(57)【要約】  本発明者は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和可能なヒト抗体を提供する。本発明者は、分岐群２のＨ５亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和可能な抗体、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和可能であってλ軽鎖を有する抗体、およびＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和可能なＩｇＧ抗体（ただしＩｇＧ１重鎖は有さない）も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和可能なヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスのビリオンに存在する血球凝集素に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号１３を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号５を含む重鎖および配列番号７を含む軽鎖を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号９を含む重鎖および配列番号１１を含む軽鎖を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号１を含む重鎖および配列番号３を含む軽鎖を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号４２を含む重鎖および配列番号４４を含む軽鎖を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号５２を含む重鎖および配列番号５４を含む軽鎖を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号６２を含む重鎖および配列番号６４を含む軽鎖を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号７２を含む重鎖および配列番号７４を含む軽鎖を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号８２を含む重鎖および配列番号８４を含む軽鎖を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号９２を含む重鎖および配列番号９４を含む軽鎖を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号１０２を含む重鎖および配列番号１０４を含む軽鎖を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項１４】
ＦＬＡ５．１０、ＦＬＤ２１．１４０、ＦＬＡ３．１４、ＦＬＤ２０．１９、ＦＬＤ８４、ＦＬＤ９３、ＦＬＤ１２２、ＦＬＤ１２７、ＦＬＤ１２９、ＦＬＤ１３２およびＦＬＤ１９４からなる群から選択される抗体の相補性決定領域（配列番号１７〜４０、４５〜５０、５５〜６０、６５〜７０、７５〜８０、８５〜９０、９５〜１００、１０５〜１１０）を１つ以上有する抗体。
【請求項１５】
ＦＬＡ５．１０、ＦＬＤ２１．１４０、ＦＬＡ３．１４、ＦＬＤ２０．１９、ＦＬＤ８４、ＦＬＤ９３、ＦＬＤ１２２、ＦＬＤ１２７、ＦＬＤ１２９、ＦＬＤ１３２およびＦＬＤ１９４からなる群から選択される抗体と同じエピトープに結合する抗体。
【請求項１６】
ＦＬＡ５．１０、ＦＬＤ２１．１４０、ＦＬＡ３．１４、ＦＬＤ２０．１９、ＦＬＤ８４、ＦＬＤ９３、ＦＬＤ１２２、ＦＬＤ１２７、ＦＬＤ１２９、ＦＬＤ１３２およびＦＬＤ１９４からなる群から選択される抗体と競合してＨ５血球凝集素に結合可能な抗体。
【請求項１７】
分岐群２のＨ５亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和可能な抗体。
【請求項１８】
λ軽鎖を有しており、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和可能な抗体。
【請求項１９】
ＩｇＧ１重鎖を有しておらず、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和可能なＩｇＧ抗体。
【請求項２０】
ヒト抗体である、請求項１４から１９までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
先行する請求項に記載の抗体であって、１００μｇ／ｍｌ以下（たとえば１μｇ／ｍｌ以下）の濃度において、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルス１００ＴＣＩＤ５０を中和可能な抗体。
【請求項２２】
請求項２１に記載の抗体であって、１００μｇ／ｍｌ以下（たとえば１μｇ／ｍｌ以下）の濃度において、分岐群１および２の両方のＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルス１００ＴＣＩＤ５０を中和可能な抗体。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の抗体であって、１００ｎｇ／ｍｌ以下の濃度で中和可能な抗体。
【請求項２４】
先行する請求項に記載の抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸。
【請求項２５】
請求項１から２３までのいずれか一項に記載の第１の抗体と請求項１から２３までのいずれか一項に記載の第２の抗体との組合せであって、前記第１の抗体および前記第２の抗体がＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの前記血球凝集素における異なるエピトープに結合する組合せ。
【請求項２６】
請求項１から２３までのいずれか一項に記載の抗体または請求項２５に記載の組合せを、必要とする患者に投与することを含む、患者の処置方法。
【請求項２７】
併行分離投与または連続投与をするための第１の抗体と第２の抗体であって、前記第１の抗体が請求項１から２３までのいずれか一項に記載の抗体であり、前記第２の抗体が請求項１から２３までのいずれか一項に記載の抗体であり、かつ前記第１の抗体と前記第２の抗体が異なる抗体。
【請求項２８】
分岐群１および分岐群２のＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを、それぞれ中和可能である、請求項２７に記載の第１および第２の抗体。
【請求項２９】
同じＨ５血球凝集素の異なるエピトープに結合する、請求項２８に記載の第１および第２の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインフルエンザウィルス、特にヒトＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスに特異性を有するヒト抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ａ型インフルエンザウィルスはヒトで重篤な疾患を引き起こす病原体である。ウィルスの表面タンパク質である血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の亜型によって、株を分類することができる。現在のところ、互いに抗原的に異なる１６種類のＨＡ亜型（Ｈ１〜Ｈ１６）および９種類のＮＡ亜型（Ｎ１〜Ｎ９）が知られている。現在、ヒト間で流行しているＡ型インフルエンザウィルスは、Ｈ１Ｎ１亜型またはＨ３Ｎ２亜型である。
【０００３】
ヒトからヒトへの感染（水平感染）が可能で、現在流行している亜型と比較して新しいＨＡまたはＮＡの亜型を有するようなＡ型インフルエンザウィルス株が出現した際に、インフルエンザの世界的流行が発生する。たとえば、ヒトは現在、鳥類間でここ数年流行しているＨ５Ｎ１亜型に対して免疫性を持たない。Ｈ５Ｎ１亜型がヒトからヒトへの感染に適応した場合、広域にわたるインフルエンザ感染の大流行となる可能性がある。
【０００４】
Ｈ５Ｎ１大流行に対処する現在の取り組みとして、予防ワクチン接種、またはオセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））およびザナミビル（Ｒｅｌｅｎｚａ（登録商標））のようなノイラミニダーゼ阻害剤が挙げられる。文献１では、ヒト定常領域（κ軽鎖およびＩｇＧ１重鎖）とマウス可変領域とのキメラのモノクローナル抗体が、Ｈ５Ｎ１亜型を中和することができ、よって予防や治療に適していることが報告されている。文献２では、トリインフルエンザＡ／Ｃｋ／ＨＫ／Ｙｕ２２／０２株に対して作製されたマウスモノクローナル抗体を開示し、この抗体がヒト化され得ることを提案している。
【０００５】
Ｈ５亜型の中で、ウィルスは、ＨＡの配列に基づき、分岐群と呼ばれる様々な系統に分類される。ベトナムで２００４年に、インドネシアで２００５年にそれぞれ単離されたウィルスは、分岐群１および２の標準ウィルス（ローマ数字ＩおよびＩＩで表すこともある）に指定されている。文献１の抗体は、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４およびＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／２１３／０３の株に対して作製されたものであり、両株共に分岐群１に入る。
【０００６】
Ｈ５Ｎ１亜型の様々な分岐群を含む、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの感染や疾患を予防し、かつ治療するためのさらなる改良物質が求められている。
【発明の概要】
【０００７】
以下で詳細を説明するように、本発明者はＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血球凝集素を中和するヒトモノクローナル抗体を提供する。
【０００８】
本発明者は、ＦＬＡ５．１０、ＦＬＤ２１．１４０、ＦＬＡ３．１４およびＦＬＤ２０．１９からなる群から選択される抗体の相補性決定領域を１つ以上有する抗体も提供する。これらの抗体は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血球凝集素を中和できることが好ましい。
【０００９】
本発明者は、ＦＬＤ８４、ＦＬＤ９３、ＦＬＤ１２２、ＦＬＤ１２７、ＦＬＤ１２９、ＦＬＤ１３２およびＦＬＤ１９４からなる群から選択される抗体の相補性決定領域を１つ以上有する抗体も提供する。これらの抗体は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血球凝集素を中和できることが好ましい。
【００１０】
本発明者は、ＦＬＡ５．１０、ＦＬＤ２１．１４０、ＦＬＡ３．１４およびＦＬＤ２０．１９からなる群から選択される抗体と同じエピトープに結合する抗体も提供する。これらの抗体は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血球凝集素を中和できることが好ましい。
【００１１】
本発明者は、ＦＬＤ８４、ＦＬＤ９３、ＦＬＤ１２２、ＦＬＤ１２７、ＦＬＤ１２９、ＦＬＤ１３２およびＦＬＤ１９４からなる群から選択される抗体と同じエピトープに結合する抗体も提供する。これらの抗体は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血球凝集素を中和できることが好ましい。
【００１２】
本発明者は、ＦＬＡ５．１０、ＦＬＤ２１．１４０、ＦＬＡ３．１４、ＦＬＤ２０．１９、ＦＬＤ８４、ＦＬＤ９３、ＦＬＤ１２２、ＦＬＤ１２７、ＦＬＤ１２９、ＦＬＤ１３２およびＦＬＤ１９４からなる群から選択される抗体と競合してＨ５血球凝集素タンパク質に結合する抗体も提供する。これらの抗体は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血球凝集素を中和できることが好ましい。
