(57)【要約】  本発明は、血清アルブミンなどの血清タンパク質に結合するアミノ酸配列；そのようなアミノ酸配列を含む、または本質的にそれからなるタンパク質およびポリペプチド；そのようなアミノ酸配列、タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸；そのようなアミノ酸配列、タンパク質およびポリペプチドを含む組成物、および具体的には医薬組成物；ならびにそのようなアミノ酸配列、タンパク質およびポリペプチドの使用に関するもので、異なる生理学的状況において本質的にコンディショナルである、例えば、酸性条件下では、ｐＨ中性条件下とは異なる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の分子に対して向けられたアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が：
ａ）第１の生物学的条件下で、１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で、および／または少なくとも１０５M-1の結合親和性（ＫＡ）で前記所望の分子に結合し；および
ｂ）第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合する解離定数よりも少なくとも１０倍を超える解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合する、アミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、前記第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合する解離定数よりも少なくとも１００倍以上である解離定数（ＫＤ）で、前記所望の分子に結合する、アミノ酸配列。
【請求項３】
請求項１に記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、前記第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合する解離定数よりも少なくとも１０００倍以上である解離定数（ＫＤ）で、前記所望の分子に結合する、アミノ酸配列。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、前記第１の生物学的条件下で、１０−６moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合する、アミノ酸配列。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、前記第１の生物学的条件下で、１０−７moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合する、アミノ酸配列。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、前記第１の生物学的条件下で、１０−８moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合する、アミノ酸配列。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、前記第２の生物学的条件下で、１０−６moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合する、アミノ酸配列。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、前記第２の生物学的条件下で、１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合する、アミノ酸配列。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、前記第２の生物学的条件下で、１０−４moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合する、アミノ酸配列。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が、第１の生理学的なコンパートメントまたは体液において広く認められる生理学的条件を含み、前記第２の生物学的条件が、第２の生理学的なコンパートメントまたは体液において広く認められる生理学的条件を含み、該第１および第２の生理学的なコンパートメントが、正常な生理学的条件下において、細胞膜、細胞内小胞の壁または細胞内コンパートメントの壁、または血管の壁などの少なくとも１つの生体膜により隔てられる、アミノ酸配列。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件がヒトまたは動物の身体の少なくとも１つの細胞の外で広く認められる生理学的条件を含み、前記第２の生物学的条件が前記細胞の中で広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が前記ヒトまたは動物の身体の血流またはリンパ系において広く認められる生理学的条件を含み、前記第２の生物学的条件がヒトまたは動物の身体の少なくとも１つの組織または細胞において広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第２の生物学的条件がヒトまたは動物の身体の細胞の少なくとも１つの細胞内コンパートメントにおいて広く認められる生理学的条件を含み、前記第１の生物学的条件が前記細胞の外において広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件がヒトまたは動物の身体の血流またはリンパ系において広く認められる生理学的条件を含み、前記第２の生物学的条件が前記ヒトまたは動物の身体の細胞の少なくとも１つの細胞内コンパートメントにおいて広く認められる生理学的条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件がヒトまたは動物の身体の血流またはリンパ系において広く認められる生理学的条件を含み、第２の生物学的条件が前記ヒトまたは動物の身体の細胞の少なくとも１つのエンドソーム、リポソーム、ピノソームのコンパートメント、または前記ヒトまたは動物の身体の細胞に存在する他の小胞において広く認められる生理学的条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は該ヒトまたは動物の身体の少なくとも１つの細胞により（例えば、インターナリゼーション、ピノサイトーシス、エンドサイトーシス、トランスサイトーシス、エキソサイトーシスファゴサイトーシスまたは細胞中への取り込みまたはインターナリゼーションの同様の機構により）取り込まれることができ、ここで前記第１の生物学的条件は、該アミノ酸配列が該細胞中に取り込まれる前に存在する生理学的条件を含み、および該第２の生物学的条件は、該アミノ酸配列が該細胞中に取り込まれた後に存在する生理学的条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、再循環にさらされる目的とする、または所望の分子に対して向けられ、ここで該第１の生物学的条件が、該所望の化合物の再循環に関与する該動物またはヒトの身体の少なくとも１つの細胞に関する細胞外条件を含み、該第２の生物学的条件が、該所望の化合物の再循環に関与する該動物またはヒトの身体の少なくとも１つの細胞の中で広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、再循環にさらされる目的とする、または所望の分子に対して向けられ（directed)、ここで該第１の生物学的条件が、動物またはヒトの身体の循環において広く認められる条件を含み、該第２の生物学的条件が、該所望の化合物の再循環に関与する該動物またはヒトの身体の少なくとも１つの細胞の中で広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、再循環にさらされる血清タンパク質に対して向けられ、ここで該第１の生物学的条件が、動物またはヒトの身体の循環において広く認められる条件を含み、該第２の生物学的条件が、該血清タンパク質の再循環に関与する該動物またはヒトの身体の少なくとも１つの細胞の中で広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、血清アルブミンに対して向けられ、ここで該第１の生物学的条件が、動物またはヒトの身体の循環において広く認められる条件を含み、該第２の生物学的条件が、血清アルブミンの再循環に関与する該動物またはヒトの身体の少なくとも１つの細胞の中で広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、再循環にさらされる目的とする、または所望の分子に対して向けられ、ここで該第１の生物学的条件が、該目的とする、または所望の化合物の再循環に関与する動物またはヒトの身体の少なくとも１つの細胞の細胞表面またはすぐ周辺において広く認められる条件を含み、該第２の生物学的条件が、前記細胞の中で広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項２２】
請求項１〜１７または２１のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、前記細胞による再循環にさらされる細胞の表面上のタンパク質またはポリペプチドに対して向けられ、ここで該第１の生物学的条件が、動物またはヒトの身体の前記細胞のすぐ周辺において広く認められる条件を含み、該第２の生物学的条件が、前記細胞の中で広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項２３】
請求項１〜１７、２１または２２のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、前記細胞による再循環にさらされる細胞の表面上の受容体に対して向けられ、ここで該第１の生物学的条件が、該動物またはヒトの身体の前記細胞のすぐ周辺において広く認められる条件を含み、該第２の生物学的条件が、前記細胞の中で広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件と前記第２の生物学的条件が以下の因子：ｐＨ、イオン強度、およびプロテアーゼ依存性のいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つまたは実質的にすべてにおいて異なる、アミノ酸配列。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が７．０を超える生理学的ｐＨであり、前記第２の生物学的条件が７．０未満の生理学的ｐＨである、アミノ酸配列。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が７．１を超える生理学的ｐＨであり、前記第２の生物学的条件が６．７未満の生理学的ｐＨである、アミノ酸配列。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が７．２を超える生理学的ｐＨであり、前記第２の生物学的条件が６．５未満の生理学的ｐＨである、アミノ酸配列。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が７．２〜７．４の範囲の生理学的ｐＨであり、前記第２の生物学的条件が６．０〜６．５の範囲の生理学的ｐＨである、アミノ酸配列。
【請求項２９】
請求項１〜２０または２４〜２７のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、血清タンパク質、具体的にはヒト血清タンパク質に対して向けられる、アミノ酸配列。
【請求項３０】
請求項１〜２０または２４〜２９のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、再循環にさらされる、血清タンパク質、具体的にはヒト血清タンパク質に対して向けられる、アミノ酸配列。
【請求項３１】
請求項１〜２０または２４〜３０のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、血清アルブミン、具体的にはヒト血清アルブミンに対して向けられる、アミノ酸配列。
【請求項３２】
請求項１〜２０または２４〜３１のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、ヒト血清アルブミンおよび少なくとも１つの他の哺乳動物種からの血清アルブミンに対して向けられる、アミノ酸配列。
【請求項３３】
請求項１〜２０または２４〜３２のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、ヒト血清アルブミンならびにマウス、ラット、ウサギおよび霊長類からなる群から選ばれる少なくとも１つの他の哺乳動物種からの血清アルブミンに対して向けられる、アミノ酸配列。
【請求項３４】
請求項１〜２０または２４〜３３のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、ヒト血清アルブミンならびにマカク属（具体的には、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）および／またはアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔｏ）など）およびヒヒ（チャクマヒヒ）からのサルからなる群から選ばれる少なくとも１種の他の霊長類からの血清アルブミンに対して向けられる、アミノ酸配列。
【請求項３５】
請求項１〜１８または２１〜２８のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、細胞表面タンパク質に対して向けられる、アミノ酸配列。
【請求項３６】
請求項１〜１８、２１〜２８または３５のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、受容体に対して向けられる、アミノ酸配列。
【請求項３７】
請求項１〜１８、２１〜２８、３５〜３６のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、細胞表面タンパク質、および具体的には再循環にさらされる受容体に対して向けられる、アミノ酸配列。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、免疫グロブリンフォールドを有するタンパク質およびポリペプチド；限定はされないが、プロテインＡドメイン、テンダミスタット、フィブロネクチン、リポカイン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、デザインアンキリンリピートおよびＰＤＺドメインを含む、免疫グロブリン以外の他のタンパク質骨格に基づく分子、ならびに限定はされないが、ＤＮＡまたはＲＮＡのアプタマーを含むＤＮＡまたはＲＮＡに基づく結合成分からなる群；またはそのようなタンパク質またはポリペプチドの適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体または誘導体からなる群から選ばれる、アミノ酸配列。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、３つの相補性決定領域により互いに隔てられた４つのフレームワーク領域を含む、または、それから本質的になる群から；またはそのようなタンパク質もしくはポリペプチドの適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体もしくは誘導体より選ばれる、アミノ酸配列。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、抗体および抗体フラグメント、抗体または抗体フラグメントに由来する結合ユニットおよび結合分子、ならびに抗体フラグメント、結合ユニットまたは結合分子からなる群から；または前記のいずれかの適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体もしくは誘導体より選ばれる、アミノ酸配列。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、ドメイン抗体ならびにドメイン抗体としての使用に適するタンパク質およびペプチド、単一ドメイン抗体ならびに単一ドメイン抗体としての使用に適するタンパク質およびペプチド、ナノボディ(登録商標)およびｄＡｂｓ(商標)からなる群から；または前記のいずれかの適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体もしくは誘導体より選ばれる、アミノ酸配列。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、４と５００の間のアミノ酸残基、好ましくは５と３００の間のアミノ酸残基、より好ましくは１０と２００の間のアミノ酸残基、例えば２０と１５０の間のアミノ酸残基、例えば約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０または１４０のアミノ酸残基を含む、アミノ酸配列。
【請求項４３】
請求項１〜４２いずれかに記載のアミノ酸配列であって、（ジスルフィド架橋／結合の有無にかかわらず）単一のアミノ酸鎖を含む、アミノ酸配列。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む化合物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の化合物であって、前記化合物がさらに少なくとも１つのさらなる成分または結合ユニットを含む、化合物。
【請求項４６】
請求項４４または４５に記載の化合物であって、前記化合物が請求項１〜４３のいずれかに記載の２つ（またはそれ以上）のアミノ酸配列、および場合により、少なくとも１つのさらなる成分または結合ユニットをさらに含む、化合物。
【請求項４７】
請求項４６に記載の化合物であって、前記化合物が、同じ所望の分子に対して、または、同じ所望の分子の異なる部分または同じ所望の分子上のエピトープに対して向けられる、請求項１〜４３のいずれかに記載の２つ（またはそれ以上）のアミノ酸配列を含む、化合物。
【請求項４８】
請求項４６に記載の化合物であって、前記化合物が、２つ（またはそれ以上）の異なる所望の分子に対して向けられる請求項１〜４３のいずれかに記載の２つ（またはそれ以上）のアミノ酸配列を含む、化合物。
【請求項４９】
請求項４７記載の化合物であって、前記化合物が、２つ（またはそれ以上）の異なる所望の分子に対して向けられる請求項１〜４３のいずれかに記載の２（またはそれ以上）のアミノ酸配列を含み、前記化合物がさらに該第１の生物学的条件下で両方の（またはすべての）所望の分子に結合する、化合物。
【請求項５０】
請求項４７記載の化合物であって、前記化合物が、２つ（またはそれ以上）の異なる所望の分子に対して向けられる請求項１〜４３のいずれかに記載の２つ（またはそれ以上）のアミノ酸配列を含み、前記化合物がさらに該第１の生物学的条件下で該所望の分子の少なくとも１つ（またはそれ以上）；および該第２の生物学的条件下で該所望の分子の少なくとも１つ（またはそれ以上）に結合する、化合物。
【請求項５１】
請求項４４〜５０のいずれかに記載の化合物であって、前記化合物中に存在する請求項１〜４３のいずれかにに記載のアミノ酸配列の少なくとも１つが血清タンパク質に対して向けられる、化合物。
【請求項５２】
請求項５１記載の化合物であって、前記化合物中に存在する請求項１〜４３のいずれかにに記載のアミノ酸配列の少なくとも１つが、血清アルブミン、ＩｇＧおよびトランスフェリンからなる群から選ばれる血清タンパク質に対して向けられる、化合物。
【請求項５３】
請求項４４〜５２のいずれかに記載の化合物であって、前記さらなる成分または（存在する場合には）結合ユニットが治療用成分または結合ユニットである、化合物。
【請求項５４】
請求項５３記載の化合物であって、前記治療用成分が、小分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはペプチドからなる群の少なくとも１つから選択される、化合物。
【請求項５５】
融合タンパク質またはコンストラクトである、請求項４４〜５４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５６】
請求項５５記載の化合物であって、前記融合タンパク質またはコンストラクトにおいて、請求項１〜４３のいずれかに記載のアミノ酸配列が、少なくとも１つの治療成分に直接的に連結している、またはリンカーもしくはスペーサーを介して少なくとも１つの治療成分に連結している（および／または少なくとも１つの治療用成分を取り込む）、化合物。
【請求項５７】
該治療用成分が免疫グロブリン配列またはそのフラグメントを含む、請求項４４〜５６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５８】
該治療用成分が（単一の）ドメイン抗体またはナノボディを含む、請求項５７記載の化合物。
【請求項５９】
ナノボディである請求項１〜４３のいずれかに記載の少なくとも少なくとも１つのアミノ酸配列および少なくとも１つのさらなるナノボディを含む、多価および多特異的なナノボディコンストラクト。
【請求項６０】
請求項５９記載の多価および多特異的なナノボディコンストラクトであって、ナノボディである請求項１〜４３のいずれかに記載の該アミノ酸配列が、少なくとも１つのさらなるナノボディに直接的に連結している、またはリンカーもしくはスペーサーを介して少なくとも１つのさらなるナノボディに連結している、ナノボディコンストラクト。
【請求項６１】
請求項４２記載の多価および多特異的なナノボディコンストラクトであって、ナノボディである請求項１〜４３のいずれかに記載のアミノ酸配列が、リンカーまたはスペーサーを介して少なくとも１つのさらなるナノボディに連結しており、かつ該リンカーがアミノ酸配列である、ナノボディコンストラクト。
【請求項６２】
請求項１〜４３のいずれかに記載のアミノ酸配列、または請求項４４〜５８のいずれか一項に記載の化合物のアミノ酸配列、または請求項５９〜６２のいずれか一項に記載の多価および多特異的なナノボディをコードするヌクレオチド配列または核酸。
【請求項６３】
請求項６２に記載のヌクレオチド配列または核酸を含む宿主または宿主細胞、および／または請求項１〜４３のいずれかに記載のアミノ酸配列、または請求項４４〜５８のいずれかに一項に記載の化合物のアミノ酸配列、または請求項５９〜６２のいずれか一項に記載の多価および多特異的なナノボディをコードするヌクレオチド配列または核酸を発現する（または発現できる）宿主または宿主細胞。
【請求項６４】
請求項１〜４３のいずれかに記載のアミノ酸配列、または請求項４４〜５８のいずれか一項に記載の化合物のアミノ酸配列、または請求項５９〜６２のいずれかに一項に記載の多価および多特異的なナノボディを調製するための方法であって、その方法が、請求項６３記載の宿主細胞が、請求項１〜４３のいずれかに記載のアミノ酸配列、または請求項４４〜５８のいずれか一項に記載の化合物のアミノ酸配列、または請求項５９〜６２のいずれか一項に記載の多価および多特異的なナノボディを産生する条件下で前記宿主細胞を培養または維持する工程を含み、および場合により、そのようにして産生された請求項１〜４３のいずれかに記載のアミノ酸配列、または請求項４４〜５８のいずれか一項に記載の化合物のアミノ酸配列、または請求項５９〜６２のいずれか一項に記載の多価および多特異的なナノボディを単離する工程をさらに含む、方法。
【請求項６５】
血清タンパク質に対して向けられたアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が：
ａ）第１の生物学的条件下で、１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で、および／または少なくとも１０５M-1の結合親和性（ＫＡ）で血清タンパク質に結合し；および
ｂ）第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記血清タンパク質に結合する解離定数よりも少なくとも１０倍を超える解離定数（ＫＤ）で血清タンパク質に結合する、
アミノ酸配列。
【請求項６６】
請求項６５記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記血清タンパク質に結合する解離定数よりも少なくとも１００倍を超える解離定数（ＫＤ）で血清タンパク質に結合する、アミノ酸配列。
【請求項６７】
請求項６５または６６記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、前記第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記血清タンパク質に結合する解離定数よりも少なくとも１０００倍を超える解離定数（ＫＤ）で血清タンパク質に結合する、アミノ酸配列。
【請求項６８】
請求項６５〜６７のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で、１０−６moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記血清タンパク質に結合する、アミノ酸配列。
【請求項６９】
請求項６５〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で、１０−７moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記血清タンパク質に結合する、アミノ酸配列。
【請求項７０】
請求項６５〜６９のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が前記前記第１の生物学的条件下で、１０−８moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記血清タンパク質に結合する、アミノ酸配列。
【請求項７１】
請求項６５〜７０のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が前記第２の生物学的条件下で、１０−６moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）で前記血清タンパク質に結合する、アミノ酸配列。
【請求項７２】
請求項６５〜７１のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が前記第２の生物学的条件下で、１０−５moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）で前記血清タンパク質に結合する、アミノ酸配列。
【請求項７３】
請求項６５〜７２のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が前記第２の生物学的条件下で、１０−４moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）で前記血清タンパク質に結合する、アミノ酸配列。
【請求項７４】
請求項６５〜７３のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が、第１の生理学的なコンパートメントまたは体液において広く認められる生理学的条件を含み、前記第２の生物学的条件が、第２の生理学的なコンパートメントまたは体液において広く認められる生理学的条件を含み、該第１および第２の生理学的なコンパートメントが、正常な生理学的条件下において、細胞膜、細胞内小胞または細胞内コンパートメントの壁、または血管の壁などの少なくとも１つの生体膜により隔てられる、アミノ酸配列。
【請求項７５】
請求項６５〜７４のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件がヒトまたは動物の身体の少なくとも１つの細胞の外で広く認められる生理学的条件を含み、前記第２の生物学的条件が前記細胞の中で広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項７６】
請求項６５から７５のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が前記ヒトまたは動物の身体の血流またはリンパ系において広く認められる生理学的条件を含み、前記第２の生物学的条件がヒトまたは動物の身体の少なくとも１つの組織または細胞において広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項７７】
請求項６５〜７６のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件がヒトまたは動物の身体の血流またはリンパ系において広く認められる条件を含み、前記第２の生物学的条件が前記ヒトまたは動物の身体の細胞の少なくとも１つの細胞内コンパートメントにおいて広く認められる生理学的条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項７８】
請求項６５〜７７のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件がヒトまたは動物の身体の血流またはリンパ系において広く認められる条件を含み、前記第２の生物学的条件が前記ヒトまたは動物の身体の細胞の少なくとも１つのエンドソーム、リポソーム、ピノソームのコンパートメント、または前記ヒトまたは動物の身体の細胞中に存在する他の小胞において広く認められる生理学的条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項７９】
請求項６５〜７８のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が該ヒトまたは動物の身体の少なくとも１つの細胞により（例えば、インターナリゼーション、ピノサイトーシス、エンドサイトーシス、トランスサイトーシス、エキソサイトーシスファゴサイトーシスまたは前記細胞中への取り込みまたはインターナリゼーションの同様の機構により）取り込まれることができ、ここで前記第１の生物学的条件は、該アミノ酸配列が該細胞中に取り込まれる前に存在する生理学的条件を含み、および該第２の生物学的条件は、該アミノ酸配列が該細胞中に取り込まれた後に存在する生理学的条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項８０】
請求項６５〜７９のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、再循環にさらされる目的とする、または所望の分子に対して向けられ、ここで該第１の生物学的条件が、該所望の化合物の再循環に関与する該動物またはヒトの身体の少なくとも１つの細胞に関する細胞外条件を含み、該第２の生物学的条件が、該所望の化合物の再循環に関与する該動物またはヒトの身体の少なくとも１つの細胞の中で広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項８１】
請求項６５〜８０のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、再循環にさらされる目的とする、または所望の血清タンパク質に対して向けられ、ここで該第１の生物学的条件が、動物またはヒトの身体の循環において広く認められる条件を含み、該第２の生物学的条件が、該所望の化合物の再循環に関与する該動物またはヒトの身体の少なくとも１つの細胞の中で広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項８２】
請求項６５〜８１のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、再循環にさらされる血清タンパク質に対して向けられ、ここで該第１の生物学的条件が、動物またはヒトの身体の循環において広く認められる条件を含み、該第２の生物学的条件が、該血清タンパク質の再循環に関与する該動物またはヒトの身体の少なくとも１つの細胞の中で広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項８３】
請求項６５〜８２のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が血清アルブミンに対して向けられ、ここで該第１の生物学的条件が、動物またはヒトの身体の循環において広く認められる条件を含み、該第２の生物学的条件が、血清アルブミンの再循環に関与する該動物またはヒトの身体の少なくとも１つの細胞の中で広く認められる条件を含む、アミノ酸配列。
【請求項８４】
請求項６５〜７４のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が７．０を超える生理学的ｐＨであり、前記第２の生物学的条件が７．０未満の生理学的ｐＨである、アミノ酸配列。
【請求項８５】
請求項６５〜７４または８４のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が７．１を超える生理学的ｐＨであり、前記第２の生物学的条件が６．７未満の生理学的ｐＨである、アミノ酸配列。
【請求項８６】
請求項６５〜７４、８４または８５のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が７．２を超える生理学的ｐＨであり、前記第２の生物学的条件が６．５未満の生理学的ｐＨである、アミノ酸配列。
【請求項８７】
請求項６５〜７４または８４〜８６のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が７．２〜７．４の範囲の生理学的ｐＨであり、前記第２の生物学的条件が６．０〜６．５の範囲の生理学的ｐＨである、アミノ酸配列。
【請求項８８】
再循環にさらされる血清タンパク質に対して向けられる、請求項６５〜８７のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項８９】
ヒト血清タンパク質に対して向けられる、請求項６５〜８８のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項９０】
ヒト血清アルブミンおよび少なくとも１種の他の哺乳動物からの血清アルブミンに対して向けられる、請求項６５〜８９のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項９１】
ヒト血清アルブミンならびにマウス、ラット、ウサギおよび霊長類からなる群から選ばれる少なくとも１つ他の哺乳動物種からの血清アルブミンに対して向けられる、請求項６５〜９０のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項９２】
ヒト血清アルブミンならびにマカク属（具体的には、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）および／またはアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔｏ）など）およびヒヒ（チャクマヒヒ）からのサルからなる群から選ばれる少なくとも１種の他の霊長類からの血清アルブミンに対して向けられる、請求項６５〜９０のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項９３】
該アミノ酸配列が前記血清タンパク質分子に結合する、またはそうでなければ会合する場合、前記血清タンパク質分子の半減期が（有意に）低下しないように、前記血清タンパク質に結合する、またはそうでなければ会合する、請求項６５〜９１のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項９４】
ＦｃＲｎに結合できる血清タンパク質に結合する請求項６５〜９２のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列が前記血清タンパク質分子に結合する、またはそうでなければ会合する場合、前記血清タンパク質分子のＦｃＲｎに対する結合が（有意に）低下または阻害しないように、前記アミノ酸配列が前記血清タンパク質に結合する、またはそうでなければ会合する、アミノ酸配列。
【請求項９５】
前記血清タンパク質のＦｃＲｎへの結合に関与しない前記血清タンパク質のアミノ酸残基に結合できる、請求項９４記載のアミノ酸配列。
【請求項９６】
免疫グロブリンフォールドを有するペプチドおよびタンパク質；限定はされないが、プロテインＡドメイン、テンダミスタット、フィブロネクチン、リポカイン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、デザインアンキリンリピートおよびＰＤＺドメインを含む、免疫グロブリン以外の他のタンパク質骨格に基づく分子、ならびに限定はされないが、ＤＮＡまたはＲＮＡのアプタマーを含むＤＮＡまたはＲＮＡに基づく結合成分からなる群；またはそのようなタンパク質もしくはポリペプチドの適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体または誘導体からなる群から選ばれる、請求項６５〜９５のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項９７】
３つの相補性決定領域により互いに隔てられた４つのフレームワーク領域を含む、または、それから本質的になる群から選ばれる；またはそのようなタンパク質もしくはポリペプチドの適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体もしくは誘導体から選ばれる、請求項６５〜９６のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項９８】
