(57)【要約】本発明は移植片に関連し、ここで培養自己メラニン細胞を、生体高分子を用いて送達する。本発明は、その組成物、調製の方法、および安全性および有効性に関連するその性質を記載する。本発明の移植片は、皮膚の再色素沈着において使用することが可能である。１つの実施態様において、本発明は、自己表皮由来のメラニン細胞および生体高分子膜を含む、皮膚における色素沈着を誘発し得る移植片組成物を含み、ここで５−３７℃の輸送条件下で、少なくとも７２時間、少なくとも７５％の細胞が、組成物中で生存可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己表皮由来のメラニン細胞および生体高分子膜を含む、皮膚における色素沈着を誘発し得る移植片組成物であって、ここで少なくとも７５％の該細胞が、５−３７℃の輸送条件下で、少なくとも７２時間、該組成物中で生存可能である、移植片組成物。
【請求項２】
少なくとも８０％の前記細胞が、５−３７℃の輸送条件下で、少なくとも９６時間、前記組成物中で生存可能である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、ケラチノサイト細胞をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記メラニン細胞組成物と前記ケラチノサイト細胞とが、前記生体高分子膜中で０．８：２から１：１の比で存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞が、前記生体高分子膜上で単層として存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記単層が、サブコンフルエントな単層である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記メラニン細胞が、さらに増殖し得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも９０％の前記細胞が、活発に増殖しているメラニン細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記生体高分子膜が、少なくとも５０，０００Ｄａの分子量を有する、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、およびポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記生体高分子膜が、ポリ乳酸（ＰＬＡ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記メラニン細胞が、結果として生じた組成物が皮膚の色素沈着低下異常に対して治療効果を有するように、十分な量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の組成物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
ａ）自己表皮からメラニン細胞を単離する工程；
ｂ）単離されたメラニン細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程；
ｃ）該メラニン細胞を増殖させる工程；
ｄ）任意で、該メラニン細胞を凍結保存する工程；
ｅ）任意で、該メラニン細胞を解凍する工程；
ｆ）該メラニン細胞を生体高分子膜に播種する工程；
ｇ）該細胞を生体高分子膜上でサブコンフルエントな単層中で増殖させる工程；および
ｈ）輸送培地を含む輸送装置を用いて、該生体高分子膜を輸送する工程；
を含み、ここで少なくとも７５％の該細胞が、輸送条件下で少なくとも７２時間、該組成物中で生存可能なままである、プロセス。
【請求項１３】
前記生体高分子膜が、ポリ乳酸（ＰＬＡ）を含み、前記メラニン細胞が、１×１０４から１×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で、該生体高分子膜に播種される、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記輸送装置が、ポリカーボネートを含む、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記輸送培地が、二酸化炭素富化培地を含む、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記輸送培地が、ＫＳＦＮ培地である、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１７】
皮膚の色素沈着を必要とする個体を治療するための方法であって、該方法は、該個体に請求項１に記載の組成物を適用する工程を含み、該組成物は、該個体の皮膚における表皮再生の速度を増強する、方法。
【請求項１８】
前記個体がヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記皮膚の色素沈着を必要とする個体が、白斑に罹患している、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
メラニン細胞のサブコンフルエントな単層および生体高分子膜を含む組成物であって、ここで少なくとも７５％の該細胞が、５−３７℃の輸送条件下で、少なくとも７２時間、該組成物中で生存可能である、組成物。
【請求項２１】
ケラチノサイトと同時培養されたメラニン細胞のサブコンフルエントな単層および生体高分子膜を含む組成物であって、ここで少なくとも７５％の該細胞が、５−３７℃の輸送条件下で、少なくとも７２時間、該組成物中で生存可能である、組成物。
【請求項２２】
前記メラニン細胞が、ケラチノサイトと１：１の比で同時培養される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
（１）未分化細胞を含むケラチノサイト細胞のサブコンフルエントな単層、および（２）生体高分子膜を含む組成物であって、ここで少なくとも７５％の該細胞が、５−３７℃の輸送条件下で、少なくとも７２時間、該組成物中で生存可能である、組成物。
【請求項２４】
被験体における色素脱失を治療するための方法であって、送達システムとして生体高分子膜を使用する工程、および皮膚にサブコンフルエントなメラニン細胞の単層を送達する工程を含む、方法。
【請求項２５】
被験体における色素過剰を治療するための方法であって、送達システムとして生体高分子膜を使用する工程、および皮膚にサブコンフルエントなメラニン細胞の単層を送達する工程を含む、方法。
【請求項２６】
白斑を治療するためのキットであって、該キットは（１）（ａ）メラニン細胞のサブコンフルエントな単層および（ｂ）生体高分子膜を含む組成物であって、ここで該単層は該生体高分子膜上にある、組成物；ならびに（２）輸送装置を含み、ここで少なくとも７５％の該メラニン細胞が、５−３７℃の輸送条件下で少なくとも７２時間、組成物中で生存可能なままである、キット。
【請求項２７】
前記請求項に記載され、本明細書の実施例および図で実質的に例示し、本明細書において実質的に記載された、自己表皮由来のメラニン細胞および生体高分子膜を含む、皮膚における色素沈着を誘発し得る移植片組成物、その方法およびキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する特許出願への相互参照）
本出願は、２００６年１０月１３日に出願されたインド国暫定特許出願番号１６９７／ＭＵＭ／２００６の利益を請求しており、その開示は、その全てにおいて参考として援用される。
【０００２】
本発明は、適当な担体システムにおける皮膚メラニン細胞の送達システム、およびその調製方法に関連する。１つの実施態様において、本発明は、自己メラニン細胞の移植片、その調製方法、病院への輸送、および白斑を含むそれらの治療的適用に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（皮膚およびメラニン細胞の生理学的役割）
皮膚は、体の最も大きな臓器であり、そして基底膜によって、下にある結合組織構成成分、真皮と分けられる、表皮と呼ばれる外側の上皮構成成分から成る。表皮に隣接する真皮の部分は、真皮網状層と呼ばれ、そして主に線維芽細胞によって産生されるコラーゲン線維、微小血管、および少数の遊走性白血球から成る。真皮網状層は、血管を欠く表皮に、全ての栄養分を供給する。表皮における大部分の細胞はケラチノサイトであり、それは重層化した層に並んでいる。真皮−表皮結合部は基底層、少数のメラニン細胞が分散した（３０個のケラチノサイトあたり約１個のメラニン細胞）ケラチノサイトの単層であり、それはメラニン細胞から伸びた樹状突起によって、付近のケラチノサイトにメラニンを供給する。皮膚の色は、異なるメラニンのタイプの絶対的および相対的な量によって決定され、そのうち２つの主な形式はユーメラニンおよびフェオメラニンである。これらは、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）によって調節される。変異ＭＣ１Ｒ配列は、異なる皮膚の色と関連する。メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）のＭＣ１Ｒへの結合は、ユーメラニンの形成を引き起こし、一方アグーチタンパク質のＭＣ１Ｒへの結合は、フェオメラニンの産生を引き起こす。ＵＶ曝露による皮膚の日焼けは、表皮内のユーメラニンの含有量の増加を示し、そしてその主な目的は光防護の増加である。これらは、メラニン細胞の数またはその活性の変化によって起こり得る。
【０００４】
色素沈着異常
色素沈着低下および過剰の異常は、メラニン細胞の数の変化、またはメラニン細胞の活性の増加または減少によって起こり得る。色素沈着過剰の最もよくある異常の１つは、黒皮症である。色素沈着過剰の誘発および維持において、日光への曝露が非常に重要な役割を果たす。防護無しでは、ＵＶ照射は、その細胞の遺伝コードまたはＤＮＡの変異を引き起こし得る。これは細胞機能を有意に変化させ、酒さ（ｒｏｓａｃｅａ）、皮膚の老化、免疫機能の不全、および癌に関連する変化を引き起こし得る。
