(57)【要約】  （ｉ）タンパク質精製の必要なく、精製及び／又は三次元構造解析に適した界面活性剤条件をスクリーニングするのに、ＳＰＰシステムを用いて産生された同位体濃縮膜タンパク質を使用するため、（ｉｉ）ハイスループット試験及び膜タンパク質ＮＭＲ試験に適した２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ濃縮タンパク質を産生するために、及び（ｉｉｉ）タンパク質中、１３Ｃ−１５Ｎ特異的ペプチド結合で標識するために（本明細書中、ＳＰＰ−ＰＢＬと呼ばれる）、タンパク質ＮＭＲによる大腸菌の単一タンパク質産生（ＳＰＰ）技術（ＳＰＰ−ＮＭＲ）のセットが本明細書中に開示される。
2010521191.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼ及び標的タンパク質を別々に誘導可能な単一タンパク質産生核磁気共鳴（ＳＰＰ−ＮＭＲ）システム。
【請求項２】
前記ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼがＭａｚＦである、請求項１に記載のＳＰＰ−ＮＭＲシステム。
【請求項３】
前記ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼがテトラサイクリンで誘導される、請求項１に記載のＳＰＰ−ＮＭＲシステム。
【請求項４】
前記標的タンパク質がＩＰＴＧで誘導される、請求項１に記載のＳＰＰ−ＮＭＲシステム。
【請求項５】
標的タンパク質を誘導する方法であって、
ｉ．ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子と、前記標的タンパク質をコードする遺伝子とを含むベクターを、該ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼを誘導するのに適した組成物と接触させること、及び
ｉｉ．前記ベクターを前記標的タンパク質を誘導するのに適した組成物と接触させることを含み、それぞれの工程が連続して行われる、標的タンパク質を誘導する方法。
【請求項６】
ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼをコードする前記遺伝子がｍａｚＦ遺伝子である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｉの後にバックグラウンドタンパク質を排除する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターを同位体濃縮培地と、工程ｉの後に該培地に該ベクターを順化させるのに十分な時間、接触させる工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍＲＮＡコード化エンドリボヌクレアーゼを誘導するのに適した前記組成物がテトラサイクリンである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的タンパク質を誘導するのに適した前記組成物がＩＰＴＧである、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
標的タンパク質を誘導する方法であって、
ｉ．ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子と、前記標的タンパク質をコードする遺伝子とを含むベクターを、テトラサイクリンと接触させることであって、該ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼを誘導する、接触させること、
ｉｉ．バックグラウンドタンパク質を排除すること、
ｉｉｉ．前記ベクターを同位体濃縮培地と、該培地に該ベクターを順化させるのに十分な時間、接触させること、及び
ｉｖ．前記ベクターをＩＰＴＧと接触させることであって、前記標的タンパク質を誘導する、接触させることを含み、それぞれの工程が連続して行われる、標的タンパク質を誘導する方法。
【請求項１２】
ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼをコードする前記遺伝子がｍａｚＦ遺伝子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
同位体標識タンパク質を製造する方法であって、
ｉ．ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子と、標的タンパク質をコードする遺伝子とを含むベクターを、該ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼを誘導するのに適した組成物と接触させること、
ｉｉ．前記ベクターを、前記標的タンパク質を標識するのに選択された同位体標識培地と接触させること、及び
ｉｉｉ．前記ベクターを、前記標的タンパク質を誘導するのに適した組成物と接触させることであって、同位体標識タンパク質を産生する、接触させることを含み、それぞれの工程が連続して行われる、同位体標識タンパク質を製造する方法。
【請求項１４】
ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼをコードする前記遺伝子がｍａｚＦ遺伝子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択された同位体標識培地が、２Ｈ濃縮タンパク質を産生する２Ｈ同位体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記選択された同位体標識培地が、２Ｈ、１５Ｎ、１３Ｃ濃縮タンパク質を産生する２Ｈ、１５Ｎ、１３Ｃ同位体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記選択された同位体標識培地が、１３Ｃ−１Ｈ標識メチル、１２Ｃ−１Ｈ標識メチル、１３Ｃ−１Ｈ標識芳香族側鎖、１２Ｃ−１Ｈ標識芳香族側鎖及びこれらの混合物から成る群から選択される同位体をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記選択された同位体標識培地が、１３Ｃ−１５Ｎペプチド結合標識タンパク質を産生する１３Ｃ−１５Ｎペプチド結合同位体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記選択された同位体標識培地が、１５Ｎ濃縮タンパク質を産生する１５Ｎ同位体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質共鳴帰属を決定する自動的発現及び精製システムに、前記同位体標識タンパク質を利用する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質共鳴帰属を解析する自動化ＮＭＲ解析に、前記同位体標識タンパク質を利用する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
界面活性剤をスクリーニングするＨＳＱＣ法又はＴＲＯＳＹ−ＨＳＱＣ法に、前記同位体標識タンパク質を利用する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
スクリーニングした前記界面活性剤を利用して、膜タンパク質精製に適した条件を同定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
共鳴帰属のためのＮＭＲに、前記同位体標識タンパク質を利用する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
３Ｄ構造解析のためのＮＭＲに、前記同位体標識タンパク質を利用する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
ベクターであって、
ｉ．Ｔｎ１０由来のｔｅｔＡ（ｔｅｔＡＰ０）遺伝子及びｔｅｔＲ遺伝子のプロモータ−オペレータ領域と、
ｉｉ．該ｔｅｔＡＰ０の下流にある多重クローニング部位とを含み、独立して少なくとも２つのタンパク質を誘導することが可能である、ベクター。
【請求項２７】
少なくとも１つのタンパク質がテトラサイクリンによって誘導され、少なくとも１つのタンパク質がＩＰＴＧによって誘導される、請求項２６に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権主張］
本願は、２００７年３月１６日に出願した米国仮特許出願第６０／９１８，４１８号明細書（この開示はその全体が参照により本明細書中に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
［連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載］
本発明は、ＮＩＨ補助金番号Ｕ５４  ＧＭＯ７４９５８及びＵ５４  ＧＭＯ７５０２６の下で政府の支援を用いて為された。
