。０日目に、ラットは、オリーブ油中のＣＣｌ４の胃内用量を受ける（０．０８ｍｌ  ＣＣｌ４／オリーブ油ｍｌ；４１２ｍｇ  ＣＣｌ４／ｋｇの初回用量）またはオリーブ油のみ（コントロール）。ラットは、試験の期間、１週間に２回、ＣＣｌ４を投薬し、毎週の用量は、死亡率を低下させるために、体重変化に基づいて調整する。
【０２３２】
試験群１
試験１日目に、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方についての血清濃度を決定する。１日目に決定した比は、実施例１において確定した目標比に達するために必要とされるＳＡＰの用量を計算するために使用する。計算した用量を、２日目に開始して、一日おきに投与する。治療群のラットに、２〜１０ｍｌ／ｋｇの薬用量のＳＡＰを尾部静脈を介して静脈内に投薬する。未治療ラットに、２〜１０ｍｌ／ｋｇの生理食塩水を投薬する。
【０２３３】
２４日目に、ラットを屠殺し、体および肝臓の重量を評価し、肝臓組織を分析のために収集する。全コラーゲン含有量は、Ｓｉｒｃｏｌアッセイを用いて測定し、コラーゲン沈着は、Ｍａｓｓｏｎ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、ヘマトキシリンおよびエオシン、ならびにＳｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色を用いて測定する。筋線維芽細胞活性化は、α−ＳＭＡについて免疫染色することによって決定する。
【０２３４】
試験群２：投薬量の調整
試験１日目に、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方についての血清濃度を決定する。１日目に決定した比は、実施例１において確定した目標比に達するために必要とされるＳＡＰの用量を計算するために使用する。計算した用量は、２日目に投与する。３日目に、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方についての血清濃度を決定する。投薬量は、２日目に決定した濃度に基づいて調整する。４日目に、調整した投薬量を投与する。これらのステップを繰り返す（奇数の日に血清濃度を測定；偶数の日に、調整した投薬量を投与）。治療群のラットに、２〜１０ｍｌ／ｋｇの薬用量のＳＡＰを尾部静脈を介して静脈内に投薬する。未治療ラットに、２〜１０ｍｌ／ｋｇの生理食塩水を投薬する。
【０２３５】
２４日目に、ラットを屠殺し、体および肝臓の重量を評価し、肝臓組織を分析のために収集する。全コラーゲン含有量は、Ｓｉｒｃｏｌアッセイを用いて測定し、コラーゲン沈着は、Ｍａｓｓｏｎ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、ヘマトキシリンおよびエオシン、ならびにＳｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色を用いて測定する。筋線維芽細胞活性化は、α−ＳＭＡについて免疫染色することによって決定する。
【０２３６】
参照：
●  Ｐａｒｓｏｎｓ  ＣＪらＡｎｔｉｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｎ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４０巻：１１０６〜１１１５頁、２００４年。
●  Ｒｉｖｅｒａ  ＣＡらＡｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＣｌ４−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ＧｄＣｌ３  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｒ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｇｌｙｃｉｎｅ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ２８１巻：Ｇ２００〜Ｇ２０７頁、２００１年。
【０２３７】
（ｉｉｉ）肝線維症、胆管結紮
肝臓傷害は、０日目の、総胆管の結紮によって成体オスラットにおいて誘発する。
【０２３８】
試験群１
試験１日目に、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方についての血清濃度を決定する。１日目に決定した比は、実施例１において確定した目標比に達するために必要とされるＳＡＰの用量を計算するために使用する。計算した用量を、２日目に開始して、一日おきに投与する。治療群のラットに、２〜１０ｍｌ／ｋｇの薬用量のＳＡＰを尾部静脈を介して静脈内に投薬する。未治療ラットに、２〜１０ｍｌ／ｋｇの生理食塩水を投薬する。
【０２３９】
