(57)【要約】  本発明は、患者における４種のデング血清型に対する防御を誘導するための方法であって、（ａ）（ｉ）ワクチン第一血清型デングウイルス用量およびワクチン第二血清型デングウイルス用量、ならびに（ｉｉ）ワクチン第三血清型デングウイルス用量およびワクチン第四血清型デングウイルス用量の第一段階投与、および（ｂ）用量（ｉ）および（ｉｉ）の第二段階投与を含む方法であり、用量（ｉ）および（ｉｉ）が解剖学的に別の部位に同時に投与され、第二段階投与が第一段階投与後少なくとも３０日以上、最長１２ヶ月以内に遂行される方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における４種のデング血清型に対する防御を誘導するための方法であって、
（ａ）（ｉ）ワクチン第一血清型デングウイルス用量およびワクチン第二血清型デングウイルス用量、ならびに（ｉｉ）ワクチン第三血清型デングウイルス用量およびワクチン第四血清型デングウイルス用量の第一段階投与、および
（ｂ）用量（ｉ）および（ｉｉ）の第二段階投与
を含む方法であり、
用量（ｉ）および（ｉｉ）が解剖学的に別の部位に同時に投与され、
第二段階投与が第一段階投与後少なくとも３０日以上、最長で１２ヶ月以内に遂行される、方法。
【請求項２】
ワクチンデングウイルス（ｉ）が単一の二価用量の形態で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ワクチンデングウイルス（ｉｉ）が単一の二価ワクチン用量の形態で投与される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ワクチンデングウイルス血清型１がＶＤＶ１株およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１からなる群より選択される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ワクチンデングウイルス血清型２がＶＤＶ２株およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２からなる群より選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ワクチンデングウイルス血清型１がＶＤＶ１株であり、ワクチンデングウイルス血清型２がＶＤｖ２株である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ワクチンデングウイルス血清型１がＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１であり、ワクチンデングウイルス血清型２がＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ワクチンデングウイルス血清型３がＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ワクチンデングウイルス血清型４がＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第一および二血清型がそれぞれＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−２であり、第三および四血清型がそれぞれＣＹＤ  ＤＥＮ−３およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４である請求項１ないし５および７ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ワクチンデングウイルス血清型１、２、３および４の量が１０３から１０６ＣＣＩＤ５０の範囲内である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
第二段階投与に使用されるワクチンウイルスが第一段階投与に使用されるものと同一である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
第二段階投与が第一段階投与後３０日から６０日までに遂行される、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
デングウイルスに対するワクチン接種のためのキットであって、少なくともワクチンデングウイルス血清型１、２、３および４を、
（ａ）４つの容器に入った一価組成物の形態で、または
（ｂ）２つの容器に入った２つの二価組成物の形態で、
収納するケースを含むキット。
【請求項１５】
少なくとも
（ａ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２を含む二価ワクチンが入った第一容器、および
（ｂ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を含む二価ワクチンが入った第二容器
を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
少なくとも、
