(57)【要約】【解決課題】本発明はリウマチ性関節炎で生成される抗体と反応するキメラポリペプチドに関する。【解決手段】このペプチドは、少なくとも２つのシトルリン化ペプチドサブユニットである（ｉ）フィブリンのα鎖又はβ鎖由来のものと、（ｉｉ）フィラグリン由来のものとを含んでいる。加えて、本発明は、病気の進行時に生成される自己抗体を検出することでリウマチ性関節炎を診断する抗原性組成物、方法及びキットにも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合された少なくとも２種のシトルリン化ペプチドサブユニット（ａ）と（ｂ）を含んだキメラポリペプチドであって、サブユニット（ａ）はαフィブリンタンパク質又はβフィブリンタンパク質の少なくとも７個のアミノ酸の断片と少なくとも８５％の相同性を有しており、サブユニット（ｂ）は環状化されており、フィラグリンタンパク質の少なくとも７個のアミノ酸の断片と少なくとも８５％の相同性を有していることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
サブユニット（ｂ）は両者間にジスルフィド架橋を形成する少なくとも２個のシステインアミノ酸を含んでいることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の部位３０６と３２４との間にフィラグリンタンパク質断片を含んでいることを特徴とする請求項１又は２記載のキメラポリペプチド。
【請求項４】
サブユニット（ｂ）は配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含んでいることを特徴とする請求項３記載のキメラポリペプチド。
【請求項５】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の部位６１７と６３１との間にαフィブリンタンパク質の断片を含んでいることを特徴とする請求項１又は２記載のキメラポリペプチド。
【請求項６】
βフィブリンタンパク質の断片は配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の部位４３と６２との間に含まれていることを特徴とする請求項１又は２記載のキメラポリペプチド。
【請求項７】
サブユニット（ａ）は、配列（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ｐ１８）、配列（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ｐ１９）及び配列（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ｐ２２）で成る群から選択される配列を含んでいることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項８】
サブユニット（ａ）は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５を含んでいることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項９】
配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であることを特徴とする請求項１又は２記載のキメラポリペプチド。
【請求項１０】
少なくとも１個の輸送分子でマーキングされ、あるいは共役されていることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載のキメラポリペプチド又はそれらの組み合わせであるキメラポリペプチドを含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項１２】
ポリペプチドＣＣＰ−２をさらに含んでいることを特徴とする請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
生体サンプル内でリウマチ性関節炎の特定自己抗体を検出する方法であって、
前記生体サンプルを、請求項１から１０に記載のキメラポリペプチドの少なくとも１種又は請求項１１に記載の抗原性組成物と接触状態に維持するステップと、
前記特定自己抗体と、前記キメラポリペプチド又は前記抗原性組成物との間の反応を検出するステップと、
を含んでいることを特徴とする方法。
【請求項１４】
生体サンプルを、請求項１から１０に記載のキメラポリペプチドの少なくとも１種又は請求項１１に記載の抗原性組成物と接触状態に維持するステップに加えて、ポリペプチドＣＣＰ−２又は請求項１２に記載の抗原性組成物を使用することを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
生体サンプルは遺伝子型ＨＬＡＤＲＢを有する患者のものであることを特徴とする請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
リウマチ性関節炎を病気診断又は予後診断のためのキットであって、請求項１から１０に記載のキメラポリペプチドの少なくとも１種又は請求項１１又は１２に記載の抗原性組成物又はそれらの組み合わせと、そのような抗体−抗原複合体を形成させるのに必要な試薬及び/又は緩衝剤とを含んでいることを特徴とするキット。
【請求項１７】
キメラポリペプチドＣＣＰ−２をさらに含んでいることを特徴とする請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
キメラポリペプチドは配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であることを特徴とする請求項１６又は１７記載の予後診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リウマチ性関節炎で発生する抗体を検出することができるキメラポリペプチドに関する。このペプチドは少なくとも２つのシトルリン化(citrullinated)ペプチドサブユニットを含む。これらサブユニットとは、(i)フィブリンのα鎖またはβ鎖からのサブユニットと(ii)フィラグリンからのサブユニットである。さらに本発明は、抗原組成物と、リウマチ性関節炎の進行過程で発生する自己抗体の検出に関わるリウマチ性関節炎の疾病診断及び予後診断を行う方法並びにキットとに関する。
【背景技術】
【０００２】
リウマチ性関節炎（ＲＡ）は、原因不明であって、人口の０．５％から１％が罹患する罹患頻度が非常に高い自己免疫症の１つであり、全身性合併症を伴い、徐々に関節を破壊し、関節変形を引き起こし、関節機能を失わせる。
【０００３】
この病気においては初期段階で適用される集中治療が非常に有効であるため、その早期診断が治療のためには重要である。米国リウマチ学大学（ＡＣＲ）によるＲＡの分類（AmeltFC,他、Arthritis Rheum.;1988;31,315-24）は純粋に臨床的なパラメータに基づいている。但し、これらの基準はＲＡの早期診断には有用ではない（Saraux A.et al.Arthritis Rheum 2001;
44;2485-91）。
【０００４】
現在、ＲＡの診断を可能にする複数の異なる血清学方法が存在する。それらは、それらの病状進行の初期段階で他の類似した病気から自身を区別するものである。このため、ＲＡ用の特定抗体がいくつか知られている。例えば、抗核周囲因子（ＡＰＦ）、抗フィラグリン抗体（ＡＦＡ）及び抗ケラチン抗体（ＡＫＡ）である。これらの抗体（シトルリン化抗タンパク質自己抗体）に対して認められるエピトープは、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ酵素によるアルギニンのシトルリンへの脱イミノ化(deimination)で成る翻訳後修飾によって発生する（VossenaarER,et al.Bioessays2003;25;1106-18）。
【０００５】
ＲＡを診断する最も特有な方法の１つは、ペプチド又はシトルリン化タンパク質に対抗して発生する自己抗体の検出である。それらは、知られているこの病気の最も効果的な血清マーカの１つを構成する（ニイェンフイスＳ他、臨床化学アクタ、２００４年版、３５０：１７−３４）。ＲＡの診断のための最も効果的であり、商業的に最も広く活用されているキットであるＥＬＩＳＡは、特にフィラグリンタンパク質由来のシトルリン化ペプチドであるＣＣＰ−１及びＣＣＰ−２に基づいている（NijenhuisS.,et al.2004）。
【０００６】
