(57)【要約】本発明は、蛍光を読み取ってプロテインキナーゼの活性を連続的にモニターするためのセンサーを提供する。本発明は、Ｍｇ２＋に結合した後、キレート化増大蛍光（ｃｈｅｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＣＨＥＦ）を示す新規な金属結合性化合物を提供する。さらに、本発明は、本発明の金属結合性ペプチド、およびキナーゼの存在下でリン酸化され得るヒドロキシアミノ酸を有する少なくとも１つのキナーゼ認識配列を含むペプチジルセンサーを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１３】
2010503617.tif 000018
［式中、
Ｒ１は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであるか、あるいはＲ２およびＲ３は、それらが置換している炭素原子と一緒になって５または６員環を形成し、
各Ｒ４は、独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであり、ここで、Ｒ４は、構造（Ｉ）内のいずれかの環の任意の空位原子価を置換することができ、
Ｘは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’’であり、
Ｙは、ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＲ’Ｒ’’’、−ＣＨＯ、または−ＣＯ２Ｈであり、
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ｔＢｏｃ、またはＦｍｏｃであり、
ｎは、０、１、２または３であり、
ｍは、１、２、３、４、５、６または７であり、
ここで、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つは−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４の少なくとももう１つは電子吸引基である］。
【請求項２】
式（ＩＩ）
【化１４】
2010503617.tif 000019
［式中、
Ｒ１は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり、
各Ｒ４は、独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであり、ここで、Ｒ４は、構造（ＩＩ）内のいずれかの環の任意の空位原子価を置換することができ、
Ｘは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’’であり、
Ｙは、ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＲ’Ｒ’’’、−ＣＨＯ、または−ＣＯ２Ｈであり、
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ｔＢｏｃ、またはＦｍｏｃであり、
ｎは、０、１、２または３であり、
ｍは、１、２、３または４であり、
ここで、少なくとも１つのＲ４は電子吸引基である］を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式（ＩＩＩ）
【化１５】
2010503617.tif 000020
［式中、
各Ｒ４は、独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであり、ここで、Ｒ４は、構造（ＩＩＩ）内のいずれかの環の任意の空位原子価を置換することができ、
Ｘは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’’であり、
Ｙは、ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＲ’Ｒ’’’、−ＣＨＯ、または−ＣＯ２Ｈであり、
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ｔＢｏｃ、またはＦｍｏｃであり、
ｎは、０、１、２または３であり、
ｍは、１、２、３、４または５であり、
ここで、少なくとも１つのＲ４は−ＳＯ２Ｘであり、少なくとももう１つのＲ４は電子吸引基である］を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
式（ＩＶ）
【化１６】
2010503617.tif 000021
［式中、
各Ｒ４は、独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであり、ここで、Ｒ４は、構造（ＩＶ）内のいずれかの環の任意の空位原子価を置換することができ、
Ｘは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’’であり、
Ｙは、ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＲ’Ｒ’’’、−ＣＨＯ、または−ＣＯ２Ｈであり、
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ｔＢｏｃ、またはＦｍｏｃであり、
ｎは、０、１、２または３であり、
ｍは、１、２、３、４または５であり、
ここで、少なくとも１つのＲ４は電子吸引基である］を有する、請求項１、２、または３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２およびＲ３が、それらが置換している炭素原子と一緒になって、５または６員の複素環または炭素環を形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
式（Ｖ）
【化１７】
2010503617.tif 000022
［式中、
Ｚは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり、
Ｒ１は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり、
各Ｒ４は、独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであり、ここで、Ｒ４は、構造（Ｖ）内のいずれかの環の任意の空位原子価を置換することができ、
Ｘは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’’であり、
Ｙは、ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＲ’Ｒ’’’、−ＣＨＯ、または−ＣＯ２Ｈであり、
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ｔＢｏｃ、またはＦｍｏｃであり、
ｎは、０、１、２または３であり、
ｍは、１、２、３、４、５、６または７であり、
ここで、少なくとも１つのＲ４は−ＳＯ２Ｘである］を有する、請求項１または５に記載の化合物。
【請求項７】
式（ＶＩ）
【化１８】
2010503617.tif 000023
［式中、
Ｚは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり、
Ｒ１は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり、
各Ｒ４は、独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであり、ここで、Ｒ４は、構造（ＶＩ）内のいずれかの環の任意の空位原子価を置換することができ、
Ｘは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’’であり、
Ｙは、ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＲ’Ｒ’’’、−ＣＨＯ、または−ＣＯ２Ｈであり、
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ｔＢｏｃ、またはＦｍｏｃであり、
