(57)【要約】  水溶性ポリエチレングリコール成分と、カチオン性ポリエチレンイミン成分と、分解可能ユニット成分とを有する水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを含む、ｓｉＲＮＡ送達のための組成物が記載される。本発明の組成物は、ｓｉＲＮＡを細胞（具体的には、ガン細胞）に送達するために使用することができる。本発明の組成物は固体表面（例えば、マルチウエルプレートなど）に適用することができ、その結果、ｓｉＲＮＡの送達を固体表面において行うことができる。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）繰り返し骨格のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ユニット、
（ｂ）繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ユニット、および
（ｃ）側鎖脂質基を含む、繰り返し骨格の分解可能ユニット
を含む水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを含む、ｓｉＲＮＡ送達のための組成物。
【請求項２】
前記繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットが約５０ダルトン〜約５，０００ダルトンの範囲での分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットが約４００ダルトン〜約６００ダルトンの範囲での分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットが約２００ダルトン〜約２５，０００ダルトンの範囲での分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットが約６００ダルトン〜約２，０００ダルトンの範囲での分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記繰り返し骨格の分解可能ユニットが、下記の式（Ｉ）：
【化１】
2010530013.tif 000011
（式中、
Ａ１は非存在であるか、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニルおよび−（ＣＨ２）ｎ１−Ｄ−（ＣＨ２）ｎ２−からなる群から選択される場合により置換された置換基であり、
ただし、ｎ１およびｎ２はそれぞれが独立して、０、または、１〜１０の範囲における整数であり、かつ
Ｄは、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基である；
Ａ２は非存在であるか、あるいは、酸素原子または−Ｎ（ＲＮ）であり、ただし、ＲＮはＨまたはＣ１〜６アルキルである；
Ｒ１は、電子対、または、水素、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基であり、
ただし、Ｒ１が、水素、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基であるならば、Ｒ１が結合する窒素原子は正電荷を有する；および
Ｒ２は、Ｃ２〜Ｃ５０アルキル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ５０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ５〜Ｃ５０アリール、Ｃ５〜Ｃ５０ヘテロアリール、−（ＣＨ２）ｐ１−Ｅ−（ＣＨ２）ｐ２−およびステロールからなる群から選択され、
ただし、ｐ１およびｐ２はそれぞれが独立して、０、または、１〜４０の範囲における整数であり、かつ
Ｅは、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基である）
の繰り返しユニットを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
Ｒ２が、オレイル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、マルガリル、ステアリル、アラキジル、ベヘニル、リグノセリルおよびステロールからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ２がオレイルである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記繰り返し骨格の分解可能ユニットが、
【化２】
2010530013.tif 000012
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記繰り返し骨格のＰＥＩユニットが約１２００ダルトンの分子量を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記繰り返し骨格のＰＥＩユニットが分岐型ＰＥＩユニットである、請求項９〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記繰り返し骨格のＰＥＩユニットが約４５４ダルトンの分子量を有する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約９５モル％の前記繰り返し骨格の分解可能ユニットを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約３０モル％〜約９０モル％の前記繰り返し骨格の分解可能ユニットを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約５０モル％〜約８６モル％の前記繰り返し骨格の分解可能ユニットを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約３５モル％の前記繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約２０モル％の前記繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約５モル％〜約１５モル％の前記繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約８０モル％の前記繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約５０モル％の前記繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約５モル％〜約３０モル％の前記繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約８モル％〜約３０モル％の前記繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを作製する方法であって、
繰り返しエチレンイミンユニットを含む第１の反応物を有機溶媒に溶解して、溶解または部分的に溶解されたポリマー反応物を形成すること；
溶解または部分的に溶解されたポリマー反応物を分解可能なモノマー反応物と反応させて、分解可能な架橋されたポリマーを形成すること（ただし、分解可能なモノマー反応物が脂質基を含む）；および
分解可能な架橋されたポリマーを第３の反応物と反応させること（ただし、第３の反応物が繰り返しポリエチレングリコールユニットを含む）
を含む、方法。
【請求項２４】
前記第１の反応物がポリエチレンイミンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記分解可能なモノマー反応物が、下記の式（ＩＩ）：
【化３】
2010530013.tif 000013
（式中、
Ａ１は非存在であるか、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニルおよび−（ＣＨ２）ｎ１−Ｄ−（ＣＨ２）ｎ２−からなる群から選択される場合により置換された置換基であり、
ただし、ｎ１およびｎ２はそれぞれが独立して、０、または、１〜１０の範囲における整数であり、かつ
Ｄは、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基である；
Ａ２は非存在であるか、あるいは、酸素原子または−Ｎ（ＲＮ）であり、ただし、ＲＮはＨまたはＣ１〜６アルキルである；
Ｒ１は、電子対、または、水素、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基であり、
ただし、Ｒ１が、水素、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基であるならば、Ｒ１が結合する窒素原子は正電荷を有する；および
Ｒ２は、Ｃ２〜Ｃ５０アルキル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ５０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ５〜Ｃ５０アリール、Ｃ５〜Ｃ５０ヘテロアリール、−（ＣＨ２）ｐ１−Ｅ−（ＣＨ２）ｐ２−およびステロールからなる群から選択され、
ただし、ｐ１およびｐ２はそれぞれが独立して、０、または、１〜４０の範囲における整数であり、かつ
Ｅは、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基である）
の化合物である、請求項２３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
Ｒ２が、オレイル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、マルガリル、ステアリル、アラキジル、ベヘニル、リグノセリルおよびステロールからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｒ２がオレイルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第３の反応物がポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコールである、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
式（ＩＩ）の前記化合物および前記ＰＥＩが約０．１：１〜約５０：１の範囲におけるモル比でそれぞれ存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
式（ＩＩ）の前記化合物および前記ＰＥＩが約１：１〜約３０：１の範囲におけるモル比でそれぞれ存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
式（ＩＩ）の前記化合物および前記ＰＥＩが約５：１〜約２５：１の範囲におけるモル比でそれぞれ存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＰＥＧおよび前記ＰＥＩが約０．１：１〜約１２：１の範囲におけるモル比でそれぞれ存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＰＥＧおよび前記ＰＥＩが約１：１〜約１０：１の範囲におけるモル比でそれぞれ存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＰＥＧおよび前記ＰＥＩが約１：１〜約４：１の範囲におけるモル比でそれぞれ存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞内に送達する方法であって、
請求項１〜２２のいずれか一項に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを前記ｓｉＲＮＡと一緒にして、混合物を形成すること、および
１つまたは複数の細胞を前記混合物と接触させること
を含む、方法。
【請求項３６】
前記ｓｉＲＮＡが１９塩基対〜２７塩基対である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３５〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記哺乳動物細胞がガン細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｓｉＲＮＡが、リポタンパク質遺伝子セグメントのコード領域の少なくとも一部分に対応するｓｉＲＮＡである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記リポタンパク質がアポリポタンパク質Ｂである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーと複合体化される、リポタンパク質遺伝子セグメントのコード領域の少なくとも一部分に対応するｓｉＲＮＡの治療効果的な量をその必要性のある対象に投与することを含む、心臓血管疾患を処置するか、または、心臓血管疾患の危険性を低下させる方法。
【請求項４２】
前記リポタンパク質がアポリポタンパク質Ｂである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
トランスフェクション剤を含む組成物が少なくとも部分的に付着する固体表面を含む、真核生物細胞をｓｉＲＮＡによりトランスフェクションするためのデバイスであって、前記トランスフェクション試薬が、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマー、カチオン性ポリマー、リポポリマー、ＰＥＧ化されたカチオン性ポリマー、ＰＥＧ化されたリポポリマー、カチオン性脂質、ＰＥＧ化されたカチオン性脂質、および、カチオン性の分解可能なＰＥＧ化されたリポポリマーからなる群から選択される、デバイス。
【請求項４４】
前記固体表面が、ディッシュの底、マルチウエルプレート、連続表面、ビーズ、繊維またはペレットである、請求項４３に記載のデバイス。
【請求項４５】
前記固体表面が、ポリスチレン樹脂、エポキシ樹脂、天然樹脂、ガラスまたは金属である、請求項４３に記載のデバイス。
【請求項４６】
前記トランスフェクション試薬が、前記試薬を手作業または自動化された機構により前記固体表面に一様に塗布することによって、あるいは、前記トランスフェクション試薬を手作業または自動化された機構により前記固体表面にスポットすることによって前記表面に付着させられる、請求項４３に記載のデバイス。
【請求項４７】
前記トランスフェクション剤が水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである、請求項４３に記載のデバイス。
【請求項４８】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、
（ａ）繰り返し骨格のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ユニット、
（ｂ）繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ユニット、および
（ｃ）側鎖脂質基を含む、繰り返し骨格の分解可能ユニット
を含む、請求項４７に記載のデバイス。
【請求項４９】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、分子量が約１２００ダルトンである繰り返し骨格のＰＥＩユニットと、分子量が約４５４ダルトンである繰り返し骨格のＰＥＧユニットと、
【化４】
2010530013.tif 000014
である繰り返し骨格の分解可能ユニットとを含む、請求項４８に記載のデバイス。
【請求項５０】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーの分子量が約５００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲にある、請求項４８〜４９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５１】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーの分子量が約２０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンの範囲にある、請求項４８〜４９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５２】
ｓｉＲＮＡが真核生物細胞の中に入ることができるかどうかを判定する方法であって、
（ａ）請求項４３に記載されるデバイスを提供すること、
（ｂ）ｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡがトランスフェクション試薬と相互作用するように前記デバイスに加えること、
（ｃ）真核生物細胞を細胞内へのｓｉＲＮＡの導入のための十分な密度および適切な条件で前記デバイスに播種すること、および
（ｄ）ｓｉＲＮＡが細胞の中に入っているかどうかを検出すること
を含む、方法。
【請求項５３】
前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳動物細胞が分裂細胞または非分裂細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記哺乳動物細胞が形質転換細胞または初代細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記哺乳動物細胞が体細胞または幹細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記真核生物細胞が植物細胞または昆虫細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
ｓｉＲＮＡを真核生物細胞に導入するための方法であって、
（ａ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにより少なくとも部分的に被覆される固体表面を提供すること、
（ｂ）真核生物細胞に導入されるためのｓｉＲＮＡを細胞表面に加えること、および
（ｃ）細胞を真核生物細胞内へのｓｉＲＮＡの導入のための十分な密度および適切な条件で前記固体表面に播種すること
を含む、方法。
【請求項５９】
前記固体表面が、フラスコ、ディッシュ、マルチウエルプレート、ガラススライドおよび埋め込みデバイスからなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記試薬を手作業または自動化された機構により前記固体表面に一様に塗布することによって、あるいは、前記トランスフェクション試薬を手作業または自動化された機構により前記固体表面にスポットすることによって前記表面に付着させられる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記哺乳動物細胞が分裂細胞または非分裂細胞である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記哺乳動物細胞が形質転換細胞または初代細胞である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記哺乳動物細胞が体細胞または幹細胞である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記真核生物細胞が植物細胞または昆虫細胞である、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は米国仮特許出願第６０／９７２，６８６号（２００７年９月１４日出願）および米国仮特許出願第６０／９４２，１２７号（２００７年６月５日出願）の優先権を主張する。両出願は参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（配列表）