１４日目に、ラットを屠殺し、体および肝臓の重量を評価し、肝臓組織を分析のために収集する。全コラーゲン含有量は、Ｓｉｒｃｏｌアッセイを用いて測定し、コラーゲン沈着は、Ｍａｓｓｏｎ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、ヘマトキシリンおよびエオシン、ならびにＳｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色を用いて測定する。筋線維芽細胞活性化は、α−ＳＭＡについて免疫染色することによって決定する。
【０２４０】
試験群２：投薬量の調整
試験１日目に、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方についての血清濃度を決定する。１日目に決定した比は、実施例１において確定した目標比に達するために必要とされるＳＡＰの用量を計算するために使用する。計算した用量は、２日目に投与する。３日目に、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方についての血清濃度を決定する。投薬量は、２日目に決定した濃度に基づいて調整する。４日目に、調整した投薬量を投与する。これらのステップを繰り返す（奇数の日に血清濃度を測定；偶数の日に、調整した投薬量を投与）。治療群のラットに、２〜１０ｍｌ／ｋｇの薬用量のＳＡＰを尾部静脈を介して静脈内に投薬する。未治療ラットに、２〜１０ｍｌ／ｋｇの生理食塩水を投薬する。
【０２４１】
１４日目に、ラットを屠殺し、体および肝臓の重量を評価し、肝臓組織を分析のために収集する。全コラーゲン含有量は、Ｓｉｒｃｏｌアッセイを用いて測定し、コラーゲン沈着は、Ｍａｓｓｏｎ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、ヘマトキシリンおよびエオシン、ならびにＳｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色を用いて測定する。筋線維芽細胞活性化は、α−ＳＭＡについて免疫染色することによって決定する。
【０２４２】
参照：
●  Ｋｉｓｓｅｌｅｖａ  ＴらＢｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４５巻：４２９〜４３８頁、２００６年。
●  Ｈｅｌｌｅｒｂｒａｎｄ  ＣらＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２４巻：６７０〜６７６頁、１９９６年。
●  Ｔｒａｍａｓ  ＥＧ、Ｓｙｍｅｏｎｉｄｉｓ  Ａ．  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒｓ  ｏｆ  ｒａｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｂｉｌｅ  ｄｕｃｔ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ３３巻：１３〜２７頁、１９５７年。
【０２４３】
（ｉ）片側尿管閉塞
腎線維症を、片側尿管閉塞によって、成体オスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（５〜７週；２００グラム）において誘発する。１本の４−０絹縫合糸を、腎臓のできるだけ近くに、左尿管のまわりにしっかりと結び、右腎臓は、非閉塞コントロールとして使用する。
【０２４４】
試験群１
試験１日目に、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方についての血清濃度を決定する。１日目に決定した比は、実施例１において確定した目標比に達するために必要とされるＳＡＰの用量を計算するために使用する。計算した用量を、２、４、６、８、および１０日目に投与する。治療群のラットに、２〜１０ｍｌ／ｋｇの薬用量のＳＡＰを尾部静脈を介して静脈内に投薬する。未治療ラットに、２〜１０ｍｌ／ｋｇの生理食塩水を投薬する。
【０２４５】
ラットは、７日目または１４日目に屠殺し、左および右腎臓の両方を摘出し、秤量し、組織学的検査のためにホルマリン中に固定した。組織損傷ならびに線維化は、ヘマトキシリンおよびエオシンならびにＳｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色（コラーゲン）ならびにα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）についての免疫組織化学的検査によって評価する。組織線維細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋細胞について免疫染色することによって定量する。
【０２４６】
試験群２：投薬量の調整
