(57)【要約】  本発明は、アクチノマデュラ・ナミビエンシス（Actinomadura namibiensis）（ＤＳＭ  ６３１３）から得ることができる式（Ｉ）：  【化１】2010505777.tif 000024（式中、Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｈ又はＯＨであり、ｍ及びｎは、互いに独立して０、１又は２である）の化合物、細菌感染、ウイルス感染及び／又は疼痛の治療のためのその使用、並びにそれを含む薬学的組成物に関する。式（Ｉ）の化合物は、ラビリントペプチン類（labyrinthopeptins）として定義されており、ランチオニン様残基およびα二置換アミノ酸アナログを含む１８個のアミノ酸の高度に架橋されたペプチド構造からなる。アミノ酸配列は、ＸＤＷＸＬＷＥＸＣＸＴＧＸＬＦＡＸＣであり、ここで、２つのＣｙｓ残基がジスルフィド架橋を形成し、各Ｘは、独立して、架橋形成結合に関与する非天然アミノ酸の１つを表す。
2010505777.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の立体化学形態、又は任意の比率の任意の立体化学形態の混合物の、式（Ｉ）：
【化１】
2010505777.tif 000021
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル又はＣ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり；
Ｒ２は、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−フェニル又はＮＨ−（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−ピリジルであり；
Ｒ３及びＲ４は、互いに独立して、Ｈ又はＯＨであり、又はＲ３及びＲ４は、一緒になって＝Ｏであり；そして
ｍ及びｎは、互いに独立して、０、１又は２である］
の化合物、又はその生理学的に許容される塩。
【請求項２】
式（ＩＩ）：
【化２】
2010505777.tif 000022
を特徴とする、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
Ｒ１がＨである、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】
Ｒ２がＯＨである、請求項１または３に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項５】
Ｒ３及びＲ４がＨ又はＯＨであり、ここで、Ｒ３がＯＨである場合はＲ４はＨであり又はＲ３がＨである場合はＲ４はＯＨであり、又はＲ３及びＲ４が一緒になって＝Ｏである、請求項１または４に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項６】
Ｒ３がＯＨでありかつＲ４がＨであるか、又はＲ３がＨでありかつＲ４がＯＨである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項７】
ｍ及びｎが両方とも０であるか、又はｍ及びｎが両方とも２であるか、又はｍが０でありかつｎが２であるか、又はｍが２でありかつｎが０である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項８】
ｍ及びｎが両方とも０である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項９】
Ｒ１がＨであり：Ｒ２がＯＨであり；Ｒ３及びＲ４が互いに独立してＨ又はＯＨであり、ここで、Ｒ３がＯＨである場合はＲ４はＨであり、Ｒ３がＨである場合はＲ４はＯＨであり；ｍ及びｎが互いに独立して０、１又は２である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１がＨであり：Ｒ２がＯＨであり；Ｒ３及びＲ４が互いに独立してＨ又はＯＨであり、ここで、Ｒ３がＯＨである場合はＲ４はＨであり、Ｒ３がＨである場合はＲ４はＯＨであり；ｍ及びｎが両方とも０であるか、又はｍ及びｎが両方とも２であるか、又はｍが０でありかつｎが２であるか、又はｍが２でありかつｎが０である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１がＨであり：Ｒ２がＯＨであり；Ｒ３及びＲ４が互いに独立してＨ又はＯＨであり、ここで、Ｒ３がＯＨである場合はＲ４はＨであり、Ｒ３がＨである場合はＲ４はＯＨであり；ｍ及びｎが両方とも０である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１２】
式（ＩＩＩ）：
【化３】
2010505777.tif 000023
の化合物を特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１３】
モノアイソトピック中性分子質量１９２２．６８７２Ｄａ、及び分子式Ｃ85Ｈ110Ｎ20Ｏ24Ｓ4を特徴とする、アクチノマデュラ・ナミビエンシス（ＤＳＭ  ６３１３）より単離された化合物。
【請求項１４】
細菌感染、ウイルス感染及び／又は疼痛の治療用の薬剤を製造するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物及び少なくとも１つの薬学的に許容される成分を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
ａ）アクチノマデュラ・ナミビエンシス株（ＤＳＭ  ６３１３）、又はその変異体及び／若しくは突然変異体の１つを、好適な条件下で培地において、式（Ｉ）の化合物の１つ又はそれ以上が培地中において増加するまで、発酵させること、
ｂ）式（Ｉ）の化合物を培地から単離すること、並びに
ｃ）必要に応じて、式（Ｉ）の化合物を誘導体化し、及び／又は必要に応じて、生理学的に許容される塩へ変換すること、
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物の製造方法。
【請求項１７】
化合物（Ｉ）が式（ＩＩ）の化合物を特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
化合物（Ｉ）が式（ＩＩＩ）の化合物を特徴とする、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｍ及びｎが両方とも０であるか、又はｍ及びｎが両方とも２であるか、又はｍが０でありかつｎが２であるか、又はｍが２でありかつｎが０である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクチノマデュラ・ナミビエンシス（Actinomadura namibiensis）（ＤＳＭ  ６３１３）から単離された新規なペプチド、その製造方法、並びに細菌感染の治療、ウイルス感染の治療及び／又は疼痛の治療用の薬剤の製造におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの高度に架橋されたペプチド、例えばイモガイ（cone snail）から単離されたコノペプチド（conopeptides：概説については、例えば非特許文献１を参照のこと）又はグラム陽性菌源由来のいわゆるランチビオティック（非特許文献２）が、文献において公知である。前記ペプチドは様々な用途を有する。ランチビオティックのナイシンは、数ある用途の中でも特に、食品防腐剤として長年使用されている。