本出願は電子的形式での配列表と一緒に出願されている。配列表は、ＮＤＴＣＯ−０６８ＰＲ２−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ＴＸＴと題されるファイル（２００７年９月１４日作製、これはサイズが２Ｋｂである）として提供される。配列表の電子的形式での情報はその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の分野
本明細書中に記載される様々な実施形態が、ｓｉＲＮＡを細胞内に送達するための組成物および方法に関連する。より具体的には、本明細書中に記載される様々な実施形態が、ｓｉＲＮＡを細胞内に送達するための水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにより被覆されるプレートに関連する。
【０００４】
（関連技術の記載）
数多くの技術が、プラスミドＤＮＡによりコードされたｓｉＲＮＡを細胞内に送達するために利用可能である。例えば、ポリ（Ｌ−リシン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、キトサン、ＰＡＭＡＭデンドリマーおよびポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリラート（ｐＤＭＡＥＭＡ）を含めて、様々なカチオン性ポリマーがこれまで、遺伝子キャリアとして使用されている。残念ながら、トランスフェクション効率は、ＰＬＬに関して典型的には不良であり、また、高分子量のＰＬＬは、細胞に対する著しい毒性が示されている。一部の場合において、ＰＥＩは、効率的な遺伝子移入を、エンドソーム溶解（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）剤または標的化剤を必要とすることなくもたらす（Ｂｏｕｓｓｉｆ  Ｏ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９５（８月１日）、９２（１６）、７２９７〜３０１（非特許文献１）を参照のこと）。様々なポリアミドアミンデンドリマーが遺伝子送達システムとして研究されている（Ｅｉｃｈｍａｎ  Ｊ．Ｄ．他、Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、２０００（７月）、３（７）：２３２〜２４５（非特許文献２）を参照のこと）。残念ながら、良好なトランスフェクション効率をもたらすことが見出されている高分子量のＰＥＩおよびデンドリマーはともに、細胞に対して毒性であることが報告されている。分解可能なカチオン性ポリマーとともに作製されるプラスミドＤＮＡキャリアは、低下した細胞毒性とともに、プラスミドを哺乳動物細胞に移入することが報告されている（Ｌｉｍ  Ｙ．Ｂ．他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２３（１０）、２４６０〜２４６１、２００１（非特許文献３）を参照のこと）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｏｕｓｓｉｆ  Ｏ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９５（８月１日）、９２（１６）、７２９７〜３０１
【非特許文献２】Ｅｉｃｈｍａｎ  Ｊ．Ｄ．他、Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、２０００（７月）、３（７）：２３２〜２４５
【非特許文献３】Ｌｉｍ  Ｙ．Ｂ．他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２３（１０）、２４６０〜２４６１、２００１
【発明の概要】
【０００６】
本明細書中に記載される様々な実施形態が、ｓｉＲＮＡ送達のための組成物に関する。１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡ送達のための組成物は、（ａ）繰り返し骨格のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ユニットと、（ｂ）繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ユニットと、（ｃ）側鎖脂質基を含む、繰り返し骨格の分解可能ユニットとを含むことができる水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを含むことができる。
【０００７】
本明細書中に記載される様々な実施形態が、本明細書中に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを作製する方法に関する。いくつかの実施形態において、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを、繰り返しエチレンイミンユニットを含む第１の反応物を有機溶媒に溶解して、溶解または部分的に溶解されたポリマー反応物を形成すること；溶解または部分的に溶解されたポリマー反応物を分解可能なモノマー反応物と反応させて、分解可能な架橋されたポリマーを形成すること（ただし、分解可能なモノマー反応物が脂質基を含む）；および、分解可能な架橋されたポリマーを第３の反応物と反応させること（ただし、第３の反応物が繰り返しポリエチレングリコールユニットを含む）によって合成することができる。
【０００８】
本明細書中に記載される様々な実施形態が、下記の工程を含む、ｓｉＲＮＡを細胞内に送達する方法に関する：本明細書中に記載されるようないずれかの水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーをｓｉＲＮＡと一緒にして、混合物を形成する工程、および、１つまたは複数の細胞をそのような混合物と接触させる工程。より好ましくは、ｓｉＲＮＡは１９塩基対〜２７塩基対を有する。好ましい実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。より好ましくは、哺乳動物細胞はガン細胞である。
【０００９】
本明細書中に記載される様々な実施形態が、本明細書中に記載されるような水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーと複合体化される、リポタンパク質遺伝子セグメントのコード領域の少なくとも一部分に対応するｓｉＲＮＡをその必要性のある個体に投与することを含むことができる、心臓血管疾患を処置するか、または、心臓血管疾患の危険性を低下させる方法に関連する。
【００１０】
本明細書中に記載される様々な実施形態が、トランスフェクション剤を含む組成物が少なくとも部分的に付着する固体表面を含むことができる、真核生物細胞をｓｉＲＮＡによりトランスフェクションするためのデバイスに関連し、この場合、トランスフェクション試薬が、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマー、カチオン性ポリマー、リポポリマー、ＰＥＧ化されたカチオン性ポリマー、ＰＥＧ化されたリポポリマー、カチオン性脂質、ＰＥＧ化されたカチオン性脂質、および、カチオン性の分解可能なＰＥＧ化されたリポポリマーから選択される。
【００１１】
本明細書中に記載される様々な実施形態が、ｓｉＲＮＡが真核生物細胞の中に入ることができるかどうかを判定する方法に関連する。この方法は下記の工程の１つまたは複数を含むことができる：（ａ）本明細書中に記載されるデバイスを提供する工程、（ｂ）ｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡがトランスフェクション試薬と相互作用するように前記デバイスに加える工程、（ｃ）真核生物細胞を細胞内へのｓｉＲＮＡの導入のための十分な密度および適切な条件で前記デバイスに播種する工程、および、（ｄ）ｓｉＲＮＡが細胞の中に入っているかどうかを検出する工程。
【００１２】
本明細書中に記載される様々な実施形態が、下記の工程を含むことができる、ｓｉＲＮＡを真核生物細胞に導入するための方法に関連する：（ａ）本明細書中に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにより少なくとも部分的に被覆される固体表面を提供する工程、（ｂ）真核生物細胞に導入されるためのｓｉＲＮＡを細胞表面に加える工程、および、（ｃ）細胞を真核生物細胞内へのｓｉＲＮＡの導入のための十分な密度および適切な条件で前記固体表面に播種する工程。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーの一部分を合成する方法を示す。
【図２】ｓｉＲＮＡトランスフェクション後のＨｅｌａ細胞における緑色蛍光タンパク質のパーセント活性を示す。この実験で使用される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーは下記の通りであった：ポリマー２（分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧ（１２：１：２））、ポリマー３（分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧ（１６：１：２））、ポリマー４（分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧ（１７：１：２））、ポリマー５（分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧ（２０：１：２））。コントロールは、ＰＥＩ１２００、Ｃｙｔｏｐｕｒｅ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）および分解可能ユニット：ＰＥＩ（５：１）である（すべてがモル比である）。ポリマー対ｓｉＲＮＡの比率が２：１である。
【図３】ｓｉＲＮＡトランスフェクション後のＢ１６Ｆ０細胞における緑色蛍光タンパク質のパーセント活性を示す。水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマー、コントロールおよびポリマー／ｓｉＲＮＡ比率は、図２に対する説明文において述べらる通りである。
【図４】ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションの後におけるＨｅｌａ細胞についてのパーセント細胞生存率を示す。水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマー、コントロールおよびポリマー／ｓｉＲＮＡ比率は、図２に対する説明文において述べらる通りである。
【図５】出発物質のポリエチレンイミン−１，２００ダルトン（分岐型ＰＥＩ−１．２Ｋ、陰性コントロール）、プラスミド送達試薬Ｃｙｔｏｐｕｒｅ（商標）（陰性コントロール）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｌ２Ｋ）およびポリマー１を使用する、Ｈｅｌａ細胞の緑色蛍光（ＧＦＰ）活性（％）をプロットする棒グラフを示す。ポリマー：ｓｉＲＮＡの比率が５：１である。結果は、ポリマー１およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）が、他の知られているプラスミド送達剤のＣｙｔｏｐｕｒｅ（商標）よりも良好な、遺伝子発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの被覆送達をもたらすことを示す。ポリマー１は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧの所定のモル比（５：１：２）を有する水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。
【図６】出発物質のポリエチレンイミン−１，２００ダルトン（分岐型ＰＥＩ−１．２Ｋ、陰性コントロール）、プラスミド送達試薬Ｃｙｔｏｐｕｒｅ（商標）（陰性コントロール）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｌ２Ｋ）およびポリマー１を使用する、Ｈｅｌａ細胞の細胞生存率（％）をプロットする棒グラフを示す。ポリマー１は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧの所定のモル比（５：１：２）を有する水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。ポリマー：ｓｉＲＮＡの比率が５：１である。結果は、ポリマー１およびＬ２Ｋがこのアッセイにおいて細胞毒性を示さないことを示す。
【図７】出発物質のポリエチレンイミン−１，２００ダルトン（分岐型ＰＥＩ−１．２Ｋ、陰性コントロール）、プラスミド送達試薬Ｃｙｔｏｐｕｒｅ（商標）（陰性コントロール）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｌ２Ｋ）およびポリマー１を使用する、Ｈｅｌａ細胞の緑色蛍光（ＧＦＰ）活性（％）をプロットする棒グラフを示す。ポリマー１は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧの所定のモル比（５：１：２）を有する水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。ポリマー：ｓｉＲＮＡの比率が１０：１である。結果は、ポリマー１およびＬ２Ｋが、プラスミド送達剤のＣｙｔｏｐｕｒｅ（商標）と異なって、遺伝子発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの同等な被覆送達をもたらすことを示す。
【図８】出発物質のポリエチレンイミン−１，２００ダルトン（分岐型ＰＥＩ−１．２Ｋ、陰性コントロール）、プラスミド送達試薬Ｃｙｔｏｐｕｒｅ（商標）（陰性コントロール）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｌ２Ｋ）およびポリマー１を使用する、Ｈｅｌａ細胞の細胞生存率（％）をプロットする棒グラフを示す。ポリマー１は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧの所定のモル比（５：１：２）を有する水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。ポリマー：ｓｉＲＮＡの比率が１０：１である。結果は、ポリマー１およびＬ２Ｋがこのアッセイにおいて細胞毒性を示さないことを示す。
【図９】出発物質のポリエチレンイミン−１，２００ダルトン（分岐型ＰＥＩ−１．２Ｋ、陰性コントロール）、プラスミド送達試薬Ｃｙｔｏｐｕｒｅ（商標）（陰性コントロール）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｌ２Ｋ）およびポリマー１を使用する、Ｂ１６Ｆ０細胞の緑色蛍光（ＧＦＰ）活性（％）をプロットする棒グラフを示す。ポリマー１は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧの所定のモル比（５：１：２）を有する水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。ポリマー：ｓｉＲＮＡの比率が２．５：１である。結果は、ポリマー１およびＬ２Ｋが、プラスミド送達剤のＣｙｔｏｐｕｒｅ（商標）よりも良好な、遺伝子発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの被覆送達をもたらすことを示す。
【図１０】出発物質のポリエチレンイミン−１，２００ダルトン（分岐型ＰＥＩ−１．２Ｋ、陰性コントロール）、プラスミド送達試薬Ｃｙｔｏｐｕｒｅ（商標）（陰性コントロール）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｌ２Ｋ）およびポリマー１を使用する、Ｂ１６Ｆ０細胞の細胞生存率（％）をプロットする棒グラフを示す。ポリマー１は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧの所定のモル比（５：１：２）を有する水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。ポリマー：ｓｉＲＮＡの比率が２．５：１である。結果は、ポリマー１およびＬ２Ｋがこのアッセイにおいて細胞毒性を示さないことを示す。
【図１１】出発物質のポリエチレンイミン−１，２００ダルトン（分岐型ＰＥＩ−１．２Ｋ、陰性コントロール）、プラスミド送達試薬Ｃｙｔｏｐｕｒｅ（商標）（陰性コントロール）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｌ２Ｋ）およびポリマー１を使用する、Ｂ１６Ｆ０細胞の緑色蛍光（ＧＦＰ）活性（％）をプロットする棒グラフを示す。ポリマー１は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧの所定のモル比（５：１：２）を有する水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。ポリマー：ｓｉＲＮＡの比率が５：１である。結果は、ポリマー１およびＬ２Ｋが、プラスミド送達剤のＣｙｔｏｐｕｒｅ（商標）よりも良好な、遺伝子発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの被覆送達をもたらすことを示す。
【図１２】出発物質のポリエチレンイミン−１，２００ダルトン（分岐型ＰＥＩ−１．２Ｋ、陰性コントロール）、プラスミド送達試薬Ｃｙｔｏｐｕｒｅ（商標）（陰性コントロール）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｌ２Ｋ）およびポリマー１を使用する、Ｂ１６Ｆ０細胞の細胞生存率（％）をプロットする棒グラフを示す。ポリマー１は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧの所定のモル比（５：１：２）を有する水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。ポリマー：ｓｉＲＮＡの比率が５：１である。結果は、ポリマー１およびＬ２Ｋがこのアッセイにおいて細胞毒性を示さないことを示す。
【図１３】出発物質のポリエチレンイミン−１，２００ダルトン（分岐型ＰＥＩ−１．２Ｋ、陰性コントロール）、プラスミド送達試薬Ｃｙｔｏｐｕｒｅ（商標）（陰性コントロール）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｌ２Ｋ）およびポリマー１を使用する、Ｂ１６Ｆ０細胞の緑色蛍光（ＧＦＰ）活性（％）をプロットする棒グラフを示す。ポリマー１は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧの所定のモル比（５：１：２）を有する水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。ポリマー：ｓｉＲＮＡの比率が１０：１である。結果は、ポリマー１およびＬ２Ｋが、プラスミド送達剤のＣｙｔｏｐｕｒｅ（商標）よりも良好な、遺伝子発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの被覆送達をもたらすことを示す。
【図１４】出発物質のポリエチレンイミン−１，２００ダルトン（分岐型ＰＥＩ−１．２Ｋ、陰性コントロール）、プラスミド送達試薬Ｃｙｔｏｐｕｒｅ（商標）（陰性コントロール）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｌ２Ｋ）およびポリマー１を使用する、Ｂ１６Ｆ０細胞の細胞生存率（％）をプロットする棒グラフを示す。ポリマー１は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧの所定のモル比（５：１：２）を有する水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。ポリマー：ｓｉＲＮＡの比率が１０：１である。結果は、ポリマー１がこのアッセイにおいて細胞毒性を示さないことを示す。
