(57)【要約】ヒト成長ホルモンのＧｌｎ−４０及びＧｌｎ−１４１に対する向上した選択性を有するＳモバレンス由来のトランスグルタミナーゼ変異体が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、配列番号１の位置Ａｓｐ−４，Ｖａｌ−３０，Ｔｙｒ−６２，Ｔｙｒ−７５，Ａｒｇ−８９，Ｇｌｕ−１１５，Ｓｅｒ−２１０，Ａｓｐ−２２１，Ａｌａ−２２６，Ｐｒｏ−２２７，ＧＩｙ− ２５０，Ｖａｌ−２５２，Ａｓｎ−２５３，Ｐｈｅ−２５４，Ｈｉｓ−２７７，Ｔｙｒ−２７８，Ｌｅｕ−２８５，Ｔｙｒ−３０２，Ａｓｐ−３０４，及びＬｙｓ−３２７に相当するアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基の一又は複数が修飾されている、単離されたペプチド。
【請求項２】
配列番号１に定義されたアミノ酸配列を含んでなり、Ａｓｐ−４，Ｖａｌ−３０，Ｔｙｒ−６２，Ｔｙｒ−７５，Ａｒｇ−８９，Ｇｌｕ−１１５，Ｓｅｒ−２１０，Ａｓｐ−２２１，Ａｌａ−２２６，Ｐｒｏ−２２７，ＧＩｙ− ２５０，Ｖａｌ−２５２，Ａｓｎ−２５３，Ｐｈｅ−２５４，Ｈｉｓ−２７７，Ｔｙｒ−２７８，Ｌｅｕ−２８５，Ｔｙｒ−３０２，Ａｓｐ−３０４，及びＬｙｓ−３２７から選択されるアミノ酸残基の一又は複数が修飾されている、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
前記配列の、配列番号１のＣｙｓ−６４に相当するアミノ酸残基から２０Å以内に位置するアミノ酸残基の一又は複数が修飾されている、請求項１又は２に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
配列の、配列番号１の位置Ｃｙｓ−６４に相当する位置が修飾されていない、請求項１ないし３のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
配列番号６に定義されたような、アミノ酸配列を含んでなる単離されたペプチド。
【請求項６】
ペプチドがトランスグルタミナ−ゼ活性を有する、請求項１ないし５のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
ペプチドがｈＧＨのＧｌｎ−４０と比較してｈＧＨのＧｌｎ−１４１に特異性を有し、該特異性が、配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するペプチドの、ｈＧＨのＧｌｎ−４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ−１４１に対する特異性よりも高いものである、請求項１ないし６のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
ｈＧＨのＧｌｎ−４０と比較してｈＧＨのＧｌｎ−１４１に特異性を有し、該特異性が、配列番号１に示されたようなアミノ酸配列を有するペプチドの、ｈＧＨのＧｌｎ−４０と比較したときのｈＧＨのＧｌｎ−１４１に対する特異性よりも高いものである、トランスグルタミナーゼペプチド。
【請求項９】
トランスグルタミナーゼペプチドが、請求項１ないし６のいずれかに記載のペプチドである、請求項８に記載のトランスグルタミナーゼペプチド。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸コンストラクト。
【請求項１１】
請求項１０の核酸コンストラクトを含んでなるベクター。
【請求項１２】
請求項１１のベクターを含んでなるホスト。
【請求項１３】
請求項１ないし９のいずれかに記載のペプチドを含んでなる組成物。
【請求項１４】
ペプチドをコンジュゲートするための方法であって、前記ペプチドを、請求項１ないし９のいずれかに記載のペプチドの存在下でアミン供与体と反応させることを含む方法。
【請求項１５】
前記成長ホルモンがｈＧＨである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
位置Ｇｌｎ−４０でコンジュゲートされたｈＧＨ量と比較した位置Ｇｌｎ−１４１でコンジュゲートされたｈＧＨ量が、前記方法において請求項１ないし９のいずれかに記載のペプチドの代わりに配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するペプチドが使用されたときの位置Ｇｌｎ−４０でコンジュゲートされたｈＧＨ量と比較した位置Ｇｌｎ−１４１でコンジュゲートされたｈＧＨ量と比較して有意に増加する、ｈＧＨをコンジュゲートするための請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｈＧＨを、請求項１ないし９のいずれかに記載のペプチドの存在下でアミン供与体と反応させることを含む、位置１４１に相当する位置でコンジュゲートされたｈＧＨの調製方法。
【請求項１８】
コンジュゲートされたｈＧＨがペグ化ｈＧＨの調製に使用され、ここで前記ペグ化がコンジュゲートされた位置で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体を、請求項１ないし９のいずれかに記載のペプチドの存在下でアミン供与体と反応させる段階を含む、コンジュゲートされた成長ホルモンの医薬品の調製方法。
【請求項２０】
コンジュゲートされた成長ホルモンの医薬品の調製方法であって、前記ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体を、請求項１ないし９のいずれかに記載のペプチドの存在下でアミン供与体と反応させ、及びその結果得られたコンジュゲートされた成長ホルモンを、ペグ化成長ホルモンの調製に使用する段階を含み、ここで前記ペグ化がコンジュゲートされた位置で行われる、方法。
【請求項２１】
コンジュゲートされた成長ホルモンの調製における、請求項１ないし９のいずれかに記載のペプチドの使用。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法を使用して調製される医薬品を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における成長ホルモンの欠乏に関連する疾病又は疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレプトマイセス・モバレンス(Streptomyces mobaraense)由来のトランスグルタミナーゼの新規の変異体に関する。この変異体は、改善された選択性を有するペプチドを修飾するために使われてもよい。
【背景技術】
【０００２】
適切に性質を変えるタンパク質に基をコンジュゲートすることによってペプチドの性質及び特徴を修飾することは、周知である。特に治療用のペプチドにとって、ペプチドの半減期を延長するペプチドへの基のコンジュゲートは、望ましいか又は、更に必要である。一般的に、このようなコンジュゲート基はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)又は脂肪酸である−J.Biol.Chem. 271, 21969-21977 (1996)を参照。
既にトランスグルタミナーゼ(ＴＧアーゼ)を用いてペプチドの性質が変更されている。食品産業、特にダイアリー産業において、例えばＴＧアーゼを用いた交差結合ペプチドには多くの技術が有用である。他の文書は、生理的に活性なペプチドの性質を変更するためのＴＧアーゼの使用を開示する。欧州特許第９５０６６５号、欧州特許第７８５２７６号及びSato, Adv. Drug Delivery Rev. 54, 487-504 (2002)は、ＴＧアーゼの存在下で、少なくとも一のＧｌｎとアミン-機能化ＰＥＧないしは類似のリガンドを含んでなるペプチド間の直接反応を開示し、Biotech. Lett. 23, 1367-1372 (2001)においてWadaは、ＴＧアーゼによる脂肪酸とのβ-ラクトグロブリンの直接的なコンジュゲートを開示する。国際特許出願の国際公開第２００５０７０４６８号は、ＴＧアーゼを用いて官能基をグルタミン含有ペプチドに組み込んで機能化ペプチドを形成してもよいこと、そしてその後の工程においてこの機能化ペプチドを該機能化タンパク質と反応しうるＰＥＧなどと反応させてＰＥＧ化ペプチドを形成してもよいことを開示している。
【０００３】
また、トランスグルタミナーゼ(Ｅ.Ｃ.2.3.2.13)は、タンパク質-グルタミン-γ-グルタミルトランスフェラーゼとして知られていて、以下のような一般的な反応を触媒する。
2010500885.tif 000002
このとき、Ｑ-Ｃ(Ｏ)-ＮＨ２はグルタミン含有ペプチドを表し、次いでＱ'-ＮＨ２は、上記の反応においてペプチドに取り込まれる官能基を提供するアミンドナーを表す。
【０００４】
インビボにおいて一般的なアミンドナーはペプチド結合リジンであり、次いで上記の反応によりペプチドの交差結合が生じる。凝固因子第XIII因子は、損傷の際の血液の凝固に作用するトランスグルタミナーゼである。例えばＧｌｎのまわりのどのアミノ酸残基が、タンパク質が基質であるために必要であるかは、異なるＴＧアーゼで互いに異なる。すなわち、異なるＴＧアーゼは、どのアミノ酸残基がＧｌｎ残基に隣接しているかによって異なるＧｌｎ含有ペプチドを基質として有するであろう。修飾されるペプチドが一以上のＧｌｎ残基を含有する場合に、この態様が利用されうる。存在するＧｌｎ残基のいくつかでのみペプチドを選択的にコンジュゲートすることが望ましい場合、関連するＧｌｎ残基(一又は複数)を基質として受け入れるだけであるＴＧアーゼの選別によってこの選択性が可能となりうる。
ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)は１１のグルタミン残基を含んでなり、任意のＴＧアーゼが媒介するｈＧＨのコンジュゲートは低選択性によって潜在的に妨害される。特定の反応条件下において、Ｓ．モバレンスＴＧアーゼ媒介反応においてｈＧＨが機能化される上記の２工程のコンジュゲート反応は、２つの位置、すなわち４０-Ｇｌｎ及び１４１-Ｇｌｎで機能化されているｈＧＨを生じうることを発見した。ｈＧＨのより特異的な機能化を媒介するＴＧアーゼの変異体を同定する必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の発明者は、驚くべきことに、Ｓ．モバレンスのＴＧアーゼの特定のアミノ酸残基の置換によりｈＧＨをより特異的に機能化するＴＧアーゼを産出することを発見した。
一実施態様では、本発明は、３以下の酸性又は塩基性のアミノ酸残基が他の塩基性又は酸性のアミノ酸残基に置換されているＳ．モバレンスのＴＧアーゼ(配列番号１)に関する。
一実施態様では、本発明は、Ｓ．モバレンスのＴＧアーゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、該配列がＡｓｐ-４，Ｖａｌ-３０，Ｔｙｒ-６２，Ｔｙｒ-７５，Ａｒｇ-８９，Ｇｌｕ-１１５，Ｓｅｒ-２１０，Ａｓｐ-２２１，Ａｌａ-２２６，Ｐｒｏ-２２７，Ｇｌｙ-２５０，Ｖａｌ-２５２，Ａｓｎ-２５３，Ｐｈｅ-２５４，Ｈｉｓ-２７７，Ｔｙｒ-２７８，Ｌｅｕ-２８５，Ｔｙｒ-３０２，Ａｓｐ-３０４及びＬｙｓ-３２７から選択される一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている単離されたペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、Ａｓｐ-４，Ｖａｌ-３０，Ｔｙｒ-７５，Ａｒｇ-８９，Ｇｌｕ-１１５，Ｓｅｒ-２１０，Ａｓｐ-２２１，Ａｌａ-２２６，Ｐｒｏ-２２７，Ｇｌｙ-２５０，Ｔｙｒ-３０２，Ａｓｐ-３０４及びＬｙｓ-３２７から選択される一又は複数のアミノ酸残基が修飾されているＳ．モバレンスのＴＧアーゼ(配列番号１)に関する。
【０００６】
一実施態様では、本発明は、置換Ｔｙｒ-７５→酸性アミノ酸残基；Ｔｙｒ-３０２→塩基性アミノ酸残基；及びＡｓｐ-３０４→塩基性アミノ酸残基のうちの一又は複数を含んでなる、配列番号１に示すペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸コンストラクトに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸を含んでなるベクターに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸を含んでなるベクターを含む宿主に関する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドを含んでなる組成物に関する。
一実施態様では、本発明は、ｈＧＨのコンジュゲート方法であって、本発明に係るペプチドの存在下でアミンドナーとｈＧＨを反応させることを含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】上記のストレプトマイセス・モバレンシスのＴＧアーゼと上記のストレプトバーティシリウム・ラダカヌムのＴＧアーゼとの配列のアラインメントを示す。
【図２】１,３-ジアミノ-２-プロパノールによるｈＧＨのＴＧアーゼ-触媒トランスグルタミン化の代表的なＣＥ分析の画像を示す。
【図３】ＨＰＬＣによるＳ.ラダカヌムのＴＧアーゼに触媒されるｈＧＨ変異体の反応混合物の分析。上：ｈＧＨ-Ｑ４０Ｎ。１つ目のピーク(２６．５ｍｉｎ、Ａｒｅａ１２３８)は生成物-Ｑ１４１であり、２つ目のピーク(２９．７ｍｉｎ、Ａｒｅａ３７５)は残存するｈＧＨ-Ｑ４０Ｎである。下：ｈＧＨ-Ｑ１４１Ｎ。１つ目のピーク(１９．２ｍｉｎ、Ａｒｅａ１２７)は生成物-Ｑ４０であり、２つ目のピーク(３０．３ｍｉｎ、Ａｒｅａ１１５８)は残存するｈＧＨ-Ｑ１４１Ｎである。
