(57)【要約】親抗ＭＵＣ１６抗体の１つ以上のアミノ酸を、架橋されていない反応性のシステインアミノ酸で置換することによって、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体を操作する。そのシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体の設計、調製、スクリーニングおよび選択の方法が提供される。システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体（Ａｂ）は、リンカー（Ｌ）を介して１つ以上の薬物部分（Ｄ）と結合体化されることにより、式Ｉ：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ        Ｉを有する、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体が形成され、ここで、ｐは、１〜４である。システイン改変抗体薬物化合物および組成物に対する診断的および治療的な用途が開示される。
2010526821.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＵＣ１６ポリペプチドに結合し、１つ以上の遊離システインアミノ酸および配列番号９〜４０から選択される配列を含む、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項２】
親抗ＭＵＣ１６抗体の１つ以上のアミノ酸残基をシステインで置換する工程を包含するプロセスによって調製される、請求項１に記載のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項３】
前記１つ以上の遊離システインアミノ酸残基が、軽鎖に位置する、請求項１に記載のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項４】
以下：
【表８】
2010526821.tif 000034
から選択される１つ以上の配列を含む、請求項３に記載のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項５】
以下：
【表９】
2010526821.tif 000035
から選択される１つ以上の配列を含む、請求項３に記載のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項６】
前記１つ以上の遊離システインアミノ酸残基が、重鎖に位置する、請求項１に記載のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項７】
以下：
【表１０】
2010526821.tif 000036
から選択される１つ以上の配列を含む、請求項６に記載のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項８】
以下：
【表１１】
2010526821.tif 000037
から選択される１つ以上の配列を含む、請求項６に記載のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項９】
以下：
【化２５】
2010526821.tif 000038
を含む重鎖配列を含む、請求項１に記載のシステイン改変ｈｕ抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項１０】
以下：
【化２６】
2010526821.tif 000039
を含む軽鎖配列を含む請求項１に記載のシステイン改変ｈｕ抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項１１】
以下：
【化２７】
2010526821.tif 000040
を含む重鎖配列を含む、請求項１に記載のシステイン改変キメラ抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項１２】
以下：
【化２８】
2010526821.tif 000041
を含む軽鎖配列を含む、請求項１に記載のシステイン改変キメラ抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項１３】
前記親抗ＭＵＣ１６抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体から選択される、請求項１に記載のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項１４】
Ｆａｂフラグメントである、請求項１に記載のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項１５】
細菌において産生される、請求項１に記載のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項１６】
ＣＨＯ細胞において産生される、請求項１に記載のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項１７】
ＭＵＣ１６タンパク質を含むと疑われるサンプル中の該タンパク質の存在を判定する方法であって、該方法は、以下の工程：
該サンプルを、１つ以上の遊離システインアミノ酸および配列番号９〜４０から選択される配列を有するシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体に曝露する工程、および；
該サンプル中の該抗体の該ＭＵＣ１６タンパク質への結合を測定する工程であって、ここで、該抗体の該タンパク質への結合は、該サンプル中の該タンパク質の存在を示す、工程
を包含する、方法。
【請求項１８】
前記細胞が、卵巣癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞または膵癌細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体が、蛍光色素、放射性同位体、ビオチンまたは金属錯化リガンドから選択される標識に共有結合されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、アウリスタチン薬物部分に共有結合されており、それによって、抗体−薬物結合体が形成されている、請求項１に記載のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体。
【請求項２１】
ＭＵＣ１６ポリペプチドに結合し、１つ以上の遊離システインアミノ酸および配列番号９〜４０から選択される配列を含むシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体、ならびに薬学的に許容可能な希釈剤、キャリアまたは賦形剤を含む、薬学的処方物。
【請求項２２】
ＭＵＣ１６ポリペプチドに結合し、１つ以上の遊離システインアミノ酸、配列番号９〜４０から選択される配列を含むシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体（Ａｂ）およびアウリスタチン薬物部分（Ｄ）を含む、抗体−薬物結合体であって、該システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、１つ以上の遊離システインアミノ酸を介してリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合され；この複合物は、式Ｉ：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ        Ｉ
を有し、ここで、ｐは、１、２、３または４である、
抗体−薬物結合体。
【請求項２３】
ｐが２である、請求項２２に記載の抗体−薬物結合体複合物。
【請求項２４】
Ｌが、式：
【化２９】
2010526821.tif 000042
を有し、ここで：
Ａは、前記システイン改変抗体（Ａｂ）のシステインチオールに共有結合されたストレッチャー単位であり；
ａは、０または１であり；
各Ｗは、独立してアミノ酸単位であり；
ｗは、０〜１２の範囲の整数であり；
Ｙは、前記薬物部分に共有結合されたスペーサー単位であり；そして
ｙは、０、１または２である、
請求項２２に記載の抗体−薬物結合体複合物。
【請求項２５】
式：
【化３０】
2010526821.tif 000043
を有し、ここで、ＰＡＢは、パラ−アミノベンジルカルバモイルであり、Ｒ１７は、（ＣＨ２）ｒ、Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル、Ｏ−（ＣＨ２）ｒ、アリーレン、（ＣＨ２）ｒ−アリーレン、−アリーレン−（ＣＨ２）ｒ−、（ＣＨ２）ｒ−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）、（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）−（ＣＨ２）ｒ、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル、（ＣＨ２）ｒ−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）、−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）−（ＣＨ２）ｒ−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２）ｒ−から選択される二価のラジカルであり；ここで、Ｒｂは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニルまたはベンジルであり；そしてｒは、独立して、１〜１０の範囲の整数である、
請求項２４に記載の抗体−薬物結合体複合物。
【請求項２６】
Ｗｗが、バリン−シトルリンである、請求項２４に記載の抗体−薬物結合体複合物。
【請求項２７】
Ｒ１７が、（ＣＨ２）５または（ＣＨ２）２である、請求項２４に記載の抗体−薬物結合体複合物。
【請求項２８】
式：
【化３１】
2010526821.tif 000044
を有する、請求項２４に記載の抗体−薬物結合体複合物。
【請求項２９】
Ｒ１７が、（ＣＨ２）５または（ＣＨ２）２である、請求項２８に記載の抗体−薬物結合体複合物。
【請求項３０】
式：
【化３２】
2010526821.tif 000045
を有する、請求項２４に記載の抗体−薬物結合体複合物。
【請求項３１】
Ｌが、ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢまたはＭＣである、請求項２２に記載の抗体薬物結合体。
【請求項３２】
Ｌが、リンカー試薬のＳＭＣＣ、ＢＭ（ＰＥＯ）２またはＢＭ（ＰＥＯ）３によって形成されたリンカーである、請求項２２に記載の抗体−薬物結合体複合物。
【請求項３３】
Ｄが、構造：
【化３３】
2010526821.tif 000046
を有するＭＭＡＥであり、ここで、波線は、前記リンカーＬへの結合部位を示す、請求項２２に記載の抗体−薬物結合体複合物。
【請求項３４】
Ｄが、構造：
【化３４】
2010526821.tif 000047
を有するＭＭＡＦであり、ここで、波線は、前記リンカーＬへの結合部位を示す、請求項２２に記載の抗体−薬物結合体複合物。
【請求項３５】
前記システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体から選択される、請求項２２に記載の抗体−薬物結合体複合物。
【請求項３６】
前記システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体が、Ｆａｂフラグメントである、請求項２２に記載の抗体−薬物結合体複合物。
【請求項３７】
構造：
【化３５】
2010526821.tif 000048
から選択される抗体−薬物結合体複合物であって、ここで、Ｖａｌは、バリンであり；Ｃｉｔは、シトルリンであり；ｐは、１、２、３または４であり；そしてＡｂは、ＭＵＣ１６ポリペプチドに結合し、１つ以上の遊離システインアミノ酸および配列番号９〜４０から選択される配列を含む、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体である、抗体−薬物結合体複合物。
【請求項３８】
Ａｂが、配列番号１を含む、請求項３７に記載の抗体薬物結合体。
【請求項３９】
Ａｂが、配列番号２を含む、請求項３７に記載の抗体薬物結合体。
【請求項４０】
Ａｂが、配列番号３を含む、請求項３７に記載の抗体薬物結合体。
【請求項４１】
Ａｂが、配列番号４を含む、請求項３７に記載の抗体薬物結合体。
【請求項４２】
Ａｂが、配列番号１および配列番号２を含む、請求項３７に記載の抗体薬物結合体。
【請求項４３】
Ａｂが、配列番号３および配列番号４を含む、請求項４２に記載の抗体薬物結合体。
【請求項４４】
ＭＵＣ１６ポリペプチドに結合し、１つ以上の遊離システインアミノ酸、配列番号９〜４０から選択される配列を含むシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体（Ａｂ）およびアウリスタチン薬物部分（Ｄ）を含む、抗体−薬物結合体複合物の混合物であって、ここで、該システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、１つ以上の遊離システインアミノ酸を介してリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合され；該複合物は、式Ｉ：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ        Ｉ
を有し、ここで、ｐは、１、２、３または４であり、平均薬物負荷は、１〜２である、抗体−薬物結合体複合物の混合物。
【請求項４５】
ＭＵＣ１６ポリペプチドに結合し、１つ以上の遊離システインアミノ酸および配列番号９〜４０から選択される配列を含むシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体を含む抗体−薬物結合体、および薬学的に許容可能な希釈剤、キャリアまたは賦形剤を含む、薬学的処方物であって、ここで該システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、アウリスタチン薬物部分に共有結合されている、薬学的処方物。
【請求項４６】
レトロゾール、オキサリプラチン、ドセタキセル、５−ＦＵ、ラパチニブ、カペシタビン、ロイコボリン、エルロチニブ、パーツズマブ、ベバシズマブおよびゲムシタビンから選択される治療有効量の化学療法剤をさらに含む、請求項４５に記載の薬学的処方物。
【請求項４７】
ＭＵＣ１６ポリペプチドに結合し、１つ以上の遊離システインアミノ酸および配列番号９〜４０から選択される配列を有するシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体を含む抗体−薬物結合体、および薬学的に許容可能な希釈剤、キャリアまたは賦形剤を含む薬学的処方物を患者に投与する工程を包含する、癌を処置する方法であって、ここで、該システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、アウリスタチン薬物部分に共有結合されている、方法。
【請求項４８】
前記癌が、卵巣癌、前立腺癌、尿路の癌、膵癌、肺癌、乳癌および結腸癌からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記患者が、前記抗体−薬物結合体複合物とともに化学療法剤を投与され、ここで、該化学療法剤は、レトロゾール、シスプラチン、カルボプラチン、タキソール、パクリタキセル、オキサリプラチン、ドセタキセル、５−ＦＵ、ロイコボリン、エルロチニブ、パーツズマブ、ベバシズマブ、ラパチニブおよびゲムシタビンから選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
ＭＵＣ１６ポリペプチドに結合し、１つ以上の遊離システインアミノ酸および配列番号９〜４０から選択される配列を有するシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体、および薬学的に許容可能な希釈剤、キャリアまたは賦形剤を含む抗体−薬物結合体を含む薬学的処方物であって、ここで、該システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、アウリスタチン薬物部分に共有結合されている、薬学的処方物；
容器；および
該複合物が、ＭＵＣ１６ポリペプチドの過剰発現を特徴とする癌を処置するために使用され得ることを示している添付文書またはラベル
を備えた、製品。
【請求項５１】
前記癌が、卵巣癌、前立腺癌、尿路の癌、膵癌、肺癌、乳癌または結腸癌である、請求項５０に記載の製品。
【請求項５２】
ＭＵＣ１６ポリペプチドに結合し、１つ以上の遊離システインアミノ酸および配列番号９〜４０から選択される配列を有するシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体（Ａｂ）およびアウリスタチン薬物部分（Ｄ）を含む抗体薬物結合体複合物を作製するための方法であって、ここで、該システイン改変抗体は、該１つ以上の操作されたシステインアミノ酸を介してリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合され；該複合物は、式Ｉ：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ        Ｉ
を有し、ここで、ｐは、１、２、３または４であり；該方法は、以下の工程：
（ａ）該システイン改変抗体の操作されたシステイン基をリンカー試薬と反応させて、抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成する工程；および
（ｂ）Ａｂ−Ｌを、活性化された薬物部分Ｄと反応させ；それによって、該抗体−薬物結合体複合物を形成する工程；
または、以下の工程：
（ｃ）薬物部分の求核基をリンカー試薬と反応させて、薬物−リンカー中間体Ｄ−Ｌを形成する工程；および
（ｄ）Ｄ−Ｌを、該システイン改変抗体の操作されたシステイン基と反応させ；それによって、該抗体−薬物結合体複合物を形成する工程
を包含する、方法。
【請求項５３】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、前記システイン改変抗体を発現させる工程をさらに包含する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記発現されたシステイン改変抗体を還元剤で処理する工程をさらに包含する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記還元剤が、ＴＣＥＰおよびＤＴＴから選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記発現されたシステイン改変抗体を、前記還元剤で処理した後、酸化剤で処理する工程をさらに包含する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記酸化剤が、硫酸銅、デヒドロアスコルビン酸および大気から選択される、請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
３７ＣＦＲ§１．５３（ｂ）の下で出願された、この本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００７年５月８日に出願された米国仮出願第６０／９１６，６５７号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
発明の分野
本発明は、概して、反応性のシステイン残基を用いて操作された抗体に関し、より詳細には、治療的または診断的な用途で用いる抗体に関する。そのシステイン改変抗体は、化学療法薬、トキシン、ビオチンなどの親和性リガンドおよびフルオロフォアなどの検出標識と結合体化され得る。本発明はまた、哺乳動物細胞または関連する病理学的状態の、インビトロ、インサイチュおよびインビボでの診断または処置のために、抗体および抗体−薬物結合体複合物を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌、免疫学的障害および血管新生障害を有する患者を標的化処置するための抗体治療が、確立されている。正常な非癌性細胞と比べて、癌細胞の表面上に特異的に発現する膜貫通型ポリペプチドまたは別の腫瘍関連ポリペプチドが、抗体を用いた癌の診断および治療のための細胞性標的として同定されている。そのような腫瘍関連細胞表面抗原ポリペプチド、すなわち、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が同定されることにより、抗体ベースの治療を介して破壊するための癌細胞の特異的な標的化が可能になる。
【０００３】
細胞傷害剤または細胞分裂抑制剤、すなわち、癌の処置において腫瘍細胞を殺滅するかまたは阻害する薬物を局所送達するための抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）、すなわち、免疫結合体を使用すること（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５：５４３−５４９；Ｗｕら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：１１３７−１１４６；Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２；（Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．Ａｒｍｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５，３８２−３８７，２００５）．Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２；ＵＳ４９７５２７８）によって、腫瘍に薬物部分を標的化して送達することおよびその中への細胞内蓄積が可能になるが、これらの非結合体化薬物の全身投与は、排除しようとしている腫瘍細胞と同様に正常な細胞に対しても、容認できないレベルの毒性をもたらすことがある（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ  ｐｐ．（Ｍａｒ．１５，１９８６）：６０３−０５；Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａら（ｅｄ．ｓ），ｐｐ．４７５−５０６）。ＡＤＣの治療指数、すなわち、最大有効性および最小毒性を改善するための努力は、ポリクローナル抗体（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３−８７）およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の選択性、ならびに薬物結合特性および薬物放出特性に集中している（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５：５４３−５４９）。抗体薬物結合体に用いられる薬物部分としては、ジフテリアトキシンなどの細菌のタンパク質トキシン、リシンなどの植物のタンパク質トキシン、小分子（例えば、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）（Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｊ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３）、カリケアマイシン（Ｌｏｄｅら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサートおよびビンデシン（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６）前出）が挙げられる。薬物部分は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合またはトポイソメラーゼ阻害をはじめとした、細胞傷害機構および細胞分裂抑制機構に影響を及ぼし得る。いくつかの細胞傷害性薬物は、大きな抗体またはタンパク質レセプターリガンドに結合体化されると、不活性になるか、または活性が低下する傾向がある。
【０００４】
アウリスタチンペプチド、アウリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルアウリスタチン（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）（ＭＭＡＥ）、ドラスタチンの合成アナログ（ＷＯ０２／０８８１７２）は、様々な抗体に対する薬物部分として結合体化されてきた（Ｋｌｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５（４）：７６５−７７３；Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−７８４；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２（４）：１４５８−１４６５；ＵＳ２００４／００１８１９４；ＷＯ０４／０３２８２８；Ｍａｏら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４（３）：７８１−７８８）；Ｂｈａｓｋａｒら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：６３８７−６３９４）；ＷＯ０３／０４３５８３；ＵＳ５７６７２３７；ＵＳ６１２４４３１；ＵＳ２００５／０２３８６４９）。
【０００５】
薬物部分を抗体上のいくつかの部位に結合する場合、抗体に薬物部分を結合する従来の手段、すなわち、共有結合を介した連結では、通常、分子の不均一な混合物がもたらされる。例えば、細胞傷害性薬物は、代表的には、抗体に存在することが多いリシン残基、または鎖間ジスルフィド結合を還元させることによって活性化されるシステインスルフヒドリル（チオール）を介して抗体に結合体化され、それにより、異なる部位に連結された、薬物と抗体とのモル比が異なる種を含む不均一な抗体−薬物結合体混合物がもたらされていた（各々が薬物動態、有効性および安全性に関する異なるインビボプロファイルを有する）（Ｈａｍｂｌｅｔｔら（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０７０；Ｗａｎｇら（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：２４３６−２４４６）。反応条件に応じて、その不均一な混合物は、代表的には、０〜約８個またはそれ以上の結合薬物部分という配分の抗体を含む。さらに、薬物部分が抗体上の様々な部位に結合されている場合、潜在的に不均一な混合物は、薬物部分と抗体との特定の整数比を有する結合体の各サブグループ内に入る。結合体化反応から生じる不均一な混合物内の抗体−薬物結合体種分子を分離し、特徴付ける分析方法および調製方法が、不十分である場合がある。抗体は、大きく、複合的で、構造的に多種多様な生体分子であり、多くの反応性官能基を有することが多い。リンカー試薬および薬物−リンカー中間体の反応性は、ｐＨ、濃度、塩濃度および共溶媒などの因子に依存する。さらに、反応条件の管理、ならびに反応物および中間体の特徴づけが困難であることに起因して、多段階の結合体化プロセスは、再現性がないことがある。
【０００６】
ｐＨ７近くでプロトン化され、低求核性であるほとんどのアミンとは異なり、システインチオールは、中性ｐＨで反応性である。遊離チオール（ＲＳＨ，スルフヒドリル）基は、比較的反応性であるので、システイン残基を有するタンパク質は、しばしば、ジスルフィド連結オリゴマーとして酸化型で存在するか、または内部架橋されたジスルフィド基を有する。細胞外タンパク質は、通常、遊離チオールを有しない（Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，５５頁）。抗体のシステインチオール基は、一般に、抗体のアミン基またはヒドロキシル基よりも反応性、すなわち、求電子性結合体化試薬に対してより求核性である。残りのシステインへの定方向の（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）結合体化を可能にする、セリンを有する、溶媒に到達可能な鎖間ジスルフィド結合システイン（ＭｃＤｏｎａｇｈら（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１９：２９９−３０７）。しかしながら、これらのジスルフィド結合が排除されることによって、抗体の四次構造が破壊され得、それにより、抗体のエフェクター機能の変化をはじめとした、インビボにおける抗体の挙動が乱れる（Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：９２４３−９２４７；Ｒｏｍａｎｓら（１９７７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７４：２５３１−２５３５；Ｓｅｅｇａｎら（１９７９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７６：９０７−９１１）。システイン残基が遺伝子操作の手法によってタンパク質に導入されることにより、リガンドに対する共有結合が形成されるか、または新しい分子内ジスルフィド結合が形成されてきた（Ｂｅｔｔｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１３：９６４４−９６５０；Ｂｅｒｎｈａｒｄら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１２６−１３２；Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄら（１９９４）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １：２４７−２５５；Ｔｕら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：４８６２−４８６７；Ｋａｎｎｏら（２０００）Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７６：２０７−２１４；Ｃｈｍｕｒａら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８（１５）：８４８０−８４８４；ＵＳ６２４８５６４）。しかしながら、タンパク質の様々なアミノ酸残基をシステインアミノ酸に変異させることによる、システインチオール基の操作は、特に、不対（遊離Ｃｙｓ）残基または反応もしくは酸化に比較的利用可能な残基の場合、潜在的に問題がある。そのタンパク質の濃縮溶液（Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム中であるか、培養上清中であるか、または部分的もしくは完全に精製されたタンパクであるかは関係ない）において、そのタンパク質の表面上の不対Ｃｙｓ残基が、対形成し、酸化することにより、分子間ジスルフィドが形成され得、ゆえに、タンパク質二量体または多量体が形成され得る。ジスルフィド二量体が形成されることによって、薬物、リガンドまたは他の標識への結合体化に対して反応性でない新しいＣｙｓがもたらされる。さらに、そのタンパク質が、新しく操作されたＣｙｓと既存のＣｙｓ残基との分子内ジスルフィド結合を酸化的に形成する場合、両方のＣｙｓチオール基が、活性部位との関与および相互作用に利用できない。さらに、そのタンパク質は、ミスフォールディングまたは三次構造の喪失によって不活性または非特異的にされ得る（Ｚｈａｎｇら（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１１：１−９）。
【０００７】
システイン改変抗体は、ＦＡＢ抗体フラグメント（チオＦａｂ）として設計され、完全長ＩｇＧモノクローナル（チオＭａｂ）抗体として発現される（ＵＳ２００７／００９２９４０、その内容が参考として援用される）。チオＦａｂおよびチオＭａｂ抗体は、チオール反応性のリンカー試薬および薬物リンカー試薬を用いて、新しく導入されたシステインチオールにおいてリンカーを介して結合体化されることにより、抗体薬物結合体（チオＡＤＣ）が調製される。
【０００８】
ＭＵＣ１６は、ヒトの眼球表面上皮によって（Ａｒｇｕｅｓｏら（２００３）Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４４（６）：２４８７−９５）、気管支の粘膜、ファロピウス管および子宮において（Ｋａｂａｗａｔら（１９８３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２：２７５−８５）発現される腫瘍関連抗原ポリペプチドである。ＭＵＣ１６の提唱されている機能の１つは、粘膜表面における粒子および感染物質に対する保護的な潤滑バリアを提供することである。高度に多形のＭＵＣ１６は、３つのドメイン、Ｓｅｒ／ＴｈｒリッチＮ末端ドメイン、各々平均１５６アミノ酸の部分的に保存された、１１（ｅｌｅｖｅｍ）〜６０超のタンデムリピートのリピートドメイン、ならびに膜貫通配列および短い細胞質テイルを含むＣ末端非リピートドメインから構成される。ＭＵＣ１６は、高度にＯ−グリコシル化およびＮ−グリコシル化される（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら（２００２）Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．２３：１５４−１６９；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら（２００１）Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．２２：３４８−３６６（２００１）；Ｆｅｎｄｒｉｃｋら（１９９７）Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．１８：２７８−２８９；Ｗｏｎｇら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２８６１９−２８６３４；ＭｃＬｅｍｏｒｅら（２００５）ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．Ｎｕｒｓ．６：２６２−２６７）。ＭＵＣ１６遺伝子から発現されるＭＵＣ１６ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、対応する正常ヒト卵巣、乳房および膵臓組織と比べて、それぞれある特定のタイプのヒト卵巣癌、乳房腫瘍および膵臓腫瘍において著しく、再現性よく、および検出可能に過剰発現される（特許文献１）。ＭＵＣ１６発現について定量的に解析された、種々の無関係なタイプおよび異なるタイプのヒト卵巣癌組織サンプルは、癌サンプル中のＭＵＣ１６の発現レベルが不定であることを示し、解析された正常な卵巣組織サンプルの群に対するＭＵＣ１６発現の平均レベルと比較するとき、かなりの数の癌サンプルが、少なくとも６倍（から約５８０倍）高いＭＵＣ１６発現を示した。特に、検出可能で再現性のあるＭＵＣ１６の過剰発現は、正常な卵巣組織と比べて、卵巣癌のタイプ；類内膜腺癌、重篤な嚢胞腺癌（乳頭状腺癌および明細胞腺癌を含む）に対して、観察された。ＭＵＣ１６ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードする核酸は、ある特定のヒト腫瘍における過剰発現に起因して、様々な哺乳動物の組織サンプルにおける定量的および定性的な比較のための標的である。ＭＵＣ１６ポリペプチドの独特の発現プロファイルおよびそのポリペプチドをコードする核酸は、哺乳動物におけるある特定のタイプの癌腫瘍の診断および治療的な処置に活用され得る。
【０００９】
ＣＡ１２５（癌抗原１２５（Ｏ７７２Ｐ、ＣＡ−Ｏ７７２Ｐ、ＣＡ−１２５）は、ＭＵＣ１６遺伝子によってコードされる細胞外に脱落したタンパク質であり（Ｙｉｎら（２００２）Ｉｎｔｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ９８（５）：７３７−７４０）、卵巣癌を有する患者をモニターするために日常的に用いられる血清マーカーである。ＣＡ１２５は、上皮卵巣癌細胞において過剰発現され、血液中に分泌されるミュラー管分化抗原であるが、その発現は、卵巣癌に完全に限定されない（Ｂａｓｔら（１９８１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６８：１３３１−１３３７）。血清ＣＡ１２５レベルは、上皮卵巣癌（ＥＯＣ）を有する約８０％の患者で上昇するが、１％未満の健常女性でも上昇する（Ｂａｓｔら（１９８３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：８８３−８８７）。ＣＡ１２５は、ベータ−ガラクトシド結合に関連する、腫瘍細胞の細胞表面上に存在する巨大なムチン様糖タンパク質、すなわち細胞表面レクチンであり、細胞接着、アポトーシス、細胞増殖および腫瘍進行の制御に関わる細胞外マトリックスの成分である（Ｓｅｅｌｅｎｍｅｙｅｒら（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１６（７）：１３０５−１３１８）。高血清濃度のＣＡ１２５は、重篤な卵巣腺癌に特有である一方、粘液性卵巣癌では上昇しない。ＣＡ１２５は、その正常レベルが、腫瘍を排除しないので、卵巣癌スクリーニングに推奨されていない。しかしながら、ＣＡ１２５の検出は、組織学的に悪性疾患と確認された患者の臨床経過および疾患状態をモニターする際の標準的なツールである。数多くの研究によって、ＥＯＣを有する患者の進行をモニターする際に（Ｂａｓｔら（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ  １３：１７９−１８７；Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎら（１９９９）Ｓｅｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．９：１１７−１２４；Ｍｅｎｏｎら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１２：３９−４２；Ｍｅｙｅｒら（２０００）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８２：１５３５−１５３８）、および癌血清マーカーとして、ＣＡ１２５レベルの有用性が確認された。ＣＡ１２５レベルの上昇は、代表的には、約３ヶ月まで臨床検出を先行する。化学療法中の血清ＣＡ１２５レベルの変化は、疾患の経過と相関する。ＣＡ１２５は、新しい薬物の治験における臨床反応に対する代用マーカーとして用いられる。他方で、ＣＡ１２５は、いくつかの良性の状態でも上昇することが原因で、ＥＯＣの初期診断では有用でない（Ｂａｓｔら（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ  １３：１７９−１８７；Ｍｅｄｅｎら（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ  １３：２３１−２３７）。ＣＡ１２５特異的抗体のＭＡｂ−Ｂ４３．１３（オレゴボマブ（ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ），ＯｖａＲｅｘ  ＭＡｂ−Ｂ４３．１３）は、卵巣癌を有する患者に対する免疫治療薬として臨床試験中だったＭｏｂｕｓら（２００３）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  １８９（１）：２８−３６；Ｅｈｌｅｎら（２００５）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ���ａｎｃｅｒ  １５（６）：１０２３−３４。
【００１０】
３Ａ５および１１Ｄ１０をはじめとした、ある特定の抗ＭＵＣ１６抗体は、特許文献１；２００６年６月１４日出願のＵＳ  Ｓｅｒ．Ｎｏ．１１／４５２，９９０、Ｄｅｎｎｉｓら“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ”（これらの内容が参考として援用される）に開示されている。３Ａ５モノクローナル抗体は、ＯＶＣＡＲ−３  Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析によって４３３ｐＭの親和性で、ＭＵＣ１６ポリペプチドの多数の部位に結合する。３Ａ５および１１Ｄ１０抗ＭＵＣ１６抗体は、アウリスタチン薬物部分ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦに結合体化されてきた。その結合体は、インビトロにおける腫瘍細胞増殖を阻害する（特許文献１）。１１Ｄ１０抗ＭＵＣ１６抗体は、メイタンシノイドＤＭ１薬物部分に結合体化された（特許文献２）。ある特定の抗ＭＵＣ１６抗体バリアントは、システインアミノ酸単位を導入することによってシステインが操作され、ＤＭ１に結合体化されてきた（特許文献３，その内容が参考として援用される）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００７／００１８５１号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／００９２９４０号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
要旨
１つの局面において、本発明は、１つ以上の遊離システインアミノ酸および配列番号９〜４０から選択される配列を含むシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体を包含する。システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、ＭＵＣ１６ポリペプチドに結合する。Ｏ７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）ポリペプチドなどの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、当該分野で周知の、例えば、ＷＯ２００７／００１８５１における方法および情報を用いて、システイン改変抗体を作製する際に使用するために調製され得る。システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、親抗ＭＵＣ１６抗体の１つ以上のアミノ酸残基をシステインで置換する工程を包含するプロセスによって調製され得る。
【００１３】
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体の１つ以上の遊離システインアミノ酸残基は、軽鎖または重鎖に位置する。
【００１４】