【００１３】
本発明者は、分岐群２のＨ５亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血球凝集素を中和できる抗体も提供する。
【００１４】
本発明者は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血球凝集素を中和でき、ラムダ（λ）軽鎖を有する抗体も提供する。
【００１５】
本発明者は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血球凝集素を中和できるＩｇＧ抗体も提供する。ただし、この抗体はＩｇＧ１重鎖を持たない。
【００１６】
本発明者は、本発明の第１の抗体と本発明の第２の抗体の組合せも提供する。ここで、第１と第２の抗体は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血球凝集素の異なるエピトープに結合する。したがって、これらの抗体が血球凝集素タンパク質の単一分子に同時に結合できることもある。このような組合せの１つには、ＦＬＤ２０．１９とＦＬＤ１９４の抗体が含まれる。他の組合せには、（ｉ）Ｈ５血球凝集素タンパク質への結合でＦＬＤ２０．１９と競合する抗体と（ｉｉ）Ｈ５血球凝集素タンパク質への結合でＦＬＤ１９４と競合する抗体とが含まれる。他の組合せには、（ｉ）ＦＬＤ２０．１９と同じエピトープに結合する抗体と（ｉｉ）ＦＬＤ１９４と同じエピトープに結合する抗体とが含まれる。
【００１７】
これらの様々な抗体は、様々な方法で作製することができ、ウィルスの感染や疾患の予防および治療に利用可能である。これらの抗体は診断にも利用可能である。
【００１８】
ヒトモノクローナル抗体
いくつかの実施形態において、本発明はＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血球凝集素を中和することができるヒトモノクローナル抗体を提供する。非ヒト抗体とは異なって、これらのヒト抗体はヒトに投与したときに、抗体の定常領域に対する免疫反応を誘発することはない。文献１で開示されているようなキメラ抗体とは異なり、これらのヒト抗体の可変領域は１００％ヒト由来である（この可変領域は、相補性決定領域だけでなく、特に、フレームワーク領域も１００％ヒト由来である）。このため、これらのヒト抗体はヒトに投与したときに、この可変領域のフレームワーク領域に対する免疫反応を誘発することはない（随意に、あらゆる抗イディオタイプの反応を除く）。これらのヒト抗体はヒト由来ではない、いかなる配列も含まない。
【００１９】
抗体に関して本来用いられている「モノクローナル」という表現は、単一クローン系統の免疫細胞から産生された抗体を指す。これは、多クローンのＢ細胞により産生される「ポリクローナル」抗体、すなわち、すべての抗体が同じ標的タンパク質を認識するものの、この標的タンパク質上にある様々なエピトープを標的とし得る抗体、とは異なる。本明細書では、「モノクローナル」という言葉は特定の細胞由来を意味するものではなく、すべて同じアミノ酸配列を有し、かつ同じ標的タンパク質における同じエピトープを認識する、あらゆる抗体の集団について言及するものである。したがって、モノクローナル抗体は、免疫細胞、非免疫細胞、無細胞系などのあらゆる適切なタンパク質合成系を用いて作製することができる。この用法は、当分野でよく用いられている。たとえば、相補性決定領域を移植してマウス骨髄腫ＮＳ０細胞株で発現させたヒト化抗体Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、ＣＨＯ細胞株で発現させたヒト化抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびＣＨＯ細胞株で発現させたファージディスプレイ抗体Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）のすべての製品情報に、これらがモノクローナル抗体製品であることが言及されている。
【００２０】
ヒトモノクローナル抗体は、様々な方法で作製することができる。目的の抗原を産生するヒトＢ細胞を、たとえば、エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）に感染させることにより、不死化させることができる。ヒトモノクローナル抗体は、たとえばスキッドマウスやトリメラマウスのような宿主において、宿主自身の免疫系を機能的なヒトの免疫系に置き換えることにより、非ヒト宿主からも作製することができる。ヒトＩｇ遺伝子座をマウスに遺伝子導入してヒトモノクローナル抗体（インフルエンザウィルスのＭ２タンパク質に対するヒト抗体を含む）を作製することに成功している。Ａｂｇｅｎｉｘ社の「ｘｅｎｏ-ｍｏｕｓｅ」がその一例である。ファージディスプレイも成功しており、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）の製品化につながっている。ヒトモノクローナル抗体産生に好ましい方法は、文献７および８に開示されている。この方法では、標的抗原に特異的なヒトのメモリーＢ細胞を、ポリクローナルＢ細胞活性化因子存在下でＥＢＶを用いて形質転換する。
【００２１】
本発明の特定の実施形態では、本発明者は本明細書でＦＬＡ５．１０、ＦＬＤ２１．１４０、ＦＬＡ３．１４およびＦＬＤ２０．１９と呼ばれるヒトモノクローナル抗体を作製した。本発明のさらに特定の実施形態では、本発明者は本明細書でＦＬＤ８４、ＦＬＤ９３、ＦＬＤ１１２、ＦＬＤ１２７、ＦＬＤ１２９、ＦＬＤ１３２およびＦＬＤ１９４と呼ばれるヒトモノクローナル抗体を作製した。これらの抗体は、文献７および８の技法を用いて作製した。
【００２２】
抗体ＦＬＡ５．１０は、分岐群１のＨ５Ｎ１亜型ウィルスを特異的に認識する。エピトープマッピング解析により、この抗体がＨＡタンパク質を認識することが示されている。この抗体の重鎖および軽鎖（κ鎖）にある可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３（配列番号１４によりコードされる）および配列番号１５（配列番号１６によりコードされる）の通りである。したがって、この抗体の相補性決定領域は以下の配列の通りである。
【表１】
2010521147.tif 000002
【００２３】
抗体ＦＬＤ２１．１４０は、分岐群１のＨ５Ｎ１亜型ウィルスを特異的に認識する。この抗体はＨＡタンパク質を認識する。この抗体の重鎖および軽鎖（λ鎖）にある可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５（配列番号６によりコードされる）および配列番号７（配列番号８によりコードされる）の通りである。したがって、この抗体の相補性決定領域は以下の配列の通りである。
【表２】
2010521147.tif 000003
【００２４】
抗体ＦＬＡ３．１４は、分岐群１および２のＨ５Ｎ１亜型ウィルスおよびを認識する。エピトープマッピング解析により、ＨＡタンパク質を認識することが示されている。この抗体の重鎖および軽鎖（κ鎖）にある可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号９（配列番号１０によりコードされる）および配列番号１１（配列番号１２によりコードされる）の通りである。したがって、この抗体の相補性決定領域は以下の配列の通りである。
【表３】
2010521147.tif 000004
【００２５】
抗体ＦＬＤ２０．１９は、分岐群１および２のＨ５Ｎ１亜型ウィルスを認識する。この抗体はＨＡタンパク質を認識する。この抗体の重鎖および軽鎖（κ鎖）にある可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１（配列番号２によりコードされる）および配列番号３（配列番号４によりコードされる）の通りである。したがって、この抗体の相補性決定領域は以下の配列の通りである。
【表４】
2010521147.tif 000005
【００２６】
抗体ＦＬＤ８４は、分岐群１および２のＨ５Ｎ１亜型ウィルスを認識する。この抗体はＨＡタンパク質を認識する。この抗体の重鎖および軽鎖（κ鎖）にある可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４２（配列番号４１によりコードされる）および配列番号４４（配列番号４３によりコードされる）の通りである。したがって、この抗体の相補性決定領域は以下の配列の通りである。
【表５】
2010521147.tif 000006
【００２７】
抗体ＦＬＤ９３は、分岐群１および２のＨ５Ｎ１亜型ウィルスを認識する。この抗体はＨＡタンパク質を認識する。この抗体の重鎖および軽鎖（κ鎖）にある可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５２（配列番号５１によりコードされる）および配列番号５４（配列番号５３によりコードされる）の通りである。したがって、この抗体の相補性決定領域は以下の配列の通りである。
【表６】
2010521147.tif 000007
【００２８】
抗体ＦＬＤ１２２は、分岐群１および２のＨ５Ｎ１亜型ウィルスを認識する。この抗体はＨＡタンパク質を認識する。この抗体の重鎖および軽鎖（κ鎖）にある可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６２（配列番号６１によりコードされる）および配列番号６４（配列番号６３によりコードされる）の通りである。したがって、この抗体の相補性決定領域は以下の配列の通りである。
【表７】
2010521147.tif 000008
【００２９】
抗体ＦＬＤ１２７は、分岐群１のＨ５Ｎ１亜型ウィルスを認識する。この抗体はＨＡタンパク質を認識する。この抗体の重鎖および軽鎖（κ鎖）にある可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７２（配列番号７１によりコードされる）および配列番号７４（配列番号７３によりコードされる）の通りである。したがって、この抗体の相補性決定領域は以下の配列の通りである。
【表８】
2010521147.tif 000009
【００３０】
抗体ＦＬＤ１２９は、分岐群１のＨ５Ｎ１亜型ウィルスならびにインフルエンザＨ５亜型のＨＡを有する分岐群１および２の両方の偽型ウィルスを認識する。この抗体はＨＡタンパク質を認識する。この抗体の重鎖および軽鎖（λ鎖）にある可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号８２（配列番号８１によりコードされる）および配列番号８４（配列番号８３によりコードされる）の通りである。したがって、この抗体の相補性決定領域は以下の配列の通りである。
【表９】
2010521147.tif 000010
【００３１】
抗体ＦＬＤ１３２は、分岐群１のＨ５Ｎ１亜型ウィルスならびにインフルエンザＨ５亜型のＨＡを有する分岐群１および２の両方の偽型ウィルスを認識する。この抗体はＨＡタンパク質を認識する。この抗体の重鎖および軽鎖（κ鎖）にある可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号９２（配列番号９１によりコードされる）および配列番号９４（配列番号９３によりコードされる）の通りである。したがって、この抗体の相補性決定領域は以下の配列の通りである。
【表１０】
2010521147.tif 000011
【００３２】
抗体ＦＬＤ１９４は、Ｈ５Ｎ１亜型ウィルスの分岐群１および２を認識する。この抗体はＨＡタンパク質を認識する。この抗体の重鎖および軽鎖（κ鎖）にある可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０２（配列番号１０１によりコードされる）および配列番号１０４（配列番号１０３によりコードされる）の通りである。したがって、この抗体の相補性決定領域は以下の配列の通りである。