【図４】ＨＰＬＣによるＳ．モバレンスのＴＧアーゼに触媒されるｈＧＨ変異体の反応混合物の分析。上：ｈＧＨ-Ｑ４０Ｎ。１つ目のピーク(２６．９ｍｉｎ、Ａｒｅａ１２８３)は生成物-Ｑ１４１であり、２つ目のピーク(３０．１ｍｉｎ、Ａｒｅａ５１９)は残存するｈＧＨ-Ｑ４０Ｎである。下：ｈＧＨ-Ｑ１４１Ｎ。１つ目のピーク(１９．５ｍｉｎ、Ａｒｅａ２９６)は生成物-Ｑ４０であり、２つ目のピーク(３０．６ｍｉｎ、Ａｒｅａ１２９１)は残存するｈＧＨ-Ｑ１４１Ｎである。
【図５】Ｓ．モバレンスのＡｌａＰｒｏ-ＴＧアーゼを用いたトランスグルタミン化反応。反応は２５℃で３０分間行われた。ｈＧＨ転換率は３３％で、選択性は５．７９であった。
【図６】
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書において、「酸性アミノ酸残基」なる用語は、７未満のｐＫａを有する天然のアミノ酸残基を示すことを意図する。具体的な例としてはＡｓｐ及びＧｌｕが挙げられる。
本明細書において、「塩基性アミノ酸残基」なる用語は、７を超えるｐＫａを有する天然のアミノ酸残基を示すことを意図する。具体的な例としてはＴｙｒ、Ｌｙｓ及びＡｒｇが挙げられる。
本明細書において「アミノ基転移」又はその類似語は、グルタミンの側鎖の窒素が他の化合物の窒素、特に他の窒素含有求核試薬の窒素と交換される反応を示すことを意図する。
名詞の「コンジュゲート」なる用語は、修飾した(変更した)ペプチド、すなわち、該ペプチドの性質を修飾するために結合した成分を有するペプチドを表すことを意図する。動詞としては、この用語は、前記ペプチドの性質を修飾するためにペプチドに成分を結合する過程を示すことを意図する。
【０００９】
本明細書において、「特異性」及び「選択性」なる用語は交換可能に用いられ、ｈＧＨの他の特定のグルタミン残基と比較して、ｈＧＨの一又は複数の特定のグルタミン残基との反応に対するＴＧアーゼの優先度を表す。本明細書のために、ｈＧＨのＧｌｎ１４１と比較したときのＧｌｎ-４０に対する本発明のペプチドの特異性は、実施例３に記載のようにペプチドを試験した結果に従って決定される。
また、微生物ストレプトマイセス・モバレンシスはストレプトバーティシリウム・モバレンスにも分類される。ＴＧアーゼは生物体から単離されてもよく、このＴＧアーゼは相対的に低い分子量(〜３８ｋＤａ)であることと、カルシウム非依存性であることに特徴を有する。Ｓ．モバレンスのＴＧアーゼは比較的十分に記載されている；例えば、結晶構造が解析されている(米国特許第１５６９５６号；Appl. Microbiol. Biotech. 64, 447-454 (2004))。
ストレプトバーティシリウム・ラダカヌム(Streptoverticillium ladakanum)から単離されたＴＧアーゼの配列は、２つの配列間で合計２２のアミノ酸の差異を除きストレプトバーティシリウム・モバレンス(Streptoverticillium mobaraense)の配列と同一性があるアミノ酸配列を有する(Yi-Sin Lin等, Process Biochemistry 39(5), 591-598 (2004))。ストレプトマイセス・モバレンシス(Streptomyces mobaraensis)のＴＧアーゼの配列は配列番号１に示され、ストレプトマイセス・ラダカヌムのＴＧアーゼの配列は配列番号６に示され、図１は上記のストレプトマイセス・モバレンシスのＴＧアーゼと上記のストレプトバーティシリウム・ラダカヌムのＴＧアーゼとの配列の配列アラインメントを示す。
【００１０】
コンジュゲートされたｈＧＨを調製する１つの方法は、機能化したｈＧＨを産出するための、官能基を含んでなるアミンドナーとｈＧＨとの間の第一反応を含んでなり、この第一反応はＴＧアーゼに媒介される(すなわち触媒される)ものである。第二反応工程では、コンジュゲートされたｈＧＨを提供するために、前記の機能化したｈＧＨを、前記の組み込まれた官能基と反応しうるＰＥＧ又は脂肪酸などと更に反応させる。第一反応を以下に略図する。
2010500885.tif 000003
Ｘは、官能基、又は潜在的な官能基、すなわち更なる反応、例えば酸化又は加水分解の際に官能基に変わる基を表す。
【００１１】
上記の反応がＳ．モバレンスのＴＧアーゼによって媒介される場合、ｈＧＨとＨ２Ｎ-Ｘ(アミンドナー)との間の反応は主にＧｌｎ-４０及びＧｌｎ-１４１で起こる。上記の反応を用いてｈＧＨをＰＥＧ化するなどして、延長された半減期を有する治療用の成長ホルモン生成物を獲得しうる。一般的に治療用組成物は単一化合物の組成物であることが望ましいので、上記の特異性の欠如により、Ｇｌｎ-４０機能化ｈＧＨをＧｌｎ-１４１機能化ｈＧＨ及び／又は、Ｇｌｎ-４０／Ｇｌｎ-１４１二重機能化ｈＧＨから分離する更なる精製工程が必要となる。
ヒト成長ホルモンのコンジュゲートのためのトランスグルタミナーゼのこのような使用は国際公開第２００５／０７０４６８号及び国際公開第２００６ＥＰ０６３２４６号に広く記載されている。
【００１２】
本発明のペプチドは、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してＧｌｎ-４０に対して特異性を有し、この特異性は実施例３に記載のように測定するところの、Ｇｌｎ-１４１と比較したときのＧｌｎ-４０に対する、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性と異なるものである。したがって、本発明のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＴＧアーゼを用いた反応と比較してＧｌｎ-４０機能化ｈＧＨ又はＧｌｎ-１４１機能化ｈＧＨの産生を増加するためのｈＧＨのトランスグルタミン化方法に用いられてもよい。
一実施態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、該配列がＡｓｐ-４，Ｖａｌ-３０，Ｔｙｒ-６２，Ｔｙｒ-７５，Ａｒｇ-８９，Ｇｌｕ-１１５，Ｓｅｒ-２１０，Ａｓｐ-２２１，Ａｌａ-２２６，Ｐｒｏ-２２７，Ｇｌｙ-２５０，Ｖａｌ-２５２，Ａｓｎ-２５３，Ｐｈｅ-２５４，Ｈｉｓ-２７７，Ｔｙｒ-２７８，Ｌｅｕ-２８５，Ｔｙｒ-３０２，Ａｓｐ-３０４及びＬｙｓ-３２７から選択される一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている、単離されたペプチドを提供する。
【００１３】
当該分野で公知である「同一性」なる用語は、配列を比較することによって決まる、２つ以上のペプチド配列間の相関性を指す。当該分野において、「同一性」はまた、２つ以上のアミノ酸残基の文字列間の合致の数によって決まるような、ペプチドの間の配列相関性の程度を意味する。「同一性」は、特定の数理モデル又はコンピュータプログラム(すなわち「アルゴリズム」)によって明らかになる、(あるならば)ギャップを含むより小さい２つ以上の配列アライメント間の同一合致のパーセントを測定する。関連するタンパク質の同一性は、周知の方法によって直ちに算出することができる。上記方法は、以下の文献に記載されているものを含むが、これらに限定されるものではない：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.編, オックスフォード大学出版, ニューヨーク, 1988年； Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.編, アカデミック出版, ニューヨーク, 1993年； Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M.及び Griffin, H. G.編, Humana Press, ニュージャージ, 1994年； Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.著, アカデミック出版, 1987年； Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 及び Devereux, J.編, M. Stockton Press, ニューヨーク 1991年； 及び Carillo等, SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)。
【００１４】
同一性を決定する好適な方法は、試される配列間で最大の合致があるように設定されている。同一性を決定する方法は、公的に利用できるコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定する好適なコンピュータプログラムの方法には、ＧＣＧプログラム・パッケージ(ＧＡＰを含む)(Devereux等, Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984)； Genetics Computer Group, ウィスコンシン大学, マディソン, ウィスコンシン), ＢＬＡＳＴＰ, ＢＬＡＳＴＮ, 及びＦＡＳＴＡ (Altschul等, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990))がある。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、バイオテクノロジー情報国立センター(ＮＣＢＩ)及び他の提供源から公的に入手可能である(BLAST Manual, Altschul等 NCB/NLM/NIH ベセズダ、マリーランド、20894； Altschul等, 上掲)。周知のスミス・ウォーターマンのアルゴリズムもまた、同一性を決定するために用いてもよい。
【００１５】
例えば、コンピュータアルゴリズムのＧＡＰ(Genetics Computer Group, ウィスコンシン大学, マディソン, ウィスコンシン)を用いて、配列同一性のパーセントを決定すべき２つのタンパク質を、個々のアミノ酸が最適に合致(アルゴリズムによって決定される「合致したスパン(matched span)」)するように整列させる。ギャップ開始ペナルティー(平均的なダイアゴナルの３倍で計算される；該「平均的なダイアゴナル」は使用する比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；該「ダイアゴナル」は特定の比較マトリックスによって、完全アミノ酸合致ごとに割り当てられるスコア又は数である)及びギャップ伸張ペナルティー(通常ギャップ開始ペナルティーの１０分の１である)と一緒に、ＰＡＭ２５０及びＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリックスが、アルゴリズムと同時に使用される。標準の比較マトリックス(ＰＡＭ２５０比較マトリックスに関してはDayhoff等, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978)；ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較マトリックスに関しては Henikoff等, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992)を参照)もまた、該アルゴリズムによって使用される。
【００１６】
ペプチド配列比較の好ましいパラメータは、以下を含む；
アルゴリズム：Needleman等, J. Mol. Biol, 48:443-453 (1970)；比較マトリックス：Henikoff等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 (1992)のＢＬＯＳＵＭ  ６２；ギャップペナルティー：１２、ギャップ長ペナルティー：４、類似性の閾値：０。
ＧＡＰプログラムは、上記パラメータを使用できる。上述したパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを使用しているペプチド比較のデフォルト・パラメータである(末端のギャップにペナルティーをかけない)。
【００１７】
一実施態様では、本発明のペプチドは配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなり、該配列はＡｓｐ-４，Ｖａｌ-３０，Ｔｙｒ-６２，Ｔｙｒ-７５，Ａｒｇ-８９，Ｇｌｕ-１１５，Ｓｅｒ-２１０，Ａｓｐ-２２１，Ａｌａ-２２６，Ｐｒｏ-２２７，Ｇｌｙ-２５０，Ｖａｌ-２５２，Ａｓｎ-２５３，Ｐｈｅ-２５４，Ｈｉｓ-２７７，Ｔｙｒ-２７８，Ｌｅｕ-２８５，Ｔｙｒ-３０２，Ａｓｐ-３０４及びＬｙｓ-３２７から選択される一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている。
一実施態様では、本発明のペプチドは配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなり、該配列はＣｙｓ-６４から２０Å未満、例えばＣｙｓ-６４から１５Å未満離れて位置する一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている。
Tatsuki Kashiwagi等, Journal of Biological Chemistry 277(46), 44252-44260 (2002)に公開されているように、Ｃｙｓ６４からの距離は、Ｓ．モバレンスのＴＧアーゼの結晶構造を用いて測定される。また、原子配位はコード１｜Ｕ４としてタンパク質データバンクに寄託されている。
Ｃｙｓ６４から１５Å未満離れて位置するＳ．モバレンスのＴＧアーゼのアミノ酸の例は以下を含む：
Ａｒｇ５，Ｖａｌ６，Ｔｈｒ７，Ｇｌｕ２８，Ｔｈｒ２９，Ｖａｌ３０，Ｖａｌ３１，Ｔｙｒ３４，Ｇｌｎ５６，Ａｒｇ５７，Ｇｌｕ５８，Ｔｒｐ５９，Ｌｅｕ６０，Ｓｅｒ６１，Ｔｙｒ６２，Ｇｌｙ６３，Ｖａｌ６５，Ｇｌｙ６６，Ｖａｌ６７，Ｔｈｒ６８，Ｔｒｐ６９，Ｖａｌ７０，Ａｓｎ７１，Ｓｅｒ７２，Ｇｌｎ７４，Ｔｙｒ７５，Ｐｒｏ７６，Ｔｈｒ７７，Ａｓｎ７８，Ｔｙｒ１９８，Ｓｅｒ１９９，Ｌｙｓ２００，Ｈｉｓ２０１，Ｐｈｅ２０２，Ｔｒｐ２０３，Ａｓｎ２３９，Ｉｌｅ２４０，Ｐｒｏ２４１，Ｐｈｅ２５１，Ｖａｌ２５２，Ａｓｎ２５３，Ｐｈｅ２５４，Ａｓｐ２５５，Ｔｙｒ２５６，Ｇｌｙ２５７，Ｔｒｐ２５８，Ｐｈｅ２５９，Ｔｒｐ２７２，Ｔｈｒ２７３，Ｈｉｓ２７４，Ｇｌｙ２７５，Ａｓｎ２７６，Ｈｉｓ２７７，Ｔｙｒ２７８，Ｈｉｓ２７９，Ａｌａ２８０，Ｌｅｕ２８５，Ｇｌｙ２８６，Ａｌａ２８７，Ｍｅｔ２８８，Ｈｉｓ２８９，Ｖａｌ２９０，Ｔｙｒ２９１，Ｇｌｕ２９２，Ｓｅｒ２９３，Ａｓｎ２９７，Ｔｒｐ２９８，Ｓｅｒ２９９，Ｇｌｙ３０１，Ｔｙｒ３０２，Ａｓｐ３０４，Ｐｈｅ３０５，Ｇｌｙ３０８及びＡｌａ３０９。
