(57)【要約】  本出願は、体細胞超変異（ＳＨＭ）系及び合成遺伝子に関する。合成遺伝子は、コンピューターベースのアプローチを使用して体細胞超変異に対するポリヌクレオチドの感受性を増加又は減小させることによって設計することができる。目的の遺伝子はベクター中に挿入され、体細胞超変異を誘導するために活性化誘導シチジンデアミナーゼに曝露される。改変された遺伝子によってコードされるタンパク質又はその部分は、体細胞超変異のためにＳＨＭ系に導入することができ、また、所望の表現型又は機能を示すタンパク質又はその部分を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの診断用途又は治療用途のために単離することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質またはその部分をコードするＳＨＭ感受性遺伝子であって、未改変のタンパク質またはその部分をコードする未改変ポリヌクレオチド配列中の１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより高い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており、該合成遺伝子は、未改変ポリヌクレオチド配列よりもホットスポットモチーフの密度が高い、および／またはホットスポットの密度が低いものである、遺伝子。
【請求項２】
タンパク質またはその部分をコードするＳＨＭ耐性の合成遺伝子であって、未改変のタンパク質またはその部分をコードする未改変ポリヌクレオチド配列中の１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより低い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており、該合成遺伝子は、未改変ポリヌクレオチド配列よりもコールドスポットの密度が高い、および／またはコールドスポットの密度が低いものである、遺伝子。
【請求項３】
該未改変ポリヌクレオチド配列と比較してホットおよび／またはコールドスポットの密度を調節する、１つ以上のサイレントな核酸変異を含む、請求項１または２記載の合成遺伝子。
【請求項４】
ホットおよび／またはコールドスポットの密度を調節するように改変されており、該未改変タンパク質と比較して１つ以上の保存的または半保存的アミノ酸変異をコードする、請求項１または２記載の合成遺伝子。
【請求項５】
該未改変タンパク質と比較して約５０％以上、約７０％以上または約９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１または２記載の合成遺伝子。
【請求項６】
該未改変ポリヌクレオチド配列と比較して好ましくないコドンの含量が減少している、請求項１または２記載の合成遺伝子。
【請求項７】
該未改変ポリヌクレオチド配列と比較して好ましいＳＨＭホットスポットモチーフの含量が増加している、請求項１記載の合成遺伝子。
【請求項８】
該未改変ポリヌクレオチド配列と比較して標準的なホットスポットおよびコールドスポットの密度が改変されている、請求項１または２記載の合成遺伝子。
【請求項９】
該未改変ポリヌクレオチド配列と比較してＡＩＤ介在性の変異誘発率が変化している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の合成遺伝子。
【請求項１０】
抗体もしくはその抗原結合フラグメント、選択マーカー、レポータータンパク質、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、酵素、受容体、構造タンパク質、毒素、補因子または転写因子をコードする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の合成遺伝子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの合成遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の合成遺伝子を含む真核細胞。
【請求項１３】
所望の性質を有する遺伝子産物の調製方法であって、
ａ）該遺伝子産物をコードする請求項１記載の合成遺伝子を調製し、
ｂ）ＡＩＤ活性を発現するか、あるいは誘導因子の添加によりＡＩＤ活性を発現するように誘導され得る細胞集団において、該合成遺伝子を発現させ、
ｃ）所望の性質を有する改変された遺伝子産物を発現する、該細胞集団内の単一または複数の細胞を選択すること
を含む、方法。
【請求項１４】
任意で、該細胞集団においてＡＩＤ活性の発現を活性化または誘導することをさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
（ｃ）において同定された単一または複数の細胞から、１つ以上のクローン細胞集団を樹立することをさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの該合成遺伝子が、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、酵素、受容体、構造タンパク質、毒素、補因子または転写因子をコードする、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
該細胞集団が請求項２記載の合成遺伝子にコードされる遺伝子産物をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
所望の性質を有する遺伝子産物の調製方法であって、
ａ）少なくとも１つの請求項２記載の遺伝子を含み、かつＡＩＤ活性を発現するか、あるいは誘導因子の添加によりＡＩＤ活性を発現するように誘導され得る細胞集団において、該遺伝子産物を発現させ、
ｂ）所望の性質を有する改変された遺伝子産物を発現する、該細胞集団内の単一または複数の細胞を選択すること
を含む、方法。
【請求項１９】
任意で、該細胞集団においてＡＩＤ活性の発現を活性化または誘導することをさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
（ｂ）において同定された単一または複数の細胞から、１つ以上のクローン細胞集団を樹立することをさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの該合成遺伝子が、ＳＨＭに関与する酵素、合成選択マーカー遺伝子、または合成レポーター遺伝子をコードする、請求項１３記載の方法。
【請求項２２】
該遺伝子産物が請求項２記載の合成遺伝子にコードされている、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
該細胞集団が請求項１記載の合成遺伝子にコードされる遺伝子産物をさらに含む、請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２００７年２月２０日に出願された米国仮出願第６０／９０２，４１４号（代理人整理番号３３５４７−７０５．１０１）、２００７年３月１日に出願された米国仮出願第６０／９０４，６２２号（代理人整理番号３３５４７−７０６．１０１）、２００８年１月９日に出願された米国仮出願第６１／０２０，１２４号（代理人整理番号３３５４７−７０６．１０２）及び２００７年９月２８日に出願された米国仮出願第６０／９９５，９７０号（代理人整理番号３３５４７−７０８．１０１）の利益を主張し、それらの出願の各々は、参照することにより、全体として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組換えタンパク質治療の使用の市場は、ここ四半世紀で着実に増加してきた。２００５年には、上位２０の薬品のうち６つがタンパク質であり、全体としては、バイオ医薬品は、国家の歳入のおよそ４００億ドルを占め、そのうちおよそ１７０億ドルが、モノクローナル抗体の売り上げに基づくものであった。
【０００３】
モノクローナル抗体は、バイオ治療法の確固としたクラスであり、多大な将来性を有している。抗体スキャフォールドは臨床において耐用性良好であり、また、グリコシル化されたＩｇＧ分子は、好ましい薬物動態特性及び薬力学的特性を有している。現在市販されている薬とほとんど変わらない新薬の候補を迅速に選択する潜在性がある。機序に基づかない毒性に関する問題、並びに抗体製品の製造及び製剤が知られ、治療集団に渡って一貫しており、そのことが、小分子の治療と比較して、このクラスの薬剤候補に関連する潜在的な失敗率を減小させる。
【０００４】
伝統的な小分子に基づくアプローチとは対照的に、治療抗体は、（ｉ）迅速に生成及び検証され得る；（ｉｉ）副作用がより少なく、安全性が改善されている、（ｉｉｉ）薬物動態的な特性がよく理解されており、投与頻度が低減された半減期の長い製品を生成するために最適化され得る；ｉｖ）用途が広く、薬の機能において柔軟性を示す；ｖ）スケールアップ及び製造プロセスがロバストであり、よく理解されている；ｖｉ）臨床上及び薬事規制上の成功実績が実証されている；並びにｖｉｉ）現在の薬事規制の環境により、競合するジェネリックな又は生物学的に同等な抗体を導入することは困難であり且つコストがかかる、という事実に挙げられるように、著しい利点を有する。
【０００５】
モノクローナル抗体の成功を鑑みたとしても、薬剤モダリティとしての抗体は、発達し続けており、非効率になりがちである。更には、自然免疫系に内在する生物学的偏りが、しばしば、改善された治療法のより早い開発に不利に働く。こういった制約としては、ｉ）治療能力のある親和定数を有する生物学的に活性な抗体の単離に長い開発時間がかかること、ｉｉ）あるクラスのタンパク質標的（手に負えない（ｉｎｔｒａｃｔａｂｌｅ）標的）に対して、抗体産生が不可能であること、及びｉｉｉ）免疫系に基づく親和性の選択に内在する、固有の親和性の上限、が挙げられる。
【０００６】
具体的には、改善された薬物動態、交差反応性、安全性、及び優れた投与レジメンを持つ抗体を、より迅速に開発する方法が必要とされている。この必要性に対して、あるタンパク質の潜在的なエピトープの体系的な解析を可能とし、且つ所望の選択特性を持つ抗体の選択的な開発を可能とする方法の開発が重要である。
【０００７】
十分確立されたモノクローナル抗体開発方法が幾つか存在する。しかしながら、これらの技術の多くは、臨床的に最善の候補を迅速に進化させる能力を制限する、特有の欠点を有する。こういった技術的な制限としては、ｉ）マウスの免疫及びハイブリドーマの技術は反復的に使用できず、また、抗原の手に負えなさに起因して所望の特徴を有する抗体の産生ができないことがしばしばである、ｉｉ）ファージディスプレイ又はパニングは、治療能力のある親和定数を持つモノクローナル抗体の産生ができないことがしばしばであり、また、重鎖及び軽鎖の全体を選択及び共に進化させるために容易に使用され得ない、及びｉｉｉ）合理的設計ストラテジーは、しばしば不完全な解決となり、また既存の知識のみに基づいていること、が挙げられる。
【０００８】
用いられるアプローチとしては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分子進化と併用したランダム又はセミランダムな変異誘発の使用（例えば、エラープローンＰＣＲの使用）が挙げられる。このアプローチは、タンパク質構造中にランダムな変更を作り出し、且つ、通常、コードされるタンパク質を生細胞内で発現させることによって、後に改善された変異型のためにスクリーニングされる変異ポリヌクレオチドの大きなライブラリーを生成することに基づく。これらのライブラリーから、少数の改善されたタンパク質が更なる最適化のために選択され得る。
【０００９】
このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異のアプローチは、任意に与えられた配列の部分を体系的にサーチすることが不可能であることによって、及び多数の変異の中から非常にまれな改善変異を検出するのが比較的難しいことによって、限定され得る。この根本的な問題は、適度なサイズのタンパク質に対して可能な変異の総数が多数であるために生じる。例えば、１００アミノ酸のタンパク質の潜在的な多様性は、２０１００の異なるアミノ酸配列であり、一方、既存のハイスループットのスクリーニングの方法論では、場合によっては、最大で、１週間に１０７−１０８サンプルのスクリーニング能力に限られる。更には、こういったアプローチは、コドン使用が重複しており、１００アミノ酸残基のタンパク質に対して可能な最大約３１００のヌクレオチド配列が、実際に同一のアミノ酸及びタンパク質をコードしているため、相対的に非効率である（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら（２００４）Ｃｏｄｏｎ  Ｂｉａｓ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（７）３４６−３５３））。
【００１０】
より洗練されたアプローチでは、改善されたタンパク質の選択のために、タンパク質ドメイン間での組換えによるランダムな変異誘発の組み合わせが用いられる（Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１（２２）１０７４７−５１））。このアプローチは、タンパク質ファミリーに渡ってタンパク質構造に特有の自然な設計概念を利用するが、これもまた、まれな改善を同定するには、かなりの組換えＤＮＡ操作や、多数の配列をスクリーニングする能力が必要とされる。両アプローチとも、大規模なフォローアップの変異誘発、並びに各変異の重要性を理解するための解析、及び何千若しくは何百万もの同定された変異体の最良の組み合わせを同定するための解析を必要とする。
【発明の概要】
【００１１】
発明の要旨
本発明は、ＳＨＭ感受性及びＳＨＭ耐性のＤＮＡ配列を設計し、且つ細胞環境内又は無細胞環境内でそれらを作製又は生成するための系の開発に基づく。本発明は更に、構造部分又はポリペプチド若しくは構造タンパク質、転写調節領域及び選択マーカーに影響せずに、好適な時間にわたって、ＳＨＭの増加及び／又は減少を再現性良く維持するために安定である、ＳＨＭ系の開発に基づく。当該系は、構造タンパク質、転写調節領域及び選択マーカーにおける非特異的な変異誘発を十分に防ぎつつ、目的のポリヌクレオチドにおける標的化されたＳＨＭを高レベルで提供する変異誘発系を、安定して維持することを可能とする。
【００１２】
部分的には、当該系は、高レベルで維持されるＳＨＭを提供し得る、より安定なバージョンの活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）の創出に基づく。
【００１３】
本出願において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ体細胞超変異（ＳＨＭ）系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＨＭを、指向された進化及びバイオインフォマティクス解析と組み合わせて使用し、以下に限定されないが、コドンの設計及び使用、ライブラリーの設計、スクリーニング、選択のための最適化され制御された系並びにデータマイニングのための統合された系を含む、統合された系を創出することを伴う。これらの系としては以下が挙げられる。
【００１４】
Ｉ．細胞環境内又は無細胞環境内でＳＨＭ感受性及び又はＳＨＭ耐性のＤＮＡ配列を作り出すように設計された発現系。該系は、構造タンパク質、転写調節領域及び選択マーカーにおける非特異的な変異誘発を有意に防ぎつつ、対象のポリヌクレオチドにおける標的化されたＳＨＭを高レベルで提供する変異誘発系を、安定して維持することを可能にする。
【００１５】
ＩＩ．サイズ及び特異性において集中的であり、且つ、目的の機能が充実し且つＳＨＭのための効率的な基質であるためにＡＩＤへの曝露でｉｎ  ｓｉｔｕでの多様性創出の起点となる、ポリヌクレオチドライブラリー。
【００１６】
ＩＩＩ．優れた選択性、異種間の反応性及びブロッキング活性を有する抗体の選択を与える最適なエピトープを選択するための、タンパク質構造、種内及び種間の配列バリエーションのコンピューターによる解析並びにタンパク質活性の機能解析に基づくプロセス。
【００１７】
ポリヌクレオチドがＳＨＭを起こす傾向を最大化又は最少化すると同時に、タンパク質の発現、ＲＮＡの安定性、及び好都合に位置する制限酵素部位の存在を最大化するポリヌクレオチド配列を設計する方法が本明細書では提供される。
【００１８】
あるポリヌクレオチドの合成又は半合成バージョンであって、該ポリヌクレオチドの変異生成率に対するＳＨＭの影響を、野生型がＳＨＭを起こす感受性と比較して、増強又は低減するように最適化された（即ち、ＳＨＭ感受性又はＳＨＭ耐性）ものもまた、本明細書では提供される。
【００１９】
ＳＨＭ感受性の配列は、ＳＨＭにより感受性であるコドン用法に基づいて設計されるポリヌクレオチドの迅速な進化を可能とし；最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＩＤに曝露されて、ポリペプチドとして発現され得る。反対に、ＳＨＭ耐性の配列は、ＳＨＭにより感受性が低い（耐性の）コドン用法に基づいて設計されるポリヌクレオチドの迅速な進化を可能とし；最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＩＤに曝露されて、ポリペプチドとして発現され得る。コードされるポリペプチドの改良版を、機能の改善又は安定性の向上及びＳＨＭへの耐性のために選択することができる。
【００２０】
本明細書に記載の系は、合理的設計の能力を、加速されたランダム変異誘発及び指向された進化と組み合わせる。
【００２１】
重要な保存されたドメインが変異誘発を免れることを可能とすると同時に所望の配列を標的化し得るＳＨＭ耐性のポリヌクレオチド配列もまた、本発明に含まれる。
【００２２】
これらの方法を適用可能なポリヌクレオチドとしては、転写され得、且つスクリーニングのための機能的活性を工夫された任意のポリヌクレオチド配列が挙げられる。
【００２３】
これらのアプローチの統合の全体的な結果が、標的化された多様性をｉｎ  ｓｉｔｕで創出するため、並びに改善された特性を持つタンパク質の自動化された解析及び選択のための統合された系である。
【００２４】
ある実施形態では、本発明は、部分的には、ポリヌクレオチド配列のリーディングフレーム内での複数回のＳＨＭという状況についての理解の向上、及びその基礎となるコドン用法パターンの論理的関係についての理解の向上に基づく。
【００２５】
タンパク質又はその部分をコードするＳＨＭ感受性の合成遺伝子であって、該合成遺伝子では、該タンパク質又はその部分をコードする未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより高い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており、該ＳＨＭ感受性の合成遺伝子は、該未改変のポリヌクレオチド配列と比較して、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）介在性の変異誘発率がより高い、前記合成遺伝子が本明細書で提供される。好ましいホットスポットＳＨＭコドン又は好ましいホットスポットＳＨＭモチーフは、例えば、以下に限定されないが、コドンＡＡＣ、ＴＡＣ、ＴＡＴ、ＡＧＴ及びＡＧＣを含むコドンである。そのような配列は、より大きなＳＨＭモチーフの構成内に埋め込まれている可能性もあり得、ＳＨＭ介在性の変異誘発をリクルートし得、且つ該コドンにおける標的化されたアミノ酸多様性を生成し得る。
【００２６】
本発明はまた、ＳＨＭ感受性の合成遺伝子が、ある改変が遺伝子に為され、次いで後の回の改変が該遺伝子に為されるようにして、段階的（ステップワイズ）又は連続的（シーケンシャル）な様式で作り出され得ることも意図する。そのような連続的又は段階的な改変は、本発明で意図されており、また、それは、当該プロセスを実行する一つの方法であり、且つ本願で主張される遺伝子を作製する一つの方法である。
【００２７】
１つの実施形態では、ＳＨＭ感受性の合成遺伝子は、未改変の遺伝子に対して、約９９％、約９５％、約９０％アミノ、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、又は約５０％と約１００％の間の任意のパーセンテージの同一性を有するタンパク質又はその部分をコードする。
【００２８】
１つの実施形態では、ＳＨＭ感受性の合成遺伝子は、以下に限定されないが、１．０５倍、１．１倍、１．２５倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍若しくはそれより大きい、又はそれらの間の任意の範囲を含む、より高いＡＩＤ介在性の変異誘発率を示す。
【００２９】
１つの実施形態では、ＳＨＭ感受性の合成遺伝子は、未改変の遺伝子が示すものの少なくとも約１０１％、少なくとも約１０５％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１１５％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１３５％、少なくとも約１１４０％、少なくとも約１４５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５０００％、又はそれより高いレベルの、ＡＩＤ介在性の変異誘発率を示す。
【００３０】
１つの実施形態では、タンパク質又はその部分をコードするＳＨＭ感受性遺伝子であって、該遺伝子では、該タンパク質又はその部分をコードする未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより高い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており、該合成遺伝子は、該未改変のポリヌクレオチド配列よりも、ホットスポットモチーフの密度が高い、前記ＳＨＭ感受性遺伝子が本明細書で提供される。
【００３１】
また別の非限定的な態様では、前記合成遺伝子は、好ましいＳＨＭホットスポットモチーフを導入する１つ以上のアミノ酸変異を含む。
【００３２】
タンパク質又はその部分をコードするＳＨＭ耐性の合成遺伝子であって、該合成遺伝子では、該タンパク質又はその部分をコードする未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより低い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており、該ＳＨＭ耐性の合成遺伝子は、該未改変のポリヌクレオチド配列と比較して、ＡＩＤ介在性の変異誘発率がより低い、前記合成遺伝子が本明細書で提供される。
【００３３】
本発明はまた、ＳＨＭ耐性の合成遺伝子が、ある改変が遺伝子に為され、次いで後の回の改変が該遺伝子に為されるようにして、段階的又は連続的な様式で作り出され得ることも意図する。そのような連続的又は段階的な改変は、本発明で意図されており、また、それは、当該プロセスを実行する一つの方法であり、且つ本願で主張される遺伝子を作製する一つの方法である。
【００３４】
１つの実施形態では、ＳＨＭ耐性の合成遺伝子は、未改変の遺伝子に対して、約９５％、約９０％アミノ、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、又は約５０％と約１００％の間の任意のパーセンテージの同一性を有するタンパク質又はその部分をコードする。
【００３５】
１つの実施形態では、ＳＨＭ耐性の合成遺伝子は、以下に限定されないが、１．０５倍、１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍若しくはそれより低い、又はそれらの間の任意の範囲を含む、より低いＡＩＤ介在性の変異誘発率を示す。
【００３６】
１つの実施形態では、ＳＨＭ耐性の合成遺伝子は、未改変の遺伝子が示すものの約９９％未満、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、又は約５０％未満のレベルの、ＡＩＤ介在性の変異誘発率を示す。
【００３７】
１つの実施形態では、タンパク質又はその部分をコードするＳＨＭ耐性の合成遺伝子であって、該合成遺伝子では、該タンパク質又はその部分をコードする未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより低い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており、該合成遺伝子は、該未改変のポリヌクレオチド配列よりも、コールドスポットの密度が高い、前記合成遺伝子が本明細書で提供される。
【００３８】
タンパク質又はその部分をコードする、選択的に標的化された、ＳＨＭに最適化された合成遺伝子であって、該合成遺伝子では、該タンパク質又はその部分をコードする未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより高い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており；且つ該タンパク質又はその部分をコードする該未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第３のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより低い１つ以上の第４のＳＨＭモチーフによって置換されており；該選択的に標的化された、ＳＨＭに最適化された合成遺伝子は、標的化されたＡＩＤ介在性の変異誘発を示す、前記合成遺伝子が本明細書で提供される。そのような実施形態では、該選択的に標的化された、ＳＨＭに最適化された合成遺伝子は、より高いＡＩＤ介在性の変異誘発率を示す部分と、より低いＡＩＤ介在性の変異誘発率を示す別の部分とを有する。
【００３９】
また別の実施形態では、タンパク質又はその部分をコードする、選択的に標的化された、ＳＨＭに最適化された合成遺伝子であって、該合成遺伝子では、該タンパク質又はその部分をコードする未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより高い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており、該合成遺伝子は、該未改変のポリヌクレオチド配列よりもホットスポットモチーフの密度が高く；且つ、該タンパク質又はその部分をコードする該未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第３のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより低い１つ以上の第４のＳＨＭモチーフによって置換されており、該合成遺伝子は、該未改変のポリヌクレオチド配列よりもコールドスポットの密度が高く；該選択的に標的化された、ＳＨＭに最適化された合成遺伝子は、標的化されたＡＩＤ介在性の変異誘発を示す、前記合成遺伝子が本明細書で提供される。１つの実施形態では、該選択的に標的化された、ＳＨＭに最適化された合成遺伝子は、より高いＡＩＤ介在性の変異誘発率を示す部分と、より低いＡＩＤ介在性の変異誘発率を示す別の部分とを有する。
【００４０】
本発明はまた、選択的に標的化された、ＳＨＭに最適化された合成遺伝子が、ある改変が遺伝子に為され、次いで後の回の改変が該遺伝子に為されるようにして、段階的又は連続的な様式で作り出され得ることも意図する。そのような連続的又は段階的な改変は、本発明で意図されており、また、それは、当該プロセスを実行する一つの方法であり、且つ本願で主張される遺伝子を作製する一つの方法である。
【００４１】
１つの非限定的な態様では、該合成遺伝子は、ホットスポット又はコールドスポットの密度を調節する１つ以上の保存的又は半保存的なアミノ酸変異を含み、且つ該合成遺伝子は、該未改変の遺伝子と比較して、約９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質又はその部分をコードする。
【００４２】
別の非限定的な態様では、該合成遺伝子は、ホットスポット又はコールドスポットの密度を調節する１つ以上の保存的又は半保存的なアミノ酸変異を含み、且つ該合成遺伝子は、該未改変の遺伝子と比較して、約７０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質又はその部分をコードする。
【００４３】
別の非限定的な態様では、該合成遺伝子は、ホットスポット又はコールドスポットの密度を調節する１つ以上の保存的又は半保存的なアミノ酸変異を含み、且つ該合成遺伝子は、該未改変の遺伝子と比較して、約５０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質又はその部分をコードする。
【００４４】
また別の非限定的な態様では、該合成遺伝子は、好ましいＳＨＭホットスポットモチーフを導入する１つ以上のアミノ酸変異を含む。
【００４５】
１つの非限定的な例では、合成遺伝子は、オープンリーディングフレームに挿入されたストップモチーフを含む遺伝子を含まない。
【００４６】
１つの態様では、合成遺伝子によりコードされるタンパク質又はその部分は、以下に限定されないが、抗体又はその抗原結合フラグメント、選択マーカー、レポータータンパク質、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、酵素、受容体、構造タンパク質、毒素、補因子及び転写因子から選択される。
【００４７】
少なくとも１つの合成遺伝子を含む発現ベクターが本明細書で提供される。１つの態様では、発現ベクターは、組込み発現ベクターである。発現ベクターが、組込み発現ベクターである場合、発現ベクターは、組換えを指示する１つ以上の配列を更に含み得る。別の態様では、発現ベクターは、エピソーム発現ベクターである。また別の態様では、発現ベクターは、ウイルス発現ベクターである。
【００４８】
本明細書に記載の合成遺伝子を含む真核細胞が本明細書で提供される。１つの態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞又は酵母細胞である。
【００４９】
本明細書に記載の合成遺伝子を含む原核細胞が本明細書で提供される。１つの態様では、原核細胞は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の細胞である。
【００５０】
所望の性質を有する遺伝子産物を調製するための方法であって、該方法は：ａ）ＳＨＭの増加を示す遺伝子産物をコードする合成遺伝子を調製することを含み；ｂ）細胞集団において該合成遺伝子を発現させることを含み；該細胞集団は、ＡＩＤを発現するか、又は誘導因子の添加によりＡＩＤを発現するように誘導され得；且つ、ｃ）該所望の性質を有する変異した遺伝子産物を発現する、該細胞集団内の細胞（単数又は複数）を選択することを含む、前記方法が本明細書で提供される。１つの態様では、該方法は、該細胞集団におけるＡＩＤの発現を活性化又は誘導することを更に含んでも良い。別の態様では、該方法は、（ｃ）において同定された細胞（単数又は複数）から１つ以上のクローン細胞集団を確立することを更に含んでも良い。該方法のまた別の態様では、少なくとも１つの合成遺伝子は、本明細書の他の箇所に記載されるいずれか１つの発現ベクターなどの発現ベクター内に位置する。該方法の１つの態様では、該細胞は、本明細書の他の箇所に記載される細胞である。
【００５１】
所望の性質を有する遺伝子産物を調製するための方法であって、該方法は：ａ）細胞集団において該遺伝子産物を発現させることを含み；該細胞集団は、ＳＨＭの減少を示す少なくとも１つの合成遺伝子を含み；且つ該細胞集団は、ＡＩＤを発現するか、又は誘導因子の添加によりＡＩＤを発現するように誘導され得；且つ、ｂ）該所望の性質を有する変異した遺伝子産物（１つ以上の変異を有する変異した合成遺伝子によってコードされるポリペプチド）を発現する、該細胞集団内の細胞（単数又は複数）を選択することを含む、前記方法が本明細書で提供される。１つの態様では、該方法は、該細胞集団におけるＡＩＤの発現を活性化又は誘導することを更に含んでも良い。別の態様では、該方法は、（ｂ）において同定された細胞（単数又は複数）から１つ以上のクローン細胞集団を確立することを更に含んでも良い。該方法のまた別の態様では、少なくとも１つの合成遺伝子は、本明細書の他の箇所に記載されるいずれか１つの発現ベクターなどの発現ベクター内に位置する。該方法の１つの態様では、該細胞は、本明細書の他の箇所に記載される細胞である。
【００５２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ超変異系であって、該系は：ａ）合成遺伝子を含むポリヌクレオチド；ｂ）組換えＡＩＤ；及びｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系を含む、前記系が本明細書で提供される。該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系は、転写後の核酸を増幅させるためのポリメラーゼを更に含み得る。該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を更に含み得る。１つの態様では、該ポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載されるいずれか１つの発現ベクターなどの発現ベクター内に位置する。該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系は、本明細書の他の箇所に記載される細胞の細胞集団を更に含み得る。
【００５３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発のためのキットであって、該キットは：ａ）組換えＡＩＤタンパク質；ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の１つ以上の試薬；及びｃ）合成遺伝子の設計又は使用のための説明書を含む、前記キットが本明細書で提供される。該キットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳用の１つ以上の試薬を更に含み得る。該キットは、例えば本明細書に記載されるいずれか１つの発現ベクターなどの発現ベクターを含むことを更に含み得る。該キットは、本明細書の他の箇所に記載される細胞の細胞集団を更に含み得る。
【００５４】
参照による組み込み
本明細書で言及する全ての刊行物及び特許出願は、参照することにより、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が、参照により組み込まれることを具体的に且つ個々に示した場合と同程度に、本明細書に組み込まれる。
【００５５】
図面の簡単な説明
本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することにより、本発明の特徴及び利点のより良い理解を得ることができる。
【００５６】
図１及び図２は、ＳＨＭ介在性の親和性成熟の間に相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＷまたはＦＲ）において観察された、最も一般的な２０のコドン遷移を示しており、単純なフレームシフトがどのようにして、ＣＤＲ及びＦＷにおいて見られる、２つの根本的に異なる変異誘発のパターンを決定し得るのかを示している。これらの観察から、親和性成熟の間の機能的な選択とリーディングフレームの構成との両方が、ＳＨＭホットスポットコドンにおいて生成されるアミノ酸多様性を決定しているという仮説が直接的に導かれる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＣＤＲ内で、（チロシン及びセリンアミノ酸をコードするコドンＡＧＣ、ＴＡＴ及びＴＡＣが、）アミノ酸多様性を生成する１次、２次及び３次のＳＨＭ事象の指向された流れを与えることを示している。ＣＤＲ内で、観察された最も一般的なコドン遷移は、セリンからアスパラギンへの変換に繋がる、ＡＧＣからＡＡＣである（７８５例）。この遷移はフレームワーク領域においても一般的であるが（３５４例）、同一のホットスポットモチーフ（．．ＴＡＣＡＧＣＴＡＴ．．；配列番号４２）の構成における同一の変異の単一のフレームシフトは、ＣＡＧからＣＡＡへのサイレント変異をもたらし、これは、フレームワーク領域において一般的であるが（２８８例）、ＣＤＲにおいては一般的には観察されない。
【図２】図１とは対照的に、フレームワーク領域において最も一般的に観察されたコドン（アミノ酸）遷移事象は、サイレント変異を生成することを示している（図２）。
【図３】３つの可能なリーディングフレームのいずれかで与えられる、ＷＡＣライブラリーによってコードされる全てのモチーフは、ホットスポットの連結を与え、これらのモチーフを、ＳＨＭ介在性の機構をリクルートする能力について、他の全ての可能な４０９６の６マーヌクレオチドの組み合わせと比較したものを与えている。より長いアセンブリーは、「コールドスポット」を有さない同じ高密度の「ホットスポット」をもたらす。縮重コドン（ＷＡＣＷ）のアセンブリーは、Ｒｏｇｏｚｉｎらに記載される可能な４マーホットスポット（ＷＲＣＨ；ここで、Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ、及びＷ＝Ｔ又はＡ）のサブセットをもたらす。
【図４】好ましいＳＨＭホットスポットコドンＡＡＣ及びＴＡＣ（これらは、合成ライブラリーの基礎である）は、Ｉｇ重鎖抗体において観察される等価なＳＨＭ変異事象による判断で、かなりのアミノ酸の多様性を生じる、一次及び二次の変異事象のセットを生じ得る。これら２つのコドンから、塩基性アミノ酸（ヒスチジン、リジン、アルギニン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸）、親水性アミノ酸（セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン）、疎水性アミノ酸（アラニン及びフェニルアラニン）、及びグリシンが、ＳＨＭ事象の結果として生じる。
【図５】ＳＨＭ介在性の変異に対するモチーフのホットさ又はコールドさを示す、全４０９６の６マーヌクレオチドのｚスコアの分布である。ＷＲＣ合成ライブラリー中の６マーの全ての順列についてのｚスコアをこの分布上に重ね合わせており、破線は、全ての可能なモチーフの上位５％を示している。
【図６】親和性成熟したＩＧＶ重鎖配列中で観察されるような、「好ましいＳＨＭホットスポットコドン」ＡＧＣ及びＴＡＣから開始する、アミノ酸多様性の生成を導く一連の変異事象である。アスパラギン及びチロシンをコードするコドンから開始する、４２００の一次及び二次の変異事象は、機能的に多様なアミノ酸のセットを導く。
【図７】ＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎプログラムを用いた進行性の置換の反復による、配列最適化の収束を示している。この図は、未改変のイヌＡＩＤヌクレオチド配列から出発した場合の、理想化されたホット配列及びコールド配列への最適化の両方を示している。
【図８】未改変のブラストサイジン遺伝子のアミノ酸配列（Ａ；配列番号２９４）及びポリヌクレオチド配列（Ｂ；配列番号２６）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｃ）、コールドスポット（Ｄ）及びＣｐＧの発生（Ｅ）の初期解析も示している。
【図９】合成のＳＨＭ耐性型のブラストサイジン遺伝子のアミノ酸配列（Ａ；配列番号２９４）及びポリヌクレオチド配列（Ｂ；配列番号２６）を与えている。太字の大文字で示すように、合成配列におけるホットスポット（Ｃ）、コールドスポット（Ｄ）及びＣｐＧの発生（Ｅ）の解析も示している。
【図１０】合成のＳＨＭ感受性型のブラストサイジン遺伝子のアミノ酸配列（Ａ；配列番号２９４）及びポリヌクレオチド配列（Ｂ；配列番号２９６）を与えている。太字の大文字で示すように、合成配列におけるホットスポット（Ｃ）、コールドスポット（Ｄ）及びＣｐＧの発生（Ｅ）の解析も示している。
【図１１−１】未改変型のハイグロマイシン遺伝子のポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号２９８）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の初期解析も示している。１０２のＣｐＧメチル化部位が存在した（データ示さず）。
【図１１−２】未改変型のハイグロマイシン遺伝子のポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号２９８）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の初期解析も示している。１０２のＣｐＧメチル化部位が存在した（データ示さず）。
【図１２−１】合成のＳＨＭ耐性（コールド）型のハイグロマイシン遺伝子のポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号２９８）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の解析も示している。４１のＣｐＧメチル化部位が存在した（データ示さず）。
【図１２−２】合成のＳＨＭ耐性（コールド）型のハイグロマイシン遺伝子のポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号２９８）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の解析も示している。４１のＣｐＧメチル化部位が存在した（データ示さず）。
【図１３−１】合成のＳＨＭ感受性（ホット）型のハイグロマイシン遺伝子のポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号２９９）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の解析も示している。３２のＣｐＧメチル化部位が存在した（データ示さず）。
【図１３−２】合成のＳＨＭ感受性（ホット）型のハイグロマイシン遺伝子のポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号２９９）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の解析も示している。３２のＣｐＧメチル化部位が存在した（データ示さず）。
【図１４】未改変型のティール蛍光タンパク質（Ｔｅａｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＴＦＰ）のポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３００）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の解析も示している。４０のＣｐＧメチル化部位が存在した（データ示さず）。
【図１５】合成のＳＨＭ感受性（ホット）型のティール蛍光タンパク質（ＴＦＰ）のポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３０１）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の解析も示している。１４のＣｐＧメチル化部位が存在した（データ示さず）。
【図１６−１】合成のＳＨＭ耐性（コールド）型のティール蛍光タンパク質（ＴＦＰ）のポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３０２）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の解析についても示している。２１のＣｐＧメチル化部位が存在した（データ示さず）。
【図１６−２】合成のＳＨＭ耐性（コールド）型のティール蛍光タンパク質（ＴＦＰ）のポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３０２）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の解析についても示している。２１のＣｐＧメチル化部位が存在した（データ示さず）。  図１６Ｄは、ホット及びコールドのＴＦＰコンストラクトの代表的なセグメントの変異を示している。中央の行は、ＴＦＰのアミノ酸配列（残基５９から８７）を一文字形式で示し（配列番号３７８）、この二つのコンストラクトをコードする「ホット」及び「コールド」の出発核酸配列を、当該アミノ酸配列の上（ホット；配列番号３７９）及び下（コールド）に示す（配列番号３８０）。ホット配列において観察された変異を並べて遺伝子配列の上に積み上げ、コールドＴＦＰ配列における変異は下に示している。この結果は、コード配列への「サイレント」な変化が、観察されたＡＩＤ介在性のＳＨＭの率に、どれほど劇的な変化を生み出すのかを示しており、設計配列を効果的に最適化してＳＨＭの速い又は遅い率を生成することができることを実証している。  図１６Ｅは、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織培養系においてＡＩＤにより生成された変異の分布が、他の研究において観察されたもの、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの親和性成熟の間に見られるものに酷似していることを示す。図１６Ｅは、本研究において生成された変異を示し（ボックス（ｉ）左上、ｎ＝１１８）、それをＺａｎら（ボックス（ｉｉ）右上、ｎ＝７０２）、Ｗｉｌｓｏｎら（左下、ｎ＝２５０００；ボックス（ｉｉｉ））によって観察された変異、並びに親和性成熟を経たＩＧＨＶ鎖の大規模解析（右下、ｎ＝１０１，９２６；ボックス（ｉｖ））と比較している。各々の図のＹ軸は出発ヌクレオチドを示し、Ｘ軸は結果のヌクレオチドを示し、各々の四角の中の数字は、ヌクレオチド遷移が観察された回数のパーセンテージ（％）を示している。本研究において、変異のトランジション及びトランスバージョン変異の頻度は、他のデータセットにおいて見られたものに類似していた。ＣからＴへ、及びＧからＡへの変異は、シチジンにおけるＡＩＤ活性の直接的な結果であり、全ての変異事象の４８％を占める。更に、塩基Ａ及びＴにおける変異は、変異事象の〜３０％を占める（即ち、他のデータセットにおいて観察された頻度よりやや少ない）。  図１６Ｆは、変異事象が、ホットＴＦＧ遺伝子のＳＨＭ最適化ヌクレオチド配列の全体に分布していることを示し、１世代当たり、１０００ヌクレオチド当たり約０．０８事象という最大の瞬間の率は、オープンリーディングフレームの始まりから３００ヌクレオチドに集中していた。ＡＩＤを持つ遺伝子の安定トランスフェクション及び選択（３０日間）は、４８０ヌクレオチド当たり１事象という最大の変異率を生じた。結果として、遺伝子は、遺伝子当たり０、１、２又はそれより多くの変異を含み得る。  図１６Ｇは、ホットＴＦＰ配列の遺伝子にて観察されたＳＨＭ介在性事象の分布を示しており、これは、コールドＴＦＰにおいて見られる変異（図１６Ｈ）の有意に減小したパターンと比較される。
【図１７−１】Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト；配列番号３０３）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス；配列番号３０４）、Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ；配列番号３０５）、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖ（ラット；配列番号３０６）、及びＰａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅ（チンパンジー；配列番号３０７）の活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）の配列比較を与えている。種間での変動は、太字のアミノ酸で示している。
【図１７−２】Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト；配列番号３０３）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス；配列番号３０４）、Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ；配列番号３０５）、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖ（ラット；配列番号３０６）、及びＰａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅ（チンパンジー；配列番号３０７）の活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）の配列比較を与えている。種間での変動は、太字のアミノ酸で示している。
【図１８】イヌシチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）（Ｌ１９８Ａ）のアミノ酸配列（Ａ；配列番号３０８）及びポリヌクレオチド配列（Ｂ；配列番号３０９）を与えている。太字の大文字で示すように、未改変の配列におけるホットスポット（Ｃ）、コールドスポット（Ｄ）及びＣｐＧの発生（Ｅ）の解析も示している。
【図１９】合成のＳＨＭ感受性型のイヌＡＩＤのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３１０）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）、コールドスポット（Ｃ）及びＣｐＧの発生（Ｄ）の解析も示している。
【図２０】合成のＳＨＭ耐性型のイヌＡＩＤのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３１１）を与えている。太字の大文字で示すように、ホットスポット（Ｂ）、コールドスポット（Ｃ）及びＣｐＧの発生（Ｄ）の解析も示している。
【図２１−１】Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ；配列番号３１２）及びＳＨＭ耐性（コールド）Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ；配列番号３１３）、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト；配列番号３１４）、及びＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス；配列番号３１５）ｍＲＮＡの活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）のゲノム配列の配列比較を与えている。ＧＡＧ配列を太字・下線で示している。種間での変動は、太字のアミノ酸で示している。
【図２１−２】Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ；配列番号３１２）及びＳＨＭ耐性（コールド）Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ；配列番号３１３）、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト；配列番号３１４）、及びＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス；配列番号３１５）ｍＲＮＡの活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）のゲノム配列の配列比較を与えている。ＧＡＧ配列を太字・下線で示している。種間での変動は、太字のアミノ酸で示している。
【図２２】図２２Ａは、蛍光タンパク質などの変異する終止コドンを含むタンパク質を用いた、復帰頻度に対するＡＩＤ活性の効果の予測を示している。図２２Ｂは、ＡＩＤを発現可能で且つ安定してＧＦＰを発現する発現ベクターを、２つの異なる濃度でトランスフェクトした細胞で達成された、蛍光の実質的な減少率（ＧＦＰの消光として示している）を示している。図２２Ｃは、野生型のヒトＡＩＤ及びコールドのイヌＡＩＤと直接比較した、初期のＧＦＰ復帰率を示している。復帰率に対するＩｇエンハンサーの効果も示している。
【図２３】未改変Ｐｏｌイータのアミノ酸配列（Ａ；配列番号３１６）及びポリヌクレオチド配列（Ｂ；配列番号３１７）、並びにホットスポット、コールドスポット及びＣｐＧの数の解析（Ｃ）を与えている。
【図２４】合成のＳＨＭ耐性（コールド）型のＰｏｌイータのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３１８）、並びにホットスポット、コールドスポット及びＣｐＧの数の解析（Ｂ）を与えている。
【図２５】合成のＳＨＭ感受性（ホット）型のＰｏｌイータのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３１９）、並びにホットスポット、コールドスポット及びＣｐＧの数の解析（Ｂ）を与えている。
【図２６】未改変Ｐｏｌシータのアミノ酸配列を与えている（配列番号３２０）。
【図２７−１】未改変Ｐｏｌシータのポリヌクレオチド配列を与えている（配列番号３２１）。
【図２７−２】未改変Ｐｏｌシータのポリヌクレオチド配列を与えている（配列番号３２１）。
【図２８−１】合成のＳＨＭ耐性（コールド）型のＰｏｌシータのポリヌクレオチド配列を与えている（配列番号３２２）。
【図２８−２】合成のＳＨＭ耐性（コールド）型のＰｏｌシータのポリヌクレオチド配列を与えている（配列番号３２２）。
【図２９−１】合成のＳＨＭ感受性（ホット）型のＰｏｌシータのポリヌクレオチド配列を与えている（配列番号３２３）。
【図２９−２】合成のＳＨＭ感受性（ホット）型のＰｏｌシータのポリヌクレオチド配列を与えている（配列番号３２３）。
【図３０】未改変ウラシルＤＮＡグリコシラーゼのアミノ酸配列（Ａ；配列番号３２４）及びポリヌクレオチド配列（Ｂ；配列番号３２５）、並びにホットスポット、コールドスポット及びＣｐＧの数の解析（Ｃ）を与えている。
【図３１】合成のＳＨＭ耐性（コールド）型のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（Ａ；配列番号３２６）及び合成のＳＨＭ感受性（ホット）型のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（Ｂ；配列番号３２７）のポリヌクレオチド配列を与えている。
【図３２】ベクターフォーマット１（Ａ）及び２（Ｂ）の概略を与えている。
【図３３】ベクターフォーマット３（Ａ）及び４（Ｂ）の概略を与えている。
【図３４】ベクターフォーマット５の概略を与えている。
【図３５】ベクターＦ１（Ａ）及びＦ７（Ｂ）の概略を与えている。
【図３６】ベクターＡＢ１０２の概略を与えている。制限部位及び遺伝エレメントを３６Ａに示し、ベクターの構築に使用したフラグメントを３６Ｂに示している。
【図３７】ベクターＡＢ１８４（Ａ）及びＦ１０（Ｂ）の概略を与えている。
【図３８】ベクターＡＮＡ２０９の概略を与えている。
【図３９】未改変ＮｉｓＢのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３２８）、並びにホットスポット、コールドスポット及びＣｐＧの含量の解析（Ｂ）を与えている。
【図４０】ＳＨＭ耐性（コールド）型のＮｉｓＢのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３２９）、並びにホットスポット、コールドスポット及びＣｐＧの含量の解析（Ｂ）を与えている。
【図４１】未改変ＮｉｓＰのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３３０）、並びにホットスポット、コールドスポット及びＣｐＧの含量の解析（Ｂ）を与えている。
【図４２】ＳＨＭ耐性（コールド）型のＮｉｓＰのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３３１）、並びにホットスポット、コールドスポット及びＣｐＧの含量の解析（Ｂ）を与えている。
【図４３】未改変ＮｉｓＴ（Ａ；配列番号３３２）及びＳＨＭ耐性（コールド）型のＮｉｓＴ（Ｂ；配列番号３３３）のポリヌクレオチド配列を与えている。
【図４４】未改変ＮｉｓＡのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３３４）、並びにホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の初期解析を与えている。また、ＳＨＭ耐性配列（Ｄ；下線）及びＳＨＭ感受性配列（Ｄ；下線なし）の領域を示して合成型のＮｉｓＡ（配列番号３３５）を示しており、且つ、ホットスポット（Ｅ）及びコールドスポット（Ｆ）の解析を示している。
【図４５】未改変ＮｉｓＣのポリヌクレオチド配列（Ａ；配列番号３３６）、並びにホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の初期解析を与えている。
【図４６】合成の耐性（コールド）型のＮｉｓＣ（Ａ；配列番号３３７）を示しており、ホットスポット（Ｂ）及びコールドスポット（Ｃ）の解析を示している。
【図４７】ナイシン（Ｎｉｓｉｎ）の合成及び成熟のダイアグラムを与えている（図４７Ａ）。図４７Ｂは、ｐｄｂの構造２Ｇ０Ｄ（ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）に記載されるタンパク質ＮｉｓＣの主鎖のトレースを、結合ポケット中の残基を強調表示しつつ示している。亜鉛金属、並びにいくつかのシステイン、ヒスチジン及びアスパラギン酸残基が、ＮｉｓＡの環化を行う残基である。ここでは、触媒部位から１０オングストローム（Å）内にある残基をラベルし、サーフェス表示で示している。
【図４８】図４８Ａは、成熟型ニワトリ卵リゾチーム（ＨＥＬ）タンパク質（タンパク質）、ＨＥＬペプチドモノマー（モノマー）、タンデムＨＥＬダイマー（タンデム）、ＨＥＬ  ＭＡＰＳダイマー（ＭＡＰＳ）とコンジュゲート化したストレプトアビジン微粒子、又はネイキッドのコンジュゲート化してないストレプトアビジン微粒子（ネイキッド）とのインキュベートによって選択後の、３０ｐＭ  ＨｙＨＥＬ抗体（暗灰色）を発現している細胞、又は抗体を発現していない細胞（明灰色）を示している。図４８Ｂは、成熟ＨＥＬタンパク質（タンパク質）とコンジュゲート化したトシル基活性化微粒子（タンパク質）、又はネイキッドのコンジュゲート化していないトシル基活性化微粒子（ネイキッド）のいずれかとのインキュベートにより、８００ｐＭ  ＨｙＨＥＬ抗体（暗灰色）を発現している細胞、又は抗体を発現していない細胞（明灰色）が選択されたことを示している。
【図４９】図４９Ａは、成熟ＨＥＬタンパク質（タンパク質）、ＨＥＬペプチドモノマー（モノマー）、タンデムＨＥＬダイマー（タンデム）、ＨＥＬ  ＭＡＰＳダイマー（ＭＡＰＳ）とコンジュゲート化したストレプトアビジン微粒子、又はネイキッドのコンジュゲート化してないストレプトアビジン微粒子（ネイキッド）とのインキュベートによって、３０ｐＭ  ＨｙＨＥＬ抗体を発現している細胞が選択されたことを示している。図４９Ｂは、成熟ＨＥＬタンパク質（タンパク質）とコンジュゲート化したトシル基活性化微粒子（タンパク質）、又はネイキッドのコンジュゲート化していないトシル基活性化微粒子（ネイキッド）のいずれかとのインキュベートにより、８００ｐＭ  ＨｙＨＥＬ抗体を発現している細胞が選択されたことを示している。
【図５０】重鎖抗体のＦＲ領域及びＣＤＲ領域内における、２０の最もホットなスポットのコドン超変異遷移事象を示しており、矢印に示した番号は、コドン遷移事象が観察された頻度を示している。親和性成熟した抗体で観察された変異の発生のうち、コドンＡＧＣ及びＡＧＴ（セリン）、並びにより少ない程度でのＴＡＣ及びＴＡＴ（チロシン）が、〜５０％を占める。正しいリーディングフレーム内でのこれらのホットスポットコドンの使用は、親和性成熟と組み合わさって、フレームワーク領域と比べて、ＣＤＲ内において観察されるサイレント変異を大きく減小させている（図中では、点線の丸で強調表示されている）。
【図５１】安定トランスフェクション及び選択後（パネルＡ及びＣ）又は再トランスフェクションしたＡＩＤ発現ベクターの添加と共に一過的に（パネルＢ及びＤ）、低親和性の抗ＨＥＬ抗体（軽鎖の変異Ｎ３１Ｇを含む）及び構成的なＡＩＤ発現ベクターでトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞を、５０ｐＭのＨＥＬ−ＦＩＴＣ（Ａ及びＢ）又は５００ｐＭのＨＥＬ−ＦＩＴＣ（Ｃ及びＤ）のいずれかと共にインキュベートし、生存するＨＥＬ−ＦＩＴＣ結合細胞を選別し、別のラウンドの選択及び配列解析のために培養物中で増幅した。
【図５２】安定トランスフェクション及び選択後（Ａ及びＣ）又は再トランスフェクションしたＡＩＤ発現ベクターの添加と共に一過的に（パネルＢ及びＤ）、抗ＨＥＬ抗体及び構成的なイヌＡＩＤを発現している予め選別したＨＥＫ−２９３細胞を、５０ｐＭのＨＥＬ−ＦＩＴＣ（Ａ及びＢ）又は５００ｐＭのＨＥＬ−ＦＩＴＣ（Ｃ及びＤ）のいずれかと共にインキュベートし、生存するＨＥＬ−ＦＩＴＣ結合細胞を選別し、別のラウンドの選択及び配列解析のために培養物中で増幅した。
【図５３】低親和性抗ＨＥＬ抗体でトランスフェクションされ、４ラウンドにわたる選択及び進化により進化したＨＥＫ−２９３細胞を、実施例１３に記載のように、５０ｐＭのＨＥＬ−ＦＩＴＣとインキュベートして解析した。パネルＡは、４ラウンドの進化にわたり、ＦＡＣＳの散布図（パネルＡ）並びにゲートされた陽性細胞の総数（パネルＢ）の両方において、陽性細胞の明らかな増加が明白であることを示す。
【図５４】パネルＡは、ＨｙＨＥＬ１０軽鎖のＣＤＲ１周辺のアミノ配列の選択を示しており、出発コンストラクトに導入されたＡｓｎ３１変異の部位周囲の進化した配列を示している（配列番号：３６７、３６８及び３６９）。パネルＢは、対応する核酸配列（配列番号：３７０、３７１及び３７２）を示しており、パネルＣは、進化した変異体の親和性の測定を示している。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書中及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、用語「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそれとは異なることを示していない限り、例えば、ある単位の１つ以上、又は少なくとも１つを意味し得る。従って、例えば「抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」に対する言及は、複数のそのような抗体を含み、また、「可変ドメイン（ａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）」への言及は、１つ以上の可変ドメイン及び当業者に公知のその同等物が含まれる、などである。本明細書中の用語に対して複数の定義がある場合は、別段の記載がない限り、このセクションでの定義が優先する。
【００５９】
値の範囲が与えられた場合、その範囲の上端と下端との間に入る各値が、文脈が明らかにそれとは異なることを示していない限りはその最小単位の十分の一まで、同様に具体的に開示されていることが理解される。記載された範囲の中の任意の記載された値若しくは間に入る値と、該記載された範囲の中の任意の記載された他の値若しくは間に入る値との間のより小さい各範囲は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上端及び下端は、独立して、該範囲に含まれ得るか又は除外され得、また、該より小さい範囲に両端のいずれかが含まれる、いずれの端も含まれない、又は両端とも含まれる各範囲もまた本発明に包含されるが、記載された範囲内に具体的に除外された端があればそれに従う。記載された範囲が一端又は両端を含む場合、それらの含められた端のいずれか又は両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００６０】
用語「特異的結合メンバー」とは、互いに対して結合特異性を有する分子ペアのメンバーを表わす。特異的結合ペアのメンバーは、天然に由来するものであっても、又は全体的若しくは部分的に合成により生成されたものであってもよい。分子ペアの１つのメンバーは、分子ペアの他方のメンバーの特定の立体的な及び／又は極性の機構に特異的に結合し、従って相補的である領域を、その表面又は空洞に有する。従って、ペアのメンバーは、互いに対して特異的に結合する特性を有する。特異的結合ペアの種類の例としては、抗原−抗体、Ａｖｉｍｅｒ（商標）−基質、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、タンパク質−タンパク質、及び酵素−基質が挙げられる。
【００６１】
用語「抗体」は、天然であるか又は部分的若しくは全体的に合成により製造されたものである免疫グロブリンを表わす。該用語はまた、抗原結合ドメインであるか又はそれに相同である結合ドメインを有する、任意のポリペプチド又はタンパク質も包含する。ＣＤＲグラフト抗体もまた、この用語によって意図される。
【００６２】
「ネイティブ抗体」及び「ネイティブ免疫グロブリン」は、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質で、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖から成る。各軽鎖は、場合によっては、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に連結されており、一方、ジスルフィド結合の個数は、様々な免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖の間で様々である。各々の重鎖及び軽鎖はまた、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（「ＶＨ」）を有し、多数の定常ドメイン（「ＣＨ」）がそれに続く。各軽鎖は、一端にある可変ドメイン（「ＶＬ」）及び他端にある定常ドメイン（「ＣＬ」）を有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の一つ目の定常ドメインと揃い、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと揃っている。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン間のインターフェイスを形成すると考えられている。
【００６３】
用語「可変ドメイン」は、ファミリーのメンバーの間で（即ち、異なるアイソフォームの間で、又は異なる種間で）、配列として幅広く異なるタンパク質のドメインを意味する。抗体に関して、用語「可変ドメイン」は、特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性に用いられる、抗体の可変ドメインを意味する。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均等に分布しない。可変性は、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方における、超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」と呼ばれる。未改変の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲ（それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含み、これらは、主としてβシート構造をとり、βシート構造を連結し且つ場合によってはβシート構造の部分を形成するループを形成する３つの超可変領域によって連結される。各鎖の超可変領域は、ＦＲによって共に近接して保持され、且つ、他鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）、第６４７〜６６９頁を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性への抗体の関与など、種々のエフェクター機能を示す。
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」とは、抗原結合に関与する、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、相補的な様式で抗原に直接に結合し、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として知られる、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。
【００６５】
軽鎖の可変ドメインでは、ＣＤＲは、おおよそ、残基２４−３４（ＣＤＲＬ１）、５０−５６（ＣＤＲＬ２）及び８９−９７（ＣＤＲＬ３）に対応し、重鎖の可変ドメインでは、ＣＤＲは、おおよそ、残基３１−３５（ＣＤＲＨ１）、５０−６５（ＣＤＲＨ２）及び９５−１０２（ＣＤＲＨ３）に対応し（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））、且つ／又は、「超可変ループ」からの残基（即ち、軽鎖の可変ドメインでは、残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）、重鎖の可変ドメインでは、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３））に対応する（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「可変フレームワーク領域」又は「ＶＦＲ」とは、抗原結合ポケット又は溝の一部を形成し、且つ／又は抗原と接触し得る、フレームワーク残基を意味する。ある実施形態では、フレームワーク残基は、抗原結合ポケット又は溝の一部であるループを形成する。ループ中のアミノ酸残基は、抗原と接触してもよく、接触しなくてもよい。１つの実施形態では、ＶＦＲのループアミノ酸は、抗体、抗体重鎖、又は抗体軽鎖の三次元構造を調べることで決定される。溶媒がアクセス可能なアミノ酸部位について三次元構造を解析することができるが、これはそのような部位が、ループを形成しやすく、且つ／又は抗体の可変ドメインにおける抗原接触を提供しやすいためである。溶媒がアクセス可能な部位のなかには、アミノ酸配列の多様性を許容するものもあり得、多様性がより少ないもの（例、構造的な部位）もあり得る。抗体の可変ドメインの三次元構造は、結晶構造又はタンパク質モデリングから導出され得る。ある実施形態では、ＶＦＲは、Ｋａｂａｔら、１９９１に従って定義された部位である、重鎖の可変ドメインのアミノ酸部位７１から７８に対応するアミノ酸部位を含み、それらから実質的になり、又はそれらからなる。ある実施形態では、ＶＦＲは、ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３との間に位置するフレームワーク領域３の一部を形成する。好ましくは、ＶＦＲは、標的抗原と接触するため又は抗原結合ポケットの一部を形成するために適切に位置するループを形成する。
【００６７】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには、５つの主要なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭであり、そのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２）に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖の定常ドメイン（Ｆｃ）は、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンについて、サブユニットの構造及び三次元の構成が周知である。
【００６８】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ若しくは（「κ」）及びラムダ若しくは（「λ」）と呼ばれる、２つのはっきり異なるタイプのうちの１つに割り当てることができる。
【００６９】
用語「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合フラグメント」、「抗原結合ドメイン」、「抗体フラグメント」又は「抗体の機能的フラグメント」は、本発明では交換可能に使用され、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１以上のフラグメントを意味する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１２９（２００５）を参照）。これに限定されないが抗体についての用語「抗原結合部分」に含まれる抗体フラグメントの非限定的な例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる単価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；並びに（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更には、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされているが、これらは、組換えの方法を用いて、それらをＶＬ及びＶＨ領域がペアになって単価分子を形成している単一のタンパク質鎖とすることができる合成リンカーによって、連結することができる（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；及びＯｓｂｏｕｒｎら（１９９８）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６：７７８を参照）。このような単鎖抗体もまた、抗体についての用語「抗原結合部分」に包含されることが意図される。完全なＩｇＧ分子又は他のアイソタイプをコードする発現ベクターを作成するために、特定のｓｃＦｖの任意のＶＨ及びＶＬ配列が、ヒト免疫グロブリンの定常領域のｃＤＮＡ又はゲノム配列に連結され得る。ＶＨ及びＶＬはまた、タンパク質化学又は組換えＤＮＡ技術のいずれかを用いて、Ｆａｂ、Ｆｖ又は免疫グロブリンの他のフラグメントの作成にも使用され得る。二重特異性抗体（ダイアボディ）などの他の形態の単鎖抗体もまた、包含される。
【００７０】
「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ」部分は、免疫グロブリン（モノクローナル抗体）を、ペプシン及びパパインなどのプロテアーゼで処理することによって作製することができ、２つのＨ鎖の各々におけるヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合の近くで免疫グロブリンを消化することにより生成される抗体フラグメントを含む。例えば、パパインは、２つのＨ鎖の各々におけるヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合の上流でＩｇＧを切断し、ＶＬ（Ｌ鎖の可変領域）及びＣＬ（Ｌ鎖の定常領域）からなるＬ鎖と、ＶＨ（Ｈ鎖の可変領域）及びＣＨγ１（Ｈ鎖の定常領域におけるγ１領域）からなるＨ鎖フラグメントとが、ジスルフィド結合によってそれらのＣ末端領域において繋がっている、２つの相同な抗体フラグメントを生成する。これらの２つの相同な抗体フラグメントの各々は、Ｆａｂ’と呼ばれる。ペプシンもまた、２つのＨ鎖の各々におけるヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合の下流でＩｇＧを切断し、上記２つのＦａｂ’がヒンジ領域において繋がったフラグメントよりもわずかに大きい抗体フラグメントを生成する。この抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる。