【０００５】
それに加えて、酒さ、レーザー治療、またはＵＶ曝露によって起こる炎症は、メラニン細胞の機能に影響を与え、メラニンまたは色素の産生の異常な増加を引き起こし得る。これは、そばかす、不均一な斑状の着色、または日光黒子（多くの場合しみと呼ばれる）として視覚的に顕在化し得る。医学的研究は、異常な産生をコントロールし、そして色素沈着過剰病変の出現を解決するために、メラニンを調節する方法に焦点をあわせてきた。
【０００６】
色素沈着低下に関連する異常は、例えば（ａ）白斑（ｌｅｕｋｏｄｅｒｍａ）、多くの場合皮膚の炎症性疾患、例えばアトピー性皮膚炎と関連する；および（ｂ）白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）を含む。
【０００７】
白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）
白斑（ｌｅｕｋｏｄｅｒｍａ）としても知られる白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）（ｖｉｔ-ｉｌｌ-ｅｙｅ-ｇｏ）は、皮膚、口および鼻の内側の組織および生殖器および直腸領域（粘膜）、および眼の網膜のメラニン細胞が破壊される、色素沈着異常である。結果として、皮膚の白い斑が体の異なる部分に現れる。白斑（ｖｉｔｌｉｇｏ）に冒された領域に生える毛は、白くなり得る。
【０００８】
白斑は、インドで１００人ごとに約１人、そして米国で２０００人に約１人が罹患している。世界の人口の約１から２％、または４千万人から５千万人の人々が、白斑（ｖｉｔｌｉｇｏ）を有する。白斑を、世界の全ての部分で見出し得る。それは全ての民族を冒すが、濃い色の皮膚を有する人々の方が、はるかにより無効である（ｄｉｓａｂｌｉｎｇ）。この疾患は、男性および女性を等しく冒す。通常の発症年齢は１０および３０歳の間であるが、その状態はあらゆる年齢において始まり得る。白斑を有する人々の９５％は、４０歳より前に発症する。白斑によって引き起こされた外見の変化は、人の感情的および心理学的な幸福に影響を与え得、そして仕事を得るまた維持するのが困難になり得る。この異常を有する人々は、特に白斑が顔、手、腕、足のような体の見える領域、または生殖器にあらわれるなら、感情的なストレスを経験し得る。多くの場合特にその外見に関心を有する青年は、広範囲の白斑によって打ちのめされ得る。白斑を有する人々のいくらかは、困惑し、恥じ、憂鬱になり、または他人がどのように反応するかについて心配する。
【０００９】
白斑を治療する目標は、皮膚の機能を修復すること、および患者の外見を改善することである。現在の白斑の治療は、多くの場合、長い時間、例えば６から１８ヶ月がかかる。治療の選択は、白い斑の数およびそれらがどれだけ広がっているか、および患者の治療に対する好みに依存する。
【００１０】
白斑の病因
現在までに、白斑の病因を説明するために３つの重要な仮説が提唱された。自己免疫仮説は、白斑は何らかの自己免疫疾患と関連するという観察から生じた。メラニン細胞への自己免疫損傷の原因となる、細胞性および体液性両方の因子が示された。自己細胞傷害性または自滅仮説は、メラニンの生合成の間に産生された何らかの毒性分子が、感受性の個体におけるメラニン細胞の損傷の原因であることを示唆する。神経仮説は、神経末端から放出された神経化学物質が、メラニン細胞に毒性であると想定する。何人かの人々が、日焼けまたは感情的苦悩が、白斑のトリガーとなり得ることを報告した。複数のメカニズムが、白斑の原因であり得る。
【００１１】
利用可能な治療
多くの（ａ  ｎｕｍｂｅｒ）アプローチが有効であることが公知であるのだが、白斑の普遍的に有効な医学的または外科的治療は存在しない。本文において後で列挙するこれらの医学的および外科的治療に加えて、白斑の皮膚の光損傷を防ぐための広域スペクトルの日焼け止め、およびしみのある醜い皮膚の美容的カモフラージュまたは白斑の露出した領域の化粧のような、補助治療も常に考えておかなければならない。
【００１２】
メラニンの合成を阻害する、多くの局所的薬剤が存在するが、研究者は、色素性変化に対してより大きなコントロールをもたらすチロシナーゼ酵素の産生を直接調節するブレークスルーに焦点を合わせている。より新しい細胞は、より少ない色素顆粒を含むようなので、細胞のターンオーバーの速度の増加および表皮の正常化を助ける、局所的なスキンケア調製物も、異常に色素沈着した領域の出現を少なくし得る。しかし、予備的な調査が、イソプリノシン、レバミゾール、トシル酸スプラタスト、シクロスポリンを含む、そのような局所スキンケア調製物（それらは全て免疫抑制剤／免疫調節剤である）による、白斑病変の再色素沈着を報告している。
【００１３】
医学的治療
局所ステロイド治療は、特に疾患の初期に開始したなら、皮膚の再色素沈着（白い斑に色を回復させる）に役立つ。患者は、結果を見るまでに少なくとも３ヶ月間、ステロイド局所クリームをその皮膚の白い斑に適用する必要がある。皮膚の収縮および皮膚線条（皮膚の線条または線）のような副作用のリスクも存在し、医師はそれらをよくモニターしなければならない。
【００１４】
ソラレンＵＶＡ光化学治療（ＰＵＶＡ）は、ソラレンを経口または局所的に投与し、続いて特別なランプからのＡ波長紫外線（ＵＶＡ）または日光に注意深く時間を合わせて曝露することを含む。患者は通常、その医師のオフィスで治療を受け、いかなる副作用に関しても注意深く観察され得る。患者は、他の時間における日光への曝露を最低限にしなければならない。しかし、それは時間がかかり、そして重症であり得る場合もある副作用を避けるために注意しなければならない。ソラレンは、紫外線と反応して皮膚を黒くする化学物質を含む薬剤である。局所ＰＵＶＡ治療には２つの主な可能性のある副作用が存在する：（１）重症の日焼けおよび水疱形成、および（２）治療したパッチまたは白斑周囲の正常皮膚の過剰な再色素沈着または黒化（色素沈着過剰）。経口ソラレンの、他の公知の副作用は、嘔気および嘔吐、掻痒、異常な毛の成長、および皮膚癌リスクの増加を含む。
【００１５】
色素脱失は、既に白い領域に合わせて、体の残りの皮膚が退色することを含み、そしてより多くの場合広範な白斑を有する人々に対して用いられる。患者は、ヒドロキノンのモノベンジルエーテルの薬剤（モノベンゾンまたはベノクイン）を、１日２回、それらが既に色素脱失した領域にマッチするまで、色素沈着した領域に適用する。患者は、薬剤を適用した後少なくとも２時間、他の人々との直接的な皮膚対皮膚の接触を避けなければならない。色素脱失治療の主な副作用は、皮膚の炎症（発赤および肥大）である。患者はまた、掻痒、皮膚の乾燥または白目を覆う膜の異常な黒化を経験し得る。色素脱失は、持続性であり、そして逆行できない。それに加えて、色素脱失を受けた患者は、常に日光に対して異常に感受性である。
【００１６】
外科的治療
色素脱失した皮膚の治療のための、いくつかの外科的手順が、医学的治療でよい反応を得るのが難しかった患者において有効であると報告された。外科的治療アプローチは、皮膚移植を含む。皮膚移植の間、医師は正常な、色素沈着した皮膚（ドナー部位）の部分を除去し、そしてそれらを色素脱失した領域（レシピエント部位）に置く。
【００１７】
外科的技術は以下のものを含む：
１．吸引水疱形成移植（Ｓｕｃｔｉｏｎ  ｂｌｉｓｔｅｒ  ｇｒａｆｔ）は、患者の正常な色素沈着皮膚に、熱、吸引、または凍結を用いて作られる。次いで水疱の上部を切り取り、そして色素脱失した皮膚領域に移植する。水疱形成移植のリスクは、敷石状所見の発生、瘢痕、および再色素沈着の欠如を含む。しかし、他の型の移植よりも、この手順によると、瘢痕のリスクが少ない。
２．パンチグラフト（ｐｕｎｃｈ  ｇｒａｆｔ）は、色素脱失した皮膚を置換するために使用された。パンチグラフトは、市販で入手可能なパンチを用いて、患者から除去された正常な皮膚の小さな部分である。白斑性皮膚の皮膚剥離の後、これらの移植片をその領域の上一面において色素沈着を誘発する。この技術は、有効であるが、敷石状所見および瘢痕を引き起こす。
３．刺青は、特に濃い皮膚を有する人々において、唇領域に最も有効である；しかし、医師が周囲の領域の皮膚の色と完全にマッチさせることは困難である。刺青は、時間につれて退色する傾向がある。それに加えて、唇の刺青は、単純ヘルペスウイルスによって引き起こされる水疱の激増のエピソードを引き起こし得る。
【００１８】
他の方法
白斑を治療するためのさらなる方法が、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、および特許文献５、特許文献６および特許文献７、および特許文献８および特許文献９を含む、いくつかの特許および特許出願において提案された。これらの文書のいくつかは、メラニンおよび／またはメラニン細胞産生を刺激するための組成物を提案する。別のものは、メラニンの皮膚への直接注入を提案する。他の文書は、細胞を送達する手段に焦点を合わせる。例えば、ケラチノサイトおよび線維芽細胞を含む細胞ペースト；フィブリン糊のような担体マトリックスを用いて送達される培養メラニン細胞およびケラチノサイト；または特別に適応した装置による細胞懸濁液の送達。別のものは、疎水性合成ポリマーフィルムに固定した哺乳類細胞を含む創傷包帯を記載する。これらの創傷包帯によって、フィルムをそれ自体皮膚に適用し、そして細胞は穿孔を通じて移動する必要がある。この型の送達は、より少ない細胞が皮膚と直接接触することをもたらし、そしてフィルムの多孔性性質の効率が、細胞の遊走に決定的である。別の文書は、有効な量のジアシルグリセロールと接触させることによって活性化したメラニン細胞を含む皮膚移植片による、白斑パッチに対する皮膚移植片の移植を含む、色素沈着を増加させる方法を提案する。この方法によって、移植のために取られるドナー皮膚領域は、その皮膚移植片によって覆われる必要のある色素脱失領域に依存する、すなわち大きな脱失領域を覆うために、ドナー皮膚のより大きな領域が必要である。他の技術は、純粋なメラニン細胞培養、およびメラニン細胞およびケラチノサイトの同時培養を含む。これらの技術は、局在化した病変に有用である。
【００１９】
