(57)【要約】本出願は、ウロジラチンといったナトリウム利尿ペプチド、および免疫グロブリンの定常領域またはその断片の複合体を記載する。当該複合体を含む組成物、および当該複合体を用いるための方法もまた記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合体がナトリウム利尿ペプチド受容体と結合する、ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域を含む複合体。
【請求項２】
ナトリウム利尿ペプチドがウロジラチンである、請求項１の複合体。
【請求項３】
ナトリウム利尿ペプチド受容体がＮＰＲ−Ａである、請求項１の複合体。
【請求項４】
ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域がリンカーを介して結合している、請求項１の複合体。
【請求項５】
融合ポリペプチドである、請求項１の複合体。
【請求項６】
融合ポリペプチドがペプチドリンカーをさらに含む、請求項５の複合体。
【請求項７】
融合ポリペプチドが配列番号：６または１２のアミノ酸配列を含む、請求項５の複合体。
【請求項８】
抗体定常領域がナトリウム利尿ペプチドのＮ末端と結合している、請求項１の複合体。
【請求項９】
抗体定常領域がナトリウム利尿ペプチドのＣ末端と結合している、請求項１の複合体。
【請求項１０】
ナトリウム利尿ペプチドが抗体定常領域の内部アミノ酸と結合している、請求項１の複合体。
【請求項１１】
ナトリウム利尿ペプチド受容体を活性化する、請求項１の複合体。
【請求項１２】
ナトリウム利尿ペプチドと比較して長い血清半減期を有する、請求項１の複合体。
【請求項１３】
ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域を含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項１４】
融合ポリペプチドがペプチドリンカーをさらに含む、請求項１３の核酸。
【請求項１５】
ナトリウム利尿ペプチドがウロジラチンである、請求項１３の核酸。
【請求項１６】
配列番号：５または１１のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１３の核酸。
【請求項１７】
請求項１３の核酸を含む発現カセット。
【請求項１８】
請求項１７の発現カセットでトランスフェクションされた単離宿主細胞。
【請求項１９】
真核細胞である、請求項１８の宿主細胞。
【請求項２０】
ａ．請求項１７の発現カセットで宿主細胞をトランスフェクションする段階；および
ｂ．細胞が融合ポリペプチドを発現するのに適した条件下で細胞を培養する段階
：を含む、ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域を含む融合ポリペプチドを組み換え的に作製するための方法。
【請求項２１】
ナトリウム利尿ペプチドがウロジラチンである、請求項２０の方法。
【請求項２２】
請求項１の複合体および薬学的に許容可能なキャリヤーを含む組成物。
【請求項２３】
必要とする患者へ請求項１の複合体の有効量を投与する段階を含む、細菌感染、肺および気管支疾患、腎不全、または心不全を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本開示に含まれる２００６年１２月２１日出願の米国仮特許出願第６０／８７６，９１３号について優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
体内の塩分および水分恒常性を達成するために協調して作用する、関連するペプチドのファミリーが発見されている。これらのペプチドは、ナトリウム利尿および利尿の調節における役割のためにナトリウム利尿ペプチドといい、さまざまなアミノ酸配列を有し、および体内のさまざまな組織を起源とする。ナトリウム利尿ペプチドのこのファミリーは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチド（ＤＮＰ）、およびウロジラチン（ＵＲＯ、またはウラリチド）を含む。それらの組織特異的分布は下記の通りである：心臓（ＡＮＰ、ＢＮＰ、およびＤＮＰ）；脳（ＡＮＰ、ＢＮＰ、およびＣＮＰ）；内皮細胞（ＣＮＰ）；血漿（ＤＮＰ）；および腎臓（ＵＲＯ）。これらのペプチドは、人体における血液量／血圧の複雑なバランスの維持に決定的な役割を果たすホルモン系の構成成分である。
【０００３】
ウロジラチンは、ＡＮＰのように、前駆体タンパク質ｐｒｏ−ＡＮＰに由来し、および腎臓細胞によって分泌される。ウロジラチンは、集合管中の腎臓細胞に直接作用してナトリウムおよび水の排泄を促進し、ナトリウムおよび水の再吸収を阻害する。ＡＮＰおよびＢＮＰといった他のナトリウム利尿ペプチドのように、ウロジラチンは、細菌感染、肺および気管支疾患、腎不全、および鬱血性心不全を含むさまざまな症状の治療における使用について研究されている（たとえば、特許文献１〜４；および非特許文献１〜４を参照）。
【０００４】
ナトリウム利尿ペプチドのさまざまな治療用途を考えると、当該ペプチドの生物活性を保持し、およびより長い血清半減期といった他の有利な性質を有する、ナトリウム利尿ペプチドまたはその誘導体の修飾型を開発する必要性が存在する。本発明はこの必要性および他の関連する必要性を、ナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域の新規複合体を提供することによって対処する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許番号５，５７１，７８９
【特許文献２】米国特許番号６，８３１，０６４
【特許文献３】米国特許出願公報ＵＳ２００５／００８９５１４
【特許文献４】ＰＣＴ出願公報ＷＯ２００６／１１０７４３
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ケンツ（Ｋｅｎｔｓｃｈ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９２，２２（１０）：６６２−６６９
【非特許文献２】ケンツ（Ｋｅｎｔｓｃｈ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９５，２５（４）：２８１−２８３
【非特許文献３】アイズナー（Ｅｉｓｎｅｒ）他，Ａｍ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．１９９５，１２９（４）：７６６−７７３
【非特許文献４】フォスマン（Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ）他，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １９９８，６４（３）：３２２−３３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域を含む新規複合体に関する。当該複合体はＮＰＲ（たとえば、ＮＰＲ−Ａ）受容体に結合する。一部の場合には、ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域はリンカーを介して結合する。別の場合には、複合体は直接融合ポリペプチドであり、ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域の間の直接融合の結果でありえ、またはペプチドリンカーを含みうる。一部の典型的な実施形態では、ナトリウム利尿ペプチドはウロジラチンである。別の典型的な実施形態では、複合体は配列番号：６または１２のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである。この複合体では、抗体定常領域はナトリウム利尿ペプチドのＮ末端またはＣ末端と結合しうるか、またはナトリウム利尿ペプチドは抗体定常領域の内部アミノ酸と結合しうる。さらに、複合体は２つ以上の抗体定常領域を含みうる。たとえば、互いに同一でありうるかまたは異なりうる２つの抗体定常領域が、ナトリウム利尿ペプチドとの複合体中に存在しうる。定常領域は、ナトリウム利尿ペプチドをはさむようにＮ末端およびＣ末端の両方に位置しうるか、またはナトリウム利尿ペプチドの同一（Ｎ末端またはＣ末端）に位置しうる。
【０００８】
さらに、複合体は単量体でも二量体でもよく、および抗体定常領域は抗体重鎖または軽鎖のどちらかに由来しうる。典型的な一実施形態では、複合体は、重鎖定常領域内に位置するジスルフィド結合を介して結合した、ナトリウム利尿ペプチド−抗体重鎖定常領域の融合ポリペプチドの２本の同一の鎖から成るホモ二量体である。別の一実施形態では、複合体は融合ポリペプチドの２つの異なる系のヘテロ二量体である：一方はナトリウム利尿ペプチド−抗体重鎖定常領域融合および他方はナトリウム利尿ペプチド−抗体軽鎖定常領域融合の、重鎖および軽鎖定常領域内に位置するジスルフィド結合を介して結合したものである。
【０００９】
ＮＰＲ−Ａ受容体と結合する能力の上に、複合体は好ましくはさらにＮＰＲ−Ａ受容体を活性化することができ、細胞内ｃＧＭＰレベルの上昇をもたらす。未修飾ナトリウム利尿ペプチドと比較して、複合体は血清半減期の増大を示す。
【００１０】
別の一態様では、本発明は、ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域を含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離核酸に関する。典型的な一実施形態では、ナトリウム利尿ペプチドはウロジラチンである。別の典型的な一実施形態では、核酸は配列番号：５または１１のポリヌクレオチド配列を含む。
【００１１】
本発明はまた、上記の核酸を含む発現カセット、当該発現カセットでトランスフェクションされた単離宿主細胞に関する。宿主細胞は原核細胞または真核細胞でありうる。
【００１２】
別の一態様では、本発明は、ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域を含む融合ポリペプチドを組み換えによって作製するための方法に関する。当該方法は下記の段階を含む：ａ．宿主細胞を上記の発現カセットでトランスフェクションする段階；およびｂ．細胞が融合ポリペプチドを発現するのに適した条件下で当該細胞を培養する段階。一例では、ナトリウム利尿ペプチドはウロジラチンである。
【００１３】
別の一態様では、本発明は、（１）ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域の複合体および（２）薬学的に許容可能なキャリヤーを含む組成物に関する。本発明はまた、必要とする患者にナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域の複合体の有効量を投与する段階を含む、細菌感染、肺および気管支疾患、腎不全、または心不全を治療する方法に関する。一部の実施形態では、複合体は融合タンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））のＤＮＡおよびタンパク質配列。
【図１Ｂ】Ｆｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））のＤＮＡおよびタンパク質配列。
【図２Ａ】Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））およびウラリチドの精製ＮＰＲ−Ａ−Ｆｃ融合タンパク質との結合。
【図２Ｂ】Ｆｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））およびウラリチドの精製ＮＰＲ−Ａ−Ｆｃ融合タンパク質との結合。
【図３Ａ】Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））およびウラリチドはトランスフェクションされた細胞上に発現されるＮＰＲ−Ａ受容体を活性化する。
【図３Ｂ】Ｆｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））およびウラリチドはトランスフェクションされた細胞上に発現されるＮＰＲ−Ａ受容体を活性化する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
「抗体」とは、対応する抗原を非共有的に、可逆的に、および特異的な方法で結合できる、免疫グロブリンファミリーの糖タンパク質、または免疫グロブリンの断片を含むポリペプチドをいう。典型的な抗体構造単位は四量体を含む。各四量体はポリペプチド鎖の同一の２対から成り、各対はジスルフィド結合を介して結合した１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を含む。認められている免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、および無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はκまたはλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはε、に分類され、それが今度は免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥをそれぞれ定義する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う、約１００から１１０以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶL）および可変重鎖（ＶH）の語は、それぞれ軽鎖および重鎖のこれらの領域をいい、一方ＣLおよびＣHはそれぞれ軽鎖および重鎖の定常領域をいう。各軽鎖定常領域すなわちＣL内には１個の定常ドメインがあり、一方、各重鎖定常領域すなわちＣH内には、重鎖の種類（γ、μ、α、δ、またはε）に応じて、３または４個の定常ドメイン（ＣH１、ＣH２、ＣH３、およびＣH４）がある。
【００１６】
「単離された」の語は、核酸またはタンパク質に用いる場合、核酸またはタンパク質が、天然状態で随伴する他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。好ましくは均一状態であるが、乾燥または水溶液内にあってもよい。純度および均一性は典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーといった分析化学手法を用いて測定される。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、当該遺伝子に隣接しおよび目的遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」の語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲル中で本質的に１本のバンドを生じることを意味する。特に、それは核酸またはタンパク質が少なくとも純度８５％、より好ましくは少なくとも純度９５％、および非常に好ましくは少なくとも純度９９％であることを意味する。
【００１７】
「ナトリウム利尿ペプチド」とは、ナトリウム利尿、利尿、および血管拡張を促進する生物活性を有するペプチドである。そのような活性を試験するためのアッセイは当該分野で公知であり、たとえば、米国特許番号４，７５１，２８４および５，４４９，７５１に記載される通りである。ナトリウム利尿ペプチドの例は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ（９９−１２６））、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチド（ＤＮＰ）、ウロジラチン（ＵＲＯ、またはウラリチド）、および、血管拡張、ナトリウム利尿、または利尿活性を保持するプロホルモンＡＮＰ（１−１２６）またはＢＮＰ前駆体ポリペプチドの任意の断片を含むがそれらに限定されない。典型的なナトリウム利尿ペプチドおよびその使用または調製のさらなる説明については、たとえば、米国特許番号４，７５１，２８４、４，７８２，０４４、４，８９５，９３２、５，４４９，７５１、５，４６１，１４２、５，５７１，７８９、および５，７６７，２３９を参照。またハ（Ｈａ）他，Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．１３３（１−３）：１３−１９，２００６も参照。ここでは、「ナトリウム利尿ペプチド」の語はまた、天然に存在するナトリウム利尿ペプチド（たとえば、ＡＮＰまたはＵＲＯ）と実質的に同一なアミノ酸配列（たとえば、配列同一性が少なくとも８０％または８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、またはより高い）を有するペプチドを広く包含する。典型的には、そのようなペプチドは、天然に存在する配列から付加、欠失、または置換によって修飾されている１、２、３、４、または最大５個のアミノ酸を含みうる。さらに、「ナトリウム利尿ペプチド」の語は、対応する野生型ナトリウム利尿ペプチドの生物活性の相当な部分、たとえば、少なくとも１％、好ましくは１０％、より好ましくは５０％、および非常に好ましくは少なくとも８０％、９０％以上を保持している限り、１つ以上の残基に化学修飾（たとえば脱アミノ化、リン酸化、ＰＥＧ化など）または対応するＤ−異性体による置換を含む、天然に存在するナトリウム利尿ペプチドのアミノ酸配列を有する任意のペプチドを包含する。
【００１８】
