(57)【要約】  本発明は、クルクマ・キサントリーザ（Curcuma xanthorrhiza）の抽出物、またはその抽出物から単離した化学式１2010530412.tif 000013で示されるキサントリゾール（xanthorrhizol）の新規使用に関するものである。本発明のクルクマ・キサントリーザの抽出物、またはキサントリゾールはコラーゲン分解酵素−１（ＭＭＰ−１，マトリクス・メタロプロテイナーゼ−１；matrix metalloproteinase-1）の抑制能力、及び新生コラーゲン（タイプ−１・プロコラーゲン；type-1 procollagen）合成能力を有し、皺を改善させる効果を有する。従って、本発明のクルクマ・キサントリーザの抽出物またはキサントリゾールは、光老化で形成される皺の治療または予防に極めて有用に使用し得る。
2010530412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式１
【化１】
2010530412.tif 000012
で示されるキサントリゾール（xanthorrhizol）を有効成分として含有する皮膚皺改善用組成物。
【請求項２】
化学式１で示されるキサントリゾールの皮膚皺改善用製剤の製造のための使用。
【請求項３】
化学式１で示されるキサントリゾールのコラーゲン合成誘導剤の製造のための使用。
【請求項４】
化学式１で示されるキサントリゾールのコラーゲン分解抑制剤の製造のための使用。
【請求項５】
化学式１で示されるキサントリゾールを、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とする皮膚皺改善方法。
【請求項６】
化学式１で示されるキサントリゾールを、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とするコラーゲン合成誘導方法。
【請求項７】
化学式１で示されるキサントリゾールを、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とするコラーゲン分解抑制方法。
【請求項８】
クルクマ・キサントリーザ（Curcuma xanthorrhiza）の抽出物を有効成分とする皮膚皺改善用組成物。
【請求項９】
クルクマ・キサントリーザ抽出物の皮膚皺改善用製剤の製造のための使用。
【請求項１０】
クルクマ・キサントリーザ抽出物のコラーゲン合成誘導剤の製造のための使用。
【請求項１１】
クルクマ・キサントリーザ抽出物のコラーゲン分解抑制剤の製造のための使用。
【請求項１２】
クルクマ・キサントリーザ抽出物を、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とする皮膚皺改善方法。
【請求項１３】
クルクマ・キサントリーザ抽出物を、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とするコラーゲン合成誘導方法。
【請求項１４】
クルクマ・キサントリーザ抽出物を、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とするコラーゲン分解抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クルクマ・キサントリーザ（Curcuma xanthorrhiza）の抽出物及びキサントリゾール（xanthorrhizol）の新たな使用に関する。さらに詳しく言えば、クルクマ・キサントリーザの抽出物または下記化学式１で示されるキサントリゾールを有効成分として含む皮膚皺改善用組成物、前記抽出物または化合物の皮膚皺改善、コラーゲン合成誘導またはコラーゲン分解抑制の使用、及び前記抽出物または化合物のコラーゲン合成を誘導するか、コラーゲン分解を抑制する皮膚皺改善方法に関する。
【化１】
2010530412.tif 000003
【背景技術】
【０００２】
通常、皺は、長期にわたって繰返される筋肉運動により形成される、皮膚の自然な老化現象の一つである。皮膚老化は、内因性老化と外因的老化とに大別され、内因性老化は遺伝的要因によるものであることから調節が難しいものの、外因的老化は環境的要因によるものであるため、人為的な調節が容易である。従って、外因的老化を防止するための研究が行われ、特に長期間の紫外線露出により進行する外因性光老化に伴う皺形成を防止するための研究が注目されている（Gilchre st B. A., J. Am. Acad. Dermatol., 1989: 21: 610-613：非特許文献１）。
【０００３】
外因性皮膚老化である光老化の臨床的特徴としては、肌が荒く弾力性がなくなり、不規則的な色素沈着が発生し、深い皺の増加がみられる。特に、美容の対象として重要な顔面、頭部等の皺形成には光老化の影響が大きいことが見い出され、抗皺化粧品開発の基礎研究として、ヒトの皮膚や動物モデルを利用した光老化と皺形成に関する研究が活発に行われている。光老化と皺形成に関しては、今まで皮膚の主要成分であるコラーゲン（collagen）の合成及び分解等の基礎的な生理代謝変化を検討した結果が多数報告されている（Lavker R. M., Blackwell science Inc., 1995: 123-135：非特許文献２）。