ｎは、０、１、２または３であり、
ｍは、１、２、３、４、５、６または７である］を有する、請求項１、５または６に記載の化合物。
【請求項８】
式（ＶＩＩ）
【化１９】
2010503617.tif 000024
［式中、
Ｙは、ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＲ’Ｒ’’’、−ＣＨＯ、または−ＣＯ２Ｈであり、
Ｒ’は、水素またはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ｔＢｏｃ、またはＦｍｏｃであり、
ｎは、０、１、２または３である］を有する、請求項１、５、６または７に記載の化合物。
【請求項９】
電子吸引基が、アルキル、ハロゲン、−ＮＲｉＲｉｉ、−ＯＲｉ、−ＳＲｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、＝Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｉ、−Ｃ（Ｏ）Ｒｉ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｉＲｉｉ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｉＲｉｉ、−ＮＲｉｉＣ（Ｏ）Ｒｉ、−ＮＲｉＣ（Ｏ）ＮＲｉｉｉＲｉｉ、−ＣＯ２Ｒｉ、−ＮＲｉＲｉｉ、−ＮＲｉｉＣＯ２Ｒｉ、−ＳＲｉ、−Ｓ（Ｏ）Ｒｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｉ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｉＲｉｉ、−ＮＲｉＳ（Ｏ）２Ｒｉｉ、非置換または置換アリール、非置換または置換ヘテロアリール、および非置換または置換ヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｒｉ、ＲｉｉおよびＲｉｉｉは、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルである、請求項１、２、３、４または５に記載の化合物。
【請求項１０】
式（ＶＩＩＩ）の化合物
【化２０】
2010503617.tif 000025
［式中、
Ｒ１は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであるか、あるいはＲ２およびＲ３は、それらが置換している炭素原子と一緒になって５または６員環を形成し、
各Ｒ４は、独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであり、ここで、Ｒ４は、構造（ＶＩＩＩ）内のいずれかの環の任意の空位原子価を置換することができ、
Ｘは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’’であり、
Ｒ５は、水素または−ＮＲ’Ｒ’’’であり、
Ｒ６は、−ＯＨ、−ＮＲ’Ｒ’’、または−Ｈであり、
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ｔＢｏｃ、またはＦｍｏｃであり、
ｐは、１、２または３であり、
ｍは、１、２、３、４、５、６または７であり、
ここで、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つは−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４の少なくとももう１つは電子吸引基である］。
【請求項１１】
式（ＩＸ）
【化２１】
2010503617.tif 000026
［式中、
各Ｒ４は、独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであり、ここで、Ｒ４は、構造（ＩＸ）内のいずれかの環の任意の空位原子価を置換することができ、
Ｘは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’’であり、
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ｔＢｏｃ、またはＦｍｏｃであり、
ｐは、１、２または３であり、
ｍは、１、２、３、４または５であり、
ここで、少なくとも１つのＲ４は電子吸引基である］を有する、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ２およびＲ３が、それらが置換している炭素原子と一緒になって５または６員の複素環または炭素環を形成する、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１３】
式（Ｘ）
【化２２】
2010503617.tif 000027
［式中、
Ｚは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり、
Ｒ１は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり、
各Ｒ４は、独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであり、ここで、Ｒ４は、構造（Ｘ）内のいずれかの環の任意の空位原子価を置換することができ、
Ｘは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’’であり、
Ｒ５は、水素または−ＮＲ’Ｒ’’’であり、
Ｒ６は、−ＯＨ、−ＮＲ’Ｒ’’、または−Ｈであり、
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ｔＢｏｃ、またはＦｍｏｃであり、
ｐは、１、２または３であり、
ｍは、１、２、３、４、５、６または７であり、
ここで、少なくとも１つのＲ４は−ＳＯ２Ｘである］を有する、請求項１０または１２に記載の化合物。
【請求項１４】
式（ＸＩ）
【化２３】
2010503617.tif 000028
［式中、
Ｚは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり、
Ｒ１は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり、
各Ｒ４は、独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであり、ここで、Ｒ４は、構造（ＸＩ）内のいずれかの環の任意の空位原子価を置換することができ、
Ｘは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’’であり、
Ｒ５は、水素または−ＮＲ’Ｒ’’’であり、
Ｒ６は、−ＯＨ、−ＮＲ’Ｒ’’、または−Ｈであり、
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ｔＢｏｃ、またはＦｍｏｃであり、
ｐは、１、２または３であり、
ｍは、１、２、３、４、５、６または７である］を有する、請求項１０、１２または１３に記載の化合物。
【請求項１５】
式（ＸＩＩ）
【化２４】
2010503617.tif 000029
［式中、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ｔＢｏｃ、またはＦｍｏｃであり、
ｐは、１、２または３である］を有する、請求項１０、１２、１３または１４に記載の化合物。
【請求項１６】