【表１１】
2010521147.tif 000012
【００３３】
これらの抗体１つ以上からの相補性決定領域配列を代替の可変領域に移すことによって、抗原結合特異性を共有するさらなる抗体を作製することができる。この方法は「相補性決定領域移植」として知られている（文献９〜１４）。相補性決定領域移植の方法は、異なる動物種からの可変領域間で抗原結合特異性を移すために一般的に用いられているが、この方法を用いてあるタイプの抗体から異なるタイプの抗体に抗原結合特異性を移すこともできる。相補性決定領域のＨ１、Ｈ２およびＨ３を、受容部位であるＶＨ領域内に共に移植してもよいが、これらのうちの１つまたは２つのみでも適切に移植できるであろう（文献１２）。同様に、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３のうちの１つまたは２つあるいは３つすべてを、受容体であるＶＬ領域内に移植してもよい。供与体の相補性決定領域を１、２、３、４、または５つ、あるいは６つすべて有する抗体が好ましい。移植する相補性決定領域が１つのみの場合、一般的に、６つの中で通常最も短いＬ２以外の相補性決定領域にするであろう。一般的に、供与体の相補性決定領域はすべて、同じヒト抗体由来となる。しかし、数種のヒト抗体を混合して用いることも可能である。たとえば、第１の抗体から軽鎖の相補性決定領域を移植し、第２の抗体から重鎖の相補性決定領域を移植するような場合である。
【００３４】
相補性決定領域を供与体の可変領域から受容体の可変領域に移植すると、多くの場合、同時に供与体の１つ以上のフレームワーク残基が改変される。
【００３５】
相補性決定領域移植の代わりに、特異性決定残基移植の方法が用いられてもよい（文献１５、１６）。これは、相補性決定領域内で特異性を決定する残基のみを移植するものである。
【００３６】
Ｋａｂａｔの番号付け（文献１７）によると、軽鎖可変領域の相補性決定領域はアミノ酸２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）であり、重鎖可変領域の相補性決定領域はアミノ酸３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）である。Ｃｈｏｔｈｉａの番号付け（文献１８）によると、軽鎖可変領域の相補性決定領域はアミノ酸２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）であり、重鎖可変領域の相補性決定領域はアミノ酸２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）である。上記の表は、標準化されたＩＭＧＴ番号付け系（文献１９〜２１）によって相補性決定領域を特定している。すなわち、相補性決定領域１はＩＭＧＴ番号で２７〜３８位、相補性決定領域２はＩＭＧＴ番号で５６〜６５位、相補性決定領域３はＩＭＧＴ番号で１０５〜１１７位となる。フレームワークまたは「ＦＲ」のアミノ酸残基は相補性決定領域以外の可変領域残基である。
【００３７】
文献２２では、インフルエンザウィルスに対するヒトモノクローナル抗体を開示しているが、Ｈ５亜型に対するヒトモノクローナル抗体は開示していない。
【００３８】
抗体
本発明の抗体は様々な形態で用いることができる。一例としては、哺乳動物から自然に見つかるような、自然抗体であってもよい。自然抗体は重鎖と軽鎖からなる。重鎖と軽鎖の双方が、可変領域と定常領域に分けられる。この重鎖と軽鎖の双方の可変領域が多様であるために、様々な抗体が様々な抗原を認識できる。脊椎動物種の自然抗体の軽鎖には、定常領域のアミノ酸配列に基づき、カッパ鎖（κ鎖）またはラムダ鎖（λ鎖）の２種が存在する。自然抗体の重鎖にはα鎖、δ鎖、ε鎖、γ鎖、μ鎖があり、それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭのクラスとなる。クラスはさらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ２などのサブクラスまたはアイソタイプに分類することができる。抗体はアロタイプにも分類することができる。たとえばγ重鎖には、Ｇ１ｍアロタイプであるａ、ｆ、ｘ、またはｚ、Ｇ２ｍアロタイプであるｎ、もしくは、Ｇ３ｍアロタイプであるｂ０、ｂ１、ｂ３、ｂ４、ｂ５、ｃ３、ｃ５、ｇ１、ｇ５、ｓ、ｔ、ｕ、またはｖがある。κ軽鎖にはＫｍ（１）、Ｋｍ（２）またはＫｍ（３）のアロタイプがある。自然ＩｇＧ抗体は同一の２本の軽鎖（一方は定常領域ＣＬ、もう一方は可変領域ＶＬ）と同一の２本の重鎖（一方は３つの定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、もう一方は可変領域ＶＨ）とを持ち、ジスルフィド架橋により結合している。自然抗体の各クラスの領域および三次元構造はよく知られている。
【００３９】
本発明の抗体が定常領域のある軽鎖を有している場合、抗体はκ軽鎖またはλ軽鎖であってもよい（しかし、一部の実施例では、抗体はλ軽鎖を有していなければならない）。本発明の抗体が定常領域のある重鎖を有している場合、抗体はα重鎖、δ重鎖、ε重鎖、γ重鎖、またはμ重鎖であってもよい。ＩｇＧクラス（ＩｇＧ抗体）の重鎖が好ましい。ＩｇＧ１サブクラスの抗体が好ましい（しかし、一部の実施例では、抗体はＩｇＧ１重鎖を有していない。）。Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体はκ軽鎖を有するＩｇＧである。本発明の抗体はすべて適切なアロタイプを有してもよい（上記参照）。
【００４０】
本発明の抗体は、抗原結合活性を保持する自然抗体の断片であってもよい。たとえば、自然抗体のパパイン分解により、２つの同一の「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる抗原結合断片が作られ、それぞれは、単一の抗原結合部位および抗原結合活性を有さない残りの「Ｆｃ」フラグメントを有する。ペプシン処理により２つの抗原結合部位を有する「Ｆ（ａｂ'）２」断片が得られる。「Ｆｖ」は自然抗体の抗原結合部位全体を含む最小の断片であり、１本の重鎖と１本の軽鎖可変領域とのダイマーからなる。したがって、本発明の抗体は、自然抗体のＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖまたは他のタイプの断片であってもよい。
【００４１】
本発明の抗体は、１本鎖ポリペプチドとしてＶＨおよびＶＬの領域を含む「１本鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖ」または「ｓＦｖ」）であってもよい（文献２３〜２５）。一般的に、ＶＨとＶＬの領域は、ｓｃＦｖが抗原に結合可能な好ましい構造を形成することを可能にする、ＶＨとＶＬの領域間の短いポリペプチドのリンカー（たとえば１２アミノ酸以上）で連結する。ｓｃＦｖタンパク質発現の一般的方法、少なくとも最初に選択する手段は、ファージディスプレイライブラリーや他のコンビナトリアルライブラリーとの関連で行うものである（文献２６〜２８）。複数のｓｃＦｖを連結して１本のポリペプチド鎖にすることができる。（文献２９）。
【００４２】
本発明の抗体は、連結した複数のＦｖ（ｓｃＦｖ）断片を含む、「二重特異性抗体」または「三重特異性抗体」などであってもよい（文献３０〜３３）。ＶＨとＶＬの領域間を、対にするには短すぎる（たとえば１２アミノ酸より短い）ＶＨとＶＬの領域間リンカーで連結することにより、他のＦｖ断片の相補的な領域と強制的に対になり、それにより２つの抗原結合部位をつくることができる。
【００４３】
本発明の抗体は単一可変領域抗体またはＶＨＨ抗体であってもよい。ラクダ科動物（ラクダやラマなど）およびサメから自然に見つかる抗体は、重鎖を有するが軽鎖はない。したがって、抗原認識は、哺乳類の自然抗原とは異なり、単一可変領域によって決定される（文献３４〜３６）。このような抗体の定常領域は、抗原結合活性を保持したまま、取り除くことができる。単一可変領域抗体を発現させる方法、少なくとも最初に選択する手段はファージディスプレイライブラリーや他のコンビナトリアルライブラリーとの関連で行うものである（文献３７）。文献３８は、Ｈ５Ｎ２亜型Ａ型インフルエンザウィルスに対して産生され、かつノイラミニダーゼに対する特異性を有する、ラクダ科動物の抗体（ＣＣ０７）について開示している。
【００４４】
本発明の抗体は「ドメイン抗体」（ｄＡｂ）であってもよい。このようなドメイン抗体はヒト抗体の重鎖または軽鎖のどちらかの可変領域を基にしており、分子量は約１３ｋＤａ（完全な抗体の分子量の１０分の１よりも少ない）である。それぞれ異なる標的を認識する重鎖と軽鎖のドメイン抗体を対にすることにより、２つの特異性を有する抗体を作ることができる。本発明のドメイン抗体は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血液凝集素に結合できる領域を少なくとも１つ含有する。ドメイン抗体は体内から迅速に除去されるが、血液のタンパク質（血清アルブミンなど）に結合する第２のドメイン抗体への融合、ポリマー（ポリエチレングリコールなど）との接合、または他の様式により、血液循環器系に残留することができる。
【００４５】
本発明の抗体は、定常領域は１つの生物種（たとえばヒト）由来であるが、可変領域は他の生物種（たとえばヒト以外）由来であるキメラ抗体であってもよい。抗体のキメラ化は本来、簡単に得られるマウスのモノクローナル抗体からヒト抗体に抗体特異性を容易に移入することによって、直接ヒトのモノクローナル抗体を作製する難点を回避するために開発された。本発明者は、さらなる研究のための原点としてヒト抗体を既に提供しているため、本発明を行う上で、一般的にはキメラ化は必要とされないであろう。しかし、Ｈ５Ｎ２亜型Ａ型インフルエンザウィルスを防ぐための非ヒト抗体が作製された場合、この抗体を用いてキメラ抗体を作製することができる。同様に、本発明のヒト抗体を非ヒト生物種に用いる際は、ヒト抗体の可変領域を非ヒト生物種からの定常領域に接合することが可能である。
【００４６】
本発明の抗体は相補性決定領域移植抗体であってもよい。相補性決定領域移植抗体の作製方法は上記の通りである。本発明者は、さらなる研究のための原点としてヒト抗体を既に提供しているため、キメラ化に関しては、相補性決定領域移植は一般的には必要とされない。
【００４７】
したがって、本明細書における「抗体」という用語は、多様な構造的特徴を有する様々なタンパク質を包含する（通常、２つのβシートの間に逆平行のβ鎖が並んだ２層サンドイッチ構造に折り畳まれているａｌｌ−βタンパク質を有する免疫グロブリン領域を少なくとも１つ含む）。しかし、すべての抗体タンパク質が、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスのビリオンに存在するタンパク質（一般的には、主な２つの表面糖タンパク質のうちの１つである血球凝集素）との結合能力を有する。
【００４８】
本発明の抗体は１つの抗原結合部位（たとえばＦａｂ断片やｓｃＦｖにあるような部位）または複数の抗原結合部位（たとえばＦ（ａｂ'）２断片または二重特異性抗体あるいは自然抗原にあるような部位）を含んでもよい。抗体が２つ以上の抗原結合部位を有する場合、有利に抗原を架橋できる。
【００４９】
抗体が２つ以上の抗原結合部位を有している場合、その抗体は単一特異性（すなわち、すべての抗原結合部位が同じ抗原を認識する）または多重特異性（すなわち、抗原結合部位が２つ以上の抗原を認識する）であることになる。したがって、多重特異性抗体の場合は、少なくとも１つの抗原結合部位はＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを認識し、他の少なくとも１つの抗原結合部位は他の抗原を認識するであろう。
