(57)【要約】  ＮＡＤ依存性リガーゼが、試料中の微生物の指標として同定される。試料中のＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物の存在を検出する方法は、（ａ）試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させるステップと、（ｂ）こうして接触させた試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下でインキュベートするステップと、（ｃ）基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼの作用の結果生じる、ライゲーションされた核酸分子の存在を特異的に決定して、ＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物の存在を示すステップとを含む。本方法は多くのアプリケーションを有しており、本方法を実施するためのキットもまた提供される。実質的にヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ汚染物質のないリゾスタフィン調製物が、ヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ活性は低減されるがリゾスタフィンのエンドペプチダーゼ活性は実質的に影響を受けない条件下で、ヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ汚染物質を含むリゾスタフィン調製物を加熱することによって産生される。【選択図】なし
2010532986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物の存在を検出する方法であって、
（ａ）試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させるステップと、
（ｂ）こうして接触させた試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下でインキュベートするステップと、
（ｃ）基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼの作用の結果生じる、ライゲーションされた核酸分子の存在を特異的に決定して、ＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物の存在を示すステップと、
を含む方法。
【請求項２】
試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子が、試料中の、存在する場合は、ＮＡＤ依存性リガーゼよりも過剰なモル濃度で用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子が、ＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物のゲノム核酸とヌクレオチド配列の同一性を欠くことによって、ライゲーションされた核酸分子の検出の特異性が確実なものとなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物が細菌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
細菌が真正細菌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件が、さらなるＮＡＤを試料に供給することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＮＡＤ依存性リガーゼ活性が内因性ＮＡＤ＋により支持される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
試料中のＡＴＰ依存性リガーゼ活性が阻害される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＡＴＰ依存性リガーゼ活性が、試料からＡＴＰを枯渇させることにより阻害される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＡＤ依存性リガーゼを放出させるための、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物の選択的溶解をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
試料からのＮＡＤ依存性リガーゼの捕捉をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＮＡＤ依存性リガーゼが、固定された核酸分子を用いて試料から捕捉される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
固定された核酸分子が、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子が、ニックを有する二本鎖核酸分子を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子が、共にライゲーションされ得る２つの核酸分子を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
予備ステップとして、ＮＡＤ依存性リガーゼを発現する特定の目的の微生物のみが存在する試験試料を得るための、開始試料からのＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物の特異的捕捉を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＮＡＤ依存性リガーゼを発現する選択された目的の微生物からのＮＡＤ依存性リガーゼの特異的捕捉を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
血小板試料の汚染を検出するために用いられる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ライゲーションされた核酸分子の存在が、核酸増幅技術を用いて決定される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
試料中のＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物の存在の指標としての、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性の使用。
【請求項２１】
ＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物が細菌である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
細菌細胞又は他のＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物の、前記細胞、細菌、又は他の微生物に対する作用物質に対する耐性をスクリーニングする方法であって、試料中において、
（ａ）細菌細胞又は微生物を作用物質にさらすステップと、
（ｂ）試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させるステップと、
（ｃ）こうして接触させた試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下でインキュベートするステップと、
（ｄ）基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼの作用の結果生じる、ライゲーションされた核酸分子が存在するかを特異的に検出するステップであって、耐性がある場合には、ライゲーションされた核酸分子が検出されるか、又は高レベルで検出されるステップと
を含む方法。
【請求項２３】
１つ又は複数の細菌細胞又は他のＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物を死滅させるか又はその増殖を抑えることが可能な作用物質をスクリーニングする方法であって、試料中において、
（ａ）細菌細胞又は微生物を作用物質にさらすステップと、
（ｂ）試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させるステップと、
（ｃ）こうして接触させた試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下でインキュベートするステップと、
（ｄ）基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼの作用の結果生じる、ライゲーションされた核酸分子が存在するかを特異的に検出するステップであって、作用物質が細菌又は微生物を死滅させるか又はその増殖を抑えることが可能な場合には、新たな核酸分子が検出されないか、又は低レベルで検出されるステップと
を含む方法。
【請求項２４】
対象における細菌細胞若しくは他のＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物の存在に関連する感染、又は疾患を診断する方法であって、対象から得られた試料中において、
（ａ）試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させるステップと、
（ｂ）こうして接触させた試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下でインキュベートするステップと、
（ｃ）基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼの作用の結果生じる、ライゲーションされた核酸分子の存在を特異的に決定して、感染又は疾患の指標として細菌又は他の微生物の存在を示すステップと
を含む方法。
【請求項２５】
血小板含有試料中における細菌汚染の存在を検出する方法であって、
（ａ）血小板試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させるステップと、
（ｂ）こうして接触させた試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下でインキュベートするステップと、
（ｃ）基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼの作用の結果生じる、ライゲーションされた核酸分子の存在を特異的に決定して、血小板含有試料中における細菌汚染の存在を示すステップと
を含む方法。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法を包含する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
試料中の、特異的な抗細菌剤に対して耐性である目的の細菌の存在を決定するための方法であって、
（ａ）特異的な捕捉試薬を用いて目的の細菌を捕捉するステップと、
（ｂ）こうして捕捉された目的の細菌を、特異的な抗細菌剤を含むインキュベーション培地中でインキュベートするステップと、
（ｃ）インキュベートされた目的の細菌を、細菌の溶解を引き起こすことが可能か、又は目的の細菌に由来する細胞内物質の存在が決定され得る程度に細菌の細胞壁の透過性を増大させることが可能な作用物質にさらすステップと、
（ｄ）目的の細菌に由来する細胞内物質の存在を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２８】
目的の細菌に由来する細胞内物質の存在を決定するステップが、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法を実施するステップを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
試料中の、特異的な抗細菌剤に対して耐性である目的の細菌の存在を決定するための方法であって、
（ａ）目的の細菌を、特異的な抗細菌剤を含むインキュベーション培地中でインキュベートするステップと、
（ｂ）インキュベートされた目的の細菌を、特異的な捕捉試薬を用いて捕捉するステップと、
（ｃ）インキュベートされた目的の細菌を、細菌の溶解を引き起こすことが可能か、又は細菌に由来するＮＡＤ依存性リガーゼの存在が決定され得る程度に細菌の細胞壁の透過性を増大させることが可能な作用物質にさらすステップと、
（ｄ）（ｉ）試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させることと、
（ｉｉ）こうして接触させた試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下でインキュベートすることと、
（ｉｉｉ）基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼの作用の結果生じる、ライゲーションされた核酸分子の存在を特異的に決定して、（ＮＡＤ依存性リガーゼを発現する）目的の細菌の存在を示すことと
により、試料中の目的の（耐性）細菌の存在を決定するステップと
を含む方法。
【請求項３０】
ステップ（ｄ）が、請求項２〜１９のいずれか一項に記載の方法を実施するステップを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下で試料をインキュベートした後に、処理ステップを実施して残余のライゲーションされていない核酸分子を除去する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
（ａ）試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる少なくとも１つの核酸分子であって、固体支持体上に固定されているか、又は前記固体支持体上に基質核酸分子を固定するための手段と共に提供されている、少なくとも１つの核酸分子と、
（ｂ）（基質核酸分子に対する）試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性により産生されるライゲーションされた核酸分子の特異的な検出のためのプライマーと
を含むキット。
【請求項３３】
請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
（ａ）特異的な抗細菌剤に対して耐性である目的の細菌を捕捉するための特異的な捕捉剤と、
（ｂ）目的の細菌が耐性を有する特異的な抗細菌剤を任意選択で含む、目的の細菌のためのインキュベーション培地と、
（ｃ）目的の細菌の細胞溶解を引き起こすことが可能か、又は目的の細菌に由来するＮＡＤ依存性リガーゼの存在が決定され得る程度に細菌の細胞壁の透過性を増大させることが可能な、適切な作用物質と、
（ｄ）試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる少なくとも１つの核酸分子と
を含むキット。
【請求項３４】
実質的にヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ汚染物質のないリゾスタフィン調製物を製造するための方法であって、ヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ活性は低減されるがリゾスタフィンのエンドペプチダーゼ活性は実質的に影響を受けない条件下で、ヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ汚染物質を含むリゾスタフィン調製物を加熱するステップを含む方法。
【請求項３５】
実質的にヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ汚染物質のないリゾスタフィン調製物。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法に従って製造されるリゾスタフィン調製物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、微生物（ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の検出、とりわけ細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）の検出の分野に関する。本発明の方法は、感度が高く、多くのアプリケーションがある。細菌のバイアビリティーの新規な指標に依る方法及びキットが記載される。
【０００２】
［発明の背景］
細胞のバイアビリティーに関連する特定の分子の存在及びレベルの測定は、多くの状況において重要である。例えば、ＡＴＰのレベルの測定は、増殖の分析及び毒物学的な目的のために、哺乳動物細胞において有用である。
【０００３】
培養アプローチは少数の細菌の検出に用いられ得るが、このような技術は、とりわけ、少数の細菌の検出を試みる際、また増殖が遅い微生物を検出する際には、完遂するために数日間を要する。
【０００４】
その代わりに、試験は、試料中における汚染細胞又は汚染生物の存在に関連し得る分子の存在の測定に基づいて行うことができる。最も一般的に検出される分子はアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。ＤＮＡ及びＲＮＡの検出もまた提案されているが、ＤＮＡ及びＲＮＡの存在とバイアビリティーとの間の相関は、死滅後の細胞における核酸の持続性が変化しやすいことから、明確なものではない（Ｋｅｅｒ  ＆  Ｂｉｒｃｈ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５３（２００３年）１７５〜１８３頁）。バイアビリティーの指標としてのアデニル酸キナーゼの検出もまた提案されている（Ｓｑｕｉｒｒｅｌｌ  ＤＪ、Ｍｕｒｐｈｙ  ＭＪ、Ｌｅｓｌｉｅ  ＲＬ、Ｇｒｅｅｎ  ＪＣＤ：Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＡＴＰ  ａｎｄ  ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｇａｒ  ｐｌａｔｅ  ｃｏｕｎｔｓ．Ｉｎ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｔａｎｌｅｙ  ＲＡ、Ｋｒｉｃｋａ  ＬＪ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００２年、並びに国際公開第９６／０２６６５号パンフレット）。