１つの局面において、本発明は、ＭＵＣ１６タンパク質を含むと疑われるサンプル中の前記タンパク質の存在を判定する方法を包含し、前記方法は、前記サンプルを、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体に曝露する工程、および前記サンプル中の前記抗体の前記ＭＵＣ１６タンパク質への結合を測定する工程を包含し、ここで、その抗体の前記タンパク質への結合は、前記サンプル中の前記タンパク質の存在を示す。
【００１５】
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、裸の抗体（薬物または標識部分に結合体化されていない抗体）または抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）として使用され得る。システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、アウリスタチン薬物部分に共有結合され得、それにより、抗体薬物結合体が形成される。抗体−薬物結合体は、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体（Ａｂ）およびアウリスタチン薬物部分（Ｄ）を含み得、ここで、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、１つ以上の遊離システインアミノ酸を介してリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合され；この複合物は、式Ｉ：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ        Ｉ
を有し、ここで、ｐは、１、２、３または４である。アウリスタチン薬物部分は、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦを含む。
【００１６】
本発明の別の局面は、ＭＵＣ１６ポリペプチドに結合し、１つ以上の遊離システインアミノ酸、配列番号９〜４０から選択される配列を含むシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体（Ａｂ）およびアウリスタチン薬物部分（Ｄ）を含む、抗体−薬物結合体複合物の混合物であり、ここで、そのシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、１つ以上の遊離システインアミノ酸を介してリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合され；この複合物は、式Ｉ：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ        Ｉ
を有し、ここで、ｐは、１、２、３または４であり、平均薬物負荷は、１〜２である。
【００１７】
アウリスタチン薬物部分としては、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦが挙げられる。
【００１８】
本発明の１つの局面は、癌細胞を検出するためのアッセイであり、そのアッセイは：（ａ）細胞を、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体に曝露する工程；および（ｂ）その細胞への、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体複合物の結合の程度を測定する工程を包含する。
【００１９】
本発明の１つの局面は、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体薬物結合体、および薬学的に許容可能な希釈剤、キャリアまたは賦形剤を含む薬学的処方物である。
【００２０】
本発明の１つの局面は、細胞増殖を阻害する方法であり、その方法は、細胞培養液中の哺乳動物の腫瘍細胞を、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体複合物で処理することにより、腫瘍細胞の増殖が阻害される工程を包含する。
【００２１】
本発明の１つの局面は、癌を処置する方法であり、その方法は、患者に上記薬学的処方物を投与する工程を包含する。その患者は、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体複合物とともに化学療法剤を投与され得る。
【００２２】
本発明の１つの局面は、薬学的処方物、容器；および本化合物がＭＵＣ１６ポリペプチドの過剰発現を特徴とする癌を処置するために使用され得ることを示している添付文書またはラベルを備えた製品である。
【００２３】
本発明の１つの局面は、式Ｉの抗体薬物結合体複合物を作製するための方法であり、その方法は、以下の工程：（ａ）システイン改変抗体の操作されたシステイン基をリンカー試薬と反応させて、抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成する工程；および（ｂ）Ａｂ−Ｌを、活性化された薬物部分Ｄと反応させ；それによって、抗体−薬物結合体を形成する工程；または、以下の工程：（ｃ）薬物部分の求核基をリンカー試薬と反応させて、薬物−リンカー中間体Ｄ−Ｌを形成する工程；および（ｄ）Ｄ−Ｌを、システイン改変抗体の操作されたシステイン基と反応させ；それによって、抗体−薬物結合体を形成する工程を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、システイン改変ヒト化抗ＭＵＣ１６抗体であるＡ１１７Ｃチオｈｕ３Ａ５の、重鎖配列：配列番号１および軽鎖配列：配列番号２を示している。
【図２】図２は、システイン改変キメラ抗ＭＵＣ１６抗体であるＡ１１７Ｃチオｃｈ３Ａ５の重鎖配列：配列番号３および軽鎖配列：配列番号４を示している。
【図３】図３は、ヒト化トラスツズマブ軽鎖（ＨｕＴＭＡｂ−ＬＣ、配列番号５）配列と、ヒト化ｓｔｄ３Ａ５抗ＭＵＣ１６軽鎖（Ｈｕ３Ａ５−ＬＣ，配列番号２）配列と、キメラｓｔｄ３Ａ５抗ＭＵＣ１６軽鎖（Ｃｈ３Ａ５−ＬＣ，配列番号４）配列とのアラインメントを示している。数値は、連続的ナンバリングの慣例に従っている。
【図４】図４は、ヒト化トラスツズマブ重鎖（ＨｕＴＭＡｂ−ＨＣ，配列番号６）配列と、ヒト化ｓｔｄ３Ａ５抗ＭＵＣ１６重鎖（Ｈｕ３Ａ５−ＨＣ，配列番号７）配列と、キメラｓｔｄ３Ａ５抗ＭＵＣ１６重鎖（Ｃｈ３Ａ５−ＨＣ、配列番号８）配列とのアラインメントを示している。数値は、連続的ナンバリングの慣例に従っている。
【図５】図５は、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体薬物結合体（ＡＤＣ）を示しており、ここで、薬物部分は：軽鎖（ＬＣ−ＡＤＣ）；重鎖（ＨＣ−ＡＤＣ）；およびＦｃ領域（Ｆｃ−ＡＤＣ）における操作されたシステイン基に結合している。
【図６ａ】図６ａは：（ｉ）システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体（チオＭａｂ）におけるシステインジスルフィド付加物ならびに鎖間および鎖内ジスルフィドを還元する工程；（ｉｉ）部分的に酸化する工程、すなわち、再酸化することにより、鎖間および鎖内ジスルフィドを再形成する工程；および（ｉｉｉ）再酸化された抗体を薬物−リンカー中間体と結合体化して、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体薬物結合体（ＡＤＣ）を形成する工程を示している。
【図６ｂ】図６ｂは、還元型抗体に対する再酸化の時間経過を示している。トラスツズマブを還元し、ｐＨ５．５において陽イオン交換カラムで精製した。上のパネルａは、時＝０分における、還元型抗体に対する逆相プロファイルを示している。保持時間７分における３つのピークは（左から右へ）：軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）および完全に還元されていない少量のＨＣ＋ＬＣである。精製された還元型抗体をｐＨ７で再酸化し、アリコートを時間の関数としてみた。中央のパネルｂは、軽鎖および重鎖の大部分が、再酸化して、９０分以内に２本のＬＣおよび２本のＨＣを含むインタクトな抗体を形成した（保持時間約１０分のピーク）ことを示している。反応時間１８０分の時点において、インタクトな抗体のさらなる形成は見られなかった（下のパネルｃ）。
【図７ａ】図７ａは、結合体化反応産物の２つのＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィ）クロマトグラムを示している：（上）ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、３．１ａｖｇ．ＭＭＡＥ／３Ａ５，；および（下）チオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、１．５ａｖｇ．ＭＭＡＥ／３Ａ５、ここで、ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５は、３Ａ５と呼ばれる親キメラ抗ＭＵＣ１６抗体であり、チオｃｈ３Ａ５は、システイン改変キメラ抗ＭＵＣ１６  ３Ａ５抗体である。サンプルをブチルＨＩＣ  ＮＰＲカラム上に注入し、０．８ｍｌ／分での０〜７０％Ｂの線形勾配で溶出した（緩衝液Ａ：５０ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ７中の１．５Ｍ硫酸アンモニウム、緩衝液Ｂ：５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７、２０％イソプロパノール）。多波長検出器およびＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣシステムを用いることにより、その抗体中の抗体種を解明し、定量化した。ピークの識別をＬＣ／ＭＳ解析に基づいて割り当てた。ＤＡＲ値は、対応するピークに対して示されている。
【図７ｂ】図７ｂは、図７ａにおける解析の条件下での、より大きいスケールのチオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ結合体化反応のＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィ）クロマトグラムを示しており、ここで、平均薬物負荷値は、１．９だった。
【図８ａ】図８ａは、還元および脱グリコシル化後の結合体化反応産物の質量分析を示している：（上）ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ；および（下）チオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ。
【図８ｂ】図８ｂは、ＴＤＣ−Ｆａｂへの細胞傷害性薬物結合についての抗体領域のマッピングを示している。上のパネル（ａ）は、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ−結合体化Ｆａｂの、還元され変性された軽鎖部分および重鎖部分の２８０ｎｍ吸光度スペクトルを示している。中央のパネル（ｂ）の一部における軽鎖および下のパネル（ｃ）の一部における重鎖のデコンボリューションされた質量（Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ  ｍａｓｓ）は、重鎖のみにおける薬物標識と一致する。（ｃ）において観察された２４１８９の質量は、その薬物の特徴的な断片化であるＭＭＡＥ−ＣＯ２の損失（−７６２ダルトン）に起因する。
【図８ｃ】図８ｃは、ＴＤＣ−Ｆａｂにおける細胞傷害性薬物を含むペプチドの同定、すなわち、ペプチドマッピングを示している。未結合体化（上のパネルａ）および結合体化（中央のパネルｂ）チオ−３Ａ５およびＴＤＣのペプチドマップは、マレイミジル化され（ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌａｔｅｄ）精製されたＦａｂのトリプシン消化物から得られた。ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥで標識されたペプチドは、高い疎水性を有し、クロマトグラムの後のほうで溶出されると予想される。４つの薬物−結合体化ペプチド（＊で標識されたもの）が、勾配の終わりに溶出した。それらはまた、すべてのＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ含有質量スペクトルにおいて観察される特徴的なインソースフラグメンテーションイオン（ｍ／ｚ７１８．５）によって、ペプチドを含む細胞傷害性薬物として同定され得る。下のパネル（ｃ）は、未結合体化消化物および結合体化消化物から抽出されたイオンクロマトグラムを重ねたものを示している。最も強いピークは、結合体消化物の後のほうの溶出ピークと一致する。４つすべてのピークが、Ｆａｂ−ＨＣの１１４位における変異されたシステイン周辺に位置する完全または部分的なトリプシン切断フラグメントと同定された。２９．０５分の主要なピークにおけるｍ／ｚイオンをデコンボリューションすることにより、３９６２ダルトンという質量が得られ、それは、ペプチドＨＣ９９−１２０＋１薬物に対して予想された質量であった。薬物含有ペプチド質量は、そのタンパク質の他の任意の領域にマッピングしなかった。上のパネル（ａ）の矢印で示されたピークは、マレイミド標識ペプチドＨＣ９９−１２０である。
【図９】図９は、標準的なヒト化３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥ結合体（ｓｔｄ  ｈｕ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥ）および対応するチオ結合体（チオｈｕ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥ）の２つの調製物のタンデム型液体クロマトグラフィおよび質量分光（ＬＣ−ＭＳ）解析によって検出された主要な種を要約している。鎖間ジスルフィド結合を破壊する還元条件下（「還元（ＤＴＴ）」）および天然の条件下（「インタクト」）で、タンパク質を解析した。
【図１０】図１０は、（Ａ）ｓｔｄ  ｈｕ３Ａ５（ｖ４ｂ．５２）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，３．５ＭＭＡＥ／Ａｂ負荷，ＰＣ３／ＭＵＣ１６；（Ｂ）チオｈｕ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，１．９ＭＭＡＥ／Ａｂ負荷，ＰＣ３／ＭＵＣ１６；（Ｃ）チオｈｕ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，１．６０ＭＭＡＥ／Ａｂ負荷，ＰＣ３／ＭＵＣ１６；（Ｄ）ｓｔｄ  ｈｕ３Ａ５（ｖ４ｂ．５２）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，３．５ＭＭＡＥ／Ａｂ負荷，親ＰＣ３；（Ｅ）チオｈｕ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，１．９ＭＭＡＥ／Ａｂ負荷，親ＰＣ３；および（Ｆ）チオｈｕ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，１．６０ＭＭＡＥ／Ａｂ負荷，親ＰＣ３を含む０．１〜１００００ｎｇのＡＤＣ／ｍｌという様々な濃度で処理したＭＵＣ１６を発現する腫瘍細胞（ＰＣ３／ＭＵＣ１６）および発現しない腫瘍細胞（親ＰＣ３）を用いたインビトロ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示している。ＡＤＣを含まない培地を与えられた細胞からのデータを０．４６ｎｇ／ｍＬにプロットした。Ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５は、３Ａ５と呼ばれる親キメラ抗ＭＵＣ１６抗体であり、チオｃｈ３Ａ５は、システイン改変キメラ抗ＭＵＣ１６  ３Ａ５抗体である。
【図１１】図１１は、（Ａ）ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，３．１ＭＭＡＥ／Ａｂ負荷、ＰＣ３／ＭＵＣ１６細胞；（Ｂ）チオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，１．６ＭＭＡＥ／Ａｂ負荷，ＰＣ３／ＭＵＣ１６細胞（Ｃ）ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，３．１ＭＭＡＥ／Ａｂ負荷，ＰＣ３／ｎｅｏ細胞；（Ｄ）チオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，１．６ＭＭＡＥ／Ａｂ負荷，ＰＣ３／ｎｅｏ細胞（Ｅ）ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，３．１ＭＭＡＥ／Ａｂ負荷，ＯＶＣＡＲ−３細胞；（Ｆ）チオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ，１．６ＭＭＡＥ／Ａｂ負荷，ＯＶＣＡＲ−３細胞を含む１．４〜９０００ｎｇのＡＤＣ／ｍｌという様々な濃度で処理した腫瘍細胞を用いたインビトロ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示している。Ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５は、３Ａ５と呼ばれる親キメラ抗ＭＵＣ１６抗体であり、チオｃｈ３Ａ５は、システイン改変キメラ抗ＭＵＣ１６  ３Ａ５抗体である。ＡＤＣを含まない培地を与えられた細胞からのデータを０．４６ｎｇ／ｍＬにプロットする。
【図１２】図１２は、全抗体およびＡＤＣを測定することによる、ラットに０．５ｍｇ／ｋｇの：チオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥおよびｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを単回投与した後の経時的な血漿クリアランスの薬物動態学的なプロットを示している。
【図１３】図１３は、好中球（左上）、血清ＡＳＴ（右上）および血小板（右下）の測定による、ラットにおける１９３４μｇ／ｍ２での細胞傷害性薬物の曝露におけるｃｈ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥおよびチオｃｈ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥの毒性を示している。
【図１４】図１４は、ビヒクル（スクシネート緩衝液）；２４．１９ｍｇ／ｋｇ＝１９３４μｇ／ｍ２  ｃｈ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥ；４９．９９ｍｇ／ｋｇ＝１９３４μｇ／ｍ２  チオｃｈ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥを投薬されたラット（６／群）の経時的な体重の変化を示している。
【図１５】図１５は、ビヒクル（１０ｍＬ／ｋｇスクシネート緩衝液）；６ｍｇ／ｋｇ＝３２８μｇ／ｍ２  ｓｔｄ  ｈｕ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、３．５  ＭＭＡＥ／Ａｂ負荷；または６ｍｇ／ｋｇ＝１５０μｇ／ｍ２  チオｈｕ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、１．６ＭＭＡＥ／Ａｂ負荷という単一用量を投与した後のＯＶＣＡＲ−３乳房脂肪パッドを有するＳＣＩＤベージュマウスにおける経時的なインビボでの平均腫瘍体積の変化を示している。
【図１６】図１６は、Ａ）ビヒクル（ＰＢＳ）；Ｂ）ＡＤＣ緩衝液；Ｃ）ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、１．５ｍｇ／ｋｇ；Ｄ）ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、３．０ｍｇ／ｋｇ；Ｅ）ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、６．０ｍｇ／ｋｇ；Ｆ）チオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、１．５ｍｇ／ｋｇ；Ｇ）チオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、３．０ｍｇ／ｋｇ；Ｈ）チオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、６．０ｍｇ／ｋｇという単一用量を投与した後のＯＶＣＡＲ−３乳房脂肪パッド腫瘍を有するＳＣＩＤベージュマウスにおける経時的なインビボでの平均腫瘍体積の変化を示している。
【図１７】図１７は、１２００μｇ／ｍ２薬物（５．９ｍｇ／ｋｇ抗体）という薬物曝露で、標準的な抗ＭＵＣ１６−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣを；および１２００、２４００および３６００μｇ／ｍ２という薬物曝露で、チオ抗ＭＵＣ１６−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣ（ＴＤＣ）を１日目および２２日目に投薬されたカニクイザルにおける安全性研究のデータを示している。投薬の８、２２（２回目の投薬前）、３２および４３日後に、好中球レベルを測定した。好中球レベルを、所与の時点の、ビヒクルで処置された動物における対応するレベルに対して正規化した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
例示的な実施形態の詳細な説明
ここで、本発明のある特定の実施形態について詳細に言及し、その実施形態の例は、添付の構造および式に図示される。本発明は、列挙される実施形態とともに説明されるが、本発明がそれらの実施形態に限定されると意図されないことが理解されるだろう。それどころか、本発明は、すべての代替物、改変物および等価物を包含すると意図され、それらは、請求項に定義されるような本発明の範囲内に含められ得る。
【００２６】
当業者は、本発明の実施において使用され得る、本明細書中に記載されるものと類似または等価な多くの方法および材料を認識するだろう。本発明は、記載される方法および材料に決して限定されない。
【００２７】
定義
別段定義されない限り、本明細書中で使用される専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有し、それは：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；およびＪａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋと一致するものである。
【００２８】
本明細書中における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを特に包含する（Ｍｉｌｌｅｒら（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０：４８５４−４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラであり得るか、または他の種由来であり得る。抗体は、特異的な抗原を認識し、その抗原に結合することができるタンパク質である（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。標的抗原は、一般に、多数の抗体上のＣＤＲによって認識される、エピトープとも呼ばれる数多くの結合部位を有する。異なるエピトープに特異的に結合する各抗体は、異なる構造を有する。したがって、１つの抗原が、それに対応する２つ以上の抗体を有し得る。抗体は、完全長免疫グロブリン分子、または完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な一部、すなわち、目的の標的の抗原またはその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を包含し、そのような標的としては、癌細胞または自己免疫疾患に関連する自己免疫性抗体を産生する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。免疫グロブリンは、任意の種（例えば、ヒト、マウスまたはウサギ）由来であり得る。様々なクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，７１頁およびＣｈａｐｔｅｒ６を参照のこと。
【００２９】
「抗体フラグメント」は、完全長抗体の一部、一般に、その抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；鎖状抗体；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）（ＵＳ５６４１８７０、実施例２；Ｚａｐａｔａら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２）；Ｏｌａｆｓｅｎら（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌ．１７（４）：３１５−３２３）、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、および癌細胞抗原、ウイルス抗原または微生物の抗原に免疫特異的に結合する上記のもののいずれかのエピトープ結合フラグメント、一本鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００３０】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用されるとき、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、その集団を構成する個別の抗体は、微量で存在することがある天然に存在し得る変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の抗体によって汚染されずに合成され得るという点で有利である。修飾語「モノクローナル」とは、抗体の実質的に均一な集団から得られているという抗体の特性を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の作製が必要であると解釈されるべきでない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって初めて報告されたハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば：ＵＳ４８１６５６７；ＵＳ５８０７７１５を参照のこと）によって作製されてもよい。モノクローナル抗体はまた、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７に記載されている手法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００３１】
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメイン（ＣＨおよびＣＬ）の配列を相同なマウス配列と置き換えることによって（ＵＳ４８１６５６７；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンコード配列を、非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）に対するコード配列の全部もしくは一部と融合することによって、キメラ抗体ポリペプチドまたは融合抗体ポリペプチドを作製するように改変され得る。非免疫グロブリンポリペプチド配列を抗体の定常ドメインと置き換え得るか、または抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置き換えることにより、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体が作製される。
【００３２】
「天然抗体」は、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、軽鎖Ｆａｂの可変ドメインならびに定常ドメインと重鎖Ｆａｂの可変ドメインならびに定常ドメインとの間に保持されるいくつかの疎水性相互作用に加えて、１つの共有結合性のジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。重鎖および軽鎖の各々は、規則正しい間隔で鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、いくつかの定常ドメインに続く可変ドメイン（ＶＨ）を一方の端に有する。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他方の端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。
【００３３】
本明細書中のモノクローナル抗体は、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体における対応配列または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一であるか、あるいは相同でありながら、それらの鎖の残りの部分が、別の種に由来する抗体における対応配列または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一であるか、あるいは相同である「キメラ」抗体、ならびに所望の生物学的活性を示す限り、それらの抗体のフラグメントを包含する（ＵＳ４８１６５６７；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５）。本明細書中の目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化された」抗体を包含する。
【００３４】
非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト抗体由来の最小配列を含むキメラ抗体である。大部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の抗体特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類）の超可変領域由来の残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を有し得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、代表的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに相当し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、代表的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含む。Ｆｃフラグメントは、いくつかのアミノ酸残基間のジスルフィドおよび疎水性相互作用によって共に保持されている両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域における配列によって決定され、その領域は、ある特定のタイプの細胞上に見られるＦｃレセプター（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；Ｐｒｅｓｔａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６；Ｓｉｍｓら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１）。他の方法は、特定のサブグループの軽鎖または重鎖のすべてのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワーク領域を使用する（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３）。
【００３５】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有し、そして／または本明細書中に開示されるようなヒト抗体を作製するための手法のいずれかを用いて作製された抗体である。ヒト抗体に関するこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。免疫すると、内因性の免疫グロブリン産生を行わずにヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）が、利用可能である（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら（１９９３）Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３；ＵＳ５５４５８０６；ＵＳ５５６９８２５；ＵＳ５５９１６６９；ＵＳ５５４５８０７；およびＷＯ９７／１７８５２。
【００３６】
本明細書中の「インタクトな抗体」は、ＶＬドメインおよびＶＨドメイン、ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメインのＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む抗体である。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。インタクトな抗体は、１つ以上の「エフェクター機能」を有し得、その機能とは、抗体のＦｃ定常領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に起因しうる生物学的活性のことを指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；およびＢ細胞レセプターなどの細胞表面レセプターのダウンレギュレーションが挙げられる。
【００３７】
用語「アミノ酸配列バリアント」とは、天然配列ポリペプチドとある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドのことを指す。通常、アミノ酸配列バリアントは、天然配列ポリペプチドの少なくとも１つのレセプター結合ドメインまたは天然レセプターの少なくとも１つのリガンド結合ドメインと少なくとも約７０％の配列同一性を有し、好ましくは、そのようなレセプターまたはリガンド結合ドメインと、配列で少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％の相同性である。アミノ酸配列バリアントは、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内のある特定の位置において、置換、欠失および／または挿入を有する。アミノ酸は、従来の名称、１文字および３文字の符号によって明示される。
【００３８】
「配列同一性」は、配列をアラインメントし、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後に同一である、アミノ酸配列バリアント中の残基のパーセンテージと定義される。アラインメントするための方法およびコンピュータプログラムは、当該分野で周知である。そのようなコンピュータプログラムの１つは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成された「Ａｌｉｇｎ２」であり、これは、１９９１年１２月１０日に米国著作権局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ  ２０５５９にユーザー文書とともに提出されたたものであり、そのコードは、ＷＯ２００７／００１８５１に見られる。
【００３９】
用語「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ定常領域に結合するレセプターを意味する。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマレセプター）であり、それらとしては、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターが挙げられ、それらには、これらのレセプターの対立遺伝子変異体および選択的スプライシング型が包含される。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）が包含され、これらは、主に細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン内に免疫受容活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）を含む。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン内に免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＩＭ）を含む（Ｍ．ｉｎ  Ｄａｅｕｒｏｎ（１９９７）“Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．”１５：２０３−２３４を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ（１９９１）“Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ”．，９：４５７−９２；Ｃａｐｅｌら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４；およびｄｅ  Ｈａａｓら（１９９５）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１に概説されている。他のＦｃＲ（将来同定されるものを含む）も、本明細書中において用語「ＦｃＲ」によって包含される。この用語はまた、胎児に母体のＩｇＧを輸送することに関与する新生児レセプターＦｃＲｎ（Ｇｕｙｅｒら（１９７６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１７：５８７およびＫｉｍら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９）も包含する。
【００４０】
用語「可変」とは、可変ドメインのある特定の部分が、抗体間で配列が広範囲に異なり、特定の各抗体のその特定の抗原に対する結合性および特異性において用いられるという事実のことを指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布するものではない。可変性は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方に存在する超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中する。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインの各々は、３つの超可変領域に接続される、大部分はβ−シート配置をとる４つのＦＲを含み、これらは、ループ接続を形成し、いくつかの場合では、β−シート構造の一部を形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲに近接して、かつ他の鎖由来の超可変領域と共に保持され、抗体の抗原−結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照のこと）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与）を示す。
【００４１】
用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」とは、本明細書中で使用されるとき、配列が超可変であり、そして／または構造上明確なループを形成する抗体可変ドメインの領域のことを指す。一般に、抗体は、６つの超可変領域；ＶＨにおいて３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬにおいて３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。いくつかの超可変領域描写が使用され、本明細書中に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づくものであり、最もよく使用される（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））一方で、Ｃｈｏｔｈｉａとは、構造上のループの位置のことを指す（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）。「接触」超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づくものである。これらの超可変領域の各々の残基を以下で述べる。別段示されない限り、タンパク質のアラインメントされた配列のＫａｂａｔデータベースに従うＫａｂａｔナンバリングを用いる（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ（１９７０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１−２５０；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ（２０００）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１）：２１４−２１８）。超可変領域の位置は、一般に、以下の通りである：アミノ酸２４〜３４（ＨＶＲ−Ｌ１）、アミノ酸４９〜５６（ＨＶＲ−Ｌ２）、アミノ酸８９〜９７（ＨＶＲ−Ｌ３）、アミノ酸２６〜３５Ａ（ＨＶＲ−Ｈ１）、アミノ酸４９〜６５（ＨＶＲ−Ｈ２）およびアミノ酸９３〜１０２（ＨＶＲ−Ｈ３）。超可変領域はまた、以下の通り：ＶＬにおけるアミノ酸２４〜３６（Ｌ１）およびアミノ酸４６〜５６（Ｌ２）の「延長された超可変領域」も含み得る。可変ドメイン残基は、これらの定義に各々について、Ｋａｂａｔら、前出に従ってナンバリングされる。本明細書中における目的で、「変更された超可変領域」は、その中に１つ以上の（例えば、１〜約１６個の）アミノ酸置換を含む超可変領域である。本明細書中における目的で、「未改変超可変領域」は、それが由来する非ヒト抗体と同じアミノ酸配列を有する、すなわち、その中に１つ以上のアミノ酸置換を有しない、超可変領域である。
【００４２】
用語「Ｋａｂａｔにおけるような可変ドメイン残基ナンバリング」、「Ｋａｂａｔにおけるようなアミノ酸位置のナンバリング」およびそれらの変形は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）における抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに対して用いられるナンバリングシステムのことを指す。このナンバリングシステムを用いると、実際の線状のアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮物またはそれらへの挿入物に相当する、より少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによれば残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、「標準的な」Ｋａｂａｔでナンバリングされた配列と、抗体の配列相同性の領域においてアラインメントすることによって、所与の抗体について決定され得る。