シトルリン化可能なシノビン組織の他のタンパク質はフィブリンのα鎖及びβ鎖と、Ｓａ抗原又はシトルリン化ビメンチンである。近年、セバッグ他（Sebbag et al. Eur.J.Clin.Immunol.,2006,36;2250-2263）はフィブリンタンパク質由来の１８種のペプチドを特定した。それらのうちの２種は［Ｃｉｔ６０，７２，７４］βフィブリン（６０−７４）及び［Ｃｉｔ３８、４２］αフィブリン（３６−５０）と呼称され、タンパク質の球状ドメインに存在し、シトルリン化抗タンパク質自己抗体のための全陽性血清に反応することができた。これらの結果は近年の研究（Perez,etal.,Chem.Biol.Drug Des.,2006,68,194-200;US 7,022,485）によって確認された。ここではＲＡの診断においてフィブリンから得られたペプチドの活性が分析され、現行の診断システムの効能の開発及び改良における利用性が確認された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＲＡの診断を改善する特殊試験の開発、並びに関節及び連結組織に影響を及ぼす他のリウマチ性疾患に関する早期診断、特に予後診断が思わしくない患者や、症状の進行が速い患者に対する関心が高まっている。これら臨床試験の採用は、病気の診断時点から集中的な治療を必要とする患者を特定することを可能とし、症状の進行を抑え、可能な限り関節の破壊を回避させ、病気の予後診断を改善する。
【０００８】
本発明の発明者は現在利用されているＲＡ診断システムの改良を目指しており、驚くべきことに、ＲＡの進行過程で発生するシトルリン化抗タンパク質自己抗体（以降単に“自己抗体”）に対する特別な感度及び特異性を備えたフィブリンのα鎖及びβ鎖のシトルリン化ペプチド類を発見した。さらにこれらフィブリンのα鎖のシトルリン化ペプチドの１つはフィラグリンの環状ペプチドに共有結合し、ペプチドＣＣＰ−１及びＣＣＰ−２（イミュノスキャンＲＡ）で得られる感度及び特異性の結果を補足又は改善できるキメラポリペプチド（フィブリン−フィラグリン）を得た。
【０００９】
よって、本発明の第１の特徴は、少なくとも２つのシトルリン化ペプチドサブユニットを含み、共有結合しており、ＲＡ進行中に発生する自己免疫抗体と反応することができるキメラポリペプチドに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
サブユニット（ａ）は、フィブリンのα鎖及びβ鎖の少なくとも７個のアミノ酸の断片、好適には１０個から１８個のアミノ酸の断片を有しており、少なくとも８５％、好適には少なくとも９０％、さらに好適には少なくとも９３％、さらに好適には少なくとも９５％、さらに好適には少なくとも９８％相同性である。
【００１１】
別の環状サブユニット（ｂ）は、フィラグリンタンパク質の少なくとも７個のアミノ酸の断片、好適には１０個から１８個のアミノ酸の断片を有しており、少なくとも８５％、好適には少なくとも９０％、さらに好適には少なくとも９３％、さらに好適には少なくとも９５％、さらに好適には少なくとも９８％相同性である。
【００１２】
本発明のこの特徴を有する１好適実施例では、サブユニット（ｂ）は、それらの間でそのサブユニットを環状にするジスルフィド架橋が形成される少なくとも２つのシステインアミノ酸を含む。好適には、これらシステインはセリンとシステインの置換により得られるものである。
【００１３】
本発明のこの特徴を有するさらに好適な実施例では、そこからサブユニット（ｂ）が得られるフィラグリン断片はそのタンパク質の部位３０６から３２４の間で成り、さらに好適な実施例では、β鎖フィブリンの部位３０６から３２４の間の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７である。
【００１４】
さらに好適な実施例では、サブユニット（ｂ）の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ｃｆｃ１ｃｙｃ）である。
【００１５】
本発明のこの特徴のさらに好適な実施例では、そこからサブユニット（ａ）が得られるフィブリン断片は、フィブリンのα鎖の部位６１７から６３１又はフィブリンのβ鎖の部位４３から６２の断片である。本発明の１好適実施例では、フィブリンのα鎖の部位６１７から６３１の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８である。さらに好適な実施例では、フィブリンのβ鎖の部位４３から６２の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９である。
【００１６】
本発明のこの特徴のさらに好適な実施例においては、キメラポリペプチドのサブユニット（ａ）は以下の群から選択される配列を含む。
ａ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ｐ１８）
ｂ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ｐ１９）
ｃ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ｐ２２）
【００１７】
本発明のこの特徴のさらに好適な実施例では、キメラポリペプチドのサブユニット（ａ）は配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ｐ３８）を含む。
【００１８】
本発明の別な好適実施例では、キメラポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ｐ１８、ｃｆｃ１ｃｙｃ）を含む。
【００１９】
本発明のさらに好適な実施例では、本発明の前出の特徴によるキメラポリペプチドは輸送分子でマーク又は共役されている。
【００２０】
以降、これらシトルリン化キメラポリペプチドを“本発明のキメラポリペプチド”という。これらポリペプチドは固形ペプチドの化学合成のごとき従来技術において良く知られる手法で得られる（材料及び方法参照）。
【００２１】
本発明の第２の特徴は、それらペプチドがｐ１８、ｐ１９、ｐ２２及びｐ３８の群から選択された配列又はそれらの相似（相同）配列（相同ペプチド）を有するα鎖及びβ鎖のフィブリンのシトルリン化ペプチドに関するものである。これらシトルリン化ペプチド及び相同ペプチドはＲＡの特定自己抗体と反応することができる。本発明の１好適実施例では、それらペプチドは環状化される。１実施例では、その環状化は２つのシステイン、好適にはセリンとシステインの置換で実行される。以降、これらシトルリン化ペプチドを“本発明のペプチド”と呼称する。
【００２２】
本発明の第３の特徴は、本発明のペプチドである本発明のキメラポリペプチド又はそれらペプチドの組み合わせ物中の少なくとも１つのペプチドを含んだＲＡの診断及び/又は予後分析のための抗原組成物に関する。以降、この組成物を“本発明の抗原組成物”と呼称する。
【００２３】
本発明の第４の特徴は、生物サンプルのＲＡに対する特定自己抗体の検出方法に関するものであり、以下のステップを含む。
（ａ）本発明のペプチド、本発明のキメラポリペプチド及び本発明の抗原組成物の少なくとも１つと接触状態で生体サンプルを配置するステップ。
（ｂ）従来の利用可能な方法等（例えば、ペプチドマーキング又はサンプルの光学密度を利用、等々）で特定自己抗体と、ステップ（ａ）の本発明のペプチド、キメラポリペプチド又は抗原組成物との反応を検出するステップ。
【００２４】
本発明の１好適実施例では、本発明の２以上のキメラポリペプチドが生体サンプルと接触状態に置かれる。本発明の別実施例では、生体サンプルは本発明のキメラポリペプチドの１種又は複数種及びポリペプチドＣＣＰ−２と接触状態に置かれる。
【００２５】
本発明の第５の特徴は、本発明のペプチドの少なくとも１種、本発明のキメラポリペプチド又は本発明の抗原組成物（抗原）を含むＲＡの病気診断と予後診断のためのキットに関する。好適にはこのキットは抗体と抗原との複合体の形成を促すのに必要な試薬及び緩衝剤を含むものである。
【００２６】
定義
本明細書を通じて“由来（得られた）ペプチド又はポリペプチド”とはフィラグリンタンパク質の少なくとも７個のアミノ酸の領域又は断片、あるいはフィブリンのα鎖及びβ鎖の少なくとも７個のアミノ酸の領域又は断片から得られるペプチド類のことである。これら由来ペプチドは修正（例：環状化、デイミネーション、等々）を受けているであろう。この修正の結果、由来先のタンパク質の当初配列との相同性が低減している。これらペプチド類の１例はＣＣＰ−１及びＣＣＰ−２として知られるペプチド群である。
【００２７】
“ＣＣＰ−１ペプチド”とはフラグリン由来の環状ペプチドのことである。
【００２８】
“ＣＣＰ−２ペプチド”とはＣＣＰ−１ペプチドで達成される検出性能より大きなＲＡ検出のための感度及び特異性の程度を備えたペプチドのことである。
【００２９】
明細書で記載されているアッセイを通じて、本発明のペプチドは商業的に入手できるイミュノスキャンキット（イミュノスキャンＲＡ；“ユーロダイアグノスチカ”、ダイアゾリン社供給、スペイン国マドリード市）から得られるＣＣＰ−２ペプチドと比較される。
【００３０】
“ポリペプチドの相同ペプチド”とは、以下で解説するように、少なくとも１つのアミノ酸が別な類似の特徴を有するアミノ酸により置換されているペプチドのことである。
【００３１】
−極性中性好水性又は（極性）：セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン（Ａｓｎ）及びグルタミン（Ｇｌｎ）