【０００３】
コノペプチドは、例えば疼痛、糖尿病、多発性硬化症及び心臓血管疾患の治療に有用であり、現在、前臨床又は臨床開発に至っている。コノペプチドの例は、α−ＧＩ（配列：ＥＣＣＮＰＡＣＧＲＨＹＳＣ*、*アミド化、連結性：１−３、２−４）及びα−ＧＩＤ（配列：ＩＲγＣＣＳＮＰＡＣＲＶＮＮＯＨＶＣ、連結性：１−３、２−４）であり、ここで、Ｏ／Ｈｙｐは、ヒドロキシプロリンであり、連結性は、各々特定のジスルフィド結合に関与するシステインの位置、例えばα−ＧＩＤにおけるように第１−第３及び第２−第４を示す：
【化１】
2010505777.tif 000003
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Terlau & Olivera, Physiol. Rev. 2004, 84, 41-68
【非特許文献２】Chatterjee et al., Chem. Rev. 2005, 105, 633-683
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
今回、驚くべきことに、高度に架橋されたペプチドが、微生物株アクチノマデュラ・ナミビエンシス（ＤＳＭ  ６３１３）から単離され得、細菌感染、ウイルス感染及び／又は疼痛の治療に有用であることを発見した。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明のある態様は、任意の立体化学形態、又は任意の比率の任意の立体化学形態の混合物の、式（Ｉ）：
【化２】
2010505777.tif 000004
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル又はＣ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであり；
Ｒ２は、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、ＮＨ−（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−フェニル又はＮＨ−（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−ピリジルであり；
Ｒ３及びＲ４は、互いに独立して、Ｈ又はＯＨであり、又はＲ３及びＲ４は、一緒になって＝Ｏであり；
ｍ及びｎは、互いに独立して、０、１又は２である］
の化合物、又はその生理学的に許容される塩である。
【０００７】
さらなる態様において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）
【化３】
2010505777.tif 000005
の化合物を特徴とし、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ及びｎは、上記に定義される通りである。
【０００８】
Ｒ１は、好ましくはＨである。Ｒ２は、好ましくはＯＨである。Ｒ３及びＲ４は、好ましくはＨ又はＯＨであり、ここで、Ｒ３がＯＨである場合はＲ４はＨであり、Ｒ３がＨである場合はＲ４はＯＨであり、又はＲ３及びＲ４は、一緒になって＝Ｏである。より好ましくは、Ｒ３及びＲ４は、Ｈ又はＯＨであり、ここで、Ｒ３がＯＨである場合はＲ４はＨであり、Ｒ３がＨである場合はＲ４はＯＨである。
【０００９】
好ましくは、ｍ及びｎは両方とも０であるか、又はｍ及びｎは両方とも２であるか、又はｍは０でありかつｎは２であるか、又はｍは２でありかつｎは０である。最も好ましくは、ｍ及びｎは両方とも０である。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、
Ｒ１が、Ｈであり；
Ｒ２が、ＯＨであり；
Ｒ３及びＲ４が、Ｈ又はＯＨであり、ここで、Ｒ３がＯＨである場合はＲ４はＨであり、Ｒ３がＨである場合はＲ４はＯＨであり；
ｍ及びｎが、互いに独立して、０、１又は２であり、好ましくはｍ及びｎが両方とも０であるか、又はｍ及びｎが両方とも２であるか、又はｍが０でありかつｎが２であるか、又はｍが２でありかつｎが０であり、特に好ましくはｍ及びｎが両方とも０である、
式（Ｉ）若しくは式（ＩＩ）の化合物、又はその生理学的に許容される塩である。
【００１１】
最も好ましくは、化合物（Ｉ）は、式（ＩＩＩ）の化合物を特徴とする：
【化４】
2010505777.tif 000006
【００１２】
本発明の化合物のさらなるキャラクタライゼーションのために、ペプチド残基を、リボソームペプチド合成由来のそれらの可能性の高い前駆体へ変換し戻した。残基１及び１０におけるα，α二置換アミノ酸は、文献に先行記載されていない。前記アミノ酸は、下記に示すように、メチレン基によって架橋されかつβ位で置換されたＡｌａ残基として記載され得る：
【化５】
2010505777.tif 000007
【００１３】
本発明は、さらに、本発明に従う式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物の全ての自明な化学的均等物に関する。これらの均等物は、ほんの僅かな化学的差異を示しかつ同一の薬理学的効果を有する化合物、又は穏やかな条件下で本発明に従う化合物へ変換される化合物である。前記均等物はまた、例えば式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物の塩、還元生成物、酸化生成物、部分加水分解処理エステル、エーテル、アセタール又はアミド、並びに当業者が標準的な方法を使用して製造し得る均等物、並びにこれに加えて、全ての光学的対掌体及びジアステレオマー及び全ての立体異性形態を含む。
【００１４】
特に記載しない限り、式（Ｉ）の化合物のキラル中心は、Ｒ立体配置又はＳ立体配置で存在し得る。本発明は、光学的に純粋な化合物、並びに立体異性体混合物、例えばエナンチオマー及びジアステレオマー混合物、の両方に関する。
【００１５】
式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物の生理学的に許容される塩は、Remington's Pharmaceutical Sciences (17th edition, page 1418 (1985))に記載されるように、それらの有機塩及びそれらの無機塩の両方であると理解される。それらの物理的及び化学的安定性並びにそれらの溶解性のために、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びアンモニウム塩が、特に酸性基について好ましく；塩酸、硫酸若しくはリン酸、又はカルボン酸若しくはスルホン酸、例えば酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸及びｐ−トルエンスルホン酸の塩が、特に塩基性基について好ましい。
【００１６】
本発明の化合物を、本明細書全体にわたってラビリントペプチン（Labyrinthopeptin）と命名している。
【００１７】
