(57)【要約】配列ＭＸ１（Ｘ２Ｘ３）ｎのペプチド・タグをコード化するＤＮＡタグを含むプラスミド（Ｘ１はＫ又はＲを表す；Ｘ２はＭ、Ｓ又はＴを表す；Ｘ３はＫ又はＲを表す；ｎは１以上の整数を表す；前記ＤＮＡは、プロモーター配列に作動可能に結合している）が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式［Ｉ］のペプチド・タグをコード化するヌクレオチド配列を有するＤＮＡタグを含む、微生物宿主細胞におけるＮ−末端が標識されたタンパク質の組換え発現のための自己再生するＤＮＡプラスミド
ＭＸ１（Ｘ２Ｘ３）ｎ      ［Ｉ］
Ｘ１はＫ又はＲを表し；
Ｘ２はＭ、Ｓ又はＴを表し；
Ｘ３はＫ又はＲを表し；
ｎは１以上の整数を表し；及び
前記ＤＮＡはプロモーター配列に作動可能に結合している。
【請求項２】
ｎが１ないし３である、請求項１に記載のＤＮＡプラスミド。
【請求項３】
前記ＤＮＡタグに融合した核酸配列にコード化されるＮ末端が標識されたタンパク質の組み換え発現のための、前記ＤＮＡがインフレームで融合したタンパク質をコード化する核酸配列を更に含む、請求項１又は２に記載のプラスミド。
【請求項４】
前記タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のプラスミド。
【請求項５】
タンパク質をコード化している前記核酸配列が配列番号１のヌクレオチド配列からなる、請求項３又は４のプラスミド。
【請求項６】
ＤＮＡタグによりコード化されるペプチドタグがＭＫＭＫ、ＭＫＴＫ又はＭＫＳＫではない、請求項１ないし５の何れかに記載のＤＮＡプラスミド。
【請求項７】
請求項１ないし６の何れかに記載のプラスミドを含む、微生物宿主細胞。
【請求項８】
タグが化学式［Ｉ］のアミノ酸配列を含む、タンパク質に融合したＮ末端ペプチド・タグを含む標識タンパク質
ＭＸ１（Ｘ２Ｘ３）ｎ      ［Ｉ］
Ｘ１はＫ又はＲを表し；
Ｘ２はＭ、Ｓ又はＴを表し；
Ｘ３はＫ又はＲを表し；及び
ｎは１以上の整数を表す。
【請求項９】
ｎが１ないし３である、請求項８に記載の標識タンパク質。
【請求項１０】
前記タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項８又は９に記載の標識タンパク質。
【請求項１１】
ペプチド・タグがＭＫＭＫ、ＭＫＴＫ又はＭＫＳＫではない、請求項８ないし１０の何れかに記載の標識タンパク質。
【請求項１２】
以下のステップを含む、微生物宿主細胞においてＮ末端が標識されたタンパク質を組み換え発現するための方法：
（ａ）  請求項１又は２の何れかのプラスミドのＤＮＡタグにタンパク質をコード化しているＤＮＡ配列をインフレームかつ３’に挿入することを含む組換えプラスミドを構築するステップ、及び
（ｂ）  前記組換えプラスミドを宿主微生物細胞に導入するステップ、及び
（ｃ）  微生物宿主細胞において、前記Ｎ末端が標識されたタンパク質の発現を誘導するステップ。
【請求項１３】
微生物宿主細胞においてタンパク質の組換え発現を増大するための方法であって、前記方法は、
（ａ）  請求項１又は２の何れかのプラスミドのＤＮＡタグにタンパク質をコード化しているＤＮＡ配列をインフレームかつ３’に挿入することを含む組換えプラスミドを構築すること、及び
（ｂ）  前記組換えプラスミドを宿主微生物細胞に導入すること、及び
（ｃ）  微生物宿主細胞において、前記Ｎ末端が標識されたタンパク質の発現を誘導すること、
を含む方法。
【請求項１４】
微生物宿主細胞においてリコンビナントに発現されたタンパク質の溶解性を減少させるための方法であって、前記方法は、
（ａ）実施態様１〜１４の何れかのプラスミドのＤＮＡタグにタンパク質をコード化しているＤＮＡ配列をインフレームかつ３’に挿入することを含む組換えプラスミドを構築すること、及び
（ｂ）  前記組換えプラスミドを宿主微生物細胞に導入すること、及び
（ｃ）  微生物宿主細胞において、前記Ｎ末端が標識されたタンパク質の発現を誘導すること、
を含む方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１２ないし１４の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質をコード化するＤＮＡ配列が配列番号１のヌクレオチド配列からなる、請求項１２ないし１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
プラスミドのＤＮＡタグにコード化されるペプチド・タグがＭＫＭＫ、ＭＫＴＫ又はＭＫＳＫではない、請求項１２ないし１６の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
組換え型タンパク質発現系は、広範囲にわたる応用のための、バイオ医薬品又は薬剤のスクリーニングの標的として用いられるタンパク質、ポリペチド及びペプチドの生産を可能にする。酵母及びバキュロウイルスは信頼性が高い代替的な発現系を提供するが、主としてバクテリにおける効果的かつ経済的な製造を理由に、バクテリアでの発現系は最も推奨される方法であった。
【０００２】
異種タンパク質の生産のための組換え型発現系が広く用いられているにもかかわらず、利用可能な方法は、下流での要件を満たすための充分な収率及び充分に均質性のあるタンパク質を製造する上では信頼に値しない。多くの哺乳類のタンパク質は、低い収率かつかなり低い溶解性でバクテリアにおいて発現される。また、特にそれらが部分的に可溶性である場合、それらは菌体にとって有毒である場合がある。多くのベクター系は、標的組換え型タンパク質を短いＮ末端ペプチド・タグ、又はより長いＮ末端ペプチド・タグを有する融合タンパクとして発現するように設計されている。この種のタグの例はヒスチジン−タグ、又はマルトース結合−タグであり、それらは特に後の組換え型タンパク質の精製に有用である。しかしながら、特に潜在的に有毒で、発現するのが困難な治療上のタンパク質の効率的な発現系に対するニーズは残っている。タンパク質の収率は転写及び翻訳開始に非常に依存しており、封入体は通常、宿主によって非常に優れた耐容性を示すので、この種のシステムは高収率かつ低溶解性を有する融合タンパクを与えるＮ末端タグを有するべきである。また、導入されたタグは、天然タンパク質の生産のために、容易に切断可能であるべきである。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、化学式［Ｉ］のペプチド・タグをコード化しているヌクレオチド配列を有するＤＮＡタグを含む微生物宿主細胞においてＮ末端を標識されたタンパク質を組換え発現するための、自己再生するＤＮＡプラスミドを提供する。
