(57)【要約】  本発明は、メタルギジン(ＲＤＤ)のディスインテグリンドメインの全て又は一部、又はその誘導体をコードする配列を、強力なサイトメガロウイルスプロモーターの制御下に含むｐＯＲＴプラスミド、特に配列番号２に示される配列を有するプラスミドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
強力なサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターの制御の下に、メタルギジンのディスインテグリンドメイン、又はその誘導体の全て又は一部をコードする配列を含み、当該配列が挿入されているｐＯＲＴプラスミド。
【請求項２】
配列番号１のメタルギジンのディスインテグリンをコードする配列、又はそのバリアントであって、１若しくは複数のヌクレオチドが、配列番号１から置換、付加、欠失されており、そして配列番号１と少なくとも８０％配列同一性を有し、そしてin vitro及び／又はin vivoにおいて内皮細胞増殖を抑制及び／又は血管新生を抑制する能力を保持するバリアントを含む、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
前記プラスミドが、配列番号２に示される配列を有する、メタルギジンのディスインテグリンドメイン(ＲＤＤ)をコードする配列を含む請求項１又は２に記載のプラスミド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
大腸菌(Excherichia coli)である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
哺乳動物細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、そして培養された宿主細胞からｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを回収することからなるステップを含む、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの生産方法。
【請求項８】
請求項４又は５に記載の宿主細胞を培養することを含み、そして以下のステップ：(ａ)培養された宿主細胞のアルカリ溶解；(ｂ)メッシュバッグろ過；(ｃ)アニオン交換クロマトグラフィー；(ｄ)濃縮；(ｅ)イオン対逆相及びサイズ排除クロマトグラフィー；及び(ｆ)ろ過  のステップにより、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを精製することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項４又は５に記載の宿主細胞から、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを精製する方法であって、当該方法が以下のステップ：(ａ)宿主細胞のアルカリ溶解；(ｂ)メッシュバッグろ過；(ｃ)アニオン交換クロマトグラフィー；(ｄ)濃縮；(ｅ)イオン対逆相及びサイズ排除クロマトグラフィー、及び(ｆ)ろ過を含む、前記方法。
【請求項１０】
哺乳動物細胞において、in vitro又はin vivoでＲＤＤペプチドを発現する方法であって、当該方法が、当該哺乳動物細胞を、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドで形質転換することを含み、それにより当該ＲＤＤペプチドが、哺乳動物細胞で発現される、前記方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物細胞が、腫瘍細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプラスミドを、医薬として許容される担体と供に含む、医薬組成物。
【請求項１３】
腫瘍の治療のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプラスミドの使用。
【請求項１４】
前記プラスミドが、転移腫瘍の予防及び／又は治療を意図する、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記プラスミドが、腫瘍又は筋肉細胞と接触され、そして当該腫瘍又は筋肉が、以下の：
第一に２００〜２０００ボルト／ｃｍの高電圧場(ＨＶ)の少なくとも１回のパルス
第二５０〜２００ボルト／ｃｍの低電圧場(ＬＶ)でかつ３００〜２０００ｍｓの期間の１回のパルス
で電気的に刺激される、請求項１３又は１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記プラスミドが、腫瘍内注射により腫瘍細胞と接触される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記プラスミドが、腫瘍内注射により腫瘍又は筋肉細胞と接触される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＨＶ及びＬＶパルスが、３００ｍｓ〜３０００ｓから構成されるラグにより離されている、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記腫瘍又は筋肉が、以下の：
ＨＶ＝１０００-１６００Ｖ／ｃｍ、５０〜２００μｓ、１回のパルス、１Ｈｚ
中断時間：５００ｍｓ〜１０ｓ
ＬＶ＝１００〜２００Ｖ／ｃｍ、３００〜８００ｍｓ、１回のパルス
にしたがい電気的に刺激される、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
腫瘍細胞増殖において、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドのin vitro阻害効力をアッセイする方法であって、当該方法が以下の：
ａ)  腫瘍細胞株のサブコンフルエント培養物を提供し；
ｂ)ステップａ)の細胞培養物に、本発明に記載のｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの漸増量、又は対照を別々にトランスフェクトし；
ｃ)対照でトランスフェクトされた細胞の増殖を得るのに適している条件下で、ステップｂ)のトランスフェクトされた細胞を培養し；
ｄ)トランスフェクトされたｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの各特定量について、当該特定量のｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドでトランスフェクトを受けたステップａ)に提供される細胞培養物における細胞数と比較して、生存細胞の割合を測定し；
ｅ)  上記対照でトランスフェクトされた細胞について、当該対照でトランスフェクトを受けたステップａ)で提供される細胞培養物中の細胞数を比較して、生存細胞数の割合を測定し；
これにより、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドが、ステップｄ)で計算される生存細胞の割合が、ステップｅ)で計算された生存細胞の割合よりも低い場合、抑制効力を有すると決定される、
からなるステップを含む、前記方法。
【請求項２１】
以下の：
ａ)  -４０℃〜-６０℃でｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの溶液を凍結させ；
ｂ)  ２００〜３００μｂａｒの圧力下で、１０〜２０時間の間、＋５℃〜＋１５℃の温度に温度を増加させることにより行う昇華ステップ
ｃ)  ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドが室温に達するまで２００〜３００μｂａｒで室温で行われ、次に最大２０時間３０〜７０μｂａｒで行われる二次乾燥ステップ
からなるステップを含む、凍結乾燥ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの製造方法。
【請求項２２】
以下のステップ：
ａ)１〜２時間のうちに＋２０℃から-５０℃にしてｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの溶液を凍結させ、そして当該温度を-５０℃で２時間維持し；
ｂ)+１０℃で３時間、次に+１０℃で１２時間２５０μｂａｒの圧力下で行われる昇華ステップ
ｃ)+２０℃で最大２０時間行われる第二次乾燥ステップ
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの溶液が、マンニトール１.９〜２.０ｍｇ／ｍｌ及びグルコース４.８〜４.９ｍｇ／ｍｌを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強力なサイトメガロウイルスプロモーターの制御下におけるメタルギジンのディスインテグリンドメイン(ＲＤＤ)又はその誘導体の全て又は一部をコードする配列を含むｐＯＲＴプラスミド、特に配列番号２に示される配列を有するプラスミドに関する。当該プラスミドは、in vivoで抗腫瘍活性を有し、そうして癌治療用の有望な治療薬を提供する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生、すでに存在する血管からの新しい毛細管の発達、は、原発固形腫瘍の増殖及び進行に必須である。腫瘍内におけるかかる血管新生を抑制することを狙った戦略が、提案されてきた(Folkman, Nat Med 1995; 1: 27 - 31)。抗血管新生治療は、癌を封じ込めるために少なくとも２つの利点を示す：(ａ)  血管新生は、全ての悪性腫瘍に対して共通する現象であることから、広範な癌に対して適用できること；及び(ｂ)  腫瘍血管新生の制限及び退行は、循環器への腫瘍細胞の伝播を抑制し、その結果、転移リスクを低くすることである。
【０００３】
アダマリシン・タンパク質のファミリー(Ａ  ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼプロテイン；(A Disintegrin And Metalloproteinase Protein; ＡＤＡＭｓ))は、メタロプロテイナーゼ・ドメイン上にディスインテグリン・ドメインを含む。ディスインテグリン領域は、インテグリンと相互作用するインテグリン結合領域を含み、そして細胞-細胞相互作用を媒介しうる(Wolfsberg, J Cell Biol 1995; 131: 275-8)。メタルギジン(メタロプロテアーゼ-ＲＧＤ-ディスインテグリン・プロテイン)は、ヒトＡＤＡＭ-１５とも呼ばれ、平滑筋細胞、メサンギウム細胞により発現され、そしてずっと高いレベルで活性化された血管新生内皮細胞により発現される膜貫通アダマリシンである(Kratzschmar ら、J Biol Chem 1996; 271: 4593-6; Ham et al., Exp Cell Res 2002; 279: 239-47; Herren et al., FASEB J 1997; 11: 173-80; Martin et al., J Biol Chem 2002; 277: 33683-9)。
【０００４】
ＡＭＥＰ(抗血管新生メタルギジン・ペプチド)は、メタルギジンの組み換えディスインテグリン(ＲＤＤ)である。ＡＭＥＰペプチドは、ＲＧＤＣインテグリン結合配列を介して、α５β１及びαｖβ３などのインテグリンに結合し(Zhang et al., J Biol Chem 1998; 273: 7345-50; Nath et al., J Cell Sci 1999; 112: 579-87))、これらのインテグリンとメタルギジンの機能が、相互に依存しうるということを示唆する。可溶性組み換えタンパク質として発現されるＡＭＥＰがこの相互作用を抑制するという仮定を元に、血管新生と腫瘍成長についてのＲＤＤの作用の調査をした。
【０００５】
ＲＤＤは、過去にin vitroにおいて、毛細管様構造における内皮細胞増殖、移動、浸潤及び組織化を抑制するということが示されていた。プラスミド中に挿入されたＲＤＤｃＤＮＡは、テトラサイクリン誘導性システムを用いて、マウス骨格筋内に電気的に形質転換された。In vivoにおけるＲＤＤ産生は、トランス遺伝子の電気的導入の１４日後、そしてドキシサイクリンにより誘導した後に、ヒト哺乳動物ＭＤＡ-ＭＢ-２３１腫瘍増殖を７８％抑制した。この抗腫瘍効果は、有意に低い腫瘍血管新生を伴った。さらに、ＲＤＤの存在下において、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ転移は、治療後１週間後に７４％マウス肺において抑制された(Trochon-Joseph et al., Cancer Res 2004; 64: 2062-2069)。
【０００６】
しかしながら、このテトラサイクリンによる誘導性システムは、３のプラスミド(ｐＢｉ-ＲＤＤプラスミド、並びにＴｅｔ-Ｏｎ及びＴｅｔ-ｔＴＳベクター)のコトランスフェクションを必要とし、そして続いてドキシサイクリンの投与を必要とする。したがって、in vivoにおいてＲＤＤｃＤＮＡを発現する単純かつ効果的な方法の開発がさらに考慮された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
最初の試みは、トランス遺伝子、及びカナマイシン抵抗性遺伝子の構成的発現をもたらすヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターを含むｐＶＡＸプラスミド(Invitrogen, V260-20)を用いて行われた。しかしながら、このベクターは、トランス遺伝子発現及びin vitro抗増殖活性の点で十分に満足行く結果を達成することはなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＲＤＤ ｃＤＮＡは、さらにプラスミド中にクローン化され、全ての抗生物質抵抗性物質を取り去り、ヒトにおける臨床適用に特化させ、Cobra Biomanufacturingにより提供された：ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド。この新たなプラスミドは、強力な構成的プロモーター(ＣＭＶ-イントロンＡ)、ヒト分泌シグナル(ヒトウロキナーゼｕＰＡシグナル)、免疫刺激性ＣｐＧ配列の数を低下させること(ｐＯＲＴ-ＲＤＤにおいて１５０個)、小さいサイズ及び高コピー数により特徴付けられる。ｐＯＲＴ-ＲＤＤベクターは、予期しなかったことであるが、in vitroにおいてＲＤＤトランス遺伝子の高い発現レベルを達成し、強力な抗増殖活性を伴うことが発見された。メラノーマの動物モデルについての抗転移活性を示すさらなる実験が行われた。
【発明の効果】
【０００９】
したがって、ｐＯＲＴ-ＲＤＤベクターは、癌及び転移の抗血管新生治療について見込みある治療を提供する。全ての抗生物質抵抗性遺伝子を欠いているので、このベクターは、遺伝子導入医薬の臨床態様に関する将来のガイドラインの点でも特に適したものである(ガイドラインEMEA CPMP/BWP/3088/99； Directive 2001/18/CE)。
【００１０】
定義
「メタルギジン」は、ヒトメタロプロテアーゼ-ＲＧＤ-ディスインテグリンタンパク質を指し、ＭＤＣ-１５又はＡＤＡＭ-１５とも呼ばれる。メタルギジンのクローニングは、Kratzschmar et al.(J Biol Chem 1996; 271: 4593-6)により記載された。
【００１１】
「ＲＤＤ」は、ヒトメタルギジンのディスインテグリンドメインを指す。ＲＤＤのｃＤＮＡ配列は、添付の配列表に配列番号１で示されている。「ＡＭＥＰ」つまり「抗血管新生メタルギジンペプチド」は、組換えＲＤＤペプチドを指す。
【００１２】
語句「誘導体」は、野生型ＲＤＤの生物学的活性を保持する限り、例えばin vitro及び／又はin vivoにおいて内皮細胞増殖の抑制及び／又は血管新生の抑制を保つ限り、１又は複数のヌクレオチドが、上記配列から置換、付加、又は欠失されているＲＤＤのｃＤＮＡ配列のバリアントを意味する。かかるバリアントが、上記ｃＤＮＡ配列(配列番号１)に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の同一性を有する配列を有する。
【００１３】
内皮細胞増殖の抑制は、例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)を、ＲＤＤ誘導体の断片量を漸増させた状況下で、又はその非存在下で、例えば９６時間培養することにより、そして細胞増殖アッセイを行って、細胞増殖の抑制を定量することにより、アッセイすることができる。細胞増殖は、当業者に知られている任意の適切な方法、例えばＭＴＴアッセイ(例えば細胞増殖キットＩ、Roche Diagnostics, Germany)を用いることにより評価することもできる。
【００１４】
血管新生の抑制は、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌなどの支持マトリクス上で培養された内皮細胞による血管様構造の形成をアッセイすることにより評価することもできる。
【００１５】
「ペプチド」という語句は、ジペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチドを意味し、つまりモノマーがアミド結合を介して結合されたアミノ酸残基であるポリマー(長さに拠らない)を意味する。
【００１６】
「プラスミド」は、細胞外染色体二本鎖ＤＮＡ(ｄｓＤＮＡ)分子であって、その宿主、例えば細菌内において自己複製可能である分子である。本明細書に使用される場合、「ベクター」と「プラスミド」という語句は、宿主を形質転換し、そしてＲＤＤ配列の発現を促進するため、ＲＤＤ・ｃＤＮＡ配列を宿主細胞へと導入するビヒクルを指す。
【００１７】
「ｐＯＲＴプラスミド」は、トランスで発現されるリプレッサーによって、結合される傾向を有するオペレーターを含むプラスミドを指す。当該オペレーターは、例えば、ｌａｃ  オペレーター、Ａオペレーター、ｔｒｐオペレーター、ｇａｌオペレーター、ａｒａオペレーター、Ａｒｇオペレーター、及びＴｅｔオペレーターであってもよい。ｐＯＲＴプラスミドは、Williams et al., Nucleic Acids Res. 1998 May 1; 26 (9): 2120-4; Cranenburgh et al., Nucleic Acids Res. 2001 Mar 1; 29 (5): E26; Cranenburgh et al., J Mol Microbiol Biotechnol. 2004; 7 (4): 197-203、並びに国際特許出願ＷＯ９７／０９４３５に記載された。
【００１８】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド及びその生成