【００４３】
「結合親和性」とは、一般に、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合性の相互作用の強度の合計のことを指す。別段示されない限り、本明細書中で使用されるとき、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性のことを指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）で表され得る。親和性は、本明細書中に記載される方法をはじめとした当該分野で公知の通常の方法によって測定され得る。低親和性抗体は、一般に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向がある一方、高親和性抗体は、一般に、抗原に速く結合し、長い間、結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が、当該分野で公知であり、それらのいずれもが、本発明の目的で使用され得る。特定の実例となる実施形態を以下で説明する。
【００４４】
「抗原」は、抗体が選択的に結合することができる、所定のポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテンまたは他の天然に存在する化合物もしくは合成の化合物である。
【００４５】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中において定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬフレームワーク配列またはヒト免疫グロブリンＶＨフレームワーク配列の選択において最もよく存在するアミノ酸残基に相当するフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ配列またはヒト免疫グロブリンＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからの選択である。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）におけるようなサブグループである。１つの実施形態において、ＶＬについて、サブグループは、ＫａｂａｔらにおけるようなサブグループカッパーＩである。１つの実施形態において、ＶＨについて、サブグループは、ＫａｂａｔらにおけるようなサブグループＩＩＩである。「ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク」は、Ｋａｂａｔらの可変重鎖サブグループＩＩＩにおけるアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含む。「ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワーク」は、Ｋａｂａｔら可変軽鎖カッパーサブグループＩにおけるアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含む。
【００４６】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、堅固な非共有結合性の会合での、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの超可変領域がＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するように相互作用する。この６つの超可変領域は、一緒になって、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つの超可変領域だけを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識し、抗原に結合する能力を有するが、結合部位全体よりも親和性は低い。
【００４７】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端においていくつかの残基が付加されている点で、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する本明細書中における呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、最初に、Ｆａｂ’フラグメントの対の間にヒンジシステインを有するような対として作製された。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。
【００４８】
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパー（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なるタイプのうちの１つに割り当てられ得る。
【００４９】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖において存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）。
【００５０】
用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントのことを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖において可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に接続された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成することができないくらい短いリンカーを用いることにより、これらのドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対形成せざるを得ず、２つの抗原結合部位が形成される（ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８）。
【００５１】
「遊離システインアミノ酸」とは、親抗体において操作され、チオール官能基（−ＳＨ）を有し、そして分子内または分子間のジスルフィド架橋として対形成されないか、またはそれらのジスルフィド架橋の一部として対形成されないシステインアミノ酸残基のことを指す。
【００５２】
用語「チオール反応性値」は、遊離システインアミノ酸の反応性の定量的な特徴づけである。チオール反応性値は、チオール反応性試薬と反応するシステイン改変抗体における遊離システインアミノ酸のパーセンテージであり、最大値１に変換される。例えば、ビオチン標識抗体を形成するためにチオール反応性試薬（例えば、ビオチン−マレイミド試薬）と１００％収率で反応する、システイン改変抗体上の遊離システインアミノ酸は、１．０というチオール反応性値を有する。チオール反応性試薬と８０％収率で反応する、同じ親抗体または異なる親抗体において操作された別のシステインアミノ酸は、０．８というチオール反応性値を有する。チオール反応性試薬と全く反応しない、同じ親抗体または異なる親抗体において操作された別のシステインアミノ酸は、０というチオール反応性値を有する。特定のシステインのチオール反応性値の測定は、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析、液体クロマトグラフィ、オートラジオグラフィまたは他の定量的な分析試験によって行われ得る。システイン改変抗体の捕捉、ならびにシステイン反応性の比較および定量化を可能にするチオール反応性試薬としては、ビオチン−ＰＥＯ−マレイミド（（＋）−ビオチニル−３−マレイミドプロピオンアミジル−３，６−ジオキサオクタインジアミン、Ｏｄａら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：３７９−３８２，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）ビオチン−ＢＭＣＣ、ＰＥＯ−ヨードアセチルビオチン、ヨードアセチル−ＬＣ−ビオチンおよびビオチン−ＨＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）、ならびにＮα−（３−マレイミジルプロピオニル）ビオシチン（ＭＰＢ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）が挙げられる。ビオチン化、二官能性および多官能性（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）のリンカー試薬に対する他の商業的供給源としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲおよびＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯが挙げられる。
【００５３】
「親抗体」は、１つ以上のアミノ酸残基が１つ以上のシステイン残基で置換されるアミノ酸配列を含む抗体である。親抗体は、天然の配列または野生型配列を含み得る。親抗体は、抗体の他の天然型、野生型または改変型と比べて、既存のアミノ酸配列の改変（例えば、付加、欠失および／または置換）を有し得る。親抗体は、目的の標的抗原、例えば、生物学的に重要なポリペプチドに対するものであり得る。非ポリペプチド抗原（例えば、腫瘍関連糖脂質抗原；ＵＳ５０９１１７８を参照のこと）に対する抗体もまた企図される。
【００５４】
「単離された」抗体は、その天然の環境の成分から同定ならびに分離および／または回収されている抗体である。その天然の環境の夾雑物成分は、抗体に対する診断的または治療的な用途を妨げ得る材料であり、それらとしては、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態において、その抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって測定されるとき、抗体の９５重量％超に、最も好ましくは、９９重量％超に、（２）スピニングカップ配列決定装置を使用することによってＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、または（３）クマシーブルー、もしくは好ましくは、銀染色を用いる、還元条件下もしくは非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一に、精製される。抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離された抗体は、組換え細胞内のインサイチュの抗体を包含する。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００５５】
分子標的または目的の抗原、例えば、ＭＵＣ１６抗原またはＣＡ１２５抗原に「結合する」抗体は、その抗体が、抗原を発現している細胞を標的化する際に有用であるのに十分な親和性で抗原に結合することができる抗体である。その抗体が、ＭＵＣ１６ポリペプチドに結合する抗体である場合、その抗体は、通常、ＭＵＣ１６に優先的に結合し、他のタンパク質と有意に交差反応しない抗体であり得る。そのような実施形態において、これらの非ＭＵＣ１６タンパク質へのその抗体の結合（例えば、内因性レセプターへの細胞表面結合）の程度は、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）解析または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって測定されるとき、ＭＵＣ１６への結合の１０％未満である。
【００５６】
「処置する」または「処置」または「軽減」とは、治療的な処置と、予防的または防止的な措置の両方のことを指し、ここで、その目標は、標的とされる病理学的状態または障害を予防するか、または遅延させる（小さくする）ことである。処置の必要な者としては、障害をすでに有する者、ならびに障害を有する傾向がある者または障害が予防されるべきである者が挙げられる。被験体または哺乳動物は、治療量の抗ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐ抗体（例えば、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体）またはその抗体薬物結合体を本発明の方法に従って投与された後、その患者が、以下：癌細胞の数の減少または癌細胞が存在しなくなること；腫瘍サイズの減少；軟部組織および骨への癌の転移をはじめとした末梢器官への癌細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度の遅延、好ましくは、停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の遅延、好ましくは、停止）；腫瘍成長のある程度の阻害；および／または、特定の癌に関連する症状の１つ以上のある程度の緩和；罹患率および死亡率の低下、ならびに生活の質の問題の改善、の１つ以上の観察可能および／もしくは測定可能な減少、またはそれらが存在しないことを示す場合、ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドを発現する癌に対して首尾よく「処置される」。システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体、またはその抗体薬物結合体が、成長を予防し得る、および／または既存の癌細胞を殺滅し得る限り、それは、細胞分裂抑制性および／または細胞傷害性であり得る。これらの徴候または症状の減少は、患者によっても感じられ得る。疾患の処置および改善の成功を評価するための上記のパラメータは、医師によく知られている日常的な手順によって容易に測定可能である。癌治療では、有効性は、例えば、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）を評価すること、および／または反応率（ＲＲ）を測定することによって、測定され得る。転移は、病期分類試験および骨スキャン、ならびにカルシウムレベルおよび骨への広がりを判定する他の酵素に関する試験によって、測定され得る。ＣＴスキャンはまた、その領域における骨盤およびリンパ節への広がりについて調べるためにも行われ得る。胸部Ｘ線および公知の方法による肝臓酵素レベルの測定は、それぞれ肺および肝臓への転移について調べるために用いられる。疾患をモニタリングするための他の日常的な方法としては、経直腸超音波断層検査（ＴＲＵＳ）および経直腸的針生検（ＴＲＮＢ）が挙げられる。
【００５７】
用語「癌」および「癌性」とは、代表的には、制御されていない細胞成長を特徴とする哺乳動物における生理学的状態のことを指すか、または記述する。「腫瘍」は、１つ以上の癌性細胞を含み、腫瘍とは、新生物細胞の成長および増殖（悪性であるか良性であるかは関係ない）のすべて、ならびに前癌性および癌性の細胞および組織のすべてのことを指す。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病またはリンパ系悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより詳細な例としては、卵巣癌、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化器癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵臓腺癌を含む膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、直腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌ならびに頭頸部癌が挙げられる。
【００５８】
抗原性レセプターを「過剰発現する」癌は、同じ組織タイプの非癌性細胞と比べて、その細胞表面に著しく高いレベルのレセプター（例えば、ＭＵＣ１６）を有する癌である。そのような過剰発現は、遺伝子増幅、または転写もしくは翻訳の増加が原因であり得る。レセプターの過剰発現は、細胞の表面上に存在する高レベルのレセプタータンパク質を評価することによって（例えば、免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣを介して）、診断アッセイまたは予後アッセイにおいて測定され得る。あるいは、またはさらに、レセプターをコードする核酸の細胞内のレベルを、例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；ＷＯ９８／４５４７９を参照のこと）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティングまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法（例えば、リアルタイム定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ））を介して測定してもよい。
【００５９】
用語「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」とは、いくらかの程度の異常な細胞増殖に関連する障害のことを指す。１つの実施形態において、細胞増殖性障害は、癌である。
【００６０】
用語「治療有効量」とは、薬物、例えば、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体薬物結合体または化学療法剤の、哺乳動物において疾患または障害を処置するのに有効な量のことを指す。癌の場合、治療有効量の薬物は、癌細胞の数を減少させ得る；腫瘍サイズを減少させ得る；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害し得る（すなわち、ある程度遅延させ得る、好ましくは、停止し得る）；腫瘍転移を阻害し得る（すなわち、ある程度遅延させ得る、好ましくは、停止し得る）；腫瘍成長をある程度阻害し得る；および／または癌に関連する症状の１つ以上をある程度軽減し得る。その薬物が、成長を妨害し得る、および／または既存の癌細胞を殺滅し得る限り、その薬物は、細胞分裂抑制性および／または細胞傷害性であり得る。用語「細胞分裂抑制性」とは、細胞の機能を制限する効果（例えば、細胞の成長または細胞の増殖の制限）のことを指す。癌治療では、有効性は、例えば、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）を評価すること、および／または反応率（ＲＲ）を測定することによって、測定され得る。
【００６１】
「化学療法剤」は、癌の処置に有用な化合物である。化学療法剤の例としては、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標），Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、スーテント（ｓｕｔｅｎｔ）（ＳＵ１１２４８，Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ）、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標），ＧＳＫ５７２０１６，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ロナファルニブ（ｌｏｎａｆａｒｎｉｂ）（ＳＣＨ６６３３６）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）（ＢＡＹ４３−９００６，Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ．）、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標），Ｒｏｃｈｅ）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））およびゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標），Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロスホスファミド）；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ））；アジリジン（例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ）；アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログのトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン合成アナログ、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）合成アナログおよびビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成アナログを含む）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎｓ）（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログのＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウセロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（ｎｏｖｅ���ｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード）；ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ））；抗生物質（例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９４）３３：１８３−１８６））；ジネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含むジネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；ならびに、ネオカルチノスタチン発色団および関連色素タンパク質のエンジイン抗菌性発色団）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝産物（例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；抗副腎物質（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）（例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄ���ｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル（ｅｎｉｌｕｒａｃｉｌ）；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｓ））；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクォン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２トキシン、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ、パクリタキセルのＣｒｅｍｏｐｈｏｒを含まないアルブミンが操作されたナノ粒子処方物（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎ��）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；および上記のもののいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。
【００６２】
以下：（ｉ）腫瘍に対するホルモン作用を制御するか、または阻害するように作用する抗ホルモン剤（例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）およびＦＡＲＥＳＴＯＮトレミフェンを含む、抗エストロゲンならびに選択的エストロゲンレセプター調節因子（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）（ＳＥＲＭ））；（ｉｉ）副腎におけるエストロゲン産生を制御する、酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビター（例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタニ（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾールおよびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾール）；（ｉｉｉ）抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリン）；ならびにトロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；（ｉｖ）アロマターゼインヒビター；（ｖ）タンパク質キナーゼインヒビター；（ｖｉ）脂質キナーゼインヒビター；（ｖｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な（ａｂｈｅｒａｎｔ）細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの（例えば、ＰＫＣ−アルファ、ＲａｌｆおよびＨ−Ｒａｓ）；（ｖｉｉｉ）リボザイム（例えば、ＶＥＧＦ発現インヒビター（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）およびＨＥＲ２発現インヒビター）；（ｉｘ）ワクチン（例えば、遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチンおよびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン）；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；（ｘ）ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などの抗血管新生剤；および（ｘｉ）上記のもののいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体もまた、「化学療法剤」のこの定義に包含される。
【００６３】
用語「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとして別の細胞に対して作用する、１つの細胞集団によって放出されるタンパク質に対する一般的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカインおよび従来のポリペプチドホルモンである。成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン）；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン（例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ））；肝臓成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトーゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β；ミュラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板成長因子；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリトロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒｓ）；インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ）；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子は、サイトカインに含まれる。本明細書中で使用されるとき、サイトカインなる用語は、天然の供給源または組換え細胞培養物由来のタンパク質および天然配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物を包含する。
【００６４】
用語「標識」は、抗体に共有結合され得：（ｉ）検出可能シグナルを提供する；（ｉｉ）第２標識と相互作用することにより、第１または第２標識によって提供される検出可能なシグナル、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を改変する；（ｉｉｉ）抗原またはリガンドとの相互作用を安定化するか、またはそれらへの結合の親和性を増大させる；（ｉｖ）移動度、例えば電気泳動移動度、または電荷、疎水性、形状もしくは他の物理的パラメータによる細胞透過性影響を及ぼすか、または（ｖ）捕捉部分を提供することにより、リガンド親和性、抗体／抗原結合性、またはイオン性錯体形成を調節する、ように機能する任意の部分のことを意味する。
【００６５】
句「薬学的に許容可能な塩」とは、本明細書中で使用されるとき、ＡＤＣの薬学的に許容可能な有機塩または無機塩のことを指す。例示的な塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸））塩が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能な塩は、別の分子（例えば、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオン）の包含を伴い得る。対イオンは、化合物上の電荷を安定化させる任意の有機部分または無機部分であり得る。さらに、薬学的に許容可能な塩は、その構造内に２つ以上の帯電した原子を有し得る。多数の帯電した原子が薬学的に許容可能な塩の一部である例は、多数の対イオンを有し得る。ゆえに、薬学的に許容可能な塩は、１つ以上の帯電した原子および／または１つ以上の対イオンを有し得る。
【００６６】
「薬学的に許容可能な溶媒和化合物」とは、１つ以上の溶媒分子とＡＤＣとの会合物のことを指す。薬学的に許容可能な溶媒和化合物を形成する溶媒の例としては、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸およびエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
「キャリア」は、本明細書中で使用されるとき、用いられる投薬量および濃度において曝露される細胞または哺乳動物に対して無毒性である薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または安定剤を包含する。生理的に許容可能なキャリアは、水性のｐＨ緩衝液であることが多い。生理的に許容可能なキャリアの例としては、緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸）；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン）；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標））が挙げられる。
【００６８】
以下の省略形が、本明細書中で使用され、示される定義を有する：Ｂｏｃは、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）であり、ｃｉｔは、シトルリン（２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸）であり、ｄａｐは、ドラプロイン（ｄｏｌａｐｒｏｉｎｅ）であり、ＤＣＣは、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドであり、ＤＣＭは、ジクロロメタンであり、ＤＥＡは、ジエチルアミンであり、ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドであり、ＤＴＮＢは、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）であり、ＤＴＰＡは、ジエチレントリアミン五酢酸であり、ＤＴＴは、ジチオトレイトールであり、Ｆｍｏｃは、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）であり、ｇｌｙは、グリシンであり、ＨＯＢｔは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、ＨＰＬＣは、高圧液体クロマトグラフィであり、Ｍｔｒは、４−アニシルジフェニルメチル（または４−メトキシトリチル）であり、ＰＡＢは、ｐ−アミノベンジルカルバモイルであり、ＰＢＳは、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７）であり、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールであり、ＭＣは、６−マレイミドカプロイルであり、ｐｈｅは、Ｌ−フェニルアラニンであり、ＳＥＣは、サイズ排除クロマトグラフィであり、ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸であり、ＴＬＣは、薄層クロマトグラフィであり、ＵＶは、紫外線であり、そしてｖａｌは、バリンである。
【００６９】
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体
本発明の複合物は、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体を包含し、ここで、野生型抗ＭＵＣ１６抗体または親抗ＭＵＣ１６抗体の任意の形態の１つ以上のアミノ酸が、システインアミノ酸が置換されている。その操作されたシステインアミノ酸は、遊離システイン酸であり、鎖内または鎖間のジスルフィド単位の一部ではない。任意の形態の抗ＭＵＣ１６抗体が、そのように操作され得る、すなわち、変異され得る。例えば、親Ｆａｂ抗体フラグメントは、本明細書中で「チオＦａｂ」と称される、システイン改変Ｆａｂを形成するように操作され得る。同様に、親モノクローナル抗体は、「チオＭａｂ」を形成するように操作され得る。１つの部位の変異によって、チオＦａｂにおいて１つの操作されたシステイン残基がもたらされるが、チオＭａｂでは、ＩｇＧ抗体の二量体という性質に起因して、１つの部位の変異によって２つの操作されたシステイン残基がもたらされることに注意されるべきである。本発明のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体には、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラモノクローナル抗体、抗体の抗原結合フラグメント、融合ポリペプチドおよび細胞関連ＭＵＣ１６ポリペプチドに優先的に結合するアナログが包含される。
【００７０】
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、野生型の親抗ＭＵＣ１６抗体対応物の抗原結合能力を保持する。したがって、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、Ｙｉｎら、Ｊ．（２００１）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２９）：２７３７１−２７３７５）；ＷＯ２００４０４５５５３（請求項１４）；ＷＯ２００２９２８３６（請求項６；図１２）；ＷＯ２００２８３８６６（請求項１５；１１６−１２１頁）；ＵＳ２００３１２４１４０（実施例１６）他所参照：ＧＩ：３４５０１４６７；ＡＡＫ７４１２０．３；ＡＦ３６１４８６＿１に記載されているようにレセプタータンパク質Ｏ７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ３６１４８６）をはじめとしたＭＵＣ１６抗原に結合することができる。
【００７１】
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、還元型スルフヒドリル（チオール）基を有する１つ以上の遊離システインアミノ酸を含み、ここで、そのシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、ＭＵＣ１６ポリペプチドに結合する。
【００７２】
１つの実施形態において、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、親抗ＭＵＣ１６抗体の１つ以上のアミノ酸残基をシステインで置換する工程を包含するプロセスによって調製される。
【００７３】
置換された（「操作された」）システイン（Ｃｙｓ）残基を有する変異体は、新しく導入された、操作されたシステインチオール基の反応性について評価され得る。チオール反応性値は、０〜１．０の範囲の相対的で数値的な用語であり、任意のシステイン改変抗体について測定され得るものである。本発明のシステイン改変抗体のチオール反応性値は、０．６〜１．０；０．７〜１．０；または０．８〜１．０の範囲であり得る。
【００７４】
１つの局面において、本発明は、（ａ）本明細書中に開示されるような完全長アミノ酸配列を有する、システイン改変抗体、（ｂ）本明細書中に開示されるようなシグナルペプチドを有しない、システイン改変抗体アミノ酸配列、（ｃ）本明細書中に開示されるようなシグナルペプチドを有するか、または有しない、システイン改変膜貫通型抗体タンパク質の細胞外ドメイン、（ｄ）本明細書中に開示される核酸配列のいずれかによってコードされるアミノ酸配列、または（ｅ）本明細書中に開示されるようなシステイン改変完全長抗体アミノ酸配列の、他の任意の明確に定義されたフラグメント、をコードするＤＮＡ分子の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むシステインが操作された単離された抗ＭＵＣ１６抗体に関する。
【００７５】
１つの局面において、本発明は、Ｎ末端のシグナル配列および／または開始メチオニンを有しない、システインが操作された単離された抗ＭＵＣ１６抗体を提供し、記載されるようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。それを作製するためのプロセスもまた本明細書中に記載され、ここで、そのプロセスは、システイン改変抗体の発現に適した条件下で、適切なコード核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する工程、およびその細胞培養物からシステイン改変抗体を回収する工程を包含する。
【００７６】
本発明の別の局面は、膜貫通ドメインが欠失しているか、または膜貫通ドメインが不活性化されている、システインが操作された単離された抗ＭＵＣ１６抗体を提供する。それを作製するためのプロセスもまた本明細書中に記載され、ここで、そのプロセスは、システイン改変抗体の発現に適した条件下で、適切なコード核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する工程、およびその細胞培養物からシステイン改変抗体を回収する工程を包含する。
【００７７】
他の実施形態では、本発明は、異種（非ＭＵＣ１６）ポリペプチドに融合された本明細書中に記載されるシステイン改変抗体のいずれかを含む、システインが操作された単離された抗ＭＵＣ１６キメラ抗体を提供する。そのようなキメラ分子の例には、異種ポリペプチド（例えば、エピトープタグ配列または免疫グロブリンのＦｃ領域）に融合された、本明細書中に記載されるシステイン改変抗体のいずれかが包含される。
【００７８】
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体または抗ＭＵＣ１６ポリペプチド抗体の、その各々の抗原性エピトープへの結合を競合的に阻害する抗体であり得る。本発明の抗体は、必要に応じて、例えば、アウリスタチン、抗生物質、放射性同位体、核酸分解酵素などをはじめとした、成長阻害剤（ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）またはトキシンなどの細胞傷害剤に結合体化され得る。本発明の抗体は、必要に応じて、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において産生され得、好ましくは、本発明の抗体が結合する細胞の成長もしくは増殖を阻害し得るか、またはその細胞の死を誘導し得る。診断的な目的で、本発明の抗体は、検出可能に標識され、固体支持体などに結合され得る。
【００７９】
本発明の他の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載されるシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体のいずれかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。そのような任意のベクターを含む宿主細胞もまた提供される。宿主細胞は、例として、ＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞または酵母細胞であり得る。本明細書中に記載されるポリペプチドのいずれかを作製するためのプロセスがさらに提供され、そのプロセスは、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程およびその細胞培養物から所望のポリペプチドを回収する工程を包含する。
【００８０】
親抗ＭＵＣ１６抗体およびシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．に対する２００６年６月１４日出願の“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ”ＷＯ２００７／００１８５１、Ｄｅｎｎｉｓら、ＵＳ  Ｓｅｒ．Ｎｏ．１１／４５２９９０に記載されているＭＵＣ１６ポリペプチドまたはＭＵＣ１６ポリペプチドバリアントに結合し、Ｏ７７２Ｐ、卵巣癌抗原ＣＡ１２５またはＭＵＣ１６ヒト、およびＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ３６１４８６として記載されている。他所参照：ＧＩ：３４５０１４６７；ＡＡＫ７４１２０．３；ＡＦ３６１４８６＿１；Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ｅｎｔｒｙ  Ｑ８ＷＸ１７。
【００８１】
