(57)【要約】  本発明は、ホモジナイザー装置を用いて生物学的細胞を破壊する方法に関し、該装置が、（ａ）少なくとも１つの入口ノズルを備えたオリフィスプレートおよび少なくとも１つの出口ノズルを備えたオリフィスプレートを含み、該オリフィスプレート同士の間の中間空隙内に、スタティックミキサーが設置され、かつ適宜、機械的エネルギーが追加的に導入されるか、または（ｂ）少なくとも１つの入口ノズルを備えたオリフィスプレートおよびバッフルプレートを含み、該オリフィスプレートと該バッフルプレートとの間の中間空隙内に、適宜、スタティックミキサーが設置され、かつ／または機械的エネルギーが導入される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホモジナイザー装置により生物学的細胞を破壊する方法であって、該装置が、
（ａ）少なくとも１つの入口ノズルを備えたオリフィスプレートおよび少なくとも１つの出口ノズルを備えたオリフィスプレートを含み、該オリフィスプレート同士の間の中間空隙内に、スタティックミキサーが設置され、かつ適宜、機械的エネルギーが追加的に導入されるか、または
（ｂ）少なくとも１つの入口ノズルを備えたオリフィスプレートおよびバッフルプレートを含み、該オリフィスプレートと該バッフルプレートとの間の中間空隙内に、適宜、スタティックミキサーが設置され、かつ／または機械的エネルギーが導入される、
上記方法。
【請求項２】
前記細胞が天然の生物または組み換え生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ホモジナイザー装置を用いて産生細胞からタンパク質を単離する方法であって、該装置が、
（ａ）少なくとも１つの入口ノズルを備えたオリフィスプレートおよび少なくとも１つの出口ノズルを備えたオリフィスプレートを含み、該オリフィスプレート同士の間の中間空隙内に、スタティックミキサーが設置され、かつ適宜、機械的エネルギーが追加的に導入されるか、または
（ｂ）少なくとも１つの入口ノズルを備えたオリフィスプレートおよびバッフルプレートを含み、該オリフィスプレートと該バッフルプレートとの間の中間空隙内に、適宜、スタティックミキサーが設置され、かつ／または機械的エネルギーが導入される、
上記方法。
【請求項４】
前記タンパク質がハイドロフォビンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記産生細胞をホモジナイズの前に死滅させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法ステップを含む、組み換えタンパク質の生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的細胞の細胞消化方法およびその後の産生細胞からのタンパク質単離方法、さらにそのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
発酵によって生産される生成物が細胞内にある場合、該細胞を、発酵完了後に破壊しなければならない（酵素またはタンパク質放出）。これは、細胞の切開および内部の細胞成分、特に求められている分子、通常はタンパク質、の培養ブロスへの放出に関する。この場合、これらのタンパク質がすでに所望のネイティブ型であるか、封入体として不活性型で存在するかは重要でない。求められているタンパク質に加えて、他の可溶性タンパク質もまた、このプロセスで放出される。そして生成物を、細胞破壊後に、例えば遠心分離機での沈降、ろ過または分別沈降によって、細胞残渣（cell debris）と称されるものから分離することができ、適切であれば、さらに精製することができる。
【０００３】
細胞破壊に使用される物理的な力は、衝突、摩擦、張力、圧力、圧縮、キャビテーションまたは音によって適用できる機械力である。そのために構築されている機械および装置では、一般に、これらの能動的な力の複数が発生する。外部から可視の特徴は特有の動力の入力（specific power input）である。この場合、破砕動作に関して導入されるエネルギーの考えられる最も有効な使用は、選択対象の方法に関する重要な意思決定基準である（Storhas W. Bioverfahrensentwicklung [Bioengineering development]. Wiley-VCh Verlag GmbH & Co KgaA Weinheim. 2003）。純粋に機械的な細胞破壊方法に加えて、化学的方法（例えば酸／アルカリ溶液、塩、溶媒）、生物学的方法、例えば酵素、ファージ、自己融解（Wisemen, Process Biochem.4 63-65 (1969); Asenjo JA, Andrews BA, Hunter JB, LeCorre S, Process Biochem. 20: 158-164. 1985, Lam KS, GrootWassink JWD, Enzyme Microb Technol. 239-242. 1985; Tanny GB, Mirelman D, Pistole T. Appl Environ Microbiol 40. 269-273. 1980）、熱による方法および物理的方法（例えば浸透圧、凍結融解、凍結乾燥）またはこれらの方法の組み合わせを細胞破壊に利用することもできる。例えば、Bailey et al.（Improved homogenization of recombinant E. coli following pre-treatment with guanidine hydrochloride. Biotechnol Prog 11: 533-539. 1995）は、ホモジナイズ前に界面活性剤およびカオトロープ（chaotropes）を加えることによる細胞破壊度の改善を報告している。