ヒトメラニン細胞の培養における最近の進歩は、今や色素脱失した皮膚の領域に、正常な皮膚の色の領域から得た自己メラニン細胞を移植することを可能にする。直接的なメラニン細胞移植手順において、患者の正常に色素沈着した皮膚のサンプルを取り、そして酵素的に解離させる。ケラチノサイトおよびメラニン細胞を含む、できた細胞懸濁液を、次いで創面切除した色素脱失領域に直接加える。
そのような方法の不利な点は、以下のものを含む：
（ａ）細胞数の同定：できた細胞懸濁液は、全ての型の表皮細胞を含むので、色素脱失部位に投与されたメラニン細胞の数の同定は、不明なままである。
（ｂ）色素脱失部位における細胞の保持：細胞を色素脱失領域にスプレーする、または注ぐので、細胞は続いて適用される包帯中で失われ得る。従って、創面切除領域に保持された細胞の数は不明である。
（ｃ）領域被覆度：最初の取られた生検が色素脱失領域と比較して小さい場合、色素脱失部位に投与されるメラニン細胞の数は、満足するレベルの色素沈着を引き起こすために十分ではない。
【００２０】
上の不利な点のいくつかは、インビトロでメラニン細胞を培養する方法を開発することによって克服される。培養皿でメラニン細胞を増殖させた後、その細胞を皿から解離させ、そしてその細胞を患者の創面切除した色素脱失皮膚パッチに移植する。今まで、メラニン細胞移植についての全ての研究は、研究センターに付属の病院またはメディカルセンターのいずれかで行われ、そしてメラニン細胞懸濁液の皮膚への送達を含む。この送達方法は非効率的であり、細胞は創傷ベッドに正しく送達されない、または治療した皮膚の上に適用されるガーゼにトラップされる。
【００２１】
白斑の病因の理解および治療において進歩したが、市販で入手可能な産物の多くは、ぎりぎりのところで有効であるのみであり、そしてむらのない外観の皮膚の調子を達成するものはほとんどない。
【００２２】
今必要なものに眼を向けると、本発明は、存在する細胞送達システムの不利な点を克服する方式で、白斑領域に機能的メラニン細胞を送達して再色素沈着を誘発するための新規システムを提供する。
【００２３】
本発明は、移植のための機能的メラニン細胞の移植片を提供し、それを集中製造または処理センターから、異なる場所に位置する医師または病院に輸送し得る。本発明によって開発したメラニン細胞は、皮膚の白斑領域に送達して再色素沈着を誘発するためのものである。以前の研究は全て、研究センターに付属の病院において行われた。
【００２４】
現在まで、メラニン細胞培養を、遠距離を越えて安全および信頼性高く輸送できないために、メラニン細胞の移植を離れて行うことは不可能であった。本発明は、組成物を組み立てまたは調製するために、病院、近くの研究センターまたは医師に頼るのではなく、製造施設から病院または医師へ直接発送され得る、包装済みの「レディメイド」組成物の利点を提供し、それはコストを大幅に抑制し、そして効率および使用し易さを増加させる。
【００２５】
従って、細胞を集中施設で処理し、そして様々な病院へ送達することを可能にするシステムを有する必要性が依然として存在する。輸送中の細胞の生存度を維持することが、移植の成功に決定的である。本発明の発明者らは、生検の輸送、メラニン細胞の培養、生体高分子上でのその輸送および送達に焦点を合わせるシステムを開発した。本発明の送達システムは、メラニン細胞の遊走および皮膚におけるコロニー形成を促進し、再色素沈着を引き起こす方式で、細胞を色素脱失した皮膚へ提供する。
【００２６】
本発明は、そのようなシステムを産生するのに成功し、それはコストを大幅に抑制し、そして治療の容易さを増加させ、従って患者のためになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】米国特許第４，８６６，０３８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７００，４５０号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０３９，９７２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，６６０，３０５号明細書
【特許文献５】米国特許第６，６７３，６０３号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００１／０００６８１３号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００２／０１０６３５３号明細書
【特許文献８】国際公開第２００４０９６９８１号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２００５０１１６７６号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明によって開発されたように、ケラチノサイトに加えて自己培養メラニン細胞の移植片を用いることは、よく回復した色素沈着を達成し、それによって白斑のような色素沈着低下状態を軽減することが提案される。同時培養システムにおけるケラチノサイトの存在は、より速い創傷の閉鎖を助ける。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
（発明の要旨）
本開示は、透明な生体適合性フィルム上で培養した、増殖性メラニン細胞を含む移植片に関連する。その細胞が創面切除部位と向かい合わせになるようにフィルムを反転することによって、細胞を色素脱失部位に直接送達する。１つの実施態様において、本発明の移植片は、メラニン細胞の生存度を、移植前に輸送条件下で最低９６時間維持する。本発明は、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、白斑（ｌｅｕｃｏｄｅｒｍａ）のような色素沈着低下異常、およびまた母斑のような色素沈着過剰状態の治療に有用である。色素沈着過剰領域を、色素沈着低下部位と同様に創面切除し得る。これは、非常に濃い色素沈着の原因である、活動亢進メラニン細胞の除去を引き起こす。この部位における正常メラニン細胞の移植は、正常色素沈着を助ける。
【００３０】
１つの実施態様において、本発明は、自己表皮由来のメラニン細胞および生体高分子膜を含む、皮膚における色素沈着を誘発し得る移植片組成物を含み、ここで５−３７℃の輸送条件下で、少なくとも７２時間、少なくとも７５％の細胞が、組成物中で生存可能である。関連する実施態様において、５−３７℃の輸送条件下で、少なくとも９６時間、少なくとも８０％の細胞が、組成物中で生存可能である。
【００３１】
さらなる実施態様において、そのメラニン細胞組成物はさらに、ケラチノサイトを含む。いくつかの実施態様において、メラニン細胞対ケラチノサイトの比は、０．８：２から１：１である。
【００３２】
本発明の移植片において、その細胞は単層であり得る。いくつかの実施態様において、その単層は少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、および１００％コンフルエントである（すなわちセミコンフルエントからコンフルエントの範囲）。
【００３３】
１つの実施態様において、本発明のメラニン細胞は、さらに増殖し得る。関連する実施態様において、移植片の少なくとも９０％のメラニン細胞が、活発に増殖しているメラニン細胞である。
【００３４】
本発明の細胞を、生物学的に適合性のポリマー（生体高分子）膜上で増殖させる。適当な生物学的に適合性の膜は、生物分解性、天然生体適合性、および合成生体適合性膜を含む。いくつかの実施態様において、その生体高分子膜は、少なくとも５０，０００Ｄａの分子量を有する、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、およびポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）からなるグループから選択される。
【００３５】
従って、関連する実施態様において、本発明は、メラニン細胞（任意でケラチノサイトと同時培養された）のサブコンフルエントな単層および生体高分子膜を含む組成物を含み、ここで５−３７℃の輸送条件下で、少なくとも７２時間、少なくとも７５％のメラニン細胞が、組成物中で生存可能なままである。
【００３６】
本発明の組成物は、皮膚の色素沈着低下異常の治療に適当である。よって、１つの局面において、メラニン細胞は、できた組成物が皮膚の色素沈着低下異常に対して治療効果を有するように、十分な量で存在する。
【００３７】
本発明はまた、色素沈着低下異常の治療に適当な、生体高分子膜上のメラニン細胞の組成物を調製する過程を含む。１つの局面において、そのような過程は以下のものを含む：
ａ）自己表皮からメラニン細胞を単離する；
ｂ）単離されたメラニン細胞を含む細胞懸濁液を調製する（ｒｅｐａｒｉｎｇ）；
ｃ）メラニン細胞を増殖させる；
ｄ）任意で、メラニン細胞を凍結保存する；
ｅ）任意で、メラニン細胞を解凍する；
ｆ）メラニン細胞を生体高分子膜に播種する；
ｇ）それらの細胞を生体高分子膜上でサブコンフルエントな単層に増殖させる；および
ｈ）輸送培地を含む輸送装置を用いて、その生体高分子膜を輸送する；
ここで、輸送条件下で少なくとも７２時間、少なくとも７５％の細胞が、組成物中で生存可能なままである。
【００３８】
関連する実施態様において、その生体高分子膜は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）を含み（ＰＬＤＡの形式で）、そしてメラニン細胞を１×１０４から１×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で、その生体高分子膜に播種する。さらなる実施態様において、その輸送装置は、ポリカーボネートを含む。別の実施態様において、その輸送培地は、二酸化炭素富化培地を含む。１つの実施態様において、その輸送培地は、ＫＳＦＮ培地である。
【００３９】