−非極性中性無極又は疎水性：グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファンン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）
−負電荷又は酸：アスパラギン酸（Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）
−正電荷又は塩基：リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）
【００３２】
“共有結合ペプチド”とは両者間に共有結合が存在し、そこでその結合がスペーサを介して、あるいはスペーサを介さずに発生することができるペプチドのことである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、フィブリンのβ鎖（断片４３〜６２）の“頭−尾”環状ペプチド（ｐ３８ＨＴ）の固相合成の手法を表す図である。試薬及び条件：（ｉ）Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏｄｍａｂ  ＤＣＭ、ＤＩＰＣＤＩ、２０分間、０℃；（ｉｉ）ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＤＭＦ、３時間；（ｉｉｉ）固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）；（ｉｖ）２０％ピペリジン/ＤＭＦ；（ｖ）３％ヒドラジン/ＤＭＦ；（ｖｉ）２０％Ｈ２Ｏ/ＤＭＦ、１６時間；（ｖｉｉ）ＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノール；（ｖｉｉｉ）１％ＤＩＰＥＡ/ＤＭＦ；（ｉｘ）１％ＧＯＢｔ/ＤＭＦ；（ｘ）ＰｙＢＯＰ/ＤＭＦ、ＤＣＭ、７２時間；（ｘｉ）１％ＤＩＥＡ/ＤＭＦ；（ｘｉｉ）ＤＭＦ/ＭｅＯＨ；（ｘｉｉｉ）ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）/ＥＤＴＡ/ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）/Ｈ２Ｏ、３時間。Ｗ基、Ｘ基及びＺ基はペプチドの化学合成反応を導くのに使用される保護基である。
【図２】図２は、ジスルフィド架橋を有した環状ペプチドの固相ペプチド（ｐ３８ＳＳ）の合成の手法を表す図である。試薬及び条件：（ｉ）ＳＰＰＳ；（ｉｉ）２０％ピペリジン/ＤＭＦ；（ｉｉｉ）ＴＦＡ/ＥＤＴ/ＴＩＳ/Ｈ２Ｏ、３時間；（ｉｖ）ｌ２/ＭｅＯＨ、６０分間、ｌ２/ＭｅＯＨ、９０分間；（ｖ）ＤＣＭ。Ｗ基、Ｘ基及びＺ基はペプチドの化学合成反応を導くのに使用される保護基である。
【図３】図３は、ペプチドｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｃの固相ペプチド合成の手法を表す図である。試薬及び条件：（ａ）（ｉ）２０％ピペリジン/ＤＭＦ；（ｉｉ）ペプチドｃｆｃ１ｃｙｃのＳＰＰＳ；（ｉｉｉ）ＳＰＰＳ、ペプチドｐ１８の固相によるペプチド合成；（ｉｖ）２０％ピペリジン/ＤＭＦ；（ｖ）ＴＦＡ/ＴＩＳ/Ｈ２Ｏ；（ｖｉ）ｌ２/メタノール、６０分間及びＨ２Ｏ、９０分間；（ｖｉｉ）ＤＣＭ；（ｂ）試薬及び条件：（ｉ）２０％ピペリジン/ＤＭＦ；（ｉｉ）ペプチドｃｆｃ１のＳＰＰＳ；（ｉｉｉ）ｌ２/メタノール/ＤＣＭ、４時間；（ｉｖ）ＤＭＦ/メタノール；（ｖ）ペプチドｐ１８のＳＰＰＳ；（ｖｉ）２０％ピペリジン/ＤＭＦ；（ｖｉｉ）ＴＦＡ/ＴＩＳ/Ｈ２Ｏ（９０：５：５）
【図４】図４は、ＲＡ患者からの３３血清のサンプルのα鎖及びβ鎖フィブリン由来のペプチドの吸光度（ＯＤ４９２）で測定した反応グラフである。
【図５】図５は、１１０ＲＡ血清サンプルのフィブリンのβ鎖由来のペプチド（ｐ３８）並びに環状ペプチドｐ３８ＨＴ及びｐ３８ＳＳの吸光度（ＯＤ４９２）で測定した反応グラフである。
【図６】図６は、ＲＡ患者又は乾癬性関節炎（ＰｓＡ）患者群の自己抗体（Ｂ、Ｃ及びＤ）に対するペプチドｐ２２、ｐ２２ｓｃ及びｐ２２ｌｃのＲＯＣ曲線（Ａ）と反応性の分析を示す。（Ａ）全ての可能なカットオフ値の感度と特異性は計算され、ＲＯＣ曲線（ｎ＝１１１  ＲＡ陽性患者、ｎ＝８２  ＰｓＡ陽性患者）として表された。グラフＢ、Ｃ及びＤは、それぞれのアッセイのＲＯＣ曲線による分析で得られた最良カットオフ値で表されるＲＡ患者及びＰｓＡ患者（対照）の抗体に対するペプチドｐ２２、２２ｓｃ及びｐ２２ｌｃの活性を示す。
【図７】図７は、ＲＡ患者又はＰｓＡ患者群のＲＯＣ曲線（Ａ）並びにβ―フィブリン（ｐ３８）の直鎖ペプチドの抗体（Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）に対する活性、α―フィブリン（ｐ２２）の直鎖ペプチド、キメラポリペプチド（ｐ３８−ＧＧＧ−ｐ２２）及びペプチドｐ３８とｐ２２の混成物の分析を示す。（Ａ）全ての可能なカットオフ値の感度と特異性は計算され、ＲＯＣ曲線（ｎ＝１１１  ＲＡ陽性患者、ｎ＝８２  ＰｓＡ陽性患者）として表された。グラフＢ、Ｃ、Ｄ及びＥは、それぞれのアッセイのＲＯＣ曲線による分析で得られた最良カットオフ値で表されるＲＡ患者及びＰｓＡ患者（対照）の自己抗体に対するペプチドｐ３８、ｐ２２、ｐ３８−ＧＧＧ−ｐ２２及びｐ３８＋ｐ２２の活性を示す。
【図８】図８は、Ｒａ患者又はＰｓＡ患者群のＲＯＣ曲線と、フィラグリン（ｃｆｃ１ｃｙｃ）由来の環状ペプチド（ペレスＴ他、ペプチド科学協会誌、２００６年版、１２（４）：２６７−２７８）及びキメラポリペプチド（ｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｌ）の活性の分析を示す。（Ａ）全可能なカットオフ値に対して感度と特異性が計算され、ＲＯＣ曲線（ｎ＝１１１  ＲＡ患者、ｎ＝８２  ＰｓＡ患者）として表された。（Ｂ）グラフＢとＣは、それぞれのアッセイのＲＯＣ曲線による分析から得られた最良カットオフ値で表されるＲＡ患者又はＰｓＡ患者（対照）の自己抗体に対するｃｆｃ１及びｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｃの活性を示す。
【図９】図９は、抗ペプチド抗体ｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｃ及び抗ＣＣＰ−２の適定濃度間相関関係の分析を示す。
【図１０】図１０は、抗ＣＣＰ−２のＲＯＣ曲線を示す。
【図１１】図１１は、フィブリン/フィラグリン抗キメラｐ−１８のＲＯＣ曲線を示す。
【図１２】図１２は、フィブリン/フィラグリン抗キメラｐ−１９のＲＯＣ曲線を示す。
【図１３】図１３は、フィブリン/フィラグリン抗キメラｐ−２２のＲＯＣ曲線を示す。
【図１４】図１４は、ＣＣＰ−２（＋）と（−）の患者間モニタリングを通じたＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の値の変化を示す
【図１５】図１５は、ＣＣＰ−２（＋）と（−）の患者間モニタリングを通じたＤＡＳ２８活性インデックスの変化を示す。
【図１６】図１６は、抗ｐ１８（＋）と（−）抗キメラの患者間モニタリングを通じたＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）値の変化を示す。
【図１７】図１７は、抗ｐ１８（＋）と（−）抗キメラの患者間モニタリングを通じたＤＡＳ２８活性インデックスの変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下では、本発明の開発に使用された物質と方法並びに実施形態が解説されている。これら実施例は本発明を限定するものではなく、実施例の目的は本発明の説明であり、本発明のキメラポリペプチド及びペプチドの感度と特異性を解説するものである。
【００３５】
材料と方法
ペプチド合成
異なる程度のデイミネーションを備えたα鎖及びβ鎖のフィブリンタンパク質に属するペプチドの合成（表１ａ及び表１ｂ）が、テンタゲルＲＡＭ樹脂（ラップポリメレＧｍｂＨ社、ドイツ）（１００ｍｇ、０．２８ｍｅｑ/ｇ）を使用してペプチド分析法により固相で実施された。この合成は半自動ペプチド合成装置（ＳＡＭ、マルチシンテック社、ドイツ）を使用して実行され、その結果はＣ末端カルボキシアミドの形態で得られた。Ｆｍｏｃ/ｔＢｕｔ手法に従ってアミノ酸同士の結合反応が、縮合剤１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）を使用して、前の３倍の濃度で２回実行された。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）内のピペリジン（２０％）を１０分間使用してＦｍｏｃ保護基の脱保護処理も２回実行された。
【００３６】
【表１ａ】
2010526042.tif 000002
【００３７】
【表１ｂ】
2010526042.tif 000003
【００３８】
これらペプチドはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）/トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）/Ｈ２Ｏ（９５/２．５/２．５）の混合物を使用して脱保護され、同時的に樹脂から１回で解離された。これらペプチドは冷却ジエチルエーテルで沈殿され、遠心分離され、１０％酢酸内で凍結乾燥された。このようにして得られたペプチドは２１５ｎｍにて分析用ＨＰＬＣにより分析された。それらの組成はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で確認された。
【００３９】
ペプチドの環状化
その配列は表２で提供されているが、“頭−尾”環状ペプチドｐ３８ＨＴを得るためにアミノ酸の標準保護が使用された。ｐ３８ＨＴは表１で示す手法に従って手作業で合成された、Ｃ末端の形態であるＮｏｖａｓｙｎ（登録商標）ＴＧＡ樹脂（スイス国ノババイオケム社）（０．２５ｍｍｏｌ/ｇ）で得られた。この樹脂はヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）で官能化されて商業的に供給された。この第１段階は、横鎖を介したＦｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＤｍａｂの無水異性体による樹脂のアシル化であった。このペプチド合成は標準Ｆｍｏｃ/ｔＢｕｔ手法に従って継続された。このペプチド合成の完了後、Ｆｍｏｃ末端基はＤＭＦ内の２０％ピペリジンで除去された。Ｄｍａｂ基の除去はＤＭＦ内の３％ヒドラジンによる処理と、続くＤＭＦ内の２０％水での処理によって実行された。
【００４０】
【表２】
2010526042.tif 000004
【００４１】
この脱保護された樹脂は１％ＤＩＰＥＡ−ＤＭＦで処理され、続いて１％ＨＯＢｔ−ＤＭＦで処理された。このマクロ環状化反応は、７２時間、常温条件下でＰｙＢＯＰの３当量を使用して実行された。最後に、ペプチド樹脂はＴＦＡ/１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）/ＴＩＳ/Ｈ２Ｏ（９５/２/１/２）の混合物の酸処理によってペプチドから放出された。この環状構造は冷却ジエチルエーテルでの沈殿により単離され、１０％酢酸内で最終残基を溶解させ、最後に凍結乾燥された。未精製ペプチドは逆相ＨＰＬＣで精製され、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ）で確認された。
【００４２】
表２と表３で示すジスルフィド形態の環状ペプチド（ｐ３８ＳＳ、ｐ１８−ｓｃ、ｐ１９−ｓｃ、ｐ２２−ｓｃ、ｐ１８−ｌｃ、ｐ１９−ｌｃ及びｐ２２−ｌｃ）を得るためには元来のペプチド配列の２セリン残基をＣｙｓ（Ａｃｍ）としての保護された２システイン残基で置換することが必要であった。対応する直鎖ペプチドは前述のようにＣ末端カルボキシアミドの形態で合成され、最終的に、ＴＦＡ/ＥＤＴ/Ｈ２Ｏ（９５/２．５/２．５）による処理で樹脂から放出され、冷却ジエチルエーテルにより沈殿された。最後に、それらは１０％酢酸内で溶解され、凍結乾燥された。得られたペプチドの特徴の特定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及び分析用ＨＰＬＣにより実行された。環状化はペプチドを酢酸内に溶解し、メタノール内にヨウ素溶液を加えてジスルフィド結合を得ることで実行された。６０分間撹拌した後、水が加えられ、Ａｃｍ保護基の放出が加速された。得られた溶液はさらに９０分間撹拌され、最後にヨウ素がジクロロメタンで抽出された。その水相物は水で３倍に希釈され、凍結乾燥された。未精製ペプチドは分析用ＨＰＬＣで特徴付けられ、予備ＨＰＬＣで精製され、ＥＳ−ＭＳで特徴付けられた。図２はジスルフィド架橋を備えた環状ペプチドの１つ（ｐ３８ＳＳ）を生成するために実行された合成法を図示する。
【００４３】
【表３】
2010526042.tif 000005
【００４４】
キメラペプチド
α及びβフィブリン（表４ａ）から選択されるペプチドの中で３個のグリシン残基を含む直鎖キメラペプチドの合成を実行するために前述の一般手法が実行された。
【００４５】
その主要配列が表４ｂで示されているαフィブリンとフィラグリンのキメラ（ポリ）ペプチド（ｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｃ）の合成を実行するための２つの異なる合成法が利用された。第１方法（図３ａ）は固相での直鎖キメラ配列の合成ステップと、ジスルフィド架橋の形成による溶液内における後の環状化ステップとで成る。第２方法（図３ｂ）ではフィラグリンペプチドに対応する領域の環状化が固相にて実行され、続いて、フィラグリンペプチドが既に環状化されている状態にてペプチジル樹脂上でαフィブリンに対応する配列により配列合成が完了した。キメラポリペプチドの解離と最終脱保護は、既成のジスルフィド結合を保存して実行された。
【００４６】
【表４】
2010526042.tif 000006
【００４７】
血清サンプル
分析された血清サンプルはバルセロナ病院のリウマチサービスセンターの患者からのものであった。全部で１９３の血清サンプルが検査され、１９８７年の米国リウマチ協会（現在、米国リウマチ学大学）の改定基準に従って、そのうち１１１サンプルがＲＡであると診断された患者に対応するものであった。これらサンプルはＣＣＰ−２抗体のキット（イミュノスキャンＲＡ、“ユーロダイアグノスチカ”、ディアゾリン社提供、スペイン国マドリード市）を使用してＥＬＩＳＡによって以前に試験されていた。８２の残りの血清サンプルはＰｓＡであると診断された患者（非予備選択）から得られたものであり、陰性対照として使用された。
【００４８】
ＥＬＩＳＡアッセイ
これらペプチド配列は、前述したように（Perez,T.;Gomez,etal. Lett.Peptide  Sci.,2002,9,291-300）ＥＬＩＳＡ適定プレートに共有結合された。
【００４９】
簡単に言えば、これらペプチドは０．０５Ｍの炭酸塩/重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ９．６）内で１０ｍｇ/ｍＬの濃度に希釈された。１００μＬのペプチド溶液が微小適定プレートの各ウェルに入れられ、４℃で一晩培養された。各適定プレートは背景ノイズを予測するための、血清サンプル以外は全試薬を含んだ対照のウェルと、非特異血清反応を評価するための、ペプチド以外は全試薬を含んだウェルとを含んでいた。対照ではそれらウェルは２ｍｇのＢＳＡ/ウェルでブロックされた。培養後、適定プレートは室温で１時間、０．０５Ｍの炭酸塩/重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ９．６）内の２％のＢＳＡでブロックされた。血清は１０％のウシ胎児血清が補充されたＲＩＡ緩衝剤（１％のＢＳＡ、３５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１％ｖｏｌ/ｖｏｌのトリトンＸ−１００、０．５％ｗｔ/ｖｏｌのＮａ−デオキシコレート、０．１％のＳＤＳ）内で２００倍に希釈された。１００μＬ/ウェルが追加され、室温にて１．５時間培養された。ＰＢＳ/０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で６回洗浄した後、１００μＬ/ウェルのペルオキシダーゼに共役された抗ヒトＬｇＧが加えられ、ＲＩＡ緩衝剤で１：１０００に希釈された。室温での１時間の培養後に適定プレートはＰＢＳ/０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で６回洗浄され、結合した抗体はｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ、シグマケミカルカンパニ社）と、０．８ｍＬ/ｍＬの３０％過酸化水素で検出された。適定プレートは室温で３０分間培養された。反応は５０ｍＬの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で留保され、得られた光吸収率は４９２ｎｍの波長で測定された。全部の血清は二重に試験された。アッセイ間及びアッセイ内の変動をモニターするために対照血清も含まれた。
【００５０】
リポペプチドｐ６６又はフィブリンペプチドの物理的混合物で実行されたＥＬＩＳＡアッセイが、前述の方法（Gomara,M.J. et al.,J.Immunol Methods 2000,234,(1-2),23-34）に従って固体表面への配列の受動的吸収後に実行された（マックスソープ、９６Ｆヌンク、デンマーク国ロスキルド市）。ペプチドｐ６５はＣｏｖａｌｉｎｋＮＨプレート（ヌンク、デンマーク国ロスキルド市）を使用して分析された。これはＣ末端領域を介してペプチドの共有結合を促す。この汎用方法は以下の通りである。
【００５１】