【図１５】ＨｅｐＧ２細胞培養におけるａｐｏ−Ｂ発現の阻害に対する、トランスフェクション剤ポリマー６／ｓｉＡｐｏ−Ｂの複合体の増大する量を示す。ポリマー６は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧのモル比が１６．５：１：２である水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。コントロール処理には、単独でのポリマー６およびｓｉＡｐｏ−Ｂ（５μｇ）が含まれた。
【図１６】ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）組み込みアッセイを使用する蛍光による、５％グルコースにおけるトランスフェクション剤／ｓｉＲＮＡの複合体の安定性を示す。トランスフェクション剤はポリマー２であり、ｓｉＲＮＡは抗Ａｐｏ−Ｂであった。ポリマー２は、図２に対する説明文において記載される。
【図１７】ポリマー６をトランスフェクション剤として使用する、抗Ａｐｏ−Ｂによるヌードマウスにおけるａｐｏ−Ｂの発現の阻害を示す。ポリマー６は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧのモル比が１６．５：１：２である水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。コントロール処理には、ＰＢＳ（Ａ）、ｓｉＡｐｏ−Ｂ（１ｍｇ／ｋｇ）（Ｂ）、ポリマー６（５ｍｇ／ｋｇ）（Ｃ）、および、５：１のモル比でのポリマーおよびランダムｓｉＲＮＡ（術後４８時間での１ｍｇ／ｋｇのｓｉＡｐｏ−Ｂの投与）（Ｆ）が含まれた。処理には、術後４８時間での１．０ｍｇ／ｋｇの抗Ａｐｏ−Ｂ  ｓｉＲＮＡ（Ｄ）、および、術後２週間での２．５ｍｇ／ｋｇの抗Ａｐｏ−Ｂ  ｓｉＲＮＡ（Ｅ）が含まれた。ポリマー対ｓｉＲＮＡの比率が５／１であった。
【図１８】ヌードマウスにおけるＡｐｏ−Ｂの阻害のためのｓｉＲＮＡ（抗Ａｐｏ−Ｂ）に対するトランスフェクション剤（ポリマー６）の比率を変化させることの影響を示す。ポリマー６は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧのモル比が１６．５：１：２である水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。コントロールはＰＢＳ（Ａ）である。処理は、５：１（重量比）の比率でのポリマー６＋ｓｉＡｐｏ−Ｂ（Ｂ）、７．５：１（重量比）の比率でのポリマー６＋ｓｉＡｐｏ−Ｂ（Ｃ）、および、１０：１（重量比）の比率でのポリマー６＋ｓｉＡｐｏ−Ｂ（Ｄ）である。すべての処理（Ｂ〜Ｄ）において、１ｍｇ／ｋｇのｓｉＡｐｏ−Ｂが投与された。
【図１９】トランスフェクション剤ポリマー６：ｓｉＲＮＡ（抗Ａｐｏ−Ｂ）の複合体をヌードマウスの尾静脈に注入した後におけるＡｐｏ−ＢのｍＲＮＡ発現の阻害の経時変化を示す。ポリマー６は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧのモル比が１６．５：１：２である水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。コントロールはＰＢＳ（Ａ）である。処理は、術後４８時間で測定された、１ｍｇ／ｋｇのｓｉＡｐｏ＿Ｂで投与されるポリマー６＋ｓｉＡｐｏ−Ｂ（Ｂ）、術後１週間で測定された、２．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＡｐｏ＿Ｂで投与されるポリマー６＋ｓｉＡｐｏ−Ｂ（Ｃ）、および、術後２週間で測定された、２．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＡｐｏ＿Ｂで投与されるポリマー６＋ｓｉＡｐｏ−Ｂ（Ｄ）である。すべての処理（Ｂ〜Ｄ）において、ポリマー対ｓｉＲＮＡの比率が５：１（重量比）であった。
【図２０】トランスフェクション剤ポリマー６：ｓｉＲＮＡ（抗Ａｐｏ−Ｂ）の複合体をＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注入した後におけるＡｐｏ−ＢのｍＲＮＡ発現の阻害の経時変化を示す。ポリマー６は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧのモル比が１６．５：１：２である水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。コントロールには、ＰＢＳ（Ａ）、および、ｓｉａｐ−Ｂ（１ｍｇ／ｋｇ）が含まれる。処理には、ポリマー６＋ｓｉａｐｏ−Ｂ（５／１、重量対重量比、１ｍｇ／ｋｇのｓｉａｐｏ−Ｂ）−４８時間（Ｃ）、ポリマー６＋ｓｉａｐｏ−Ｂ（５／１、重量対重量比、１ｍｇ／ｋｇのｓｉａｐｏ−Ｂ）−１週間（Ｄ）、ポリマー６＋ｓｉａｐｏ−Ｂ（５／１、重量対重量比、１ｍｇ／ｋｇのｓｉａｐｏ−Ｂ）−２週間（Ｅ）、ポリマー６＋ｓｉａｐｏ−Ｂ（５／１、重量対重量比、１ｍｇ／ｋｇのｓｉａｐｏ−Ｂ）−３週間（Ｆ）が含まれる。
【００１４】
図面は、本明細書中に記載される特定の実施形態を例示するために意図され、本発明を限定するために意図されない。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書中に記載される様々な実施形態が、１つまたは複数の細胞へのｓｉＲＮＡの送達に関する。ｓｉＲＮＡ送達を溶液において行うことができ、または、好ましくは、水溶液において行うことができ、または、より好ましくは、固体表面（例えば、トランスフェクションデバイスなど）において行うことができる。好ましい実施形態において、本明細書中に記載される方法は、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを、細胞内へのｓｉＲＮＡの輸送において非常に効果的であるトランスフェクション剤として含む。
【００１６】
本明細書中に記載される様々な実施形態が、ポリマーの骨格において、側鎖脂質基を含む１つまたは複数の分解可能ユニットと、１つまたは複数のカチオン性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ユニットと、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ユニットとを含むことができる水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーに関連する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットは約５０ダルトン〜約５，０００ダルトンの範囲での分子量を有することができる。１つの実施形態において、繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットは約４００ダルトン〜約６００ダルトンの範囲での分子量を有することができる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットは約２００ダルトン〜約２５，０００ダルトンの範囲での分子量を有することができる。１つの実施形態において、繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットは約６００ダルトン〜約２，０００ダルトンの範囲での分子量を有することができる。
【００１９】
好ましい実施形態において、繰り返し骨格の分解可能ユニットは下記の式（Ｉ）の繰り返しユニットが可能である：
【化１】
2010530013.tif 000002
【００２０】
式（Ｉ）において、Ａ１は非存在が可能であるか、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニルおよび−（ＣＨ２）ｎ１−Ｄ−（ＣＨ２）ｎ２−からなる群から選択される場合により置換された置換基が可能であり、ただし、ｎ１およびｎ２はそれぞれが独立して、０、または、１〜１０の範囲における整数が可能であり、かつ、Ｄは、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基が可能である；Ａ２は非存在が可能であるか、あるいは、酸素原子または−Ｎ（ＲＮ）が可能であり、ただし、ＲＮはＨまたはＣ１〜６アルキルである；Ｒ１は、電子対、または、水素、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基が可能であり、ただし、Ｒ１が水素であるか、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基であるならば、Ｒ１が結合する窒素原子は、関連した正電荷を有する；および、Ｒ２は、Ｃ２〜Ｃ５０アルキル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ５０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ５〜Ｃ５０アリール、Ｃ５〜Ｃ５０ヘテロアリール、−（ＣＨ２）ｐ１−Ｅ−（ＣＨ２）ｐ２−およびステロールからなる群から選択することができ、ただし、ｐ１およびｐ２はそれぞれが独立して、０、または、１〜４０の範囲における整数が可能であり、かつ、Ｅは、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基が可能である。１つの実施形態において、Ｒ２は、Ｃ４〜Ｃ３０アルキル、Ｃ４〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ４〜Ｃ３０アルキニルまたはステロールが可能である。好ましい実施形態において、Ｒ２は、Ｃ８〜Ｃ２４アルキル、Ｃ８〜Ｃ２４アルケニル、Ｃ８〜Ｃ２４アルキニルまたはステロールが可能である。理論によってとらわれることを望まないが、式（Ｉ）におけるエステル基により、改善された生分解性が水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーに与えられることが考えられる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、Ｒ２は脂質基が可能である。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、オレイル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、マルガリル、ステアリル、アラキジル、ベヘニルおよびリグノセリルからなる群から選択することができる。１つの実施形態において、Ｒ２はオレイルが可能である。いくつかの実施形態において、Ｒ２はステロールが可能である。１つの実施形態において、ステロールはコレステリル成分が可能である。
【００２２】
Ｒ１が式（Ｉ）において結合する窒素原子は、電子対、または、水素、または、それに結合するアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基を有することができる。当業者は、この窒素原子が電子対を有するとき、上記の式（Ｉ）の繰り返しユニットは低いｐＨにおいてカチオン性であり、また、Ｒ１が水素であるか、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基であるとき、この窒素原子は、関連する正電荷を有することを理解する。
【００２３】
１つの実施形態において、繰り返し骨格の分解可能ユニットは下記の構造を有することができる：
【化２】
2010530013.tif 000003
【００２４】
好ましい実施形態実施において、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約９５モル％の繰り返し骨格の分解可能ユニットを含む。より好ましくは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約３０モル％〜約９０モル％の繰り返し骨格の分解可能ユニットを含む。さらにより好ましくは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約５０モル％〜約８６モル％の繰り返し骨格の分解可能ユニットを含む。
【００２５】
好ましい実施形態実施において、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約３５モル％の繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットを含む。より好ましくは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約２０モル％の繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットを含む。さらにより好ましくは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約５モル％〜約１５モル％の繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットを含む。
【００２６】
好ましい実施形態実施において、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約８０モル％の繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットを含む。さらにより好ましくは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約５０モル％の繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットを含む。さらにより好ましくは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約５モル％〜約３０モル％の繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットを含む。なおさらにより好ましくは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約８モル％〜約３０モル％の繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットを含む。
【００２７】
水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーの１つの例示的な一部分が下記に示される：
【化３】
2010530013.tif 000004
【００２８】
１つの実施形態において、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーは、約１２００ダルトンの分子量を有する、ポリマーの骨格における１つまたは複数の分岐型ＰＥＩユニットと、ポリマーの骨格における式（Ｉ）の１つまたは複数の分解可能ユニットと、約４５４ダルトンの分子量を有する、ポリマーの骨格における１つまたは複数のポリエチレングリコールユニットとを含むことができる。
【００２９】
プラスミドＤＮＡを細胞内に効果的に送達するポリマーは、ｓｉＲＮＡを細胞内に必ずしも同様に効果的に送達することができない。それらの送達の非相関要因の１つは、それらの分子サイズにおける違いが関係する：ｓｉＲＮＡは典型的にはおよそ２１塩基対（ｂｐ）〜２３ｂｐであり、これに対して、プラスミドＤＮＡは約７，０００ｂｐ〜９，０００ｂｐである。Ｋｉｍ他、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２００７（印刷中）を参照のこと。大きい環状巨大分子（例えば、プラスミドＤＮＡなど）を効率的に送達することができるキャリアは多分、短い線状フラグメント（例えば、ｓｉＲＮＡなど）については全く適さないであろう。
【００３０】
別途定義される場合を除き、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じを意味を有する。本明細書中で参照されるすべての特許、特許出願、公開された特許出願および他の刊行物は、参照によってその全体が組み込まれる。複数の定義が本明細書中の用語について存在する場合には、別途述べられない限り、この節における定義が優先する。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「Ｃｍ〜Ｃｎ」（ただし、「ｍ」および「ｎ」は整数である）は、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基における炭素原子の数、あるいは、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基またはヘテロアリシクリル基の環における炭素原子の数を示す。すなわち、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルの環、シクロアルケニルの環、シクロアルキニルの環、アリールの環、ヘテロアリールの環、または、ヘテロアリシクリルの環が、「ｍ」個から、「ｎ」個を含めて、「ｎ」個までの炭素原子を含有することができる。従って、例えば、「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」基は、１個から４個までの炭素を有するすべてのアルキル基、すなわち、ＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−、（ＣＨ３）２ＣＨ−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−および（ＣＨ３）３Ｃ−を示す。「ｍ」および「ｎ」が、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基またはヘテロアリシクリル基に関して何ら指定されないならば、これらの定義において記載される最も広い範囲が想定されるものとする。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「アルキル」は、直鎖炭化水素鎖または分岐型炭化水素鎖の完全に飽和した（二重結合または三重結合が存在しない）炭化水素基を示す。アルキル基は１個〜５０個の炭素原子を有することができる（数値範囲が本明細書中に現れるときは常に、数値範囲、例えば、「１〜５０」などは、示された範囲におけるそれぞれの整数を示す；例えば、「１個〜５０個の炭素原子」は、アルキル基が１個の炭素原子からなり得ること、２個の炭素原子からなり得ること、３個の炭素原子などからなり得ること、そして、５０個の炭素原子を含めて、５０個に至るまでの炭素原子からなり得ることを意味し、だが、この定義はまた、数値範囲が何ら指定されない「アルキル」の用語の存在を包含する）。アルキル基はまた、１個〜３０個の炭素原子を有する中サイズのアルキルである場合がある。アルキル基はまた、場合により、１個〜５個の炭素原子を有する低級アルキルとすることができる。化合物のアルキル基は、「Ｃ１〜Ｃ４アルキル基」または類似する指定として指定される場合がある。例としてのみではあるが、「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」は、１個〜４個の炭素原子がアルキル鎖に存在すること、すなわち、アルキル鎖が、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔ−ブチルからなる群から選択されることを示している。典型的なアルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチルおよびヘキシルなどが含まれ、しかし、決してこれらに限定されない。
【００３３】
