(57)【要約】本発明は、キヌレニン変換酵素および／またはキヌレン酸-、アントラニル酸-および／または3-ヒドロキシキヌレニン-生成酵素の活性を測定する方法であって、好ましくはCSF（脳脊髄液）または血清から選択される干渉サンプルの存在下にて活性を測定し、キヌレニンおよび／またはキヌレン酸および／またはアントラニル酸および／または3-ヒドロキシキヌレニンの変換を検出することを特徴とする、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キヌレニン変換酵素および／またはキヌレン酸-、アントラニル酸-および／または3-ヒドロキシキヌレニン-生成酵素の活性を測定する方法であって、好ましくはCSF（脳脊髄液）または血清サンプルから選択される干渉サンプルの存在下にて活性を測定し、キヌレニンおよび／またはキヌレン酸および／またはアントラニル酸および／または3-ヒドロキシキヌレニンの変換を検出することを特徴とする、方法。
【請求項２】
酵素がキヌレニンアミノトランスフェラーゼ（KAT）、好ましくはKAT I、KAT IIまたはKAT IIIであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
活性が組織サンプル、好ましくは肝臓組織サンプル、より好ましくは単離または合成された肝臓組織サンプルのキヌレニン変換酵素および／またはキヌレン酸生成酵素に由来することを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
組織サンプルが組織ホモジネートであることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
組織サンプルが哺乳類、好ましくは齧歯類またはヒトに由来することを特徴とする、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
干渉サンプル、好ましくはCSFおよび／または血清サンプルが哺乳類、好ましくはヒトに由来することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
干渉サンプルの非存在下または異なる量の干渉サンプルもしくは酵素を用いることにより、活性を好ましくは請求項３〜５記載の組織サンプルに由来するキヌレニン変換酵素および／またはキヌレン酸生成酵素の活性と比較することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７記載の（インビトロ）方法を用いてキヌレニンまたはキヌレン酸代謝を伴う病変を診断する方法であって、病変が干渉成分なし（対照）の活性と比較して80%未満、好ましくは60%未満、特に好ましくは50%未満、より好ましくは40%未満、特に好ましくは30%未満、最も好ましくは20%未満の活性の軽減を示す、方法。
【請求項９】
病変が神経免疫学的病変、神経炎症性病変または神経変性病変であることを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
病変が統合失調症、うつ病または多発性硬化症（MS）であることを特徴とする、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
キヌレニンおよび／またはキヌレン酸の変換が検出されることを特徴とする、キヌレニン変換酵素および／またはキヌレン酸生成酵素の活性を測定するための請求項１〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
干渉サンプルが血清サンプルおよび／またはCSFであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
キヌレニン変換酵素および／またはキヌレン酸生成酵素を、好ましくは組織サンプルまたはホモジネート、特に肝臓ホモジネートまたは合成肝臓、適当な緩衝剤およびキヌレニン、好ましくはL-キヌレニンと一緒に含み、適宜ピリドキサル-5'-リン酸も含んでもよい、生物サンプルを含む、キット。
【請求項１４】
酵素がキヌレニンアミノトランスフェラーゼ（KAT）、好ましくはKAT I、KAT IIまたはKAT IIIであることを特徴とする、請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
さらに、好ましくはピルビン酸、3-ヒドロキシピルビン酸、2-オキソグルタル酸、2-オキソイソ吉草酸、2-オキソアジピン酸、フェニルピルビン酸、2-オキソ酪酸、グリオキサル酸、オキサロ酢酸、2-オキソ-ガンマ-メチオール酪酸、2-オキソ-n-吉草酸、2-オキソ-n-カプロン酸および2-オキソイソカプロン酸から選択されるオキソ酸を含む、請求項１３または１４記載のキット。
【請求項１６】
さらにタンパク質変性剤を好ましくは微小遠心管中に含む、請求項１３〜１５のいずれか記載のキット。
【請求項１７】