【０００５】
ＡＴＰのレベルを決定するために通常用いられる方法は、生物発光の使用を含む。この方法は、発光ルシフェラーゼがルシフェリンの酸化を触媒する反応の、ＡＴＰ依存性を利用する。この方法は、比較的低濃度のＡＴＰを測定するために用いることができる。生物発光を用いたＡＴＰの検出に有用なキットは、Ｒｏｃｈｅ、Ｎｅｗ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ、Ｃｅｌｓｉｓなどから市販されている。
【０００６】
生物発光の検出に関しては、多くの問題が存在する。例えば、非微生物源に由来するＡＴＰの存在下で、微生物のＡＴＰのみの検出は問題となり得る。この問題は、非細菌ＡＴＰ源から細菌を分離し得るフィルターを用い、それにより、より正確なシグナルを得ることによって、ある程度は解決されている。
【０００７】
さらに、試料中の化学物質及び／又は金属は、生物発光反応に干渉し得る。これは、例えば、洗浄剤を用いて表面を洗浄した後に表面の汚染が測定される場合に、特に関連性がある。化学洗浄剤はルシフェラーゼにより触媒される反応に干渉し、それにより、時として、微生物の又は他の汚染ＡＴＰが存在するが生物発光反応は有効ではないという、偽陰性の結果をもたらす。
【０００８】
リガーゼは、核酸分子のライゲーションを触媒する酵素である。ライゲーション反応には、関与するリガーゼに応じて、補因子としてＡＴＰ又はＮＡＤ＋が必要である。
【０００９】
［発明の概要］
本発明は、（生存能力を有する）微生物又は極小微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）の存在の有用な指標として、リガーゼ、とりわけ、ＮＡＤ依存性リガーゼを同定するものである。
【００１０】
したがって、本発明は、試料中の（生存能力を有する）微生物の存在の指標としての、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性の使用を提供する。ＮＡＤ依存性リガーゼの活性とバイアビリティーとの間の関連は、本発明の中心であり（Ｋｏｒｙｃｋａ−Ｍａｃｈａｌａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２００７年８月、２８８８〜２８９７頁）、それは、その関連により、この酵素の活性を、試料中の、とりわけ細菌由来の、生存能力を有する微生物細胞の指標として用いることが可能となるためである。
【００１１】
同様に、本発明は、試料中の微生物の存在の指標としてＮＡＤ依存性リガーゼを検出する方法であって、
（ａ）試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させるステップと、
（ｂ）こうして接触させた試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下でインキュベートするステップと、
（ｃ）基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼの作用の結果生じる、ライゲーションされた核酸分子の存在（及び／又は量）を特異的に決定して、微生物の存在を示すステップと
を含む方法を提供する。
【００１２】
したがって、本発明の方法は、ＮＡＤ依存性リガーゼが発現する（又はしている）すべての微生物を同定するために有用である。この方法は、したがって、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物を検出する方法として作り出され得る。特定の実施形態において、本発明の方法は、生存能力を有する微生物の検出に適用され、したがって、試料中の生存能力を有する微生物を検出するための方法であると考えることができる。とりわけ、本方法は、ＮＡＤ依存性リガーゼの遺伝子がバイアビリティーに必須である細菌又は微生物を同定するために有用であり得る。しかし、生存能力を有さなくされたばかりの（例えば、本明細書において論じられる抗細菌剤での処理を介して）、細菌などの微生物は、酵素が分解されるまで、検出可能なＮＡＤ依存性リガーゼの活性を保持している可能性がある。したがって、微生物への言及は、必要に応じて、ＮＡＤ依存性リガーゼが分解されている時点まで、直前に生存能力を有していた微生物を含み得る。生存能力を有する微生物と、直前まで生存能力を有していた微生物との間の区別が必要である場合、適切な条件下での、単純な経時変化、又は２つ以上の時点間のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の比較により、ＮＡＤ依存性リガーゼの活性が経時的に増大するか、持続するか、又は低減するかどうかを決定するので十分である。ＮＡＤ依存性リガーゼの活性が、長期間にわたり、又は１つ若しくは複数のその後の時点で、持続又は増大する場合（最初の測定と比較して）、このことは、微生物が生存能力を有することを示し得る。ＮＡＤ依存性リガーゼの活性が、１つ又は複数のその後の時点で低減する場合、このことは、検出された活性が、直前まで生存能力を有していた微生物に由来するものであったことを示し得る。検出方法は、本明細書において詳細に論じられる。特定の実施形態において、微生物は細菌である。すべての（真正）細菌は、ＮＡＤ依存性（ＤＮＡ）リガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むと考えられる。より特定の実施形態において、細菌は真正細菌である。しかし、ＮＡＤ依存性リガーゼはまた、好熱性及び耐寒性の細菌においても見られており、したがって、本発明の方法は、より一般的に適用可能である（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００１年）４０（６）、１２４１〜１２４８頁）。したがって、細菌は、例えば中温性及び／又は好熱性の細菌であり得る。
【００１３】
本発明の文脈において「試料」は、ＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物、とりわけ細菌の存在について試験することが望ましい、任意の試料を含むと定義される。したがって、試料は、例えば、臨床試料又はインビトロでのアッセイシステムを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得る。試料は、飲料若しくは食品の試料若しくはそれらの調製物、又は、シャンプー、コンディショナー、保湿剤などを含むパーソナルケア製品などの医薬品若しくは化粧品を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得て、すべて通常的に細菌汚染について試験される。試料は、例えば、組織又は細胞を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得て、また、唾液若しくは血液の試料又は血小板試料を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得る。さらに、本発明の方法及びキットは、例えば食品が準備される場所などにおける表面の汚染をモニターするために用いることができる。汚染は、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性の存在によって示される。汚染は、任意の細菌源、とりわけ細菌汚染に由来するものであり得る。さらに、本発明はまた、水道、排水、海洋環境などの、環境の状態のモニタリングにおいても有用である。本発明はまた、発酵手順における細菌の増殖のモニタリングにおいて、及び、病院、産業設備、又は生体防御への適用における、細菌又は胞子の含有量が評価され得る空気サンプリングにおいても有用である。
【００１４】
「ＮＡＤ依存性リガーゼ」は、活性がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）補因子に依存するＤＮＡリガーゼを意味する。ＮＡＤ依存性リガーゼは、活性が補因子ＡＴＰに依存するＡＴＰ依存性リガーゼとは区別され得る。ＮＡＤ依存性リガーゼの活性は、核酸分子の５’末端と核酸分子の３’末端との間のホスホジエステル結合の形成である。
【００１５】
本発明の方法は、１つ又は複数の（生存能力を有する）微生物、とりわけ細菌が試料中に存在する場合にＮＡＤ依存性リガーゼが存在するという事実に依るものである。したがって、この酵素は、適切な条件下において、ライゲーション反応を触媒し、（その後のプロセスにおいて）検出可能な新たな核酸分子を生成する。新たな核酸分子は、任意の適切な手段によって検出することができ、それにより、試験下にある試料中の微生物の存在を決定することが可能になる。
【００１６】
したがって、試料中に微生物が存在しない場合、試料中にはＮＡＤ依存性リガーゼの活性は存在せず、したがって、検出可能な新たな核酸分子は生成しない。
【００１７】
本発明の方法は、主に、新たな核酸分子が本方法の一環として生じるということにより、顕著な技術的利点を提供する。本発明の方法において、反応していない核酸分子はシグナルには寄与せず、その結果、本方法を実施した場合には偽陽性シグナルは生じない。
【００１８】
さらに、本方法は、感度が高く、フェムトグラム、及び場合によってはアトグラムのレベルまでの、試料中に存在するＮＡＤ依存性リガーゼの検出を提供する。感度は、すべての細菌細胞が数千の酵素分子を含み、したがってそれぞれが適切な条件下で複数のライゲーション事象を触媒し得ることに由来する。すべての細菌細胞は、進行中のゲノムのダメージを修復するためにリガーゼ活性を生成させなくてはならず、この必須の活性は、生存能力を有する微生物細胞の存在についてのマーカーとして、その有用性に寄与する。したがって、細胞当たり１つ又は少数の遺伝子コピーを標的としなくてはならないか又はリボソームＲＮＡ若しくはメッセンジャーＲＮＡを検出するためにさらなるステップ若しくは試薬を用いなくてはならないＰＣＲアプローチとは異なり、本明細書において記載されるアプローチは、単純なアッセイ形式で、細胞当たり複数コピーのＮＡＤ依存性リガーゼの検出を標的とするものである。感度は、リガーゼのそれぞれのコピーが複数（数百又は数千）の基質核酸分子を修飾し得、その基質核酸分子が次にそれぞれ検出され得るという点で、他のアプローチと比較してさらに増強されている。
【００１９】
ＡＴＰ検出技術と比較してのさらなる利点は、ＡＴＰが細菌細胞、真菌細胞、及び哺乳動物細胞に共通であり、例えば細菌の検出又はバイアビリティーの試験を実施する際にヒトのＡＴＰ及び細菌のＡＴＰを区別する必要があることである。細菌に特異的な酵素であるＮＡＤ依存性リガーゼを標的とすることにより、細菌の検出について特異性が存在する。補因子としてＮＡＤ＋を必要とする細菌のリガーゼとは異なり、哺乳動物及び真菌のリガーゼはＡＴＰを必要とする。ＮＡＤ＋は、アッセイにおいて、とりわけ非常に過剰なモル濃度でもたらされ得るため、哺乳動物及び真菌のリガーゼによる干渉を避けることができる。
【００２０】
本明細書において述べるように、本方法の第１のステップは、試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させることを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。ライゲーションされると特異的に検出され得る、任意の適切なライゲーション可能な分子を、本発明の方法において用いることができる。
【００２１】
疑念を避けるために、ライゲーションされた核酸分子が通常、元の（基質）核酸分子とは異なる全体構造を有する新たな検出可能な核酸分子であることが、本明細書において述べられる。したがって、新たな検出可能な核酸分子はさらなるヌクレオチドを含み得、それにより、新たな核酸分子は、例えば、ライゲーションされた核酸分子を鋳型として用いて増幅産物を結合及び産生のみし得るプライマーを用いる増幅により、特異的に同定され得る。しかし、一方の鎖のみが（元の）基質核酸分子と比較して伸長している可能性があり、例えば、リガーゼは、二本鎖の基質分子の一方の鎖におけるニックを塞ぐ可能性がある。
【００２２】
本発明の方法において用いるための基質核酸分子、及び本発明のキットに含まれる包含物は、ＮＡＤ依存性リガーゼが分子に作用して、検出可能なライゲーションされた（新たな）核酸分子を産生し得るような配列及び構造のものでなくてはならない。
【００２３】
本発明において用いるための適切な基質核酸分子は、配列番号１から４、７、及び８として示され、以下の実験の節においてより詳細に記載される。これらの配列のバリアントが本発明において用いられ得ることに注意されたい。例えば、さらなるフランキング配列を付加することができる。バリアント配列は、配列番号１から４、７、及び８として示される基質核酸分子のヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有し得る。核酸分子は、必要に応じて合成ヌクレオチド類似体を包含し得るか、或いは、例えばＲＮＡ若しくはＰＮＡに基づいたもの、又はそれらの混合物であり得る。それらは、特定の実施形態において、検出を容易にするために蛍光標識又はＦＲＥＴ対などを用いて標識され得る。適切な検出方法は本明細書において記載される。
【００２４】
「核酸」は、本明細書において、ＮＡＤ依存性リガーゼによってライゲーションされ得、それにより、ライゲーションされた（新たな検出可能な）核酸分子を生成する、任意の天然の核酸、及び天然又は合成の類似体を含むと定義される。ライゲーション反応では、例えば、２つのＤＮＡ分子を結合させるか又は核酸分子におけるニックを塞ぎ、検出可能なライゲーションされた核酸分子を産生することができる。適切な核酸分子は、例えば、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖又は一本鎖ＲＮＡから構成され得る。部分的に二本鎖であり部分的に一本鎖である核酸分子もまた、本発明の特定の実施形態において意図される。特定の実施形態において、基質核酸分子は、ｄｓＤＮＡを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり、ニックを有するｄｓＤＮＡを含む。「核酸」という用語は、天然の核酸に類似の様式で試料中のＮＡＤ依存性リガーゼによってライゲーションされ得る合成類似体、例えば、非天然塩基若しくは誘導塩基を取り込んだ核酸類似体、又は修飾された骨格を有する核酸類似体を包含する。とりわけ、「二本鎖ＤＮＡ」又は「ｄｓＤＮＡ」という用語は、非天然塩基を含むｄｓＤＮＡを包含すると解釈されるものである。
【００２５】
核酸基質は平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡ分子を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得るが、個別の実施形態において、ＮＡＤ依存性リガーゼの核酸基質は、結合される末端に、相補的な突出及び５’リン酸基を有する、２つの二本鎖ＤＮＡ分子を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。１つの特定の実施形態において、相補的な突出は、２から１０個、例えば３又は５個の塩基対である。別の実施形態において、核酸基質は、５’リン酸を含むニックを有する、部分的に二本鎖であるＤＮＡ分子を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。合成核酸分子は市販されており、末端の５’リン酸基が付着した状態で注文することができる。これは、本発明の方法において用いられる核酸分子の１００％が５’リン酸基で標識されるという技術的利点を有する。さらに、核酸基質は、本明細書において記載されるように、特定のために、例えば、望ましい場合にはライゲーション後のその後の捕捉にビオチン分子を含めるように設計することが可能である。
【００２６】
したがって、本発明の実施形態において、検出される新たな核酸分子は、核酸分子の３’末端が、さらなる核酸分子の５’末端にライゲーションされることによって生成する。これらの実施形態において、リガーゼが試料中に存在する場合、それはライゲーションを触媒し、ライゲーションされた核酸分子（全体として新たな配列を包含する）が形成され、この分子は、本明細書において詳述されるように、その後のプロセス（例えば核酸増幅プロセスなど）によって検出され得る。
【００２７】
したがって、基質核酸分子は、実際には、必要に応じて、２つ以上の核酸分子を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得る。これは概して、本発明の方法及びキットに適用される。
【００２８】
特定の実施形態において、核酸基質は、一本鎖の相補的な突出を有する２つの二本鎖核酸分子を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。
【００２９】
その後検出される（結合していることが望ましい）、ライゲーションされた生成物の産生に関して生産的に結合していない、核酸基質分子の３’末端は、適切な保護基によって保護され得、それにより、それらがライゲーション反応に関与し得ないことが確実となる。任意の適切な保護基を用いることができる。
【００３０】
特定の実施形態において、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子は、ニックを有する二本鎖核酸分子を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。特定の実施形態において、すべての基質は、３つの特異的な一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子からなり得る。ｓｓＤＮＡ分子の２つ以上は同一の配列を有し得る。１つのｓｓＤＮＡ分子は、ニックを含む二本鎖領域が形成されるような様式で、他の２つの核酸分子にハイブリダイズし得る。ＮＡＤ依存性リガーゼの活性は、試料中に存在する場合、ニックを塞ぎ得、それにより、本明細書において記載される方法に従って検出され得る二本鎖ＤＮＡ分子を産生する。このような設定の適切な例には、本明細書において論じられるように、配列番号７及び８（２つのコピー）として示される核酸分子が含まれる。
【００３１】
さらなる特定の実施形態において、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子は、共にライゲーションされ得る２つの核酸分子を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。