電子吸引基が、アルキル、ハロゲン、−ＮＲｉＲｉｉ、−ＯＲｉ、−ＳＲｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、＝Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｉ、−Ｃ（Ｏ）Ｒｉ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｉＲｉｉ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｉＲｉｉ、−ＮＲｉｉＣ（Ｏ）Ｒｉ、−ＮＲｉＣ（Ｏ）ＮＲｉｉｉＲｉｉ、−ＣＯ２Ｒｉ、−ＮＲｉＲｉｉ、−ＮＲｉｉＣＯ２Ｒｉ、−ＳＲｉ、−Ｓ（Ｏ）Ｒｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｉ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｉＲｉｉ、−ＮＲｉＳ（Ｏ）２Ｒｉｉ、非置換または置換アリール、非置換または置換ヘテロアリール、および非置換または置換ヘテロシクリルからなる群から選択され、Ｒｉ、ＲｉｉおよびＲｉｉｉは、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルである、請求項１０、１１または１２に記載の化合物。
【請求項１７】
側鎖が、式（Ｉ）の化合物
【化２５】
2010503617.tif 000030
［式中、
Ｒ１は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであるか、あるいはＲ２およびＲ３は、それらが置換している炭素原子と一緒になって５または６員環を形成し、
各Ｒ４は、独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであり、ここで、Ｒ４は、構造（Ｉ）内のいずれかの環の任意の空位原子価を置換することができ、
Ｘは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’’であり、
Ｙは、ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＲ’Ｒ’’’、−ＣＨＯ、または−ＣＯ２Ｈであり、
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ｔＢｏｃ、またはＦｍｏｃであり、
ｎは、０、１、２または３であり、
ｍは、１、２、３、４、５、６または７であり、
ここで、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つは−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４の少なくとももう１つは電子吸引基である］で修飾されているアミノ酸残基を含むペプチド。
【請求項１８】
さらに、キナーゼ認識配列を含む、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
さらに、２つのキナーゼ認識配列を含む、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項２０】
キナーゼ活性の検出方法であって、
（ａ）側鎖が式（Ｉ）の化合物
【化２６】
2010503617.tif 000031
［式中、
Ｒ１は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであるか、あるいはＲ２およびＲ３は、それらが置換している炭素原子と一緒になって５または６員環を形成し、
各Ｒ４は、独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであり、ここで、Ｒ４は、構造（Ｉ）内のいずれかの環の任意の空位原子価を置換することができ、
Ｘは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’’であり、
Ｙは、ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＲ’Ｒ’’’、−ＣＨＯ、または−ＣＯ２Ｈであり、
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、ｔＢｏｃ、またはＦｍｏｃであり、
ｎは、０、１、２または３であり、
ｍは、１、２、３、４、５、６または７であり、
ここで、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つは−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４の少なくとももう１つは電子吸引基である］を用いて修飾されたアミノ酸残基を含むペプチドを提供するステップと、
（ｂ）該ペプチドをＭｇ２＋、リン酸供給源、およびキナーゼを含むサンプルと接触させるステップと、
（ｃ）リン酸化されたペプチド生成物の存在について分析するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓｏｘに基づくキナーゼセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、蛍光を読み取ってプロテインキナーゼの活性を連続的にモニターするためのセンサーを提供する。該センサーは、プロテインキナーゼペプチド基質の最小限の摂動を必要とする。反応過程にわたる時間に関係する蛍光反応は、酵素活性に対応する。本発明のセンサーは、阻害物質または基質の高処理能スクリーニング、細胞抽出物または酵素精製物での活性の検出、細胞中のキナーゼ活性の空間的または時間的局在化、および複雑なシグナル伝達経路の解明に使用できる。
【０００３】
プロテインキナーゼは、細胞内調節のすべての局面に関与している。プロテインキナーゼは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）からペプチドまたはタンパク質配列中のセリン、トレオニンまたはチロシン残基へのリン酸基の転移を触媒する。各キナーゼは、リン酸化される残基の周囲にあるアミノ酸に対して特異的である。キナーゼ活性をアッセイするための従来法は、不連続的であり、特殊な取り扱いを必要とする３２Ｐで標識されたＡＴＰを必要とする。多くの企業が、特化した蛍光キナーゼアッセイシステムを上市しているが、そのすべては不連続的であり、反応混合物をサンプリングし、続いて反応生成物を蛍光部分で標識する追加の処理ステップを必要とする（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐａｎｖｅｒａ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ、Ｕｐｓｔａｔｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。リアルタイムで実施できる連続的蛍光アッセイは、大きな有用性を有する。現在、このようなアッセイが可能なセンサーの例は、ほとんど存在しない。手法には、リン酸化部位の近傍の環境感受性フルオロフォア（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）、リン酸化後に高次構造変化を受ける配列に隣接するＦＲＥＴ対（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）、またはＰＥＴ−クエンチングの妨害を引き起こすリン酸と内部キレーターとの間のＣａ２＋キレート化（非特許文献１３）が含まれる。Ｌａｗｒｅｎｃｅとその共同研究者によって報告されたプローブで１．５〜２．５倍増加する顕著な例外はあるが、これらのセンサーの大部分は、極めてわずかな蛍光増大を示すか、あるいは時によっては蛍光の低下を示す（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。しかし、リン酸化される残基に隣接したフルオロフォアまたは極めて大きなフルオロフォアを有するこれらのタイプのプローブは、特定のキナーゼ類によるそれらのプローブの認識、および特定のキナーゼとそれらのプローブとの反応に干渉する可能性がある。
【０００４】