【０００４】
高圧ホモジナイズは工業的ワークアップ実施において最も頻繁に使用される破壊装置である。高圧ホモジナイザーの原理は、自発的減圧によって生じるキャビテーションに基づき、強い張力を伴って細胞破壊を生じさせる。キャビテーション蒸気泡の崩壊では、１０５ｂａｒまでの圧力が発生し、結局それが細胞の破壊をも担う。その懸濁液を、通常、低い初期圧力でピストンポンプにフィードし、ポンプがそれをホモジナイズ圧力まで加圧する。ホモジナイズユニットでは、バルブがこの圧力を速度、剪断、法線力（normal forces）および張力に変換する。高度なキャビテーションフローが形成される。これらのプロセスは、圧力に応じて、約２００〜２５０ｍｓｅｃ続く。高圧ホモジナイザーでの破壊に影響する主な要因は、理論的には、ホモジナイズ圧力差、通過回数、ホモジナイズバルブの設計、フィード濃度および温度である（Storhas, 2003）。
【０００５】
高圧細胞破壊中に、温度上昇は、一般に、使用される圧力差に比例して増加する（約２．２℃／１０Ｍｐａ, Storhas, 2003）。高い圧力差での細胞破壊の改善に起因する生成物収率の増加は該生成物の熱不活性化によって相殺される。細胞破壊度を改善するために圧力差を増加させると、結果として、冷却能力の増加を伴う。
【０００６】
バルブ構築を最適化することによって、例えば、同一エネルギー入力に対する、より小さい細胞残渣または細胞断片のより狭いサイズ分布のおかげで、ダウンストリーミングのための一定の生成物品質および／または改善された特性を伴って、省エネルギーを達成することができる。例えば、Storhas（2003）は、パン酵母からの酵素の放出に関する実験においてナイフエッジバルブが最高の効率を有し、次いでコニカルバルブおよびフラットバルブであることを実証している。
【０００７】
高圧細胞破壊の市販の変法は「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ」（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，  ＵＳＡ）である。この場合、細胞懸濁液を、増圧ポンプ（intensifier pump）を使用して一定流速で所望の圧力にする。そして細胞懸濁液を、破壊槽と称される部品内の固定形状を有する正確に規定されたマイクロチャネルに通し、その結果、細胞懸濁液を高速に加速する。これにより非常に高い剪断速度が生じる（＝剪断ゾーン）。剪断ゾーンに続いて、細胞懸濁液を衝突ゾーンに通す。このゾーンでは、衝突によって細胞を破壊する。この破壊方法では、１２４０ｂａｒでの大腸菌（E. coli）懸濁液の一回通過で９９％までの破壊度が期待される（Microfluidics brochure, Innovation by Microfluidizer processor technology, 2005）。
【０００８】
攪拌型ボールミル（ＳＢＭ）での衝突−圧力破砕によって細胞を破壊することも多い。ここでは主に大きな細胞残渣が形成される。ローター−ステーターマシンおよびコロイドミルの使用による細胞破壊も考えられる。
【０００９】
機械的細胞破壊から生じる細胞残渣のサイズはディスクセパレーターでの分離結果に直接影響しうる；（Wong et al. Centrifugal processing of cell debris and inclusion bodies from recombinant E. coli, Bioseparation 6: 361-372, 1997）。細胞残渣のサイズが低下して封入体サイズが一定の場合に、ディスクセパレーターを使用した場合の、封入体から得られる生成物中の望ましくない細胞残渣の分離効率改善に関する報告である。この場合、ホモジナイザー通過回数を２回から１０回に増加させることによって細胞残渣サイズの低下が達成された。セパレーターの排除運転において優先的に分離される、小さな細胞残渣を生じさせることによって、封入体濃縮物の純度が５８％増加した。
【００１０】
しかし、破壊済み細胞懸濁液が有益な溶存生成物を含む場合、ろ過法による細胞残渣の分離は、小さな細胞残渣によって、より困難になりうる（Storhas, 2003）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Storhas W. Bioverfahrensentwicklung. Wiley-VCh Verlag GmbH & Co KgaA Weinheim. 2003
【非特許文献２】Wisemen, (1969) Process Biochem.4 63-65
【非特許文献３】Asenjo JA, Andrews BA, Hunter JB, LeCorre S, Process Biochem. 1985, 20: 158-164
【非特許文献４】Lam KS, GrootWassink JWD, 1985, Enzyme Microb Technol. 239-242
【非特許文献５】Tanny GB, Mirelman D, Pistole T. 1980, Appl Environ Microbiol 40. 269-273
【非特許文献６】Bailey et al. 1995, Biotechnol Prog 11: 533- 539
【非特許文献７】Microfluidics brochure, Innovation by Microfluidizer processor technology, 2005
【非特許文献８】Wong et al., 1997, Bioseparation 6: 361-372
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