【００１８】
一実施態様では、本発明のペプチドは配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなり、該配列はＡｓｐ-４，Ａｒｇ-８９，Ｇｌｕ-１１５，Ｓｅｒ-２１０，Ａｓｐ-２２１，Ｌｙｓ-３２７から選択される一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている。
一実施態様では、本発明のペプチドは配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなり、該配列はＡｌａ-２２６及びＰｒｏ-２２７から選択される一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている。
一実施態様では、本発明のペプチドは配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなり、該配列はＴｙｒ-７５で修飾されている。
一実施態様では、本発明のペプチドは配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなり、該配列はＴｙｒ-３０２で修飾されている。
一実施態様では、本発明のペプチドは配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなり、該配列はＡｓｐ-３０４で修飾されている。
一実施態様では、本発明のペプチドは配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなり、該配列は配列番号６に示すものである。
一実施態様では、本発明のペプチドは、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に対する特異性を有し、この特異性はｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較したときのｈＧＨのＧｌｎ-４０に対する、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性と異なるものである。
【００１９】
一実施態様では、Ｇｌｎ-１４１と比較したときのＧｌｎ-４０に対する本発明のペプチドの特異性が、Ｇｌｎ-１４１と比較したときのＧｌｎ-４０に対する、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性より高く、その結果、本明細書中に記載のＴＧアーゼを用いたトランスグルタミナーゼ反応におけるＧｌｎ-４０の産生が、Ｇｌｎ-１４１と比較して増加する。
一実施態様では、Ｇｌｎ-１４１と比較したときのＧｌｎ-４０に対する本発明のペプチドの特異性は、Ｇｌｎ-１４１と比較したときのＧｌｎ-４０に対する、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性より、少なくとも１．２５、例として少なくとも１．５０、例えば少なくとも１．７５、例として少なくとも２．０、例えば少なくとも２．５、例として少なくとも３．０、例えば少なくとも３．５、例として少なくとも４．０、例えば少なくとも４．５、例として少なくとも５．０、例えば少なくとも５．５、例として少なくとも６．０、例えば少なくとも６．５、例として少なくとも７．０、例えば少なくとも７．５、例として少なくとも８．０、例えば少なくとも８．５、例として少なくとも９．０、例えば少なくとも９．５、例として少なくとも１０．０倍高い。
【００２０】
一実施態様では、Ｇｌｎ-４０と比較したときのＧｌｎ-１４１に対する本発明のペプチドの特異性が、Ｇｌｎ-４０と比較したときのＧｌｎ-１４１に対する、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性より高く、その結果、本明細書中に記載のＴＧアーゼを用いたトランスグルタミナーゼ反応におけるＧｌｎ-１４１の産生が、Ｇｌｎ-４０と比較して増加する。
一実施態様では、Ｇｌｎ-４０と比較したときのＧｌｎ-１４１に対する本発明のペプチドの特異性は、Ｇｌｎ-４０と比較したときのＧｌｎ-１４１に対する、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性より、少なくとも１．２５、例として少なくとも１．５０、例えば少なくとも１．７５、例として少なくとも２．０、例えば少なくとも２．５、例として少なくとも３．０、例えば少なくとも３．５、例として少なくとも４．０、例えば少なくとも４．５、例として少なくとも５．０、例えば少なくとも５．５、例として少なくとも６．０、例えば少なくとも６．５、例として少なくとも７．０、例えば少なくとも７．５、例として少なくとも８．０、例えば少なくとも８．５、例として少なくとも９．０、例えば少なくとも９．５、例として少なくとも１０．０倍高い。
【００２１】
一実施態様では、本発明は、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に対して特異性を有し、この特異性はｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較したときのｈＧＨのＧｌｎ-４０に対する、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性と異なるものである、トランスグルタミナーゼペプチドを提供する。
一実施態様では、本発明は、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較してｈＧＨのＧｌｎ-４０に対して特異性を有し、この特異性はｈＧＨのＧｌｎ-１４１と比較したときのｈＧＨのＧｌｎ-４０に対する、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性より高いものである、トランスグルタミナーゼペプチドを提供する。
【００２２】
一実施態様では、本発明は、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較してｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対して特異性を有し、この特異性はｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したときのｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性より高いものである、トランスグルタミナーゼペプチドを提供する。一実施態様では、こういったトランスグルタミナーゼペプチドは、例えば上述したようなストレプトマイセス・モバレンシスのＴＧアーゼの変異体でありうる。一実施態様では、こういったトランスグルタミナーゼペプチドは、例えばストレプトマイセス・ラダカナム（配列番号６）のＴＧアーゼでありうる。一実施態様では、こういったトランスグルタミナーゼペプチドは、例えばストレプトマイセス・ラダカナム（配列番号６）のＴＧアーゼの変異体でありうる。一実施態様では、こういったストレプトマイセス・ラダカナムのＴＧアーゼの変異体は、配列番号６の配列を有するトランスグルタミナーゼのトランスグルタミナーゼ活性を保持したまま、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドである。一実施態様では、こういったストレプトマイセス・ラダカナムのＴＧアーゼの変異体は、配列番号６の配列を有するトランスグルタミナーゼのトランスグルタミナーゼ活性を保持したまま、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドである。一実施態様では、こういったストレプトマイセス・ラダカナムのＴＧアーゼの変異体は、配列番号６の配列を有するトランスグルタミナーゼのトランスグルタミナーゼ活性を保持したまま、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドである。一実施態様では、こういったストレプトマイセス・ラダカナムのＴＧアーゼの変異体は、配列番号６の配列を有するトランスグルタミナーゼのトランスグルタミナーゼ活性を保持したまま、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドである。更なる実施態様では、前記ソトレプトマイセス・ラダカナムのＴＧアーゼの変異体はアミノ酸配列を有し、前記配列は配列番号６のアミノ酸残基Ｔｙｒ-６２、Ｔｙｒ-７５及びＳｅｒ-２５０に相当する一又は複数の位置で修飾されている。一実施態様では、前記アミノ酸配列はＴｙｒ-６２に相当する位置で修飾されており、該修飾は、元のチロシン残基の、Ｍｅｔ，Ａｓｎ，Ｔｈｒ及びＬｅｕから選択されるアミノ酸残基との置換からなる。一実施態様では、前記アミノ酸配列はＴｙｒ-７５に相当する位置で修飾されており、該修飾は、元のチロシン残基の、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基との置換からなる。一実施態様では、前記アミノ酸配列はＳｅｒ-２５０に相当する位置で修飾されており、該修飾は、元のチロシン残基の、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ及びＶａｌから��択されるアミノ酸残基との置換からなる。
【００２３】
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドをコードする核酸コンストラクトを提供する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係る核酸コンストラクトを含んでなるベクターを提供する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るベクターを含んでなる宿主を提供する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドを含んでなる組成物を提供する。
一実施態様では、本発明は、本発明に係るペプチドの存在下でアミンドナーとｈＧＨを反応させることを含んでなるｈＧＨのコンジュゲート方法を提供する。
一実施態様では、本発明は、コンジュゲートされたｈＧＨの調製における本発明に係るペプチドの使用を提供する。
【００２４】
以下は、本発明の実施態様の非限定的な一覧である：
実施態様１：配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、該配列が配列番号１のＡｓｐ-４，Ｖａｌ-３０，Ｔｙｒ-６２，Ｔｙｒ-７５，Ａｒｇ-８９，Ｇｌｕ-１１５，Ｓｅｒ-２１０，Ａｓｐ-２２１，Ａｌａ-２２６，Ｐｒｏ-２２７，Ｇｌｙ-２５０，Ｖａｌ-２５２，Ａｓｎ-２５３，Ｐｈｅ-２５４，Ｈｉｓ-２７７，Ｔｙｒ-２７８，Ｌｅｕ-２８５，Ｔｙｒ-３０２，Ａｓｐ-３０４及びＬｙｓ-３２７から選択される一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている単離されたペプチド。
実施態様２：配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、該配列が配列番号１のＡｓｐ-４，Ｖａｌ-３０，Ｔｙｒ-６２，Ｔｙｒ-７５，Ａｒｇ-８９，Ｇｌｕ-１１５，Ｓｅｒ-２１０，Ａｓｐ-２２１，Ａｌａ-２２６，Ｐｒｏ-２２７，Ｇｌｙ-２５０，Ｖａｌ-２５２，Ａｓｎ-２５３，Ｐｈｅ-２５４，Ｈｉｓ-２７７，Ｔｙｒ-２７８，Ｌｅｕ-２８５，Ｔｙｒ-３０２，Ａｓｐ-３０４及びＬｙｓ-３２７から選択される一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１に記載の単離されたペプチド。
実施態様３：配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、該配列が配列番号１のＡｓｐ-４，Ｖａｌ-３０，Ｔｙｒ-６２，Ｔｙｒ-７５，Ａｒｇ-８９，Ｇｌｕ-１１５，Ｓｅｒ-２１０，Ａｓｐ-２２１，Ａｌａ-２２６，Ｐｒｏ-２２７，Ｇｌｙ-２５０，Ｖａｌ-２５２，Ａｓｎ-２５３，Ｐｈｅ-２５４，Ｈｉｓ-２７７，Ｔｙｒ-２７８，Ｌｅｕ-２８５，Ｔｙｒ-３０２，Ａｓｐ-３０４及びＬｙｓ-３２７から選択される一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている、実施態様２に記載の単離されたペプチド。
実施態様４：配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、該配列が配列番号１のＡｓｐ-４，Ｖａｌ-３０，Ｔｙｒ-６２，Ｔｙｒ-７５，Ａｒｇ-８９，Ｇｌｕ-１１５，Ｓｅｒ-２１０，Ａｓｐ-２２１，Ａｌａ-２２６，Ｐｒｏ-２２７，Ｇｌｙ-２５０，Ｖａｌ-２５２，Ａｓｎ-２５３，Ｐｈｅ-２５４，Ｈｉｓ-２７７，Ｔｙｒ-２７８，Ｌｅｕ-２８５，Ｔｙｒ-３０２，Ａｓｐ-３０４及びＬｙｓ-３２７から選択される一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている、実施態様３に記載の単離されたペプチド。
