(57)【要約】  Streptoverticillium ladakanum由来のトランスグルタミナーゼの変異体で、ヒト成長ホルモンのＧｌｎ-１４１に対する改善された選択性を有する変異体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高い、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する特異性を有するトランスグルタミナーゼペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる請求項１に記載のトランスグルタミナーゼペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対応する位置の一又は複数において修飾されている請求項２に記載のトランスグルタミナーゼペプチド。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、該配列が、配列番号１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対する位置の一又は複数において修飾されている単離されたペプチド。
【請求項５】
配列番号１に定められたようなアミノ酸配列を含んでなり、該配列が、配列番号１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対応する位置の一又は複数において修飾されている請求項４に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
Ｔｙｒ６２に対応する位置のアミノ酸残基が、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、又はＬｅｕである請求項５に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
Ｔｙｒ７５に対応する位置のアミノ酸残基が、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、又はＣｙｓである請求項３から６のいずれか１項に記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
Ｓｅｒ２５０に対応する位置のアミノ酸残基が、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌである請求項３から７のいずれか１項に記載の単離されたペプチド。
【請求項９】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、該配列が、１〜１０のアミノ酸残基をＮ末端に付加することにより修飾されている単離されたペプチド。
【請求項１０】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでなり、該配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている請求項９に記載の単離されたペプチド。
【請求項１１】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、該配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている単離されたペプチド。
【請求項１２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなり、該配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている請求項１１に記載の単離されたペプチド。
【請求項１３】
前記配列が、２つのアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている請求項９から１２のいずれか１項に記載の単離されたペプチド。
【請求項１４】
ペプチドが、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較してｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対し、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高い、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較してｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する特異性を有する請求項４から１３のいずれか１項に記載の単離されたペプチド。
【請求項１５】
配列番号１の配列を含んでなる単離されたペプチド。
【請求項１６】
配列番号１の配列を有する単離されたペプチド。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸コンストラクト。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸コンストラクトを含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１から１６のいずれか１項に記載のペプチドを含有する組成物。
【請求項２１】
ペプチドをコンジュゲートさせる方法において、請求項１から１６のいずれか１項に記載のペプチドの存在下で該ペプチドをアミン供与体と反応させることを含む方法。
【請求項２２】
前記成長ホルモンが、ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の成長ホルモンをコンジュゲートさせる方法において、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチドが、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載のペプチドの代わりに該方法に使用される場合、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートした成長ホルモンの量が、位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨと比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比べて、有意に増加している方法。
【請求項２４】
位置１４１に対応する位置でコンジュゲート化したｈＧＨを調製する方法であって、請求項１から１６のいずれか１項に記載のペプチドの存在下で、前記ｈＧＨをアミン供与体と反応させることを含む方法。
【請求項２５】
コンジュゲート化成長ホルモンの薬学的組成物を調製する方法において、請求項１から１６のいずれか１項に記載のペプチドの存在下で、前記ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体をアミン供与体と反応させる工程を含む方法。
【請求項２６】
ペグ化成長ホルモンの薬学的組成物を調製する方法において、請求項１から１６のいずれか１項に記載のペプチドの存在下で、前記ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体をアミン供与体と反応させ、得られたコンジュゲート化成長ホルモンペプチドをペグ化成長ホルモンの調製に使用する工程を含み、ここで該ペグ化がコンジュゲート化位置で生じる方法。
【請求項２７】
コンジュゲート化成長ホルモンの調製における請求項１から１６のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項２８】
患者における成長ホルモン欠乏に関連した病気又は疾患を治療する方法において、請求項２５又は２６に記載の方法を使用して調製された薬学的調製物を、治療を必要とする患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Streptoverticillium ladakanum（ストレプトベルティシリウム・ラダカヌム）由来のトランスグルタミナーゼの新規変異体に関する。該変異体は、改善された特異性を有し、所定のグルタミン残基での、ペプチドの部位特異的修飾に使用できる。
【背景技術】
【０００２】
性質を十分に変化させる基をタンパク質にコンジュゲートすることにより、該ペプチドの性質及び特性を修飾することはよく知られている。特に、治療用ペプチドの場合、ペプチドの半減期を延長させる基を該ペプチドにコンジュゲートさせることが所望され、又は必要とさえされることがある。典型的には、このようなコンジュゲート基は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、デキストラン、又は脂肪酸である−J.Biol.Chem. 271, 21969-21977 (1996)を参照。
【０００３】
トランスグルタミナーゼ(ＴＧａｓｅ)はペプチド特性を変化させるためにこれまでに使用されている。食品産業、特に乳業においては、多くの技術が、例えばＴＧａｓｅを使用してペプチドを架橋するのに利用されている。他の文献には、生理学的に活性なペプチドの性質を変えるためにＴＧａｓｅを使用することが開示されている。欧州特許第950665号、欧州特許第785276号、及びSato, Adv. Drug Delivery Rev. 54, 487-504(2002)には、ＴＧａｓｅの存在下での、少なくとも一のＧｌｎ及びアミノ官能化ＰＥＧ又は類似リガンドを含むペプチド間の直接反応が開示されており、Wada、Biotech. Lett. 23, 1367-1372(2001)には、ＴＧａｓｅによる脂肪酸を用いたβ-ラクトグロブリンの直接的コンジュゲーションが開示されており、Valdivia, J. Biotechnol. 122, 326-333(2006)には、カタラーゼの部位特異的グリコシド化を触媒するＴＧａｓｅが開示されている。国際公開第2005070468号には、ＴＧａｓｅが、グルタミン含有ペプチド中に官能基を導入して官能化ペプチドを形成するために使用され、次の工程において、該官能化ペプチドが、例えば該官能化タンパク質と反応可能なＰＥＧと反応させられてペグ化ペプチドが形成されることが開示されている。
【０００４】
またトランスグルタミナーゼ(Ｅ．Ｃ．２．３．２．１３)はタンパク質-グルタミン-γ-グルタミルトランスフェラーゼとしても知られ、一般反応
2010500886.tif 000002
[上式中、Ｑ-Ｃ(Ｏ)-ＮＨ２はグルタミン含有ペプチドを表し、Ｑ'-ＮＨ２は、上で検討した反応において、ペプチドに導入される官能基を提供するアミン供与体を表す]
を触媒する。
【０００５】
インビボでの一般的なアミン供与体はペプチド結合リジンであり、上述した反応により、ペプチドの架橋が可能となる。凝固第ＸＩＩＩ因子は、傷害時に血液凝固をなすトランスグルタミナーゼである。種々のＴＧａｓｅは、例えば、Ｇｌｎ周囲にどのようなアミノ酸残基が、タンパク質が基質となるために必要になるかにおいて互いに異なっており、すなわち、異なったＴＧａｓｅは、どのようなアミノ酸残基がＧｌｎ残基に隣接しているかに応じて、基質として異なったＧｌｎ含有ペプチドを有するのである。この側面は、修飾されるペプチドが一以上のＧｌｎ残基を有しているならば、活用可能である。存在するＧｌｎ残基のいくつかにのみ、ペプチドを選択的にコンジュゲートさせることが望まれる場合には、この選択性は、関連するＧｌｎ残基(類)のみ基質として受容するＴＧａｓｅを選択することにより得ることができる。
【０００６】
ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)は１３のグルタミン残基を有しており、よって、ｈＧＨのＴＧａｓｅ媒介コンジュゲーションは、低選択性により潜在的に妨げられる。ｈＧＨについて１３のグルタミン(Ｇｌｎ)残基のうち、２つの(Ｑ１４１及びＱ４０)グルタミンが、ＴＧａｓｅの触媒作用下で反応性であることが過去に記載されている(国際公開第2006/134148号)。ｈＧＨのさらに特異的な官能化を媒介するＴＧａｓｅを同定する必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
Streptoverticillium ladakanum由来のｍＴＧａｓｅ(ｍＴＧａｓｅなる用語は、ＴＧａｓｅが、それが単離された微生物により発現された場合のＴＧａｓｅであることを示すために使用される)(S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅは、ｍＴＧａｓｅ-ＳＬと省略される)は、Streptomyces mobaraensis（ストレプトベルティシリウム・モバラエンス）のｍＴＧａｓｅの２倍の、高度な部位特異的(選択性とも称される)を有している。例えば、異なった発現及びプロセシングストラテジーの結果として、又は計画的な変異として、ｍＴＧａｓｅのＮ末端位に付加された残基により、このような部位特異的が高められることが見出されている。例えば、Ｇｌｎ４０に対するＧｌｎ１４１についてのS. mobaraensis由来のｍＴＧａｓｅの選択性を１に設定すると、S. ladakanum由来の天然、Ｍｅｔ-、ＡｌａＰｒｏ-又はＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅでは、ぞれぞれ１．７；１．８；２．１及び２．７の相対選択性が得られる。
【０００８】
本発明は、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高い、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する特異性を有するトランスグルタミナーゼペプチドを提供する。
【０００９】
一実施態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する単離されたペプチドに関し、ここで、前記配列は、配列番号１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対する位置の一又は複数で修飾されている。
一実施態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたペプチドに関し、ここで、該配列は、Ｎ末端に、１〜１０のアミノ酸が付加されることにより修飾されている。
【００１０】
一実施態様では、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸コンストラクトに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸を含有するベクターに関する。
一実施態様では、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸を含有するベクターを含む宿主に関する。
一実施態様では、本発明は、本発明のペプチドを含有する組成物に関する。
一実施態様では、本発明は、ｈＧＨのコンジュゲート方法に関し、該方法は、本発明のペプチドの存在下でｈＧＨをアミン供与体と反応させることを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、Streptomyces mobaraensis由来のｍＴＧａｓｅと、Streptoverticillium ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの配列の配列アラインメントを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、反応に対するブランクである：１,３-ジマニノール(dimaninol)プロパノールを用いた野生型ｈＧＨ。ｍＴＧａｓｅを添加せず。
【図２Ｂ】図２Ｂは、S. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅである。反応時間＝３０分；選択性＝５．７；転換率＝３２％。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ-ＳＬである；反応時間＝１５分；選択性＝１０．３１；ｈＧＨ転換率＝５５％。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ７５Ａ-ＳＬである；反応時間＝３００分；選択性＝１７．３３；ｈＧＨ転換率＝４０％。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ７５Ｆ-ＳＬである；反応時間＝７５分；選択性＝２０．９４；ｈＧＨ転換率＝３３％。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ７５Ｎ-ＳＬである；反応時間＝９０分；選択性＝１５．６６；ｈＧＨ転換率＝５０％。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｎ-ＳＬである；反応時間＝７５分；選択性＝２６．３３；ｈＧＨ転換率＝３８％。