（ａ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３を含む二価ワクチンが入った第一容器、および
（ｂ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を含む二価ワクチンが入った第二容器
を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
デングウイルスに対するワクチン接種のためのキットであって、少なくともワクチン第一血清型および第二血清型デングウイルスを、
（ａ）２つの容器に入った２つの一価組成物の形態で、または
（ｂ）１つの容器に入った二価組成物の形態で、
収納するケースを含むキット。
【請求項１８】
少なくとも
（ａ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３を含む二価ワクチンを含む容器、または
（ｂ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を含む二価ワクチンを含む容器、または
（ｃ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２を含む二価ワクチンを含む容器、または
（ｄ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を含む二価ワクチンを含む容器
を含む請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
免疫付与効果のある量のワクチン第一および第二血清型デングウイルスおよび医薬上許容される賦形剤からなる二価ワクチン。
【請求項２０】
ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３；またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４；またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２；またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４からなる群より選択されるワクチンウイルスを含む請求項１９に記載の二価ワクチン。
【請求項２１】
４種のデング血清型に対して防御を誘導するワクチンの調製ためのワクチンデングウイルス用量の使用であって、
（ａ）（ｉ）ワクチン第一血清型デングウイルス用量およびワクチン第二血清型デングウイルス用量、ならびに（ｉｉ）ワクチン第三血清型デングウイルス用量およびワクチン第四血清型デングウイルス用量の第一段階投与および
（ｂ）用量（ｉ）および（ｉｉ）の第二段階投与を含み、
用量（ｉ）および（ｉｉ）が解剖学的に別の部位に同時に投与され、
第二段階投与が第一段階投与の後少なくとも３０日以上最長１２ヶ月以内に遂行される、ワクチンデングウイルス用量の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は患者における４種のデング血清型に対する防御を誘導するための方法であって、
（ａ）（ｉ）ワクチン第一血清型デングウイルス用量およびワクチン第二血清型デングウイルス用量、ならびに（ｉｉ）ワクチン第三血清型デングウイルス用量およびワクチン第四血清型デングウイルス用量の第一段階投与、および
（ｂ）用量（ｉ）および（ｉｉ）の第二段階投与
を含む方法であり、
用量（ｉ）および（ｉｉ）が解剖学的に別の部位に同時に投与され、
第二段階投与（ｂ）が第一段階投与（ａ）後少なくとも３０日以上、最長で１２ヶ月以内に遂行される、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デング熱疾患は、フラビウイルス属の４種のウイルスによって引き起こされ、この血清型は似ているけれども抗原性の観点から区別できる（Ｇｕｂｌｅｒら．，１９８８：節足動物媒介性ウイルス疾患の疫学．Ｍｏｎａｔｈ  ＴＰＭ編、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（ＦＬ）：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：２２３−６０；Ｋａｕｔｎｅｒら．，１９９７，Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１３１：５１６−５２４；Ｒｉｇａｕ−Ｐｅｒｅｚら．，１９９８，Ｌａｎｃｅｔ；３５２：９７１−９７７；Ｖａｕｇｈｎら．，１９９７，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ；１７６：３２２−３０）。デング血清型に感染すると、非特異性ウイルス症候群から致死的となる重篤な出血性疾患の範囲にまで及ぶ臨床疾患が引き起こされ得る。蚊に刺された後のデング熱の潜伏期間は、およそ４日（３日から１４日の範囲）である。デング熱は二相性発熱、頭痛、身体中の痛み、衰弱、発疹、リンパ節腫大および白血球減少症（Ｋａｕｔｎｅｒら．，１９９７，Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１３１：５１６−５２４；Ｒｉｇａｕ−Ｐｅｒｅｚら．，１９９８，Ｌａｎｃｅｔ；３５２：９７１−９７７）によって特徴付けられる。ウイルス血症期は発熱性疾患期と同じである（Ｖａｕｇｈｎら．，１９９７，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．；１７６：３２２−３０）。デング熱は７ないし１０日間で回復するが、通常遷延性の無力症が生じる。白血球数および血小板数の減少が一般的に生じる。