実施態様５：配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなり、該配列がＡｓｐ-４，Ｖａｌ-３０，Ｔｙｒ-６２，Ｔｙｒ-７５，Ａｒｇ-８９，Ｇｌｕ-１１５，Ｓｅｒ-２１０，Ａｓｐ-２２１，Ａｌａ-２２６，Ｐｒｏ-２２７，Ｇｌｙ-２５０，Ｖａｌ-２５２，Ａｓｎ-２５３，Ｐｈｅ-２５４，Ｈｉｓ-２７７，Ｔｙｒ-２７８，Ｌｅｕ-２８５，Ｔｙｒ-３０２，Ａｓｐ-３０４及びＬｙｓ-３２７から選択される一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている、実施態様４に記載の単離されたペプチド。
【００２５】
実施態様６：前記配列が、配列番号１のＧｌｙ-２５０に相当するアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１ないし５のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様７：Ｇｌｙ-２５０がＴｈｒに置換されている、実施態様６に記載の単離されたペプチド。
実施態様８：Ｇｌｙ-２５０がＳｅｒに置換されている、実施態様６に記載の単離されたペプチド。
実施態様９：前記配列が、配列番号１のＣｙｓ-６４に相当するアミノ酸残基から２０Å未満離れて位置する一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１ないし８のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様１０：前記配列が、配列番号１のＣｙｓ-６４に相当するアミノ酸残基から２０Å未満離れて位置する一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１ないし９のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【００２６】
実施態様１１：配列が、配列番号１の位置Ｃｙｓ６４に相当する位置で修飾されていない、実施態様１０に記載の単離されたペプチド。
実施態様１２：前記配列が、配列番号１のＶａｌ-３０，Ｔｙｒ-６２，Ｖａｌ-２５２，Ａｓｎ-２５３，Ｐｈｅ-２５４，Ｈｉｓ-２７７，Ｔｙｒ-２７８及びＬｅｕ-２８５から選択される一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１０又は１１に記載の単離されたペプチド。
実施態様１３：前記配列が、配列番号１のＴｙｒ-６２に相当するアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１２に記載の単離されたペプチド。
実施態様１４：前記Ｔｙｒ-６２が、Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｔｈｒ，Ｖａｌ又はＴｒｐに置換されている、実施態様１２又は実施態様１３に記載の単離されたペプチド。
実施態様１５：前記Ｔｙｒ-６２がＧｌｕに置換されている、実施態様１２ないし１４のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様１６：前記Ｔｙｒ-６２がＴｒｐに置換されている、実施態様１２ないし１４のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様１７：前記Ｔｙｒ-６２が、Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｔｈｒ又はＶａｌに置換されている、実施態様１２から１４のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様１８：前記Ｔｙｒ-６２がＨｉｓに置換されている、実施態様１７に記載の単離されたペプチド。
実施態様１９：前記Ｔｙｒ-６２がＧｌｕに置換されている、実施態様１７に記載の単離されたペプチド。
実施態様２０：前記Ｔｙｒ-６２がＩｌｅに置換されている、実施態様１７に記載の単離されたペプチド。
【００２７】
実施態様２１：前記Ｔｙｒ-６２がＭｅｔに置換されている、実施態様１７に記載の単離されたペプチド。
実施態様２２：前記Ｔｙｒ-６２がＡｓｎに置換されている、実施態様１７に記載の単離されたペプチド。
実施態様２３：前記Ｔｙｒ-６２がＧｌｎに置換されている、実施態様１７に記載の単離されたペプチド。
実施態様２４：前記Ｔｙｒ-６２がＴｈｒに置換されている、実施態様１７に記載の単離されたペプチド。
実施態様２５：前記Ｔｙｒ-６２がＶａｌに置換されている、実施態様１７に記載の単離されたペプチド。
実施態様２６：前記Ｔｙｒ-６２がＴｒｐに置換されている、実施態様１７に記載の単離されたペプチド。
実施態様２７：前記配列が、配列番号１のＨｉｓ-２７及びＴｙｒ-２７８に相当する一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１２ないし２６のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様２８：前記配列が、配列番号１のＬｅｕ-２８５に相当するアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１２ないし２７のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様２９：前記Ｌｅｕ-２８５が、Ｔｈｒに置換されている、実施態様２８に記載の単離されたペプチド。
実施態様３０：前記配列が、配列番号１の位置Ｖａｌ-２５２，Ａｓｎ-２５３及びＰｈｅ-２５４に相当するアミノ酸残基から選択される一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１２ないし２９のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【００２８】
実施態様３１：前記配列が、配列番号１のＶａｌ-３０に相当するアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１０ないし３０のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様３２：前記Ｖａｌ-３０が配列番号１のＩｌｅに置換されている、実施態様３１に記載の単離されたペプチド。
実施態様３３：前記配列が、配列番号１の位置Ａｓｐ-４，Ａｒｇ-８９，Ｇｌｕ-１１５，Ｓｅｒ-２１０，Ａｓｐ-２２１及びＬｙｓ-３２７に相当するアミノ酸残基から選択される一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１ないし３２のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様３４：前記Ａｓｐ-４がＧｌｕに置換されている、実施態様３３に記載の単離されたペプチド。
実施態様３５：前記Ａｓｐ-４がＧｌｕに置換されており、位置１，２及び３のアミノ酸が削除されている、実施態様３３又は３４に記載の単離されたペプチド。
実施態様３６：配列番号１のＡｒｇ-８９に相当するアミノ酸残基がＬｙｓに置換されている、実施態様３３ないし３５のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様３７：配列番号１のＧｌｕ-１１５に相当するアミノ酸残基が、Ａｓｐに置換されている、実施態様３３ないし３６のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様３８：配列番号１のＳｅｒ-２１０に相当するアミノ酸残基が、Ｇｌｙに置換されている、実施態様３３ないし３７のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様３９：配列番号１のＡｓｐ-２２１に相当するアミノ酸残基が、Ｓｅｒに置換されている、実施態様３３ないし３８のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様４０：配列番号１のＬｙｓ-３２７に相当するアミノ酸残基が、Ｔｈｒに置換されている、実施態様３３ないし３９のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【００２９】
実施態様４１：前記配列が、配列番号１の位置Ａｌａ-２２６及びＰｒｏ-２２７に相当するアミノ酸残基から選択される一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１ないし４０のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様４２：前記Ａｌａ-２２６がＡｓｐに置換されている、実施態様４１に記載の単離されたペプチド。
実施態様４３：配列番号１のＰｒｏ-２２７に相当するアミノ酸残基がＡｒｇに置換されている、実施態様４１に記載の単離されたペプチド。
実施態様４４：前記配列が、配列番号１のＴｙｒ-７５に相当するアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１ないし４３のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様４５：前記Ｔｙｒ-７５がＧｌｕと異なるアミノ酸に置換されている、実施態様４４に記載の単離されたペプチド。
実施態様４６：前記Ｔｙｒ-７５がＡｓｐ又はＧｌｕと異なるアミノ酸に置換されている、実施態様４５に記載の単離されたペプチド。
実施態様４７：前記Ｔｙｒ-７５がアミノ酸残基と異なるアミノ酸に置換されている、実施態様４６に記載の単離されたペプチド。
実施態様４８：前記Ｔｙｒ-７５がＡｌａに置換されている、実施態様４４ないし４７のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様４９：前記Ｔｙｒ-７５がＣｙｓに置換されている、実施態様４４ないし４７のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様５０：前記Ｔｙｒ-７５がＰｈｅに置換されている、実施態様４４ないし４７のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【００３０】
実施態様５１：前記Ｔｙｒ-７５がＬｅｕに置換されている、実施態様４４ないし４７のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様５２：前記Ｔｙｒ-７５がＭｅｔに置換されている、実施態様４４ないし４７のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様５３：前記Ｔｙｒ-７５がＡｓｎに置換されている、実施態様４４ないし４７のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様５４：前記Ｔｙｒ-７５がＰｒｏに置換されている、実施態様４４ないし４７のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様５５：前記Ｔｙｒ-７５がＳｅｒに置換されている、実施態様４４ないし４７のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様５６：前記配列が、配列番号１のＴｙｒ-３０２に相当するアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１ないし５５のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様５７：前記Ｔｙｒ-３０２がＴｙｒと異なる塩基性アミノ酸残基に置換されている、実施態様５６に記載の単離されたペプチド。
実施態様５８：前記Ｔｙｒ-３０２がＡｒｇ又はＬｙｓに置換されている、実施態様５７に記載の単離されたペプチド。
実施態様５９：前記Ｔｙｒ-３０２がＡｒｇに置換されている、実施態様５８に記載の単離されたペプチド。
実施態様６０：前記配列が、配列番号１のＡｓｐ-３０４に相当するアミノ酸残基で修飾されている、実施態様１ないし５９のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【００３１】
実施態様６１：前記Ａｓｐ-３０４が塩基性アミノ酸残基に置換されている、実施態様６０に記載の単離されたペプチド。
実施態様６２：前記Ａｓｐ-３０４がＴｙｒ，Ｌｙｓ又はＡｒｇに置換されている、実施態様６１に記載の単離されたペプチド。
実施態様６３：前記Ａｓｐ-３０４がＬｙｓに置換されている、実施態様６２に記載の単離されたペプチド。
実施態様６４：配列番号２に示された配列を有する実施態様５５に記載の単離されたペプチド。
実施態様６５：配列番号３に示された配列を有する実施態様５９に記載の単離されたペプチド。
実施態様６６：配列番号４に示された配列を有する実施態様６３に記載の単離されたペプチド。
実施態様６７：配列番号５に示された配列を有する実施態様４４ないし６３のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様６８：配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたペプチド。
実施態様６９：配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、実施態様６８に記載の単離されたペプチド。
実施態様７０：配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、実施態様６９に記載の単離されたペプチド。
【００３２】
実施態様７１：配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、実施態様７０に記載の単離されたペプチド。
実施態様７２：配列番号６に示すようなアミノ酸配列を含んでなる、実施態様７１に記載の単離されたペプチド。
実施態様７３：置換Ｔｙｒ-７５→酸性アミノ酸残基；Ｔｙｒ-３０２→Ｔｙｒではない塩基性アミノ酸残基；及びＡｓｐ-３０４→塩基性アミノ酸残基のうちの一又は複数を含んでなる配列番号１に示す配列を有するペプチド。
