(57)【要約】  本発明は、乾癬を研究するためのモデルとしての遺伝子改変ブタに係る。当該改変ブタモデルは乾癬に関連する１つ又は複数の表現型を発現する。内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1及び/又はLIG1遺伝子又における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ、及び/又は少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタも開示される。本発明はさらに、改変ブタの製造方法、乾癬の治療的処置における応答の評価方法、医薬品組成物の有効性のスクリーニング方法、並びに乾癬に罹患しているヒトの治療方法が開示される。
2010520751.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾癬を研究するためのモデルとしての遺伝子改変ブタであって、上記疾患に関連した少なくとも1種類の表現型を発現するブタモデル、及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタに関する。
【請求項２】
ブタがミニブタである、請求項1に記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項３】
ミニブタがゲッティンゲン、ユカタン、バマ・シャン・チュー(Bama Xiang Zhu)、ウージーシャン(Wuzhishan)及びシーサンバンナ(Xi Shuang Banna)並びにその任意の組合せから成る群から選択される、請求項2に記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項４】
ブタがミニブタではない、請求項1に記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項５】
ブタがS.domesticus種に属する、請求項1に記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項６】
ブタがランドレース、ヨークシャー、ハンプシャー、デュロック、チャイニーズ
メイシャン(Chinese Meishan)、バークシャー及びピエトラン並びにその任意の組合せから成る群から選択される、請求項5に記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項７】
ブタが近交系ブタである、請求項1に記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項８】
上記のヒト、マウス及び/又はブタPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部が異種性(heterologous)のプロモーターにより発現される、請求項1〜7のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項９】
上記の異種性プロモーターが、K1、K5、K10、K14及びインボルクリン(involucrine)から成る群から選択される、請求項8に記載される遺伝子改変ブタ。
【請求項１０】
上記動物が少なくとも1つのブタPPARδ遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜9のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項１１】
上記動物が少なくとも1つのヒトIκB-α遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜10のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項１２】
上記動物が少なくとも1つのブタPPARδ遺伝子又はその一部及びヒトIκB-α遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜11のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項１３】
上記動物が少なくとも1つのブタIκB-αcDNA又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜12のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項１４】
上記動物が少なくとも1つのブタPPARδcDNA又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜13のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項１５】
上記動物が少なくとも1つのヒトIκB-αcDNA又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜14のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項１６】
上記動物が少なくとも1つのブタPPARδcDNA又はその一部及びヒトIκB-αcDNA又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜15のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項１７】
上記動物が少なくとも1つのブタIκB-αcDNA又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部の挿入によりトランスジェニックである、請求項1〜16のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項１８】
上記少なくとも1種類の表現型が、乾癬に関連していると知られる任意の表現型を含む、請求項1〜17のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項１９】
上記少なくとも1種類の表現型が、尋常性乾癬、滴状乾癬、屈側性(flexural)乾癬、乾癬性紅皮症、膿疱性乾癬及び乾癬性関節炎からなる群から選択される、請求項1〜18のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項２０】
上記少なくとも1種類の表現型が、白色鱗屑、皮膚炎症、隆起皮膚、赤色皮膚、皮膚の剥脱、爪の変化、爪の黄変、及び抜け毛からなる群から選択される、請求項1〜19のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項２１】
上記少なくとも1種類の表現型が、皮膚の剥脱である、請求項1〜20のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項２２】
上記少なくとも1種類の表現型が、体幹、腕、足、膝、肘、生殖器及び頭皮の赤色隆起皮膚斑である、請求項1〜21のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項２３】
上記少なくとも1種類の表現型が、赤色皮膚、隆起皮膚の小斑、及び身体の広い領域全体に出現する多数の小卵円形スポットから成る群から選択される、請求項1〜22のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項２４】
上記少なくとも1種類の表現型が、皮膚襞中に、例えば腋窩に、乳房下に、特に生殖器周囲に生じる皮膚の平滑炎症斑からなる群から選択される、請求項1〜23のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項２５】
上記少なくとも1種類の表現型が、身体表面のほとんどに亘る皮膚の広範な炎症及び剥離、そう痒感、膨潤及び疼痛、身体が温度を調節する能力の障害並びに死から成る群から選択される、請求項1〜24のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項２６】
上記少なくとも1種類の表現型が、身体全体に亘る、又は掌、足裏及びその他の小領域上だけに現れる小膿疱である、請求項1〜25のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項２７】
上記少なくとも1種類の表現型が、臨床的観察及び/又は(例えば生検の形態における)皮膚組織の顕微鏡検査に基づいて検出される、請求項1〜26のいずれかに記載の遺伝子改変ブタ。
【請求項２８】
請求項1に規定される遺伝子改変ブタモデル由来の遺伝子改変ブタ胚盤胞、及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ胚盤胞、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタ胚盤胞。
【請求項２９】
請求項1に規定される遺伝子改変ブタモデル由来の遺伝子改変ブタ胚、及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ胚、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタ胚。
【請求項３０】
請求項1に規定される遺伝子改変ブタモデル由来の遺伝子改変ブタ胎仔、及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ胎仔、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタ胎仔。
【請求項３１】
請求項1に規定される遺伝子改変ブタモデル由来の遺伝子改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核、及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核。
【請求項３２】
i)修飾透明帯の少なくとも一部を有する少なくとも1つの卵母細胞を確立する工程、ii)卵母細胞を少なくとも2つの部分に分離し、核を有する卵母細胞及び少なくとも1つの細胞質体を得る工程、iii)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞又は細胞核を確立する工程、iv)少なくとも1つの細胞質体をドナー細胞又は膜包囲細胞核(membrane surrounded
cell nucleus)と融合する工程、v)再構築胚(reconstructed
embryo)を得る工程、vi)胚を形成するように再構築胚を活性化し、上記胚を培養する工程、及びvii)胚が遺伝子改変胎仔に発生するように上記培養胚を宿主哺乳動物に移す工程から成る核移植により得られることができる、請求項1〜31のいずれかに記載の遺伝子改変ブタモデル、ブタ胚盤胞、胚、胎仔及び/又はドナー細胞。この場合、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胚は工程i)〜工程v)及び/又は工程vi)を含み、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胚盤胞は工程i)〜工程vi)及び/又は工程vii)を含み、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胎仔は工程i)〜工程vii)を含む。
【請求項３３】
i)少なくとも1つの卵母細胞を確立する工程、ii)卵母細胞を少なくとも3つの部分に分離し、少なくとも1つの細胞質体を得る工程、iii)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞又は細胞核を確立する工程、iv)少なくとも1つの細胞質体をドナー細胞又は膜包囲細胞核と融合する工程、v)再構築胚を得る工程、vi)胚を形成するように再構築胚を活性化し、上記胚を培養する工程、及びvii)胚が遺伝子改変胎仔に発生するように上記培養胚を宿主哺乳動物に移す工程から成る、乾癬のモデルとしてのトランスジェニックブタ、ブタ胚盤胞、胚、胎仔及び/又はドナー細胞の製造方法。この場合、上記トランスジェニック胚は工程i)〜工程v)及び/又は工程vi)を含み、上記トランスジェニック胚盤胞は工程i)〜工程vi)及び/又は工程vii)を含み、上記トランスジェニック胎仔は工程i)〜工程vii)を含む。
【請求項３４】
請求項1〜33のいずれかに規定される1つまたは複数の特徴を含む、請求項28〜33のいずれかに記載の方法であって、再構築胚の活性化のための方法が、電気パルス、化学誘導性ショック、二価カチオンの細胞内レベルの増大及びリン酸化の低減から成る方法の群から選択される方法。
【請求項３５】
請求項1〜34のいずれかに規定される1つまたは複数の特徴を含む、請求項28〜33のいずれかに記載の方法であって、工程iv)及び工程vi)が順番に又は同時に実施される方法。
【請求項３６】
請求項1〜35のいずれかに規定される1つまたは複数の特徴を含む、請求項28〜33のいずれかに記載の方法であって、胚がインビトロで培養される方法。
【請求項３７】
請求項36に記載の方法であって、胚が順次培養(sequential culture)によって培養される方法。
【請求項３８】
請求項1〜37のいずれかに規定される1つまたは複数の特徴を含む、請求項28〜33のいずれかに記載の方法であって、胚が宿主哺乳動物に移される前に凍結保存される方法。
【請求項３９】
胚が胚盤胞期である、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
ブタがミニブタではない、請求項28〜33のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
ブタがS.domesticus種に属する、請求項28〜33のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
ブタがランドレース、ヨークシャー、ハンプシャー、デュロック、チャイニーズ
メイシャン、バークシャー及びピエトラン並びにその任意の組合せから成る群から選択される、請求項28〜33のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
ブタが近交系ブタである、請求項28〜33のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
ブタがミニブタである、請求項28〜33のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
ミニブタがゲッティンゲン、ユカタン、バマ・シャン・チュー、ウージーシャン及びシーサンバンナ並びにその任意の組合せから成る群から選択される、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
乾癬の治療的処置の効果を評価する方法であって、i)請求項1〜27のいずれかに記載のブタモデルを用意する工程、ii)上記表現型に効果を発揮する医薬品組成物で上記ブタモデルを処置する工程、及びiii)観察された効果を評価する工程を含む方法。
【請求項４７】
前述の観察された効果に基づき医学的処置について勧告をする工程を更に含む、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
医薬品組成物の有効性をスクリーニングする方法であって、i)請求項1〜27のいずれかに記載のブタモデルを用意する工程、ii)上記遺伝的決定因子を上記ブタモデルにおいて発現し、上記疾患に関する上記表現型を発揮する工程、iii)有効性を評価すべき医薬品組成物を上記ブタモデルに投与する工程、及びiv)ブタモデルにおいて遺伝的決定因子を発現することにより発揮される表現型に及ぼす医薬品組成物の効果(もしあれば)を評価する工程を含む方法である。
【請求項４９】
乾癬に罹患しているヒトの治療方法であって、以下の初期工程:i)請求項1〜27のいずれかに記載のブタモデルを用意する工程、ii)上記遺伝的決定因子を上記ブタモデルにおいて発現し、上記疾患に関する上記表現型を発揮する工程、iii)有効性を評価すべき医薬品組成物を上記ブタモデルに投与する工程、及びiv)観察された効果を評価する工程、並びにv)ブタモデルで観察された効果に基づいて乾癬に罹患している上記ヒトを治療する工程を含む方法である。
【請求項５０】
上記遺伝的決定因子が請求項8〜17のいずれかに規定されたものである、請求項46〜49のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
上記表現型が請求項18〜27のいずれかに規定されたものである、請求項46〜50のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾癬を研究するためのモデルとしての遺伝子改変ブタであって、上記疾患に関連した少なくとも1種類の表現型を発現する遺伝子改変ブタに関する。本発明はさらに、上記遺伝子改変ブタの製造方法に関する。さらに、乾癬の治療的処置における応答の評価方法、医薬品組成物の有効性のスクリーニング方法、並びに乾癬に罹患しているヒトの治療方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
身体全体のコンテクストにおける単一遺伝子又は複数遺伝子の作用、並びに相関する現象である遺伝子活性、遺伝子発現及び遺伝子相互作用を理解するために、トランスジェニック非ヒト動物が用いられ得る。当該技術は、ヒト及びその他の動物における多様な疾患における遺伝的メカニズムの、並びに特定の疾患に関連した遺伝子の理解を増大するのに著しく寄与する研究用モデルの産生ももたらした。
【０００３】
伝統的には、例えばマウスなどの小動物がヒト疾患についての疾患モデルとして用いられており、そして一定の疾患においてはそれらがモデルとして適切であることが見出されている。しかしながら、多数のヒト疾患のための動物モデルとしてのそれらの価値は、ヒトと比較した場合のマウスにおける差異のために非常に限定される。大型トランスジェニック動物は、多数の側面においてヒトとの類似性がより大きいため、ほとんどのヒト疾患の影響及び治療についての研究のために多くの場合マウスより格段に適している。特にブタは、ヒト疾患のための疾患モデルとして有益であると考えられている。
【０００４】
西欧の人口の2%〜3%が乾癬に罹患している、と概算されている。乾癬は両性に等しく影響を及ぼし、あらゆる年齢で起こり得るが、最も一般的には15歳〜25歳の年齢で最初に現れる。乾癬は、白色鱗屑(white scales)で被覆された炎症性赤色隆起領域(inflamed, red,
raised areas)を特徴とする慢性的な皮膚の状態である。鱗屑形成は、皮膚の外層中の細胞が正常より速く再生し、皮膚表面に積み重なる場合に起こる。その結果として、皮膚は3日〜4日毎に剥げ落ちる。最もしばしば、肘、膝、頭皮、又は生殖器領域の皮膚が、乾癬に侵される。さらに、爪の変化は一般的であり、真菌感染に似た点食(pitting)及び黄色っぽい変色を含む。乾癬は、抜け毛を引き起こす場合もある。
【０００５】
乾癬は、身体の局所的領域に止まる小規模なものから全身の範囲に及ぶものまで、重症度を変えながら乾癬の発生が再発する慢性的な状態である。さらに、乾癬性関節炎も、乾癬に罹患している患者の10%〜15%で観察される。乾癬性関節炎は、乾癬による関節の炎症により引き起こされる。
【０００６】
発生後、乾癬はしばしば種々の重症度で再発する。乾癬の原因は、十分に理解されていない。乾癬は自己免疫疾患、すなわち身体が自らの組織又は細胞型のうちの1つに対して免疫応答を起こす状態であると一般的に考えられている。乾癬は感染性ではないが、遺伝性を有すると見られる。
【０００７】
乾癬は、種々の形態で、例えば尋常性乾癬、膿疱性乾癬、滴状乾癬及び屈側性乾癬として病状発現し得る。乾癬は異なった形態及び重症度で生じるので、各個体は相違した症状を経験し得る。
【０００８】
円板状乾癬は尋常性乾癬とも呼ばれ、最も一般的な形態である。症状としては、体幹、腕、足、膝、肘、生殖器及び頭皮の赤色隆起皮膚斑が挙げられ得る。爪も肥厚し、点食するようになり、そして爪床から分離し得る。尋常性乾癬は、乾癬を有するヒトの80%〜90%に影響を及ぼす。
【０００９】
滴状乾癬は中等度レベルの乾癬であり、これは主として小児に影響を及ぼす。症状としては、赤色隆起皮膚の多数の小斑が挙げられ得る。連鎖球菌感染に関連した咽頭炎が、通常この型の乾癬の開始に先行する。滴状乾癬は、身体の広い領域、例えば体幹、四肢及び頭皮に出現する多数の小卵円形スポットを特徴とする。
【００１０】
屈側性(flexural)乾癬は、皮膚襞中に、例えば腋窩に、乳房下に、特に生殖器周囲に生じる皮膚の平滑炎症斑である。屈側性乾癬はしばしば真菌感染に罹り易く、状態は摩擦及び汗により悪化するようになると見られる。
【００１１】
重症例では、乾癬性紅皮症が、特に系統的な治療の突然の中止後に観察される。乾癬性紅皮症は、身体表面のほとんどに亘る皮膚の広範な炎症及び剥離を包含し、しばしばそう痒感、膨潤及び疼痛を伴う。皮膚の極度の炎症及び剥離は、身体が温度を調節する能力、そして皮膚がバリア機能を実施することの障害となり得ることさえあり、その結果として致命的にもなり得る。
【００１２】
最後に、膿疱性乾癬では、身体全体に亘る、又は掌、足裏及びその他の小領域上だけに現れる小膿疱(非感染性膿含有水疱)が症状として挙げられ得る。乾癬の症状は、他の皮膚の状態に類似し得る。皮膚の状態が白色鱗屑の発生にまで進行する場合、医者は通常は、爪及び皮膚の診察で乾癬と診断し得る。診断の確証は皮膚生検によりなされ得るが、この場合、小皮膚検体が顕微鏡下で検査される。
【００１３】
残念ながら、乾癬の原因は解明されていない。この疾患の発症において生じるプロセスについては2つの主要な理論が存在すると思われる。一理論によれば、乾癬は、主として皮膚細胞の過剰な成長及び再生による障害であり、表皮及びそのケラチノサイトの機能不全を伴うものだと考えられる。別の理論によれば、乾癬は免疫媒介性障害であると考えられ、その症状は、免疫系により産生される因子のため、皮膚細胞において起こる。T細胞は、活性化されて真皮に移動し、そしてここでサイトカインの放出を誘発すると示唆されている。その後、サイトカインは皮膚細胞の炎症及び迅速産生を引き起こす。後者の理論は、免疫抑制剤の処方が乾癬プラークを軽減し得る、という観察により支持されている。しかしながら乾癬の動物モデルは、T細胞を欠くマウスにおいて誘発され得る(Zenz R, Eferl R, Kenner
L, Florin L, Hummerich L, Mehic D, Scheuch H, Angel P, Tschachler E, Wagner E.