【０００３】
［参考文献に関する記載］
本明細書中に言及される全ての特許、特許公報及び非特許参考文献は、その全体が本願に参照により援用されると考えられる。
【背景技術】
【０００４】
核磁気共鳴（以下、「ＮＭＲ」）による正確な（precise and accurate）タンパク質構造の決定には一般的に、特に側鎖共鳴帰属を完了するのに必要なＮＭＲデータを全て取得及び解釈するのに、数週間又はさらには数ヶ月を要する。しかしながら、中程度の精度の（medium-accuracy）折り畳み（fold：フォールド）情報は多くの場合、タンパク質進化及び生化学機能（複数可）に対する重要且つ有益な手掛かりを提供することができる。中程度の精度のタンパク質骨格構造を迅速に決定する、大部分が自動的な戦略がこれまでに説明されている（非特許文献１）。この迅速な折り畳み決定戦略は、側鎖メチル基を選択的にプロトン化した（１３ＣＨ３）、重水素化された１３Ｃ、１５Ｎ濃縮タンパク質試料を使用して、巨大タンパク質の中程度の精度のＮＭＲ構造を決定するのに元々は導入された考えに由来する（非特許文献２）。データ採取には、骨格及び側鎖の１５Ｎ、ＨＮ共鳴、並びに側鎖の１３ＣＨ３メチル共鳴のための自動的な帰属解析に適したＮＭＲスペクトルを取得することが含まれる。また場合によっては、標識されたＴｙｒ残基及びＰｈｅ残基の１Ｈ原子及び／又は１３Ｃ原子に関して帰属を決定する。ＡｕｔｏＡｓｓｉｇｎプログラム等の自動化ＮＭＲ帰属プログラムによって、ＮＭＲ共鳴帰属を決定することができる（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。ＡｕｔｏＳｔｒｕｃｔｕｒｅ等のプログラムを用いて自動的に三次元構造を解析することができる（非特許文献７、非特許文献８）。中程度の精度の戦略でＮＭＲスペクトルを採取及び処理するのに要する全時間は、比較的短くすることができる。例えば、プロトン化メチル（及び／又は芳香族）基を有する２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ濃縮タンパク質に関するＮＭＲデータを使用して、ＡｕｔｏＡｓｓｉｇｎ及びＡｕｔｏＳｔｒｕｃｔｕｒｅ等の公開されたＮＭＲソフトウェアパッケージを使用して、ＮＭＲスペクトルを処理し、共鳴帰属を行い、核オーバーハウザー強化分光法（Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy）（以下、「ＮＯＥＳＹ」）のデータを解釈し、数日内に中程度の精度の構造を生成することができる。これらの構造は、タンパク質の生体活性を特徴付けるのに必須の三次元情報を与え、付加的なＮＭＲデータを用いて正確性が高くなるまでさらに微調整するのに良好な出発点である。未処理のＮＭＲ時間領域データを根幹とするこの複合データの回収及び解析戦略が容易であることは既に、ブドウ球菌（Staphylococcal）プロテインＡのＺドメインの中程度の精度の構造の自動的な解析によって実証されている（非特許文献１）。
【０００５】
また過重水素化（Perdeuteration）（２Ｈによるタンパク質の濃縮）は、ＮＭＲによって膜タンパク質の三次元構造を試験するために最も高度なＮＭＲ法の幾つかを使用するのに前提となる（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。これらの方法は、１３Ｃ−１Ｈ（又は１２Ｃ−１Ｈ）メチル標識を有する２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ濃縮膜タンパク質試料の使用を必要とする。このような試料の作製には費用がかかる可能性があり（１つの試料当たり１５００ドル〜１００００ドル）、このアプローチの適用性が制限される。高コストの試料作製が、強力な自動化構造解析法（非特許文献１）及び或る特定の強力な膜タンパク質構造解析法（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）の適用を大幅に制限する。
【０００６】
ＮＭＲによる膜タンパク質構造解析には、３つの主なアプローチがある。第１のアプローチは溶液ＮＭＲであり、これは感度増大した横緩和最適化分光（Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy）（以下、「ＴＲＯＳＹ」）検出法による従来の三重共鳴ＮＭＲ法を使用して、界面活性剤可溶化膜タンパク質の三次元構造を決定するのに使用することができる（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。このアプローチでの方法には、１３Ｃ−１Ｈメチル標識を有する２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ濃縮膜タンパク質試料の使用が必要である。
【０００７】
他の２つのアプローチは、２つの固体ＮＭＲ法であり、これは膜タンパク質構造解析に首尾よく適用されている。これらのアプローチの１つである配向固体ＮＭＲは、分子配向を利用し、双極子結合及びそうでなければタンパク質の固体ＮＭＲスペクトルを複雑にする化学シフトの線幅拡大の影響を克服する。膜タンパク質に適用する前段階として、脂質二重層又はバイセルの試料を特定のＮＭＲプローブで静的に配向し、原子間の結合配向についての情報を包含する高分解能ＮＭＲスペクトルを提供する。このアプローチは、未だに開発中であるが、脂質二重層中の小膜タンパク質の三次元構造を決定するのに使用されている（非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３）。
【０００８】
第２の固体ＮＭＲアプローチであるマジック角回転（Magic Angle Spinning）（以下「ＭＡＳ」）ＮＭＲは、適用される磁場に対して、特定の配向（５４．７度）で固体試料を迅速に回転させることによって、双極子結合の影響を最小限にすることによって、広幅の固体ＮＭＲ試料を狭める別の方法を提供する。今日では、ＭＡＳ法は、膜タンパク質を含む、固体状態の小タンパク質の完全な共鳴帰属及び三次元構造を得ることが可能な程度までさらに開発されている（非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２）。
【０００９】
固体ＮＭＲには、結晶化することができない多くの膜タンパク質の三次元構造を与える非常に大きな可能性がある。配向固体ＮＭＲ実験は、へリックス（helical）膜タンパク質構造を決定するのに特に適しており、隣接β鎖中の骨格原子間の双極子相互作用を同定することができるＭＡＳ実験は、β型の膜構造に特に適しているが、これらの新規の方法でαへリックスタンパク質の構造を決定することも可能であり得る。
【００１０】
ＮＭＲは、特定のタンパク質構築物の「折り畳み（foldedness）」を迅速に特徴化する構造ゲノミクス努力において特別な価値がある（非特許文献３３、非特許文献３４）。一次元Ｈ−ＮＭＲ及び二次元Ｎ−Ｈ相関スペクトル又はＣ−Ｈ相関スペクトルで測定された共鳴の分散及び線形によって、構築物を規定する「折り畳み」基準、及び折り畳みタンパク質試料を与える溶液条件が与えられる（図１を参照されたい）。１５Ｎによる要求される同位体濃縮は比較的費用がかからず、従来のＮＭＲシステムを用いて、二次元１５Ｎ−１Ｈ相関スペクトルを数十分で記録することができる。
【００１１】
大腸菌の単一タンパク質産生（Single Protein Production）（以下「ＳＰＰ」）細菌発現システムがこれまでに記載されており、これはバックグラウンドタンパク質を合成することなく、安定した高レベルのタンパク質発現（全細胞タンパク質の約３０％）を容易にする特性（低温誘導性プロモータ、低温、宿主細胞成長停止を引き起こすｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦの誘導及び培養物凝縮）の組合せを利用する（非特許文献３５、非特許文献３６）。この発現システムは、セレノメチオニン及びフルオロフェニルアラニンによる特異的な標識を与えることが示されている（非特許文献３５）。さらに、最適化ＳＰＰベクターを使用して、指数関数的に増殖する培養物を、タンパク質の収率には有意な影響を与えることなく、４０倍に凝縮することができる（非特許文献３５）。これには、試料標識コストを従来の同位体標識実験のコストの数％（small percentage）まで下げる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Zheng, D., Huang, Y. J., Moseley, H.N.B., Xiao, R., Aramini, J., Swapna. G.V.T.; Montelione, G. T. （2003） Automated protein fold determination using a minimal NMR constraint strategy. Protein Science 2003, 12: 1232-1246.
