(57)【要約】本発明群は、医療技術、すなわち腫瘍を患った患者に行う免疫療法に属する。主成分として腫瘍表面抗原を有する本発明の抗腫瘍ワクチンは、腫瘍表面抗原の混合物を含有する。本発明の抗腫瘍ワクチンの調製方法は、腫瘍細胞の培養及び腫瘍表面抗原の単離を含む。事前に生きた腫瘍細胞の初代培養物から成長培地を洗い流し、次に細胞を殺さないプロテアーゼの作用に曝露し、放出された腫瘍表面抗原を回収する。細胞による腫瘍表面抗原の回復に必要な時間が経ってから、生きた腫瘍細胞の初代培養物の処理を繰り返す。ワクチン接種に十分な用量が得られるまで腫瘍表面抗原を収穫し、これらの腫瘍表面抗原の組成を管理する。プロテアーゼとしては、トリプシンを使用することができる。抗腫瘍治療の実行方法は、抗腫瘍ワクチンを患者の生体に注射することを含む。本発明群の使用により得られる技術的成果は、抗腫瘍免疫応答の強化による、腫瘍学的な疾患の治療の有効性の強化から成る。【選択図】図１
2010530843.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍表面抗原を基礎とした抗腫瘍ワクチンであって、前記ワクチンが腫瘍表面抗原の混合物を含有しており、前記抗原は生きた腫瘍細胞の表面タンパク質から蓄積したペプチドであり、前記生きた腫瘍細胞の初代培養物をプロテアーゼで周期的に、前記細胞が死なないように処理することで得たものであることを特徴とするワクチン。
【請求項２】
プロテアーゼとして選択したトリプシンの使用により得られる、請求項１に記載の抗腫瘍ワクチン。
【請求項３】
腫瘍細胞の培養及び腫瘍表面抗原の単離を含む抗腫瘍ワクチンの調製方法であって、成長培地を事前に洗い流した生きた腫瘍細胞の初代培養物を、細胞を殺さないプロテアーゼ処理に供し、放出された腫瘍表面抗原を回収し、細胞による腫瘍表面抗原の回復に必要な時間が経ってから、前記生きた腫瘍細胞の初代培養物の処理を繰り返し、ワクチン接種に十分な用量に達するまで前記腫瘍表面抗原を蓄積し、蓄積する腫瘍表面抗原の組成を管理することを特徴とする方法。
【請求項４】
前記プロテアーゼとしてトリプシンを使用する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
抗腫瘍免疫療法の実行方法であって、腫瘍表面抗原の混合物から得られるワクチンを患者の生体に注射することを含み、前記抗原は腫瘍細胞の表面タンパク質から得られるペプチドであり、前記腫瘍表面抗原の混合物を使用する方法であり、前記抗原は生きた腫瘍細胞の表面タンパク質から蓄積したペプチドであり、前記生きた腫瘍細胞の初代培養物をプロテアーゼで周期的に、前記細胞が死なないように処理することで得たものである方法。
【請求項６】
前記プロテアーゼとしてトリプシンを使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
患者自身の腫瘍細胞の腫瘍表面抗原を使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
別の患者の腫瘍細胞からの腫瘍表面抗原を使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
アジュバントを抗腫瘍ワクチンの組成物中に使用する、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明群は、医療技術、すなわち腫瘍を患った患者に行う免疫療法に属し、腫瘍学的な疾患の治療及びその再発防止を目的として、医療分野において用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
外科的な方法、化学療法及び放射線療法による腫瘍学的な疾患の治療には限界があることから、腫瘍を患っている患者のための新しい治療方法を見つけることが最も求められている。特に、免疫療法の手法の開発の展望は良いと信じられており、免疫療法の原理は、ヒトの免疫に生来備わっている抗腫瘍防御力の強化である。
【０００３】
免疫療法の効果的な手法の１つは、ワクチン接種と考えられており、その有効性は、ワクチン組成物中に存在する又はワクチン製造の様々な段階において必要とされる（例えば、抗イディオタイプ抗体、樹状細胞等を基礎として調製したワクチン）腫瘍抗原によって引き起こされる免疫応答の強度によって決まる。このため、腫瘍抗原の単離が、抗腫瘍ワクチン開発のための必要前提条件となる。
【０００４】
様々な抗腫瘍ワクチンの調製方法がよく知られている。
【０００５】
一部のワクチンは、腫瘍細胞（ＴＣ）の特定の抗原、すなわちペプチド、熱ショックタンパク質、多糖類及びその他の物質を用いて調製される。特に、合成により腫瘍ペプチド抗原を製造する方法がよく知られている。このようにして、９個のアミノ酸長さの合成ペプチドから成るワクチンは、骨髄性白血病の患者に行った臨床試験中に良好な結果を示した（Williams R., "Harnessing the Immune System: The Promise and  Potential of Cancer Vaccines", Oncolog., 2005, v. 50, No.4）。その他のペプチドの結果にはばらつきがあった。例えば、予備試験での結果が良好であったｇｐ１００タンパク質のペプチドは、患者における腫瘍発現を阻むに十分な免疫応答を引き起こさなかった（Yu Z., Restifo N.P., "Cancer Vaccines: Progress Reveals New  Complexities",J.Clin. Invest., 2002, v.110, 289-294）。
【０００６】
免疫応答を刺激する抗原として腫瘍の糖鎖を用いる方法がよく知られている。しかしながら、同様の抗原の有効性は、単一の腫瘍細胞及び早期転移の場合でしか実証されていない（Franco A., "CTL-Based cancer Preventive/Therapeutic Vaccines  for Carcinomas: Role of Tumour-Associated Carbohydrate  Antigens", Scand.  J.Immunol., 2005, v.