ＭＵＣ１６ポリペプチドバリアントは：（ｉ）完全長天然配列；（ｉｉ）シグナルペプチドを有しないポリペプチド配列；（ｉｉｉ）シグナルペプチドを有するか、もしくは有しない細胞外ドメイン；（ｉｖ）または完全長ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチド配列の他の任意のフラグメント（例えば、完全長ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドに対する完全なコード配列の一部のみを代表する核酸によってコードされるもの）である、ＷＯ２００７／００１８５１に開示されているようなＭＵＣ１６またはＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチド配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドである。そのようなＭＵＣ１６ポリペプチドバリアントとしては、例えば、完全長天然アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端において、１つ以上のアミノ酸残基が、付加されているか、または欠失しているポリペプチドが挙げられる。通常、ＭＵＣ１６ポリペプチドバリアントは、完全長天然配列ＭＵＣ１６ポリペプチド配列、シグナルペプチドを有しないＭＵＣ１６ポリペプチド配列、シグナルペプチドを有するか、もしくは有しないＭＵＣ１６ポリペプチドの細胞外ドメイン、または完全長ＭＵＣ１６ポリペプチド配列の他の任意の明確に定義されたフラグメントに対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。通常、ＭＵＣ１６ポリペプチドバリアントは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００アミノ酸長、またはそれ以上である。必要に応じて、ＭＵＣ１６バリアントポリペプチドは、天然のＭＵＣ１６ポリペプチド配列と比べてわずか１つの保存的アミノ酸置換を有するか、あるいは、天然のＭＵＣ１６ポリペプチド配列と比べて、わずか２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の保存的アミノ酸置換を有する。
【００８２】
ＭＵＣ１６ポリペプチドは、：（ｉ）ｐＢＲ３２２ベクターを含むＥ．ｃｏｌｉ；（ｉｉ）ｐＲＫ５ベクターを含む哺乳動物細胞（例えば、ヒトＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１５７３）、ＣＯＳ（サル線維芽細胞、ＳＶ−４０）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）；（ｉｉｉ）酵母（例えば、酵母ＡＢ１１０株）；または（ｉｖ）バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＷＯ２００７／００１８５１）における、組換え発現によって調製され得る。天然または組換えのＭＵＣ１６ポリペプチドは、タンパク質精製の分野における種々の標準的な手法によって精製され得る。例えば、プロ−ＭＵＣ１６ポリペプチド、成熟ＭＵＣ１６ポリペプチドまたはプレ−ＭＵＣ１６ポリペプチドは、目的のＭＵＣ１６ポリペプチドに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィによって精製される。通常、イムノアフィニティーカラムは、活性化されたクロマトグラフィ樹脂に抗ＭＵＣ１６ポリペプチド抗体を共有結合させることによって構築される。ＭＵＣ１６ポリペプチドは、シグナル配列、または成熟タンパク質もしくは成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドであり得る異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換え的に産生され得る。あるいは、ＭＵＣ１６ポリペプチドは、シグナル配列、およびＭＵＣ１６融合ポリペプチドの精製を可能にする異種ポリペプチド配列との融合ポリペプチドとして作製され得る；そのようなポリペプチドの例は、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６またはＨｉｓ８）、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ、ＦＬＡＧエピトープ（ＫＤＹＫＤＤＤＤＫ）およびｇＤエピトープ（ＫＹＡＬＡＤＡＳＬＫＭＡＤＰＮＲＦＲＧＫＤＬＰＶＬ）である。シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入される、抗ＭＵＣ１６抗体もしくはＭＵＣ１６ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部であり得る。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列であり得る。酵母分泌の場合、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  α−因子リーダーを含む（ＵＳ５０１０１８２）、または酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（ＥＰ０３６２１７９）、またはＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物の細胞発現において、哺乳動物のシグナル配列（例えば、同じ種または関連する種の分泌型ポリペプチド由来のシグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー）は、タンパク質の分泌を指示するために使用され得る。
【００８３】
ＭＵＣ１６を発現する細胞は、細胞表面上に、または分泌型として、内在性ＭＵＣ１６ポリペプチド抗原またはトランスフェクトされたＭＵＣ１６ポリペプチド抗原を発現する。ＭＵＣ１６を発現する癌は、細胞表面上に存在するＭＵＣ１６ポリペプチドを有する細胞、またはＭＵＣ１６抗原性ポリペプチドを産生して分泌する細胞を含む。ＭＵＣ１６を発現する癌は、必要に応じて、十分なレベルのＭＵＣ１６ポリペプチドをその細胞の表面上に産生し、その結果、抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体は、それに結合することができ、その癌に対する治療効果を発揮し得る。ＭＵＣ１６ポリペプチドを過剰発現する癌は、その細胞表面に、同じ組織タイプの非癌性細胞と比べて著しく高いレベルのＭＵＣ１６ポリペプチドを有するか、または産生して分泌する癌である。そのような過剰発現は、遺伝子増幅または転写もしくは翻訳の増加が原因であり得る。ＭＵＣ１６ポリペプチドの過剰発現は、細胞の表面上に存在するか、または細胞によって分泌される、高レベルのＭＵＣ１６タンパク質を評価することによって、臨床の設定において測定され得る（例えば、ＭＵＣ１６ポリペプチドをコードする単離された核酸から、組換えＤＮＡ技術を用いて調製され得る単離されたＭＵＣ１６ポリペプチドに対して調製された抗ＭＵＣ１６抗体を用いる免疫組織化学アッセイ；ＦＡＣＳ解析などを介して）。あるいは、またはさらに、例えば、ＭＵＣ１６をコードする核酸またはその相補体に対応する核酸ベースのプローブを用いる蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）；（ＷＯ９８／４５４７９）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティングまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法（例えば、リアルタイム定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ））を介して、細胞内の、ＭＵＣ１６ポリペプチドをコードする核酸またはｍＲＮＡのレベルを測定してもよい。また、例えば、抗体ベースのアッセイ（ＵＳ４９３３２９４；ＷＯ９１／０５２６４；ＵＳ５４０１６３８；Ｓｉａｓら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３２：７３−８０）を用いて、血清などの生体液中の脱落した抗原を測定することによって、ＭＵＣ１６ポリペプチドの過剰発現を検出してもよい。様々な他のインビボアッセイが企図され得る。あるいは、患者の体内の細胞を、検出可能な標識、例えば、放射性同位体で必要に応じて標識された抗体に曝露してもよいし、例えば、放射能に対する外部スキャンまたは事前にその抗体に曝露されていた患者から採取されたバイオプシーの解析によって、その抗体の、患者内の細胞への結合を評価することもできる。
【００８４】
親抗ＭＵＣ１６抗体およびシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、本明細書中に記載されるようなＭＵＣ１６ポリペプチドに結合すること、好ましくは、特異的に結合することができる。ＭＵＣ１６に結合するオリゴペプチドは、周知の手法を用いて過度の実験を行うことなく同定され得る。この点に関して、ポリペプチド標的に特異的に結合することができるオリゴペプチドに対するオリゴペプチドライブラリーについてスクリーニングするための手法が当該分野で周知であることに注意されたい（ＵＳ５５５６７６２；ＵＳ５７５０３７３；ＵＳ４７０８８７１；ＵＳ４８３３０９２；ＵＳ５２２３４０９；ＵＳ５４０３４８４；ＵＳ５５７１６８９；ＵＳ５６６３１４３；ＷＯ８４／０３５０６；ＷＯ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１７８−１８２；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１３０−１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：６１１−６１６（１９８８），Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８）。
【００８５】
本発明の親抗ＭＵＣ１６抗体およびシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体およびヘテロ結合体抗体が包含される。様々な形態のヒト化抗ＭＵＣ１６抗体が企図される。例えば、ヒト化抗体は、Ｆａｂなどの抗体フラグメントであり得る。あるいは、ヒト化抗体は、インタクトなＩｇＧ１抗体などのインタクトな抗体であり得る。
【００８６】
二重特異性抗ＭＵＣ１６抗体は、少なくとも異なる２つのエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗ＭＵＣ１６抗体は、本明細書中に記載されるようなＭＵＣ１６タンパク質の異なる２つのエピトープに結合し得る。他のそのような抗体は、ＭＵＣ１６結合部位と、別のタンパク質に対する結合部位とを組み合わせ得る。あるいは、抗ＭＵＣ１６アームは、細胞防御機構を、ＭＵＣ１６を発現する細胞に集中させ、局在化するために、白血球上のトリガー分子（例えば、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ３）またはＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）））に結合するアームと組み合わされ得る。二重特異性抗体はまた、ＭＵＣ１６を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化させるためにも使用され得る。これらの抗体は、ＭＵＣ１６に結合するアーム、および細胞傷害剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。完全長二重特異性抗体の従来の作製は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づくものであり、ここで、その２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９）。
【００８７】
ヘテロ結合体抗ＭＵＣ１６抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は、２つの共有結合された抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、不必要な細胞に対して免疫系細胞を標的化するために（ＵＳ４６７６９８０）、およびＨＩＶ感染を処置するために提案されている（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）。それらの抗体は、架橋剤が関与する方法をはじめとした、合成タンパク質化学において公知の方法を用いてインビトロで調製され得ることが企図される。
【００８８】
本発明の抗ＭＵＣ１６抗体は、３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（例えば、四価抗体）であり得、それは、その抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に作製され得る。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３つ以上の抗原結合部位を含み得る。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはそれらからなる）。このシナリオでは、その抗体は、Ｆｃ領域、およびそのＦｃ領域に対してアミノ末端の３つ以上の抗原結合部位を含む。本明細書中の好ましい多価抗体は、３〜約８つ、しかし好ましくは４つの、抗原結合部位を含む（またはそれらからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは、２つのポリペプチド鎖）を含み、ここで、そのポリペプチド鎖は、２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、そのポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含み得、ここで、ＶＤ１は、第１可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは、０または１である。例えば、そのポリペプチド鎖は：ＶＨ−ＣＨ１−可撓性リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含み得る。本明細書中の多価抗体は、好ましくは、少なくとも２つ（好ましくは、４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。本明細書中の多価抗体は、例えば、約２〜約８個の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。本明細書中で企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、必要に応じて、ＣＬドメインをさらに含む。
【００８９】
抗ＭＵＣ１６抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域内に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって改変され得る。そのような改変は、抗ＭＵＣ１６抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害（ｃｙｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強し得る。このように作製されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力、ならびに／または増大された補体媒介性細胞殺滅および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２を参照のこと。抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体抗ＭＵＣ１６抗体もまた、Ｗｏｌｆｆら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製され得る。あるいは、二重Ｆｃ領域を有する抗体が操作され得、それにより、補体溶解およびＡＤＣＣ能力が増強され得る（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら（１９８９）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０）。
【００９０】
抗ＭＵＣ１６抗体の血清半減期は、サルベージレセプター結合エピトープ、例えば、抗体フラグメント（ＵＳ５７３９２７７）を組み込むことによって調節され得る。本明細書中で使用されるとき、用語「サルベージレセプター結合エピトープ」とは、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期の延長に関与する、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープのことを指す。
【００９１】
３Ａ５をはじめとした、ＭＵＣ１６エピトープに結合するモノクローナル抗体は、蛍光を定量化するＰＡＮＤＥＸＴＭ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｍａｃｈｉｎｅ（Ｆｅｎｄｌｙら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５５０−１５５８）を用いる、ＭＵＣ１６を発現するように操作されたインタクトなＰＣ３細胞上の直接蛍光による相互阻止（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）研究をはじめとした標準的な競合的結合解析およびエピトープマッピング（ＷＯ２００７／００１８５１）によって測定される。モノクローナル抗体３Ａ５の、ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡ−４３２およびＳＫ−ＯＶ−３細胞に対する結合を、標準的なフローサイトメトリー解析によって測定した結果、それは、標準的な定量的ＰＣＲ解析によって測定されたときの、これらの３つの特定の細胞株の各々において発現されるＭＵＣ１６  ｍＲＮＡの発現レベルに対応した。より詳細には、標準的な定量的ＰＣＲ解析によって測定されるとき、ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡ−４３２およびＳＫ−ＯＶ−３細胞は、それぞれ高レベル、中レベルおよび低レベルのＭＵＣ１６  ｍＲＮＡを発現する。フローサイトメトリー解析は、モノクローナル抗ＭＵＣ１６抗体３Ａ５が、定量的に結合し、それらの細胞株内に存在するＭＵＣ１６  ｍＲＮＡの相対量に対応することを示した。
【００９２】
図３は、ヒト化トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２）軽鎖配列（ＨｕＴＭＡｂ−ＬＣ、配列番号５）と、ヒト化ｓｔｄ（標準、親）３Ａ５抗ＭＵＣ１６軽鎖配列（Ｈｕ３Ａ５−ＬＣ，配列番号２）と、キメラｓｔｄ（標準、親）３Ａ５抗ＭＵＣ１６軽鎖配列（Ｃｈ３Ａ５−ＬＣ，配列番号４）（ＷＯ２００７／００１８５１、参考として援用される）とのアラインメントを示している。数値は、連続的ナンバリングの慣例に従っている。
【００９３】
図４は、ヒト化トラスツズマブ重鎖配列（ＨｕＴＭＡｂ−ＨＣ，配列番号６）と、ヒト化ｓｔｄ３Ａ５抗ＭＵＣ１６重鎖配列（Ｈｕ３Ａ５−ＨＣ，配列番号７）と、キメラｓｔｄ３Ａ５抗ＭＵＣ１６重鎖配列（Ｃｈ３Ａ５−ＨＣ、配列番号８）（ＷＯ２００７／００１８５１、参考として援用される）とのアラインメントを示している。数値は、連続的ナンバリングの慣例に従っている。標識が付けられている配列中の番号２８１位は、実際は２７８位である（Ｋａｂａｔ２７５；Ｅｕ２７９）。
【００９４】
免疫組織化学解析は、３Ａ５モノクローナル抗体を用いて行われた（ＷＯ２００７／００１８５１；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ３．１６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９７）。モノクローナル抗体３Ａ５は、２０個中１６個のヒト類内膜腺癌腫瘍サンプルに、２５個中２４個のヒト漿液性卵巣嚢胞腺癌サンプルおよび１０個中５個のヒト明細胞卵巣腫瘍サンプルに強く結合する。
【００９５】
モノクローナル抗体３Ａ５は、その抗体が細胞表面上のＭＵＣ１６ポリペプチドに結合する細胞内に内部移行する。具体的には、ＯＶＣＡＲ−３細胞を、モノクローナル抗体３Ａ５および蛍光デキストランとともに１８時間インキュベートし、次いで、フルオレセイン標識抗３Ａ５抗体を用いて、細胞関連３Ａ５を定量的に検出した。これらの解析は、抗体３Ａ５が、デキストランとともに共局在化することを証明し、このことから、インキュベートされた細胞の細胞内成分（これらの細胞のリソソーム区画を含む）への３Ａ５抗体の輸送が示唆される。
【００９６】
抗ＭＵＣ１６抗体の改変
本明細書中に記載される抗ＭＵＣ１６抗体における改変および変形は、例えば、保存的変異および非保存的変異に対して当該分野で公知の手法およびガイドラインのいずれか、例えば、ＵＳ５３６４９３４におけるものを用いて作製され得る。変形は、天然配列の抗ＭＵＣ１６抗体と比べて、アミノ酸配列を変化させた抗体またはポリペプチドをコードする１つ以上のコドンの置換、欠失または挿入であり得る。必要に応じて、変形は、抗ＭＵＣ１６抗体のドメインの１つ以上における他の任意のアミノ酸による、少なくとも１つのアミノ酸の置換による。変形は、当該分野で公知の方法（例えば、オリゴヌクレオチド媒介性（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニングおよびＰＣＲ突然変異誘発）を用いて行われ得る。部位特異的突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１；Ｚｏｌｌｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７）、カセット突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓら（１９８５）Ｇｅｎｅ，３４：３１５）、制限部位選択突然変異誘発（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｗｅｌｌｓら（１９８６）Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５）または他の公知の手法が、抗ＭＵＣ１６抗体バリアントＤＮＡを作製するために、クローニングされたＤＮＡにおいて行われ得る。アミノ酸の変更は、抗ＭＵＣ１６抗体の翻訳後プロセスを変化させ得る（例えば、グリコシル化部位の数もしくは位置を変更し得るか、または膜アンカー特性を変化させ得る）。他の改変としては、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基へのアミド分解、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン側鎖、アルギニン側鎖およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，（１９８３）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端のアミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端のカルボキシル基のアミド化が挙げられる。抗ＭＵＣ１６抗体は、適切なヌクレオチドの変更をコードＤＮＡに導入すること、および／または化学合成によって調製され得る。
【００９７】
抗ＭＵＣ１６抗体フラグメントは、例えば、完全長抗ＭＵＣ１６抗体と比べると、Ｎ末端またはＣ末端において切断されていることがあるか、または内部残基を欠いていることがある。ある特定のフラグメントは、抗ＭＵＣ１６抗体の所望の生物学的活性にとって必須でないアミノ酸残基を欠いている。抗ＭＵＣ１６抗体フラグメントは、いくつかの従来の手法のいずれかによって調製され得る。所望のペプチドフラグメントは、化学的に合成され得る。代替のアプローチは、酵素的消化による、例えば、特定のアミノ酸残基によって規定される部位でタンパク質を切断すると知られている酵素でタンパク質を処理することによるか、または適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望のフラグメントを単離することによる、抗体フラグメントの作製を含む。なおも別の適当な手法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望の抗体またはフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントの単離および増幅を含む。ＤＮＡフラグメントの所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドが、ＰＣＲにおける５’および３’プライマーに使用される。好ましくは、抗ＭＵＣ１６抗体フラグメントは、少なくとも１つの生物学的活性および／または免疫学的活性を、本明細書中に開示される天然の抗ＭＵＣ１６抗体と共有する。
【００９８】
特に好ましいタイプの置換バリアントは、ヒト化抗体またはヒト抗体の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。一般に、さらなる発展のために選択され、得られるバリアントは、それらをもたらす抗体と比べて、生物学的特性が改善されている。そのような置換バリアントを作製するための簡便な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟を含む。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７個の部位）が変異されて、各部位において起き得るすべてのアミノ置換が作製される。そのように作製された抗体バリアントは、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として、繊維状ファージ粒子から一価の様式でディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイされたバリアントを、本明細書中に開示されるようなその生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための超可変領域部位の候補を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を行うことにより、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基が同定され得る。あるいは、またはさらに、その抗体とヒトＭＵＣ１６ポリペプチドとの接触点を同定するために、抗原抗体複合体の結晶構造を解析することが有益であり得る。そのような接触残基および隣接残基が、本明細書中に詳しく述べられる手法に従う置換に対する候補である。いったん、そのようなバリアントが作製されると、バリアントのパネルは、本明細書中に記載されるようなスクリーニングに供され、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体は、さらなる発展のために選択され得る。
【００９９】
本発明の範囲内に包含される抗ＭＵＣ１６抗体の別のタイプの共有結合性の改変は、天然配列の抗ＭＵＣ１６抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失させることによって（化学的および／もしくは酵素的手段によって、潜在するグリコシル化部位を除去するか、またはグリコシル化を欠失させることによって）その抗体またはポリペプチドの天然のグリコシル化パターンを変更すること、および／または天然配列の抗ＭＵＣ１６抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを含む。さらに、改変は、存在する様々な炭水化物部分の性質および割合の変更を含む、天然のタンパク質のグリコシル化における定性的な変更を含む。抗体および他のポリペプチドのグリコシル化は、代表的には、Ｎ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合のことを指す。トリペプチド配列の、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的な結合に対する認識配列である。したがって、ポリペプチド内にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することによって、潜在的なグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはトレオニンへの、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの結合のことを指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用してもよい。抗ＭＵＣ１６抗体へのグリコシル化部位の付加は、その抗体が、上記のトリペプチド配列（Ｎ結合型グリコシル化部位用）の１つ以上を含むようにアミノ酸配列を変更することによって都合よく達成される。その変更はまた、抗ＭＵＣ１６抗体の配列への１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基の付加または置換（Ｏ結合型グリコシル化部位用）によっても行われ得る。抗ＭＵＣ１６抗体のアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルにおける変更を介して、特に、抗ＭＵＣ１６抗体をコードするＤＮＡを、予め選択された塩基において変異させることによって、必要に応じて変更され得、所望のアミノ酸に翻訳するコドンがもたらされ得る。
【０１００】
抗ＭＵＣ１６抗体上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、そのポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的な結合によるものである。そのような方法は、当該分野において、例えば、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）において説明されている。
【０１０１】
抗ＭＵＣ１６抗体上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的もしくは酵素的に、またはグリコシル化に対する標的として機能するアミノ酸残基をコードするコドンの変異性置換によって、達成され得る。化学的な脱グリコシル化手法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）によって説明されている。炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって説明されているような種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
【０１０２】
抗ＭＵＣ１６抗体の別のタイプの共有結合性の改変は、その抗体またはポリペプチドを種々の非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシエチレンアルキルのうちの１つに、ＵＳ４６４０８３５；ＵＳ４４９６６８９；ＵＳ４３０１１４４；ＵＳ４６７０４１７；ＵＳ４７９１１９２またはＵＳ４１７９３３７に示されている様式で連結することを含む。その抗体またはポリペプチドはまた、例えば、コアセルベーション手法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセル）、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョン内に封入され得る。そのような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。
【０１０３】
本発明の抗ＭＵＣ１６抗体はまた、別の異種ポリペプチド配列または異種アミノ酸配列に融合された抗ＭＵＣ１６抗体を含むキメラ分子を形成する方法で改変され得る。１つの実施形態において、そのようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの、抗ＭＵＣ１６抗体の融合物を含む。そのエピトープタグは、一般に、抗ＭＵＣ１６抗体のアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。そのようなエピトープタグ化型の抗ＭＵＣ１６抗体の存在は、そのタグポリペプチド対する抗体を用いて検出され得る。また、エピトープタグが提供されることによって、抗ＭＵＣ１６抗体が、抗タグ抗体またはそのエピトープタグに結合する別のタイプの親和性マトリックスを用いる親和性精製によって容易に精製されることが可能になる。様々なタグポリペプチドおよびそれらの各々の抗体は、当該分野で周知である。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５）；ｃ−ｍｙｃタグならびにそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら（１９８５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６）；および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３）が挙げられる。他のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇペプチド（Ｈｏｐｐら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４−１２１０）；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４）；α−チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６）；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７）が挙げられる。
【０１０４】
代替の実施形態では、キメラ分子は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域と抗ＭＵＣ１６抗体との融合物を含み得る。キメラ分子（「イムノアドヘシン」とも称される）の二価の形態の場合、そのような融合物は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。Ｉｇ融合物は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、可溶型（膜貫通ドメイン欠失型または不活性化型）の抗ＭＵＣ１６抗体の置換を含む。特に好ましい実施形態において、免疫グロブリン融合物は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、またはＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む（ＵＳ５４２８１３０）。
【０１０５】
抗ＭＵＣ１６抗体の調製
本発明のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体および親抗ＭＵＣ１６抗体のアミノ酸配列バリアントをコードするＤＮＡは、種々の方法によって調製され、その方法としては、そのポリペプチドをコードする、予め調製されていたＤＮＡの、天然の供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列バリアントの場合）、部位特異的（またはオリゴヌクレオチド媒介性）突然変異誘発による調製（Ｃａｒｔｅｒ（１９８５）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３；Ｈｏら（１９８９）Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）７７：５１−５９；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８；Ｌｉｕら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２０２５２−２０２６０）、ＰＣＲ突然変異誘発（Ｈｉｇｕｃｈｉ，（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１７７−１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｉｔｏら（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０２：６７−７０；Ｂｅｒｎｈａｒｄら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１２６−１３２；およびＶａｌｌｅｔｔｅら（１９８９）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７２３−７３３）およびカセット突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓら（１９８５）Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３）が挙げられるが、これらに限定されない。突然変異誘発プロトコル、キットおよび試薬は、市販されており、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）である。単一突然変異もまた、二本鎖プラスミドＤＮＡをＰＣＲベースの突然変異誘発（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｚｏｌｌｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００）による鋳型として用いるオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によってもたらされる。組換え抗体のバリアントは、制限フラグメント操作、または合成オリゴヌクレオチドを用いるオーバーラップ伸長ＰＣＲによっても構築され得る。変異原性プライマーは、システインコドン置換をコードする。標準的な突然変異誘発の手法は、そのようなシステインが操作された変異体抗体をコードするＤＮＡを生成するために使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３）。
【０１０６】
ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３）を用いることにより、免疫されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから抗ＭＵＣ１６ヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロにおいて作製することができる。この手法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなどの繊維状バクテリオファージの主要かまたは主要でないコートタンパク質遺伝子にインフレームでクローニングし、そのファージ粒子の表面上に機能的な抗体フラグメントとしてディスプレイさせる。その繊維状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、その抗体の機能的特性に基づいて選択することによってもまた、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択される。したがって、そのファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する（Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４；ＵＳ５５６５３３２；ＵＳ５５７３９０５；ＵＳ５５６７６１０；ＵＳ５２２９２７５）。
【０１０７】
抗ＭＵＣ１６抗体は、公知のオリゴペプチド合成法を用いて化学的に合成されてもよいし、組換え技術を用いて調製され、精製されてもよい。固相の手法を用いて直接ペプチド合成することによって、適切なアミノ酸配列またはその一部を作製してもよい（Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（１９６９）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４）。手動の手法を用いるか、または自動化によって、インビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動化された固相合成は、例えば、ｔ−ＢＯＣまたはＦｍｏｃで保護されたアミノ酸を使用し、製造者の指示書を用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、達成され得る。抗ＭＵＣ１６抗体またはＭＵＣ１６ポリペプチドの様々な部分が、化学的に別々に合成され得、化学的または酵素的な方法を用いて組み合わされて、所望の抗ＭＵＣ１６抗体またはＭＵＣ１６ポリペプチドが生成され得る。
【０１０８】
抗体フラグメントの生成のために、様々な手法が開発されている。従来、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して得た（Ｍｏｒｉｍｏｔｏら（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７；およびＢｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１）かまたは、組換え宿主細胞によって直接産生された。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗ＭＵＣ１６抗体フラグメントはすべて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、Ｅ．ｃｏｌｉから分泌され得るので、容易に大量のこれらのフラグメントを生成することができる。抗体フラグメントは、本明細書中で述べられる抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的に結合することにより、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが形成され得る（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７）か、または組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗ＭＵＣ１６抗体は、（ｓｃＦｖ）一本鎖Ｆｖフラグメントであり得る（ＷＯ９３／１６１８５；ＵＳ５５７１８９４；ＵＳ５５８７４５８）。抗ＭＵＣ１６抗体フラグメントは、「鎖状抗体」でもあり得る（ＵＳ５６４１８７０）。そのような鎖状抗体フラグメントは、単一特異性であってもよいし、二重特異性であってもよい。
【０１０９】
