(57)【要約】【要約】本発明は、特定の苦味リガンド、つまり、２−アセチルピラジンおよびエチルピラジンに応答するＴ２Ｒ味覚受容体ファミリー内のヒト味覚受容体ｈＴ２Ｒ５０の新規ハプロタイプの発見に関する。また、本発明は、ｈＴ２Ｒ５０味覚受容体の活性化を調節するリガンドを同定するためのアッセイにおけるこの新規ハプロタイプの使用にも関する。これらの化合物は、ｈＴ２Ｒ５０関連の苦味を修飾する（遮断する）ために、食物、飲料および医薬品において添加物として使用され得る可能性がある。【選択図】    図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列であって、配列番号：３に含有される配列を有するＴ２Ｒポリペプチド配列をコードする苦味受容体ｈＴ２Ｒ５０のハプロタイプ、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を保有するＴ２Ｒポリペプチドをコードし、そのカルボキシ末端に配列番号：３に含有されるｈＴ２Ｒ５０ポリペプチドと同じ１０のアミノ酸を含有するその変異形をコードする核酸配列。
【請求項２】
配列番号：３に含有されるポリペプチドをコードすることを特徴とする核酸配列。
【請求項３】
配列番号：２に含有される核酸配列を含むことを特徴とする請求項２に記載の核酸配列。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸配列を含有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項５】
請求項２に記載の核酸配列を含有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項６】
請求項３に記載の核酸配列を含有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項７】
請求項１のいずれか１つに記載の発現ベクターを含有することを特徴とする細胞。
【請求項８】
哺乳類細胞、バクテリア細胞、酵母細胞および両生類卵母細胞から選択されることを特徴とする請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
ＨＥＫ−２９３細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃｏｓ細胞、およびＢＨＫ細胞から成る群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の哺乳類細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の哺乳類細胞はＨＥＫ−２９３細胞であることを特徴とする哺乳類細胞。
【請求項１１】
ｈＴ２Ｒポリペプチドと機能的に関連するＧタンパク質を付加的に発現することを特徴とする請求項８に記載の細胞。
【請求項１２】
前記Ｇタンパク質は、その一部を含むＧα１６、Ｇα１６、ガストデューシン、ランスデューシンまたはキメラＧタンパク質から成る群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
配列番号：３に含有されるポリペプチド配列を有するｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプ、またはそれと少なくとも９０％配列同一性を保有し、２−アセチルピラジンまたはエチルピラジンに特異的に応答する変異形を含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号：３に含有される配列を含有することを特徴とする請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号：３に含有されるｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプポリペプチド、または最後の１０のカルボキシアミノ酸を欠くことを除いて、前記ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプと同じアミノ酸配列を保有するｈＴ２Ｒ５０ポリペプチド、あるいは前記配列と少なくとも９０％配列を保有し、２−アセチルピラジンまたはエチルピラジンに特異的に応答する変異ｈＴ２Ｒ５０ポリペプチドから成る群から選択される２−アセチルピラジンまたはエチルピラジンに特異的に応答するヒトｈＴ２Ｒ５０苦味受容体を調節する化合物を同定するためのアッセイであって、
ｉ．前記ｈＴ２Ｒポリペプチドの活性化を誘発するために、２−アセチルピラジンまたはエチルピラジンあるいは構造上関連する化合物へのその効果のために化合物をスクリーニングするステップと、
ｉｉ．前記ピラジンまたは構造上関連する化合物による前記受容体の活性化へのその効果に基づいて、前記化合物が、ｈＴ２Ｒ５０関連の苦味を調節するかどうかを判定するステップと、を含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項１６】
ｈＴ２Ｒ５０味覚受容体は、単離細胞膜上に発現されることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項１７】
ｈＴ２Ｒ５０味覚受容体は、無傷細胞上に発現されることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項１８】
ｈＴ２Ｒ５０味覚受容体は、真核細胞上に発現されることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項１９】
ｈＴ２Ｒ５０味覚受容体は、両生類、哺乳類または昆虫細胞によって発現されることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項２０】
味覚受容体は、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、Ｃ０Ｓ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯおよびアフリカツメガエル卵母細胞から選択される細胞上に発現されることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項２１】
請求項１５に記載のアッセイは蛍光定量アッセイであることを特徴とするアッセイ。
【請求項２２】
請求項１５に記載のアッセイは結合アッセイであることを特徴とするアッセイ。
【請求項２３】
細胞内イオン濃度へのその効果をアッセイすることによって、前記化合物への効果を検出することを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項２４】
細胞内ナトリウムまたはカルシウムへの前記化合物の効果を検出することを特徴とする請求項２３に記載のアッセイ。
【請求項２５】
細胞膜電位への前記化合物の効果を検出することを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項２６】
味覚受容体の転写への前記化合物の効果を検出することを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項２７】
前記化合物は、ｈＴ２Ｒ５０味覚受容体の活性化またはピラジン化合物との相互作用を遮断するその能力に基づいて選択されることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項２８】
細胞内ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰまたはＩＰ３への前記化合物の効果を検出することを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項２９】
ｈＴ２Ｒ味覚受容体は、前記ｈＴ２Ｒ味覚受容体の細胞外ドメインまたは膜貫通領域を含むことを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項３０】
前記アッセイは、カルシウム特異的な蛍光色素を使用して、カルシウムの変化を検出することを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項３１】
前記アッセイは、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４およびＦｕｒａ−２から選択される色素を使用して、細胞内カルシウムの変化を検出することを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項３２】
味覚受容体は、溶液中にあることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項３３】
分光学的特性、流力特性または溶解度の変化を検出する結合アッセイであることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項３４】
Ｇタンパク質とのｈＴ２Ｒ５０味覚受容体の複合への前記化合物の効果を検出することを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項３５】
トランスデューシン、ガストデューシン、Ｇa１５、およびＧa１６から選択されるＧタンパク質と味覚受容体の複合への前記化合物の効果を検出することを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項３６】
蛍光偏光アッセイであることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項３７】
ｈＴ２Ｒ５０味覚受容体ポリペプチドは、固相基質に付着されることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項３８】
ハイスループットアッセイであることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項３９】
ｈＴ２Ｒ５０味覚受容体ポリペプチドは、ＨＥＫ２９３細胞によって発現されることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項４０】
前記アッセイは、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４およびＦｕｒａ−２から選択される色素を使用して、細胞内カルシウムの変化を検出することを特徴とする請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４１】
味覚受容体は、溶液中にあることを特徴とする請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４２】
分光学的特性、流力特性または溶解度の変化を検出する結合アッセイであることを特徴とする請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４３】
Ｇタンパク質と味覚受容体の複合への、前記化合物の効果を検出することを特徴とする請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４４】
トランスデューシン、ガストデューシン、Ｇa１５、およびＧa１６から選択されるＧタンパク質と前記味覚受容体の複合への前記化合物の効果を検出することを特徴とする請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４５】
蛍光偏光アッセイであることを特徴とする請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４６】
味覚受容体は、固相基質に接着されることを特徴とする請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４７】
ハイスループットアッセイであることを特徴とする請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４８】
味覚受容体は、ＨＥＫ２９３細胞によって発現されることを特徴とする請求項３０に記載のアッセイ。
【請求項４９】
厳密なハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２に含有されるＤＮＡ配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を有するＴ２Ｒハプロタイプポリペプチドを発現し、配列番号：３に含有される前記Ｔ２Ｒ５０ハプロタイプペプチドに特異的に結合する苦味リガンドに結合することを特徴とする単離味覚または胃腸細胞。
【請求項５０】
前記細胞は、配列番号：２に含有されるＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求項４９に記載の単離味覚または胃腸細胞。
【請求項５１】
ヒトＴ２Ｒ５０ハプロタイプポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法であって、請求項４９または５０に記載の味覚または胃腸細胞を、潜在的Ｔ２Ｒ調節化合物と接触させるステップと、前記化合物が、味覚または胃腸細胞内で発現したＴ２Ｒの活性と特異的に結合するおよび／または調節するかどうか、および／または別の化合物によるヒトＴ２Ｒの特異的結合および活性化に影響するかどうかを検出するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項５２】
Ｔ２Ｒ５０ハプロタイプを有する個人に対してスクリーニングする方法であって、個人の遺伝子検査を行うステップと、前記個人が、配列番号：２に含有されるｈＴ２Ｒ５０配列を含むかどうかを判定するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項５３】
配列番号：３に記載のｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプポリペプチド配列を発現する細胞を、推定調節化合物と接触させるステップと、Ｔ２Ｒ５０ハプロタイプの活性を調節する化合物を検出するステップと、を含むことを特徴とするＴ２Ｒ５０ハプロタイプ。
【請求項５４】
Ｔ２Ｒ５０ハプロタイプの発現と関連する差異を検出する方法であって、ｈＴ２Ｒ５０に特異的に結合および／またはそれを活性化するが、他のｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプと特異的に結合および／またはそれを活性化しない化合物を同定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５５】
配列番号：３に含有されるどちらか一方のｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプポリペプチドを発現する細胞を接触させるステップと、ｈＴ２Ｒ５０配列を特異的に活性化する化合物を同定するステップと、を含むことを特徴とするＴ２Ｒリガンドスクリーニングアッセイ。
【請求項５６】
舌または胃腸系におけるＴ２Ｒ発現細胞を含む味覚および／または胃腸あるいは消化機能へのリガンドの効果を検査するステップをさらに含むことを特徴とする請求項５５に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
［０００１］本出願は、２００６年９月５日出願の米国暫定特許出願第６０／８４２，０１６号の優先権を主張するものである。本出願は、本譲受人Ｓｅｎｏｍｙｘ  Ｉｎｃ．による２００１年３月５日出願の米国特許出願第０９／８２５，８８２号にも関する。これらの出願の両方は、参照することによりそれら全体が本願明細書に組み込まれる。これらの出願は、ｈＴ２Ｒ５０苦味受容体および他のヒトＴ２Ｒ味覚受容体ならびに味覚調節分子および有力な治療薬を同定するためのその使用に関する。
技術分野
［０００２］本出願は、特異的ヒト味覚受容体ｈＴ２Ｒ５０（ｈＴ２Ｒ４５またはｈＴａｓ２Ｒ４５としても当技術分野において既知である）の新規ハプロタイプの解明およびこの新規ハプロタイプを調節するリガンドの解明に関する。
【０００２】
［０００３］この発見に基づいて、この新規ハプロタイプおよびその変異形は、このｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプと関連する苦味を調節、好ましくは遮断する化合物を同定するためのアッセイ、好ましくハイスループットの細胞ベースのアッセイにおいて有用である。これらのアッセイを使用して同定された化合物は、その味覚を向上させるために、食物、飲料または医薬品において添加物として使用され得る。
【０００３】
［０００４］また、本発明は、例えば、食物センシング、吸収、胃腸ホルモンおよびペプチド分泌の制御、輸送および吸収、舌および胃腸系における毒素に対する応答等の胃腸機能を調節することができる化合物を同定するための、ならびに摂食障害、糖尿病、肥満症等の胃腸および代謝疾患を治療するための治療的スクリーニングにおける、対象Ｔ２Ｒ遺伝子およびそれを発現する対応するポリペプチドおよび細胞の使用に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
（発明が解決しようとする課題）
［０００５］ヒトが認識できる基本的な味覚モダリティのうちの１つが苦味である。苦味の生理機能は、ごく最近までほとんど解明されていなかった。最近の研究により、味覚の生物学が明らかになり始めている（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ（２００１））。苦味化合物の多くは、細胞表面受容体と相互作用することによって、苦味を生成することが知られている。これらの受容体は、細胞内Ｇタンパク質と相互作用する７つの膜貫通ドメイン受容体のファミリーに属する。Ｔ２Ｒと称されるＧＰＣＲの新規ファミリーは、ヒトおよびげっ歯類において同定されている（Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １００（６）：６９３−７０２（２０００）；Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １００（６）：７０３−７１１（２０００）；Ｍａｔｓｕｎａｍｉ  Ｈ，Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒ  Ｊ  Ｐ，Ｂｕｃｋ  Ｌ  Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ４０４（６７７８）：６０１−４（２０００））。主題発明前のいくつかの一連の根拠により、Ｔ２Ｒが苦味化合物に対する応答を媒介することが示唆された。第１に、Ｔ２Ｒ遺伝子は、舌および口蓋上皮の味覚受容体細胞のサブセットに特異的に発現される。第２に、ヒトＴ２Ｒ（ｈＴ２Ｒ１）のうちの１つに対する遺伝子は、ヒトにおける苦味化合物６−ｎ−プロピル−２−チオウラシルに対する感受性に連結される染色体座内に位置している（Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｉｄ．）（２０００））。第３に、マウスＴ２Ｒ（ｍＴ２Ｒ５）のうちの１つは、マウスにおける苦味化合物シクロヘキシミドに対する感受性に連結される染色体座内に位置している。ｍＴ２Ｒ５は、味覚細胞内に特異的に発現され、苦味刺激伝達に連結されるガストデューシン、Ｇタンパク質を活性化できることもまた示された（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：７９６−８００（１９９６））。ｍＴ２Ｒ５によるガストデューシン活性化は、シクロヘキシミドに応じてのみ生じる（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｉｄ．）（２０００）。したがって、ｍＴ２Ｒファミリーは、マウスにおける苦味に対する応答を媒介し、一方、ｈＴ２Ｒファミリーは、ヒトにおける苦味に対する応答を媒介することが示されている。１つのヒトＴ２Ｒのみが苦味リガンドを同定したと示唆され、ｈＴ２Ｒ４は、デナトニウムによって活性化されることが示された（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｉｄ．）２０００）。しかしながら、研究で使用された有効なデナトニウム濃度（１．５ｍＭ）は、異常に高く、つまり、ヒトに対するデナトニウムの既報告苦味閾値よりも１０５倍高かった（Ｓａｒｏｌｉ，Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ７１：４２８−４２９（１９８４））。したがって、特異的苦味リガンドは、いかなるｈＴ２Ｒにも説得力をもって一致しなかった。また、各ｈＴ２Ｒは、多数の苦味リガンドを結合できることもまた示唆されている。この仮説は、ｈＴ２Ｒファミリーが２５のみの同定されたメンバーから成り、それに対してヒトは、何百もの異なる化合物を苦味として認識できるという事実に基づいている。ｈＴ２Ｒの配列は、以前に報告されており、Ｚｕｋｅｒら（ＷＯ０１／１８０５０  Ａ２，（２００１））およびＡｄｌｅｒら���ＷＯ０１／７７６７６Ａ１（２００１））による公開ＰＣＴ出願に開示され、両方とも参照することによりそれら全体が本願明細書に組み込まれる。
【０００５】
