(57)【要約】  本発明は、１つまたはそれ以上の機能性セストリンを産生しないかあるいは最適以下の量でのみ産生し、かつまた潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質４（ｌｔｂｐ４）を産生しないかあるいは最適以下の量でのみ産生する非ヒト動物モデル、それ由来の細胞および組織培養物に関する。また、本発明は、本発明の動物モデル、細胞または組織培養物を利用することによって示される肺気腫および／または結腸直腸癌を治療するための薬剤を選択する方法に関する。動物モデル、細胞または組織培養物は、可能性のある薬剤の効果、毒性および生物学的利用能の前臨床試験に適する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたはそれ以上の機能性セストリンを発現しないかあるいは１つまたはそれ以上のセストリンを最適以下の量で発現し、かつ潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質４（ｌｔｂｐ４）を発現しないかあるいはｌｔｂｐ４を最適以下の量で発現する非ヒト動物モデル。
【請求項２】
（ｉ）動物のゲノムがセストリン遺伝子のホモ接合破壊またはヘテロ接合破壊を含有し、好ましくは破壊されたセストリン遺伝子がセストリン１、セストリン２、およびセストリン３から選択され、最も好ましくはセストリン２である；および／または
（ｉｉ）動物のゲノムがｌｔｂｐ４遺伝子のホモ接合破壊またはヘテロ接合破壊を含有する、請求項１に記載の動物モデル。
【請求項３】
前記破壊が変異によって生じるものであり、好ましくは前記変異が、
（ｉ）挿入、欠失または置換変異である；および／または
（ｉｉ）遺伝子ターゲッティング、遺伝子トラッピングまたは化学的変異誘発によって生じる；および／または
（ｉｉｉ）セストリン遺伝子およびｌｔｂｐ４遺伝子のエキソン、イントロン、調節領域またはスプライス部位に生じている；および／または
（ｉｖ）レポーター遺伝子の発現を生じさせる；および／または
（ｖ）セストリン２遺伝子の第９イントロンに生じている；および／または
（ｖｉ）ｌｔｐｂ４遺伝子の第５イントロンに生じている；
請求項２に記載の動物モデル。
【請求項４】
（ｉ）セストリン２遺伝子が、遺伝子トラップベクター、好ましくはｐＴ１βｇｅｏ（配列番号１０）を挿入することによって第９イントロンにおいて破壊される；および／または
（ｉｉ）ｌｔｂｐ４遺伝子が、遺伝子トラップベクター、好ましくはＵ３Ｃｒｅ（配列番号１６）を挿入することによって第５イントロンにおいて破壊される；
請求項２または３に記載の動物モデル。
【請求項５】
（ｉ）前記非ヒト動物が非ヒト哺乳動物であり、好ましくは前記非ヒト哺乳動物が齧歯類、例えばマウスおよびラットである；および／または
（ｉｉ）前記動物が肺気腫および癌を示し、好ましくは癌が結腸癌である；
請求項１から４のいずれか１項に記載の動物モデル。
【請求項６】
１つまたはそれ以上の機能性セストリンを発現しないかあるいは１つまたはそれ以上のセストリンを最適以下の量で発現する非ヒト動物モデルであり、好ましくは前記動物モデルが請求項１から５に定義されるものである非ヒト動物モデル。
【請求項７】
請求項１から６に記載の動物モデルから単離される細胞または組織培養物。
【請求項８】
細胞または組織培養物が肺または結腸由来のものである、請求項７に記載の細胞または組織培養物。
【請求項９】
出発非ヒト動物の生殖細胞においてセストリンおよび／またはｌｔｂｐ４遺伝子を破壊することを含む、請求項１から６に記載の非ヒト動物モデルの調製方法。
【請求項１０】
非ヒト動物が非ヒト哺乳動物であり、および生殖細胞がＥＳ細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の非ヒト動物モデルにおいて生じる症状を治療するための薬剤を選択する方法であって、
（ｉ）試験すべき１つまたはそれ以上の薬剤を前記動物モデルに施用し、
（ｉｉ）前記動物モデルにおいて生じる1つまたはそれ以上の症状が前記薬剤の施用の結果として変化しているかどうかを調べる
ことを含む、前記方法。
【請求項１２】
症状が癌および肺気腫からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＯＳ産生およびＴＧＦ−βシグナル伝達を妨害する薬剤を選択する方法であって、
（ｉ）試験すべき１つまたはそれ以上の薬剤を請求項７に記載の細胞または組織培養物に施用し、
（ｉｉ）細胞ＲＯＳ量およびＴＧＦ−βシグナル伝達が前記薬剤の施用の結果として変化しているかどうかを調べる、
ことを含む、前記方法。
【請求項１４】
細胞または組織培養物が肺または結腸由来のものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
癌および／または肺気腫が差次的ｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量によって引きこされるかまたはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の欠陥によって引き起こされるかどうかを解析する方法であって、
（ｉ）癌または肺気腫を有する個体のｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態を特定し、
（ｉｉ）対照個体のｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態、すなわち癌および／または肺気腫および／または心筋症が差次的ｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の欠陥に関連付けられることを示すｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態の相違を特定する、
ことを含む、前記方法。
【請求項１６】
癌および／または肺気腫および／または心筋症の診断方法であって、
（ｉ）個体のｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態を特定し、
（ｉｉ）対照個体のｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態、すなわち前記個体の癌および／または肺気腫および／または心筋症の存在を示すＬＴＢＰ−４遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態の相違を特定する、
ことを含む、前記方法。
【請求項１７】
（ｉ）ｌｔｂｐ４およびセストリンの発現または発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザン分析、マイクロアレイ分析またはｌｔｂｐ４およびセストリンタンパク質に対する抗体によって検出する；および／または
（ｉｉ）ｌｔｂｐ４およびセストリンの遺伝子の発現または発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザン分析、マイクロアレイ分析またはｌｔｂｐ４およびセストリンタンパク質に対する抗体によって検出する；および／または
（ｉｉｉ）ｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態を、変異スクリーニングによって検出する、
請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
個体および対照のｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態を検出する手段を含有する、癌および／または肺気腫および／または心筋症の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１種またはそれ以上の機能性セストリンを産生しないかあるいは最適以下の量でのみ産生し、かつまた潜在性トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質４（ｌｔｂｐ４）を産生しないかあるいは最適以下の量でのみ産生する非ヒト動物モデル、それ由来の細胞および組織培養物に関する。また、本発明は、本発明の動物モデル、細胞または組織培養物を利用することによって示される肺気腫および／または結腸直腸癌を治療するための薬剤を選択する方法に関する。動物モデル、細胞または組織培養物は、潜在的因子（potential agent）の効果、毒性および生物学的利用能の前臨床試験に適している。
【０００２】
発明の背景