本発明はまた、ｍ及びｎが互いに独立して０、１又は２である式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、
ａ）アクチノマデュラ・ナミビエンシス株（ＤＳＭ  ６３１３）、又はその変異体及び／若しくは突然変異体の１つを、好適な条件下で培地において、式（Ｉ）の化合物の１つ又はそれ以上が培地中において増加するまで、発酵させること、
ｂ）式（Ｉ）の化合物を培地から単離すること、並びに
ｃ）必要に応じて、式（Ｉ）の化合物を誘導体化し、及び／又は必要に応じて、生理学的に許容される塩へ変換すること、
を含む方法に関する。
【００１８】
本発明は、好ましくは化合物（Ｉ）が式（ＩＩ）の化合物を特徴とする式（Ｉ）の化合物の製造方法に関し、より好ましくは、本発明は、ｍ及びｎが両方とも０であるか、又はｍ及びｎが両方とも２であるか、又はｍが０でありかつｎが２であるか、又はｍが２でありかつｎが０である、式（Ｉ）又は好ましくは（ＩＩ）の化合物の製造方法に関する。
【００１９】
特に好ましくは、本発明は、好ましくは、化合物（Ｉ）が式（ＩＩＩ）の化合物を特徴とする式（Ｉ）の化合物の製造方法に関する。
【００２０】
培地は、少なくとも１つの通常の炭素源及び少なくとも１つの窒素源並びに１又はそれ以上の通常の無機塩を含有する栄養溶液又は固形培地である。
【００２１】
本発明の方法は、実験室規模（ミリリットル〜リットル規模）での発酵及び工業規模（立方メートル規模）での発酵に使用され得る。
【００２２】
発酵のための好適な炭素源は、同化可能な炭水化物及び糖アルコール、例えばグルコース、ラクトース、スクロース又はＤ−マンニトール、並びに炭水化物含有天然物、例えば麦芽エキス又は酵母エキスである。窒素含有栄養素の例は、アミノ酸；ペプチド及びタンパク質並びにまたそれらの分解産物、例えばカゼイン、ペプトン又はトリプトン；肉エキス；酵母エキス；グルテン；例えばトウモロコシ、小麦、豆、大豆又はワタ由来の、粉砕した種子；製造アルコールからの蒸留残滓；肉粉；酵母エキス；アンモニウム塩；ニトレートである。好ましくは、窒素源は、合成的に又は生合成的に得られている１つ又はそれ以上のペプチドである。無機塩の例は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバルト及びマンガンの、塩化物、炭酸塩、硫酸塩又はリン酸塩である。微量元素の例は、コバルト及びマンガンである。
【００２３】
本発明のラビリントペプチンを形成するために特に好適である条件は、以下の通りである：０．０５〜５％、好ましくは０．１〜２．５％、酵母エキス；０．２〜５．０％、好ましくは０．１〜２％、カジトン（casitone）；０．０２〜１．０％、好ましくは０．０５〜０．５％、ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ；０．０２〜１．５％、好ましくは０．０５〜０．７％、ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、及び０．００００１％〜０．００１％シアノコバラミン。与えられるパーセンテージ値は、各場合において、栄養溶液全体の質量に基づく。
【００２４】
前記微生物を、好気的に、即ち例えば必要に応じて空気又は酸素を通気させながら、振盪又は撹拌しながら振盪フラスコ又は発酵槽の液中、又は固形培地上において、培養する。微生物は、約１８〜３５℃、好ましくは約２０〜３２℃、特に２７〜３０℃の温度範囲で培養し得る。ｐＨ範囲は、４〜１０、好ましくは６．５〜７．５とした方が良い。微生物を、一般的に、これらの条件下で、２〜１０日間、好ましくは７２〜１６８時間、培養する。有利には、数工程で微生物を培養する。即ち、最初に１つ又はそれ以上の予備培養物を液体栄養培地に調製し、次いでこれらの予備培養物を例えば１：１０〜１：１００の体積比で、実際の生産培地（即ち本培養）に接種する。予備培養物は、例えば前記株を栄養細胞又は胞子の形態で栄養溶液中に接種し、そしてそれを約２０〜１２０時間、好ましくは４８〜９６時間増殖させることによって得られる。栄養細胞及び／又は胞子は、例えば前記株を約１〜１５日間、好ましくは４〜１０日間、固形又は液体栄養培地、例えば酵母寒天上において増殖させることによって、得ることができる。
【００２５】
ラビリントペプチン誘導体は、公知の方法を使用し、かつ、該天然物質の化学的、物理的及び生物学的特性を考慮して、培養培地から単離しそして精製し得る。培地における又は個々の単離工程におけるそれぞれのラビリントペプチン誘導体の濃度を試験するためにＨＰＬＣを使用し、形成された物質の量を較正溶液と便宜的に比較した。
【００２６】
単離のために、培養ブロス、又は固形培地と一緒の培養物を、場合により凍結乾燥し、そして有機溶媒、又は好ましくは有機溶媒を５０〜９０％含有する水と有機溶媒との混合液を使用して、ラビリントペプチン誘導体を凍結乾燥物から抽出する。有機溶媒の例は、メタノール及び２−プロパノールである。有機溶媒相は、本発明に従う天然物質を含有し；それは、必要に応じて真空で濃縮され、そしてさらなる精製に供される。
【００２７】
本発明の１つ又はそれ以上の化合物のさらなる精製は、好適な材料、好ましくは例えばモレキュラーシーブ、シリカゲル、酸化アルミニウム、イオン交換体又は吸着樹脂又は逆相（ＲＰ）の、クロマトグラフィーによって行われる。このクロマトグラフィーは、ラビリントペプチン誘導体を分離するために使用される。ラビリントペプチン誘導体は、緩衝化された、塩基性又は酸性の水溶液又は水溶液と有機溶液との混合液を使用して、クロマトグラフィーに供される。
【００２８】
水溶液又は有機溶液の混合液は、５〜９９％有機溶媒、好ましくは５〜５０％有機溶媒の濃度での、全ての水混和性有機溶媒、好ましくはメタノール、２−プロパノール若しくはアセトニトリル、又は有機溶媒と混和性である全ての緩衝化された水溶液であると理解される。使用される緩衝剤は、上記で挙げたものと同一である。
【００２９】
ラビリントペプチン誘導体は、それらの異なる極性に基づいて、例えばＭＣＩ（吸着樹脂、三菱、日本）若しくはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ（ＴＯＳＯＨＡＡＳ）の、又は他の疎水性材料の、例えばＲＰ−８若しくはＲＰ−１８相の、逆相クロマトグラフィーによって分離される。さらに、分離は、例えばシリカゲル、酸化アルミニウムなどの、順相クロマトグラフィーによって行われ得る。
【００３０】
緩衝化された、塩基性又は酸性水溶液は、例えば０．５Ｍまでの濃度での水、リン酸緩衝液、酢酸アンモニウム及びクエン酸緩衝液、並びに好ましくは１％までの濃度での、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、アンモニア及びトリエチルアミン、又は当業者に公知の全ての市販の酸及び塩基であると理解される。緩衝水溶液の場合、０．１％酢酸アンモニウムが、特に好ましい。
【００３１】
クロマトグラフィーは、１００％水から開始しそして１００％有機溶媒で終了する勾配を使用して行うことができ；クロマトグラフィーは、好ましくは５から９５％へのアセトニトリルの線形勾配で行った。
【００３２】
あるいは、疎水性相のクロマトグラフィー又はゲルクロマトグラフィーを行うことも可能である。ゲルクロマトグラフィーは、例えばポリアクリルアミドゲル又はコポリマーゲルで行なうことができる。上述のクロマトグラフィー工程の順序は、逆にされ得る。
