(57)【要約】  式（Ｉ）：2010520192.tif 000028に対応するサマプリンＡの誘導体、それらの合成方法、並びに腫瘍又は癌を予防及び／又は治療する薬剤の製造のためのそれらの使用。
2010520192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2010520192.tif 000023
（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８から選択される整数であり；
ｉは、１、２から選択される整数であり；
ｊは、０、１から選択される整数であり；
ここで、ｉ＝２である場合にはｊ＝０であり、そしてｉ＝１である場合にはｊ＝１であり；
Ｘは、ハロゲン原子であり；
Ｗは、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｓ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、共有結合から選択されるリンカーであり；
Ｒは、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６カルボキシアルキル基から選択される基であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、同一であるか又は異なり、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６ハロゲノアルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６飽和へテロシクロアルキル基、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基、Ｃ６〜Ｃ２０アラルキル基、Ｃ４〜Ｃ１２へテロアリール基から選択され；
Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ２〜Ｃ６アシル基、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基、Ｃ６〜Ｃ２０アラルキル基、Ｃ４〜Ｃ１２へテロアリール基から選択され；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２０アラルキル基から選択される）
に対応する分子、及びその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
以下の条件：
ｎは、２、３、４、５、６から選択される整数であり；
ｉは、２であり；
ｊは、０であり；
Ｘは、Ｂｒであり；
Ｗは、−ＣＯ−ＮＨ−であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、水素原子であり；
Ｒ４は、Ｈであり；
Ｒ５は、Ｈである、
の１つ又はいくつかが満たされる、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
以下のリスト：
【化２】
2010520192.tif 000024
に含まれる、請求項１に記載の分子。
【請求項４】
薬学的に許容される担体中に請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の分子又はその塩を含む薬剤。
【請求項５】
腫瘍又は癌を予防するか及び／又は治療する薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の分子の使用。
【請求項６】
肺癌、卵巣癌、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、皮膚癌及び結腸癌、又は白血病から選択される癌の予防及び／又は治療のための、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
Ｗ＝−ＣＯ−ＮＨ−である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の分子を合成する方法であって、スキーム３：
【化３】
2010520192.tif 000025
（式中、インドール（ＩＩ）は約１当量のニトロソアクリレートＣＨ２＝Ｃ（ＮＯ）−ＣＯＯＺでアルキル化され、この場合、Ｚは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、アリール基から選択され、対応するブロモ−オキシムからｉｎ  ｓｉｔｕで生成される基を表わし、そして反応は塩基性媒質中で、溶媒中、周囲温度で実行される）
に示されるような少なくとも１つの工程を包含することを特徴とする、方法。
【請求項８】
Ｚがエチル基であり、前記溶媒がＣＨ２Ｃｌ２であり、前記塩基がＫ２ＣＯ３である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｉ＝２及びｊ＝０である場合、スキーム４：
【化４】
2010520192.tif 000026
（式中、オキシム（ＩＩＩ）は適切な保護基Ｙ（好ましくはＹはトリチル基である）を用いたオキシム官能基の保護により化合物（ＩＶ）に転化され；次にエステル官能基−ＣＯＯＺは適切な処理により−ＣＯＯＨに脱保護化されて、分子（Ｖ）を生じ；この分子は次に、適切なジアミンＮＨ２−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２と反応されて、（ＶＩ）を生じ、そしてオキシム官能基は次に遊離されて、式（Ｉ）の分子を生じる）
に示されたプロセスが第一工程の後に続くことを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
ｉ＝ｊ＝１である場合、スキーム５：
【化５】
2010520192.tif 000027
（式中、化合物（ＶＩ）はアミンＨ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｒと反応され、そしてオキシム官能基は脱保護化されて、式（Ｉ）を生じる）
に示されたプロセスが第一工程の後に続くことを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サマプリンＡ(psammaplin A)の新規の誘導体、その合成方法、並びに癌又は腫瘍の予防及び／又は治療のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
【化１】
2010520192.tif 000003
【０００３】
サマプリンＡ（１）は、非同定海綿動物（非特許文献１）、トレクトサムマ・キサナ（Thorectopsamma xana）（非特許文献２）及びサマプリシラ（Psammaplysilla）種（非特許文献３）から、１９８７年に初めて単離された対称性ブロモチロシン由来ジスルフィド二量体である。早期の研究は、サマプリンＡが一般的抗菌及び抗腫瘍特性を有する、ということを明示した。１９９９年に、サマプリンＡが黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＳＡ）及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の両方に対して有意のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌活性を示すことが判明したが、これは、ＤＮＡギラーゼの阻害を介したサマプリンＡによる誘導細菌ＤＮＡ合成停止の結果であると推測された（非特許文献４）。付加的には、サマプリンＡは、多数の酵素、例えばトポイソメラーゼＩＩ（トポＩＩ）（非特許文献５）、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ及びロイシン・アミノペプチダーゼ（非特許文献６）、並びに近年報告されたようなキチナーゼ（非特許文献７）の或る種の阻害を示すことが報告されている。これらの酵素の中で、トポＩＩ（真核生物ＤＮＡ複製のために必要とされる）及び細菌ＤＮＡギラーゼは、ＤＮＡトポロジーの再構築に関与する酵素のトポイソメラーゼ・ファミリーに属する。サマプリンＡは、ヒト肺（Ａ５４９）、卵巣（ＳＫＯＶ−３）、皮膚（ＳＫ−ＭＥＬ−２）、ＣＮＳ（ＸＦ４９８）及び結腸（ＨＣＴ１５）癌細胞株に対して有意の細胞傷害性を示す、ということが近年報告された（非特許文献８）。サマプリンＡの細胞傷害性は基本的細胞過程すなわちＤＮＡ複製に及ぼす阻害作用に関連する場合があり、そしてサマプリンＡの主要標的分子のうちの１つはポルα−プリマーゼであり得る、ということを他の研究は示唆している（非特許文献９）。近年、１は、ＡＰＮの強力な阻害剤（腫瘍侵襲及び血管新生に必要とされるメタロプロテイナーゼ）として見出されている（非特許文献１０）。
【０００４】
サマプリンＡ（１）に起因すると考えられる報告された生物活性の中で、最も重要なものは、おそらくは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）として知られているヒストンを脱アセチル化する酵素を阻害するその能力（ＩＣ５０  ４．２  ｎＭ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ無細胞酵素アッセイ）である（非特許文献１１）。いくつかのＨＤＡＣ阻害剤は、癌のための潜在的分子標的化学療法薬として臨床試験が進行中である（非特許文献１２）。１はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で腫瘍増殖を阻害したが、しかしその不十分な生理学的安定性が薬剤としてのその開発を妨げた。生理学的条件下での１の不安定性（又は貧細胞膜透過性）は、細胞ベースのアッセイにおけるＨＤＡＣの阻害が、酵素ベースのアッセイにおいてＨＤＡＣを阻害するのに要する濃度の１８００倍以上である１の濃度を必要とする理由を説明し得る。
【０００５】
強力な且つ選択的ＨＤＡＣ阻害剤を開発する過程中、ヘテロ芳香族酸由来のアミド部分はＨＤＡＣ阻害剤の有用な末端残基として役立ち得る、ということが実証された。一連の複素環式アミドヒドロキサム酸の合成は、高効力のインドール−アミド、特に２−置換インドール−カルボキサミド、例えばＨＤＡＣｉｓを実証した（非特許文献１３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Arabshahi, L.; Schmitz, F.J. J. Org. Chem. 1987, 52, 3584-3586
【非特許文献２】Rodriguez, A.D. et al., Tetrahedron Lett. 1987, 28, 4989-4992