ＭＸ１（Ｘ２Ｘ３）ｎ      ［Ｉ］
Ｘ１はＫ又はＲを表し；
Ｘ２はＭ、Ｓ又はＴを表し；
Ｘ３はＫ又はＲを表し；
ｎは１以上の整数を表し；
前記ＤＮＡはプロモーター配列に作動可能に結合している。
【０００４】
本発明のプラスミドは、ＤＮＡタグに融合された核酸によってコード化される、Ｎ−末端を標識されたタンパク質の組換え発現のための前記ＤＮＡタグをインフレームに融合するタンパク質をコード化している核酸配列を更に含んでもよい。
本発明は、本発明のＤＮＡプラスミドを含む微生物宿主細胞を提供する。
一実施形態において、本発明はタンパク質に融合したＮ末端ペプチド・タグを含む標識されたタンパク質を提供し、前記タグは化学式［Ｉ］の配列を有する。
一実施態様において本発明は、タンパク質をコード化しているＤＮＡ配列をインフレームに、本発明のプラスミドのＤＮＡタグを３’に挿入することを含む組換えプラスミドを構築するステップ、前記組換えプラスミドを宿主微生物細胞に導入するステップ、及び微生物宿主細胞においてＮ末端が標識されたタンパク質の発現を誘導するステップを含む、Ｎ末端を標識されたタンパク質の組換え型発現のための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１Ａ及びＢに示すように、成熟ｈＩＬ−２１を得るためのタグ除去の効率及び完了は、マススペクトロメトリで測定された。パネルＡは、タグ除去前の画分のＭａｌｄｉスペクトルを示す。パネルＢは、タグ除去の後の同じ画分を示す。
【図２】２Ａ：ＭＫＭＫ−ＩＬ２１のＤＡＰ／Ｑ−シクラーゼ処理前のＭａｌｄｉマススペクトル。１５９４８Ｄａの一価分子イオン（完全長のＭＫＭＫ−ＩＬ２１に対応する）。２Ｂ：ＭＫＭＫ−ＩＬ２１のＤＡＰ／Ｑ−シクラーゼ処理後のＭａｌｄｉマススペクトル。１５４２３Ｄａの一価分子イオン（Ｎ末端ピログルタミン酸残基を有するＩＬ２１に対応する）。完全長のＭＫＭＫ−ＩＬ２１に対応するシグナルは、観察されなかった。
【図３】３Ａ：ＭＫＳＫ−ＩＬ２１のＤＡＰ／Ｑ−シクラーゼ処理前のＭａｌｄｉマススペクトル。１５９１１．６Ｄａの一価分子イオン（完全長のＭＫＳＫ−ＩＬ２１に対応する）。３Ｂ：ＭＫＳＫ−ＩＬ２１のＤＡＰ／Ｑ−シクラーゼ処理後のＭａｌｄｉマススペクトル。１５４２９Ｄａの一価分子イオン（Ｎ末端ピログルタミン酸残基を有するＩＬ２１に対応する）。完全長のＭＫＳＫ−ＩＬ２１に対応するシグナルは、観察されなかった。
【図４】４Ａ：ＭＫＴＫ−ＩＬ２１のＤＡＰ／Ｑ−シクラーゼ処理前のＭａｌｄｉマススペクトル。１５９３３．６Ｄａの一価分子イオン（完全長のＭＫＴＫ−ＩＬ２１に対応する）。４Ｂ：ＭＫＴＫ−ＩＬ２１のＤＡＰ／Ｑ−シクラーゼ処理後のＭａｌｄｉマススペクトル。１５４３０．９Ｄａの一価分子イオン（Ｎ末端ピログルタミン酸残基を有するＩＬ２１に対応する）。完全長のＭＫＴＫ−ＩＬ２１に相当するシグナルは、観察されなかった。
【０００６】
略記号：
アミノ酸：  アラニン（Ａ）；アルギニン（Ｒ）；アスパラギン（Ｎ）；アスパラギン酸（Ｄ）；システイン（Ｃ）；グリシン（Ｇ）；グルタミン（Ｑ）；グルタミン酸（Ｅ）；ヒスチジン（Ｈ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；リシン（Ｋ）；メチオニン（Ｍ）；フェニルアラニン（Ｆ）；プロリン（Ｐ）；セリン（Ｓ）；スレオニン（Ｔ）；トリプトファン（Ｗ）、
チロシン（Ｙ）；バリン（Ｖ）。
Ｃ末端：  タンパク質のカルボキシ（Ｃ）−末端部（一つ以上のアミノ酸残基を含む）。
ｈＩＬ−２１：ヒト・インターロイキン−２１Ｎ末端：  タンパク質のアミノ（Ｎ）−末端部（一つ以上のアミノ酸残基を含む）。
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ：  ナトリウム・ドデシル（ラウリル）硫酸塩−ポリアクリルアミドゲル。
【０００７】
（発明の説明）
本発明は、ＤＮＡタグ、異種タンパク質の組換え型発現に適した発現−ベクター又は発現−プラスミド、及び組換え型タンパク質の後の精製及びその天然型及び活性型のタンパク質を回収するための組換え型タンパク質の最終的な処理に適合した組換え型タンパク質発現のための方法を提供する。
本発明のＮ末端タグと共に発現されるタンパク質は、難溶解性であり、封入体中に優先して発現され、通常、宿主に対して非常に高い耐容を示す。
【０００８】
一実施形態において、本発明は、化学式［Ｉ］のペプチド・タグをコード化しているヌクレオチド配列を有するＤＮＡタグを含む微生物宿主細胞においてＮ末端を標識されたタンパク質を組換え発現するための、自己再生するＤＮＡプラスミドを提供する
ＭＸ１（Ｘ２Ｘ３）ｎ      ［Ｉ］
Ｘ１はＫ又はＲを表し；
Ｘ２はＭ、Ｓ又はＴを表し；
Ｘ３はＫ又はＲを表し；
ｎは１以上の整数を表し；
前記ＤＮＡはプロモーター配列に作動可能に結合している。
【０００９】
用語「タンパク質」、「ポリペチド」及び「ペプチド」は、ここでは交換可能に用いられ、ペプチド結合によって接続される少なくとも５つの構成アミノ酸からなる化合物を意味すると解されるべきである。構成アミノ酸は、遺伝コードによってコード化されるアミノ酸の群からでもよく、遺伝コードによってコード化されない天然アミノ酸であってもよく、合成アミノ酸であってもよい。遺伝コードによってコード化されない天然アミノ酸は、例えばヒドロキシプロリン、ｙ−カルボキシ・グルタミン酸塩、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ−アラニン及びＤ−グルタミンである。合成アミノ酸は、化学合成によって製造されるアミノ酸、すなわちＤ−アラニン及びＤ−ロイシンなどの遺伝コードによってコード化されるアミノ酸のＤ−アイソフォーム、Ａｉｂ（ａ−アミノイソ酪酸）、Ａｂｕ（ｓ−アミノ酪酸）、Ｔｌｅ（ｔｅｒｔ−ブチルグリシン）、β−アラニン、３−アミノメチル安息香酸及びアントラニル酸を含む。