【００３３】
ラビリントペプチンが立体異性体として存在する場合、それらは、公知の方法を使用して、例えばキラルカラムを使用する分離によって、分離され得る。
【００３４】
ＯＨ基のエステル又はエーテル誘導体への誘導体化は、自体公知の方法（J. March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4th edition, 1992）を使用して、例えば酸無水物との反応、又は炭酸ジアルキル若しくは硫酸ジアルキルとの反応によって、行われる。ＣＯＯＨ基のエステル又はアミド誘導体への誘導体化は、自体公知の方法（J. March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4th edition, 1992）を使用して、例えばアンモニアとのそれぞれのＣＯＮＨ2基への反応、又は場合により活性化されたアルキル化合物とのそれぞれのアルキルエステルへの反応によって、行われる。−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−基の−ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ2−又は−ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2−基への酸化は、それぞれのラビリントペプチン誘導体を酸素又は空気へ曝露することで達成され得る。
【００３５】
微生物株アクチノマデュラ・ナミビエンシスの分離株は、番号：ＤＳＭ  ６３１３で、１９９１年１月２３日に、ブダペスト条約の規則に従って、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures] GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1B, 38124 Braunschweig, Germanyに識別リファレンスＦＨ−Ａ  １１９８で寄託された。微生物株アクチノマデュラ・ナミビエンシスは、Wink et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2003, 53, 721-724にさらに記載されている。
【００３６】
アクチノマデュラ・ナミビエンシス株（ＤＳＭ  ６３１３）の代わりに、本発明の１つ又はそれ以上の化合物を合成するその突然変異体及び／又は変異体を使用することも可能である。
【００３７】
突然変異体は、本発明化合物を産生する前記生物の能力の原因である遺伝子は機能性かつ遺伝性のまま、ゲノム中の１つ又はそれ以上の遺伝子が修飾されている微生物である。
【００３８】
このような突然変異体は、物理的手段、例えば紫外線若しくはＸ線での照射、又は化学的突然変異原、例えばメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）；２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（ＭＯＢ）若しくはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）を使用して、自体公知の様式で、又はBrock et al., “Biology of Microorganisms”, Prentice Hall, pages 238-247 (1984) に記載されるように、生産することができる。
【００３９】
変異体は、前記微生物の表現型である。微生物は、それらの環境に適応する能力を有し、従って高度に発達した生理学的適応性を示す。微生物の全ての細胞は、表現型適応に関与し、変化の性質は、遺伝的に条件付けされず、変更された条件下で可逆性である（H. Stolp, Microbial ecology: organism, habitats, activities. Cambridge University Press, Cambridge, GB, page 180, 1988）。
【００４０】
本発明の１つ又はそれ以上の化合物を合成する突然変異体及び／又は変異体のスクリーニングは、場合により発酵培地を凍結乾燥し、そして凍結乾燥物又は発酵ブロスを上述の有機溶媒又は水と有機溶媒との混合液で抽出し、そしてＨＰＬＣ若しくはＴＬＣにより分析することにより、又は生物学的活性を試験することにより、達成される。
【００４１】
前記発酵条件は、アクチノマデュラ・ナミビエンシス（ＤＳＭ  ６３１３）並びにその突然変異体及び／又は変異体に適用され得る。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、細菌感染、特にグラム陽性菌によって引き起こされる細菌感染の治療、ウイルス感染の治療及び／又は疼痛、特に神経因性疼痛若しくは炎症誘発疼痛の治療のための、上述の、式（Ｉ）の化合物、好ましくは式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物の使用である。
【００４３】
上述の薬剤（薬剤又は薬学的組成物ともいう）は、上述の、任意の立体化学形態、又は任意の比率の任意の立体化学形態の混合物の、有効量の少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物、又はそれらの生理学的に許容される塩若しくは化学的均等物と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、好ましくは１つ又はそれ以上の薬学的に許容される担体物質（又はビヒクル）及び／又は添加物（又は添加剤）とを含有する。
【００４４】
薬剤は、例えば丸剤、錠剤、ラッカー錠剤（lacquered tablet）、コーティング錠剤、顆粒剤、ゼラチン硬及び軟カプセル剤、液剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤又はエアゾール混合物の形態で、経口投与され得る。しかし、投与はまた、例えば坐剤の形態で、直腸投与で、又は非経口的に、例えば注射用液剤若しくは注入液剤、マイクロカプセル剤、インプラント剤若しくはロッド剤（rods）の形態で、静脈内に、筋肉内に若しくは皮下に、又は例えば軟膏剤、液剤若しくはチンキ剤の形態で、経皮的に若しくは局所的に、又は例えばエアゾール剤若しくは鼻スプレー剤の形態で、他の様式で、行われ得る。
【００４５】
本発明の薬剤は、自体公知でかつ当業者によく知られている様式で調製され、薬学的に許容される不活性無機及び／又は有機担体物質及び／又は添加物が、上述の、任意の立体化学形態、又は任意の比率の任意の立体化学形態の混合物の、式（Ｉ）の化合物、又はそれらの生理学的に許容される塩若しくは化学的均等物に加えて使用される。丸剤、錠剤、コーティング錠剤及びゼラチン硬カプセル剤の作製には、例えば、ラクトース、トウモロコシデンプン又はその誘導体、タルク、ステアリン酸又はその塩などを使用することが可能である。ゼラチン軟カプセル剤及び坐剤用の担体物質は、例えば、脂肪、ワックス、半固体及び液体ポリオール、天然又は硬化油などである。液剤（例えば、注射用液剤）又は乳剤又はシロップ剤の作製用の好適な担体物質は、例えば、水、生理食塩水、アルコール、グリセリン、ポリオール、スクロース、転化糖、グルコース、植物油などである。マイクロカプセル剤、インプラント剤又はロッド剤用の好適な担体物質は、例えばグリコール酸と乳酸とのコポリマーである。製剤は、通常、式（Ｉ）の化合物及び／又はそれらの生理学的に許容される塩及び／又はそれらのプロドラッグを約０．５〜約９０質量％含有する。薬剤中における、上述の、任意の立体化学形態、又は任意の比率の任意の立体化学形態の混合物の、式（Ｉ）の有効成分、又はそれらの生理学的に許容される塩若しくは化学的均等物の量は、通常、約０．５〜約１０００ｍｇ、好ましくは約１〜約５００ｍｇである。