【００３２】
好ましくは、核酸基質は試料中に過剰に存在しており、とりわけ、リガーゼよりも非常に過剰なモル濃度で存在している。これは、先行技術の方法との重要な技術的差異である。ライゲーションされた新たな核酸分子が検出されるため、試料中におけるこの分子の存在のみが、この検出方法が効果的に機能するために必須である。したがって、例えば、検出される細菌に由来するか、又は試験される試料中において見られ得る哺乳動物若しくは真菌源に由来するような他の核酸分子が試料中に存在していても、本発明の方法に不利益ではない。
【００３３】
好ましくは、基質核酸分子は、試料中において検出されるＮＡＤ依存性リガーゼを産生する、１つ又は複数の細菌又は他の微生物のゲノムと高レベルの相同性を有さないように設計される。このことは、汚染核酸分子の存在下においてさえも、ライゲーションされた新たな核酸分子のみが検出され得ることを意味する。したがって、基質は、偽陽性の結果を引き起こすゲノムＤＮＡの非特異的な増幅を防ぐために、検出される細菌のゲノムＤＮＡと十分に低いレベルの配列同一性を有しているべきである。基質の配列は、したがって、標的細菌を考慮して設計され得る。とりわけ、ライゲーションされた新たな核酸分子を特異的に増幅するためのプライマーは、それらが細菌のゲノムＤＮＡから増幅産物を産生しないように設計される。例えば、基質及びプライマーは、互いに塩基対を形成し得、細菌のゲノムＤＮＡの特異的な増幅を可能にする、相補的な非天然的に生じる分子を組み込み得る。例として、ｐｙＤＡＤ及びｐｕＡＤＡが、必要に応じてプライマー及び基質分子に組み込まれる（Ｓｉｓｍｏｕｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、Ｖｏｌ．３２、Ｎｏ．２：７２８〜７３５頁）。
【００３４】
好ましくは、相同性は、試料中において検出されるＮＡＤ依存性リガーゼを産生する１つ又は複数の細菌又は他の微生物に由来する対応するヌクレオチド配列と、約５％未満、約１０％未満、約１２．５％未満、約１５％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％未満の配列同一性である。１つの実施形態において、配列同一性は、試料中において検出されるＮＡＤ依存性リガーゼを産生する１つ又は複数の細菌又は他の微生物に由来する対応するヌクレオチド配列と、約１０、２０、３０、４０、又は５０個の連続するヌクレオチドにわたり存在しない。別の実施形態において、配列同一性は、試料中において検出されるＮＡＤ依存性リガーゼを産生する１つ又は複数の細菌又は他の微生物に由来する対応するヌクレオチド配列と、約１０、２０、３０、４０、又は５０個の連続するヌクレオチドにわたり、約１０％未満、又は約１２．５％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、若しくは６０％未満である。
【００３５】
本発明の方法の第２のステップは、試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼの活性に適した条件下でインキュベートすることを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。当業者により容易に決定されるように、任意の適切な条件を用いることができる。例えば、ライゲーションは、関与するリガーゼに依って、約４から８０℃の任意の温度で生じ得る（例えば、好熱性細菌は、中温性細菌よりも高い温度でインキュベートされる反応を用いて検出され得る）。一般的な（生存能力を有する）細菌の検出のために好ましいインキュベーション温度は、約４から４０℃であり、より好ましくは約２０から３７℃であり、最も好ましくは室温である。適切なインキュベーション時間は、約１０分間から１０時間、例えば約３０分間、１時間、又は２時間から５、６、７、８、又は９時間であり得る。インキュベーションは、適切な緩衝液内で生じ得る。市販のリガーゼ緩衝液には、ＮＥＢから入手可能な大腸菌のリガーゼ緩衝液が含まれる。リガーゼを用いるための適切なインキュベーション条件は、当技術分野において周知であり、市販のリガーゼと共に推奨されている。
【００３６】
特定の実施形態において、ＮＡＤ依存性リガーゼの活性に適した条件には、試料にさらなるＮＡＤ＋を供給することが含まれる。このＮＡＤ＋添加のアプローチの論理的根拠は、それが、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性のための最適な条件を示すということである。したがって、試料中におけるＮＡＤ依存性リガーゼの活性は、試料中におけるＡＴＰ依存性リガーゼの活性などの任意の他の酵素活性よりも非常に有利である。このことは、試料中に生存能力を有する細菌が存在しない場合であってもライゲーションされた核酸分子の産生をもたらし得る（即ち偽陽性の結果）ＡＴＰ依存性リガーゼの活性などのさらなる酵素活性を試料が含み得る状況において、とりわけ関連性がある。したがって、試料中におけるＮＡＤ依存性リガーゼの活性を積極的に促進することによって、もし存在しても、潜在的な競合酵素活性の存在下であっても、試料中において、生存能力を有する微生物、とりわけ細菌の存在を同定することが可能である。以下の実験の節において示されるように、試料にＮＡＤ＋を添加すると、検出の感度が向上する。
【００３７】
別の実施形態において、試料にはさらなるＮＡＤ＋を添加しない。したがって、この場合、本方法は、内因性ＮＡＤ＋に依存して、ＮＡＤ依存性リガーゼの活性を裏付ける。（生存能力を有する）細菌細胞の不在下では、検出可能なＮＡＤ依存性リガーゼの活性は存在しない可能性がある。細菌細胞が試料中に存在する場合、内因性ＮＡＤ＋により、ＮＡＤ依存性リガーゼが基質核酸分子に作用して、その後検出されるライゲーションされた核酸分子を産生することが可能となる。本明細書における記載の実験の節において示されるように、生存能力を有さない細胞は低レベルのＮＡＤ＋を有するため、このような方法はシグナルにおける優れた区別を可能にし得る。
【００３８】
用いる試料のタイプ及び本発明の方法の特定の適用に依って、試料中における任意のＡＴＰ依存性リガーゼの活性を阻害することが望ましい場合がある。とりわけ、試料は、ＡＴＰ依存性リガーゼを発現する真核細胞及び／又は原核細胞を含み得る。このようなＡＴＰ依存性リガーゼは、基質核酸分子に作用して、ライゲーションされた核酸分子を産出し、それにより偽陽性の結果をもたらし得る。したがって、本発明の方法は、試料中におけるＡＴＰ依存性リガーゼの活性を阻害するステップを含み得る。ＡＴＰ依存性リガーゼ活性の阻害は、任意の適切な手段によりなされ得る。１つの実施形態において、ＡＴＰ依存性リガーゼの活性は、試料から（その補因子である）ＡＴＰを枯渇させることにより阻害される。これは、例えば、試料に基質核酸を加える前にルシフェラーゼなどの酵素を用いて、試料中のＡＴＰを消費することによりなされ得る。ＡＴＰ依存性リガーゼの活性は、例えば競合基質を添加することにより、直接的に阻害することができる。適切な競合基質は、ｄＡＴＰを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得る（Ｗｏｏｄ  ＷＢら（１９７８年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３、２４３７頁）。インキュベーション条件はまた、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼの活性に悪影響を与えることなくＡＴＰ依存性リガーゼの活性を阻害するために変えることもできる。例えば、約２００ｍＭを超えるような高濃度の１価陽イオンの使用により、ＡＴＰ依存性リガーゼ活性の選択的な阻害が可能になり得る（Ｏｋａｚａｋｉ、Ｒら（１９６８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ５９、５９８頁、及びＥｄｗａｒｄｓ、ＪＢら（１９９１年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９、５２２７頁）。
【００３９】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、ＮＡＤ依存性リガーゼの活性を決定する前の、試料からの任意のＡＴＰ依存性リガーゼの捕捉を含む。これは、得られる結果にＡＴＰ依存性の活性が影響することを防ぐための、別の方法である。ＡＴＰ依存性リガーゼは、任意の適切な手段によって試料から捕捉され得る。例えば、ＡＴＰ依存性リガーゼは、ＡＴＰ依存性リガーゼに結合する特異的な試薬又は捕捉剤を用いて捕捉され得る。結合は、ＡＴＰ依存性リガーゼ、及び／又は必要に応じて特定源から得られたＡＴＰ依存性リガーゼに選択的であり得る。特定の実施形態において、ＡＴＰ依存性リガーゼは、固定された核酸分子を用いて試料から捕捉される。別の捕捉剤には、抗体（並びに本明細書において定義されるその誘導体及びバリアント）、レクチン、受容体などが含まれる。
【００４０】
（必要に応じてＡＴＰ依存性又はＮＡＤ依存性の）リガーゼを捕捉するための試薬は、１つの実施形態において、固体支持体上に固定され得る。任意の適切な固体支持体を用いることができる。固体支持体の性質は、リガーゼが（ＮＡＤ依存性の形態の場合には酵素活性に悪影響を与えることなく）その固体支持体上に効果的に固定され得るならば、本発明の性能にとって重大なものではない。固体支持体の非限定的な例には、ポリスチレンビーズ及びその誘導体並びに常磁性ビーズなどの任意のビーズ、アフィニティーカラム、マイクロタイタープレートなどが含まれる。必要に応じて、固定を容易にするために、ビオチン及びストレプトアビジンを用いることができる。固定の方法は、当技術分野において周知であり、本明細書において論じられる。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明の方法はさらに、ＮＡＤ依存性リガーゼを放出させるための、試料中の微生物／細菌の溶解を含む。溶解は好ましくは選択的であり、したがって、微生物以外のもの、とりわけ細菌細胞以外のものをインタクトなままとするものである。このことにより、試料中におけるＮＡＤ依存性リガーゼ活性の検出が容易になる。このステップは、好ましくは試料を核酸基質と接触させる前に実施されるが、これは本質的ではない。選択的に細菌細胞を溶解するための適切な作用物質は、当技術分野で知られており、例えばＢ−ＰＥＲ（Ｐｉｅｒｃｅ）などの細菌タンパク質抽出試薬を含む。他の条件には、例えば超音波処理又はフレンチプレスが含まれ得る。しかし、溶解は本発明のすべての実施形態において必須ではない可能性がある。とりわけ、特定の実施形態において、細菌の細胞壁及び／又は細胞膜の透過性の増大は、本発明の方法に従ったＮＡＤ依存性リガーゼ活性の検出を可能にするために十分であり得る。この透過性の増大をなし得るために適した作用物質及び技術は、当技術分野において知られている。
【００４２】
本発明の様々なアプリケーションにおいて有用なさらなる作用物質は、リゾスタフィン（ＡＭＢＩ）である。リゾスタフィンは、ブドウ球菌の細胞壁のペプチドグリカンに特異的なエンドペプチダーゼであり、したがって、ブドウ球菌の細胞を特異的に溶解するために用いることができる。
【００４３】
リゾスタフィン遺伝子はクローニングされており、組換えにより産生することができる。しかし、（アンビシン（ＡＭＢＩＣＩＮ）（登録商標）Ｌという商品名で）市販されている組換え形態は、本発明に関連する多くの重要な不純物を含むことが明らかにされている。とりわけ、市販されている組換えリゾスタフィンは、ヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性の両方を含む。これは、核酸に基づいた基質に対するＮＡＤ依存性リガーゼ活性の検出を利用する本発明の性能に不利益なものである。
【００４４】
市販されているリゾスタフィンの問題を克服するために、本発明者らは、調製物におけるリガーゼ及び／又はヌクレアーゼ活性を不活性化させ、一方でリゾスタフィンのエンドペプチダーゼ活性を保持するプロセスを考え出した。したがって、本発明は、実質的にヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ汚染物質のない（且つ、エンドペプチダーゼ活性を保持する）リゾスタフィン調製物を提供する。本発明はまた、実質的にヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ汚染物質のないリゾスタフィン調製物を産生するための方法であって、ヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ活性は阻害及び／又は低減されるがリゾスタフィンの（エンドペプチダーゼ）活性は実質的に影響を受けない条件下で、ヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ汚染物質を含むリゾスタフィン調製物を加熱するステップを含む方法を提供する。したがって、さらなる態様において、本発明は、ヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ活性は阻害及び／又は低減されるがリゾスタフィンの（エンドペプチダーゼ）活性は実質的に影響を受けない条件下で、ヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ汚染物質を含むリゾスタフィン調製物を加熱することによって産生される、実質的にヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ汚染物質のないリゾスタフィン調製物を提供する。
【００４５】
加熱は、約５０から６０℃の温度までであり得る。特定の実施形態において、リゾスタフィン調製物は、約５５℃の温度まで加熱されるが、それは、この温度が、汚染リガーゼ活性及び／ヌクレアーゼ活性を除去する一方でリゾスタフィンの（エンドペプチダーゼ）活性を保持するという観点からとりわけ効果的であることが示されているためである。
【００４６】
調製物は、適切な時間にわたり加熱することができる。例えば、調製物は、１から３０分間、例えば５から２０分間にわたり加熱することができる。低い加熱温度を用いる場合は長い処理時間が望ましい場合があり、逆もまた同様である。特に適切な処理は、約５分間実施される。これは、特定の実施形態において、約５５℃であり得る。
【００４７】
特定の実施形態において、リゾスタフィンは、適切なリガーゼ緩衝液内に含まれ得る。このようなリガーゼ緩衝液は、本発明の方法においてとりわけ有用であり、塩、洗浄剤、タンパク質などの標準的な構成要素を含み得る。１つの特定の実施例は、本明細書における実験の節において記載されており、ＭｇＣｌ２、ＤＴＴ、ＢＳＡ、ＮＡＤ＋、及びＴｒｉｓ（ｐＨ８）を含む。したがって、１つの態様において、本発明は、ＮＡＤ＋及びリゾスタフィン、とりわけ本発明のリゾスタフィンを含む緩衝液を提供する。本明細書において論じられるように、緩衝液へのＮＡＤ＋の補充は、ＮＡＤ依存性リガーゼの活性を促進するという観点から有利である。
【００４８】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、試料からの任意のＮＡＤ依存性リガーゼの捕捉を含む。これにより、試料からのＮＡＤ依存性リガーゼ活性の濃縮が可能になり、また、試料中において見られ得る酵素活性の（例えば洗浄を介した）任意の阻害剤の除去が可能になる。ＮＡＤ依存性リガーゼは、任意の適切な手段によって試料から捕捉され得る。ＮＡＤ依存性リガーゼは、ＮＡＤ依存性リガーゼに結合する特異的試薬を用いて捕捉されることが好ましい。結合は、ＮＡＤ依存性リガーゼ、及び／又は必要に応じて特定源から得られたＮＡＤ依存性リガーゼに選択的であり得る。特定の実施形態において、ＮＡＤ依存性リガーゼは、固定された核酸分子を用いて試料から捕捉される。より具体的には、固定された核酸分子は、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子であり得る。
【００４９】
さらなる実施形態において、細菌のリガーゼは、固体表面上に固定された核酸基質を用いて試料から捕捉することができる。例えば、１つの方法において、ＤＮＡ基質は、核酸基質を形成している１つ又は複数のＤＮＡ鎖の３’末端のビオチンを介して、ストレプトアビジンビーズに固定され得る。所与の溶液中における任意の細菌リガーゼは、固定されたＤＮＡ基質の３’ヒドロキシルに共有結合し得、その後のライゲーションのために捕捉され得る。この実施形態の利点は、リガーゼが捕捉され得、大量の溶液から濃縮され、それにより検出の感度が増強し得ることである。したがって、本発明の方法は、有利には、大量の及び／又は希釈された試料中において細菌を同定又は検出するために用いられ得る。さらに、リガーゼは細菌抽出物から精製され、それにより、酵素の活性が増強し得る。基質核酸分子が２つ以上の核酸分子を含む場合、分子のそれぞれは必要に応じて固定され得る。それぞれは、必要に応じて、同一の、又は個別の固体表面上に固定され得る。
【００５０】
他の実施形態において、ＮＡＤ依存性リガーゼは、例えばタンパク質及び／又は核酸に基づいたものであり得る試薬を用いて捕捉され得る。試薬は、抗体、レクチン、受容体、及び／又は核酸に基づいた分子であり得る。「抗体」という用語は、抗原（ＮＡＤ依存性リガーゼ）結合能を保持している、そのすべての誘導体及びバリアントを包含する。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を用いることができる。例えばヒト抗体でないものをヒト化した形態であり得る誘導体化形態もまた意図される。誘導体には、限定はしないが、重鎖抗体、単一ドメイン抗体、ナノボディ、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖなどが含まれる。
【００５１】