ＯＲＴ(商標)技術は、宿主の選択可能マーカーを活性化させるプラスミド媒介性のリプレッサーを使用して、プラスミドが有するマーカー遺伝子に対する必要性を除くものでる。一例として、細菌株は、ｌａｃオペレーター／プロモーター(ｌａｃＯ／Ｐ)の転写制御の下で、ｄａｐなどの必須遺伝子を含む細菌株が作成された。ラクトースなどのインデューサーがない状態では、この株は、ＬａｃＩリプレッサーがｌａｃＯ／Ｐに結合することによるｄａｐＤ発現の抑制のために、増殖することができない。ｌａｃオペレーター(ｌａｃＯ)を含む高コピー数のプラスミドの形質転換は、オペレーターからＬａｃＩを滴定(titration)することによりｄａｐＤ発現を効果的に誘導する。必須遺伝子を制御することにより、細菌増殖およびｌａｃＯ及び複製起点を含む組換えプラスミドの維持が保障される(Williams et al, Nucleic Acids Res. 1998 May 1; 26 (9): 2120-4; Cranenburgh et al., Nucleic Acids Res. 2001 Mar 1; 29 (5): E26; Cranenburgh et al., J Mol Microbiol Biotechnol. 2004; 7(4): 197-203)。
【００１９】
ＲＤＤ遺伝子をコードする発現プラスミド、ｐＯＲＴ-ＲＤＤが設計された。より具体的に、ヒトウロキナーゼ分泌シグナルにより駆動されるＲＤＤ遺伝子を含む発現カセットが、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ、つまり強力な真核細胞構成的プロモーター(ＣＭＶ-イントロンＡ)を含むＯＲＴ(商標)プラスミドに挿入された。ＲＤＤ発現カセットは、こうして強力なサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターの制御下にあり、そしてウシ成長ホルモン(ｂＧＨ)ポリアデニル化シグナルの上流に配置される。ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの配列は、配列番号２に示される。
【００２０】
こうして、本発明は、メタルギジンのディスインテグリンドメイン又はその誘導体の全て又は一部をコードする配列を含むｐＯＲＴプラスミドに関し、ここで当該配列は、強力なサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターの制御下に挿入される。
【００２１】
特に、ｐＯＲＴプラスミドは、配列番号１の配列のメタルギジンのディスインテグリンドメイン、又はそのバリアントをコードする配列を含むことがある。ここでバリアントは、配列番号１から１又は複数のヌクレオチドが置換、付加、欠失されており、そして配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつin vitro及び／又はin vivoにおいて内皮細胞の増殖を抑制する能力及び／又は血管新生の抑制を維持するものである。
【００２２】
本発明のプラスミドは、メタルギジンのディスインテグリンドメインの「部分」を含むこともある。このような場合、メタルギジンのディスインテグリンドメインの部分(当該部分は、「フラグメント」と呼ばれても良い)は、野生型ＲＤＤの生物学的活性(例えば、in vitro及び／又はin vivoにおける内皮細胞増殖の抑制及び／又は血管新生の抑制)を保持する。特に、メタルギジンのディスインテグリンドメイン(ＲＤＤ)をコードする配列を含むプラスミドは、配列番号２で示される配列を有することがある。
【００２３】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドとも呼ばれる当該プラスミドは、任意の適切な方法、特に組換えＤＮＡ技術、に従って産生することができる。例えば、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドは、細菌宿主細胞などの適切な宿主細胞、特に大腸菌(Escherichia coli)、さらにより具体的には、ｌａｃオペレーター／プロモーター(ｌａｃＯ／Ｐ)の転写制御下で、ｄａｐＤなどの必須染色体遺伝子を含むように遺伝子操作された大腸菌中で増幅することができる。
【００２４】
さらに、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドは、適切な宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞、特に腫瘍細胞、にトランスフェクションされた場合に、ＲＤＤペプチドを発現することを可能にする発現プラスミドである。
【００２５】
こうして、本発明はさらに、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドで形質転換された宿主細胞を提供する。「宿主細胞」という語句は、任意の生物の任意の細胞であって、当該細胞による物質の産生のため、例えば当該細胞によるｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドによる増幅、又は当該細胞によるＲＤＤペプチドの発現のために、如何様にも選択、改変、形質転換、成長、又は使用又は操作される細胞を意味する。
【００２６】
宿主細胞中へのｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドのex vivo又はin vivoでの導入は、当業者により周知の標準的な方法により、例えばトランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃又はリポフェクションにより行われてもよい。
【００２７】
本発明はさらに、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを産生する方法であって、以下のステップ：ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドで形質転換された宿主細胞を培養し、そしてｂ)培養された宿主細胞からｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを回収することからなるステップを含む方法を提供する。
【００２８】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを産生及び増幅するため、Cranenburgh et al.(Nucleic Acids Res. 2001 Mar 1; 29 (5): E26)により記載される大腸菌ＤＨ１株、つまりｌａｃオペレーター／プロモーターの制御下でｄａｐＤ染色体遺伝子を含む株から作られる。これらの株は、Ｃｏｂｒａ-Ｂｉｏ-manufacturingから市販されている。形質転換された宿主細胞は、容易に単離され、そして増殖させることができる。なぜなら、ＩＰＴＧ(当該薬剤はｄａｐＤの発現を誘導する)又はＤＡＰを添加した培地中で培養されない限り、リプレッサー滴定選択によって形質転換体のみが任意の培地で増殖することができるからである。
【００２９】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドは、例えば、適切な培養媒体、例えばＬＢ培地(つまり、ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ)に、形質転換ＯＲＴ-株で植菌して、そして培養することにより、当業者が容易に製造することができる。研究室スケールでは、培養は、３７℃でインキュベートし、好ましくは振盪することにより(例えば２００ｒｐｍ)慣用される研究室フラスコ中で行うことができる。
【００３０】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドは、発酵機の中で大規模で製造することもできる。利点として、発酵は、Varleyら(Bioseparation. 1999; 8 (1-5): 209-17)により記載されるプロトコルにしたがって行うことができるか、又はその適用にしたがって行われてもよい。発酵を行うための適切な培養培地は、３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、６ｇ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4、０.５ｇ／ｌのＮａＣｌ、０.２％のポリプロピレングリコールＭＷ２０２５ｇ、微量元素溶液、０.０３ｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０.０４ｇ／ｌのＦｅＳＯ4７Ｈ2Ｏ、０.０２ｇ／ｌのクエン酸、及び０.５ｇ／ｌのＭｇＳＯ4、ビタミン溶液、１２ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む。培地はさらに、２g／ｌのペプトン、２０ｇ／ｌの酵母抽出物、１０ｇ／ｌの(ＮＨ4)2ＳＯ4、２.８％のグリセロールを含む。あるいは、ペプトン、酵母抽出物、(ＮＨ4)2ＳＯ4及びグリセロールは、発酵容器に連続して与えられても良い。発酵は、好ましくは３７℃、ｐＨ６.８で、設定点５０％の空気飽和溶解酸素で行われる。
【００３１】
通常、培養回収物を遠心して、細胞をペレット化する。細胞ペレットを次に凍結させ、そして精製前に-７０℃で貯蔵した。
【００３２】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを精製する適切な方法の選択は、当業者の通常技術の範囲内である。
【００３３】
好ましくは、精製は、以下のステップ：(ａ)培養された宿主細胞をアルカリ溶解し、次に中和し；(ｂ)メッシュバッグろ過し；(ｃ)アニオン交換クロマトグラフィーをし；(ｄ)濃縮し；(ｅ)イオン対逆相及びサイズ排除クロマトグラフィーを行い；そして(ｆ)ろ過することにより達成されてもよい。
【００３４】
したがって、本発明は、さらに、以下の：
ａ)ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドで形質転換された宿主細胞を培養し；
ｂ)培養された宿主細胞から、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを回収し；
ｃ)(ｉ)培養された宿主細胞をアルカリ溶解して中和し；(ｉｉ)メッシュバッグろ過し；(ｉｉｉ)アニオン交換クロマトグラフィーをし；(ｉｖ)濃縮／限外ろ過し；(ｖ)イオン対逆相及びサイズ排除クロマトグラフィーを行い；そして(ｖｉ)ろ過することにより、当該ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを精製する
からなるステップを含む、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの製造方法を提供する。
【００３５】
本発明は、形質転換された宿主細胞からｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを精製する方法であって、以下の：(ａ)宿主細胞をアルカリ溶解し、続いて中和し；(ｂ)メッシュバッグろ過し；(ｃ)アニオン交換クロマトグラフィーをし；(ｄ)濃縮し；(ｅ)イオン対逆相及びサイズ排除クロマトグラフィーを行い；そして(ｆ)ろ過するを含むステップを含む。
【００３６】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの製造及び／又は精製方法がさらに、以下の実施例１に詳細に記載されている。
【００３７】
宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、本発明はさらに、細胞においてin vitroで又はin vivoでＲＤＤペプチドを発現させる方法を提供する。当該方法は、当該細胞をｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドで形質転換し、それにより当該ＲＤＤペプチド(又はＡＭＥＰ,なぜならこれは組換えＲＤＤペプチドだからである)が細胞内で発現される。哺乳動物細胞は、特に腫瘍細胞である。
【００３８】
ＲＤＤペプチドの発現は、例えば癌において血管新生活性が抑制される状況下で、適用を見出すことができる。さらに、本発明者は、in vitroでＲＤＤペプチドが直接的な抗腫瘍活性を示すということを思いがけなく示した。特に、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドが、プラスミドでトランスフェクションされたメラノーマ細胞の培養物中で、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドが、腫瘍細胞増殖を抑制することを示した。治療適用が以下にさらに詳述される。
【００３９】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドバッチの特徴決定のためのin vitro効力アッセイ
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの様々なバッチの効力を比較又は標準化することを可能にするために、in vitroでｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの効力をアッセイする方法が、本発明者により開発された。本発明はこうして、腫瘍細胞増殖についてのｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド抑制効力をアッセイするin vitro方法であって、以下の：
(ａ)  腫瘍細胞株のサブコンフルエント培養物を提供し；
(ｂ)  ステップａ)の細胞培養物を、別々に、本発明のｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの漸増量、又は対照でトランスフェクトし；
(ｃ)  ステップｂ)のトランスフェクトされた細胞を、対照でトランスフェクトされた細胞の増殖を得るのに適している条件下で培養し；
(ｄ)  ある量のトランスフェクトされたｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの各々について、ある量のｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドのトランスフェクションに供されたステップａ)で得られた細胞培養物中の細胞数に比較して、生存細胞の割合を測定し；
(ｅ)  対照でトランスフェクトされた細胞について、対照のトランスフェクションに供されたステップａ)で得られた細胞培養物中の細胞数に比べて、生存細胞の割合を測定する
からなるステップを含む方法を提供する。ここで、ステップｄ)で培養された生存細胞の割合が、ステップｅ)で計算された生存細胞の割合よりも低い場合に、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドが抑制効力を有すると決定される。
【００４０】
本発明の方法に従って用いられうる腫瘍細胞株は、特にメラノーマ細胞、例えばＢ１６Ｆ１０細胞、Ｃ９細胞、又は４５１Ｌｕ細胞であってもよい。
【００４１】
好ましくは、腫瘍細胞株の培養物は、５０〜８０％コンフルエント、より好ましくは５０％コンフルエントで提供される。腫瘍細胞株のサブコンフルエント培養物は、例えば、２４ウェルプレートの１ウェルあたり１５０００個のＢ１６Ｆ１０細胞、又は３００００個のＣ９細胞、又は３００００個の４５１Ｌｕ細胞を播種することにより調製することができる。
【００４２】
トランスフェクトに用いられうるｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの漸増量は、当業者により容易に決定することができる。例えば、０.１〜２.０μｇのｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの範囲の量は、１５０００個のＢ１６Ｆ１０細胞、又は３００００個のＣ９細胞、又は３００００個の４５１Ｌｕ細胞をトランスフェクトするために使用することができる。
【００４３】
In vitroトランスフェクションの割合は、リポフェクションにより、例えばインビトロゲンから市販されているＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）及びＰｌｕｓ(商標)試薬を用いることにより改善することができる。
【００４４】
本発明の方法では、「対照」は、対照でない場合、様々な量のｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを含んで、細胞をトランスフェクトするために用いられるトランスフェクション混合物である。対照は、任意のプラスミドを欠いているものである。
【００４５】
トランスフェクションは、典型的に、例えばリポフェクション用の試薬、及びプラスミドＤＮＡ(対照)を含まないか、又は様々な量のプラスミドＤＮＡを含む無血清培地中で、３７℃５％ＣＯ2でインキュベートすることにより行うことができる。
【００４６】
次に細胞を古典的方法で培養し、つまり、完全培地(つまり細胞増殖を支える培地)中で３７℃、５％ＣＯ2で例えば７２〜１２０時間、好ましくは９６時間培養した。
【００４７】
細胞の生存性を、当業者に知られている任意の適切な方法により、例えばＭＴＴ(３-１４,５-ジメチルチアゾール-２-イル)-２,５-ジュイフェニルテトラゾリウム・ブロミド)試薬又はトリパンブルーを用いて、培養期間の最後に評価する。
【００４８】
バッチを比較する目的で、細胞生存性の決定された割合は、図１２〜１４に示されるようにトランスフェクトされたプラスミドＤＮＡの量の関数として生存細胞の割合としてプロットすることができる。
【００４９】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの凍結乾燥
本発明は、凍結乾燥されたｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの製造方法であって、以下の：
ａ)ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの溶液を-４０℃〜-６０℃で凍結し；
ｂ)２００〜３００μｂａｒの圧力下で、１０〜２０時間、+５℃〜+１５℃の温度に増加させることにより昇華させ；そして
ｃ)ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドが室温(＋２０℃)に達するまで２００〜３００μｂａｒ、次に３０〜７０μｂａｒで室温、好ましくは+２０℃で、最大２０時間行われる第二次乾燥ステップ
からなるステップを含む。
【００５０】
凍結ステップは、ｐＯＲＴ-ＲＤＤ溶液の温度を室温(特に+２０℃)から-４０℃〜-６０℃に１〜２時間で減少させ、そして温度を２時間維持することにより行うことができる。好ましくは、凍結ステップは、-５０℃以下の温度で行われる。
【００５１】
昇華ステップは、好ましくは、-５０℃〜＋１０℃で３時間、そして＋１０℃(tab le temperature)で１２時間２５０μｂａｒの圧力下で行われる。
【００５２】
二次乾燥は、好ましくは５０μｂａｒで、＋２０℃で最大２０時間行われる。
【００５３】
好ましい態様では、マンニトール及びグルコースが、凍結乾燥法の途中に凍結保護剤として使用されてもよい。したがって、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドは、マンニトール及びグルコースを含むよう液中で剤形することができる。
【００５４】