１０μｇ/ｍＬのペプチド溶液が８ｍＭの濃度にてスルフォ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（スルフォ−ＮＨＳ）を含有した蒸留水内で準備された。１００μＬのペプチド/スルフォ−ＮＨＳ溶液が各ウェルに入れられた。同様に２％のＢＳＡ/スルフォ−ＮＨＳの溶液が準備され、対照ウェルに入れられた。５０μＬの１６ｍＭである１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）が各ウェルに入れられた後、共有反応が開始した。適定プレートは室温にて一晩培養され、ＥＬＩＳＡアッセイの残りステップはＣｏｓｔａｒプレートに関して前述した方法に従って実行された。
【００５２】
統計解析
統計プログラムＳＰＳＳバージョン１２．０を使用した統計解析が実行された。異なる病気での異なるＥＬＩＳＡアッセイの感度/特異性を確立するためにＲＯＣ曲線研究が実行された。比率を比較するため、カイ二乗検定又はフィッシャ検定が実行され、継続的変動要素の二変系分析のために、スチューデントｔ−検定及び/又はウィルコキソン−マン−ウィットニーアッセイが利用された。複数比較のために変動分析又はクルスカル−ワリス検定が利用された。パラメトリック検定を利用するため、常態対比（コルモゴロフ−スミルノフ）及びホモセダスティシティ検定（レベン検定）が前もって実行されていた。
【００５３】
本発明の実施例
【実施例１】
【００５４】
αフィブリン及びβフィブリンのエピトープ特定
ＲＡの陽性血清（以降“ＲＡ血清”）に対してさらに反応性（活性）であるフィブリンタンパク質のペプチドを検出する目的で、デイミネーション程度の影響が、異なるアルギニン/シトルリン比を有するフィブリンから得られたペプチドの合成によって分析された。このアッセイで使用されるαフィブリン鎖及びβヒブリン鎖の領域の特定はコンピュータで作成された抗原性の予測によって実行された。ジャナン疎通性とウェリング抗原性のホップとウッズ親水性スケールが使用された。さらに、どの領域がベータターンを形成するさらに高い確率を有しており、従って、抗体との反応のためのさらに高い活性を有してタンパク質のさらに外部の区分に存在すべきであるか考察された。これらペプチドは最終的に固相で合成され、それらの配列である質量分析のＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−Ｔによって特徴付けられた。
【００５５】
ＲＡの陽性血清内に存在する自己抗体を認識する能力を見極めるため、これらペプチドはイミュノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により分析された。どのペプチドが自己抗体の最良基材であるかを特定するため、当初は全ての合成ペプチドがＲＡの３３の陽性血清と４０の対照血清とで検定された。図４で示すように、αフィブリン鎖由来のペプチドｐ１８、ｐ１９及びｐ２２の感度が相当程度の増加されていた。アルギニンは部位６３０で置換されていた。ペプチドｐ２４もこの特定部位にシトルリンを有しているが、それは領域６１７から６３１の全面的にシトルリン化されたペプチドである。本発明の発明者による過去の研究によれば、正味正電荷はペプチドの活性に貢献する追加的要素である。発明者の経験によれば、ペプチド内のＡｒｇ/Ｃｉｔ残基の好適なバランスは自己抗体に対するさらに大きな結合能力での形成に有利である。これはそれらの分析、病気診断及び予後診断の利用性を改善するのに好適であった。
【００５６】
同一部位に非変質アルギニンを有したαフィブリンの領域６１７から６３１の対応するその他のペプチドは相対的に低い反応性を示した。部位４３から６２で定義された領域から得られたペプチドのβフィブリン鎖由来のペプチドにおいては、ｐ３８が最良の吸収性結果（ＤＯ４９２）を有した。すなわち、自己抗体に対するさらに大きな結合性を有していた。
【実施例２】
【００５７】
環状化ペプチドによる自己抗体の検出検定
βフィブリンの環状化ペプチド
βフィブリンの領域４３から６２由来のペプチドは環状化され、この環状化処理が抗体に対する親和性を増加させたか否かが判定された。よって、βフィブリンの領域４３から６２由来の環状ペプチドの２形態（表２）が準備された。これら形態の一方であるｐ３８ＨＴ（頭−尾）は環状ペプチドｐ３８に対応する。ｐ３８はそのペプチドのＮ末端と、オドマブ基（４［Ｎ−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキシルイデン）−３−メチルブチルアミノ］ベンジルオキシ］）（図１）によって保護されたペプチドの配列のＣ末端に導入されたＡｓｐ残基のカルボキシル基との間のアミノ結合の形成によって固相にて得られた。そのペプチドの別形態であるｐ３８ＳＳは、２つのセリン残基を、βフィブリンの領域４３から６２の２つのシステインで置換することにより得られ、環状化はヨウ素/メタノール溶液の酸化によって実行された（図２）。
【００５８】
環状化ペプチドのこれら２形態はＥＬＩＳＡにより、ＲＡの１１０の陽性血清と８０の対照血清を使用して検定された。図５で示すように、ｐ３８ＨＴとｐ３８ＳＳとの間の相違はさほどではなかったが（ｐ＝１６２）、自己抗体を検出する直鎖ペプチドの能力は環状ペプチド（ｐ＜０．０５）に大きく劣った。
【００５９】
αフィブリンの環状化ペプチド
βフィブリンの場合と同様に、αフィブリン由来の環状化ペプチドは、さらに高い抗原値ｐ１８、ｐ１９及びｐ２２を提供していたペプチドから得られた。このように、各ペプチドの２つの環状化形態（表３で示すように長大形態と短小形態）が準備され、ＲＡの１１０の陽性血清と、ＰｓＡの７０の陽性血清で検定された。ＲＯＣ曲線分析は短小環状ペプチドの曲線（ＡＵＣ）値（ｐ１８−ｓｃ、ｐ１９−ｓｃ及びｐ２２−ｓｃそれぞれに対して０．８２９、０．７４５及び０．７０３）の下側で、長大環状ペプチドのもの（ｐ１８−ｌｃ、ｐ１９−ｌｃ及びｐ２２−ｌｃそれぞれに対して０．７３８、０．７０３及び０．６８５）と較べて大きな領域を示した。図６で示すように、環サイズが相対的に小さいときにはペプチドｐ２２−ｓｃに対してさらに高いＡＵＣ及び感度値（Ｐ＝０．００８）が得られた。
【００６０】
一方、このアッセイに使用されたフィブリンペプチドは、他のＲＡ検出法の結果とは異なり、ＰｓＡに対する陽性サンプルで偽陽性の原因とはならなかった。その結果、抗ＣＣＰ検定で検出された抗体がＰｓＡによって影響を受けるさらに高頻度の個体群であると主張する様々な研究者（２１、２２）によって解説されているように、ここで解説するαフィブリンの環状化ペプチドはＲＡ検出システムの改善に大きな関連性を有するであろう。
【実施例３】
【００６１】
αフィブリン−βフィブリン及びフィブリン−フィラグリンキメラペプチドによるＲＡ自己抗体の検出検定
αフィブリン及びβフィブリン由来のポリペプチドの異なる領域のために得られた特異性及び選択性データから、キメラペプチドが設計され、固相にて合成された（表４）。
【００６２】
ＥＬＩＳＡ分析は、ＲＯＣ曲線によって分析されたαフィブリン及びβフィブリンキメラポリペプチドが、モノマーペプチドに対応するものよりも高いＡＵＣ値を提供することを示した（図７）。驚くことに、このアッセイが、フィラグリンペプチドが環状化されているフィブリン−フィラグリンキメラポリペプチドで実行されると、感度及び特異性の結果はさらに改善された。
【００６３】
この最後のアッセイを準備するために２つのペプチドが準備された。すなわち、ＣＣＰ−１（１５）として知られるペプチド群に属するｃｆｃ１ｃｙｃと、ｐ１８との前記一方の共有結合で得られたｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｃとが準備された。これら両ペプチドの感度と特異性の比は図８で示す。ｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｃに対するＥＬＩＳＡの感度は８２％であり、これはｃｆｃ１ｃｙｃに対してＥＬＩＳＡにより到達されたもの（６５．８％；Ｐ＝０．００２）より大幅に高かった。特異性は両方の場合とも非常に大きかった（９３％）。対照として使用された群がＰｓＡ患者（ＲＡを擬似する臨床症状の炎症）で成ることを考慮すると、特異性を維持したこの高い感度は見落とせない。一方、対照固体群（ＰｓＡ）におけるポリペプチドｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｃ（６％）に対する抗体頻度は、ＣＣＰ−２に基づく商業的検定を利用する他の研究者により発表されているものに類似しており、５．６から７．８％の発現率を報告した。
【実施例４】
【００６４】
ペプチド混合物によるキメラポリペプチドＲＡ抗体の検出検定
フィブリン由来ペプチドに基づいてＲＡ検出法を改善するため、様々に異なるペプチド混合物が準備された。
【００６５】