ＮＡＤ依存性リガーゼは互いに高レベルの相同性を有する一方でＡＴＰ依存性リガーゼには類似していないため（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００１年）４０（６）、１２４１〜１２４８頁）、ＮＡＤ依存性リガーゼに特異的な試薬を用いてＮＡＤ依存性リガーゼを捕捉することは、元の試料の中に存在する可能性があり得る任意のＡＴＰ依存性リガーゼの活性を明らかにするための１つの有用な方法である。さらに、相同性レベルが高いため、通常ＮＡＤ依存性リガーゼを捕捉し得る一般的な試薬を用いることも可能である。これは、上述したように任意の種類の試薬であり得るが、好ましくは、ライゲーション可能な基質などの核酸に基づいた試薬、又は抗体若しくはその誘導体である。例えば、抗体は、ＮＡＤ依存性リガーゼのアミノ酸配列から得られる保存されたモチーフを包含する抗原に対して特異的なものであり得る（例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００１年）４０（６）、１２４１〜１２４８頁の図２を参照されたい）。
【００５２】
さらなる実施形態において、本発明の方法が用いられるアプリケーションに依って、ＮＡＤ依存性リガーゼの源を区別することが望ましい場合がある。このような実施形態に従って、目的のＮＡＤ依存性リガーゼを捕捉するために、十分な特異性を有する試薬が用いられる。タンパク質又は核酸に基づいたものであり得る任意の特異的な試薬を用いることができる。例としては、レクチン、受容体、抗体、ＤＮＡ、及びＲＮＡが含まれる。例えば、抗体は、目的のＮＡＤ依存性リガーゼの非保存領域から得られた抗原に対するものであり得るが、それはとりわけ、多くのリガーゼのアミノ酸配列が公知であるためである（例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００１年）４０（６）、１２４１〜１２４８頁の図２を参照されたい）。
【００５３】
ＮＡＤ依存性リガーゼを捕捉するための試薬は、１つの実施形態において、固体支持体上に固定され得る。任意の適切な固体支持体を用いることができる。固体支持体の性質は、ＮＡＤ依存性リガーゼが酵素活性に悪影響を与えることなくその固体支持体上に固定され得るならば、本発明の性能にとって重大なものではない。固体支持体の非限定的な例には、ポリスチレンビーズ及びその誘導体並びに常磁性ビーズなどの任意のビーズ、アフィニティーカラム、マイクロタイタープレートなどが含まれる。必要に応じて、固定を容易にするために、ビオチン及びストレプトアビジンを用いることができる。
【００５４】
同様に、固定の化学反応は、当業者によって通常実施される。とりわけ、試料中の生存能力を有する微生物の存在の指標として産生される、ライゲーションされた核酸分子の検出の特異性及び感度の観点から、本発明の方法に対して悪影響を有さなければ、任意の固定の手段を用いることができる。
【００５５】
ＮＡＤ依存性リガーゼが捕捉されると、固定された酵素は洗浄され、その後の検出プロセスに影響し得る阻害物質が除去され得る。したがって、特定の実施形態において、本方法はさらに、新たな（ライゲーションされた）核酸分子の検出の前の洗浄ステップを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。洗浄は、任意の適切な緩衝液又は洗浄溶液を用いることができ、ＥＤＴＡ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌなどの構成要素を含み得る。適切な洗浄溶液は当業者に周知である。
【００５６】
他の実施形態において、本発明の方法は、予備ステップとして、目的の特定の細菌のみが存在する試験試料を得るための、開始試料からの微生物、とりわけ細菌の特異的な捕捉を含む。特定の実施形態において、本発明は、試料がまず濾過され、それにより１つ又は複数の細菌細胞又は他の微生物（上述したような）が濃縮される方法を提供する。特定の細菌細胞又は微生物のさらなる特異的な検出には、これらの細胞を他の（ＮＡＤ依存性又はＡＴＰ依存性の）リガーゼ産生細胞から分離するための特異的な濾過が必要であり得る。このようなフィルター並びに濾過システム及び濾過方法は、当技術分野において周知であり、市販されている（例えばＮｅｗ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．から）。特異的な捕捉はまた、適切な試薬を介してもなされ得る。タンパク質又は核酸に基づいたものであり得る任意の特異的な試薬を用いることができる。例としては、本明細書において論じられるように、レクチン、受容体、抗体（及びその誘導体）、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれ、その議論は、必要な変更を加えて適用される。
【００５７】
本発明の方法は、検出前の、（新たな）ライゲーションされた核酸分子の精製を含み得る。任意の適切な精製技術を、当技術分野において周知のように用いることができる。例えば、核酸を単離し、ゲル上を泳動させることができ、予想されたサイズの生成物が検出の前に精製される。本明細書において記載される、基質核酸分子の固定により、ライゲーションされた核酸分子も固定されるため、ライゲーションされた核酸分子の精製もまた容易になり得る。
【００５８】
特定の実施形態において、ライゲーションされていない基質分子は、試料から選択的に除去されるか、或いは、ライゲーションされた核酸分子の検出の前に（それらの検出を防ぐために）修飾される。これは、ライゲーションされていない基質が、ライゲーションされた核酸分子の検出の感度及び／又は特異性に影響することを防ぐために行われ得る。特定の実施形態において、これは、選択的ヌクレアーゼを用いる処理ステップによってなされる。とりわけ、１つ又は複数のエキソヌクレアーゼを用いて、ライゲーションされていない基質分子を除去することができる。特定の実施形態において、ＥｘｏＩＩＩ、ＥｘｏＩ、及び／又はＥｘｏＴなどの３’−５’エキソヌクレアーゼを用いて、ライゲーションされていない基質分子を消化する。
【００５９】
インキュベーション条件、とりわけインキュベーションの温度及び時間を制御することにより、ライゲーションされていない基質は消化され得るが、（２以上のライゲーションされた基質を組み合わせる）ライゲーションされた核酸分子はインタクトのまま維持され、それにより、本明細書において論じられるように、とりわけライゲーションの境界で、それらを検出することができる。試料中のＮＡＤ依存性リガーゼの活性によりライゲーションされるニックを含む二本鎖領域を共に形成する、少なくとも３つの基質核酸分子からライゲーションされた核酸分子が形成される場合、ＥｘｏＩＩＩなどのｄｓＤＮＡに特異的な３’−５’エキソヌクレアーゼと、ＥｘｏＩ及び／又はＥｘｏＴなどのｓｓＤＮＡに特異的な１つ又は複数の３’−５’エキソヌクレアーゼとの組合せを有利に用いることができる。ｄｓＤＮＡ３’−５’エキソヌクレアーゼは、ｄｓＤＮＡ部分を消化してｓｓＤＮＡを産生するように作用し得る。ニックがＮＡＤ依存性リガーゼにより塞がれていない場合、ｓｓＤＮＡ３’−５’エキソヌクレアーゼはライゲーション部位での消化を開始し、そして、検出反応に潜在的に影響し得るライゲーションされていない基質を除去し得る。ＥｘｏＩＩＩは、３’突出で効率的に開始しないため、特に有用であり得る（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい）。配列番号７及び８として示されるヌクレオチド配列を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなるものなどの、本明細書において記載される基質の使用などの、適切な基質の設計により、ライゲーションされていない基質分子の効率的且つ特異的な除去がなされ得る。
【００６０】
ヌクレアーゼ処理は、１０分間から１時間、とりわけ３０分間などの適切な時間にわたり、２０から４０℃、とりわけ３７℃などの適切な温度で実施され得る。ヌクレアーゼは次に、ライゲーションされた核酸分子の消化を防ぐために不活性化され得る。任意の適切な条件を用いることができる。例えば、ヌクレアーゼは、６０℃超又は５０℃から１００℃、とりわけ９５℃などの高温での処理により不活性化され得る。これは、２から１０分間、とりわけ約５分間などの任意の適切な時間にわたり実施され得る。
【００６１】
本発明の方法は、適切な対照を包含し得る。これは、正確な結果が得られていることを確実にするための、（以下に記載されるような）核酸増幅技術などの特定の高感度の検出技術との併用において有用であり得る。例えば、対照は、ＮＡＤ依存性リガーゼの活性が存在することが知られている試料を試験することを包含し得る。基質がこの試料に添加されている場合に、ライゲーションされた核酸分子が産生されない場合、例えば本方法において用いる試薬、又は検出技術に問題があることは明らかである。適切な陰性対照は、ＮＡＤ依存性リガーゼの活性が存在しないことが知られている試料であり得る。さらに、試験試料において見られるものと同様のレベルの生成物の陽性の結果／検出は、問題が存在していることを示している。核酸に基づいた基質分子が添加されていない対照もまた、無関係なライゲーション事象が本方法により検出されないことを確実にするために用いることができる。適切な対照のすべての組合せ及び順列が本発明において想定される。核酸増幅反応において用いるための適切な対照は、本明細書において記載されるように、本発明の特定の実施形態において用いられる。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態において、（試料中における１つ又は複数の（生存能力を有する）微生物、とりわけ細菌の存在の指標としての）試料中におけるＮＡＤ依存性リガーゼ活性の存在に従って産生された新たな核酸分子は、核酸増幅技術を用いて検出される。
【００６３】
これは、本発明の方法を最も高感度にするために役立つ。このような増幅技術は、当技術分野において周知であり、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Ｃｏｍｐｔｏｎ、１９９１年）、３ＳＲ（Ｆａｈｙら、１９９１年）、ローリングサークル複製、転写介在増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：７７７〜７８４頁、１９９９年、米国特許第６２６１８４６号明細書（参照により本明細書に包含される）に記載されているＤＮＡオリゴマー自己集合プロセス、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、１９９０年）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６４１０２７６号明細書）、任意プライムＰＣＲ（国際公開第９０／０６９９５号パンフレット）、コンセンサス配列プライムＰＣＲ（米国特許第４４３７９７５号明細書）インベーダー技術、鎖置換技術及びニック置換増幅（国際公開第２００４／０６７７２６号パンフレット）などの方法が含まれる。上記の列挙は、網羅的であることを意図したものではない。適切な核酸生成物が特異的に増幅されるならば、任意の核酸増幅技術が用いられ得る。
【００６４】
増幅は、検出される新たな／ライゲーションされた核酸分子の配列に特異的な増幅プライマーを用いてなされる。核酸分子に特異性をもたらすために、配列の適切な領域に対応するプライマー結合部位が選択され得る。当業者には、核酸分子が、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼの活性により産生される新たな核酸分子の検出に必要なプライマー結合部位以外の配列も含み得ること、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位又はプロモーター配列がＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、及びＴＭＡなどの等温増幅技術に必要であり得ることが理解されよう。
【００６５】
１つ又は複数のプライマー結合部位は、基質核酸分子のライゲーションの境界を架橋し得、それにより、例えば、ライゲーションが生じた場合にのみ、増幅産物が生成する。或いは、プライマーは、ライゲーションの境界のいずれかの側に結合し得、境界を横切る増幅を指示するので、それにより、ライゲーションされた核酸分子が形成される場合にのみ、増幅産物が（指数関数的に）生成する。上記に論じたように、プライマー及び１つ又は複数の基質核酸分子は、細菌のゲノムＤＮＡの非特異的な増幅を避けるように設計され得る。
【００６６】
本発明の方法において用いるための適切なプライマーは、それぞれ配列番号５及び６又は９及び１０として示され、以下の実験の節においてより詳細に記載される。これらのプライマーは、本発明の個別の態様を形成するものである。これらの配列のバリアントが本発明において用いられ得ることに注意されたい。とりわけ、必要に応じて、例えば結合特異性を向上させるために、さらなる配列特異的なフランキング配列を付加することができる。バリアント配列は、配列番号５及び６又は９及び１０で示されるプライマーのヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有し得る。プライマーは、必要に応じて合成ヌクレオチド類似体を包含し得るか、或いは、例えばＲＮＡ若しくはＰＮＡに基づいたもの、又はその混合物であり得る。プライマーは、用いる検出の態様に依って、蛍光標識及び／又はＦＲＥＴ対などで標識され得る。プローブを用いることができ、これもまた、必要に応じて標識することができる。
【００６７】
したがって、特定の態様において、本発明の方法は、核酸増幅技術を用いて実施され、それにより、試料中における細菌細胞又は他のＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物の存在を示す、基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼ活性の作用の直接的な結果として産生される、新たな核酸分子が検出される。特定の実施形態において、用いられる技術は、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、ＴＭＡ、ＳＤＡ、及びＤＮＡオリゴマー自己集合から選択される。増幅産物の検出は、例えばゲル電気泳動などの通常の方法によるものであり得るが、好ましくは、リアルタイム又はエンドポイントでの検出方法を用いて実施される。
【００６８】
増幅反応の生成物のリアルタイム又はエンドポイントでの検出のための多くの技術が、当技術分野において知られている。これらには、増幅されたＤＮＡの収量が、生じた蛍光の量に基づいて推定されることを可能にする、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版）などのインターカレート蛍光染料の使用が含まれる。リアルタイムの検出方法の多くが、連続的にモニターされ得る蛍光の読み出しを生じ、具体的な例としては、分子ビーコン及び蛍光共鳴エネルギー移動プローブが含まれる。リアルタイム及びエンドポイントの技術は、「単一の試験管」における反応を維持するため、有利である。このことは、結果を得るために下流の分析は必要なく、それにより、より迅速に結果が得られることを意味する。さらに、「単一の試験管」の環境において反応を維持すると、交差汚染のリスクが低減し、本発明の方法からの定量的なアウトプットが可能になる。これは、健康及び安全性の懸念が最も重要であり得る本発明の状況において（例えば血小板試料の潜在的な細菌汚染の検出などにおいて）、とりわけ重要であり得る。
【００６９】
リアルタイム及びエンドポイントでのＰＣＲ反応の定量は、タックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてなされ得、Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｂｙ  ｕｔｉｌｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ５’−３’  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８、７２７６〜７２８０頁（１９９１年）、Ｇｅｌｍｉｎｉら、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  Ｃ−Ｅｒｂ−２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３、７５２〜７５８頁（１９９７年）、及びＬｉｖａｋら、Ｔｏｗａｒｄｓ  ｆｕｌｌｙ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｗｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．９、３４１〜３４２頁（１９９９５年）（参照することにより本明細書に包含される）を参照されたい。このタイプのプローブは、一般的に加水分解プローブと呼ばれ得る。リアルタイム又はエンドポイントの検出において用いるための適切な加水分解／タックマンプローブもまた提供される。それらは、配列番号１１として示されるヌクレオチド配列を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得る。プローブは、例えば以下に詳述する標識を用いて、適切に標識される。
【００７０】
分子ビーコンシステムにおいては、（Ｔｙａｇｉ  ＆  Ｋｒａｍｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ−ｐｒｏｂｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ  ｕｐｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４、３０３〜３０８頁（１９９６年）、及びＴｙａｇｉら、Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｌｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６、４９〜５３頁（１９９８年）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）ビーコンは、内部で消光しているフルオロフォアを有するヘアピン形状のプローブであり、フルオロフォアの蛍光は、その標的に結合すると回復する。これらのプローブは、ヘアピンプローブと呼ばれ得る。
【００７１】