先行技術に記載の方法は、高いエネルギー量を必要とし、破壊ステップの多数の反復を必要とし、機能的タンパク質の収量に関して満足のいくものではない、有毒物質を使用することがあり、以後のワークアップをより困難にする核酸の高レベルの混入を伴うことが多い。該方法は、多くの場合、コストの理由で小規模でしか適用可能でなく、この方法ではタンパク質の工業的生産を有益に実行できない。
【００１３】
したがって本発明の目的は、生物学的細胞を破壊するための新規な方法であって、産生細胞からのタンパク質の特に良好な単離を首尾良く達成し、かつ公知方法の上述の不都合を回避する方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
該目的は、ホモジナイザー装置を用いて、産生細胞からのタンパク質の特に良好な単離を首尾良く達成する、生物学的細胞の破壊方法によって達成され、ここで該装置は、
（ａ）  少なくとも１つの入口ノズルを備えたオリフィスプレートおよび少なくとも１つの出口ノズルを備えたオリフィスプレートを含み、該オリフィスプレート同士の間の中間空隙内に、スタティックミキサーが設置され、かつ適宜、機械的エネルギーが追加的に導入されるか、または
（ｂ）  少なくとも１つの入口ノズルを備えたオリフィスプレートおよびバッフルプレートを含み、該オリフィスプレートと該バッフルプレートとの間の中間空隙内に、適宜、スタティックミキサーが設置され、かつ／または機械的エネルギーが導入される。
【００１５】
本発明は、さらに、ホモジナイザー装置を用いて産生細胞からタンパク質を単離する方法であって、該装置が、
（ａ）  少なくとも１つの入口ノズルを備えたオリフィスプレートおよび少なくとも１つの出口ノズルを備えたオリフィスプレートを含み、該オリフィスプレート同士の間の中間空隙内に、スタティックミキサーが設置され、かつ適宜、機械的エネルギーが追加的に導入されるか、または
（ｂ）  少なくとも１つの入口ノズルを備えたオリフィスプレートおよびバッフルプレートを含み、該オリフィスプレートと該バッフルプレートとの間の中間空隙内に、適宜、スタティックミキサーが設置され、かつ／または機械的エネルギーが導入される、
上記方法に関する。
【００１６】
本発明は、同様に、産生細胞からのタンパク質の特に良好な単離を首尾良く達成する生物学的細胞の破壊用装置であって、
（ａ）  少なくとも１つの入口ノズルを備えたオリフィスプレートおよび少なくとも１つの出口ノズルを備えたオリフィスプレートを含み、該オリフィスプレート同士の間の中間空隙内に、スタティックミキサーが設置され、かつ適宜、機械的エネルギーが追加的に導入されるか、または
（ｂ）  少なくとも１つの入口ノズルを備えたオリフィスプレートおよびバッフルプレートを含み、該オリフィスプレートと該バッフルプレートとの間の中間空隙内に、適宜、スタティックミキサーが設置され、かつ／または機械的エネルギーが導入される、
上記装置に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法を用いて、すべてのタイプの生物学的細胞を破壊することができ、かつ、細胞破壊に続いて、特にタンパク質を、産生細胞から特に容易に単離することができる。本発明の方法は、先行技術と比べて、かなり低い差圧（約２倍）で同等の細胞破壊度を達成する。換言すれば、先行技術と比べて、同じ差圧で、より高い細胞破壊度が達成される。したがって、例えば継続滅菌または化学物質の添加による生物学的細胞の引き続く死滅に必要とされる出費は顕著に減少しうる。さらに、細胞断片の特性には、セパレーターまたはノズルセパレーターによる細胞断片の引き続く分離がかなり容易になるといった影響を及ぼす。本方法は、引き続いて非酵素タンパク質を単離する必要がある場合、特に界面活性タンパク質を単離する必要がある場合に、細胞破壊に好ましく使用される。微生物起源、植物起源のタンパク質、特にハイドロフォビンのクラスのタンパク質の引き続く単離は、特に容易に首尾良く達成される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は実施例１〜８の生細胞数［１／ｍＬ］である。
【図２】図２は実施例１〜８の破壊度［−］である。
【図３】図３は実施例９のタンパク質ゲルである：４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル／ＭＥＳバッファー、左：ハイドロフォビンＡをマンニトールとともにスプレー乾燥した後、右：マーカー：プレ染色済みＳＤＳ−Ｐａｇｅ標準、アプリケーション／スロット：１５μｇ Ｐｒ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ハイドロフォビンは約１００アミノ酸の小タンパク質であり、糸状菌に特徴的であり、他の生物には存在しない。最近、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）においてハイドロフォビン様タンパク質が発見された。それは「ｃｈａｐｌｉｎ」と名付けられ、同様に高度な界面活性特性を有する。Ｃｈａｐｌｉｎは組み立てられて、水／空気界面でアミロイド様原繊維になりうる（Classen et al. 2003 Genes Dev 1714-1726; Elliot et al. 2003, Genes Dev. 17, 1727-1740）。
【００２０】
ハイドロフォビンは種々の真菌構造、例えば気菌糸、胞子、子実体の表面上に水不溶型で分布している。ハイドロフォビンの遺伝子は、子嚢菌類（Ascomycetes）、不完全菌類（Deuteromycetes）および担子菌類（Basidiomycetes）から単離されている。いくつかの真菌、例えばシゾフィラム・コミュネ（Schizophyllum commune）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）は２種以上のハイドロフォビン遺伝子を含む。明らかに、種々のハイドロフォビンは異なる真菌発生段階に関与する。この場合、ハイドロフォビンは種々の機能を担うと考えられる（van Wetter et al., 2000, Mol. Microbiol., 36, 201-210; Kershaw et al. 1998, Fungal Genet. Biol, 1998, 23, 18-33）。