肺気腫を伴う慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、患者およびその家族の生活の質に大きな影響を及ぼし、かつ世界中で何百万という人々を死に至らしめる広く蔓延している疾患である。ＣＯＰＤの主な危険因子は、主としてタバコの煙の中に生じるがそれに限らない有毒ガスおよび粒子の吸入であるが、喫煙者のごく一部だけがＣＯＰＤを発症することから、原発性（遺伝的）気道異常も関与する。ＣＯＰＤは、主として長期の酸素療法および入院などの費用のかかる治療、並びに作業能力の損失を含む間接費用のせいで、大きな医療費を伴う。また、ＣＯＰＤの治療は、薬理学的介入が疾患の自然な経過を変えることがこれまでに明らかにされていないことから、症状に限定される（Vestbo J. and Hogg, J.C. Thorax. 61：86-8, 2006；Fabbri L.M., et al. Am J Respir Crit Care Med. 173：1056-65, 2006）。
【０００３】
結腸直腸癌は、西半球では最も一般的な新生物の一つであり、発見および療法の進歩にも関わらず主要な公衆衛生の課題である。その５年での全死亡率は、約４０％である。早期の疾患は、外科手術によって治療することができるが、生存率が７〜２４ヶ月である切除できない転移性癌を有する患者については対症療法が利用できるのみである（Shaheen N.J., et al. Am J Gastroenterol. 2006)。
【０００４】
上記から、上記の両方の疾患を治療するための新規な医薬化合物が強く望まれていること、かつセストリン２遺伝子および潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質４遺伝子の機能損失型変異の結果として肺気腫および結腸癌の両方を示す本発明の動物モデルを用いて同定し得ることが明らかになる。
【０００５】
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）類は、タンパク質スーパーファミリーに属し、そのメンバーは種々様々な成体組織において細胞の増殖と分化を調節し、かつ広範な免疫応答および炎症反応に関与する（Shi Y. and Massague, J. Cell. 113：685-700, 2003；Sheppard D. Proc Am Thorac Soc. 3：413-7, 2006)。大半の細胞は、タンパク分解性切断による活性化の後にのみその受容体と相互作用するその潜伏関連プロペプチド（ＬＡＰ）に複合した機能的に不活性な潜在型サイトカインとしてＴＧＦ−βを分泌する。ＴＧＦ−βの２つの公知の構造的に異なる潜在型複合体が存在する。小さい潜在型複合体は、ＴＧＦ−β−ＬＡＰプロペプチドのＮ末端部に結合された成熟ＴＧＦ−β二量体からなる。大きい潜在型複合体は、ＴＧＦ−β−ＬＡＰの他に、３つの潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質（ｌｔｂｐ１、ｌｔｂｐ３およびｌｔｂｐ４）のうちの１つを含有する。分泌後に該ｌｔｂｐ類から置換される（displaced）にもかかわらず、ＴＧＦ−βは、通常は、ｌｔｂｐおよびＬＡＰとの高分子量複合体として細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に沈着する（Annes J.P., et al. J Cell Sci. 116：217-24, 2003）。ｌｔｂｐの４つの存在するイソ型（ｌｔｂｐ１〜４）全部が、マウスにおいて変異によって不活性化されている（Dabovic B., et al. J Cell Biol. 56：227-232, 2002；Sterner-Kock A., et al., Genes Dev. 16：2264-2273, 2002；Shipley J.M., et al. Mol Cell Biol. 20：4879-87, 2000）。ノックアウトマウスの表現型はイソ型の間で変化しているが、ｌｔｂｐ３変異体およびｌｔｂｐ４変異体の両方は、ＴＧＦ−βシグナル伝達の欠陥により肺気腫を発症する。しかし、比較的軽度であり、かつ厳密にいえば発生性である（Dabovic B., et al. J Cell Biol. 56：227-232, 2002）肺気腫を発症する変異ｌｔｂｐ３マウスとは対照的に、変異ｌｔｂｐ４（ｌｔｂｐ４−／−）マウスの肺気腫は、年齢と共に悪化し、ヒトのＣＯＰＤとの関連で発症する遅発性肺気腫の特徴を漸次獲得する（Sterner-Kock A., et al. Genes Dev. 16：2264-2273, 2002；国際公開第ＷＯ０３／０１５５０５号明細書）。ＣＯＰＤの発症におけるｌｔｂｐ４の潜在的関連性が、最近、具体的なＣＯＰＤの症状とｌｔｂｐ４の一塩基変異多型（ＳＮＰ）との間の極めて重要な相関関係を報告する臨床研究によって強調されている（Hersh C. P., et al. Am J Respir Crit Care Med. 173：977-84, 2006）。肺気腫の他に、変異ｌｔｂｐ４マウスは、浸潤性結腸直腸癌を発症する（Sterner-Kock A., et al. Gene Dev. 16：2264-2273, 2002；国際公開第ＷＯ０３／０１５５０５号明細書）。ｌｔｂｐ４発現と癌進行との間の関連もまた、最近、大腸癌を有する患者の臨床研究において報告されている（Bertucci F., et al. Oncogene. 23：1377-91, 2004）。
【０００６】
セストリン２は、ｐ５３誘導タンパク質として最初に発見された高度に保存されたタンパク質のファミリーに属する（Velasco-Miguel S., et al. Oncogene. 18：127-37, 1999；Peeters H., et al. Hum Genet. 112：573-80, 2003；Budanov A.V., et al. Oncogene. 21：6017-31, 2002；国際公開第ＷＯ００／１２５２５号明細書；米国特許出願公開第２００２／０１０３３５３号明細書）。哺乳動物細胞は、セストリン１（セストリン１；ＰＡ２６としても公知である）、セストリン２（セストリン２；Ｈｉ９５としても公知である）およびセストリン３と呼ばれる３つのイソ型を発現する（図１）。該セストリン類の中の２つ（セストリン１およびセストリン２）は、最近、細胞内過酸化物（ＲＯＳ）量を調節することが明らかにされている（Budanov A.V., et al. Science. 304：596-600, 2004；Sablina A.A., et al. Nat Med. 11：1306-13, 2005）。さらに詳しくは、セストリン類は、高度に保存され、かつ偏在的に発現されるペルオキシレドキシン（Ｐｒｘ）類、すなわち抗酸化タンパク質を再生する（還元する）と考えられる（Georgiou G. and Masip, L. Science. 300：592-4, 2003；Wood Z.A., et al. Trends Biochem Sci. 28：32-40, 2003に概説されている）。Ｈ２Ｏ２をＨ２Ｏに還元する間に、Ｐｒｘ類は、そのいわゆる過酸化システイン（Ｃｙｓ−ＳＨ）において酸化され、過酸化システイン（Ｃｙｓ−ＳＨ）はスルフェン酸に転化される（Ｃｙｓ−ＳＯＨ）（図２）。細菌において、Ｐｒｘ  ＡｈｐＣが一次Ｈ２Ｏ２スカベンジャーである場合には、酸化されたＡｈｐＣは、その後にその専用レダクターゼＡｈｐＦによって還元される。しかし、ＡｈｐＣとは異なり、哺乳動物のＰｒｘは、高い過酸化物濃度の存在下でスルフィン酸（ＣｙＳ−ＳＯ２Ｈ）を生成する過剰酸化に極めて感受性である（図２）。タンパク質スルフィン酸は、典型的な細胞還元剤、例えばグルタチオンおよびチオレドキシンによって還元することができず、従ってその形成は不可逆プロセスであると考えられている。Ｐｒｘは、スルフィン酸に転化されると、酸化ストレスにさらされた細胞においてもはや酵素的に活性なおよび不活性な酵素蓄積体ではない（Wood Z.A., et al. Trends Biochem Sci. 28：32-40, 2003）。しかし、最近になって、Ｐｒｘ類の穏やかな回復が、真核細胞における初期の酸化的不活性化の後に観察されており（Mitsumoto A., et al. Free Radic Biol Med. 30：625-35, 2001；Woo H.A., et al. Science. 300：653-6, 2003）、またセストリンは、ＡｈｐＣ  Ｐｒｘを再生する細菌セストリンホモローグ −ＡｈｐＤ−とのその相同性によりおよびその細胞内ＲＯＳ量を還元する能力により触媒性酵素として提案されている（Budanov A. V., et al. Science. 304：596-600, 2004）。
【０００７】