【図２Ｈ】図２Ｈは、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆ-ＳＬである；反応時間＝１２０分；選択性＝３６．２１；ｈＧＨ転換率＝４９．４％。
【図３】図３は、ＨＰＬＣによる、S. ladakanumのＴＧａｓｅで触媒されるｈＧＨ変異体の反応混合物の分析である。頂部：ｈＧＨ-Ｑ４０Ｎ。第１のピーク(２６．５分、面積１２３８)は生成物-Ｑ１４１であり、第２のピーク(２９．７分、面積３７５)は残存するｈＧＨ-Ｑ４０Ｎである。底部：ｈＧＨ-Ｑ１４１Ｎ。第１のピーク(１９．２分、面積１２７)は生成物-Ｑ４０であり、第２のピーク(３０．３分、面積１１５８)は残存するｈＧＨ-Ｑ１４１Ｎである。
【図４】図４は、ＨＰＬＣによる、S. mobarenseのＴＧａｓｅで触媒されるｈＧＨ変異体の反応混合物の分析である。頂部：ｈＧＨ-Ｑ４０Ｎ。第１のピーク(２６．９分、面積１２８３)は生成物-Ｑ１４１であり、第２のピーク(３０．１分、面積５１９)は残存するｈＧＨ-Ｑ４０Ｎである。底部：ｈＧＨ-Ｑ１４１Ｎ。第１のピーク(１９．５分、面積２９６)は生成物-Ｑ４０であり、第２のピーク(３０．６分、面積１２９１)は残存するｈＧＨ-Ｑ１４１Ｎである。
【図５】図５は、表５のアミノ基転移混合物３及び４のＣＩＥ ＨＰＬＣである。ピーク１＝ｈＧＨ、ピーク２＝４０位におけるアミノ基転移、ピーク３＝１４１位におけるアミノ基転移、及びピーク４＝４０／１４１位におけるアミノ基転移。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ｈＧＨ中のＧｌｎ４０よりはｈＧＨ中のＧｌｎ１４１に対して改善された選択性を有するＴＧａｓｅ活性を有するペプチドに関し、より詳細には、本発明は、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高い、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する特異性を有するトランスグルタミナーゼペプチドを提供する。
【００１３】
「ポリペプチド」及び「ペプチド」なる用語は、ここでは交換可能に使用され、ペプチド結合により連結した少なくとも５の構成アミノ酸からなる化合物を意味すると理解されるべきである。該構成アミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるアミノ酸の群からものであってよく、またそれらは遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸、並びに合成アミノ酸であってもよい。遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸は、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ-アラニン及びＤ-グルタミンである。合成アミノ酸は、化学合成により製造されるアミノ酸、すなわち遺伝暗号によりコードされるアミノ酸のＤ-異性体、例えばＤ-アラニン及びＤ-ロイシン、Ａｉｂ(ａ-アミノイソ酪酸)、Ａｂｕ(ａ-アミノ酪酸)、Ｔｌｅ(tert-ブチルグリシン)、β-アラニン、３-アミノメチル安息香酸、及びアントラニル酸を含む。名詞としての「コンジュゲート」なる用語は、修飾されたペプチド、すなわち該ペプチドの特性を改変するように結合した部分を有するペプチドを表すものである。動詞としては、該用語は、前記ペプチドの特性を改変するために、ペプチドに部分を結合させるプロセスを表すものである。
【００１４】
本明細書において、「ＴＧａｓｅ活性を有するペプチド」又は「トランスグルタミナーゼ」又はその類似語は、グルタミン残基のγ-カルボキシアミド基と、アミン供与体として作用する様々な第１級アミンとの間のアシル転移反応を触媒する能力を有するポリペプチドを意味するものである。
本明細書において、「アミノ基転移」、「グルタミン転移」、「トランスグルタミナーゼ反応」又はその類似語は、タンパク質／ペプチドからのグルタミン残基のγ-グルタミニルが、アンモニア分子が放出される水又はリジンのε-アミノ基又は第１級アミンに移動する反応を示すものである。
【００１５】
本明細書において、「特異性」及び「選択性」なる用語は、交換可能に使用され、ｈＧＨにおける他の特定のグルタミン残基と比較した場合に、ｈＧＨにおける一又は複数の特定のグルタミン残基と反応するためのＴＧａｓｅの優先性を記述する。この明細書における目的に対して、ｈＧＨにおけるＧｌｎ１４１と比較した場合のＧｌｎ-４０に対する本発明のペプチドの特異性は、実施例に記載したようなペプチドの試験結果に従って決定される。
【００１６】
本発明のペプチドは、ｈＧＨ等、グルタミン転移ペプチドのためのトランスグルタミナーゼとして有用である。ペプチドのグルタミン転移は、例えば国際公開第2005/070468号及び国際公開第2006/134148号に記載されているように、前記ペプチドのコンジュゲートを調製するのに有用である。
【００１７】
例としてｈＧＨを使用してコンジュゲートペプチドを調製する一方法は、官能基を有するアミン供与体とｈＧＨを反応させ、官能化されたｈＧＨを提供する第１の反応を含み、該第１の反応は、ＴＧａｓｅによって媒介(すなわち触媒)される。第２の反応工程において、前記官能化されたｈＧＨは、該導入官能基と反応可能な脂肪酸又はＰＥＧとさらに反応させられて、コンジュゲート化ｈＧＨが提供される。第１の反応は以下に概略を示す。
2010500886.tif 000003
[上式中、Ｘは官能基又は潜在的官能基、すなわち、さらなる反応、例えば酸化又は加水分解時に官能基に転換される基を表す]
【００１８】
また、微生物S. mobaraensisは、Streptoverticillium mobaraenseとして分類されている。ＴＧａｓｅは生物体から単離することができ、このＴＧａｓｅは比較的低分子量(〜３８ｋＤａ)であること、またカルシウム非依存性であることで特徴付けられる。S. mobaraensis由来のＴＧａｓｅは、比較的よく記載されている；例えば、結晶構造が解析されている(米国特許第156956号; Appl. Microbiol. Biotech. 64, 447-454(2004))。
【００１９】
上述の反応が、Streptomyces mobaraensis由来のＴＧａｓｅにより媒介される場合、ｈＧＨとＨ２Ｎ-Ｘ(アミン供与体)との反応は、主にＧｌｎ-４０及びＧｌｎ-１４１で生じる。上述の反応は、例えばｈＧＨのペグ化に使用され、長時間にわたる半減期を有する治療用成長ホルモン生成物が得られる。一般的に、治療用組成物は単一化合物の組成物であるのが望ましいとされているので、上で議論した特異性の欠如は、Ｇｌｎ-４０官能化ｈＧＨ、Ｇｌｎ-１４１官能化ｈＧＨ、及び／又はＧｌｎ-４０／Ｇｌｎ-１４１二重官能化ｈＧＨが互いに分離されるさらなる精製工程を必要とする。
【００２０】
ヒト成長ホルモンのコンジュゲーションのためのこのようなトランスグルタミナーゼの使用は、国際公開第2005/070468号、国際公開第2006/134148号、国際公開第2006EP065440及び国際公開第2006EP065439に広範囲に記載されている。
S. ladakanumから単離されたＴＧａｓｅの配列は、２つの配列間に、全部で２２のアミノ酸差異があることを除けば、S. mobaraensis由来の配列と同じアミノ酸配列を有する(Yi-Sin Linら, Process Biochemistry 39(5), 591-598(2004)。
【００２１】
S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの配列は、配列番号１に与えられており、S. mobaraensis由来のｍＴＧａｓｅの配列は、配列番号２に与えられている。
本発明のペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチドのｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したＧｌｎ-１４１に対する特異性よりも有意に高い、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したＧｌｎ-１４１に対する特異性を有し、ここで、特異性は実施例に記載したようにして測定される。よって、本発明のペプチドは、ｈＧＨをグルタミン転移させる方法に使用して、配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＧａｓｅを使用する反応と比較したＧｌｎ-４０官能化ｈＧＨ又はＧｌｎ-１４１官能化ｈＧＨの生産を増加させることができる。
【００２２】
よって、一実施態様では、本発明のトランスグルタミナーゼペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチドのｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する特異性よりも高い、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する特異性を有する。一実施態様では、Ｇｌｎ-４０と比較したＧｌｎ-１４１に対する本発明のペプチドの特異性は、少なくとも１．２５、例えば少なくとも１．５０、例えば少なくとも１．７５、例えば少なくとも２．０、例えば少なくとも２．５、例えば少なくとも３．０、例えば少なくとも３．５、例えば少なくとも４．０、例えば少なくとも４．５、例えば少なくとも５．０、例えば少なくとも５．５、例えば少なくとも６．０、例えば少なくとも６．５、例えば少なくとも７．０、例えば少なくとも７．５、例えば少なくとも８．０、例えば少なくとも８．５、例えば少なくとも９．０、例えば少なくとも９．５、例えば少なくとも１０．０倍、Ｇｌｎ-４０と比較したＧｌｎ-１４１に対する配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高い。
【００２３】
一実施態様では、本発明のトランスグルタミナーゼペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチド、又はＡｌａ-ＰｒｏのＮ末端付加を有する配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドのｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したＧｌｎ-１４１に対する特異性よりも高い、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する特異性を有し、これは、Ａｌａ-ＰｒｏのＮ末端付加を有する配列番号１に示すようなアミノ酸配列を有するペプチドが配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドと同じ特異性を有するためである(実施例を参照)。一実施態様では、Ｇｌｎ-４０と比較したＧｌｎ-１４１に対する本発明のペプチドの特異性は、少なくとも１．２５、例えば少なくとも１．５０、例えば少なくとも１．７５、例えば少なくとも２．０、例えば少なくとも２．５、例えば少なくとも３．０、例えば少なくとも３．５、例えば少なくとも４．０、例えば少なくとも４．５、例えば少なくとも５．０、例えば少なくとも５．５、例えば少なくとも６．０、例えば少なくとも６．５、例えば少なくとも７．０、例えば少なくとも７．５、例えば少なくとも８．０、例えば少なくとも８．５、例えば少なくとも９．０、例えば少なくとも９．５、例えば少なくとも１０．０倍、Ｇｌｎ-４０と比較したＧｌｎ-１４１に対する配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高い。
【００２４】
一実施態様では、本発明のペプチドは、特定のアミノ酸残基における変異を担持し、及び／又はさらにＮ末端付加されたアミノ酸残基を有する、S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの配列をベースにした配列を含む。一実施態様では、本発明のペプチドは、さらにＮ末端付加されたアミノ酸配列を有する、S. mobaraensis由来のｍＴＧａｓｅの配列をベースにした配列を含む。
【００２５】
本発明は、特にStreptoverticillium ladakanum由来のトランスグルタミナーゼの新規の変異体に関する。変異体は、改善された選択性を有する、指定のグルタミン残基でのペプチドの部位特異的修飾のために使用することができる。
本明細書において、「変異体」なる用語は、一又は複数のアミノ酸残基が、アミノ酸の置換、付加、欠失、挿入、又は反転(invertion)により修飾されている、与えられたポリペプチドの自然に生じた変異体、又は与えられたペプチド又はタンパク質の組換え的に調製され又は他の方法で修飾された変異体を意味するものである。
【００２６】
一実施態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する単離されたペプチドを提供し、ここで、該配列は、配列番号１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対する位置の一又は複数で修飾されている。
【００２７】
当該分野で知られている「同一性」なる用語は、配列を比較することにより決定される、２又はそれ以上のペプチド配列の間の関係を意味する。当該分野において、「同一性」とは、２又はそれ以上のアミノ酸残基のストリングの間の適合数により決定される、ペプチド間の配列関連性の度合いを意味する。「同一性」は、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム(すなわち「アルゴリズム」)により処理されるギャップアラインメント(もしあれば)を用いて、２又はそれ以上の配列の同一適合性のパーセントを測定する。関連ペプチドの同一性は、既知の方法により容易に算出することができる。このような方法は、限定されるものではないが、 Computational Molecular Biology, Lesk, A. M編, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W編, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M.,及びGriffin, H. G編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 及びDevereux, J編, M. Stockton Press, New York, 1991;及びCarilloら, SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)に記載されているものを含む。
【００２８】
同一性を決定するための好ましい方法は、調べられる配列間に最も大きな適合性を付与するように設計される。同一性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法は、ＧＡＰ(Devereuxら, Nucl. Acid. Res., 12：387(1984)を含むＧＣＧプログラムパッケージ；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ(Altschulら, J. Mol. Biol., 215：403-410(1990))を含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)及び他の供給源(BLAST Manual, Altschulら, NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894；Altschulら, 上掲)から公に入手可能である。よく知られているスミス・ウォーターマン・アルゴリズム(Smith Waterman algorithm)も、同一性を決定するために使用することができる。