［０００６］Ｔ２Ｒ機能を研究することの難点の１つは、これらの受容体が、培養細胞株に容易に発現されないことである。Ｔ２Ｒ発現を改善するため、良好に発現されたＧＰＣＲ、ロドプシンからのＮ末端配列が、Ｔ２Ｒ配列に付着された（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｉｄ．）２０００）。このＮ末端タグは、利用可能な抗体に起因するタンパク質発現の容易な監視もまた可能にした。ロドプシンタグの取り込みが、哺乳類細胞株における一部のＴ２Ｒの発現を改善させた一方で、それらの多くは、それでも機能的研究によって十分なほど発現されなかった。異なるアプローチにおいて、ｍＴ２Ｒ５は、昆虫Ｓｆ９細胞内でうまく発現され、生化学ＧＴＰgＳ結合アッセイを使用する機能的研究に使用した（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｉｄ．）２０００）。
【０００６】
［０００７］出願人の以前の特許出願、現在特許権を有する米国特許出願第０９／８２５，８８２号において、出願者は、ｈＴ２Ｒ５１、ｈＴ２Ｒ５４、ｈＴ２Ｒ５５、ｈＴ２Ｒ６１、ｈＴ２Ｒ６３、ｈＴ２Ｒ６４、ｈＴ２Ｒ６５、ｈＴ２Ｒ６７、ｈＴ２Ｒ７１、およびｈＴ２Ｒ７５を含む、多数の当時の新規ヒト味覚受容体に対する核酸配列およびポリペプチド配列を同定し、提供した。さらに、２００３年７月２９日出願された米国特許出願第１０／６２８，４６４号において、出願者は、ｈＴ２Ｒ７６としてその中で称される、別の同定された新規ヒト味覚受容体に対するポリペプチドおよびＤＮＡ配列を提供した。
【０００７】
［０００８］また、参照することによりその全体が本願明細書に組み込まれる米国特許出願第１０／１９１，０５８号において、出願者は、３つの異なるヒトＴ２Ｒを特異的に活性するリガンドを発見した。さらに、出願者は、他のヒトＴ２Ｒと特異的に結合する苦味リガンドをさらに同定し、関連アッセイを提供する米国特許出願第１１／４５５，６９３号を最近出願した。
【０００８】
［０００９］また、本発明の実用性に関連して、Ｔ２ＲおよびＴ１Ｒ味覚受容体の両方が胃腸系に発現されることが報告されている。例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９９（４）：２３９２−７（２００２）は、Ｔ２Ｒが、ガストデューシンおよびトランスデューシンサブユニットと同様に、腸管内分泌細胞（ＳＴＣ１細胞）内に発現されること、ならびにこれらの細胞が胃腸管の苦味リガンドに応答する可能性が高いことを報告している。また、苦味刺激は、腸管内分泌ＳＴＣ−１細胞においてＣａ＋＋シグナル、および伝達コレシストキニン（ＣＣＫ）放出を誘発することがＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９１（４）：Ｃ７２６−３９（２００６）によって報告されている。また、Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ，Ａ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９１（２）：Ｇ１７１−７（２００６）は、腸内の味覚受容体が、消化機能、ならびにホルモンおよび／またはニューロン経路の制御を送る分子に関与する可能性があり、ならびに有害な薬および生存応答の検出に影響を与える可能性があることを報告している。さらに、Ｓｔｅｒｎｉｎｉ  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９２（２）：Ｇ４５７−６１（２００７）は、腸内の味覚受容体が、分子センシング、栄養吸収、有害物質からの保護等の胃腸機能に関与し得ることを報告しており、さらに、これらの機構の理解が、栄養補給障害および炎症等の病状および状態と関係していることを示唆している。さらに、近年、Ｍａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００７［Ｅｐｕｂ｝によって、Ｔ２ＲおよびＴ１ＲがホスホリパーゼＣβ２、ＰＬＣβ２を活性化すること、舌細胞内に存在するものと同様に、腸内に分子腸管センシングシステムが存在する可能性と、味覚受容体を発現する刷子細胞または単生化学感覚細胞等の胃腸細胞が、ＧＬＵＴ２増加をもたらし得、栄養素センシング、ならびに肥満症および糖尿病の治療における栄養素に影響を与え得ることが示唆されている。また、Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．１２（３５）：４５９１−６００（２００６）は、腸内に発現されるＴ１Ｒが、人工甘味料と同様に、肥満症および糖尿病の治療における化合物のためのアッセイに使用され得ることを示唆している。
【０００９】
［００１０］しかしながら、報告されているものおよびＴ２Ｒメンバーが苦味を制御することおよび胃腸機能におけるそれらの可能な役割の理解にかかわらず、ヒト苦味Ｔ２Ｒ味覚受容体を活性化する特異的リガンドを同定することの必要性が存在する。異なるＴ２Ｒ、特にヒトＴ２Ｒの結合特性についてさらなる理解を深めることは、所望の味覚調節特性を有する、つまり、特異的苦味化合物の味覚を遮断または抑制する化合物を選択するその使用をさらに促進するために、非常に有益であろう。また、胃腸機能および肥満症、糖尿病、食物吸収、食物センシング、摂食障害等の関連疾患を、ならびにＧＬＵＴ２、コレシストキニン等の関連ホルモンおよびペプチドの制御において治療および調節するための化合物の同定を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（課題を解決するための手段）
［００１１］その目的のために、本発明は、ヒトＴ２Ｒの新規ハプロタイプの発見、および味覚モジュレータアッセイにおけるその使用に関する。
【００１１】
［００１２］より具体的には、本発明は、ｈＴ２Ｒ５０の新規ハプロタイプをコードする核酸配列および対応する味覚受容体ポリペプチドを提供する。
【００１２】
［００１３］また、本発明は、この新規ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプおよびその変異形を発現する組換え細胞を提供する。
【００１３】
［００１４］さらに、本発明は、以前に同定された形態のｈＴ２Ｒ５０と同様に、このｈＴ２Ｒハプロタイプを特異的に認識するリガンドを同定する。
【００１４】
［００１５］また、本発明は、該ハプロタイプが、以前に同定された形態のｈＴ２Ｒ５０とは異なる苦味リガンドに応答するかどうかを同定するための細胞ベースのアッセイを提供する。
【００１５】
［００１６］これらの発見は、特異的苦味リガンドの存在下および非存在下において、特定のＴ２Ｒを発現する細胞を使用して本明細書に開示した該新規ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプを含むＴ２Ｒの活性を測定した、細胞ベースのアッセイを使用してなされた。具体的には、以下に詳述するように、該対象ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプおよびそれらの表面上で元来同定されたｈＴ２Ｒ５０対立遺伝子（上記のＡｄｌｅｒ  ＰＣＴおよび米国出願において報告された）を含む特異的Ｔ２Ｒを発現し、それと共役するＧタンパク質をさらに発現するＨＥＫ細胞株を、細胞内カルシウム濃度の変化に基づいて推定される苦味リガンドを検出した細胞ベースのアッセイにおいて使用した。該対象新規ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプおよび以前に同定されたＴ２Ｒ５０対立遺伝子の両方は、構造上関連する苦味化合物（２−アセチルピラジンおよびエチルピラジン）を特異的に認識し、それに応答した一方で、他のｈＴ２Ｒは同様の条件下で活性化されなかったことが分かった。
【００１６】
［００１７］したがって、本発明は、これらの苦味化合物および可能性として他の苦味化合物によって、この受容体の活性化を遮断する化合物を同定するために、アッセイ、好ましくはハイスループットアッセイにおけるこのｈＴ２Ｒハプロタイプの使用を包含する。
【００１７】
［００１８］さらに、本発明は、たとえば、食物および栄養素センシング、食物吸収、消化ホルモンおよびペプチドの制御、毒素に対する応答等胃腸機能を制御または調節する化合物を同定するための、ならびに肥満症、糖尿病等の胃腸または代謝疾患、およびＩＢＤ、セリアック病、クローン病等の炎症性または自己免疫性胃腸疾患を治療するための治療的スクリーニングアッセイにおける、該対象Ｔ２Ｒハプロタイプおよびそれを発現する対応するポリペプチドおよび細胞の使用に関する。
【００１８】
［００１９］本発明は、ヒトまたは他の味覚検査における同定された調節化合物の効果を評価し、苦味への同定された化合物の効果を評価するさらなるステップ、および／または特定の胃腸、消化もしくは代謝機能または疾患への同定された化合物の効果を評価する生体外もしくは生体内臨床試験をさらに含むアッセイもまた包含する。また、本発明は、風味または味覚モジュレータとしての、つまり、苦味、例えば特定の飲料および食物または医薬品と関連する苦味を抑制するための、食物、飲料または医薬品における同定された化合物の使用を包含する。
【００１９】
［００２０］さらに、本発明は、苦味受容体を特異的に活性化する化合物を除去するように処置された食物、飲料および医薬品、例えば、本明細書に含まれる苦味化合物の量を除去または減少するように加工された食物および飲料の生成を包含する。
【００２０】
［００２１］その上さらに、本発明は、Ｔ２Ｒを含む代謝疾患、消化機能、および胃腸疾患を治療または予防するのに好適に同定された化合物を含有する医薬品を包含する。具体的には、本発明は、クローン病、セリアック病、肥満症、糖尿病、食物センシング、食物吸収、消化ホルモンまたはペプチド分泌等の状態を治療または調節するための医薬品を検討する。
（発明の目的）
［００２２］本発明の目的は、ｈＴ２Ｒ５０の新規ハプロタイプを同定することである。
【００２１】
［００２３］本発明の別の目的は、このハプロタイプが、スクリーニングされた個人における苦味知覚の遺伝的差異と相関するかどうかを判定することである。
【００２２】
［００２４］本発明の特定の目的は、２−アセチルピラジンおよびエチルピラジンを含む苦味リガンドまたはそれに構造上関連する化合物を含む他の苦味リガンドによって、このｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプまたはそのフラグメント、変異形、オルソログ、もしくはキメラの活性化を調節する、好ましくは遮断する化合物を同定することである。
【００２３】
［００２５］本発明の別の特定の目的は、この苦味受容体の活性化を調節する、好ましくは遮断する化合物を同定するアッセイにおいて、対象ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプまたはそのフラグメント、変異形、オルソログ、変異体もしくはキメラを含むもしくは発現する（安定的または過渡的に）細胞または細胞膜を使用することである。
【００２４】
［００２６］本発明のさらにより特定の目的は、この新規ハプロタイプの活性化を調節する化合物を検出するために、細胞内カルシウムの変化を検出する細胞ベースのアッセイにおいて、好ましくは哺乳類、両生類または昆虫細胞、例えば、Ｇa１５、Ｇa１６、ガストデューシン、トランスデューシンまたはそのキメラ等のそれと共役するＧタンパク質を発現する、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞等の細胞を使用することである。
【００２５】
［００２７］本発明の別の目的は、例えば、食物および栄養素センシング、食物吸収、消化ホルモンおよびペプチドの制御、毒素に対する応答等胃腸機能を制御または調節する化合物を同定するための、ならびに肥満症、糖尿病等の胃腸または代謝疾患、およびＩＢＤ、セリアック病、クローン病等の炎症性または自己免疫性胃腸疾患を治療するための治療的スクリーニングアッセイにおいて、対象Ｔ２Ｒハプロタイプおよびそれを発現する対応するポリペプチドおよび細胞の使用を提供することである。
【００２６】
［００２８］本発明の別の目的は、ヒトまたは他の味覚検査における同定された調節化合物の効果を評価し、苦味への同定された化合物の効果を評価するさらなるステップ、および／または特定の胃腸、消化もしくは代謝機能または疾患への同定された化合物の効果を評価する生体外もしくは生体内臨床試験をさらに含むアッセイを提供することである。
【００２７】
［００２９］本発明の別の目的は、風味または味覚モジュレータとしての、つまり、苦味、例えば特定の飲料および食物または医薬品と関連する苦味を抑制するための、食物、飲料または医薬品における同定された化合物の使用を提供することである。
【００２８】
［００３０］本発明の別の目的はまた、苦味受容体を特異的に活性化する化合物を除去するように処置された食物、飲料および医薬品、例えば、本明細書に含まれる苦味化合物の量を除去または減少するように加工された食物および飲料の生成を提供することである。
【００２９】
［００３１］その上さらに、本発明の目的は、Ｔ２Ｒを含む代謝疾患、消化機能、および胃腸疾患を治療または予防するのに好適な同定された化合物を含有する医薬品を提供することである包含する。具体的には、本発明は、クローン病、セリアック病、肥満症、糖尿病、食物センシング、食物吸収、消化ホルモンまたはペプチド分泌等の状態を治療または調節するための医薬品を検討する。
【００３０】
［００３２］本発明の別の目的は、味覚検査、好ましくはヒト味覚検査において、例えばピラジン化合物によって引き出される苦味を調節、好ましくは遮断する同定された化合物を確認することである。
【００３１】
［００３３］本発明の別の目的は、この味覚受容体を特異的に活性化する化合物によって誘発される苦味を調節する、好ましくは遮断するために、本明細書に記述したアッセイで同定された化合物を、組成物中の添加物として利用することである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
（図面の簡単な説明）
【図１】［００３４］  図１は、そのカルボキシ末端での１０の付加的アミノ酸の存在によって、以前に同定されたｈＴ２Ｒ５０とは異なるｈＴ２Ｒ５０の対象ハプロタイプに対する核酸配列およびタンパク質配列を含有することを示す図である。
【図２】［００３５］  図２は、対象ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプ、以前に同定されたｈＴ２Ｒ５０、ｈＴ２Ｒ６１、ｈＴ２Ｒ６４およびｈＴ２Ｒ７５のカルボキシ末端を配列する図である。以前の（より短い形態）ｈＴ２Ｒ５０を除いて、これらのｈＴ２Ｒは、それらのＣ末端で同じ１０のカルボキシ末端アミノ酸を含有し、ｈＴ２Ｒ７５は、そのＣ末端（ｈＴ２Ｒ７５の最後のアミノ酸は、プロリンよりもむしろセリンである）で同じ１０のうち９のアミノ酸を含有することが分かる。
【図３】［００３６］  図３は、対象ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプおよび以前のより短い形態と特異的に相互作用する苦味リガンドである２−アセチルピラジンおよびエチルピラジンに対する構造を含有することを示す図である。
【図４】［００３７］  図４は、１０ｍＭでの２−アセチルピラジンに対する対象ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプおよび以前に同定されたより短い形態の用量反応を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（発明の詳細な説明）
［００３８］本発明を具体的に説明する前に、以下の定義が提供される。
【００３４】
［００３９］「Ｔ２Ｒ」ファミリーとは、多型変異体、対立遺伝子、変異体、およびホモログを含み、それらは（１）本明細書に開示される、ならびに参照することによって本明細書に組み込まれるＺｕｋｅｒ（Ｉｄ）（２００１）およびＡｄｌｅｒ（Ｉｄ．）のＰＣＴおよび米国出願のＴ２Ｒに対し、約２５のアミノ酸、好ましくは５０〜１００アミノ酸の範囲にわたる約３０〜４０％のアミノ酸配列同一性、より具体的には約４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％のアミノ酸配列同一性を有し；（２）以下に開示のＴ２Ｒ配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫原に対し生じる抗体、および保存的に修飾された変異形と特異的に結合し、（３）以下に開示のＴ２Ｒ  ＤＮＡ配列から成る群から選択された配列、および保存的に修飾された変異形と、厳密なハイブリダイゼーション条件下で特にハイブリダイズし（少なくとも約１００、任意に少なくとも約５００〜１０００の大きさのヌクレオチドで）（４）以下に開示のＴ２Ｒアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約４０％同一である配列を含み、または（５）記載のＴ２Ｒ配列と厳密なハイブリダイゼーション条件下で特にハイブリダイズするプライマーにより増幅される。
【００３５】
［００４０］特に、これらの「Ｔ２Ｒ」は、本明細書でｈＴ２Ｒ５０、および図１に含まれるＤＮＡおよびアミノ酸配列を有するそのハプロタイプとして言及されるヒトの苦味受容体、例えば、２−アセチルピラジンおよびエチルピラジンを含むピラジン等の、苦味リガンドと特に結合する変異形、対立遺伝子、変異体、オルソログおよびこれらのキメラを含む。
【００３６】
［００４１］「Ｔ２Ｒハプロタイプ」は、ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプおよび図１に含まれる対応するＤＮＡ等の、異なる個人において見られるｈＴ２Ｒポリペプチドの自然発生対立遺伝子を指す。このようなＴ２Ｒハプロタイプは、上述の元来同定されたｈＴ２Ｒポリペプチドとして、同じ、または異なる苦味リガンドに反応してもよい。例えば、いくつかのハプロタイプは、ある個人が異なる苦味リガンドを味わう、または他の個人と比べてこのようなリガンドを異なって感知する能力に関与する場合がある。
【００３７】
［００４２］Ｔ２Ｒ遺伝子は、タンパク質およびＤＮＡレベルの両方において実質的な配列分散を示すが、これまでに単離されたすべてのＴ２Ｒは、参照することにより本明細書に完全に組み込まれる、Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（ＷＯ  ０１／７７６７６  Ａ１（２００１）およびＺｕｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ＷＯ  ０１／１８０５０  Ａ２において、既に同定されたＴ２Ｒコンセンサス配列に対して、同一または少なくとも７０〜７５％の配列同一性を保有する特定の領域において特定のコンセンサス配列を含むことがわかっている。
【００３８】
［００４３］トポロジー的には、特定の化学感覚ＧＰＣＲは、「Ｎ末端ドメイン」、「細胞外ドメイン」、７回膜貫通領域を含む「膜貫通ドメイン」、ならびに対応する細胞質および細胞外ループ、ならびに「細胞質領域」および「Ｃ末端領域」を有する（例えば、Ｈｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，９６：５４１−５１（１９９９）；Ｂｕｃｋ  ＆  Ａｘｅｌ，Ｃｅｌｌ，６５：１７５−８７（１９９１）を参照）。これらの領域は、疎水性および親水性ドメイン（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（３ｒｄ  ｅｄ．１９８８）を参照のこと。またｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ等に見られるもの等の、あらゆる多くのインターネットベースの配列分析プログラムも参照のこと。）を同定する配列分析プログラム等の当業者に既知の方法を使用し、構造的に同定されることが可能である。これらの領域は、キメラタンパク質の製造、および例えば、リガンド結合アッセイ等の、本発明の体外アッセイに有用である。
【００３９】
［００４４］したがって、「細胞外ドメイン」は、細胞膜から突出し、細胞の細胞外表面に暴露するＴ２Ｒポリペプチドのドメインを指す。このような領域は、細胞の細胞外表面へ暴露する「Ｎ末端ドメイン」ならびに、細胞の細胞外表面へ暴露する膜貫通ドメインの細胞外ループ、すなわち、膜貫通領域２と３との間、膜貫通領域４と５との間、および膜貫通領域６と７との間の細胞外ループを含み得る。「Ｎ末端ドメイン」は、Ｎ末端で始まり、膜貫通領域の開始点に近い領域へ延在する。これらの細胞外領域は、可溶性相および固相の両方の、体外リガンドアッセイにおいて有用である。さらに、以下に記載される膜貫通領域は、細胞外領域との組み合わせまたはそれのみで、リガンド結合に関与することが可能であり、したがって体外リガンド結合アッセイにおいても有用である。
【００４０】
［００４５］［００３４］７回膜貫通「領域」を含む「膜貫通ドメイン」は、原形質膜内に位置するＴ２Ｒポリペプチドのドメインを指し、対応する細胞質性（細胞内）および細胞外ループを含んでもよく、膜貫通「領域」としても言及される。７回膜貫通領域、ならびに細胞外および細胞性ループは、上記のＫｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−３２（１９８２））、または上記のＳｔｒｙｅｒに記載の標準的な方法を使用して同定されることが可能である。
【００４１】
［００４６］［００３５］「細胞質ドメインは」、例えば、「Ｃ末端ドメイン」および、例えば、膜貫通領域１と２との間、膜貫通領域３と４との間、および膜貫通領域５と６との間等の細胞内ループ膜貫通ドメインの細胞内ループの、細胞内部に面するＴ２Ｒタンパク質のドメインを指す。「Ｃ末端ドメイン」は、最後の膜貫通領域の端部から、通常細胞質内に位置する、タンパク質のＣ末端に及ぶ領域を指す。