本発明の方法に包含され得る、さらなるリアルタイムの蛍光に基づいたシステムは、ＺｅｎｅｃａのＳｃｏｒｐｉｏｎシステムであり、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅらによる、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ−ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７、８０４〜８０７頁（１９９９年８月１日）を参照されたい。当業者に周知であり市販されている、さらなるリアルタイム又はエンドポイントの検出技術には、ライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ）（登録商標）技術、アンプリフロール（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｕｒ）（登録商標）プライマー技術、ＤｚｙＮＡプライマー（Ｔｏｄｄら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：５、６２５〜６３０頁（２０００年））、又はプレクサー（Ｐｌｅｘｏｒ）（商標）ｑＰＣＲシステム及びｑＲＴ−ＰＣＲシステムが含まれる。
【００７２】
したがって、本発明のさらなる態様において、核酸増幅の生成物は、リアルタイム又はエンドポイントの技術を用いて検出される。本発明の特定の実施形態において、リアルタイムの技術は、加水分解プローブ（タックマン（登録商標）システム）、ＦＲＥＴプローブ（ライトサイクラー（登録商標）システム）、ヘアピンプライマー（アンプリフロール（登録商標）システム）、ヘアピンプローブ（分子ビーコンシステム）、プライマー内に包含されたヘアピンプローブ（スコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）（登録商標）プローブシステム）、ＤＮＡｚｙｍｅ及び切断可能な蛍光ＤＮＡｚｙｍｅ基質（ＤｚＹＮＡ）の相補的配列を包含するプライマー、プレクサーｑＰＣＲ及びオリゴヌクレオチド保護システムのいずれか１つの使用から構成される。
【００７３】
特定の実施形態において、反応混合物は、増幅産物のリアルタイム又はエンドポイントの検出を可能にするために必要な試薬に加えて任意選択で、新たな（ライゲーションされた）核酸分子の増幅に必要な、試験下にある試料、１つ又は複数の基質核酸分子、試薬、緩衝液、及び酵素のすべてを含む。したがって、（１つ又は複数の目的の細菌細胞又は微生物からの）ＮＡＤ依存性リガーゼの完全な検出方法は、定量的なアウトプットを伴い、且つ任意の中間の洗浄ステップの必要性を伴わない、単一の反応で生じ得る。「単一の試験管」の反応の使用は有利であり、それは、結果を得るために下流の分析が必要なく、それにより、より迅速に結果が得られるためである。さらに、「単一の試験管」の環境において反応を維持すると、交差汚染のリスクが低減し、本発明の方法からの定量的なアウトプットが可能になる。また、単一の試験管の反応は、例えばハイスループットの状況において、より自動化に適している。
【００７４】
或いは、本発明の方法は、段階的な様式で実施することができる。したがって、第１のステップにおいて、本発明の方法において用いるのに適した形態で試料を調製することがまず必要であり得る。例えば、本明細書において記載されるように、選択的な細胞溶解、又は細胞の透過性の増大が必要であり得る。本明細書において記載されるように、ＮＡＤ依存性リガーゼの捕捉もまた同様に望ましい場合がある。例えば、ＡＴＰ依存性リガーゼの活性は阻害され得る。
【００７５】
本発明の方法は多くのアプリケーションを有する。例えば、それらは、既存の治療に対する微生物の耐性の重要な分野において有用である。多くの細菌が現在、非常に多くの現在利用可能な抗微生物治療に対して耐性であり、メチシリン耐性のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）などの特定の株は、とりわけ臨床状況において、危険な健康上のリスクを有している。
【００７６】
したがって、抗微生物剤に対する耐性が迅速に決定されることを可能にする技術及びアッセイキットが必要とされている。
【００７７】
したがって、さらなる態様によれば、本発明は、細菌細胞又は他の微生物の、前記細胞、細菌、又は他の微生物に対する作用物質に対する耐性をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、試料中において
（ａ）細菌細胞又は微生物を作用物質にさらすステップと、
（ｂ）試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させるステップと、
（ｃ）こうして接触させた試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下でインキュベートするステップと、
（ｄ）基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼの作用の結果生じる、（新たな）ライゲーションされた核酸分子が存在するか（及び／又はその量）を特異的に検出するステップであって、耐性が存在する場合には、（新たな）ライゲーションされた核酸分子が検出される（又は高レベルで検出される）ステップと
を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。
【００７８】
同一の方法をまた、新たな化合物、作用物質、又は分子が、必須の酵素としてＮＡＤ依存性リガーゼを発現する特定の１つ又は複数の標的細菌細胞又は他の微生物に対する効果を有するかどうかを決定するための、化合物のスクリーニング方法として用いることができる。
【００７９】
したがって、本発明のまたさらなる態様は、１つ又は複数の細菌細胞又は他の適切な微生物を死滅させるか又はその増殖を抑えることが可能な作用物質をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、試料中において、
（ａ）細菌細胞又は微生物を作用物質にさらすステップと、
（ｂ）試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させるステップと、
（ｃ）こうして接触させた試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下でインキュベートするステップと、
（ｄ）基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼの作用の結果生じる、（新たな）ライゲーションされた核酸分子が存在するか（及び／又はその量）を特異的に検出するステップであって、作用物質が細菌又は微生物を死滅させるか又はその増殖を抑えることが可能な場合には、新たな核酸分子が検出されない（又は低レベルで検出される）ステップと
を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。
【００８０】
本発明のこの態様はまた、化合物のスクリーニングにおいて、迅速なバイアビリティー試験として用いることができる。したがって、化合物、作用物質、又は分子は、それが適切な細胞に対して毒性であるかを決定するために、本方法に従ってスクリーニングされ得る。したがって、新たな核酸分子の検出という観点からの本方法における陽性の結果は、化合物が細胞に対して低毒性であることを示すものである。本発明の方法はまた、診断上の有用性を有していることが明らかにされ得、それにより、ＮＡＤ依存性リガーゼを発現する感染性の細菌細胞又は他の微生物が最小レベルでのみ存在している場合に、感染は、初期段階において特異的に及び高感度で検出され得る。
【００８１】
したがって、さらなる態様において、感染、又は対象における細菌細胞若しくは他の微生物の存在に関連する疾患を診断する方法が提供され、この方法は、対象から得られた試料中において、
（ａ）試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させるステップと、
（ｂ）こうして接触させた試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下でインキュベートするステップと、
（ｃ）基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼの作用の結果生じる、ライゲーションされた核酸分子の存在（及び／又は量）を特異的に決定して、感染又は疾患の指標として（生存能力を有する）細菌又は他の微生物の存在を示すステップと
を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。
【００８２】
この文脈において、「試料」は通常、臨床試料である。用いられる試料は、試験される条件に依る。用いられ得る典型的な試料には、本発明を限定することを意図したものではないが、患者、最も好ましくはヒトの患者から採取された全血、血清、血漿、血小板、及び尿の試料などが含まれる。
【００８３】
好ましい実施形態において、試験は、対象から取り出された試料に対して実施されるインビトロでの試験である。
【００８４】
さらなる実施形態において、上述した診断方法は、対象から試料を得るステップをさらに含み得る。対象から適切な試料を得る方法は、当技術分野において周知である。或いは、この方法は、別の手順において患者から既に単離されている試料で開始して実施することができる。この診断方法は、最も好ましくは、ヒトから得られた試料に対して実施されるが、本発明の方法は、多くの動物に対して診断上の有用性を有し得る。
【００８５】
本発明の診断方法は、潜在的には初期診断を確認する方法として、任意の既に利用可能な診断技術を補完するために用いることができる。或いは、本方法は、迅速且つ便利な診断手段を提供するため、それ自体で予備的な診断方法として用いられ得る。さらに、本発明の診断方法は、その固有の感度のため、最少の試料のみを必要とし、それにより、不必要な侵襲的な手術が避けられる。また、大量の、しかし濃縮されていない試料もまた、本発明の方法に従って効果的に試験することができる。
【００８６】
したがって、本発明の方法は、試料中の汚染生物の検出を超えた多様なアプリケーションを有する。本発明の第１の態様に関する上記の記載は、必要な変更を加えて本発明のさらなる態様に適用され、それは、簡潔性の理由から繰り返さない。例えば、適切な対照が、本発明のこれらの方法について包含され得る。
【００８７】
特定の実施形態において、ＮＡＤ依存性リガーゼは、病原性微生物、とりわけ病原性細菌に由来するものである。
【００８８】
細菌は、対象、好ましくはヒトの対象における感染又は疾患を引き起こし得る任意の細菌であり得る。１つの実施形態において、細菌は、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、とりわけ黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）及び好ましくはメチシリン耐性株、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、とりわけ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）種、とりわけコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、並びに／又は大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのいずれか１つ又は複数を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。特定の実施形態において、細菌は、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、とりわけクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得る。クロストリジウム・ディフィシルは、他の基礎疾患を有する高齢者の患者に最も影響する医療関連の腸内感染である、抗生物質関連の下痢及び大腸炎の主要な原因である。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明のこれらのさらなる態様に従って、（耐性、又は感染若しくは細胞に対する毒性を治療する能力について）本方法において試験される分子は、抗微生物化合物である。化合物のスクリーニング方法において、任意の分子を試験することができる。例としては、抗微生物剤、ｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子及びアンチセンス分子を含む核酸分子、小分子、抗体及びそのすべての誘導体が含まれ、この誘導体には、例えばそれらが結合親和性などを保持しているならば、Ｆａｂ断片、可変領域断片、及び単一ドメイン抗体が含まれる。本方法は、短い時間で非常に多くの分子をスクリーニングするためのハイスループットの状況において実施され得る。
【００９０】
１つの実施形態において、抗微生物剤は、２つの主なタイプの抗微生物剤、抗生物質（微生物により産生される天然物質）、及び化学療法剤（化学合成されたもの）から得られ得るか、又は、半合成抗生物質（その後修飾された天然に産生された抗生物質）若しくは合成抗生物質（天然抗生物質の合成形態）などの２つのものの混成物であり得る。
【００９１】
適切な候補抗微生物剤は、細菌又は細菌細胞又は他の適切な微生物を死滅させるか又はその増殖を抑える能力に関する、本発明の方法における陽性の結果に従って、以下の特性の少なくとも１つ又は複数について試験され得る：
（１）その候補抗微生物剤が対象に対して非毒性であり、副作用を有さないこと、
（２）その候補抗微生物剤が対象に対して非アレルギー誘発性であること、
（３）その候補抗微生物剤が対象の天然の微生物叢を排除しないこと、
（４）その候補抗微生物剤が安定であること、
（５）その候補抗微生物剤が好ましくは安価であり、入手が容易である／製造が容易であること、及び
（６）その候補抗微生物剤が、病原体の耐性が（いかなる相当な程度にも）発現しない程に十分に強力であること。この特徴は、上述された方法に従って試験され得る。
【００９２】
１つの実施形態において、複数の適切な抗微生物剤の組合せを、感染を治療する能力及び／又はそれに対する耐性について試験することができる。
【００９３】
耐性について及びおそらくはまた特定の感染を治療するそれらの新たな能力について試験し得る抗生物質又はその誘導体は、例として挙げられ、限定するものではないが、ペニシリン、とりわけペニシリンＧ又はＶなどのβ−ラクタム；並びにセファロチンなどのセファロスポリン；アンピシリン、メチシリン、及びアモキシシリンなどの半合成ペニシリン；好ましくは半合成ペニシリン調製物（例えばクラバモックス又はオーグメンチンなど）と組み合わせて用いられるクラブラン酸；アズトレオナムなどのモノバクタム；イミペネムなどのカルボキシペネム；ストレプトマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、及びゲンタマイシンなどのアミノグリコシド；バンコマイシン、リンコマイシン、及びクリンダマイシンなどの糖ペプチド；エリスロマイシン及びオレアンドマイシンなどのマクロライド；ポリミキシン及びバシトラシンなどのポリペプチド；アムホテリシン及びナイスタチンなどのポリエン；リファンピシンなどのリファマイシン；テトラサイクリンなどのテトラサイクリン類、ドキシサイクリンなどの半合成テトラサイクリン；塩化テトラサイクリン；クロラムフェニコール；ナリジクス酸及びフルオロキノロンなどのキノロン；並びにスルホンアミドなどの競合阻害剤、例えばガントリシン及びトリメトプリンからなる群から選択され得る。セフトリアキソン及び／又はニトロフルラゾンもまた用いることができる。
【００９４】
本発明の方法はまた、指定の又は特定の抗細菌剤に対して耐性である目的の細菌の存在を決定するためにも適用され得る。したがって、本発明は、試料中における、特定の抗細菌剤に対して耐性である目的の細菌の存在を決定するための方法であって、（とりわけ特定された順序で以下のステップ、即ち）
（ａ）培養の前に、特異的な捕捉試薬を用いて目的の細菌を捕捉するステップと、
（ｂ）こうして捕捉された目的の細菌を、特定の抗細菌剤を含むインキュベーション培地中でインキュベートするステップと、
（ｃ）インキュベートされた目的の細菌を、細菌の溶解を引き起こすことが可能か、又は細菌に由来する細胞内物質の存在が決定され得る程度に細菌の細胞壁の透過性を増大させることが可能な作用物質にさらすステップと、
（ｄ）目的の細菌（その透過性が増大されているか、又は溶解されている）に由来する細胞内物質の存在を決定するステップと
を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる方法を提供する。
【００９５】
目的の細菌は、特定の抗細菌剤に対して耐性であることが知られている任意の細菌であり得る。典型的には、細菌は、１つ又は複数の特定の抗細菌剤に対する耐性を有することが知られている、感染又は疾患を引き起こす細菌であり得る。特定の実施形態において、細菌は、ブドウ球菌属種、とりわけ黄色ブドウ球菌及び最も好ましくはメチシリン耐性株、腸球菌属種、連鎖球菌属種、マイコバクテリウム属種、とりわけ結核菌、ビブリオ属種、とりわけコレラ菌、サルモネラ属、並びに／又は大腸菌などのいずれか１つ又は複数を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。特定の実施形態において、細菌は、クロストリジウム属種、とりわけクロストリジウム・ディフィシルを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得る。
【００９６】
目的の細菌が耐性を有する特定の抗細菌剤は、任意の特定の抗細菌剤であり得る。抗細菌剤は、有利にはステップ（ｂ）で用いられ、ステップ（ａ）において捕捉されている可能性がある感受性細菌の増殖を抑えるか、阻害するか、又は制限する。抗細菌剤は、感受性細菌の溶解を引き起こし得るが、それは必須ではない。抗細菌剤は、本明細書において論じられるように、抗生物質若しくは化学療法剤であり得るか、又は２つのもの（半合成若しくは合成された抗生物質）の混成物であり得る。特定の細菌が耐性を有し、そのため本発明の方法において用いられ得る、抗生物質又はその誘導体は、本明細書において列挙されるものから選択され得、その列挙は必要な変更を加えて適用され得る。
【００９７】
特定の実施形態において、アンピシリン、メチシリン、及びアモキシシリンなどのβ−ラクタム抗生物質、とりわけメチシリンが、本方法において用いられる。ここで、細菌は黄色ブドウ球菌であり得、とりわけ、本方法は、試料中のＭＲＳＡを検出するために用いることができる。
【００９８】