【００２９】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)を使用して、パーセント配列同一性が決定される２つのペプチドが、そのそれぞれのアミノ酸が最適に適合するように整列させられる(アルゴリズムにより決定される「適合スパン」)。ギャップ開裂ペナルティ(平均ダイアゴナルの３倍と算出される；「平均ダイアゴナル」は使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」とは、特定の比較マトリックスにより適合するそれぞれ完全アミノ酸に割り当てられるスコア又は数である)及びギャップ伸長ペナルティ(通常、ギャップ開裂ペナルティの{分率(１／１０)倍}である)、並びに比較マトリックス、例えばＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２が、アルゴリズムに併せて使用される。標準的な比較マトリックス(ＰＡＭ２５０比較マトリックス用には、Dayhoffら, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.5, supp.3(1978)；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックス用には、Henikoffら, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89：10915-10919(1992))も、アルゴリズムにより使用される。
【００３０】
ペプチド配列比較のために好ましいパラメータは、次のものを含む：
アルゴリズム：Needlemanら, J. Mol. Biol, 48：443-453(1970)；比較マトリックス：Henikoffら, PNAS. USA, 89：10915-10919(1992)のＢＬＯＳＵＭ６２；ＧＡＰペナルティ：１２、ＧＡＰ長ペナルティ：４、類似性閾値：０。
上述のパラメータを有するＧＡＰプログラムが有用である。上述したパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを使用するペプチド比較(末端ギャップに対するペナルティを伴わない)のための初期設定パラメータである。
【００３１】
一実施態様では、本発明は、上述の単離したペプチドを提供するものであり、ここで該アミノ酸配列はＴｙｒ６２に対応する位置で修飾されており、修飾はＴｙｒとは異なるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基を置換することからなる。一実施態様では、Ｔｙｒ６２に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基を置換することからなる。一実施態様では、Ｔｙｒ６２に対応する位置におけるＴｙｒは、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、及びＬｅｕから選択されるアミノ酸残基で置換される。
【００３２】
一実施態様では、本発明は、上述の単離したペプチドを提供するものであり、ここで該アミノ酸配列はＴｙｒ７５に対応する位置で修飾されており、修飾はＴｙｒとは異なるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基を置換することからなる。一実施態様では、Ｔｙｒ７５に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基を置換することからなる。一実施態様では、Ｔｙｒ７５に対応する位置におけるＴｙｒは、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、又はＣｙｓで置換される。
【００３３】
一実施態様では、本発明は、上述の単離したペプチドを提供するものであり、ここで該アミノ酸配列はＳｅｒ２５０に対応する位置で修飾されており、修飾はＳｅｒとは異なるアミノ酸残基で、最初のセリン残基を置換することからなる。一実施態様では、Ｓｅｒ２５０に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基を置換することからなる。
【００３４】
一実施態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する単離されたペプチドに関し、該配列は、一又は複数、例えば１〜９、例えば１〜８、例えば１〜７、例えば１〜６、例えば１〜５、例えば１〜４、例えば１〜３、例えば１〜２、例えば１つのアミノ酸が、Ｎ末端に付加されることにより修飾される。一実施態様では、前記配列は、ＭｅｔがＮ末端に付加されることより修飾される。
【００３５】
一実施態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する単離されたペプチドに関し、該配列は、一又は複数、例えば２〜９、例えば２〜８、例えば２〜７、例えば２〜６、例えば２〜５、例えば２〜４、例えば２〜３、例えば２つのアミノ酸が、Ｎ末端に付加されることにより修飾される。一実施態様では、付加されたアミノ酸残基は、ジペプチド基Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-である。一実施態様では、付加されたアミノ酸残基は、ジペプチド基Ａｌａ-Ｐｒｏ-である。
【００３６】
一実施態様では、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する単離されたペプチドに関し、該配列は、一又は複数、例えば１〜９、例えば１〜８、例えば１〜７、例えば１〜６、例えば１〜５、例えば１〜４、例えば１〜３、例えば１〜２、例えば１つのアミノ酸が、Ｎ末端に付加されることにより修飾される。一実施態様では、前記配列は、ＭｅｔがＮ末端に付加されることより修飾される。
【００３７】
一実施態様では、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する単離されたペプチドに関し、該配列は、一又は複数、例えば２〜９、例えば２〜８、例えば２〜７、例えば２〜６、例えば２〜５、例えば２〜４、例えば２〜３、例えば２つのアミノ酸が、Ｎ末端に付加されることにより修飾される。一実施態様では、付加されたアミノ酸残基は、ジペプチド基Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-である。一実施態様では、付加されたアミノ酸残基は、ジペプチド基Ａｌａ-Ｐｒｏ-である。
【００３８】
一実施態様では、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば１００％の同一性を有するアミノ酸配列は、国際公開第2007020290号に開示されたＴＧａｓｅのいずれかのアミノ酸配列である。よって本発明は、１〜１０のアミノ酸がＮ末端に付加されることによって修飾されているＴＧａｓｅを提供する。
また本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＴＧａｓｅを提供する。
【００３９】
本発明のペプチドは、米国特許第5,156,956号に記載されたアッセイで測定されるＴＧａｓｅ活性を示す。簡単に記載すれば、与えられたペプチドの活性の測定は、Ｃａ２＋の不在下、基質としてベンジルオキシカルボニル-Ｌ-グルタミニルグリシン及びヒドロキシルアミンとを使用する反応を実施し、トリクロロ酢酸の存在下、得られたヒドロキサム酸を用いて鉄錯体を形成させ、５２５ｎｍでの吸光度を測定し、検量線によりヒドロキサム酸の量を測定し、活性を算出することにより行われる。この明細書の目的では、前記アッセイにおいてトランスグルタミナーゼ活性を示すペプチドは、トランスグルタミナーゼ活性を有しているとみなされる。特に、本発明のペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有するS. ladakanum由来のＴＧａｓｅより、３０％以上、例えば５０％以上、例えば７０％以上、例えば９０％以上多い活性を示す。
【００４０】
本発明のペプチドは、様々な方法で調製されてよい。ペプチドは当該分野で既知のタンパク質合成技術により調製することができる。ペプチドがかなり大きい場合は、これは、ペプチドの断片をいくつか合成し、ついで組合せることにより、本発明のペプチドを提供することにより、より簡便になされうる。しかしながら、特定の実施態様では、本発明のペプチドは、本発明のペプチドをコードする核酸コンストラクトを含有する適切な宿主を発酵させることにより調製される。
【００４１】
一実施態様では、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸コンストラクトを提供する。
ここで使用される場合、「核酸コンストラクト」なる用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はＲＮＡ起源の任意の核酸分子を示すことを意図している。「コンストラクト」なる用語は、一本鎖又は二本鎖であってよく、関心あるタンパク質をコードする、完全に又は部分的に自然に発生するヌクレオチド配列をベースにしてよい核酸セグメントを示すことを意図している。コンストラクトは、場合によっては、他の核酸セグメントを含有していてもよい。
本発明のペプチドをコードする本発明の核酸コンストラクトは、ゲノム又はｃＤＮＡ由来のものが適しており、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準的な技術(例えば、J. Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor,New York)に従い、合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションによりペプチドの全体又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングし、当該分野で知られているようにして、変異を導入することにより得られる。
【００４２】
また、タンパク質をコードする本発明の核酸コンストラクトは、確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22, 1859-1869(1981)に記載されたホスホラミダイト法、又はMatthesら, EMBO Journal 3, 801-805(1984)により記載された方法により合成的に調製してもよい。ホスホラミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機において合成され、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされて、適切なベクターでクローニングされる。
【００４３】
さらに、核酸コンストラクトは、標準的な技術に従い、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ由来(適切であるならば)の断片、全核酸コンストラクトの種々の部位に相当する断片をライゲーションすることにより調製される、混合された合成及びゲノム、混合された合成及びｃＤＮＡ、又は混合されたゲノム及びｃＤＮＡ由来のものであってよい。
核酸コンストラクトは、また、例えば米国特許第4,683,202号、又はSaikiら, Science 239, 487-491(1988)に記載されたようにして、特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により調製することができる。
核酸コンストラクトは、好ましくはＤＮＡコンストラクトであり、該用語が以下において専ら使用される。
【００４４】
一実施態様では、本発明は、本発明の核酸コンストラクトを含有する組換えベクターを提供する。
一実施態様では、本発明は、本発明のベクターを含む宿主を提供する。
本発明のＤＮＡコンストラクトが挿入される組換えベクターは、簡便には組換えＤＮＡ手順にかけられうる任意のベクターであってよく、多くの場合、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存する。例えば、ベクターは自己複製可能なベクターであってよく、すなわちベクターは染色体外実体として存在しており、その複製は染色体複製、例えばプラスミドとは独立している。また、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれる染色体(群)と共に複製される。
【００４５】
ベクターは好ましくは発現ベクターであり、そこで本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ＤＮＡの転写に必要な付加的なセグメントに作用可能に結合している。一般的に、発現ベクターはプラスミド又はウイルスＤＮＡから誘導され、又は双方の要素を含むものであってもよい。「作用可能に結合する」なる用語は、セグメントが、意図する目的に合わせて機能するように、例えばプロモーターにおいて転写が開始し、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を介して進行するように配列されることを示す。
プロモーターは、宿主細胞の選択において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主細胞と相同又は異種のタンパク質をコードする遺伝子から誘導されたものであってもよい。
【００４６】
酵母宿主細胞への使用に適したプロモーターの例には、酵母解糖遺伝子(Hitzemanら, J. Biol. Chem. 255, 12073-12080(1980); Alber及びKawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 419-434(1982))、又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Youngら, Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaenderら編), Plenum Press, New York, 1982)、又はＴＰＩ１(米国特許第4,599,311号)又はＡＤＨ２-４ｃ(Russellら, Nature 304, 652 - 654(1983))プロモーターが含まれる。
【００４７】
糸状菌宿主細胞への使用に適したプロモーターの例は、例えばＡＤＨ３プロモーター(McKnightら, The EMBO J. 4, 2093-2099(1985))、又はｔｐｉＡプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、A. oryzaeのＴＡＫＡアミラーゼ、Rhizomucor mieheiのアスパラギン酸プロテイナーゼ、A. nigerの中性のα-アミラーゼ、A. nigerの酸安定性のα-アミラーゼ、A. niger又はA. awamoriのグルコアミラーゼ(ｇｌｕＡ)、Rhizomucor mieheiのリパーゼ、A. oryzaeのアルカリ性プロテアーゼ、A. oryzaeのトリオースリン酸イソメラーゼ、又はA. nidulansのアセトアミダーゼ(acetamidase)をコードする遺伝子から誘導されたものである。好ましくは、ＴＡＫＡ-アミラーゼ及びｇｌｕＡプロモーターである。
【００４８】
細菌宿主細胞への使用に適したプロモーターの例には、Bacillus stearothermophilusのマルトゲン(maltogenic)アミラーゼ遺伝子、Bacillus licheniformisのα-アミラーゼ遺伝子、Bacillus amyloliquefaciensのＢＡＮアミラーゼ遺伝子、Bacillus subtilisのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子、又はBacillus pumilusのキシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はファージ ラムダＰＲ又はＰＬプロモーター、又は大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ、又はｔａｃプロモーターが含まれる。