【００４２】
［００４７］［００３６］「７回膜貫通受容体」とは、原形質膜を７回貫通する７つの領域を有する、膜貫通タンパク質のスーパーファミリーに属するポリペプチドを意味する（したがって、７つの領域は、「貫通膜」またはＴＭ  ＩからＴＭ  ＶＩＩの「ＴＭ」ドメインと呼ばれる）。嗅覚器官および特定の味覚受容体のファミリーは、それぞれこのスーパーファミリーに属する。７回膜貫通受容体ペプチドは、以下にさらに詳しく述べるように、類似のおよび特徴的な第１の、第２の、および第３の構造を有する。
【００４３】
［００４８］「リガンド結合領域」とは、膜貫通ドメインＩＩからＶＩＩ（ＴＭ  ＩＩからＶＩＩ）を実質的に組み込む化学感覚または味覚受容体由来の配列を指す。該領域は、リガンド、より具体的には、味覚を引き出す化合物を結合する能力を有しうる。
【００４４】
［００４９］「原形質膜転移ドメイン」または、単に「転移ドメイン」とは、細胞表面上のＴ２Ｒポリペプチド等のポリペプチドを輸送することができるポリペプチドを意味する。例示的な転移ドメインは、
［００５０］（５’−ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶ；配列番号：１）等のロドプシン由来であってもよい。これらのペプチドドメインは、ポリペプチドをコードする配列のアミノ末端に組み込まれた際、非常に高い効率で、細胞原形質膜にハイブリッド（「融合」）タンパク質を「付与」または「転移」させることができる。この特定の「転移ドメイン」は、当初は７回膜貫通受容体である、ヒトロドプシン受容体ポリペプチドのアミノ末端由来であった。別の転移ドメインは、ウシロドプシン配列由来であり、また転移を促進するのに有用である。ロドプシン由来配列は、７回膜貫通型融合タンパク質を原形質膜に転移させるのに特に有効である。
【００４５】
［００５１］「機能等価」とは、新しく翻訳されたタンパク質を、類似の常態下において、例示的な配列番号１等の効率的に別の転移ドメインとして原形質膜へ転移することにおけるドメインの能力および効率を意味し、相対的効率は、本明細書に記載されるように、測定され（量的表現で）、比較される。本発明の範囲内に含まれるドメインは、１２アミノ酸長転移ドメイン配列番号：１と同じ効率性を有する新たな合成ペプチドを細胞（哺乳類、ゼノパス等）の原形質膜へ転移することにおけるその効率性について、一連のスクリーニングによって決定されることが可能である。
【００４６】
［００５２］Ｔ２Ｒファミリーメンバーを調節する試験化合物のためのアッセイの文脈において、「機能的効果」とは、味覚伝達を媒介し、例えば、機能的、物理的、および化学的効果等の間接的または直接的に受容体の作用の下にある任意のパラメータの測定値を含む。それは、体外、体内、および生体外でのリガンド結合、イオン流出の変化、膜電位、電流、転写、Ｇタンパク質結合、ＧＰＣＲのリン酸化または脱リン酸化、シグナル伝達、受容体−リガンド相互作用、二次伝達物質の濃度（例えば、ｃＡＭＰ，ｃＧＭＰ，ＩＰ３，または細胞内Ｃａ２＋）を含み、また、神経伝達物質またはホルモンの放出の増加または減少等の他の生理学的効果を含む。
【００４７】
［００５３］「機能的効果を測定すること」は、間接的または直接的にＴ２Ｒファミリーのメンバーの作用の下にあるパラメータ、例えば、機能的、物理的、および化学的効果等を増加、または減少させる化合物についてのアッセイを意味する。そのような機能的効果は、当業者に既知の手段により測定されることが可能であり、例えば、分光特性（例えば、蛍光、吸収度，屈折率）、水力学的特性（例えば、形態）、クロマトグラフィー特性、または溶解特性の変化、パッチクランプ法、電圧感受性色素、全細胞電流、放射性同位体流出、遊動性マーカー、卵母細胞Ｔ２Ｒ遺伝子発現；組織培養細胞Ｔ２Ｒ発現；Ｔ２Ｒ遺伝子の転写活性化；リガンドの結合アッセイ；電圧、膜電位およびコンダクタンスの変化；イオン流出アッセイ；ｃＡＭＰ，ｃＧＭＰ，およびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）等の細胞内二次伝達物質の変化；細胞内カルシウムのレベルの変化；神経伝達物質の放出等がある。
【００４８】
［００５４］Ｔ２Ｒタンパク質受容体の「阻害剤」、「活性剤」、および「モジュレータ」は、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、およびそれらのホモログおよび模倣物等の、味覚伝達のための体外および体内アッセイを使用して同定される阻害分子、活性分子、または調節分子を指す。阻害剤は、例えば、結合して、刺激を部分的または全体的に遮断する、活性を減少、阻止、遅延する、味覚伝達を不活性化、減感化、または下方制御する、例えばアンタゴニスト等の化合物である。活性剤は、例えば、結合して、活性を増加、開始、活性化、促進、強化し、味覚伝達を敏感化、または上方制御する、例えばアゴニスト等の化合物である。モジュレータは、例えば、受容体と以下のものとの相互作用を変化するものを含み、それらは、活性剤または阻害剤と結合する細胞外タンパク質（例えば、エブネリンおよび疎水性キャリアファミリーの他のメンバー）；Ｇタンパク質；キナーゼ（例えば、受容体の不活性および脱感作に関与するロドプシンキナーゼおよびβアドレナリン受容体キナーゼのホモログ）；および、また受容体を不活性化および脱感作するアレスチンである。モジュレータは、例えば、変化された活性を伴う、Ｔ２Ｒファミリーメンバーの遺伝的修飾物を含み、さらに、自然発生のおよび合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低化学分子等を含む。
【００４９】
［００５５］阻害剤および活性剤についてのそのようなアッセイは、例えば、細胞または細胞膜において、発現Ｔ２Ｒファミリーメンバーを発現させること、例えば、苦味化合物等の化合物の存在または非存在下において推定されるモジュレータ化合物を適用すること、および上述のように味覚伝達における機能的効果を測定することを含む。潜在的な活性剤、阻害剤、またはモジュレータで処理されたＴ２Ｒファミリーメンバー試料およびアッセイは、調節の程度を調べるために阻害剤、活性剤、またはモジュレータを含まない比較参照データと比較される。比較参照データ（モジュレータで処理されない）は、相対Ｔ２Ｒ活性値が１００％であると指定される。対照に対するＴ２Ｒ活性値は約８０％、任意に５０％または２５〜０％である場合、Ｔ２Ｒの阻害が達成される。対照に対するＴ２Ｒ活性値が１１０％、任意に１５０％、任意に２００〜５００％、または１０００〜３０００％以上である場合、Ｔ２Ｒの活性が達成される。
【００５０】
［００５６］本明細書で使用される「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」という用語は、本発明の化合物がその自然な状態において通常伴うような他の異なる化合物が含まれていない状態を指す。好ましくは、「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」とは、化合物が所定の試料の質量の、少なくとも０．５重量％、１重量％、５重量％、１０重量％、または２０重量％、および最も好ましくは少なくとも５０重量％または７５重量％を含むことを意味する。好ましい一実施形態において、これらの用語は、所定の試料の質量で少なくとも９５重量％を含む本発明の化合物を指す。本明細書に使用されるとき、核酸またはタンパク質の「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質を指す場合、哺乳動物、特にヒト、人体において自然に発生するような精製または濃縮とは異なる状態を指す。哺乳動物、特にヒト、人体において自然に発生するようなものを上回る程度の精製または濃縮は、（１）他の関連する構造または稼動物からの精製、または（２）哺乳類、特にヒト、人体に通常関連しない構造または化合物との関連を含み、「単離」の意味の範囲内である。本明細書に記載される、核酸もしくはタンパク質、または核酸もしくはタンパク質のクラスは、単離されてもよく、あるいは当業者に既知の様々な方法および手順に従い、通常まったく関連しない構造または化合物と関連してもよい。
【００５１】
［００５７］本明細書に使用される場合、「単離」という用語は、核酸またはポリペプチドを指す場合、哺乳類、特にヒト、人体に通常発生するものとは異なる精製または濃縮の状態を指す。人体において自然に発生しないするものを上回る精製または濃縮のあらゆる程度は、（１）他の自然発生的な構造または化合物からの精製、または（２）人体に通常関連しない構造または化合物に関連するものを含み、本明細書において「単離」の意味の範囲内である。本明細書に記載の核酸またはポリペプチドは、単離されてもよく、あるいは当業者に既知の様々な方法および手順に従い、通常まったく関連しない構造または化合物と関連してもよい。
【００５２】
［００５８］本明細書において使用される、「増幅する」および「増幅」という用語は、以下に詳細に記載されるように、組み換えまたは自然発生の核酸を生成または検出するためのいずれかの適した増幅方法の使用を意味する。例えば、本発明は、体外または生体内で本発明の自然発生の（例えば、ゲノムまたはｍＲＮＡ）または組み換え（例えば、ｃＤＮＡ）核酸（例えば、本発明の味覚を引き出す化合物結合配列）を（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲによる）増幅するための方法および試薬（例えば、特定のオリゴヌクレオチドプライマー対）を提供する。
【００５３】
［００５９］「発現ベクター」とは、原核細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞を含む任意の細胞において、構成的または誘導的に体外または生体内で本発明の核酸配列を発現するための任意の組み換え発現系を意味する。本用語は、線状または環状の発現系を含む。本用語は、エピソームのままであるか宿主細胞のゲノムに組み込まれている発現系を含む。発現系は、自己複製する能力を有するまたは有しない（すなわち、細胞において一過性の発現のみを駆動する）ものとすることができる。本用語は、組み換え核酸の転写に必要な最小限の要素のみを含む組み換え発現カセットを含む。
【００５４】
［００６０］「ライブラリ」とは、感覚を生成させる組み換えのライブラリ、具体的には、縮重プライマー対との核酸の増幅により生成された味覚受容体リガンド結合領域もしくは増幅されたリガンド結合領域に組み込む単離されたベクターの集まり等の異なる核酸またはポリペプチド分子の混合物、または味覚受容体をコードする少なくとも１つのベクターでそれぞれ無作為に導入された細胞の混合物である、調製物を意味する。
【００５５】
［００６１］「核酸」または「核酸配列」とは、１本鎖または２本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを意味する。この用語は、核酸類、すなわち天然のヌクレオチド類の既知の類似体を含むオリゴヌクレオチド類を包含する。また、この用語は、合成された骨格を有する核酸類似構造物も包含する。
【００５６】
［００６２］他の指示がない限り、特定の核酸配列は、その保存的に修飾された変異形（例えば縮重コドン置換体）および相補配列、ならびに明示されたその配列をも暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換体は、例えば、１つ以上の選択されたコドンの第３の位置を混合基および／またはデオキシイノシン残基で置換した配列を生成させることによって、得ることができる（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５−０８（１９８５）、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１−９８（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと交換可能に使用される。
【００５７】
［００６３］「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを意味するため、本明細書で交換可能に使用される。これらの用語は、自然発生するアミノ酸ポリマーおよび自然発生しないアミノ酸ポリマー、ならびに、１つ以上のアミノ酸残基が対応する自然発生するアミノ酸の人工的化学模倣物であるようなアミノ酸ポリマーにもあてはまる。
【００５８】
［００６４］本明細書に記載される「転移ドメイン」、「リガンド結合ドメイン」、およびキメラ受容体組成物は、典型的な配列に実質的に対応する構造および活性を有する「類似体」または「保存的変異形」および「模倣物」（「ペプチド模倣物」）をも含む。従って、「保存的変異形」または「類似体」または「模倣物」とは、変更が本明細書に特定するポリペプチドの（保存的変異形の）構造および／または活性を実質的に変えることのないよう、修飾したアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。これらは、アミノ酸配列の保存的に修飾された変異形を含み、すなわち、タンパク質活性に重要でないアミノ酸残基の置換、添加または欠失を含み、あるいは、重要なアミノ酸の置換であっても、構造および／または活性を実質的に変えることのないよう、類似の特性（例えば、酸性、塩基性、正または負の荷電、極性または非極性等）を有する残基によってアミノ酸を置換したものを含む。
【００５９】
［００６５］さらに具体的には、「保存的に修飾された変異形」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方にあてはまる。特定の核酸配列に関し、保存的に修飾された変異形は、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、または、該核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、実質的に同一の配列を意味する。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸がいずれの所定のタンパク質をコードする。
【００６０】
［００６６］例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵのすべてがアミノ酸のアラニンをコードする。従って、アラニンが１つのコドンで特定される各位置において、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変えることなく、対応する記載のコドンのいずれかに変えることができる。
【００６１】
［００６７］そのような核酸の変異形は「サイレントバリエーション」であり、それは、保存的に修飾された変異形の一種である。１つのポリペプチドをコードする本明細書に示す各核酸配列は、その核酸の可能なすべてのサイレントバリエーションも記載する。当業者には、核酸中の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は、機能的に同じ分子をもたらすよう変更することができることを理解されよう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載される各配列において、暗に意味されるものである。
【００６２】
［００６８］機能的に類似するアミノ酸を示す保存的置換体の表は、当該技術分野において周知である。例えば、保存的置換を選ぶための１つの典型的なガイドラインは以下のとおり（本来の残基の後に例示的な置換体が示される）である。ａｌａ／ｇｌｙまたはｓｅｒ；ａｒｇ／ｌｙｓ；ａｓｎ／ｇｌｎまたはｈｉｓ；ａｓｐ／ｇｌｕ；ｃｙｓ／ｓｅｒ；ｇｉｎ／ａｓｎ；ｇｌｙ／ａｓｐ；ｇｌｙ／ａｌａまたはｐｒｏ；ｈｉｓ／ａｓｎまたはｇｌｎ；ｉｌｅ／ｌｅｕまたはｖａｌ；ｌｅｕ／ｉｌｅまたはｖａｌ；ｌｙｓ／ａｒｇまたはｇｌｎまたはｇｌｕ；ｍｅｔ／ｌｅｕまたはｔｙｒまたはｉｌｅ；ｐｈｅ／ｍｅｔまたはｌｅｕまたはｔｙｒ；ｓｅｒ／ｔｈｒ；ｔｈｒ／ｓｅｒ；ｔｒｐ／ｔｙｒ；ｔｙｒ／ｔｒｐまたはｐｈｅ；ｖａｌ／ｉｌｅまたはｌｅｕ。他の例示的なガイドラインは、以下の６つのグループを使用する（それぞれは、互いに保存的置換体となるアミノ酸を含む）。１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｉ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）；Ｓｃｈｕｌｔｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９７９）も参照）。当業者には、上記に同定された置換のみが可能な保存的置換であるわけではないことを理解されよう。例えば、ある目的のため、すべての荷電アミノ酸を、正および負にかかわらず、互いに保存的置換として考えることができる。さらに、コードされた配列において単一のアミノ酸または小さな割合のアミノ酸を変更、添加または削除する個々の置換、欠失または添加もまた、「保存的に修飾された変異形」とみなすことができる。
【００６３】
［００６９］「模倣物」および「ペプチド模倣物」とは、ポリペプチド（例えば、本発明の転移ドメイン、リガンド結合領域、またはキメラの受容体）と実質的に同じ構造的、および／または機能的特性を有する合成の化合物を意味する。この模倣物は、全体が合成による非天然のアミノ酸類似体からなるものであってもよいし、あるいは、部分的に天然のペプチドアミノ酸からなり、かつ部分的に非天然のアミノ酸類似体からなるキメラの分子であってもよい。また、この模倣物は、このような置換が模倣物の構造、および／または活性を実質的に変えないものであるかぎり、天然アミノ酸の保存的置換体を任意の量で組み込むこともできる。
【００６４】
［００７０］保存的変異形である本発明のポリペプチドと同様に、慣用的な実験によって、模倣物が本発明の範囲内であるかどうか、すなわち、その構造および／または機能が実質的に変わっていないかを判定できる。ポリペプチド模倣物の組成物は、非天然の構造要素の任意の組合せを含むことができ、その構造要素は、典型的に次の３つの構造グループからのものである。ａ）天然のアミド結合（「ペプチド結合」）による連結以外の残基連結基；ｂ）自然発生するアミノ酸残基に代わる非天然の残基、または；ｃ）二次構造の模倣を生じる残基（すなわち、二次構造（例えば、ベータターン、ガンマターン、ベータシート、アルファヘリックス構造等）を誘導または安定化するため）。その残基のすべてまたはあるものが天然のペプチド結合以外の化学的手段によって連結される場合、ポリペプチドは模倣物として特徴づけることができる。個々のペプチド模倣物の残基は、ペプチド結合、他の化学結合または結合手段（例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能マレイミド類、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）もしくはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等）によって連結できる。通常のアミド結合（「ペプチド結合」）による連結の代わりとなりうる連結基には、例えば、ケトメチレン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−に対して−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２）、アミノメチレン（ＣＨ２ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ．ｄｂｄ．ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４）、チアゾール、レトロアミド、またはエステルがある（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．７，２６７−３５７，Ｍａｒｃｅｌｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，ＮＹ（１９８３）を参照）。また、ポリペプチドは、自然発生するアミノ酸残基の代わりにすべてまたは一部の非天然残基を含むことにより、模倣物として特徴づけることができ、非天然残基は、科学文献および特許文献に十分に説明されている。
【００６５】
［００７１］「標識」または「検出可能な部分」は、分光手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段によって検出可能な構成である。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、蛍光色素、電子稠密試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに通常使用されるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、もしくはハプテン類、およびタンパク質（例えば、そのペプチド中に放射性標識を組み込むことにより検出可能にすることができ、あるいは、そのペプチドに特異的に反応する抗体を検出するよう使用することができる）を含む。
【００６６】
［００７２］「標識された核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、プローブに結合された標識の存在を検出することによってプローブの存在が検出できるように、リンカーまたは化学結合を介して標識に共有結合されたもの、あるいは、イオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、または水素結合を介して非共有結合的に標識に結合されたものである。
