(57)【要約】本発明は、最近発見されたマクロファージ特異的受容体ＣＲＩｇに特異的に結合する遮断抗体、並びにウイルス、細菌、寄生生物などの細胞内病原体の細胞侵入の阻止及び赤血球及び血小板の望ましくないクリアランスの防止のためのその使用に関する。一態様において、本発明は、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドのＣ３ｂ及び／又はｉＣ３ｂとの結合を遮断し、並びに細胞内病原体のＣＲＩｇ媒介補体依存性細胞侵入を阻害し、又は血液循環から細胞内病原体を除去するＣＲＩｇアンタゴニストに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然配列ＣＲＩｇポリペプチドのＣ３ｂ及び／又はｉＣ３ｂとの結合を遮断し、並びに細胞内病原体のＣＲＩｇ媒介補体依存性細胞侵入を阻害し、又は血液循環から細胞内病原体を除去するＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項２】
抗ＣＲＩｇ抗体又はその断片である請求項１に記載のＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項３】
モノクロナール抗体又はその断片である請求項２に記載のＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項４】
該抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ＳｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、および抗体断片から形成した多特異性抗体からなる群から選ばれる請求項３に記載のＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項５】
１４Ｇ８（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２９８）、３Ｄ１０（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２９９）及び２Ｈ１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８３００）又はこれらの断片からなる群から選ばれる抗ＣＲＩｇ抗体と同じエピトープに基本的に結合するモノクロナール抗体である請求項３に記載のＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項６】
１４Ｇ８（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２９８）、３Ｄ１０（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２９９）及び２Ｈ１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８３００）又はこれらの断片からなる群から選ばれるモノクロナール抗ＣＲＩｇ抗体である請求項３に記載のＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項７】
前記抗体がキメラ型、ヒト化型もしくはヒト型又はこれらの断片である請求項３に記載のＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項８】
前記抗体がヒト化型抗体又はその断片である請求項７に記載のＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項９】
前記細胞内病原体がウイルス、寄生生物、細菌、真菌及びプリオンからなる群から選ばれる請求項１に記載のＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項１０】
前記病原体がＲＮＡ又はＤＮＡウイルスである請求項９に記載のＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項１１】
前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ、Ｂ及びＣ型肝炎ウイルス、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ）ならびにヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）からなる群から選ばれる請求項１０に記載のＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項１２】
前記病原体が寄生生物である請求項９に記載のＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項１３】
前記病原体が細菌である請求項９に記載のＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項１４】
前記病原体が真菌である請求項９に記載のＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項１５】
前記病原体がプリオンである請求項９に記載のＣＲＩｇアンタゴニスト。
【請求項１６】
請求項３に記載の抗体をコードする核酸又はその断片。
【請求項１７】
担体と混合された請求項１又は請求項３に記載のＣＲＩｇアンタゴニストを含む組成物。
【請求項１８】
医薬組成物である請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
細胞内病原体のＣＲＩｇ媒介補体依存性細胞侵入を阻害する方法であって、有効量のＣＲＩｇアンタゴニストを必要とする哺乳動物の対象に投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物の対象がヒトである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＲＩｇアンタゴニストが抗ＣＲＩｇ抗体又はその断片である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物の対象の血液循環から細胞内病原体を除去する方法であって、有効量のＣＲＩｇアンタゴニストを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物の対象がヒトである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＲＩｇアンタゴニストが抗ＣＲＩｇ抗体又はその断片である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
感染症の予防又は治療のための方法であって、有効量のＣＲＩｇアンタゴニストを必要とする哺乳動物の対象に投与することを含む方法。
【請求項２６】
前記ＣＲＩｇアンタゴニストが抗ＣＲＩｇ抗体又はその断片である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＲＩｇアンタゴニストと前記ＣＲＩｇアンタゴニストを投与して感染症を治療するための使用説明書とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、最近発見されたマクロファージ特異的受容体ＣＲＩｇに特異的に結合する遮断抗体、並びにウイルス、細菌、寄生生物などの細胞内病原体の細胞侵入の阻止及び赤血球及び血小板の望ましくないクリアランスの防止のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体系
補体系は、通常は不活性な酵素前駆体として存在する一連の血清糖蛋白質から構成される複雑な酵素カスケードである。２つの主要経路、古典的経路と代替経路がＣ３のレベルで融合している補体を活性化することができ、そこでは２種の類似のＣ３コンバターゼがＣ３をＣ３ａとＣ３ｂとに開裂させる。
【０００３】
マクロファージは、細胞表面に発現された識別タグ、いわゆる分子パターンの構造の微妙な相違を認識する生得の能力を発達させた専門細胞である（Ｔａｙｌｏｒほか、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３３：ｐ．２０９０−２０９７（２００３年）；Ｔａｙｌｏｒほか、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：ｐ．９０１−９４４（２００５年））。こうした表面構造の直接的な認識は先天性免疫の基本的な側面であるが、オプソニン作用によって一般的なマクロファージ受容体が貪食を媒介することが可能となり、その結果その効率が増し、この食細胞の認識レパートリーが多様化する（Ｓｔｕａｒｔ及びＥｚｅｋｏｗｉｔｚ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２：ｐ．５３９−５５０（２００５年））。貪食の過程は複数のリガンド−受容体相互作用を必要とし、現在、種々のオプソニン（免疫グロブリン、コレクチン及び補体成分を含む）がマクロファージ細胞表面の受容体との相互作用を介した病原体のインターナリゼーションに必要な細胞活性を誘導することが明らかになっている（Ａｄｅｒｅｍ及びＵｎｄｅｒｈｉｌｌ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７：ｐ．５９３−６２３（１９９９年）；Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ及びＯｚｉｎｓｋｙ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０：８２５−８５２（２００２年）に概説されている）。生殖細胞遺伝子によってコードされている天然の免疫グロブリンは多種多様な病原体を認識することができるが、オプソニン化ＩｇＧの大部分は適応免疫によって生じ、従って、Ｆｃ受容体を介した効率的なクリアランスは迅速ではない（Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５：ｐ．９８１−９８６（２００４年））。一方、補体は病原体表面の分子を迅速に認識して補体受容体による取り込みのための粒子を用意する（Ｂｒｏｗｎ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ａｇｉｅｎｔｓ  Ｄｉｓ．  １：ｐ．６３−７０（１９９１年））。
【０００４】
補体は、多種多様な病原体を補体受容体による認識のためにオプソニン化する３０種を超える血清蛋白質からなる。上記カスケードの最初の引き金によって、３つの経路を区別することができる（Ｗａｌｐｏｒｔ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．  ３４４：ｐ．１０５８−１０６６（２００１年）に概説されている）。これらの３経路は全て中心性成分Ｃ３を活性化する共通の段階を備えているが、認識の内容及びＣ３活性化をもたらす最初の生化学的段階によってこれらは異なる。古典的経路は病原体表面に結合した抗体によって活性化され、こうした抗体はＣＩｑ補体成分と結合し、その結果、最終的にＣ３をその活性型Ｃ３ｂに開裂するセリンプロテアーゼカスケードが作動する。レクチン経路は、レクチン蛋白質により炭水化物モチーフが認識された後に活性化される。現在に至るまで、この経路の３構成物質、即ち、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ：ｍａｎｎｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｅｃｔｉｎｓ）、ＳＩＧＮ−Ｒｌファミリーのレクチン及びフィコリンが同定されている（Ｐｙｚほか、Ａｎｎ．Ｍｅｄ．  ３８：ｐ．２４２−２５１（２００６年））。ＭＢＬ及びフィコリンはセリンプロテアーゼと関係があり、このプロテアーゼが古典的経路でＣ１のように働き、中心的Ｃ３段階に導くＣ２成分及びＣ４成分が活性化される。代替経路は、内部Ｃ３エステルと病原体表面の認識モチーフとの直接反応によって活性化される点で、古典的経路及びレクチン経路と異なる。活性化表面への最初のＣ３結合によって、代替経路プロテアーゼＢ因子及びＤ因子の作用によるＣ３ｂ沈着の速やかな拡大がもたらされる。重要なことは、古典的経路又はレクチン経路により沈着したＣ３ｂがＢ因子及びＤ因子の作用によるＣ３ｂ沈着の拡大をもたらすこともできることである。補体活性化の３経路全てにおいて、オプソニン化の極めて重要な段階はＣ３成分のＣ３ｂ成分への変換である。これらの補体カスケードの酵素によってＣ３が開裂されると、そのチオエステルが求核攻撃に曝され、その結果、Ｃ３ｂがそのチオエステルドメインを介して抗原表面に共有結合することが可能となる。これは補体オプソニン化の最初の段階である。その後、この結合Ｃ３ｂが蛋白分解されて、異なる受容体によって認識されるｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ及びＣ３ｄｇ断片が生じる（Ｒｏｓｓ及びＭｅｄｏｆ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３７：ｐ．２１７−２６７（１９８５年））。この開裂によって、Ｃ３ｂ沈着をさらに拡大し、膜に直接損傷を与えることができる細胞膜傷害複合体を初めとする補体カスケードの後期成分（ｌａｔｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）を活性化するＣ３ｂの能力が消失する。しかしながら、マクロファージ貪食受容体はＣ３ｂ及びその断片を選択的に認識し、従って、エステル結合の多用性のためもあり、Ｃ３媒介オプソニン化は病原体認識の要となり（Ｈｏｌｅｒｓほか、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １３：ｐ．２３１−２３６（１９９２年））、このため、各種Ｃ３分解産物の受容体は宿主免疫反応において重要な役割を果たす。
【０００５】
Ｃ３自体は、１３個の異なるドメインからなる複雑で柔軟な蛋白質である。この分子のコアは８個のいわゆるマクログロブリン（ＭＧ：  ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）ドメインから構成され、これらのドメインはＣ３の密に詰め込まれたα及びβ鎖を構成している。この構造に挿入されているのはＣＵＢ（Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ、Ｕｅｇｆ及び骨形成蛋白質−１）及びＴＥＤドメインであり、後者は病原体表面とＣ３ｂとを共有結合させるチオエーテル結合を含んでいる。残余のドメインはＣ３ａを含有し、又はコアドメインのリンカー及びスペーサの役目をする。Ｃ３ｂ及びＣ３ｃ構造をＣ３と比較すると、この分子は各蛋白質分解を伴う大幅な立体配座転位を受け、この分解によってＴＥＤのみならず、細胞受容体と相互作用することができるこの分子の別の新たな表面が露出されることが分かる（Ｊａｎｓｓｅｎ及びＧｒｏｓ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４４：ｐ．３−１０（２００７年））。
【０００６】
貪食細胞の補体Ｃ３受容体
補体受容体には３つの遺伝子スーパーファミリー、即ち、ＣＲ１及びＣＲ２をコードする短コンセンサスリピート（ＳＣＲ：ｓｈｏｒｔ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｅｐｅａｔ）モジュール、ベータ−２インテグリンファミリーメンバーＣＲ３及びＣＲ４並びに免疫グロブリンＩｇ−スーパーファミリーメンバーＣＲＩｇの存在が知られている。
【０００７】
ＣＲ１は３０の短コンセンサスリピート（ＳＣＲ）からなる１８０乃至２１０ｋＤａの糖蛋白質であり、免疫複合体のクリアランスにおいて主要な役割を果たしている。ＳＣＲは構造の剛性をもたらす２対のジスルフィド結合をそれぞれ含む約６０個のアミノ酸のモジュール構造である。３つのＳＣＲでそれぞれ構成される２つの異なる部位を介してＣ３ｂ及びＣ４ｂの両者への高親和性結合が生じる（Ｋｒｙｃｈ−Ｇｏｌｄｂｅｒｇ及びＡｔｋｉｎｓｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．  １８０：ｐ．１１２−１２２（２００１年））。ＣＲ１のＳＣＲ１５乃至１７（部位２）内に含まれるＣ３ｂ結合部位の構造はＭＲＩによって決定されており（Ｓｍｉｔｈほか、Ｃｅｌｌ  １０８：ｐ．７６９−７８０（２００２年））、その結果、これらの３つのモジュールは接合部１６乃至１７に屈曲性を有する頭−尾配置で伸びていることが明らかになっている。構造誘導変異誘発によって、Ｃ４ｂ結合に重要なモジュール１５の正荷電表面領域が特定された。この部位（ｐａｔｃｈ）は、ＣＲ１の同じ面に露出されたモジュール１６の塩基性側鎖と共に、Ｃ３ｂ結合に必要である。最初免疫粘着受容体（ｉｍｍｕｎｅ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と呼ばれた（Ｒｏｔｈｍａｎほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１５：ｐ．１３１２−１３１５（１９７５年））ＣＲ１の主要な機能は、輸送及び肝臓によるクリアランスのための赤血球の表面のＩＣを捕捉することにある（Ｔａｙｌｏｒ、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  ８２：ｐ．４９−５９（１９９７年））。好中球のＣＲ１には貪食における役割があるが、組織マクロファージにはない（Ｓｅｎｇｅｌｏｖほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５３：ｐ．８０４−８１０（１９９４年））。免疫複合体のクリアランスにおける役割の他に、ＣＲ１は古典的及び代替経路活性化に対する、それぞれのコンバターゼとの相互作用を介する阻害因子である（Ｋｒｙｃｈ−Ｇｏｌｄｂｅｒｇ及びＡｔｋｉｎｓｏｎ、２００１年、上記文献；Ｋｒｙｃｈ−Ｇｏｌｄｂｅｒｇほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７４：ｐ．３１１６０−３１１６８（１９９９年））。マウスでは、ＣＲ１及びＣＲ２は選択的スプライシングにより形成された同じ遺伝子の２つの産物であり、主としてＢリンパ球及び小胞樹状突起細胞と関係があり、主にＢ細胞反応の調節において機能している（Ｍｏｌｉｎａほか、１９９６年）。マウスにおけるＣＲ１の機能的等価体であるＣｒｒｙは古典的及び代替経路の酵素を不活性化し、貪食受容体としてではなく、補体活性化の内因性調節因子として働く（Ｍｏｌｉｎａほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：ｐ．３３５７−３３６１（１９９２年））。
【０００８】
ＣＲ２（ＣＤ２１）はｉＣ３ｂ及びＣ３ｄｇを結合し、Ｂ細胞免疫を増強する主要補体受容体である（Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５：ｐ．９８１−９８６（２００４年）；Ｗｅｉｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：ｐ．８８１−８８５（１９８４年））。同族Ｂ細胞によってＣ３ｄ被覆抗原が取り込まれると、Ｂ細胞抗原受容体を介したシグナルが増強される。従って、Ｂ細胞抗原受容体とＣＤ２１−ＣＤ１９−ＣＤ８１補助受容体とのコエンゲージメントはＢ細胞活性化の閾値を低下させ、重要な生存シグナルをもたらす（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １７３：ｐ．５５−６４（１９９１年））。ｉＣ３ｂのＣＲ２結合部位はＴＥＤドメインとＭＧ１ドメインとの間の界面で部分的にマッピングされている（Ｃｌｅｍｅｎｚａ及びＩｓｅｎｍａｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５：ｐ．３８３９−３８４８（２０００年））。
【０００９】