真核細胞において、Ｐｒｘ類は、ストレスから保護する抗酸化剤およびＲＯＳ介在シグナル伝達の調節剤の両方であると考えられる（Wood Z. A., et al. Science. 300：650-3, 2003）。受容体／リガンド相互作用は、シグナル伝達経路、例えばＴＧＦ−β経路において二次メッセンジャーとして働くＲＯＳのバーストを生じることが少し前から知られている（Bae Y.S., et al. J Biol Chem. 272：217-21, 1997；Lo Y.Y. and Cruz, T.F. J Biol Chem. 270：11727-30, 1995；Mills E.M., et al. J Biol Chem. 273：22165-8, 1998；Sundaresan M., et al. Science. 270：296-9, 1995；Thannickal V.J., et al. J Biol Chem. 273：23611-5, 1998；Thannickal V.J, et al. Faseb J. 14：1741-8, 2000）。欠陥のあるＴＧＦ−βシグナル伝達は、動物モデル（例えば、国際公開第ＷＯ０３／０１５５０５Ａ３号明細書）および人間の両方において肺気腫および結腸直腸癌の病態に関与していることが明らかにされている（Morris D.G., et al. Nature. 422：169-73, 2003；Neptune E.R., et al. Nat Genet. 33：407-11, 2003；Sterner-Kock A., et al. Genes Dev. 16：2264-2273, 2002；Massague J., et al. Cell. 103：295-309. 2000；Zhu Y., et al. Cell. 94：703-14, 1998）。
【０００８】
ＲＯＳとＴＧＦ−βの間の会合は、複雑であり、シグナル伝達カスケードの種々のレベルで生じる。第一に、ＲＯＳは、潜在型ＴＧＦ−β１を生体外および生体内の両方で活性化させることが明らかにされている（Annes J.P., et al. J Cell Sci. 116：217-24, 2003；Barcellos-Hoff M.H. and Dix, T.A. Mol Endocrinol. 10：1077-83, 1996）。これに従って、Ｆａｔｍａらは、最近、Ｐｒｘ６ノックアウトマウスから誘導された水晶体上皮細胞が酸化ストレスに極めて感受性であり、ＴＧＦ−β刺激と区別ができない表現型を発現することを報告している。彼らは、この表現型を、抗酸化剤によって容易に逆転可能(reversible)であった潜在型ＴＧＦ−βのＲＯＳ介在性活性化に帰することができた（Fatma N., et al. Cell Death Differ. 12：734-50, 2005）。第二に、ＴＧＦ−βは、種々の標的遺伝子、例えばＰＡＩ−１、ＣＴＧＦおよび細胞外マトリックス遺伝子の誘導にＲＯＳを必要とする（Jiang Z., et al. Biochem Biophys Res Commun. 309：961-6, 2003；Park S.K., et al. Biochem Biophys Res Commun. 284：966-71, 2001）。最近の研究は、ＴＧＦ−β誘導ｓｍａｄ２，３リン酸化もまた、部分的にＲＯＳに依存し（Cucoranu I., et al. Circ Res. 97：900-7, 2005）、おそらくは専用ホスファターゼの不活性化によると思われることを明らかにしている。ホスファターゼがＲＯＳによる不活性化に感受性であることが少し前から知られており（Seo J. H., et al. Mol Biol Cell. 16：348-57, 2005；Chiarugi P. and Cirri, P. Trends Biochem Sci. 28：509-14, 2003）、またＴＧＦ−βシグナル伝達を終結させることができるｓｍａｄ２，３ホスファターゼ（ＰＰＭ１Ａ）が、最近発見されている（Lin X., et al. Cell. 125：915-28, 2006）。第三に、ＴＧＦ−βそれ自体は、おそらくはＮｏｘ４の転写アップレギュレーションによると思われるＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化することによってスーパーオキシドの産生を誘導する（Sturrock A., et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 290：L661-L673, 2006）。
【０００９】
発明の詳細
今般、国際公開第ＷＯ０３／０１５５０５号明細書に記載されている動物モデル（ｌｔｂｐ４−／−マウスモデル）由来のセストリン、特にセストリン２の遺伝子除去が病状の著しい回復をもたらし（実施例参照）、このファミリーのタンパク質がＣＯＰＤおよび結腸直腸癌の治療のための分子標的を提供できることを示すことがわかった。国際公開第ＷＯ０３／０１５５０５号明細書の動物モデルにおけるセストリン２の除去は、おそらくは細胞内二次メッセンジャーＲＯＳ量を増加させることによって、ＴＧＦ−βシグナル伝達を再活性化したと考えられる。これは、次に、実施例によって例証されるように両方の病態を有意に改善し、肺気腫および大腸癌がセストリン機能を拮抗することによって治療できることを示唆する。従って、本発明は、
（１）１つまたはそれ以上の機能性セストリンを産生しないかあるいは１つまたはそれ以上のセストリンを最適以下の量で産生し、かつ潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質４（以下「ｌｔｂｐ４」という）を産生しないかあるいはｌｔｂｐ４を最適以下の量で産生する非ヒト動物モデル；
（２）１つまたはそれ以上の機能性セストリンを発現しないかあるいは１つまたはそれ以上のセストリンを最適以下の量で発現する非ヒト動物モデル；
（３）上記の（１）または（２）に定義したような動物モデルから単離される細胞または組織培養物；
（４）出発非ヒト動物の生殖細胞においてセストリンおよび／またはｌｔｂｐ４遺伝子を破壊することを含む、上記（１）の非ヒト動物モデルの調製方法；
（５）上記（１）の非ヒト動物モデルにおいて生じる症状を治療するための薬剤を選択する方法であって、
（ｉ）試験すべき１つまたはそれ以上の薬剤を該動物モデルに施用し、
（ｉｉ）該動物モデルに生じる1つまたはそれ以上の症状が該薬剤の施用の結果として変化しているかどうかを調べる
ことを含む、前記方法；
（６）ＲＯＳ産生およびＴＧＦ−βシグナル伝達を妨害する薬剤を選択する方法であって、
（ｉ）試験すべき１つまたはそれ以上の薬剤を上記（３）の細胞または組織培養物に施用し、
（ｉｉ）細胞ＲＯＳ量およびＴＧＦ−βシグナル伝達が該薬剤の施用の結果として変化しているかどうかを調べる
ことを含む、前記方法；
（７）癌および／または肺気腫が差次的ｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量によって引き起こされるかあるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の欠陥によって引き起こされるかどうかを解析する方法であって、
（ｉ）癌または肺気腫を有する個体のｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態を特定し、
（ｉｉ）対照個体のｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態、すなわち癌および／または肺気腫および／または心筋症が差次的ｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の欠陥に関連付けられることを示すｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態の相違を特定する、
ことを含む、前記方法；
（８）癌および／または肺気腫および／または心筋症の診断方法であって、
（ｉ）個体のｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態を特定し、
（ｉｉ）対照個体のｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態、すなわち該個体の癌および／または肺気腫および／または心筋症の存在を示すＬＴＢＰ−４遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態の相違を特定する、
ことを含む、前記方法；
（９）個体および対照のｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態を検出する手段を含有する、肺気腫および／または癌の診断用キット；並びに
（１０）上記（６）の方法を実施するためのキットであって、上記（３）の細胞または組織培養物を含有する、前記キット
に関する。
【００１０】
上記（９）および（１０）のキットは、さらに、該方法を実施するための説明書、特にｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態を検出するための説明書を含有していてもよい。
【００１１】
要するに、本発明は、セストリンタンパク質の幾つかの重要な機能を明らかにするヒトの疾患の動物モデルを提供する。これらの機能に照らして、本発明の動物モデルは、セストリンタンパク質並びにＲＯＳ代謝およびＴＧＦ−βシグナル伝達におけるその役割を標的とする肺気腫および癌の新規な治療法を開発するのに使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】マウスセストリン類のアミノ酸配列およびイソ型同士の間の相同性を表す。各イソ型の配列をさらに配列番号１〜３に示す。