特許文献１では、金属結合性アミノ酸残基、およびキナーゼの存在下でリン酸化され得るヒドロキシアミノ酸を有するキナーゼ認識配列を含む直鎖状Ｓｏｘペプチドセンサーが開示された。金属結合性アミノ酸残基は、ヒドロキシアミノ酸のどちらかの側（Ｎ−末端またはＣ−末端）に位置し、好ましくは、βターン構造（「βターン配列」）を想定することが可能なペプチドによってその認識配列から分離する。場合によっては、該βターン配列は、別のアミノ酸によってヒドロキシアミノ酸から分離する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／００８０２４３号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｒｉｇｈｔ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８１年、７８巻、６０４８〜６０５０頁
【非特許文献２】ＭｃＩｌｒｏｙ，Ｂ．Ｋ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９１年、１９５巻、１４８〜１５２頁
【非特許文献３】Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｈ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９７年、４１４巻、５５〜６０頁
【非特許文献４】Ｐｏｓｔ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４年、２６９巻、１２８８０〜１２８８７頁
【非特許文献５】Ｎａｇａｉ，Ｙ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０００年、１８巻、３１３〜３１６頁
【非特許文献６】Ｏｈｕｃｈｉ，Ｙ．ら、Ａｎａｌｙｓｔ、２０００年、１２５巻、１９０５〜１９０７頁
【非特許文献７】Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００１年、９８巻、１４９９７〜１５００２頁
【非特許文献８】Ｔｉｎｇ，Ａ．Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００１年、９８巻、１５００３〜１５００８頁
【非特許文献９】Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２００１年、１１巻、３０９１〜３０９４頁
【非特許文献１０】Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、２７６巻、３１３０５〜３１３１０頁
【非特許文献１１】Ｓａｔｏ，Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２００２年、２０巻、２８７〜２９４頁
【非特許文献１２】Ｖｉｏｌｉｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２００３年、１６１巻、８９９〜９０９頁
【非特許文献１３】Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ａ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００２年、１２４巻、３８４０〜３８４１頁
【非特許文献１４】Ｙｅｈ、Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００２年、２７７巻、１１５２７〜１１５３２頁
【非特許文献１５】Ｗａｎｇ，Ｑ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００６年、１２８巻、１８０８〜１８０９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、Ｍｇ２＋に結合した後、キレート化増大蛍光（ｃｈｅｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＣＨＥＦ）を示す式（Ｉ）〜（ＸＩＩ）の新規な金属結合性化合物を提供する。
【０００８】
本発明は、さらに、本発明の金属結合性ペプチド、およびキナーゼの存在下でリン酸化され得るヒドロキシアミノ酸を有する少なくとも１つのキナーゼ認識配列を含むペプチジルセンサーを提供する。該ペプチドセンサーは、同様に、ヒドロキシアミノ酸の硫酸化を検出する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｓｏｘに基づくキナーゼセンサーの概略図である。
【図２Ａ】ＰＫＣアイソザイムに対する１μＭの基質での反応勾配のプロットである。
【図２Ｂ】ＰＫＣアイソザイムに対する１μＭの基質での反応勾配のプロットである。
【図２Ｃ】ＰＫＣアイソザイムに対する１μＭの基質での反応勾配のプロットである。
【図２Ｄ】ＰＫＣアイソザイムに対する１μＭの基質での反応勾配のプロットである。
【図３】ＰＫＣアイソザイムとＰＫＣα−Ｓ１０の交差反応性
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、キナーゼ活性を検出するためにキナーゼ認識モチーフを含むセンサーを構築するのに有用である金属結合性化合物を提供する。本発明によるセンサーは、図１で例示される。該センサーは、金属結合部位、リン酸化部位、および少なくとも１つのキナーゼ認識モチーフを含む。
【００１１】
定義
用語「ヒドロキシ」は、−ＯＨ基を意味する。
【００１２】
用語「アミノ」は、−ＮＲ’Ｒ’’基（ここで、Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素またはアルキルである）を意味する。
【００１３】
用語「チオール」は、−ＳＲ’基（ここで、Ｒ’は水素である）を意味する。
【００１４】
用語「ハロゲン」は、塩素、臭素、ヨウ素、またはフッ素原子を意味する。
【００１５】
用語「アルキル」は、示された数の炭素原子（すなわち、Ｃ１〜８は１〜８個の炭素原子を意味する）を有する線状、環状または分枝の、あるいはそれらの組合せでよい炭化水素基を意味する。アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、シクロペンチル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．２］オクタンなどが含まれる。アルキル基は、特記しない限り、置換または非置換でよい。置換アルキル基の例には、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキルなどが含まれる。
【００１６】
用語「アリール」は、単一環（単環式）、または相互に縮合され得るまたは共有結合で連結され得る複合環（２環式または多環式）を有する多不飽和の芳香族炭化水素基を意味する。アリール基の例には、フェニルおよびナフタレン−１−イル、ナフタレン−２−イル、ビフェニルなどが含まれる。アリール基は、特記しない限り、置換または非置換でよい。
【００１７】
用語「ヘテロアリール」は、少なくとも１個のへテロ原子を含む芳香族基を意味し、ここで該へテロアリール基は、単環式または二環式でよい。例には、ピリジル、ピリダジニル、ピラジニル、ピリミジニル、トリアジニル、キノリニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、フタラジニル、ベンゾトリアジニル、プリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、イソベンゾフリル、イソインドリル、インドリジニル、ベンゾトリアジニル、チエノピリジニル、チエノピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、イミダゾピリジン、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、インドリル、キノリル、イソキノリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、インダゾリル、プテリジニル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、ピロリル、チアゾリル、フリルまたはチエニルが含まれる。