例えば２％のマンニトール(１００ｍｇ／ｍｌ)及び１％グルコース(５００ｍｇ／ｍｌ)(％は、プラスミド溶液の体積に対するマンニトール又はグルコース溶液の体積として表される)は、ｐＯＲＴ-ｒＤＤプラスミド溶液、特に凍結前に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡｐＨ７.５に剤形されたｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの溶液中に加えられうる。
【００５５】
それゆえ、凍結に付されるｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド溶液は、好ましくは１.９〜２.０ｍｇ／ｍｌのマンニトールと４.８〜４.９ｍｇ／ｍｌのグルコースを含む。
【００５６】
医薬組成物及び治療適用
本発明は、腫瘍の治療を意図した医薬の製造のための、pＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの使用をさらに提供する。
【００５７】
本発明は、腫瘍の治療のためのｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの使用にも関する。
【００５８】
治療を必要とする対象に、治療有効量のｐＯＲＴ-ＲＤＤを投与することを含む腫瘍の治療方法が提供される。
【００５９】
本発明の文脈では、「治療する」又は「治療」は、かかる用語が適用される疾患又は状態、あるいはかかる疾患又は状態の１又は複数の徴候を回復、軽減、進行の抑制、又は予防することを意味する。
【００６０】
「治療有効量」は、受益者において、特に癌治療の点で、有益な結果をもたらすために有効な量である。このような量は、刊行物を参照することにより、in vitro試験を行うことにより、又は健康な実験動物において代謝試験を行うことによりはじめに決定することができる。
【００６１】
本明細書に使用される場合、「対象」は、げっ歯類、ネコ科、イヌ科、及び霊長類などの哺乳動物を指す。好ましくは本発明に記載の対象はヒトである。
【００６２】
ＲＤＤペプチドは、抗血管新生活性を有するので、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドでの治療は、幅広い癌において適用が見出される可能性があり、そして腫瘍細胞が循環器へと通過することを予防する可能性、つまり転移の発生及び／又は発達を予防する可能性がある。
【００６３】
本発明によると、腫瘍は、任意の腫瘍、例えば原発又は転移腫瘍、固形腫瘍又は軟組織腫瘍、又は血液悪性腫瘍であってもよい。実際、血管新生が、血液悪性腫瘍において重要な役割を果たすことが多くの証拠により示されている(Dong et al., Crit Rev Oncol Hematol. 2006 Dec 21)。固形又は軟腫瘍の例として、膀胱癌、乳癌、骨癌、脳癌、子宮頸癌、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、神経系癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、及び皮膚癌、特にメラノーマが挙げられる。血液悪性腫瘍としては、例えば、急性又は慢性白血病、例えば急性骨髄白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄白血病、又は慢性リンパ球性白血病；リンパ腫；多発性骨髄腫；及び骨髄異形成症候群が挙げられる。
【００６４】
ある実施態様によると、本発明に記載の医薬、プラスミド、又は治療方法は、転移性腫瘍の予防及び／又は治療を意図する。
【００６５】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを単独で投与することが可能である一方で、ｐＯＲＴ-  ＲＤＤを医薬組成物とすることが好ましい。
【００６６】
したがって、本発明は、ｐＯＲＤ-ＲＤＤプラスミドを、医薬として許容される担体と併せて含む医薬組成物をさらに提供する。
【００６７】
本明細書において使用されるように、「医薬として許容される」という語句、並びにその文法的に変えたもの、組成物について言及する場合は、ビヒクル、担体、希釈剤、及び試薬は、互換性を持って用いられ、そして当該物質が、不所望の生理的効果、例えば悪心、眩暈、異常高進などをもたらすことなく患者に投与することができる物質を指すことを意味する。当該技術分野において知られている適切な医薬として許容される担体は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース、緩衝溶液を含むがそれらに限られるわけではない。担体は、希釈液、安定剤(すなわち、糖類及びアミノ酸類)、保存料、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、増粘剤、着色剤などの助剤含むがそれらに限られるわけではない。
【００６８】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを含む医薬組成物は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、腟内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、膀胱内、粘膜内、心膜内、経口的、局所的、局所的に、及び／又はエアロゾルを用いて、注射、輸液、持続点滴、直接又はカテーテル及び／又はラバージ(lavage)を介して標的細胞を局所的に洗浄することにより投与することができる。例えば、本発明のｐＯＲＴ-ＲＤＤ組成物は、非経口投与用に剤形されても、例えば静脈内、筋中、又は皮下経路を介して注射するために剤形されてもよいが、エアロゾル投与などの他の経路が使用されてもよい。本発明のｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド及び／又は活性成分などの追加薬剤を含む水性組成物の調製は、本開示の範囲で当業者に知られている。例えばRemington's Pharmaceutical Science, 16th Ed. Mack Publishing Companyにより例示される。
【００６９】
典型的に、かかる組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして注射液として調製され；注射前に液体を加えて溶液又は懸濁液を調製するのに適している固体形態として調製することもできる。調製品は乳化されていてもよい。特に、医薬組成物は、固体剤形、例えばカプセル、錠剤、ピル、粉末、ドラッジー又は顆粒の形態で剤形されてもよい。滅菌注射溶液は、必要に応じて、上で列挙された様々なほかの成分を加えた適切な溶媒中に必要量のプラスミドを取り込み、続いて滅菌ろ過することにより調製した。液体媒体は、必要に応じて適切に緩衝化すべきであり、そして液体希釈液は、先ず注射前に十分な生理食塩水又はグルコースで等張にすべきである。直接注射用の高濃度組成物の調製も意図されており、ここでＤＭＳＯを溶媒として用いることは、かなり早い浸透をもたらし、高濃度の活性剤を小さな領域にデリバリーすることが意図されている。組成物は、滅菌され、容易な注入可能性が存在する程度に液状であり、製造及び貯蔵の条件下で安定であり、そして微生物の汚染作用に対して保存されている。注射可能組成物を製造するために使用可能な適切な溶媒の例として、１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７.５、又は生理食塩水(ＮａＣｌ０.９％)が挙げられる。
【００７０】
製剤は、薬学分野における任意の周知方法により、単位投与形態に調製することができる。このような方法は、１又は複数の補助成分から構成される担体と、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを組み合わせるステップを含む。一般的に、製剤は、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを、液体担体又は細かく分割された固体単体、又はその両方と均一かつ緊密に組み合わせ、必要に応じて製品を成形することにより調製される。
【００７１】
対象に投与するための本発明のｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド組成物の実際の投与量は、肉体的及び生理的要因、例えば体重、腫瘍体積、病状の重篤度、対象の特発性疾患、及び投与経路により決定することができる。これらを考慮に入れて、特定の対象用の脂質組成物の投与、及び／又は治療コースは、容易に決定することができる。
【００７２】
治療は、治療される対象、そして特定の投与様式に応じて変化することもある。例えば、本発明において、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの用量範囲は、約０.０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重でありうる。「体重」は、動物が治療される場合に適用可能である。単離細胞が処理される場合、ここで用いられる「体重」は、「合計細胞重量」と読むべきである。「合計重量」という語句は、単離細胞と動物治療の両方に適用するように用いることができる。しかしながら、当業者においては、様々な用量範囲、例えば０.０５ｍｇ／ｋｇ体重〜３００ｍｇ／ｋｇ体重、０.１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、０.２ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、又は０.５ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重が用いられることを認識されたい。好ましい用量レジメンは、０.１〜１ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。もちろん、これらの用量の全ては例示であり、そしてこれらの点の任意の用量が本発明において使用されることを意図する。任意の特定対象の特定用量レベルは、体重、全身健康、性別、食事、投与時間及び投与経路、吸収割合及び排出割合、他の薬剤との組み合わせ、及び治療される特定癌の重篤度を含む様々な要因に依存するであろう。
【００７３】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの任意の適切な投与様式が、当業者により用いられることもある。このような方法として、注射、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、エレクトロトランスファー（electrotransfer）、ジェット-注射、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ-デキストランに続きポリエチレングリコールを用いること、直接的な超音波充填(direct sonic loading),リポソーム媒介性トランスフェクション、受容体媒介性トランスフェクション、マイクロ発射照射(microprojectile bombardment)、二酸化ケイ素ファイバーを用いたアジテーション、ＰＥＧ-媒介性プロトプラスト形質転換、乾燥／抑制媒介性ＤＮＡ取り込み、又はこのような方法の任意の組み合わせによりプラスミドを直接デリバリーすることを含むが、これらに限られない。好ましくはｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドは、以下に記載されるエレクトロトランスファーにより投与される。
【００７４】
エレクトロトランスファー・プロトコル
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを、皮下腫瘍を有しているマウスに腫瘍内又は筋肉内エレクトロトランスファーすることにより成功裏に投与した。そうして、本発明は、エレクトロトランスファー、特に腫瘍内及び／又は筋肉内エレクトロトランスファーにより、腫瘍を治療するためのｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの使用に関する。
【００７５】
本発明は、さらに、in vivoで腫瘍細胞にエレクトロトランスファーされることを意図する医薬の製造のための当該ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの使用もさらに提供する。本発明は、in vivoで腫瘍細胞にエレクトロトランスファーするためのｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの使用にも関する。
【００７６】
投与するプラスミドは、当該技術分野に知られている任意の適切な方法に従って、エレクトロトランスファーすることができる。
【００７７】
好都合なことに、エレクトロトランスファーは、国際特許出願PCT/IB2006/002401号に記載されるプロトコルにしたがって行うことができる。
【００７８】
本プロトコルにしたがうと、当該プラスミド又は医薬は、腫瘍又は筋細胞と接触され、そして腫瘍又は筋肉は、以下のように電気的に刺激される：
第一に、２００〜２０００ボルト／ｃｍの高電界強度(ＨＶ)の少なくとも１回のパルスを与え；
第二に、５０〜２００ボルト／ｃｍで、３００〜２０００ｍｓの低い電解強度(ＬＶ)の一回のパルスを与える。
【００７９】
プラスミドは、ＨＶパルスを適用する前に数秒〜１０分間、例えば３０秒〜５分、腫瘍又は筋細胞と接触されてもよい。
【００８０】
筋肉内エレクトロトランスファーは、エレクトロトランスファー用電極を近づけることができる筋肉、つまり体の表面にある筋肉において好ましくは行われる。
【００８１】
プラスミドは、直接腫瘍内注射を介して、全身投与を介して(例えば、静脈内又は動脈内経路)を介して、或いは局所若しくは皮下投与により、接触指せれられてもよい。
【００８２】
特に、腫瘍又は筋肉組織は、４００〜２０００ボルト／ｃｍ、好ましくは６００〜２０００、好ましくは８００〜１６００ボルト／ｃｍ、より好ましくは９００〜１２００、典型的には約１０００ボルト／ｃｍのＨＶ電解強度の少なくとも１回のパルスで電気的に刺激することができ、ＨＶパルスは、１０〜１０００μｓ、好ましくは５０〜２００μｓ、典型的に約１００μｓの範囲を有していてもよい。
【００８３】
幾回のＨＶパルス、本明細書に開示される特徴を有するつまり２〜１０回のＨＶパルスが存在してもよい。この場合、同一ＨＶパルスを有することがより都合がよい。ＨＶパルスの振動数は１Ｈｚでありうる。しかしながら、上に記載されるように１回のＨＶパルスは、細胞膜を浸透させるために十分である。その結果、好ましい実施態様では、１回のＨＶパルスが使用される。
【００８４】
一回のＨＶパルスが存在する場合、好ましくは、二乗パルス(a squared pulse)である。数回のＨＶパルスの場合、単極性パルス又は双極性パルスを用いることができるし、又は異なる方向及び／又は極性、好ましくは二乗型のパルスを使用することができる。
【００８５】
ある実施態様によると、ＨＶ電界強度の少なくとも１のパルスは、１回のパルス(ＨＶ＝１５００Ｖ／ｃｍ、１００μｓ、１Ｈｚ)からなる。
【００８６】
ＨＶ及びＬＶパルスは、ラグにより分離されていてもよく、そしてこのラグは、３００ｍｓ〜３０００ｓであることが都合よく、好ましくは５００ｍｓ〜１０００ｓ、好ましくは５００ｍｓ〜１０００ｓ、好ましくは５００ｍｓ〜１０ｓ、一般的には約１０００ｍｓでありうる。特定の実施態様では、ラグが全くないか、又は短いラグ、つまり３００ｍｓ未満があり、そしてＨＶパルスは、３００〜１０００ボルト／ｃｍ、好ましくは４００〜８００ボルト／ｃｍを有する。
【００８７】
一回のＬＶパルスは、１００〜２００ボルト／ｃｍ、好ましくは１２０〜１６０ボルト／ｃｍ、典型的に約１４０ボルト／ｃｍの電場強度を有することがある。一回のＬＶパルスは、３００〜８００ｍｓ、好ましくは３５０〜６００ｍｓの期間を有してもよく、典型的には約４００ｍｓである。
【００８８】
ＬＶパルスは、ＨＶパルスと同一の極性であってもよいし、又はＨＶパルスと反対の極性を有していてもよい。好ましくは一回のＬＶパルスは、二乗パルスである。パルスは、台形のパルスであってもよいし、又は不連続パルスであってもよい。
【００８９】
当該実施態様にしたがうと、ＬＶパルスは、１４０Ｖ／ｃｍの電場強度を有し、そして４００ｍｓ続く。
本発明にしたがって実行することができる好ましいエレクトロトランスファープロトコルは以下の：
ＨＶ：１０００〜１６００Ｖ／ｃｍ、５０〜２００μｓ、１パルス、１Ｈｚ
中断期間：５００ｍｓ〜１０ｓ
ＬＶ＝１００〜２００Ｖ／Ｃｍ、３００〜８００ｍｓ、１パルス
である。
【００９０】
好ましくは、以下のエレクトロトランスファープロトコルが使用されてもよい：
ＨＶ＝１３００Ｖ／ｃｍ、１００μｓ、１Ｈｚ、１パルス
中断期間：１０００ｍｓ
ＬＶ＝１４０Ｖ／ｃｍ、４００ｍｓ、１パルス。
【００９１】
或いは、好ましくは以下のエレクトロトランスファープロトコルが使用されてもよい：
ＨＶ＝１５００Ｖ／Ｃｍ、１００μｓ、１Ｈｚ、１パルス
中断期間：１０００ｍｓ
ＬＶ＝１４０Ｖ／Ｃｍ、４００ｍｓ、１パルス。
【００９２】
本発明は、添付の図面及び以下に記載する実施例を参照してさらに例示されよう。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶプラスミドのマップである。
【図２】図２は、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドのマップである。
【図３】図３は、ｐＶＡＸ１プラスミドのマップである。
【図４】図４は、ｐＯＲＴ-に基づくベクターを腫瘍内にエレクトロトランスファーした後の１４日間のＢ１６Ｆ１０皮下腫瘍の腫瘍増殖を示す。腫瘍体積が＞３０ｍｍ3となった際に、５０μｇのプラスミド(５０μｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.９％ＮａＣｌ、ｐＨ７.５)を注射し、そして電気パルスを適用した(０日目)。各群についてデータは、腫瘍体積を表す(平均±ＳＤ)(０日目では、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ：ｎ＝１０(実験の間に１匹が自然死した)、及びｐＯＲＴ-ＲＤＤ：ｎ＝１１(実験の間に２匹が自然死した)；１４日では各群についてｎ＝９)。星は、統計的有意差を示す。
【図５】図５は、ｐＯＲＴ-に基づくベクターを腫瘍内エレクトロトランスファーした後の、最初の７日間におけるＢ１６Ｆ１０皮下腫瘍の腫瘍増殖を表す。各群について、データは、腫瘍体積(平均±ＳＤ)を表す。星は統計的有意差を示す。
【図６】図６は、ｐＯＲＴ-に基づくベクターを腫瘍内エレクトロトランスファーすることにより治療された小さいＢ１６Ｆ１０皮下腫瘍について、腫瘍体積モニタリング(ｍｍ3)の分析を示す。腫瘍体積は、０日目に３３.５１〜６５.４５ｍｍ3から構成された。各群について、データは腫瘍体積(平均±ＳＤ)を示す。死亡したマウスはこのグラフからは除いた：ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ ｎ＝６及びｐＯＲＴ-ＲＤＤ ｎ＝７.統計的有意差はなかった。