Psoriasis-like skin disease and arthritis caused by inducible epidermal
deletion of Jun proteins. Nature. 2005; 437 (7057): 369-75)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Kragh,et al., 2004 Reprod. Fertil. Dev 16, 315-318
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
現存する動物モデルは、ヒト乾癬に類似する2〜3の側面を表示するのみである。したがってヒト乾癬に類似する側面を表示する効率的な動物モデルに対する必要性が存在する。このような動物モデルは、乾癬の原因をさらに研究し、そして乾癬に罹患している多数のヒトの症状を軽減する薬剤を試験することを可能にする。
【００１６】
たとえ乾癬の原因であるか又は疾患の発症に関与する遺伝子がヒトにおいて同定されているとしても、このような突然変異に関してトランスジェニックである動物がヒト疾患のものに匹敵する表現型を表示するということにならない。しかしながら本発明は驚くべきことに、本発明による遺伝子改変ブタモデルが乾癬表現型を表示する、ということを示した。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、乾癬の研究を可能にする遺伝子改変ブタモデルに関する。したがって本発明の一側面は、乾癬を研究するためのモデルとしての遺伝子改変ブタであって、上記疾患に関連した少なくとも1種類の表現型を発現する遺伝子改変ブタ、及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタに関する。
【００１８】
本発明の実施形態は、例えばゲッティンゲン、ユカタン、バマ・シャン・チュー(Bama Xiang Zhu)、ウージーシャン(Wuzhishan)及びシーサンバンナ(Xi Shuang Banna)(その任意の組合せを含める)から成る群から選択されるミニブタを含む。しかしながら別の実施形態は、ミニブタではないブタ、例えばSus domesticus種であって、ランドレース、ヨークシャー、ハンプシャー、デュロック、チャイニーズ メイシャン(Chinese Meishan)、バークシャー及びピエトラン、並びにその任意の組合せから成る群から選択されるブタに関する。好ましい一実施形態では、ブタ、胚、胎仔、胚盤胞、ドナー細胞及び/又は細胞核は、ゲッティンゲン・ミニブタであるか又はゲッティンゲン・ミニブタ由来のものである。
【００１９】
本発明の実施形態は、遺伝子改変ブタであって、少なくともブタPPAR-δ遺伝子若しくはその一部の挿入のため、又は少なくともヒトPPAR-δ遺伝子若しくはその一部の挿入のため、又は少なくともヒトPPAR-δ cDNA若しくはその一部の挿入のため、又は少なくともブタPPAR-δ cDNA若しくはその一部の挿入のため、又は少なくともブタIκB-α遺伝子若しくはその一部の挿入のため、又は少なくともヒトIκB-α遺伝子若しくはその一部の挿入のため、又は少なくともヒトIκB-α cDNA若しくはその一部の挿入のため、又は少なくともブタIκB-α cDNA若しくはその一部の挿入のため、又は少なくともブタNFκB遺伝子若しくはその一部の挿入のため、又は少なくともヒトNFκB遺伝子若しくはその一部の挿入のため、又は少なくともヒトNFκB cDNA若しくはその一部の挿入のため、又は少なくともブタNFκB cDNA若しくはその一部の挿入のため、トランスジェニックである遺伝子改変ブタを含む。
【００２０】
本発明の第2の側面は、本明細書中に開示される遺伝子改変ブタモデル由来の遺伝子改変ブタ胚盤胞;及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ胚盤胞;及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタ胚盤胞
に関する。
【００２１】
本発明の第3の側面は、本明細書中に開示される遺伝子改変ブタモデル由来の遺伝子改変ブタ胚;及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ胚;及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタ胚に関する。
【００２２】
本発明の第4の側面は、本明細書中に開示される遺伝子改変ブタモデル由来の遺伝子改変ブタ胎仔;及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ胎仔;及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタ胎仔に関する。
【００２３】
本発明の第5の側面は、本明細書中に開示される遺伝子改変ブタモデル由来の遺伝子改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核;及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核;及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核に関する。
【００２４】
また本発明は、以下の工程:
i)修飾透明帯の少なくとも一部を有する少なくとも1つの卵母細胞を確立する工程:
ii)卵母細胞を少なくとも2つの部分に分離し、核を有する卵母細胞及び少なくとも1つの細胞質体を得る工程、
iii)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞又は細胞核を確立する工程、
iv)少なくとも1つの細胞質体をドナー細胞又は膜包囲細胞核(membrane surrounded cell nucleus)と融合する工程、
v)再構築胚(reconstructed embryo)を得る工程、
vi)胚を形成するように再構築胚を活性化し、上記胚を培養する工程、及び
vii)胚が遺伝子改変胎仔に発生するように上記培養胚を宿主哺乳動物に移す工程
を含む核移植により得られる上記の遺伝子改変ブタモデル、ブタ胚盤胞、胚、胎仔及び/又はドナー細胞に関し、
この場合、核移植により得られる上記遺伝子改変胚は工程i)〜工程v)及び/又は工程vi)を含み、核移植により得られる上記遺伝子改変胚盤胞は工程i)〜工程vi)及び/又は工程vii)を含み、核移植により得られる上記遺伝子改変胎仔は工程i)〜工程vii)を含む。
【００２５】
さらに第6の側面は、以下の工程:
i)少なくとも1つの卵母細胞を確立する工程、
ii)卵母細胞を少なくとも3つの部分に分離し、少なくとも1つの細胞質体を得る工程、
iii)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞又は細胞核を確立する工程、
iv)少なくとも1つの細胞質体をドナー細胞又は膜包囲細胞核と融合する工程、
v)再構築胚を得る工程、
vi)胚を形成するように再構築胚を活性化し、上記胚を培養する工程、及び
vii)胚が遺伝子改変胎仔に発生するように上記培養胚を宿主哺乳動物に移す工程
を含む、乾癬のモデルとしてのトランスジェニックブタ、ブタ胚盤胞、胚、胎仔及び/又はドナー細胞を製造する方法に関し、
この場合、上記トランスジェニック胚は工程i)〜工程v)及び/又は工程vi)を含み、上記トランスジェニック胚盤胞は工程i)〜工程vi)及び/又は工程vii)を含み、上記トランスジェニック胎仔は工程i)〜工程vii)を含む。
【００２６】
上記側面の実施形態は、先行特許請求の範囲のいずれかで定義される特徴のうちの1つ又は複数を含み、この場合、再構築胚の活性化のための方法は、電気パルス、化学誘導性ショック、二価カチオンの細胞内レベルの増大及びリン酸化の低減から成る方法の群から選択される。第6の側面のさらなる実施形態は、工程iv)及び工程vi)が順番に又は同時に実施される上記で定義される特徴のうちの1つ又は複数を含み、そして実施形態は、胚がインビトロで培養される該特徴のうちの1つ又は複数を含む。このような胚は、順次培養(sequential culture)で培養され得る。胚は、例えば胚盤胞期において、宿主哺乳動物に移される前に凍結保存される。
【００２７】
本発明の方法のために、実施形態は、ブタ、ミニブタ(例えばゲッティンゲン、ユカタン、バマ・シャン・チュー、ウージーシャン及びシーサンバンナ、並びにその任意の組合せから成る群から選択される)を包含する。しかしながら別の実施形態は、ミニブタではないブタ、例えばSus
domesticus種であって、ランドレース、ヨークシャー、ハンプシャー、デュロック、チャイニーズ メイシャン、バークシャー及びピエトラン、並びにその任意の組合せから成る群から選択されるブタに関する。
【００２８】
本発明の第7の側面は、乾癬の治療的処置の効果の評価方法であって、以下の工程:
i)本発明のブタモデルを用意する工程、
ii)上記表現型に効果を発揮する医薬品組成物で上記ブタモデルを処置する工程、及び
iii)観察された効果を評価する工程を含む方法に関する。
【００２９】
第8の側面は、医薬品組成物の有効性のスクリーニング方法であって、以下の工程:
i)本発明のブタモデルを用意する工程、
ii)上記遺伝的決定因子を上記ブタモデルにおいて発現し、上記疾患に関する上記表現型を発揮する工程、
iii)有効性を評価すべき医薬品組成物を上記ブタモデルに投与する工程、及び
iv)ブタモデルにおいて遺伝的決定因子を発現することにより発揮される表現型に及ぼす医薬品組成物の効果(もしあれば)を評価する工程
を含む方法に関する。
【００３０】
最後に、本発明の第9の側面は、乾癬に罹患しているヒトの治療方法であって、以下の初期工程:
i)本発明のブタモデルを用意する工程、
ii)上記遺伝的決定因子を上記ブタモデルにおいて発現し、上記疾患に関する上記表現型を発揮する工程、
iii)有効性を評価すべき医薬品組成物を上記ブタモデルに投与する工程、
iv)観察された効果を評価する工程、並びに
v)ブタモデルで観察された効果に基づいて乾癬に罹患している上記ヒトを治療する工程
を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】レポーター遺伝子及び選択的マーカー遺伝子を保有する組込みSBベクターが連続的な遺伝子発現のためのレポーターとして、したがって遺伝子挿入のための標的として役立つ本発明の技法(bi-phased technology)を示す図である。第2の改変工程では、このベクターは、特徴が十分に理解された遺伝子座において1つ又は複数の遺伝子発現カセットを挿入するための標的として役立ち得る。
【図２】pSBT/RSV-GFIPの概略図である。
【図３】ブタ線維芽細胞におけるSBベクターの転位を示す図である。ピューロマイシン耐性遺伝子(Puro)をコード化する標準トランスポゾン(SBT/PGK-puro)を用いて種々のレベルの転位が検出され、pSBT/PGK-puro及びpCMV-SBを同時導入した線維芽細胞の培養中には約75個の薬剤耐性コロニーが生じ、pSBT/PGK-puro及びpCMV-mSB(後者はトランスポゼースの不活性バージョンをコード化する)を同時導入した場合には3個未満のコロニーが生じた。興味深いことに、機能亢進性トランスポゼースバリアントHSB3を用いるとほぼ140個にも及ぶ平均コロニー数が得られ、これは、HSB3が、ブタ細胞においても、元のSBトランスポゼースと比較してより高レベルの転位を媒介するということを示す。
【図４】ブタ線維芽細胞中における、FRTタグをつけたSBベクターの効率的な挿入を示す図である。部位特異的遺伝子挿入のためのFlp組換え標的部位を含有するSBタグをつけた細胞クローンを生成するために、pSBT/loxP.SV40-lopP257プラスミドと共にpCMV-mSB、pCMV-SB及びpCMV-HSB3をそれぞれ同時導入した。HSB3は再び最高活性を示し、3×104個の線維芽細胞のトランスフェクション後に約30個の薬剤耐性コロニーを生じた。
【図５】単離及び増殖されたピューロマイシン耐性コロニーの蛍光顕微鏡によるクローン分析が効率的なFRTeGFP発現を実証することを示す図である。
【図６】(a)卵母細胞の三分割;(b)一次融合のための線維芽細胞-卵母細胞断片のカプレット;(c)トリプレットで再構築された胚(AC電流下での伸長に注目);(d)トリプレット融合。尺度バー=50μm。
【図７】(a)透明帯部分消化後のインビトロ成熟卵母細胞。(b)遠心分離後の脂肪分離(delipated)卵母細胞。(c)脂肪分離卵母細胞の二分割。(d)一次融合のための線維芽細胞-卵母細胞断片のカプレット。(e)脂肪分離卵母細胞から発生した4細胞期の再構築胚。(f)無傷卵母細胞から発生した4細胞期の再構築胚。(g)加温後の脂肪分離胚から再展開した胚盤胞。(h)加温後の脂肪分離胚から再展開した胚盤胞のHoechst染色及びUV照射。バーは100μmを表す。
【図８】化学的に促進される(chemically assisted)除核時の二分割。小さい方の部分(推定核体)に連結した突出錐体又は極体に注目。立体顕微鏡写真。バーは50μmを表す。
【図９】クロマチンの非存在及び存在のHoechst染色及びUV照射。UV光、倒立蛍光顕微鏡写真。バーは50μmを表す。(a)推定細胞質体中のクロマチンの非存在。(b)推定核体中のクロマチンの存在。
【図１０】化学的に促進されるハンドメイド(handmade)除核(CAHE)で産生された7日目の胚盤胞の立体顕微鏡写真。バーは50μmを表す。
【図１１】化学的に促進されるハンドメイド除核(CAHE)後に発生した胚盤胞のHoechst染色及びUV照射。バーは50μmを表す。
【図１２】ブタモデルの皮膚で発現されたブタPPARδ cDNA(Sus scrofa;ランドレース種)を示す。
【図１３】ブタモデルの皮膚中で発現するためのヒトIκB-α cDNAを示す。
【図１４】ブタモデルの皮膚中で発現されるヒトPPARδ cDNAを示す。
【図１５】ブタモデルの皮膚中で発現するためのブタIκB-α cDNA(Susscrofa;ランドレース種)を示す。
【図１６】本発明によるトランスジーン(好ましくはインテグリン)の挿入のために用いられ得るトランスポゾンベクター(pT2ベクター)コンストラクトの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
異常表皮増殖及び分化は、炎症性皮膚疾患である乾癬の特徴である。乾癬性ヒト表皮は、調節遺伝子PPAR-δ及びNFκBに関して均衡が失われている。ブタにおけるIκB-αのドミナントネガティブバリアントの発現によるNFκBの下向き調節、及びPPAR-δ上向き調節は、乾癬様調節不全の研究に活用され得るブタ原始表皮組織の発生を引き起こす。
【００３３】
本発明は、乾癬を研究するための遺伝子改変ブタモデルであって、乾癬に関連した少なくとも1種類の表現型を発現する遺伝子改変ブタモデルに関する。
【００３４】
本発明は、ヒト又は動物に対する如何なる実質的な医学的恩恵も欠きながらブタの遺伝的同一性を改変してブタに苦痛を与えると思われる過程、あるいはそのような過程から生じる動物を含むものではない、ということが理解されるべきである。
【００３５】
本発明は、本明細書中に記載される方法により得ることができる遺伝子改変ブタ胚、胚盤胞、胎仔、ドナー細胞及び/又は細胞核にも関する。
【００３６】
本明細書中に記載される乾癬を研究するためのブタモデルを製造するための方法は、ブタに実施される外科的工程を包含しない。
【００３７】
本明細書中においては、「遺伝的決定因子」という用語は対象の構造遺伝子を含む一本鎖又は二本鎖「ポリヌクレオチド分子」又は「核酸」を指すよう用いられる。「遺伝的決定因子」は、標的細胞中で普通は検出可能量では作られないタンパク質をコード化する。したがって「遺伝的決定因子」は、標的細胞のゲノム中に普通は見出されない核酸を含む。「遺伝的決定因子」は、標的細胞のゲノム内に普通に見出されるが、通常は検出可能量で標的細胞中で発現されないタンパク質の発現を可能にする形態である核酸も包含する。「遺伝的決定因子」はまた、天然タンパク質のバリアント又は突然変異体形態をコード化する場合もあり得る。
【００３８】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は互換的に用いられ、そして単数又は複数で用いられる場合、一般的に任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これは非修飾RNA若しくは非修飾DNA又は修飾RNA若しくは修飾DNAであり得る。したがって、例えば本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチドとしては、一本鎖DNA及び二本鎖DNA、一本鎖領域及び二本鎖領域を含むDNA、一本鎖RNA及び二本鎖RNA、並びに一本鎖領域及び二本鎖領域を含むRNA、一本鎖又はより典型的には二本鎖又は一本鎖領域及び二本鎖領域を含むDNA及びRNAから成るハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で用いる場合、RNA若しくはDNAか、又はRNA及びDNAの両方を含む三本鎖領域を指すことも追加される。このような領域における鎖は、同一分子由来、又は異なる分子由来であり得る。該領域は、1つ又は複数の分子の全てを含み得るが、より典型的には分子のうちのいくつかのものの一領域のみを包含する。三重らせん領域の分子のうちの1つはしばしば、オリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」という用語はcDNAを特定的に含む。この用語は、1つ又は複数の修飾塩基を含有するDNA(cDNAを含む)及びRNAを包含する。したがって安定性のため又は他の理由のために修飾された主鎖を有するDNA又はRNAは、その用語が本明細書中で意図されるところの「ポリヌクレオチド」である。さらに通常でない塩基、例えばイノシン、又は修飾塩基、例えばトリチウム化塩基を含むDNA若しくはRNAは、本明細書中で定義されるような「ポリヌクレオチド」という用語内に含まれる。概して、「ポリヌクレオチド」という用語は、非修飾ポリヌクレオチドの全ての化学的、酵素的及び/又は代謝的修飾形態、並びにウイルス及び単純型及び複雑型細胞を含む細胞に特徴的なDNA及びRNAの化学的形態を包含する。
【００３９】
ブタ
「トランスジェニック」ブタ及び「遺伝子改変」ブタという用語は、本明細書中では同一の意味で用いられる。
【００４０】
本発明は、乾癬を研究するための一モデルとしての改変ブタであって、乾癬に関連した少なくとも1種類の表現型を発現する改変ブタに関する。本発明のブタは、任意のブタであり得る。ブタは、例えば齧歯類と比較して、ヒトに進化的に近い。さらに、ヒトとブタとの間の生理上の類似性のため、ブタは生物医学的研究に広く用いられてきた(Douglas, 1972;Book & Bustad, 1974)。
【００４１】
本発明の一実施形態では、ブタは野生ブタである。別の実施形態では、ブタは家畜ブタ(Sus scrofa)、例えばS. domesticusである。さらに別の実施形態では、本発明は、ミニブタ、及び近交系ブタに関する。ブタは、例えばランドレース、ヨークシャー、ハンプシャー、デュロック、チャイニーズ
メイシャン、バークシャー及びピエトランから成る群、例えばランドレース、ヨークシャー、ハンプシャー及びデュロックから成る群、例えばランドレース、デュロック及びチャイニーズ
メイシャンから成る群、例えばバークシャー、ピエトラン、ランドレース及びチャイニーズ メイシャンから成る群、例えばランドレース及びチャイニーズ メイシャンから成る群から選択され得る。一実施形態では、ブタはミニブタではない。別の実施形態では、本発明のブタは近交系ブタである。
【００４２】
本発明の別の実施形態では、ブタはミニブタであり、そしてミニブタは、好ましくはゲッティンゲン、ユカタン、バマ・シャン・チュー、ウージーシャン及びシーサンバンナから成る群から選択される。したがって本発明は、個別での又は任意の組合せでの、ゲッティンゲン、ユカタン、バマ・シャン・チュー、ウージーシャン及びシーサンバンナのいずれかに関する。
【００４３】
そのサイズ及び約200kgという重量のため、家畜ブタは実験室環境では容易に取り扱われない。家畜ブタに代わる好ましい代替物は、約30kgの重量であるゲッティンゲン(Goettingen)ミニブタである。ゲッティンゲン・ミニブタの脳は家畜ブタとほぼ同一のサイズを有し、形態学的にも同一であるが、出生後の発達に差異が存在し得る(Jelsing et al. J. Exp. Biol. 2006)。したがってゲッティンゲン・ミニブタは神経科学において用いられることが増えており、機能画像診断研究のための実験モデルとして役立ってきており、そして容積スクリーニング手法並びに磁気共鳴ベースの定位固定地図が開発されてきた(Jelsing et al. Exp Brain Res 2005;Watanabe et al. NeuroImage 2001)。したがって、本発明のブタの好ましい一実施形態はゲッティンゲン・ミニブタである。
【００４４】
遺伝子改変
改変は、細胞核移植前に体細胞に導入される。しかしながら、別の実施形態では、例えばハンドメイドクローニング(HMC)手法の異なる工程でのトランスジーンの付加により(これはその後、胚のゲノムにたどり着く)、改変は細胞核移植過程中にも導入され得る。
【００４５】
遺伝子改変は、体細胞のゲノム中への疾患原因遺伝子(突然変異化遺伝子)の無作為組込みを含む。それは、特定組織中で又は特定発現レベルで発現される場合に疾患を引き起こす正常な非突然変異化遺伝子の無作為組込みでもあり得る。
【００４６】
しかしながら本発明は、本明細書中に開示される遺伝子に係るmRNA及び/又はタンパク質の転移により得られる改変ブタ胚、胚盤胞、胎仔、ドナー細胞及び/又は細胞核にも関する。したがってブタ胚、胚盤胞、胎仔、ドナー細胞及び/又は細胞核の改変は、一実施形態においては、ブタ、胚、胚盤胞及び/又は胎仔のゲノム中へのトランスジーンの組込みを伴わない。
【００４７】
導入された遺伝子又はトランスジーン、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部は、任意の種、例えば細菌、ブタ、ヒト、マウス、ラット、酵母、無脊椎動物又は植物に由来し得る。トランスジーンの調節配列は、遍在性若しくは誘導性又は組織特異的及び/又は時間特異的発現を推進し、また、任意の種、例えばブタ、ヒト、マウス、ラット、酵母、無脊椎動物又は植物にも由来し得る。
【００４８】
体細胞における遺伝子改変は、標的コンストラクトの相同組換えにより、又は遺伝子編集手法により、ブタゲノム中の特定領域に挿入され得る、ということは重要である。これは特定遺伝子を不活性化(ノックアウト)し疾患若しくは表現型を引き起こし得るし、或いは特定遺伝子に対して特定突然変異を組込み(ノックイン)その結果疾患を引き起こすこともあり得る。さらにまた、疾患を引き起こすトランスジーンは、相同組換え法によりブタゲノムの特定調節領域にも組込まれ得る。