【非特許文献３】Quinnoa, E.; Crews, P. Tetrahedron Lett. 1987, 28, 3229-3232
【非特許文献４】Kim, D. et al., Arch. Pharm. Res. 1999, 22, 25-29
【非特許文献５】Kim, D. et al., Anticancer Res. 1999, 19, 4085-4090
【非特許文献６】Shin, J. et al., J. Tetrahedron 2000, 56, 9071-9077
【非特許文献７】Tabudravu, J.N. et al., Bioorg. Med. Chem 2002, 10, 1123-1128
【非特許文献８】Park, Y. et al., J Nat. Prod. 2003, 66, 1495-1498
【非特許文献９】Jiang, Y. et al., BMC Cancer 2004, 4: 70
【非特許文献１０】Shima, J.S. et al., J. Cancer Letters 2004, 203, 163-169
【非特許文献１１】Pina, I.C. et al., J. Org. Chem. 2003, 68, 3866-3873
【非特許文献１２】Remiszewski, S.W. Curr. Med. Chem. 2003, 10, 2393-2402
【非特許文献１３】Dai, Y. et al.; Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 1897-1901
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一目的は、サマプリンＡの構造と類似の構造並びに癌性細胞株に対する有意な生物学的活性を有する新規の分子を得ることである。
【０００８】
本発明の一目的は、式（Ｉ）：
【０００９】
【化２】
2010520192.tif 000004
【００１０】
（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８から選択される整数であり；
ｉは、１、２から選択される整数であり；
ｊは、０、１から選択される整数であり；
ここで、ｉ＝２である場合にはｊ＝０であり、そしてｉ＝１である場合にはｊ＝１であり；
Ｘは、ハロゲン原子であり；
Ｗは、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｓ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、共有結合から選択されるリンカーであり；
Ｒは、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６カルボキシアルキル基から選択される基であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、同一であるか又は異なり、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６ハロゲノアルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６飽和へテロシクロアルキル基、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基、Ｃ６〜Ｃ２０アラルキル基、Ｃ４〜Ｃ１２へテロアリール基から選択され；
Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ２〜Ｃ６アシル基、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基、Ｃ６〜Ｃ２０アラルキル基、Ｃ４〜Ｃ１２へテロアリール基から選択され；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２０アラルキル基から選択される）
に対応する分子、及びその薬学的に許容される塩である。
【００１１】
ハロゲン原子は、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉから選択される原子である。
【００１２】
Ｃ１〜Ｃ６アルキル基は、１、２、３、４、５又は６個の炭素原子を含む直鎖、分枝鎖又は環状のアルキル鎖を意味する。
【００１３】
Ｃ１〜Ｃ６ハロゲノアルキル基は、１、２、３、４、５又は６個の炭素原子及び少なくとも１つのハロゲン原子を含む直鎖、分枝鎖又は環状のアルキル鎖を意味する。
【００１４】
Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基は、アルキル鎖が１、２、３、４、５又は６個の炭素原子を含む直鎖、分枝鎖又は環状である−Ｏ−アルキル基を意味する。
【００１５】
Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル基は、アルキル鎖が１、２、３、４、５又は６個の炭素原子を含む直鎖、分枝鎖又は環状である−ＮＨ−アルキル基又は−Ｎ−ジアルキル基を意味する。
【００１６】
Ｃ１〜Ｃ６飽和へテロシクロアルキル基は、１、２、３、４、５又は６個の炭素原子及び１又は２個の異種原子、例えばＮ、Ｏ、Ｓを含む飽和環状鎖、例えばピロリジン、ピペリジン、テトラヒドロフランである。
【００１７】
Ｃ６〜Ｃ１２アリール基は、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の炭素原子を含む芳香族基、例えばフェニル又はナフチル基である。
【００１８】
Ｃ６〜Ｃ２０アラルキル基は、アルキル鎖及び少なくとも１つの芳香族基及び６〜２０個の炭素原子を含み、例えばベンジル基又はトリチル基を含む。
【００１９】
Ｃ４〜Ｃ１２へテロアリール基は、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の炭素原子及び１又は２個の異種原子、例えばＮ、Ｏ、Ｓを含む芳香族基、例えばピリジン、フラン、ピリミジンである。
【００２０】
Ｃ２〜Ｃ６アシル基は、アルキル鎖が１、２、３、４又は５個の炭素原子を含む−ＣＯ−アルキル基である。
【００２１】
好ましくは、以下の条件：
ｎは、２、３、４、５、６から選択される整数であり；
ｉは、２であり；
ｊは、０であり；
Ｘは、Ｂｒであり；
Ｗは、−ＣＯ−ＮＨ−であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、水素原子であり；
Ｒ４は、Ｈであり；
Ｒ５は、Ｈである、
の１つ又はいくつかが満たされる。
【００２２】
好ましい分子は、以下のリスト：
【００２３】
【化３】
2010520192.tif 000005
【００２４】
に含まれるものである。
【００２５】
意外にも、式（Ｉ）に対応する分子は、癌細胞の細胞周期のうちの少なくとも１つの、より良好には２つの、さらに好ましくは３つの工程を阻害するという特性を有する、ということを本発明者らは発見した。特に、式（Ｉ）の分子は、癌細胞と接触する場合、以下の特性のうちの１つ又は複数を有する：
−  細胞周期停止を誘導する、
−  アポトーシスを誘導する、
−  ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤として作用する、
−  ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）の阻害剤として作用する、
−  ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンドＴＲＡＩＬの発現を誘導する、
−  ヒトＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２の阻害剤として作用する。
【００２６】
式（Ｉ）のいくつかの分子は、生物学的により活性な分子の合成のための中間体としても有用である。
【００２７】
薬学的に許容される塩としては、薬学的に許容される無機又は有機の塩基及び酸由来のものが挙げられる。適切な塩としては、製薬業界でよく知られた多数の他の酸の中でも、アルカリ金属、例えばカリウム及びナトリウム、アルカリ土類金属、例えばカルシウム及びマグネシウム由来のものが挙げられる。特に、薬学的に許容される塩の例は、生理学的に許容される陰イオンを生じる酸を用いて形成される有機酸付加塩、例えばトシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩及びα−グリセロリン酸塩である。適切な無機塩、例えば硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩及び炭酸塩も形成され得る。薬学的に許容される塩は、当該技術分野でよく知られた標準手法を用いて得られる。
【００２８】
本発明の一目的は、薬学的に許容される担体中に有効量の式（Ｉ）の分子又はその塩を含む薬剤又は薬学的組成物である。
【００２９】
本発明によれば、組成物は、適切な担体、例えば水を含み、そしてそれを必要とする個体への所望の投与経路のために処方される。任意に、化合物は、腫瘍又は癌の治療のために、少なくとも１つの付加的治療薬と組合せて、又はそれと交互に、投与される。
【００３０】
本発明の別の目的は、必要とする個体において腫瘍又は癌を予防するか及び／又は治療する薬剤の製造のための式（Ｉ）の分子の使用である。この使用は、肺癌、卵巣癌、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、皮膚癌及び結腸癌、又は白血病から選択される癌の予防及び／又は治療に特に関連する。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、癌及び癌性という用語は、典型的には非調節細胞増殖、特に増殖性障害により特性化される、哺乳類における生理学的状態を指すか又は説明する。このような増殖性障害の例としては、とりわけ、癌、例えば癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が挙げられる。このような癌のさらに特定の例としては、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌（肝癌）、膀胱癌、結腸直腸癌、子宮体癌、腎臓癌及び甲状腺癌が挙げられる。
【００３２】