61, 391-397）。
【０００７】
特定の抗原を基礎としたワクチンには根本的な欠点があることに留意する必要がある。腫瘍細胞は複数の抗原によって特徴づけられるだけでなく、その高い変異率及び生体において絶え間なく作用している細胞選択メカニズムは、新しい抗原の出現と、既に存在している腫瘍細胞の抗原の変化をもたらす。このため、自家ワクチン（患者自身の腫瘍細胞を基礎としたワクチン）を使用する利点は明らかであり、自家ワクチンはその患者の腫瘍の発現を識別する、個別かつ疾患の段階に特異的な抗原を含む、免疫応答を誘発する全ての抗原を含有する。
【０００８】
エキソソームを用いた腫瘍抗原の調製方法がよく知られている。エキソソームは、直径数ナノメートルの膜小胞であり、腫瘍細胞（例えば、論文Wolfers J. et al., "Tumor-derived exosomes are a source of  shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming",Nat.Med.,2001,  v. 7, 297-303を参照のこと）、Ｔ−及びＢ−リンパ球（Raposo G. et al.,"B  lymphocytes secrete antigenpresenting  vesicles",J.Exp.Med.,1996,
v.183,1161-1172）及び樹状細胞（Zitvogel  L.et  al.,"Eradication of established  murine tumors using a novel cell-free  vaccine:dendritic  ell-derived  exosomes",Nature  Med.,1998, v.4,594-600）を含む多くの種類の細胞によって分泌される。
【０００９】
この方法の欠点は、免疫療法を行うにあたっての抗原候補である表面タンパク質でのエキソソームの富化レベルが低いことである。エキソソームは、主に、サイトゾルタンパク質及びエンドソームコンパートメントのタンパク質を含有していることが知られている（例えば、論文Thery C.et al.,“Exosomes:composition,biogenesis  and  function”Reviews  Immunology,2002,v.2,569-579を参照のこと）。この方法のよく知られている第２の欠点はエキソソームの蓄積に長時間を要することであり、成長培地中に腫瘍細胞の存在を必要とし、また成長培地成分から抗原を精製する必要がある。
【００１０】
抗原それ自体の代わりに抗原をコードするＤＮＡを生体に導入する抗腫瘍ワクチン調製方法がよく知られている。抗原提示細胞はＤＮＡを吸収し、腫瘍抗原を産生し、その腫瘍抗原を主要組織適合性複合体と結合させて細胞表面で提示すると、細胞障害性Ｔリンパ球を活性化させることができる。このため、ウィルスベクターを基礎としたワクチンを用いて、動物モデルでは良好な結果が得られた（例えば、論文Yu Z., Restifo N.Р., "Cancer  Vaccines:Progress Reveals New  Complexities",J.Clin.  Invest, 2002, v. 110, 289-294を参照のこと）。
【００１１】
この方法の欠点は、ウィルスベクターそれ自体によって誘発される免疫系の反応であり、ヒトへの抗腫瘍ワクチン接種の明白なプラス効果が現れない。
【００１２】
患者自身の腫瘍（自家ワクチンの場合）及び他の患者の腫瘍（同種異系ワクチンの場合）から得た全腫瘍細胞の抗原としての使用を前提とした抗腫瘍ワクチンの調製方法がよく知られている。細胞は、電離放射線で事前に不活性化される。このようなワクチンの利点は、特定の抗原の同定及び単離の必要性がないことである。このため、アジュバントとしてのＢＣＧワクチンと混合した細胞が、結腸直腸がん、メラノーマ、腎癌に用いられた（Armstrong  А.С.,  Eaton D.,EwingJ.C.,"Cellular  Immunotherapy  for  Cancer",Brit.Med.J.,2001,v.3323,1289-1293を参照のこと）。
【００１３】
この方法の欠点は、腫瘍細胞の不活性化が必要なこと並びに全腫瘍細胞表面上にある抗原の、抗原提示細胞による貪食及びプロセシングに対する適性が低いことである。
【００１４】
米国特許第６０３９９４１号明細書により、免疫刺激活性を有する表面タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子操作による導入を通して得られた腫瘍細胞から、高免疫原性の抗腫瘍ワクチンを調製する方法がよく知られている。
【００１５】
この方法の欠点は、第１に、腫瘍細胞の不活性化が必要なことであり、第２に、腫瘍細胞表面上の抗原が、抗原提示細胞による貪食及びプロセシングにほとんど適していないことである。
【００１６】
国際出願第ＷＯ０２０５３１７６号パンフレットにより、培養した腫瘍細胞の溶解物を基礎とした抗腫瘍ワクチンの調製方法がよく知られている。これらのワクチンの利点は、電離放射線による不活性化を必要とせず、無傷の腫瘍細胞とは異なり、脱凝集細胞抗原が抗原提示細胞による貪食及びプロセシングに適しており、より顕著な免疫応答が得られることである。
【００１７】
この方法の欠点は、腫瘍細胞溶解物の大部分が細胞内タンパク質から成ること及びこれらのタンパク質によって引き起こされる免疫応答が抗腫瘍活性を有していないことであり、これは腫瘍細胞の細胞内タンパク質が、免疫系に関してアクセス不可能だからである。
【００１８】
この方法に最も近いものが（特許出願）、米国特許第５９９３８２９号明細書に記載の抗腫瘍ワクチンの調製方法である。腫瘍細胞の培養及びその表面抗原の単離を含む類似の方法は、米国特許第６３３８８５３号明細書、米国特許第５０３０６２１号明細書、米国特許第５６３５１８８号明細書にも記載されている。
【００１９】
周知の方法では、腫瘍細胞を血清を含有していない成長培地中で培養し、腫瘍細胞が培養過程において失うところの細胞表面抗原を成長培地から単離することを前提としている。精製後、回収した抗原を抗腫瘍ワクチンの抗原として使用する。このようなワクチンの利点は、細胞表面から得た腫瘍抗原の含有量が高いことであり、これらの腫瘍抗原は、（細胞内に隠れていないため）免疫系の作用に関してアクセス可能である。