【図７】図７は、ｐＯＲＴに基づくベクターの腫瘍内エレクトロトランスファーにより治療される小さいＢ１６Ｆ１０皮下腫瘍についてのＶ／Ｖ０日により表される腫瘍モニタリング分析を示す。Ｖ／Ｖ０は、０日目の腫瘍体積と、Ｄ日目の腫瘍体積との間における比を示す。各群について腫瘍比(平均±ＳＤ)を表す。死亡したマウスはこのグラフからは除いた。ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ ｎ＝６及びｐＯＲＴ-ＲＤＤ ｎ＝７であった。星は、統計的有意差を示した。
【図８】図８は、漸増用量のｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを腫瘍内エレクトロトランスファー下の地のＢ１６Ｆ１０皮下腫瘍の腫瘍増殖の分析を示す。腫瘍体積が３０〜５０ｍｍ3を構成した際に、漸増用量のｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを前もって確立したＢ１６Ｆ１０皮下腫瘍に注射し、そして電気パルスを適用した(０日目)。データは、各群の腫瘍体積を表す(平均±ＳＤ)。
【図９】図９は、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの繰り返し腫瘍内エレクトロトランスファーにより治療されたＢ１６Ｆ１９皮下腫瘍についての腫瘍体積モニタリング(ｍｍ3)の分析を示す。データは、各群(ＴＥ ビヒクル ｎ＝２０；ｐＯＲＴ-ＲＤＤ１× ｎ＝１０；ｐＯＲＴ-ＲＤＤ ２× ｎ＝２０)についての腫瘍体積を表す。
【図１０】図１０は、２００μｇのｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを１回腫瘍内エレクトロトランスファーしたのちの超音波による腫瘍体積モニタリングを示す。
【図１１】図１１は、２００μｇのｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを１回腫瘍内エレクトロトランスファーしたのちのドップラー超音波による腫瘍血管モニタリングを示す。
【図１２】図１２は、ｐＯＲＴ-ＲＤＤ(ＢＡ０１５-ＶＣＣ-００４)プラスミドの漸増量でトランスフェクションした後におけるＢ１６Ｆ１０細胞増殖の抑制を示す。
【図１３】図１３は、ｐＯＲＴ-ＲＤＤ(ＢＡ０１５-ＶＣＣ-００４)プラスミドの漸増量でトランスフェクションした後におけるＣ９細胞増殖の抑制を示す。
【図１４】図１４は、ｐＯＲＴ-ＲＤＤ(ＢＡ０１５-ＶＣＣ-００４)プラスミドの漸増量でトランスフェクションした後における４５１Ｌｕ細胞増殖の抑制を示す。
【図１５】図１５は、凍結乾燥されていないプラスミドサンプルと凍結乾燥されたプラスミドサンプルについて、プラスミド形態についてのアガロースゲル分析の結果を示す(Ｍ：１Ｋｂ ＤＮＡラダーマーカー、Invitrogen)。
【図１６】図１６は、Ｃ９メラノーマ細胞増殖の分析結果を示す。リポフェクタミンＰｌｕｓプロトコールに従い、凍結乾燥されていないｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド(バッチ３)及び凍結乾燥されたｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド(バッチ４)の漸増量で細胞をトランスフェクションした(各用量についてｎ＝４)。データは、平均±ＳＤを表す。
【図１７】図１７は、４５１Ｌｕメラノーマ細胞増殖の分析結果を示す。リポフェクタミンＰｌｕｓプロトコールに従い、凍結乾燥されていないｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド(バッチ３)と凍結乾燥されたｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド(バッチ４)の漸増用量でトランスフェクションした(各用量についてｎ＝４)。データは平均±ＳＤを表す。
【図１８】図１８は、凍結乾燥されていないｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド又は凍結乾燥されているｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの腫瘍内エレクトロトランスファーにより治療されたＢ１６Ｆ１０皮下腫瘍についての腫瘍体積モニタリング(ｍｍ3)の分析を示す。
【図１９】図１９は、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドとビヒクルの筋肉内エレクトロトランスファーにより治療されたＢ１６Ｆ１０皮下腫瘍の腫瘍体積モニタリングを示す。データは、各群について腫瘍体積(平均±ＳＤ)を表す。
【図２０】図２０は、０日目(細胞注入)〜８二地目における、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドとビヒクルの筋肉内エレクトロトランスファーにより治療されたＢ１６Ｆ１０皮下腫瘍の腫瘍体積モニタリングを示す。データは、各群について腫瘍体積(平均±ＳＤ)を表す。
【実施例】
【００９４】
実施例１：ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの生成
プラスミド 
Ｃｏｂｒａ ＢｉｏＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇは、発現プラスミド、ｐＯＲＴ-ＲＤＤ、ヒトウロキナーゼのシグナルペプチドの下流に翻訳されるように融合されたＲＤＤ遺伝子をコードする、を作成した。コード配列は、強力な真核サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターの制御下にあり、そしてウシ増殖ホルモン(ｂＧＨ)ポリアデニル化シグナルの上流に配置された。
【００９５】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤは、ヒトウロキナーゼ分泌シグナルにより駆動されるＲＤＤ遺伝子を含む遺伝子カセットを、Ｃｏｂｒａ ＢｉｏＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇのｐＯＲＴ１ａＣＭＶプラスミド(図１の遺伝子地図)に挿入することにより設計した。
【００９６】
遺伝子カセットの配列は以下の通りである：
【化１】
2010519919.tif 000002
【００９７】
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位は、太字で示されており、ヒトウロキナーゼ分泌シグナルに下線を付し、そしてＲＤＤ遺伝子をイタリックで表した。
【００９８】
合成遺伝子カセットとｐＯＲＴ１ａＣＭＶを、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断され、そして断片をライゲーションして、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを作成した。
【００９９】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤベクターは、こうして、以下の要素：ヒト サイトメガロウイル前初期(ＣＭＶ)プロモーター＋イントロンａ(従来のＣＭＶ(Ｃｏｂｒａ Ｓｏｕｒｃｅ)よりも強力なプロモーター)、ウシ成長ホルモン(ｂＧＨ)ポリアデニル化シグナル、選別用のＬａｃＯ配列、及びヒト ウロキナーゼ分泌シグナルの制御下のヒトＲＤＤ遺伝子を含む(図２のプラスミド地図を参照)。
【０１００】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤを宿主株ＤＨ１-ＯＲＴに形質転換し、そして発酵により製造した。Cranenburghら、2001に言及されたＤＨ１ Ｌａｃ ｄａｐＤ株を使用してもよい。
【０１０１】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤ生産
研究機関細胞バンク(Research Working Cell Bank)の製品
形質転換されたＤＨ１-ＯＲＴのグリセロールストック(Cobra Biomanufacturing, CTL 2006#0492P)を用いて、５ｍｌの滅菌ＬＢ培地を入れた２５ｍｌの滅菌ユニバーサルチューブ×８に植菌した。５ｍｌの培養物を約１６時間、３７℃、２００ｒｐｍの撹拌インキュベーター中でインキュベートした。２ＯＤｍｌのサンプルをミニプレップして、プラスミドの存在を確認した。次に１ＯＤｍｌの選択された培養物を用いて、２５ｍｌのＬＢ培地に植菌した。これを０.８〜１.５ＯＤユニットの光学密度(６００ｎｍ)に達するまで、３７℃２００ｒｐｍで撹拌して増殖させた。２０％ｖ／ｖグリセロールを用いて培養物を凍結保存した。これを１ｍｌ±０.２ｍｌの一定量で２０超の滅菌凍結バイアルにわけ、そして-７０℃で貯蔵した。
【０１０２】
遺伝的安定性試験
プラスミドの構造的安定性及び分離安定性を、４０細胞世代超にわたり評価した。これは、同数の細胞(０.１０ＯＤｍｌ)を新たなＬＢ培地(５ｍｌ)に植菌し、そして２４時間間隔で継代培養することにより行われた。培養物を３７℃及び２００ｒｐｍで軌道シェーカー中でインキュベートした。各々２４時間の間隔で、光学密度を計測し、そして細胞倍化時間(又は世代)経過を計算するために用いた：
【数１】
2010519919.tif 000003
【０１０３】
これを、４０細胞世代超が達成されるまで繰り返した。各継代培養段階での既知細胞数(２ＯＤｍｌ)を遠心によりペレット化し、そして２つのミニプレップ法を用いてｐＤＮＡを抽出した：Ｂｉｒｎｂｏｉｍ  ａｎｄ  Ｄｏｌｙ(Nucleic Acids Res. 1979 Nov 24; 7(6)1513 - 23)により考案されたミニプレップ法、及びＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ法及びキット(Qiagen（登録商標）)を用いた。各継代培養物からの等量の単離ｐＤＮＡを、次に０.８％アガロースゲルに充填し、臭化エチジウムで染色し、そして分離及び構造安定性の兆候について定量的可視化を行った。
【０１０４】
４４世代にわたる連続継代培養及びサンプリングによって、全体としての分離又は構造的不安定性のあきらかな兆候が存在しなかった。
【０１０５】
５ｌの発酵容器の評価
ｐＯＲＴ-ＲＤＤを含むＤＨ１-ＯＲＴを、ＦＴ- Ａｐｐｌｉｋｏｎ ５／７Ｉ発酵容器中で、５ｌのスケールで評価した。複合体媒体及び用いられる発酵プロトコルは、Ｖａｒｌｅｙら(Bioseparation. 1999; 8(1-5):209-17)に記載されるプロトコルに以下の変更を加えたものである。
【０１０６】
Ｖａｒｌｅｙらにより記載された培地は、終濃度で、３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、６ｇ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4、０.５ｇ／ｌのＮａＣｌ、０.２％ポリプロピレングリコール(ＭＷ２０２５)、０.０５％の微量元素溶液［２ｇ／ｌのＣｏＣｌ2.６Ｈ2Ｏ、１.９ｇ／ｌのＣｕＣｌ2.２Ｈ2Ｏ、１.６ｇ／ｌのＨ3ＢＯ3、１.６ｇ／ｌのＭｎＳＯ4-Ｈ2Ｏ、２ｇ／ｌＮａ2ＭｏＯ4.２Ｈ2Ｏ、２ｇ／ｌのＺｎＣｌ2７Ｈ2Ｏ、１ｇ／ｌのＦｅ2(ＳＯ4)3.ｘＨ2Ｏ、１ｇ／ｌのＣａＣｌ2.２Ｈ2Ｏ、及び６０ｇ／ｌのクエン酸からなる］、０.０３ｇのＣａＣｌ2.２Ｈ2Ｏ、０.０４ｇ／ｌのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０.０２ｇ／ｌのクエン酸、０.５ｇ／ｌのＭｇＳＯ4、５ｍｌ/ｌのビタミン溶液［０.６ｇ/ｌのビオチン、０.０４ｇ/ｌの葉酸、１.４ｇ/ｌのピリドキシン-ＨＣｌ、０.４２ｇ/ｌのリボフラビン、５.４ｇ/ｌのパントテン酸、及び６.１ｇ／ｌのナイアシンからなる］、１２ｍｇ／ｌのテトラサイクリン、並びに２ｇ／ｌのペプトン、２０ｇ／ｌの酵母抽出物、１０ｇ／ｌの(ＮＨ4)2ＳＯ4、及び２.８％のグリセロールであった。
【０１０７】
しかしながら、線形回分発酵(linear fed batch)用グリセロール、ファイトン(phytone)ペプトン、酵母抽出物及び硫酸アンモニウムを、バルク培地から除き、そして６０、４０及び３０ｍｌ／時の定常供給速度で容器に加えた。供給溶液を、１００ｇのＢａｃｔｏ酵母抽出物、１０ｇのファイトン、１７６.５ｇのグリセロール、２５ｇの硫酸アンモニウムを混合することにより調製し、そして精製水を７４０ｍｌになるまで加えた。供給溶液をさらに０.２μｍフィルターでろ過した。
【０１０８】
分析用のサンプルを、発酵のタイムコースを通して回収した。サンプルの光学密度(６００ｎｍ)、分離又は構造的不安定性、及びｐＤＮＡ特異的収量を分析した。
【０１０９】
植菌用培地を、研究機関細胞バンクから得た２００μｌを、２ｌのバッフル-エルレンマイヤー撹拌フラスコ中にいれた２００ｍｌのＴブロス培地(１１.８ｇ／ｌのファイトンペプトン、２３.６ｇ／ｌ酵母抽出物、２.２ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、９.４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、５.０４ｇ/ｌグリセロール)にいれて調製した。植菌用培地を３７℃、２００ｒｐｍで撹拌して、およそ１２時間インキュベートした。次に１２００ＯＤｍｌを用いて、５ｌの容器を植菌した。
【０１１０】
物理的パラメーター
溶解酸素、ｐＨ、撹拌速度及び温度は、発酵のタイムコースにわたって一定になるようモニタリングした。
【０１１１】
回収
水道水を供給されたジャケットを用いて容器を１０℃に冷却した。培養物を１Ｌ遠心ポットに集め、そしてＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ ３Ｂ Ｐｌｕｓ遠心機で、４５００ｒｐｍで２０分間４℃にて遠心することにより細胞をペレット化した。上清を捨て、そして２％Ｔｅｇｏ２０００(商標)で消毒した。細胞ペレットを-７０℃未満で凍結した。
【０１１２】
分析
増殖速度をえるために、発酵のタイムコースに渡って光学密度(６００ｎｍ)を計測した。
【０１１３】
発酵のタイムコースに沿って、既知の量の細胞(つまり、ＯＤ600×ｍｌ)(１００ＯＤｍｌ)を数時間のインターバルでペレット化した。これらのサンプルを-２０℃で貯蔵した。これらの細胞から得たプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ-５００Ｍａｘｉ-prep(商標)キット及びプロトコル(Ｑｉａｇｅｎ(商標))を用いて単離した。ｐＤＮＡの濃度を、２６０ｎｍでＤＮＡのＯＤを計測することにより計算した。これから、培養物の特定のプラスミド収量を、ｐＤＮＡ濃度(μｇ/ｍｌ)をサンプルのＯＤｍｌ数により割ることによって計算した。これは、各発酵について行われ、そして０.８％アガロースゲルを、臭化エチジウムで染色し、各サンプルについて泳動を行って、ｐＤＮＡを定量的に視覚化した。
４０ｍｌ/時間の供給速度が、発酵の間におけるプラスミド収率に最適であることを最終的に見出した(約１μｇ/ＯＤｍｌ)。
【０１１４】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤ精製
全ての緩衝塩及び試薬を、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ(Leicestershire, UK)から購入し、そしてこれらは全て、他に特記ない限り分析品質(ＡｎａｌａＲ)であった。全ての緩衝溶液及び消毒液を、精製水及び注射用の水(ＷＦＩ)品質の水(Ｈｙｃｌｏｎｅ,ＵＫ)を用いて調製した。光学密度の計測を、ＤＵ８００分光光度計(Beckman Coulter, UK)を用いて行った。Sorvall Evolution RCを用いて遠心を行った(Kendro UK)。アガロースゲル電気泳動を、EC CSSI１２１４ Turn＆Cast Gel System(VWR International UK)を用い、そして電気泳動電源６００(Amersham Biosciences, UK)を用いて行った。Qiagen Plasmid Maxiキットの構成要素(Qiagen-tip５００、緩衝液QBT、QC及びQF)(Qiagen、UK)を溶解滴定法に用いた。
【０１１５】
細胞溶解及びライセートの清澄化
２ｌの細胞懸濁緩衝液を、１０ｌのステンレス鋼容器に入れた凍結細胞ペースト(バッチ１について最終濃度１２０ｇ／ｌ及びバッチ２について１５０ｇ／ｌ)に加え、そして凝集体がなくなるまでステンレス鋼製スパチュラを用いて手動で混合した。４ｌの溶解用液(０.１５５Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ、２０〜２２℃)で３分間(バッチ１)及び１０分間(バッチ２)混合することにより細胞を溶解した。２ｌの中和溶液(ｐＨ５.５で１０ｍＭ ＥＤＴＡを加えた３Ｍ酢酸カリウム)をライセートに加え、その間ゆっくり撹拌した。沈殿した細胞破砕片を次に５００μｍのメッシュバッグフィルター(Ｌ１ＮＭ５００ＢＢＳＳ、Ｐｌａｓｔｏｋ,ＵＫ)、及び公称５０μｍ、５μｍ、及び０.３μｍの深さのフィルター(ＫＲ５０Ａ０５ＨＨ１、ＫＲ０５Ａ０５ＨＨ１及びＫＲＫ３Ａ０５ＴＴ１、Millipore、UK)を用いて取り除いた。
【０１１６】
イオン交換クロマトグラフィー
ＸＫ５０／３０クロマトグラフィーカラムに、３５４ｍｌの精製水で洗浄したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ(Merck KGaA, Germany)を充填し、充填ベッド体積２６４.６ｍｌにして、バッチ１についてベッドの高さを１３.５ｃｍにした。バッチ２について、３７０ｍｌの精製水で洗浄されたFractogel EMD TMAE(Merck KGaA、Germany)を充填して、充填されたベッド体積を２５４.８ｍｌにして、ベッドの高さを１３.０にした。２.５ｍｌの１％アセトンを適用することにより充填培地上で充填試験を行い、バッチ１及び２について、許容される非対称値(Asymmetry value)１.６５及び１.３５にした。次に培地を、２カラム体積の０.５M NaOHを、１時間を超える接触時間で消毒した。溶出液のpＨが８.５以下に到達するまで次に平衡緩衝液をカラムを通して送りこんだ。カラムに６３１２.５ｍｌ(バッチ１)及び６３９３.３ｍｌ(バッチ２)の清澄供給液を充填し、１００ｃｍ／時間の定常線形流速で行った。pＤＮＡが、１００ｃｍ／時間の流速で溶出緩衝液を適用することによりpＤＮＡを回収する前に、平衡化緩衝液を再適用して未結合物質及び汚染物質を洗い流した。
【０１１７】
接線流れろ過によるイオン交換後の中間体濃度
Millipore LabScale TFFシステムを用い、そして５０ｃｍ2、３０ｋＤａ再生セルロースＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ膜(Millipore,UK)を備え付けた。システム及び膜を、精製水で１０分間洗浄し、次にイオン交換溶出緩衝液(２×５００ｍｌ、１０分)を用いて平衡化した。イオン交換後に、pＤＮＡ溶液をリザーバーに注ぎいれた。ポンプのスイッチを入れ、そして、膜を介して１５ｐｓｉの圧力が適用されるまで、１０分間システムを稼動させた。全ての溶出物質が加えられるまで、リザーバーは連続して充填され、そして体積を減少させて、約２ｍｇ／ｍｌのｐＤＮＡの最終名目濃度を得た。濃縮物を当該システムから排出し、次に最終緩衝液でのすすぎにより、ｐＤＮＡの最大量が、膜から回収されることを保障した。使用の間に１ｍｇ／ｍｌの最終ｐＤＮＡ濃度を達成するように洗浄緩衝液の体積を計算し、システムと膜を精製水で洗浄した。次に当該システムを、水で洗浄し、そして０.１Ｍ ＮａＯＨ中に貯蔵した。