「ウロジラチン」の語は一般的に、米国特許番号５，４４９，７５１に記載されおよびＧｅｎＢａｎｋ受入番号１５０６４３０Ａに示されるアミノ酸配列を有する３２アミノ酸のペプチドホルモンをいう。ウロジラチンは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の９５−１２６断片であり、ＡＮＰ（９５−１２６）ともいう。「心房性ナトリウム利尿ペプチド」または「ＡＮＰ（９９−１２６）」の語は、ウロジラチンと同一の遺伝子から転写されおよび同一のポリペプチド前駆体ＡＮＰ（１−１２６）に由来するが、Ｎ末端の最初の４個のアミノ酸を有しない、２８アミノ酸ペプチドホルモンをいう。プロホルモンの詳細な説明については、たとえば、オイカワ（Ｏｉｋａｗａ）他 （Ｎａｔｕｒｅ １９８４；３０９：７２４−７２６），ナカヤマ（Ｎａｋａｙａｍａ）他（Ｎａｔｕｒｅ １９８４；３１０：６９９−７０１），グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）他（Ｎａｔｕｒｅ １９８４；３１２：６５６−６５８），サイドマン（Ｓｅｉｄｍａｎ）他（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ １９８５；７：３１−３４）およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号１００７２０５Ａ、１００９２４８Ａ、１１０１４０３Ａ、およびＡＡＡ３５５２９を参照。このプロホルモンをコードするポリヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿６１７２．１に提供される。従来、ウロジラチン（ＵＲＯ）の語は天然に存在するペプチドをいうものとしてしばしば用いられているが、一方「ウラリチド」の語は組み換え的に作製されたかまたは化学的に合成されたペプチドをいうものとしてしばしば用いられる。本出願では、「ウロジラチン」および「ウラリチド」の語は、天然に存在するペプチドおよび組み換えまたは合成ペプチドの両方を広く包含するように相互に交換可能に用いられる。それらの語はまた、ナトリウム利尿ペプチドとしての生物活性を保持している限り、１つ以上の残基に化学修飾（たとえば脱アミノ化、リン酸化、ＰＥＧ化など）または対応するＤ−異性体による置換を含む、上述のアミノ酸配列の任意のペプチドを包含する。さらに、化学的に修飾されたウロジラチンまたはウラリチドは、目的の化学修飾を促進する目的で（たとえば、複合体化のための反応基を提供するために）、１または２個のアミノ酸置換を含みうる。本出願の「ウロジラチン」または「ウラリチド」は、それが化学修飾またはアミノ酸配列修飾を含むかどうかにかかわらず、天然に存在する野生型ウロジラチンまたはＡＮＰ（９５−１２６）の生物活性の相当な部分、すなわち、少なくとも１％、好ましくは１０％、より好ましくは５０％、および非常に好ましくは少なくとも８０％または９０％を保持する。
【００１９】
ここでは、「抗体（または免疫グロブリン）定常領域」は、抗体重鎖または軽鎖の定常領域の少なくとも一部に対応するポリペプチドをいい、そのような一部は少なくとも１つの定常ドメイン（たとえば、ＣLの定常ドメイン、またはＣHの定常ドメインのうちの１つ）を含む。たとえば、本発明の複合体を作製するために用いられる「抗体定常領域」は、抗体重鎖に由来することができ、および３つのうち２つ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧについてＣH２およびＣH３）または４つのうち３つ（ＩｇＥおよびＩｇＭについてＣH２、ＣH３、およびＣH４）の定常ドメインを含む；第１の定常ドメイン（ＣH１）は一部の場合に存在しうるが、しかし他では除外されうる。そのような抗体定常領域は、さまざまな手段によって、たとえば、組み換え法または合成法によって、または、たとえば、未変化抗体または抗体重鎖または軽鎖のペプシンまたはパパイン消化といった酵素消化後の精製によって、得ることができる。本明細書でこの語によってさらに包含されるのは、ナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域複合体中のそのような「抗体定常領域」の存在が複合体へ、より高い血清安定性、たとえば、抗体定常領域を含まないナトリウム利尿ペプチドと同一条件下で比較した場合、血清半減期の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、５０％、８０％、１００％、２００％以上の増加を与える限り、対応する抗体重鎖または軽鎖定常領域または少なくとも抗体鎖のＣ末端に最も近い１つの定常ドメインを含むその一部のアミノ酸配列と実質的な配列同一性（たとえば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％以上）を有するポリペプチドである。ヒト抗体、たとえば、ヒトＩｇＧは、本発明のナトリウム利尿ペプチド複合体を作製する目的で、定常領域またはその断片を得るためにしばしば用いられる。
【００２０】
本明細書では「複合体」は、リンカーの使用ありまたは無しで、ポリペプチドレベルで結合した、少なくとも１つのナトリウム利尿ペプチドおよび１つの抗体定常領域を有する化合物をいう。複合体は、ペプチドリンカーのためのコード領域を含むかまたは含まない、少なくとも１つのナトリウム利尿ペプチドおよび１つの抗体定常領域をコードする遺伝子の核酸レベルでの結合の結果として生じる融合ポリペプチドでありうる。
【００２１】
「ＮＰＲ−Ａ受容体」は本明細書では、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ型をいう。グアニリルシクラーゼＡともいい、細胞表面上に発現される膜貫通型タンパク質であり、およびホルモン刺激に応じてｃＧＭＰを合成する。たとえば、チンカーズ（Ｃｈｉｎｋｅｒｓ）他，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：７８−８３，１９８９およびロウ（Ｌｏｗｅ）他，ＥＭＢＯＪ．８（５）：１３７７−８４，１９８９を参照。ＮＰＲ−Ｂ（グアニリルシクラーゼＢ）およびＮＰＲ−Ｃ（非グアニリルシクラーゼ）はＮＰＲファミリーの２つの他のメンバーである。
【００２２】
「ナトリウム利尿ペプチド受容体」すなわち「ＮＰＲ」は、３つの受容体：ＮＰＲ−Ａ（グアニリルシクラーゼＡ）、ＮＰＲ−Ｂ（グアニリルシクラーゼＢ）およびＮＰＲ−Ｃ（非グアニリルシクラーゼ）を含む受容体ファミリーである。
【００２３】
本明細書では、ナトリウム利尿ペプチド（たとえば、ウロジラチン）および抗体定常領域を含む複合体は、当該複合体が同一アッセイ条件下で、対応する野生型ナトリウム利尿ペプチド（たとえば、ウロジラチン）と同様のＮＰＲ−Ａ受容体に対する結合親和性を示す場合、ＮＰＲ−Ａ受容体と「結合する」という。たとえば、本発明のウロジラチン−抗体定常領域複合体は、ＮＰＲ−Ａ結合アッセイで野生型ウロジラチンによって示されるよりも、少なくとも０．１％、１％、１０％、または２０％、好ましくは少なくとも２５％または３０％、およびより好ましくは少なくとも５０％またはさらに高い結合親和性を有する。
【００２４】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」の語は、１本鎖または２本鎖型の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそのポリマーをいう。特に限定されない限り、その語は、参照核酸と同様の結合特性を有しおよび天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される、天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含する。特記されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾された変異体（たとえば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、ＳＮＰ、および相補配列、ならびに明示的に示された配列を黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じることによって達成されうる（バツァー（Ｂａｔｚｅｒ）他，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；オオツカ（Ｏｈｔｓｕｋａ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；およびロソリニ（Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ）他，ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４）。核酸の語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと相互に交換可能に用いられる。
【００２５】
「遺伝子」の語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡセグメントを意味する。それはコード領域の先行領域および後続領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに各コードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００２６】
「アミノ酸」の語は、天然に存在するおよび合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸ミメティクス（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードでコードされるもの、および後で修飾されるアミノ酸、たとえば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合するα炭素を有する化合物、たとえば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。そのようなアナログは修飾Ｒ基（たとえば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、しかし天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造を保持する。「アミノ酸ミメティクス」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、しかし天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能する化合物をいう。
【００２７】
非天然アミノ酸誘導体またはアナログの部位特異的な方法でのポリペプチド鎖への組み込みを可能にする、本分野で公知である多数の方法がある。たとえば、ＷＯ０２／０８６０７５を参照。
【００２８】
アミノ酸はここでは一般的に知られる３文字表記によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される１文字表記で表わすことができる。ヌクレオチドも、同様に、一般的に許容される１文字表記で表わすことができる。
【００２９】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾された変異体」とは、同一なまたは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸をいい、または当該核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のために、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所定のタンパク質をコードする。たとえば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定されるすべての部位で、当該コドンは、コードされたポリペプチドを変化させることなく、記載の対応コドンのうちのいずれかに変更されうる。そのような核酸変異は、保存的に修飾された変異の一種である、「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードするすべての核酸配列はここでは、当該核酸のすべての可能なサイレント変異もまた記載する。当業者は、核酸中の各コドン（メチオニンの通常唯一のコドンであるＡＵＧ、およびトリプトファンの通常唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は修飾され、機能的に同一な分子を生じ得ることを理解する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載される各配列に内在する。
【００３０】
アミノ酸配列については、当業者は、コードされた配列中の１個のアミノ酸または小さい割合のアミノ酸を変化、付加または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、当該変化が化学的に類似のアミノ酸とのアミノ酸置換を結果として生じる場合は、「保存的に修飾された変異体」であることを理解する。機能的に類似のアミノ酸を与える保存的置換表は本分野でよく知られている。そのような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えて存在し、およびそれらを除外しない。
【００３１】
下記の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（たとえば、クレイトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ），『タンパク質』（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９８４）を参照）。
【００３２】
アミノ酸はここでは一般的に知られる３文字表記によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される１文字表記で表わすことができる。ヌクレオチドも、同様に、一般的に許容される１文字表記で表わすことができる。
【００３３】
本出願では、アミノ酸残基は、未修飾野生型ポリペプチド配列において１番を付けられる最も左側の残基からの相対位置にしたがって番号が付けられる。
【００３４】
ここでは、「同一な」またはパーセント「同一性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列を説明する関連で、下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いてまたは手動整列および目視検査によって、比較ウィンドウまたは測定される指定の領域にわたって最大の一致について比較および整列する際、同一であるかまたは、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの規定の割合を有する２つ以上の配列または部分配列をいう（たとえば、本発明の複合体を作製するのに用いられるウラリチドペプチドは、天然に存在するウロジラチンの配列（配列番号：２）と実質的に同一な、配列番号：２と少なくとも８０％または８５％、好ましくは９０％同一性、より好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を有する；一方複合体中の定常領域ポリペプチドは、天然に存在する抗体重鎖または軽鎖定常領域、たとえば、配列番号：４の完全長または一部と実質的に同一な、配列番号：４と少なくとも８０％または８５％、好ましくは９０％同一性、より好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を有する）。一例として、配列番号：２または４と実質的に同一なアミノ酸配列は、配列番号：２において１、２、３、４、または最大５個のアミノ酸を置換、欠失または付加することによる、または配列番号：４において１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個のアミノ酸を置換、欠失または付加することによる、配列番号：２または４に由来する配列でありうる。配列番号：２または４といった天然に存在するナトリウム利尿ペプチドまたは抗体定常領域のアミノ酸配列と実質的に同一な配列は、本発明の複合体の作製における使用に適する。ポリヌクレオチド配列に関して、同一性の定義はまた、被験配列の相補鎖もいう。好ましくは、同一性は、長さ少なくとも約５０アミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって、またはより好ましくは長さ７５〜１００または１００〜１５０（たとえば、約１２０）アミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【００３５】
配列比較のためには、典型的には１つの配列が、被験配列を比較する参照配列の役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、被験配列および参照配列はコンピュータに入力され、部分配列座標が必要に応じて指定され、および配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターが使用されうるか、または代替的なパラメーターが指定されうる。配列比較アルゴリズムは次いで、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較して被験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。たとえば、それぞれ配列番号：２または４の、典型的なアミノ酸配列と共に用いられるナトリウム利尿ペプチドまたは抗体定常領域の配列比較については、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムおよび下記で考察されるデフォルトパラメーターが用いられる。