【非特許文献２】Gardner, K. H., Rosen, M. K., and Kay, L. E. （1997）. Global folds of highly deuterated, methyl-protonated proteins by multidimensional NMR. Biochemistry 36, 1389-1401.
【非特許文献３】Moseley, H. N., Monleon, D., and Montelione, G. T. （2001）. Automatic determination of protein backbone resonance assignments from triple resonance nuclear magnetic resonance data. Methods Enzymol 339, 91-108
【非特許文献４】Moseley, H. N., and Montelione, G. T. （1999）. Automated analysis of NMR assignments and structures for proteins. Curr Opin Struct Biol 9, 635-642
【非特許文献５】Zimmerman, D. E., Kulikowski, C. A., Huang, Y., Feng, W., Tashiro, M., Shimotakahara, S., Chien, C., Powers, R., and Montelione, G. T. （1997）. Automated analysis of protein NMR assignments using methods from artificial intelligence. J Mol Biol 269, 592-610
【非特許文献６】Zimmerman, D. E., and Montelione, G. T. （1995）. Automated analysis of nuclear magnetic resonance assignments for proteins. Curr Opin Struct Biol 5, 664-673
【非特許文献７】Huang, Y. J., Moseley, H. N., Baran, M. C., Arrowsmith, C., Powers, R., Tejero, R., Szyperski, T., and Montelione, G. T. （2005）. An integrated platform for automated analysis of protein NMR structures. Methods Enzymol 394, 111-141
【非特許文献８】Huang, Y. J., Tejero, R., Powers, R., and Montelione, G. T. （2006）. A topology-constrained distance network algorithm for protein structure determination from NOESY data. Proteins 62, 587-603
【非特許文献９】Arora, A., Abildgaard, F., Bushweller. J. H., and Tamm, L. K. （2001）. Structure of outer membrane protein A transmembrane domain by NMR spectroscopy. Nat Struct Biol 8, 334-338
【非特許文献１０】Fernandez, C., Hilty, C., Wider, G., Guntert, P., and Wuthrich, K. （2004）. NMR structure of the integral membrane protein OmpX. J Mol Biol 336, 1211-1221
【非特許文献１１】Fernandez, C., Hilty, C., Wider, G., and Wuthrich, K. （2002）. Lipid-protein interactions in DHPC micelles containing the integral membrane protein OmpX investigated by NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 13533-13537
【非特許文献１２】Fernandez, C., and Wuthrich, K. （2003）. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Lett 555, 144-150
【非特許文献１３】Sorgen, P. L., Cahill, S. M., Krueger-Koplin, R. D., Krueger-Koplin, S. T., Schenck, C. C., and Girvin, M. E. （2002a）. Structure of the Rhodobacter sphaeroides light-harvesting 1 beta subunit in detergent micelles. Biochemistry 41, 31-41
【非特許文献１４】Sorgen, P. L., Hu, Y., Guan, L., Kaback, H. R., and Girvin, M. E. （2002b）. An approach to membrane protein structure without crystals. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 14037-14040
【非特許文献１５】Tamm, L. K., Abildgaard, F., Arora, A., Blad, H., and Bushweller, J. H. （2003）. Structure. dynamics and function of the outer membrane protein A （OmpA） and influenza hemagglutinin fusion domain in detergent micelles by solution NMR. FEBS Lett 555, 139-143
【非特許文献１６】De Angelis, A. A., Howell, S. C., Nevzorov, A. A., and Opella, S. J. （2006）. Structure determination of a membrane protein with two trans-membrane helices in aligned phospholipid bicelles by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc 128, 12256-12267
【非特許文献１７】Kim, S., Quine, J. R., and Cross, T. A. （2001）. Complete cross-validation and R-factor calculation of a solid-state NMR derived structure. J Am Chem Soc 123, 7292-7298
【非特許文献１８】Marassi, F. M., and Opella, S. J. （2002）. Using pisa pies to resolve ambiguities in angular constraints from PISEMA spectra of aligned proteins. J Biomol NMR 23, 239-242