【００５０】
本発明の抗体は、共有結合など介して、タンパク質以外の物質を含んでいてもよい。たとえば、抗体が放射線同位体を含んでいてもよい。Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）とＢeｘｘａｒ（登録商標）の製品は、それぞれ９０Ｙ放射線同位体および１３１Ｉ放射線同位体を含んでいる。さらなる例として、抗体は細胞毒性分子を含んでいてもよい。たとえば、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）には、細菌毒素であるＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンが結合されている。さらなる例として、抗体が共有結合で結合されたポリマーを含んでいてもよい。たとえば、ポリオキシエチル化ポリオールやポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の結合により、抗体の循環半減期が長くなることが報告されている。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態では、抗体が１つ以上の定常領域（たとえばＣＨ領域またはＣＬ領域を含む）を含んでいてもよい。上記のように、定常領域は、κ軽鎖、またはλ軽鎖、あるいはα重鎖、δ重鎖、ε重鎖、γ重鎖、またはμ重鎖を形成してもよい。本発明の抗体が定常領域を有する場合、この定常領域は自然ものか、改変されたものである。重鎖は３つ（αクラス、γクラス、δクラスにおけるように）または４つ（μクラス、εクラスにおけるように）の定常領域を含んでいてもよい。定常領域は、抗体-抗原間の相互作用に直接関わらないが、抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害活性、Ｆｃ受容体結合、食作用、および細胞表面受容体の下方制御を含む様々なエフェクター機能を与えることができるが、これらに限定されない。
【００５２】
定常領域は、自然抗体のＣ末端領域であって、Ｆｃ領域を形成することができる。本発明の抗体がＦｃ領域を有するとき、このＦｃ領域は自然のものであるか、改変されたものである。Ｆｃ領域は一部の抗体の機能に重要であり、たとえば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の活性はＦｃ依存的である。自然抗体のＦｃ領域の境界は変化することもあるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位またはＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基から重鎖のＣ末端にわたって定義される。Ｆｃ領域は一般的に、１種類以上のＦｃ受容体に結合することができる。Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（たとえば、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＣ）、ＦｃγＲＩＩＩ（たとえば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ）、ＦｃＲｎ、ＦｃαＲ（ＣＤ８９）、ＦｃδＲ、ＦｃμＲ、ＦｃεＲＩ（たとえば、ＦｃεＲＩαβγ２またはＦｃεＲＩαγ２）、ＦｃεＲＩＩ（たとえば、ＦｃεＲＩＩＡまたはＦｃεＲＩＩＢ）などがある。Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体に加えて、またはＦｃ受容体の代わりに、Ｃ１ｑのような補体タンパク質に結合することができる。抗体のＦｃ領域を改変することによって、エフェクター機能を変化させることができる。たとえば、受容体の結合親和性を上昇または低下させることができる。一例を挙げると、文献３９で報告しているように、Ｆｃ領域の残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および／または３２２に変異を入れることによって、エフェクター機能を改変することができる。同様に、文献４０で報告しているように、Ｆｃ領域の残基２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８および／または４３９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付け）に変異を入れることにより、ヒトＩｇＧ１のエフェクター機能を改良することができる。文献４１では、ヒトＩｇＧ抗体のＣ１ｑに対する親和性を改変するためのＦｃ領域の残基３２２、３２９および／または３３１の改変を報告している。文献４２では、改変する残基として、２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３３１、３３３および／または３３４が選択されている。文献４３では、ＦｃＲＩ、ＦｃＲＩＩ、ＦｃＲＩＩＩおよびＦｃＲｎ、これらの受容体にヒトＩｇＧが結合するために重要な残基のマッピングと同時に、ＦｃＲ結合特性が改良されたバリアントの設計も報告している。すべてのＣＨ領域はアイソタイプ間で置換可能である。たとえば、文献４４に開示しているような、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３領域（および随意にＣＨ２領域）をヒトＩｇＧのＣＨ３領域に置換した抗体では、凝集体形成が抑制される。文献４４において��、ヒトＩｇＧの４０９位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付け）のアルギニンをたとえばリジンに変異させると、凝集体形成の抑制が示されることを報告している。利用可能なモノクローナル抗体のＦｃ領域の変異によって、エフェクター機能が変化することが知られている。たとえば文献４５では、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）のＣ１ｑ結合を変化させるための変異の研究を報告している。文献４６では、Ｎｕｍａｘ（登録商標）のＦｃＲ結合を変化させるための変異の研究において、残基２５２、２５４および２５６の変異によって、抗原結合には影響を与えずに、ＦｃＲｎの結合が１０倍上昇することを報告している。
【００５３】
本発明の抗体は一般的にグリコシル化されるであろう。重鎖ＣＨ２領域にＮ結合型糖鎖を付加することによってグリコシル化された抗体は、たとえば、Ｃ１ｑやＦｃＲの受容体との親和性が低くなり、Ｃ１ｑ結合やＦｃＲ結合に影響を及ぼし得る（文献４３）。グリカンの構造も活性に影響を及ぼし得る。たとえば、グリカン二分岐鎖末端におけるガラクトース糖の数（０、１または２）によって、補体媒介の細胞死に相違がみられることもある。抗体のグリカンは、投与後にヒト免疫原生反応を誘引しないものが好ましい。
【００５４】
本発明の抗体は、本来は付随するであろう産物が存在しない状態で作製されてもよい。抗体の自然な混入物質には、酵素、ホルモン、または宿主細胞の他のタンパク質などが含まれる。
【００５５】
本発明の抗体は直接使用することが可能であり（たとえば、医薬品の有効性分、または診断薬として）、また開発研究の基礎としても利用可能である。たとえば、所望の特性を改良するために、抗体の配列改変または化学修飾をしてもよい。所望の特性とは、たとえば、結合親和性または結合力、薬物動態学的な特性（たとえば生体内での半減期）などである。このようにして抗体を改良する技法は、当技術分野で周知である。たとえば、抗体は「親和性成熟」の対象となってもよい。親和性成熟では、標的抗原に対する親和性を改良するために、（一般的には相補性決定領域内にある）１残基以上を変異させる。ランダム変異導入法または特異的変異誘導法を用いることができるが、文献４７では、ランダム点突然変異に代わる技法として、ＶＨ領域とＶＬ領域のシャフリングによる親和性成熟を記載している。文献４８では、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）の重鎖および軽鎖の相補性決定領域にｉｎ  ｖｉｔｒｏで親和性成熟を誘導して、Ｎｕｍａｘ（登録商標）を作製した方法について報告している。得られた抗体は力価が改良されて、ＲＳＶ  Ｆタンパク質への結合親和性が７０倍上昇している。
【００５６】
本発明の抗体は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルス由来の抗原に特異的なものであることが好ましい。したがって、抗体は、ヒトタンパク質のような任意の対照抗原よりも、このウィルス抗原に対してより高い結合親和性を有することになる。抗体が、標的抗原に対してナノモルまたはピコモル（たとえば、１０-９Ｍ、１０-10Ｍ、１０-11Ｍ、１０-12Ｍ、１０-13Ｍまたはそれ以上）の親和定数をもつことが好ましい。このような親和性は従来の解析技法を用いて測定できる。たとえば、メーカーの使用説明書に従って操作するとＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）測定器内で実施される、表面プラズモン共鳴技術を用いて測定できる。他の方法では、放射線標識した標的抗原（血球凝集素）を用いる放射線免疫測定法によって、結合親和性を測定することもある。
【００５７】
本発明の抗体は、分岐群１および／または２のＨ５亜型ウィルスを認識することができる。この抗体は、他の分岐群のＨ５亜型ウィルスも認識してもよい。いくつかの実施形態では、抗体が分岐群２を認識しなければならない。
【００５８】
文献４９では、Ｈ５血液凝集素と反応する、免疫測定機器用のモノクローナル抗体について開示している。
【００５９】
中和活性
本発明の抗体は、ヒトに感染する恐れのあるＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血球凝集素を中和するために利用することができる。したがって、この抗体は、ヒトを宿主としてウィルスが感染を開始および／または持続する能力を中和することができる。中和活性を測定するために、本明細書において記載しているマイクロ中和試験などの様々な試験方法が利用可能である。１００ＴＣＩＤ５０（５０％の組織細胞が感染するウィルス量）のＨ５Ｎ１型ウィルスのＭＤＣＫ細胞における感染力を、抗体が中和できることが好ましい。このような試験に使用するためのＨ５Ｎ１型ウィルスは、米国疾病予防管理センター（ＣＤＣ）のインフルエンザウィルス部門（ジョージア州、アトランタ）などのあらゆる適切な供給源から入手することができる。Ｈ５Ｎ１型ウィルスは、感染患者からも単離することができる。あるいは、逆遺伝学的な技法を用いて、Ｈ５亜型のＨＡとＮ１亜型のＮＡを他の６つのウィルスセグメントと組み合わせることによって単離することもできる。本発明のいくつかの実施形態では、インフルエンザ中和試験にウィルスを用いる代わりに、Ｈ５亜型インフルエンザのＨＡを有するレトロウィルスの偽型を用いることができる。
【００６０】
試験で用いられているＭＤＣＫ細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から、カタログ番号ＣＣＬ-３４で入手可能である。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態では、１００μｇ／ｍｌ以下の濃度（たとえば、７５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌまたはそれ以下）の抗体が、１００ＴＣＩＤ５０のＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和することができる。１００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以下の濃度でウィルスを中和できる抗体が特に好ましい。上記の濃度で、分岐群１および分岐群２のＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスそれぞれ１００ＴＣＩＤ５０を、独立に中和することができる抗体が特に有用である。