ここで用いられるように、用語「ＤＮＡタグ」は、異種タンパク質をコード化するＤＮＡ配列に付加されるＮ末端タンパク質タグをコード化しているＤＮＡ分子として定義され、微生物におけるインフレームでの発現により標識されたタンパク質又は融合タンパクを製造する。
【００１０】
一実施形態において、Ｘ１はＫを表す。一実施形態において、Ｘ１はＲを表す。
一実施形態において、Ｘ２はＭ又はＳを表す。一実施形態において、Ｘ２はＭ又はＴを表す。一実施形態において、Ｘ２はＳ又はＴを表す。一実施形態において、Ｘ２はＭを表す。
一実施形態において、Ｘ２はＳを表す。一実施形態において、Ｘ２はＴを表す。
一実施形態において、Ｘ３はＫを表す。一実施形態において、Ｘ３はＲを表す。
一実施形態において、ｎは１から１０の整数である。一実施形態において、ｎは１から９の整数である。一実施形態において、ｎは１から８の整数である。一実施形態において、ｎは１から７の整数である。一実施形態において、ｎは１から６の整数である。一実施形態において、ｎは１から５の整数である。一実施形態において、ｎは１から４の整数である。一実施形態において、ｎは１から３の整数である。一実施形態において、ｎは１から２の整数である。一実施形態において、ｎは１である。一実施形態において、ｎは２である。一実施形態において、ｎは３である。
【００１１】
実施例にて例示したように、タンパク質のコード化配列にインフレームで融合している本発明のＤＮＡタグを含むＤＮＡ配列の発現は、Ｎ末端メチオニンに融合したタンパク質をコード化するコントロール配列よりも有意に高いタンパク質の発現レベルを可能にする。理論によって結びつけることを望まないが、発現タンパク質が宿主細胞代謝又は増殖に非毒性である形、例えば封入体として蓄積する場合、宿主微生物細胞、特に大腸菌細胞の組換え型タンパク質の発現が強化されると思われている。したがって、組換え型タンパク質に融合される選択されたＮ末端タンパク質タグは、封入体への蓄積を促進にすることによって、発現を強化しているかもしれない。
【００１２】
興味がある多くの哺乳類のタンパク質は天然の宿主において分泌されており、シグナルペプチドを伴って合成され、分泌において切断される。大腸菌の細胞内に蓄積された異種のタンパク質を含む全ての新規合成されたタンパク質の天然のＮ末端など、分泌され、成熟したタンパク質のＮ末端は、したがって、ほとんどの場合メチオニンとは異なるアミノ酸から始まる。Ｎ末端メチオニンの切断についての不確実性を回避するために、記載したような既知のインヴィトロでの切断特性を有する小さいペプチドタグの付加は、興味がある成熟タンパク質を得る際に非常に有利である。
【００１３】
本発明によって提供されるＤＮＡタグは、宿主微生物細胞（特に細菌細胞）におけるその組換え発現のためにタンパク質をコード化しているＤＮＡ配列に付加されてもよい。ＤＮＡタグは、宿主微生物細胞における多くの有用なタンパク質、特に治療タンパク質（例えばヒト成長ホルモン、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１及びＧＬＰ−１）の組換え発現に応用できる。Ｎ末端ペプチド・タグをコード化しているＤＮＡタグは発現されるタンパク質をコード化しているＤＮＡ配列にインフレームで融合され、そのような場合、宿主細胞において入手可能な発現産物は標識−タンパク質又は融合−タンパクである。ＤＮＡタグが４以上のアミノ酸のＮ末端ペプチドタグをコード化する場合、ペプチドタグはジペプチドの付加により伸長されてもよく、そのようなアミノ酸合成物は、たとえばジペプチジル・アミノ・ペプチダーゼＩのようなジアミノペプチダーゼによる切断に適合する。
発現された標識−タンパク質又は融合−タンパク質は、発現される成熟タンパク質の第１のアミノ酸に直接融合されるペプチド・タグを含んでもよく、そのような場合、ジペプチドの除去を伴うペプチド・タグの切断は、その成熟形態として発現タンパク質を放出する。発現された標識−タンパク質又は融合−タンパクのペプチド・タグがアミノペプチダーゼによって除去される場合、発現タンパク質の熟成形態のアミノ酸配列は、アミノペプチダーゼが続けることができないストップポイントとして機能する残基から開始するか、先行することが望ましい。このように、発現タンパク質の成熟形態は、Ｎ末端タンパク質切断から保護されている。ジアミノペプチダーゼに対するストップポイントとして作用するのに適したアミノ酸残基は、Ｑ、Ｐ、Ｒ、Ｋから選択されてもよい。グルタミン酸塩シクロトランスフェラーゼの存在下でピログルタミン酸を形成する能力により、アミノ酸残基Ｑはストップポイントとして用いることができる。成熟タンパク質のＮ−末端アミノ酸がそれ自体でストップポイントとして作用する残基でない場合には、所望の成熟タンパク質をコード化するＤＮＡ配列に融合した適切なストップ残基をコード化するコドンによりＤＮＡタグを伸長することが望ましい。ペプチド・タグのジペプチジル・アミノペプチダーゼ切断に続いてピログルタミルアミノペプチダーゼによって発現タンパク質のＮ末端から除去できるので、ペプチド・タグの末端に付加される好適なストップ残基はＱである。
【００１４】
本発明のＤＮＡタグは、リコンビナントに発現されるタンパク質のコード化配列にインフレームで融合した時、ペプチド・タグが荷電極性側鎖の優性を有する標識−タンパク質を提供する。標識タンパク質の付加的な荷電残基の存在は、特にタンパク質の質量電荷に基づいて選別する後の精製ステップにおいて有用でありえる。
【００１５】
本発明のＤＮＡタグは、ｈＩＬ−２１をコード化するＤＮＡ配列にインフレームで融合してもよい。本発明の１実施例において、本発明のＤＮＡタグは、配列番号４のヌクレオチド配列を有するｈＩＬ−２１をコード化するＤＮＡ分子にインフレームで融合している。他の制限酵素認識部位も選択され得、配列を調整することは当業者の能力の範囲内である。
【００１６】