【００３６】
「比較ウィンドウ」はここでは、同数の連続部位の参照配列と、２つの配列が最適に整列された後に比較されうる、２０から６００、普通は約５０から約２００、より普通は約１００から約１５０から成る群から選択される連続部位の数のうちいずれか１つのセグメントへの参照を含む。比較のための配列の整列の方法は本分野でよく知られている。比較のための配列の最適整列は、たとえば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ），Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所ホモロジーアルゴリズムによって、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジー整列アルゴリズムによって、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施によって（ウィスコンシンジェネティクス（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）ソフトウェアパッケージ（ジェネティクスコンピューターグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ５７５（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ））のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動整列および目視検査によって（たとえば、『分子生物学最新プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他編．１９９５補遺）を参照）、実施されうる。
【００３７】
パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適するアルゴリズムの好ましい一例が、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）他，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２ （１９７７）およびアルトシュル他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０ （１９９０）にそれぞれ記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、ここに記載されるパラメーターと共に、本発明の核酸およびタンパク質についてパーセント配列同一性を決定するために用いられる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを通じて公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列する際に一致するかまたはある正の閾値スコアＴを満たす、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコアの 配列対 （ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔを近隣ワードスコア閾値という（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）他，前掲）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含む、より長いＨＳＰを見出すための検索を開始するための種として作用する。ワードヒットは、累積整列スコアを増加できるかぎり長く、各配列に沿って両方向へ伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（マッチ残基の対についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するためにスコアマトリクスが用いられる。ワードヒットの各方向への伸長は：累積整列スコアが最大達成値から量Ｘ低下する時；；１つ以上のネガティブスコア残基整列の累積によって、累積スコアがゼロ以下となる時；または配列の各終端に達した時、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３、および期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリクス（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８９：１０９１５ （１９８９））整列（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。
【００３８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析を実施する（たとえば、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然によって起こる確率の指標を提供する、最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。たとえば、被験核酸の参照核酸との比較の最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、および非常に好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似していると考えられる。
【００３９】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である指標は、下記のように、第１の核酸にコードされるポリペプチドが、第２の核酸にコードされるポリペプチドに対して作製された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、ポリペプチドは典型的には、たとえば２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第２のペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるというもう１つの指標は、下記のように、２つの分子またはその相補鎖が厳密条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の指標は、配列を増幅するために同一のプライマーが使用されうることである。
【００４０】
「ポリペプチド」および「ペプチド」は、ここではアミノ酸残基のポリマーをいうのに相互に交換可能に用いられる；一方「タンパク質」は１または複数のポリペプチド鎖を含みうる。３つすべての語が、１つ以上のアミノ酸残基が天然に存在するアミノ酸の人工化学ミメティックであるアミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーにも適用される。ここでは、それらの語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合で結合している、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
【００４１】
「発現カセット」とは、組み換え的にまたは合成的に作製された、宿主細胞において特定のポリヌクレオチド配列（たとえば、本発明のナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域融合タンパク質をコードするもの）の転写を可能にする一連の特定の核酸配列を有する核酸構築物である。発現カセットは、ウイルスゲノム、または核酸断片の一部でありうる。典型的には、発現カセットは、プロモーターと、および随意的にエンハンサーといった他の甜茶調節配列と、調節可能に結合した、転写すべきポリヌクレオチドを含む。
【００４２】
「投与」または「投与する」の語は、ある物質を、哺乳類、特にヒトといった動物と接触させるさまざまな方法をいう。投与様式は、静脈内、腹腔内、鼻内、経皮、局所、皮下、非経口、筋肉内、経口、または全身、および注射、経口摂取、吸入、埋め込み、または任意の他の手段による吸着を介して物質を接触させる方法を含みうるがそれらに限定されない。候補治療薬は、シロップ、エリキシル、懸濁液、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、菱形剤、トローチ、水溶液、クリーム、軟膏、ローション、ジェル、または乳液の形で医薬組成物として処方されうる。本発明のナトリウム利尿ペプチド複合体の投与の１つの典型的な方法は、複合体がたとえば水溶液、懸濁液、または乳液などといった静脈内注射に適する形の医薬組成物として処方されうる、静脈内デリバリー経由である。本発明のナトリウム利尿ペプチド複合体を配送するための別の方法は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、またはクリーム、パッチ、または坐剤の形のような経皮または経粘膜投与を含む。
【００４３】
「有効量」は、有益なまたは目的の作用を、そのような作用の検出に一般的に用いられる方法によって容易に検出可能なレベルで生じるのに十分な、有効成分、たとえば、本発明のウロジラチン−Ｆｃ融合タンパク質の、医薬組成物または生理的組成物中の量をいう。好ましくは、そのような作用は、当該有効成分が投与されていない基底レベルの値から少なくとも１０％の変化を結果として生じ、より好ましくは当該変化は基底レベルから少なくとも２０％、５０％、８０％、またはさらに高い割合である。下に記載される通り、有効成分の有効量は、対象の年齢、一般状態、治療する症状の重症度、および投与される特定の生物活性物質、などに応じて対象ごとに異なりうる。任意の個別ケースにおける適当な「有効」量は、当業者によって、関連テキストおよび文献を参照しておよび／または通常の実験を用いることによって決定されうる。
【００４４】
「薬学的に許容可能なキャリヤー」または「添加物」とは、たとえば、本発明のナトリウム利尿ペプチド融合タンパク質を含む、本発明の組成物の処方に用いられる、不活性な成分である。そのようなキャリヤーまたは添加物は、有効成分を安定化するように作用でき、および、たとえば、それを必要とする患者への注射による使用に適しうる。この不活性な成分は、本発明の組成物に含まれる場合、組成物の目的のｐＨ、粘度、色、臭い、または芳香を提供する物質でありうる。薬学的に許容可能なキャリヤーは、糖質（たとえばグルコース、スクロース、またはデキストラン）、抗酸化剤（たとえばアルコルビン酸またはグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質、高分子量ポリマー、ゲル形成剤、または他の安定剤および添加剤を含みうるがそれらに限定されない。薬学的に許容可能なキャリヤーの他の例は、湿潤剤、乳化剤、分散剤、または特に微生物の増殖または作用を防ぐのに有用な保存料を含む。さまざまな保存料がよく知られており、および、たとえば、フェノールおよびアスコルビン酸を含む。キャリヤー、安定剤、またはアジュバントの例は、『レミントンの薬科学』（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ），ペンシルベニア州フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ），第１７版（１９８５）に見ることができる。
【００４５】
ここでは、「患者」とはヒトまたは非ヒト哺乳類をいう。
【００４６】
「血清半減期の増加」とは、修飾された生物活性な分子（たとえば、ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域を含む本発明の複合体）の、その被修飾形（たとえば、ナトリウム利尿ペプチド単独）と比較した循環半減期の正の変化である。血清半減期は、生物活性な分子の投与後のさまざまな時点での血液試料採取、および各試料中のその分子の濃度測定によって測定される。血清濃度の時間との相関は、血清半減期の計算を可能にする。増加は望ましくは少なくとも約１０％から２０％、または少なくとも約５０％から１００％である。好ましくは増加は少なくとも約３倍、より好ましくは少なくとも約５倍、および非常に好ましくは少なくとも約１０倍以上である。
【００４７】
Ｉ．序論
本発明者らは、ナトリウム利尿ペプチド、たとえばウロジラチン（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号１５０６４３０）、および免疫グロブリン重鎖または軽鎖定常領域の少なくとも一部に相当するポリペプチドの間の複合体の作製に成功し、および当該複合体が、ナトリウム利尿ペプチドの生物活性、たとえば、ウロジラチンの活性を、その天然受容体であるＮＰＲ−Ａ受容体に対する特異的結合特異性、および受容体との結合に際して細胞内ｃＧＭＰレベル上昇を誘導する能力に関して保持することを実証した。複合体の抗体定常領域部分が複合体の半減期を延長し、非複合体型ナトリウム利尿ペプチド単独よりも複合体をより安定化するため、抗体定常領域を含む複合体は、ナトリウム利尿ペプチドの使用が適応される症状の治療において、非複合体型ナトリウム利尿ペプチドのより有効な代替物を提供する。
【００４８】
ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域を含む本発明の複合体を作製するためのいくつかの方法がある。たとえば、当業者は、ナトリウム利尿ペプチドおよび定常領域をコードする遺伝子が融合タンパク質の結合コード配列として核酸レベルで結合される場合、ナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域融合タンパク質はトランスフェクションされた細胞で発現されうることを理解する。一方、ナトリウム利尿ペプチド部分および抗体定常領域は、別々の作製後に、組み換え産生、化学合成、または必要に応じて酵素消化後の天然起源からの精製といったさまざまな方法によってポリペプチドレベルで結合されうる。別々に作製されたナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域は、直接化学結合（ペプチド結合または非ペプチド結合、たとえばジスルフィド結合）によって、または１つ以上の化学リンカーを介して結合されうる。ペプチドのＮ−またはＣ−末端アミノ酸が結合部位を提供でき、またはいずれかのペプチド配列の中に位置するアミノ酸、すなわち、内部アミノ酸が、結合部位を提供できる。第３の選択肢として、ナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域融合タンパク質は、本分野で公知である化学的方法によって、単一ペプチドとして直接的に合成されうる。
【００４９】
ＩＩ．ナトリウム利尿ペプチド、抗体定常領域、またはそれらの融合タンパク質の組み換え作製
Ａ．一般的な組み換え技術
本発明は、分子生物学および細胞生物学における多数の通常の技術を利用する。組み換え遺伝学の分野の一般的な方法および技術を開示する基本的な文書は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ），『分子クローニング・実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第３版２００１）；クリーグラー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ），『遺伝子導入および発現：実験の手引き』（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９９０）；およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他編，『分子生物学最新プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９４）を含む。
【００５０】
核酸については、サイズはキロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）で与えられる。これらは、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動に、配列決定された核酸に、または出版されたＤＮＡ配列に由来する推定である。タンパク質については、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、由来するアミノ酸配列から、または出版されたタンパク質配列から推定される。
【００５１】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、たとえば、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびカルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２ （１９８１）によって最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法にしたがって、バンデバンター（Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒ）他，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載される通り自動合成装置を用いて化学的に合成されうる。オリゴヌクレオチドの精製は、たとえば、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリーニエ（Ｒｅａｎｉｅｒ），Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７−１４９（１９８３）に記載される通り、未変性アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換ＨＰＬＣといった任意の本分野で認められた戦略を用いて実施される。