【００６７】
［００７３］本明細書において使用される、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、１種以上の化学結合、通常、水素結合の形成を介する相補的塩基対合を介して、相補的配列を有する標的核酸に結合することができる核酸として定義される。本明細書において使用される、プローブとは、天然の塩基（すなわちＡ、Ｇ、ＣまたはＴ）または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシン等）を含むことができる。さらに、プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを阻害しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって連結されていてもよい。従って、例えば、プローブは、ホスホジエステル結合以外のペプチド結合によって構成塩基が連結されたペプチド核酸であってもよい。当業者には、プローブは、ハイブリダイゼーション条件の厳密度に応じて、該プローブ配列に対して相補性が完全ではない標的配列にも結合できることを理解されよう。プローブは、任意で、例えば、同位体、発色団、発光団、色素原等で直接的に標識されるか、あるいは、例えば、ビオチン（それに対しストレプトアビジン複合体を後に結合できる）等により、間接的に標識される。該プローブの存在または非存在について検定することにより、選択配列または部分配列の存在または非存在を検出できる。
【００６８】
［００７４］「異種（の）」とは、核酸の部分について使用される場合、該核酸が２種以上の部分配列を含み、それらの配列は自然において互いに同じ関係で存在するものではないことを意味する。例えば、該核酸は、典型的に遺伝子組み換えによって生産されたものであり、新しい機能の核酸となるよう配列された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列（例えば、ある起源からのプロモーターと、別の起源からのコード領域）を有するものである。同様に、異種のタンパク質は、該タンパク質が２種以上の部分配列を含み、それらの配列は自然において互いに同じ関係で存在するものではないことを意味する（例えば融合タンパク質）。
【００６９】
［００７５］「プロモーター」は、核酸の転写を誘導する核酸配列のアレイとして定義される。本明細書において使用される、プロモーターとは、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターであるＴＡＴＡエレメントの場合のように、転写の開始部位に近い必要な核酸配列を含む。また、プロモーターは、任意で、離れたエンハンサーまたはリプレッサー要素を含み、それらは、転写の開始部位から数千塩基対も離れて配置することができる。「構成的」プロモーターは、多くの環境条件および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導」プロモーターは、環境または発生の制御の下で活性なプロモーターである。「作動可能に連結」とは、核酸発現制御配列（例えばプロモーター、または転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列との機能的な連結を意味し、該発現制御配列は、該第２の配列に対応する核酸の転写を誘導する。
【００７０】
［００７６］本明細書において使用される、「組み換え」は、合成されたポリヌクレオチドあるいは体外で操作されたポリヌクレオチド（例えば「組み換えポリヌクレオチド」）、細胞または他の生物学的系において遺伝子産物を生産するために組み換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組み換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド（「組み換えタンパク質」）を意味する。また「組み換え手段」は、発現（例えば、本発明の転移ドメインを含む融合タンパク質および本発明のプライマーを使用して増幅した核酸配列の誘導的または構成的な発現）のため、異なる起源からの種々のコード領域またはドメインまたはプロモーター配列を有する核酸を発現カセットまたはベクターに連結することを包含する。
【００７１】
［００７７］「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」とは、その配列が複合混合物（例えば、全細胞またはライブラリのＤＮＡまたはＲＮＡ）に存在する場合、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、ある分子が特定のヌクレオチド配列のみに対して結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズすることを意味する。
【００７２】
［００７８］「厳密なハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、典型的に核酸の複合混合物において、その標的部分配列にハイブリダイズする一方、他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。厳密な条件は、配列依存性であり、種々の環境によって異なってくる。より長い配列は、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについて広範な指針を示しているものに、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）がある。一般的に、厳密な条件は、特定の配列について、所定のイオン強度ｐＨにおいて、熱融解点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が標的配列にハイブリダイズして平衡となっている温度である（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度において）（標的配列が過剰に存在するため、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡において占められる）。厳密な条件は、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオン濃度より低くなり、典型的に約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）となり、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）に対し少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドより大きいもの）に対し少なくとも約６０℃であるような条件となる。厳密な条件は、ホルムアミド等の不安定化剤を添加して得ることもできる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションでは、ポジティブなシグナルは、バックグランドの少なくとも２倍、任意でバックグランドハイブリダイゼーションの１０倍である。典型的な厳密なハイブリダイゼーション条件は、以下のものとなり得る。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃で培養、あるいは、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃で培養、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにおいて６５℃で洗浄。そのようなハイブリダイゼーションおよび洗浄のステップは、例えば、１、２、５、１０、１５、３０、６０分間またはそれ以上の間行うことができる。
【００７３】
［００７９］厳密な条件下で互いにハイブリダイズしない核酸同士でも、それらがコードするポリペプチドが実質的に関連する場合には、やはり実質的に関連している。このことは、例えば、遺伝コードに許容される最大のコドン縮重を使用して核酸の複製物を作る場合に、生じる。そのような場合、典型的に、核酸は、中位に厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。典型的な「中位に厳密なハイブリダイゼーション条件」とは、４０％ホルムアミドの緩衝液中で、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、３７℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣにおける４５℃での洗浄を含む。そのようなハイブリダイゼーションおよび洗浄のステップは、例えば、１、２、５、１０、１５、３０、６０分間またはそれ以上の間行うことができる。ポジティブなハイブリダイゼーションは、バックグランドの少なくとも２倍である。当業者には、類似するストリンジェンシーの条件を得るため、異なるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を使用することができることを容易に理解されよう。
【００７４】
［００８０］「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子からのフレームワーク領域またはそのフラグメントを含み、抗原を特異的に結合し、認識するポリペプチドを意味する。認識される免疫グロブリンの遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロン、およびミューの定常領域遺伝子と、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖（Ｌ鎖）は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖（Ｈ鎖）は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはエプシロンとして分類され、それらは、免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥをそれぞれ特定する。
【００７５】
［００８１］典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、四量体からなる。各四量体はポリペプチド鎖の２つの同じ対からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原の認識を主としてつかさどる約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。「可変軽鎖」（ＶＬ）および「可変重鎖」（ＶＨ）とは、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を意味する。
【００７６】
［００８２］「キメラの抗体」は、抗体分子であって、（ａ）定常領域またはその一部が変更、置換または交換されることにより、抗原結合部位（可変領域）が、異なるまたは変更されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域に連結されているか、あるいは、キメラの抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬剤等）に連結されている抗体分子、または（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるまたは変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、置換または交換された抗体分子である。
【００７７】
［００８３］「抗Ｔ２Ｒ」抗体は、Ｔ２Ｒの遺伝子、ｃＤＮＡ、またはそれらの部分配列によりコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである。
【００７８】
［００８４］「イムノアッセイ」とは、抗原に特異的に結合するための抗体を使用するアッセイである。イムノアッセイは、抗原を単離、標的化、および／または定量するため、特定の抗体の特異的結合特性を使用することを特徴とする。
【００７９】
［００８５］抗体に「特異的（または選択的）に結合する」または「特異的（または選択的）に免疫反応する」とは、タンパク質またはペプチドに言及する場合、タンパク質および他の生物製剤の異種集団において、該タンパク質の存在を決定づける結合反応を意味する。従って、所定のイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は、バックグランドの少なくとも２倍、特定のタンパク質に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に有意な量で実質的に結合することはない。そのような条件下での抗体への特異的結合には、特定のタンパク質に対するその特異性について選択された抗体が必要になり得る。
【００８０】
［００８６］例えば、ラット、マウスもしくはヒト等の特定の種からＴ２Ｒファミリーメンバーに生じさせられるポリクローナル抗体は、Ｔ２Ｒポリペプチドのオルソログもしくは多型変異体および対立遺伝子を除く他のタンパク質とではなく、Ｔ２Ｒポリペプチドもしくはその免疫部分と特異的に免疫反応するそれらのポリクローナル抗体のみを得るために選択され得る。本選択は、他種からのＴ２Ｒ分子または他のＴ２Ｒ分子と交差反応する抗体を減算することによって達成され得る。また、Ｔ２Ｒ  ＧＰＣＲファミリーメンバーだけでなく他のファミリーからのＧＰＣＲも認識する抗体を選択することができる。様々な免疫学的方法を、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために使用してもよい。例えば、あるタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するため、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを常用することができる（例えば、特異的な免疫反応性を測定するため使用できるイムノアッセイの方法および条件の解説について、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）を参照）。典型的に、特異的または選択的な反応は、バックグランドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍となり、より典型的には、バックグランドの１０〜１００倍より大きくなる。
【００８１】
［００８７］「に選択的に結合する」とは、上に記載されるように他のものに「選択的にハイブリダイズする」核酸の能力、または、上に記載されるようにタンパク質に「選択的（または特異的）に結合する」抗体の能力を意味する。
【００８２】
［００８８］「発現ベクター」とは、原核細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞を含む任意の細胞において、構成的または誘導的に体外または生体内で本発明の核酸配列を発現するための任意の組み換え発現系を意味する。本用語は、線状または環状の発現系を含む。本用語は、エピソームのままであるか宿主細胞のゲノムに組み込まれている発現系を含む。発現系は、自己複製する能力を有するまたは有さない（すなわち、細胞において単に一過性の発現を駆動する）ものとすることができる。本用語は、組み換え核酸の転写に必要な最小限の要素のみを含む組み換え発現カセットを含む。
【００８３】
［００８９］「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、該発現ベクターの複製または発現を支える細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞（例えば大腸菌）または真核細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、両性動物細胞、温血動物細胞または哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ−２９３等）とすることができ、例えば、培養細胞、外植体、および生体内の細胞とすることができる。
【００８４】
［００９０］上述に基づいて、本発明は、新規ハプロタイプのｈＴ２Ｒ５０の特異的活性化、および苦味化合物、すなわち、ピラジンおよび構造的関連化合物で既に同定されたヒト苦味受容体ｈＴ２Ｒ５０を調節する、好ましくは遮断する化合物を同定するためのアッセイを提供する。特に、本発明は、ｈＴ２Ｒ５０の活性化および苦味リガンドによるハプロタイプを調節する（例えば、遮断する）化合物を同定するための細胞ベースのアッセイを提供する。これらの化合物は、対象におけるｈＴ２Ｒ５０および潜在的な他のＴ２Ｒ味覚受容体と関連する苦味を調節することが予測される。これは、味覚テストで立証され得る。
【００８５】
［００９１］苦味リガンド、すなわち、特定のピラジン化合物に特異的に応答する対象のｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプおよび本来のｈＴ２Ｒ配列は、他の刊行物、ならびに本譲受人によって出願された特許出願、例えば、米国特許出願第１０／１９１，０５８号、および同第０９／８２５，８８２号（いずれも、参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に報告されるＨＥＫ２９３発現系およびカルシウム画像検査法を使用して決定された。さらに具体的には、本発明者は、カルボキシ−４４アミノ酸残基とガストデューシンのカルボキシ−４４アミノ酸残基との置換により修飾されたＧα１４Ｇタンパク質配列を含む、キメラＧタンパク質（Ｇ１６ガスト４４）と共にｈＴ２Ｒを有するＨＥＫ２９３細胞を導入し、カルシウム画像検査法によりこれらの細胞の特異的な苦味リガンドに対する応答を記録した。
【００８６】
［００９２］図４に示されるように、ｈＴ２Ｒ５０およびそのハプロタイプは共に、２−アセチルピラジンおよびエチルピラジンンに応答し、ｈＴ２Ｒ７５およびｈＴ２Ｒ６１は、同一濃度でこれらの化合物に応答しないことが認められた。従って、これらの細胞またはこれらのｈＴ２Ｒ５０受容体配列を機能的に発現する他の細胞は、これらの受容体の活性を調節する化合物、例えば、ピラジンおよび他の苦味リガンドによりこの受容体およびその新規ハプロタイプの活性化を遮断する、好ましくは、苦味リガンドによりこれらの受容体の活性化を遮断する化合物を同定するためのアッセイに使用されてもよい。
【００８７】
［００９３］ｈＴ２Ｒ５０と関連する苦味を遮断するこれらの同定された化合物は、苦味を含有する食物または医薬品の味を改善し、それによりその特性を改善するために、添加剤として使用され得る可能性がある。
【００８８】
［００９４］好ましくは、対象Ｔ２Ｒアッセイは、以下に同定されたアミノ酸配列を有するｈＴ２ＲをコードするＤＮＡを発現する被検細胞を利用する。しかしながら、この受容体ポリペプチドのフラグメント、オルソログ、変異形、もしくはキメラは、苦味受容体の機能特性を保有する、すなわち、いくつかの苦味化合物に応答し、これらのアッセイに有用であることも予測される。このような変異形の例としては、スプライス変異、単一ヌクレオチド多型、対立遺伝子多型、および組み換えもしくは化学的手段、または自然発生によって生成された変異体を含む。Ｔ２Ｒの単離および発現手段は、本発明のアッセイ、およびこれらの受容体の活性化を抑制する化合物を同定するための本発明の使用に検討されるアッセイに使用され、下に記載される。
【００８９】
［００９５］Ｔ２Ｒの単離および発現
［００９６］本発明のＴ２Ｒの単離および発現、またはそのフラグメントもしくは変異形は、本出願に開示されるＴ２Ｒ核酸配列に基づいて構成されたプローブまたはプライマーを使用する安定したクローニング法によって達成され得る。関連Ｔ２Ｒ配列はまた、本明細書に開示された配列および既知のコンピュータベースの検索技術、例えば、ＢＬＡＳＴ配列検索を使用してヒトまたは他種のゲノムデータベースから同定されてもよい。特定の実施形態において、本明細書に開示された偽遺伝子は、機能的対立遺伝子または関連遺伝子を同定するために使用され得る。
【００９０】
［００９７］発現ベクターは、その後、これらの配列の機能発現のための宿主細胞に伝染する、または導入するために使用され得る。これらの遺伝子およびベクターは、体外または生体内で生成および発現され得る。当業者は、核酸発現を変化および制御するための所望の表現型は、本発明のベクター内で遺伝子および核酸（例、プロモーター、エンハンサー等）の発現または活性を調節することにより得られ得ることは理解されよう。発現または活性を増大または低減するために記載される既知の方法のいずれも使用することができる。本発明は、科学的および特許文献に十分に記載されている当技術分野において既知の任意の方法またはプロトコルと組み合わせて実施することができる。
【００９１】