【００４６】
上述の、任意の立体化学形態、又は任意の比率の任意の立体化学形態の混合物の、式（Ｉ）の有効成分、又はそれらの生理学的に許容される塩若しくは化学的均等物、並びに担体物質に加えて、製剤は、１つ又はそれ以上の添加物、例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、保存剤、甘味剤、着色剤、着香剤、芳香剤、増粘剤、希釈剤、緩衝剤物質、溶剤、可溶化剤、デポー効果を達成するための薬剤、浸透圧を変化させるための塩、コーティング剤又は抗酸化剤を含有し得る。それらはまた、任意の立体化学形態、又は任意の比率の任意の立体化学形態の混合物の、式（Ｉ）の化合物、又はそれらの生理学的に許容される塩若しくは化学的均等物を、２つ又はそれ以上含有し得る。製剤が式（Ｉ）の化合物を２つ又はそれ以上含有する場合、個々の化合物の選択は、製剤の特定の全体的な薬理学的プロフィールを目標とし得る。例えば、短い作用持続期間を有する非常に強力な化合物は、より低い効力の長く作用する化合物と組み合わせられ得る。式（Ｉ）の化合物中における置換基の選択に関して許されるフレキシビリティーのために、化合物の生物学的及び物理化学的特性の多くの制御が可能となり、従って、このような所望の化合物の選択が可能となる。さらに、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物に加えて、製剤はまた、１つ又はそれ以上の他の治療的又は予防的有効成分を含有し得る。
【００４７】
式（Ｉ）の化合物を使用する場合、用量は、広い限度範囲内で変動し得、通例でありかつ医師に公知であるように、各個体の症例における個体の状態に適合すべきである。それは、例えば使用される特定の化合物、治療しようとする疾患の性質及び重症度、投与の様式及びスケジュール、又は急性若しくは慢性の状態を治療するかどうか、又は予防を行なうのかどうかに依存する。好適な用量は、医学の分野においてよく知られた臨床的アプローチを使用して確立し得る。一般的に、体重約７５ｋｇの成人において所望の結果を達成するための一日用量は、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、特に約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ（各場合において、体重１ｋｇ当たりのｍｇ）である。一日用量は、特に比較的多量の投与の場合に、いくつかの、例えば２、３又は４つの部分の投与へ分割し得る。通常であるように、個体の反応に依存して、示した一日用量から上方又は下方へ外す必要があり得る。
【００４８】
実施例１：アクチノマデュラ・ナミビエンシス（ＤＳＭ  ６３１３）の凍結培養物（cryoculture）の作製
滅菌５００ｍｌ  エルレンマイヤーフラスコ中培地１００ｍｌ（デンプン１０ｇ、酵母エキス２ｇ、グルコース１０ｇ、グリセリン１０ｇ、コーンスティープ粉末２．５ｇ、ペプトン２ｇ、ＮａＣｌ  １ｇ、水道水１ｌ中ＣａＣＯ3３ｇ、滅菌前ｐＨ７．２）に、アクチノマデュラ・ナミビエンシス株（ＤＳＭ  ６３１３）を播種し、そして振盪器において１２０ｒｐｍで２７℃にて７２時間インキュベートした。引き続いて、培養物１ｍｌ及び滅菌保存溶液１ｍｌ（グリセリン２０ｇ、サッカロース１０ｇ、脱イオン水７０ｍｌ）を混合し、そして−８０℃で保存した。代替として、寒天上の十分に増殖させた培養物の小片を、５０％滅菌グリセリン溶液１．５ｍｌを含むＣｒｙｏｔｕｂｅｓ（登録商標）（Ｖａｎｇａｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に移し、そして液体窒素で−１９６℃で保存した。
【００４９】
実施例２：ラビリントペプチンの作製
実施例１に記載の培地１００ｍｌを含有する滅菌５００ｍｌ  エルレンマイヤーフラスコに、寒天プレート上で増殖させたアクチノマデュラ・ナミビエンシス（ＤＳＭ  ６３１３）の培養物を播種し、そして振盪器において１２０ｒｐｍで２７℃にてインキュベートした。７２時間後、同一量の同一培地を含有するさらなるエルレンマイヤーフラスコに、各々、この前培養物２ｍｌを播種し、そして同一条件下で１６８時間インキュベートした。代替として、実施例１に記載の培地１００ｍｌを含有する３００ｍｌ  エルレンマイヤーフラスコに、アクチノマデュラ・ナミビエンシス（ＤＳＭ  ６３１３）の培養物を播種し、そして１８０ｒｐｍで２５℃にてインキュベートした。７２時間後、同一量の同一培地を含有するさらなるエルレンマイヤーフラスコに、各々、この前培養物５ｍｌを播種し、そして同一条件下で１６８時間インキュベートした。
【００５０】
実施例３：ラビリントペプチンの単離
２％  Ｈｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒ−ｃｅｌ珪藻土（Ｈｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒｃｅｌｌ；ＶＷＲ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、実施例２の培養ブロス１０Lへ加え、そして培養溶液をミセル（mycel）から分離するために培養物をフィルタープレスで濾過した。濾液を、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−１６樹脂１Lを含有するカラム（カラム直径：５．５ｃｍ、カラムの高さ：４２ｃｍ）に加え、そして脱イオン５L水及び２０％メタノール水溶液５Lで洗浄した。ラビリントペプチンを、６０％メタノール水溶液５L及び８０％メタノール水溶液５  ｌで溶離した。ラビリントペプチン含有フラクションを、ＨＰＬＣ−ＤＡＤ及びＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって確認し、水性残留物が得られるまでロータリーエバポレーターでまとめて濃縮し、そして引き続いて凍結乾燥した。粗生成物３００ｍｇが得られた。
【００５１】
実施例４：ラビリントペプチンの、ダイオードアレイ検出を伴う高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＤＡＤ）
カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １００−Ｃ18；２０＋１２５ｍｍ×４．６ｍｍ，５μ（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）
移動相：
０．１％Ｈ3ＰＯ4水溶液（溶離剤Ａ）及びアセトニトリル（溶離剤Ｂ）
溶離剤Ａ中０％から１００％への溶離剤Ｂの線形勾配
１５分間
流量：毎分２ｍｌ
【００５２】