【００５２】
ナトリウム利尿ペプチド、抗体定常領域、またはそれらの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび合成オリゴヌクレオチドの配列は、たとえば、ウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ）他，Ｇｅｎｅ １６：２１−２６ （１９８１）の２本鎖テンプレートを配列決定するための鎖終止法を用いて確認されうる。
【００５３】
Ｂ．ナトリウム利尿ペプチドまたは抗体定常領域のコード配列の作製
天然に存在するナトリウム利尿ペプチドのアミノ酸配列は本分野で公知であるため、それらのコードポリヌクレオチド配列もまた公知であるかまたは容易に導くことができる。たとえば、ウロジラチンをコードするポリヌクレオチド配列は本分野でよく知られており、および本明細書で配列番号：１として、配列番号：２で示す対応するアミノ酸配列と共に提供される。ヒトまたは他の種のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ抗体の定常領域および重鎖または軽鎖の各定常ドメインをコードするいくつかの配列もまた同定されている。ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の一部をコードする１つの典型的な配列が本明細書で配列番号：３として、配列番号：４で示す対応するアミノ酸配列と共に提供される。
【００５４】
本分野でよく知られている方法を用いて、これらの配列の変異体をコードするポリヌクレオチド配列が容易に作製されうる。たとえば、ＰＣＲに基づく突然変異誘発法は、配列番号：２のアミノ酸配列と実質的な同一性（たとえば、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％配列同一性）を有する変異体のコード配列を作製することを可能にする。同様に、抗体定常領域の変異体をコードするポリヌクレオチド配列を作製することができ、それはこれらの典型的な配列との９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、ないし９９％またはさらに高い配列同一性を有しうる。
【００５５】
本出願に記載される通りナトリウム利尿ペプチドペプチド、抗体定常領域、またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を得る際に、当業者は次いで当該ポリヌクレオチド配列をベクター、たとえば、発現ベクターへ、組み換えポリペプチドが結果として得られる構築物から作製されうるようにサブクローニングできる。コード配列へのさらなる修飾、たとえば、ヌクレオチド置換が、組み換えポリペプチドの特徴を変化させるように後で実施されうる。
【００５６】
Ｃ．宿主生物における好ましいコドン用法のための核酸の修飾
ナトリウム利尿ペプチド、抗体定常領域、またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、特定の宿主の好ましいコドン用法に一致するようにさらに偏光されうる。たとえば、細菌細胞の１系統の好ましいコドン用法を用いて、本発明のナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域融合タンパク質をコードしおよびこの系統に好まれるコドンを含むポリヌクレオチドを得ることができる。宿主細胞が示す好ましいコドン用法の頻度は、宿主細胞が発現する多数の遺伝子における好ましいコドン用法の頻度を平均することによって計算できる（たとえば、計算サービスをかずさＤＮＡ研究所（Ｋａｚｕｓａ ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（日本）のウェブサイトで利用できる）。この分析は、好ましくは、宿主細胞が高度に発現する遺伝子に限定される。
【００５７】
修飾の完了に際して、コード配列は配列決定によって確認され、および次いで、目的ポリペプチド、たとえばウロジラチンおよびＦｃ断片を含む融合タンパク質の、組み換え産生のための適当な発現ベクターへサブクローニングされる。
【００５８】
ＩＩＩ．組み換えタンパク質の発現および精製
コード配列の確認後、目的の組み換えタンパク質、たとえば、本発明のナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域融合タンパク質は、組み換え遺伝学の分野の通常の方法を用いて作製されうる。
【００５９】
Ａ．組み換えポリペプチドの発現のための細胞
原核および真核の両方の、さまざまな細胞型が、本発明の組み換えタンパク質の発現に適する。これらの細胞型は、たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）といったさまざまな細菌、および、酵母、昆虫細胞、および哺乳類細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞）といった真核細胞を含むがそれらに限定されない。一部の場合には、植物細胞もまた、組み換えポリペプチドの組み換え発現のための宿主細胞として適当である。遺伝子発現に適する細胞は当業者によく知られており、およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）（前掲）といった多数の科学文献に記載されている。
【００６０】
Ｂ．発現系
本発明の組み換えポリペプチドをコードする核酸の高レベル発現を得るために，典型的には、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、直接転写の強力なプロモーター，転写／翻訳ターミネーターおよび翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクターへサブクローニングする。適当な細菌プロモーターは本分野でよく知られており、およびたとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）（前掲）、およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他（前掲）に記載されている。ポリペプチドを発現するための細菌発現系は、たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびカウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）で利用可能である。そのような発現系のためのキットは市販されている。哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核発現系は本分野でよく知られておりおよびまた市販されている。一実施形態では、真核発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスベクターである。
【００６１】
異種核酸の直接発現に用いられるプロモーターは、特定の用途に依存する。プロモーターは随意的に異種転写開始部位から、天然の状況での転写開始部位からとほぼ等しい距離に配置される。本分野で公知である通り、しかし、この距離にいくらかの変化を、プロモーター機能の損失無しに与えることができる
【００６２】
プロモーターに加えて、発現ベクターは典型的には、宿主細胞においてポリペプチドの発現に必要なすべての追加の配列を含む、転写ユニットまたは発現カセットを含む。典型的な発現カセットは、したがって、ポリペプチドをコードする核酸配列に動作可能に結合したプロモーター、および転写産物の効率的なポリアデニル化に必要なシグナル、リボソーム結合部位、および翻訳終止部を含む。ポリペプチドをコードする核酸配列は典型的には、形質転換細胞によるポリペプチドの分泌を促進するための、切断可能なシグナルペプチド配列と結合している。そのようなシグナルペプチドは、特に、組織プラスミノーゲン活性化因子、インシュリン、および神経増殖因子、およびオオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の幼若ホルモンエステラーゼに由来するシグナルペプチドを含む。カセットの他の配列は、エンハンサー、および、ゲノムＤＮＡが構造遺伝子として用いられる場合は、機能性スプライスドナーおよびアクセプター部位を有するイントロンを含みうる。
【００６３】
プロモーター配列に加えて、発現カセットもまた、効率的な終止を提供するために構造遺伝子の下流に転写終止領域を含むべきである。終止領域はプロモーター配列と同一の遺伝子から得ることができ、または別の遺伝子から得ることができる。
【００６４】
細胞へ遺伝情報を運ぶのに用いられる具体的な発現ベクターは特に決定的ではない。真核または原核細胞における発現に用いられる従来のベクターの任意のものが使用されうる。標準的な細菌発現ベクターは、ｐＢＲ３２２を基礎とするプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄといったプラスミド、およびＧＳＴおよびＬａｃＺといった融合発現系を含む。たとえば、ｃ−ｍｙｃのように、単離の便利な方法を提供するためにエピトープタグもまた組み換えタンパク質に加えることができる。
【００６５】
真核ウイルス由来の調節配列を含む発現ベクターは、典型的には、真核発現ベクター、たとえば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルスに由来するベクターに使用される。他の典型的な真核ベクターは、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ+、ｐＭＴＯ１０／Ａ+、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳がんウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリへドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効であることが示されている他のプロモーターの調節下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターを含む。
【００６６】
一部の発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼおよびジヒドロ葉酸還元酵素といった、遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。代替的に、ポリへドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの支配下にある組み換え抗体または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターといった、遺伝子増幅が関与しない高収量発現系もまた適当である。
【００６７】
典型的には発現ベクターに含まれる配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で機能するレプリコン、組み換えプラスミドを持つ細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域の唯一の制限部位もまた含む。選択される具体的な抗生物質耐性遺伝子は決定的でなく、本分野で公知の多数の耐性遺伝子のうち任意のものが適当である。原核配列は、必要に応じて、真核細胞におけるＤＮＡの複製に干渉しないように、随意的に選択される。抗生物質耐性選択マーカーと同様に、既知の代謝経路に基づく代謝選択マーカーもまた、形質転換宿主細胞を選択するための手段として使用されうる。
【００６８】
組み換えタンパク質（たとえば、本発明のウロジラチン−Ｆｃ断片融合タンパク質）の周辺発現が望まれる場合、発現ベクターはさらに、発現すべきタンパク質のコード配列の５'に直接結合された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＯｐｐＡ（周辺オリゴペプチド結合タンパク質）分泌シグナルまたはその修飾型といった分泌シグナルをコードする配列を含む。このシグナル配列は、細胞質で産生された組み換えタンパク質を、細胞膜を通過して周辺腔へ導く。発現ベクターはさらに、組み換えタンパク質が周辺腔に入る際にシグナル配列を酵素的に切断できる、シグナルペプチダーゼ１をコードする配列を含みうる。組み換えタンパク質の周辺産生についてのより詳細な記載は、たとえば、グレイ（Ｇｒａｙ）他，Ｇｅｎｅ ３９：２４７−２５４（１９８５），Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．６，１６０，０８９および６，４３６，６７４に見出すことができる。
【００６９】
上記で考察した通り、当業者は、一部の修飾、特にさまざまな保存的置換を、典型的なナトリウム利尿ペプチドまたは抗体定常領域（たとえば、配列番号：２および４）に、ナトリウム利尿ペプチドの生物活性および抗体定常領域の望まれる安定化作用をまだ保持したままで行うことができることを理解する。さらに、ポリヌクレオチドコード配列の修飾はまた、結果として生じるアミノ酸配列を変えることなく、特定の発現宿主において好ましいコドン用法を与えるように実施されうる。
【００７０】
Ｃ．トランスフェクション法
標準的なトランスフェクション法を用いて、大量の組み換えポリペプチドを発現する細菌、哺乳類、酵母、昆虫、または植物細胞株が作製され、組み換えポリペプチドは次いで標準的な方法を用いて精製される（たとえば、コリー（Ｃｏｌｌｅｙ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９−１７６２２ （１９８９）；『タンパク質精製ガイド』（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ），ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２ （ドイチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）編，１９９０）を参照）。真核および原核細胞の形質転換は、標準的な方法にしたがって実施される（たとえば、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ），Ｊ Ｂａｄ．１３２：３４９−３５１（１９７７）；クラーク・カーチス（Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ）およびカーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７−３６２（ウー（Ｗｕ）他編，１９８３）を参照。
【００７１】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞へ導入するためのよく知られた方法のうち任意のものが使用されうる。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、血漿ベクター、ウイルスベクターおよび、クローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の外来遺伝物質を宿主細胞へ導入するための任意の他のよく知られた方法の使用を含む（たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）、前掲）。使用する具体的な遺伝子工学手順は、ウロジラチン、ＣＨ断片、またはそれらの融合タンパク質を発現できる宿主細胞へ、少なくとも１個の遺伝子の導入に成功できさえすればよい。
【００７２】
Ｄ．組み換えによって産生されたポリペプチドの精製
トランスフェクションされた宿主細胞における組み換えポリペプチドの発現が一旦確認されれば、宿主 細胞は次いで、組み換え ポリペプチドを精製する目的のために適当なスケールで培養される。
【００７３】
１．原核および真核細胞からの組み換えタンパク質の精製
ポリペプチド、たとえば、本発明のナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域融合タンパク質が、典型的にはプロモーター誘導後、組み換え的に形質転換細菌によって大量に産生される際、発現は構成的でありうるが、ポリペプチドは不溶性凝集物を形成しうる。タンパク質封入体の精製に適したいくつかの手順がある。たとえば、凝集タンパク質（以後、封入体と呼ぶ）の精製は、典型的には、たとえば約１００〜１５０μｇ／ｍｌリゾチームおよび非イオン性界面活性剤０．１％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０の緩衝液中でのインキュベートによる細菌細胞の破壊による、封入体の抽出、分離および／または精製を含む。細胞懸濁液は、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）グラインダー（ブリンクマン・インスツルメンツ社（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ニューヨーク州ウェストベリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ））を用いて磨砕されうる。代替的に、細胞は氷上で超音波処理されうる。細菌を溶解する代替的な方法は、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）（共に前掲）に記載され、および当業者に明らかとなる。