抗体および抗体フラグメント、抗体または抗体フラグメントに由来する結合ユニットおよび結合分子、ならびに抗体フラグメント、結合ユニットまたは結合分子からなる群から；または前記のいずれかの適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体もしくは誘導体から選ばれる、請求項６５〜９７のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項９９】
重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、ドメイン抗体ならびにドメイン抗体としての使用に適切なタンパク質およびペプチド、単一ドメイン抗体ならびに単一ドメイン抗体としての使用に適するタンパク質およびペプチド、ナノボディ（登録商標）およびｄＡｂｓ(商標)からなる群から；または前記のいずれかの適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体もしくは誘導体から選ばれる、請求項６５〜９８のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項１００】
４と５００の間のアミノ酸残基、好ましくは５と３００の間のアミノ酸残基、より好ましくは１０と２００の間のアミノ酸残基、例えば２０と１５０の間のアミノ酸残基、例えば約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０または１４０のアミノ酸残基を含む、請求項６５から９９のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項１０１】
（ジスルフィド架橋／結合の有無にかかわらず）単一のアミノ酸鎖を含む、請求項６５〜１００のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項１０２】
該アミノ酸配列が前記霊長類において前記血清タンパク質に結合する、またはそうでなければ会合する場合、前記アミノ酸配列が、前記霊長類における前記血清タンパク質の自然血清半減期の少なくとも５０%の血清半減期を呈するように、少なくとも１つ霊長類種の血清タンパク質に結合する、またはそうでなければ会合する、請求項６５〜１０１のいずれかに記載のアミノ酸配列。
【請求項１０３】
請求項１０２記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、前記霊長類における前記血清タンパク質の自然血清半減期の少なくとも６０%の血清半減期を呈する、アミノ酸配列。
【請求項１０４】
請求項１０２または１０３記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、前記霊長類における前記血清タンパク質の自然血清半減期の少なくとも８０%の血清半減期を呈する、アミノ酸配列。
【請求項１０５】
請求項１０２〜１０４のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、前記霊長類における前記血清タンパク質の自然血清半減期の少なくとも９０%の血清半減期を呈する、アミノ酸配列。
【請求項１０６】
請求項６５〜１０５のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が少なくとも４日の血清半減期を呈する、アミノ酸配列。
【請求項１０７】
請求項１０６記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が少なくとも７日の血清半減期を呈する、アミノ酸配列。
【請求項１０８】
請求項１０６または１０７に記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が少なくとも９日の血清半減期を呈する、アミノ酸配列。
【請求項１０９】
請求項６５〜１０８のいずれかに一項に記載のアミノ酸配列を含む化合物。
【請求項１１０】
請求項１０９に記載の化合物であって、前記化合物がさらに少なくとも１つの治療用成分を含む、化合物。
【請求項１１１】
請求項１０９または１０１に記載の化合物であって、前記化合物が、請求項６５〜１０１のいずれかに記載の少なくとも１つのアミノ酸配列、（治療用成分を形成しうる、または形成することのない）所望の分子に対して向けられる請求項１〜４３に記載の少なくとも１つのアミノ酸配列、および場合によりさらに少なくとも１つの治療用成分を含む、化合物。
【請求項１１２】
請求項１１１に記載の化合物であって、前記化合物が、さらに該第１の生物学的条件下で該血清タンパク質および前記少なくとも１つの所望の分子の両方に結合する、化合物。
【請求項１１３】
請求項１１１に記載の化合物であって、前記化合物が、さらに、該第１の生物学的条件下で該血清タンパク質に、および該第２の生物学的条件下で前記少なくとも１つの所望の分子に結合する、化合物。
【請求項１１４】
請求項１１１に記載の化合物であって、前記化合物が、さらに該第１の生物学的条件下で前記少なくとも１つの所望の分子に、および該第２の生物学的条件下で該血清タンパク質に結合する、化合物。
【請求項１１５】
請求項１１０〜１１４のいずれかに記載の化合物であって、前記治療用成分が、小分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはペプチドからなる群の少なくとも１つから選択される、化合物。
【請求項１１６】
融合タンパク質またはコンストラクトである、請求項１０９〜１１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１７】
請求項１１６に記載の化合物であって、前記融合タンパク質またはコンストラクトにおいて、請求項６５〜１０８のいずれかに記載のアミノ酸配列が、該少なくとも１つの治療用成分に直接的に連結している、またはリンカーもしくはスペーサーを介して該少なくとも１つの治療用成分に連結している（および／または少なくとも１つの治療用成分を取り込む）、化合物。
【請求項１１８】
請求項１１０から１１７のいずれか一項に記載の化合物であって、該治療用成分が免疫グロブリン配列またはそのフラグメントを含む、化合物。
【請求項１１９】
請求項１１８に記載の化合物であって、該治療用成分が少なくとも１つの（単一の）ドメイン抗体またはナノボディを含む、化合物。
【請求項１２０】
ナノボディである請求項６５〜１０８のいずれかに記載の少なくとも１つのアミノ酸配列および少なくとも１つのさらなるナノボディを含む、多価および多特異的なナノボディコンストラクト。
【請求項１２１】
請求項１２０に記載の多価および多特異的なナノボディコンストラクトであって、ナノボディである請求項６５〜１０８のいずれかに記載のアミノ酸配列が、該少なくとも１つのさらなるナノボディに直接的に連結している、またはリンカーもしくはスペーサーを介して該少なくとも１つのさらなるナノボディに連結している、ナノボディコンストラクト。
【請求項１２２】
請求項１２１に記載の多価および多特異的なナノボディコンストラクトであって、ナノボディである請求項６５〜１０８のいずれかに記載のアミノ酸配列が、リンカーまたはスペーサーを介して該少なくとも１つのさらなるナノボディに連結しており、該リンカーがアミノ酸配列である、ナノボディコンストラクト。
【請求項１２３】
請求項６５〜１０８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または請求項１０９〜１１９のいずれか一項に記載の化合物のアミノ酸配列、または請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の多価および多特異的なナノボディ、をコードするヌクレオチド配列または核酸。
【請求項１２４】
請求項１２３に記載のヌクレオチドまたは核酸を含む宿主または宿主細胞、および／または請求項６５〜１０８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または請求項１０９〜１１９のいずれか一項に記載の化合物のアミノ酸配列、または請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の多価および多特異的なナノボディ、を発現する（または発現できる）宿主または宿主細胞。
【請求項１２５】
請求項６５〜１０８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または請求項１０９〜１１９のいずれか一項に記載の化合物のアミノ酸配列、または請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の多価および多特異的なナノボディを調製するための方法であって、その方法が、請求項１２４記載の宿主細胞が請求項６５〜１０８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または請求項１０９〜１１９のいずれか一項に記載の化合物のアミノ酸配列、または請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の多価および多特異的なナノボディを産生または発現する条件下で該宿主細胞を培養または維持する工程を含み、および場合により、そのようにして産生された請求項６５〜１０８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または請求項１０９〜１１９のいずれか一項に記載の化合物のアミノ酸配列、または請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の多価および多特異的なナノボディ、を単離する工程をさらに含む、方法。
【請求項１２６】
請求項６５〜１０８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項１０９〜１１９のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の多価および多特異的なナノボディからなる群から選択される１つ以上を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物が前記霊長類における前記血清タンパク質の該自然半減期の少なくとも５０%の間隔で霊長類への投与のために適している、医薬組成物。
【請求項１２７】
少なくとも１つの医薬に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む、請求項１２６に記載の医薬組成物。
【請求項１２８】
霊長類への投与を目的とした医薬品製造のための、請求項６５〜１０８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項１０９〜１１９のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の多価および多特異的なナノボディのいずれかの使用であって、前記医薬品は前記霊長類における前記血清タンパク質の該自然半減期の少なくとも５０%の間隔で投与される、使用。
【請求項１２９】
該霊長類がヒトである、請求項１２８記載の使用。
【請求項１３０】
該医薬品が少なくとも７日の間隔で投与される、請求項１２９記載の使用。
【請求項１３１】
請求項６５〜１０８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項１０９〜１１９のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の多価および多特異的なナノボディのいずれかをそれを必要とする霊長類へ投与することを含む処置の方法であって、前記投与が前記霊長類における前記血清タンパク質の自然半減期の少なくとも５０%の間隔で生じる、方法。
【請求項１３２】
該霊長類がヒトである、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
該医薬品が少なくとも７日の間隔で投与される、請求項１３２に記載の使用。
【請求項１３４】
治療薬の該血清中半減期を延長または増大させるための方法であって、該治療薬を該アミノ酸配列、化合物、または多価および多特異的なナノボディに結合させる、あるいはそうでなければ会合させるように、該治療薬を、請求項６５〜１０８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項１０９〜１１９のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１２０〜１２２のいずれか一項に記載の多価および多特異的なナノボディのいずれかと接触させる工程を含む、方法。
【請求項１３５】
該治療薬が生物学的治療薬である、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
請求項１３５に記載の方法であって、該生物学的治療薬がペプチドまたはポリペプチドであり、該治療薬を接触させる工程が、該ペプチドまたはポリペプチドを該アミノ酸配列、化合物、または多価および多特異的なナノボディに連結させることによる融合タンパク質を調製する工程を含む、方法。
【請求項１３７】
請求項１３４から１３６のいずれかに記載の方法であって、該治療薬を該アミノ酸配列、化合物、または多価および多特異的なナノボディに結合させる、あるいはそうでなければ会合させた後に霊長類に該治療薬を投与することをさらに含む、方法。
【請求項１３８】
請求項１３７に記載の方法であって、該霊長類における該治療薬の該血清半減期が、治療薬それ自体の該半減期の少なくとも１．５倍である、方法。
【請求項１３９】
請求項１３８に記載の方法であって、該霊長類における該治療薬の該血清半減期が、治療薬それ自体の該半減期と比較して少なくとも１時間増大する、方法。
【請求項１４０】
所望の分子に対して向けられたアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が：
ａ）第１の生物学的条件下で、１０−６moles/liter以上のｋｏｆｆ速度で前記所望の分子に結合し；および
ｂ）第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合するｋｏｆｆ速度よりも少なくとも２倍を超えるｋｏｆｆで所望の分子に結合する、
アミノ酸配列。
【請求項１４１】
該ｋｏｆｆ速度が５倍を超える、請求項１４０記載のアミノ酸配列。
【請求項１４２】
該ｋｏｆｆ速度が１０倍を超える、請求項１４０記載のアミノ酸配列。
【請求項１４３】
該ｋｏｆｆ速度が１００倍を超える、請求項１４０記載のアミノ酸配列。
【請求項１４４】
該ｋｏｆｆ速度が１０００倍を超える、請求項１４０記載のアミノ酸配列。
【請求項１４５】
請求項１４０記載のアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列が、該第２の生物学的条件下で、該所望の分子に結合しない、アミノ酸配列。
【請求項１４６】
所望の分子に対して向けられたアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が：
ａ）第２の生物学的条件下で、１０−６moles/liter以上のｋｏｆｆ速度で前記所望の分子に結合し；および
ｂ）第１の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第２の生物学的条件下で前記所望の分子に結合するｋｏｆｆ速度よりも少なくとも２倍を超えるｋｏｆｆで所望の分子に結合する、
アミノ酸配列。
【請求項１４７】
該ｋｏｆｆ速度が５倍を超える、請求項１４６記載のアミノ酸配列。
【請求項１４８】
該ｋｏｆｆ速度が１０倍を超える、請求項１４６記載のアミノ酸配列。
【請求項１４９】
該ｋｏｆｆ速度が１００倍を超える、請求項１４６記載のアミノ酸配列。
【請求項１５０】
該ｋｏｆｆ速度が１０００倍を超える、請求項１４６記載のアミノ酸配列。
【請求項１５１】
請求項１４６に記載のアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列が、該第１の生物学的条件下で、該所望の分子に結合しない、アミノ酸配列。
【請求項１５２】
請求項１４０〜１５１に記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件および前記第２の生物学的条件が以下の因子：ｐＨ、イオン強度、およびプロテアーゼ依存性のいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つまたは実質的にすべてについて異なる、アミノ酸配列。
【請求項１５３】
請求項１４０〜１５１に記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が７．０を超える生理学的ｐＨであり、前記第２の生物学的条件が７．０未満の生理学的ｐＨである、アミノ酸配列。
【請求項１５４】
請求項１４０〜１５１に記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が７．１を超える生理学的ｐＨであり、前記第２の生物学的条件が６．０未満の生理学的ｐＨである、アミノ酸配列。
【請求項１５５】
請求項１４０〜１５１に記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が７．２を超える生理学的ｐＨであり、前記第２の生物学的条件が５．７未満の生理学的ｐＨである、アミノ酸配列。
【請求項１５６】
請求項１４０〜１５１に記載のアミノ酸配列であって、前記第１の生物学的条件が７．２〜７．４の範囲の生理学的ｐＨであり、前記第２の生物学的条件が５．０〜６．０の範囲、例えば５．５の生理学的ｐＨである、アミノ酸配列。
【請求項１５７】
血清タンパク質、具体的にはヒト血清タンパク質に対して向けられる、請求項１４０〜１５６に記載のアミノ酸配列。
【請求項１５８】
再循環にさらされる、血清タンパク質、具体的にはヒト血清タンパク質に対して向けられる、請求項１４０〜１５６に記載のアミノ酸配列。
【請求項１５９】
ヒト血清アルブミンおよび少なくとも一種類の他の哺乳動物種からの血清アルブミンに対して向けられる、請求項１４０〜１５８に記載のアミノ酸配列。
【請求項１６０】
請求項１４０〜１５９に記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列がａ）ヒト血清アルブミンおよびｂ）その１つ以上の同じ配列の標的タンパク質に対しても二価または多価であり、または２つ以上の標的タンパク質に結合する場合、１つ以上の異なる配列の標的タンパク質に対しても二価または多価である、アミノ酸配列。
【請求項１６１】
請求項１６０記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列がナノボディまたはｄＡｂである、アミノ酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンディショナルな方法（本明細書に記載する）で所望の分子に結合するアミノ酸配列、そのようなアミノ酸配列を含む、または本質的にそれからなるタンパク質およびポリペプチド；そのようなアミノ酸配列、タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸；そのようなアミノ酸配列、タンパク質およびポリペプチドを含む組成物、および具体的には医薬組成物；ならびにそのようなアミノ酸配列、タンパク質およびポリペプチドの使用に関する。
【０００２】
本発明の他の態様、実施態様、利点および適用は、本明細書でのさらなる記載から明らかになろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
所望の分子に結合するタンパク質およびペプチドは、当技術分野において周知である。非限定的ないくつかの例には、抗体および抗体フラグメント、抗体および抗体フラグメントに由来する結合ユニットおよび結合分子（重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、ドメイン抗体およびドメイン抗体としての使用に適切なタンパク質およびペプチド、単一ドメイン抗体および単一ドメイン抗体としての使用に適切なタンパク質およびペプチド、ナノボディ(登録商標)およびｄＡｂｓ(商標)；ならびに前述のいずれかの適切なフラグメント）、ならびにそのような抗体フラグメント、結合ユニットまたは結合分子（ｓｃＦｖｓおよびダイアボディなど）を含むコンストラクト、などの免疫グロブリンフォールド（つまり、免疫グロブリン）を有するペプチドおよびタンパク質が含まれる。本明細書に引用する先行技術を参照する。
【０００４】
他の結合ユニットまたは結合分子には、例えば、限定はされないが、プロテインＡドメイン、テンダミスタット、フィブロネクチン、リポカイン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、デザインアンキリンリピートおよびＰＤＺドメイン（Binz et al., Nat. Biotech 2005, Vol 23: 1257）を含む、免疫グロブリン以外の他のタンパク質骨格に基づく分子、ならびに、限定はされないが、ＤＮＡまたはＲＮＡのアプタマーを含むＤＮＡまたはＲＮＡに基づく結合成分（Ulrich et al., Comb Chem High Throughput Screen 2006 9(8）: 619-32）が非限定的に含まれる。
【０００５】
第一の態様では、本発明は、所望の分子に対して向けられたアミノ酸配列（本明細書に「本発明のアミノ酸配列」とも呼ぶ）に関するもので、ここで前記アミノ酸配列は：
ａ）１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で、第１の生物学的条件下で所望の分子に結合し；および
ｂ）前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合する解離定数とは１０倍（および具体的にはそれ以上）異なる解離定数（ＫＤ）で、第２の生物学的条件下で所望の分子に結合する。
【０００６】
本発明は、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列を含む化合物（本明細書に定義する）にも関する。そのような化合物は、本明細書で「本発明の化合物」とも呼ばれる。
【０００７】
本発明の他の態様および実施態様は、本明細書でのさらなる記載から明らかになろう。
【０００８】
この記載および請求項において、「生物学的条件」という用語は、健康な動物もしくは健康なヒト、または病気もしくは疾患を患う動物もしくはヒトであり得る、動物（および具体的にはマウス、ラット、ウサギ、イヌまたは霊長類などの哺乳動物）またはヒトの身体（例えば、少なくとも１つの細胞、組織、器官または生体液、例えば血液またはリンパ液内）において生じ得る条件（または一連の条件）を指す。「生物学的条件」という用語は、動物またはヒトの身体において生じ得る条件に対応する、および／またはその代表的なインビトロまたは細胞のアッセイまたはモデルの条件も包含する。そのような条件（ヒトまたは動物の身体においてインビボで、またはインビトロまたは細胞のアッセイまたはモデルにおいてエクスビボで生じる）は当業者には明らかであろう。
【０００９】
「第１の生物学的条件」が少なくとも１点において「第２の生物学的条件」とは異なることも本明細書の開示から明らかであろう。例えば、第１の生物学的条件は、第１の生理学的なコンパートメントまたは体液において広く認められる生理学的条件を含み得るし、第２の生物学的条件は、第２の生理学的なコンパートメントまたは体液において広く認められる生理学的条件を含むが、第１および第２の生理学的なコンパートメントまたは体液は、正常な生理学的条件下において、細胞膜、細胞内小胞または細胞内コンパートメントの壁、または血管の壁などの少なくとも１つの生体膜により隔てられる。
【００１０】
特定の、非限定的な一態様では、本発明のアミノ酸配列（またはそれを含む化合物）は、ヒトまたは動物の身体において、前記生体膜を通過することもでき、および／または、前記生体膜を通過できるようにする生物学的な作用または機構（能動的または受動的な輸送機構など）にさらされて、本発明のアミノ酸配列または化合物は、第１の生理学的コンパートメント（第１の生物学的条件にさらされる）から第２の生理学的コンパートメント（第２の生物学的条件にさらされる）に行く。
【００１１】
このように、本発明の１つの特定の、しかし、非限定的な態様によると、第１の生物学的条件は、ヒトまたは動物の身体の少なくとも１つの細胞の外に広く認められる生理学的条件（つまり、細胞のすぐ周辺または近傍の条件などの細胞外条件、および／またはヒトまたは動物の身体の循環中）を含み、第２の生物学的条件は、細胞の中で広く認められる条件（つまり、細胞内条件）を含み得る（逆もまた同様である）。例えば、本発明のこの特定の非限定的な態様によると、第２の生物学的条件は、ヒトまたは動物の身体の細胞の少なくとも１つの細胞内または細胞外のコンパートメント（エンドソームのコンパートメントなど）において広く認められる生理学的条件を含み、第１の生物学的条件は、細胞の外に広く認められる条件を含み得る（逆もまた同様である）。
【００１２】
本発明の別の特定の非限定的な態様によると、第１の生物学的条件は、ヒトまたは動物の身体の循環において（例えば、血流またはリンパ系において）広く認められる生理学的条件を含み、第２の生物学的条件は、ヒトまたは動物の身体の少なくとも１つの組織または細胞において（エンドソームのコンパートメントなど、そのような細胞の少なくとも１つの細胞内コンパートメントにおいて）広く認められる生理学的条件を含み得る（逆もまた同様である）。
【００１３】
本発明の１つの特別な態様によると、本発明のアミノ酸配列が（それ自体で、または所望の分子に結合して）、取り込まれることができ（例えば、インターナリゼーション、ピノサイトーシス、トランスサイトーシス、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシスまたは同様の生物学的機構により）、または取り込まれて、ヒトまたは動物の身体の少なくとも１つの細胞によりエキソサイトーシスまたは他の手段により細胞外に移されるプロセスである場合、第１の生物学的条件は、アミノ酸配列が細胞により取り込まれる前に存在する生理学的条件を含み（例えば、本発明のアミノ酸配列がインターナリゼーションまたはピノサイトーシス、トランスサイトーシスまたはエンドサイトーシスにより例えば血流またはリンパ系に取り込まれる細胞の外）、第２の生物学的条件は、アミノ酸配列が細胞において〔例えば、本発明のアミノ酸配列がインターナリゼーション、ピノサイトーシス、トランスサイトーシス、エンドサイトーシス（エンドソーム、リソソーム、ピノソーム、または他の細胞小胞など）時に（すぐに）存在する細胞内コンパートメントにおいて〕取り込まれる前に存在する生理学的条件を含み得る；または、逆もまた同様である。
【００１４】
以下により詳細に説明する通り、この態様は、血清アルブミンの場合のように、所望の分子が、その再循環の経過において細胞により取り込まれる（つまり、インターナリゼーション、ピノサイトーシス、トランスサイトーシス、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシスまたは同様の生物学的機構にさらされる）分子である場合に特に重要である。
【００１５】
このように、特定の、非限定的な一態様では、アミノ酸配列は、再循環にさらされる目的とする、または所望の分子に対して向けられ、その経過において少なくとも１つの細胞により取り込まれ、第１の生物学的条件は、所望の化合物の再循環に関与する動物またはヒトの身体の少なくとも１つの細胞に関する細胞外条件（つまり、細胞の細胞表面またはすぐ周辺または近傍の条件などの該細胞の外で広く認められる条件、および／または例えば、血流またはリンパ系などの循環において広く認められる条件）を含み、第２の生物学的条件は、細胞の中で広く認められる条件（つまり、細胞における条件またはその１つの細胞内または細胞内コンパートメントにおける条件、例えば、細胞内のエンドソームまたは小胞内、具体的にはタンパク質またはポリペプチドの再循環に関与する細胞内または細胞内コンパートメント内の条件）を含む。
【００１６】
本発明の本態様の非限定的な例として、本発明のアミノ酸配列は、ヒトまたは動物の身体の少なくとも１つの細胞による再循環にさらされる血清タンパク質（血清アルブミンなど）に向けられ、第１の生物学的条件は、動物またはヒトの身体の循環において広く認められる条件を含み、第２の生物学的条件は、細胞の中で広く認められる条件（つまり、細胞中の条件またはその１つの細胞内または細胞内コンパートメント中の条件、例えば、細胞内のエンドソームまたは小胞内、具体的にはタンパク質またはポリペプチドの再循環に関与する細胞内または細胞内コンパートメント内の条件）を含み得る。
【００１７】
本発明の本態様の非限定的な別の例として、本発明のアミノ酸配列は、細胞による再循環にさらされる細胞の表面上のタンパク質またはポリペプチド（受容体など）に向けられ、第１の生物学的条件は、動物またはヒトの身体の細胞の細胞表面またはすぐ周辺において広く認められる条件を含み、第２の生物学的条件は、細胞の中で広く認められる条件（つまり、細胞中の条件またはその１つの細胞内または細胞内コンパートメント中の条件、例えば、細胞内のエンドソームまたは小胞内、具体的にはタンパク質またはポリペプチドの再循環に関与する細胞内または細胞内コンパートメント内の条件）を含み得る。
【００１８】
本態様（その２つの特定な実施例を含む）によって、所望の分子がインターナリゼーション、ピノサイトーシス、トランスサイトーシスまたはエンドサイトーシス（再循環またはその他の一部として）により取り込まれる特定の細胞または組織に対する本発明のアミノ酸配列（または、本明細書にさらに記載する、それを含む化合物）のターゲッティングが可能になりうる。細胞の外では、本発明のアミノ酸配列または化合物は、高い親和性または結合力で（つまり、第１の生物学的条件下での結合について本明細書に記載する会合定数または解離定数で）所望の分子に結合し、このようにして所望の分子に結合したまま細胞中に取り込まれる。そのようなインターナリゼーション、ピノサイトーシス、トランスサイトーシスまたはエンドサイトーシス時に、所望の化合物についての本発明のアミノ酸配列または化合物の親和性または結合力が（つまり、第２の生物学的条件下での結合について本明細書に記載する会合定数または解離定数まで）低下し、アミノ酸配列または化合物が所望の分子から放出され、細胞においてその目的とする、または所望の生物学的、生理学的、医薬的または治療的な作用を実行できる。一般的に、当業者に明らかなように、この機構を使用して、本発明のアミノ酸配列または化合物が細胞の細胞膜を通過して、細胞中に入ることもでき、本発明の化合物の細胞内ターゲティングにも使用できる。
【００１９】
特定の、非限定的な別の態様によると、第１の生物学的条件および第２の生物学的条件はｐＨの点で異なる可能性があるが、ここで前記第１の生物学的条件は７．０を超える生理学的ｐＨ、例えば７．１を超えるｐＨまたは７．２を超えるｐＨ、例えば７．２〜７．４の範囲のｐＨを含み得る；および第２の生物学的条件は７．０未満の生理学的ｐＨ、例えば６．７未満のｐＨまたは６．５未満のｐＨ、例えば６．５〜６．０の範囲のｐＨを含み得る（逆もまた同様である）。
【００２０】
さらに特定の、非限定的な別の態様によると、第１の生物学的条件および第２の生物学的条件は、プロテアーゼの数および種類の点で異なる可能性がある。プロテアーゼ分解に対するアミノ酸配列の感受性は、非常に変わり易く、配列およびタンパク質に依存的であり、インビボでのタンパク質分解のレベルは、アミノ酸配列が実際に遭遇するプロテアーゼの種類に依存する。例えば、エンドソームにおいて、多くのシステインカテプシンが存在し；リソソームにおいて、リパーゼ、カルボヒドラーゼ、プロテアーゼおよびヌクレアーゼの大パネルが存在し、酸性ｐＨ（４．８）で最適に活性となり；細胞外空間および血流において、多くの他のプロテアーゼ（例えば、セリンプロテアーゼ）が活性である。
【００２１】
特定の、非限定的な別の態様によると、第１および第２の生物学的条件は、以下の因子のいずれか２つ、いずれか３つまたは実質的にすべての点において異なる：ｐＨ、イオン強度、プロテアーゼ含量；ここで前記因子は本明細書に記載の通りであり得る、および／または、異なる可能性がある。
【００２２】
特定の、非限定的な別の態様によると、第１の生物学的条件は、第１の生理学的なコンパートメントまたは体液において広く認められる生理学的条件を含み、第２の生物学的条件は、第２の生理学的なコンパートメントまたは体液において広く認められる生理学的条件を含み得るが、ここで第１および第２の生理学的なコンパートメントまたは体液は、正常な生理学的条件下において、細胞膜、細胞内小胞または細胞内コンパートメントの壁、または血管の壁などの少なくとも１つの生体膜により隔てられ、第１の生理学的なコンパートメントまたは体液において広く認められる条件と第２の生理学的なコンパートメントまたは体液において広く認められる条件は、以下の因子のいずれか２つ、いずれか３つまたは実質的にすべての点において異なる：ｐＨ、イオン強度、プロテアーゼ含量；ここで前記因子は本明細書に記載の通りであり得る、および／または、異なる可能性がある。
【００２３】
本明細書での記載から明らかなように、本発明のアミノ酸配列および化合物は、それらが、第１および第２の生物学的条件下で、それらのそれぞれの所望の分子に異なる解離定数または会合定数（本明細書に記載する）でそれぞれ結合するようになっている。これは一般的に本明細書で「コンディショナル結合」と言及され、そのようなコンディショナル結合は本明細書で「コンディショナルな」アミノ酸配列（例えば、「コンディショナルナノボディ」など）または「コンディショナル結合剤」とも呼ばれる。
【００２４】
本発明のコンディショナルアミノ酸配列（ならびにそれを含む化合物）は、好ましくは、それらが第２の生物学的条件（一連の生物学的条件）下で、コンディショナルアミノ酸配列が第１の生物学的条件（一連の生物学的条件）下で目的とする、または所望の分子に結合する解離定数より少なくとも１０倍を超える、より好ましくは１００倍を超える、より好ましくは少なくとも１０００倍を超える解離定数（ＫＤ）で結合し；および／またはそれらが第２の生物学的条件（一連の生物学的条件）下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件（一連の生物学的条件）下で前記目的とする、または所望の分子に結合する結合親和性より少なくとも１０倍未満、より好ましくは１００倍未満、より好ましくは少なくとも１０００倍未満である結合親和性（ＫＡ）で結合する。
【００２５】
このように、例証として、限定はされないが、本発明のアミノ酸配列が前記第１および第２の生物学的条件下で、約１０−７moles/literの解離定数（ＫＤ）および／または約１０７M-1の結合親和性（ＫＡ）で前記所望の分子に結合し得る場合、本発明のアミノ酸配列が前記第２の生物学的条件下で、約１０−６moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）および／または約１０６M-1以下の結合親和性（ＫＡ）、好ましくは約１０−５moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）および／または約１０５M-1以下の結合親和性（ＫＡ）、より好ましくは約１０−４moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）および／または約１０４M-1以下の結合親和性（ＫＡ）で前記所望の分子に結合する。
【００２６】
また、本発明のアミノ酸配列および化合物は、好ましくは、それらが前記第１の生物学的条件下で、１０−６moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）、より好ましくは１０−７moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）、さらにより好ましくは１０−８moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記目的とする、または所望の分子に結合する。
【００２７】
さらに、本発明のアミノ酸配列または化合物は、好ましくは、それらが前記第２の生物学的条件下で、約１０−６moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）、より好ましくは約１０−５moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）、さらにより好ましくは約１０−４moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）で前記目的とする、または所望の分子に結合する。
【００２８】
解離定数は、当業者に明らかなように、実際の、または、見掛け上の解離定数であり得る。解離定数を測定するための方法は当業者に明らかであり、例えば、本明細書に言及する技術が含まれる。この点において、１０−４moles/literまたは１０−３moles/liter（例えば、１０−２moles/liter）を超える解離定数を測定することは不可能であり得ることも明らかであろう。したがって、解離定数を測定できない場合、１０−５moles/literの解離定数より少なくとも１０００倍を超える解離定数であることが本発明の目的として考えられる。
【００２９】
場合により、当業者に明らかなように、（実際の、または見掛け上の）解離定数は、関係［ＫＤ＝１／ＫＡ］により、（実際の、または、見掛け上の）会合定数（ＫＡ）に基づいて算出されうる。この目的とするために、特定のｐＨ値で会合定数を測定するための方法は当業者に明らかであろうし、例えば、本明細書に言及する技術が含まれる。また、本発明のアミノ酸配列は、それらが第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合する結合親和性より少なくとも１０倍未満である結合親和性（ＫＡ）で、前記所望の分子に結合しうることも明らかであろう。
【００３０】