ＵＶ／Ｖｉｓ吸収による検出によって、２１０、２３０、２６０、２８０、３１０、３６０、４３５及び５００ｎｍでピークが得られた。
【００５３】
式（ＩＩ）のラビリントペプチンの保持時間：７．７５分。
【００５４】
実施例５：ラビリントペプチンの、エレクトロスプレーイオン化質量分析を伴う高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）
カラム：Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ−１８ｅ；１２５ｍｍ×４ｍｍ，５μ（Ａｇｉｌｅｎｔ）
移動相：
水（Wasser）中０．１％トリフルオロ酢酸（溶離剤Ａ）及び
アセトニトリル（Acetonitril）中０．１％トリフルオロ酢酸（溶離剤Ｂ）
溶離剤Ａ中５％から１００％への溶離剤Ｂの線形勾配
１０分間
流量：毎分１．５ｍｌ。質量分析計のＥＳインターフェースへの流量は、Ｔスプリッターによって毎分０．４ｍｌへ減らした。
【００５５】
２１０ｎｍでのＵＶ吸収及びＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブモード）による検出；ここで、イオントラップを質量分析器として使用した。
【００５６】
式（ＩＩＩ）のラビリントペプチンの保持時間は５．９分であった。分子質量は１９２２Ｄａであった。
【００５７】
実施例６：ラビリントペプチンの精製
実施例３に従って得られたラビリントペプチン粗生成物（３００ｍｇ）を、ジメチルスルホキシド、メタノール及び水（１：３：６）の混合液に溶解し、そして成分を、毎分２０ｍｌの流量で定組成溶離（水＋０．１％ギ酸／メタノール  ３５：６５）を使用して、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １００−Ｃ18カラム（粒径：１０μ、カラムサイズ：２５０×１６ｍｍ）におけるクロマトグラフィーによって分離した。フラクションをＨＰＬＣ（実施例４を参照のこと）で分析した。式（ＩＩＩ）のラビリントペプチン６２ｍｇが９９％純度で得られた。
【００５８】
実施例７：ラビリントペプチン（ＩＩＩ）の一般的特性
式（ＩＩＩ）の化合物を、空気への曝露で酸化してそれぞれのスルホキシドにした。式（ＩＩＩ）の化合物は、2Ａｓｐ−3Ｔｒｐ及び11Ｔｈｒ−12Ｇｌｙ間に２つのｃｉｓアミドを含有する。
【００５９】
実施例８：高分解能ＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ−質量分析
メタノール中の式（ＩＩＩ）のラビリントペプチンの溶液（ｃ＝０．２ｍｇ／ｍｌ）を、エレクトロスプレー源を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ａｐｅｘ  ＩＩＩ  ＦＴＩＣＲ  ＭＳ（７Ｔ  ｍａｇｎｅｔ）に２μｌ／分の流量でシリンジポンプを通して入れた。スペクトルを、外部較正を使用してポジティブモードで記録した。
【表１】
2010505777.tif 000008
【００６０】
実施例９：アミノ酸分析
加水分解：ラビリントペプチン（ＩＩＩ）（０．０５ｍｇ）を、６Ｎ  ＨＣｌ、５％フェノール（phenole）で、窒素雰囲気において１１０℃で２４時間加水分解した。加水分解物を窒素流中において乾燥した。
【００６１】
アキラルＧＣ−ＭＳ：前記加水分解物を、ビス−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）／アセトニトリル（Acetonitril）（１：１）と共に１５０℃で４時間加熱した。ＧＣ−ＭＳ実験用に、ＤＢ５溶融シリカキャピラリーを使用した（ジメチル−（５％−フェニルメチル）−ポリシロキサンでコーティングされたｌ＝１５ｍ×０．２５μｍ溶融シリカ、ｄf＝０．１０μｍ；温度プログラム：Ｔ＝６５°／３｀／６／２８０°Ｃ）。
【００６２】
キラルＧＣ−ＭＳ：前記加水分解物を、エタノール中の２Ｎ  ＨＣｌ  ２００μｌで、１１０℃で３０分間エステル化し、そして乾燥した。引き続いて、混合物をジクロロメタン１００μｌ中のＴＦＡＡ  ２５μｌで、１１０℃で１０分間アシル化し、そして乾燥した。ＧＣ−ＭＳ実験用に、溶融シリカキャピラリーを使用した（ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｓ−Ｖａｌ（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）でコーティングされたｌ＝２２ｍ×０．２５μｍ溶融シリカ、ｄf＝０．１３μｍ；温度プログラム：Ｔ＝５５°／３｀／３，２／１８０°Ｃ）。
【表２】
2010505777.tif 000009
【００６３】
実施例１０：ＮＭＲ分光法
２−Ｄ  ＮＭＲスペクトル（ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ）を、５ｍｍ  Ｚ−Ｇｒａｄ三重共鳴プローブヘッドを備えたＡＭＸ  ６００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、及び５ｍｍ  Ｚ−Ｇｒａｄブロードバンドインバースプローブヘッドを備えたＤＲＸ５００  ＮＭＲ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。下記表は、測定において得られたシグナルを示す。
【００６４】
【表３】
2010505777.tif 000010
【００６５】
実施例１１：ラビリントペプチン（ＩＩＩ）のＸ線結晶学
結晶化条件：前記タンパク質を０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．２に溶解した（濃度７ｍｇ／ｍｌ）。タンパク質溶液と、６０％エタノール、０．７５％ＰＥＧ６０００、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム及び０．０５Ｍ塩化ナトリウムの溶液との１：１混合液からの蒸気ドロップ拡散（vapour drop diffusion）によって、室温で結晶を成長させた。結晶は約１週間以内に成長した。
【００６６】
測定：Ｘ線データを、回転陽極及びミラー単色化（mirror monochromated）ＣｕＫα線を備えたＢｒｕｋｅｒ  ３サークル回折計で収集した。強度をＳＭＡＲＴ  ６０００  ＣＣＤエリアディテクターで収集した。
【００６７】
【表４】
2010505777.tif 000011
【００６８】
【表５】
2010505777.tif 000012
【００６９】
【表６】
2010505777.tif 000013
【００７０】
【表７】
2010505777.tif 000014
【００７１】
【表８】
2010505777.tif 000015
【００７２】
実施例１２：ラビリントペプチン（ＩＩＩ）の酸化
【化６】
2010505777.tif 000016