【００４９】
相同組換えは、2つの相同DNA分子間で起こる。それは、DNA交差とも呼ばれる。相同組換えにより、1つのDNAセグメントが、類似の配列を有する別のDNAセグメントと置き換わり得る。その過程は、特定の酵素により媒介されるDNAの相同領域間の切断及び再結合を包含する。該技法は、ゲノム中の他の遺伝子座に影響を及ぼすことなく、1つの対立遺伝子を操作されたコンストラクトと置換することを可能にする。相同組換えを用いて、宿主細胞ゲノムの特定の既知の遺伝子座へのトランスジーンの挿入を指図することができる。標的遺伝子座のDNA配列が分かれば、任意の遺伝子を遺伝子改変DNAコンストラクトと置換し、それにより標的配列を置き換えるか又は欠失させることができる。この技法は、正常遺伝子を発見し、単離して、次にそれを生体内で欠陥コピーと置換することによりその機能を決定することを包含する。この手法は「遺伝子ノックアウト」として知られており、これは、相同組換えを利用することにより特定遺伝子の標的化を可能にする。標的遺伝子のクローン化コピーは、それらを非機能性にするよう変更され、その後ES細胞中に導入され、ここでそれらは細胞のゲノム中の相同遺伝子と組み換えられ、正常遺伝子を非機能性コピーに置換する。
【００５０】
相同組換えは、「ノックイン」戦略において融合遺伝子又は点突然変異の挿入を作成するために同様に利用され得るが、この場合、染色体転座-融合パートナーのcDNA配列と融合された標的遺伝子座の関連エキソンを含む標的化ベクターが胚性幹細胞中にトランスフェクションされ、それにより組換え配列が内在性遺伝子と融合されて、融合遺伝子を生じる。
【００５１】
別の適用可能な技法はRNA干渉(RNAi)と呼ばれる現象を利用するが、この場合、21個のヌクレオチドから成る低分子干渉RNA(siRNA)が特定のmRNAを効率よく分解することができる。RNA干渉は、真核生物細胞における新しいレベルの遺伝子調節機構である。それは、細胞中に二本鎖RNAが存在すると同一配列の遺伝子の発現が排除されるが、その一方、関連しない他の遺伝子の発現は邪魔されないままである、という事実に基づいている。siRNAは、siRNAと同一配列を有する他の一本鎖RNAを切断するよう細胞機構を刺激する。
【００５２】
HMC手法の前又は最中にブタゲノム中に導入される遺伝子改変は、エピジェネティックな改変(例えばDNAのメチル化、又はヒストンのメチル化若しくはアセチル化/脱アセチル化)でもあり得るが、これは体細胞、卵母細胞又は再構築HMC胚をトリコスタチン又は類似の効果を有する化合物のような化学成分と共にインキュベートすることによって得られる。
【００５３】
本発明は、本明細書中に詳細に記載されるような遺伝的決定因子を含む改変ブタ胚、胚盤胞、胎仔、ドナー細胞及び/又は細胞核に関する。本発明は、乾癬に関連した少なくとも1種類の表現型を発現する改変ブタ由来のブタ胚、胚盤胞及び/又は胎仔にも関する。
【００５４】
本発明の一実施形態では、トランスジェニックブタ胚、胚盤胞、胎仔、ドナー細胞及び/又は細胞核は、ブタPPARδ遺伝子(配列番号1)若しくはその一部;ヒトPPARδ遺伝子(配列番号2)若しくはその一部;ブタIκB-α遺伝子(配列番号3)若しくはその一部;又はヒトIκB-α遺伝子(配列番号4)若しくはその一部から選択される少なくとも1つの遺伝子に関してトランスジェニックである。しかしながら、別の実施形態では、トランスジェニックブタは、遺伝子の組合せ、例えばブタPPARδ遺伝子若しくはその一部とヒトIκB-α遺伝子若しくはその一部とに関してトランスジェニックであり、又はトランスジェニックブタは、ブタPPARδ遺伝子若しくはその一部とブタIκB-α遺伝子若しくはその一部との組合せに関してトランスジェニックであり、又はトランスジェニックブタは、ヒトPPARδ遺伝子若しくはその一部とヒトIκB-α遺伝子若しくはその一部との組合せに関してトランスジェニックであり、又はトランスジェニックブタは、ヒトPPARδ遺伝子若しくはその一部とブタIκB-α遺伝子若しくはその一部との組合せに関してトランスジェニックである。
【００５５】
ブタPPARδ遺伝子のcDNA若しくはその一部、及び/又はヒトPPARδ遺伝子のcDNA若しくはその一部、及び/又はブタIκB-α遺伝子のcDNA若しくはその一部、及び/又はヒトIκB-α遺伝子のcDNA若しくはその一部、並びに本明細書中に概説される組合せは、本発明の範囲内であると理解される。さらに、別の実施形態では、遺伝子改変ブタは、ブタ及び/又はヒトのPPARδ遺伝子の転写産物若しくはその一部及び/又は翻訳産物若しくはその一部を含む。さらなる一実施形態では、遺伝子改変ブタは、ブタ及び/又はヒトのIκB-α遺伝子、又は本明細書中に記載されるその組合せの転写産物若しくはその一部及び/又は翻訳産物若しくはその一部を含む。
【００５６】
遺伝子(トランスジーン)は本発明によるブタの皮膚におけるトランスジーンの発現を指図するプロモーターにより駆動され得る、と理解される。例えばケラチン1(K1)プロモーター、ケラチン5(K5)プロモーター、ケラチン10(K10)プロモーター、ケラチン14(K14)プロモーター及びインボルクリン(involucrine)プロモーターのようないくつかの皮膚特異的プロモーターは、皮膚特異的発現に適することが知られている。トランスジーンが恒常的に又は誘導により発現される、というのも、本発明の範囲内である。
【００５７】
本発明による乾癬の遺伝的決定因子は、トランスジーンの過剰発現も含む。本明細書中に記載されるトランスジーンの過剰発現は、本発明によるブタにおける乾癬表現型をもたらす。実施形態は、トランスジーン、例えばPPAR、例えばPPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-1IKK2
fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1に関する。
【００５８】
本明細書中に列挙される遺伝子のcDNA又はその一部、及びトランスジーンの組合せは、本発明の範囲内である。さらに、別の実施形態では、遺伝的改変ブタは、ブタ、ヒト又はマウス遺伝子の転写産物若しくはその一部及び/又は翻訳産物若しくはその一部を含む。
【００５９】
別の実施形態では、本発明による乾癬の遺伝的決定因子は、トランスジーンの欠失、突然変異及び/又は抑制も含む。したがって、他の実施形態では、本明細書中に記載されるトランスジーンの欠失、突然変異及び/又は抑制は、本発明によるブタにおける乾癬表現型をもたらす。このような実施形態は、トランスジーン、例えばJunB/c-Jun、IL-1Ra、ILK-1Ra、CD18及び/又はLIG2を含む。
【００６０】
プロモーターとトランスジーンとの組合せに関して本発明の実施形態は、例えばK5-STAT3c(Sano et al Nat Immunol 2005)、インボルクリン-インテグリンβ1(Caroll et al Cell 1995)、インボルクリン-インテグリンα2(Carrol et al Cell 1995)、インボルクリン-MEK1(Hobbs et al J Invest derm 2004)、K14-アンフィレギュリン(Cook et al J Clin Invest 1997)、K10-BMP-6(Blessing
et al J Cell biol 1996、Kaiser et al J Invest Dermatol
1998)、K14-VEGF(Kunstfeldt et al Blood 2004、Xia et al Blood 2003)、K5-JunBΔec-JunΔep(Zenz et al 2005)、K14-IL-1a(Groves et al J Clin Invest 1996、Groves
et al PNAS 1995)、K5-TGFβ1(Li et
al Derm Symp Proc 2005、Li et al EMBO 2004)、CD18ハイポ(Bullard et al PNAS 1996、Barlow et al Am J pathol 2003)、K14-Cre-IIKK2
fl7fl(Pasparakis et al Nature 2002)、K1-Dsg1若しくはK1-Dsg3(Merrit et al Mol Cell Biol 2002)、SCCE(Ny
et al Act Derm Venerol 2004)、K14-TGF-a(Vassar et al
Genes devel 1991)、K14-TNF-a(Genes Dev. 1992
Aug;6(8):1444-56)、K14-IL-20(Blumberg et al Cell 2001)、インボルクリン-IFN-γ(Carroll et al J Invest dermatol 1997)、LIG1 KO(Suzuki et al FEBS 2002)、K14-KGF(Guo
et al EMBO 1993)、K14-IL-6(Turksen et al PNAS 1992)、PAFR(sato et al Arch Dermatol Res 1999)、K14-Cre/Ikk2FL/FL、K14-p40(Kopp et al, J Invest Dermatol. 2001 Sep;117(3):618-26)、K14-Tie2(Voskas et al, Am J Pathol. 2005 Mar;166(3):843-55)、K14-IL-1Ra(Shepherd et al, J Invest Dermatol. 2004 Mar;122(3):665-9)、K14-IKK2(M. Pasparakis et al., Nature 417(6891), 2002, pp. 861-866)、又はK14-LIG-1(Y. Suzuki et al., FEBS Lett. 521(1-3), 2002, pp. 67-71)である。
【００６１】
配列同一性
機能的等価物及びバリアントは、本明細書中では互換的に用いられる。本発明の好ましい一実施形態では、本明細書中に記載されるヒト及び/又はブタのPPARδ遺伝子及び/又はIκB-α遺伝子のバリアント並びにその断片のバリアント、及び/又は任意のその他のトランスジーンも提供される。ポリペプチドである場合、バリアントは、予定アミノ酸配列(predetermined amino acid sequence)(即ち配列番号4及び/又は配列番号6)とそれらとの同一性若しくは相同性の程度に基づいて決定され、又はバリアントが断片である場合は、それぞれ上記アミノ酸配列のいずれかの断片である。
【００６２】
同様に、PPARの機能的等価物及びバリアント、例えばPPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-1IKK2
fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1は、本発明の範囲内である。
【００６３】
したがって、バリアントは好ましくは、予定配列と、少なくとも91%の配列同一性を、例えば少なくとも91%の配列同一性、例えば少なくとも92%の配列同一性、例えば少なくとも93%の配列同一性、例えば少なくとも94%の配列同一性、例えば少なくとも95%の配列同一性、例えば少なくとも96%の配列同一性、例えば少なくとも97%の配列同一性、例えば少なくとも98%の配列同一性、例えば99%の配列同一性を有する。
【００６４】
以下の用語は、2つ以上のポリヌクレオチドの間の配列関係を記述するために用いられる:「予定配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」及び「実質的同一性」。
【００６５】
「予定配列」は、配列比較のための基礎として用いられる定義済みの配列である;予定配列は、より大きな配列の一部分、例えば全長DNA若しくは配列表に示された遺伝子配列(例えば配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4のポリヌクレオチド配列)の一セグメントであり得るし、又は完全なDNA配列若しくは遺伝子配列を含み得る。一般的には、予定配列は、少なくとも20ヌクレオチド長、しばしば少なくとも25ヌクレオチド長、そして多くの場合少なくとも50ヌクレオチド長である。
【００６６】
2つのポリヌクレオチドは各々、(1)2つのポリヌクレオチド間で類似している配列(すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部分)を含み、さらに(2)2つのポリヌクレオチド間で相違する配列をも含み得るので、2つ(又はそれより多く)のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、「比較ウインドウ」の範囲内で2つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性を有する局所的領域を同定し、比較することにより実施される。「比較ウインドウ」は、本明細書中で用いる場合、少なくとも20個の近接するヌクレオチドからなる概念的セグメントを指し、この場合、ポリヌクレオチド配列は少なくとも20個の近接するヌクレオチドから成る予定配列と比較され、また、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列は、2つの配列のアラインメントを最適化するために、予定配列(これは付加又は欠失を含まない)と比較して、最大20%までの付加又は欠失(すなわちギャップ)を含み得る。
【００６７】
比較ウインドウを比較するための配列の最適アラインメント(optimal alignment)は、Smith and Waterman
(1981) Adv. Appl. Math. 2: 482の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman
and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444の類似性検索メソッドにより、以下のアルゴリズムのコンピューターによる実行により(GAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA;
Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.によるWisconsin Genetics Software Package Release 7.0に含まれる)、又は精査により実行され得るし、種々の方法により生成される最良のアラインメント(すなわち、比較ウインドウ内での相同性の百分率が最高であるもの)が選択される。
【００６８】
「配列同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が、比較ウインドウに亘って同一である(すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドを基準として)、ということを意味する。「配列同一性の百分率」という用語は、比較ウインドウに亘って2つの最適に整列させた配列を比較して、核酸塩基(例えば、A、T、C、G、U又はI)が両方の配列で同一となる位置の数を決定し、一致した位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数(すなわちウインドウサイズ)で割り、そしてその結果に100を掛けて配列同一性の百分率を得ることにより算定される。「実質的同一性」という用語は、本明細書中で用いる場合、ポリヌクレオチド配列の一特徴を示し、この場合、ポリヌクレオチドは、少なくとも20個のヌクレオチドから成る比較ウインドウに亘って(しばしば少なくとも25個〜50個のヌクレオチドのウインドウに亘って)予定配列と比較した場合、少なくとも85%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%〜95%の配列同一性、さらに通常は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含み、この場合、配列同一性の百分率は予定配列とポリヌクレオチド配列(予定配列に対して最大20%までの欠失又は付加を含み得る)を比較ウインドウに亘って比較することにより算定される。予定配列は、例えば本明細書中に示される全長PPAR及び/又はIκB-αポリヌクレオチド配列の一セグメントであるような、より大きな配列のサブセットであり得る。
【００６９】
「転写産物又は翻訳産物」という用語は、本明細書中では、遺伝子転写の産物、例えばRNA転写物、例えば非スプライス型RNA転写物、mRNA転写物及び上記mRNA転写物スプライシング産物、並びに遺伝子翻訳の産物、例えば遺伝子mRNA転写物のいずれかから翻訳されるポリペプチド(単数又は複数)、及び上記ポリペプチドの翻訳後プロセシングの種々の産物、例えばポリペプチド(単数又は複数)の翻訳後タンパク質分解プロセシングの産物又は上記ポリペプチド(単数又は複数)の種々の翻訳後修飾の産物を意味する。
【００７０】
本明細書中で用いる場合、「遺伝子の転写産物」という用語は、遺伝子と同一の配列情報を含有する(UヌクレオチドがTヌクレオチドに置き換わりはするが)プレ-メッセンジャーRNA分子(プレmRNA)、又はプレmRNAのスプライシングの結果産生され、遺伝子の遺伝情報がタンパク質に翻訳されるための鋳型である成熟メッセンジャーRNA分子(mRNA)を指す。
【００７１】
表現型
乾癬に関連した表現型は、多数存在する。本発明のブタモデルは乾癬に関連した少なくとも1種類の表現型、例えば乾癬に関連した3種類、例えば4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、11種類、12種類、13種類、14種類、15種類、16種類、17種類、18種類、19種類又は20種類の表現型を発現する、と理解される。
【００７２】
乾癬に関連した表現型は、尋常性乾癬、滴状乾癬、屈側性乾癬、乾癬性紅皮症、膿疱性乾癬又は乾癬性関節炎から選択される疾患の症状を含む。したがって、尋常性乾癬、滴状乾癬、屈側性乾癬、乾癬性紅皮症、膿疱性乾癬又は乾癬性関節炎の表現型のいずれか1つが、個別に又は組み合わされて、ブタモデルで表示される、と理解される。しかしながら表現型のうちの1つ又は複数、例えば尋常性乾癬及び乾癬性関節炎の組合せ、又は滴状乾癬及び乾癬性関節炎の組合せ、又は乾癬性紅皮症及び乾癬性関節炎の組合せ、又は膿疱性乾癬及び乾癬性関節炎の組合せ、屈側性乾癬及び乾癬性関節炎の組合せ、又は尋常性乾癬及び屈側性乾癬の組合せ、又は膿疱性乾癬及び尋常性乾癬の組合せ、又は尋常性乾癬及び屈側性乾癬の組合せ、又は尋常性乾癬及び乾癬性紅皮症の組合せ、又は滴状乾癬及び乾癬性紅皮症の組合せ、又は膿疱性乾癬及び乾癬性紅皮症の組合せ、又は屈側性乾癬及び乾癬性紅皮症の組合せが、ブタモデルで表示され得る。
【００７３】
乾癬を示す一表現型は、白色鱗屑で被覆される炎症性赤色隆起領域である。鱗屑形成は、皮膚の外層中の細胞が正常より速く再生し、皮膚表面に積み重なる場合に起こる。その結果として、皮膚は3日〜4日毎に剥げ落ちる。最もしばしば、肘、膝、頭皮、又は生殖器領域の皮膚が、乾癬に侵される。さらに、爪の変化は一般的であり、真菌感染に似た点食(pitting)及び黄色っぽい変色を含む。乾癬は、抜け毛を引き起こす場合もある。
【００７４】
乾癬は、種々の形態で、例えば尋常性乾癬、膿疱性乾癬、滴状乾癬及び屈側性乾癬として病状発現し得る。乾癬は異なった形態及び重症度で生じるので、各個体は相違した症状を経験し得る。
【００７５】
円板状乾癬は尋常性乾癬とも呼ばれ、最も一般的な形態である。症状としては、体幹、腕、足、膝、肘、生殖器及び頭皮の赤色隆起皮膚斑が挙げられ得る。爪も肥厚し、点食するようになり、そして爪床から分離し得る。尋常性乾癬は、乾癬を有するヒトの80%〜90%に影響を及ぼす。
【００７６】
滴状乾癬は中等度レベルの乾癬であり、これは主として小児に影響を及ぼす。症状としては、赤色隆起皮膚の多数の小斑が挙げられ得る。連鎖球菌感染に関連した咽頭炎が、通常この型の乾癬の開始に先行する。滴状乾癬は、身体の広い領域、例えば体幹、四肢及び頭皮に出現する多数の小卵円形スポットを特徴とする。
【００７７】
屈側性乾癬は、皮膚襞中に、例えば腋窩に、乳房下に、特に生殖器周囲に生じる皮膚の平滑炎症斑である。屈側性乾癬はしばしば真菌感染に罹り易く、状態は摩擦及び汗により悪化するようになると見られる。
【００７８】
重症例では、乾癬性紅皮症が、特に系統的な治療の突然の中止後に観察される。乾癬性紅皮症は、身体表面のほとんどに亘る皮膚の広範な炎症及び剥離を包含し、しばしばそう痒感、膨潤及び疼痛を伴う。皮膚の極度の炎症及び剥離は、身体が温度を調節する能力、そして皮膚がバリア機能を実施することの障害となり得ることさえあり、その結果として致命的にもなり得る。
【００７９】
最後に、膿疱性乾癬では、身体全体に亘る、又は掌、足裏及びその他の小領域上だけに現れる小膿疱(非感染性膿含有水疱)が症状として挙げられ得る。乾癬の症状は、他の皮膚の状態に類似し得る。皮膚の状態が白色鱗屑の発生にまで進行する場合、医者は通常は、爪及び皮膚の診察で乾癬と診断し得る。診断の確証は皮膚生検によりなされ得るが、この場合、小皮膚検体が顕微鏡下で検査される。
【００８０】
一実施形態では、本発明の表現型は、尋常性乾癬、滴状乾癬、屈側性乾癬、乾癬性紅皮症、膿疱性乾癬又は乾癬性関節炎から成る群から選択される。別の実施形態では、本発明の表現型は、白色鱗屑、皮膚炎症、隆起皮膚、赤色皮膚、皮膚の剥脱、爪の変化、爪の黄変、及び抜け毛から成る群から選択される。さらなる一実施形態では、本発明の表現型は皮膚の剥脱である。さらなる別の実施形態では、本発明の表現型は、体幹、腕、足、膝、肘、生殖器及び頭皮の赤色隆起皮膚斑である。別の実施形態では、本発明の表現型は、赤色皮膚、隆起皮膚の小斑、身体の広い領域全体に出現する多数の小卵円形スポットから成る群から選択される。さらなる一実施形態では、本発明の表現型は、皮膚襞中に、例えば腋窩に、乳房下に、特に生殖器周囲に生じる皮膚の平滑炎症斑から成る群から選択される。別の一実施形態では、本発明の表現型は、身体表面のほとんどに亘る皮膚の広範な炎症及び剥離、そう痒感、膨潤及び疼痛、身体が温度を調節する能力の障害並びに死から成る群から選択される。さらに別の実施形態では、本発明の表現型は、身体全体に亘る、又は掌、足裏及びその他の小領域上だけに現れる小膿疱である。
【００８１】
診断は、臨床的観察及び(例えば生検の形態における)皮膚組織の顕微鏡検査に基づいて主に行われる。
【００８２】
表現型は、ブタの種々の年齢で、例えば6月齢、12月齢、18月齢、24月齢、又は2.5年齢、3年齢、3.5年齢、4年齢、4.5年齢、5年齢、5.5年齢、6年齢、6.5年齢若しくは7年齢で研究され得る。
【００８３】