一態様において、本発明は、本発明のペプチドタグをコード化するＤＮＡタグを含む、発現−ベクター又は発現−プラスミドを提供する。ＤＮＡタグはベクター又はプラスミドの適したクローニング・サイトに隣接して挿入され得、そのような場合、タグは下流に位置し、プロモーター配列に作動可能に結合している。好ましくは、ＤＮＡタグは、リコンビナントに発現されるタンパク質をコード化しているＤＮＡ配列の下流にインフレームで挿入することを可能にする制限酵素切断部位に隣接して位置する。当業者であれば、所望のタンパク質のコード化配列の下流でのインフレームのクローニングを容易にするための適切で好ましい隣接配列を容易に認識するであろう。本発明のプラスミド又はベクターにおけるプロモーター配列は、本発明のＤＮＡタグに作動可能に結合しており、選択された宿主微生物細胞において、標識タンパク質をコード化するＤＮＡ分子の転写を導くことが可能なヌクレオチド配列を有する。細菌、特に大腸菌における組換えタンパク質の発現に適したプロモーター配列は、当業者には既知であるが、Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ及びｔａｃプロモーターのいずれかを含む。本発明のＤＮＡタグに作動可能に結合したプロモーターを含む発現カセットを導入した好適なベクターは、自己再生し、選択マーカー（例えばアンピシリン）を有するものである。
【００１７】
一実施形態において、本発明の発現ベクター又は発現−プラスミドは、さらにリコンビナントに発現されるタンパク質をコード化しているＤＮＡ配列を含み、ＤＮＡ配列は下流かつインフレームに前記ＤＮＡタグを伴ってクローニングされる。一実施例において、発現プラスミド中でクローニングされたＤＮＡ配列は、発現プラスミドが適切な宿主細胞に導入される場合、標識タンパク質として発現可能なｈＩＬ−２１をコード化するものである。本発明の発現ベクター又は発現−プラスミドにおけるｈＩＬ−２１をコード化するＤＮＡ配列は、配列番号４のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００１８】
本発明の発現−プラスミド、−ベクターで形質転換するための、標識タンパク質の発現に適した宿主細胞は、当業者に周知である。好適なバクテリア宿主系統は、例えば染色体上にＴ７ポリメラーゼ遺伝子を有する、プロテアーゼ欠損系統大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）などの大腸菌Ｂの派生系統である。
【００１９】
本発明は、タンパク質に融合したＮ末端ペプチド・タグを含む標識タンパク質を提供し、前記タグは化学式[I]のアミノ酸配列を含む
ＭＸ１（Ｘ２Ｘ３）ｎ      ［Ｉ］
Ｘ１はＫ又はＲを表し；
Ｘ２はＭ、Ｓ又はＴを表し；
Ｘ３はＫ又はＲを表し；
ｎは１以上の整数を表す。
一実施形態において、Ｘ１はＫを表す。
一実施形態において、Ｘ１はＲを表す。
一実施形態において、Ｘ２はＭ又はＳを表す。
一実施形態において、Ｘ２はＭ又はＴを表す。
一実施形態において、Ｘ２はＳ又はＴを表す。
一実施形態において、Ｘ２はＭを表す。
一実施形態において、Ｘ２はＳを表す。
一実施形態において、Ｘ２はＴを表す。
一実施形態において、Ｘ３はＫを表す。
一実施形態において、Ｘ３はＲを表す。
一実施形態において、ｎは１から１０の整数である。一実施形態において、ｎは１から９の整数である。一実施形態において、ｎは１から８の整数である。一実施形態において、ｎは１から７の整数である。一実施形態において、ｎは１から６の整数である。一実施形態において、ｎは１から５の整数である。一実施形態において、ｎは１から４の整数である。一実施形態において、ｎは１から３の整数である。一実施形態において、ｎは１から２の整数である。一実施形態において、ｎは１である。一実施形態において、ｎは２である。一実施形態において、ｎは３である。
【００２０】
一実施形態において、前記タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、前記ペプチド・タグはＭＫＭＫ、ＭＫＴＫ又はＭＫＳＫではない。
【００２１】
本発明の標識したタンパク質は、本発明の発現−プラスミド又は発現−ベクターの組換え発現によって得られる。標識したタンパク質は、一以上の応用を有する成熟タンパク質を提供するために、標識タンパク質からペプチド・タグの除去のためのここに記載された精製ステップおよび／または一以上のタンパク分解処理ステップに供されてもよい。
【００２２】
本発明は、発現された標的タンパク質の収率を改良するために、融合されたＤＮＡ配列が前記標識タンパク質をコード化することによって、コード化配列にインフレームで融合した本発明のＤＮＡタグによってコード化される標識タンパク質の宿主微生物細胞における組換え発現のための方法を更に提供する。したがって、本方法はタンパク質に融合するＮ末端ペプチドタグを含む融合タンパク質をコード化する発現−プラスミド又は発現−ベクターを構築するステップを含み、コード化配列は終止コドンによって終了する。プロモーターは宿主細胞の発現系に認識されるものであるので、標識タンパク質の発現は、標識タンパク質のコード化配列に作動可能に結合したプロモーターにより方向付けられる。本発明の一実施態様によれば、ｈＩＬ−２１の発現のための発現ベクターの構造は、実施例１に記載される。
【００２３】
本発明の発現−ベクター又は発現−プラスミドは、宿主微生物細胞（好ましくはバクテリア大腸菌）に形質導入され、ベクターにより形質転換された宿主細胞は、同定、単離、及び標識タンパク質の発現及び宿主細胞の増殖に適合した条件下で培養される。
【００２４】
宿主微生物細胞における本発明の標識タンパク質の発現は、好ましくは誘導性である。例えば、宿主細胞が大腸菌系統であり、発現がｌａｃオペレーターによって制御される場合、発現はｌａｃプロモーターを抑制解除する約０．５−１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導し得る。ＩＰＴＧによる適切な誘導の後、例えば３−４時間、宿主細胞は、例えば音波処理又は凍結融解処理により溶解され得、細胞可溶化液は遠心によって可溶性画分及び不溶性画分に分けられる。標識したタンパク質は、その溶解性に従い、可溶性分画、より好ましくは細胞ペレットを分画する封入体に位置し得る。