【００７１】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメイン、及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）もまた含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む数個の残基が加えられていることにより、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’を意味する。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元々は、間にヒンジのシステインを有するＦａｂ’フラグメントのペアとして生成された。抗体フラグメントの他の化学的結合も知られている。
【００７２】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、非共有結合的に堅固に会合した、１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変ドメインのダイマーからなる。この構成では、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に、抗原結合部位を規定する。全体としては６つの超可変領域が、抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は、抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含む、半分のＦｖ）であっても、結合部位全体よりも親和性が低いとはいえ、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００７３】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。ある実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、それにより、ｓＦｖが抗原結合のために望ましい構造を形成することが可能となる。ｓＦｖ分子の総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｖｏｌ．１１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００７４】
用語「Ａｖｉｍｅｒ（商標）」は、ヒト由来の新たなクラスの治療タンパク質であって、抗体及び抗体フラグメントとは関係なく、且つＡ−ドメインと呼ばれる（クラスＡモジュール、補体型リピート（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｙｐｅ  ｒｅｐｅａｔ）若しくはＬＤＬ受容体クラスＡドメインとも呼ばれる）、いくつかのモジュール式且つ再利用可能な結合ドメインから構成されるものを意味する。これらはｉｎ  ｖｉｔｒｏエクソンシャッフリング及びファージディスプレイによって、ヒトの細胞外受容体ドメインから開発された（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１４９３−９４；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２２０）。得られたタンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質と比べて、改善された親和性（場合によっては、サブナノモーラー）及び特異性を示し得る複数の独立した結合ドメインを含み得る。例えば、米国特許出願公開公報第２００５／０２２１３８４号、同第２００５／０１６４３０１号、同第２００５／００５３９７３号並びに同第２００５／００８９９３２号、同第２００５／００４８５１２号及び同第２００４／０１７５７５６号を参照されたい。これらの各々は、本明細書で参照することにより、全体として本明細書に組み込まれる。
【００７５】
公知の２１７個のヒトＡ−ドメインの各々は、〜３５アミノ酸（〜４ｋＤａ）を含み、ドメインは、長さとして平均５アミノ酸であるリンカーによって分離されている。ネイティブのＡ−ドメインは、主にカルシウムの結合及びジスルフィドの形成に介在されて、均一で安定な構造へと、素早く且つ効率よく折りたたまれる。１２アミノ酸のみの保存されたスキャフォールドモチーフが、この共通構造のために必要である。最終的な結果として、その各々が別個の機能を表すような複数のドメインを含む、単一のタンパク質鎖となる。該タンパク質の各ドメインは、独立して結合し、また、各ドメインのエネルギー的な寄与は相加的である。これらのタンパク質は、結合活性マルチマー（ａｖｉｄｉｔｙ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ）にちなんで「Ａｖｉｍｅｒ（商標）」と呼ばれた。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「天然の」又は「天然に存在する」抗体又は抗体の可変ドメインは、例えば、生殖系列の配列、又はｅｘ  ｖｉｖｏで得られた分化した抗原特異的なＢ細胞若しくはその対応するハイブリドーマ細胞株、又は動物の血清からといった、非合成の供給源から同定された、抗体又は抗体の可変ドメインの配列を有する抗体又は抗体の可変ドメインを意味する。これらの抗体には、天然のものであっても、他の方法で誘導されたものであっても、任意の種類の免疫応答で産生された抗体が含まれ得る。天然の抗体には、例えばＫａｂａｔのデータベースにおいて特定されるような抗体を構成又はコードする、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列が含まれる。
【００７７】
用語「合成ポリヌクレオチド」又は「合成遺伝子」は、対応するポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、全体として又は部分的に、設計された、又はｄｅ  ｎｏｖｏで合成された、又は同等の未改変の配列と比較して改変された配列に由来することを意味する。合成遺伝子は、全体的又は部分的に、化学合成によって作製され得るか、又はＰＣＲ若しくは同様の酵素的な増幅系によって増幅され得る。合成遺伝子は、ある実施形態では、アミノ酸レベル若しくはポリヌクレオチドレベルのいずれかにおいて（又は両方において）、未改変の遺伝子とは異なり、例えば、合成の発現調節配列の状況内に位置する。合成遺伝子の配列は、例えば、元の配列とは異なるアミノ酸配列若しくはポリヌクレオチドコード配列を与えるような、１つ以上のアミノ酸若しくはポリヌクレオチドの置換、欠失若しくは付加によって変えられた、アミノ酸又はポリヌクレオチド配列を含み得る。合成遺伝子のポリヌクレオチド配列は、未改変の遺伝子と比較して、異なるアミノ酸を有するタンパク質を必ずしもコードしなくても良く、例えば、異なるコドン若しくはモチーフを組み込んでいるが、同一のアミノ酸をコードする（即ち、ヌクレオチドの変化がアミノ酸レベルではサイレント変異として現れ得る）合成ポリヌクレオチド配列も包含し得る。１つの実施形態では、合成遺伝子は、未改変の遺伝子と比較して、ＳＨＭに対する感受性の変化を示す。合成遺伝子は、本明細書に記載の方法を用いて、反復で改変され得、且つ、その各連続的な反復において、対応するポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、全体的又は部分的に、設計された配列、又はｄｅ  ｎｏｖｏで合成された配列、又は同等の未改変の配列と比較して改変された配列に由来する。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「半合成ポリヌクレオチド」又は「半合成遺伝子」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又は増幅反応のための出発物質として天然のドナー（即ち、末梢血中単球）を利用する他の同様の酵素的な増幅系によって得られた核酸配列から部分的になる、ポリヌクレオチド配列を意味する。残りの「合成」ポリヌクレオチド、即ち、ＰＣＲ又は他の同様の酵素的な増幅系によって得られたものではない半合成ポリヌクレオチドの部分は、これに限定されないが核酸配列の化学的合成を含む、当該分野において公知の方法を使用してｄｅ−ｎｏｖｏで合成され得る。
【００７９】
用語「合成可変領域」は、ＡＩＤ及び１つ以上のエラープローンポリメラーゼの活性と組み合わさったときに各位置において可能な広範なアミノ酸配列多様性を生成する、最適なＳＨＭホットスポット及びホットコドン若しくはホットモチーフから実質的になる合成遺伝子内の、合成ポリヌクレオチド配列を意味する。合成可変領域は、抗体又は非抗体ポリペプチドをコードし得、また、合成のフレームワーク配列によって分離され得る。該合成のフレームワーク配列は、ＳＨＭを特異的に標的化しない、若しくはＳＨＭに対して感受性ではない、又はＳＨＭに対して耐性である、コドン又はモチーフを包含する。
【００８０】
用語「二重特異性抗体（ダイアボディー）」は、同一のポリペプチド鎖中に、軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）、２つの抗原結合部位を持つ小さな抗体フラグメントを意味する。同一鎖上の２つのドメインの間でペアになるのを許容するには短すぎるリンカーを使用することにより、該ドメインは、他鎖の相補的なドメインとペアになることを余儀なくされて、２つの抗原結合部位を作り出す。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ ９３／１１１６１；並びにＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、より完全に記載されている。
【００８１】
本発明の抗体はまた、ラクダ科動物及びサメの抗体などの重鎖ダイマーも含む。ラクダ科動物及びサメの抗体は、Ｖ様ドメイン及びＣ様ドメインの２つの鎖のホモダイマー対を含む（いずれも軽鎖を有さない）。ラクダ科動物の重鎖ダイマーＩｇＧのＶＨ領域は、軽鎖と疎水性相互作用をする必要がないため、通常軽鎖と接触する重鎖内の領域は、ラクダ科動物においては、親水性のアミノ酸残基に変化している。重鎖ダイマーＩｇＧのＶＨドメインは、ＶＨＨドメインと呼ばれる。サメのＩｇ−ＮＡＲは、１つの可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲドメインと称される）及び５つのＣ様の定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲドメイン）のホモダイマーを含む。
【００８２】
ラクダ科動物においては、抗体レパートリーの多様性は、ＶＨ又はＶＨＨ領域中の、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３によって決定される。ラクダのＶＨＨ領域中のＣＤＲ３は、平均１６アミノ酸と、比較的長い長さであることを特徴とする（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（９）：１１２９）。これは、多くの他種の抗体のＣＤＲ３領域とは対照的である。例えば、マウスＶＨのＣＤＲ３では、平均９アミノ酸である。
【００８３】
ラクダ科動物の可変領域のｉｎ  ｖｉｖｏでの多様性を維持している、ラクダ科動物由来の抗体可変領域のライブラリーは、例えば、２００５年２月１７日に公開された米国特許出願第２００５００３７４２１号に記載の方法により、作製され得る。
【００８４】
「ヒト化」型の非ヒト（例、マウス）抗体は、非ヒトの免疫グロブリンに由来する最少配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、その殆どの部分について、レシピエントの超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する、合成由来、又はマウス、ラット、ウサギ若しくは非ヒト霊長類などの非ヒト由来（ドナー抗体）の超可変領域の残基で置換されたヒトの免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒトの免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒトの残基で置換される。更には、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能を更に洗練させるために行われる。ヒト化抗体は、超可変領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に一致し、且つＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲに一致している、少なくとも１つ（場合によっては２つ）の可変ドメインのうちの実質的に全てを含み得る。ヒト化抗体は、任意で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部（例えば、ヒトの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部）もまた含み得る。更なる詳細のためには、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．  ２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００８５】
本発明の「ヒト化抗体」としては、遺伝子工学により作製された半合成の抗体が挙げられ、特には、モノクローナル抗体であって、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３が非ヒトモノクローナル抗体（例、マウスモノクローナル抗体）由来であるか、或いは領域が、本明細書に記載されるように、合成可変領域ポリヌクレオチドに由来し（重鎖及び軽鎖の両方）、且つ定常領域が、同様に本明細書に記載されるように、及び所有者が共通である優先の米国仮特許出願第６０／９０４，６２２号及び同第６１／０２０，１２４号に記載されるように、合成のヒト定常領域の鋳型由来である、前記モノクローナル抗体が挙げられる。
【００８６】
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体（即ち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る自然に生じ得る変異を除いて同一である）の集団から得られる抗体を意味する。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原部位を対象とする。更には、異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含み得る従来の（ポリクローナルな）抗体の作製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるような抗体の性質を示しており、何らかの特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されてはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法により作製され得、又は、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）により作製され得る。ある実施形態では、「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。
【００８７】
他の実施形態では、モノクローナル抗体は、飽和硫酸アンモニウム沈殿、オイグロブリン沈殿法、カプロン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ若しくはＤＥ５２）、又は抗免疫グロブリンカラム若しくはプロテインＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、上述の培養上清又は腹水から単離及び精製され得る。
【００８８】
ポリクローナル抗体（抗血清）又はモノクローナル抗体は、公知の方法により作製され得る。即ち、哺乳類、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマ若しくはウシ、又はより好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット若しくはウサギを、例えば上で述べた抗原で、必要であればフロインドアジュバントとともに、免疫する。ポリクローナル抗体は、こうして免疫された動物から得られた血清から得ることができる。モノクローナル抗体は、以下のようにして作製される。こうして免疫された動物から得られた抗体産生細胞を、自己抗体を産生できないミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマを作製する。続いて該ハイブリドーマをクローン化し、該哺乳動物を免疫するのに使用した抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンをスクリーニングする。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「細胞内抗体又はそのフラグメント」は、細胞内で発現及び機能する抗体を意味する。細胞内抗体は、ある実施形態では、ジスルフィド結合を欠き、その特異的結合活性を通じて、標的遺伝子の発現又は活性を調節することができる。細胞内抗体は、単離されたＶＨ及びＶＬドメイン並びにｓｃＦｖのような、単一のドメインフラグメントを含む。細胞内抗体は、標的タンパク質が位置する細胞内区画において該細胞内抗体が高濃度で発現されるのを可能とする、該細胞内抗体のＮ末端又はＣ末端に取り付けられた細胞内輸送シグナルを含み得る。標的遺伝子との相互作用で、細胞内抗体は、標的タンパク質の分解の加速、標的タンパク質の非生理的な細胞内区画への隔離などの機構により、標的タンパク質の機能を調節し、且つ／又は表現型／機能のノックアウトを達成する。細胞内抗体介在性の遺伝子不活性化の他の機構は、標的タンパク質上の触媒部位への結合、又はタンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、若しくはタンパク質−ＲＮＡの相互作用に関与するエピトープへの結合など、細胞内抗体が対象とするエピトープに依存し得る。１つの実施形態では、細胞内抗体は、ｓｃＦｖである。
【００９０】
本発明の「タンパク質又はそのフラグメントに反応する抗体を産生する細胞」とは、上記本発明の抗体のいずれかを産生する任意の細胞を意味する。
【００９１】
用語「生殖系列遺伝子セグメント」は、生殖系列（一倍体の配偶子及びそれらが形成される由来である二倍体細胞）の遺伝子を意味する。生殖系列のＤＮＡは、単一の免疫グロブリン重鎖又は軽鎖をコードする多数の遺伝子セグメントを含む。これらの遺伝子セグメントは生殖細胞中に保有されるが、それらが機能的な遺伝子にされるまでは、重鎖又は軽鎖への転写及び翻訳はされ得ない。骨髄におけるＢ細胞分化の間に、これらの遺伝子セグメントは、１０８を超える特異性を生み出すことが可能な、動的な遺伝子系により、ランダムにシャッフルされる。これらの遺伝子セグメントの殆どは公開され、生殖系列のデータベースによって集められている。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「ライブラリー」は、２以上の同一でないメンバーを含む、複数のポリヌクレオチド、タンパク質又は細胞を意味する。「合成ライブラリー」は、複数の合成ポリヌクレオチド、又は複数の合成ポリヌクレオチドを含む細胞集団を意味する。「半合成ライブラリー」は、複数の半合成ポリヌクレオチド、又は複数の半合成ポリヌクレオチドを含む細胞集団を意味する。「シードライブラリー」は、ＳＨＭ（例、ＡＩＤ介在性のＳＨＭ）に対する感受性が増大又は減少するように改変されており、且つ体細胞超変異が作用したときに、ｉｎ  ｓｉｔｕでポリヌクレオチド、タンパク質又は細胞のライブラリーを作り出すことができる１つ以上の配列又はその部分を含む、１以上の合成若しくは半合成ポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを含む細胞の複数を意味する。
【００９３】
本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、適切な条件下で、物質に対する免疫応答を誘導でき、且つ該免疫応答の産生物と反応できる物質をいう。例えば、抗原は、抗体（液性免疫応答）又は感作されたＴリンパ球（Ｔヘルパー若しくは細胞介在性の免疫応答）、或いはその両方によって認識され得る。抗原は、毒素及び外来タンパク質などの可溶性物質、又は細菌及び組織細胞などの粒子であり得る。しかしながら、抗原決定基（エピトープ）として知られるタンパク質又は多糖類分子の一部分のみが、抗体又はリンパ球上の特異的受容体と結合する。より広範には、用語「抗原」は、免疫原性であろうがなかろうが、抗体が結合するか又は抗体が所望される任意の物質を意味する。そのような抗原に対して、抗体は、どんな免疫応答とも無関係に、組換えの方法によって同定され得る。
【００９４】
本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、２つの物質の可逆的な結合の平衡定数を意味し、Ｋｄとして表される。エピトープに対する抗体の親和性など、リガンドに対するタンパク質の結合の親和性は、例えば約１００ナノモーラー（ｎＭ）から約０．１ｎＭ、約１００ｎＭから約１ピコモーラー（ｐＭ）、又は約１００ｎＭから約１フェムトモーラー（ｆＭ）であり得る。本明細書で使用される場合、用語「結合活性」は、２以上の物質の複合体についての希釈後の解離に対する抵抗を意味する。
【００９５】
「エピトープ」は、結合タンパク質（ｐｒｏｔｉｅｎ）の可変領域の結合ポケットと相互作用する結合性相互作用を形成することができる、抗原又は他の巨大分子の部分を意味する。そのような結合性相互作用は、ＣＤＲの１つ以上のアミノ酸残基との分子間接触として現れ得る。抗原結合は、ＣＤＲ３又はＣＤＲ３ペアが関与し得る。エピトープは、直線状のペプチド配列（即ち、「連続的」）であり得るか、又は、不連続なアミノ酸配列（即ち、「コンフォメーショナル」若しくは「不連続的」）から構成され得る。結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸配列を認識し得る。それゆえエピトープは、１つより多くの異なるアミノ酸配列を規定し得る。結合タンパク質によって認識されるエピトープは、ペプチドマッピング及び当業者に周知の配列解析技術によって決定され得る。「潜在性（ｃｒｉｐｔｉｃ）エピトープ」又は「潜在的な結合部位」とは、露出されていないか又は未改変のポリペプチド内の認識からは実質的に保護されているが、変性又はタンパク質分解されたポリペプチドの結合タンパク質によって認識され得る、エピトープ又はタンパク質配列の結合部位である。未改変のポリペプチド構造において、露出されていないか、又は一部のみが露出されているアミノ酸配列は、潜在性エピトープの可能性がある。エピトープが露出されていないか、又は一部のみが露出されている場合、エピトープは、ポリペプチドの内部に埋もれている可能性がある。潜在性エピトープの候補は、例えば、未改変のポリペプチドの三次元構造を調べることによって特定することができる。
【００９６】
用語「特異的」とは、特異的結合ペアの１つのメンバーが、その特異的結合パートナー以外の分子には、何らの有意な結合を示さない状況に適用され得る。該用語はまた、例えば、抗原結合ドメインが多数の抗原によって保有される特定のエピトープに特異的である場合にも適用され、この場合、該抗原結合ドメインを保有する特異的結合メンバーは、該エピトープを保有する種々の抗原に対して結合することができるであろう。
【００９７】
用語「結合」は、例えば共有的、静電的、疎水的、及びイオン性及び／又は水素結合の相互作用による２分子間の直接的な会合を意味し、塩橋及び水架橋などの相互作用を含む。
【００９８】
用語「アジュバント」は、免疫応答（特に抗原に対する免疫応答）を増強する、化合物又は混合物を意味する。アジュバントは、抗原を徐放する組織デポとして、及び非特異的に免疫応答を増強するリンパ系のアクチベーターとしても、機能し得る（Ｈｏｏｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｏｎｄ編、１９８４、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ：Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ｐ．３８４）。アジュバントの非存在下での抗原のみでの最初のチャレンジでは、液性又は細胞性免疫応答は引き起こされないことがしばしばである。既に知られ且つ利用されているアジュバントとしては、以下に限定されないが、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオールなどの表面活性物質、ポリアニオン、ペプチド、油性若しくは炭化水素エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びコリネバクテリウム・パルバムなどの潜在的に有用であるヒトアジュバントが挙げられる。無機塩アジュバントとしては、以下に限定されないが：水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、水酸化亜鉛及び水酸化カルシウムが挙げられる。好ましくは、アジュバント組成物は、約１０％（重量比）の植物油及び約１−２％（重量比）のリン脂質を含む脂肪エマルジョンの脂質を更に含む。好ましくは、アジュバント組成物は、連続的な水相中に分散した油状粒子を有し、エマルジョンを形成するポリオールを約０．２％（重量比）から約４９％（重量比）の量で有し、エマルジョンを形成する最大１５％（重量比）の量の代謝可能な油を任意に有し、且つエマルジョンを安定化させる最大約５％（重量比）の量のグリコールエーテルベースの界面活性剤を任意に有する、エマルジョン形態を任意で更に含む。
【００９９】
本明細書で使用される場合、用語「免疫調節剤」は、免疫応答を調節することができる剤を意味する。そのような調節の例は、抗体産生の増強である。そのような調節の別の例は、Ｔ細胞応答の増強である。
【０１００】
抗原からなる組成物又はワクチンへの「免疫応答」とは、宿主内における、目的の組成物又はワクチンに対する細胞介在性及び／又は抗体介在性の免疫応答の発達である。通常、そのような応答は、目的の組成物又はワクチンに含まれる抗原を特異的に対象とする、抗体を産生する主体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞からなる。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、複素環塩基、糖、及び１以上のリン酸基からなる、ポリヌクレオチドのモノマー単位を意味する。天然に存在する塩基（グアニン、（Ｇ）、アデニン、（Ａ）、シトシン、（Ｃ）、チミン、（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ））は、プリン又はピリミジンの誘導体であるが、天然に存在する及び天然に存在しない塩基アナログも含まれることを理解すべきである。天然に存在する糖は、ペントース（５炭素の糖）デオキシリボース（ＤＮＡを形成する）又はリボース（ＲＮＡを形成する）であるが、天然に存在する及び天然に存在しない糖アナログも含まれることを理解すべきである。核酸は、リン酸結合を介して結合し、核酸又はポリヌクレオチドを形成するが、他の多くの結合が当該分野において公知である（以下に限られないが、ホスホロチオエート及びボラノリン酸など）。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味し、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のいずれかである。これらの用語は、分子の一次構造に関し、従って、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡを含む。これらの用語は、同等のものとして、ヌクレオチドアナログから作られたＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかのアナログ、並びに以下に限定されないがメチル化及び／又はキャップポリヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを含む。
【０１０３】
「ＤＮＡ分子」は、一本鎖形又は二本鎖ヘリックスのいずれかの、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン又はシトシン）のポリマー形態を意味する。この用語は、分子の一次構造及び二次構造のみについて言及しており、いかなる特定の三次的な形態に限るものではない。従ってこの用語は、とりわけ、直鎖ＤＮＡ分子（例、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド及び染色体で見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論じる場合、配列は、ＤＮＡの転写されない鎖（即ち、ｍＲＮＡに対応する配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを与える通常の慣例に従って本明細書では記載され得る。
【０１０４】
ＤＮＡの「コード配列」又は「コード領域」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、適当な発現調節配列の制御下に置かれた場合に、転写され且つポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列（「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」）の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、以下に限定されないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含み得る。ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置する。用語「非コード配列」又は「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないポリヌクレオチド配列の領域（例、５’及び３’非翻訳領域）を意味する。
【０１０５】
用語「リーディングフレーム」は、二本鎖ＤＮＡ分子についての各方向毎に３つの、可能な６つのリーディングフレームのうちの１つを意味する。使用されるリーディングフレームが、ＤＮＡ分子のコード配列内において、アミノ酸をコードするのにどのコドンを使うかを決定する。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「アンチセンス」核酸分子は、タンパク質をコードする「センス」核酸に対して相補的（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的、ｍＲＮＡ配列に相補的、又は、遺伝子のコード鎖に相補的）な、ヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンスの核酸分子は、センスの核酸分子に水素結合することができる。
【０１０７】
用語「塩基対」又は（「ｂｐ」）：二本鎖ＤＮＡ分子における、アデニン（Ａ）のチミン（Ｔ）とのパートナーシップ、又はシトシン（Ｃ）のグアニン（Ｇ）とのパートナーシップである。ＲＮＡでは、ウラシル（Ｕ）がチミンの代わりになる。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「コドン」は、転写及び翻訳された場合に、単一のアミノ酸残基をコードする；又は、ＵＵＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧの場合は停止シグナルをコードする、３ヌクレオチドを意味する。アミノ酸をコードするコドンは当該技術分野で周知であり、本明細書での便宜のため、表１にて与えられる。
【０１０９】
【表１−１】
2010520748.tif 000002
【０１１０】
【表１−２】
2010520748.tif 000003
【０１１１】
ＡＡ：アミノ酸；Ａｂｂｒ；略称。上に明記したコドンは、ＲＮＡ配列のためのものであることを理解すべきである。ＤＮＡのための対応するコドンは、Ｕの代わりにＴとなる。最適なコドン用法は、例えば、ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．からのプログラム“Ｈｕｍａｎ−Ｈｉｇｈ．ｃｏｄ”からのコドン用法表に示されるように、発現される遺伝子のためのコドン利用頻度により示される。コドン用法は、例えば、Ｒ．Ｎｕｓｓｉｎｏｖ、“Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ”、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４９：１２５−１３１（１９８１）にも記載されている。高度に発現するヒト遺伝子において最も頻繁に使用されるコドンは、ヒト宿主細胞における発現のための最適なコドンであって、合成のコード配列を構築するための基礎となると推測される。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「揺らぎ位置」は、コドンの三番目の位置を意味する。コドンの揺らぎ位置におけるＤＮＡ分子内の変異は、ある実施形態では、アミノ酸レベルでは、サイレント変異又は保存的変異となる。例えばグリシンをコードするコドンは４つ、即ち、ＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡ及びＧＧＧであるため、いかなる揺らぎ位置ヌクレオチドの任意の他のヌクレオチドへの変異も、コードされるタンパク質のアミノ酸レベルでの変化をもたらさず、従って、サイレント置換である。
【０１１３】
即ち、「サイレント置換」又は「サイレント変異」とは、コドン内のヌクレオチドが改変されているが、該コドンによってコードされるアミノ酸残基の変化を生じないものである。例としては、コドンの３番目の位置での変異、並びに、ＡＧＧに変異してもなおＡｒｇをコードするコドン「ＣＧＧ」における変異など、特定のコドンの１番目の位置における変異が挙げられる。
【０１１４】
語句「保存的アミノ酸置換」又は「保存的変異」は、あるアミノ酸を、共通の特性を持つ別のアミノ酸で置き換えることを意味する。個々のアミノ酸の間の共通の特性を定義する有効な方法は、同種生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化した頻度を解析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．及びＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このような解析に従って、グループ内のアミノ酸が優先的に互いに交換され、従って、タンパク質の全体構造に対する影響が互いに最も似ているアミノ酸のグループが、定義され得る（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．及びＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。
【０１１５】
このようにして定義されたアミノ酸グループの例としては：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる「荷電／極性グループ」；Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐからなる「芳香族又は環状グループ」；並びにＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＣｙｓからなる「脂肪族のグループ」が挙げられる。
【０１１６】
各グループ内でサブグループも特定することができ、例えば、荷電／極性アミノ酸のグループは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる「正に荷電したサブグループ」；Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる「負に荷電したサブグループ」、並びにＡｓｎ及びＧｌｎからなる「極性サブグループ」からなるサブグループに更に分類することができる。
【０１１７】
芳香族又は環状グループは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ及びＴｒｐからなる「窒素環サブグループ」；並びにＰｈｅ及びＴｙｒからなる「フェニルサブグループ」からなるサブグループに更に分類することができる。
【０１１８】
脂肪族グループは、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる「大きい脂肪族の非極性サブグループ」；Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＣｙｓからなる「脂肪族のわずかに極性のサブグループ」；並びにＧｌｙ及びＡｌａからなる「小さい残基のサブグループ」からなるサブグループに更に分類することができる。
【０１１９】
保存的変異の例としては、上記のサブグループ内のアミノ酸のアミノ酸置換が挙げられ、例えば、ＬｙｓをＡｒｇにする及びその逆（正電荷が維持され得る）；ＧｌｕをＡｓｐにする及びその逆（負電荷が維持され得る）；ＳｅｒをＴｈｒにする（遊離の−ＯＨが維持され得る）；並びに、ＧｌｎをＡｓｎにする（遊離の−ＮＨ２が維持され得る）、といったものである。
【０１２０】
「半保存的変異」としては、上で挙げた同じグループであって、同一のサブグループを共有しないアミノ酸のアミノ酸置換が挙げられる。例えば、Ａｓｎに対するＡｓｐ、又はＬｙｓに対するＡｓｎの変異は全て、同一グループ内であるが異なるサブグループ内のアミノ酸を伴う。
【０１２１】
「非保存的変異」は、例えばＬｅｕに対するＬｙｓ又はＳｅｒに対するＰｈｅなど、異なるグループ間でのアミノ酸置換を伴う。
【０１２２】
用語「アミノ酸残基」は、カルボキシル基のＯＨ部分及びアルファアミノ基のＨ部分を除去することにより、対応するアルファアミノ酸から得られるラジカルを意味する。殆どの部分について、本願において使用されるアミノ酸は、アミノ基及びカルボキシル基を含む、タンパク質に見られる天然に存在する、又はそのようなアミノ酸の天然に存在する同化若しくは異化生成物である。或いは、他のタンパク質、毒素、小有機化合物又は抗癌剤への化学的結合を促進するために、非天然のアミノ酸をタンパク質に組み入れることもできる（Ｄａｔｔａら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００２；１２４（２０）：５６５２−３）。アミノ酸及び保護基を記載するために本明細書で用いられる略称は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコミッション推奨の生化学命名法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７２）１１：１７２６−１７３２を参照）に基づく。用語「アミノ酸残基」にはまた、本明細書で言及される任意の特定のアミノ酸のアナログ、誘導体及び同類物（コンジェナー）、並びにＣ末端若しくはＮ末端を保護されたアミノ酸誘導体（例、Ｎ末端若しくはＣ末端保護基にて修飾されたもの）も含まれる。例えば、本発明は、カルボキシル基、アミノ基、又は環化のための他の反応性の前駆体官能基を与えながらも、側鎖を長く又は短くしたアミノ酸アナログ、並びに適当な官能基を持つ変種側鎖を有するアミノ酸アナログの使用を意図する。
【０１２３】
用語「アミノ酸側鎖」は、Ｋ．Ｄ．Ｋｏｐｐｌｅによる“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ”、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＡｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９６、第２頁及び３３頁にて定義されたように、−ＣＨ−（ＮＨ２）ＣＯＯＨ部分を除いたアミノ酸の部分である；一般的なアミノ酸のそのような側鎖の例としては、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３（メチオニンの側鎖）、−ＣＨ２（ＣＨ３）−ＣＨ２ＣＨ３（イソロイシンの側鎖）、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（ロイシンの側鎖）又はＨ−（グリシンの側鎖）である。
【０１２４】
本明細書に記載されるアミノ酸残基は、好ましくは「Ｌ」異性体である。しかしながら、抗体（免疫グロブリン）結合の所望の機能特性がポリペプチドによって維持される限り、任意のＬアミノ酸残基を「Ｄ」異性体の残基で置換することができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を意味する。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離のカルボキシル基を意味する。
【０１２５】
「アミノ酸モチーフ」とは、アミノ酸の配列で、特定の機能的活性に関連するアミノ酸配列であり、場合によっては、保存されたアミノ酸の総称的な集合である。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、隣接するアミノ酸残基のアルファアミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに連結された任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを意味するために交換可能に使用される。ポリペプチド、タンパク質及びペプチドは、直鎖ポリマー、分岐鎖ポリマー又は環状形で存在し得る。これらの用語はまた、翻訳後にｉｎ  ｖｉｖｏで修飾される形態又は合成中に化学的に修飾される形態も含む。
【０１２７】
本明細書において、全てのアミノ酸残基配列は、その左右の方向がアミノ末端からカルボキシル末端へという慣習的な方向である式によって表現されていることに留意すべきである。更には、アミノ酸残基配列の始まり又は終わりのダッシュは、１以上のアミノ酸残基の更なる配列へのペプチド結合を示すことを留意すべきである。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」、「組換え遺伝子」及び「遺伝子コンストラクト」は、タンパク質又はその部分をコードするＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子の部分を意味する。ＤＮＡ分子は、（エクソン配列として）タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み得、且つイントロン配列を更に含み得る。本明細書で使用される場合、用語「イントロン」は、タンパク質に翻訳されず且つ全ての場合ではないが場合によってはエクソン間に見られる、所与の遺伝子中に存在するＤＮＡ配列を意味する。望ましくは、遺伝子は、１以上のプロモーター、エンハンサー、リプレッサー及び／又は遺伝子の活性若しくは発現を調節するための当該分野で周知の他の調節配列に対して作動可能に連結され得る（或いは、それらを有し得る）。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、用語「相補的ＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」には、ｍＲＮＡの逆転写によって合成され且つ介在する配列（イントロン）が取り除かれた組換えポリヌクレオチドが含まれる。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、機能的に関係するような又は互いに連結されているような、二つのポリヌクレオチド領域間の関係を示す。例えば、プロモーター（又は他の発現調節配列）は、コード配列の転写を調節している（且つ、それを生じさせ得る）場合、該コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたプロモーターはコード配列の上流に位置し得るが、必ずしもそれに隣接している必要はない。
【０１３１】
「発現調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などの、宿主細胞におけるコード配列の発現を与えるＤＮＡ調節配列である。例示的な発現調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。
【０１３２】
「プロモーター」は、細胞内でのＲＮＡポリメラーゼとの結合及び下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本明細書で使用される場合、プロモーター配列は、その３’末端では転写開始部位が境界となり、且つバックグラウンドよりも高く検出され得るレベルの転写を開始させるのに必要な、最小数の塩基又はエレメントを含むように、上流（５’方向）へ広がる。転写開始部位（簡便には、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングにより定義される）、並びに、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）は、プロモーター配列内に見出されるであろう。真核生物のプロモーターは、常にではないが、しばしば、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含み得る。原核生物のプロモーターは、−１０及び−３５のコンセンサス配列に加えて、シャイン−ダルガノ配列を含む。
【０１３３】
種々の異なる由来からの、構成的、誘導性及び抑制性プロモーターを含む多数のプロモーターが当該技術分野で周知である。代表的な由来としては、例えば、ウイルス、哺乳動物、昆虫、植物、酵母及び細菌細胞の種類）が挙げられ、これらの由来からの好適なプロモーターは容易に入手可能であるか、或いは、オンライン又は例えばＡＴＣＣなどの寄託機関、並びに他の商業的若しくは個人的なソースから一般に入手可能な配列に基づいて合成により作製することができる。プロモーターは、一方向性（即ち、一方向で転写を開始させる）であっても、二方向性（即ち、３’若しくは５’のいずれの方向でも転写を開始させる）であってもよい。プロモーターの非限定的な例としては、例えば、Ｔ７バクテリア発現系、ｐＢＡＤ（ａｒａＡ）バクテリア発現系、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターとしては、Ｔｅｔ系（米国特許５，４６４，７５８号及び５，８１４，６１８号）、エクダイソン誘導系（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６）９３（８）：３３４６−３３５１；Ｔ−ＲＥＸＴＭ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｌａｃ  Ｓｗｉｔｃｈ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））並びにＣｒｅ−ＥＲＴ  タモキシフェン誘導性リコンビナーゼ系（Ｉｎｄｒａら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９９）２７（２２）：４３２４−４３２７；Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（２０００）２８（２３）：ｅ９９；米国特許第７，１１２，７１５号；及びＫｒａｍｅｒ及びＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００５）３０８：１２３−１４４）、或いは所望の細胞での発現に好適な、当該技術分野で公知の任意のプロモーターが挙げられる。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「最小プロモーター」は、転写開始部位を規定するが、それ自体では、たとえ出来たとしても、効率的に転写を開始させることができない、部分的なプロモーター配列を意味する。このような最小プロモーターの活性は、テトラサイクリン調節性トランスアクチベーターなどのアクチベーターの、作動可能に連結された結合部位への結合に依存する。
【０１３５】
用語「ＩＲＥＳ」又は「内部リボソーム侵入部位」は、ポリシストロニックなメッセンジャーＲＮＡでコードされるコード配列の翻訳を増強するように作用する、ポリヌクレオチドのエレメントを意味する。ＩＲＥＳエレメントは、典型的なリボソームスキャニングに関与する７−メチルグアノシンキャップをバイパスして、リボソームをメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に直接集めて結合させることにより、翻訳の開始を仲介する。ＩＲＥＳ配列の存在により、所望のタンパク質のキャップ非依存的な翻訳のレベルが増加され得る。初期の刊行物においては、ＩＲＥＳ配列は、記述として「翻訳エンハンサー」と呼ばれている。例えば、カルジオウイルスＲＮＡの「翻訳エンハンサー」が、Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇらに対する米国特許第４，９３７，１９０号、及びＢｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅに対する米国特許第５，７７０，４２８号に記載されている。
【０１３６】
用語「核局在化シグナル」及び「ＮＬＳ」は、タンパク質又はポリヌクレオチドの核移行、又は細胞の核内でのその保持を仲介することができるドメイン（単数又は複数）を意味する。「強力な核移行シグナル」とは、目的のタンパク質に作動可能に連結された場合に、細胞内局在の９０％より多くを核内に仲介できるドメイン（単数又は複数）を表す。ＮＬＳの代表例としては、以下に限定されないが、単極性（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）核局在化シグナル、二極性（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）核局在化シグナル並びにＮ及びＣ末端モチーフが挙げられる。Ｎ末端の塩基性ドメインは、通常、ＳＶ４０ラージＴ抗原で最初に発見され単極性ＮＬＳを示す、コンセンサス配列Ｋ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒに従う。Ｎ末端の塩基性ドメインＮＬＳの非限定的な１つの例は、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３４０）である。ヌクレオプラスミンのＮＬＳ：ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号３６６）に例示される、約１０アミノ酸のスペーサーで分離された２つの塩基性アミノ酸クラスターを含む、二極性核局在化シグナルもまた知られている。Ｎ及びＣ末端モチーフとしては、例えば、ｈｎＲＮＰ  Ａ１の酸性Ｍ９ドメイン、酵母の転写リプレッサーＭａｔα２における配列ＫＩＰＩＫ（配列番号３８１）及びＵ ｓｎＲＮＰの複合シグナルが挙げられる。これらのＮＬＳの大部分は、インポーチンβファミリーの特異的受容体によって直接認識されるようである。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、用語「エンハンサー」は、例えば、それが作動可能に連結されている遺伝子又はコード配列の転写を増加させるＤＮＡ配列を意味する。エンハンサーは、コード配列から何キロベースも離れて位置していてもよく、調節因子の結合、ＤＮＡメチル化パターン、又はＤＮＡ構造の変化を仲介し得る。種々の異なる由来からの多数のエンハンサーが当該分野において周知であり、クローニングされたポリヌクレオチドとして、又はクローニングされたポリヌクレオチド内で、（例えば、ＡＴＣＣなどの寄託機関並びに他の商業的若しくは個人のソースから）入手可能である。（一般に使用されるＣＭＶプロモーターなどの）プロモーターを含む多数のポリヌクレオチドは、エンハンサー配列も含む。作動可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部、又は下流に位置し得る。用語「Ｉｇエンハンサー」は、Ｉｇ遺伝子座内にマップされたエンハンサー領域に由来するエンハンサーエレメントを意味する（そのようなエンハンサーとしては、例えば、重鎖（ミュー）５’エンハンサー、軽鎖（カッパ）５’エンハンサー、カッパ及びミューのイントロンエンハンサー、並びに３’エンハンサーなどが挙げられる（例えば、Ｐａｕｌ  ＷＥ（編）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）第３５３−３６３頁；米国特許第５，８８５，８２７号を参照）。
【０１３８】
「転写終結配列（ターミネーター配列）」とは、転写の終結をもたらす配列である。転写終結配列は当該分野で公知であり、これに限定されないが、ポリＡ（例、ＢｇｈポリＡ及びＳＶ４０ポリＡ）ターミネーターが挙げられる。転写終結シグナルは、典型的には、３’非翻訳領域（即ち、「３’ｕｔ」）、任意のイントロン（介在配列又は「ＩＶＳ」とも呼ばれる）及び１以上のポリアデニル化シグナル（「ｐ（Ａ）」又は「ｐＡ」の領域を含むであろう。転写終結配列はまた、「ＩＶＳ−ｐＡ」、「ＩＶＳ＋ｐ（Ａ）」、「３’ｕｔ＋ｐ（Ａ）」又は「３’ｕｔ／ｐ（Ａ）」とも呼ばれることがある。ターミネーター領域としては、天然又は合成のターミネーターが使用され得る。
【０１３９】
用語用語「ポリアデニル化」、「ポリアデニル化配列」、「ポリアデニル化シグナル」、「ポリＡ」、「ｐ（Ａ）」又は「ｐＡ」は、ポリアデニル転移酵素の存在下において転写物がポリアデニル化されるのを可能とする、ＲＮＡ転写物中に存在する核酸配列を意味する。多くのポリアデニル化シグナルが当該分野において知られている。非限定的な例としては、ヒトバリアント成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが挙げられる。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、用語「スプライス部位」は、真核生物細胞のスプライス機構によって、切断及び／又は対応するスプライス部位へのライゲーションのために好適であると認識され得るポリヌクレオチドを意味する。スプライス部位は、プレｍＲＮＡ転写物中に存在するイントロンの切断を可能とする。一例では、スプライス部位の５’部分は、スプライスドナーと呼ばれ、対応する３’スプライス部位は、アクセプタースプライス部位と呼ばれる。スプライス部位という用語には、例えば、天然に存在するスプライス部位、遺伝子工学的なスプライス部位、例えば合成のスプライス部位、標準的即ちコンセンサスのスプライス部位、及び／又は、例えば潜在性スプライス部位といった非標準的なスプライス部位が含まれる。
【０１４１】
「シグナル配列」は、コード配列の前に含まれ得る。この配列は、ポリペプチドのＮ末端側のシグナルペプチドをコードし、宿主細胞に対して、該ポリペプチドを細胞表面へ向かわせること、又は該ポリペプチドを培地中へ分泌させることを知らせ、また、このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞を離れる前に、宿主細胞によって切り取られる。シグナル配列は、原核生物及び真核生物に由来する種々のタンパク質と関連して見出すことができる。
【０１４２】
「翻訳語修飾」は、翻訳が完了した後に、及びリボソームから放出された後に、或いは新生ポリペプチドの翻訳と同時にタンパク質が被る、共有結合性の修飾を含むいずれか１つの修飾又はその組み合わせを包含し得る。翻訳後修飾としては、以下に限定されないが、リン酸化、ミリスチル化、ユビキチン化、グリコシル化、コエンザイム付加、メチル化、Ｓ−ニトロシル化及びアセチル化が挙げられる。翻訳語修飾は、タンパク質の活性、細胞内若しくは細胞外の行き先、安定性若しくは半減期、及び／又はリガンド、受容体若しくは他のタンパク質による認識を調節し得るか、或いはそれらに影響し得る。翻訳後修飾は、細胞オルガネラ内、核内又は細胞質内、或いは細胞外で起こり得る。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、用語「プライマー」は、オリゴヌクレオチドであって、精製された制限消化物として天然に存在するものであれ、合成により生成されたものであれ、核酸鎖に相補的なプライマーの伸長生成物の合成が誘導される条件下、即ち、ヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導因子が存在し、且つ適切な温度及びｐＨの条件下に置かれた時に、合成の開始位置として機能し得る、前記オリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいが、誘導因子の存在下で所望の伸長生成物の合成を開始させるのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの由来、及び方法の使用など、多くの要因に依存し得る。例えば、診断用途のためには、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、それより少ないヌクレオチドを含み得るが、約１５から約２５又はそれより多くのヌクレオチドを含み得る。
【０１４４】
本明細書でのプライマーは、特定の標的ポリヌクレオチド配列の異なる鎖に対して、「実質的に」相補的であるように選択される。これは、プライマーが、それぞれの鎖に対してハイブリダイズするために十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映していなくてもよい。例えば、残りのプライマー配列が鎖に相補的であるようにしつつ、非相補的なヌクレオチドフラグメントをプライマーの５’末端に取り付けることができる。或いは、プライマー配列が、鎖の配列とハイブリダイズし、それによって伸長生成物の合成のための鋳型を形成するために十分相補的であれば、非相補的な塩基又はより長い配列をプライマー中に散在させてもよい。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」は、細菌の酵素であって、その各々が、二本鎖ＤＮＡを、特定のヌクレオチド配列において又はその近くで切断するものを意味する。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、用語「多重クローニング部位」は、複数の異なる制限酵素を認識し得る、ベクターポリヌクレオチドのセグメントを意味する。
【０１４７】
「レプリコン」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＮＡ複製の自律的な単位として機能する；即ち、それ自身の制御下で複製が可能であり且つ自律的な複製配列を含む、任意の遺伝エレメント（例、プラスミド、エピソーム、染色体、ＹＡＣ、ウイルス）である。
【０１４８】
「ベクター」又は「クローニングベクター」は、それに対して別のポリヌクレオチドセグメントを導入して、該挿入されたセグメントの複製を惹起することができる、プラスミド、ファージ又はコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、環状、二本鎖ＤＮＡとして存在し得、数キロベース（ｋｂ）から（ｆｏｒｍ）数百ｋｂのサイズに及ぶ。好ましいクローニングベクターは、ポリヌクレオチド配列のクローニング及び組換え操作を容易にするため、天然に存在するプラスミドから改変されたものである。そのような多くのベクターが、当該分野において周知である；例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＭａｎｉａｔｉｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９））、Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｖｏｌ．３、Ｇｅｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ｐｐ．５６３−６０８（１９８０））を参照されたい。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」は、宿主細胞内又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系において、あるポリヌクレオチドを発現するために使用されるベクターを意味する。該用語は、プラスミド、エピソーム、コスミド、レトロウイルス又はファージを含み；発現ベクターは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現させるために使用することができ、１つの態様では、発現調節配列のアセンブリーを含む転写ユニットを含む。プロモーター及び他の調節エレメントの選択は、対象とする宿主細胞又はｉｎ−ｖｉｔｒｏ発現系により異なり得る。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「組換え系」は、目的の遺伝子の組み込みのための、本出願のベクターと染色体との間の組換えを可能とする系を意味する。組換え系は当該分野において公知であり、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系及びＦＬＰ−ＩＮ系が挙げられる。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「ｉｎ−ｖｉｔｒｏ発現系」は、ＤＮＡ鋳型の転写又は共役転写及び翻訳を可能にする無細胞系を意味する。このような系としては、例えば、古典的なウサギ網状赤血球系並びに新規の無細胞合成系（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）１１０（３）：２５７−６３；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．（２００４）１０：１−３０）が挙げられる。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「Ｃｒｅ／Ｌｏｘ」系は、バクテリオファージＰ１の部位特異的な組み換え系についてＡｂｒｅｍｓｋｉら（Ｃｅｌｌ、３２：１３０１-１３１１（１９８３））によって記載されたようなものを意味する。Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系の使用方法は、当該分野において公知である；例えば、参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる米国特許第４，９５９，３１７号を参照されたい。該系は、ｌｏｘＰで示される組換え部位及びＣｒｅで示されるレコンビナーゼからなる。真核生物細胞においてＤＮＡの部位特異的組換えを作り出す方法では、第一及び第二のｌｏｘ部位を有するＤＮＡ配列を真核生物細胞に導入してＣｒｅと接触させることにより、ｌｏｘ部位にて組換えを生成することができる。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「ＦＬＰ−ＩＮ」組換えは、ポリヌクレオチドの活性化／不活性化及び部位特異的組込み系が哺乳動物細胞のために開発されている系を意味する。該系は、サッカロミセス属由来のリコンビナーゼであるＦＬＰによってトランスフェクトされた配列の組換えに基づく。ＦＬＰは、いくつかの細胞株では、特定の標的配列のコピーを迅速且つ正確に組換えることが示されている。ＦＬＰ−ＩＮ系は、例えば、米国特許第５，６５４，１８２号及び同５，６７７，１７７号に記載されている。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクション（形質移入）」、「トランスフォーメーション（形質転換）」又は「トランスダクション（形質導入）」は、１つ又は物理的又は化学的な方法を使用して、宿主細胞に１以上の外来ポリヌクレオチドを導入することを意味する。以下に限定されないが、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．７、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照）；ＤＥＡＥ−デキストラン；エレクトロポレーション；カチオン性リポソーム介在トランスフェクション；タングステン粒子促進性の微粒子照射（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：７７６−７７７（１９９０））；並びにリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿（Ｂｒａｓｈ  Ｄ．Ｅ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ７：２０３１−２０３４（１９８７））を含む多くのトランスフェクション技術が、当業者に周知である。ファージ又はレトロウイルスベクターは、市販のパッケージ細胞内での感染粒子の成長後に、宿主細胞に導入することができる。
【０１５５】
用語「細胞」、「細胞培養物」、「細胞株」、「組換え宿主細胞」、「レシピエント細胞」及び「宿主細胞」は、しばしば交換可能に使用され、それらが使用される文脈から明らかとなるであろう。これらの用語は、初期の対象細胞及びその任意の子孫を含み、移入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）の回数は問わない。全ての子孫が、（意図的若しくは意図的でない変異又は環境の相違に起因して）親細胞と正確に同一であるわけではないが、これらの変化した子孫も、元々の形質転換された細胞の機能と同じ機能を保持している限り、これらの用語に含まれることを理解すべきである。そのような特徴は、例えば、これに限定されないが、特定の組換えタンパク質を産生する能力であるかもしれない。「ミューテーター陽性細胞株」とは、他のベクターエレメントとの組み合わせで超変異を及ぼすために機能するのに十分な細胞因子を含む細胞株である。該細胞株は、当該分野において公知のもの及び本明細書に記載されるもののいずれであってもよい。「クローン」とは、単一の細胞から又は有糸分裂により共通の祖先から得られた細胞集団である。
【０１５６】
「レポーター遺伝子」は、目的の細胞で発現させた場合に、特異的に検出（即ち、検出及び選択）される能力を付与するポリヌクレオチドを意味する。数多くのレポーター遺伝子系が当該分野において知られ、例えば、アルカリホスファターゼ（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ  ６６：１−１０（１９８８）；Ｋａｉｎ，ＳＲ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ６３：４９−６０（１９９７））、ベータ・ガラクトシダーゼ（米国特許第５，０７０，０１２号）、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（Ｇｏｒｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ２：１０４４−５１（１９８２））、ベータ・グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼ、ベータ・ラクタマーゼ（米国特許第５，７４１，６５７号、第５，９５５，６０４号）、触媒抗体、ルシフェラーゼ（米国特許第５，２２１，６２３号；第５，６８３，８８８号；第５，６７４，７１３号；第５，６５０，２８９号；第５，８４３，７４６号）、並びに天然の蛍光タンパク質（Ｔｓｉｅｎ，ＲＹ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６７  ５０９−５４４  （１９９８））が挙げられる。用語「レポーター遺伝子」には、目的のペプチドと相互作用し得る又はそれが所望される（若しくは所望されない）ことにより検出可能なシグナルを作り出す１以上の抗体、エピトープ、結合パートナー、基質、修飾酵素、受容体、又はリガンドの使用に基づいて特異的に検出され得る任意のペプチドも含まれる。レポーター遺伝子には、細胞の表現型を改変し得る遺伝子もまた含まれる。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、用語「選択マーカー遺伝子」は、ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドを保有する細胞が、対応する選択試薬の存在下で、特異的に選択されるように又はされないようにすることを可能にする前記ポリヌクレオチドを意味する。選択マーカーは、陽性、陰性又は二機能性であり得る。陽性の選択マーカーは、該マーカーを保有する細胞の選択を可能とし、陰性の選択マーカーは、該マーカーを保有する細胞が選択的に除かれることを可能とする。選択マーカーのポリヌクレオチドは、発現されるポリヌクレオチドに直接連結されていてもよく、又は、共トランスフェクションにより同一細胞に導入されていてもよい。種々のそのようなマーカーポリヌクレオチドが、二機能性（即ち、陽性／陰性）マーカー（例えば、１９９２年５月２９日公開のＷＯ９２／０８７９６号、及び１９９４年１２月８日公開のＷＯ９４／２８１４３号を参照；これらは、本明細書で参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる）を含めて、記載されてきた。薬剤耐性遺伝子の選択マーカーの具体例としては、以下に限定されないが、アンピシリン、テトラサイクリン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ウアバイン又はカナマイシンが挙げられる。選択マーカーの具体例としては、例えば、メトトレキセートへの耐性を付与するＤＨＦＲタンパク質（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：３５６７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸への耐性を付与するＧＰＦタンパク質（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：２０７２（１９８１））、アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を付与するネオマイシン耐性マーカー（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：１（１９８１））；ハイグロマイシンへの耐性を付与するハイグロマイシンタンパク質（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ、３０：１４７（１９８４））、ウアバインへの耐性を付与するマウスＮａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅアルファサブユニット（Ｋｅｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３７：９０１-９０３（１９８７））；並びにＺｅｏｃｉｎ（商標）耐性マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より商業的に入手可能）など、細胞増殖抑制剤又は細胞破壊剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードするものである。更には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、１１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ及びＳｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、４８：２０２６（１９６２））及びアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ、２２：８１７（１９８０））を、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞において用いることができる。グルタミン合成酵素は、グルタミン（ＧＳ）フリー培地での細胞の増殖を可能とする（例えば、米国特許第５，１２２，４６４号；第５，７７０，３５９号；及び第５，８２７，７��９号を参照）。他の選択マーカーは、例えば、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、又はアデノシンデアミナーゼをコードする。
【０１５８】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間での配列の類似性を意味する。相同性及び同一性は、比較の目的のためにアラインされ得る各配列内の位置を比較することによってそれぞれ決定され得る。比較された配列における対応する位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められている場合、該分子は、その位置において同一である；対応する部位が、同一又は類似のアミノ酸残基（例えば立体的及び／又は電気的な性質が類似する）で占められている場合、該分子は、その位置において相同（類似）であるということができる。相同性／類似性又は同一性のパーセンテージとしての表現は、比較された配列により共有される位置における同一又は類似のアミノ酸の個数の関数を参照する。「関連しない」又は「非相同的な」配列は、本発明の配列と、４０％未満の同一性、３５％未満の同一性、３０％未満の同一性、又は２５％未満の同一性を共有する。二つの配列の比較において、残基（アミノ酸又は核酸）の不在又は余分な残基の存在もまた、同一性及び相同性／類似性を減少させる。
【０１５９】