【００２１】
ハイドロフォビンの生物学的機能として、気菌糸を発生させるための水の表面張力の低下に加えて、胞子の疎水性化（hydrophobicizing）も報告されている（Wosten et al. 1999, Curr. Biol., 19, 1985-88; Bell et al. 1992, Genes Dev., 6, 2382-2394）。さらに、ハイドロフォビンは、地衣の子実体の気道（gas channels）を裏打ちするために働き、かつ真菌病原体による植物表面の認識系の構成要素として働く（Lugones et al. 1999, Mycol. Res., 103, 635-640; Hamer & Talbot 1998, Curr. Opinion Microbiol., volume 1, 693-697）。
【００２２】
本発明の方法を用いて、融合タンパク質の単離に非常に大きな成功をもたらすこともできる。これらは、天然にはこの形態で存在しない、２つの部分から人工的に組み立てられている少なくとも１つのポリペプチド鎖を有するタンパク質を意味するものとする。特に、本発明の方法はハイドロフォビンの単離に好適である。
【００２３】
本発明の方法に特に非常に好適なハイドロフォビンは、以下の一般構造式（Ｉ）のポリペプチドであり：
Ｘｎ−Ｃ１−Ｘ１−５０−Ｃ２−Ｘ０−５−Ｃ３−Ｘｐ−Ｃ４−Ｘ１−１００−Ｃ５−Ｘ１−５０−Ｃ６−Ｘ０−５−Ｃ７−Ｘ１−５０−Ｃ８−Ｘｍ            （Ｉ）
式中、Ｘは２０種の天然に存在するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ）のいずれかであってよく、Ｘの指数はアミノ酸の数を示し、指数ｎおよびｍは０〜５００の数であり、好ましくは１５〜３００の数であり、ｐは１〜２５０の数であり、好ましくは１〜１００の数であり、Ｃはシステイン、アラニン、セリン、グリシン、メチオニンまたはトレオニンであり、Ｃによって指定される部分のうちの少なくとも４つはシステインであり、ただし、ＸｎまたはＸｍまたはＸｐによって略記されるペプチド配列の少なくとも１つが、天然にはハイドロフォビンに連結されていない少なくとも２０アミノ酸長のペプチド配列であり、
該ポリペプチドは、ガラス表面にコーティング後、少なくとも２０°の接触角の変化をもたらす。
【００２４】
Ｃ１〜Ｃ８によって指定されるアミノ酸は好ましくはシステインであり；しかし、それらは、類似の空間充填性（spatial filling）を有する他のアミノ酸、好ましくはアラニン、セリン、トレオニン、メチオニンまたはグリシンによって置き換えることもできる。しかし、位置Ｃ１〜Ｃ８の少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、特に好ましくは少なくとも６つ、特に少なくとも７つはシステインを含むべきであろう。本発明のタンパク質中のシステインは還元型で存在するか、または互いにジスルフィド架橋を形成していてよい。Ｃ−Ｃ架橋の分子内形成、特に少なくとも１つ、好ましくは２つ、特に好ましくは３つ、非常に特に好ましくは４つの分子内ジスルフィド架橋を有するものが特に好ましい。上記類似の空間充填性を有するアミノ酸によるシステインの置換では、有益には、互いに分子内ジスルフィド架橋を形成できるペアでＣ位置が置換される。
【００２５】
Ｘによって指定される位置でも、システイン、セリン、アラニン、グリシン、メチオニンまたはトレオニンが使用される場合、一般式中の個々のＣ位置の番号付けは対応して変化しうる。
【００２６】
特に有益なポリペプチドは以下の一般式（ＩＩ）のポリペプチドであり：
Ｘｎ−Ｃ１−Ｘ３−２５−Ｃ２−Ｘ０−２−Ｃ３−Ｘ５−５０−Ｃ４−Ｘ２−３５−Ｃ５−Ｘ２−１５−Ｃ６−Ｘ０−２−Ｃ７−Ｘ３−３５−Ｃ８−Ｘｍ            （ＩＩ）
式中、Ｘは２０種の天然に存在するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ）のいずれかであってよく、Ｘの指数はアミノ酸の数であり、指数ｎおよびｍは２〜３００の数であり、Ｃはシステイン、アラニン、セリン、グリシン、メチオニンまたはトレオニンであり、Ｃによって指定される部分のうちの少なくとも４つはシステインであり、ただし、ＸｎまたはＸｍによって略記されるペプチド配列の少なくとも１つが、天然にはハイドロフォビンに連結されていない少なくとも３５アミノ酸長のペプチド配列であり、
該ポリペプチドは、ガラス表面にコーティング後、少なくとも２０°の接触角の変化を生じさせる。
【００２７】
この場合、ハイドロフォビンの起源は重要ではない。例えば、ハイドロフォビンは例えば微生物、例えば細菌、酵母および真菌から単離されていてよい。特に遺伝子改変生物を用いて取得されたハイドロフォビンが本発明で考慮される。
【００２８】
本発明の方法を使用して、タンパク質を容易に単離することができる。タンパク質が細胞内で産生および蓄積される場合、産生細胞からの単離は、通常、タンパク質精製の最初のステップの１つである。
【００２９】