・外部の影響に関係なく、培養腫瘍細胞により抗原が自然に失われるため、抗原の出力が低い；
・抗原を蓄積する工程は、成長培地での長時間にわたる腫瘍細胞のインキュベーションを前提としており（例えば、米国特許第６３３８８５３号明細書ではＲＰＭＩ−１６４０培地での３時間のインキュベーション）、４０種類を越える物質（アミノ酸、塩、緩衝剤、ビタミン、グルコース等）を含有し、また培養過程において腫瘍細胞が分泌する代謝産物及びその他の物質も含有する成長培地中での抗原の蓄積を想定していることから、所望の産物（抗原）の含有量が低く、不純物の量が多い材料が得られる；
・抗原混合物の組成分析が、成長培地の成分及び細胞代謝産物からの調製物の事前の精製を必要とする；
・ワクチン接種に必要な用量の抗原の単離は、長時間にわたる培養による腫瘍細胞の増殖を想定しており、これは抗原混合物の組成のゆがみにつながり、ワクチン接種の効果が低くなる；
・この方法では、ワクチン接種に必要な量の抗原を、腫瘍細胞の培養工程を通してしか得ることができず、つまり、この方法では単離した（培養していない）細胞からの抗原の抽出が不可能である；
・腫瘍細胞の培養に時間がかかり、かつ腫瘍表面抗原を精製する必要性があるため、ワクチンが高価である；
が、この方法の欠点である。
【００２０】
基本組成物、異なる抗原の混合物又は抗原と異なる免疫刺激物質との混合物である抗腫瘍ワクチンもよく知られている。
【００２１】
国際出願第２００４０１２６８５号パンフレットからは、培養過程で細胞により「失われる」腫瘍表面抗原を基礎とした抗腫瘍ワクチンが知られている。このワクチンの調製は、様々な影響を受けた後に、成長培地中への細胞による抗原の分泌工程が促進され、これによりワクチンの有効性が若干上昇することを想定している。しかしながら、このワクチンもまた、血清非含有培地での腫瘍細胞の培養を通して得られたその他のワクチンにつきものの欠点を有している。
【００２２】
ここに記載の特許出願に最も近いものは、米国特許第５９９３８２９号明細書に開示の、腫瘍表面抗原を基礎としたワクチンである。類似のワクチンも、米国特許第６３３８８５３号明細書、米国特許第５０３０６２１号明細書、米国特許第５６３５１８８号明細書に記載されている。よく知られたこのワクチンの欠点は、前述したように、腫瘍細胞の培養時間及び精製段階の存在に負うところのそのコストの高さである。
【００２３】
抗腫瘍治療を実行するための様々な方法もよく知られている。
【００２４】
単味ワクチンを用いた抗腫瘍免疫療法の実行方法もよく知られており、特定の腫瘍抗原を生体に導入することを含む。このようなワクチンは、例えば、合成ペプチド、熱ショックタンパク質、多糖類及びその他の物質を基礎としたワクチンに属する。これらの方法は、特に国際公開第２００５０８３０７４号パンフレット及び露国特許第２２７１８３１号明細書に開示されている。
【００２５】
これらの方法の欠点は、一部の抗原はその患者の腫瘍に特異的でないため、誘発される抗腫瘍免疫の特異性が低いことであり、これはこれらの抗原が、統計学的に腫瘍の種類に共通した抗原であると判明したからである。
【００２６】
不活性化した全腫瘍細胞及び免疫原性を強化した全腫瘍細胞を生体に注射することを含む、抗腫瘍治療の実行方法がよく知られている（例えば、米国特許第６０３９９４１号明細書を参照のこと）。
【００２７】
この手法の免疫療法の欠点は、腫瘍細胞の表面上の抗原が抗原提示細胞による貪食及び続くプロセシングにほとんど適さないため、誘発される抗腫瘍応答の特異性が低いことである。この方法も、ワクチン接種に十分な用量の抗原を得るために必要な、インビトロでの細胞の増殖を前提としており、これもまた抗原組成の変化及び免疫療法の有効性の低下につながる。
【００２８】
国際出願第０２０５３１７６号パンフレットにより、腫瘍細胞溶解物を生体に導入することを含む、抗腫瘍免疫療法の実行方法がよく知られている。
【００２９】
このワクチン接種法の欠点は、誘発される抗腫瘍免疫の特異性が低いことである。この場合、免疫応答に関与する腫瘍表面抗原に加えて、ワクチンは、溶解物の大部分を構成する細胞内タンパク質も含有している。このため、雑多なタンパク質塊に対する免疫付与が起こり、また免疫応答の腫瘍特異性の「不明瞭化（ｂｌｕｒｒｉｎｇ）」が起きる。この方法も、ワクチン接種に十分な用量の抗原を得るのに必要な、インビトロでの細胞増殖を前提にしており、これは腫瘍細胞の抗原組成の変化と、この結果としての抗腫瘍治療の有効性の低下につながる。
【００３０】
特定の腫瘍抗原の組み合わせ及び異なる抗原と様々な種類の免疫刺激物質との組み合わせに基づいた方法が知られている。
【００３１】
ここに記載の抗腫瘍治療の実行方法に最も近いものが、米国特許第５９９３８２９号明細書に開示の方法である。類似の方法が、米国特許第６３３８８５３号明細書、米国特許第５０３０６２１号明細書、米国特許第５６３５１８８号明細書及び国際公開第２００４０１２６８５号パンフレットにも記載されている。この方法は、血清非含有培地での培養中に細胞によって自然に失われる、腫瘍細胞の表面抗原のフラグメントである抗原の混合物から得られるワクチンを患者の生体に注射することを含む。
【００３２】
この方法の欠点の１つは、誘発される免疫応答の特異性が低いことである。この方法は、長時間にわたって培養された腫瘍細胞の使用を前提としており、これはその抗原組成の変化とワクチンの有効性の低下につながる。別の欠点は、細胞の培養時間及び成長培地の成分から単離した抗原を精製する必要性があることから、この方法が比較的高コストなことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３３】
【特許文献１】米国特許第６０３９９４１号明細書
【特許文献２】国際公開第０２０５３１７６号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５９９３８２９号明細書
【特許文献４】米国特許第６３３８８５３号明細書
【特許文献５】米国特許第５０３０６２１号明細書
【特許文献６】米国特許第５６３５１８８号明細書
【特許文献７】国際公開第２００４０１２６８５号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００５０８３０７４号パンフレット
【特許文献９】露国特許第２２７１８３１号明細書
【非特許文献】
【００３４】