この文脈において、「試料」は通常、臨床試料である。用いられる試料は、試験される耐性細菌のタイプに応じ得る。用いられ得る典型的な試料には、本発明を限定することを意図したものではないが、患者、最も好ましくはヒトの患者から採取された鼻、鼠径部、及び腋窩のスワブなどが含まれる。通常、本発明のこの態様の方法は、対象から取り出された試料に対して実施されるインビトロでの試験である。
【００９９】
さらなる実施形態において、上述した方法は、対象から試料を得るステップをさらに含み得る。対象から適切な試料を得る方法は、当技術分野において周知である。或いは、この方法は、別の手順において患者から既に単離されている試料で開始して実施することができる。この方法は通常、ヒトから得られた試料に対して実施されるが、本発明の方法は、多くの動物に対して診断上の有用性を有し得る。
【０１００】
ステップ（ａ）は、哺乳動物細胞及び他の細菌細胞などの他の細胞タイプを含み得る一般的な（臨床）試料から目的の細菌を捕捉するために設計される。任意の適切な特異的な捕捉試薬をこの目的のために用いることができる。特定の実施形態において、特異的な捕捉試薬は、特定の細菌種にのみ特異的であり得る。他の実施形態において、特異的な捕捉試薬は、特定の細菌株に特異的であり得る。例えば、特異的な捕捉試薬により、ブドウ球菌属を全般的に捕捉することが可能となり得るか、又は、黄色ブドウ球菌をより特異的に捕捉すること、若しくはさらに黄色ブドウ球菌のＭＲＳＡなどの抗生物質耐性株のみを特異的に捕捉することが可能となり得る。特異的な捕捉試薬は、例えばタンパク質及び／又は核酸に基づいたものであり得る。この試薬は、例えば、抗体、レクチン、受容体、及び／又は核酸に基づいた分子であり得る。「抗体」という用語は、抗原結合能を保持している、そのすべての誘導体及びバリアントを包含する。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を用いることができる。例えばヒト抗体でないものをヒト化した形態であり得る誘導体化形態もまた意図される。誘導体には、限定はしないが、重鎖抗体、単一ドメイン抗体、ナノボディ、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖなどが含まれる。
【０１０１】
特定の実施形態において、特異的な捕捉試薬は固体支持体上に固定される。任意の適切な固体支持体を用いることができる。固体支持体の性質は、目的の細菌が、その後のステップにおける増殖に悪影響を与えることなくその固体支持体上に固定され得るならば、本発明の性能にとって重大なものではない。固体支持体の非限定的な例には、ポリスチレンビーズ及びその誘導体並びに常磁性ビーズなどの任意のビーズ、アフィニティーカラム、マイクロタイタープレートなどが含まれる。必要に応じて、固定を容易にするために、ビオチン及びストレプトアビジンを用いることができる。
【０１０２】
同様に、固定の化学反応は、当業者によって通常実施される。とりわけ、目的の細菌の検出の特異性及び感度の観点から、本発明の方法に対して悪影響を有さなければ、任意の固定の手段を用いることができる。
【０１０３】
ステップ（ｂ）は、特定の抗細菌剤に対して感受性を有するがステップ（ａ）において捕捉された、任意の捕捉された細菌の増殖を抑えるか、阻害するか、又は制限するために重要である。このステップにより、目的の耐性細菌が、捕捉されるが特定の抗細菌剤に感受性を有する細菌から容易に検出及び判別され得ることが、効果的に確実となる。任意の適切なインキュベーション培地を用いることができる。特定の実施形態において、液体培地が用いられる。細菌の増殖を可能にする適切な培地は、当技術分野において周知であり、市販されている。論じられているように、インキュベーション培地は、ステップ（ａ）において捕捉された感受性を有する任意の細菌の増殖を制御するための、特定の抗細菌剤を含む。このことは、本発明の方法におけるバックグラウンドが低く維持されることを確実にし、特定の抗細菌剤に対して耐性である目的の細菌の検出の感度及び特異性が向上する助けとなる。当然のことながら、目的の細菌は抗細菌剤に対して耐性であるため、それらは増殖し続け、したがって、ステップ（ｃ）及び（ｄ）における、溶解、又は細胞透過性の増大後のそれらの高感度の及び特異的な検出が可能になる。
【０１０４】
ステップ（ｃ）により、目的の細菌の細胞内容物の放出が可能になり、それにより、ステップ（ｄ）における目的の細菌の検出が可能になる。細胞溶解を引き起こすことが可能な任意の作用物質を用いることができる。本発明の特定の実施形態において、細胞溶解を引き起こし得る作用物質は、目的の細菌に対して選択的である。しかし、特異的な捕捉をもたらすステップ（ａ）及び感受性細菌の増殖を抑えるステップ（ｂ）により、このことは必須ではない。特定の実施形態において、作用物質は、黄色ブドウ球菌に対して選択的である。さらに特定の実施形態において、細胞溶解を引き起こし得る作用物質はリゾスタフィンである。リゾスタフィンは、市販されているリゾスタフィンであり得るか、又は、本発明のリゾスタフィンであり得、この議論は、必要な変更を加えて適用される。
【０１０５】
他の実施形態において、細胞溶解を引き起こし得る作用物質はバクテリオファージである。バクテリオファージは、目的の細菌に対して選択的であり得る。別の実施形態において、この作用物質は、必要に応じて、コリシン又はミクロシンなどのバクテリオシンであり得る。しかし、溶解は、本発明のすべての実施形態において必須ではない可能性がある。とりわけ、特定の実施形態における細菌の細胞壁及び／又は細胞膜の透過性の増大は、本発明の方法に従ったＮＡＤ依存性リガーゼの活性などの細胞内物質の検出を可能にするために十分であり得る。この透過性の増大を達成するための適切な作用物質及び技術は、当技術分野において知られている。
【０１０６】
ステップ（ｄ）は、目的の細菌に由来する細胞内物質（細菌細胞の溶解又は細胞透過性の増大により生じる）の存在を決定することを含む。このステップは、当技術分野において知られている任意の適切なアッセイを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得る。例としては、例えば国際公開第９４／１７２０２号パンフレット及び国際公開第９６／０２６６５号パンフレットに記載されているような、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）に基づくもののような生物発光アッセイが含まれる。しかし、このアッセイは、或いは、ホスファターゼ又はペルオキシダーゼなどの細胞内酵素マーカーに基づいた比色アッセイ又は蛍光アッセイを含み得る。しかし、好ましい実施形態において、ステップ（ｄ）は、目的の細菌の存在の指標としてＮＡＤ依存性リガーゼを用いることを含む、本発明の検出方法を包含する。したがって、適切な核酸分子基質を、細胞内物質に添加することができる。目的の耐性細菌が試料中に存在する場合、ＮＡＤ依存性リガーゼの活性が存在し、基質はライゲーションされて、ライゲーションされた核酸分子が生成する。このライゲーションされた核酸分子の特異的な検出により、開始試料における目的の耐性細菌の存在の指標が得られる。したがって、本明細書において記載される、本発明の方法のすべての実施形態は、本発明のこの態様に適用され得る。したがって、ステップ（ｄ）は、
（ａ）試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させるステップと、
（ｂ）こうして接触させた試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下でインキュベートするステップと、
（ｃ）基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼの作用の結果生じる、ライゲーションされた核酸分子の存在を特異的に決定し、ＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物の存在を示すステップと
を包含し得る。
【０１０７】
特定の実施形態において、細胞内物質、具体的な実施形態ではＮＡＤ依存性リガーゼ活性の測定は、ステップ（ａ）の最後／ステップ（ｂ）の最初に行われる。この測定により、試験シグナルの比較対象となり得るバックグラウンドシグナルが得られ、それにより、結果の有意性に関する結論が得られる。それは、特定の抗細菌剤に対して耐性である細菌の増殖を選択的に可能にするように設計されたインキュベーションステップの前の、試料中における細胞内物質、とりわけＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基底レベルを示すものである。ステップ（ｄ）で行われた、ＮＡＤ依存性リガーゼの活性などの測定における、ステップ（ａ）の最後／ステップ（ｂ）の最初に行われたものと比較しての顕著な又は有意な増大は、特定の抗細菌剤に対して耐性である目的の細菌の存在の、信頼性のある指標である。インキュベーション（ステップ（ｂ））、及び透過性を増大させるか又は細胞溶解を引き起こすための処理（ステップ（ｃ））の後に、バックグラウンドシグナルと比較して増大がない（又は実際に低減している）場合、これは、特定の抗細菌剤に対して耐性である細菌が存在していないことの指標である。
【０１０８】
本発明の特定の実施形態において、本方法はさらに、捕捉試薬と非特異的に関連する任意の細胞又は他の物質を除去するために、ステップ（ａ）の後に洗浄ステップを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。このようなステップは、特異的な捕捉手順を扱う場合に、当業者にとって通常のことである。
【０１０９】
ステップ（ｄ）が、目的の細菌の存在の指標としてＮＡＤ依存性リガーゼを用いることを含む本発明の検出方法を包含する、好ましい実施形態において、本方法のステップは、特定された順序に制限される必要はない。とりわけ、特異的な捕捉試薬を用いる、目的の細菌を捕捉するステップ（ａ）は、最初のステップ（ｂ）、即ち特定の抗細菌剤を含むインキュベーション培地における目的の細菌のインキュベーションの後に実施され得る。したがって、本発明は、試料中における、特定の抗細菌剤に対して耐性である目的の細菌の存在を決定するための方法であって、（とりわけ特定された順序で以下のステップ、即ち）
（ａ）目的の細菌を、特定の抗細菌剤を含むインキュベーション培地中でインキュベートするステップと、
（ｂ）インキュベートされた目的の細菌を、特異的な捕捉試薬を用いて捕捉するステップと、
（ｃ）捕捉された目的の細菌を、細菌の溶解を引き起こし得るか、又は細菌の細胞壁の透過性を、細菌に由来するＮＡＤ依存性リガーゼの存在が決定され得る程度に増大し得る作用物質にさらすステップと、
（ｄ）（ｉ）試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させることと、
（ｉｉ）こうして接触させた試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下でインキュベートすることと、
（ｉｉｉ）基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼの作用の結果生じる、ライゲーションされた核酸分子の存在を特異的に決定して、ＮＡＤ依存性リガーゼを発現する微生物の存在を示すことと
により、試料中における目的の（耐性）細菌の存在を決定するステップと
を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる方法を提供する。
【０１１０】
当然のことながら、本明細書において提供される方法の様々なステップの全記載は、これらの特定の態様に適用される。捕捉の後に培養を行うという順序は、特定の実施形態において単一の培養ステップのみを必要とするため、一般的に好ましいものである。培養が捕捉の前に実施される場合、実際には、試験における十分な感度を確実にするために、捕捉後のさらなる培養ステップが必要となり得ることが明らかにされている。
【０１１１】
本発明の方法は、２つ以上の標的細菌の存在が決定されることを可能にするための１つ又は複数のさらなる介在ステップを含み得る。典型的には、これらのステップは、１つ又は複数の適切な捕捉剤を用いて複数の異なる目的の細菌を捕捉することを含み得る。同様に、本発明の方法には、多数のこのようなステップが含まれ得、それにより、他の標的細菌の存在が決定され得る。
【０１１２】
また、本発明のこれらの方法を実施するための試験キットも提供される。試験キットは、特定の実施形態において、使い捨ての試験キットであり得る。試験キットのそれぞれの構成要素は、個別の区画若しくは担体において提供され得るか、又は、構成要素が共に安定して保存され得るならば、構成要素の１つ若しくは複数を組み合わせることができる。試験キットは、特定の抗細菌剤に対して耐性である目的の細菌を捕捉するための特異的な捕捉剤を包含する。適切な捕捉剤は上記に論じられており、この議論は、必要な変更を加えて適用される。特定の実施形態において、特異的な捕捉剤に対する固体支持体がキットにおいて提供される。さらなる実施形態において、特異的な捕捉剤は、固体支持体上に事前に添加されて提供される。適切な固体支持体及び固定の手段は本明細書において記載されており、この記載は、必要な変更を加えて、本発明のこれらの態様に適用される。
【０１１３】
キットはまた、目的の細菌のためのインキュベーション培地を包含し得る。特定の実施形態において、培地は、目的の細菌が耐性を有する特定の抗細菌剤を包含する。或いは、この抗細菌剤は、独立に提供され得、本方法が実施される時のみに、培地に添加され得る。適切な培地及び特定の抗細菌剤は（対応する方法に関して）本明細書において記載されており、この議論は、必要な変更を加えて適用される。培地は、例えば凍結乾燥形態などの任意の適切な形態で提供され得る。
【０１１４】
キットはまた、目的の細菌の細胞溶解を引き起こすことが可能か、又は本発明の方法に従った細胞内物質（とりわけＮＡＤ依存性リガーゼの活性）の検出を可能にするために十分に細菌の細胞壁及び／若しくは細胞膜の透過性を増大させることが可能な、適切な作用物質を包含し得る。適切な作用物質は上記に論じられており、その議論は、必要な変更を加えて適用される。特定の実施形態において、作用物質は、本発明により提供される（機能的な）リゾスタフィンなどのリゾスタフィン、とりわけ、（本明細書において論じられるように、これらの化合物の不活性化により生じる）ヌクレアーゼ及び／又はリガーゼ汚染物質を実質的に有さないリゾスタフィン調製物である。
【０１１５】
キットはまた、溶解された目的の細菌細胞又は透過性が増大するように処理されている細胞に由来する細胞内物質の存在を決定するための手段もさらに包含し得る。任意の適切な構成要素が、用いられる特定の検出技術に応じて含まれ得る。特定の実施形態において、キットには、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の検出を可能にする構成要素が含まれる。したがって、本明細書において記載される本発明のキットは、本キットと組み合わせて、試料中における特定の抗細菌剤に対して耐性である目的の細菌の存在を決定するためのＮＡＤ依存性リガーゼに関連する検出キットを提供することができる。特定の実施形態において、キットは、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる少なくとも１つの核酸分子を包含する。２つ以上のライゲーション可能な核酸分子を含み得る適切な基質核酸分子は本明細書において論じられており、この議論は、必要な変更を加えて適用される。したがって、基質核酸分子は、特定の実施形態において、固体支持体上に固定され得るか、又は固体支持体上への固定が可能となるように固体支持体と共に提供され得る。
【０１１６】
キットはまた、特定の実施形態において、核酸増幅に必要な試薬を包含し得る。核酸増幅技術の使用により、ライゲーションされた新たな核酸分子の存在を高感度で検出することが可能になる。適切な技術及び必要な試薬は、当業者に容易に明らかとなるものである。したがって、キットはとりわけ、本明細書において非常に詳細に論じられている、ライゲーションされた核酸分子の特異的な検出のための適切なプライマーを包含し得る。キットはまた、増幅産物のリアルタイムでの検出のための適切な試薬を包含し得る。
【０１１７】
キットは、反応が生じる場である適切な担体を包含し得る。有利には、このような担体は、例えば４８又は９６ウェルプレートなどのマルチウェルプレートを含み得る。このような担体により、検出方法が比較的少量で実施されることが可能となり、それにより、スケールアップ及び必要な試料の量の最少化が容易になる。
【０１１８】
キットは、典型的には、適切な指示書を包含する。これらの指示書により、本発明の方法を本発明のキットを用いて高い信頼性で実施することが可能になる。
【０１１９】
１つの特定の態様において、本発明の方法は、血小板試料の細菌汚染を検出するために用いられる。
【０１２０】
したがって、血小板（含有）試料中における細菌汚染の存在の指標としてＮＡＤ依存性リガーゼを検出する方法であって、
（ａ）血小板試料を、試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる核酸分子と接触させるステップと、
（ｂ）こうして接触させた試料を、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性に適した条件下でインキュベートするステップと、
（ｃ）基質核酸分子に対するＮＡＤ依存性リガーゼの作用の結果生じる、ライゲーションされた核酸分子の存在を特異的に決定して、血小板（含有）試料中における細菌汚染の存在を示すステップと
を含む方法が提供される。
【０１２１】
特定の実施形態において、血小板の細菌汚染を検出するための方法は、さらなるサブステップを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。これらのサブステップは、例えば、
（ｉ）細菌細胞をインタクトなままとする条件下での血小板の溶解。これにより、主に、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性の存在についての試験の前に細菌細胞を選択的に濃縮することが可能となる。したがって、哺乳動物細胞によってもたらされる任意のＡＴＰ依存性リガーゼの活性は、試験の前に除去され得る
（ｉｉ）細菌の濃縮（例えば、遠心分離して細菌細胞を含有するペレットを産生することによる）
（ｉｉｉ）細菌の溶解、又は細菌の透過性を増大させてＮＡＤ依存性リガーゼを放出させるための処理
を含み得る。
【０１２２】