親和性は、分子間相互作用の強度または安定性を示す。親和性は、一般に、Ｋｄ、または解離定数により与えられ、それはmol/literの単位を有し、簡単にＭで表示される。親和性は会合定数Ｋａとしても表わされ、それは１／Ｋｄと等しく、(mol/liter）-1、簡単にM-1の単位を有する。この文書を通して、我々は分子間相互作用の安定性をそのＫｄ値により表す。しかし、当然のことながら、関係Ｋａ＝１／Ｋｄに照らして、分子間相互作用の強度をそのＫｄ値により特定することによって、自動的にＫａ値も特定される。Ｋｄは熱力学的な意味においても分子間相互作用の強度を特性付け、それが周知の関係ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（Ｋｄ）（ＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（Ｋａ）と同等）による結合の自由エネルギー（ＤＧ）に関連するためで、ここでＲは気体定数と等しく、Ｔは絶対温度と等しく、ｌｎは自然対数を表示する。意味のある生物学的複合体のＫｄは、典型的に、１０−１０M（０．１nM）〜１０−５M（１００００nM）の範囲内である。相互作用が強いほど、そのＫｄは低くなる。
【００３１】
Ｋｄは、ｋｏｎで表示されるその会合の速度に対するｋｏｆｆで表示される複合体の解離速度定数の比率として表わすこともできる。換言すると、Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎである。明らかに、Ｋａ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆである。ｏｆｆ速度ｋｏｆｆは単位s-1を有する（ここでｓは秒のＳＩユニット表記である）。ｏｎ速度ｋｏｎは単位M-1s-1を有する。ｏｎ速度は１０２M-1s-1から約１０７M-1s-1の間で変動し、二分子間相互作用についての拡散律速の会合速度定数に近づきうる。ｏｆｆ速度は、関係ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆによる任意の分子間相互作用の半減期に関連する。ｏｆｆ速度は、１０−６  s-1（複数日のｔ１／２を有するほとんど不可逆的な複合体）〜１s-1（ｔ１／２＝０．６９s）の間で変動しうる。
【００３２】
２つの分子の間での分子間相互作用の親和性は、周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術（例えば、Ober et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001では、Biacore 3000 SPRバイオセンサーが使用され、様々なｐＨ条件下でのＦｃＲｎに対するアルブミンの親和性を研究された。）などの異なる技術によって測定でき、ここでは１つの分子をバイオセンサーチップ上に固定化し、他の分子を流動条件下で固定化した分子上を通過させ、ｋｏｎ、ｋｏｆｆの測定値およびそれによりＫｄ（またはＫａ）値が得られる。
【００３３】
測定プロセスが、例えば１つの分子のバイオセンサー上のコーティングに関連するアーチファクトにより、意味する分子の内因性の結合親和性にいくらか影響を及ぼす場合、注目すべきは、測定したＫｄが見掛け上のＫｄに対応することである。また、１つの分子が他の分子に対して２つ以上の認識部位を含む場合、見掛け上のＫｄが測定され得る。このような状況において、測定された親和性は、２つの分子による相互作用の結合力により影響を受け得る。例えば、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用の２：１化学量論に匹敵する、ＦｃＲｎのＩｇＧとの親和性を比較すると、固定化ヒトＦｃＲｎでのＳＰＲ実験によって、ヒトＩｇＧに対する有意に高い親和性（結合力）が示される（Sanchez et al., Biochemistry, 38, 9471-9476, 1999）。
【００３４】
親和性を評価するために使用されうる別のアプローチは、Friguetらの２工程ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）手順である（J. Immunol.Methods, 77, 305-19, 1985）。この方法によって液相結合平衡測定が確立され、プラスチックなどの支持体上の分子の１つの吸着に関連する起こりうるアーチファクトが避けられる。
【００３５】
例えば、Nguyenら（Protein EngDes SeL, 19, 291-297, 2006）は、最近、Friguetアッセイを使用して、アルブミンに対するＦａｂコンストラクトの親和性を測定した。しかし、Ｋｄの正確な測定は非常に労力を要し、結果として、２つの分子の結合強度を評価するために見掛け上のＫｄ値を測定することが多い。注目すべきは、すべての測定値が一貫した方法（例えば、アッセイ条件を不変に保って）で行う限り、見掛け上のＫｄ測定値を真のＫｄの近似値として使用できることであり、それゆえに本文書ではＫｄおよび見掛け上のＫｄを同等の重要性および関連性で扱うべきである。
【００３６】
最後に、注目すべきは、多くの場合、経験豊富な科学者は、ある基準分子に対する結合親和性を測定することが便利であると判断する可能性があることである。例えば、分子ＡとＢの間の結合強度を評価するために、例えば、Ｂに結合することが知られており、および、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）での容易な検出のためのビオチンまたは他のフォーマット（蛍光検出のためのフルオロフォア、光吸収検出のための発色団、ストレプトアビジン媒介ＥＬＩＳＡ検出のためのビオチン）などのフルオロフォアまたは発色団の基または他の化学成分で適切に標識されるレファレンス分子Ｃを使用できる。通常は、レファレンス分子Ｃは一定濃度に保たれ、Ｂの濃度はＢの任意の濃度または量について変動する。結果として、ＩＣ５０値がＡの濃度に応じて得られ、ここでＡの非存在下でＣについて測定されるシグナルが半分になる。Ｋｄｒｅｆ、つまりレファレンス分子のＫｄ、ならびにレファレンス分子の総濃度ｃｒｅｆが既知であるという条件で、相互作用Ａ−Ｂについての見掛け上のＫｄが以下の式から得られる：Ｋｄ＝ＩＣ５０／（ｌ＋ｃｒｅｆ／Ｋｄｒｅｆ）。ｃｒｅｆ＜＜Ｋｄｒｅｆの場合にＫｄ＝ＩＣ５０であることに留意すること。ＩＣ５０測定を一貫した方法で（例えば、ｃｒｅｆを一定に保って）実施するとの条件で、分子間相互作用の強度または安定性はＩＣ５０により評価でき、この測定値は本文を通してＫｄまたは見掛け上のＫｄと同等であると判断される。
【００３７】
好ましくは、一価型である本発明のアミノ酸配列（本明細書に記載する）は、第１の生物学的条件下で、３０００nMよりも大きい、好ましくは３００nMより大きい、より好ましくは３０nMより大きい、例えば３nMより大きい親和性（ＫＤ）で、目的とする、または所望の分子に結合し、第２の生物学的条件下で、少なくとも１０倍劣る、好ましくは１００倍以上劣る、例えば少なくとも１０００倍以上劣る親和性で、目的とする、または所望の分子に結合する。例えば、限定はされないが、一価アミノ酸配列は、第２の生物学的条件下で、３nMよりも劣る、より好ましくは３０nMより劣る、より好ましくは３００nMより劣る、例えば３０００nMより劣る親和性で、目的とする、または所望の分子に結合しうる。
【００３８】
相互作用の親和性の他に、相互作用の動態もまた分子のコンディショナルな結合挙動における促進因子であり得る。例えば、オンおよびオフの速度における差は、結合事象の結果、例えば生物学的条件を変化させた際の結合抗原からの脱離スピード、生物学的条件を変化させた際の抗原への結合速度に影響を及ぼす際に役割を果たしうる。好ましくは、一価型である本発明のアミノ酸配列（本明細書に記載する）は、第１の生物学的条件下で、１０−１s-1よりも大きい、好ましくは１０−２s-1よりも大きい、より好ましくは１０−３s-1よりも大きい、例えば１０−４s-1より大きいｏｆｆ速度で、目的とする、または所望の分子に結合し、第２の生物学的条件下で、少なくとも１０倍劣る、好ましくは１００倍以上劣る、例えば少なくとも１０００倍以上劣るオフ速度で、目的とする、または所望の分子に結合する。例えば、限定はされないが、一価アミノ酸配列は、第２の生物学的条件下で、１０−４s-1よりも劣る、より好ましくは１０−３s-1よりも劣る、より好ましくは１０−２s-1よりも劣る、例えば１０−１s-1よりも劣るｏｆｆ速度で、目的とする、または所望の分子に結合しうる。好ましくは、一価型である本発明のアミノ酸配列（本明細書に記載する）は、第１の生物学的条件下で、１０２M-1s-1よりも大きい、好ましくは１０３M-1s-1よりも大きい、より好ましくは１０４M-1s-1よりも大きい、例えば１０５M-1s-1よりも大きいｏｎ速度で、目的とする、または所望の分子に結合し、第２の生物学的条件下で、少なくとも１０倍劣る、好ましくは１００倍以上劣る、例えば少なくとも１０００倍以上劣るｏｎ速度で、目的とする、または所望の分子に結合する。例えば、限定はされないが、一価アミノ酸配列は、第２の生物学的条件下で、１０５M-1s-1よりも劣る、より好ましくは１０４M-1s-1よりも劣る、より好ましくは１０３M-1s-1よりも劣る、例えば１０２M-1s-1よりも劣る対応ｏｎ速度で、目的とする、または所望の分子に結合しうる。
【００３９】
本発明の別の実施態様において、一価、二価または多価型である本発明のアミノ酸配列（例えば、本明細書に記載する）は、第１の生物学的条件下で、０．１s-1と１０−６s-1の間、好ましくは０．１s-1と１０−5s-1の間、より好ましくは０．０１s-1と１０−４s-1の間のｋｏｆｆ速度（つまり、ｏｆｆ速度）で、目的とする、または所望の分子に結合し、本発明の前記アミノ酸配列は、第２の生物学的条件下で、第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より少なくとも１．５倍以上であるｏｆｆ速度で、好ましくは第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より１．７倍以上であるｏｆｆ速度で、より好ましくは第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より２倍以上であるｏｆｆ速度で、より好ましくは第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より３倍以上であるｏｆｆ速度で、より好ましくは第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より５倍以上であるｏｆｆ速度で、より好ましくは第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より１０倍以上であるｏｆｆ速度で、より好ましくは第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より２０倍以上であるｏｆｆ速度で、目的とするまたは所望の分子に結合する。
【００４０】
本発明の別の実施態様において、一価、二価または多価型である本発明のアミノ酸配列（例えば、本明細書に記載する）は、第１の生物学的条件下で、０．１s-1と１０−６s-1の間、好ましくは０．１s-1と１０−５s-1の間、より好ましくは０．０１s-1と１０−４s-1の間のｋｏｆｆ速度（つまり、ｏｆｆ速度）で、目的とする、または所望の分子に結合し、本発明の前記アミノ酸配列は、第２の生物学的条件下で、第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より少なくとも１．５倍以上であるｏｆｆ速度で、好ましくは第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より１．７倍以上であるｏｆｆ速度で、より好ましくは第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より２倍以上であるｏｆｆ速度で、より好ましくは第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より３倍以上であるｏｆｆ速度で、より好ましくは第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より５倍以上であるｏｆｆ速度で、より好ましくは第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より１０倍以上であるｏｆｆ速度で、より好ましくは第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より２０倍以上であるｏｆｆ速度で、目的とする、または所望の分子に結合し；ここで本発明の前記アミノ酸配列は、血清タンパク質（好ましくは、血清アルブミン）に一価で、標的タンパク質に一価、二価または多価で結合する。
【００４１】
本発明の別の実施態様では、一価、二価または多価型であり得る本発明のアミノ酸配列（例えば、本明細書に記載する）は、第１の生物学的条件下で、０．１s-1と１０−６s-1の間のｋｏｆｆ速度（つまり、ｏｆｆ速度）で、目的とする、または所望の分子に結合し、本発明の前記アミノ酸配列は、第２の生物学的条件下で、第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より少なくとも２倍以上であるｏｆｆ速度で、目的とする、または所望の分子に結合する。
【００４２】
本発明の別の実施態様では、一価、二価または多価型である本発明のアミノ酸配列（例えば、本明細書に記載する）は、第１の生物学的条件下で、０．１s-1と１０−６s-1の間のｋｏｆｆ速度（つまり、ｏｆｆ速度）で、目的とする、または所望の分子に結合し、本発明の前記アミノ酸配列は、第２の生物学的条件下で、第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より少なくとも５倍以上であるｏｆｆ速度で、目的とする、または所望の分子に結合する。
【００４３】
本発明の別の実施態様では、一価、二価または多価型である本発明のアミノ酸配列（例えば、本明細書に記載する）は、第１の生物学的条件下で、０．０１s-1と１０−４s-1の間のｋｏｆｆ速度（つまり、ｏｆｆ速度）で、目的とする、または所望の分子に結合し、本発明の前記アミノ酸配列は、第２の生物学的条件下で、第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より少なくとも２倍以上であるｏｆｆ速度で、目的とする、または所望の分子に結合し；ここで本発明の前記アミノ酸配列は、血清タンパク質（好ましくは、血清アルブミン）に一価で、標的タンパク質に一価、二価または多価で結合する。
【００４４】
本発明の別の実施態様では、一価、二価または多価型である本発明のアミノ酸配列（例えば、本明細書に記載する）は、第１の生物学的条件下で、０．０１s-1と１０−４s-1の間のｋｏｆｆ速度（つまり、ｏｆｆ速度）で、目的とする、または所望の分子に結合し、本発明の前記アミノ酸配列は、第２の生物学的条件下で、第１の生物学的条件下でのｏｆｆ速度より少なくとも５倍以上であるｏｆｆ速度で、目的とする、または所望の分子に結合し；ここで本発明の前記アミノ酸配列は、血清タンパク質（好ましくは、血清アルブミン）に一価で、標的タンパク質に一価、二価または多価で結合する。
【００４５】
第１および第２の生物学的条件下でのアミノ酸配列の目的とする、または所望の分子への結合（会合定数、解離定数、親和性、そのような結合のｋｏｎ速度またはｋｏｆｆ速度を含む）は、例えば、スキャチャード解析および／または競合結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、およびサンドイッチ競合アッセイ、および当技術分野においてそれ自体公知の様々な異なる変法を含む、それ自体公知の任意の適切な方法で測定できる。ここでも、上記の通り、結合は、ヒトもしくは動物の身体においてインビボで、またはこれが実現可能または実際的ではない場合にはエクスビボで、例えば、インビトロまたは細胞アッセイもしくは動物の身体または人体において起こりうる条件に対応する、および／またはそれを代表するモデル、の条件下で測定できる。例えば、第１または第２の生物学的条件が、ヒトまたは動物の循環において広く認められる生理学的条件を含む場合、前記条件下での本発明のアミノ酸配列の結合は、血液サンプル、血漿サンプルまたは別の適切な血液もしくは血漿に由来する調製物または前記ヒトもしくは動物に由来する溶液中で測定できる。第１または第２の生物学的条件が、ヒトまたは動物の循環において広く認められる生理学的条件を含む場合、前記条件下での本発明のアミノ酸配列の結合は、適切な細胞抽出物中で測定できる。第１または第２の生物学的条件がｐＨおよび／またはイオン強度において異なる場合、前記第１および第２の生物学的条件下での（つまり、ｐＨおよび／またはイオン強度の関連値での）本発明のアミノ酸配列の結合は、例えば、１つ以上の適切な生理学的バッファーまたは溶液を使用して測定できる。
【００４６】
本発明のアミノ酸配列は、目的とする、または所望の分子に結合できる（本明細書に記載の通り）、および／または、それに親和性を有する任意のタンパク質またはポリペプチド（または、ペグ化誘導体などのその誘導体）であり得る。
【００４７】
本発明の特定の、非限定的な一態様によると、本発明のアミノ酸配列は、例えば、限定はされないが、免疫グロブリンフォールドを有するペプチドおよびタンパク質、プロテインＡドメイン、テンダミスタット、フィブロネクチン、リポカイン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、デザインアンキリンリピートおよびＰＤＺドメイン（Binz et al., Nat. Biotech 2005, Vol 23: 1257）を含む、免疫グロブリン以外の他のタンパク質骨格に基づくペプチドおよびタンパク質、ならびに限定はされないが、ＤＮＡまたはＲＮＡのアプタマーを含むＤＮＡまたはＲＮＡに基づく結合成分（Ulrich et al., Comb Chem High Throughput Screen 2006 9(8）: 619-32）からなる群；および、具体的には、免疫グロブリンフォールドを有するタンパク質およびペプチドからなる群から（または、前記のいずれかの適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体、誘導体などから）選択できる。
【００４８】
また、特定の、非限定的な一態様によると、本発明のアミノ酸配列は、３つの相補性決定領域により互いに隔てられた４つのフレームワーク領域（または、そのようなタンパク質またはポリペプチドの適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体、誘導体など）を含む、または、それから本質的になりうる。本明細書にさらに記載される通り、そのような部分またはフラグメントは、好ましくは、そのようなタンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つのＣＤＲを少なくとも含む。）。例えば、本発明のアミノ酸配列は、抗体および抗体フラグメント、抗体または抗体フラグメントに由来する結合ユニットおよび結合分子、ならびに抗体フラグメント、結合ユニットまたは結合分子からなる群；および具体的には、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、ドメイン抗体ならびにドメイン抗体としての使用に適切なタンパク質およびペプチド、単一ドメイン抗体ならびに単一ドメイン抗体としての使用に適切なタンパク質およびペプチド、ナノボディ（登録商標）およびｄＡｂｓ(商標)（または、そのようなタンパク質またはポリペプチドの適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体、誘導体などから。ここでも、そのような部分またはフラグメントは、好ましくは、少なくとも１つのＣＤＲを少なくとも含む。）からなる群から選んでよい。
【００４９】
本発明のアミノ酸配列が選ばれる方法に依存して、それは、好ましくは、４と５００の間のアミノ酸残基、より好ましくは５と３００の間のアミノ酸残基、さらにより好ましくは１０と２００の間のアミノ酸残基、例えば、２０と１５０の間のアミノ酸残基、例えば約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０または１４０のアミノ酸残基を含む。
【００５０】
また、本発明のアミノ酸配列は、好ましくは、（ジスルフィド架橋／結合の有無にかかわらず）単一のアミノ酸鎖を含む。
【００５１】
特定で、非限定的な一実施態様では、本発明のアミノ酸配列は、本質的に免疫グロブリンフォールドを含まない小さな直鎖ペプチドである。本実施態様では、本発明のアミノ酸配列は、３と５０の間、好ましくは５と４０の間、例えば１０、１５、２０または２５のアミノ酸残基を含み得る。そのようなペプチドは、例えば、小さな合成または半合成のペプチドであり得る、および／または、目的とする、または所望の分子に向けられる本発明の免疫グロブリンからの少なくとも１つのＣＤＲに由来しうる、または、それを含み得る（つまり、ここで前記免疫グロブリンは本明細書にさらに記載されうる。）。例えば、そのようなペプチドは、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、本発明のナノボディ(商標)およびｄＡｂｓ(商標)からの、ならびに、具体的には本発明のナノボディからの少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、具体的にはＣＤＲ３）に由来しうる、またはそれを含み得る。例えば、国際公開第０３／０５０５３１号（Ablynx N. V. and Algonomics N.V.）を参照し、そこにはペプチド、具体的には、任意の標的または目的とする標的に結合する免疫グロブリン重鎖可変ドメインＣＤＲ配列の同定および選択のための方法を記載している。
【００５２】
別の好ましい実施態様によると、本発明のアミノ酸配列は、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体ならびに単一ドメイン抗体としての使用に適切なタンパク質およびペプチド、ナノボディ(登録商標)およびｄＡｂｓ(商標)（または、その適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体、誘導体）からなる群から選ばれる。
【００５３】
最も好ましくは、本発明のアミノ酸配列は、ＶＨＨドメインナノボディ(登録商標)である。ナノボディおよびそれを産生するための方法の説明については、本明細書に引用するさらなる先行技術を参照する。
【００５４】
本発明のアミノ酸配列が向けられる目的とする、または所望の分子は、任意の適切な、または、所望の分子であり得る。一般的に、それは、ヒトまたは動物の身体において存在する分子、例えば、ヒトまたは動物の身体において自然発生する分子；前記ヒトまたは動物が病気または疾患を患っている時にヒトまたは動物の身体において発生する分子；もしくはヒトまたは動物の身体において自然発生しない（しかし、投与された、もしくは、そうでなければヒトまたは動物の身体中に侵入した）分子である。
【００５５】
所望の、または目的とする分子がヒトもしくは動物の身体において、または病気もしくは疾患を患うヒトまたは動物の身体において自然発生する分子である場合、分子は、例えば、タンパク質、（ポリ）ペプチド、受容体、抗原、抗原決定基、酵素、因子などの任意の生物学的分子であり得る。これらおよび他の適切な生物学的分子の例は、本明細書での開示に基づいて当業者に明らかであろう。
【００５６】
所望の、または目的とする分子がヒトまたは動物の身体において自然発生しない分子である場合、分子は、例えば、異種タンパク質、ウイルスの（被膜に存在するタンパク質）、細菌またはカビの（細胞壁に存在するタンパク質）、生体異物化合物などであり得る。これらおよび他の適切な生物学的分子の例は、本明細書での開示に基づいて当業者に明らかであろう。
【００５７】
特定の、非限定的な一実施態様（本明細書にさらに詳細に記載する）によると、目的とする、または所望の分子は、アルブミンなどの血清タンパク質、具体的には、ヒト血清アルブミンなどのヒト血清タンパク質であり得る。このアミノ酸配列が向けられ得る他の血清タンパク質の例は、国際公開第０４／００３０１９号（欧州特許第１  ５１７  ９２１号も参照）において言及されるものである。
【００５８】
特定の、非限定的な一実施態様によると、目的とする、または所望の分子は、それが存在するヒトまたは動物の身体内において、再循環、インターナリゼーション、ピノサイトーシス、トランスサイトーシスまたはエンドサイトーシスにさらされる、またはそうでなければヒトの身体内の少なくとも１つの細胞または組織により取り込まれる、任意の生物学的分子であり得る。いくつかの非限定的な例には、血清アルブミンなどのいくつかの血清タンパク質およびいくつかの受容体が含まれる。
【００５９】
特定の、非限定的な一実施態様によると、目的とする、または所望の分子は、ヒトまたは動物の身体の少なくとも１つの細胞または組織の表面上に存在する任意の生物学的分子であり得る。ここでも、いくつかの非限定的な例には、インシュリン受容体などの受容体が含まれる。本実施態様の特定の態様によると、この生物学的分子は、それが存在する細胞により、例えば、再循環（例えば、受容体の再循環）の一部として取り込まれることもできる。
【００６０】
他の態様では、本発明は、本発明のアミノ酸配列を生成するための方法に関する。一態様では、前記方法は少なくとも以下の工程を含む：
ａ）アミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを提供する工程；および
ｂ）第１の生物学的条件下で、１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で、前記所望の分子に結合できるアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程；
ｃ）前記第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合する解離定数よりも少なくとも１０倍を超える解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合するアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程；および
ｄ）第１の生物学的条件下で、１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合でき、および前記第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合する解離定数よりも少なくとも１０倍を超える解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合するアミノ酸配列を単離する工程。
【００６１】
具体的には、そのような方法は以下の工程を含むことができる：
ａ）アミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを提供する工程；および
ｂ）第１の生物学的条件下で１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で、前記所望の分子に結合できるアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを提供するように、第１の生物学的条件下で、１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で、前記所望の分子に結合できるアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の該セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程；
ｃ）前記第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合する解離定数よりも少なくとも１０倍を超える解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合するアミノ酸配列についての工程ｂ）で得られたアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程；および
ｄ）第１の生物学的条件下で１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合でき、および前記第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合する解離定数よりも少なくとも１０倍を超える解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合する、アミノ酸配列を単離する工程。
【００６２】
一般的に、これらの方法では、第１の生物学的条件下で１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合できるアミノ酸配列についてのアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程ｂ）は、第１の生物学的条件下でスクリーニングすることにより実施される。
【００６３】
同様に、これらの方法では、第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合する解離定数よりも少なくとも１０倍を超える解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合するアミノ酸配列についてのアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程ｃ）は、第２の生物学的条件下で実施される。
【００６４】
他の態様では、本発明は、本発明のアミノ酸配列を生成するための方法に関する。一態様では、前記方法は以下の工程を少なくとも含む：
ａ）アミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを提供する工程；および
ｂ）第１の生物学的条件下で、０．１s-1および１０−６s-1、例えば、０．０１〜０．００００１のｋｏｆｆなどのｋｏｆｆ速度で、前記所望の分子に結合できるアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程；および
ｃ）前記第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合するｋｏｆｆ速度よりも少なくとも１．５倍以上であるｋｏｆｆ速度で前記所望の分子に結合するアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程であって、より好ましくはｋｏｆｆ速度が１．７倍以上、より好ましくはｋｏｆｆ速度が２倍以上、より好ましくはｋｏｆｆ速度が３倍以上、より好ましくはｋｏｆｆ速度が４倍以上、より好ましくはｋｏｆｆ速度が５倍以上、より好ましくはｋｏｆｆ速度が１０倍以上であり；および
ｄ）前記アミノ酸配列を単離する工程。
【００６５】
本発明の別の実施態様では、そのような方法は以下の工程を含むことができる：
ａ）アミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを提供する工程；および
ｂ）第１の生物学的条件下で、０．１s-1および１０−６s-1、例えば、０．０１〜０．００００１のｋｏｆｆなどのｋｏｆｆ速度で、前記所望の分子に結合できるアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程；
ｃ）前記第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合するｋｏｆｆ速度よりも少なくとも２倍以上であるｋｏｆｆ速度で前記所望の分子に結合するアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程；および
ｄ）前記アミノ酸配列を単離する工程。
【００６６】
本発明の別の実施態様では、そのような方法は以下の工程を含むことができる：
ａ）アミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを提供する工程；および
ｂ）第１の生物学的条件下、例えば７．２〜７．４の間のｐＨ、例えば７．２で、０．１s-1および１０−６s-1、例えば、０．０１〜０．００００１のｋｏｆｆなどのｋｏｆｆ速度で、前記所望の分子に結合できるアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程；および
ｃ）前記第２の生物学的条件下、例えば５〜６の間のｐＨ、例えばｐＨ５．５で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合するｋｏｆｆ速度よりも少なくとも２倍以上であるｋｏｆｆ速度で前記所望の分子に結合するアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程；および
ｄ）前記アミノ酸配列を単離する工程；および、場合により
ｅ）前記アミノ酸配列の半減期のインビボでの評価工程（例えば、カニクイザルにおけるＰＫ評価）。
【００６７】
本発明の別の実施態様では、そのような方法は以下の工程を含むことができる：
ａ）アミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを提供する工程；および
ｂ）第１の生物学的条件下、例えば７．２〜７．４の間のｐＨ、例えば７．２で、０．１s-1および１０−６s-1、例えば、０．０１〜０．００００１のｋｏｆｆなどのｋｏｆｆ速度で、前記所望の分子に結合できるアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程；
ｃ）前記第２の生物学的条件下、例えば５〜６の間のｐＨ、例えばｐＨ５．５で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記所望の分子に結合するｋｏｆｆ速度よりも少なくとも２倍以上、例えば３倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍であるｋｏｆｆ速度で前記所望の分子に結合するアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程；および
ｄ）前記第２の生物学的条件下で、前記所望の分子に結合しないアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程、および
ｅ）前記アミノ酸配列を単離する工程；および、場合により
ｆ）前記アミノ酸配列の半減期のインビボでの評価工程（例えば、カニクイザルにおけるＰＫ評価）。
【００６８】
本発明の別の実施態様では、そのような方法は以下の工程を含むことができる：
ａ）アミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを提供する工程；および
ｂ）第２の生物学的条件下、例えば５〜６の間のｐＨ、例えば５．５で、０．１s-1および１０−６s-1、例えば、０．０１〜０．００００１のｋｏｆｆなどのｋｏｆｆ速度で、前記所望の分子に結合できるアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程；
ｃ）前記第１の生物学的条件下、例えば７．２〜７．４の間のｐＨ、例えばｐＨ７．３で、前記アミノ酸配列が前記第２の生物学的条件下で前記所望の分子に結合するｋｏｆｆ速度よりも少なくとも２倍以上、例えば３倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍であるｋｏｆｆ速度で前記所望の分子に結合するアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程；および
ｄ）前記第１の生物学的条件下で、前記所望の分子に結合しないアミノ酸配列についてのアミノ酸配列の前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程、および
ｅ）前記アミノ酸配列を単離する工程；および、場合により
ｆ）前記アミノ酸配列の半減期のインビボでの評価工程（例えば、カニクイザルにおけるＰＫ評価）。
【００６９】
当業者には明らかなように、スクリーニング工程は、選択工程として実施することもできる。例えば、抗体‐抗原相互作用は、バッファー条件、ｐＨおよびイオン強度における変化に敏感な場合が多いことが知られているが、しかし、ほとんどの場合、それらの変化はスコア化または検証されず、変動が全般的に予測不可能であるため、それらを使用して薬物治療をデザインすることはあまりない。望ましい結合特性を有する結合タンパク質は、例えば、感受性の相互作用の発生について結合タンパク質のレパートリーをスクリーニングすることにより、例えば、第１および第２の生物学的条件下で、および、測定された相対的な結合強度で結合アッセイを実施することにより見出される。相対的な相互作用のそのような強度は、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ法、スキャチャード解析などを含む任意の適切な結合テストで測定できる。そのようなテストによって、いずれの結合タンパク質が、どの程度で、選ばれたパラメーターに敏感な相互作用を呈するのかが明らかになる。望ましい結合特性を有する結合タンパク質は、代わりに、結合タンパク質のレパートリー、例えば、望ましい感受性について優先的に濃縮する選択における条件を使用して、ファージ、リボソーム、酵母または細胞のライブラリーから選択することにより見出される。ｐＨの点で異なる第１および第２の生物学的条件を例に取ると、塩基性ｐＨ（例、ｐＨ７．４）でファージ抗体ライブラリーをインキュベートし、結合したファージ粒子を低ｐＨ（例、ｐＨ６．０）のバッファーで溶出することによって、このｐＨ変化に敏感な抗原を認識しているファージ抗体が濃縮される。そのような選択の反復サイクルの後に、このｐＨウィンドウにおいてｐＨ依存的結合を呈する結合タンパク質を同定するための個々のクローンをスクリーニングする工程が続く。望ましい結合特性を有する結合タンパク質は、さらに、推定結合部位が特定の「敏感な」相互作用において好ましいアミノ酸残基または配列、例えば、ｐＨ感受性のためのヒスチジンを含むように改変されたデザイナータンパク質ライブラリーから単離できる。例えば、ＦｃＲｎとＩｇＧの間の相互作用はｐＨに精巧に感受性であり、ｐＨがｐＨ６．０〜ｐＨ７．０に上昇すると２桁超低下することが知られている。親和性移行の主な基本機構は、結合部位のヒスチジン含量である：ヒスチジン残基のイミダゾール側変化は、通常、ｐＨ範囲６．０〜７．０にわたり脱プロトン化する。推定結合部位におけるヒスチジンの明確な含有（例えば、トリヌクレオチドの使用および当技術分野において公知の通りに、ライブラリーにおいてこの残基を優先的に導入するオリゴヌクレオチド、例、Knappik et al., J. Mol. Biol 2000, vol 296: 57-86）は、本質的にｐＨに非依存的に結合する高頻度のアミノ酸配列をもたらすと予測される。