【非特許文献１】Williams R., "Harnessing the Immune System: The Promise andPotential of Cancer Vaccines", Oncolog., 2005, v. 50, No.4
【非特許文献２】Yu Z., Restifo N.P., "Cancer Vaccines: Progress Reveals NewComplexities", J. Clin. Invest., 2002, v. 110, 289-294
【非特許文献３】Franco A., "CTL-Based cancer Preventive/Therapeutic Vaccines forCarcinomas: Role of Tumour-Associated Carbohydrate Antigens", Scand.J.Immunol., 2005, v. 61, 391-397
【非特許文献４】Wolfers J. et al., "Tumor-derived exosomes are a source of sharedtumor rejection antigens for CTL cross-priming", Nat. Med., 2001,v. 7,297-303
【非特許文献５】Raposo G. et al., "B lymphocytes secrete antigenpresenting vesicles", J.Exp.Med., 1996, v. 183, 1161-1172
【非特許文献６】Zitvogel L. et al., "Eradication of established murine tumors  using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derivedexosomes", Nature  Med., 1998, v. 4, 594-600
【非特許文献７】Thery C. et al.,“Exosomes: composition,biogenesis and function”Reviews Immunology, 2002, v. 2,569-579
【非特許文献８】Yu Z., Restifo N.Р., "Cancer Vaccines: ProgressReveals New Complexities", J. Clin. Invest, 2002, v. 110, 289-294
【非特許文献９】Armstrong А.С.,Eaton D., Ewing J.C., "Cellular Immunotherapy  forCancer", Brit. Med. J., 2001, v. 3323, 1289-1293
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
本特許発明群の使用によって得られる技術的成果は、抗腫瘍免疫応答の強化による、腫瘍学的な疾患の治療の有効性の強化から成る。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
この技術的果は、腫瘍表面抗原を基礎とした抗腫瘍ワクチンの使用によって得られる。本発明において、ワクチンは腫瘍表面抗原の混合物を含有しており、これらの抗原は生きた腫瘍細胞の表面タンパク質から蓄積したペプチドであり、生きた腫瘍細胞の初代培養物にプロテアーゼを周期的に、非致死的に作用させることで得たものである。
【００３７】
本発明の好ましい実現態様において、抗腫瘍ワクチンは、プロテアーゼとして選択したトリプシンの使用を通して得ることができる。
【００３８】
上記の技術的成果は、腫瘍細胞の培養及び腫瘍表面抗原の単離を含む、抗腫瘍ワクチンの調製方法を実現することによっても得られる。本発明では、成長培地を事前に洗い流した生きた腫瘍細胞の初代培養物を、細胞を殺さないプロテアーゼの作用に供し、放出された腫瘍表面抗原を回収し、加えて、細胞による腫瘍表面抗原の回復に必要な時間が経ってから、プロテアーゼによる生きた腫瘍細胞の初代培養物の処理を繰り返し、ワクチン接種に十分な用量に達するまで腫瘍表面抗原を蓄積し、得られる腫瘍表面抗原の組成を管理する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
更に、本発明群を、特定の実現例及び以下の添付図面により説明する。
【図１】抗腫瘍ワクチンの調製方法の実現スキームである。
【図２】初代腫瘍細胞培養物から本発明の第２の実現態様に従って得られた表面抗原の質量スペクトル（Ａ）；表面抗原の完全回復及びプロテアーゼにより細胞を繰り返し処理した後に同じ細胞培養物から得られた表面抗原の質量スペクトル（Ｂ）；プロテアーゼでの細胞の処理に続く部分的な回復後に同じ細胞培養物から得られた表面抗原の質量スペクトル（Ｃ）である。
【図３Ａ】抗原の糖鎖部分のＣＩＤフラグメンテーションのスペクトルである。
【図３Ｂ】抗原の糖鎖部分のＣＩＤフラグメンテーションのスペクトルである。
【図３Ｃ】ｂ／ｙイオンを同定した抗原のペプチド配列のＣＩＤフラグメンテーションのスペクトルである。
【図３Ｄ】ｂ／ｙイオンを同定した抗原のペプチド配列のＣＩＤフラグメンテーションのスペクトルである。
【図４】ペプチド混合物をワクチン接種した、腫瘍細胞株Ｈ２２を播種したマウスの生存曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明の好ましい実現態様において、プロテアーゼとしてトリプシンを使用する。
【００４１】
上記の技術的成果は、腫瘍細胞の表面タンパク質から得られるペプチドである腫瘍表面抗原の混合物から得られるワクチンを患者の生体に注射することを含む、抗腫瘍免疫療法の実行方法を実現することによっても得られる。
【００４２】
本発明においては、腫瘍表面抗原の混合物を使用し、これらの抗原は、生きた腫瘍細胞の表面タンパク質から蓄積したペプチドであり、抗原は、生きた腫瘍細胞の初代培養物にプロテアーゼを周期的に、非致死的に作用させることで得られる。
【００４３】
好ましい実現態様において、プロテアーゼとしてトリプシンを用いる。
【００４４】
より特異的な免疫応答を得るために、患者自身の腫瘍細胞の腫瘍表面抗原を用いる。
【００４５】
本発明のその他の実現態様において、別の患者の細胞から得た腫瘍表面抗原を用いる。
【００４６】