アルキル基は置換または非置換であり得る。置換される場合、置換基は、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、エステル、メルカプト、シアノ、ハロゲン、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、保護されたＣ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、スルフェニル、スルフィニル、スルホニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミドおよびアミノ（一置換アミノ基および二置換アミノ基、ならびに、これらの保護された誘導体を含む）から個々に、かつ、独立して選択される１つまたは複数の基である。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「アルケニル」は、１つまたは複数の二重結合を直鎖炭化水素鎖または分岐型炭化水素鎖において含有するアルキル基を示す。アルケニル基は非置換または置換であり得る。置換される場合、置換基は、別途示されない限り、アルキル基の置換に関して上記で開示される同じ基から選択することができる。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「アルキニル」は、１つまたは複数の三重結合を直鎖炭化水素鎖または分岐型炭化水素鎖において含有するアルキル基を示す。アルケニル基は非置換または置換であり得る。置換される場合、置換基は、別途示されない限り、アルキル基の置換に関して上記で開示される同じ基から選択することができる。
【００３６】
「ヘテロアルキル」は、本明細書中で使用される場合、アルキル基の骨格における炭素原子の１つまたは複数がヘテロ原子（例えば、窒素、イオウおよび／または酸素など）によって置換されている本明細書中に記載されるようなアルキル基を示す。
【００３７】
「ヘテロアルケニル」は、本明細書中で使用される場合、アルケニル基の骨格における炭素原子の１つまたは複数がヘテロ原子（例えば、窒素、イオウおよび／または酸素）によって置換されている本明細書中に記載されるようなアルケニル基を示す。
【００３８】
「ヘテロアルキニル」は、本明細書中で使用される場合、アルキニル基の骨格における炭素原子の１つまたは複数がヘテロ原子（例えば、窒素、イオウおよび／または酸素など）によって置換されている本明細書中に記載されるようなアルキニル基を示す。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「アリール」は、完全に非局在化したπ電子系を有する炭素環式の（すべてが炭素である）単環芳香族環系または多環芳香族環系を示す。アリール基の例には、ベンゼン、ナフタレンおよびアズレンが含まれるが、これらに限定されない。アリール基の環は５個〜５０個の炭素原子を有することができる。アリール基は置換または非置換であり得る。置換される場合、置換基が別途示されない限り、水素原子が、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、エステル、メルカプト、シアノ、ハロゲン、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、保護されたＣ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、スルフェニル、スルフィニル、スルホニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミドおよびアミノ（一置換アミノ基および二置換アミノ基、ならびに、これらの保護された誘導体を含む）から独立して選択される１つまたは複数の基である置換基によって置換される。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「ヘテロアリール」は、１つまたは複数のヘテロ原子（すなわち、炭素以外の元素、これには、窒素、酸素およびイオウが含まれるが、これらに限定されない）を含有する単環芳香族環系または多環芳香族環系（完全に非局在化したπ電子系を有する環系）を示す。ヘテロアリール基の環は５個〜５０個の原子を有することができる。ヘテロアリール基は置換または非置換であり得る。ヘテロアリール環の例には、フラン、フラザン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フタラジン、ピロール、オキサゾール、ベンゾオキサゾール、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、チアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、ベンゾチアゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、インドール、インダゾール、ピラゾール、ベンゾピラゾール、イソオキサゾール、ベンゾイソオキサゾール、イソチアゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、チアジアゾール、テトラゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、プリン、プテリジン、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、キノキサリン、シンノリンおよびトリアジンが含まれるが、これらに限定されない。ヘテロアリール基は置換または非置換であり得る。置換される場合、水素原子が、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、エステル、メルカプト、シアノ、ハロゲン、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、保護されたＣ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、スルフェニル、スルフィニル、スルホニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミドおよびアミノ（一置換アミノ基および二置換アミノ基、ならびに、これらの保護された誘導体を含む）から独立して選択される１つまたは複数の基である置換基によって置換される。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「シクロアルキル」は、完全に飽和した（二重結合が存在しない）単環炭化水素環系または多環炭化水素環系を示す。２つ以上の環から構成されるときには、これらの環は、縮合様式、架橋様式またはスピロ結合様式で連結され得る。シクロアルキル基はＣ３からＣ１０にまで及ぶことができ、他の実施形態では、シクロアルキル基はＣ３からＣ８にまで及ぶことができる。シクロアルキル基は非置換または置換であり得る。典型的なシクロアルキル基には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルなどが含まれるが、決してこれらに限定されない。置換されるならば、別途示されない限り、置換基はアルキルであり得るか、または、アルキル基の置換に関して上記で示されるそのような置換基から選択することができる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「シクロアルケニル」は、１つまたは複数の二重結合を環において含有するシクロアルキル基を示し、だが、２つ以上が存在するならば、これらの二重結合は、環における完全に非局在化したπ電子系を形成することができない（そうでないならば、その基は、本明細書中で定義されるように「アリール」である）。２つ以上の環から構成されるときには、これらの環は、縮合様式、架橋様式またはスピロ結合様式で連結され得る。シクロアルキニル基は非置換または置換であり得る。置換される場合、別途示されない限り、置換基はアルキルであり得るか、または、アルキル基の置換に関して上記で開示される置換基から選択することができる。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「シクロアルキニル」は、１つまたは複数の三重結合を環において含有するシクロアルキル基を示す。２つ以上の環から構成されるときには、これらの環は、縮合様式、架橋様式またはスピロ結合様式で連結され得る。シクロアルキニル基は非置換または置換であり得る。置換される場合、別途示されない限り、置換基はアルキルであり得るか、または、アルキル基の置換に関して上記で開示される置換基から選択することができる。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「複素脂環式」または「ヘテロアリシクリル」は、炭素原子と、窒素、酸素およびイオウからなる群から選択される１個〜５個のヘテロ原子とからなる安定な３員環〜１８員環を示す。「複素脂環式」または「ヘテロアリシクリル」は、縮合様式、架橋様式またはスピロ結合様式で連結され得る単環、二環、三環または四環の環系である場合がある；「複素脂環式」または「ヘテロアリシクリル」における窒素原子、炭素原子およびイオウ原子は場合により酸化されることがある；窒素は場合により四級化されることがある；環はまた、二重結合がすべての環にわたる完全に非局在化したπ電子系を形成しないならば、１つまたは複数の二重結合を含有することができる。ヘテロアリシクリル基は非置換または置換であり得る。置換される場合、置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、エステル、メルカプト、アルキチルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロゲン、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、保護されたＣ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミドおよびアミノ（一置換アミノ基および二置換アミノ基、ならびに、これらの保護された誘導体を含む）から独立して選択される１つまたは複数の基であり得る。そのような「複素脂環式」または「ヘテロアリシクリル」の例には、アゼピニル、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、１，３−ジオキシン、１，３−ジオキサン、１，４−ジオキサン、１，２−ジオキソラニル、１，３−ジオキソラニル、１，４−ジオキソラニル、１，３−オキサチアン、１，４−オキサチイン、１，３−オキサチオラン、１，３−ジチオール、１，３−ジチオラン、１，４−オキサチアン、テトラヒドロ−１，４−チアジン、２Ｈ−１，２−オキサジン、マレイミド、スクシンイミド、バルビツール酸、チオバルビツール酸、ジオキソピペラジン、ヒダントイン、ジヒドロウラシル、トリオキサン、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン、イミダゾリニル、イミダゾリジン、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、オキサゾリン、オキサゾリジン、オキサゾリジノン、チアゾリン、チアゾリジン、モルホリニル、オキシラニル、ピペリジニルＮ−オキシド、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、ピロリドン、ピロリジオン、４−ピペリドニル、ピラゾリン、ピラゾリジニル、２−オキソピロリジニル、テトラヒドロピラン、４Ｈ−ピラン、テトラヒドロチオピラン、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、チアモルホリニルスルホンおよびそれらのベンゾ縮合アナログ（例えば、ベンゾイミダゾリジノン、テトラヒドロキノリン、３，４−メチレン���オキシフェニル）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
基が、「場合により置換された」として記載されるときは常に、そのような基は非置換であり得るか、あるいは、示された置換基の１つまたは複数により置換され得る。同様に、基が、「非置換または置換」であり、置換されるならば、として記載されるとき、置換基は、示された置換基の１つまたは複数から選択することができる。
【００４６】
別途示される場合を除き、置換基が、「場合により置換された」または「置換された」と見なされるとき、置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、エステル、メルカプト、シアノ、ハロゲン、カルボニル、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、保護されたＣ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、スルフェニル、スルフィニル、スルホニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミドおよびアミノ（一置換アミノ基および二置換アミノ基、ならびに、これらの保護された誘導体を含む）から個々に、かつ、独立して選択される１つまたは複数の基により置換され得る基であることが意味される。上記置換基の保護し得る誘導体を形成することができる様々な保護基が当業者には知られており、これらを様々な参考文献において見出すことができ、例えば、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９９（これは本明細書により参照によってその全体が組み込まれる）などにおいて見出すことができる。
【００４７】
１つまたは複数のキラル中心を有する本明細書中に記載されるどの化合物においても、絶対的な立体化学が明示的に示されないならば、それぞれの中心は独立して、Ｒ−立体配置またはＳ−立体配置またはそれらの混合であり得ることが理解される。従って、本明細書中に提供される化合物はエナンチオマーにおいて純粋であり得るか、または、立体異性体の混合物であり得る。加えて、ＥまたはＺとして定義することができる幾何異性体を生じさせる１つまたは複数の二重結合を有するどの化合物においても、それぞれの二重結合は独立して、ＥまたはＺまたはそれらの混合であり得ることが理解される。同様に、互変異性形態もまた、含まれることが意図される。
【００４８】
用語「脂質」は、本明細書中で使用される場合、脂肪および脂肪様化合物を示す。例示的な脂質には、脂肪酸およびステロールが含まれる。脂肪酸は長鎖のモノカルボン酸である。脂肪酸は飽和または不飽和であり得る。脂質は、本質的には水に不溶性であるとして、すなわち、水における溶解度が約０．０１％（重量基準）未満であるとして特徴づけられる。本明細書中で使用される場合、用語「脂質基」は、別の基に直接に結合している脂質またはその一部分を示す。例えば、脂質基は、別の化合物（例えば、モノマー）に、脂肪酸における官能基（例えば、カルボン酸基など）と、モノマーにおける適切な官能基との間における化学反応によって結合させることができる。
【００４９】
用語「架橋された」は、本明細書中で使用される場合、共有結合などの結合によって横方向に連結されているポリマー鎖を示す。本明細書中で使用される場合、用語「架橋された」は、様々な架橋度（例えば、わずかに架橋された、中程度に架橋された、および、非常に架橋されたなど）を包含することが意味される。
【００５０】
本明細書中に記載される様々な実施形態が、本明細書中に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーの合成に関連する。Ｌｙｎｎ他は、ジアクリラートをカチオン性化合物の間におけるリンカー分子として使用して、生分解可能なカチオン性ポリマーを合成する方法を記載している（Ｌｙｎｎ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００１、１２３、８１５５〜８１５６を参照のこと）（これは本明細書により参照によってその全体が組み込まれる）。いくつかの実施形態において、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを、繰り返しエチレンイミンユニットを含む第１の反応物を有機溶媒に溶解して、溶解または部分的に溶解されたポリマー反応物を形成すること、溶解または部分的に溶解されたポリマー反応物を分解可能なモノマー反応物と反応させて、分解可能な架橋されたポリマーを形成すること（ただし、分解可能なモノマー反応物が脂質基を含む）、および、分解可能な架橋されたポリマーを第３の反応物と反応させること（ただし、第３の反応物が繰り返しポリエチレングリコールユニットを含む）によって合成することができる。例えば、式（Ｉ）の繰り返し骨格の分解可能ユニットを含む水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを、下記で示される１つの方法によって合成することができる。スキームＡに示されるように、式（ＩＩ）の化合物をＰＥＩと反応させて、式（ＩＩＩ）の１つまたは複数の成分を含む分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを形成することができる。
【化４】
2010530013.tif 000005
【００５１】
スキームにおいて、Ａ１、Ａ２、Ｒ１およびＲ２は、式（Ｉ）に関して本明細書中に記載されるのと同じ意味を有する。
【００５２】
スキームＡに例示される反応は、ＰＥＩおよび式（ＩＩ）の化合物を、好ましくは室温で数時間、撹拌とともに相互溶媒（例えば、エタノール、メタノールまたはジクロロメタンなど）において混合することによって行うことができる。得られるポリマーは、当業者に知られている様々な技術を使用して回収することができる。例えば、溶媒を、得られるポリマーを回収するために蒸発させることができる。本発明は理論によってとらわれないが、ＰＥＩと、式（ＩＩ）の化合物との間における反応は、ＰＥＩの１つまたは複数のアミンと、式（ＩＩ）の化合物の二重結合との間におけるＭｉｃｈｅａｌ反応を伴うことが考えられる（Ｊ．Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、７１１頁〜７１２頁（１９８５）を参照のこと）。スキームＡに示される式（ＩＩ）の化合物は、米国特許出願公開第２００６／０２５８７５１号に記載されるような様式で調製することができる（これは、すべての図面を含めて、参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００５３】
ＰＥＩは線状または分岐型が可能である。繰り返し骨格のＰＥＩユニットは、下記の式（ＩＶ）、式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩＩ）および／または式（ＶＩＩＩ）の構造を有することができる。
【化５】
2010530013.tif 000006
【００５４】
様々な分子量のＰＥＩを使用することができる。分岐型であるとき、繰り返し骨格のＰＥＩユニットの分子量は好ましくは約２００ダルトン〜２５，０００ダルトンの範囲にあり、より好ましくは４００ダルトン〜５，０００ダルトンの範囲にあり、さらにより好ましくは約６００ダルトン〜２０００ダルトンの範囲にある。線状であるとき、繰り返し骨格のＰＥＩユニットの分子量は好ましくは約２００ダルトン〜２５，０００ダルトンの範囲にある。１つの実施形態において、線状の繰り返し骨格のＰＥＩユニットは分子量を約４００ダルトン〜約１２００ダルトンの範囲に有することができる。
【００５５】
分解可能ユニット対ＰＥＩの様々なモル比を、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを作製するために使用することができる。いくつかの実施形態において、分解可能なモノマー反応物（例えば、式（ＩＩ）の化合物）対ＰＥＩのモル比は、約０．１：１〜約５０：１の範囲であることが可能である。１つの実施形態において、分解可能なモノマー反応物対ＰＥＩのモル比は、約１：１〜約３０：１の範囲であることが可能である。いくつかの実施形態において、分解可能なモノマー反応物対ＰＥＩのモル比は、約５：１〜約２５：１の範囲であることが可能である。
【００５６】