本明細書中で用いる場合、腫瘍という用語は、悪性であるか又は良性であるかに拘わらず、新生物性細胞増殖及び増殖、並びに全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を指す。注目すべきことに、癌は、固形腫瘍塊により特性化され得る。固形腫瘍塊は、存在する場合、原発性腫瘍塊であり得る。原発性腫瘍塊は、組織の正常細胞の形質転換に起因するその組織中の癌細胞の増殖を指す。
【００３３】
本発明の薬剤の投与の投与量及びリズムは、式（Ｉ）の選択分子の生物学的活性、患者の年齢及び体重、癌及び／又は腫瘍の型及び重要性、並びに選択される投与経路に鑑みて、適合される。
【００３４】
本発明の別の目的は、式（Ｉ）の分子を合成する方法である。
【００３５】
Hoshino他（Bioorg. Med. Chem. Lett. 1992, 2, 1561-1562）は、４つの工程における３−ブロモチロシンからの１の合成を報告している（スキーム１）。４つの工程全体で２３％の収率で、サマプリンＡ（１）を得た。
【００３６】
【化４】
2010520192.tif 000006
【００３７】
スキーム１。試薬及び条件：（ｉ）（ＣＦ３ＣＯ）２Ｏ、８０℃〜１２０℃、１時間（６１％）；（ｉｉ）７０％水性ＴＦＡ、２５℃、１２時間（９７％）；（ｉｉｉ）ＨＯＮＨ２・ＨＣｌ、ＡｃＯＮａ、ＥｔＯＨ、２５℃（５７％）；（ｉｖ）ＤＤＣ、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｅｔ３Ｎ、シスタミン、１，４−ジオキサン−ＭｅＯＨ、２５℃、１２時間（６７％）。
【００３８】
Hoshinoのアプローチの本質的特徴は、スキーム２に示されるNicolaou（Nicolaou, K. et al., J. Chem. -Eur. J. 2001, 7, 4280-4295）により報告されたサマプリンＡ型誘導体への一般的アプローチに実質的に援用されている。４から４つの工程全体で３６％の収率で、サマプリン１類似体を得た（Nicholaou, G.M. et al., A. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12, 2487-2490）。抗菌特性に関してスクリーニングされたサマプリンＡ類似体の３８２８成員ライブラリーの、触媒的に誘導されるジスルフィド交換による調製において、Nicolaouのアプローチを利用した（Nicolaou, G.M. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12, 2487-2490）。
【００３９】
【化５】
2010520192.tif 000007
【００４０】
スキーム２。試薬及び条件：（ｉ）ＫＢｒ−ＫＢｒＯ３、Ｈ２Ｏ、２３℃、１２時間（８１％）；（ｉｉ）ＴＦＡＡ、８０℃、１２時間；（ｉｉｉ）７０％水性ＴＦＡ、２３℃、１２時間（６０％、２工程）；（ｉｖ）ＴＨＰ−ＯＮＨ２、ＥｔＯＨ、２３℃、１２時間；（ｖ）ＥＤＣ、ＮＨＳ、１，４−ジオキサン、２３℃、２時間；（ｖｉ）Ｅｔ３Ｎ、シスタミン・ＨＣｌ、１，４−ジオキサン−ＭｅＯＨ、２３℃、２時間；（ｖｉｉ）ＨＣｌ、ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ、６０℃、２時間（７から３６％）。
【００４１】
これら全合成は、不十分な全体的収率でサマプリンＡを生じた。オキシム基の保護−脱保護工程を回避し、そしてより高い収率で進行する最近のサマプリンＡの合成が言及されるべきである（Godert, A.M. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 3330-3333）。本発明の別の目的は、簡単であり、高収率を生じ、そして容易に工業化され得るサマプリンＡ誘導体の合成方法を見出すことであった。
【００４２】
ここで、本発明者らは、２−置換インドール−カルボキサミド型のサマプリンＡ誘導体を合成する新規の方法を見出したが、この方法は、迅速、簡単であり、そして高収率を生じる。
【００４３】
Ｗ＝−ＣＯ−ＮＨ−である場合、本発明の方法は、スキーム３に示されるような少なくとも１つの工程を含むことを特徴とする：
【００４４】
【化６】
2010520192.tif 000008
【００４５】
スキーム３に示された合成は、対応するブロモ−オキシムからｉｎ  ｓｉｔｕで生成された約１当量のニトロソアクリレートＣＨ２＝Ｃ（ＮＯ）−ＣＯＯＺ（式中、Ｚは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、アリール基、例えばベンジル基（Gilchrist, T.L.; Roberts T.G. J. Chem. Soc. Perkin Trans I 1983, 1283-1292）から選択される基を表す）を用いたインドール（ＩＩ）のアルキル化で開始した。上記のブロモ−オキシムは、エチルブロモピルベートとヒドロキシルアミン塩酸塩との反応により、既知のやり方で調製される。好ましくは、反応は、塩基性媒質中で、溶媒中で、周囲温度で実行される。溶媒は、塩素化溶媒、例えばＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨＣｌ３又はＣｌＣＨ２−ＣＨ２Ｃｌ又はニトロエタン若しくはジオキサンであり得る。用いられる塩基は、金属炭酸塩、金属重炭酸塩又は水素化ナトリウムであり得る。好ましくは、炭酸塩、例えばＫ２ＣＯ３又はＮａ２ＣＯ３を用いた。反応の進行はＴＬＣ又はＨＰＬＣにより追跡され、そして置換基、溶媒及び温度によって、１時間〜数時間継続し得る。有益には、Ｚはアルキル基（第一級、第三級）から選択されるか、又はベンジル基であり得る。好ましくは、Ｚはエチルである。
【００４６】
Ｗが−ＣＯ−ＮＨ−と異なる場合、当業者は、一般知識を用いることによりこの方法を容易に適合させる。例えばオキシムの保護及び鹸化後、アルコールへの酸のボラン還元はアルデヒドを調製させ、そしてそれらから、ホーナー・ワズワース・エモンス反応により、不飽和類似体（Ｗ：ＣＨ＝ＣＨ）を調製させる。
【００４７】
有益には、この第一工程の後、スキーム４に示されるプロセスが続く：
【００４８】
【化７】
2010520192.tif 000009
【００４９】
オキシム（ＩＩＩ）を、適切な保護基Ｙ（トリチル、ベンジル、メトキシメチル、メトキシエトキシメチル、２−テトラヒドロピラニルから選択され得る）を用いたオキシム官能基の保護により、化合物（ＩＶ）に転化する。好ましくは、Ｙはトリチル基である。次に、エステル官能基−ＣＯＯＺを、適切な処理により−ＣＯＯＨに脱保護して、分子（Ｖ）を得る。この分子を次に、適切なジアミンＨ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２と反応させて（ＶＩ）を生じ、次にオキシム官能基を遊離して、式（Ｉ）の分子を得る。
【００５０】
ｉ＝ｊ＝１である場合、この方法が適合されて、スキーム５に従って式（Ｉ）の対応する分子を生じる：
【００５１】
【化８】
2010520192.tif 000010
【００５２】
化合物（ＶＩ）をアミンＨ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｒと反応させ、そしてオキシム官能基を脱保護して、（Ｉ）を得る。
【００５３】
細胞癌モデルにおけるサマプリンＡ誘導体の生物学的作用を調べた：
細胞周期停止及びアポトーシスの誘導
本発明の分子は、Ｕ９３７急性骨髄性白血病細胞株における増殖（図１ａ）及び／又はアポトーシス（図１ｂ）の阻害を誘導した（図１）。それらは、細胞周期阻害剤ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１（Ｇ１期に必要であり、そしてＧ２期停止を持続することが知られている）の発現も増大する（Bunz, F. et al., Science 282, 1497-501 (1998)）（図１ｃ）。
【００５４】
サマプリンＡ及びその２つの誘導体５００８及び５０１０の抗増殖及びアポトーシス誘導作用も、固形癌細胞株、例えば乳癌細胞（ＺＲ７５．１）及び前立腺癌細胞（ＬｎＣａｐ；データは示されていない；図６も参照）において確認した。
ＵＶＩ５００８は強力なＨＤＡＣ阻害剤である：
ヒストンＨ３アセチル化（図１ｄ）及びＨＤＡＣ阻害（図１ｅ、レーン６、７）を観察した。
ＵＶＩ５００８は腫瘍抑制遺伝子ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲＡＲβ２のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化を阻害する：
ＵＶＩ５００８が付加的活性を有するか否かを試験するために、腫瘍抑制遺伝子のプロモーターのＤＮＡメチル化の考え得る阻害を試験した。メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）を用いて、非メチル化ＲＡＲβ２の有意の増大を観察した（図２ａ）。付随的に、非メチル化ｐ１６ＩＮＫ４ａプロモーターＤＮＡの量は増大した（図２ｂ）。ｐ１６ＩＮＫ４ａプロモーターの脱メチル化を続けるに際して、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子発現を本発明の分子への曝露により脱サイレント化したが、この発現は、５−デアザシチジンとＳＡＨＡの組合せを用いて観察されたものに匹敵した（図２ｃ）。
【００５５】
最後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）アッセイを用いて、式（Ｉ）の分子はＤＮＭＴ阻害剤である、ということを確認した（図２ｄ）。
ＵＶＩ５００８は腫瘍選択的アポトーシス誘導デスリガンドをコードするＴＲＡＩＬ遺伝子座でのクロマチンのアセチル化状態を変更する：
注目すべきことに、式（Ｉ）の分子へのＵ９３７骨髄性細胞の曝露は、ＴＲＡＩＬプロモーターでのクロマチンの急速な劇的Ｈ３Ｋ９アセチル化をもたらし、そして最初のイントロンでの遅延動態も伴う（図５ａ）。この「活性化」クロマチン・マークは、それぞれＲＴ−ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡアッセイにより示されるような、ｍＲＮＡ（図５ｂ）及びタンパク質（図５ｂ）レベルの両方での発現増大と相関する。
ＨＤＡＣ活性の構造−活性相関（ＳＡＲ）試験：
ＵＶＩ５００８の上記ＨＤＡＣ阻害剤活性のＳＡＲ試験を開始するために、一連の誘導体を合成した（図７）。体系的に研究された活性読出しは、細胞周期停止及びｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１誘導、分化の誘導、並びに標的（この場合はａ−チューブリン）のアセチル化であった。