【０００３】
出血性デング熱は、重篤な内出血と合併して血液量減少や低血圧症（ショック症候群を伴うデング熱）に至る恐れがある恒常性異常および血管透過性の増加によって特徴付けられる重篤な熱性疾患である。出血性デング熱の致死率は、治療が行なわれないと１０％までにのぼるが、治療経験のあるほとんどのセンターでは、１％である（ＷＨＯ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，１９８６．デング出血熱：診断，治療および制御，ｐ１−２．世界保健機関，ジュネーブ，スイス）。
【０００４】
通常行なわれるデング熱の検査室診断はウイルスの単離および／またはデングウイルスに特異的な抗体の検出に基づくものである。
【０００５】
デング熱はマラリアに次いで二番目によく見られる熱帯伝染病であり、世界人口の半分以上が流行性伝播の危険性がある地域に住んでいる。毎年、デング熱の件数は５千万から１億と見積もられ、出血性デング熱で５０万人の患者が入院し、２万５千人が命を落としている。デング熱はアジア、太平洋領域、アフリカ、ラテンアメリカ、およびカリブ海における風土病である。１００以上の熱帯国はデングウイルス感染が多く発生し、出血性デング熱はこれらの国のうち６０カ国で報告されている（Ｇｕｂｌｅｒ，２００２，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１０：１００−１０３；Ｍｏｎａｔｈ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．；９１：２３９５−２４００）。よく記載される因子のいくつかはデング熱に関連しているように思われる：人口増加；特に貧困を伴う、無計画で無制御の都市化；飛行機旅行の増加；蚊の効果的な制御手段の欠如ならびに衛生社会基盤および公衆衛生の悪化（Ｇｕｂｌｅｒ，２００２，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１０：１００−１０３）。旅行者および国外居住者はデング熱について警告されることが多くなっている（Ｓｈｉｒｔｃｌｉｆｆｅら．，１９９８，Ｊ．Ｒｏｙ．Ｃｏｌｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｏｎｄ．；３２：２３５−２３７）。デング熱が風土病である熱帯に配置された米軍の間で、デング熱は熱性疾患の主要因の一つである（ＤｅＦｒａｉｔｅｓら．，１９９４，ＭＭＷＲ  １９９４；４３：８４５−８４８）。
【０００６】
ウイルスは、ヒトと、ヒトを好んで日中刺咬する屋内に生息する蚊のネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）との間を循環して維持される。ヒトへの感染は、感染したネッタイシマカが血液を摂取している間に、ウイルスが注入されることによって起こる。唾液中のウイルスは主に血管外組織に沈着している。接種後に感染した細胞の第１分類は樹状細胞であり、その後リンパ節に移動する（Ｗｕら．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．；７：８１６−８２０）。皮膚およびリンパ節での最初の複製の後、急性の発熱期間中に、一般的に３から５日間、ウイルスは血中に現れる。
【０００７】
単球およびマクロファージは、樹状細胞とともに、デングウイルスの最初の標的である。ホモタイプの再感染に対する防御は完全であり、おそらく生涯維持されるが、多種のデング熱型での交差防御は数週間から数ヶ月しか続かない（Ｓａｂｉｎ，１９５２，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．；１：３０−５０）。したがって、患者は異なる血清型に感染する可能性がある。デング熱による二度目の感染は、理論上、重篤なデング熱疾患を発症する危険要因である。しかしながら、出血性デング熱は多因性である：これらの因子は関係するウイルス株や患者の年齢、免疫状態、遺伝的素因を含む。２つの因子が出血性デング熱の発症に大きな影響を与える：高ウイルス血症を伴う急速なウイルス複製（ウイルス血症レベルに関係する疾病の重症度；Ｖａｕｇｈｎら．，２０００，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．；１８１：２−９）および炎症メディエータの高レベル放出を伴う多大な炎症反応（ＲｏｔｈｍａｎおよびＥｎｎｉｓ，１９９９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２５７：１−６）。デング熱に対する具体的な治療はない。デング熱の治療は、ベッドでの拘束、解熱剤と鎮痛剤による熱と痛みの制御、および適切な水分摂取といった対症的なものである。出血性デング熱の治療には水分の喪失に対する均衡、凝固因子の交換およびヘパリン注入が必要である。