その後、式（ＩＩＩ）の成分を、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを形成するために、ＰＥＧまたはその誘導体（例えば、ｍＰＥＧ（メトキシポリ（エチレングリコール）など）と反応させることができる。いくつかの実施形態において、この反応は室温で行われる。反応生成物を、クロマトグラフィー技術を含むこの技術分野において知られているいずれかの手段によって単離することができる。１つの実施形態において、反応生成物を、沈殿化、その後での遠心分離によって取り出すことができる。
【００５７】
様々な分子量のＰＥＧおよびその誘導体を使用することができる。いくつかの実施形態において、繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットは約５０ダルトン〜約５，０００ダルトンの分子量を有することができる。１つの実施形態において、繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットは約４００ダルトン〜約６００ダルトンの分子量を有することができる。
【００５８】
ＰＥＧ対ＰＥＩのモル比もまた変化し得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ対ＰＥＩのモル比は、約０．１：１〜約１２：１の範囲であることが可能である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ対ＰＥＩのモル比は、約１：１〜約１０：１の範囲であることが可能である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ対ＰＥＩのモル比は、約１：１〜約４：１の範囲であることが可能である。
【００５９】
Ｒ１が水素であるか、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基であるとき、式（ＩＩ）の化合物は、当業者に知られている様々な方法によって調製することができる。１つの方法が下記においてスキームＢに示される。
【化６】
2010530013.tif 000007
【００６０】
スキームＢにおいて、Ａ１、Ａ２、Ｒ１およびＲ２は、本明細書中に記載されるのと同じであり、ＬＧは好適な脱離基（例えば、ハロゲンなど）である。
【００６１】
水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーの重量平均分子量は変化し得る。いくつかの実施形態において、重量平均分子量は約５００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲であり得る。１つの実施形態において、重量平均分子量は約２、０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンの範囲であり得る。分子量は、当業者に知られている様々な方法によって求めることができ、例えば、ＰＥＧ標準物を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって、または、アガロースゲル電気泳動によって求めることができる。
【００６２】
本明細書中に記載される繰り返し骨格ユニット（例えば、式（Ｉ）、ＰＥＩおよびＰＥＧ）を含む広範囲の様々な水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを、ＰＥＩの分子量および構造、ならびに、ＰＥＧの分子量および構造、式（ＩＩ）の化合物におけるＲ１基およびＲ２基のサイズおよびタイプ、Ａ１基および／またはＡ２基、ならびに／あるいは、ＰＥＩおよびＰＥＧに対する式（ＩＩ）の化合物のモル比を変化させることによって作製することができる。加えて、異なるジアクリラートおよびその誘導体の混合物、ならびに／または、異なるＰＥＩの混合物、ならびに／または、異なるＰＥＧの混合物を使用することができる。１つの実施形態において、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーの合成に関して本明細書中に記載される方法は、本明細書中に示される式（Ｉａ）の部分を含むポリマーを合成するために使用することができる。
【００６３】
水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーは好ましくは生分解可能である。分解可能な機構の限定されない列挙には、加水分解、酵素切断、還元、光切断および／または超音波処理が含まれるが、これらに限定されない。本発明は理論によって限定されないが、細胞内における式（Ｉ）の分解可能ユニットの分解が、エステル連結の酵素による切断および／または加水分解によって進行することが考えられる。
【００６４】
本明細書中に記載される様々な実施形態が、ＲＮＡを細胞内に送達するために、本明細書中に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを使用する方法に関連する。好ましくは、ＲＮＡは短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ＲＮＡ、および、より具体的には、ｓｉＲＮＡには、５塩基対〜５０塩基対を有するＲＮＡ、好ましくは、１０塩基対〜３５塩基対を有するＲＮＡ、より好ましくは、１９塩基対〜２７塩基対を有するＲＮＡが含まれる。ＲＮＡにはまた、混合型のＲＮＡ／ＤＮＡ分子または混合型のタンパク質／ＲＮＡ分子が含まれ得る。核酸の送達を水溶液中または固体支持体表面において行うことができる。
【００６５】
好ましい実施形態が、従来のトランスフェクションアッセイと比較して、簡便で、便利で、かつ、効率的であるトランスフェクションデバイスおよびトランスフェクション方法に関する。トランスフェクションデバイスが、トランスフェクション試薬（例えば、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーなど）を細胞培養デバイスの固体表面に付着させることによって本明細書中に記載される方法に従って作製される。この好ましい実施形態では、核酸をトランスフェクション試薬と事前に混合する必要がない。このことにより、従来のトランスフェクション手順によって要求される、時間のかかる重要な工程が除かれる。科学者は、１０サンプルについての全トランスフェクションプロセスを完了するために、従来の方法によって要求される２時間〜５時間またはそれ以上と比較して、およそ４０分を必要とするだけである。このことは、数百のサンプルが一度に試験される高処理能のトランスフェクションアッセイのためには特に好都合である。
【００６６】
好ましい実施形態において、本明細書中に記載されるようなトランスフェクションデバイスを被覆するためのトランスフェクション剤には、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマー、カチオン性ポリマー、リポポリマー、カチオン性のＰＥＧ化されたポリマー、ＰＥＧ化されたリポポリマー、カチオン性脂質およびＰＥＧ化されたカチオン性脂質が含まれるが、これらに限定されない。カチオン性ポリマーの例には、ＣｙｔｏＰｕｒｅ（商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）、ポリ（リシン）およびポリ（アルギニン）が含まれるが、これらに限定されない。リポポリマー試薬の例には、ｊｅｔＰＥＩ（商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）が含まれるが、これに限定されない。ＰＥＧ化されたカチオン性ポリマーの例には、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマー（Ｚｈｏｎｇ他（２００５）、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、第６巻：３４４０〜３４４８、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）、ＰＥＧによりグラフト化されたカチオン性ポリマー（米国特許第６，５８６，２５４号（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）、および、本明細書中に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。カチオン性脂質試薬の例には、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−（トリメチアンモニウム）プロパン）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｓｉＰＯＲＴ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）が含まれるが、これらに限定されない。ＰＥＧ化されたカチオン性脂質の例には、ＰＥＧ−脂質複合体（Ｍａｒｔｉｎ−Ｈｅｒｒａｎｚ他（２００４年、２月）、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、第８６巻：１１６０〜１１６８、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）が含まれるが、これに限定されない。トランスフェクションデバイスを被覆することにおいて有用なさらなるカチオン性ポリマーが下記の表１に記載される。いくつかの実施形態において、トランスフェクション剤はカチオン性のＰＥＧ化されたポリマーである。１つの実施形態において、カチオン性のＰＥＧ化されたポリマーは、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが可能であり、例えば、本明細書中に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーなどが可能である。
【表１】
2010530013.tif 000008
【００６７】
様々な好ましい実施形態が、カチオン性のＰＥＧ化されたポリマーのトランスフェクション剤（例えば、本明細書中に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマー）を、貯蔵することが非常に容易であり、かつ、ｓｉＲＮＡ／トランスフェクション試薬の混合工程を全く必要としないｓｉＲＮＡ送達のための簡便な方法を提供するトランスフェクションデバイスに被覆することに関する。本明細書中に記載されるトランスフェクション手順は短い時間（例えば、およそ４０分）で終了することができ、また、本明細書中に記載されるトランスフェクション手順により、非常に多数のサンプルを一度にトランスフェクションすることができるトランスフェクションのための高処理能方法が提供される。
【００６８】
本明細書中に記載される、遺伝子抑制のための方法およびデバイスの様々な実施形態では、上記で記載される従来のトランスフェクションアッセイにおいて遭遇する様々な共通する問題が克服される。カチオン性のＰＥＧ化されたポリマーのトランスフェクション試薬は、細胞培養デバイスの表面に簡単に被覆することができ、従って、容易に商品化および大量生産することができる。顧客、例えば、研究者は、核酸（例えば、目的とするｓｉＲＮＡなど）をトランスフェクションの前に細胞培養デバイスの表面に直接に加えることのみが必要である。細胞が、その後、細胞培養デバイスの表面に播種され、培地を換えることなくインキュベーションされ、細胞が分析される。培地をトランスフェクション手順の期間中に換えることが不要である。本明細書中に記載される方法では、間違いの危険性が、関与する工程の数を減らすことによって劇的に減少し、従って、システムの一貫性および正確性が増大する。
【００６９】
好ましい実施形態において、トランスフェクション試薬がスライドまたはマルチウエルプレートの表面に付着させられる。しかしながら、任意の形状の固体支持体または半固体支持体を使用することができ、これらには、プレート、フィルターおよびカラム充填材（例えば、任意の形状およびサイズのビーズ、繊維、ペレットなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
ｓｉＲＮＡ含有混合物をその表面に付着させるために使用することができる任意の好適な表面を使用することができる。いくつかの実施形態において、様々な半固体の支持体、例えば、メンブラン（例えば、ニトロセルロース、メチルセルロース、ＰＴＦＥまたはセルロースなど）、ならびに、ナイロンフィルターおよび紙の支持体などを使用することができる。
【００７１】
支持体のための固体材料または半固体材料は、金属、非金属、ポリマーまたはプラスチック、エラストマー、あるいは、生物学的に得られる材料であり得る。好ましくは、金属は、金、ステンレススチール、アルミニウム、ニチノール、コバルトクロムまたはチタンである。好ましい非金属材料には、ガラス、シリコン、シリカまたはセラミックが含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
好ましいプラスチックポリマー材料およびエラストマー材料には、ポリスチレン、ポリアセタール、ポリウレタン、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリラート、ポリヒドロキシエチルメタクリラート、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリエーテルケトン、ポリフェニレンオキシド、ポリ塩化ビニル、ポリカーボナート、ポリスルホン、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、ポリエーテルイミド、ポリフッ化ビニリデン、ならびに、これらのコポリマーおよび組合せが含まれるが、これらに限定されない。材料は、ポリシロキサン、フッ素化ポリシロキサン、エチレン−プロピレンゴム、フルオロエラストマーおよびこれらの組合せから選択することができる。材料は、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリパラジオキサノン、ポリトリメチレンカーボナートおよびそれらのコポリマーから選択することができる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、生物学的に得られる材料、例えば、タンパク質、ゼラチン、寒天、コラーゲン、エラスチン、キチン、サンゴ、ヒアルロン酸、骨およびこれらの組合せなどを利用することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、固体支持体または半固体支持体は、組織（例えば、皮膚、内皮組織、骨、軟骨など）、または、鉱物（例えば、ヒドロキシルアパタイト、グラファイトなど）を含むことができる。
【００７５】
好ましい実施形態によれば、表面は、スライド（ガラス製スライドまたはポリ−Ｌ−リシン被覆されたスライド）、または、マルチウエルプレートのウエルである場合がある。いくつかの実施形態において、固体表面または半固体表面は、埋め込み可能なデバイス（例えば、ステントなど）である場合がある。
【００７６】
このようなデバイスを使用することによって、ｓｉＲＮＡを表面に加え、トランスフェクション試薬がｓｉＲＮＡとの複合体を形成することを可能にすることが必要であるにすぎない。この反応はおよそ３０分で生じる。細胞が、その後、表面に播種され、ｓｉＲＮＡを細胞内に導入するための好適な条件のもとでインキュベーションされる。これらの工程を手作業によって行うことができ、または、自動化されたシステムによって行うことができ、または、いくつかの工程が手作業により行われ、他の工程が自動化される組合せによって行うことができる。
【００７７】
スライド、例えば、ポリ−Ｌ−リシン（例えば、Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．）により被覆されたガラス製スライドなどについては、トランスフェクション試薬が表面に固定され、乾燥され、その後、目的とする核酸（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡなど）が導入される。スライドは、ｓｉＲＮＡ／トランスフェクション試薬の複合体をトランスフェクションデバイスの表面に形成させるために室温で３０分間インキュベーションされる。ｓｉＲＮＡ／トランスフェクション試薬の複合体は、数百〜数千の核酸を同時に調べるために使用することができる高処理能マイクロアレイにおける使用のための媒体をもたらす。１つの代わりの実施形態において、トランスフェクション試薬または薬物送達試薬を、トランスフェクション試薬または薬物送達試薬のマイクロアレイを形成するために、別々の規定された領域においてトランスフェクションデバイスの表面に付着させることができる。この実施形態において、細胞内に導入されることになる分子（例えば、核酸など）が、トランスフェクション試薬または送達試薬と一緒にトランスフェクションデバイスの表面に塗布される。この方法は、トランスフェクション試薬または他の送達試薬を数千の化合物からスクリーニングすることにおいて使用することができる。そのようなスクリーニング方法の結果をコンピューター分析によって調べることができる。
【００７８】
別の実施形態において、マルチウエルプレートの１つまたは複数のウエルをカチオン性のＰＥＧ化されたポリマーのトランスフェクション剤により被覆することができる。トランスフェクションおよび薬物スクリーニングにおいて一般に使用されるプレートは９６ウエルプレートおよび３８４ウエルプレートである。カチオン性のＰＥＧ化されたポリマーのトランスフェクション剤をプレートの底に一様に適用することができる。数百の生体分子（例えば、ｓｉＲＮＡなど）が、その後、例えば、マルチチャンネルピペットまたは自動化された装置によってウエルに加えられる。トランスフェクションの結果が、その後、マイクロプレートリーダーを使用することによって求められる。様々なマイクロプレートリーダーがほとんどの生物医学研究室では一般に使用されるので、これは、トランスフェクションされた細胞を分析する非常に便利な方法である。カチオン性のＰＥＧ化されたポリマーのトランスフェクション剤により被覆されたマルチウエルプレートは、薬物スクリーニングと同様に、遺伝子調節、遺伝子機能、分子治療およびシグナル伝達を研究するためにほとんどの研究室において広く使用することができる。同様にまた、異なる種類のカチオン性のＰＥＧ化されたポリマーのトランスフェクション剤がマルチウエルプレートの異なるウエルに被覆されるならば、プレートを、多くのカチオン性のＰＥＧ化されたポリマーのトランスフェクション剤を比較的効率的にスクリーニングするために使用することができる。最近では、１，５３６ウエルプレートおよび３，４５６ウエルプレートが開発されており、これらもまた、本明細書中に記載される方法に従って使用することができる。
【００７９】
トランスフェクション試薬または送達試薬は、好ましくは、生体分子（例えば、核酸など、好ましくは、ｓｉＲＮＡ）を細胞に導入することができるカチオン性のＰＥＧ化されたポリマーのトランスフェクション剤である。好ましい実施形態では、分解可能なカチオン性のＰＥＧ化されたポリマーが使用され、例えば、本明細書中に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーなどが使用される。
【００８０】
適切な条件のもとで、ｓｉＲＮＡが、生体分子／送達試薬の複合体を形成するために、トランスフェクション試薬または送達試薬（例えば、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーなど）により被覆されるトランスフェクションデバイスの中に加えられる。生体分子は、好ましくは、ウシ胎児血清および抗生物質を含まない細胞培養培地、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に溶解される。トランスフェクション試薬または送達試薬がスライド表面に一様に付着させられるならば、生体分子をスライド上の異なった場所にスポットすることができる。あるいは、トランスフェクション試薬または送達試薬をスライド上の異なった場所にスポットしてもよく、ｓｉＲＮＡを、トランスフェクションデバイスの表面全体を覆うように単に加えることができる。トランスフェクション試薬または送達試薬がマルチウエルプレートの底に付着させられるならば、ｓｉＲＮＡが、マルチチャンネルピペット、自動化デバイスまたは他の方法によって、異なるウエルに単に加えられる。得られる生成物（トランスフェクション試薬または送達試薬と、ｓｉＲＮＡとにより被覆されるトランスフェクションデバイス）が、ｓｉＲＮＡ／トランスフェクション試薬（または送達試薬）の複合体を形成するために、５分間〜３時間、好ましくは１０分間〜９０分間、より好ましくは２０分間〜３０分間、室温でインキュベーションされる。いくつかの場合には、例えば、異なる種類の生体分子がスライドの異なった場所にスポットされ、ｓｉＲＮＡ溶液が、トランスフェクション試薬との複合体を形成しているｓｉＲＮＡを有する表面を生じさせるために除かれる。他の場合には、ｓｉＲＮＡ溶液が表面に保たれる。続いて、適切な培地および適切な密度における細胞が表面に播かれる。得られる生成物（ｓｉＲＮＡと、播かれた細胞とを有する表面）が、播かれた細胞の中への生体分子の進入をもたらす条件のもとで維持される。