本方法の好ましい実現態様において、アジュバントをワクチン組成物の一部として使用する。
【００４７】
図１は、抗腫瘍ワクチンの一般的な調製スキームを図示している。更に、マウスに播種したヒト肝細胞癌Ｈ２２に対する抗腫瘍ワクチンの調製方法の第１の実現例を挙げる。Ｈ２２細胞の同じ培養物を、ワクチン調製に用いる。
【実施例１】
【００４８】
１．Ｈ２２細胞培養物を入れたフラスコから成長培地を除去し、成長培地の体積の半分以上の体積の滅菌生理溶液を用いて、細胞の単層を洗浄する。洗浄は、成長培地の残留分を完全に除去するために、３回以上行うべきである。
【００４９】
次の重要な工程は、非致死的なプロテアーゼ濃度での通常はトリプシン（活性〜３０００Ｕ／ｍｇ）による細胞の処理である。
【００５０】
２．トリプシンの０．０００１％溶液を、フラスコ表面２５ｃｍ２あたり溶液１ｍｌの割合で細胞の単層に添加する。
【００５１】
３．フラスコを３７℃でインキュベートする。５〜７分のインキュベーションの間に、細胞表面から分離した抗原を含有するトリプシン溶液を回収する。
【００５２】
４．細胞に血清を含有する（通常、１０％）新しい成長培地を添加し、培養を継続する。
【００５３】
５．必要量の抗原を得るために、工程２〜４を２４時間間隔で繰り返す。
【００５４】
６．抗原の有用性を評価するために、質量スペクトル分析を行う。
【００５５】
７．蓄積した抗原を、ワクチンの調製に使用する。
【００５６】
質量スペクトル分析は以下のようにして行われる。１４０μｌの抗原溶液を、１４０μｌのエタノール及び７２０μｌのブタノールと混合し、１５μｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ４Ｂを添加する。混合物をゆっくりと攪拌しながら４５分の間、インキュベートする。インキュベーションの後、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを同じエタノール・ブタノール溶液で２回洗浄し、５０％エタノール溶液中で３０分間にわたってインキュベートする。エタノール溶液を回収し、ローター蒸発装置（ｒｏｔｏｒ−ｅｖａｐｏｒａｔｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）で乾燥させる。得られた乾燥材料を１０μｌの水に溶解させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて分析する。分析対象である溶液２μｌを、質量分析計のターゲット上で、５０％のアセトニトリルと０．５％のトリフルオロ酢酸とを含有する２，５−ジヒドロキシ安息香酸の飽和溶液と１：１の比で混合する。ターゲット上に準備した液滴を風乾させ、質量範囲６００〜４０００Ｄａのペプチドの質量スペクトル分析を行う。
【００５７】
ワクチン開発にとって非常に重要な腫瘍抗原の大部分が、細胞表面上に見られることがよく知られている（例えば、総説Bocchia M. et al., "Antitumor vaccination: where we
stand", Hematologica, 2000, v. 85, 1172-1206を参照のこと）。初代細胞培養物をトリプシンで非致死的に処理すると、細胞表面からタンパク質フラグメントが分離する（Lokhov P.G., Archakov A.I.,“Proteomic  footprinting:a method for cells  profiling by  direct  mass spectrometry”,HUPO  theses, 5-th Annual  World Congress,2006,abstract  No 1201を参照のこと）。このため、本発明において、トリプシン及びその他のプロテアーゼによる作用は、腫瘍表面タンパク質のフラグメントの溶液中への放出につながる。トリプシンの作用により放出された腫瘍表面抗原（表面タンパク質のフラグメント）は、主に、腫瘍を患っている患者のワクチン接種に使用する免疫療法用の抗原に適したものである。
【００５８】
細胞から分離したペプチドを含有するトリプシン溶液の回収を、望ましくはフラスコ底部から細胞が剥がれる前に行うべきであることに留意する必要があり、これにより細胞の試料中への移動を回避することができ、追加の精製工程が不要となる。
【００５９】
プロテアーゼでの細胞の処理の条件は、腫瘍細胞の種類ごと及び使用するプロテアーゼの活性の度合いごとに実験的に規定され、プロテアーゼ濃度については０．０００１％〜０．０５％、処理時間については３０秒〜１０分と大幅に異なり得る。異なる活性度のトリプシンを使用する場合、その濃度は、酵素活性の上昇又は低下に正比例して変化する。
【００６０】
非致死的なプロテアーゼ濃度での処理後、細胞は死なず、初代細胞培養物のトリプシンでの処理工程を繰り返すことが可能となる。ワクチン接種に必要な用量の腫瘍表面抗原を得るために、生細胞培養物のトリプシン処理工程を、最高２４時間に達する間隔を置いて何度も繰り返す。次のトリプシン処理までの間に、細胞を、その細胞についてのインキュベーションプロトコルに従ってインキュベートする（すなわち、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃、血清及び必要な追加補助栄養素を含有する成長培地中でのインキュベーション）。
【００６１】
蓄積した腫瘍表面抗原を、所定のワクチンの調製技法に従って処理する。すなわち、抗原を、精製、濃縮、その組成分析に供することができる。また、免疫原性を上げるために変性又はアジュバントと混合することができる。
【００６２】
本発明のその他の実現態様においては、プロテアーゼ処理を、細胞の継代工程と組み合わせることができる。
【００６３】
トリプシン溶液は、滅菌生理溶液又はその他の適当な生理食塩水を用いて調製することができる。
【００６４】
トリプシンの代わりにその他のプロテアーゼ、例えばキモトリプシン等を用いることができる。
【００６５】
細胞懸濁液を使用する場合、抗原を蓄積する前に、遠心分離又はその他の適当な方法の使用により、細胞を収穫する必要がある。
【００６６】
第１の実現態様に従って得られた抗原の前述の組成分析は、グリコシル化ペプチドについて質量分析のプロトコルを用いて行う（M. Tajiri et al., "Differential analysis of site-specific  glycans on plasma and cellular fibronectins: application of a