【０００８】
予防対策としては、現在のところベクターを制御することおよび高価で実施が困難である個人的防御策を講じることに基づいている。デング熱に対するワクチンは現時点で承認されていない。４種のデング血清型が世界中で流行することを考慮し、そして、それらが出血性デング熱を発症するものであると報告されているのであるから、ワクチン接種によりデングウイルスの４種の血清型を防御することが理想とされる。
【０００９】
解剖学的に別の部位にデングウイルスを投与することはすでに文献に述べられている。
【００１０】
Ｈａｌｓｔｅａｄら（１９７３，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，２２：３７５−３８１）は、野生型デングウイルスを４種の異なる血清型に対して２または４箇所の解剖学的に別の部位に投与することにより、次の感染に対する防御を誘導することについて示している。しかしながら、著者は、この種の分割したワクチン接種については、１箇所にワクチン接種することに比べて何の優位性も見出せない。
【００１１】
４価のワクチンという形態で投与された場合、デングウイルスの弱毒化ウイルス形態は、ヒトの体内で干渉をもたらす。この現象は、特に下記の出版物に記載されている：Ｇｕｂｌｅｒ  Ｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９８；１１（３）：４８０−９６；Ｒｏｔｈｍａｎ  Ａ．Ｌ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００１；１９：４６９４−９。
【００１２】
Ｚｈｏｕ  ＨおよびＤｅｅｍ  ＭＷ．（Ｖａｃｃｉｎｅ．２００６  Ｍａｒ  ２４；２４（１４）：２４５１−９）は、ＣＤ８エピトープの使用に唯一基づく数学的モデルを開発し、４種のデング血清型のＣＤ８エピトープ間での干渉をシミュレートすることを目的とした。この理論モデルによると、干渉を避けるための最良の方法は、非優位ＣＤ８エピトープを用いた一次免疫を行い、続いて４種それぞれの血清型の同じＣＤ８エピトープを解剖学的に別の部位に投与する追加免疫をすることである。
【００１３】
したがって、各種血清型間での干渉を減らし、４種のデング血清型に対する中和抗体を誘導する方法が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、第一段階投与、次いで、４種血清型の第一段階投与後３０日から１２ヶ月までに遂行される第二段階投与において、４種血清型が対となって解剖学的に別の部位に投与されて、４種血清型を中和化する抗体を含む相同的な免疫応答を生じさせることが可能であることを明らかにした。
【００１５】
本発明者らは、特に、ＤＥＮ−１，２の二価免疫とＤＥＮ−３，４の二価免疫とを併用して解剖学的に別の部位の２箇所に投与し、次いで同じ条件下で同じワクチン用量を追加免疫することによって、一匹の動物につき１種の血清型を除いてワクチン接種されたすべてのサルにおいて、４種の血清型に対する高い応答が誘導されることを示した。反対に、１箇所にされた４価のワクチン接種は、４種のうち２種の血清型に対してしか十分な応答の誘導を可能にしなかった。
【００１６】
したがって、本発明の方法による免疫応答は量的にも質的にも優れている（すべての血清型を網羅している）。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって本発明の第一の対象によれば、本発明は患者における４種のデング血清型に対する相補的な防御を誘導するための方法であって、
（ａ）（ｉ）ワクチン第一血清型デングウイルス用量およびワクチン第二血清型デングウイルス用量、ならびに（ｉｉ）ワクチン第三血清型デングウイルス用量およびワクチン第四血清型デングウイルス用量の第一段階投与、および
（ｂ）用量（ｉ）および（ｉｉ）の第二段階投与
を含む方法であり、
用量（ｉ）および（ｉｉ）が解剖学的に別の部位に同時に投与され、
第二段階投与（ｂ）が第一段階投与（ａ）後少なくとも３０日以上、最長で１２ヶ月以内に遂行される、方法に関する。
【００１８】
本発明に係る方法の別の態様によれば、ワクチンデングウイルス（ｉ）は単一の二価のワクチン用量の形態で投与される。
【００１９】
本発明に係る方法の別の態様によれば、ワクチンデングウイルス（ｉｉ）は単一の二価のワクチン用量の形態で投与される。
【００２０】
本発明に係るワクチン接種方法の一つの具体的な実施態様によれば、該ワクチンデングウイルス血清型１はＶＤＶ１株およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１からなる群より選択される。
【００２１】
本発明に係る方法の別の具体的な実施態様によれば、該ワクチンデングウイルス血清型２はＶＤＶ２株およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２からなる群より選択される。
【００２２】
本発明に係る方法の別の具体的な実施態様によれば、該ワクチンデングウイルス血清型１はＶＤＶ１株であり、該ワクチンデングウイルス血清型２はＶＤＶ２株である。