この場合、任意のタイプの細胞または細胞集団、特に動物、植物もしくは真菌起源または、細菌もしくはアーキア（Archaea）由来の微生物の細胞である細胞が産生細胞として指定される。好ましい産生細胞は組み換え生物である。特に非常に好適な産生細胞は、原核生物（アーキア（Archaea）を含む）または真核生物、特に細菌、例えば好塩菌およびメタノコッカエ（methanococcae）、真菌、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞、特に好ましくは、大腸菌（Escherichia coli）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・メガテリウム（Bacillus. megaterium）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzea）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、シュードモナス種（Pseudomonas spec.）、ラクトバシレン（Lactobacillen）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、ＳＦ９（および／または関連細胞）、ＣＨＯである。
【００３０】
産生細胞は、培養（例えば発酵）後に直接、本発明の方法において使用することができる；しかし、まず、例えば滅菌によって産生細胞を死滅させ、かつ適宜、培養培地のろ過によって細胞集団を濃縮することも可能である。
【００３１】
細胞破壊用のホモジナイザー装置は、少なくとも１つの入口ノズルを備えたオリフィスプレートおよび少なくとも１つの出口ノズルを備えたオリフィスプレートを含み、該ノズルは互いに軸方向に配置されている。オリフィスプレート同士の間の中間空隙には、スタティックミキサーが設置される。さらに、適宜、機械的エネルギーが導入される。
【００３２】
本発明の方法によって使用可能なオリフィスプレートは少なくとも１つのオリフィス、すなわち少なくとも１つのノズルを有する。この場合、２つのオリフィスプレートは、それぞれ、任意の所望の数のオリフィスを有しうるが、好ましくはそれぞれ５つ以下のオリフィス、特に好ましくはそれぞれ３つ以下のオリフィス、非常に特に好ましくはそれぞれ２つ以下のオリフィス、特に好ましくはそれぞれ１つ以下のオリフィスを有する。両オリフィスプレートは異なる数または同数のオリフィスを有しうるが、好ましくは両オリフィスプレートは同数のオリフィスを有する。一般に、オリフィスプレートは、それぞれ少なくとも１つのオリフィスを有する孔のあいたプレートである。
【００３３】
本発明の方法の別の実施形態では、第２のオリフィスプレートがふるいによって置き換えられ、すなわち第２のオリフィスプレートは多数のオリフィスまたはノズルを有する。使用可能なふるいは広範囲の孔サイズにおよびうる。一般に孔サイズは、０．１〜２５０μｍ、好ましくは０．２〜２００μｍ、特に好ましくは０．３〜１５０μｍ、特に０．５〜１００μｍである。
【００３４】
オリフィスまたはノズルは任意の考えられる幾何学的形状を有しうる。それらは、例えば、円形、卵形、任意の所望の数のコーナー（適宜、丸められていてもよい）を有する角形、あるいは星形であってよい。好ましくは、オリフィスは円形の形状を有する。
【００３５】
オリフィスは、一般に、０．０５ｍｍ〜１ｃｍ、好ましくは０．０８ｍｍ〜０．８ｍｍ、特に好ましくは０．１〜０．５ｍｍ、特に０．２〜０．４ｍｍの直径を有する。
【００３６】
２つのオリフィスプレートは、好ましくは、オリフィスまたはノズルが互いに軸方向に配置されるように構築される。軸方向の配置とは、ノズルオリフィスの形状によって生成されるフローの方向が両オリフィスプレートで同一であることを意味するものとする。入口ノズルおよび出口ノズルのオリフィス配置は、そのために一列になる必要はなく、上記考察から進んでそれらは平行にずれていてもよい。好ましくは、オリフィスプレートは平行に配置される。
【００３７】
しかし、他の形状、特に非平行オリフィスプレート、または入口および出口ノズルの異なるオリフィス配置が可能である。
【００３８】
オリフィスプレートの厚さは所望の厚さであってよい。好ましくは、オリフィスプレートは０．１〜１００ｍｍ、好ましくは０．５〜３０ｍｍ、特に好ましくは１〜１０ｍｍの範囲の厚さを有する。この場合、オリフィスプレートの厚さ（ｌ）は、オリフィスの直径（ｄ）および厚さ（ｌ）の比率が１：１、好ましくは１：１．５、特に好ましくは１：２の範囲であるように選択される。
【００３９】
２つのオリフィスプレートの間の中間空隙は任意の所望の長さであってよく、一般に中間空隙の長さは１〜５００ｍｍ、好ましくは１０〜３００ｍｍ、特に好ましくは２０〜１００ｍｍである。
【００４０】
オリフィスプレート同士の間の中間空隙では、本発明にしたがってスタティックミキサーが設置され、それは、全体的または部分的に、２つのオリフィスプレートの間のセクションを満たしうる。好ましくは、スタティックミキサーは２つのオリフィスプレートの間の中間空隙の全長におよぶ。スタティックミキサーは当業者に公知である。この場合、それは、例えば、ボアホールを有するバルブミキサーまたはスタティックミキサー、溝付きラメラ（fluted lamellae）からなるもの、または嵌合リッジ（interdigitating ridges）からなるものであってよい。さらに、それはらせん形またはＮ形のスタティックミキサー、または加熱可能もしくは冷却可能ミキシング要素を有するものであってよい。
【００４１】
２つのオリフィスプレートの間の中間空隙内にスタティックミキサーを取り付けることによって、結果として得られるタンパク質懸濁液の安定性が顕著に改善する。
【００４２】
スタティックミキサーに加えて、２つのオリフィスプレートの間の中間空隙には、機械的エネルギーをさらに導入することができる。該エネルギーは、例えば機械的振動、超音波または回転エネルギーの形態で導入することができる。この手段によって乱流が生じ、その効果は、中間空隙中の粒子が凝集しないことである。