【００４９】
また、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、必要であるならば、適切なターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiterら, 前掲)又は(真菌宿主用)ＴＰＩ１(Alber及びKawasaki, 前掲)又はＡＤＨ３(McKnightら, 前掲)ターミネーターに作用可能に結合していてもよい。さらにベクターは、ポリアデニル化シグナル(例えば、ＳＶ４０又はアデノウイルス５Ｅｌｂ領域からのもの）、転写エンハンサー配列(例えば、ＳＶ４０エンハンサー)、及び翻訳エンハンサー配列(例えば、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードするもの)等のエレメントを含んでいてもよい。
【００５０】
本発明の組換えベクターは、ベクターが当該問題における宿主細胞で複製できるようなＤＮＡ配列をさらに含有していてもよい。
宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターを複製させることができる配列は酵母プラスミド２μｍ複製遺伝子ＲＥＰ１-３及び複製起点である。
宿主細胞が細菌細胞である場合、ベクターを複製させることができる配列は、遺伝子をコードするＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ錯体及び複製起点である。
【００５１】
また、ベクターは、選択可能マーカー、例えば宿主細胞における欠失を補完する生成物の遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)をコードする遺伝子、又はSchizosaccharomyces pombeＴＰＩ遺伝子(P.R. Russell, Gene 40, 125-130(1985)に記載)、又は例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、又はメトトレキサート等、薬剤に対する耐性を付与するものを含んでいてもよい。糸状菌用の選択可能マーカーには、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ及びｓＣが含まれる。
【００５２】
宿主細胞の分泌経路に、本発明のタンパク質を方向付けるために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても知られている)が、組換えベクター内に提供されてもよい。分泌シグナル配列は正確なリーディングフレームにおいて、タンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合している。分泌シグナル配列は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡ配列に対し、５'に位置している。分泌シグナル配列は通常、タンパク質に関連していてもよく、又は他の分泌タンパク質をコードする遺伝子からのものであってもよい。
【００５３】
酵母細胞からの選択のために、分泌シグナル配列は、細胞の分泌経路における発現タンパク質の有効方向を保証する、任意のシグナルペプチドをコードするものであってもよい。シグナルペプチドは、自然に生じたシグナルペプチド、又はその機能的部分であってよく、又は合成ペプチドであってもよい。適切なシグナルペプチドは、α因子シグナルペプチド(米国特許第4,870,008号を参照)、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド(O. Hagenbuchleら, Nature 289, 643-646(1981)を参照)、修飾されたカルボキシペプチターゼシグナルペプチド(L.A. Vallsら, Cell 48, 887-897(1987)を参照)、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド(国際公開第87/02670号を参照)、又は酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３)シグナルペプチド(M. Egel-Mitaniら, Yeast 6, 127-137(1990)を参照)に見出される。
【００５４】
酵母における有効選択のために、リーダーペプチドをコードする配列は、シグナル配列の下流とタンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に挿入されてよい。リーダーペプチドの機能は、発現ポリペプチドを小胞体からゴルジ体へ、さらには培地中への分泌のために分泌小胞へ向けることを可能にすることである(すなわち、タンパク質は、酵母細胞のペリプラズム空間中に細胞壁又は少なくとも細胞膜を通って出て行く)。リーダーペプチドは酵母α因子リーダーであってもよい(その使用については、例えば米国特許第4,546,082号、欧州特許第16201号、欧州特許第123294号、欧州特許第123544号、及び欧州特許第163529号に記載されている)。また、リーダーペプチドは、合成リーダーペプチド、すなわち自然に見出されないリーダーペプチドであると言われるものであってもよい。例えば、合成リーダーペプチドは、国際公開第89/02463号又は国際公開第92/11378号に記載されているように構築されてもよい。
【００５５】
糸状菌への使用のために、シグナルペプチドは、Aspergillus種のアミラーゼ又はグルコアミラーゼをコードする遺伝子、Rhizomucor mieheiのリパーゼ又はプロテアーゼ、又はHumicola lanuginosaのリパーゼをコードする遺伝子から、簡便には誘導されてよい。シグナルペプチドは、好ましくはA. oryzaeのＴＡＫＡアミラーゼ、A. nigerの中性のα-アミラーゼ、A. nigerの酸安定性アミラーゼ、又はA. nigerのグルコアミラーゼをコードする遺伝子から誘導される。
【００５６】
本タンパク質、プロモーター、場合によってはターミネーター、及び／又は分泌シグナルペプチドをそれぞれコードするＤＮＡ配列をライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者によく知られている(例えば、Sambrookら, 前掲を参照)。
本発明の組換えベクター又はＤＮＡコンストラクトが導入される宿主細胞は、本タンパク質を生成可能な任意の細胞であってよく、細菌、酵母、真菌、及び高等真核細胞が含まれる。
【００５７】
培養において、本発明のタンパク質を生成可能な細菌宿主細胞の例は、グラム陽性菌、例えばBacillusの菌株、特にB. subtilis、B. licheniformis、B. lentus、B. brevis、B. stearothermophilus、B. alkalophilus、B. amyloliquefaciens、B. coagulans、B. circulans、B. lautus、B. megatherium又はB. thuringiensisの菌株、又はStreptomycesの菌株、例えばS. lividans又はS. murinusの菌株、又はグラム陰性菌、例えば大腸菌である。細菌の形質転換は、プロトプラストの形質転換、又はそれ自体公知の方式でコンピテント細胞を使用することによりなされてもよい(Sambrookら, 上掲を参照)。他の適切な宿主細胞には、S. mobaraensis、S. lividans、及びC. glutamicumが含まれる(Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 447-454(2004))。
【００５８】
大腸菌等の細菌においてタンパク質が発現する場合、タンパク質は、典型的には不溶性の顆粒(封入体として公知)として、原形質に保持されてよく、又は細菌分泌配列によりペリプラズム空間に方向付けされてもよい。前者のケースにおいては、細胞を溶解し、顆粒を回収し、変性させ、その後、変性剤を希釈することにより、タンパク質が再折り畳みされる。後者のケースにおいては、タンパク質は、例えば超音波処理又は浸透圧ショックにより、細胞を破壊することによりペリプラズム空間から回収されてよく、ペリプラズム空間の内容物が放出され、タンパク質が回収される。
【００５９】
適切な酵母細胞の例には、Saccharomyces種又はSchizosaccharomyces種の細胞、特にSaccharomyces cerevisiae又はSaccharomyces kluyveriの菌株が含まれる。異種ＤＮＡを用いて酵母細胞を形質転換し、異種タンパク質を生成させる方法は、例えば米国特許第号4,599,311号、米国特許第4,931,373号、米国特許第4,870,008号、同5,037,743号、及び米国特許第4,845,075号に記載されており、その全てが参照としてここに導入される。形質転換した細胞は、選択可能マーカーにより決定されたフェノタイプ、一般的には薬剤耐性、又は特定の栄養素、例えばロイシンの不在下で成長する能力によって選択される。酵母に使用される好ましいベクターは、米国特許第4,931,373号に記載のＰＯＴ１ベクターである。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、シグナル配列、及び場合によってはリーダー配列、例えば上述したものに先行してよい。さらに、適切な酵母細胞の例は、Kluyveromyces、例えばK. lactis、Hansenula、例えばH. polymorpha、又はPichia、例えばP. pastorisの菌株である(Gleesonら, J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465(1986); 米国特許第4,882,279号を参照)。
【００６０】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばAspergillus種、Neurospora種、Fusarium種、又はTrichoderma種、特にA. oryzae、A. nidulans又はA. nigerの菌株である。タンパク質の発現のためにAspergillus種を使用することは、例えば欧州特許第272277号、及び欧州特許第230023号に開示されている。F. oxysporumの形質転換は、例えば Malardierら Gene 78, 147-156(1989)に記載されたようにして実施されてよい。
【００６１】
宿主細胞として糸状菌が使用される場合、簡便には宿主染色体にＤＮＡコンストラクトを組み込むことによって、本発明のＤＮＡコンストラクトを用いて形質転換させ、組換え宿主細胞を得てもよい。この組み込みは、一般的に、ＤＮＡ配列が細胞内で安定して維持されていると思われる場合に、有利であると考えられている。宿主染色体へのＤＮＡコンストラクトの組み込みは、従来からの方法、例えば相同又は異種組換えに従い、実施されてよい。
ついで、上述した形質転換又は形質移入された宿主細胞は、本ペプチドの発現を可能にする条件下で、適切な栄養培地において培養され、その後、得られたタンパク質は培地から回収される。
【００６２】
細胞培養に使用される培地は、宿主細胞の増殖に適した任意の従来からの培地、例えば適切なサプリメントを含有する最小又は複合培地であってよい。適切な培地は商業的供給者から入手可能であり、又は公開されているレシピ(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)に従い調製されてもよい。ついで、細胞により生成されるペプチドは、遠心分離又は濾過、硫酸アンモニウム等の塩により上清又は濾液のタンパク質様成分を沈殿させることによって、培地から宿主細胞を分離させ、当該分野のタンパク質の種類に応じて、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の多様なクロマトグラフィー手順により精製することを含む従来からの手順により、培養培地から回収されてよい。
【００６３】
一実施態様では、本発明は、本発明のペプチドを含有する組成物を提供する。
一実施態様では、本発明は、ペプチドをコンジュゲートさせる方法を提供し、該方法は、本発明のペプチドの存在下でアミン供与体と該ペプチドを反応させることを含む。一実施態様では、コンジュゲートされるペプチドは成長ホルモンである。一実施態様では、ペプチドは、ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である。
本明細書において、「誘導体」なる用語は、その修飾された、すなわち親ペプチドに、好ましくは生物活性を有する、任意の種類の分子を共有結合させたポリペプチド又は変異体又は断片を意味するものである。典型的な修飾は、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステル、ペグ化等である。
【００６４】
一実施態様では、本発明は、上述の成長ホルモンをコンジュゲートさせる方法を提供し、ここで、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチドが、本発明のペプチドの代わりに該方法に使用される場合、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートした成長ホルモンの量は、位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨと比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比べて、有意に増加している。
【００６５】
一実施態様では、本発明は、ｈＧＨをコンジュゲートさせる方法を提供し、ここで、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドが、本発明のペプチドの代わりに該方法に使用される場合、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートした成長ホルモンの量は、位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨと比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比べて、有意に増加している。
【００６６】
一実施態様では、本発明は、位置１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨを調製する方法を提供し、該方法は、本発明のペプチドの存在下でアミン供与体とｈＧＨを反応させることを含む。
本発明の方法の一実施態様では、コンジュゲートしたｈＧＨは、ペグ化されたｈＧＨの調製にも使用され、ここで該ペグ化はコンジュゲートした位置で生じる。
一実施態様では、本発明はコンジュゲートした成長ホルモンを製薬調製する方法を提供し、該方法は、本発明のペプチドの存在下でアミン供与体と該ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体を反応させる工程を含む。
【００６７】
一実施態様では、本発明は、ペグ化された成長ホルモンを製薬調製する方法を提供し、該方法は、本発明のペプチドの存在下でアミン供与体と該ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体を反応させ、ペグ化された成長ホルモンの調製に、得られたコンジュゲートした成長ホルモンペプチドを使用する工程を含み、ここで該ペグ化はコンジュゲートした位置で生じる。一実施態様では、成長ホルモンはｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である。一実施態様では、ペグ化された成長ホルモンは、位置Ｇｌｎ１４１でペグ化されたｈＧＨである。一実施態様では、ペグ化された成長ホルモンは、国際公開第2006/134148号に記載されているペグ化された成長ホルモンである。
【００６８】
一実施態様では、本発明は、コンジュゲートした成長ホルモンの調製への、本発明のペプチドの使用を提供する。一実施態様では、成長ホルモンはｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である。一実施態様では、成長ホルモンは、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ１４１に対応する位置でコンジュゲートされている。