用語「相同性」は、類似の機能又はモチーフを持つ遺伝子又はタンパク質を同定するために使用される、数学に基づく配列類似性の比較を示す。本発明の核酸及びタンパク質の配列は、例えば、他のファミリーのメンバー、関連する配列又はホモログを同定するために、公共のデータベースに対するサーチを行うための「クエリ配列」として使用され得る。そのようなサーチは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチを、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２でＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて行って、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチを、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３でＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて行って、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的のためのギャップを入れたアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されたようにしてＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各々のプログラム（例、ＸＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用することができる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「同一性」は、配列のマッチングが最大になるように、即ちギャップ及び挿入を考慮に入れて、配列をアライメントしたときの、２つ以上の配列における対応する位置での同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセンテージを意味する。同一性は、以下に限定されないが、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及び、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１；並びに、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）に記載の方法を含む公知の方法により、容易に計算することができる。同一性を決定する方法は、テストされた配列の間で最大のマッチを与えるように設計されている。更には、同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムにおいてコード化されている。２つの配列間での同一性を決定するコンピュータープログラムの方法としては、以下に限定されないが、ＧＣＧプログラム・パッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）、並びにＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２（１９９７））が挙げられる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他のソースから公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０（１９９０））。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性の決定のために使用され得る。
【０１６１】
ＤＮＡ配列の「異種」領域とは、より長いＤＮＡ配列内の特定可能なＤＮＡのセグメントであって、本来は、そのより長いＤＮＡ配列と関連して見出されないものを意味する。従って、異種領域が哺乳動物の遺伝子をコードする場合、該遺伝子は、由来となる生物のゲノムにおいて通常該哺乳動物のゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡによって隣接され得る。異種コード配列の別の例は、該コード配列それ自体が天然には見出されない配列である（例えば、ゲノムコード配列が、未改変の遺伝子と異なるコドン若しくはモチーフを有するイントロン若しくは合成配列を含むｃＤＮＡ）。アレル変異体又は自然に生じる変異事象は、本明細書で定義されるようなＤＮＡの非相同的な領域を生じない。
【０１６２】
用語「活性化誘導シチジンデアミナーゼ」又は（「ＡＩＤ」）は、ＤＮＡ配列内で、シトシンのウラシルへの脱アミノ化を仲介することのできる、ＲＮＡ／ＤＮＡエディテイングシチジンデアミナーゼのＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣファミリーのメンバーを意味する。（例えば、Ｃｏｎｔｉｃｅｌｌｏら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．  ２２  Ｎｏ  ２  ３６７−３７７  （２００５）、“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  （Ｄｅｏｘｙ）ｃｙｔｉｄｉｎｅ  Ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ”及び米国特許第６，８１５，１９４号を参照）。好適なＡＩＤ酵素としては、当該酵素の、例えば霊長類、げっ歯類、鳥類及び硬骨魚類を含む、あらゆる脊椎動物の型のものが挙げられる。ＡＩＤ酵素の代表例としては、以下に限定されないが、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６５７１２）、ラット、ニワトリ、イヌ及びマウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３３７７５）の型が挙げられる。用語「ＡＩＤホモログ」は、Ａｐｏｂｅｃファミリーの酵素を意味し、例えばＡｐｏｂｅｃが挙げられ、詳細には、Ａｐｏｂｅｃ−１、Ａｐｏｂｅｃ３Ｃ又はＡｐｏｂｅｃ３ＧなどのＡｐｏｂｅｃファミリーのメンバーから選択され得る（例えばＪａｒｍｕｚら（２００２）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、７９：２８５−２９６）（２００２）に記載されている）。ＡＩＤ及びＡＩＤホモログとしてはまた、以下に限定されないが、ポリヌクレオチド配列を脱アミノ化する能力を保持した改変型ポリペプチド（例、ミュータント又はムテイン）が更に挙げられる。用語「ＡＩＤ活性」には、ＡＩＤ及びＡＩＤホモログにより仲介される活性が含まれる。
【０１６３】
用語「トランジション変異」は、ＤＮＡ配列における塩基の変化であって、ピリミジン（シチジン（Ｃ）又はチミジン（Ｔ）が別のピリミジンによって置換される、或いはプリン（アデノシン（Ａ）又はグアノシン（Ｇ）が別のプリンに置換されるものを意味する。
【０１６４】
用語「トランスバージョン変異」は、ＤＮＡ配列における塩基の変化であって、ピリミジン（シチジン（Ｃ）又はチミジン（Ｔ）がプリン（アデノシン（Ａ）又はグアノシン（Ｇ）によって置換される、或いはプリンがピリミジンによって置換されるものを意味する。
【０１６５】
用語「塩基除去修復」は、シチジンの脱アミノ化により生じたウリジンヌクレオチドなどの単一の塩基を、ＤＮＡから除去するＤＮＡ修復経路を意味する。修復は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡからウラシルを認識して除去し、脱塩基部位とするウラシルグリコシラーゼによって開始される。
【０１６６】
用語「ミスマッチ修復」は、染色体ＤＮＡの複製のエラーにより生じるものなど、ミスマッチ塩基を認識して訂正する修復経路を意味する。
【０１６７】
用語「ｐｏｌイータ（ｐｏｌη）」（ＰｏｌＨ、ＲＡＤ３０Ａ、ＸＰＶ、ＸＰ−Ｖとも呼ばれる）は、忠実性の低いＤＮＡポリメラーゼであって、例えばＵＶ誘発性チミジンダイマーを通過する複製といった、損傷を通過する複製において役割を果たすものを意味する。色素性乾皮症のバリアント型タンパク質ＸＰＶでは、ｐｏｌイータの遺伝子が欠損している。損傷していないＤＮＡでは、ｐｏｌイータは、１００ｂｐあたり約３つの割合で正しくないヌクレオチドを組み込み、そして、ＷＡジヌクレオチド（Ｗ＝Ａ又はＴ）を含む鋳型を通過して複製するときに特にエラーを起こしやすい（Ｇｅａｒｈａｒｔ及びＷｏｏｄ、２００１）。ｐｏｌイータは、免疫グロブリンの可変遺伝子におけるＳＨＭの間のＡ／Ｔミューテーターとして重要な役割を果たすことが示されてきた（Ｚｅｎｇら、２００１）。ｐｏｌイータの代表例としては、以下に限定されないが、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ８１６６６）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００１０６６７４３）、ニワトリ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１００１３０４）、イヌ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿５３２１５０）及びマウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿１０９６４０）の型が挙げられる。
【０１６８】
用語「ｐｏｌシータ（ｐｏｌθ）」（ＰｏｌＱとも呼ばれる）は、忠実性の低いＤＮＡポリメラーゼであって、架橋修復（クロスリンク修復）における役割を果たし得（Ｇｅａｒｈａｒｔ及びＷｏｏｄ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １：１８７-１９２（２００１））、且つ内因性のＡＴＰａｓｅ−ヘリカーゼドメインを含む（Ｋａｗａｍｕｒａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０９（１）：９−１６（２００４））ものを意味する。該ポリメラーゼは、誤対合挿入因子及び誤対合伸長因子の両方として機能することにより、脱塩基部位を通過する複製を効率的に行うことができる（Ｚａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２４、３７５７-３７６９（２００５））。ｐｏｌシータの代表例としては、以下に限定されないが、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９５５４５２）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿２２１４２３）、ニワトリ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿４１６５４９）、イヌ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿５４５１２５）及びマウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０８４２５３）の型が挙げられる。ｐｏｌイータ（Ｐｏｌ  ｅｔｅ）及びＰｏｌシータは、総称して「エラープローンポリメラーゼ」と呼ばれることもある。
【０１６９】
本明細書で使用される場合、用語「ＳＨＭホットスポット」又は「ホットスポット」又は「ホットスポットモチーフ」は、３〜６ヌクレオチド（即ち、１〜２コドン）のポリヌクレオチド配列又はモチーフであって、抗体遺伝子におけるＳＨＭ変異の統計解析による決定で、ＳＨＭを起こす傾向の増加を示すものを意味する（ＳＨＭについて種々のモチーフの相対的な順位を与える表２及び３、並びに標準的なホットスポット及びコールドスポットを挙げている表７を参照）。該統計解析は、本明細書の他の箇所に記載されるように、非抗体遺伝子におけるＳＨＭ変異の解析にも当てはめられ得る。ホットスポットを図中にグラフィカルに表示する目的のために、標準的ホットスポットの最初のヌクレオチドを、文字「Ｈ」で表す。
【０１７０】
同様に、本明細書で使用される場合、「ＳＨＭコールドスポット」又は「コールドスポット」又は「コールドスポットモチーフ」は、３〜６ヌクレオチド（即ち、１〜２コドン）のポリヌクレオチド又はモチーフであって、抗体遺伝子におけるＳＨＭ変異の統計解析による決定で、ＳＨＭを起こす傾向の減小を示すものを意味する（ＳＨＭについて種々のモチーフの相対的な順位を与える表２及び３、並びに標準的なホットスポット及びコールドスポットを挙げている表７を参照）。該統計解析は、本明細書の他の箇所に記載されるように、非抗体遺伝子におけるＳＨＭ変異の解析にも当てはめられ得る。コールドスポットを図中にグラフィカルに表示する目的のために、標準的コールドスポットの最初のヌクレオチドを、文字「Ｃ」で表す。
【０１７１】
用語「体細胞超変異モチーフ」又は「ＳＨＭモチーフ」は、１以上のホットスポット及び／又はコールドスポットを含むか、又は含むように改変され得、且つ規定されたアミノ酸の集合をコードする、ポリヌクレオチド配列を意味する。ＳＨＭモチーフは任意のサイズであり得るが、サイズとして約２から約２０ヌクレオチドのポリヌクレオチドに基づくことが好都合であり、好ましいＳＨＭモチーフは、サイズとして約３から約９ヌクレオチドの範囲である。ＳＨＭモチーフは、標準的ホットスポット及び／又はコールドスポットの任意の組み合わせを含むことができ、或いは標準的ホットスポット及び／又はコールドスポットの両方を欠いてもよい。
【０１７２】
用語「好ましいＳＨＭモチーフ」は、１以上の好ましいＳＨＭコドンを意味する（下記の表７を参照）。
【０１７３】
用語「好ましいホットスポットＳＨＭコドン」、「好ましいホットスポットＳＨＭモチーフ」、「好ましいＳＨＭホットスポットコドン」及び「好ましいＳＨＭホットスポットモチーフ」は全て、以下に限定されないが、コドンＡＡＣ、ＴＡＣ、ＴＡＴ、ＡＧＴ及びＡＧＣを含むコドンを意味する。そのような配列は、より大きなＳＨＭモチーフの構成内に埋め込まれている可能性もあり得、ＳＨＭ介在性の変異誘発をリクルートし得、且つ該コドンにおける標的化されたアミノ酸多様性を生成し得る。
【０１７４】
ポリヌクレオチド配列は、該ポリヌクレオチド又はその部分が、該ポリヌクレオチド内でのホットスポット及び／又はコールドスポットの頻度及び／又は位置を増加又は減少させるように改変されている場合、「ＳＨＭのために最適化され」ている。ポリヌクレオチド又はその部分が、該ポリヌクレオチド内でのホットスポットの頻度（密度）及び／又は位置を増加させるように、或いは該ポリヌクレオチド内でのコールドスポットの頻度及び／又は位置を減小させるように改変されている場合、「ＳＨＭ感受性」にされているポリヌクレオチドである。反対に、ポリヌクレオチド又はその部分が、該ポリヌクレオチド内で、ホットスポットの頻度及び／又は位置を減小させるように、並びに／或いはコールドスポットの頻度（密度）及び／又は位置を増加させるように改変されている場合、「ＳＨＭ耐性」にされているポリヌクレオチドである。１つの実施形態では、コドン使用、及び／又はポリヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸を改変することにより、ＳＨＭ介在性の変異誘発を起こす感受性（又は率）が、未改変のポリヌクレオチドよりも高い又は低い配列を作製することができる。
【０１７５】
ポリヌクレオチド配列の最適化は、ポリヌクレオチド配列における、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約５０％、約７５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、１００％、又はそれらの中の任意の範囲のヌクレオチドを改変することを意味する。ポリヌクレオチド配列の最適化はまた、ポリヌクレオチド配列における、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約１０個、約２０個、約２５個、約５０個、約７５個、約９０個、約９５個、約９６個、約９７個、約９８個、約９９個、約１００個、約２００個、約３００個、約４００個、約５００個、約７５０個、約１０００個、約１５００個、約２０００個、約２５００個、約３０００個、又はそれより多い、或いはそれらの中の任意の範囲のヌクレオチドを、ヌクレオチドの一部又は全てがＳＨＭ介在性の変異誘発のために最適化されるように改変することを意味する。ホットスポット及び／又はコールドスポットの頻度（密度）の減小は、ポリヌクレオチド配列における、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約５０％、約７５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、１００％、又はそれらの中の任意の範囲のホットスポット又はコールドスポットの減小を意味する。ホットスポット及び／又はコールドスポットの頻度（密度）の増加は、ポリヌクレオチド配列における、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約５０％、約７５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、１００％、又はそれらの中の任意の範囲のホットスポット又はコールドスポットの増加を意味する。
【０１７６】
ホットスポット又はコールドスポットの位置又はリーディングフレームは、ＳＨＭ介在性の変異誘発が、生成するアミノ酸配列に関して、サイレントな変異をもたらし得るものであるのかどうか、或いは、アミノ酸レベルでは、保存的、半保存的又は非保存的な変化を引き起こすものであるのかどうかを支配する要因でもある。以下で論じるように、これらの設計パラメーターは、核酸配列のＳＨＭに対する相対的な感受性又は耐性を更に高めるように操作され得る。従って、ＳＨＭのリクルートの程度及びモチーフのリーディングフレームの両方が、ＳＨＭ感受性及びＳＨＭ耐性のポリヌクレオチド配列の設計において考慮される。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、「体細胞超変異」又は「ＳＨＭ」は、ポリヌクレオチドの変異であって、該ポリヌクレオチド配列に対する活性化誘導シチジンデアミナーゼ、ウラシルグリコシラーゼ及び／又はエラープローンポリメラーゼの作用によって開始される或いはそれと関連するものを意味する。該用語は、ミスマッチ修復機構及び関連する酵素が介在する変異誘発を含む、初期損傷のエラープローン修復の結果として生じる変異誘発を含むことが意図される。
【０１７８】
本明細書で使用される場合、用語「ＵＤＧ」は、種々の損傷したＤＮＡ塩基を認識し、ゲノムの複製前にそれらを除去するいくつかのＤＮＡグリコシラーゼのうちの１つである、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを意味する。ＤＮＡグリコシラーゼは、細胞毒性である又はＤＮＡポリメラーゼにエラーを引き起こさせるＤＮＡ塩基を除去することができ、また、ＤＮＡの塩基除去修復経路の一部である。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼは、シチジンの脱アミノ化生成物であるＤＮＡ中のウラシルを認識し、その除去を引き起こし、且つ新たな塩基での置換を引き起こし得る。
【０１７９】
用語「単離された」は、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドが本発明に従っている状態を意味する。ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、それらの本来の環境において、或いは調製がｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施される組換えＤＮＡ技術によるものであるときにはそれらが調製された環境（例、細胞培養物）において、それらと共に見出される他のポリペプチド又はポリヌクレオチドなど、本来関連がある物質を含まない又は実質的に含まないであろう。ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、希釈剤又はアジュバントと共に処方されてもよく、且つ実際的な目的のために単離されてもよい  −  例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、免疫アッセイでの使用のためのマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される場合、ゼラチン又は他の担体と混合されてもよく、或いは、診断又は治療において使用される場合、医薬上許容される担体又は希釈剤と混合されてもよい。ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、自然に又は異種真核細胞系によってのいずれかによりグリコシル化されていてもよく、或いは（例えば、原核細胞での発現により生成される場合、）グリコシル化されていなくてもよい。
【０１８０】
用語「選択」は、ポリヌクレオチド、タンパク質又は細胞などの１以上のメンバーを、そのようなメンバーのライブラリーから分離することを意味する。選択は、検出及び選択の両方を伴ってよく、例えば、レポーター遺伝子を検出し、次いでそれに従って細胞をソーティングする蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を使用することにより、細胞は選択される。
【０１８１】
本明細書で使用される場合、「ｐｇ」はピコグラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｕｇ」又は「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｕｌ」又は「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｌ」はリットルを意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｎＭ」はナノモーラーを意味し、「ｐＭ」はピコモーラーを意味し、「ｆＭ」はフェムトモーラーを意味し、「Ｍ」はモーラーを意味する。
【０１８２】
語句「医薬上許容される」は、生理的に耐容され得、且つ安全でない反応を引き起こさない分子的実体及び組成物を意味する。
【０１８３】
ＩＩ．体細胞超変異
抗体が生成される際、抗原受容体の可変領域（Ｖ領域）コード配列内でｉｎ  ｖｉｖｏ点変異が生じ、ＳＨＭと呼ばれる観察される変異の率は、他の遺伝子における自然発生的な変異の率よりもおおよそ１００万倍大きい。Ｂａｃｈｌら、Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｈｉｇｈｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ  ｉｎ  ａ  ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００１  Ａｐｒ  １５；１６６（８）：５０５１−７；Ｍａｒｔｉｎ及びＳｃｈａｒｆｆ、ＡＩＤ  ａｎｄ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００２；２（８）：６０５−１４。
【０１８４】
ヒト及びマウスでは、Ｖ−Ｄ−Ｊ再構成によって抗体特異性の一次レパートリーが作り出された後、抗原遭遇後に該抗原によって誘発されたＢ細胞内の再構成されたＶ遺伝子は、更に２つのタイプの遺伝子改変に供される：免疫グロブリン遺伝子の可変領域の多様化を誘発して、二次レパートリーを生成し、それにより液性応答の親和性成熟を可能にするＳＨＭ、及び、発現された抗体の定常領域におけるアイソタイプの変化をもたらす特異的な非相同組換えプロセスを伴うクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）。ニワトリ及びウサギでは（ヒト又はマウスではそうではないが）、更なる機構として、遺伝子変換が、Ｖ遺伝子の多様性に寄与する主要なものである。
【０１８５】
ＡＩＤは、活性化Ｂ細胞内で発現され、ＳＨＭ、ＣＳＲ及び遺伝子変換のための必須のタンパク質因子である（Ｍｕｒａｍａｔｓｕら、２０００；Ｒｅｖｙら、２０００）。ＡＩＤは酵素のファミリーであるＡＰＯＢＥＣファミリーに属し、このＡＰＯＢＥＣファミリーは、代謝性のシチジンデアミナーゼと一部の特徴を共有するが、ＡＩＤは１本鎖ポリヌクレオチド内のヌクレオチドを脱アミノ化し、遊離のヌクレオチドを基質として利用できないという点においてそれらとは異なる。ＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣファミリーの他の酵素もまた、１本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ上のシチジンを脱アミノ化するために作用し得る（Ｃｏｎｔｉｃｅｌｌｏら（２００５））。
【０１８６】
ヒトＡＩＤタンパク質は、１９８アミノ酸からなり、予想分子量２４ｋＤａを有する。ヒトＡＩＤ遺伝子は、ＡＰＯＢＥＣ−１に近い、遺伝子座１２ｐ１３に位置する。ＡＩＤタンパク質は、シチジン／デオキシシチジンデアミナーゼモチーフを有し、亜鉛に依存し、また、シチジンデアミナーゼの特異的阻害剤である、テトラヒドロウリジン（ＴＨＵ）によって阻害され得る。
【０１８７】
未改変ＡＩＤの発見前にも、ＷＲＣＹ（ＡＴ／ＧＡ／Ｃ／ＡＴ）モチーフの構成内にあるシチジンにおいて、より頻繁にＳＨＭが生じることが指摘されていた。ＳＨＭのためのこのモチーフは、ＡＩＤ脱アミノ化のため、並びにＤＮＡポリメラーゼｐｏｌイータ及びｐｏｌシータによるエラープローン修復の開始のためのホットスポットモチーフの複合体を表すらしいとする証拠が現在集積されている（Ｒｏｇｏｚｉｎら（２００４）；Ｚａｎら（２００５））。
【０１８８】
ＡＩＤ介在性の変異誘発のためには、高レベルのＤＮＡ転写が必要であるが、それだけでは十分ではないことが示されてきた。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＳＨＭは、転写開始部位から約８０から約１００ヌクレオチドで始まるが、その頻度は、プロモーターからの距離の関数として減少する。ネイティブのＡＩＤは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、転写伸長複合体と直接相互作用するが、転写開始複合体とは直接相互作用しないことが示されており、この相互作用は、転写開始複合体が、完全に進行性で伸長能力のある転写伸長複合体に変わるときに生じる、開始因子の解離に依存する可能性がある（Ｂｅｓｍｅｒら、２００６）。
【０１８９】
ＡＩＤは、１本鎖ＤＮＡ上のシチジンのみ脱アミノ化できるため、転写のための必要条件は、転写バブルによる１本鎖領域の生成を反映するようである。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの精製された未改変ＡＩＤの研究は、ＡＩＤの結合は、配列に依存せず、遺伝子のアクティブな転写により引き起こされるホットスポットの捕捉のためのスキャンする様式を可能とし得ることを示唆している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究は、未改変ＡＩＤが１本鎖ＤＮＡに対して０．３から２ｎＭの範囲の見かけのＫｄを有すること、及び該複合体が４〜８分の半減期を有することを示唆している。精製された未改変ＡＩＤの１本鎖ＤＮＡに対する代謝回転数は、おおよそ、４分毎に１つの脱アミノ化である（Ｌａｒｉｊａｎｉら（２００６））。
【０１９０】
ＡＩＤは、転写されているＤＮＡ分子のいずれの鎖上でもシチジン残基をウラシル残基へ脱アミノ化するように、ＤＮＡに対して作用する。初期（Ｃ→Ｕ）の損傷が、ＤＮＡ複製の前又は間に更に修正されない場合、アデノシン（Ａ）が、このＵヌクレオチドの反対側に挿入され得、最終的には、Ｃ→Ｔ又はＧ→Ａのトランジション変異をもたらす。この変化のアミノ酸レベルでの意義は、リーディングフレーム内のコドンの中での該ヌクレオチドの位置に依存する。この変異がコドンの１番目又は２番目の位置にて生じた場合、結果としては恐らく、非保存的なアミノ酸置換である。それに対し、この変化が、コドンリーディングフレームの３番目の位置、揺らぎ位置内で生じた場合、ヌクレオチドの変化の効果はサイレント、即ち保存的なアミノ酸置換となるであろうため、該変異のアミノ酸レベルでの実際の効果はわずかであろう。
【０１９１】
或いは、Ｃ→Ｕの損傷、及び潜在的には隣接する塩基は、ＳＨＭにおいてエラープローンの様式での修復に繋がるＤＮＡ修復機構によって作用され得る。ノックアウトマウスでの研究によって、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を介した塩基除去修復が、ホットスポットモチーフ近くのＡ及びＴ残基の変異を仲介する役割を果たすことが確立された；（Ｓｈｅｎら、（２００６））。加えて、ＵＤＧによる脱塩基部位の創出により、ｐｏｌイータ及びｐｏｌシータなどのエラープローンポリメラーゼが集められるという証拠、並びに、これらのポリメラーゼが、周囲の配列の全ての塩基位置において、更なる変異を導入するという証拠が増加している（Ｗａｔａｎａｂｅら（２００４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（２００５）)。ｐｏｌイータが、ＳＨＭの際のＡ変異の創出の中心であり、また、優先的にＧへと変異される、コード鎖のＡ又はＴの後のアデノシン（Ｗ／Ａ）に対して特にエラーを起こしやすいと考えられている。
【０１９２】
抗体遺伝子において、コドン用法、並びにそれぞれＣＤＲ及びＦＲにおけるＡＩＤ活性及びｐｏｌイータのエラーに付随する正確なホットスポット／コールドスポットの標的化は、可変領域における変異を最大化し且つフレームワーク領域における変異を最小化する選択圧の下で進化してきたことが観察されている（Ｚｈｅｎｇら、ＪＥＭ  ２０１（９）：１４６７−１４７８（２００５））。例えば、Ｚｈｅｎｇらは、抗体遺伝子内で優先的に使用されるコドン内のＣ及びＧヌクレオチドの正確なアライメントは、殆どのＣからＴ及びＧからＡへの変異を、サイレント又は保存的なものにしていることを観察している。Ｃ及びＧの正確な配置と並べて、Ｚｈｅｎｇらはまた、Ａ及びＴは可変領域内のｐｏｌイータのホットスポットに優先的に配置され、フレームワーク領域内のそれらの部位からは除外されていることも観察した。
【０１９３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＨＭの調節、及び、ＳＨＭをＩｇ遺伝子座に指示し且つＩｇ遺伝子座に限定する決定因子については、激しい議論及び実験研究の対象であった。ｉｎ  ｖｉｖｏで観察されるＳＨＭの率は、少なくとも部分的には、例えば以下の要因に依存することが示されている：１）特定の細胞タイプ内でのＡＩＤの発現レベル及びＡＩＤの活性レベル；（Ｍａｒｔｉｎら（２００２）、Ｒｕｃｃｉら（２００６））、２）ＡＩＤの翻訳後修飾の度合い及び核内局在の度合い；（ＭｃＢｒｉｄｅら（２００６）、Ｐａｓｑｕａｌｕｃｃｉら（２００６）、Ｍｕｔｏら（２００６））、３）免疫遺伝子座に特異的なエンハンサー領域、Ｅ−ｂｏｘモチーフ、又は関連するシスに作用する結合因子の存在；（Ｋｏｍｏｒｉら（２００６），Ｓｃｈｏｅｔｚら（２００６））、４）標的配列の、翻訳開始部位／プロモーター領域への近さ；（Ｒａｄａら（２００１））、５）標的配列の転写率；（Ｓｔｏｒｂら（２００１））、６）標的遺伝子のメチル化の度合い；（Ｌａｒｉｊａｎｉら（２００５））、７）細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている場合は、標的遺伝子の遺伝的背景；８）ｐｏｌイータ、ＭＳＨ２などの補助因子の存在又は不在；（Ｓｈｅｎら（２００６））、９）標的配列内のホットスポット配列又はコールドスポット配列の存在；（Ｚｈｅｎｇら（２００５））、１０）阻害因子の存在；（Ｓａｎｔａ−Ｍａｒｔａら（２００６））、１１）対象とする細胞タイプ内でのＤＮＡ修復速度（Ｐｏｌｔｏｒａｔｓｋｙ（２００６））、１２）局所的なＤＮＡ又はＲＮＡヘアピン構造の形成；（Ｓｔｅｅｌｅら（２００６））、並びに１３）ヒストンＨ２Ｂのリン酸化の状態（Ｏｄｅｇａｒｄら（２００５））。
【０１９４】
本発明は、部分的には、時間的及び空間的の両方について制御された超変異のための系を作り出すために、上記因子の一部を最適化することに基づく。
【０１９５】
ＩＩＩ．体細胞超変異のためのポリヌクレオチドの同定及び解析
抗体配列に関する過去の解析（例えば、Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２００５）；２０１（９）：１４６７−１４７８；並びにＷａｎｇ及びＷａｂｌ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；１７４（９）：５６５０−４を参照）は、ポリヌクレオチド配列内でのタンパク質の進化の間の、複数回のＳＨＭを関連付ける、基礎となるロジカルな工程を精密化することよりむしろ、ＳＨＭに関与するポリヌクレオチド配列のモチーフを同定することに主として基づいていた。
【０１９６】
ポリヌクレオチド配列のリーディングフレーム内における１ラウンド以上のＳＨＭという状況、及びコドン用法パターンにおける基礎となる関係性のロジックについてのそのような理解の向上を発達させるための最初のステップとして、本出願は、コンセンサスのホットスポット及びコールドスポットを同定するための統計的なアプローチを使用した。このような統計的なアプローチはまた、ＡＩＤによるＳＨＭ後の、ヌクレオチドレベルにおける変異の結果及びアミノ酸レベルにおける構造的な結果を、機能的に追跡するためにも使用され得る。
【０１９７】
任意の所与のポリヌクレオチド配列から開始し、アミノ酸レベルでの構造的結果として、本明細書中に記載する特性について最適化された少数の可能な配列に迅速に収束するポリヌクレオチド配列を生成するためにこのアプローチを使用することが可能である。
【０１９８】
本出願のポリヌクレオチド配列は、完全合成ポリヌクレオチド、完全合成遺伝子、半合成ポリヌクレオチド及び半合成遺伝子を含む。本明細書で使用される場合、用語「半合成ポリヌクレオチド」及び「半合成遺伝子」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又は増幅反応のための出発物質として天然のドナー（即ち、末梢血単球）を利用する他の同様の酵素的な増幅系によって得られた核酸配列から部分的になる、ポリヌクレオチド配列を意味する。残りの「合成」ポリヌクレオチド、即ち、ＰＣＲ又は他の同様の酵素的な増幅系によって得られたものではない半合成（ｓｅｍｉ−ｓｙｔｈｅｔｉｃ）ポリヌクレオチドの部分は、これに限定されないが核酸配列の化学合成を含む、当該技術において公知の方法を使用してｄｅ  ｎｏｖｏで合成され得る。
【０１９９】
本出願では、ポリヌクレオチドモチーフにおいて観察されるＳＨＭ変異の数は、そのモチーフを観察する元々の頻度で条件付けられ、ポリヌクレオチド配列又はモチーフがＳＨＭの「ホットスポット」又は「コールドスポット」である度合いは、およそ５０，０００の抗体配列において同定されたＳＨＭ変異の解析から導出された。ＳＨＭ「ホット」又は「コールド」モチーフの統計的有意性の一つの指標としては、ＳＨＭ変異事象の部位においてモチーフが観察された回数（Ｎｓ）を、無作為な場合に予期される頻度（Ｎｐｓ）（Ｎは、データセット中で観察された変異の総数と等しく、ｐｓはモチーフを観察する背景確率である）と比較することである。変異の部位で任意のモチーフを観察する背景頻度を計算するために、下記に示す、ヒト生殖系列ＩＧＨＶ配列から直接に得られたジヌクレオチドの遷移確率を使用して、以前に記載されたようにしてマルコフ連鎖を用いた（Ｔｏｍｐａ、１９９９）。
【０２００】
【数１】
2010520748.tif 000004
【０２０１】
変異の部位における、観察されたモチーフ発生数：期待されるモチーフ発生数の差は、Ｎｓ−Ｎｐｓで与えられ、ここで、
【０２０２】
【数２】
2010520748.tif 000005
【０２０３】
は、Ｎｐｓの標準偏差を表し、各モチーフについてのｚスコアは、
【０２０４】
【数３】
2010520748.tif 000006
【０２０５】
で与えられる。
【０２０６】
式中、Ｍｓは、（変異の部位における）観察されたモチーフ発生数が期待値を超える、標準偏差の数である。この測定規準は、全ての可能なＳＨＭ「ホットスポット」及び「コールドスポット」モチーフをランク付けするため、及び、任意のモチーフが、ＳＨＭ介在性の変異誘発に対して「ホット」又は「コールド」である度合いを特徴付けるために使用され得る。例えば、全ての同等の長さのポリヌクレオチドモチーフのうちで、上位５％又は１０％にランク付けされたｚスコアを有する３マー、４マー、５マー又は６マーのポリヌクレオチドモチーフを、ＳＨＭ「ホットスポット」と考えることができる。同様に、全ての同等の長さのポリヌクレオチドモチーフのうちで、下位５％又は１０％にランク付けされたｚスコアを有する３マー、４マー、５マー又は６マーのポリヌクレオチドモチーフを、ＳＨＭ「コールドスポット」と考えることができる。１つの側面において、ホットスポットは、例えば、好ましいホットスポットＳＨＭコドン若しくはモチーフ、又はより好ましいホットスポットＳＨＭコドン若しくはモチーフであり得る。以下の表２及び３には、上位の３マー、４マー及び６マーのヌクレオチド配列のランク付けの表を、ＳＨＭ介在性の変異誘発を引き付ける（即ち、ＳＨＭに対してより感受性である）傾向を示す、対応するＳＨＭ変異のｚスコアと共に、与えている。
【０２０７】
【表２−１】
2010520748.tif 000007
【０２０８】
【表２−２】
2010520748.tif 000008
【０２０９】
【表３−１】
2010520748.tif 000009
【０２１０】
【表３−２】
2010520748.tif 000010
【０２１１】
【表３−３】
2010520748.tif 000011
【０２１２】
【表３−４】
2010520748.tif 000012
【０２１３】
【表３−５】
2010520748.tif 000013
【０２１４】
【表３−６】
2010520748.tif 000014
【０２１５】
【表３−７】
2010520748.tif 000015
【０２１６】
【表３−８】
2010520748.tif 000016
【０２１７】
【表３−９】
2010520748.tif 000017
【０２１８】
【表３−１０】
2010520748.tif 000018
【０２１９】
【表３−１１】
2010520748.tif 000019
【０２２０】
【表３−１２】
2010520748.tif 000020
【０２２１】
【表３−１３】
2010520748.tif 000021
【０２２２】
【表３−１４】
2010520748.tif 000022
【０２２３】
【表３−１５】
2010520748.tif 000023
【０２２４】
【表３−１６】
2010520748.tif 000024
【０２２５】
【表３−１７】
2010520748.tif 000025
【０２２６】
【表３−１８】
2010520748.tif 000026
【０２２７】
【表３−１９】
2010520748.tif 000027
【０２２８】
【表３−２０】
2010520748.tif 000028
【０２２９】
【表３−２１】
2010520748.tif 000029
【０２３０】
【表３−２２】
2010520748.tif 000030
【０２３１】
【表３−２３】
2010520748.tif 000031
【０２３２】
【表３−２４】
2010520748.tif 000032
【０２３３】
【表３−２５】
2010520748.tif 000033
【０２３４】
【表３−２６】
2010520748.tif 000034
【０２３５】
【表３−２７】
2010520748.tif 000035
【０２３６】
ＳＨＭ介在性の変異誘発を増加又は減少させる能力についての全モチーフのランク付けの他の適用は、野生型配列と比較して、よりコールド又はよりホットな遺伝子コンストラクトを創出することである。遺伝子中の任意の配列位置を、表２及び表３に示されたｚスコアに従って、当該アミノ酸と一致する、（出発配列又は未改変配列と比較して）よりホット又はよりコールドなモチーフを有する同等の配列について評価する（ｅｖｕｌａｔｅｄ）ことができる。そのため、表７からの最も好ましいホットスポット又はコールドスポットが、特定の配列位置を置換するために見出されなかったとしても、コドン配列における縮退が内在的に存在していれば、交換モチーフのＳＨＭ特性における相対的な改善が、ほぼ常に為され得る。各モチーフにおける、期待される変異頻度に対する観察された変異頻度の対数オッズベースのスコアは、ＳＨＭに対するポリヌクレオチドの累積的なホットさ又はコールドさに関するタイルライブラリーをスコア付けするためにも用いられるかもしれない。
【０２３７】
即ち、任意のＳＨＭモチーフを、ＳＨＭ介在性の変異誘発の確率がより高いモチーフで置換することにより、体細胞超変異に対してより感受性の配列を生成できること、及び、任意のＳＨＭモチーフを、ＳＨＭ介在性の変異誘発の確率がより低いモチーフで置換することにより、体細胞超変異に対してより耐性の配列を生成できることが理解され得る。
【０２３８】
表２及び表３は、ＳＨＭ介在性の変異誘発を引き付ける能力について、ｚスコアによりランク付けられた、３マー、４マー及び６マーモチーフを示している。ホット及びコールドホットスポットモチーフの別の可能な表現は、最高のｚスコア及び最低のｚスコアの間で表されるモチーフのアセンブリーから、位置特異的なマトリクスを構築することによって為され得る。以下に、上位スコアのモチーフである「ホットスポット」の中で過剰に出現した６マーモチーフの１つの例を、位置特異的なマトリクスとして表４に与えた。
【０２３９】
【表４】
2010520748.tif 000036
【０２４０】
１つの非限定的な例において、用語「好ましいホットスポットＳＨＭコドン」又は「好ましいホットスポットＳＨＭモチーフ」は、ＡＩＤ介在性の変異誘発をリクルートし、その位置での標的化されたアミノ酸多様性を生成する、より大きなホットスポットモチーフの構成内に潜在的に埋め込まれているコドン又はモチーフ（以下に限定されないが、コドンＴＡＣ、ＴＡＴ又はＡＧＴ、ＡＧＣを含む）を意味する。ＳＨＭは、定量可能な頻度で「ホットスポット」モチーフの各位置において特異的なヌクレオチド遷移を導入する。ヌクレオチド遷移のこのスペクトルは、３つの可能なリーディングフレームのどれが使用されるかに依存して、種々の可能なサイレント又は非サイレントのアミノ酸遷移を生じる。ＳＨＭにより介在される最も可能性の高いコドン遷移と、変異事象の連続的な流れとを規定することによって、セクションＶに記載されるように、「好ましいホットスポットＳＨＭコドン」又は「好ましいホットスポットＳＨＭモチーフ」を、各アミノ酸位置でライブラリーの機能性を満足させる特定のアミノ酸遷移群を生成するように、選択できる。
【０２４１】
ＩＶ．ＳＨＭのためのポリヌクレオチド設計ストラテジー
ポリヌクレオチドがＳＨＭを起こす傾向を最大化又は最少化すると同時に、タンパク質の発現、ＲＮＡの安定性、及び好都合に位置する制限酵素部位の存在を最大化するヌクレオチドテンプレートを設計する方法が本明細書では提供される。
【０２４２】
あるポリヌクレオチドの合成バージョンであって、該ポリヌクレオチドの変異生成率に対するＳＨＭの影響を、野生型がＳＨＭを起こす感受性と比較して、増強又は低減するように改変された（即ち、ＳＨＭ感受性又はＳＨＭ耐性）ものもまた、本明細書では提供される。
【０２４３】
ＳＨＭ感受性配列は、タンパク質の迅速な進化及び改善された変異体の選択を促進し、当該系は、合理的な設計の力を、加速されたランダム変異誘発及び指向された進化と結合させる。
【０２４４】
反対に、ＳＨＭ耐性配列は、タンパク質の迅速な進化及び改善された変異体の選択を促進し、当該系は、合理的な設計の力を、低減されたランダム変異誘発及び指向された進化と結合させる。
【０２４５】
本発明にはまた、保存されたドメインがＳＨＭ介在性の変異誘発に耐性であるのを可能とすると同時に、所望の配列をＳＨＭ介在性の変異誘発への感受性が増加するように標的化し得るものである、ＳＨＭ耐性ポリヌクレオチド配列も含まれる。
【０２４６】
これらの方法を適用可能なポリヌクレオチドとしては、転写され得、且つスクリーニングのための機能的アッセイを備え得る、任意のポリヌクレオチド配列が挙げられる。好ましいポリヌクレオチド配列としては、例えば、特異的結合メンバー、抗体又はそのフラグメント、抗体重鎖又はその部分、抗体軽鎖又はその部分、細胞内抗体、選択マーカー遺伝子、酵素、受容体、ペプチド成長因子及びホルモン、補因子及び毒素などの、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドをコードするものが挙げられる。
【０２４７】
本明細書において使用するための分子の他の非限定的な例としては、タンパク質又はペプチド配列への翻訳を必要とせずに酵素活性又は結合活性を有するポリヌクレオチドが挙げられ、そのようなポリヌクレオチドとしては、例えば、酵素核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、ＲｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、ａｂｄアプタマーが挙げられる。
【０２４８】
本発明の生物学的に活性な分子には、他の生物学的に活性なタンパク質分子の薬物動態及び／又は薬力学を調節可能な分子も含まれ、例えば、脂質及びポリマー（例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール及び他のポリエーテル）が含まれる。例えば、ポリペプチドは、例えば以下のようなポリペプチドである：ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ毒素サブユニットＡ、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素、ＣＣケモカイン（例えば、ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８）、ＣＸＣケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１６）、Ｃケモカイン（例えば、ＸＣＬ１及びＸＣＬ２）及びＣＸ３Ｃケモカイン（例えば、ＣＸ３ＣＬ１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＥＰＯ、ヒト増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、核補因子、Ｊａｋ及びＳｔａｔファミリーメンバー、Ｇタンパク質シグナル伝達分子（例えば、ケモカイン受容体、ＪＮＫ、Ｆｏｓ−Ｊｕｎ、ＮＦ−κＢ、Ｉ−κＢ、ＣＤ４０、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ７、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４）。
【０２４９】
ポリヌクレオチドがＳＨＭを起こす能力を改変するための一つのストラテジーは、目的のポリヌクレオチド配列内のホットスポットの頻度及び位置を調節することを通じるものである。ホットスポット又はコールドスポットの位置又はリーディングフレームは、ＳＨＭ介在性の変異誘発が、生成するアミノ酸配列に関して、サイレントな変異をもたらし得るものであるのかどうかを支配する重要な要因でもある。ＳＨＭのリクルートの程度及びモチーフのリーディングフレームの両方が、ホットスポット及びコールドスポットの設計において考慮される。
【０２５０】
最適化されたポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列又はその部分が、野生型のポリヌクレオチド配列と比較して、オープンリーディングフレーム内でのホットスポットの頻度及び／又は位置を増加させるように改変又は設計され、且つ／又は、該ポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム内でのコールドスポットの頻度及び／又は位置を減小させるように改変又は設計されている場合、「ＳＨＭ感受性」にされている。
【０２５１】
反対に、最適化されたポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列又はその部分が、野生型のポリヌクレオチド配列と比較して、該ポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム内でのホットスポットの頻度及び／又は位置を減少させるように改変され、且つ／又は、該ポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム内でのコールドスポットの頻度及び／又は位置を増加させるように改変又は設計されている場合、「ＳＨＭ耐性」にされている。
【０２５２】
ホットスポット、コールドスポット、又はその両方を最適化するために、ポリヌクレオチドの特定の領域を標的化することができる。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドの他の領域（例えば、構造的な折りたたみやコンフォメーションに必要な領域など）をコールドにすることができながら、ポリヌクレオチドのある領域をホットにすることができる（例えば、リガンド結合、酵素活性、など）。例えば、抗体遺伝子において、コドン用法、並びにＡＩＤ活性及びｐｏｌイータのエラーに付随する正確なホットスポット／コールドスポットの標的化は、可変領域における変異を最大化し且つフレームワーク領域における変異を最小化する選択圧の下で進化してきたことが観察されている。
【０２５３】
コドン用法を選択的に改変して、ＳＨＭホットスポット及び／又はコールドスポットの密度を調節することにより、ＳＨＭ介在性の変異誘発を起こす傾向がより大きい又はより小さいポリヌクレオチド配列を作成することができる。この情報に基づいて、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の機能的属性に直接関与すると思われる、該タンパク質の特定の領域を最適化することが可能である。一つの非限定的な例としては、最適化すべきヌクレオチドは、目的の特定の機能的又は構造的属性の内側、又はその約５Å以内に存在し得るアミノ酸をコードし得る。具体的な例としては、抗体のＣＤＲ内、受容体の結合ポケット内、酵素の触媒クレフト内、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン内、補因子の、アロステリック結合部位などの、アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５４】
ＳＨＭホットスポット及びコールドスポットのモチーフについては、本明細書中の他の箇所（例えば、表２、３及び７など）に記載した。この目的のために使用され得る４マーヌクレオチドのホットスポットモチーフの非限定的な例としては、例えば、ＴＡＣＣ、ＴＡＣＡ、ＴＡＣＴ、ＴＧＣＣ、ＴＧＣＡ、ＴＧＣＴ、ＡＡＣＣ、ＡＡＣＡ、ＡＡＣＴ、ＡＧＣＣ、ＡＧＣＡ、ＡＧＣＴ、ＧＧＴＡ、ＴＧＴＡ、ＡＧＴＡ、ＧＧＣＡ、ＴＧＣＡ、ＡＧＣＡ、ＧＧＴＴ、ＴＧＴＴ、ＡＧＴＴ、ＧＧＣＴ、ＴＧＣＴ及びＡＧＣＴというヌクレオチド配列、並びにもう一方のＤＮＡ鎖にコードされるそれらの相補配列が挙げられる。例示的な３マーコールドスポットモチーフとしては、例えば、ＣＣＣ、ＣＴＣ、ＧＣＣ、ＧＴＣ、ＧＧＧ、ＧＡＧ、ＧＧＣ及びＧＡＣというヌクレオチド配列が挙げられる。
【０２５５】
更なる考慮としては、ホットスポット又はコールドスポットのリーディングフレームである。ホットスポットモチーフは、コドンの揺らぎ位置（３番目の位置）においてＳＨＭ介在性の変異誘発がより生じやすく、サイレント変異がより生じやすいように、リーディングフレームに対して位置し得る。反対に、ホットスポットモチーフは、コドンの変化により非サイレント変異が生じるように、リーディングフレームに対して位置し得る（データ図示せず）。以下で論じるように、これらの設計パラメーターは、反復のコンピュータアルゴリズムを用いて、好都合に最適化することができる。
【０２５６】
ホットスポット及び／又はコールドスポット密度を最適化することに加えて、最適化されたポリヌクレオチドが効率的に翻訳され且つ宿主系において安定であるように、以下の特徴を考慮することも望ましいものであり得る。
【０２５７】
ＣｐＧジヌクレオチドモチーフの密度：過剰のＣＧモチーフは、遺伝子サイレンシングに繋がる遺伝子メチル化をもたらし得、対象としている宿主系で高度に転写されている遺伝子において見出される密度に正規化され得る（例えば、Ｋａｍｅｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．  （２００６）３４９（４）：１２６９−１２７７を参照）。
【０２５８】
１本鎖配列がステムループ構造を形成する能力：ステムループ構造の形成は、特にコーディングフレームの５’領域の近くに位置する場合、非効率的な転写及び又は翻訳をもたらし得る（例えば、Ｚｕｋｅｒ  Ｍ．、Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  （２００３）；３１（１３）：３４０６−３４１５を参照）。ステムループ構造の形成は、例えば５’末端の近くで、６ヌクレオチドより長い重複又は回文のストレッチを避けることによって最小化され得る。或いは、ループが約２５ヌクレオチド（ｎｔ）よりも多くを含む場合には、より長いステムが許容される。
【０２５９】
コドン用法：適切なコドン用法、即ち、非常にまれなｔＲＮＡではなく、より一般的且つ頻繁に使用されるｔＲＮＡをコードするコドンを使用することは、使用している発現系における効率的な翻訳を可能とするために重要である（一般には、２０００年現在でのＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡ配列データベース中の全タンパク質配列の各々のコドン頻度表を挙げたＮａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（２０００）２８（１）：２９２、“Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：  ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００”を参照されたい）。一般に、コドン用法は、ポリヌクレオチドの転写が開始される遺伝子の５’末端近くにおいてより重要であり、この領域では、レアコドンは極力避けるべきである。目的の生物における発現遺伝子のコーディングフレーム内において１０％未満の回数で使用されるコドンの約８０％以上を除去することが好ましい。
【０２６０】
ＧＣ含量：これは一般に、宿主生物において高度に発現している遺伝子のＧＣ含量にあわせるべきであり、例えば哺乳動物の系においては、ＧＣ含量は約６０％未満であるべきである。
【０２６１】
制限部位：制限部位は、所望される場合には熟考して置かれるべきである。同様に、ポリヌクレオチド内の重要な制限部位（即ち、全遺伝子又は他の遺伝子をクローニングするために使用されることが意図される制限部位）は、所望でなければ、揺らぎ位置を改変することによって取り除くべきである。
【０２６２】
同一ヌクレオチドのストレッチ：同一ヌクレオチドのストレッチを、６未満の連続ヌクレオチドまで最小化又は除去する。
【０２６３】
加えて、開始コドンにおいて、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列〔即ち、（ａ／ｇ）ｃｃ（ａ／ｇ）ｃｃＡＴＧｇ〕を含めることにより、発現は更に最適化され得る。この目的のために有用なＫｏｚａｋ配列は、当該分野において公知である（Ｍａｎｔｙｈら、ＰＮＡＳ  ９２：２６６２−２６６６（１９９５）；Ｍａｎｔｙｈら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．＆Ｐｕｒｉｆ．  ６，１２４（１９９５））。
【０２６４】
終止コドンを生成するように１ステップで変異され得る特定のコドン（「好ましくないＳＨＭコドン」）の使用を回避又は最少化する。「好ましくないコドン」には、ＵＧＧ（Ｔｒｐ）、ＵＧＣ（Ｃｙｓ）、ＵＣＡ（Ｓｅｒ）、ＵＣＧ（Ｓｅｒ）、ＣＡＡ（Ｑ）、ＧＡＡ（Ｇｌｕ）及びＣＡＧ（Ｇｌｎ）が含まれる。
【０２６５】
ＳＨＭへの感受性が改変されたポリヌクレオチド配列を設計するための、目的のポリヌクレオチドのコード配列内での配列特異的な制約を超えた更なる設計基準としては、以下の要素を挙げることができる：
【０２６６】
プロモーターの選択；強力なプロモーターは、一般により高い割合で転写を誘導し、全体として、より弱いプロモーターと比べ、より高い変異誘発率を生じる。更には、ｔｅｔ−プロモーターなどの誘導性プロモーターは、発現、従ってＳＨＭが、目的のポリヌクレオチドの転写及び変異誘発をオン又はオフに切り換えるように誘導的に制御されることを可能とする。Ｇｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ、Ｔｉｇｈｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９２  Ｊｕｎ  １５；８９（１２）：５５４７−５１；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９５  Ｊｕｎ  ２３；２６８（５２１８）：１７６６−９。
【０２６７】
転写開始点に対するコード配列の位置；一般に高レベルの変異誘発のためには、目的のポリヌクレオチドは、転写開始部位から、約５０ヌクレオチドと２ｋｂとの間に位置しているべきである。
【０２６８】
ポリヌクレオチド配列をＳＨＭに対して最適化する１つの簡便なアプローチは、目的の対応するアミノ酸配列をコードするための選択的なコドン用法によって使用され得る可能な選択的なヌクレオチド配列を（上記パラメーターに従って）比較及びスコア付けするコンピュータアルゴリズムを通じて、目的の該アミノ酸配列を解析することを伴う。コドン又はコドン群（タイル又はＳＨＭモチーフ）を漸進的に好ましい配列で繰り返し置換することにより、所望の特性を有するポリヌクレオチド配列をコンピューター上で進化させることが可能である。具体的には、例えば、ＳＨＭに対して感受性又はＳＨＭに対して耐性であるが、それでもなお、妥当な翻訳効率、安定性を示し、制限部位を最小化し、且つ対象としている特定の生物におけるレアコドンを回避している配列である。
【０２６９】
このアプローチを使用して、出発アミノ酸又はポリヌクレオチド配列に基づいたファイルのライブラリーを作成できる。この解析及び最適化ストラテジーの１つの非限定的な例において、当該ライブラリーは、３コドンに対応する、９ヌクレオチドの群（「タイル」又は「ＳＨＭモチーフ」）の解析に基づいて作成できる。各タイルは、上記の属性に関してスコア付けされて、何十万もの９マー順列及びそれら各々のスコアを含む、タイルの初期ライブラリーデータセットを生成し得る。
【０２７０】
ライブラリーファイルのセクションの代表的なサンプルを表５に示しており、これは、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）及びロイシン（Ｌ）の３つのアミノ酸のみについて、選択的なコドン用法から生じるヌクレオチド配列における潜在的な多様性を示している。当業者であれば、全ての可能なアミノ酸の組み合わせに対して、公知のコドン用法パターンを使用して、ファイルの完全なセットを容易にまとめることが出来ることを容易に理解する。各配列の隣の括弧内にあるのは、配列識別番号である。
【０２７１】
【表５−１】
2010520748.tif 000037
【０２７２】
【表５−２】
2010520748.tif 000038
【０２７３】
【表５−３】
2010520748.tif 000039
【０２７４】
【表５−４】
2010520748.tif 000040
【０２７５】
【表５−５】
2010520748.tif 000041
【０２７６】
各ポリヌクレオチド配列は、以下の属性に基づいてランク付けされている；ＳＨＭホットモチーフ及びコールドモチーフの数、ＣｐＧモチーフの数、ＭａｘＮｔ（単一ストレッチ内の最大のヌクレオチド数）及び使用される宿主細胞におけるコドン利用頻度。表４の最後の列に含まれる用語「Ｌｏｇ（πｐ（ＡＡ））」は、トリマー内にアミノ酸の各々を観察した個々の確率の積の対数として計算され、以下の式にて与えられる：
【０２７７】
Ｌｏｇ（πｐ（ＡＡ）＝ｌｎ（ｐ（コドンｉ−１｜アミノ酸ｉ−１）＊ｐ（コドンｉ｜アミノ酸ｉ）＊ｐ（コドンｉ＋１｜アミノ酸ｉ＋１）
【０２７８】
各アミノ酸に対する個々の確率は、対象としている生物（この場合、哺乳動物細胞）における、公表されているコドン用法パターンに基づいた（一般にはＮａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  （２０００）２８（１）：２９２  Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：  ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００を参照）。
【０２７９】
上記から容易にわかるように、配列内に存在するホットスポットモチーフ又はコールドスポットモチーフの数（密度）での評価で、コドン用法多様性のみで、体細胞超変異に対する感受性が幅広く異なるポリヌクレオチド配列を作成することが可能である。
【０２８０】
この解析から、ＳＨＭに最適化され、ＣｐＧを最少化し、且つ効率的な翻訳のための最適なコドンを使用する、可能なコドン又はモチーフの組み合わせが容易に同定される。例えば、下記表６に挙げる配列は、最大のホットスポット数を含みコールドスポットを含まないため、上位ランクのホット配列を示している。各配列の隣の括弧内にあるのは、配列識別番号である。
【０２８１】
【表６】
2010520748.tif 000042
【０２８２】
これらのうち、哺乳動物細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを含むため、配列ＡＧＴＡＧＧＣＴＧ及びＡＧＣＡＧＧＣＴＧが好ましい。
【０２８３】
可能な全ての９マーヌクレオチドタイルを規定してスコア付けすることで、出発アミノ酸又はヌクレオチドテンプレートをスキャンして、タイルライブラリーからの置換によって改善され得るような遺伝子／タンパク質の位置を同定することが可能である。このプロセスは、ｐｅｒｌプログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎ．ｐｌのようなコンピュータアルゴリズムを用いることで簡便に完了され得る；そのコードを以下に示す：
2010520748.tif 000043
2010520748.tif 000044
2010520748.tif 000045
2010520748.tif 000046
2010520748.tif 000047
2010520748.tif 000048
2010520748.tif 000049
2010520748.tif 000050
【０２８４】
上に示した可能な３アミノ酸タイルのファイルに加えて、プログラムは、以下の表７に概要したホットスポットモチーフ及びコールドスポットモチーフのファイル、並びにポリヌクレオチド配列に対してアミノ酸配列を翻訳するための遺伝コードリストもまた、必要とする：
【０２８５】
【表７】
2010520748.tif 000051
【０２８６】
ホットスポット又はコールドスポットの密度を最大化するのに最良のコドン用法を見出すために使用できる多くの可能なアプローチ及びコンピュータによる方法が存在すること、並びに、本発明が最適な配列を決定するいずれか１つの特定の方法に限定されることを意図しないことが、認識され得る。
【０２８７】
出発アミノ酸テンプレートが与えられる場合には（例えば、元となるＤＮＡ配列が公知でない場合）、所与のアミノ酸配列及びその生物における公知のコドン用法の両方と一致するＤＮＡヌクレオチド配列を先ず生成することによってアルゴリズムが始まる。出発ヌクレオチドテンプレートは、ホット又はコールド部位が所与の位置に組み込まれるべきかどうかをｐｅｒｌプログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎ．ｐｌに指示する更なるラインを含み、これによって、ＳＨＭを、例えば抗体分子のＣＤＲを標的化するための領域に向かわせるのと同時に、進化しているタンパク質の部分におけるＳＨＭを抑制又は最小化することが可能となる。ポリヌクレオチド中の所与の９マーＳＨＭモチーフは、その位置で同一の３アミノ酸をコードするであろう可能な他の全てのノナマーオリゴヌクレオチドと比較され得る。
【０２８８】
配列又はその部分が、ＳＨＭに対して感受性である（「ホット」にされる）場合、アミノ酸配列と一致する全てのヌクレオチド配列の網羅的な検索がなされ、進化しているコンストラクトのヌクレオチド配列は、以下の条件を満たす場合、新たなヌクレオチド配列により置換される：（１）新たな９マーＳＨＭモチーフが、既存の配列よりも多いホットスポットモチーフを含む、（２）新たな９マーが、進化している配列と同等かそれより少ない数のコールドスポットモチーフを含む、（３）新たな９マーが、進化している配列と同等かそれより少ない数のＣｐＧ配列モチーフを含む、（４）進化している配列が、その位置での公知の集合コドン用法（ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）と同等又は改善されたコドン用法スコアを有する、及び（５）配列が、４残基を超えるどの１ヌクレオチドストレッチも含まない。
【０２８９】
配列又はその部分が、ＳＨＭに対して耐性とされている（「コールド」にされている）場合、アミノ酸配列と一致する全てのヌクレオチド配列の網羅的な検索がなされ、進化しているコンストラクトのヌクレオチド配列は、以下の条件を満たす場合、新たなヌクレオチド配列により置換される：（１）新たな９マーＳＨＭモチーフが、既存の配列よりも多いコールドスポットを含む、（２）新たな９マーが、進化している配列と同等かそれより少ない数のホットスポットモチーフを含む、（３）新たな９マーが、進化している配列と同等かそれより少ない数のＣｐＧ配列モチーフを含む、（４）進化している配列が、その位置での公知の集合コドン用法と同等又は改善されたコドン用法スコアを有する、及び（５）新たな９マーヌクレオチド配列が、４残基を超えるどの１ヌクレオチドストレッチも含まない。
【０２９０】
配列がＳＨＭ以外の他の因子のために最適化されている（「中立」にされている）場合、アミノ酸配列と一致する全てのヌクレオチド配列の網羅的な検索がなされ、進化しているコンストラクトのヌクレオチド配列は、以下の条件を満たす場合、新たなヌクレオチド配列により置換される：（１）新たな９マーが、進化している配列と同等かそれより少ない数のＣｐＧ配列モチーフを含む、（２）進化している配列が、その位置での公知の集合コドン用法と同等又は改善されたコドン用法スコアを有する、及び（３）新たな９マーのヌクレオチド配列が、４残基を超えるどの１ヌクレオチドストレッチも含まない。
【０２９１】
任意の所与のポリヌクレオチド配列から開始し、本明細書中に記載する特性について最適化された少数の可能な配列に迅速に収束するポリヌクレオチド配列を生成するためにこのアプローチを使用することが可能である（実施例１）。
【０２９２】
コンピュータ分析後、最終的な最適化ポリヌクレオチドは、標準的な方法論を使用して合成でき、正確な合成を確認するために配列決定され得る。一旦ポリヌクレオチドの配列が確認されると、このポリヌクレオチドはベクター中に挿入することができる。このベクターは、本明細書中に記載するように、宿主細胞中に導入され得、発現、活性、又はＳＨＭに対する感受性の増加及び／若しくは減少に関して試験され得る。
【０２９３】
Ｖ．ＳＨＭ介在性の多様化のための合成ライブラリーの構築
合成ポリヌクレオチドライブラリーは、ＳＨＭの多様性生成特性及び標的化特性を利用することによって、新規表現型を有するタンパク質の指向された進化及び選択のために使用され得る。
【０２９４】
抗体の場合、これは、新たな若しくは変更されたエピトープに結合し得る相補性決定領域（ＣＤＲ）の標的化した多様化を意味する。４つの、そして実に２つのアミノ酸のアルファベット（セリン及びチロシン）を含む単純化したＣＤＲライブラリーもまた記載されており、高い親和性及び選択性で抗原に結合できることが見出されている。例えば、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ  ＦＡ、Ｌｉ  Ｂ、Ｃｏｍｐａａｎ  ＤＭ、Ｐｅｄｅｎ  ＡＡ、Ｈｙｍｏｗｉｔｚ  ＳＧ、Ｓｉｄｈｕ  ＳＳ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｂｉｎａｒｙ  ｃｏｄｅ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（２００５）３４８：１１５３−６２；及びＦｅｌｌｏｕｓｅ  ＦＡ、Ｗｉｅｓｍａｎｎ  Ｃ、Ｓｉｄｈｕ  ＳＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｆｏｕｒ−ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｃｏｄｅ：ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．（２００４）１０１：１２４６７−７２を参照のこと。
【０２９５】
合成ポリヌクレオチドライブラリーはまた、酵素及び他のタンパク質クラスなどの非抗体性ポリペプチドの場合にも使用することができ、これは、目的の酵素又はタンパク質の生物学的活性（例えば、結合特異性、酵素機能、蛍光又は他の特性）を調節する、該酵素又はタンパク質の領域の標的化された多様化をいう。ライブラリーは通常、ライブラリーの改善された又は機能的なメンバーをライブラリーの非機能的メンバーから同定及び／又は分離する、以下に開示するような１以上の選択ストラテジーと組み合わされる。
【０２９６】
静的ライブラリーは、実施形態によっては、そのサイズ及び範囲において限定されている。例えばファージディスプレイライブラリーは１０１２ほどの多くのメンバーをディスプレイでき、約１０１６のメンバーを潜在的に含むリボソームライブラリーが構築されている。細菌細胞及び哺乳動物細胞の表面上に提示されたライブラリーは、通常はこれほど複雑ではなく、約１０９よりも少ないメンバーである。さらに、強固なライブラリーの構築及び選択は通常、この理論的複雑性をさらに制限し、全ライブラリーのスクリーニングを、遅くてコストがかかり、ある場合には実用的でないものにする数倍の冗長性を、ライブラリーが含むことを必要とする。
【０２９７】
これらのレベルの複雑性にもかかわらず、このような静的ライブラリーは、ほんの僅かな可能な配列空間のみを調査できる。一つの非限定的な例では、重鎖ＩｇＧ配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の相補性領域内に３０より多いアミノ酸を含み得、この単一鎖に２０３０より多い可能な順列を与え、可能性のあるライブラリーの最大のものさえも小さくする。この制限に起因して、研究者らは、進化するタンパク質配列及びライブラリーのための方法論を調査してきた。本出願で扱うＳＨＭは、親和性成熟を受ける抗体配列を進化させるための機構として、ＡＩＤ及びエラープローンポリメラーゼを使用する。所与の遺伝子のポリヌクレオチドライブラリー内の目的の各位置におけるＳＨＭ介在性の変異誘発及び選択を促進するであろう系は、機能的配列空間の選択的調査を可能とするであろう。このような検索ストラテジーにより、はるかに大きな配列多様性の調査が可能となり、それにより、この方法を、新たな機能性及び治療剤の迅速な開発にとって非常に魅力的なものにする。例えば、１０アミノ酸ストレッチの各コーディング位置において、少数のホットスポットコドンのみから構成されるライブラリー（２１０の順列＝１．６＊１０４）（ここで、各位置は、ＳＨＭ下において、生成される多様なアミノ酸群を進化させることが可能である）は、各１０のライブラリー位置にて全２０アミノ酸の同等の静的ライブラリーをコードするために必要な複雑性／多様性（２０１０の順列＝１．６＊１０１４）についての大きな単純化を表す。
【０２９８】
１態様において、本発明は、ＳＨＭ介在性の変異誘発を介した迅速な進化が可能な、合成動的ライブラリーを含む。このような合成ライブラリーは、以下の特性を有する：ｉ）このライブラリーは合成が容易であり、限定数の別個の機能的配列に基づく；ｉｉ）このライブラリーは、選択的変異誘発のために標的化される１以上の合成可変領域を含み且つ高密度の好ましいＳＨＭコドンを含む、合成ポリヌクレオチド配列を含む；ｉｉｉ）このライブラリーは、ＳＨＭ介在性の変異誘発に対して耐性の１以上の合成フレームワーク領域を含み且つ低密度のＳＨＭホットスポットを含む、合成ポリヌクレオチド配列を含む；ｉｖ）このライブラリーは、ＳＨＭを介して１ステップで終止コドンに変異し得る特定のコドン（「好ましくないコドン」）（ＵＧＧ（Ｔｒｐ）、ＵＧＣ（Ｃｙｓ）、ＵＣＡ（Ｓｅｒ）、ＵＣＧ（Ｓｅｒ）、ＣＡＡ（Ｇｌｎ）、ＧＡＡ（Ｇｌｕ）及びＣＡＧ（Ｇｌｎ）が含まれる）を含まない又は最小数で含む；ｖ）ＡＩＤ介在性の変異誘発は、機能の更なる進化及び選択のために、コドンの出発セットから、各位置において、大きな潜在的多様性を生じる（「好ましいＳＨＭホットスポットコドン」又は「好ましいＳＨＭホットスポットモチーフ」）。
【０２９９】
本明細書に記載される遺伝子配列のＳＨＭ最適化のための方法は、アミノ酸配列及び他の所望の特性を維持しつつも上述したような「よりホットな」又は「よりコールドな」配列を創出するために、配列を改変するために置換され得る９マータイル（ＳＨＭモチーフ）の前もってスコア付けされたライブラリーを使用する。タイルは、本出願では９ヌクレオチドであるように選択されているが、配列に基づく特性を正確に評価することが可能である限りは、任意の長さであり得ることに留意されるべきである。同様に、ホット及びコールドＳＨＭモチーフは、置換のために９マータイルライブラリーをスコア付けするために使用され得、このアプローチと組み合わせて、改良されたコンストラクトを作成するために、例えば統計解析に由来したホット及びコールドのスコアに基づいて、任意の他の大きさ又は決められたＳＨＭホット若しくはコールドスポットモチーフを使用することが可能である。変異誘発だけでなく、コンストラクトを通じた種々の位置での生成するアミノ酸の多様性（又はその欠失）の種をまく方法として、インフレームのＳＨＭホットスポットモチーフの使用に基づいて、タイルはスコア付けされ得る。コンストラクトを通じた種々の位置でのＡＩＤを介する変異誘発に対してポリヌクレオチドを安定化する方法として、インフレームのＳＨＭコールドスポットモチーフの使用に基づいて、タイルはスコア付けされ得る。
【０３００】
ホットスポット又はコールドスポットの密度を最大化するのに最良のコドン用法を見出すために使用できる多くの可能なアプローチ及びコンピュータによる方法が存在すること、並びに本発明が最適な配列を決定するいずれか１つの特定の方法に限定されることを意図しないことが、認識され得る。
【０３０１】
ＶＩ．ライブラリー設計
目的の特定のタンパク質に関する合成ライブラリーは、（入手可能であれば）任意の公知既存の、構造と活性との関係に関する情報、異なる種間の相同性、及びそのタンパク質のＸ線又はＮＭＲ構造情報、或いは問題のタンパク質ファミリーを考慮して、設計できる。
【０３０２】
１態様において、最初のライブラリー設計は以下の工程を含み得る：
１．目的のタンパク質のアミノ酸配列を同定し、対応するポリヌクレオチド配列を決定するか、逆転写する。
２．目的のタンパク質、及び関連タンパク質、又は目的の相同タンパク質に関する任意の適切な構造情報を得る。
３．目的のタンパク質に対して配列比較を実施し、密接に関連した種由来の全ての他のタンパク質及び既知のアイソフォームに対して比較を行ない、特定の実施形態では、配列アラインメントが、種間での保存された及び可変性のアミノ酸配列を同定するために作成され得る。
【０３０３】
この情報は、特定のアミノ酸又はタンパク質ドメインが、目的のタンパク質の機能的又は構造的な属性において重要である可能性があるかどうか、タンパク質ファミリーを横断したタンパク質の機能的アイソフォームにわたってそれが保存されているか又はバリアントであるかどうかを確立するために、使用できる。
【０３０４】
この情報に基づいて、目的のタンパク質の機能的又は構造的属性に直接関与するように思われる、目的の特定の領域を確立することが可能である。例えば、これらのアミノ酸は、目的の特定の機能的又は構造的属性の内側、又はその５Å以内に存在し得る。具体的な例としては、抗体のＣＤＲ内、受容体の結合ポケット内、酵素の触媒クレフト内、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン内、補因子の、アロステリック結合部位などの、アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０５】