ＣＲ３及びＣＲ４はアルファサブユニット（それぞれ、ＣＤ１１ｂもしくはαＭ及びＣＤ１１ｃもしくはαＸ）並びに共通ベータ鎖（ＣＤ１８もしくはβ２）から構成される膜貫通ヘテロ二量体であり、細胞外マトリックス及び他の細胞への接着並びにｉＣ３ｂの認識に関与している。これらはインテグリンファミリーに属し、貪食ばかりでなく、白血球の輸送及び遊走、シナプス形成並びに共刺激においても機能している（Ｒｏｓｓ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３７：ｐ．２１７−２６７（２０００年）に概説されている）。インテグリンの接着性は、細胞の中からのシグナル伝達（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と呼ばれる過程によって調節されており、その結果、これらのインテグリンは低親和性結合状態から高親和性結合状態に変わる（Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｎ及びＧｉｎｓｂｅｒｇ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １５８：ｐ．８３３−８３９（２００２年））。さらに、リガンドが結合すると、シグナルが細胞外ドメインから細胞質へ伝達される。ｉＣ３ｂの結合部位はＣＲ３及びＣＲ４のアルファ鎖のいくつかのドメインにマッピングされている（Ｄｉａｍｏｎｄほか、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １２０：ｐ．１０３１−１０４３（１９９３年）；Ｌｉ及びＺｈａｎｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７８：ｐ．３４３９５−３４４０２（２００３年）；Ｘｉｏｎｇ及びＺｈａｎｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７８：ｐ．３４３９５−３４４０２（２００１年））。ＣＲ３の複数のリガンド、即ち、ｉＣ３ｂ、ベータ−グルカン及びＩＣＡＭ−１はＣＤ１１ｂのＩドメイン内に含まれる部分的に重複する部位に結合するように思われる（Ｂａｌｓａｍほか、１９９８年；Ｄｉａｍｏｎｄほか、１９９０年；Ｚｈａｎｇ及びＰｌｏｗ、１９９６年）。Ｃ３ｂが蛋白質分解により不活性化された形態であるｉＣ３ｂに対するその特異的な認識は、補体調節プロテアーゼのファクターＩによるα’鎖開裂の際に生じるＣ３ｂ中のＣＵＢドメインの変性の際、露出されるようになる残基にＣＲ３結合部位を位置付けた構造研究から予測される（Ｎｉｓｈｉｄａほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：ｐ．１９７３７−１９７４２（２００６年））。
【００１０】
ＣＲＩｇは、Ａ３３抗原及びＪＡＭ１と相同性を有する新規なマクロファージ関連受容体である。ヒトＣＲＩｇ蛋白質は、ヒトＪＡＭ１の保存Ｉｇドメインを認識する縮重プライマーを用いてヒト胎児ｃＤＮＡライブラリから初めてクローニングされた。数種のクローンの配列決定により、４００アミノ酸のオープンリーディングフレームが明らかになった。Ｂｌａｓｔ検索によって、１型膜貫通蛋白質Ｚ３９Ｉｇとの類似性が裏付けられた（Ｌａｎｇｎａｅｓｅほか、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４９２（２０００年）ｐ．５２２−５２５）。この分子の細胞外領域は、Ｎ末端Ｖセットドメイン及びＣ末端Ｃ２セットドメインを含む２つのＩｇ様ドメインからなることが分かった。この新規なヒト蛋白質は、最初は「単一膜貫通型Ｉｇスーパーファミリーメンバーのマクロファージ関連」（ｈｕＳＴＩｇＭＡ：ｓｉｎｇｌｅ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）と命名された。（ｈｕＳＴＩｇＭＡ）。その後、３’及び５’プライマーを用いて、膜貫通部位に隣接したＩｇＣドメインを欠損し、５０アミノ酸短いｈｕＳＴＩｇＭＡのスプライス変異体がクローニングされた。従って、このヒト蛋白質の短いスプライス変異体はｈｕＳＴＩｇＭＡｓｈｏｒｔと命名された。ｈｕＳＴＩｇＭＡ（ＰＲＯ３６２と称する）のアミノ酸配列及びこれをコードするポリヌクレオチド配列は２００２年６月２５日発行の特許文献１に開示されている。さらに、ｈｕＳＴＩｇＭＡ及びｈｕＳＴＩｇＭＡｓｈｏｒｔが、マウスのＳＴＩｇＭＡ（ｍｕＳＴＩｇＭＡ）蛋白質及び核酸配列と共に、２００４年４月１５日公開の特許文献２に開示されている。
【００１１】
肝洞様毛細血管の管腔内に存在するクップファー細胞（ＫＣ）は体内で最大のマクロファージ集団を形成する。ＫＣは他の組織に存在するマクロファージと共通のマーカを有するが、これは、消化管の微小血管系から流出する門脈血に存在する腸管由来の細菌、微生物残骸、細菌内毒素、免疫複合体及び死細胞の効率的クリアランスを対象とする特殊化した機能を行っている（Ｂｉｌｚｅｒほか、Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｔ．  ２６：ｐ．１１７５−１１８６（２００６年））。ＫＣ表面に病原体を効率的に結合することは、病原体に対する一次免疫防御において重要な段階である（Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １１０：ｐ．２７−４８（１９５９年））。血中からの病原体の迅速なクリアランスにＫＣが中心的な役割を果たすことは、ＫＣを枯渇させたマウスにおいて死亡率が有意に増加することが物語っている（Ｈｉｒａｋａｔａ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ５９：ｐ．２８９−２９４（１９９１年））。さらに、ＣＲＩｇが同定されたことによって、血中病原体に対する一次免疫防御における補体及びＫＣの役割の重要性が強調されている。
【００１２】
マウスのＫＣで同定された補体Ｃ３受容体はＣＲＩｇ及びＣＲ３のみである（Ｈｅｌｍｙほか、Ｃｅｌｌ  １２４：ｐ．９１５−９２７（２００６年））が、ヒトのＫＣはさらにＣＲ１及びＣＲ４の発現を示す（Ｈｉｎｇｌａｉｓほか、１９８９年）。ＫＣのＣＲＩｇ及びＣＲ３はいずれも、インビトロにおいてｉＣ３ｂによりオプソニン化された粒子への結合に寄与する（Ｈｅｌｍｙほか、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．  ６１：ｐ．５０９−５１４（２００６年））。インビボでは、ｉＣ３ｂ被覆病原体への結合におけるＫＣ発現ＣＲ３の役割はあまりよく分かっていない。ＣＲ３は、好中球の動員及び好中球発現のＩＣＡＭ１との相互作用を介して間接的に病原体のクリアランスに寄与すると提唱されている（Ｃｏｎｌａｎ及びＮｏｒｔｈ、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １７９：ｐ．２５９−２６８（１９９４年）；Ｅｂｅほか、Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．  ４９：ｐ．５１９−５３２（１９９９年）；Ｇｒｅｇｏｒｙ  ほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５７：ｐ．２５１４−２５２０（１９９６年）；Ｇｒｅｇｏｒｙ及びＷｉｎｇ、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．  ７２：ｐ．２３９−２４８（２００２年）；Ｒｏｇｅｒｓ及びＵｎａｎｕｅ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ６１：ｐ．５０９０−５０９６（１９９３年））。これに対して、ＣＲＩｇは、肝洞様毛細血管の管腔を通過する病原体を捕捉することにより直接的な役割を果たしている（Ｈｅｌｍｙほか、２００６年、上記文献）。ＣＲ３に対するＣＲＩｇの生物学における差違はこれらの２種の受容体の結合特性の差違によってある程度反映されている。ＫＣ表面に発現されるＣＲＩｇは単量体のＣ３断片に構成的に結合するのに対して、ＣＲ３はｉＣ３ｂによりオプソニン化された粒子に結合するのに過ぎない（Ｈｅｌｍｙほか、２００６、上記文献）。単量体Ｃ３ｂ及びｉＣ３ｂ並びにＣ３ｂ／ｉＣ３ｂ被覆粒子を効率的に捕捉するＣＲＩｇの能力は、マクロファージの伸長膜の先端に集中したＣＲＩｇ分子（Ｈｅｌｍｙほか、２００６、上記文献）と病原体表面に存在するＣ３ｂ及びｉＣ３ｂの多量体との多価相互作用により生じる結合活性の増加を反映している。ＣＲ３はｉＣ３ｂ被覆粒子を結合するのに過ぎないが、ＣＲＩｇは、血清によりオプソニン化された病原体の表面に形成される最初のＣ３開裂産物であるＣ３ｂにさらに結合する（Ｃｒｏｉｚｅほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ６１：ｐ．５１３４−５１３９（１９９３年））。病原体表面に結合した多数のＣ３ｂ分子はＨ及びＩ因子による開裂から保護される（Ｇｏｒｄｏｎほか、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．  １５７：ｐ．６９７−７０４（１９８８年））ので、ＣＲＩｇによりＣ３ｂリガンドが認識されると、迅速な結合及びクリアランスが確実なものとなる。従って、ＫＣの表面にはＣＲＩｇ及びＣＲ３のいずれもが発現されるが、これらは異なるリガンド特異性、異なる結合特性及び異なる病原体クリアランス速度を示す。
【００１３】
細胞に侵入するために細胞表面受容体を利用する病原体の例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）のようなウイルス、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＬｉｓｔｅｒｉａ  Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのような細胞内細菌並びにｐｒｏｓｔｉｇｍａｔｏｉｄ  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒのような寄生生物がある（Ｃｏｓｓａｒｔ及びＳａｎｓｏｎｅｔｔｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：ｐ．２４２−２４８（２００４年）；Ｇａｌａｎ、Ｃｅｌｌ  １０３：ｐ．３６３−３６６（２０００年）；Ｈｏｒｎｅｆほか、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３：ｐ．１０３３−１０４０（２００２年）；Ｓｔｏｉｂｅｒほか、ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４２：ｐ．１５３−１６０（２００５年））。補体系は病原体を殺し、貪食を促進するようになっているが、これは、まだ知られていない補体受容体による病原体の細胞侵入をも媒介している。ＣＲＩｇは、細胞内病原体の補体依存性細胞侵入を媒介する受容体類の１つとなっていると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６，４１０，７０８号明細書
【特許文献２】国際公開第２００４／０３１１０５号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、Ｃ３オプソニン化病原体の細胞表面への結合を遮断する抗ＣＲＩｇ抗体並びにそのような病原体の細胞侵入を防止し、及び／又は生存を阻止するためのその使用に関する。
【００１６】
一態様において、本発明は、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドのＣ３ｂ及び／又はｉＣ３ｂとの結合を遮断し、並びに細胞内病原体のＣＲＩｇ媒介補体依存性細胞侵入を阻害し、又は血液循環から細胞内病原体を除去するＣＲＩｇアンタゴニストに関する。
【００１７】
一実施態様において、このアンタゴニストは抗ＣＲＩｇ抗体又はその断片であり、この場合、この抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ＳｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ及び抗体断片から形成した多特異性抗体からなる群から選ぶことができる。
【００１８】
別の実施態様において、上記ＣＲＩｇアンタゴニストは、１４Ｇ８（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２９８）、３Ｄ１０（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２９９）及び２Ｈ１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８３００）又はこれらの断片からなる群から選ばれる抗ＣＲＩｇ抗体と同じエピトープに基本的に結合するモノクロナール抗体である。
【００１９】
さらに別の実施態様において、上記ＣＲＩｇアンタゴニストは、１４Ｇ８（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２９８）、３Ｄ１０（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２９９）及び２Ｈ１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８３００）又はこれらの断片からなる群から選ばれるモノクロナール抗ＣＲＩｇ抗体である。
【００２０】
全ての実施態様において、上記抗体又は抗体断片はキメラ型、ヒト化型又はヒト型とすることができる。
【００２１】
全ての実施態様において、上記細胞内病原体は、ウイルス、寄生生物、細菌、真菌及びプリオンからなる群から選ぶことができる。
【００２２】
別の態様において、本発明は、本明細書の遮断抗ＣＲＩｇ抗体をコードする核酸又はその断片に関する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、担体と混合されたＣＲＩｇアンタゴニストを含む組成物に関する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、細胞内病原体のＣＲＩｇ媒介補体依存性細胞侵入を阻害する方法であって、有効量のＣＲＩｇアンタゴニストを必要とする哺乳動物の対象に投与することを含む方法に関する。
【００２５】
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物の対象の血液循環から細胞内病原体を除去する方法であって、有効量のＣＲＩｇアンタゴニストをこの対象に投与することを含む方法に関する。
【００２６】
別の態様において、本発明は、感染症の予防又は治療の方法であって、有効量のＣＲＩｇアンタゴニストを必要とする哺乳動物の対象に投与することを含む方法に関する。
【００２７】
全ての態様において、上記哺乳動物の対象はヒトであることが好ましく、上記ＣＲＩｇアンタゴニストは遮断抗ＣＲＩｇ抗体であることが好ましい。
【００２８】
別の態様において、本発明は、ＣＲＩｇアンタゴニストとこのＣＲＩｇアンタゴニストを投与して感染症を治療するための使用説明書とを含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】３９９−アミノ酸完全長長鎖型天然ヒトＣＲＩｇのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（ｈｕＣＲＩｇ、それぞれ配列番号１及び２）を示す図である。
【図２Ａ】３０５−アミノ酸短鎖型天然ヒトＣＲＩｇのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ、それぞれ配列番号３及び４）を示す図である。
【図２Ｂ】３０５−アミノ酸短鎖型天然ヒトＣＲＩｇのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ、それぞれ配列番号３及び４）を示す図である。
【図３Ａ】２８０−アミノ酸天然マウスＣＲＩｇのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（ｍｕＣＲＩｇ、それぞれ配列番号５及び６）を示す図である。
【図３Ｂ】２８０−アミノ酸天然マウスＣＲＩｇのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（ｍｕＣＲＩｇ、それぞれ配列番号５及び６）を示す図である。
【図３Ｃ】２８０−アミノ酸天然マウスＣＲＩｇのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（ｍｕＣＲＩｇ、それぞれ配列番号５及び６）を示す図である。
【図４】ｍｕＣＲＩｇ−ｉＣ３ｂ／Ｃ３ｂ結合の遮断能に関するハイブリドーマ上清の特性を示す図である。
【図５】ｈｕＣＲＩｇ−ｉＣ３ｂ／Ｃ３ｂ結合の遮断能に関するハイブリドーマ上清の特性を示す図である。
【図６】マウスＣＲＩｇ発現ＣＨＯ細胞へのｉＣ３ｂ結合の抗ＣＲＩｇ抗体２Ｈ１及び１４Ｇ８による遮断を示す図である。
【図７】ＣＲＩｇ＋腹膜マクロファージへのｉＣ３ｂの結合の抗ＣＲＩｇ抗体２Ｈ１による遮断を示す図である。
【図８】インビトロにおけるＣＲＩｇ＋腹膜マクロファージへのＬｉｓｔｅｒｉａ  Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの結合の抗ＣＲＩｇ抗体２Ｈ１による阻害を示す図である。
【図９】血液循環からのＬｉｓｔｅｒｉａ  ＭｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのクリアランスのＣＲＩｇ抗体１４Ｇ８による阻害を示す図である。
【図１０】血液循環からのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｔｒａｉｎＭのクリアランスの抗ＣＲＩｇ抗体１４Ｇ８による阻害によりもたらされる肝臓の細菌負荷の低下及び心臓、脾臓及び腎臓の細菌負荷の増大を示す図である。
【図１１Ａ】抗原誘発関節炎（ＡＩＡ）における抗ＣＲＩｇ抗体１４Ｇ８の役割を示す図である。
【図１１Ｂ】抗原誘発関節炎（ＡＩＡ）における抗ＣＲＩｇ抗体１４Ｇ８の役割を示す図である。
【図１２】ＣＲＩｇ発現細胞への抗ＣＲＩｇ抗体３Ｄ１０の結合を示す図である。
【図１３−１】ヒト及びマウスＣＲＩｇを発現する細胞へのｉＣ３ｂ結合の抗ＣＲＩｇ抗体３Ｄ１０による遮断を示す図である。
【図１３−２】表１は、抗ＣＲＩｇ抗体３Ｄ１０、２Ｈ１及び１４Ｇ８の特性をまとめた表である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
Ｉ．定義
「ＣＲＩｇ」、「ＰＲＯ３６２」、「ＪＡＭ４」及び「ＳＴＩｇＭＡ」という用語は同じ意味で用いており、天然配列及び変異体ＣＲＩｇポリペプチドのことをいう。
【００３１】
「天然配列」ＣＲＩｇとは、その調製方法に無関係に、天然由来のＣＲＩｇポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。従って、天然配列ＣＲＩｇは天然から単離してもよく、組み換え及び／又は合成手段によって作製してもよい。「天然配列ＣＲＩｇ」という用語は、具体的には、天然の切断型もしくは分泌型のＣＲＩｇ（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然の変異体型（例えば、選択的スプライス型）及びＣＲＩｇの天然の対立遺伝子変異体を包含する。天然配列ＣＲＩｇポリペプチドとしては、具体的には、配列番号２の完全長の３９９アミノ酸長ヒトＣＲＩｇポリペプチド（図１Ａ−１Ｂに示したｈｕＣＲＩｇ）であって、Ｎ末端シグナル配列を含むか含まないもの、１位に開始メチオニンを含むか含まないもの、かつ、配列番号２の約２７７乃至３０７番目アミノ酸に膜貫通ドメインの一部もしくは全部を含むか含まないものが挙げられる。別の実施態様において、上記天然配列ＣＲＩｇポリペプチドは、アミノ酸３０５個の短鎖型ヒトＣＲＩｇ（図２Ａ及び２Ｂに示した配列番号４のｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ）であって、Ｎ末端シグナル配列を含むか含まないもの、１位に開始メチオニンを含むか含まないもの、かつ、配列番号４の約１８３乃至２１３番目アミノ酸に膜貫通ドメインの一部もしくは全部を含むか含まないものである。別の実施態様において、上記天然配列ＣＲＩｇポリペプチドは、配列番号６の２８０アミノ酸長の完全長マウスＣＲＩｇポリペプチド（図３Ａ乃至３Ｃに示したｍｕＣＲＩｇ）であって、Ｎ末端シグナル配列を含むか含まないもの、１位に開始メチオニンを含むか含まないもの、かつ、配列番号６の約１８１乃至２１１番目アミノ酸に膜貫通ドメインの一部もしくは全部を含むか含まないものである。高等霊長類及び哺乳類を含む他の非ヒト動物のＣＲＩｇポリペプチドは、具体的にはこの定義内に含まれる。