【００２５】
標識したタンパク質が封入体に位置する場合、更なる精製の前に、可溶化及びリフォールディングするステップが必要であり、公知技術のプロトコルに従って標識タンパク質に最適化した条件を用いる。様々なタンパク質の分離及び精製プロトコルは、必要な精製度を達成するために用いられ得る。本発明の精製された標識タンパク質及び後に得られる成熟タンパク質の精製度を測定するための方法は、公知技術であり、実施例２において例示される。
【００２６】
ストップ残基がＱである場合、本発明の標識したタンパク質からのペプチド・タグの除去は、ジペプチジル・アミノペプチダーゼを使用してもよく、グルタミンシクロトランスフェラーゼと組み合わせてもよい。タグの除去は、本発明のリコンビナントに発現されたタンパク質の精製の前又は後に行われてもよい。
【００２７】
以下は本発明の実施態様の一覧であり、限定的に解釈されるべきでない。
実施態様１：化学式［Ｉ］のペプチド・タグをコード化するヌクレオチド配列を有するＤＮＡタグを含む、微生物宿主細胞におけるＮ−末端が標識されたタンパク質の組換え発現のための自己再生するＤＮＡプラスミド
ＭＸ１（Ｘ２Ｘ３）ｎ      ［Ｉ］
Ｘ１はＫ又はＲを表し；
Ｘ２はＭ、Ｓ又はＴを表し；
Ｘ３はＫ又はＲを表し；
ｎは１以上の整数を表し；
前記ＤＮＡはプロモーター配列に作動可能に結合している。
実施態様２：Ｘ１がＫを表す、実施態様１のＤＮＡプラスミド。
実施態様３：Ｘ１がＲを表す、実施態様１のＤＮＡプラスミド。
実施態様４：Ｘ２がＭ又はＳを表す、実施態様１〜３の何れかのＤＮＡプラスミド。
実施態様５：Ｘ２がＭ又はＴを表す、実施態様１〜３の何れかのＤＮＡプラスミド。
実施態様６：Ｘ２がＳ又はＴを表す、実施態様１〜３の何れかのＤＮＡプラスミド。
実施態様７：Ｘ２がＭを表す、実施態様１〜３の何れかのＤＮＡプラスミド。
実施態様８：Ｘ２がＳを表す、実施態様１〜３の何れかのＤＮＡプラスミド。
実施態様９：Ｘ２がＴを表す、実施態様１〜３の何れかのＤＮＡプラスミド。
実施態様１０：Ｘ３がＫを表す、実施態様１〜９の何れかのＤＮＡプラスミド。
実施態様１１：Ｘ３がＲを表す、実施態様１〜９の何れかのＤＮＡプラスミド。
実施態様１２：ｎが１である、実施態様１〜１１の何れかのＤＮＡプラスミド。
実施態様１３：ｎが２である、実施態様１〜１１の何れかのＤＮＡプラスミド。
実施態様１４：ｎが３である、実施態様１〜１１の何れかのＤＮＡプラスミド。
実施態様１５：前記ＤＮＡタグに融合した核酸配列にコード化されるＮ末端が標識されたタンパク質の組み換え発現のための、前記ＤＮＡがインフレームで融合したタンパク質をコード化する核酸配列を更にむ、実施態様１〜１４の何れかのプラスミド。
実施態様１６：前記プラスミドを用いたタンパク質の発現が、前記ペプチド・タグのないタンパク質の発現と比較して増大される、実施態様１５のプラスミド。
実施態様１７：前記プラスミドを用いて発現されるタンパク質の溶解性が、前記ペプチドタグのないタンパク質の溶解性と比較して減少する実施態様１５又は１６のプラスミド。
実施態様１８：前記タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施態様１５〜１７の何れかのプラスミド。
実施態様１９：タンパク質をコード化している前記核酸配列が配列番号１のヌクレオチド配列からなる、実施態様１５〜１８の何れかのプラスミド。
実施態様２０：ＤＮＡタグによりコード化されるペプチドタグがＭＫＭＫ、ＭＫＴＫ又はＭＫＳＫではない、実施態様１〜１９の何れかのＤＮＡプラスミド。
実施態様２１：実施態様１〜２０の何れかのプラスミドを含む、微生物宿主細胞。
実施態様２２：前記細胞がＥ大腸菌である、実施態様２１の微生物宿主細胞。
実施態様２３：タグが化学式［Ｉ］のアミノ酸配列を含む、タンパク質に融合したＮ末端ペプチド・タグを含む標識タンパク質
ＭＸ１（Ｘ２Ｘ３）ｎ      ［Ｉ］
Ｘ１はＫ又はＲを表し；
Ｘ２はＭ、Ｓ又はＴを表し；
Ｘ３はＫ又はＲを表し；
ｎは１以上の整数を表す。
実施態様２４：Ｘ１がＫを表す、実施態様２３の標識タンパク質。
実施態様２５：Ｘ１がＲを表す、実施態様２３の標識タンパク質。
実施態様２６：Ｘ２がＭ又はＳを表す、実施態様２３〜２５の何れかの標識タンパク質。
実施態様２７：Ｘ２がＭ又はＴを表す、実施態様２３〜２５の何れかの標識タンパク質。
実施態様２８：Ｘ２がＳ又はＴを表す、実施態様２３〜２５の何れかの標識タンパク質。
実施態様２９：Ｘ２がＭを表す、実施態様２３〜２５の何れかの標識タンパク質。
実施態様３０：Ｘ２がＳを表す、実施態様２３〜２５の何れかの標識タンパク質。
実施態様３１：Ｘ２がＴを表す、実施態様２３〜２５の何れかの標識タンパク質。
実施態様３２：Ｘ３がＫを表す、実施態様２３〜３１の何れかの標識タンパク質。
実施態様３３：Ｘ３がＲを表す、実施態様２３〜３１の何れかの標識タンパク質。
実施態様３４：ｎが１である、実施態様２３〜３３の何れかの標識タンパク質。
実施態様３５：ｎが２である、実施態様２３〜３３の何れかの標識タンパク質。
実施態様３６：ｎが３である、実施態様２３〜３３の何れかの標識タンパク質。
実施態様３７：前記タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施態様２３〜３６の何れかの標識タンパク質。
実施態様３８：ペプチド・タグがＭＫＭＫ、ＭＫＴＫ又はＭＫＳＫではない、実施態様２３〜３７の何れかの標識タンパク質。
実施態様３９：以下のステップを含む、微生物宿主細胞においてＮ末端が標識されたタンパク質を組み換え発現するための方法：
（ａ）実施態様１〜１４の何れかのプラスミドのＤＮＡタグにタンパク質をコード化しているＤＮＡ配列をインフレームかつ３’に挿入することを含む組換えプラスミドを構築するステップ、及び（ｂ）前記組換えプラスミドを宿主微生物細胞に導入するステップ、及び（ｃ）微生物宿主細胞において、前記Ｎ末端が標識されたタンパク質の発現を誘導するステップ。