上に示した構造及び配列分析に基づいて、上述したパラメーターを用いて、１以上のポリヌクレオチドを、ＳＨＭ介在性の変異誘発を増加又は減小するように設計することができる。更には、設計は、以下の概念を１以上取り込み得る：
ｉ）高度に保存されたアミノ酸、又は重要な結合エネルギーに直接寄与することが知られている若しくはそう考えられているアミノ酸は、最初は保存され得、本明細書に記載するようにして、それらの近傍内のコドン用法を、コールドスポットモチーフを生成するように変化させるか、ＳＨＭの間の大抵の保存的なアミノ酸変化を促進するように変更することができる。
ｉｉ）タンパク質のコア構造フレームワークを維持するのに関与すると思われるアミノ酸ドメインは最初は保存され得、それらのコドン用法を、ＳＨＭの間に大抵の保存的なアミノ酸変化を促進するよう変化させることができる。特に重要なフレームワーク領域中のアミノ酸残基は、より高い割合のコールドスポットを使用するように、及びＳＨＭに対して耐性であるか又はＳＨＭの間にサイレント変異を生じるコドン又はモチーフを利用するように、変更できる。
ｉｉｉ）目的の領域中のアミノ酸は、以下に記載するように、高効率のＳＨＭを可能にする合成可変領域を組み込むように変化させることができる。
ｉｖ）ポリペプチドの機能又は構造に関して、明確に特定された役割を果たすと同定されないアミノ酸は、効果的なＳＨＭを可能にする（即ち、ＳＨＭホットスポットの頻度が最大化でき、ＳＨＭコールドスポットの頻度が最小化できる）ために改変され得る。
【０３０６】
ＶＩＩ．合成可変領域の設計
ＡＩＤ及びエラープローンポリメラーゼのための全てのＳＨＭホットスポットの、変異原性に対する感受性の序列は、セクションＩＩＩに与えられている。本発明者らはさらに、サイレント変異対非サイレント変異の生成に重要なリーディングフレーム構成を同定した。本明細書中で、本発明者らは、変異が所望される各ライブラリー位置における多様なアミノ酸の生成を導く、高密度の好ましいホットスポットコドン又はモチーフの使用を含む、合成ライブラリーアプローチを記載する。このような高密度のホットスポットモチーフは、効率的な変異誘発を確実にするために、合成可変領域の境界において特に重要である。
【０３０７】
Ａ．ＷＡＣベースのモチーフ
配列ＷＡＣ（ＷＡＣ、ここで、Ｗ＝Ａ又はＴが同じ割合でコードされ、参照のリーディングフレームは、各コドンのゆらぎ即ち３番目の位置にＣをおく）のみを含むポリヌクレオチド配列は、高密度のホットスポットを提供する。
【０３０８】
この単純なパターンは、２つのアミノ酸（アスパラギン（Ａｓｎ）及びチロシン（Ｔｙｒ）をコードする２つのコドン（ＡＡＣ及びＴＡＣ）だけを含む４つの可能な６マーヌクレオチドパターンのみを生じるであろう。各配列の隣の括弧内にあるのは、配列識別番号である。
【０３０９】
【表８】
2010520748.tif 000052
【０３１０】
３つの可能なリーディングフレームのいずれかで与えられたＷＡＣライブラリーがコードする全てのモチーフは、ホットスポットの集積を生じる。図３は、ＳＨＭ介在性の機構をリクルートする能力について、これらのモチーフを、全ての他の可能な４０９６の６マーヌクレオチドの組合せと比較する。より長いアセンブリーは、「コールドスポット」なしの同じ高密度のＳＨＭ「ホットスポット」を生じる。縮重コドンのこのアセンブリー（ＷＡＣＷ）は、Ｒｏｇｏｚｉｎらが記載した可能な４マーのホットスポットのサブセット（ＷＲＣＨ（ここで、Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ、及びＷ＝Ｔ又はＡ））を生じることも、注目に値する。
【０３１１】
図４に示されるように、好ましいＳＨＭホットスポットコドンＡＡＣ及びＴＡＣ（これらは、この合成ライブラリーの基礎である）は、Ｉｇ重鎖抗体において観察される等価なＳＨＭ変異事象による判断で、かなりのアミノ酸の多様性を生じる、一次及び二次の変異事象のセットを生じ得る。これら２つのコドンから、塩基性アミノ酸（ヒスチジン、リジン、アルギニン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸）、親水性アミノ酸（セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン）、疎水性アミノ酸（アラニン及びフェニルアラニン）、及びグリシンが、ＳＨＭ事象の結果として生じる。
【０３１２】
Ｂ．ＷＲＣベースのモチーフ
第２の可能な合成高密度ＳＨＭモチーフ（ここでは、ＷＲＣモチーフと呼ぶ）は、２つのアミノ酸、セリン（Ｓｅｒ）及びチロシン（Ｔｙｒ）をコードするＡＧＣ及びＴＡＣという、２つの可能なコドンを含むものである。この実施形態では、以下の４つの可能な６マーヌクレオチドが挙げられる：
【０３１３】
【表９】
2010520748.tif 000053
【０３１４】
各配列の隣の括弧内にあるのは、配列識別番号である。
【０３１５】
ＳＨＭ介在性の変異に対するこのモチーフのホットさ又はコールドさを記述する、全４０９６の６マーヌクレオチドのｚスコアの分布を、図５に示す。ＷＲＣ合成ライブラリー中の６マーの全ての順列についてのｚスコアがこの分布上に重ねられており、点線は全ての可能なモチーフの上位５％を示す。
【０３１６】
親和性成熟したＩＧＶ重鎖配列中で観察されるような、「好ましいＳＨＭホットスポットコドン」ＡＧＣ及びＴＡＣから開始する、アミノ酸多様性の生成を導く一連の変異事象を、図６に示す。アスパラギン及びチロシンをコードするコドンから開始する、４２００の一次及び二次の変異事象は、機能的に多様なアミノ酸のセットを導く。
【０３１７】
再び、このモチーフは、図５に示されるように、全ての他の６マーヌクレオチドモチーフと比較すると、非常に高密度の最適なＳＨＭホットスポット及びホットコドンを生じる。ＷＡＣ合成モチーフと同様、ＷＲＣ合成モチーフは、ＳＨＭ、ＡＩＤ及び１以上のエラープローンポリメラーゼの活性と組み合わせたとき、各位置において可能なアミノ酸多様性の広いスペクトルを生じる、好ましいＳＨＭホットスポットコドンを与える（図６）。
【０３１８】
従って、１態様において、このような合成可変領域は、目的の特定のドメイン又はサブドメインをコードし、高い程度の多様性が所望される、ポリヌクレオチド配列内の目的の特定の領域へと標的化され得る。
【０３１９】
別の態様において、ＷＡＣモチーフ又はＷＲＣモチーフは、目的のタンパク質のオープンリーディングフレームの全体にわたって、体系的に挿入できる。例えば、１００アミノ酸残基のタンパク質について、ＷＡＣモチーフ又はＷＲＣモチーフがそのタンパク質内の全ての可能な位置に一旦個別に導入された、３００の別個のポリヌクレオチドが生成され得るであろう。次いで、これら１００個のポリヌクレオチドの各々が、個別に又はライブラリー中にプールした後のいずれかにスクリーニングされ、各位置での最適なアミノ酸置換を同定できるであろう。次いで、各位置での改善された変異が組換えられて、各位置で同定された最良の個々のアミノ酸の全てを含む次世代のコンストラクトを生成できるであろう。
【０３２０】
Ｃ．領域変異誘発
より大きい領域内の効果的な変異誘発を提供するために、以前に議論したように、コドン又はモチーフが、ホットスポットの密度を増加させるように、１以上の目的の領域の全体にわたって改変され得る。このアプローチは、ＳＨＭをどこに標的化すべきか、又はどの特定のアミノ酸が活性に必須であるかについて、先入観を必要としないという利点を有する。
【０３２１】
効率的なＳＨＭが必要とされる領域について、改善されたホットスポット密度を有するコドン又はモチーフを挿入するために、コドン用法を変化させること及び保存的アミノ酸置換を行なうことの両方によって合成可変領域を生成することができる。適切なアミノ酸置換は、安定な遺伝子生成及びドメイン構造に関する同じ全般的な基準に注意しながら、以下の表１０に列挙するものから選択できる。
【０３２２】
【表１０】
2010520748.tif 000054
【０３２３】
いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｔｒｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｙは、それらの位置が機能的又は構造的役割を示唆する場合、保存される。これらのアミノ酸以外は、最適化すべきアミノ酸が列挙されていない場合、下に列挙するのと同じサブグループからアミノ酸が選択される。
【０３２４】
このような合成可変領域では、以前に記載されたようにして設計できる、主にＳＨＭ耐性配列を含むフレームワーク領域が散在し得る。
【０３２５】
利用可能な情報の量に依存して、ＷＡＣモチーフ又はＷＲＣモチーフの使用に基づく非常に意欲的な標的化アプローチから、きわめて選択的なアミノ酸置換を使用するより保守的なストラテジーまで、そしてコドン用法のみが変化する慎重なストラテジーにまで及ぶ、多数の異なるライブラリー設計ストラテジーを使用することができる。本発明の利点は、各アプローチが限られた数の独自のヌクレオチド配列のみの生成を生じることであり；したがって、これらのストラテジーは全て、重大なさらなる負担なしに、平行してＳＨＭ介在性の多様性に供することができる。
【０３２６】
ＶＩＩＩ．ＳＨＭ活性をモニタリングするための方法
様々なベクター及び細胞系列を使用して、抗体及び非抗体タンパク質でのＳＨＭをモニタリングするための当該分野で理解された方法が公知である（Ｒｕｃｋｅｒｌら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３（２００６）；１６４５−１６５２）、Ｂａｃｌら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１、１６６：５０５１−５０５７）、Ｃｕｍｂｅｒｓら（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；２０（１１）：１１２９−１１３４）、Ｗａｎｇら、（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００４；１０１（１９）：７３５２−７３５６））。更に、シチジン脱アミノ化を直接測定するための様々な方法が、当該分野にて公知である；例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ、Ｃｏｋｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４０８：１５６−１７０（２００６）参照。
【０３２７】
このような方法は、進行性のＳＨＭの率を評価するための迅速な手段を提供する。方法としては、例えば、ＡＩＤ活性の存在下で変異され得るコーディングフレーム内のストップコドンを含むように改変されたレポーター遺伝子又は選択マーカー遺伝子の使用が挙げられる。
【０３２８】
ＡＩＤは集団に作用するため、（例えば、選択マーカーの）機能を保持若しくは改良する変異、又は機能を減少若しくは除去する変異を生じ得る。これら２つの比率のバランスによって、機能を保持する初期及び稀な変異事象と、それに引き続くこれらのタンパク質の機能を破壊する２次及び３次（ｔｅｒｎｉａｒｙ）変異事象が生じる。これらの競合の正味の効果は、集団における機能獲得事象の観察で評価される。ＧＦＰをサイレンシングするために必要とされる不活性型変異の数に関する３つの異なる仮定を考慮すれば、ＡＩＤの酵素活性の比率に依存した時間の関数として、３つの非常に異なる復帰事象のプロファイルを観察することが予期されるであろう。
【０３２９】
更に、ＳＨＭ活性に曝露されたポリヌクレオチドは、そのヌクレオチド配列は改変されているのかどうか、及びどの程度改変されているのかを決定するために、配列決定され得る。様々な時点においてＳＨＭを決定するために、ポリヌクレオチドは培養物からレスキューされ得る。遺伝子の単離及び配列決定方法は、当該分野において周知であり、例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などの、標準的な技術の使用が挙げられる。簡単に言うと、ポリヌクレオチドは逆転写されて、適切なプライマーを使用するＰＣＲに供され得る。クローンは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどの会社の自動化ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ−３７７又はＡＢＩ３７３０  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を使用して、配列決定され得る。配列は、ヌクレオチド改変頻度について解析され得る。ポリヌクレオチドは、出発物質のポリヌクレオチドと比較され、配列改変について解析され得る。
【０３３０】
ＩＸ．体細胞超変異（ＳＨＭ）系
Ａ．合成ポリヌクレオチド配列
ＳＨＭの使用のための実用的な系の開発には、変異が、目的の特定の遺伝子（ポリヌクレオチド）又は領域に向けられ（「ホット」にされる）、且つ、系全体の機能性及び／又は安定性を維持するために、細胞又はエピソーム内において機能的に必要とされる構造遺伝子又はマーカー遺伝子には向けられない（「コールド」にされる）ことが要求される。特定の実施形態において、合成遺伝子は、Ｂ細胞中にて発現された際に、天然にＳＨＭを起こす遺伝子（即ち抗体遺伝子）である。他の実施形態において、合成遺伝子は、Ｂ細胞中にて発現された際に、天然にはＳＨＭを起こさない遺伝子（即ち非抗体遺伝子）である。
【０３３１】
本発明は、ＳＨＭ感受性及びＳＨＭ耐性のポリヌクレオチド配列を設計し、且つ細胞環境内又は無細胞環境内でそれらを作製又は生成するための系の開発に基づく。本発明は更に、構造部分又はポリペプチド若しくは構造タンパク質、転写調節領域及び選択マーカーに影響せずに、好適な時間にわたって、ＳＨＭの率の増加及び／又は減少を再現性良く維持するために安定である、ＳＨＭ系の開発に基づく。当該系は、構造タンパク質、転写調節領域及び選択マーカーにおける非特異的な変異誘発を十分に防ぎつつ、目的のポリヌクレオチドにおける標的化されたＳＨＭを高レベルで提供する変異誘発系を、安定して維持することを可能とする。
【０３３２】
部分的には、本発明は、高レベルで維持されるＳＨＭを提供し得る、より安定なバージョンのシチジンデアミナーゼの創出に基づく。哺乳動物細胞における野生型ＡＩＤの高レベルの過剰発現は、酵素そのものが、それ自身のＤＮＡ配列のＳＨＭによる不活性化変異を蓄積し得るか、又は翻訳後修飾によってサイレンシングされ得るかのいずれかであり得ることから、ＳＨＭ活性の安定な増加を必ずしも導かない（Ｒｏｎａｉら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ２００５；１０２（３３）：１１８２９−３４；Ｉｇｌｅｓｉａｓ−Ｕｓｓｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６、３１６：５９−６６）。それゆえ、本ＳＨＭ系は、ＳＨＭに耐性で（コールド）、自己変異率の減少を示す、合成ＡＩＤ遺伝子（配列番号２２）を含む。
【０３３３】
従って、１つの態様において、本発明は、ホットスポット数が減少するように、及び／又はコールドスポット数が増加するように、ポリヌクレオチドレベルで改変された合成ＡＩＤ遺伝子を含む。この合成遺伝子の１つの実施形態において、遺伝子はまた、改変されたＣｐＧメチル化部位含量を有する。別の態様において、合成遺伝子は、該合成遺伝子が発現されるべき又は変異されるべき生物に特異的なＳＨＭコドン用法のために最適化されている。
【０３３４】
さらに、種々の他の成分ヌクレオチド配列（例えば、実施形態によっては全般的な系の一体性を維持するために超変異することが好まれないであろう、コアの系を形成し得るコード配列及び遺伝エレメント）が存在する。これらの成分ヌクレオチド配列には以下が含まれるが限定されない：ｉ）選択マーカー（例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、アンピシリンなど）；ｉｉ）レポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質、エピトープタグ、レポーター酵素）；ｉｉｉ）遺伝子調節シグナル（例えば、プロモーター、誘導可能な系、エンハンサー配列、ＩＲＥＳ配列、転写又は翻訳ターミネーター、ｋｏｚａｋ配列、スプライス部位、複製起点、リプレッサー）；ｉｖ）高レベルの増強されたＳＨＭ又はその調節、又は測定に使用される酵素又は補助因子（例えば、ＡＩＤ、ｐｏｌイータ、転写因子、及びＭＳＨ２）；ｖ）シグナル伝達成分（キナーゼ、受容体、転写因子）、及びｖｉ）タンパク質のドメイン又はサブドメイン（例えば、核局在化シグナル、膜貫通ドメイン、触媒ドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、並びに他のタンパク質ファミリーで保存されたモチーフ、ドメイン及びサブドメイン）。
【０３３５】
従って、本発明の別の態様において、本明細書に記載のＳＨＭ系は、本明細書に記載の方法を使用して、ホットスポット数が減小するように及び／又はコールドスポット数が増加するように、全体的又は部分的に、ポリヌクレオチドレベルにおいて改変された任意の合成遺伝子を含み得る。１つの実施形態において、合成遺伝子はまた、改変されたＣｐＧメチル化部位の含量も有する。
【０３３６】
少なくとも１つの合成遺伝子を含む発現ベクターが本明細書で提供される。１つの態様では、該発現ベクターは、組込み発現ベクターである。発現ベクターが、組込み発現ベクターである場合、発現ベクターは、組換えを指示する１つ以上の配列を更に含み得る。別の態様では、発現ベクターは、エピソーム発現ベクターである。また別の態様では、発現ベクターは、ウイルス発現ベクターである。
【０３３７】
別の態様において、合成遺伝子は、該合成遺伝子が発現及び／又は変異されるべき生物に特異的なＳＨＭコドン用法のために最適化されている。
【０３３８】
タンパク質又はその部分をコードするＳＨＭ耐性の合成遺伝子であって、該合成遺伝子では、該タンパク質又はその部分をコードする未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより低い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており、該ＳＨＭ耐性の合成遺伝子は、該未改変のポリヌクレオチド配列と比較して、ＡＩＤ介在性の変異誘発率がより低い、前記合成遺伝子が本明細書で提供される。
【０３３９】
本発明はまた、ＳＨＭ耐性の合成遺伝子が、ある改変が遺伝子に為され、次いで後の回の改変が該遺伝子に為されるようにして、段階的又は連続的な様式で作り出され得ることも意図する。そのような連続的又は段階的な改変は、本発明で意図されており、また、それは、当該プロセスを実行する一つの方法であり、且つ本願で主張される遺伝子を作製する一つの方法である。
【０３４０】
１つの実施形態では、ＳＨＭ耐性の合成遺伝子は、未改変の遺伝子に対して、約９５％、約９０％アミノ、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、又は約５０％と約１００％の間の任意のパーセンテージの同一性を有するタンパク質又はその部分をコードする。
【０３４１】
１つの実施形態では、ＳＨＭ耐性の合成遺伝子は、以下に限定されないが、１．０５倍、１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍若しくはそれより低い、又はそれらの間の任意の範囲を含む、より低いＡＩＤ介在性の変異誘発率を示す。
【０３４２】
１つの実施形態では、ＳＨＭ耐性の合成遺伝子は、未改変の遺伝子が示すものの約９９％未満、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、又は約５０％未満のレベルの、ＡＩＤ介在性の変異誘発率を示す。
【０３４３】
他の実施形態において、目的のポリヌクレオチドを標的とする高いＳＨＭ介在性の変異誘発率は、該ポリヌクレオチドの迅速な指向された進化を指示するために望ましい。
【０３４４】
タンパク質又はその部分をコードするＳＨＭ感受性の合成遺伝子であって、該合成遺伝子では、該タンパク質又はその部分をコードする未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより高い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており、該ＳＨＭ感受性の合成遺伝子は、該未改変のポリヌクレオチド配列と比較して、ＡＩＤ介在性の変異誘発率がより高い、前記合成遺伝子が本明細書で提供される。
【０３４５】
本発明はまた、ＳＨＭ感受性の合成遺伝子が、ある改変が遺伝子に為され、次いで後の回の改変が該遺伝子に為されるようにして、段階的（ステップワイズ）又は連続的（シーケンシャル）な様式で作り出され得ることも意図する。そのような連続的又は段階的な改変は、本発明で意図されており、また、それは、当該プロセスを実行する一つの方法であり、且つ本願で主張される遺伝子を作製する一つの方法である。
【０３４６】
１つの実施形態では、ＳＨＭ感受性の合成遺伝子は、未改変の遺伝子に対して、約９５％、約９０％アミノ、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、又は約５０％と約１００％の間の任意のパーセンテージの同一性を有するタンパク質又はその部分をコードする。
【０３４７】
１つの実施形態では、ＳＨＭ感受性の合成遺伝子は、以下に限定されないが、１．０５倍、１．１倍、１．２５倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍若しくはそれより大きい、又はそれらの間の任意の範囲を含む、より高いＡＩＤ介在性の変異誘発率を示す。
【０３４８】
１つの実施形態では、ＳＨＭ感受性の合成遺伝子は、未改変の遺伝子が示すものの少なくとも約１０１％、少なくとも約１０５％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１１５％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１３５％、少なくとも約１１４０％、少なくとも約１４５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５０００％、又はそれより高いレベルの、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）介在性の変異誘発率を示す。
【０３４９】
タンパク質又はその部分をコードする、選択的に標的化された、ＳＨＭに最適化された合成遺伝子であって、該合成遺伝子では、該タンパク質又はその部分をコードする未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより高い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており；且つ該タンパク質又はその部分をコードする該未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第３のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより低い１つ以上の第４のＳＨＭモチーフによって置換されており；該選択的に標的化された、ＳＨＭに最適化された合成遺伝子は、標的化されたＡＩＤ介在性の変異誘発を示す、前記合成遺伝子が本明細書で提供される。そのような実施形態では、該選択的に標的化された、ＳＨＭに最適化された合成遺伝子は、より高いＡＩＤ介在性の変異誘発率を示すある部分と、より低いＡＩＤ介在性の変異誘発率を示すある部分とを有する。
【０３５０】
本発明はまた、選択的に標的化された、ＳＨＭに最適化された合成遺伝子が、ある改変が遺伝子に為され、次いで後の回の改変が該遺伝子に為されるようにして、段階的又は連続的な様式で作り出され得ることも意図する。そのような連続的又は段階的な改変は、本発明で意図されており、また、それは、当該プロセスを実行する一つの方法であり、且つ本願で主張される遺伝子を作製する一つの方法である。
【０３５１】
更に本明細書では、変異誘発及び発現系に関与する成分の非特異的な変異誘発を回避しつつ、目的の特定のポリヌクレオチド（例えば、合成遺伝子又は合成遺伝子内の領域）を標的化し得る高レベルの体細胞超変異を可能とする系が提供される。当該系において変異され得るポリヌクレオチドには、発現され得且つＡＩＤ介在性の変異誘発を介して改変され得る任意のポリヌクレオチド配列が含まれる。そのようなポリヌクレオチドとしては、例えば、特異的結合メンバー、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、構造タンパク質、補因子、毒素、又は他の任意の目的のポリペプチド若しくはタンパク質或いはそれらの部分を含む、ポリペプチドをコードするものが挙げられる。１つの態様において、そのようなポリヌクレオチドは、可変重鎖若しくは軽鎖又はそれらの部分などの、免疫グロブリンポリペプチド（抗体）をコードする。
【０３５２】
本明細書では、少なくとも１つの成分（例えば、ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸配列、コード配列、遺伝エレメント、それらの部分など）を含むＳＨＭ系（例えば、ＳＨＭのための１以上のベクター（例、発現ベクター））が提供される。該成分としては、以下に限定されないが、該成分又はその部分が被るＳＨＭの率に正又は負のいずれかの影響を与えるように野生型から改変されたポリヌクレオチドが挙げられる。
【０３５３】
該ＳＨＭ系の１つの態様において、発現系の少なくとも１つの成分は、該成分が被るＳＨＭの率に負の影響を与えるように、全体的又は部分的に改変されたポリヌクレオチドを含む。この系の１つの態様において、該成分は、以下に限定されないが、ＡＩＤ、又はＡＩＤホモログ、Ｐｏｌイータ、選択マーカー、蛍光タンパク質、ＥＢＮＡ１、又はリプレッサー（若しくはトランスアクチベーター）タンパク質などのタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【０３５４】
該ＳＨＭ系の１つの態様において、発現系の少なくとも１つの成分は、該成分が被るＳＨＭの率に正の影響を与えるように、全体的又は部分的に野生型から改変されたポリヌクレオチドを含むか；或いは、例えば、抗体遺伝子の超可変領域、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン、酵素の活性部位、受容体の結合ドメイン、又は目的のサブドメイン若しくはドメインなどの、高いＳＨＭの率を有するポリヌクレオチドを含む。
【０３５５】
別の態様において、該ＳＨＭ系は以下を含む；ｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチド（該ポリヌクレオチドが被るＳＨＭの率に正の影響を与えるように、全体的又は部分的に野生型ポリヌクレオチドから改変されたポリヌクレオチドか、或いは、天然に高頻度のホットスポットを有するポリヌクレオチドであり得る）；ｉｉ）且つ、発現系が、ＳＨＭの率に対して負の影響を与えるように、全体的又は部分的に野生型から改変されたポリヌクレオチドも含む。
【０３５６】
一つの実施形態において、タンパク質又はその部分をコードするＳＨＭ感受性の遺伝子であって、該遺伝子では、該タンパク質又はその部分をコードする未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより高い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており、該合成遺伝子は、該未改変のポリヌクレオチド配列よりも高いホットスポットモチーフの密度を有する、前記遺伝子が本明細書で提供される。
【０３５７】
別の実施形態において、タンパク質又はその部分をコードするＳＨＭ耐性の合成遺伝子であって、該合成遺伝子では、該タンパク質又はその部分をコードする未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより低い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており、該合成遺伝子は、該未改変のポリヌクレオチド配列よりも高いコールドスポットの密度を有する、前記合成遺伝子が本明細書で提供される。
【０３５８】
さらに別の実施形態において、タンパク質又はその部分をコードする、選択的に標的化された、ＳＨＭに最適化された合成遺伝子であって、該合成遺伝子では、該タンパク質又はその部分をコードする未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより高い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており；該合成遺伝子は、該未改変のポリヌクレオチド配列よりも高いホットスポットモチーフの密度を有し；且つ、該タンパク質又はその部分をコードする該未改変のポリヌクレオチド配列における１つ以上の第３のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより低い１つ以上の第４のＳＨＭモチーフによって置換されており、該合成遺伝子は、該未改変のポリヌクレオチド配列よりも高いコールドスポットの密度を有し；該選択的に標的化された、ＳＨＭに最適化された合成遺伝子は、標的化されたＡＩＤ介在性の変異誘発を示す、前記合成遺伝子が本明細書で提供される。
【０３５９】
さらに別の非限定的な態様において、該合成遺伝子は、好ましいＳＨＭホットスポットモチーフを導入する１以上のアミノ酸変異を含む。
【０３６０】
即ち、１つの態様では、本発明は、ＳＨＭ耐性（「コールド」）又はＳＨＭ感受性（「ホット」）遺伝子の作成方法であって、該遺伝子では、合成タンパク質の翻訳効率（即ち、哺乳動物細胞において首尾よく発現される能力）を維持しつつ、ホットスポット又はコールドスポット密度が、未改変の密度から改変されている、前記方法を含む。
【０３６１】
１つの態様において、本発明の合成ＳＨＭ耐性遺伝子は、１００ヌクレオチド当たり７ホットスポット未満である、平均ホットスポット密度を有する。別の態様において、該合成ＳＨＭ耐性遺伝子は、１００ヌクレオチド当たり１６コールドスポットを上回る、平均コールドスポット密度を有する。
【０３６２】
好ましい態様において、本発明の合成ＳＨＭ耐性遺伝子は、１００ヌクレオチド当たり６ホットスポット未満である、平均ホットスポット密度を有する。別の態様において、該合成ＳＨＭ耐性遺伝子は、１００ヌクレオチド当たり１８コールドスポットを上回る、平均コールドスポット密度を有する。別の態様において、該合成ＳＨＭ耐性遺伝子は、１００ヌクレオチド当たり２０コールドスポットを上回る、平均コールドスポット密度を有する。別の態様において、該合成ＳＨＭ耐性遺伝子は、１００ヌクレオチド当たり２２コールドスポットを上回る、平均コールドスポット密度を有する。
【０３６３】
１つの態様において、本発明の合成ＳＨＭ感受性遺伝子は、１００ヌクレオチド当たり１３コールドスポット未満である、平均コールドスポット密度を有する。別の態様において、該合成ＳＨＭ感受性遺伝子は、１００ヌクレオチド当たり１０ホットスポットを上回る、平均ホットスポット密度を有する。
【０３６４】
好ましい態様において、本発明の合成ＳＨＭ感受性遺伝子は、１００ヌクレオチド当たり１１コールドスポット未満である、平均コールドスポット密度を有する。別の態様において、該合成ＳＨＭ感受性遺伝子は、１００ヌクレオチド当たり１３ホットスポットを上回る、平均ホットスポット密度を有する。別の態様において、該合成ＳＨＭ感受性遺伝子は、１００ヌクレオチド当たり１４ホットスポットを上回る、平均ホットスポット密度を有する。別の態様において、該合成ＳＨＭ感受性遺伝子は、１００ヌクレオチド当たり１６ホットスポットを上回る、平均ホットスポット密度を有する。
【０３６５】
別の態様において、合成ＳＨＭ感受性ポリヌクレオチドは、少なくとも１２の連続的なヌクレオチドにわたって、１００ヌクレオチド当たり２０ホットスポットを上回る、平均ホットスポット密度を有する。別の態様において、合成ＳＨＭ感受性ポリヌクレオチドは、少なくとも１５の連続的なヌクレオチドにわたって、１００ヌクレオチド当たり２０ホットスポットを上回る、平均ホットスポット密度を有する。別の態様において、合成ＳＨＭ感受性ポリヌクレオチドは、少なくとも１８の連続的なヌクレオチドにわたって、１００ヌクレオチド当たり２０ホットスポットを上回る、平均ホットスポット密度を有する。別の態様において、合成ＳＨＭ感受性ポリヌクレオチドは、少なくとも３０の連続的なヌクレオチドにわたって、１００ヌクレオチド当たり２０ホットスポットを上回る、平均ホットスポット密度を有する。
【０３６６】
１つの非限定的な例において、合成遺伝子は、オープンリーディングフレーム内に挿入されたストップモチーフを含む遺伝子を含まない。
【０３６７】
本明細書に記載の各ＳＨＭ系において、系はさらに、以下の更なるエレメントの１以上を含み得る：ｉ）ＡＩＤ又はＡＩＤホモログの発現を調節するための誘導性の系、ｉｉ）１以上のエンハンサー、ｉｉｉ）１以上のＥ−ボックス、ｉｖ）ＳＨＭに関する１以上の補助因子、又は、ｖ）安定なエピソーム発現のための１以上の因子（例えば、ＥＢＮＡ１若しくはＥＢＰ２）。
【０３６８】
ＳＨＭ系の別の態様において、当該系は、２つのポリヌクレオチドを含み、両ポリヌクレオチドは、プロモーターの近位に位置する。当該系の１態様において、このプロモーターは、二方向性ＣＭＶプロモーターなどの二方向性プロモーターであり得る。
【０３６９】
別の態様において、ポリヌクレオチドは、抗体鎖をコードし得る。例えば、重鎖又は軽鎖は、発現のためのベクター中に挿入され得る。別の態様において、ポリヌクレオチドは、任意のタンパク質、即ち、野生型ポリペプチド、非野生型ポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチド、又はそれらの任意の部分（非限定的には例えば、抗体重鎖又はそのフラグメント、抗体軽鎖又はそのフラグメント、酵素、受容体、構造タンパク質、補因子、合成ペプチド、細胞内抗体、又は毒素）をコードし得る。
【０３７０】
所望の性質を有する遺伝子産物を調製するための方法であって、該方法は：ａ）体細胞超変異の増加を示す遺伝子産物をコードする合成遺伝子を調製することを含み；ｂ）細胞集団において該合成遺伝子を発現させることを含み；該細胞集団は、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を発現するか、又は誘導因子の添加によりＡＩＤを発現するように誘導され得；且つ、ｃ）該所望の性質を有する変異した遺伝子産物を発現する、該細胞集団内の細胞（単数又は複数）を選択することを含む、前記方法が本明細書で提供される。１つの態様では、該方法は、該細胞集団におけるＡＩＤの発現を活性化又は誘導することを更に含んでも良い。別の態様では、該方法は、（ｃ）において同定された細胞（単数又は複数）から１つ以上のクローン細胞集団を確立することを更に含んでも良い。該方法のまた別の態様では、少なくとも１つの合成遺伝子は、本明細書の他の箇所に記載されるいずれか１つの発現ベクターなどの発現ベクター内に位置する。該方法の１つの態様では、該細胞は、本明細書の他の箇所に記載される細胞である。
【０３７１】
所望の性質を有する遺伝子産物を調製するための方法であって、該方法は：ａ）細胞集団において該遺伝子産物を発現させることを含み；該細胞集団は、体細胞超変異の減少を示す少なくとも１つの合成遺伝子を含み；且つ該細胞集団は、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を発現するか、又は誘導因子の添加によりＡＩＤを発現するように誘導され得る、前記方法が本明細書で提供される。本明細書では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおけるホットスポット及び／又はコールドスポットを改変することにより、ＳＨＭ感受性又はＳＨＭ耐性のポリヌクレオチドを生成する方法が提供される。ＳＨＭ感受性又はＳＨＭ耐性のポリペプチドを生成する方法は、以下を含む：ａ）ポリペプチド又はその部分を同定すること；ｂ）同定されたポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を生成すること、ｃ）該ポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸を実質的に変えることなく、該ポリヌクレオチド配列内のホットスポット及び／又はコールドスポットの頻度を増加又は減小させるように該ポリヌクレオチド配列におけるコドン用法を変更するか、又はリーディングフレームに対する該ポリヌクレオチド配列内のホットスポット及び／又はコールドスポットの位置を変更すること；ｄ）該頻度が、ポリヌクレオチド配列を選択すること、及び、ｂ）該所望の性質を有する変異した遺伝子産物（例えば、１つ以上の変異を有する変異した合成遺伝子によってコードされるポリペプチド）を発現する、該細胞集団内の細胞（単数又は複数）を選択することを含む、前記方法が本明細書で提供される。１つの態様では、該方法は、該細胞集団におけるＡＩＤの発現を活性化又は誘導することを更に含んでも良い。別の態様では、該方法は、（ｂ）において同定された細胞（単数又は複数）から１つ以上のクローン細胞集団を確立することを更に含んでも良い。該方法のまた別の態様では、少なくとも１つの合成遺伝子は、本明細書の他の箇所に記載されるいずれか１つの発現ベクターなどの発現ベクター内に位置する。該方法の１つの態様では、該細胞は、本明細書の他の箇所に記載される細胞である。
【０３７２】
１つの態様において、合成遺伝子によってコードされるタンパク質は、抗体又はその抗原結合フラグメント、選択マーカー、蛍光タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、酵素、受容体、構造タンパク質、毒素、補因子及び転写因子から選択される。
【０３７３】
本明細書では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおけるホットスポット及び／又はコールドスポットを改変することによる、ＳＨＭ感受性又はＳＨＭ耐性のポリヌクレオチドの生成方法が提供される。ＳＨＭ感受性又はＳＨＭ耐性のポリペプチドの生成方法は、以下を含む：ａ）ポリペプチド又はその部分を同定すること；ｂ）ポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸を実質的に変える同定されたものをコードするポリヌクレオチド配列を生成すること；ｄ）ホットスポット及び／又はコールドスポットの頻度が所望の程度まで改変されたポリヌクレオチド配列を選択すること。１つの態様において、ホットスポットの頻度は、約０％から約２５％改変され得、別の態様において、約２５％から約５０％改変され得る。なお別の態様において、全ての可能なホットスポット又はコールドスポットの、約５０％から約７５％、さらに別の態様において、約７５％から約１００％である。
【０３７４】
所望の性質を有する遺伝子産物を調製するための方法であって、該方法は：（ａ）細胞集団において合成遺伝子を発現させることを含み；該細胞集団は、ＡＩＤを発現するか、又は誘導因子の添加によってＡＩＤを発現するように誘導され得；且つ（ｂ）該所望の性質を有する改変された遺伝子産物を発現する該細胞集団内の細胞（単数又は複数）を選択することを含む、前記方法が本明細書では提供される。
【０３７５】
本発明の別の態様において、ポリヌクレオチド配列はまた、好ましくないコドン又はモチーフを、より好ましいコドン又はモチーフに置換することによっても改変され得る。
【０３７６】
本発明の別の態様において、ポリヌクレオチド配列はまた、ホットスポットの頻度及び又は位置をさらに改変するように、ヌクレオチドを置換又は交換することによって改変され得る。１つの態様において、これらのヌクレオチド置換は、保存的なアミノ酸の交換であり得るか、又はタンパク質ファミリーにわたって変化する領域に位置し得る。
【０３７７】
配列をＳＨＭに対して感受性又は耐性にすることによって、ＳＨＭのために配列を最適化する方法であって、該方法は；ａ）ポリヌクレオチド配列を同定するステップを含み；ｂ）該ポリヌクレオチド配列内のホットスポット又はコールドスポットの頻度及び／又は位置を変更するように、並びに、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度、予測されるステップループ（ｓｔｅｐ−ｌｏｏｐ）構造の形成；制限部位の頻度、哺乳動物のコドン用法；全体のＧＣ含量を約６０％未満に制限すること；６を上回る（＞）同一のヌクレオチドストレッチを最小化又は除去すること、からなる最適化因子群から選択される少なくとも２つのパラメーターを変更するように、該ポリヌクレオチド配列におけるコドン用法を変更するステップを含み；該ＳＨＭ感受性又はＳＨＭ耐性の配列は、改変されたＳＨＭへの感受性を示し、且つ未改変のポリヌクレオチド配列と同等のレベルで、細胞内でタンパク質に翻訳される、前記方法が本明細書で提供される。
【０３７８】
本方法の１つの態様において、工程ｂ）は、最適化因子群の少なくとも３つのパラメーターの変更を伴う。
【０３７９】
本方法の１つの態様において、工程ｂ）は、最適化因子群の少なくとも４つのパラメーターの変更を伴う。
【０３８０】
本方法の１つの態様において、工程ｂ）は、最適化因子群の少なくとも５つのパラメーターの変更を伴う。
【０３８１】
本方法の１つの態様において、工程ｂ）は、最適化因子群の少なくとも６つのパラメーターの変更を伴う。
【０３８２】
１つの態様において、工程ｂ）は、ｐｅｒｌプログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎ．ｐｌ（ｗｗｗ．ＰＥＲＬ．ＣＯＭ／ＤＯＷＮＬＯＡＤ．ＣＳＰ）を使用することによって行われる。
【０３８３】
これらの方法は、任意の配列のＳＨＭ感受性又はＳＨＭ耐性ポリヌクレオチドを生成するために使用され得る。いずれの場合においても、ポリヌクレオチドは、少なくとも１８ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含み得、目的のポリヌクレオチドがＲＮＡへと効率的に転写されることを可能とするように、調節エレメントに作動可能に連結され得る。ポリヌクレオチドは、当該分野で理解される標準的な技術を使用して、ベクター中にクローニングすることができる。１つの態様において、ベクターは、本明細書に記載のベクターである。
【０３８４】
このような方法を使用して全体的又は部分的に改変されるポリヌクレオチドの非限定的な例としては、野生型ポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、又はそれらの任意の部分が挙げられる。ポリヌクレオチドは、タンパク質又はポリペプチド配列をコードし得る。
【０３８５】
本明細書では、本明細書に記載の方法を使用して生成された種々の遺伝子をコードするＳＨＭ耐性ポリヌクレオチド配列が提供される。１つの非限定的な実施形態において、遺伝子は、ＳＨＭに関与する酵素であり、これには、以下に限定されないが、本明細書に記載の方法によって作られた、活性化誘導シチジンアミナーゼ（ＡＩＤ）、Ｐｏｌイータ、及びＵＤＧが含まれる。
【０３８６】
１つの実施形態において、ＳＨＭに関与する酵素をコードするＳＨＭ耐性ポリヌクレオチドは、脊椎動物由来である。１つの態様において、遺伝子は哺乳動物由来であり、１つの態様において、ラット、イヌ、ヒト、マウス、ウシ、及び霊長類からなる群から選択される哺乳動物由来である。
【０３８７】
１つの実施形態において、ＳＨＭ耐性の酵素は、配列番号２２と少なくとも９０％同一な核酸配列を有するＡＩＤである。
【０３８８】
１つの実施形態において、ＳＨＭ耐性遺伝子は、配列番号２３と少なくとも９０％同一な核酸配列を有するＰｏｌイータである。
【０３８９】
１つの実施形態において、ＳＨＭ耐性遺伝子は、配列番号２４と少なくとも９０％同一な核酸配列を有するＵＤＧである。
【０３９０】
１つの実施形態において、コールドＡＩＤは、ミューテーター活性の増加を示す変異型酵素である。変異型ＡＩＤは、強力な核移行シグナル（ＮＬＳ）、核外移行シグナルの活性を改変する変異、又は両方を含み得る。
【０３９１】
１つの態様において、変異型ＡＩＤは、改変されるＡＩＤのミューテーター活性を増強する、ＡＩＤの１８０から１９８の位置（配列番号３１１）における独立して選択される１以上の変異によって作られた、改変型の核外移行配列を含む。
【０３９２】
変異型ＡＩＤの１つの実施形態において、改変型の核外移行配列は、ロイシン１８１（Ｌ１８１）、ロイシン１８３（Ｌ１８３）、ロイシン１８９（Ｌ１８９）、ロイシン１９６（Ｌ１９６）及び／又はロイシン１９８（Ｌ１９８）のアミノ酸残基位置における１以上の変異を含む。１つの非限定的な例において、核外移行配列内の各ロイシン残基は、アラニンに変異され得る。
【０３９３】
１つの実施形態において、ロイシン１８１、１８３、１８９、１９６及び１９８の各々は、グリシン、アラニン、イソロイシン、バリン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸又はリジンにより独立して置換され得る。別の実施形態において、各ロイシンは、グリシン、アラニン又はセリンにより独立して置換され得る。１つの実施形態において、変異タンパク質は、Ｌ１８１Ａ、Ｌ１８３Ａ、Ｌ１８９Ａ、Ｌ１９６Ａ及びＬ１９８Ａから選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ又は少なくとも４つの変異を含む。
【０３９４】
変異型ＡＩＤの１つの実施形態において、改変型の核外移行配列は、アスパラギン酸１８７（Ｄ１８７）、アスパラギン酸１８８（Ｄ１８８）、アスパラギン酸１９１（Ｄ１９１）及び／又はスレオニン１９５（Ｔ１９５）の１つ以上のアミノ酸残基位置における変異を含む。１つの非限定的な例において、改変型の核外移行配列は、Ｄ１８７Ｅの変異を含む。１つの非限定的な例において、核外移行配列内の各アスパラギン酸残基は、グルタミン酸に変異され得る。別の非限定的な例において、スレオニン１９５は、イソロイシンに変異され得る。
【０３９５】
１つの実施形態において、アスパラギン酸１８７、１８８及び１９１の各々は、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン又はグルタミンにより独立して置換され得る。別の実施形態において、各アスパラギン酸は、グルタミン酸又はアスパラギンにより独立して置換され得る。１つの態様において、変異タンパク質は、Ｄ１８７Ｅ、Ｄ１８８Ｅ、Ｄ１９１Ｅ、Ｔ１９５Ｉ及びＬ１９８Ａから選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ又は少なくとも４つの変異を含む。
【０３９６】
変異型ＡＩＤポリペプチドはまた、Ｎ末端又はＣ末端であり得る核局在化シグナルも含み得る。１つの非限定的な例において、変異型ＡＩＤは、これに限定されないがＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３４０）などの、強力な核局在化シグナルを含み得る。別の非限定的な例において、ＮＬＳは、モチーフＫ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒに従う配列であり得る。
【０３９７】
別の態様において、変異型ＡＩＤは、強力なＮＬＳ及び改変型の核外移行配列の両方を含む。１つの非限定的な例において、改変型の核外移行配列は、１以上の以下の変異を含む：Ｌ１８１Ａ、Ｌ１８３Ａ、Ｌ１８９Ａ、Ｌ１９６Ａ及びＬ１９８Ａ。別の非限定的な例において、改変型の核外移行配列は、１以上の以下の変異を含む：Ｄ１８７Ｅ、Ｄ１８８Ｅ、Ｄ１９１Ｅ、Ｔ１９５Ｉ及びＬ１９８Ａ。
【０３９８】
これらの任意の変異型ＡＩＤにおいて、遺伝子は、ＳＨＭ耐性、ＳＨＭ感受性であり得、又は、ＳＨＭ感受性に関係なく、選択された宿主細胞でのＡＩＤの発現のために適切な最適コドン用法を含み得る。目的のタンパク質にＳＨＭを標的化するための発現系において使用される場合、変異型ＡＩＤはＳＨＭ耐性であり得る。
【０３９９】
別の実施形態において、ＳＨＭ耐性遺伝子は、選択マーカー遺伝子である。１つの非限定的な実施形態において、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリン、アンピシリン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン  ＤＨＦＲ  ネオマイシン、ゼオシンＴＭ、チミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ及びアデノシンデアミナーゼからなる群から選択される。
【０４００】
１つの態様において、ＳＨＭ耐性遺伝子は、配列番号２５と少なくとも９０％同一な核酸配列を有するテトラサイクリン耐性遺伝子である。
【０４０１】
１つの態様において、ＳＨＭ耐性遺伝子は、配列番号２６と少なくとも９０〜９５％同一な核酸配列を有するブラストサイジン耐性遺伝子である。
【０４０２】
１つの態様において、ＳＨＭ耐性遺伝子は、配列番号２７と少なくとも９０％同一な核酸配列を有するピューロマイシン耐性遺伝子である。
【０４０３】
１つの態様において、ＳＨＭ耐性遺伝子は、配列番号２８と少なくとも９０％同一な核酸配列を有するハイグロマイシン耐性遺伝子である。
【０４０４】
１つの態様において、ＳＨＭ耐性遺伝子は、配列番号２９と少なくとも９０％同一な核酸配列を有するネオマイシン耐性遺伝子である。
【０４０５】
１つの態様において、ＳＨＭ耐性遺伝子は、配列番号３０と少なくとも９０％同一な核酸配列を有するゼオシン耐性遺伝子である。
【０４０６】
１つの態様において、ＳＨＭ耐性遺伝子は、配列番号３１と少なくとも９５％同一な核酸配列を有するチミジンキナーゼである。
【０４０７】
本発明にはまた、特定の目的の遺伝子の最適化バージョンであって、ＳＨＭ介在性の不活性化に特異的に感受性であり、且つＳＨＭの活性化が該遺伝子の機能を選択的にノックアウトするために使用され得るものも含まれる。例えば、目的の遺伝子は、ＳＨＭ介在性の変異誘発の結果としてストップコドンを導入する、１以上のホットスポットモチーフを含み得る。
【０４０８】
本明細書ではまた、種々の目的のタンパク質をコードするＳＨＭに最適化されたポリヌクレオチド配列又はその部分であって、該タンパク質の改良バージョンが本発明のＳＨＭ系を使用して迅速に進化されることを可能とするものも提供される。例えば、当該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質又はその部分は、より高い親和性、選択性、安定性又は溶解性へと反復して進化され得る抗体遺伝子を含む。
【０４０９】
ＳＨＭによって最適化され得る他の例示的なポリヌクレオチド配列としては、以下に限定されないが、以下のタンパク質毒素、成長因子、神経伝達物質、補因子、転写因子（例えば、ジンクフィンガー結合タンパク質）、受容体（例えば、Ｆｃ受容体）（これら全ては、本発明を使用して進化され得る）が挙げられる。具体的な目的のタンパク質、及びその改良形態への進化については、セクションＸにおいて詳細に論じる。
【０４１０】
Ｂ．ベクター系
本明細書では、構造タンパク質、耐性マーカー及びＳＨＭのための他の因子の変異生成を抑制しつつ、標的核酸配列、遺伝子、又はそれらの部分の選択的な改変を促進するために、本明細書に記載のＳＨＭ系のいずれかにおいて使用するためのレプリコンが提供される。
【０４１１】
このようなレプリコンは、ＳＨＭに耐性である、少なくとも１つの合成ポリヌクレオチド配列を含み得る。１つの態様では、該レプリコンは、ＳＨＭのために最適化されている設計されたヌクレオチド配列であるか又はＳＨＭのために最適化されているヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つの未改変又は合成の目的のポリヌクレオチド配列を含み得る。ある実施形態では、該レプリコンは、ミューテーター細胞系における１以上の目的のポリヌクレオチドの発現を可能とする発現調節領域を含み得る。
【０４１２】
適切なレプリコンは、任意の公知のウイルスベクター若しくは非ウイルスベクター又は人工染色体に基づき得る。発現系は、ＳＨＭのための協調的な系を創出するように併せて使用され得る、種々のレプリコンの任意の組み合わせを含み得る。
【０４１３】
１つの態様において、本発明のために適切なレプリコンは、ＳＨＭに耐性である合成ポリヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の挿入又は置換によって作成される。
【０４１４】
別の態様において、本発明のために適切なレプリコンは、ＳＨＭのために最適化されている合成ポリヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の挿入又は置換によって作成される。
【０４１５】
別の態様において、本発明のために適切なレプリコンは、ＳＨＭのために最適化されている合成ポリヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の挿入又は置換によって作成され、且つ該レプリコンはまた、ＳＨＭに耐性である合成ポリヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド配列も含む。好ましい実施形態において、該レプリコンは、ミューテーター細胞系内の１以上の合成ポリヌクレオチド配列の発現が可能である。
【０４１６】
適切なベクターは、本明細書に記載のもの、当該分野で公知のもの、又は将来発見若しくは設計されるものを含む、任意の公知のエピソームベクター又は組込みベクターに基づき得る。
【０４１７】
代表的な市販のウイルス発現ベクターには以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．から入手可能なＰｅｒ．Ｃ６系などのアデノウイルスベースの系、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＬＰ１などのレンチウイルスベースの系、並びにＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なレトロウイルスベクターｐＦＢ−ＥＲＶ及びｐＣＦＢ−ＥＧＳＨなどのレトロウイルスベクター。
【０４１８】
エピソーム発現ベクターは、宿主細胞において複製可能であり、適切な選択圧の存在下で、宿主細胞内において、染色体外エピソームとして存続する（例えば、Ｃｏｎｅｓｅら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：１７３５−１７４２（２００４）を参照のこと）。代表的な市販のエピソーム発現ベクターとしては、エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を利用するエピソームプラスミドが挙げられるがこれに限定されない。具体例としては、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのベクターｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７が挙げられる。ＥＢＶベースのベクターの宿主範囲は、ＥＢＮＡ１結合タンパク質２（ＥＰＢ２）を通じて実質的にあらゆる真核生物細胞種にまで増すことができ（Ｋａｐｏｏｒら、ＥＭＢＯ．Ｊ．２０：２２２−２３０（２００１））、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのベクターｐｃＤＮＡ３．１、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＢＫ−ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１及びｏｒｉＰの代わりにＴ抗原及びＳＶ４０複製起点を使用するエピソームベクターの非限定的な例を示す。
【０４１９】
組込み発現ベクターは、宿主細胞のＤＮＡ中にランダムに組み込まれ得るか、発現ベクターと宿主細胞染色体との間の特異的組換えを可能にする組換え部位を含み得る。このような組込み発現ベクターは、所望のタンパク質の発現をもたらすために、宿主細胞染色体の内因性発現制御配列を利用できる。部位特異的な様式で組み込まれるベクターの例としては、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｆｌｐ−ｉｎ系（例えば、ｐｃＤＮＡＴＭ５／ＦＲＴ）又はｃｒｅ−ｌｏｘ系（例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＥｘｃｈａｎｇｅ−６  Ｃｏｒｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓ中に見出され得る）の成分が挙げられる。ランダムな様式で宿主細胞染色体中に組み込まれるベクターの例としては、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ３．１（Ｔ抗原の非存在下で導入する場合）、ＰｒｏｍｅｇａのｐＣＩ又はｐＦＮ１０Ａ（ＡＣＴ）Ｆｌｅｘｉ（登録商標）が挙げられる。
【０４２０】
或いは、発現ベクターは、目的の内因性遺伝子の発現を調節するために、細胞中の遺伝子座に強力なプロモーター又はエンハンサー配列を導入し及び組み込むために使用され得る（Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ＭＲ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．（２００５）；６（６）：５０７−１２；Ｓｃｈｉｎｄｅｈｕｔｔｅら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（２００５）；２３（１）：１０−５）。このアプローチは、誘導性プロモーター（例えば、Ｔｅｔ−Ｏｎプロモーター（米国特許第５，４６４，７５８号及び同第５，８１４，６１８号））を、目的の内因性遺伝子の誘導性の発現を提供するために、細胞のゲノムＤＮＡ中に挿入するためにも、使用できる。活性化コンストラクトは、目的の遺伝子に特異的な所望の遺伝子座への活性化配列の相同組換え又は非相同組換えを可能にするための標的化配列も含むことができる（例えば、Ｇａｒｃｉａ−Ｏｔｉｎ＆Ｇｕｉｌｌｏｕ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．（２００６）１１：１１０８−３６を参照のこと）。或いは、誘導性リコンビナーゼ系（例えば、Ｃｒｅ−ＥＲ系）が、４−ヒドロキシタモキシフェンの存在下で導入遺伝子を活性化するために使用され得る（Ｉｎｄｒａら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９９）２７（２２）：４３２４−４３２７；Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（２０００）２８（２３）：ｅ９９；及び、米国特許第７，１１２，７１５号）。
【０４２１】
発現ベクターに含めるべきエレメントは当該分野で周知であり、例えば上述の合成ポリヌクレオチド配列を有する１以上のポリヌクレオチド配列の挿入又は置換を通じて、任意の既存のベクターを本発明における使用のために容易に改変することができる。
【０４２２】
本発明の発現ベクターは、単一レプリコン上又は複数レプリコン内のいずれかで、作動可能に連結された１以上の以下のエレメントを含み得る：発現調節配列、目的の遺伝子のオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド、転写終結シグナル、複製起点、及び選択マーカー遺伝子。
【０４２３】
発現ベクターはまた、１以上の内部リボソーム侵入部位、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質の精製を容易にするための１以上のタグ（例えば、ＶＳＶタグ、ＨＡタグ、６ｘＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ）、１以上のレポーター遺伝子、ＥＢＮＡ１（エピソーム複製が、ＯｒｉＰベースのベクター及び又はＥＢＰ２のために所望される場合；ＥＢＮＡ１及びｏｒｉＰの代替として、ＳＶ４０  ｏｒｉと組み合わせて、Ｔ抗原も使用され得る）、宿主細胞の染色体ＤＮＡに対するベクターのコピー数を検証するために使用され得る遺伝子部分などの、コピー解析のための１以上の部分（例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｈＧ６ＰＤＨ）（又はそのバリアント）、ＳＨＭのための１又は酵素若しくは因子（例えば、ＡＩＤ、ｐｏｌイータ、ＵＤＧ、エンハンサー配列）も含み得る。
【０４２４】
発現ベクターはまた、標的配列の発現を低減するため（例えば、Ｐｏｌベータのレベルを低減するためなど）のアンチセンス、リボザイム又はｓｉＲＮＡポリヌクレオチドも含み得る（例えば、Ｓｉｏｕｄ  Ｍ及びＩｖｅｒｓｅｎ、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ（２００５）６（６）：６４７−５３；Ｓａｎｄｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００５）３９（２）：２１５−２４を参照のこと）。
【０４２５】
ある場合には、さらなる特徴付けのために、表面ディスプレイされたタンパク質を分泌タンパク質に変換することが所望され得る。変換は、選択的プロテアーゼ（例えば、第Ｘ因子、トロンビン又は任意の他の選択的タンパク分解剤）とのインキュベーションによって切断され得る特異的リンカーの使用によって達成できる。ベクター中のコードされたタンパク質の遺伝子操作を可能にする（即ち、タンパク質のリーディングフレームからの表面結合シグナルの切り出しを可能にする）ポリヌクレオチド配列を含むことも可能である。例えば、随意に目的のタンパク質の結合シグナルの選択的除去及び引き続く細胞内蓄積（又は分泌）を可能にする、１以上の独自の制限部位、又はｃｒｅ／ｌｏｘエレメント、又は他の組換えエレメントの挿入。さらなる例には、目的のタンパク質の効率的な細胞表面発現を可能にする、結合シグナル（例えば、膜貫通ドメイン）の周囲の隣接するｌｏｘＰ部位の挿入が含まれる。しかし、細胞におけるｃｒｅリコンビナーゼの発現の際、ＬｏｘＰ部位間で組換えが生じ、結合シグナルの喪失を生じ、それにより目的のタンパク質の分泌を導く。
【０４２６】
ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質をコードするプラスミド（ＤＮＡ２．０により合成され、発現ベクター中に挿入されたオープンリーディングフレーム（ｆｒｏｍ））は、目的の細胞集団に、一過的にトランスフェクトされ得る（又はウイルスにより形質導入され得る）。発現されたｃｒｅリコンビナーゼタンパク質による作用は、さらなる研究のために次に使用され得る、トランスフェクトされた細胞集団における分泌形態の該タンパク質の翻訳及び産生を生じるコード領域の膜貫通部分のｉｎ  ｓｉｔｕ除去を導く。
【０４２７】
エレメントの順序及び数は、当業者によって決定され得る。
【０４２８】
以下の実施例５は、本明細書で提供されるＳＨＭ系のいずれかにおいて使用され得るベクターの簡単な説明を提供している。
【０４２９】
簡潔に述べれば、１つの態様において、本明細書では、以下を含む、超変異能力を有する（超変異コンピテントな）エピソーム発現ベクターが提供される：１以上の複製起点（例えば、原核生物のｏｒｉ（ｃｏｌＥ１など）、及び１以上の真核生物の複製起点（ｏｒｉＰ若しくはＳＶ４０−ｏｒｉ、又はｏｒｉＰ及びＳＶ４０  ｏｒｉの両方など））、１以上の選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性遺伝子）、１以上のｂ−アクチン若しくはＧ６ＰＤＨ断片又はそれらのバリアント、１以上のプロモーター（例えば、ｐＣＭＶプロモーター）（それらの少なくとも１つは、超変異が所望される遺伝子（単数又は複数）の転写を引き起こす）、核酸配列又は遺伝子を挿入するための１以上の制限部位、任意で、１以上の分泌シグナル、付着シグナル、目的の遺伝子（単数又は複数）のための精製タグ（例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ）、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、１以上のピューロマイシン遺伝子、及び１以上の転写終結シグナル。転写終結シグナルは、３’非翻訳領域、随意のイントロン（介在配列又はＩＶＳとも呼ばれる）及び１以上のポリアデニル化シグナル（ｐ（Ａ））の領域を含み得る。１つの非限定的な例において、エピソーム発現ベクターは、蛍光を増加又は減少させるため又は吸収若しくは発光の波長を変化させるために、ＳＨＭのためのベクターに挿入された、蛍光タンパク質のための核酸配列を有し得る。
【０４３０】
別の態様において、本明細書では、組換え系及び作動可能に連結された１以上の以下のエレメントを含む組込み発現ベクターが提供される；発現調節配列、目的の遺伝子のオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド、転写終結シグナル、複製起点及び選択マーカー遺伝子。
【０４３１】
発現ベクターはまた、１以上の内部リボソーム侵入部位、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質の精製を容易にするための１以上のタグ（例えば、ＶＳＶタグ、ＨＡタグ、６ｘＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ）、１以上のレポーター遺伝子、コピー解析のための１以上の部分、ＳＨＭのための１又は酵素若しくは因子（例えば、ＡＩＤ、ｐｏｌイータ、ＵＤＧ、Ｉｇエンハンサー配列）も含み得る。
【０４３２】
１つの非限定的な実施形態において、発現ベクターは、目的の遺伝子の、ゲノム遺伝子座（例えば、Ｉｇ遺伝子座）への挿入を可能とするように設計される。
【０４３３】
Ｃ．転写及び超変異のための系
１．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ発現系及び超変異系
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系及び超変異系には、ＤＮＡテンプレートの転写又は連動した転写及び翻訳を可能にし、並びにＳＨＭを介した進行性の変異誘発を可能にする、無細胞系が挙げられる。１実施形態において、このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系及び超変異系は、リボソームディスプレイと組み合わせて使用されて、タンパク質の進行性の変異誘発及び選択を可能にすることができる。
【０４３４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系としては、例えば、古典的なウサギ網状赤血球系、並びに新規無細胞合成系が挙げられる（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）１１０（３）２５７−６３；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．（２００４）１０  １−３０）。リボソームディスプレイのための系は、例えば、Ｖｉｌｌｅｍａｇｎｅら、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．（２００６）３１３（１−２）１４０−１４８）に記載されている。
【０４３５】
１つの態様において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ超変異系は、目的の遺伝子の発現のための発現カセットを含む、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドライブラリーを含み得る。目的の遺伝子は、ＳＨＭのために最適化された配列を含む、合成又は半合成の遺伝子であり得る。リボソームディスプレイのために、ポリヌクレオチドは、翻訳後にリボソームに結合したままとなるように、ストップコドンを欠いていても良い。
【０４３６】
目的の遺伝子の転写及び又は翻訳をもたらすために、当該系は、例えば精製された７０Ｓリボソームと共に組換え因子を使用することを介する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写及び翻訳のための、精製又は半精製された成分を含むであろう。進行性のＳＨＭを可能とするために、系は更に、組換え若しくは精製されたＡＩＤ、及び／又はＳＨＭ／ＤＮＡ修復のための他の因子を含むであろう。最適化されたタンパク質は、表面ディスプレイされたタンパク質について説明したように、機能的な選択を介して選択され、次いで関連するリボソームは、有益な変異の素性を決定するために配列決定されるであろう。
【０４３７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ超変異系であって：ａ）合成遺伝子を含むポリヌクレオチド；ｂ）組換えＡＩＤ；及びｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系を含む、系が本明細書で提供される。１態様では、該合成遺伝子は、ＳＨＭのために最適化されている。該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系は、転写後の核酸を増幅させるためのポリメラーゼを更に含み得る。該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を更に含み得る。１つの態様では、該ポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載されるいずれか１つの発現ベクターなどの発現ベクター内に位置する。該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系は、本明細書の他の箇所に記載される細胞の細胞集団を更に含み得る。
【０４３８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発のためのキットであって：ａ）組換えＡＩＤタンパク質；ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の１つ以上の試薬；及びｃ）合成遺伝子の設計又は使用のための説明書を含む、キットが本明細書で提供される。該キットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳用の１つ以上の試薬を更に含み得る。該キットは、例えば本明細書に記載されるいずれか１つの発現ベクターなどの発現ベクターを含むことを更に含み得る。該キットは、本明細書の他の箇所に記載される細胞の細胞集団を更に含み得る。
【０４３９】
２．細胞の発現及び超変異系
細胞ベースの発現及び超変異系は、任意の適切な原核生物又は真核生物の発現系を含む。好ましい系は、容易且つ確実に増殖でき、合理的に速い増殖速度を有し、充分特徴付けられた発現系を有し、容易且つ効率的に形質転換又はトランスフェクトできる、系である。
【０４４０】
ａ．原核生物発現系
これらの一般的ガイドラインにおいて、有用な微生物宿主としては、以下に限定されないが、属Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ由来の細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、種々の株のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、（ＡＴＣＣ  ＮＯ．３３６９４）ＤＨ５α、ＤＨ１０及びＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ  ＮＯ．５３３３８））が挙げられる。
【０４４１】
ｂ．酵母
当業者に公知の多くの酵母細胞株もまた、ポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能であり、これには、属Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ並びに他の真菌由来のものが含まれる。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅ及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０４４２】
ｃ．昆虫細胞
さらに、所望の場合、昆虫細胞系が本発明の方法において利用できる。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：８１０−８１７（１９９３）；Ｌｕｃｋｌｏｗ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４：５６４−５７２（１９９３）；及びＬｕｃｋｌｏｗら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：４５６６−４５７９（１９９３）に記載されている。好ましい昆虫細胞としては、Ｓｆ−９及びＨＩ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０４４３】
ｄ．哺乳動物発現系
多数の適切な哺乳動物宿主細胞もまた当該分野で公知であり、多くがＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９から入手可能である。例としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ６１）ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：４２１６−４２２０（１９８０））、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３若しくは２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）、又は３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ９２）。形質転換、培養、増幅、スクリーニング並びに産物の産生及び精製に適切な哺乳動物宿主並びに方法の選択は、当該分野で公知である。他の適切な哺乳動物細胞系は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ−７細胞系（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、並びにＣＶ−１細胞系（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ７０）である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、形質転換された細胞系を含む、霊長類細胞系及びげっ歯類細胞系が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物由来の細胞株、並びに初代外植片もまた、適切である。候補細胞は、選択遺伝子において遺伝子型欠損であり得、又は優性に作用する選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞株には、以下が挙げられるがこれらに限定されない：マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃ若しくはＮＩＨマウス由来の３Ｔ３系、ＢＨＫ若しくはＨａＫハムスター細胞系（これらは、ＡＴＣＣから入手可能である）。これらの細胞系の各々は公知であり、タンパク質発現のために利用可能である。