【００１８】
用語「ヘテロシクリル」または「複素環」は、本明細書で使用される場合には同義語であり、窒素、酸素または硫黄から選択される少なくとも１個のへテロ原子（典型的には１〜５個のヘテロ原子）を含む飽和または不飽和環を意味する。ヘテロシクリル環は、単環式または二環式でよい。複素環基の例には、ピロリジン、ピペリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、ブチロラクタム、バレロラクタム、イミダゾリジノン、ヒダントイン、ジオキソラン、フタルイミド、ピペリジン、１，４−ジオキサン、モルホリン、チオモルホリン、チオモルホリン−Ｓ−オキシド、チオモルホリン−Ｓ，Ｓ−ジオキシド、ピペラジン、ピラン、ピリドン、３−ピロリン、チオピラン、ピロン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、キヌクリジンなどが含まれる。
【００１９】
用語「電子吸引基」は、該基の方向に双極子モーメントを生じさせる基を意味する。適切な電子吸引基には、限定はされないが、ハロ（好ましくはクロロ）、ハロアルキル（好ましくはトリフルオロメチル）、ニトロ、シアノ、スルホンアミド、スルホン、およびスルホキシドが含まれる。
【００２０】
用語「環」は、その原子が環形態の式中に配置されている化合物を意味する。環式化合物は、炭素環式または複素環式でよい。
【００２１】
用語「炭素環式」は、炭素原子のみから構成される環を意味する。
【００２２】
用語「置換基」は、分子中の別の原子または基に取って代わる原子または基を意味する。
【００２３】
用語「Ｎ−末端保護基」は、後に続く変換中でのアミノ官能基の望ましくない反応を防止する基を指し、限定はされないが、ベンジル、置換ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、トリチル、Ｎ−ベラチルオキシカルボニル（Ｎ−Ｖｏｃ）、Ｎ−アリルオキシカルボニル（Ｎ−Ａｌｌｏｃ）およびＮ−ペンテノイル（Ｎ−Ｐｅｎｔ）が含まれる。
【００２４】
用語「Ｃ−末端保護基」は、カルボキシル官能基の望ましくない反応を防止する基を指し、限定はされないが、Ｃ１〜１２アルキル（例えば、ｔｅｒｔ−ブチル）およびＣ１〜１２ハロアルキルが含まれる。
【００２５】
用語「キレート化増大蛍光（ＣＨＥＦ）」は、その化合物への金属イオンの結合（キレート化）の結果としての該化合物の蛍光増大を意味する。
【００２６】
用語「キャッピング基」は、ペプチドの分解を防止するために、該ペプチドのＮ−またはＣ−末端に連結される化学基を意味する。
【００２７】
化合物
本発明の化合物は、金属に結合する部分を含む。該化合物は、一般に「Ｓｏｘ」化合物と呼ばれる。
【００２８】
一実施形態において、本発明の金属結合性化合物は、式（Ｉ）
【００２９】
【化１】
2010503617.tif 000002
を有し、式中、
Ｒ１は、ヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであるか、あるいはＲ２およびＲ３は、それらが置換している炭素原子と一緒になって５または６員環を形成し、
各Ｒ４は、独立に、水素、電子吸引基、または−ＳＯ２Ｘであり、ここでＲ４は、構造（Ｉ）内のいずれかの環の任意の空位原子価を置換することができ、
Ｘは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’’であり、
Ｙは、ハロゲン（好ましくは、−Ｂｒまたは−Ｃｌ）、−ＳＨ、−ＮＲ’Ｒ’’’、−ＣＨＯ、または−ＣＯ２Ｈであり、
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素またはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ’’’は、水素、Ｃ１〜６アルキル、またはＮ−保護基であり、
ｎは、０、１、２または３であり、かつ
ｍは、１、２、３、４、５、６または７であり、
ここで、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つは−ＳＯ２Ｘであり、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４の少なくとももう１つは電子吸引基である。
【００３０】
別の実施形態において、本発明の金属結合性化合物は、式（ＶＩＩＩ）
【００３１】
【化２】
2010503617.tif 000003
を有し、式中、
Ｒ５は、水素または−ＮＲ’Ｒ’’’であり、
Ｒ６は、−ＯＨ、−ＮＲ’Ｒ’’、または−Ｈであり、
ｐは、１、２または３であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびｍは、式（Ｉ）で定義した通りである。
【００３２】
１つの好ましい実施形態において、金属結合性化合物は、式（ＩＶ）
【００３３】
【化３】
2010503617.tif 000004
の化合物であり、式中、
Ｒ４、ｍ、ｎおよびＹは、式（Ｉ）で定義した通りである。
【００３４】
式（Ｉ）および（ＶＩＩＩ）中で、Ｒ２およびＲ３は、それらが置換している炭素と一緒になって環を形成することができる。Ｒ２およびＲ３が環を形成する場合、金属結合性化合物は、５または６員の複素環化合物あるいは５または６員の炭素環化合物を含むことができる。好ましくは、Ｒ２およびＲ３は、５または６員のＮ含有複素環を形成する。
【００３５】
好ましい実施形態において、金属結合性化合物は、式（Ｖ）または（Ｘ）
【００３６】
【化４】
2010503617.tif 000005
を有することができ、式中、Ｚは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり、Ｒ１、Ｒ４、Ｘ、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、Ｙ、ｍ、ｎおよびｐは、式（Ｉ）および（ＩＩＩ）に関して前述した通りであり、ここで、少なくとも１つのＲ４は−ＳＯ２Ｘである。
【００３７】
式（Ｉ）、（ＩＶ）および（Ｖ）において、Ｙは、好ましくはハロゲンである。
【００３８】
前述の様々な実施形態において、Ｒ１は、好ましくは−ＯＨである。Ｘは、好ましくは−ＮＲ’Ｒ’’’（より好ましくは−ＮＭｅ２）である。ｍは、好ましくは１である。ｎは、好ましくは０、１または２（より好ましくは０または１）である。ｐは、好ましくは１、２または３である。少なくとも１つのＲ４は、好ましくはＲ１に対してパラ位に存在する。Ｒ４は、好ましくは−ＳＯ２Ｘである。
【００３９】
式（ＶＩＩＩ）および（Ｘ）において、Ｒ５は、好ましくは−ＮＨＲ’’’（より好ましくはＮＨ−Ｆｍｏｃ）である。Ｒ６は、好ましくは−ＯＨである。
【００４０】
前述の様々な実施形態において、電子吸引基は、アルキル、ハロゲン、−ＮＲｉＲｉｉ、−ＯＲｉ、−ＳＲｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、＝Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｉ、−Ｃ（Ｏ）Ｒｉ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｉＲｉｉ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｉＲｉｉ、−ＮＲｉｉＣ（Ｏ）Ｒｉ、−ＮＲｉＣ（Ｏ）ＮＲｉｉｉＲｉｉ、−ＣＯ２Ｒｉ、−ＮＲｉＲｉｉ、−ＮＲｉｉＣＯ２Ｒｉ、−ＳＲｉ、−Ｓ（Ｏ）Ｒｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｉ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｉＲｉｉ、−ＮＲｉＳ（Ｏ）２Ｒｉｉ、非置換または置換アリール、非置換または置換ヘテロアリール、および非置換または置換ヘテロシクリルでよく、ここで、Ｒｉ、ＲｉｉおよびＲｉｉｉは、それぞれ独立に水素またはＣ１〜６アルキルである。
【００４１】