【０１１８】
イオン対逆相クロマトグラフィー
約８５０ｍｌのＰｅｒｆｌｕｏｒｏｓｏｒｂ-Ｓ培地を含むＶＳ６０クロマトグラフィーカラム(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ,ＵＫ)を、この方法に用いた。カラムと培地の滅菌を、１時間超の接触時間で２カラム体積量の０.５Ｍ ＮａＯＨをポンプで送り込むことにより行った。次に、使用前に媒体を平衡化した(ｐＨが７±０.２に達するまで)。カラムを、６９.０ｍｌ(バッチ１)で充填し、そして２００.８ｍｌのイオン交換ＴＦＦ濃縮物で充填し、そして７０ｃｍ／時間の定常線形流速で作動させた。２カラム体積量の洗浄緩衝液１及び４カラム体積量の洗浄緩衝液２を次に当該カラムに導入して、残りのエンドトキシン、ＲＮＡ及び未結合物質を取り除き、続いて溶出緩衝液を用いて、捕捉されたｐＤＮＡを回収した。溶出ピークを回収し、そしてＵＶ分光法を用いて分析して、回収されたｐＤＮＡの濃度を測定した。
【０１１９】
接線流れろ過による濃縮／膜分離、及び生成物製剤
当該システムを、前に記載されるように調製した。全てのｐＤＮＡ溶液が加えられるまで、リザーバーに連続して充填した。ｐＤＮＡ溶液を、必要な濃度にまで濃縮すると、浸透液のｐＨ及び伝導性膜分離緩衝液に等しくなるまで、製剤緩衝液に対して膜分離を行った(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５)。膜分離された濃縮物を、次に当該システムから排出し、次に２×緩衝液のリンスにより、ｐＤＮＡの最大量を膜から回収することが保障された。回収されたｐＤＮＡの一定量を、０.２μｍフィルターを用いてろ過し、そして無菌状態で滅菌凍結バイアルに入れられた。
【０１２０】
精製プロセスを表１に要約する。
【表１】
2010519919.tif 000004
【０１２１】
実施例２：ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドのin vitro研究
本研究の目的は、トランスフェクション後に、in vitroで新規のｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを確認すること：ＲＤＤ分泌効力及び抗増殖活性の評価することである。ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドは、内部陽性対照として使用される従来のｐＶＡＸ-ＲＤＤコンストラクトと比較された。
【０１２２】
プラスミド
ｐＯＲＴプラスミド
実施例１に記載されるように、ＬＢ培地中で増殖されたＤＨ１-ＯＲＴ宿主株中で、ｐＯＲＴ-ＲＤＤ及びｐＯＲＴ１ａＣＭＶ(空の対照プラスミドとして使用される)ベクターを生産した。細胞を溶解し、そしてプラスミドＤＮＡをイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、接線流れろ過により濃縮し、イオン対逆相クロマトグラフィーに供し、そして接線流れろ過により濃縮した。プラスミドを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.９％ＮａＣｌ、ｐＨ７.５に剤形し、そして-２０℃で凍結して維持した。
【０１２３】
ｐＶＡＸプラスミド
ｐＶＡＸベクターを対照として用いた。ｐＶＡＸ１(Invitrogen、ref V260-20)は、３.０ｋｂプラスミドベクターであり、これは多くの哺乳動物細胞において目的のタンパク質の高レベル一過的発現を許容する。当該ベクターは、以下の要素を含む(図３の地図)：ヒトＣＭＶプロモーター、ウシ増殖ホルモン(ＢＧＨ)ポリアデニル化シグナル、及び大腸菌選別用のカナマイシン抵抗性遺伝子。
【０１２４】
マウスウロキナーゼ分泌シグナルの制御下のヒトＲＤＤ遺伝子を含むＲＤＤカセットは、ＣＭＶとＢＧＨポリＡのあいだでｐＶＡＸ１にクローニングして、ｐＶＡＸ-ＲＤＤを生成した。
【０１２５】
ｐＶＡＸ１とｐＶＡＸ-ＲＤＤは、ＬＢブロス培地１５００ｍｌ+５０μｇ／ｍｌカナマイシン中で一晩細菌培養することにより生成した。プラスミドをＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＰＣ２００ＥＦキット(Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ)を用いて精製し、そして１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.９％ＮａＣｌ、ｐＨ７.５に剤形し、そして-２０℃で凍結した。
【０１２６】
細胞株及び培養物条件
１０％の熱不活化胎児ウシ血清(Invitrogen Gibco ref 10270-106)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ+ＧｌｕｔａＭａｘ、Invitrogen Gibco, ref 61965-026)で、３７℃、５％ＣＯ2加湿雰囲気下でヒトＣ９メラノーマ細胞を増殖させた。
【０１２７】
１０％熱不活化胎児ウシ血清、１.５ｇ／ｌ炭酸水素ナトリウムを添加したダルベッコ改変イーグル培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ(Invitrogen Gibco、ref 25080-060)中で、Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ-６４７５)を増殖させた。
【０１２８】
凍結細胞のバイアルを、単一バイアルから生産し、そして液体窒素中に維持した。
【０１２９】
細胞を週２回継代培養した(Ｃ９細胞について１：１０希釈、Ｂ１６Ｆ１０細胞について１：１５希釈)。継代培養では、培地を取り除き、ＰＢＳですすぎ、そして(７５ｃｍ2フラスコあたり)２ｍｌのトリプシン-ＥＤＴＡ溶液(Invitrogen Gibco, ref 25300-096, lot 3107779)を加えた。細胞が剥離するまでフラスコを室温に静置した。新たな培地を加え、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、吸引し、新たな培地を加え、そして細胞を新たなフラスコに分注した。
【０１３０】
トランスフェクション及び増殖アッセイ
トランスフェクションの前日に、６００００細胞／ウェル(Ｃ９)又は１５０００細胞／ウェル(Ｂ１６Ｆ１０)(５００μｌの完全培地)を２４ウェルプレートに播種した。１μｇの各プラスミド(ｐＶＡＸ１、ｐＶＡＸ-ＲＤＤ、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ、ｐＯＲＴ-ＲＤＤ)を、リポフェクタミンＰＬＵＳ試薬(Gibco Invitrogen)とトランスフェクトした。６ウェル／プラスミドを調製し、そして実験を２回行った。
【０１３１】
トランスフェクションプロトコルを、製造方法から適用した：１μｇのプラスミドＤＮＡを、４４μｌの培地０％及び６μｌのＰＬＵＳ試薬で室温で１５分間インキュベートする。リポフェクタミンを加え、そして混合物を室温で１５分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで洗浄し、そして１ウェルあたり５００μｌのトランスフェクション混合物を加えた。３７℃で４時間インキュベート後、トランスフェクション培地を取り除き、７５０μｌの完全培地を加えた。トランスフェクトされた細胞を３７℃で９６時間インキュベートした。
【０１３２】
２５０μｌのＰＢＳと２５μｌの５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ(Ｓｉｇｍａ)でインキュベートする。３７℃で２時間インキュベートした後に、２５０μｌの溶解緩衝液(２０％ＳＤＳ-３３％ジメチルホルムアミド-２％酢酸-０.０２５ＮのＨＣｌ-０.０５Ｎ ＮａＯＨ)を加えて一晩おいた。５７０ｍｍ光学密度測定するために、２００μｌの各サンプルを９６ウェルプレートに分配した。
この実験を同じ条件で２回繰り返した。
【０１３３】
懸濁緩衝液改変のためのＤＮＡ沈殿
【表２】
2010519919.tif 000005
【０１３４】
上記混合物の２つのチューブを調製し、そして一晩-２０℃でインキュベートした。混合物を４℃、１２０００ｒｐｍで３０分間遠心する。上清を捨て、７０％エタノールを加える。溶液を遠心し、上清を捨てる。ペレットを乾燥させ、そして２５μｌの滅菌ＮａＣｌ０.９％(１のチューブ)又は２５μｌの滅菌１０ｍＭのＴｒｉｓ-１ｍＭ ＥＤＴＡ-ＮａＣｌ０.９％、ｐＨ７.５(ＴＥ-ＮａＣｌ)(他のチューブ)で懸濁する。
【０１３５】
ＤＮＡ濃度を２６０／２８０ｎｍで読み取られる光学密度により計測する。
【０１３６】
ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ-ＮａＣｌ、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ-ＴＥ ＮａＣｌ、ｐＯＲＴ-ＲＤＤ-ＮａＣｌ、及びｐＯＲＴ-ＲＤＤ-ＴＥ ＮａＣｌ ＤＮＡを、１プラスミドあたり６ウェルで、従来のトランスフェクションプロトコルに従ってトランスフェクトした。この実験を１回行った。
【０１３７】
ＲＤＤウエスタンブロット
ヒトＣ９メラノーマ細胞を２４ウェルプレートに播種し(６０,０００細胞／ウェル)、そして増殖アッセイ用に設計されるプロトコルに従って、リポフェクタミンＰｌｕｓ試薬(Gibco Life technologies)を用いて１μｇのプラスミドをトランスフェクトした。無血清培地中で４時間トランスフェクトした後に、トランスフェクション上清を、１０％血清を添加した培地に置き換えた。
【０１３８】
トランスフェクション後７２時間で上清を回収した。細胞抽出物用に、細胞を掻き取りにより回収し、そして３０分間５０μｌの溶解緩衝液(１０ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液＋１抗プロテアーゼコンプリートミニ錠剤(ref. 11 836 153, Roche)でインキュベートした。１００００ｒｐｍで１０分間遠心した後に、ライセートを一定量にわけ、そして-８０℃で貯蔵した。
【０１３９】
各上清についてのタンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイで測定した。
【０１４０】
ウエスタンブロットを、抽出物について１８μｌの上清又は１８μｌのＰＢＳ中に溶解した３０μｇの全タンパク質を、６μｌＮｕＰａｇｅＬＤＳサンプル緩衝液４×(ＮＰ０００７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)及び２.５μｌＮｕＰａｇｅサンプル還元剤(ＮＰ０００４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)と混合することにより行った。サンプルを７０℃で１０分間加熱する。
【０１４１】
ＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘプロトコルにしたがい、ＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ-Ｔｒｉｓ１２％ゲル(ＮＰ０３４１ＢＯＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)にサンプルをロードし、ＭＯＰＳ ＳＢＳ緩衝液上で泳動した。
【０１４２】
ニトロセルロース膜Ｏｐｔｉｔｒａｎ ＢＡ-Ｓ８５ ０.２２μ(Schleicher ＆ Schuell)上に転写緩衝液(４８ｍＭのＴｒｉｓ-３９ｍＭのグリシン-０.０３７％のＳＤＳ-２０％メタノール)を用いて半乾燥転写を行い、ＰＢＳ-５％ミルク(ブロッティング品質ブロッカー脱脂粉乳、ref 170-6404、ＢｉｏＲａｄ)を用いて一晩４℃でブロッキングした。膜をＰＢＳ-０.１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、そして一次抗体(Neosystem抗血清、ＰＢＳ-０.１％Ｔｗｅｅｎ２０-２％ミルク中に１：２０００で希釈)と室温で１時間半インキュベートした。洗浄後、膜を、ＨＲＰロバ抗ウサギＩｇＧ(NA934、Amersham)(ＰＢＳ-０.１％Ｔｗｅｅｎ２０-２％ミルク中に１：５０００希釈)１時間室温でインキュベートする。膜を洗浄し、そしてＥＣＬで現像した(ＲＰＮ２２０９、Ａｍｅｒｓｈａｍ)。
【０１４３】
統計分析
ＳｉｇｍａＳｔａｔ３.１ソフトウェアを用いて全ての統計分析を行った。スチューデントｔ検定を用いて、対照プラスミド又はＲＤＤプラスミドでトランスフェクションした後の生存細胞の割合を比較した。ｐ値＜０.０５を有意とみなした。
【０１４４】
結果
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドにより駆動されるＲＤＤ分泌
細胞抽出物とｐＯＲＴ-ＲＤＤトランスフェクトされた細胞の上清の両方において、予期したサイズ(１０ｋＤａ)にバンドを特異的に検出した。
しかしながら、ＲＤＤペプチドは、ｐＶＡＸ-ＲＤＤトランスフェクトされた細胞の上清で検出されていない。
こうして、ｐＯＲＴベクター由来の完全なＣＭＶ-イントロンＡプロモーターは、ｐＶＡＸベクターの従来型のＣＭＶプロモーターよりも強力なＡＭＥＰペプチドの生産及び分泌を誘導する。
【０１４５】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤトランスフェクション後のＣ９増殖抑制
ｐＯＲＴ-ＲＤＤから産生されるＲＤＤペプチドの抗増殖活性を示すために、増殖アッセイを、細胞のトランスフェクション後にセットアップした。新たなｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを、ｐＶＡＸ-ＲＤＤと比較し、構成的プラスミドを陽性対照として用いた。実験結果を以下の表３に示す。
【０１４６】
【表３】
2010519919.tif 000006
【０１４７】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤトランスフェクションは、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ対照プラスミドトランスフェクションに対して、Ｃ９メラノーマ細胞増殖を６５.５％抑制する(スチューデントｔ検定ｐ＜０.００１)。同じ結果が両方の実験で得られるので、この抑制はかなり再現性がある。幾つかの条件では、ｐＶＡＸ-ＲＤＤプラスミドトランスフェクションは、Ｃ９増殖を抑制することができなかった。
【０１４８】
ＤＮＡ再懸濁緩衝液の効果
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-１ｍＭ ＥＤＴＡ-１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５(ＴＥＮａＣｌ)に懸濁した。ＥＤＴＡが、ＲＤＤ活性と相互作用するかを調べるために、ＴＥＮａＣｌ又は生理食塩水(ＮａＣｌ０.９％)のいずれかで調製されたｐＯＲＴ-ＲＤＤの抗増殖活性をアッセイした。
【表４】
2010519919.tif 000007
【０１４９】
懸濁緩衝液に関わらず、Ｃ９細胞の強力な増殖抑制が得られた。差異は、統計的有意に達しなかった(ｐ＝０.２９１、スチューデントｔ検定)。
【０１５０】
この結果は、ＴｒｉｓもＥＤＴＡもＡＭＥＰ活性に影響を与えないことを示している。
【０１５１】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤトランスフェクション後のＢ１６Ｆ１０増殖抑制
メラノーマ細胞に対するｐＯＲＴ-ＲＤＤの抗増殖活性を完了するために、マウスＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶに基づくプラスミドでトランスフェクションし、そしてＭＴＴ増殖アッセイを行った。
【表５】
2010519919.tif 000008
【０１５２】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤトランスフェクションは、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ対照プラスミドトランスフェクションに対して７４.５％だけＢ１６Ｆ１０細胞増殖を抑制した(スチューデントｔ検定ｐ＜０.００１)
【０１５３】
まとめると、これらの結果により、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドが、従来のｐＶＡＸ-ＲＤＤプラスミドよりも強力に、ＡＭＥＰペプチドの強力な生成及び分泌を誘導し、そしてメラノーマ細胞(ヒトＣ９及びマウスＢ１６Ｆ１０)の増殖を抑制することが示される。さらに、この抗増殖効果は、ＤＮＡを調製するために用いられる懸濁緩衝液から独立している。ＴＥＮａＣｌ緩衝液に含まれるＥＤＴＡは、この活性には影響を及ぼさなかった。
【０１５４】
実施例３：皮下Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍において単一のｐＯＲＴ-ＲＤＤの腫瘍内エレクトロトランスファーの抗腫瘍効力試験
本試験の目的は、すでに確立された皮下Ｂ１６Ｆ１０腫瘍内に、空の対照ｐＯＲＴ１ａＣＭＶベクターに比べて、新たなｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを１回の治療的腫瘍内エレクトロトランスファーをした際の効果を調べることである。
【０１５５】
材料と方法
細胞株と培養条件
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を、１０％熱不活性化胎児ウシ血清、１.５ｇ／ｌ炭酸水素ナトリウム、及び抗生物質(１００ＵＩ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン；Invitrogen Gibco、ref 15140-122)を添加したダルベッコ改変イーグル培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ中で、３７℃、加湿５％ＣＯ2雰囲気下でＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を増殖させた。凍結細胞のバイアルを、１バイアルから調製し、そして液体窒素中に維持した。実施例２に記載されるコンフルエント割合に従って細胞を週に２、３回継代した。
【０１５６】
動物
メスの６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｊａｎｖｉｅｒ(Le Genest-St-Isle, France)から購入した。全ての動物実験を、動物実験倫理ガイドライン(Directive No 86/609CEE)に従って行い、そしてＢｉｏＡｌｌｉａｎｃｅ Ｐｈａｒｍａ倫理委員回から承認を得た。
【０１５７】
実験が行われる領域内で腫瘍細胞の移植前少なくとも４日間動物を馴化させた。動物を温度(２１℃)、明期(明１２時間／闇１２時間)及び換気(１時間あたり１２回の換気)の制御された条件下で室温で維持した。湿度を３０〜７０％に維持した。動物を、特定病原菌フリー条件下で維持し、室温及び湿度を連続してモニタリングした。