以下の説明は、主に、抗ＭＵＣ１６抗体をコードする核酸を含むベクターで形成転換またはトランスフェクトされた細胞を培養することによる抗ＭＵＣ１６抗体の産生に関する。抗ＭＵＣ１６抗体をコードするＤＮＡは、抗ＭＵＣ１６抗体ｍＲＮＡを有し、かつそれを検出可能なレベルで発現すると考えられている組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得られることがある。したがって、ヒト抗ＭＵＣ１６抗体またはＭＵＣ１６ポリペプチドのＤＮＡは、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから都合よく得ることができる。抗ＭＵＣ１６抗体をコードする遺伝子はまた、ゲノムライブラリーから得てもよいし、公知の合成手順（例えば、自動化核酸合成）によって得てもよい。
【０１１０】
ライブラリーは、目的の遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（例えば、少なくとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド）を用いてスクリーニングされ得る。選択されたプローブを用いたｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、標準的な手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているもの）を用いて行われ得る。抗ＭＵＣ１６抗体またはＭＵＣ１６ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する代替の手段は、ＰＣＲ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５）である。
【０１１１】
抗ＭＵＣ１６抗体またはＭＵＣ１６ポリペプチドの産生用の、本明細書中に記載されている発現ベクターまたはクローニングベクターで宿主細胞をトランスフェクトするかまたは形成転換し、そしてその宿主細胞を、プロモーターを誘導するためか、形質転換体を選択するためか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、必要に応じて改変された従来の栄養培地中で培養する。培養条件（例えば、培地、温度、ｐＨなど）は、過度の実験を行うことなく当業者によって選択され得る。一般に、細胞培養の生産性を最大するための原理、プロトコルおよび実際の手法は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，ｅｄ．（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前出に見られる。
【０１１２】
本明細書中のベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に適した宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞または高等真核生物細胞が挙げられる。適当な原核生物としては、グラム陰性生物またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの腸内細菌科が挙げられるがこれらに限定されない。様々なＥ．ｃｏｌｉ株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＭＭ２９４株（ＡＴＣＣ３１，４４６）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７，３２５）およびＫ５  ７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）は、公的に入手可能である。他の適当な原核生物宿主細胞としては、腸内細菌科、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓおよびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。これらの例は、限定ではなく、例示である。Ｗ３１１０株は、組換えＤＮＡ産物の発酵用の例示的な宿主株である。好ましくは、宿主細胞は、最少量のタンパク分解性酵素を分泌する。例えば、Ｗ３１１０株は、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子に遺伝的変異をもたらすように改変され得、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎｒを有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎｒを有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を有する３７Ｄ６株であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株４０Ｂ４；および変異ペリプラズムプロテアーゼを有するＥ．ｃｏｌｉ株（ＵＳ４９４６７８３）が挙げられる。あるいは、インビトロにおけるクローニング方法、例えば、ＰＣＲまたは他の核酸ポリメラーゼ反応が適当である。
【０１１３】
完全長抗体、抗体フラグメントおよび抗体融合タンパク質は、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要でないとき（例えば、治療用抗体が、細胞傷害剤（例えば、トキシン）に結合体化されるとき、および免疫複合体が単独で、腫瘍細胞の破壊において有効性を示すとき）に、細菌において作製され得る。完全長抗体は、循環での半減期が長い。例えば、発現および分泌を最適化するための翻訳開始領域（ｒｅｇｉｏ）（ＴＩＲ）およびシグナル配列を含む抗体フラグメントおよびポリペプチドを細菌において発現させることを用いると、Ｅ．ｃｏｌｉにおける作製は、速く、コスト効率が高いことがある（ＵＳ５，６４８，２３７；ＵＳ５７８９１９９；ＵＳ５８４０５２３）。発現後、その抗体は、可溶性画分中のＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから単離され、アイソタイプに応じて、例えば、プロテインＡまたはＧのカラムで精製され得る。最終的な精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現される抗体を精製するためのプロセスと同様に行われ得る。
【０１１４】
原核生物に加えて、真核生物の微生物（例えば、糸状菌または酵母）も、抗ＭＵＣ１６抗体またはＭＵＣ１６ポリペプチドをコードするベクターに適したクローニングまたは発現の宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、よく用いられる下等真核生物宿主微生物である。他のものとしては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（Ｂｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０；ＥＰ１３９，３８３）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（ＵＳ４９４３５２９；Ｆｌｅｅｒら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５）、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４（２）：７３７−７４２）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら（１９８８）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：２６５−２７８）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（ＥＰ３９４５３８））；および糸状菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（ＷＯ９１／００３５７）およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅら（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９；Ｔｉｌｂｕｒｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１；Ｙｅｌｔｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１４７０−１４７４）およびＡ．ｎｉｇｅｒ（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：４７５−４７９））が挙げられる。メチロトロピック（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母が、本明細書中で適当であり、そのような酵母としては、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａからなる属から選択される、メタノールにおいて成長することができる酵母が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
グリコシル化された抗ＭＵＣ１６抗体またはＭＵＣ１６ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物由来のものでもあり得る。無脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９）ならびに植物細胞（例えば、ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの細胞培養物）が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株およびバリアント、ならびに宿主（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来の対応する許容可能な昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクション用の種々のウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１バリアントおよびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株は、公的に入手可能であり、そのようなウイルスは、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従って、本明細書中のウイルスとして使用され得る。
【０１１６】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形成転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎系統（懸濁培養において生育するためにサブクローン化された２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ（１９８０）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら（１９８２）Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーム系統（ＨｅｐＧ２）である。
【０１１７】
抗ＭＵＣ１６抗体産生用の上記の発現ベクターまたはクローニングベクターで宿主細胞を形質転換し、そしてその宿主細胞を、プロモーターを誘導するためか、形質転換体を選択するためか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、必要に応じて改変された従来の栄養培地中で培養する。クローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、抗ＭＵＣ１６抗体またはＭＵＣ１６ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を複製可能なベクターに挿入し得る。そのベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子またはファージの形態であり得る。適切な核酸配列が、種々の手順によってベクターに挿入され得る。
【０１１８】
インビトロまたはインビボにおける腫瘍細胞の成長阻害（例えば、インビトロまたはインビボにおけるＭＵＣ１６を発現する腫瘍細胞の、未処理腫瘍細胞と比べて約２５〜１００％または約３０〜１００％または約５０〜１００％または７０〜１００％の細胞増殖の阻害）は、当該分野で公知の様々な方法で測定され得る。インビトロにおける抗ＭＵＣ１６抗体の成長阻害効果は、当該分野で公知の方法によって、例えば、内因的に、またはＭＵＣ１６遺伝子でのトランスフェクション後に、ＭＵＣ１６ポリペプチドを発現する細胞を用いて、評価され得る。例えば、適切な腫瘍細胞株およびＭＵＣ１６でトランスフェクトされた細胞を、様々な濃度の抗ＭＵＣ１６モノクローナル抗体で数日間（例えば、２〜７）日間処理し、クリスタルバイオレットもしくはＭＴＴで染色し得るか、または他のいくつかの比色定量アッセイによって解析し得る。シグナルの低下は、成長阻害を示す。あるいは、細胞を抗ＭＵＣ１６抗体または薬物結合体で数日間処理し、次いで、その細胞を、ＡＴＰ含有量と比例して細胞数を決定する試薬とともにインキュベートすることによって、例えば、Ｃｅｌｌ  ＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などの試薬を用いるルミネセンスアッセイによって、細胞の生存率を測定することができる。増殖を測定する別の方法は、抗ＭＵＣ１６抗体の存在下または非存在下において処理された細胞による３Ｈ−チミジンの取り込みを比較することによる方法であり得る。処理後、その細胞を回収し、ＤＮＡ中に取り込まれた放射能の量をシンチレーションカウンターで定量化する。増殖の阻害は、放射能の減少によって証明され得る。細胞死を誘導する抗ＭＵＣ１６抗体について選択するために、例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルーまたは７ＡＡＤの取り込みによって示されるような膜の完全性の喪失を、コントロールと比較して評価してもよい。適切なポジティブコントロールは、選択された細胞株を、その細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体で処理することを含む。成長阻害は、細胞培養物中、約０．００５〜３０μｇ／ｍｌまたは約０．０３ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度で測定され得、ここで、成長阻害は、その抗体に腫瘍細胞を曝露した１〜１０日後に測定される。約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重での抗ＭＵＣ１６抗体の投与によって、その抗体の最初の投与から約５日〜３ヶ月以内、好ましくは、約５〜３０日以内に腫瘍サイズの縮小または腫瘍細胞増殖の低下がもたらされる場合、その抗体は、インビボにおいて成長阻害性である。
【０１１９】
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体の調製
本発明の設計、選択および調製の方法によって、求電子性官能基と反応性である、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体がもたらされる。これらの方法は、指摘され、設計された選択的部位において、薬物分子との抗体結合体複合物（例えば、抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）複合物）をさらにもたらす。抗体表面上の反応性システイン残基は、チオール反応基（例えば、マレイミドまたはハロアセチル）を介して薬物部分と特異的に結合体化することを可能にする。マレイミド基に対するＣｙｓ残基のチオール官能基の求核的な反応性は、タンパク質中の他の任意のアミノ酸官能基（例えば、リシン残基のアミノ基またはＮ末端のアミノ基）と比べて約１０００倍高い。ヨードアセチルおよびマレイミド試薬におけるチオール特異的官能基は、アミン基と反応性であり得るが、より高いｐＨ（＞９．０）およびより長い反応時間が必要である（Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）。タンパク質中の遊離チオールの量は、標準的なＥｌｌｍａｎアッセイによって推定され得る。免疫グロブリンＭは、ジスルフィド結合五量体の例であり、免疫グロブリンＧは、サブユニットを共に結合する内部ジスルフィド架橋を有するタンパク質の例である。このようなタンパク質では、試薬（例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはセレノール）によるジスルフィド結合の還元（Ｓｉｎｇｈら（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０４：１４７−１５６）が、反応性の遊離チオールを生成するために必要である。このアプローチは、抗体の三次構造および抗原結合特異性の喪失をもたらし得る。
【０１２０】
ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲ（反応性チオールの選択のためのファージＥＬＩＳＡ）アッセイは、ＥＬＩＳＡファージ形式において、抗体−Ｆａｂ内の反応性システイン基の検出を可能にすることにより、システイン改変抗体の設計を補助する（ＵＳ２００７／００９２９４０）。システイン改変抗体に結合する抗原を壁の表面にコーティングし、続いて、システイン改変Ｆａｂをディスプレイするファージ粒子とともにインキュベートし、ＨＲＰ標識された二次抗体を加え、吸光度を検出する。ファージ上にディスプレイされた変異タンパク質は、迅速、頑強かつハイスループットな様式でスクリーニングされ得る。システイン改変抗体のライブラリーが作製され、そして、抗体または他のタンパク質のランダムなタンパク質−ファージライブラリーから、遊離Ｃｙｓの取り込みに関する反応性部位を適切に同定するアプローチと同じアプローチを用いる結合選択に供され得る。この手法は、ファージ上にディスプレイされるシステイン変異タンパク質を、チオール反応性でもある親和性試薬またはレポーター基と反応させる工程を包含する。
【０１２１】
上記ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイは、抗体における反応性チオール基のスクリーニングを可能にする。この方法による、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｓｕｍａｂ）−Ｆａｂにおける重鎖Ａ１１４Ｃ  Ｋａｂａｔナンバリング（Ａ１２１Ｃ連続的ナンバリング）バリアントの同定が、好例である。Ｆａｂ分子全体が、効率的に検索されることにより、反応性チオール基を有するより多くのチオＦａｂバリアントが同定され得る。１つのパラメータである、小部分の表面到達性を用いることにより、ポリペプチド内のアミノ酸残基に対する溶媒の到達性が特定され、定量化された。表面到達性は、溶媒分子、例えば、水が接触し得る表面積（Å２）として表され得る。水の占有空間は、半径１．４Åの球体として近似される。既知のＸ線結晶構造解析がもたらした座標を用いて、タンパク質の各アミノ酸の表面到達性を計算するアルゴリズムを使用する結晶学プログラムのＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ（“Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ”（１９９４）Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０：７６０−７６３）のようなソフトウェアは、自由に入手可能であるか、または許諾可能である（Ｓｅｃｒｅｔａｒｙ  ｔｏ  ＣＣＰ４，Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＷＡ４  ４ＡＤ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，Ｆａｘ：（＋４４）１９２５  ６０３８２５またはインターネットによって：ｗｗｗ．ｃｃｐ４．ａｃ．ｕｋ／ｄｉｓｔ／ｈｔｍｌ／ＩＮＤＥＸ．ｈｔｍｌ）。表面到達性の計算を行う２つの例示的なソフトウェアモジュールは、Ｂ．Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｆ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ（１９７１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９−４００のアルゴリズムに基づいた、「ＡＲＥＡＩＭＯＬ」および「ＳＵＲＦＡＣＥ」である。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、プローブ球体（溶媒分子を意味する）がタンパク質のファンデルワールス面を超えて転がるとき、溶媒が到達可能なタンパク質の表面をそのプローブ球体の中心の位置として定義する。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、各原子に関して拡大された球体上に表面の点を生成し（原子およびプローブの半径の合計に等しい、原子の中心からの距離で）、そして隣接原子と会合した等価な球体内に存在するそれらの点を除去することによって、溶媒が到達可能な表面積を計算する。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、ＰＤＢ座標ファイルにおいて溶媒が到達可能な原子の領域を見つけ出し、残基、鎖によって、および分子全体について、その到達可能面積を要約する。個別の原子に対する到達可能面積（または領域の相違）は、偽（ｐｓｅｕｄｏ）−ＰＤＢ出力ファイルに書き出され得る。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、各エレメントについて単一の半径を仮定し、限定された数の様々なエレメントを認識するだけである。
【０１２２】
ＡＲＥＡＩＭＯＬおよびＳＵＲＦＡＣＥは、絶対的な到達性、すなわち、平方オングストローム（Å）の数値を報告する。小部分の表面到達性は、ポリペプチド内のアミノ酸に対して関連性のある標準的な状態を参照することにより計算される。その参照状態は、トリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙであり（ここで、Ｘは目的のアミノ酸である）、参照状態は、「拡大された」立体構造、すなわち、β−ストランドにおける立体構造のようなものでなければならない。その拡大された立体構造は、Ｘの到達性を最大にする。計算された到達可能面積は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙトリペプチド参照状態における到達可能面積で除され、そして小部分の到達性である商が報告される。パーセント到達性は、小部分の到達性に１００を乗したものである。表面到達性を計算するための別の例示的なアルゴリズムは、プログラムｘｓａｅのＳＯＬＶモジュールに基づくものであり（Ｂｒｏｇｅｒ，Ｃ．，Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ）、それは、そのポリペプチドのＸ線座標に基づいて、水球体に対するアミノ酸残基の小部分の到達性を計算するものである。抗体内のすべてのアミノ酸に対して小部分の表面到達性が、入手可能な結晶構造情報を用いて計算され得る（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔら（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２９：９６９−９９５）。
【０１２３】
システイン改変抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの供給源として機能する。ＤＮＡは、いったん単離されると、発現ベクターに入れられ、次いで、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または別途抗体タンパク質を生成しない他の哺乳動物の宿主細胞（例えば、ミエローマ細胞（ＵＳ５８０７７１５；ＵＳ２００５／００４８５７２；ＵＳ２００４／０２２９３１０））にトランスフェクトされることにより、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成がもたらされ得る。
【０１２４】
抗体のエフェクター機能を妨げず、かつ、部位特異的標識のためにシステイン残基で置換する部位を同定した。抗体Ｆａｂの定常領域（ＣＬおよびＣＨ１）が、抗原結合またはＦｃエフェクター機能において明らかな役割を有していないとき、このドメインを、上記の目的で理想的に位置させた（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ”Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，，Ｏｘｆｏｒｄ；１９９０）。Ｆａｂ表面上の反応性システインをスクリーニングするＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲファージディスプレイベースの方法によって、バリアントのＬＣ−Ｖ１１０Ｃ（Ｋａｂａｔナンバリング）およびＨＣ−Ａ１１４Ｃ（Ｋａｂａｔナンバリング，抗ＭＵＣ１６抗体に対するＥｕナンバリングにおけるＡ１１８Ｃおよび連続的ナンバリングにおけるＡ１１７Ｃと等価）、ならびに抗体−Ｆａｂの部位特異的標識に適するその他のバリアントが同定された（Ｊｕｎｕｔｕｌａ，Ｊ．Ｒ．ら（２００８）“Ｒａｐｉｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｆａｂｓ”  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ３３２：４１−５２。
【０１２５】
操作された高度に反応性の不対Ｃｙｓ残基を有するシステイン改変抗体、例えば、チオＦａｂは、設計されて選択された後、（ｉ）細菌系、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ系（Ｓｋｅｒｒａら（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６−２６２；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１−１８８）または哺乳動物細胞培養系（ＷＯ０１／００２４５）、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）における発現；および（ｉｉ）通常のタンパク質精製手法（Ｌｏｗｍａｎら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（１７）：１０９８２−１０９８８）を用いる精製によって作製され得る。
【０１２６】
操作されたＣｙｓチオール基は、求電子性リンカー試薬および薬物−リンカー中間体と反応して、システイン改変抗体薬物結合体および他のシステイン改変標識抗体を形成する。対形成されて、鎖間および鎖内ジスルフィド結合を形成する、システイン改変抗体のＣｙｓ残基および親抗体に存在するＣｙｓ残基は、いかなる反応性チオール基も有さず（還元剤で処理されていない限り）、求電子性リンカー試薬または薬物−リンカー中間体と反応しない。新たに操作されたＣｙｓ残基は、不対のままであり得、求電子性リンカー試薬または薬物−リンカー中間体（例えば、薬物−マレイミド）と反応することができる、すなわち、それらと結合体化することができる。例示的な薬物−リンカー中間体としては：ＭＣ−ＭＭＡＥ、ＭＣ−ＭＭＡＦ、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥおよびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦが挙げられる。重鎖および軽鎖の操作されたＣｙｓ残基の構造位置は、連続的ナンバリングシステムに従ってナンバリングされる。この連続的ナンバリングシステムは、Ｎ末端から開始するＫａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）と対応するが、ａ、ｂ、ｃと記される挿入という点でＫａｂａｔナンバリングスキーム（下の列）と異なる。Ｋａｂａｔナンバリングシステムを用いると、実際の線状のアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮物または挿入物に対応する、より少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含み得る。システイン改変重鎖バリアント部位は、連続的ナンバリングおよびＫａｂａｔナンバリングスキームによって特定される。
【０１２７】
１つの実施形態において、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は：
（ａ）親抗ＭＵＣ１６抗体の１つ以上のアミノ酸残基をシステインで置換する工程；および
（ｂ）システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体をチオール反応性試薬と反応させることによって、そのシステイン改変抗体のチオール反応性を測定する工程
を包含するプロセスによって調製される。
【０１２８】
システイン改変抗体は、親抗体よりもチオール反応性試薬に対して反応性であり得る。
【０１２９】
遊離システインアミノ酸残基は、重鎖もしくは軽鎖、または定常ドメインもしくは可変ドメインに位置し得る。抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂもまた、抗体フラグメントのアミノ酸を置換する１つ以上のシステインアミノ酸で操作されることにより、システイン改変抗体フラグメントを形成し得る。
【０１３０】
本発明の別の実施形態は、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体を調製する（作製する）方法を提供し、その方法は：
（ａ）システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体を作製するために、１つ以上のシステインアミノ酸を親抗ＭＵＣ１６抗体に導入する工程；および
（ｂ）システイン改変抗体の、チオール反応性試薬に対するチオール反応性を測定する工程；
を包含し、
ここで、システイン改変抗体は、親抗体よりもチオール反応性試薬に対して反応性である。
【０１３１】
システイン改変抗体を調製する方法の工程（ａ）は：
（ｉ）システイン改変抗体をコードする核酸配列を突然変異誘発する工程；
（ｉｉ）そのシステイン改変抗体を発現させる工程；および
（ｉｉｉ）そのシステイン改変抗体を単離し、精製する工程
を包含し得る。
【０１３２】
システイン改変抗体を調製する方法の工程（ｂ）は、ファージまたはファージミド粒子から選択されるウイルス粒子上に、システイン改変抗体を発現させる工程を含み得る。
【０１３３】
システイン改変抗体を調製する方法の工程（ｂ）は：
（ｉ）システイン改変抗体を、チオール反応性の親和性試薬と反応させることにより、システイン改変親和性標識抗体を作製する工程；および
（ｉｉ）そのシステイン改変親和性標識抗体の、捕捉媒体に対する結合を測定する工程
も包含し得る。
【０１３４】
本発明の別の実施形態は、高度に反応性の不対システインアミノ酸を有する、システイン改変抗体をチオール反応性についてスクリーニングする方法であり、その方法は：
（ａ）システイン改変抗体を作製するために、親抗体に１つ以上のシステインアミノ酸を導入する工程；
（ｂ）システイン改変抗体を、チオール反応性の親和性試薬と反応させることにより、システイン改変親和性標識抗体を作製する工程；および
（ｃ）そのシステイン改変親和性標識抗体の、捕捉媒体に対する結合を測定する工程；および
（ｄ）システイン改変抗体の、チオール反応性試薬に対するチオール反応性を測定する工程
を包含する。
【０１３５】
システイン改変抗体をスクリーニングする方法の工程（ａ）は：
（ｉ）システイン改変抗体をコードする核酸配列を突然変異誘発する工程；
（ｉｉ）そのシステイン改変抗体を発現させる工程；および
（ｉｉｉ）システイン改変抗体を単離し、精製する工程
を包含し得る。
【０１３６】
システイン改変抗体をスクリーニングする方法の工程（ｂ）は、ファージまたはファージミド粒子から選択されるウイルス粒子上に、システイン改変抗体を発現させる工程を包含し得る。
【０１３７】
システイン改変抗体をスクリーニングする方法の工程（ｂ）は：
（ｉ）システイン改変抗体を、チオール反応性の親和性試薬と反応させることにより、システイン改変親和性標識抗体を作製する工程；および
（ｉｉ）そのシステイン改変親和性標識抗体の、捕捉媒体に対する結合を測定する工程
も包含し得る。
【０１３８】
３Ａ５  ＩｇＧバリアントのシステイン操作
本明細書中に記載されるシステイン操作方法によって、完全長、ヒト化およびキメラの親モノクローナル抗ＭＵＣ１６  ３Ａ５抗体内の重鎖１１７（抗ＭＵＣ１６  ３Ａ５抗体に対する連続的ナンバリング）部位にシステインを導入することにより、重鎖配列：配列番号１および軽鎖配列：配列番号２、図１を有するＡ１１７Ｃチオｈｕ抗ＭＵＣ１６  ３Ａ５ヒト化バリアント、ならびに重鎖配列：配列番号３および軽鎖配列：配列番号４、図２を有するＡ１１７Ｃチオｃｈ抗ＭＵＣ１６  ３Ａ５キメラバリアントを得た。これらのシステイン改変モノクローナル抗体は、１ｍＭシステインを含む培地中での一過性の発酵によって、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞において発現された。
【０１３９】
シフトの減少が観察されるまで抗体を段階希釈して、ＯＶＣＡＲ−３細胞（内因性ＭＵＣ１６を発現する細胞）におけるフローサイトメトリーによって、システイン改変ヒト化チオ抗ＭＵＣ１６抗体および標準的な３Ａ５  ＩｇＧの親和性を比較した；滴定の間を通して抗体が細胞結合部位に対して過剰となるように、結合条件を選択した。結合した抗体を、蛍光抗ヒトＦｃ二次抗体を用いて検出した。フローサイトメトリーヒストグラムは、飽和濃度（４００ｎｇ／ｍＬ）および亜飽和濃度（２５ｎｇ／ｍＬ）での結合を示した。解析されたすべての抗体濃度において、上記２つの抗ＭＵＣ１６バリアント（標準およびチオ）が、等価な結合をもたらしたことから、抗原に対する等価な親和性が示唆される。試験された各濃度において、チオ抗ＭＵＣ１６抗体は、標準的な（親）抗ＭＵＣ１６抗体と同程度に効率的にＯＶＣＡＲ−３細胞に結合した。ＭＵＣ１６細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の一部を用いる表面プラズモン共鳴解析からもまた、この抗原に対するチオ３Ａ５抗ＭＵＣ１６抗体の高親和性が確かめられた（ＫＤ＝１１６ｐＭ）。ＭＵＣ１６発現が高いか、または低い／無い細胞をＲＴ−ＰＣＲ研究に基づいて比較すると、チオ抗ＭＵＣ１６抗体は、ＭＵＣ１６を発現する細胞に結合するが、ＭＵＣ１６陰性細胞株には結合しない。ゆえに、ＨＣ−Ａ１１８における置換は、抗原結合に影響を及ぼさない。
【０１４０】
１つの実施形態によれば、システイン改変ヒト化３Ａ５抗ＭＵＣ１６抗体は、遊離システインアミノ酸を有する以下の可変領域重鎖配列（配列番号９〜１７、表１）のうちの１つ以上を含む。
【０１４１】
【表１】
2010526821.tif 000003
１つの実施形態によれば、システイン改変キメラ３Ａ５抗ＭＵＣ１６抗体は、遊離システインアミノ酸を有する以下の可変領域重鎖配列（配列番号１８〜２６、表２）のうちの１つ以上を含む。
【０１４２】
【表２】
2010526821.tif 000004
１つの実施形態によれば、システイン改変ヒト化３Ａ５抗ＭＵＣ１６抗体は、遊離システインアミノ酸を有する以下の可変領域軽鎖配列（配列番号２７〜３３、表３）のうちの１つ以上を含む。
【０１４３】
【表３】
2010526821.tif 000005
１つの実施形態によれば、システイン改変キメラ３Ａ５抗ＭＵＣ１６抗体は、遊離システインアミノ酸を有する以下の可変領域軽鎖配列（配列番号３４〜４０、表４）のうちの１つ以上を含む。
【０１４４】
【表４】
2010526821.tif 000006
システイン改変標識抗ＭＵＣ１６抗体
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、チオール反応性試薬と、部位特異的および効率的に結合され得る。チオール反応性試薬は、多官能性（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカー試薬、捕捉標識試薬、すなわち、親和性標識試薬（例えば、ビオチン−リンカー試薬）、検出標識（例えば、フルオロフォア試薬）、固相固定化試薬（例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ、ポリスチレンまたはガラス）または薬物−リンカー中間体であり得る。チオール反応性試薬の１つの例は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）である。例示的な実施形態において、チオＦａｂとビオチン−リンカー試薬との反応は、ビオチン化チオＦａｂをもたらし、それによって、操作されたシステイン残基の存在および反応性が検出され、測定され得る。チオＦａｂと多官能性リンカー試薬との反応によって、薬物部分試薬または他の標識とさらに反応し得る、多官能化されたリンカーを有するチオＦａｂが提供される。チオＦａｂと薬物−リンカー中間体との反応は、チオＦａｂ薬物結合体を提供する。
【０１４５】
本明細書中に記載される例示的な方法は、一般に、抗体の同定および作製に適用され得、より一般には、本明細書中に記載される設計およびスクリーニングの工程を応用することによって、他のタンパク質に適用され得る。
【０１４６】
そのようなアプローチは、他のチオール反応性試薬の結合体化に適用され得、ここで、その反応基は、例えば、マレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィドまたは他のチオール反応性結合体化パートナーである（Ｈａｕｇｌａｎｄ，２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：２；Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｅａｎｓ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：２；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．４０−５５，６４３−６７１）。チオール反応性試薬は、薬物部分、フルオロフォア（例えば、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光色素）、画像化用のキレート剤または放射線療法用金属、ペプチジル標識もしくは非ペプチジル標識、または検出タグ、あるいはクリアランス改変剤（例えば、ポリエチレングリコールの様々な異性体）、第３の成分に結合するペプチド、または別の炭水化物もしくは脂肪親和性剤であり得る。
【０１４７】
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体の用途
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体、ならびにその抗体−薬物結合体および標識結合体は、治療用薬剤および／または診断用薬剤としての用途を見出し得る。本発明は、ＭＵＣ１６関連障害に関連する１つ以上の症状を予防するか、管理するか、処置するか、または回復させる方法をさらに提供する。特に、本発明は、細胞増殖性障害（例えば、癌、例えば、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、膵臓腺癌を含む膵癌、肺癌および乳癌）に関連する１つ以上の症状を予防するか、管理するか、処置するか、または回復させる方法を提供する。本発明は、ＭＵＣ１６関連障害またはそのような障害を発症する素因を診断するための方法、ならびに細胞に会合したＭＵＣ１６ポリペプチドに優先的に結合する抗体および抗体の抗原結合フラグメントを同定するための方法をなおもさらに提供する。
【０１４８】
本発明の別の実施形態は、ＭＵＣ１６関連障害の処置に有用な薬物を調製するための、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体の使用に関する。
【０１４９】
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体は、規定された部位においてほぼ一様の化学量論（薬物／抗体比、ｐ値）で薬物部分の結合をもたらすことによって、抗体−薬物結合体不均一性の問題点を解決する。さらに、その結合体化条件は、すべての天然の免疫グロブリンジスルフィド結合を保持する。
【０１５０】
本発明の１つの局面は、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体（Ａｂ）およびアウリスタチン薬物部分（Ｄ）を含む抗体−薬物結合体複合物であり、ここで、そのシステイン改変抗体は、１つ以上の遊離システインアミノ酸を介してリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合され；この複合物は、式Ｉ：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ        Ｉ
を有し、ここで、ｐは、１、２、３または４であり；システイン改変抗体は、親抗ＭＵＣ１６抗体の１つ以上のアミノ酸残基を１つ以上の遊離システインアミノ酸で置換する工程を包含するプロセスによって調製される。単一のシステイン変異が、抗ＭＵＣ１６親抗体中に操作されることにより、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体が形成されるとき、重鎖および軽鎖の対称的な性質に起因して、２つの遊離システインアミノ酸が生じる。
【０１５１】
図５は、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体薬物結合体（ＡＤＣ）の実施形態を示しており、ここで、アウリスタチン薬物部分は：軽鎖（ＬＣ−ＡＤＣ）；重鎖（ＨＣ−ＡＤＣ）；およびＦｃ領域（Ｆｃ−ＡＤＣ）において、操作されたシステイン基に結合している。
【０１５２】
従来の抗体−薬物結合体化ストラテジーは、標的細胞に対して活性であるが全身性毒性ももたらし得る、結合体の不均一な混合物を生成する。システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体薬物結合体の潜在的な利点としては、抗体の鎖間ジスルフィド結合の保持、規定された部位の薬物結合体化、およびよりほぼ均一な生成物の混合物に起因する、改善された安全性（より高い治療指数）、改善されたＰＫパラメータ、より高い安定性および結合の保存が挙げられる。実際、チオ抗ＭＵＣ１６ＡＤＣは、前臨床動物モデルにおいて、標準的な抗ＭＵＣ１６  ＡＤＣよりも広い治療濃度域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）（約４倍）を示す。ＩｇＧ抗体（ｍｇ／ｋｇ）の同じ用量レベルを比較すると、本発明者らのデータは、マウス異種移植片において、チオＭＵＣ１６ＡＤＣと標準的なＭＵＣ１６ＡＤＣとでは等価な有効性を示すのに対し、ラットでは、６８．６ｍｇ／ｋｇ（２８２０μｇ／ｍ２ＭＭＡＥ）という用量のチオＡＤＣが、１６．６ｍｇ／ｋｇ（１５００μｇ／ｍ２ＭＭＡＥ）という用量の標準的なＡＤＣと同様の毒性を発揮する。細胞傷害性薬物の用量（μｇ／ｍ２）と比較するとき、チオＡＤＣは、標準的なＡＤＣよりも安全かつ有効である。標準的なＡＤＣに対してチオＡＤＣの利点は、有効な（ｍｇ／ｋｇ）用量のＡＤＣにおいて、ＭＭＡＥ曝露を減少させることであり得る。そして、チオＡＤＣの改善された認容性によって、ｍｇ／ｋｇの抗体基準に基づいてより高い用量レベルが可能となり得、また、より困難な悪性疾患、例えば、ＭＭＡＥに対して比較的感度が低いかまたはＭＵＣ１６発現が比較的低いレベルの悪性疾患を有する患者に治療的な利益をもたらすことが可能となり得る。