【００６２】
Ｈ５亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和できる抗体が、必ずしも他の１５種類の亜型の血球凝集素をすべて中和できないわけではない。いくつかの実施形態では、抗体が複数の血球凝集素亜型（たとえば全１６亜型）を中和することもある。他の実施形態では、抗体がＨ３Ｎ２亜型インフルエンザウィルスを中和しないこともある。他の実施形態では、抗体がＨ５亜型のみを中和することもある。
【００６３】
核酸および組換え抗体の発現
本発明には、本発明の抗体をコードする核酸配列も含まれる。本発明の抗体が２本以上の鎖（たとえば重鎖１本および軽鎖１本）を有する場合には、本発明にはそれぞれの鎖をコードする核酸が含まれる。本発明には、本発明の抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列をコードする核酸配列も含まれる。
【００６４】
これらの抗体をコードする核酸は、目的の抗体を発現する細胞、ウィルスまたはファージから調整することができる。たとえば、目的とする不死化Ｂ細胞から核酸（ｍＲＮＡ転写産物またはＤＮＡ）を調整した後、目的の抗体をコードする遺伝子をクローニングして、組換え発現に使用できる。組換え供給源からの発現は、Ｂ細胞やハイブリドーマからの発現に比べて安定で再現性があり培養も容易であるなどの理由から、医薬の用途により一般的に用いられている。Ｂ細胞から免疫グロブリン遺伝子を採取して核酸配列を決定する方法は、当技術分野で周知である（文献５１などを参照されたい）。したがって、培養、継代培養、クローニング、サブクローニング、核酸配列決定、核酸調整などの様々な工程を経て、目的の細胞またはファージで永続的に抗体を発現させることができる。本発明は、細胞、核酸、ベクター、配列、抗体など、このような工程で使用するものおよび調整するものすべてを含む。
【００６５】
本発明は、（ｉ）目的の抗体を発現している不死化Ｂ細胞クローンを作製する工程と、（ｉｉ）このＢ細胞クローンから目的の抗体をコードする核酸を採取する工程とを含む、目的の抗体をコードする１分子以上の核酸（たとえば、重鎖および軽鎖の遺伝子）の調整方法を提供する。工程（ｉｉ）において得られる核酸は、異なる細胞型に挿入してもよく、またはその核酸配列を決定してもよい。
【００６６】
本発明は、（ｉ）目的の抗体をコードするＢ細胞クローンから１つ以上の核酸分子（たとえば、重鎖および／または軽鎖の遺伝子）を採取する工程と、（ｉｉ）発現宿主内に核酸を挿入して宿主内で目的の抗体を発現させる工程とを含む、組換え細胞の作製方法も提供する。
【００６７】
同様に、本発明は、（ｉ）目的の抗体をコードするＢ細胞クローンから得られた核酸の配列を決定する工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）から得られた配列情報を利用して核酸を調整し、発現宿主内に挿入して宿主内で目的の抗体を発現させる工程とを含む、組換え細胞の作製法も提供する。
【００６８】
これらの方法で作製した組換え細胞は、発現および培養の目的で利用することができる。これらの組換え細胞は、抗体を発現させて大規模に医薬品を製造するために、特に有用である。
【００６９】
本発明は、細胞が抗体を産生するように細胞を培養する工程を含む、本発明の抗体の作製法を提供する。この方法が、細胞が産生した抗体を回収して精製抗体を提供するための工程をさらに含んでもよい。本明細書中の他の部分で記載されているように、これらの方法で用いられる細胞は、組換え細胞、不死化Ｂ細胞、または他のあらゆる適切な細胞であってよい。これらの方法で精製した抗体は、医薬組成物および／または診断組成物などに利用可能である。
【００７０】
組換え発現のための細胞には、細菌、酵母、および動物細胞、特に哺乳細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）寄託番号９６０２２９４０、文献５２）のようなヒト細胞、ＮＳＯ細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号８５１１０５０３）、またはＨＫＢ-１１細胞（文献５３、５４）など）、ならびに植物細胞を含む。本発明の抗体をグリコシル化することができて、特に、抗体に付加される糖鎖構造自体がヒトで免疫原生とならない発現宿主が好ましい（上記を参照されたい）。無血清の培地で増殖可能な発現宿主が好ましい。動物由来産物が存在しない培地で増殖可能な宿主が好ましい。
【００７１】
発現宿主を培養して、１つの株化細胞としてもよい。
【００７２】
本発明で使用する核酸を操作して、一部の核酸配列を挿入、欠失、または改良してもよい。これらの操作による変更には、制限酵素認識部位の導入、コドン使用頻度の改良、転写、および／あるいは翻訳調節配列の追加または最適化などを含むが、これらに限定されるものではない。また、核酸を変更して、コードするアミノ酸を変えることも可能である。たとえば、抗体のアミノ酸配列内に、１残基以上（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）のアミノ酸置換、１残基以上（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）のアミノ酸欠失、および／または１残基以上（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）のアミノ酸挿入をすることが有用である。このような点変異によって、エフェクター機能、抗原結合親和性、翻訳後修飾、免疫原生などの改良や、共有結合基（たとえば標識）を付加するためのアミノ酸の導入、または（たとえば精製用に）タグの導入をすることができる。変異は、部位特異的に導入してもよく、あるいは、ランダムに導入した後に（たとえば分子進化などで）選択してもよい。
【００７３】
本発明に記載の特定の核酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および／または１６の配列を１つ以上含む。
【００７４】
本発明の核酸は、（プラスミドのような）ベクター内に存在してもよい。たとえば、クローニングベクター内や発現ベクター内などに存在してもよい。したがって、目的のアミノ酸配列をコードしている配列は、転写を適切に制御するために、プロモーターの下流にあってもよい。本発明は、このようなベクターを提供し、これらのベクターを含有している細胞も提供する。
【００７５】
本発明は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血球凝集素を中和可能な抗体を分泌できるヒト不死化Ｂ細胞も提供する。本発明は、本発明の抗体を分泌できるヒト不死化Ｂ細胞も提供する。
【００７６】
医薬組成物
医薬品の有効成分としての抗体の利用は広く普及していて、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）、Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）（ダクリズマブ）などの製品が含まれる。Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）およびＮｕｍａｘ（登録商標）（モタビズマブ）は、呼吸器疾患予防に特に効果的である。したがって、本発明者は、１つ以上の抗体を含有する医薬組成物を提供する。医薬品等級用にモノクローナル抗体を精製する技法は、当技術分野で周知である。
【００７７】
分岐群１のＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和可能な少なくとも１つの抗体と、分岐群２のＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和可能である少なくとも１つの抗体の組合せは、特に有用である。Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスの血球凝集素上の異なるエピトープにそれぞれ結合する２つの抗体を含む組合せも有用である。これらの組合せの抗体は、併行分離投与または連続投与によって患者に投与してもよい。
【００７８】
したがって、たとえば、本発明者はＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和可能な第１のヒトモノクローナル抗体、およびＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和可能な第２のヒトモノクローナル抗体を含む医薬組成物を提供する。このとき、第１および第２の抗体は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルス血球凝集素上の異なるエピトープに独立して結合する。第１および第２の抗体が、協力して、分岐群１と分岐群２のＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを中和してもよく、かつ／または２つの抗体が同じＨ５血球凝集素上の異なるエピトープに独立して結合してもよい。
【００７９】
（たとえば受動免疫法などで）抗体を有効成分として患者に送達することに代わる方法として、（たとえば能動免疫法などで）本発明の抗体に認識するエピトープを含有するペプチドを送達することができる。したがって、本発明の医薬組成物は、ＦＬＡ５．１０、ＦＬＤ２１．１４０、ＦＬＡ３．１４、ＦＬＤ２０．１９、ＦＬＤ８４、ＦＬＤ９３、ＦＬＤ１２２、ＦＬＤ１２７、ＦＬＤ１２９、ＦＬＤ１３２およびＦＬＤ１９４からなる群から選択される抗体により認識されるエピトープを含有しているポリペプチドを含んでいてもよい。ポリペプチドはＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２のペプチドの全長より短いものであってもよい。
【００８０】
抗体を送達する、さらに別の方法として、患者のｉｎ  ｓｉｔｕで発現できるような抗体をコードする核酸を送達することが可能である。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の抗体をコードしている核酸を含んでいてもよい。核酸は複製ベクターまたは非複製ベクターの形状であってもよい。ウィルスベクターまたは非ウィルスベクターを使用してもよい。適した遺伝子治療および核酸送達ベクターは、当技術分野で周知である。
【００８１】
医薬組成物は、一般的に医薬的に許容可能な１つ以上の担体および／または賦形剤を含有する。文献５５では、これらの成分について詳細に検討している。これらの成分には、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体が含まれていてもよい。さらに、この組成物の中には、湿潤剤や乳化剤やｐＨ緩衝剤のような、補助的な物質が含まれていてもよい。
【００８２】
医薬組成物は、様々な形状で調合してもよい。たとえば、液状の溶液または懸濁液として注射可能な形状などでもよい。注射前に液体溶媒中で溶解または懸濁をするのに適した固体の形状で調合してもよい（たとえば、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）やＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のように、任意に防腐剤を含み、滅菌水や緩衝液で再構成するために凍結乾燥された組成物）。局所投与のために、たとえば、軟膏、クリーム、または粉末剤として、組成物を調合してもよい。経口投与のために、たとえば、錠剤、カプセル剤、噴霧剤または（任意で風味をつけた）シロップ剤として、組成物を調合してもよい。この場合には、一般的に、有効成分が分解されるのを防ぐための物質を含むことになるであろう。肺内投与のために、たとえば、微細粉末剤や噴霧剤を用いた吸入器として、組成物を調合してもよい。坐剤や膣坐剤として組成物を調合してもよい。経鼻投与、経耳投与または経眼投与のために、たとえば滴下剤として、組成物を調合してもよい。使用時に（たとえば滅菌水や滅菌緩衝液で）再構成してから患者に投与する組成物の組合せとして設計したキットの形状で、組成物を調合してもよい。たとえば、抗体を乾燥させた形状で提供することができる。