さらにキヌレン酸、アントラニル酸および／または3-ヒドロキシキヌレニン標準物質を含む、請求項１３〜１６のいずれか記載のキット。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか記載の方法のための請求項１３〜１７のいずれか記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学的マーカー化合物の測定分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素キヌレニンアミノトランスフェラーゼ（以下、KATと略す）はキヌレニンからのキヌレン酸（KYNA）の生合成を触媒する。末梢におけるいくつかの酵素はKYNA形成に関与し、ラット肝臓は最高KAT活性を示す(1)。ヒトCSF（脳脊髄液）および血清は検出可能なKAT活性をほとんどまたは全く示さない(2)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
キヌレニン代謝における変化は、統合失調症およびうつ病などの神経免疫学的工程、神経炎症工程および神経変性工程に記録されている。これらの疾患において、キヌレニン代謝に伴う新規臨床マーカーは特に興味深い。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
それゆえ、本発明は、キヌレニン変換酵素（例えばキヌレニンアミノトランスフェラーゼ、キヌレニナーゼ、キヌレニンヒドロキシラーゼ）、キヌレン酸-、アントラニル酸-および／または3-ヒドロキシキヌレニン-生成酵素の活性を測定する方法であって、好ましくは生物液体サンプルまたは体液サンプル、特にCSF（脳脊髄液）および／または血清サンプルから選択される干渉サンプル（interfering sample）の存在下にて活性を測定し、キヌレニンおよび／またはキヌレン酸および／またはアントラニル酸および／または3-ヒドロキシキヌレニンの変換を検出することを特徴とする、方法を提供する。CSFおよび／または血清などの体液中、キヌレニン変換活性と干渉する部分が含まれる。この干渉効果はいくつかの疾患に罹患する患者にて減少（または増大）する。好ましくはCSFおよび／または血清から選択される、二の異なる用量の干渉サンプルにより生じる二の効果の比較は、病変／疾患と関連するRHBまたはRBK比を与える。結果的に、本発明の方法は、以下に記載のように、診断方法のために用いることができる。好ましくは、キヌレニンの減少、および／またはキヌレン酸、アントラニル酸および／または3-ヒドロキシキヌレニンの形成が検出される。
好ましい酵素はキヌレニンアミノトランスフェラーゼ（KAT）であり、好ましくはKAT I、KAT IIまたはKAT IIIである。もちろんKAT I、KAT IIまたはKAT IIIと類似する任意の単離または合成トランスフェラーゼを用いることもできる。
【０００５】
好ましくは、活性は、組織サンプル、好ましくは肝臓組織サンプル、好ましくは組織ホモジネート、より好ましくは単離または合成肝臓組織サンプルのキヌレニン変換酵素および／またはキヌレン酸生成酵素に由来する。KATは、組織サンプルまたはホモジネートと同様に、多くの組織にて存在し、精製せずにまたはほとんど精製しないで用いることができる、内因性酵素である。そのような組織サンプルは好ましくは哺乳類、好ましくは齧歯類、例えばラットまたはヒトに由来する。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
最も好ましい具体的態様にて、干渉サンプル、好ましくはCSFサンプルおよび／または血清は、哺乳類、好ましくはヒトに由来する。干渉サンプルはまた、健康な試験個体に由来して標準参照として用いることができるか、あるいは、キヌレニン変換の阻害または活性化がほとんど期待されない疾患に罹患する試験個体に由来することができる。同様に、異なる量の干渉サンプル、好ましくはCSFおよび／または血清を用い、干渉サンプルまたは酵素の量の関数として干渉曲線を構築することも可能である。二の特定量の干渉サンプル（または酵素）を選択し、完全な曲線を描かずに変換における開示された異なる効果の比を測定することも可能である。これらの比（RHBおよびRBK）は特定の疾患を診断するために用いることができる（例えば1.5〜3.5の範囲のRHB、および0〜2.5の範囲のRBK）。
【０００７】
本方法は、好ましくは干渉サンプルの非存在下または異なる量の干渉サンプルもしくは酵素を用いることにより、活性を好ましくは組織サンプルに由来するキヌレニン変換酵素および／またはキヌレン酸生成酵素の活性と比較することを特徴とする。
【０００８】
さらなる態様にて、本発明は、上記（インビトロ）方法を用いることによりキヌレニンまたはキヌレン酸代謝を伴う病変を診断する方法であって、病変が干渉成分なし（対照）の活性と比較して80%未満、好ましくは60%未満、特に好ましくは50%未満、より好ましくは40%未満、特に好ましくは30%未満、最も好ましくは20%未満の活性の減少を示す、方法を提供する。好ましくはCSFおよび／または血清から選択される異なる量の干渉サンプルの効果の比を診断方法に用いることができる。
【０００９】
特定の具体的態様において、病変は神経免疫学的病変、神経炎症性（neuroinflammatory）病変または神経変性病変、特に統合失調症、うつ病または多発性硬化症（MS）である。