hydrophilic  affinity method for glycopeptides  enrichment", Glycobiology, 2005, v. 15,1332-1340）。これは、一方ではタンパク質フラグメントが通常、グリコシル化されるからであり、他方では、すなわち、グリコシル化ペプチドが最も免疫原性が高く、ワクチン抗原として明白な効果を示すからである（例えば、Franco A., "CTL-Based cancer Preventive/Therapeutic  Vaccines for Carcinomas: Role of Tumour-Associated Carbohydrate  Antigens",Scand.J.Immunol.,2005,v.61,391-397を参照のこと）。
【００６７】
グリコシル化抗原の脱塩及び濃縮は、いずれの適当な手段、特に液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）でも行うことができる。
【００６８】
その他の実現態様においては、腫瘍細胞を、血液、尿、体液、リンパ液、腹水、胸水等の生体液から単離することができる。
【００６９】
抗腫瘍ワクチンのこの調製方法は、どんなタイプの細胞培養物、すなわち接着培養物、懸濁培養物、マトリックス及びその他の基質を用いた細胞培養物、全ての態様の細胞共培養物、器官型培養物、細胞凝集塊（顆粒、球状）並びに新しく単離した腫瘍細胞及び腫瘍組織フラグメントにも応用することができる。
【００７０】
更に、本発明を、抗腫瘍ワクチンの第２の調製例により説明する。この調製方法では、ヒト結腸癌細胞の初代接着培養物を用いる。
【実施例２】
【００７１】
１．腫瘍を外科的に切除した結果得られる結腸腫瘍組織のフラグメントを、抗生物質を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を入れた滅菌試験管に移し、ラボに運ぶ。
２．滅菌環境下にて、腫瘍組織をペトリ皿に移し、壊死、凝血した部位、残留脂肪分及び結合組織を機械的に除去する。
３．組織をハサミで小さなフラグメントに正確に切断する。
４．腫瘍組織のフラグメントを、力強いピペット操作により小さい細胞凝集塊に解離させ、この工程中、フラグメントは１０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁させてある。
５．残留している大きな組織フラグメントを、試験管の底面に沈殿させる。
６．液体中に依然として浮遊している細胞凝集塊を注意深くピペットで回収し、新しい試験管に移す。
７．試験管を４００ｇで５分間にわたって遠心分離し、上清を廃棄する。細胞凝集塊を含有するペレットを以下の補助栄養素：インシュリン（２０μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（５０ｎＭ）、上皮増殖因子（１ｎｇ／ｍｌ）、エタノールアミン（１０μＭ）、ホスホエタノールアミン（１０μＭ）、トリヨードチロニン（１００ｐＭ）、ウシ血清アルブミン（２ｍｇ／ｍｌ）、グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（０．５ｍＭ）、ウシ胎仔血清（５％）と共にＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁させ、次に細胞培養のために２５ｃｍ２のフラスコに移す。
８．培養を、３７℃、５％ＣＯ２で行う。
９．ストロマ細胞から腫瘍細胞を単離するために、培養フラスコを数秒の間、振動攪拌装置に押し付ける。接着力が弱いため、腫瘍細胞が剥がれ、成長培地中に移動する。
１０．浮遊細胞を含む培地をピペットで回収し、次に、続く３７℃、５％ＣＯ２での培養のために新しい培養フラスコに移す。
１１．腫瘍細胞が、培養密度８０％に達したら、成長培地をフラスコから除去し、細胞を、０．９％のＮａＣｌ又はリン酸緩衝生理食塩水で３回すすぐ。すすぎ溶液の体積は、成長培地の体積の半分以上であるべきである。すすぎの結果、成長培地に含まれていた微量の血清が除去される。
１２．トリプシンの０．０００１％溶液（活性〜３０００Ｕ／ｍｇ）を、培養フラスコ表面２５ｃｍ２あたり溶液１ｍｌの割合で細胞に添加する。
１３．フラスコを３７℃でインキュベートする。インキュベーションから５分〜７分後、細胞から分離した表面抗原を含有する溶液を回収する。溶液を回収する間、腫瘍細胞は、培養フラスコの底部に付着したままであるべきである。トリプシンの作用により細胞の一部が剥がれ、自由に浮遊し始めた場合、５分の間、４００ｇで遠心分離を行い、細胞を含有していない上清を使用する。
１４．培養フラスコ中のトリプシンの残分を不活性化させるため、ウシ胎仔血清を含有する、新しく調製した成長培地をフラスコに添加し、細胞のインキュベーションを３７℃、５％ＣＯ２で継続することが必要である。
１５．工程１３に従って得られた溶液を、真空濃縮装置で４５℃にて濃縮する。事前に、溶液を適当な手段、例えば逆相クロマトグラフィ、ゲル濾過等により脱塩することができる。トリプシンの残分を除去するために、溶液を事前に、４ｋＤａ未満の分子量のペプチドが通過可能なフィルタを通して濾過することができる。
１６．必要な量の抗原を蓄積するために、工程１１〜１５を、２４時間間隔で繰り返す。これらの抗原のワクチン接種についての有用性を、質量分析により評価する。
【００７２】
細胞をプロテアーゼで処理する回数及び処理と処理との間隔は、蓄積した抗原混合物の組成分析により制御する。抗原組成が変化しはじめ、細胞のプロテアーゼ処理と処理との間の時間を延長しても新しく単離した腫瘍細胞に対応する最初の抗原組成が得られなくなったら、細胞はワクチン製造に不適と見なされる。
【００７３】
蓄積する抗原混合物の組成の管理は、本方法の第１の実現例において示したように、質量分析により行う。
【００７４】
腫瘍組織からの細胞の単離には、いずれの適した方法が用いられる。腫瘍細胞の放出を目的として腫瘍組織の解離にプロテアーゼを使用する場合、初代腫瘍培養の開始から２４時間以降に、表面構造の質量スペクトル分析を行う必要がある。
【００７５】