【０４４４】
リンパ系、又はリンパ系由来細胞系（例えば、プレＢリンパ球起源の細胞系）もまた目的のものである。具体的な例としては、限定なしに、ＲＡＭＯＳ（ＣＲＬ−１５９６）、Ｄａｕｄｉ（ＣＣＬ−２１３）、ＥＢ−３（ＣＣＬ−８５）、ＤＴ４０（ＣＲＬ−２１１１）、１８−８１（Ｊａｃｋら、ＰＮＡＳ（１９８８）８５  １５８１−１５８５）、Ｒａｊｉ細胞、（ＣＣＬ−８６）及びそれらに由来するものが挙げられる。
【０４４５】
ＳＨＭ系において使用するために、本明細書に記載のベクターのいずれかが、ＡＩＤの核酸配列を含む別個のベクターで宿主細胞に共トランスフェクションされ得る。１つの態様において、本明細書に記載のベクターは、内在性ＡＩＤを含む宿主細胞にトランスフェクションされ得る。別の態様において、本明細書に記載のベクターは、ＡＩＤが細胞内で過剰発現されるように、ＡＩＤの核酸配列を含む別個のベクターで、内在性ＡＩＤを含む宿主細胞に共トランスフェクションされ得る。さらに別の態様において、本明細書に記載のベクターは、内在性ＡＩＤを含む又は含まない宿主細胞にトランスフェクションするために、ＡＩＤの配列を含むように改変され得る。好ましい実施形態において、ＡＩＤは、ＳＨＭ耐性のポリヌクレオチド配列を含む合成ＡＩＤである。
【０４４６】
１つの実施形態において、ＳＨＭ系は、以下から選択される１以上を含む：ｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが被るＳＨＭの率に正の影響を与えるように、全体的又は部分的に野生型ポリヌクレオチドから改変されたポリヌクレオチドか、或いは、何らの改変前に、天然に高いパーセンテージのホットスポットを有するポリヌクレオチドのいずれかを含む、前記ポリヌクレオチド；及び、ｉｉ）発現系の少なくとも１つの成分は、ＳＨＭの率に対して負の影響を与えるように、全体的又は部分的に改変されたポリヌクレオチドを含む。
【０４４７】
１つの態様において、ＳＨＭ系は、ＳＨＭの率に負の影響を与えるように、野生型から改変された１以上のポリヌクレオチドを含む。該ポリヌクレオチドは、例えば、ＳＨＭのための１以上の因子（例えば、ＡＩＤ、Ｐｏｌイータ、ＵＤＧ）、１以上の選択マーカー遺伝子、又は１以上のレポーター遺伝子をコードし得る。
【０４４８】
別の態様において、ＳＨＭ系は、ＳＨＭの率に正の影響を与えるように、全体的又は部分的に野生型から改変された１以上のポリヌクレオチドを含む。該ポリヌクレオチドは、例えば、酵素、受容体、転写因子、構造タンパク質、毒素、補因子、目的の特異的結合タンパク質をコードする、目的のポリヌクレオチドであり得る。
【０４４９】
さらに別の態様において、ＳＨＭ系は、本来的に高いＳＨＭの率を有するポリヌクレオチド（例えば、免疫グロブリン重鎖若しくは免疫グロブリン軽鎖、又は抗体遺伝子の超可変領域をコードする、目的のポリヌクレオチドなど）を含む。
【０４５０】
本明細書に記載されるＳＨＭ系はさらに、以下から選択されるさらなるエレメントを１以上含み得る：ｉ）ＡＩＤ又はＡＩＤホモログの発現を調節するための誘導性の系、ｉｉ）１以上のＩｇエンハンサー、ｉｉｉ）１以上のＥ−ボックス、ｉｖ）ＳＨＭに関する１以上の補助因子、ｖ）安定なエピソーム発現のための１以上の因子（例えば、ＥＢＮＡ１、ＥＢＰ２又はｏｒｉ−Ｐ）、ｖｉ）１以上の選択マーカー遺伝子、ＡＩＤの遺伝子を含む１以上の第２のベクター、及びｖｉｉ）それらの組み合わせ。
【０４５１】
１態様において、当該系は、目的の２つのポリヌクレオチドを含み、両ポリヌクレオチドは、プロモーターの近位に位置し、同じ細胞中で同時に発現され及び同時進化される。１実施形態において、このプロモーターは、二方向性ＣＭＶプロモーターなどの二方向性プロモーターである。別の実施形態において、目的の２つのポリペプチドは、２つの一方向プロモーターの前に配置される。２つのプロモーターは、同じプロモーターでも異なるプロモーターでもよい。目的の２つのポリヌクレオチドは、同一ベクター内にあっても、異なるベクター上にあっても良い。
【０４５２】
１以上の目的のポリヌクレオチドの発現ベクター内への組換え導入後、ベクターは、増幅、精製、標準的なトランスフェクション技術を使用した宿主細胞への導入、及び標準的な分子生物学的技術を使用した特徴付けを為され得る。精製されたプラスミドＤＮＡは、標準的なトランスフェクション／トランスフェクション技術を使用して宿主細胞に導入でき、得られたトランスフォーマント／トランスフェクタントは、抗生物質、選択試薬、及び／又は目的のポリヌクレオチドの発現を誘導するための活性化／トランスアクチベーターシグナル（例えば、ドキシサイクリンなどの誘導可能な試薬）を含む適切な培地で増殖できる。宿主細胞が内在的にＡＩＤを発現する場合、１以上の目的のポリヌクレオチドを含むベクターは、単独で宿主細胞に導入され得る。或いは、該細胞が内在的にはＡＩＤを発現しない場合、ＡＩＤ遺伝子、又はより好ましくは、野生型よりもＳＨＭに耐性である合成のＡＩＤ遺伝子が、宿主細胞にトランスフェクトされ得る。従って、ＡＩＤの発現は、目的のポリヌクレオチドについて上述したように、同一又は異なる発現ベクターを使用することによって達成され得る。
【０４５３】
エンハンサー（例えば、Ｉｇエンハンサー）は、目的のポリヌクレオチドの発現、及び／又はそれへのＳＨＭの標的化を増すために、ベクター中に挿入され得る。
【０４５４】
誘導性の系（例えば、Ｔｅｔ制御された系）が使用される場合、ドキシサイクリンが、目的のポリヌクレオチド又はＡＩＤの発現を誘導するために一定期間にわたって（例えば、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１５時間、２０時間、２４時間又は任意の他の時間）培地に添加され得、その後、適切なアッセイによる分析がなされる。細胞は、進行性の多様化を提供するための特定の時間にわたって、例えば、１〜３細胞世代、又は特定の場合には３〜６世代、又はある場合には６〜１０世代、又はそれより長く、増殖させることができる。
【０４５５】
細胞は、本明細書中に記載したように、繰り返し増殖、アッセイ及び選択されて、所望の特性を示す目的のポリヌクレオチドを発現する細胞を選択的に濃縮することができる。適切なアッセイ及び濃縮ストラテジー（例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）；アフィニティ分離、酵素活性、毒性、受容体結合、増殖刺激など）を以下に記載する。
【０４５６】
一旦目的の細胞集団が得られると、目的のポリヌクレオチドがレスキューされ得、対応する変異が配列決定され同定される。例えば、総ｍＲＮＡ又は染色体外プラスミドＤＮＡは、ＳＶ４０  Ｔ抗原の共発現によって増幅され得（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６２（１０）３７３８−３７４６）、及び／又は細胞から抽出され得、適切なプライマーを使用する、改変されたポリヌクレオチドをクローニングするためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲのためのテンプレートとして使用され得る。変異体ポリヌクレオチドは、ベクター中にサブクローニングされ得、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現され得る。タグ（例えば、Ｈｉｓ−６タグ）が、クロマトグラフィーを使用したタンパク質精製を促進するために、カルボキシ末端に付加され得る。
【０４５７】
Ｘ．目的のタンパク質
本明細書で使用される場合、用語「目的のタンパク質」は、そのタンパク質の改善されたバリアントを迅速に生成、選択及び同定するために、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチドをＡＩＤによりＳＨＭのために最適化することが所望される、タンパク質又はその部分に関する。このような最適化されたポリヌクレオチドは、コドン用法の結果として、ＳＨＭに対してより感受性にすることができ、それにより、ポリヌクレオチドがＡＩＤに供されたときにアミノ酸変化を誘導し、改善された機能のためにスクリーニングされ得る。反対に、このような最適化されたポリヌクレオチドは、ＳＨＭに対してより耐性にすることができ、それにより、コドン用法の結果として、ポリヌクレオチドがＡＩＤに供されたときのアミノ酸変化を低減し、改善された機能のためにスクリーニングされ得る。
【０４５８】
しかしながら、本発明はまた、ＳＨＭに耐性であるタンパク質をコードするか、又はストップコドンに変換され得るコドンを含むポリヌクレオチド配列に関する組成物及び方法も含むことが理解されるべきである。このような合成遺伝子は、本発明においてある種の利点を付与し、例えば、セクションＩＸに具体的に開示されている。
【０４５９】
アミノ酸又は対応するヌクレオチド配列が公知であるか又は利用可能であり（例えば、本発明のベクター中にクローニングできる）、表現型又は機能が改善され得る任意のタンパク質は、本明細書中に提供するベクター及びＳＨＭ系において使用するための候補である。目的のタンパク質としては、例えば、任意の未改変又は合成の供給源由来の、表面タンパク質、細胞内タンパク質、膜タンパク質及び分泌タンパク質が挙げられる。本明細書中に提供されるベクター及びＳＨＭ系において使用するためのタンパク質の例示的であるが非限定的なタイプには、抗体重鎖又はその部分、抗体軽鎖又はその部分、酵素、受容体、構造タンパク質、補因子、ポリペプチド、ペプチド、細胞内抗体、選択マーカー、毒素、増殖因子、ペプチドホルモンが含まれ、最適化できる任意の他のタンパク質が含まれる意図である。
【０４６０】
生物学的に活性なタンパク質（分子）には、他の生物学的に活性なタンパク質（分子）の薬物動態及び／又は薬力学を調節可能な分子も含まれ、例えば、脂質及びポリマー（例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール及び他のポリエーテル）が含まれる。例えば、ポリペプチドは、例えば以下のようなポリペプチドである：ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ毒素サブユニットＡ、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素、ＣＣケモカイン（例えば、ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８）、ＣＸＣケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１６）、Ｃケモカイン（例えば、ＸＣＬ１及びＸＣＬ２）及びＣＸ３Ｃケモカイン（例えば、ＣＸ３ＣＬ１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＥＰＯ、ヒト増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、核補因子、Ｊａｋ及びＳｔａｔファミリーメンバー、Ｇタンパク質シグナル伝達分子（例えば、ケモカイン受容体、ＪＮＫ、Ｆｏｓ−Ｊｕｎ、ＮＦ−κＢ、Ｉ−κＢ、ＣＤ４０、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ７、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４）。
【０４６１】
さらに、種々の他の成分ヌクレオチド配列（例えば、ある実施形態においては系全体の完全性を維持するために超変異させることが好まれないコアとなる系を形成できる、コード配列及び遺伝エレメント）が存在する。これらの成分ヌクレオチド配列には以下が挙げられるがこれらに限定されない：ｉ）選択マーカー（例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、アンピシリンなど）；ｉｉ）レポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質、エピトープタグ、レポーター酵素）；ｉｉｉ）遺伝子調節シグナル（例えば、プロモーター、誘導可能な系、エンハンサー配列、ＩＲＥＳ配列、転写又は翻訳ターミネーター、ｋｏｚａｋ配列、スプライス部位、複製起点、リプレッサー）；ｉｖ）高レベル増強ＳＨＭ又はその調節、又は測定のために使用される、酵素又は補助因子（例えば、ＡＩＤ、ｐｏｌη、転写因子及びＭＳＨ２）；ｖ）シグナル伝達成分（キナーゼ、受容体、転写因子）、並びにｖｉ）タンパク質のドメイン又はサブドメイン（例えば、核局在化シグナル、膜貫通ドメイン、触媒ドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、並びに他のタンパク質ファミリーの保存されたモチーフ、ドメイン及びサブドメイン）。
【０４６２】
本出願に基づいて、最適化のための適切な候補として目的のタンパク質を選択し、目的のタンパク質の所望の形質をモニタリングするために適切なアッセイを考案することができるであろう。
【０４６３】
目的のタンパク質の性質及び目的のタンパク質に関する利用可能な情報の量に依存して、実務者（ｐｒａｃｔｉｏｎｅｒ）は、最適化されたポリヌクレオチドを生成するための変異誘発の前に、以下のストラテジーの任意の組み合わせに従うことができる。
【０４６４】
１．最適化なし：目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列内のホットスポットの数を増強させることが望ましいものであり得るが、任意の未改変タンパク質は、何らかの量のＳＨＭを受けると予測され、最適化も実際の配列の何らの具体的な知識もなしに本発明において使用され得ることに、留意すべきである。さらに、ある種のタンパク質（例えば抗体）は、適切なコドン用法を進化させたポリヌクレオチド配列を天然に含み、コドン改変を必要としない。或いは、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、抗体のフレームワーク領域又はそのフラグメント）内のコールドスポットの数を増強することが望ましいものであり得る。
【０４６５】
２．グローバルなホットスポット最適化：ある態様では、タンパク質をコードするポリヌクレオチド中のホットスポットの数は、本明細書中に記載するように、増加させることができる。このアプローチは、遺伝子のコード領域全体に適用でき、それにより、タンパク質全体を、ＳＨＭに対してより感受性にする。本明細書中で議論するように、タンパク質内又は関連のタンパク質アイソタイプ間の構造活性関係について比較的あまり知られていない場合に、このアプローチが好まれ得る。
【０４６６】
３．選択的ホットスポット改変：或いは、本明細書中で議論するように、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、高密度のホットスポットを提供し、特定の遺伝子座でＳＨＭを介する最大の多様性の種となる、合成可変領域による、目的の領域の標的化した置換を介して、選択的及び又は体系的に改変できる。
【０４６７】
当業者は、本明細書中に提供される教示に基づいて、上記のアプローチのいずれか又は全てが本発明を使用して行なわれ得ることを理解するであろう。しかし、グローバルなホットスポット最適化及び選択的ホットスポット改変に関するアプローチは、タンパク質機能のより迅速且つより効率的な最適化に繋がる可能性がある。
【０４６８】
目的のタンパク質をコードする最適化されたポリヌクレオチドの設計後、このポリヌクレオチドは標準的方法論を使用して合成され得、正確な合成を確認するために配列決定され得る。一旦ポリヌクレオチドの配列が確認されると、このポリヌクレオチドは本発明のベクター中に挿入され得、次いでこのベクターは本明細書中に記載したように宿主細胞中に導入されて、変異誘発をもたらし得る。
【０４６９】
一旦適切な宿主細胞中に導入されると、細胞は、ＳＨＭを開始するためにＡＩＤ及び／又は他の因子を発現するように誘導され得、それにより、目的のタンパク質の進行性の配列多様化を誘導することができる。適切な期間（例えば、２〜１０細胞分裂）後、目的のタンパク質のバリアントを含む得られた宿主細胞がスクリーニングされ、改善された変異体が同定されて細胞集団のために分離され得る。このプロセスは、目的のタンパク質の特性を選択的に改善するために、反復され得る。
【０４７０】
細胞表面にディスプレイされたタンパク質は、適切な膜貫通ドメインにインフレームでカップリングされた目的のタンパク質のキメラ分子の生成を介して、生成できる。哺乳動物細胞発現の場合、例えば、ＭＨＣタイプ１膜貫通ドメイン、例えば、Ｈ２ｋｋ由来のもの（ペリ膜貫通ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む；ＮＣＢＩ遺伝子アクセッション番号ＡＫ１５３４１９）が使用できる。同様に、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、昆虫細胞及び酵母におけるタンパク質の表面発現は、当該分野で充分確立されている。総説については、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１２：４３３−５５；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５−５５１；Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎら、（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ７８  １３４１−１３４６；Ｇｈｉａｓｉら、（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８５  １８７−１９４；Ｂｏｄｅｒ及びＷｉｔｔｒｕｐ、（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５  ５５３−５５７；並びにＭａｚｏｒら、（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（５）５６３−５６５を参照のこと。
【０４７１】
表面ディスプレイされた抗体又はタンパク質は、細胞表面上の分泌タンパク質の分泌及び続く結合（又は会合）を介して、生成できる。抗体又はタンパク質の細胞膜へのコンジュゲート化は、タンパク質合成の間又はタンパク質が細胞から分泌された後のいずれかに生じ得る。コンジュゲート化は、共有結合、結合相互作用（例えば、特異的結合メンバーにより介在される）又は共有結合と非共有結合との組合せによって、生じ得る。
【０４７２】
なお別の態様において、タンパク質は、細胞表面上へのディスプレイに特有の第二の結合メンバーに融合した目的の標的に特異的に結合する第一の特異的結合メンバーを含む、抗体又は結合タンパク質融合タンパク質の生成を介して、細胞にカップリングされ得る（例えば、プロテインＡとＦｃドメインとの結合を利用する場合：プロテインＡは、細胞表面上に発現されてそこに結合し、分泌された抗体（又はＦｃ融合タンパク質として発現された目的のタンパク質）に結合し、それを局在化させる）。
【０４７３】
対応するポリヌクレオチド配列を含む適切な発現ベクターの、適切なミューテーター陽性細胞へのトランスフェクションは、任意の当該分野で認識された又は公知のトランスフェクションプロトコルを使用して実施できる。タンパク質の例示的な表面発現されたライブラリーは、優先の米国出願第６０／９０４，６２２号及び同第６１／０２０，１２４号の実施例４及び５に記載されている。
【０４７４】
上記トランスフェクション由来の複数の抗体又は結合タンパク質を発現する細胞は、必要に応じて、従来のアッセイ（ＦＡＣＳを含むがこれに限定されない）を使用して、細胞表面上での特定の範囲の該タンパク質の表面発現を示す細胞を選択するために、特徴付けられ得る。
【０４７５】
軽鎖及び重鎖の発現の染色は、例えば、市販のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）コンジュゲート化ラット抗マウスＩｇ、κ軽鎖、及びＦＩＴＣ又はＲ−ＰＥコンジュゲート化ラット抗マウスＩｇ  Ｇ１モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用することによって、達成できる。染色は、製造業者が示したプロトコルを使用して、通常は、氷上での３０分間にわたる、標識抗体の存在下での試験細胞のインキュベーションによって、実施できる。細胞抗原発現の発現レベルは、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  ｒａｉｎｂｏｗ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、ＩＬ）を使用して定量できる。
【０４７６】
特定の範囲の発現を示すトランスフェクトされた細胞集団が選択できる。例えば、１細胞当たり約１０，０００、約５０，０００、約１００，０００又は約５００，０００個のタンパク質よりも多い表面コピー数を有する細胞が選択され得、次いで、効率的な親和性プロファイリングのために使用され得る。
【０４７７】
安定にトランスフェクトされた細胞の集団は、例えば、適切な選択剤の存在下での２〜３週間の増殖を介して生成できる。得られた細胞ライブラリーは、細胞バンクとして凍結及び保存できる。或いは、細胞は、一過的にトランスフェクトされ、トランスフェクションの数日以内に使用され得る。
【０４７８】
ある場合には、さらなる特徴付けのために、表面ディスプレイされたタンパク質を分泌タンパク質に変換することが所望され得る。変換は、選択的プロテアーゼ（例えば、第Ｘ因子、トロンビン又は任意の他の選択的タンパク分解剤）とのインキュベーションによって切断され得る特異的リンカーの使用によって達成できる。ベクター中のコードされたタンパク質の遺伝子操作を可能にする（即ち、タンパク質のリーディングフレームからの表面結合シグナルの切り出しを可能にする）ポリヌクレオチド配列を含むことも可能である。例えば、随意に目的のタンパク質の結合シグナルの選択的除去及び引き続く細胞内蓄積（又は分泌）を可能にする、１以上の独自の制限部位、又はｃｒｅ／ｌｏｘエレメント、又は他の組換えエレメントの挿入。さらなる例には、目的のタンパク質の効率的な細胞表面発現を可能にする、結合シグナル（例えば、膜貫通ドメイン）の周囲の隣接するｌｏｘＰ部位の挿入が含まれる。しかし、細胞におけるｃｒｅリコンビナーゼの発現の際、ＬｏｘＰ部位間で組換えが生じ、結合シグナルの喪失を生じ、それにより目的のタンパク質の分泌を導く。
【０４７９】
一旦ポリペプチドが所定の程度まで最適化されると、目的の最適化されたポリペプチドを発現する細胞又は細胞集団が、単離又は濃縮され得、最適化されたポリペプチドの表現型（機能）が、当該分野で認識されたアッセイを使用してアッセイされ得る。
【０４８０】
次いで、細胞は再増殖され、ＳＨＭ再誘導され、多数のサイクルにわたって再スクリーニングされて、所望の機能における改善を繰り返しもたらし得る。任意の時点で、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、進行性の変異誘発をモニタリングするために、レスキュー及び／又は配列決定され得る。
【０４８１】
例えば、エピソームプラスミドＤＮＡが、抽出（又はＳＶ４０  Ｔ抗原との共発現によって増幅（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６２（１０）３７３８−３７４６））され得、次いで抽出されて、標準的な方法論を用いて、ポリヌクレオチド又は目的又は隣接領域に特異的なＤＮＡプライマーを使用するＰＣＲによって増幅され得る。或いは、総ＲＮＡが、フローサイトメトリー又は磁気ビーズによって単離された種々の細胞集団から単離され得る。エピソームＤＮＡ及び／又は総ＲＮＡは、標準的な方法論を用いて、ポリヌクレオチド又は目的又は隣接領域に特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによって、増幅され得る。クローンは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどの会社からの自動化ＤＮＡ配列（ＡＢＩ−３７７又はＡＢＩ  ３７３０  ＤＮＡシーケンサー）を使用して、配列決定され得る。配列は、出発配列と比較した、ヌクレオチドの挿入及び欠失の頻度について、分析され得る。
【０４８２】
Ａ．抗体及びそのフラグメント
抗体に関して、本発明は、標的タンパク質の機能に対する最も大きい生物学的影響を生じることと結びついた重要な表面エピトープに結合する抗体を選択するためのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫の必要性を回避する能力を提供する。さらに、哺乳動物抗体は、標的化ＳＨＭのための最適なコドン用法パターンを本来的に処理し、テンプレート設計ストラテジーを大いに単純化する。特定の抗原について、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫は、標的の機能に影響を与えないエピトープ選択を導き、それにより、強力かつ有効な抗体候補の選択を妨害する。なお他の実施形態において、本発明は、標的タンパク質の機能を決定する際のそのエピトープの役割の性質により、強力な活性を有する部位特異的抗体の迅速な進化を提供できる。これは、最適なエピトープ位置について標的タンパク質をスキャンし、臨床で使用するためのそのクラスで最高の抗体薬物を産生する能力を提供する。
【０４８３】
本明細書中に記載するように、全ての天然に存在する生殖系列の親和性成熟した合成又は半合成の抗体、並びにそれらのフラグメントが、本発明において使用され得る。一般に、このような抗体は、ＳＨＭを介して変更されて、以下の機能的形質の１以上を改善できる：親和性、結合活性、選択性、熱安定性、タンパク分解安定性、溶解度、折り畳み、免疫毒性及び発現。抗体形式に依存して、抗体ライブラリーは、宿主細胞において共発現され得る、別個の重鎖ライブラリー及び軽鎖ライブラリーを含むことができる。特定の実施形態において、全長抗体が分泌され得、及び／又は宿主細胞の細胞膜で表面ディスプレイされ得る。なお他の実施形態において、重鎖ライブラリー及び軽鎖ライブラリーは、同じ発現ベクター中又は異なる発現ベクター中に挿入でき、両方の抗体鎖の同時共進化を可能にする。
【０４８４】
１実施形態において、抗体又はそのフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄＡｂ又は単鎖結合ポリペプチド）の特定のサブドメイン中のホットスポット密度を増加させることは、改善された特徴（例えば、結合親和性の増大、結合活性の増大及び／又は非特異的結合の減少のうち１以上）をもたらし得る。別の実施形態において、定常ドメイン（例えばＦｃ）中のホットスポットが増加した合成抗体の使用は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合親和性の増大を生じ得、それにより、シグナルカスケードが調節される。重鎖及び軽鎖、又はそれらの一部は、本明細書中に記載する手順を使用して、同時に改変できる。
【０４８５】
本明細書中に提供する方法において使用される細胞内抗体は、細胞質の還元環境における重鎖及び／又は軽鎖のフォールディングを改善又は増強するために、改変され得る。或いは、又はさらに、ｓＦｖ細胞内抗体は、ドメイン内ジスルフィド結合の非存在下でも適切に折り畳まれ得るであろうフレームワークを安定化するために、改変され得る。細胞内抗体は、例えば、以下の特徴のうち１以上を増大させるためにも、改変され得る：結合親和性、結合活性、エピトープ接近可能性、標的エピトープについての内因性タンパク質との競合、半減期、標的隔絶、標的タンパク質の翻訳後修飾など。細胞内抗体は細胞の内部で作用するので、それらの活性は、酵素活性アッセイのためのアッセイ方法論により類似している。これは以下のセクションＢで議論する。
【０４８６】
ポリヌクレオチドの同定及び設計
標的化された抗体ライブラリーを設計及び生成するための方法、並びに優れた選択性、種間反応性及びブロッキング活性を有する抗体の選択を提供する最適なエピトープを同定するための方法は、当該分野で公知であり、本明細書中に説明している。このような方法は、本明細書のセクションＩＶ及びＶ、並びに共通の所有の優先の米国特許出願第６０／９０４，６２２号及び同第６１／０２０，１２４号に開示されている。
【０４８７】
スクリーニング方法論
改善された形質を有する、表面露出された抗体又は分泌された抗体を検出及び選択するための具体的なスクリーニングは、当該分野で周知であり、セクションＸＩに詳細に記載される。このようなスクリーニングは、全般的に最良の抗体を進化させるために、複数のパラメーター（例えば、親和性、結合活性、選択性及び熱安定性）の同時選択に基づく数ラウンドの選択を含み得る。
【０４８８】
一旦抗体又はそのフラグメントがＳＨＭを使用して最適化されると、最適化された抗体又はそのフラグメントの表現型／機能が、当該分野で認識されたアッセイを使用してさらに分析され得る。抗体又はそのフラグメントのためのアッセイとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：結合親和性、結合活性などを決定できる、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）、変異したＩｇＨ鎖のゲル検出及び蛍光検出、スキャッチャード分析、ＢＩＡＣＯＲ分析、ウエスタンブロット、ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）分析、ラジオイムノアッセイなど。このようなアッセイは、以下のセクションＸＩにおいてより充分に記載される。
【０４８９】
一旦最適化された抗体が同定されると、エピソームＤＮＡが、抽出（又はＳＶ４０  Ｔ抗原との共発現によって増幅（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６２（１０）３７３８−３７４６））され得、次いで抽出されて、可変重鎖（ＶＨ）リーダー領域及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）リーダー領域特異的なセンスプライマー並びにアイソタイプ特異的なアンチセンスプライマーを使用するＰＣＲに供され得る。或いは、選択されたソートされた細胞集団から総ＲＮＡが単離され、可変重鎖（ＶＨ）リーダー領域及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）リーダー領域特異的なセンスプライマー並びにアイソタイプ特異的なアンチセンスプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲに供され得る。クローンは標準的な方法論を使用して配列決定され得、得られた配列は、ヌクレオチドの挿入及び欠失の頻度、受容体のリビジョン（ｒｅｖｉｓｉｏｎ）並びにＶ遺伝子選択について分析され得る。得られたデータは、１以上の所望の特性における変化と特定のアミノ酸置換とを連結するデータベースに投入するために使用され得る。次いで、このようなデータベースは、好都合な変異を組換えるため、又は新たに同定された目的の領域（例えば、タンパク質の機能的部分をコードする核酸配列）中に標的化された多様性を有する次世代のポリヌクレオチドライブラリーを設計するために、使用され得る。
【０４９０】
Ｂ．酵素
酵素及びプロ酵素は、迅速に改善でき、ＳＨＭが有用な、ポリペプチドの別のカテゴリーを示す。２つ以上の酵素の同時変異を含む、複数の酵素経路の同時進化への本発明の適用は、特に興味深い。特に留意すべき酵素及び酵素系には、例えば、微生物学的発酵、代謝経路工学、タンパク質製造、バイオレメディエーション、並びに植物の成長及び発達、に関連する酵素が挙げられる。
【０４９１】
改善された形質を有する酵素を測定、選択及び進化させるための具体的なハイスループットスクリーニング系が当該分野で周知であり、セクションＸＩに概説される。このようなスクリーニングは、複数のパラメーター（例えば、ｐＨ安定性、Ｋｍ、Ｋｃａｔ、熱安定性、溶解度、タンパク分解安定性、基質特異性、補因子依存性、及びヘテロ二量体化又はホモ二量体化の傾向）の同時選択に基づく数ラウンドの選択を含み得る。
【０４９２】
ポリヌクレオチドの同定及び設計
既に説明したように、変異誘発の開始点は、目的の遺伝子のｃＤＮＡクローンか、又はそのアミノ酸若しくはポリヌクレオチド配列のいずれかである。ＳＨＭの有効性を最大化するために、出発ポリヌクレオチド配列は、ホットスポット密度を最大化し、且つコールドスポット密度を減少するように改変され得る。このような方法は、本明細書のセクションＩＶ及びＶ、並びに共通の所有の優先の米国特許出願第６０／９０４，６２２号及び同第６１／０２０，１２４号に開示されている。
【０４９３】
目的の特定の領域が、目的のタンパク質（単数又は複数）において定義された場合には、これらの領域は、好ましいホットスポットモチーフで標的化され得るか、或いは、既に説明したように、目的の酵素（単数又は複数）のリーディングフレームにわたって、ホットスポットモチーフを体系的に挿入するための走査アプローチが使用され得る。
【０４９４】
複数の酵素を伴う特定の酵素経路の共進化のための本発明の特定の利点は、全ての酵素を単一の細胞で同時に共進化できることである。このアプローチは、系の全ての要素が存在する時に、系全体に利点のみを付与する変異を同定するための能力を開発する。例えば、酵素間のヘテロダイマー化を誘導する変異は、連続的な酵素反応を伴う。
【０４９５】
スクリーニング方法論
多くのハイスループットスクリーニングアプローチが当該分野で周知であり、改善された酵素を同定及び選択するために容易に適用できる（例えば、Ｏｌｓｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）２３０：３２９−３４９；Ｔｕｒｎｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）２１（１１）：４７４−４７８；Ｚｈａｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）１３（２）：１０４−１１０；及び、Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａら、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．（２００５）１２（１２）：１２９１−３００を参照のこと）。使用されるスクリーニングの様式は、酵素の性質、及び目的の酵素が細胞内であるか細胞外であるか、そしてさらには膜結合型であるか自由に分泌されるか、に依存し得る。
【０４９６】
広い動的ウインドウにわたって有用な定量情報を提供し、高いスクリーニング能力を有する最初のスクリーニングが、好ましい。代表的なスクリーニングアプローチには、例えば、フローサイトメーターを使用した、改善された細胞の変更された能力又は増殖速度に基づくアッセイ、及び／又は細胞のソーティングに基づくアッセイが挙げられる。ＦＡＣＳベースのアプローチは、細胞内蛍光発生反応産物の存在又は変更されたレポーター遺伝子発現を検出でき、酵素活性のＦＡＣＳベースの最適化のための具体的なプロトコルは、以下の参考文献に総説がある；Ｆａｒｉｎａｓら、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ（２００６）９（４）：３２１−８；Ｂｅｃｋｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）１５（４）：３２３−９；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０００）２４３（１−２）：２１１−２２７。
【０４９７】
一旦酵素又は酵素のセットがＳＨＭを使用して最適化されると、最適化された酵素の完全な生化学的分析が、当該分野で認められたアッセイを使用して、さらに分析され得る。さらに、既に議論したように、一旦最適化された酵素が同定されると、エピソームＤＮＡが、抽出又はＳＶ４０  Ｔ抗原との共発現によって増幅され得（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６２（１０）３７３８−３７４６）、次いで、抽出され、特異的プライマーを使用するＰＣＲに供され得る。或いは、選択された細胞集団から総ＲＮＡが取得され得、特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲに供され得る。クローンが、標準的な方法論を使用して配列決定され得、得られた配列は、ヌクレオチド変異の頻度について分析され得る。得られたデータは、１以上の所望の特性における変化と特定のアミノ酸置換とを連結するデータベースに投入するために使用され得る。次いで、このようなデータベースは、好都合な変異を組換えるため、又は新たに同定された目的の領域（例えば、タンパク質の機能的部分をコードする核酸配列）中に標的化された多様性を有する次世代のポリヌクレオチドライブラリーを設計するために、使用され得る。
【０４９８】
Ｃ．受容体
受容体はリガンドに結合し、細胞結合受容体（例えば、抗体（Ｂ細胞受容体）、Ｔ細胞受容体、Ｆｃ受容体、Ｇ共役タンパク質受容体、サイトカイン受容体、糖鎖受容体、及びＡｖｉｍｅｒＴＭベースの受容体）が挙げられるがこれらに限定されない特異的結合メンバーをコードする、未改変及び合成のポリペプチドの広い属を包含する。
【０４９９】
一つの実施形態において、このような受容体は、以下の形質の１以上を改善するためにＳＨＭを介して変更され得る：親和性、結合活性、選択性、熱安定性、タンパク分解安定性、溶解度、二量体化、折り畳み、免疫毒性、シグナル伝達カスケードへのカップリング及び発現。
【０５００】
ポリヌクレオチドの同定及び設計
上述のように、変異誘発の出発点は、目的の遺伝子のｃＤＮＡクローン又はそのアミノ酸若しくはポリヌクレオチド配列のいずれかであり得る。ＳＨＭの有効性を最大化するために、出発ポリヌクレオチド配列は、ホットスポットの密度を最大化し、コールドスポットの密度を減少させるように改変され得る。このような方法は、本明細書のセクションＩＶ及びＶに開示される。
【０５０１】
このような受容体は、ＳＨＭにより最適化された配列の使用を介して変異誘発のために標的化されるか、ＳＨＭ耐性配列の使用を介して変異誘発の間に保存されるかのいずれかであり得る、明確に規定されたドメインを保有する。変異誘発のために典型的に標的化されるドメイン（領域）としては、以下に限定されないが、翻訳後修飾の部位、表面露出されたループドメイン、種間のバリエーションの位置、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン及び結合ドメインが挙げられる。変異誘発の間に保存されるドメイン（領域）としては、膜貫通ドメイン、不変アミノ酸位置、シグナル配列及び細胞内輸送ドメインが挙げられる。或いは、スクリーニングアプローチを使用して、以前に記載したように、目的の受容体のリーディングフレームを通じてホットスポットモチーフを体系的に挿入できる。
【０５０２】
スクリーニング方法論
多数のハイスループットスクリーニングアプローチが当該分野で周知であり、改善された受容体を同定及び選択するために容易に適用できる。代表的なスクリーニングアプローチとしては、例えば、結合アッセイ、増殖アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ及びＦＡＣＳベースのアッセイが挙げられる。
【０５０３】
一旦酵素又は酵素のセットがＳＨＭを使用して最適化されると、最適化された受容体の完全な薬理学的分析が、当該分野で認められたアッセイを使用してさらに分析され得る。さらに、既に議論したように、一旦最適化された受容体が同定されると、エピソームＤＮＡが、抽出又はＳＶ４０  Ｔ抗原との共発現によって増幅され得（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６２（１０）３７３８−３７４６）、次いで、抽出され、特異的プライマーを使用するＰＣＲに供される。或いは、総ＲＮＡが、選択された細胞集団から取得され、特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲに供され得る。クローンは標準的な方法論を使用して配列決定され得、得られた配列は、ヌクレオチド変異の頻度について分析され得る。得られたデータは、１以上の所望の特性における変化と特定のアミノ酸置換とを連結するデータベースに投入するために使用され得る。次いで、このようなデータベースは、好都合な変異を組換えるため、又は新たに同定された目的の領域（例えば、タンパク質の機能的部分をコードする核酸配列）中に標的化された多様性を有する次世代のポリヌクレオチドライブラリーを設計するために、使用され得る。
【０５０４】
ＸＩ．スクリーニング系及び濃縮系
本明細書中に記載するポリヌクレオチドの合成ライブラリー、半合成ライブラリー又はシードライブラリーの発現により生成されるポリペプチドは、種々の標準的な生理学的手順、薬理学的手順及び生化学的手順を使用して、改善された表現型についてスクリーニングされ得る。このようなアッセイとしては、例えば以下が挙げられる：生化学的アッセイ（例えば、結合アッセイ、蛍光偏光アッセイ、溶解度アッセイ、折り畳みアッセイ、熱安定性アッセイ、タンパク分解安定性アッセイ、及び酵素活性アッセイ（一般には、Ｇｌｉｃｋｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、７  Ｎｏ．１  ３−１０（２００２）；Ｓａｌａｚａｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３０  ８５−９７（２００３）を参照のこと））、並びにある範囲の細胞ベースのアッセイ（シグナル伝達、遊走性、全細胞結合、フローサイトメトリー及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）ベースのアッセイが含まれる）。本明細書中に記載する合成ライブラリー又は半合成ライブラリーがコードする目的のポリペプチドを発現する細胞は、任意の当該分野で認められたアッセイ（ペプチドを微粒子にカップリングする方法が挙げられるが、それらに限定されない）で濃縮され得る。
【０５０５】
ハイスループット様式でこれらのアッセイを実施することを可能にする、多数のＦＡＣＳ及びハイスループットスクリーニング系が市販されている（例えば、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、Ｍａｓｓ．；Ａｉｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｍｅｎｔｏｒ、Ｏｈｉｏ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆ．；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓ．を参照のこと）。これらの系は典型的に、全てのサンプル及び試薬のピペッティング、液体分配時限式インキュベーション、及びアッセイに適した検出器におけるマイクロプレートの最終的な読み取りを含む、手順全体を自動化する。これらの設定可能な系は、ハイスループット及び迅速なスタートアップ、並びに高い程度の柔軟性及びカスタマイズ性を提供する。このような系の製造者は、種々のハイスループット系に関する詳細なプロトコルを提供している。即ち、例えばＺｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．は、遺伝子転写、リガンド結合などの調節を検出するためのスクリーニング系を記載する技術告示を提供している。
【０５０６】
Ａ．活性を測定するための細胞ベースの方法
１．シグナル伝達ベースのアッセイ
例えば、増殖因子、酵素、受容体及び抗体などのタンパク質は、細胞又は細胞集団内のシグナル伝達に影響を与え得、それにより、レポーター遺伝子アッセイを使用して検出され得る転写活性に影響を与え得る。このようなモジュレーターは、完全アゴニスト又は部分アゴニスト、完全アンタゴニスト又は部分アンタゴニスト、或いは完全インバースアゴニスト又は部分インバースアゴニストとして、機能的に挙動し得る。
【０５０７】
従って、１つのアッセイ形式において、シグナル伝達アッセイは、目的のタンパク質によって直接又は間接的に発現が調節されるレポーター遺伝子（これは、種々の標準的な手順によって測定できる）を含む細胞の使用に基づき得る。
【０５０８】
レポータープラスミドは、レポーター遺伝子をコードするｃＤＮＡを、レポーター遺伝子のコード配列に対して５’側に存在する適切な最小プロモーター（即ち、真核生物細胞における転写開始を支持する任意の配列）の下流に配置することによって、標準的な分子生物学的技術を使用して構築できる。最小プロモーターは、ウイルス供給源由来であり得るか（例えば、ＳＶ４０初期又は後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター）；又は真核生物細胞プロモーター由来であり得る（例えば、βアクチンプロモーター（Ｎｇ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：６０１−６１５、１９８９；Ｑｕｉｔｓｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９５３９−９５４５、１９８９）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５０９２−５０９６、１９８８、Ｅｒｃｏｌａｎｉ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５３３５−１５３４１、１９８８）、ＴＫ−１（チミジンキナーゼ）プロモーター、ＨＳＰ（ヒートショックプロテイン）プロモーター、又はＴＡＴＡボックスを含む任意の真核生物プロモーター）。
【０５０９】
レポータープラスミドはまた、モニタリングが所望されるシグナル伝達経路の適切なブランチに対し、通常２回〜７回反復して連結されるコンセンサス認識配列を含む、最小プロモーターに対して５’側のエレメントを典型的に含む。例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：サイクリックＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なファージミドベクターｐＣＲＥ−Ｌｕｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２１９０７６中、細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化に応答する）、血清応答エレメント（ＳＲＥ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅファージミドベクターｐＳＲＥ−Ｌｕｃ．Ｃａｔ．Ｎｏ．２１９０８０）、核因子Ｂ応答エレメント（ＮＦ−ｋＢ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅファージミドベクターｐＮＦＫＢ−Ｌｕｃ  Ｃａｔ．Ｎｏ．２１９０７８）、活性化タンパク質１応答エレメント（ＡＰ−１、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅファージミドベクターｐＡＰ−１−Ｌｕｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２１９０７４）、血清応答因子応答エレメント（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅファージミドベクターｐＳＲＦ−Ｌｕｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２１９０８２）、又はｐ５３結合部位。
【０５１０】
多数のレポーター遺伝子系が当該分野で公知であり、例えば、アルカリホスファターゼ（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．ら、（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６６  １−１０；Ｋａｉｎ，Ｓ．Ｒ．（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６３  ４９−６０）、β−ガラクトシダーゼ（米国特許第５，０７０，０１２号（１９９１年１２月３日に、Ｎｏｌａｎらに対して発行された）及びＢｒｏｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．ら、（１９８９）Ｊ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍ．Ｂｉｏｌｕｍ．４  ９９−１１１を参照のこと）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｇｏｒｍａｎら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８２）２  １０４４−５１を参照のこと）、β−グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼ、β−ラクタマーゼ（米国特許第５，７４１，６５７号及び同第５，９５５，６０４号）、触媒的抗体、ルシフェラーゼ（米国特許第５，２２１，６２３号；同第５，６８３，８８８号；同第５，６７４，７１３号；同第５，６５０，２８９号；同第５，８４３，７４６号）及び天然に蛍光なタンパク質（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７  ５０９−４４）が挙げられる。
【０５１１】
或いは、遺伝子調節に近接した中間シグナル伝達事象もまた、例えば、細胞内変化（細胞内貯蔵からの放出に起因するカルシウム濃度の変動、膜電位又はｐＨの変化、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）又はｃＡＭＰ濃度の増加、或いはアラキドン酸の放出が挙げられるが、これらに限定されない）に応答するレポーター分子からの蛍光シグナルを測定することによって、観察できる。
【０５１２】
本明細書中で使用する場合、アゴニストとは、シグナル伝達を刺激するモジュレーターをいい、上で挙げたコンストラクトのエレメントの種々の組合せを使用して測定できる。本明細書中で使用する場合、部分アゴニストとは、バックグラウンドよりも高いが、完全アゴニストと比較して１００％未満であるレベルまで、シグナル伝達を刺激できるモジュレーターをいう。スーパーアゴニストは、完全アゴニスト参照標準と比較して、１００％を超えて、シグナル伝達を刺激できる。
【０５１３】
本明細書中で使用する場合、アンタゴニストとは、それら自体ではシグナル伝達に対して影響を有さないが、アゴニスト（又は部分アゴニスト）誘導性のシグナル伝達を阻害できるモジュレーターをいう。本明細書中で使用する場合、部分アンタゴニストとは、それら自体ではシグナル伝達について影響を有さないが、アゴニスト（又は部分アゴニスト）誘導性のシグナルを、１００％未満であるが測定可能な程度まで、阻害できるモジュレーターをいう。
【０５１４】
本明細書中で使用する場合、インバースアゴニストとは、アゴニスト（又は部分アゴニスト）誘導性のシグナル伝達を阻害でき、単独で添加した場合にもシグナル伝達を阻害できるモジュレーターをいう。
【０５１５】
２．遊走性アッセイ
細胞表面分子のいくつかのカテゴリー（例えば、ＧＰＣＲ（例えば、ケモカイン受容体、ヒスタミンＨ４、カンナビノイド受容体など））に対するアゴニスト活性は、細胞運動を導き得る。従って、試験分子の部分又は完全アゴニスト又はアンタゴニスト活性は、例えば、走化性アッセイ（Ｇｈｏｓｈら、（２００６）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．Ｍａｙ  ４；４９（９）：２６６９−２６７２）、ケモキネシス（Ｇｉｌｌｉａｎら、（２００４）ＡＳＳＡＹ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．２（５）：４６５−４７２）又は走触性（Ｈｉｎｔｅｒｍａｎｎら、（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（９）：８００４−８０１５）において、細胞の遊走性に対する影響を介してモニタリングできる。
【０５１６】
３．全細胞結合アッセイ
受容体、膜結合抗体及び細胞表面タンパク質を利用する結合アッセイが、目的のタンパク質の活性又は結合選択性をモニタリングするために、全細胞（膜調製物の対語として）を使用して実施され得る。このようなアッセイは、ＦＡＣＳの使用を介して、所望の細胞集団を直接選択するためにも使用できる（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら、（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．１９９８  Ｎｏｖ；２８７（２）：４４８−４５６；Ｂａｋｅｒ、（２００５）Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｆｅｂ；１４４（３）：３１７−２２）。
【０５１７】
多数の蛍光タグ化化合物が、全細胞結合アッセイを実施するために利用可能である。さらに、膜結合抗体の結合親和性及び選択性をプロファイリングするために、特定のペプチドが容易に標識され得る。一般に、ペプチドは、広範な種々の蛍光色素、クエンチャー及びハプテン（例えば、フルオレセイン、Ｒ−フィコエリトリン及びビオチン）にコンジュゲート化され得る。コンジュゲート化は、ペプチド合成の間又はペプチドが合成及び精製された後のいずれかに、行なうことができる。
【０５１８】
ビオチンは、小さい（２４４キロダルトン）のビタミンであり、アビジン及びストレプトアビジンタンパク質に高い親和性で結合し、ほとんどのペプチドに対して、それらの生物学的活性を変更することなくコンジュゲート化できる。ビオチン標識したペプチドは、固定化したストレプトアビジン及びアビジンアフィニティゲルを使用して、未標識のペプチドから容易に精製され、ストレプトアビジン又はアビジンとコンジュゲート化されたプローブは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット又はウエスタンブロット適用において、ビオチン化ペプチドを検出するために使用できる。
【０５１９】
ビオチンのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルは、最も一般に使用されるタイプのビオチン化剤である。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド活性化ビオチンは、生理的緩衝液中で一級アミノ基と効率的に反応して、安定なアミド結合を形成する。ペプチドはＮ末端に一級アミンを有し、また、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド活性化ビオチン試薬を用いて標識するための標的として利用可能なリジン残基の側鎖中に数個の一級アミンを有することができる。特性及びスペーサーアームの長さが異なるいくつかの異なるビオチンのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルが利用可能である（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）。スルホ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル試薬は水溶性であり、有機溶媒の非存在下での反応の実施を可能にする。
【０５２０】
或いは、ペプチドは、Ｒ−フィコエリトリン（赤色蛍光タンパク質）とコンジュゲート化され得る。Ｒ−フィコエリトリンは、海藻から単離されたフィコビリンタンパク質である。Ｒ−フィコエリトリンをペプチドを標識するのに理想的なものにしている特性がいくつか存在し、これには、広範な潜在的励起波長を含む吸収スペクトル、水性緩衝液中の溶解度、及び低い非特異的結合が含まれる。Ｒ−フィコエリトリンはまた、広い範囲にわたって温度及びｐＨに非依存的な、高い蛍光量子収量（５７８ナノメートルで０．８２）を有する。Ｒ−フィコエリトリンとペプチドとのコンジュゲート化は、例えば、Ｇｌａｚｅｒ，ＡＮ及びＳｔｒｙｅｒ  Ｌ．（１９８４）．Ｐｈｙｃｏｆｌｕｏｒ  ｐｒｏｂｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．９：４２３−７；Ｋｒｏｎｉｃｋ，ＭＮ及びＧｒｏｓｓｍａｎ，ＰＤ（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２９：１５８２−６；Ｌａｎｉｅｒ，ＬＬ及びＬｏｋｅｎ，ＭＲ（１９８４）Ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｒｅｅ−ｃｏｌｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｕ−２，Ｌｅｕ−３，Ｌｅｕ−７，ａｎｄ  Ｌｅｕ−１１  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３２：１５１−１５６；Ｐａｒｋｓ，ＤＲら（１９８４）Ｔｈｒｅｅ−ｃｏｌｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ５：１５９−６８；Ｈａｒｄｙ，ＲＲら（１９８３）ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｔｈｒｅｅ−ｃｏｌｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：２７０−２；Ｈａｒｄｙ  ＲＲら（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９：１１６９−８８；並びにＫｒｏｎｉｃｋ，ＭＮ（１９８６）Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．９２：１−１３に記載された、当該分野で認められた技術を使用して達成され得る。
【０５２１】
多数の架橋剤が、フィコビリンタンパク質コンジュゲートを産生するために使用でき、これには、Ｎ−スクシンイミジル  ３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド、（スクシンイミジル  ６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート、又は（スルホスクシンイミジル  ６−（３−［ピリジルジチオ］−プロピアンアミド）ヘキサノエートが挙げられるがこれらに限定されない。このような架橋剤は、フィコビリンタンパク質の表面露出した一級アミンと反応し、遊離スルフヒドリル基又は一級アミンのいずれかを含むペプチドと反応し得るピリジルジスルフィド基を生成する。
【０５２２】
別の選択肢は、フルオレセインイソチオシアネート（分子量３８９）でペプチドを標識することである。フルオレセイン上のイソチオシアネート基は、ペプチド上のアミノ、スルフヒドリル、イミダゾイル（ｉｍｉｄａｚｏｙｌ）、チロシル又はカルボニル基と架橋されるが、一般に、一級及び二級アミンの誘導体だけが安定な生成物を生じる。フルオレセインイソチオシアネートは、それぞれ４９４ナノメートル及び５２０ナノメートルの励起波長及び発光波長、並びにｐＨ８の水性緩衝液中で７２，００００Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数を有する（Ｄｅｒ−Ｂａｌｉａｎ  Ｇ，Ｋａｍｅｄａ，Ｎ及びＲｏｗｌｅｙ，Ｇ．（１９８８）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｆａｂ  ｗｈｉｌｅ  ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｔｈｉｏｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７３：５９−６３）。
【０５２３】
４．全細胞活性アッセイ
多くのタンパク質（酵素、細胞内抗体及び受容体を含む）は、生きた細胞内で、又は表面上に表面ディスプレイされた場合に、直接的にアッセイできる。典型的には、首尾よいＦＡＣＳベースのスクリーニングのために、蛍光又は蛍光発生膜透過性物質が必要とされ、多くのこのような試薬は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）から市販されている。酵素活性の増加は典型的に、細胞内に捕捉される蛍光産物の産生の増加を生じ、蛍光が低い細胞から例えばＦＡＣＳによって分離され得る、より高い蛍光を有する細胞を生じる。さらに、多くのハイスループットのマイクロプレートスクリーニングが、酵素活性の事実上任意の既存のアッセイを利用する、タンパク質ライブラリーのスクリーニングのために存在する（一般には、Ｇｅｄｄｉｅ，ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３８８  １３４−１４５（２００４）を参照のこと）。
【０５２４】
５．細胞増殖アッセイ
種々のタンパク質（例えば、増殖因子、酵素、受容体及び抗体など）の発現又は活性は、アッセイとして又は改善されたタンパク質を分離する手段として利用される宿主細胞の増殖速度に影響を与え得る。
【０５２５】
従って、１つのアッセイ形式において、細胞は、限界希釈まで希釈され得、より迅速に増殖する細胞が検出及び選択され得る。１態様において、このような増殖ベースのアッセイは、改善された酵素的代謝経路が必要とされる新規基質（例えば、新たな炭素供給源）の存在下で増殖する能力を含み得る。別の実施形態において、増殖アッセイは毒素の存在下での選択を含み得、この場合、毒素の活性解除機構が必要とされる。別の場合、増殖は、特異的リガンドの存在に応答して所望され得、この場合、リガンドの高親和性の結合が必要とされる。
【０５２６】
Ｂ．選択及び濃縮のストラテジー
１．フローサイトメトリー及びＦＡＣＳ
フローサイトメトリー及び関連のフローソーティング（蛍光活性化セルソーティング即ちＦＡＣＳとしても知られる）は、蛍光レポーターによる染色に基づいて、特定の成分又は成分バリアントの存在について個々の細胞が定量的にアッセイされ得る方法である。フローサイトメトリーは、生きた細胞の定量的なリアルタイム分析を提供し、５０，０００細胞／秒の効率的なセルソーティング速度を達成でき、個々の細胞又は規定された集団を選択することが可能である。多くの市販のＦＡＣＳ系（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡ）、Ｃｙｔｏｐｅｉａ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ））が利用可能である。
【０５２７】
ＦＡＣＳは、複数のパラメーター分析のため及び異なるフルオロフォアとの使用のための、利用可能な広範な波長を発生させることができる、種々のレーザーを備え得る。古典的に、アルゴン、クリプトン、又は両者の混合を使用する水冷イオンレーザーは、いくつかの特異的な線を生じ得る。４０８ｎｍ、５６８ｎｍ及び６４７ｎｍは、例えば、クリプトンについての主要な輝線であり、４８８ｎｍ、４５７ｎｍ及びその他は、アルゴンの線である。これらのレーザーは、高電圧多相電源及び冷却水を必要とするが、高い出力を生じ得る。さらに、波長可変（ｔｕｎａｂｌｅ）及び非可変ダイオードレーザーが存在し、例えば、４０８ｎｍの線は、発光ダイオード（ＬＥＤ）を介して安定に生成され得、これは、容易にソーターに追加できる。さらに、色素レーザーを使用して、ＦＡＣＳ分析に利用可能な波長の利用可能な範囲をさらに拡張することができる。
【０５２８】
ＦＡＣＳ分析の間に、細胞は特異的レポーターで染色され、次いで、蛍光部分を励起するレーザーによる照合のための単一細胞ストリームへと、水力学的に集中させられる。蛍光発光は、波長制限された光学経路を介して検出され、個々の細胞に対応する数値データに変換される。フローソーティングの場合、予め規定された発光基準のサブセットが満たされ得、目的の細胞が、静電反発又は機械的作用により、さらなる使用のために収集レセプタクル中へと方向転換される（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ  ＬＡ、Ｓｗｅｅｔ  ＲＧ、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ  ＬＡ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、Ｓｃｉ  Ａｍｅｒ  ２３４（３）：１０８、Ｍａｒ  １９７６）。
【０５２９】
ＦＡＣＳベースのアプローチは、シグナル伝達ベースのアッセイ、活性ベースのアッセイ及び結合アッセイと適合し、広範な目的のタンパク質（例えば、抗体、受容体、酵素及び任意の表面ディスプレイされたタンパク質が挙げられる）と適合する。ＦＡＣＳは、ほとんどの哺乳動物、酵母及び細菌細胞、並びに蛍光タグ化ビーズに対して、有効に適用できる。
【０５３０】
１実施形態において、ＦＡＣＳは、ＳＨＭ介在性の多様性を受けているか又は既に受けた、表面ディスプレイされたタンパク質（例えば、表面ディスプレイされた抗体）を発現する細胞のライブラリーをスクリーニングするために使用できる。このアプローチにおいて、細胞表面ディスプレイされたライブラリーが使用され、ディスプレイされたタンパク質は、溶液中で蛍光タグ化抗原と共に最初にインキュベートされる。ＦＡＣＳ装置は、ライブラリーのより低い親和性のメンバーから、より高い蛍光強度を有する、ライブラリーの高親和性タンパク質メンバーを分離することができる。ＦＡＣＳベースの選択と組合わせた最適化された結合プロトコルの使用は、フェムトモルレベルまでの親和性を有する抗体を進化させることが可能であると示されている。例えば、Ｂｏｄｅｒら  ＰＮＡＳ、（２０００）９７：１０７０１−１０７０５；Ｂｏｄｅｒら、（２０００）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３２８：４３０−４４４；ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２０００）１６：３１−３７）を参照のこと。
【０５３１】
目的の抗原に対する高い親和性を有する抗体及び結合タンパク質を効率的に選択し迅速に進化させるために、目的の抗原に対する広範な親和性を有する抗体の単離を促進でき、標識試薬又はカップリング試薬に結合するタンパク質をなお排除できるプロトコルが、確立され得る。これらのプロトコルは、選択された細胞集団の厳密さにおける前進、並びに細胞に提示される標的抗原の濃度及び密度の低下の両方を含む。
【０５３２】
各ラウンドの選択の間に収集された総細胞集団の厳密さ又は分画に関して、最初のスクリーニングは一般に、結合特徴における小さい漸進的改善を有するタンパク質を可能な限り多く捕捉するために、比較的低い選別の係数（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）を使用するであろう。例えば、典型的な初回ソーティングは、標的に結合する全細胞の上位１０％、上位５％又は上位２％を捕捉し得る。親和性における大きい改善は、そのそれぞれが全体的親和性に対して小さい付加的効果を与える変異の組合わせの結果であり得る（Ｈａｗｋｉｎｓら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：９５８−９６４）。従って、例え僅かであっても改善された親和性（２〜３倍）を有する全てのライブラリークローンの回収が、ライブラリースクリーニングの初期段階の間には所望され、ソーティングゲートは、濃縮における犠牲を最小にして可能な限り多くのクローンを回収するために最適化され得る。
【０５３３】
これらの選択された細胞は引き続いて回収されて、その集団がＦＡＣＳソーティング、分析、変異誘発、細胞バンキングの引き続くラウンドが可能になるのに、又は配列情報を決定するのに合理的な数に達するまで、何日もの間標準的な培養条件を使用して増殖され得る。以下に議論するように、より高い親和性のバインダーを同定するための選択の引き続くラウンドは、ＦＡＣＳ分析前のプレインキュベーション工程で使用される標識された結合ペプチドの密度及び濃度を漸進的に低下させることによって、達成できる。
【０５３４】
ソーティングの首尾よい第一ラウンドの後に、収集された細胞は、集団を増幅するために再増殖され、次いで再ソーティングされ得る。各所望のクローンのより多いコピーが試験した細胞集団内に存在するので、ソーティングのこの段階及び引き続く段階で、より高い濃縮が可能である。例えば、集団中の細胞の上位約１％、上位約０．５％、上位約０．２％、又は上位約０．１％だけが、有意に改善されたクローンを同定するために選択され得る。最適な結合及び選択ストラテジーを確立することに関して、生殖系列抗体を含む第一世代のヒットは、典型的に、低い親和性及び比較的迅速な解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）を有する。例えば、Ｓａｇａｗａら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３９：８０１−８０８（２００３））は、生殖系列Ａｂについての見かけの親和性は、典型的に２×１０４〜５×１０６Ｍ−１の範囲であるが、この親和性は、親和性成熟の間に約１０９Ｍ−１まで増加する（即ち、解離速度（Ｋｏｆｆ）を低下させることによって主に介在される効果）ことを観察している。
【０５３５】
弱い結合抗体の結合特徴は、初期世代の非最適化ライブラリーのスクリーニングを遅くし得る。なぜなら、特異的だが低い親和性の結合抗体は、典型的に、迅速な解離速度を有し、従って洗浄工程の間に失われる傾向が高いからである。これらの特異的バインダーの喪失は、選択プロセスで使用される成分に非特異的に結合する抗体の単離を生じ得る（Ｃｕｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２Ｎｏｖ；２０（１１）：１１２９−１１３）。
【０５３６】
比較的低い親和性を有する（即ち、約５００ｎＭより高いＫｄを有する）タンパク質の選択を最大化するために、結合相互作用は、スクリーニングプロセスの間の結合ペプチドの解離を防止するために安定化され、カップリング試薬及び支持マトリクスへの結合を排除するための適切なブロッキング試薬を含む。この目的を達成するために、最初のスクリーニングは、非特異的結合を排除するための、カップリング試薬及び標識試薬（例えば、ストレプトアビジン、アビジン及びネイキッドビーズなど）とのプレインキュベーションをも含みつつ、低親和性相互作用の結合強度を増加させるための複数の結合相互作用の使用に基づく結合活性効果を利用するために、高密度の抗原を負荷（ロード）した蛍光タグ化ビーズを使用すべきである（一般には、Ａｇｇａｒｗａｌら、（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１７  ３３５−３４０；Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３  ４５８−６４；Ｔｅｒｓｋｉｋｈら（１９９７）ＰＮＡＳ  ９４  １６６３−８；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６  １６９６−９；及びＷａｎｇら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９４  ２３−３５を参照のこと）。
【０５３７】
ビーズ負荷密度、洗浄及びプレインキュベーション条件の注意深い制御により、このような低い親和性の結合相互作用でさえ再現性良くモニタリングできることが実証されている（Ｗｅｒｔｈｅｎら、（１９９３）ＢＢＡ  ３２６−３３２）。重要なことに、結合効率に関するこれらの改善は、非特異的反応性の何らの有意な増加なしに生じることが実証されている（Ｇｉｏｒｄａｎｏら、（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７  １２４９−５３）。既に議論したように、選択はまた一般に、これらの弱い結合のライブラリーメンバーの全てが選択されるのを確実にするために、ＦＡＣＳの間に比較的低い厳密さのカットオフを使用することに基づくであろう。
【０５３８】
ライブラリーの非特異的メンバー（即ち、結合ペプチドではなく、ビーズ又はカップリング試薬に結合するもの）をさらに排除するために、得られた細胞集団は、別個のカップリング試薬を使用して、ポリマー性結合ペプチド又はインタクトなポリマー性抗原のいずれかを用いて直接スクリーニングされる（例えば、抗原−ストレプトアビジン蛍光複合体を形成するための、ストレプトアビジン−フルオロフォアコンジュゲートにカップリングされたビオチン化抗原の使用を介して）。ビオチン又はフルオロフォアへの結合ペプチドのカップリング又は標識化は、本明細書中及び実施例に記載したように、標準的な当該分野で認められたプロトコルを使用して達成できる。
【０５３９】
ストレプトアビジンは、フェムトモルレベルの親和性でビオチンと結合し、生理学的条件下でテトラマーを形成し、それにより、１つのビオチンでビオチン化された抗原とプレインキュベートした場合、４価の複合体（これ以降、以下に記載するように、ストレプトアビジン微小凝集体と呼ぶ）を生成する。ストレプトアビジンのプレローディングは、有効抗原濃度を５００倍まで増加させることができ、抗原に特異的に結合する弱い抗原バインダーを単離するために有用である。ストレプトアビジン微小凝集体の使用は、非常に弱い親和性から中程度の親和性（約２００ｎＭより高いＫｄ）までの範囲の親和性の抗体を単離するために有用である。さらに、細胞集団との接触前に微小凝集体を生成するために、ビオチン化エピトープを、室温で１０〜１５分間、ストレプトアビジン−フルオロフォアと予め反応させることができる。微小凝集体を引き続いて、二次試薬（例えば、抗ヒトＩｇＧ−フルオロフォアコンジュゲート）の添加の前に、１５〜３０分間にわたり同時に細胞と接触させる。１つの実験的アプローチにおいて、細胞は、１５００×ｇで５分間遠心分離され、小容量（典型的には５００μＬ〜１ｍＬ）のＤＡＰＩ（ＰＢＳ、１％  ＢＳＡ、２μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ）中に再懸濁される。「均一なアッセイ条件」と称する第二のアプローチにおいて、細胞は、抗原−ストレプトアビジン微小凝集体及びヤギ抗ヒトＩｇＧ−フルオロフォアが添加されるＤＡＰＩ中に直接再縣濁される。この第二のアプローチは特に、解離時間を最小化することがより適切であり得る場合、より弱く相互作用する抗体（約２００ｎＭより高いＫｄ）にとって望ましい。
【０５４０】
より高い親和性（Ｋｄ＞１０ｎＭであるが約１００ｎＭ未満のＫｄ）で、ライブラリーは、出発（野生型）相互作用のＫｄ（見かけのＫｄは、ソーティングの前に、ある範囲の抗原濃度で実施した一連の分析的ＦＡＣＳ実験によって容易に決定できる）よりも理想的には低い結合ペプチドのある濃度での平衡結合条件下で、モノマー結合ペプチド又は全長標的タンパク質と共にライブラリーをインキュベートすることによって、改善された親和性についてより容易に直接スクリーニングされる。これらの条件下で、より高い親和性を有する抗体及び結合タンパク質を保有する細胞は、より弱いバインダーよりもより有意に蛍光標識された結合ペプチドを保有して、集団中の最も蛍光性の細胞がさらなる最適化のために容易に選択されるのを可能にするであろう。典型的に、上位約０．５％〜約０．１％の細胞を選択するＦＡＣＳソーティングゲートが確立できる。１つの非限定的な方法において、上位約０．２％の細胞が選択される。
【０５４１】