試験１日目に、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方についての血清濃度を決定する。１日目に決定した比は、実施例１において確定した目標比に達するために必要とされるＳＡＰの用量を計算するために使用する。計算した用量は、２日目に投与する。３日目に、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方についての血清濃度を決定する。投薬量は、２日目に決定した濃度に基づいて調整する。４日目に、調整した投薬量を投与する。これらのステップを繰り返す（奇数の日に血清濃度を測定；偶数の日に、調整した投薬量を投与）。治療群のラットに、２〜１０ｍｌ／ｋｇの薬用量のＳＡＰを尾部静脈を介して静脈内に投薬する。未治療ラットに、２〜１０ｍｌ／ｋｇの生理食塩水を投薬する。
【０２４７】
ラットは、７日目または１４日目に屠殺し、左および右腎臓の両方を摘出し、秤量し、組織学的検査のためにホルマリン中に固定した。組織損傷ならびに線維化は、ヘマトキシリンおよびエオシンならびにＳｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色（コラーゲン）ならびにα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）についての免疫組織化学的検査によって評価する。組織線維細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋細胞について免疫染色することによって定量する。
【０２４８】
参照：
●  Ｅｌ  Ｃｈａａｒ  Ｍ、Ｃｈｅｎ  Ｊ、Ｓｅｓｈａｎ  ＳＶ、Ｊｈａ  Ｓ、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  Ｉ、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ  ＳＲ、Ｖａｕｇｈａｎ  ＥＤ，  Ｊｒ．、Ｐｏｐｐａｓ  ＤＰ，およびＦｅｌｓｅｎ  Ｄ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｅｎａｌａｐｒｉｌ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  １Ｄ１１  ｉｎ  ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ  ｕｒｅｔｅｒａｌ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ２９２巻：Ｆ１２９１〜１３０１頁、２００７年。
●  Ｗｕ  ＭＪ、Ｗｅｎ  ＭＣ、Ｃｈｉｕ  ＹＴ、Ｃｈｉｏｕ  ＹＹ、Ｓｈｕ  ＫＨ、およびＴａｎｇ  ＭＪ．  Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ  ｕｒｅｔｅｒａｌ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｎａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ６９巻：２０２９〜２０３６頁、２００６年。
【０２４９】
（実施例３）ヒト心血管疾患におけるＳＡＰ／ＣＲＰ比
近年公開された臨床試験において、循環ＳＡＰ濃度は、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙ（ＣＨＳ）からの高齢者において準臨床的および臨床的心血管疾患（ＣＶＤ）を有する患者において測定された（Ｊｅｎｎｙら２００７年Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２７巻：３５２〜３５８頁）。年齢、性別、および民族性について調整したＣｏｘ回帰モデルにおいて、ＳＡＰの標準偏差増加は、発作またはＣＶＤ死亡ではなく、アンギナおよびＭＩと関連していた。しかしながら、この試験において、ＳＡＰ対ＣＲＰの比の決定は、行われなかった。発明者らは、この試験に含まれたそれぞれの患者においてＳＡＰ／ＣＲＰ比を決定するためにデータの予測分析を行い、次いで、疾患発生率とのこの比の関連を決定した（表２）。発作、ＣＶＤ死亡、およびすべての死亡を有する患者において、コントロールと比較して、より低いＳＡＰ／ＣＲＰ比の統計的に有意な関連があった。重要なことには、これらの関連は、ＳＡＰ自体を分析した場合に、もとの公開された試験において認識されなかった。
【０２５０】
【表２】
2010532872.tif 000003
（実施例４）ＦｃγＲに対するＳＡＰおよびＣＲＰの相対的な結合の決定
発明者らは、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方へのＦｃγ受容体の様々なサブタイプの結合を特徴づけ、比較し、ＳＡＰまたはＣＲＰについてそれぞれの選択性を決定し、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方にわたる結合について、特異的なＦｃγ受容体サブタイプの順位をつけた。発明者らのデータは、ＳＡＰ結合Ｆｃγ受容体を特徴づけ、ＳＡＰおよびＣＲＰの結合を比較し、様々なＦｃγ受容体に対するそれらの親和性の差異についての情報を提供する生化学的結合分析の第１のセットを示す。結果は、血漿または血清中のＳＡＰ／ＣＲＰ比の変化の、可能性として考えられる効果の理解に向けた有用な情報を提供する。