【非特許文献１９】Marassi, F. M., and Opella, S. J. （2003）. Simultaneous assignment and structure determination of a membrane protein from NMR orientational restraints. Protein Sci 12, 403-411
【非特許文献２０】Opella, S. J. （2003）. Membrane protein NMR studies. Methods Mol Biol 227, 307-320
【非特許文献２１】Park, S. H., Mrse, A. A., Nevzorov, A. A., Mesleh, M. F., Oblatt-Montal, M., Montal, M., and Opella, S. J. （2003）. Three-dimensional structure of the channel-forming trans-membrane domain of virus protein "u" （Vpu） from HIV-1. J Mol Biol 333, 409-424
【非特許文献２２】Valentine, K. G., Mesleh, M. F., Opella, S. J., Ikura, M., and Ames, J. B. （2003）. Structure, topology, and dynamics of myristoylated recoverin bound to phospholipid bilayers. Biochemistry 42, 6333-6340
【非特許文献２３】Zeri, A. C., Mesleh, M. F., Nevzorov, A. A., and Opella, S. J. （2003）. Structure of the coat protein in fd filamentous bacteriophage particles determined by solid-state NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 6458-6463
【非特許文献２４】Astrof, N. S., Lyon, C. E., and Griffin, R. G. （2001）. Triple resonance solid state NMR experiments with reduced dimensionality evolution periods. J Magn Reson 152, 303-307
【非特許文献２５】Castellani, F., van Rossum, B., Diehl, A., Schubert, M., Rehbein, K., and Oschkinat, H. （2002）. Structure of a protein determined by solid-state magicangle-spinning NMR spectroscopy. Nature 420, 98-102
【非特許文献２６】Castellani, F., van Rossum, B. J., Diehl, A., Rehbein, K., and Oschkinat, H. （2003）. Determination of solid-state NMR structures of proteins by means of three-dimensional 15N-13C-13C dipolar correlation spectroscopy and chemical shift analysis. Biochemistry 42, 11476-11483
【非特許文献２７】Igumenova, T. I., McDermott, A. E., Zilm, K. W., Martin, R. W., Paulson, E. K., and Wand, A. J. （2004a）. Assignments of carbon NMR resonances for microcrystalline ubiquitin. J Am Chem Soc 126, 6720-6727
【非特許文献２８】Igumenova, T. I., Wand, A. J., and McDermott, A. E. （2004b）. Assignment of the backbone resonances for microcrystalline ubiquitin. J Am Chem Soc 126, 5323-5331
【非特許文献２９】Jaroniec, C. P., MacPhee, C. E., Bajaj, V. S., McMahon, M. T., Dobson, C. M., and Griffin, R. G. （2004）. High-resolution molecular structure of a peptide in an amyloid fibril determined by magic angle spinning NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 711-716
【非特許文献３０】Krabben, L., van Rossum, B. J., Castellani, F., Bocharov, E., Schulga, A. A., Arseniev. A. S., Weise, C., Hucho, F., and Oschkinat, H. （2004）. Towards structure determination of neurotoxin II bound to nicotinic acetylcholine receptor: a solid-state NMR approach. FEBS Left 564, 319-324
【非特許文献３１】Petkova, A. T., Baldus, M., Belenky, M., Hong, M., Griffin, R. G., and Herzfeld, J. （2003）. Backbone and side chain assignment strategies for multiply labeled membrane peptides and proteins in the solid state. J Magn Reson 160, 1-12
【非特許文献３２】Rienstra, C. M., Tucker-Kellogg, L., Jaroniec, C. P., Hohwy, M., Reif, B., McMahon, M. T., Tidor, B., Lozano-Perez, T., and Griffin, R. G. （2002）. De novo determination of peptide structure with solid-state magic-angle spinning NMR spectroscopy. Proc Nat! Acad Sci U S A 99, 10260-10265
【非特許文献３３】Kennedy, M. A., Montelione, G. T., Arrowsmith, C. H., and Markley, J. L. （2002）. Role for NMR in structural genomics. J Struct Funct Genomics 2, 155-169