【０００４】
皮膚老化に影響を及ぼす外部因子としては、風、温度、湿度、煙草の煙、公害、紫外線等が挙げられるが、この中でも特に、紫外線による老化を光老化と言う。多量の紫外線に曝されると、皮膚に高濃度の活性酸素種（reactive oxygen species）が生成し、皮膚の酵素的及び非酵素的抗酸化防御系を崩壊させる。これにより皮膚組織の主な蛋白質であるコラーゲンが著しく減少する。このコラーゲン減少に重要な影響を及ぼすのがマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１，matrix metalloproteinase-1）である。マトリクス・メタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）は細胞外基質（extracellular matrix）と基底膜（basement membrane）の分解に関与する酵素であり、紫外線照射により、皮膚内のマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１活性が増大し、コラーゲンを著しく崩壊させることにより、マトリクス・メタロプロテイナーゼ−１が真皮層のコラーゲン分解に影響を及ぼして、皺形成に極めて重要な役割をしているとの研究結果等が報告されている（Sim G. S., Kim J. H et al., Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 2005: 20(1): 40-45：非特許文献３）。
【０００５】
現在開発されている皮膚皺改善有効成分の一部には、極めて不安定で、皮膚への伝達が容易でないため、特別な安定化システムと伝達体系が必要な化粧品原料としての使用が不可能であるという問題や、皮膚皺の改善効果が明らかでない等の問題がある。従って、近年はレチノイド（retinoid）を含有した皮膚保護剤へと関心が漸次集中されつつある。現在、レチノイドは日光によってできた皺、皮膚の肥厚、垂れ、弾力性減少等の光老化現象を解決する手段として利用されている。しかしながら、レチノイドは極めて不安定な化合物であり、紫外線、水分、熱、酸素に敏感なため、容易に化学変化を起こす問題点を有していることから、これを解決するための天然物由来の有効成分開発に研究が集中している。
【０００６】
ここで、本発明者らは皺改善に効果的に使用できる天然物由来の化合物を長期間探索した結果、クルクマ・キサントリーザ抽出物から単離及び精製したキサントリゾールが、皺改善に卓越した効果を有することを見い出し、本発明を完成させた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Gilchre st B. A., J. Am. Acad. Dermatol., 1989: 21: 610-613
【非特許文献２】Lavker R. M., Blackwell science Inc., 1995: 123-135
【非特許文献３】Sim G. S., Kim J. H et al., Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 2005: 20(1): 40-45
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の課題は、キサントリゾールまたはクルクマ・キサントリーザの抽出物の新規使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記の課題を解決するために、本発明は化学式１で示されるキサントリゾールを有効成分として含有する皮膚皺改善用組成物を提供する。
【化２】
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さらに、本発明は化学式１で示されるキサントリゾールの皮膚皺改善用製剤、コラーゲン合成誘導剤、またはコラーゲン合成抑制剤の製造のための使用を提供する。
さらに、本発明は化学式１で示されるキサントリゾールを、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とする皮膚皺改善方法、コラーゲン合成誘導方法、またはコラーゲン合成抑制方法を提供する。
さらに、本発明はクルクマ・キサントリーザ抽出物を有効成分として含有する皮膚皺改善用組成物を提供する。
さらに、本発明はクルクマ・キサントリーザ抽出物の皮膚皺改善用製剤、コラーゲン合成誘導剤、またはコラーゲン合成抑制剤の製造のための使用を提供する。
さらに、本発明はクルクマ・キサントリーザ抽出物を、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とする皮膚皺改善方法、コラーゲン合成誘導方法、またはコラーゲン合成抑制方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