本発明の金属結合性化合物は、Ｍｇ２＋に結合した後、キレート化増大蛍光（ＣＨＥＦ）を示す。本発明によるアミノ酸残基の蛍光は、Ｍｇ２＋に結合した場合に、少なくとも約１００％、好ましくは少なくとも約４００％、より好ましくは少なくとも約８００％増大する。
【００４２】
ペプチド
式（ＶＩＩＩ）および（Ｘ）などの金属結合性化合物は、標準的なペプチド合成（固相または溶液相）を使用してペプチド中に形成できる。標準的なペプチド合成は、当技術分野で周知である。例えば、「Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  −  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００３年、Ｗ．Ｃ．ＣｈａｎおよびＰ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ編（ＩＳＢＮ  ０  １９  ９６３  ７２４  ５）；および「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９４年、Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．（ＩＳＢＮ  ０  １９  ８５５８３９  ２）を参照されたい。
【００４３】
ＳＯＸ化合物を、合成後にペプチドと連結する場合には、ペプチドをまず合成し、該ペプチドの側鎖上の保護基を選択的に除去する。次いで、式（Ｉ）などの金属結合性ＳＯＸ化合物を、形成されたペプチドの側鎖に標準的カップリング法を使用して連結することができる。例えば、Ｙがハロゲンである場合には、該化合物を、その側鎖中にチオール基を含む残基（Ｃｙｓなど）にチオエーテル結合を形成して連結することができる。別法として、Ｙがアミンである場合には、それを、その側鎖中にカルボン酸を含む残基（ＡｓｐまたはＧｌｕなど）にアミド結合を形成して連結することができる。別法として、Ｙがチオールである場合は、それを、その側鎖中にチオール基を含む残基（Ｃｙｓなど）にジスルフィド結合を形成して連結することができる。別法として、Ｙがカルボン酸である場合には、それを、その側鎖中にアミンを含む残基に連結することができる。次いで、ＳＯＸを含むペプチドを、脱保護し、精製する。別法として、Ｙがアルデヒドである場合には、それを、アミンを含む残基に還元アミノ化により連結することができる。別法として、ＳＯＸ残基を含む構成ブロックを、標準的ペプチド合成ステップを使用して合成し（すなわち、実施例の部を参照されたい）、組み込むことができる。
【００４４】
アミノ酸の選択的脱保護は、当技術分野で周知である。好ましい方法は、（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸の側鎖中のカルボキシル基に対して）アリル（ＯＡｌｌ）、（例えば、リシンまたはオルニチンの側鎖中のアミノ窒素に対して）アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、（システインのスルフヒドリルに対して）ｐ−メトキシトリチル（ＭＭＴ）またはアセトアミドメチル（Ａｃｍ）などの直交性側鎖保護を使用するものである。ＯＡｌｌおよびＡｌｌｏｃは、Ｐｄにより容易に除去され、Ａｃｍはヨウ素処理により容易に除去され、ＭＭＴは、極めて穏やかな酸処理により容易に除去される。
【００４５】
本発明の金属結合性化合物は、好ましくは、キナーゼ認識配列から−５、−４、−３、−２、−１、１、２、３、４または５残基内に存在する（マイナス（−）の位置は、該化合物がキナーゼ認識配列のＮ−末端側に位置することを示す。プラス（＋）の位置は、該化合物がキナーゼ認識配列のＣ−末端側に位置することを示す）。場合によっては、金属結合性化合物は、キナーゼ認識配列からさらに遠くに位置してもよい。
【００４６】
本発明によるリン酸化部位には、キナーゼ認識モチーフ内のヒドロキシル含有アミノ酸が含まれる。例には、セリン、トレオニンおよびチロシンなどの天然に存在するヒドロキシル含有アミノ酸残基、ならびに天然に存在しないヒドロキシル含有アミノ酸残基が含まれる。
【００４７】
当技術分野で周知の任意のキナーゼ認識モチーフを、本発明により使用できる。非リン酸化ペプチドのＭｇ２＋に対する親和性は塩基性条件下で増加するので、酸性残基を有する認識配列は、リン酸化されると類似配列に比べてより小さい蛍光増大度を示す可能性がある。本発明の金属結合性ペプチドを使用してリン酸化をモニターできる認識モチーフの例を表Ｉに示す。
【００４８】
【表１】
2010503617.tif 000006
リン酸化できるその他のペプチド（および対応するキナーゼ）のリストは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰｉｎｎａおよびＤｏｎｅｌｌａ−Ｄｅａｎａ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１２２２巻、４１５〜４３１頁（１９９４年）の表Ｉ中に見出される。もう１つのリストは、オンラインでｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂ／ｔｅｃｈ／ｔｅｃｈ＿ｒｅｓｏｕｒｃｅ／ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｔｏｏｌｓ／ｓｕｂｓｔｒａｙｅ＿ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．ｈｔｍｌに見出される（２００３年９月２６日に存在したこのウェブサイトのコピーは、本出願と同時に提出された情報開示書中に提供され、参照によりその全体が組み込まれる）。
【００４９】
本発明によるペプチドセンサーは、少なくとも１つのキナーゼ認識配列を有する。いくつかの場合では、リン酸化されるの側鎖の一方の側にある残基がより重要ではあるが、より多くの残基が、さらなる特異性を付与する可能性があることは明白である。この特異性は、複雑な媒体中の、特に、すべての細胞内酵素が基質ペプチドと相互作用する潜在性を有する生存細胞または細胞溶解物中のキナーゼを評価する任意のアッセイで重要な役割を果たす可能性がある。付加される認識エレメントは、いくつかの異なるキナーゼまたはあるキナーゼのアイソザイムが存在する競合アッセイにおいて、センサーをより特異的に所望のキナーゼに向けることができる。
【００５０】
アッセイ
ペプチドの蛍光を、Ｍｇ２＋の存在下または不在下で測定する。レポーター官能基は、金属に結合した後、キレート化増大蛍光（ＣＨＥＦ）を示す非天然のＳｏｘ発色団である。化学センサーのＭｇ２＋親和性は、リン酸基が存在しない場合に低く（ＫＤ＝１００〜３００ｍＭ）、一方、リン酸化は、Ｍｇ２＋親和性を有意に増強する（ＫＤ＝０．１〜２０ｍＭ）。したがって、選択されたＭｇ２＋濃度で、大部分のリンペプチドは、拘束され、蛍光状態で存在する。飽和ＭｇＣｌ２の存在下で、Ｓｏｘペプチドは、４８５ｎｍに極大発光を、３６０ｎｍに極大励起を示す。さらに、これらのペプチドは、フルオロフォアの顕著なルミネセンス特性を維持する。代表的な化学センサー−Ｍｇ２＋錯体に関する消光係数および量子収量は、定量的アミノ酸分析に続いて決定される。
【００５１】
この反応に関する酵素の動態パラメーターを求めるには、蛍光強度の増加から生成物形成の初期速度を決定する必要がある。このセンサーの場合、初期勾配から生成物形成の速度を決定するには、出発物質が消費されることによる蛍光強度の低下に関する補正が必要である。任意の所定時点での蛍光強度は、次式
Ｉ（ｔ）＝ｆＳＳ（ｔ）＋ｆＰＰ（ｔ）                              （１）
から決定することができ、式中、Ｉ（ｔ）は蛍光強度であり、Ｓ（ｔ）は基質の量（μＭ）であり、Ｐ（ｔ）は生成物の量（μＭ）であり、ｆＳは、基質１μＭ当たりの蛍光強度であり、ｆＰは生成物１μＭ当たりの蛍光強度である。任意の所定時点での基質および生成物の量は、
Ｓ（ｔ）＋Ｐ（ｔ）＝Ｓ０                                          （２）