サマプリンＡ誘導体はＡＭＬ患者芽細胞におけるアポトーシスを誘導する：
いくつかのサマプリンＡ誘導体の抗癌能力が興味深いため、ｅｘ  ｖｉｖｏＡＭＬ患者芽細胞におけるそれらの活性を試験した。図４に示したように、異なる患者（ＡＭＬ患者＃１０２、＃１０８、＃１０９、＃１１６）の４つの個々のｅｘ  ｖｉｖｏ培養におけるカスパーゼ３活性化アッセイにより測定した場合、式（Ｉ）の分子は、芽細胞における細胞周期停止及びアポトーシスを誘導した。試験した誘導体は全て、患者芽細胞の２つの異なる試料においてアポトーシス活性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ａ）１μＭ及び５μＭで用いられた指示化合物で３０時間処理されたＵ９３７細胞の細胞周期分析；ｂ）Ｕ９３７細胞における処理の２４時間後の指示化合物のカスパーゼ３アポトーシスアッセイ；ｃ）指示化合物による処理後６時間及び１６時間でのチューブリン・アセチル化レベル及びｐ２１発現レベル；総チューブリン発現レベルは均等負荷のために用いられる；ｄ）指示化合物による処理後６時間及び１６時間でのヒストンＨ３アセチル化レベル及びＫ９  Ｈ３メチル化発現レベル；総チューブリン発現レベルは均等負荷のために用いられる；ｅ）指示化合物による処理後６時間及び１６時間でのＫ９、Ｋ１４、Ｋ１８  ヒストンＨ３アセチル化発現レベル；総ＥＲＫ発現レベルは均等負荷のために用いられる；ｆ）ＨＤＡＣ１酵素アッセイ：ＩＰ−ＨＤＡＣ１を指示阻害剤とともに２４時間インキュベートする；活性を３Ｈ−アセチル放出として測定する；ｇ）ＨＤＡＣ４酵素アッセイ：ＩＰ−ＨＤＡＣ４を指示阻害剤とともに２４時間インキュベートする；活性を３Ｈ−アセチル放出として測定する。
【図２】ａ）指示化合物による処理の１６時間及び２４時間後のＲＡＲβ遺伝子に関するメチル化特異的ＰＣＲ；ｂ）指示処理の２４時間後のｐ１６遺伝子に関するメチル化特異的ＰＣＲ。試料は実際の複製物を代表する；ｃ）指示処理の２４時間後のＵ９３７細胞におけるｐ１６発現レベル；ｄ）１．５μＭ及び５０μＭの指示化合物を用いて実行されるＤＮＭＴ酵素的ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ。
【図３】ａ）指示化合物を用いて２４時間後にＵ９３７細胞で実行された細胞周期及びアポトーシス分析；値は個々の三重反復実験の中間値である；ｂ）指示化合物を用いてＵ９３７細胞で実行されたＣＤ１１ｃ発現分析；値は個々の二重反復実験の中間値である；ｃ）指示処理の２４時間後のＵ９３７細胞におけるチューブリン・アセチル化レベル及びｐ２１発現レベル；総ＥＲＫ発現レベルは均等負荷のために用いられる；ｄ）（ｃ）に示された条件下でのヒストンＨ３のアセチル化。
【図４】ａ）番号で識別されるＡＭＬ患者からのｅｘ  ｖｉｖｏ試料で実行した細胞周期分析及びアポトーシス；ｂ）指示処理の２０時間後の＃１１６  ＡＭＬ細胞の細胞周期分析、アポトーシス及びヒストンＨ３アセチル化レベル。
【図５】ａ）ＴＲＡＩＬプロモーター調節領域並びにＴＲＡＩＬ遺伝子第一イントロンに関するヒストンＨ３アセチル化レベルの分析は、ＵＶＩ５００８による指示時間経過後のＵ９３７細胞におけるＣｈｉｐ及びｑＰＣＲを実行した；「ＮｏＡｂ」は陰性対照を表す；ｂ）ＵＶＩ５００８を用いた指示時間のインキュベーション後のＴＲＡＩＬ  ｍＲＮＡ発現；Ｇ６ＰＤＨレベルは均等負荷のために用いられた；ｃ）ＵＶＩ５００８による処理２４時間後のＵ９３７細胞におけるＥＬＩＳＡアッセイにより測定したＴＲＡＩＬタンパク質発現レベル。
【図６】ＨＤＡＣ阻害剤に対するＡ３７５、ＤＵ１４５、ＨＣＴ１１６及びＭａＴｕ細胞株の感受性。ＳＡＨＡ、ＭＳ２７５又はＵＶＩ５００８（０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ）の存在下で、細胞をインキュベートした。（ａ）ＭＴＴ試験を用いて４８時間後に、細胞増殖を測定した。結果は、対照と比較した場合の生存パーセンテージとして示され、そして三重反復測定の平均±ＳＤを表す。（ａ）４８時間培養でのアポトーシス細胞のパーセンテージをＡＰＯ２．７染色により決定した。結果は、三重反復測定の平均±ＳＤを表す。
【図７】試験した分子の一覧である。
【図８ａ】ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５及びＵＶＩ５００８を用いたＡ−３７５細胞株の用量応答曲線、ＩＣ５０値の計算を示す図である。
【図８ｂ】ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５及びＵＶＩ５００８を用いたＨＣＴ−１１６細胞株の用量応答曲線、ＩＣ５０値の計算を示す図である。
【図８ｃ】ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５及びＵＶＩ５００８を用いたＤＵ−１４５細胞株の用量応答曲線、ＩＣ５０値の計算を示す図である。
【図９Ａ】ＨＣＴ−１１６異種移植片の正規化動物体重プロファイルを示す図である。
【図９Ｂ】ＨＣＴ−１１６異種移植片の正規化腫瘍重量プロファイルを示す図である。
【図１０Ａ】ＹＱＫＳＴＥＬＬＩＲのＭＳ／ＭＳ断片化を示す図である。
【図１０Ｂ】Ｈ３Ｋ５６ａｃのＭＳ同定を示す図である。
【図１１】選択数のヒストン修飾のＳＩＬＡＣプロテオミック分析を示す図である。
【図１２】Ｈ３のアセチル化Ｋ５６を特異的に認識する抗体を用いたＡ及びＢウエスタンブロット分析を示す図である。
【図１３Ａ】対照、スラミンナトリウム、サーチュイン阻害剤、及びＳＩＲＴ１活性剤であるレスベラトロールによる、並びに５０μＭ及び５μＭの濃度でのＵＶＩ５００８によるＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２活性の％を示す図である。
【図１３Ｂ】エトポシド単独で又はサーチュイン（既知のＳＩＲＴ２阻害剤）の存在下での、並びに５０μＭ及び５μＭの濃度でのＵＶＩ５００８で処理されたＭＣＦ７細胞のウエスタンブロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
合成
合成（スキーム６）は、エチルブロモピルベート２４とヒドロキシルアミン塩酸塩との反応により調製されたブロモ−オキシム２３からｉｎ  ｓｉｔｕで生成されたニトロソアクリレート２２（Gilchrist, T.L.; Roberts T.G. J. Chem. Soc. Perkin Trans I 1983, 1283-1292）を用いたインドール２１のアルキル化で開始した。アルキル化は、Ｃ３位置での２連続アタック（attacks）に起因するシクロ付加物２６も生じた。それらを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  ４０：６０）により分離した。したがって、反応は、３−置換インドールのアルキル化の一方法としての可能性を有する。反応生成物２５の収率は、最適化後、６７％に増大された（表参照）。
【００５８】
【化９】
2010520192.tif 000011
【００５９】
スキーム６  試薬及び条件：（ｉ）２４、ＣＨＣｌ３、ＮＨ２ＯＨ・ＨＣｌ、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（１：１）、２２時間、２５℃（８６％）。（ｉｉ）Ｋ２ＣＯ３、ＣＨ２Ｃｌ２、２５℃、２０時間（表１参照）。
【００６０】
【表１】
2010520192.tif 000012
【００６１】
化合物２５ａ及び２６ａの構造を、Ｘ線結晶構造解析により確認した。
【００６２】
次に、塩化トリチルとの反応により化合物２５ａ及び２５ｂを保護化オキシム２６（スキーム６）に転化し、加水分解し、そしてＮ−スクシニミジルエステルとして活性化によりシスタミンとカップリングした（Nicolaou, K. C. et al., Chem. -Eur. J. 2001, 7, 4280-4295）。次にトリチル保護基の切断は、２５から４つの工程全体で４３％及び５０％の収率で２９ａ及び２９ｂを得た。
【００６３】
【化１０】
2010520192.tif 000013
【００６４】
スキーム７  試薬及び条件：（ｉ）Ｋ２ＣＯ３、ＣＨ２Ｃｌ２、ＴｒＣｌ、２５℃、２０時間（９７％、２６ａ；７４％、２６ｂ）。（ｉｉ）ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ、ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（１：１）、２５℃、２０時間（９０％、２７ａ；９９％、２７ｂ）。（ｉｉｉ）ｉ．ＥＤＣ、ＮＨＳ、ジオキサン、２５℃、２時間。ｉｉ．シスタミン、Ｅｔ３Ｎ、ＭｅＯＨ、ジオキサン、２５℃、１５時間（６４％、２８ａ；８４％、２８ｂ）。（ｉｖ）Ｅｔ２Ｏ、ＣＨ２Ｃｌ２中２Ｍ  ＨＣｌ、２５℃、２時間（７８％、２９ａ；８１％、２９ｂ）。
【００６５】
嵩高い基による保護は、Ｘ線構造により確認されるようにオキシム２７の幾何学的配列(geometry)Ｅを変えなかった。
【００６６】
ジアミンのシリーズとのカップリングにより同様のやり方で、異なる鎖長を有する類似体を合成した（スキーム８）。
【００６７】
【化１１】
2010520192.tif 000014
【００６８】
スキーム８  試薬及び条件：（ｉ）ｉ．ＥＤＣ、ＮＨＳ、ジオキサン、２５℃、２時間。ｉｉ．１３、Ｅｔ３Ｎ、ＭｅＯＨ、ジオキサン、２５℃、１５時間。（ｉｖ）Ｅｔ２Ｏ、ＣＨ２Ｃｌ２中２Ｍ  ＨＣｌ、２５℃、２時間。各工程に関する収率を、以下の表２にまとめる：
【００６９】
【表２】
2010520192.tif 000015
【００７０】
この方法を、ブロモインドール異性体の全シリーズの調製のためにも利用した。Leimgruber-Batcho法（Moyer, M.P. et al., H.J. Org. Chem. 1986, 56, 5106-5110）の適用により、又はBartoli手法（Nicolaou, K.C. et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 12888-12896）により、これらのブロモインドールを合成した。上記の同一工程後、ブロモインドール位置異性体周囲に構築されたサマプリン類似体のシリーズを得た（スキーム９）。
【００７１】
【化１２】
2010520192.tif 000016
【００７２】