【非特許文献３４】Montelione, G. T. （2001）. Structural genomics: an approach to the protein folding problem. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 13488-13489
【非特許文献３５】Suzuki, M., Roy, R., Zheng, H., Woychik, N., and Inouye, M. （2006）. Bacterial bioreactors for high yield production of recombinant protein. J Biol Chem 281, 37559-37565
【非特許文献３６】Suzuki, M., Zhang, J., Liu, M., Woychik, N. A., and Inouye, M. （2005）. Single protein production in living cells facilitated by an mRNA interferase. Mol Cell 18, 253-261
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の組成物、システム及び方法は、膜タンパク質精製、膜タンパク質構造解析のための条件をスクリーニングするのに、並びに迅速な構造解析及び巨大タンパク質構造の解析に適した重水素分離ＮＭＲ法を使用して、三次元タンパク質構造を決定するのに効果的な手段を提供する。また本発明は、コストを低減して、重水素化タンパク質試料を作製する手段を提供するという点で有益である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（ｉ）（本明細書中でさらに記載されるように）大腸菌のＳＰＰ−ＮＭＲ発現システムを使用して、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ濃縮タンパク質を産生するため、（ｉｉ）精製及び／又は三次元構造解析に適した界面活性剤条件をスクリーニングするためにＳＰＰ−ＮＭＲシステムを用いて産生された同位体濃縮膜タンパク質を使用するため、及び（ｉｉｉ）（さらに記載され、本明細書中、ＳＰＰ−ＰＢＬと呼ばれる）タンパク質中、１３Ｃ−１５Ｎ特異的ペプチド結合で標識するための新規の方法が本明細書中に開示される。同位体濃縮法は、ハイスループットデータ採取、及びＮＭＲによる小タンパク質構造の迅速解析を与える解析法と合わせることができる。界面活性剤スクリーニングによって同定される条件は、膜タンパク質を精製するのに、又は精製せずにＮＭＲによって三次元構造を直接決定するのに使用することができる。
【００１５】
或る特定の実施の形態において、本発明は、ＳＰＰ−ＮＭＲシステムを使用して、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ濃縮タンパク質を産生するための組成物、システム及び方法、精製及び／又は三次元構造解析に適した界面活性剤条件をスクリーニングするためにこれらの同位体濃縮タンパク質を使用する方法、並びにタンパク質中、１３Ｃ−１５Ｎ特異的ペプチド結合で標識する方法に関する。
【００１６】
他の実施の形態において、本発明は、ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼ及び標的タンパク質を別々に誘導することが可能なＳＰＰ−ＮＭＲシステムに関する。
【００１７】
さらなる実施の形態において、本発明は、初めに、ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子と標的タンパク質をコードする遺伝子とを含有するベクターを、ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼを誘導するのに適した組成物と接触させること、及びそれから同じベクターを、標的タンパク質を誘導するのに適した組成物と接触させることによって標的タンパク質を誘導する方法に関する。
【００１８】
他の実施の形態において、本発明は、初めに、ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子と標的タンパク質をコードする遺伝子とを含有するベクターを、テトラサイクリンと接触させ、ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼを誘導すること、次いでバックグラウンドタンパク質を排除すること、その後ベクターを同位体濃縮培地と、該培地にベクターを順化させるのに十分な時間、接触させること、及び最終的にベクターをＩＰＴＧと接触させて、標的タンパク質を誘導することによって標的タンパク質を誘導する方法に関する。
【００１９】
さらなる実施の形態において、初めに、ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子と標的タンパク質をコードする遺伝子とを含有するベクターを、ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼを誘導するのに適した組成物と接触させること、次いでベクターを、標的タンパク質を標識するのに選択された同位体標識培地と接触させること、及び最終的にベクターを、標的タンパク質を誘導するのに適した組成物と接触させ、同位体標識タンパク質を産生することによって、同位体標識タンパク質を製造する方法に関する。
【００２０】
他の実施の形態において、本発明は、Ｔｎ１０由来のｔｅｔＡ（ｔｅｔＡＰ０）遺伝子及びｔｅｔＲ遺伝子のプロモータ−オペレータ領域と、ｔｅｔＡＰ０の下流にある多重クローニング部位とを含有する新規のベクターに関し、２つのタンパク質を独立して誘導することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】変性（disordered）タンパク質及び十分に折り畳まれたタンパク質に関する１５Ｎ−１Ｈ  ＨＳＱＣ相関スペクトルの比較を示す図である。（Ａ）水溶液中、明確な三次元構造を有する、ＮＥＳＧ標的ＷＲ６４のホモログであるＤＮＡリガーゼのサーマス・サーモフィルス（T. thermophilus）ＢＲＣＴドメインのＨＳＱＣスペクトル、（Ｂ）主にこれらの測定条件下で変性するドメイン構築物であるキイロショウジョウバエ（D. melanogaster）Ｐａｒ  １  Ｃ末端ドメインのＨＳＱＣスペクトル。
【図２】ＳＰＰシステムによって産生された同位体濃縮タンパク質を精製しないタンパク質構造解析のためのＮＭＲ法を示す図である。
【図３】（Ａ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ｂｄｄｍ、（Ｂ）５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ｂｄｄｍ、（Ｃ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｉｄａｏ、（Ｄ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）両性界面活性剤及び（Ｅ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＤＰＣのミセルにおいて非精製１５Ｎ標識ＲＡＭＰ−４によって測定された１５Ｎ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルを示す図である。