【０１５３】
薬物部分
式Ｉの抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）のアウリスタチン薬物部分としては、ドラスタチン、アウリスタチン（ＵＳ５６３５４８３；ＵＳ５７８０５８８；ＵＳ５７６７２３７；ＵＳ６１２４４３１）、ならびにそれらのアナログおよび誘導体が挙げられる。ドラスタチンおよびアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解ならびに核分裂および細胞分裂を妨げること（Ｗｏｙｋｅら（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、ならびに抗癌活性（ＵＳ５６６３１４９）および抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔら（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）を有することが示されている。様々な形態のドラスタチンまたはアウリスタチン薬物部分が、ペプチド性の薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して、抗体に共有結合され得る（ＷＯ０２／０８８１７２；Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−７８４；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２（４）：１４５８−１４６５）。
【０１５４】
例示的なアウリスタチン実施形態としては、ＷＯ２００５／０８１７１１；２００４年３月２８日提出のＳｅｎｔｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ６２３（これらの各々の開示の全体が、明示的に参考として援用される）に開示されているＮ末端連結型のモノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦが挙げられる。例示的なアウリスタチン薬物部分としては、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦが挙げられる。
【０１５５】
式Ｉの抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）のアウリスタチン薬物部分（Ｄ）は、モノメチルアウリスタチン薬物部分ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦを包含する。そのＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ薬物部分のＮ末端は、リンカーを介して、その抗体の操作されたシステインに共有結合される。
【０１５６】
【化１】
2010526821.tif 000007
他の例示的なアウリスタチン薬物部分としては、ペンタペプチドアウリスタチン薬物部分のＣ末端にフェニルアラニンカルボキシ修飾を有するモノメチルバリン化合物（ＷＯ２００７／００８８４８）およびペンタペプチドアウリスタチン薬物部分のＣ末端にフェニルアラニン側鎖修飾を有するモノメチルバリン化合物（ＷＯ２００７／００８６０３）が挙げられる。
【０１５７】
代表的には、ペプチドベースの薬物部分は、２つ以上のアミノ酸間および／またはペプチドフラグメント間にペプチド結合を形成することによって調製され得る。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知である液相合成法（Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｌｕｂｋｅ，“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐｐ７６−１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）に従って調製され得る。
【０１５８】
リンカー
「リンカー」、「リンカー単位」または「リンク（ｌｉｎｋ）」とは、抗体を薬物部分に共有結合する、共有結合を含む化学部分または原子の鎖のことを意味する。様々な実施形態において、リンカーは、Ｌとして明記される。「リンカー」（Ｌ）は、１つ以上の薬物部分（Ｄ）と抗体単位（Ａｂ）とを連結して、式Ｉの抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）を形成するために使用され得る二官能性または多官能性の部分である。抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）は、薬物および抗体への結合のための反応性官能性を有するリンカーを用いて都合よく調製され得る。システイン改変抗体（Ａｂ）のシステインチオールは、リンカー試薬、薬物部分または薬物−リンカー中間体の求電子性官能基と結合を形成し得る。
【０１５９】
１つの局面において、リンカーは、抗体上に存在する求核性システインに対して反応性である求電子性基を有する反応性部位を有する。その抗体のシステインチオールは、リンカー上の求電子性基と反応性であり、リンカーと共有結合を形成する。有用な求電子性基としては、マレイミド基およびハロアセトアミド基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
リンカーとしては、二価のラジカル（例えば、アルキルジイル、アリーレン、ヘテロアリーレン）、−（ＣＲ２）ｎＯ（ＣＲ２）ｎ−などの部分、アルキルオキシの繰り返し単位（例えば、ポリエチレンオキシ、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ）およびアルキルアミノの繰り返し単位（例えば、ポリエチレンアミノ、ＪｅｆｆａｍｉｎｅＴＭ）；ならびにスクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネートおよびカプロアミドを含む二酸のエステルおよびアミドが挙げられる。
【０１６１】
システイン改変抗体は、Ｋｌｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５（４）：７６５−７７３の７６６頁の結合体化方法および実施例３のプロトコルによれば、求電子性官能基（例えば、マレイミドまたはα−ハロカルボニル）を有するリンカー試薬または薬物−リンカー中間体と反応する。
【０１６２】
リンカーは、１つ以上のリンカー成分から構成され得る。例示的なリンカー成分としては、１つ以上の繰り返し単位として、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」または「ｖｃ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」または「ａｆ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」）、エチレンオキシ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（「ＥＯ」または「ＰＥＯ」）が挙げられる。さらなるリンカー成分は、当該分野で公知であり、そのいくつかを本明細書中に記載する。
【０１６３】
１つの実施形態において、ＡＤＣのリンカーＬは、以下の式：
【０１６４】
【化２】
2010526821.tif 000008
を有する。
【０１６５】
ここで：
−Ａ−は、抗体（Ａｂ）のシステインチオールに共有結合されたストレッチャー単位であり；
ａは、０または１であり；
各−Ｗ−は、独立して、アミノ酸単位であり；
ｗは、独立して、０〜１２の範囲の整数であり；
−Ｙ−は、薬物部分に共有結合されたスペーサー単位であり；そして
ｙは、０、１または２である。
【０１６６】
ストレッチャー単位
ストレッチャー単位（−Ａ−）は、存在するとき、抗体単位をアミノ酸単位（−Ｗ−）に連結することができる。この点に関して、抗体（Ａｂ）は、ストレッチャー単位の求電子性官能基と結合を形成し得る遊離システインチオール基を有する。式Ｉ結合体における例示的なストレッチャー単位は、式ＩＩおよびＩＩＩによって表され、ここで、Ａｂ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは、上で定義したとおりであり、Ｒ１７は、（ＣＨ２）ｒ、Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル、Ｏ−（ＣＨ２）ｒ、アリーレン、（ＣＨ２）ｒ−アリーレン、−アリーレン−（ＣＨ２）ｒ−、（ＣＨ２）ｒ−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）、（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）−（ＣＨ２）ｒ、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル、（ＣＨ２）ｒ−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）、−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）−（ＣＨ２）ｒ−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２）ｒ−から選択される二価のラジカルであり；ここで、Ｒｂは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニルまたはベンジルであり；ｒは、独立して、１〜１０の範囲の整数である。
【０１６７】
アリーレンは、芳香族環系から２つの水素原子を除去することによって得られる６〜２０個の炭素原子の二価の芳香族炭化水素ラジカルを包含する。代表的なアリーレン基としては、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから得られるラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
ヘテロシクリル基は、１つ以上の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素および硫黄である環系を包含する。複素環ラジカルは、１〜２０個の炭素原子、ならびにＮ、Ｏ、ＰおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む。複素環は、３〜７個の環メンバー（２〜６個の炭素原子、ならびにＮ、Ｏ、ＰおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子）を有する単環、または７〜１０個の環メンバー（４〜９個の炭素原子、ならびにＮ、Ｏ、ＰおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子）を有する二環（ｂｉｃｙｃｌｅ）、例えば：ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］または［６，６］系であり得る。複素環は、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌｅｏ  Ａ．；“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６８），特にＣｈａｐｔｅｒ  １、３、４、６、７および９；“Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９５０から現在）、特に、Ｖｏｌｕｍｅ  １３、１４、１６、１９および２８；ならびにＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６０）８２：５５６６に説明されている。
【０１６９】
複素環の例としては、ピリジル、ジヒドロピリジル（ｄｉｈｙｄｒｏｙｐｙｒｉｄｙｌ）、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化（ｓｕｌｆｕｒ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ）テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル、インドリル、インドレニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、２−ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、ビス−テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ビス−テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチニル、２Ｈ−ピロリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、４Ａｈ−カルバゾリル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソオキサゾリル、オキシンドリル、ベンゾオキサゾリニルおよびイサチノイルが例として挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
カルボシクリル基は、単環として３〜７個の炭素原子もしくは二環として７〜１２個の炭素原子を有する飽和または不飽和の環を包含する。単環式の炭素環式化合物は、３〜６個の環原子、なおもより代表的には、５または６個の環原子を有する。二環式の炭素環式化合物は、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］もしくは［６，６］系として配置される７〜１２個の環原子を有するか、またはビシクロ［５，６］もしくは［６，６］系として配置される９もしくは１０個の環原子を有する。単環式の炭素環式化合物の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペンタ−１−エニル、１−シクロペンタ−２−エニル、１−シクロペンタ−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキサ−１−エニル、１−シクロヘキサ−２−エニル、１−シクロヘキサ−３−エニル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが挙げられる。
【０１７１】
明確に示されない場合でさえも、操作されたシステイン残基の数に応じて、１〜４個の薬物部分が、抗体に連結される（ｐ＝１〜４）ことが、式Ｉ  ＡＤＣの例示的な実施形態（例えば、ＩＩ〜Ｖ）のすべてから理解されるべきである。
【０１７２】
【化３】
2010526821.tif 000009
実例となる式ＩＩストレッチャー単位は、マレイミド−カプロイル（ＭＣ）から得られ、ここで、Ｒ１７は、−（ＣＨ２）５−である：
【０１７３】
【化４】
2010526821.tif 000010
式ＩＩの実例となるストレッチャー単位は、マレイミド−プロパノイル（ＭＰ）から得られ、ここで、Ｒ１７は、−（ＣＨ２）２−である：
【０１７４】
【化５】
2010526821.tif 000011
Ｒ１７が、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−であり、ｒが２である、式ＩＩの実例となる別のストレッチャー単位：
【０１７５】
【化６】
2010526821.tif 000012
Ｒ１７が、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−であり、ここで、Ｒｂは、Ｈであり、各ｒは、２である、式ＩＩの実例となる別のストレッチャー単位：
【０１７６】
【化７】
2010526821.tif 000013
Ｒ１７が−（ＣＨ２）５−である、式ＩＩＩの実例となるストレッチャー単位：
【０１７７】
【化８】
2010526821.tif 000014
別の実施形態では、ストレッチャー単位は、抗体の操作されたシステイン硫黄原子とストレッチャー単位の硫黄原子との間のジスルフィド結合を介して、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体に連結される。この実施形態の代表的なストレッチャー単位は、式ＩＶによって表され、ここで、Ｒ１７、Ａｂ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは、上で定義したとおりである。
【０１７８】
【化９】
2010526821.tif 000015
なおも別の実施形態では、ストレッチャーの反応基は、抗体の遊離システインチオールと結合を形成し得るチオール反応性官能基を含む。チオール反応官能基の例としては、マレイミド、α−ハロアセチル、活性化エステル（例えば、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル）、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられるが、これらに限定されない。この実施形態の代表的なストレッチャー単位は、式ＶａおよびＶｂによって表され、ここで、−Ｒ１７−、Ａｂ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは、上で定義したとおりである；
【０１７９】
【化１０】
2010526821.tif 000016
別の実施形態では、リンカーは、分枝状の多官能性リンカー部分を介して、抗体に対して２つ以上の薬物部分を共有結合させるための樹枝状タイプのリンカーであり得る（Ｓｕｎら（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：２２１３−２２１５；Ｓｕｎら（２００３）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：１７６１−１７６８；Ｋｉｎｇ（２００２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３：１９８７−１９９０）。樹枝状リンカーは、ＡＤＣの効力に関連する、薬物と抗体とのモル比、すなわち、負荷を高め得る。したがって、システイン改変抗体が、ただ１つの反応性システインチオール基を有する場合、多数の薬物部分が、樹枝状リンカーを介して結合され得る。
【０１８０】
アミノ酸単位
リンカーは、アミノ酸残基を含み得る。アミノ酸単位（−Ｗｗ−）は、存在するとき、抗体（Ａｂ）を、本発明のシステイン改変抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）の薬物部分（Ｄ）に連結する。
【０１８１】
−Ｗｗ−は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチド単位である。アミノ酸単位を含むアミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸残基、ならびに主要でないアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸アナログ（例えば、シトルリン）を包含する。各−Ｗ−単位は、独立して、以下に示される角括弧内の式を有し、ｗは、０〜１２の範囲の整数である：
【０１８２】
【化１１】
2010526821.tif 000017
ここで、Ｒ１９は、水素、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンジル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジルメチル−、３−ピリジルメチル−、４−ピリジルメチル−、フェニル、シクロヘキシル、
【０１８３】
【化１２】
2010526821.tif 000018
である。
【０１８４】
Ｒ１９が、水素以外であるとき、Ｒ１９が結合している炭素原子は、キラルである。Ｒ１９が結合している各炭素原子は、独立して、（Ｓ）もしくは（Ｒ）配置、またはラセミ混合物である。したがって、アミノ酸単位は、鏡像異性的に純粋、ラセミ、またはジアステレオ異性であり得る。
【０１８５】
例示的な−Ｗｗ−アミノ酸単位としては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチドが挙げられる。例示的なジペプチドとしては：バリン−シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ−ｐｈｅ）が挙げられる。例示的なトリペプチドとしては：グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）およびグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）が挙げられる。アミノ酸リンカー成分を含むアミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸残基、ならびに主要でないアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸アナログ（例えば、シトルリン）を包含する。
【０１８６】
アミノ酸単位は、腫瘍関連プロテアーゼをはじめとした１つ以上の酵素によって酵素的に切断されて、薬物部分（−Ｄ）を遊離し、１つの実施形態では、放出時にインビボにおいてプロトン化されて、薬物（Ｄ）がもたらされ得る。アミノ酸リンカー成分は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤまたはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断に対するそれらの選択性において設計され、最適化され得る。
【０１８７】
スペーサー単位
スペーサー単位（−Ｙｙ−）が存在し（ｙ＝１または２）、アミノ酸単位も存在するとき（ｗ＝１〜１２）、そのスペーサー単位は、アミノ酸単位（−Ｗｗ−）を薬物部分（Ｄ）に連結する。あるいは、アミノ酸単位が存在しないとき、スペーサー単位は、ストレッチャー単位を薬物部分に連結する。アミノ酸単位とストレッチャー単位の両方が存在しないとき（ｗ，ｙ＝０）、スペーサー単位は、薬物部分を抗体単位にも連結する。スペーサー単位は、２つの一般的なタイプ：自壊的（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）および非自壊的である。非自壊的スペーサー単位は、スペーサー単位の一部または全部が、抗体−薬物結合体または薬物部分−リンカーからのアミノ酸単位の切断後、特に酵素的切断後に、薬物部分に結合したままであるものである。グリシン−グリシンスペーサー単位またはグリシンスペーサー単位を含むＡＤＣが、腫瘍細胞関連プロテアーゼ、癌細胞関連プロテアーゼまたはリンパ球関連プロテアーゼを介して酵素的切断を起こすとき、グリシン−グリシン−薬物部分またはグリシン薬物部分は、Ａｂ−Ａａ−Ｗｗ−から切断される。１つの実施形態では、無関係な加水分解反応が、標的細胞内で生じ、グリシン−薬物部分の結合が切断され、薬物が遊離される。
【０１８８】
別の実施形態では、−Ｙｙ−は、Ｑｍで置換されるフェニレン部分を有するｐ−アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢ）単位であり、ここで、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり；ｍは、０〜４の範囲の整数である。
【０１８９】
非自壊的スペーサー単位（−Ｙ−）の例示的な実施形態は：−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−；−Ｇｌｙ−；−Ａｌａ−Ｐｈｅ−；−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−である。
【０１９０】
１つの実施形態において、スペーサー単位が、存在しない（ｙ＝０）か、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和化合物である、薬物部分−リンカーまたはＡＤＣが提供される。
【０１９１】
あるいは、自壊的スペーサー単位を含むＡＤＣが、−Ｄを放出し得る。１つの実施形態において、−Ｙ−は、ＰＡＢ基のアミノ窒素原子を介して−Ｗｗ−に連結され、カルボネート、カルバメートまたはエーテル基を介して−Ｄに直接接続された、ＰＡＢ基であり、ここで、そのＡＤＣは、以下の例示的な構造：
【０１９２】
【化１３】
2010526821.tif 000019
を有する。
【０１９３】
ここで、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり；ｍは、０〜４の範囲の整数であり；そしてｐは、１〜４の範囲である。
【０１９４】
自壊的スペーサーの他の例としては、ＰＡＢ基に電子的に類似した芳香族化合物（例えば、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体）（Ｈａｙら（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７）、複素環式ＰＡＢアナログ（ＵＳ２００５／０２５６０３０）、ベータ−グルクロニド（ＷＯ２００７／０１１９６８）およびオルトまたはパラ−アミノベンジルアセタールが挙げられるが、これらに限定されない。アミド結合が加水分解されると環化を起こすスペーサー（例えば、置換および非置換の４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら（１９９５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２２３）、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系（Ｓｔｏｒｍら（１９７２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：５８１５）ならびに２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙら（１９９０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：５８６７））が使用され得る。グリシンにおいて置換されるアミン含有薬物の除去（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙら（１９８４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１４４７）もまた、ＡＤＣにおいて有用な自壊的スペーサーの例である。
【０１９５】
例示的なスペーサー単位（−Ｙｙ−）は、式Ｘ〜ＸＩＩ：
【０１９６】
【化１４】
2010526821.tif 000020
によって表される。
【０１９７】
樹枝状リンカー
別の実施形態では、リンカーＬは、分枝状の多官能性リンカー部分を介して抗体に２つ以上の薬物部分を共有結合させるための樹枝状タイプのリンカーであり得る（Ｓｕｎら（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：２２１３−２２１５；Ｓｕｎら（２００３）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：１７６１−１７６８）。樹枝状リンカーは、ＡＤＣの効力に関連する、薬物と抗体とのモル比、すなわち、負荷を高め得る。したがって、システイン改変抗体が、ただ１つの反応性システインチオール基を有する場合、多数の薬物部分が、樹枝状リンカーを介して結合され得る。分枝状で樹枝状のリンカーの例示的な実施形態としては、２，６−ビス（ヒドロキシメチル）−ｐ−クレゾールおよび２，４，６−トリス（ヒドロキシメチル）−フェノールデンドリマー単位（ＷＯ２００４／０１９９３；Ｓｚａｌａｉら（２００３）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１５６８８−１５６８９；Ｓｈａｍｉｓら（２００４）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：１７２６−１７３１；Ａｍｉｒら（２００３）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４２：４４９４−４４９９）が挙げられる。
【０１９８】
１つの実施形態において、スペーサー単位は、分枝状のビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）であり、これは、多数の薬物を組み込み、放出するために使用され得、２−（４−アミノベンジリデン）プロパン−１，３−ジオールデンドリマー単位を含む以下の構造：
【０１９９】
【化１５】
2010526821.tif 000021
を有し（ＷＯ２００４／０４３４９３；ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら（２００３）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４２：４４９０−４４９４）、ここで、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり；ｍは、０〜４の範囲の整数であり；ｎは、０または１であり；そしてｐは、１〜４の範囲である。
【０２００】
式Ｉの抗体−薬物結合体複合物の例示的な実施形態としては、ＸＩＩＩａ（ＭＣ）、ＸＩＩＩｂ（ｖａｌ−ｃｉｔ）、ＸＩＩＩｃ（ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ）およびＸＩＩＩｄ（ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ）が挙げられる：
【０２０１】
【化１６】
2010526821.tif 000022
式Ｉａの抗体−薬物結合体複合物の他の例示的な実施形態としては、ＸＩＶａ〜ｅが挙げられる：
【０２０２】
【化１７】
2010526821.tif 000023
ここで、Ｘは：
【０２０３】
【化１８】
2010526821.tif 000024
であり；
Ｙは：
【０２０４】
【化１９】
2010526821.tif 000025
であり；
ここで、Ｒは、独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルであり；ｎは、１〜１２である。
【０２０５】
別の実施形態では、リンカーは、抗体上に存在する求電子性基に対して反応性である求核基を有する反応性官能基を有する。抗体上の有用な求電子性基としては、アルデヒドおよびケトンカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。リンカーの求核基のヘテロ原子は、抗体上の求電子性基と反応し得、抗体単位と共有結合を形成し得る。リンカー上の有用な求核基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレートおよびアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。抗体上の求電子性基は、リンカーに対する結合にとって好都合な部位を提供する。
【０２０６】
代表的には、ペプチドタイプのリンカーは、２つ以上のアミノ酸間および／またはペプチドフラグメント間のペプチド結合を形成することによって調製され得る。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知である液相合成法（Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｌｕｂｋｅ（１９６５）“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐｐ７６−１３６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）に従って調製され得る。スペーサー、ストレッチャーおよびアミノ酸単位を含むリンカー中間体は、任意の組み合わせまたは順序の反応によって組み立てられ得る。そのスペーサー、ストレッチャーおよびアミノ酸単位は、実際は求電子性ラジカル、求核性ラジカルまたは遊離ラジカルである反応性官能基を使用し得る。反応性官能基としては、カルボキシル、ヒドロキシル、パラ−ニトロフェニルカーボネート、イソチオシアネートおよび脱離基（例えば、Ｏ−メシル、Ｏ−トシル、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ；またはマレイミド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０７】
別の実施形態では、リンカーは、溶解性または反応性を調節した基で置換され得る。例えば、帯電した置換基（例えば、スルホネート（−ＳＯ３−）またはアンモニウム）は、試薬の水溶性を増大させ得、そして、ＡＤＣを調製するために使用される合成経路に応じて、リンカー試薬と抗体もしくは薬物部分とのカップリング反応を促進し得るか、またはＡｂ−Ｌ（抗体−リンカー中間体）とＤ、もしくはＤ−Ｌ（薬物−リンカー中間体）とＡｂとのカップリング反応を促進し得る。
【０２０８】
リンカー試薬
抗体とアウリスタチンとの結合体は、種々の二官能性リンカー試薬（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を用いて作製され得る。
【０２０９】
本発明の抗体薬物結合体に有用なリンカー試薬としては：ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣおよびスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）が挙げられるがこれらに限定されず、また、ビス−マレイミド試薬：ＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＯ）２）および１，１１−ビス−マレイミドトリエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＯ）３）も挙げられ、これらは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬおよび他の試薬供給業者から市販されている。ビス−マレイミド試薬は、抗体のシステイン残基の遊離チオール基と、チオール含有薬物部分、標識またはリンカー中間体との、連続的な様式または同時の様式での結合を可能にする。抗体のチオール基、ネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）代謝産物およびアナログ薬物部分またはリンカー中間体と反応性である、マレイミド以外の他の官能基としては、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられる。
【０２１０】
【化２０】
2010526821.tif 000026
有用なリンカー試薬は、他の商業的供給源を介して入手され得るか、またはＴｏｋｉら（２００２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：１８６６−１８７２；Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：５３５２−５３５５；Ｆｒｉｓｃｈら（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．７：１８０−１８６；ＵＳ６２１４３４５；ＷＯ０２／０８８１７２；ＵＳ２００３１３０１８９；ＵＳ２００３０９６７４３；ＷＯ０３／０２６５７７；ＷＯ０３／０４３５８３；およびＷＯ０４／０３２８２８に記載されている手順に従って合成され得る。
【０２１１】
マレイミドストレッチャーおよびパラ−アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢ）自壊的スペーサーを有する例示的なバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔまたはｖｃ）ジペプチドリンカー試薬は、以下の構造：
【０２１２】
【化２１】
2010526821.tif 000027
を有する。
【０２１３】
マレイミドストレッチャー単位およびＰＡＢ自壊的スペーサー単位を有する例示的なｐｈｅ−ｌｙｓ（Ｍｔｒ，モノ−４−メトキシトリチル）ジペプチドリンカー試薬は、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８：５２５７−６０に従って調製され得、その試薬は、以下の構造：
【０２１４】
【化２２】
2010526821.tif 000028
を有する。
【０２１５】
例示的な薬物−リンカー中間体としては：
【０２１６】
【化２３】
2010526821.tif 000029
が挙げられる。
【０２１７】
本発明の例示的な抗体−薬物結合体複合物としては：
【０２１８】
【化２４】
2010526821.tif 000030
が挙げられる。
【０２１９】
ここで、Ｖａｌは、バリンであり；Ｃｉｔは、シトルリンであり；ｐは、１、２、３または４であり；そしてＡｂは、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体である。
【０２２０】
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体の調製
式ＩのＡＤＣは、当業者に公知の有機化学の反応、条件および試薬を用いて、いくつかの経路によって調製され得、その経路としては：（１）システイン改変抗体のシステイン基をリンカー試薬と反応させることにより、共有結合を介して抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成させた後、活性化された薬物部分Ｄと反応させる経路；および（２）薬物部分の求核基をリンカー試薬と反応させることにより、共有結合を介して薬物−リンカー中間体Ｄ−Ｌを形成させた後、システイン改変抗体のシステイン基と反応させる経路が挙げられる。結合体化の方法（１）および（２）は、システインが操作された種々の抗体、薬物部分およびリンカーとともに用いられることにより、式Ｉの抗体−薬物結合体が調製され得る。
【０２２１】
抗体システインチオール基は、求核性であり、リンカー試薬上および薬物−リンカー中間体上の求電子性基と共有結合を形成する反応を起こすことができ、そのリンカー試薬および薬物−リンカー中間体としては：（ｉ）活性エステル（例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸エステルおよび酸ハロゲン化物）；（ｉｉ）アルキルハロゲン化物およびベンジルハロゲン化物（例えば、ハロアセトアミド）；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基；ならびに（ｉｖ）スルフィド交換を介するピリジルジスルフィドをはじめとしたジスルフィドが挙げられる。薬物部分上の求核基としては：リンカー部分上およびリンカー試薬上の求電子性基と共有結合を形成する反応を起こすことができる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレートおよびアリールヒドラジド基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２２】
システイン改変抗体は、還元剤（例えば、ＤＴＴ（Ｃｌｅｌａｎｄ試薬，ジチオトレイトール）またはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩；Ｇｅｔｚら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ  ２７３：７３−８０；Ｓｏｌｔｅｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））で処理することによって、リンカー試薬との結合体化に対して反応性にされた後、再酸化されて、鎖間および鎖内のジスルフィド結合が再形成され得る（実施例２）。例えば、ＣＨＯ細胞において発現された、システイン改変完全長モノクローナル抗体（チオＭａｂ）は、３７℃で３時間、約５０倍過剰量のＴＣＥＰを用いて還元されることにより、新しく導入されたシステイン残基と、培養液中に存在するシステインとの間に形成され得る、システインおよびグルタチオン付加物におけるジスルフィド結合が還元される。鎖間ジスルフィド結合を破壊するが、鎖内ジスルフィド結合を破壊しないこの部分的な還元の後に、膜分離法が行われ得る。還元されたチオＭａｂを希釈し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５中のＨｉＴｒａｐＳカラム上に充填し、そして０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むＰＢＳで溶出する。室温で一晩、希（２００ｎＭ）硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液を用いて親Ｍａｂに存在するシステイン残基間にジスルフィド結合を再度確立した。あるいは、デヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって証明されるような、システイン付加物の還元的切断の後に、システイン改変抗体の鎖内ジスルフィド基を再確立する有効な酸化体である。当該分野で公知である他の酸化体、すなわち、酸化剤および酸化条件を用いてもよい。外気による酸化もまた有効である。この穏やかで部分的な再酸化工程によって、鎖内ジスルフィドが高忠実度で効率的に形成され、そして新しく導入されたシステイン残基のチオール基が保存される。抗体に対しておよそ３倍過剰量の薬物−リンカー中間体、例えば、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（新しく導入されたシステイン残基に対して約１．５倍過剰量）を加え、混合し、そして約１時間、室温で静置することにより、結合体化をもたらし、３Ａ５抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体を形成させた。この結合体化混合物をゲル濾過し、充填し、そしてＨｉＴｒａｐＳカラムに通して溶出することにより、過剰な薬物−リンカー中間体および他の不純物を除去した。
【０２２３】