［００９８］あるいは、例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−１８（１９８２）；Ａｄａｍｓ，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５：６６１（１９８３）；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４（１９９７）；Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０（１９９５）；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７８８６−７８９６（１９９４）；Ｎａｒａｎｇ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０（１９７９）；Ｂｒｏｗｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９（１９７９）；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９（１９８１）；米国特許第４，４５８，０６６号に記載されるような既知の化学合成技法によって、これらの核酸を体外で合成することができる。次いで２本鎖ＤＮＡフラグメントを、相補鎖を合成し、適切な条件下で一緒にそれらの鎖をアニーリングさせることによって、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を添加することによって得ることができる。
【００９２】
［００９９］核酸の操作のための技法、例えば、配列における変異体の生成、サブクローニング、ラベリングプローブ、シークエンシング、ハイブリダイゼーション等は、科学的文献および特許文献に十分説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９７）、Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照。
【００９３】
［００１００］     核酸、ベクター、カプシド、ポリペプチド等は、当業者に既知の多くの一般的手段のうちのいずれかによって分析および定量化され得る。これらとしては、例えば、ＮＭＲ、分光測光法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、および超拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー等の生化学的分析方法、様々な免疫学的方法、例えば、液体もしくはゲル沈降素反応、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、他の核酸もしくは標的もしくはシグナル増幅方法、放射標識、シンチレーション計数法およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【００９４】
［００１０１］     オリゴヌクレオチドプライマーを、Ｔ２Ｒリガンド結合領域をコードする核酸を増幅するために使用してもよい。本明細書に記載された核酸はまた、増幅技法を使用してクローンまたは定量的に測定され得る。増幅方法は、当技術分野で既知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓ  ｅｄ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｉｎｎｉｓ  ｅｄ．，ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９９５））；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：５６０（１９８９）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７（１９８８）；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ，Ｇｅｎｅ，８９：１１７（１９９０））；転写増幅（Ｋｗｏｈ，ＰＮＡＳ，８６：１１７３（１９８９））；自立配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，ＰＮＡＳ，８７：１８７４（１９９０））；Ｑベータレプリカ−ゼ増幅（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５：１４７７−９１（１９９７））；自動Ｑベータレプリカ−ゼ増幅アッセイ（Ｂｕｒｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１０：２５７−７１（１９９６））；および他のＲＮＡポリメラーゼ介在技法（例えば、ＮＡＳＢＡ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）が挙げられる。また、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：３０７−１６（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ；米国特許第４，６８３，１９５  ａｎｄ  ４，６８３，２０２号；Ｓｏｏｋｎａｎａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５６３−６４（１９９５）も参照。
【００９５】
［００１０２］     一旦増幅されると、核酸（単独にまたはライブラリーとして）は、当技術分野に既知の方法に従いクローニングすることができ、必要に応じて、通常の分子生物学的方法；例えば、米国特許第５，４２６，０３９号に記載される体外増幅核酸をクローニングするための方法等を使用して様々なベクターのいずれかに、クローニングすることができる。増幅配列のクローニングを促進するために、制限酵素部位を、ＰＣＲプライマー対に「組み込む」ことができる。例えば、Ｐｓｔ  ＩおよびＢｓｐ  Ｅ１部位は、本発明の典型的なプライマー対に設計された。これらの特定の制限部位は、連結される場合、スプライスされる配列をコードする７回膜受容体「ドナー」に対して「枠内」である配列を有する（配列をコードするリガンド結合領域は、７回膜ポリペプチドの内部にある、従って、構成物が制限酵素スプライス部位のダウンストリームに翻訳されることが望ましい場合、枠外の結果は避けられるべきであるが、挿入されたリガンド結合領域が膜貫通ＶＩＩ領域の実質的にほとんどを備える場合、必要ではない場合がある）。プライマーは、「ドナー」７回膜受容体の本来の配列を保持するよう設計することができる。あるいは、プライマーは、保存的置換（例えば、疎水性残基に対する疎水性（上述）あるいは機能的に有利な置換（例えば、原形質膜挿入を阻止しないもの、ペプチダーゼによる開裂を引き起こすもの、受容体の異常な折りたたみを引き起こすもの等））であるアミノ酸残基をコードすることができる。
【００９６】
［００１０３］     プライマー対は、Ｔ２Ｒタンパク質のリガンド結合領域を選択的に増幅するように設計してもよい。それらの結合領域は、異なるリガンドに対し、変わり得る。従って、１つのリガンドに対して最小限の結合領域となり得るものは、第２の潜在的リガンドについて限定しすぎたものとなり得る。従って、異なるドメイン構造、例えば、７回膜貫通Ｔ２Ｒの膜貫通（ＴＭ）ドメインＩＩからＶＩＩ、ＩＩＩからＶＩＩ、ＩＩＩからＶＩもしくはＩＩから、ＶＩ、またはその変異形（例えば、特定のドメインの配列のみ、ドメインの順序の混合等）を有する異なるサイズの結合領域を増幅してもよい。
【００９７】
［００１０４］     多くの７回膜Ｔ２Ｒタンパク質のドメイン構造および配列は周知であるため、当業者は、縮重増幅プライマー対を設計するために、モデル配列としてドメイン側面および内部ドメイン配列を容易に選択することができる。例えば、ドメイン領域ＩＩからＶＩＩをコードする核酸配列を、プライマー対を使用してＰＣＲ増幅によって縮重することができる。膜貫通ドメインＩ（ＴＭＩ）配列を含む核酸を増幅するために、縮重プライマーを、上に記載のＴ２Ｒファミリーコンセンサス配列のアミノ酸配列をコードする核酸から設計することができる。このような縮重プライマーを、ＴＭ  Ｉ  からＴＭ  ＩＩＩ、ＴＭ  ＩからＴＭ  ＩＶ、ＴＭ  ＩからＴＭ  Ｖ、ＴＭ  ＩからＴＭ  ＶＩ  ｏｒ  ＴＭ  ＩからＴＭ  ＶＩＩ）を組み込む結合領域に生成するために使用することができる。他の縮重プライマーを、本明細書に提供される他のＴ２Ｒファミリーコンセンサス配列に基づいて設計することができる。このような縮重プライマーを、ＴＭ  ＩＩＩからＴＭ  ＩＶ、ＴＭ  ＩＩＩからＴＭ  Ｖ、ＴＭ  ＩＩＩからＴＭ  ＶＩ、またはＴＭ  ＩＩＩからＴＭ  ＶＩＩを組み込む結合領域を生成するために使用することができる。
【００９８】
［００１０５］     縮重プライマー対を設計するためのパラダイムは、当技術分野において周知である。例えば、ＣＯｎｓｅｎｓｕｓ−ＤＥｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（ＣＯＤＥＨＯＰ）ストラテジーコンピュータプログラムを、アクセスすることができ、既知の味覚受容体リガンド結合領域として一連の関連タンパク質配列から始めるハイブリッドプライマー予測について、ＢｌｏｃｋＭａｋｅｒマルチプル・シークエンス・アラインメント・サイトから直接リンクする（例えば、Ｒｏｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１６２８−１６３５（１９９８）、Ｓｉｎｇｈ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：３１８−３１９（１９９８）を参照）。
【００９９】
［００１０６］     オリゴヌクレオチドプライマー対を合成する手段は、当該技術分野において周知である。「天然の」塩基対または合成した塩基対を使用できる。例えば、人工的な核酸塩基を使用することにより、プライマー配列を操作し、増幅産物のより複雑な混合物を生成させるため、汎用性のある方法が得られる。様々なファミリーの人工的な核酸塩基は、縮重分子認識のための手段を提供するため、内部結合の回転を介して、複数の水素結合配向性を呈することができる。ＰＣＲプライマーの単一の位置にこれらの類似体を組み込むことにより、増幅産物の複雑なライブラリを生成させることができる。例えば、Ｈｏｏｐｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：４８６６−７１（１９９７）を参照。天然のＤＮＡ塩基の形態を模倣するため、非極性分子も利用できる。アデニンに対する非水素結合性型の模倣物は、チミンに対する非極性型の模倣物に対して、効率よく選択的に複製し得る（例えば、Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：９５０−９５４（１９９８）を参照）。例えば、２つの縮重塩基は、ピリミジン塩基である６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オンまたはプリン塩基であるＮ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリンとすることができる（例えば、Ｈｉｌｌ，  ＰＮＡＳ，９５：４２５８−４２６３（１９９８）を参照）。本発明の例示的な縮重プライマーは、核酸塩基類似体である５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシ−シチジン，３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−アミド亜リン酸（配列において文字「Ｐ」で示す（上記参照））を組み込む。このピリミジン類似体は、プリン類（ＡおよびＧの残基を含む）と水素結合する。
【０１００】
［００１０７］     本明細書に開示される味覚受容体と実質的に同じである多型変異体、対立遺伝子、および種間ホモログは、上に記載の核酸プローブを使用して単離できる。あるいは、Ｔ２Ｒポリペプチドならびにその多型変異体、対立遺伝子、および種間ホモログをクリーニングするため、発現ライブラリを使用することができる（それは、Ｔ２Ｒポリペプチドに対して作られた抗血清または精製抗体（Ｔ２Ｒホモログをやはり認識し、それに選択的に結合するもの）を免疫学的に用いて、発現されたホモログを検出することにより、行われる）。
【０１０１】
［００１０８］     味覚受容体のリガンド結合領域をコードする核酸は、適切な（完全または縮重）プライマー対を使用して適当な核酸配列の増幅（例えばＰＣＲ）により、生成させてもよい。増幅核酸は、任意の細胞または組織からのゲノムＤＮＡ、あるいは、味覚受容体を発現する細胞から得られるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとすることができる。
【０１０２】
［００１０９］     一実施形態において、転移配列（トランスロケーション配列）に融合されるＴ２Ｒをコードする核酸を含むハイブリッドタンパク質コード配列を構築してもよい。また、ハイブリッドのＴ２Ｒが提供され、それは、転移モチーフ（トランスロケーションモチーフ）と、化学感覚受容体（特に、味覚受容体）の他のファミリーの味覚を引き出す化合物結合領域とを含む。これらの核酸配列は、転写または翻訳の調節因子（例えば、転写および翻訳の開始配列、プロモーターおよびエンハンサー、転写および翻訳のターミネーター、ポリアデニル化配列、およびＤＮＡをＲＮＡに転写するのに有用な他の配列）に作動可能に連結することができる。組み換え発現カセット、ベクターおよび遺伝子組み換えの構成において、すべての所望の細胞または組織で所望の核酸の発現を誘導するため、プロモーターフラグメントを使用することができる。
【０１０３】
［００１１０］     別の実施形態において、融合タンパク質は、Ｃ末端またはＮ末端の転移配列を含んでもよい。さらに、融合タンパク質は、追加の要素（例えば、タンパク質検出、精製、または他の用途のための要素）を含むことができる。検出および精製を容易にするドメインには、例えば、金属キレートペプチド（例えば、ポリヒスチジン領域、ヒスチジン−トリプトファンモジュール、あるいは、固定化された金属上での精製を可能にする他のドメイン）、マルトース結合タンパク質、固定化された免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、または、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ精製系で使用されるドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）がある。
【０１０４】
［００１１１］     開裂可能なリンカー配列（例えば、第Ｘａ因子（例えばＯｔｔａｖｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８０：２８９−２９３（１９９８）を参照）、スブチリシンプロテアーゼ認識モチーフ（例えばＰｏｌｙａｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：６１５−６１９（１９９７）を参照））、エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）等）を、転移ドメイン（効率的な原形質膜発現用）と新しく翻訳されるポリペプチドの残りの部分との間に入れることは、精製の促進に有用であり得る。例えば、１つの構成物は、チオレドキシンが後に続く６つのヒスチジン残基に結合される核酸配列コードのポリペプチドと、エンテロキナーゼ開裂部位（例えばＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４：１７８７−９７（１９９５）を参照）と、Ｃ末端転移ドメインとを含むことができる。該ヒスチジン残基は検出および精製を容易にする一方、エンテロキナーゼ開裂部位は、所望のタンパク質（類）を融合タンパク質の残りの部分から精製するための手段となる。融合タンパク質をコードするベクターおよび融合タンパク質の応用に関する技術は、科学文献および特許文献に詳細に記載されている（例えば、Ｋｒｏｌｌ，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，．１２：４４１−５３（１９９３）を参照）。
【０１０５】
［００１１２］     リガンド結合領域をコードする配列を含む発現ベクター（単独の発現ベクターとして、あるいは、発現ベクターのライブラリとして）は、ゲノムに、細胞質に、あるいは、細胞の核に導入することができ、種々の通常の技法によって発現させることができ、科学文献および特許文献に詳細に記載されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）、Ｂｅｒｇｅｒ  ｓｕｐｒａ；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｅｒ．Ｐｕｒｉｆ．，６４３５：１０（１９９５）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ｔｉｊｓｓｅｎ；Ａｕｓｕｂｅｌを参照。生物学的試薬および実験装置の製造者からの製品情報も、既知の生物学的方法に関する情報を提供するものである。ベクターは、天然の起源から単離することができ、ＡＴＣＣまたはＧｅｎｅＢａｎｋライブラリのような起源から入手することができ、あるいは、合成または組み換えの方法により調製できる。
【０１０６】
［００１１３］     核酸は、細胞において安定にまたは一過的に発現される発現カセット、ベクターまたはウイルスを使用して、発現させることができる（例えば、エピソームの発現系）。形質転換された細胞および配列において選択可能な表現型をもたらすため、発現カセットおよびベクターに選択マーカーを組み込むことができる。例えば、選択マーカーは、宿主ゲノムへの統合が必要でないよう、エピソームでの維持および複製をコードすることができる。例えば、マーカーは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の選別が可能になるよう、抗生物質耐性（例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、Ｇ４１８、ブラストサイジン、ハイグロマイシン）、あるいは、除草剤耐性（例えば、クロロスルフロン、またはバスタ（Ｂａｓｔａ））をコードしてもよい（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ，Ｇｅｎｅ，１９０：３１５−１７（１９９７）、Ａｕｂｒｅｃｈｔ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８１：９９２−９７（１９９７）を参照）。ネオマイシンまたはハイグロマイシン等の基質に対する耐性を付与する選択可能なマーカーの遺伝子は、組織培養においてのみ利用できるため、さらに、化学耐性遺伝子を、体外および生体内での選択可能なマーカーとして使用される。
【０１０７】
［００１１４］     キメラの核酸配列は、任意の７回膜貫通型ポリペプチド内におけるＴ２Ｒリガンド結合領域をコードしてもよい。７回膜貫通型受容体ポリペプチド類は、類似する一次配列ならびに二次構造および三次構造を有するため、構造的ドメイン（例えば、細胞外ドメイン、ＴＭドメイン、細胞質ドメイン等）は、配列解析によって容易に同定できる。例えば、ホモロジーモデリング、フーリエ解析、およびらせん周期の検出によって、７回膜貫通型受容体配列を有する７つのドメインを同定し、特徴づけることができる。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）のアルゴリズムを使用して、分析配列の疎水性および変動性のプロファイルを特徴づける支配的な周期を評価することができる。周期性検出の強化およびアルファらせん周期の指標もまた、例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２：５５−７０（１９９３）により行うことができる。他のアラインメントおよびモデル化のアルゴリズムも当該技術分野において周知である（例えば、Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ，４：１６１−６４（１９９６）、Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｄ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−３２（１９８２）、およびＣｒｏｎｅｔ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，６：５９−６４（１９９３）を参照）。
【０１０８】
［００１１５］     また、本発明は、特定の核酸配列およびアミノ酸配列を有する核酸分子およびポリペプチドのみならず、そのフラグメント、特に、例えば４０、６０、８０、１００、１５０、２００、もしくは２５０のヌクレオチドまたはそれ以上のフラグメント、さらには、例えば１０、２０、３０、５０、７０、１００、もしくは１５０のアミノ酸またはそれ以上のポリペプチドフラグメントも含む。任意で、該核酸のフラグメントは、Ｔ２Ｒファミリーのメンバーに対して生じる抗体に結合できる抗原性ポリペプチドをコードすることができる。さらに、本発明のタンパク質フラグメントは、任意に、Ｔ２Ｒファミリーのメンバーに対して生じる抗体に結合できる抗原性フラグメントとすることができる。
【０１０９】