前述の通り、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールは、皺形成と関連した重要要素であるコラーゲン分解酵素−１（ＭＭＰ−１，matrix metalloproteinase-1）の発現を抑制することにより、コラーゲンの分解を抑制し、新生コラーゲン（タイプ−１・プロコラーゲン；type-1 procollagen）の生成を促進させ、光老化による皺を改善する効果がある。従って、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物とキサントリゾールは光老化による皺改善の治療または予防に極めて有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のクルクマ・キサントリーザ（Curcuma xanthorrhiza）抽出物によるコラーゲン分解酵素−１抑制活性を示したグラフである。
【図２】本発明のクルクマ・キサントリーザ（Curcuma xanthorrhiza）抽出物によるコラーゲン合成能を示したグラフである。
【図３】本発明のキサントリゾール（xanthorrhizol）によるコラーゲン分解酵素−１抑制活性を示したグラフである。
【図４】本発明のキサントリゾール（xanthorrhizol）によるコラーゲン合成能を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はクルクマ・キサントリーザ（Curcuma xanthorrhiza）から単離及び精製されたキサントリゾール（xanthorrhizol）の新規な使用を提供する。
【００１３】
クルクマ・キサントリーザは、インドネシアの伝統的薬用植物であるショウガ科（Zingiberaceae）植物であり、一般的に、トゥムラワック（temulawak）またはジャワニーズ・ターメリック（Javanese turmeric）として知られている。クルクマ・キサントリーザは、主成分としては、アチュメノン（artumenone）、α−クルクメン（α-curcumene）、β−クルクメン（β-curcumene）、クルゼレノン（curzerenone）、ゲルマクロン（germacrone）、β−セスキフェランドレン（β-sesquiphellandrene）、α−ターメロン（α-turmerone）、β−ターメロン（β-turmerone）、キサントリゾール（xanthorrhizol）等のテルペノイド（terpenoid）系化合物、と７〜３０％のエセンシャルオイル（essential oil）、３０〜４０％のカーボハイドレイト（carbohydrate）、及び０．０２〜２０％の芳香性色素であるクルクミノイド（curcuminoid）等を含む（Lin S. C. et al., Am. J. Chin. Med., 1995: 23: 243-254）。
【００１４】
キサントリゾールは、クルクマ・キサントリーザの代表的な構成成分であるセスキテルペン（sesquiterpene）の一種である。キサントリゾールは、口腔微生物に対する抗菌作用（Hwang, J. K. et al., Fitoterapia. 2000: 71: 321-323; Hwang, J. K. et al., Planta Medica, 2000: 66: 196-197）、抗癌剤で誘発される毒性の抑制活性（Kim, S. H. et al., Toxicology and Applied Pharmacology, 2004: 196: 346-355; Kim S. H. et al., Food and Chemical Toxicology, 2005: 43: 117-122）、癌転移抑制作用（Choi, M. A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005: 326: 210-217）等を有することが知られている。しかしながら、本発明のキサントリゾールによる皺改善効果に対しては、今まで全く報告された例がない。
【００１５】
クルクマ・キサントリーザの抽出方法には、大韓民国出願公開第２０００−００００３４２号明細書及び国際公開第８８／０５３０４号パンフレットに開示された通り、有機溶媒抽出法、超臨界流体抽出法、マイクロウェーブ抽出法、及び超音波抽出法等が使用できる。クルクマ・キサントリーザ抽出物からキサントリゾールを単離及び精製する過程は、大韓民国出願公開第２０００−００７３２９５号明細書に開示された例がある。
【００１６】
好ましくは、本発明のキサントリゾールは当業界において公知の方法、例えば、溶媒抽出法及びクロマトグラフィーを利用した分離方法により単離、精製し得る。
【００１７】
クルクマ・キサントリーザは、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールのような炭素数１〜６のアルコール（organic alcohol）、アセトン、エーテル、クロロホルム、エチルアセテート、メチレンクロライド、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル（petroleum ether）、ジエチルエーテル、及びベンゼンからなる群から選ばれるいずれか１つ、またはこれらの混合溶媒を利用して抽出し得る。好ましくは、水または炭素数１〜６のアルコールを使用して抽出し得る。