【００３２】
上記ＣＲＩｇ「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ」は、それぞれの完全長分子の膜貫通及び細胞質ドメインを基本的に含んでいないＣＲＩｇポリペプチドの形態のことを指す。通常、このＣＲＩｇＥＣＤはそのような膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満有し、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満有する。ＣＲＩｇＥＣＤは、配列番号２、４又は６の１又は約２１乃至Ｘ番目のアミノ酸残基を含むことができ、この場合、Ｘは配列番号２における約２７１乃至２８１番目の任意のアミノ酸、配列番号４における約１７８乃至１８６番目の任意のアミノ酸及び配列番号６における約１７６乃至１８４番目の任意のアミノ酸である。
【００３３】
「ＣＲＩｇアンタゴニスト」という用語は、最も広い意味で用いており、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドのＣ３ｂ及び／又はｉＣ３ｂとの結合を遮断し、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドの定性的生物活性を部分的又は完全に阻止又は中和する（ひとまとめにして、「阻害する」と称する）任意の分子を包含する。この生物活性は、好ましくは、細胞内病原体の補体依存性細胞侵入を媒介し、及び／又は赤血球又は血小板の望ましくないクリアランスを防止するＣＲＩｇの能力である。従って、アンタゴニストは細胞内病原体のＣＲＩｇ媒介補体依存性細胞侵入を阻害することが好ましい。好適なＣＲＩｇアンタゴニスト分子としては、具体的には、抗体断片をふくむ遮断抗ＣＲＩｇ抗体、本明細書の天然配列ＣＲＩｇポリペプチドの変異体及び融合体などの他のポリペプチド、ペプチド及び非ペプチド（有機）低分子並びにアンチセンスポリヌクレオチド分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましいグループのＣＲＩｇアンタゴニストとしては、天然ＣＲＩｇポリペプチドに特異的に結合し、そのＣ３ｂ及び／又はｉＣ３ｂとの結合を遮断する、抗体断片を含む抗ＣＲＩｇ抗体が挙げられる。
【００３４】
本明細書で定義する「遮断抗体」とは、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドのＣ３ｂ及び／又はｉＣ３ｂとの結合を遮断し、天然配列ＣＩｇポリペプチドの定性的生物活性を部分的又は完全に阻止又は中和する（ひとまとめにして、「阻害する」と称する）抗体である。この生物活性は、好ましくは、細胞内病原体の補体依存性細胞侵入を媒介するＣＲＩｇの能力である。従って、遮断抗体は、細胞内病原体のＣＲＩｇ媒介補体依存性細胞侵入を阻害し、及び／又は赤血球又は血小板の望ましくないクリアランスを防止することが好ましい。
【００３５】
「低分子」とは、本明細書では、分子量が約６００未満、好ましくは約１，０００未満、例えば、１００乃至６００又は１００乃至１，０００ダルトンであるものと定義される。「非ペプチド低分子」という用語は、上記の分子量範囲の低分子有機化合物のことをいう。
【００３６】
「抗体」（Ａｂ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は同じ構造特性を有する糖蛋白質である。抗体が特定の抗原に対して結合特異性を示すのに対して、免疫グロブリンは抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子との両方を包含する。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系において低レベルで、骨髄腫において高レベルで産生される。「抗体」という用語は、最も広い意味で用いており、具体的には、完全な状態のモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、少なくとも２種の完全な状態の抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び所望の生物活性を示す限りにおける抗体断片を対象として含むが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」とは、通常、２本の同一軽（Ｌ：ｌｉｇｈｔ）鎖と２本の同一重（Ｈ：ｈｅａｖｙ）鎖とからなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖蛋白質である。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンアイソタイプが異なる重鎖間で異なる。また、各重及び軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００３８】
「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で配列が大幅に異なっており、その特定の抗原に対する各特定抗体の結合及び特異性に利用されているという事実のことをいう。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体にわたって均一には分布していない。これは、軽鎖及び重鎖の可変ドメインのいずれにおいても相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大きくベータ−シートを構造をとり、このベータ−シート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより連結された４つのＦＲ領域を含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によってごく近接して結合されており、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔほか、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．  Ｎｏ．９１−３２４２、第Ｉ巻、ｐ．６４７−６６９（１９９１年）参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与といった種々のエフェクター機能を示す。
【００３９】
「抗体断片」は、完全な状態の抗体の一部、好ましくは完全な状態の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ＳｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、抗体断片から形成した多特異性抗体及び、一般に、抗原に特異的に結合するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる種類の一つに分類することができる。
【００４１】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンを種々のクラスに分類することができる。免疫グロブリンには、５つの主要なクラス、即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類することができる。これら各種クラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれγ、μ、δ、α及びεと呼ばれる。各種クラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構造については公知である。
【００４２】
本明細書に用いている「モノクロナール抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことを指し、言い換えれば、この集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る、自然に起こる可能性のある突然変異を別にすれば、同一である。モノクロナール抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を標的とする。さらに、通常、種々の決定基（エピトープ）を標的とする種々の抗体を含む従来の（ポリクロナール）抗体調製物とは対照的に、各モノクロナール抗体はその抗原の単一の決定基を標的とする。特異性の他に、モノクロナール抗体は、他の免疫グロブリンに汚染されないハイブリドーマ培養によって合成されるという点においても有利である。「モノクロナール」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示すものであり、この抗体が任意の特定の方法によって作製される必要があると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクロナール抗体は、Ｋｏｈｌｅｒほか、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：ｐ．４９５（１９７５年）に最初に報告されたハイブリドーマ法によって作製してもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製してもよい。また「モノクロナール抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎほか、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：ｐ．６２４−６２８（１９９１年）及びＭａｒｋｓほか、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：ｐ．５８１−５９７（１９９１年）に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離してもよい。ファージミド及びファージベクターを用いた抗体の調製について開示している米国特許第５，７５０，３７３号、同５，５７１，６９８号、同５，４０３，４８４号及び同５，２２３，４０９号をも参照されたい。
【００４３】
本明細書のモノクロナール抗体としては、具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から誘導されたか、特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同的であるが、この鎖（類）の残りの部分が、別の種から誘導されたか、別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同的である「キメラ」抗体、並びに所望の生物学的活性を示すのであれば、このような抗体の断片が挙げられる（米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：ｐ．６８５１−６８５５（１９８４年））。
【００４４】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はこれらの断片である。大部分において、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、そのレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）のいくつか又は全てが、マウス、ラット、ウサギなどのヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する所望の特異性、親和性及びキャパシティーを持つ残基で置換されている免疫グロブリンである。場合によっては、ヒト免疫グロブリンの特定のＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基を対応する非ヒト残基で置換させることもできる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されるＣＤＲ又はフレームワーク配列にも存在しない残基を含むことができる。こうした修飾を施すことによって抗体の性能がさらに改良され、最大限に引き出される。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲ領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインの実質的に全部を含有することになる。また、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常ヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含むのが最適であると考えられる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓほか、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：ｐ．５２２−５２５（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎほか、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：ｐ．３２３−３２９［１９８８年］；及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ、２：ｐ．５９３−５９６（１９９２年）を参照されたい。ヒト化抗体としては、抗体の抗原結合領域が、対象抗原でマカクザルを免疫化することにより産生される抗体に由来する「霊長類化」抗体が挙げられる。旧世界（Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ）ザル由来の残基を含有する抗体も本発明の範囲内で可能である。例えば、米国特許第５，６５８，５７０号、同５，６９３，７８０号、同５，６８１，７２２号、同５，７５０，１０５号及び５，７５６，０９６号を参照されたい。
【００４５】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、このＦｖポリペプチドは、ｓＦＶが抗原結合のために望ましい構造を形成するのを可能にする、ＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．２６９−３１５（１９９４年）を参照されたい。
【００４６】
「ダイアボディ」という用語は、二つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片であって、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が結合している抗体断片のことをいう。極めて短いために同一鎖上でこれら二つのドメインの対形成を可能にすることができないリンカーを使用して、これらのドメインを別の鎖の相補性ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創出する。ダイアボディについては、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ  ９３／１１１６１及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：ｐ．６４４４−６４４８（１９９３年）にさらに十分に説明されている。
【００４７】
本明細書に用いている「免疫付着因子」という用語は、異種蛋白質（「付着因子」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを併せ持つ抗体様分子を示す。構造的には、免疫付着因子は、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち、「異種」である）所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体を含む。免疫付着因子の分子の付着因子部分は、通常、少なくとも受容体又はリガンドの結合部位を含む連続したアミノ酸配列である。この免疫付着因子の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００４８】
「感染症」という用語は、本明細書では、感染性微生物によって引き起こされる任意の疾患を指して用いている。感染性微生物は、ウイルス（例えば、一本鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖ＤＮＡウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ、Ｂ及びＣ型肝炎ウイルス、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ：ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ：ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、エプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ：ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ））、寄生生物（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ属、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属）、細菌（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（特に、Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．  ｌｅｐｒａｅ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属）、真菌（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ及びプリオンを含むことができる。
【００４９】
「治療」とは、疾病の発症を予防し、又はその病状を改善することを意図して行う介入である。従って、「治療」とは、治療的処置及び予防的又は再発防止措置の両方を指す。治療を必要とする対象には、すでに疾患を有する対象、および疾患を予防すべきである対象が含まれる。
【００５０】
本明細書に用いている「感染症発症の予防又は阻止」という用語は、感染症の発生が防止され、感染症の発症が遅延され、又は現存する感染症の伝染が食い止められる状況のことをいう。
【００５１】
本明細書に用いている「寛解する（Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）」とは、本明細書では、好転する又は改善することと定義する。
【００５２】
本明細書に用いている「哺乳動物」という用語は、哺乳類として分類される動物のことを指し、このようなものとしては、ヒト、非ヒト霊長類、家畜動物、及びウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、フェレットなどの動物園用、スポーツ用又はペット用動物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の好ましい実施態様では、哺乳動物は高等霊長類、最も好ましくはヒトである。
【００５３】
ＩＩ．詳細な説明
ＣＲＩｇポリペプチドのアンタゴニストの同定