【００２３】
本発明に係る方法の別の具体的な実施態様によれば、該ワクチンデングウイルス血清型１はＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１であり、該ワクチンデングウイルス血清型２はＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２である。
【００２４】
本発明に係る方法の別の具体的な実施態様によれば、該ワクチンデングウイルス血清型３はＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３である。
【００２５】
本発明に係る方法の別の具体的な実施態様によれば、該ワクチンデングウイルス血清型４はＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４である。
【００２６】
本発明に係る方法の別の具体的な実施態様によれば、第１および第２血清型は、それぞれＣＹＤ  ＤＥＮ１およびＣＹＤ  ＤＥＮ２であり、ならびに第３および第４血清型は、それぞれＣＹＤ  ＤＥＮ３およびＣＹＤ  ＤＥＮ４である。
【００２７】
本発明に係る方法の別の具体的な実施態様によれば、第１および第２血清型は、それぞれＣＹＤ  ＤＥＮ１およびＣＹＤ  ＤＥＮ３であり、ならびに第３および第４血清型は、それぞれＣＹＤ  ＤＥＮ２およびＣＹＤ  ＤＥＮ４である。
【００２８】
本発明に係る方法の別の具体的な実施態様によれば、ワクチンデングウイルス血清型１、２、３および４の投与量は１０３から１０６ＣＣＩＤ５０の範囲内である。
【００２９】
本発明に係る方法の別の具体的な実施態様によれば、第二段階投与に用いるワクチンウイルスは第一段階投与に用いたものと同じである。
【００３０】
本発明に係る方法の別の具体的な実施態様によれば、第二段階投与は第一段階投与の後、３０日から６０日以内に遂行される。
【００３１】
本発明の対象は、デングウイルスに対するワクチン接種のためのキットであって、少なくともデングウイルス血清型１、２、３および４を、
（ａ）４つの別の容器に入った一価組成物の形態で、または
（ｂ）２つの別の容器に入った２つの二価組成物の形態で、
収納したケースを含む。
【００３２】
一つの実施態様によれば、本発明に係るキットは、少なくとも，
（ａ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２を含む二価ワクチンが入った第一容器、および
（ｂ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を含む二価ワクチンが入った第二容器を含む。
【００３３】
別の実施態様によれば、本発明に係るキットは、少なくとも、
（ａ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３を含む二価ワクチンが入った第一容器、および
（ｂ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を含む二価ワクチンが入った第二容器を含む。
【００３４】
本発明の対象は、デングウイルスに対するワクチン接種のためのキットであり、少なくともワクチンデングウイルス第一および第二血清型を
（ａ）２つの別の容器に入った２つの一価組成物の形態で、または
（ｂ）一つの容器に入った二価組成物の形態で、
収納したケースを含むキットである。
【００３５】
一つの態様によれば、キットは少なくとも以下を含む：
（ａ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３を含む二価ワクチンが入った一つの容器、または
（ｂ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を含む二価ワクチンが入った一つの容器、または
（ｃ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２を含む二価ワクチンが入った一つの容器、または
（ｄ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を含む二価ワクチンが入った一つの容器。
【００３６】
本発明は、免疫効果がある量のワクチンデングウイルス第一および第二血清型および医薬上許容される賦形剤を含む二価組成物または二価ワクチンを提供する。
【００３７】
具体的な実施態様によれば、二価組成物またはワクチンは以下からなる群より選択されるワクチンウイルスを含有する：ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３；またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４；またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２；またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４。
【００３８】
本発明について、以下に続く明細書にさらに詳しく記載する。
【００３９】
定義