【０２５１】
発明者らは、表面プラズモン共鳴技術を使用して、Ｆｃγ受容体へのペントラキシンＳＡＰおよびＣＲＰの結合を同定し、定量するための方法を確立した。表面プラズモン共鳴技術は、表面プラズモン共鳴の変化として検出される、チップの表面の質量の変化を通して、２つのタンパク質の間の結合および解離の事象を検出し、定量する。これらの試験のために、発明者らは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００機器を使用した。
【０２５２】
ＳＡＰを、チップの試験フローセルの表面に結合し、Ｆｃγ受容体の可溶性組換え形態（ｓＦｃγＲ）をチップの表面にわたって流し、接触または結合の段階を示した。次いで、緩衝液をチップ表面にわたって流し、解離段階を示した。時間との、表面プラズモン共鳴ユニット（ＲＵ）の変化として検出される時間に対する細胞表面での質量における変化を、センサーグラムと呼ばれるグラフによって示した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップのＣＭ５デキストラン表面へのＳＡＰの結合は、ランニング緩衝液としての１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ７．４の存在下において実行した。ＳＡＰの結合は、ＳＡＰ上の、提示が制限されるアミン基含有アミノ酸を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシサクシンイミドを用いて活性化したチップ表面上の基に共有結合するアミン共役（Ｂｉａｃｏｒｅ試薬）を使用して、非常に短い固定によって安定させた。ネガティブコントロールフローセルは、ＳＡＰと同じレベルまでヒト血清アルブミンを固定するために、同じアミン共役手順を使用して調製した。このフローセルへのあらゆる結合は、非特異的結合と考え、試験フローセル結合結果から減算した。可溶性ＦｃγＲタンパク質は、受容体の完全長膜結合形態の細胞外領域を提示し、Ｃ末端に、６〜１０個のヒスチジンのポリヒスチジン尾部を持っていた。５つまでの異なる濃度の可溶性ＦｃγＲを、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ７．４を含有するランニング緩衝液を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅチップの試験フローセルおよびネガティブコントロールフローセルの両方の表面にわたって流した。表面での表面プラズモン共鳴変化は、ＳＡＰへのｓＦｃγＲ結合およびＳＡＰからの解離の結合キネティクスを評価するために使用した。ネガティブコントロールフローセル結合結果を使用して、あらゆる非特異的結合を減算するのと同様に、シグナルの微量の試験フローセル特異的変動を、試験ランの直前に実行した、いくつかの緩衝液ブランクランの最後の試験フローセルから得たシグナルを使用して、減算した。結合および解離の速度定数、ＫａおよびＫｄは、それぞれ、結合モデルに基づいて、キネティックフィッティング法を通して決定し、ＳＡＰへのｓＦｃγＲの結合のキネティクスを定義するために使用した。比Ｋｄ／Ｋａを計算し、Ｆｃγ受容体およびＳＡＰの間の結合の親和性（ＫＤ）を確定するために使用した。発明者らは、ＳＡＰからのｓＦｃγＲの解離が、非常に遅く、この密接な結合の結果として、他の結合事象を評価するためにチップ表面を再生し、ＳＡＰ活性を保持することができないことが分かったので、発明者らは、Ｂｉａｃｏｒｅによって定義されるような単一サイクルキネティクス方法論およびこの方法に関連するキネティクス評価を使用した。評価には、異なる受容体濃度のサイクルの間の不完全なチップ表面再生に適応し、発明者らが、単一のランからＫａ、Ｋｄ、およびＫＤを得るために、５つの異なる受容体濃度を使用することを可能にしたアルゴリズムを適用する。
【０２５３】
同様の方法は、ＣＲＰおよびｓＦｃγＲの間の結合相互作用を評価するために使用し、詳細は、ここで述べられる場合以外は、同じである。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップへのＣＲＰの結合は、ＰＣ−ＫＬＨ（ホスホコリン−キーホールリンペットヘモシニアン抱合体）を介しての捕捉を通して達成した。手短かに言えば、ＰＣ−ＫＬＨは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシサクシンイミドを用いて活性化したチップ表面上でアミン共役を通してＣＭ５チップ上に固定した。ネガティブコントロールフローセルは、ＰＣ−ＫＬＨと同じレベルまでヒト血清アルブミンを固定するために、同じアミン共役を使用して調製した。