本発明はまた、皮膚の色素沈着を必要とする個人を治療するための方法を提供する。１つの実施態様において、その個人はヒトである。さらなる実施態様において、その個人は白斑（ｌｅｕｃｏｄｅｒｍａ）または白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）のような、色素沈着低下異常に罹患している。関連する実施態様において、その方法は、自己表皮由来のメラニン細胞および生体高分子膜を含む、皮膚における色素沈着を誘発し得る移植片組成物を適用することを含み、ここで、５−３７℃の輸送条件下で少なくとも７２時間、少なくとも７５％の細胞が、組成物中で生存可能なままである。関連する実施態様において、５−３７℃の輸送条件下で少なくとも９６時間、少なくとも８０％の細胞が、組成物中で生存可能なままである；ここでその組成物は、個人の皮膚における表皮再生の速度を増強する。よって、本発明は、送達システムとして生体高分子膜を使用すること、および皮膚にサブコンフルエントなメラニン細胞の単層を送達することを含む、患者において白斑を治療するための方法を提供する。
【００４０】
他の実施態様において、本発明は白斑を治療するためのキットを提供し、ここでそのキットは（１）（ａ）メラニン細胞のサブコンフルエントな単層および（ｂ）生体高分子膜を含む組成物、ここでその単層は生体高分子膜上にある、および（２）輸送装置を含み、ここで５−３７℃の輸送条件下で少なくとも７２時間、少なくとも７５％のメラニン細胞が、組成物中で生存可能なままである。
【００４１】
以下の図は、本明細書の一部を形成し、そして本開示のある局面をさらに示すために含まれ、その発明は、本明細書中で提示される特定の実施態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図の１つまたは複数を参照することによってよりよく理解し得る。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＰＬＡシート上の培養メラニン細胞を含む、本発明の相互作用的生体高分子移植片を示す。
【図２】本発明の創傷カバーのための輸送容器の概略図を示す。輸送容器のデザインは、本明細書中で参考文献に組み込まれる、番号１９８５９１を有するインド意匠特許法下で登録されている。
【図３】３Ａ：マイコプラズマポジティブコントロール；３Ｂ：マイコプラズマの欠如を示す培養メラニン細胞において示すように、細胞のマイコプラズマ試験の比較した結果を示す。
【図４】ＭＥＬ−５抗体染色によるメラニン細胞の細胞アイデンティティー試験（ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ）を示し、ここでメラニン細胞は緑色の細胞として同定される。その細胞核をＤＡＰＩで染色する。
【図５】ＰＣＲ分析による、メラニン細胞におけるＭＡＲＴ−１遺伝子発現を示す。
【図６】ＤＯＰＡ染色による培養メラニン細胞の機能性を示す。
【図７】創傷ベッドにおける赤色蛍光標識細胞の存在によって示される、ＰＬＡシートから創傷カバーへのメラニン細胞の遊走を示す。
【図８】表１。移植のための培養メラニン細胞の安全性を示す、インビトロ腫瘍形成アッセイの結果を示す。
【図９】輸送条件下でのメラニン細胞の生存度を示す。
【図１０】位相差顕微鏡下の、メラニン細胞プラスケラチノサイトの同時培養。
【図１１】ケラチン染色によるケラチノサイトの同定。
【図１２】同種ケラチノサイトを使用する場合の、ＰＣＲによるケラチノサイトにおけるＭＨＣ−ＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）発現の同定。
【図１３】移植のための培養ケラチノサイトの安全性を示す、インビトロ腫瘍形成アッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＰＬＡのような生体適合性の支持材料に、メラニン細胞、またはメラニン細胞−ケラチノサイト混合物のような、活発に増殖している表皮細胞の培養移植片を含む、および集中処理センターから、それらが移植される様々な他の場所にある病院に送達するために適当な、組成物および送達システムを提供する。
【００４４】
１つの実施態様において、移植片を調製する過程は、細胞を播種する骨格の最適化を含む。骨格を、コラーゲンおよびフィブリンのような天然材料、または外科縫合術において使用される分解性ポリエステルのような合成材料を含むグループから選択し得る。骨格は、スポンジ様のシートおよび織物から、ゲル、新しい材料処理技術によって産生された複雑な孔およびチャネルを有する高度に複雑な構造までの形式を取る。骨格の空間的および組成上の性質、骨格の空隙率および孔の相互連結性は、全て、細胞の骨格への浸透、および栄養素および老廃物の輸送を可能にするのに必要である。
【００４５】
別の実施態様において、分化したケラチノサイト細胞培養過程の一部を形成するメラニン細胞を、４−５層の厚さの組織として送達し、それを次いで培養皿から酵素的に分離して、創面切除（ｄｅｂｒｉｄｍｅｎｔ）後に色素脱失領域に移植し得る。
【００４６】
ある実施態様において、メラニン細胞を、培養容器内の送達膜に直接培養し得、それを次いで使用のために必要な場合にはがす。
【００４７】
本発明の別の実施態様において、生体高分子上の培養メラニン細胞の移植片は、色素沈着を改善するための移植細胞の遺伝的改変を含む。
【００４８】
生体適合性ポリマーは、天然または合成のいずれかであり得る。一般的に、合成ポリマーは天然材料よりも大きな利点を提供し、ここでそれらを天然供給源由来の材料より広い範囲の性質、およびより予測可能なロット間の均一性を与えるために作り得る。合成ポリマーはまた、未加工材料のより信頼できる供給源、免疫原性および感染性の心配のないものを意味する。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）およびポリウレタンが、本発明において好ましい生体適合性ポリマーのいくつかである。これらのポリマーは、その意図する目的を果たした後、外科的に除去する必要がないという利点を有する。これらのポリマーは、可変性の分解動態、無毒性、および生物適合性を含む、その独特の性質に基づいて、広い範囲の薬剤学的および生物医学的適用を見出した。ＰＧＡは高度に結晶性のポリマーであり、そしてそれらの中で最も親水性である。それは非常に高い融点を有し（２２４℃から２２６℃）、そしてＰＧＡの分解速度は、ＰＬＡのそれよりはるかに高い。異なる比のラクチド（ＬＡ）およびグリコリド（ＧＡ）を有するランダムＰＬＧＡコポリマーは、異なる分解速度を示し、そして従って数週から数ヶ月の範囲の特定の分解動態を必要とする特定の適用のためにテイラーメイドし得る。それらは一般的に、そのホモポリマーより無定形であり、そして２つのモノマー含有量が同じである場合に、加水分解に対して最も感受性となる。ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリグリコール酸（ＰＧＡ）は、臨床的な使用のために認可された少数の合成分解性ポリマーに含まれ、そしてこれらは組織の発達において広く研究されてきた。
【００４９】
分割型ポリウレタンエラストマーは、その優れた機械的性質および高い化学的汎用性のために、バイオマテリアルとして広く使用される。生物医学的ポリウレタンの開発に当てられた研究は、主に血管移植およびペースメーカーの導線絶縁体のような、長期の適用に焦点をあてた。ポリウレタンポリマーを、生物医学的分野および他の両方において、多くの異なる形式で、そして適用の範囲で使用する。その材料を、鋳造または他の成形技術によって制作して、基質を形成し、それを他の基質と共に、または組み合わせて使用して、均一な多層の材料を形成し得る。そのような多層の均一なポリウレタン材料を、異なる分解性の程度を有する層で形成し得る。
【００５０】
生物分解性ポリマーの機械的性能に影響を与える因子は、モノマーの選択、発動因子の選択、過程の条件、および添加物の存在を含む。これらの因子は、次に、ポリマーの親水性、結晶性、融解およびガラス転移温度、分子量、分子量の分布、末端グループ、配列の分布（ランダム対ブロッキー）、および残留性のモノマーまたは添加物の存在に影響する。それに加えて、生物分解性材料を研究しているポリマーサイエンティストは、生分解に対するその影響に関してこれらの変数をそれぞれ評価しなければならない。これらのポリマーの特徴はよく理解されているが、それらは単にその上に細胞が接着し得る３−Ｄの生体適合性構造を提供するために役立つだけであり、そして細胞と相互作用しない。体において、細胞は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に位置し、それは組織に適当な構造、および遊走、増殖、および分化のような、重要な細胞機能に影響を与えるシグナル送達経路を提供する。研究は、骨格への細胞接着および直接的な細胞活性を最適化するための特異的増殖因子と共に、マトリックス分子の利用について継続する。
【００５１】
本送達システム上でメラニン細胞を培養することは、既存のメラニン細胞の送達システムが直面する不利益を回避する。
【００５２】
皮膚細胞が培養および移される、本発明下でのポリマーの使用は、細胞培養およびその移植の間の、移植片の取り扱い易さを改善する。本発明において使用されるポリマーが透明であることは、細胞培養の間に細胞を顕微鏡で観察すること、および色素脱失した皮膚へのその適用後に、下にある皮膚を可視化することを可能にする。
【００５３】
１つの実施態様において、本開示は、色素脱失皮膚の治療のために、ヒト表皮メラニン細胞の培養および輸送を提供する。本発明は、その報告された性質の代わりに生体適合性のポリマーを使用することを目指す。創傷治癒または創傷治癒組成物のために本発明における使用が企図された生物分解性ポリマーは、ポリエステル類、ポリ（アミノ酸）類、ポリエステルアミド類、ポリウレタン類、またはそれらのコポリマーを含む。そのうえ、ＰＬＡ、ＰＧＬＡ、およびポリウレタンから選択されるポリマーシートは、以下の、培養および創傷ベッドへの適用の間の取り扱いやすさ、および創傷の輪郭に接着する能力の利点を有する。ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＧＬＡおよびポリウレタンのシートは、透明であり、培養および創傷部位に適用した後の色素沈着過程の間、細胞の可視化を可能にする。さらに、それはバリアの性質を有し、創傷の微生物の混入を防ぐ。
【００５４】