本発明において、２箇所の解剖学的部位が異なるリンパ節へ流入する場合、それは「別」を意味する。たとえば、右腕と左腕は別の部位であると考えられる。以下に限定されないが、別の部位であるとして列挙することができる：右腕／右大腿部；左腕／左大腿部、左腕／右大腿部。
【００４０】
本発明において、「同時投与」という用語は、同日に実施される投与を意味する（すなわち、最長２４時間）。同時投与は有利には最長１時間おきに、通常１−５分おきに実施される。
【００４１】
本発明において、用量（ｉ）は、２つの一価用量の形態か、または単一の二価用量の形態で、第一解剖学的部位に投与される。一方、用量（ｉｉ）は、２つの一価用量の形態か、または単一の二価用量の形態で、上記定義のとおり第一解剖学的部位とは別の第二解剖学的部位に、同時に投与される。
【００４２】
「デングウイルス」または「ＤＥＮ」は、陽性で、フラビウイルス科フラビウイルス属に属する一本鎖ＲＮＡウイルスである。ゲノムＲＮＡは５’末端にＩ型キャップを含み、３’末端にポリ−Ａテールを欠く。ゲノム構成は以下の要素からなる：５’非コード領域（ＮＣＲ）、構造タンパク質（カプシド（Ｃ）、前膜／膜（ｐｒＭ／Ｍ）、エンベロープ（Ｅ））および非構造タンパク質（ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５）、および３’ＮＣＲ。ウイルスゲノムＲＮＡはカプシドタンパク質と結合してヌクレオカプシドを形成する。他のフラビウイルスに関して、ＤＥＮウイルスゲノムは、単一のポリタンパク質に翻訳される連続したコード領域をコードしている。
【００４３】
本発明において、「ワクチンデングウイルス」という用語は、特異的に相同的な免疫応答を誘導し得るデングウイルスのウイルス形態を意味し、好ましくはデングウイルス感染に対してヒトにおける予防接種として使用され得るデングウイルスのウイルス形態を意味する。したがって、「ワクチンデングウイルス」という用語は、不活性化ウイルス、弱毒化ウイルスまたはデングウイルスエンベロープタンパク質など組み換えタンパクを意味する。
【００４４】
ワクチンウイルスが許容細胞上でもはや複製できなければ、「不活性化」されたものとみなす。
【００４５】
ワクチンウイルスは、Ｈｕｈ−７、ベロ（ＶＥＲＯ）および／またはＣ６／３６肝細胞上で３７℃または３９℃で成長させた後、力価計測方法を用いて計測したとき、該ワクチンウイルスが、同じ培養条件下で野生型親株を用いて得られる最大力価より少なくとも１０倍小さい最大力価となった場合、「弱毒化」されたものと考えられる。したがって、本発明では、上記に示された３つの細胞のうち少なくとも１つの細胞上で成長が抑制されたことを示すワクチンウイルスは「弱毒化」されたものとみなす。
【００４６】
ヒトに使用され得るワクチンウイルスは正の効果対リスク比を有し、該比率は一般的に製造承認を得るための規制上の要件を満たすことができる。本発明に用いられるワクチンデングウイルスは好ましくはヒトに病気を誘発しないような弱毒化ウイルスである。ワクチンウイルスは、有利には、接種したヒトの大半においてせいぜい中程度（すなわち、中から弱、またはほぼゼロ）の副作用しか引き起こさないと同時に、抗体反応の中和化を誘導する能力を保持している。
【００４７】
本発明に使用され得るワクチンデングウイルスの限定されない例として、たとえば、弱毒化株ＶＤＶ−１またはＶＤＶ−２、ＷＯ０２／６６６２１，ＷＯ００５７９０４，ＷＯ００５７９０８，ＷＯ００５７９０９；ＷＯ００５７９１０，ＷＯ０２／０９５００７５およびＷＯ０２／１０２８２８の出願に記載された株、またはキメラなど不活性化ワクチンウイルス、弱毒化ワクチンウイルスを言及してもよい。キメラウイルスは上記に定義された弱毒化ウイルスの特徴を有しているという特殊性がある。デングウイルスエンベロープタンパク質を発現し、エンベロープタンパク質が由来する血清型を中和化する抗体を有する免疫応答を誘導するキメラウイルスを本発明に使用することができる。限定されない例として、たとえば特許出願ＷＯ９８／３７９１１に記載されるｄｅｎｇｕ  ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭ生成物、および、たとえば特許出願ＷＯ９６４０９３３およびＷＯ０１６０８４７に記載されるデング／デングキメラを言及してもよい。ワクチンデングウイルス血清型１は、たとえば、ＶＤＶ１ワクチン株またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１であり、特に、ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−１ウイルス、あるいは１６００７／ＰＤＫ１３  ＤＥＮ−１株である。ワクチンデングウイルス血清型２は、たとえば、ＶＤＶ２ワクチン株またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２であり、特に、ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−２ウイルス、あるいは１６６８１／ＰＤＫ５３  ＤＥＮ−２株である。