ＣＲＩｇポリペプチドのアンタゴニストとは、天然配列ＣＲＩｇポリペプチドのＣ３ｂ及び／又はｉＣ３ｂとの結合を遮断し、この天然配列ＣＲＩｇポリペプチドの定性的生物活性を部分的又は完全に阻止、阻害又は中和する分子である。ＣＲＩｇアンタゴニストとしては、抗ＣＲＩｇ抗体（抗体断片を含む）、ポリペプチド、ペプチド及び非ペプチド低分子並びにアンチセンス分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。こうしたアンタゴニストは、標準的な結合及び／又は機能アッセイを含む、当該分野で公知の方法によって同定することができる。天然配列ＣＲＩｇポリペプチドのアンタゴニストは、ウイルス、細菌、寄生生物などの細胞内病原体の細胞侵入を阻止することができるため、感染症の予防及び治療に有用である。
【００５４】
抗ＣＲＩｇ抗体は、上記及び実施例１に記載したような当該分野で周知の方法により作製することができる。ＣＲＩｇ結合能を有する他の分子は、当該分野で公知の結合アッセイにおいて同定することができる。
【００５５】
アンタゴニストの結合アッセイは全て、これらが候補アンタゴニストをＣＲＩｇポリペプチドと、これらの成分間の相互作用を可能にするのに十分な条件及び時間で接触させることを必要とする点で共通している。結合アッセイにおいて、この相互作用とは結合であり、形成された複合体は単離又は反応混合物中に検出することができる。特定の実施態様において、このＣＲＩｇポリペプチド又は候補アンタゴニストを共有又は非共有結合によって固相、例えばマイクロタイタープレート上に固定化する。一般に、非共有結合は、ＣＲＩｇポリペプチドの溶液で固体表面を被覆し、乾燥させることにより達成することができる。或いは、固定化対象のＣＲＩｇポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクロナール抗体を用いてこれを固体表面にしっかりと固定することができる。アッセイは、検出可能な標識により標識することができる非固定化成分を固定化成分、例えば固定化成分が固定されている被覆表面に添加することにより実施することができる。反応が完了すれば、反応しなかった成分を、例えば洗浄によって除去し、固体表面に固定された複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能標識を有する場合、この表面に固定化された標識を検出することにより、複合体形成が生じたことが分かる。最初の非固定化成分が標識を有しない場合、複合体形成は、例えば、この固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体を用いることによって、検出することができる。
【００５６】
上記候補化合物がＣＲＩｇと相互作用するが、結合しないポリペプチドである場合、ＣＲＩｇとそれぞれのポリペプチドとの相互作用を、蛋白質−蛋白質相互作用を検出するための公知の方法によってアッセイすることができる。このようなアッセイとしては、例えば、架橋法、免疫共沈降法、勾配もしくはクロマトグラフィーカラムによる同時精製法などの従来の方法が挙げられる。さらに、蛋白質−蛋白質相互作用は、Ｃｈｅｖｒａｙ  ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８９：ｐ．５７８９−５７９３（１９９１年）に開示されているように、Ｆｉｅｌｄｓら（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，  Ｎａｔｕｒｅ  （Ｌｏｎｄｏｎ），  ３４０：ｐ．２４５−２４６（１９８９年）；Ｃｈｉｅｎほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８８：ｐ．９５７８−９５８２（１９９１年））によって報告された酵母ベースの遺伝子系を用いることにより測定することができる。酵母ＧＡＬ４などの多くの転写活性化因子は２つの物理的に異なるモジュラードメインからなり、そのうちの１つはＤＮＡ結合ドメインの機能を果たし、他の１つは転写活性化ドメインとして機能する。上記刊行物に記載されている酵母発現系（通常「ツーハイブリッドシステム」と称する）は、これを利用するものであり、２種のハイブリッド蛋白質、即ち、標的蛋白質を上記のＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと融合させた１種と候補活性化蛋白質を上記活性化ドメインと融合させた別の１種とを用いる。ＧＡＬ４活性化プロモータの制御下のＧＡＬ１−ｌａｃＺレポータ遺伝子の発現は蛋白質−蛋白質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存している。相互作用するポリペプチドを含有するコロニーはβ−ガラクトシダーゼの発色基質で検出される。ツーハイブリッド技術を用いて２種の特定の蛋白質間の蛋白質−蛋白質相互作用を同定するための完全キット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（商標））がＣｌｏｎｔｅｃｈ社から市販されている。このシステムは、特定の蛋白質間相互作用に関与する蛋白質ドメインをマッピングし、こうした相互作用に不可欠なアミノ酸残基を突き止めるために拡張することができる。
【００５７】
本明細書に記載したスクリーニングアッセイはもっぱら説明のためのものであることを強調しておく。スクリーニングするアンタゴニスト候補の種類（例えば、ポリペプチド、ペプチド、非ペプチド有機低分子、核酸など）に応じて選択することができる種々の他のアッセイについては当業者には公知であり、同様に本発明の目的に適している。
【００５８】
本明細書に具体的に記載したアッセイを用いて化合物のライブラリをスクリーニングすることができ、このようなライブラリとしては、化学ライブラリ、天然物ライブラリ（例えば、微生物、動物、植物などのコレクション）並びにランダムペプチド、オリゴヌクレオチド又は有機低分子からなるコンビナトリアルライブラリが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施態様において、本明細書のアッセイを用いて、限定されない例として未処置ヒト抗体、組み換え抗体、合成抗体及び半合成抗体のライブラリが挙げられる抗体ライブラリをスクリーニングする。上記抗体ライブラリは、例えば、ファージ粒子当たり平均１個の一本鎖抗体もしくは抗体断片を提示する一価ライブラリ及びウイルス粒子当たり平均２個以上の抗体もしくは抗体断片を提示する多価ライブラリを含むファージディスプレイライブラリとすることができる。しかしながら、本発明によるスクリーニングの対象となる抗体ライブラリはファージディスプレイライブラリに限定されるものではない。例えば、他のディスプレイ技術として、リボソームもしくはｍＲＮＡディスプレイ（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：ｐ．９０２２−９０２６（１９９４年）；Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：ｐ．４９３７−４９４２（１９９７年））、細菌ディスプレイなどの微生物細胞ディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕほか、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：ｐ．２９−３４（１９９７年））又は酵母細胞ディスプレイ（Ｋｉｅｋｅほか、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １０：ｐ．１３０３−１３１０（１９９７年））、哺乳動物細胞におけるディスプレイ、胞子ディスプレイ、レトロウイルスディスプレイなどのウイルスディスプレイ（Ｕｒｂａｎほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３：ｐ．ｅ３５（２００５年））、蛋白質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐほか、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：ｐ．２８０６−２８１０（２００４年）；Ｒｅｉｅｒｓｅｎほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３：ｐ．ｅｌＯ（２００５年））及びマイクロビーズディスプレイ（Ｓｅｐｐほか、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５３２：ｐ．４５５−４５８（２００２年））が挙げられる。合成低分子のコンビナトリアルライブラリなどの他の分子のライブラリも同様にしてスクリーニングすることができる。
【００５９】
Ｃ３ｂ及び／又はｉＣ３ｂとのＣＲＩｇの結合を遮断する候補アンタゴニストの能力は細胞利用のアッセイで評価することができる。従って、ＣＲＩｇ核酸を形質移入されてこれを発現する組換えＣＨＯ細胞などのＣＲＩｇ発現細胞をＣ３ｂ／ｉＣ３ｂ及びこれまでの実験でＣＲＩｇと結合することが分かっていてもいなくてもよい１種以上の候補アンタゴニストとインキュベートすることができ、その結果を、実施例２で説明するように、ＦＡＣＳｃａｎなどの当該分野で周知の方法により分析することができる。或いは、又はさらに、Ｃ３ｂ及び／又はｉＣ３ｂとのＣＲＩｇの結合を遮断する候補アンタゴニストの能力は、腹膜マクロファージなどの天然にＣＲＩｇを発現する細胞を用いるアッセイで試験することができる。
【００６０】
本明細書の一次結合／相互作用アッセイで得られた結果は、種々の感染のインビトロ及びインビボアッセイで確認し、補完することができる。或いは、感染又は感染症の治療における有効性のインビトロ及び／又はインビボアッセイを一次アッセイとして用いて本明細書に記載のＣＲＩｇアンタゴニストを同定することができる。従って、Ｌｙｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどの病原菌とＣＲＩｇ発現腹膜マクロファージとのインビボでの結合の阻害については、実施例２で記載したようにして試験することができる。
【００６１】
動物モデルを用いて本明細書に記載の抗体及び他のＣＲＩｇアンタゴニストを試験することもできる。マウスの血中からのＬｉｓｔｅｒｉａ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのクリアランスの阻害については実施例２で説明する。
【００６２】
抗ＣＲＩｇアンタゴニスト抗体の調製
（ｉ）抗原の調製
任意選択的に他の分子に結合させた可溶性抗原又はその断片を抗体作製のための免疫原として用いることができる。受容体などの膜貫通分子の場合、こうしたものの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）を免疫原として用いることができる。或いは、この膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として用いることができる。このような細胞は天然の供給源（例えば、癌細胞株）から得ることができ、又はこの膜貫通分子を発現するように組換え技術により形質転換した細胞とすることができる。他の抗原及び抗体調製に有用なその形態については、当業者には明らかであろう。
【００６３】
（ｉｉ）ポリクロナール抗体
ポリクロナール抗体は、動物を用いて関連する抗原およびアジュバントを皮下（ｓｃ）もしくは腹腔内（ｉｐ）注射を繰り返すことにより産生させることが好ましい。免疫化の対象とする種において免疫原性である蛋白質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又は大豆トリプシンインヒビター）に二官能性薬剤もしくは誘導化剤（例えば、マレイミドベンゾイル・スルホサクシンイミド・エステル（システイン残基を介する結合用）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（リジン残基を介する結合用）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣＩ２又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である））を用いて関連抗原を結合させることは有用と考えられる。
【００６４】
上記抗原、免疫原性結合体もしくは誘導体に対する動物の免疫化は、例えば１００μｇもしくは５μｇ（それぞれ、ウサギもしくはマウスの場合）のこの蛋白質もしくは結合体を３容の完全フロインドアジュバントと混合し、この溶液を複数の部位に皮内注射することにより行う。１ヶ月後、こうした動物に対して、ペプチドもしくは結合体の完全フロインドアジュバント液の元の量の１／５乃至１／１０を複数の部位に皮下注射することにより追加免疫を行う。７乃至１４日後に、上記動物を瀉血し、血清の抗体価をアッセイする。この抗体価がプラトーに達するまで追加免疫を繰り返す。好ましくは、動物の追加免疫は、抗原は同一とするが、これに結合させる蛋白質および／またはこの結合に用いる架橋剤は別のものに変えた結合体を用いて行う。また、結合体は、組換え細胞の培養によって融合蛋白質として作製することができる。また、この免疫反応を高めるためにミョウバンなどの凝集剤を適切に用いる。
【００６５】
（ｉｉｉ）モノクロナール抗体
モノクロナール抗体は、Ｋｏｈｌｅｒほか、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：ｐ．４９５（１９７５年）に最初に報告されたハイブリドーマ法を用いて作製することができ、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又はハムスター、マカクザルなどの他の適切な宿主動物を上記の方法で免疫化することにより、免疫化に用いた蛋白質に特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することができるリンパ球を誘導する。或いは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させることによりハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、１９８６年））。
【００６６】
こうして作製したハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合しなかった元の骨髄腫細胞の増殖もしくは生残を阻害する１種以上の物質を含む適切な培養培地に接種し、増殖させる。例えば、元の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴもしくはＨＰＲＴ）を欠損している場合、上記ハイブリドーマの培養培地には、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを添加し（ＨＡＴ培地）、これらの物質によりＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
【００６７】
骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定的な高レベルの産生を維持し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものが好ましい。こうしたものの中でも、好ましい骨髄腫細胞株は、ＳａＩｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国から入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍並びにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ロックビル、メリーランド州、米国から入手可能なＳＰ−２もしくはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するものなどのマウス骨髄腫細胞株である。ヒトモノクロナール抗体を産生させるためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒト・ヘテロ骨髄腫細胞株についても報告されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：ｐ．３００１（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒほか、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク州、１９８７年））。
【００６８】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地について抗原に対するモノクロナール抗体の産生のアッセイを行う。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクロナール抗体の結合特異性は、免疫沈降法、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素標識免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイ法により測定することが好ましい。
【００６９】
所望の特異性、親和性および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定した後、このクローンは、限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ｐ．５９−１０３  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、１９８６年））を用いて増殖させることができる。この目的のための好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭもしくはＲＰＭＩ−１６４０が挙げられる。さらに、このハイブリドーマ細胞は、動物体内において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【００７０】
上記サブクローンにより分泌されたモノクロナール抗体は、通常の免疫グロブリン精製法、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析もしくはアフィニティ・クロマトグラフィーを用いて培養培地、腹水液もしくは血清から適切に分離することができる。
【００７１】
モノクロナール抗体をコードするＤＮＡは、通常の方法により（例えば、このモノクロナール抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチド・プローブを用いることによって）容易に単離し、配列決定することができる。上記ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。一旦単離したＤＮＡは、発現ベクターに挿入した後、普通なら免疫グロブリン蛋白質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、骨髄腫細胞などの宿主細胞内にこのベクターを形質移入することにより、この組換え宿主細胞にモノクロナール抗体を合成させることができる。以下に、抗体の組換え法による作製についてさらに詳細に説明する。
【００７２】
別の実施態様において、抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙほか、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：ｐ．５５２−５５４（１９９０年）に報告されている技術を用いて作製された抗体ファージライブラリから単離することができる。
【００７３】