【００７４】
細胞懸濁液は一般的に遠心分離され、および封入体を含む沈澱が、封入体を溶解せずに洗浄する緩衝液、たとえば、２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび非イオン性界面活性剤２％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００に再懸濁される。細胞残渣を可能な限り除去するように洗浄段階を反復する必要がありうる。残った封入体の沈澱を、適当な緩衝液（たとえば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁しうる。他の適当な緩衝液は当業者に明らかとなる。
【００７５】
洗浄段階後、封入体は、強い水素受容体および強い水素供与体の両方（またはこれらの性質の一方をそれぞれ有する溶媒の組み合わせ）である溶媒の添加によって可溶化される。封入体を形成したタンパク質は、次いで、適合する緩衝液での希釈または透析によって再生されうる。適当な溶媒は、尿素（約４Ｍないし約８Ｍ）、ホルムアルデヒド（少なくとも約８０％、体積／体積基準）、および塩酸グアニジン（約４Ｍないし約８Ｍ）を含むがそれらに限定されない。凝集形成タンパク質を可溶化できる一部の溶媒、たとえばＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および７０％ギ酸は、免疫原性および／または活性の欠如を伴うタンパク質の不可逆的変性の可能性のために、この手順には不適当でありうる。塩酸グアニジンおよび類似の物質は変性剤であるが、この変性は不可逆でなく、および変性剤の除去（たとえば透析によって）または希釈に際して再生が可能であり、目的の免疫学的におよび／または生物学的に活性なタンパク質の再変性を可能にする。可溶化後、当該タンパク質は、他の細菌タンパク質から標準的な分離方法によって分離されうる。組み換えポリペプチドの細菌封入体からの精製のさらなる説明については、たとえば、パトラ（Ｐａｔｒａ）他，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １８：１８２−１９０（２０００）を参照。
【００７６】
代替的に、組み換えポリペプチド、たとえば、組み換えによって産生された本発明のウロジラチン−Ｆｃ断片融合タンパク質を、細菌周辺質から精製することが可能である。組み換えタンパク質が細菌の周辺質へ排出される場合、細菌の周辺画分は、当業者に明らかである他の方法に加えて、冷浸透圧ショックによって単離されうる（たとえば、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他（前掲）を参照）。組み換えタンパク質を周辺質から単離するために、細菌細胞は遠心分離されて沈澱が形成される。沈澱は、２０％スクロースを含む緩衝液に再懸濁される。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、および沈澱を氷冷５ｍＭ ＭｇＳＯ4に再懸濁し、および氷浴中に約１０分間保持する。細胞懸濁液を遠心分離し、および上清をデカントしおよび保存する。上清中に存在する組み換えタンパク質は宿主タンパク質から、当業者によく知られた標準的な分離方法によって分離されうる。
【００７７】
２．精製のための標準的なタンパク質分離法
下記の標準的なタンパク質精製方法は、原核細胞（たとえば細菌細胞）および真核細胞（たとえば哺乳類細胞）での組み換えタンパク質産生過程の両方に適用可能である。組み換えポリペプチド、たとえば、本発明のナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域融合タンパク質が宿主細胞において可溶型で発現される場合、その精製は下記の標準的なタンパク質精製手順に従うことができる。この標準的な精製手順はまた、化学合成から得られたナトリウム利尿ペプチド、抗体定常領域、またはそれらの複合体（ペプチド結合によって結合したそれらの複合体、すなわち、融合タンパク質を含む）を精製するのにも適している。
【００７８】
ｉ．可溶性分画
しばしば最初の段階として、およびタンパク質混合物が複雑である場合は、最初の塩分画が、不要な宿主細胞タンパク質（または細胞培地に由来するタンパク質）の多くを、目的の組み換えタンパク質、たとえば、本発明のウロジラチン−Ｆｃ断片融合タンパク質から分離できる。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に減少させることによってタンパク質を沈澱する。タンパク質は次いで、それらの溶解度に基づいて沈澱する。タンパク質が疎水性であるほど、タンパク質はより低い硫酸アンモニウム濃度にて沈澱する可能性が高い。典型的な手順は、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液へ、結果として生じる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％の間になるように加える。これは大部分の疎水性タンパク質を沈澱する。沈澱は廃棄され（目的のタンパク質が疎水性でない限り）、および硫酸アンモニウムが上清へ、目的のタンパク質を沈澱することが知られている濃度へ添加される。沈澱は次いで緩衝液中で可溶化され、および必要に応じて透析またはダイアフィルトレーションによって過剰の塩が除去される。冷エタノール沈澱といった、タンパク質の溶解度に基づく他の方法は当業者によく知られており、および複雑なタンパク質混合物を分画するのに使用されうる。
【００７９】
ｉｉ．サイズ分画ろ過
計算分子量に基づいて、サイズがより大きい、およびより小さいタンパク質は、異なる孔径の膜（たとえば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）またはミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜）を通した限外ろ過を用いて単離されうる。最初の段階として、タンパク質混合物を、目的のタンパク質、たとえば、ナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域融合タンパク質の分子量よりも小さい分子量カットオフを有する孔径の膜を通して限外ろ過する。限外ろ過の不透過物を次いで、目的のタンパク質の分子量よりも大きい分子量カットオフを有する膜に対して限外ろ過する。組み換えタンパク質は膜をろ液へと通過する。ろ液を次いで下記の通りクロマトグラフィーしうる。
【００８０】
ｉｉｉ．カラムクロマトグラフィー
目的のタンパク質（たとえば本発明のナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域融合タンパク質）はまた、他のタンパク質から、サイズ、正味表面電荷、疎水性、またはリガンドに対する親和性に基づいて分離されうる。さらに、ナトリウム利尿ペプチドまたはその融合パートナーの抗体定常領域に対して作製された抗体を、カラムマトリクスに結合しおよび組み換えポリペプチドを免疫精製できる。これらの方法のすべては本分野でよく知られている。
【００８１】
クロマトグラフィー法は任意のスケールでおよび多数の異なる製造者（たとえば、ファルマシア・バイオテク社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））由来の装置を用いて実施できることが当業者に明らかとなる。
【００８２】
ＩＶ．ナトリウム利尿ペプチド、抗体定常領域、またはそれらの融合タンパク質の化学合成
組み換え産生が上記の方法にしたがって実行可能である一方、ａナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域はまた、それらの複合体化の前に、従来のペプチド合成または本分野でよく知られた他の手順を用いて合成されうる。さらに、ナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域融合タンパク質はまた、特に融合タンパク質が相対的に長さが短い、たとえば、１５０〜２００アミノ酸未満である場合は、単一ポリペプチドとして化学的に合成されうる。
【００８３】
ポリペプチドは、固相ペプチド合成法によって、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）他，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，８５：２１４９−２１５６（１９６３）；『ペプチド：分析、合成、生物学』（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ）グロス（Ｇｒｏｓｓ）およびマイエンホファー（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）（編），アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク，第２巻，ｐｐ．３−２８４（１９８０）のバラニー（Ｂａｒａｎｙ）およびメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ），『固相ペプチド合成』（Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）；およびスチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）他，『固相 ペプチド合成第２版』（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ２ｎｄ ｅｄ．），ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．），ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ），１１１．（１９８４）によって記載されたものと同様の手順を用いて合成されうる。合成中に、保護された側鎖を持つＮ−α−保護アミノ酸が、Ｃ末端でおよび固相担体へ、すなわち、ポリスチレンビーズへ結合された成長中のポリペプチド鎖へ段階的に添加される。ペプチドは、Ｎ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドといった試薬と反応させることによって活性化されているＮ−α−保護アミノ酸のα−カルボキシ基へ結合させることによって合成される。活性化カルボキシルへの遊離アミノ基の付加は、ペプチド結合形成に繋がる。最も一般的に用いられるＮ−α−保護基は、酸不安定性であるＢｏｃ、および塩基不安定性であるＦｍｏｃを含む。
【００８４】
固相担体としての使用に適する材料は当業者によく知られており、および下記を含むがそれらに限定されない：クロロメチル樹脂またはブロモメチル樹脂といったハロメチル樹脂；ヒドロキシメチル樹脂；４−（α−[２，４−ジメトキシフェニル]−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ樹脂といったフェノール樹脂；ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−ヒドラジド化樹脂など。そのような樹脂は市販されており、およびそれらの調製方法は当業者に公知である。
【００８５】
要約すると、Ｃ−末端Ｎ−α−保護アミノ酸がまず固相担体に付加される。Ｎ−α−保護基が次いで除去される。脱保護されたα−アミノ基は、次のＮ−α−保護アミノ酸の活性化α−カルボキシラート基と結合する。その過程は目的のペプチドが合成されるまで反復される。結果として生じるペプチドは、次いで不溶性ポリマー担体から切断され、およびアミノ酸側鎖は脱保護される。より長いペプチドを、保護ペプチド断片の縮合によって得ることができる。適当な化学、樹脂、保護基、保護アミノ酸および試薬の詳細は当業者によく知られており、およびそのためここで詳細に考察しない（アサートン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）他，固相ペプチド合成：実践的手法（Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），ＩＲＬプレス社（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８９），およびボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ），『ペプチド化学・実践的テキストブック第２版』（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，２ｎｄ Ｅｄ．），シュプリンガー・フェアラーク社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）（１９９３）を参照）。
【００８６】
Ｖ．ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域の化学的複合体化
ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域は、たとえば、組み換え発現および精製といった別々の作製後に、本発明の複合体を生じるように化学的手段によって結合されうる。化学的複合体化は、典型的には、ペプチド結合（一部の場合には単一融合タンパク質を形成する）およびジスルフィド結合といった非ペプチド結合を含むさまざまな共有結合によって達成される。代替法では、化学的複合体化はまた、ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域を結合する１つ以上の化学リンカーを用いることによっても達成されうる。２つ以上の化合物の化学結合を介した複合体化を可能にする複数の官能基を有する分子である、さまざまなリンカーが本分野で公知であり、および多数の販売者から容易に入手されうる。
【００８７】
一部の場合には、化学修飾は、たとえば、ナトリウム利尿ペプチドを抗体定常領域と、または２つの抗体定常領域を互いに、直接的にまたは結合化合物を介して、タンパク質化学の分野でよく知られている方法によって結合する目的での誘導体化を含む、複合体化過程を円滑化しうる。共有結合は複合体化の好ましい手段であるが、一部の場合には、ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域を結合するために非共有結合が使用されうる。複合体化部位はしばしばペプチドのＮ−またはＣ末端であるが、しかしまた内部アミノ酸上の官能基を介してペプチドの中に位置しうる。
【００８８】
ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域を結合するための手順は、それらのアミノ酸組成、およびペプチドが結合する場所にしたがって異なる。ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域の両方のペプチドが、典型的にはカルボン酸（−ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ2）、またはスルフヒドリル（−ＳＨ）基といったさまざまな官能基を含み、それらは他方のペプチド鎖上の適当な官能基との反応に利用可能であり、結果として結合を生じる。
【００８９】
代替的に、ナトリウム利尿ペプチドまたは抗体定常領域は、追加の反応性官能基を露出または付加するように誘導体化されうる。誘導体化は、シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））、ピアス・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ））、およびモレキュラー・バイオサイエンシズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（コロラド州ボールダー（Ｂｏｕｌｄｅｒ））から入手可能であるもののようないくつかのリンカー分子のうち任意のものの付加を含みうる。リンカーは、ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域のペプチド鎖の両方と共有結合を形成できる。適当なリンカーは当業者によく知られており、および、直鎖または分枝鎖炭素リンカー、ヘテロ環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーを含むがそれらに限定されない。複合体化パートナーはポリペプチドであるため、リンカーは構成アミノ酸とそれらの側基を通じて（たとえば、ジスルフィド結合を通じてシステインと）結合しうる。リンカーはまた、末端アミノ酸のα炭素アミノ基およびカルボキシル基と結合しうる。
【００９０】
複合体化の代替法として、ペプチド鎖は、タグおよびタグバインダーの相互作用を介して非共有的に結合されうる。タグおよびタグバインダーは、ナトリウム利尿ペプチドおよび抗体定常領域に化学的手段によって結合されうる。たとえば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアクリレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテートといった合成ポリマーは、適当なタグまたはタグパインダーを形成しうる。この目的に適した対はまた、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、および多数の公知の細胞表面受容体−リガンド対、たとえば、サイトカイン、細胞接着分子、ウイルスタンパク質、ステロイド、およびさまざまなトキシン／ベノムとそれぞれの受容体を含む。これらのタグまたはそのコード配列の多くは市販されている。ペプチド、ポリエーテルなどといった他の一般的なリンカーもまたタグの役割を果たすことができ、および約５ないし２００アミノ酸のポリＧｌｙ配列といったポリペプチド配列を含む。そのような柔軟なリンカーは当業者に公知である。たとえば、ポリ（エチレングリコール）リンカーはシアウォーター・ポリマーズ社（ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ．）（アラバマ州ハンツビル（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）から入手可能である。これらのリンカーは随意的に、アミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能結合を有する。多数の他のタグ／タグバインダー対もまたこの目的に使用でき、およびこの開示の検討に際して当業者に明らかとなる。