【００４３】
この第１の変法の代わりに、ミキシング装置は少なくとも１つの入口ノズルを備えたオリフィスプレートおよびバッフルプレートを含みうる。オリフィスプレートとバッフルプレートとの間の中間空隙には、適宜、スタティックミキサーが設置される。スタティックミキサーの代わりに、またはそれに加えて、中間空隙に機械的エネルギーを導入することができる。
【００４４】
前述のことは、入口ノズルを備えたオリフィスプレート、スタティックミキサーおよび機械的エネルギー導入を有する中間空隙に適用される。
【００４５】
この変法では、第２のオリフィスプレートをバッフルプレートによって置き換える。バッフルプレートは、一般に、該バッフルプレートが取り付けられる位置のチューブの直径より０．５〜２０％、好ましくは１〜１０％、小さい直径を有する。
【００４６】
一般に、バッフルプレートは任意の幾何学的形状を有してよく、好ましくは円板の形状で、前面像にリングギャップが見えるようになっている。例えば、スロットまたはチャネルの形状も考えられる。
【００４７】
バッフルプレートは、上記変法の第２のオリフィスプレートと同様に、第１のオリフィスプレートに対して種々の距離でマウントすることができる。それにより、オリフィスプレートとバッフルプレートとの間の中間空隙は所望の長さであり、一般に、中間空隙の長さは１〜５００ｍｍ、好ましくは１０〜３００ｍｍ、特に好ましくは２０〜１００ｍｍである。
【００４８】
本発明の方法は、先行技術からの公知の方法と比較して、いくつかの利点を有する。特に活性型タンパク質の高い収率が達成されるからである。
【００４９】
本発明の方法によって生物学的細胞破壊が進行する温度は、一般に、０〜１５０℃、好ましくは５〜８０℃、特に好ましくは２０〜４０℃である。この場合、装置中の使用されるホモジナイザーユニットのすべてを加熱または冷却することができる。
【００５０】
ホモジナイズは、一般に、大気圧を超える圧力、すなわち＞１ｂａｒで実行される。しかし、この場合、圧力は１０ ０００ｂａｒの値を超えず、好ましくは＞１ｂａｒ〜１０ ０００ｂａｒ、好ましくは５〜２０００ｂａｒ、特に好ましくは１０〜１５００ｂａｒのホモジナイズ圧が設定される。
【００５１】
本発明の方法において使用される産生細胞濃度（総乾燥物として）は約３〜２５重量％、好ましくは５〜１５重量％である。
【００５２】
本発明の方法によって得られるタンパク質単離物は、使用目的に応じて、直接、または該タンパク質の再生後、追加の精製後、および適宜、製剤化後に使用することができる。
【００５３】
したがって本発明は、さらに、産生細胞からの上記単離ステップを特に含むタンパク質の生産方法に関する。
【００５４】
本発明の方法に続いて公知方法を使用してタンパク質を精製することができる。封入体と称されるものの中に細胞タンパク質が存在する場合、特に容易に精製に成功する。この場合、特に有益には、封入体を、セパレーターまたはノズルセパレーターにおいて遠心分離によって望ましくない細胞残渣から選択的に分離することができる。タンパク質の再生に続いて、公知のクロマトグラフ方法、例えば分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、例えばＱ−セファロースクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーを使用し、さらに他の慣用の方法、例えば遠心分離、限外ろ過、結晶化、塩析、透析およびネイティブゲル電気泳動を使用して、追加の精製を達成することができる。可溶性細胞タンパク質の生産では、細胞破壊に続いて、直接、公知のクロマトグラフ方法、例えばＱ−セファロースクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーを用い、さらに他の慣用の方法、例えば遠心分離、限外ろ過、結晶化、塩析、透析およびネイティブゲル電気泳動を用いて実施する。好適な方法は、例えばCooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical working methods], Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York, またはScopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
【００５５】
続いて、または代わりに、所望であれば、乾燥し、かつ適宜、助剤および保存剤を加えることによってタンパク質を製剤化することができる。
【実施例】
【００５６】
実験パート
発酵およびワークアップ（実施例１〜８）
ツーサイドシケイン（two side chicanes）を備えた１０００ｍＬ三角フラスコ中で２００ｍＬの複合培地にＬＢ−Ａｍｐプレート（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン）の大腸菌（E. coli）株を接種する（＝第１前培養）。該菌株を、ｄｏ＝２．５ｃｍを有するシェーカー上で、２００ｒｐｍ、３７℃でインキュベートして、ＯＤ６００ｎｍを約３．５にする。次いで、シケインを備えた追加の４つの１０００ｍＬ三角フラスコ（それぞれ２００ｍＬの複合培地を有する）にそれぞれ１ｍＬの第１前培養を接種し、振盪キャビネット（ｄｏ＝２．５ｃｍ、ｎ＝２００ｒｐｍ）中で３７℃でインキュベートする（＝第２前培養）。ＯＤ６００ｎｍが６を超えたらすぐに、複合培地を充填した前発酵槽にこの第２振盪培養から接種する。ＯＤ６００ｎｍ＞９またはＯＴＲ＝８０ｍｍｏｌ／（Ｌ＊ｈ）に達した後、本発酵槽に接種する。本培養を流加培養で実施してＯＤを７０にする。４℃に冷却することによって発酵を終わらせる。細胞集団を流速２００Ｌ／ｈでディスクセパレーターに通す。３３００ｋｇの発酵ブロスから８６０ｋｇの濃縮物を得る。１２００ｋｇの水で再懸濁細胞を作製し、生細胞数を決定する（＝ヌルサンプル）。再懸濁細胞ブロスの乾燥物含量（ＤＭ）は５重量％である。