Ｃｌａｃｋｓｏｎほか、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：ｐ．６２４−６２８（１９９１年）及びＭａｒｋｓほか、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：ｐ．５８１−５９７（１９９１年）に、ファージライブラリを用いてマウス及びヒト抗体をそれぞれ単離する方法が報告されている。その後の刊行物には、鎖シャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｍａｒｋｓほか、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：ｐ．７７９−７８３（１９９２年））並びに超大型ファージライブラリ構築方法としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅほか、ＮｕｃＬ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１：ｐ．２２６５−２２６６（１９９３年））による高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の作製が報告されている。従って、これらの技術は、モノクロナール抗体の単離のための従来のモノクロナール抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別の方法である。
【００７４】
また、上記ＤＮＡは、例えば、ヒト重及び軽鎖定常ドメインのコーディング配列をマウスの相同配列の代わりに用いる（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８１：ｐ．６８５１（１９８４年））ことにより、又は、非免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列の全てもしくは一部を免疫グロブリンのコーディング配列に共有結合させることにより修飾することもできる。
【００７５】
通常、抗体の定常ドメインをこのような非免疫グロブリンポリペプチドで置換し、又は、これを抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインで置換することにより、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と別の抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作製する。
【００７６】
（ｉｖ）ヒト化及びヒト抗体
ヒト化抗体では非ヒトの供給源からの１種以上のアミノ酸残基がこれに導入されている。こうした非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と呼ばれることが多く、通常、「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、基本的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Ｊｏｎｅｓほか、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：ｐ．５２２−５２５（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎほか、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：ｐ．３２３−３２７（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：ｐ．１５３４−１５３６（１９８８年））の方法に従い、齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することにより実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、完全な状態のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、通常、幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００７７】
ヒト化抗体を作製するのに用いることになるヒト可変ドメインは軽鎖及び重鎖ともその選択が抗原性を低減するために極めて重要である。いわゆる「最良適合」法に従って、周知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してげっ歯類抗体の可変ドメイン配列をスクリーニングする。その結果、げっ歯類配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れられる（Ｓｉｍｓほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：ｐ．２２９６（１９９３年）；Ｃｈｏｔｈｉａほか、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：ｐ．９０１（１９８７年））。別の方法では、特定のサブグループの軽鎖又は重鎖のヒト抗体全てのコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体に同じフレームワークを使用することができる（Ｃａｒｔｅｒほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：ｐ．４２８５（１９９２年）：Ｐｒｅｓｔａほか、Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．、１５１：ｐ．２６２３（１９９３年））。
【００７８】
抗原に対する高親和性および他の好ましい生物学的性質を保持させて抗体をヒト化することはさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によって、元の配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用した元の配列および種々の概念上のヒト化産物の分析のプロセスによってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の有望な三次元配座構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらディスプレイの調査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割の分析（即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析）が可能となる。この方法では、標的抗原（単数又は複数）に対する親和性の増大などの所望の抗体特性が達成されるように、レシピエントおよび移入配列からＦＲ残基を選択して組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に対する影響に直接かつ極めて大きく関与する。
【００７９】
或いは、現在、免疫化時に内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の全レパートリーを産生することができる遺伝子導入動物（例えば、マウス）を作製することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠損によって内因性抗体産生が完全に阻害されることが報告されている。このような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを移入すると、抗原チャレンジ時にヒト抗体が産生されることになる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：ｐ．２５５１（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓほか、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：ｐ．２５５−２５８（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎほか、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：ｐ．３３（１９９３年）；及びＤｕｃｈｏｓａｌほか、Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：ｐ．２５８（１９９２年）を参照されたい。ヒト抗体はファージディスプレイライブラリから得ることもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍほか、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：ｐ．３８１（１９９１年）；Ｍａｒｋｓほか、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：ｐ．５８１−５９７（１９９１年）；Ｖａｕｇｈａｎほか、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １４：ｐ．３０９（１９９６年））。抗体ファージディスプレイライブラリからのヒト抗体の作製については以下でさらに説明する。
【００８０】
（ｖ）抗体断片
抗体断片の作製のための種々の技術が開発されている。従来から、こうした断片は、完全な状態の抗体の蛋白分解によって得られていた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏほか、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：ｐ．１０７−１１７（１９９２年）及びＢｒｅｎｎａｎほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：ｐ．８１（１９８５年）参照）。しかしながら、現在、このような断片は、組換え宿主細胞によって直接産生させることができる。例えば、こうした抗体断片は上記の抗体ファージライブラリから単離することができる。或いは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片をＥ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的に結合させることによりＦ（ａｂ’）２断片を形成させることができる（Ｃａｒｔｅｒほか、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：ｐ．１６３−１６７（１９９２年））。下記実施例に記載した別の実施態様では、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いてＦ（ａｂ’）２を形成させることにより、Ｆ（ａｂ’）２分子の構築を促進する。別の方法では、組換え宿主細胞培養物から直接Ｆ（ａｂ’）２断片を単離することができる。抗体断片作製の他の方法については熟練した実務者には明らかであろう。他の実施態様では、最適な抗体は一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５を参照されたい。
【００８１】
（ｖｉ）多特異性抗体
多特異性抗体は少なくとも２種のエピトープに対する結合特異性を有し、この場合のこれらのエピトープは通常異なる抗原に由来するものである。このような分子は、普通２種のエピトープに結合するに過ぎない（即ち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）が、本明細書で用いる場合のこの表現には三重特異性抗体などの更なる特異性を有する抗体も包含される。ＢｓＡｂの例としては、ＣＲＩｇに向けられた１つのアームと、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３及びＣＲ４からなる群から選ばれるマクロファージ受容体のような免疫複合体クリアランスに関与する別の蛋白質に向けられた別のアームとを有するものが挙げられる。
【００８２】
二重特異性抗体を作製する方法は、当該分野において周知である。従来より行われている完全長の二重特異性抗体の作製は２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づくものであり、この場合の２本の鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎほか、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：ｐ．５３７−５３９（１９８３年））。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖が無作為に組み合わされるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の抗体分子の混合物を産生すると考えられ、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。この正しい分子の精製は、通常親和性クロマトグラフィー工程によって行われるが、かなり面倒であり、産物の収率が低い。同様の手順がＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒほか、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：ｐ．３６５５−３６５９（１９９１年）に開示されている。別の方法では、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。この融合は、少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものであることが好ましい。少なくとも一つの融合には、軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体及び、必要に応じて、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主微生物へ同時形質移入する。これによって、上記構築に用いる３本のポリペプチド鎖の比率が異なることにより最適な収率が得られる場合の実施態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合を調整する際に大きな融通性が得られる。しかしながら、少なくとも２本のポリペプチド鎖を等しい比率で発現させることにより高収率が得られる場合、又はこれらの比率が特に重要ではない場合、２本もしくは３本全てのポリペプチド鎖のコーディング配列を１つの発現ベクターに挿入することは可能である。
【００８３】
この方法の好ましい実施態様では、上記二重特異性抗体は、１つのアームとしての第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他のアームとしての（第２の結合特異性を示す）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対とから構成される。この非対称構造は、この二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することにより容易な分離方法が得られるので、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。この方法については、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の作製についての更なる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈほか、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：ｐ．２１０（１９８６年）を参照されたい。
【００８４】
ＷＯ９６／２７０１１に開示されている別の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体類の割合を最大にすることができる。この界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含むことが好ましい。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１個以上の小さいアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖と同一又は同様なサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖（単数又は複数）を小さいもの（アラニン又はスレオニン）と置き換えることによって、第２の抗体分子の界面に作り出す。これによって、ホモ二量体のような不要の他の最終産物よりもヘテロ二量体の収率を増大させるためのメカニズムがもたらされる。
【００８５】
二重特異性抗体としては、架橋型又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体のうちの１つにはアビジンを、他の抗体にはビオチンを結合させることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞の的を望ましくない細胞（米国特許第４，６７６，９８０号）及びＨＩＶ感染の治療（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３）に合わさせるものであると提唱されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野で公知であり、いくつかの架橋技術と共に、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【００８６】
抗体断片から二重特異性抗体を作製する技術についても文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を用いて調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：ｐ．８１（１９８５年）には、完全な状態の抗体を蛋白質分解によって開裂させてＦ（ａｂ’）２断片を作製する方法が記載されている。こうした断片はジチオール複合体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元させることにより、近接ジチオールが安定化され、分子間ジスルフィド形成が防止される。次いで、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体へ変換する。次に、こうしたＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１種をメルカプトエチルアミンで還元してＦａｂ’−チオールへ再変換し、他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成させる。この作製した二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用薬剤として使用することができる。
【００８７】
Ｆａｂ’ＳＨ断片をＥ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的に結合させて二重特異性抗体を形成させることもできる。Ｓｈａｌａｂｙほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５：ｐ．２１７−２２５（１９９２年）には、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の作製について記載されている。各Ｆａｂ’断片をＥ．ｃｏｌｉから別々に分泌させ、インビトロで定方向化学結合させて二重特異性抗体を形成させた。
【００８８】