実施態様７４：置換Ｔｙｒ-７５→Ａｓｐ又はＧｌｕ；Ｔｙｒ-３０２→Ａｒｇ又はＬｙｓ；及びＡｓｐ-３０４→Ｔｙｒ，Ｌｙｓ又はＡｒｇのうちの一又は複数を含んでなる配列番号１に示す配列を有する、実施態様７３に記載のペプチド。
実施態様７５：置換Ｔｙｒ-７５→Ｇｌｕ；Ｔｙｒ-３０２→Ａｒｇ；及びＡｓｐ-３０４→Ｌｙｓのうちの一又は複数を含んでなる配列番号１に示す配列を有する、実施態様７３又は７４に記載のペプチド。
実施態様７６：配列が配列番号２に示すものである、実施態様７３ないし７５のいずれかに記載のペプチド。
実施態様７７：配列が配列番号３に示すものである、実施態様７３ないし７５のいずれかに記載のペプチド。
実施態様７８：配列が配列番号４に示すものである、実施態様７３ないし７５のいずれかに記載のペプチド。
実施態様７９：配列が配列番号５に示すものである、実施態様７３に記載のペプチド。
実施態様８０：前記ペプチドが単離されたペプチドである、実施態様７３ないし７９のいずれかに記載のペプチド。
【００３３】
実施態様８１：ペプチドがトランスグルタミナーゼ活性を有する、実施態様１ないし８０のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様８２：ペプチドがｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較してｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対して特異性を有し、この特異性はｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したときのｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性より高いものである、実施態様１ないし８１のいずれかに記載の単離されたペプチド。
実施態様８３：ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較してｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対して特異性を有し、この特異性はｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したときのｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性より高いものである、トランスグルタミナーゼペプチド。
実施態様８４：トランスグルタミナーゼペプチドが実施態様１ないし５０のいずれかに記載のペプチドである、実施態様８３に記載のトランスグルタミナーゼペプチド。
実施態様８５：実施態様１ないし８４のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸コンストラクト。
実施態様８６：実施態様８５の核酸コンストラクトを含んでなるベクター。
実施態様８７：実施態様８６のベクターを含んでなる宿主。
実施態様８８：実施態様１ないし８４のいずれかに記載のペプチドを含んでなる組成物。
実施態様８９：実施態様１ないし８４のいずれかに記載のペプチドの存在下でアミンドナーとペプチドを反応させることを含んでなる、ペプチドのコンジュゲート方法。
実施態様９０：コンジュゲートされるべきペプチドが成長ホルモンである、実施態様８９に記載のペプチドのコンジュゲート方法。
【００３４】
実施態様９１：前記成長ホルモンがｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である、実施態様９０に記載の方法。
実施態様９２：前記成長ホルモンがｈＧＨである、実施態様９１に記載の方法。
実施態様９３：位置Ｇｌｎ-１４１でコンジュゲートされたｈＧＨの量と比較したときの位置Ｇｌｎ-４０でコンジュゲートされたｈＧＨの量が、実施態様１ないし８４のいずれかに記載のペプチドの代わりに配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドが使用された場合の、位置Ｇｌｎ-１４１でコンジュゲートされたｈＧＨの量と比較したときの位置Ｇｌｎ-４０でコンジュゲートされたｈＧＨの量と比べて有意に増加する、ｈＧＨをコンジュゲートするための実施態様９１又は９２に記載の方法。
実施態様９４：位置Ｇｌｎ-４０でコンジュゲートされたｈＧＨの量と比較したときの位置Ｇｌｎ-１４１でコンジュゲートされたｈＧＨの量が、実施態様１ないし８４のいずれかに記載のペプチドの代わりに配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドが使用された場合の、位置Ｇｌｎ-４０でコンジュゲートされたｈＧＨの量と比較したときの位置Ｇｌｎ-１４１でコンジュゲートされたｈＧＨの量と比べて有意に増加する、ｈＧＨをコンジュゲートするための実施態様９１又は９２に記載の方法。
実施態様９５：ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に相当する位置でコンジュゲートされた成長ホルモンの量と比較したときのｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に相当する位置でコンジュゲートされた成長ホルモンの量が、実施態様１ないし８４のいずれかに記載のペプチドの代わりに配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチドが使用された場合の、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に相当する位置でコンジュゲートされた成長ホルモンの量と比較したときのｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に相当する位置でコンジュゲートされた成長ホルモンの量と比べて有意に増加する、成長ホルモンをコンジュゲートするための実施態様９１又は９２に記載の方法。
【００３５】
実施態様９６：ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に相当する位置でコンジュゲートされた成長ホルモンの量と比較したときのｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に相当する位置でコンジュゲートされた成長ホルモンの量が、実施態様１ないし８４のいずれかに記載のペプチドの代わりに配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドが使用された場合の、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に相当する位置でコンジュゲートされた成長ホルモンの量と比較したときのｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に相当する位置でコンジュゲートされた成長ホルモンの量と比べて有意に増加する、ｈＧＨをコンジュゲートするための実施態様９１又は９２に記載の方法。
実施態様９７：実施態様１ないし８４のいずれかに記載のペプチドの存在下でアミンドナーとｈＧＨを反応させることを含んでなる、位置１４１に相当する位置でコンジュゲートされたｈＧＨの調製方法。
実施態様９８：コンジュゲートされたｈＧＨがＰＥＧ化ｈＧＨの調製に使用され、前記ＰＥＧ化がコンジュゲートされた位置で行われる、実施態様９１ないし９７のいずれかに記載の方法。
実施態様９９：実施態様１ないし８４のいずれかに記載のペプチドの存在下でアミンドナーとｈＧＨ又はその変異体又は誘導体を反応させる工程を含んでなる、コンジュゲートされた成長ホルモンの医薬調製方法。
実施態様１００：前記成長ホルモンがｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である、実施態様９９に記載の方法。
【００３６】
実施態様１０１：実施態様１ないし８４のいずれかに記載のペプチドの存在下でアミンドナーとｈＧＨ又はその変異体又は誘導体を反応させ、及び結果として生じるコンジュゲートされた成長ホルモンペプチドをＰＥＧ化ｈＧＨの調製に使用し、前記ＰＥＧ化がコンジュゲートされた位置で行われる工程を含んでなる、ＰＥＧ化成長ホルモンの医薬調製方法。
実施態様１０２：前記成長ホルモンがｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である、実施態様１０１に記載の方法。
実施態様１０３：ＰＥＧ化成長ホルモンが位置Ｇｌｎ１４１でＰＥＧ化されたｈＧＨである、実施態様１０２に記載の方法。
実施態様１０４：ＰＥＧ化成長ホルモンがＮε１４１-[２-(４-(４-(４０ＫＤａ ｍＰＥＧｙｌ)ブタノイル)-アミノ-ブチルオキシイミノ)-エチル]である、実施態様１０３に記載の方法。
実施態様１０５：コンジュゲートされた成長ホルモンの調製における、実施形態１ないし８４のいずれかに記載のペプチドの使用。
【００３７】
実施態様１０６：成長ホルモンがｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である、実施態様１０５に記載の使用。
実施態様１０７：ｈＧＨが、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に相当する位置でコンジュゲートされている、実施態様１０５又は１０６に記載の使用。
実施態様１０８：成長ホルモンが、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に相当する位置でコンジュゲートされている、実施態様１０５又は１０６に記載の使用。
実施態様１０９：実施態様１０１ないし１０４のいずれかに記載の方法を使用して調製した医薬品を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、患者における成長ホルモンの欠乏に関連する疾病又は疾患の治療方法。
実施態様１１０：  患者における成長ホルモンの欠乏に関連する疾病又は疾患が、成長ホルモン欠損症(ＧＨＤ)；ターナー症候群；プラダーウィリ症候群(ＰＷＳ)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎臓病、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症；ＨＡＡＲＴ治療を受けた小児のＨＩＶ感染(ＨＩＶ／ＨＡＬＳ小児)；胎内発育遅延(ＳＧＡ)低身長出生児；ＳＧＡ以外の極低出生体重(ＶＬＢＷ)で生まれた小児の低身長症；骨格形成異常；軟骨低形成症；軟骨無形成症；突発性短身症(ＩＳＳ)；成人おけるＧＨＤ；脛骨、腓骨、大腿、上腕、橈骨、尺骨、鎖骨、中手骨、中足骨、及び指等の長骨内又は長骨の骨折；頭蓋骨、手の基部、及び足の基部等の海綿様骨内部又は海綿様骨の骨折；手、膝又は肩等における腱又は靱帯手術後の患者の症状；仮骨延長術を受けた又は受けている患者の症状；人工股関節又は円板置換術、半月板修復、脊椎固定術、又は膝、臀部、肩、肘、手首又は顎等のプロテーゼ固定術を受けた患者の症状；骨接合術材料、例えば爪、ネジ及びプレートが固定された患者の症状；骨折の癒着不能又は変形治癒を有する患者の症状；脛骨又は第１つま先等からの骨切除術後の患者の症状；移植片植え込み後の患者の症状；外傷又は関節炎に起因する膝の関節軟骨変性；ターナー症候群を患っている患者の骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症；慢性透析の成人患者(ＡＰＣＤ)の症状；ＡＰＣＤにおける栄養不良関連循環器疾患；ＡＰＣＤにおける悪液質の逆流；ＡＰＣＤにおける癌；ＡＰＣＤにおける慢性閉塞性肺疾患；ＡＰＣＤにおけるＨＩＶ；高齢ＡＰＣＤの症状；ＡＰＣＤにおける慢性的な肝臓病；ＡＰＣＤにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；ＨＩＶ感染の男性の症状；短腸症候群；中心性肥満；ＨＩＶ関連リポジストロフィ症候群(ＨＡＬＳ)：男性不妊；主要な待機手術、アルコール／薬物解毒又は神経性トラウマ後の患者の症状；加齢；虚弱な高齢者の症状；骨関節炎；外傷性損傷を受けた軟骨；勃起障害；線維筋痛；記憶障害；鬱病；外傷性脳損傷；くも膜下出血；極低出生体重；メタボリックシンドローム；グルココルチコイドミオパシー；及び小児のグルココルチコイド処置による低身長症から選択される、実施態様１０９に記載の方法。
【００３８】
配列番号２に示す用いられる場合、主にＧｌｎ-１４１機能化ｈＧＨが得られ、ごくわずかな量のＧｌｎ-４０機能化ｈＧＨ、又はＧｌｎ-４０／Ｇｌｎ-１４１二重機能化ｈＧＨが得られる。
一実施態様では、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなり、配列Ｔｙｒ-７５がＡｓｐ又はＧｌｕに置換されている；及び／又はＴｙｒ-３０２がＡｒｇ又はＬｙｓに置換されている；及び／又はＡｓｐ-３０４がＴｙｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇに置換されている、及び／又はＧｌｙ-２５０がＳｅｒ又はＴｈｒに置換されている；及び／又はＡｓｐ-４がＧｌｕに置換されている；及び／又はＶａｌ-３０がＩｌｅに置換されている；及び／又はアミノ酸１−４が欠失しているか又はＧｌｙ(Δ(ＤＳＤＤ)１-４Ｇ)に置換されているペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなり、配列Ｔｙｒ-７５がＧｌｕに置換されている；及び／又はＴｙｒ-３０２がＡｒｇに置換されている；及び／又はＡｓｐ-３０４がＬｙｓに置換されている；及び／又はＧｌｙ-２５０がＳｅｒに置換されている；及び／又はＡｓｐ-４がＧｌｕに置換されている；及び／又はＶａｌ-３０がＩｌｅに置換されている；及び／又はアミノ酸１-４が欠失しているペプチドに関する。
【００３９】