【図２】スーパーオキシドによるペルオキシレドキシン（Ｐｒｘ）類の過酸化システインの酸化を表す。還元されたＰｒｘ類は、ジスルフィド結合（１）によって２量体を形成する。酸化されたＰｒｘ類は、スルフェン酸（２）を形成し、これは逆反応（１）においてチオレドキシンまたはグルタチオンによって還元される。過酸化されたＰｒｘ類はスルフィン酸を形成し、これはチオレドキシンまたはグルタチオンでは還元できない（３）。セストリン類は、過酸化されたＰｒｘ類を生成すると考えられる。さらなる説明については、本文参照。
【図３】セストリン２遺伝子（Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｉｄ：ＥＮＳＭＵＳＧ００００００２８８９３）の最後のイントロンへのｐＴ１βｇｅｏ遺伝子トラップの挿入および対立遺伝子特異的プライマーの位置（矢印）を表す。得られる融合タンパク質は、セストリン２の２７ａａを欠く。
【図４】Ｘ−ＧａＩで染色されるホールマウントＥ７．５胚を表す。
【図５】Ｗ０７７Ｅ０４変異マウスにおけるセストリン２遺伝子発現の分析を表す。Ａは、野生型（ＷＴ）マウス、ヘテロ接合（＋／−）マウスおよびホモ接合（−／−）マウスの肺から抽出した全ＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲを表す。Ｂは、ポリクロナール抗マウスセストリン２（ＰＴＧ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）および抗チューブリン抗体を使用する単離されたマウスの結腸（レーン１、２）および肺（レーン３、４）の線維芽細胞におけるセストリン２タンパク質発現のウェスタンブロット分析を表す。ポリクロナール抗セストリン２抗体と反応する小さいバンドは、おそらくは非特異的である思われる。
【図６】５．５月齢の老いた野生型の単一ｌｔｂｐ４変異マウスおよび二重ｌｔｂｐ４／ｓｅｓｎ２変異マウスの気管支シリコーンキャストを表す。
【図７】年齢に適合した単一ｌｔｂｐ４変異マウスおよび二重ｌｔｂｐ４／ｓｅｓｎ２変異マウスの肺気腫を表す。倍率４０倍でのＨＥ染色。
【図８】単一ｌｔｂｐ４変異および二重ｌｔｂｐ４／ｓｅｓｎ２変異肺のエラスチンおよびコラーゲン含有量を表す。Ａは、倍率２００でのレゾルシン−フクシン法で染色されたエラスチン（黒色）を表す。Ｂは、倍率２００でのＭａｓｓｏｎのトリクローム染色法で染色されたコラーゲン（青色）を表す。
【図９】ｓｅｓｎ２ヌル対立遺伝子についてヘテロ接合のｌｔｂｐ４−／−肺の気管支シリコーンキャストを表す。
【図１０】ｓｅｓｎ２ヌル対立遺伝子についてヘテロ接合（ｓｅｓｎ＋／−）およびホモ接合（ｓｅｓｎ−／−）のｌｔｂｐ４変異肺のコラーゲン沈着を表す。倍率２００でのＭａｓｓｏｎのトリクローム染色法で染色されたコラーゲン（青色）を表す。
【図１１】年齢に適合した単一（ｌｔｂｐ４−／−）変異マウスおよび二重（ｌｔｂｐ４−／−ｓｅｓｎ２−／−）変異マウスの結腸直腸腺腫を表す。
【図１２】年齢に適合した単一（ｌｔｂｐ４−／−）変異マウスおよび二重（ｌｔｂｐ４−／−ｓｅｓｎ２−／−）変異マウスの結腸のＰ−ｓｍａｄ２量を表す。陽性細胞は赤褐色である。
【図１３】ｓｅｓｎ２変異体の肺のＰ−ｓｍａｄ２量を表す。肺の切片は、ポリクロナール抗Ｐ−ｓｍａｄ２抗体で染色された。陽性細胞は赤褐色である。
【図１４】変異ｓｅｓｎ２肺の増加した結合組織沈着を表す。２００倍（上部）および４００倍（下部）のＨＥ染色。
【図１５】ＭＬＦにおけるＲＯＳ量を表す。Ａは、ＤＣＦ処理後にＦＡＣＳ（５３０ｎｍ）で測定したＢａｓａｌおよびＨ２Ｏ２誘導（２００μＭ、３時間）ＲＯＳ量を表す。ＦＬｌ−Ｈ、蛍光強度。Ｂは、Ａに示した２つの独立した実験の平均細胞蛍光強度±ＳＤとして表したＭＬＦに蓄積するＢａｓａｌおよびＨ２Ｏ２誘導ＲＯＳ量を表す。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明を定義するために利用される個々の用語および略語を、以下においてさらに定義する。
【００１４】
「機能性セストリンを産生しない」および「機能性ｌｔｂｐ４を産生しない」という用語は、それぞれ、有効なセストリンおよびｌｔｂｐ４の発現がないことを表す。「有効なセストリンおよびｌｔｂｐ４の発現がない」とは、天然タンパク質の機能を発揮しない非機能性（すなわち切断された）セストリンおよびｌｔｂｐ４タンパク質の発現も包含する。
【００１５】
「セストリンを最適以下の量で産生する」および「ｌｔｂｐ４を最適以下の量で産生する」という用語は、その機能を発揮するのに十分でない翻訳量のセストリンおよびｌｔｂｐ４タンパク質を包含する。好ましくは、その量は、少なくとも５０％まで、さらに好ましくは７０％まで、最も好ましくは１００％まで減らされる。
【００１６】
「ホモ接合破壊」という用語は、遺伝子の二つの対立遺伝子における同一の変異に関する。
【００１７】
「ヘテロ接合破壊」という用語は、遺伝子の１個の対立遺伝子だけにおける変異に関する。「変異」という用語は、ＤＮＡ分子の１個またはそれ以上のヌクレオチド対の変化を指す。
【００１８】
「挿入」という用語は、ＤＮＡ中の１つまたはそれ以上の追加的な塩基対の存在によって同定される変異に関する。「欠失」という用語は、ＤＮＡの配列（１つまたはそれ以上の塩基対）の除去によって生じる変異に関し、いずれかの側の領域は一緒に結合される。「置換変異」とは、ヌクレオチドの交換に関する。置換変異は、アミノ酸変化をもたらすかまたは早期翻訳終止コドンを誘導することができる。また、置換変異は、スプライシングまたは遺伝子調節に必要な部位で生じる場合には、遺伝子のスプライシングまたは発現に影響を及ぼすことができる。
【００１９】
「遺伝子ターゲッティング」という用語は、ゲノムＤＮＡの断片が細胞中に導入される場合に生じる相同的組換えおよび断片がゲノム中の相同配列と再結合する相同的組換えの一つの型に関する。「遺伝子トラップの組み込み」という用語は、レポーター遺伝子を含有し、かつゲノムの活性転写単位への挿入の際に活性化されるベクターの挿入に関する。「変異誘発」とは、生物のゲノム中のヌクレオチドを変化させる化学的または物理的処理を表す。化学的変異誘発の例は、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）変異誘発である。
【００２０】
「エキソン」という用語は、ｍＲＮＡ産物を得るために解読される遺伝子のセグメントを包含する。個々のエキソンは、タンパク質コードＤＮＡおよび／または非コードＤＮＡを含有していてもよい。「イントロン」という用語は、遺伝子中の隣接エキソン同士を隔てる非コードＤＮＡを表す。遺伝子の発現中に、イントロンはエキソンのようにＲＮＡに転写されるが、転写されたイントロン配列はその後にＲＮＡスプライシングによって除去され、ｍＲＮＡ中に存在しない。「調節領域」とは、遺伝子転写の調節に必要である領域を含有するヌクレオチド配列に関する。これらの領域は、例えばプロモーターおよびエンハンサーを含有し、これらの領域は、５’非翻訳領域、エキソン、イントロンおよび３’ＵＴＲに配置されることができる。「スプライス部位」という用語は、機能性ｍＲＮＡへの一次転写産物プロセシング中に挿入イントロンを除去することによる２つのエキソンの結合に必要とされるイントロンの先端および末端のヌクレオチドを包含する。
【００２１】
「肺気腫」という用語は、終末細気管支よりも末梢の気腔の、正常なサイズを越えるサイズの増大および炎症性浸潤物によって特徴付けられる慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の症状を表す。
【００２２】
「心筋症」という用語は、ＣＯＰＤを悪化させる肺高血圧症の結果である心筋の原発性非炎症性疾患をいう。「癌」という用語は、結腸陰窩の内側を覆う上皮細胞の制御されない増殖を指す。
【００２３】
「ＲＯＳ代謝」とは、細胞内活性酸素種、例えば過酸化水素アニオンおよび酸素アニオンの産生および中和（還元）を指す。「線維化誘導性変化」という用語は、線維芽細胞の増殖に付随するコラーゲンの増大した組織沈着を指す。
【００２４】
「症状を治療するための薬剤を選択する」という用語は、状態の管理のための組成物を選択することを包含する。
【００２５】
「１つまたはそれ以上の薬剤の施用」という用語は、単一の化合物または化合物の組み合わせを、経口的に、吸入によって、非経口的に、例えば静脈内に、皮下に、腹腔内にまたは筋肉内に、あるいは局所的に、例えば眼に、膣に、直腸にまたは鼻腔内に投与することに関する。
【００２６】
本発明を、添付の図面および実施例を参照することによって以下でさらに詳しく説明する。
【００２７】