本発明により得られる腫瘍表面抗原は、細胞ドナーの腫瘍に特異的であるべきである。しかしながら、ドナーの生体内で腫瘍細胞が成長する場合と同じ環境をインビトロで人工的に再現するのは不可能であることから、細胞の培養により初代培養物の表現型に著しい歪みが生じる。このため、蓄積する抗源の組成を、強制的な管理に供する。更に挙げるのは、本発明の第２の態様に従って得られる抗原の質の評価例である。
【００７６】
抗原混合物を繰り返し質量スペクトル分析した後に得られたデータによると、グリコシル化ペプチド塊の９５％以上が再生され、比較する２つの抗原混合物の同一性の判断基準と見なすことができる。ワクチン接種用に蓄積した抗原がこの目的に適しているかを、新しく単離した腫瘍細胞に共通するグリコシル化ペプチド塊が９０％以上存在するかによって評価することが提案される。
【００７７】
得られた実験データから、直腸腫瘍細胞の培養により、３〜４日で継代を実行する条件下での第１及び第２継代細胞を用いてのみ、ワクチン接種に適した抗原が調製できることが判明している。細胞の表現型を保つ成分を成長培地に添加すると、ワクチン用抗原の蓄積に適用可能な継代数を増やせる可能性も除外できない。
【００７８】
腫瘍組織から十分な量の細胞を得ることが不可能と判明した場合は、必要な量に達するまで培養による増殖を行う必要があり、細胞培養中の表面抗原の変異性の制御は依然として必須である。本発明において、培養過程での抗原組成の管理は、追加の細胞増殖なく行われる。例えば、非致死的なプロテアーゼ処理及び質量スペクトル分析を、培養工程中、週に１又は２回実行する。
【００７９】
腫瘍の抗原とワクチンの抗原との同一性により、ワクチンによって誘発される抗腫瘍免疫応答の特異性が得られる。元の腫瘍の抗原の質量スペクトルと、本発明に従って蓄積した抗原の質量スペクトルとを比較することにより、このような同一性を管理することができる。図２Ａは、元の腫瘍細胞の表面抗原の質量スペクトルを表す。図２Ｂは、本発明に従って得られた、ワクチン接種に適した抗原の質量スペクトルを表す（図２Ａと２Ｂの質量スペクトルは同じである）。図２Ｃも、本発明に従って得られたもののワクチン接種には適していない抗原の質量スペクトルを示す（図２Ａと２Ｃのスペクトルは著しく異なる）。矢印は、消失した（図２Ｂ）及び新しく出現した（図２Ｃ）抗原に対応する質量を指し示す。このようにしてペプチド組成を管理することにより、特異的な抗腫瘍免疫応答を誘発するワクチン接種に必要な量の抗原を蓄積することが可能である。
【００８０】
抗原が腫瘍細胞の表面タンパク質に由来することを裏付けるために、（本発明の実現に不要ではあるが）そのフラグメンテーションスペクトルを得た。この例を図３に示す。
【００８１】
これを目的として、トリプシンとの細胞のインキュベーション過程において得られた試料を、逆相ＺｉｐＴｉｐｃ１８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国）を自動ピペットのチップに用いて製造者のプロトコルに従って脱塩し、上述したように、マトリックスと共に質量分析計ターゲットの上に適用した。質量スペクトルを、イオンフラグメンテーションの型で記録した。タンパク質の同定を、検索システムＭａｓｃｏｔ（ＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｃｅ社、米国）を用いて、タンパク質配列のデータベースＮＣＢＩ（米国）の分類群ホモサピエンスについてイオン質量ｂ、ｙ（シークエンスタグ法）を用いて及び／又は確立されたアミノ酸配列を用いて行った（ｄｅ  ｎｏｖｏ法）。
【００８２】
図３Ａ及び３Ｂは、質量１６４０及び１４８０Ｄａのグリコシル化ペプチドの糖鎖の解離の例を示し、質量１６２、２０３及び２９１Ｄａのフラグメントが分離し、これはそれぞれヘキソース（マンノース、グルコース又はガラクトース）、アセチルグルコサミン及びシアル酸に対応する。ペプチドのフラグメンテーションによりそのアミノ酸配列の同定が可能となり、抗原混合物における、免疫グロブリン（ＣＤ抗原、組織適合性複合体、Ｔ細胞受容体及び細胞接着分子の殆どを含む）、低密度リポタンパク質受容体、インターロイキンＩＲ−２の受容体、Ｇタンパク質結合受容体、主要組織適合性複合体Ｉ及びＩＩの重鎖の可変及び定常ドメインのペプチドが判明する。図３Ｃは、解離したフラグメントの例を示し、８５７．４Ｄａの２電荷ペプチドについてｂ−ｙイオンが示され、Ｇタンパク質結合受容体のフラグメントに対応する確立されたアミノ酸配列は
2010530843.tif 000003
である。
【００８３】
図３Ｄは、質量５７３．３Ｄａの１電荷ペプチドの解離フラグメントの別の例を示し、ｂ−ｙイオンが示されており、主要組織適合性複合体ＩＩのフラグメントに対応する確立されたアミノ酸配列は
2010530843.tif 000004
である。
【００８４】
従って、本発明に従って得られる抗原は、以下によって特徴付けられる。
１）質量１．２〜４ｋＤａを有する、水溶性の、主にグリコシル化されたタンパク質分解ペプチドから構成される（トリプシンをプロテアーゼとして使用する場合、その配列は、通常、リジン又はアルギニンで終了する）。
２）１つの供給源に由来する。すなわち、腫瘍細胞の外部細胞膜のタンパク質の細胞外フラグメントである。
３）生細胞を非致死的な濃度のプロテアーゼで処理することにより得られる。
【００８５】
本発明によって得られる腫瘍抗原の混合物の実用的な使用は、アミノ酸配列の種類及び細胞表面上に提示されたタンパク質フラグメントによる混合物のペプチドの修飾（グリコシル化）によって決定される。腫瘍学的な疾患の発生は、生体に生じる腫瘍細胞を破壊する免疫系の不能の結果であることがよく知られている。免疫応答を強化するアジュバントと混合した、精製及び蓄積した抗原を、人体又は動物の体に注射する。生体による、注射したペプチドを無効にする細胞及び液性免疫応答の結果、既に存在している又は新しく出現した腫瘍細胞が互いに破壊され、これにより抗腫瘍ワクチン接種の治癒及び予防効果が得られる。完全な免疫応答を得るために、抗原を繰り返し注射する。
【００８６】
本発明に従って得られたワクチンの抗腫瘍活性の裏づけをとるため、同じ年及び体重の２０匹のオスのＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて、モデル実験を行った（対照群に１０匹、試験群に１０匹）。
【００８７】