【００８３】
抗体を投与するための好ましい薬剤的形状には、たとえば大量瞬時投与または持続点滴投与のような、注射または点滴などによる非経口投与に適した形状が含まれる。医薬製品が注射用または点滴用である場合、油性溶媒中または水性溶媒中の懸濁液、溶液、または乳濁液の形状であってもよく、薬剤を懸濁し、防腐し、安定化し、かつ／または分散させるような担体／賦形剤を含有してもよい。
【００８４】
医薬組成物は、一般的にｐＨ５．５〜８．５であり、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくは約７である。ｐＨは緩衝液によって一定に保たれる。
【００８５】
医薬組成物は、通常滅菌される。医薬組成物は一般的に非発熱性であり、たとえば、１用量あたり１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準測定値）未満、好ましくは１用量あたり０．１ＥＵ未満である。無グルテン医薬組成物が好ましい。医薬組成物はヒトに対して実質的に等張であってもよい。
【００８６】
組成物は抗菌剤および／または防腐剤を含有してもよい。
【００８７】
組成物は界面活性剤を含有してもよい。界面活性剤を有する場合、一般的には、たとえば０．０１％未満のような低レベルで用いられる。
【００８８】
組成物には、浸透圧を与えるためにナトリウム塩（塩化ナトリウムなど）を含有させてもよい。１０±２ｍｇ／ｍｌの濃度のＮａＣｌが一般的である。
【００８９】
組成物は、糖アルコール（マンニトールなど）または二糖類（スクロースまたはトレハロースなど）を１５〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲（たとえば２５ｍｇ／ｍｌ）で含有してもよい。これは、組成物が、凍結乾燥した組成物または凍結乾燥してから再構成した物質を含む組成物である場合には、特に好ましい。
【００９０】
組成物は、ヒスチジンなどの遊離アミノ酸を含有してもよい。たとえば、文献５６では、水性担体の中にヒスチジンを含有させてＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）抗体を改良した水性製剤を開示している。
【００９１】
医薬組成物は、効果的な分量の有効成分を含有するであろう。当然ながら、有効成分の濃度は、送達される組成物の量により変化する。また、抗体を主成分とする既知の医薬品は、この点について指針を提供している。たとえば、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）は、５０ｍｇの抗体を０．５ｍｌに、または１００ｍｇの抗体を１．０ｍｌに再構成することが規定されている。推奨される用量に基づいて適切量が患者に送達される。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、調製後、被験者に直接投与することができる（下記を参照されたい）。この医薬組成物は、ヒトの被験者に対する投与に適合していることが好ましい。この医薬組成物は、一般的に液状（水溶液など）であろう。
【００９３】
抗体を含有する組成物、特に医薬組成物においては、抗体の質量パーセント濃度が、全タンパク質のうち少なくとも５０％（たとえば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）で調合することが好ましい。したがって、抗体は精製されている。
【００９４】
本発明の医薬組成物は、気密密封容器に入れて供給されることが好ましい。
【００９５】
本発明は、本発明の抗体と薬剤的に許容可能な１つ以上の成分とを混合する工程を含む医薬組成物の調合方法も提供する。
【００９６】
医学的な処置と用法
本発明の抗体は、特にヒトにおける、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスによって引き起こされる疾患の治療および／または予防に利用してもよい。したがって、本発明は療法用に本発明の抗体を提供する。さらに、処置する患者に本発明の抗体を投与する過程を含む、患者の処置法を提供する。さらに、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスが引き起こす疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造における、本発明の抗体の利用を提供する。さらに、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスが引き起こす疾患の治療および／または予防に利用するための本発明の抗体も提供する。
【００９７】
本発明者は、併行分離投与または連続投与のための第１および第２の抗体も提供する。いくつかの実施形態では、上記のように、第１および第２の抗体が、協力して分岐群１と分岐群２のウィルスを中和できる。いくつかの実施形態では、上記のように、第１および第２の抗体が同じＨ５血球凝集素上の異なったエピトープに結合する。
【００９８】
本発明者は、組み合わせて療法に用いるための前記第１の抗体および前記第２の抗体も提供する。本発明者は、療法に用いるための前記第１の抗体および前記第２の抗体の組合せも提供する。本発明者は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスが引き起こす疾患の治療法および／または予防法に用いるための前記第１の抗体および前記第２の抗体も提供する。
【００９９】
本発明者は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスが引き起こす疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造における前記第１の抗体および前記第２の抗体の利用を提供する。本発明者は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスが引き起こす疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造における前記第１の抗体の利用であって、この薬剤を前記第２の抗体と共に投与するために調合する場合の前記第１の抗体の利用も提供する。同様に、本発明者は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスが引き起こす疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造における前記第２の抗体の利用であって、この薬剤を前記第１の抗体と共に投与するために調合する場合の前記第２の抗体の利用も提供する。
【０１００】
本発明者は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスが引き起こす疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造における前記第１の抗体の利用であって、この患者が事前に第２の抗体で処置を受けている場合の前記第１の抗体の利用も提供する。同様に、本発明者は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスが引き起こす疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造における前記第２の抗体の利用であって、この患者が事前に第１の抗体で処置を受けている場合の前記第２の抗体の利用も提供する。事前に処置を受けている患者が、あらかじめ投与された抗体を体内血液循環中に保持したままであってもよい。
【０１０１】
本発明者は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスが引き起こす疾患の治療法および／または予防法に用いるための前記第１の抗体であって、前記第１の抗体を前記第２の抗体と共に投与する（または投与のために調合する）場合の前記第１の抗体も提供する。本発明者は、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスが引き起こす疾患の治療法および／または予防法に用いるための前記第２の抗体であって、前記第２の抗体を前記第１の抗体と共に投与する（または投与のために調合する）場合の前記第２の抗体も提供する。
【０１０２】
抗体の治療的な用途は、ヒト以外の生物種（一般的に鳥類）からのＨ５Ｎ１型ウィルスの人畜共通感染症と、Ｈ５Ｎ１型インフルエンザの世界的な大流行の発生との両方に関連がある。
【０１０３】
抗体は免疫学的予防（受動免疫法）および／または免疫療法に用いることができる。たとえば中和試験などで血中循環抗体レベルを検査することによって、患者に感染試験をさせることなく予防有効性を確認することができる。本発明の医薬組成物を投与した後の治療有効性を確認するために、Ａ型インフルエンザ感染症の存在および／または重篤性を評価するためのあらゆる方法を用いることができる。このような方法は、抗ウィルス薬やワクチンの分野において、インフルエンザに対してよく用いられている。
【０１０４】
Ｈ５Ｎ１型感染の危険性が特に高い患者群、または特に感染しやすい患者群が処置対象となることもある。このような被験者群には、ＨＩＶ患者または臓器移植患者のような免疫抑制治療中の患者などの免疫無防備状態の被験者、高齢者（５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、乳幼児（５歳以下）、入院患者、医療従事者、軍務関係者および軍人、妊婦、慢性疾患患者、免疫不全患者、抗ウィルス剤（たとえば、オセルタミビル組成物またはザナミビル組成物）をワクチン接種の７日前以降に服用している患者、抗ウィルス剤で治療を受けているが抗ウィルス反応が十分ではない患者、および海外渡航者が含まれるが、これに限られるものではない。
【０１０５】
本発明の医薬組成物は、あらゆる方法によって投与してもよく、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、経皮的塗布、経口、局所、皮下、経鼻、腸内、舌下、膣内または直腸などの投与方法が含まれるが、これに限られるものではない。皮下噴射器も本発明の医薬組成物の投与に利用してもよい。一般的に、治療組成物は溶液または懸濁液のように、注射剤として調合されてもよい。注射前に液体溶媒中で溶解または懸濁をするのに適した固体の形状で調合してもよい。
【０１０６】
組成物は一般的に、皮下、腹腔内、静脈または筋肉内に注射することにより直接的に送達されるか、あるいは組織の間質腔に直接的に送達されるであろう。組成物は、患部内に投与することもできる。投与処置は、単回または複数回で行われる。抗体を主成分とする既知の医薬品は、投薬頻度に関する指針を提供している。これは、たとえば、医薬品が毎日、毎週、毎月などの間隔で送達されるべきかどうかといった指針である。頻度および用量は、症状の重症度によって決まることもある。
【０１０７】