【００５７】
細胞破壊では、懸濁細胞を高圧ポンプによって所望の作業圧にする（図１）。続く圧力増大は上記高圧オリフィスプレートにおいて行われる。このプロセスで細胞破壊が生じる。剪断、引っ張り（extension）および乱流力が懸濁微生物への攻撃を担う。実験室規模では、約２５Ｌ／ｈの流速および２５００ｂａｒまでのポンプ下流の作業圧を用いる。ポンプの取り込み側の温度は随意選択である（通常室温かまたは４℃にあらかじめ冷却される）。出口側では、放散エネルギーが５０℃までの温度上昇を生じさせる。したがって、高圧ノズルの下流に熱交換器を取り付ける。さらに、ノズル自体を冷却することができ／すでに冷却しておく。以下のノズルペアを細胞破壊に使用する：
５００ｂａｒ：              ０．２および０．４ｍｍ
１０００〜２４００ｂａｒ    ０．１および０．２ｍｍ。
【００５８】
2010500042.tif 000002
【００５９】
発酵およびワークアップ（実施例９）
ツーサイドシケインを備えた１０００ｍＬ三角フラスコ中で２００ｍＬの複合培地にＬＢ−Ａｍｐプレート（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン）のＹａａＤ−ＤｅｗＡ−Ｈｉｓ６発現大腸菌（E. coli）株を接種する（＝第１前培養）。該菌株を、ｄｏ＝２．５ｃｍを有するシェーカー上で、２００ｒｐｍ、３７℃でインキュベートして、ＯＤ６００ｎｍを約３．５にする。次いで、シケインを備えた追加の４つの１０００ｍＬ三角フラスコ（それぞれ２００ｍＬの複合培地を有する）にそれぞれ１ｍＬの第１前培養を接種し、振盪キャビネット（ｄｏ＝２．５ｃｍ、ｎ＝２００ｒｐｍ）中で３７℃でインキュベートする（＝第２前培養）。ＯＤ６００ｎｍが６を超えたらすぐに、複合培地を充填した前発酵槽にこの第２振盪培養から接種する。ＯＤ６００ｎｍ＞９またはＯＴＲ＝８０ｍｍｏｌ／（Ｌ＊ｈ）に達した後、本発酵槽に接種する。無機培地中で流加法で本培養を行う。ＯＤ６００ｎｍが７０を超えた時点で、５０μｍのＩＰＴＧで細胞を誘導する。４〜２０ｈの範囲の誘導時間後、発酵を中断し、容器の内容物を４℃に冷却する。発酵に続いて、７００Ｌ／ｈの流速を有するノズルセパレーターを用いて発酵ブロスから細胞を分離し（濃縮物：ＤＭ＝１３．４重量％，生物学的ＤＭ＝１０．４重量％）、脱イオン水に再懸濁する。ノズルセパレーターを使用して細胞を再び分離した後、乾燥物含量は１４．９重量％であり、生物学的乾燥物は１３．３重量％である。
【００６０】
実験室規模（実施例１〜８）から工業規模へのスケールアップを７００Ｌ／ｈまでの処理量および２５００ｂａｒまでの圧力で実行した。入力側の温度に関して、実施例１〜８と同じ条件を適用する（上記参照のこと）。圧縮空気メンブレンポンプを用いて、細胞含有懸濁液を７０μｍプレフィルターに通す。少なくとも１．５ｂａｒの入口圧で、高圧ピストンポンプを使用して細胞含有懸濁液を適切な圧力にし、次いでオリフィスプレートブロックと称されるものに通す。オリフィスプレートブロックは２つのオリフィスプレートを含む。第１のオリフィスプレートは１４個のボアホールを有し、各ホールは０．１または０．２ｍｍの直径を有する（上記参照のこと）。８ｍｍ直径を有するボアホールを通過後、１．５ｍｍの直径を有する第２のオリフィスプレートに細胞含有懸濁液を通し、加圧されていない側に送る。続いて、細胞含有懸濁液を冷却器に通す。
【００６１】
生細胞数の決定
生細胞数の決定では、各場合で、１００；１０および１μＬの懸濁液をＬＢ ＡＭＰ１００寒天プレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートする。次いで、コロニー形成単位（ＣＦＵ）をカウントし、単位体積あたりの生細胞数を見積もる。
【００６２】
定義
総乾燥物：        乾燥サンプル、乾燥物質のすべてを含む
生物学的乾燥物：  ２回洗浄され、次いで乾燥されたサンプル。
【００６３】
破壊度
以下の式から破壊度（Ａ）を定義する：
【数１】
2010500042.tif 000003
【００６４】
Ｎｏ    細胞破壊前の生細胞数
Ｎ      細胞破壊後の生細胞数（一回通過）。
【００６５】
活性検査
再溶解スプレー乾燥またはスプレー顆粒化ハイドロフォビン融合タンパク質のコーティング特性をタンパク質活性の評価のために使用する。コーティング特性は、好ましくは、それぞれ親水性および疎水性表面のモデルであるガラスおよびテフロン（登録商標）上で評価する。
【００６６】
ガラス：
−  ハイドロフォビンの濃度：５０ｍｇ／Ｌ
−  １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８中で一晩（温度：８０℃）、スライドガラスをインキュベートする
−  コーティング後、脱イオン水で洗浄する
−  その後、１０分／８０℃／１％ＳＤＳでインキュベートする
−  脱イオン水で洗浄する。
【００６７】
テフロン（登録商標）：
−  濃度：５０ｍｇ／Ｌ
−  １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８中で一晩（温度：８０℃）、テフロン（登録商標）スライドをインキュベートする
−  コーティング後、脱イオン水で洗浄する
−  その後、１０分／８０℃／１％ＳＤＳでインキュベートする
−  脱イオン水で洗浄する。
【００６８】
サンプルを空気中で乾燥させ、５μＬの水滴の接触角（度）を決定する。これは例えば以下の結果をもたらす：
ＹａａＤ−ＤｅｗＡ融合タンパク質を有するバッチ（対照：タンパク質なし；ＹａａＤ−ＤｅｗＡ−Ｈｉｓ６：１００ｍｇ／Ｌの精製済み融合パートナー）：
【表１】