本発明の態様（１）の好ましい実施形態において、動物のゲノムは、ｓｅｓｎ２およびｌｔｂｐ４遺伝子のホモ接合破壊を含有する。好ましくは、このホモ接合破壊は、変異によって生じており、この変異は、挿入、欠失または置換変異であることができる。また、好ましくは、該変異は、遺伝子ターゲッティング、遺伝子トラッピングまたは化学的変異誘発によって生じ、かつセストリン２遺伝子のエキソン、イントロン、調節領域またはスプライス部位に、好ましくはセストリン２遺伝子の最終イントロン（すなわち、第９イントロン）に生じており、およびｌｔｂｐ４遺伝子のエキソン、イントロン、調節領域またはスプライス部位に、好ましくはｌｔｂｐ４の第５イントロンに生じている。変異の部位が、検出可能なレポーター遺伝子、例えば蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰおよびその誘導体）、酵素（例えば、ＬａｃＺ）または選択マーカー（例えば、βｇｅｏ）などを発現することも好ましい。特に好ましいのは、
（ｉ）セストリン２遺伝子が、第９イントロンにおいて遺伝子トラップベクター、好ましくはｐＴ１βｇｅｏ（配列番号１０）を挿入することによって破壊されることである；および／または
（ｉｉ）ｌｔｂｐ４遺伝子が第５イントロンにおいて遺伝子トラップベクター、好ましくはＵ３Ｃｒｅ（配列番号１６）を挿入することによって破壊されることである。
【００２８】
さらに好ましい実施形態において、該動物は、セストリン２遺伝子のヘテロ接合破壊と、ｌｔｂｐ４遺伝子のホモ接合破壊またはセストリン２遺伝子のホモ接合破壊と、ｌｔｂｐ４遺伝子のヘテロ接合破壊とを含有する。
【００２９】
本発明の別の態様において、動物モデルは、肺気腫および／または心筋症および／または結腸直腸癌を示す。また、非ヒト動物は、好ましくは非ヒト哺乳動物であり、さらに好ましくは齧歯類、例えばマウスおよびラットである。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、動物モデルは、ＲＯＳ代謝の欠陥を示すおよび／または１つまたはそれ以上の主要臓器、好ましくは肺または結腸において線維化誘導性変化を示す。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、動物モデルは、国際公開第ＷＯ０３／０１５５０５Ａ３号明細書に開示されている動物モデルによって示される症状よりも軽い症状を起こす。
【００３２】
本発明の実施形態（３）は、非ヒト動物モデル（１）または（２）から単離される細胞または組織培養物に関する。好ましくは、細胞は肺または結腸由来である。
【００３３】
本実施形態の好ましい態様において、細胞または組織培養物は、非ヒト動物モデルであってそのゲノムが、１つまたはそれ以上のセストリン遺伝子のホモ接合破壊を、該遺伝子が機能性セストリン、好ましくはセストリン２を産生しないように含有し、かつｌｔｂｐ４遺伝子のホモ接合破壊を、該遺伝子が機能性ｌｔｂｐ４を産生しないように含有する非ヒト動物モデルから単離される。
【００３４】
本実施形態の別の好ましい態様において、細胞または組織培養物は、非ヒト動物モデルであってそのゲノムが、１つまたはそれ以上のセストリン遺伝子のヘテロ接合破壊を、該遺伝子が機能性セストリン、好ましくはセストリン２をわずか５０％以下に産生するように含有し、かつｌｔｂｐ４遺伝子のホモ接合破壊を、該遺伝子が機能性ｌｔｂｐ４を産生しないように含有する非ヒト動物モデルから単離される。
【００３５】
本実施形態の別の好ましい態様において、細胞または組織培養物は、非ヒト動物モデルであってそのゲノムが、１つまたはそれ以上のセストリン遺伝子、好ましくはセストリン２のホモ接合破壊を含有し、かつｌｔｂｐ４遺伝子のヘテロ接合破壊を該遺伝子が機能性ｌｔｂｐ４をわずか５０％以下に産生するように含有する非ヒト動物モデルから単離される。細胞または組織培養物が肺または結腸由来であることが特に好ましい。
【００３６】
本発明の実施形態（４）は、出発非ヒト動物の生殖細胞においてセストリンおよび／またはｌｔｂｐ４遺伝子を破壊することを含む、実施形態（１）および（２）の非ヒト動物モデルの調製方法に関する。本実施形態の好ましい態様において、非ヒト動物および出発非ヒト動物は非ヒト哺乳動物であり、かつ生殖細胞はＥＳ細胞である。この方法は、さらに、得られるＥＳ細胞を胚盤胞に導入し、得られる胚盤胞をそれぞれの非ヒト養母に注入し、得られるキメラを異種交配することを含み得る。
【００３７】
本発明の実施形態（５）は、本発明の動物モデルに生じる症状を治療するための１つまたはそれ以上の薬剤を選択する方法であって、（ｉ）試験すべき１つまたはそれ以上の薬剤を本発明の動物モデルに施用し；（ｉｉ）本発明の動物モデルに生じる1つまたはそれ以上の症状が該１つまたはそれ以上の薬剤の施用の結果として変化しているかどうかを調べることを含む、前記方法に関する。好ましい実施形態において、症状は、肺気腫、心筋症および癌からなる群より選択される。本発明の別の態様において、本発明の動物モデルに生じる症状を治療するのに適する薬剤は、医薬である。また、本発明は、肺気腫の治療用の医薬組成物を製造するための本発明の動物モデルに生じる症状を治療するのに適している薬剤の使用に関する。また、本発明は、本発明の動物モデルに生じる症状を治療するのに適している薬剤を使用する癌および肺気腫の治療方法に関する。
【００３８】
本発明の実施形態（６）は、ＲＯＳ産生およびＴＧＦ−βシグナル伝達を妨害する薬剤を選択する方法であって、
（ｉ）試験すべき１つまたはそれ以上の薬剤を上記（３）の細胞または組織培養物に施用し、
（ｉｉ）細胞ＲＯＳ量およびＴＧＦ−βシグナル伝達が該薬剤の施用の結果として変化しているかどうかを調べる
ことを含む、前記方法に関する。該方法において、細胞または組織培養物は肺または結腸由来のものであることが特に好ましい。
【００３９】
本発明の実施形態（７）は、肺気腫および／または癌が差次的ｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量によって引き起こされるかどうか、あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の欠陥によって引き起こされるかどうかを解析する方法であって、（ｉ）ｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいは肺気腫および／または癌を有する個体のｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態を特定し、（ｉｉ）対照個体のｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態を特定することを含む、前記方法である。ｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量の相違またはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態の相違は、ｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の欠陥が肺気腫および／または癌の発病に関与することを示す。
【００４０】
本発明の実施形態（８）は、肺気腫または癌の診断方法であって、（ｉ）個体のｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態を特定し、（ｉｉ）対照個体のｌｔｂｐ４遺伝子またはタンパク質の発現または発現量あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態を特定することを含む、前記方法に関する。ｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子またはタンパク質の発現または発現量の相違あるいはｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態の相違は、該個体において肺気腫および／または癌が存在することを示す。測定された発現量の中で、ｌｔｂｐ４発現量は、肺気腫または癌の重症度の指標であり、これに対してセストリン発現量は、低い発現量が疾患の進行に役立つような疾患の進行のマーカーである。
【００４１】
実施形態（７）および（８）に関連して使用される「個体」とは、異常が疑われるｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子対立遺伝子状態を有する個体、すなわち患者に関する。「対照個体」とは、正常なｌｔｂｐ４およびセストリン対立遺伝子状態を有する健常な個人を指す。
【００４２】
肺気腫および／または癌がｌｔｂｐ４およびセストリンに関連しているかどうかを解析する方法、および肺気腫および癌を診断する方法の好ましい実施形態において、ｌｔｂｐ４およびセストリン遺伝子の対立遺伝子状態並びにｌｔｂｐ４およびセストリンの発現または発現量は、ゲノムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザン分析、マイクロアレイ（ＤＮＡチップ）分析またはｌｔｂｐ４およびセストリンタンパク質抗体に対する抗体によって検出される。
【００４３】
実施形態（５）〜（８）の方法は、in vivoおよびin vitroで実施するのに適している。
【００４４】