スキーム９  試薬及び条件：（ｉ）２３、Ｋ２ＣＯ３、ＣＨ２Ｃｌ２、２５℃、２０時間（６５％、３３ａ；４３％、３３ｂ、４１％、３３ｃ）。（ｉｉ）Ｋ２ＣＯ３、ＣＨ２Ｃｌ２、ＴｒＣｌ、２５℃、２０時間（７４％、３４ａ；５１％、３４ｂ、４１％、３４ｃ）。（ｉｉｉ）ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ、ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（１：１）、２５℃、２０時間（８２％、３５ａ；９７％、３５ｂ；９１％、３５ｃ）。（ｉｖ）ｉ．ＥＤＣ、ＮＨＳ、ジオキサン、２５℃、２時間。ｉｉ．シスタミン、Ｅｔ３Ｎ、ＭｅＯＨ、ジオキサン、２５℃、１５時間（６７％、３６ａ；７７％、３６ｂ、５０％、３６ｃ）。（ｖ）Ｅｔ２Ｏ、ＣＨ２Ｃｌ２中２Ｍ  ＨＣｌ、２５℃、２時間（８１％、３７ａ；５４％、３７ｂ；６０％、３７ｃ）。
【００７３】
同様に、酸２８ｂをアミン３８及び４１とカップリングすることにより、他の化合物を合成した（スキーム１０）。３９におけるトリチル基の切断のためにはＴＦＡを用いることが必要であった（Glinka, T. et al., Bioorg. Med. Chem. 2003, 11, 591-600）。
【００７４】
【化１３】
2010520192.tif 000017
【００７５】
スキーム１０  試薬及び条件：（ｉ）ｉ．ＥＤＣ、ＮＨＳ、ジオキサン、２５℃、２時間。ｉｉ．３８又は４１、Ｅｔ３Ｎ、ＭｅＯＨ、ジオキサン、２５℃、１５時間（７４％、３９；６３％、４２）。（ｉｉ）ＴＦＡ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃〜２５℃、１時間（５０％）。（ｉｉｉ）ＴＨＦ：ＨＣＯ２Ｈ：Ｈ２Ｏ（７：２：１）、１９時間、２５℃（９９％）。（ｉｖ）Ｅｔ２Ｏ、ＣＨ２Ｃｌ２中２Ｍ  ＨＣｌ、２５℃、２時間（５９％）。
【００７６】
合成された他の化合物は、ベンジル保護化オキシム（Rutger, R.P. et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans I 1987, 2473-2480）（スキーム１１）、並びにＮａＢＨ４を用いたジスルフィドの還元及びＭｅＩを用いたメチル化によるメチルスルフィド（スキーム１２）（Rutger, R.P. et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans I 1987, 2473-2480）であった。
【００７７】
【化１４】
2010520192.tif 000018
【００７８】
スキーム１１  試薬及び条件：（ｉ）ＢｎＢｒ、ＫＯｔＢｕ、ＤＭＥ、１２時間、２５℃（７２％）。（ｉｉ）ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ、ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（１：１）、２５℃、２０時間（９９％）。（ｉｖ）ｉ．ＥＤＣ、ＮＨＳ、ジオキサン、２５℃、２時間。ｉｉ．シスタミン、Ｅｔ３Ｎ、ＭｅＯＨ、ジオキサン、２５℃、１５時間（８０％）。
【００７９】
【化１５】
2010520192.tif 000019
【００８０】
スキーム１２  試薬及び条件：（ｉ）ｉ．ＮａＢＨ４、ＮａＯＨ、ＥｔＯＨ、２５℃、０．５時間。ｉｉ．ＭｅＩ、２５℃、１６時間、２５℃（８０％）。
生物学的活性
Ａ−方法：
細胞培養：
１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清；Hyclone）及び抗生物質（１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２５０ｎｇ／ｍＬアンフォテリシン−Ｂ）を補足したＲＰＭＩ培地中で、ヒト白血病細胞株Ｕ９３７を増殖させた。培地１ミリリットル当たり２０００００細胞の一定濃度で、細胞を保持した。ＡＭＬ試料に関して、８０％〜９０％白血病芽細胞を含有する骨髄を、Ｆｉｃｏｌｌ上で精製した。ナポリ第二大学の倫理委員会により、この試験は承認された。
リガンド及び材料：
ＳＡＨＡ（Alexis）をＤＭＳＯ中に溶解し、５×１０−６Ｍで用いた。ＭＳ−２７５（Schering AG）をエタノール中に溶解し、５×１０−６Ｍで用いた；バルプロ酸（ＶＰＡ；Sigma）を１ｍＭで用いた。記載した他の化合物すべてをＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich）中に溶解し、１μＭ又は５μＭで用いた。
細胞周期分析：
２．５×１０５細胞を収集し、５００μＬの低張緩衝液（０．１％トリトンＸ−１００、０．１％クエン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム、ＲＮアーゼＡ）中に再懸濁した。細胞を、暗所で３０分間インキュベートした。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson）を用いてＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター上で試料を得て、そしてＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson）及びＭｏｄＦｉｔ  ＬＴバージョン３ソフトウェア（Verity）を用いて標準手法で分析した。実験は全て、３回実施した。
アポトーシスのＦＡＣＳ分析：
供給元により示されたようにカスパーゼ３活性検出（B-Bridge）を用いてアポトーシスを測定し、ＦＡＣＳ（Becton Dickinson）により定量した。
顆粒球分化：
顆粒球分化を、以下のように実行した。要するに、Ｕ９３７細胞を採取し、１０μＬのフィコエリトリン複合体化ＣＤ１１ｃ（ＣＤ１１ｃ−ＰＥ）中に再懸濁した。対照試料を１０μＬのＰＥ複合体化マウスＩｇＧ１とともにインキュベートし、暗所で４℃で３０分間インキュベートして、ＰＢＳ中で洗浄し、ヨウ化プロピジウム（０．２５μｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳ  ５００μＬ中に再懸濁した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ技法（Becton Dickinson）を用いてＦＡＣＳにより、試料を分析した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性細胞は、分析から除外されている。
ウエスタンブロット分析：
抗体供給元の示唆に従って、標準手法によりウエスタンブロット分析を実施した。ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１及びｐ１６ＩＮＫ４の測定のために、１００μｇの総タンパク質抽出物を１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ブロッティングした。ウエスタンブロットをｐ２１（Transduction Laboratories、１：５００希釈）、ｐ１６（Santa Cruz）に関して示し、そして総ＥＲＫ（Santa Cruz）を用いて均等負荷に関して正規化した。α−チューブリン・アセチル化のために、２５μｇの総タンパク質抽出物を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ブロットした。ウエスタンブロットをアセチル化α−チューブリン（Sigma、１：５００希釈）に関して示し、そして総ＥＲＫ（Santa Cruz）又は総チューブリン（Sigma）を用いて均等負荷に関して正規化した。
ゲノムＤＮＡの単離：
細胞を１５０μｌのＴＥ（トリス  １０ｍＭ−ＥＤＴＡ  １ｍＭ）中に再懸濁した。１．５ｍＬの溶解緩衝液（１０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．０−０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０−０．５％ＳＤＳ−２０μｇ／ｍｌ  ＲＮアーゼ  ＤＮアーゼ無含有）を添加し、３７℃で１時間のインキュベーション時間後、最終濃度１００μｇ／ｍｌでプロテイナーゼＫを用いた５６℃での二次インキュベーションを一晩に亘って実施した。フェノール−クロロホルム抽出により、タンパク質を除去した。次にゲノムＤＮＡを０．２容積の１０Ｍ酢酸アンモニウム及び２容積のエタノールを用いて沈殿させて、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、空気乾燥させ、そして揺れ台上で４℃でヌクレアーゼ無含有水中に再懸濁した。濃度を２６０ｎｍで測定した。
ゲノムＤＮＡの消化：
４０μｇのゲノムＤＮＡを、３７℃で一晩、５０ＵのＥｃｏＲＶ及びＰｖｕＩＩ（ＲＡＲβ２プロモーターにおいて切断しない）で消化した。タンパク質をフェノール−クロロホルム抽出により取り出し、そしてＤＮＡを沈殿させて、４０μｌの濾過水を用いて再懸濁した。
ゲノムＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化
２０μｇの消化ＤＮＡを、３７℃で２時間の間、最終濃度３．２ｍＭのＳＡＭの存在下で、８ＵのＳｓｓ１メチラーゼ（New England Biolabs）でメチル化した。フェノール−クロロホルム抽出後、ＤＮＡを沈殿させ、そして２０μｌの濾過水を用いて再懸濁した。
ＲＡＲβメチル化に関するビスルファイト処理及びＰＣＲ：
２０μｇのゲノムＤＮＡ（又はｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化ＤＮＡ）を５．５μｌの３Ｍ  ＮａＯＨと混合し、濾過水を用いて容積を５５．５μｌに調整した。４２℃で１５分間のインキュベーション後、０．０５Ｍヒドロキノンを含有する３Ｍ重亜硫酸ナトリウム  ５００μｌを添加した。混合物を、５４℃で１６時間インキュベートした。修飾ＤＮＡをＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ抽出物精製キットで精製し、５０μｌの濾過水中に溶離した。溶離液を、室温で１５分間、３ＭのＮａＯＨ  ５．５μｌを用いて脱スルホン化した。１６．８μｌの１０Ｍ酢酸アンモニウム、１μｌのグリコブルー及び２００μｌのエタノールを、ＤＮＡ沈殿のために添加した。ＤＮＡを遠心分離後に回収し、洗浄し、空気乾燥させ、５０μｌの濾過水を用いて再懸濁した。ＰＣＲを、以下のように実施した：９４℃での変性のために５分；３５サイクル；９４℃での変性、１分、メチル化プライマーに関して５７．５℃及び非メチル化プライマーに関して５２℃でのアニーリング１分間、７２℃での伸長１分間、７２℃でのさらなる伸長５分間。ＰＣＲ生成物（１０μｌ＋５μｌの負荷染料）を、１．５％アガロースゲル上で分析した。ＲＡＲβ２メチル化プライマーＳ：５’ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＡＣＧ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＡＴＴ  ＣＧ；ＡＳ：５’ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＣＧＡ  ＡＡＣ  ＧＡ；ＲＡＲβ２非メチル化プライマーＳ：５’ＴＴＧ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  ＴＧＡ  ＧＴＧ  ＡＴＴ  ＴＧ；ＡＳ：５’ＡＡＣ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＣＡＡ  ＡＡＣ  ＡＡ。