【００８１】
本明細書中に記載される方法に従って使用される好適な細胞には、原核生物、酵母または高等真核生物細胞（植物細胞および動物細胞を含む）が含まれ、とりわけ、哺乳動物が含まれる。いくつかの実施形態において、細胞はガン細胞である。いくつかの好ましい実施形態において、ガンについてのモデルシステムである様々な細胞株が使用され、これらには、乳ガン（ＭＣＦ−７細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８細胞株）、Ｕ８７神経膠芽細胞腫細胞株、Ｂ１６Ｆ０細胞（メラノーマ）ＨｅＬａ細胞（子宮頸ガン）、Ａ５４９細胞（肺ガン）、ならびに、ラットの腫瘍細胞株のＧＨ３および９Ｌが含まれる。１つの非常に好ましい実施形態において、Ｂ１６Ｆ０細胞（メラノーマ）またはＨｅＬａ細胞（子宮頸ガン）が試験系として使用される。好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡ送達剤が、処置方法としてガンに対するｓｉＲＮＡの有効性を試験するために使用される。
【００８２】
真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシまたはマウスの細胞）など、細菌細胞、昆虫細胞または植物細胞が、トランスフェクション試薬または送達試薬と、生体分子とにより被覆されるトランスフェクションデバイスに、真核生物の中への生体分子の導入／進入、および、生体分子と、細胞成分との相互作用のための十分な密度および適切な条件で播かれる。具体的な実施形態において、細胞を、造血細胞、ニューロン細胞、膵臓細胞、肝臓細胞、軟骨細胞、骨細胞または筋細胞から選択することができる。細胞は、完全に分化した細胞であるか、または、始原体／幹細胞である。
【００８３】
好ましい実施形態において、真核生物細胞は、１０％の熱不活化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）をＬグルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）とともに含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において成長させられる。いくつかの細胞は特別な栄養（例えば、増殖因子およびアミノ酸など）を必要とするので、ある種の細胞は特別な培地において培養されなければならないことが当業者によって理解される。細胞の最適な密度は細胞タイプおよび実験目的に依存する。例えば、７０％〜８０％のコンフルエントな細胞の集団が遺伝子のトランスフェクションのためには好ましく、しかし、オリゴヌクレオチド送達のためには、最適な条件は３０％〜５０％のコンフルエントな細胞である。１つの例示的な実施形態において、ウエルあたり５ｘ１０４個の２９３細胞が９６ウエルプレートに播種されたならば、細胞は、細胞播種後１８時間〜２４時間で、８０％のコンフルエンシーに達する。ＨｅＬａ７０５細胞については、ウエルあたりほんの１ｘ１０４個の細胞が、９６ウエルプレートにおいて、類似するコンフルエントな割合に達するために必要とされるにすぎない。
【００８４】
細胞が、ｓｉＲＮＡ／送達試薬を含有する表面に播種された後、細胞は、その細胞タイプのための最適な条件（例えば、３７℃、５％〜１０％のＣＯ２）のもとでインキュベーションされる。培養時間は実験目的に依存する。典型的には、細胞は、遺伝子トランスフェクション実験については、細胞が標的遺伝子を発現するために２４時間〜４８時間インキュベーションされる。細胞におけるｓｉＲＮＡの細胞内輸送の分析では、数分〜数時間のインキュベーションが要求されることがあり、細胞を、規定された時点で観測することができる。
【００８５】
ｓｉＲＮＡ送達の結果を種々の方法によって分析することができる。遺伝子トランスフェクションおよびアンチセンス核酸送達の場合には、標的遺伝子の発現レベルをレポーター遺伝子によって検出することができ、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子またはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現などによって検出することができる。例えば、ＧＦＰのシグナルを顕微鏡下で直接に観測することができる；ルシフェラーゼの活性をルミノメーターによって検出することができる；β−ガラクトシダーゼにより触媒される青色生成物を顕微鏡下で観測することができ、または、マイクロプレートリーダーによって求めることができる。本発明の実施はこれらの例に限定されない。当業者は、これらのレポーターがどのように機能するかを熟知しており、また、これらのレポーターがどのように遺伝子送達システムに導入され得るかを熟知している。本明細書中に記載される方法によって送達される核酸およびその産物（タンパク質、ペプチドまたは他の生体分子）、ならびに、これらの生体分子によって調節される標的を様々な方法によって求めることができ、例えば、免疫蛍光または酵素免疫細胞化学、オートラジオグラフィー、あるいは、インサイチューハイブリダイゼーションを検出することなどによって求めることができる。免疫蛍光が、コードされたタンパク質の発現を検出するために使用されるならば、標的タンパク質と結合する蛍光標識された抗体が使用される（例えば、抗体がタンパク質に結合するための好適な条件のもとでスライドに加えられる）。タンパク質を含有する細胞が、その後、蛍光シグナルを検出することによって特定される。送達された分子により、遺伝子発現が調節され得るならば、標的遺伝子の発現レベルもまた、様々な方法によって求めることができ、例えば、オートラジオグラフィー、インサイチューハイブリダイゼーションおよびインサイチューＰＣＲなどによって求めることができる。しかしながら、特定方法は、送達された生体分子、送達された生体分子の発現産物、発現産物によって調製される標的、および／または、生体分子の送達から生じる最終的な産物の性質に依存する。
【００８６】
送達方法は、ポリマーを表面（例えば、ディッシュ、スライドまたはマルチウエルプレートなど）に塗布することを含むことができる。その後、細胞およびｓｉＲＮＡを任意の順序で加え、細胞内へのｓｉＲＮＡの送達のために効果的な期間にわたってインキュベーションすることができる。
【００８７】
送達エンハンサー
いくつかの実施形態において、組成物は送達エンハンサーを含むことができる。細胞内へのＲＮＡｉ生体分子またはｓｉＲＮＡ生体分子の輸送には３つの障壁が存在することが一般に認識されている。これらは、細胞膜、エンドソーム膜、および、キャリアからの生体分子の放出である。
【００８８】
ＤＮＡおよびＲＮＡの両方の場合において、核酸−キャリアの複合体は最初に細胞膜を通過しなければならない。これがエンドサイトーシスによって達成されるとき、その後、核酸−キャリアの複合体が内在化される。キャリアが、核酸カーゴととともに、ポケットの形成により細胞膜によって包まれ、続いて、ポケットがくびれて切れる。その結果が、核酸カーゴおよびキャリアを取り囲む大きい膜結合した構造体である細胞エンドソームである。核酸−キャリアの複合体は、その後、エンドソーム膜から細胞質に抜け出なければならず、また、細胞質における酵素分解を避けなければならない。核酸カーゴはキャリアから分離しなければならない。一般に、上記で記載された障壁の１つまたは複数を克服するために設計されるものはどれも、送達エンハンサーであると見なすことができる。
【００８９】
一般に、送達エンハンサーは２つのカテゴリーに分けられる。これらはウイルスキャリアシステムおよび非ウイルスキャリアシステムである。ヒトウイルスは、上記で議論された核内への輸送に対する障壁を克服するための様々な進化させた様式を有するので、ウイルスまたはウイルス成分が細胞内への核酸の輸送において有用である。送達エンハンサーとして有用なウイルス成分の一例が赤血球凝集素ペプチド（ＨＡペプチド）である。このウイルスペプチドは、細胞内への生体分子の輸送をエンドソーム破壊によって促進させる。エンドソームの酸性ｐＨにおいて、このタンパク質は細胞質ゾル内への生体分子およびキャリアの放出を生じさせる。
【００９０】
非ウイルス性の送達エンハンサーはポリマーに基づき得るか、または、脂質に基づき得るかのどちらかである。それらは一般には、核酸の負電荷をバランスさせるように作用するポリカチオンである。分岐鎖形態のポリカチオン、例えば、ＰＥＩデンドリマーおよびＳｔａｒｂｕｒｓｔデンドリマーなどはエンドソーム放出を媒介することができる（Ｂｏｕｓｓｉｆ他（１９９５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９２巻：７２９７〜７３０１）。ＰＥＩは、ｐＨ６．９においてイオン化し得る末端アミンと、ｐＨ３．９においてイオン化し得る内部アミンとを有する非常に分岐したポリマーであり、この構成のために、小胞の膨潤、および、究極的には、エンドソーム捕捉からの放出を引き起こす、小胞のｐＨにおける変化を生じさせることができる。
【００９１】
送達を高めるための別の手段が、リガンドをキャリア表面に設計することである。リガンドは、受容体を、カーゴ送達のために標的化されている細胞の表面に有しなければならない。その場合、細胞内への生体分子の送達が受容体認識によって開始される。リガンドがその特異的な細胞受容体に結合するとき、エンドサイトーシスが刺激される。生体分子の輸送を高めるために様々な細胞タイプとともに使用されているリガンドの例として、ガラクトース、トランスフェリン、糖タンパク質のアシアロオロソムコイド、アデノウイルス繊維、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク質、上皮増殖因子、ヒトパピローマウイルスのカプシド、線維芽細胞増殖因子および葉酸がある。葉酸受容体の場合、結合したリガンドが、ポトサイトーシスと呼ばれるプロセスを介して内在化される（ポトサイトーシスでは、受容体がリガンドと結合し、周囲の膜が閉じて細胞表面から離れ、その後、内在化物が小胞の膜を通って細胞質の中に移動する）（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ他（１９９４）、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１：１８５〜１９１）。
【００９２】
様々な作用因がエンドソーム破壊のために使用されている。上記で記載されたＨＡタンパク質のほかに、欠陥ウイルスの粒子もまた、エンドソーム溶解剤として使用されている（Ｃｏｔｔｅｎ他（１９９２年、７月）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻：６０９４頁〜６０９８頁）。非ウイルス性の作用因は両親媒であるか、または、脂質に基づくかのどちらかである。
【００９３】
細胞の細胞質の中への生体分子（例えば、ＤＮＡなど）の放出を、エンドソーム破壊を媒介するか、または、分解を低下させるか、または、このプロセスを一度に迂回するかのどれかである作用因によって高めることができる。クロロキンは、エンドソームのｐＨを上昇させるので、エンドサイトーシスを受けた物の分解を、リソソームの加水分解酵素を阻害することによって低下させるために使用されている（Ｗａｇｎｅｒ他（１９９０）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８７巻：３４１０〜３４１４）。分岐鎖のポリカチオン、例えば、ＰＥＩデンドリマーおよびスターバースト型デンドリマーなどもまた、上記で議論されるようなエンドソーム放出を促進させる。
【００９４】
エンドソームでの分解を完全に迂回するために、様々な毒素（例えば、ジプテリア毒素およびシュードモナス菌体内毒素など）のサブユニットが、遺伝子／遺伝子キャリアの複合体に取り込むことができるキメラタンパク質の成分として利用されている（Ｕｈｅｒｅｋ他（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７３巻：８８３５〜８８４１）。これらの成分は、エンドソーム膜を通過し、小胞体を通って戻る核酸のシャトル輸送を促進させる。
【００９５】
使用方法
本明細書中に開示される１つの実施形態が、ｓｉＲＮＡをガンの処置のために哺乳動物ガン細胞に送達するために、本明細書中に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを使用することを含む、ガンを処置する方法に関連する。例示的なガンには、子宮頸ガン、メラノーマ、前立腺ガン、肺ガン、結腸直腸ガン、白血球、膵臓ガン、子宮内膜ガン、卵巣ガンまたは非ホジキンリンパ腫が含まれる。
【００９６】
１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡが、疾患の処置として投与される。好ましい実施形態において、疾患状態において発現または過剰発現する遺伝子のコード領域の全体または一部に対応するｓｉＲＮＡが、処置を必要としている患者に投与される。好ましい実施形態において、心臓血管疾患または糖尿病において上昇するタンパク質をコードする遺伝子の全体または一部に対応するｓｉＲＮＡが、遺伝子産物のレベルを正常な範囲および／または健康な範囲にするか、あるいは、正常な範囲および／または健康な範囲により近づけるために、対象に投与される。１つの好ましい実施形態において、アポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｏ−Ｂ）に対するｓｉＲＮＡが、本明細書中に記載されるトランスフェクション剤（例えば、本明細書中に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーなど）との複合体で投与される。アポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｏ−Ｂ）のコード領域に対応するｓｉＲＮＡの投与は、心臓血管疾患、心筋梗塞および／または発作の危険性を低下させることができる。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、「対象」は、処置、観察または実験の対象体である動物を示す。「動物」には、冷血脊椎動物および温血脊椎動物、ならびに、非脊椎動物が含まれ、例えば、魚類、甲殻類、爬虫類、および、特に、哺乳動物などが含まれる。「哺乳動物」には、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、霊長類（例えば、小形サル、チンパンジーおよび大形サルなど）、および、特に、ヒトが含まれる。
【００９８】
本明細書中で使用される場合、用語「処置する」、用語「処置」、用語「治療的」または用語「治療」は、疾患または状態の完全な治癒または消滅を必ずしも意味しない。疾患または状態の何らかの望ましくない徴候または症状を何らかの程度に緩和することはどれも、処置および／または治療であると見なすことができる。さらに、処置には、健康であることの患者の全般的な感覚、または、患者の外観を悪くし得る行為が含まれる場合がある。
【００９９】
用語「治療効果的な量」は、示される生物学的応答または医学的応答を誘発する活性な化合物または医薬剤の量を示すために使用される。この応答は、組織、系、動物またはヒトにおいて生じさせることができ、処置されている疾患の症状の緩和を含む。
【０１００】
本明細書中に開示される組成物および医薬組成物のための的確な配合、投与経路および投薬は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、第１章（これは本明細書により参照によってその全体が組み込まれる）を参照のこと）。典型的には、患者に投与される組成物の用量範囲は、約０．５ｍｇ／ｋｇ患者体重〜１０００ｍｇ／ｋｇ患者体重、または、１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜５００ｍｇ／ｋｇ患者体重、または、１０ｍｇ／ｋｇ患者体重〜５００ｍｇ／ｋｇ患者体重、または、５０ｍｇ／ｋｇ患者体重〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重であり得る。投薬は、患者によって必要とされるように、１日またはそれ以上の経過において与えられる単回投薬または２回以上の連続であり得る。ヒトへの投薬量が確立されていない場合、ヒトへの好適な投薬量を、動物における毒性研究および効力研究によって修正されるように、インビトロ研究またはインビボ研究から導かれるＥＤ５０値またはＩＤ５０値、あるいは、他の適切な値から推定することができる。
【０１０１】
的確な投薬量は薬物毎に基づいて決定されるが、ほとんどの場合において、投薬量に関するいくつかの一般化を行うことができる。成人患者についての１日の投薬様式は、例えば、遊離塩基として計算される場合、本明細書中に開示される医薬組成物のそれぞれの成分またはその医薬的に許容される塩の、それぞれの成分が０．１ｍｇ〜５００ｍｇの間である経口用量（好ましくは、１ｍｇ〜２５０ｍｇの間、例えば、５ｍｇ〜２００ｍｇ）、あるいは、それぞれの成分が０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの間である静脈内用量、皮下用量または筋肉内用量（好ましくは、０．１ｍｇ〜６０ｍｇの間、例えば、１ｍｇ〜４０ｍｇ）とすることができ、この場合、組成物は１日あたり１回〜４回投与される。あるいは、本明細書中に開示される組成物は、連続静脈内注入によって、好ましくは１日あたり４００ｍｇまでのそれぞれの成分の用量で投与することができる。従って、それぞれの成分の経口投与による１日の総投薬量は典型的には１ｍｇ〜２０００ｍｇの範囲にあり、非経口経口投与による１日の総投薬量は典型的には０．１ｍｇ〜４００ｍｇの範囲にある。いくつかの実施形態において、化合物は連続治療の期間にわたって投与され、例えば、１週間またはそれ以上にわたって、あるいは、数ヶ月または数年にわたって投与される。
【０１０２】
投薬量および投薬間隔を、調節効果または最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するために十分である、活性な成分の血漿中レベルを提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの化合物について変化し、しかし、インビトロデータから見積もることができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個々の特性および投与経路に依存する。しかしながら、様々なＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを、血漿中濃度を求めるために使用することができる。
【０１０３】
投薬間隔もまた、ＭＥＣ値を使用して決定することができる。組成物は、ＭＥＣを越える血漿中レベルを、時間の１０％〜９０％にわたって、好ましくは３０％〜９０％の間で、最も好ましくは５０％〜９０％の間で維持する治療方式を使用して投与されなければならない。
【０１０４】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、対象の体重、苦痛の重篤度、投与様式および処方医師の判断に依存する。
【実施例】
【０１０５】