【００７０】
したがって、この記載に使用する「スクリーニング」という用語は、選択、スクリーニング、または選択および／もしくはスクリーニングの技術の任意の適切な組み合わせを含み得る。
【００７１】
一般に、工程ｂ）およびｃ）は、単一もしくは別々のスクリーニング工程として、または単一のスクリーニングプロセスの一部として実施できる。工程ｂ）およびｃ）を単一のスクリーニングプロセスの一部として実施する場合、そのようなスクリーニングプロセスは、例えば、以下の工程を含み得る：
ｉ）第１の生物学的条件下での（つまり、１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で所望の分子に結合できるアミノ酸配列は所望の分子に結合し、および、１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で所望の分子に結合できないアミノ酸配列は所望の分子に結合しないように）アミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを血清タンパク質に接触させる工程；
ｉｉ）目的とする、または所望の分子に結合している（および第１の生物学的条件下で依然、存在している）アミノ酸配列のセットまたはコレクションが残るように、工程ｉ）で結合しないアミノ酸配列（つまり、第１の生物学的条件下で、１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記所望の分子に結合しないアミノ酸配列）を除去する工程；
ｉｉｉ）目的とする、または所望の分子にコンディショナルに結合しない（本明細書に記載）アミノ酸配列が、目的とする、または所望の分子に結合したままであり、および目的とする、または所望の分子にコンディショナルに結合する（本明細書に記載）アミノ酸配列が、もはや目的とする、または所望の分子に結合したままでいないように、第２の生物学的条件にアミノ酸配列のセットまたはコレクションをさらす工程；
ｉｖ）目的とする、または所望の分子にコンディショナルに結合するアミノ酸配列を所望の分子にコンディショナルには結合しない（所望の分子に依然、結合している）アミノ酸配列から分離する工程；および、場合により
ｖ）目的とする、または、所望の分子にコンディショナルに結合するアミノ酸配列を回収する工程。
【００７２】
例えば、この単一のスクリーニングプロセスは、（例えば、共有結合またはアビジン‐ストレプトアビジン結合を介して）所望の分子を適切に固定化した適切な担体または支持体（カラム、ビーズ、もしくはマルチウェルプレートのウェルの表面などの固形表面、またはBiacoreの固定相など）を提供すること；担体または支持体をアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーと接触させること；担体または支持体に結合している所望の分子に結合しないアミノ酸配列を洗い流すこと；第２の生物学的条件を変更すること、および第２の生物学的条件下で担体または支持体に結合している所望の分子に結合しないアミノ酸配列を回収することにより容易に実施できる。
【００７３】
あるいは、以下にさらに詳細に記載する通り、本発明のアミノ酸配列は、所望の分子に結合するコンディショナルな結合剤に対するアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリー（本明細書に記載）を濃縮することにより得ることができる。
【００７４】
上記の方法において使用するアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーは、任意の適切なアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーであり得る。例えば、アミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーは、免疫グロブリン可変ドメイン配列またはそのフラグメントのセット、コレクションまたはライブラリー、例えば、ＶＨ−、ＶＬ−、またはＶＨＨ−配列またはそれらのフラグメントのセット、コレクションまたはライブラリーなどの免疫グロブリン配列または免疫グロブリン配列のフラグメントのセット、コレクションまたはライブラリーであり得る。特定の、非限定的な一態様では、アミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーは、ドメイン抗体の、ドメイン抗体として使用できるタンパク質の、「ｄＡｂ」の、単一ドメイン抗体の、単一ドメイン抗体として使用できるタンパク質の、またはナノボディの（または先のいずれかの適切なフラグメントの）セット、コレクションまたはライブラリーであり得る。
【００７５】
アミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーは、未処置のセット、コレクションまたはライブラリーであり得る；合成または半合成のアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリー（例えば、限定はされないが、親和性成熟により生成されたアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリー）であり得るし、または、免疫セット、コレクションまたはライブラリーであり得る。一実施態様では、セット、コレクションまたはライブラリーは、哺乳動物（ウサギ、ラット、マウス、ブタまたはイヌ、もしくはラクダ）を抗原（該哺乳動物が該抗原に対して抗体を形成するように）適切に免疫し、次に該哺乳動物から得られた生物学的サンプル（血液またはＢ細胞サンプルなど）から開始して免疫グロブリン配列のセット、コレクションまたはライブラリーを生成することにより得られた免疫セット、コレクションまたはライブラリーである。そのような免疫セット、コレクションまたはライブラリーを得て、スクリーニングするための方法および技術は、例えば、本明細書に引用する先行技術から、当業者に明らかである。好ましい一態様では、免疫グロブリン配列のセット、コレクションまたはライブラリーは、目的とする血清タンパク質で（例えば、血清アルブミンで）適切に免疫化された哺乳動物から得られる。別の好ましい態様において、セット、コレクションまたはライブラリーは、ラクダから得られたＶＨＨ配列のセット、コレクションまたはライブラリー、具体的には、目的とする血清タンパク質で（例えば、血清アルブミンで）適切に免疫化されたラクダから得られたＶＨＨ配列の免疫セット、コレクションまたはライブラリーである。
【００７６】
セット、コレクションまたはライブラリーは、任意の適切な数のアミノ酸配列、例えば、１、２、３または約５、１０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８またはそれ以上の配列を含み得る。
【００７７】
上記のアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーは、例えば、仮にこれらの配列が１つ以上の任意のアミノ酸配列のランダム化工程の（例えば、エラープローンＰＣＲまたは他の手段による）結果である場合、選択および／またはスクリーニングプロセスより前に知られていない１つ以上の配列を含み得る。また、上記のアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーにおける１つ以上またはすべては、コンピュータモデリング技術または生物静力学またはデータマイニング技術などの合理的な、もしくは半経験的なアプローチにより得ることができ、または定義でき、ここでは安定性の上昇、最適ｐＨ、プロテアーゼ感受性、もしくは他の特性またはそれらの組み合わせなどの特定の特性により予測される、または賦与されると期待される、アミノ酸配列が定義または提示されうる。
【００７８】
そのようなセット、コレクションまたはライブラリー（および／または本明細書に記載するスクリーニング工程中）において、前記セット、コレクションまたはライブラリー中に存在するアミノ酸配列を適切な宿主または宿主細胞、例えば、ファージ粒子、リボソーム、細菌、酵母細胞などの上に適切にディスプレイすることもできる。ここでも、適切な宿主または宿主細胞、そのような宿主または宿主細胞の上にアミノ酸配列をディスプレイするための適切な技術、およびそのような宿主または宿主細胞の上にディスプレイされたアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングするための適切な技術は、例えば、本明細書に引用する先行技術から当業者に明らかであろう。アミノ酸配列が適切な宿主または宿主細胞の上にディスプレイされた場合、最初に前記宿主または宿主細胞から、所望のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を単離し、次に適切な宿主生物において前記ヌクレオチド配列を適切に発現させることにより所望のアミノ酸配列を得ることも可能（および習慣的）である。ここでも、これは、当業者に明らかなように、それ自体公知の任意の適切な方法より実施できる。
【００７９】
非限定的な例として、そのようなセット、コレクションまたはライブラリーは、互いに変異体であり（例えば、デザインされた点突然変異またはランダム化位置を有する）、多様なセットの自然多様化アミノ酸配列（例えば、免疫ライブラリー）に由来する複数のアミノ酸配列を損なう、１、２つまたはそれ以上のアミノ酸配列、または多様なアミノ酸配列の任意の他の源（例えば、Hoogenboom et al., Nat Biotechnol 23: 1105, 2005 and Binz et al.,Nat Biotechnol 2005, 23: 1247において記載される）を含むことができる。そのようなアミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーは、ファージ粒子、リボソーム、細菌、酵母細胞、哺乳動物細胞の表面上にディスプレイでき、これらの担体内においてアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に連結できる。これによって、本発明の所望のアミノ酸配列を単離するための選択手順に適した、そのようなセット、コレクションまたはライブラリーが作製される。
【００８０】
本発明のアミノ酸配列は、１つ以上の他の抗原、抗原決定基、タンパク質、ポリペプチド、または他の化合物、に対する１つ以上の追加の結合部位も含み得る。
【００８１】
本明細書に開示しているアミノ酸配列は、他の成分（他のアミノ酸配列、タンパク質もしくはポリペプチド、または他の化学物質など）に対する融合パートナーとして、具体的には、治療用のタンパク質またはポリペプチド、治療用化合物（限定はされないが、小分子を含む）または他の治療用物質などの治療成分のための融合パートナーとして有利に使用できる。少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列および少なくとも１つのさらなる化合物、成分もしくは物質を含むそのようなコンストラクトまたは融合物も本明細書に「本発明の化合物」と呼ばれる。
【００８２】
このように、別の態様では、本発明は、任意に１以上の適切なリンカーまたはスペーサーを介して少なくとも１つの治療成分に連結している、本明細書に開示するアミノ酸配列を含む、または本質的にそれからなる、ポリペプチドまたはタンパク質のコンストラクトなどの化合物を提供する。そのようなポリペプチドまたはタンパク質のコンストラクトは、例えば（限定はされないが）、本明細書にさらに記載する融合タンパク質であり得る。
【００８３】
本発明は、さらに、ポリペプチドまたはタンパク質コンストラクトの治療的使用、およびそのようなポリペプチドもしくはタンパク質コンストラクトまたは融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【００８４】
いくつかの実施態様では、少なくとも１つの治療成分は、治療用のタンパク質、ポリペプチド、化合物、因子もしくは他の物質を含む、またはそれから本質的になる。好ましい実施態様では、治療成分は、所望の抗原もしくは標的に対するものであり、所望の抗原に結合でき（具体的には所望の抗原に特異的に結合でき）、および／または所望の標的と相互作用できる。別の実施態様では、少なくとも１つの治療成分は、治療用のタンパク質もしくはポリペプチドを含む、またはそれから本質的になる。さらなる実施態様では、少なくとも１つの治療成分は、抗体または抗体フラグメント（限定はされないが、ＳｃＦｖフラグメントを含む）などの免疫グロブリンまたは免疫グロブリン配列（限定はされないが、免疫グロブリンのフラグメントを含む）を含む、またはそれから本質的になる。さらに別の実施態様では、少なくとも１つの治療成分は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインなどの抗体可変ドメインを含む、またはそれから本質的になる。
【００８５】
好ましい実施態様では、少なくとも１つの治療成分は、少なくとも１つのドメイン抗体または単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」またはナノボディ(登録商標)を含む、または、それから本質的に成り、結果として得られるポリペプチドまたはタンパク質のコンストラクトもしくは融合タンパク質は多価コンストラクト、好ましくは多特異的コンストラクトである。
【００８６】
「多価」の化合物、タンパク質、ポリペプチドまたはコンストラクトにより、この記載では、少なくとも２つの結合ユニットを含む（つまり、同じ、または、異なるエピトープに結合する）化合物、タンパク質、ポリペプチドまたはコンストラクトを意味し、それらのすべてが同じ（種類の）生物学的分子に結合できる。「二価」の化合物、タンパク質、ポリペプチドまたはコンストラクトにより、この記載では、２つの結合ユニットを含む化合物、タンパク質、ポリペプチドまたはコンストラクトを意味し、それらは同じ（種類の）生物学的分子に結合できる。「一価」の化合物、タンパク質またはポリペプチドにより、この記載では、本質的に１つの結合ユニットからなる化合物、タンパク質またはポリペプチドを意味し、それらは生物学的分子に結合できる。
【００８７】
「結合ユニット」により、この記載では、本明細書に記載する生物学的分子に結合できる任意のアミノ酸配列、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、コンストラクト、融合タンパク質、化合物、因子または他の物質、例えば、本発明のアミノ酸配列または治療成分（いずれも本明細書に記載）を意味する化合物、タンパク質、ポリペプチドまたはコンストラクトが２以上の結合ユニットを含む場合、前記結合ユニットは任意に１以上の適切なリンカーを介して互いに連結されうる。
【００８８】
「多特異的」な化合物、タンパク質、ポリペプチドまたはコンストラクトにより、この記載では、少なくとも２つの結合ユニットを含む化合物、タンパク質、ポリペプチドまたはコンストラクトを意味し、それらの少なくとも第１の結合ユニットは第１の生物学的機能分子に結合でき、それらの少なくとも第２の結合ユニットは第２の生物学的機能分子に結合できる。「二特異的」な化合物、タンパク質、ポリペプチドまたはコンストラクトにより、この記載では、少なくとも２つの結合ユニットを含む化合物、タンパク質、ポリペプチドまたはコンストラクトを意味し、それらの第１の結合ユニットは第１の生物学的機能分子に結合でき、それらの第２の結合ユニットは第２の生物学的機能分子に結合できる。第１および第２の生物学的機能分子は、異なる分子であり得る、または同じ生物学的分子であり得るが、この場合二特異的な化合物は異なる部位で生物学的分子を認識する、または、それに結合する。
【００８９】
特定の実施態様では、少なくとも１つの治療成分は、少なくとも１つの一価ナノボディ(登録商標)または二価、多価、二特異的または多特異的ナノボディ(登録商標)コンストラクトを含む、またはそれから本質的になる。
【００９０】
別の特定の実施態様では、本発明の化合物は、任意に１つ以上の適切なリンカーを介して連結された本発明の２つ以上のアミノ酸配列（および任意に、本明細書に記載する１つ以上のさらなる成分）を含み得るが、その場合本発明の２つ以上のアミノ酸配列は、同じ所望の、または目的とする分子（例えば、第１の生物学的条件下で増大した結合力を有するコンディショナルな結合剤を提供する）、同じ所望の、または、目的とする分子上のエピトープの異なる部分（ここでも、例えば、第１の生物学的条件下で増大した結合力を有するコンディショナルな結合剤を提供する）に対して、または異なる所望の、または目的とする分子に対して向けられうる。
【００９１】
この最後の非限定的な実施態様によると、本発明の化合物は、２つ以上の異なる目的とする、または所望の分子にコンディショナルに結合する二特異的（または多特異的）な化合物であり得る。そのようなものとして、本発明の化合物は、第１の生物学的条件下で（あるいは、第２の生物学的条件下で）第１および第２の目的とする、もしくは所望の分子の両方に結合する、または第１の生物学的条件下で第１の目的とする、もしくは所望の分子に結合するが、第２の生物学的条件下で第２の目的とする、または所望の分子に結合する、ものであり得る。このように、第１の生物学的条件から第２の生物学的条件に変化する場合、本発明のそのような化合物は、それゆえ第１の目的とする、または所望の分子から放出され、第２の目的とする、または所望の分子に結合する。
【００９２】
治療用の化合物、成分または物質の半減期を延長する目的とするための本発明のそのような化合物におけるコンディショナルな結合剤の特定の、非限定的ないくつかの用途は、本明細書のさらなる記載から明らかになるであろう。
【００９３】
他の実施態様では、本発明の化合物は、本明細書に記載する少なくとも１つのコンディショナルな結合ユニット、およびコンディショナルな結合剤ではない１つ以上のさらなる結合ユニットを含んでよい。
【００９４】
ここでも、治療用の化合物、成分または物質の半減期を延長する目的とするための本発明のそのような化合物におけるコンディショナルな結合剤の特定の、非限定的ないくつかの用途は、本明細書のさらなる記載から明らかになる。
【００９５】
本発明は、本明細書に記載するアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質、または多価もしくは多特異的コンストラクトをコードするヌクレオチド配列または核酸にも関する。本発明は、さらに、先のヌクレオチド配列または核酸およびそれ自体公知の遺伝的コンストラクトについての１つ以上のエレメントを含む遺伝的コンストラクトを含む。遺伝的コンストラクトは、プラスミドまたはベクターの形であり得る。そのような、および他の遺伝的コンストラクトは、当業者に公知である。
【００９６】
本発明は、そのようなヌクレオチド配列もしくは核酸を含み、および／または、本明細書に記載するアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質、または多価列もしくは多特異的コンストラクトを発現する（または発現できる）宿主または宿主細胞にも関する。ここでも、そのような宿主または宿主細胞は、当業者に公知である。
【００９７】
本発明は、一般的に、本明細書に記載するアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質、または多価もしくは多特異的コンストラクトを調製するための方法にも関するもので、その方法は、前記宿主細胞が本明細書に記載するアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質、または多価もしくは多特異的コンストラクトを産生または発現する条件下で本明細書に記載する宿主細胞を培養する工程または維持する工程を含み、かつ場合によりそのようにして産生したアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質、または多価もしくは多特異的コンストラクトを単離する工程をさらに含む。ここでも、そのような方法は、本明細書に言及する出願者による同時係属特許出願において一般的に記載される通りに実施できる。
【００９８】
本発明のアミノ酸配列および化合物は、本発明の化合物中に存在するコンディショナルな結合剤が向けられる目的とする、または所望の化合物の選択に依存して、および本発明の化合物中に存在するさらなる成分、化合物または（コンディショナルまたは非コンディショナルな結合ユニットのいずれかであり得る）結合ユニットにも依存して、それ自体公知の任意の適切な目的のために設計および使用できる。そのような目的ならびにそのような用途のために適切な本発明のアミノ酸配列および化合物は、本明細書での開示に基づいて当業者に明らかである。
【００９９】
本発明の特定の、非限定的な一用途によると、本発明のアミノ酸配列は血清タンパク質に向けられ、治療用の成分または化合物（本明細書に記載する）の半減期を増大するための融合パートナー、結合ユニットまたは成分として使用できる。
【０１００】
血清タンパク質に結合できるアミノ酸配列、ならびに治療関連のタンパク質、ポリペプチドおよび他の化合物の半減期を増大するためにポリペプチドコンストラクトにおいてそれを使用することは、当技術分野において公知である。
【０１０１】
例えば、国際公開第９１／０１７４３号、国際公開第０１／４５７４６号、および国際公開第０２／０７６４８９号には、治療用タンパク質および他の治療用の化合物、ならびその半減期を増大するための物質、に融合できる血清アルブミンに結合するペプチド成分について記載されている。しかし、これらのペプチド成分は細菌または合成に由来し、それは治療での使用にはあまり好まれない。
【０１０２】
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、「Ｂｒａｍｂｅｌｌ受容体」とも呼ばれ、循環中のアルブミンの寿命の延長に関与する（Chaudhury et al., The Journal of Experimental Medicine, vol. 3, no.197, 315-322 (2003）参照）。ＦｃＲｎ受容体は、３つの細胞外ドメインを有する４３kDのα鎖に非共有結合したβ２ミクログロブリン、細胞膜貫通領域および約５０個のアミノ酸の細胞質テールからなる可溶性軽鎖からなる内在性膜糖タンパクである。細胞質テールは、受容体の内在化に関与するジヌクレオチドモチーフベースのエンドサイトーシスシグナルを含む。α鎖は、タンパク質の非古典的ＭＨＣ  Ｉファミリーのメンバーである。α鎖とのβ２ｍ会合は、ＦｃＲｎの正確なフォールディングならびにエンドソームおよび細胞表面への経路選択のための小胞体からの脱出のために重要な意味を持つ。
【０１０３】
ＦｃＲｎの全体構造は、クラスＩ分子のそれに似ている。α１およびα２の領域は、８つの逆平行βストランドで構成されるプラットフォームに似ており、２つの逆平行αヘリックスにより覆われた単一のβ−シートを形成し、ＭＨＣ  Ｉ分子におけるペプチド溝に非常に酷似している。Ｐｒｏ１６２の存在によって導入されたヘリックスにおける切断に起因する、α１ヘリックスの全体的な再配置およびα２ヘリックスのＣ末端部分の屈曲のため、ＦｃＲｎヘリックスが大幅に接近し、ペプチド結合を塞ぐ。ＦｃＲｎのＡｒｇ１６４の側鎖もペプチドＮ末端のＭＨＣポケットとの潜在的な相互作用を塞ぐ。さらに、α１ヘリックスとα２ヘリックスとの間の塩橋および疎水的相互作用も溝閉鎖に寄与しうる。
【０１０４】
ＦｃＲｎは、したがって、抗原提示に関与せず、ペプチド溝は空である。
【０１０５】
ＦｃＲｎはＩｇＧを結合し、母体循環から胎児循環まで胎盤シンシチウム栄養芽層を越えて輸送し、成体における分解からＩｇＧを保護する。ホメオスタシスに加えて、ＦｃＲｎは組織におけるＩｇＧのトランスサイトーシスを調節する。ＦｃＲｎは上皮細胞、内皮細胞、および肝細胞において局在する。
【０１０６】
Chaudhuryら（上記）によると、アルブミンはＦｃＲｎに結合してＩｇＧと三分子複合体を形成する。アルブミンおよびＩｇＧのいずれもＦｃＲｎ上の別々の部位に非協同的に結合する。セファロースＨＳＡおよびセファロースｈＩｇＧに対するヒトＦｃＲｎの結合はｐＨ依存的であり、ｐＨ５．０で最大であり、ｐＨ７．０からｐＨ８まででゼロに近づく。ＩｇＧを結合するのと同じｐＨ依存的な様式でＦｃＲｎがアルブミンを結合するとの知見は、アルブミンがＦｃＲｎと相互作用して、これにより分解から保護される機構がＩｇＧのそれと同じであり、ｐＨに敏感なＦｃＲｎとの相互作用により同様に媒介されることを示唆する。ＳＰＲを使用して個々のＨＳＡドメインが固定化された可溶性ｈＦｃＲｎを結合する能力を測定し、Chaudhuryは、ＦｃＲｎとアルブミンがＩｇＧ結合部位とは別の部位上において、ｐＨ依存的にアルブミンのＤ−ＩＩＩドメインを介して相互作用することを示した（Chaudhury，  ＰｈＤ学位論文，  http://www.andersonlab.com/biosketchCC.htmを参照；Chaudhury et al., Biochemistry, ASAPArticle 10.1021/bi052628y S0006-2960(05）02628-0  （ウェブ公開日：２００６年３月２２日））。
【０１０７】
出願者による国際公開第０４／０４１８６５号には、タンパク質の半減期を増大させるために、他のタンパク質に（所望の標的に結合できる１つ以上の他のナノボディ(登録商標)など）連結できる血清アルブミンに（および具体的にはヒト血清アルブミンに対して）結合できるナノボディ(登録商標)を記載している。これらのナノボディ(登録商標)は、従来の４鎖血清アルブミン結合抗体よりも強力かつ安定であり、（１）より低用量な剤形、より少ない投与頻度で、より少ない副作用を導く；（２）改良された安定性で、静脈内経路に加えて、経口または皮下の経路を含む、より広い投与経路の選択を導く；（３）商品の低コストに起因するより低い治療コストを導くことが知られている。
【０１０８】
本発明の本実施態様では、所望の分子は血清タンパク質、および具体的にはヒトまたは動物の体内において再循環にさらされる血清タンパク質である。そのような血清タンパク質のいくつかの非限定的な例は、血清アルブミンやＩｇＧなどのＦｃＲｎに結合できる血清タンパク質である。本発明のアミノ酸配列が結合できる他の血清タンパク質は、当業者に明らかであり、例えば、国際公開第０４／００３０１９号において言及される血清タンパク質が含まれる（欧州特許第１  ５１７  ９２１号も参照）。
【０１０９】
このように、本実施態様によると、本発明は、血清タンパク質に向けられるアミノ酸配列に関するもので、ここで前記アミノ酸配列は：
ａ）第１の生物学的条件下で、１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で、および／または少なくとも１０５M-1の結合親和性（ＫＡ）で前記血清タンパク質に結合し；および
ｂ）第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記血清タンパク質に結合する解離定数よりも少なくとも１０倍を超える解離定数（ＫＤ）で前記血清タンパク質に結合する。
【０１１０】
本発明のアミノ酸配列が結合する（または生理的条件下で結合できる）血清タンパク質は、本明細書および国際公開第０４／００３０１９号に言及されるものなど任意の血清タンパク質、および、具体的には、前記血清タンパク質が自然に発生するヒトまたは動物の身体において再循環または再循環機構にさらされる任意の血清タンパク質であり得る。このような血清タンパク質の例は、当業者に明らかであろう。
【０１１１】
具体的には、本発明のアミノ酸配列が結合する（または生理的条件下で結合できる）血清タンパク質は、血清アルブミン、ＩｇＧなどの免疫グロブリン、およびトランスフェリンからなる群から選んでよい。好ましいが、非限定的な実施態様によると、本発明のアミノ酸配列は血清アルブミンに結合する。
【０１１２】
血清タンパク質は、好ましくは、ヒト血清アルブミン、ＩｇＧあるいはトランスフェリンなどのヒト血清タンパク質、具体的には、ヒト血清アルブミンである。一方、当然のことながら、本発明のいくつかの特定の、非限定的な態様によると、本発明のアミノ酸配列は、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたは霊長類などの少なくとも別の哺乳類種からの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質と交差反応を起こしうる。具体的には、これらの態様によると、本発明のアミノ酸配列は、本明細書にさらに記載する通り、少なくとも別の霊長類種からの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質と交差反応を起こしうる。
【０１１３】
具体的には、本実施態様によると、本発明のアミノ酸配列は、第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記血清タンパク質に結合する解離定数よりも少なくとも１０倍を超える、好ましくは１００倍を超える、より好ましくは１０００倍を超える解離定数（ＫＤ）で、前記血清タンパク質に結合しうる。好ましい実施態様では、本発明のアミノ酸配列、例えば一本鎖抗体、例えばｄＡｂまたはナノボディは、前記第２の生物学的条件下ではまったく結合せず、例えば、本発明のアミノ酸配列はｐＨ５．５では（またはｐＨ５〜６の間では）結合しないが、しかし、生理学的ｐＨ、つまりｐＨ７．２〜７．４では結合する。
【０１１４】
好ましくは、本実施態様によると、本発明のアミノ酸配列は、前記第１の生物学的条件下で、１０−６moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）、好ましくは１０−７moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）、より好ましくは１０−８moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）で前記血清タンパク質に結合する。
【０１１５】
また、好ましくは、本実施態様によると、本発明のアミノ酸配列は、前記第２の生物学的条件下で、１０−６moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）、好ましくは１０−５moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）、より好ましくは１０−４moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）で前記血清タンパク質に結合する。
【０１１６】
本発明の別の実施態様では、本発明のアミノ酸配列は、前記第２の生物学的条件下で、前記アミノ酸配列が前記第１の生物学的条件下で前記血清タンパク質に結合する解離定数よりも少なくとも１０倍未満、好ましくは１００倍未満、より好ましくは１０００倍未満である解離定数（ＫＤ）で、前記血清タンパク質に結合する。
【０１１７】
本発明の別の実施態様では、本発明のアミノ酸配列は、前記第１の生物学的条件下で１０−６moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）で、および第前記２の生物学的条件下で１０−７moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）、例えば、１０−８moles/liter以下または１０−９moles/liter以下で前記血清タンパク質に結合する。
【０１１８】
本発明の別の実施態様では、本発明のアミノ酸配列は、前記第１の生物学的条件下で１０−５moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）で、および前記第２の生物学的条件下で１０−６moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）、例えば１０−７moles/liter以下；または例えば１０−８moles/liter以下で前記血清タンパク質に結合する。
【０１１９】
本発明の別の実施態様では、本発明のアミノ酸配列は、前記第１の生物学的条件下で１０−４moles/liter以上の解離定数（ＫＤ）で、および前記第２の生物学的条件下で１０−５moles/liter以下の解離定数（ＫＤ）、例えば１０−６moles/liter以下；または例えば１０−７moles/liter以下で前記血清タンパク質に結合する。
【０１２０】
好ましい実施態様では、本発明のアミノ酸配列、例えば一本鎖抗体、例えばｄＡｂまたはナノボディは、前記第１の生物学的条件下ではまったく結合せず、例えば、本発明のアミノ酸配列はエンドソームのｐＨ５．５では（またはｐＨ５〜６の間では）結合するが、細胞外ｐＨ、つまりｐＨ７．２〜７．４では結合しない。
【０１２１】
さらなる好ましい実施態様では、本発明のアミノ酸配列、例えば一本鎖抗体、例えばｄＡｂまたはナノボディは、二価または多価のアミノ酸配列であり、ここで１つの結合ブロックはヒト血清アルブミンに対して向けられており、および前記ヒト血清アルブミン結合ブロックはｐＨ５．５では（またはｐＨ５から６の間では）結合しないが、ｐＨ７．２から７．４では結合する；および任意に、本発明のアミノ酸配列、例えば一本鎖抗体、例えばｄＡｂまたはナノボディは、（例、一価または多価、例、二価のフォーマットで）治療的介入のための標的タンパク質に結合する。
【０１２２】
治療的介入のためのそのような標的の例は、ＴＮＦスーパーファミリーのタンパク質である（Aggarwal, Nature Reviews Immunology 3: 747, 2003）。タンパク質のこのスーパーファミリーは、２９の受容体を通じてシグナルを送る１９のメンバーからなる。一方、これらのリガンドは、免疫反応、造血および形態形成などの通常の機能を制御しながら、腫瘍形成、移植片拒絶、敗血症性ショック、ウイルス複製、骨再吸収、関節リウマチおよび糖尿病にも関与してきた。ＴＮＦのブロッカーは、ＴＮＦ関連自己免疫病気の治療におけるヒトでの使用のために承認されている。大部分のリガンドは単一の受容体に結合するが、他は２つ以上に結合する。例えば、ＴＲＡＩＬは５つもの受容体（ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＶＲ１、ＤＣＲ２およびＯＰＧ）に結合するが、ＢＡＦＦは３つの受容体、膜貫通性活性化因子およびサイクロフィリンリガンド相互作用子（ＴＡＣＩ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＭＣＡ）およびＢＡＦＦＲに結合する（Aggarwal, 2003, 図１）。ＴＮＦスーパーファミリーの異なるリガンドについて受容体の間でのクロストークの証拠も存在する。したがって、最大限の治療効果を達成するために、全リガンドの特定の受容体との相互作用、または特定のリガンドのその全受容体との相互作用は同時に阻害されなければならないということになる。それゆえに、効率的な治療のために、様々な異なる結合分子または複数の結合特異性を有する結合分子が必要とされる。
【０１２３】
治療的介入のためのあり得る標的の別の例は、受容体チロシンキナーゼのサブファミリーである、１６の既知のＥｐｈ受容体（１４は哺乳動物において見出される）および９つの既知のエフリンリガンド（８つは哺乳動物において見出される）からなるＥｐｈファミリーである。Ｅｐｈ受容体およびエフリンリガンド誘導システムが細胞を位置づけ、細胞形態を調節する能力は、発生におけるそれらの様々な役割を反映する。これらの膜固定リガンドおよび受容体は、（受容体保有細胞およびリガンド保有細胞への）双方向シグナル伝達に関与する。Ｅｐｈ受容体は、軸索経路探索および神経細胞移動の重要な制御因子であることが最初に示され（Drescher et al., Cell 82: 359, 1995; Henkemeyer et al., Cell 86: 35,1996）、血管内皮細胞（Wang et al., Cell93: 741, 1998; Adams et al., Genes Dev.13: 295, 1999; Gerety et al., Mol.Cell4: 403, 1999）および固有上皮（Orioli et al.,EMBO J. 15: 6035, 1996; Flanagan and Vanderhaeghen Annu.Rev.Neurosci.21: 309,1998; Frisen et al., EMBO J. 18: 5159, 1999; Cowan et al., Neuron 26: 417, 2000）の細胞間相互作用を含む、多様な数々の他の細胞間相互作用の調節において役割を有することが現在知られている。エフリンおよびエフリン受容体の双方向シグナル伝達は、軸索ガイダンス、血管新生および骨リモデリングに関与してきた。治療的には、特定のエフリン‐Ｅｐｈ受容体のシグナル伝達プロセスの拮抗に興味が持たれている。
【０１２４】