実施態様４０：微生物宿主細胞においてタンパク質の組換え発現を増大するための方法であって、前記方法は、（ａ）実施態様１〜１４の何れかのプラスミドのＤＮＡタグにタンパク質をコード化しているＤＮＡ配列をインフレームかつ３’に挿入することを含む組換えプラスミドを構築すること、及び（ｂ）前記組換えプラスミドを宿主微生物細胞に導入すること、及び（ｃ）微生物宿主細胞において、前記Ｎ末端が標識されたタンパク質の発現を誘導すること、を含む方法。
実施態様４１：微生物宿主細胞においてリコンビナントに発現されたタンパク質の溶解性を減少させるための方法であって、前記方法は、（ａ）実施態様１〜１４の何れかのプラスミドのＤＮＡタグにタンパク質をコード化しているＤＮＡ配列をインフレームかつ３’に挿入することを含む組換えプラスミドを構築すること、及び（ｂ）前記組換えプラスミドを宿主微生物細胞に導入すること、及び（ｃ）微生物宿主細胞において、前記Ｎ末端が標識されたタンパク質の発現を誘導すること、を含む方法。
実施態様４２：前記タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施態様３９〜４１の何れかの方法。
実施態様４３：タンパク質をコード化するＤＮＡ配列が配列番号１のヌクレオチド配列からなる、実施態様３９〜４２の何れかの方法。
実施態様４４：プラスミドのＤＮＡタグにコード化されるペプチド・タグがＭＫＭＫ、ＭＫＴＫ又はＭＫＳＫではない、実施態様３９〜４３の何れかの方法。
【００２８】
本願明細書において引用される出版物、特許出願、特許を含む全ての文献は、他の場所で特定に文献が出典明示により別個に援用されているかにかかわらず、本願明細書にあたかも各文献が個々に特定に出典明示により援用されたかのように参照文献として組み込まれ、（法が許可する最大限の範囲で）全体がここに完全に効力を有する。
【００２９】
本発明で記載されて使用されている「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似指示対象なる用語は、ここで示され、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーすると解釈される。例えば、「その化合物」という表現は、特に明記しない限り、本発明又は特定の記載された態様での様々な「化合物」について言及していると解されるべきである。
【００３０】
特に明記しない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の要因又は測定値に関して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる)。
【００３１】
特に明記せず、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、成分又は成分類に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含める」等の用語を使用する、本発明の任意の側面又は実施態様のここでの記載は、特定の成分又は成分類「からなる」、「本質的になる」、又は「実施的に含有する」といった本発明の類似した側面又は実施態様を支持することを意図したものである(例えば、特定の成分を含有するここに記載の組成物は、特に明記しない又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、その成分からなる組成物を記載するものと理解すべきである)。
【００３２】
要約すると、本発明は、ペプチドをコード化するＤＮＡタグを含む発現−ベクター又は発現−プラスミドを提供し、それは宿主微生物細胞における前記ＤＮＡタグ及び前記ＤＮＡタグがインフレームに融合した配列をコード化するあらゆるタンパク質の発現を導くことが可能なプロモーターに作動可能に結合している。前記ＤＮＡタグをインフレームに融合した配列をコード化するタンパク質の組換えタンパク質発現において本発明の発現−ベクター又は発現−プラスミドを用いる利点は、宿主細胞における発現レベルが有意に強化されることである。したがって、タンパク質がＮ末端に本発明のペプチド・タグを伴って微生物宿主細胞、例えば大腸菌においてリコンビナントに発現される場合、このタグの存在は、タンパク質の減少した溶解性及び宿主細胞に対する減少した毒性によりほとんどの場合で発現を増強し、更に効率的な組換えタンパク質発現に必要な多くのさらなる重要な基準を満たす。特に、タグの適切な切断後に、その成熟形態としてタンパク質を得ることができる。さらに、荷電したタグによってもたらされるタンパク質全体の電荷の変更は、タンパク質の精製を容易にする。
【実施例】
【００３３】
（実施例１）
標識されたヒト・インターロイキン−２１の発現
発現及び下流のプロセシングについて、様々な小さいＮ末端タグの比較のために、ヒト・インターロイキンｈＩＬ−２１が標的タンパク質として選ばれた。タンパク質ｈＩＬ−２１をコード化している核酸分子は配列番号１（Ｍｅｔ  ｈＩＬ−２１  Ｎｄｅ１−ＢａｍＨ１ヌクレオチド配列）であり、分子の５末端及び３末端はそれぞれＮｄｅ１−ＢａｍＨ１の制限酵素部位を有する。
【００３４】
Ｍｅｔ  ｈＩＬ−２１  Ｎｄｅ１−ＢａｍＨ１ヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるｈＩＬ−２１タンパク質配列をコード化する。大腸菌において発現される場合、このタンパク質はＮ末端に付加的なメチオニンを有する。ｈＩＬ２１のこのバージョンは、Ｍｅｔ−ｈＩＬ２１と呼ばれている。
【００３５】
一連の構築物は、以下のスキームに従って作られた：
５’末端と３’末端にＳｔｙ１−ＢａｍＨ１サイトを有し、Ｍｅｔ−ｈＩＬ−２１のアミノ酸残基１−１３３に対応した、ｈＩＬ−２１の成熟形態をコード化する４１０塩基対のＤＮＡ分子は、配列番号３（ｈＩＬ−２１  Ｓｔｙ１−ＢａｍＨ１ヌクレオチド配列）に示される。ヌクレオチド２から始まるｈＩＬ−２１  Ｓｔｙ１−ＢａｍＨ１ヌクレオチド配列は、配列番号４に示すヌクレオチド配列を含み、配列番号２のアミノ酸配列を有する成熟ｈＩＬ−２１タンパク質配列をコード化する。
【００３６】
ｈＩＬ−２１  Ｓｔｙ１−ＢａｍＨ１分子は、５’Ｎｄｅ１サイト及び３’適合サイトに隣接した一連のリンカーの何れかと共にＮｄｅ１−ＢａｍＨ１消化Ｔ７発現ベクター（５．６ｋｂのｐＥＴ−１１ｃ）に連結されており、それらは表１の記載される。