Ｂｏｄｅｒ及びＷｉｔｔｒｕｐ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（１９９８）１４  ５５−６２）により認識されるように、非常に高い親和性（Ｋｄ＜１０ｎＭ）のタンパク質−リガンド相互作用のスクリーニングは、親和性について直接スクリーニングするのではなく、低下した解離速度についてスクリーニングすることによって、達成できる。このアプローチにおいて、細胞は、蛍光結合ペプチドで飽和まで標識され、その後過剰の非蛍光リガンドが添加される。細胞に会合した蛍光は、時間と共に指数関数的に減衰してバックグラウンドレベルに達し、解離反応は、通常冷緩衝液での大規模な希釈により、一定の持続時間の後停止させる。競合反応の持続時間は、異なるライブラリークローンについて、観察された蛍光における差異を決定し、従って、ライブラリーから選択される可能性の高い動力学的改善の範囲を決定する。競合的解離反応について、過剰の非蛍光リガンドの存在は、ゼロの有効正反応速度を生じ得る。競合反応の開始後所与の時間での平均蛍光強度は、解離速度（Ｋｏｆｆ）の関数である（ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐ及びＷｉｔｔｒｕｐ（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６  ３１−３７；Ｂｏｄｅｒら（２０００）ＰＮＡＳ  ９７  １０７０１−１０７０５；並びにＦｏｏｔｅ及びＥｉｓｅｎ（２０００）ＰＮＡＳ  ９７  １０６７９−１０６８１）。改善された親和性及びより安定な結合を有する抗体を発現する、集団中の細胞は、競合反応の時間の長さを漸増させ、次いで、さらなる最適化のために集団中に残存する最も蛍光性の細胞を選択することによって、体系的に同定できる。
【０５４２】
これらの条件下で、より高い親和性を有する、表面ディスプレイされた抗体及び結合タンパク質を保有する細胞は、ほとんど又は全く結合がないタンパク質を発現する細胞と比較して、有意により多くのビーズ又はストレプトアビジン−ビオチン化抗原微小凝集体結合を示すであろう。最も蛍光標識された細胞（最も高い親和性を有するタンパク質をディスプレイする）は次いで、標準的なＦＡＣＳソーティングプロトコルを使用して、例えば実施例９に記載するように、集団中の細胞の残部から分離できる。
【０５４３】
結合ペプチドへの再現性の良い結合を示すタンパク質を発現する選択された細胞集団が一旦作成されると、これは、抗体又は結合タンパク質が、所望のパターンの交差反応性及び／若しくは特異性（例えば、目的のタンパク質のマウス及びヒト両方のバリアントに対する）、又は関連の遺伝子ファミリーの２つの異なるメンバーに対する（しかし、関連がないか関連性が遠いタンパク質に対してではない））を示すことを確認するために、２以上のインタクトなタンパク質を用いて特徴付けされ得る。
【０５４４】
１実施形態において、これは、フローサイトメーターで同時に分析できる２つの異なる色の検出可能なタグ（例えば、ＦＩＴＣ及びフィコエリトリン）で標識した２以上のタンパク質種を使用した、マルチパラメータＦＡＣＳを使用して達成できる。このアプローチを使用して、一方のタンパク質のみへの結合を示すか又は両方のタンパク質に結合可能な細胞を同定することが可能である。求められる二重特異的結合を示す細胞集団は、ソートされた細胞の数に基づいてＦＡＣＳ操作者によって選択され得、多特異性を示す細胞の割合が同定され得る。既に記載したように、これらの選択された細胞は、引き続いて回収され、その集団がＦＡＣＳソーティング、分析、細胞バンキングの引き続くラウンドを可能にし、又は配列情報を決定するのに合理的な数に達するまで、何日もの間標準的な培養条件を用いて増殖され得る。
【０５４５】
ライブラリーから選択されたバインダーはさらに、本明細書中に記載したように特徴付けでき、抗体又は結合タンパク質の配列が、細胞ＤＮＡのＰＣＲ、選択された細胞集団から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ又はエピソームレスキューの後に決定され得る。
【０５４６】
候補抗体及び結合タンパク質は、本明細書中に記載するように、増強された結合特性を有する抗体又は結合タンパク質を発現する細胞の集団を進化させるために、超変異及び選択のラウンドに繰り返し供され得る。より高い親和性を有する結合ペプチドに優先的及び／又は選択的に結合する細胞が選択され、増幅される。必要に応じて、別のラウンドの変異誘発が繰り返され、再度、改善された選択的かつ高い親和性の結合を示す細胞が、さらなる増幅及び増殖のために保持される。得られた新規改善されたバリアントはさらに、本明細書中に記載したように特徴付けでき、ＲＴ−ＰＣＲ又はエピソームレスキューの後に、重鎖及び軽鎖の配列が決定され得る。
【０５４７】
超変異／選択の最初の１、２又は３ラウンドで同定された変異は、元の親骨格の背景内の新たなテンプレートのセットへと、コンビナトリアルに組換えられ得、得られたテンプレートの全て又はサブセットは、その後、細胞中にトランスフェクトされ得、この細胞が次いでＦＡＣＳソーティングによって選択される。変異の最良の組み合わせはこうして単離及び同定され、超変異／選択の引き続くラウンドで使用されるか、又は新たに同定されたテンプレートが充分に強力な親和性を示す場合には、さらなる機能的特徴付けのために、実験において代わりに使用されるかのいずれかである。
【０５４８】
別の実施形態において、ＦＡＣＳは、ＳＨＭ介在性の多様性生成を受けているか又は既に受けた細胞内タンパク質を発現する細胞のライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。このアプローチにおいて、膜透過性の蛍光発生又は蛍光試薬が使用され、試薬の取り込み及び変換を可能にするために、細胞のライブラリーと共に最初にプレインキュベートされる。ＦＡＣＳ機器は、より高い割合の試薬を変換でき、かつより低い活性のメンバーを含む細胞よりも蛍光が強い、ライブラリーの高活性タンパク質メンバーを分離することができる（例えば、Ｆａｒｉｎａｓ、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．（２００６）９：（４）３２１−３２８を参照のこと）。
【０５４９】
検出される蛍光部分としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：フルオレセイン（一般にＦＩＴＣと呼ばれる）、フィコビリタンパク質（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）（Ｋｒｏｎｉｃｋ，Ｍ．Ｎ．Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．９２：１−１３（１９８６）））、蛍光半導体ナノ結晶（例えば、超高感度非同位体検出のための量子ドット（ＱＤｏｔ）バイオコンジュゲート（Ｃｈａｎ  ＷＣ、Ｎｉｅ  Ｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２０１６−８（１９９８）））、及びクマリン誘導体（例えば、７−ヒドロキシクマリン由来のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｃｙｌａｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ）などの化合物。
【０５５０】
蛍光はまた、ティール蛍光タンパク質（ＴＦＰ）などの蛍光タンパク質から、ＤＮＡに結合したＤＡＰＩなどの細胞成分の化学染色から、細胞性産物を認識する抗体に共有結合によりコンジュゲート化された蛍光部分から、細胞性受容体のリガンドに共有結合によりコンジュゲート化された蛍光部分から、及び細胞性酵素の基質に共有結合によりコンジュゲート化された蛍光部分から、報告され得る。
【０５５１】
膜不透過レポーター（例えば抗体）で染色された細胞は、遺伝子、エピソーム又は目的のタンパク質などの成分を回収するための引き続く処理のためにソーティングされ得る。増幅についてインタクトな、表面発現成分について染色された細胞又は細胞膜透過レポーターで染色された細胞もまた、ソーティングされ得る。
【０５５２】
２．アフィニティ分離
微粒子の使用に基づくアフィニティ分離は、特定の化合物又は目的の配列への親和性に基づいた、表面ディスプレイされたタンパク質の分離を可能にする。このアプローチは迅速であり、スケールアップが容易に可能であり、生きた細胞を用いて繰り返し使用できる。
【０５５３】
官能基で修飾されたか又は種々の抗体若しくはリガンド（例えば、アビジン、ストレプトアビジン又はビオチン）でコーティングされた微粒子表面へ、化合物又はペプチドをカップリングする、常磁性ポリスチレン微粒子が市販されている（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ、ＩＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。
【０５５４】
１態様において、微粒子の常磁性の特性により磁石を使用した溶液からの分離が可能な常磁性ビーズが、使用され得る。微粒子は、磁石から外されると容易に再縣濁でき、それにより、付着したプローブを見出す、細胞の選択的分離を可能にする。
【０５５５】
１実施形態において、ペプチドは、チューブ中で、ポリウレタン層でコーティングされた常磁性ポリスチレン微粒子にカップリングされ得る。微粒子表面上のヒドロキシル基は、ｐ−トルエンスルホニルクロライドとの反応によって活性化される（Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｋ及びＭｏｓｂａｃｈ  Ｋ．「ｐ−Ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ａｓ  ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｏｆ  ａｇａｒｏｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８０：１１２：３９７−４０２）。得られたスルホニルエステルはその後、ペプチドのアミノ基又はスルフヒドリル基と、共有結合により反応できる。ペプチドは、活性化された微粒子の表面上に迅速に吸収され、その後、さらなるインキュベーションにより、共有アミン結合が形成される。微粒子（２０９微粒子／ミリリットル）は、微粒子１ミリリットル（ｍｌ）を含むチューブを磁石上に配置し、微粒子をチューブの磁石側に移動させ、上清を除去し、１００ミリモル濃度（ｍＭ）のホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）１ｍｌ中に微粒子を再縣濁することによって、２回洗浄される。洗浄後、微粒子は、１００ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に１０９微粒子／ｍｌの濃度で再縣濁される。１１ナノモルのペプチドを微粒子に添加し、微粒子／ペプチド混合物を１分間ボルテックスして混合する。少なくとも４８時間、ゆっくりした傾斜回転で室温で、微粒子をペプチドとインキュベートする。微粒子上へのペプチドの最適な方向付けを保証するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、インキュベーションが１０分間進行した後に、０．１％（重量／体積）の最終濃度になるように、微粒子／ペプチド混合物に添加する。インキュベーション後、微粒子／ペプチド混合物を含むチューブを、微粒子がチューブの磁石側に移動するまで、磁石上に配置する。上清を除去し、微粒子を、１％（重量／体積）ＢＳＡ含有のリン酸緩衝化生理食塩溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）１ｍｌで、４回洗浄する。最後に、微粒子を、１％（重量／体積）ＢＳＡ含有のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）１ｍｌ中に再縣濁する。
【０５５６】
或いは、表面カルボン酸を含む常磁性ポリスチレン微粒子は、カルボジイミドで活性化され得、その後ペプチドにカップリングされ、ペプチドの一級アミノ基と微粒子表面上のカルボン酸基との間の安定なアミド結合を生じる（Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｎ及びＩｋａｄｅ  Ｙ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｍｉｄｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｆｏｒ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｍｅｄｉａ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９５、６（１）、１２３−１３０；Ｇｉｌｌｅｓ  ＭＡ、Ｈｕｄｓｏｎ  ＡＱ及びＢｏｒｄｅｒｓ  ＣＬ  Ｊｒ、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０  Ｆｅｂ  １；１８４（２）：２４４−２４８；Ｓｅｈｇａｌ  Ｄ及びＶｉｊａｙ  ＩＫ、ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｉｄａｔｉｏｎ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４  Ａｐｒ；２１８（１）：８７−９１；Ｓｚａｊａｎｉ  Ｂら、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅｓ、Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９１  Ａｕｇ；３０（２）：２２５−２３１）。微粒子（２９微粒子／ミリリットル）を、２５ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ｐＨ５）１ｍｌで１０分間、室温でゆっくりした傾斜回転で２回洗浄する。洗浄した微粒子を、２５ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ｐＨ５）７００マイクロリットル（μＬ）中に再縣濁し、その後、２５ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ｐＨ５）中に再縣濁したペプチド２１ナノモルを、微粒子溶液に添加する。微粒子／ペプチド混合物をボルテックスによって混合し、室温で３０分間ゆっくりした傾斜回転でインキュベートする。この最初のインキュベーション後、２５ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ｐＨ５）中に１００ミリグラム（ｍｇ）／ｍＬで再縣濁した氷冷１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩３００μＬを、ペプチド／微粒子混合物に添加し、４℃で一晩ゆっくりした傾斜回転でインキュベートする。ペプチドがカップリングした微粒子を、１ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）／０．１％  ＢＳＡで、室温で１５分間、ゆっくりした傾斜回転で４回洗浄する。洗浄後、ペプチドがカップリングした微粒子を、１％（重量／体積）ＢＳＡ含有のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）１ｍｌ中１９微粒子の濃度で再縣濁する。
【０５５７】
別の選択肢は、その表面がストレプトアビジンの単層と共有結合した常磁性ポリスチレン微粒子に、ビオチン化ペプチドをカップリングすることである。簡潔に述べると、１ｍｌのストレプトアビジン微粒子を、微量遠心分離チューブに移し、チューブを磁石上に配置し、チューブの磁石側に微粒子を集めることによって４回洗浄する。次いで、溶液を除去し、微粒子を、１％（重量／体積）ＢＳＡ含有のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）１ｍｌ中に穏やかに再縣濁する。最後の洗浄後、微粒子を、１％（重量／体積）ＢＳＡ含有のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）１ｍｌ中に再縣濁し、３３ピコモルのビオチン化ペプチドを、微粒子溶液に添加する。微粒子／ペプチド溶液を、ゆっくりした傾斜回転で、室温で３０分間インキュベートする。カップリング後、未結合のビオチン化ペプチドを、１％（重量／体積）ＢＳＡ含有のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）で４回洗浄することによって、微粒子から除去する。最後の洗浄後、微粒子／ペプチド混合物を、１９微粒子／ｍｌの最終ビーズ濃度になるよう再縣濁する（Ａｒｇａｒａｎａ  ＣＥ、Ｋｕｎｔｚ  ＩＤ、Ｂｉｒｋｅｎ  Ｓ、Ａｘｅｌ  Ｒ、Ｃａｎｔｏｒ  ＣＲ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｇｅｎｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８６；１４（４）：１８７１−８２；Ｐａｈｌｅｒ  Ａ、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ＷＡ、Ｇａｗｉｎｏｗｉｃｚ  Ｋｏｌｋｓ  ＭＡ、Ａｒａｇａｎａ  ＣＥ、Ｃａｎｔｏｒ  ＣＲ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｒｅ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９８７：２６２（２９）：１３９３３−７）。
【０５５８】
本発明において使用するための特定のペプチド配列の同定、選択及び使用は、共有に係る優先出願第６０／９９５，９７０号（代理人書類番号３３５４７−７０８．１０１）（２００７年９月２８日出願）に開示されている。
【０５５９】
ＸＩＩ．データベース
本発明は、特定のタンパク質の配列及び同定された変異（結合ドメインの配列、又は活性部位、並びにそれらの結合特徴、活性、安定性特徴及び３次元分子構造が含まれるが、これらに限定されない）を含む、コンピュータ可読データベースを生成する方法を含む。具体的には、本発明は、目的のタンパク質又はその関連のタンパク質若しくはその部分から生成した変異のデータベースに基づいた、目的のタンパク質の設計及び最適化を助けるための、このようなデータベースの使用を含む。
【０５６０】
他の実施形態において、本発明のデータベースは、スクリーニングによって特異的標的に結合することが同定されたタンパク質（単数又は複数）の変異、又はこのようなタンパク質の他の表示（例えば、図的表示又は名称など）を含み得る。
【０５６１】
「データベース」とは、読み出し可能なデータの収集を意味する。本発明は、本明細書中に記載するような、タンパク質（単数又は複数）のアミノ酸及び核酸構造（例えば、その配列、構造、及び活性又は結合活性）に関する情報が組み込まれたか又はそのような情報を含む、機械可読媒体を包含する。このような情報は、サブユニット、ドメイン及び／又はそれらの部分（例えば、リガンド結合（結合）若しくはリガンド未結合（未結合）のいずれかの、活性部位、補助結合部位、及び／又は結合ポケットを含む部分）に関するものであり得る。
【０５６２】
或いは、情報は、タンパク質中に見出される特定の構造を示す識別子の情報であり得る。本明細書中で使用する場合、「機械可読媒体」とは、コンピュータ又はスキャナにより読み取られ直接アクセスされ得る、任意の媒体をいう。このような媒体は、多くの形態をとり得、これには、不揮発性媒体、揮発性媒体及び伝送媒体が挙げられるが、これらに限定されない。不揮発性媒体（即ち、電源の非存在下で情報を保持できる媒体）には、ＲＯＭが含まれる。揮発性媒体（即ち、電源の非存在下で情報を保持できない媒体）には、メインメモリが含まれる。
【０５６３】
伝送媒体としては、同軸ケーブル、銅線及び光ファイバー（バスを含むワイヤが含まれる）が挙げられる。伝送媒体は、搬送波（即ち、情報信号を伝達するために、周波数、振幅又は位相などにおいて調節され得る、電磁波）の形態をとることもできる。さらに、伝送媒体は、音波又は光波（例えば、電波及び赤外線通信の間に発生するもの）の形態をとり得る。
【０５６４】
このような媒体には以下も挙げられるがこれらに限定されない：磁気記憶媒体（例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク記憶媒体及び磁気テープ）；光学記憶媒体（例えば、光ディスク又はＣＤ−ＲＯＭ）；電気記憶媒体（例えば、ＲＡＭ又はＲＯＭ）、ＰＲＯＭ（即ち、プログラム可能なリードオンリメモリ（ＲＯＭ））、ＥＰＲＯＭ（即ち、消去可能ＰＲＯＭ）（ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭを含む）、任意の他のメモリチップ又はカートリッジ、搬送波、又はプロセッサが情報を読み出せる任意の他の媒体、及びこれらのカテゴリーのハイブリッド（例えば、磁気／光学記憶媒体）。このような媒体にはさらに、スキャン装置によって読み取られ得、コンピュータ若しくは本明細書中に記載する任意のソフトウェアプログラム（例えば、光学式文字認識（ＯＣＲ）ソフトウェア）によって容易にアクセスされるフォーマットに変換され得る、アミノ酸又はポリヌクレオチドの配列の表示が記録された、紙が含まれる。このような媒体には、穴のパターンを有する物理的媒体（例えば、パンチカード及び紙テープなど）も含まれる。
【０５６５】
具体的には、目的のタンパク質の設計及び最適化を助けるための、データベースから伝送媒体を介した第三者サイトへのデータの伝送が、本発明に含まれる。
【０５６６】
種々のデータ記憶構造が、本発明のアミノ酸配列若しくはポリヌクレオチド配列又はそれらの部分及び／或いは活性データが記録された、コンピュータ可読媒体を作成するために利用可能である。データ記憶構造の選択は、記憶された情報にアクセスするために選択される手段に基づき得る。本明細書中に記載するアミノ酸配列若しくはポリヌクレオチド配列又はそれらの部分の全てのフォーマットの表示が、本発明によって企図される。本発明の配列が記憶されたコンピュータ可読媒体を提供することによって、改善されたタンパク質を生成するための、モデリングプログラム及び設計プログラムにおいて使用するためのアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列におけるＳＨＭ介在性の変化並びに関連情報に、日常的にアクセスできる。
【０５６７】
コンピュータは、本発明のタンパク質若しくはペプチド構造の配列又はその部分（例えば、リガンド結合形態若しくはリガンド未結合形態のいずれかの、活性部位、補助結合部位及び／又は結合ポケットを含む部分）を表示するために使用され得る。用語「コンピュータ」には以下が挙げられるがこれらに限定されない：データを保存でき、１以上のアプリケーション（即ちプログラム）を独立して実行できる、メインフレームコンピュータ、パーソナルコンピュータ、携帯用ラップトップコンピュータ、及び携帯情報端末（「ＰＤＡ」）。コンピュータとしては、例えば、本発明の機械可読記憶媒体、機械可読記憶媒体中にコード化された機械可読データを処理するための指示を記憶するためのワーキングメモリ、機械可読情報を処理するための、ワーキングメモリ及び機械可読記憶媒体に作動可能に連結された中央演算処理装置、及び構造座標又は三次元表示を表示するための、中央演算処理装置に作動可能に連結されたディスプレイ、を挙げることができる。
【０５６８】
本発明のコンピュータとしては、例えば以下も挙げることができる：中央演算処理装置、例えばランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）又は「コアメモリ」であり得るワーキングメモリ、大容量記憶装置（例えば、１以上のディスクドライブ又はＣＤ−ＲＯＭドライブ）、１以上のブラウン管（「ＣＲＴ」）ディスプレイターミナル又は１以上のＬＣＤディスプレイ、１以上のキーボード、１以上の入力線、及び１以上の出力線（これらは全て、従来の双方向システムバスによって相互接続される）。本発明の機械可読データは、電話回線又は専用データ回線（そのいずれも、例えばワイヤレスモードの連絡を含み得る）によって接続されたモデム（単数又は複数）を介して、入力及び／又は出力できる。入力ハードウェアもまた（又はその代わりに）、ＣＤ−ＲＯＭドライブ又はディスクドライブを含み得る。入力デバイスの他の例は、キーボード、マウス、トラックボール、フィンガーパッド又はカーソル指示キーである。出力ハードウェアもまた、従来のデバイスにより実装され得る。例えば、出力ハードウェアとして、ＣＲＴ、又は任意の他のディスプレイターミナル、プリンター、又はディスクドライブを挙げることができる。ＣＰＵは、種々の入力デバイス及び出力デバイスの使用を調整し、大容量記憶装置からのデータアクセス並びにワーキングメモリへの及びワーキングメモリからのアクセスを調整し、データ処理工程の順序を決定する。コンピュータは、本発明のデータを処理するために、種々のソフトウェアプログラムを使用できる。多数のこれらのタイプのソフトウェアの例は、本出願を通じて議論されている。
【実施例】
【０５６９】
以下の実施例により本願の構成要素を説明するが、何ら限定して解釈されるべきではない。
【０５７０】
実施例１
ブラストサイジンをコードする合成ポリヌクレオチドの作製
選択マーカー、ＳＨＭに関与する酵素、又はレポーター遺伝子等のベクターエレメントにおいて体細胞超変異が起こる可能性を減らすことにより、ＳＨＭを起こして追跡するためのベクター及びシステムがより安定となり、それによって目的のポリヌクレオチドを体細胞超変異のより効果的な標的とすることが可能となる。
Ａ．ポリヌクレオチド設計
【０５７１】
一般的に、配列を本明細書中に記載の教示を用い、そしてセクションＩＩＩ及びセクションＩＶ中に詳述した通りＳＨＭ用に工夫する。以下の実施例において、配列最適化は上記の通りコンピュータープログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎ．ｐｌを用い、表７に列挙したホットスポット及びコールドスポットモチーフに基づく。
【０５７２】
このプログラムを用い、配列内のどの位置も「＋」、「−」、又は「．」のいずれかの記号で注記し、その特定位置でＳＨＭ感受性においてよりホット、よりコールド、又はニュートラルな変化が所望かどうか指定する。ここで「＋」はホットスポット、「−」はコールドスポット、及び「．」はニュートラルポジションを指定する。例えば、ブラストサイジン遺伝子のどの位置でもＳＨＭ耐性型を同定するためには以下のブラストサイジンの入力配列が用いられる。
【０５７３】
【化１】
2010520748.tif 000055
【０５７４】
それに比べて、当該遺伝子のどの位置でもＳＨＭにより感受性の、ブラストサイジン遺伝子のよりホットな型を同定するためには以下の入力ファイルが用いられる。
【０５７５】
【化２】
2010520748.tif 000056
【０５７６】
以前に記載された通り、この過程の間に、野生型タンパク質のアミノ酸配列に一致する９塩基に渡る領域の全てのヌクレオチド配列を列挙し、ホットスポットモチーフ、コールドスポットモチーフ、ＣｐＧモチーフ、コドン使用頻度、及び同一ヌクレオチドのストレッチの数について記録する。次いで、当該プログラムによりいずれかのランダム配列をよりホット、よりコールド、又はニュートラルなポリヌクレオチドタイルと置換できるかどうか決定する。
【０５７７】
図７に示す通り、このアプローチは、イヌＡＩＤに迅速に適用した場合に、当該ヌクレオチド配列の１５〜２０％の置換により元の配列と相違するコールドに最適化した新たなイヌＡＩＤ配列の同定に（数百のタイル置換内で）収束する。変化の大半が、反復サイクルの初期に起こり、通常、反復約５００回の後に完了する。予想されるとおり、より大きな遺伝子では完全最適化配列に到達するためにより多くの反復回数が必要となる。通常、大半の遺伝子については、反復２０００〜３０００回の使用で十二分である。
【０５７８】
多くの未改変遺伝子の無作為解析により、たいていの哺乳動物遺伝子は、１００ヌクレオチド当たり平均約９〜１５コールドスポットを創出し、メジアン密度が約１３．８コールドスポット／１００ヌクレオチドを有し、１００ヌクレオチド当たり約７〜１３ホットスポットのホットスポット密度（メジアン密度が１００ヌクレオチド当たり約８．３ホットスポット）を有するコドンを使用することが示されている。
【０５７９】
未改変ブラストサイジン遺伝子についての初期の出発配列、並びにホットスポット、コールドスポット及びＣｐＧの頻度を図８に示す。
【０５８０】
１．コールド  ブラストサイジン
このアプローチを用いて作製したＳＨＭ耐性（コールド）型のブラストサイジンについての最適化配列を、結果生じるホットスポット及びコールドスポット頻度における変化と共に図９に示す。ブラストサイジン配列をより体細胞超変異に耐性にするための当該配列の最適化により約１８８％のコールドスポット数増加（７３増加）、及び約５７％のホットスポット数減少（１５減少）がもたらされた。全体のコールドスポット頻度は１００ヌクレオチド当たり約１５コールドスポットの初期密度から１００ヌクレオチド当たり約２８コールドスポットの平均密度へと増加し、全体のホットスポット頻度は未改変遺伝子中の１００ヌクレオチド当たり約９ホットスポットから、ＳＨＭ耐性型中の１００ヌクレオチド当たり約５ホットスポットへと減少した。
【０５８１】
２．ホット  ブラストサイジン
このアプローチを用いて作製したＳＨＭ感受性型のブラストサイジンについての最適化配列を、結果生じるホットスポット及びコールドスポット頻度における変化と共に図１０に示す。ブラストサイジン配列をより体細胞超変異に感受性にするための当該配列の最適化により約１９７％のホットスポット数増加（３４増加）、及び約５６％のコールドスポット数減少（２６減少）がもたらされた。全体のホットスポット頻度は１００ヌクレオチド当たり約９ホットスポットの初期密度から１００ヌクレオチド当たり約１７ホットスポットの平均密度へと増加し、全体のコールドスポット頻度は未改変遺伝子中の１００ヌクレオチド当たり約１５コールドスポットから、ＳＨＭ感受性型中の１００ヌクレオチド当たり約９コールドスポットへと減少した。
【０５８２】
Ｂ．クローニング及び解析
合成ポリヌクレオチド配列に、無関係な制限部位が確実に無いことを最終的に点検した後、完全なポリヌクレオチド配列を合成し(DNA2.0,MenloPark,CA)、ＤＮＡ２．０のクローニングベクターのうちの１つにクローニングし（以下表１１参照）、正しく合成されていることを確認するため配列決定する。
【０５８３】
【表１１】
2010520748.tif 000057
【０５８４】
例えばＥボックスモチーフ又はＩｇエンハンサーエレメントといった他のエレメントは、下記実施例５に記載されるようにオリゴ合成又はＰＣＲ増幅のいずれかにより創出する。
【０５８５】
新たな合成インサートの機能性を試験するため、上記表１１に列挙した制限酵素を用いてＤＮＡ２．０ソースベクターからコーディング領域を切り出し、標準的な組み換え分子生物学的技法を用いて発現ベクター（表１１）に挿入する。ＡＢシリーズベクターへの選択マーカー（即ち、コールドブラストサイジン、コールドハイグロマイシン、及び未改変ピューロマイシン）の挿入によりそれらをＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列（ＡＢ１５０、ＡＢ１０２、ＡＢ１７９；図３３Ａ参照）の下流又はｐＳＶプロモーター（ＡＢ１６１、ＡＢ１５３、ＡＢ１６３；図３３Ｂ参照）の下流に配置する。
【０５８６】
最適化された合成遺伝子の機能活性を試験するために、Ｈｅｋ２９３細胞を６ウェルマイクロタイターディッシュ中、４ｘ１０５／ウェルで播種する。２４時間後、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ (Indianapolis,IN)のＦｕｇｅｎｅ６試薬を用い、試薬とＤＮＡの比率をウェル当たり３μＬ：１μｇＤＮＡとしてトランスフェクションを行う。この比率は複数のプラスミドを用いたトランスフェクションについても維持される。トランスフェクションは製造元のプロトコールに従って行う。
【０５８７】
体細胞超変異に対する各コンストラクトの相対的安定性／感受性を測定するために、トランスフェクトされた各細胞集団の安定な細胞系を作製し、それらがＳＨＭ介在性の変異を蓄積する相対速度を測定するために試験した。これらの変異の大半は機能の損失をもたらすので、相対的変異誘発負荷はＦＡＣＳを介して蛍光欠失として簡便に測定できる（以下及び実施例４を参照）。
【０５８８】
ＦＡＣＳ解析。ＦＡＣＳ解析前に、細胞をトリプシン処理により回収し、１％  ｗ／ｖ  ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で２回洗浄し、２ｎｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを含有するＰＢＳ／１％ＢＳＡ２００μｌ中に再懸濁する。細胞をＣｙｔｏｐｅｉａ  Ｉｎｆｌｕｘ中、２００ｍＷ  ４８８ｎｍ及び５０ｍＷ  ４０３ｎｍレーザー励起で解析する。１試料当たり最大百万個の細胞を取得する。ＤＡＰＩ蛍光を４６０／５０バンドパスフィルターを通して測定する。ＧＦＰ蛍光を５２８／３８バンドパスフィルターを通して測定する。細胞バックグラウンドを超えるＧＦＰ蛍光が検出できず、ＤＡＰＩを排除している生細胞のパーセンテージとして、パーセントＧＦＰ発現を報告する。
【０５８９】
イヌＡＩＤ遺伝子の機能を試験するための復帰アッセイ。ＧＦＰ＊（部位特異的変異誘発により８２位に導入した終止コドン［Ｙ８２ｓｔｏｐ］を伴うＧＦＰ）をＡＢ１７４（コールド  イヌＡＩＤ）と共トランスフェクションし、トランスフェクションから３日後に細胞をフローサイトメトリーで解析し、抗生物質による選択下に置き、１３〜１５日間、隔日で更にフローサイトメトリーで解析する。
【０５９０】
抗生物質による選択。Ｈｅｋ２９３細胞の選択に用いられる抗生物質の濃度は殺菌曲線を実行する（即ち、トランスフェクションしていない−従って抗生物質感受性の−細胞を全て殺す最少抗生物質濃度の測定）ことによって経験的に決定する。トランスフェクションから３日後、細胞を４ｘ１０５／ウェルで播種し、以下の濃度：１．５μｇ／ｍｌピューロマイシン(Clontech,Mountain View,CA)；１６μｇ／ｍＬブラストサイジン(Invitrogen,Carlsbad,CA)；及び３６０μｇ／ｍＬハイグロマイシン(Invitrogen,Carlsbad,CA)、で選択する。
【０５９１】
機能性を測定するために耐性マーカー遺伝子を、１６μｇ／ｍＬブラストサイジン(Invitrogen,Carlsbad,CA)；及び３６０μｇ／ｍＬハイグロマイシン(Invitrogen,Carlsbad,CA)存在下で２週間の薬剤耐性細胞増殖を促進するその能力に基づき、適切な発現プラスミド（即ち、ブラストサイジンについてはＡＢ１０２、ハイグロマイシンについてはＡＢ１７９）でＨｅｋ２９３細胞をトランスフェクトすることにより試験する。
【０５９２】
コールド  ブラストサイジンを含有するＡＢ１０２でトランスフェクトすることにより、野生型遺伝子に匹敵する割合で、トランスフェクトされたｈｅｋ２９３細胞の薬剤耐性コロニーが結果的に作り出された。
【０５９３】
実施例２
ハイグロマイシンをコードする合成ポリヌクレオチドの作製
Ａ．ポリヌクレオチド設計
未改変ハイグロマイシンの出発配列を図１１に、ホットスポット及びコールドスポット頻度の初期解析と共に示す。
【０５９４】
実施例１に記載したとおり、表７に列挙したホットスポット及びコールドスポットモチーフに基づき、コンピュータープログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎを用いて配列最適化を完了する。
【０５９５】
１．コールド  ハイグロマイシン
反復１回から反復２０００回までで、７１コールドスポットが更に当該遺伝子に挿入され、存在する１２ホットスポットが除去され、６１ＣｐＧサイトが除去されて、当該遺伝子配列を体細胞超変異により感受性でなくなる。更なる反復による、更なる有益な変化は観察されない。
【０５９６】
このアプローチを用いて作製したＳＨＭ耐性型のハイグロマイシンについての最適化配列を、結果生じるホットスポット及びコールドスポット頻度における変化と共に図１２に示す。ハイグロマイシン配列をより体細胞超変異に耐性にするための当該配列の最適化により約１４４％のコールドスポット数増加（７１増加）、及び約１７％のホットスポット数減少（１２減少）がもたらされた。全体のコールドスポット頻度は１００ヌクレオチド当たり約１５コールドスポットの初期密度から１００ヌクレオチド当たり約２２コールドスポットの平均密度へと増加し、全体のホットスポット頻度は未改変遺伝子中の１００ヌクレオチド当たり約７ホットスポットから、ＳＨＭ耐性型中の１００ヌクレオチド当たり約５ホットスポットへと減少した。
【０５９７】
コールド  ハイグロマイシンを含有するＡＢ１７９でトランスフェクトすることにより、野生型遺伝子に匹敵する割合で、トランスフェクトされたＨｅｋ２９３細胞の薬剤耐性コロニーが作り出された。
【０５９８】
２．ホット  ハイグロマイシン
逆に言えば、選択マーカー等のベクターエレメントにおける体細胞超変異の確率を高めることにより、将来の使用のためマーカーを「回収」することができる。
【０５９９】
ホット  ハイグロマイシンコンストラクトの場合、設計したヌクレオチド配列はホットスポットについては最多にし、コールドスポットについては最少にし、ＣｐＧリピートについては最少にし、且つ公知の哺乳動物の最適化コドン使用頻度に整合させる。
【０６００】
ハイグロマイシン配列をより体細胞超変異に感受性にするための当該配列の最適化により約１８３％のホットスポット数増加（６１増加）、及び約４２％のコールドスポット数減少（３５減少）がもたらされた（図１３）。全体のホットスポット頻度は１００ヌクレオチド当たり約７ホットスポットの初期密度から１００ヌクレオチド当たり約１３ホットスポットの平均密度へと増加し、全体のコールドスポット頻度は未改変遺伝子中の１００ヌクレオチド当たり約１５コールドスポットから、ＳＨＭ感受性型中の１００ヌクレオチド当たり約１２コールドスポットへと減少した。
【０６０１】
Ｂ．クローニング及び解析
合成ポリヌクレオチド配列に、無関係な制限部位が確実に無いことを最終的に点検した後、完全なポリヌクレオチド配列を合成し(DNA2.0,Menlo Park,CA)、ＤＮＡ２．０のクローニングベクターのうちの１つにクローニングし（表１１；実施例１を参照）、正しく合成されていることを確認するため配列決定し、活性について上記実施例１に記載されるようにして試験する。
【０６０２】
体細胞超変異に対する各コンストラクトの相対的安定性／感受性を測定するために、トランスフェクトされた各細胞集団の安定な細胞系を作製し、それらがＳＨＭ介在性の変異を蓄積する相対速度を測定するために試験する。これらの変異の大半は機能の損失をもたらすので、相対的変異誘発負荷はＦＡＣＳを介して蛍光欠失として簡便に測定できる（実施例４参照）。
【０６０３】
実施例３
レポーター遺伝子をコードする合成ポリヌクレオチドの作製
Ａ．ポリヌクレオチド設計
未改変ティール（Ｔｅａｌ）蛍光タンパク質（ＴＦＰ）の出発配列を図１４に、ホットスポット及びコールドスポット頻度の初期解析と共に示す。
【０６０４】
１．ホットＴＦＰ
実施例１に記載したとおり、表７に列挙したホットスポット及びコールドスポットモチーフに基づき、コンピュータープログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎを用いて配列最適化を完了し；得られたＴＦＰのホット及びコールド型をそれぞれ図１５及び１６に示す。
【０６０５】
ＴＦＰ配列をより体細胞超変異に感受性にするための当該配列の最適化により約１７０％のホットスポット数増加（２８増加）、及び約２６％のコールドスポット数減少（２７減少）がもたらされた。全体のホットスポット頻度は１００ヌクレオチド当たり約６ホットスポットの初期密度から１００ヌクレオチド当たり約１０ホットスポットの平均密度へと増加し、全体のコールドスポット頻度は未改変遺伝子中の１００ヌクレオチド当たり約１５コールドスポットから、ＳＨＭ感受性型中の１００ヌクレオチド当たり約１１コールドスポットへと減少した。
【０６０６】
２．コールドＴＦＰ
ＴＦＰ配列をより体細胞超変異に耐性にするための当該配列の最適化により約１２０％のコールドスポット数増加（２１増加）、及び約１０％のホットスポット数減少（４減少）がもたらされた。全体のコールドスポット頻度は１００ヌクレオチド当たり約１５コールドスポットの初期密度から１００ヌクレオチド当たり約１８コールドスポットの平均密度へと増加し、全体のホットスポット頻度は未改変遺伝子中の１００ヌクレオチド当たり約６ホットドスポットから、ＳＨＭ耐性型中の１００ヌクレオチド当たり約５ホットスポットへと減少した。
【０６０７】
Ｂ．クローニング及び解析
合成ポリヌクレオチド配列に、無関係な制限部位が確実に無いことを最終的に点検した後、完全なポリヌクレオチド配列を合成し(DNA2.0, Menlo Park,CA)、ＤＮＡ２．０のクローニングベクターのうちの１つにクローニングし（表１１；実施例１を参照）、正しく合成されていることを確認するため配列決定し、活性について下記に記載されるようにして試験する。
【０６０８】
Ｈｅｋ２９３細胞を、同一のＣＭＶプロモーターにより発現が駆動されるホット又はコールドのいずれかの型のＴＦＰを含有する発現ベクター（実施例１で上記されるようなＡＢ１０２及び１３６）でトランスフェクトする。トランスフェクションから３日後に安定した発現についての選別を開始した。ＦＡＣＳ解析前に、細胞をトリプシン処理により回収し、１％  ｗ／ｖ  ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で２回洗浄し、２ｎｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを含有するＰＢＳ／１％ＢＳＡ２００μｌ中に再懸濁する。細胞をＣｙｔｏｐｅｉａ  Ｉｎｆｌｕｘ中、２００ｍＷ  ４８８ｎｍ及び５０ｍＷ  ４０３ｎｍレーザー励起で解析する。１試料当たり最大百万個の細胞を取得する。ＤＡＰＩ蛍光を４６０／５０バンドパスフィルターを通して測定する。ＧＦＰ蛍光を５２８／３８バンドパスフィルターを通して測定する。細胞バックグラウンドを超えるＧＦＰ蛍光が検出できず、ＤＡＰＩを排除している生細胞のパーセンテージとして、パーセントＧＦＰ発現を表１２Ａに報告する。
【０６０９】
【表１２Ａ】
2010520748.tif 000058
【０６１０】
これらの結果より、ホット及びコールド両型のＴＦＰの、バックグラウンドを上回る良好な発現が示される。この場合、配列を「コールド」にすることにより、タンパク質の相対的な発現が向上するという驚くべき結果がもたらされた。そのような発現の向上によりＳＨＭ耐性合成遺伝子に更なる利益がもたらされる。
【０６１１】
体細胞超変異に対する各コンストラクトの相対的安定性／感受性を測定するために、トランスフェクトされた各細胞集団の安定な細胞系を作製し、それらがＳＨＭ介在性の変異を蓄積する相対速度を測定するために試験する。これらの変異の大半は機能の損失をもたらすので、相対的変異誘発負荷はＦＡＣＳを介して蛍光欠失として簡便に測定できる（実施例４参照）。
【０６１２】
ホットＴＦＰ又はコールドＴＦＰいずれかのＳＨＭ最適化コーディング配列を含むエピソーム性の発現コンストラクトを個々に、ＨＥＫ２９３にＡＩＤとともに安定的に共トランスフェクトし、３週間増殖及び生育させた（これらの実験において用いたコールド  イヌＡＩＤはＮＥＳを不活性化するＬ１９８Ａ変異を含有する；配列番号２２）。次いで、細胞ストックを凍結し、ホットＴＦＰ及びコールドＴＦＰの各１バイアルを融解し、４日間培養して増殖させ、次いで融解して４日培養したものを、一定分量の更なるオリジナルＡＩＤ発現コンストラクトで一過的にトランスフェクトすることにより補足的ＡＩＤでパルスした（「ＡＩＤパルシング」と称される）。ＡＩＤパルス後９日目に細胞をトリプシン処理により回収し、１１５０ｘｇで５分でペレットにし、後に使用するため凍結した。
【０６１３】
続いて細胞ペレットを融解し、オリゴヌクレオチド（オリゴ）プライマーGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGC(配列番号339)及びGATCGTCTCACGCGGATTGTAC(配列番号377)を用いてＰＣＲによりＴＦＰ  ＯＲＦを回収した。前者のオリゴは、ＴＦＰ開始コドンの５’側１４２ｎｔに位置する、ＴＦＰｍＲＮＡ発現を駆動するために用いられるＣＭＶプロモーターの３’端近くから増幅し、後者のオリゴはＴＦＰ終止コドンの３’側１ｎｔで終わる配列と一致する。各ＰＣＲ反応（全体積５０μＬ）は以下の条件下で３５サイクル行った：９５℃５分間、３５サイクルの（９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、６８℃４５秒間）、続いて４℃に冷却前に６８℃１分。増幅したＰＣＲ産物はTOPO(登録商標)TA cloning vector (Invitrogen,Carlsbad,CA)にクローニングし、インサートを配列決定した。合計ホット１６６及びコールド１１１のＴＦＰ  ＯＲＦをレスキューし、配列決定し、結果生じる変異のスペクトルを比較した。表１２Ｂに、当該２組の配列中に観察された変異についての全体統計を示す。
【０６１４】
【表１２Ｂ】
2010520748.tif 000059
【０６１５】
変異の頻度はホットスポットを最多にした型のＴＦＰ鋳型中ではホットスポットを最少にしたコールドＴＦＰ配列に比べておよそ３．８倍高い。本データにより、ポリヌクレオチド配列のＳＨＭ最適化が、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドによってもたらされる変異の頻度を増加又は減少のいずれかをさせるために使用できることが示される。
【０６１６】
図１６Ｄにホット及びコールドのＴＦＰコンストラクトの代表的なセグメントについての変異を示す。中央列にはＴＦＰのアミノ酸配列（５９〜８７残基）が１文字表記で示され、２つのコンストラクトをコードする「ホット」及び「コールド」の出発核酸配列がアミノ酸配列の上（ホット）及び下（コールド）に示されている。ホットの配列中に観察された変異を並べて遺伝子配列の上端に重ね、コールドのＴＦＰ配列中の変異を下に示す。当該結果によりコーディング配列への「サイレント」な変化がいかにして、ＡＩＤ介在性のＳＨＭ率において観察される劇的変化を生み出すかが説明されるが、このことは、工夫された配列を、早い又は遅いＳＨＭ率をもたらすのに有効に最適化できることを示している。
【０６１７】
図１６Ｅには、本ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織培養システムにおいてＡＩＤにより生成された変異のスペクトルが、他の研究において観察されるもの及びｉｎ  ｖｉｖｏの親和性成熟の間に見られるものに酷似することが示されている。図１６Ｅには本研究において生成された変異（ボックス（ｉ）左上、ｎ＝１１８）が示され、それらがＺａｎら（ボックス（ｉｉ）右上、，ｎ＝７０２）、Ｗｉｌｓｏｎら（左下、ｎ＝２５０００；ボックス（ｉｉｉ））により観察された変異、及びより大規模な、親和性成熟を経たＩＧＨＶ鎖の解析（右下、ｎ＝１０１，９２６；ボックス（ｉｖ））と比較されている。各チャート中のＹ軸に出発ヌクレオチドを示し、Ｘ軸に最終のヌクレオチドを示し、各正方形中の数でヌクレオチドの遷移が観察される時間のパーセンテージを示す。本研究において、変異のトランジション及びトランスバージョンの頻度は他のデータセットにおいて見られるものに似ている。ＣからＴ及びＧからＡへの変異が、シチジンへのＡＩＤ活性の直接的な結果であり、変異事象全体の４８％を占める。更に、塩基Ａ及びＴでの変異が変異事象の３０％までを占める（即ち、他のデータセットにおいて観察される頻度よりわずかに少ない）。
【０６１８】
図１６Ｆには、変異事象がホットＴＦＰ遺伝子の、ＳＨＭに最適化したヌクレオチド配列の至る所に分布し、１世代、１０００ヌクレオチド当たり約０．０８事象の最大瞬間変化率が、オープンリーディングフレームの開始から３００ヌクレオチド前後に集中していることが示されている。ＡＩＤによる（３０日間の）遺伝子の安定したトランスフェクション及び選択により４８０ヌクレオチド当たり１事象の変異の最大変異率がもたらされる。結果として遺伝子は、１遺伝子当たり０、１、２又はそれ以上の変異を含有し得る。ホットのＴＦＰ配列の遺伝子において観察されるＳＨＭ介在性事象の分布を、コールドＴＦＰにおいて見られる有意に減少した変異のパターン（図１６Ｈ）と比較して、図１６Ｇで見ることができる。
【０６１９】
したがって本研究により、通常は体細胞超変異を起こさないティール蛍光タンパク質（ＴＦＰ）等の非類似型の遺伝子の作製が、そのような遺伝子を高率の体細胞超変異の為に標的化するのに使用できることが示される。更に、（同一アミノ酸をコードするが）ＳＨＭ耐性遺伝子を作製することにより、体細胞超変異のホットスポット数が減少したタンパク質が生じ得、従ってＡＩＤ介在性の超変異レベルの劇的な減少が起きる。ＳＨＭ最適化の各例において、哺乳動物のコドン使用頻度及び遺伝子発現レベルに影響する他の因子が工夫された配列の生成において考慮され、それによって適度な翻訳及び発現レベルも示すタンパク質が生じる。従って当該結果により、ＳＨＭ最適化の本方法を（ｉ）ＡＩＤ活性を発現遺伝子の特定領域に標的化するためにうまく使用でき、（ｉｉ）ＳＨＭ率を速め、又は遅くするために使用できることが示され、（ｉｉｉ）この方法論を用いることによってＡＩＤにより生み出された変異のスペクトルがｉｎ  ｖｉｖｏで観察されるものと均等であることが示され、（ｉｖ）ＳＨＭの最適化が、目的の遺伝子上でその発現に有意な負の影響をもたらすことなく、そのＡＩＤ介在性のＳＨＭの率に正又は負のいずれかの影響を与えるために首尾よく行われ得ることが示される。
【０６２０】
実施例４
ＳＨＭに関与する酵素をコードする合成ポリヌクレオチドの作製
本明細書中に記載されるシステム及び方法は、例えばＡＩＤ、Ｐｏｌイータ、Ｐｏｌシータ及びＵＤＧ等の酵素に適用できる。
Ａ．活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）
哺乳動物種（例、ラット、チンパンジー、マウス、ヒト、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリ、カエル、ゼブラフィッシュ、フグ及びテトラオドン（パッファーフィッシュ））間のシチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）の配列変異を解析しヒトと比較すると、ヒト及びカエルほど遠縁の生物が驚くほど高い（７０％）配列同一性及び＞８０％の配列類似性を示すことが証明される。更に、体細胞超変異（ＳＨＭ）において他の生物由来のＡＩＤがヒトＡＩＤと置換でき、全ての哺乳動物種のＡＩＤが機能的に均等であることが示されている。
【０６２１】
図１７に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＨＭ用に有望な開始コンストラクトを同定するためヒトＡＩＤと地球上の他のＡＩＤとの比較を示す。当該図にはヒト（Ｈ＿ｓａｐ／１−１９８）、マウス（Ｍ＿ｍｕｓｃ／１−１９８）、イヌ（Ｃ＿ｆａｍ／１−１９８）、ラット（Ｒ＿ｎｏｒｖ／１−１９９）、及びチンパンジー（Ｐ＿ｔｒｏｇ／１−１９９）由来ＡＩＤの配列アラインメントを提供する。図２１ではヒト、イヌ及びマウスＡＩＤタンパク質間の配列同一性を図解する。
【０６２２】
イヌＡＩＤは全体でヒト及びマウスＡＩＤと９４％のアミノ酸同一性を有し、従ってコドン最適化用の開始点として選択する。コドン使用頻度を最適化するために、イヌのアミノ酸配列を逆翻訳し、次いで反復して最適化する。
【０６２３】
ＡＩＤはＣ末端の１０アミノ酸内に含有される核外搬出シグナルを含有することが知られている(McBride et al.,J Exp Med.2004 Can 3;199(9):1235-44;Ito et al.,PNAS 2004 Feb 17;101(7):1975-80)。下記の実験の目的でイヌＡＩＤは１９８位でロイシンからアラニンへの変異を含有し、一方ヒトＡＩＤコンストラクトは無変異でインタクトな核外搬出シグナルを保持する。
【０６２４】
実施例１中に記載の通り、表７に列挙したホットスポット及びコールドスポットモチーフに基づき、コンピュータープログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎを用いてＳＨＭの配列最適化を完了し、生じるイヌＡＩＤのホット及びコールド型を、それぞれ図１９及び２０に示す。イヌＡＩＤについての出発配列を図１８に、ホットスポット及びコールドスポット頻度の初期解析と共に示す。
【０６２５】
１．ホットＡＩＤ
ＡＩＤ配列をより体細胞超変異に感受性にするための当該配列の最適化により約２００％のホットスポット数増加（４３増加）、及び約３０％のコールドスポット数減少（２３減少）がもたらされた。全体のホットスポット頻度は１００ヌクレオチド当たり約７ホットスポットの初期密度から１００ヌクレオチド当たり約１４ホットスポットの平均密度へと増加し、全体のコールドスポット頻度は未改変遺伝子中の１００ヌクレオチド当たり約１３コールドスポットから、ＳＨＭ感受性型中の１００ヌクレオチド当たり約９コールドスポットへと減少した。
【０６２６】
２．コールドＡＩＤ
ＡＩＤ配列をより体細胞超変異に耐性にするための当該配列の最適化により約１８６％のコールドスポット数増加（６８増加）、及び約３５％のホットスポット数減少（１４減少）がもたらされた。全体のコールドスポット頻度は１００ヌクレオチド当たり約１３コールドスポットの初期密度から１００ヌクレオチド当たり約２５コールドスポットの平均密度へと増加し、全体のホットスポット頻度は未改変遺伝子中の１００ヌクレオチド当たり約７ホットドスポットから、ＳＨＭ耐性型中の１００ヌクレオチド当たり約５ホットスポットへと減少した。
【０６２７】
合成ポリヌクレオチド配列に、無関係な制限部位が確実に無いことを最終的に点検した後、完全なポリヌクレオチド配列を合成し(DNA2.0,Menlo Park,CA)、ＤＮＡ２．０のクローニングベクターのうちの１つにクローニングし（表１１；実施例１を参照）、正しく合成されていることを確認するため配列決定し、活性について下記及び実施例１の通り試験する。
【０６２８】
イヌＡＩＤ活性を測定するため、コールド型又は野生型のイヌＡＩＤを、標的ベクター配列内のＩｇエンハンサーエレメント存在下又は非存在下のいずれかで、そのコーディング領域内に（実施例１中に記載の通り）終止コドンを含有するＧＦＰ＊コンストラクトを発現させる発現ベクターと共に共トランスフェクトする。ＡＩＤによる当該終止コドンの変異で、ＡＩＤ活性の直接的な指標である機能的蛍光タンパク質が作り出される。
【０６２９】
本実験においては、細胞をトリプシン処理により回収し、１％  ｗ／ｖ  ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で２回洗浄し、２ｎｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを含有するＰＢＳ／１％ＢＳＡ２００μｌ中に再懸濁する。細胞をＣｙｔｏｐｅｉａ  Ｉｎｆｌｕｘ中、２００ｍＷ  ４８８ｎｍ及び５０ｍＷ  ４０３ｎｍレーザー励起で解析する。１試料当たり最大百万個の細胞を取得し、リバータントは細胞バックグラウンドを超えるＧＦＰ蛍光が検出でき、ＤＡＰＩを排除している生細胞のパーセンテージとして測定される。
【０６３０】
図２２Ａにこの種のアッセイにおけるＡＩＤ活性の、タンパク質機能への予想される効果を示す。注目すべきは、変異誘発により初めに機能を回復又は改善し後に機能を低減又は無くす変異が生み出され得るという観察結果である。これら２つの比率のバランスにより、これらのタンパク質において、機能を回復する初期の稀少な変異事象、それに続く機能を破壊する第二及び第三の変異事象が生じる。集団中の機能獲得型事象の観察結果におけるこれら競合する割合の正味の効果は、図２２Ｂに見ることができる。サイレンス型ＧＦＰに必要な不活性型変異の数に関して３つの異なる仮説を考えると、ＡＩＤの酵素活性の率に依存した、時間の関数としての、非常に異なる復帰事象のプロファイルが３通り観察されると予想される。
【０６３１】
従って、初期復帰率はＡＩＤ活性の正確な評価を提供できるが、活性の長期的研究では蛍光の復帰よりもむしろ活性の消失率の解析が必要である。
【０６３２】
この可能性を試験するために、蛍光タンパク質を安定して発現する細胞系を、コールド  イヌＡＩＤを含有する２通りの濃度の発現ベクターでトランスフェクトする。細胞を培養中に安定的に維持し、表示した時間後全体の蛍光について試料をアッセイする。
【０６３３】
ＦＡＣＳ解析前に、細胞をトリプシン処理により回収し、１％  ｗ／ｖ  ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で２回洗浄し、２ｎｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを含有するＰＢＳ／１％ＢＳＡ２００μｌ中に再懸濁する。細胞をＣｙｔｏｐｅｉａ  Ｉｎｆｌｕｘ中、２００ｍＷ  ４８８ｎｍ及び５０ｍＷ  ４０３ｎｍレーザー励起で解析する。ＤＡＰＩ蛍光を４６０／５０バンドパスフィルターを通して測定する。ＧＦＰ蛍光を５２８／３８バンドパスフィルターを通して測定する。細胞バックグラウンドを超えるＧＦＰ蛍光が検出できず、ＤＡＰＩを排除している生細胞のパーセンテージとして、パーセントＧＦＰ発現を報告する。
【０６３４】
図２２Ｃに示す結果により、定常的且つ持続的に進行する、（ＧＦＰの消光増加として示される）ＧＦＰ発現の濃度依存的な減少が、コールドＡＩＤ量を増加させて共発現させる時間と共に示される。当該データは、コールドＡＩＤが標的遺伝子に複数の変異を導入でき、「コールド型」で数日間発現させたとき機能的であり安定でもあるという仮説と整合する。
【０６３５】
コールド  イヌＡＩＤの、変異誘発を発揮する能力を直接比較するために、コールド  イヌＡＩＤと野生型ヒトＡＩＤとを比較する初期復帰アッセイを用意する。Ｈｅｋ２９３細胞を、上記の通りのＧＦＰ＊又はＣＭＶプロモーターの５’側に挿入されたカッパＥ３及びイントロン性エンハンサーを伴うＧＦＰ＊のいずれかを含有する（上記実施例１中の通りの）発現ベクターで、ヒト又はコールド  イヌＡＩＤのいずれかと共にトランスフェクトする。トランスフェクションから３日後に安定的な発現についての選択を開始した。ＦＡＣＳ解析前に、細胞をトリプシン処理により回収し、１％  ｗ／ｖ  ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で２回洗浄し、２ｎｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを含有するＰＢＳ／１％ＢＳＡ２００μｌ中に再懸濁する。細胞をＣｙｔｏｐｅｉａ  Ｉｎｆｌｕｘ中、２００ｍＷ  ４８８ｎｍ及び５０ｍＷ  ４０３ｎｍレーザー励起で解析する。１試料当たり最大百万個の細胞を取得する。ＤＡＰＩ蛍光を４６０／５０バンドパスフィルターを通して測定する。ＧＦＰ蛍光を５２８／３８バンドパスフィルターを通して測定する。細胞バックグラウンドを超えるＧＦＰ蛍光が検出できず、ＤＡＰＩを排除している生細胞のパーセンテージとして、パーセントＧＦＰ発現を報告する。
【０６３６】
当該結果（図２２Ｃ）により、イヌＡＩＤがヒトＡＩＤと比較して有意に亢進された復帰活性を示したことが示される。この実験においては、カッパ３’Ｅ及びイントロン性のエンハンサーを発現ベクター中に含めたとき、標的遺伝子に起こる復帰率へのこれらの効果も示される。示される通り、エンハンサーエレメントを含むことにより更に復帰頻度が亢進された。
【０６３７】
Ｂ．Ｐｏｌイータ
Ｐｏｌイータの未改変の出発配列を図２３に、ホットスポット及びコールドスポット頻度の初期解析と共に示す。
【０６３８】
上記の通り、表７に列挙したホットスポット及びコールドスポットモチーフに基づき、コンピュータープログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎを用いて配列の最適化を完了し、生じるＰｏｌイータのコールド及びホット型を、それぞれ図２４及び２５に示す。ホット及びコールドスポット密度の変化を以下の表１３に要約する：
【０６３９】
【表１３】
2010520748.tif 000060
【０６４０】
表１３中、「ホットスポット密度」又は「コールドスポット密度」はＯＲＦ中のヌクレオチド数で除したＯＲＦ中のホット又はコールドスポットモチーフの総数に１００を乗じ、直近の整数に四捨五入したものを指す。
【０６４１】
Ｃ．Ｐｏｌシータ
Ｐｏｌシータの出発アミノ酸配列及び出発核酸配列をそれぞれ図２６及び図２７に、ホットスポット及びコールドスポット頻度の初期解析と共に示す。
【０６４２】
上記の通り、表７に列挙したホットスポット及びコールドスポットモチーフに基づき、コンピュータープログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎを用いて配列の最適化を完了し、生じるＰｏｌシータのコールド及びホット型を、それぞれ図２８及び図２９に示す。ホット及びコールドスポット密度（１００ヌクレオチド当たり）の変化を以下の表１４に要約する：
【０６４３】
【表１４】
2010520748.tif 000061
【０６４４】
表１４中、「ホットスポット密度」又は「コールドスポット密度」はＯＲＦ中のヌクレオチド数で除したＯＲＦ中のホット又はコールドスポットの総数に１００を乗じ、直近の整数に四捨五入したものを指す。
【０６４５】
Ｄ．ＵＤＧ
ＵＤＧの出発アミノ酸配列及び出発核酸配列をそれぞれ図３０Ａ及び３０Ｂに、ホットスポット及びコールドスポット頻度の初期解析（図３０Ｃ）と共に示す。
【０６４６】
上記の通り、表７に列挙したホットスポット及びコールドスポットモチーフに基づき、コンピュータープログラムＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎを用いて配列の最適化を完了し、生じるＵＤＧのコールド及びホット型を、それぞれホットスポット及びコールドスポット頻度の初期解析（図３１Ｂ及び３１Ｄ）と共に、それぞれ図３１Ａ及び３１Ｃに示す。ホット及びコールドスポット密度（１００ヌクレオチド当たり）の変化を以下の表１５に要約する：
【０６４７】
【表１５】
2010520748.tif 000062
【０６４８】
表１５中、「ホットスポット密度」又は「コールドスポット密度」はＯＲＦ中のヌクレオチド数で除したＯＲＦ中のホット又はコールドスポットの総数に１００を乗じ、直近の整数に四捨五入したものを指す。
【０６４９】
実施例５
体細胞超変異用ベクターの作製
ＤＮＡ２．０(Menlo Park,CA)により合成された各サブフラグメントからベクターを構築する。ベクターは複数のオープンリーディングフレームを同時に発現でき、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）含有ベクターの複製についてもとから許容状態にあるか、又は許容状態となるようにされた（即ち、ヒトＥＢＰ２の共発現を介して(Habel et al.,2004;Kapoor et al.,2001)哺乳動物細胞において安定なエピソーム複製ができる。
【０６５０】
ベクターの至る所で、別個(discreet)の断片間での１以上の制限エンドヌクレアーゼ認識配列（制限部位）の戦略的配置を通してプラスミドを、高度にモジュールにする。
【０６５１】
Ａ．ベクターフォーマット
最初のフォーマット（図３２Ａ）において、ベクターには脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有させた。図３２Ａに示す通り、ベクター内に含有させるエレメントは互いに機能可能に連結し、ある場合には以下の機能的エレメント：１）ＣＭＶプロモーター；２）マルチクローニングサイト；３）目的の遺伝子；４）ＩＲＥＳ；５）ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｄ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）又はピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ等の真核生物の選択マーカー；６）ターミネーター配列、（３′非翻訳領域、ＳＶ４０由来の小イントロン及びポリＡシグナル（“ＩＶＳ  ｐＡ”））；７）エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）（任意の遺伝子間スペーサー領域が先行する）；８）原核生物の複製起点ＣｏｌＥ１；９）ベータラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子又はカナマイシン（ｋａｎ）等の原核生物の選択マーカー；１０）（ベータアクチン又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）等のコピー数判定のための遺伝子断片、及びＩｇエンハンサー、を含めた（番号はこのセクション中以下に更に見られる、対応の配列情報を指す）。
【０６５２】
第二のフォーマット（図３２Ｂ）においては、発現ベクターにはＩＲＥＳは無いが、代わりに選択マーカー遺伝子を発現させるための独立した遺伝子カセットを含有させた。この発現カセットには１１）ＳＶ４０即時型初期プロモーター（ｐＳＶ）及び真核生物の選択マーカー、並びに上記のようにＩＶＳ  ｐＡを含めた。ベクター内に含有させるエレメントは図３２に示す通り互いに機能可能に連結し、ある場合には以下の機能的エレメント：ＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、目的の遺伝子、ＩＶＳ  ｐＡ；エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）、ｐＳＶ、選択マーカー、ＩＶＳ  ｐＡ、原核生物の複製起点ＣｏｌＥ１、ベータラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子又はカナマイシン（ｋａｎ）等の原核生物の選択マーカー、コピー数判定のための遺伝子断片、Ｉｇエンハンサー及びマルチクローニングサイト、を含めた。
【０６５３】
第三のフォーマット（図３３Ａ）においては、ベクターには逆方向に向けられた２つの異なる遺伝子の発現を駆動する二方向性プロモーターを含有させた。１又は２の２又は３シストロン性のメッセージを生成するために、このベクターにはＩＲＥＳ配列も含有させた。ベクター内に含有させるエレメントは図３３に示す通り、以前に記載された機能的エレメントと同じ機能的エレメントを用いて、互いに機能可能に連結させる。
【０６５４】
第四のフォーマット（図３３Ｂ）においては、二方向性プロモーター、２又は３シストロン性のメッセージを発現させる１以上のＩＲＥＳ配列、及びそこから真核生物の選択マーカーが発現する独立したシス−連結型カセットを含有させる。
【０６５５】
ハイブリッドを形成するために、いずれのベクターも互いに置き換わることができる。更に、所望の遺伝子の条件的発現を達成するため、エピソームベクター上に含有させる構成的で強力な真核生物のプロモーターは、誘導性プロモーター（即ち、リバーステトラサイクリントランスアクチベータープロモーターシステム［ｐｒｔＴＡ］）に置換できる。この場合、目的の他の遺伝子の１つが、（図３４に示すように）同一エピソーム上でｃｉｓに発現できるトランス活性化因子タンパク質をコードするか、又はトランスフェクトされた別のエピソームベクター上でｔｒａｎｓに供給されなければならない。
【０６５６】
選択可能な原核生物のマーカー及び複製起点ｃｏｌＥＩについての方向性は、以下のセクション８及びセクション９（配列番号９−１１）、図３３−３５で記載されるが絶対的ではわけではなく、ベクターの残りの部分に関しては逆転させることができる。同様に、独立した発現カセット（ｐＳＶ−選択マーカー（又は目的の他の遺伝子）−ＩＶＳ  ｐＡ）の方向性も、ベクターの残りの部分に関しては逆転させることができる（即ち、転写がｏｒｉＰから離れる現在の描写ではなく、ｏｒｉＰに向かう転写）。更に、Ｉｇエンハンサー等のエンハンサーエレメントは目的の遺伝子の５’側又は３’側に置くか、或いは排除することができる。
【０６５７】
Ｂ．機能的エレメントの代表的な配列
１．真核細胞中で働く強力な転写プロモーター。図３２−３３においては、ＣＭＶプロモーターを用い、該配列は配列番号１として提供される（ＴＡＴＡボックス配列を下線で示す）。ＣＭＶプロモーターはＳａｃＩ及びＢｓｒＧＩサイトを除去するため改変される。
【０６５８】
AGCTTGGCCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATCTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTA (配列番号1)。
【０６５９】
２．マルチクローニングサイト（ｍｃｓ）領域と称せられる複数の制限部位をコードする領域：
【０６６０】
TTCCCTGCAGGATTGTTTAAACACCAGATCTGCTTGAATCCGCGGATAAGAGGACTAGTATTCGTCTCACTAGGGAGAGCTCCTA (配列番号2)。
【０６６１】
３．例えば、目的の遺伝子は、特異的結合メンバー、抗体又はその断片、抗体重鎖又は軽鎖、酵素、受容体、ペプチド性増殖ホルモン又は転写因子であり得る。
【０６６２】
４．図３２−３４における脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の２シストロン性の同時発現（一方はそれ自身に対して５’側、もう一方はそれ自身に対して３’側）を可能にする。２つの制限部位（ＢｓｒＧＩ及びＡｓｃＩ）を含有する領域を、ＩＲＥＳに対して５’側に示す（小文字）。ＩＲＥＳの３’端はＮｇｏＭＩＶサイトを含む。
【０６６３】
tgtacaatccgcgtgagacgatcggcgcgccCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCGGC (配列番号3)。
【０６６４】
５．例えば、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｄ）（配列番号４）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）（配列番号５）、又はピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（配列番号６）等の、哺乳動物の選択マーカー遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）。開始及び終止コドンを下線で示す。各ＯＲＦの３’側にクローニング工程で用いられるＸｂａＩサイト(TCTAGA)がある。
【０６６５】
ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｄ；コールドスポット最適化）
【０６６６】
ATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAGAATCCACCCTCATTGAAAGGGCCACTGCTACAATCAACAGCATCCCCATCTCTGAAGACTACTCTGTCGCCAGCGCAGCTCTCTCCTCTGACGGGAGAATCTTCACTGGTGTCAATGTATATCATTTTACTGGGGGACCTTGCGCAGAGCTTGTGGTCCTGGGGACTGCTGCTGCTGCTGCAGCCGGAAACCTGACTTGTATCGTCGCCATAGGGAATGAGAACAGAGGCATCTTGAGCCCCTGTGGGAGATGCAGACAAGTCCTCCTGGACCTCCATCCTGGGATCAAAGCCATAGTGAAGGACAGTGATGGACAGCCCACAGCCGTTGGGATCAGGGAGTTGCTGCCATCTGGTTATGTGTGGGAGGGCTAATCTAGA (配列番号4)。
【０６６７】
ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ；コールドスポット最適化）
【０６６８】
ATGAAAAAGCCTGAACTGACTGCCACCTCTGTTGAGAAGTTTTTAATAGAGAAGTTTGACTCTGTGTCAGACCTCATGCAGCTTTCTGAGGGAGAGGAGTCTAGAGCCTTTAGCTTTGATGTGGGGGGGAGAGGCTATGTCCTGAGAGTCAATAGCTGTGCAGATGGTTTCTACAAAGATAGGTATGTCTATAGACATTTTGCATCCGCCGCCCTCCCCATTCCAGAGGTCCTTGACATTGGGGAATTCTCAGAGAGCCTGACCTATTGCATTTCCCGGAGAGCCCAGGGTGTGACTCTTCAAGACCTGCCTGAGACAGAACTCCCTGCAGTGCTCCAGCCCGTCGCCGAGGCCATGGATGCAATCGCCGCCGCAGACCTCAGCCAGACCTCGGGGTTTGGGCCCTTTGGCCCCCAGGGGATAGGCCAATACACTACATGGAGAGATTTCATATGCGCTATTGCTGACCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACAGTCTCAGCCTCTGTCGCACAAGCCCTGGACGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCAGAGGTCAGACATCTCGTCCATGCCGACTTTGGGTCAAACAATGTCCTGACGGACAATGGGAGAATCACTGCTGTCATTGACTGGAGCGAGGCCATGTTTGGGGACTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGACCCTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACCCGTTACTTTGAGAGGAGGCATCCAGAGCTCGCTGGGAGCCCTAGATTGAGGGCCTATATGCTCAGGATAGGGCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTTGATGACGCAGCTTGGGCTCAGGGGAGATGCGACGCCATAGTGAGGAGTGGGGCCGGGACTGTCGGGAGAACTCAGATCGCCAGGAGGTCAGCTGCCGTCTGGACTGACGGCTGTGTAGAAGTCTTAGCCGACTCTGGGAACAGGAGACCCAGCACTCGTCCAGAGGCCAAGGAATGATCTAGA (配列番号5)。
【０６６９】
ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｐｕｒ；野生型配列）。
【０６７０】
開始コドンのすぐ５’側にＫｏｚａｋコンセンサス配列を含有する（下線）。終止コドンも下線で示す。
【０６７１】
CACCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTTCGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTGGACCCGGACAGGCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCTGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCTACCGTCGGAGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCTGCCGAGCGTGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTCGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGATCTAGA (配列番号6)。