ワクチンデングウイルス血清型３は、たとえば、ＶＤＶ２ワクチン株またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３であり、特に、ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−３である。ワクチンデングウイルス血清型４は、たとえば、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４であり、特に、ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−４ウイルスである。この株はマヒドール大学の特許出願ＥＰ１１５９９６８号に記載され、そしてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に番号Ｉ−２４８３のもと寄託された。
【００４８】
「ＶＤＶ」または「ベロデングワクチン」は、ベロ細胞に適応し、霊長類および特にヒトにおいて抗体の中和化を誘導することを含めて、特異的体液性応答を誘導することができる弱毒化生デングウイルス株を意味する。
【００４９】
「ＶＤＶ−１」は、ＰＤＫ細胞上で１１回継代された野生型株ＤＥＮ−１  １６００７から得られる株（ＤＥＮ−１  １６００７／ＰＤＫ１１）であり、その後ベロ細胞で３２℃にて増幅され、そのＲＮＡを精製して、ベロ細胞にトランスフェクトした。ＶＤＶ−１株は、ワクチン株ＤＥＮ−１  １６００７／ＰＤＫ１３（ＰＤＫ−プライマリードッグの腎臓細胞の１３継代）と比較して、１４個の付加的変異を有する。「ＬＡＶ１」とも呼ばれるＤＥＮ−１  １６００７／ＰＤＫ１３株は、マヒドール大学の特許出願ＥＰ１１５９９６８号に記載されており、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に番号Ｉ−２４８０のもと寄託された。ＶＤＶ−１株の完全な配列は配列番号１に記載されている。該株は該配列から容易に再現することができる。ＶＤＶ−１株の調製方法および特徴づけは、サノフィ・パスツールおよびｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎの国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００１３１３号に記載されている。
【００５０】
「ＶＤＶ−２」は、ＰＤＫ細胞上で５０回継代された野生型株ＤＥＮ−２  １６６８１から得られる株（ＤＥＮ−２  １６６８１／ＰＤＫ５０）であり、プラーク精製され、そのＲＮＡが抽出され、精製された後、ベロ細胞にトランスフェクトされた。その後ＶＤＶ−２株は、プラーク精製およびベロ細胞上の増幅によって得られた。ＶＤＶ−２株はワクチン株ＤＥＮ−２  １６６８１／ＰＤＫ５３（ＰＤＫ細胞上の５３回継代）と比較して１０個の付加的変異があり、そのうち４つの変異はサイレントである。「ＬＡＶ２」とも呼ばれるＤＥＮ−２  １６６８１／ＰＤＫ５３株は、マヒドール大学の特許出願ＥＰ１１５９９６８に記載されており、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  （ＣＮＣＭ）に番号Ｉ−２４８１のもと寄託された。ＶＤＶ−２株の完全な配列は配列番号２に示される。ＶＤＶ−２株は該配列から容易に再現され得る。ＶＤＶ−２の調製方法および特徴づけはサノフィ・パスツールおよびＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎの国際出願ＰＣＴ／ＩＢ  ２００６／００１５１３に記載されている。
【００５１】
ＶＤＶ１および２株は、ベロ細胞上の増幅によって調製される。生成されたウイルスを採取し濾過によって細胞の残骸を精製した。ＤＮＡは酵素処理によって消化される。不純物は限外濾過によって除去される。濃縮方法を用いて感染力価を向上させることができる。安定剤の追加後、使用前まで凍結乾燥または凍結状態で株を保存し、その後即座に復元させる。
【００５２】
「ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭデング」または「ＣＹＤ」という用語は、前膜（ｐｒｅｍｅｍｂｒａｎｅ）およびエンベロープタンパク質をコードしている配列がＤＥＮウイルスのそれと置換している黄熱（ＹＦ）ウイルスの骨格を含むキメラ黄熱（ＹＦ）ウイルスを意味する。したがって、「ＣＹＤ−１またはＣＹＤ  ＤＥＮ１」という用語は、デング血清型１株（ＤＥＮ−１）のｐｒＭおよびＥの配列を含むキメラＹＦウイルスを表すのに用いられる。「ＣＹＤ−２またはＣＹＤ  ＤＥＮ２」という用語は、ＤＥＮ−２株のｐｒＭおよびＥの配列を含むキメラＹＦウイルスを表すのに用いられる。「ＣＹＤ−３またはＣＹＤ  ＤＥＮ３」という用語は、ＤＥＮ−３株のｐｒＭおよびＥの配列を含むキメラＹＦウイルスを表すのに用いられる。「ＣＹＤ−４またはＣＹＤ  ＤＥＮ４」という用語は、ＤＥＮ−４株のｐｒＭおよびＥの配列を含むキメラＹＦウイルスを表すのに用いられる。これらＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭデングの調製は、国際特許出願ＷＯ９８／３７９１１およびＷＯ０３／１０１３９７に詳述されており、調製方法の明確な記載として挙げることができる。例に記載されたキメラは、ＤＥＮ１  ＰＵＯ３５９（ＴＹＰ１１４０），ＤＥＮ２  ＰＵ０２１８，ＤＥＮ３  ＰａＨ８８１／８８およびＤＥＮ４  １２８８（ＴＶＰ９８０）株に由来のｐｒＭおよびＥ配列を用いて生成された。本発明において、デングウイルスのいずれの株をキメラ構築のために用いてもよい。