一実施態様では、本発明は、Ｔｙｒ-７５→Ｇｌｕ置換を有する配列番号１である、配列番号２に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、Ｔｙｒ-３０２→Ａｒｇ置換を有する配列番号１である、配列番号３に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する。
一実施態様では、Ａｓｐ-３０４→Ｌｙｓ置換を有する配列番号１である、配列番号４に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、Ｔｙｒ-７５→Ｇｌｕ置換、Ｔｙｒ-３０２→Ａｒｇ置換、及びＡｓｐ-３０４→Ｌｙｓ置換を有する配列番号１である、配列番号５に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する。
一実施態様では、本発明は、ストレプトバーティシリウム・ラダカヌムのＴＧアーゼである、配列番号６に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関する。
【００４０】
本発明のペプチドは、米国特許第５１５６９５６号に記載のアッセイにおいて決定されるようなＴＧアーゼ活性を表す。簡単に説明すると、所定のペプチドの活性の測定は、Ｃａ２＋の非存在下でベンジルオキシカルボニル-Ｌ-グルタミニルグリシン及びヒドロキシルアミンを基質として用いた反応を行うこと、トリクロロ酢酸の存在下で結果として生じるヒドロキサム酸との鉄複合体を形成すること、５２５ｎｍの吸光度を測定すること、及びヒドロキサム酸の量を較正曲線によって測定して活性を算出することによって実施される。本明細書においては、前記アッセイにおいてトランスグルタミナーゼ活性を表すペプチドを、トランスグルタミナーゼ活性を有するものとみなした。特に、本発明のＴＧアーゼ変異体は、Ｓ．モバレンス由来のＴＧアーゼの活性の３０％より高い、例として５０％より高い、例として７０％より高い、例として９０％より高い活性を表す。
一実施態様では、本発明は、配列番号：２、３、４又は５のいずれかを有するポリペプチドを含んでなる組成物に関する。
【００４１】
本発明のペプチドは異なる方法で調製されてもよい。ペプチドは、当分野で公知のタンパク質合成方法によって調製されてもよい。ペプチドのサイズによって、いくつかのペプチドの断片を合成し、次いで本発明のペプチドを提供するために組み合わせることによってより都合よく行われてもよい。しかしながら、特定の実施態様では、本発明のペプチドは、本発明のペプチドをコードする核酸コンストラクトを含んでなる好適な宿主の発酵によって調製される。
【００４２】
一実施態様では、本発明はまた、本発明のペプチドをコードする核酸コンストラクトにも関する。
本明細書中で用いられる「核酸コンストラクト」なる用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はＲＮＡ起源の任意の核酸分子を示すことを意図する。「コンストラクト」なる用語は、一本鎖又は二本鎖でありえ、且つ対象のタンパク質をコードする完全ないしは部分的な天然に生じるヌクレオチド配列に基づきうる核酸セグメントを示すことを意図する。場合によってコンストラクトは他の核酸セグメントを含有してもよい。
本発明のペプチドをコードする本発明の核酸コンストラクトは、適切にゲノム又はｃＤＮＡ起源のものでよく、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリを調製して、標準的な技術（J. Sambrook等, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照）に従った合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによってすべて又は一部のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることによって、そして当分野で公知の突然変異を導入することによって得てもよい。
【００４３】
また、タンパク質をコードする本発明の核酸コンストラクトは、確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22, 1859-1869 (1981) )に記載のホスホアミダイト法、又はMatthes等., EMBO Journal 3, 801-805 (1984)に記載の方法によって合成して調製してもよい。ホスホアミダイト法によると、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機において合成され、精製され、アニールされ、ライゲートされ、適切なベクターにクローニングされる。
更に、核酸コンストラクトは、標準的な技術によって、核酸コンストラクト全体の様々な部分に対応する断片である合成起源、ゲノム起源又はｃＤＮＡ起源(必要に応じて)の断片をライゲートすることによって調製された、合成起源とゲノム起源を混合、合成起源とｃＤＮＡ起源を混合、又はゲノム起源とｃＤＮＡ起源を混合したものであってもよい。
また、核酸コンストラクトは、例えば米国特許第４６８３２０２号又はSaiki等., Science 239, 487-491 (1988)に記載のように、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって調製されてもよい。
核酸コンストラクトはＤＮＡコンストラクトであることが好ましく、以下では当該用語だけが用いられる。
【００４４】
更なる態様では、本発明は、本発明のＤＮＡコンストラクトを含んでなる組み換えベクターに関する。本発明のＤＮＡコンストラクトが挿入される組み換えベクターは、組み換えＤＮＡ手順に都合よく供される任意のベクターであってよく、ベクターの選択は導入しようとする宿主細胞に依存することが多いであろう。したがって、ベクターは自己複製するベクター、すなわち染色体外の実体として存在し、その複製が染色体複製から独立しているベクター、例えばプラスミドであってもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、組み込まれている染色体(一又は複数)と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、ベクターは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列がＤＮＡの転写に必要な付加的なセグメントに作用可能に連結されている発現ベクターである。通常、発現ベクターは、プラスミド又はウイルスＤＮＡ由来であるか、又は両方の成分を含有してもよい。「作用可能に連結される」なる用語は、セグメントが、意図する目的の通りに機能するように、例えば転写がプロモーターにおいて開始しタンパク質をコードするＤＮＡ配列まで進行するように整列されることを表す。
【００４５】
プロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列でよく、宿主細胞に相同な又は異種性のタンパク質をコードする遺伝子由来でもよい。
酵母宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例には、酵母糖分解遺伝子(Hitzeman等, J. Biol. Chem. 255, 12073-12080 (1980)；Alber及びKawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 419 - 434 (1982))又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young等, in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender等, 編集), Plenum Press, New York, 1982)由来のプロモーター、又はＴＰＩ１(米国特許第４５９９３１１号)ないしははＡＤＨ２-４ｃ(Russell等, Nature 304, 652 - 654 (1983))プロモーターが含まれる。
糸状菌宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例は、例えば、ＡＤＨ３プロモーター(McKnight等, The EMBO J. 4, 2093 - 2099 (1985))又はｔｐｉＡプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、Ａ．オリゼーＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー中性α-アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性α-アミラーゼ、Ａ．ニガーないしはＡ．アワモリのグルコアミラーゼ(ｇｌｕＡ)、リゾムコール・ミーヘイリパーゼ、Ａ．オリゼーアルカリプロテアーゼ、Ａ．オリゼートリオースリン酸イソメラーゼ、又はＡ．ニデュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子由来のものである。ＴＡＫＡ-アミラーゼ及びｇｌｕＡプロモーターが好ましい。
細菌性宿主細胞における使用に好適なプロモーターの例には、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトジェニック(maltogenic)アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)α-アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)ＢＡＮアミラーゼ遺伝子、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)アルカリプロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミラス(Bacillus pumilus)キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又は、ファージλＰＲプロモーターないしはＰＬプロモーターないしは大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターが含まれる。
【００４６】
また、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、必要に応じて、ヒト成長ホルモンターミネーター(前掲のPalmiter等)又は(真菌宿主のための)ＴＰＩ１(前掲のAlber及びKawasaki)ないしはＡＤＨ３(前掲のMcKnight等)ターミネーターなどの、適切な転写ターミネーターに作用可能に連結されうる。ベクターは更に、ポリアデニル化シグナル(例えばＳＶ４０又はアデノウイルス５Ｅｌｂ領域由来)、転写エンハンサー配列(例えばＳＶ４０エンハンサー)及び翻訳エンハンサー配列(例えばアデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードするもの)などの成分を含みうる。
本発明の組み換えベクターは更に、問題の宿主細胞中でのベクターの複製を可能にするＤＮＡ配列を含みうる。
宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターの複製を可能にする好適な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１-３及び複製開始点である。
宿主細胞が細菌細胞である場合、ベクターの複製を可能にする配列は、ＤＮＡポリメラーゼIII複合体コード遺伝子及び複製開始点である。
【００４７】
また、ベクターは、選択マーカー、例えばその生成物が宿主細胞中の欠損を補う遺伝子、例として、ジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)をコードする遺伝子又はシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)ＴＰＩ遺伝子(P.R. Russell, Gene 40, 125-130 (1985)に記載)、又はアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキセートなどの薬剤に耐性を与えるものを含む。糸状菌では、選択マーカーには、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ及びｓＣが含まれる。
宿主細胞の分泌経路に本発明のタンパク質を導くために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列ともしても知られる)を組み換えベクターに提供してもよい。分泌シグナル配列を、正確なリーディングフレーム内のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合する。一般的に、分泌シグナル配列はタンパク質をコードするＤＮＡ配列の５'に位置する。分泌シグナル配列は、通常タンパク質と関連するものか、又は他の分泌されたタンパク質をコードする遺伝子からのものであってもよい。
【００４８】
酵母細胞からの分泌の場合、分泌シグナル配列は、細胞の分泌経路内への発現されたタンパク質の効率的な誘導を導く任意のシグナルペプチドをコードしうる。シグナルペプチドは、天然に生じるペプチドないしはその機能的な部分であってよく、合成ペプチドであってもよい。好適なシグナルペプチドは、α-因子シグナルペプチド(米国特許第４８７０００８号を参照)、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド(O. Hagenbuchle等, Nature 289, 643-646 (1981)を参照)、変性カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド(L.A. Valls等, Cell 48, 887-897 (1987)を参照)、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド(国際公開第８７／０２６７０号を参照)、又は酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３(ＹＡＰ３)シグナルペプチド(M. Egel-Mitani等, Yeast 6, 127-137 (1990)を参照)であることが明らかとなった。