また、組換え細胞培養から直接に二重特異性抗体断片を作製し分離する様々な技術も報告されている。例えば、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体が作製されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：ｐ．１５４７−１５５３（１９９２年）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２種の抗体のＦａｂ’部分に連結させた。こうした抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを形成させ、次いで再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成させた。この方法は、抗体ホモ二量体の作製に利用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：ｐ．６４４４−６４４８（１９９３年）に報告されている「ダイアボディ」技術によって、二重特異性抗体断片を作製する別のメカニズムがもたらされている。こうした断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短かすぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでいる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインを別の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させ、それによって２つの抗原結合部位を形成させる。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用して二重特異性抗体断片を作製する別の方法についても報告されている。Ｇｒｕｂｅｒほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：ｐ．５３６８（１９９４年）を参照されたい。
【００８９】
三重特異性以上の抗体も想定している。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｆｔほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：ｐ．６０（１９９１年）。さらに、同じ抗原に対して２以上の結合特異性を有する多価（例えば、二価）抗体も本明細書の範囲内にある。
【００９０】
（ｖｉｉ）エフェクター機能の設計
エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することにより、この抗体の有効性を高めることは望ましいと考えられる。例えば、システイン残基（単数又は複数）をＦｃ領域に導入することによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にすることができる。このようにして作製したホモ二量体抗体では、インターナリゼーション能力を改善させ、及び／又は補体媒介殺細胞性及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増大させることができる。Ｃａｒｏｎほか、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １７６：ｐ．１１９１−１１９５（１９９２年）及びＳｈｏｐｅｓ、Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：ｐ．２９１８−２９２２（１９９２年）を参照されたい。Ｗｏｌｆｆほか、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：ｐ．２５６０−２５６５（１９９３年）に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して、抗腫瘍活性の増強されたホモ二量体抗体を調製することもできる。或いは、二重Ｆｃ領域を有し、それによって補体溶解及びＡＤＣＣ能が増強されたと考えられる抗体を設計することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎほか、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：ｐ．２１９−２３０（１９８９年）を参照されたい。
【００９１】
（ｖｉｉｉ）抗体−サルベージ受容体結合エピトープ融合体
本発明の特定の実施態様では、例えば、腫瘍浸透を増大させるために、完全な状態の抗体ではなく、抗体断片を用いることが望ましいと考えられる。この場合、その血清半減期を増大させるために抗体断片を修飾することが望ましいと考えられる。これは、例えば、抗体断片内にサルベージ受容体結合エピトープを取り込ませることよって（例えば、抗体断片中の適切な領域に突然変異を生じさせることによって、又は例えばＤＮＡ合成またはペプチド合成によって、ペプチドタグ内にエピトープを取り込ませ、次いでこれを、抗体断片の末端又は中央に融合させることによって）達成することができる。
【００９２】
このサルベージ受容体結合エピトープは、Ｆｃドメインの１つ又は２つのループからの１以上の任意の残基が上記抗体断片の類似の位置に移されている領域を構成することが好ましい。このＦｃドメインの１つ又は２つのループからの残基は３以上移されることがより好ましい。さらにより好ましくは、このエピトープは上記Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧの）のＣＨ２ドメインから得て、上記抗体のＣＨ１、ＣＨ３もしくはＶＨ領域又は２以上のそのような領域に移す。或いは、このエピトープは上記Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得て、上記抗体断片のＣＬ領域もしくはＶＬ領域又はこれらの両者に移す。
【００９３】
（ｉｘ）抗体の他の共有結合修飾
抗体の共有結合修飾は本発明の範囲に含まれる。これは、該当する場合、化学合成又はこの抗体の酵素的もしくは化学的開裂によって行うことができる。この抗体の他の種類の共有結合修飾は、特定の側鎖又はＮ−もしくはＣ−末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と上記抗体の標的アミノ酸残基とを反応させることによって分子中に導入する。共有結合修飾の例については、特に引用により本明細書に組み込まれている米国特許第５，５３４，６１５号に記載されている。上記抗体の好ましい種類の共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号、同４，４９６，６８９号、同４，３０１，１４４号、同４，６７０，４１７号、同４，７９１，１９２号又は同４，１７９，３３７号に記載の方法で各種非蛋白質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリアルキレン）のうちの１種に上記抗体を連結させることを含む。
【００９４】
（ｘ）合成抗体ファージライブラリからの抗体の作製
好ましい実施態様において、本発明は、特別なファージディスプレイ法を用いて新規な抗体を作製し、選択する方法を提供する。この方法は、単一フレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリを作製し、可変ドメイン内に十分な多様性を設計し、多様化した可変ドメインを有するポリペプチドをディスプレイさせ、抗原を標的とする高親和性を有する候補抗体を選択し、選択した抗体を単離するものである。
【００９５】
ファージディスプレイ法の詳細は例えば２００３年１２月１１日公開のＷＯ０３／１０２１５７に見出すことができ、その内容全体が引用により本明細書に明確に組み込まれている。
【００９６】
一態様では、本発明において使用される抗体ライブラリは抗体可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲにおいて溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置を変異させることによって作製することができる。こうしたＣＤＲのいくつか又は全てを本明細書に示した方法を使用して突然変異させることができる。一部の実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置を突然変異させて単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ３中の位置を突然変異させて単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置を突然変異させて単一のライブラリを形成することにより、多様な抗体ライブラリを作製することが好ましいと考えられる。
【００９７】
例えば、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３の溶媒接近可能及び／又は高度多様性の位置に突然変異を有する抗体可変ドメインのライブラリを作製することができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及び／又はＣＤＲＬ３に突然変異を有する別のライブラリを作製することができる。これらのライブラリを互いに連結して用いることにより所望の親和性のバインダーを作製することができる。例えば、標的抗原への結合に関して重鎖ライブラリを１回以上選択した後に、軽鎖ライブラリを重鎖バインダーの集団中に置き換えてさらに選択の回数を重ねることにより、こうしたバインダーの親和性を増大させることができる。
【００９８】
上記ライブラリは重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域において元のアミノ酸を変異アミノ酸で置換することにより作製することが好ましい。得られるライブラリは複数の抗体配列を含み得、この場合、配列多様性は主として重鎖配列のＣＤＲＨ３領域にある。
【００９９】
一態様では、ライブラリは、ヒト化抗体４Ｄ５配列、又はヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列との関連で作製する。好ましくは、このライブラリはＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸で重鎖の少なくとも残基９５乃至１００ａを置換することにより作製し、この場合、このＤＶＫコドンセットを用いてこれらの位置の個々の全てについて一組の変異アミノ酸をコードする。これらの置換をもたらすのに有用なオリゴヌクレオチドセットの一例は配列（ＤＶＫ）７を含む。一部の実施態様では、ライブラリは、ＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で残基９５乃至１００ａを置換することにより作製する。これらの置換をもたらすのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列（ＤＶＫ）６（ＮＮＫ）を含む。別の実施態様では、ライブラリは、ＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で少なくとも残基９５乃至１００ａを置換することにより作製する。これらの置換をもたらすのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列（ＤＶＫ）５（ＮＮＫ）を含む。これらの置換をもたらすのに有用なオリゴヌクレオチドセットの別の例は配列（ＮＮＫ）６を含む。好適なオリゴヌクレオチド配列の他の例については、本明細書に記載した基準に従って当業者が決定することができる。
【０１００】
別の実施態様では、異なったＣＤＲＨ３設計を用いて高親和性バインダーを単離し様々なエピトープに対するバインダーを単離する。このライブラリにおいて作製したＣＤＲＨ３の長さの範囲はアミノ酸１１個乃至１３個であるが、これとは異なった長さも作製することができる。Ｈ３多様性は、ＮＮＫ、ＤＶＫ及びＮＶＫコドンセットを使用し、並びにＮ及び／又はＣ末端での多様性をより制限して、拡張することができる。
【０１０１】
多様性はＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２においてももたらすことができる。ＣＤＲ−Ｈ１及びＨ２の多様性の設計は、上述の天然抗体レパートリーを模倣するターゲティングの方法に従い、これまでの設計よりも天然の多様性に対してより厳密に適合する多様性に焦点を当てた改変を行う。
【０１０２】
ＣＤＲＨ３での多様性に対しては、複数のライブラリを、異なった長さのＨ３を用いて別個に構築し、次いで、標的抗原に対するバインダーを選択するために組み合わせる。これらの複数のライブラリをプールし、以前に報告され、以下の本明細書記載したような固体支持体選別及び溶液ソーティング方法を用いて選別することができる。複数のソーティング方法を用いることができる。例えば、１つの変法は、固体に結合した標的によってソートした後、上記融合ポリペプチドに存在させることができるタグ（例えば、抗ｇＤタグ）についてソートし、次いで固体に結合した標的によってさらにソートするものである。別法として、ライブラリを固体表面に結合した標的によって先ずソートすることができ、次いで溶出したバインダーを標的抗原の濃度を減少させた溶液相結合によってソートする。異なるソーティング方法を併用することによって、高度に発現される配列のみを選択することが最小限に抑えられ、多くの異なる高親和性クローンが選択される。
【０１０３】
上記標的抗原に対する高親和性バインダーはこれらのライブラリから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域における多様性を制限することによって縮重が約１／１０４乃至１／１０５に減少し、Ｈ３多様性を増大させることができることにより、より多くの高親和性バインダーが得られる。ＣＤＲＨ３において異なったタイプの多様性を持つライブラリを利用することにより（例えばＤＶＫ又はＮＶＴを利用して）、標的抗原の異なったエピトープに結合することができるバインダーの単離が可能となる。
【０１０４】
上述のプールしたライブラリから単離したバインダーに関して、軽鎖の多様性を制限することにより親和性を更に改善することができることが見出された。軽鎖の多様性は、この実施態様では以下のように生じる。即ち、ＣＤＲＬ１においては２８番目のアミノ酸がＲＤＴによりコードされ、２９番目のアミノ酸がＲＫＴによりコードされ、３０番目のアミノ酸がＲＶＷによりコードされ、３１番目のアミノ酸がＡＮＷによりコードされ、３２番目のアミノ酸がＴＨＴによりコードされ、任意選択的に３３番目のアミノ酸がＣＴＧによりコードされ、ＣＤＲＬ２においては５０番目のアミノ酸がＫＢＧによりコードされ、５３番目のアミノ酸がＡＶＣによりコードされ、任意選択的に５５番目のアミノ酸がＧＭＡによりコードされ、ＣＤＲＬ３においては９１番目のアミノ酸がＴＭＴ又はＳＲＴ又はこれらの両者によりコードされ、９２番目のアミノ酸がＤＭＣによりコードされ、９３番目のアミノ酸がＲＶＴによりコードされ、９４番目のアミノ酸がＮＨＴによりコードされ、９６番目のアミノ酸がＴＷＴ又はＹＫＧ又はこれらの両者によりコードされる。
【０１０５】
別の実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域に多様性を有するライブラリ又はライブラリ群を作製する。この実施態様では、ＣＤＲＨ３の多様性は様々な長さのＨ３領域を用い、主にコドンセットＸＹＺ及びＮＮＫ又はＮＮＳを用いてもたらす。ライブラリは個々のオリゴヌクレオチドを使用して形成させ、プールすることができ、又は、オリゴヌクレオチドをプールしてライブラリのサブセットを形成させることができる。この実施態様のライブラリは固体に結合させた標的に対してソートすることができる。複数回のソーティングから単離されるクローンはＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異性及び親和性についてスクリーニングすることができる。特異性の場合、これらのクローンを所望の標的抗原並びに他の非標的抗原に対してスクリーニングすることができる。次いで、上記標的抗原に対するバインダーを溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイ又はスポット競合アッセイで親和性についてスクリーニングすることができる。高親和性バインダーは上記のようにして調製したＸＹＺコドンセットを使用してライブラリから単離することができる。こうしたバインダーは、抗体又は抗原結合断片として細胞培養物中に高収量で容易に生成させることができる。
【０１０６】
一部の実施態様では、ＣＤＲＨ３領域の長さにより大きな多様性を有するライブラリを作製することが望ましいと考えられる。例えば、アミノ酸約７乃至１９個の範囲のＣＤＲＨ３領域を有するライブラリを作製することが望ましいと考えられる。
【０１０７】
これらの実施態様のライブラリから単離される高親和性バインダーは、細菌及び真核細胞培養において高収量で容易に作製することができる。ベクターは、ｇＤタグ、ウイルスコート蛋白質成分配列などの配列を容易に除去することができ、及び／又は定常領域配列を加えて完全長抗体又は抗原結合断片を高収量で生成することができるように設計することができる。
【０１０８】
ＣＤＲＨ３に変異を有するライブラリは、例えばＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２などの他のＣＤＲの変異型を含むライブラリと組み合わせることができる。従って、例えば、一実施態様では、ＣＤＲＨ３ライブラリは、所定のコドンセットを用いて２８、２９、３０、３１、及び／又は３２番目の位置に変異アミノ酸を有するヒト化４Ｄ５抗体配列との関連で作製したＣＤＲＬ３ライブラリと組み合わせる。別の実施態様では、ＣＤＲＨ３に対する突然変異を有するライブラリを変異ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリと組み合わせることができる。一実施態様では、このＣＤＲＨ１ライブラリは、２８、３０、３１、３２及び３３番目の位置に変異アミノ酸を有するヒト化抗体４Ｄ５配列を用いて作製する。ＣＤＲＨ２ライブラリは、所定のコドンセットを用いて５０、５２、５３、５４、５６及び５８番目の位置に変異アミノ酸を有するヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いて作製することができる。
【０１０９】
（ｘｉ）抗体変異体
ファージライブラリから作製した新規の抗体を、さらに修飾して、元の抗体に対して改善された物理学的、化学的及び／又は生物学的性質を有する抗体変異体を作製することができる。使用するアッセイが生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は、選択したアッセイにおける生物活性がこのアッセイにおけるその元の抗体の生物活性よりも少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約２０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、時として少なくとも約１００倍又は２００倍優れていることが好ましい。例えば、抗ＣＲＩｇ抗体変異体は、ＣＲＩｇに対する結合親和性がその元の抗体の結合親和性よりも少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約２０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、時として少なくとも約１００倍又は２００倍強いことが好ましい。
【０１１０】
抗体変異体を作製するためには、元の抗体の１つ以上の超可変領域に１つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換）を導入する。或いは、又はさらに、元の抗体にフレームワーク領域の残基の１つ以上の改変（例えば、置換）を導入することができ、この場合、こうした改変は第２の哺乳動物種からの抗原に対する抗体変異体の結合親和性の改善をもたらす。修飾すべきフレームワーク領域残基の例としては、抗原を非共有結合で直接結合するもの（Ａｍｉｔほか、（１９８６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：ｐ．７４７−７５３）、ＣＤＲの高次構造と相互作用し、／これに影響を及ぼすもの（Ｃｈｏｔｈｉａほか、（１９８７年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １９６：ｐ．９０１−９１７）及び／又はＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの（ＥＰ  ２３９  ４００Ｂ１）が挙げられる。特定の実施態様では、１個以上のそのようなフレームワーク領域残基を修飾することによって、第２の哺乳動物種由来の抗原に対する抗体の結合親和性が増強される。例えば、本発明のこの実施態様では約１個乃至約５個のフレームワーク残基を改変することができる。時として、これは、超可変領域の残基が何ら改変されていない場合でさえ、前臨床試験に使用するのに適した抗体変異体をもたらすのに十分な場合がある。しかしながら、通常は、この抗体変異体は更に超可変領域の改変（単数又は複数）を含むことになる。