【００９１】
１つの別の代替法は、２つのペプチド鎖は、結合当事者の一方がまず固相担体に固定化される場合、タグ／タグバインダー相互作用を介して結合されうることである。タグバインダーは、現在利用可能な任意のさまざまな方法を用いて、固相基材へ固定される。固相基材は、基材のすべてまたは一部を、タグバインダーの一部と反応性である化学基を表面へ固定する化学試薬へ曝露することによって、一般的に誘導体化または官能化される。たとえば、より長い鎖部分との結合に適した基は、アミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基を含む。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを用いて、ガラス表面といったさまざまな表面を官能化できる。固相バイオポリマーアレイの構築は、文献によく記載されている。たとえば、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４（１９６３）（たとえばペプチドの固相合成を記載）；ガイセン（Ｇｅｙｓｅｎ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．１０２：２５９−２７４（１９８７） （ピン上の固相成分の合成を記載）；フランク（Ｆｒａｎｋ）およびドリング（Ｄｏｒｉｎｇ），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４４：６０３１−６０４０（１９８８）（セルロースディスク上のさまざまなペプチド配列の合成を記載）；フォダー（Ｆｏｄｏｒ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７（１９９１）；シェルドン（Ｓｈｅｌｄｏｎ）他，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（４）：７１８−７１９（１９９３）；およびコザール（Ｋｏｚａｌ）他，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（７）：７５３７５９（１９９６）（すべて固相基材に固定されたバイオポリマーのアレイを記載）を参照。タグバインダーを基材へ固定するための非化学的手法は、熱、ＵＶ照射による架橋、などといった他の一般的な方法を含む。
【００９２】
ＶＩ．複合体についての機能アッセイ
本発明のナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域複合体は、非複合体型ナトリウム利尿ペプチドによって治療可能であると知られている症状のための治療用途に有用である。たとえば、当該複合体は、医薬用途に該当するナトリウム利尿ペプチドの生物活性の一部（たとえば、少なくとも０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、５０％以上）を保持する。ナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域の複合体が一旦作製されれば、当該複合体によって保持されている目的の生物活性のレベルを評価するために、いくつかの機能アッセイのうち１つ以上を実施でき、対応する野生型ナトリウム利尿ペプチドが典型的には対照または比較基準としてアッセイに用いられる。
【００９３】
Ａ．ＮＰＲ結合アッセイ
ナトリウム利尿ペプチドの活性の１つの側面は、その天然受容体を高い親和性で結合する能力である。たとえば、ウロジラチンはＮＰＲ−Ａ受容体を高い親和性で結合し、本発明に記載の潜在的に有用なウロジラチン−抗体定常領域複合体はしたがって、さまざまなＮＰＲ−Ａ結合アッセイで試験されうる。１つのアッセイ形式は、無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ系であり、ここで受容体およびウロジラチンのような野生型ナトリウム利尿ペプチドの間の特異的結合を可能にする条件下で、ＮＰＲ−Ａ受容体またはその細胞外ドメインを含むその修飾型が被験化合物（たとえばウロジラチン複合体）と共に提供される。別のアッセイ形式は、細胞を基礎とするｉｎ ｖｉｔｒｏ系であり、ここでＮＰＲ−Ａ受容体を天然に発現するかまたはトランスフェクション後に受容体（またはその細胞外ドメインを含むＮＰＲ−Ａの修飾型）を発現する細胞が、ナトリウム利尿ペプチド（たとえば、ウロジラチン）および抗体定常領域の複合体といった被験化合物と、受容体および野生型ナトリウム利尿ペプチド（たとえばウロジラチン）の間の特異的結合を可能にする条件下で、接触して配置される。同様のアッセイが、ＮＰＲ−ＢおよびＮＰＲ−Ｃについての結合親和性を評価するために使用されうる。この種類の典型的なアッセイ系は、たとえば、ロウ（Ｌｏｗｅ）およびフェンドリー（Ｆｅｎｄｌｙ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１６９１−２１６９７，１９９２といった科学文献に、および本明細書の後の項でより詳細に記載される。
【００９４】
Ｂ．ＮＰＲ−Ａ活性化アッセイ
ナトリウム利尿ペプチドの活性の別の指標は、その自然のＮＰＲ受容体（たとえば、ＮＰＲ−Ａ受容体）、グアニリルシクラーゼを活性化する能力であり、それは細胞内ｃＧＭＰレベルの検出可能な上昇に繋がる。典型的には、この種類のアッセイは、ＮＰＲ受容体（たとえばＮＰＲ−Ａ）または当該タンパク質の機能性変異体を発現するようにトランスフェクションされている細胞全体を用いて実施される。これらの細胞の被験化合物（たとえばウロジラチン−Ｆｃ断片複合体）への曝露後、それらの細胞内ｃＧＭＰ濃度が測定され、および、野生型ナトリウム利尿ペプチド（たとえば、ウロジラチン）へ、またはＮＰＲ−Ａ受容体に対して作用を有しない物質だけへ曝露された対照細胞で見られる濃度と比較される。同様の受容体活性化アッセイが、ＮＰＲ−Ｂの活性化を評価するために使用されうる。ｃＧＭＰレベルを測定するＮＰＲ活性化アッセイ系のより詳細な記載はまた、ロウ（Ｌｏｗｅ）およびフェンドリー（Ｆｅｎｄｌｙ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１６９１−２１６９７，１９９２に、および本明細書の後の項に見出すことができる。
【００９５】
Ｃ．薬物動態試験
薬物動態試験が、本発明のナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域複合体の、ナトリウム利尿ペプチド単独と比較した血清半減期の増加を測定するために実施される。被験化合物のｉｎ ｖｉｖｏすなわち血清半減期を測定するためのいくつかの方法が本分野で公知であり、典型的にはラットおよびマウスといった実験動物で、化合物の動物への投与（たとえば、静脈内注射による）後のさまざまな時点での被験化合物の血清濃度を監視することによって実施される。一般的な方法論についてのより詳細な説明については、たとえば、Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏｓ．５，７８０，０５４；６，４２３，６８５；および７，０２２，６７３を参照。これらの本分野で知られた方法を用いた薬物動態実験で観察される血清半減期の増加は、ヒト患者における半減期の増加の指標として一般に受容されている。
【００９６】
ＶＩＩ．医薬組成物および投与
ウロジラチンおよびその他を含むナトリウム利尿ペプチドは、細菌感染、肺および気管支疾患、腎不全、および鬱血性心不全といったさまざまな医学的症状の治療における使用について知られており、たとえば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，５７１，７８９および６，８３１，０６４、ＵＳ２００５／００８９５１４、およびＷＯ２００６／１１０７４３を参照。したがって、本発明の別の態様は、ナトリウム利尿ペプチドの治療的有効性を保持しおよび好ましくは非複合体型ナトリウム利尿ペプチド単独と比較してより長い血清半減期を有する、ナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域複合体を含む医薬組成物である。この組成物は、しばしば少なくとも１つの薬学的に許容可能なキャリヤーをさらに含み、特定のナトリウム利尿ペプチドの投与が適応される症状のための治療用途に使用されうる。本発明の医薬組成物は、さまざまなドラッグデリバリーシステムにおける使用に適する。本発明における使用に適当な処方は、『レミントンの薬科学』（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ），ペンシルベニア州フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ），第１７版（１９８５）に見られる。ドラッグデリバリーのための方法の短い総説については、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３ （１９９０）を参照。
【００９７】
本発明の化合物を含む医薬組成物を調製するために、不活性なおよび薬学的に許容可能な添加物またはキャリヤーが用いられる。液体医薬組成物は、たとえば、皮内、皮下、非経口、筋肉内、または静脈内投与に適する、液剤、懸濁剤、および乳剤を含む。有効成分（たとえば、本発明のウロジラチン−Ｆｃ融合タンパク質）の無菌水溶液、または有効成分の水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、エタノール、またはプロピレングリコールを含む溶媒の無菌溶液は、非経口投与に適する液体組成物の例である。組成物は、生理条件に近づけるために必要に応じて、ｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、界面活性剤、などといった薬学的に許容可能な助剤を含みうる。
【００９８】
無菌溶液は、有効成分（たとえば、本発明のナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域複合体）を目的の溶媒系に溶解し、および次いで結果として得られた溶液を滅菌するためにメンブレンフィルターを通すことによって、または、代替的に、無菌化合物を無菌条件下で予め滅菌された溶媒に溶解することによって、調製されうる。結果として生じる水溶液は、そのまま使用するために包装でき、または凍結乾燥して、使用前に凍結乾燥調製物を無菌水キャリヤーと合わせることができる。調製物のｐＨは典型的には５ないし９、より好ましくは７ないし８、および非常に好ましくは６．５ないし７または７．５となる。
【００９９】
一部の実施形態では、組成物は、ゼラチン、アスコルビン酸、トレハロース、スキムミルク、デンプン、キシリトールなどといった不活性成分を用いる、固体または半固体処方でありうる。
【０１００】
本発明の医薬組成物は、たとえば、皮下、皮内、経皮、筋肉内、静脈内、または腹腔内といったさまざまな経路によって投与されうる。一部の場合には、組成物は非経口、鼻内、局所、経口、またはエアロゾルまたは経皮的にといった局所投与によって、予防的処置のために配送されうる。しばしば、医薬組成物は局所的に投与、たとえば、膣内または直腸内にデポされうる。代替的に、医薬組成物は経口投与されうる。このように、本発明は、生理的に許容可能なキャリヤー、好ましくは水系キャリヤー、たとえば、水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳなどに溶解または懸濁された、本発明のナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域複合体を含む、全身、局所、および経口投与のための組成物を提供する。組成物は、生理条件に近づけるために必要に応じて、ｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、界面活性剤、などといった薬学的に許容可能な助剤を含みうる。
【０１０１】
代替的に，組成物は坐剤またはペッサリーとして配送されうる。一部の実施形態では、本発明の化合物は米国特許第６，４６８，５２６および６，３７２，２０９号明細書に記載されるような保存マトリクス中で調製され、および溶解性について選択された可溶性ポリマー材料および／または複合糖質材料製の可溶性要素内で配送され、そのためそれは使用前は実質的に固形のままであり、およびヒトの体温および水分のために使用中に溶解し、望まれる時限放出および投与で化合物を放出する。たとえば、米国特許第５，５２９，７８２号明細書を参照。化合物はまた、米国特許第４，６９３，７０５号明細書に記載されたようなスポンジ状配送媒体で、またはタンポン様配送チューブを介して、配送されうる。
【０１０２】
一部の実施形態では、本発明のナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域複合体（たとえば、ウロジラチン−Ｆｃ融合タンパク質）を含む組成物は、経口投与用に処方される。たとえば、最終組み換え産物の物理的形状は、随意的に徐放処方の、経口摂取に適した錠剤／カプセルでありうる。
【０１０３】
医薬組成物を投与する好ましい経路は、平均的な成人患者について、ナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域複合体の週用量約０．０１〜１０ｇ／ｋｇ患者体重、好ましくは０．０５〜５ｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１〜１ｇ／ｋｇでの静脈内または筋肉内注射による。適当な用量は、日、週、隔週、または月間隔で、組成物の単回または反復投与によって、主治医の決定する用量レベルおよびパターンを用いて、配送されうる。いずれにしろ、医薬処方は、本発明のナトリウム利尿ペプチド−抗体定常領域複合体の、個人において目的の医学的用途を達成するのに十分な量を提供すべきである。
【０１０４】
本発明の医薬組成物の治療的有効性を高めるために、相加または相乗効果を提供するための追加の成分が組成物に含まれうる。そのような随意的な成分の一部の例は、当業者に既に公知である腎臓または心臓症状のための治療剤を含む。
【実施例】
【０１０５】
下記の実施例は説明のためだけに提供され、および限定のためではない。当業者は、本質的に同一または類似の結果を生じるように変化または改変されうるさまざまな決定的でないパラメーターを容易に理解する。
【０１０６】
方法
１．Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））およびＦｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））ＤＮＡ構築物および融合タンパク質の作製
Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））ＤＮＡ構築物を下記の通り作製した：ｐｒｏＡＮＰのシグナル配列（Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＮＭ＿００６１７２．１：ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ（ＮＰＰＡ）、ｍＲＮＡ配列を使用）をゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いて作製した。シグナル配列の３'末端について用いたプライマーはウロジラチン配列の最初の２０塩基を含み、およびウロジラチンの５'末端についてのプライマーはシグナル配列の最後の２０塩基を含んだ。これらの２つのＰＣＲの産物を２回目のラウンドに合わせて、外側プライマーの内側にＰａｄ制限部位および部分Ｋｏｚａｋ配列（ＣＡＣＣ）を５'末端におよびＮｏｔｌ制限部位を５'末端に付加した、完全長シグナル配列を伴うウロジラチンを増幅した。結果として生じる産物をＰａｃｌ／Ｎｏｔｌで切断し、およびｈｕＦｃＧ１ｍ（１）配列を含む発現ベクターへ、標準的な分子生物学手法を用いてライゲーションした。
【０１０７】
ＨｕＦｃＧ１ｍ（１）はＧｅｎｂａｎｋ配列ＢＣ０６７０９１（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）免疫グロブリン重鎖定常γ１（Ｇ１ｍマーカー）、ｍＲＮＡ）に基づいて作製し、および標準的な分子生物学手法を用いて配列変化を行い、プライマーが必要な変化を有し、およびＮｏｔｌ制限部位を両側に付加した。結果として生じる産物をＮｏｔｌで切断し、および次いで発現ベクターへライゲーションした。
【０１０８】
ＢＣ０６７０９１への塩基変化を下記の通り行った：ＨｕＦｃＧ１ｍ（１）はＢＣ０６７０９１の７４９位で開始する。塩基変化は下記の位置で行った：７８８Ｃ→Ｇ、７８９Ｔ→Ｃ、７９１Ｃ→Ｇ、７９２Ｔ→Ａ、７９６Ｇ→Ｃ、７９８Ｇ→Ｃ、７９９Ａ→Ｇ、１１５４Ｇ→Ｃ、１１５６Ｔ→Ｇ、１１６０Ｃ→Ｔ、および１３０９Ｃ→Ｔ。
【０１０９】
Ｆｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））ＤＮＡ構築物は下記の通り調製した：Ｆｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））ＤＮＡは、３対のＰＣＲプライマーおよび上記のＵｒｏ−Ｆｃ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））ＤＮＡを用いて作製した。第１の対の５'プライマーは、Ｐａｄ制限部位と後続のｐｒｏＡＮＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＮＭ＿００６１７２．１：ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ（ＮＰＰＡ）、ｍＲＮＡ配列を使用）のシグナル配列の最初の２０塩基に対応した。第１の対の３'プライマーは、シグナル配列の最後の２１塩基とｈｕＦｃＧ１ｍ（１）の最初の１９塩基（上記参照）を含んだ。第２のプライマー対の５'プライマーは、第１の３'プライマー（シグナル配列）の相補配列を含み、一方、第２の対の３'プライマーはｈｕＦｃＧ１ｍ（１）の最後の２１塩基とウロジラチン配列の最初の２０塩基に対応した。第３の組の５'プライマーはｈｕＦｃＧ１ｍ（１）の３'プライマーの相補配列を含み、一方、３'プライマーはウロジラチン配列の最後の２０塩基と後続の終止コドンおよびＮｏｔｌ制限部位に対応した。結果として生じるＤＮＡ断片をＰａｄおよびＮｏｔｌで切断し、および続いて発現ベクターへライゲーションした。
【０１１０】
上記のＤＮＡ配列を含む哺乳類発現ベクターを、哺乳類組織培養細胞へトランスフェクションし、および記載のＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質を、組織培地から、標準的な分子生物学およびタンパク質精製法を用いて精製した。
【０１１１】
２．ナトリウム利尿ペプチド受容体（ＮＰＲ）結合アッセイ
結合親和性定数（ＫD）の推定値を結果として生じる、分析物の動態測定をＢＩＡｃｏｒｅ２０００＆３０００装置および製造元（ビアコア社（ＢＩＡｃｏｒｅ）、スウェーデン）による方法を用いて実施した。ヒト免疫グロブリンのＦｃドメインをコードするＤＮＡと融合した受容体ＮＰＲ−Ａの細胞外ドメインをコードする発現構築物を、哺乳類細胞で発現し、および培地から、標準的な分子生物学およびタンパク質精製法を用いて精製した（ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（３４）：２３０６０−２３０６７，１９９１）。精製されたＮＰＲ−Ａ−Ｆｃ受容体融合タンパク質を、センサーチップ表面に固定されたヤギ抗ヒトＦｃγ（ＧＡＨＦｃ）抗体（ジャクソン・イムノリサーチ社（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ），品番１０９−００５−０９８）によって捕捉した。捕捉後に占有されていないＧＡＨＦｃを分析物から、ヒトＦｃ（ｈｕＦｃ，ジャクソン・イムノリサーチ社，品番００９−０００−００８）の注射によって遮蔽した。分析物を注射して結合相を得て、次いでＨＢＳ−Ｐ分析緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．００５％Ｐ−２０界面活性剤、ｐＨ７．４）を注射して各結合サイクルについて解離を監視した。
【０１１２】
各分析物−受容体対の結合動態を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｅプログラム（ビアコア社（ＢＩＡｃｏｒｅ）、スウェーデン）を用いて異なる分析物濃度から集めたセンサーグラムデータの全体的分析から計算した。各受容体に対する各分析物の結合（ｋａ）および解離（ｋｄ）の結果として生じる親和性（ＫD）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｅソフトウェア（（ビアコア社、スウェーデン）からの同一の１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）モデルを用いて分析物濃度系列由来のセンサーグラムの結合相および解離相を同時に合致させることによって得られた。
【０１１３】
３．ＮＰＲ−Ａ受容体活性化の測定
被験化合物によるＮＰＲ−Ａ受容体活性化は、ＮＰＲ−Ａ受容体をコードする発現ベクターＤＮＡでトランスフェクションされた哺乳類細胞とのインキュベート、およびこれらの細胞において産生されたｃＧＭＰの量を測定することによって測定された。
【０１１４】
ＮＰＲ−Ａをコードする発現ベクターＤＮＡでトランスフェクションされた哺乳類組織培養細胞（たとえば、３Ｔ１２細胞）を、９６ウェルマイクロタイタープレートで１８〜２０時間（〜５０，０００細胞／ウェル）、標準的な組織培養条件を用いて培養した。組織培地を次いで無血清培地に交換し、細胞を１ｍＭ ＩＢＭＸで３０分間予備インキュベートし、およびさまざまな濃度の被験化合物で１０分間処理した。細胞を次いで０．２ｍｌ／ウェルの０．１Ｍ ＨＣｌで２０分間溶解し、および溶解物を１０００Ｘｇにて２分間遠心分離した。上清中のｃＧＭＰ を、市販キット（直接ｃＧＭＰ ＥＩＡキット、アッセイデザインズ社（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．）、品番９０１−０１４）を用いて取扱説明書に従って測定した。
【０１１５】
４．薬物動態試験
被験化合物のｉｎ ｖｉｖｏ 半減期を、薬物動態 試験をラットで標準的な手順を用いて実施することによって推定した。 すべての動物手順は、ＰＤＬバイオファーマ社（ＰＤＬ ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．）の施設内動物実験委員会によって承認されたプロトコルに基づいて実施した。ＰＤＬバイオファーマ社は国際実験動物管理公認協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）によって認証されている。体重２８０〜３５５ｇの雄スプレイグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットの群をイソフラレンで麻酔し、および頸静脈および頸動脈をそれぞれ静脈内ボーラス注射および採血のためにカニューレ処置した。被験化合物を単回静脈内ボーラスとして投与し、およびＫ2ＥＤＴＡおよびアプロチニン入りの採血管へ規定の時点に採血した。血漿を血液試料から標準的な手順を用いて調製し、および分割して−８０℃にて分析まで保存した。
【０１１６】
Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈＦｃＧ１（ｍ１））の血漿レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡによって９６ウェルマイクロタイタープレートで測定した。要約すると、血漿試料希釈（未処理動物由来プール血漿を用いて調整および１０％スーパーブロック（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）ブロッキング緩衝液（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ），イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）で１：１０希釈）を、アフィニピュア（ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ）ロバ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的（ジャクソン・イムノリサーチラブズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．），ペンシルベニア州ウェストグローブ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ））でコーティングされたマイクロタイタープレートでインキュベートした。精製Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈＦｃＧ１（ｍ１））（プールしたラット血漿で調整および１０％スーパーブロック・ブロッキング緩衝液で１：１０希釈）の段階希釈を標準として用いた。プレートを洗浄後、ヒツジ抗ヒトウロジラチン血清（ストラテジック・バイオソリューションズ社（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ），デラウェア州ニューアーク（Ｎｅｗａｒｋ））を添加し、およびインキュベートおよび洗浄後、ウェルをペルオキシダーゼ複合体化ロバ抗ヒツジＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソン・イムノリサーチラブズ社，ペンシルベニア州ウェストグローブ）とインキュベートした。ＥＬＩＳＡを発色させ、プレートをマイクロタイタープレートリーダーで読み取り、および濃Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈＦｃＧｌ（ｍｌ））の血漿試料中の濃度を標準的な手順を用いて計算した。
【０１１７】
血漿ウラリチド濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡによって９６ウェルマイクロタイタープレートで測定した。プレートをアフィニピュア（ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ）Ｆ（ａｂ'）2断片ウサギ抗マウスＩｇＧ，Ｆｃγ断片特異的（ジャクソン・イムノリサーチラブズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．），ペンシルベニア州ウェストグローブ（ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ））でコーティングし、次いで洗浄および捕捉抗体マウス抗ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）モノクローナル抗体アブカム２０９３（アブカム社（Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．），マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ））と共にインキュベートした。血漿試料インキュベートおよびＥＬＩＳＡの以降の段階は、Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈＦｃＧ１（ｍ１））ＥＬＩＳＡについて上述の通り実施した。
【０１１８】
薬物濃度−時間データを、非コンパートメント分析（ＮＣＡ）手法で市販の薬物動態（ＰＫ）ソフトウェアＷｉｎＮｏｎｌｉｎ５．２（ファーサイト社（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ））を用いて分析した。薬物の終末半減期（ｔ1/2）を式ｔ1/2＝ｌｎ（２）／λzから計算し、一方λzは終末期の試料採取時間における濃度の自然対数の回帰から推定された終末消失速度である。
【０１１９】
結果
図１Ａに示す通り、アミノ末端にｐｒｏ−ＡＮＰのシグナル配列およびヒトウロジラチン、続いて３アミノ酸残基のリンカー、およびカルボキシ末端にヒト免疫グロブリン重鎖定常γ１領域の変異体のＦｃ部分（Ｇ１ｍマーカー）から成る融合タンパク質Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））をコードする組み換えＤＮＡ断片が作製された。図１Ｂは、アミノ末端にヒト免疫グロブリン重鎖定常γ１領域の変異体のＦｃ部分（Ｇ１ｍマーカー）、およびカルボキシ末端にヒトウロジラチンから成る別の融合タンパク質Ｆｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））をコードする組み換えＤＮＡ断片を示す。これらのＤＮＡ配列によってコードされる融合タンパク質を、標準的な分子生物学およびタンパク質精製法を用いて作製した。
【０１２０】
図２は、ウラリチドを対照として用いた、Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））およびＦｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））の、精製ＮＰＲ−Ａ−Ｆｃ融合タンパク質との結合を示す。Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））ＤＮＡによってコードされる精製ウロジラチン−Ｆｃ融合タンパク質の受容体結合活性は、ウラリチドと比較して、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）システムを用いて上記の通り測定された。結合測定は、受容体ＮＰＲ−Ａの細胞外ドメインの精製Ｆｃ融合タンパク質を用いて実施した。ＮＰＲ−Ａ受容体タンパク質に対する結合親和性（ＫD）は、ウラリチドについて３．１±１．０ｐＭ（ｎ＝５）、およびウロジラチン−Ｆｃ融合タンパク質について７．０±５．８ｐＭ（ｎ＝８）であった。これは、ウラリチドと同様に、Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））融合タンパク質は高い親和性でＮＰＲ−Ａ受容体と結合することを実証する（図２Ａ）。同様に、Ｆｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））ＤＮＡによってコードされる精製Ｆｃ−ウロジラチン融合タンパク質の受容体結合活性もまた、ウラリチドと比較して、ビアコア・システムを用いて上記の通り測定された。ＮＰＲ−Ａ受容体に対する結合親和性（ＫD）は、ウラリチドについて４．２±１．０ｐＭ（ｎ＝３）、およびＦｃ−ウロジラチン融合タンパク質について０．３５±０．１ｎＭ（ｎ＝６）であった。これは、Ｆｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））融合タンパク質がＮＰＲ−Ａ受容体と結合することを実証する（図２Ｂ）。
【０１２１】
融合タンパク質Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））およびＦｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））はさらに、トランスフェクションされた細胞上に発現されるＮＰＲ−Ａ受容体を活性化する能力について試験された。図３に示す通り、Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））およびＦｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））ＤＮＡによってコードされる精製ウロジラチン−Ｆｃ融合タンパク質の生物活性が、ウラリチドと比較して測定された。さまざまな濃度のウラリチドおよびＵｒｏ−Ｆｃ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））タンパク質を、ＮＰＲ−Ａ受容体を発現する細胞とインキュベートし、および細胞内ｃＧＭＰレベルを上記の方法にしたがって測定した。ウラリチドおよび融合タンパク質の両方が用量依存的にｃＧＭＰレベルを誘導し、ＥＣ５０はそれぞれ８．９±２．４ｎＭおよび２６．３±７．５ｎＭであった（平均±ＳＤ、ｎ＝４回の独立実験）。これは、Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））融合タンパク質が、ウロジラチン受容体ＮＰＲ−Ａの刺激において生物活性であることを実証する（図３Ａ）。同様の方法で、Ｆｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））およびウラリチドは、トランスフェクションされた細胞上に発現されたＮＰＲ−Ａ受容体を活性化することが示された。Ｆｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））ＤＮＡによってコードされる精製Ｆｃ−ウロジラチン融合タンパク質の生物活性が、ウラリチドと比較して、上記の方法にしたがって測定された。さまざまな濃度のウラリチドおよびＦｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））タンパク質を、ＮＰＲ−Ａ受容体を発現する細胞とインキュベートし、および細胞内ｃＧＭＰレベルを測定した。ウラリチドおよび融合タンパク質の両方が用量依存的にｃＧＭＰレベルを誘導し、ＥＣ５０はそれぞれ２７ｎＭおよび８６ｎＭであった。これは、Ｆｃ−Ｕｒｏ（ｈｕＦｃＧ１（ｍ１））融合タンパク質が、ウロジラチン受容体ＮＰＲ−Ａの刺激において生物活性であることを実証する（図３Ｂ）。
【０１２２】
ナトリウム利尿ペプチド複合体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期の潜在的な延長を測定するため、融合タンパク質Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈＦｃＧ１（ｍ１）および非複合体型ウラリチドを、方法に記載される通り、ラットでの薬物動態試験に供した。精製Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈＦｃＧ１（ｍ１）を単回静脈内ボーラスとして２種類の用量（用量群あたりラット５匹）、０．４１ｍｇ／ｋｇ（２５ｕｇ／ｋｇウラリチドのモル当量）、および２．９ｍｇ／ｋｇ（２５ｕｇ／ｋｇウラリチドの７倍モル当量）にて投与した。動物から０．５、１、２、５、１０、３０分、および１、３、６、２４時間に、および次いで２４時間毎に、ボーラス注射の８日後まで採血した。Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈＦｃＧ１（ｍ１）の血漿レベルをＥＬＩＳＡによって測定し、および終末半減期（ｔ1/2）を計算した。中央値ｔ1/2は、用量０．４１ｍｇ／ｋｇを用いて４．９時間（範囲：１．６〜２４．７時間）、および用量２．９ｍｇ／ｋｇについて１６．１時間（範囲：０．６〜３１．６時間）であった。