本発明は、メラニン細胞の送達システムとして、ＰＬＡのような生体適合性、生物分解性ポリマーでできたシートを使用すること、およびこのシステムを、増殖しているメラニン細胞を色素脱失した皮膚へ送達するためのツールとして使用する能力を提供する。
【００５５】
１つの実施態様において、本発明の創傷被覆は、特別にデザインされた容器中（図２）において、主にＰＬＡシート上に培養メラニン細胞を含む（図１）。粗ＰＬＡを、ジラクチド（ｄｉｌａｃｔｉｄｅ）を用いて触媒反応によって調製し、そしてアセトン、クロロホルムのような溶媒に再溶解することによって精製し、それを次いで水で再沈殿させる。この過程において、未変換のジラクチド、他のモノマー、および不純物が、使用した触媒の一部と共に除かれる。精製ＰＬＡを用いてポリマーフィルムを作成する。
【００５６】
本開示は、生体適合性および生物分解性ポリマーが、装置設計者および医師に利用可能になることを期待し、それは患者の回復を早めることを助ける。本発明は、メラニン細胞の組成物を提供する。
【００５７】
別の実施態様において、本発明は、ケラチノサイトのような他の細胞と共にメラニン細胞を培養すること、および生体適合性ポリマー上でのその送達を提供する。
【００５８】
本発明は、同時培養の過程および白斑のような皮膚状態における移植へのその使用を提供した。メラニン細胞と共にケラチノサイトを同時に送達することの利点は、冒された皮膚の上皮化の速度を増加させることである。
【００５９】
本発明の可能性のある利点または特徴は以下のようである：
１．メラニン細胞の移植片が色素沈着を助ける。
２．そのポリマーフィルムが、創傷ベッドを微生物の侵入に対して保護することによって、治癒を助ける。
３．ポリマーフィルムが創傷ベッドに接着し、そして神経末端を封鎖することによって疼痛を軽減する。
４．ポリマーフィルムが、創傷の乾燥を予防することによって、湿性の創傷環境を保証する。
５．感染性疾患の伝播が、厳格な製造過程のコントロールを用いることによって、最小限になる。
６．その送達システムにおいて培養されたメラニン細胞を、次いで患者に移すことができ、医師による細胞の取り扱いを最小限にすることができる。その細胞がフィルム上で送達されるので、細胞は医師による最小限の取り扱いを受ける。
７．細胞送達に使用されるポリマーフィルムは、細胞の創傷ベッドへの遊走を可能にし、それによって細胞の損失を防ぐ。
８．そのポリマーフィルムは、培養過程およびその適用の間、移植片に十分な強度を与える。細胞の移植に使用されるコラーゲンシートおよびフィブリンシートと違って、ＰＬＡフィルムは壊れやすくなく、そして十分な強度を有する。この性質は、製造過程の間、すなわち細胞培養の時ならびに移植中の移植片の取り扱い時に有用である。
９．透明な生体高分子は、細胞培養過程の間の細胞の顕微鏡による評価およびその適用後の皮膚の可視化を保証する。
１０．大きい領域の色素脱失皮膚を、患者から得た小さい生検でカバーし得る。
１１．移植片の生存度を、輸送条件下で約９６時間維持し得、それによって、集中処理施設から遠く離れた様々な病院への送達を促進する。
【００６０】
本発明の生体高分子上の培養メラニン細胞の移植片の調製に使用される原料のほとんどは、滅菌製品である。患者および／またはドナー皮膚輸送に使用されるウシ胎児血清の供給源は、ＢＳＥ−フリーの国から保証される。製造過程において使用される全てのプラスチック容器は使い捨てであり、そしてＮＵＮＣＴＭ（ＵＳＡ）およびＦａｌｃｏｎＴＭ（ＵＳＡ）から得る。本発明の生体高分子上の培養メラニン細胞の移植片において、ＰＬＡ膜はメラニン細胞の担体としてはたらく。ＰＬＡを、フィルムに鋳造し、そしてエチレンオキシド（ＥＴＯ）で滅菌する。本発明の生体高分子上の培養メラニン細胞の移植片を、特別に設計したポリカーボネートの皿で輸送する。本発明の創傷被覆の輸送容器の一部として、シリコンのＯリングを使用する。全ての原料を、材料の滅菌性をさらに保証するために試験する。本発明の創傷被覆を製造する過程を、ｃＧＭＰ基準の下で、クリーンルームで行う。
【００６１】
本発明の下で、培養メラニン細胞の移植片の組成物の調製に、以下のものが含まれる：
１．メラニン細胞の単離
２．メラニン細胞の培養
３．生体高分子フィルムの調製
４．安全性および有効性の研究。
【００６２】
本発明の生体高分子上の培養メラニン細胞の移植片を、患者が白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、白斑（ｌｅｕｃｏｄｅｒｍａ）等のような色素脱失または色素沈着低下した皮膚を有する状態において使用する。
【００６３】
１つの実施態様において、本発明は、生体適合性、コントロールされた分解速度、証明された無毒性、高い強度およびコントロールされた分解速度のような、その生化学的性質を考慮して、ＰＬＡを、メラニン細胞を送達するための基質として使用する。ＰＬＡフィルムは半透過性であり、それは液体および細菌に対してそれらを閉塞性にするが、水蒸気、酸素および二酸化炭素に対して透過性である。本発明者らは、ＫＳＦＭのようなＣＯ２が豊富な培地は、思いがけずこの基質上のメラニン細胞の生存度を増加させることを発見したので、透過性は重要である。ＰＬＡの創傷ベッドのへの接着は、細胞の創傷ベッドへの遊走を促進する。ＰＬＡフィルムが透明であることは、細胞培養の間の、細胞の顕微鏡による評価、および移植後の創傷ベッドの可視化を助ける。ポリマーフィルムはまた、その適用の間の移植片の取り扱いを容易にし、および移植片を白斑病変にあうように切り取ることを可能にする。生検の生存度の維持は、その処理の間に得られた細胞の生存度に反映される。単離細胞の生存度がより高いほど、メラニン細胞の生存および増殖のチャンスはより大きい。本発明は、生検の病院から集中処理センターへの輸送の間、生検の生存度を保証する。切除後、輸送培地中の皮膚生検は、５−３７℃で保存した場合、その生存度の約８０％を９６時間維持する。冷却パックを詰めた断熱ボックスは、輸送条件下で９６時間、５−２５℃を維持する。従って、生細胞を７２時間輸送した生検から単離し得た。移植片の生存度を、輸送条件下で約９６時間維持し得、それによって集中処置施設から遠く離れた様々な病院への送達を促進する。
【００６４】
同様に、本発明は、培養処理センターから移植のための病院まで細胞の生存度を維持するための輸送条件を提供した。本発明は、輸送中の生存度を保証するために、理想的な保存培地、輸送条件および輸送時間を提供した。輸送中、培養を密封して汚染および培地の漏出を防ぐ。本発明は輸送のために最適化した条件を提供し、ここで例えば８−２５℃で輸送した場合、ＣＯ２富化培地の存在下で９６時間、８０％の細胞がその生存度を維持する。
【００６５】
ＣＯ２富化培地の１つの例は、ＫＳＦＭである（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ専門培地から入手可能；Ｄａｌｅｙ，Ｊ．Ｐ．、Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ａ．およびＨａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ，Ｐ．（１９９０）Ｆｏｃｕｓ（登録商標）  １２、６８；Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｊ．（１９９８）Ｆｏｃｕｓ  ２０、３８を参照のこと）。ＫＳＦＭ培地は、例えばＬ−グルタミンを含むケラチノサイト−ＳＦＭ（基本培地）（５００ｍｌ）；ウシ下垂体抽出物（２５ｍｇ）；および組換え表皮増殖因子（ｒＥＧＦ）（２．５μｇ）を含む。メラニン細胞を、その増殖を支持するメラニン細胞培地で培養する。細胞を、３７℃の温度を維持するインキュベーターで培養する。しかし、輸送の間は、温度を９６時間の間８−２５℃の間に維持する。メラニン細胞増殖培地のメラニン細胞は、輸送温度に曝された場合にその生存度を維持できない。しかし、細胞をインキュベーター中で通常の条件下（３７℃）で、ＫＳＦＭ培地で培養する場合、細胞はその生存度を維持するが、増殖は増殖培地と同じではない。１つの目的は、輸送中に、生存度およびその機能を維持することである。ＣＯ２富化無しのＫＳＦＭ中で培養したメラニン細胞は、２４時間でさえ生存可能でなかったことが観察された。しかし、ＣＯ２富化ＫＳＦＭ中で輸送されたメラニン細胞は、９６時間生存可能なままである。
【００６６】
本発明は、約１６ｓｑ．ｃｍ．の円形フィルムとして、生体高分子上の培養メラニン細胞の移植片を提供した。しかし、そのサイズは本発明の範囲を制限せず、ここでその移植片は、あらゆるサイズまたは形であり得る。さらに本発明は、３×１０４／ｃｍ２の播種密度で３５−４０日の培養条件を用いて、１ｃｍ２の皮膚生検から６４ｃｍ２の移植片を提供した。従って、本発明は、小さい生検から得たメラニン細胞を増殖して、大きな白斑病変を覆うことができる。臨床的使用のために、細胞が皮膚切除した皮膚に対して閉鎖した反対側にあるように、その移植片を創傷ベッドに反転する。皮膚切除術は、皮膚剥削器（ｄｅｒｍａｂｒａｄｅｒ）を用いて皮膚から表皮を除去する方法である。皮膚切除した皮膚上のシートの逆位において、メラニン細胞は遊走し、そして再生した表皮の一部を形成する。再生した上皮に機能的なメラニン細胞が存在することが、日光またはＰＵＶＡへの曝露後に皮膚の色素沈着を引き起こす。ケラチノサイトも、同時培養した移植片として存在した場合、創傷ベッドに遊走し、コロニー形成し、そして表皮を再構築する。ケラチノサイトから分泌される増殖因子が、レシピエントのケラチノサイトを遊走、増殖および表皮を再形成するように誘発するのを助け、早期の創傷の閉鎖を引き起こす。
【００６７】
再生した上皮に機能的なメラニン細胞が存在することが、日光またはＰＵＶＡへの曝露後に皮膚の色素沈着を引き起こす。ケラチノサイトも、同時培養した移植片として存在した場合、創傷ベッドに遊走し、コロニー形成し、そして表皮を再構築する。これらの細胞から分泌される増殖因子が、レシピエント細胞を遊走、増殖および表皮を再形成するように誘発するのを助け、創傷の再生を引き起こす。ＰＬＡフィルム上の培養メラニン細胞を、それ自体で、または自己または同種ケラチノサイトとの同時培養として送達し得る。以下のものは、本発明の代表的な実施態様である。実施例において開示された技術は、発明者によって、本発明の実施においてよく機能することが発見された技術を示すことが、当業者によって認識される。