【図４】（Ａ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ｂｄｄｍ、（Ｂ）５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ｂｄｄｍ、（Ｃ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｉｄａｏ、（Ｄ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）両性界面活性剤及び（Ｅ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＤＰＣのミセルにおいて非精製１５Ｎ標識ＲＡＭＰ−４の１５Ｎ−１Ｈ  ＴＲＯＳＹスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ＳＰＰシステムをタンパク質の同位体濃縮及び過重水素化により適したものにする新規の技術を導入する。特許請求される単一タンパク質産生−核磁気共鳴（以下「ＳＰＰ−ＮＭＲ」）システムは、Ｔｎ１０由来のｔｅｔＡ（ｔｅｔＡＰ０）遺伝子及びｔｅｔＲ遺伝子のクローン化したプロモータ−オペレータ領域を利用する。ｔｅｔＡ遺伝子の発現は、ＴｅｔＲ（ｔｅｔリプレッサ）によって抑制され、またテトラサイクリンによって調節されることが知られている。多重クローニング部位（以下「ＭＣＳ」）がｔｅｔＡＰ０の下流に存在するので、任意の対象の遺伝子をこのプラスミドにクローン化することができる。したがって、ＭＣＳにクローン化した遺伝子の発現は、テトラサイクリンの添加によって誘導される。ＳＰＰ−ＮＭＲシステムの特有の特徴は、ｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼ及び標的タンパク質を別々に誘導することができることである。特許請求されるＳＰＰ−ＮＭＲシステムの一実施形態では、ＭａｚＦ及び標的タンパク質がそれぞれ、テトラサイクリン及びＩＰＴＧの添加によって誘導されるように、ｍａｚＦ遺伝子をこのテトラサイクリン誘導性ベクターにクローン化する。しかしながら、当業者は、この実施形態では、任意のｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼ遺伝子をｍａｚＦ遺伝子に置き換えることができると認識している。これまでの同時誘導性システムに比べて、新規のベクターの使用によって、初めに、ＭａｚＦ又は任意の他のｍＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼを誘導し、バックグラウンドタンパク質産生を排除して、同位体濃縮培地中で細胞を適切に順化させた後、標的タンパク質を誘導することが可能になる。このように、培地を同位体標識に特異的な培地に交換した後でしか、標的タンパク質の産生を誘導することができない。これが、ＮＭＲ試験のための過重水素化膜タンパク質試料の実用的な作製に必須である重要な新しい技術革新である。
【００２３】
ＳＰＰ−ＮＭＲシステムを用いたタンパク質過重水素化
１Ｈ−１３Ｃ及び／又は１Ｈ−１２Ｃ標識メチル、及び／又は芳香族側鎖を有する２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ濃縮タンパク質試料を得るコストが高いことが、様々なＮＭＲ法の適用の主な障害として残っている。ＳＰＰ発現システムを同位体標識プロトコルと合わせるＳＰＰ−ＮＭＲシステムによって、コストが劇的に低減した、ＮＭＲ品質の試料を得る強力な方法が与えられる。ＳＰＰ−ＮＭＲシステムの特有の特徴は、重水素の非存在下で細胞を増殖するだけでなく、重水素、同位体濃縮培地の導入前に、最大４０倍に細菌培地を凝縮する能力である（非特許文献３５）。テトラサイクリン及びＩＰＴＧ誘導性システムを含む多種多様の誘導システムにこれを適用することができる。凝縮限界は、対象のタンパク質によって変わる可能性があり、したがって最適な倍数凝縮は、それぞれのタンパク質標的に対して個別に評価する必要がある。培養物は、小規模に５倍、１０倍、２０倍、３０倍、及び４０倍に凝縮して１倍培養物と比較する。それから、１倍対照と等しいタンパク質発現レベルを示す最も高い倍数凝縮が、標識実験に最適であるとして選択される。
【００２４】
ＳＰＰ−ＮＭＲ法によって、可溶性細菌細胞溶解物を直接又は最小限の精製工程で解析することが可能になる。発現したタンパク質のみ、したがってＮＭＲ同位体の導入後に標識されたタンパク質のみが標的タンパク質になるので、このような解析が可能である。体積を減らして再懸濁すると、対象のタンパク質は、全収率を損わずに凝縮状態で発現する。これによって、従来の方法での１５００ドル〜１００００ドルからＳＰＰ−ＮＭＲ法で４０倍に凝縮したときの３７．５ドル〜２５０ドルまでの試料調製コストの低減に直結する５分の１〜４０分の１のコストの低減がもたらされる。この技法の使用は、ＮＭＲ分光法に広く適用可能であり、わずかのコストで迅速な共鳴帰属を得るのに適した高度に標識された試料の作製を可能にする。
【００２５】
２Ｈ標識にＳＰＰ−ＮＭＲ法を利用する際、最初にＭ９−グルコース培地又はＭＪ９−グルコース培地等の規定の最小培地中で、ＯＤ６００が０．５〜０．６になるまで、細胞を増殖する（Jansson, M., Li. Y. C., Jendeberg, L., Anderson, S., Montelione, B. T., and Nilsson, B. （1996）. High-level production of uniformly 15N- and 13C-enriched fusion proteins in Escherichia coli. J Biomol NMR 7, 131-141）。これは、初めに重水素培地の存在下で適切な細胞密度まで細胞を培養しなければいけない従来の２Ｈ標識法とは異なる。完全に重水素化した最小培地中で、細胞を０．６のＯＤ６００に到達させるために、培地中で重水素の割合を徐々に増大させる様々な順化工程が必要になることが多い。ＳＰＰ−ＮＭＲ法を用いて、３７℃のＨ２Ｏ培地中で増殖した細胞が適切な密度に達したら、培地を低温に移行させ（例えば１５℃の振盪器で、４５分間）、培養物を低温ショック状態に順化させる。低温ショック状態は、単一タンパク質産生及び培養物凝縮の必要条件である宿主細胞タンパク質発現の低減を容易にする。エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦ及び標的タンパク質の両方が、誘導性低温ショックプロモータの制御下にある。それからＭａｚＦの発現をテトラサイクリン又はＩＰＴＧのいずれかで数時間（例えばそれぞれ１６時間及び３時間）、誘導する。好ましい実施形態では、テトラサイクリン誘導ＭａｚＦ発現及びそれによる半休止状態の開始の後、細胞培養物を遠心分離し、重水素化最小培地中で洗い、余分なＨ２Ｏを除去し、最終的に最大４０分の１に低減した体積の１３Ｃ重水素化グルコース及び１５Ｎを含有する重水素培地中で再懸濁する。その後、特定のアミノ酸前駆体（例えば１３Ｃ−ａ−ケト酪酸、１３Ｃ−ａ−ケトイソ吉草酸、１Ｈ−１３Ｃ−１５Ｎ−フェニルアラニン、及び１Ｈ−１３Ｃ−１５Ｎ−チロシン）を添加し、メチル及び／又は芳香族側鎖を選択的に１Ｈ−１３Ｃ及び／又は１Ｈ−１２Ｃ標識させる。次に、典型的に１時間（ＭａｚＦＩＰＴＧ）又は４時間（ＭａｚＦｔｅｔ）（他の特定のシステムでは他の時間が最適であり得る）、同位体濃縮培地中、テトラサイクリン又はＩＰＴＧの非存在下で、培養物を平衡にし、標的タンパク質のＩＰＴＧ誘導前に同位体を細胞に浸透させる。最終的に、ＩＰＴＧを凝縮細胞培養物に添加し、重水素化した同位体含有培地中で単一標的タンパク質の産生を誘導する。標的タンパク質の産生をこれまでに規定の最適発現時間、典型的に２０時間まで進める。この時点で、遠心分離によって培養物を回収し、溶解し、可溶性細胞抽出物を直接解析するか、又はその後精製工程を実施する。
【００２６】
ＮＭＲによる構造解析用の膜タンパク質を調製するためのＳＰＰ−ＮＭＲシステムの使用