ｐ１６メチル化に関するビスルファイト処理及びＰＣＲ：
ＤＮＡ抽出を、下記のように実施した。ｐ１６メチル化の確定のためのビスルファイト処理及びＰＣＲを、供給元（Chemicon）から説明されたように実施した。
ＭＴＴ細胞傷害性アッセイ：
ＨＣＴ−１１６、Ａ−３７５及びＤＵ−１４５細胞を、８０００細胞／ウエルで９６ウエル透明細胞培養等級プレート（Corning）で平板培養した。細胞が底に付着するよう、プレートを湿潤ＣＯ２（５％）インキュベーター中に一晩保持した。翌朝、化合物（ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５及びＵＶＩ５００８）を、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１０００ｎＭ、３０００ｎＭ及び１００００ｎＭの濃度で添加し、そしてプレートを４８時間、再び５％ＣＯ２インキュベーター中に保持した。完全４８時間処理後、化合物を含有する培地を各ウエルから取り出した。０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（Sigma）を培地中に溶解し、各ウエルに添加して、プレートを２時間インキュベートした。成育可能細胞は、ＭＴＴテトラゾリウム環を暗青色ホルマザン反応生成物に開裂するが、一方、死細胞は無色のままである。ＭＴＴ含有培地を静かに取り出し、ＤＭＳＯを各培地中に添加した。振盪後、プレートを５４０ｎｍの吸光度で読み取った。結果は全て、３つのウエルの平均として表わされる。細胞傷害性％を各化合物について測定し、そのＩＣ５０値に換算して表した。
抗ＡＰＯ２．７モノクローナル抗体による蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）分析：
アポトーシスを受けている細胞中の３８ｋＤａミトコンドリア膜タンパク質と優先的に反応するＡＰＯ２．７（７Ａ６）発現により、ＴＣアポトーシスの誘導を分析し、そして細胞成育可能性及びアポトーシス性応答を追跡することにより、確立した（Koester, S.K. et al., Cytometry 29, 306-12, 1997；Zhang, C., Ao, Z., Seth, A. & Schlossman, S.F., J Immunol 157, 3980-7, 1996）。Ａ３７５、ＤＵ１４５、ＨＣＴ１１６及びＭａＴｕ細胞株を、ＳＡＨＡ（１μＭ、３μＭ、１０μＭ）、ＭＳ２７５（１μＭ、３μＭ、１０μＭ）又はＵＶＩ５００８（１μＭ、３μＭ、１０μＭ）とともに４８時間インキュベートした。トリプシン処理後、処理をした又は処理をしない細胞をＰＢＳ中で１回洗浄した。次に、２．５％ＦＣＳ及び１００μｇ／ｍｌジギトニンを含有するＰＢＳとともに細胞を４℃でインキュベートした。洗浄後、マウス抗ヒトＡＰＯ２．７フィコエリトリン複合体化ｍＡｂ（Beckman Coulter）とともに、細胞をインキュベートした。細胞を洗浄し、ＰＢＳ／２．５％ＦＣＳ中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳｏｒｔ（Becton Dickinson）により分析した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson Immunocytometry Systems）を用いて、ＡＰＯ２．７発現に関して標識細胞を分析した。
ＵＶＩ５００８のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性：
免疫不全マウスにＨＣＴ−１１６結腸癌細胞を異種移植することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでのこの化合物の抗腫瘍活性を検査した。
材料及び方法：
ＳＡＨＡ（汎ＨＤＡＣ阻害剤）はMerckから贈与されたものであり、ＭＳ−２７５（クラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤）はScheringから贈与されたものであり、そしてＵＶＩ５００８は上記に開示されたように合成した。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験におけるマウスは全て、無胸腺雌ヌードＣｒｌ：Ｎｕ（Ｉｃｏ）−Ｆｏｘｎｌｎｕマウス（ｓｗｉｓｓ）（Charles Riverから購入）であった。
用量の調製：
化合物全てを、８％ＤＭＳＯ＋２．５％トゥイーン８０＋８９．５％油中に溶解した。これら３つの用量と一緒に、ビヒクル対照も取り上げた。
実験計画：
４×１０６個のＨＣＴ−１１６結腸癌細胞を、各動物の左脇腹に皮下注射した。腫瘍が４ｍｍのサイズに増殖したら、各群が処理前にほぼ同サイズの腫瘍を有する動物を含有するよう、動物をそれぞれ４つの群に無作為化した。薬剤を、腹腔内経路により投与した。３０ｍｇ／マウス１ｋｇの用量でのＳＡＨＡはマウスにとって耐容可能でなく、６０％の死亡率が観察される、ということを早期試験は明示した。したがって用量を２０ｍｇ／ｋｇに低減することにより、比較試験を実行した。３０ｍｇ／ｋｇでのＵＶＩ５００８は良好に耐容され、早期試験において死亡は観察されなかった；したがって用量を４０ｍｇ／ｋｇに増大した。そしてＭＳ−２７５はＳＡＨＡと同様の２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。２日毎に処置を施した。各群の動物は１０匹であった。Ｖｅｒｎｉｅｒ  Ｃａｌｌｉｐｅｒ測定を用いて、腫瘍サイズを測定した。式：ＴＶ＝（ａ２×ｂ）／２（式中、ａは腫瘍の幅を表し、ｂは腫瘍の長さを表す）を用いることにより、腫瘍容積を決定した。
ヒトＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２に及ぼすＵＶＩ５００８の活性：
ヒト組換えＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２を用いて、ＳＩＲＴ活性アッセイを実施した。それぞれＳＩＲＴ１（１  Ｕ／ウエル）又はＳＩＲＴ２（５  Ｕ／ウエル）を、ＮＡＤ＋及び種々の濃度の試験化合物（サーチュイン活性化剤又は阻害剤）の存在下で、ＳＩＲＴ１／２基質（ｐ５３アセチル化ペプチドに対応する）とともにインキュベート（３７℃で１時間）した。活性を、蛍光強度として測定した。内部対照として、スラミンナトリウム（サーチュイン阻害剤）及びレスベラトロール（ＳＩＲＴ１活性化剤）が含まれた。３６０ｎｍに設定された励起及び４６０ｎｍに設定された発光検出での蛍光読取機（Inphinite 200 TECAN）で、蛍光を測定した。
ｐ５３アセチル化に及ぼすＵＶＩ５００８の活性：
ＭＣＦ７細胞（ヒト乳癌細胞）を標準手法に従って増殖させ、そして２５μＭのエトポシドの存在下で指示化合物で６時間処理した。総タンパク質抽出物をＳＤＳゲル上にかけ、ブロッティングした。標準手法に従って、抗ｐ５３  ａｃ３８２（Abcam）を用いることにより、ウエスタンブロットを実行した。ＥＲＫ（Santa Cruz）を均等負荷対照のために用いた。
ＵＶＩ５００８による細胞の処理時のヒストンタンパク質に関する翻訳後修飾の試験：
リシン及びアルギニン（「軽」）又は同位体バージョンＡｒｇ１０及びＬｙｓ８（「重」）の存在下で、ＲＰＭＩ培地中で、Ｕ９３７細胞を増殖させた。軽培地中で増殖させた細胞を、５μＭの最終濃度で、ＵＶＩ５００８又はＳＡＨＡで２４時間処理した。対照として、重培地中で増殖させた細胞をＤＭＳＯで２４時間処理した。軽細胞及び重細胞は７．５×１０６細胞収穫物であり、１：１比（総数１５×１０６細胞）で混合した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞ペレットを−８０℃で保存した。
ヒストン抽出
細胞を、７５０μｌのトリトン抽出緩衝液（ＴＥＢ：０．５％トリトンＸ１００（ｖ／ｖ）、２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）及び０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）中に再懸濁し、静かに撹拌しながら１０分間、氷上で溶解させた。溶解物を６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを３７５μｌのＴＥＢで洗浄し、前と同じように遠心分離によりペレット化した。ペレットを２０μｌの２５０ｍＭ  ＨＣｌ中に再懸濁し、ヒストンの酸抽出を４℃でｏ／ｎで実施した。
質量分光分析
抽出ヒストンを遠心分離により清澄化して、１５％アクリルアミドゲル上で分離し、ゲルをクーマシーで染色した。ヒストンを含有するゲル領域を薄片にして、ゲル中で還元し、アルキル化した。タンパク質を、トリプシン（Promega）でｏ／ｎで消化した。トリフルオロ酢酸を用いて、ゲルからペプチドを溶離した。７−Ｔｅｓｌａ直鎖四重極イオントラップ型フーリエ変換（ＦＴ）質量分光計（Thermo Electron, Bremen, Germany）とオンライン接続されたナノ高圧液体クロマトグラフィーＡｌｉｇｅｎｔ  １１００ナノフロー・システムを用いて、全体で２０μｌからの８μｌをシーケンシングした。３０分勾配を適用し、それにより緩衝液Ｂが３０μｌ／分の流量で３％から４０％に増大することにより、Ｃ１８カラムからペプチドを溶離した。Mascotアルゴリズムを用いて、ペプチド／タンパク質を同定した。
Mascot検索判定基準：
ＭＳ／ＭＳイオン検索
酵素：                トリプシン
固定修飾：            カルバミドメチル（Ｃ）