乾癬に関連した少なくとも1種類の表現型を発現している、乾癬を研究するための改変ブタモデル由来の改変ブタ胚、胚盤胞、及び/又は胎仔は、例えばPPAR、例えばPPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-1IKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1のうちの1つ又は複数のトランスジーンを過剰発現するブタを、同一群の異なるトランスジーンと交雑することの結果であり得ることが理解される。しかしながら、例えばPPAR、例えばPPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-1IKK2
fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIGのうちの1つ又は複数を過剰発現するブタは、JunB/c-Jun、IL-1Ra、ILK-1Ra、CD18、及び/又はLIG2のようなトランスジーンの少なくとも1つの欠失、突然変異及び/又は抑制を保有するブタと交雑され得る。
【００８４】
乾癬を研究するためのブタモデルの製造方法
本発明の改変ブタ胚、胚盤胞、胎仔、ドナー細胞及び/又は細胞核は、改変した遺伝物質、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部がドナー細胞から例えば除核卵母細胞のような宿主細胞に移されるいずれかの技法を使用して、製造され得る。例えばマイクロインジェクションにより、又は核移植により、遺伝子改変体細胞から除核卵母細胞に遺伝物質を導入するといったような多数の技法が存在する。本発明は、或る細胞からの核DNA全てを除核細胞に導入することを指す核移植によりブタをクローニングするための改良型手法を提供する。
【００８５】
クローニングに際して、自身の核を除去(脱核又は除核)された卵細胞(卵母細胞)中へ体(身体)細胞又は体細胞の核を移植することは、体細胞核移植と呼ばれる。この再構築胚から新個体が発生し、その個体は体細胞のドナーと遺伝的に同一である。
【００８６】
本発明において、改変ブタモデル、ブタ胚、胚盤胞及び/又は胎仔は、a)修飾透明帯の少なくとも一部を有する少なくとも1つの卵母細胞を確立する工程、b)卵母細胞を少なくとも2つの部分に分離し少なくとも1つの細胞質体を得る工程、c)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞又は細胞核を確立する工程、d)少なくとも1つの細胞質体をドナー細胞又は膜包囲細胞核と融合する工程、e)再構築胚を得る工程を含む体細胞核移植により得ることができる。
【００８７】
しかしながら、本発明は、乾癬のためのモデルとしてのトランスジェニックブタの製造方法であって、a)少なくとも1つの卵母細胞を確立する工程、b)卵母細胞を少なくとも3つの部分に分離し、少なくとも2つの細胞質体を得る工程、c)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞又は細胞核を確立する工程、d)少なくとも1つの細胞質体をドナー細胞又は膜包囲細胞核と融合する工程、e)再構築胚を得る工程、f)胚を形成するように再構築胚を活性化する工程、及びg)胚が遺伝子改変胎仔に発生するように上記培養胚を宿主哺乳動物に移す工程を含む方法にも関し、
この場合、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胚は工程a)〜工程e)及び/又は工程f)を含み、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胚盤胞は工程a)〜工程e)及び/又は工程f)を含み、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胎仔は工程a)〜工程g)を含む。
【００８８】
c)のドナー細胞又は細胞核は、例えば改変ヒト又はブタPPAR及び/又はインテグリン遺伝子又はその一部及び/又はその転写産物及び/又は翻訳産物の形態で、乾癬のための遺伝的決定因子を保有する、と理解される。g)の宿主哺乳動物は、一実施形態では、ブタ、好ましくはゲッティンゲン・ミニブタである。
【００８９】
しかしながら本発明は、乾癬のモデルとしてのトランスジェニックブタ、ブタ胚盤胞、胚及び/又は胎仔の製造方法であって、a)少なくとも1つの卵母細胞を確立する工程、b)卵母細胞を少なくとも3つの部分に分離し、少なくとも1つの細胞質体を得る工程、c)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞又は細胞核を確立する工程、d)少なくとも1つの細胞質体をドナー細胞又は膜包囲細胞核と融合する工程、e)再構築胚を得る工程、f)胚を形成するように再構築胚を活性化する工程、及びg)胚が遺伝子改変胎仔に発生するように上記培養胚を宿主哺乳動物に移す工程を含む方法にも関し、
この場合、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胚は工程a)〜工程e)及び/又は工程f)を含み、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胚盤胞は工程a)〜工程e)及び/又は工程f)を含み、核移植により得ることができる上記遺伝子改変胎仔は工程a)〜工程g)を含む。
【００９０】
b)の卵母細胞は、別の実施形態では、少なくとも3つの部分に分離されて、少なくとも2つの細胞質体を得ることができる。c)のドナー細胞又は細胞核は、例えば改変ヒト若しくはブタPPAR及び/又はインテグリン遺伝子又はその一部及び/又はその転写産物及び/又は翻訳産物の形態で、乾癬のための遺伝的決定因子を保有する、と理解される。g)の宿主哺乳動物は、一実施形態では、ブタ、好ましくはゲッティンゲン・ミニブタである。
【００９１】
多様なパラメーターを、以下で詳細に説明する。
【００９２】
卵母細胞
本発明による「卵母細胞」という用語は、未成熟雌生殖細胞、すなわち、卵子(配偶子)を形成するための成熟過程を完了していないものを意味する。本発明において、除核卵母細胞は、核移植過程におけるレシピエント細胞である。
【００９３】
本発明による卵母細胞は、哺乳動物の輸卵管及び/又は卵巣から単離される。通常は、卵母細胞は死亡ブタから回収されるが、それらは生存ブタの輸卵管及び/又は卵巣からも単離され得る。一実施形態では、卵母細胞は、輸卵管的回収手法又は経膣回収法により単離される。好ましい一実施形態では、卵母細胞は吸引により単離される。卵母細胞は、典型的には、除核前に当業者に既知の種々の培地中で成熟させられる。卵母細胞は、屠殺された直後の動物の卵巣から、又は卵巣が凍結され及び/又は解凍された場合の卵巣からも単離され得る。卵母細胞は輸卵管から新たに単離されるのが好ましい。
【００９４】
卵母細胞又は細胞質体はまた、使用前に凍結保存され得る。新たに単離され、成熟させた卵母細胞が好ましいと当業者により理解されるが、一方、採取後又は成熟後に卵母細胞を凍結保存することができることも理解される。凍結保存卵母細胞が利用される場合には、成熟培地中に入れられる前に先ず解凍されなければならない。解凍過程後にそれらが活性であるような凍結保存材料の解凍方法は、当業者には既知である。しかしながら、概して、卵母細胞及び細胞質体の凍結保存は非常に過度な労力を要する手法であり、ブタの卵母細胞及び細胞質体の上記の一般的脆弱性のため、また脂質の含量が多いことによる冷害(すなわち、冷却及び加温手順中に+15℃〜+5℃で起こる損傷)に対する高い感受性のため、ブタにおいて特にそれは困難である。
【００９５】
別の実施形態では、生体内で成熟させた成熟(減数第二分裂中期(metaphase II))卵母細胞が採取され、そして本明細書中に開示される核移植方法に用いられ得る。本質的には、成熟減数第二分裂中期卵母細胞は、発情期開始後、又はヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)又は類似のホルモンの注射後、35時間〜48時間目に非過剰排卵ブタ又は過剰排卵ブタから外科的に収集される。
【００９６】
卵母細胞がインビトロで培養された場合、生体内で卵母細胞を取り囲み蓄積している卵丘細胞を除去して、除核のために成熟のより適切な段階にある卵母細胞を提供し得る。卵丘細胞は、例えば0.1%〜5%の範囲のヒアルロニダーゼ、例えば0.2%〜5%の範囲のヒアルロニダーゼ、例えば0.5%〜5%の範囲のヒアルロニダーゼ、例えば0.2%〜3%の範囲のヒアルロニダーゼ、例えば0.5%〜3%の範囲のヒアルロニダーゼ、例えば0.5%〜2%の範囲のヒアルロニダーゼ、例えば0.5%〜1%の範囲のヒアルロニダーゼ、例えば0.5%のヒアルロニダーゼの存在下で、ピペッティング又はボルテックスにより除去され得る。
【００９７】
好ましい方法における第一工程は、適切なブタからのレシピエント卵母細胞の単離に係わる。この点では、卵母細胞は、任意のブタ源から、そして任意の成熟段階で得られ得る。
【００９８】
除核及び核移植における卵母細胞の成熟段階は、核移植法の成功にとって重要であることが報告されている。ブタ卵巣からは未成熟(分裂前期I(prophase I))卵母細胞がしばしば吸引により採取される。遺伝子工学処理、核移植及びクローニングのような技法を用いるためには、採取されたこのような卵母細胞は、核移植のためのレシピエント細胞として用いられ得る前に、インビトロで成熟させることが好ましい。
【００９９】
ブタ胚クローニングを成功させるためには、レシピエント卵母細胞として減数第二分裂中期卵母細胞を用いるのが好ましいが、これは成熟のこの段階の卵母細胞は、導入核をあたかもそれが受精精子であるかのように処理するように活性化させることができるか又は既にそのような活性を十分に有している、と考えられるためである。しかしながら本発明は、体細胞核移植、本発明の体細胞核移植の方法により得ることができる胚、胚盤胞及び/又はトランスジェニックブタを実行するのに適する卵母細胞の任意の成熟段階に関する。
【０１００】
卵母細胞のインビトロでの成熟は、卵母細胞が減数第二分裂中期段階に到達するか又は第一極体を押出すまで、通常は成熟培地中で行われる。未成熟卵母細胞が成熟に達するのに要する時間は、成熟期間と呼ばれる。
【０１０１】
本発明の好ましい一実施形態では、卵母細胞は成熟雌ブタ(sow)又は若い雌ブタ(gilt)由来、好ましくは成熟雌ブタ由来である。
【０１０２】
本発明による細胞核移植法に関与するドナー(体細胞又は体細胞の核)及びレシピエント(細胞質体)は、ブタである。同様に、再構築胚は、本発明によるブタに移植され得る。ドナー、レシピエント又は養母(foster mother)として適している様々なブタが、本明細書中の他の箇所に記載されている。
【０１０３】
本発明によるドナーブタは、雌又は雄であり得る。ブタの歳は、任意の歳、例えば成体、又は例えば胎仔であり得る。
【０１０４】
胚
本発明によれば、再構築胚(すなわち単細胞胚)は、ドナー細胞の遺伝物質を含有する。その後、再構築胚は、有糸分裂の開始後、進行的に多細胞胚に分裂する。インビトロでは、有糸分裂の開始は本明細書中に記載されるような活性化により誘導されるのが典型的である。
【０１０５】
本発明において、「胚」という用語は、活性化による有糸分裂の開始後の核移植の過程後に形成される胚である再構築胚も指す。再構築胚は、インビトロで培養される。
【０１０６】
胚が約12個〜16個の細胞を含有する時、それは「桑実胚」と呼ばれる。その後、胚はさらに分裂し、多数の細胞が形成され、そしてその中心の内側に流体充填嚢胞性空洞(fluid-filled cystic cavity)、すなわち胞胚腔(blastocoele
cavity)が形成される。この段階で、胚は「胚盤胞」と呼ばれる。移植するのが容易である時点である発生段階の「受精」卵母細胞は、桑実胚から形成され、内部細胞塊、内部空洞、及び栄養外胚葉細胞と呼ばれる細胞の外層から成る。
【０１０７】
本発明による胚盤胞は、宿主哺乳動物、特にブタ、好ましくはゲッティンゲン・ミニブタの子宮中に移植されることができ、胎仔に、その後動物に成長し続ける。
【０１０８】
遺伝子改変又はトランスジェニック非ヒト哺乳動物を製造するために、非ヒト哺乳動物をクローニングするために、再構築胚を培養するために、及び/又はブタ胚の凍結保存のために、本明細書中に提供される方法において、胚はインビトロで培養され得る。胚は、例えば順次培養で培養され得る。胚は、正常胚であり得るし、又は本明細書中の他の箇所に定義されるような再構築胚であり得る、と理解される。
【０１０９】
したがって本発明は、本明細書中に開示される遺伝子改変ブタモデル由来の改変ブタ胚、胚盤胞及び/又は胎仔、及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタ胚、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-1IKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタに関する。
【０１１０】
乾癬を研究するための、乾癬に関連した少なくとも1種類の表現型を発現する改変ブタモデルから得られる改変ブタ胚、胚盤胞及び/又は胎仔は、本明細書中で定義される乾癬に関する遺伝的決定因子のいずれかに対してトランスジェニックなブタ、特に少なくとも1つのヒト又はブタPPAR遺伝子又はその一部を含むブタ、及び/又は少なくとも1つの改変インテグリン遺伝子又はその一部を含むブタの交雑の結果であり得た、と理解される。
【０１１１】
細胞質体
核が除去された卵母細胞又は卵母細胞の一部。
【０１１２】
ドナー細胞
本発明の「ドナー細胞」という用語は、体細胞、及び/又は生殖系由来の細胞を意味する。
【０１１３】
本発明の「体細胞」という用語は、発生の任意の段階での動物由来の任意の(体)細胞を意味する。例えば体細胞は、胎仔、新生仔又は成体組織に由来し得る。特に好ましい体細胞は、胎仔又は新生仔起源のものである。しかしながら生殖系由来の細胞も用いられ得る。本発明によれば、ドナー細胞は体細胞である。本発明の別の実施形態では、ドナー細胞は生殖細胞系由来の細胞である。
【０１１４】
本発明の好ましい一実施形態では、ドナー細胞は、所望の遺伝的特性を保有する。しかしながらドナー細胞は、本明細書中の他の箇所に記載されるような遺伝子操作により得られた所望の遺伝的特性を保有し得る。
【０１１５】
体細胞は、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球(B及びTリンパ球)、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、線維芽細胞、心筋細胞及びその他の筋細胞から成る群から選択される。
【０１１６】
これらは、異なる臓器、例えば皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、小腸、心臓、生殖器、膀胱、腎臓、尿道及びその他の泌尿器から得られ得る。
【０１１７】
体細胞が得られ得るブタは、本明細書中の他の箇所に記載されている。本発明の好ましい一実施形態は、レシピエント卵母細胞(細胞質体)と同一種から生じる体細胞の使用である。
【０１１８】
体細胞は線維芽細胞が好ましいが、これは発生中の胎仔、新生仔ブタ及び成体動物の何れもから大量に得られるからである。線維芽細胞はまた、インビトロで容易に増殖され得る。最も好ましくは、体細胞は、胎仔又は新生仔起源のインビトロで培養した線維芽細胞である。
【０１１９】
好ましい一実施形態では、体細胞は、遺伝的に改変される。さらに本発明のさらなる好ましい一実施形態では、体細胞は好ましくは胎仔又は新生仔起源のものであるか、例えば成体由来のものである。
【０１２０】
本発明の一側面は、本明細書中に開示されるような改変ブタモデル由来の改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核、及び/又は
内在性ILK-1Ra、JunB/cJun、CD18、IKK2及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部における少なくとも1つの突然変異を含む改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核、及び/又は
少なくとも1つのヒト、ブタ及び/又はマウスPPAR、PPAR-δ、IκB-α、STAT3c、インテグリンβ1、インテグリンα2、MEK1、アンフィレギュリン、BMP-6、VEGF、JunBΔec-JunΔep、IL-1a、TGFβ1、CD18ハイポ、Cre-IIKK2 fl7fl、Dsg1、SCCE、TGF-a、TNF-a、IL-20、IFN-g、LIG1 KO、KGF、IL-6、PAFR、Cre/Ikk2FL/FL、IL1R、Dsg3、IFN-γ、p40、IL1Ra、IKK2、JunB/c-Jun、及び/又はLIG1遺伝子又はその一部、転写産物及び/又は翻訳産物又はその一部を含む改変ブタドナー細胞及び/又は細胞核に関する。改変ドナー細胞は本明細書中の他の箇所に記載される任意の型の組織であり得るが、好ましいドナー細胞はブタ線維芽細胞である、と理解される。
【０１２１】
乾癬を研究するための、乾癬に関連した少なくとも1種類の表現型を発現する改変ブタモデルから得られる改変ブタドナー細胞又は細胞核は、本明細書中で定義される乾癬に関する遺伝的決定因子のいずれかに対してトランスジェニックなブタ、特に少なくとも1つのヒト若しくはブタPPAR遺伝子又はその一部を含むブタ、及び/又は少なくとも1つの改変インテグリン遺伝子又はその一部を含むブタの交雑の結果であり得た、と理解される。
【０１２２】
遺伝子改変の型
ドナー細胞は、当業者に既知の標準的な方法のいずれかにより遺伝的に改変され得る。遺伝子改変は、欠失、挿入、重複及び/又はその他の形態の突然変異、例えば点突然変異によるゲノムDNAの改変であり得る。改変は、コード配列及び/又は非コード配列中になされ得る。挿入のためのDNAコンストラクトは、対象の遺伝子及び/又は調節配列、例えばプロモーター、インシュレーター、エンハンサー、リプレッサー又はリボソーム進入部位を保有し得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、1つの遺伝子改変だけがゲノム中に導入される。しかしながら他の実施形態では、ゲノムは2つ以上の部位で改変され得る。
【０１２４】
哺乳動物細胞、例えば線維芽細胞の遺伝子改変のための適切な技法としては、非相同組換えによる遺伝子付加、相同組換えによる遺伝子置換、及び遺伝子編集のような技法が挙げられる。これは、レトロウイルス挿入、トランスポゾン移入及び/又は人工染色体技術の使用を包含し得る。非相同DNA組換えは、例えばKragh et al. (2004) Reprod. Fert. Dev. 16: 290又はKragh et al. (2004) Reprod. Fert. Dev. 16: 315に記載されているように実行され得る。
【０１２５】
トランスポゾンベースの遺伝子移入は、Izsvak et al. (1997) Cell 91: 501に記載されているように実行され得る。相同組換えによる遺伝子置換は、例えば、Urnow et al. (2005) Nature 435: 646により記載された技法を包含し得る。遺伝子編集のための技法は、Andersen et al. (2002) J. Mol. Med. 80: 770、Liu
et al. (2002) Gene Ther. 9: 118及びSorensen et al. (2005)
J. Mol. Med. 83: 39に記載されている。
【０１２６】
好ましい一実施形態では、ドナー細胞は、本明細書中に開示される遺伝子のドナー細胞のゲノム中への無作為組込みにより、遺伝的に改変される。
【０１２７】
本発明の別の好ましい実施形態では、ドナー細胞は、遺伝的に改変される(同時係属出願に記載)。ドナー細胞又は核は、部位特異的遺伝子挿入又は組込みのためのFlp組換え標的部位を含有するSBタグをつけたゲノムを保有する。SBタグをつけたゲノムは、DNAトランスポゾンコンストラクト並びに(i)FRT組換え部位、及び(ii)IRESで駆動される選択遺伝子を含むバイシストロン性遺伝子カセットから成る組換え標的ベクターの組込みの結果として生じる。DNAトランスポゾンコンストラクトは、任意のDNAトランスポゾンを有する任意のコンストラクトであり得る。本発明において、DNAトランスポゾンコンストラクトは、スリーピングビューティー(SB)DNAトランスポゾンベクターである。FRT組換え部位は、転位が起きているか否かを検出するのを可能にする選択遺伝子のコード配列中に埋め込まれ得る。本発明の選択遺伝子は、任意の特定の選択遺伝子には限定されない。好ましい実施形態では、選択遺伝子は、抗生物質又は薬剤に対する耐性を付与する遺伝子、例えばピューロマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン若しくはハイグロマイシン耐性遺伝子、又は高感度緑色蛍光タンパク質(eGFP)遺伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子等である。
【０１２８】
したがってFRT組換え部位は、SV40プロモーターに駆動される選択遺伝子の融合バリアントの中に埋め込まれ得る。しかしながら選択遺伝子の発現を付与するのに適した任意のプロモーターが、本発明により用いられ得る。このようなプロモーターの非限定例は、CMV(サイトメガロウイルス)又はPGKプロモーターである。
【０１２９】
IRESで駆動される選択遺伝子は、同様に、任意の特定選択遺伝子に限定されない。好ましい一実施形態では、選択遺伝子は、抗生物質又は薬剤に対する耐性を付与する遺伝子、例えばピューロマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン若しくはハイグロマイシン耐性遺伝子、又は高感度緑色蛍光タンパク質(eGFP)遺伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子等である。
【０１３０】
組換えベクターコンストラクトは、Creリコンビネースに関する少なくとも1つの部位も含み得る。Creリコンビネースに関する少なくとも1つの部位は、本明細書中の実施例に開示されるように配置され得る。
【０１３１】
ドナー細胞又は核は、少なくとも1つのトランスジーンの組込みのための少なくとも1つの部位を含む遺伝子改変ブタにも起源を有し得る。好ましい一実施形態は、線維芽細胞、例えば一次線維芽細胞の形態のドナー細胞又は核である。
【０１３２】
本発明は、部位特異的遺伝子挿入のためのFlp組換え標的部位を含有するSBタグをつけたゲノムを含むブタ細胞の製造方法にも関する。該方法は、以下の工程を含む。