図２は、組換え膜タンパク質発現実験の４つの起こり得る結果を概説している。タンパク質を組換え宿主で発現する場合、このタンパク質は可溶性（又は部分可溶性）又は不溶性に分類され得る（Acton, T. B., Gunsalus, K. C., Xiao, R., Ma, L. C., Aramini, J., Baran, M. C., Chiang, Y. W., Climent, T., Cooper, B., Denissova, N. G., et al. （2005）. Robotic cloning and Protein Production Platform of the Northeast Structural Genomics Consortium. Methods Enzymol 394, 210-243）。一般的に可溶性タンパク質は、溶液ＮＭＲ、円偏光二色性法、又は他の方法を使用することによってさらに「折り畳み」又は「変性（unfolded）」に分類することができる。ほとんどの膜タンパク質はこれらの単一アッセイでは「不溶性」であり、これは膜に直接組み込まれているものもあれば、細胞中に封入体又は他の不溶性凝集体を形成するものもあるためである。ＳＰＰ−ＮＭＲシステムは、溶液及び固体のＮＭＲによる構造解析のためにこれらの不溶性膜タンパク質の同位体濃縮試料を調製する手段を与える。
【００２７】
溶液ＮＭＲ試験の試料調製
不溶性タンパク質（膜画分に組み込まれるもの、及び封入体を形成するか又は他の理由で不溶性であるものを含む）は、溶液ＮＭＲ試験のために可溶化するために、界面活性剤スクリーニング方法にかけることができる。約１２個〜１５個のミセル形成界面活性剤及びバイセル形成界面活性剤群は、この「膜タンパク質界面活性剤可溶化スクリーニング（membrane protein detergent solubilization screen）」から開発される（Krueger-Koplin, R. D., Sorgen, P. L., Krueger-Koplin, S. T., Rivera-Torres, I. O., Cahill, S. M., Hicks, D. B., Grinius, L., Krulwich, T. A., and Girvin, M. E. （2004）. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. J Biomol NMR 28, 43-57）。可溶化スクリーニングは、多くのミセル可溶化タンパク質又はバイセル可溶化タンパク質の混合物を提供し、その標的タンパク質だけが同位体で標識され、標的タンパク質を精製する必要がなくなる。最初にＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した後、１５Ｎ−１Ｈ異核単一量子コヒーレンス（以下「ＨＳＱＣ」）、１５Ｎ−１Ｈ  ＴＲＯＳＹ−ＨＳＱＣ、又は類似種のＮＭＲ分光法を使用して、界面活性剤の可溶化を評価する。
【００２８】
Acton et al., 2005（Acton, T. B., Gunsalus, K. C., Xiao, R., Ma, L. C., Aramini, J., Baran, M. C., Chiang, Y. W., Climent, T., Cooper. B., Denissova, N. G., et al. （2005）. Robotic cloning and Protein Production Platform of the Northeast Structural Genomics Consortium. Methods Enzymol 394, 210-243）に記載されるもの等のロボットによる（robotic：自動）クローニングプロトコルを、膜タンパク質のＳＰＰ−ＮＭＲ標識に適用し、ハイスループット膜タンパク質可溶化スクリーニングを準備することができる。ロボットによる結晶化スクリーニング方法を開発する際に見られるように、粘性界面活性剤溶液のピペッティングを再現可能にするのに幾つかの技術的な障害に直面し得る。しかし、構造ゲノミクス研究グループによるロボットによる結晶化技術の開発における幅広い経験は、これらの課題に対処しようという今後の取り組みに役立つ。
【００２９】
したがって、選択的同位体濃縮のためにＳＰＰ−ＮＭＲシステムを用いて、混合ミセルシステム又はバイセルシステムのサイズに応じて、１５Ｎ、１３Ｃ、及び／又は２Ｈ濃縮によって、良好な品質のＨＳＱＣスペクトルを与える界面活性剤可溶化タンパク質を調製する。それから、典型的にクライオプローブ（cryoprobe）を備えた高磁場（例えば８００ＭＨｚ）ＮＭＲシステムを用いた標準的なＴＲＯＳＹベースの三重共鳴ＮＭＲ法によって、共鳴帰属及び三次元構造を追跡する。標的タンパク質のみが同位体濃縮されるので、標的タンパク質を精製する必要なく、同位体フィルター（isotope-filtered）溶液のＮＭＲ法によって、共鳴帰属を実施し、幾つかの膜タンパク質の三次元構造の決定を完了することが完全に実現可能となる。
【００３０】
界面活性剤可溶化タンパク質を結晶化することは可能であるが、これらの混合ミセル中では、可溶化タンパク質混合物は不均質性が強く、結晶化には適していない。しかしながら、このようにしてスクリーニングした界面活性剤の条件によって、膜タンパク質を精製するのに界面活性剤を使用することができるという指針が与えられる。この情報は、結晶化のために標的タンパク質を精製するのに、又はＮＭＲ試験のために同位体濃縮標的タンパク質を精製するのに利用することができる。
【００３１】
固体ＮＭＲ試験用の試料調製
さらに精製することなく、膜画分に取り込まれた標的となる１５Ｎ濃縮タンパク質を、数十ミリグラム量調製し、ＭＡＳ及び配向固体ＮＭＲ解析に使用してもよい。これらの固体ＮＭＲスペクトルは、溶液ＮＭＲ  ＨＳＱＣスペクトルと同じように良好な品質のＮＭＲデータを与える膜タンパク質試料をスクリーニングするのに使用する。これらの試料が良好な品質の固体ＮＭＲスペクトルを与える場合、固体ＮＭＲによる共鳴帰属及び三次元構造解析を実施しようとするのを助けるために、１５Ｎ、１３Ｃ、及び／又は２Ｈ同位体濃縮したさらなるタンパク質試料を準備する必要がある（Drechsler, A., and Separovic. F. （2003）. Solid-state NMR structure determination. IUBMB Life 55, 515-523）。
【００３２】
膜タンパク質をクローン化して、ＳＰＰ−ＮＭＲシステムで発現した後、ＳＤＳＰＡＧＥゲルを用いて、全細胞抽出物中の可溶性挙動対不溶性挙動をスクリーニングして、全細胞、可溶性抽出物及び膜だけの画分における発現タンパク質の画分を決定する。このようにして、それぞれの構築物を、「可溶性」、「不溶性／膜結合」、「不溶性／非膜結合」に分類する。次いで、全細胞抽出物のＨＳＱＣスクリーニングによって、希少な可溶性膜タンパク質試料を解析する。固体ＮＭＲ法又は溶液ＮＭＲ法のいずれかを利用して、２つの並行経路（図２に記載）によって、不溶性タンパク質構築物を解析することができる。
【００３３】
ＳＰＰシステムによる同位体濃縮された膜タンパク質の界面活性剤スクリーニング
選択的同位体濃縮のためのＳＰＰ−ＮＭＲシステムの使用及びリボソーム結合膜タンパク質４（ＲＡＭＰ−４）の界面活性剤スクリーニングが示されている。タンパク質配列は、
ＭＮＨＫＶＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＨＭＡＶＱＴＰＲＱＲＬＡＮＡＫＦＮＫＮＮＥＫＹＲＫＹ
ＧＫＫＫＥＧＫＴＥＫＴＡＰＶＩＳＫＴＷＬＧＩＬＬＦＬＬＶＧＧＧＶＬＱＬＩＳＹＩＬ
である（親和性精製タグは下線処理した）。
【００３４】