エフリンおよびＥｐｈ受容体は、それらの互いの親和性および配列保存に基づいて、２つのクラスＡおよびＢに分けられる。一般的に、９つの異なるＥｐｈＡ  ＲＴＫ（ＥｐｈＡ１−ＥｐｈＡ９）は、６つのＡエフリン（エフリンＡ１−エフリンＡ６）に乱交雑に結合し、それらにより活性化され、ＥｐｈＢサブクラス受容体（ＥｐｈＢ１−ＥｐｈＢ６、および場合によってはＥｐｈＡ４）は３つの異なるＢエフリン（エフリンＢ１‐エフリンＢ３）と相互作用する。最大限の治療効果を達成するために、したがって、すべてのエフリンリガンドの特定のＥｐｈ受容体との相互作用、または特定のエフリンのすべてのそのＥｐｈ受容体との相互作用を同時に阻害しなければならない。したがって、ここでも、効率的な治療のために、様々な異なる結合分子または複数の結合特異性を有する結合分子が必要とされる。
【０１２５】
Ｂ７スーパーファミリーの共刺激分子は、治療的介入のためのあり得る標的の別の例である。未処置の抗原反応性Ｔ細胞の効率的な刺激を得るために、ＭＨＣ分子に関連する抗原ペプチド（「シグナル１」）と同時に、ＡＰＣ上の共刺激分子（「シグナル２」）の存在が必要とされる。ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、誘導性共刺激因子（ＩＣＯＳ）、プログラム死１（ＰＤ−１）およびＯＸ４０を、Ｔ細胞を操作するための標的として使用し、自己免疫疾患の進行を遅らせ、またはＴ細胞活性化の増大を介して腫瘍を治療する。ＣＤ８０（以前はＢ７−１と呼ばれた）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）は、樹状細胞、マクロファージまたはＢ細胞などの活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）の膜上に発現される。共刺激分子の存在は、Ｔ細胞の表面上のカウンターレセプターにより感知される。Ｔ細胞上でのそのような共刺激分子のそれらの同種活性化受容体（ＣＤ２８）との相互作用の選択的遮断は、したがって、Ｔ細胞の活性化を阻害しうる（Howard et al., Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 4: 85, 2005;Stuart and Racke, Expert Opinion Ther. Targets 6: 275, 2002）。
【０１２６】
Ｔ細胞に向けられた活性化自己抗原は、それらのエフェクター機能により、関節リウマチまたは多発性硬化症などの自己免疫疾患における少なくとも一部の組織損傷、および間接的に、Ｂ細胞に「ヘルプ」を提供することにより高親和性の自己反応性抗体の産生に関与する。このように、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６のＣＤ２８との相互作用の遮断は、自己免疫状態において治療となり得る。これらの原理は、ＣＤ８０またはＣＤ８６に向けられた遮断モノクローナル抗体の使用または可溶型のカウンターレセプターの使用のいずれかにより、ヒト疾患の動物モデルならびにヒトのいずれにおいてもしっかりと確立されている（Stuart and Racke, 2002）。
【０１２７】
ＣＤ１５２（以前はＣＴＬＡ４として知られていた）は、ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方についてのＴ細胞上の別のカウンターレセプターである。しかし、ＣＤ２８とは異なり、ＣＤ１５２のＣＤ８０および／またはＣＤ８６との相互作用は、Ｔ細胞の活性化を引き起こさない。ＣＤ１５２は、ＣＤ２８よりも高い親和性でＣＤ８０およびＣＤ８６の両方と相互作用すると考えられ、それゆえに、ＣＤ２８のおとり受容体としての役割を果たし、そのリガンドの後者を奪い、したがって間接的にＴ細胞の活性化を減少させる（Collins et al., Immunity 17: 201, 2002）。また、ＣＤ１５２はＴ細胞にネガティブシグナルも伝達し、より低い全体的レベルのＴ細胞活性化を招く。機構と無関係に、ＣＤ１５２シグナル伝達の活性は、表面ＣＤ５１２発現が高まるＴ細胞刺激の、特に後期（４８−７２ｈ）後にＴ細胞反応の減弱を招く。ＣＤ８０および／またはＣＤ８６とのその相互作用を遮断するモノクローナル抗体の使用によるＣＤ１５２シグナル伝達の遮断によって、インビボでのＴ細胞活性化のレベルが増大し、これは、腫瘍ワクチン治療における補助処置として有益であることを実証している。ＣＴＬＡ４シグナル伝達の阻害は、Ｔ細胞活性化中にＣＤ２８遮断とは非常に異なる結果を招くため、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６のＣＴＬＡ４ではなくＣＤ２８との相互作用を阻害するＣＤ８０および／またはＣＤ８６中和治療物質をデザインすることは有益であり得るし、または逆もまた同様である。
【０１２８】
ＣＤ８０およびＣＤ８６は、Ｂ細胞由来の多くのリンパ腫上に高レベルに存在する。このように、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６に結合するモノクローナル抗体、そのフラグメントおよび他のタンパク質は、エフェクター機能の動員、細胞死の誘導により、または免疫毒素もしくは放射性毒素の抱合体中の標的物質として、そのような腫瘍の治療において有用であり得る（Friedberg et al., Blood10-6: 11 Abs 2435, 2005）。
【０１２９】
ＣＤ８０およびＣＤ８６のいずれもカウンターレセプターに結合するため、これらの分子は少なくとも部分的に重複する機能的役割（部分的な機能的重複性）を有すると考えられる。したがって、最大限の治療効果を達成するために、ＣＤ８０およびＣＤ８６のＣＤ２８またはＣＤ１５２との相互作用を同時に阻害する必要があるということになる。潜在的に、これは、可溶型のＣＤ１５２（アバタセプト、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、Linsley et al., J. Exp. Med. 174: 561, 1991を参照）、その親和性変異体（ベラタセプト、ＬＥＡ２９Ｙ、Larsen et al., Am.J. Transplant 5: 443, 2005を参照）またはＣＤ２８（Ｄ２８−Ｉｇ、Linsley et al., J. Exp. Med. 173: 721, 1991を参照）を使用して達成できる。ＣＤ８０およびＣＤ８６のいずれにも結合できる単一モノクローナル抗体は未だに一つも記載されていないが（国際公開第０４／０７６４８８号、van den Beucken et al., J. Mol. Biol. 310-591, 2001）、これは明らかに有益であり得る。
【０１３０】
さらなる好ましい実施態様では、本発明のアミノ酸配列、例えば一本鎖抗体、例えばｄＡｂまたはナノボディは、二価または多価のアミノ酸配列であり、ここで１つの結合ブロックは血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンに対して向けられており、および前記血清アルブミン結合ブロックは例えばｐＨ５．５では（または例えばｐＨ５〜６の間、または例えばｐＨ５．３〜５．７の間では）結合するが、しかし、ｐＨ７．２〜７．４では結合しない。
【０１３１】
本発明のアミノ酸配列について本明細書に記載する通り、前記第１の生物学的条件は、第１の生理学的なコンパートメントまたは体液において広く認められる生理学的条件を含み、前記第２の生物学的条件は、第２の生理学的なコンパートメントまたは体液において広く認められる生理学的条件を含み得るが、ここで該第１および第２の生理学的なコンパートメントは、正常な生理学的条件下において、細胞膜、細胞内小胞または細胞内コンパートメントの壁、または血管の壁などの少なくとも１つの生体膜により隔てられる。
【０１３２】
具体的には、前記第１の生物学的条件はヒトまたは動物の身体の少なくとも１つの細胞の外で広く認められる生理学的条件（前記ヒトまたは動物の身体の血流またはリンパ系において広く認められる生理学的条件など）を含み、前記第２の生物学的条件は前記細胞の中で広く認められる生理学的条件（または逆もまた同様であるが、これは半減期延長の目的とするためにはあまり好まれない）を含む。
【０１３３】
本実施態様の目的とするために、「動物またはヒトの身体の細胞の中において広く認められる生理学的条件」により、細胞の中、具体的には、血清タンパク質の再循環に関与する細胞の中で生じ得る条件（ｐＨ値など）を意味する。具体的には、「動物またはヒトの身体の細胞の中において広く認められる生理学的条件」により、エンドソーム、リソソームまたはピノソームなど、（例えば、ピノサイトーシス、エンドサイトーシス、エキソサイトーシスおよびファゴサイトーシスまたは細胞中への取り込みまたはインターナリゼーションの同様の機構の結果として）血清タンパク質の再循環に関与する細胞（内）コンパートメントまたは小胞の中で生じ得る条件（ｐＨ値など）を意味する。
【０１３４】
例えば、細胞は、具体的には本発明のアミノ酸配列がＦｃＲｎに結合する血清タンパク質に対して向けられる場合、ＦｃＲｎ受容体を含む、または、それを発現する細胞であり得る。本明細書でのさらなる記載から明らかになるように、そのような細胞は、血清アルブミンおよびＩｇＧなどの免疫グロブリンなど、ＦｃＲｎに結合できる特定の血清タンパク質の再循環に関与する。あるいは、例えば、限定はされないが、細胞は、具体的には本発明のアミノ酸配列がトランスフェリンに対して向けられる場合、トランスフェリン受容体を含む、または、それを発現する細胞であり得る。
【０１３５】
本実施態様の目的のために、「動物またはヒトの身体の細胞の外において広く認められる生理学的条件」により、前記細胞の細胞表面またはすぐ周辺または近傍など、前記細胞が存在するが、しかし、前記細胞の外であるヒトまたは動物の身体の中で生じ得る条件（ｐＨ値など）を一般的に意味する。具体的には、動物またはヒトの身体の細胞の外において広く認められる生理学的条件」により、血（流）またはリンパ系など、前記細胞が存在するヒトまたは動物の身体の循環において生じ得る条件（ｐＨ値など）を意味する。
【０１３６】
このように、一般的に、本実施態様では、血清タンパク質はヒトまたは動物の身体の少なくとも１つの細胞により（例えば、インターナリゼーション、ピノサイトーシス、エンドサイトーシス、トランスサイトーシス、エキソサイトーシスファゴサイトーシスまたは前記細胞中への取り込みまたはインターナリゼーションの同様の機構により）取り込まれることができ、ここで前記第１の生物学的条件は、アミノ酸配列が細胞中に取り込まれる前に存在する生理学的条件を含み得るし、および第２の生物学的条件は、アミノ酸配列が細胞中に取り込まれた後に存在する生理学的条件を含み得る。具体的には、本発明のアミノ酸配列が、再循環にさらされる血清タンパク質に対して向けられる場合、ここで第１の生物学的条件は、所望の化合物の再循環に関与する動物またはヒトの身体の少なくとも１つの細胞に関する細胞外条件（例えば、循環において広く認められる条件）を含み、および第２の生物学的条件は、所望の化合物の再循環に関与する動物またはヒトの身体の少なくとも１つの細胞の中で広く認められる条件を含む。
【０１３７】
本実施態様の別の非限定的な態様によると、第１の生物学的条件は７．０を超える生理学的ｐＨであり得る、および第２の生物学的条件は７．０未満の生理学的ｐＨであり得る。具体的には、第１の生物学的条件は７．１を超える生理学的ｐＨであり得る、および第２の生物学的条件は６．７未満の生理学的ｐＨであり得る。具体的には、第１の生物学的条件は７．２を超える生理学的ｐＨであり得る、および第２の生物学的条件は６．５未満の生理学的ｐＨであり得る。具体的には、第１の生物学的条件は７．２を超える生理学的ｐＨであり得る、および第２の生物学的条件は６．０未満の生理学的ｐＨであり得る。具体的には、第１の生物学的条件は７．２を超える生理学的ｐＨであり得る、および第２の生物学的条件は５．７未満の生理学的ｐＨであり得る。例えば、第１の生物学的条件は７．２〜７．４の範囲の生理学的ｐＨであり得る、および第２の生物学的条件は６．０〜６．５の範囲の生理学的ｐＨであり得る。例えば、第１の生物学的条件は７．２〜７．４の範囲の生理学的ｐＨであり得る、および第２の生物学的条件は５．０〜６．０の範囲の生理学的ｐＨであり得る。例えば、第１の生物学的条件は７．２〜７．４の範囲の生理学的ｐＨであり得る、および、第２の生物学的条件は５．３〜５．７の範囲の生理学的ｐＨであり得る。
【０１３８】
別の実施態様では、血清タンパク質に対して向けられるアミノ酸配列は、（さらに）本発明のアミノ酸配列について本明細書に一般的に記載される通りであり得る。例えば、それらは、免疫グロブリンフォールドを有するペプチドおよびタンパク質；限定はされないが、プロテインＡドメイン、テンダミスタット、フィブロネクチン、リポカイン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、デザインアンキリンリピートおよびＰＤＺドメインを含む、免疫グロブリン以外の他のタンパク質骨格に基づく分子、ならびに限定はされないが、ＤＮＡまたはＲＮＡのアプタマーを含むＤＮＡまたはＲＮＡに基づく結合成分からなる群；またはそのようなタンパク質もしくはポリペプチドの適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体または誘導体から；ならびに具体的には抗体および抗体フラグメント、抗体または抗体フラグメントに由来する結合ユニットおよび結合分子、ならびに抗体フラグメント、結合ユニットまたは結合分子からなる群から；または前記のいずれかの適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体、誘導体から選択できる。
【０１３９】
また、好ましくは、それらは、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、ドメイン抗体およびドメイン抗体としての使用に適切なタンパク質およびペプチド、単一ドメイン抗体および単一ドメイン抗体としての使用に適切なタンパク質およびペプチド、ナノボディ(登録商標)およびｄＡｂｓ(商標)からなる群；または前記のいずれかの適切な部分、フラグメント、アナログ、ホモログ、オルソログ、変異体または誘導体より選ばれる。
【０１４０】
具体的には、本実施態様では、本発明のアミノ酸配列（ならびに、本明細書に定義する、これを含む化合物）は、アミノ酸配列が霊長類において前記血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合する、またはそうでなければ会合する場合、それは、前記霊長類における血清アルブミンなどの血清タンパク質の自然半減期の少なくとも約５０%（約５０%〜７０%など）、好ましくは少なくとも６０%（約６０%〜８０%など）または好ましくは少なくとも７０%（約７０%〜９０%など）、より好ましくは少なくとも約８０%（約８０%〜９０%など）または好ましくは少なくとも約９０%の血清半減期を呈するように、血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合する、またはそうでなければ会合しうる。例えば、本実施態様では、本発明のアミノ酸配列は、アミノ酸配列が血清アルブミンなどのヒト血清タンパク質に結合する、またはそうでなければ会合する場合、アミノ酸配列は、前記血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）の自然半減期の少なくとも約５０%（約５０%〜７０%など）、好ましくは少なくとも６０%（約６０%〜８０%など）または好ましくは少なくとも７０%（約７０%〜９０%など）、より好ましくは少なくとも約８０%（約８０%〜９０%など）または好ましくは少なくとも約９０%の血清半減期を呈するように、血清アルブミンなどの血清タンパク質に結合する、またはそうでなければ会合しうる。また、好ましくは、本実施態様では、本発明のアミノ酸配列は、本明細書に定義する解離定数（ＫＤ）および／または結合親和性（ＫＡ）で前記血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）に結合する。ヒトにおいて、血清アルブミンの半減期は約１９日である（Peters T (1996） All AboutAlbumin. Academic Press, San Diego）。
【０１４１】
霊長類におけるこのインビボの半減期によって、本発明のアミノ酸配列は、それに付着した治療薬の血清半減期を延長するための理想的な候補となる。本発明のアミノ酸配列および治療薬の併用での長い血清半減期は、次に投与回数の減少および／または投与量の減少を可能にし、処置される被験体に対して大きな利益をもたらす。
【０１４２】
本実施態様は、したがって、そのようなアミノ酸配列を含む本発明の化合物、および前記化合物中に存在するアミノ酸配列のヒトにおける半減期の少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、例えば９５%以上、またはその半減期に本質的に同じヒトにおける半減期を有する本発明の化合物も含む。
【０１４３】
本実施態様の特定の一態様では、本発明のアミノ酸配列は、それらが少なくともさらに１種の霊長類からの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）、および具体的にはマカク属（具体的には、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）および／またはアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔｏ）など）およびヒヒ（チャクマヒヒ）からのサルからなる群から選ばれる少なくとも１種の霊長類からの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質と交差反応を起こし得る。好ましくは、そのような交差反応を起こし得るアミノ酸配列は、さらに、霊長類における対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）の自然半減期の少なくとも約５０%（約５０%から７０%など）、好ましくは少なくとも６０%（約６０%から８０%など）または好ましくは少なくとも７０%（約７０%から９０%など）、より好ましくは少なくとも約８０%（約８０%から９０%など）または好ましくは少なくとも約９０%の血清半減期を前記霊長類において呈する。本発明のそのようなアミノ酸配列は、好ましくは、本明細書に定義する解離定数（ＫＤ）および／または結合親和性（ＫＡ）で霊長類からの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）にも結合する。
【０１４４】
本実施態様は、したがって、本発明の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む本発明の化合物、および、前記化合物中に存在する本発明のアミノ酸配列のヒトおよび／または少なくとも霊長類の1種類における半減期のそれぞれ少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、例えば９５%以上である、またはその半減期と本質的に同じ、ヒトおよび／または前記霊長類種における半減期を有する本発明の化合物も含む。
【０１４５】
本発明の本実施態様の別の好ましいが、非限定的な態様によると、本発明のアミノ酸配列は、アミノ酸配列が前記血清タンパク質に結合する、あるいはそうでなければ会合する場合、アミノ酸配列が少なくとも約９日（約９日〜１４日など）、好ましくは少なくとも約１０日（約１０日〜１５日など）または少なくとも１１日（約１１日〜１６日など）、より好ましくは少なくとも約１２日（約１２日〜１８日以上など）または１４日を超える（約１４日〜１９日など）ヒトにおける血清半減期を呈するように、ヒト血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）に結合する、あるいはそうでなければ会合する。本発明のそのようなアミノ酸配列は、好ましくは、本明細書に定義する解離定数（ＫＤ）および／または結合親和性（ＫＡ）で前記ヒト血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合できる。
【０１４６】
本実施態様は、したがって、そのようなアミノ酸配列を含む本発明の化合物、および、該化合物において存在するアミノ酸配列のヒトにおける半減期の少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、例えば９５%以上である、またはその半減期と本質的に同じ、ヒトにおける半減期を有する本発明の化合物も含む。
【０１４７】
本実施態様の特定の、非限定的な一態様において、本発明のアミノ酸配列は、それらが、少なくともさらに１つの霊長類種からの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）、および具体的には、マカク属（アカゲザルまたはカニクイザルなど）およびヒヒからのサルからなる群から選ばれる少なくとも１つの霊長類種からの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）と交差反応を起こし得る。好ましくは、そのような交差反応を起こし得るアミノ酸配列は、霊長類における対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）の自然半減期の少なくとも約５０%（約５０%〜７０%など）、好ましくは少なくとも６０%（約６０%〜８０%など）または好ましくは少なくとも７０%（約７０%〜９０%など）、より好ましくは少なくとも約８０%（約８０%〜９０%など）または好ましくは少なくとも約９０%の血清半減期を前記霊長類において呈する。本発明のそのようなアミノ酸配列は、好ましくは、本明細書に定義する解離定数（ＫＤ）および／または結合親和性（ＫＡ）で前記霊長類からの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）にも結合する。
【０１４８】
本実施態様は、したがって、そのようなアミノ酸配列を含む本発明の化合物、および、前記化合物中に存在するアミノ酸配列の、ヒトおよび／または前記少なくとも１つの霊長類種における半減期のそれぞれ少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、例えば９５%以上である、またはその半減期と本質的に同じ、ヒトおよび／または前記霊長類種における半減期を有する本発明の化合物も含む。
【０１４９】
本実施態様の特定の、非限定的な別の態様によると、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１つの霊長類種からの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合する、そうでなければ会合し、および、霊長類における対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質の半減期が少なくとも約１０日、例えば１０日と１５日の間、例えば約１１日〜１３日（例として、アカゲザルにおいて、血清アルブミンの期待半減期が約１１日と１３日の間、具体的には約１１〜１２日である）の場合、霊長類において少なくとも約５日（約５日〜９日など）、好ましくは少なくとも約６日（約６日〜１０日など）または少なくとも７日（約７日〜１１日など）、より好ましくは少なくとも約８日（約８日〜１２日）または９日超（約９日〜１２日以上など）の血清半減期を有する。本発明のそのようなアミノ酸配列は、好ましくは、さらに、本明細書に定義する解離定数（ＫＤ）および／または結合親和性（ＫＡ）で前記霊長類種からの血清タンパク質に結合する。本実施態様の特定の好ましい一態様では、そのようなアミノ酸列はヒト血清アルブミンと交差反応を起こし得るし、より好ましくは本明細書に定義する解離定数（ＫＤ）および／または結合親和性（ＫＡ）で対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合する。
【０１５０】
本実施態様は、そのようなアミノ酸配列を含む本発明の化合物、および、前記化合物中に存在するアミノ酸配列の前記霊長類種における半減期の少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、例えば９５%以上である、またはその半減期と本質的に同じ、前記少なくとも１つの霊長類種における半減期を有する本発明の化合物も含む。
【０１５１】
本実施態様の特定の、非限定的な別の態様では、本発明のアミノ酸配列は、さらに、少なくとも１種の霊長類からの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合する、あるいはそうでなければ会合し、および霊長類における対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）の半減期が少なくとも約１３日、例えば１３日と１８日の間（例として、ヒヒにおいて、血清アルブミンの半減期が少なくとも約１３日、通常は約１６〜１８日である）の場合、霊長類において少なくとも約７日（約７日〜１３日など）、好ましくは少なくとも約８日（約８〜１５日など）または少なくとも９日（約９日〜１６日など）、より好ましくは少なくとも約１０日（約１０日〜１６日以上）または１３日を超える（約１３日〜１８日など）血清半減期を有するものであり得る。本発明のそのようなアミノ酸配列は、好ましくは、さらに、本明細書に定義する解離定数（ＫＤ）および／または結合親和性（ＫＡ）で前記霊長類種からの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合するものである。
【０１５２】
本実施態様は、そのようなアミノ酸配列を含む本発明の化合物、および前記化合物中に存在するアミノ酸配列の前記霊長類種の半減期の少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、例えば９５%以上またはその半減期と本質的に同じである前記少なくとも１つの霊長類種の半減期を有する本発明の化合物も含む。
【０１５３】
本実施態様の特定の、非限定的な別の態様では、本発明のアミノ酸配列はさらに：
ａ）アミノ酸配列が血清タンパク質に結合する、あるいはそうでなければ会合する場合、アミノ酸配列が少なくとも約９日（約９日〜１４日など）、好ましくは少なくとも約１０日（約１０日〜１５日など）または少なくとも１１日（約１１日〜１６日など）、より好ましくは少なくとも約１２日（約１２日〜１８日以上など）または１４日を超える（約１４日〜１９日など）ヒトにおける血清半減期を呈するように、ヒト血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合する、あるいはそうでなければ会合し；および
ｂ）マカク属の種から選択される少なくとも１種の霊長類からの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）（具体的には、カニクイザルおよび／またはアカゲザルからの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質）と交差反応を起こし得るし；および
ｃ）前記霊長類において少なくとも約５日（約５日〜９日など）、好ましくは少なくとも約６日（約６日〜１０日など）または少なくとも７日（約７日〜１１日など）、より好ましくは少なくとも約８日（約８日〜１２日）または９日を超える（約９日〜１２日以上など）血清半減期を有しうる。
【０１５４】
好ましくは、そのようなアミノ酸配列は、本明細書に定義する解離定数（ＫＤ）および／または結合親和性（ＫＡ）でヒトのタンパク質（ヒト血清アルブミンなど）および／または前記霊長類種からの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合する。
【０１５５】
本実施態様は、そのようなアミノ酸配列を含む本発明の化合物、および前記化合物中に存在するアミノ酸配列のヒトおよび／または前記霊長類種における半減期のそれぞれ少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、例えば９５%以上または本質的に同じである、ヒトおよび／または前記少なくとも１つの霊長類種における半減期を有する本発明の化合物も含む。
【０１５６】
本実施態様の特定の、非限定的な別の態様では、本発明のアミノ酸配列はさらに：
ａ）アミノ酸配列がヒト血清タンパク質に結合する、あるいはそうでなければ会合する場合、アミノ酸配列が少なくとも約９日（約９日〜１４日など）、好ましくは少なくとも約１０日（約１０日〜１５日など）または少なくとも１１日（約１１日〜１６日など）、より好ましくは少なくとも約１２日（約１２日〜１８日以上など）または１４日を超える（約１４日〜１９日など）ヒトにおける血清半減期を呈するように、ヒト血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合する、あるいはそうでなければ会合し；および
ｂ）ヒヒからの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）と交差反応を起こ得るし；および
ｃ）ヒヒにおいて少なくとも約７日（約７日〜１３日など）、好ましくは少なくとも約８日（約８日〜１５日など）または少なくとも９日（約９日〜１６日など）、より好ましくは少なくとも約１０日（約１０日〜１６日）または１３日を超える（約１３日〜１８日など）血清半減期を有する。
【０１５７】
好ましくは、そのようなアミノ酸配列は、本明細書に定義する解離定数（ＫＤ）および／または結合親和性（ＫＡ）でヒト血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）および／またはヒヒからの対応する（つまり、オルソロガスな）血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合する。
【０１５８】
本実施態様は、そのようなアミノ酸配列を含む本発明の化合物、および前記化合物中に存在するアミノ酸配列のヒトおよび／または前記霊長類種における半減期のそれぞれ少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、例えば９５%以上または本質的に同じである、ヒトおよび／または前記少なくとも１つの霊長類種における半減期を有する本発明の化合物も含む。
【０１５９】
好ましくは、また、本実施態様の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む化合物、コンストラクト、融合タンパク質などの半減期は、好ましくは、その中での（つまり、同じ霊長類での）アミノ酸配列の半減期の少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、例えば９５%以上またはその半減期に本質的に同じである。
【０１６０】
本発明の本実施態様の特定の、非限定的な一態様では、本発明のアミノ酸配列（または、それを含む化合物）は、（例えば、血清タンパク質の再循環の一部として）ＦｃＲｎ受容体に結合する、またはそれに結合できる血清タンパク質に対して向けられ、それらは、アミノ酸配列またはポリペプチドコンストラクトが血清タンパク質分子に結合する、あるいはそうでなければ会合する場合、血清タンパク質分子のＦｃＲｎに対する結合が（有意に）低下または阻害されないように、血清タンパク質に結合する、あるいはそうでなければ会合する。ＦｃＲｎに結合できるいくつかの特定の、非限定的な血清タンパク質には、血清アルブミンおよび特別なＩｇＧなどの免疫グロブリンが含まれる。
【０１６１】
本実施態様のさらなる態様では、本発明のアミノ酸配列（または、それを含む化合物）は、アミノ酸配列またはポリペプチドコンストラクトが血清タンパク質分子に結合する、あるいはそうでなければ会合する場合、血清タンパク質分子の半減期が（有意に）減少しないように、血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合する、あるいはそうでなければ会合する。
【０１６２】
本実施態様のさらなる態様では、本発明のアミノ酸配列（または、それを含む化合物）は、前記血清タンパク質のＦｃＲｎに対する結合に関与しない血清タンパク質上のアミノ酸残基に結合できる。例えば、血清タンパク質が血清アルブミンである場合、本発明のアミノ酸配列（または、それを含む化合物）は、血清アルブミンのドメインＩＩＩの一部を形成しないアミノ酸残基に結合できる。
【０１６３】
本発明の本実施態様の一態様では、アミノ酸配列は免疫グロブリン配列またはそのフラグメント、より具体的には免疫グロブリン可変ドメインまたはそのフラグメント、例えばＶＨ−、ＶＬ−、ＶＨＨ−配列またはそのフラグメントである。本発明のアミノ酸配列は、ドメイン抗体、「ｄＡｂ」、単一ドメイン抗体またはナノボディ、またはこれらの任意の１つのフラグメントであり得る。本発明のアミノ酸配列は、完全なヒト、ヒト化、ラクダ、ラクダ化ヒトまたはヒト化ラクダの配列であり、より具体的には、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含み得る。
【０１６４】
より具体的には、本発明によるアミノ酸配列は、（単一）ドメイン抗体またはナノボディであり得る。
【０１６５】
本実施態様で使用するために血清タンパク質に対して向けられるアミノ酸配列を生成するための方法が、本明細書に一般的に記述されうるが、所望の化合物は所望の血清タンパク質（血清アルブミンなど）である。
【０１６６】
本実施態様のさらなる態様は、本実施態様による少なくとも１つのアミノ酸配列を含む本発明の化合物に関するもので、化合物は、場合により、小分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはペプチドから成る群の少なくとも１つから選択される治療成分を含む少なくとも１つの治療成分をさらに含み得る。本発明のそのような化合物は、好ましくは、霊長類における血清タンパク質（血清アルブミンなど）の自然半減期の５０%未満（約５０%〜７０%）、好ましくは少なくとも６０%（約６０%〜８０%）または好ましくは少なくとも７０%（約７０%〜９０%）、より好ましくは少なくとも８０%（約８０%〜９０%）または好ましくは少なくとも９０%に対応する頻度で、または、代わりに、少なくとも４日（約４〜１２日以上）、好ましくは少なくとも７日（約７〜１５日以上）、より好ましくは少なくとも９日（約９〜１７日以上）、例えば少なくとも１５日（具体的にはヒトへの投与において約１５〜１９日以上）または少なくとも１７日（具体的にはヒトへの投与において約１７〜１９日以上）霊長類への投与に適し；そのような投与は、具体的には、化合物で処置される被験体の血清中の所望の化合物レベル（当業者に明らかなように、とりわけ、使用する化合物および／または処置される病気に依存する）を維持するためになされる。臨床医または医師は、本発明の化合物が本明細書に記載する頻度で投与される場合、所望の血清レベルを選択し、前記被験体において所望の血清レベルを達成および／または維持するために、処置される被験体に投与される用量および／または量を選択できる。例えば、そのような用量は、所望の血清レベルの１倍と１０倍の間、例えば所望の血清レベルの２倍と４倍の間の範囲であり得る（ここで、所望の血清レベルは、投与される対応する用量を提供するように、それ自体公知の方法で再計算される）。
【０１６７】
本発明のそのような化合物は、上記の頻度での投与を目的とする、および／またはそのために包装される（例えば、適切な使用説明書とともに）単位用量として製剤化してもよく、そのような単位用量およびパッケージ製品は本発明のさらなる態様を形成する。本発明の別の態様は、そのような単位用量または包装製品を提供する際の（つまり、化合物を製剤化および／または包装することによる）本発明の化合物の使用に関する。
【０１６８】
本実施態様の特定の態様では、本発明の化合物は、融合タンパク質またはコンストラクトである。融合タンパク質またはコンストラクトにおいて、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１つの治療成分に直接的に連結し得る、またはリンカーもしくはスペーサーを介して少なくとも１つの治療成分に連結している。特定の実施態様は、免疫グロブリン配列またはそのフラグメント、より具体的には（単一）ドメイン抗体またはナノボディを含む治療成分に関する。
【０１６９】
具体的な態様では、本実施態様は、ナノボディである本発明の少なくとも１つのアミノ酸配列および少なくとも１つのさらなるナノボディを含む、多価および多特異的なナノボディにも関する。ナノボディは、少なくとも１つのさらなるナノボディに直接的に連結している、またはリンカーもしくはスペーサーを介して少なくとも１つのさらなるナノボディに連結しており、好ましくはアミノ酸配列のリンカーもしくはスペーサーを介して少なくとも１つのさらなるナノボディに連結している。
【０１７０】
また、本明細書に示すとおり、限定はされないが、少なくとも１つの血清タンパク質および少なくとも１つ（他の）目的とする、または所望の分子にコンディショナルに結合する二特異的（または多特異的）化合物は、本発明の本実施態様における特別な使用を見出しうる。そのようなものとして、本実施態様の化合物は、第１の生物学的条件下で（あるいは、第２の生物学的条件下で）血清タンパク質および目的とする、または所望の分子の両方に結合する、または、第１の生物学的条件下で血清タンパク質に結合するが、しかし、第２の生物学的条下で他の目的とする、または所望の分子に結合しうる。このように、第１の生物学的条件を第２の生物学的条件に変更する場合、本実施態様のそのような化合物は、したがって、第１の血清タンパク質分子から放出され、目的とする、または所望の分子に結合するであろう（逆もまた同様である）。
【０１７１】
また、そのような二特異的分子において、目的とする、または所望の分子に結合するコンディショナル結合剤は、それ自体が治療成分として形成し、または機能し（この場合において、それは本明細書にさらに記載する通りであり得る）および／または、本発明のそのような化合物は、１つ以上のさらなる治療成分（本明細書に定義する）を含み得る。
【０１７２】