可変修飾：            アセチル（Ｋ）、Ａｒｇ重６Ｃ１３  ４Ｎ１５４  （Ｒ）、ジメチル化（Ｋ）、ジメチル化（Ｒ）、ＧｌｙＧｌｙ（ユビキチン化）（Ｋ）、Ｌｙｓ＋８  ６Ｃ１３  ２Ｎ１５（Ｋ）、メチル（Ｋ）、メチル（Ｒ）、酸化（Ｍ）
質量値：              モノアイソトピック
タンパク質質量：      非制限的
ペプチド質量許容誤差：±１０ｐｐｍ
断片質量許容誤差：    ±０．８Ｄａ
最大切れ残り（Max Missed Cleavages）：        ３
計器型：              ＥＳＩ−ＴＲＡＰ
Ｕ９３７細胞をＵＶＩ５００９８で２４時間処理し、ヒストンを酸抽出した。タンパク質をトリプシンで消化し、そしてＦＴ−ＩＣＲ質量分光計とともに、ナノＬＣ（オンライン）を用いてペプチドを分析した。その親イオン質量に基づいて、並びにMascotを用いた断片化パターンに基づいて、ペプチドを同定した。ｂ−又はｙ−イオンの質量を、表に列挙する（図１０ｂ）。太字で示された質量は、ＹＱＫＳＴＥＬＬＩＰペプチドの予測断片に高質量精度で適合する。
ウエスタンブロット分析：
アセチル化されたＫ５６を特異的に認識する抗体を用いて、分析を実施した。Ａ）溶媒ＤＭＳＯ（レーン１及び２）で、又はＵＶＩ５００８（レーン３及び４）で２４時間処理されたＵ９３７細胞（図１２Ａのレーン１及び３）及びＵ２０Ｓ細胞（図１２Ａのレーン２及び４）から抽出された等量のヒストンを、ＳＤＳゲル上に載せた。矢じりは、ヒストンＨ３の位置を示す。  Ｂ）５分間、３０分間、又は１時間、２時間、３時間若しくは４時間の溶媒（図１２Ｂ上の−）による又はＵＶＩ５００８（図１２Ｂ上の＋）によるＵ９３７の処理。同一ブロットを、ヒストンＨ３コア抗体を用いて展開し、ストリップ化し、Ｈ３Ｋ５６アセチル化特異的抗体で再プローブした。
Ｂ−結果：
ＭＴＴ細胞傷害性アッセイ：
細胞傷害性％は、下記の表３ではＩＣ５０値に換算して表される。
【００８１】
【表３】
2010520192.tif 000020
【００８２】
細胞周期停止及びアポトーシスの誘導：
サマプリンＡ（ＵＶＩ５０００）及びその誘導体（ＵＶＩ５００４、ＵＶＩ５００８、ＵＶＩ５０１０）（図７）は、Ｕ９３７急性骨髄性白血病細胞株（図１）における増殖（図１ａ）及び／又はアポトーシス（図１ｂ）の阻害を誘導した。これらの化合物は、Ｇ１における遮断（ＵＶＩ５０１０、１μＭで）からＳ及びＧ２期における停止（ＵＶＩ５０００、ＵＶＩ５００４、ＵＶＩ５００８）までの範囲である細胞周期停止を誘導した。注目すべきことに、１μＭでＧ１において遮断し、そして５μＭでＧ２−Ｍにおいて細胞を停止するＵＶＩ５０１０のようないくつかの化合物に関する細胞周期内の遮断の位置に特徴的用量依存性スイッチが存在する（図１ａ）。ＵＶＩ５００８は、それが１μＭですでにＧ２−Ｍにおける細胞を停止するという点で際立っている。これらのデータは、これらのＵＶＩ化合物が別個の効能を有する細胞周期のいくつかのチェックポイントに影響を及ぼす、ということを示唆する。細胞周期作用と一致して、Ｇ１を必要とされ、Ｇ２停止を持続することが知られている細胞周期阻害剤ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の発現（Bunz, F. et al., Science 282, 1497-501 (1998)）は、ＵＶＩ５０００、ＵＶＩ５００８及びＵＶＩ５０１０に関して示されるように、劇的に増大される（図１ｃ）。
【００８３】
細胞周期進行に影響を及ぼすほかに、ＵＶＩ化合物は、非常に異なる程度とはいえ、アポトーシスを誘導する。興味深いことに、Ｇ２−Ｍ停止に及ぼす最も顕著な作用を有する化合物は、最も強力なアポトーシス誘導作用も発揮する（図１ｂにおけるＵＶＩ５０００、ＵＶＩ５００８、ＵＶＩ５０１０）。
【００８４】
サマプリンＡ及びその２つの誘導体５００８及び５０１０の抗増殖及びアポトーシス誘導作用を、固形癌細胞株、例えば乳癌細胞（ＺＲ７５．１）及び前立腺癌細胞（ＬｎＣａｐ；データは示されていない；図６も参照）でも確認した。
ＵＶＩ５００８は強力なＨＤＡＣ阻害剤である：
サマプリンＡ（ＵＶＩ５０００）は、弱いヒストンデアセチラーゼ阻害剤として知られており、そしてＵＶＩ５０００へのＵ９３７細胞の曝露は、ヒストンＨ３アセチル化の中等度の時間依存性増大をもたらした（図１ｄ、レーン２、３）。この活性は、ＵＶＩ５００８で劇的に増強される（図１ｄ、レーン４、５）が、一方、ＵＶＩ５０１０は全体的Ｈ３アセチル化に有意の影響を及ぼさない（図１ｄ、レーン６、７）。Ｈ３Ｋ９、Ｈ３Ｋ１４及びＨ３Ｋ１８アセチル化はＵＶＩ５００８（図１ｅ、レーン４、５）の存在下で、そしてより少ない程度に親化合物ＵＶＩ５０００（図１ｅ、レーン２、３）により、全て増大されるので、特定のヒストンアセチル化は、全体的Ｈ３アセチル化と同様に影響を及ぼされる。興味深いことに、ＵＶＩ５０１０が全体的ヒストンＨ３アセチル化に測定可能的に影響を及ぼさない場合でさえ、この化合物はＨ３Ｋ１８アセチル化を、そしてより少ない程度にＨ３Ｋ１４アセチル化を増強する（図１ｅ、レーン６、７）ので、それはＨＤＡＣ阻害剤として作用する。
【００８５】
Ｈ３Ｋ９のメチル化は、一般的にプロモーターでの「転写活性化的」修飾と考えられるアセチル化と反比例して相関し、一方、メチル化は「サイレンシング」修飾である。これと一致して、Ｈ３Ｋ９のメチル化は、ＵＶＩ５００８への曝露により低減された（図１ｄ、中パネル；レーン１とレーン４及び５を比較）。
【００８６】
ＵＶＩ５００８及びその親化合物ＵＶＩ５０００は、同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＨＤＡＣ阻害剤活性を示した。実際、ＵＶＩ５０００はＨＤＡＣ１の弱い阻害剤に過ぎないが、しかしＵＶＩ５００８は、ほぼ定量的に、そして最も注目すべきことに、第ＩＩ相臨床試験に今は入りつつある確立されたクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤ＭＳ２７５（図１ｆ）より効率的に、ＨＤＡＣ１活性を遮断する。さらにまた、クラスＩＩ  ＨＤＡＣの一成員であるＨＤＡＣ４のデアセチラーゼ活性はＵＶＩ５００８によりほぼ完全に遮断されるが、一方、ＵＶＩ５０００は中等度の活性を示すに過ぎない（図１ｇ）。この観察と一致して、ＵＶＩ５００８（並びにＵＶＩ５０００及びＵＶＩ５０１０）は、その基質がαチューブリンである別のクラスＩＩ  ＨＤＡＣであるＨＤＡＣ６の活性を阻害した（図１ｃ、中パネル、レーン１をレーン２〜７と比較；比較のために下のパネルにおける総αチューブリンの量に注目）。総合して、これらのデータは、ＵＶＩ５００８が、クラスＩ及びクラスＩＩの両方のＨＤＡＣ活性を遮断する汎ＨＤＡＣ阻害剤として作用する、ということを明示する。ＵＶＩ５００８は、このアッセイでは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫の治療に関して認可されており、そして他の適応症に関して臨床試験中であるＳＡＨＡ（ボリノスタット、ゾリンザ（登録商標））より活性である、ということは重要である。
ＵＶＩ５００８は腫瘍抑制遺伝子ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲＡＲβ２のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化を阻害する：
ＵＶＩ５００８が付加的活性を有するか否かを試験するために、腫瘍抑制遺伝子のプロモーターのＤＮＡメチル化の考え得る阻害を試験した。ＲＡＲβ２のプロモーターは、そのプロモーター中のＣｐＧ島のメチル化によりサイレンス化されることが知られている。メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）を用いて、非メチル化ＲＡＲβ２の有意の増大がＵＶＩ５００８で観察された（図２ａ）。同様に、ＭＳＰは、もう一つの十分に確立された腫瘍抑制遺伝子及び細胞周期調節因子であるｐ１６ＩＮＫ４ａプロモーターでのＣｐＧ島メチル化の低減を明示した。付随的に、非メチル化ｐ１６ＩＮＫ４ａプロモーターＤＮＡの量は、ＵＶＩ５００８で処理することにより増大した（図２ｂ）。この場合、ＵＶＩ５０００も同様の活性を示した。注目すべきことに、古典的ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤５−アザシチジン（「ＡＺＡ」）は、ＵＶＩ５００８を用いて観察されたものと非常によく似た活性を示したが、一方、ＳＡＨＡは不活性であった（図２ｂ）。ｐ１６ＩＮＫ４ａプロモーターの脱メチル化と一致して、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子発現は、ＵＶＩ５００８への曝露により、さらにまたより低度にＵＶＩ５０００及びＵＶＩ５０１０により脱サイレンスされ、そしてこの発現は５−デアザシチジンとＳＡＨＡとの組合せを用いて観察されたものに匹敵した（図２ｃ）。
【００８７】
最後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）アッセイを用いて、ＵＶＩ５００８が、より高濃度であってもＲＧ１０８とほぼ同様に活性であるＤＮＭＴ阻害剤である、ということを確認した（図２ｄ）。
ＵＶＩ５００８は腫瘍選択的アポトーシス誘導デスリガンドをコードするＴＲＡＩＬ遺伝子座でのクロマチンのアセチル化状態を変える：
ＭＳ２７５のようなＨＤＡＣ阻害剤は、造血細胞株及び患者芽細胞におけるＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２Ｌ又はＴＮＦＳＦ１０とも呼ばれる）の発現を誘導する、ということを、本発明者らの従来の研究は明示している（Insinga, A. et al., Nat Med 11, 71-6 (2005)；Nebbioso, A. et al., Nat Med 11, 77-84 (2005)）。注目すべきことに、Ｕ９３７骨髄性細胞のＵＶＩ５００８曝露は、ＴＲＡＩＬプロモーターでのクロマチンの迅速な劇的Ｈ３Ｋ９アセチル化をもたらし、第一イントロンでの動態遅延も伴う（図５ａ）。この「活性化しつつある」クロマチン・マークは、それぞれＲＴ−ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡアッセイにより示されるように、ｍＲＮＡ（図５ｂ）及びタンパク質（図５ｂ）の両方のレベルでの発現増大と相関する。
ＨＤＡＣ活性の構造−活性相関（ＳＡＲ）研究：