で関連付けられ、式中、Ｓ０は基質の初期量である。（２）を（１）に代入し、続いて整理すると、
【００５２】
【化５】
2010503617.tif 000007
が得られる。
【００５３】
反応の初期速度は、経時的な生成物量の変化であり、それゆえ、（３）を時間で微分すれば、
【００５４】
【化６】
2010503617.tif 000008
が得られる。
【００５５】
反応の初期勾配ｄＩ（ｔ）／ｄｔを、基質代謝回転の最初の５％以内で測定した。それぞれＰおよびＳの濃度に対する蛍光強度直線の勾配から、定数ｆＰおよびｆＳを計算した。Ｈａｎｅｓプロット（［Ｓ］／Ｖ対Ｖ）の直線近似を使用してＫｍおよびＶｍａｘを求めた。
【００５６】
本発明のセンサーは、キナーゼ活性の検出法で使用できる。本発明の方法は、リン酸化部位を含む１つまたは２つのキナーゼ認識モチーフ、および側鎖が式（Ｉ）の化合物で修飾されているアミノ酸残基を含む金属結合性ペプチドを含むセンサーを提供するステップと、該センサーをＭｇ２＋、リン酸供給源（例えばＡＴＰ）、およびキナーゼを含むサンプルと接触させるステップと、リン酸化されたペプチド生成物の存在について分析するステップとを含む。
【００５７】
本発明の方法は、インビトロまたはインビボで使用できる。インビトロでの応用では、反応は、典型的には、Ｍｇ２＋およびリン酸供給源を含む緩衝液中で実施される。適切な緩衝液には、ＨＥＰＥＳおよびＴＲＩＳが含まれる。好ましいＭｇ２＋供給源はＭｇＣｌ２である。好ましいリン酸供給源はＡＴＰである。
【００５８】
本発明では、セリン／トレオニンおよびチロシンキナーゼを使用できる。典型的なＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼには、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼＣ、Ｃａ／カルモジュリン依存性キナーゼ、ＡＭＰ活性化キナーゼ、ｓ６キナーゼ、ｅＩＦ−２キナーゼ、ｐ３４ｃｄｃ２プロテインキナーゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、カゼインキナーゼ−２、カゼインキナーゼ−１、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３、ＡＵＲＯＲＡ、Ａｋｔ、Ｅｒｋ、Ｊｎｋ、ＣＤＫ２が含まれ、Ｔｙｒに特異的な典型的プロテインキナーゼには、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、インスリン受容体キナーゼ、およびＥＧＦＲが含まれる。
【００５９】
インビトロでの応用では、キナーゼの濃度は、約０．５ｎＭ〜約１μＭの範囲でよく、典型的には約５００ｎＭを超えず、好ましくは約２５０ｎＭを超えない。センサーの濃度は、変え得るが、通常、約０．０１μＭ〜０．１ｍＭの範囲でよい。アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）は、約１０〜１００ｍＭのストック溶液中での好ましいリン酸供給源である。ほとんどのキナーゼは、ＡＴＰに対して約１０〜１５０μＭの範囲のＫｍ値を有するので、飽和濃度のＡＴＰを使用して、その基質に関するＫｍおよびＶｍａｘ値に到達する。インビボでの応用では、センサーが細胞中に内部移行すると、十分なキナーゼ、Ｍｇ２＋、およびリン酸供給源が、細胞質ゾル中に存在する。インビボで検知する場合には、細胞内部移行配列をセンサーの設計に含めることができる。適切な細胞内部移行配列には、ペネトラチン、ＨＩＶ−Ｔａｔドメイン、およびポリアルギニン配列が含まれる（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ｍ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０００年、２１巻、９９〜１０３頁；Ｗａｄｉａ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２００２年、１３巻、５２〜５６頁：Ｃａｒｒｉｇａｎ，Ｃ．Ｎ．、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００５年、３４１巻、２９０〜２９８頁）。
【００６０】
キナーゼが補因子に依存する応用では、補因子の供給源もサンプル中に含める。例えば、ＰＫＣの場合では、Ｃａ２＋、リン脂質およびジアシルグリセロールの供給源が必要とされる。
【００６１】
本発明のセンサーは、金属結合性アミノ酸残基が、光退色を受けないので、キナーゼ反応を連続的に測定するのに使用できる。
【実施例】
【００６２】
化合物の合成：
金属結合性化合物は、Ｓｋｒａｕｐのキノリン合成、変法であるＦｒｉｅｄｌａｎｄｅｒのキノリン合成、またはｏ−２，４−ジニトロフェニルオキシム誘導体のＮａＨおよびＤＤＱを用いる環化に基づいて調製することができる。
【００６３】
【化７】
2010503617.tif 000009
Ｓｋｒａｕｐのキノリン合成法では、２−アミノ−ナフタレン−１−オール（６）を酸性条件下でブタ−２−エナールで処理して所望の伸長した三環系（７）を得る。フェノール部分をメトキシ基として保護して環化を促進できる。別法として、伸長した三環系（７）は、経路Ｂにより得ることもでき、その経路では、２−アミノ−ナフタレン−１−オール（６）をメシル化し、ブタ−２−エナールと縮合し、次いで、酸処理で環化して１０を得る。次いで、芳香族化およびメシル基の脱保護を実施して７を得る。次いで、伸長したキノリン環系をスルホンアミド部分の組込みに付し、伸長した直鎖状Ｓｏｘ発色団類似体８を得る。さらなるキレート形成官能基を所持する伸長した直鎖状Ｓｏｘ発色団類似体１４は、経路Ｃ（スキーム２）中に示す市販の５−クロロ−８−ヒドロキシキノリンから調製される。
【００６４】
【化８】
2010503617.tif 000010
Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒのキノリン合成法では、まず、ヨウ化メチルを用いて市販の２−アミノ−ナフタレン−１−オール（６）のフェノール基を保護してメトキシ誘導体１５を得る。続いて、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルを用いてアニリン基を保護してアミド１６を得る。１６のｔｅｒｔ−ブチルオキシオキシカルボニルに対するリチオ化、ジメチルホルムアミドを用いるアルキル化、およびその後のＴＦＡを用いるｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルの脱保護で、ｏ−アミノベンズアルデヒド誘導体１８を生じさせる。アルデヒド１８を得た後、アセトンとの環化を、ＺｎＣｌ２またはＢｉ（ＯＴｆ）３での処理により行うことによって、伸長したキノリン環系１９を得る。ＢＢｒ３を用いてメトキシ基を脱保護し、続いて前述のようにスルホンアミド部分を組み込むと、伸長したＳｏｘキノリン類似体系８がうまく得られる。
【００６５】
【化９】
2010503617.tif 000011
三環性発色団を合成した後、伸長した８−ヒドロキシキノリン（８）をｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルエーテルとして保護し、続いて、３ステップ法でブロモメチル誘導体（２１）を得る。ｔｅｒｔ−ブチルエステル２２を用いる２１の不斉アルキル化により、それぞれのＳｏｘで修飾されたアミノ酸２３が得られ、次いで、該アミノ酸をＦｍｏｃ誘導体２４に転換できる。
【００６６】
【化１０】
2010503617.tif 000012
ペプチドの合成：
センサーペプチドは、文献から選択された最適なＰＫＣαペプチド基質（ＲＲＲＫＧＳ＊ＦＲＲＫＡ、ＫＭ＝３．８μＭ）に基づく標準的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって合成される。ペプチドは、樹脂上で優先的に除去されてＳｏｘ−Ｂｒを用いるスルフヒドリル側鎖のアルキル化を可能にする直交性保護基を有するＣｙｓ残基を含めて合成される（スキーム５）。