図６ａは、結合体化にむけて、細胞培養物から発現された、システイン改変抗体を調製する一般的なプロセスを示している。細胞培養液が、システインを含んでいるとき、新しく導入されたシステインアミノ酸と、培地由来のシステインまたはグルタチオンとの間に、ジスルフィド付加物が形成され得る。図６ａ中の例示的なチオＭａｂ（左）における丸で示されたシステイン付加物は、結合体化に対して反応性である、システイン改変抗体を生成するために還元されなければならない。システイン付加物は、おそらく様々な鎖間ジスルフィド結合とともに、ＴＣＥＰなどの還元剤によって還元的に切断され、それにより、還元型の抗体がもたらされる。対形成されたシステイン残基間の鎖間ジスルフィド結合は、硫酸銅、ＤＨＡＡまたは周囲の酸素への曝露による、部分的な酸化条件下で再形成される。その新しく導入され、操作された不対のシステイン残基は、リンカー試薬または薬物−リンカー中間体との反応に利用可能なままであることにより、本発明の抗体結合体が形成される。哺乳動物の細胞株において発現されたチオＭａｂは、−Ｓ−Ｓ−結合の形成によって、操作されたＣｙｓに対して、外部に結合体化されるＣｙｓ付加物をもたらす。ゆえに、精製されたチオＭａｂを、実施例２に記載されるような還元手順および再酸化手順で処理することにより、反応性のチオＭａｂが得られる。これらのチオＭａｂは、細胞傷害性薬物、フルオロフォアおよび他の標識を含むマレイミドと結合体化するために用いられる。
【０２２４】
図６ｂは、還元型抗体に対する再酸化の時間経過を示している。トラスツズマブを還元し、ｐＨ５．５において陽イオン交換カラムで精製した。上のパネルａは、時＝０分における、還元型抗体に対する逆相プロファイルを示している。保持時間７分における３つのピークは（左から右へ）：軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）および完全に還元されていない少量のＨＣ＋ＬＣである。精製された還元型抗体をｐＨ７で再酸化し、アリコートを時間の関数としてみた。中央のパネルｂは、軽鎖および重鎖の大部分が、再酸化して、９０分以内に２本のＬＣおよび２本のＨＣを含むインタクトな抗体を形成した（保持時間約１０分のピーク）ことを示している。反応時間１８０分の時点において、インタクトな抗体のさらなる形成は見られなかった（下のパネルｃ）。
【０２２５】
システイン改変抗体薬物結合体反応の解析から、鎖間または鎖内ジスルフィド結合の還元の後に、チオール反応性薬物リンカー中間体との結合体化によって調製された抗体薬物結合体（標準的なＡＤＣ）に対する不均一性の低下が示される。図７ａは、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを有する標準的なキメラ３Ａ５の結合体化産物のＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィ）解析を示している（上）。ＨＩＣ解析は、１抗体あたりの薬物に基づいてＡＤＣを区別する。１抗体あたり様々な数の薬物を有するＡＤＣの群の分布が得られ、ＡＤＣが、１つの３Ａ５抗体あたり、０個（１２％）、１個（３％）、２個（４３％）、３個（３％）、４個（３２％）、６個（６％）および８個（１％）のＭＭＡＥを有する。各群内において、８つの鎖間ジスルフィド結合のいずれかにおける、３Ａ５に連結されたＭＭＡＥとのさらなる不均一性が推定される。これらの種のうちのいくつかは、質量分析によって検出可能であるが、ＨＩＣクロマトグラフィによって分解されない。比較として、図７ａは、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを有するシステイン改変キメラ３Ａ５の結合体化産物のＨＩＣ解析も示している（下）。生成物（ＡＤＣの混合物）のそれほど不均一でない（ｌｅｓｓ  ｈｅｔｅｒｅｏｇｅｎｅｏｕｓ）分布およびより低い平均薬物負荷値（ｐ，薬物の平均個数／Ａｂ）がもたらされる。生成混合物は、主に２ＭＭＡＥ／３Ａ５（６０％）という単一種であり、ここで、その薬物は、重鎖におけるＡ１１７Ｃシステイン変異部位の各々において結合される。不完全な反応は、約３２％の１ＭＭＡＥ／抗体および７％の非結合体化抗体をもたらす。負荷の高いＡＤＣは、検出されない。図７ｂは、図７ａにおける解析の条件下でのチオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ結合体化反応のより大きいスケールのＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィ）クロマトグラムを示しており、ここで、平均薬物負荷値は、１つのチオｃｈ３Ａ５あたり１．９ＭＭＡＥだった。
【０２２６】
図８ａは、還元および脱グリコシル化後の、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとの標準的な（親）キメラ３Ａ５の結合体化産物の質量分析を示しており、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）に結合している薬物の相対量を示している（上）。軽鎖の約半分が、１つの薬物と結合体化していた。重鎖は、０、１、２および３個の薬物の分布を有した。検出可能な各質量内において、鎖間ジスルフィド結合のいずれかにおいて、３Ａ５に連結されたＭＭＡＥとのさらなる不均一性の存在が推定される。比較として、図８ａは、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとのシステイン改変キメラ３Ａ５の結合体化産物の質量分析も示している（下）。予想通り、軽鎖は、ＭＭＡＥを有しない。重鎖の大部分が、図８ｂおよび８ｃに記載されるように、Ａ１１７Ｃシステイン変異部位を介して１つのＭＭＡＥと結合体化されている。標準的なＡＤＣおよびチオＡＤＣを、ＬＣ／ＭＳ解析の前に脱グリコシルし、還元した。標準的なＡＤＣのデコンボルーションされた質量スペクトル（上、図８ａ）は、軽鎖において０または１個の薬物種を示し、重鎖において０、１、２または３個の薬物種を示したのに対し、チオＡＤＣは、重鎖においてただ１つの薬物種を示したことから、予想されるようにチオＡＤＣのより高い均一性が示唆される。
【０２２７】
図８ｂは、ＴＤＣ−Ｆａｂへの細胞傷害性薬物結合についての抗体領域のマッピングを示している。上のパネル（ａ）は、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ−結合体化Ｆａｂの、還元され変性された軽鎖部分および重鎖部分の２８０ｎｍ吸光度スペクトルを示している。中央のパネル（ｂ）の一部における軽鎖および下のパネル（ｃ）の一部における重鎖のデコンボリューションされた質量は、重鎖のみにおける薬物標識と一致する。（ｃ）において観察された２４１８９の質量は、その薬物の特徴的な断片化であるＭＭＡＥ−ＣＯ２の損失（−７６２ダルトン）に起因する。
【０２２８】
図８ｃは、ＴＤＣ−Ｆａｂにおける細胞傷害性薬物を含むペプチドの同定、すなわち、ペプチドマッピングを示している。未結合体化（上のパネルａ）および結合体化（中央のパネルｂ）チオ−３Ａ５およびＴＤＣのペプチドマップは、マレイミジル化され精製されたＦａｂのトリプシン消化物から得られた。ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥで標識されたペプチドは、高い疎水性を有し、クロマトグラムの後のほうで溶出されると予想される。４つの薬物−結合体化ペプチド（＊で標識されたもの）が、勾配の終わりに溶出した。それらはまた、すべてのＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ含有質量スペクトルにおいて観察される特徴的なインソースフラグメンテーションイオン（ｍ／ｚ７１８．５）によって、細胞傷害性薬物を含むペプチドとして同定され得る。下のパネル（ｃ）は、未結合体化消化物および結合体化消化物から抽出されたイオンクロマトグラムを重ねたものを示している。最も強いピークは、結合体消化物の後のほうの溶出ピークと一致する。４つすべてのピークが、Ｆａｂ−ＨＣの１１４位における変異されたシステイン周辺に位置する完全または部分的なトリプシン切断フラグメントと同定された。２９．０５分の主要なピークにおけるｍ／ｚイオンをデコンボリューションすることにより、３９６２ダルトンという質量が得られ、それは、ペプチドＨＣ９９−１２０＋１薬物に対して予想された質量であった。薬物含有ペプチド質量は、そのタンパク質の他の任意の領域にマッピングしなかった。上のパネル（ａ）の矢印で示されたピークは、マレイミド標識ペプチドＨＣ９９−１２０である。
【０２２９】
標準的なＡＤＣおよびチオ（システイン操作された）ＡＤＣもまた、非還元条件下および還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。標準的なＡＤＣは、図９ａに示されるように、鎖間ジスルフィド結合の喪失に起因して、多数の種を示した。
【０２３０】
図９ｂは、標準的なＨｕ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥおよび２つの調製物のチオＨｕ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥのタンデム型液体クロマトグラフィおよび質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって検出された主要な種を比較している。クロマトグラフィ解析の前に、サンプルをＤＴＴで処理して、ジスルフィド結合を還元的に切断するか、またはインタクトなまま放置した。従来の方法によって調製されたＨｕ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥは、広範な種の分布をもたらし、これは、結合体化プロセスの不均一性および鎖間スルフィド結合の喪失を反映している。対照的に、チオＨｕ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥの調製物の両方が、ほぼ同種であり、検出された種は、インタクトな非結合体化抗体（すべて通常のジスルフィド結合を有するもの）または他のどこでもなく操作されたシステインにおいてリンカー−薬物と結合体化された抗体のいずれかに相当する。
【０２３１】
スクリーニングの方法
本発明のなおも別の実施形態は、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドを含むと疑われるサンプル中のＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドの存在を判定する方法に関し、ここで、その方法は、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドに結合する、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体に上記サンプルを曝露する工程、およびそのサンプル中のＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドに対するシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体の結合を測定する工程（ここで、そのような結合の存在は、サンプル中のＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドの存在を示す）を包含する。必要に応じて、上記サンプルは、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドを発現していると疑われる細胞（癌細胞であり得る）を含み得る。本方法において使用されるシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体は、必要に応じて、検出可能に標識され得るか、固体支持体などに結合され得る。
【０２３２】
本発明の別の実施形態は、哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に関し、ここで、その方法は、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞を含む被験サンプルを、ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドに結合する、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体と接触させる工程、および（ｂ）その被験サンプルにおいて、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体と、ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドとの間の複合体の形成を検出する工程（ここで、複合体の形成は、その哺乳動物における腫瘍の存在を示す）を包含する。必要に応じて、そのシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体は、検出可能に標識され、固体支持体などに結合され、そして／または組織細胞の被験サンプルは、癌性腫瘍を有すると疑われる個体から得られる。
【０２３３】
インビトロ細胞増殖アッセイ
本発明の１つの実施形態は、ＭＵＣ１６ポリペプチドを発現する細胞の成長を阻害するための方法に関し、ここで、その方法は、その細胞を、ＭＵＣ１６ポリペプチドに対するシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体と接触させる工程を包含し、ＭＵＣ１６を発現している細胞の成長の阻害を引き起こす。その細胞は、癌細胞であり得、システイン改変抗体またはその抗体薬物結合体のＭＵＣ１６ポリペプチドに対する結合は、ＭＵＣ１６ポリペプチドを発現している細胞の死を引き起こすか、またはその細胞の増殖を阻害する。
【０２３４】
一般に、抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）の細胞傷害活性または細胞分裂抑制活性は：細胞培養液中で、ＭＵＣ１６ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞をＡＤＣに曝露すること；その細胞を約６時間〜約５日間にわたって培養すること；および細胞の生存率を測定することによって測定される。細胞増殖アッセイにとって有用な哺乳動物細胞としては：（１）ＭＵＣ１６ポリペプチドを発現する細胞株ＯＶＣＡＲ−３；（２）細胞表面上にＭＵＣ１６ポリペプチドの一部を安定的に発現するように操作されたＰＣ３由来の細胞株（ＰＣ３／ＭＵＣ１６）；（３）ＭＵＣ１６ポリペプチドを発現しない親ＰＣ３細胞株；および（４）ＭＵＣ１６ポリペプチドを発現しないが、外来性ＭＵＣ１６発現を駆動するために用いられるベクター（ＰＣ３／ｎｅｏ）を有するＰＣ３細胞株が挙げられる。細胞ベースのインビトロアッセイは、生存率（増殖）、細胞傷害性および本発明のＡＤＣのアポトーシス（カスパーゼ活性化）の誘導を測定するために用いられる。
【０２３５】
抗体−薬物結合体のインビトロでの効力を細胞増殖アッセイによって測定した（図１０および１１、実施例４）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙは、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａルシフェラーゼ（ＵＳ５５８３０２４；ＵＳ５６７４７１３；ＵＳ５７００６７０）の組換え発現に基づいた、市販されている（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）均一なアッセイ方法である（Ｍｅｎｄｏｚａら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：５４８５−５４８８）。この細胞増殖アッセイは、代謝的に活性な細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量化に基づいて、培養物中の生存細胞の数を決定する（Ｃｒｏｕｃｈら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：８１−８８；ＵＳ６６０２６７７）。
【０２３６】
インビトロ細胞増殖アッセイの結果を図１０および１１に示し、これらの結果から、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体薬物結合体の各々が、ＯＶＣＡＲ−３およびＰＣ３／ＭＵＣ１６細胞（すなわち、細胞表面上にＭＵＣ１６ポリペプチドを発現する細胞）において有意水準の細胞死をもたらしたのに対し、親ＰＣ３およびＰＣ３／ｎｅｏ細胞（細胞表面上にＭＵＣ１６ポリペプチドを発現しない細胞）においては、いずれの抗体についても有意な細胞殺滅が観察されなかったことが証明される。これらのデータは、試験された結合体が、細胞の表面上に発現されたＭＵＣ１６ポリペプチドに結合することができ、それらの細胞の死をインビトロにおいて引き起こすことができることを証明している。
【０２３７】
薬物動態−血清クリアランスおよび安定性
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの単回の静脈内ボーラス投薬後の抗体および薬物結合体の血清濃度を測定することによって、抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体のインビボでの性質を解析した。少なくとも１つの細胞傷害性薬物を有する抗体−薬物結合体の濃度を、捕捉用にＭＵＣ１６細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質、ならびに検出用に抗ＭＭＡＥおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化抗マウスＦｃ抗体を使用するＥＬＩＳＡを用いて測定された。捕捉用にＭＵＣ１６ＥＣＤおよび検出用に抗ヒト−ＦｃＨＲＰを使用するＥＬＩＳＡを用いて、血清中の全Ｃｈ３Ａ５およびチオＣｈ３Ａ５の濃度を測定した。このアッセイから、結合体化ＭＭＡＥ有りおよび無しの両方における、すべての抗ＭＵＣ１６抗体が測定された。このアッセイは、１：１０という最低希釈での０．７８ｎｇ／ｍＬという定量化の下限を有する。このアッセイは、１：１０という最低希釈での０．７８ｎｇ／ｍＬという定量化の下限を有する。ＩＶボーラス投与、一次除去およびマクロ（ｍａｃｒｏ）速度定数を用いる２成分モデル（Ｍｏｄｅｌ  ８，ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏ  ｖ．５．０．１，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して、各動物からの血清濃度−時間データを解析した。全体の適合度は、予測される推定値、その予測に対する標準誤差、および１次および２次パラメータに対する変動係数のパーセンテージ、ならびに観察された濃度−時間データと予測された濃度−時間データとの間の残差プロットの調査に基づいた。個別の主要なＰＫパラメータは、それぞれアルファ相およびベータ相に関連する時間ゼロにおける切片（ＡおよびＢ）ならびにマイクロ速度定数（アルファおよびベータ）を包含した。以下のモデリング選択肢を用いた：ＷｉｎＮｏｎｌｉｎを用いて最初の推定値を決定した；予測される濃度の二乗値の逆数（１／ｙ２）によって濃度を重み付けした；Ｎｅｌｄｅｒ−Ｍｅａｄ最小化アルゴリズムを用いた。
【０２３８】
ラットにおける２８日間の薬物動態解析の結果を図１２に示す。０．５ｍｇ／ｋｇ体重で、チオｃｈ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥまたはｃｈ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥをラットに投薬した。投薬の５分後、１時間後、６時間後、２４時間後ならびに２、３、４、８、１１、１５、２１および２８日後にラットから血清を回収した。チオｃｈ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥは、全抗体に関して、または薬物−結合体化抗体に関して、より遅いインビボクリアランスの動態を示した。この挙動は、代謝をはじめとした迅速なクリアランス経路を通じて細胞傷害性薬物のクリアランスの潜在的に有害な影響を減少させつつ、悪性疾患または他の障害を処置する過程においてその治療薬への曝露を改善するために有益であり得る。
【０２３９】
動物毒性
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体の安全性を急性毒性ラットモデルにおいて評価した。雌Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＡＤＣで処置し、続いて様々な器官に対する影響を検査し、解析することによって、ＡＤＣの毒性を調べた。ＡＤＣの毒性は、巨視的観察（体重）、臨床病理学パラメータ（血清化学および血液学）および組織病理学に基づいて、観察され、特徴づけられ、そして測定され得る。等価な用量レベルにおいて、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体は、対応する標準的な抗体−薬物結合体よりも急性でない毒性と関連することが見出された。
【０２４０】
青年期雌ラット（１００〜１２５ｇ）における１２日間の急性毒性研究は：１日目の、ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥ（２４．１９ｍｇ／ｋｇ＝１９３４μｇ／ｍ２）、チオｃｈ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥ（４９．９９ｍｇ／ｋｇ＝１９３４μｇ／ｍ２）およびコントロールビヒクルの単回の注射によって行われた。Ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５は、３Ａ５と呼ばれる親キメラ抗ＭＵＣ１６抗体であり、チオｃｈ３Ａ５は、システイン改変キメラ抗ＭＵＣ１６  ３Ａ５抗体である。体重を毎日測定した。５および１２日目に臨床化学、血清酵素および血液学の解析を行った；病理組織学的な評価を用いた徹底的な剖検によって結論づけた。毒性シグナルには、体重減少の臨床所見が含められた。
【０２４１】
血清中の肝臓酵素（例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびｇ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）が挙げられる）の増加によって、肝毒性を判断した。白血球（主に顆粒球（ｇｒａｎｕｌｏｃｔｙｅｓ）（好中球））および／または血小板の枯渇、ならびにリンパ系器官の介入、すなわち、萎縮またはアポトーシスの活性による、血液リンパ系毒性が観察された。ビヒクルで処置された動物と比べて、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体は、血清ＡＳＴのレベルまたは循環血小板もしくは循環好中球のレベルの検出可能な変化を引き起こさなかったことが見出された。これらの知見を図１３に示す。対照的に、標準的な抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体は、同じ用量の細胞傷害性薬物および半分の用量の抗体において、ＡＳＴの一過性の増加、ならびに循環中の好中球および血小板の枯渇をもたらした（５日目に観察された）。血清ＡＳＴおよびＧＧＴの増加もまた観察された。システイン改変抗体結合体化技術は、げっ歯類モデルにおける抗体−薬物結合体の安全性を改善するとみられる。ラットでは、１６．６ｍｇ／ｋｇの標準的な抗ＭＵＣ１６  ＡＤＣ（１５００μｇ／ｍ２の薬物曝露と等価）の単回用量によって、５日目に循環好中球および他の白血球の顕著な枯渇がもたらされ（投薬の４日後；図１３）、その後、１２日目に代償的な回復がもたらされた。この標準的なＡＤＣの用量は、肝臓酵素アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの血清レベルの穏やかな上昇（ＡＳＴ；図１３）および一過性の体重減少（図１４）ももたらした。ＡＳＴレベルは、用量を５０％増加させることによってより著明に影響を受けた（２４．５ｍｇ／ｋｇ  ＡＤＣ；２２５０μｇ／ｍ２  ＭＭＡＥ）。その用量において、６匹中３匹のラットが、研究が終了するまで生存しなかった（１２日目）。対照的に、３６．４ｍｇ／ｋｇのチオ抗ＭＵＣ１６ＡＤＣ（１５００μｇ／ｍ２の薬物曝露と等価）であっても有害作用はもたらされず、すべてのパラメータが、ビヒクルで処置された動物と本質的に同一であった。６８．６ｍｇ／ｋｇチオ抗ＭＵＣ１６ＡＤＣ（２８２０μｇ／ｍ２薬物）という用量によって、その用量の４分の１の標準的な抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体を用いて観察された毒性とほぼ等価な毒性がもたらされた。重要なことに、最も高いチオ抗ＭＵＣ１６ＡＤＣ用量（１００．８ｍｇ／ｋｇ；４１５０μｇ／ｍ２薬物）は、明白な効果をもたらしたが、有害作用の全体のプロファイルは、標準的な抗ＭＵＣ１６ＡＤＣの高い用量（２４．５ｍｇ／ｋｇ  ＡＤＣ；２２５０μｇ／ｍ２  ＭＭＡＥ）において観察されたプロファイルとかなり類似していた。この同じ傾向は、キメラ結合体を用いる予備的な研究において観察された。
【０２４２】
ビヒクルのみを投薬された動物に対して、ＡＤＣを投薬した後の体重減少または体重の変化は、全身性または局在型の毒性の肉眼的かつ一般的な指標であると考えられる。図１４は、１２日間にわたる体重の変化（グラム）を示している。システイン改変結合体を投与されたラットは、ビヒクルで処置された動物と同じ割合で体重増加したのに対し、標準的な抗体−薬物結合体を投与されたラットは、一過性の体重減少または体重増加の遅延を起こした。
【０２４３】
標準的な抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体およびチオ抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体の安全性をカニクイザルにおいても評価した。ラットとサルの両方の種が、３Ａ５抗体によって認識されるＭＵＣ１６を発現するが、カニクイザル抗原のほうが、１次配列に関してヒト抗原に似ている。競合結合アッセイにおいて、ＣＡ１２５に対するＭＡｂ３Ａ５の結合が、同様の濃度のヒトおよびサルＭＵＣ１６ＥＣＤタンパク質によって阻害された（それぞれＩＣ５０＝０．７６ｎＭおよび１．８９ｎＭ）が、ラットＭＵＣ１６ＥＣＤによる競合は、それほど効率的ではなかった（ＩＣ５０＝１３．５ｎＭ）。ラットとカニクイザルの両方が、抗体−ＭＭＡＥ結合体に感受性である。カニクイザルにおけるパイロット研究は、ラットにおける知見と本質的に同様であった。標準的およびチオ抗ＭＵＣ１６−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣを投薬された霊長類における最も有意な有害事象は、好中球の可逆的な減少である。１２００μｇ／ｍ２薬物（５．９ｍｇ／ｋｇ抗体）という薬物曝露での標準的な抗ＭＵＣ１６−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣによって、著しい減少が誘導されたのに対し、１２００μｇ／ｍ２薬物（１２．８ｍｇ／ｋｇ抗体）におけるチオＡＤＣは、注目すべき有害事象をもたらさず、好中球数は、偽処置動物と近い数であった（図１７）。１および２２日目に、動物に投薬した。２２日目の好中球レベルは、２回目の投薬の前におけるものだった（ｐｒｅ−ｓｅｃｏｎｄ  ｄｏｓｅ）。２５．６ｍｇ／ｋｇ；２４００μｇ／ｍ２薬物まで用量を倍加させると、好中球数が減少したが、これは、完全に可逆的だった。チオ抗ＭＵＣ１６ＡＤＣは、より高い用量（３８．４ｍｇ／ｋｇ；３６００μｇ／ｍ２薬物）であっても、好中球の減少を超える著しい影響をもたらさず、その影響は、中レベルの用量よりも著明であるが、可逆的なままであった。重要なことに、ＭＵＣ１６を発現すると知られている器官（例えば、角膜、肺、卵管および子宮が挙げられる）において毒性は観察されなかった。ＴＤＣを投薬されたサルにおける、唯一の注目すべき病理組織学的知見は、骨髄造血の最小から穏やかな増加、および胸腺リンパ系の最小から穏やかな枯渇であり、これは、好中球の減少と一致し、かつ修復性の応答を示すものだった。これらの結果は、細胞傷害性薬物の用量（すなわち、等価なμｇ／ｍ２）に基づいて比較するときでさえも、チオＡＤＣが前臨床モデルにおいて標準的なＡＤＣよりも安全であることを証明する。
【０２４４】
インビボ活性アッセイ
げっ歯類において癌細胞の同種移植片または異種移植片を移植し、その腫瘍をＡＤＣで処置することによって、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体の有効性をインビボにおいて測定した。細胞株、癌細胞上に存在するレセプターに対するＡＤＣの抗体結合特異性、投薬レジメンおよび他の因子に応じて、可変的な結果が予測される。中レベルのＭＵＣ１６を発現するトランスジェニック外植片マウスモデルを用いて、ＡＤＣのインビボでの有効性を測定した。被験体をＡＤＣで１回処置し、３〜６週間にわたってモニターすることにより、腫瘍が倍加するまでの時間、対数細胞殺滅および腫瘍縮小を測定した。用量反応の追跡調査および多用量の実験を行った。
【０２４５】
図１５および１６は、雌ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪パッドに移植されたＯＶＣＡＲ−３腫瘍細胞に対する、システイン改変抗ＭＵＣ１６薬物結合体の活性を、標準的な結合体と比較して示している。腫瘍を確立し、０日目における１回の処置の前までに、その腫瘍を１５０〜２００ｍｍ３の体積まで（ノギスを用いて測定する）生育させた。式：Ｖ（ｍｍ３）＝０．５Ａ×Ｂ２（ここで、ＡおよびＢは、それぞれ、長径および短径である）に従って、ノギスを用いて腫瘍体積を測定した。腫瘍体積が、３０００ｍｍ３に達する前か、または腫瘍が潰瘍形成を起こしそうな徴候を示したときに、マウスを安楽死させた。各実験群（１群あたり１０匹のマウス）から回収されたデータを平均値±ＳＥとして表した。図１５は、６ｍｇ／ｋｇという用量でのｓｔｄ  ｈｕ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥ（３２８ｍｇ／ｍ２薬物用量）とチオｈｕ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥ（１５０ｍｇ／ｍ２薬物用量）との同等の活性を示している。図１６は、１．５、３および６ｍｇ／ｋｇという用量を適用するキメラ結合体を比較しており；システイン改変結合体および標準的な結合体は、各用量レベルにおいて同等の活性を示した。データを以下に表の形式で要約する。
【０２４６】
【表５】
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チオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは、卵巣癌の異種移植片モデルに対して、各ＩｇＧ用量レベルにおいて、ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと少なくとも同程度に活性であり、１．５ｍｇ／ｋｇにおいて部分的な有効性がもたらされ（ＭＭＡＥ用量は、チオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥに対して３５μｇ／ｍ２であり、ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥに対して７１μｇ／ｍ２である）、３ｍｇ／ｋｇ（６９  対  １４１μｇ／ｍ２  ＭＭＡＥ）および６ｍｇ／ｋｇ（１３９  対  ２８３μｇ／ｍ２  ＭＭＡＥ）において腫瘍のほぼ完全な除去がもたらされた。ＭＭＡＥ用量に関して述べると、チオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは、ｓｔｄ  ｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの約２倍有効だった。いずれの結合体についても、すべての用量レベルにおいて、有害作用は観察されなかった。
【０２４７】
処置の方法
本発明の別の実施形態は、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドを発現する細胞を含む癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する方法に関し、ここで、その方法は、その哺乳動物に、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドに結合する、治療有効量のシステイン改変抗体またはその抗体薬物結合体を投与することによって、その腫瘍の有効な治療的処置をもたらす工程を包含する。
【０２４８】
本発明の別の実施形態は、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドの発現または活性の変化、好ましくは、増加に関連する細胞増殖性障害を処置するためまたは予防するための方法に関し、その方法は、そのような処置の必要のある被験体に、有効量のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体を投与する工程を包含する。例示的な細胞増殖性障害は、癌である。細胞増殖性障害の有効な処置または予防は、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドを発現する細胞の直接的な殺滅もしくは成長の阻害の結果であり得るか、またはＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドの細胞成長を増強する活性を、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体で拮抗させることによる結果であり得る。
【０２４９】
本発明のなおも別の実施形態は、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体を、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドを発現する細胞に結合する方法に関し、ここで、その方法は、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドを発現する細胞を、前記システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体と、そのシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体が前記ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドに結合するのに適した条件下で接触させる工程、およびそれらの間の結合を可能にする工程を包含する。好ましい実施形態では、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体は、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体の、細胞に対する結合の位置および／または量を定性的および／または定量的に測定するのに有用な分子または化合物で標識される。
【０２５０】
本発明の他の実施形態は、（ｉ）癌もしくは腫瘍の治療的処置もしくは診断的検出、または（ｉｉ）細胞増殖性障害の治療的処置もしくは予防に有用な薬物の調製における、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体の使用に関する。
【０２５１】
本発明の別の実施形態は、癌細胞の成長を阻害するための方法に関し、ここで、前記癌細胞の成長は、少なくとも部分的に、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドの成長増強作用に依存し（ここで、ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドは、癌細胞自体、または癌細胞に対して成長増強作用を有するポリペプチドを産生する細胞のいずれかによって発現され得る）、ここで、その方法は、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドを、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体と接触させることによって、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドの成長増強活性を拮抗させる工程、そしてその癌細胞の成長を阻害する（それによって癌細胞の成長が阻害される）工程を包含する。
【０２５２】
本発明の別の実施形態は、哺乳動物において腫瘍を治療的に処置する方法に関し、ここで、前記腫瘍の成長は、少なくとも部分的に、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドの成長増強作用に依存し、ここで、その方法は、哺乳動物に、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドに結合する、治療有効量のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体薬物結合体を投与することによって、前記ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドの成長増強活性を拮抗させる工程、およびその腫瘍の有効な治療的処置をもたらす工程を包含する。
【０２５３】
上記抗体、その抗体フラグメントおよび結合体は、細胞外液に放出される原形質膜ＭＵＣ１６タンパク質の細胞外エピトープを認識する。本発明は、上記抗体、抗体フラグメントおよび結合体を用いて、乳癌および卵巣癌などの悪性疾患を検出し、モニターし、そして処置するための方法をさらに提供する。
【０２５４】
本発明の抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）は、例えば、ＭＵＣ１６腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする様々な疾患または障害を処置するために使用され得る。例示的な状態または過剰増殖性障害としては、良性または悪性の腫瘍；白血病およびリンパ系悪性疾患が挙げられる。他のものとしては、ニューロンの障害、グリアの障害、アストロサイトの（ａｓｔｒｏｃｙｔａｌ）障害、視床下部の障害、腺の障害、マクロファージの（ｍａｃｒｏｐｈａｇａｌ）障害、上皮の障害、間質の障害、胞胚腔の障害、炎症性障害、血管新生の障害および免疫学的障害（自己免疫性障害を含む）が挙げられる。
【０２５５】
動物モデルおよび細胞ベースのアッセイにおいて同定されるＡＤＣ複合物は、腫瘍を有する高等霊長類およびヒトの臨床試験においてさらに試験され得る。その臨床試験は、公知の治療レジメン（例えば、放射線照射ならびに／または、公知の化学療法剤および／もしくは細胞傷害剤が関わる化学療法）と併用してＡＤＣの有効性を評価するために設計され得る。
【０２５６】
一般に、処置される疾患または障害は、癌などの過剰増殖性疾患である。本明細書中で処置される癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病またはリンパ系悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより特定の例としては、卵巣癌、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化器癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵臓腺癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、直腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓の癌腫、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が挙げられる。
【０２５７】
疾患の予防または処置のための、ＡＤＣの適切な投薬量は、上に定義されたような処置される疾患のタイプ、疾患の重症度および経過（その分子が予防的な目的で投与されるか、治療的な目的で投与されるかは関係ない）、それまでの治療、患者の病歴および抗体に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。本分子は、患者に、１回または一続きの処置において、適切に投与される。疾患のタイプおよび重症度に応じて、分子の約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）が、例えば、１回以上の分割投与によるか持続注入によるかに関係なく、患者に投与するための最初の候補投薬量である。代表的な１日投薬量は、上で述べた因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲またはそれ以上であり得る。患者に投与されるＡＤＣの例示的な投与量は、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲である。
【０２５８】
数日間またはそれ以上にわたる反復投与に対しては、その状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで、処置が継続される。例示的な投薬レジメンは、抗ＭＵＣ１６抗体の、約４ｍｇ／ｋｇという最初の負荷投与量に続いて、約２ｍｇ／ｋｇという１週間あたりの維持用量を投与する工程を包含する。他の投与レジメンも有効であり得る。この治療の進捗は、超音波イメージングをはじめとした従来の手法およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０２５９】
抗体−薬物結合体の投与
本発明の抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）は、処置される状態に対して適切な任意の経路によって投与され得る。ＡＤＣは、代表的には、非経口的に、すなわち注入で、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外に、投与される。
【０２６０】
薬学的処方物
本発明の治療的な抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）の薬学的処方物は、代表的には、薬学的に許容可能な非経口ビヒクルとともに、そして単位投薬量の滅菌された注射可能な形態での、非経口投与、すなわち、ボーラス、静脈内、腫瘍内注射のために調製される。所望の純度を有する抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）は、必要に応じて、凍結乾燥された処方物または水溶液の形態で、薬学的に許容可能な希釈剤、キャリア、賦形剤または安定剤と混合される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．）。
【０２６１】
許容可能な希釈剤、キャリア、賦形剤および安定剤は、使用される投薬量および濃度においてレシピエントに対して無毒性であり、それらとしては、緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸）；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム）；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；ＥＤＴＡなどのキレート剤；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられる。