図３及び図４で示されるように、ＳＰＰ−ＮＭＲシステムは、最良品質のＨＳＱＣスペクトル（図３）又はＴＲＯＳＹ−ＨＳＱＣスペクトル（図４）を与えるものを同定するのに、１５Ｎ濃縮された標的タンパク質を精製することなく、様々な界面活性剤条件をスクリーニングすることが可能である。これらのミセル可溶化膜タンパク質のような比較的ゆっくり回転するシステムのためによりはっきりした線形を有するＴＲＯＳＹ−ＨＳＱＣ実験が、好ましい実施となる。
【００３５】
高品質のこれらのＴＲＯＳＹ−ＨＳＱＣスペクトルが、１５Ｎ−１Ｈ検出２Ｈ分離三重共鳴実験を用いて、さらに精製することなく膜タンパク質に対する完全な骨格共鳴帰属を決定することが可能であることを示唆する（非特許文献２、Shan, X., Gardner, K. H., Muhandiram, D. R., Kay, L. E., and Arrowsmith, C. H. （1998）. Subunit-specific backbone NMR assignments of a 64 kDa trp repressor/DNA complex: a role for N-terminal residues in tandem binding. J Biomol NMR 11, 307-318）。ミセル中の１５Ｎ濃縮タンパク質に対するこのようなスペクトルの産生は、これまでは不可能であった。このようにして得られた骨格共鳴帰属は、内在性膜タンパク質構造におけるαへリックス鎖及びβ鎖の位置を与える。
【００３６】
高品質のこれらのＴＲＯＳＹ−ＨＳＱＣスペクトルが、１５Ｎ−１Ｈ検出２Ｈ分離三重共鳴実験を用いて、さらに精製することなく膜タンパク質に対する広範囲に及ぶ骨格及び側鎖の共鳴帰属を決定することが可能であることを示唆する（非特許文献２、Shan, X., Gardner, K. H., Muhandiram, D. R., Kay, L. E., and Arrowsmith, C. H. （1998）. Subunit-specific backbone NMR assignments of a 64 kDa trp repressor/DNA complex: a role for N-terminal residues in tandem binding. J Biomol NMR 11, 307-318）。
【００３７】
高品質のこれらのＴＲＯＳＹ−ＨＳＱＣスペクトルがさらに、タンパク質を精製することなくミセル中のこのような内在性膜タンパク質の完全な三次元構造を決定することが可能であることを示唆する。
【００３８】
またこれらのＨＳＱＣスペクトル又はＴＲＯＳＹ−ＨＳＱＣスペクトルは、生化学試験、抗体産生、ＮＭＲ試験での使用のため、及び／又は結晶化及びＸ線結晶構造解析による三次元構造の決定のために、標的タンパク質の精製に使用する界面活性剤を同定することができる。
【００３９】
ハイスループット共鳴帰属のためのＳＰＰによる選択的なペプチド結合標識
配列Ｘ−Ｙにおけるアミノ酸残基Ｘとアミノ酸残基Ｙ（Ｘ及びＹのそれぞれが２０個の一般的なＬアミノ酸のいずれかである）との間のペプチド結合の選択的標識が、骨格のカルボニル位置で１３Ｃ濃縮したアミノ酸Ｘと、骨格の１５Ｎ原子で１５Ｎ濃縮されたアミノ酸Ｙとを有するタンパク質を濃縮することによって与えられる。したがって、タンパク質配列において、Ｘ−Ｙジペプチド部位だけが１３Ｃ−１５Ｎ標識ペプチド結合を有する。これらの部位は、ＨＮＣＯ型の三重共鳴ＮＭＲ実験を利用して選択的に観察することができ、ペプチド結合の１５Ｎ原子、１３Ｏ原子、及び１Ｈ原子、並びに他のスカラー結合原子又は双極子結合原子の部位特異的共鳴帰属が与えられる。従来の大腸菌実験、及び細胞無含有タンパク質発現システムを用いて、このペプチド結合標識（ＰＢＬ）アプローチを実証している。
【００４０】
凝縮発酵によるＳＰＰ−ＮＭＲが、ＰＢＬアプローチに理想的に適している。この方法は、単一タンパク質産生−ペプチド結合標識（以下「ＳＰＰ−ＰＢＬ」）とも称され得る。
【００４１】
ロボットによるタンパク質試料精製プラットフォーム（Acton et al, 2005）を用いて、ＳＰＰ−ＰＢＬを９６ウェルフォーマットで実行することもできる。このアプローチを用いて、それぞれが異なるペプチド結合を標識した一連の９６個のタンパク質試料を作製することができる。１ｍｍのマイクロＮＭＲプローブ及びロボットによる試料交換装置を使用して、ほんの１０μｇのこれらのタンパク質試料で、ＨＮＣＯ（又は他のＮＭＲ実験）を記録することができる。このようにして、タンパク質構造における９６個の異なる部位で、骨格共鳴帰属を得ることができる。
【００４２】
このＳＰＰ−ＰＢＬ技術は、可溶性タンパク質又は膜タンパク質、及び特に重水素化膜タンパク質で、骨格共鳴帰属を決定するのに役立つ。与えられた情報は、薬剤設計及びタンパク質の構造機能試験に役立つ。
【実施例】
【００４３】
実施例１
（Ａ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ｂｄｄｍ、（Ｂ）５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ｂｄｄｍ、（Ｃ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｉｄａｏ、（Ｄ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）両性界面活性剤及び（Ｅ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＤＰＣのミセルにおいて非精製１５Ｎ標識ＲＡＭＰ−４によって１５Ｎ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した。全てのスペクトルを、２０℃でクライオプローブを備えた８００ＭＨｚのBruker製のＵＳ２スペクトロメーターで採取した。ｐＨ７．５で１０ｍＭのリン酸ナトリウム、７５ｍＭの塩化ナトリウム、５０μＭのＥＤＴＡ、５％Ｄ２Ｏのバッファー中で試料を調製した。タンパク質濃度は２００ｆＬＭであった。異なる界面活性剤によるスペクトルを記録し、同じように処理した。それぞれのスペクトルの測定時間は４．５時間であった。図３を参照されたい。
【００４４】
実施例２
（Ａ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ｂｄｄｍ、（Ｂ）５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ｂｄｄｍ、（Ｃ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｉｄａｏ、（Ｄ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）両性界面活性剤及び（Ｅ）１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＤＰＣのミセルにおいて非精製１５Ｎ標識ＲＡＭＰ−４によって１５Ｎ−１Ｈ  ＴＲＯＳＹスペクトルを測定した。試料の調製及びデータ採取に使用するＮＭＲ機器は、実施例１と同じであった。異なる界面活性剤条件によるスペクトルを記録し、同じように処理した。それぞれのスペクトルのデータ採取時間は９．５時間であった。図４を参照されたい。
【図１】
2010521191.tif 000003
【図２】
2010521191.tif 000004
【図３】
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【図４】
2010521191.tif 000006
【国際調査報告】
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2010521191.tif 000008
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