【０１１１】
改変される超可変領域残基は、特に元の抗体の出発結合親和性が、無作為に作製された抗体変異体を容易にスクリーニングすることができるほどのものである場合には、無作為に変化させることができる。
【０１１２】
そのような抗体変異体を作製するための一つの有用な方法は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：ｐ．１０８１−１０８５）と呼ばれる。この場合、１個以上の超可変領域残基（単数又は複数）をアラニン又はポリアラニン残基（単数又は複数）によって置換することにより、第２の哺乳動物由来の抗原とこれらのアミノ酸との相互作用が影響される。次いで、置換に対する機能的感受性を示すこうした超可変領域残基（単数又は複数）を、置換部位において、又はこうした部位に対して更なる又は他の突然変異を導入することによって改良する。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異の種類自体は予め決める必要はない。このようにして作製したａｌａ変異体については、本明細書に記載したようにしてその生物活性をスクリーニングする。
【０１１３】
通常は、「好ましい置換」と題して以下に示したもののような保存的置換で始める。このような置換により生物活性（例えば、結合親和性）に変化が生じる場合には、下表で「例示的な置換」と称し、又はさらにアミノ酸クラスを基準として以下に記載したより大きな変更を導入し、得られる生成物をスクリーニングにかける。
【０１１４】
好ましい置換：
【０１１５】
【化１−１】
2010526076.tif 000002
【０１１６】
【化１−２】
2010526076.tif 000003
【０１１７】
【化１−３】
2010526076.tif 000004
抗体の生物学的性質の更により実質的な修飾は、（ａ）例えばシートもしくはヘリカル構造としての、置換領域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持に対する効果が有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然の残基は共通の側鎖特性に基づいて以下のように群分けされる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ，  ｓｅｒ，  ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ，  ｇｌｕ；
（４）塩基性：ｈｉｓ，  ｌｙｓ，  ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ，  ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ，  ｔｙｒ，  ｐｈｅ。
【０１１８】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスのものと交換するものである。
【０１１９】
別の実施態様では、修飾のために選択した部位をファージディスプレイ（上記参照）を使用して親和性成熟させる。
【０１２０】
アミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は当該分野で周知の様々な方法により調製される。これらの方法としては、元の抗体の先に調製された変異体又は非変異体型のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されるものではない。変異体を作製するための好ましい方法は部位特異的突然変異誘発（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：ｐ．４８８参照）である。
【０１２１】
特定の実施態様では、抗体変異体は単に、単一の超可変領域残基が置換されたものとなる。他の実施態様では、元の抗体の２個以上の超可変領域残基が置換され、例えば、約２乃至約１０個の超可変領域置換である。
【０１２２】
通常、生物学的性質が改善された抗体変異体は、元の抗体の重鎖又は軽鎖の何れかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性又は類似性は、これらの配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大の配列同一性百分率とした後の、元の抗体の残基と同一（即ち、同じ残基）又は同様（即ち、共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基、上記参照）である、候補配列におけるアミノ酸残基の百分率と本明細書では定義する。可変ドメインの外側の抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端もしくは内部の伸長、欠失、又は挿入は、何れも配列同一性又は類似性に影響を及ぼすものとは見なさないものとする。
【０１２３】
抗体変異体の作製後、その分子の生物活性を元の抗体と比較して測定する。上述のように、これは、抗体の結合親和性及び／又は他の生物活性を測定するものである。本発明の好ましい実施態様では、抗体変異体のパネルを調製し、抗原又はその断片に対する結合親和性についてスクリーニングする。この最初のスクリーニングから選択した抗体変異体のうちの１種以上を任意選択的に１種以上の別の生物活性アッセイにかけて、この結合親和性が増強された抗体変異体（類）が、（例えば前臨床研究に）実際に有用であることを確認する。
【０１２４】
このようにして選択した抗体変異体（類）は、多くの場合、抗体の目的とする用途に応じて更に修飾することができる。このような修飾は、アミノ酸配列をさらに改変し、異種ポリペプチド（単数又は複数）と融合させ、及び／又は以下に詳述するような共有結合により修飾するものである。アミノ酸配列改変については例示的な修飾を上記で詳細に説明した。例えば、抗体変異体の固有の高次構造を維持することに関与しない任意のシステイン残基を（一般にはセリンで）置換して、分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防止することもできる。逆に、システイン結合（単数又は複数）を抗体に付加することによって、（特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合）その安定性を改善することができる。別のタイプのアミノ酸変異体はグリコシル化パターンが改変されたものである。これは、抗体に存在する炭水化物部分を１つ以上欠失させ、及び／又は抗体に存在しないグリコシル化部位を１つ以上加えることにより達成される。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）が炭水化物部分をアスパラギン側鎖に酵素的に結合させるための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、グリコシル化部位を生じさせることが可能である。Ｏ結合グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン（但し５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンもまた使用できる）へ糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースのうちの１つが結合することを意味する。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが上述のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変することによってうまい具合に達成される（Ｎ結合グリコシル化部位の場合）。この改変は、元の抗体の配列への１個以上のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によって行うこともできる（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。
【０１２５】
（ｘｉｉ）抗体の組換え法による作製
抗体の組換え法による作製のために、これをコードする核酸を単離し、複製可能なベクター中に挿入してさらにクローニング（ＤＮＡの増幅）するか、発現させた。上記モノクロナール抗体をコードしているＤＮＡは、容易に単離することができ、通常の手順を用いて（例えば、この抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチド・プローブを用いて）配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分としては、一般に、次のうちの１種以上が挙げられるが、これらに限定されるものではない：シグナル配列、複製起点、１種以上のマーカ遺伝子、エンハンサー配列、プロモータ、及び転写終結配列（これらは、例えば、特に引用により本明細書に組み込まれている米国特許第５，５３４，６１５号に記載されている）。
【０１２６】
本明細書に記載のベクター中のＤＮＡをクローニングし又は発現させるための好適な宿主細胞は、上述の原核、酵母、又は高等真核細胞である。この目的のための好適な原核細胞としては、グラム陰性又はグラム陽性微生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｆｉａ属（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及びＳｈｉｇｅｉｌａ属）などの腸内細菌科細菌並びにＢａｃｉｌｌｕｓ属（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属などの真正細菌が挙げられる。一つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主はＥ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他のＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの株も好適である。これらの例は単なる例示に過ぎず、限定的なものではない。
【０１２７】
原核性細胞の他に、糸状菌または酵母等の真核性微生物も、抗体コードベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又は通常のパン酵母は、下等真核性宿主微生物の中では最も一般的に使用されている。しかしながら、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ及びＫ．  ｍａｒｘｉａｎｕｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；並びに、例えばＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、及びＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主などの糸状菌のような多くの他の属、種及び株が一般的に入手可能であり、本明細書において有用である。
【０１２８】
グリコシル化抗体の発現のための好適な宿主細胞は多細胞生物由来である。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株及び変異体とこれに対応する許容状態の昆虫宿主細胞として、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモ虫）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ等の宿主から細胞が特定されている。例えばＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変異体及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株等の形質移入用の多くのウイルス株が公的に入手可能であり、このようなウイルスは、本発明に従って本明細書のウイルスとして、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の形質移入のために使用することができる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物培養細胞も宿主として利用することができる。
【０１２９】
しかしながら、最も関心が持たれているのは脊椎動物細胞であり、培養（組織培養）で脊椎動物細胞を増殖させるのは常法になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎細胞系（２９３または懸濁培養で増殖のためにサブクロ−ニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍほか、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．  ３６：ｐ．５９  （１９７７年））；仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：ｐ．４２１６（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３：ｐ．２４３−２５１（１９８０年））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸部腫瘍細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒほか、Ａｎｎａｌ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ３８３：ｐ．４４−６８（１９８２年））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；並びにヒト肝癌系（Ｈｅｐ  Ｇ２）がある。
【０１３０】
宿主細胞は、抗体作製用の上記発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモータを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改良した通常の栄養培地で培養する。
【０１３１】
本発明の抗体を作製するために用いる宿主細胞は種々の培地で培養することができる。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ社）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  （（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ社）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ社）などの市販の培地がこうした宿主細胞を培養するのに適切である。さらに、Ｈａｍほか、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．  ５８：ｐ．４４（１９７９年）、Ｂａｒｎｅｓほか、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０２：ｐ．２５５（１９８０年）、米国特許第４，７６７，７０４号、同４，６５７，８６６号、同４，９２７，７６２号、同４，５６０，６５５号もしくは同５，１２２，４６９号、ＷＯ  ９０／０３４３０、ＷＯ  ８７／００１９５又は米国再発行特許第３０，９８５号に記載されている培地のいずれかを上記宿主細胞の培養培地として用いることができる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標））、微量元素（最終濃度が通常マイクロモル範囲で存在する無機化合物として定義される）及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者には周知であると思われる適当な濃度で含めることができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選ばれる宿主細胞に対してこれまでに用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１３２】
組換え法を用いた場合、上記抗体は細胞内、細胞周辺腔内で産生させ、又は直接培地内に分泌させることができる。この抗体を細胞内で産生させる場合、第一の工程として、宿主細胞又は溶解細胞のいずれであれ、粒子状デブリを、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去する。抗体を培地中に分泌させる場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販の蛋白質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の工程のいずれかに含めて、蛋白質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含ませて外来性の汚染菌の増殖を防止してもよい。
【０１３３】
こうした細胞から調製した抗体組成物は、例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを用いて精製することができ、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適切性は、この抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプによって決まる。プロテインＡは、ヒトγ１，γ２またはγ４重鎖（Ｌｉｎｄｍａｒｋほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．  ６２：ｐ．１−１３（１９８３年））に基づいている抗体を精製するために用い得る。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプ及びヒト・ガンマ３（Ｇｕｓｓほか、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５：ｐ．１５６７−１５７５（１９８６年））に対して推奨される。親和性リガンドが結合するマトリックスは、最も一般的にはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。調整細孔性ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスによって、アガロースを用いて達成できるよりも早い流速及び短いプロセッシング時間が可能となる。上記抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．  Ｔ．  Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ．）が精製のために有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムなど）、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他の蛋白質精製法も、回収対象の抗体に応じて利用可能である。
【０１３４】
ＣＲＩｇアンタゴニストの用途