本発明の方法の様々な実施形態の記載は、必要な変更を加えてこの特定の利用に適用され、それは、簡潔性の理由から繰り返さない。
【０１２３】
本発明はまた、本発明の様々な方法の実施を可能にし、その実施に適したキットを提供する。
【０１２４】
したがって、さらなる態様において、本発明は、
（ａ）試料中のＮＡＤ依存性リガーゼ活性の基質となる少なくとも１つの核酸分子、
（ｂ）基質核酸分子を固定するための手段、並びに／若しくは
ＮＡＤ依存性リガーゼを特異的に捕捉するための試薬、並びに／若しくは
試料中におけるＮＡＤ依存性リガーゼの活性を含む細菌細胞若しくは他の微生物を選択的に溶解するため、又は細菌細胞若しくは他の微生物の透過性を増大させてＮＡＤ依存性リガーゼ活性の検出を可能にするための手段、並びに／若しくは
ＮＡＤ依存性リガーゼの活性を含まない、試料中における任意の細胞（例えば、哺乳動物細胞など、とりわけ血小板試料中における血小板）を選択的に溶解するための手段、並びに／若しくは
試料中のＡＴＰ依存性リガーゼの活性を阻害するための手段、並びに／若しくは
（ライゲーションされていない基質が、ライゲーションされた核酸分子の検出の感度及び／又は特異性に影響することを防ぐための）ライゲーションされていない基質分子を選択的に除去するための手段
を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる、本発明の方法の１つを実施するためのキットを提供する。
【０１２５】
本発明の方法（及び他のキット）に関して示される実施形態は、必要な変更を加えて適用され、それは、簡潔性の理由から繰り返さない。したがって、すべての必要な構成要素及び本発明の方法を実施するために必要な試薬は、本発明のキット内に包含され得る。とりわけ、基質核酸分子には、ＮＡＤ依存性リガーゼによりライゲーションされ得るｄｓＤＮＡ構成要素が含まれる。具体的な例は、（本明細書における詳細な説明において示されるように）それぞれ配列番号１から４並びに／又は７及び８として示されるヌクレオチド配列を含む核酸基質から選択され得る。それぞれ配列番号１〜４として示されるヌクレオチド配列を含む４つの核酸分子は、本発明の１つの態様において、ライゲーション可能な相補的な５つのヌクレオチドのオーバーラップを有する基質分子を形成し得る。さらなる態様において、配列番号７及び８として示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子は、ハイブリダイズして、ニックを有する二本鎖区域を含む基質分子を形成し得る。
【０１２６】
本発明のキットはまた、検出すべき細菌細胞又は他の微生物を他の（リガーゼ産生）細胞から分離するための、適切なフィルターを含み得る。このようなフィルター並びに濾過システム及び濾過方法は、当技術分野において周知であり、市販されている（例えばＮｅｗ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．から）。本発明のキットはまた、ＮＡＤ依存性リガーゼの活性が存在しているかを決定する前に標的細胞又は標的生物を単離することを可能にするための、適切なフィルター又は濾過機構若しくは濾過システムを包含し得る。
【０１２７】
さらに、特定の細菌細胞又は他の微生物はまた、その細胞又は微生物に結合し得る特異的な試薬を用いることによって選択及び／又は単離され得る。適切な試薬には、タンパク質及び核酸に基づいた試薬の両方が含まれる。例としては、抗体、レクチン、受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが含まれる。したがって、本発明のキットはさらに、目的の１つ又は複数の細菌を単離するための適切な試薬を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。特異的な結合親和性を保持している抗体及びその全誘導体（Ｆａｂ断片、単一ドメイン抗体、及び可変領域断片など）が、「抗体」という用語の定義に含まれる。
【０１２８】
本明細書において論じられるように、基質核酸分子は、固体支持体上に固定され得る。固体支持体上への基質核酸分子の固定により、試料からのＮＡＤ依存性リガーゼの効果的な捕捉が可能になる。ＮＡＤ依存性リガーゼと固定された基質核酸分子との相互作用の結果、ライゲーションされた新たな核酸分子が生成する。したがって、本発明のキットはさらに、固体支持体を含み得る。基質は、固体支持体上に事前に添加されてもよいし、又は添加されなくてもよい。基質が固体支持体上に事前に固定されていない場合、固定を可能にする適切な試薬が、場合によっては適切な指示書と共に、キットにおいて提供されてもよい。固定を可能にする試薬は、当業者に周知である。固定の任意の手段を、とりわけ１つ又は複数の標的細菌細胞又は標的微生物に由来するＮＡＤ依存性リガーゼの検出の特異性及び感度の観点から、本発明の方法の実施に悪影響を与えないならば、用いることができる。
【０１２９】
任意の適切な固体支持体が本発明のキットに含まれ得る。固体支持体の性質は、基質核酸分子が、核酸分子と相互作用する酵素の能力を含むＮＡＤ依存性リガーゼの活性に悪影響を与えることなくその固体支持体上に固定され得るならば、本発明の性能にとって重大なものではない。固体支持体の非限定的な例には、ポリスチレンビーズ及び常磁性ビーズ並びにその誘導体などの任意のビーズ、アフィニティーカラム、マイクロタイタープレートなどが含まれる。基質核酸分子が、実際には、共にライゲーションされる２つ（以上）の核酸分子である場合、基質核酸分子のいずれか１つ又は両方が固体支持体上に固定され得る。特定の実施形態において、個別の基質核酸分子を、互いに、同一の支持体上に固定することができる。これにより、分子が近接することが可能になり、それにより、試験下にある試料中にＮＡＤ依存性リガーゼが存在する場合、ライゲーションが効率的となることが保証される。例えば、ビオチン及び／又はストレプトアビジン試薬が、固定を容易にするために、キット内に包含され得る。
【０１３０】
さらなる実施形態において、本発明のキットはさらに、核酸増幅に必要な試薬を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。好ましくは、試薬は、本明細書において論じられる増幅技術のいずれか１つを実施するためのものである。核酸増幅を実施するための試薬は市販されており、当技術分野においてよく特徴付けされている。適切な試薬の例には、ライゲーションされた新たな核酸分子を増幅するために設計された適切なプライマーが含まれる。本発明の方法に関するプライマーの設計の議論は、本明細書において、必要な変更を加えて適用される。したがって、本発明の適切なプライマーは、ライゲーションされた核酸分子（例えば、それぞれ配列番号５及び６又は９及び１０で示される）を検出するための適切なキット内に包含され得る。様々なバリアント（ホットスタートバリアントを含む）が利用可能なＴａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼ、並びにＫＣｌ及び（ＮＨ４）２ＳＯ４などの緩衝液もまた含まれ得る。
【０１３１】
関連する実施形態において、キットはさらに、リアルタイム又はエンドポイントでの核酸増幅産物を検出するための試薬を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。キットには、本明細書において開示される蛍光に基づいた任意のシステムを用いる、リアルタイム又はエンドポイントでの増幅及び検出を実施するための試薬が含まれ得る。これらの方法において用いるための適切な試薬は、当技術分野において周知であり、市販されている。
【０１３２】
適切な試薬の例には、配列特異的プローブが含まれる。これらのプローブは、新たな核酸分子を増幅するために用いられるプライマーの間において結合し得、それにより、増幅された核酸分子に結合して、増幅の際に形成される生成物のレベルの直接的な指標を提供し得る。このようなプローブの設計は、当業者には通常のことである。或いは、例えば増幅産物のリアルタイム又はエンドポイントでの検出を可能にするアンプリフロールシステム及びスコーピオンシステムにおいて、適切なプライマーが設計される必要がある場合がある。したがって、本発明のキットは、例えば、ヘアピンプライマー（アンプリフロール）、ヘアピンプローブ（分子ビーコン）、加水分解プローブ（タックマン）、ＦＲＥＴプローブ対（ライトサイクラー）、ヘアピンプローブを包含するプライマー（スコーピオン）、蛍光染料（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎなど）、ＤＮＡｚｙｍｅ及び切断可能な蛍光ＤＮＡｚｙｍｅ基質（ＤｚＹＮＡ）の相補的配列を包含するプライマー、又はオリゴヌクレオチド保護物を包含し得る。適切な加水分解プローブは、配列番号１１として示される。
【０１３３】
任意の適切なフルオロフォアが、標識のために、又は関連するプライマー若しくはプローブの一部として、本発明の範囲内に含まれる。本発明のキット内に含まれる可能性があり得るフルオロフォアには、例として、ＦＡＭ、ＨＥＸ（商標）、ＮＥＤ（商標）、ＲＯＸ（商標）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）（商標）などが含まれる。同様に、本発明のキットは、単一の消光物質には限定されない。例えばＤａｂｃｙｌ及びＴＡＭＲＡである消光物質は、本発明の方法において用いられ得る、及び本発明のキット内に含まれ得る、周知の消光分子である。
【０１３４】
本発明のキットはまた、増幅産物の検出に用いられ得る、又は増幅（チップ上での増幅）及び増幅産物の検出に用いられ得る、マイクロアレイなどの、上述したもの以外の、ＰＣＲ産物の生成及び検出に必要なさらなる構成要素も含み得る。他の構成要素にはさらに、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより記載されている「マイクロ流体カード」、ＬＩＰＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍにより記載されているような、又はＵｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ＵＬＳ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｋｒｅａｔｅｃｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））により記載されているような、リバースハイブリダイゼーションストリップが含まれ得る。このような構成要素は、当技術分野において知られており、例として列挙され、本発明のキットにおける包含物を制限するものではない。
【０１３５】
本発明のキットを用いて試験するための試料は、上記に定義されたように、任意の適切な試料であり得る。
【０１３６】
さらに、細菌細胞又は微生物を標的とせず、アッセイシステムに対するリガーゼの活性に寄与し得る他の細胞を溶解する溶解試薬が、本発明のキットに含まれ得る。検出される細菌又は他の微生物の細胞を好ましくは溶解しない適切な試薬には、例として、また限定するものではないが、アルコール、塩などが含まれ、また、どのような細菌又は他の微生物が検出されるかに依って、プロテイナーゼＫ及びクロロホルムなどの試薬も含まれ得る。血小板の細菌汚染を検出するための特定のアプリケーションにおいて、炭酸ナトリウム及び両性洗浄剤を適切な濃度で用いて血小板を選択的に溶解し、任意の細菌細胞をインタクトなままとすることができる。したがって、キットは、これらの構成要素を包含し得る。
【０１３７】
本発明のキットはさらに、試料からＡＴＰを除去するか又はなくし、それにより、細菌の検出に影響する、試料中における任意のＡＴＰ依存性リガーゼの活性を抑えるための酵素を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得る。特定の実施形態において、酵素は、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、及びピロホスファターゼのいずれか１つ又は複数を含み、それは、これらの酵素のすべてが、試料中における非標的細胞又は非標的生物に由来するＡＴＰシグナルをなくすために用いられ得るためであり、さもなければこのＡＴＰシグナルにより偽陽性の結果が生じ得る。適切な（保存）緩衝液などの、これらの酵素に適切な試薬が、キットに含まれ得る。
【０１３８】
本発明のキットはさらに、検出される細菌又は他の微生物の細胞を溶解し、それによりＮＡＤ依存性リガーゼを放出するための試薬を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得る。適切な試薬には、例として、また限定するものではないが、フェノール、クロロホルム、プロテイナーゼＫ、及びリゾスタフィン、とりわけ本発明のリゾスタフィンが含まれる。ＮＡＤ依存性リガーゼ活性の検出を可能にするために細胞の透過性を増大させるための作用物質も同様に、本明細書において論じられるように包含され得る。
【０１３９】
本発明のキットはさらに、試料中において検出されるＮＡＤ依存性リガーゼの活性を引き起こす細菌又は他の微生物と関連する核酸分子を分解するための、１つ又は複数のヌクレアーゼを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり得る。これは、例えば非特異的なライゲーション事象を防ぐために有利であり得る。しかし、これは絶対条件でない可能性があり、それは、基質核酸分子が、（そのバイアビリティーが）検出される細菌又は他の微生物の核酸分子と相同ではないように設計され得るためである。したがって、ライゲーションされた新たな核酸分子の特異的な検出は、「汚染」内因性核酸の存在下でなされ得る。このことは上記に詳細に論じられており、この議論及び実施形態は、必要な変更を加えて、本発明のキットに適用される。
【０１４０】
上記に述べたように、キットは、ライゲーションされていない基質分子を選択的に除去するための手段を含み得る。これは、ライゲーションされていない基質が、ライゲーションされた核酸分子の検出の感度及び／又は特異性に影響することを防ぐために役立つ。特定の実施形態において、ライゲーションされていない基質分子を選択的に除去するための手段は、１つ又は複数の選択的なヌクレアーゼを含む。とりわけ、１つ又は複数のエキソヌクレアーゼを用いて、ライゲーションされていない基質分子を除去することができる。特定の実施形態において、ＥｘｏＩＩＩ、ＥｘｏＩ、及び／又はＥｘｏＴなどの３’−５’エキソヌクレアーゼを用いて、ライゲーションされていない基質分子を消化する。とりわけ、ライゲーションされた核酸分子が、試料中におけるＮＡＤ依存性リガーゼの活性によりライゲーションされるニックを含む二本鎖領域を共に形成する、少なくとも３つの基質核酸分子から形成される場合、ＥｘｏＩＩＩなどのｄｓＤＮＡ特異的な３’−５’エキソヌクレアーゼと、ＥｘｏＩ及び／又はＥｘｏＴなどのｓｓＤＮＡ特異的な１つ又は複数の３’−５’エキソヌクレアーゼとの組合せが、有利にはキットに包含され得る。
【０１４１】
特定の実施形態において、キットには、すべての構成要素が同一の区画又は保存容器内において提供されることを可能にする、適切な緩衝液が提供される。したがって、完全なキットは、完全な（均質な）反応混合物として基本的に提供される。したがって、本発明の方法は、単一の反応ステップで実施され得、それにより、試料の交差汚染の可能性が低減し、また、迅速に結果が得られる。リアルタイム又はエンドポイントでの結果をもたらす反応混合物が特に好ましい。好ましくは、このような反応混合物は水性組成物であるが、例えば滅菌水又は蒸留水を用いて再構成するための乾燥粉末として提供され得る。
【０１４２】
好ましくは、含まれる試薬により、ＴＭＡなどの等温増幅技術を用いることが可能になる。試薬により、（ＴＭＡなどの）等温増幅技術がリアルタイム又はエンドポイントで実施されることが可能となり得る。
【０１４３】
本発明のすべてのキットには、本発明の方法のいずれか１つにおいて用いるための適切な指示書が提供され得る。指示書は、挿入物として、例えばキットの包装の内部に提供される冊子として提供され得るか、及び／又は、例えばキットの包装上に印刷され得る。
【０１４４】
したがって、またさらなる態様によれば、本発明は、本発明の方法を実施するために必要なすべての構成要素を含む反応混合物を表面に塗布するための噴霧（ｓｐｒａｙ）装置を提供する。任意の適切な噴霧装置が用いられ得、それは、例えばポンプスプレー又はエアロゾル化した装置であり得る。このような装置は、表面上の細菌の検出、又は任意の供給源に由来する任意の汚染微生物の検出が必要な多くの状況において適用され得る。例えば、食品が準備される場合、食品の準備の後に表面を洗浄した後に、その表面上に潜在的に有害な細菌細胞又は微生物が残っていないことを確実にし得ることが有利である。このことにより、表面が「清潔」となり、さらなる食品の準備に用いられ得ることが確実となる。噴霧装置はまた、ＮＡＤ依存性リガーゼの活性を検出することにより、衛生のモニタリングへの適用において表面上の細菌汚染を検出するためにも用いることができる。したがって、（生存能力を有する）細菌のマーカーとしてのこの酵素の存在は、何らかの形の汚染がこの表面上に存在していることを示す。等温ＤＮＡ増幅方法の使用は、表面上におけるＮＡＤ依存性リガーゼ活性の検出に好ましい。ＴＭＡなどの適切な例が上記に述べられている。
【０１４５】
本発明は、以下に説明する添付の図面及び実施例を包含する詳細な説明によりさらに規定され、またそれに関して理解されるものである。
［発明の詳細な説明］
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】細菌の酵素であるＮＡＤ依存性リガーゼを検出する、本発明のリガーゼ介在性アッセイの概略図である。ＮＡＤ依存性リガーゼは、真正細菌（２）においてのみ見られ、哺乳動物においては報告されていない。したがって、この技術は、迅速且つ高感度に検出されない場合には宿主からのバックグラウンドが問題となる臨床試料における、迅速且つ高感度の細菌の検出における使用に理想的である。本発明の方法のさらなる利点は、ＮＡＤ依存性リガーゼがＮＡＴ増幅の前にＤＮＡプライマーの多くの分子を生成するため、システムにおいてさらなる増幅ステップが存在することである。したがって、このアッセイは、感度の高いアプローチであり、現在は、大腸菌及び黄色ブドウ球菌に対する検出限界は、培養試料において１００から１０００個の細胞の範囲である。