ラビリントペプチン（ＩＩＩ）５０ｍｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）を、室温で、ＤＭＳＯ１  ｍｌに溶解し、そして１−ヒドロキシ−１−オキシド−１，２−ベンゾヨードキソール−３（１Ｈ）−オン１１ｍｇ（ＩＢＸ，０．０３９ｍｍｏｌ）と混合した。混合物を４０℃で６時間そしてさらに室温で１２時間撹拌し、引き続いて、ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｐｒｅｐ  ＭＳ  Ｃ１８  １０μｍプレカラム（Ｗａｔｅｒｓ、寸法：１９×１０ｍｍ）を備えるＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ（登録商標）Ａｘｉａ  ５μｍ  Ｃ１８（２）カラム（寸法：１００ｍｍ×３０ｍｍ）の逆相ＨＰＬＣによって精製した。３０分かけての水中５％から９５％アセトニトリルへの勾配（０．１％酢酸アンモニウムを含有、ｐＨ７．０）を溶離剤として使用した。カラム流量（６０ｍｌ／分）をフラクションに分け、そしてＵＶ検出した。該フラクション７〜１１が所望の化合物を含有した。フラクションから、凍結乾燥後、２５ｍｇ（５０％）が得られた。生成物を質量分析（Ｂｒｕｋｅｒ
Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ＭｉｃｒｏＴｏｆ）によってキャラクタライズした。
ＵＶ：２２２ｓｈ、２７８ｎｍ
ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１９２０．６６５１８［モノアイソトピック質量（ｍｏｎｏ）  ＭＷ）］
分子式：Ｃ８５Ｈ１０８Ｎ２０Ｏ２４Ｓ４
分子量（ＭＷ）＝１９２２．２
【００７３】
実施例１３：ラビリントペプチン（ＩＩＩ）のＣ末端におけるペプチド合成
【化７】
2010505777.tif 000017
ラビリントペプチン（ＩＩＩ）４０ｍｇ（０．０２１ｍｍｏｌ）を、無水（abs.）ジメチルホルムアミド２ｍｌに溶解し、そしてジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネート（Ｂｏｃ2Ｏ）１０ｍｇ（０．０４５ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン７ｍｇ（０．０５４ｍｍｏｌ）で室温で１時間処理した。引き続いて、ベンジルアミン６．８ｍｇ（０．０６３ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ中のプロピルホスホン酸無水物の５０％溶液５０μｌ（０．０７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｓｈｉｅｌｄ（登録商標）Ｃ１８  １０μｍプレカラム（Ｗａｔｅｒｓ、寸法：１９×１０ｍｍ）を含有するＷａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｓｈｉｅｌｄ（登録商標）５μｍ  Ｃ１８  Ｓａｅｕｌｅ（寸法：１００ｍｍ×３０ｍｍ）の逆相ＨＰＬＣによって精製した。３０分かけての水中５％から９５％へのアセトニトリルの勾配（０．１％酢酸アンモニウムを含有、ｐＨ７．０）を溶離剤として使用した。カラム流量（６０ｍｌ／分）をフラクションに分け、そしてＵＶ検出した。フラクション３０及び３１を合わせ、そして所望の化合物９．６ｍｇ（２２％）が得られた。生成物を質量分析（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ＭｉｃｒｏＴｏｆ）によってキャラクタライズした。
ＵＶ：２２２ｓｈ、２７６ｎｍ
ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝２１１１．７９０１８（ｍｏｎｏ  ＭＷ）
分子式：Ｃ９７Ｈ１２５Ｎ２１Ｏ２５Ｓ４
分子量（ＭＷ）＝２１１３．５
【００７４】
実施例１４：ラビリントペプチン（ＩＩＩ）のＮ末端におけるペプチド合成
【化８】
2010505777.tif 000018
２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）５ｍｇ（０．０２８ｍｍｏｌ）を、無水ジメチルホルムアミド２ｍｌに溶解し、そしてＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）８．６ｍｇ（０．０８５ｍｍｏｌ）と混合した。混合物を室温で１時間撹拌した。ｎ−カプロン酸３．３ｍｇ（０．０２８ｍｍｏｌ）を添加し、そして混合物を室温でさらに３０分間撹拌した。引き続いて、ラビリントペプチン（ＩＩＩ）４０ｍｇ（０．０２１ｍｍｏｌ）を添加し、そして得られた混合物を室温でさらに２時間撹拌した。反応混合物を、ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｓｈｉｅｌｄ（登録商標）Ｃ１８  １０μｍプレカラム（Ｗａｔｅｒｓ，寸法：１９×１０ｍｍ）を備えるＷａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｓｈｉｅｌｄ（登録商標）５μｍ  Ｃ１８  Ｓａｅｕｌｅ（寸法：１００ｍｍ×３０ｍｍ）の逆相ＨＰＬＣによって精製した。３０分かけての水中５％から９５％アセトニトリルへの勾配（０．１％ギ酸を含有、ｐＨ２．０）を溶離剤として使用した。カラム流量（６０ｍｌ／分）をフラクションに分け、そしてＵＶ検出した。フラクション３８〜４０を合わせ、そして所望の化合物１１．０ｍｇ（２６％）が得られた。生成物を質量分析（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ＭｉｃｒｏＴｏｆ）によってキャラクタライズした。
ＵＶ：２２０ｓｈ、２７８ｎｍ
ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝２０２０．７５７３８（ｍｏｎｏ  ＭＷ）
分子式：Ｃ９１Ｈ１２０Ｎ２０Ｏ２５Ｓ４
分子量（ＭＷ）＝２０２２．３
【００７５】
実施例１５：抗菌活性
液体牛肉エキスブロスにおいて前記微生物を培養した後、細菌の懸濁液を、新鮮な培地で希釈することによって所定の密度へ調整した（５・１０5微生物／ｍｌ）。
【００７６】
ラビリントペプチン（ＩＩＩ）を、幾何学的希釈系列（ファクター２）で水に溶解及び希釈した。個々の希釈段階の溶液１．５ｍｌを、約４５℃で液体寒天（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天）１３．５ｍｌと混合した。
【００７７】
ペトリ皿における最大化合物濃度は、通常、１００ｍｇ／ｌであった。化合物を含まない寒天プレートをコントロールとして利用した。
【００７８】
培地を冷却して固化した後、寒天プレートに、１接種スポット当たり５・１０4コロニー形成単位（ｃｆｕ）を送り出す多点接種装置（Ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ  Ｉｎｏｃｕｌａｔｏｒ）を使用して２０種の異なる細菌株を同時に接種し、次いで好気条件下において３７℃で１７時間インキュベートした。
【００７９】
インキュベーション後、細菌増殖がもはや目に見えない最小化合物濃度について、プレートを肉眼で検査した。接種スポットでの単一コロニー又はかすんだ増殖は無視した。
【００８０】
抗菌効果を、試験化合物の最小阻止濃度（ＭＩＣ：細菌増殖がもはや肉眼で見えない最小化合物濃度）として評価した：
【表９】
2010505777.tif 000019
【００８１】
実施例１６：抗ウイルス活性