a)哺乳動物細胞を用意する工程、b)トランスポゼースを発現するプラスミドと、DNAトランスポゾンコンストラクト並びに(i)FRT組換え部位、及び(ii)IRESで駆動される選択遺伝子を含むバイシストロン性遺伝子カセットから成る組換え標的ベクターとで、a)の細胞をトランスフェクションする工程、c)SBタグをつけた細胞を選択する工程。
【０１３３】
本明細書中の他の箇所に記載されるように、哺乳動物細胞は任意の細胞であり得る。本明細書中に記載されるハンドメイドプロトコルに従う核移植により遺伝子改変ブタを製造するためにブタ細胞がその後用いられることとなる一実施形態では、ブタ細胞は、好ましい一実施形態では、線維芽細胞であり、最も好ましくはブタ一次線維芽細胞である。
【０１３４】
所望のトランスジーンは、細胞のゲノム中に存在する組込みのための少なくとも1つの部位に直接組込まれ得る、と理解される。しかしながら、組込みのための少なくとも1つの部位をゲノムが保有する細胞は、別の実施形態では、例えば卵母細胞中へのドナー細胞又はその核のマイクロインジェクションによる、又は例えば体細胞核移植による遺伝子改変ブタの製造のためのドナー細胞として用いられる。好ましい一実施形態では、ドナー細胞又はその核は、本明細書中の他の箇所に記載されるような手法を用いた体細胞核移植により遺伝子改変ブタの製造に用いられる。
【０１３５】
本発明の標的細胞中に組込まれるべきトランスジーン又は対象の遺伝子は、任意の特定遺伝子に限定されない。一実施形態では、組込まれるべき遺伝子は、対象の表現型を表示する遺伝子改変ブタの形成をもたらす疾患原因遺伝子である。本発明によれば、ブタ細胞中に組込まれるべき対象の遺伝子は、PPAR-δ及びIκB-αである。
【０１３６】
細胞のゲノム中に存在する組込みのための少なくとも1つの部位へのトランスジーンの組込みは、対象の遺伝子及びFRT部位を含有するプラスミドDNAと、並びにFRT部位での組込みを実行するために用いられるFlpリコンビネースを発現するプラスミドとを細胞中にトランスフェクションすることにより用いられる。
【０１３７】
除核
卵母細胞の除核方法は、吸引、物理的除去、DNA特異的蛍光色素の使用、紫外線への曝露、及び/又は化学的に促進される除核から成る方法の群から選択され得る。一実施形態では、本発明はDNA特異的蛍光色素の使用に関する。
【０１３８】
しかしながら除核は、紫外線への曝露によっても実施され得る。特定の一実施形態では、除核は、核の物理的除去前に化学的に幇助される。例えば抗腫瘍薬、例えばデメコルチン(N-デアセチル-N-メチル 1 コルヒチン)、及び/又は例えばエトポシド又は関連薬剤を用いる化学的に促進される除核は、透明帯の酵素的修飾前に実施され得る。
【０１３９】
化学的に促進される除核は、特定期間の間デメコルチンを添加した本明細書中の他の箇所に記載される成熟培地中で成熟COCを培養することを含む。0.1μg/ml〜10μg/mlのデメコルチンの範囲で、例えば0.2μg/ml〜10μg/ml、例えば0.3μg/ml〜10μg/ml、例えば0.25μg/ml〜5μg/ml、例えば0.3μg/ml〜1μg/ml、例えば0.25μg/ml〜0.5μg/ml、例えば0.4μg/mlのデメコルチンが、成熟培地に添加され得る。同様に、成熟培地は、例えば0.1μg/ml〜10μg/mlのエトポシドの範囲でエトポシドを添加され、例えば0.2μg/ml〜10μg/ml、例えば0.3μg/ml〜10μg/ml、例えば0.25μg/ml〜5μg/ml、例えば0.3μg/ml〜1μg/ml、例えば0.25μg/ml〜0.5μg/ml、例えば0.4μg/mlのエトポシドが、成熟培地に添加され得る。抗腫瘍薬の存在下でCOCを培養するための時間は、10分〜5時間、例えば30分〜5時間、例えば10分〜2時間、例えば30分〜2時間、例えば10分〜1.5時間、例えば20分〜3時間、例えば10分〜3時間、例えば30分〜1.5時間の範囲、例えば45分である。
【０１４０】
特定の一実施形態では、化学的に促進される除核は、45分間、成熟培地に付加される0.45μg/mlデメコルチン及び/又はエトポシドを用いて実施される。
【０１４１】
特定の一実施形態では、除核は核の物理的除去によって行われるのが好ましい。物理的除去は、分離、例えば2つの半分(2部分)への卵母細胞の二分割(核を含有する半分と、除核卵母細胞(細胞質体として知られている)に相当する半分)によるものであってもよく、この場合、卵母細胞の有核半分は除去し、そしてその結果生じた細胞質体を本発明のさらなる手順のために選択する。代替的には、分離は三分割によるものであり、2部分の細胞質体を含む3部分を生じる。別の実施形態では、卵母細胞は4部分に分離されてもよく、この場合3つの細胞質体の産生が達成される。卵母細胞は、物理的除去により5部分に分離されることさえあり、4つの細胞質体を生じる。同様に、卵母細胞は6部分、例えば7部分、例えば8部分、例えば9部分、例えば10個又はそれより多くの部分に分離され得る。
【０１４２】
卵母細胞の物理的分離とその後の卵母細胞の核保有部分の除去とは、顕微手術用の刃の使用により達成され得る。
【０１４３】
卵母細胞は、どの卵母細胞が首尾よく除核されているかを同定するためにスクリーニングされ得る。核DNAを保有する卵母細胞部分は、Hoechst蛍光色素で染色することにより同定され得る。この染色手法は、当業者に既知である。核DNAを保有する卵母細胞部分は廃棄され、除核卵母細胞(細胞質体)がさらなる手順のために選択される。
【０１４４】
透明帯
透明帯は、卵母細胞を取り囲む均一の厚い透明な非細胞層又は外被である。
【０１４５】
一般的に、無傷透明帯は、いくつかのパラメーターのため、細胞核移植において重要であると考えられる。一パラメーターは、除核に適切な部位を示すため、卵母細胞の分裂中期板(metaphase plate:分裂中期赤道面)近くに極体を保持することである。別のパラメーターは、融合の前及び最中に卵母細胞細胞質体近くにドナー細胞を保持することに関する。透明帯は、融合中のドナー細胞及び細胞質体に対する保護を付与するとも考えられる。最後に、再構成及び活性化後の胚発生は、透明帯により支持されると考えられる。
【０１４６】
透明帯の少なくとも一部の修飾は、いくつかの方法により実施され得る。例えば物理的操作を用いて該帯を修飾し得る。しかし、酸性溶液(酸性タイロード)のような薬剤による化学的処置も用いられ得る。本発明に用いられ得る化学的薬剤の一例は、酸性溶液、例えばタイロードである。本発明の特定の一実施形態では、透明帯は酵素消化により修飾される。このような酵素消化は、例えばトリプシンを含む酵素により実施され得る。代替的には、特定のプロテアーゼ、例えばプロナーゼが用いられ得る。
【０１４７】
好ましい一実施形態では、酵素消化は、透明帯部分の少なくとも一部消化を生じ、これは本発明の好ましい一実施形態では、少なくとも一部の透明帯が除去されていること、又は透明帯が部分的に除去されることを意味する。本発明の情況では、透明帯は完全に除去されない。
【０１４８】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、透明帯の部分的消化部分は、透明帯が依然として目に見えていること、及び卵母細胞が形を崩していないことを特徴とする。
【０１４９】
部分消化は、プロテアーゼへの曝露により達成され得る。本発明の別の実施形態では、部分消化は、プロナーゼの使用により成し遂げられ得る。さらに別の実施形態では、部分消化はプロテアーゼ及びプロナーゼの組合せにより達成され得る。
【０１５０】
好ましい実施形態において、プロナーゼの濃度は、0.1mg/ml〜10mg/ml、例えば0.5mg/ml〜10mg/ml、例えば1mg/ml〜10mg/ml、例えば1.5mg/ml〜10mg/ml、例えば2mg/ml〜10mg/ml、例えば2.5mg/ml〜10mg/ml、例えば2.75mg/ml〜10mg/ml、例えば3mg/ml〜10mg/ml、例えば3.25mg/ml〜10mg/ml、例えば3.3mg/ml〜10mg/ml、例えば3.5mg/ml〜10mg/mlの範囲である。
【０１５１】
好ましい実施形態は、2mg/ml〜5mg/ml、例えば2.25mg/ml〜5mg/ml、例えば2.5mg/ml〜5mg/ml、例えば2.75mg/ml〜5mg/ml、例えば2.8mg/ml〜5mg/ml、例えば2.9mg/ml〜5mg/ml、例えば3mg/ml〜5mg/ml、例えば3.1mg/ml〜5mg/ml、例えば3.2mg/ml〜5mg/ml、例えば3.3mg/ml〜5mg/mlの範囲のプロナーゼ濃度である。
【０１５２】
本発明の特定の実施形態は、1mg/ml〜4mg/ml、例えば1mg/ml〜3.9mg/ml、例えば1mg/ml〜3.8mg/ml、例えば1mg/ml〜3.7mg/ml、例えば1mg/ml〜3.6mg/ml、例えば1mg/ml〜3.5mg/ml、例えば1mg/ml〜3.4mg/ml、例えば1mg/ml〜3.3mg/mlの範囲のプロナーゼ濃度である。
【０１５３】
好ましい実施形態において、プロナーゼ濃度は、2.5mg/ml〜3.5mg/ml、例えば2.75mg/ml〜3.5mg/ml、例えば3mg/ml〜3.5mg/mlの範囲である。特定の実施形態では、プロナーゼ濃度は3.3mg/mlである。
【０１５４】
プロナーゼは適切な培地中に溶解されるべきであることは当業者に明らかであり、本発明による好ましい一培地はT33(33%ウシ血清を含有するHepes緩衝TCM199培地)(Vajta, et al., 2003により以前に記載されている)である、。
【０１５５】
プロナーゼ溶液中での卵母細胞のインキュベーション時間は、1秒〜30秒、例えば2秒〜30秒、例えば3秒〜30秒、例えば4秒〜30秒、例えば5秒〜30秒の範囲である。
【０１５６】
本発明の別の実施形態において、インキュベーション時間は、2秒〜15秒、例えば2秒〜14秒、例えば2秒〜13秒、例えば2秒〜12秒、例えば2秒〜11秒、例えば2秒〜10秒、例えば2秒〜9秒、例えば2秒〜8秒、例えば2秒〜7秒、例えば2秒〜6秒、例えば2秒〜5秒の範囲である。
【０１５７】
本発明の特定の実施形態において、インキュベーション時間は、3秒〜10秒、例えば3秒〜9秒、例えば4秒〜10秒、例えば3秒〜8秒、例えば4秒〜9秒、例えば3秒〜7秒、例えば4秒〜8秒、例えば3秒〜6秒、例えば4秒〜7秒、例えば3秒〜5秒、例えば4秒〜6秒、例えば4秒〜5秒の範囲である。特に好ましいインキュベーション時間は5秒である。
【０１５８】
本発明の好ましい一実施形態では、卵母細胞は39℃で3.3mg/mlプロナーゼ溶液中で5秒間処理される。
【０１５９】
再構築胚
「再構築胚」という用語は、除核卵母細胞中へのドナー細胞又はドナー細胞の核の挿入により形成される細胞を意味し、正常受精における受精卵に対応するものである。しかしながら「再構築胚」という用語は、「再構成細胞」とも呼ばれる。本発明において、ドナー細胞は体細胞である。しかしながらドナー細胞は生殖系細胞由来でもあり得る。
【０１６０】
融合
ドナー細胞から少なくとも細胞質体へのドナー細胞又は膜包囲核の移入は、本発明によれば、融合により実施される。下記の筋書きでは、「ドナー細胞」という用語は、ドナー細胞由来の膜包囲核も指す。融合は、いくつかの方法により達成され得る。
【０１６１】
融合は、ドナー細胞及び少なくとも1つの細胞質体間、例えばドナー細胞及び少なくとも2つの細胞質体間、例えばドナー細胞及び少なくとも2つの細胞質体間、例えばドナー細胞及び少なくとも3つの細胞質体間、例えばドナー細胞及び少なくとも4つの細胞質体間、例えばドナー細胞及び少なくとも5つの細胞質体間、例えばドナー細胞及び少なくとも6つの細胞質体間、例えばドナー細胞及び少なくとも7つの細胞質体、例えばドナー細胞及び少なくとも8つの細胞質体間であり得る。
【０１６２】
融合は、上記に列挙された組合せにより、同時に又は順番に、実施され得る。本発明の一実施形態では、融合は同時に実施される。別の実施形態では、少なくとも1つの細胞質体とドナー細胞との融合が順番に実施される。
【０１６３】
例えば融合は化学的融合により達成され得るが、この場合、ドナー細胞及び少なくとも1つの細胞質体は融合促進剤、例えばタンパク質、糖タンパク質若しくは炭水化物、又はその組合せに曝露される。種々の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール(PEG)、トリプシン、ジメチルスルホキシド(DMSO)、レクチン、アグルチニン、ウイルス、例えばセンダイウイルスが既知である。好ましくは、フィトヘマグルチニン(PHA)が用いられる。しかしながらマンニトール及び/又はポリビニルアルコールが用いられ得る。
【０１６４】
代替的には、融合は、融合面を横断する直流(DC)を用いた誘導により成し遂げられ得る。しばしば、交流(AC)を用いて、ドナー及びレシピエント細胞を整列させる。電気融合法は、細胞質体及びドナー細胞の膜を一次的に破壊し、その後、膜を再形成し得るのに十分な強さの電気のパルスを発生させる。その結果、ドナー細胞及びレシピエント細胞間に小溝(channel:チャネル)が開く。ドナー細胞及びレシピエント細胞の膜が連結される場合、小溝は次第に増大し、最後に2つの細胞が1つの細胞に融合する。
【０１６５】
0.06KV/cm〜0.5KV/cm、例えば0.1KV/cm〜0.4KV/cm、例えば0.15KV/cm〜0.3KV/cmの範囲である交流を使用して、少なくとも1つの細胞質体及びドナー細胞のアラインメントを実施し得る。好ましい一実施形態では、少なくとも1つの細胞質体及びドナー細胞のアラインメントは、0.2KV/cmで交流を用いて実施され得る。
【０１６６】
融合は、少なくとも1つの細胞質体及びドナー細胞の融合面を横断する直流の印加により誘導され得る。直流は、0.5KV/cm〜5KV/cm、例えば0.75KV/cm〜5KV/cm、例えば1KV/cm〜5KV/cm、例えば1.5KV/cm〜5KV/cm、例えば2KV/cm〜5KV/cmの範囲である。本発明の別の好ましい実施形態は、0.5KV/cm〜2KV/cmの範囲の直流の印加である。さらなる好ましい一実施形態では、直流は2KV/cmであり得る。
【０１６７】
直流は、好ましくは1マイクロ秒〜15マイクロ秒、例えば5マイクロ秒〜15マイクロ秒、例えば5マイクロ秒〜10マイクロ秒の範囲で印加され得る。特定の実施形態は、9マイクロ秒であり得る。
【０１６８】
特に好ましい一実施形態では、直流による融合は、2KV/cmで9マイクロ秒の直流を用いるものであり得る。
【０１６９】
しかしながら、電気融合及び化学融合は組合されることもあり得る。典型的には、電気融合は、当業者に既知のような融合チャンバー中で実施される。融合は、少なくとも1工程、例えば2工程、例えば3工程、例えば4工程、例えば5工程、例えば6工程、例えば7工程、例えば8工程で実施され得る。
【０１７０】
融合は、例えば少なくとも1つの細胞質体がドナー細胞と融合される第一の工程で実施され得る。融合の第2の工程は、融合対(細胞質体-ドナー細胞、再構築胚)と少なくとも1つの細胞質体、例えば少なくとも2つの細胞質体、例えば3つの細胞質体、例えば4つの細胞質体、例えば5つの細胞質体、例えば6つの細胞質体、例えば7つの細胞質体、例えば8つの細胞質体との融合を包含する。少なくとも1つの細胞質体及び融合対の融合による融合の第2の工程は、順番に又は同時に実施され得る。一実施形態では、少なくとも2つの細胞質体は、融合対と同時に融合される。別の実施形態では、少なくとも2つの細胞質体は融合対と順番に融合される。
【０１７１】
本発明の一実施形態では、本明細書中で他の箇所に記載されるように、融合の第2の工程は、再構築胚が活性化されて有糸分裂に入る活性化工程でもあり得る。
【０１７２】
活性化
好ましい一実施形態では、ドナー細胞の核にそのゲノムをリセットさせ、そして除核細胞質体中の新規の周囲環境における分化全能性を獲得させるため、再構築胚は、活性化の前の或る期間、静止させられ得る。再構築胚は、例えば活性化前に1時間静止し得る。
【０１７３】
好ましくは、再構築胚は、有糸分裂を誘導するために活性化され得る。活性化方法は、好ましくは、電気パルス、化学誘導ショック、二価陽イオンの細胞内レベル増大、又はリン酸化低減から成る群から選択され得る。活性化のためには、方法の組合せが好まれ得る。
【０１７４】
本発明の特定の一実施形態では、活性化、並びに融合の第2の工程は同時に実施され得る。しかしながら再構成胚の活性化、並びに再構築胚及び少なくとも1つの細胞質体間の少なくとも1つの付加的融合工程は、順番に実施され得る。
【０１７５】
既知の方法による、例えばキナーゼ阻害剤の付加による再構築胚における細胞タンパク質のリン酸化の低減は、再構成胚を活性化し得る。好ましい実施形態は、タンパク質合成を抑制する薬剤、例えばシクロヘキシミドの使用を包含し得る。さらなる好ましい実施形態は、紡錘体形成を抑制する薬剤、例えばサイトカラシンBの使用であり得る。
【０１７６】
本発明の一実施形態では、二価陽イオンの細胞内レベルを増大し得る。二価陽イオン、例えばカルシウムは、活性化培地中に含まれ得る。好ましくは陽イオンは、特に再構築胚に電気パルスを施す際に、再構築胚に進入し得る。好ましい一実施形態では、電気パルスは再構築胚へのカルシウムの進入を引き起こし得る。
【０１７７】
直流を用いる電気パルスの印加は、一活性化工程であり得る。しかしながら好ましい一実施形態では、活性化のために印加される電気パルスは、付加的融合工程としても役立ち得る。
【０１７８】
直流を用いた電気パルスの印加前に、少なくとも1つの細胞質体及び少なくとも1つの再構築胚が交流の印加により整列され得る。交流は、0.06KV/cm〜0.5KV/cm、例えば0.1KV/cm〜0.4KV/cm、例えば0.15KV/cm〜0.3KV/cmの範囲であり得る。好ましい一実施形態では、少なくとも1つの細胞質体及びドナー細胞のアラインメントは、0.2KV/cmで交流を用いて実施され得る。
【０１７９】
活性化は、少なくとも1つの細胞質体及びドナー細胞の融合面を横断する直流の印加により誘導され得る。直流は、0.2KV/cm〜5KV/cm、例えば0.4KV/cm〜5KV/cm、例えば0.5KV/cm〜5KV/cmの範囲である。本発明の別の好ましい実施形態は、0.5KV/cm〜2KV/cmの範囲の直流の印加である。さらなる好ましい一実施形態では、直流は0.7KV/cmであり得る。
【０１８０】
直流は、好ましくは10マイクロ秒〜200マイクロ秒、例えば25マイクロ秒〜150マイクロ秒、例えば50マイクロ秒〜100マイクロ秒の範囲で印加され得る。特定の実施形態は、80マイクロ秒であり得る。
【０１８１】
特に好ましい一実施形態では、直流による融合は、0.7KV/cmで80マイクロ秒の直流を用いるものであり得る。
【０１８２】
本発明による活性化の特に好ましい一実施形態は、タンパク質合成、紡錘体形成及び二価陽イオンを抑制する薬剤を再構築胚に施すことと組合せた電気パルスの使用であり得る。
【０１８３】
活性化は、上記の方法の任意の組合せにより実施され得る。
【０１８４】
胚のインビトロ培養
本発明の一側面は、胚のインビトロ培養方法に関し、これにより胚盤胞率は25.3%に増大した。したがって再構築胚の培養方法であって、a)透明帯の少なくとも一部を有する少なくとも1つの卵母細胞を確立する工程、b)卵母細胞を少なくとも2つの部分に分離し、核を含む卵母細胞及び少なくとも1つの細胞質体を得る工程、c)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞又は細胞核を確立する工程、d)少なくとも1つの細胞質体をドナー細胞又は膜包囲細胞核と融合する工程、e)再構築胚を得る工程、f)胚を形成するように再構築胚を活性化する工程、並びにe)上記胚を培養する工程を包含する、再構築胚の培養方法は、本発明の範囲内である。
【０１８５】
本発明の別の側面は、胚を培養する工程が包含される細胞核移植の方法に関する。
【０１８６】
本明細書中に記載される方法に関連した好ましい一実施形態では、胚は順次、組となる培地中でインビトロで培養される。好ましくは胚盤胞は、従来の培地中で、例えばNCSU37又は当業者に知られているような同等培地中で増殖されるが、この場合、グルコースは除去され、他の薬剤に置換される。一薬剤は、ピルビン酸塩であり得る。別の薬剤は、乳酸塩であり得る。薬剤は組合されて従来の培地中のグルコースを置き換えてもよい。
【０１８７】
胚は、0日目から3日目まで、例えば0日目から2日目まで、上記のような置換培地中で培養され得る。
【０１８８】
ピルビン酸濃度は、0.05mM〜1mM、例えば0.1mM〜1mM、例えば0.125mM〜1mM、例えば0.15mM〜1mMの範囲であり得る。しかしながら、ピルビン酸ナトリウムの濃度はまた、0.05mM〜0.9mM、例えば0.05mM〜0.8mM、例えば0.05mM〜0.7mM、例えば0.05mM〜0.6mM、例えば0.05mM〜0.5mM、例えば0.05mM〜0.4mM、例えば0.05mM〜0.3mM、例えば0.05mM〜0.2mMの範囲でもあり得る。好ましくは、その濃度は0.05mM〜0.17mMの範囲であり得る。ピルビン酸ナトリウムの好ましい濃度は、0.17mMである。
【０１８９】
乳酸塩濃度は、0.5mM〜10mM、例えば0.75mM〜10mM、例えば1mM〜10mM、例えば1.5mM〜10mM、例えば1.75mM〜10mM、例えば2mM〜10mM、例えば2.5mM〜10mMの範囲であり得る。しかしながら、乳酸ナトリウムの濃度はまた、0.5mM〜9mM、例えば0.5mM〜8mM、例えば0.5mM〜7mM、例えば0.5mM〜6mM、例えば0.5mM〜5mM、例えば0.5mM〜4mM、例えば0.5mM〜3mMの範囲であり得る。好ましくはその濃度は、1mM〜5mM、例えば2mM〜4mM、例えば2mM〜3mMの範囲である。乳酸ナトリウムの好ましい濃度は、2.73mMである。
【０１９０】
初期グルコース無含有培地インキュベーション後、グルコースは再びピルビン酸塩及び乳酸塩に取って代わる。胚は、4日目から3日目まで、好ましくは3日目から7日目まで、グルコース含有培地中で培養され得る。グルコース濃度は、1mM〜10mM、例えば2mM〜10mM、例えば3mM〜10mM、例えば4mM〜10mM、例えば5mM〜10mMの範囲であり得る。しかしながらグルコース濃度は、1mM〜9mM、例えば2mM〜8mM、例えば3mM〜7mM、例えば4mM〜6mMの範囲でもあり得る。本発明によるグルコースの好ましい濃度は、5.5mMのグルコースである。
【０１９１】
器官又は組織提供
一実施形態では、本発明の動物はヒト又は他の動物、同一種の動物又は他の種の動物のいずれかの器官又は組織提供のための供給源として用いられ得る。種間の移植は、通常は異種移植と呼ばれる。移植され得る全体器官としては、心臓、腎臓、肝臓、膵臓又は肺が挙げられる。代替的には、器官の一部、例えば特定器官組織が、ヒト又は他の動物に移植又は移入され得る。さらなる一実施形態では、本発明の動物由来の個々の細胞又は個々の細胞の集団が、治療目的のためにヒト又は別の動物に移入され得る。
【０１９２】
凍結保存