【００１８】
抽出時のクルクマ・キサントリーザと溶媒の比率は特に限定はされないものの、クルクマ・キサントリーザ粉末に対して１〜２倍重量の溶媒を添加することができる。好ましくは、抽出効率を上げるために、クルクマ・キサントリーザ粉末に対して２〜５倍重量の溶媒を添加することができる。
【００１９】
抽出は、常圧、室温で行うのが好ましく、抽出時間は、抽出温度によって異なるものの、６〜９６時間、好ましくは、３６〜７２時間かけて抽出する。さらに、抽出時に撹拌器（shaker）で撹拌すると、さらに、抽出効率を上げられる。
【００２０】
抽出に使用するクルクマ・キサントリーザは、収穫した後、洗浄してそのまま使用するか、または乾燥して使用してよい。乾燥方法は、天日干し、陰干し、熱風乾燥及び自然乾燥のいずれの方法で行ってもよい。さらに、抽出効率を上げるために、クルクマ・キサントリーザまたはその乾燥物を粉砕機で粉砕して使用してもよい。
【００２１】
抽出物からキサントリゾールを単離する方法としては、当業界において公知のクロマトグラフィーにより行われる。例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ；thin-layer chromatography）に溶媒を展開させその展開距離に伴う分画物を得る方法であり、特に、キサントリゾールは、ヘキサンとエチルアセテートを１０：１で混合した溶媒を用いたＴＬＣ法で行い、分離された特定分画物をアセチル化（acetylation）及び脱アセチル化（deacetylation）を介して分離することができる。
【００２２】
好ましくは、本発明のキサントリゾールは、乾燥したクルクマ・キサントリーザを２０〜４０メッシュ（mesh）の大きさに粉砕し、粉砕したクルクマ・キサントリーザ試料１００ｇを７５体積％のメタノール４００ｍｌと混合して、常温で２日間繰返し抽出する。抽出された試料はワットマンろ過紙第２番（Whatman filter paper No. 2）を利用してろ過することにより、粗抽出物が得られる。このようにして得られた７５％メタノール粗抽出物を、エチルアセテート、ブタノールとそれぞれ１：１の比率で混合して各溶媒に対する溶解性成分を抽出し、最後に水溶性成分が得られる。各溶媒につき２回繰返し抽出した後、各溶媒層毎に分離し、溶媒成分を蒸発させ、メタノール分画、エチルアセテート分画、ブタノール分画、水分画を調製する。そのうち、エチルアセテート分画を、ＴＬＣ法により、ヘキサンとエチルアセテートを１０：１（ｖ／ｖ）で混合した溶媒で展開させ、該分画をアセチル化（acetylation）及び脱アセチル化（deacetylation）を介してキサントリゾールを得る。
【００２３】
前述の本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物及びキサントリゾールは、紫外線照射によって起こる、人体皮膚繊維芽細胞（human skin fibroblast）におけるマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１，matrix metalloproteinase-1）の生成を濃度依存的に抑制し、タイプ−１・プロコラーゲン（type-1 procollagen）の合成を増加させる。さらに、紫外線を照射したヌードマウス（hairless mouse）に、クルクマ・キサントリーザ抽出物及びキサントリゾールの処理を施すと、マウスにおいてもコラーゲンの合成を増加させた。
【００２４】
このように、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物及びキサントリゾールは、紫外線照射によるマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１の生成を抑制する効果とコラーゲンを合成する効果が極めて優れている。
【００２５】
従って、本発明は、クルクマ・キサントリーザ抽出物、またはキサントリゾールを有効成分として含有する皮膚皺改善用組成物を提供する。前記組成物を化粧料組成物または食品組成物としてもよい。
【００２６】
前記化粧料組成物は、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールと共に、化粧料組成物の分野で一般的に使用される１つ以上の賦形剤及び添加剤を含み、公知の方法により、容易に製造される。