【０１５８】
統計試験
ＳｉｇｍａＳｔａｔ３.１ソフトウェアを用いて全ての統計分析を行った。２つの群を比較するために、当該ソフトウェアは、正規性検定及び等分散検定がうまく行われた場合にスチューデントｔ検定を行った。これらの検定が失敗した場合は、当該ソフトウエアは、マン・ホイットニー順位和検定を行った。各々の分析について、使用者は自由に各統計試験を受容する。０.０５未満のｐ値を有意とみなした。
【０１５９】
実験試験設計及び処理
細胞注入
Ｂ１６Ｆ１０細胞を、マウスに注射する前に最大５回継代して培養物中に維持した。細胞を、注射の日前に４８時間継代培養した。
【０１６０】
サブコンフルエントのＢ１６Ｆ１０細胞を、ＰＢＳですすぎ、そして次に細胞が剥離するまでトリプシンーＥＤＴＡ溶液(Invitrogen Gibco, Ref２５３００-０９６)とインキュベートした。新たな培地を加え、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心し、そして２５ｍｌの新たな培地中に再懸濁した。生存性の定量のために、細胞を０.０４％トリパンブルー中で計数した。細胞を遠心し、そして１００μｌ中に１０6個のＢ１６Ｆ１０細胞を得るために適切な量の０.９％ＮａＣｌ(Versol, Laboratoire Aguettant, Lyon, France)に再懸濁した。
【０１６１】
１００μｌの細胞を、マウスの右わき腹にＳＣ経路で注射した。細胞注射の前日に、電気かみそりで事前にマウスのわき腹の毛を剃っておいた。
【０１６２】
プラスミドエレクトロトランスファー(０日目)
細胞の接種後７日目に腫瘍体積を始めて調べた。この時点で、幾つかの腫瘍はすでに十分に確立されており、そしてこれらの第一群で使用された。０日目での腫瘍体積の変動を最もよく制限するために、１４匹のマウスの第一群にエレクトロトランスファーを行い(ｐORT１aCMVに対して７匹、及びｐORT-RDDに対して７匹)、そして７匹のマウスの第二群について２日後にエレクトロトランスファーを行った(ｐＯＲＴ１ａＣＭＶに対して３匹、及びｐＯＲＴ-ＲＤＤに対して４匹)。
【０１６３】
プラスミド希釈
腫瘍あたり、５０μｌの滅菌緩衝液に溶解した５０μｇのプラスミドを投与した。
【０１６４】
当該プラスミドの希釈を、以下のとおり、滅菌条件下で滅菌緩衝液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.９％ＮａＣｌ,ｐＨ７.５)を用いて行った：
第一群：ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ：２.２μｇ／μｌのｐＯＲＴ１ａＣＭＶ３６４μｌを、４３６μｌのＴＥ-ＮａＣｌ；
ｐＯＲＴ-ＲＤＤ：１.９６μｇ/μｌのｐＯＲＴ-ＲＤＤ４０８μｌを、３９２μｌのＴＥ-ＮａＣｌで希釈した。
第二群：ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ：少量の対照であるので、第一群に用いた希釈液を-２０℃で凍結保存し、そして第二群注射の際に再利用した。
ｐＯＲＴ-ＲＤＤ：１.９６μｇ/μｌのｐＯＲＴ-ＲＤＤ２０４μｌを、１９６μｌのＴＥ-ＮａＣｌで希釈した。
【０１６５】
試験デザイン
皮下Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６メスマウスを、以下の群に割り当てた。
【表６】
2010519919.tif 000009
【０１６６】
麻酔する前に腫瘍を計測した。
動物を、以下の：０.５ｍｌキシラジン２％(Ｒｏｍｐｕｎ(商標)、Ｂａｙｅｒ)、２.０ｍｌのケタミン／５０ｍｇ/ｍｌ(Ketalar;Panapharma,Fougeres, France)、７.５ｍｌのＮａＣｌ０.９％を腹腔内注射することにより麻酔した。
【０１６７】
エレクトロトランスファー
当該処置は、５０μｌのＴＥ-ＮａＣｌ緩衝液中の５０μｇのプラスミドの１回の腫瘍内注射からなった。研究室において、そしてエレクトロトランスファーの刊行物において通常用いられる用量に対応するため、この用量を選択した。
【０１６８】
伝導性ゲルを腫瘍に適用した。注射後すぐに、腫瘍から５ｍｍ離して配置された２つのステンレス鋼のプレートを用いることにより、以下のプロトコル：
ＨＶ＝１５００Ｖ／ｃｍ、１００μｓ、１Ｈｚ、１パルス
中断時間＝１０００ｍｓ
ＬＶ＝１４０Ｖ／ｃｍ、４００ｍｓ、１パルス
に従いＣｌｉｎｉｐｏｒａｔｏｒ装置を用いて電気パルスを適用した。
【０１６９】
腫瘍体積モニタリング及び腫瘍増殖研究
エレクトロトランスファー後、０、２、５、７、９、１２、及び１４日目に、デジタルカリパーを用いて２つの垂直直径を計測することにより腫瘍サイズをモニターした。
腫瘍体積を、以下の式に従い計算した：(長さ＋幅／２)3×Π／６
マウスは実験の間、秤量しなかった。
実験の間に死亡したマウスを記録した。
腫瘍増殖曲線を、腫瘍体積(ｍｍ3)、又はＶ／Ｖ０比(つまりＤ日目の体積／０日目の体積)のいずれかに基づいて腫瘍増殖曲線を得た。
腫瘍増殖の抑制を、以下のとおりに計算した：
阻害％＝１００×[１-(治療群の腫瘍体積／対照群の腫瘍体積)]
【０１７０】
結果
死亡率
実験の間における自然死(７日目：ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ、ケージー１；ｐＯＲＴ-ＲＤＤ、ケージ２；及びｐＯＲＴ-ＲＤＤ、ケージ３)を観測した。この死亡率は、治療と特別関連付けられなかった。自然死は、Ｂ１６Ｆ１０モデルでしばしば観察される。
【０１７１】
腫瘍体積モニタリング
結果を表７に要約し、そして図４に示す。
【表７】
2010519919.tif 000010
【０１７２】
治療の日に、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ治療された腫瘍は、４０.１９ｍｍ3〜８４.７６ｍｍ3(平均体積：５９.２６±１４.１３ｍｍ3)の範囲であり、そしてｐＯＲＴ-ＲＤＤ治療された腫瘍は、３３.５１ｍｍ3〜８９.５１ｍｍ3(平均体積：５６.０３±１８.６５ｍｍ3)の範囲であった。
【０１７３】
７日目に、腫瘍体積は、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ対照群において２７９.０２±２０１.８８ｍｍ3に達し、そしてｐＯＲＴ-ＲＤＤ治療群において１３０.２８±２９.９７ｍｍ3であった。５３％の阻害は、こうして観察された(スチューデントｔ検定ｐ＝０.０２６)。
【０１７４】
１４日目に、腫瘍体積は、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ対照群において８６４.３１±５７１.７８ｍｍ3、及びｐＯＲＴ-ＲＤＤ治療群で６４２.７１±１８２.９６ｍｍ3に達し、２６％の腫瘍増殖阻害に相当した(有意差なし、スチューデントｔ検定ｐ＝０.２８５)。
【０１７５】
以前の試験において、同一プロトコルに従い、０日目で１００ｍｍ3未満の腫瘍では、ｐＶＡＸ-ＲＤＤ及びｐＢｉ-ＲＤＤプラスミドは、エレクトロトランスファー後１４日目でそれぞれ２０％及び２９％Ｂ１６Ｆ１０腫瘍増殖を抑制することが示されたが、統計的有意性はなかった。エレクトロトランスファー後７日目に、阻害割合は１９％未満であった。
【０１７６】
小さい腫瘍についての腫瘍体積
治療日において小さい腫瘍を有するものを選択した後に、結果分析を行った。結果を表８に要約し、そして図６に示す。
【表８】
2010519919.tif 000011
【０１７７】
ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ治療された腫瘍は、４０.１９ｍｍ3〜５９.７３ｍｍ3のはんいであり(平均体積５０.１９±７.６３ｍｍ3)、そしてｐＯＲＴ-ＲＤＤ治療された腫瘍は、３３.５１ｍｍ3〜６５.４５ｍｍ3の範囲であった(平均体積４８.０５±１１.４９ｍｍ3)。
７日目に、腫瘍体積は、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ対照群において２１９.７４±１７４.４９ｍｍ3に達し、そしてｐＯＲＴ-ＲＤＤ治療群で１２１.４２±２９.８１ｍｍ3に達した。
１４日目に、腫瘍体積は、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ対照群において９７１.８５±６４８.９５ｍｍ3に達し、そしてｐＯＲＴ-ＲＤＤ治療群において５９０.６３±１５５.２１ｍｍ3に達した。
ｐＯＲＴ-ＲＤＤ腫瘍内エレクトロトランスファーは、エレクトロトランスファー後７日目に４５％、そして１４日目に、３９％だけＢ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍の増殖を抑制した。しかし、この差異は、統計的有意差に達しなかった。
【０１７８】
小さい腫瘍に対するＶ／Ｖ０比
０日目において腫瘍体積の変動についての影響を減らすために、結果をＶ／Ｖ０比で示す(Ｄ日目の体積／０日目の体積)。
結果を表９及び図７に示す。
【表９】
2010519919.tif 000012
【０１７９】
７日目に、腫瘍体積比は、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ対照群において、４.６９±３.０８ｍｍ3に達し、そしてｐＯＲＴ-ＲＤＤ治療群において２.５５±０.３９ｍｍ3に達した。
１４日目に、腫瘍体積は、ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ対照群において、２０.９５±１１.８７ｍｍ3に達し、そしてｐＯＲＴ-ＲＤＤ治療群において１２.５４±３.０１ｍｍ3に達した。
【０１８０】
生データに示されるように(表９)、少なくとも４０％の腫瘍増殖抑制が、５日目〜１４日目で維持され、１２日目に最大５０％であった。統計的有意性は、９日目及び１２日目に得られた。
【０１８１】
まとめると、これらの結果により、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドが、導入後特に７日後において従来のプラスミドよりも強力であった。この抑制効果は、治療開始日において腫瘍が小さい場合(３３.５１ｍｍ3〜６５.４５ｍｍ3)により重要である。
【０１８２】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤ腫瘍内エレクトロトランスファーは、エレクトロトランスファー後７日目において４５％、そして１４日目において３９％、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍増殖を抑制した。しかしながらこの差異は統計的有意には達しなかった。この最後の点については、１群あたりのマウス群が少なかったことにより説明されうる(ｐＯＲＴ１ａＣＭＶ ｎ＝６、及びｐＯＲＴ-ＲＤＤ ｎ＝７)。さらに、ｐＯＲＴ-ＲＤＤ治療群について観察された低い標準偏差は、ＲＤＤ因子の抗腫瘍効果に一致しているようであった。
【０１８３】
実際、抗血管新生抗腫瘍因子が、小さい腫瘍についてより強力であることは広く知られている。それゆえ、さらなる実験では、腫瘍体積は、小さくかつ測定された腫瘍を治療するために、接種後７日よりも早く調べられうる。
【０１８４】
さらに、高い細胞死亡率は、生理的血清中にＢ１６Ｆ１０細胞の調製後に観察された。この細胞死を制限するために、無血清培地などの他の懸濁緩衝液がアッセイされてもよい。
【０１８５】
しかしながら、この第一実験から、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド腫瘍内エレクトロトランスファーが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにあらかじめ確立されたＢ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍の腫瘍増殖を抑制するということが結論付けられる。
【０１８６】
実施例４：皮下Ｂ１６Ｆ１０腫瘍内へのｐＯＲＴ-ＲＤＤの１回の腫瘍内エレクトロトランスファーに続く用量範囲の評価
この研究の目的は、皮下に予め確立されたＢ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍において、ビヒクルの電気穿孔に比べて、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの漸増用量の１回の腫瘍内エレクトロトランスファー後における抗腫瘍効果を調査することである。この目的のため、腫瘍体積は３０〜５０ｍｍ3であり、そして６つの群を：(１)ビヒクル(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.９％ＮａＣｌ、ｐＨ７.５滅菌緩衝液)、(２)２５μｇ、(３)５０μｇ、(４)１００μｇ、(５)２００μｇ、及び(６)４００μｇの治療ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドで処理した。エレクトロポレーション治療後、少なくとも１４日で腫瘍体積をモニターした。
【０１８７】
実験研究デザイン及び治療
細胞注入
Ｂ１６Ｆ１０細胞は、マウスに注射前に、最大６回継代培養で維持された。注射の日前４８時間で細胞を継代した。
【０１８８】
サブコンフルエントになったＢ１６Ｆ１０細胞をＰＢＳですすぎ、そして次に細胞が剥離するまでトリプシン-ＥＤＴＡ溶液(Invitrogen Gibco、ref25300-096)とインキュベートした。新たな培地を加え、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心し、そして２５ｍｌの新たな培地に再懸濁した。生存性定量のため、細胞を、０.０４％トリパンブルーで計数した。細胞を遠心し、そして１００μｌ中に１０6Ｂ１６Ｆ１０細胞を得るために、適切な量の０.９％ＮａＣｌ(Versol, Laboratoire Aguettant, Lyon, France)中に懸濁した。
【０１８９】
１００μｌの細胞を、マウスの右わき腹にＳＣ経路で注射した。細胞注射の前日に電気かみそりで事前にマウスのわき腹の毛を剃った。
【０１９０】
プラスミドエレクトロトランスファー
細胞接種後６日目にマウスをランダムにｐＯＲＴ１ａＣＭＶ、ｐＶＡＸ又はｐＯＲＴ-ＲＤＤ群に割り当てた。
プラスミドの漸増量：５０μｌ中に２５、５０、１００、２００、４００μｇを注射し、漸増濃度でプラスミドを調製した：０.５、１、２、４、８ｍｇ/ｍｌ。
試験設計
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、腫瘍が３０〜５０ｍｍ3に達した際に治療用に選択された。次に３の異なる日に行い、準備できたマウスを、各治療群にランダムに含めた：
【表１０】
2010519919.tif 000013
【０１９１】
麻酔前に腫瘍を計測した。
【０１９２】
動物を、０.５ｍｌキシラジン２％(Ｒｏｍｐｕｎ(商標)、Ｂａｙｅｒ)、２.０ｍｌケタミン５０ｍｇ／ｍｌ(ケタラール；Ｐａｎｐｈａｒｍａ,Ｆｏｕｇｅｒｅｓ,Ｆｒａｎｃｅ)、７.５ｍｌ ＮａＣｌ０.９％を含む０.２ｍｌのケタミン／キシラジンミックスを腹腔内注射することにより麻酔した。
【０１９３】
エレクトロトランスファー
治療は、５０μｌのＴＥ-ＮａＣｌ緩衝液中に溶解した増量のプラスミドを腹腔内注射することからなる。伝導性ゲルを腫瘍に適用した。注射のすぐ後に、腫瘍から５ｍｍ離して配置された２つのステンレス鋼プレート電極を用いて、プロトコルにしたがってＣｌｉｎｉｐｏｒａｔｏｒ装置を用いて電気パルス適用をした(ｐＶＡＸ-ＲＤＤ腫瘍内装置で以前に用いられた)：
ＨＶ＝１５００Ｖ／ｃｍ、１００μｓ、１Ｈｚ、１パルス
中断時間＝１０００ｍｓ
ＬＶ＝１４０Ｖ／ｃｍ、４００ｍｓ、１パルス
【０１９４】
動物モニタリング及び屠殺
腫瘍体積モニタリング
電気穿孔処理後、処理後０、２、５、７、９、１２、１４日目に、デジタルキャリパーを用いて、２つの垂直直径(最長かつ最大の直径)を計測することにより、腫瘍体積をモニタリングした。
腫瘍体積を、次式：(長さ＋幅／２)3×π／６
腫瘍増殖曲線を、腫瘍体積(ｍｍ3)に基づき描いた。
腫瘍増殖阻害を、以下のように計算した：
阻害割合(％)＝１００×[１-(標的群の腫瘍体積／対照群の腫瘍体積)]
【０１９５】
体重モニタリング
細胞注射前日に動物の体重を記録し、その日に腫瘍体積をモニタリングした。
【０１９６】
自然死のモニタリング
実験の間の自然死を記録した。実験コースの間に、苦しみの徴候(悪液質、衰弱、及び移動困難)を示し、そして初期体重から２０％超減った動物を、ＣＯ2吸入により屠殺した。実験の終わり(１４日目)に、マウスをＣＯ2吸入により屠殺した。
【０１９７】
統計検定
ＳｉｇｍａＳｔａｔ３.１ソフトウェアを用いて、全ての統計分析を行った。当該ソフトウェアは、２つの群を比較するためにスチューデントｔ検定を行い、そして全ての群を比較するためにＡＮＯＶＡ試験を行った。０.０５未満のｐ値は、有意であるとみなされた。
【０１９８】
結果
死亡率
実験の間に自然死が観察され、そして苦しみの徴候を示す動物を屠殺した。１４日目に、生存率は、緩衝液群では２２.２％(９匹のうち７匹が死亡／屠殺)、２５μｇ群では５５.６％(９匹のうち４匹が死亡／屠殺)、５０μｇ群では６６.７％(９匹のうち３匹が死亡／屠殺)、１００μｇ群では９０％(１０匹のうち１匹が死亡／屠殺)、２００μｇ群では７７.８％(９匹のうち２匹が死亡／屠殺)、４００μｇ群では７７.８％(９匹のうち２匹が死亡／屠殺)であった。
【０１９９】
死亡率は、腫瘍発達と関係した。治療を受けていない群及び低用量治療群が、高い死亡率を示した。
【０２００】
体重変化
群間で体重の有意差は観察されなかった。１２日目での緩衝液群の少しの減少は、その後に屠殺された１のマウスの体重減少によって説明がつく。
【０２０１】
腫瘍体積モニタリングの比較
２人の実験者が、モニタリングの各日に、各腫瘍について２つの垂直直径を計測した。ほんの少しの差異が、各実験者により計測される腫瘍体積の間で観察された。
【０２０２】
腫瘍体積の治療効果
１の実験者が計測した腫瘍体積を、分析に用いた。結果を図８に示す。
ｐＯＲＴ-ＲＤＤで治療された腫瘍の用量依存性の阻害は、対照腫瘍に比べて観察された。抑制は、７日目に最大であり、特に２００μｇの用量で８０.３％であった：
【表１１】
2010519919.tif 000014
【０２０３】
７日後、全ての腫瘍を再び増殖し、特に、対照、２５及び５０μｇで処理させた腫瘍において増殖した。対照腫瘍増殖曲線は１４日目に減少した。なぜなら、１２日目から、少数のマウス：高い死亡率が観察されたためである。
【０２０４】
統計分析(一元配置分散分析)により、ｐＯＲＴ-ＲＤＤ処理群の阻害は、５、７、及び９日で強く有意であった(ｐ＜０.００１)。
【０２０５】
スチューデントｔ検定による２-及び-２比較により、１００、２００、及び４００μｇの群間で統計的有意性はなかったことが示された。腫瘍の再増殖のため、１２日目に、統計的有意性は、一元分散分析後に得られた。しかし、スチューデントｔ検定分析により、統計的有意差が、５０μｇと２００μｇの用量を比較した際に達成された。
【０２０６】