【０２６２】
活性な薬学的成分はまた、例えば、コアセルベーション手法または界面重合、例えば、ヒドロキシメチルセルロースによって調製されたマイクロカプセル、またはコロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）もしくはマクロエマルジョンにおいてそれぞれゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセル内に封入され得る。そのような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２６３】
徐放調製物を調製してもよい。徐放調製物の適当な例としては、ＡＤＣを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、成形された物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（ＵＳ３７７３９１９）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア））およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０２６４】
上記処方物は、前述の投与経路に適したものを含む。その処方物は、便利に単位剤形で存在し得、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。手法および処方物は、通常、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に見られる。そのような方法は、活性成分を、１つ以上の付属成分を構成するキャリアと会合させる工程を包含する。一般に、処方物は、活性成分を液体キャリアもしくは微粉化した固体キャリアまたはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要であれば、生成物を成形することによって、調製される。
【０２６５】
本発明の水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合された活性な材料を含む。そのような賦形剤としては、懸濁剤（例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、クロスカルメロース、ポビドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ  ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｏｓｅ）、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴム）および分散剤または湿潤剤（例えば、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン））、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られる部分エステルとの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられる。水性懸濁液はまた、１つ以上の保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル）、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味料および１つ以上の甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）を含み得る。
【０２６６】
ＡＤＣの薬学的組成物は、滅菌された注射可能な調製物（例えば、滅菌された注射可能な水性懸濁液または油性懸濁液）の形態であり得る。この懸濁液は、上で述べた適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて、公知の技術に従って製剤化され得る。滅菌された注射可能な調製物はまた、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒（例えば、１，３−ブタン−ジオール中の溶液）中の滅菌された注射可能な溶液または懸濁液であってもよいし、凍結乾燥された粉末として調製されてもよい。水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液が、使用され得る許容可能なビヒクルおよび溶媒の中に入る。さらに、従来、滅菌された固定油が、溶媒または懸濁媒質として使用され得る。この目的で、合成モノグリセリドまたはジグリセリドをはじめとした任意の無刺激性の（ｂｌａｎｄ）固定油が、使用され得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射可能物の調製において同様に使用され得る。
【０２６７】
単回投与形態を生成するためにキャリア材料と混合され得る活性成分の量は、処置される宿主および特定の投与様式に応じて変化し得る。例えば、静脈内注入が意図された水溶液は、約３０ｍＬ／時という速度で、適当な体積の注入がもたらされ得るように、溶液１ミリリットルあたり約３〜５００μｇの活性成分を含み得る。
【０２６８】
非経口投与に適した処方物としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および意図されたレシピエントの血液とその処方物とを等張性にする溶質を含み得る水性および非水性の滅菌された注射溶液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌された懸濁液が挙げられる。
【０２６９】
腸における加水分解または変性が理由で、タンパク質治療薬の経口投与は嫌われるが、経口投与に適したＡＤＣの処方物は、各々が所定量のＡＤＣを含む別々の単位（例えば、カプセル、カシェ剤または錠剤）として調製され得る。
【０２７０】
その処方物は、単位用量または多用量用の容器、例えば、密閉されたアンプルおよびバイアル内にパッケージされていてもよいし、注射用の滅菌された液体キャリア、例えば、水を使用の直前に加えることだけが必要なフリーズドライ（凍結乾燥）の状態で保存されていてもよい。即時調合の注射溶液および懸濁液は、先に記載した種類の滅菌された粉末、顆粒剤および錠剤から調製される。好ましい単位投与量の処方物は、本明細書中の上で列挙したような１日量または１日量より少ない単位の活性成分または適切な分割量の活性成分を含むものである。
【０２７１】
本発明の組成物はまた、リポソーム；哺乳動物への薬物の送達に有用な、様々なタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小型のベシクルとして製剤化され得る。そのリポソームの成分は、通常、生物学的膜の脂質の配置に類似した二重層を形成した状態で配置されている。抗体を含むリポソームは、当該分野で公知方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８；Ｈｗａｎｇら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０；ＵＳ４４８５０４５；ＵＳ４５４４５４５；ＵＳ５０１３５５６；ＷＯ９７／３８７３１に記載されている方法）によって調製される。リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって作製され得る。リポソームは、規定のポアサイズのフィルターを通って押し出されることにより、所望の直径を有するリポソームがもたらされ得る。本発明の組成物のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合体化され得る（Ｍａｒｔｉｎら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８）。化学療法剤は、必要に応じて、リポソーム内に含められる（Ｇａｂｉｚｏｎら（１９８９）Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４。
【０２７２】
併用療法
本発明の抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）は、抗癌特性を有する第２化合物との、薬学的な併用処方物または併用療法としての投薬レジメンにおいて組み合わされ得る。その薬学的な併用処方物または投薬レジメンの第２化合物は、好ましくは、組み合わせのＡＤＣに対して補完的な活性を有するものであり、それらが互いに悪影響を及ぼさないものである。
【０２７３】
第２化合物は、化学療法剤、細胞傷害剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤および／または心臓保護剤（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）であり得る。そのような分子は、意図される目的のために有効な量で適切に組み合わされる。本発明のＡＤＣを含む薬学的組成物はまた、治療有効量の化学療法剤（例えば、チューブリン形成インヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、ＤＮＡインターカレーターまたはＤＮＡ結合剤）も有し得る。
【０２７４】
他の治療レジメンは、本発明に従って特定される抗癌剤の投与と併用され得る。併用療法は、同時または連続的なレジメンとして行われ得る。連続的に投与されるとき、その併用物は、２回以上の投与において投与され得る。その併用投与としては、別個の処方物または単一の薬学的処方物を用いる同時投与、およびいずれかの順序での継続的な投与が挙げられ、ここで、好ましくは、両方（またはすべて）の活性な薬剤が、それらの生物学的活性を同時に発揮する時間にわたる投与である。
【０２７５】
１つの実施形態において、ＡＤＣによる処置は、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体−薬物結合体と、１つ以上の化学療法剤、治療的な生物製剤または成長阻害剤との併用投与（様々な化学療法剤のカクテルの同時投与を含む）を含む。化学療法剤としては：タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；カルボプラチンなどの白金含有化合物；エルロチニブおよびゲフィチニブなどのＥＧＦＲインヒビター；イマチニブなどのチロシンキナーゼインヒビター；およびアントラサイクリン抗生物質（例えば、ドキソルビシンまたはドキシル（ｄｏｘｉｌ））が挙げられるが、これらに限定されない。システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体−薬物結合体と併用して使用される治療的な生物学的薬剤としては、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））またはパーツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）（ＯｍｎｉｔａｒｇＴＭ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）が挙げられる。そのような化学療法剤に対する調製および投薬スケジュールは、製造者の指示書に従って、または当業者によって経験的に決定されるように、使用され得る。そのような化学療法に対する調製および投薬スケジュールは、“Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ”，（１９９２）Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄにも記載されている。
【０２７６】
ＡＤＣは、抗ホルモン化合物；例えば、タモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物；オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）（ＥＰ６１６８１２）などの抗プロゲステロン；またはフルタミドなどの抗アンドロゲンと、そのような分子に対して公知の投薬量で、併用され得る。処置される癌が、ホルモンと無関係の癌である場合、患者は、予め抗ホルモン治療に供されることがあり、癌がホルモンと無関係になったあと、ＡＤＣ（および必要に応じて、本明細書中に記載されるような他の薬剤）が、その患者に投与され得る。その患者に、心臓保護剤（その治療に関連する心筋の機能不全を予防するためまたは減少させるために）または１つ以上のサイトカインを同時投与することも有益であり得る。上記の治療レジメンに加えて、患者は、癌細胞の外科的除去および／または放射線治療に供されることがある。
【０２７７】
上記の同時投与される薬剤のいずれかに対する適当な投薬量は、現在使用されている量であり、新しく同定された薬剤および他の化学療法剤または処置の併用作用（相乗作用）に起因して、減少され得る。
【０２７８】
併用療法は、「相乗作用」をもたらし得、「相乗的な」効果、すなわち、一緒に使用される活性成分がそれらの化合物を別々に使用して生じる効果の合計よりも大きいときに達成される効果を証明し得る。活性成分が：（１）組み合された単位投薬量の処方物で同時に製剤化されて、投与されるか、もしくは同時に送達されるか；（２）交互に、もしくは別個の処方物として平行して、送達されるか；または（３）いくつかの他のレジメンによるものであるとき、相乗効果が達成され得る。交互療法で送達されるとき、相乗効果は、それらの化合物が、例えば、別個の注射器における異なる注射によって、連続的に投与されるか、または送達されるときに、達成され得る。通常、交互療法においては、有効な投薬量の各活性成分は、連続的に、すなわち、一続きで投与されるのに対し、併用療法では、有効な投薬量の２つ以上の活性成分が、一緒に投与される。
【０２７９】
抗体−薬物結合体の代謝産物
本明細書中に記載されるＡＤＣ複合物のインビボ代謝産物もまた、そのような生成物が、従来技術と比較して新規であり、自明でない程度まで、本発明の範囲内に入る。そのような生成物は、例えば、投与された化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、エステル化、酵素的切断などから生じ得る。したがって、本発明は、本発明の化合物を、その代謝産物を得るのに十分な時間にわたって哺乳動物と接触させる工程を包含するプロセスによって生成される新規かつ自明でない化合物を包含する。
【０２８０】
代謝産物は、代表的には、放射標識された（例えば、１４Ｃまたは３Ｈ）ＡＤＣを調製し、それを検出可能な用量（例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇを超える用量）で動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、サルまたはヒト）に非経口的に投与し、十分な時間にわたって代謝を起こし（代表的には約３０秒〜３０時間）、そしてその変換産物を尿、血液または他の生物学的サンプルから単離することによって、同定される。これらの生成物は、標識されているので、容易に単離される（他のものは、代謝産物中に残存するエピトープに結合することができる抗体を使用することによって、単離される）。代謝産物の構造は、従来の様式、例えば、ＭＳ、ＬＣ／ＭＳまたはＮＭＲ解析によって測定される。一般に、代謝産物の解析は、当業者に周知の従来の薬物代謝研究と同じ方法で行われる。変換産物は、それらが別途インビボにおいて見られない限り、本発明のＡＤＣ複合物の治療的な投薬についての診断的アッセイにおいて有用である。
【０２８１】
製品
本発明の別の実施形態において、上に記載した障害の処置に有用な材料を備えた製品すなわち「キット」が提供される。本製品は、容器、およびその容器上または容器に関連する、ラベルまたは添付文書を備える。その添付文書とは、治療的な生成物の市販のパッケージに慣例上含まれていて、適応症、使用法、投薬量、投与、禁忌症および／またはそのような治療的な生成物の使用に関する警告についての情報を含んでいる指示書のことを指し得る。適当な容器としては、例えば、ビン、バイアル、注射器、ブリスター包装などが挙げられる。その容器は、種々の材料（例えば、ガラスまたはプラスチック）から形成され得る。
【０２８２】
１つの実施形態において、本製品は、容器、およびその容器内に含められている、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体またはその抗体−薬物結合体の処方物を備える。本物品は、必要に応じて、容器に貼られたラベルまたは容器とともに含められる添付文書をさらに備え得、そのラベルまたは添付文書は、腫瘍の治療的処置または診断的検出のための組成物の使用について言及している。その処方物を保持している容器は、その治療薬の保存および送達に対して有効なものであり、滅菌された接続口を有し得る（例えば、その容器は、皮下注射針で貫通可能な栓を有する、静脈内溶液のバッグまたはバイアルであり得る）。そのラベルまたは添付文書は、その処方物が、癌などの最適な状態を処置するために使用されることを示している。あるいは、またはさらに、本製品は、薬学的に許容可能な緩衝液（例えば、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液）が入った第２（または第３）の容器をさらに備え得る。本製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針および注射器をはじめとした、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに備え得る。
【０２８３】
以下の実施例は、実例となる目的のためだけに提供され、本発明の範囲を限定すると決して意図されない。
【０２８４】
本明細書に引用されるすべての特許および参照文献は、それらの全体が本明細書によって参考として援用される。
【実施例】
【０２８５】
実施例において言及される市販の試薬は、別段示されない限り、製造者の指示に従って使用した。以下の実施例において、および明細書全体を通じて、ＡＴＣＣアクセッション番号によって識別される細胞の供給源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡである。
【０２８６】
実施例１  抗ＭＵＣ１６  ３Ａ５抗体の調製
ヒト化およびキメラ３Ａ５抗Ｍｕｃ１６  ３Ａ５抗体（図３および４）をＷＯ２００７／００１８５１に従って調製した（その配列および抗体が参考として援用される）。
【０２８７】
Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（１９９１）５ｔｈ  Ｅｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に従って、軽鎖アミノ酸に番号を付けた。Ｋａｂａｔシステムとして述べられる部分を除いて、Ｅｕナンバリングシステム（Ｅｄｅｌｍａｎら（１９６９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６３（１）：７８−８５）に従って、重鎖アミノ酸に番号を付けた。１文字のアミノ酸省略形を用いる。
【０２８８】
２つの実施形態を含む、システイン改変ヒト化（チオｈｕ）およびキメラ（チオｃｈ）抗ＭＵＣ１６  ３Ａ５モノクローナル抗体をＡ１１７Ｃバリアントとして発現させ、精製した：
チオｈｕ抗ＭＵＣ１６ＨＣ  Ａ１１７Ｃ  ３Ａ５：ＭＷ＝１４４８３４．８４；ｐＩ＝８．２８；ｐＩ（酸化型Ｃ）＝８．７９；長さ＝１３２０；Ｅｘｔ．Ｃｏｅｆ．（２８０）＝１．６１。重鎖４４６ａａ；ＭＷ：４８９５２．２３，ｐＩ：８．５５，ｐＩ（酸化型ｃ）：９．１２，Ｅｘｔ．Ｃｏｅｆｆ．（２８０）：１．７０；計算の前に切り落とされる潜在的なシグナル配列（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）．長さ＝１９；ｄｎａ開始位置：９８７，ｄｎａ停止位置：２３２４，図１，配列番号１。軽鎖２１４ａａ；ＭＷ：２３４８３．２０，ｐＩ：６．７１，ｐＩ（酸化型ｃ）：６．７２，Ｅｘｔ．Ｃｏｅｆｆ（２８０）：１．４３；計算の前に切り落とされる潜在的なシグナル配列（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）．長さ＝１９；ｄｎａ開始位置：７１０３，ｄｎａ停止位置：７７４４，図１，配列番号２
チオｃｈ抗ＭＵＣ１６ＨＣ  Ａ１１７Ｃ：ＭＷ＝１４５１１８．９；ｐＩ＝７．９９；ｐＩ（酸化型Ｃ）＝８．４４；長さ＝１３２０；Ｅｘｔ．Ｃｏｅｆ．（２８０）＝１．５９．重鎖４４６ａａ；ＭＷ：４９２３６．５０，ｐＩ：８．２９，ｐＩ（酸化型ｃ）：８．８５，Ｅｘｔ．Ｃｏｅｆｆ（２８０）：１．６６；計算の前に切り落とされる潜在的なシグナル配列（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＡＹＡ）．長さ＝１９；ｄｎａ開始位置：９８７，ｄｎａ停止位置：２３２４，図２，配列番号３。軽鎖２１４ａａ；ＭＷ：２３３４０．９６，ｐＩ：６．７１，ｐＩ（酸化型ｃ）：６．７２，Ｅｘｔ．Ｃｏｅｆｆ（２８０）：１．４４；計算の前に切り落とされる潜在的なシグナル配列（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）．長さ＝１９；ｄｎａ開始位置：７１０３，ｄｎａ停止位置：７７４４。図２，配列番号４
実施例２  還元および再酸化による結合体化のための、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体の調製
ＣＨＯ細胞において発現させる、システイン改変完全長抗ＭＵＣ１６モノクローナル抗体（チオＭａｂ）は、システイン付加物（シスチン）を有するか、または細胞培養条件に起因して、操作されたシステイン上でグルタチオン付加される。操作されたシステインの反応性のチオール基を遊離させるために、チオＭａｂをｐＨ約８．０の５００ｍＭホウ酸ナトリウムおよび５００ｍＭ塩化ナトリウムに溶解し、約５０〜１００倍過剰量の１ｍＭ  ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩；Ｇｅｔｚら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ  ２７３：７３−８０；Ｓｏｌｔｅｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で、３７℃において約１〜２時間還元する。あるいは、還元剤としてＤＴＴを用いることができる。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは変性逆相ＨＰＬＣ  ＰＬＲＰカラムクロマトグラフィのいずれかによって、鎖間のジスルフィド結合の形成をモニターした。還元されたチオＭａｂ（図６ａ）を希釈し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５中のＨｉＴｒａｐ  Ｓカラム上に充填し、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むＰＢＳで溶出する。溶出した還元型チオＭａｂを、２ｍＭデヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）でｐＨ７において３時間、または２ｍＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液で室温において一晩、処理する。外気による酸化もまた有効であり得る。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５樹脂からの溶出によって緩衝液を交換し、１ｍＭ  ＤＴＰＡを含むＰＢＳで溶出する。ＤＴＮＢ（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）と反応させることによる、溶液の２８０ｎｍにおける吸光度からの還元型抗体の濃度およびチオール濃度の測定ならびに４１２ｎｍにおける吸光度の測定によって、チオール／Ａｂ値を確認する。
【０２８９】
標準的な３Ａ５抗体の３つの主なグリコフォームに対する理論的質量は：１４７４０７、１４７５６８および１４７７３１Ｄａである。標準的な３Ａ５抗体のデコンボリューションされた質量スペクトルにおいて観察された質量は、１４７４１０、１４７５６９および１４７７３４Ｄａであり、予想された理論的質量とよく一致していた。チオ３Ａ５抗体の３つの主なグリコフォームに対する理論的質量は、１４７４６９、１４７６３１および１４７７９３Ｄａである。デコンボリューションされた質量スペクトルにおけるチオ−３Ａ５抗体の観察された質量（不均一で十分に分解されていない）は、約１４７７７４、１４７９０４および１４８０６１だった。この不均一性は、２つの新しく導入されたシステイン上のキャッピング基（通常、システインまたはグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ））の混合物の存在が原因である。
【０２９０】
広範な質量範囲のＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｔｒｉｐｌｅ四極子質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において液体クロマトグラフィ／質量分光分析を行った。サンプルを、７５℃に加熱したＰＲＬＰ−Ｓ、１０００Ａ、マイクロボアカラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｈｒｏｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）におけるクロマトグラフィに供した。３０〜４０％Ｂ（溶媒Ａ：０．０５％ＴＦＡ水溶液、溶媒Ｂ：アセトニトリル中の０．０４％ＴＦＡ）の線形勾配を用い、エレクトロスプレー源を用いて、溶離剤を直接イオン化した。Ｘｃａｌｉｂｕｒデータシステムによってデータを収集し、ＰｒｏＭａｓｓ（Ｎｏｖａｔｉａ，ＬＬＣ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて逆重畳を行った。ＬＣ／ＭＳ解析の前に、抗体または薬物結合体（５０μｇ）を３７℃で２時間、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（２単位／ｍｌ；ＰＲＯｚｙｍｅ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）で処理することにより、Ｎ結合型炭水化物を除去した。
【０２９１】
疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）サンプルをブチルＨＩＣ  ＮＰＲカラム（２．５μｍ、４．６ｍｍ×３．５ｃｍ）（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上に注入し、０．８ｍｌ／分における０〜７０％Ｂの線形勾配で溶出した（Ａ：５０ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ７中の１．５Ｍ硫酸アンモニウム、Ｂ：５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７、２０％イソプロパノール）。多波長検出器およびＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣシステムを用いて、１抗体あたりの様々な薬物の比で、抗体種を分解し、定量化する。
【０２９２】
実施例３  システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体と薬物−リンカー中間体との結合体化
実施例２の還元および再酸化手順の後、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）緩衝液に溶解し、氷上で冷却する。１抗体あたり操作されたシステインが約１．５モル濃度の、マレイミドなどのチオール反応性の官能基を有するアウリスタチン薬物リンカー中間体（例えば、ＭＣ−ＭＭＡＥ（マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンＥ）、ＭＣ−ＭＭＡＦ、ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥまたはＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ）をＤＭＳＯに溶解し、アセトニトリルおよび水で希釈し、そしてＰＢＳ中の、冷却され、還元され、再酸化された抗体に加える。約１時間後、過剰量のマレイミドを加えることによって、反応をクエンチし、そして任意の未反応抗体チオール基をキャッピングする。その反応混合物を遠心限外濾過によって濃縮し、システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体薬物結合体を精製し、ＰＢＳ中のＧ２５樹脂に通して溶出することによって脱塩し、滅菌条件下において０．２μｍフィルターで濾過し、そして保存のために凍結する。
【０２９３】
上記の手順によって、以下のシステイン改変抗ＭＵＣ１６抗体薬物結合体を調製した：
Ａ１１７Ｃチオｈｕ３Ａ５とＭＣ−ＭＭＡＦとの結合体化によるチオｈｕ３Ａ５−ＭＣ−ＭＭＡＦ；
Ａ１１７Ｃチオｈｕ３Ａ５とＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとの結合体化によるチオｈｕ３Ａ５−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ；
Ａ１１７Ｃチオｃｈ３Ａ５とＭＣ−ＭＭＡＦとの結合体化によるチオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ＭＭＡＦ；および
Ａ１１７Ｃチオｃｈ３Ａ５とＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥとの結合体化によるチオｃｈ３Ａ５−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ。
【０２９４】
実施例４  インビトロ細胞増殖アッセイ
抗体−薬物結合体のインビトロにおける効力を細胞増殖アッセイによって測定した（図１０および１１）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙは、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａルシフェラーゼの組換え発現に基づく市販の（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）均一なアッセイ方法である（ＵＳ５５８３０２４；ＵＳ５６７４７１３；ＵＳ５７００６７０）。この細胞増殖アッセイは、代謝的に活性な細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量に基づいて培養物中の生存細胞数を決定する（Ｃｒｏｕｃｈら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：８１−８８；ＵＳ６６０２６７７）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイを、自動ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適用できるように９６ウェル様式において行った（Ｃｒｅｅら（１９９５）ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ６：３９８−４０４）。均一なアッセイ手順は、血清が補充された培地中で培養された細胞に単一の試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を直接加える工程を包む。
【０２９５】
その均一な「添加−混合−測定」という様式によって、細胞溶解、および存在するＡＴＰの量に比例した発光シグナルの発生がもたらされる。基質であるＢｅｅｔｌｅルシフェリンは、組換えホタルルシフェラーゼによって酸化的に脱炭酸され、ＡＴＰからＡＭＰへの変換と、光子の生成とを同時に起こす。生存細胞は、相対ルミネセンス単位（ＲＬＵ）を反映する。データは、ルミノメーターまたはＣＣＤカメラのイメージングデバイスによって記録され得る。ルミネセンス出力は、経時的に測定されたＲＬＵとして示される。あるいは、ルミネセンスからの光子は、シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）の存在下でシンチレーションカウンターにおいてカウントされ得る。次いで、光の単位は、１秒間あたりのＣＰＳカウントとして表され得る。
【０２９６】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＴＢ２８８およびＭｅｎｄｏｚａら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：５４８５−５４８８から適応された以下のプロトコルを使用し、細胞増殖アッセイによってＡＤＣの有効性を測定した：
１．約１０００個（ＰＣ３）または３０００個（ＯＶＣＡＲ−３）の細胞を含む細胞培養物の５０μｌのアリコート：培地中の（１）ＭＵＣ１６ポリペプチドを発現する細胞株ＯＶＣＡＲ−３；（２）細胞表面上にＭＵＣ１６ポリペプチドを安定的に発現するように操作されたＰＣ３由来細胞株（ＰＣ３／ＭＵＣ１６）；および（３）ＭＵＣ１６ポリペプチドを発現しないＰＣ３細胞株（ＰＣ３／ｎｅｏ）を、９６ウェルの不透明な壁のプレートの各ウェルに沈着させた。
２．ＡＤＣ（５０ｍｌ）を３つ組の実験ウェルに、９０００、３０００、１０００、３３３、１１１、３７、１２．４、４．１または１．４ｎｇ／ｍＬという最終濃度になるように加え、「ＡＤＣなし」コントロールウェルには、培地のみを与え、３日間（ＰＣ３）または５日間（ＯＶＣＡＲ−３）インキュベートした。
３．そのプレートを約３０分間、室温に平衡化した。
４．ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（１００ｍｌ）を加えた。
５．その内容物を回転シェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）上で２分間混合することにより、細胞溶解を誘導した。
６．そのプレートを室温で１０分間インキュベートすることにより、ルミネセンスシグナルを安定化させた。
７．ルミネセンスを記録し、ＲＬＵ＝相対ルミネセンス単位としてのグラフで報告した。ＡＤＣを含まない培地とともにインキュベートされた細胞からのデータを０．４６ｎｇ／ｍｌにおいてプロットした。
培地：ＰＣ３／ｎｅｏおよびＰＣ３／ＭＵＣ１６は、ＤＭＥＭ＋Ｈａｍ’ｓ  Ｆ０１２／１０％ＦＢＳ／グルタミン／２５０μｇ／ｍＬ  Ｇ−４１８中で生育し、ＯＶＣＡＲ−３は、ＲＰＭＩ／２０％ＦＢＳ／グルタミン中で生育する。
【０２９７】
実施例５  薬物動態−血清クリアランスおよび安定性
抗ＭＵＣ１６抗体−薬物結合体のインビボにおける性質を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの単回の静脈内ボーラス投薬後に、抗体および薬物結合体の血清濃度を測定することによって、解析した。少なくとも１つの細胞傷害性薬物を有する抗体−薬物結合体の濃度を、捕捉用にＭＵＣ１６細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質および検出用に抗ＭＭＡＥおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化抗マウスＦｃ抗体を用いるＥＬＩＳＡで測定した。血清中の全Ｃｈ３Ａ５濃度および全チオＣｈ３Ａ５濃度を、捕捉用にＭＵＣ１６  ＥＣＤおよび検出用に抗ヒト−Ｆｃ  ＨＲＰを用いるＥＬＩＳＡで測定した。このアッセイは、結合体化ＭＭＡＥ有りおよび無しの両方で任意の抗ＭＵＣ１６抗体を測定した。このアッセイは、１：１０の最低希釈で０．７８ｎｇ／ｍＬという定量化の下限を有する。このアッセイは、１：１０の最低希釈で０．７８ｎｇ／ｍＬという定量化の下限を有する。各動物からの血清濃度−時間データを、ＩＶボーラス注入、一次除去およびマクロ速度定数による２区画モデルを用いて解析した（Ｍｏｄｅｌ  ８，ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏ  ｖ．５．０．１，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。
【０２９８】
【表６】
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実施例６ 動物毒性
青年期雌ラット（１００〜１２５ｇ）における１２日間の急性毒性研究を：１日目の、標準的なｃｈ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥ（２４．１９ｍｇ／ｋｇ＝１９３４μｇ／ｍ２）、チオｃｈ３Ａ５−ＶＣ−ＭＭＡＥ（４９．９９ｍｇ／ｋｇ＝１９３４μｇ／ｍ２）およびコントロールビヒクルの単回注射によって行った。試験物の注射は、静脈内ボーラスとしてであった。体重を毎日測定した。５および１２日目に、臨床化学、血清酵素および血液学の解析を行った。毒性シグナルには、体重減少の臨床所見が含められた。
【０２９９】
カニクイザルにおいて好中球数を減少させるためには、より高用量のチオＡＤＣが必要だった。２つの別個の研究において、１および２２日目に、雌チャイニーズカニクイザル（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）に：標準的なヒト化抗ＭＵＣ１６ＡＤＣ（５．９ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ＝１２００μｇ／ｍ２ＭＭＡＥ）；１２．８ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ（１２００μｇ／ｍ２ＭＭＡＥ）のチオＡＤＣ；２５．６ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ（２４００μｇ／ｍ２ＭＭＡＥ）のチオＡＤＣ；または３８．４ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ（３６００μｇ／ｍ２ＭＭＡＥ）のチオＡＤＣを投薬した。血液学および血清化学のために、８、２２、３２および４３日目に血液を採取した（２２日目の値は、２回目の投薬の前のものである）。平均循環好中球数を、同じ研究の所与の時点における、ビヒクルで処置されたサルの平均数に対して正規化した。好中球レベルの最下点は、投薬の約１週間後に起き、その後、３週間以内に正常レベルに回復した。
【０３００】
実施例７  腫瘍成長阻害、インビボ有効性マウスモデル
雌Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて有効性研究を行った。すべての研究をＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，“Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ”，（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＃８５−２３）．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（ＤＣ）：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ；１９９６．）に従って行った。報告されているとおりに（Ｃｈｅｎら（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：４９２４−４９３２）ＯＶＣＡＲ−３乳房脂肪パッド移植有効性モデルを使用し、単回静脈内投薬後に腫瘍体積を評価した。
【０３０１】
腹腔内腫瘍を有するマウスから切除された腫瘍を用いるＯＶＣＡＲ−３乳房脂肪パッド移植モデルを開発し、次いで、レシピエントマウスの乳房脂肪パッドに連続的に継代した。腫瘍が、約１５０〜２００ｍｍ３の体積に達したときに、マウスを１０匹の５つの群に分け、記載されるように投薬した。式：Ｖ（ｍｍ３）＝０．５Ａ×Ｂ２（ここで、ＡおよびＢは、それぞれ長径および短径である）に従い、ノギスを用いて、腫瘍体積を測定した。腫瘍体積が３０００ｍｍ３に達する前か、または腫瘍が潰瘍形成を起こしそうな徴候を示したときに、マウスを安楽死させた。各実験群から回収されたデータを平均値±ＳＥとして表した。
【０３０２】
システイン改変抗ＭＵＣ１６抗体薬物結合体の有効性をインビボにおいて試験するために、１匹のＳＣＩＤマウスあたり（合計１１０匹のマウス）２×１０７個のＯＶＣＡＲ−３細胞を乳房脂肪パッドに１回接種し、注射後の１４〜２１日間、生育させた。腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ３に達したとき（代表的には接種の１４日後〜２１日後）に、マウスを、以下のとおり、１群あたり９〜１０匹の８つの異なる群に分け、腫瘍体積を各マウスにおいて測定した：
【０３０３】
【表７】
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実施例８  フローサイトメトリーおよびインビトロ研究
ＯＶＣＡＲ−３細胞（１サンプルあたり３０，０００細胞）を、ヒト化標準またはチオ抗ＭＵＣ１６ＭＡｂとともに、総体積１ｍＬ中において７５分間氷上でインキュベートした。抗体を、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ中、２５、５０、１００、２００および４００ｎｇ／ｍＬで適用した。このインキュベートの後、細胞を洗浄し、次いで、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｅｉｎ）標識ヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体とともにインキュベートした（氷上で１時間）。次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーで解析した。３×１０４個のＯＶＣＡＲ−３細胞が、抗ＭＵＣ１６抗体３Ａ５に対して約１×１０１０個の結合部位を発現する。試験された最低の抗体濃度（２５ｎｇまたは約１×１０１１個の抗体）でさえも、結合部位に対して過剰なモル濃度の抗体を提供する。ゆえに、結合が減少する濃度（フローサイトメトリーによって検出される）は、ＭＵＣ１６に対するこの抗体の親和性を反映する。抗ＭＵＣ１６バリアントの結合親和性を、従来の手順を用いて表面プラズモン共鳴および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図３】
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【図４】
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【図７ａ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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