本発明の動物モデルは、セストリン／ＴＧＦ−β経路を制御する分子機構を精査するのに使用することができ、かつ本発明の動物モデルに生じる肺気腫および癌またはその他の疾患に関連する表現型を変更するか、悪化させるか、減らすかまたは阻害することができる変更遺伝子の同定およびクローニングに使用することができる。また、動物モデルは、本発明の動物モデルに生じる癌および／または肺気腫またはその他の疾患用の早期診断マーカーの同定に使用することができる。また、本発明の動物モデルは、本発明の動物モデルに生じる癌および／または肺気腫またはその他の疾患の予防または治療に有用な薬剤の活性の監視に使用でき、かつ本発明の動物モデルにおいて生じる癌および／または肺気腫またはその他の疾患を進行させるかまたは悪化させると疑われる薬剤の試験モデル系として使用できる。
【００４５】
本発明を、以下の実施例においてさらに説明するが、実施例は本発明を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４６】
方法
細胞培養：［１２９／ＳｖＰａｓ］株由来ＥＳ細胞を、記載のとおりに（De-ZoIt S., et al., Nucleic Acids Res. 34：e25, 2006）して、１５％（ｖ／ｖ）の予め選択し、加熱不活性化させたウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｌｉｎａｒｉｓ、Ｂｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１００ｍＭ非必須アミノ酸類（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１０００ Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ）（Ｅｓｇｒｏ（登録商標）；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を添加したＤＭＥＭ中で、放射線照射（３２Ｇｙ）ＭＥＦ支持細胞層上で増殖させた。成体野生型およびｓｅｎｓ-/-マウス由来の肺および結腸線維芽細胞培養物を、既に記載されているような標準プロトコル（Koli K., et al. J Cell Biol., 167：123-33, 2004）に従って確立し、１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００ ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させた。最初の２週間の間に、培養物において、自然発生的な不死化が生成細胞株で生じた。
【００４７】
５’ＲＡＣＥおよび配列決定：遺伝子トラップ発現ＥＳ細胞株由来のｃＤＮＡを、ポリアデニル化ＲＮＡから、９６試料／日の処理能力を有するＲｏｂｏＡｍｐロボット装置（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して調製した。２×１０５個の細胞の試料を、１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＬｉＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＬｉＤＳおよび５ｍＭ ＤＴＴを含有する溶解緩衝液１ｍｌに溶解した。ポリアデニル化ＲＮＡを、溶解液から、製造業者の使用説明書（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）に従ってビオチン標識オリゴ−ｄ（Ｔ）プライマーで捕捉し、ストレプトアビジン被覆９６ウエルプレート（ＡＢ Ｇｅｎｅ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）上に置いた。洗浄後に、固相ｃＤＮＡ合成を、ランダムヘキサマーおよびＳｕｐｅｒ-ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してその場で行った。過剰のプライマーを除去するために、ｃＤＮＡｓをＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＰＣＲプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）で濾過した。精製ｃＤＮＡの５’末端を、ｄＣＴＰ類を用いて、製造業者の使用説明書に従ってターミナルトランスフェラーゼ−ＴｄＴ−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してつなぎ合わせた。遺伝子トラップ転写物に付加された細胞配列のＰＣＲ増幅のために、次のベクター特異的プライマー：５’−ＣＴＡ  ＣＴＡ  ＣＴＡ  ＣＴＡ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＧＣＧ  ＴＣＧ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＧＧＩ  ＩＧＧ  ＧＩＩ  ＧＧＧ  ＩＩＧ−３’（配列番号４）および５’−ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  Ａ−３’（配列番号５）；並びにネステッドＰＣＲについては、５’−ＣＴＡ  ＣＴＡ  ＣＴＡ  ＣＴＡ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＧＣＧ  ＴＣＧ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＡＣ−３’（配列番号６）および５’−ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＣＧＡ  ＧＧＣ  ＣＧ−３’（配列番号７）を使用した。増幅生成物は、ＡＢ３７７またはＡＢＩ３７００配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）を使用して直接に配列決定した。
【００４８】
ＥＳ細胞注入、増殖および遺伝子型決定：Ｗ０７７Ｅ０６（ＴＢＶ−２；１２９ＳｖＰａｓ）ＥＳ細胞由来キメラを、Ｃ５７ＢＩ／６胚盤胞を注入することによって生じさせた。得られた雄性キメラをＣ５７ＢＩ／６雌性に交配させ、破壊された導入遺伝子を含有するＦ１アグーチ子孫を異種交配させてホモ接合Ｆ２マウスを得た。遺伝子型決定を、マウス尾部ＤＮＡについて、インバースＰＣＲおよび配列決定によってＥＳ細胞において先に同定された遺伝子トラップ挿入に隣接する配列に対してプライマーを使用するゲノムＰＣＲで行った。
【００４９】
組織学的検査、組織化学的検査および免疫組織化学的検査：マウス組織のパラフィン切片を調製し、標準組織学的手法を使用して染色した。エラスチンおよびコラーゲン線維を視覚化するために、顕微鏡スライドを、以前に記載のようにして（Sterner-Kock A., et al., Gene Dev., 16：2264-2273, 2002）ワイゲルトのレゾルシン−フクシン染色法またはＭａｓｓｏｎのトリクローム染色法で染色した。ウサギポリクロナール抗Ｐ−Ｓｍａｄ２抗体を使用する免疫染色を、Ｓｔｅｒｎｅｒ−Ｋｏｃｋら（Sterner-Kock A., et al., Genes Dev. 16：2264-2273, 2002）に記載のとおりにして行った。
【００５０】
プラスチネーション：野生型マウスおよび変異マウスから調製した肺の気管に、室温で、２ｍｌ注射器を使用して１〜２ｍｌのＥ ＲＴＶシリコーン（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ，ＵＳＡ）を注入した。注入の直前に、硬化剤をシリコーンポリマーに１：１０の比率で加えた。シリコーンが両方の肺の表面下で目に見えた時に注入を止めた。注入後に、シリコーンを２４〜４８時間硬化させ、その後に標本を１０％水酸化カリウム溶液に５〜７日間入れて置き、次いで沸騰水中に８〜１２時間放置して組織をポリマーから切り離した。沸騰水中で浸軟後に、標本を５％過酸化水素中に約２時間入れておき残存組織の除去を終えた。次いで、キャストを流水で一夜洗浄した。
【００５１】