前述の試験に行われた初期プロトコルで、５０μｇのｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの1回用量が投与された。これは、最大で５０％の腫瘍増殖抑制をもたらした。プラスミドの漸増用量の抗腫瘍効果を評価することが決定された。まとめると、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド腫瘍内エレクトロトランスファーは、用量依存的な様式で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに予め確立されたＢ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍の増殖を有意に抑制する。
【０２０７】
最も高い阻害が得られ、そして緩衝液、２５μｇ、及び５０μｇ群に対して裁量の有意差が得られたので、２００μｇの用量は、５０ｍｍ3の腫瘍を治療するために最も有効な用量であるようだ。この用量は腫瘍１ｍｍ3あたり、４μｇに相当する。
【０２０８】
さらに、治療は、死亡率及び体重に影響がないので、最も高い用量(４００μｇ)でさえも、毒性効果を誘導しなかった。
【０２０９】
実施例５：皮下Ｂ１６Ｆ１０腫瘍においてｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの腫瘍内エレクトロトランスファーの繰り返しの評価
実施例４に記載される用量範囲実験により、２００μｇのｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの１回の腫瘍内エレクトロトランスファーは、２５、５０、１００、及び４００μｇの用量に比べて最も効果的であり、エレクトロトランスファー後７日目で、皮下メラノーマＢ１６Ｆ１０腫瘍の約８０％の増殖抑制を与えた(ｐ＜０.００１)。その後、腫瘍は再び増殖した。
これらの結果は、腫瘍増殖についての繰り返し治療の利点を評価することを促進する。こうして、本研究の目的は、０及び７日目での繰り返し治療の抗腫瘍効果を調べることである。治療は、０日目及び７日目に、２００μｇのｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの腫瘍内エレクトロトランスファーからなり、あらかじめ確立されたＢ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍マウスは第一治療において３０〜５０ｍｍ3から構成された。マウスの３つの群は、以下の：１)ビヒクル(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.９％ＮａＣｌ、ｐＨ７.５滅菌緩衝液)、２)ｐＯＲＴ-ＲＤＤ一回注射、３)ｐＯＲＴ-ＲＤＤ繰り返し注射により定められた。
【０２１０】
実験研究設計及び治療
細胞注射
Ｂ１６Ｆ１０細胞を、マウスに注射するまで最大で５回継代して培養液中に維持した。細胞を注射の日の４８時間前に継代した。
【０２１１】
細胞注射の日に、サブコンフルエントのＢ１６Ｆ１０細胞をＰＢＳですすぎ、そして次に細胞が剥離するまでトリプシン-ＥＤＴＡ溶液(Invitrogen Gibco, ref 25300-096)とインキュベートした。新たな培地を加え、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心し、そして２５ｍｌの新たな培地中に懸濁した。生存性の定量のために、細胞を０.０４％トリパンブルー中で計数した。細胞を遠心し、そして１００μｌ中に１０6Ｂ１６Ｆ１０細胞を有するように、適切な体積の０.９％ＮａＣｌ(Ｖｅｒｓｏｌ, Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ａｇｕｅｔｔａｎｔ, Ｌｙｏｎ, Ｆｒａｎｃｅ)に再懸濁した。
【０２１２】
１００μｌの細胞を、マウスの右わき腹にＳＣ経路で注射した。細胞注射の前日に、電気かみそりで事前にマウスのわき腹の毛を剃っておいた。
【０２１３】
プラスミド調製
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドをエタノール沈殿し、そして10ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.９％ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５滅菌緩衝液中に再構成することにより、プラスミド調製品(０.４μｇ／μｌ)を得て、２００μｇのプラスミドを５０μｌで注射した。
【０２１４】
試験設計
本試験は、その右わき腹に３０〜５０ｍｍ3腫瘍を有する５０匹のＣ５７ＢＬ／６メスマウスに関する。治療部位は、アトランダムで決定され、そして以下の通りである：
【表１２】
2010519919.tif 000015
【０２１５】
エレクトロトランスファープロトコル
動物を、以下の：０.５ｍｌキシラジン２％(Ｒｏｍｐｕｎ(商標)、Ｂａｙｅｒ)、２.０ｍｌのケタミン／５０ｍｇ/ｍｌ(Ketalar;Panapharma,Fougeres, France)、及び７.５ｍｌのＮａＣｌ０.９％を腹腔内注射することにより麻酔した。
【０２１６】
エレクトロトランスファー
０日目及び７日目の治療は、５０μｌのＴＥ-ＮａＣｌ緩衝液中に溶解した２００μｇのプラスミドを腹腔内注射することからなる。伝導性ゲルを腫瘍に適用した。注射後すぐに、腫瘍から５ｍｍ離して配置された２つのステンレス鋼のプレート電極を用いることにより、以下のプロトコル：
ＨＶ＝１５００Ｖ／ｃｍ、１００μｓ、１Ｈｚ、１パルス
中断時間＝１０００ｍｓ
ＬＶ＝１４０Ｖ／ｃｍ、４００ｍｓ、１パルス
に従いＣｌｉｎｉｐｏｒａｔｏｒ装置を用いて電気パルスを適用した。
０日目は、エレクトロトランスファー治療の初日に一致する。
【０２１７】
腫瘍サイズは、２つの垂直直径をデジタルキャリパーを用いて計測することによりモニターした。
腫瘍体積は、以下の式：
(長さ+幅／２)3×π／６
に従って計算した。
腫瘍増殖抑制は、以下の：
阻害％＝１００×[１-(治療群における腫瘍体積／対照群における腫瘍体積)]
に従い計算した。
【０２１８】
結果
第一に、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの２回の腫瘍内エレクトロトランスファーは安全であり、そして動物により耐用性であり、マウス体重及び死亡率について影響が観察されないということが示された。
【０２１９】
最も重要なことに、図９及び表１３に示されるように繰り返し腫瘍内エレクトロトランスファーは、１２日目にビヒクル群(ＴＥと呼ぶ)に比べて９７％の腫瘍増殖阻害、及び１回のｐＯＲＴ-ＲＤＤ群(ｐＯＲＴ-ＲＤＤ１×と呼ぶ)に比べて７６.７％の阻害を誘導した。
【０２２０】
【表１３】
2010519919.tif 000016
【０２２１】
さらに、完全な腫瘍退行は、9日目に現れ始め、２１日目に４０％の完全退行に達した(表１４)。これらの退行は、１回の治療後、最大８０日間維持された。
【０２２２】
【表１４】
2010519919.tif 000017
【０２２３】
まとめると、最良の治療プロトコルは、２００μｇの最適ｐＯＲＴ-ＲＤＤ用量で、０日目と７日目に２回の連続腫瘍内エレクトロトランスファーとして定義することができる。
【０２２４】
実施例６：皮下におけるＢ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍における１回のｐＯＲＴ-ＲＤＤ腫瘍内エレクトロトランスファーの抗腫瘍及び抗血管新生効果の研究
この研究の目的は、ビヒクルに比べて、予め確立された皮下Ｂ１６Ｆ１０腫瘍における一回の治療用のｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの腫瘍内エレクトロトランスファーの効力を調査することである。腫瘍増殖についての効力は、ドップラー超音波診断により得られた腫瘍体積及び腫瘍血管により、腫瘍増殖についての効果が評価された。
【０２２５】
材料と方法
細胞株と培養条件
１０％熱不活性化胎児ウシ血清、１.５ｇ／ｌ炭酸水素ナトリウム及び抗生物質(１００ＵＩ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇｉｂｃｏ、ref 15140-122)を添加したダルベッコ改変イーグル培地＋ＧｌｕｔａＭａｘ中で、３７℃で加湿５％ ＣＯ2雰囲気下でＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を増殖させた。
【０２２６】
動物
メス６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６のマウスをＪａｎｖｉｅｒ(Le Genest-St-Isle, France)から購入した。全ての動物実験を、動物実験倫理ガイドライン(Directive No 86/609CEE)に従って行い、そしてＢｉｏＡｌｌｉａｎｃｅ Ｐｈａｒｍａ倫理委員回から承認を得た。
【０２２７】
実験が行われる領域内で腫瘍細胞の移植前少なくとも４日間動物を馴化させた。動物を温度(２１℃)、明期(明１２時間／闇１２時間)及び換気(１時間あたり１２回の換気)の制御された条件下で室温にて維持した。湿度を３０〜７０％に維持した。
【０２２８】
統計試験
ＳｉｇｍａＳｔａｔ３.１ソフトウェアを用いて全ての統計分析を行った。２つの群を比較するために、当該ソフトウェアは、正規性検定及び等分散検定がうまく行われた場合にスチューデントｔ検定を行った。これらの検定が失敗した場合は、当該ソフトウエアは、マン・ホイットニー順位和検定を行った。各々の分析について、使用者は自由に各統計試験を受容する。０.０５未満のｐ値を有意とみなした。
【０２２９】
実験試験設計及び処理
細胞注入
Ｂ１６Ｆ１０細胞を、注射の日前４８時間継代培養した。
【０２３０】
サブコンフルエントのＢ１６Ｆ１０細胞を、ＰＢＳですすぎ、そして次に細胞が剥離するまでトリプシンーＥＤＴＡ溶液(Invitrogen Gibco, Ref２５３００-０９６)とインキュベートした。新たな培地を加え、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心し、そして２５ｍｌの新たな培地中に再懸濁した。生存性の定量のために、細胞を０.０４％トリパンブルー中で計数した。細胞を遠心し、そして１００μｌ中に１０6個のＢ１６Ｆ１０細胞を得るために適切な量の０.９％ＮａＣｌ(Versol, Laboratoire Aguettant, Lyon, France)に再懸濁した。
【０２３１】
１００μｌの細胞を、マウスの右わき腹にＳＣ経路で注射した。細胞注射の前日に、電気かみそりで事前にマウスのわき腹の毛を剃っておいた。
【０２３２】
プラスミド調製
２００μｇのプラスミドを５０μｌで注射し、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを得たエタノール沈殿することにより４.０μｇ／μｌでプラスミドを調製し、そして１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ,０.９％ＮａＣｌ、ｐＨ７.５滅菌緩衝液中に懸濁した。
【０２３３】
試験設計
皮下Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６メスマウスを以下の群数に割り当てた。
【表１５】
2010519919.tif 000018
【０２３４】
プラスミドのエレクトロトランスファー(０日目)
０.５ｍｌキシラジン２％(Ｒｏｍｐｕｎ(商標)、Ｂａｙｅｒ)、２.０ｍｌケタミン５０ｍｇ／ｍｌ(Ｋｅｔａｌａｒ；Ｐａｎｐｈａｒｍａ、Ｆｏｕｇｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ)、７.５ｍｌ  ＮａＣｌ０.９％を含む０.２ｍｌのケタミン／キシラジン混合物を腹腔内注射により動物を麻酔した。
【０２３５】
治療は、５０μｌのＴＥ-ＮａＣｌ緩衝液中に２００μｇのプラスミドを含む１回の腫瘍内注射からなった。
【０２３６】
伝導性ゲルを腫瘍に適用した。注射後すぐに、腫瘍から５ｍｍはなして配置された２つのステンレス鋼プレート電極を使用することにより、以下のプロトコル：
ＨＶ＝１５００  Ｖ／ｃｍ、１００μｓ、１Ｈｚ、１パルス
中断時間＝１０００ｍｓ
ＬＶ＝１４０Ｖ／ｃｍ、４００ｍｓ、１パルス
に従いＣｌｉｎｐｏｒａｔｏｒ(商標)デバイスを用いて電気パルスを適用した。
【０２３７】
腫瘍体積のモニタリング及び腫瘍増殖の研究
２つの線形プローブを備えたＡｐｌｉｏ超音波装置(Ｔｏｓｈｉｂａ)を用いてすべてのモニタリングを行った：Ｂモード及びＰｏｗｅｒＤｏｐｐｌｅｒ試験には１４ＭＨｚプローブ(優れた感受性及び解像度)、そしてＶＲＩモード(Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ)において造影剤を用いた浸透試験には９ＭＨｚプローブを用いた。
【０２３８】
マウスを０日のケタミン／キシラジン混合物を腹腔内注射することにより麻酔し、そして１、２、３、４、及び７日目にイソフルラン吸入することにより麻酔した。
【０２３９】
腫瘍体積モニタリング
腫瘍体積を、Ｂモードで幅、長さ、及び深さを計測することにより測定した。超音波Ｂモードは、グレースケールに基づいて器官の形態及び組織の表示を可能にした。かかるＢモードイメージに基づく、腫瘍の寸法が計測され、そして壊死は、低エコー領域の程度により定量的に認めることができる。
【０２４０】
超音波計測は、１４ＭＨｚ線形プローブを用いたスキャン上で、最大の横及び縦の腫瘍断面を発見することからなる。横及び縦断面を、マウスの体に対して規定した。縦断面で長さを計測し、幅及び深さを横断面で計測した。これらの計測を、カリパーを用いて超音波で直接行った。最大横及び縦スキャンが、記録され、そして印刷された。
【０２４１】
腫瘍体積を、以下の式：
体積(ｍｍ3)＝(長さ×幅×深さ)／２
に従い計算した。
【０２４２】
腫瘍血管の数
各腫瘍を、１４ＭＨｚプローブを用いて、腫瘍体積内の血管の数を計数するためにＤｏｐｐｌｅｒ Ｐｏｗｅｒモードで横断面と縦断面の両方でスキャンした。Ｄｏｐｐｌｅｒ Ｐｏｗｅｒモードは、カラースケールで、かつＢモード画像と重ね合わせて、血管ルーメン中に循環する赤血球細胞により後方散乱された超音波を表す。連続プローブ移動による腫瘍スキャンに対応するビデオシーケンスが記録され、全腫瘍体積上の３Ｄ定量を可能にした。これらのシーケンスは、腫瘍内血管の数を測定するために、オペレーターにより後で再考された。色彩ピクセルクロットは、腫瘍ない血管のマーカーとして考えられ、これらのピクセルは、血流の連続フローアップを示す連続腫瘍部分において繰り返し発見された。横断面と縦断面において血管の平均数を血管の平均として計算した。
【０２４３】
結果
腫瘍体積モニタリング
腫瘍体積は、ビヒクル群に比べて、ｐＯＲＴ-ＲＤＤ処理により、４日目において７７.５％、そして７日目において８９.２％有意に阻害された(スチューデントｔ検定、ｐ＜０.００１及びｐ＝０.００６)(図１０)。
【０２４４】
血管モニタリング
腫瘍血管の数は、ビヒクル群に比べてｐＯＲＴ-ＲＤＤ処理により、４日目に７０.１％、そして７日目に７８.１％だけ有意に阻害された(スチューデントｔ検定、ｐ＜０.００１及びｐ＝０.００１)(図１１)
【０２４５】
まとめると、これらの結果により、ｐＯＲＴ-ＲＤＤ腫瘍内エレクトロトランスファーは、腫瘍増殖阻害に関連して、最大で腫瘍血管の数を最大７８％有意に阻害した。これらの結果により、内皮細胞とメラノーマ細胞の両方について、ディスインテグリンフラグメントの二重の活性が確認された。
【０２４６】
実施例７：ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドバッチの特徴決定のためのin vitro効力アッセイの開発：メラノーマ細胞トランスフェクション後の増殖アッセイ
この研究の目的は、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド(ＢＡ０１５-ＶＣＣ-００４と呼ぶ)とリポフェクタミンＰｌｕｓ(商標)プロトコルを用いたメラノーマ細胞のトランスフェクションに基づくin vitro効力アッセイを発達させることであった。アッセイは、ＭＴＴ試薬でトランスフェクション後９６時間で、生存細胞の割合を測定した。
【０２４７】
材料と方法
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドは、ＬＢ培地で増殖させた宿主ＤＨ１-ＯＲＴ株において産生され、そして前に記載されたように精製された。当該プラスミドを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.９％ＮａＣｌ、ｐＨ７.５で剤形し、そして-２０℃で凍結させた。
【０２４８】
細胞株及び培養条件
１０％熱不活化胎児ウシ血清(Invitrogen Gibco, ref 10270-106)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ+ＧｌｕｔａＭａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇｉｂｃｏ、ref61965-026)でヒトＣ９メラノーマ細胞を増殖させた。
【０２４９】
１０％熱不活化胎児ウシ血清、１.５ｇ／ｌ炭酸水素ナトリウム(Invitrogen Gibco, ref 25080-060)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ+ＧｌｕｔａＭａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇｉｂｃｏ、ref61965-026)でＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ-６４７５)を増殖させた。
【０２５０】
１.５ｇ／ｌ炭酸水素ナトリウム(Invitrogen Gibco, Cat no.25080-060)及び２ｍＭ Ｌ-グルタミン(Invitrogen,Catno.25030-024)及び０.００５ｍｇ／ｍｌウシインスリン(Sigma、ref. 10516-5ML)、１.６８ｍＭ  ＣａＣｌ2(Cambrex, Cat no. CC-4202)、及び２％熱不活化胎児ウシ血清(Invitrogen、Cat No. 10270-106)を添加したLeibovitz's L-15培地(Invitrogen, Cat No.11415-049)中で、ヒト４５１Luメラノーマ細胞(ATCC CRL-2813)を増殖させた。
【０２５１】
凍結細胞のバイアルを、１のバイアルから製造し、そして液体窒素中に維持した。
【０２５２】
加湿５％ＣＯ2雰囲気において、３７℃にて、細胞を週２回継代した(Ｃ９細胞について１：１０希釈、Ｂ１６Ｆ１０細胞について１：１５、及び４５１Ｌｕ細胞について１：４)。継代培養では、培地を取り除き、ＰＢＳですすぎ、そして(７５ｃｍ2フラスコに対して)２ｍｌのトリプシン-ＥＤＴＡ溶液(Invitrogen Gibco, ref 25300-096)を加えた。細胞が剥離するまでフラスコを室温に静置した。新たな培地を加え、５分間１２００ｒｐｍで遠心し、培地を吸引し、新たな培地を加え、そして細胞を新たなフラスコに懸濁した。
【０２５３】
トランスフェクション及び増殖アッセイ
トランスフェクションの前日、マルチウェル２４プレートを、１ウェルあたり５００μｌで、１５０００個のＢ１６Ｆ１０細胞、３００００個のＣ９細胞、又は３００００個の４５１Ｌｕ細胞を調製した。