本実施態様のそのような二特異的化合物の非限定的な例は、図１にも例示されており、これはＦｃＲｎ、ＦｃＲｎに結合する血清タンパク質（血清アルブミンまたはＩｇＧなど）、本発明の二特異的化合物（具体的には、本明細書に記載する半減期を延長するための特定の実施態様による二特異的化合物）および抗原（つまり、第２の目的とする、または所望の分子）の間の起こり得る相互作用の例を示す非限定的な略図である。また、表１〜３は、本発明の二特異的化合物（具体的には、本明細書に記載する半減期を延長するための特定の実施態様による二特異的化合物）が血清タンパク質（つまり、第１の目的とする、または所望の分子）および（第２の目的とする、または所望の分子としての）抗原に結合できる方法の異なる非限定的の例を概説している。本明細書での詳細な説明をさらに参照する。
【０１７３】
さらに、本実施態様は、本実施態様による化合物のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列もしくは核酸、または本実施態様による化合物のアミノ酸配列、または本実施態様の多価および多特異的なナノボディに関する。本実施態様は、本実施態様のヌクレオチド配列または核酸を含み、および／または本実施態様のアミノ酸配列、または本実施態様による化合物のアミノ酸配列、または本実施態様の多価および多特異的なナノボディを発現する（または発現できる）宿主もしくは宿主細胞も提供する。
【０１７４】
さらに、本実施態様は、宿主細胞が産物を産生または発現するような条件下での本実施態様の宿主細胞の培養または維持する工程を含む、本実施態様のアミノ酸配列、化合物、または多価および多特異的なナノボディを調製するための方法に関するもので、任意にそのようにして産生された前記産物をさらに含む。
【０１７５】
一実施態様において、本実施態様は、本実施態様のアミノ酸配列、化合物、または多価および多特異的なナノボディから成る群から選択される１つ以上を含む医薬組成物に関するもので、前記医薬組成物は、前記霊長類における血清タンパク質の自然半減期の少なくとも約５０%の間隔での前記霊長類への投与に適する。医薬組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。
【０１７６】
この実施態様は、本実施態様のアミノ酸配列、化合物または多価および多特異的なナノボディを包含する医学的な使用および処置の方法も包含し、前記医学的な使用または方法は、前記医薬品が前記霊長類における血清タンパク質の自然半減期の少なくとも約５０%の間隔での投与に適し、方法が前記霊長類における血清タンパク質の自然半減期の少なくとも約５０%の頻度での投与を含むことを特徴とする。
【０１７７】
本実施態様は、治療薬の血清半減期を延長または増加させるための方法にも関する。方法は、治療薬を本実施態様の前記のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクト（多価および多特異的なナノボディを含む）のいずれかと接触させることを含み、治療薬はこの実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトに結合する、あるいはそうでなければ会合する。いくつかの実施態様では、治療薬は、生物学的治療薬、好ましくはペプチドまたはポリペプチドであり、この場合において、治療薬を接触させる工程は、ペプチドまたはポリペプチドを本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトに連結することによる融合タンパク質の調製を含むことができる。
【０１７８】
これらの方法は、治療薬が本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトに結合した、あるいはそうでなければ会合した後に、霊長類に治療薬を投与することをさらに含むことができる。そのような方法において、霊長類における治療薬の血清半減期は、治療薬それ自体の半減期の少なくとも１．５倍、または治療薬それ自体の半減期と比較して少なくとも１時間増大する。いくつかの好ましい実施態様では、霊長類における治療薬の血清半減期は、対応する治療薬成分それ自体の半減期よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍または２０倍超である。他の好ましい実施態様では、霊長類における治療薬の血清半減期は、対応する治療用成分それ自体の半減期と比較して２時間を超えて、６時間を超えて、または１２時間を超えて増大する。
【０１７９】
好ましくは、霊長類における治療薬の血清半減期は増大され、治療薬が本実施態様の化合物について本明細書に定義する（つまり、ヒトにおいて、および／または、少なくとも１種の霊長類における）半減期を有する。
【０１８０】
別の態様では、本実施態様は、所望の治療レベルを達成するための治療薬の適切な投与時に、前記治療薬の前記所望の治療レベルが長期間持続されるように、治療薬を改変するための方法に関する。
【０１８１】
方法は、治療薬を、前記の本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクト（多価および多特異的なナノボディを含む）のいずれかと接触させることを含み、治療薬は本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトに結合する、あるいはそうでなければ会合する。いくつかの実施態様では、治療薬は、生物学的治療薬、好ましくはペプチドまたはポリペプチドであり、この場合において、治療薬を接触させる工程は、ペプチドまたはポリペプチドを本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトに連結することによる融合タンパク質の調製を含むことができる。
【０１８２】
これらの方法は、そのような投与時に所望の治療レベルが達成できるように、治療薬を本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトに結合する、あるいはそうでなければ会合した後に霊長類に治療薬を投与することをさらに含むことができる。そのような方法において、治療薬の所望の治療レベルがそのような投与時に維持される時間は、治療薬それ自体の半減期の少なくとも１．５倍である、または治療薬それ自体の半減期と比較して少なくとも１時間増大される。好ましいいくつかの実施態様では、前記治療薬の所望の治療レベルがそのような投与時に維持される時間は、対応する治療成分それ自体の半減期よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍または２０倍を超える。他の好ましい実施態様では、前記治療薬の所望の治療レベルがそのような投与時に維持される時間は、対応する治療成分それ自体の半減期と比較し、２時間を超えて、６時間を超えて、または１２時間を超えて増大される。
【０１８３】
好ましくは、前記治療薬の所望の治療レベルがそのような投与時に維持される時間が増大され、治療薬は本実施態様の化合物について本明細書に定義する頻度で投与できる。
【０１８４】
別の態様では、本実施態様は、患者の血清において前記化合物またはコンストラクト中の治療剤のレベルを増大および／または延長する医薬品の産生のためのこの実施態様の化合物（本明細書に定義する）の使用に関するもので、前記化合物またはコンストラクト中の前記治療剤は治療剤単独と比較してより低用量で（つまり、本質的に同じ投与頻度で）投与できる。
【０１８５】
本実施態様のアミノ酸配列は、また好ましくは、アミノ酸配列またはポリペプチドコンストラクトが霊長類において血清タンパク質分子に結合する、あるいはそうでなければ会合する場合、それらは前記霊長類における血清タンパク質の自然半減期の少なくとも約５０%、好ましくは少なくとも約６０%、好ましくは少なくとも約７０%、より好ましくは少なくとも約８０%および最も好ましくは少なくとも約９０%の血清半減期を呈するように、血清タンパク質（アルブミンなど）に結合する、あるいはそうでなければ会合する。
【０１８６】
霊長類への投与後の本実施態様のアミノ酸配列の血清半減期は、前記霊長類における血清タンパク質の自然半減期の少なくとも５０%、５５%、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、または少なくとも１００%であり得る。
【０１８７】
「前記霊長類における血清タンパク質の自然血清半減期」により、以下で定義する、血清タンパク質が生理的条件下の健康な個人において有する血清半減期を意味する。血清アルブミンを血清タンパク質の例として取ると、ヒトにおける血清アルブミンの自然半減期は１９日である。より小さな霊長類は、血清アルブミンのより短い自然半減期、例えば、８から１９日の範囲を有することが知られている。血清アルブミンの特定の半減期は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９日以上であり得る。
【０１８８】
このことから、例えばヒトの個人において、本実施態様のアミノ酸配列は、１９日の少なくとも約５０%、つまり７．６日の血清アルブミンに関連する血清半減期を示す。より小さな霊長類において、血清半減期は、これらの種における血清アルブミンの自然半減期に依存して日数が短くなりうる。
【０１８９】
この記載において、「霊長類」という用語は、サルおよび類人猿のいずれの種も指し、マカク属からのサル（具体的には、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）および／またはアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔｏ）など）およびヒヒ（チャクマヒヒ）、ならびにマーモセット（カリスリクス属からの種）、リスザル（サイミリ属からの種）およびタマリン（サグイヌス属からの種）などのサルの種、ならびにチンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）などの類人猿の種が含まれ、またヒトも含まれる。ヒトは、本実施態様による好ましい霊長類である。
【０１９０】
アミノ酸配列または化合物の半減期は、一般的に、例えば、自然の機構による配列または化合物の分解および／または配列または化合物のクリアランスまたは隔離に起因してインビボでポリペプチドの血清濃度が５０%低下するために必要な時間と定義できる。関連する霊長類の種における本実施態様のアミノ酸配列の（およびそれを含む化合物の）半減期は、薬物動態解析などによる、それ自体公知の方法により測定できる。適切な技術は当業者に明らかであり、例えば、一般的に以下の工程を含む：処置されるアミノ酸配列または化合物の適切な量を霊長類へ適切に投与する工程；規則的間隔で前記霊長類からの血液サンプルまたは他のサンプルを採取する工程；前記血液サンプル中で、本実施態様のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を測定する工程；および、このようにして得られたデータ（のプロット）から、本実施態様のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が、投与時の最初のレベルと比較し、５０%まで減少するまでの時間を計算する工程。例えば、標準的なハンドブック、Kenneth, A et al.: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbookfor Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinete analysis: A PracticalApproach (1996)などを参照する。“Pharmacokinetics”,M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)も参照する。
【０１９１】
国際公開第０４／００３０１９号の６および７ページおよび本明細書に引用するさらなる参考文献に記載しているように、半減期はｔ１／２アルファ、ｔ１／２ベータおよび濃度曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメーターを使用して表現できる。本明細書に、「半減期の増大」は、これらのパラメーターのいずれか１つ、例えば、これらのパラメーターのいずれか２つ、または本質的にこれらのパラメーターの３つすべてにおける増大を指す。具体的には「半減期の増大」は、ｔ１／２アルファおよび／またはＡＵＣあるいは両方における増大の有無にかかわらず、ｔ１／２ベータにおける増大を指す。
【０１９２】
別の態様では、血清タンパク質（血清アルブミン、好ましくはヒト血清アルブミンなど）に対して向けられる、本実施態様のアミノ酸配列、および具体的には本実施態様の免疫グロブリン配列、およびさらに具体的には本実施態様の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、それらがアカゲザルにおいて少なくとも約４日、好ましくは少なくとも約７日、より好ましくは少なくとも約９日の半減期を有する。
【０１９３】
さらに別の態様では、本実施態様のアミノ酸配列は、ヒトにおいて少なくとも約７日、好ましくは少なくとも約１５日、より好ましくは少なくとも約１７日の半減期を有する。本実施態様は、ヒトにおいて、化合物中に存在する本実施態様のアミノ酸配列の半減期の少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、例えば９５%以上または本質的に同じである半減期を有する本実施態様の化合物にも関する。さらに具体的には、本実施態様は、ヒトにおいて少なくとも約７日、好ましくは少なくとも約１５日、より好ましくは少なくとも約１７日の半減期を有する本実施態様の化合物にも関する。
【０１９４】
本実施態様は、本実施態様のアミノ酸配列を含む化合物、具体的には、本実施態様のアミノ酸配列に加えて少なくとも１つの治療成分を含む化合物も提供する。本実施態様による化合物は、霊長類において本実施態様のアミノ酸配列と同等の血清半減期、より好ましくは本実施態様のアミノ酸配列の少なくとも血清半減期である半減期、より好ましくは霊長類における本実施態様のアミノ酸配列の半減期よりも高い半減期を呈することにより特徴付けられる。
【０１９５】
一態様では、本実施態様は、ＦｃＲｎに結合できる血清タンパク質に結合できる、本明細書に開示されるアミノ酸配列を提供することにより本目的を達成し、アミノ酸配列はさらに、アミノ酸配列またはポリペプチドコンストラクトが血清タンパク質に結合する、あるいはそうでなければ会合する場合、血清タンパク質分子のＦｃＲｎへの結合は（つまり、アミノ酸配列またはポリペプチドコンストラクトがそれに結合していない場合での血清タンパク質分子のＦｃＲｎへの結合と比較して）（有意に）低下または阻害されないように、血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合する、あるいはそうでなければ会合する。本実施態様の本態様では、「有意に低下または阻害されない」により、血清タンパク質のＦｃＲｎに対する結合親和性（ＳＲＰなどの適切なアッセイを使用して測定される）が５０%を超えて低下せず、好ましくは３０%を超えて低下せず、さらに好ましくは１０%を超えて低下せず、例えば５%を超えて低下せず、または本質的にまったく低下しないことを意味する。本実施態様の本態様では、「有意に低下または阻害しない」は、血清タンパク質分子の半減期が有意に低下しない（以下に定義する）ことも意味する（または追加で意味する）。
【０１９６】
本記載において、結合を参照する場合、当業者が通常理解するように、そのような結合は特異的結合である。
【０１９７】
本明細書に記載するアミノ酸配列は一価免疫グロブリン配列（例えば、一価ナノボディ）である場合、一価免疫グロブリン配列は、好ましくは、第１の生物学的条件下で、１０−５〜１０−１２moles/liter以下、好ましくは１０−７〜１０−１２moles/liter以下およびより好ましくは１０−８〜１０−１２moles/literの解離定数（ＫＤ）で（つまり１０５〜１０１２liter/moles以上、好ましくは１０７〜１０１２liter/moles以上およびより好ましくは１０８〜１０１２liter/molesの会合定数（ＫＡ）で）、および／または少なくとも１０７M-1、好ましくは少なくとも１０８M-1、より好ましくは少なくとも１０９M-1、例えば少なくとも１０１２M-1の結合親和性（ＫＡ）で血清アルブミンに結合する１０−４mol/literより高い任意のＫＤ値（または１０４M-1 liters/molより低い任意のKＡ値）は、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。好ましくは、本実施態様の一価免疫グロブリン配列は、第１の生物学的条件下で、３０００nM未満、好ましくは３００nM未満、より好ましくは３０nM未満、例えば３nM未満の親和性で所望の血清タンパク質に結合する。抗原結合タンパク質の抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば、スキャチャード解析および／または競合結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、およびサンドイッチ競合アッセイ、および当技術分野においてそれ自体公知の様々な異なる変法を含む、それ自体公知の任意の適切な方法で測定できる。
【０１９８】
別の態様では、本実施態様のアミノ酸配列（および具体的には免疫グロブリン配列、およびさらに具体的には免疫グロブリン可変ドメイン配列）は、さらにアミノ酸配列またはポリペプチドコンストラクトが前記血清タンパク質に結合する、あるいはそうでなければ会合する場合、前記血清タンパク質分子の半減期が（つまり、アミノ酸配列またはポリペプチドコンストラクトがそれに結合していない場合の血清タンパク質分子の半減期と比較して）（有意に）低下しないように、血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合する、あるいはそうでなければ会合する。本実施態様の本態様において、「有意に低下しない」は、血清タンパク質分子の半減期（それ自体公知の適切な技術を使用して測定される）が、５０%を超えて低下せず、好ましくは３０%を超えて低下せず、さらに好ましくは１０%を超えて低下せず、例えば５%を超えて低下せず、または本質的にまったく低下しないことを意味する。
【０１９９】
別の態様では、本実施態様のアミノ酸配列（および具体的には免疫グロブリン配列、およびさらに具体的には免疫グロブリン可変ドメイン配列）は、ＦｃＲｎに結合できる血清タンパク質に対して向けられる可能性があるが、さらに血清タンパク質のＦｃＲｎへの結合に関与しない血清タンパク質分子上のアミノ酸残基（血清アルブミン上のアミノ酸残基など）に結合できるようになり得る。具体的には、本実施態様の本態様によると、本実施態様のアミノ酸配列が血清アルブミンに対して向けられる場合、それらは血清アルブミンのドメインＩＩＩの一部を形成しない血清アルブミンのアミノ酸配列に結合できる。例えば、それに限定されないが、本実施態様の本態様は、ドメインＩおよび／またはドメインＩＩの一部を形成する血清アルブミンのアミノ酸配列に結合できるアミノ酸配列を提供する。
【０２００】
本実施態様のアミノ酸配列は、好ましくは（単一）ドメイン抗体または（単一）ドメイン抗体としての使用に適切であり、そのようなものとして、重鎖可変ドメイン配列（ＶＨ配列）または軽鎖可変ドメイン配列（ＶＬ配列）があり得るが、好ましくはＶＨ配列である。アミノ酸配列は例えばいわゆる「ｄＡｂ」であり得る。
【０２０１】
しかし、特に好ましい実施態様によると、本発明のアミノ酸配列はナノボディである。ナノボディ、ならびにこの説明に使用する追加用語の一部（例えば、限定はされないが、「向けられた」という用語など）のさらなる説明および定義については、Ablynx N. V.（国際公開第０６／０４０１５３号および同時係属中の国際出願ＰＣＴ／欧州特許第２００６／００４６７８など））による同時係属特許出願；ならびに本明細書に引用するさらなる先行技術を参照する。
【０２０２】
そのようなものとして、それらは「ＫＥＲＥ」クラス、「ＧＬＥＷ」クラスまたは「１０３−Ｐ，Ｒ，Ｓ」クラスに属するナノボディ（これもAblynx N. V.による同時係属特許出願に定義する）であり得る。
【０２０３】
好ましくは、本発明のアミノ酸配列はヒト化ナノボディ（これもAblynx N. V.による同時係属特許出願に定義する）である。
【０２０４】
本明細書に開示するアミノ酸配列は、タンパク質、化合物（限定はされないが、小分子を含む）または他の治療用物質などの治療成分の半減期を増大させるために、融合パートナーとしての利点とともに使用できる。
【０２０５】
このように、別の態様では、本実施態様は、本明細書に開示するアミノ酸配列を含む、または本質的にそれから成るタンパク質またはポリペプチドを提供する。具体的には、本実施態様は、場合により１つ以上の適切なリンカーまたはスペーサーを介して少なくとも１つの治療成分に連結している少なくとも１つの本実施態様のアミノ酸配列を含む、またはそれから成るタンパク質またはポリペプチドを提供する。そのようなタンパク質またはポリペプチドのコンストラクトは、例えば（限定はされないが）、本明細書にさらに記載する融合タンパク質であり得る。
【０２０６】
本実施態様は、さらに、タンパク質またはポリペプチドコンストラクトの治療的使用、および、そのようなタンパク質またはポリペプチドコンストラクトまたは融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【０２０７】
いくつかの実施態様では、少なくとも１つの治療成分は、治療用のタンパク質、ポリペプチド、化合物、因子または他の物質を含む、またはそれから本質的になる。好ましい実施態様では、治療成分は、所望の抗原または標的に対して向けられ、所望の抗原に結合でき（具体的には所望の抗原に特異的に結合でき）、および／または所望の標的と相互作用できる。別の実施態様では、少なくとも１つの治療成分は、治療用のタンパク質またはポリペプチドを含む、またはそれから本質的になる。さらなる実施態様では、少なくとも１つの治療成分は、抗体または抗体フラグメント（限定はされないが、ＳｃＦｖフラグメントを含む）などの免疫グロブリンまたは免疫グロブリン配列（限定はされないが、免疫グロブリンのフラグメントを含む）を含む、またはそれから本質的になる。さらに別の実施態様では、少なくとも１つの治療成分は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインなどの抗体可変ドメインを含む、またはそれから本質的になる。
【０２０８】
好ましい一実施態様では、少なくとも１つの治療成分は、少なくとも１つのドメイン抗体または単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」またはナノボディ(登録商標)を含む、またはそれから本質的になる。本実施態様によると、本実施態様のアミノ酸配列は好ましくはドメイン抗体または単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」またはナノボディでもあり、結果として得られるコンストラクトまたは融合タンパク質は、少なくとも１つが本実施態様のアミノ酸配列である少なくとも２つのドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」またはナノボディ(登録商標)（またはその組み合わせ）を含む多価コンストラクト（本明細書に記載）および好ましくは多特異的コンストラクト（同じく本明細書に記載）である。
【０２０９】
特定の一実施態様では、少なくとも１つの治療成分は、少なくとも１つの一価ナノボディ(登録商標)または二価、多価、二特異的または多特異的ナノボディ(登録商標)コンストラクトを含む、またはそれから本質的になる。本実施態様によると、本実施態様のアミノ酸配列は好ましくはナノボディでもあり、結果として得られるコンストラクトまたは融合タンパク質は、少なくとも１つが本実施態様のアミノ酸配列である少なくとも２つのナノボディを含む多価ナノボディコンストラクト（本明細書に記載）および好ましくは多特異的ナノボディコンストラクト（同じく本明細書に記載）である。
【０２１０】
本実施態様の一実施態様によると、本実施態様のアミノ酸配列はヒト化ナノボディである。
【０２１１】
また、本実施態様のアミノ酸配列、タンパク質、ポリペプチドまたはコンストラクトが医薬または診断的な使用を目的としている場合、前記のものは好ましくはヒト血清アルブミンなどのヒト血清タンパク質に対して向けられる。
【０２１２】
アミノ酸配列が免疫グロブリン可変ドメイン配列などの免疫グロブリン配列である場合、そのような配列の適切な（つまり、本明細書に言及する目的に適する）フラグメントも使用できる。例えば、アミノ酸配列がナノボディである場合、そのようなフラグメントは本質的に国際公開第０４／０４１８６５号に記載している通りであり得る。
【０２１３】
本実施態様は、本明細書に記載するアミノ酸配列、またはその適切なフラグメントを含む、またはそれから本質的になるタンパク質またはポリペプチドにも関する。
【０２１４】
本実施態様のアミノ酸配列は、１つ以上の他の抗原、抗原決定基、タンパク質、ポリペプチド、または他の化合物について１つ以上の追加の結合部位も含み得る。
【０２１５】
本明細書に言及する通り、本明細書に記載するアミノ酸配列は、タンパク質、化合物（限定はされないが、小分子を含む）または他の治療用物質などの治療成分の半減期を増大させるために、融合パートナーとして有利に使用できる。このように、本実施態様の一実施態様は、本実施態様の少なくとも１つのアミノ酸配列および少なくとも１つの治療成分を含むコンストラクトまたは融合タンパク質に関する。そのようなコンストラクトまたは融合タンパク質は、好ましくは、治療成分それ自体と比較し、増大した半減期を有する。一般に、そのような融合タンパク質およびコンストラクトは、上に引用した先行技術において記載される通りであるが、しかし、先行技術に記載する半減期を増大させる成分の代わりに本実施態様のアミノ酸配列を有する。
【０２１６】
一般に、本明細書に記載するコンストラクトまたは融合タンパク質は、好ましくは、対応する治療成分それ自体の半減期より少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍の半減期、または２０倍を越える半減期を有する。
【０２１７】
また、好ましくは、任意のそのような融合タンパク質またはコンストラクトは、対応する治療成分それ自体の半減期と比較し、１時間を越えて、好ましくは２時間を越えて、より好ましくは６時間を越えて、例えば１２時間を越えて増大した半減期を有する。
【０２１８】
また、好ましくは、任意の融合タンパク質またはコンストラクトは、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間を越えた、例えば１２時間を越えた、および例えば、約１日、２日、１週間、２週間または３週間、好ましくは２ヵ月未満である半減期を有し、もっとも後者はそれほど重要ではない。
【０２１９】
また、上で言及する通り、本実施態様のアミノ酸配列がナノボディである場合、それを使用して、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」またはナノボディなどの他の免疫グロブリン配列の半減期を増大できる。
【０２２０】
このように、本実施態様の一実施態様は、本実施態様の少なくとも１つのアミノ酸配列およびドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」またはナノボディなどの少なくとも１つの免疫グロブリン配列を含むコンストラクトまたは融合タンパク質に関する。免疫グロブリン配列は、好ましくは、所望の標的（それは好ましくは治療標的である）、および／または治療、予防および／または診断の目的に有用な、または適する別の免疫グロブリン配列に対して向けられる。
【０２２１】
このように、別の態様では、本実施態様は、本明細書に記載する少なくとも１つのナノボディ、および少なくとも１つの他のナノボディを含む多特異的（および具体的には二重特異的）ナノボディコンストラクトに関するもので、ここで前記少なくとも１つの他のナノボディは好ましくは所望の標的（それは好ましくは治療標的である）、および／または治療、予防および／または診断の目的に有用な、または適する別のナノボディに対して向けられる。
【０２２２】
ナノボディならびに１以上のナノボディおよびそれらの調製物を含む多価および多特異的ポリペプチドの一般的な説明については、国際公開第０６／０４０１５３号および同時係属の国際出願ＰＣＴ／欧州特許第２００６／００４６７８号などのAblynx N. V.による同時係属出願ＰＣＴ／欧州特許第２００６／００４６７８号（ならびにこれらの出願において引用されるさらなる先行技術）ならびに例えばConrath et al., J. Biol Chem., Vol. 276, 10-7346-7350, 2001;Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302；ならびに例えば国際公開第９６／３４１０３号および国際公開第９９／２３２２１号を参照する。本実施態様のある特定の多特異的および／または多特異的ポリペプチドのいくつかの他の例は、Ablynx N. V.による同時係属出願において見出せる。具体的には、半減期を増大させるための血清タンパク質に対する少なくとも１つのナノボディを含む多価および多特異的コンストラクト、それをコードする核酸、それを含む組成物、前記の調製物、および前記の使用の一般的な説明については、Ablynx N. V.による国際公開第０４／０４１８６５号を参照する。本明細書に記載するアミノ酸配列は、一般的に、本明細書に記載する半減期を増大するナノボディと同じように使用できる。
【０２２３】
非限定的な一実施態様において、前記他のナノボディは、単量体型および／または多量体（つまり、三量体）型で腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）に対して向けられる。そのようなナノボディコンストラクトのいくつかの例は、Ablynx N. V.による同時係属の国際出願、表題「ImprovedNanobodies(商標) against TumorNecrosis Factor-alpha」に見出すことができ、これは本出願と同じ優先権および同じ国際出願日を有する。
【０２２４】
本実施態様は、本明細書に記載するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または核酸、化合物、融合タンパク質およびコンストラクトにも関する。本実施態様は、先のヌクレオチド配列または核酸およびそれ自体公知の遺伝子コンストラクトのための１以上のエレメントを含む遺伝子コンストラクトをさらに含む。遺伝子コンストラクトはプラスミドまたはベクターの形であり得る。ここでも、そのようなコンストラクトは、一般的に、Ablynx N. V.による同時係属特許出願および本明細書に言及する先行技術、および本明細書に引用するさらなる先行技術に記載している通りであり得る。
【０２２５】
本実施態様は、そのようなヌクレオチド配列または核酸、および／または本明細書に記載するアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質およびコンストラクトを発現する（または発現できる）宿主または宿主細胞にも関する。ここでも、そのような宿主細胞は、一般的に、Ablynx N. V.による同時係属特許出願および本明細書に言及する先行技術、ならびに本明細書に引用するさらなる先行技術に記載している通りであり得る。
【０２２６】
本実施態様は、本明細書に記載するアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトを調製するための方法にも関し、その方法は、前記宿主細胞が本明細書に記載するアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトを産生または発現する条件下で本明細書に記載する宿主細胞を培養または維持する工程を含み、場合によりそのようにして産生したアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトを単離する工程をさらに含む。ここでも、そのような方法は、Ablynx N. V.による同時係属特許出願および本明細書に言及する先行技術、ならびに本明細書に引用するさらなる先行技術に一般的に記載している通りに実施できる。
【０２２７】
本実施態様は、本明細書に記載する少なくとも１つのアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクト、および任意に少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物にも関する。そのような調製物、担体、賦形剤および希釈剤は、一般的に、Ablynx N. V.による同時係属特許出願および本明細書に言及する先行技術、ならびに本明細書に引用するさらなる先行技術に記載している通りである。
【０２２８】
しかし、本明細書に記載するアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトは増大した半減期を有するため、それらは好ましくは循環系に投与される。そのようなものとして、それらは、アミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトが循環中に入ることができる任意の適切な方法、例えば静脈内、注射または注入を介して、またはアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトが循環中に入ることができる任意の適切な方法（経口投与、皮膚を通した投与、経粘膜投与、経鼻投与、肺を通した投与などを含む）により投与できる。適切な方法および投与経路は、ここでも、例えば、国際公開第０４／０４１８６２号の教示から当業者に明らかであろう。
【０２２９】
このように、別の態様において、本実施態様は、本明細書に記載する化合物、融合タンパク質またはコンストラクトの使用により予防または処置できる少なくとも１つの病気または疾患の予防および／または処置のための方法に関するもので、その方法は、医薬的活性量の本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクト、および／またはそれを含む医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。本明細書に記載する化合物、融合タンパク質またはコンストラクトの使用により予防または処置できる病気または疾患は、一般的に、本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクト中に存在する治療成分の使用により予防または処置できる病気および疾患と同じであろう。
【０２３０】
処置される被験体は、任意の霊長類であり得るが、しかし、具体的にはヒトである。当業者に明らかなように、被験体は、具体的には、本明細書に言及する病気および疾患を患う、またはそのリスクを有するヒトであろう。
【０２３１】
より具体的には、本発明は治療の方法に関するもので、ここで本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトを投与する頻度が、本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトが向けられる血清タンパク質の自然半減期の少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、より好ましくは少なくとも８０%および最も好ましくは少なくとも９０%である。
【０２３２】
本発明の範囲内にある霊長類への特定の投与頻度は、本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトが向けられる血清タンパク質の自然半減期の少なくとも５０%、５５%、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%または少なくとも１００%である。
【０２３３】
換言すると、本発明の範囲内にある特定の投与頻度は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９日毎である。
【０２３４】
限定はされないが、上に指す投与頻度は、具体的には、場合により所望のレベルを確立することを意図した１以上の（初期）用量の投与後に、アミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトで治療された被験体の血清で所望のレベルのアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトを維持するために適している。当業者に明らかなように、所望の血清レベルは、とりわけ、使用されるアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトおよび／または処置される病気に依存しうる。臨床医または医師は、本実施態様のアミノ酸、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトを本明細書に言及する頻度で投与する場合、前記被験体において所望の血清レベルを達成および／または維持するために、所望の血清レベルを選択でき、治療する被験体に投与する用量および／または量を選択できるであろう。
【０２３５】
本発明との関連で、「予防および／または処置」という用語は、病気の予防および／または処置のみでなく、一般的に、病気の発症の予防、病気の進行の緩徐化または逆転、病気に伴う１つ以上の症状の発症の予防または緩徐化、病気に伴う１つ以上の症状の低減または軽減、病気および／またはそれに伴う症状の重症度および／または期間の低減および／または病気および／またはそれに伴う症状の重症度のさらなる増大の予防、病気が原因となる任意の生理学的損傷の低減または逆転、および一般的に、治療中の患者に有益な任意の薬理作用も含む。
【０２３６】
処置される被験体は任意の霊長類であり得るが、しかし、具体的にはヒトである。当業者に明らかなように、処置される被験体は、具体的には、本明細書に言及する治療成分により治療可能な病気および疾患を患う、またはそのリスクを有するヒトである。