【０６７２】
６．ターミネーター配列、ＩＶＳ−ｐＡ（３’側のＢａｍＨＩと共に示す）。
【０６７３】
GGATCTTTGTGAAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTGTGGTATTTTAGATTCCAACCTATGGAACTTATGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGCCTTTAATGAGGAAAACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCATCTAGTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAGACCCCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGGTAAGTTTTTTGAGTCATGCTGTGTTTAGTAATAGAACTCTTGCTTGCTTTGCTATTTACACCACAAAGGAAAAAGCTGCACTGCTATACAAGAAAATTATGGAAAAATATTTGATGTATAGTGCCTTGACTAGAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTATCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCC (配列番号7)。
【０６７４】
７．ＥＢＶ  ｏｒｉＰ配列。このエレメントは、エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）を発現するＥＢＶ  ｏｒｉＰ許容細胞においてエピソーム複製を可能にする。任意の遺伝子間スペーサー領域（小文字）がｏｒｉＰ配列に先行する：
【０６７５】
actgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccctggccgggtccGCAGGAAAAGGACAAGCAGCGAAAATTCACGCCCCCTTGGGAGGTGGCGGCATATGCAAAGGATAGCACTCCCACTCTACTACTGGGTATCATATGCTGACTGTATATGCATGAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCTAATCTCTATTAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCATGGCAACATTAGCCCACCGTGCTCTCAGCGACCTCGTGAATATGAGGACCAACAACCCTGTGCTTGGCGCTCAGGCGCAAGTGTGTGTAATTTGTCCTCCAGATCGCAGCAATCGCGCCCCTATCTTGGCCCGCCCACCTACTTATGCAGGTATTCCCCGGGGTGCCATTAGTGGTTTTGTGGGCAAGTGGTTTGACCGCAGTGGTTAGCGGGGTTACAATCAGCCAAGTTATTACACCCTTATTTTACAGTCCAAAACCGCAGGGCGGCGTGTGGGGGCTGACGCGTGCCATCACTCCACAATTTCAAGAGAAAGAGTGGCCACTTGTCTTTGTTTATGGGCCCCATTGGCGTGGAGCCCCGTTTAATTTTCGGGGGTGTTAGAGACAACCAGTGGAGTCCGCTGCTGTCGGCGTCCACTCTCTTTCCCCTTGTTACAAATAGAGTGTAACAACATGGTTCACCTGTCTTGGTCCCTGCCTGGGACACATCTTAATAACCCCAGTATCATATTGCACTAGGATTATGTGTTGCCCATAGCCATAAATTCGTGTGAGATGGACATCCAGTCTTTACGGCTTGTCCCCACCCCATGGATTTCTATTGTTAAAGATATTCAGAATGTTTCATTCCTACACTAGGATTTATTGCCCAAGGGGTTTGTGAGGGTTATATTGGTGTCATAGCACAATGCCACCACTGAACCCATCGTCCAAATTTTATTCTGGATGCGTCACCTGAAACCTTGTTTTCGAGCACCTCACATACACCTTACTGTTCACAACTCAGCAGTTATTCTATTAGCTAAACGAAGGAGAATGAAGAAGCAGGCGAAGATTCAGGAGAGTTCACTGCCCGCTCCTTGATCTTCAGCCACTGCCCTTGTGACTAAAATGGTTCACTACCCTCGTGGAATCCTGACCCCATGTAAATAAAACCGTGACAGCTCATGGGGTGGGAGATATCGCTGTTCCTTAGGACCCTTTTACTAACCCTAATTCGATAGCATATGCTTCCCGTTGGGTAACATATGCTATTGAATTAGGGTTAGTCTGGATAGTATATACTACTACCCGGGAAGCATATGCTACCCGTTTAGGGTTAACAAGGGGGCCTTATAAACACTATTGCTAATGCCCTCTTGAGGGTCCGCTTATCGGTAGCTACACAGGCCCCTCTGATTGACGTTGGTGTAGCCTCCCGTAGTCTTCCTGGGCCCCTGGGAGGTACATGTCCCCCAGCATTGGTGTAAGAGCTTCAGCCAAGAGTTACACATAAAGG (配列番号8)。
【０６７６】
８．ＤＮＡ２．０(Menlo Park,CA)由来のベクターｐＪ１５及びｐＪ３１由来のEscherichia coli複製起点、ｃｏｌＥＩ配列：ｃｏｌＥ１
【０６７７】
AAAAGGGGCCCGAGCTTAAGACTGGCCGTCGTTTTACAACACAGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGGGCCTTCTGCTTAGTTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGGCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGACGCGCGCGTAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGCTTGCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTG (配列番号9)。
【０６７８】
９Ａ．耐性のためのベータラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子の配列。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は逆方向で示される。
【０６７９】
CTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGCGCTGCGATGATACCGCGAGAACCACGCTCACCGGCTCCGGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATCGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGAGCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGCAGTGCGACTAACGGCATGAAGCTCGTCGGGGCGTACG (配列番号10)。
【０６８０】
９Ｂ．ＤＮＡ２．０(Menlo Park,CA)由来のベクターｐＪ３１由来のカナマイシン配列（ｋａｎ）。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は逆方向で示される。
【０６８１】
CTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGGCGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAGTGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAACGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGTGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGAGCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGCAGTGCGACTAACGGCATGAAGCTCGTCGGGGAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAGCAATGCTTTCTTATAATGCCAACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTTTTTTTAGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGGCATTATAAAAAAGCATTGCTCATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTT (配列番号11)。
【０６８２】
１０．細胞当たりのエピソームコピー数を判定するために用いる部分。理想的には、当該部分はゲノム中特有に存在する配列を含有する。以下に当該技術において公知の、又は本明細書中に記載するベクターにおいて使用できる２種の断片、ベータアクチン及びＧ６ＰＤＨを示す。ＢｓｉＷＩ及びＣｌａＩサイトが各断片の境界になる。
【０６８３】
ベータアクチン部分。
【０６８４】
CGTACGTACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGAGGCCAGGATGGAGCCGCCGATCCACACGGAGTACTTGCGCTCAGGAGGAGCAATGAAGCTTATCTGAGGAGGGAAGGGGACAGGCAGTGAGGACCCTGGATGTGACAGCTCCAAGCTTCCACACACCACAGGACCCCACAGCCGACCTGCCCAGGTCAGCTCAGGCAGGAAAGACACCCACCTTGATCTTCATTGTGCTGGGTGCCAGGGCAGTGATCTCCTTCTGCATCCTGTCATCGAT (配列番号12)。
【０６８５】
ヒトグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｈＧ６ＰＤＨ）部分。
【０６８６】
CGTACGAGGTGAGGCTGCAGTTCCATGATGTGTCCGGCGACATCTTCCACCAGCAGTGCAAGCGCAACGAGCTGGTGATCCGCGTGCAGCCCAACGAGGCCGTGTACCAGAGAAGGAGCAGTGTGGAGGGTGGGCGGCCTGGGCCCGGGGGACTCCACATGGTGGCAGGCAGTGGCATCAGCAAGACACTCTCTCCCTCACAGAACGTGAAGCTCCCTGACGCCTACGAGCGCCTCATCCTGGACGTCTTCTGCGGGAGCCAGATGCACTTCGTGCGCAGGAATCGAT (配列番号13)。
【０６８７】
１１．ｐＳＶ、ＳＶ４０由来の即時型初期プロモーター。ＢｓｔＢＩサイトが当該配列に先行し、ＮｇｏＭＩＶサイトがその後に続く。
【０６８８】
TTCGAAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCTGACCCCTCACAAGGAGCCGGC (配列番号14)。
【０６８９】
Ｉｇエンハンサー。代表的なＩｇエンハンサー配列としては、重鎖又は軽鎖エンハンサーが挙げられる。カッパ３’エンハンサー領域（Ｅｋ３’）(Meyer,K.B.and Neuberger,M.S.,EMBO J.8(7),1959-1964(1989)を参照)、及びカッパイントロン性エンハンサー領域、Ｅｋｉ  ＬＯＣＵＳ  Ｌ８００４０  ７４６６  ｂｐ  ＲＯＤ  ０２−ＳＥＰ−２００３を例示する目的で以下に示す。エンハンサー領域内の少なくとも１種の、活性を有する主要なエレメントがＥボックス配列：CAGGTG(N)13CAGGTG［コア配列：CANNTG］Storb et al.,Immunity 19:235-242,2003）である。Ｅｋ３’及びＥｋｉエンハンサーエレメントはＤｒ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（ＭＲＣ，ＵＫ）より入手する。Ｅｋ３’配列を、クローニング用に用いるＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩサイトをそれぞれ含有する以下のプライマー：GACTACCTCGAGccagcttaggctacacagag（配列番号２７６）及びGTAGTCGAATTCCCACATGTCTTACATGGTATATG（配列番号２７７）を用い、識別番号１３５２のＮｅｕｂｅｒｇｅｒプラスミドからＰＣＲにより増幅する。
【０６９０】
ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限部位をそれぞれコードするオリゴヌクレオチドGACTACGAATTCtcctgaggacacagtgatag（配列番号２７８）及びGTAGTCGCGGCCGCCTAGTTCCTAGCTACTTCTTTA（配列番号２７９）を用い、Ｅｋｉエンハンサー配列をＤｒ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒのベクター（識別番号Ｍｅ１２３）から増幅する。結果生じる断片を適切な制限酵素により消化し、続けてｍｃｓ２（以下に記載）へクローニングする：Ｅｋ３’はｍｃｓ２のＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩサイトへクローニングし、次いで結果生じるプラスミドをＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化し、そこへ続けてＥｋｉ断片をライゲーションしてベクターＡＢ１５６を生成する。
【０６９１】
上記の通り、Ｅボックスはカッパエンハンサー領域中に存在することが知られている。それ故、アニーリングされるとＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ突出部を含有する相補的なオリゴヌクレオチドAATTCaggtgctggggtagggagcaggtgctacactgcagaccaggtgctGC（配列番号２８０）及びggccgcagcacctggtctgcagtgtagcacctgctccctaccccagcacctg（配列番号２８１）用い、縦列する３つのＥボックスから成る合成カセットを合成する。こうしてアニーリングされたオリゴ産物をｍｃｓ２のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩサイトへクローニングし、ベクターＡＢ１５７を生成する。
【０６９２】
代表的なＩｇ−カッパ遺伝子座３’エンハンサーエレメントを以下に列挙する（アクセッション番号Ｘ１５８７８）。
【０６９３】
CCAGCTTAGGCTACACAGAGAAACTATCTAAAAAATAATTACTAACTACTTAATAGGAGATTGGATGTTAAGATCTGGTCACTAAGAGGCAGAATTGAGATTCGAAGCCAGTATTTTCTACCTGGTATGTTTTAAATTGCAGTAAGGATCTAAGTGTAGATATATAATAATAAGATTCTATTGATCTCTGCAACAACAGAGAGTGTTAGATTTGTTTGGAAAAAAATATTATCAGCCAACATCTTCTACCATTTCAGTATAGCACAGAGTACCCACCCATATCTCCCCACCCATCCCCCATACCAGACTGGTTATTGATTTTCATGGTGACTGGCCTGAGAAGATTAAAAAAAGTAATGCTACCTTATTGGGAGTGTCCCATGGACCAAGATAGCAACTGTCATAGCTACCGTCACACTGCTTTGATCAAGAAGACCCTTTGAGGAACTGAAAACAGAACCTTAGGCACATCTGTTGCTTTCGCTCCCATCCTCCTCCAACAGCCTGGGTGGTGCACTCCACACCCTTTCAAGTTTCCAAAGCCTCATACACCTGCTCCCTACCCCAGCACCTGGCCAAGGCTGTATCCAGCACTGGGATGAAAATGATACCCCACCTCCATCTTGTTTGATATTACTCTATCTCAAGCCCCAGGTTAGTCCCCAGTCCCAATGCTTTTGCACAGTCAAAACTCAACTTGGAATAATCAGTATCCTTGAAGAGTTCTGATATGGTCACTGGGCCCATATACCATGTAAGACATGTGG (配列番号282)。
【０６９４】
代表的なカッパイントロン性エンハンサー領域、Ｅｋｉを以下に示す：
【０６９５】
TCCTGAGGACACAGTGATAGGAACAGAGCCACTAATCTGAAGAGAACAGAGATGTGACAGACTACACTAATGTGAGAAAAACAAGGAAAGGGTGACTTATTGGAGATTTCAGAAATAAAATGCATTTATTATTATATTCCCTTATTTTAATTTTCTATTAGGGAATTAGAAAGGGCATAAACTGCTTTATCCAGTGTTATATTAAAAGCTTAATGTATATAATCTTTTAGAGGTAAAATCTACAGCCAGCAAAAGTCATGGTAAATATTCTTTGACTGAACTCTCACTAAACTCCTCTAAATTATATGTCATATTAACTGGTTAAATTAATATAAATTTGTGACATGACCTTAACTGGTTAGGTAGGATATTTTTCTTCATGCAAAAATATGACTAATAATAATTTAGCACAAAAATATTTCCCAATACTTTAATTCTGTGATAGAAAAATGTTTAACTCAGCTACTATAATCCCATAATTTTGAAAACTATTTATTAGCTTTTGTGTTTGACCCTTCCCTAGCCAAAGGCAACTATTTAAGGACCCTTTAAAACTCTTGAAACTACTTTAGAGTCATTAAGTTATTTAACCACTTTTAATTACTTTAAAATGATGTCAATTCCCTTTTAACTATTAATTTATTTTAAGGGGGGAAAGGCTGCTCATAATTCTATTGTTTTTCTTGGTAAAGAACTCTCAGTTTTCGTTTTTACTACCTCTGTCACCCAAGAGTTGGCATCTCAACAGAGGGGACTTTCCGAGAGGCCATCTGGCAGTTGCTTAAGATCAGAAGTGAAGTCTGCCAGTTCCTCCCAGGCAGGTGGCCCAGATTACAGTTGACCTGTTCTGGTGTGGCTAAAAATTGTCCCATGTGGTTACAAACCATTAGACCAGGGTCTGATGAATTGCTCAGAATATTTCTGGACACCCAAATACAGACCCTGGCTTAAGGCCCTGTCCATACAGTAGGTTTAGCTTGGCTACACCAAAGGAAGCCATACAGAGGCTAATACCAGAGTATTCTTGGAAGAGACAGGAGAAAATGAAAGCCAGTTTCTGCTCTTACCTTATGTGCTTGTGTTCAGACTCCCAAACATCAGGAGTGTCAGATAAACTGGTCTGAATCTCTGTCTGAAGCATGGAACTGAAAAGAATGTAGTTTCAGGGAAGAAAGGCAATAGAAGGAAGCCTGAGAATATCTTCAAAGGGTCAGACTCAATTTACTTTCTAAAGAAGTAGCTAGGAACTAG (配列番号283)。
【０６９６】
Ｃ．ベクター構築
ベクターフォーマット１．以下に記載する機能的エレメントは７つの合成ＤＮＡ断片として順序付けられ、それぞれがＤＮＡ２．０(Menlo Park,CA)由来のベクターｐＪ２又はｐＪ１５中にクローニングされる。ｐＪベクターは両方とも、Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点ｃｏｌＥ１及び選択マーカー（ｐＪ１５についてはａｍｐ、ｐＪ２についてはｋａｎ）を含有し；制限部位を最少化するために各配列をＤＮＡ２．０により改変させている。ｐＪベクターインサートを、望まれる順に正しく断片をアッセンブリすることを可能とする制限部位を境界とする最終的なベクターコンストラクトのために、以下に列挙した遺伝子エレメントを１以上含むように設計する。
【０６９７】
共有結合で閉環したプラスミドであるベクターＦ１は：ＤＮＡ２．０ベクターｐＪ１５（ｃｏｌＥ１  ｏｒｉ及びａｍｐ耐性マーカーを含有する）、制限部位ＢｓｉＷＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｒＧＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＭｌｕＩ、おおよそ８００ｂｐのＥＢＶ  ｏｒｉＰ、及びＡｆｌＩＩを（順に）含有する（図３５Ａ参照）。
【０６９８】
インサートＦ２は、もとからコードされている制限部位Ｍｌｕ  ＩからＮｓｉ  Ｉまでの、高度に反復された部分を含むおおよそ８８０ｂｐのｏｒｉＰを含有する。この断片は、制限部位Ｍｌｕ  ＩからＮｓｉ  Ｉまでを用いて、American Type Culture Collection (catalog number ATCC 59562)から購入されるクローンから回収する。
【０６９９】
インサートＦ３は、ｐＪ２から回収されるが、ＳＶ４０  ３’非翻訳領域及びポリアデニル化シグナル（３’ｕｔ／ｐＡ）、ＢａｍＨＩ制限部位、並びにｏｒｉＰの残存部位をコードする。当該断片はＮｓｉＩ及びＸｂａＩサイトが境界となる。
【０７００】
インサートＦ４は、ｐＪ２から回収されるが、制限部位ＮｇｏＭＩＶ及びＸｂａＩが境界となる真核生物の抗生物質耐性マーカー、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒ）を含有する。
【０７０１】
インサートＦ５は、ｐＪ１５から回収されるが、制限部位ＮｇｏＭＩＶ及びＢｓｒＧＩが境界となるＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列を含有する。
【０７０２】
インサートＦ６は、ｐＪ１５から回収されるが、体細胞超変異（ＳＨＭ）により感受性になるするよう改変される、つまり「ホット」と称される合成型のティール蛍光タンパク質オープンリーディングフレーム（ｈｏｔＴＦＰ）を含有する。当該断片は制限部位ＢｓｒＧＩ及びＳａｃＩにより描写される。
【０７０３】
共有結合で閉環したプラスミドベクターであるＦ７は：ＤＮＡ２．０ベクターｐＪ１５（ａｍｐ耐性マーカー及びｃｏｌＥ１  ｏｒｉを含有する）、制限部位ＡｆｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＢｓｒＧＩ、ＳａｃＩ、マルチクローニングサイト領域１（ｍｃｓ１）、ＣＭＶ即時型初期プロモーター、マルチクローニングサイト領域２（ｍｃｓ２）、細胞当たりのエピソームコピー数を判定するためのベータアクチン（βアクチン）部分、ＢｓｉＷＩを（順に）含有する（図３５Ｂ参照）。
【０７０４】
Ｍｃｓ１は次の制限部位：（５’）ＳｂｆＩ、ＰｍｅＩ、、ＢｇｌＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｍＢＩ、及びＳａｃＩ（３’）を含有する。Ｍｃｓ２は（５’）ＣｌａＩ、ＸｈｏＩ、ＢｃｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＡｇｅＩ、ＮｏｔＩ、及びＮｈｅＩ（３’）を含有する。
【０７０５】
プロトタイプベクターＡＢ１０２は、標準的な分子生物学的操作を用いて以下に記載の通りアッセンブリされる：最終の全コンストラクトを配列解析で確認する。
【０７０６】
１．トリプルライゲーションを行って、インサートＦ５（ＢｓｒＧＩ及びＮｇｏＭＩＶを用いて回収）及びＦ６（ＳａｃＩ及びＢｓｒＧＩを用いて回収）をベクターＦ７に組み込み、ベクターＡＮＡ１１３を作製する。
【０７０７】
２．別にトリプルライゲーションを行って、インサートＦ２（ＭｌｕＩからＮｓｉＩ）及びＦ３（ＮｓｉＩからＸｂａＩ）をベクターＦ１にインテグレートしベクターＡＮＡ１１０を作製する。
【０７０８】
３．ダブルライゲーションを行って、インサートＦ４（ＸｂａＩからＮｇｏＭＩＶ）をベクターＡＮＡ１１０に含めて、ベクターＡＮＡ１１９を作製する。
【０７０９】
４，最後に、ダブルライゲーションを行って、上記ＡＮＡ１１３由来のインサート（ＢｓｉＷＩからＮｇｏＭＩＶ）をＢｓｉＷＩ及びＮｇｏＭＩＶで切断したベクターＡＮＡ１１９中に取り入れ、ＡＢ１０２を作製する。
【０７１０】
制限部位を慎重に配置することでＡＢ１０２を高度にモジュールにする（図３６Ａ及び３６Ｂを参照）。それ故、ある場合は、それに続く殆どのベクターフォーマット（即ち、ベクターフォーマット２−４）は、断片の単純な交換によって作製される。例えば、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（コールドｂｓｄ）及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（コールドｈｙｇ）のオープンリーディングフレームは、本明細書中に記載のとおりＳＨＭ耐性のコドンを用いてＤＮＡ２．０で合成される（したがって「コールド」と表示）。これらマーカーは両方とも制限部位ＮｇｏＭＩＶ及びＸｂａＩが境界となり、従ってｐｕｒ（やはりＮｇｏＭＩＶ及びＸｂａＩで描写される）の代わりに容易にクローニングされてそれぞれｂｓｄ又はｈｙｇへの耐性を付与する型のベクターを作製する。
【０７１１】
同様にして、目的の他の遺伝子を、５’側のｍｃｓ１中の特有な制限部位の１つと３’末のＢｓｒＧＩ又はＡｓｃＩが境界となるように合成する。そのような、当初ＴＦＰが占めていた部位（図３６Ａ及び３６Ｂ）にクローニングされる遺伝子としては、他の蛍光タンパク質（ＧＦＰ及び“ＧＦＰ＊”［インフレームでｔｙｒ８２の代わりに終止コドンを含有するＧＦＰ］）、抗体重鎖又は軽鎖等のイムノグロブリン、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ、ＡＩＣＤＡとしても知られる）、及びリバーステトラサイクリントランス活性化タンパク質（ｒｔＴＡ）が挙げられる。
【０７１２】
１以上のエピソームベクターの同定及び定量を同時に可能にするベータアクチン及びＧ６ＰＤＨには、長さが異なる型がいくつかある。それぞれの型はＢｓｉＷＩ及びＣｌａＩサイトを用いて同位置にクローニングする。
【０７１３】
ＣＭＶ即時型初期プロモーターの異なる変形（即ち、ＳａｃＩ、及びＢｓｒＧＩ制限部位が除去された型、及びエンハンサー領域の５’末により多い、又はより少ないヌクレオチドを含む型）は、ｍｃｓ２（５’）及びｍｃｓ１（３’′）にそれぞれ見られる特有の制限部位であるＮｈｅＩ及びＳｂｆＩを用いることによってＡＢベクターシリーズのコンストラクト内外で交換される。
【０７１４】
ベクターフォーマット５．ＡＢ１０２の誘導体であるＡＢ１８４は、目的の遺伝子の発現がドキシサイクリン（ｄｏｘ）の添加により誘導できるベクターの典型的な例である（図３７Ａ）。ＡＢ１８４は以下の点でＡＢ１０２と異なる：
【０７１５】
ＴＦＰオープンリーディングフレームが、コールドコドン型のｒｔＴＡコーディング領域で置換されている(例えば、Gossen and Bujard,Proc Natl Acad Sci USA.(1992)89(12):5547-51;Gossen et al.,Science(1995)268(5218):1766-9を参照)。ｒｔＴＡ遺伝子はベクターｐＪ２中、ＤＮＡ２．０で合成し、クローニングサイトとしてＢｇｌＩＩを５’（センス）プライマーに含み、ＡｓｃＩを３’（アンチセンス）プライマーに含むようなＰＣＲ増幅によって回収される。ＰＣＲ断片はＡＢ１０２のＢｇｌＩＩ（ｍｃｓ１に見られる）及びＡｓｃＩサイトにクローニングする（図３８）。
【０７１６】
ｈｙｇオープンリーディングフレームはコールドコドンを使用して、ＤＮＡ２．０によりｐＪ２中で５’ＮｇｏＭＩＶサイト及び３’ＸｂａＩサイトを伴うように合成し、ベクターＡＮＡ１１２を作製する。このベクター由来のｈｙｇインサートは、ＡＢ１８４中、選択マーカーとしてｐｕｒ（図３８）と置換される。
【０７１７】
ＡＮＡ１１２も、原核生物型耐性マーカーｋａｎを供給するために使用される。部位特異的変異誘発法（ＳＤＭ）によりｋａｎマーカーの５’にＢｓｉＷＩサイトを付加し、ＡＮＡ１３６を作製する。連続するｋａｎ及びｃｏｌＥ１断片はＢｓｉＷＩ及びＡｆｌＩＩを用いてＡＮＡ１３６から回収し、ＡＢ１０２中の相同性のあるａｍｐ−ｃｏｌＥ１断片を置換してＡＢ１８４に対するｋａｎ耐性前駆体を生成する。
【０７１８】
ＢｓｔＢＩサイトを、特有のＡｆｌＩＩサイトの次に付加する（エレメントの順：ｋａｎ−ｃｏｌＥ１−ＡｆｌＩＩ−ＢｓｔＢＩ…）。
【０７１９】
最後に、ｄｏｘ−誘導性のコールド  イヌＡＩＤ発現カセットを作り出し、ｏｒｉＰとｃｏｌＥ１  ｏｒｉとの間に見られるＡｆｌＩＩサイトで当該ベクターに付加する。こうする工程を以下に記載する。
【０７２０】
ベクターＦ１０は、ＤＮＡ２．０で合成し、以下のエレメント：ｉ．ｐＪ２由来のｃｏｌＥ１  ｏｒｉ及びｋａｎマーカー；ｉｉ．ＳａｃＩサイト；ｉｉｉ．ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）最小プロモーター(配列ACAGTGGGAGAGAAGGGGCCAGGGTATAAAAAGGGCCCACAAGAGACCAGCTCAAGGATTCCAAGGC;配列番号２８４)；ｉｖ．ＳｐｅＩサイト；ｖ．コールドコドンを使用したイヌＡＩＤ及び核外搬出シグナルを無効にする単一変異（Ｌ１９８Ａ）；並びにＡｇｅＩサイトを（順に）含有する。
【０７２１】
ベクターＦ１０は好ましからざるＡｆｌＩＩサイトをＡｇｅＩサイトの３’側に含有していた（図３７Ｂ）。このサイトは部位特異的変異誘発法により除去する。ＡｆｌＩＩサイトを部位特異的変異誘発法によりＳａｃＩサイトの５’側に添加し、ＡＮＡ１６５を作製する。
【０７２２】
上記（ａ）に列挙されたｈＧＨミニマルプロモーターを含む、７回反復を有するｔｅｔオペレーターエレメントをプラスミドｐＪ５１中、ＤＮＡ２．０で合成し、ベクター７ｘｐｒｔＴＡを作製する。インサートの順は（５’）ＡｆｌＩＩ−７ｘｐｒｔＴＡオペレーターエレメント−ＳａｃＩ−ｈＧＨプロモーター−及びＳｐｅＩ（３’）である。当該７ｘ反復をＡｆｌＩＩ及びＳｐｅＩによりｐＪ５１から回収し、ＡＮＡ１６５の同じサイトにクローニングし、ＡＮＡ２０９を作製する（図３８）。
【０７２３】
発現カセットを完成させるために、（１）ＡｆｌＩＩで切断し、ＣＩＰ（仔ウシ腸ホスファターゼ）処理したベクターｐＪ１５；と（２）ＡｇｅＩからＡｆｌＩＩまでのインサート７ｘｐｒｔＴＡ−コールド  イヌＡＩＤｎｅｓ（−）；と（３）元々はインサートＦ３として合成され、ＡｇｅＩ（５’）及びＡｆｌ  ＩＩ（３’）制限部位をＰＣＲプライマーに取り込んでいる、ＰＣＲ増幅した３’ｕｔ／ｐＡ断片を含めたトリプルライゲーションを行う。これでベクターＡＮＡ２８５が作り出される。
【０７２４】
最後に、発現誘導カセット（以下の遺伝子マーカー：ＡｆｌＩＩ−７ｘｐｒｔＴＡ−イヌＡＩＤ−３’ｕｔ／ｐＡ−ＡｆｌＩＩを順に含有する）全体を、ＢｓｔＢＩサイトを含み、且つ５’側にＡｆｌＩＩサイトを補ったオリゴを用いるＰＣＲによりＡＮＡ２８５から回収する。従って、回収するインサートは以下の遺伝子エレメント：ＡｆｌＩＩ−ＢｓｔＢＩ−７ｘｐｒｔＴＡ−イヌＡＩＤ−３’ｕｔ／ｐＡ−ＡｆｌＩＩ−ＢｓｔＢＩを有する。このＰＣＲ増幅産物はＢｓｔＢＩで消化し、上記工程（３）中に記載のＡＢ１８４前駆体中に特有のＢｓｔＢＩサイトにクローニングしＡＢ１８４を作製する（図３７Ａ）。（当該カセット３’末端のＡｆｌＩＩサイトはクローニングベクターの一部であり、ＰＣＲ増幅インサートにより最終コンストラクトには持ち込まれないことに留意）。
【０７２５】
実施例６
新規ランチビオティクス合成法の創出へのＳＨＭの適用
既存の治療法への耐性を伴う細菌の進化は、新規抗生物質の発見及び開発において注目されるきっかけとなる。更なる研究のための理想的な候補は、複合的な作用様式を介して作用し、耐性の獲得を有意に、そしてより困難にするものである。そのような抗生物質の１つが、ナイシンである。
【０７２６】
ナイシンはLactococcus lacticの天然産物であるランチビオティクスであり、グラム陽性細菌に対して広範な活性を有し、食物の保存においてListeria monocytogenes及びClostridium botulinum等の病原体に対して一般的に使用される。(BAVIN et  al.,Lancet.1952 Jan 19;1(3):127-9)ナイシンはリボソームで翻訳され、ポスト翻訳されたペプチドであるが、食物産業において数十年使用されてきたにもかかわらず、共通の耐性機構の誘導が見られていない。この知見は２つの事実の結果のようである：１つはナイシンの殺菌活性の作用様式が、そのＬｉｐｉｄ  ＩＩへの結合及び二次的な孔形成の誘導に由来することである(Breukink et al.,Nat Rev Drug Discov.2006 Apr;5(4):321-32)。Ｌｉｐｉｄ  ＩＩは、グラム陽性細菌によっては容易に改変されない細菌の細胞壁成分であり、その使用は細菌の細胞壁生成の律速段階を形成する。ナイシンは胞子形成阻害にも作用する。
【０７２７】
ナイシンは現在、数種の細菌病原体の処置のための臨床前の開発途上にある。ナイシンは、多剤耐性のStreptococcus pneumoniae、バンコマイシン耐性のEnterococcus faecium、及びStrepococcus pyogenes等の数種の病原体への一定範囲の活性を示すが、それらすべてが、新たな治療が是非とも必要な領域である(Goldstein et al.,J.Antimicrob.Chemother.1998 Aug;42(2):277-8)。ある研究では（マウスにおける）S.pneumoniaeの処置において、ナイシンがバンコマイシンよりも８〜１６倍強力であることが示された(Brumfitt et al.,J Antimicrob Chemother.2002 Nov;50(5):731-4)。
【０７２８】
これらの有望な特徴にもかかわらず、ナイシン及び他のランチビオティクスはいくつかの重大な限界をかかえている。細菌は、密接に関連する（同系の）種でさえ、ナイシン及び他のランチビオティクスに対する感受性に有意な多様性を示す。第二に、ナイシンは哺乳動物の循環系から迅速に一掃される。ナイシンが真に効果的な治療薬となるには、広範な殺菌活性を伴う改善された薬理動態特性を有することが必要である。ここで、質的改善を伴うナイシンを設計するのにＳＨＭを適用することを検討する。
【０７２９】
生物活性を持つナイシンの生合成はたった５つのL.lactisのタンパク質、ＮｉｓＡ，ＮｉｓＢ，ＮｉｓＣ，ＮｉｓＰ、及びＮｉｓＴに依存することが示されている(Kuipers et al.,J Biol Chem.2004 Can 21;279(21):22176-82;Rink et al.,Biochemistry.2005 Jun 21;44(24):8873-82)。ＮｉｓＡは、いくつかのセリン及びスレオニン部位でＮｉｓＢにより脱水される前駆体ペプチドをコードし、ＮｉｓＣにより５箇所で環状化される修飾ペプチドとなる。最後に、プロテアーゼのＮｉｓＰにより当該抗生物質前駆体のリーダーペプチドが切断され、トランスポーターのＮｉｓＴにより培地へと排出される（図４７Ａ参照）。それぞれがＮｉｓＣにより触媒される５つのチオエステル環は、ランチオニンと称され、修飾ペプチド抗生物質であるランチビオティクスファミリーを定義づける。
【０７３０】
本経路のモジュール特性、生物活性の容易なアッセイ、広範な特異性及びデヒドラターゼ及びシクラーゼのＮｉｓＢ及びＮｉｓＣの活性により、これを、ＳＨＭによって駆動される共進化に対する理想的な標的とし、新規抗生物質コンストラクトが製造される。１つのアプローチにおいて、そのような戦略はある種の遺伝子、又は遺伝子の部分をＳＨＭに対してより感受性とすることに基づき得るが、一方では他の遺伝子、又はそのような遺伝子の部分をＳＨＭに耐性とすることに基づき得る。
【０７３１】
ナイシン生合成に関わる５つの遺伝子のアミノ酸配列を以下に示す：これらの配列においては、太字の残基はそれらの位置がＳＨＭに対してホットにされるものであることを示すが、一方で下線の残基は、ＳＨＭに対してコールドにされるものであることを示している。
【０７３２】
ＮｉｓＡ，ネイティブ遺伝子>NisA|gi|530218|gb|AAA26948.1|ナイシン[Lactococcus lactis]NisA,
【０７３３】
MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSK(配列番号285)
【０７３４】
ＮｉｓＣ，ネイティブ遺伝子＞NisC|gi|44045|emb|CAA48383.1|nisC[Lactococcus lactis]
【０７３５】
MRIMMNKKNIKRNVEKIIAQWDERTRKNKENFDFGELTLSTGLPGIILMLAELKNKDNSKIYQKKIDNYIEYIVSKLSTYGLLTGSLYSGAAGIALSILHLREDDEKYKNLLDSLNRYIEYFVREKIEGFNLENITPPDYDVIEGLSGILSYLLLINDEQYDDLKILIINFLSNLTKENNGLISLYIKSENQMSQSESEMYPLGCLNMGLAHGLAGVGCILAYAHIKGYSNEASLSALQKIIFIYEKFELERKKQFLWKDGLVADELKKEKVIREASFIRDAWCYGGPGISLLYLYGGLALDNDYFVDKAEKILESAMQRKLGIDSYMICHGYSGLIEICSLFKRLLNTKKFDSYMEEFNVNSEQILEEYGDESGTGFLEGISGCILVLSKFEYSINFTYWRQALLLFDDFLKGGKRK (配列番号286)
【０７３６】
ＮｉｓＢ，ネイティブ遺伝子＞gi|473018|emb|CAA79468。1|NisBタンパク質[Lactococcus lactis]
【０７３７】
MIKSSFKAQPFLVRNTILSPNDKRSFTEYTQVIETVSKNKVFLEQLLLANPKLYNVMQKYNAGLLKKKRVKKLFESIYKYYKRSYLRSTPFGLFSETSIGVFSKSSQYKLMGKTTKGIRLDTQWLIRLVHKMEVDFSKKLSFTRNNANYKFGDRVFQVYTINSSELEEVNIKYTNVYQIISEFCENDYQKYEDICETVTLCYGDEYRELSEQYLGSLIVNHYLISNLQKDLLSDFSWDTFLTKVEAIDEDKKYIIPLKKVQKFIQEYSEIEIGEGIEKLKEIYQEMSQILENDNYIQIDLISDSEINFDVKQKQQLEHLAEFLGNTTKSVRRTYLDDYKDKFIEKYGVDQEVQITELFDSTFGIGAPYNYNHPRNDFYESEPSTLYYSEEEREKYLSMYVEAVKNHNVINLDDLESHYQKMDLEKKSELQGLELFLNLAKEYEKDIFILGDIVGNNNLGGASGRFSALSPELTSYHRTIVDSVERENENKEITSCEIVFLPENIRHANVMHTSIMRRKVLPFFTSTSHNEVQLTNIYIGIDEKEKFYARDISTQEVLKFYITSMYNKTLFSNELRFLYEISLDDKFGNLPWELIYRDFDYIPRLVFDEIVISPAKWKIWGRDVNNKMTIRELIQSKEIPKEFYIVNGDNKVYLSQENPLDMEILESAIKKSSKRKDFIELQEYFEDENIINKGQKGRVADVVVPFIRTRALGNEGRAFIREKRVSVERREKLPFNEWLYLKLYISINRQNEFLLSYLPDIQKIVANLGGKLFFLRYTDPKPHIRLRIKCSDLFLAYGSILEILKRSQKNRIMSTFDISIYDQEVERYGGFDTLELSEAIFCADSKIIPNLLTLIKDTNNDWKVDDVSILVNYLYLKCFFQNDNKKILNFLNLVSPKKVKENVNEKIEHYLKLLKVDNLGDQIFYDKNFKELKHAIKNLFLKMIAQDFELQKVYSIIDSIIHVHNNRLIGIERDKEKLIYYTLQRLFVSEEYMK (配列番号287)
【０７３８】
ＮｉｓＰ，ネイティブ遺伝子＞gi|730155|sp|Q07596|NISP_LACLAナイシンリーダーペプチドをプロセッシングするセリンプロテアーゼｎｉｓＰ前駆体
【０７３９】
MKKILGFLFIVCSLGLSATVHGETTNSQQLLSNNINTELINHNSNAILSSTEGSTTDSINLGAQSPAVKSTTRTELDVTGAAKTLLQTSAVQKEMKVSLQETQVSSEFSKRDSVTNKEAVPVSKDELLEQSEVVVSTSSIQKNKILDNKKKRANFVTSSPLIKEKPSNSKDASGVIDNSASPLSYRKAKEVVSLRQPLKNQKVEAQPLLISNSSEKKASVYTNSHDFWDYQWDMKYVTNNGESYALYQPSKKISVGIIDSGIMEEHPDLSNSLGNYFKNLVPKGGFDNEEPDETGNPSDIVDKMGHGTEVAGQITANGNILGVAPGITVNIYRVFGENLSKSEWVARAIRRAADDGNKVINISAGQYLMISGSYDDGTNDYQEYLNYKSAINYATAKGSIVVAALGNDSLNIQDNQTMINFLKRFRSIKVPGKVVDAPSVFEDVIAVGGIDGYGNISDFSNIGADAIYAPAGTTANFKKYGQDKFVSQGYYLKDWLFTTANTGWYQYVYGNSFATPKVSGALALVVDKYGIKNPNQLKRFLLMNSPEVNGNRVLNIVDLLNGKNKAFSLDTDKGQDDAINHKSMENLKESRDTMKQEQDKEIQRNTNNNFSIKNDFHNISKEVISVDYNINQKMANNRNSRGAVSVRSQEILPVTGDGEDFLPALGIVCISILGILKRKTKN (配列番号288)
【０７４０】
ＮｉｓＴ，ネイティブ遺伝子＞gi|44044|emb|CAA48382。1|nisT[Lactococcus lactis]
【０７４１】
MDEVKEFTSKQFFYTLLTLPSTLKLIFQLEKRYAIYLIVLNAITAFVPLASLFIYQDLINSVLGSGRHLINIIIIYFIVQVITTVLGQLESYVSGKFDMRLSYSINMRLMRTTSSLELSDYEQADMYNIIEKVTQDSTYKPFQLFNAIIVELSSFISLLSSLFFIGTWNIGVAILLLIVPVLSLVLFLRVGQLEFLIQWQRASSERETWYIVYLLTHDFSFKEIKLNNISNYFIHKFGKLKKGFINQDLAIARKKTYFNIFLDFILNLINILTIFAMILSVRAGKLLIGNLVSLIQAISKINTYSQTMIQNIYIIYNTSLFMEQLFEFLKRESVVHKKIEDTEICNQHIGTVKVINLSYVYPNSNAFALKNINLSFEKGELTAIVGKNGSGKSTLVKIISGLYQPTMGIIQYDKMRSSLMPEEFYQKNISVLFQDFVKYELTIRENIGLSDLSSQWEDEKIIKVLDNLGLDFLKTNNQYVLDTQLGNWFQEGHQLSGGQWQKIALARTFFKKASIYILDEPSAALDPVAEKEIFDYFVALSENNISIFISHSLNAARKANKIVVMKDGQVEDVGSHDVLLRRCQYYQELYYSEQYEDNDE (配列番号289)
【０７４２】
ＮｉｓＢ，ＮｉｓＰ及びＮｉｓＴ
【０７４３】
上記した通り、ＳＨＭ耐性（コールド）型の必須遺伝子ＮｉｓＰ及びＮｉｓＴが作り出されることは、これらの遺伝子が、多様性を生み出すための標的となるＳＨＭ感受性遺伝子よりも低い割合で変異する傾向にあるであろうことを意味する。ＮｉｓＰ及びＮｉｓＴは両方とも、現在ナイシンに対して広範な特異性を有し、且つ翻訳後修飾されたペプチドに潜在的な多様性を付加しない。この冒頭の例においては、ＮｉｓＢもＳＨＭ耐性にされるが、ＮｉｓＡについて以下に概説される指針と同じ指針に従って、選択的に変異させることもできる。ネイティブなＮｉｓＢポリヌクレオチド及びＳＨＭ耐性ＮｉｓＢポリヌクレオチドを、それぞれホットスポット頻度及びコールドスポット頻度の初期解析（図４３９Ｂ及び４０Ｂ）と共に、それぞれ図３９Ａ及び図４０Ａにおいて提供する。ネイティブなＮｉｓＰポリヌクレオチド及びＳＨＭ耐性ＮｉｓＰポリヌクレオチドを、それぞれホットスポット頻度及びコールドスポット頻度の初期解析（図４１Ｂ及び４２Ｂ）と共に、それぞれ図４１Ａ及び図４２Ａにおいて提供する。
【０７４４】
ＮｉｓＡペプチド
【０７４５】
上記に示す通り、ＮｉｓＡペプチドのリーダーペプチド領域の大半は、この配列がＮｉｓＢＣＰＴによる基質認識に絶対的に必要であるため、ＡＩＤ介在性の変異誘発に耐性とすることができる。残りのＮｉｓＡペプチド配列の大部分はＡＩＤ介在性の変異誘発に感受性とすることができ、あるいは上記に示すとおりランチオニン類の生成に関与する鍵となる残基はＳＨＭに耐性とすることができ、それによってそれらの変異誘発の割合を低減できる。
【０７４６】
ＮｉｓＡポリヌクレオチド配列の対応する未改変型ポリヌクレオチド及びＳＨＭ耐性（コールド）型ポリヌクレオチドをそれぞれ図４４Ａ及び４４Ｄに示す。未改変のホットスポット及びコールドスポット頻度の初期解析（図４４Ｂ及び４４Ｃ）をそれぞれＳＨＭ耐性のホットスポット及びコールドスポット頻度（図４４Ｅ及び４４Ｆ）のそれぞれと比較する。ＮｉｓＡのコドンを最適化することによってリーダー配列中２０個のコールドスポットが作り出され、１個以外は全てホットスポットが排除される。そして、当該分子の残りの部分において、野生型配列ではホットスポットが８個なのに比べ１７個のホットスポットが作り出される。
【０７４７】
ＮｉｓＣタンパク質
【０７４８】
上記に太字の残基として概説し、図４７Ｂに示されるように、基質認識及び環状化に関わるＮｉｓＣの領域は、ＡＩＤ介在性の変異にホット（感受性）にすることができ、それらは活性及び特異性の変化を伴う変異体を作出する蓋然性が高まり、よって改変された修飾及び生物活性を伴う成熟ナイシン分子が作り出される。当該タンパク質の安定性のみを支配する構造領域はコールドにできる。ＮｉｓＣポリヌクレオチド配列の対応する未改変型ポリヌクレオチド及びＳＨＭ耐性（コールド）型ポリヌクレオチドをそれぞれ図４５Ａ及び４６Ａに示す。未改変のホットスポット及びコールドスポット頻度の初期解析（図４５Ｂ及び４５Ｃ）をそれぞれＳＨＭ耐性のホットスポット及びコールドスポット頻度（図４６Ｂ及び４６Ｃ）のそれぞれと比較する。
【０７４９】
この遺伝子中の標的化ホットスポット作成の具体例を以下に示す：
【０７５０】
本実施例では、ＳＨＭｒｅｄｅｓｉｇｎを用い、更なるホットスポットが目的の領域（ＬＳＴＧ）中へと挿入され、且つコールドスポットが除去されている。更に、フランキング配列は有意に、よりＳＨＭ耐性とされている。
【０７５１】
【化３】
2010520748.tif 000063
【０７５２】
合成ポリヌクレオチド配列に、無関係な制限部位が確実に無いことを最終的に点検した後、完全な合成ポリヌクレオチド配列を合成し(DNA2.0,Menlo Park,CA)、適切なクローニングベクターにクローニングし、そして正しく合成されていることを確認するために配列決定することができる。
【０７５３】
次いで合成遺伝子を発現ベクターに導入し、適切な細菌株、例えば以前に記載されたLactococcus lactis株(Mota-Meira et al.,FEBS Lett.1997 Jun 30;410(2-3):275-9)にＡＩＤ(Besmer et al.,Mol Cell Biol.2006 Jun;26(11):4378-85)又はＡｐｏｂｅｃ−１酵素等のＡＩＤホモログと共に、形質転換できる。
【０７５４】
スクリーニングは、ＳＨＭを介して生じる多様性が、現在はほとんどナイシンによって標的化されていないグラム陽性細菌標的と共培養されたL. lactisを進化させることにより遂行され得る。結果的に、選別された標的細菌に対する活性が増強した変異型ナイシン遺伝子を含むL. lactis株が生じるであろう。
【０７５５】
工程の進行を評価するために、生じた細胞培養物の培養液上清の質量分析を用いることができる（即ち、病原体への活性が向上した新規ランチビオティクスの同定）。
【０７５６】
実施例７
改良受容体生成へのＳＨＭの適用
受容体はリガンドを結合し、抗体（Ｂ細胞受容体）、Ｔ細胞受容体、Ｆｃ受容体、Ｇタンパク質共役受容体、サイトカイン受容体等の細胞結合受容体を含むが、これらに限定されない広範な一群のポリペプチドを包含する。
【０７５７】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）はイムノグロブリン（Ｉｇ）分子のＦｃ部分に特異的な受容体であり、関連の受容体でファミリーを構成する。受容体はそれぞれのイムノグロブリンクラスについて定義されており、そのようなものとして、それらが結合するＩｇのクラスにより定義される：Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）はガンマイムノグロブリン（ＩｇＧ）に結合し、Ｆｃイプシロン受容体（ＦｃεＲ）はイプシロンイムノグロブリン（ＩｇＥ）に結合し、Ｆｃアルファ受容体（ＦｃαＲ）はアルファイムノグロブリン（ＩｇＡ）に結合する。
【０７５８】
Ｆｃγ受容体はたいていの造血細胞上に発現し、ＩｇＧの結合を介して、免疫系の恒常性及び感染に対する非修飾宿主防御において重要な役割を果たす。ＦｃγＲ受容体は３種類のサブファミリーメンバーに同定されている（１）ＩｇＧに対する高親和性受容体であるＦｃγＲＩ；（２）凝集した免疫複合体に強く結合する、ＩｇＧに対する低親和性受容体であるＦｃγＲＩＩ；（３）免疫複合体に結合する低親和性受容体であるＦｃγＲＩＩＩ。構造的に関連するにもかかわらず、当該受容体は異なる機能を果たす。
【０７５９】
ＦｃγＲ  は３つのサブクラスに同定されている：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）。それぞれのＦｃγＲサブクラスが２又は３個の遺伝子にコードされ、選択的スプライシング(spicing)で複数の転写産物を生じるため多様なＦｃγＲアイソフォームが存在する。ＦｃγＲＩサブクラス（ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ及びＦｃγＲＩＣ）をコードする３つの遺伝子は第１染色体長腕の１ｑ２１．１領域中にクラスター化しており；ＦｃγＲＩＩアイソフォーム（ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＣ）をコードする遺伝子群及びＦｃγＲＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＢ）をコードする２つの遺伝子は全て１ｑ２２領域中にクラスター化している。これらの異なるＦｃＲサブタイプは異なるタイプの細胞で発現する(Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)で総説されている)。例えば、ヒトにおいてはＦｃγＲＩＩＩＢは好中球上にのみ見られるが、ＦｃγＲＩＩＩＡはマクロファージ、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＴ細胞亜集団上に見られる。とりわけ、ＦｃγＲＩＩＩＡはＡＤＣＣに関連するタイプの細胞の１つであるＮＫ細胞上に存在する唯一のＦｃＲである。
【０７６０】
ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩはイムノグロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）の受容体である；ＦｃγＲＩはその細胞外ドメインに３つのＩｇＳＦドメインを有するが、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩはそれらの細胞外ドメインに２つのＩｇＳＦドメインしか有しない。
【０７６１】
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は別のタイプのＦｃ受容体である。ＦｃＲｎは構造的に主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）と類似し、β２ミクログロブリンに非共有結合するα鎖から成る。
【０７６２】
ＦｃγＲに対するヒト及びマウス抗体上の結合部位は、２３３〜２３９(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中のＥＵインデックス番号)残基から成るいわゆる「ヒンジ領域下流」に以前マッピングされている。Woof et al.Molec.Immunol.23:319-330(1986);Duncan et al.Nature 332:563(1988);Canfield and Morrison,J.Exp.Med.173:1483-1491(1991);Chappel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 88:9036-9040(1991)。
【０７６３】
ＦｃγＲへの結合に関与すると考えられる他のアミノ酸残基としては：ヒトＦｃγＲＩに対してＧ３１６−Ｋ３３８（ヒトＩｇＧ）(Woof et al.Molec.Immunol.23:319-330(1986))；ヒトＦｃγＲＩＩＩに対してＫ２７４−Ｒ３０１（ヒトＩｇＧ１）（ペプチドベース）(Sarcan et al.Molec.Immunol.21:43-51(1984))；ヒトＦｃγＲＩＩＩに対してＹ４０７−Ｒ４１６（ヒトＩｇＧ）（ペプチドベース）(Gergely et al.Biochem.Soc.Trans.12:739-743(1984))；並びにマウスＦｃγＲＩＩに対してＮ２９７及びＥ３１８（マウスＩｇＧ２ｂ）(Lund et al.,Molec.Immunol.,29:53-59(1992))が挙げられる。ある場合には、ＩｇＧ３中のＰｒｏ３３１をＳｅｒに変異させ、この改変ＩｇＧ３の標的細胞への親和性が解析される：該親和性は未変異のＩｇＧ３のそれよりも６倍低く、これはＦｃγＲＩ結合におけるＰｒｏ３３１の関与を示唆している。Morrison et al.,Immunologist,2:119-124(1994);及びCanfield and Morrison,J.Exp.Med.173:1483-91(1991)。
【０７６４】
２つのＦｃγＲＩＩタンパク質間の境界面のダイマー化を妨げる化合物は、一方又は両方の当該ＦｃＲタンパク質による細胞シグナル伝達に影響を与え得る。具体的には、ＦｃγＲＩＩのアミノ酸残基１１７〜１３１及び１５０〜１６４はＦｃγＩＩａダイマーの境界領域と考えられ、この領域を模倣するか又はこの領域に結合できる化合物は良好な結合調節因子と考えられる（米国特許第６，８３５，７５３号を参照）。
【０７６５】
１つの側面において、複数のＩｇＧ分子のＦｃ領域の少なくとも一部をコードする合成ポリヌクレオチドは、ＦｃγＲＩＩａのこの領域に対する結合親和性の増大を示す改変ＩｇＧ分子を作り出すための、本明細書中に記載する方法を用いる体細胞超変異に対する当該部位の感受性が増大するように改変することができる。
【０７６６】
他の側面においては、そのようなＳＨＭで改変されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが本明細書中で検討される。１つの実施形態において、ＳＨＭで改変されたＩｇＧとしては、Ｐｈｅ１２１からＳｅｒ１２６のヘキサペプチド配列か、又は有意な水素結合相互作用を伴う領域にわたるより短い断片をコードする合成ポリヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドがＳＨＭに最適化されているポリヌクレオチドが挙げられる。そのようなＩｇ分子は２つのＦｃγＲＩＩａ分子同士のダイマー化の、好適な調節因子である。
【０７６７】
ＦｃＲのＦＧループの上側部分は、変異誘発の研究で証明された通り、Ｉｇ結合に関与することが示されている。ＦＧペプチド鎖は、“3 Dimensional Structure and Models of Fc Receptors and Uses Thereof.”という名称の米国特許第６，６７５，１０５号に記載されるような、ＦＧループにおいて定まった方向にアミノ酸側鎖を突き出す伸張βシートを含有する。βターンの模倣体のように作用でき、且つＦＧループの先端で、受容体中のそれらと同様にその側鎖を提示する分子も、ＦｃＲ受容体活性の調節において有効であることがわかっている。
【０７６８】
１つの側面において、ＦＧループにおいて定まった方向にアミノ酸側鎖を突き出す伸張βシートを含有するＰＦペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドは、ＦｃＲのこの領域に対する結合親和性の増大を示す改変ポリペプチドを作り出すための、本明細書中に記載する方法を用いる体細胞超変異に対する感受性が増大するように改変することができる。他の側面においては、そのようなＳＨＭで改変されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが本明細書中で検討される。
【０７６９】
Ｆｃ受容体は正常免疫及び感染抵抗性において役割を果たし、且つ細胞性エフェクターの動員を伴う体液性免疫システムを提供する。Ｉｇガンマ（ＩｇＧ）のＦｃγＲへの結合は、ＦｃγＲによる制御と関連する疾患の兆候をもたらし得る。例えば、自己免疫疾患の血小板減少性紫斑病は、血小板のＦｃγＲ依存性ＩｇＧ免疫複合体活性化又はＦｃγＲ＋食細胞によるそれらの破壊に起因する組織（血小板）損傷を伴う。更に、ＩＩ型及びＩＩＩ型過敏性反応を含む様々な炎症性疾患（例、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデス）がＩｇＧ免疫複合体を伴うことが知られている。ＩＩ型及びＩＩＩ型過敏性反応には、補体介在性機構又は食細胞エフェクター機構のいずれかを活性化できるＩｇＧが介在し、組織損傷を引き起こす。
【０７７０】
様々な生物学的機構におけるＦｃＲの役割という要因を背景として、イムノグロブリンのＦｃＲへの結合に影響し、ＦｃＲによる調節に関連する様々な病気の治療用に使用できる化合物が必要である。
【０７７１】
Ｆｃ受容体調節因子（イムノグロブリンのＦｃ受容体結合の調節因子）はＦｃαＲ、ＦｃεＲ及びＦｃγＲポリペプチドを調節できる。ＦｃαＲ、ＦｃεＲ及びＦｃγＲポリペプチドのＦｃ受容体調節因子をコードするポリヌクレオチドは、本明細書中に記載の方法を用いて、当該ポリペプチドの１以上の部分の、体細胞超変異への感受性を増大及び／又は減少させるように改変できる。そのような方法を用いて作製された改変Ｆｃ受容体調節因子を、改変された結合及び活性を示す調節因子を同定するためにアッセイできる。１つの側面において、ＦｃＲ調節因子はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及び／又はＦｃγＲＩＩＩと相互作用する。更なる側面において、ＦｃＲ調節因子はＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及び／又はＦｃγＲＩＩｃと相互作用する。本明細書中で提供されるＦｃ受容体調節因子は、抗体の凝集体が生成され、且つ抗体の内因性又は外因性抗原との接触により免疫複合体が産生される任意の疾患の治療又は診断を含む、様々な用途に使用できる。当該Ｆｃ受容体調節因子により適用可能な治療及び診断としては、非限定的に、免疫複合体疾患；関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、免疫性血小板減少症、好中球減少症、溶血性貧血を含むがこれらに限定されない自己免疫疾患；結節性多発性動脈炎、全身性血管炎を含むがこれらに限定されない血管炎(vasculitities)；異種移植拒絶反応；及びデングウィルス−デング出血熱等のフラビウイルス感染及び麻疹ウイルス感染を含むがこれらに限定されない、ＦｃＲによるウイルスの取り込みが感染を亢進する感染性疾患が挙げられる。Ｆｃ受容体調節因子はＩｇＧが介在する組織損傷を低減するため、そして炎症を低減するためにも使用できる。
【０７７２】
本明細書中で提示される、ＳＨＭで改変されたＦｃ受容体調節因子は、細胞介在性の抗体依存的細胞毒性、食作用及び炎症性サイトカイン遊離等の、ＦｃＲの機能を亢進することにより白血球の機能を亢進させることもできる。亢進したＦｃＲの機能についての治療及び診断としては、病原体除去のために正常抗体が産生される任意の感染；及び未改変又は組み換え抗体が癌及び感染等の治療に使用できる、ＦｃＲの機能を要する任意の疾患が挙げられる。イムノグロブリン治療の効果を亢進させるために、例えば、イムノグロブリン（例、正常Ｉｇ又はＳＨＭで改変したＩｇ）をＦｃ受容体調節因子（例、ＳＨＭで改変した調節因子）と併用して投与できる。
【０７７３】
他の側面において、ＦｃＲはＣ１ｑ結合を介して補体経路に関わる。Ｃ１ｑ及び２つのセリンプロテアーゼ（Ｃ１ｒ及びＣ１ｓ）が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路の最初の成分、複合体Ｃ１を形成する。補体カスケードを活性化するためには、Ｃ１ｑがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３のうちの少なくとも２つの分子と結合することが必要であるが、ＩｇＭの１分子だけが、標的抗原に付着する(Ward and Ghetie,Therapeutic Immunology 2:77-94(1995)80頁)。化学的修飾及び結晶学的研究の結果に基づいて、Ｂｕｒｔｏｎら(Nature,288:338-344(1980))はＩｇＧ上の、補体サブコンポーネントＣ１ｑの結合部位がＣＨ２ドメインの最後の２つ（Ｃ末端）のβ鎖を含むことを提唱した。Ｂｕｒｔｏｎは後に、アミノ酸残基３１８〜３３７を含む領域が補体結合に関与するであろうこと(Molec.Immunol.,22(3):161-206(1985))を提唱した。１つの側面において、標的抗原への親和性増大を示すか、Ｃ１ｑへの結合性増大を示すか、又はその両方となるように改変された、ＳＨＭで改変されたＩｇ分子（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３或いはＩｇＭ）が本明細書中で提供される。そのような改変Ｉｇ分子は、出発Ｉｇと比較して結合及び／又は生物活性における変化を評価するために、当該技術分野において承認されている１以上のアッセイにおいて試験できる。
【０７７４】
ＳＨＭで改変されたＦｃ受容体調節因子を試験するためのアッセイとしては、例えば、結合アッセイ、血小板凝集阻害アッセイ、ＡＤＣＣ活性の評価、Ｃ１ｑ結合の評価、並びに下記の、結合及び機能を試験するための他のアッセイ等、Ｆｃ受容体活性を調節する化合物を試験するための当該技術において公知のものが挙げられる。ＳＨＭで改変されたＦｃ受容体調節因子の結合及び活性はコントロールのＩｇ分子と比較できる。
【０７７５】
結合アッセイ
一例において、可溶性の組み換えＦｃγＲＩＩａとヒトイムノグロブリンとの相互作用を、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００バイオセンサー(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)を用い、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩液 [HBS:10mM Hepes(pH7.4),150mM NaCl,3.4mM EDTA,0.005%Surfactant P20 (Pharmacia)]中、２２℃で、ＳＨＭで改変されたＦｃ受容体調節因子存在下で検討した。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、及びＩｇＥ（５０μｇ／ｍＬ）（非特異的結合のコントロール）モノマーを、アミンカップリングプロトコール(BIAcore,Uppsala,Sweden)を用いてＣＭ−５センサーチップ(BIAcore,Uppsala,Sweden)のカルボキシメチルデキストラン表面に共有結合でカップリングする。更なるチャンネルを該カップリングプロトコールを用いて化学的に処理する。可溶性の組み換えＦｃγＲＩＩａを、５０％結合能に等しい、濃度１２５μｇ／ｍＬで使用する。可溶性の組み換えＦｃγＲＩＩａを、ＳＨＭで改変された各Ｆｃ受容体調節因子と、室温で３０分間プレインキュベートし、その後、センサーチップ表面上に１０μＬ／ｍｉｎで１分間注入し、次いで３分間の解離段階を行う。それぞれの化合物を解析する間に、表面は全て５０ｍＭジエチルアミン（ｐＨ約１１．５）、１Ｍ  ＮａＣｌで再生する。それぞれの相互作用について応答の最大値を測定する。非特異的結合応答（ＩｇＥチャンネル）を、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３への結合から差し引く。ＳＨＭで改変されたＦｃ受容体調節因子及び受容体間の緩衝液組成の相違に関して測定値を補正する。
【０７７６】
血小板凝集阻害
血小板凝集阻害は本明細書中に記載したような、当該技術分野において承認されているアッセイを用いて試験できる。簡単に言えば、試験化合物を血小板とＨＡＧＧとの混合物に添加してコントロール化合物と比較することが手法に含められる。この手法により、試験化合物の血小板凝集体形成を阻害する能力及び当該化合物の添加前に形成された血小板凝集体を粉砕する能力をコントロールと比較して説明する。
【０７７７】
血小板には単一クラスのガンマ受容体、ＦｃγＲＩＩａが発現している。ＦｃγＲＩＩａの架橋後、血小板では様々な生化学的及び細胞的な修飾が起き、凝集に至る。血小板活性化を阻害する化合物の能力は、血小板凝集を特異的に測定するアッセイを用いて測定される。
【０７７８】
簡単に言えば、血小板は以下のようにして単離される：新鮮な全血３０ｍＬをクエン酸を入れた回収バイアル中へ回収し、１０００ｒｐｍで１０分遠心する。血小板に富む血漿を分離し、４本のチューブ中、２０００ｒｐｍで５分遠心する。上清を除去し、血小板をチューブあたり２ｍｌのＴｙｒｏｄｅｓ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．３６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．１％デキストロース、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２．６Ｈ２０、ｐＨ６．５）中で穏やかに再懸濁し、再び２０００ｒｐｍで５分遠心する。再度上清を除去し、血小板をチューブあたり０．５ｍｌのＨｅｐｅｓ含有Ｔｙｒｏｄｅｓ緩衝液中に再懸濁する（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．３６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．１％デキストロース、５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２  １．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．３５）。血小板数は血液分析器(Coulter)を用いて測定し、Ｈｅｐｅｓ含有Ｔｙｒｏｄｅｓ緩衝液を用いておおよそ１００ｘ１０５血小板／ｍＬの濃度に調整する。
【０７７９】
それぞれの凝集実験について、５０μＬのＦｃ受容体アゴニスト、熱凝集ガンマグロブリン（“ＨＡＧＧ”、２００μｇ／ｍＬ）又はコラーゲン（２μｇ／ｍＬ）の混合物を５０μＬリン酸緩衝生理食塩液（“ＰＢＳ”：３．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）又はＢＲＩ化合物（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）と室温で６０分インキュベートする。次いで２つの細胞凝集計を用い、３７℃で以下のようにアッセイを行った：ガラスのキュベットをホルダーに置き、予め３７℃に加温し、４００μＬの血小板懸濁液を添加する。安定なベースラインに達した後、１００μＬのＨＡＧＧ：ＰＢＳ、ＨＡＧＧ：ＢＲＩ化合物又はコラーゲン：ＰＢＳ、コラーゲン：ＢＲＩ化合物を血小板懸濁液に添加する。引き続いて起こる血小板の凝集を１５分間又は凝集が完了するまでモニターする。凝集スロープの傾きを測定することにより凝集の割合を決定する。
【０７８０】
ＡＤＣＣ活性アッセイ
ＳＨＭで改変されたＦｃ受容体調節因子のＡＤＣＣ活性を評価するために、様々なエフェクター：標的比を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＤＣＣアッセイを行うことができる。そのようなアッセイに有用な「エフェクター細胞」としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えて、又はこれに加えてポリペプチド変異体のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば、ClynesらPNAS(USA)95:652-656(1998)により開示されたような動物モデル中で、で評価できる。
【０７８１】
例えばクロム５１で標識した標的細胞を調製するため、腫瘍細胞株を組織培養プレート中で増殖させ、滅菌した１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＰＢＳ中）を用いて回収する。すべてのアッセイにおいて３＋ＨＥＲ２を過剰発現するヒト乳癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ−３細胞を用いる。剥離した細胞を細胞培養培地で２回洗浄する。細胞（５ｘ１０６）を２００μＣｉのクロム５１(New England Nuclear/DuPont)で３７℃で１時間、時折混合しつつ標識する。標識した細胞を細胞培養培地で３回洗浄し、次いで再懸濁して１ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度にする。ＰＢＭＣアッセイ又はＮＫアッセイで、オプソニン化されていないか、又はアッセイ前にｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２野生型（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮTM）又はＳＨＭで改変されたＦｃＲ調節因子とインキュベートすることによりオプソニン化された細胞のいずれかを用いる。
【０７８２】
健康で正常なドナーから血液をヘパリン上に回収し、等体積のリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で希釈することにより末梢血単核球を調製する。次いで、製造元の使用説明書に従って血液をＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥ  ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ  ＭＥＤＩＵＭ（トレードマーク）(LSM:Organon Teknika)上に積層し、遠心する。単核球をＬＳＭと血漿の境界から回収し、ＰＢＳで３回洗浄する。エフェクター細胞を細胞培養培地中に懸濁し、最終濃度１ｘ１０７細胞／ｍＬにする。
【０７８３】
ＬＳＭを通して精製後、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を、ＮＫ細胞単離キット及び磁気カラム(Miltenyi Biotech)を用い、製造元の使用説明書に従ってネガティブ選択によりＰＢＭＣから単離する。単離したＮＫ細胞を回収し、洗浄して細胞培養培地に再懸濁し、２ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度にする。ＮＫ細胞であるかどうかはフローサイトメトリー解析で確認する。
【０７８４】
エフェクター細胞（ＰＢＭＣ又はＮＫのいずれか）をマイクロタイタープレートの列に沿って、細胞培養培地で２倍段階希釈（最終容積１００μＬ）していくことにより様々なエフェクター：標的比を調製する。エフェクター細胞の濃度範囲はＰＢＭＣについては１．０ｘ１０７／ｍＬ〜２．０ｘ１０４／ｍＬ、ＮＫについては２．０ｘ１０６／ｍＬ〜３．９ｘ１０３／ｍＬである。エフェクター細胞を滴定後、１００μＬのクロム５１で標識した１ｘ１０５細胞／ｍＬの（オプソニン化された、又はオプソニン化されていない）標的細胞をプレートの各ウェルに添加する。これで初期のエフェクター：標的比がＰＢＭＣについては１００：１、ＮＫについては２０：１となる。アッセイはすべてデュプリケートで行い、各プレートに自発的溶解（エフェクター細胞無し）及び全溶解（標的細胞に加えて１００μＬ）の１％ドデシル硫酸ナトリウム、１Ｎ水酸化ナトリウム）についてのコントロールを両方含める。プレートを３７℃で１８時間インキュベートし、その後細胞培養液上清をsupernatant collection system (Skatron Instrument,Inc.)を用いて回収し、Minaxi auto-gamma 5000 series gamma counter (Packard)で１分間計数する。次いで結果を式：％細胞毒性＝（試料ｃｐｍ−自発的溶解）／（全溶解−自発的溶解）ｘ１００を用いて％細胞毒性として表す。次いでデータの評価のため４変数曲線近似を用いる。
【０７８５】
Ｃ１ｑ結合
変異体のＣ１ｑへの結合能及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する能力を評価できる。Ｃ１ｑ結合を決定するために、Ｃ１ｑ結合のＥＬＩＳＡを行うことができる。簡単に言えば、アッセイプレートを４℃で一晩、コーティング緩衝液中、ＳＨＭで改変されたＦｃ受容体調節因子又はコントロールポリペプチドでコーティングする。次いでプレートを洗浄、ブロッキングする。洗浄後、一定分量のヒトＣ１ｑを各ウェルに添加し室温で２時間インキュベートする。更に洗浄後、１００μｌのペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗補体Ｃ１ｑ抗体を各ウェルに添加し室温で１時間インキュベートする。次いで洗浄緩衝液でプレートを洗浄し、ＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩(Sigma)）を含有する基質緩衝液１００μｌを各ウェルに添加する。黄呈色により観察される酸化反応を３０分間進行させ、１００μｌの４．５ＮＨ２ＳＯ４の添加により停止する。次いで、（４９２〜４０５）ｎｍでの吸光度を読み取る。
【０７８６】
結合及び生物学的活性
次いで、出発ポリペプチドと比較した、結合及び生物学的活性における任意の変化を評価するために、ＳＨＭで改変されたＦｃ受容体調節因子を１以上のアッセイに付すことができる。
【０７８７】
一例では、ＳＨＭで改変されたＦｃ受容体調節因子は未改変ポリペプチドと比較して原則的に受容体結合能を保持する、即ち結合能が約２０倍ほどは悪くない（例えば未改変ポリペプチドの結合能より約５ほどは悪くない）。ＳＨＭで改変されたＦｃ受容体調節因子の結合能は、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）等の技法を用いて測定する。