ＣＭ５チップ上に固定したＰＣ−ＫＬＨのＰＣ部分へのＣＲＰの結合は、所望の量の結合ＣＲＰを達成するために、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ７．４中でＣＲＰとＣＭ５チップの表面を接触させることによって達成した。発明者らは、これを、同じ条件およびランニング緩衝液として同じ１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ７．４を使用して異なるフローセル上で試みた場合に、同じレベルまで固定したＫＬＨに結合しないことが明らかであったので、結合が、ＰＣ−ＫＬＨ中のＰＣ部分に対して特異的であることを確証した。ＰＣ−ＫＬＨへのＣＲＰの結合は、アミン共役を使用して、非常に短い固定によって安定させた。発明者らは、ＣＲＰからのｓＦｃγＲの解離が、比較的速く、ランニング緩衝液中で、解離段階の間にチップ表面を完全に再生することが可能であることが分かったので、「再生した」ＣＲＰは、ｓＦｃγＲを再結合させるのに際して完全な活性を保持した。この理由で、発明者らは、Ｂｉａｃｏｒｅによって定義されるようなマルチサイクルキネティクス方法論およびこの方法に関連するキネティクス評価を使用し、これに、異なる受容体濃度のサイクルの間の、完全なチップ表面再生を必要とするアルゴリズムを適用する。発明者らは、単一マルチサイクル評価からＫＤを得るために５つの異なる受容体濃度を使用した。
【０２５４】
発明者らは、結合が、Ｃａ２＋の非存在下において生じず、Ｃａ２＋の存在下において結合したＳＡＰを、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて容易に除去することができたので、チップ表面上のＣＭ５デキストランへのＳＡＰの結合がＣａ２＋依存的であることを実証した。発明者らは、ＳＡＰが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１変異体）、およびＦｃγＲＩＩＩＢに結合することができるが、ＦｃγＲＩＩＢに結合することができないことが分かった。結合が生じた場合、オン速度（Ｋａによって示される）は高く、オフ速度（Ｋｄによって示される）は低かった。表３は、Ｋｄ／Ｋａの比として計算される、それぞれの相互作用についての親和性（ＫＤ）を示す。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１変異体）、およびＦｃγＲＩＩＩＢに対するＳＡＰの親和性は、タンパク質／タンパク質相互作用についての親和性を示すための、当技術分野において知られている親和性の正常範囲と比較して、すべて高く、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢに対するＩｇＧについて報告されたものよりも高く、ＦｃγＲＩに対するＩｇＧと同様の範囲にある（Ｇｅｓｓｎｅｒ  ＪＥら、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ７６巻：２３１頁（１９９８年））。そのため、ＳＡＰは、高い親和性で、ほとんどのＦｃγＲに結合することができるが、それは、おそらく、ＦｃγＲ２Ａクラスの受容体に優先的に結合するであろう。ＦｃγＲＩＩＩＢへのＳＡＰの結合の、代表的なセンサーグラムを図４に示す、また、これは、５つの異なる、経時的に送達した受容体濃度の結合段階または接触段階および解離段階についてのデータを示す。
【０２５５】
【表３】
2010532872.tif 000004
発明者らは、結合が、Ｃａ２＋の非存在下において生じず、Ｃａ２＋の存在下において結合したＣＲＰを、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて容易に除去することができたので、チップ表面上のＰＣ−ＫＬＨのＰＣ部分へのＣＲＰの結合がＣａ２＋依存的であることを実証した。発明者らは、ＣＲＰもまた、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１変異体）、およびＦｃγＲＩＩＩＢに結合することができるが、ＦｃγＲＩＩＢに結合することができず、この意味において、これらの異なるＦｃγＲに対する特異性が、ＳＡＰと同じであることが分かった。結合が生じた場合、オン速度は高く、オフ速度もまた、ＳＡＰとは対照的に、高く、ベースラインに素早く戻った。定性的に、発明者らは、いずれのこれらのＦｃγＲ受容体に対しても、ＳＡＰよりもＣＲＰの親和性が非常に低く、これは、主に、オフ速度によって推進されることが分かった。これらのデータは、ＳＡＰ／ＣＲＰの比が著しく低下しない限り、ＳＡＰが、ＦｃγＲへの結合についてＣＲＰと有効に競合するであろうということを暗示する。
【０２５６】