【０２３７】
別の実施態様において、本実施態様は、免疫療法の方法、具体的には受動免疫療法に関するもので、その方法は、本明細書に言及する病気および疾患を患う、またはそのリスクを有する被験体への、医薬的活性量の本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクト、および／またはそれを含む医薬組成物を投与する工程を含む。
【０２３８】
本実施態様は、治療薬の血清半減期を延長または増大させるための方法にも関する。これらの方法において、治療薬は、多価および多特異的なナノボディを含む、本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトのいずれかに接触させ、治療薬がアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトに結合する、あるいはそうでなければ会合する。
【０２３９】
治療薬およびアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトは、当業者に公知の様々な方法で結合できる、あるいはそうでなければ会合できる。ペプチドまたはポリペプチドなどの生物学的治療薬の場合、治療薬は、当技術分野において公知の方法により、アミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトに融合できる。治療薬は直接融合でき、またはスペーサーまたはリンカーの分子または配列を使用して融合できる。スペーサーまたはリンカーは、好ましい実施態様では、アミノ酸で作製されるが、しかし、当技術分野において周知の通り、他の非アミノ酸のスペーサーまたはリンカーを使用できる。このように、治療薬を接触させる工程は、ペプチドまたはポリペプチドを、多価および多特異的なナノボディを含む本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトに連結させることによる融合タンパク質の調製を含むことができる。
【０２４０】
治療薬は本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトにより直接結合することもできる。一例として、多価および多特異的なナノボディは、血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合する少なくとも１つの可変ドメインおよび治療薬に結合する少なくとも１つの可変ドメインを含むことができる。
【０２４１】
治療薬の血清半減期を延長または増大するための方法は、本実施態様のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトに結合する、あるいはそうでなければ会合した後に治療薬を霊長類に投与することをさらに含むことができる。そのような方法では、治療薬の半減期は、本明細書の別の個所に記載する通り、かなりの量によって延長または増大する。
【０２４２】
アミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトおよび／またはそれを含む化合物は、予防または処置される病気または疾患を予防および／または処置するために適切である処置計画に従って投与される。臨床医は、一般的に、予防または処置される病気または疾患、処置される病気の重症度および／またはその症状の重症度、使用する本実施態様の特定のナノボディまたはポリペプチド、使用される特定の投与経路および医薬製剤または組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身状態などの因子、および臨床医に周知の同様の因子に応じて、適切な処置計画を決定できる。
【０２４３】
一般的に、処置計画は、１つ以上の医薬的な有効量または用量で、本実施態様の１つ以上のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質もしくはコンストラクト、またはそれを含む１つ以上の組成物の投与を含む。投与される特定の量または用量は、ここでも上に引用する因子に基づいて、臨床医により決定できる。
【０２４４】
一般的に、本明細書に言及する病気および疾患の予防および／または処置のために、ならびに処置される特定の病気または疾患、使用される特定のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質またはコンストラクトの効力および／または半減期、使用される特定の投与経路および特定の医薬製剤または組成物に応じて、本実施態様のナノボディおよびポリペプチドは一般的に１g/kg体重／日と０．０１μg/kg体重／日の間、好ましくは０．１g/kg体重／日と０．１μg/kg体重／日の間、例えば約１、１０、１００、１０００μg/kg体重／日の量で、1日1回用量（例えば注入により）または1日複数回分割用量のいずれかで連続投与される。臨床医は、一般的に、本明細書に言及する因子に応じて、適切な１日用量を決定できる。特定の場合には、臨床医は、例えば、上に引用した因子および自身の判断に基づき、これらの量から逸脱することを選択できる。一般的に、投与される量に関するある種のガイダンスは、しかし、親和性／結合力、効力、体内分布、半減期および当業者に周知の同様の因子の差を考慮して、本質的に同じ経路を介して投与される同じ標的に対する同等の従来の抗体または抗体フラグメントについて通常投与される量から得ることができる。
【０２４５】
通常、上の方法において、本実施態様の単一のナノボディまたはポリペプチドが使用される。しかし、本実施態様の２つ以上のナノボディおよび／またはポリペプチドを併用することは本実施態様の範囲内である。
【０２４６】
本実施態様のナノボディおよびポリペプチドは、１つ以上のさらなる医薬的活性化合物または原理、すなわち相乗効果を引き起こす可能性のある、または可能性のない併用処置計画と併用してもよい。ここでも、臨床医は、上に引用した因子および自身の判断に基づき、そのようなさらなる化合物または原理、ならびに適切な併用処置計画を選択できるであろう。
【０２４７】
具体的には、本実施態様のナノボディおよびポリペプチドは、本実施態様の融合タンパク質またはコンストラクトで予防または処置できる病気または疾患の予防および／または処置のためである、またはそのために使用できる他の医薬的活性化合物または原理と併用でき、その結果、相乗効果が得られる、または得られないことがある。
【０２４８】
本実施態様に従って使用される処置計画の有効性は、臨床医に明らかなように、関与する病気または疾患についてそれ自体公知の任意の方法で判断および／または追跡調査できる。臨床医は、適宜および／またはケースバイケースで、特別な処置計画を変更または改変して、所望の治療効果を達成し、不要な副作用を回避、制限または低減し、および／または一方では所望の治療効果を達成すること、他方で望ましくない副作用を回避、制限または低減することの間の適当なバランスを達成することもできる。
【０２４９】
一般的に、処置計画は、所望の治療効果が達成されるまで、および／または所望の治療効果が維持される限り、追跡調査される。ここでも、このことは臨床医により判断できる。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】本発明のアミノ酸配列の起こり得る相互作用を示し、図中英文は以下の意味。Interaction 1: 相互作用１Interaction 2: 相互作用２Amino acid sequence(depicted to have two binding units):アミノ酸配列（２つの結合ユニットを有するように描かれる）Interaction 3: 相互作用３Human serum protein with long half-life due to FcRn interaction:ＦｃＲｎ相互作用に起因する長い半減期を有するヒト血清タンパク質Amino acid sequence 1: アミノ酸配列１、血清タンパク質への結合Amino acid sequence 2: アミノ酸配列２、抗原への結合Antigen: 抗原
【図２】相互作用１はｐＨの変化に敏感であることを示し、図中英文は以下である。pH6.0(endosomal compartment):ｐＨ６．０（エンドソームコンパートメント）pH7.4(blood): ｐＨ７．４（血液）Interaction 1: 相互作用１Interaction 2: 相互作用２Interaction 3: 相互作用３Interaction 1 lost: 相互作用１喪失
【図３】選択されたクローンからのｈｉｓタグ付きナノボディタンパク質を含むペリプラズム調製物のヒト血清アルブミン特異的ＥＬＩＳＡ解析。可溶性ナノボディタンパク質フラグメントのペリプラズム調製物を、ＨＳＡ抗原でコーティングし、追加でＰＢＳ＋１%カゼインでブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートのウェルに加える。検出は、モノクローナルビオチン化抗ｈｉｓ抗体、続いてホースラディッシュ抱合ストレプトアビジンにより実施する。ＥＬＩＳＡは、実施例１に記載の通り、ＴＭＢ基質により発現させる。ＯＤ値（Ｙ軸）は、ＥＬＩＳＡリーダーにより４５０nmで測定する。各バーは、個々のペリプラズム抽出物を表す。図中英文は以下である。HAS-binding ELISA: ＨＡＳ結合ＥＬＩＳＡ
【図４Ａ】異なるｐＨでのアルブミン結合ナノボディとヒト血清アルブミンの間の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。可溶性ナノボディタンパク質フラグメントのペリプラズム調製物を、ｐＨ５、ｐＨ６またはｐＨ７で、固定化ヒト血清アルブミン全体に注入する。図４Ａおよび４Ｂはそれぞれナノボディ４Ａ１および４Ｃ３の相互作用を示す。
【図４Ｂ】異なるｐＨでのアルブミン結合ナノボディとヒト血清アルブミンの間の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。可溶性ナノボディタンパク質フラグメントのペリプラズム調製物を、ｐＨ５、ｐＨ６またはｐＨ７で、固定化ヒト血清アルブミン全体に注入する。図４Ａおよび４Ｂはそれぞれナノボディ４Ａ１および４Ｃ３の相互作用を示す。図中英文は以下である。Adjusted sensorgram: 調整済みセンサーグラムResponse(0= baseline): 反応（０＝ベースライン）Time: 時間
【図５Ａ】アミノ酸配列
【図５Ｂ】アミノ酸配列図中英文は以下である。Sequences: 配列
【図６】中性条件でのみ結合するが、酸性条件では結合しないナノボディ（クローン）を示し、図中英文は以下である。Clone ID: クローンＩＤLlama: ラマSelection condition: 選択条件ELISA results: ＥＬＩＳＡの結果Acidic: 酸性Neutral: 中性Acidic with trypsin elution: トリプシン溶出で酸性
【図７Ａ】酸性条件でのみ結合するが、中性条件では結合しないナノボディ（クローン）を示す。
【図７Ｂ】酸性条件でのみ結合するが、中性条件では結合しないナノボディ（クローン）を示し、図中英文は以下である。Clone ID: クローンＩＤLlama: ラマSelection condition: 選択条件ELISA results: ＥＬＩＳＡの結果Acidic: 酸性Neutral: 中性Acidic with trypsin elution: トリプシン溶出で酸性Neutral with acidic buffer elution*PBS buffer@pH5.8: 酸性バッファー溶出で中性*ＰＢＳバッファー＠ｐＨ５．８Neutral with acidic buffer elution*CPA buffer@pH5.8:酸性バッファー溶出で中性*ＣＰＡバッファー＠ｐＨ５．８
【発明を実施するための形態】
【０２５１】
本発明の他の態様、実施態様、利点、および適用は、本明細書のさらなる記載から明らかとなろうが、ここで：
ａ）図１は、これはＦｃＲｎ、ＦｃＲｎに結合する血清タンパク質（血清アルブミンまたはＩｇＧなど）、本発明の二特異的化合物（具体的には、本明細書に記載する半減期を延長するための特定の実施態様による二特異的化合物）および抗原（つまり、第２の目的とする、または所望の分子）の間の起こり得る相互作用の例を示す非限定的な略図である。本明細書のさらなる記載を参照する。
ｂ）図２は、ＦｃＲｎとＦｃＲｎに結合する血清タンパク質の間の相互作用がｐＨに依存的／に敏感であることを示す略図である。本明細書でのさらなる記載を参照する。
ｃ）表１−３は、本発明の二特異的化合物（具体的には、本明細書に記載する半減期を延長するための特定の実施態様による二特異的化合物）が（つまり、第１の目的とする、または所望の分子としての）血清タンパク質および（第２の目的とする、または所望の分子としての）抗原に結合できる方法の異なる非限定的な例の概要を示す。本明細書でのさらなる記載を参照する。
ｄ）別段、指示または定義のない限り、使用するすべての用語は当技術分野における通常の意味を有し、それらは当業者に明らかであろう。例えば、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2nd.Ed.),Vols-1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al., eds.,“Current protocols in molecular biology”, Green Publishing and WileyInterscience, New York (1987); Lewin, “Genes II”, John Wiley & Sons, NewYork, N. Y., (1985); Old et al., “Principles of Gene Manipulation: AnIntroduction to Genetic Engineering”, 2nd edition, University of CaliforniaPress, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., “Immunology” (6th.Ed.),Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt’s Essential Immunology,10th Ed.Blackwell Publishing, UK (2001); and Janeway et al., “Immunobiology”(6th Ed,), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005)などの標準的ハンドブック、ならびに本明細書に引用する一般的な背景技術を参照する；
ｅ）別段、指示のない限り、「免疫グロブリン配列」という用語は、それが本明細書に重鎖抗体または従来の４本鎖抗体を指すために使用するかを問わず、一般用語として使用され、完全サイズの抗体、その個々の鎖、ならびにそのすべての部分、ドメインまたはフラグメント（限定はされないが、抗原結合ドメインまたはＶＨＨドメインもしくはＶＨ／ＶＬドメインなどのフラグメントを含む）のいずれも含む。また、（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」などの用語において）本明細書に使用する「配列」という用語は、一般的に、文脈がより限定的な解釈を必要としない限り、関連するアミノ酸配列ならびにそれをコードする核酸またはヌクレオチド配列を含むように理解すべきである；
ｆ）他に指示しない限り、具体的に詳述されないすべての方法、工程、技術および操作は、当業者に明らかな通り、それ自体公知の方法で実施でき、実施されてきた。例えば、ここでも、標準的ハンドブックおよび本明細書に言及する一般的な背景技術ならびに本明細書に引用するさらなる参考文献を参照する；
ｇ）核酸またはアミノ酸配列は、その天然の生物学的原料および／またはそれが得られた反応媒質または培養媒質と比較し、別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分もしくは巨大分子または少なくとも１つの汚染物質、不純物または微量成分などの、それが前記原料または媒質において通常会合している少なくとも１つの他の成分から分離されている場合、「本質的に単離された（形状）」であると見なされる。具体的には、核酸またはアミノ酸配列は、それが少なくとも２倍、具体的には少なくとも１０倍、具体的には少なくとも１００倍、および最高１０００倍以上で精製されている場合、「本質的に単離されている」と見なされる。「本質的に単離された形状」である核酸またはアミノ酸配列は、適切な技術、例えばアクリルアミドゲル電気泳動などの適切なクロマトグラフィー技術を使用して決定されるように、好ましくは本質的に均質である。
ｈ）本明細書に使用する「ドメイン」という用語は、一般的に、抗体鎖の球状領域、具体的には重鎖抗体の球状領域、またはそのような球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。通常、そのようなドメインは、例えば、シートとして、またはジスルフィド結合により安定化されたペプチドループ（例えば、３または４のペプチドループ）を含む；
ｉ）「抗原決定基」という用語は、抗原結合分子（本発明のナノボディまたはポリペプチドなど）、具体的には前記分子の抗原結合部位により認識される抗原上のエピトープを指す。「抗原決定基」および「エピトープ」という用語は、本明細書に互換的に使用してもよい；ｊ）特定の抗原決定基、エピトープ、抗原またはタンパク質（またはその少なくとも１つの部分、フラグメントもしくはエピトープ）に結合できる、それに親和性がある、および／または特異性を有するアミノ酸配列（本発明のナノボディ、抗体、ポリペプチド、または一般的に抗原結合タンパク質、またはそのポリペプチドもしくはフラグメントなど）は、前記抗原決定基、エピトープ、抗原またはタンパク質に「対する」または「対して向けられる」と言われる；
ｋ）「特異性」という用語は、特別の抗原結合分子または抗原結合タンパク質（本発明のナノボディまたはポリペプチドなど）が結合できる異なるタイプの抗原または抗原決定基の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性および／または結合力に基づいて決定できる。親和性は、抗原の抗原結合タンパク質との解離についての平衡定数（ＫＤ）により表わされ、抗原結合タンパク質上の抗原決定基と抗原結合部位の間の結合についての測定値であり；ＫＤの値が小さいほど、抗原決定基と抗原結合分子の間の結合強度は強い（あるいは、親和性は１／ＫＤである親和性定数（ＫＡ）として表わすこともできる）。（例えば、本明細書でのさらなる開示に基づき）当業者に明らかなように、親和性は、目的とする特異的抗原に依存してそれ自体公知の方法で決定できる。結合力は、抗原結合分子（本発明のナノボディまたはポリペプチドなど）と関連抗原の間の結合の力の測定値である。結合力は、抗原結合分子上の抗原決定基とその抗原結合部位の間の親和性と、抗原結合分子上の関連結合部位の数の両方に関連する。抗原結合タンパク質の抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば、スキャチャード解析および／または競合結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、およびサンドイッチ競合アッセイ、および当技術分野においてそれ自体公知の様々な異なる変法を含む、それ自体公知の任意の適切な方法で測定できる。
【０２５２】
重鎖抗体およびその可変ドメインの一般的な記載については、とりわけ以下の参考文献を参照し、それらは一般的な背景技術として言及される：Vrije Universiteit Brusselの国際公開第９４／０４６７８号、国際公開第９５／０４０７９号および国際公開第９６／３４１０３号；Unileverの国際公開第９４／２５５９１号、国際公開第９９／３７６８１号、国際公開第００／４０９６８号、国際公開第００／４３５０７号、国際公開第００／６５０５７号、国際公開第０１／４０３１０号、国際公開第０１／４４３０１号、欧州特許第１１３４２３１および国際公開第０２／４８１９３号；Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)国際公開第９７／４９８０５号、国際公開第０１／２１８１７号、国際公開第０３／０３５６９４号、国際公開第０３／０５４０１６および国際公開第０３／０５５５２７号；Algonomics N.V.および出願者の国際公開第０３／０５０５３１号；National Research Council of Canadaの国際公開第０１／９０１９０号；Institute of Antibodiesの国際公開第０３／０２５０２０号（＝欧州特許第１  ４３３  ７９３）；  ならびに出願者による国際公開第０４／０４１８６７号、国際公開第０４／０４１８６２号、国際公開第０４／０４１８６５号、国際公開第０４／０４１８６３号、国際公開第０４／０６２５５１号および出願者によるさらなる公開特許出願；Hamers-Casterman et al., Nature 1993 June 3; 363 (6428): 446-8;Davies and Riechmann, FEBS Lett. 1994 Feb 21; 339(3): 285-90; Muyldermans etal., Protein Eng.1994 Sep; 7(9): 1129-3; Davies and Riechmann, Biotechnology (NY) 1995 May;13(5): 475-9; Gharoudi et al., 9th Forum of Applied Biotechnology, Med. Fac.Landbouw Univ. Gent. 1995; 60/4a part I: 2097-2100; Davies and Riechmann,Protein Eng.1996 Jim; 9(6): 531-7; Desmyter et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep ; 3(9): 803-11 ; Sheriff et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 733-6; Spinelli et al.,Nat Struct Biol. 1.996 Sep ; 3(9): 752-7; Arbabi Ghahroudi et al., FEBS Lett.1997 Sep 15; 414(3): 521-6; Vu et al., Mol Immunol. 1997 Nov-Dec; 34(16-17): 1121-31; Atarhouch et al., Journal of Camel Practice and Research 1997; 4:177-182; Nguyen et al., J. MoL Biol.1998 Jan 23; 275(3): 413-8; Lauwereys etal., EMBO J. 1998 Jul 1 ; 17(13): 3512- 20; Frenken et al., Res Immunol. 1998 Jul-Aug; 149(6): 589-99; Transue etal., Proteins  1998 Sep 1; 32(4): 515-22; Muyldermans and Lauwereys,J. MoL Recognit 1999 Mar-Apr; 12 (2): 131-40; van der Linden et al., Biochim.Biophys. 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Virol. 2003Nov: 77 (22): 12132-9; Meddeb-Mouelhi et al., Toxicon. 2003 Dec; 42 (7):785-91; Verheesen et al., Biochim. Biophys. Acta 2003 Dec 5; 1624 (1-3): 21-8;Zhang et al., J Mol Biol. 2004 Jan 2; 335 (1): 49-56; Stijlemans et al., J BiolChem. 2004 Jan 9; 279 (2): 1256-61; Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 2004Apr 15; 64 (8): 2853-7; Spinelli et al., FEBS Lett. 2004 Apr 23; 564 (1-2):35-40; Pleschberger et al., Bioconjug. Chem. 2004 May-Jun; 15 (3): 664-71;Nicaise et al., Protein Sci. 2004 Jul; 13 (7): 1882-91; Omidfar et al., TumourBiol. 2004 Jul- Aug; 25 (4): 179-87; Omidfar et al., Tumour Biol. 2004 Sep Dec;25(5-6): 296-305; Szynol et al., Antimicrob Agents Chemother. 2004 Sep; 48(9):3390-5; Saerens et al., J. Biol. Chem. 2004 Dec 10,279 (50):51965-72; De Genst et al., J. Biol. Chem. 2004 Dec 17; 279 (51): 53593-601 ;Dolk et al., Appl. Environ. Microbiol. 2005 Jan; 71(1): 442-50; Joosten et al.,Appl Microbiol Biotechnol 2005 Jan; 66(4): 3S4-92; Dumoulin et al., J. Mol.Biol. 2005 Feb 25; 346 (3): 773-88; Yau et al., J Immunol Methods. 2005 Feb;297 (1-2): 213-24; De Genst et al., J. Biol. Chem. 2005 Apr 8; 280 (14):14114-21; Huang et al., Eur. J. Hum. Genet. 2005 Apr 13; Dolk et al., Proteins.2005 May 15; 59 (3): 555-64; Bond et al., J. Mol. Biol. 2005 May 6; 348(3):699-709; Zarebski et al., J. Mol. Biol. 2005 Apr 21;  ［電子出版；印刷前］；
【０２５３】
上の参考文献に使用する用語法に従って、天然の重鎖抗体において存在する可変ドメインは「ＶＨＨドメイン」とも呼ばれるが、それらを従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（以下で「ＶＨドメイン」と呼ばれる）および従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（以下で「ＶＬドメイン」と呼ばれる）から区別するためである。
【０２５４】
前記の先行技術において言及する通り、ＶＨＨドメインは多数の独自の構造的特徴および機能的特性を有し、それらによって、単離ＶＨＨドメイン（およびそれに基づくナノボディで、それは天然のＶＨＨドメインとこれらの構造的特徴および機能的特性を共有する）およびそれを含むタンパク質は機能的な抗原結合ドメインまたはタンパク質としての使用に有利となる。具体的には、それに限定されないが、ＶＨＨドメイン（軽鎖可変ドメインの存在なく、およびそれとの相互作用なく、抗原に機能的に結合する性質によりデザインされている）およびナノボディは、単一の、比較的小さな、機能的な抗原結合構造ユニット、ドメインまたはタンパク質として機能できる。これによって、ＶＨＨドメインは従来の４本鎖抗体のＶＨおよびＶＬのドメインから区別され、それら自体は一般的に単一の抗原結合タンパク質またはドメインとしての実際の適用に適さず、機能的な抗原結合ユニットを提供するためにさまざまに形状を変えて結びつく必要がある（例えば、Ｆａｂフラグメントなどの従来の抗体フラグメント；ＳｃＦｖフラグメントにおいて、それはＶＬドメインに共有結合するＶＨドメインからなる）。
【０２５５】
これらの独自の特性のために、単一の抗原結合タンパク質としての、または抗原結合ドメインとしての（つまり、より大きなタンパク質またはポリペプチドの一部としての）ＶＨＨドメインおよびナノボディの使用は、従来のＶＨおよびＶＬのドメイン、ｓｃＦｖｓまたは従来の抗体フラグメント（Ｆａｂ−またはＦ（ａｂ'）２−フラグメントなど）の使用よりも多くの有意な利点を与える：
‐２つの別々のドメインを存在させる、または、これらの２つのドメインが正しい空間的立体構造および配置において存在することを（ｓｃＦｖｓを用いるなど、特別にデザインされたリンカーの使用により）保証する必要がないように、高い親和性および高い選択性で抗原に結合するために単一のドメインのみが必要である；
‐ＶＨＨドメインおよびナノボディを単一の遺伝子から発現でき、翻訳後のフォールディングまたは修飾は必要ない；
‐ＶＨＨドメインおよびナノボディを多価および多特異的なフォーマットに容易に改変できる（本明細書にさらに考察する）；
‐ＶＨＨドメインおよびナノボディは高溶解性であり、凝集する傾向はない（Ward et al., Nature, Vol. 341, 1989, p. 544に記載のマウス由来抗原結合ドメインと同様である）；
‐ＶＨＨドメインおよびナノボディは、熱、ｐＨ、プロテアーゼおよび他の変性剤または条件に高度に安定である（例えば、Ewert et al., 上記参照）；
‐ＶＨＨドメインおよびナノボディは、生産のために要求されるスケールでさえ容易かつ比較的安価に調製される。例えば、（例えば、以下にさらに記載する）微生物発酵を使用してＶＨＨドメイン、ナノボディおよびそれを含むタンパク質／ポリペプチドを産生でき、例えば従来の抗体フラグメントと同様に哺乳動物の発現系の使用は必要ない；
‐ＶＨＨドメインおよびナノボディは、従来の４本鎖抗体やその抗原結合フラグメントと比較して、比較的小さく（約１５kDa、または従来のＩｇＧより１０倍小さく）、したがって、そのような従来の４本鎖抗体やその抗原結合フラグメントよりも組織（限定はされないが、固形腫瘍や他の密性組織を含む）への高い浸透性を示す；
‐ＶＨＨドメインおよびナノボディは（とりわけ、従来のＶＨドメインと比較して、それらの延長したＣＤＲ３ループに起因して）いわゆる空洞結合特性を示すことができ、したがって、従来の４本鎖抗体やその抗原結合フラグメントに接近できない標的やエピトープにも接近できる。例えば、ＶＨＨドメインおよびナノボディは酵素を阻害できることが示されている（例えば、国際公開第９７／４９８０５号；Transue et al., (1998）上記参照；Lauwereys et al., (1998)上記参照）。
【０２５６】
本発明において、標的および抗原に結合する能力を有する結合分子、好ましくはタンパク質またはペプチドを使用し、ここで標的および抗原は一般的に２つの異なる分子であり、結合タンパク質または抗原ならびに結合分子により認識される結合分子の、または、抗原の血清半減期が、血液などの血液コンパートメントの外、または、結合分子が出会うエンドソームなどの細胞内コンパートメントを問わず、他のコンパートメントと比較して、血液循環のコンパートメントにおける異なる結合条件による影響を受けるように、特定の条件に感受性である結合相互作用を有する。
【０２５７】
具体的には、本発明のアミノ酸配列は、細胞外循環から細胞内エンドソームコンパートメントへ行く場合、例えば、ピノサイトーシスのプロセス中に、条件変化に敏感である相互作用を受けることができる。そのような「敏感な」相互作用の例は、ｐＨ依存的、イオン強度依存的、プロテアーゼ依存的、または容積依存的なものであり、依存性によって、結合タンパク質とその標的の間の相互作用の見掛け上の親和性における好ましくは１０倍または等しく好ましくは１００倍または１０００倍の差を作り、結果として、抗原の循環中半減期に影響を与える。この標的は、抗原自体、身体において循環するタンパク質、または細胞表面受容体のいずれかであり得る。
【０２５８】
本発明の一態様によると、コンディショナルな結合剤、好ましくはタンパク質またはペプチドは、感受性の様式で選ばれた抗原に直接的に結合する。好ましい実施態様では、相互作用はｐＨ依存的であり、生理学的ｐＨ（７．２〜７．４）で、相互作用が、エンドソームコンパートメントにおけるｐＨ（６．０〜６．５）よりも好ましくは１０×、１００×、１０００×より効率的に生じる。結果は、循環において結合タンパク質が抗原に結合するが、しかし、細胞内コンパートメントにおいて、例えば、結合タンパク質‐抗原の複合体のエンドソームコンパートメントへのインターナリゼーション後、抗原は結合タンパク質から離れる。好ましい実施態様では、この結合タンパク質は単一可変ドメイン、好ましくはナノボディまたは等しく好ましくはＤａｂ（ドメイン抗体）である。そのような結合親和性における低減の結果は、エンドソームコンパートメントにおける進行中のプロセスに対し、結合した結合タンパク質によりもはや保護されず、それは（結合タンパク質が抗原への結合時に影響を与えうる）プロテアーゼやイオン状態の変化による攻撃への感受性が高まり、それにより抗原および／または結合分子をタンパク質またはペプチドの分解のリソソーム経路により容易に適合させる。これは抗原の循環中半減期に影響を与える。主な利点は、例えば、従来のモノクローナル抗体での治療中に記載される、抗原結合タンパク質との複合体の高レベルな蓄積が認められることである。代わりに、抗原が破壊される。
【０２５９】
ｐＨ依存性は、すべての「敏感な」結合様式の内で最も重要である。弱塩基性ｐＨ（細胞表面近く）から酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）への急なｐＨ依存的な親和性の移行は、タンパク質／タンパク質の相互作用の異常な特色である。受容体媒介性のエンドサイトーシスは、受容体が細胞内と細胞外の環境の間でリガンドを輸送するプロセスであり、細胞表面と細胞内小胞の間のｐＨにおける差を利用して、プロセスを調節することが多い（Melmann, Sprague et al.の参考文献６１）。
【０２６０】
本発明の別の態様では、抗原反応性（第１）結合タンパク質はそれ自体が、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）またはサルベージ受容体を認識することが知られている血清タンパク質を認識する別の（第２）結合タンパク質に連結している。あるいは、等しく好ましくは、抗原反応性結合タンパク質は、抗原結合部位とは異なる、Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）またはサルベージ受容体を認識することが知られている血清タンパク質を認識する第２の結合部位を含む。特に重要なのはアルブミンであり、ヒト血漿中に４１．８mg/mlで存在し（Davies andMorris, 1993）、それはエンドソーム再循環の経過において（Kimet al., 2006）、ＩｇＧ結合において用いられる部位とは異なる部位でＦｃＲｎに結合することが知られている。別の等しく重要な血清タンパク質はＩｇＧであり、ヒト血清において多量に（１１−１２mg/ml）存在する（Waldmannand Strober）。
【０２６１】
抗原反応性タンパク質がＦｃＲｎにより認識される部位で血清タンパク質に結合する場合、血清タンパク質がＦｃＲｎにより取り返されるその潜在能力を喪失するため、抗原結合タンパク質複合体はエンドソーム取り込み時に急速に分解される。
【０２６２】
本発明によると、血漿において広く認められる条件とエンドソームコンパートメントのそれの間でのアルブミンへの結合タンパク質の結合強度における差は、Ｋｄとｔ１／２の間の関係を正当化できる。アルブミンはすべての動物において非常に高濃度で血漿中に存在する（マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌおよびヒトにおいてそれぞれ３２．７、３１．６、３８．７、４９．３、２６．３、４１．８mg/ml、Davis andMorris, 1993による作表）。Chaudhuryら（２００３）とKimら（２００６）は、ＦｃＲｎ（組織適合性複合体に関連するＦｃ受容体）への酸依存的な高親和性結合を通じて、アルブミンが構成的に取り込まれ、分解から救出されることを示した。ＦｃＲｎによって、液相ピノサイトーシスを介して、または、受容体媒介性の取り込みによりエンドサイトーシス経路に入るＩｇＧも再循環される（Ober et al., 2004）。興味深いことに、マウスにおいて記載される見掛け上の１：１の化学量論（Popov et al., 1996）にもかかわらず平衡条件下で２：１の化学量論を有するＦｃＲｎ−ＩｇＧ  （Sanchez et al., 1999）とは対照的に、アルブミンは１：１の化学量論を有するＦｃＲｎ（Chaudhury et al., 2006）に結合するが、しかし、これはマウスにおける炭水化物成分の変化に関係することが示されており、非平衡測定値に関連しうる（Sanchez et al., 1999）。重量およびＦｃＲｎ欠損マウスの解析から、アルブミンの回転速度が詳細に解析されてきた（Kim et al., 2006）。アルブミン再循環速度は非常に高い。より正確には、アルブミン再循環速度は３１，０００nmol/day/kgに等しく、定常状態のアルブミン産生を伴い、異化速度は３１，０００nmol/day/kgである。
【０２６３】