すべての化学薬品、メタノール、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ポリエチレングリコールメチルエーテルアクリラート（ＰＥＧ）および他の試薬をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ化学会社から購入した。ポリエチレンイミンをＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．から購入した。式（ＩＩ）の分解可能なモノマー反応物を、米国特許出願第１１／２１６，９８６号（米国特許出願公開第２００６／０２５８７５１号）（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に報告される一般的手順に従って合成した。
【０１０６】
ＨｅＬａヒト子宮頸部腺ガン細胞およびＢ１６Ｆ０マウス皮膚メラノーマ細胞をＡＴＣＣから購入し、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。ＧＦＰ発現の安定な細胞株を、ＧＦＰ発現ベクターを細胞にトランスフェクションすることによって作製し、ヒグロマイシンＢ（ＨｅＬａ−ＧＦＰについて）またはネオマイシン（Ｂ１６Ｆ０−ＧＦＰについて）によって選抜した。
【０１０７】
（実施例１）
水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーの合成：
合成の概略図が図１に示される。ＰＥＩ（３０ｍｇ）をメタノール（３ｍＬ）に溶解した。ＤＣＭ（ジクロロメタン）（６ｍＬ）における式（ＩＩ）の分解可能なモノマー反応物（３６ｍｇ）の溶液をＰＥＩ溶液に加えた。混合物を４時間撹拌した。ＤＣＭ（２ｍＬ）におけるｍＰＥＧ（２３ｍｇ）の溶液を混合物に加えた。添加後、混合物をさらに４時間撹拌した。反応混合物を、ジエチルエーテルにおける２Ｍ塩酸を加えることによって反応停止させた。白色の沈殿物が形成され、これを遠心分離によって単離し、ジエチルエーテルにより洗浄した。水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマー生成物（６５ｍｇ、７４％の収率）を高真空による乾燥の後で得た。生成物を１Ｈ−ＮＭＲにより確認した。
【０１０８】
（実施例２）
水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーの合成：
合成の概略図が図１に示される。ＰＥＩ（１５ｍｇ）をメタノール（３ｍＬ）に溶解した。ＤＣＭ（６ｍＬ）における式（ＩＩ）の分解可能なモノマー反応物（７１ｍｇ）の溶液をＰＥＩ溶液に加えた。混合物を４時間撹拌した。ＤＣＭ（２ｍＬ）におけるｍＰＥＧ（１１ｍｇ）の溶液を混合物に加えた。添加後、混合物をさらに４時間撹拌した。反応混合物を、ジエチルエーテルにおける２Ｍ塩酸を加えることによって反応停止させた。白色の沈殿物が形成され、これを遠心分離によって単離し、ジエチルエーテルにより洗浄した。水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマー生成物（６５ｍｇ、７４％の収率）を高真空による乾燥の後で得た。生成物を１Ｈ−ＮＭＲにより確認した。
【０１０９】
（実施例３）
水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーの合成：ポリマー１
ジクロロメタン：メタノールの混合物（１：２、８ｍＬ）における分岐型ＰＥＩ（ＭＷ＝１２００ダルトン、０．９６０ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）の溶液をジクロロメタン：メタノール（１：２、４０ｍＬ）における式（ＩＩ）の分解可能なモノマー反応物（１．９１ｇ、４．０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。添加前に、式（ＩＩ）の分解可能なモノマー反応物を含有するフラスコをジクロロメタン：メタノールにより洗浄した（１：２、０．５ｍＬで４回）。添加が完了した後、反応混合物を室温で２時間撹拌した。
【化７】
2010530013.tif 000009
【０１１０】
その後、ジクロロメタン：メタノール（１：２、３ｍＬ）におけるｍＰＥＧ（ＭＷ＝４５４ダルトン、０．７２６ｇ、１．６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。添加前に、ｍＰＥＧを含有するフラスコをジクロロメタン：メタノールにより洗浄した（１：２、０．５ｍＬで４回）。その後、反応混合物をさらに１時間撹拌した。
【化８】
2010530013.tif 000010
【０１１１】
その後、反応液を、撹拌を行いながら、エーテルにおける２Ｍ塩酸の溶液（３０ｍＬ）により反応停止させる前に氷水で１０分間冷却した。懸濁物を８本の５０ｍＬの円錐型遠心分離チューブに入れ、さらなる冷却されたエーテル（−２０℃）により希釈した。チューブにおける懸濁物を遠心分離した。液体を捨て、白色の固体生成物を２回、より多くのエーテルにより洗浄し、遠心分離した。生成物を真空下で乾燥して、３．９７グラム（９０％）を得た。生成物のポリマー１（分解可能な脂質ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧ（５：１：２））を１Ｈ−ＮＭＲによって特徴づけた。
【０１１２】
（実施例４）
ｓｉＲＮＡトランスフェクション：
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞を、トランスフェクションの１日前に、ウエルあたり１ｘ１０４個の細胞の密度で９６ウエルプレートに播種した。ｓｉＲＮＡ（１．０μｇ）の溶液を蒸留水に溶解し、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により３０μＬに希釈した。これらの実験で使用されるｓｉＲＮＡは抗ＧＦＰであった（ＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＵＣＡＣＡＵＧＵＵ（配列番号１））。選択された水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマー［ポリマー２（分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧ（１２：１：２））、ポリマー３（分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧ（１６：１：２））、ポリマー４（分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧ（１７：１：２））、ポリマー５（分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧ（２０：１：２））］、および、コントロール［ＰＥＩ１２００、Ｃｙｔｏｐｕｒｅ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）、および、分解可能ユニット：ＰＥＩ（５：１）、すべてがモル比である］を、送達試薬を適量のｄＨ２Ｏに溶解することによって５ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。実験期間中、実験において指定される化合物対ｓｉＲＮＡの比率に従って、送達試薬溶液をさらに、３０μｌの最終的な体積にＯｐｔｉＭＥＭにより希釈した。希釈されたｓｉＲＮＡ溶液と、送達試薬溶液とを混合し、室温で１５分間インキュベーションした。ｓｉＲＮＡおよび送達試薬の混合物（１５ｕＬ）を、事前に播種された細胞のそれぞれのウエルに加え、混合し、５％ＣＯ２とともに３７℃のインキュベーターでインキュベーションした。４８時間後、トランスフェクションおよび効率細胞生存率を評価した。
【０１１３】
（実施例５）
トランスフェクション効率の評価：
約４８時間後、トランスフェクションを、ＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡下で測定することによって評価した。ＧＦＰの吸光度をＵＶ−ｖｉｓマイクロプレートリーダーにより４８５ｎｍ〜５２８ｎｍにおいて検出した。ＨｅＬａ細胞における緑色蛍光タンパク質のパーセント活性の結果が図２に示される。Ｂ１６Ｆ０細胞における緑色蛍光タンパク質のパーセント活性の結果が図３に示される。これらの結果は、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、コントロール［ＰＥＩ１２００、Ｃｙｔｏｐｕｒｅ（商標）、および、架橋された分解可能ユニット：ＰＥＩ（５：１）］と比較して、より効果的に緑色蛍光タンパク質の発現を阻害する（または停止させる）ことを示す。
【０１１４】
（実施例６）
細胞生存率アッセイ：
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の溶液を、２５０ｍｇの固体ＭＴＴを５０ｍＬのＤｕｂｅｃｃｏ  ＰＢＳに溶解することによって調製し、４℃で貯蔵した。４８時間のトランスフェクションの後、ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬの１０μＬ）を細胞のそれぞれのウエルに加え、紫色結晶の成長が観測され得るまで３７℃で２時間〜４時間インキュベーションした。その後、可溶化された溶液（１００μＬ）を加え、３７℃で一晩インキュベーションした。吸光度を、６９０ｎｍでの吸光度を参照として、５７０ｎｍの波長で検出した。細胞生存率アッセイの結果が図４に示される。
【０１１５】
（実施例７）
プレートの被覆：
ＰＥＩ−１．２Ｋ、Ｃｙｔｏｐｕｒｅ（商標）、Ｌ２Ｋおよびポリマー１を別々にＨ２Ｏに溶解して、５ｍｇ／ｍＬのストック溶液を作製した。種々の化合物を、３０μＬの最終的な体積において、０．６２５μｇ／ウエル、１．２５μｇ／ウエル、２．５０μｇ／ウエルおよび５．０μｇ／ウエルの量で９６ウエルプレートに被覆し、真空乾燥機で一晩乾燥した。乾燥したプレートを使用までアルミニウムホイルで密封した。
【０１１６】
（実施例８）
トランスフェクション：
１．０μｇのｓｉＲＮＡ（抗ＧＦＰ）をＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により３０μＬに希釈し、被覆されたウエルに加え、室温で２５分間インキュベーションした。その後、（ＧＦＰを発現する）細胞を１００μＬの培養培地において１．５ｘ１０４個／ウエルで対応するウエルに播種し、５％ＣＯ２とともに３７℃のインキュベーターでインキュベーションした。
【０１１７】
（実施例９）
検出：
４８時間のトランスフェクションの後、ＧＦＰの発現を顕微鏡下で観測した。ＧＦＰの吸光度をＵＶ−ｖｉｓマイクロプレートリーダーにより４８５ｎｍ〜５２８ｎｍにおいて検出した。結果が、Ｈｅｌａ細胞については５：１および１０：１のポリマー：ｓｉＲＮＡの比率で、Ｂ１６Ｆ０細胞については２．５：１、５：１および１０：１の比率で、図５、図７、図９、図１１および図１３において報告される。すべての場合において、ポリマー１を使用するトランスフェクションは、陽性コントロール（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標））と比較して、より良好（Ｈｅｌａ細胞、５：１；Ｂ１６Ｆ０、試験されたすべての比率）、または、同等（Ｈｅｌａ細胞、１０：１の比率）であった。
【０１１８】
（実施例１０）
細胞生存率アッセイ：
４８時間のトランスフェクションの後、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、ＰＢＳにおいて５ｍｇ／ｍＬ）溶液の１０μＬを細胞のそれぞれのウエルに加え、細胞を、紫色結晶の成長が観測され得るまで３７℃で２時間〜４時間インキュベーションした。その後、１００μＬの可溶化溶液をそれぞれのウエルに加え、それぞれのウエルを３７℃で一晩インキュベーションした。吸光度を、６９０ｎｍでの吸光度を参照として、５７０ｎｍの波長で検出した。結果が、Ｈｅｌａ細胞については５：１および１０：１のポリマー：ｓｉＲＮＡの比率で、Ｂ１６Ｆ０細胞については２．５：１、５：１および１０：１の比率で、図６、図８、図１０、図１２および図１４において報告される。両方の細胞タイプについてのすべての試験された比率において、ポリマー１は細胞毒性を示さなかった。
【０１１９】
（実施例１１）
ＨｅｐＧ２細胞におけるｓｉＲＮＡによるアポリポタンパク質Ｂタンパク質の阻害
アポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｏ−Ｂ）は低密度リポタンパク質の主要なアポリポタンパク質であり、心臓疾患の危険性についてのマーカーである。Ａｐｏ−Ｂ発現の阻害は心臓疾患の危険性を低下させ得る。
【０１２０】
ポリマー６を、実施例１〜実施例３に記載されるように合成した。ポリマー６は、分解可能ユニット：ＰＥＩ：ＰＥＧのモル比が１６．５：１：２である水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである。分解可能ユニットおよびＰＥＩは、実施例３に記載されるのと同じである。ポリマー６を図１５および図１７〜図２０の実験におけるトランスフェクション剤として使用した。
【０１２１】
センス：５’−ＧＵＣＡＵＣＡＣＡＣＵＧＡＡＵＡＣＣＡＡＵＵＵ−３’（配列番号２）およびアンチセンス：５’−ＡＵＵＧＧＵＡＵＵＣＡＧＵＧＵＧＡＵＧＡＣＵＵ−３’（配列番号３）（抗Ａｐｏ−Ｂ）の配列を有するｓｉＲＮＡ（抗Ａｐｏ−Ｂ、これはＤｈａｒｍａｃｏｎにおいて合成された）の１μｇ、２．５μｇまたは５μｇをＯｐｔｉＭＥＭ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により３０μＬに希釈し、上記の実施例４に記載されるようにトランスフェクション剤としてのＰＥＧ化ポリマー６と複合体化した。トランスフェクション剤：ｓｉＲＮＡの比率が２：１であった。混合物を、１００μＬの培養培地においてウエルあたり１．５ｘ１０４個でウエルに播種されたＨｅｐＧ２細胞を含有する９６ウエルプレートに加え、５％ＣＯ２とともに３７℃インキュベーターでインキュベーションした。コントロールの処置は、（１）ｓｉＲＮＡ非存在およびポリマー非存在（ブランク）、（２）抗Ａｐｏ−Ｂのみ（ｓｉａｐｏＢ単独：５μｇ）、および、（３）トランスフェクション剤単独（ポリマー６単独）であった。
【０１２２】
４８時間のインキュベーションの後、ｍＲＮＡ発現を、Ａｐｏ−ＢのｍＲＮＡについての下記のプライマーを用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲによって求めた：フォワード：５’−ＴＴＴＧＣＣＣＴＣＡＡＣＣＴＡＣＣＡＡＣ−３’（配列番号４）、および、リバース：５’−ＴＧＣＧＡＴＣＴＴＧＴＴＧＧＣＴＡＣＴＧ−３’（配列番号５）。図１５は、ＨｅｐＧ２細胞培養におけるＡｐｏ−ＢのｍＲＮＡの発現に対するｓｉＲＮＡの影響を示す。発現が、ブランクに対して示される。予想されるように、ｓｉＡｐｏ−Ｂ単独またはトランスフェクション剤（ポリマー６）単独のどちらも、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡｐｏ−Ｂの発現に対する影響を何ら有していなかった。トランスフェクション剤／ｓｉＲＮＡの複合体の量が増大するにつれて、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡｐｏ−ＢのｍＲＮＡレベルの阻害が低下する。このことは、カチオン性のＰＥＧ化されたポリマーのトランスフェクション剤が、Ａｐｏ−Ｂをインビトロで阻害するための哺乳動物細胞内への抗Ａｐｏ−Ｂの送達において効果的であることを示す。
【０１２３】
（実施例１２）
５％グルコースにおけるトランスフェクション剤／ｓｉＲＮＡの複合体の安定性
図１６は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合した後における蛍光によって明らかにされるようなトランスフェクション剤／ｓｉＲＮＡの複合体の安定性を示す。結果は、トランスフェクション剤（ポリマー２）対ｓｉＲＮＡの比率が増大するにつれて、蛍光が低下することを示す。
【０１２４】
（実施例１３）
ｎｕ／ｎｕマウスにおける抗ｓｉＲＮＡの影響
複合体を、５：１の比率で、トランスフェクション剤のポリマー６と、上記の実施例１１に記載されるように調製されるｓｉＲＮＡ（抗Ａｐｏ−Ｂ）との間で形成させた。複合体をマウスの尾静脈に皮下注入した。結果が図１７に示される。
【０１２５】
図１７に示されるように、１．０ｍｇ／ｋｇの抗Ａｐｏ−Ｂ  ｓｉＲＮＡの術後４８時間での投与、および、２．５ｍｇ／ｋｇの抗Ａｐｏ−Ｂ  ｓｉＲＮＡの術後２週間での投与はともに、ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＡｐｏ−ＢのｍＲＮＡの発現を効果的に阻害した。
【０１２６】
別個の実験において、トランスフェクション剤（ポリマー６）対抗Ａｐｏ−Ｂ  ｓｉＲＮＡの比率を５：１から１０：１にまで変化させた。注入された量は１．０ｍｇ／ｋｇで維持された。すべての比率により、Ａｐｏ−ＢのｍＲＮＡの発現が阻害されたが、最も強い阻害が５：１および７．５：１の比率において観測された（図１８）。
【０１２７】
カチオン性のＰＥＧ化されたポリマーをマウスに注入することの阻害効果が、２．５ｍｇ／ｋｇの注入量により、図１９に示されるように少なくとも２週間にわたって持続した。
【０１２８】
（実施例１４）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける抗ｓｉＲＮＡの影響
図２０は、トランスフェクション剤のポリマー６と複合体化された、１．０ｍｇ／ｋｇの抗Ａｐｏ−Ｂ  ｓｉＲＮＡの汎用マウス系統（Ｃ５７ＢＬ／６）への注入を示す。注入された量が、実施例１３のｎｕ／ｎｕマウスと比較して、１．０ｍｇ／ｋｇに増大されたとき、Ａｐｏ−ＢのｍＲＮＡ発現のより強い阻害が観測された（図２０）。阻害が２週間にわたって観測された。３週間で、Ａｐｏ−Ｂ発現のレベルがコントロールのレベルに戻った（図２０）。
【０１２９】
数多くの様々な改変が、本発明の精神から逸脱することなく行われ得ることが当業者によって理解される。従って、本発明の様々な形態は例示にすぎず、本発明の範囲を限定するために意図されないことが明らかに理解されなければならない。
【図１】
2010530013.tif 000015
【図２】
2010530013.tif 000016
【図３】
2010530013.tif 000017
【図４】
2010530013.tif 000018
【図５】
2010530013.tif 000019
【図６】
2010530013.tif 000020
【図７】
2010530013.tif 000021
【図８】
2010530013.tif 000022
【図９】
2010530013.tif 000023
【図１０】
2010530013.tif 000024
【図１１】
2010530013.tif 000025
【図１２】
2010530013.tif 000026
【図１３】
2010530013.tif 000027
【図１４】
2010530013.tif 000028
【図１５】
2010530013.tif 000029
【図１６】
2010530013.tif 000030
【図１７】
2010530013.tif 000031
【図１８】
2010530013.tif 000032
【図１９】
2010530013.tif 000033
【図２０】
2010530013.tif 000034
【配列表】
2010530013000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年3月18日(2010.3.18)
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）繰り返し骨格のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ユニット、