【０７８８】
受容体結合を測定するために、少なくとも目的の受容体の結合ドメインを含むポリペプチド（例、ＦｃＲのαサブユニットの細胞外ドメイン）をアッセイプレート等の固相にコーティングする。受容体の結合ドメイン単独か、又は受容体融合タンパク質を、標準的な方法を用いてプレート上にコーティングする。受容体融合タンパク質の例としては、（それぞれグルタチオン、キチン、及びニッケルをコーティングしたプレ−ト上にコ−ティングされる）受容体−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質、受容体−キチン結合ドメイン融合タンパク質、受容体−ヘキサＨｉｓタグ融合タンパク質が挙げられる。又は、アッセイプレート上に捕捉分子をコーティングし、融合タンパク質の非受容体部分を介して受容体融合タンパク質を結合するために用いる。例としては、受容体−ヘキサＨｉｓ尾部の融合を捕捉するために用いるアッセイプレート上にコーティングした抗ヘキサＨｉｓ  Ｆ（ａｂ’）２、又は受容体−ＧＳＴの融合を捕捉するために用いるアッセイプレート上にコーティングした抗ＧＳＴ抗体が挙げられる。他の実施形態においては、少なくとも受容体の結合ドメインを発現する細胞への結合を評価する。当該細胞は目的のＦｃＲを発現する、天然の造血細胞でもよく、又は試験する細胞の表面に結合ドメインが発現するようにＦｃＲ又はその結合ドメインをコードする核酸で形質転換されてもよい。
【０７８９】
本明細書中、上記に記載の免疫複合体を、受容体をコーティングしたプレートに添加し、ポリペプチドが受容体に結合するのに十分な時間インキュベートする。次いでプレートを洗浄して未結合の複合体を除去し、公知の方法に従い検体の結合を検出する。例えば、試薬（例、検体に特異的に結合し、任意で検出可能な標識をコンジュゲートした抗体又はその断片―検出可能な標識及びそれらをポリペプチドに結合する方法は、以下、「ポリペプチド変異体の非治療的使用」という題されるセクションに記載する）を用いて結合を検出する。
【０７９０】
低親和性受容体結合アッセイ
Ｈｉｓ６−グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付の融合タンパク質として発現する組み換えＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡαサブユニットへのＩｇＧＦｃ領域の結合を測定できる。ＦｃγＲＩに対するＩｇＧ１Ｆｃ領域の親和性はナノモルの範囲であるから、ＳＨＭで改変されたＩｇＧ１Ｆｃの結合は、ＩｇＧモノマーの滴定及び標準的なＥＬＩＳＡフォーマットでのポリクローナル抗ＩｇＧを用いて結合したＩｇＧを測定することにより測定できる。しかしながら、ＦｃγＲファミリーの他のメンバー、即ちＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡのＩｇＧに対する親和性はマイクロモルの範囲にあり、これら受容体へのＩｇＧ１モノマーの結合はＥＬＩＳＡフォーマットでは信頼性のある測定ができない。
【０７９１】
ＦｃγＲ結合ＥＬＩＳＡ
ＦｃγＲＩαサブユニット−ＧＳＴ融合物を、１００μｌの受容体−ＧＳＴ融合物をＰＢＳ中１μｇ／ｍｌで添加することによってＮｕｎｃ  Ｆ９６  ｍａｘｉｓｏｒｂ  ｐｌａｔｅｓ(cat no.439454)上にコーティングし、４℃で４８時間インキュベートする。アッセイ前にプレートを２５０μｌの洗浄緩衝液（０．５％ＴＷＥＥＮ  ２０含有ＰＢＳ  ｐＨ  ７．４）で３回洗浄し、２５０μｌのアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝食塩液、０．０５％ＴＷＥＥＮ  ２０、０．５％ＲＩＡグレード仔ウシアルブミン(Sigma A7888)、及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ７．４）でブロッキングする。１ｍｌのアッセイ緩衝液中、１０μｇ／ｍｌに希釈した試料をＦｃγＲＩαサブユニットでコーティングしたプレートに添加しオービタルシェイカー上、２５℃で１２０分インキュベートする。未結合の複合体を除去するためにプレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、１００μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ重鎖特異的抗体(Boehringer Mannheim 1814249)をアッセイ緩衝液中、１：１０，０００で添加することによりＩｇＧ結合を検出し、オービタルシェイカー上、２５℃で９０分インキュベートする。未結合のＨＲＰヤギ抗ヒトＩｇＧを除去するためにプレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、１００μｌの基質溶液（ＰＢＳ中、０．４ｍｇ／ｍｌ  ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩，Ｓｉｇｍａ  Ｐ６９１２，６ｍＭ  Ｈ２Ｏ２）を添加し２５℃で８分インキュベートすることにより結合した抗ＩｇＧを検出する。１００μｌ  ４．５Ｎ  ＮＨ２ＳＯ４を加えることにより酵素反応を停止し、発色生成物を９６ウェルプレートデンシトメーター(Molecular Devices)で４９０ｎｍで測定する。ＳＨＭで改変されたＦｃＲ調節因子の結合は親（即ち、野生型又は以前に改変された）分子のパーセントとして表す。
【０７９２】
ＦｃＲｎ結合ＥＬＩＳＡ
ＩｇＧ変異体のＦｃＲｎ結合活性測定のため、ＥＬＩＳＡプレートを５０ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中、２μｇ／ｍｌストレプトアビジン(Zymed,South San Francisco)で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳ−０．５％ＢＳＡ、ｐＨ７．２により室温で１時間ブロッキングする。プレートにＰＢＳ−０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．２中のビオチン化ＦｃＲｎ（Research Organics,Cleveland,Ohio由来のビオチン−Ｘ−ＮＨＳ用いて調製し、１−２μｇ／ｍｌで使用）を添加し、１時間インキュベートする。ＰＢＳ−０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０中、ＩｇＧ標準（１．６−１００ｎｇ／ｍｌ）又は変異体の２倍段階希釈列をプレートに添加し、２時間インキュベートする。上記のｐＨ６．０の緩衝液中の、ペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆ（ａｂ’）２(Jackson ImmunoResearch,West Grove,Pa.)、続いて基質としての３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン(Kirgaard&Perry Laboratories)を用いて結合したＩｇＧを検出する。工程の間にｐＨ７．２又は６．０のいずれかでＰＢＳ−０．０５％ポリソルベート２０でプレートを洗浄する。Vmax plate reader(Molecular Devices,Menlo Park,Calif.)で４５０ｎｍの吸光度を読み取る。滴定曲線を４変数非線形曲線近似プログラムを用いて適合させる(KaleidaGraph,Synergy software,Reading,Pa.)。標準滴定曲線の吸収の中央値に対応するＩｇＧ変異体の濃度を計算し、次いで標準滴定曲線の吸収の中央値に対応する標準の濃度で除す。
【０７９３】
実施例８
酵素経路の最適化のためのＡＩＤの使用
本明細書中に記載するＳＨＭシステムを用いて、代謝的変換の速度又は効率を増大させるため１種以上の酵素をコードするポリヌクレオチドを、体細胞超変異を介して同時に改変できる。目的の経路に関わる酵素としては、例えば、酵母の発酵、抗生物質及び漏出石油の浄化に関連するものが挙げられる(例えば、Ho,.N.W.Y.,Chen Z.and A.Brainard.1998.Appl.and Environ.Microbiol.64:1852-1859;及びSonderegger M.and U.Sauer.2003.Appl.And Environ.Microbiol.69:1990-1998を参照)。
【０７９４】
１つの側面において、植物ベースのセルロース系バイオマスをエタノールに変換するための、商業的に実現可能な酵母の発酵システムを開発するため、キシロースを基質として使用するよう遺伝子的に工夫されたSaccharomyces cerevisiaeを、体細胞超変異の段階的導入し、そしてそれに続いて、キシロースを増殖培地中に存在する唯一の炭素源として用いて嫌気的に生育する能力について選別することによりさらに改変できる。
【０７９５】
エタノールの利点の１つは、それがガソリンよりも生じる汚染が少ない非化石バイオ燃料であることである。別の利点はエタノールが、植物原料由来の、容易に入手できて再生可能なセルロース系バイオマスから製造できることである。セルロース系バイオマスは五炭糖（主にグルコース及びキシロース）で構成される。しかしながら、酵母のSaccharomyces種（現在グルコースからの工業的な大規模エタノール生産用に用いられている微生物）が現在のところ高収率且つ特定の率でキシロースからエタノール発酵できないことが、セルロース系バイオマスをエタノールに変換するための商業的過程の開発に対する主な障害となっている。
【０７９６】
キシロースとアラビノースの両方をエタノールに発酵させ得るSaccharomyces cerevisiae株を開発するために代謝工学に首尾よく用いられている。しかしながら、その組み換え体株や他の天然由来の酵母株はどれも、キシロース単独では嫌気的に生育することができない。
【０７９７】
キシロース単独で嫌気的に生育でき、キシロース及びアラビノースをエタノールに発酵させ得るSaccharomyces cerevisiae等の、キシロースを利用する嫌気性真核生物の組み換え体株を作り出すための、キシロース利用経路の１以上の遺伝子の体細胞超変異法が本明細書中で提供される。
【０７９８】
１つの側面において、キシロース単独で嫌気的に生育できる酵母株を開発するために、段階的な細胞超変異を使用できる。１つの非制限的な実施形態において、キシロースをキシロース(Xylulose)５−リン酸（Saccharomyces種が発酵できる基質）に変換するために逐次的に作用するPichia stipitis由来の３種の酵素を過剰発現するSaccharomyces cerevisiae株。結果生じるキシロースを利用する酵母株は、植物ベースのセルロース系バイオマスからの、エタノール発酵の有意な改良及び商業的に実現可能なエタノール生産の為の用途を有する。
【０７９９】
簡単に言えば、誘導型活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）のＳＨＭ耐性ポリヌクレオチド配列を、染色体への安定な挿入によって出発酵母株に導入し、次いでＡＩＤによる段階的な体細胞超変異を、工程間の培養増殖及びキシロースの利用をモニターしつつ誘導する。培養物の増殖率を、６００ナノメートルでの光学密度測定によってモニターする。キシロースの利用は、培養培地中のキシロースを測定するための市販の酵素キット(Medichem, Steinenbronn, Germany)を用いてモニターする。
【０８００】
培養物の増殖率及びキシロースの利用が、例えば約２倍に増大すると、次の工程が開始される。１リットル当たりキシロース５グラム及び１リットル当たりグルコース１グラムを含有する好気的ケモスタット培養物を調製する。ＡＩＤ発現を約１０世代、約１５世代、又は約２０世代の間（即ち、おおよそ６−１２日）誘導する。ＡＩＤ発現誘導についての世代数は復帰のデータ、ＤＴ４０のスクリーニングデータ(Cumbers et al.Nat.Biotechnol.2002 Nov;20(11):1129-1134))、及び１．７３世代／日という酵母の増殖率に基づいて決定できる。培養増殖率が増大し、且つキシロースが消費される時点で、一定分量の培養液が取り出され、１リットル当たり５グラムのキシロースを唯一の炭素源として含有する新たな好気的ケモスタット培養物が植え継がれる。この培養物において、ＡＩＤ発現を約１０世代、約１５世代、又は約２０世代の間誘導する。再び、増殖率及びキシロース濃度について当該培養物をモニターする。キシロースを消費する増殖集団が得られるとき、通気率を１分当たり１ミリリットル未満に下げ、ＡＩＤ発現を再び約１０世代、約１５世代、又は約２０世代の間誘導する。培養増殖率が安定すると、一定分量の培養液が取り出され、１リットル当たり５グラムのキシロースを唯一の炭素源として含有する新たな好気的ケモスタット培養物が植え継がれ、あらゆる通気が無い中で増殖させ、ＡＩＤ発現を約１０世代、約１５世代、又は約２０世代の間誘導する。培養増殖率及びキシロースの利用をモニターする。
【０８０１】
培養物の増殖率が増加し始め、キシロース濃度が減少すると、一定分量の培養液が取り出され、ブチルゴム隔膜及びプラスチックのスクリューキャップで封じた１７ミリリットルのＰｙｒｅｘガラスチューブ中での、キシロースを唯一の炭素源とした厳密な嫌気的バッチ培養物が植え継がれる。ＡＩＤ発現を約１０世代、約１５世代、又は約２０世代の間誘導し、増殖率及びキシロースの利用について当該培養物をモニターする。培養物の増殖率が増加し、キシロース濃度が減少すると、一定分量の集団を、唯一の炭素源として１リットル当たり２０グラムのキシロースを含有する嫌気的最少培地寒天プレート上に播種する。嫌気気体を提供するために、例えばＧａｓＰａｃｋ  Ｐｌｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ(Becton Dickinson)を用いて、密封した瓶中、３０℃（セルシウス）でプレートをインキュベートして嫌気性雰囲気を得る。嫌気性雰囲気は、インジケーターストリップ(Becton Dickinson)を用いてモニターする。
【０８０２】
進化した集団の他に親株の、そして、嫌気性キシロースプレートから単離した１５クローンの発酵成績を、１リットル当たり５０グラムのグルコース及び１リットル当たり５０グラムのキシロースを含む嫌気的バッチ培養において比較する。培養物の増殖率、キシロース及びグルコースの利用をモニターする。グルコースの利用は市販のキット(Beckman)を用いて測定する。
【０８０３】
ＳＨＭの最終工程は、増殖及びキシロースの利用の特徴が最も優良なクローンを採取し、ＡＩＤ発現を誘導し、約１５世代の間、複数の連続したバッチ培養で増殖させることである。次いで、この培養物から単離される２０個のクローンを、キシロースを唯一の炭素源として厳密な嫌気的培養条件で増殖させる。増殖率が最速のクローンの成績を、嫌気的なキシロースバッチ培養において更に評価する。
【０８０４】
実施例９
抗体の親和性成熟に対するＳＨＭの適用
以前に記載したとおり、抗体は増強された特性を伴う変異タンパク質を作り出すための、ＳＨＭが適用できる未改変の鋳型を提供する。そのような改良された抗体は、親和性選択に基づき、例えばＦＡＣＳを介して、又は磁気ビーズへの結合を介して選択し得る。
【０８０５】
ニワトリ卵リゾチーム（ＨｙＨｅｌ）に対する抗体は極めてよく特性解析された、本発明の変異及び選択システムの試験及び最適化を可能にするシステムである。具体的にはＨｙＨｅｌ抗体は、親和性の範囲が十分に定義づけられており、且つ配列及び結合特性が解析された、多くの高度に関連付けられた抗体の試験を可能にする。例えば以下の抗体及びその配列変異体（ムテイン）は、生殖細胞系列の配列から始まって完全に親和性成熟した抗体まで、完全に定義付けられた配列を有する（例、Pons et al.,(1999)Protein Science 8:958-68;及びSmith-Gill et al.,(1984)J.Immunology 132:963を参照）。
【０８０６】
【表１６】
2010520748.tif 000064
【０８０７】
本発明のシステムを更に最適化するために、ある範囲の高親和性及び低親和性ＨｙＨｅｌコンストラクトを作製し、本発明の発現ベクターにクローニングする。次いでこれらベクターを、ＡＩＤを発現する変異誘発細胞にトランスフェクトし、磁気ビーズを用いて選別する。結合条件を最適化し、且つアッセイの方法論の正当性を確認するために、野生型ＨｙＨｅｌコンストラクトをポジティブコントロールとして用いる。
【０８０８】
Ａ．（「野生型」）ＨｙＨｅｌ１０重鎖及び軽鎖コンストラクトの合成及びクローニング
ＨｙＨｅｌ１０重鎖及び軽鎖発現ベクターのプロトタイプを、以下の標準的な分子遺伝学的操作を用い、発現ベクターＡＢ１０２から出発して（前に記載の通り）作り出す：
【０８０９】
ＡＢ１０２中のピューロマイシン耐性マーカーを、ＮｇｏＭＩＶ及びＸｂａＩ制限部位を用いてコールドのｂｓｄ又はコールドのｈｙｇで置換し、ベクターＡＢ１８７及びＡＢ１８５をそれぞれ生成する。
【０８１０】
ＮｈｅＩ（最もＣＭＶプロモーターに近いｍｃｓ２の制限部位）及びＳｂｆＩ（最もＣＭＶに近いｍｃｓ１部位）を用い、わずかに長く、転写がよりロバストな型のＣＭＶプロモーターと、ＡＢ１０２中に見られる元の配列を交換する。元のＡＢ１０２ＣＭＶプロモーターは、ＴＡＴＡボックスの最初のＴから上流の５５３ｂｐの未改変ＣＭＶ配列を含んでいるが、ＡＢ１８７型はＴＡＴＡボックスの最初のＴから上流の６４５ｂｐを含む。
【０８１１】
「野生型」ＨｙＨＥＬ重鎖及び軽鎖（上記の通り）のヌクレオチド配列を、ＤＮＡ２．０，(Menlo Park,CA)で合成する。クローニングの目的で、ＢｇｌＩＩ及びＡｓｃＩを重鎖の境界にし、制限部位ＳａｃＩ及びＡｓｃＩを軽鎖の境界にする。
【０８１２】
細胞表面上にＨｙＨｅｌ１０  ＩｇＧ及びそのムテインを発現させるため、重鎖を以下の特徴を有するキメラ分子として作り出す：
【０８１３】
Ｋｏｚａｋコンセンサス配列；ＨｙＨＥＬ１０重鎖可変領域；マウスＩｇＧ定常領域全長；ＸｈｏＩサイト；マウスＨ２ｋｋ（ＭＨＣＩ型）膜表在性−貫通ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン。Ｈ２ｋｋ配列は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のヌクレオチドデータベースのアクセッション番号ＡＫ１５３４１９から決定する。
【０８１４】
細胞表面結合したキメラＨｙＨＥＬ１０重鎖全長のヌクレオチド配列は以下に列挙する通りである：
【０８１５】
この配列において、ＢｇｌＩＩサイトを下線で示し；Ｋｏｚａｋ配列を下線と斜体で示し、終止コドンを下線と太字で示し；ＸｈｏＩサイトを囲んだヌクレオチドで示し；二重下線で示す配列はＨ２ｋｋ由来である。ＴＧＡ終止コドンの３’側のＡｓｃＩクローニングサイトは斜体のヌクレオチドで示す。
【０８１６】
【化４】
2010520748.tif 000065
【０８１７】
細胞表面結合性キメラＨｙＨＥＬ１０重鎖のアミノ酸配列は以下に列挙する通りである。合成ＸｈｏＩサイトによりコードされる２アミノ酸（ｌｅｕ−ｇｌｕ）を太字及び下線でマークし；太字下線のＧｌｕはまた、Ｈ２ｋｋドメインの最もアミノ側のアミノ酸を表し；二重下線は推定上の膜貫通ドメインを示し；アスタリスクは終止コドンを示す。
【０８１８】
【化５】
2010520748.tif 000066
【０８１９】
（「野生型」）ＨｙＨＥＬカッパ軽鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列。
【０８２０】
ＨｙＨＥＬカッパ軽鎖のアミノ酸配列。アスタリスクは終止コドンを示す。
【０８２１】
MNKLLCCALVFLDISIKWTTQDIVLTQSPATLSVTPGNSVSLSCRASQSIGNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC* (配列番号338)。
【０８２２】
ＨｙＨＥＬカッパ軽鎖のヌクレオチド配列。開始及び終止コドンを下線で示す。ＳａｃＩ及びＡｓｃＩクローニングサイトを太字で示す。
【０８２３】
【化６】
2010520748.tif 000067
【０８２４】
以下表１７に記載される「野生型」重鎖及び軽鎖のムテイン並びに生殖細胞系列配列を、部位特異的変異誘発法及び配列決定によりそれらの配列を確認することによって作り出す。
【０８２５】
【表１７】
2010520748.tif 000068
【０８２６】
太字のヌクレオチドは、以下に記載の通り、「野生型」（ＨｙＨＥＬ１０）配列（「ｗｔ」）に比して体細胞超変異を増大させるために、示された変異がＳＨＭ最適化コドンに導入されるようになされているコドンを表す。ＬＣ＝軽鎖；ＨＣ＝重鎖。ＢＩＡＣＯＲＥ解析を介して得られる各変異体の親和性測定値も示す。
【０８２７】
これらの位置は結合に重要であり、体細胞超変異の間に、対応する生殖細胞系列配列から自然に変異してきたことが以前に示されている。具体的には、ＨｙＨＥＬ１０の軽鎖配列は、ＣＤＲ１内に位置する残基、Ａｓｎ３１を含有し、これはＨＥＬ抗原の残基Ｌｙｓ９６に熱力学上重要な接触をなす。ＨｙＨＥＬ１０のＧｌｙ３１変異体（コドンＧＧＴ）は２．５ｎＭ前後の解離定数測定値を有するが、ＨｙＨＥＬ１０のＡｓｐ３１変異体（コドンＧＡＴ）は１１０ｐＭ前後の解離定数測定値を有し、ＨｙＨＥＬ１０の野生型Ａｓｎ３１（コドンＧＡＴ）は３０ｐＭ前後の解離定数測定値を有する。
【０８２８】
Ｂ．細胞のトランスフェクション
Ｈｅｋ  ２９３細胞を６ウェルマイクロタイターディッシュ中、４ｘ１０５／ｗｅｌｌで播種する。２４時間後、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ(Indianapolis,IN)のＦｕｇｅｎｅ６試薬を用い、ウェルあたり３μＬ：１μｇの試薬：ＤＮＡ比で、それぞれＨｙＨＥＬ重鎖又は軽鎖を含んで、ブラストサイジン又はハイグロマイシン耐性を付与した発現ベクター、ＡＢ１８７又はＡＢ１８５を用いてトランスフェクションを行う。トランスフェクションは製造元の使用説明書に従って行う。
【０８２９】
Ｃ．ペプチドの選別
大多数のニワトリ卵リゾチーム（ＨＥＬ）結合表面を含む、未標識且つビオチン化したモノマーペプチド配列を合成する。当該ペプチドをダイマーとして提示することが、抗体−ペプチド相互作用の親和性を増大させることにより抗体の結合を増強させるかどうかを比較するために、２つのダイマーペプチド配列もまた合成する。タンデムなダイマー及び分枝多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）ダイマーも試験する。ペプチド及びビオチン化又は未標識ＨＥＬタンパク質を、官能基で修飾されているか、又はストレプトアビジンでコーティングされている常磁性ポリスチレンミクロ粒子表面(Invitrogen,1600 Faraday Ave.PO Box 6482,Carlsbad,CA 92008)にカップリングする。
【０８３０】
Ｄ．ＨＥＬタンパク質及びペプチドのトシル基活性化ミクロ粒子へのカップリング
ＨＥＬタンパク質及びペプチドは、１．５ｍｌの微小遠心チューブ内で２．８ミクロンのトシル基活性化常磁性ポリスチレンミクロ粒子にカップリングする(Nilsson K and Mosbach K.“p-Toluenesulfonyl chloride as an activating agent of agarose for the preparation of immobilized affinity ligands and proteins.”Eur. J.Biochem.1980:112:397-402)。ミクロ粒子（２ｅ０９ミクロ粒子／ミリリットル）を洗浄し、１ｅ０９ミクロ粒子／ｍｌの濃度で１００ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ９．５中に再懸濁する。１１ナノモルのペプチド又は６ｕｇ／ｍｌのＨＥＬをミクロ粒子に添加し、ミクロ粒子／ペプチド混合物を室温で少なくとも４８時間、低速で傾斜回転させつつインキュベートする。インキュベートの後、上清を除去し、ミクロ粒子を１％（重量／体積）ＢＳＡを含有する１ｍｌリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２で洗浄する。最後に、ミクロ粒子を１％（重量／体積）ＢＳＡを含有する１ｍｌ  ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中に再懸濁する。
【０８３１】
Ｅ．ビオチン化ＨＥＬタンパク質及びペプチドのストレプトアビジン結合ミクロ粒子へのカップリング
別の選択肢では、その表面が単層のストレプトアビジンに共有結合で連結している常磁性ポリスチレンミクロ粒子にビオチン化ペプチドをカップリングする。簡単に言えば、ストレプトアビジンミクロ粒子を洗浄し、１％（重量／体積）ＢＳＡを含有する１ｍｌ  ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中に再懸濁し、次いで３３ピコモルのビオチン化ペプチド又はおおよそ１０μｇ／ｍｌのビオチン化ＨＥＬをミクロ粒子溶液に添加する。ミクロ粒子／ペプチド溶液を室温で３０分間、低速で傾斜回転させつつインキュベートする。カップリング後、ミクロ粒子洗浄し、再懸濁してミクロ粒子の最終濃度を１ｅ０９ミクロ粒子／ｍｌにする(Argarana CE,Kuntz ID,Birken S,Axel R,Cantor CR.Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene.Nucleic Acids Res.1986;14(4):1871-82;Pahler A,Hendrickson WA,Gawinowicz Kolks MA,Aragana CE,Cantor CR.Characterization and crystallization of core streptavidin.J Biol Chem 1987:262(29):13933-7)。
【０８３２】
Ｆ．細胞の選別
ペプチド結合常磁性ミクロ粒子に結合する細胞を単離するために、ＨｙＨＥＬ親和性抗体の重鎖及び軽鎖を３０ｐＭ及び８００ｎＭで発現する、トランスフェクトされたＨＥＫ  ２９３細胞をスクリーニングする。選別用に、抗体を発現しない類似の対照細胞株をネガティブコントロールとして用いる。
【０８３３】
細胞を等体積のＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２で洗浄し、１％（重量／体積）ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中に再懸濁して最終濃度を１ｅ０７細胞／ｍｌにする。１ｅ０６個のネイキッドなミクロ粒子を細胞に添加し、ローテーター上、４℃で３０分インキュベートすることにより細胞をプレクリアする。未結合の細胞を静かに新たなチューブへ移す。ペプチド結合又はネイキッドなミクロ粒子（１ｅ０７）を当該細胞入りのチューブへと移し、細胞：ミクロ粒子混合物をローテーター上、４℃で３０分インキュベートする。次いで未結合の細胞を除去し、ミクロ粒子：細胞混合物を冷ＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄する。ミクロ粒子及び付着細胞を１００μｌ細胞培養培地中に再懸濁し、当初は９６ウェルプレートの１ウェルで増殖させる。ミクロ粒子に結合した細胞数を測定し、細胞を次回の選別まで増殖させる。ペプチド結合ミクロ粒子上で選別したミクロ粒子に結合した細胞の数を、ネイキッドなミクロ粒子に結合した細胞及び抗体を発現しない細胞に結合した細胞と比較する。
【０８３４】
図４８Ａでは成熟型ＨＥＬタンパク質（タンパク質）、ＨＥＬペプチドモノマー（モノマー）、タンデムなＨＥＬダイマー（タンデム）、ＨＥＬ  ＭＡＰＳダイマー（ＭＡＰＳ）に結合したストレプトアビジンミクロ粒子又は未結合のネイキッドなストレプトアビジンミクロ粒子（ネイキッド）とインキュベートすることにより選別した後の、３０ｐＭ  ＨｙＨＥＬ抗体発現細胞（暗灰色）又は抗体なしの細胞（明灰色）を示す。ＨＥＬタンパク質及びＨＥＬペプチドモノマーが結合したミクロ粒子全体が、本実施例において３０ｐＭ  ＨｙＨＥＬ抗体発現細胞の単離に有効である。
【０８３５】
図４８Ｂにおいて、成熟型ＨＥＬタンパク質（タンパク質）と結合したトシル基活性化ミクロ粒子又は未結合のネイキッドなトシル基活性化ミクロ粒子（ネイキッド）のいずれかとインキュベートすることにより、８００ｐＭ  ＨｙＨＥＬ抗体発現細胞（暗灰色）又は抗体なしの細胞（明灰色）を選別する。ＨＥＬタンパク質が結合したミクロ粒子全体が、本実施例において８００ｐＭ  ＨｙＨＥＬ抗体発現細胞の単離に有効である。
【０８３６】
図４９Ａにおいて、成熟型ＨＥＬタンパク質（タンパク質）、ＨＥＬペプチドモノマー（モノマー）、タンデムなＨＥＬダイマー（タンデム）、ＨＥＬ  ＭＡＰＳダイマー（ＭＡＰＳ）に結合したストレプトアビジンミクロ粒子、又は未結合のネイキッドなストレプトアビジンミクロ粒子（ネイキッド）とインキュベートすることにより、３０ｐＭ  ＨｙＨＥＬ抗体発現細胞を選別する。ＨＥＬタンパク質及びＨＥＬペプチドモノマーが結合したミクロ粒子全体が、本実施例において３０ｐＭ  ＨｙＨＥＬ抗体発現細胞の単離に有効である。
【０８３７】
図４９Ｂにおいて、成熟型ＨＥＬタンパク質（タンパク質）に結合したトシル基活性化ミクロ粒子又は未結合のネイキッドなトシル基活性化ミクロ粒子（ネイキッド）のいずれかとインキュベートすることにより８００ｐＭ  ＨｙＨＥＬ抗体発現細胞を選別する。ＨＥＬタンパク質が結合したミクロ粒子全体が、本実施例において８００ｐＭ  ＨｙＨＥＬ抗体発現細胞の単離に有効である。
Ｇ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの親和性成熟
【０８３８】
体細胞超変異が、比較的結合が弱い変異体の親和性をどの程度効率的に回復できるか測定するために、以下に記載の通りＨｙＨＥＬ１０  Ｇｌｙ３１（ＧＧＴ）変異体（ＨＥＫ２９３細胞の表面上に提示）のクローン集団で、ＳＨＭ存在下５０ｐＭＦＩＴＣ−ＨＥＬに対してＦＡＣＳに基づく選別を何回も繰り返して行った。
・  細胞のトランスフェクション
【０８３９】
Ｔ７５培養フラスコで、１０％ＦＢＳを含有する１０ｍＬＤＭＥＭ培地(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)中に３ｘ１０６ＨＥＫ−２９３細胞を播種することにより、［Ｎ３１Ｇ  ＬＣ／ｗｔ  ＨＣ］抗ＨＥＬイムノグロブリン及びＡＩＤ活性を発現する安定なＨＥＫ−２９３細胞株を生み出した。翌日、５００μＬＯｐｔｉＭＥＭ(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)、２０μＬ  ＨＤ−Ｆｕｇｅｎｅ(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis、IN)、１μｇの最適化されたＡＩＤ発現ベクター（実施例５）、及び各１．５μｇの重鎖及び軽鎖発現ベクターを混合し室温でおおよそ２５〜３０分インキュベートした。インキュベート後、混合物を細胞培養培地に滴下して添加した。
【０８４０】
トランスフェクションからおおよそ３日後、細胞増殖培地を１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬゲネチシン、１０μｇ／ｍＬ抗真菌性抗生物質溶液、１．５μｇ／ｍＬピューロマイシン、１５μｇ／ｍＬブラストサイジン、及び３５０μｇ／ｍＬハイグロマイシンを含有する１０ｍＬＤＭＥＭ培地(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)と交換し、細胞をおおよそ４週間、周期的に再播種及び細胞培養培地交換しつつインキュベートした。選別期間の最後に、細胞培養を拡大し、保管し、Ｔ７５細胞培養フラスコで１０％ＦＢＳを含有する１０ｍＬＤＭＥＭ培地(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)中に［Ｎ３１Ｇ  ＬＣ／ｗｔ  ＨＣ］抗ＨＥＬイムノグロブリン及びＡＩＤ活性を発現する３ｘ１０６ＨＥＫ−２９３細胞を播種した。翌日、５００μＬＯｐｔｉＭＥＭ(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)、２０μＬ  ＨＤ−Ｆｕｇｅｎｅ(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis、IN)、及び３μｇの上記ＡＩＤ発現ベクターＤＮＡ、を混合し室温でおおよそ２５〜３０分インキュベートした。インキュベート後、混合物を細胞培養培地に滴下して添加した。おおよそ１週間インキュベートした後、細胞ソーティング用に［Ｎ３１Ｇ  ＬＣ／ｗｔ  ＨＣ］抗ＨＥＬイムノグロブリン及びＡＩＤを発現する安定な元のＨＥＫ−２９３細胞及び追加のＡＩＤ発現ベクターで一過的にトランスフェクトされた培養物を調製した。
【０８４１】
２．より高親和性の変異体の選別
［Ｎ３１Ｇ  ＬＣ／ｗｔ  ＨＣ］抗ＨＥＬイムノグロブリン及びＡＩＤ活性を発現するＨＥＫ−２９３細胞系及び追加のＡＩＤ発現ベクターで一過的にトランスフェクトされた培養物を、細胞を回収し、等体積のＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２で洗浄、各培養液より１ｅ０７細胞を１％（重量／体積）ＢＳＡ及び５０ｐＭ又は５００ｐＭ  ＦＩＴＣ−ＨＥＬのいずれかを含有する氷冷ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中に最終濃度２ｅ０５細胞／ｍｌで再懸濁することにより、細胞ソーティング用に調製した。
ラウンド１
【０８４２】
ＥＺ−Ｌａｂｅｌ（登録商標）ＦＩＴＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ(Pierce、Rockford、IL)を用い、製造元の指示に従ってニワトリ卵リゾチーム(Sigma Aldrich、MO)をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した。
【０８４３】
４℃で３０分インキュベートした後、細胞を遠心してペレットとし、体積を２００μＬに減らした。３ｍＬ滅菌チューブに移した後、１：５００希釈のＰＥ結合ヤギ抗マウスイムノグロブリンを細胞に添加し、細胞を４℃で３０分インキュベートした。次いで、細胞を遠心によりペレットとし、１％（重量／体積）ＢＳＡと２ナノグラム／ミリリットルＤＡＰＩを含有する氷冷滅菌ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中に再懸濁した。ＦＩＴＣについて陽性（１５０ｍＷ  ４８８ｎｍレーザーで励起、５２８／３８フィルターにより回収）のＩｇＧ陽性の生細胞を、Ｃｙｔｏｐｉｅａ  Ｉｎｆｌｕｘ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒを用いて流速おおよそ１０，０００事象／秒で蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により単離した（図５１）。ＨｙＨＥＬ発現細胞を用いたこのアプローチを用いてより高親和性のクローンを確実に識別でき得るようＦＡＣＳウィンドーを較正した。
【０８４４】
結果ではすべての場合において、細胞の小集団が主なバルクの無変異細胞から明瞭に分離されることを示している。ＡＩＤ発現で新たにトランスフェクトした細胞（図５１のパネルＢ及びＤ）中では、この細胞集団は一貫して、追加のＡＩＤ発現ベクターを受容しなかった細胞集団（図５１のパネルＡ及びＣ）よりも大きなものであった。これらの細胞は下記の通り培養した。
【０８４５】
選別した細胞を６ウェルプレートのウェル１つの中で、１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬゲネチシン、１０μｇ／ｍＬ抗真菌性抗生物質溶液、１．５μｇ／ｍＬピューロマイシン、１５μｇ／ｍＬブラストサイジン、及び３５０μｇ／ｍＬハイグロマイシンを含有する３ｍＬＤＭＥＭ培地(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)中に入れた。細胞をコンフルエントになるまで培養し、次いで保管し、細胞密度４ｘ１０５細胞／ｍＬで６ウェルプレートのウェル１つの中に再播種した。次の日、１００μＬＯｐｔｉＭＥＭ(Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)、４μＬ  Ｆｕｇｅｎｅ６(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis、IN)、及び１μｇのＡＩＤ発現ベクタープラスミドＤＮＡを混合し室温でおおよそ２５〜３０分インキュベートした。インキュベート後、混合物を細胞培養培地に滴下して添加し、細胞をおおよそ７日間培養し増殖させた。配列解析のために細胞の試料も分取した。
ラウンド２
【０８４６】
次いで、第１ラウンドで上記の通りＦＩＴＣ−ＨＥＬを用いて選別した細胞を同一の選択条件（即ち、５０又は５００ｐＭ  ＦＩＴＣ標識ＨＥＬのいずれかとのインキュベーション）で、第２ラウンドのＦＡＣＳ選別に付した。第１ラウンドで選別した細胞５０ミリリットル（１ｅ０７細胞）を１％（重量／体積）ＢＳＡ及びおおよそ５０ｐＭ又は５００ｐＭいずれかのＨＥＬ−ＦＩＴＣを含有する氷冷ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．２中、４℃で３０分インキュベートした。細胞混合物をペレットにし、体積を２００μＬに減らし、当該細胞を３ｍｌ滅菌チューブに移した。１：５００希釈のＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇを細胞に添加し、細胞を４℃で３０分インキュベートした。次いで、細胞をペレットとし、１％（重量／体積）ＢＳＡと２ナノグラム／ミリリットルＤＡＰＩを含有する氷冷ＰＢＳ溶液１ｍＬ、ｐＨ７．２中に再懸濁した。ＦＩＴＣについて陽性（１５０ｍＷ  ４８８ｎｍレーザーで励起、５２８／３８フィルターにより回収）のＩｇＧ陽性の生細胞を、Ｃｙｔｏｐｉｅａ  Ｉｎｆｌｕｘ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒを用いて流速おおよそ１０，０００事象／秒で蛍光活性化細胞選別により単離した（図５２）。
【０８４７】
２回目の選別の結果では、高親和性のＨＥＬ結合を示す細胞集団が有為に大きくなったことが示されたが、このことは増殖及び培養の間にＳＨＭにより高親和性の変異体が形成されたことと整合する。新たにＡＩＤ発現ベクターでトランスフェクトされ、次いで５００ｐＭ  ＨＥＬとインキュベートした細胞（図５２のパネルＤ）においては、これは明らかに、蛍光が強い細胞の相当大きな集団である（追加のＡＩＤ発現ベクターを受容しなかった細胞６．８８％に比べ、２５．９％の集団；図５２のパネルＣ）。これらの結果より、ＡＩＤ発現ベクターによる再形質転換が変異誘発率の有為な改善の促進に有効なことが示される。
【０８４８】
選別した細胞において、ゲートを厳密にして、この工程をさらに２ラウンドの変異誘発の間継続すると（図５３、パネルＡ）、選別した細胞の結合特性に、重大で且つ有意な変化が生じた（図５３、パネルＢ）。
【０８４９】
３．機能解析用の分泌イムノグロブリン産生
目的の重鎖及び軽鎖は、更なる機能解析のため、下記の通り分泌型で産生されてもよい。表面ディスプレイライブラリーから得られる重鎖の場合は、膜貫通ドメインを除去して抗体を培地中に直接分泌できるようにするために、これらを優先権の基礎となる米国特許出願番号６０／９０４，６２２及び６１／０２０，１２４の実施例５に記載の通り（即ち、ＸｈｏＩによる消化、続いて再ライゲーション）に処理する。
【０８５０】
トランスフェクションのおおよそ１日前に、３ｘ１０６  ＨＥＫ−２９３細胞をＴ７５培養フラスコ中で１０ｍＬ  ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地中に播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。トランスフェクション当日、５００μＬ  ＯｐｔｉＭＥＭ(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)、２０μＬ  ＨＤ−Ｆｕｇｅｎｅ(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)及び１．５μｇの各重鎖及び軽鎖の発現ベクターを混合し室温でおおよそ２５〜３０分インキュベートした。インキュベーションの後、この混合物を細胞培養培地へ滴下して添加した。
【０８５１】
トランスフェクションからおおよそ３日後、細胞増殖培地を１０ｍＬ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)と交換し、更に７日間細胞をインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、細胞培養液上清を回収し、０．２μｍ滅菌フィルターを通して濾過した。分泌されたイムノグロブリンは、下記の通りＢＩＡＣＯＲＥ解析前に標準的なプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを介して単離した。
【０８５２】
標準的なアミンカップリングを用い、ＨＥＬを研究グレードのＣＭ５センサーチップ上に固定した。３つの表面各々をまず０．１ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）及び０．４ｍＭ  １−エチル３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）の１：１混合物を用いて７分間活性化する。次いでＨＥＬ密度が異なる３種類の表面を作り出すため、ＨＥＬ試料を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中で１倍から５０倍に希釈し、活性化チップ表面に時間の長さを変えて（１０秒〜２分）曝す。次いで、各表面を１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．２を７分注入してブロッキングする。又は、ビオチン化ＨＥＬを１００倍に希釈し、異なる３種の細胞密度（６０ＲＵ、４５ＲＵ、１２ＲＵ；レスポンスユニット（ＲＵ）はＢｉａｃｏｒｅにより称され、表面積当たりの標的分子に関する）で捕捉される時間を変えてストレプトアビジンを含有するセンサーチップ上へ注入する。実験はすべてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００又はＴ１００光バイオセンサー上で行う。抗ＨＥＬ抗体は１００μｇ／ｍＬで提供され、ＨＥＬ結合表面上で試料泳動緩衝液における３倍希釈系列で試験する。結合した抗ＨＥＬ抗体はセンサー再生溶液で５秒パルスして除去する。データは全て温度を２０℃に制御して収集する。抗体注入に対する動的応答を、非線形最小二乗解析プログラムＣＬＡＭＰ(Myszka,D.G.and Morton,T.A.(1998)Trends Biochem.Sci.,23:149-150)を用いて解析する。
【０８５３】
４．配列解析
最初の選別において単離された重鎖及び軽鎖の配列は、下記の通り重鎖及び軽鎖のＰＣＲ増幅により決定した。
【０８５４】
目的の集団から分取した少なくとも５０，０００個の細胞を４℃、１１００ｘｇ、５分でペレットにした。ペレットにした細胞を１５μＬ蒸留Ｈ２Ｏ中に再懸濁し、すぐにＰＣＲ反応において使用するか、後の工程用に凍結するかいずれかにした。
【０８５５】
全体５０μＬについて２７．６μＬ  Ｈ２Ｏ、５μＬ  １０ｘＰｆｘ緩衝液、１μＬ上記細胞、８μＬの２．５μＭ各プライマー（以下に列記）及び０．４μＬ  Ｐｆｘポリメラーゼ(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)から成るＰＣＲ反応は以下のフォーマットを用いて行った：９５℃ｘ２分を１サイクル、続いて９５℃ｘ３０秒、５５℃３０秒間、６８℃４５秒間を３５サイクル、続いて６８℃１分間を１サイクル。オープンリーディングフレーム増幅に用いるＰＣＲプライマーは：
【０８５６】
オリゴ５４０：ＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣ（配列番号３６２）、これは重鎖及び軽鎖オープンリーディングフレームの両方についてのＡＴＧ開始コドンよりおおよそ１４０ヌクレオチド５’側の、ＣＭＶプロモーター領域の３’端にマップされるフォワードプライマーである。
【０８５７】
オリゴ５５４：ＣＡＧＡＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴ（配列番号３６３）、これはＩｇＧガンマ鎖定常領域中にマップされる重鎖特異的リバースプライマーである。
【０８５８】
オリゴ５５２：ＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴ（配列番号３６４）、これはカッパ定常領域のアミノ末端近くにマップされるカッパ軽鎖特異的リバースプライマーである。
【０８５９】
オリゴ５７７：ＡＧＴＧＴＧＧＣＣＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＧＡＡ（配列番号３６５）、これは５つの機能性ヒトラムダ遺伝子（ＩｇＬ１、２、３、６及び７）全てにより共有されるＮ付近側の定常領域配列へマップされるラムダ軽鎖特異的リバースプライマーである。
【０８６０】
重鎖を増幅するために、オリゴ５４０と５５４を用いた。
【０８６１】
（カッパ及びラムダ両方の軽鎖の混合物が存在するらしい）細胞集団から軽鎖を増幅するために、オリゴ５４０、５５２及び５７７を同時に用いた。この場合、ＰＣＲ反応混合物中の水体積を１９．６μＬに調節した。
【０８６２】
ＰＣＲ後、アガロースゲルでの解析のため試料を５μＬ除去した。次いで、ゲルで可視化したバンドについての反応物を、以下の条件でＴａｑポリメラーゼ(Invitrogen)存在下、更にＰＣＲにかけた：全体５０μＬについて、２μＬ  Ｈ２Ｏ、０．５μＬ  Ｔａｑ、各２．５ｍＭの０．２μＬ  ｄＮＴＰｓ、及び１．５μＬｘ５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（又はＭｇＣｌ２の代わりに１μＬの１０ｘＴａｑ緩衝液を用い、一方Ｈ２Ｏを最終体積５０μＬを維持するため調節する）を４５μＬの残存ＰＣＲ反応物に直接添加した。ＰＣＲサイクルは以下のように行った：９５℃ｘ２分を１サイクル、続いて９５℃ｘ３０秒、５５℃  ３０秒間、７２℃  ４５秒間を２サイクル、続いて７２℃  １分間を１サイクル。
【０８６３】
ゲルで可視化されなかったか、そうでなければ薄すぎて継続できないと判定されたかのいずれかのバンドについての反応物には、１μＬ  Ｐｆｘ緩衝液、３．７μＬ  Ｈ２Ｏ、及び０．３μＬ  Ｐｆｘポリメラーゼが補填され、そして９５℃ｘ２分を１サイクル、続いて９５℃ｘ３０秒、５５℃  ３０秒間、６８℃  ４５秒間を１０サイクル、続いて６８℃  １分間を１サイクル行った。
【０８６４】
アガロースゲルでの解析後可視化されたバンドについてのＰＣＲ反応物を、製造元提示のプロトコールに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキットを用いてクローニングした。簡単に言えば、４μＬのＰＣＲ反応物を１μＬの（ＴＯＰＯ（登録商標）キット中で提供される）塩溶液と１μＬのＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクターに添加した。室温で２０分インキュベート後、１又は２μＬを、製造元提示のプロトコールにより１００μＬ  ＸＬ１ｂｌｕｅを形質転換するために用いた。
【０８６５】
更に目的の配列の鋳型由来のリーディングフレームは、以下のようにして回収した：重鎖の鋳型はＴＯＰＯ（登録商標）クローンを、ＳｇｒＡＩ及びＮｈｅＩ（両方共元の重鎖配列全てに存在する）で消化することにより回収した。結果生じるおおよそ５００ｂｐの断片（ＣＤＲ３を全て含む可変領域全体を含有する）を、インタクトな連続する重鎖オープンリーディングフレームを生成するため、既に重鎖定常領域を含んでいる発現ベクターのコグネイト部位に、クローニングした。最終的なＩｇＧ分子の細胞表面上における保持を可能にするため、このベクターのある型では実施例９に記載される通り、ＩｇＧ１定常領域とインフレームで融合する、マウスＨ２ｋｋ遺伝子由来の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインも含まれる。発現ベクターの代替型では、目的の抗体の直接分泌を可能にするため膜貫通領域を欠失させる。
【０８６６】
同様に、目的の軽鎖の鋳型をＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクターから、カッパについてはＳｂｆＩ及びＭｕｎＩで、又はラムダについてはＳｂｆＩ及びＡｃｌＩを用いて（これらは全て元の配列に存在する）除去した。結果生じる３５０〜４００ｂｐの断片（ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域全体を含有する）を、インタクトな連続する軽鎖オープンリーディングフレームを生成するため、発現ベクターのコグネイト部位に、クローニングした。
【０８６７】
当該結果により、配列決定したクローンのおおよそ２３％に、グリシン３１からアスパラギン酸（Aspartate）（Ｇ３１Ｄ）への変異をもたらす、軽鎖ＣＤＲ内の少なくとも１つの変異があることが示された。ＨＥＬに結合したＨｙＨＥＬ  １０の結晶構造(Pons et al.,(1999)Protein Science 8:958-68)に基づくと、この変異は抗原結合の間に更なる水素結合相互作用の形成をもたらすと予想され、それが５００ｐＭ  ＨＥＬ存在下及びＢｉａｃｏｒｅ測定で観察される結合の増大（図５２中）の原因となる。（図５４Ａ及びＢで）観察される変異の型は（図５０で示されるように）ＳＨＭ介在型の変異についての予想される変異パターンに従い、重鎖及び軽鎖のコーディング領域全体に大きく広がる非特異的変異をもたらさなかった。従って、これらの結果により、良好な親和性の区別、抗体及び結合タンパク質の改良変異体の選別を提供する本発明のシステムの能力、及び１種以上の標的タンパク質内で目的の特定領域に向けられた持続的及び単発的な超変異の両方を提供する能力が示される。更に、単一抗体のコンストラクトに組み換えられたとき、野生型タンパク質の親和性を３０ｐＭから４ｐＭを超えるまでに改良された少数の更なる変異が同定された（図５４Ｃ）。この実施例で、単一配列又はライブラリーが選択圧下、及びＳＨＭの存在下でいかに迅速により高親和性の変異体を生成できるか、及びこの変異事象の流れが、上で概要を示したコンピューターアルゴリズムによりいかに正確に予測できるかが示される。
【０８６８】
本明細書中で提示したデータにより、体細胞超変異について開示されたシステム及び種ポリヌクレオチドが、目的の標的タンパク質を高レベルで標的変異誘発できることが示される。当該システムでは、回を重ねた変異誘発を可能にし、中立の、及び有害な変異の蓄積を減らす一方、好ましい変異の指定された進化を可能にする選別が可能となる（ともに目的のタンパク質内及び発現系内で）。
【０８６９】
５．エピソームレスキュー
エピソームベクターはインテグレートせずに残り、宿主細胞の染色体物質から容易に分離できるので、プラスミドをＨｉｒｔ(Hirt,1967;Kapoor and Frappier,2005;Yates et al.,1984)の方法により回収でき、コンピテントな細菌に形質転換でき、更にコードされたポリペプチドの配列、道程及び／又は特性を確認するためにさらに操作できる。
【０８７０】
各細胞当たり平均３個の８，０００ベースペアー（ｂｐ）の内在エピソームという概算を用いると、細胞百万個当たりおおよそ３０ピコグラム（ｐｇ）の収率が期待できる（例、式１参照）。エレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉへの形質転換効率を、弛緩型環状ＤＮＡ１μｇ当たり１０７コロニーと仮定すれば、それぞれが単一の回収エピソームを表すおおよそ３００個のＥ．ｃｏｌｉコロニーが、百万個の哺乳動物細胞から期待できる。
【０８７１】
式１：
（１０６細胞ｘ３エピソーム／細胞）ｘ（６６０ｇ／モル／ｂｐ）ｘ（８０００ｂｐ／エピソーム）ｘ（１０６コロニー／μｇ）ｘ（１０６μｇ／ｇ），（６ｘ１０２３エピソーム／モル）＝２．６ｘ１０−１１ｇ（１０６細胞当たりのＤＮＡ）
【０８７２】
プラスミドは、標準的な(例、Qiagen,Inc.のプロトコール(手順については、例、www1.qiagen.com/literature/handbooks/PDF/PlasmidDNAPurification/PLS_QP_Miniprep/1034641_HB_QIAprep_112005.pdf;及びWade-Martins et al.,Nuc Acids Res 27:1674-1682(1999)を参照）のような）アルカリ溶解の手順を用いても回収できる。１つの側面において、哺乳動物細胞をＱｉａｇｅｎプロトコール中に記載のＥ．ｃｏｌｉと同様にして処理する。最終溶出液中に存在するエピソームを上記の通りコンピテントなＥ．ｃｏｌｉへ形質転換する。Ｈｉｒｔ上清又はアルカリ溶解法のいずれかを使用することは、内在エピソームの単離のため、かなりの細胞集団から始める必要がある。１つの非限定的な例において、形質転換したＥ．ｃｏｌｉコロニーで明らかなように、クローン的に派生した細胞５０，０００個から開始して、１０〜２０個の回収エピソームを得ることを期待し得る。
【０８７３】
更に、ＳＶ４０  Ｔ抗原の発現によりＳＶ４０Ｏｒｉを含有するベクターが急速に増幅され、従ってエピソームレスキュー前にベクター数を増幅する方法を提供する。この増幅を達成するために、ＳＶ４０Ｔ抗原を発現ベクター（本明細書中に記載）にクローニングし、ＨｙＨＥＬ１０  ＨＣ及びＬＣエピソームベクターを安定して含有する６．３ｘ１０ｅ５  ＨＥＫ  ２９３細胞へ一過的にトランスフェクトした。０時間（トランスフェクション直前）並びに１、２及び３日目に試料を分取した。細胞をトリプシン処理により回収し、エピソームＤＮＡをＱｉａｇｅｎ社のミニプレップキットを用いて抽出した。抽出したＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、カルベニシリンプレート上で一晩増殖させ、翌朝コロニーを計数した（表１８）。
【０８７４】
【表１８】
2010520748.tif 000069
【０８７５】
トランスフェクトされた遺伝子を特性解析する為の別の標準的な方法には、エピソーマルであるか、インテグレートされたか否かに関わらず、関係する細胞集団で直接ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応を行い、続いて得られる個々のＰＣＲ断片をクローニングし、特性解析することを包含する。この方法は大量の細胞集団から開始する必要が無いという利点を有する。内在性の活性を持つ抗体のオープンリーディングフレームのＰＣＲ増幅は、細胞１個程度で首尾よく行うことができる。これには、目的の細胞の単離から、原因となるオープンリーディングフレームの配列決定の時点までの時間を短縮する効果がある。
【０８７６】
別の選択肢は、単離細胞でＲＴ−ＰＣＲを行うこと、したがって発現しているｍＲＮＡを介して内在性ポリペプチドの同定と特性解析を行うことである。
【０８７７】
実施例１０
工学的に増強された変異体
活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）は、免疫系による親和性成熟の間に体細胞超変異（ＳＨＭ）、クラススイッチ組み換え（ＣＳＲ）及び遺伝子変換の事象を開始させる責を担う主要酵素である。当該酵素は進化の間にとりわけよく保存されてきており、ヒト、ラット、ウシ、マウス及びニワトリオルソログがイヌアミノ酸配列にそれぞれ９４．４％、９３．９％、９３．９％、９２．４％及び８９．４％の同一性を示す。
【０８７８】
ＡＩＤは予想されるタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、翻訳後修飾部位及び細胞内標的モチーフをいくつか含有し、当該酵素のカルボキシル末端アミノ酸中に局在する核外搬出シグナル（ＮＥＳ）は、それらのうちの１つである。核局在化シグナル（ＮＬＳ）がＡＩＤ内に存在するか否かという疑問に関しては、いくつかのグループがそのようなシグナルは存在すると主張するが(Ito et al.,PNAS 2004 Feb 17;101(7):1975-80)、別のグループは機能するＮＬＳは存在しないと主張し(Brar et al.,J.Biol.Chem.2004 Jun 8;279(25):26395-401;McBride et al.,J.Exp.Med.2004 May 3;199(9):1235-44)、意見が分かれている。
【０８７９】
ネイティブなＡＩＤは、細胞分画、ウェスタンブロット及び免疫組織化学により示されるように、主に細胞の細胞質コンパートメント中に見られる。ＮＥＳの除去又は無効化により、核における定常的な内在ＡＩＤの濃度を高くし、ＳＨＭレベルを高くできる傾向があるが、ＣＳＲを損なわせ、又は無くしもする(Brar et al,Id.;Durandy et al.,Hum.Mutat.2006 Dec;27(12):1185-91;Ito et al,Id.;McBride et al,Id.)。
【０８８０】
上記実施例２では、核外排出を無効化し、それにより核保持を促進するよう設計されたＮＥＳ内の変異（Ｌ１９８Ａ）を含むＳＨＭ耐性型ＡＩＤ（配列番号３４１）の設計及び構築を記載する。ＡＩＤの核局在、ひいては変異誘発因子活性を更に増強するために、アミノ末端近くにＳＶ４０  Ｔ抗原(Kalderon et al,(1984).Cell 39,499-509)由来の強力な核局在シグナル（ＮＬＳ；ＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号３４０）を挿入することにより、当該酵素の更に工夫された型を作り出した。ＡＩＤ発現を追跡するため、ＦＬＡＧエピトープタグも挿入し、強力なＮＬＳ及び変異ＮＥＳ配列を両方含有するもの（配列番号３４２）を作り出した。
【０８８１】
Ｃ末端のＮＥＳを、核外搬出を減らすよう更に改変することにより、更に工夫されたＡＩＤの型も作り出した。これらのコンストラクトはＳＶ４０  Ｔ抗原ＮＬＳ有り又は無しで調製した。
【０８８２】
最初のＮＥＳ変異体ペアにおいては、配列番号３４１（ＮＬＳ無し）及び配列番号３４２（ＮＬＳ有り）のポリヌクレオチド配列を、当該ポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸残基Ｌ１８１、Ｌ１８３、Ｌ１８９、Ｌ１９６及びＬ１９８をアラニンに変異させるよう改変して、それぞれ配列番号３４４（ＮＬＳ無し）及び配列番号３４６（ＮＬＳ有り）のポリヌクレオチド配列、並びにそれぞれ配列番号３４５（ＮＬＳ無し）及び配列番号３４７（ＮＬＳ有り）のアミノ酸配列とした。
【０８８３】
ＰＣＲによりムテインを生成し、次いで親ＤＮＡを除去するためＤｐｎ１で処理した。
【０８８４】
アラニンを含有するムテインを生成するため、以下のオリゴを用いた：CAGCTCAGGAGAATCCTCGCCCCCGCTTATGAGGTCGACGACCTC(配列番号352)及びGAGGTCGTCGACCTCATAAGCGGGGGCGAGGATTCTCCTGAGCTG (配列番号353)。
【０８８５】
Ｐｆｕ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(Invitrogen)を製造元のキットの緩衝液及び２．５ｕＭの各デオキシヌクレオチド(Roche)と共に用い、配列番号３４１又は配列番号３４２として示したポリヌクレオチド配列を含有するベクターを鋳型ＤＮＡとして用い、別々のＰＣＲ反応を２通り計画した。ＰＣＲは、以下のサイクル条件で行った：９５℃３分間を１サイクル、続いて［９５℃４５秒間、５５℃４５秒間、６８℃１７分間］を２０サイクル、続いて６８℃５分間を１サイクル。完了後、反応成功を確認するためＰＣＲ反応物５μｌを１％アガロースゲルで泳動した。次いで、ＰＣＲ反応混合物を３７℃で少なくとも４時間Ｄｐｎ１(New England Biolabs)で処理して親ＤＮＡを除去した。
【０８８６】
５μｌのＤｐｎ１で処理したＰＣＲ反応物を１００μＬのＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ｓｕｐｅｒ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ(Invitrogen)に添加し、製造元提示のプロトコールにより形質転換した。配列を確認後、得られたＤＮＡ（４つの所望する変異のうち２つ；即ち１８１及び１８３、を含有する）を鋳型として用い、オリゴCCGCTTATGAGGTCGACGACGCCAGAGATGCCTTCCGGACCG(配列番号354)及びAGGGTCCGGAAGGCATCTCTGGCGTCGTCGACCTCATAAGCGG(配列番号355)と共に、上記したものと同じプロトコールを用いて、４つの変異のうちの３番目（即ち、１８９）を導入した。最後に、オリゴCCAGAGATGCCTTCCGGACCGCCGGGGCTTGATGTACAATC配列番号356)及びGATTGTACATCAAGCCCCGGCGGTCCGGAAGGCATCTCTGG(配列番号357)を用いて、４番目であり最後となる変異（即ち、１９６）を導入した。
【０８８７】
最終的に得られたアラニン含有ムテイン産物をＳａｃ１及びＢｓｒＧ１を用いて消化し、コグネイトな制限酵素で切断したベクター骨格へライゲーションしてそれぞれ配列番号３４４（ＮＬＳ無し）及び配列番号３４６（ＮＬＳ有り）を生成した。
【０８８８】
第二のムテインペアにおいては：配列番号３４１（ＮＬＳ無し）及び配列番号３４２（ＮＬＳ有り）のポリヌクレオチド配列を、当該ポリヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸残基Ａｓｐ１８７、Ａｓｐ１８８及びＡｓｐ１９１をグルタミン酸（Glutamate）に変異させ、当該ポリヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸残基Ｔｈｒ１９５をイソロイシンに変異させるよう改変して、それによりそれぞれ配列番号３４８（ＮＬＳ無し）及び配列番号３５０（ＮＬＳ有り）のポリヌクレオチド配列、並びにそれぞれ配列番号３４９（ＮＬＳ無し）及び配列番号３５１（ＮＬＳ有り）のアミノ酸配列を作り出した。
【０８８９】
アラニンムテインに関する一連の上記手順と同一の手順を、以下のオリゴ：TCCTCCCCCTCTATGAGGTCGAAGAACTCAGAGAAGCCTTCCGGACCCTCGGGGC(配列番号358)及びGCCCCGAGGGTCCGGAAGGCTTCTCTGAGTTCTTCGACCTCATAGAGGGGGAGGA(配列番号359)を最初のオリゴペアの代わりに用い、以下のオリゴ：AACTCAGAGAAGCCTTCCGGATCCTCGGGGCTTGATGTACAAT(配列番号360)及びATTGTACATCAAGCCCCGAGGATCCGGAAGGCTTCTCTGAGTT(配列番号361)を第二のオリゴペアの代わりに用いた（この場合、第三のＰＣＲ反応は不要であった）点を除いて繰り返し、配列番号３４８及び配列番号３５０のグルタミン酸含有ＡＩＤムテインを生成した。産物を上記の通り処理し、配列番号３４８（ＮＬＳ無し）及び配列番号３５０（ＮＬＳ有り）を生成した。
【０８９０】
結果及び考察
次いで、結果生じる６種のＡＩＤコンストラクトを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）復帰アッセイにおける活性及びイムノグロブリンＩｇＧ重鎖（ＨＣ）鋳型上の変異頻度について試験した。
【０８９１】
ＧＦＰ復帰アッセイを行うために、チロシン８２のＴＡＣコドンをＴＡＧ終止コドンに改変した（ＧＦＰ＊）。ＧＦＰ＊をＡｎａｐｔｙｓ  エピソーム発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫ  ２９３に安定的にトランスフェクトした（注釈：この細胞系はＥＢＮＡ１を、インテグレートした当該遺伝子のコピーから発現させる）。同様に、各ＡＩＤコンストラクトを、安定的にトランスフェクトされしたＧＦＰ＊細胞系にトランスフェクトし、トランスフェクションから２日後までに細胞を選択（ＧＦＰ＊についてはブラストサイジン、各ＡＩＤコンストラクトについてはハイグロマイシン）下に置いた。終止コドンが元のチロシンに復帰するとエピソームを有する細胞に緑色蛍光が誘導された。選択から３、６、及び１０日後に蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）解析によりＧＦＰ復帰の頻度を測定した。
【０８９２】
【表１９】
2010520748.tif 000070
【０８９３】
結果から、６種のＡＩＤコンストラクトのそれぞれと共トランスフェクトするとバックグラウンドを有意に上回るＧＦＰリバータントが一貫して生じることが示されるが、このことは６種のＡＩＤムテインすべてが機能することを示している。
【０８９４】
ＧＦＰ復帰アッセイには、陽性の復帰細胞を生み出すためＡＩＤ初期活性及びそれに続くエラープローンポリメラーゼによる作用が共に必要なため、当該結果は機能に関して定性的なｙｅｓ／ｎｏを提供する。実際の復帰率を測定するために、より正確な鋳型変異誘発実験も行われた。従って当該ＧＦＰ復帰アッセイに加えて、ＡＩＤコンストラクト２種（配列番号３４１；ＮＥＳ中、Ｌ１９８Ａ変異を含有）及び配列番号３４２（Ｌ１９８Ａ  ＮＥＳ変異及びＳＶ４０  ＮＬＳを含有））を、ＨｙＨＥＬ１０  ＩｇＧのＨＣにおいて変異を誘発するそれらの能力について試験した(Pons et al,(1999)Protein Science 8:958-68;Smith-Gill et al.(1984)J.Immunology 132:963)。（以前に記載した通り）ＨｙＨＥＬ１０のＨＣ、ＨｙＨＥＬ１０軽鎖（ＬＣ）のＮ３１Ｇムテインをコードするエピソーム性発現コンストラクト、及び配列番号３４１を含有する発現ベクター又は配列番号３４２を含有する同じベクター骨格のいずれかをＨＥＫ  ２９３に共トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞集団に抗生物質の選択圧（即ち、ＨＣ、ＬＣ及びＡＩＤについて、それぞれブラストサイジン、ピューロマイシン及びハイグロマイシン）を加え、２ヶ月培養後細胞を回収した。配列番号３４１を含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞から合計８３の鋳型ＩｇＧ  ＨＣを配列決定し、配列番号３４２を含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞から６１の鋳型を配列決定した。ＡＩＤの型に対する鋳型当たりの変異のパーセンテージを以下の表２０に示す。配列決定のデータから計算された変異頻度は、配列番号３４１では１４３８ｂｐ当たり１変異が生じ、配列番号３４２では１０５９ｂｐ当たり１変異が生じる、というものである。
【０８９５】
【表２０】
2010520748.tif 000071
【０８９６】
結果からＮＬＳを含有する型のＡＩＤ（配列番号３４２）が、鋳型ＨｙＨＥＬ１０  ＨＣ  ＩｇＧ中により多数の変異（１０５９ｂｐ当たり１に対してＮＬＳを含有しないホモログについては１４３８あたり１）を誘発し、同様に変異を複数含有する鋳型をより多くもたらした（ＡＩＤ−ＮＬＳでは２．４％であるのに対してＡＩＤ＋ＮＬＳでは鋳型の１０％）ことが示される。
【０８９７】
配列
コールド  イヌＡＩＤ。核外搬出シグナルを未改変のＣＴＴ（Ｌｅｕ１９８）コドンをＧＣＴ（ａｌａ、以下に下線で示す）に改変することにより無効にした。
【０８９８】
ATGGACTCTCTCCTCATGAAGCAGAGAAAGTTTCTCTACCACTTCAAGAACGTCAGATGGGCCAAGGGGAGACATGAGACCTATCTCTGTTACGTCGTCAAGAGGAGAGACTCAGCCACCTCTTTCTCCCTCGACTTTGGGCATCTCCGGAACAAGTCTGGGTGTCATGTCGAACTCCTCTTCCTCCGCTATATCTCAGACTGGGACCTCGACCCCGGGAGATGCTATAGAGTCACTTGGTTTACCTCTTGGTCCCCCTGTTATGACTGCGCCAGACATGTCGCCGACTTCCTCAGGGGGTATCCCAATCTCTCCCTCCGCATATTCGCCGCCCGACTCTATTTTTGTGAGGACAGGAAAGCCGAGCCCGAGGGGCTCAGGAGACTCCACCGGGCCGGGGTCCAGATCGCCATCATGACATTTAAGGACTATTTCTATTGTTGGAATACATTTGTCGAGAATCGGGAGAAGACTTTCAAAGCCTGGGAGGGGCTCCATGAGAACTCTGTCAGACTCTCTAGGCAGCTCAGGAGAATCCTCCTCCCCCTCTATGAGGTCGACGACCTCAGAGATGCCTTCCGGACCCTCGGGGCTTGA (配列番号341)。
【０８９９】
以下のように、ポリヌクレオチド配列（又はアミノ酸配列）の特徴は、５’から３’（又は必要に応じて、Ｎ−からＣ−末端）の方へ、である：
【０９００】
クローニング用に用いるＳａｃＩ制限部位、囲んだ文字；Ｋｏｚａｋコンセンサス、下線；ＡＴＧ開始コドン（太字大文字）；ＦＬＡＧエピトープタグ（一重下線）；ＮＬＳ（二重下線）；コールド  イヌＡＩＤ；ＴＧＡ終止コドン（太字大文字）；クローニング用に用いるＢｓｒＧＩ及びＡｓｃＩ制限部位（囲んだ文字）。＊はタンパク質配列中の終止コドンを示す。
【０９０１】
【化７】
2010520748.tif 000072
【０９０２】
下線且つ大文字のＧＣＣコドン（ａｌａ）４つは、部位特異的変異誘発法により元の配列（ＬｅｕをコードするＣＴＣ）から変化させた。
【０９０３】
【化８】
2010520748.tif 000073
【０９０４】
下線且つ大文字のＧＣＣコドン（ａｌａ）４つは、部位特異的変異誘発法により元の配列（ＬｅｕをコードするＣＴＣ）から変化させた。囲み及び下線は上記した通りである。
【０９０５】
【化９】
2010520748.tif 000074
【０９０６】
下線且つ大文字のＧＡＡコドン（Ｇｌｕ）３つは、元の配列（アスパラギン酸をコードするコドン）から変化させた。更に１つの変異Ｔ１９５Ｉ、（ＡＣＣからＡＴＣ）も生成した。
【０９０７】
【化１０】
2010520748.tif 000075
【０９０８】
下線且つ大文字のＧＡＡコドン（Ｇｌｕ）３つは、元の配列（アスパラギン酸をコードするコドン）から変化させた。更に１つの変異Ｔ１９５Ｉ、（ＡＣＣからＡＴＣ）も生成した。囲み及び下線は上記した通りである。
【０９０９】
【化１１】
2010520748.tif 000076
【０９１０】
本明細書中、本発明の好ましい実施形態が示され、そして記載されたが、そのような実施形態は単なる例示として提供される。本明細書中に記載される本発明の実施形態の様々な変更が、本発明の実施において採用され得ることを理解すべきである。以下のクレームが本発明の範囲を明示し、それらによってこれらクレームの範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物が包含されることが意図される。
【０９１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年10月21日(2009.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質またはその部分をコードするＳＨＭ感受性遺伝子であって、未改変のタンパク質またはその部分をコードする未改変ポリヌクレオチド配列中の１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより高い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており、該合成遺伝子は、未改変ポリヌクレオチド配列よりもホットスポットモチーフの密度が高い、および／またはコールドスポットの密度が低いものである、遺伝子。
【請求項２】
タンパク質またはその部分をコードするＳＨＭ耐性の合成遺伝子であって、未改変のタンパク質またはその部分をコードする未改変ポリヌクレオチド配列中の１つ以上の第１のＳＨＭモチーフが、ＳＨＭの確率がより低い１つ以上の第２のＳＨＭモチーフによって置換されており、該合成遺伝子は、未改変ポリヌクレオチド配列よりもコールドスポットの密度が高い、および／またはホットスポットの密度が低いものである、遺伝子。
【請求項３】
該未改変ポリヌクレオチド配列と比較してホットおよび／またはコールドスポットの密度を調節する、１つ以上のサイレントな核酸変異を含む、請求項１または２記載の合成遺伝子。
【請求項４】
ホットおよび／またはコールドスポットの密度を調節するように改変されており、該未改変タンパク質と比較して１つ以上の保存的または半保存的アミノ酸変異をコードする、請求項１または２記載の合成遺伝子。
【請求項５】
該未改変タンパク質と比較して約５０％以上、約７０％以上または約９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１または２記載の合成遺伝子。
【請求項６】
該未改変ポリヌクレオチド配列と比較して好ましくないコドンの含量が減少している、請求項１または２記載の合成遺伝子。
【請求項７】
該未改変ポリヌクレオチド配列と比較して好ましいＳＨＭホットスポットモチーフの含量が増加している、請求項１記載の合成遺伝子。
【請求項８】
該未改変ポリヌクレオチド配列と比較して標準的なホットスポットおよびコールドスポットの密度が改変されている、請求項１または２記載の合成遺伝子。
【請求項９】
該未改変ポリヌクレオチド配列と比較してＡＩＤ介在性の変異誘発率が変化している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の合成遺伝子。
【請求項１０】
抗体もしくはその抗原結合フラグメント、選択マーカー、レポータータンパク質、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、酵素、受容体、構造タンパク質、毒素、補因子または転写因子をコードする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の合成遺伝子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの合成遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の合成遺伝子を含む真核細胞。
【請求項１３】
所望の性質を有する遺伝子産物の調製方法であって、
ａ）該遺伝子産物をコードする請求項１記載の合成遺伝子を調製し、
ｂ）ＡＩＤ活性を発現するか、あるいは誘導因子の添加によりＡＩＤ活性を発現するように誘導され得る細胞集団において、該合成遺伝子を発現させ、
ｃ）所望の性質を有する改変された遺伝子産物を発現する、該細胞集団内の単一または複数の細胞を選択すること
を含む、方法。
【請求項１４】
所望の性質を有する遺伝子産物の調製方法であって、
ａ）少なくとも１つの請求項２記載の遺伝子を含み、かつＡＩＤ活性を発現するか、あるいは誘導因子の添加によりＡＩＤ活性を発現するように誘導され得る細胞集団において、該遺伝子産物を発現させ、
ｂ）所望の性質を有する改変された遺伝子産物を発現する、該細胞集団内の単一または複数の細胞を選択すること
を含む、方法。
【国際調査報告】
2010520748.tif 000140