ＵＶＩ５００８の上記ＨＤＡＣ阻害剤活性のＳＡＲ研究を開始するために、一連の誘導体を合成した（表１）。系統的に研究された活性読出しは、細胞周期停止及びｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１誘導、分化の誘導、並びに標的（この場合はａ−チューブリン）のアセチル化であった。目的は、特定の構造素子及び特定置換の役割、特に（ｉ）対称分子の一方又は両方の単位が生物学的活性に必要であるか否か、（ｉｉ）ジスルフィド架橋が必須でないか否か、そして（ｉｉｉ）最後に、非切断可能化合物が何らかの作用を示すか否かを理解することであった。
臭素置換の位置：ＵＶＩ５００８は、インドール環のＣ５に結合されたＢｒを有する。Ｃ５からＣ６への置換の変更（ＵＶＩ５０１３）は、細胞周期停止及びアポトーシスには小作用しか及ぼさず（図３ａ）、むしろＣＤ１１ｃマーカーの発現により測定される分化の誘導を増大した（図３ｂ）。予測どおり、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１はＵＶＩ５００８に関する場合と同様に誘導され、一方、αチューブリンのアセチル化により測定されるようなＨＤＡＣ６の阻害は多少低減された（図３ｃ、レーン９）。Ｃ７でのＢｒの置換（ＵＶＩ５０１４）は、細胞周期停止及びアポトーシスを弱く低減したが、しかしｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１誘導及びαチューブリン・アセチル化のレベルは、ＵＶＩ５００８を用いて観察されたものと非常によく似ていた（図３ａ、図３ｂ；図３ｃ  レーン１２）。Ｃ４での臭素原子の配置は、活性をかなり低減した（ＵＶＩ５０１２）。
オキシム：トリフェニルメチル（トリチル）（ＵＶＩ５０１８）及びベンジル（ＵＶＩ５０１７）誘導体は図３ａ、図３ｂ及び図３ｃ（レーン１３、１４）に示されたアッセイ全てにおいて不活性であるので、オキシム機能は活性に必要とされる。
ジスルフィド架橋：炭素によるイオウの置換（ＵＶＩ５０１９）は不活性分子を生じるので、ジスルフィド架橋の存在は活性に不可欠である（図３ａ、図３ｂ；図３ｃ  レーン１５）。ＵＶＩ５０２２（Ｓ→Ｃ置換生成物）は図３ａ、図３ｂ及び図３ｃ（レーン１８）に示されたアッセイ全てにおいて不活性であるので、同じことはＵＶＩ５０００の対応する類似体（サマプリンＡ）に関して言える。したがって、１又は２個のイオウ原子の存在、及び／又はジスルフィド架橋、及び／又は活性ＵＶＩ５０００及びＵＶＩ５００８の切断は、細胞周期停止、アポトーシス誘導及び分化に必要とされる。
単量体同族化合物：ＵＶＩ５００８及び全ての活性誘導体は二量体切断可能分子であり、これは還元時に対応するチオールを生じる。ヒドロキシル誘導体ＵＶＩ５０２１は不活性であるので、このチオールは活性のために必要である（図３ａ、図３ｂ及び図３ｃ  レーン１７）。同一の観察は、ＵＶＩ５０２３（ＵＶＩ５０００のヒドロキシル誘導体）に関して成される（（図３ａ、図３ｂ及び図３ｃ  レーン１９））。しかしながら、興味深いことに、メチルチオエステルＵＶＩ５０２０はアポトーシス及びＧ２Ｍ停止を誘導するに際して不活性であるが、しかしそれはＧ１停止並びにｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の対応する発現増強を誘導する（図３ａ、図３ｂ及び図３ｃ  レーン１６）。
サマプリンＡ誘導体はＡＭＬ患者芽細胞におけるアポトーシスを誘導する：
いくつかのサマプリンＡ誘導体の興味をそそる抗癌能力は、ｅｘ  ｖｉｖｏＡＭＬ患者芽細胞におけるそれらの活性を試験するよう促した。図４に示したように、サマプリンＡ（ＵＶＩ５０００）及びＵＶＩ５００８はともに、異なる患者（ＡＭＬ患者＃１０２、＃１０８、＃１０９、＃１１６）の４つの個々のｅｘ  ｖｉｖｏ培養におけるカスパーゼ３活性化アッセイにより測定されるように、芽細胞における細胞周期停止及びアポトーシスを誘導した。よく知られたＨＤＡＣｉ、例えばＭＳ２７５及びＳＡＨＡはＵＶＩ５００８と類似の活性を示す、ということに留意しなければならない。派生的に製造される誘導体のｅｘ  ｖｉｖｏでのＡＭＬ患者芽細胞に及ぼす作用を立証するために、５μＭの濃度での化合物ＵＶＩ５００８、ＵＶＩ５０１３、ＵＶＩ５０１４及びＵＶＩ５０２０の活性を試験した。図４に示したように、試験した誘導体は全て、患者芽細胞の２つの異なる試料においてアポトーシス活性を示した。ＵＶＩ５０２０は、上記の変更活性プロファイルと一致して、アポトーシスの弱い誘導を示しただけである、ということに留意されたい。
癌細胞株Ａ−３７５、ＤＵ１４５及びＨＣＴ−１１６に及ぼす抗増殖活性：
ＵＶＩ５００８を用いた用量応答曲線は、１．５μＭ〜３μＭの範囲のＩＣ５０値で異なる型の癌細胞株に及ぼす強力な抗増殖活性を示した（図８ａ〜図８ｃ）。
ＵＶＩ５００８のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性：
結果を、図９Ａ及び９Ｂに示す。化合物はすべて、それらの最大耐容用量で用いた。処理群の何れにおいても、死亡は認められなかった。他の動物に比して体重が増大したことによる腹腔内液の貯留の形態で、１０個体の動物のうちの３個体におけるＵＶＩ５００８処置群において毒性の何らかの徴候が認められた。他の毒性症候は観察されなかった。この実験から、ＵＶＩ５００８は、それらのＭＴＤでのＳＡＨＡ及びＭＳ−２７５に関してより大きい抗腫瘍活性を示しており、そして動物体重損失を引き起こした化合物はなかった、と結論する。正規化腫瘍重量プロファイルを、表４に示す：
【００８８】
【表４】
2010520192.tif 000021
【００８９】
【表５】
2010520192.tif 000022
【００９０】
ＵＶＩ５００８による細胞の処理時のヒストンタンパク質に関する翻訳後修飾の試験：
広範な質量分光分析を実施して、ＵＶＩ５００８による細胞の処理時に誘導されるか又は除去されるヒストンタンパク質の翻訳後修飾を同定した。高精度のＦＴ−ＩＣＲ質量分光計は、アセチル化ペプチドの明白な同定を含めてヒストンの種々の翻訳後修飾を確定するのを可能にした。ＵＶＩ５００８によるＵ９３７（及びその他の）細胞の処理は、相対的に多くのアセチル化ペプチドのシフト（ＳＩＬＡＣ試験）を、並びにヒストンＨ３、Ｈ３Ｋ５６における新規のアセチル化リシン残基の同定（図１０ａ）を生じた。今まで、Ｈ３Ｋ５６のアセチル化は、本発明者ら及び他の人達により下等真核生物で検出され［Ozdemir A, Spicuglia S, Lasonder E, Vermeulen M, Campsteijn C, Stunnenberg HG, Logie C., Characterization of lysine 56 of histone H3 as an acetylation site in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 2005 Jul 15; 280(28): 25949-52. Epub 2005 May 10］、そして［Ozdemir A, Masumoto H, Fitzjohn P, Verreault A, Logie C. Histone H3 lysine 56 acetylation: a new twist in the chromosome cycle Cell Cycle. 2006 Nov; 5(22): 2602-8. Epub 2006 Nov 15］で再検討されただけであった。酵母における試験は、この修飾が、酵母においてＳ期中にクロマチンに沈着される事実上全ての新規合成ヒストンにおいて生じる、ということを明示した。Ｋ５６アセチル化の除去は細胞周期のＧ２／Ｍ期に起こり、そしてＮＡＤ＋依存性ヒストンデアセチラーゼＳｉｒ２に関連する２つのタンパク質Ｈｓｔ３及びＨｓｔ４に依存する。酵母データに基づいて、ヒトＳｉｒ１及び／又は−２がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＵＶＩ５００８により阻害され得るか否か、そして既知のＳｉｒ２基質、即ちｐ５３のアセチル化がｉｎ  ｖｉｖｏでのＵＶＩ５００８処理後に増大されるか否かを試験した。
ヒトＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２に関するＵＶＩ５００８の活性：
結果を図１３Ａに示す。ＵＶＩ５００８の活性を、ヒトＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２に関して２つの異なる濃度で試験した。対照として、既知の活性剤及び阻害剤、例えばレスベラトロール及びスラミン（Ａ）を用いた。明らかに示されているように、ＵＶＩ５００８は、両方に対する阻害能力を示した。ＳＩＲＴ１に関しては８．９μＭ、そしてＳＩＲＴ２に関しては７．８μＭとして、ＵＶＩ５００８のＩＣ５０を算出した。ＵＶＩ５００８は良好なＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２阻害剤である、ということをこれらのデータは明らかに実証する。それにより抗癌活性のいくつかは、癌細胞において他のＳＩＲＴ阻害剤に関して報告されたようなこの作用のためでもあり得る。
ｐ５３アセチル化に関するＵＶＩ５００８の活性：
図１３Ｂは、ＳＩＲＴ阻害の読出しとして得られるｐ５３アセチル化レベルに及ぼすＵＶＩ５００８の作用を示す。ＤＮＡ変異を誘導し、ｐ５３を活性化するためのエトポシド２５μＭでの同時処理におけるｐ５３  ＷＴであるＭＣＦ７細胞で、この実験を実施した。ｐ５３に関するＵＶＩ５００８の高アセチル化作用を、本発明者らは確認し得た。
【図１】
2010520192.tif 000029
【図２】
2010520192.tif 000030
【図３】
2010520192.tif 000031
【図４】
2010520192.tif 000032
【図５】
2010520192.tif 000033
【図６】
2010520192.tif 000034
【図７】
2010520192.tif 000035
【図８ａ】
2010520192.tif 000036
【図８ｂ】
2010520192.tif 000037
【図８ｃ】
2010520192.tif 000038
【図９Ａ】
2010520192.tif 000039
【図９Ｂ】
2010520192.tif 000040
【図１０Ａ】
2010520192.tif 000041
【図１０Ｂ】
2010520192.tif 000042
【図１１】
2010520192.tif 000043
【図１２】
2010520192.tif 000044
【図１３】
2010520192.tif 000045
【国際調査報告】
2010520192.tif 000046
2010520192.tif 000047