「凍結保存」という用語は、本明細書中で用いる場合、本発明の卵母細胞、細胞質体、細胞、胚又はブタのガラス化(vitrification)を指し得る。凍結保存に用いられる温度は、好ましくは-80℃より低い温度、さらに好ましくは-196℃より低い温度である。本発明の卵母細胞、細胞及び胚は、不定量の時間、凍結保存され得る。生物学的材料は50年より長い間、凍結保存され得る、ということが知られている。
【０１９３】
遺伝子工学処理又はトランスジェニック非ヒト哺乳動物を産生する方法を用いる場合、胚は宿主ブタに移入される前に凍結保存され得る、ということは本発明の範囲内である。このような移入前の凍結保存は、胚発生の胚盤胞段階であり得る。ガラス化は凍結保存の一形態であって、この場合、細胞の流体が氷に固まらないよう、生きている細胞は急速に冷却される。したがってガラス化は、細胞又は全体組織が冷却により0℃より低い温度、例えば(典型的には)-80℃又は-196℃に冷却することにより保存される冷却プロセスに関する。
【０１９４】
特に本発明は卵母細胞のガラス化に関するが、本発明は、胚、好ましくは胚盤胞期の胚のガラス化にも関する。一実施形態では、胚は、ガラス化前に胚盤胞期まで培養される。特にブタ胚は、本発明に包含される。ガラス化細胞質体も、細胞と同様、本発明に包含される。
【０１９５】
本発明のさらなる別の側面は、本明細書中に記載されるような細胞核移植方法により得られるブタ胚をガラス化する工程を包含する、ブタ胚の凍結保存に関する。本発明のさらなる側面は、ここで与えられる方法により得られるか又は得られることが可能なブタ胚に関する。
【０１９６】
ミトコンドリア
本発明により獲得可能な遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び/又は非ヒト胚の組織の細胞は、異なる母系起源のミトコンドリアを保有し得る。好ましい一実施形態では、非ヒト哺乳動物及び/又は非ヒト胚は、1つだけの母系起源からのミトコンドリアを保有し得る。しかしながら別の好ましい実施形態では、非ヒト哺乳動物及び/又は非ヒト胚は、少なくとも2つの母系起源、例えば3つの母系起源、例えば4つの母系起源、例えば5つの母系起源、例えば6つの母系起源、例えば7つの母系起源、例えば8つの母系起源、例えば9つの母系起源、例えば10個の母系起源からのミトコンドリアを保有し得る。特定数の母系起源を有するという可能性は、観察されるミトコンドリアの型に基づいて算定され得る。
【０１９７】
治療の評価
乾癬に罹患している患者に施される治療は様々であるが、これは或る型の治療の有効性が患者によって異なるという事実のためである。施される治療は、乾癬の型、位置、程度及び重症度によって変わる。
【０１９８】
患者が乾癬の治療のほかに乾癬以外の疾患のための治療を受けている場合、乾癬以外の疾患のための治療の影響が、乾癬のための治療を決定する場合に考慮される。
【０１９９】
概して、乾癬を治療するための第一工程は、局所的治療、すなわち皮膚に適用される媒介軟膏又はクリームである。このような局所治療は、活性成分として、コールタール、ジトラノール(アントラリン)、コルチコステロイド、ビタミンD3類似体、例えばカルシポトリオール、及びレチノイドを包含する。第一工程が不首尾に終わった場合の典型的な次の工程は、光線療法としても知られている紫外線への皮膚の曝露である。光線療法は、組合せにおける相乗作用が観察されているために、局所治療(コールタール、カルシポトリオール)又は全身治療(レチノイド)と組合される場合もある。第3の工程は、経口投与又は注射投薬を包含する全身治療である。全身治療における薬物として従来選択されるのは、免疫抑制剤メトトレキセート及びシクロスポリン、並びにレチノイド(ビタミンAの合成形態である)である。乾癬に関して特には認可されていない他の付加的薬剤も有効であることが判明している。これらとしては、抗代謝薬チオグアニン、細胞傷害薬ヒドロキシ尿素、スルファサラジン、免疫抑制薬ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン及び経口タクロリムスが挙げられる。
【０２００】
所定の患者の治療の型は、治療に対する耐性を回避するため、そして有害反応の危険を低減するためにも、時間と共に変更され得る。
【０２０１】
本発明は、医薬品組成物の有効性のスクリーニング方法であって、i)本発明のブタモデルを用意する工程、ii)遺伝的決定因子を該ブタモデルにおいて発現し、上記疾患に関する上記表現型を発揮する工程、iii)有効性を評価すべき医薬品組成物を該ブタモデルに投与する工程、及びiv)ブタモデルにおいて遺伝的決定因子を発現することにより発揮される表現型に及ぼす医薬品組成物の効果(もしあれば)を評価する工程 を含む方法を提供する。
【０２０２】
さらに、乾癬の治療的処置の応答を評価する方法であって、i)本発明のブタモデルを用意する工程、ii)上記表現型に及ぼす作用を発揮する医薬品組成物で該ブタモデルを処置する工程、及びiii)観察された作用を評価する工程を含む方法が本発明の範囲内である。ここで観察された作用およびその評価に基づき、治療についてさらに勧告することもでき得る。
【０２０３】
さらに本発明は、乾癬に罹患しているヒトの治療方法であって、以下の初期工程:i)本発明のブタモデルを用意する工程、ii)上記遺伝的決定因子を該ブタモデルにおいて発現し、上記疾患に関する上記表現型を発揮する工程、iii)有効性を評価すべき医薬品組成物を該ブタモデルに投与する工程、及びiv)観察された効果を評価する工程、並びにv)ブタモデルで観察された効果に基づいて乾癬に罹患している上記ヒトを治療する工程を含む方法に関する。
【０２０４】
したがって、乾癬のための薬剤及びブタに投与される他の薬剤の併用作用を試験するために、本発明によるブタモデルは乾癬以外の疾患のための薬物も摂取し得る、と理解される。
【実施例】
【０２０５】
トランスジェニックブタ線維芽細胞中への組込みのための遺伝子及びプロモーター-トランスジーンコンストラクト
異常表皮増殖及び分化は、炎症性皮膚疾患である乾癬の特徴である。乾癬性ヒト表皮は、調節遺伝子PPAR-δ及びNFκBに関して均衡が失われている。IκB-αのドミナントネガティブバリアントの発現によるNFκBの下向き調節、及びPPAR-δの上向き調節は、本明細書中の他の箇所に記載されるような組込み部位を含む、タグをつけた線維芽細胞中への上記遺伝子の組込みにより得られる。したがって乾癬様調節不全を有するブタ表皮組織は、本発明のブタモデルで試験され得る。
【０２０６】
同様に、本明細書中に記載されるように、プロモーター-トランスジーンコンストラクトK5-STAT3c(Sano et al Nat
Immunol 2005)、インボルクリン-インテグリンβ1(Caroll
et al Cell 1995)、インボルクリン-インテグリンα2(Carrol et al Cell 1995)、インボルクリン-MEK1(Hobbs
et al J Invest derm 2004)、K14-アンフィレギュリン(Cook et al J Clin Invest 1997)、K10-BMP-6(Blessing
et al J Cell biol 1996、Kaiser et al J Invest Dermatol
1998)、K14-VEGF(Kunstfeldt et al Blood 2004、Xia et al Blood 2003)、K5-JunBΔec-JunΔep(Zenz et al 2005)、K14-IL-1a(Groves et al J Clin Invest 1996、Groves
et al PNAS 1995)、K5-TGFβ1(Li et
al Derm Symp Proc 2005、Li et al EMBO 2004)、CD18ハイポ(Bullard et al PNAS 1996、Barlow et al Am J pathol 2003)、K14-Cre-1IKK2
fl7fl(Pasparakis et al Nature 2002)、K1-Dsg1若しくはK1-Dsg3(Merrit et al Mol Cell Biol 2002)、SCCE(Ny
et al Act Derm Venerol 2004)、K14-TGF-a(Vassar et al
Genes devel 1991)、K14-TNF-a(Genes Dev. 1992
Aug;6(8):1444-56)、K14-IL-20(Blumberg et al Cell 2001)、インボルクリン-IFN-γ(Carroll et al J Invest dermatol 1997)、LIG1 KO(Suzuki et al FEBS 2002)、K14-KGF(Guo
et al EMBO 1993)、K14-IL-6(Turksen et al PNAS 1992)、PAFR(sato et al Arch Dermatol Res 1999)、K14-Cre/Ikk2FL/FL、K14-p40(Kopp et al, J Invest Dermatol. 2001 Sep;117(3):618-26)、K14-Tie2(Voskas et al, Am J Pathol. 2005 Mar;166(3):843-55)、K14-IL-1Ra(Shepherd et al, J Invest Dermatol. 2004 Mar;122(3):665-9)、K14-IKK2(M. Pasparakis et al., Nature 417(6891), 2002, pp. 861-866)、又はK14-LIG-1(Y. Suzuki et al., FEBS Lett. 521(1-3), 2002, pp. 67-71)がゲノム組み込み部位を保有する線維芽細胞株に組み込まれる。
【０２０７】
トランスジェニックブタ線維芽細胞の確立
SB転位(4〜8)及びFlp組換え(9、10)についての十分に説明されたメカニズムに基づいて、本発明は、ゲノム中への部位特異的組込みのための新規の標的ベクターを開示する。このベクターは、SBトランスポゾンベクターのコンテクスト内で、(i)eGFPのコード配列中に埋め込まれるFRT組換え部位、及び(ii)IRESで駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子を含有するバイシストロン性遺伝子カセットを保有する。SBタグをつけたゲノム遺伝子座中への効率的な選択的プラスミド挿入を、本発明者らは実証する。これらのベクターの性能をさらに改善するための一つの試みにおいて、SBベクターのコンテクスト内で、転写的サイレンシングに対して挿入外来遺伝子を保護すると考えられるインシュレーターエレメントの作用を、本発明者らは分析した。FRT遺伝子発現カセットの側面に位置するインシュレーターは、Flp挿入トランスジーンの遺伝子発現を維持及び安定化するのに役立ち得る、ということを本発明者らの研究は示す。
【０２０８】
本発明においては、活性遺伝子座の検出(SBにより媒介される)並びに望ましい部位での部位特異的挿入(Flpにより媒介される)の達成という2つの努力の連携において、2つの非ウイルス性組込み技法、すなわちSBトランスポゾン系及びFlpリコンビネースを用いる。二段階技法が開示され、ここでレポーター遺伝子及び選択的マーカー遺伝子を保有する組込みSBベクターは、先ず、連続遺伝子発現のためのレポーターとして、それから遺伝子挿入のための標的として役立ち得る(図1)。ゲノム中で無作為に組換えられるプラスミドDNAとは対照的に、能動的に組込まれたベクターを用いることにより、(i)ベクターのコンカテマーでなく、単一コピーのみが挿入されるということ、そしてさらに、(ii)レポーターカセットは、長時間に亘って遺伝子座活性に有害作用を及ぼし得る細菌プラスミド主鎖由来の配列の側面に位置しないということを、本発明者らは証明する。第2の修飾工程では、このベクターは、特徴が十分に理解された遺伝子座における1つ又は複数の遺伝子発現カセットを挿入するための標的として役立ち得る。
【０２０９】
ベクター構築
この試験に用いられるSBトランスポゾンベースのベクターは、pSBT/SV40-GFIP.loxPベクターから得られた。このベクターは、SBトランスポゾンのコンテクスト内で、上流はATG開始コドンにより、そして下流はポリA配列により挟まれたバイシストロン性FRTeGFP-IRES-puro(GFIP)カセットを含有する。さらに、ベクターの上方逆方向反復(inverted repeat)とFRTeGFP-IRES-puroカセットの発現を駆動するSV40プロモーターとの間に位置するCreリコンビネース(loxP)認識部位を、該ベクターは含有する。
【０２１０】
pSBT/SV40-GFIP.loxPベクターの構築
pSBT/RSV-GFIPベクターは、ラウス肉腫ウイルス(RSV)由来のプロモーターにより駆動されるFRT-GFP.IRES.puroバイシストロン性遺伝子カセット、及びそれを挟むSB DNAトランスポゾンの末端逆方向反復を含有する。eGEP配列は、48bpのFRT配列を含有する順方向プライマーを用いてpeGFP.N1(Clontech)から増幅された。FRT-GFPの機能性を分析するために、FRT-eGFP融合物を、SV40プロモーターを含有する発現ベクター中に挿入した。FRTタグをつけたeGFP融合遺伝子を含有するPCR断片をMluI及びXmaIで消化し、MluI/XmaI消化pSBT/RSV-hAAT(参考文献(8)におけるpT/hAAT、Mark
Kay, Stanford University, USAから入手)中に挿入して、RSVに駆動されるeGFP発現を伴うトランスポゾンベクターを生じた(pSBT/RSV-eGFP)。IRES-puroカセットをpecoenv-IRES-puro(Finn Skou Pedersen, University of Aarhus, Denmarkにより提供された)からPCR増幅し、XmaIで消化し、XmaI消化pSBT/RSV-eGFP中に挿入して、pSBT/RSV-GFIPを生じた(図2参照)。SV40プロモーター(pSBT/SV40-GFIP)及びヒトユビキチン遺伝子由来のプロモーター(pSBT/Ubi-GFIP)を含有するこのベクターの代替的バージョンを生成した。さらに、トランスポゾンの左逆方向反復とpSBT/SV40-GFIPのSV40プロモーターとの間に位置するMluI部位にCre組換え標的部位(loxP)を挿入することにより、ベクターpSBT/SV40-GFIP.loxPを作製した。開始コドンを伴わないFRT-hygro融合遺伝子を含有するドナープラスミドpcDNA5/FRTは、Invitrogenから入手した。FlpコードプラスミドであるpCMV-Flpは、A. Francis Stewart (University of California San Francisco, USA)から入手した。このプラスミドは、Flpx9と呼ばれる強化Flpバリアントをコード化する(11)。ニワトリ1.2kbデオキシリボヌクレアーゼ高感受性部位4(cHS4)由来インシュレーターエレメント(12、13)の2つのコピーを含有するSBベクターは、PCR増幅cHS4配列及び介在リンカーをNotI/SpeI消化pSBT/PGK-puro(Mark Kay(米国スタンフォード大学)から入手)中に挿入することにより、生成した。リンカー中に位置する制限部位を用いることによりPGK-puroカセットをコンストラクト中にクローン化し戻して、pSBT/cHS4.PGK-puro.cHS4を生成した。
【０２１１】
ブタにおけるさらなる使用のために、代替的Cre認識部位(loxP-257)を、ポリA配列とベクターの下方逆方向反復との間に置かれた位置での突然変異誘発により作製された特有のAscI部位に挿入した。このベクターを、pSBT/loxP.SV40-GFIP.loxP257と呼んだ。2つのCre組換え部位の存在は、Flpベースのプラスミド挿入後のCreリコンビネース媒介性カセット交換を可能にし、それにより、必要な場合、プラスミド配列及び選択遺伝子の除去を促進する。
【０２１２】
一次ブタ線維芽細胞におけるSB転位
1.5μgのpSBT/lox.RSV-GFIP.loxP257(又はpSBT/PGK-puro)を1.5μgのpCMV-SB(又はネガティブコントロールとしての1.5μgのpCMV-mSB)と同時導入する(Roche製Fugene-6を用いる)ことにより、SBトランスポゾンベクター(SBT/PGK-puro又は標的トランスポゾンSBT/loxP.RSV-GFIP.loxP257のいずれか)をブタ線維芽細胞のゲノム中に挿入した。pCMV-SB(権利は、Perry Hackett, University of Minnesota, Minnesota, USAが保持)は、サケ科魚類の化石DNA転位因子から再構築されたスリーピングビューティートランスポゼースをコード化する。pCMV-SB、pCMV-mSB及び機能亢進性バリアントpCMV-HSB3は、Mark Kay(米国スタンフォード大学)から入手した。SBタグをつけた細胞クローンは、ピューロマイシン(0.5μg/ml)によりトランスフェクトした細胞を選択する結果として出現した。コロニーを固定し、メタノール中のメチレンブルーで染色して、その後、計数した。
【０２１３】
一次ブタ線維芽細胞における確固たるSB転位
SBは、ほとんどの哺乳動物細胞において効率的に転位するが、ヒト細胞においては、マウス細胞よりも高い有効性を有する。SBベクターの転位はブタ細胞では分析されていなかったので、したがって、ブタ一次線維芽細胞における活性を本発明者らが最初に試験した。ピューロマイシン耐性遺伝子をコード化する標準トランスポゾン(SBT/PGK-puro)を利用したところ、適切なレベルの転位が見出され、pSBT/PGK-puro及びpCMV-SBで同時導入された線維芽細胞の培養液中に約75個の薬剤耐性コロニーが生じた(図3)。pSBT/PGK-puro及びpCMV-mSB(後者はトランスポゼースの不活性バージョンをコード化する)でのトランスフェクション後には3個未満のコロニーしか出現しなかった。興味深いことに、機能亢進性トランスポゼースバリアントHSB3を用いるとほぼ140個にも及ぶ平均コロニー数が得られ、これは、HSB3が、ブタ細胞においても、元のSBトランスポゼースと比較してより高レベルの転位を媒介するということを示す。
【０２１４】
ブタ線維芽細胞におけるFRTタグをつけたSBベクターの効率的挿入
部位特異的遺伝子挿入のためのFlp組換え標的部位を含有するSBタグをつけた細胞クローンを生成するために、pSBT/loxP.SV40-lopP257プラスミドと共にpCMV-mSB、pCMV-SB及びpCMV-HSB3をそれぞれ同時導入した。HSB3は再び最高活性を示し、3×104個の線維芽細胞のトランスフェクション後に約30個の薬剤耐性コロニーを生じた(図4)。
【０２１５】
ピューロマイシン耐性コロニーは単離し、増殖させた。蛍光顕微鏡によるクローン分析は効率的FRTeGFP発現を実証し(図5)、ブタ線維芽細胞におけるベクター機能性及び容易なFRTeGFP検出を実証した。Flp FRT組換え配列を保有するこれらの蛍光細胞クローンは、ハンドメイドクローニングによるクローン化トランスジェニック動物の作製のために現在用いられているものである。
【０２１６】
Flp組換えのための標的としてのSBT/loxP.SV40-GFIP.loxP257の実証
組織培養液におけるブタ一次線維芽細胞の長期的成長の制限のため、ブタ線維芽細胞におけるFRTタグをつけたSBベクターへのFlpベースの遺伝子挿入を実証することができなかった。したがって、本発明者らは、HEK-293細胞中で実行される標準的な一連の組換え実験によりFRT含有ベクターの機能性を試験することを選択した。本発明者らは、転位されたSBT/loxP.SV40-GFIP.loxP257ベクターを含有するHEK-293細胞のクローンを生成した。(i)FRT-hygo融合遺伝子及び赤色蛍光タンパク質(RFP)発現カセットを含有するpcDNA5/FRT由来基質プラスミド、並びに(ii)Flpリコンビネースをコード化するプラスミド(pCMV-Flpx9)によるこのような細胞クローンへの同時トランスフェクションにより、本発明者らはハイグロマイシンB耐性クローンをその後同定した。蛍光顕微鏡により、部位特異的に工学処理されたクローンが、予測どおり、eGFP発現を止め、そしてRFP発現を作動する、ということを本発明者らは観察した(データは示されていない)。この「緑色から赤色への」表現型変化は、組込まれたSB由来標的ベクターがFlpベースの組換えのためのアクセプター部位として役立つ、ということを示す。
【０２１７】
結論として、本発明のスリーピングビューティーDNAトランスポゾンベースのベクターは、組込まれた形態において、リコンビネースベースの遺伝子挿入のための標的として役立つ。SBベクターは、ブタ一次線維芽細胞のゲノム中にカットアンドペースト型転位により効率的に移入され、したがってプラスミド由来細菌配列の側面に配置されない。例えばマイクロインジェクション及びハンドメイドクローニングにおけるこれらの遺伝子工学処理一次細胞の使用は、クローン化ブタにおけるSBベクター由来eGFP発現のその後の詳細な分析、及び興味を引く発現プロファイル(例えば遍在的、組織特異的)を有する動物の同定を可能にする。このような「マスターブタ」由来の一次線維芽細胞はFlpベースの組換えによりさらに改変されて、対象組織中でサイレンシングされないSBベクタータグをつけた遺伝子座における部位特異的遺伝子挿入を可能にする。部位特異的に挿入された対象の疾患遺伝子、又は内在性遺伝子の下向き調節のためのshRNA発現カセットを保有するクローン化ブタは、2回目の動物クローニングにより生成され得る。
【０２１８】
さらなる実施例
別記する場合を除いて、化学物質は全て、Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)から入手した。
【０２１９】
卵母細胞収集及びインビトロ成熟(IVM)
卵丘-卵母細胞複合体(COC)は、食肉処理場から得られた成熟雌ブタ又は若い雌ブタ卵巣からの2mm〜6mmの卵胞から吸引した。加湿空気中で5%CO2で、41時間〜44時間、「サブマリンインキュベーション系(Submarine Incubation System)」(SIS、Vajta, et al. 1997)において、38.5℃で、10%(v/v)ウシ血清(CS)、10%(v/v)ブタ卵胞液、10IU/mlのeCG、5IU/mlのhCG(Suigonan Vet; Skovlunde, Denmark)を添加した重炭酸塩緩衝TCM-199(GIBCO BRL)400μl中で50個の群において成熟させた。
【０２２０】
インビトロ受精(IVF)