本発明の第１の実現態様に従って、腫瘍抗原を、肝細胞癌Ｈ２２細胞培養物から得た。回収した抗原を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０でのゲル濾過により脱塩し、真空濃縮装置ＳｐｅｅｄＶａｃで濃縮した。
【００８８】
事前に完全フロイントアジュバントと１：１（ｖ／ｖ）の比で混合した１５０μｇの抗原を、皮下注射した。不完全フロイントアジュバントを用いて、３週間の間（注射１回／週）、免疫付与を繰り返した。同じスキームに従って、生理溶液と混合したフロイントアジュバントを対照群のマウスに注射した。４回目の免疫付与後、１００万個の細胞を皮下注射することにより、マウスに肝細胞癌Ｈ２２を播種した。３ヶ月の間、対照群及び試験群のマウスの生存率をチェックした。得られた生存曲線（図４）は、本発明によって得られる抗原の抗腫瘍活性の存在を裏付けている。
【００８９】
抗腫瘍免疫の機序は動物でもヒトでも同じことから、モデル実験の結果は、動物での本発明の使用の成功を限定しないことに留意する必要がある。抗原の投与方法及び体重１ｋｇあたりで計算した抗原用量は、ヒトの免疫療法の場合でも変わらないが、治療スキームは、疾患の重篤度、疾患の段階、腫瘍細胞の変異性、生体が抗原に対してはっきりとした免疫応答を示す力等に応じて各患者に合わせて個別化することができる。
【００９０】
更に挙げるのは、ヒトに抗腫瘍治療を施すための、本発明の第２の実現態様に従って調製された腫瘍表面抗原を基礎とした抗腫瘍ワクチン及び抗腫瘍治療の実行方法の例である。
【００９１】
ワクチンは、０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に溶解させ、１ｍｌのアジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄ  ＩＳＡ−５１、スクアレン、Ｐｌｕｎｏｒｉｃ  Ｌ１２１、Ｔｗｅｅｎ８０を含有する水・油エマルションを基礎としたＳｙｎｔｅｘ社のアジュバント）と混合した１ｍｇの腫瘍抗原混合物（本発明の第２の実現態様に従って調製）から成る。
【００９２】
１用量のワクチンを３週間の間（毎週）及び５ヶ月の間（毎月）、患者に皮下注射する。
【００９３】
ワクチン接種の有効性を、導入した腫瘍抗原に対する免疫の強度により評価する。注射から２〜３日後に、注射した抗原に対する過敏性反応を、注射部位の紅斑の寸法を判断して評価する。基準値として、初回の注射の後に出現した紅斑の寸法を採用する。ワクチン接種を繰り返した後の過敏性反応の明らかな強化は、抗腫瘍免疫応答の発現を示している。
【００９４】
抗腫瘍免疫療法の実行方法のその他の実現態様において、ワクチンの静脈内又は筋肉内注射も可能であり、アジュバントなしのワクチン注射も可能である。
【００９５】
本発明の使用による免疫応答の発現は、腫瘍抗原の混合物の適用により得られる。ワクチン中に存在する複数のペプチドにより、その表面に同じアミノ酸配列のタンパク質を有する細胞全てに対する免疫応答が可能になる。
【００９６】
従って、本方法により、単味ワクチンを使用する周知の方法と比較して、抗腫瘍免疫療法の有効性を何倍も上げることができる。
【００９７】
本発明群の採用により、腫瘍細胞の表面抗原である腫瘍特異的な抗原で富化したワクチンを用いて、抗腫瘍免疫療法の実行が可能になる。
【００９８】
これは細胞を殺さない濃度のプロテアーゼでの腫瘍細胞のプロテアーゼ処理により可能になる。非致死的な濃度のプロテアーゼの使用により、腫瘍細胞の表面抗原だけを分離し、その細胞質膜の破壊を伴う細胞死（細胞質内容物のワクチンへの混入、特にワクチン接種に無用な細胞内タンパク質塊のワクチンへの混入につながる）を回避することができる。ワクチンへの混入は、周知のワクチンにおける腫瘍特異的な抗原の一部の弱体化、免疫応答の「不明瞭化」及び、その結果としての腫瘍抗原に特異的な免疫応答の低下につながる。
【００９９】
このため、本発明に従って調製した腫瘍抗原で富化したワクチンの使用により、抗腫瘍免疫療法の有効性を上げることができる。
【０１００】
更に、免疫療法の有効性の上昇は、初代腫瘍細胞培養物からの蓄積によって得られる抗原の使用によって達成される。抗腫瘍ワクチンのこの調製方法では、毎回のプロテアーゼ処理の後、実質的に変わらない組成を有する抗原を得ること及び、初代細胞培養物を用いて、ワクチン接種に必要な量の抗原を蓄積することが可能になる。蓄積する抗原の組成を管理することができるため、ワクチン組成物において、所定の腫瘍に対してだけ特異的な腫瘍抗原を使用することができる。
【０１０１】
また、所定の腫瘍に対して特異的でない抗原のワクチン内への混入の可能性が排除できる。このような抗原は、増殖細胞を使用して調製した周知のワクチンの組成に存在することがあるが、これはインビトロでの増殖中に初代培養物がその抗原組成を変えてしまうことが知られているからである。このため、増殖細胞から回収した抗原混合物の組成は、単離した（培養していない）腫瘍細胞から得られる抗原の組成とは大きく異なる場合がある。
【０１０２】
本発明に従って調製したワクチンは自家ワクチン（患者自身の細胞から得られる）又は同種異系（別の患者の細胞を基礎としている）であってよい。
【０１０３】
本発明に従って実行する免疫療法はどちらの場合でも効果的であるが、これは別々の患者の腫瘍細胞が、その表面に同じアミノ酸配列のペプチドを有しているからである。
【０１０４】
また、本発明に従って調製する自家ワクチンの使用はより効果的であるが、これは後者の場合、ワクチンがその患者の腫瘍の発現を識別する、個別かつ段階特異的な抗原を含有しているからである。
【０１０５】
従って、本発明により、細胞表面抗原を基礎とした腫瘍抗原を得ることができ、またこの表面抗原を基礎として、腫瘍学的な疾患の治療、すなわちワクチン接種の実行が可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2010530843.tif 000009
【図３Ｄ】
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【図４】
2010530843.tif 000011
2010530843.tif 000012
【国際調査報告】
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2010530843.tif 000014
2010530843.tif 000015