【０１２３】
比較して、非複合体型ウラリチドの半減期を、ラットにおいて２５および１００ｕｇ／ｋｇ（４匹／用量群）にて単回静脈内ボーラス注射後に測定した。ボーラス注射後０．５、１、２、３．５、５、７．５、１０、２０、および３０分に採血した。終末半減期を、ＥＬＩＳＡによって測定したウラリチド血漿レベルから計算した。中央値ｔ1/2は、２５ｕｇ／ｋｇについて０．７８分（範囲：０．５０〜０．９９分）、および１００ｕｇ／ｋｇのボーラスについて０．８３分（範囲：０．５７〜１．１６分）であった。これらの値は、別の方法論を用いて生じた公表データと非常に似通っている（０．７３分、アバシ（Ａｂａｓｓｉ），Ｚ．Ａ．，他，１９９２，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６３ （Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２６）： Ｅ８７０−Ｅ８７６）。これは、ウロジラチン融合タンパク質Ｕｒｏ−Ｆｃ（ｈＦｃＧ１（ｍ１）のｉｎ ｖｉｖｏ終末半減期が、非複合体型ウラリチドと比較して延長されることを実証する（２５ｕｇ／ｋｇウラリチドのモル当量にて〜４００倍）。
【０１２４】
本出願に引用された、公開されたアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を含む、すべての特許、特許出願、および他の出版物は、本明細書において全体が参照により本開示に含まれる。ここに引用されるいずれかの参照文献および本明細書の特定の教示の間の対立があれば後者を支持して解決される。同様に、本分野で理解される単語または語句の定義、および本明細書で具体的に教示される単語または語句の定義の間の対立があれば後者を支持して解決される。
【０１２５】
配列一覧
配列番号:1  ウロジラチンポリヌクレオチド配列
1 actgcccctc ggagcctgcg gagatccagc tgcttcgggg gcaggatgga
61 caggattgga gcccagagcg gactgggctg taacagcttc cggtactga
配列番号:2  ウロジラチンアミノ酸配列
1 TAPRSLRRSS CFGGRMDRIG AQSGLGCNSF RY
配列番号:3  ヒトFc IgG1(m1）ポリヌクレオチド配列(配列番号:7の76-756)
1 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgagggcgc gccgtcagtc
61 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca
121 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac
181 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac
241 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag
301 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa
361 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccggcagga gttgaccaag
421 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag
481 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc
541 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg
601 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc
661 ctctccctgt ctccgggtaa a
配列番号:4  ヒトFc IgG1(m1）アミノ酸配列(配列番号:8の26-252)
1 DKTHTCPPCP APEAEGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
61 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
121 GQPREPQVYT LPPSRQELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
181 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
配列番号:5  Fc-Uro huFcG1(m1）融合ポリヌクレオチド配列(シグナルペプチド配列を含まない、配列番号:7の76-855に相当)
1 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgagggcgc gccgtcagtc
61 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca
121 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac
181 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac
241 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag
301 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa
361 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccggcagga gttgaccaag
421 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag
481 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc
541 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg
601 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc
661 ctctccctgt ctccgggtaa aactgcccct cggagcctgc ggagatccag ctgcttcggg
721 ggcaggatgg acaggattgg agcccagagc ggactgggct gtaacagctt ccggtactga
配列番号:6  Fc-Uro huFcG1(m1）融合アミノ酸配列(シグナルペプチドを含まない、配列番号:8の26-284に相当)
1 DKTHTCPPCP APEAEGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
61 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
121 GQPREPQVYT LPPSRQELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
181 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKTAP RSLRRSSCFG
241 GRMDRIGAQS GLGCNSFRY
配列番号:7  Fc-Uro huFcG1(m1）融合ポリヌクレオチド配列(1-76位に位置するシグナルペプチド配列を含む)
1 atgagctcct tctccaccac caccgtgagc ttcctccttt tactggcatt ccagctccta
61 ggtcagacca gagctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgag
121 ggcgcgccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg
181 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc
241 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag
301 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat
361 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc
421 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg
481 caggagttga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc
541 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct
601 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc
661 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac
721 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaactg cccctcggag cctgcggaga
781 tccagctgct tcgggggcag gatggacagg attggagccc agagcggact gggctgtaac
841 agcttccggt actga
配列番号:8  Fc-Uro huFcG1(m1）融合アミノ酸配列(1-25位に位置するシグナルペプチドを含む)
1 MSSFSTTTVS FLLLLAFQLL GQTRADKTHT CPPCPAPEAE GAPSVFLFPP KPKDTLMISR
61 TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
121 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR QELTKNQVSL TCLVKGFYPS
181 DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH
241 YTQKSLSLSP GKTAPRSLRR SSCFGGRMDR IGAQSGLGCN SFRY
配列番号:9  リンカーポリヌクレオチド配列(配列番号:13の172-180に相当、NotI部位を含む)
1 gcggccgcg
配列番号:10リンカーアミノ酸配列(配列番号:14の58-60に相当)
1 AAA
配列番号:11  Uro-Fc huFcG1(m1）融合ポリヌクレオチド配列(シグナルペプチドを含まない、配列番号:13の76-864に相当) 
1 actgcccctc ggagcctgcg gagatccagc tgcttcgggg gcaggatgga caggattgga
61 gcccagagcg gactgggctg taacagcttc cggtacgcgg ccgcggacaa aactcacaca
121 tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgag ggcgcgccgt cagtcttcct cttcccccca 
181 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac
241 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat
301 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc
361 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 
421 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa
481 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg caggagttga ccaagaacca ggtcagcctg
541 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg
601 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc
661 ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 
721 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg
781 ggtaaatga
配列番号:12  Uro-Fc huFcG1(m1）融合アミノ酸配列(シグナルペプチドを含まない、配列番号:14の26-287に相当)
1 TAPRSLRRSS CFGGRMDRIG AQSGLGCNSF RYAAADKTHT CPPCPAPEAE GAPSVFLFPP
61 KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
121 LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR QELTKNQVSL
181 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
241 SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
配列番号:13  Uro-Fc huFcG1(m1）融合ポリヌクレオチド配列(1-75位に位置するシグナルペプチド配列を含む)
1 atgagctcct tctccaccac caccgtgagc ttcctccttt tactggcatt ccagctccta
61 ggtcagacca gagctactgc ccctcggagc ctgcggagat ccagctgctt cgggggcagg
121 atggacagga ttggagccca gagcggactg ggctgtaaca gcttccggta cgcggccgcg
181 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgagggcgc gccgtcagtc 
241 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca
301 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac
361 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac
421 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag
481 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 
541 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccggcagga gttgaccaag
601 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag
661 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc
721 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 
781 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc
841 ctctccctgt ctccgggtaa atga
配列番号:14  Uro-Fc huFcG1(m1）融合アミノ酸配列(1-25位に位置するシグナルペプチド配列を含む)
1 MSSFSTTTVS FLLLLAFQLL GQTRATAPRS LRRSSCFGGR MDRIGAQSGL GCNSFRYAAA
61 DKTHTCPPCP APEAEGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
121 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
181 GQPREPQVYT LPPSRQELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
241 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 
【図１Ａ】
2010514417.tif 000002
【図１Ｂ】
2010514417.tif 000003
【図２Ａ】
2010514417.tif 000004
【図２Ｂ】
2010514417.tif 000005
【図３Ａ】
2010514417.tif 000006
【図３Ｂ】
2010514417.tif 000007
【配列表】
2010514417000001.xml
【国際調査報告】
2010514417.tif 000013
2010514417.tif 000014