IVF実験は3回の同一反復実験で、インビトロ成熟卵母細胞を用いて実施した。成熟後、2mMのカフェインを含有するmTBM(mTBMfert)でCOCを2回洗浄し、50個の群で400μlのmTBMfertに移した。新たに射出された精液を、前に記載されたように処理した(Booth, et al.、近刊)。38.5℃で、加湿空気中の5%CO2中で2時間受精能獲得後、1×105個の精子/mlという調整最終濃度で精子を卵母細胞に付加した。SISで加湿空気中の5%CO2中で3時間、38.5℃で受精を実施した。精液注入後、予定接合子をmTBMfert中でボルテックスして卵丘細胞を除去した後、IVC培地中で洗浄し、培養皿中に入れた(「胚培養及び評価」参照)。
【０２２１】
ハンドメイドクローニング(HMC)
適用されたHMC法は、ウシ及びブタにおける本発明者らの以前の研究を基礎にした(Kragh, et al., 2004、Peura and Vajta, 2003、Vajta, et al., 2003)が、有意の変法も加えられた。簡約すると、成熟の開始後41時間で、Hepes緩衝TCM199中の1mg/mlヒアルロニダーゼ中で反復ピペッティングすることにより、COCの卵丘外被を除去した。この時点から(別記する場合を除いて)、39℃に調整した加熱台上で全ての操作を実施し、そして卵母細胞を取り扱うために用いられる滴量は全て、ミネラルオイルで被覆された20μl容量であった。T33(TはHepes緩衝TCM199培地を意味し、数字はCSサプリメントの百分率(v/v)を意味する、ここでは33%)中に溶解した3.3mg/mlのプロナーゼ中で短時間(5秒間)、卵母細胞をインキュベートした。卵母細胞がプロナーゼ溶液中で形を崩し始める前に、それらを摘み出し、T2滴及びT20滴中で迅速に洗浄した。一部消化されているが、依然として目に見える帯を有する卵母細胞を、3mg/mlのポリビニルアルコール(TPVA)及び2.5μg/mlのサイトカラシンBを添加したT2の滴中に整列させた。ウルトラ・シャープ・スプリッティング・ブレード(AB
Technology, Pullman, WA, USA、図6a)を用いて、立体顕微鏡制御下で、手動で二分割の代わりに三分割した。三分割卵母細胞の断片を収集し、TPVA滴中の5μg/mlHoechst33342蛍光色素で5分間染色し、次に、オイルで被覆した60mmのFalconペトリ皿の底の1μl滴のTPVA培地中に入れた(3〜4断片/滴)。倒立顕微鏡及びUV光を用いて、クロマチン染色なしの断片(細胞質体)の位置を登録し、その後、融合の開始まで、T10滴中で立体顕微鏡下で収集した。
【０２２２】
胎仔線維芽細胞を、前に記載されたように調製した(Kragh, et al.、近刊)。融合を二段階で実施したが、この場合、第2の工程は活性化の開始を同様に包含した。第一の工程に関しては、選択された細胞質体の3分の1(好ましくは小さい方の部分)を用いた。細く伸ばして、火仕上げしたガラスピペットを用いて、10個の細胞質体を、一群として、1mg/mlのフィトヘマグルチニン(PHA、ICN Pharmaceuticals, Australia)に3秒間移して、次に、T2滴中に沈殿させた少数の線維芽細胞の1つの上に個別に、迅速に滴下した。付着後、10個の細胞質体-線維芽細胞対を、融合培地(0.3Mのマンニトール及び0.01%のPVA)中で10秒間、平衡させた。0.6KV/cm及び700KHzの交流(AC)を用いて、ドナー細胞が導線から最も離れて位置するように、融合チャンバー(BTXマイクロスライド0.5mm融合チャンバー、モデル450、BTX, SanDiego, CA,USA)の導線に沿って細胞対を一列に並べ(図6b)、次に、2.0KV/cmの直流(DC)で9μ秒間、融合した。電気パルス後、細胞対を注意深く導線から除去し、T10滴に移して、融合が起きていたか否かを観察するためにインキュベートした。
【０２２３】
最初の融合の約1時間後、融合対を残り3分の2の細胞質体と一緒に、活性化培地滴中で別々に平衡させた(0.3Mのマンニトール、0.1mMのMgSO4、0.1mMのCaCl2及び0.01%ポリビニルアルコール(PVA))。0.6KV/cmのAC下で、細胞質体-融合対-細胞質体トリプレットを、10個の群で、順次導線に沿って一列に並べて、融合対を中央に配置した(図6c)。0.7KV/cmで80μ秒間の単一DCパルスを、二次融合及び活性化開始のために用いた。次にトリプレットを導線から除去し、T10滴に注意深く移して、融合を確認した(図6d)。再構築胚を、5μg/mlのサイトカラシンB及び10μg/mlのシクロヘキシミドを添加した培養培地(「胚培養及び評価」参照)中で、5%CO2、5%O2及び90%N2中で、最大湿度で、38.5℃で4時間、インキュベートし、次に、培養前にIVC培地中で3回、十分に洗浄した。
【０２２４】
単為生殖的活性化(PA)
単為生殖的活性化卵母細胞は、HMCと別々に、又は平行して、産生された。透明帯を完全に除去させるためにプロナーゼ中でのインキュベーションがより長時間であったということを除いて、上記と同様にして卵母細胞を裸出した。次に無帯(zona free: ZF)卵母細胞を、活性化培地(0.3Mのマンニトール、0.1mMのMgSO4、0.1mMのCaCl2及び0.01%PVA)中で10秒間平衡させて、融合チャンバー(BTXマイクロスライド0.5mm融合チャンバー、モデル450、BTX, SanDiego, CA, USA)に移した。0.85KV/cmで80μ秒間の単一DCパルスを、BLS CF-150/B細胞融合機(BLS, Budapest, Hungary)で生成し、ZF卵母細胞に印加した。無傷帯(zona intact: ZI)卵母細胞に関しては、1.25KV/cmで80μ秒間の単一DCパルスを用いた(本発明者らの未発表予備実験によれば、これらのパラメーターは、ZI卵母細胞及びZF卵母細胞それぞれに関して最高の活性化、及びその後のインビトロ発生を与えた)。電気パルス後の手順は、HMC再構築胚に関するものと同一であった。
【０２２５】
胚培養及び評価
上記の処理により産生されるブタ胚は全て、4mg/mlのBSAを含有する改変NCSU37培地(Kikuchi, et al., 2002)中で、5%O2、5%CO2及び90%N2中で、最大湿度で、38.5℃で培養した。0日目(受精及び活性化の当日)から2日目までは0.17mMのピルビン酸ナトリウム及び2.73mMの乳酸ナトリウムを、次に2日目から7日目までは乳酸ナトリウム及びピルビン酸ナトリウムを5.5mMのグルコースに取り替えて、培地に補充した。ZF胚は全て、上記で用いたものと同一培養培地及びガス混合物中で、WOW系(Vajta, et al., 2000)で培養し、WOWから胚を取り出すことなく2日目に注意深く培地を変えた。胚盤胞率を、7日目に登録した。総細胞数を確定するために、胚盤胞を固定し、20μg/μlのHoechst33342蛍光色素を含有するグリセロール中で顕微鏡スライドガラス上に載せた。24時間染色後、エピフルオレッセンスアタッチメント及びUV-2Aフィルターを備えたDiaphot200倒立顕微鏡(株式会社ニコン、日本、東京)下で、胚を観察した。
【０２２６】
実施例1
成熟雌ブタ(2.5歳、体重170Kg)由来の卵母細胞及び若い雌ブタ(5.5月齢〜6月齢、体重75Kg)由来の卵母細胞間の発生コンピテンスの差を、44時間インビトロ成熟後にZF及びZIのPAにより調べた。4つの併合群を、3回の同一反復実験で調べた:(1)成熟雌ブタからのZF卵母細胞、(2)成熟雌ブタからのZI卵母細胞、(3)若い雌ブタからのZF卵母細胞、(4)若い雌ブタからのZI卵母細胞。ZF卵母細胞活性化には0.85KV/cmで80μ秒間の単一DCパルスを印加したが、ZI卵母細胞活性化には1.25KV/cmの単一のパルスを用いた。上記のように7日培養後、活性化胚当たりの胚盤胞の百分率を確定した。
【０２２７】
成熟雌ブタ又は若い雌ブタ由来の単為生殖的活性化卵母細胞のインビトロ発生コンピテンスを調べた。表1に示したように、成熟雌ブタの単為生殖的活性化卵母細胞の胚盤胞率は、ZF又はZIのPA後、若い雌物の胚盤胞率より有意に高かった。
【０２２８】
【表１】
2010520751.tif 000003
【０２２９】
成熟雌ブタ及び若い雌ブタ間の卵母細胞発生コンピテンスの差を、インビトロ産生(IVP)及び体細胞核移植(SCNT)胚で別々に検査して、他の研究グループの以前の出版物の場合(Sherrer, et al., 2004、Hyun, et al., 2003)と同様の、すなわち、成熟雌ブタ由来卵母細胞からの胚は、胚盤胞発生を支持することにおいて、若い雌ブタ由来の卵母細胞からの胚より優れている、という結論を得た。本発明者らの研究に用いた若い雌ブタは境界域の成熟度であったが、PA後7日目胚盤胞率間の差は有意であって、成熟雌ブタ卵母細胞のより優れた発生コンピテンスを証明した。
【０２３０】
実施例2
改変ブタHMCの実現可能性を、6回の同一反復実験で、IVFを用いて、平行して対照としてZFのPAを用いて調べた。より適格性の成熟雌ブタ卵母細胞(実施例1に記載)を、実施例2で用いた。再構築及び/又は活性化後7日目に、再構築胚当たりの胚盤胞数、並びに無作為選択胚盤胞の総細胞数を確定した。
【０２３１】
形態学的に無傷の卵母細胞を三分割後、90%より多くの卵母細胞断片をHMCのために回収し得た。100個の成熟卵母細胞から平均で37個の胚を再構築し得た。ブタ胚の全供給源の発生コンピテンスを、表2に示す。7日目に、胚盤胞期への再構築胚の発生は17±4%で、平均細胞数は46±5個であったが、一方、IVF及びZFのPAに関する胚盤胞率はそれぞれ30±6%及び47±4%(n=243、170、97)であった。
【０２３２】
【表２】
2010520751.tif 000004
【０２３３】
理論的最大効率には依然として近づかなかったが、帯部分消化及び卵母細胞三分割の組込みは、本発明者らの以前の系(Kragh, et al., 2004 Reprod. Fertil. Dev 16, 315-318)と比較して再構築胚の数をほぼ倍加した。吸引後の卵母細胞回収はウシの場合より過大な労力を要し、時間が掛かるため、再構築効率のこの増大はブタクローニングにおいて特別な利益を有し得る。より重要な点は、ブタ核移植後の妊娠の確立に要する高胚数である。
【０２３４】
ブタにおけるIVCはまた、過大な労力を要し且つ非効率的な手法であるとみなされる(Reed, et al., 1992 Theriogeneology 37, 95-109)。ZF系の欠点は、透明帯の保護層を伴わずに輸卵管における崩壊を回避するためにはインビトロでの少なくとも圧縮桑実胚又は初期胚盤胞期に胚が到達しなければならない、という点である。他方で、一旦胚盤胞期になると、胚性又は体性の細胞核の移植後に産まれた仔ウシ(Peura et al., 1998、Tecirlioglu et al., 2004、Oback et al., 2003、Vajta, et al., 2004)により、そして卵母細胞の無帯IVP後に産まれた仔ブタ(Wu, et al., 2004)によっても立証されたように、無帯胚は首尾よく移入され得る。
【０２３５】
NCSU37は、ブタ胚の培養のために最も広範にそして上首尾に用いられる培地であった。しかしながら、他の培地と比較して胚発生が改善されたにもかかわらず、IVC後のIVPブタ胚の成育可能性は依然として危ういものである。グルコースは8細胞期前の初期ブタ胚により容易に代謝されないが、圧縮桑実胚及び胚盤胞期間の胚においてはより多量に用いられる、ということをいくつかの報告は示唆した(Flood, et al., 1988)。最初の2日培養に関するNCSU37におけるグルコースのピルビン酸塩及び乳酸塩による置換えは、Kikuchiの研究(Kikuchi, et al., 2002)では、IVPブタ胚に関して25.3%の胚盤胞率を生じたが、これは、平均で30%のIVP胚盤胞率を有する本発明者らの本研究によりさらに裏付けられた。さらに、ブタHMC及びZFのPA胚に関するこの順次培養系の一次評価によって、それぞれ17%及び47%の胚盤胞率が得られた。時として、ZIのPAの胚盤胞率は、90%という高いレベルに達することさえあった(Du、未発表)。
【０２３６】
統計学的分析
SPSS11.0を用いて、ANOVA分析を実施した。P<0.05の確率は、統計学的に有意であるとみなされた。
【０２３７】
実施例3
脂肪分離インビトロ成熟卵母細胞から産生されるハンドメイドクローン化ブタ胚盤胞のガラス化
近年、遠心分離を用いるが、その後の顕微操作を伴わないブタ胚の脂肪分離に関する、非侵襲的手法が発表された(Esaki et al. 2004 Biol Reprod. 71, 432-6)。
【０２３８】
前に記載されたように(Kuwayama et al. 2005a;2005b)、クライオトップ(株式会社北里サプライ、日本、富士宮)を用いたガラス化により、胚/胚盤胞の凍結保存を実行した。ガラス化の時点で、胚/胚盤胞を、39℃で5分〜15分間、20%合成血清代替物(SSS)を添加したTCM199中の7.5%(V/V)エチレングリコール(EG)及び7.5%ジメチルスルホキシド(DMSO)から成る平衡溶液(ES)中に移した。初期収縮後、胚はその元の容積を取り戻した。20%SSSを添加したTCM199中に溶解した15%(V/V)EG及び15%DMSO及び0.5Mスクロースから成るガラス化溶液(VS)の20ul滴中に、4〜6つの胚/胚盤胞を移した。20秒間インキュベーション後、胚をクライオトップ上に載せて、液体窒素中に投入した。VS中への曝露から投入までの過程は、1分で完了した。
【０２３９】
TCM199+20%SSS中の1.0Mのスクロースから成る解凍溶液(TS)中に1分間直接クライオトップを浸漬することにより、胚/胚盤胞を解凍し、次にTCM199+20%SSS中の0.5Mのスクロースから成る希釈溶液(DS)に3分間移した。凍結保護剤を除去するために、胚/胚盤胞を洗浄溶液(WS、TCM199+20%SSS)中に2回、各回5分、保持した。10%仔ウシ血清(CS)を添加した培地中における24時間回復後の再増殖率により、ガラス化胚盤胞の生存率を確定した。
【０２４０】
非侵襲的脂肪分離法をインビトロ成熟ブタ卵母細胞に適用し、そして単為生殖的活性化後の脂肪分離卵母細胞のさらなる発生を4回の同一反復実験で調べた。卵母細胞を、脂肪分離群及び対照群に無作為に分けた。
【０２４１】
脂肪分離のために、卵母細胞を50%ウシ血清(CS)の存在下で3分間、1mg/mlのプロナーゼで消化し、20%CSを添加したHepes緩衝TCM-199培地中で洗浄して、透明帯の部分的消化をもたらした(図7a)。その後、2%CS、3mg/mlのPVA及び7.5μg/mlのサイトカラシンB(CB)を添加したHepes緩衝TCM-199培地中で、40〜50個の卵母細胞を室温で遠心分離した(12000×g、20分)(図7b)。遠心分離卵母細胞及び無傷卵母細胞の両方の透明帯を、2mg/mlのプロナーゼ溶液中でのさらなる消化により完全に除去した。活性化のために、85Kv/cmで80μ秒間の単一直流を両群に印加し、その後、5μg/mlのCB及び10μg/mlのシクロヘキシミド(CHX)で4時間処理した。次に全ての胚を、変法NCSU37培地中で培養した。7日目胚盤胞をガラス化し、クライオトップ技法(Kuwayama et al., RBM
Online、近刊)を用いて38.5℃で加温した。10%CSを添加した培養培地中での24時間回復後の再増殖率により、ガラス化胚盤胞の生存率を確定した。両群からの再増殖胚盤胞の細胞数を、Hoechst染色後に確定した。結果を、ANOVA分析により比較した。帯の部分的消化及び遠心分離は、173/192(90%)の卵母細胞における上首尾の脂肪分離を生じた。胚盤胞の発生は、脂肪分離卵母細胞と無傷卵母細胞との間で異ならなかった(それぞれ28±7%対28±5%、P>0.05)。しかしながら、脂肪分離卵母細胞由来の胚盤胞の生存率は、無傷卵母細胞から発生した胚盤胞の生存率より有意に高かった(それぞれ85±6%対32±7%、P<0.01)。脂肪分離卵母細胞又は無傷卵母細胞由来の再増殖胚盤胞の平均細胞数において差は認められなかった(それぞれ36±7対38±9、P>0.05)。これらの結果は、簡便な脂肪分離技法は活性化ブタ卵母細胞のインビトロ発生コンピテンスを妨げず、そして細胞数の有意の損失を伴わずに、得られた胚盤胞の凍結生存率を改良する、ということを示す。
【０２４２】
脂肪分離後、両群からの卵母細胞の透明帯を完全に除去した。電気的活性化に関する上記と同一のパラメーターを、両群に適用した。活性化後7日目に、胚盤胞率及び胚盤胞細胞数を確定した。
【０２４３】
インビトロ成熟ブタ卵母細胞に非侵襲的脂肪分離技法を適用することの実現可能性を調べた。90%(173/192)の卵母細胞が、首尾よく脂肪分離され得る。表3に示すように、胚盤胞への発生は、脂肪分離卵母細胞と無傷卵母細胞との間で異ならなかった(それぞれ28±7%対28±5%、P>0.05)。しかしながら、脂肪分離卵母細胞由来の胚盤胞の生存率は、無傷卵母細胞から発生した胚盤胞の生存率より有意に高かった(それぞれ85±6%対32±7%、P<0.01)。脂肪分離卵母細胞又は無傷卵母細胞由来の再増殖胚盤胞の平均細胞数において差は認められなかった(それぞれ36±7対38±9、P>0.05)。
【０２４４】
【表３】
2010520751.tif 000005
【０２４５】
脂肪分離卵母細胞のハンドメイドクローニング
脂肪分離卵母細胞を、5回の反復実験でHMCのために用いた。非脂肪分離卵母細胞を用いたHMCの4回の同一反復実験を、対照系として用いた。再構築後7日目に、両群から産生された胚盤胞をクライオトップでガラス化した。再増殖胚盤胞の生存率及び細胞数を、PAにより産生された胚盤胞に関する上記のように確定した。
【０２４６】
別記する場合を除いて、操作は全て、39℃に調整された加熱台上で実施し、卵母細胞を取り扱うために用いられる滴量は全て、ミネラルオイルで被覆された20μl容量であった。体細胞核移植のために、本発明者らの以前の研究(Du, et al., 2005)で記載したハンドメイドクローニング(HMC)を適用したが、1点だけ変更した:すなわち脂肪分離卵母細胞及び対照卵母細胞の両方の除核に関して、三分割の代わりに二分割を適用した。
【０２４７】
要するに、卵丘外被を除去した後、T33中に溶解した3.3mg/mlのプロナーゼ中で10秒間、対照卵母細胞をインキュベートした。卵母細胞がプロナーゼ溶液中で形を崩し始める前に、それらを摘み出し、T2滴及びT20滴中で迅速に洗浄した。遠心分離後の脂肪分離卵母細胞は、3.3mg/mlのプロナーゼ溶液中でさらに5秒間消化した。
【０２４８】
一部消化され、膨張され、そして軟化された透明帯を有する対照卵母細胞及び脂肪分離卵母細胞の両方を、2.5μg/mlのサイトカラシンBを添加したT2滴中に整列させた。ウルトラ・シャープ・スプリッティング・ブレード(AB
Technology, Pullman, WA, USA)を用いて、立体顕微鏡制御下で、二分割を手動で実施した(図7c)。半分片を収集し、T2滴中の5μg/mlのHoechst33342蛍光色素で5分間染色し、次に、オイルで被覆した60mmのFalconペトリ皿の底の1μl滴のT2培地中に入れた(3〜4個の半分片/滴)。倒立顕微鏡及びUV光を用いて、クロマチン染色なしの半分片(細胞質体)の位置を登録した。その後、細胞質体を立体顕微鏡下で収集し、T10滴中に保存した。
【０２４９】
ブタ胎仔線維芽細胞を、前に記載されたように単一層からトリプシン消化を用いて調製した(Kragh, et al., 2005)。融合を二段階で実施したが、この場合、第2の工程は活性化の開始を同様に包含した。第一の工程に関しては、利用可能な細胞質体の50%を、T0中に溶解した1mg/mlのフィトヘマグルチニン(PHA、ICN Pharmaceuticals, Australia)中に3秒間移して、次に、単一線維芽細胞上に迅速に滴下した。付着後、細胞質体-線維芽細胞対を、融合培地(0.3Mのマンニトール及び0.01%のPVA)中で10秒間、平衡させ、融合チャンバーに移した。0.6KV/cm及び700KHzの交流(AC)を用いて、体細胞が導線から最も離れて位置するように、融合チャンバーの導線沿いに細胞対を一列に並べ(図7d)、次に、2.0KV/cmの直流で9μ秒間、融合した。電気パルス後、細胞対を注意深く導線から除去し、T10滴に移して、融合が起きていたか否かを観察するためにインキュベートした。
【０２５０】
最初の融合の約1時間後、各対を、活性化培地滴中で別の細胞質体と融合させた。AC電流及び0.7KV/cmで80μ秒間の単一DCパルスを、上記と同様に印加した。融合をT10滴中で検出し、次に再構築胚を、5μg/mlのサイトカラシンB及び10μg/mlのシクロヘキシミドを添加したIVC0-2培地(「胚培養及び評価」参照)中に移した。5%CO2、5%O2及び90%N2中で、最大湿度で、38.5℃で4時間インキュベーション後、胚を培養前にIVC0-2培地中で3回洗浄した。
【０２５１】
【表４】
2010520751.tif 000006
【０２５２】
脂肪分離卵母細胞を用いたHMCにおける7日目胚盤胞率を対照HMC群と比較した場合、インビトロ発生コンピテンスが観察された(それぞれ21±6%対23±6%、P>0.05、表4)。脂肪分離卵母細胞由来のクローン化胚盤胞のガラス化後の凍結生存率は、無傷卵母細胞から発生したものより有意に高かった(それぞれ79±6%対32±8%、P<0.01)。
【０２５３】
実施例4
化学的に促進されるハンドメイド除核(CAHE)及び現行方法との比較
41時間〜42時間インビトロ成熟後、0.4μg/mlデメコルチンを添加した同一溶液中で45分間、COCをさらに培養した。次に、Hepes緩衝TCM199中に溶解した1mg/mlヒアルロニダーゼ中でピペッティングすることにより、卵丘細胞を除去した。この時点から(別記する場合を除いて)、39℃に調整した加熱台上で全ての操作を実施した。卵母細胞を取り扱うために用いられる滴量は全て、20μl容量であり、ミネラルオイルで被覆された。
【０２５４】
HMC手法の基本工程は、本明細書中の別の箇所に記載されている。要するに、T33(Hepes緩衝TCM199培地に関するT、数字はCSサプリメントの数平均百分率(v/v)を意味する、ここでは33%)中に溶解した3.3mg/mlのプロナーゼ中で20秒間、卵丘細胞を伴わずに卵母細胞をインキュベートした。透明帯の部分的溶解及び卵母細胞のわずかな変形が起きた場合、それらを摘み出し、T2滴及びT20滴中で迅速に洗浄した。9つの卵母細胞を、2.5μg/mlのサイトカラシンB(CB)を添加した1つのT2滴中に整列させた。細く伸ばして、火仕上げした(fire-polished)ガラスピペットを用いて、卵母細胞を回転させて、表面に軽度突出錐体(extrusion cone)及び/又は強度付着極体を見出し、そしてマイクロブレード(AB Technology, Pullman, WA, USA)を用いて、立体顕微鏡制御下で、二分割を手動で実施した。(突出又はPB近くの)細胞質体の半分未満を残りの部分から分離した(図8)。滴中の9つの卵母細胞全ての二分割後、大きい方の部分及び小さい方の部分(突出又は付着PBを有する)を収集し、それぞれT2の別個の滴中に入れた。