【００６８】
しかし、当業者は、本開示を考えて、本発明の意図および範囲から離れることなく、開示された実施態様に変更を加え得、そして依然として同様のまたは類似の結果を得ることを認識する。
【実施例】
【００６９】
実施例１：生体高分子上の培養メラニン細胞移植片の調製  皮膚の採取
ここで患者として呼ばれる、移植の必要がある人から、パンチ生検を採取した。移植時の技師および患者の安全性を保証するために、感染性疾患検査のために患者の血液（５ｍｌ）を採取して、患者のＩＤ状態を決定した。ＤＭＥＭ、イスコフ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵＳＡ）、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）、抗生物質−抗真菌薬溶液（Ｓｉｇｍａ  ＵＳＡ）およびゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を含む、皮膚生検採取バイアルを、アイスパックを含む断熱ボックス中で病院に輸送した。断熱ボックスは、ＥＰＳ（発泡スチロール）でできていて、そして８−２５℃の温度で７２時間維持された。バイアルを、使用まで最大１週間、冷蔵庫で保存した。生検をこれらの輸送バイアルに採取して、そしてサンプルの採取から４８時間以内に、さらなる処理のために断熱ボックスで返送した。
【００７０】
ポリマーフィルムの調製
ポリマーフィルムを、溶媒鋳造法によって調製した。外気温で溶媒を蒸発させることによってフィルムを乾燥させ、そしてＥＴＯによって滅菌した。生体高分子シートの典型的な調製は、例えば２００６年２月１４日に出願された、インド特許出願番号ＩＮ２０５／ＭＵＭ／２００６において詳細に記載されている。より正確には、本発明は、ＤＬ−ラクチドおよびＬ−ラクチドの共重合によって調製されたＰＬＤＡ（ｗｔ／ｗｔ：５０／５０、０．８５の固有の粘性を有する）を使用した。アセトン中約１５−２５％のＰＬＤＡ溶液を、スピンコーティングによってステンレススチールのプレート上に鋳造し、そして３７℃で一晩置いて乾燥させた。細胞培養のために、フィルムを直径４．５ｃｍの円形に切断し、そしてエチレンオキシド（ＥＴＯ）によって滅菌した。ＥＴＯ滅菌フィルムの物理的性質は、標準化した方法（ＩＳ／ＡＳＴＭ）を用いて特徴付けられた。細菌、酵母および真菌のような微生物に対する、フィルムのバリア性質を、フィルムの下にある栄養マトリックスの混入を防ぐ能力によって評価した。
【００７１】
細胞培養手順
メラニン細胞の単離および増殖は、以下の工程を含んでいた：
１．患者の皮膚から過剰の脂肪を切除し、そして７０％アルコール、ポビドンヨード（Ｍｕｎｄｉｐｈａｒｍａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、および抗生物質−抗真菌薬溶液中で連続的に洗浄することによって除染した。
２．真皮の厚さに依存して、生検を０．２−０．４％のディスパーゼ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）中で１−１８時間インキュベートした。ディスパーゼ消化後、表皮を下にある真皮から分離し、そして０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）による酵素的消化によって、メラニン細胞を表皮から遊離させた。
３．トリプシン処理後、トリプシン活性を、ダイズトリプシン阻害剤で中和化し、そして遊離した細胞を、市販で入手可能なメラニン細胞増殖培地２５４−ＣＦ（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＵＳＡ）に再懸濁した。細胞を組織フラスコに４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種した。培地を１日おきに交換し、そして細胞を７０−８０％の培養密度に達した時に継代し、そして細胞生存度を評価した。
４．細胞がコンフルエントに達した時、細胞を継代した。覆うべき皮膚の領域に依存して、細胞を２−３回継代して、十分な細胞数を得た。移植片を発送する前に、細胞をトリプシン処理し、そして特別に設計した容器（Ｄｅｓｉｇｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  １９８５９１）中で、生体高分子フィルム（１×１０４−１×１０５細胞／ｃｍ２の移植片）に播種した。
５．細胞を接着および増殖させた。
【００７２】
図１は、本発明の生体高分子移植片を示し、ここで培養メラニン細胞がＰＬＤＡフィルム上に分布しているのが見える。
【００７３】
製造過程のコントロール：
培養期間中、細胞の滅菌性およびエンドトキシンレベルを連続的にモニターすることによって、レシピエントに対する細胞の安全性を保証する。
【００７４】
その上、培養条件が細胞において異常を生じることを退けるために、いくつかのバッチのメラニン細胞を、インビトロ腫瘍形成能および核型分析に関して試験した。
【００７５】
全ての実験は、培養細胞において異常を示さなかった。
【００７６】
ＰＬＤＡフィルム上のメラニン細胞の増殖を、トリプシン処理後にトリパンブルーによって、播種後２、３、および４日目に分析した。各実験を３組行った。トリパンブルーは、死んだ組織または細胞を青色に選択的に着色するために使用する、生体染色である。それはジアゾ色素である。無傷の細胞膜を有する生きた細胞または組織は着色されない。細胞は膜を通過する化合物について非常に選択的であるので、生細胞においてトリパンブルーは吸収されない；しかし、死んだ細胞において、それは膜を通過する。従って、死んだ細胞は、顕微鏡下で特徴的な青色として示される。生きた細胞は染色から除かれるので、この染色法は、色素排除法としても記載される。
【００７７】
１つの実験において、インフォームドコンセント後、年齢２５−６３歳の２２人のドナーから得た、パンチ生検（８ｍｍ）から正常メラニン細胞を単離および培養した。平均１．６×１０６／ｃｍ２の生細胞（トリパンブルー排除法によって）が、各生検の表皮から単離された。先に述べた培養条件を用いて、本発明者らは、年齢、性別、または白斑の存在または欠如に関わらず、全ての患者において、メラニン細胞を３継代よりも多くの間培養することができた。いくつかの場合において、細胞の形態の変化無く、７継代まで細胞を培養することができた。４５歳およびそれ以上のドナーにおいて、コンフルエントに達する時間がより長いことが観察された。
【００７８】
使用の少なくとも１時間前に、ＰＬＡの裏打ち上のメラニン細胞を含む小袋を、特別に適合した輸送容器から取り出し、室温で安定化させる。ＰＬＡの裏打ち上のメラニン細胞および特別に適合した輸送容器は、本明細書中の他の場所で記載される。使用時に、滅菌条件下で密閉したトレイを開け、そして皿のふたを注意深く上げ、そして輸送培地を、皿の矢印によって示された切込みから捨てる。細胞を含む移植片を、皿から静かに持ち上げ、そして通常の生理食塩水ですすぐ。上向きの細胞を有する移植片を、滅菌グローブをはめた手のひらに置く。移植片を病変のサイズに切断し、そしてピンセットを用いて、切断した移植片を端から持ち上げ、そして細胞が創傷ベッドに対して並列になるように、病変に対して下向きに置く。シートを創傷ベッドの上を引きずらないように注意すべきである。次いで移植片を最後に２番目の包帯で覆う。患者は少なくとも２−３日間固定されたままであるべきであり、そして創傷エリアにいかなる機械的または摩擦力もかけるべきではない。患者を、研究装置の適用の日から３、６および９ヶ月後にフォローアップする。患者を、安全性および有効性データを取得するために、より長い期間フォローし得る。主な目的は、コントロールグループと比較して、製品の適用後に再色素沈着をした治療部位のパーセンテージを研究することである。２次的な目的は、感染およびレシピエント部位の崩壊の報告、テスト部位の色素沈着過剰、治療後の治療部位における白斑パッチの再発を研究することである。
【００７９】
実施例２：同時培養技術
皮膚へのケラチノサイトの適用は、上皮化の速度の増強および色素脱失した皮膚の創面切除後に生じた創傷の治癒速度の改善を引き起こした。
【００８０】
ケラチノサイトは、メラニン細胞治療を受ける患者、または別のドナーのいずれかから得た。図１０は、生体高分子上の同時培養した細胞を示す。患者から直接得た培養ケラチノサイトを使用する場合、ケラチノサイトはより長い時間生存し続け、そして再構築された上皮の一部を形成する。しかし、同種培養ケラチノサイトの適用は、これらの細胞が一時的にしか生存しないとしても、体の再生を刺激することによって、治癒の速度を増強する。メラニン細胞増殖培地は、メラニン細胞の増殖を選択的に誘発するが、ケラチノサイトの増殖は維持しない。ケラチノサイトおよびメラニン細胞は、表皮に存在する。表皮は、酵素的消化の後、真皮から物理的に分離する（従って、表皮細胞において線維芽細胞の混入はない）。
【００８１】
実施例３：培養メラニン細胞生体高分子の移植片の輸送
輸送容器のデザイン、その組み立て、および培養細胞の輸送における使用の例が、インド国特許出願６０／ＭＵＭ／２００６において示され、それは本明細書中で参考文献に組み込まれる。容器のデザインを図２に示す。滅菌ＰＬＡフィルムを、これらの輸送皿中に置き、そしてＰＢＳに１時間浸した。各皿のフィルムを、ポリカーボネートのリングで定位置に保持した。細胞を３−５×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、そして輸送前に２日間培養した。病院に発送する前に、皿の培地を、流量計を用いてＣＯ２富化培地と交換した。皿の留め金をしっかり閉じて、輸送中の移植片の生存度および滅菌性を保証した。次いで皿を、８〜２５℃の間の温度を９６時間維持する断熱ボックスに入れ、そして移植のための様々な病院へ発送した。輸送シミュレーション研究のために使用した断熱ボックスは、Ｔｅｍｐｒｅｃｏｒｄデータ自記計測器（Ｔｅｍｐｒｅｃｏｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．ＵＳＡ）を用いて検証した。ＥＰＳ  ＢＯＸＥＳが９６時間の間維持する温度を決定するために、この研究を行った。９６時間の間、ボックス内の温度を追跡するために、データ自記計測器を用いた。