（ｂ）繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ユニット、および
（ｃ）側鎖脂質基を含む、繰り返し骨格の分解可能ユニット
を含む水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを含む、ｓｉＲＮＡ送達のための組成物。
【請求項２】
前記繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットが約５０ダルトン〜約５，０００ダルトンの範囲での分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットが約４００ダルトン〜約６００ダルトンの範囲での分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットが約２００ダルトン〜約２５，０００ダルトンの範囲での分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットが約６００ダルトン〜約２，０００ダルトンの範囲での分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記繰り返し骨格の分解可能ユニットが、下記の式（Ｉ）：
【化１】
2010530013.tif 000037
（式中、
Ａ１は非存在であるか、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニルおよび−（ＣＨ２）ｎ１−Ｄ−（ＣＨ２）ｎ２−からなる群から選択される、場合により置換された置換基であり、
ただし、ｎ１およびｎ２はそれぞれが独立して、０、または、１〜１０の範囲における整数であり、かつ
Ｄは、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される、場合により置換された置換基である；
Ａ２は非存在であるか、あるいは、酸素原子または−Ｎ（ＲＮ）であり、ただし、ＲＮはＨまたはＣ１〜６アルキルである；
Ｒ１は、電子対、または、水素、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基であり、
ただし、Ｒ１が、水素、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基であるならば、Ｒ１が結合する窒素原子は正電荷を有する；および
Ｒ２は、Ｃ２〜Ｃ５０アルキル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ５０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ５〜Ｃ５０アリール、Ｃ５〜Ｃ５０ヘテロアリール、−（ＣＨ２）ｐ１−Ｅ−（ＣＨ２）ｐ２−およびステロールからなる群から選択され、
ただし、ｐ１およびｐ２はそれぞれが独立して、０、または、１〜４０の範囲における整数であり、かつ
Ｅは、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される、場合により置換された置換基である）
の繰り返しユニットを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
Ｒ２が、オレイル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、マルガリル、ステアリル、アラキジル、ベヘニル、リグノセリルおよびステロールからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ２がオレイルである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記繰り返し骨格の分解可能ユニットが、
【化２】
2010530013.tif 000038
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記繰り返し骨格のＰＥＩユニットが約１２００ダルトンの分子量を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記繰り返し骨格のＰＥＩユニットが分岐型ＰＥＩユニットである、請求項９〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記繰り返し骨格のＰＥＧユニットが約４５４ダルトンの分子量を有する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約９５モル％の前記繰り返し骨格の分解可能ユニットを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約３０モル％〜約９０モル％の前記繰り返し骨格の分解可能ユニットを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約５０モル％〜約８６モル％の前記繰り返し骨格の分解可能ユニットを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約３５モル％の前記繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約２０モル％の前記繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約５モル％〜約１５モル％の前記繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミンユニットを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約８０モル％の前記繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約１モル％〜約５０モル％の前記繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約５モル％〜約３０モル％の前記繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにおける繰り返しユニットの総モル数に基づいて約８モル％〜約３０モル％の前記繰り返し骨格のポリエチレングリコールユニットを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを作製する方法であって、
繰り返しエチレンイミンユニットを含む第１の反応物を有機溶媒に溶解して、溶解または部分的に溶解されたポリマー反応物を形成すること；
溶解または部分的に溶解されたポリマー反応物を分解可能なモノマー反応物と反応させて、分解可能な架橋されたポリマーを形成すること（ただし、分解可能なモノマー反応物が脂質基を含む）；および
分解可能な架橋されたポリマーを第３の反応物と反応させること（ただし、第３の反応物が繰り返しポリエチレングリコールユニットを含む）
を含む、方法。
【請求項２４】
前記第１の反応物がポリエチレンイミンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記分解可能なモノマー反応物が、下記の式（ＩＩ）：
【化３】
2010530013.tif 000039
（式中、
Ａ１は非存在であるか、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニルおよび−（ＣＨ２）ｎ１−Ｄ−（ＣＨ２）ｎ２−からなる群から選択される、場合により置換された置換基であり、
ただし、ｎ１およびｎ２はそれぞれが独立して、０、または、１〜１０の範囲における整数であり、かつ
Ｄは、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基である；
Ａ２は非存在であるか、あるいは、酸素原子または−Ｎ（ＲＮ）であり、ただし、ＲＮはＨまたはＣ１〜６アルキルである；
Ｒ１は、電子対、または、水素、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基であり、
ただし、Ｒ１が、水素、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基であるならば、Ｒ１が結合する窒素原子は正電荷を有する；および
Ｒ２は、Ｃ２〜Ｃ５０アルキル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ５０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ５〜Ｃ５０アリール、Ｃ５〜Ｃ５０ヘテロアリール、−（ＣＨ２）ｐ１−Ｅ−（ＣＨ２）ｐ２−およびステロールからなる群から選択され、
ただし、ｐ１およびｐ２はそれぞれが独立して、０、または、１〜４０の範囲における整数であり、かつ
Ｅは、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルからなる群から選択される場合により置換された置換基である）
の化合物である、請求項２３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
Ｒ２が、オレイル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、マルガリル、ステアリル、アラキジル、ベヘニル、リグノセリルおよびステロールからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｒ２がオレイルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第３の反応物がポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコールである、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
式（ＩＩ）の前記化合物および前記ＰＥＩが約０．１：１〜約５０：１の範囲におけるモル比でそれぞれ存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
式（ＩＩ）の前記化合物および前記ＰＥＩが約１：１〜約３０：１の範囲におけるモル比でそれぞれ存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
式（ＩＩ）の前記化合物および前記ＰＥＩが約５：１〜約２５：１の範囲におけるモル比でそれぞれ存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＰＥＧおよび前記ＰＥＩが約０．１：１〜約１２：１の範囲におけるモル比でそれぞれ存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＰＥＧおよび前記ＰＥＩが約１：１〜約１０：１の範囲におけるモル比でそれぞれ存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＰＥＧおよび前記ＰＥＩが約１：１〜約４：１の範囲におけるモル比でそれぞれ存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞内に送達する方法であって、
請求項１〜２２のいずれか一項に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーを前記ｓｉＲＮＡと一緒にして、混合物を形成すること、および
１つまたは複数の細胞を前記混合物と接触させること
を含む、方法。
【請求項３６】
前記ｓｉＲＮＡが１９塩基対〜２７塩基対である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３５〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記哺乳動物細胞がガン細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｓｉＲＮＡが、リポタンパク質遺伝子セグメントのコード領域の少なくとも一部分に対応するｓｉＲＮＡである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記リポタンパク質がアポリポタンパク質Ｂである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
心臓血管疾患を処置するか、または、心臓血管疾患の危険性を低下させるための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物の効果的な量を含む医薬組成物。
【請求項４２】
前記医薬組成物が、リポタンパク質遺伝子セグメントのコード領域の少なくとも一部分に対応するｓｉＲＮＡの治療効果的な量と組み合わせて用いるために作製されたものである、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記ｓｉＲＮＡが水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーと複合体化されている、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記リポタンパク質がアポリポタンパク質Ｂである、請求項４２〜４３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
トランスフェクション剤を含む組成物が少なくとも部分的に付着する固体表面を含む、真核生物細胞をｓｉＲＮＡによりトランスフェクションするためのデバイスであって、前記トランスフェクション試薬が、水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマー、カチオン性ポリマー、リポポリマー、ＰＥＧ化されたカチオン性ポリマー、ＰＥＧ化されたリポポリマー、カチオン性脂質、ＰＥＧ化されたカチオン性脂質、および、カチオン性の分解可能なＰＥＧ化されたリポポリマーからなる群から選択される、デバイス。
【請求項４６】
前記固体表面が、ディッシュの底、マルチウエルプレート、連続表面、ビーズ、繊維またはペレットである、請求項４５に記載のデバイス。
【請求項４７】
前記固体表面が、ポリスチレン樹脂、エポキシ樹脂、天然樹脂、ガラスまたは金属である、請求項４５に記載のデバイス。
【請求項４８】
前記トランスフェクション試薬が、前記試薬を手作業または自動化された機構により前記固体表面に一様に塗布することによって、あるいは、前記トランスフェクション試薬を手作業または自動化された機構により前記固体表面にスポットすることによって前記表面に付着させられる、請求項４５に記載のデバイス。
【請求項４９】
前記トランスフェクション剤が水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーである、請求項４５に記載のデバイス。
【請求項５０】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、
（ａ）繰り返し骨格のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ユニット、
（ｂ）繰り返し骨格のカチオン性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ユニット、および
（ｃ）側鎖脂質基を含む、繰り返し骨格の分解可能ユニット
を含む、請求項４９に記載のデバイス。
【請求項５１】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、分子量が約１２００ダルトンである繰り返し骨格のＰＥＩユニットと、分子量が約４５４ダルトンである繰り返し骨格のＰＥＧユニットと、
【化４】
2010530013.tif 000040
である繰り返し骨格の分解可能ユニットとを含む、請求項５０に記載のデバイス。
【請求項５２】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーの分子量が約５００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲にある、請求項５０〜５１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５３】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーの分子量が約２０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンの範囲にある、請求項５０〜５１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５４】
ｓｉＲＮＡが真核生物細胞の中に入ることができるかどうかを判定する方法であって、
（ａ）請求項４５に記載されるデバイスを提供すること、
（ｂ）ｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡがトランスフェクション試薬と相互作用するように前記デバイスに加えること、
（ｃ）真核生物細胞を細胞内へのｓｉＲＮＡの導入のための十分な密度および適切な条件で前記デバイスに播種すること、および
（ｄ）ｓｉＲＮＡが細胞の中に入っているかどうかを検出すること
を含む、方法。
【請求項５５】
前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記哺乳動物細胞が分裂細胞または非分裂細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記哺乳動物細胞が形質転換細胞または初代細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記哺乳動物細胞が体細胞または幹細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記真核生物細胞が植物細胞または昆虫細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
ｓｉＲＮＡを真核生物細胞に導入するための方法であって、
（ａ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載される水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーにより少なくとも部分的に被覆される固体表面を提供すること、
（ｂ）真核生物細胞に導入されるためのｓｉＲＮＡを細胞表面に加えること、および
（ｃ）細胞を真核生物細胞内へのｓｉＲＮＡの導入のための十分な密度および適切な条件で前記固体表面に播種すること
を含む、方法。
【請求項６１】
前記固体表面が、フラスコ、ディッシュ、マルチウエルプレート、ガラススライドおよび埋め込みデバイスからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記水溶性の分解可能な架橋されたカチオン性ポリマーが、前記試薬を手作業または自動化された機構により前記固体表面に一様に塗布することによって、あるいは、前記トランスフェクション試薬を手作業または自動化された機構により前記固体表面にスポットすることによって前記表面に付着させられる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記哺乳動物細胞が分裂細胞または非分裂細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記哺乳動物細胞が形質転換細胞または初代細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記哺乳動物細胞が体細胞または幹細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記真核生物細胞が植物細胞または昆虫細胞である、請求項６０に記載の方法。
【国際調査報告】
2010530013.tif 000041
2010530013.tif 000042
2010530013.tif 000043
2010530013.tif 000044