［００１１６］     また、キメラタンパク質も想定され、別のＧＰＣＲ（好ましくは７回膜貫通型スーパーファミリーのメンバー）の全体または一部に相当する付加的なアミノ酸に結合する、本明細書に記載のＴ２Ｒポリペプチドのうちの少なくとも１つの少なくとも１０、２０、３０、５０、７０、１００、もしくは１５０のアミノ酸またはそれ以上を含む。これらのキメラは、本受容体と別のＧＰＣＲとから作ることができ、あるいは、本受容体類の２つ以上を組み合わせることにより作ることができる。一実施形態において、該キメラの一部分は、本発明のＴ２Ｒポリペプチドの膜貫通ドメインに相当するものまたはそれに由来するものである。別の実施形態において、該キメラの一部分は、本明細書に記載のＴ２Ｒポリペプチドの１つ以上の膜貫通領域に相当するものまたはそれらに由来するものであり、残りの部分は、もう１つのＧＰＣＲに由来するものとすることができる。キメラの受容体は当該技術分野において周知であり、また、それらを調製する技法およびそこでの組み込みのためのＧタンパク質共役受容体のドメインまたはフラグメントの選択および範囲も周知である。従って、そのようなキメラの受容体を作るため、当業者のこの知識を容易に使用することができる。そのようなキメラ受容体の使用は、例えば、本明細書に具体的に開示される受容体の１つの味選択性の特性と、もう１つの受容体（例えば、従来のアッセイ系に使用される周知の受容体）のシグナル伝達特性とが組み合わされる。
【０１１０】
［００１１７］     例えば、リガンド結合領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、またはそれらの任意の組合せ等の領域は、異種タンパク質に共有結合することができる。例えば、Ｔ２Ｒの膜貫通ドメインを、異種ＧＰＣＲ膜貫通ドメインに結合することができ、あるいは、異種ＧＰＣＲ細胞外ドメインを、Ｔ２Ｒの膜貫通領域に結合することができる。選択の他の異種タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質、ｂｅｔａ−ｇａｌ（ベータガラクトシダーゼ）、グルタミン酸受容体、およびロドプシンＮ末端を用いることができる。
【０１１１】
［００１１８］     また、本発明のＴ２Ｒ、フラグメント、または変異形を発現するための宿主細胞も本発明の範囲内である。クローニングした遺伝子または核酸（例えば、本発明のＴ２Ｒ、フラグメント、または変異形をコードするｃＤＮＡ）の高レベルな発現を得るため、当業者は、典型的に、着目核酸配列を発現ベクターにサブクローニングする（該発現ベクターは、転写を誘導するための強いプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、タンパク質をコードする核酸の場合、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む）。適当な細菌のプロモーターは、当該技術分野において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されている。しかしながら、細菌または真核細胞の発現系を使用することができる。
【０１１２】
［００１１９］     外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための既知の手順の任意のものを使用してもよい。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター、および、クローニングしたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の外来遺伝材料を宿主細胞に導入するための他の既知の任意の方法の使用を含む（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。単に必要なことは、使用する特定の遺伝子工学法が、着目Ｔ２Ｒ、フラグメント、または変異形を発現できる宿主細胞に少なくとも１つの核酸分子をうまく導入することができるということである。
【０１１３】
［００１２０］     発現ベクターを細胞に導入した後、トランスフェクトされた細胞を、着目受容体、フラグメント、または変異形の発現に有利な条件下で培養し、次いで、標準的な手法を用いて培養物から回収する。そのような技法の具体例は、当該技術分野において周知である。例えば、ＷＯ００／０６５９３（本開示に一致するように、参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
本発明によるＴ２Ｒハプロタイプの活性を調節する化合物の検出のためのアッセイ
［００１２１］     検査化合物が、生体外および生体内の両方において、本発明のＴ２Ｒハプロタイプポリペプチドと特異的に結合するかどうかを判定するための方法および組成物を後述する。細胞生理機能の側面の多くは、自然発生またはキメラのＴ２Ｒとのリガンド結合の効果を評価するために監視することができる。これらのアッセイは、Ｔ２Ｒポリペプチドを発現する無傷細胞上、透過性細胞上、または標準的な方法によって生成された膜画分上で行うことができる。
【０１１４】
［００１２２］     味覚受容体は、味覚を引き出す化合物に結合し、電気シグナルへの化学的刺激の伝達を開始する。活性化または抑制されたＧタンパク質は、標的酵素、チャネル、および他のエフェクタタンパク質の特性を順に変化させる。一部の実施例は、視覚系内のトランスデューシンによるｃＧＭＰホスホジエステラーゼの活性化、刺激性Ｇタンパク質によるアデニル酸シクラーゼ、Ｇｑおよび他の同族Ｇタンパク質によるホスホリパーゼＣ、ならびにＧｉおよび他のＧタンパク質による多様なチャネルの調節である。下流事象もまた、ホスホリパーゼＣによるジアシルグリセロールおよびＩＰ３の産生、および順に、ＩＰ３によるカルシウム動員に対して試験することができる。
【０１１５】
［００１２３］     アッセイのｈＴ２Ｒ５０タンパク質またはポリペプチドは、典型的に、配列番号：３に含有される配列を有するポリペプチドまたはフラグメントもしくはその保存的に修飾された変異形から選択される。
【０１１６】
［００１２４］     あるいは、アッセイのＴ２Ｒタンパク質またはポリペプチドは、真核宿主細胞に由来することができ、配列番号：３とのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列またはその保存的に修飾された変異形を含むことができる。概して、アミノ酸配列同一性は、少なくとも３０％、好ましくは３０〜４０％、具体的には５０〜６０、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。任意で、アッセイのＴ２Ｒタンパク質またはポリペプチドは、細胞外ドメイン、膜貫通領域、細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン等のＴ２Ｒポリペプチドの領域を含むことができる。任意で、Ｔ２Ｒポリペプチド、またはその一部は、本明細書に記述したアッセイで使用されるキメラタンパク質を生成するために、共有結合的に異種タンパク質に連結することができる。
【０１１７】
［００１２５］     Ｔ２Ｒ活性のモジュレータは、組換えまたは自然発生のいずれか一方の上記のようなＴ２Ｒタンパク質またはポリペプチドを使用して検査されてもよい。Ｔ２Ｒタンパク質またはポリペプチドは、単離、細胞に発現、細胞に由来する膜に発現、組織または動物に発現されることができ、組換えまたは自然発生のいずれか一方であることができる。例えば、舌切片、舌からの解離細胞、形質転換された細胞、または膜を使用することができる。調節は、本明細書に記述される生体外または生体内アッセイのうちの一方を使用して検査することができる。
モジュレータの検出
［００１２６］     ［０１１９］検査化合物が、生体外および生体内の両方において、本発明のｈＴ２Ｒ５０受容体と特異的に結合するかどうかを判定するための方法および組成物を後述する。細胞生理機能の側面の多くは、本発明のＴ２Ｒポリペプチドとのリガンド結合の効果を評価するために監視することができる。これらのアッセイは、化学感覚受容体を発現する無傷細胞上、透過性細胞上、または標準的な方法によって、もしくは生体外で、デノボ合成タンパク質を使用して生成された膜画分上で行うことができる。
【０１１８】
［００１２７］     生体内で、味覚受容体は、味覚調節化合物に結合し、電気シグナルへの化学的刺激の伝達を開始する。活性化または抑制されたＧタンパク質は、標的酵素、チャネル、および他のエフェクタタンパク質の特性を順に変化させる。一部の実施例は、視覚系のトランスデューシンによるｃＧＭＰホスホジエステラーゼの活性化、刺激性Ｇタンパク質によるアデニル酸シクラーゼ、Ｇｑおよび他の同族Ｇタンパク質によるホスホリパーゼＣ、ならびにＧｉおよび他のＧタンパク質による多様なチャネルの調節である。下流事象もまた、ホスホリパーゼＣによるジアシルグリセロールおよびＩＰ３の産生、および順に、ＩＰ３によるカルシウム動員に対して試験されることができる。
【０１１９】
［００１２８］     あるいは、アッセイのＴ２Ｒタンパク質またはポリペプチドは、真核宿主細胞に由来することができ、本明細書に開示したＴ２Ｒポリペプチドとのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは保存的に修飾された変異形を含むことができる。概して、アミノ酸配列同一性は、少なくとも３５から５０％、または任意で７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。任意で、アッセイのＴ２Ｒタンパク質またはポリペプチドは、細胞外ドメイン、膜貫通領域、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン等のＴ２Ｒタンパク質のドメインを含むことができる。さらに、上記のように、Ｔ２Ｒタンパク質またはそのドメインは、本明細書に記述したアッセイで使用されるキメラタンパク質を生成するために、共有結合的に異種タンパク質に連結することができる。
【０１２０】
［００１２９］     Ｔ２Ｒ受容体活性のモジュレータは、組換えまたは自然発生のいずれか一方の上記のようなＴ２Ｒタンパク質またはポリペプチドを使用して検査される。Ｔ２Ｒタンパク質またはポリペプチドは、単離、細胞に発現、細胞に由来する膜に発現、組織または動物に発現されることができ、組換えまたは自然発生のいずれか一方であることができる。例えば、舌切片、舌からの解離細胞、形質転換された細胞、膜を使用することができる。調節は、本明細書に記述される生体外または生体内アッセイのうちの一方を使用して検査されることができる。
【０１２１】
［００１３０］     １．生体外結合アッセイ
［００１３１］     味覚伝達は、本発明のＴ２Ｒポリペプチドを使用して、溶解または固体状態反応において生体外で検査することもできる。特定の実施形態において、Ｔ２Ｒリガンド結合ドメインは、リガンド結合をアッセイするために、溶解または固体状態反応において生体外で使用することができる。
【０１２２】
［００１３２］     リガンド結合ドメインは、膜貫通ドメインの細胞外ループ等の細胞外ドメインの付加的な部分とともに、Ｎ末端ドメインによって形成され得ることが可能である。
【０１２３】
［００１３３］     生体外結合アッセイは、代謝型グルタミン酸受容体等の他のＧＰＣＲとともに使用されていた（例えば、Ｈａｎ  ａｎｄ  Ｈａｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１０００８−１００１３（１９９９）を参照）。これらのアッセイは、放射活性または蛍光標識したリガンドを置換すること、内部蛍光の変化またはタンパク質分解感受性の変化を測定すること等を伴う可能性がある。
【０１２４】
［００１３４］     本発明によるＴ２Ｒポリペプチドへのリガンド結合は、溶液中、任意で固相に付着される２重膜中、脂質単分子層中、または小胞中で検査することができる。モジュレータの結合は、例えば、分光学的特性（例えば、蛍光、吸収度、屈折率）水力学的（例えば、形状）、クロマトグラフ的、または溶解特性の変化を使用して検査することができる。
【０１２５】
［００１３５］     本発明の好適な実施形態において、［３５Ｓ］ＧＴＰgＳ結合アッセイを使用する。上記のように、ＧＰＣＲの活性化後、Ｇタンパク質複合体のＧaサブユニットは、結合したＧＤＰをＧＴＰと交換するように刺激される。Ｇタンパク質交換活性のリガンド媒介の刺激は、推定リガンドの存在下で、Ｇタンパク質に追加された放射活性標識した［３５Ｓ］ＧＴＰgＳの結合を測定する生化学アッセイにおいて測定することができる。典型的に、着目化学感覚受容体を含有する膜は、Ｇタンパク質と混合される。潜在的な抑制剤および／または活性化因子ならびに［３５Ｓ］ＧＴＰgＳがアッセイに追加され、Ｇタンパク質との［３５Ｓ］ＧＴＰgＳの結合が測定される。結合は、液体シンチレーション計数によって、またはシンチレーション近接アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ：ＳＰＡ）を含む当技術分野において既知の任意の他の手段によって測定することができる。他のアッセイ形式において、蛍光標識したＧＴＰgＳを利用することができる。
【０１２６】
［００１３６］     ２．蛍光偏光アッセイ
［００１３７］     別の実施形態において、蛍光偏光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：「ＦＰ」）ベースのアッセイは、リガンド結合を検出および監視するために使用してもよい。蛍光偏光は、平衡結合、核酸ハイブリダイゼーション、および酵素活性を測定するための万能な検査技術である。蛍光偏光アッセイは、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、沈殿、または電気泳動等の分離ステップを必要としない点で同種的である。これらのアッセイは、直接溶液中でリアルタイムに行われ、固定化段階を必要としない。偏光値は繰り返し測定することができ、試薬の添加後、偏向の測定は急速に行われるため、試料を破壊しない。概して、この技術は、低いピコモルからマイクロモルレベルへのフルオロフォアの偏光値を測定するために使用することができる。この項では、蛍光偏光を試料中でどのように使用するか、および本発明のＴ２Ｒポリペプチドとのリガンドを測定する定量的方法に関して説明する。
【０１２７】
［００１３８］     蛍光標識した分子が平面偏光で励起される時、それは、その分子旋光度に反比例する偏向度を有する光を放射する。蛍光標識した大分子は、励起された状態（フルオレセインの場合には４ナノ秒）の間比較的定常のままであり、光の偏向は、励起と放射との間で比較的一定のままである。蛍光標識した小分子は、励起された状態の間急速に回転し、偏光は、励起と放射との間で著しく変化する。したがって、小分子は、低偏光値を有し、大分子は、高偏光値を有する。例えば、１本鎖フルオレセイン標識したオリゴヌクレオチドは、比較的低い偏光値を有するが、相補鎖とハイブリダイズされた時には、より高い偏光値を有する。本発明の化学感覚受容体を活性化または抑制し得る味覚を引き出す化合物結合を検出および監視するためにＦＰを使用する場合、蛍光標識した味覚を引き出す化合物または自動蛍光の味覚を引き出す化合物が使用されてもよい。
【０１２８】
［００１３９］     蛍光偏光（Ｐ）は、１Ｐ＝Ｉｎｔ−Ｉｎｔ  Ｉｎｔ＋Ｉｎｔと定義する。
【０１２９】
［００１４０］     ［０１３３］．ＰＩ．が励起光面と平行な放射光の強度であり、Ｉｎｔ  ｐｅｒｐ．が励起光面と垂直な放射光の強度である場合、光度の比率であるＰは、無次元数である。例えば、Ｂｅａｃｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅａｃｏｎ２０００システムが、これらのアッセイに関連して使用されてもよい。そのようなシステムは、典型的に、ミリ偏光単位（１偏光単位＝１０００ｍＰ単位）。
【０１３０】
［００１４１］     分子旋光度およびサイズ間の関係は、Ｐｅｒｒｉｎ方程式により説明され、読者は、この方程式を詳細に説明するＪｏｌｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．（１９９１）ｉｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２３６−２４０を参照する。概要で、Ｐｅｒｒｉｎ方程式は、偏光が、約６８．５．度の角度で分子が回転するのにかかる時間である回転緩和時間に正比例すると述べている。回転緩和時間は、方程式：２回転緩和時間＝３ＶＲＴによる、粘性（ｅｔａ）、絶対温度（Ｔ）、分子容（Ｖ）、および気体定数（Ｒ）に関連している。
【０１３１】
［００１４２］     回転緩和時間は、小分子（例えば、フルオレセイン）に対しては小さく（．ａｐｐｒｘｅｑ．１ナノ秒）、大分子（例えば、免疫グロブリン）に対しては大きい（．ａｐｐｒｘｅｑ．１００ナノ秒）。粘性および温度が一定に保たれるならば、回転緩和時間、しがたって偏光は、分子容に直接関連する。分子容の変化は、他の分子、解離、重合、分解、ハイブリダイゼーション、または蛍光標識した分子の立体構造変化との相互作用に起因し得る。例えば、蛍光偏光は、プロテアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、およびリボヌクレアーゼによる多数のフルオレセイン標識ポリマーの酵素的切断を測定するために使用されてきた。また、タンパク質／タンパク質相互作用、抗体／抗原結合、およびタンパク質／ＤＮＡ結合に対する平衡結合を測定するためにも使用されてきた。
【０１３２】
［００１４３］     Ａ．固体状態および可溶性ハイスループットアッセイ
［００１４４］     さらに別の実施形態において、本発明は、Ｔ２Ｒポリペプチド、またはＴ２Ｒポリペプチドを発現する細胞もしくは組織を使用した可溶性アッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、ハイスループット形式における固相ベースの生体外アッセイを提供し、Ｔ２Ｒポリペプチド、またはＴ２Ｒポリペプチドを発現する細胞もしくは組織は、固相基質もしくは味覚刺激化合物に付着され、Ｔ２Ｒ受容体と接触され、結合は、適切なタグまたはＴ２Ｒ受容体に対して産生された抗体を使用して検出される。
【０１３３】
［００１４５］     本発明のハイスループットアッセイにおいて、最大数千の異なるモジュレータまたはリガンドを１日でスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択された潜在的なモジュレータに対して別々のアッセイを行うために使用することができ、または濃度もしくはインキュベーション時間効果が観察されたならば、５〜１０ウェルごとに１つのモジュレータを検査することができる。したがって、単一の標準的マイクロタイタープレートは、約１００（例えば、９６）モジュレータをアッセイすることができる。１５３６ウェルプレートを使用する場合は、単一のプレートは、約１０００から約１５００の異なる化合物を容易にアッセイすることができる。各プレートウェルにおいて多数の化合物をアッセイすることもまた可能である。１日当たりいくつかの異なるプレートをアッセイすることが可能であり、アッセイは、最大約６，０００〜２０，０００の異なる化合物に対するアッセイスクリーニングは、本発明の統合システムを使用して可能である。最近になり、試薬操作へのマイクロ流体アプローチが発達してきている。
【０１３４】
［００１４６］     着目分子は、共有結合性または非共有結合性連結、例えばタグを介して、直接または間接的に固体状態の構成要素に結合することができる。タグは、任意の種々の構成要素であることができる。概して、タグ（タグ結合剤）に結合する分子は、固体支持に固定され、着目タグ分子（例えば、着目味覚伝達分子）は、タグの相互作用およびタグ結合剤によって固体支持に付着される。
【０１３５】
［００１４７］     多くのタグおよびタグ結合剤は、文献で広く説明される既知の分子間相互作用に基づいて使用することができる。例えば、タグが、天然結合剤、例えば、ビオチン、タンパク質Ａ、またはタンパク質Ｇを有する場合、適切なタグ結合剤（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、免疫グロブリンのＦｃ領域等）と併用して使用することができる。また、ビオチン等の天然結合剤を有する分子に対する抗体および適切なタグ結合剤は広く利用可能である（ＳＩＧＭＡ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １９９８  ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ．を参照）。
【０１３６】
［００１４８］     同様に、任意のハプテン性または抗原性化合物は、タグ／タグ結合剤対を形成するために、適切な抗体との組み合わせで使用することができる。何千の特異的な抗体が市販されており、付加的な抗体の多くが文献で説明されている。例えば、１つの一般的な構成において、タグは、第１の抗体であり、タグ結合剤は、第１の抗体を認識する第２の抗体である。抗体−抗原相互作用に加えて、受容体−リガンド相互作用もまた、タグおよびタグ−結合剤対として適切である。例えば、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、トランスフェリン、ｃ−ｋｉｔ、ウイルス性受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体および抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー等の細胞受容体−リガンド相互作用。例えば、Ｐｉｇｏｔｔ＆Ｐｏｗｅｒ，Ｔｈｅ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ  Ｉ（１９９３）を参照）。同様に、毒素および毒液、ウイルス性エピトープ、ホルモン（例えば、オピエート、ステロイド等）、細胞内受容体（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンＤ、ペプチドを含む種々の小リガンドの効果を媒介する）、薬物、レクチン、糖、核酸（線状および環状ポリマー構成の両方）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質ならびに抗体は全て、種々の細胞受容体と相互作用することができる。