【００８２】
（産物の特徴づけおよび試験）
実施例４：安全性試験
レシピエントの安全性を保証するために、輸送シミュレーション前のドナー由来の細胞で、以下の試験を行った：
１．核型分析：染色体の数を決定し、および異常の存在をチェックするために、核学的分析を細胞に対して行った。臨床的に有意な数のまたは構造的な染色体異常の証拠は存在しなかった。
２．マイコプラズマ試験：この試験を、ヘキスト染色によって行った。マイコプラズマ染色キットを用いて、細胞を蛍光染色下で検査し、ここで陽性培養は、細胞核周囲の粒子性または線維状蛍光によって同定され（図３Ａ）、そして陰性培養は、本明細書中で示されたように、核のみの染色によって同定される（図３Ｂ）。
３．感染性疾患に関する試験：患者の安全性を保証するために、患者の血液（生検採取時に採取した）で、ＥＬＩＳＡ法による感染性疾患試験を行って、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＣＭＶ、ＨＢＳＡｇおよび梅毒に関してチェックした。病院／レシピエントへの発送前の細胞を、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によっても、感染性疾患に関して試験した。
４．滅菌性：産物の滅菌性を、バイオバーデン、ＬＡＬ法によるエンドトキシン試験および滅菌性試験のような、厳密な製造過程の試験によって保証した。滅菌性試験は、好気性および嫌気性微生物の検出を含む。テストサンプルを、２つの異なる滅菌栄養培地、すなわち液状チオグリコレート培地（ＦＴＭ）およびダイズカゼイン消化培地（ＳＣＤＭ）に播種することによって、試験を行った。その結果は、１４日のインキュベーション期間中、播種した培地で増殖を示さず、それはサンプルの滅菌性を示す。細菌エンドトキシンの存在を、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）試薬を用いたゲル−凝塊技術によって決定した。細菌エンドトキシンの存在下で、３７℃で１時間インキュベートした場合、ＬＡＬ試薬は硬いゲル塊を形成する。産物中の微生物量を決定するために、バイオバーデン試験を行い、それを固体培地（ｓｏｌｉｄ  ｍｅｄｉａ）のプレートに出現したコロニーの数で表して（ｉｎ  ｔｅｒｍ  ｓｏｆ）決定した。試験に使用した培地は、ダイズカゼイン消化寒天（ＳＣＤＡ）であった。
【００８３】
実施例５：細胞の特徴づけ
１．同定：培養細胞を、免疫組織化学的分析によって分析および同定した。
メラニン細胞移植片
メラニン細胞培養の純度を決定するために、ＭＥＬ−５に対する抗体を用いて細胞を同定した。全ての細胞は、ＭＥＬ−５抗体に対して陽性であった（図４）。ＭＥＬ−５（Ｔａ９９）モノクローナル抗体は、メラノーマ細胞、正常メラニン細胞および母斑によって発現される、分化関連、色素沈着関連糖タンパク質（ｇｐ７５）（７５ｋＤ）を検出する。ｇｐ７５抗原は現在、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ−１）として考えられている。
【００８４】
同時培養移植片
移植片中のケラチノサイトのアイデンティティーおよび数を決定するために、ケラチノサイトに特異的に結合するＰＡＮ−ケラチン抗体で細胞を免疫染色することによって、細胞を決定した。ＦＩＴＣ結合抗マウス２次抗体を用いて陽性細胞を検出し、そして図１１で見られるように、細胞の核を同定するためにＤＡＰＩを用いた。
【００８５】
手順：培養メラニン細胞を、０．２×１０４細胞／ウェルで、２穴チャンバースライドに播種した。細胞を、４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  ＵＳＡ）で２０分間固定し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。０．２％ＴｒｉｒｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）で１時間透過処理した後、細胞を１次モノクローナルＭｅｌ−５抗体（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）で１時間染色し、ＰＢＳで洗浄し、そして陽性細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−結合ヤギ抗マウス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＵＳＡ）２次抗体で検出した。細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と室温で１０分間インキュベートした。メラニン細胞を、緑色蛍光によって同定し、一方視野内の全ての細胞を青い核によって検出した。染色の特異性を、コントロールとなる、２次抗体単独によって決定した。
【００８６】
２．ＭＡＲＴ−１  ＰＣＲ：図５に示すように、培養メラニン細胞の全ての継代におけるＭＡＲＴ−１の発現は、ＭＡＲＴ−１タンパク質の産生のために、培養細胞の色素沈着を誘発する能力を示した。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ３−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、内部コントロールとなる。ＭＡＲＴ−１は、Ｐｍｅｌ１７（メラノソームタンパク質）と複合体を形成し、そしてステージＩＩメラノソームの形成に重要な、その発現、安定性、輸送、および処理に影響を与える。従って、ＭＡＲＴ−１は、Ｐｍｅｌ１７機能に不可欠であり、そして哺乳類の色素沈着の調節において、重要な役割を果たす。ＲＴ−ＰＣＲ技術は、以下の工程を含んでいた：異なる継代におけるメラニン細胞由来の全ＲＮＡを、トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で、製造会社のプロトコールによって抽出した。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭを用いて逆転写を行った。製造会社のプロトコールによる、ＲＴ−ＰＣＲの第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）。それぞれ１．５μＬのｃ−ＤＮＡをＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中に含む、２５μＬの反応容量で、遺伝子増幅を行った。使用したＰＣＲ条件は、９５℃で５分、続いて９５℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、そして７２℃で４５秒間、最終的な伸長が７２℃で１０分間であった。Ｇｅｎｂａｎｋから得られた配列からデザインされた、以下の特異的なプライマーを用いて、サーマルサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で増幅を行った。
ＭＡＲＴ−１（２４０ｂｐ）：
【００８７】
【化１】
2010505580.tif 000002
グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＤＰＨ）（７５０ｂｐ）：
【００８８】
【化２】
2010505580.tif 000003
ＰＣＲ産物を、２％のアガロースゲル上で分離し、そしてＵＶ光下で可視化した（Ｉｍａｇｅ  ｍａｓｔｅｒ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）。
【００８９】
培養メラニン細胞の全ての継代において、ＭＡＲＴ−１発現のレベルは変化しないままであり、全ての試験した継代における培養細胞の、色素沈着を誘発する能力を示した。本発明はまた、継代５回まで発現レベルを試験した。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ３−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、等しいＲＮＡ量に関する内部コントロールとなった。
【００９０】
３．機能的アッセイ：培養メラニン細胞の、ＤＯＰＡをメラニンへ変換する能力は、細胞の機能的特徴を示す。機能的メラニン細胞は、化学反応においてメラニンを産生したが、ここでチロシナーゼがチロシンのＤＯＰＡへの変換を触媒し、それがさらにメラニンへと変換される。機能的アッセイを以下のように行った。ＰＬＡフィルムへ播種する前の培養メラニン細胞を、チャンバースライドで培養し、そしてＰＢＳ中１０％のホルマリンで、４℃で３時間固定した。細胞をＰＢＳですすぎ、そしてＰＢＳ中でＬ−ＤＯＰＡ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）と、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳですすぎ、そして１０％の緩衝化ホルマリンで１時間固定した。機能的メラニン細胞は、Ｌ−ＤＯＰＡの存在下で茶色に染色した（図６）。
【００９１】
４．ＭＨＣ−ＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）発現：ＭＨＣ−ＩＩは、免疫応答において重要な役割を果たす。ＭＨＣマーカーのダウンレギュレーションは、多くの場合癌と関連する。同時培養産物における、ＰＣＲによるケラチノサイトにおけるＭＨＣ−クラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）発現の同定を、図１２に示す。
【００９２】