【００６９】
一実施態様では、本発明は、患者の成長ホルモンの欠乏に関連した病気又は疾患を処置する方法を提供し、該方法は、本発明の方法を使用して調製された薬学的調製物を、それを必要とする患者に投与することを含み、ここで、コンジュゲート化ペプチドは成長ホルモンである。一実施態様では、患者の成長ホルモンの欠乏に関連した病気又は疾患は、成長ホルモン欠損症(ＧＨＤ)；ターナー症候群；プラダーウィリ症候群(ＰＷＳ)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎臓病、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症、ＨＡＡＲＴ治療を受けた小児のＨＩＶ感染(ＨＩＶ／ＨＡＬＳ小児)；短い妊娠期間で出生した低身長小児(ＳＧＡ)；ＳＧＡ以外の極少低出生時体重(ＶＬＢＷ)で出生した低身長症；骨格形成異常；軟骨低形成症；軟骨形成不全；特発性低身長(ＩＳＳ)；成人のＧＨＤ；脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手、中足、及び指等、長骨又はその内部の骨折；頭蓋骨、手の基部、及び足の基部等、海綿様骨又はその内部の骨折；例えば手、膝又は肩等における、腱又は靱帯の手術後の患者；仮骨延長術を受ける又は受けた患者；腰又は円板置換、半月板修復、脊椎固定術、膝、臀部、肩、肘、手首又は顎のプロテーゼ固定術後の患者；骨接合術物質、例えば爪、ネジ及びプレートが固定されている患者；骨折の変形癒合又は偽関節を有する患者；例えば脛骨又は第一趾からの骨切り術後の患者；移植片植え込み後の患者；外傷又は関節炎に起因する膝の関節軟骨変性；ターナー症候群を患っている患者の骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症、慢性透析の成人患者(ＡＰＣＤ)；ＡＰＣＤにおける栄養不良関連循環器疾患；ＡＰＣＤにおける悪液質の逆流；ＡＰＣＤにおける癌；ＡＰＣＤにおける慢性的な抽象的肺病；ＡＰＣＤにおけるＨＩＶ；ＡＰＣＤの高齢者；ＡＰＣＤにおける慢性的な肝臓病、ＡＰＣＤにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；ＨＩＶ感染した男性；短腸症候群；中心性肥満；ＨＩＶ関連リポジストロフィ症候群(ＨＡＬＳ)：男性不妊；主として待機手術、アルコール／薬物解毒又は神経的トラウマを受けた後の患者；加齢；虚弱な高齢者；骨関節炎；外傷性の損傷を受けた軟骨；勃起障害；線維筋痛；記憶障害；鬱病；外傷性脳損傷；くも膜下出血；極小未熟児；メタボリックシンドローム；グルココルチコイドミオパシー；又は小児のグルココルチコイド処置による低身長症から選択される。
【００７０】
以下は、本発明の実施態様の列挙であり、該列挙に限定されるとみなされるものではない。
実施態様１：ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高い、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較したｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する特異性を有するトランスグルタミナーゼペプチド。
実施態様２：配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する、実施態様１のトランスグルタミナーゼペプチド。
実施態様３：配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する、実施態様２のトランスグルタミナーゼペプチド。
実施態様４：配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する、実施態様３のトランスグルタミナーゼペプチド。
実施態様５：配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する、実施態様４のトランスグルタミナーゼペプチド。
【００７１】
実施態様６：前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対応する一又は複数の位置において修飾されている、実施態様２ないし５のいずれかのトランスグルタミナーゼペプチド。
【００７２】
実施態様７：配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、該配列が、配列番号１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対する一又は複数の位置において修飾されている、単離されたペプチド。
実施態様８：配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、該配列が、配列番号１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対応する一又は複数の位置において修飾されている、実施態様７の単離されたペプチド。
実施態様９：配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、該配列が、配列番号１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対応する一又は複数の位置において修飾されている、実施態様８の単離されたペプチド。
実施態様１０：配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、該配列が、配列番号１のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及びＳｅｒ２５０に対応する一又は複数の位置において修飾されている、実施態様９の単離されたペプチド。
【００７３】
実施態様１１：前記配列が、配列番号１：のアミノ酸残基Ｔｙｒ６２、Ｔｙｒ７５及び
Ｓｅｒ２５０に対応する一又は複数の位置において修飾されている、配列番号１に定められたようなアミノ酸配列を含有する、実施態様１０の単離されたペプチド。
実施態様１２：前記アミノ酸配列が、Ｔｙｒ６２に対応する位置で修飾されており、修飾が、Ｔｙｒとは異なるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基が置換されることからなる、実施態様６ないし１１のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様１３：Ｔｙｒ６２に対応する位置でのアミノ酸残基の修飾が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基が置換されることからなる、実施態様１２の単離されたペプチド。
【００７４】
実施態様１４：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒが、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、及びＬｅｕから選択されるアミノ酸残基で置換されている、実施態様１３の単離されたペプチド。
実施態様１５：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒがＨｉｓで置換されている、実施態様１４の単離されたペプチド。
実施態様１６：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒがＶａｌで置換されている、実施態様１４の単離されたペプチド。
【００７５】
実施態様１７：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒが、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、及びＬｅｕから選択されるアミノ酸残基で置換されている、実施態様１４の単離されたペプチド。
実施態様１８：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒがＭｅｔで置換されている、実施態様１７の単離されたペプチド。
実施態様１９：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒがＡｎｓで置換されている、実施態様１７の単離されたペプチド。
実施態様２０：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒがＴｈｒで置換されている、実施態様１７の単離されたペプチド。
実施態様２１：Ｔｙｒ６２に対応する位置のＴｙｒがＬｅｕで置換されている、実施態様１７の単離されたペプチド。
【００７６】
実施態様２２：前記アミノ酸配列がＴｙｒ７５に対応する位置において修飾されており、修飾が、Ｔｙｒとは異なるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基が置換されることからなる、実施態様６ないし２１のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様２３：Ｔｙｒ７５に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のチロシン残基が置換されることからなる、実施態様２２の単離されたペプチド。
【００７７】
実施態様２４：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒが、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、又はＣｙｓで置換されている、実施態様２３の単離されたペプチド。
実施態様２５：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒがＰｈｅで置換されている、実施態様２４の単離されたペプチド。
実施態様２６：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒがＡｓｎで置換されている、実施態様２４の単離されたペプチド。
実施態様２７：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒが、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、又はＣｙｓで置換されている、実施態様２４の単離されたペプチド。
【００７８】
実施態様２８：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒがＡｌａで置換されている、実施態様２７の単離されたペプチド。
実施態様２９：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒがＭｅｔで置換されている、実施態様２７の単離されたペプチド。
実施態様３０：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒがＬｅｕで置換されている、実施態様２７の単離されたペプチド。
実施態様３１：Ｔｙｒ７５に対応する位置のＴｙｒがＣｙｓで置換されている、実施態様２７の単離されたペプチド。
【００７９】
実施態様３２：前記アミノ酸配列がＳｅｒ２５０に対応する位置において修飾されており、修飾が、Ｓｅｒとは異なるアミノ酸残基で、最初のセリン残基が置換されることからなる、実施態様６ないし３１のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様３３：Ｓｅｒ２５０に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のセリン残基が置換されることからなる、実施態様３２の単離されたペプチド。
【００８０】
実施態様３４：Ｓｅｒ２５０に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のセリン残基が置換されることからなる、実施態様３３の単離されたペプチド。
実施態様３５：Ｓｅｒ２５０に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾が、Ｇｌｙで最初のセリン残基が置換されることからなる、実施態様３３の単離されたペプチド。
実施態様３６：Ｓｅｒ２５０に対応する位置におけるアミノ酸残基の修飾が、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基で、最初のセリン残基が置換されることからなる、実施態様３３の単離されたペプチド。
【００８１】
実施態様３７：前記Ｓｅｒ２５０がＣｙｓで置換されている、実施態様３６の単離されたペプチド。
実施態様３８：前記Ｓｅｒ２５０がＬｅｕで置換されている、実施態様３６の単離されたペプチド。
実施態様３９：前記Ｓｅｒ２５０がＰｒｏで置換されている、実施態様３６の単離されたペプチド。
実施態様４０：前記Ｓｅｒ２５０がＴｒｐで置換されている、実施態様３６の単離されたペプチド。
実施態様４１：前記Ｓｅｒ２５０がＴｙｒで置換されている、実施態様３６の単離されたペプチド。
実施態様４２：前記Ｓｅｒ２５０がＶａｌで置換されている、実施態様３６の単離されたペプチド。
【００８２】
実施態様４３：配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、該配列が、１〜１０のアミノ酸残基をＮ末端に付加することにより修飾されている、単離されたペプチド。
実施態様４４：配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、該配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４３の単離されたペプチド。
実施態様４５：配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、該配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４４の単離されたペプチド。
実施態様４６：配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、該配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４５の単離されたペプチド。
【００８３】
実施態様４７：配列番号１に定められたようなアミノ酸配列を含有し、該配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４６の単離されたペプチド。
実施態様４８：前記アミノ酸配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様２ないし４２のいずれかの単離されたペプチド。
【００８４】
実施態様４９：配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、該配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、単離されたペプチド。
実施態様５０：配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、該配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４９の単離されたペプチド。
実施態様５１：配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、該配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様５０の単離されたペプチド。
実施態様５２：配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、該配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様５１の単離されたペプチド。
【００８５】
実施態様５３：配列番号２に定められたようなアミノ酸配列を含有し、該配列が、１〜１０のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様５２の単離されたペプチド。