2010500042.tif 000004
【００６９】
実施例１
消化槽「Ｃｅｒａｍｉｃ  ＩＸＣ  Ｈ１０Ｚ−６  ｓｌｏｔ」および「Ｃｅｒａｍｉｃ  ＡＰＭＨ３０Ｚ」（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用してＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  Ｍ−７１２５−３０  Ｓ．Ｎ．  ２００４１４によって１７５０ｂａｒの差圧で再懸濁細胞の一部分を破壊する。この場合の流速は３．３Ｌ／分である。一回通過後の細胞破壊液中で得られる生細胞数を表１に列挙する。
【００７０】
実施例２
高圧オリフィスプレート（ＨＤオリフィスプレート）によって５００ｂａｒの差圧で再懸濁細胞の一部分を破壊する。この場合の流速は３．３Ｌ／分である。一回通過後の細胞破壊液中で得られる生細胞数を表１に列挙する。
【００７１】
実施例３
高圧オリフィスプレート（ＨＤオリフィスプレート）によって１０００ｂａｒの差圧で再懸濁細胞の一部分を破壊する。この場合の流速は３．３Ｌ／分である。一回通過後の細胞破壊液中で得られる生細胞数を表１に列挙する。
【００７２】
実施例４
高圧オリフィスプレート（ＨＤオリフィスプレート）によって１２００ｂａｒの差圧で再懸濁細胞の一部分を破壊する。この場合の流速は３．３Ｌ／分である。一回通過後の細胞破壊液中で得られる生細胞数を表１に列挙する。
【００７３】
実施例５
高圧オリフィスプレート（ＨＤオリフィスプレート）によって１４００ｂａｒの差圧で再懸濁細胞の一部分を破壊する。この場合の流速は３．３Ｌ／分である。一回通過後の細胞破壊液中で得られる生細胞数を表１に列挙する。
【００７４】
実施例６
高圧オリフィスプレート（ＨＤオリフィスプレート）によって１８００ｂａｒの差圧で再懸濁細胞の一部分を破壊する。この場合の流速は３．３Ｌ／分である。一回通過後の細胞破壊液中で得られる生細胞数を表１に列挙する。
【００７５】
実施例７
高圧オリフィスプレート（ＨＤオリフィスプレート）によって２０００ｂａｒの差圧で再懸濁細胞の一部分を破壊する。この場合の流速は３．３Ｌ／分である。一回通過後の細胞破壊液中で得られる生細胞数を表１に列挙する。
【００７６】
実施例８
高圧オリフィスプレート（ＨＤオリフィスプレート）によって２４００ｂａｒの差圧で再懸濁細胞の一部分を破壊する。この場合の流速は３．３Ｌ／分である。一回通過後の細胞破壊液中で得られる生細胞数を表１に列挙する。
【００７７】
この実施例は、高圧オリフィスプレートが、先行技術と比較して、同じ差圧で、顕著に高い破壊度を生じさせることを示す（さらに図２および３を参照のこと）。
【００７８】
実施例９
１０００；１５００および２０００ｂａｒの差圧で７００Ｌ／ｈの流速で高圧オリフィスプレートを使用して細胞懸濁液を破壊し、それぞれの生細胞数を決定する（表２を参照のこと）。２０００ｂａｒの差圧で破壊された細胞ブロスを４００Ｌ／ｈの流速でノズルセパレーターに通す。求められている封入体は濃縮物１（ＤＭ＝１４．８重量％，ｍ＝３４７ｋｇ）中に優先的に蓄積し、一方、細胞残渣は透明な流出液１（ＤＭ＝８．２重量％，ｍ＝５０８ｋｇ）とともに優先的に分離される。５００Ｌの水で濃縮物を調製し、再び４００Ｌ／ｈでノズルセパレーターに通す（＝洗浄ステップ）。求められている封入体は濃縮物２（ＤＭ＝１１重量％，ｍ＝３４３ｋｇ）中に優先的に蓄積し、一方、細胞残渣は透明な流出液２（ＤＭ＝２．９重量％，ｍ＝５０８ｋｇ）とともに優先的に分離される。洗浄ステップを繰り返す。その結果、７．９重量％の乾燥物含量を有する３７０ｋｇのＩＢ（封入体）収量が得られる。この得られた濃縮物をｐＨ１２．５にし、１５分後、ｐＨを９に下げる。中和されたハイドロフォビン含有溶液を固体分離のためにチューブ遠心分離機にかける。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、最終遠心分離後にハイドロフォビンは上清中に存在する。この上清を以後「ハイドロフォビン水溶液」と称する。ハイドロフォビン水溶液の乾燥物含量は３．４重量％である。ハイドロフォビン含有溶液に乾燥助剤としてＤＭ：マンニトール＝１：１の比でマンニトールを加える。Geyrig Gr.0型の２液ノズルを４１ｋｇ／ｈの注入速度で使用してこの溶液を１２００ｋｇ／ｈの窒素中で並流で（im Gleichstrom）スプレーする。スプレータワーは直径８００ｍｍおよび高さ１２ｍを有する。この場合の乾燥ガスの入口温度は１６１ＤＥＧである。乾燥ガスの出口温度は８０ＤＥＧである。フィルターで分離を進め、３１．７ｋｇの乾燥物質を回収する。６．１ｋｇの乾燥物質をタワーから取り出す。再溶解されたハイドロフォビン含有乾燥物質の活性検査から得られる接触角を表２に列挙する。再溶解乾燥物質のタンパク質ゲルを図３に示す。
【表２】
2010500042.tif 000005
【表３】
2010500042.tif 000006
【表４】
2010500042.tif 000007
【図１】
2010500042.tif 000008
【図２】
2010500042.tif 000009
【図３】
2010500042.tif 000010
【国際調査報告】
2010500042.tif 000011
2010500042.tif 000012
2010500042.tif 000013
2010500042.tif 000014
2010500042.tif 000015
2010500042.tif 000016
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2010500042.tif 000019
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