ＣＲＰによるＦｃγＲの結合のさらなる特徴もまた観察し、ＣＲＰの生物学的現象およびＳＡＰ／ＣＲＰ比のあたりの生物学的現象に関連すると考えられ、相互作用分析の接触または結合段階の間に、結合受容体の実際の質量は、時間と共に減少し、受容体が一度、結合すると、この段階の間に、ＣＲＰへの受容体分子の再結合または最初の結合についての親和性を減少させる高次構造の変化が結果として生じることを暗示した。この効果は、五量体分子内の１を超える、５つまでのＣＲＰプロトマー上の結合部位の、受容体による占有の増加についての可能性が存在する場合、受容体濃度の増加と共に増加した。代表的なセンサーグラムを、ＣＲＰ（ＣＭ５チップ上のＰＣ−ＫＬＨに結合）に対するＦｃγＲＩ結合について図５（Ａ）におよびＣＲＰ（ＣＭ５チップ上のＰＣ−ＫＬＨに結合）に対するＦｃγＲＩＩＩＢ結合について図５（Ｂ）に示す。
【０２５７】
この効果の存在は、ｓＦｃγＲへのＣＲＰ結合を正確に定量するための標準的な方法の適用を妨げた。しかしながら、受容体は、完全に解離する（ベースラインに戻る）ことができ、たとえば０．４４４μＭ  ｓＦｃγＲＩを使用する、重複分析で見られるように、同じ程度までの等価な量の受容体の再結合は、影響を与えられないので、効果は、完全に可逆的である。ＣＲＰへのＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩＢの結合の速いオン速度は、接触段階における初期のほぼ定常な状態の達成を可能にし、それでもなお、発明者らの、初期の結合段階データのみを使用する、親和性についてのおよその読み取りを可能にした。受容体濃度に対するＲｅｑ（平衡時の応答）の代表的なプロットを、ＦｃγＲＩへのＣＲＰの結合について図６（Ａ）におよびＦｃγＲＩＩＩＢへのＣＲＰの結合について図６（Ｂ）に示す。
【０２５８】
定性的に、曲線が、表面上、飽和に決して接近しないが（Ｒｍａｘ（飽和に達した最大の応答）は、約１００×ＫＤ以上で理論的に達する）、多くの濃度の、使用した受容体が、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩＩＢに対するＳＡＰの１００×ＫＤを超えたので、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩＢに対するＣＲＰの親和性がＳＡＰの親和性未満であることは明確である。図６におけるそれぞれのグラフの垂直線は、得られたおよその親和性（ＫＤ）を示すが、これは、親和性のおよその指標としてのみ採用されるべきである。ＦｃγＲＩと同じ濃度範囲にわたって評価した場合、同じチップ上のＣＲＰに結合することができた全ＦｃγＲＩＩＩＢはより少なく（図５（Ａ））、たとえオン速度もまた急速であったとしても、ＦｃγＲＩ（図５（Ｂ））と比較して、ＣＲＰに対するＦｃγＲＩＩＩＢの親和性がより低いことを示す。これは、受容体濃度に対するＲｅｑ（平衡時の応答）のプロット（ＡおよびＢ）の比較によって支持される（図６）。ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）もまた同じ濃度範囲にわたって試験した場合、同じチップ上のＣＲＰに結合することができたＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）は、相当に、より少なく、なおまた同様のオン速度が見られた。異なるチップ上で、ＣＲＰに結合することができた全ＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）は、同じ濃度のＦｃγＲＩ（同じ条件）を使用して観察されたものよりも少なかった。この同じチップ上で、同じ条件および濃度下でＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）およびＦｃγＲＩＩＩＢについて達成された結合レベルは同様であった。ＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）の結合は、用量依存的であった。これは、ＣＲＰに結合する、ここで試験した４つのＦｃγＲ受容体のうち、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）が最も低い親和性を有することを暗示し、これは、文献における細胞ベースの試験において報告されたデータと一致し、これは、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）へのＣＲＰの結合が、非常に低い親和性によるものであり、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）へのＣＲＰの結合よりも低いことを実証する（Ｓｔｅｉｎ  Ｍ−Ｐら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．１０５巻：３６９頁（２０００年））。
【０２５９】