実施態様５４：前記配列が、配列番号２の位置Ａｓｐ-４、Ｖａｌ-３０、Ｔｙｒ-６２、Ｔｙｒ-７５、Ａｒｇ-８９、Ｇｌｕ-１１５、Ｓｅｒ-２１０、Ａｓｐ-２２１、Ａｌａ-２２６、Ｐｒｏ-２２７、Ｇｌｙ-２５０、Ｖａｌ-２５２、Ａｓｎ-２５３、Ｐｈｅ-２５４、Ｈｉｓ-２７７、Ｔｙｒ-２７８、Ｌｅｕ-２８５、Ｔｙｒ-３０２、Ａｓｐ-３０４、及びＬｙｓ-３２７に対応するアミノ酸残基から選択される、一又は複数のアミノ酸残基においてさらに修飾されている、実施態様４９ないし５３のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様５５：前記配列が、配列番号２のＧｌｙ-２５０に対応するアミノ酸残基において修飾されている、実施態様５４の単離されたペプチド。
【００８６】
実施態様５６：前記Ｇｌｙ-２５０がＴｈｒで置換されている、実施態様５５の単離されたペプチド。
実施態様５７：前記Ｇｌｙ-２５０がＳｅｒで置換されている、実施態様５５の単離されたペプチド。
【００８７】
実施態様５８：前記配列が、配列番号２のＣｙｓ-６４に対応するアミノ酸残基から２０Å未満離間して位置している一又は複数のアミノ酸残基においてさらに修飾されている、実施態様４９ないし５７のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様５９：前記配列が、配列番号２のＣｙｓ-６４に対応するアミノ酸残基から１５Å未満離間して位置している一又は複数のアミノ酸残基においてさらに修飾されている、実施態様５８の単離されたペプチド。
実施態様６０：前記配列が、配列番号２の位置Ｃｙｓ６４に対応する位置において修飾されていない、実施態様５９の単離されたペプチド。
【００８８】
実施態様６１：前記配列が、配列番号２の位置Ｖａｌ-３０、Ｔｙｒ-６２、Ｖａｌ-２５２、Ａｓｎ-２５３、Ｐｈｅ-２５４、Ｈｉｓ-２７７、Ｔｙｒ-２７８、及びＬｅｕ-２８５に対応するアミノ酸残基から選択される、一又は複数のアミノ酸残基において修飾されている、実施態様５９又は６０の単離されたペプチド。
実施態様６２：前記配列が、配列番号２のＴｙｒ-６２に対応するアミノ酸残基において修飾されている、実施態様６１の単離されたペプチド。
【００８９】
実施態様６３：前記Ｔｙｒ-６２が、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ又はＴｒｐで置換されている、実施態様６１又は６２の単離されたペプチド。
実施態様６４：前記Ｔｙｒ-６２がＧｌｕで置換されている、実施態様６１ないし６３のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様６５：前記Ｔｙｒ-６２がＴｒｐで置換されている、実施態様６１ないし６３のいずれかの単離されたペプチド。
【００９０】
実施態様６６：前記Ｔｙｒ-６２が、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、又はＶａｌで置換されている、実施態様６１ないし６３のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様６７：前記Ｔｙｒ-６２がＨｉｓで置換されている、実施態様６６の単離されたペプチド。
実施態様６８：前記Ｔｙｒ-６２がＧｌｕで置換されている、実施態様６６の単離されたペプチド。
実施態様６９：前記Ｔｙｒ-６２がＩｌｅで置換されている、実施態様６６の単離されたペプチド。
実施態様７０：前記Ｔｙｒ-６２がＭｅｔで置換されている、実施態様６６の単離されたペプチド。
【００９１】
実施態様７１：前記Ｔｙｒ-６２がＡｓｎで置換されている、実施態様６６の単離されたペプチド。
実施態様７２：前記Ｔｙｒ-６２がＧｌｎで置換されている、実施態様６６の単離されたペプチド。
実施態様７３：前記Ｔｙｒ-６２がＴｈｒで置換されている、実施態様６６の単離されたペプチド。
実施態様７４：前記Ｔｙｒ-６２がＶａｌで置換されている、実施態様６６の単離されたペプチド。
実施態様７５：前記Ｔｙｒ-６２がＴｒｐで置換されている、実施態様６６の単離されたペプチド。
【００９２】
実施態様７６：前記配列が、配列番号２のＨｉｓ-２７７及びＴｙｒ-２７８に対応する、一又は複数のアミノ酸残基において修飾されている、実施態様６１ないし７５のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様７７：前記配列が、配列番号２のＬｅｕ-２８５に対応するアミノ酸残基において修飾されている、実施態様６１ないし７６のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様７８：前記Ｌｅｕ-２８５がＴｈｒで置換されている、実施態様７７の単離されたペプチド。
【００９３】
実施態様７９：前記配列が、配列番号２の位置Ｖａｌ-２５２、Ａｓｎ-２５３、及びＰｈｅ-２５４に対応するアミノ酸残基から選択される、一又は複数のアミノ酸残基で修飾されている、実施態様６１ないし７８のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様８０：前記配列が、配列番号２のＶａｌ-３０に対応するアミノ酸残基において修飾されている、実施態様５８ないし７９のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様８１：前記Ｖａｌ-３０が配列番号２のＩｌｅで置換されている、実施態様８０の単離されたペプチド。
【００９４】
実施態様８２：前記配列が、配列番号２の位置Ａｓｐ-４、Ａｒｇ-８９、Ｇｌｕ-１１５、Ｓｅｒ-２１０、Ａｓｐ-２２１、及びＬｙｓ-３２７に対応するアミノ酸残基から選択戯れる、一又は複数のアミノ酸残基においてさらに修飾されている、実施態様５４の単離されたペプチド。
実施態様８３：前記Ａｓｐ-４がＧｌｕで置換されている、実施態様８２の単離されたペプチド。
実施態様８４：前記Ａｓｐ-４がＧｌｕで置換され、位置１、２及び３のアミノ酸が欠失している、実施態様８２又は８３の単離されたペプチド。
【００９５】
実施態様８５：配列番号２のＡｒｇ-８９に対応するアミノ酸残基がＬｙｓで置換されている、実施態様８２ないし８４のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様８６：配列番号２のＧｌｕ-１１５に対応するアミノ酸残基がＡｓｐで置換されている、実施態様８２ないし８５のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様８７：配列番号２のＳｅｒ-２１０に対応するアミノ酸残基がＧｌｙで置換されている、実施態様８２ないし８６のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様８８：配列番号２のＡｓｐ-２２１に対応するアミノ酸残基がＳｅｒで置換されている、実施態様８２ないし８７のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様８９：配列番号２のＬｙｓ-３２７に対応するアミノ酸残基がＴｈｒで置換されている、実施態様８２ないし８８のいずれかの単離されたペプチド。
【００９６】
実施態様９０：前記配列が、配列番号２の位置Ａｌａ-２２６及びＰｒｏ-２２７に対応するアミノ酸残基から選択される、一又は複数のアミノ酸残基において修飾されている、実施態様５４ないし８９のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様９１：前記Ａｌａ-２２６がＡｓｐで置換されている、実施態様９０の単離されたペプチド。
【００９７】
実施態様９２：配列番号２のＰｒｏ-２２７に対応するアミノ酸残基が、Ａｒｇで置換されている、実施態様９０の単離されたペプチド。
実施態様９３：前記配列が、配列番号２のＴｙｒ-７５に対応するアミノ酸残基において修飾されている、実施態様５４ないし９２のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様９４：前記Ｔｙｒ-７５が、Ｇｌｕとは異なるアミノ酸で置換されている、実施態様９３の単離されたペプチド。
実施態様９５：前記Ｔｙｒ-７５が、Ａｓｐ又はＧｌｕとは異なるアミノ酸で置換されている、実施態様９４の単離されたペプチド。
実施態様９６：前記Ｔｙｒ-７５が、酸性アミノ酸残基とは異なるアミノ酸で置換されている、実施態様９５の単離されたペプチド。
【００９８】
実施態様９７：前記Ｔｙｒ-７５がＡｌａで置換されている、実施態様９３ないし９６のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様９８：前記Ｔｙｒ-７５がＣｙｓで置換されている、実施態様９３ないし９６のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様９９：前記Ｔｙｒ-７５がＰｈｅで置換されている、実施態様９３ないし９６のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様１００：前記Ｔｙｒ-７５がＬｅｕで置換されている、実施態様９３ないし９６のいずれかの単離されたペプチド。
【００９９】
実施態様１０１：前記Ｔｙｒ-７５がＭｅｔで置換されている、実施態様９３ないし９６のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様１０２：前記Ｔｙｒ-７５がＡｓｎで置換されている、実施態様９３ないし９６のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様１０３：前記Ｔｙｒ-７５がＰｒｏで置換されている、実施態様９３ないし９６のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様１０４：前記Ｔｙｒ-７５がＳｅｒで置換されている、実施態様９３ないし９６のいずれかの単離されたペプチド。
【０１００】
実施態様１０５：前記配列が、配列番号２のＴｙｒ-３０２に対応するアミノ酸残基において修飾されている、実施態様５４ないし１０４のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様１０６：前記Ｔｙｒ-３０２が、Ｔｙｒとは異なる塩基性アミノ酸残基で置換されている、実施態様１０５の単離されたペプチド。
実施態様１０７：前記Ｔｙｒ-３０２が、Ａｒｇ又はＬｙｓで置換されている、実施態様１０６の単離されたペプチド。
実施態様１０８：前記Ｔｙｒ-３０２がＡｒｇで置換されている、実施態様１０７の単離されたペプチド。
【０１０１】
実施態様１０９：前記配列が、配列番号２のＡｓｐ-３０４に対応するアミノ酸残基において修飾されている、実施態様５４ないし１０８のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様１１０：前記Ａｓｐ-３０４が塩基性アミノ酸残基で置換されている、実施態様１０９の単離されたペプチド。
実施態様１１１：前記Ａｓｐ-３０４が、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇで置換されている、実施態様１１０の単離されたペプチド。
実施態様１１２：前記Ａｓｐ-３０４がＬｙｓで置換されている、実施態様１１１の単離されたペプチド。
【０１０２】
実施態様１１３：前記配列が、１〜９のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４３ないし１１２のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様１１４：前記配列が、１〜８のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１１３の単離されたペプチド。
実施態様１１５：前記配列が、１〜７のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１１４の単離されたペプチド。
実施態様１１６：前記配列が、１〜６のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１１５の単離されたペプチド。
実施態様１１７：前記配列が、１〜５のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１１６の単離されたペプチド。
【０１０３】
実施態様１１８：前記配列が、１〜４のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１１７の単離されたペプチド。
実施態様１１９：前記配列が、１〜３のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１１８の単離されたペプチド。
実施態様１２０：前記配列が、１〜２のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１１９の単離されたペプチド。
実施態様１２１：前記配列が、１つのアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１２０の単離されたペプチド。
実施態様１２２：前記配列が、ＭｅｔをＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１２１の単離されたペプチド。
【０１０４】
実施態様１２３：前記配列が、２〜９のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様４３ないし１１２のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様１２４：前記配列が、２〜８のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１２３の単離されたペプチド。
実施態様１２５：前記配列が、２〜７のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１２４の単離されたペプチド。
実施態様１２６：前記配列が、２〜６のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１２５の単離されたペプチド。
【０１０５】
実施態様１２７：前記配列が、２〜５のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１２６の単離されたペプチド。
実施態様１２８：前記配列が、２〜４のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１２７の単離されたペプチド。
実施態様１２９：前記配列が、２〜３のアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１２８の単離されたペプチド。
実施態様１３０：前記配列が、２つのアミノ酸をＮ末端に付加することにより修飾されている、実施態様１２９の単離されたペプチド。
【０１０６】
実施態様１３１：付加されたジペプチド基がＧｌｙ-Ｐｒｏ-である、実施態様１３０の単離されたペプチド。
実施態様１３２：付加されたジペプチド基がＡｌａ-Ｐｒｏ-である、実施態様１３０の単離されたペプチド。
【０１０７】
実施態様１３３：ペプチドがトランスグルタミナーゼ活性を有している、実施態様７ないし１３２のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様１３４：ペプチドが、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較して、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する特異性を有し、これが、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較してｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対し、配列番号２に示すようなアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高い、実施態様１ないし６又は１３３のいずれかの単離されたペプチド。
実施態様１３５：ペプチドが、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較して、ｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対する特異性を有し、これが、ｈＧＨのＧｌｎ-４０と比較してｈＧＨのＧｌｎ-１４１に対し、配列番号１に示すようなアミノ酸配列を有するペプチドの特異性よりも高い、実施態様１ないし６又は１３３のいずれかの単離されたペプチド。