トランスフェクションの当日(プレート作成の翌日)、細胞を計数して、１ウェルあたりの細胞数を確認した(少なくとも前日に播種された数)。細胞は、〜５０％コンフルエントであるべきである。
【０２５４】
トランスフェクションサンプルを、無血清培地：Ｂ１６Ｆ１０及びＣ９細胞についてはＤＭＥＭ(Invitrogen, Cat no. 61965-026)、及び４５１Ｌｕ細胞についてはＯｐｔｉ-ＭＥＭ(商標)(Invitrogen、Cat No. 51985-026)に調製した。
【０２５５】
ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの漸増用量を、１条件あたり４個のウェルにトランスフェクトした(１ウェルあたり、０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、１.５、及び２.０μｇ)。
【０２５６】
全てのＤＮＡ用量について、サンプルを１のＤＮＡ溶液から調製した(バッチの１：１０希釈)。
【０２５７】
２μｌのリポフェクタミン／５μｌの試薬ＰＬＵＳ(商標)の比を選択して、細胞障害性を限定的なものにし、そして製品プロトコルに推奨されるＤＮＡの漸増量を変更しなかった。
【０２５８】
トランスフェクション混合物を、以下のプロトコルに従い、滅菌５ｍｌのポリスチレン丸底チューブ中に調製した。人差し指でチューブのそこを２回ゆっくりタッピングすることにより撹拌を行った。
【０２５９】
混合物の調製：混合物を平行して調製した
混合物１：ＤＮＡ／試薬ＰＬＵＳ(商標)
試薬ＰＬＵＳ(商標)／リポフェクタミン培地のみを含むチューブを、ＤＮＡを含まないリポフェクタミン対照として各実験で調製した。
【表１６】
2010519919.tif 000019
【０２６０】
表１７は、ＤＮＡ体積に依存した詳細なサンプル調製を記載する(プラスミドバッチの例は、０.１９６ｍｇ／ｍｌ)に希釈した。まず培地に播種し、次に試薬ＰＬＵＳそして最後にＤＮＡをいれた。
【０２６１】
【表１７】
2010519919.tif 000020
【０２６２】
混合物２：リポフェクタミン(商標)
１のチューブを全てのトランスフェクション条件のために調製した。
【表１８】
2010519919.tif 000021
【０２６３】
各混合物を室温で１５分間インキュベートした。
次に予め複合体形成したＤＮＡ(混合物１)と希釈されたリポフェクタミン(混合物２)を合わせ、２００μｌの混合物２を１滴ずつ混合物１に加えて(混合物１＋混合物２終量＝４００μｌ)、複合体ＤＮＡを調製した。様々な量のＤＮＡを有する各混合物を室温で１５分間インキュベートした。
【０２６４】
細胞を、１ウェルあたり５００μｌの無血清培地で洗浄した。
１６００μｌの無血清培地を、混合物１＋２に加え、それにより４のウェルについて収量２ｍｌを達成した。
無血清培地を細胞から取り除き、そして無血清培地に希釈した５００μｌの混合物１＋２を１ウェル毎に加えた。このステップは、１つずつの条件で行った(４ウェル／４ウェル)。
【０２６５】
３７℃５％ＣＯ2で正確に４時間細胞をインキュベートした。トランスフェクション混合物を、１ウェルあたり７５０μｌの完全培地で置き換え、そして細胞を３７℃５％ＣＯ2で９６時間インキュベートした。
【０２６６】
増殖アッセイの開示
96時間のインキュベートの後に、生存している細胞を、ＭＴＴ(３-(４,５-ジメチルチアゾール-２-イル)-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)試薬に暴露した。
【０２６７】
細胞を、２５０μｌのＰＢＳとインキュベートし、そして５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ(Ｓｉｇｍａ)とインキュベートした。３７℃２時間のインキュベート後、２５０μｌの溶解緩衝液(２０％ＳＤＳ、３３％ジメチルホルムアミド、２％酢酸、０.０２５ＮのＨＣｌ、０.０５ＮのＮａＯＨ)を一晩加えた。２００μｌの各サンプルを９６ウェルプレートに分配し、５７０ｎｍで光学密度を読み取った。
【０２６８】
結果
３の細胞株について、用量依存的に細胞増殖抑制を観察した(図１２、１３、及び１４)。
【０２６９】
実施例８：ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの凍結乾燥及びin vitro評価
高用量のｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを注射することを可能にするために、凍結乾燥プロセスが開発され、当該プロセスは、高濃度のｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを提供することができる。
【０２７０】
凍結乾燥プロトコル
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.５に剤形された４０ｍｇのｐＯＲＴ-ＲＤＤは、凍結乾燥され、以下の凍結乾燥プロトコルに従って、５ｍｌガラス製バイアルあたり２ｍｇ、２％マンニトール、及び１％グルコースにされた。
【表１９】
2010519919.tif 000022
【０２７１】
アガロースゲル電気泳動によるプラスミド分析
１のバイアル(２ｍｇ)を、滅菌０.９％ＮａＣｌを加えることにより滅菌条件下で、２ｍｇ／ｍｌに再構成した。
１μｇのＤＮＡを、１％アガロースゲルで分析した。
サンプル(凍結乾燥されていないプラスミド、及び凍結乾燥されたプラスミド)
水を加えて１０μｌにする
１μｌの充填緩衝液を加える
ゲルにロードし、そして泳動する(１Ｋｂラダー、Invitrogen、パラレル)
ｐＯＲＴ-  ＲＤＤ凍結乾燥され、再構成されたプラスミドのＤＮＡプラスミド形態は、ｐＯＲＴ-ＲＤＤ非凍結乾燥プラスミドと比べられた。
【０２７２】
図１５に示されるように、同量の凍結乾燥されたプラスミド及び凍結乾燥されていないプラスミドの泳動後にアガロースゲル上で差異は検出可能ではなかった。分解の徴候はなく、そして各プラスミド形態の等しい量が存在した。
【０２７３】
細胞増殖アッセイによるプラスミド分析
凍結乾燥プロセスが、ｐＯＲＴ-ＲＤＤの生物学的活性に影響しないということを示すために、実施例７に詳細に示された最適化リポフェクタミンＰｌｕｓプロトコルに従って、ヒトＣ９及び４５１Ｌｕメラノーマ細胞を、漸増量の凍結乾燥されたｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド及び凍結乾燥されていないｐＯＲＴ-ＲＤＤでトランスフェクトされた。
【０２７４】
トランスフェクション後９６時間において、ＭＴＴ試薬により生存細胞を明らかにした。
【０２７５】
結果を図１６及び図１７に示す。バッチ３は、非凍結乾燥ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドに一致し、そしてバッチ４は、凍結乾燥プラスミドに一致する。
【０２７６】
同様の抑制プロファイルは、両方の細胞株について、凍結乾燥されたプラスミドと、凍結乾燥されていないプラスミドとの間で得られた。
【０２７７】
こうして、変性の徴候が観察されていないので、開発された凍結乾燥プロセスが、プラスミド完全性と、生物学的活性の両方の点で安全であることが示された。凍結乾燥されたバッチと凍結乾燥されていないバッチは、トランスフェクション後にメラノーマ細胞増殖について比較可能な阻害効果を示すことが示された。
【０２７８】
まとめると、これらの結果により、さらなるｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドバッチについての凍結乾燥プロセスの使用が可能になる。
【０２７９】
実施例９：皮下Ｂ１６Ｆ１０腫瘍内で、凍結乾燥されたｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの１回の腫瘍内エレクトロトランスファーの評価
この試験の目的は、最適２００μｇ用量で投与され、そして最終製品であるｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド(２％マンニトール、１％グルコース中に凍結乾燥される)は、凍結乾燥されないプラスミドと同じよう式で、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍増殖を阻害する。治療は、皮下の予め確立されたＢ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍において、ビヒクル(ＴＥ-ＮａＣｌ緩衝液)、凍結乾燥された偽薬(２％マンニトール、１％グルコースの凍結乾燥用液)、又は２００μｇのｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミド(凍結乾燥されるかされていない)からなる。この目的では、腫瘍体積は、３０〜５０ｍｍ3から構成され、そして３つの群は、１)ビヒクル、２)沈殿により４ｍｇ／ｍｌに調製された２００μｇのｐＯＲＴ-ＲＤＤ、及び３)４ｍｇ／ｍｌで調製された２００μｇのｐＯＲＴ-ＲＤＤの凍結乾燥バッチで治療された。腫瘍体積を治療後１４日間モニタリングした。
【０２８０】
実験研究設計及び治療
細胞注入
Ｂ１６Ｆ１０細胞を、注射の日前４８時間継代培養した。
サブコンフルエントのＢ１６Ｆ１０細胞を、ＰＢＳですすぎ、そして次に細胞が剥離するまでトリプシンーＥＤＴＡ溶液(Invitrogen Gibco, Ref２５３００-０９６)とインキュベートした。新たな培地を加え、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心し、そして２５ｍｌの新たな培地中に再懸濁した。生存性の定量のために、細胞を０.０４％トリパンブルー中で計数した。細胞を遠心し、そして１００μｌ中に１０6個のＢ１６Ｆ１０細胞を得るために適切な量の０.９％ＮａＣｌ(Versol, Laboratoire Aguettant, Lyon, France)に再懸濁した。
【０２８１】
１００μｌの細胞を、マウスの右わき腹にＳＣ経路で注射した。細胞注射の前日に、電気かみそりで事前にマウスのわき腹の毛を剃っておいた。
【０２８２】
プラスミド調製
２００μｇのｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを５０μｌで注射された群では、プラスミドをエタノール沈殿し、そして１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ,０.９％ＮａＣｌ、ｐＨ７.５滅菌緩衝液中に再懸濁することにより、することにより４.０μｇ／μｌのプラスミドを調製した。
再構成された凍結乾燥プラスミドを注射された群については、必要とされるバイアルを、滅菌０.９％ＮａＣｌで４μｇ／μｌに再構成した。
【０２８３】
試験設計
本試験は、その右わき腹に３０〜５０ｍｍ3の腫瘍を有する５０匹のＣ５７ＢＬ／６メスマウスに関した。治療配は、ランダムに、そして以下のとおりに行った。
【表２０】
2010519919.tif 000023
【０２８４】
エレクトロトランスファープロトコル
以前に記載されるように動物を麻酔した。
５０μｌのＴＥ-ＮａＣｌ緩衝液中に２００μｇのプラスミドを、１回腫瘍内注射することからなった。伝導性ゲルを腫瘍に適用した。注射のすぐ後に、腫瘍から５ｍｍ離して配置された２つのステンレス鋼プレート電極を用いて、プロトコルにしたがってＣｌｉｎｉｐｏｒａｔｏｒ装置を用いて電気パルス適用をした(ｐＶＡＸ-ＲＤＤ腫瘍内装置で以前に用いられた)：
ＨＶ＝１５００Ｖ／ｃｍ、１００μｓ、１Ｈｚ、１パルス
中断時間＝１０００ｍｓ
ＬＶ＝１４０Ｖ／ｃｍ、４００ｍｓ、１パルス
【０２８５】
動物モニタリング及び屠殺
デジタルキャリパーを用いて、２つの垂直直径(最長かつ最大の直径)を計測することにより、腫瘍サイズをモニタリングした。
腫瘍体積を、以下の式：(長さ＋幅／２)3×π／６
腫瘍体積を、以下の式：
阻害割合(％)＝１００×[１-(治療群の腫瘍体積／対照群の腫瘍体積)]
により計算した。
【０２８６】
結果
図１８及び表２１に示されるように、凍結乾燥されたプラスミド及び凍結乾燥されていないプラスミドの両方は、有意にＢ１６Ｆ１０腫瘍増殖を阻害する。同様の腫瘍増殖曲線は、凍結乾燥されたプラスミド及び凍結乾燥されていないプラスミドについて得られた。
【０２８７】
最も重要なことに、全ての実験のあいだに凍結乾燥されていないｐＯＲＴ-ＲＤＤ治療群と凍結乾燥されたｐＯＲＴ-ＲＤＤ治療群との間で、有意差は観察されない。
【０２８８】
【表２１】
2010519919.tif 000024
【０２８９】
まとめると、これらの結果により、凍結乾燥プロセスは、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの生物学的活性について効果的である。凍結乾燥されたバッチ及び凍結乾燥されていないバッチは、Ｂ１６Ｆ１０皮下腫瘍増殖についてかなりの阻害効果を示す。
【０２９０】
実施例１０：Ｂ１６Ｆ１０皮下腫瘍増殖について、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの筋肉内エレクトロトランスファーの予防効果の評価
本試験の目的は、腫瘍細胞の摂取前にマウス筋肉にエレクトロトランスファーされた際に、ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドの、Ｂ１６Ｆ１０皮下腫瘍増殖についての効果を潜在的な予防を決定することである。
【０２９１】
治療は、-１日目において、Tibialis cranialis 筋肉中に４００μｇのｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドをエレクトロトランスファーすることからなる(各Tibialiscranialis muscleにおいて５０μｌ中に２００μｇ)。同一の実験条件下で、対照動物はビヒクルを受容した。次に、エレクトロトランスファー治療した日(０日目)に腫瘍細胞を、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの右わき腹に注射した。腫瘍の発達及び腫瘍体積を常にモニターした。
【０２９２】
実験試験デザイン及び治療
プラスミド調製
マウス１匹あたり、合計で４００μｇの量の凍結乾燥ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドを、１００μｌの体積で注射した(Tibialis Cranialis筋肉各々に５０μｌ)。滅菌凍結乾燥バイアルのプラスミドを、注射のために水を加えることにより４ｍｇ／ｍｌに再構成した。プラスミド懸濁液を４℃にて注射時間のあいだ維持した。
【０２９３】
試験設計
当該試験は、３０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウスを含んだ。
治療配分は、ランダムに決定し、以下のとおりであった：
【表２２】
2010519919.tif 000025
【０２９４】
エレクトロポレーションまえに、動物を、０.２ｍｌのケタミン／キシラジン混合物を腹腔内注射することにより麻酔した。
治療は、マウスのTibialis cranialis筋肉の各々において、注射用の水５０μｌに、２００μｇのプラスミドを筋肉内注射することからなり、その後すぐにエレクトロポレーションを行った。伝導性ゲルを足に適用した。注射のすぐ後に、腫瘍から５ｍｍ離して配置された２つのステンレス鋼プレート電極を用いて、プロトコルにしたがってＣｌｉｎｉｐｏｒａｔｏｒ装置を用いて電気パルス適用をした：
ＨＶ＝７００Ｖ／ｃｍ(つまり、３５０Ｖ)、１００μｓ、１Ｈｚ、１パルス
中断時間＝１０００ｍｓ
ＬＶ＝１００Ｖ／ｃｍ(つまり、５０Ｖ)、４００ｍｓ、１パルス
１日目は、エレクトロトランスファー治療をした日に対応する。
筋肉内エレクトロトランスファーの前日に、背中の毛を電気かみそりで剃った。治療の日に、手に印をつけ、足の毛を剃ってマウスを識別した。
【０２９５】
細胞注射
エレクトロトランスファー処理(０日目)の次の日にＢ１６Ｆ１０細胞に注射をした。
B16F10細胞を、培地に維持して、マウスに注射前に最大８回継代した。注射の日前に、細胞を４８〜７２時間培養した。
【０２９６】
細胞接種の日にサブコンフルエントのＢ１６Ｆ１０細胞を、ＰＢＳですすぎ、そして次に細胞が剥離するまでトリプシンーＥＤＴＡ溶液(Invitrogen Gibco, Ref２５３００-０９６)と３７℃でインキュベートした。新たな培地を加え、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心し、そして５０ｍｌの新たな培地中に再懸濁した。生存性の定量のために、細胞を０.０４％トリパンブルー中で計数した。細胞を遠心し、そして１００μｌ中に１０6個のＢ１６Ｆ１０細胞を得るために適切な量の０.９％ＮａＣｌ(Versol, Laboratoire Aguettant, Lyon, France)に再懸濁した。
【０２９７】
１００μｌの細胞を、マウスの右わき腹に皮下経路で注射した。
【０２９８】
動物モニタリング及び屠殺
B16F10腫瘍細胞注射後(０日目)、腫瘍が、触診可能になるまで定期的にモニターした(約５日〜７日)。次に、腫瘍体積を、デジタルキャリパーを用いて、２つの垂直直径(最長かつ最大の直径)を計測することにより、腫瘍体積をモニタリングした。
腫瘍体積を、以下の式：(長さ＋幅／２)3×π／６に従い計算した。
腫瘍増殖阻害を、以下のように計算した：
阻害割合(％)＝１００×[１-(治療群の腫瘍体積／対照群の腫瘍体積)]
【０２９９】
結果
【表２３】
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図１９及び２０、並びに表２３に示されるように、４００μｇの筋肉内ｐＯＲＴ-ＲＤＤプラスミドのエレクトロトランスファーは、対照ビヒクル群に比べて６日目で７５.９％の腫瘍増殖の阻害を誘導し、そして７日目から試験の終わりまで、約２５〜３５％の抑制をもたらした。ｐＯＲＴ-ＲＤＤ治療群と対照群とのあいだの６日目の差異は、治療群における皮下腫瘍の移植の遅れにより説明することができる。実際、実験のこの時点で、より少ない腫瘍(より小さい体積)しかマウスにおいて検出されなかった。
【０３００】
治療群と対照群との間の差異は、１６日目(３３.６％)と、１９日目(２８.７％)で有意であった(ｐ値＜０.０５)。
【０３０１】
さらに、表２４において示されるように、ｐＯＲＴ-ｒＤＤプラスミド治療は、Ｂ１６Ｆ１０皮下腫瘍増殖を有意に遅くすることができる。実際１０００ｍｍ3及び２０００ｍｍ3の腫瘍体積に達するための平均時間は、対照群に比べて治療群において低い。
【表２４】
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【０３０２】
これらの結果により、全身性ＡＭＥＰは、ｐＯＲＴ-ＲＤＤの筋肉エレクトロトランスファーのおかげによりＢ１６Ｆ１０腫瘍増殖移植を抑制することができる。
７日のインターバルにおける繰り返しの筋肉エレクトロトランスファー治療は、この全身性保護効果を増加することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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