表１
2010519894.tif 000002
【００３７】
ＤＮＡ分子ｈＩＬ−２１  Ｓｔｙ１−ＢａｍＨ１にインフレームで連結したＤＮＡタグを含有するリンカーを含むＴ７発現ベクターｐＥＴ−１１ｃは、宿主細胞大腸菌Ｂ、ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換された。
【００３８】
それぞれＴ７発現ベクターで形質転換された宿主細胞株は、０．２ｍｇ／ｌアンピシリンを補充されたＬＢ培地において、３７℃で増殖され、Ｔ７発現ベクターによる組換えタンパク質の発現は３−４時間、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導された。宿主細胞は遠心によって採取、溶解され、試料は可溶性分画ペレット封入体画分を提供するために遠心分離された。各宿主細胞試料からの全細胞抽出物、封入体及び可溶性細胞分画はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離され、ゲルは非標識タンパク質（Ｍｅｔ  ｈＩＬ−２１）と比較して、標識されたｈＩＬ−２１タンパク質発現の相対レベルを決定するためにクマシーブルーで染色された。
【００３９】
表１に示すように、ｈＩＬ−２１の様々な標識されたバージョンの発現量はタグのアミノ酸配列に依存しているが、場合によってはヌクレオチド配列（すなわちｍＲＮＡの二次構造）にも依存している。二次構造の問題に直面した場合、その問題を回避するためにコドンを調整することは、当業者の技術の範囲内である。表１は、２つのポイントを例示する：通常、特異的なペプチド・タグの添加によって発現量は増大され、ｈＩＬ−２１の溶解性は減少し、それによりｈＩＬ−２１の有毒な作用からの大腸菌宿主細胞を保護する。また、溶解性の減少は、封入体へｈＩＬ−２１を分配するのに好都合であり、それによりその後の精製を容易にする。
【００４０】
（実施例２）
リコンビナントに発現された標識ヒト・インターロイキン−２１は、その成熟型、活性型にプロセシングされる。
構築物ＤＡＰ１７を用いて発現されるＭＫＨＫ−ｈＩＬ−２１は、ＷＯ０４／５５１６８に開示されるように、封入体からリフォールディングされ、その後セファロースＳＰカラムクロマトグラフィを用いておよそ９０−９５％の純度まで精製された。ＭＫＨＫ−ｈＩＬ−２１に対応している単一の主なポリペプチド・バンドは、セファロースＳＰカラムから得られた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析によって検出され、その後、４アミノ酸のＮ末端ペプチド・タグの制御された除去を実施するために、レーン４−１０に示される画分のプールは、ジペプチジル・アミノペプチダーゼ（ＤＡＰアーゼ）及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（Ｑシクラーゼ）処理にかけられた。ペプチド・タグ切断のための条件は、以下の通りであった：２７．５μＭＭＫＨＫ−ＩＬ２１、６７．５ｍＵＤＡＰアーゼ、５．５ＵＱシクラーゼ、２５ｍＭトリス、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０の水溶液、室温（２０−２５°Ｃ）での９０分間のインキューベート、Qiagen.comによって供給される酵素の使用。
【００４１】
図１Ａ及びＢに示すように、産生成熟ｈＩＬ−２１へのタグ除去の効率及び完了は、マススペクトロメトリで測定された。
パネルＡは、タグ除去前の画分のＭａｌｄｉスペクトルを示す。
パネルＢは、タグ除去後の同じ画分を示す。
天然のｈＩＬ２１は１５４３３Ｄａの分子量を有するが、ＭＫＨＫ−ＩＬ２１は１５９７５Ｄａの分子量を有する。パネルＢにおいて観察されるように、切断及びタグ除去はおよそ９０％完了していた。
【００４２】
（実施例３）
リコンビナントに発現されたＭＫＭＫ標識されたヒト・インターロイキン−２１は、その成熟型、活性型にプロセシングされる。
構築物ＤＡＰ２１を用いて発現されるＭＫＭＫ−ｈＩＬ−２１は、ＷＯ２００４５５１６８に開示されるように封入体からリフォールディングされ、その後ＴｏｓｏＨａａｓ  ｓｐ  ５５０ｃカラムクロマトグラフィを用いておよそ９０−９５％の純度まで精製された。ＭＫＭＫ−ｈＩＬ−２１に対応している単一の主なポリペプチド・バンドは、ＴｏｓｏＨａａｓ  ｓｐ  ５５０ｃカラムから得られる画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析によって検出され、その後、４アミノ酸のＮ末端ペプチド・タグの制御された除去を行うために、画分のプールはジペプチジル・アミノペプチダーゼ（ＤＡＰアーゼ）及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（Ｑシクラーゼ）処理にかけられた。ペプチド・タグ切断のための条件は、以下の通りであった：２ｍｇ／ｍｌのＭＫＭＫ−ＩＬ２１の水溶液、及び２５ｍＭトリス、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０においてＭＫＭＫ−ＩＬ２１：ＤＡＰアーゼ：Ｑシクラーゼのモル比が８００：１：３２、室温（２０−２５°Ｃ）で３０分のインキューベート、Qiagen.comによって供給される酵素の使用。
【００４３】
図２Ａ及びＢに示すように、産生成熟ｈＩＬ−２１へのタグ除去の効率及び完了は、マススペクトロメトリで測定された。
パネルＡは、タグ除去前の画分のＭａｌｄｉスペクトルを示す。パネルＢは、タグ除去後の同じ画分を示す。
Ｎ末端ピログルタミン酸を有する天然ｈＩＬ２１は１５４４２Ｄａの分子量を有するが、ＭＫＭＫ−ＩＬ２１は１５９７８Ｄａの分子量を有する。パネルＢにおいて観察されるように、切断及びタグ除去は完了していた。
【００４４】
（実施例４）
リコンビナントに発現されたＭＫＳＫ標識されたヒト・インターロイキン−２１は、その成熟型、活性型にプロセシングされる。