ＲＮＡ単離、ＲＴ−ＰＣＲおよびタンパク質分析：全細胞ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造業者の使用説明書に従って単離した。ＲＮＡ濃度および純度を、分光光度分析（ＵｌｔＲＯＳｐｅｃ ３０００、Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびアガロースゲル電気泳動、次いで臭化エチジウム染色によって調べた。ＲＴ−ＰＣＲを、標準プロトコルに従って全用量５０μｌ中に７５ｎｇの逆転写された全ＲＮＡを使用することによって行った。ＥＳ細胞におけるセストリン２遺伝子の発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を、ＳＹＢＲグリーンケミストリー（ＡＢｇｅｎｅ，Ｅｐｓｏｍ，ＵＫ）およびｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）装置を使用して行った。ｃＤＮＡを、全ＲＮＡからランダムプライミングおよびＳｕｐｅｒ-ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）逆転写酵素を使用して合成した。ＰＣＲ反応を、９６ウエルプレートで、２５μｌ容量で三重反復として行い、それぞれの反応は、１５ｎｇの全ＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡ、１×ＡＢｓｏｌｕｔｅ ＳＹＢＲフルオレセインミックス（ＡＢＧｅｎｅ）およびそれぞれ５ピコモルの次のプライマー：５’−ＣＣＴＧＧＡＡＣＧＧＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＴＣ−３’（配列番号８）および５’−ＧＧＧＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＧ−３’（配列番号９）を含有する。増幅反応を、９４℃で１５秒間、６１℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間で、３５サイクルについて進行させた。ウェスタンブロッティングについて、肺および結腸線維芽細胞の溶解液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで再溶解し、ニトロセルロース膜に移し、ウサギ抗セストリン２ポリクロナール抗体（ＰＴＧ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）と反応させた。
【００５２】
細胞内過酸化物量の測定：１日前に６ｃｍペトリ皿に移植した野生型マウスおよびｓｅｓｎ２−／−マウス由来の３×１０５個の肺または結腸線維芽細胞を、トリプシン処理し、血清無含有ＤＭＥＭ中で洗浄し、５ｍｌの血清無含有ＤＭＥＭに再懸濁した。幾つかの培養物に、Ｈ２Ｏ２を最終濃度２００μＭまで加えた。３時間インキュベートした後に、細胞にジクロロジヒドロフルオレセイン（ＤＣＦ）を３０μＭの最終濃度で加え、さらに１時間インキュベートした。その後に、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、トリプシン処理し、３００μｌのＰＢＳに再懸濁し、これをＦＡＣＳ分析に供した。
【００５３】
実施例１：セストリン２遺伝子中へのｐＴ１βｇｅｏ遺伝子トラップの挿入は、トランジェニックマウスにおいてヌル変異を誘導する。
Ｗ０７７Ｅ０６遺伝子トラップＥＳ細胞株を、配列番号１０に示すｐＴ１βｇｅｏ遺伝子トラップベクターをＴＢＶ−２（１２９ＳｖＰａｓ）ＥＳ細胞に以前に記載のようにして（Floss, T. & Wurst, W. Methods Mol Biol 185, 347-79, 2002）電子穿孔することによって得た。遺伝子トラップ発現ＥＳ細胞クローンを、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で選択し、手で採取し、拡大し、液体窒素中で凍結保存した。セストリン２（ｓｅｓｎ２）遺伝子の第９イントロン中への遺伝子トラップの挿入を、回収したクローンの中から、方法の部に記載の５’ＲＡＣＥによっておよびＢｌａｓｔＮアルゴリズムを使用する配列データベース分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＧｅｎｂａｎｋ）によって同定した。Ｗ０７７Ｅ０６細胞株への遺伝子トラップの挿入は、遺伝子トラップおよび隣接上流イントロン配列に相補的な次のプライマー：５’−ＣＡＧＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＣ−３’（配列番号１１）および５’−ＣＴＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣＣＧ−３’（配列番号１２）を使用してゲノムＰＣＲ（方法を参照）で精査した。次いで、精査したＷ０７７Ｅ０６ＥＳ細胞を、胚盤胞注入によってマウスに転換させた。遺伝子トラップ対立遺伝子を有するＦ１マウスを異種交配し、Ｆ２子孫をｌｔｂｐ４−／−マウス（国際公開第ＷＯ０３／０１５５０５Ａ３号明細書）に交配させて二重ノックアウトマウスを得た。
【００５４】
図３は、Ｗ０７７Ｅ０６（ｓｅｓｎ２）マウスについての遺伝子型決定法を表す。尾部ＤＮＡを、第９エキソンにおいてフォワードプライマー（５’−ＣＴＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣＣＧ−３’；配列番号１３）を使用しておよび２つのリバースプライマー；野生型対立遺伝子を検出するための第９イントロンに一方のプライマー（５’−ＧＧＡＣＡＡＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＧＴＣ−３’；配列番号１４）および遺伝子トラップ対立遺伝子を検出するための遺伝子トラップのスプライスアクセプター部位に他方のプライマー（５’−ＣＡＧＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＣ−３’；配列番号１５）使用して並行反応でＰＣＲ増幅した。増幅反応を、９４℃で１５秒間、６１℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を、３０サイクルで進行させた。
【００５５】
Ｆ１ヘテロ接合子孫を異種交配させると、破壊された導入遺伝子のメンデル遺伝パターンと一致した頻度でホモ接合子孫を生じ、ｓｅｓｎ２が発生に必要とされないことを示す。変異マウスは出生後正常に発育し、その野生型およびヘテロ接合同腹子と大きく区別ができなかった。
【００５６】
ｓｅｓｎ２遺伝子の第９イントロンへの遺伝子トラップの挿入は、挿入の上流のエキソンがβｇｅｏに枠内でスプライスされている融合転写物を誘導する。転写は遺伝子トラップのポリアデニル化部位で終結するので、プロセス融合転写物は、ｓｅｓｎ２の切断バージョンおよびβｇｅｏリポーターをコードする（図３）。図４は、Ｘ−ＧａＩで染色された初期ヘテロ接合胚におけるこのタンパク質のわずかな発現を表す。
【００５７】
野生型ｓｅｓｎ２転写物は、ホモ接合Ｗ０７７Ｅ０６マウスの肺から完全に失われており、これに対してヘテロ接合肺は野生型量の約５０％を発現した（図５Ａ）。また、単離された肺（ＭＬＦ）および結腸（ＣＬＦ）線維芽細胞（両方が多量のｓｅｓｎ２を発現する（図５Ｂ））において、タンパク質はホモ接合Ｗ０７７Ｅ０６マウス由来の細胞において検出されず、遺伝子トラップの挿入がヌル変異を誘発することを示唆している（図５Ｂ）。初期肺におけるわずかなβ-ガラクトシダーゼ発現と一致して（図４）、変異体ＭＬＦは、極微量のｓｅｓｎ２／βｇｅｏ融合タンパク質を発現し、比較的多くのタンパク質が不安定であることを暗示している（図５Ｂ）。その低い発現を仮定すれば、このタンパク質は、たとえ切断タンパク質が若干の残存機能を保持していたとしても優性阻害効果を有するとは思われない。
【００５８】
実施例２：ｓｅｓｎ２ヌル対立遺伝子は、ｌｔｂｐ４−／−マウスの肺気腫を改善する。
ｌｔｂｐ４遺伝子の第５イントロンへのＵ３Ｃｒｅ遺伝子トラップベクター（配列番号１６）の挿入を有する１２９／Ｓｖ（Ｄ３）ＥＳ細胞を、以前に記載のようにＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入した（国際公開第ＷＯ０３／０１５５０５号明細書、Thorey, I.S. et al. Mol Cell Biol 18, 3081-3088, 1998）。得られる雄性キメラをＣ５７ＢＬ／６雌性に交配し、アグーチ子孫を尾部ブロッティングによって導入遺伝子伝達について試験した。マウス尾部ＤＮＡを、プロウイルスを切断しないＢｇｌＩＩを用いて切断した。ＤＮＡを、１％アガロースゲル上で分画し、Ｈｙｂｏｎｄナイロンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上にブロットし、３２Ｐ標識プロウイルスフランキング配列プローブにハイブリダイズした。遺伝子トラップの挿入についてヘテロ接合の動物を、ヘテロ接合およびホモ接合子孫における表現型を分析する前に、少なくとも６世代にわたってＣ５７ＢＬ／６マウスに戻し交配した。二重変異株を得るために、ヘテロ接合ｌｔｂｐ４＋／−マウスをホモ接合ｓｅｓｎ２−／−マウスに交配し、その子孫を、以下の対立遺伝子特異的プライマー：ｌｔｂｐ４野生型対立遺伝子＝５’−ＣＣＡＡＴＣＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣ−３’（配列番号１７）および５’−ＧＧＣＴＣＡＴＧＣＴＴＧＡＡＴＧＴＴＴＣＡＧ−３’（配列番号１８）；ｌｔｂｐ４遺伝子トラップ（変異対立遺伝子）＝５’−ＣＣＡＡＴＣＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣ−３’（配列番号１９）および５’−ＡＴＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＧ−３’（配列番号２０）；ｓｅｓｎ２野生型対立遺伝子＝５’−ＣＴＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣＣＧ−３’（配列番号２１）および５’−ＧＧＡＣＡＡＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＧＴＣ−３’（配列番号２２）；ｓｅｓｎ２遺伝子トラップ（変異対立遺伝子）＝５’−ＣＴＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣＣＧ−３’（配列番号２３）および５’−ＣＡＧＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＣ−３’（配列番号２４）を使用して実施例１に記載のとおりに尾部ＤＮＡのＰＣＲにより表現型を決定した。