より具体的に、本発明の化粧料組成物は、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを有効成分として含有し、皮膚学的に許容可能な賦形剤と共に、基礎化粧品（化粧水、クリーム、エッセンス、クレンジングフォーム及びクレンジングウォーターのような洗顔剤、パック、ボディオイル、マッサージクリーム）、色調化粧品（coloring cosmetics）（ファウンデーション、リップスティック、マスカラ、化粧下地（make-up base））、頭髪製品（シャンプー、リンス、ヘアコンディショナー、ヘアゲル）の形態で製造される。前記賦形剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、皮膚軟化剤、皮膚浸透増強剤、着色剤、着臭剤、乳化剤、増粘剤及び溶媒を含む。さらに、香料、色素、殺菌剤、酸化防止剤、防腐剤及び保湿剤等を含み、物性改善を目的に増粘剤、無機塩類、合成高分子物質等を含む。
【００２７】
例えば、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを含む洗剤及び石鹸を製造する場合には、通常の洗剤及び石鹸ベースにクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを添加して容易に製造される。クリームを製造する場合には、一般的な水中油型（Ｏ／Ｗ）のクリームベースに、クルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを添加して製造される。ここに、香料、キレート剤、色素、酸化防止剤、防腐剤等と物性改善を目的とした蛋白質、塩、または合成高分子物質を追加して添加し得る。本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールは、化粧料組成物の形態にもよるが、化粧料（formulation）総重量に対して、０．００５〜１０重量％、好ましくは、０．０１〜５重量％含有させることができる。０．００５重量％より少なければ、皺改善効果を得難く、１０重量％より多く配合すると、使用量に対して皺改善効果の増加は微々たるもので非経済的である。
【００２８】
さらには、本発明に伴うクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールは、食品組成物の形態で提供できる。本発明の食品組成物は、機能性食品（functional food）、栄養補助剤（nutritional supplement）、健康食品（health food）及び食品添加剤（food additives）等の全ての形態を含む。前記食品組成物は、当業界において公知の一般的な方法により多様な形態に製造し得る。
【００２９】
例えば、健康食品としては、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを茶、ジュース及びその他ドリンク等の飲料の形態で製造するか、または顆粒化、カプセル化及び粉末化して摂取できる形態で製造できる。さらに、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールは、皮膚皺の改善及び予防効果がある公知の活性成分と共に混合して組成物の形態で製造できる。
【００３０】
さらに、機能性食品、飲料（アルコール性飲料を含む）としては、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを、果実及びその加工食品（例えば、缶詰果物、瓶詰果物、ジャム、マーマレード等）、魚類、肉類及びそれらの加工食品（例えば、ハム、ソーセージ、コーンビーフ等）、パン類及び麺類（例えば、うどん、そば、ラーメン、スパゲッティー、マカロニ等）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例えば、バター、チーズ等）、食用植物油、マーガリン、植物性蛋白質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例えば、味噌、醤油、ソース等）等に添加して製造できる。
【００３１】
さらに、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを食品添加剤の形態で使用するには、粉末または濃縮液形態で製造できる。
【００３２】
本発明の食品組成物には、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを、食品総重量に対して約０．０００１〜５０重量％含むのが好ましい。
【００３３】
さらに、本発明はクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールの皮膚皺改善用製剤の製造のための使用を提供する。同時に、クルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールのコラーゲン合成誘導剤の製造のための使用、及びクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールのコラーゲン分解抑制剤の製造のための使用を提供する。
【００３４】