【０１３７】
［００１４９］     ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリレンサルファイド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテート等の合成ポリマーもまた、適切なタグまたはタグ結合剤を形成することができる。また、多くの他のタグ／タグ結合剤対は、本開示の検討により当業者に明らかとなるため、本明細書に記述したアッセイシステムにおいて有用である。
【０１３８】
［００１５０］     また、ペプチド、ポリエーテル等の一般的なリンカーは、タグとして機能することができ、約５から約２００アミノ酸のポリグリシン配列等のポリペプチド配列を含むことができる。そのような柔軟なリンカーは、当業者には既知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａから入手可能である。これらのリンカーは、任意でアミド連結、スルフヒドリル連結、または異種機能的連結を有する。
【０１３９】
［００１５１］     タグ結合剤は、現在利用可能な任意の種々の方法を使用して、固体基質に固定される。固体基質は、タグ結合剤の一部と反応する表面に化学基を固定する化学試薬に、基質の全てまたは一部を曝露することによって、一般的に誘導体化または機能化される。例えば、より長い鎖部分への付着に好適な基は、アミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基を含むであろう。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランは、ガラス表面等の種々の表面を機能化するために使用することができる。そのような固相バイオポリマー配列の構成は、文献で広く説明される。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）（例えば、ペプチドの固相合成について記述）；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）（ピン上の固相構成要素の合成について記述）；Ｆｒａｎｋ＆Ｄｏｒｉｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４４：６０３１６０４０（１９８８）（セルロースディスク上の種々のペプチド配列の合成について記述）；  Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７（１９９１）；  Ｓｈｅｌｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９（４）：７１８−７１９（１９９３）；およびＫｏｚａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２（７）：７５３７５９（１９９６）（全て、固体基質に固定されたバイオポリマーの配列について記述）を参照。タグ結合剤を基質に固定するための非化学的アプローチは、熱、紫外線放射による架橋結合等の他の一般的な方法を含む。
【０１４０】
［００１５２］     ３．細胞ベースのアッセイ
［００１５３］     好適な一実施形態において、Ｔ２Ｒタンパク質は、修飾されない形態において、またはキメラ、変異型もしくは、その成熟および分泌経路を介する標的化を促進する異種のシャペロン配列を有する、もしくは好ましくは有さない切断受容体として真核細胞内に発現される。そのようなＴ２Ｒポリペプチドは、ＨＥＫ−２９３細胞等の任意の真核細胞内に発現することができる。好ましくは、細胞は、機能的Ｇタンパク質、例えば、キメラ受容体を細胞内シグナル伝達経路と、またはホスホリパーＣ等のシグナル伝達タンパク質と共役することができるＧ．a１５を含む。そのような細胞におけるＴ２Ｒ受容体の活性化は、細胞内のＦＵＲＡ−２依存性蛍光を検出することによって、細胞内カルシウムの変化を検出すること等による任意の標準的な方法を使用して検出することができる。そのようなアッセイは、本用途に提示される実験的発見の根拠である。
【０１４１】
［００１５４］     活性化されたＧＰＣＲ受容体は、受容体Ｃ末端尾部（および可能性として他の部位も）をリン酸化するキナーゼのための基質であることが多い。したがって、活性化因子は、放射標識したＡＴＰから受容体への３２Ｐの移動を促進し、これはシンチレーションカウンターでアッセイすることができる。Ｃ末端尾部のリン酸化は、アレスチン様のタンパク質の結合を促進し、Ｇタンパク質の結合を妨げる。ＧＰＣＲシグナル伝達およびシグナル伝達をアッセイする方法の一般的検討に関しては、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｓ．２３７  ａｎｄ  ２３８（１９９４）ａｎｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ９６（１９８３）；Ｂｏｕｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１０：３４９：１１７−２７（１９９１）；Ｂｏｕｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：１２５−３２（１９９０）；Ｐｉｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：６５３−９２（１９９８）を参照。
【０１４２】
［００１５５］     Ｔ２Ｒ調節は、推定Ｔ２Ｒモジュレータで処置されたＴ２Ｒポリペプチドの応答を、未処置対照試料または既知の「陽性」対照を含有する試料と比較することによってアッセイされてもよい。そのような推定Ｔ２Ｒモジュレータは、Ｔ２Ｒポリペプチド活性を抑制または活性する分子を含むことができる。一実施形態において、Ｔ２Ｒを活性化する化合物で処置された対照試料に、１００の相対Ｔ２Ｒ活性値を指定した。Ｔ２Ｒポリペプチドの抑制は、対照試料と比べたＴ２Ｒ活性値が、約９０％、任意で５０％、任意で２５〜０％である時に達成される。Ｔ２Ｒポリペプチドの活性化は、対照と比べたＴ２Ｒ活性値が、１１０％、任意で１５０％、２００〜５００％、または１０００〜２０００％である時に達成される。
【０１４３】
［００１５６］     イオン流出の変化は、Ｔ２Ｒポリペプチドを発現する細胞または膜のイオン偏光（つまり、電位）の変化を判定することによって、評価されてもよい。細胞偏光の変化を判定するための一手段は、電圧クランプおよびパッチクランプ技術で電流の変化を測定すること（それによって、偏光の変化を測定すること）によるものである（例えば、「細胞付着」モード、「インサイドアウト」モード、および「全細胞」モード、例えば、Ａｃｋｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ  Ｍｅｄ．，３３６：１５７５−１５９５（１９９７）を参照）。全細胞電流は、標準物質を使用して便利に判定される。他の既知のアッセイは、電圧感受性色素を使用する放射標識されたイオン流出アッセイおよび蛍光アッセイを含む（例えば、Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．，８８：６７−７５（１９８８）；Ｇｏｎｚａｌｅｓ＆Ｔｓｉｅｎ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：２６９−２７７（１９９７）；Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２５：１８５−１９３（１９９１）；Ｈｏｌｅｖｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３７：５９−７０（１９９４）を参照）。
［００１５７］ポリペプチドの機能への検査化合物の効果は、上記のパラメータのいずれかを検討することによって測定することができる。ＧＰＣＲ活性に影響を及ぼす任意の好適な生理学的変化は、本発明のポリペプチドへの検査化合物の影響を評価するために使用することができる。機能的事象が無傷細胞または動物を使用して判定される場合、伝達物質放出、ホルモン放出、既知および未同定の遺伝子マーカーの両方に対する転写変化（例えば、ノーザンブロット）、細胞増殖またはｐＨ変化等の細胞代謝の変化、およびＣａ．ｓｕｐ．２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、またはｃＡＭＰ等の細胞内２次メッセンジャーの変化等の種々の効果を測定することもできる。
【０１４４】
［００１５８］     ＧＰＣＲのための好適なアッセイは、受容体活性を報告するために、イオンまたは電圧感受性色素を負荷された細胞を含む。また、そのような受容体の活性を判定するためのアッセイは、検査された化合物の活性を評価するために、対照としての他のＧタンパク質共役受容体のための既知のアゴニストおよびアンタゴニストを使用することもできる。調節化合物（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト）を同定するためのアッセイにおいて、細胞質または膜電圧におけるイオンレベルの変化は、イオン感受性または膜電圧蛍光指標をそれぞれ使用して監視される。イオン感受性の指標および電圧プローブのうちで、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  １９９７Ｃａｔａｌｏｇに開示されるものを用いることができる。Ｇタンパク質共役受容体のために、Ｇa１５およびＧa１６等の乱交雑Ｇタンパク質を選択アッセイにおいて使用することができる（Ｗｉｌｋｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：１００４９−１００５３（１９９１））。
【０１４５】
［００１５９］     受容体活性化は、その後の細胞内現象、例えば、２次メッセンジャーの増加を開始する。一部のＧタンパク質共役受容体の活性化は、ホスファチジルイノシトールのホスホリパーゼＣ媒介の加水分解を介して、イノシトール３リン酸（ＩＰ３）の形成を刺激する（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ＆Ｉｒｖｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３１５−２１（１９８４））。同様に、ＩＰ３は、細胞内カルシウムイオン貯蔵の放出を刺激する。したがって、細胞質カルシウムイオンレベルの変化、またはＩＰ３等の２次メッセンジャーレベルの変化は、Ｇタンパク質共役受容体機能を評価するために使用することができる。そのようなＧタンパク質共役受容体を発現する細胞は、細胞内貯蔵からのカルシウム放出および原形質膜イオンチャネルを経由する細胞外カルシウム流入の両方からの寄与の結果として、細胞質カルシウムレベルの増加を示し得る。
【０１４６】
［００１６０］     好適な実施形態において、Ｔ２Ｒポリペプチド活性は、受容体をホスホリパーゼＣシグナル伝達経路に連結させる乱交雑Ｇタンパク質を有する異種細胞において、Ｔ２Ｒ遺伝子を発現することによって測定される（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１５１７５−１５１８０（１９９５）を参照）。任意で、細胞株はＨＥＫ−２９３（通常、Ｔ２Ｒ遺伝子を発現しない）であり、乱交雑Ｇタンパク質は、Ｇa１５（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ、上記参照）である。味覚伝達の調節は、Ｔ２Ｒポリペプチドと関連する分子の投与を介したＴ２Ｒシグナル伝達経路の調節に対する応答の変化である、細胞内Ｃａ２＋レベルの変化を測定することによってアッセイされる。Ｃａ２＋レベルの変化は、任意で、蛍光Ｃａ２＋指標色素および蛍光定量イメージングを使用して測定される。
【０１４７】
［００１６１］     別の実施形態において、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ：ＰＩ）加水分解は、参照することにより本願明細書に組み込まれる米国特許第５，４３６，１２８号に従って分析することができる。簡潔に、アッセイは、４８時間以上３Ｈ−ミオイノシトールで細胞を標識することを含む。標識された細胞は、１時間検査化合物で処置する。処置された細胞を溶解し、クロロホルム−メタノール水において抽出し、その後、イノシトールリン酸を、イオン交換クロマトグラフィーで分離し、シンチレーション測定で数量化した。刺激比は、アゴニストの存在下のｃｐｍと緩衝液対照の存在下のｃｐｍとの比率を計算することによって決定する。同様に、抑制比は、アンタゴニスト存在下のｃｐｍと緩衝液対照（アゴニストを含有してもよく、またはしなくてもよい）の存在下のｃｐｍとの比率を計算することによって決定する。
【０１４８】
［００１６２］     他の受容体アッセイは、細胞内環状ヌクレオチド、例えば、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰのレベルを決定することを含んでもよい。受容体の活性化が環状ヌクレオチドレベルの減少に繋がる場合では、アッセイにおいて受容体活性化化合物を細胞に加える前に、細胞内環状ヌクレオチドレベル、例えば、フォルスコリンを増加させる薬剤に細胞を曝露することが好適であり得る。一実施形態において、細胞内ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの変化は、免疫測定法を使用して測定することができる。Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１５１７５−１５１８０（１９９５）に記載される方法は、ｃＡＭＰのレベルを決定するために使用されてもよい。また、Ｆｅｌｌｅｙ−Ｂｏｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：１５９−１６４（１９９４）に記載される方法は、ｃＧＭＰのレベルを決定するために使用されてもよい。さらに、ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰを測定するためのアッセイキットは、米国特許第４，１１５，５３８号に記載され、参照することにより本願明細書に組み込まれる。
【０１４９】
［００１６３］     別の実施形態において、転写レベルは、シグナル伝達への検査化合物の効果を評価するために測定することができる。着目Ｔ２Ｒポリペプチドを含有する宿主細胞を、任意の相互作用をもたらすのに十分な時間の間検査化合物と接触させ、次いで、遺伝子発現のレベルを測定する。そのような相互作用をもたらす時間は、時間的経過を稼動し、時間の関数としての転写レベルを測定すること等によって、経験的に判定されてもよい。転写量は、好適であるとして等業者には既知の任意の方法を使用して測定されてもよい。例えば、着目タンパク質のｍＲＮＡ発現は、ノーザンブロットを使用して検出されてもよく、またはそれらのポリペプチド産物は、免疫測定法を使用して同定されてもよい。あるいは、レポーター遺伝子を使用する転写ベースのアッセイは、参照することにより本願明細書に組み込まれる、米国特許第５，４３６，１２８号に記載されるように使用されてもよい。レポーター遺伝子は、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼβラクタマーゼおよびアルカリホスファターゼであることができる。さらに、着目タンパク質は、緑色蛍光タンパク質等の第２のレポーターへの付着を介する間接的レポーターとして使用することができる（例えば、Ｍｉｓｔｉｌｉ＆Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：９６１−９６４（１９９７）を参照）。
【０１５０】
［００１６４］     転写量は、次いで、検査化合物の非存在下における一方の同じ細胞内の転写量と比較されるか、あるいは着目Ｔ２Ｒポリペプチドを欠く実質的に同一の細胞内の転写量と比較されてもよい。実質的に同一の細胞は、組換え細胞が調製されたが、異種ＤＮＡの導入によって修飾されなかった同じ細胞に由来してもよい。転写量における任意の差異は、検査化合物が、着目ｈＴ２Ｒ５０ポリペプチドの活性を何らかの方法で変化させたことを示す。
【０１５１】
［００１６５］     ４．化学感覚受容体を発現する遺伝子導入非ヒト動物
［００１６６］     本発明の１つ以上の味覚受容体配列を発現する非ヒト動物は、受容体アッセイにも使用することができる。そのような発現は、化学感覚受容体またはそのリガンド結合領域をコードする核酸を安定にまたは過渡的に形質移入された非ヒト動物を、検査化合物を接触させることによって、ならびに動物が、受容体ポリペプチド複合体に特異的に結合させることにより検査化合物に反応するかどうかを判定することによって、検査化合物が、生体内の哺乳類味覚膜貫通受容体複合体に特異的に結合するかどうかを判定するために使用することができる。
【０１５２】
［００１６７］     本発明のベクターを形質移入されたまたはそれに感染した動物は、特異的または一連の受容体に結合することができる味覚刺激を同定および特徴付けるためのアッセイに特に有用である。ヒト味覚受容体配列を発現するそのようなベクターに感染した動物は、味覚刺激および例えば、細胞生理機能（例えば、味覚ニューロン）への、ＣＮＳ、または行動へのそれらの効果の生体内スクリーニングのために使用することができる。
【０１５３】
［００１６８］     個々にまたはライブラリとして、核酸およびベクターを感染／発現させる手段は、当技術分野において既知である。種々の個々の細胞、器官、または動物全体のパラメータは、種々の手段によって測定することができる。本発明のＴ２Ｒ配列は、感染性病原体、例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いた送達によって、例えば、動物味覚組織内に発現することができる。
【０１５４】
［００１６９］     内在性味覚受容体遺伝子は、機能的なままであることができ、野生型（天然）活性は、依然として存在することができる。他の状況において、全ての味覚受容体活性が、外来性ハイブリッド受容体によって導入されることが望ましい場合、ノックアウトラインの使用が好適である。非ヒト遺伝子導入動物、特に遺伝子導入マウスの構成、ならびに形質転換した細胞を産生するための組換えコンストラクトの選択および調製のための方法は、当技術分野において既知である。
【０１５５】
［００１７０］     「ノックアウト」細胞および動物の構成は、哺乳類細胞内の特定の遺伝子の発現レベルは、抑制される遺伝子のＤＮＡ配列のいくらかの部分を妨害するように機能する新しいＤＮＡ配列内へゲノムを導入することによって、減少または完全に抑止され得るという前提に基づいている。また、「遺伝子トラップ挿入」は、宿主遺伝子を破壊するために使用することができ、マウス胚性幹（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ：ＥＳ）細胞は、ノックアウト遺伝子導入動物を生成するために使用することができる（例えば、Ｈｏｌｚｓｃｈｕ，遺伝子導入Ｒｅｓ６：９７−１０６（１９９７）を参照）。外来性の挿入は、典型的に、相補的核酸配列間の相同組換えによるものである。外来性配列は、エクソン、イントロンもしくは転写制御配列、または標的遺伝子の発現レベルに影響を与えることができる任意のゲノム配列、あるいはそれらの組み合わせ等の、修飾される標的遺伝子のいくらかの部分である。多能性胚性幹細胞における相同組換えを介した遺伝子標的化は、着目ゲノム配列を正確に修飾することを可能にする。任意の技術は、ノックアウト動物を生成、スクリーニング、増殖するために使用することができる。例えば、Ｂｉｊｖｏｅｔ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．７：５３−６２（１９９８）；Ｍｅｒｅｄｉｔｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５：２０８−２１６（１９９７）；Ｔｏｊｏ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：１６１−１６５（１９９５）；Ｍｕｄｇｅｔｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：１６７−１８４（１９９５）；Ｌｏｎｇｏ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６：３２１−３２８（１９９７）；米国特許第５，６１６，４９１号、第５，４６４，７６４号、第５，６３１，１５３号、第５，４８７，９９２号、第５，６２７，０５９号、第５，２７２，０７１号、ＷＯ９１／０９９５５、ＷＯ９３／０９２２２、ＷＯ９６／２９４１１、ＷＯ９５／３１５６０、ＷＯ９１／１２６５０を参照。
【０１５６】