【００６７】
【化１１】
2010503617.tif 000013
別法として、標準的なペプチド合成技術を使用して、構成ブロックを合成し、ペプチドに、Ｆｍｏｃで保護され、ＳＯＸで修飾されたシステイン残基（Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｓｏｘ）−ＯＨ）を導入できる。
【００６８】
【化１２】
2010503617.tif 000014
ペプチドの特徴付け：
合成を完了した後、ペプチドを切断し、Ｆｍｏｃに基づくペプチド合成のための標準的手順（前述を参照）に従って全体的に脱保護し、ＨＰＬＣで精製に付し、それらの質量をＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化、飛行時間型）質量分光計を使用して確認した（表ＩＩＩ）。（ａ）ＰＫＣα−Ｓ１０およびＰ１０を除くすべてのペプチドでは、逆相分取Ｃ１８カラムを１５ｍＬ／分の流速で使用した。溶媒Ａ：０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを含むＨ２Ｏ；溶媒Ｂ：０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを含むＣＨ３ＣＮ。Ｂを５％で溶出を開始し（５分超）、Ｂを直線的に５０％まで増加し（３０分超）、続いてＢを９５％まで増加し（１分超）、Ｂを９５％で維持した（５分）。ＰＫＣα−Ｓ１０およびＰ１０では、Ｂを５％で溶出を開始し（５分）、Ｂを１５％まで増加し（１分）、続いてＢを直線的に３０％まで増加した（３０分）。（ｂ）ＰＫＣα−Ｓ１０およびＰ１０を除くすべてのペプチドでは、逆相分析Ｃ１８カラムを１ｍｌ／分の流速で使用した。溶媒Ａ：０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを含むＨ２Ｏ；溶媒Ｂ：０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを含むＣＨ３ＣＮ。Ｂを５％で溶出を開始し（５分超）、Ｂを直線的に９５％まで増加し（３０分超）、Ｂを９５％で維持した（５分）。ＰＫＣα−Ｓ１０およびＰ１０では、Ｂを５％で溶出を開始し（５分）、Ｂを１５％まで増加し（１分）、続いてＢを３０％まで直線的に増加した（３０分）。（ｃ）すべてのペプチドについて、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍａｒｉｎｅｒ質量分光計でＥＳＩ−ＭＳデータを収集した。
【００６９】
【表３】
2010503617.tif 000015
ストック溶液：
リン酸化ペプチドのＺｎ２＋に対する親和性のため、調製後に金属イオン不純物を除去する必要性を回避するために、純度が最も高く金属含有量が最も低い試薬を使用した。
【００７０】
すべてのストック溶液は、特記しない限り、アッセイ当日に先立って調製し、室温で貯蔵した。
【００７１】
蛍光実験：
蛍光実験は、Ｊｏｂｉｎ  ＹｖｏｎのＦｌｕｏｒｏｍａｘ３を用いて実施した。５ｎｍの発光および励起スリット幅を使用した。すべての実験で、３６０ｎｍの励起波長を使用した。酵素アッセイは、４８５ｎｍの発光をモニターすることによって実施した。
【００７２】
リン酸化および非リン酸化ペプチドのスペクトル比較：
ペプチドを特徴付けた後、非リン酸化およびリン酸化ペプチドについて適切な条件下で発光スペクトルを得た。スペクトルは、一般に、１０ｍＭのＭｇ２＋（より低いＭｇ２＋濃度も同様に使用可能であり、使用された）、および０、０．１または１ｍＭ  ＡＴＰ／事前に選択した緩衝液（通常は２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）の存在下で取得した。発光スペクトルに依拠して、４８５ｎｍでのリンペプチドの蛍光強度をその非リン酸化対照物の蛍光強度で除算することによって、倍率蛍光差を比較した。図２に、適切なアッセイ混合物中でのリン酸化および非リン酸化ペプチドの蛍光スペクトルを示す。（Ａ）ＰＫＣβＩ−１（１０μＭ）、１０ｍＭ  Ｍｇ（ＩＩ）での発光走査、３ｘ；（Ｂ）ＰＫＣβＩ−１（１０μＭ）、１０ｍＭ  Ｍｇ（ＩＩ）、０ｍＭ  ＡＴＰでの発光走査、３ｘ；（Ｃ）ＰＫＣβＩ−１（１０μＭ）、１０ｍＭ  Ｍｇ（ＩＩ）での蛍光差、３ｘ。
【００７３】
センサーの生物物理学的特性および動態特性：
ＰＫＣα、ＰＫＣα−Ｓ１に対する「直鎖状」センサーの生物物理学的特性は良好であるが（表ＩＶ）、細胞溶解物中で使用すると、ＰＫＣα−Ｓ１は、細胞中に存在するＰＫＣアイソザイムの多くに対して反応性がある。比較として、ＰＫＣα、ＰＫＣα−Ｓ９、およびＰＫＣα−Ｓ１０に対して本発明中で開示されるような伸長した認識ドメインを有する化学センサーは、やはり良好な生物物理学的特性を有する（表ＩＶ）。さらに、これらのセンサーは、動態パラメーター（表Ｖ）を得ることによって判定されるように、ＰＫＣαに対してより一層選択的であり、そのため、細胞アッセイにおいてより高い特異性を提供できる。
【００７４】
【表４】
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【００７５】
【表５】
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Ｓｏｘペプチドの交差反応性：
手元にある動態パラメーターを用いて、ＰＫＣα−Ｓ１０とＰＫＣアイソザイムとの交差反応性を試験することが可能である。１２の別個の反応で、ＰＫＣα−Ｓ１０（１μＭ）を、ＰＫＣα、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣβＩＩ、ＰＫＣγ、ＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣζ、ＰＫＣη、ＰＫＣθ、ＰＫＣι、ＰＫＣμおよびＰＫＣν（２ｎｇ）と一緒のリン酸化に付す。これらの条件下で、ＰＫＣβＩおよびＰＫＣθは、ＰＫＣαに比べてわずかにより活性があり、一方、ＰＫＣβＩＩおよびＰＫＣγは、ＰＫＣαのそれと同等の活性を有する。これに反して、ＰＫＣδ、ＰＫＣμおよびＰＫＣγと一緒では活性が観察されず、ＰＫＣε、ＰＫＣζ、ＰＫＣηおよびＰＫＣιと一緒では極めて小さい活性が検出される（図３）。
【００７６】
３種のアイソザイムは、ＰＫＣα−Ｓ１０上で反応を実施せず、さらなる４種は、ほんのわずかに活性があることが示された。したがって、１１種のアイソザイム（ＰＫＣαを含まない）中の４種のみが、ＰＫＣαと同程度またはわずかに良好にリン酸化を実施することができる。この傾向は、文献中で以前から認められている。Ｃａｎｔｌｅｙらは、ＰＫＣα−Ｓ１０に類似したペプチドのＰＫＣα、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣδ、ＰＫＣζ、およびＰＫＣμとのＫＭ値を測定し、ＰＫＣαは最低のＫＭを有するが、基質は、ＰＫＣμ以外のすべてのアイソザイムによってほとんど同様に受け入れられることを示した。このことは、これらのアイソザイムが極めて類似した基質を有するので、驚くべきことではない。本発明中で開示されるような伸長した認識ドメインを用いるこの手法は、任意の他のアイソザイムからのリン酸化を心配することのない、いくつかのＰＫＣアイソザイムに対して特異的な基質の合成を可能にする。
【００７７】
本発明をいくつかの実施形態に関して説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱しないでその他の特徴を含むことができる。したがって、前述の詳細な説明は、限定ではなく例示と見なされることを意味し、本発明の精神および範囲を画定すると見なされるものは、すべての等価形態を含む以下の特許請求の範囲であると理解される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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