ＣＣＰ−２に基づく商業検定が陰性結果を出した２３の血清サンプルのパネルが使用され、抗原的にさらに関連が深かったものから選択された、異なるペプチド混合物に対するそれらの反応性が研究された（表５）。これらペプチド混合物は、２３のＲＡ陽性サンプルのうちで４サンプルを検出できただけであった。しかし、キメラポリペプチドｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｃは８血清サンプルでＲＡ自己抗体を検出でき、試された他の方法で得られた最大２１％と１７％と比して３３％の反応性に達した。これらの結果はフィブリン−フィラグリンキメラペプチドがＲＡの検出方法の感度を改善できることを証明した。
【００６６】
【表５】
2010526042.tif 000007
【００６７】
フィブリン−フィラグリンキメラポリペプチド、特に、ポリペプチドｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｃがｃｆｃ１ｃｙｃのものよりも高い感度を提供できること、及び商業的ＣＣＰ−２検定が偽陰性を検出したＲＡの陽性血清を検出することができたことすら言及することは重要なことである。実際に、ＣＣＰ−２検定で４６％以上の陰性血清がｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｃ及び/又はｐ３８と反応し、フィブリン由来のペプチド及びフィブリン−フィラグリンキメラポリペプチドが、本発明以前の検定結果よりも良好な結果を提供するＲＡ自己抗体検出検定の開発を可能にすることを示している。
【００６８】
これらアッセイの実行中に、図９（ｒ＝０．８６、ｐ＜０．００１）で示すようにｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｃとＣＣＰ−２の相関関係の存在も確認された。これら結果は、ＲＡの病気診断及び予後診断の方法を補強するためにフィブリン−フィラグリンペプチドの利用性を向上させる。
【実施例５】
【００６９】
抗ＣＣＰ−２抗体及びシトルリン化キメラ抗ペプチド（フブリン/フィラグリン）（ｆｂ/ｆ（フィブリン/フィラグリン）抗キメラ）の感度並びに特異性
この分析を実行するため、抗ＣＣＰ２及びｆｂ/ｆ抗キメラ（ｐ１８．ｐ１９、ｐ２２）抗体の値がＥＬＩＳＡ技術を活用して利用された。よって、ＲＡの診断のために感度、特異性及び陽性と陰性の予測値を評価するため、リウマチ性関節炎（ＲＡ）の患者の血清サンプル（ＡＣＲ規準、１９８７年）（ｎ＝３２２）及びクリニコ病院の血液バンクからの対照血清サンプル（ｎ＝３０７）が使用された。このため、ＲＯＣ曲線分析が実行され、９８％の特異性が示された。以下は、異なる抗原に対するカットオフ値を示す。
抗ＣＣＰ２：                ２９ＩＵ/Ｉ
ｆｂ/ｆ抗キメラ−ｐ１８：    ０．２４１
Ｆｂ/ｆ抗キメラ−ｐ１９：    ０．２２９
Ｆｂ/ｆ抗キメラ−ｐ２２：    ０．２８０
【００７０】
以下において、ＲＡ患者群（ｎ＝３２２）と血液バンクからの対照群（ｎ＝３０７）の間のＲＡ診断のためのＲＯＣ曲線が詳述されている。
【００７１】
【表６】
2010526042.tif 000008
【００７２】
【表７】
2010526042.tif 000009
【００７３】
【表８】
2010526042.tif 000010
【００７４】
【表９】
2010526042.tif 000011
【００７５】
このアッセイで、ＲＡ患者の血清に、シトルリン化フィブリン/フィラグリンキメラペプチドに対して反応する抗体が存在していることが示された。このことは、リウマチ滑膜に存在するヒトヒブリンのα鎖のエピトープが、ＲＡ患者においてこれら自己抗体を形成して免疫反応を引き起こす主抗原で構成されているという考察を補強する。
【００７６】
これら抗体の感度/特異性分析で、それら抗体がＲＡ診断において高感度及び高特異性を有することが証明された。実際に、３２２のＲＡ患者と３０７の対照（血液バンク）の固体群を使用し、９８％の特異性を維持して、３種のフィブリン/フィラグリン（ｆｂ/ｆ）キメラペプチド（ｐ１８、ｐ１９、ｐ２２）の感度はそれぞれ７２％、７８％及び７１％であった。これは商業用抗ＣＣＰ−２で観察されたもの（７４％）と類似した感度であった。興味深いことに、異なる抗体間の相関関係は非常に緊密であるが、それらには相当な不一致性（１３％から１５％の不調和血清）が存在する。このことは特異性（９６％から９７％）を維持しつつ、複数の抗体の判定が感度を向上させている（最高８１％）ことを示す。
【００７７】
事実、比較的に多数の患者が非調和値で観察された。１３．９％の患者はＣＣＰ−２抗体とｆｂ/ｆ抗キメラｐ−１８の陽性判定において不一致を有している。
【００７８】
【表１０】
2010526042.tif 000012
【００７９】
分析が抗ＣＣＰ−２とｆｂ/ｆキメラペプチドｐ１９及びｐ２２に対する抗体との間で実行されると、それぞれ１３．３％と１５．３％の不一致も観察される。３つのｆｂ/ｆキメラ抗体間でさえも不一致レベルは１３．９％であり、図１１で示すようにｆｂ/ｆキメラ抗体に対してはさらに多数の陽性判定不一致である血清が存在する。
【００８０】
【表１１】
2010526042.tif 000013
【実施例６】
【００８１】
異なる病気におけるシトルリン化ペプチド（ＣＣＰ−２及びｆｂ/ｆキメラ）に対する抗体の感度/特異性
後に、ＲＡ患者と血液バンクの対照群との間でＲＯＣ曲線を介して陽性を判定するためのカットオフポイントを使用して、３つの異なる研究における患者の血清が研究された。
１．全身性紅斑性エリテマトーデス（ＳＬＥ）：ｎ＝１１９
２．乾癬性関節炎：（ＰｓＡ）：ｎ＝１３３
３．慢性肝炎Ｃ型ウィルス（ＨＣＶ）：ｎ＝８４
【００８２】
異なる抗体の感度又は陽性判定はこれら３種の病気では非常に低い。これは表１２に従って、ＲＡの診断に使用された４種の抗体の特異性及びそれらの特異性の値を示している。表１２では、抗ＣＣＰ−２及びｆｂ/ｆ抗キメラｐ１８抗体の特異性に関するデータが示されている。
【００８３】
【表１２】
2010526042.tif 000014
【００８４】
表１２で確認できるように、抗ＣＣＰ−２及びキメラの両方で、乾癬性関節炎及び慢性肝炎Ｃ型ウイルスにおいて特異性は非常に高い（９７％から９８％）。偽陽性は非常に少ない。
【００８５】
従って、この異なる自己抗体の特異性研究で、自己免疫症状が観察される他の病気（全身性紅斑性エリテマトーデス、慢性Ｃ型肝炎）の場合、又はＲＡに類似した臨床症状（乾癬性関節炎）の場合には、ｆｂ/ｆ抗キメラ抗体が非常に特異的であることが明確に確認される。
【実施例７】
【００８６】
予後診断の重要性
この分析の目的は、ＲＡのヒトフィブリンドメイン由来シトルリン化抗体の予後診断値を分析し、それを次世代商業キット（ＣＣＰ−２、ユーロダイアグノスチカ社）による臨床検定で決定されたものと比較することであった。以上の本発明の説明で解説したように、さらに大きな感度/特異性バランスを有することを示したペプチドはｆｂ/ｆキメラｐ１８、ｐ１９及びｐ２２である。この理由で、それらペプチドは予後診断の重要性の研究に使用されてきた。
【００８７】
この分析を実行するため、１１８のＲＡ患者が２年以上にわたって研究された。抗リウマチ薬を使用した治療プロトコルはこの２年間にわたってモニターされた。この２年間のモニター終結時に関節破壊の程度（放射線プログレッション）が主測定因子として検査された。異なる臨床学的、生物学的及び免疫遺伝学的な変動要素が大きな関節破壊に関与していることを確認することは可能であった。それらのなかにはシトルリン化環状ペプチドに対する特異的抗体の存在が含まれていた。特に抗ＣＣＰ−２及びｆｂ/ｆキメラｐ１８抗体の場合には、ベースライン時におけるその存在は２年のモニター後にさらに大きな放射線性病変にさらに明確に関連していた。
【００８８】
しかし、これら抗ＣＣＰ−２には陰性であるが、抗キメラに対しては陽性である患者が、抗ＣＣＰに対する陽性に類似する関節破壊の程度を示し、これら抗体が追加の予後診断情報を提供していることに注目することは非常に重要である。
【００８９】
以下では、既に上記で解説した結論に到達するために得られたデータが提供されている。まず、分析された患者の異なる特徴が提供されている。
女性（％）                                    ８２．２
年齢（歳）±Ｓ．Ｄ．                          ５３．８±１５
病気期間（月）Ｘ±Ｓ．Ｄ．                    １０±６．７
ＥＡＶ痛み（ｍｍ）Ｘ±Ｓ．Ｄ．                ５０．６±２１
ＶＧＰａｔｉｅｎｔ（ｍｍ）Ｘ±Ｓ．Ｄ．        ５７．６±１５．８
ＶＧＭｅｄｉｕｍ（ｍｍ）Ｘ±Ｓ．Ｄ．          ５５．７±１４
ＮＡＤ２８、Ｘ±Ｓ．Ｄ．                      ９．８±５．５
ＮＡＩ２８、Ｘ±Ｓ．Ｄ．                      ８．１±４．２
ＤＡＳ２８、Ｘ±Ｓ．Ｄ．                      ５．７±０．９
ＤＡＳ２８＞５．１（％）                      ７５．４
ｍＨＡＱ、Ｘ±Ｓ．Ｄ．                        ０．９±０．５
ＶＳＧ（ｍｍ/ｈ）Ｘ±Ｓ．Ｄ．                ３９．７±２４．４