酵母での効率的な分泌のために、リーダーペプチドをコードする配列も、シグナル配列の下流とタンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に挿入されうる。リーダーペプチドの機能は、発現されたタンパク質を小胞体からゴルジ体へ、更に培養培地への分泌のために分泌小胞へ誘導することである(すなわち、細胞壁を越えて、又は少なくとも細胞膜を通過して酵母細胞のペリプラズム空間へタンパク質を放出すること)。リーダーペプチドは酵母α-因子リーダーであってよい(その使用は例えば米国特許第４５４６０８２号、欧州特許第１６２０１号、欧州特許第１２３２９４号、欧州特許第１２３５４４号及び欧州特許第１６３５２９号に記載される)。あるいは、リーダーペプチドは合成リーダーペプチド、つまり天然には見られないリーダーペプチドであってもよい。合成リーダーペプチドは、例えば、国際公開第８９／０２４６３号又は国際公開第９２／１１３７８号に記載のように構築されてもよい。
【００４９】
糸状菌での使用の場合、シグナルペプチドは、都合よく、アスペルギルスｓｐ．アミラーゼないしはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミーヘイリパーゼないしはプロテアーゼをコードする遺伝子、又はフミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)リパーゼをコードする遺伝子由来でもよい。シグナルペプチドは、Ａ．オリゼーＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガー中性α-アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性アミラーゼ、又はＡ．ニガーグルコアミラーゼをコードする遺伝子由来であることが好ましい。
本タンパク質をコードするＤＮＡ配列、プロモータ及び場合によってターミネーター及び／又は分泌シグナル配列のそれぞれをライゲートして、複製に必要な情報を含む好適なベクターにこれらを挿入するために用いられる手順は、当業者に周知である(例えば上掲のSambrook等を参照のこと)。
【００５０】
本発明のＤＮＡコンストラクト又は組み換えベクターが導入される宿主細胞は、本タンパク質を生産することが可能である任意の細胞であって、細菌、酵母、真菌類及び高等真核細胞が含まれる。
培養の際に、本発明のタンパク質を生産することが可能である細菌性宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばＢ．スブチリス(B. subtilis)、Ｂ．リチェニホルミス(B. licheniformis)、Ｂ．レンタス(B. lentus)、Ｂ．ブレビス(B. brevis)、Ｂ．ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、Ｂ．アルカロフィルス(B. alkalophilus)、Ｂ．アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、Ｂ．コアグランス(B. coagulans)、Ｂ．サーキュランス(B. circulans)、Ｂ．ロータス(B. lautus)、Ｂ．メガテリム(B. megatherium)又はＢ．サリンジエンシス(B. thuringiensis)などのバシラス属の株、又はＳ．リビダンス(S. lividans)又はＳ． ミュリナス(S. murinus)などのストレプトマイセスの株、又はエシェリキア・コリ(大腸菌)などのグラム陰性細菌である。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換によって、又は当然知られている方法でコンピテント細胞を用いて行ってよい(上掲のSambrook等を参照)。他の好適な宿主には、Ｓ．モバレンス(S. mobaraense)、Ｓ．リビダンス(S. lividans)及びＣ．グルタミカム(C. glutamicum)が含まれる(Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 447-454 (2004))。
【００５１】
大腸菌といった細菌でタンパク質が発現されると、タンパク質は、一般的に不溶性顆粒(封入体ともいう)として細胞質で保持されうるか、又は細菌性分泌配列によってペリプラズム空間に誘導されうる。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒が回収されて変性された後に、変性剤を希釈することによってタンパク質がリフォールディングされる。後者の場合、タンパク質は、例えば超音波処理又は浸透圧ショックにより細胞を崩壊させてペリプラズム空間の内容物を放出させてタンパク質を回収することによって、ペリプラズム空間から回収されうる。
【００５２】
好適な酵母細胞の例には、サッカロマイセスｓｓｐ．又はシゾサッカロマイセスｓｓｐ．の細胞、特にサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)又はサッカロマイセス・クリヴェリ(Saccharomyces kluyveri)の菌株が含まれる。異種性のＤＮＡにより酵母細胞を形質転換して、そこから異種性タンパク質を生産する方法は、例えば米国特許第４５９９３１１号、米国特許第４９３１３７３号、米国特許第４８７０００８号、米国特許第５０３７７４３号及び米国特許第４８４５０７５号に記載されており、これらはすべて出典明記によって本明細書中に援用される。形質転換細胞は、選択マーカー、一般的に薬剤耐性、又は特定の栄養分(例えばロイシン)の非存在下での生育能によって決定される表現型により選択可能である。酵母における使用に好適なベクターは、米国特許第４９３１３７３号に開示されるＰＯＴ１ベクターである。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、シグナル配列及び場合によってリーダー配列(例えば上記のもの)の後にあってもよい。更に、好適な酵母細胞の例は、Ｋ．ラクチス、ハンゼヌラ、例えばＨ．ポリモルファ(H. polymorpha)といったクリベロマイセス属、又はＰ．パストリスなどのピキア属の菌株である(参照Gleeson等, J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465 (1986)；米国特許第４８８２２７９号)。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルスｓｐｐ．、パンカビｓｐｐ．、フザリウムｓｐｐ．又はトリコデルマｓｓｐ．、特にＡ． オリゼー、Ａ．ニデュランス又はＡ． ニガーの菌株の細胞である。タンパク質の発現のためのアスペルギルスｓｐｐ．の使用は、例として欧州特許第２７２２７７号及び欧州特許第２３００２３号に記述される。Malardier等 Gene 78, 147-156 (1989)に記載のように、例えばＦ．オキシスポラム(F. oxysporum)の形質転換が行われてもよい。
【００５３】
糸状菌を宿主細胞として用いる場合、宿主染色体にＤＮＡコンストラクトを組み込んで、組み換え宿主細胞を得ることによって都合よく、本発明のＤＮＡコンストラクトにて形質転換されうる。ＤＮＡ配列は細胞中で安定して維持される傾向が強いので、一般的にこの組み込みは有用であると思われる。ＤＮＡコンストラクトの宿主染色体への組み込みは、従来法、例えば相同組み換え又は異種性の組み換えによって実施されうる。
次いで、上記の形質転換された又は形質移入された宿主細胞を、本発明のペプチドの発現を促す条件下で適切な栄養培地に培養し、その後結果として生じるタンパク質を培養物から回収する。
細胞を培養するために用いられる培地は、適切な添加物を含有する最少培地又は混合培地といった、宿主細胞を生育するために適した任意の従来の培地であってよい。好適な培地は、市販元から入手可能であるか又は公開された製法(例えばアメリカ培養細胞系統保存機関のカタログにおいて)に従って調製されてもよい。次いで、細胞によって生産されるタンパク質は、問題のタイプのタンパク質の種類に依存して、遠心ないしは濾過によって培地から宿主細胞を分離すること、塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清又は濾過液のタンパク質の構成成分を沈殿させること、様々なクロマトグラフィ、例えばイオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィの手順によって精製すること、などを含む従来の手順によって培養液から取り戻されてもよい。
【００５４】
本明細書中で引用される刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、本明細書の至る所に個別に特定の記載がなされようとも、あたかも各文献が個々にかつ特に出典明示により援用されることが示され、その全体が本明細書中に記載されている場合と同じ程度にその全体が出典明示により(法が許容する最大の範囲で)ここに援用される。
発明を特定する文脈における「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」なる語、並びに類似の表現の使用は、ここに特段の注記がなければ又は文脈上明らかに矛盾するということがなければ、単数と複数の双方をカバーするものとみなされる。例えば、「化合物」なる表現は、特に明記しない限り、本発明又は特定の記述された態様の様々な「化合物」を指すと理解されるものである。
【００５５】
特に明記しない限り、本明細書において示されたすべての厳密値は、対応する近似値の代表である(例えば、特定の因子又は測定に関して示されたすべての例示的な厳密値は、必要に応じて「およそ」を修飾した対応するおよその測定値を示すともみなされうる)。
一又は複数の構成成分に関して「含む(comprising)」、「有する(having)」、「包含する(including)」、及び「含有する(containing)」といった用語を用いた本発明の態様ないしは任意の態様の本明細書中の記載は、特に明記しない限り又は内容と明らかに矛盾しない限り、特定の一又は複数の構成成分「からなる」、「から実質的になる」又は「を本質的に含む」本発明の態様ないしは類似の態様をサポートすることを意図する(例えば、本明細書中で、特定の構成成分を含むと記載されている組成物は、特に明記しない限り又は内容と明らかに矛盾しない限り、その構成成分からなる組成物を表すとも理解されるべきである)。
【実施例】
【００５６】
実施例１
ｈＧＨのＰＥＧ化
ａ）ｈＧＨをリン酸バッファ(５０ｍＭ、ｐＨ８．０)に溶解する。この溶液を、アミンドナーの溶液、例えば１，３-ジアミノ-プロパン-２-オール溶解リン酸バッファ(５０ｍＭ、１ｍｌ、ｐＨ８．０、アミンドナーの溶解後に希塩酸にてｐＨを８．０に調整)と混合する。
最後に、リン酸バッファ(５０ｍＭ、ｐＨ８．０、１ｍｌ)に溶解したＴＧアーゼ(〜４０Ｕ)の溶液を加え、リン酸バッファ(５０ｍＭ、ｐＨ８)を加えて容量を１０ｍｌに調整する。混合した混合物を３７℃でおよそ４時間インキュベートした。
温度を室温にまで下げ、１ｍＭの終濃度までＮ-エチル-マレイミド(ＴＧアーゼ阻害薬)を添加する。更に１時間後、１０倍容量のトリスバッファ(５０ｍＭ、ｐＨ８．５)で混合物を希釈する。
ｂ）次いで、ａ）から得られたアミノ基転移ｈＧＨを場合によって更に反応させ、存在する場合にはアミンドナー中にある潜在的な官能基を活性化してもよい。 
ｃ）次いで、ａ）又はｂ）から得られた機能化ｈＧＨを、ｈＧＨに導入される官能基と反応することができる好適な機能化されたＰＥＧと反応させる。例えば、オキシム結合が、アルコキシアミンとカルボニル成分(アルデヒド又はケトン)を反応させることによって形成されてもよい。
【００５７】
実施例２
ＴＧアーゼ特異的アッセイＩ
記載する方法を用いて、実施例１に記載の反応において修飾されているｈＧＨのＧｌｎ残基(一又は複数)を決定してよい。すなわち、ここで記載する方法を用いて、本発明のＴＧアーゼの選択性を決定してよい。
【００５８】
ＰＥＧ化部位(一又は複数)の決定
実施例１において得られたモノＰＥＧ化ｈＧＨを、イオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾過の組合せを用いて精製する。
ＰＥＧ化の部位(一又は複数)を決定するために、精製された化合物を希釈して、ジチオトレイトール及びヨードアセトアミドを用いてアルキル化する。その後、化合物を非特異的なプロテアーゼであるプロテイナーゼＫを用いて消化し、結果として生じた消化物をアセトニトリル／ＴＦＡバッファシステムを用いた逆相Ｃ-１８ＨＰＬＣカラムにて分離する。ＰＥＧ化ペプチドの保持時間は主にＰＥＧ成分によって決定されるので、ＰＥＧ化されたペプチドはこれらの条件下にて、ＰＥＧ化されていないペプチドよりも有意にゆっくりと溶出し、更に、すべてのＰＥＧ化ペプチド(一より多くある場合)は同じピークで溶出する。
ピーク含有ＰＥＧ化ペプチド(一又は複数)を回収し、自動エドマン分析を用いたアミノ酸配列決定を行う。その結果、ＰＥＧ化の正確な位置−ＰＥＧ化アミノ酸が配列決定分析においてブランクサイクルを生じる−と同時に存在するペプチドの数と相対的な量との両方についての情報が得られ、それにより、ＰＥＧ化が一より多い部位で生じているかどうかが明らかとなる。
【００５９】
実施例３