【図２】様々な反応条件（さらなるＮＡＤ＋を伴う又は伴わない状態、及びゲンタマイシン処理を伴う又は伴わない状態）についての、時間に対する相対的な増幅のプロットを示す図である。
【図３】本発明の方法を用いる、黄色ブドウ球菌の検出のためのプロトコルを示すフローチャートである。
【図４】黄色ブドウ球菌細胞の希釈を示す図である。本発明の方法（ＬｉＭＡ−２と呼ばれる）及びリアルタイムＰＣＲ（タックマン）を用いた検出。左から右へ、曲線は、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０、０個の細胞及びＰＣＲブランクを示す。
【図５】抗生物質に対する黄色ブドウ球菌細胞の感受性を示す図である。１０４個の細胞を培地に添加し、左から右へ、Ｔ＝５時間の培養（オキサシリンなし）、Ｔ＝０時間、及びＴ＝５時間の培養（オキサシリンを添加）のＰＣＲの形跡が示される。
【０１４７】
実施例１．血小板汚染の検出
原理
血小板の細菌汚染は、血小板を選択的に溶解した後に、細菌細胞を溶解し、細菌のリガーゼを検出することにより検出することができる。哺乳動物のリガーゼは補因子としてＡＴＰを用いる一方で細菌のリガーゼはＮＡＤ＋を用いるため、任意の哺乳動物の汚染リガーゼはこのアッセイによっては効率的に検出されない。このケースにおいて、リガーゼ緩衝液には細菌の特異的ＮＡＤ＋補因子が補充される。細菌のリガーゼは、５つの塩基からなる相補的な突出を有する２つの合成ＤＮＡ二本鎖のライゲーションにより検出される。ライゲーションされると、ライゲーションされた分子は、ライゲーションの結合部を横切るＰＣＲによって検出される。
【０１４８】
方法
１．  ０．５ｍｌの血小板（アフェレーシスにより回収された）に、既知の数の大腸菌、黄色ブドウ球菌、及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細菌をスパイクした（事前の培養及び計数による評価）。
２．  スパイクされた試料は、５０ｍＭの炭酸ナトリウム及び１％（ｗ／ｖ）の両性洗浄剤で作製し、最終体積を１ｍｌとした。
３．  ５分間インキュベーションして血小板を溶解した後、４ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）を１００μｌ添加した。
４．  細菌を６０００×ｇで５分間遠心分離することによりペレット化し、上清を除去した。
５．  ２０μｌのＢＰｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加し、５分間インキュベートして細菌細胞を溶解した。
６．  次に、２μｌの細菌溶解物を、２μｌの１０×大腸菌リガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、それぞれ２μｌ（２０ｎｇ）のＤＮＡ基質Ｓ１／ＡＳ１及びＳ２／ＡＳ２を含むリガーゼ反応物に添加し、最終体積を２０μｌとした。ＤＮＡ基質は、ライゲーション可能な５つの塩基からなる相補的なオーバーラップ、即ち
Ｓ１  ５’ＧＣＣＧＡＴＡＴＣＧＧＡＣＡＡＣＧＧＣＣＧＡＡＣＴＧＧＧＡＡＧＧＣＧＣＡＣＧＧＡＧＡＧＡ３’（配列番号１）
ＡＳ１  ３’ＴＡＴＡＧＣＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＴＴＣＣＧＣＧＴＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＴＧＣ５’、５’末端でリン酸化されている（配列番号２）
Ｓ２  ５’ＣＣＡＣＧＡＡＧＴＡＣＴＡＧＣＴＧＧＣＣＧＴＴＴＧＴＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＴＡ３’、５’末端でリン酸化されている（配列番号３）
ＡＳ２  ３’ＴＴＣＡＴＧＡＴＣＧＡＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴ５’（配列番号４）
を有する４つの合成オリゴから形成した。
基質は、等モル濃度のＳ１及びＡＳ１を９３℃で混合し、室温まで冷却することで形成した。同様に、Ｓ２及びＡＳ２を同様の方法で形成した。
７．  室温で３０分放置した後、２μｌのライゲーションされた生成物をＰＣＲによって調べた。
８．  リアルタイムＰＣＲ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、並びにフォワードプライマー５’ＧＧＡＣＡＡＣＧＧＣＣＧＡＡＣＴＧＧＧＡＡＧＧ３’（配列番号５）及びリバースプライマー３’ＣＧＡＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴ５’（配列番号６）を含むものであり、９４℃で１０秒間の変性、６５℃で１５秒間のアニーリング、及び７２℃で１５秒間の伸長を伴うものであった。
【０１４９】
【表１】
2010532986.tif 000003
【０１５０】
考察
１０倍希釈の細菌をスパイクすると、ＰＣＲシグナルの、対応する滴定が得られた。ＰＣＲの結果から、わずか１０個の細菌が、０．５ｍｌの血小板内にスパイクされて検出され得ることがわかる。同様の結果が、血小板の溶解のための炭酸ナトリウムを硫酸アンモニウムで置き換えても得られた。
【０１５１】
実施例２．薬剤感受性試験
原理
生じるＰＣＲシグナルは、ＤＮＡ基質のライゲーションされた分子の数に関連し、この分子の数は、存在するリガーゼ分子の数に関連する。同様に、存在するリガーゼ分子の数は、細菌のバイアビリティーに依存する。所与の細菌を培養すると、細菌が健康であり、増殖して数が増大している場合、存在するリガーゼは徐々に増え、それによりより多くのライゲーション及びより多くのＰＣＲシグナルが生じる。細菌が健康ではなく、生存能力を有さないか又は死んでいる場合、培養してもリガーゼは増大せず、リガーゼ分子の数は減少するとさえ予想され得、それは生じるライゲーション及びＰＣＲシグナルの量に反映される。この実施例において、本発明者らは、抗生物質に対する生物の感受性について試験した。抗生物質の存在下及び不在下で培養することにより、異なる時点で細菌のリガーゼから生じるシグナルを比較することができる。さらに、この実験は、ＮＡＤ＋補因子を添加した状態及び添加しない状態で行うことができる。添加された補因子の存在下では、リガーゼは多くのライゲーションステップを繰り返し得る。添加された補因子の不在下では、リガーゼは、ライゲーションについて、内因性の細菌ＮＡＤ＋に依存しなくてはならない。これらの２つの条件は、したがって、細菌細胞の健康状態の２つの異なる評価基準である。
【０１５２】
方法
１．  ５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む１０ｍｌの培地（ＬＢ  ｂｒｏｔｈ）に、大腸菌１０４個／ｍｌを接種し、３時間インキュベートした。３０分の時点で、１ｍｌの培養物を取り出し、時間が経過するまで氷の上に置いた。
２．  次に、細菌を６０００×ｇで５分間遠心分離することによりペレット化し、上清を除去した。
３．  ここからのプロトコルは、リガーゼ反応をＮＡＤ＋を添加した状態及び添加しない状態で実施したことを除き、実施例１のステップ３から８と同一であった。
【０１５３】
【表２】
2010532986.tif 000004
【０１５４】
結果はグラフで示され得、ここで、各時点での、及びそれぞれの条件についての増幅因子は、時間０の時点と比較してプロットされる（図２を参照されたい）。
【０１５５】
考察
このアッセイは、抗生物質感受性試験として良好に機能するものである。ゲンタマイシンの存在下では、細菌のリガーゼに由来するシグナルはインキュベーションで増大しない。しかし、ゲンタマイシンの不在下では、各時点で、ライゲーション及び関連するＰＣＲシグナルが徐々に増大する。これは、大腸菌の増殖及びバイアビリティーを反映するものである。この実施例において、１０４個の大腸菌のみを元の接種材料として用いたが、このことは、このアプローチが高感度であることを示す。ライゲーション緩衝液にＮＡＤ＋を含めると、リガーゼ酵素が、ＤＮＡ基質の多くの分子を繰り返すことが可能になり、したがって、検出の感度が増大する。しかし、外因性ＮＡＤ＋の不在下では、細菌酵素は細菌のＮＡＤ＋を用いなければならず、シグナルが遅延しても、時点０とその後の時点との間のシグナルに大きな差異が存在する。これは、生存能力を有さない細菌が有する利用可能なＮＡＤ＋のレベルが低減することを反映している。
【０１５６】
実施例３．核酸の捕捉の後の細菌リガーゼの検出
この実施例は、固定された核酸基質を用いて、細菌のリガーゼが溶液から捕捉され得ることを示すものである。この実施例は、実施例１に基本的に類似していたが、核酸基質は、３’末端でビオチニル化されたＡＳ１の合成を介して、ストレプトアビジンビーズ上に固定された。
【０１５７】
方法
１．  まず、この方法は、０．５ｍｌの血小板（アフェレーシスにより回収された）を用い、既知の数の大腸菌、黄色ブドウ球菌、及び緑膿菌細菌をスパイクした（事前の培養及び計数による評価）、実施例１のステップ１〜５と同一であった。
２．  ２０μｌのＢＰｅｒを用いて細菌細胞を溶解した後、ＮＡＤ＋を含まない１×リガーゼ緩衝液を用いて溶液を１００μｌとした。
３．  核酸二本鎖Ｓ１／ＡＳ１を、ＡＳ１を３’末端でビオチニル化し、二本鎖が２０μｌのビーズ当たり２０ｎｇの二本鎖の濃度でストレプトアビジンビーズ（Ｓｉｇｍａ）に結合していることを除き、上記に記載したようにして形成した。固定されたＳ１／ＡＳ１を有する２０μｌのビーズを、上記のステップ２から得られた溶解物に添加し、１０分間インキュベートした。
４．  リガーゼが付着したビーズを磁石を用いて回収し、ＮＡＤ＋を含む１×リガーゼ緩衝液及び２０ｎｇの核酸二本鎖Ｓ２／ＡＳ２を含む２０μｌのライゲーション反応物内に置いた。
５．  ３０分間のライゲーションの後、反応物を９５℃で５分間加熱し、２μｌを、実施例１のステップ８において記載したようにＰＣＲに供した。
【０１５８】
【表３】
2010532986.tif 000005
【０１５９】
考察
この実施例は、細菌から放出されたリガーゼが、その後のライゲーションの前に、固定された核酸基質上に捕捉され得ることを示すものである。このアプローチによりリガーゼが濃縮され、放出されたリガーゼの大部分を分析することが可能になる。これにより、より感度の高い検出が得られ、それは、所与の数の生物についてのＰＣＲ分析が初期のサイクル数で陽性となることに反映される。
【０１６０】
実施例４．黄色ブドウ球菌からのＮＡＤ依存性リガーゼの検出
培地洗浄ステップ：
１ｍｌの新鮮な黄色ブドウ球菌培養物（１０６個細胞／μｌ）を採取し、８０００ｒｐｍで５分間回転させ、１ｍｌの脱イオン水にペレットを再懸濁し、１０２個細胞／μｌまでの一連の１０倍希釈物に希釈する。
【０１６１】
溶解／ライゲーション混合物
２μｌの「１０×リガーゼ緩衝液」の添加（４ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、２６μＭのＮＡＤ＋、３０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８））
ＤＮＡ基質＊＊（「アンカー及び鋳型」）    １μｌ（１００ｎｇ／μｌの最終濃度にアニーリングされた）
熱処理したリゾスタフィン              ２μｌ＊
１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００          ２μｌ
非特異的ＤＮＡ  １００μＭ            ０．２μｌ（一本鎖オリゴマー）
脱イオン水                            １２．８μｌ
１μｌの関連する黄色ブドウ球菌培養物の希釈物の添加
室温で３０分間のインキュベーション
＊１０ｍｇ／ｍｌのストックのリゾスタフィンを採取し、ＮＡＤ＋を添加することなく１×最終リガーゼ緩衝液中で１０倍希釈し、５５℃で５分間加熱し、次に再び１０倍希釈する。リゾスタフィンの熱処理により、溶液から汚染ヌクレアーゼ及び汚染リガーゼが除去され、それによりその後のＮＡＤ依存性リガーゼのアッセイにおいてバックグラウンドが減りシグナルロスの問題がなくなることに注意されたい。
＊＊ハイブリダイズするとニックを有する二本鎖区画を生成する２つの構成要素。
アンカー：
５’−ＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＡＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＡ−３’（配列番号７）
鋳型：５’Ｐ−
ＧＴＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＧＧＣＧＴＡＧＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＴＣＴＡＣＧＡＧＴＣＴＡＣＧＡＧＴＴＣＴＡＣＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡ−３’（配列番号８）
【０１６２】
ライゲーションされていない基質の処理
上記のライゲーションステップの後、２μｌの以下のヌクレアーゼ混合物をそれぞれの試験管に加える。
１０×希釈のＥｘｏＩＩＩ  ２μｌ
ＥｘｏＩ  ２μｌ
ＥｘｏＴ  ２μｌ
１００倍希釈の「１０×リガーゼ緩衝液」（ＮＡＤ＋を含まない）  １４μｌ
３７℃で３０分間のインキュベーション
９５℃で５分間の加熱（エキソヌクレアーゼを不活性化させるため）
【０１６３】
ＰＣＲステップ
２μｌをＰＣＲマスターミックスに添加し、サイクルは、
９０℃で１０分間を１回、次に、
９０℃で５秒間を４０回、
６０℃で１０秒間を４０回
である。
使用：
プライマー１  ５’−ＧＡＧＴＣＴＡＣＧＡＧＴＣＴＡＣＧＡＧＴＴＣＴ−３’（配列番号９）
プライマー２  ５’−ＴＣＡＴＣＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＡＣＴＧＣ−３’（配列番号１０）
タックマンプローブ  ５’ＦＡＭ−ＣＴＣＡＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣ−３’ＴＡＭ（配列番号１１）二重標識ＨＰＬ（５’フルオレセイン及び３’ＴＡＭＲＡ消光物質）
を用いる。
【０１６４】
結果
図３は、ＬｉＭＡ−２技術を用いた黄色ブドウ球菌の検出のためのアッセイプロトコルを示す。図４は、タックマンアプローチを用いた「リアルタイム」ＰＣＲアッセイで得られた黄色ブドウ球菌の連続希釈からの典型的なデータを示す。この実験における検出限界は、１０から１００個細胞であると推定された。図５は、培地への抗生物質の添加の効果を示し、ＮＡＤ依存性リガーゼの含有量は、抗生物質の存在下で４時間放置した後、２×１０３倍超低下する。
【０１６５】
結論
本発明者らは、ＮＡＤ依存性リガーゼが、生存能力を有する細菌細胞についての有用なマーカーであり、核酸鋳型に基づく技術を用いて非常に高感度で検出され得ることを示した。黄色ブドウ球菌に対する検出限界が非常に低いことは、ＬｉＭＡ−２技術が、細菌の検出に現在利用可能な最も感度の高い方法の１つであることを示す。
【０１６６】
参考文献
Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  ＫＪ、Ｏｒｇｅｌ  Ｌ、Ｗａｈｌ  Ｇ、Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ＴＲ、Ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ  ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｌｉｇａｓｅ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｃｈｅｍｅ．Ｇｅｎｅ．１９９０年、４月３０日、８９（１）：１１７〜２２頁
Ｃｏｍｐｔｏｎ  Ｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１年３月７日、３５０（６３１３）：９１〜２頁
Ｆａｈｙ  Ｅ、Ｋｗｏｈ  ＤＹ、Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ＴＲ、Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（３ＳＲ）：ａｎ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ＰＣＲ、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ、１９９１年８月；１（１）：２５〜３３頁、概説
Ｔｈｅ  ＬｉＭＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＡＴＰ  ｏｎ  ａ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ｂａｎｉｎ  Ｓ、Ｗｉｌｓｏｎ  ＳＭ、及びＳｔａｎｌｅｙ  ＣＪ（２００７年）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３、２０３４〜２０３６頁
Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｌｉｇａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｃａｏ  Ｗ（２００４年）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（１）、３８〜４４頁
【０１６７】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な変更が、上記の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されるものである。さらに、本明細書において記載されているすべての実施形態は、広く適用可能であり、必要に応じて、ありとあらゆる他の整合する実施形態と組合せ可能であると考えられる。
【０１６８】
様々な刊行物が本明細書において引用されており、その開示は、参照により、その全体が組み込まれる。
【図１】
2010532986.tif 000006
【図２】
2010532986.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2010532986000001.app
【国際調査報告】
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