さらに、本発明はクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とする皮膚皺改善方法を提供する。同時に、クルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とするコラーゲン合成を誘導する方法及びクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールを、それらを必要とする個体に有効量を塗布または投与することを特徴とするコラーゲン分解を抑制する方法を提供する。
【００３５】
クルクマ・キサントリーザ抽出物、キサントリゾール及びこれらの効果は前述の通りであり、前記“有効量”とは、本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールが投与対象である個体内で皮膚皺改善、コラーゲン合成誘導またはコラーゲン分解抑制の効果を示す量を意味し、前記“個体（subject）”とは、哺乳動物、特にヒト（human）を含む動物を意味する。前記個体は治療を必要とする患者（patient）でもあり得る。
【００３６】
本発明のクルクマ・キサントリーザ抽出物またはキサントリゾールは、前述の効果のうち望む効果が得られるまで投与することができ、当業界において公知の方法により経口または非経口の多様な経路で投与できる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するものであって、本発明の内容は下記実施例に限定されるものではない。
【００３８】
実施例１：細胞増殖効果
皮膚の皺改善効果を示す細胞増殖効果を試験するために、繊維芽細胞を使用してＭＴＴ試験法［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル  テトラゾリウム  ブロマイド還元方法；3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide reduction method］を行った。
まず、ヒトの正常繊維芽細胞を９６−ウェルプレート（96-well plate）の各ウェルに２×１０5cells／wellになるように分株して、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；fetal bovine serum）を含有したディエムイエム（ＤＭＥＭ）培地で３７℃、５％ＣＯ2条件下で２４時間かけて１次培養した。前記１次培養後、本発明の試料を各種濃度に処理し、培地を無血清培地（serum-free medium）に替えて４８時間、２次培養した。前記２次培養後、ＭＴＴ溶液１００μｌずつ培地に添加した後、４時間放置し、培地を除去した。各ウェルにジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide）溶液１００μｌずつを添加して、２０分間撹拌した後、マイクロプレートリーダー（microplate reader）により、５４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３９】
試験例１：クルクマ・キサントリーザ抽出物とキサントリゾールの細胞増殖効果
前記実施例１の方法により、クルクマ・キサントリーザエタノール抽出物とキサントリゾールの細胞増殖効果を測定した。前記ＭＴＴ試験での対照群は、試料を処理していない培地を使用し吸光度を測定し、比較群は、試料として皮膚皺改善効果があるものとして知られる緑茶抽出物（green tea extract）及びエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ；epigallocatechin-3-gallate）を使用した。結果を下記表１に示す。
【表１】
2010530412.tif 000005
表１に示した通り、本発明のクルクマ・キサントリーザエタノール抽出物及びキサントリゾールは、比較群より細胞増殖効果が優れていることが確認できた。
【００４０】
実施例２：紫外線照射に伴う繊維芽細胞におけるマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）及びコラーゲン生合成の測定
繊維芽細胞を２×１０5cells/mlの濃度で６０ｍｍディッシュ（dish）に、約８５％コンフルエンス（confluence）に達するまで培養する。紫外線（ＵＶ）照射前に、培地を除去した後、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄して、培地の血清成分を除去した後、２０ｍＪ／ｃｍ2の照射量で紫外線を照射した。繊維芽細胞に紫外線を照射した後、各試料を処理して４８時間培養し、その培地を使用してマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）及びコラーゲンの発現程度を測定した。
マトリクス・メタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）のコラーゲン生合成発現量を測定するために、ウェスタンブロット（western blot）法を利用し、繊維芽細胞が培養された培地内の総蛋白質量は、ブラッドフォード（Bradford）法により定量した。