患者は、有効成分の効果的な用量、すなわち、Ｈ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルス感染の治療、改善または予防にじゅうぶんな用量を投与される。治療効果には、身体症状の緩和も含まれる。あらゆる特定の被験者それぞれの最適有効量は、被験者の体格と健康状態、疾患の性質および程度、投薬のために選択される療法または療法の組合せなどによって決まるであろう。ある状況下で投与される効果的な量は、ルーチン試験によって決まり、かつ臨床医の判断に委ねられている。本発明の目的で、投与される本発明組成物の有効用量は、一般的に約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇである。抗体を主成分とする既知の医薬品は、この点についての指針を提供しており、たとえば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は２１ｍｇ／ｍｌ溶液を静脈内注入で初回投与は４ｍｇ／ｋｇ（体重）を、２回目以降は２ｍｇ／ｋｇ（体重）を１週間間隔で投与する。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）は３７５ｍｇ／ｍ２を１週間間隔で投与する。Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）は、一般的にＲＳウィルス流行期に月に１度、１５ｍｇ／ｋｇ（体重）を筋肉内投与する。
【０１０８】
本発明の抗体は、他の療法と共に（組合せてまたは独立で）投与されてもよい。たとえば、インフルエンザウィルスに対して有効な抗ウィルス組成物（オセルタミビルまたはザナミビル）である。これらの抗ウィルス組成物には(3R,4R,5S)-4-アセチルアミノ-5-アミノ-3(1-エチルプロポキシ)-1-シクロヘキセン-1-カルボン酸、または5-(アセチルアミノ)-4-[(アミノイミノメチル)-アミノ]-2,6-アンヒドロ-3,4,5-トリデオキシ-D-グリセロ-D-ガラクトノン-2-エノン酸などのノイラミニダーゼ阻害剤が含まれ、これらのエステル（エチルエステル）や塩（リン酸塩）も含まれる。より好ましい抗ウィルス組成物は(3R,4R,5S)-4-アセチルアミノ-5-アミノ-3(1-エチルプロポキシ)-1-シクロヘキセン-1-カルボン酸エチルエステルリン酸塩 (1:1)で、オセルタミビルリン酸塩（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））としても知られている。このような組合せ療法は治療効果において相乗的向上をもたらす。このような抗ウィルス剤は、組合せ療法において、１つ以上の本発明の抗体（本発明で開示されている範囲内）を共に投与する場合に、特に有用である。
【０１０９】
診断
治療的に有効であるだけでなく、本発明の抗原結合活性（非中和抗体を含む）は、診断にも利用可能であることを意味する。抗体は免疫測定法、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などに用いられてもよい。したがって、本発明の抗体は固相担体に吸着させてもよい。固相に吸着させることで、診断試験における抗体の用途を広げることができる。標的抗原の精製においても、その用途を広げることができる。
【０１１０】
本発明の抗体は、放射線同位体、蛍光分子、または酵素のように、解析によって検出可能な試薬で標識してもよい。標識することによって、診断試験における抗体の用途を広げることができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗原性または免疫原生ペプチドを、スクリーニングおよび／または同定するための免疫測定法に用いることができる。たとえば、患者に投与した時に、抗ＨＡ反応を誘引するペプチドを同定する場合である。
【０１１２】
全般
「含む（comprising）」は、「含む（including）」および「からなる（consisting）」を包含する。たとえば、「Ｘを含む」はもっぱらＸを含むか、Ｘ＋Ｙのように他のものが加わっていてもよい。「実質上」は「完全」を除外しない。たとえば、「実質上」Ｙを含まない組成物は、「完全に」Ｙを含まない可能性があり、本発明の記述で「実質上」という言葉は省略されている場合がある。
「およそ」、「約」という言葉は、数値Ｘとの関係を指し、たとえばＸ±１０％である。
本発明の異なる工程は、任意で異なる時に、異なる人が、異なる場所（異なる国など）で、行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、免疫学的予防試験（カプラン-マイヤー生存曲線）における、感染（０日目）から１５日間にわたる生存マウスの割合（％）を示す。
【図２】図２は、予防学的試験における、マウスの脳、脾臓および肺組織でのウィルス力価（組織グラムあたりのｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の値）の平均値を示す。Ｄ２．２（対照）、ＦＬＡ３．１４およびＦＬＡ５．１０の抗体のデータを、感染後２日後および４日後について示す。アスタリスクは統計的有意性を示す（*＝Ｄ２．２に対してＰ＜０．０１、**＝Ｄ２．２に対してＰ＜０．００１）。矢印は、試験での検出の下限を示す（１．５ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｇ）。
【図３】図３は、マウスからの肺組織における免疫組織化学的解析を示す。パネルＡおよびＣはＦＬＡ５．１０抗体で処理したマウスからの肺組織を示す。パネルＢ及Ｄは無処理の対照マウスからの肺組織を示す。パネルＥおよびＦはパネルＢおよびＣの拡大図を示す。Ｂｒは細気管支を指す。
【図４】図４は血清療法における、図１と同様のデータを示す。
【図５】図５は血清療法における、図１と同様のデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
不死化Ｂ細胞の作製
４名の成人がＨＰＡＩ（病原性の高い鳥インフルエンザ）Ｈ５Ｎ１感染と診断された。回復期初期（疾患発症後１〜４ヶ月）に、すべての被験者から、自己のウィルスに力価のある中和抗体が検出された。記入済みのインフォームド・コンセントを患者から受け取った後に、４名全員から血液を採取した。
【０１１５】
凍結した抹消血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍し、ＣＤ２２、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡに対する抗体で染色した。ＦＡＣＳＡｒｉａ機器を用いてＣＤ２２＋、ＩｇＭ-、ＩｇＤ-、ＩｇＡ-のＢ細胞を単離した。ＣpＧオリゴデオキシヌクレオチド２００６および放射線照射した同種異系のＰＢＭＣ存在下でＥＢＶを用いて、３０細胞／ウェルでＢ細胞を不死化した（文献８）。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０（ｃＲＰＭＩ）完全培地で細胞を培養した。１４日後に培養液の上清を回収して、中和活性をスクリーニングした。
【０１１６】
本質的に文献５８で記載されているように、ＭＤＣＫ細胞を用いて、１００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）用いて、マイクロ中和試験で中和を評価した。簡潔に述べると、無希釈の上清を１００ＴＣＩＤ５０のウィルスと共に室温で１時間培養した後に、単層のＭＤＣＫ細胞を加えた。単層細胞をさらに２〜３日培養し、細胞変性効果（ＣＰＥ）を測定した。終点中和抗体力価の測定も同様に行った。ただし、１００ＴＣＩＤ５０のウィルスと混合する前に、血漿または上清サンプルを２倍希釈した。血漿サンプルは初回希釈１：１０で測定し、一方上清サンプルは初回希釈１：８で測定した。感染力の残存性は１希釈あたり４ウェルで測定した。中和抗体力価は、ＭＤＣＫ細胞に対して１００ＴＣＩＤ５０の感染力を有する適切な野生株のＨ５Ｎ１亜型ウィルスを、ウェルの５０％で完全に中和することのできる血清の最高希釈率の逆数で定義される。感染力は４日目のＣＰＥの有無によって確認され、力価はＲｅｅｄ-Ｍｕｅｎｃｈ法によって算出した。
【０１１７】
測定可能な中和活性を有する培養液は、ＣｐＧ２００６および照射ＰＢＭＣ存在下で、希釈を０．５細胞／ウェルに制限することによりクローン化した。Ｂ細胞クローンは、ＣＥＬＬｉｎｅ  Ｔｗｏ−Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ内でＩｇ除去されたＦＣＳ１０％含有ｃＲＰＭＩ培養液で高密度培養して、１〜３ｍｇ／ｍｌの抗体が濃縮された上清を産生させた。抗体はさらに、プロテインＧカラムで精製した。抗体のアイソタイプ、サブクラス、および軽鎖は、特殊な抗体およびＨＲＰ標識抗ヒトＩｇ抗体を利用したＥＬＩＳＡにより、特徴付けした。抗体は標準認定試薬（シグマ−アルドリッチ、ブーフス、ザンクト・ガレン州）で定量化した。
【０１１８】
中和ヒト抗体を産生する、いくつかの独立したクローンを単離した。ＥＬＩＳＡではＨ５-ＨＡを認識するが生存ウィルスは中和できない抗体を産生するクローンも、各患者から確認された。ＦＬＡ３．１４、ＦＬＡ５．１０、ＦＬＤ２０．１９、ＦＬＤ２１．１４０と名付けた４クローンを選抜して、これ以降の試験に用いた。すべてのクローンは、ベトナムで単離された分岐群１のＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスに対する中和活性を有するＩｇＧ１抗体を分泌した。Ｈ５Ｎ１亜型分岐群１の異なる３株の１００ＴＣＩＤ５０に対するヒト抗体の中和抗体力価を記録した。
【０１１９】
【表１２】
2010521147.tif 000013
【０１２０】
ＦＬＡ５．１０およびＦＬＤ２１．１４０は、分岐群１のＨ５Ｎ１亜型の基準株に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏでの中和活性を示した。ＦＬＤ２１．１４０は、ＦＬＡ５．１０、ＦＬＡ３．１４およびＦＬＤ２０．１９より高い活性を持ち、分岐群１および２の両方のＨ５Ｎ１亜型の基準株に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏでの中和活性を示した。ＦＬＤ２０．１９は特に分岐群１および２のＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスに非常に効果的だった。Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウィルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｌｎｉａ／７／０４を中和した抗体はなかった。中和抗体力価は次の通りである。抗体濃度は１ｍｇ／ｍｌに標準化した。
【０１２１】
【表１３】
2010521147.tif 000014
【０１２２】
他の一連のモノクローナル抗体は、４名のうち１名の提供者の凍結ＰＢＭＣから単離したＢ細胞から作製した。中和抗体を産生するいくつかの独立クローンを単離した。ＦＬＤ８４、ＦＬＤ９３、ＦＬＤ１２２、ＦＬＤ１２７、ＦＬＤ１２９、ＦＬＤ１３２、およびＦＬＤ１９４と名付けた７つのクローンを、これ以降の試験に用いるために選抜した。ＦＬＤ１２７、ＦＬＤ１２９およびＦＬＤ１３２は、分岐群１のＨ５Ｎ１亜型基準株に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの中和活性を示した。ＦＬＤ１３２およびＦＬＤ１２９は、ＦＬＤ１２７、ＦＬＤ８４、ＦＬＤ９３、ＦＬＤ１２２およびＦＬＤ１９４よりも高い活性を有し、分岐群１および２のＨ５Ｎ１亜型基準株に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの中和活性を示した。ＦＬＤ１９４、およびＦＬＤ１２２は、特に分岐群１および２のＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスに非常に効果的だった。
培養液上清の中和抗体力価は次の通りである。
【０１２３】
【表１４】
2010521147.tif 000015
*これらのFLD20.19力価と前出データは直接比較できない。
異なる初期抗体濃度および異なるウィルス量が用いられている。
【０１２４】