【０１０８】
実施態様１３６：配列番号１の配列を含有する、単離されたペプチド。
実施態様１３７：配列番号１の配列を有する、単離されたペプチド。
【０１０９】
実施態様１３８：実施態様１ないし１３７のいずれかのペプチドをコードする核酸コンストラクト。
実施態様１３９：実施態様１３８の核酸コンストラクトを含有するベクター。
実施態様１４０：実施態様１３９のベクターを含有する宿主細胞。
実施態様１４１：実施態様１ないし１３７のいずれかのペプチドを含有する組成物。
【０１１０】
実施態様１４２：ペプチドをコンジュゲートさせる方法であって、該方法が、実施態様１ないし１３７のいずれかのペプチドの存在下で、アミン供与体と該ペプチドとを反応させることを含む方法。
実施態様１４３：前記コンジュゲートされるペプチドが成長ホルモンである、実施態様１４２のペプチドをコンジュゲートさせる方法。
実施態様１４４：前記成長ホルモンが、ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である、実施態様１４３の方法。
【０１１１】
実施態様１４５：実施態様１４４の成長ホルモンをコンジュゲートさせる方法であって、ここで、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するペプチドが、実施態様１ないし１３７のいずれかのペプチドの代わりに該方法に使用される場合、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートした成長ホルモンの量が、位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨと比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比べて、かなり増加している方法。
【０１１２】
実施態様１４６：実施態様１４２のｈＧＨをコンジュゲートさせる方法であって、ここで、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドが、実施態様１ないし１３７のいずれかのペプチドの代わりに該方法に使用される場合、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートした成長ホルモンの量が、位置Ｇｌｎ-４０に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨと比較した、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ-１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨの量と比べて、かなり増加している方法。
【０１１３】
実施態様１４７：位置１４１に対応する位置でコンジュゲートしたｈＧＨを調製する方法であって、該方法が、実施態様１ないし１３７のいずれかのペプチドの存在下で、アミン供与体とｈＧＨとを反応させることを含む方法。
実施態様１４８：実施態様１４２ないし１４７のいずれかの方法であって、コンジュゲートしたｈＧＨが、ペグ化されたｈＧＨの調製に使用され、ここで該ペグ化がコンジュゲートした位置で生じる方法。
実施態様１４９：コンジュゲートした成長ホルモンを製薬調製する方法であって、該方法が、実施態様１ないし１３７のいずれかのペプチドの存在下で、アミン供与体と該ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体とを反応させる工程を含む方法。
実施態様１５０：成長ホルモンがｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である、実施態様１４９の方法。
【０１１４】
実施態様１５１：ペグ化された成長ホルモンを製薬調製する方法であって、該方法が、実施態様１ないし１３７のいずれかのペプチドの存在下、アミン供与体と該ｈＧＨ又はその変異体又は誘導体とを反応させ、ペグ化された成長ホルモンの調製に、得られたコンジュゲートした成長ホルモンペプチドを使用する工程を含み、ここで該ペグ化がコンジュゲートした位置で生じる方法。
実施態様１５２：成長ホルモンがｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である、実施態様１５１の方法。
実施態様１５３：ペグ化された成長ホルモンが、位置Ｇｌｎ１４１でペグ化されたｈＧＨである、実施態様１５２の方法。
【０１１５】
実施態様１５４：コンジュゲートした成長ホルモンの調製における、実施態様１ないし１３７のいずれかのペプチドの使用。
実施態様１５５：成長ホルモンがｈＧＨ又はその変異体又は誘導体である、実施態様１５４の使用。
実施態様１５６：成長ホルモンが、ｈＧＨの位置Ｇｌｎ１４１に対応する位置でコンジュゲートしている、実施態様１５４又は１５５の使用。
【０１１６】
実施態様１５７：患者の成長ホルモンの欠失に関連した病気又は疾患を処置する方法であって、該方法が、実施態様１４９ないし１５３のいずれかの方法を使用して調製された薬学的調製物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
実施態様１５８：実施態様１５７の方法であって、成長ホルモンの欠失に関連した病気又は疾患が、成長ホルモン欠損症(ＧＨＤ)；ターナー症候群；プラダーウィリ症候群(ＰＷＳ)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎臓病、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症、子供が受けたＨＡＡＲＴ処置によるＨＩＶ感染(ＨＩＶ／ＨＡＬＳ小児)；短い妊娠期間で出生した低身長小児(ＳＧＡ)；ＳＧＡではないがかなりの出生時低体重(ＶＬＢＷ)を有する小児出生における低身長症；骨格形成異常；軟骨低形成症；軟骨形成不全；特発性低身長(ＩＳＳ)；成人おけるＧＨＤ；脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手、中足、及び指等、長骨又はその内部の骨折；頭蓋骨、手の基部、及び足の基部等、海綿様骨又はその内部の骨折；例えば手、膝又は肩等における、腱又は靱帯の手術後の患者；仮骨延長術を受ける又は受けた患者；腰又は円板置換、半月板修復、脊椎固定術、膝、臀部、肩、肘、手首又は顎のプロテーゼ固定術後の患者；骨接合術物質、例えば爪、ネジ及びプレートが固定されている患者；骨折の変形癒合又は偽関節を有する患者；例えば脛骨又は第一趾からの骨切り術後の患者；移植片植え込み後の患者；外傷又は関節炎に起因する膝の関節軟骨変性；ターナー症候群を患っている患者の骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症、慢性透析の成人患者(ＡＰＣＤ)；ＡＰＣＤにおける栄養不良関連循環器疾患；ＡＰＣＤにおける悪液質の逆流；ＡＰＣＤにおける癌；ＡＰＣＤにおける慢性的な抽象的肺病；ＡＰＣＤにおけるＨＩＶ；ＡＰＣＤの高齢者；ＡＰＣＤにおける慢性的な肝臓病、ＡＰＣＤにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；ＨＩＶ感染した男性；短腸症候群；中心性肥満；ＨＩＶ関連リポジストロフィ症候群(ＨＡＬＳ)：男性不妊；主として待機手術、アルコール／薬物解毒又は神経的トラウマを受けた後の患者；加齢；虚弱な高齢者；骨関節炎；外傷性の損傷を受けた軟骨；勃起障害；線維筋痛；記憶障害；鬱病；外傷性脳損傷；くも膜下出血；極小未熟児；メタボリックシンドローム；グルココルチコイドミオパシー；又は小児のグルココルチコイド処置による低身長症から選択される、実施態様１５７の方法。
【０１１７】
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、特定の文献の任意の別個に提供される援用がここの他の箇所でなされているかにかかわらず、その全体が出典明示によりここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
本発明で記載されて使用されている「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」等の用語は、ここで示され、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーすると解釈される。例えば、「化合物」なる表現は、特に示さない限りは、本発明又は特定の記載された態様の種々の「化合物」を称すると理解される。
【０１１８】
特に示さない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の要因又は測定値に関して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる)。
特に明記せず、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、成分又は成分類に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含める」等の用語を使用する、本発明の任意の側面又は実施態様のここでの記載は、特定の成分又は成分群「からなる」、「本質的になる」、又は「実施的に含有する」といった本発明の類似した側面又は実施態様をサポートすることを意図したものである(例えば、特定の成分を含有するここに記載の組成物は、特に明記しない又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、その成分からなる組成物を記載するものと理解すべきである)。
【実施例１】
【０１１９】
ＧｌｙＰｒｏ-ＴＧａｓｅ形態におけるプロペプチド-ｍＴＧａｓｅのクローニング及び変異体生成
Streptoverticillium ladakanum  ＡＴＣＣ２７４４１由来のＴＧａｓｅ
S. ladakanum由来のプロペプチド-ｍＴＧａｓｅの配列(プロペプチド-ｍＴＧａｓｅは、大腸菌等の他の生物において、S. ladakanum由来のＴＧａｓｅをコードするＤＮＡを発させて得られるペプチドである)を、配列番号３に示す。ポリペプチドの一部は、配列番号３のａａ１-４９であり、残りの配列は配列番号１に示すような成熟ｍＴＧａｓｅであった。成熟ｍＴＧａｓｅ部分(配列番号１)は、図１に示すようなS. mobaraensis由来のｍＴＧａｓｅ(配列番号２)と、９３．４％の同一性を有する。
【０１２０】
３Ｃ-プロテアーゼ配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ(３Ｃ)を、S. ladakanumのプロペプチド-ＴＧａｓｅの成熟ＴＧａｓｅドメインとプロペプチド-ドメイン(配列番号３のａａ１-４９)との間でクローニングした。３Ｃ-プロテアーゼを、ＬＥＶＬＦＱＧＰ部位のＱとＧとの間で特異的に切断し、成熟ｍＴＧａｓｅ(配列番号１に示す)のＮ末端に付加される、２つの付加的なアミノ酸残基Ｇｌｙ-Ｐｒｏを得た。大腸菌における発現のために、Ｍｅｔ-プロペプチド-(３Ｃ)-ｍＴＧａｓｅをコードするＤＮＡを、ｐＥＴ３９ｂ(Novagen)発現ベクターのＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ部位の間でクローニングし、発現用に大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)に移した。
部位特異的突然変異を、QuikChange部位特異的突然変異キット(Stratagene)を使用して実施した。例えばＹ７５Ａ、Ｙ７５Ｆ、Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｎ及びＹ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆの突然変異(配列番号１の番号付けを使用)を、ＰＣＲの鋳型として、プロペプチド-(３Ｃ)-ｍＴＧａｓｅ配列をコードするＤＮＡを使用して生成させた。
【実施例２】
【０１２１】
Ｎ末端にアミノ酸残基が付加されたＴＧａｓｅ変異体の選択性
ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅの調製
ｐＥＴ３９ｂ＿Ｍｅｔ-プロペプチド-(３Ｃ)-ｍＴＧａｓｅ／大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞を、光学密度０．４まで、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンが捕捉されたＬＢ培地において３０℃で培養し、さらに４時間、細胞を０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘発させた。遠心分離により、細胞ペレットを収集した。
細胞ペレットからの可溶性フラクションを抽出し、アニオン交換、Ｑ-セファロースＨＰ、カラムを用いて精製し、純粋なプロペプチド-(３Ｃ)−ｍＴＧａｓｅタンパク質を得た。ついで、このタンパク質を、２０℃で一晩、プロペプチド-(３Ｃ)-ｍＴＧａｓｅタンパク質に対して１：１００(ｗ／ｗ)の比率で３Ｃ-プロテアーゼ(ポリオウイルス由来)を用いて消化した。消化混合物を、カチオン交換カラム、ＳＰセファロースＨＰ／ソース３０Ｓでさらに精製し、ｍＴＧａｓｅの活性について、ＴＧａｓｅ活性アッセイにより同定した。
【０１２２】
ＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅの調製
ポリペプチドの消化が、３Ｃプロテアーゼの代わりにエンテロキナーゼ(ＥＫ)にて実施したことを除けば、ＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅを、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅに類似した方法で生成させた。簡単には、Streptomyces mobaraensis由来のプロペプチド-ｍＴＧａｓｅを大腸菌で発現させ、可溶性フラクションに見出した。プロペプチド-ｍＴＧａｓｅをＱセファロースＨＰイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、ＥＫにより消化させることで、ＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅが得られた。ついで、ＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅを、ＳＰセファロースＨＰイオン交換カラムにおいてさらに精製した。
S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの選択性における、種々のＮ末端外配列の効果を比較するために、S. ladakanum由来の野生型ｍＴＧａｓｅ、ＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ、Ｍｅｔ-ｍＴＧａｓｅの形態のｍＴＧａｓｅを別々にクローニングし、発現させ、精製した。
上述したように、ＥＫから生じたS. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅを比較すると、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ-ＳＬの生成は、プロペプチド-３Ｃ−ｍＴＧａｓｅ-ＳＬからの３Ｃ-プロテアーゼ(ポリオウイルス由来)消化により進行し、ＥＫ消化を使用するよりも、改善された回収収率を有するといった、より特異的なものであった。
【実施例３】
【０１２３】
高度選択性変異体用のスクリーニングアッセイ−S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの選択性に対するＮ末端外配列の効果を評価するために使用される動力学的方法
ｈＧＨＱ４０Ｎ及びｈＧＨＱ１４１Ｎの調製