【００１０】
特定の具体的態様において、血清サンプルは干渉サンプルとして用いる。驚くべきことに、同様の阻害特性のCFSは、使いやすい血清サンプルにても可能であることが判明した。本発明によれば、「血清」は、血液（細胞成分を含む）または血漿（凝固因子を含む）などのすべての血清含有体液であると理解され、最も好ましくは血清そのものである。
【００１１】
別の態様によれば、本発明は、キヌレニン変換酵素および／またはキヌレン酸生成酵素、好ましくは組織サンプルまたはホモジネート、特に肝臓ホモジネート、適当な緩衝剤およびキヌレニン、好ましくはL-キヌレニンとともに含み、適宜ピリドキサル-5'-リン酸も含んでもよい、生物サンプルを含む、キットを提供する。
【００１２】
キットは、本発明の方法により用いることができる。酵素は、好ましくはKAT I、KAT IIもしくはKAT IIIまたは類似の特性を有するアミノトランスフェラーゼと類似する合成肝臓またはホモジネートの形態にても存在しうる。
【００１３】
キットにて、酵素は、好ましくはキヌレニンアミノトランスフェラーゼ（KAT）、好ましくはKAT I、KAT IIまたはKAT IIIである。
【００１４】
さらに、好ましいキットは、好ましくはピルビン酸、3-ヒドロキシピルビン酸、2-オキソグルタル酸、2-オキソイソ吉草酸、2-オキソアジピン酸、フェニルピルビン酸、2-オキソ酪酸、グリオキサル酸、オキサロ酢酸、2-オキソ-ガンマ-メチオール酪酸、2-オキソ-n-吉草酸、2-オキソ-n-カプロン酸または2-オキソイソカプロン酸から選択されるオキソ酸を含む。
【００１５】
同様に、キットはタンパク質変性剤を好ましくは微小遠心管中に含むことが好ましい。
【００１６】
キットは、好ましくは測定比較のためにキヌレン酸、アントラニル酸および／または3-ヒドロキシキヌレニン標準物を含む。
【００１７】
本発明はさらに以下の実施例により説明されるが、これに限定されない。
【実施例】
【００１８】
実施例1：CSFおよび血清の存在下における肝臓中のKAT（KAT IおよびKAT II）活性の測定は、KAT活性の有意な低下を示す。
【００１９】
CSFおよび血清は、ラット肝臓ホモジネートにてKYNA形成（KAT I活性）が有意に70%減少し（対照の30%）、肝臓ホモジネートのKAT II活性はヒトCSFまたは血清により穏やかに影響された。二の異なる量のCSFまたは血清を診断についてのKAT反応における混合物の成分として適用し、両効果の比を定めた。対照試験個体およびMS患者からのヒトCSFまたは血清は、肝臓KAT I活性、すなわちKYNAおよび他のキヌレニン代謝体、例えばアントラニル酸および3-ヒドロキシキヌレニンの形成への異なる効果を示した。
【００２０】
MS患者からのCSFまたは血清は、肝臓ホモジネートにてKAT I活性（対照の60%）の有意に弱い減少可能性、すなわち対照試験個体からのCSFまたは血清の効果と比較して有意に高いKYNAの形成を示し、ここに、KAT Iの阻害は対照から20〜30%であった(3)。ラット肝臓のKAT II活性はヒトCSFまたは血清により適度に影響された。
【００２１】
実施例2：KATアッセイ
KATアッセイは一般に知られており、刊行物に記載のように行った（Baran et al., 2004）。（KAT活性測定はまた、1994; 2000; 2004にも刊行された）。診断目的のために、反応カクテルはラット肝臓ホモジネートおよびCSFまたは血清の混合物を含む。全容積0.2 ml中にL-キヌレニン、ピルビン酸、ピリドキサル-5'-リン酸、およびKAT Iとして150 mM 2-アミノ-2-メチル-1-プロプラノール（propranol）（AMPOL）緩衝液pH 9.6またはKAT IIとして150 mM トリス-アセテート緩衝液pH 7.0であった。37℃（華氏98.6度）でのインキュベーション後（16時間；時間は可変）、反応は50% TCA 10μlの添加により測定した。次いで0.1 M HCl 1 mlを加え、変性タンパク質を14,000 rpmにて10分で除去した（エッペンドルフ・マイクロフュージ）。基質L-キヌレニン、ピルビン酸およびピリドキサル5'-リン酸の条件もまた可変であり、刊行物に記載のように用いることができる（1、2、3）。
【００２２】
KAT活性および／またはキヌレニン代謝、すなわちKYNA形成の測定は、異なる方法で行うことができる：
1. Baran et al., 1994 (5)記載の分光光度計によるアッセイ
2. Baran el al., 1995 (8)および(6, 7)記載のHPLCおよびアントラニル酸によるアッセイ
3. Kepplinger et al., 2005 (3)記載の放射酵素測定（radioenzymatic）法によるアッセイ
【００２３】
Ad1）新たに形成されたKYNAは333 nmにて分光光度的に測定した（Knox, 1953）。
【００２４】