５．輸送条件下での細胞の生存度：輸送条件下でのメラニン細胞の生存度を、ＭＴＴ法によって間接的に評価した。簡単には、ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を、発送後０、１、２、３および４日目に、３組の皿の細胞に加えた。生細胞を、可溶性のＭＴＴを不溶性のホルマザン結晶に変換するその能力によって、間接的に決定した。その結晶を可溶化し、そして５７０ｎｍのテスト波長および６５０ｎｍの参照波長において測定した吸光度の違いとして吸光度を決定した（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−ＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｊａｐａｎ）。発送時（すなわち０日目）に全ての細胞が生存可能であったと仮定して、発送時の吸光度の値を１００％と仮定した。各時点で、０日目の吸光度と比較した吸光度のパーセンテージとして、生存度を計算する。輸送条件下で、約８０％の細胞が、約９６時間その生存度を維持した。９６時間以内に、輸送条件下の細胞を、生存度の大きな損失なく、３次病院（ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｈｏｓｐｉｔａｌｓ）へ輸送し得ることを仮定する。９６時間で観察された、生存度のわずかな増加は、７２時間までに約２５℃に達した、断熱ボックス内の温度に起因し得る。少数の細胞の増殖がこの点で始まり、細胞数の増加を引き起こし得る。輸送シミュレーション条件の間、断熱ボックスによって維持された温度は、９６時間で１１−２４℃であった。移植片の細胞は、８−３５℃の温度で、４日まで生存度を維持した（図９）。
【００９３】
実施例６：前臨床研究による有効性試験
１．毒性試験
ＰＬＡは、マウスおよびモルモットについて試験した場合、いかなる毒性も示さなかった。移植片全体も、動物においていかなる毒性作用も示さなかった。３７℃で７２時間、ＰＬＡシート（下で「テスト物質」）を含むダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で、毒性試験を行った。全ての毒性試験を、１９９８年にＯＥＣＤによって発表されたＧｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（ＧＬＰ）の原則によって行った。急性皮内毒性試験を、オスおよびメスＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白色ウサギで、接触溶液を用いて行った。そのテストを、各ウサギの片側の５ヶ所において、０．２ｍｌのテスト物質（接触溶液）を皮内投与することによって行った。同様に、各ウサギの他の側の５ヶ所において、０．２ｍｌの蒸留水（コントロール）を注射した。各注射部位の外見を、注射直後、および注射後２４、４８、および７２時間後に観察した。次いで各動物を、１４日間毒性の徴候に関して毎日観察した。紅斑、浮腫に関する組織反応を、各注射部位に関して、および各時間間隔において評価した。７２時間の評価後、全ての紅斑評価および浮腫評価を、各テスト物質およびコントロールに関して別々に総計した。各合計を、３６（６匹の動物×３段階の評価×２つの評価カテゴリー）で割って、各テスト物質対コントロールに関する全体の平均スコアを決定した。テストおよびコントロール平均スコアの間の差異が１．０またはそれより少ないなら、試験の必要条件は満たされた。
【００９４】
接触溶液で処置したウサギにおいて、有害な臨床的徴候または死亡は観察されなかった。
【００９５】
２．腫瘍形成能
細胞が、レシピエントにおいて腫瘍の形成を引き起こし得る、いかなる異常／形質転換も有さないことを保証するために、腫瘍形成能アッセイをインビトロで行った。培養細胞の、軟寒天においてコロニーを形成する能力を、可能性のある形質転換およびヒトにおいて細胞が腫瘍を形成する潜在的な能力の指標として評価した。１０細胞より多いコロニーの形成に関して、培養を２８日間モニターした。試験した培養細胞のロットによって、コロニーは形成されなかった。図８は、メラニン細胞培養を示し、そして図１３は、メラニン細胞と同時培養したケラチノサイトの結果を示す。
【００９６】
３．動物における移植
メラニン細胞（４×１０４細胞／ｃｍ２）を、ＰＬＡフィルムに播種し、そして３日間培養した。移植時に、細胞をＨＢＳＳですすぎ、そしてフィルムを下記で述べるように、創傷に対して反転した。
【００９７】
ＳＣＩＤマウス（４  ｎｏｓ．）を、８０ｍｇ／ｋｇのケタミン、４０ｍｇ／ｋｇのキシラジン、および０．０５ｍｇ／ｋｇのアトロピンのカクテルのｉ．ｐ．を用いて麻酔した。背側の毛を剃り、そして皮膚を７０％のエタノールで清潔にした。無菌条件下で、１ｃｍ２の部分層創傷を動物の背側に作成した。創傷を生理食塩水ですすぎ、そしてメラニン細胞を播種したＰＬＡフィルムを創傷に対して反転し、そしてパラフィン含有ガーゼで覆い、それを外科プラスターで固定した。動物を個別に収容し、そして食物および水を自由に与えた。全ての動物を、インド政府によって策定された実験動物の福祉に関するＣＰＣＳＥＡガイドラインによって扱った。７２時間後、動物を屠殺し、そしてその創傷を切除した。その組織をホルマリンで固定し、そしてパラフィンに包埋した。遊走メラニン細胞を検出するための免疫組織化学的染色を、ＩＨＣ  ＨＲＰ検出キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＵＳＡ）を用いて、５μｍ厚さの切片で行った。簡単には、切片をキットの固定緩衝液で固定し、そして次いでモノクローナルヒト核抗体１：５０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＵＳＡ）またはモノクローナルＭＥＬ−５抗体１：５０（Ｓｉｇｎｅｔ、ＵＳＡ）のいずれかとインキュベートした。続いて、サンプルをビオチン化ヤギ抗マウス２次抗体と、続いてキット中に存在するＨＲＰストレプトアビジンとインキュベートした。ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を基質として使用して、陽性細胞におけるシグナルを得た。それに加えて、２次抗体の非特異的結合のコントロールとして、切片を２次抗体単独で染色した。動物を７２時間後に屠殺した。
【００９８】
４．生体高分子からの細胞の遊走
ケラチノサイトおよびメラニン細胞の、皮膚へ遊走する能力を、モルモットおよびＳＣＩＤマウスそれぞれにおいて、全層パンチ創傷生検モデル（ｆｕｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｐｕｎｃｈ  ｗｏｕｎｄ  ｂｉｏｐｃｙ  ｍｏｄｅｌ）で試験した。創傷ベッドに反転したＰＬＤＡフィルムからのメラニン細胞の遊走の証拠を、ポイント４において述べたように、ＳＣＩＤマウスにおいて評価した。動物を７２時間後に屠殺し、創傷を切除し、そして免疫組織化学的検査のために処理した。
【００９９】
組織化学的分析は、その細胞は創傷ベッドに遊走し、そして再生上皮の一部を形成したことを示した（図７）。ＭＥＬ−５陽性染色の存在によって、メラニン細胞を同定した（図７ＡおよびＢ）。ＭＥＬ−５陽性細胞を、創傷ベッドにおいて観察した（図７ＡおよびＢの矢印）。遊走したヒトメラニン細胞の存在を、抗ヒト核抗体による同様の染色パターンを観察することによって実証した（図７ＣおよびＤ）。
【０１００】
インビボ実験を、ヒト細胞を用いて動物で行った。実験の目的は、細胞のフィルムから創傷ベッドへの遊走を示すことであった。
【０１０１】
本発明はまた、移植後の自己患者を研究することによって、色素沈着低下の治療において従来の技術で観察される、以下の合併症に取り組むことを目的とした。
１．浸出
２．色のミスマッチ
３．移植片の拒絶
４．ドナー部位の瘢痕
５．移植後の炎症
６．敷石状所見。
【０１０２】
前述の発明は、理解の明快さの目的で、説明および実施例によって、いくらか詳細に記載されたが、本発明の教示を考えて、添付の請求の意図または範囲から離れることなく、ある変化および修飾をそれに加え得ることが、当業者に容易に明らかである。本明細書中で開示および請求された全ての組成物および方法を、本開示を考えて、過度の実験無しに、産生および実行し得る。本発明の組成物および方法が、好ましい実施態様に関して記載されたが、本発明の概念、意図および範囲から離れることなく、本明細書中で記載された組成物および／または方法に、およびその方法の工程または一連の工程で、変化を加え得ることが、当業者に明らかである。より具体的には、化学的または生理学的に関連するある薬剤を、本明細書中で記載された薬剤と置換し得るが、同じまたは同様の結果が達成されることが明らかである。当業者に明らかな、全てのそのような同様の置換および改変は、本発明の意図、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
【図１】
2010505580.tif 000004
【図２】
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【図３】
2010505580.tif 000006
【図４】
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【図５】
2010505580.tif 000008
【図６】
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【図７】
2010505580.tif 000010
【図８】
2010505580.tif 000011
【図９】
2010505580.tif 000012
【図１０】
2010505580.tif 000013
【図１１】
2010505580.tif 000014
【図１２】
2010505580.tif 000015
【図１３】
2010505580.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月24日(2009.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010505580000001.app
【国際調査報告】
2010505580.tif 000017
2010505580.tif 000018
2010505580.tif 000019
2010505580.tif 000020