ｈＧＨのＧｌｎ-４０とＧｌｎ-１４１に対する特異性についてのＴＧアーゼ変異体の試験(アッセイＩ)
２０μｌの１，３-ジアミノ-２-プロパノール(１０ｍＭのリン酸バッファ中に１８０ｍｇ／ｍｌ、濃縮ＨＣｌを加えてｐＨを８．３に調整)を、１０ｍＭのリン酸バッファｐＨ８．１の溶液(５０μｌ)中のｈＧＨ(１ｍｇ)の溶液に加える。１０ｍＭのリン酸バッファを、最終反応混合物容量が１００μｌとなる量で加える。反応は、酵素(終濃度０．０７〜７μＭ)を加えて開始する。反応混合物を３７℃でインキュベートし、その反応の後にキャピラリー電気泳動法(ＣＥ)を行う。
一定量の反応混合物(１０μｌ)に、１００ｍＭのＮ‐エチルマレイミド(１μｌ)を加える。混合物を室温で５分間インキュベートし、次いでＨ２Ｏで１００倍に希釈してＣＥ分析を行う。
ＣＥは、Agilent Technologies 3D-CEシステム(Agilent Technologies)を用いて行う。データ収集及びシグナル処理は、Agilent Technologies 3DCE ChemStationを用いて行う。キャピラリーは、６４．５ｃｍ(有効な長さ５６．０ｃｍ)、５０μｍ内径のAgilent製「Extended Light Path Capillary」である。２００ｎｍでＵＶ検出を行う(１６ｎｍＢｗ、基準３８０ｎｍ及び５０ｎｍＢｗ)。ランニング電解質は５０ｍＭのリン酸バッファｐＨ７．０である。キャピラリーは、０．１ＭのＮａＯＨにて３分間、次いでミリＱ水にて２分間、そして、電解質にて３分間調整する。
【００６０】
各動作の後、ミリＱ水にて２分間、次いでリン酸にて２分間、そして、ミリＱ水にて２分間、キャピラリーを洗い流す。４．０秒間、５０ｍｂａｒで水力学的注入を行う。電圧は＋２５ｋＶである。キャピラリーの温度は３０℃とし、動作時間は１０．５分とする。
図２は、１，３-ジアミノ-２-プロパノールによるｈＧＨのＴＧアーゼ-触媒トランスグルタミン化の代表的なＣＥ分析の画像を示す。
単一-アミノ基転移生成物の量が５時間の反応時間内でその最大に達するように、酵素量を調整する。
反応速度の指標が、基質であるｈＧＨの半分がアミノ基転移された時間により与えられる。
表１は、選択されたＴＧアーゼの結果を示す。
【００６１】
表１
2010500885.tif 000004
ＷＴ                  配列番号１のアミノ酸配列を有するＴＧアーゼ
Ｙ７５Ｅ              配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＧアーゼ
Ｙ３０２Ｒ            配列番号３のアミノ酸配列を有するＴＧアーゼ
Ｙ７５Ｅ、Ｙ３０２Ｒ  Ｔｙｒ-７５がＧｌｕに置換され、Ｔｙｒ-３０２がＡｒｇに置換されている配列番号１に記載のＴＧアーゼ
【００６２】
実施例４
ｈＧＨのＧｌｎ-４０とＧｌｎ-１４１に対する特異性についてのＴＧアーゼ変異体の試験(アッセイＩＩ)
このアッセイは、位置Ｇｌｎ-４０及びＧｌｎ-１４１のうちの１つにグルタミンの代わりにアスパラギン残基を有し、反応のために１つのグルタミンを残している各々２つのｈＧＨ変異体を使用する。前記変異体の調製は、Kunkel TA等, Methods in Enzymology 154, 367-382 (1987)及びChung Nan Chang等, Cell 55, 189-196 (1987)に記載される。ｈＧＨ変異体Ｑ４０ＮはｈＧＨのＧｌｎ-１４１のモデル基質であり、Ｑ１４１ＮはＧｌｎ-４０のモデル基質である。
２２５ｍＭの１，３-ジアミノ-２-プロパノール及び３５ｍＭのトリス(ｐＨは濃縮ＨＣｌを加えて８．０に調整)を有する４００μｌのバッファ溶液に、６００μｌの変異体ｈＧＨ(１．５ｍｇ／ｍｌ)及び５μｌのＴＧアーゼ(１．６ｍｇ／ｍｌ)を添加する。反応混合物は２５℃で３０分間インキュベートする。
Mono Q 5/5 GL 1 ml (GE Health)カラムを用いたＦＰＬＣと２８０ｎｍでのＵＶ検出によって次の分析を行う。バッファＡ：２０ｍＭのトリエタノールアミンｐＨ８．５；バッファＢ：２０ｍＭのトリエタノールアミン ０．２ＭのＮａＣｌ ｐＨ８．５；流速：０．８ｍｌ／分。以下のように溶出勾配を定める：
2010500885.tif 000005
【００６３】
次いで、選択性比率が、Ｑ１４１及びＱ４０の２つの生成物による曲線(図３及び４に示す)の下の２つの領域(任意の単位)の比率から算出される。Ｓ．モバレンスのＴＧアーゼ(配列番号１)とＳ．ラダカヌムのＴＧアーゼ(配列番号６)を用いた場合の結果を表２に示す。Ｑ４０Ｎ＋その生成物−Ｑ１４１＝Ｑ１４１Ｎ＋その生成物−Ｑ４０、そして１００に規準化する。
表２
2010500885.tif 000006
【００６４】
実施例５
Ｓ．モバレンスのＴＧアーゼ変異体の選択性Ｉ
ＴＧアーゼ変異体の調製
テンプレートとしてＳ．モバレンシスの野生型ＴＧアーゼをコードするＤＮＡを用いた部位特異的突然変異誘発法により変異体コンストラクトを作成し、選択マーカーとしてカナマイシンを用いてｐＥＴ３９ｂ（Novagen）ベクターにクローンした。ＤＮＡ配列決定により変異部位の配列を確認した。次いで、該コンストラクトを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。３０μｇ／ｍｌカナマイシンを補給したＬＢ培地で変異タンパク質の発現を行った。３７℃で細胞を培養し、更に４時間、０．６の光学濃度で１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。細胞破壊のために、細胞を、２０ｍＭのトリス、５ｍＭのＥＤＴＡ、３０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％トリトンＸ-１００ｐＨ７．０に懸濁した。遠心分離後、封入体をペレットから単離し、１００ｍＭのクエン酸、８Ｍの尿素、３０ｍＭのＤＴＴｐＨ６．０に溶解させた。リフォールディングバッファ、２０ｍＭのクエン酸、１０％のグリセロール、１０％のエチレングリセロール、ｐＨ６．０で１：２０（ｖ／ｖ）に希釈してリフォールディングを行った。
次いでリフォールディングされたタンパク質を、ｐＨ６．０で、Sepharose SP HP陽イオン交換カラムにより精製した。活性ｍＴＧアーゼ含有画分をプールし、次に約１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルで最終タンパク質を確認し、活性定量を行った。
【００６５】
反応速度選択性アッセイ
ｈＧＨのＱ１４１又はＱ４０部位に連結されると、蛍光色素、ダンシルカダベリン（ＤＮＣ）は強く蛍光を発する。よって、蛍光増加によりＴＧアーゼ活性が連続的にモニターできる。安定した反応状態において、Ｑ１４１及びＱ４０に対するＴＧアーゼの選択性は、Ｓ＝ｖ０＿Ｑ４０Ｎ／ｖ０＿Ｑ１４１Ｎ＝ｋｃａｔ＿Ｑ４０Ｎ／ｋｃａｔ＿Ｑ１４１Ｎ、ここでｖ０は初速度；ｋｃａｔは擬似一次速度定数である、として容易に計算される。選択性は、ｍＴＧアーゼ濃度及び反応時間と無関係である。２００ｍＭのＮａＣｌ、５０μＭのｈＧＨＱ１４１Ｎ又はｈＧＨＱ４０Ｎ、１００μＭのダンシルカダベリン（ＤＮＣ、Ｆｌｕｋａ）を含有する２００μｌのトリス-ＨＣｌバッファ，２０ｍＭ，ｐＨ７．４で速度反応を行った。２μｇのｍＴＧアーゼの添加により反応を開始し、２６℃で実行した。一時間２０秒毎にＥｘ／Ｅｍ：３４０／５２０ｎｍで蛍光をモニターした。プログレス曲線を、０−２０００秒の間に収集されたデータを用いて二次多項式に当てはめた。時間０における曲線の傾斜を反応初速度として用いた。
【００６６】
ｍＴＧアーゼ変異体の高い選択性を検証するためのキャピラリー電気泳動：
ｈＧＨのトランスグルタミン化反応
ＴＧアーゼの触媒作用を受けてｈＧＨには反応性リシン残基が存在する。よって、ｈＧＨは低いアシル受容体濃度で架橋反応を受けうる。活発に選択性にアクセスするためには、高濃度のアシル受容体を用いなければならない。アシル受容体として１００ｍＭの１，３-ジアミノ-プロパノールを用いてトランスグルタンミン化反応を実行すると、架橋反応は完全に抑制される。ＴＧアーゼタンパク質を添加して反応を開始し、室温で２時間インキュベートした。試料を１５−３０分の間隔で取り、液体窒素で凍らせ、ＣＥ分析まで−２０℃で保存した。表３に示したように反応混合物を作った。
表３
野生型ｈＧＨ及び１，３-ジアミノールプロパノールを用いたトランスグルタミン化のための反応混合物の調製
2010500885.tif 000007
ｈＧＨ希釈標準溶液を、トリスＨＣｌ，５ｍＭ，ｐＨ７．０の原液から最初に調製した。
【００６７】
ＣＥ分析
まず、凍らせた試料をＨ２Ｏで１：１０に希釈し、３０．５ｃｍ×５０ｕｍ内径のキャピラリーを用いてBeckman CoulterのP/ACE MDQを使用してＣＥを行った。トランスグルタミン化されたｈＧＨのｐｌは約５．８０−６．２０であるため、トリスＨＣｌ，５０ｍＭ，ｐＨ８．０でＣＥ分析を実行した。
選択性の改善された変異体
結果は、Ｓ．モバレンシス由来のｍＴＧアーゼへのＭｅｔ又はＡｌａＰｒｏのＮ-末端添加が酵素の選択性に影響しないことを示す。しかして、プロペプチド-ＴＧアーゼからエンテロキナーゼ消化により作成されたＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧアーゼ（Ｎ末端においてＴＧアーゼに付着された追加のＡｌａＰｒｏを有する）を基準として用い、変異体について選択性の改善を評価した。
いくつかの変異についてのデータを表４に挙げた。Ｓ．ラダカヌム由来のｍＴＧアーゼのＳ２５０を模倣する変異体Ｇ２５０Ｓは、その野生型と比べて選択性を２倍に改善する。この選択性は、Ｓ．ラダカヌム由来のｍＴＧアーゼのものに似ている。
表４
2010500885.tif 000008
１ＲＳ１：相対的選択性、変異体の選択性  対  Ｓ．モバレンシス由来の野生型成熟ＴＧアーゼの選択性
２ＷＴ：Ｇ２５０Ｓについては、Ｓ．モバレンシス由来の野生型成熟ＴＧアーゼを基準として使用した；他の全ての変異については、野生型ｍＴＧアーゼのＡｌａＰｒｏ-ＴＧアーゼバージョンを基準として使用した。野生型ＴＧアーゼ及びＡｌａＰｒｏ-ＴＧアーゼは両方ともｈＧＨＱ４０Ｎ／Ｑ１４１Ｎについて類似の選択性を有する。
ｈＧＨＱ４０Ｎを用いてＱ１４１部位に対する活性を測定し、そしてｈＧＨＱ１４１Ｎを用いてＱ４０部位に対する活性を測定した。選択性は、ｈＧＨＱ４０Ｎ／Ｑ１４１Ｎの活性の比として計算した。
【００６８】
反応速度アッセイで使用されたＤＮＣ濃度は、二量体又はマルチマー形成を阻害するほど高くなく、該アッセイにより測定された選択性は改善の一般的傾向を示しうるが、実際の選択性より低く見積もりうる。したがって、ＣＥにより改善された選択性を確認した。Ｍｅｔ-ＴＧアーゼ＿Ｙ７５Ｎの結果を表５にまとめた。Ｑ４０を超えてｈＧＨのＱ１４１について１８．９９の選択性を有し、これは野生型ＴＧアーゼのものよりも約３．２倍高く、このことは反応速度アッセイで得られた相対的選択性３と一致する。
表５
2010500885.tif 000009
野生型ＴＧアーゼ（ＡｌａＰｒｏ-ＴＧアーゼバージョンでの）を比較のための基準として使用した。選択性は、位置Ｑ４０におけるモノ置換ｈＧＨを越える、位置Ｑ１４１におけるモノ置換ｈＧＨの比率である。転換率は、反応に添加された野生型ｈＧＨの量を超える、転換された野生型ｈＧＨの量として計算した。
また、反応についてのＣＥプロファイルを、野生型ＴＧアーゼ（ＡｌａＰｒｏ-ＴＧアーゼバージョン）については図５に、Ｍｅｔ-ＴＧアーゼ＿Ｙ７５Ｎについては図６に示す。ＣＥにおける野生型ｈＧＨ、Ｑ１４１でのモノ置換ｈＧＨ、及びＱ４０でのモノ置換ｈＧＨについての保持時間は、６．５、７．９、及び１０分であった。
【００６９】
実施例６
Ｓ．モバレンスのＴＧアーゼ変異体の選択性ＩＩ
５０μＭのＱ１４１Ｎ又はＱ４０Ｎヒト成長ホルモン及び１００μＭのモノダンシルカダベリンを含有する２０ｍＭのトリス-ＨＣｌ，ｐＨ７．４及び２００ｍＭのＮａＣｌバッファ（酢酸で粉末を溶解して調製し、１Ｍのトリス-ＨＣｌ，ｐＨ８．５で緩衝した）で、室温で各反応を実行した。ＴＧアーゼを混合物に添加して反応を開始した。蛍光を３０秒毎にｅｘｔ／ｅｍ．３４０／５２０ｎｍで測定した。Ｑ４０Ｎ及びＱ１４１Ｎについて反応初速度を推定し、選択性を計算するために使用した。
複数のＳ．モバレンスＴＧアーゼについての当該実験の結果を表６に示す。
表６
2010500885.tif 000010
【００７０】
実施例７
Ｓ．ラダカヌムのＴＧアーゼ変異体の選択性
５０μＭのＱ１４１Ｎ又はＱ４０Ｎヒト成長ホルモン及び１００μＭのモノダンシルカダベリンを含有する２０ｍＭのトリス-ＨＣｌ，ｐＨ７．４及び２００ｍＭのＮａＣｌバッファ（酢酸で粉末を溶解して調製し、１Ｍのトリス-ＨＣｌ，ｐＨ８．５で緩衝した）で、室温で各反応を実行した。ＴＧアーゼを混合物に添加して反応を開始した。蛍光を３０秒毎にｅｘｔ／ｅｍ．３４０／５２０ｎｍで測定した。Ｑ４０Ｎ及びＱ１４１Ｎについて反応初速度を推定し、選択性を計算するために使用した。
複数のＳ．ラダカヌムＧｌｙＰｒｏ-ＴＧアーゼについての当該実験の結果を表７に示す。
表７
2010500885.tif 000011
【図１】
2010500885.tif 000012
【図２】
2010500885.tif 000013
【図３】
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【図４】
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【図５】
2010500885.tif 000016
【図６】
2010500885.tif 000017
【配列表】
2010500885000001.app
【国際調査報告】
2010500885.tif 000018
2010500885.tif 000019
2010500885.tif 000020
2010500885.tif 000021
2010500885.tif 000022
2010500885.tif 000023