抽出した蛋白質は、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに電気泳動させ、ニトロセルロース膜（nitrocellulose membrane）に移し取った。ニトロセルロース膜が、他の未知の蛋白質により汚染されないように、５％脱脂粉乳（skim milk）を使用して１時間常温で遮断（block）した。マトリクス・メタロプロテイナーゼ−１及びタイプ−１・プロコラーゲン（type-1 procollagen）の１次抗体をブロッキング溶液（blocking solution）に１：１０００の比率で希釈して、２時間常温で膜と反応させた。１次抗体反応後膜を１０分間ずつ３回、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳＴ；Tris-buffer Saline Tween 20）で振りながら洗浄した。マトリクス・メタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）とコラーゲンの１次抗体を認知する２次抗体を５％脱脂粉乳に１：１０００になるように希釈して１時間常温で膜と反応させ、１次抗体の時と同様に１０分間ずつ３回、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳＴ；Tris-buffer Saline Tween 20）で振りながら洗浄した後、化学発光法（chemiluminescence）で分析した。
【００４１】
試験例２：クルクマ・キサントリーザエタノール抽出物処理時の細胞内におけるマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＴ−１）及びコラーゲン発現量の測定
クルクマ・キサントリーザエタノール抽出物のマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＴ−１）抑制活性とコラーゲン合成効果を測定するために、前記実施例２のウェスタンブロット法を使用した。その結果、細胞にクルクマ・キサントリーザエタノール抽出物を処理した場合、マトリクス・メタロプロテイナーゼ−１が濃度依存的に抑制され、コラーゲン合成もやはり濃度依存的に増加することを確認した。この分析結果を図１及び図２に示す。図１に示す通り、細胞にクルクマ・キサントリーザエタノール抽出物を０．０１μｇ／ｍｌの濃度で処理したとき１６％、０．１μｇ／ｍｌのとき２８％、０．５μｇ／ｍｌのとき７８％のマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１抑制効果を示し、さらに、図２に示す通り、細胞にクルクマ・キサントリーザエタノール抽出物を０．０１μｇ／ｍｌの濃度で処理したとき２４％、０．０１μｇ／ｍｌのとき１２７％、０．５μｇ／ｍｌのとき１９６％のコラーゲン合成促進効果を示した。
【００４２】
試験例３：クルクマ・キサントリーザヘキサン抽出物処理時の細胞内におけるマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＴ−１）及びコラーゲン発現量の測定
クルクマ・キサントリーザヘキサン抽出物のマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＴ−１）抑制活性とコラーゲン合成効果を測定するために、前記実施例２のウェスタンブロット法を使用した。その結果、試験例２でクルクマ・キサントリーザエタノール抽出物を処理した時と類似した活性を示し、マトリクス・メタロプロテイナーゼ−１は、細胞にクルクマ・キサントリーザヘキサン抽出物を０．５μｇ／ｍｌの濃度で処理した場合７５％抑制され、コラーゲン合成活性は同一濃度で１９１％増加する結果を示した。
【００４３】
試験例４：キサントリゾール処理時の細胞内におけるマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＴ−１）及びコラーゲン発現量の測定
キサントリゾールのマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１抑制活性と、コラーゲン活性効果を測定するために、前記実施例２のウェスタンブロット法を使用したその結果、キサントリゾールを細胞に処理した場合、マトリクス・メタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＴ−１）が濃度依存的に抑制され、コラーゲン合成もやはり濃度依存的に増加することを確認した。この結果を図３及び図４に示す。図３に示す通り、細胞にキサントリゾールを、０．００１μＭの濃度で処理したとき１８％、０．０１μＭのとき６８％、０．１μＭのとき９２％のマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１抑制活性を示し、この時、同一濃度の０．１μＭで比較した時、比較群のＥＧＣＧは７２％のマトリクス・メタロプロテイナーゼ−１抑制活性を示し、キサントリゾール処理による活性が高いことを確認した。さらに、図４に示す通り、細胞にキサントリゾールを０．０１μＭの濃度で処理したとき５７％、０．１μＭにおいて８６％のコラーゲン合成促進効果を示し、この時、同一濃度の０．１μＭで比較した時、比較群のＥＧＣＧは６５％のコラーゲン合成促進活性を示して、キサントリゾール処理による活性が高いことを確認した。従って、本発明のキサントリゾールは皺改善に効果があるものとして広く知られたＥＧＣＧより活性が高いものとして最終的に確認した。