本明細書において試験したＦｃγＲへのＳＡＰおよびＣＲＰの結合についての親和性の順位：ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）／ＳＡＰ＞ＦｃγＲＩＩＩＢ／ＳＡＰ＞ＦｃγＲＩ／ＳＡＰ＞＞ＦｃγＲＩ／ＣＲＰ＞ＦｃγＲＩＩＩＢ／ＣＲＰ〜ＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）＞＞ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）／ＣＲＰ、ＦｃγＲＩＩＢに対して検出可能なＳＡＰまたはＣＲＰの結合なし。
【０２６０】
ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）およびＦｃγＲＩＩＩＢに対する、ＳＡＰおよびＣＲＰの親和性を比較する際に、ＳＡＰの親和性が、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）およびＦｃγＲＩＩＩＢに対するＣＲＰ結合の親和性よりも１０００倍大きいことは明らかである。ヒト血清において、ＳＡＰレベルは、２０〜４０μｇ／ｍｌまたは１．５〜３×１０−７Ｍの範囲で全く一定のままである。ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）およびＦｃγＲＩＩＩＢに対するＳＡＰ結合について発明者らが得た親和性は、低い１０−１０Ｍの範囲にある。したがって、ＳＡＰは、競合する結合の非存在下において、これらの受容体に飽和まで結合することができ、ＦｃγＲに結合するＳＡＰおよびＣＲＰについての発明者らの現在の理解の中で、ＣＲＰは、ＣＲＰレベルの正常な血漿範囲で競合的ではないであろう。ＦｃγＲＩについては、ＳＡＰの親和性は、ＣＲＰよりも高いが、ＣＲＰが、１ｍｇ／ｍｌに接近し得る血漿中で増加する場合、おそらく競合が生じるであろう。ＦｃγＲＩＩＢへのＳＡＰまたはＣＲＰの結合の不足は、これが、ＦｃγＲを通して媒介される活性化ＩＴＡＭシグナル伝達を調節すると考えられる、細胞における完全長膜貫通形態において阻害ＩＴＩＭシグナル伝達経路を通してシグナル伝達する唯一の受容体であるので、ＳＡＰおよびＣＲＰの両方の生物学的現象に関連する（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ＦおよびＲａｖｅｔｃｈ  ＪＶ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２４巻：１９頁（２００６年））。したがって、ＦｃγＲを通してのＩｇＧシグナル伝達とは対照的に、ＦｃγＲを通してのＳＡＰおよびＣＲＰのシグナル伝達は、活性化シグナル伝達受容体および阻害シグナル伝達受容体のバランスによってではなく、オーバーラップする受容体プールに対するＳＡＰおよびＣＲＰの競合的結合を通して調節されるように思われる。
【０２６１】
（実施例５）線維細胞成長のＣＲＰ媒介性の増強は、ＦｃγＲＩＩａ−Ｒ１３１対立遺伝子に依存する。
【０２６２】
ＦｃγＲＩＩＡ遺伝子型同定
ゲノムＤＮＡは、Ｆｌｅｘｉｇｅｎｅ  ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ  Ｃａ）を使用して、ヒトＰＢＭＣから抽出した。ＰＣＲ遺伝子型同定については、特異的センスプライマーは、ＦｃγＲＩＩ  Ｈ１３１およびＦｃγＲＩＩ  Ｈ１３１の第２の細胞外ドメインにおけるヌクレオチドの差異に従って設計し、遺伝子型同定のためのセンスプライマーは、配列番号８および配列番号９によってそれぞれ示す。アンチセンスプライマーは、下流のイントロン配列（配列番号１０）に従って設計した。これにより２５３ｂｐ  ＰＣＲ断片がもたらされる。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲキットは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ａ）から購入し、ＰＣＲ反応溶液は、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．１μｇゲノムＤＮＡ、それぞれの方向の０．５ｍＭプライマー、および０．５μｌ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する。使用した熱サイクルは、１分間９８℃を１サイクル、１０秒間９８℃、２０秒間６０℃、および１５秒間７２℃を３０サイクル、５分間７２℃を１サイクルとした。増幅ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル上で分離した図７。図において示されるように、Ｒ／Ｒ（Ｇ／Ｇ）遺伝子型は、センスプライマーとしてＲ１３１のレーンにおいてバンドを示すのみであり、Ｈ／Ｈ（Ａ／Ａ）遺伝子型は、センスプライマーとしてＨ１３１のレーンにおいてバンドを示すのみであるのに対して、Ｈ／Ｒ遺伝子型は、両方のレーンにおいてバンドを示す。
【０２６３】
（１）Ｆｌｅｓｃｈ  ＢＫ、Ｂａｕｅｒ  Ｆ、Ｎｅｐｐｅｒｔ  Ｊ．  Ｒａｐｉｄ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩＡ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．１９９８年、３８巻（２号）：１７４〜６頁。