ｈＧＨ変異体ｈＧＨＱ４０Ｎ及びｈＧＨＱ１４１Ｎを、部位特異的突然変異により構築した。それらを、Ｎ末端に４つの付加アミノ酸残基を有する大腸菌において、ＭＥＡＥ-ｈＧＨＱ４０Ｎ及びＭＥＡＥ-ｈＧＨＱ１４１Ｎとして発現させ、野生型組換えｈＧＨと同様の方法で精製した。簡単には、可溶性ＭＥＡＥ-ｈＧＨ変異体を、ＱセファロースＸＬクロマトグラフィーを用いて、粗大腸菌溶解液から回収し、ついで、フェニルセファロースＦＦを用いて、さらに磨いた。部分的に精製されたＭＥＡＥ-ｈＧＨ変異体を、４２℃で１時間、ＤＡＰ-１酵素を用いて消化し、Ｎ末端でＭＥＡＥを除去した。最後に、ｈＧＨ変異体を、３８％の冷エタノールを用いて沈殿させ、ついで、７Ｍの尿素を用いて溶解させ、ソース３０Ｑカラムを用いて精製した。
【０１２４】
動態反応
動態反応を、２００μｌのトリス-ＨＣｌバッファー、２０ｍＭ、ｐＨ７．４、２００ｍＭのＮａＣｌ、５０μＭのｈＧＨＱ１４１Ｎ又はｈＧＨＱ４０Ｎ、１００μＭのダンシル-カダベリン(DNC, Fluka)を含有するものにおいて実施した。２μｇのｍＴＧａｓｅを添加することにより反応を開始し、２６℃で実行した。２０秒毎に１時間、Ｅｘ／Ｅｍ：３４０／５２０ｎｍで、蛍光をモニターした。０-２０００秒の間に収集されたデータを使用し、第２の順序多項式(order polynomial)を用いて、進行曲線を適合させ、勾配を得た。適合計算は、初期時間範囲(０-２０００秒)に得られたデータに基づいており、進行曲線の勾配は線形で、逆反応は比較的小さい。
【実施例４】
【０１２５】
ＴＧａｓｅ変異体の高度選択性を検証するためのキャピラリー電気泳動：
ｈＧＨのグルタミン転移反応
アミン供与体として１,３-ジアミノ-プロパノールを使用し、グルタミン転移反応を実施した。ＴＧａｓｅタンパク質を添加することにより、反応を出発させ、室温で２時間インキュベートした。時間間隔(１５-３０分)でサンプルを取り、液体窒素を使用して凍結させ、転換率及びＣＥによる選択性を分析するために、−２０℃で保存した。反応混合物を表１のように作製した。
【０１２６】
表１
野生型ｈＧＨと１,３-ジアミノプロパノールを用いた、グルタミン転移用の反応混合物の調製。まず、ｈＧＨの希釈標準溶液を、トリスＨＣｌ、５ｍＭ、ｐＨ７．０の保存溶液から調製し、ついで反応に使用した。
2010500886.tif 000004
【０１２７】
ＣＥ分析
まず、グルタミン転移反応からの凍結サンプルを、Ｈ２Ｏを用いて１：１０に希釈し、３０．５ｃｍｘ５０μｍ内径のキャピラリーを用い、ベックマンコールターからＰ／ＡＣＥ ＭＤＱを使用してＣＥを実施し、ＵＶ検出を２０℃、２１４ｎｍで実施した。アミノ基転移したｈＧＨのｐｌが約５．８０-６．２０になったときから、トリスＨＣｌ、５０ｍＭ、ｐＨ８．０で、ＣＥ分析を実行した。
０．５分、０．１ＭのＨＣｌを用いてキャピラリーを調整し、蒸留水で１．５分すすぎ、０．５分サンプルを注入し、最後に、サンプル分離のために、＋１５ｋＶで２５分実行した。
ＣＥプロファイルから、野生型ｈＧＨ、Ｑ１４１で一置換されたｈＧＨ、及びＱ４０で一置換されたｈＧＨの保持時間は、それぞれ６．５、７．９及び１０分であった。
【実施例５】
【０１２８】
高選択性を有するｍＴＧａｓｅ変異体の評価
変異体の選択性の改善度合いを、S. mobaraensisからの野生型ｍＴＧａｓｅ(ＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ形態)からのものと比較した。Ｎ末端変異体の選択性は、スクリーニングアッセイで評価した。全ての変異体の選択性を、基質として野生型ｈＧＨ、及びアミン供与体として１,３-ジアミノプロパノールを使用する、グルタミン転移反応におけるＣＥ分析により評価した。
【実施例６】
【０１２９】
S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの選択性に対する、種々のＮ末端配列の効果
種々のＮ末端外配列を有する、S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの変異体を、実施例３に記載したアッセイを使用し、ｈＧＨＱ４０(基質としてｈＧＨＱ１４１を使用)を越え、ｈＧＨＱ１４１(基質としてｈＧＨＱ４０Ｎを使用)での選択性に対して比較した。
表２に示す結果には、S. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅの全体的な選択性が、S. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅのものよりも高いことが示された。
【０１３０】
異なるＮ末端配列を有する、S. ladakanum由来の４つの異なるバージョンのｍＴＧａｓｅの中でも、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅはＲＳ２．７の最も高度な選択性を有していことで目立つ。S. ladakanumからのｍＴＧａｓｅの結晶構造は入手できないが、表２に示す結果には、ｍＴＧａｓｅのＮ末端が、ｈＧＨ等、その基質に対するｍＴＧａｓｅの結合ポケットの高次構造の変化に関与していることが示された。ｍＴＧａｓｅの結合ポケットの締め付け低下により選択性が改善され、例えばｈＧＨのＱ１４１等、基質の所定部位でＧｌｎ残基により、ｍＴＧａｓｅが触媒するグルタミン転移にとってさらに好ましくなる。S. ladakanum由来の野生型ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅの選択性を、ＣＥにより測定されるグルタミン転移反応でさらに確認した。上述した結果に基づき、S. ladakanumのＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅにおいて、さらなる突然変異が生じた。
S. mobaraensis由来の種々のＮ末端バージョンのｍＴＧａｓｅに対する選択性において、何の差異も観察されないため、S. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ  は参照として使用され、選択性の改善度合いを、実施例３に記載のスクリーニングアッセイから算出されるＲＳ(相対的選択性)により評価した。
【０１３１】
表２
種々のＮ末端配列を有するS. ladakanum由来のｍＴＧａｓｅ変異体の選択性の比較。
参照として、S. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅを使用した。算出された選択性は、ｈＧＨ４０(基質としてｈＧＨＱ１４１を使用)よりもｈＧＨＱ１４１(基質としてｈＧＨＱ４０Ｎを使用)に対する活性であった。
2010500886.tif 000005
【実施例７】
【０１３２】
S. ladakanum由来のＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅをベースにした、部位特異的突然変異よって生成されたｍＴＧａｓｅ
基質として野生型ｈＧＨ、及びアミン供与体として１,３-ジアミノプロパノールを用い、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅを使用して、グルタミン転移反応を実施した。Ｑ４０を越え、ｈＧＨのＱ１４１でのグルタミン転移に対する選択性を、ＣＥにより評価した。選択性の改善度合いを、参照としてS. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ、及びベンチマークとしてS. ladakanum由来のＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅを使用して評価した。結果を表３に列挙する。各変異体に対するＣＥグラフを、図２Ｂないし図２Ｈに示す。
【０１３３】
表３に列挙した結果には、Ｙ７５Ａ、Ｙ７５Ｆ、Ｙ７５Ｎ、Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｎ及びＹ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆを含む全ての変異体で、ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ-ＳＬのものよりも、選択性が改善されていることが示されている。最も高い選択性変異体は、ｈＧＨの転換率が４９．２％の場合に、３６．２の選択性を有するＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆであり、S. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅのものよりも、６．４倍高い。ｈＧＨ転換率が３８．１％以下で、選択性が７．６倍改善された、さらなる測定を実施した。ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆ変異体を使用するグルタミン転移反応を繰り返すと、変異体及び参照ｍＴＧａｓｅの双方に対するｈＧＨ転換率が約４０％である場合、S. mobaraensis由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅのものより、選択性の改善度合いが、７．６倍高かった。
【０１３４】
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S. ladakanum由来のＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ＿Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆの配列は、配列番号４として与えられる。
S. ladakanum由来のペプチド プロペプチド-(３Ｃ)-ＭＴＧａｓｅの配列は、配列番号５に与えられる。
【実施例８】
【０１３５】
ｈＧＨにおけるＧｌｎ-１４１対Ｇｌｎ-４０に対するそれらの選択性についての、S. ladakanum及びS. mobarense由来のｍＴＧａｓｅのテスト
このアッセイでは、位置Ｇｌｎ-４０及びＧｌｎ-１４１の一方で、グルタミンの代わりにアスパラギン残基を有し、一方のグルタミンのみが離脱して反応する、２つのｈＧＨ変異体を使用する。前記変異体の調製法は、Kunkel TAら, Methods in Enzymology 154, 367-382(1987)、及びChung Nan Changら, Cell 55, 189-196(1987)に記載されている。ｈＧＨ変異体Ｑ４０Ｎは、ｈＧＨにおけるＧｌｎ-１４１用のモデル基質であり、Ｑ１４１ＮはＧｌｎ-４０用のモデル基質である。
４００μｌのバッファー溶液に、２２５ｍＭの１,３-ジアミノ-２-プロパノール、及び３５ｍＭのトリス(ｐＨは、濃ＨＣｌを添加することにより、８．０に調節)、６００μｌの変異ｈＧＨ(１．５ｍｇ／ｍｌ)及び５μｌのＴＧａｓｅ(１．６ｍｇ／ｍｌ)を添加する。反応混合物を２５℃で３０分、インキュベートする。
【０１３６】
続く分析を、２８０ｎｍで、モノＱ５／５ＧＬ １ｍｌ(GE Health)カラム及び２８０ｎｍでのＵＶ検出器を使用するＦＰＬＣにより実施する。バッファーＡ：２０ｍＭのトリエタノールアミン、ｐＨ８．５；バッファーＢ：２０ｍＭのトリエタノールアミン、０．２ＭのＮａＣｌ、Ｈ８．５；流量：０．８ｍｌ／分。溶出勾配を以下のように定める：
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【０１３７】
ついで、選択率を、２つの生成物Ｑ１４１及びＱ４０に起因する曲線(図３及び図４に示す)下、２つの面積(任意単位)の比率から算出する。S. ladakanum(配列番号１)及びS. mobarense(配列番号２)由来のＴＧａｓｅを使用する場合に達成される結果を、表４に示す。Ｑ４０Ｎ＋その生成物−Ｑ１４１＝Ｑ１４１Ｎ＋その生成物−Ｑ４０で、１００に標準化させる。
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【実施例９】
【０１３８】
ｈＧＨのペグ化
ａ)  ｈＧＨを、リン酸バッファー(５０ｍＭ、ｐＨ８．０)に溶解させる。この溶液を、リン酸バッファーにアミン供与体、例えば１,３-ジアミノ-プロパン-２-オールが入った溶液(５０ｍＭ、１ｍｌ、ｐＨ８．０、アミン供与体を溶解させた後、希塩酸で８．０に調整)と混合する。
最後に、リン酸バッファーにＴＧａｓｅ(〜４０Ｕ)を溶解させた溶液(５０ｍＭ、ｐＨ８．０、１ｍｌ)を添加し、リン酸バッファー(５０ｍＭ、ｐＨ８)を添加することにより、容量を１０ｍｌに調節する。組合せた混合物を３７℃で約４時間、インキュベートする。温度を室温まで低下させ、Ｎ-エチル-マレイミド(ＴＧａｓｅインヒビター)を、１ｍＭの最終濃度まで添加する。さらに１時間後、混合物を、１０容量のトリスバッファー(５０ｍＭ、ｐＨ８．５)で希釈する。
ｂ)  ついで、アミン供与体が存在しているならば、ａ）で得られたアミノ基転移されたｈＧＨを、場合によってはさらに反応させて、潜在的官能基を活性化させる。
ｃ)  ついで、ａ）又はｂ）で得られた官能化されたｈＧＨを、ｈＧＨに導入された官能基と反応可能な、適切に官能化されたＰＥＧと反応させる。例として、オキシム結合は、アルコキシアミンとカルボニル部分(アルデヒド又はケトン)と反応させることにより形成されてよい。
【実施例１０】
【０１３９】
ｈＧＨのペグ化
工程ａ
ｈＧＨを、トリエタノールアミンバッファー(２０ｍＭ、ｐＨ８．５、４０％ｖ／ｖのエチレングリコール)に溶解させる。この溶液を、トリエタノールアミンバッファーに、アミン供与体、例えば１,３-ジアミノ-プロパン-２-オールを溶解させた溶液(２０ｍＭ、ｐＨ８．５、４０％ｖ／ｖのエチレングリコール、アミン供与体を溶解させた後、希塩酸を用いて、ｐＨを８．６に調整)と混合する。
最終的に、S. mobarense由来のＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ(ＡｌａＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ-ＳＭ)、又はS. ladakanum由来のＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ  Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆ(ＧｌｙＰｒｏ-ｍＴＧａｓｅ  Ｙ６２Ｈ＿Ｙ７５Ｆ-ＳＬ)(〜０．５−７ｍｇ／ｇのｈＧＨ)を、２０ｍＭのＰＢに溶解させた溶液、ｐＨ６．０を添加し、容量を調節し、５-１５ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ(２０ｍＭ、ｐＨ８．５)に至らしめる。組合せた混合物を、室温で１-２５時間インキュベートする。表５及び図５に示すように、反応混合物をＣＩＥ ＨＰＬＣにより分析する。ＴＡ４０は位置４０におけるアミノ基転移を意味し、ＴＡ１４１は位置１４１におけるアミノ基転移を意味し、ＴＡ４０／１４１は、位置４０及び１４１におけるアミノ基転移を意味する。
【０１４０】
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【０１４１】
工程ｂ
アミン供与体が存在しているならば、工程ａ）で得られたアミノ基転移されたｈＧＨを、場合によってはさらに反応させて、潜在的官能基を活性化させる。
工程ｃ
ついで、工程ａ）又はｂ）で得られた官能化されたｈＧＨを、ｈＧＨに導入された官能基と反応可能な、適切に官能化されたＰＥＧと反応させる。例として、オキシム結合は、アルコキシアミンとカルボニル部分(アルデヒド又はケトン)と反応させることにより形成されてよい。
【実施例１１】
【０１４２】
S. ladakanumのＴＧａｓｅ変異体の選択性
各反応を、室温、１００μＭのモノダンシル-カダベリン(酢酸にパウダーを溶解させて調製し、１Ｍのトリス-ＨＣｌで緩衝、ｐＨ８．５)、及び５０μＭのＱ１４１Ｎ又はＱ４０Ｎヒト成長ホルモンを含有する２００ｍＭのＮａＣｌバッファー、及び２０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．４において実施した。ＴＧａｓｅを混合物に添加し、反応を開始させる。３０秒毎に、ｅｘｔ／ｅｍ３４０／５２０ｎｍで蛍光を測定した。Ｑ４０Ｎ及びＱ１４１Ｎについての最初の反応速度を概算し、選択性を算出するのに使用した。
いくつかの S. ladakanumＧｌｙＰｒｏ-ＴＧａｓｅ変異体についてのこの実験の結果を、表６に示す。
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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