【００４４】
実施例３〜６：クルクマ・キサントリーザ抽出物を含有する化粧水の製造
クルクマ・キサントリーザエタノール抽出物を使用して、実施例３〜６の組成を有する化粧水を製造した。抽出物を１０．０重量％、１．０重量％、０．１重量％、０．０１重量％の４種の濃度にして、それぞれエタノールに溶解させ、エタノールで重量を調整して均一に混合した。
【表２】
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【００４５】
実施例７〜１０：クルクマ・キサントリーザ抽出物を含有するクリームの製造
クルクマ・キサントリーザエタノール抽出物を使用して、実施例７〜１０の組成を有するクリームを製造した。まず、表３に示す物質（１）〜（５）を７５〜８０℃で溶解させ、物質（６）〜（９）を同じ温度で溶解させた。物質（６）〜（９）を物質（１）〜（５）に乳化させ、粗抽出物を１０．０重量％、１．０重量％、０．１重量％、０．０１重量％の濃度でそれぞれ添加して再混合した後、最後に香料を添加して精製水で定量を合わせた。
【表３】
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【００４６】
実施例１１〜１４：キサントリゾールを含有する化粧水の製造
キサントリゾールを使用して、実施例１１〜１４の組成を有する化粧水を製造した。キサントリゾールを５．０重量％、０．１重量％、０．０１重量％、０．００１重量％の４種の濃度にして、それぞれ水に溶解させてリン酸水溶液と混合した。エタノール、グリセリン、プロピレングリコールを混合して前記混合物に添加して混合しながら、香料、保存料を追加して水で重量を調整して均一に混和させた。
【表４】
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【００４７】
実施例１５〜１８：キサントリゾールを含有するクリームの製造
キサントリゾールを使用して、実施例１５〜１８の組成を有するクリームを製造した。まず、表５に示す物質（１）〜（５）は７５〜８０℃で溶解させ、物質（６）〜（９）を同じ温度で溶解させた。物質（６）〜（９）を物質（１）〜（５）に乳化させ、キサントリゾールを５．０重量％、０．１重量％、０．０１重量％、０．００１重量％の濃度でそれぞれ添加して再混合した後、最後に香料を添加して精製水で定量を合わせた。
【表５】
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【００４８】
試験例５：クルクマ・キサントリーザ抽出物含有組成物のコラーゲン合成量のインビボ（in vivo）での測定
ヌードマウス（hairless mouse）に紫外線２０ｍＪ／ｃｍ2を４週間毎日１回照射し、前記実施例３〜１０のクルクマ・キサントリーザエタノール抽出物含有組成物を、それぞれ４週間毎日１００ｍｌずつ背部位に塗布した後、生検して組織学的にコラーゲンの形成を測定した。この時、新たに生成されるコラーゲン量の測定は、組織を免疫染色した後、これを画像分析を介して測定した。その結果を下記表６に示す。
【表６】
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前記表６に示した通り、クルクマ・キサントリーザエタノール抽出物の含量が、増加するほどコラーゲン合成量が増加し、化粧水よりクリームの方がさらに高い活性を示すことを確認できた。これは化粧水よりクリームの方が皮膚における残存力がより高いためと判断される。
【００４９】
試験例６：キサントリゾール含有組成物のコラーゲン合成量のインビボ（in vivo）での測定
ヌードマウス（hairless mouse）に紫外線２０ｍＪ／ｃｍ2を４週間毎日１回照射し、前記実施例１１〜１８のキサントリゾール含有組成物を、それぞれ４週間毎日１００ｍｌずつ背部位に塗布した後、生検して組織学的にコラーゲンの形成を測定した。この時、新たに生成されるコラーゲン量の測定は、組織を免疫染色した後、これを画像分析を介して測定した。その結果を下記表７に示す。
【表７】
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前記表７に示した通り、キサントリゾールの含量が、増加するほどコラーゲン合成量が増加され、化粧水よりクリームの方がさらに高い活性を示すことを確認できた。これは化粧水よりクリームの方が皮膚における残存力がより高いためと判断される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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