［００１７１］     本発明の核酸は、「ノックアウト」ヒト細胞およびそれらの子孫を生成するために、試薬としても使用することができる。同様に、本発明の核酸は、マウスにおいて「ノックイン」を生成するために、試薬として使用することもできる。ヒトまたはラットＴ２Ｒ遺伝子配列は、マウスゲノムにおいてオルソログＴ２Ｒを交換することができる。このようにして、ヒトまたはラットＴ２Ｒを発現するマウスを生成する。次いで、このマウスは、ヒトまたはラットＴ２Ｒの機能を分析するために、およびそのようなＴ２Ｒのためのリガンドを同定するために使用することができる。
モジュレータ
［００１７２］     Ｔ２Ｒファミリーメンバーのモジュレータとして検査される化合物は、任意の小さい化学化合物、またはタンパク質、糖、核酸もしくは脂質等の生物学的実体であることができる。あるいは、モジュレータは、Ｔ２Ｒファミリーメンバーの型を遺伝的に変化されることができる。典型的に、検査化合物は、小さい化学分子およびペプチドであってもよい。ほとんどの場合、化合物は水溶液または有機（特に、ＤＭＳＯベースの）溶液中に溶解されて使用されるが、基本的に、任意の化学化合物は、本発明のアッセイにおいて潜在的なモジュレータまたはリガンドとして使用することができる。アッセイは、アッセイステップを自動化し、典型的に平行して行われるアッセイ（例えば、ロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイター形態で）に、便利な源から化合物を提供することによって、大きな化学ライブラリをスクリーニングするように設計されてもよい。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）等を含む化学化合物の供給者が多く存在することを理解されたい。
【０１５７】
［００１７３］     一実施形態において、ハイスループットスクリーニング方法は、多数の潜在的な治療的化合物（潜在的なモジュレータまたはリガンド化合物）を含有するコンビナトリアル化学またはペプチドライブラリを提供することを含む。次いで、そのような「コンビナトリアル化学ライブラリ」または「リガンドライブラリ」を、所望の特徴的活性を表示するそれらのライブラリメンバー（特定化学種またはサブクラス）を同定するために、１つ以上のアッセイにおいてスクリーニングする。したがって、同定された化合物は、従来の「鉛化合物」として機能することができ、またはそれら自体を潜在的なもしくは実際の消費者製品として使用することができる。
【０１５８】
［００１７４］     コンビナトリアル化学ライブラリは、試薬等の多くの化学的「ビルディングブロック」を組み合わせることによって、化学合成または生物学的合成のいずれか一方によって産生された多様な化学化合物の収集物である。例えば、ポリペプチドライブラリ等の線状コンビナトリアル化学ライブラリは、所与の化合物の長さ（つまり、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）のための可能な限りの方法で、一連の化学ビルディングブロック（アミノ酸）を組み合わせることによって形成される。何百万の化学化合物は、化学ビルディングブロックのそのようなコンビナトリアル混合を通じて合成することができる。
【０１５９】
［００１７５］     コンビナトリアル化学ライブラリの調製およびスクリーニングは、当業者には既知である。そのようなコンビナトリアル化学ライブラリは、ペプチドライブラリ（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，３７：４８７−９３（１９９１）およびＨｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８４−８８（１９９１）を参照）を含むがこれらに限定されない。また、化学多様性ライブラリを産生するための他のケミストリを使用することもできる。そのようなケミストリは、ペプトイド（例えば、ＷＯ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えば、ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド等のダイバーソマー（Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．，９０：６９０９−１３（１９９３））、ビニル性ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：６５６８（１９９２））、グルコース骨格を持つ非ペプチド性ペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：９２１７−１８（１９９２））、小化合物ライブラリの類似性有機合成（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１：１３０３（１９９３））、ペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリ（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｂｅｒｇｅｒ、およびＳａｍｂｒｏｏｋ、全て上記参照）、ペプチド核酸ライブラリ（米国特許第５，５３９，０８３号）、抗体ライブラリ（Ｖａｕｇｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７）、炭水化物ライブラリ（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−２２（１９９６）および米国特許第５，５９３，８５３号）、有機小分子ライブラリ（ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ，Ｃ＆ＥＮ，Ｊａｎ  １８，ｐａｇｅ３３（１９９３）；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、第５，２８８，５１４号等）を含むがこれらに限定されない。
【０１６０】
［００１７６］     コンビナトリアルライブラリの調製のための装置は、市販されている（例えば、３５７ＭＰＳ，３９０ＭＰＳ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  Ｋｙ．）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓ．）、４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、９０５０  Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）を参照）。さらに、数々のコンビナトリアルライブラリは、それ自体が市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；３ＤＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，Ｐａ．；Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍｄ．等を参照）。
【０１６１】
［００１７７］     本発明の一側面において、Ｔ２Ｒモジュレータは、それによって、所望の方法で生成物、組成物、または成分の味覚を調節するために、任意の食品、医薬組成物、またはその成分において使用することができる。例えば、苦味感覚を増強させるＴ２Ｒモジュレータは、生成物または組成物に苦味を提供するために添加することができ、一方、苦味感覚を遮断するＴ２Ｒモジュレータは、生成物または組成物の苦味を遮断するために添加することができる。
本発明により同定された化合物の使用
［００１７８］     本発明に従って同定された化合物は、例えば、ピラジン化合物および他の苦味化合物等の苦味化合物によって、対象ｈＴ２Ｒ５０配列および潜在的に他のｈＴ２Ｒの活性化により誘発される苦味を調節する、好ましくは遮断するために、食品、飲料または医薬品に添加されてもよい。例えば、ｈＴ２Ｒ５０の活性化を遮断する化合物または関連する化合物は、ｈＴ２Ｒ５０味覚受容体を活性化する薬物と関連する苦味を遮断するために、医薬品中の添加物として使用されてもよい。例えば、これらの化合物は、それらと関連する苦味を抑制するために、そのような薬物を含有する、または有効量の小児医薬品製剤に添加されてもよい。
【０１６２】
［００１７９］     ｈＴ２Ｒ５０の活性化を遮断する化合物は、例えば、ピラジンおよび構造上関連する化合物等の、これらの受容体を活性化する化合物の苦味を遮断するために、食物、飲料または医薬品において使用することができる。
キット
［００１８０］     Ｔ２Ｒ遺伝子およびそれらの相同体は、法医学的および親子判定に対して味覚受容体細胞を同定するための、ならびに検査伝達を試験するための有用なキットである。Ｔ２Ｒプローブおよびプライマー等のＴ２Ｒ核酸と特異的にハイブリダイズするＴ２Ｒファミリーメンバー特異的な試薬、ならびに例えば、Ｔ２Ｒ抗体等のＴ２Ｒタンパク質に特異的に結合するＴ２Ｒ特異的な試薬は、味覚細胞発現および味覚伝達制御を試験するために使用される。
【０１６３】
［００１８１］     試料中のＴ２Ｒファミリーメンバーに対するＤＮＡおよびＲＮＡの存在を調べる核酸アッセイは、サザン解析、ノーザン解析、ドットブロット、リボヌクレアーゼプロテクション、Ｓ１解析、ＰＣＲ等の増幅技術、およびインサイツハイブリダイゼーション等の多数の技術を含み、当業者には既知である。インサイツハイブリダイゼーションにおいて、例えば、標的核酸は、その後の解釈および解析のための細胞形態学を保存しながら、細胞内のハイブリダイゼーションに利用可能となるように、細胞周囲から遊離される。以下の論説は、インサイツハイブリダイゼーション技術の概要を提供する。Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４：２３０２５０（１９８６）；Ｈａａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．ＶＩＩ，１８９−２２６（１９８４）；およびＮａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８７）。さらに、Ｔ２Ｒタンパク質は、上記の種々の免疫測定法技術で検出することができる。検査試料は、典型的に、陽性対照（例えば、組換えＴ２Ｒタンパク質を発現する試料）および陰性対照の両方と比較される。
【０１６４】
［００１８２］     また、本発明は、Ｔ２Ｒファミリーメンバーのモジュレータに対してスクリーニングするためのキットも提供する。そのようなキットは、容易に利用可能な材料および試薬から調製することができる。例えば、そのようなキットは、１つ以上の以下の材料のいずれかを含むことができる。Ｔ２Ｒ核酸またはタンパク質、反応管、およびＴ２Ｒ活性を検査するための指示。任意に、該キットは、機能性Ｔ２Ｒポリペプチドを含む。多種多様のキットおよび構成要素は、対象とするユーザおよびユーザの特定の必要性に応じて、本発明に従って調製することができる。
【０１６５】
［００１８３］     本発明を概して説明したが、例証の目的で与えられるものであり、限定を意図するものではない、以下の実施例を参照してより容易に理解される。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書において開示した例示的な実施形態に種々の修正および変更ができることを理解されたい。
【０１６６】
［００１８４］            実施例
［００１８５］     対象ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプが機能的であり、以前に同定されたｈＴ２Ｒ５０対立遺伝子としての特異的苦味リガンドに応答することを明らかにする機能的アッセイ。
【０１６７】
［００１８６］     ｈＴ２Ｒ５０（文献においてｈＴ２Ｒ４５またはｈＴａｓ２Ｒ４５とも称される）は、ヒト苦味受容体ファミリーのメンバーである。先述のＡｄｌｅｒ特許出願を含む以前の公報および特許出願は、短いバーションのタンパク質をコードするハプロタイプのみを明らかにした。本発明者は、長い型のタンパク質をコードする新しいハプロタイプの同定を本明細書において報告する。さらに、本実施例において、長いおよび短い型の両方のタンパク質が、機能的アッセイにおいて２つの構造上関連する苦味分子を認識する一方で、対照ｈＴ２Ｒは認識しないことを示し、ｈＴ２Ｒ５０は、少なくともこれらの２つの苦味分子に対する味覚受容体であることを示す。
【０１６８】
［００１８７］     本明細書において同定した新しいｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプのヌクレオチドおよびタンパク質配列は、特許請求の範囲に先行する図１および配列リストに含有される。図１に含有されるより長い（ハプロタイプ）型のｈＴ２Ｒ５０タンパク質（ｈＴ２Ｒ５０  Ｌと称す）は、元来同定されたｈＴ２Ｒ５０対立遺伝子（これらの残基は太字および下線で示す）と比べて追加の１０のアミノ酸を有することがそこから分かり、図２に示すように、そのＣ末端に追加され、元来報告されたハプロタイプ（ｈＴ２Ｒ５０）と比較される。
【０１６９】
［００１８８］     図２に示すように、ｈＴ２Ｒ５０Ｌの伸長されたＣ末端配列は、ｈＴ２Ｒ６１、６４、および７５等の他の密接に関連するｈＴ２Ｒと高度に相同または同じである。今日までの利用可能な遺伝子解析により、ｈＴ２Ｒ５０Ｌ対立遺伝子の相対頻度は、４６％であると推定されることが示唆される。これは、２４人の個人（約５０％欧州人および約５０％アジア人遺伝形質）からの本発明人の配列決定データに基づいている。
【０１７０】
［００１８９］     後述する生体外アッセイを使用して、ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプは、２つの構造上関連する苦味分子、２−アセチルピラジンおよびエチルピラジンを認識し、それに応答することが分かった。これらの結果を図３に示す。これらのピラジン化合物はどちらも、約５ｍＭの濃度でヒトに対して苦味がある。同じ生体外アッセイは、短いおよび長い型のｈＴ２Ｒ５０はどちらも、苦味分子に応答することができることを示し、一方、密接に関連するｈＴ２Ｒ７５および６１は応答を示さなかった（図４）。
ｈＴ２Ｒ５０アッセイ条件
［００１９０］     本明細書における新規ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプおよび他のｈＴ２Ｒの活性化は、細胞内カルシウム濃度の変化を検出する細胞ベースのアッセイにおいて測定する。手短に言うと、ヒト胎児由来腎臓細胞を、４８ウェル組織培養プレートに播種する。２４時間後、細胞は、ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプまたは別のｈＴ２Ｒ核酸配列を含有するプラスミド、およびキメラＧタンパク質（Ｇ１６ｇｕｓｔ４４）を含有するプラスミドを過渡的に形質移入される。さらに２４時間後、細胞内のカルシウム濃度の変化を検出するための高速で簡便な信頼できる蛍光ベースの方法を提供するカルシウムに特異的な蛍光色素（Ｆｌｕｏ−４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とともに、細胞をインキュベートする。Ｔ２Ｒの活性化は、シグナル伝達カスケードを引き出し、ＰＬＣの活性化および細胞内カルシウム濃度のその後の増加をもたらす。このカルシウム濃度の増加は、細胞内のカルシウム色素の蛍光特性を変化させる。これらの変化を、蛍光顕微鏡を使用して監視する。
配列表
ロドプシン転座ドメインに対するタンパク質配列（配列番号：１）
ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶ
ｈＴ２Ｒ５０Ｌに対するＤＮＡおよびタンパク質配列（配列番号：２）
コードＤＮＡ配列：  ＡＴＧＡＴＡＡＣＴＴＴＴＣＴＧＣＣＣＡＴＣＡＴＡＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴＴＡＣＡＴＴＴＧＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＡＧＣＧＴＴＧＧＴＡＡＡＴＴＣＣＡＣＣＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＡＴＴＧＴＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＧＧＴＴＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＴＣＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＧＴＡＧＡＡＴＴＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＡＴＡＡＴＡＴＣＴＧＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＧＧＣＣＡＴＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＴＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＣＧＣＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＧＣＣＴＴＴＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＣＡＧＡＴＴＧＴＡＴＧＧＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣＡＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡＴＴＧＡＧＧＣＧＴＧＣＡＡＴＧＴＡＣＣＴＴＴＣＡＧＡＴＡＣＧＡＣＴＧＴＡＡＣＣＡＴＧＣＴＡＧＣＡＡＡＣＴＴＡＧＴＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＡＧＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＧＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＴＣＣＣＡＧＴＡＣＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＡＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＧＣＡＡＡＣＴＧＴＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＴＡＴＧＴＧＣＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＡＡＴＡＡＴＡＴＣＡＧＴＴＴＧＧＡＧＴＴＴＴＡＡＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＧＴＴＣＴＧＣＣＡＡＧＣＴＡＴＴＧＧＡＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＣＣＣＡＣＣＣＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＴＡＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＧＣＡＡＡＴＧＡＣＧＴＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＣＡＴＣＴＣＣＡＴＡＧ
ｈＴ２Ｒ５０ハプロタイプタンパク質配列：（配列番号：３）
ＭＩＴＦＬＰＩＩＦＳＩＬＶＶＶＴＦＶＩＧＮＦＡＮＧＦＩＡＬＶＮＳＴＥＷＶＫＲＱＫＩＳＦＡＤＱＩＶＴＡＬＡＶＳＲＶＧＬＬＷＶＬＬＬＮＷＹＳＴＶＬＮＰＡＦＣＳＶＥＬＲＴＴＡＹＮＩＷＡＶＴＧＨＦＳＮＷＰＡＴＳＬＳＩＦＹＬＬＫＩＡＮＦＳＮＬＩＦＬＲＬＫＲＲＶＫＳＶＩＬＶＭＬＬＧＰＬＬＦＬＡＣＨＬＦＶＶＮＭＮＱＩＶＷＴＫＥＹＥＧＮＭＴＷＫＩＫＬＲＲＡＭＹＬＳＤＴＴＶＴＭＬＡＮＬＶＰＦＴＶＴＬＩＳＦＬＬＬＶＣＳＬＣＫＨＬＫＫＭＨＬＨＧＫＧＳＱＤＰＳＴＫＶＨＩＫＶＬＱＴＶＩＳＦＬＬＬＣＡＩＹＦＶＳＶＩＩＳＶＷＳＦＫＮＬＥＮＫＰＶＦＭＦＣＱＡＩＧＦＳＣＳＳＡＨＰＦＩＬＩＷＧＮＫＫＬＫＱＴＹＬＳＶＬＷＱＭＴＹＷＶＫＧＥＫＰＳＳＰ
ｈＴ２ＲＣ末端配列の配列比較
ｈＴ２Ｒ５０-ＫＬＫＱＴＹＬＳＶＬＷＱＭＲＹ停止（配列番号：４）
ｈＴ２Ｒ５０Ｌ-  ＫＬＫＱＴＹＬＳＶＬＷＱＭＴＹＷＶＫＧＥＫＰＳＳＰ停止（配列番号：５）
ｈＴ２Ｒ６１-ＫＬＫＱＴＦＬＳＶＦＷＱＭＲＹＷＶＫＧＥＫＴＳＳＰ停止     （配列番号：６）
ｈＴ２Ｒ６４-ＫＬＫＱＴＦＬＳＶＬＲＱＶＲＹＷＶＫＧＥＫＰＳＳＰ停止     （配列番号：７）
ｈＴ２Ｒ７５-ＫＬＫＱＴＦＬＳＶＬＷＨＶＲＹＷＶＫＧＥＫＰＳＳＳ停止     （配列番号：８）
本明細書は、本発明のいくつかの実施形態に関して説明したが、上記の説明は例証のみであり、開示した本発明の限定を意図しないことを理解されたい。本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2010514411.tif 000002
【図２】
2010514411.tif 000003
【図３】
2010514411.tif 000004
【図４】
2010514411.tif 000005
【配列表】
2010514411000001.app
【国際調査報告】
2010514411.tif 000006
2010514411.tif 000007