ウイルスは、生細胞においてのみ増殖し得る。従って、ウイルス研究を細胞培養物において行った。ウイルスは、感染因子としてのそれらの重要性、又は典型的な生化学的若しくは形態学的構造のいずれかの理由で、選択した。
【００８２】
ラビリントペプチン（ＩＩＩ）の希釈系列を９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて調製した。感染性ウイルスに従って、ヒーラ（Ｈｅｌａ）又はベロ（Ｖｅｒｏ）細胞を添加し、２４時間のインキュベーション内にコンフルエントな単層が得られた。３時間インキュベーションした後、それぞれのウイルスを、２日内に細胞単層を完全に破壊すると予想される濃度で細胞に添加した。培養物を、脱気したインキュベーター（空気中５％ＣＯ2）において３７℃でインキュベートした。２４時間後、細胞培養物における試験化合物の最大耐用量（ＭＴＤ）を、顕微鏡検査によって評価した。結果を、感染していない組織コントロール及び対応する感染コントロールと比較した：
【表１０】
2010505777.tif 000020
【００８３】
実施例１７：神経因性疼痛活性
接触性アロディニアに対する活性を試験するために、ラビリントペプチン（ＩＩＩ）を神経因性疼痛の坐骨神経部分損傷（spared nerve injury）（ＳＮＩ）マウスモデルで研究した。全身麻酔下で、腓腹神経はインタクトのまま、成体雄性Ｃ５７Ｂ６マウス（２２．７ｇ±０．２６ＳＥＭ）における坐骨神経の２つの主要な枝を結紮しそして切断した。接触性アロディニアを、自動ｖｏｎ  Ｆｒｅｙテストで測定した：ダンプニードルスティックを使用して、後肢の足底皮膚を、５ｇまで増加する強度の圧力刺激に曝露した。動物が後肢を引込めて反応したグラムの力を接触性アロディニアの読み出しとして使用した。研究を神経損傷の７日後に６時間にわたって行い、２４時間後さらに測定した。神経切断後２日以内に、接触性アロディニアが完全に発症し、そして少なくとも２週間にわたって安定したままであった。化合物を単回適用（３ｍｇ／ｋｇ）として静脈内投与した。静脈内適用についてのビヒクルとして、１：１：１８（エタノール：ソルトール（Solutol）：リン酸緩衝食塩水）ビヒクルを選択した。
【００８４】
肢逃避反応閾値（paw withdrawal threshold）（ＰＷＴ）測定値を使用して、有意な治療効果を計算し、並びに基準期間（６時間）にわたるＡＵＣ計算及び引き続いての％便益計算を行った。統計分析のために、同側後肢のＰＷＴ値を２つの様式で使用した：第１に、特定の時間（２４時間の期間内）のＰＷＴ値に基づく２ウエイＡＮＯＶＡ、及び第２に、非変換デルタＡＵＣ値｜ＡＵＣ１−６時間｜の１ウエイＡＮＯＶＡ。
【００８５】
反復測定（repeated measures）の２ウエイ分散分析（反復要因（Repeated factor）：ＴＩＭＥ、分析変数（Analysis variable）：ＰＷＴ）続いての補足分析（Complementary Analysis）（要因ＴＩＭＥの各レベルについての要因ＧＲＯＵＰの効果（Ｗｉｎｅｒ分析）、分析変数：ＰＷＴ）及び要因ＴＩＭＥの各レベルについての要因ＴＲＥＡＴＭＥＮＴに関する引き続いてのＤｕｎｎｅｔｔ検定（両側比較  対  レベルＶＥＨＩＣＬＥ）によって、各化合物についての静脈内適用後１〜６時間のビヒクル群に対する非常に有意な差が明らかとなった。効果は適用の２４時間後なくなった。デルタ｜ＡＵＣ１−６時間｜値を使用する１ウエイＡＮＯＶＡは、ｐ＜０．０００１のｐ値を示した。Ｄｕｎｎｅｔｔ分析は両方の化合物について有意な治療効果を与えた。治療のパーセント便益を、同側ビヒクル群（０％便益）の｜ＡＵＣ１−６時間｜値、及び反対側の３つ全ての群［１００％便益＝最大可能効果（maximal possible effect）］の全ての｜ＡＵＣ１−６時間｜値を使用して評価した。これらのマージンを比較すると、ラビリントペプチン（ＩＩＩ）は９７％便益を達成した。
【００８６】
結論として、本化合物は、神経因性疼痛のＳＮＩマウスモデルにおける接触性アロディニアを有意に軽減した。
【００８７】
実施例１８：炎症誘発疼痛活性
炎症誘発疼痛についての典型的な読み出しである温熱性痛覚過敏に対する活性を試験するために、ラビリントペプチン（ＩＩＩ）を、カラゲナン（ＣＡＲ）誘発後肢炎症マウスモデルで研究した。
【００８８】
後肢炎症の誘発：軽い全身イソフルラン麻酔下で、２０μｌ食塩水中ＣＡＲ２％（Ｓｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、雄性Ｃ５７Ｂ６マウスの両側の後肢の足底面内に注射した。肢逃避反応潜時（paw withdrawal latency）（ＰＷＬ）を、問題の後肢の下における赤外線熱の適切な配置を確実にするための小型カメラが取り付けられた市販の装置（Ｐｌａｎｔａｒ  Ｔｅｓｔ  Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｃｏｍｅｒｉｏ，Ｉｔａｌｙ）を使用して、所定の熱刺激への肢の曝露時に測定した。マウスを、全研究期間（６時間）にわたって試験ケージ内に維持した。
【００８９】
温熱性痛覚過敏の測定：後肢によって赤外線に反射する持続期間を測定するタイマーを、研究者がスタートし、そして動物が冒された後肢を振っている場合、ストップした。組織損傷を防止するために、カットオフを１６秒に設定した。研究を、ＣＡＲ注射前及びＣＡＲ注射後６時間にわたって行った。肢逃避反応潜時（秒）を、さらなる分析についての読み出しとして使用した。
【００９０】
静脈内適用についてのビヒクルとして、１：１：１８（エタノール：ソルトール：リン酸緩衝食塩水）ビヒクルを選択した。
【００９１】
肢逃避反応潜時（ＰＷＬ）測定値を使用して、顕著な治療効果を計算し、並びに基準期間（６時間）にわたるＡＵＣ計算及び引き続いての％便益計算を行った。統計分析のために、両方の後足のＰＷＬ値を２つの様式で使用した：第１に、特定の時間（６時間の期間内）のＰＷＬ値に基づく変動の２ウエイ分析（ＡＮＯＶＡ）、及び第２に、非変換デルタＡＵＣ値｜ＡＵＣ１−６時間｜の１ウエイＡＮＯＶＡ。
【００９２】
反復測定の２ウエイ分散分析（反復要因：ＴＩＭＥ、分析変数：ＰＷＬ）続いての補足分析（要因ＴＩＭＥの各レベルについての要因ＧＲＯＵＰの効果（Ｗｉｎｅｒ分析）、分析変数：ＰＷＬ）及び要因ＴＩＭＥの各レベルについての要因ＤＯＳＡＧＥに関する引き続いてのＤｕｎｎｅｔｔ検定（両側比較  対  レベル０＝ＶＥＨＩＣＬＥ）によって、両方の用量についての静脈内適用後１〜２時間のビヒクル群に対する非常に有意な差が明らかとなった。効果は適用の４時間後なくなった。デルタ｜ＡＵＣ１−６時間｜値を使用する１ウエイＡＮＯＶＡは、ｐ＜０．０００１のｐ値を示した。Ｄｕｎｎｅｔｔ分析は両方の用量について有意な治療効果を与えた。治療のパーセント便益を、ビヒクル群（０％便益）の｜ＡＵＣ１−６時間｜値、及びＣＡＲが注射される前（６時間にわたる理論的ベースライン＝最大可能効果＝１００％効果）の全ての｜ＡＵＣ１−６時間｜値を使用して評価した。これらのマージンを比較すると、１ｍｇ／ｋｇ用量群が３７％便益を達成し、１０ｍｇ／ｋｇ群が３４％便益を達成した。
【００９３】
結論として、本化合物は、炎症誘発疼痛のＣＡＲマウスモデルにおける温熱性痛覚過敏を有意に軽減した。
【国際調査報告】
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