構築物ＤＡＰ２３を用いて発現されるＭＫＳＫ−ｈＩＬ−２１は、ＷＯ２００４５５１６８において開示されるように封入体からリフォールディングされ、その後ＴｏｓｏＨａａｓ  ｓｐ  ５５０ｃカラムクロマトグラフィを用いておよそ９０−９５％の純度まで精製された。ＭＫＳＫ−ｈＩＬ−２１に対応している単一の主なポリペチド・バンドは、ＴｏｓｏＨａａｓ  ｓｐ  ５５０ｃカラムから得られる画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析によって検出され、その後、４アミノ酸のＮ末端ペプチド・タグの制御された除去を行うために、画分のプールはジペプチジル・アミノペプチダーゼ（ＤＡＰアーゼ）及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（Ｑシクラーゼ）処理にかけられた。ペプチド・タグ切断のための条件は、以下の通りであった：２ｍｇ／ｍｌのＭＫＳＫ−ＩＬ２１の水溶液、及び２５ｍＭトリス、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０におけるＭＫＳＫ−ＩＬ２１：ＤＡＰアーゼ：Ｑシクラーゼのモル比が８００：１：３２、室温（２０−２５°Ｃ）で３０分のインキューベート、Qiagen.comによって供給される酵素の使用。
【００４５】
図３Ａ及びＢに示すように、産生成熟ｈＩＬ−２１へのタグ除去の効率及び完了は、マススペクトロメトリで測定された。
パネルＡは、タグ除去前の画分のＭａｌｄｉスペクトルを示す。パネルＢは、タグ除去後の同じ画分を示す。
Ｎ末端ピログルタミン酸を有する天然ｈＩＬ２１は１５４４２Ｄａの分子量を有するが、ＭＫＳＫ−ＩＬ２１は１５９３４Ｄａの分子量を有する。パネルＢにおいて観察されるように、切断及びタグ除去は完了していた。
【００４６】
（実施例５）
リコンビナントに発現されたＭＫＴＫ標識されたヒト・インターロイキン−２１は、その成熟型、活性型にプロセシングされる。
構築物ＤＡＰ２４を用いて発現されるＭＫＴＫ−ｈＩＬ−２１は、ＷＯ０４／５５１６８にて開示したように、封入体からリフォールディングされ、ＴｏｓｏＨａａｓ  ｓｐ  ５５０ｃカラムクロマトグラフィを用いておよそ９０−９５％の純度まで精製した。ＭＫＴＫ−ｈＩＬ−２１に対応している単一の主なポリペチド・バンドは、ＴｏｓｏＨａａｓ  ｓｐ  ５５０ｃカラムから得られる画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析によって検出され、その後、４アミノ酸のＮ末端ペプチド・タグの制御された除去を行うために、画分のプールは、ジペプチジル・アミノペプチダーゼ（ＤＡＰアーゼ）及びグルタミンシクロトランスフェラーゼ（Ｑシクラーゼ）処理にかけられた。ペプチド・タグ切断のための条件は、以下の通りであった：２ｍｇ／ｍｌのＭＫＴＫ−ＩＬ２１の水溶液、及び２５ｍＭトリス、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０におけるＭＫＴＫ−ＩＬ２１：ＤＡＰアーゼ：Ｑシクラーゼのモル比が８００：１：３２、室温（２０−２５°Ｃ）で３０分のインキューベート、Qiagen.comによって供給される酵素の使用。
【００４７】
図４Ａ及びＢに示すように、産生成熟ｈＩＬ−２１へのタグ除去の効率及び完了は、マススペクトロメトリで測定された。
パネルＡは、タグ除去前の画分のＭａｌｄｉスペクトルを示す。パネルＢは、タグ除去後の同じ画分を示す。
Ｎ末端ピログルタミン酸を有する天然のｈＩＬ２１は１５４４２Ｄａの分子量を有するが、ＭＫＴＫ−ＩＬ２１は１５９４８Ｄａの分子量を有する。パネルＢにおいて観察されるように、切断及びタグ除去は完了していた。
【００４８】
（薬理学的方法）
アッセイ（Ｉ）ＩＬ−２１活性を測定するためのＢＡＦ−３アッセイ
ＢＡＦ−３細胞（骨髄に由来するマウスのプロＢリンパ性細胞株）は、本来、増殖及び生存をＩＬ−３に依存していた。Ｉｌ−３は、ＩＬ−２１と同じメディエーターであるＪＡＫ−２及びＳＴＡＴを活性化し、刺激により活性化する。ヒトＩＬ−２１受容体の形質導入後、細胞株はＩＬ−２１−依存性の細胞株に変わった。このクローンは、ＢＡＦ−３細胞の生存についてＩＬ−２１試料の効果を評価するために用いることができる。
ＢＡＦ−３細胞は、３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間、飢餓培地（ＩＬ−２１を含まない培地）において増殖される。
細胞は、飢餓培地で洗浄及び再懸濁され、プレート上に播種される。１０μｌのＩＬ−２１化合物、コントロールとしての異なる濃度のヒトＩＬ−２１が細胞に添加され、プレートは３７℃、５％ＣＯ２で６８時間インキューベートされる。
アラマーブルー(AlamarBlue)（登録商標）は各ウェルに添加され、細胞はさらに４時間インキューベートされる。アラマーブルーは、酸化還元指示薬であり、細胞代謝の反応によって減少するので、生存可能な細胞数の間接的な基準を提供する。
最終的に、細胞の代謝活性は、蛍光プレートリーダーで測定される。試料の吸光度は、成長ホルモン化合物、又は、コントロールで刺激されない細胞のパーセンテージで表され、濃度−反応曲線から、活性（５０％の細胞を刺激する化合物の量）が算出され得る。
本発明の構築物の生物学的活性は、ＩＬ−２１受容体を用いたこのアッセイにおいて試験されるように、全ての構築物から切断された天然のＩＬ−２１の活性がＷＯ２００４５５１６８に記載される方法によって製造されるＭｅｔ−ＩＬ２１と等力だったことを示す。
【図１Ａ】
2010519894.tif 000003
【図１Ｂ】
2010519894.tif 000004
【図２Ａ】
2010519894.tif 000005
【図２Ｂ】
2010519894.tif 000006
【図３Ａ】
2010519894.tif 000007
【図３Ｂ】
2010519894.tif 000008
【図４Ａ】
2010519894.tif 000009
【図４Ｂ】
2010519894.tif 000010
【配列表】
2010519894000001.app
【国際調査報告】
2010519894.tif 000011
2010519894.tif 000012
2010519894.tif 000013