【００５９】
図６Ｂは、成体ｌｔｂｐ４−／−マウス（国際公開第ＷＯ０３／０１５５０５号明細書）の典型的な気腫性肺を表す。それは、薄くて異形異常で、かつ頻繁に破壊された隔壁によって取り囲まれた大量の拡張肺胞を示す。小葉結合組織が有意に減少し、肺は多病巣性無気性領域を示す。部分回復と一致して、二重変異ｌｔｂｐ４−／−ｓｅｓｎ−／−同腹子における肺胞空間は、より多く、サイズが減少し、より厚い壁で隔てられていた（図６Ｄ）。
【００６０】
細気管支、肺胞管および肺胞に対する損傷の程度を検出するために、本発明者らは、これらの動物の気管気管支樹をプラスチネーションによって視覚化した。プラスチネーションは、単離された肺の気管内へのシリコーンの点滴注入を伴う。肺胞管はシリコーンが肺胞嚢に入るのを妨げることから、この方法は、情報を与える気管気管支樹の三次元画像を提供する（Perry S. F., et al. Exp Lung Res. 26：27-39, 2000）。図７（左側のパネル）は、終末細気管支および肺胞管に至る分岐を有する２匹の５．５月齢の老化野生型マウスの気管気管支樹を表す。変異ｌｔｂｐ４同腹子においては、これらの分岐は、シリコーンで満たされた拡張気腔によってほぼ完全に覆い隠され、終末細気管支および肺胞管が拡張され、漏出することを示唆する（図７、中央のパネル）。しかし、気管支構造の劇的な改善が、２つのｓｅｓｎ２ヌル対立遺伝子（ｌｔｂｐ４−／−ｓｅｓｎ２−／−）を有するｌｔｂｐ４−／−マウスにおいて観察された（図７右側のパネル）。ｌｔｂｐ４−／−マウスのほぼ目に見えない気管支構造とは異なり、二重変異気管気管支樹は、この場合も正常に近く、終末細気管支および肺胞管の再生を示唆する。これらの一次的変化（modification）は、おそらくは肺ＥＣＭの主成分であるコラーゲン繊維およびエラスチン線維の不規則な再生を反映する実質性変化よりもはるかに劇的であった（Suki B., et al. J Appl Physiol. 98：1892-9, 2005）。コラーゲン繊維およびエラスチン線維の両方は肺全体に密集した線維ネットワークを形成するが、エラスチン線維は均一に分布しており、これに対してコラーゲン線維は、終末細気管支および肺胞管の周りに集まる傾向がある（Toshima M., et al. Arch Histol Cytol. 67：31-40, 2004）。これに基づいて、本発明者らは、ｌｔｂｐ４−／−ｓｅｓｎ２−／−マウスの気管気管支樹の優先的な回復は肺ＥＣＭ内への過剰のコラーゲン沈着の結果であり得ると推測した。
【００６１】
これを試験するために、本発明者らは、特異的な組織化学的染色を使用して肺組織切片のエラスチンおよびコラーゲンを視覚化した。図８Ａは、両方において断片化され、途切れ途切れであり、かつ密集していると思われるｌｔｂｐ４−／−およびｌｔｂｐ４−／−ｓｅｓｎ２−／−の肺のエラスチンネットワークを表す。これに対し、コラーゲン沈着は二重変異肺で劇的に増加した（図８Ｂ）。ＴＧＦ−βは最も効力あるコラーゲン誘導物質の一つであるので、コラーゲンの過剰沈着は、ｌｔｂｐ４−／−ｓｅｓｎ２＋／−の肺におけるＴＧＦ−βシグナル伝達の再活性化を示唆した。気管気管支回復およびコラーゲン沈着の増加が、ｓｅｓｎ２（ｌｔｂｐ４−／−ｓｅｓｎ２＋／−）に対してヘテロ接合のｌｔｂｐ４−／−マウスにおいても認められた（図９、１０）ことから、ｓｅｓｎ２変異は、ハプロ不全であり得る。
【００６２】
実施例３：ｓｅｓｎ２ヌル対立遺伝子は、ｌｔｂｐ４−／−マウスにおいて直腸脱および結腸直腸腺腫を改善する。
図１３は、３月齢の老化ｌｔｂｐ４−／−（国際公開第ＷＯ０３／０１５５０５Ａ３号明細書）マウスの典型的な結腸直腸腺腫を表す。顕微鏡によって、この領域は、再生しつつある上皮細胞および増大した数の杯細胞を含有する大腸異常陰窩巣を示した。二重変異ｌｔｂｐ４−／−ｓｅｓｎ２−／−同腹子も腺腫を示したが、これらは、大きさが顕著に小さく、かつ少ない杯細胞を含有しており（図１１）、部分表現型救済を示唆する。ｌｔｂｐ４−／−表現型は、本質的に欠陥のあるＴＧＦ−β活性化によって引き起こされる（Sterner-Kock A., et al. Genes Dev. 16：2264-2273, 2002）ことから、本発明者らは部分的レスキューがＴＧＦ−βシグナル伝達の再活性化に関連するかを試験した。この目的に向けて、本発明者らは、免疫組織化学によって組織切片中のリン酸化されたｓｍａｄ２の量を調べた。ｌｔｂｐ４−／−ｓｅｓｎ２＋／−マウスにおけるＴＧＦ−βシグナル伝達の活性化と一致して、ｐ−ｓｍａｄ２量は、その結腸に検出可能なＰ−ｓｍａｄ２を有していない単一の変異ｌｔｂｐ４−／−マウスと比べて極めて高かった（図１２）。
【００６３】
実施例４：ｓｅｓｎ２−／−肺は高められたＴＧＦ−βシグナル伝達を示す。
肺の増大したコラーゲン沈着およびｌｔｂｐ４−／−ｓｅｓｎ２−／−マウスの結腸の増大したＰ−ｓｍａｄ２量は、ＴＧＦ−β経路がｓｅｓｎ２−／−マウスにおいてその有意に正常な表現型にかかわらず同様に活性化され得ることを示唆した。これを試験するために、本発明者らは、上記のようにして肺組織切片のＰ−ｓｍａｄ２を視覚化した。予備実験において、本発明者らは、ｓｅｓｎ−／−肺のＰ−ｓｍａｄ２量が野生型の量を有意に上回り、セストリン２の喪失がＴＧＦ−βを活性化することを示唆することを見出した（図１３）。また、本発明者らはＭａｓｓｏｎのトリクローム染色法では増大したコラーゲン沈着を発見できなかった（データは示さない）が、ｓｅｓｎ２−／−肺は、より豊富な結合組織、より小さい気腔およびより厚い肺胞間壁を示し、これらは全て初期のＴＧＦ−β誘発線維症と一致する（図１４）（Sime P.J., et al. J Clin Invest. 100：768-76, 1997；Lee M.S., et al. Am J Pathol. 147：42-52, 1995；Sanderson N., et al. Proc Natl Acad Sci USA. 92：2572-6, 1995）。
【００６４】
実施例５：ｓｅｓｎ−／−マウスから誘導されたマウス肺線維芽細胞（ＭＬＦ）における増大した過酸化物の蓄積
最近公表された実験は、ｓｈＲＮＡによるｓｅｓｎ２発現の阻害はＲＯＳ蓄積および酸化ストレスを招くＲＯＳを処理することができる細胞の能力を損なうことを明らかにしている（Budanov A.V., et al. Science. 304：596-600, 2004）。これに沿って、本発明者らは、抗酸化機能がｓｅｓｎ２ノックアウトマウスから誘導された細胞において同様に損なわれることを予測した。これを試験するために、本発明者らは、ジクロロジヒドロフルオレセイン（ＤＣＦ）蛍光法を使用してＭＬＦにおける基礎およびＨ２Ｏ２誘導ＲＯＳ量を定量した。図１５は、ｓｅｓｎ−／−ＭＬＦが２００ｍＭのＨ２Ｏ２による予備処理にかかわらず、対応する野生型細胞よりも有意に多いＲＯＳを蓄積したことを表す。結果は、該のｓｈＲＮＡノックダウン実験で得られる結果に相当し、変異体ＭＬＦにおけるｓｅｓｎ２機能損失と一致する。
【００６５】
配列表フリーテキスト
配列番号１−９      プライマー
配列番号１０        遺伝子トラップベクターｐＴβｇｅｏ
プラスミド要素：
−  Ｅｎ−２スプライスアクセプター  ２２８４−４１６３
−  βＧｅｏ                        ４１６４−８０５３
−  ＳＶ４０  ｐＡ                  ８０５４−８４９６
−  プラスミド主鎖                  ８４９７−２２８３
配列番号１１−１５  プライマー
配列番号１６        遺伝子トラップベクターＵ３Ｃｒｅ
プラスミド要素：
−  ＬＴＲｓ１−１４７５および３０４６−４５２０
−  Ｃｒｅ  ３−１０９０および３０７４−４１３３
−  ｇａｇ／ｅｎｖ：１４７５−３０４５
配列番号１７−２４  プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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