遮断抗ＣＲＩｇ抗体及びその断片を初めとする本発明のＣＲＩｇアンタゴニストは、細胞内病原体の細胞内侵入を阻止し、及び／又は血中から病原体を除去するのに用いることができる。従って、本明細書のＣＲＩｇアンタゴニストはこのような病原体によって起こる感染症を予防し、及び／又は治療するのに用いることができる。そのような感染症としては、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ：）、Ａ型、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）などのウイルス疾患；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ属、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属などの寄生生物によって起こる疾患；並びにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（特に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属によって起こる感染などの細菌感染症及びＣａｎｄｉｄａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉによって起こるような真菌感染が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１３５】
さらに、遮断抗ＣＲＩｇ抗体及びその断片を初めとする本発明のＣＲＩｇアンタゴニストは、補体受容体ＣＲＩｇを介する赤血球又は血小板の望ましくないクリアランスを防止するのに用いることができる。その結果、本明細書のアンタゴニストは溶血性貧血及び／又は血小板減少症の予防又は治療に有用である。
【０１３６】
本明細書の化合物の治療用製剤は、所望の純度を有する（抗体などの）同定された化合物を、任意選択的に、生理学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記文献）と混合して凍結乾燥ケーク又は水溶液とすることにより保存用に調製する。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに毒性がないものであり、このようなものとしては、リン酸、クエン酸及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を初めとする抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどの蛋白質ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１３７】
インビボ投与に使用される化合物は無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及びそれからの戻しの前又は後に、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０１３８】
治療用組成物は、滅菌アクセスポート、例えば、皮下注射針が貫通可能なストッパーを有する静脈内投与溶液バッグ又はバイアルを有する容器に入れることができる。
【０１３９】
投与経路は、既知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内もしくは病巣内経路による注射もしくは注入、局所投与又は下記のような持続放出製剤による投与によく適合する。
【０１４０】
脳内使用の場合、上記化合物はＣＮＳの液リザーバ中に注入により連続的に投与することができるが、急速静注が適格である。こうした化合物は、脳室内に投与するか、そうでない場合はＣＮＳもしくは脊髄液内に導入することが好ましい。投与はポンプなどの連続投与手段を用いて留置カテーテルによって実施することができ、又は持続放出ビヒクルの埋め込み、例えば脳内埋め込みによって投与することができる。より具体的には、上記化合物は、慢性的に埋め込んだカニューレを介して注射するか、浸透圧ミニポンプの助けを借りて慢性的に注入することができる。小チューブを介して脳室に蛋白質を送達させる皮下ポンプが利用可能である。高度に精巧なポンプは皮膚を通して補充することができ、その送達速度は外科的な介入なしに設定することができる。皮下ポンプ装置又は完全埋め込み型薬物送達装置を介する連続脳室内注入を含む好適な投与プロトコール及び送達システムの例には、Ｈａｒｂａｕｇｈ、Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ．Ｓｕｐｐｌ、２４：ｐ．２７１（１９８７年）及びＤｅＹｅｂｅｎｅｓほか、Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．  ２：ｐ．１４３（１９８７年）に記載されている、アルツハイマー病患者及びパーキンソン病の動物モデルに対するドーパミン、ドーパミン作動性アゴニスト及びコリン作動性アゴニストの投与に用いられるものがある。
【０１４１】
持続放出製剤の好適な例としては、成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎほか、１９８３、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：ｐ．５４７）、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）（Ｌａｎｇｅｒほか、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．  １５：ｐ．１６７及びＬａｎｇｅｒ、１９８２、Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．  １２：ｐ．９８）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒほか、同上）又はポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ  １３３，９８８Ａ）が挙げられる。持続放出組成物としては、自体公知の方法により調製することができる（Ｅｐｓｔｅｉｎほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８２：ｐ．３６８８（１９８５年）；Ｈｗａｎｇほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：ｐ．４０３０（１９８０年）；米国特許第  ４，４８５，０４５号及び同４，５４４，５４５号並びにＥＰ  １０２，３２４Ａ）リポソームに取り込ませた化合物が挙げられる。通常、こうしたリポソームは、小さな（約２００乃至８００オングストローム）単層型であり、その脂質含量は３０モル％コレステロール超であるが、最適治療のために特定の割合を調整する。
【０１４２】
治療的に用いる活性化合物の有効量は、例えば、治療対象、投与経路及び患者の状態によって決まることになる。従って、治療専門家は、最適な治療効果を得るために必要とされるように、投薬量を力価測定し、投与経路を変更する必要があることになる。代表的な１日投与量は、上述の要因に応じて約１μｇ／ｋｇ乃至最大１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲とすることができる。通常、臨床医は、神経機能を修復し、維持し、任意選択的に回復させる投与量が達成されるまで、活性化合物を投与することになる。この治療の経過は通常のアッセイによって容易にモニターすることができる。
【０１４３】
本発明の更なる詳細については以下の実施例によって説明するが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１４４】
（実施例１）
ｍｕＣＲＩｇ及びｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔに対するモノクロナール抗体の作製
マウスＣＲＩｇ（ｍｕＣＲＩｇ）に対するモノクロナール抗体は、免疫付着因子マウス（ｍｕ）ＣＲＩｇ−ｍＦｃ（ＰＵＲ９４６５、マウスＩｇＧ１のＣ末端Ｆｃ部分に融合させたマウスＣＲＩｇ）２μｇ含有モノホスホリル脂質Ａ／トレハロースジコリノミコレートアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ社、ハミルトン、モンタナ州）をＢ６（ＫＯ）マウスＪａｍ４  ６Ｅ３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）の足蹠に１１回注射することによって作製した。マウスの膝窩リンパ節をＰ３Ｘ６３Ａｇ．Ｕ．ｌ（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１９５７）骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞は、ｍｕＣＲＩｇに対する結合親和性についてｍｕＣＲＩｇ−ＬＦＨ（ＰＵＲ９０５２、ロイシンジッパー、フラッグ及び（８×）ヒスチジンタグに結合させたマウスＣＲＩｇ）に対してスクリーニングした。抗体産生細胞株を限界希釈法によってクローニングした。
【０１４５】
別の実験において、ｍｕＣＲＩｇ及びｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔに対するモノクロナール抗体を、ｍｕＣＲＩｇ−ｈＦｃ（ＰＵＲ  ９４６０、マウスＩｇＧ１のＣ末端Ｆｃ部分を含むマウスＣＲＩｇ）及びｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ−ｈｕＦｃ（ＰＵＲ  １０１２５、ヒトＩｇＧ１のＣ末端Ｆｃ部分を含むヒトＣＲＩｇ短縮型）各２μｇ含有モノホスホリル脂質Ａ／トレハロースジコリノミコレートアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ社、ハミルトン、モンタナ州）をＢ６（ＫＯ）マウスＪａｍ４  ６Ｅ３の足蹠に１１回注射することでｍｕＣＲＩｇ−ｈＦｃとｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ−ｈｕＦｃとを同時免疫することによって作製した。マウスの膝窩リンパ節をＰ３Ｘ６３Ａｇ．Ｕ．ｌ骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞は、ｍｕＣＲＩｇ、ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ又はこれらの両方に対する結合親和性についてｍｕＣＲＩｇ及びｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔに対してスクリーニングした。抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法によってクローニングした。
【０１４６】
マウスＣＲＩｇ−ｉＣ３ｂ／Ｃ３ｂ又はヒトＣＲＩｇ−ｉＣ３ｂ／Ｃ３ｂ結合の遮断能に関するハイブリドーマ上清の特性を図４及び図５に示した。
【０１４７】
（実施例２）
ｍｕＣＲＩｇ及びｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔに対するモノクロナール抗体の更なる特性の決定
抗ＣＲＩｇ遮断抗体とインキュベートしたＣＲＩｇ発現ＣＨＯ細胞に対するｉＣ３ｂ結合の阻害：４００，０００個のＣＨＯ細胞をこうした抗体で４℃２５分間被覆し、１×洗浄した。５μｇ／ｍｌ（２７ｎＭ）のｉＣ３ｂを４℃で３０分間添加した後、洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎで分析した。その結果は図６に示した。
【０１４８】
ＣＲＩｇ＋腹膜マクロファージに対するｉＣ３ｂ結合の遮断：腹膜細胞を洗浄し、一度遠心し、１％ゼラチン、１ｍＭ  Ｃａ＋＋及び１ｍＭ  Ｍｇ＋＋（ＧＶＢ＋＋）を含有するベロナール緩衝液に再懸濁した。細胞を、内毒素を含まないモノクロナール抗体（抗ＣＲＩｇ  ｍＡｂ、クローン２Ｈ１及びアイソタイブ対照）と共に、又はこれなしにインキュベートした。３０分間インキュベートした後、細胞を種々の濃度のＡ４８８標識ｉＣ３ｂ（Ａｄｖｅｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）とインキュベートした。次いで、細胞を（上記のように）ＦｃＲ媒介結合について遮断し、１７Ｃ９−Ａ６４７及びＦ４／８０−ＰＥについて染色した。ＣＲＩｇｈｉｇｈ  Ｆ４／８０ｈｉｇｈ及び  ＣＲＩｇｎｅｇ  Ｆ４／８０ｈｉｇｈ細胞に対する補体蛋白質の結合について評価した。その結果は図７に示した。
【０１４９】
インビトロにおけるＣＲＩｇ＋腹膜マクロファージへのＬｉｓｔｅｒｉａ  Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ結合の阻害：腹膜細胞を洗浄し、Ｍ１／７０又は２Ｈ１モノクロナール抗体と共に、又はこれなしにインキュベートした。ＬＭ−Ａ４８８をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ：Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に懸濁し、Ｃ３ノックアウトもしくは野生型マウス血清（１０％）と混合した後、３７℃で３０分間回転させた。次いで、血清オプソニン化ＬＭ−Ａ４８８をＲＰＭに添加し、ロッカで３７℃３０分間混和した。細胞を氷上で冷やし、ＦｃＲ媒介結合について遮断した後、１７Ｃ９−Ａ６４７及びＦ４／８０−ＰＥについて染色した。さらに、細胞を７−ＡＡＤとインキュベートして死細胞及びデブリを検出した。氷上で数分間インキュベートした後に、細胞を２度洗浄して未結合の７−ＡＡＤ及び抗体を除去した。細胞をＨＢＳＳに懸濁し、１％ホルムアルデヒドで１６時間固定した後、４色フローサイトメトリー装置を通した。その結果は図８に示した。
【０１５０】
血中からのＬｉｓｔｅｒｉａ  Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのクリアランスの阻害：マウスに対して、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｍ．を感染させる前日に１４Ｇ８遮断抗体１００μｇを２回注射した。注射の間隔は６時間とした。１日後、マウスに２×１０７ＣＦＵのＬｉｓｔｅｒｉａ  Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを感染させた。１０分後に採血し、脳心臓浸出物プレートで一夜増殖させたコロニーを計数することで細菌の有無を分析した。その結果は図９に示した。
【０１５１】
血中からのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓＭ株のクリアランスの阻害：この実験に用いた方法は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの代わりに２×１０７ＣＦＵのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓＭ株をｉ．ｖ．注射した以外は、上記の通りとした。図１０に示した結果から、試験したＣＲＩｇ遮断抗体が血中からのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓＭ株のクリアランスを阻害することにより、肝臓の細菌負荷が低下し、心臓、脾臓及び腎臓の細菌負荷が増大することが分かる。
【０１５２】
遮断マウスＣＲＩｇ抗体による処置によって受動関節炎のマウスモデルの足腫脹が抑制される（図１１Ａ、Ｂ）。動物は全て滅菌病原体除去条件下に維持し、動物実験はＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社の施設内動物管理使用委員会により承認された。関節炎は６週令のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）に関節炎を発症させるモノクロナール抗体混合物を注射して誘発させた。簡単に言えば、マウスに抗ＩＩ型コラーゲン抗体２ｍｇを静脈内注射し、３日後にＬＰＳ２５μｇを腹腔内注射した。抗体注射の前日に４ｍｇ／ｋｇのＣＲＩｇ−Ｆｃ又はｇｐ−１２０に対する抗体（ＩｇＧ１アイソタイプ、対照−ＦＣ）による処置を開始した。臨床的評点づけは、治療の種類について知らされていない訓練された要員によって実施された。
【０１５３】
マウス及びヒトＣＲＩｇの両方に結合する遮断抗体。マウスＣＲＩｇ（ｍｕＣＲＩｇ）又は短鎖及び長鎖型ヒトＣＲＩｇ（ｈｕＣＲＩｇ（Ｓ）、ｈｕＣＲＩｇ（Ｌ））を発現するＣＨＯ細胞をＡｌｅｘａ−４８８結合抗体と共に４℃で２５分間インキュベートし、洗浄してＦＡＣＳｃａｎで分析した。その結果は図１２に示した。
【０１５４】
Ｃ３断片とのマウス及びヒトＣＲＩｇの結合の交差遮断モノクロナール抗体による阻害。抗ＣＲＩｇ遮断抗体とインキュベートしたマウスＣＲＩｇ発現ＣＨＯ細胞及びヒトＣＲＩｇ発現ＴＨＰ−１細胞に対するｉＣ３ｂ結合の阻害：４００，０００個のＣＨＯ細胞又はＴＨＰ−１を上記抗体で４℃２５分間被覆し、１×洗浄した。５μｇ／ｍｌ（２７ｎＭ）ｉＣ３ｂを４℃で３０分間添加した後、洗浄してＦＡＣＳｃａｎで分析した。その結果は図１３に示した。
【０１５５】
表１に、マキシソーププレートに被覆されたＣＲＩｇ融合蛋白質への結合、フローサイトメトリーにより観察した細胞表面のＣＲＩｇへの結合及びＣＲＩｇ−Ｃ３ｂ／ｉＣ３ｂ相互作用の遮断に基づくＣＲＩｇ抗体の特性解析結果をまとめた。
【０１５６】
その後、抗ＣＲＩｇ抗体をコードするｃＤＮＡをブダペスト条約の条項に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０−２２０９、米国（ＡＴＣＣ）に寄託した。
【０１５７】
材料        ＡＴＣＣ寄託番号            寄託日
１４Ｇ８    ＰＴＡ−８２９８            ２００７年３月２７日
３Ｄ１０    ＰＴＡ−８２９９            ２００７年３月２７日
２Ｈｌ      ＰＴＡ−８３００            ２００７年３月２７日
これらの寄託は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則（ブダペスト条約）に従って行った。これは、寄託日から３０年間、寄託の生存可能な培養物の維持を保証する。寄託物はブダペスト条約の条項の下で、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社とＡＴＣＣとの間の合意を条件として、ＡＴＣＣ  によって入手可能となり、これは、適切な米国特許が発行された時点、またはあらゆる米国または外国特許出願が公開された時点のどちらが先にきても、寄託物の培養物の子孫を、公衆が永続的に無制限に入手できることを保証する。そして、３５ＵＳＣ§１２２  およびそれに準ずるＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ’ｓ  ｒｕｌｅｓ  （８８６ＯＧ６８３に特に言及している３７Ｃ  ．Ｆ．Ｒ．§１．１４  を含む）  によって、米国特許庁長官によってその権利があると決定されたものが子孫を入手できることを保証する。本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が適切な条件下で培養されている時に死滅または失われたまたは破壊された場合、通知に基づいて直ちにもう１つの同じものと交換することに同意した。寄託した材料の入手可能性は、あらゆる政府の権威のもとでその特許法に従って授与された権利に違反して本発明を実施するライセンスとは解釈されるべきではない。
【０１５８】
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献は、その全体が引用により本明細書に明確に組み込まれている。
【０１５９】
本発明を具体的な実施態様であると考えられるものに関して説明してきたが、本発明をこのような実施態様に限定するものでないことは言うまでもない。これとは逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれる種々の修正及び均等物を保護しようとするものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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