特に、ＦＬＤ１２２およびＦＬＤ１９４は、先の選抜で単離された最良のモノクローナル抗体により示されたもの（ＦＬＤ２０．１９）に匹敵する効能で、３つのウィルスを中和した。
【０１２５】
マウスにおける予防的および治療的血清療法
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、アジアで１９９７年から２００３年までに単離されたＨ５Ｎ１亜型ウィルスＨＰＡＩ（病原性の高い鳥インフルエンザ）に、非常に感染しやすい。ウィルスの経鼻投与後、アジアで１９９７年から単離されたＨ５Ｎ１亜型ウィルスは、マウスの肺で高い力価で複製し、一部のウィルスは肺外部位に広がり、マウスにとって致死的となる。抗Ｈ５Ｎ１ヒト抗体の、ウィルス暴露前の予防またはウィルス暴露後の免疫治療の有効性を調査するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに抗体で受動免疫後、抗体接種から２４時間後にＡ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１亜型）への経鼻投与、またはＡ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１亜型）の経鼻投与し２４、４８、または７２時間後に抗体注入を行った。すべての実験で４〜８の群のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢）を用いた。マウスの接種と組織の回収はバイオセーフティーキャビネットでろ過式呼吸用保護装備を着用した者により行われた。
【０１２６】
予防効果を測定するために、段階的な抗体量１ｍｌのＦＬＡ３．１４またはＦＬＡ５．１０モノクローナル抗体、またはＡ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１亜型）の組換え型ＨＡに対して作製したヒツジ過免疫血清、をマウス腹腔内に注入した。対照として、ヒトモノクローナル抗体Ｄ２．２（ジフテリア毒素特異的）またはＡ１４６（炭疽防御抗原特異的）をマウスに投与した。腹腔内投与から２４時間後、中和抗体力価測定のためマウスから採血し、その後１０５ＴＣＩＤ５０のＡ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１亜型）５０μｌを経鼻注入した。ウィルス感染の前後日でマウスの観察と体重測定を行った。図１に示すように、抗Ｈ５ポリクローナル過免疫抗体を注入したマウスは完璧にウィルスから保護された。予防効果の試験において、ＦＬＡ５．１０で処理したすべてで、１００％致死が回避された。ＦＬＡ３．１４も致死が回避されたが、効果は低く、抗体量依存的であった。最高抗体量のＦＬＡ３．１４を投与したマウスは、致死をほとんど完全に回避した。最小抗体量のＦＬＡ３．１４（１ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウスは、死亡までの時間は遅くなったが、致死感染を防ぐことはできなかった。ｉｎ  ｖｉｖｏでＦＬＡ５．１０はＦＬＡ３．１４よりも強い効力を有するというデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／０４に対する中和抗体力価と合致している（上記参照）。
【０１２７】
ＦＬＡ３．１４およびＦＬＡ５．１０の抗体がどのようにして致死を回避するのかを調べるために、受動免疫させたマウスにおける動態研究を行った。ＦＬＡ３．１４、ＦＬＡ５．１０またはＤ２．２で受動免疫させたマウスに、２４時間後にＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）を感染させた。２日後および４日後のマウスを死亡させ、肺、脳および脾臓を無菌で取り出した。組織は、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ-１５培地で均質化した。培地には抗生・抗真菌溶液を、肺破砕液（１０％  ｗ／ｖ）、脾臓破砕液（５％  ｗ／ｖ）および脳破砕液（１０％  ｗ／ｖ）となるように添加した。その後、各組織４つのＭＤＣＫ単層細胞で力価評価を行った。力価はＲｅｅｄ-Ｍｕｅｎｃｈ法で計算し、組織ｇあたりのｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０で表した。図２は、２日目および４日目で、ＦＬＡ３．１４およびＦＬＡ５．１０の抗体を投与されたマウスの脳、脾臓および肺組織の方が、Ｄ２．２対照抗体を投与されたものよりも、顕著にウィルスが少なかったことを示す。
【０１２８】
病理学的試験を行うために、マウスの解剖を行い、肺を１０％中性ホルマリン溶液で膨張させ、パラフィンに包埋し、切片を作製した。スライドはヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。Ｈ５抗原に対する免疫染色を行うために、パラフィン切片を作製した。染色はヤギ抗体を用い、ヤギ抗鳥インフルエンザＨ５抗体を１：１０００に希釈し、ベクター社の抗ヤギ２次抗体、色素原としてジアミノベンチジン、および対比染色としてヘマトキシリンを用いてＡＢＣ免疫組織染色を行なった。図３は、ＦＬＡ５．１０でウィルス感染予防されたマウスは、肺気道および実質組織に劇的な病理学的変化が少なかったことを示す。したがって、予防的にＦＬＡ５．１０を投与したマウスからの肺組織切片における、ネクローシスのある異常な細気管支およびウィルスＨＡ抗原の割合（１３％）は、対照マウス（８０％）と比較して低かった（図３のパネルＡとＣ対パネルＢとＤ、またはパネルＡとＣ対パネルＥとＦ）。同様に、肺組織切片の免疫染色でＨ５抗原が多く検出された炎症性間質（Ｉ）病変は、ＦＬＡ５．１０を投与したマウスの方がＤ２．２対照抗体を投与したマウスより少なかった（１対１０＋）。これらのデータにより、ＦＬＡ３．１４またはＦＬＡ５．１０は、肺でのウィルス複製の制限、ウィルスが引き起こす肺症状の減弱、および離れた臓器への肺外転移を克服することで、おそらく死亡を回避していることを示唆している。
【０１２９】
確立した感染の減退化は、Ｈ５Ｎ１に対する抗ウィルス治療の臨床に関連のある終点を示す。この目的のために、ＦＬＡ３．１４、ＦＬＡ５．１０、ＦＬＤ２０．１９およびＦＬＤ２１．１４０（１ｍｇ／マウスを腹腔内注入）での処理の有効性を、５ＬＤ５０のＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４ウィルスを２４、４８および７２時間前に経鼻投与したＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて測定した。図４は、ＦＬＡ３．１４、ＦＬＡ５．１０、ＦＬＤ２０．１９およびＦＬＤ２１．１４０がＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４ウィルスに全時点で感染したマウスにおいて死亡を強力に回避しており、対照抗体（Ｄ２．２）では死亡回避がないことが示されている。Ｈ５Ｎ１分岐群２からの抗原的に多岐となるＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５感染に対するＦＬＡ３．１４、ＦＬＡ５．１０およびＦＬＤ２０．１９抗体の治療効果も調べた。図５は、ＦＬＡ３．１４およびＦＬＤ２０．１９がＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５ウィルスに２４時間目に感染したマウスにおいて死亡を強力に回避しており、ＦＬＡ５．１０および対照抗体（Ｄ２．２）では死亡回避がないことが示されている。この結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの中和データと合致している。これらのデータは、マウスモデルにおいて感染から７２時間以内のモノクローナル抗体治療は伝染力の強いＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスからの生存を顕著に改善可能であるという、考えを立証している。重要なことに、これらのデータは、たとえば共通のエピトープによって生じた抗体を用いて、分岐群２のＨ５Ｎ１亜型ウィルスに対して交差的に死亡回避可能であることが暗示する。
【０１３０】
Ｈ５Ｎ１亜型ウィルスパネルに対するモノクローナル抗体の反応幅
モノクローナル抗体中和の交叉反応性の幅を、偽型レトロウィルスを用いて調べた。ＨＡオープン・リーディング・フレーム翻訳領域全長を含む分岐群１、２．１、２．２、および２．３のＨ５Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウィルスを用いた。データはｎｇ／ｍｌで表されたＩＣ５０値を示している。
【表１５】
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【０１３１】
ＦＬＤ２０．１９に加えて、他の２つのモノクローナル抗体（ＦＬＤ１２２およびＦＬＤ１９４）も、試験した様々な分岐群のすべてのウィルスを高い力価で中和可能な、幅広い反応性を示した。
【０１３２】
抗体の特徴付け
ＦＬＡ５．１０、ＦＬＤ２１．１４０、ＦＬＡ３．１４およびＦＬＤ２０．１９の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子の配列決定をした（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６）。コードされているアミノ酸配列を推定し（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５）、ＩＭＧＴ番号付け系を用いて相補性決定領域のアミノ酸残基を決定した（文献１９〜２１）（配列番号１７〜４０）。
【０１３３】
ＦＬＤ８４、ＦＬＤ９３、ＦＬＤ１２２、ＦＬＤ１２７、ＦＬＤ１２９、ＦＬＤ１３２およびＦＬＤ１９４の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子の配列決定をした（配列番号４１、４３、５１、５３、６１、６３、７１、７３、８１、８３、９１、９３、１０１、１０３）。コードされているアミノ酸配列を推定し（配列番号４２、４４、５２、５４、６２、６４、７２、７４、８２、８４、９２、９４、１０２、１０４）、ＩＭＧＴ番号付け系を用いて相補性決定領域のアミノ酸残基を決定した（文献１９〜２１）（配列番号１７〜４０）。（配列番号４５〜５０、５５〜６０、６５〜７０、７５〜８０、８５〜９０、９５〜１００、１０５〜１１０）。
【０１３４】
特異性が重複しない抗体を同定するために、交叉阻害実験を行った。ＦＬＤ２０．１９、ＦＬＡ３．１４、およびＦＬＤ１９４．１１０に対する競合性を様々な抗体で試験した。阻害％は以下の通りである。
【表１６】
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【０１３５】
このように、ＦＬＤ２０．１９とＦＬＤ１９４はＨＡ結合で交叉競合はしておらず、よって、明確に異なる、重ならないエピトープを認識しているはずである。したがって、これらの抗体は、エスケープ変異体を封じ込めるために、組み合わせて用いることができる。
【０１３６】
本発明が一例としてのみ説明されるものであり、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲において、変更をする可能性もあることを理解されたい。
【０１３７】
【表１７−１】
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【０１３８】
【表１７−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年11月17日(2009.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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