Ad2）HPLCによるKYNAの測定はShibata, 1988 (9)およびSwartz, 1990 (10)によりBaran et al., 1996記載のように改変して行った。得られた上清をDowex 50 Wカチオン交換カラムに適用し、KYNAをTurski et al., 1989 (11)記載のように蒸留水2 mlで溶出し、蛍光検出連結HPLCにより測定した（Shibata et al., 1988; Swartz et al., 1990）。KYNAおよびアントラニル酸および／または3-ヒドロキシキヌレニンの分析に用いたHPLC系は以下からなる：ポンプ（Shimadzu, LC-6A）、励起波長340 nmおよび発光波長398 nmに設定した蛍光検出器（Shimadzu, RF-535）およびShimadzu C-R5Aクロマトパック・インテグレータ（Chromatopac Integrator）。移動相（アイソクラチック系）は50 mM酢酸ナトリウム、250 mM酢酸亜鉛および4%アセトニトリルpH 6.2からなり、10 cm x 0.4 cmカラム（HR-80, C-18, 粒子径3 |o,M, InChrom, Austria）に流速1.0 ml/min、室温（23℃, 華氏73.4度）にてポンプで送り込んだ。アントラニル酸およびKYNAの保持時間は、およそ3.5および5分であり、注射当たり250 fmolおよび150 fmolの感度であった（シグナル-ノイズ比=5）。
【００２５】
Ad3）放射酵素測定法はBaran at al., 2004およびKepplinger et al., 2005記載の方法により行うことができる。
【００２６】
参照文献
1. Okuno E, Nishikawa T, M Nakamura, (1996) Kynurenine aminotransferases in the rat. Localization and Characterization. Recent Advances in Tryptophan Research, edited by Graziella Allegri Filipini et al., Plenum Press, New Your, 1996.
2. B. Kepplinger, H. Baran, A. Kainz, H. Ferraz-Leite, J. Newcombe and P. Kalina (2005) Age-related increase of kynurenic acid in human cerebrospinal: Positive corratio with IgG and Sa-microglobulin changes. Neurosignals, 14(3), 126-135.
3. Kepplinger B, Baran H, Kainz A, Zeiner D, Wallner J (2006) Cerebrospinal Fluid of Multiple Sclerosis patients exert significantly weaker inhibition of Kynurenine Aminotransferases I activity in rat liver homogenate. Multiple Sclerosis 2006; 12:S1-S228, P496
4. H. Baran, B. Kepplinger, M. Draxler and H. Ferraz-Leite (2004) Kynurenic acid metabolism in rat, piglet and human tissues. In European Society for Clinical Neuropharmacology by ed L. Battistin, International Proceedings MEDIMOND S.r.1. E505R9004, 227-231.
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9. Swartz KJ, Matson WR, MacGarvey U, Ryan EA, Beal MF. Measurement of kynurenic acid in mammalian brain extracts and cerebrospinal fluid by high-performance liquid chromatography with fluorometric and coulometric electrode array detection. Anal Biochem 1990; 185: 363-376.
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【国際調査報告】
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2010521979.tif 000003
2010521979.tif 000004
2010521979.tif 000005
2010521979.tif 000006
2010521979.tif 000007
2010521979.tif 000008
2010521979.tif 000009