ＣＲＰ（ｍｍ/ｄＬ）Ｘ±Ｓ．Ｄ．              ２．８±２．３
ヘモグロビン（ｍｇ/ｄＬ）Ｘ±Ｓ．Ｄ．        １２．７±１．４
陽性リウマチ因子（＞２５Ｕ）                  ７３．７
陽性抗ＣＣＰ−２（＞５０Ｕ）（％）            ６９．７
リウマチエピトープ（％）                      ７２．５
ホモ接合リウマチエピトープ（％）              １９．３
ＨＬＡ−ＤＲＢ１−０４（％）                  ４４．５
【００９０】
このアッセイ（ｆｂ/ｆ抗キメラ）（ＥＬＩＳＡ）でシトルリン化合成キメラペプチドに対する特定抗体の検出に関して、キトルリナーゼ化合成キメラペプチドに対する特殊抗体の検出に関し、結果は以下の通りであった。
【００９１】
【表１３】
2010526042.tif 000015
【００９２】
表１４において、シトルリン化ペプチドに対する異なる特定自己抗体の存在又は不在に従った放射線損傷値（ベースライン時及び２年後）を観察することが可能である。
【００９３】
【表１４】
2010526042.tif 000016
【００９４】
関節破壊を予測するとき、異なる変動要素の予後診断値が評価され、破壊の進行の存在が列挙される。そのとき、モニター終了時（２４ヶ月）に４ポイント以上のラルセン値の増加がある（０ヶ月から２４ヶ月）この規準に従って判定すると、１１８の患者の３９（３３％）は関節破壊の進行があり、７９（６７％）にはなかった。
【００９５】
一方、シトルリン化キメラペプチド（抗キメラ）に対する３種の抗体の二変系分析は表１５に記載された結果をもたらした。
【００９６】
【表１５】
2010526042.tif 000017
【００９７】
これらの結果は、シトルリン化フィブリン／フィラグリンキメラペプチドに対する抗体を有した患者の割合が、そのような抗体を有しない患者の場合よりも放射線的進行を有する患者においては高いことが示した。さらに、陽性及び陰性である抗ＣＣＰ−２の患者（陽性及び陰性のｆｂ/ｆ抗キメラ）間の放射線的進行データが分析されたとき、実施例５で既に述べた結果に注意すれば、ＣＣＰ−２/−キメラ＋が、ＣＣＰ−２基ではなくＣＣＰ−２＋基（すなわち、さらに大きな放射線的進行）の振る舞いにどのように類似しているかが観察される。このことは、これら抗体の存在が、陰性抗ＣＣＰ２の患者においても大きな放射線的進行が存在すると判定することを示す。よって、本発明のキメラペプチドを利用した病気診断と予後診断の重要性が理解されよう。
【００９８】
従って、これらデータに基づいて、シトルリン化環状ペプチドに対する抗体、特に抗ＣＣＰ−２及びｆｂ/ｆキメラｐ１８抗体がどのように関節破壊に関与するか、並びにベースライン時においてその存在が２時間のモニター後にどのように増加した放射線疾患に関連するかを確認することができる。
【実施例８】
【００９９】
シトルリン化ペプチド及びＨＬＡＤＲＢ遺伝子型に対する抗体間の関連性の分析
表１６で、異なるＤＲＢ０４及びＤＲＢ０３対立遺伝子の頻度並びにシトルリン化ペプチドに対する特定抗体を有した患者のリウマチエピトープを観察することができる。
【０１００】
【表１６】
2010526042.tif 000018
【０１０１】
表１６はＤＲＢ０４と抗ＣＣＰ−２及びｆｂ/ｆキメラｐ１８抗体間の関連性を示している。
【図１】
2010526042.tif 000019
【図２】
2010526042.tif 000020
【図３Ａ】
2010526042.tif 000021
【図３Ｂ】
2010526042.tif 000022
【図４】
2010526042.tif 000023
【図５】
2010526042.tif 000024
【図６】
2010526042.tif 000025
【図７】
2010526042.tif 000026
【図８】
2010526042.tif 000027
【図９】
2010526042.tif 000028
【図１０】
2010526042.tif 000029
【図１１】
2010526042.tif 000030
【図１２】
2010526042.tif 000031
【図１３】
2010526042.tif 000032
【図１４】
2010526042.tif 000033
【図１５】
2010526042.tif 000034
【図１６】
2010526042.tif 000035
【図１７】
2010526042.tif 000036
【配列表】
2010526042000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月18日(2010.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合された少なくとも２種のシトルリン化ペプチドサブユニット（ａ）と（ｂ）を含んだキメラポリペプチドであって、サブユニット（ａ）はαフィブリンタンパク質又はβフィブリンタンパク質の少なくとも７個のアミノ酸の断片と少なくとも８５％の相同性を有しており、サブユニット（ｂ）は環状化されており、フィラグリンタンパク質の少なくとも７個のアミノ酸の断片と少なくとも８５％の相同性を有しており、前記キメラポリペプチドはリウマチ性関節炎の最中に発生する自己免疫抗体と相互作用できることを特徴とするキメラポリペプチド。
【請求項２】
サブユニット（ｂ）は両者間にジスルフィド架橋を形成する少なくとも２個のシステインアミノ酸を含んでいることを特徴とする請求項１記載のキメラポリペプチド。
【請求項３】
サブユニット（ｂ）はフィラグリンタンパク質の部位３０６と３２４との間を含んだ断片から得られることを特徴とする請求項１又は２記載のキメラポリペプチド。
【請求項４】
フィラグリンタンパク質の部位３０６と３２４との間を含む断片は配列ＳＱ  ＩＤ  ＮＯ：７であることを特徴とする請求項３記載のキメラポリペプチド。
【請求項５】
サブユニット（ｂ）は配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含んでいることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項６】
サブユニット（ａ）はαフィブリンタンパク質の以下の部位を含んだ断片から選択される断片から得られることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
ａ）１８５〜２０２
ｂ）２０８〜２２５
ｃ）４１８〜４３５
ｄ）５０１〜５１８、又は
ｅ）６１７〜６３１
【請求項７】
サブユニット（ａ）はαフィブリンタンパク質の部位６１７と６３１との間を含む断片から得られることを特徴とする請求項６記載のキメラポリペプチド。
【請求項８】
αフィブリンタンパク質の部位６１７と６３１との間を含む断片は配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８であることを特徴とする請求項７記載のキメラポリペプチド。
【請求項９】
サブユニット（ａ）はβフィブリンタンパク質の以下の部位を含んだ断片から選択される断片から得られることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
ａ）４０〜５７
ｂ）４３〜６２
ｃ）７２〜８９
ｄ）１５１〜１６８
ｅ）３６５〜３８３
ｆ）３６５〜３９０
ｇ）３６７〜３９６、又は
ｈ）３７３〜３９０
【請求項１０】
サブユニット（ａ）はβフィブリンタンパク質の部位４３と６２との間を含む断片から得られることを特徴とする請求項９記載のキメラポリペプチド。
【請求項１１】
βフィブリンタンパク質の部位４３と６２との間を含む断片は配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９であることを特徴とする請求項１０記載のキメラポリペプチド。
【請求項１２】
サブユニット（ａ）は以下の配列から選択される配列を含んでいることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、又は
ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５
【請求項１３】
サブユニット（ａ）は環式であることを特徴とする請求項１２記載のキメラポリペプチド。
【請求項１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であることを特徴とする請求項１又は２記載のキメラポリペプチド。
【請求項１５】
少なくとも１個の輸送分子でマーキングされているか共役されていることを特徴とする請求項１から１４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれかに記載のキメラポリペプチドを含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項１７】
ポリペプチドＣＣＰ−２をさらに含んでいることを特徴とする請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