【０２６４】
異なるＦｃγＲＩＩａ多型を発現する単球を用いる線維細胞アッセイにおけるＳＡＰおよびＣＲＰの活性
線維細胞アッセイは、ドナー１（Ｒ／Ｒホモ接合性）、ドナー２（Ｈ／Ｈホモ接合性）、またはドナー３（Ｈ／Ｒヘテロ接合性）を使用して、実施例１において記載されるよう実行した。線維細胞アッセイは、ドナー単球の線維細胞応答性を増加させるＭＣＳＦの存在下または非存在下において実行した。図８Ａにおいて見られるように、Ｒ１３１／Ｒ１３１ホモ接合性のドナー１は、線維細胞分化を阻害するためのＳＡＰの能力に対抗する時の最も大きなＣＲＰ応答性を実証した。ドナー１については、わずか５ｕｇ／ｍｌのＣＲＰが１〜２ｕｇ／ｍｌのＳＡＰに対抗するのに必要であった。より高い濃度のＣＲＰにより、このドナーのＣＲＰ受容体を飽和し、架橋の低下に至り、それによって、その効果を打ち消した。これらのデータは、ＣＲＰに対するＦｃｇＲＩＩ−Ｒ１３１の、報告された、より高い結合活性と十分に相関する。対照的に、Ｈ１３１／Ｈ１３１ホモ接合性のドナー２は、線維細胞分化を阻害するためのＳＡＰの能力に対抗するＣＲＰの能力の著しい低下を実証した図８Ｂ。ドナー２については、４０ｕｇ／ｍｌのＣＲＰが２ｕｇ／ｍｌのＳＡＰに対抗するのに必要であり、ＭＣＳＦなしの培地における線維細胞成長の刺激に対してほとんど影響を及ぼさず、ＣＲＰに結合するためのＦｃｇＲＩＩ−Ｈ１３１の能力の低下と一致した。最後に、Ｒ１３１／Ｈ１３１ヘテロ接合性のドナー３は、ＭＣＳＦなしの培地における線維細胞分化のＣＲＰ依存性で、用量応答性の刺激を実証した（図８Ｃ）。これらの結果は、ＳＡＰが、ＣＲＰ駆動性の線維性活性に及ぼす相対的な影響を決定する際に役割を果たすＦｃｇＲＩＩ−１３１の多型と一致している。
【０２６５】
配列表
配列番号１  ヒト血清アミロイドタンパク質Ｐ
【０２６６】
【数１】
2010532872.tif 000005
配列番号２  Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ血清アミロイドタンパク質Ｐ
【０２６７】
【数２】
2010532872.tif 000006
配列番号３  Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ血清アミロイドタンパク質Ｐ
【０２６８】
【数３】
2010532872.tif 000007
配列番号４  Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉｕｓ血清アミロイドタンパク質Ｐ
【０２６９】
【数４】
2010532872.tif 000008
配列番号５  ヒトＦｃγＲＩＩＡ（ＮＭ＿０２１６４２）
【０２７０】
【数５】
2010532872.tif 000009
【０２７１】
【数６】
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Ｈ１３１／Ｒ１３１対立遺伝子は、ｍＲＮＡ配列中の位置５３４〜５３６で太字ｃａｔコドンによって定義され、これは、タンパク質におけるこの位置でヒスチジンをコードする。第２の位置（５３５）が、ａではなく、その代わりにｇである場合、コドンはｃｔｇになり、アミノ酸アルギニンをコードする。
配列番号６  ヒトＦｃγＲＩＩＡ（ＮＰ＿０６７６７４）
【０２７２】
【数７】
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太字アミノ酸はシグナル配列を特定する。
【０２７３】
Ｒ１３１多型が存在する場合、１６６位のＨはＲである。
配列番号７  ヒトＦｃγＲＩＩＡ（ＳＮＰ  ｒｓ１８０１２７４）
ｇｎｌ｜ｄｂＳＮＰ｜ｒｓ１８０１２７４｜ａｌｌｅｌｅＰｏｓ＝３０１｜ｔｏｔａｌＬｅｎ＝６０１｜ｔａｘｉｄ＝９６０６｜ｓｎｐｃｌａｓｓ＝１｜ａｌｌｅｌｅｓ＝’Ｃ／Ｔ’｜ｍｏｌ＝Ｇｅｎｏｍｉｃ｜ｂｕｉｌｄ＝１２９
【０２７４】
【数８】
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配列番号８  ＦＣγＲＩＩ  Ｈ１３１
５’−ＡＴＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＴＣＣＣＡ−３’
配列番号９  Ｒ１３１：
５’−ＡＴＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＴＣＣＣＧ−３’
配列番号１０  下流のイントロン配列に対するアンチセンスプライマー
５’−ＣＡＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＣ−３’
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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