エンドソームプロセシング中、アルブミンまたはＩｇＧはエンドソームの酸性条件下で結合型ＦｃＲｎであり、ＩｇＧサルベージについて詳述される通りに、エキソサイトーシスへのエンドソームの分離経路に続く（Ober et al., 2004）。注目すべきは、アルブミンおよびＩｇＧはＦｃＲｎにおける異なる部位に結合することである（Kim et al., 2006）。アルブミンのＦｃＲｎへの親和性は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨで約２００倍高く、ＦｃＲｎ結合アルブミンがリソソーム分解経路に入るのを妨げる保護受容体としてのＦｃＲｎの提案された役割に一致する。ヒトＦｃＲｎについてのヒトアルブミンのｐＨ６でのＫｄは１．８から３μＭである（Chaudhury et al., 2006）。ｐＨ６と中性ｐＨの間のＦｃＲｎへのＩｇＧの結合増大もＩｇＧについて認められる。野生型ＩｇＧ１およびヒトＦｃＲｎについてのｐＨ６でのＫｄは２５２７nMであることが見出された（Dall’Acqua et al., 2002）。注目すべきは、ＦｃＲｎが酸性ｐＨでの同様の親和性でアルブミンまたはＩｇＧに結合するが、ＩｇＧ−ＦｃＲｎと比較したアルブミン‐ＦｃＲｎの間の化学量論の差は、恐らくエンドソームコンパートメントにおけるＦｃＲｎによるＩｇＧの保護増強をもたらし得ることである。
【０２６４】
血清タンパク質に結合したコンディショナルなアミノ酸配列（アルブミンまたはＩｇＧに結合したナノボディなど）はエンドソームコンパートメントに入った後、それはエンドソームの酸性ｐＨ（ｐＨ６近く）にさらされて、それはアルブミンについてのコンディショナルなアミノ酸配列の親和性の低下を招く。また、アルブミンへの結合における（さらなる）減少は、プロテアーゼ感受性における増大を伴いうる。
【０２６５】
本発明は特定の機構または説明に限定されないが、滴定成分がアルブミンとの相互作用に関与する、または酸性ｐＨがＫｄに影響を与える構造調節を誘導する場合、ＫｄがｐＨの影響を受けると予測される。本発明によると、これによって本発明のアミノ酸配列（またはそれを含む化合物）のｔ１／２が大幅に増大される。
【０２６６】
このように、本発明の非限定的な態様によると、本発明のアルブミン結合コンディショナル結合剤（またはそれを含む化合物）の半減期の延長は、結合分子の限定的な分画のみがアルブミンから解離するようなあまり好ましくないエンドソームの条件下で、血清ｐＨ（７．２〜７．４）でのアルブミンについてのその結合強度を増大することにより；および／または血清ｐＨでのアルブミンについてのその結合強度は増大しないが、エンドソームの条件下での結合強度を増強することによって得られる。ここでも、本発明によると、この教示はアルブミンに限定されないが、ＩｇＧなどの他の血清タンパク質へ結合する分子にも適用できる。
【０２６７】
本発明のこの特別な態様を非限定的な図１において図式的に描く。ＦｃＲｎに結合する様々な血清タンパク質の相互作用はｐＨに敏感であることが知られていることは周知である（図１の相互作用１）。結果的に、複合的な結合タンパク質、抗原および血清タンパク質の間の複合体は、ピノサイトーシスおよびｐＨの下落の後、血清タンパク質を介してＦｃＲｎに結合し、その構成要素は分解からサルベージされる（図２）。
【０２６８】
本発明のコンディショナルな結合剤は、インターナリゼーション時の条件の変化にひとしく敏感であり、そのようなものとして結合抗原の半減期に影響を与える。本発明の本態様のいくつかの特定で、非限定的な例として、この複合結合タンパク質、抗原または血清タンパク質の相互作用（図１のそれぞれ相互作用３と２）は、インターナリゼーション時の条件における変化に「感受性」である場合とない場合がある。これは、代表的な、しかし、非限定的な例により表１、２および３にもまとめており、ここではコンディショナルな結合剤は、ｐＨ６では相互作用はなく、ｐＨ７．４では相互作用が１００%であり、これらの原理が両方の条件の間の１０倍、１００倍または１０００倍を表す好ましい相互作用に適用されることが理解される。ｐＨ６．０が「酸性ｐＨ」を表示すること、および、この条件がＫａｍｅｉら（２００５）が示唆した５から６の範囲のエンドソームｐＨを意味しうることも明らかなはずである。
【０２６９】
インターナリゼーション後、本発明のアミノ酸配列、血清タンパク質および／または抗原（第２の目的とする、または所望の化合物として）の間の相互作用は、（本発明の化合物と血清タンパク質または抗原の間の相互作用の少なくとも１つが影響を受けるという条件で）、インターナリゼーション時に本質的に影響を受けず、弱められず、または強化されない。相互作用２と３のいずれもインターナリゼーション時の条件の変化に敏感ではなく、循環において形成する、抗原、複合結合タンパク質および血清タンパク質の間の複合体が、血清タンパク質のＦｃＲｎとの相互作用に起因して（例えば、ＦｃＲｎとの相互作用を可能にする、ＩｇＧまたは血清アルブミン上の部位との相互作用により）大半が再循環される。
【０２７０】
第１の非限定的な例を表１のケースＢとして描いている：このケースにおいて、第１の結合タンパク質とその抗原の間の相互作用は、ｐＨの減少時に失われ、エンドソームコンパートメント中に放出される。結果的に、抗原自体が分解されるが、複合結合タンパク質は分解から救出される。そのようなアプローチを使用して、循環における複合結合タンパク質‐Ａｇ複合体の蓄積を回避できる。そのような複合体は、（例えば、いくつかの抗ＴＮＦ遮断薬と共に）薬剤の増量を必要とすることのある抗原のシンクを形成する。別の利点は、複合結合タンパク質が再循環され、これにより再循環されない分子として頻回の注射や高用量は必要なくなる。この選択的な除去によって薬剤自体が再循環され（例えば、ナノボディ融合体）、ナノボディ融合体自体が排除される場合、循環からのより効率的なクリアランスが可能になる。この例によると、循環からの抗原の効率的なクリアランスのこの経路では、エフェクターＦｃ部分のない結合タンパク質（例えば、ナノボディ、ドメイン抗体または他の分子）の使用が好まれ、相互作用を介して、Ｆｃガンマ受容体が抗体依存的細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または抗体依存的細胞媒介性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）および関連するＩｇＧ複合体のクリアランスを媒介する（Lovdal et al., 2000）。また、より少ない薬剤はＭＨＣクラスＩＩ提示を導くタンパク質分解的切断およびエンドソームプロセシングの傾向があるため、薬剤の再循環はその免疫原性にプラスの影響を与えうる。両方の特色が薬剤の有効性に寄与しうる。
【０２７１】
別の非限定的な例は表１のケースＣとして描く。生理学的ｐＨで、循環における複合結合タンパク質の抗原への結合は認められないが、しかし、ピノサイトーシス後には認められる。このコンパートメントにおける特定の取り込みが好まれる場合、例えば、循環における抗原との相互作用が好ましくない方法（立体障害に起因して複合結合タンパク質の抗原機能との干渉）でその機能に影響を与えうる場合、そのような設定が有用である。その血清タンパク質との相互作用に起因してそれ自体が寿命の長い分子である複合タンパク質による低ｐＨでの結合の結果は、抗原が分解から保護され、分解から救出されうることである。しかし、それが細胞から放出されるとすぐに、それは複合タンパク質から離れ、独立した分子として機能できる。例えば、そのような設定を使用して、内因性に存在するサイトカインまたはホルモンの半減期を増大できうる。
【０２７２】
さらなる別の非限定的な例（表２のケースＤ、ＥおよびＦ）において、第２結合タンパク質と血清タンパク質の間の相互作用は、ｐＨの７．４から６．０への下落時に低減される。結果的に、複合結合タンパク質の複合体（それに結合した抗原を有する、または伴わない）のピノサイトーシス後、複合結合タンパク質はＦｃＲｎについての結合親和性を緩め、または、受容体をサルベージし、エンドソームコンパートメントにおいて破壊される。抗原の半減期の延長がサイズの増大に限定され、再循環が望ましくない場合（例えば、抗原が異なる方法で除去されることが好まれる細菌またはウイルスである場合）、そのような相互作用が使用されると予想できる。このアプローチは、循環抗原（サイトカイン、毒素）の迅速破壊にも適切になりうる。表２の３つの異なるケースは、起こることが、ｐＨの変化（Ｄ）に感受性ではなく、またはｐＨ７．４と６．０の間で変化しない複合結合タンパク質の抗原との相互作用であることを描く（ケースＥおよびＦ）。
【０２７３】
ケースＦの価値のある適用は、本発明のアミノ酸配列もしくは化合物または例えばＲａｂ１１  ＧＴＰａｓｅ（Ward et al. 2005）標的とする他の結合分子を介したエンドソームコンパートメントの運命の制御であり、エキソサイトーシスまたはＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅと干渉して、エンドソーム酸性化を増強する（Rybak et al., 1997）。また、例えば、高過ぎるレベルの血清（ＩｇＧまたはアルブミン）が病気または他の状態に関連する患者において存在する場合、分解のリソソーム経路が増強されうる。あるいは、この適用は、（例えば、抗体の望ましくない副作用を避けるために）その作用が小さな時間窓に限定されるべき先に投与された抗体を迅速に除去するために価値があり得る。複合結合タンパク質の投与により、結合分子（ナノボディ、ドメイン抗体または他の分子）は、糸球体ろ過による迅速クリアランスが妨げられ、エンドソームにおける作用に入り、その時点で、目的とする作用がいずれにせよ全エンドソーム内容物のリソソーム分解経路への再ルーティングであるため、担体（例えば、ＩｇＧまたはアルブミン）に結合したままである必要はない。
【０２７４】
別の非限定的な例（表３のケースＧ、ＨおよびＩ）では、第２結合タンパク質と血清タンパク質の間の相互作用は、７．４から６．０へのｐＨの下落時に増大する。例えば、生理学的ｐＨでの結合タンパク質の血清タンパク質への結合がほとんどない、またはない場合、循環において、結合タンパク質は自由に抗原と相互作用し、この相互作用は血清タンパク質へのいかなる相互作用の影響も受けない。後者の相互作用はある立体障害を引き起こし、抗原‐複合結合タンパク質の複合体の薬物動態を阻害し、または複合タンパク質へ結合した抗原の機能を阻害しうる。抗原−複合結合タンパク質のインターナリゼーション後、複合体は  インターナライズされ、ｐＨが低下し、好ましくはｐＨ６．０で、複合結合タンパク質の第２結合部位の結合が十分になり、分解から複合結合タンパク質をサルベージする。そのような場合、複合結合タンパク質に結合した抗原は、保持できる（ケースＧ）、または分解のために放出できる（ケースＨ）。最後の一ケース（ケースＩ）では、抗原への結合は低ｐＨで生じ、それは複合結合タンパク質によって取り返すことに起因するエンドソームコンパートメントのコンパートメント中に放出された細胞内タンパク質を取り返すための経路になりうる。
【０２７５】
本発明のこれらの態様および例では、本発明のアミノ酸配列または化合物自体の結合は、それ自体で抗原の偏ったクリアランスを誘導するのに十分であり得るが、しかし、好ましくは、例えば、定期的にインターナライズされ、エンドソームコンパートメントを介して除去される、細胞表面標的（好ましくはＦｃＲｎ）を認識する本発明の別のアミノ酸配列または化合物により、または、エンドソームコンパートメントを介して循環される循環において存在する因子の認識を介して、本発明のアミノ酸配列または化合物および抗原の複合体は、エンドソームコンパートメントへ能動的に標的化される。この細胞表面標的がＦｃＲｎであること、または血清タンパク質がＩｇＧもしくはアルブミン、またはトランスフェリンであることが好まれる。
【０２７６】
本発明は、さらなる態様では、その相互作用、例えば、インターナリゼーション時の環境変化に感受性である抗原および／または血清タンパク質への結合タンパク質を生成するための方法を包含する。抗体−抗原相互作用はバッファー条件、ｐＨ、およびイオン強度の変化にしばしば敏感であることが知られているが、しかし、それらの変化はスコア化または検討されないことがほとんどで、変化が全般的に予想できないため、それらを薬物治療の設計に使用することはあまりない。
【０２７７】
望ましい結合特性を有する結合タンパク質は、例えば、感受性の相互作用の発生について結合タンパク質のレパートリーをスクリーニングすることにより、例えば、２つの代表的な条件（例えば、ｐＨ７．４およびｐＨ６．０）での相対的結合強度が決定された結合アッセイを実施することにより見出される。相対的相互作用のそのような強度は、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ法、スキャチャード解析などを含む、任意の適切な結合テストにより測定できる。そのようなテストによって、どの結合タンパク質が選ばれたパラメーター（ｐＨ、イオン強度、温度）に敏感である相互作用を表示するのか、およびその程度が明らかになる。
【０２７８】
本発明のコンディショナルな結合剤は、あるいは、望ましい感受性について優先的に濃縮する選択条件を使用して、例えばファージ、リボソーム、酵母、または細胞のライブラリーから結合タンパク質のレパートリーを選択することにより生成される。ファージ抗体ライブラリーを生理的ｐＨでインキュベートし、ｐＨを６．０に変えるだけで結合したファージ粒子を溶出することによって、ｐＨに敏感な相互作用を有するファージが溶出される。同様に、イオン強度における変化（例えば、１５０mMから１．０mMのＮａＣｌまたはＫＣｌ）を用いて、これらの相互作用に非常に敏感な相互作用を同定できる。Ｃａ２＋濃度に敏感な条件が等しく重要である。例えば、Christensenら（２００１）は、ｐＨが新たに形成したピノソームにおいて７．２から６．２に低下する際の［Ｃａ２＋］ｐｉｎｏにおける２桁の減少、それに続くピノソームが成熟する際の［Ｃａ２＋］ｐｉｎｏの有意な上昇を観察しており、低カルシウム濃度が早期エンドソームの異なる生理学的特色であることを意味する。
【０２７９】
望ましい結合特性を有するコンディショナルな結合タンパク質は、さらに、推定結合部位を操作して、特定の「感受性」相互作用において好ましいアミノ酸残基または配列、例えば、ｐＨ感受性のためのヒスチジンを含むようにしたデザイナータンパク質ライブラリーから単離できる。例えば、ＦｃＲｎとＩｇＧの間の相互作用は精巧にｐＨに敏感であり、ｐＨがｐＨ６．０〜７．０まで上昇するにつれて２桁を超えて低下することが知られている。親和性転移の主な機構的基礎は、結合部位のヒスチジン含量である：ヒスチジン残基のイミダゾール側の変化は、通常、ｐＨ範囲６．０〜７．０にわたり脱プロトン化する。推定結合部位におけるヒスチジンの含有（例えば、ライブラリーにおいてこの残基を優先的に取り込むオリゴヌクレオチドを使用する）は、ｐＨに敏感な相互作用を有する結合タンパク質を高頻度にもたらすと予測される。
【０２８０】
用いてきた用語および表現は、説明の用語として使用され、限定されるものでなく、そのような用語および表現を使用する際に、示し、記載した特徴またはその一部の任意の同等物を除外する意図はないので、本実施態様の範囲内において様々な改変が可能であることが認識されている。
【０２８１】
本明細書に記載する参考文献すべては、特に本明細書の上で参照された教示について、参照により組み入れられる。
【実施例】
【０２８２】
実施例１：コンディショナルな血清アルブミン特異的ナノボディの同定
獣医学部倫理委員会（University Ghent、ベルギー）の承認後、標準的プロトコールに従って、２匹のラマ（１１７、１１８）にヒト血清アルブミンならびにマウス血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミンおよびヒヒ血清アルブミンの混合物での６回の筋内注射で、１週間間隔で交互に免疫する。
【０２８３】
ライブラリー構築
ラマにおいて適当な免疫反応が誘発される場合、最後の抗原注射から４日後、１５０mlの血液サンプルを採取し、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭで製造業者の指示に従って、密度勾配遠心分離法により精製する。次に、全ＲＮＡをこれらの細胞から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲのための出発材料として使用して遺伝子フラグメントをコードするナノボディを増幅する。これらのフラグメントをファージミドベクターｐＡＸ５０中にクローニングする。ファージを標準方法（例えば、本明細書に引用する先行技術および出願者が出願する出願書類を参照する）に従って調製し、さらなる使用のために４℃で保存する。
【０２８４】
選択
血清アルブミンへの結合についてのレパートリーの選択
第１選択において、ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａ−８７６３）をＭａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）上に１００μg/mlで、室温で一晩コーティングする。プレートをＰＢＳ中の４%Ｍａｒｖｅｌで、室温で２時間ブロッキングする。ＰＢＳＴでの３回の洗浄後、ファージを４%  Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ中に加え、室温で１時間インキュベートする。十分な洗浄に続き、結合したファージを０．１Mトリエタノールアミン（ＴＥＡ）で溶出し、１M  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５で中和する。
【０２８５】
血清アルブミンへのコンディショナルな結合についてのレパートリーの選択
コンディショナルな結合剤、ｐＨに敏感な相互作用を有する前記結合剤について濃縮するために、ファージライブラリーを生理学的ｐＨで抗原とインキュベートし、以下の通りに、酸性ｐＨで溶出する。
【０２８６】
第１選択では、ヒト血清アルブミン（Sigma A-8763）をMaxisorp 96ウェルプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）上に１００μg/mlで、室温で一晩コーティングする。プレートをＰＢＳ  ｐＨ７．３中の４%Ｍａｒｖｅｌで、室温で２時間ブロッキングする。ＰＢＳ／０．０５%  Ｔｗｅｅｎ２０  （ＰＢＳＴ）  ｐＨ７．３での５回の洗浄後、ファージを２%  Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ  ｐＨ７．３中に加え、室温で２時間インキュベートする。未結合ファージをＰＢＳＴ  ｐＨ７．３での１０回の洗浄、続いてＰＢＳ  ｐＨ５．８での２回の洗浄により除去する。結合ファージをＰＢＳ  ｐＨ５．８を室温で３０分間溶出し、１M  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５で中和する。
【０２８７】
第２選択では、ｐＨ７．３に調整した２%  Ｍａｒｖｅｌｌ／ＣＰＡバッファー（１０mMクエン酸ナトリウム  ＋  １０mMリン酸ナトリウム  ＋  １０mM酢酸ナトリウム  ＋  １１５mM  ＮａＣｌ）中のヒト血清アルブミンで、室温で２時間インキュベートする。未結合ファージをＣＰＡ／０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０  （ＣＰＡＴ）  ｐＨ７．３での１０回の洗浄、続いてＣＰＡＴ  ｐＨ５．８での２回の洗浄により除去する。結合ファージをＣＰＡ  ｐＨ５．８を室温で３０分間溶出し、１M  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７で中和する。
【０２８８】
第３選択戦略では、２%  Ｍａｒｖｅｌｌ／ＣＰＡ  ｐＨ５．８中のヒト血清アルブミンで、室温で２時間インキュベートする。未結合ファージをＣＰＡＴ  ｐＨ５．８での１０回の洗浄、続いてＣＰＡ  ｐＨ７．３での２回の洗浄により除去する。結合ファージを１mg/mlトリプシン／ＣＰＡ  ｐＨ７．３を室温で３０分間溶出する。
【０２８９】
第４選択戦略では、２%  Ｍａｒｖｅｌｌ／ＰＢＳ  ｐＨ５．８中のヒト血清アルブミンで、室温で２時間インキュベートする。未結合ファージをＰＢＳＴ  ｐＨ５．８での１０回の洗浄、続いてＰＢＳ  ｐＨ７．３での２回の洗浄により除去する。結合ファージを１mg/mlトリプシン／ＣＰＡ  ｐＨ７．３を室温で３０分間溶出する。
【０２９０】
全選択では、濃縮が観察される。各選択からの産出物を、発現ベクターｐＡＸ５１中にプールとしてリクローニングする。コロニーを選定し、９６ディープウェルプレート（容積１ml）中において増殖させ、ナノボディ発現のためにＩＰＴＧを加えることにより誘導させる。ペリプラズム抽出物（容積：〜８０μl）を標準方法に従って調製する（例えば、本明細書に引用する、先行技術および出願者が出願する出願を参照する）。
【０２９１】
ＥＬＩＳＡによるライブラリー評価
アルブミン特異性について、ヒト血清アルブミンでコーティングした固相上でＥＬＩＳＡにより個々のナノボディのペリプラズム抽出物をスクリーニングする。固定化ヒト血清アルブミンに結合したナノボディの検出は、ビオチン化マウス抗Ｈｉｓ抗体（Serotec MCA 1396B）を使用して行い、ストレプトアビジンＨＲＰ（DakoCytomation #P0397）で検出する。ＴＭＢ基質溶液（Pierce 34021）を加えることによりシグナルを発現させ、波長４５０  ｎｍで検出する。１回のパニング後、陽性クローンの高いヒット率をすでに得ることができる。図３は、典型的なＥＬＩＳＡの結果を例証している。
【０２９２】
ＥＬＩＳＡによる、ナノボディのアルブミンへのコンディショナルな、またはｐＨに敏感な結合について選択
コンディショナルな結合剤、ｐＨに敏感な相互作用を有する結合剤について濃縮するために、ファージライブラリーを生理学的ｐＨで抗原とインキュベートし、以下の通りに、酸性ｐＨで溶出できる。
【０２９３】
第１選択戦略では、ヒト血清アルブミン（Sigma A-8763）をMaxisorp 96ウェルプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）上に１００μg/mlで、室温で一晩コーティングする。プレートをＰＢＳ  ｐＨ７．３中の４%  Ｍａｒｖｅｌで、室温で２時間ブロッキングする。ＰＢＳ／０．０５%  Ｔｗｅｅｎ２０  （ＰＢＳＴ）  ｐＨ  ７．３での５回の洗浄後、ファージを２%  Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ  ｐＨ７．３中に加え、室温で２時間インキュベートする。未結合ファージをＰＢＳＴ  ｐＨ７．３での１０回の洗浄、続いてＰＢＳ  ｐＨ５．８での２回の洗浄により除去する。結合ファージをＰＢＳ  ｐＨ５．８を室温で３０分間溶出し、１M  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５で中和する。
【０２９４】
第２選択戦略では、ｐＨ７．３に調整した２%  Ｍａｒｖｅｌｌ／ＣＰＡバッファー（１０mMクエン酸ナトリウム  ＋  １０mMリン酸ナトリウム  ＋  １０mM酢酸ナトリウム  ＋  １１５mM  ＮａＣｌ）中のヒト血清アルブミンで、室温で２時間インキュベートする。未結合ファージをＣＰＡ／０．０５%  Ｔｗｅｅｎ２０  （ＣＰＡＴ）  ｐＨ７．３での１０回の洗浄、続いてＣＰＡＴ  ｐＨ５．８での２回の洗浄により除去する。結合ファージをＣＰＡ  ｐＨ５．８を室温で３０分間溶出し、１M  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７で中和する。
【０２９５】
第３選択では、２%  Ｍａｒｖｅｌｌ／ＣＰＡ  ｐＨ５．８中のヒト血清アルブミンで、室温で２時間インキュベートする。未結合ファージをＣＰＡＴ  ｐＨ５．８での１０回の洗浄、続いてＣＰＡ  ｐＨ７．３での２回の洗浄により除去する。結合ファージを１mg/mlトリプシン／ＣＰＡ  ｐＨ７．３を室温で３０分間溶出する。
【０２９６】
第４選択戦略では、２%  Ｍａｒｖｅｌｌ／ＰＢＳ  ｐＨ５．８中のヒト血清アルブミンで、室温で２時間インキュベートする。未結合ファージをＰＢＳＴ  ｐＨ５．８での１０回の洗浄、続いてＰＢＳ  ｐＨ７．３での２回の洗浄により除去する。結合ファージを１mg/mlトリプシン／ＣＰＡ  ｐＨ７．３を室温で３０分間溶出する。
【０２９７】
全選択では、濃縮が観察される。各選択からの産出物を、発現ベクターｐＡＸ５１中にプールとしてリクローニングする。コロニーを選定し、９６ディープウェルプレート（容積１ml）中において増殖させ、ナノボディ発現のためにＩＰＴＧを加えることにより誘導させる。ペリプラズム抽出物（容積：〜８０μl）を標準方法に従って調製する（例えば、本明細書に引用する、先行技術および出願者が出願する出願を参照する）。
【０２９８】
表面プラズモン共鳴（BIAcore）を介したｐＨに敏感な相互作用の発生についてのナノボディレパートリーのスクリーニング
活性化のためのＮＨＳ／ＥＤＣおよび非活性化のためのエタノールアミンを使用し、アミン結合を介してCM5センサーチップ（Biacoreamine coupling kit）表面上にヒト血清アルブミンを固定化する。
【０２９９】
約１０００ＲＵのヒト血清アルブミンを固定化する。実験は２５℃で実施する。ナノボディのアルブミン（Biacore）へのｐＨ依存的結合のために使用するバッファーは以下の通りである：１０mMクエン酸ナトリウム（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７）＋  １０mMリン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）＋１０mM酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）＋  １１５mM  ＮａＣｌＨＣｌまたはＮａＯＨを加えることにより、この混合物をｐＨ７、ｐＨ６、およびｐＨ５にする（測定する混合物のｐＨに依存する）。
【０３００】
ペリプラズム抽出物をｐＨ７、ｐＨ６、およびｐＨ５のランニングバッファー中に希釈する。活性化およびレファレンスの表面全体に流速４５μl／分で１分間サンプルを注入する。それらの表面は、グリシン−ＨＣｌ  ｐＨ１．５  ＋  ０．１%  Ｐ２０の３ｓパルスで再生する。BiacoreT100評価ソフトウェアを使用して評価を行う。
【０３０１】
ｐＨ７およびｐＨ５での異なるナノボディのｏｆｆ速度を表１に記録する。ナノボディの大半（４Ａ２、４Ａ６、４Ｂ５、４Ｂ６、４Ｂ８、４Ｃ３、４Ｃ４、４Ｃ５、４Ｃ８、４Ｃ９、４Ｄ３、４Ｄ４、４Ｄ７および４Ｄ１０）は、ｐＨ７と比較し、ｐＨ５でより速いｏｆｆ速度を有する（ｏｆｆ速度において２−６倍の差）。ナノボディ４Ａ９は、ｐＨ７と比較し、ｐＨ５でより遅いｏｆｆ速度を有する（ｏｆｆ速度において０．５４倍の差）。４Ｃ１２、４Ｂ１、４Ｂ１０、ＩＬ６Ｒ２０２、Ａｌｂ−８および４Ｄ５を含む他のナノボディについて、抗原への結合は異なるｐＨで変化しない。
【０３０２】
抗原へのコンディショナルな結合についてのナノボディのレパートリーの直接スクリーニング法をこのようにして使用できる。
【０３０３】
ＥＬＩＳＡによるナノボディのコンディショナルな結合に対するスクリーニング
コンディショナルなアルブミンへの結合についてナノボディをスクリーニングするために、２つの代表的な条件、ｐＨ５．８およびｐＨ７．３ならびに測定された相対的結合強度でも結合ＥＬＩＳＡを実施できる。Maxisorbマイクロタイタープレート（Nunc,Article No 430341）を重炭酸バッファー（５０mM、ｐＨ９．６）中の１μg/mlヒト血清アルブミン溶液１００μlにより４℃で一晩コーティングする。コーティング後、プレートを０．０５%  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）により３回洗浄し、２%  Ｍａｒｖｅｌを含むＰＢＳ（ＰＢＳＭ）により室温（ＲＴ）で２時間ブロッキングする。ブロッキング工程後、コーティングしたプレートをＰＢＳＴ  ｐＨ  ５．８で２回洗浄し、ＰＢＳＭ  ｐＨ５．８（１００μl）中の各ペリプラズムサンプルの１０倍希釈の一定分量をコーティングしたプレートに移し、ＲＴで１時間結合させる。サンプルのインキュベート後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、２%  ＰＢＳＭ中の１：１０００希釈マウス抗ｍｙｃ抗体１００μlによりＲＴで１時間インキュベートする。ＲＴでの１時間後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼで抱合したヤギ抗マウス抗体の１：１０００希釈液１００μlとインキュベートする。１時間後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、Slow TMB(Pierce, Article No. 34024）１００μlとインキュベートする。２０分後、反応を１００μlのＨ２ＳＯ４で停止する。各ウェルの吸光度を４５０nmで測定する。
【０３０４】
本明細書に記載するコンディショナルな選択の戦略のそれぞれについての９２のペリプラズムペリプラズム抽出物をこのＥＬＩＳＡにおいて解析する。図６は、中性ｐＨ、つまりｐＨ７．４ではヒト血清アルブミンにコンディショナルに結合するが、しかし、酸性pH、つまりｐＨ５．８ではしないナノボディについての結果を描く。図７は、酸性ｐＨ、つまりｐＨ５．８ではヒト血清アルブミンにコンディショナルに結合するが、中性ｐＨ、つまりｐＨ７．４では結合しないナノボディについての結果を図示する。
【０３０５】
ヒト血清アルブミンでの１回の選択、それに続く全溶出時に、酸性ｐＨ（ｎ＝１６）または中性ｐＨ（ｎ＝１９）のいずれかでコンディショナルに結合するナノボディを同定する。選択条件をコンディショナルな結合に促進させることによって、結果的に高い割合のコンディショナルに結合するナノボディがもたらされる（ｎ＝２３）。
【０３０６】
実施例２：ナノボディの薬物動態学的動態に及ぼすコンディショナルな結合の効果の解析
１．二重特異的ナノボディフォーマットの構築
Ｃ末端コンディショナルＨＳＡ結合ナノボディ、９アミノ酸Ｇｌｙ／ＳｅｒリンカーおよびＮ末端抗標的ナノボディからなる二重特異的ナノボディを例えば生成する。これらのコンストラクトをｃ−ｍｙｃ、Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質として大腸菌内で発現させ、続いて固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）により培養液から精製できる。
【０３０７】
２．多特異的フォーマットへフォーマット化する際のコンディショナルな結合の保持
多特異的ナノボディフォーマット内での抗ＨＳＡナノボディまたはｄＡｂのコンディショナルなｐＨ結合特性を、表面プラズモン共鳴（BIAcore）を介して評価し、例えば、本出願において開示するコンディショナル結合剤を、１つ以上のタンパク質標的に結合する１つ以上のナノボディまたはｄＡｂに連結する。カニクイザル血清アルブミンへの交差反応性も評価する。活性化のためのＮＨＳ／ＥＤＣおよび非活性化のためのエタノールアミンを使用し、アミン結合を介してＣＭ５センサーチップ（Biacore amine coupling kit）表面上にヒトおよびカニクイザルの血清アルブミンを固定化する。
【０３０８】
実験は２５℃で実施する。ナノボディのアルブミン（Biacore）へのｐＨ依存的結合のために使用するバッファーは以下の通りである：１０mMクエン酸ナトリウム（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７）＋  １０mMリン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）＋１０mM酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）＋  １１５mM  ＮａＣｌ。ＨＣｌまたはＮａＯＨを加えることにより、この混合物をｐＨ７、ｐＨ６、およびｐＨ５にする（測定する混合物のｐＨに依存する）。
【０３０９】
精製ナノボディをｐＨ７、ｐＨ６、およびｐＨ５のランニングバッファー中に希釈する。活性化およびレファレンスの表面全体に流速４５μl／分で１分間サンプルを注射する。それらの表面は、グリシン−ＨＣｌ  ｐＨ１．５  ＋  ０．１%  Ｐ２０の３ｓパルスで再生する。BiacoreT100評価ソフトウェアを使用して評価を行う。
【０３１０】
３．カニクイザルにおける二特異的ナノボディフォーマットの薬物動態プロファイル
薬物動態試験をカニクイザルにおいて実施する。ナノボディ（例えば、ＩＬ６Ｒ−  ４Ｄ１０、つまり９アミノ酸ＧｌｙＳｅｒリンカーを介してコンディショナルなアルブミン結合ブロックに連結したＩＬ−６受容体結合ブロック）を左または右腕の橈側皮静脈におけるボーラス注入（１．０ml/kg、約３０秒）により静脈内投与して、２．０mg/kgの用量を得る。血漿サンプルにおけるナノボディ濃度を、ＥＬＩＳＡを介して測定する。
【０３１１】
血漿サンプル中の濃度を以下の通りに測定する：Maxisorbマイクロタイタープレート（Nunc,Article No. 430341）を重炭酸バッファー（５０mM、ｐＨ  ９．６）中の５μg/ml  １２Ｂ２−ＧＳ９−１２Ｂ２（Ｂ２＃１３０２ｎｒ４．３．９）溶液１００μlにより４℃で一晩コーティングする。コーティング後、プレートを０．１%  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳにより３回洗浄し、１%カゼインを含むＰＢＳ（２５０μl/ウェル）により室温（ＲＴ）で２時間ブロッキングする。血漿サンプルおよびナノボディスタンダードの連続希釈液（１００%プールブランクカニクイザル血漿中でスパイクする）を別々のコーティングしていないプレート（Nunc, Article No. 249944）においてＰＢＳ中に希釈し、ＰＢＳ中の１０%プールカニクイザル血漿から成る最終サンプルマトリクスにおいて所望の濃度／希釈を得る。すべての前希釈物を未コーティングプレートにおいてＲＴで３０分間インキュベートする。ブロッキング工程後、コーティングしたプレートを３回洗浄し（０．１%  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）、各サンプル希釈物の一定分量（１００μl）をコーティングしたプレートに移し、ＲＴで１時間結合させる。サンプルのインキュベート後、プレートを３回洗浄し（０．１%  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）、ＰＢＳ中の１００ng/ml  ｓＩＬ６Ｒ溶液（Peprotech,Article No. 20006R）１００μlによりＲＴで１時間インキュベートする。ＲＴでの１時間後、プレートを３回洗浄し（０．１%  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）、１%カゼインを含むＰＢＳ中のビオチン化ポリクローナル抗ＩＬ６Ｒ抗体の２５０ng/ml溶液１００μlとインキュベートする（R&D systems, Article No.BAF227）。３０分間（ＲＴ）のインキュベート後、プレートを３回洗浄し（０．１%  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）、西洋わさびペルオキシダーゼで抱合したストレプトアビジン（DaktoCytomation, Article No. P0397）の１／５０００希釈液（１%カゼインを含むＰＢＳ中）１００μlとインキュベートする。３０分後、プレートを３回洗浄し（０．１%  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）、Slow TMB（Pierce, Article No. 34024）１００μlとインキュベートする。２０分後、反応を１００μlのＨＣｌ（１N）で停止する。各ウェルの吸光度を４５０nmで測定し（Tecan Sunrise分光光度計）、６２０nmの吸光度で補正する。このアッセイでは、遊離ナノボディならびにｓＩＬ６Ｒおよび／またはカニクイザル血清アルブミンに結合したナノボディを測定する。各血漿サンプルにおける濃度は、各ナノボディの複合法面を有するシグモイド型標準曲線に基づいて測定する。
【０３１２】
それぞれの個々の血漿サンプルを２つの独立したアッセイにおいて解析し、薬物動態データ解析のために平均血漿濃度を算出する。
【０３１３】
すべてのパラメーターは、ツーコンパートメントモデリング（ｔｗｏ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ）により算出され、中心コンパートメントから除外する。
【０３１４】
表１．第１のアミノ酸配列と血清タンパク質の間ではなく、第２のアミノ酸配列と抗原の間のｐＨ依存的な相互作用。
【表１】
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【０３１５】
表２．第１のアミノ酸配列と血清タンパク質の間の相互作用が生理学的ｐＨで優先的に発生する。
【表２】
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注意：ｐＨ６．０は酸性の生理学的ｐＨ、つまり、５．５以下または以上でもあり得ることを意味しうる。ｐＨ７．４は中性の生理学的ｐＨ、つまり、（恐らくはおおよそ）７．２と７．４の間のｐＨでもあり得ることを意味し得る。
【０３１６】
表３．酸性ｐＨでのアミノ酸配列の血清タンパク質への優先的結合
【表３】
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注意：ｐＨ６．０は酸性の生理学的ｐＨ、つまり、５．５以上または以下でもあり得ることを意味しうる。ｐＨ７．４は中性の生理学的ｐＨ、つまり、（恐らくはおおよそ）７．２と７．４の間のｐＨでもあり得ることを意味し得る。
【０３１７】
表４．ｐＨ７およびｐＨ５での異なるナノボディ(登録商標)のｏｆｆ速度（Biacoreにより測定）を記録する。
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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