生体サンプル内のリウマチ性関節炎の特定自己抗体を検出する方法であって、（ａ）請求項１から１５のいずれかに記載のキメラポリペプチド又は請求項１６又は１７記載の組成物の少なくとも１つと前記生体サンプルとを接触させるステップと、（ｂ）前記特定自己抗体とステップ（ａ）のキメラポリペプチド又は組成物との相互作用を検出するステップとを含んでいることを特徴とする方法。
【請求項１９】
生体サンプルは遺伝子型ＨＬＡＤＲＢの患者のものであることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
リウマチ性関節炎を病気診断又は予後診断するためのキットであって、請求項１から１５のいずれかに記載のキメラポリペプチドの少なくとも１種と、抗体−抗原複合体を形成させるのに必要な試薬及び/又は緩衝剤を含んでいることを特徴とするキット。
【請求項２１】
キメラポリペプチドＣＣＰ−２をさらに含んでいることを特徴とする請求項２０記載のキット。
【請求項２２】
リウマチ性関節炎を病気診断又は予後診断するためのキットであって、請求項１６又は１７記載の組成物と、抗体−抗原複合体を形成させるのに必要な試薬及び/又は緩衝剤を含んでいることを特徴とするキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明のこの特徴を有するさらに好適な実施例では、そこからサブユニット（ｂ）が得られるフィラグリン断片はそのタンパク質の部位３０６から３２４の間で成り、さらに好適な実施例では、フィラグリンの部位３０６から３２４の間の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】  図１は、フィブリンのβ鎖（断片４３〜６２）の“頭−尾”環状ペプチド（ｐ
３８ＨＴ）の固相合成の手法を表す図である。試薬及び条件：（ｉ）Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏｄｍａｂ  ＤＣＭ、ＤＩＰＣＤＩ、２０分間、０℃；（ｉｉ）ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＤＭＦ、３時間；（ｉｉｉ）固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）；（ｉｖ）２０％ピペリジン/ＤＭＦ；（ｖ）３％ヒドラジン/ＤＭＦ；（ｖｉ）２０％Ｈ２Ｏ/ＤＭＦ、１６時間；（ｖｉｉ）ＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノール；（ｖｉｉｉ）１％ＤＩＰＥＡ/ＤＭＦ；（ｉｘ）１％ＧＯＢｔ/ＤＭＦ；（ｘ）ＰｙＢＯＰ/ＤＭＦ、ＤＣＭ、７２時間；（ｘｉ）１％ＤＩＥＡ/ＤＭＦ；（ｘｉｉ）ＤＭＦ/ＭｅＯＨ；（ｘｉｉｉ）ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）/ＥＤＴＡ/ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）/Ｈ２Ｏ、３時間。Ｗ基、Ｘ基及びＺ基はペプチドの化学合成反応を導くのに使用される保護基である。
【図２】図２は、ジスルフィド架橋を有した環状ペプチドの固相ペプチド（ｐ３８ＳＳ）
の合成の手法を表す図である。試薬及び条件：（ｉ）ＳＰＰＳ；（ｉｉ）２０％ピペリジン/ＤＭＦ；（ｉｉｉ）ＴＦＡ/ＥＤＴ/ＴＩＳ/Ｈ２Ｏ、３時間；（ｉｖ）ｌ２/ＭｅＯＨ、６０分間、ｌ２/ＭｅＯＨ、９０分間；（ｖ）ＤＣＭ。Ｗ基、Ｘ基及びＺ基はペプチドの化学合成反応を導くのに使用される保護基である。
【図３】図３は、ペプチドｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｃの固相ペプチド合成の手法を表す図で
ある。試薬及び条件：（ａ）（ｉ）２０％ピペリジン/ＤＭＦ；（ｉｉ）ペプチドｃｆｃ１ｃｙｃのＳＰＰＳ；（ｉｉｉ）ＳＰＰＳ、ペプチドｐ１８の固相によるペプチド合成；（ｉｖ）２０％ピペリジン/ＤＭＦ；（ｖ）ＴＦＡ/ＴＩＳ/Ｈ２Ｏ；（ｖｉ）ｌ２/メタノール、６０分間及びＨ２Ｏ、９０分間；（ｖｉｉ）ＤＣＭ；（ｂ）試薬及び条件：（ｉ）２０％ピペリジン/ＤＭＦ；（ｉｉ）ペプチドｃｆｃ１ｃｙｃのＳＰＰＳ；（ｉｉｉ）ｌ２/メタノール/ＤＣＭ、４時間；（ｉｖ）ＤＭＦ/メタノール；（ｖ）ペプチドｐ１８のＳＰＰＳ；（ｖｉ）２０％ピペリジン/ＤＭＦ；（ｖｉｉ）ＴＦＡ/ＴＩＳ/Ｈ２Ｏ（９０：５：５）
【図４】図４は、ＲＡ患者からの３３血清のサンプルのα鎖及びβ鎖フィブリン由来のペ
プチドの吸光度（ＯＤ４９２）で測定した反応グラフである。
【図５】図５は、１１０ＲＡ血清サンプルのフィブリンのβ鎖由来のペプチド（ｐ３８）
並びに環状ペプチドｐ３８ＨＴ及びｐ３８ＳＳの吸光度（ＯＤ４９２）で測定した反応グラフである。
【図６】図６は、ＲＡ患者又は乾癬性関節炎（ＰｓＡ）患者群の自己抗体（Ｂ、Ｃ及びＤ
）に対するペプチドｐ２２、ｐ２２ｓｃ及びｐ２２ｌｃのＲＯＣ曲線（Ａ）と反応性の分析を示す。（Ａ）全ての可能なカットオフ値の感度と特異性は計算され、ＲＯＣ曲線（ｎ＝１１１  ＲＡ陽性患者、ｎ＝８２  ＰｓＡ陽性患者）として表された。グラフＢ、Ｃ及びＤは、それぞれのアッセイのＲＯＣ曲線による分析で得られた最良カットオフ値で表されるＲＡ患者及びＰｓＡ患者（対照）の抗体に対するペプチドｐ２２、２２ｓｃ及びｐ２２ｌｃの活性を示す。
【図７】図７は、ＲＡ患者又はＰｓＡ患者群のＲＯＣ曲線（Ａ）並びにβ―フィブリン（
ｐ３８）の直鎖ペプチドの抗体（Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）に対する活性、α―フィブリン（ｐ２２）の直鎖ペプチド、キメラポリペプチド（ｐ３８−ＧＧＧ−ｐ２２）及びペプチドｐ３８とｐ２２の混成物の分析を示す。（Ａ）全ての可能なカットオフ値の感度と特異性は計算され、ＲＯＣ曲線（ｎ＝１１１  ＲＡ陽性患者、ｎ＝８２  ＰｓＡ陽性患者）として表された。グラフＢ、Ｃ、Ｄ及びＥは、それぞれのアッセイのＲＯＣ曲線による分析で得られた最良カットオフ値で表されるＲＡ患者及びＰｓＡ患者（対照）の自己抗体に対するペプチドｐ３８、ｐ２２、ｐ３８−ＧＧＧ−ｐ２２及びｐ３８＋ｐ２２の活性を示す。
【図８】図８は、Ｒａ患者又はＰｓＡ患者群のＲＯＣ曲線と、フィラグリン（ｃｆｃ１ｃ
ｙｃ）由来の環状ペプチド（ペレスＴ他、ペプチド科学協会誌、２００６年版、１２（４）：２６７−２７８）及びキメラポリペプチド（ｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｌ）の活性の分析を示す。（Ａ）全可能なカットオフ値に対して感度と特異性が計算され、ＲＯＣ曲線（ｎ＝１１１  ＲＡ患者、ｎ＝８２  ＰｓＡ患者）として表された。（Ｂ）グラフＢとＣは、それぞれのアッセイのＲＯＣ曲線による分析から得られた最良カットオフ値で表されるＲＡ患者又はＰｓＡ患者（対照）の自己抗体に対するｃｆｃ１及びｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｃの活性を示す。
【図９】図９は、抗ペプチド抗体ｐ１８−ｃｆｃ１ｃｙｃ及び抗ＣＣＰ−２の適定濃度間
相関関係の分析を示す。
【図１０】図１０は、抗ＣＣＰ−２のＲＯＣ曲線を示す。
【図１１】図１１は、フィブリン/フィラグリン抗キメラｐ−１８のＲＯＣ曲線を示す。
【図１２】図１２は、フィブリン/フィラグリン抗キメラｐ−１９のＲＯＣ曲線を示す。
【図１３】図１３は、フィブリン/フィラグリン抗キメラｐ−２２のＲＯＣ曲線を示す。
【図１４】図１４は、ＣＣＰ−２（＋）と（−）の患者間モニタリングを通じたＣ反応性
タンパク質（ＣＲＰ）の値の変化を示す
【図１５】図１５は、ＣＣＰ−２（＋）と（−）の患者間モニタリングを通じたＤＡＳ２
８活性インデックスの変化を示す。
【図１６】図１６は、抗ｐ１８（＋）と（−）抗キメラの患者間モニタリングを通じたＣ
反応性タンパク質（ＣＲＰ）値の変化を示す。
【図１７】図１７は、抗ｐ１８（＋）と（−）抗キメラの患者間モニタリングを通じたＤ
ＡＳ２８活性インデックスの変化を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010526042000001.app
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ａ】
2010526042.tif 000037
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ｂ】
2010526042.tif 000038
【国際調査報告】
2010526042.tif 000039
2010526042.tif 000040
2010526042.tif 000041
2010526042.tif 000042
2010526042.tif 000043
2010526042.tif 000044
2010526042.tif 000045
2010526042.tif 000046
2010526042.tif 000047