【０２５５】
デメコルチン処理を用いない配向ハンドメイド除核(OHE)
工程は全て前に記載された手順と同様であったが、デメコルチン予備インキュベーションを適用しなかった。
【０２５６】
除核のための無作為ハンドメイド二分割(RHE)
デメコルチン予備インキュベーションを、同様にこの群の前処理から省いた。卵丘細胞の除去後、透明帯を上記のようにプロナーゼにより部分消化した。無作為ハンドメイド二等分割を、2.5μg/mlのCBを添加したT2の滴で適用した。全ての半卵母細胞を選択し、T2滴中の10μg/mlのHoechst33342で10分間染色して、次に、ミネラルオイルで被覆されたT2培地の1μl滴中に入れた(各滴中に3つの半卵母細胞)。倒立顕微鏡及びUV光を用いて、無クロマチン半卵母細胞、すなわち細胞質体の位置を登録した。その後、これらの細胞質体を立体顕微鏡下で収集し、さらなる操作の前にT2滴中に保存した。
【０２５７】
融合及び活性化開始
ブタ胎仔線維芽細胞を、前に記載されたように調製した(Kragh, et al., 2005、Du, et al., 2005)。融合を二段階で実施したが、この場合、第2の工程は活性化の開始を同様に包含した。第一の工程に関しては、細く伸ばして、火仕上げしたガラスピペットを用いて、約100個の体細胞をT2滴中に入れ、そして20〜30個の細胞質体をT10滴中に入れた。短時間平衡後、3つの細胞質体の群を、1mg/mlのフィトヘマグルチニン(PHA)に2秒〜3秒間移して、次に、各々を単一体細胞上に迅速に滴下した。付着後、細胞質体-体細胞対を再び摘み出し、融合培地(0.01%(w/v)のPVAを添加した0.3Mのマンニトール)に移した。0.6KV/cm及び700KHzの交流(AC)を用いて、体細胞が導線から最も離れて位置するように、融合チャンバー(BTXマイクロスライド0.5mm融合チャンバー、モデル450、BTX, San Diego, CA)の一導線に沿って平衡後の対を一列に並べ、次に、2.0KV/cmの直流(DC)インパルスで9μ秒間、融合した。次に、対を注意深く導線からT10滴に取り出し、融合が起きていたか否かを観察するためにインキュベートした。
【０２５８】
融合の約1時間後、融合対及び残りの細胞質体を、活性化培地(0.01%(w/v)PVAを添加、0.3Mのマンニトール、0.1mMのMgSO4、0.1mMのCaCl2)中で別々に平衡させた。0.6KV/cmのACを用いて、融合対が導線と接触して位置するように、1つの対及び1つの細胞質体を融合チャンバーの1つの導線に沿って並べた。0.86KV/cmで80μ秒間の単一DCパルスを、二次融合及び活性化開始のために用いた。T10滴でのインキュベーション後に、融合を確認した。
【０２５９】
従来のクローニング(TC)
前に記載されたように(Chen et al., 1999、Zhang et al., 2005)、Diaphot200倒立顕微鏡(株式会社ニコン、日本、東京)を用いて、顕微操作を実行した。要するに、42時間〜44時間インビトロ成熟後、上記と同様に卵丘細胞を除去した。39℃に調整した加熱台上で全ての操作を実施した。単一50μLの顕微操作溶液滴を、60mm培養皿の蓋上の中央域に作り、ミネラルオイルで被覆した。20〜30個の卵母細胞及び胎仔線維芽細胞の群を、同一滴中に入れた。15分〜30分間のインキュベーション後、卵母細胞をホールディングピペット(内径=25μm〜35μm及び外径=80μm〜100μm)で確保した。5時〜6時の位置に配置後、第一極体及び隣接細胞質体(卵母細胞の総容量の約10%)(おそらくは分裂中期板を含有)を斜端インジェクションピペット(内径=20μm)を用いて吸引し取り除いた。次に胎仔線維芽細胞を、同一スリットを通して空隙中に注入した。核移植(NT)後、再構築カプレットを、融合及び活性化が実行されるまで、1時間〜1.5時間、回復のためにミネラルオイルで被覆された培地の滴中に移した。回復培地は、4mg/mLのBSA及び7.5μg/mLのCBを添加したNCSU-23であった。再構築カプレットを、融合培地中で4分間インキュベートした。細く伸ばして、火仕上げしたガラスキャピラリを用いてカプレットを手動で整列させて、接触面を電極と平行にした。次に、20kV/cmの30μ秒、単一直流パルスを印加した。7.5μg/mLのCBを添加したIVC0-2(「胚培養及び評価」に明記)の滴中で30分〜60分間培養後、融合結果を立体顕微鏡下で検査した。融合カプレットに、活性化溶液中で二次パルスを施した。T10中での30分インキュベーション後、それらをIVC0-2に移して、インビトロ発生を評価した。
【０２６０】
活性化のさらなる工程
活性化インパルス後、5%CO2、5%O2及び90%N2中で、最大湿度で、38.5℃で、5μg/mlのCB及び10μg/mlのシクロヘキシミドを添加したIVC0-2中で、全ての再構築胚をインキュベートした。
【０２６１】
胚培養及び評価
4時間後、全ての再構築及び活性化胚を、Nunc4ウェル皿中で、ミネラルオイルで被覆した400μlのIVC0-2中で、5%CO2、5%O2及び90%N2中で、最大湿度で、38.5℃で、洗浄及び培養した。IVC0-2は、0日目(活性化の当日)から2日目まで用いられ、4mg/mlのBSA、0.17mMのピルビン酸ナトリウム及び2.73mMの乳酸ナトリウムを含有する、変法NCSU37培地(Kikuchi, et al., 1999)であった。2日目から7日目までは、ピルビン酸ナトリウム及び乳酸ナトリウムを5.5mMのグルコースに取り替えた(IVC2-7)。無帯胚は全て、上記で用いたものと同一培養培地及びガス混合物中で、the Well of the Well(WOW)系(Vajta, et al.,
2000)で培養し、WOWから胚を取り出すことなく2日目に注意深く培地を変えた。同一培地量及び組成を用いて4ウェル皿のウェル中での15〜30個の群で、TC胚を培養した。卵割及び胚盤胞率を、それぞれ2日目及び7日目に登録した。総細胞数を確定するために、胚盤胞を固定し、10μg/mlのHoechst33342を含有する少量(2μl未満)のグリセロール中で顕微鏡スライドガラス上に載せた。室温で数時間染色後、エピフルオレッセンスアタッチメント及びUV-2Aフィルターを備えたDiaphot200倒立顕微鏡(株式会社ニコン、日本、東京)下で、胚を観察した。
【０２６２】
CAHE対OHEの効率の比較
合計620個の卵母細胞を用いて、12回の同一反復実験で、CAHEの効率及び信頼度を試験した。41時間〜42時間成熟後、卵母細胞をデメコルチンインキュベーションに付した。突出錐体及び/又は強度付着PBが部分的プロナーゼ消化後に検出された卵母細胞では、配向二分割を実施した。二分割卵母細胞対全体卵母細胞、及び生存卵母細胞対二分割卵母細胞の百分率を登録した。その後、推定細胞質体及び核体両方を別々に収集し、Hoechst33342で染色した(T2中10μg/ml、10分間)。クロマチンの有無を、倒立蛍光顕微鏡下で検出した(図9)。
【０２６３】
合計414個の卵母細胞を用いて、9回の同一反復実験で、OHEの効率及び信頼度を試験した。42時間〜43時間インビトロ成熟後、部分プロナーゼ消化後に突出錐体及び/又はPBが検出された成熟卵母細胞で、配向二分割を実施した。結果を、前段落に記載したように評価した。結果を表5に示す。
【０２６４】
【表５】
2010520751.tif 000007
【０２６５】
配向二分割を可能にする突出錐体及び/又は付着極体に関する、又は溶解率における、群間の差は検出されず、そして上首尾の除核/二分割卵母細胞比も同様であった。しかしながら、細胞質体/総卵母細胞数により測定した手法の全体的効率は、CAHEにおいては、OHE群におけるよりも高かった。
【０２６６】
CAHE、RHE及びTCを用いて産生された胚のインビトロ発生の比較
8回の反復実験で、合計468個のインビトロ成熟卵母細胞を無作為に配分して、3つの上記の除核手順に付した。細胞質体及びドナー線維芽細胞間の融合率を登録した。再構築胚を、上記と同様に活性化及び培養した。卵割及び胚盤胞率を、それぞれ2日目及び7日目に確定した。発生胚盤胞の立体顕微鏡下の特徴を、群間で比較した。
【０２６７】
【表６】
2010520751.tif 000008
【０２６８】
除核後の融合率は、それぞれCAHE、RHE及びTC間で同様であった。二次融合及び活性化は、最初の2つの群において、無視できるほど(1%未満)の損失しか生じなかった。TCは他の2つの群より低い卵割/再構築胚率を生じたが、この差は、胚盤胞/再構築胚率では存在しなかった。
【０２６９】
立体顕微鏡下の特徴(サイズ、内部細胞塊の概算比率及び輪郭)は、群間で異ならなかった。CAHE、RHE及びTCからの産生胚盤胞の細胞数(57±6対49±7対53±6)を、表6、図10及び図11に示す。
【０２７０】
統計学的分析
マイクロソフトXPエクセルソフトウエアによりAVEDEVを実施し、そしてSASシステムによりANOVAを実施した。P<0.05という確率は、統計学的に有意であるとみなされた。
【０２７１】
実施例5
実施例1、実施例2、実施例3、実施例4及び実施例5に関するハンドメイドクローニング(HMC)及び妊娠の確立
トランスジェニックのクローニング及び分娩のために、線維芽細胞をHMCに用いる。レシピエント成熟雌ブタに、60〜70個の総量の5日目及び/又は6日目の胚盤胞の混合物を投与する。
【０２７２】
別記する場合を除いて、化学物質は全て、Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)から入手した。
【０２７３】
卵母細胞収集及びインビトロ成熟(IVM)
卵丘-卵母細胞複合体(COC)は、食肉解体処理場から得られた成熟雌ブタ卵巣からの2mm〜6mmの卵胞から吸引し、加湿空気中で5%CO2で、41時間〜44時間、「サブマリンインキュベーション系」(SIS、Vajta, et al. 1997)において、38.5℃で、10%(v/v)ウシ血清(CS)、10%(v/v)ブタ卵胞液、10IU/mlのeCG、5IU/mlのhCG(Suigonan
Vet; Skovlunde, Denmark)を添加した重炭酸塩緩衝TCM-199(GIBCO BRL)から成るIVM培地400μl中で50個の群において成熟させた。
【０２７４】
前に記載したように(Du et al., 2005及び2007)、透明帯の部分消化に基づいた手法により、HMCを実施した。成熟COCは、Hepes緩衝TCM-199中の1mg/mlのヒアルロニダーゼ中で卵丘細胞から分離された。この時点から(別記する場合を除いて)、39℃に調整した加熱台上で全ての操作を実施し、そして卵母細胞を取り扱うために用いられる滴量は全て、ミネラルオイルで被覆された20μlであった。T33(TはHepes緩衝TCM199培地を意味し、数字はCSサプリメントの百分率(v/v)を意味する、ここでは33%)中に溶解した3.3mg/mlのプロナーゼで20秒間、透明帯を部分消化し、次に、卵母細胞をT2滴及びT20滴中で迅速に洗浄した。膨張及び軟化透明帯を有する卵母細胞を、2.5μg/mlのサイトカラシンBを添加したT20滴中に整列させた。細く伸ばしたガラスピペットを用いて、表面に極体を配置するよう、卵母細胞を回転する。ウルトラ・シャープ・スプリッティング・ブレード(AB Technology, Pullman, WA, USA)を用いて、細胞質体の極体近くの半分未満を、残りの推定細胞質体から手動で取り除く。
【０２７５】
10%FCSを添加したDMEM中で集密的単層に増殖させたトランスジェニックドナー線維芽細胞をトリプシン処理し、T20中に保持した(Kragh, et al., 2004)。融合を二段階で実施した。第一の工程に関しては、利用可能な細胞質体の50%を、T0中に溶解した1mg/mlのフィトヘマグルチニン(PHA、ICN Pharmaceuticals, Australia)に3秒間移して、次に、各々を、単一トランスジェニック線維芽細胞の上に迅速に滴下した。付着後、細胞質体-線維芽細胞対を、融合培地(0.3Mのマンニトール及び0.01%のPVA)中で10秒間、平衡させて、融合チャンバー(BTXマイクロスライド0.5mm融合チャンバー、モデル450、BTX, SanDiego, CA,USA)に移した。0.6kV/cm及び700kHzの交流(AC)を用いて、体細胞が導線から最も離れて位置するように、融合チャンバーの導線沿いに対を一列に並べ、次に、2.0kV/cmの直流で9μ秒間、融合した。電気パルス後、細胞対をT10滴中で、融合が起きていたか否かを観察するためにインキュベートする。
【０２７６】
最初の融合の約1時間後、活性化培地(0.3Mのマンニトール、0.1mMのMgSO4、0.1mMのCaCl2及び0.01%PVA)中で各々の対を別の細胞質体と融合させて、同時に活性化する。0.6kV/cm及び700kHzのACを用いて、1つの融合対及び1つの細胞質体を融合チャンバーの1つの導線に沿って並べて、融合対が導線と接触するように位置づけ、その後、0.85kV/cmの単一DCパルスを80μ秒間用いる。T10滴で融合が観察されたら、再構築胚を、5μg/mlのサイトカラシンB及び10μg/mlのシクロヘキシミドを添加したブタ接合子培地3(PZM-3、Yoshioka et al., 2002)中に移す。5%CO2、5%O2及び90%N2中で、最大湿度で、38.5℃で4時間インキュベーション後、培養前にPZM-3培地中で3回、胚を洗浄する。
【０２７７】
胚培養及び移入
胚を、the
Well of the Well系(WOW、Vajta, et
al., 2000)で、PZM-3培地中で、5%CO2、5%O2及び90%N2中で、最大湿度で、38.5℃で培養する。明瞭に目に見える内部細胞塊を有する5日目及び6日目胚盤胞を、離乳後4日目又は5日目のデンマークランドレース成熟雌ブタに外科的に移入する。21日目に超音波診断により妊娠を診断し、2週間毎に確認する。114日目に、プロスタグランジンF2による処理の24時間後に、帝王切開により仔ブタを分娩させる。
【０２７８】
実施例6
仔ブタ産生
ハンドメイドクローニング(HMC)
インビトロ成熟開始の41時間後、Hepes緩衝TCM199中の1mg/mlヒアルロニダーゼ中で反復ピペッティングすることにより、COCの卵丘外被を除去した。この時点から(別記する場合を除いて)、39℃に調整した加熱台上で全ての操作を実施し、そして卵母細胞を取り扱うために用いられる滴量は全て、ミネラルオイルで被覆された20μl容量であった。T33(TはHepes緩衝TCM199培地を意味し、数字は仔ウシ血清(CS)サプリメントの百分率(v/v)を意味する、ここでは33%)中に溶解した3.3mg/mlのプロナーゼ中で短時間(20秒間)、卵母細胞をインキュベートし、次に、T2滴及びT20滴中で迅速に洗浄した。一部消化されているが、依然として目に見える帯を有する卵母細胞を、2.5μg/mlのサイトカラシンB(CB)を添加したT2の滴中に整列させた。細く伸ばし、火仕上げしたガラスピペットを用いて、表面に極体(PB)が見られるように、卵母細胞を回転し、マイクロブレード(AB Technology, Pullman, WA, USA)を用いて、立体顕微鏡制御下で手動で、配向二分割を実施した。したがって、(突出又はPB近くの)卵母細胞細胞質体の半分未満を残りの推定細胞質体から除去した。細胞質体をT2滴中で2回洗浄し、T10滴中に収集した。
【０２７９】
胎仔線維芽細胞を、前に記載されたように調製した(Kragh, P.M. et al. Theriogenology 64, 1536-1545 (2005))。
【０２８０】
融合を二段階で実施したが、この場合、第2の工程は活性化の開始を同様に包含した。第一の工程に関しては、推定細胞質体の半分を用いた。細く伸ばして、火仕上げしたガラスピペットを用いて、10個の細胞質体を、一群として、1mg/mlのフィトヘマグルチニン(PHA、ICN Pharmaceuticals, Australia)に3秒間移して、次に、T2滴中に沈殿させたいくつかの線維芽細胞の1つの上に個別に、迅速に滴下した。付着後、10個の細胞質体-線維芽細胞対を、融合培地(0.3Mのマンニトール及び0.01%のPVA)中で10秒間、平衡させた。0.6KV/cm及び700KHzの交流(AC)を用いて、導線から体細胞が最も離れて位置するように、融合チャンバー(BTXマイクロスライド0.5mm融合チャンバー、モデル450、BTX, SanDiego, CA, USA)の導線沿いに細胞対を一列に並べ、次に、2.0KV/cmの直流(DC)で9μ秒間、融合した。電気パルス後、細胞対を注意深く導線から除去し、T10滴に移して、融合が起きていたか否かを観察するためにインキュベートした。
【０２８１】
最初の融合の約1時間後、融合対を残りの細胞質体と共に、活性化培地滴中で個別に平衡させた(0.3Mのマンニトール、0.1mMのMgSO4、0.1mMのCaCl2及び0.01%PVA)。0.6KV/cmのAC下で、細胞質体-融合対を、10個の群で、融合対が導線から離れて位置するように順次導線沿いに並べた。0.7KV/cmで80μ秒間の単一DCパルスを、二次融合と活性化開始のために用いた。次に対を導線から除去し、T10滴に注意深く移して、融合を確認した。再構築胚を、5μg/mlのCB及び10μg/mlのシクロヘキシミドを添加したPZM-3培地中で、5%CO2、5%O2及び90%N2中で、最大湿度で、38.5℃で4時間、インキュベートし、次に、培養前に十分に洗浄した。
【０２８２】
従来のクローニング(TC)
Diaphot200倒立顕微鏡(株式会社ニコン、日本、東京)を用いて、顕微操作を実行した。42時間〜44時間成熟後、上記と同様に卵丘細胞を除去した。39℃に調整した加熱台上で全ての操作を実施した。単一50μL滴の顕微操作溶液(4mg/mLのBSA及び7.5μg/mLのCBを添加したNCSU-23)を、60mm培養皿の蓋上の中央域に作り、ミネラルオイルで被覆した。20〜30個の卵母細胞及び胎仔線維芽細胞の群を、同一滴中に入れた。15分〜30分間のインキュベーション後、1つの卵母細胞をホールディングピペット(内径=25μm〜35μm及び外径=80μm〜100μm)で確保した。5時〜6時の位置に配置後、第一極体及び隣接細胞質体(卵母細胞の総容量の約10%)(おそらくは分裂中期板を含有)を斜端インジェクションピペット(内径=20μm)を用いて吸引し取り除いた。次に単一の胎仔線維芽細胞を、同一スロットを通して空隙中に注入した。核移植(NT)後、再構築カプレットを、融合及び活性化が実行されるまで、1時間〜1.5時間、回復のためにミネラルオイルで被覆された培地の滴中に移した。再構築カプレットを、融合培地中で4分間インキュベートした。細く伸ばして、火仕上げしたガラスキャピラリを用いてカプレットを手動で整列させて、接触面を電極と平行にした。次に、2.0kV/cmの30μ秒、単一直流パルスを印加した。7.5μg/mLのCBを添加したPZM-3培地の滴中で30分〜60分間培養後、融合結果を立体顕微鏡下で検査した。融合カプレットに、活性化溶液中で二次パルスを施した。T10中での30分インキュベーション後、それらをPZM-3培地に移して、インビトロ発生を評価した。
【０２８３】
胚培養及び移入
4mg/mlのBSAを添加したPZM-3培地(Dobrinsky,
J.T. et al. Biol Reprod 55, 1069-1074 (1996))中で、再構築胚を培養した。HMCから産生された無帯胚は、変法WOW系(Feltrin, C. Et al. Reprod Fertil Dev 18, 126 (2006))で培養した。2つの異なる細胞株(HMCのためのLW1-2、TCのためのLW2)を、HMC及びTCのための核ドナー細胞として用いて、2つの手順からの子孫の同定を可能にした。LW1-2及びLW2は、それぞれ(デュロック種との)交雑及び純系デンマークランドレースからの胎仔に由来する。
【０２８４】
7日間のインビトロ培養後の平均胚盤胞/再構築胚率は、HMCにおいて50.1±2.8%(平均±S.E.M)であったが、これは、本発明者らの実験室で平行して実施したTCのものより有意に高く(p<0.01)(表7)、また今までに報告されているブタクローニングの中で最高のものである。
【０２８５】
【表７】
2010520751.tif 000009
【０２８６】
HMC及びTCの両方から産生された混合胚盤胞を、11頭の自然同期化成熟雌ブタに、発情周期の4日目又は5日目に、外科的に移入した。6頭(55%)のレシピエントが、超音波診断により妊娠と診断されたが、2頭が流産し、そして執筆時点までに、2頭が、それぞれ3匹及び10匹の仔ブタを分娩した。10匹というクローン化仔ブタの産仔数は、本発明者らの知る限り、ブタクローニングで今までに達成された最大産仔数である。一匹が前足一本の遠位関節に硬直性弯曲を示したことを除いて、それらの仔ブタの全てが健常であり行動も正常である(%)。
【０２８７】
同様の段階の胚を移入した場合、発情周期の4日目のレシピエントが、5日目のものより良好な妊娠確立を支持した、ということを、予備的結果は示唆している(表8)。
【０２８８】
【表８】
2010520751.tif 000010
【０２８９】
マイクロサテライト分析
10個の異なるブタマイクロサテライトマーカーを用いた親分析によって、クローン化仔ブタ及び核移植のために用いたドナー細胞の同一遺伝子型が確認された。新生仔ブタ、代理成熟雌ブタ、並びにそれぞれデンマークランドレース及びデュロック種を代表する2匹の胎仔に由来するドナー皮膚線維芽細胞LW1-2及びLW2の各々からの、ゲノムDNAのマイクロサテライト分析により、同定を実行した。異なるブタ染色体上に位置する10個の多型性マイクロサテライト遺伝子座(SW886、SW58、SW2116、SW1989、SW152、SW378、KS139、SO167、SW1987、SW957)を、3色多重PCRにより増幅し、そして生成物を、プログラムGene Mapper3.7を用いて、遺伝子分析機3130X1(Applied
Biosystems)で分析した。
【０２９０】
二番目のレシピエントに関しては、子孫/胚率(22%)は、ブタクローニングで今までに報告された最高のものであった(Walker, S.C. et al. Cloning Stem Cells 7, 105-112 (2005)、Hoshino, Y. et al. Cloning Stem Cells 7, 17-26 (2005))。同様の生仔出産/移入胚効率を、HMC(17%)及びTC(15%)において得た。
【０２９１】
統計学的分析
SPSS
11.5による独立試料t検定を用いて、実験群の差を評価した。P<0.05は、有意であるとみなされた。
【配列表フリーテキスト】
【０２９２】
2010520751.tif 000011
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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