【００５３】
好ましくは、キメラＹＦウイルスは、弱毒化黄熱株ＹＦ１７Ｄ（Ｔｈｅｉｌｅｒ  Ｍ，およびＳｍｉｔｈ  ＨＨ（１９３７）Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  ６５，ｐ７６７−７８６．）の骨格を含む（ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−１，ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−２，ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−３，ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−４ウイルス）。使用することができるＹＦ１７Ｄ株の例は、ＹＦ１７Ｄ２０４（ＹＦ−Ｖａｘ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｓｗｉｆｗａｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ；Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｍａｒｃｙ  ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ；ＡＲＩＬＶＡＸＴＭ，Ｃｈｉｒｏｎ，Ｓｐｅｋｅ，Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ，ＵＫ；ＦＬＡＶＩＭＵＮ（登録商標），Ｂｅｒｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；ＹＦ１７Ｄ−２０４  Ｆｒａｎｃｅ（Ｘ１５０６７，Ｘ１５０６２）；ＹＦ１７Ｄ−２０４，２３４  ＵＳ（Ｒｉｃｅら．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：７２６−７３３），または他の関連株ＹＦ１７ＤＤ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ１７０６６），ＹＦ１７Ｄ−２１３（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ１７０６７）およびＧａｌｌｅｒらによって記載されたＹＦ１７ＤＤ株（１９９８，  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １６（９／１０）：１０２４−１０２８）を含む。ヒトに用いるために弱毒化された他の黄熱ウイルス株を、キメラ構築のために、本発明において用いることができる。
【００５４】
したがって、本発明の対象は、また、免疫効果のある量のワクチンデングウイルス第一血清型およびワクチンデングウイルス第二血清型、ならびに医薬上許容される賦形剤を含む二価組成物またはワクチンである。
【００５５】
本発明にしたがったワクチンに用いることができるワクチンウイルスの記載に関して、本発明に係るワクチン接種方法に言及することができる。
【００５６】
具体的な実施態様にしたがって、本発明に係る二価組成物またはワクチンは、ＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−２、またはＣＹＤ  ＤＥＮ−３およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４、またはＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３またはＣＹＤ  ＤＥＮ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４を含み；有利には、ワクチンウイルスは１０５ＣＣＩＤ５０量でワクチン中に存在する。
【００５７】
各ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭ一価ワクチンデングウイルス（血清型１、２、３および４）はベロ細胞上で各血清型の増幅によって調製される。さらに具体的には、４つのウイルスは無血清培地上の接着ベロ細胞で別々に生成される。濾過によって細胞残屑を除去し精製したウイルス採取物は、その後宿主細胞ＤＮＡを除去するために、限外濾過およびクロマトグラフィによって濃縮、精製される。ワクチン株は、安定剤の添加後、使用する前まで凍結または凍結乾燥された状態で保存され、その後即座に復元される。同じ方法が４つのキメラに適用される。
【００５８】
医薬上許容される賦形剤に加えて、単一のデングウイルス血清型を含有する場合、用量、組成物またはワクチンは一価である。２つの異なるデングウイルス血清型を含有する場合、用量、組成物またはワクチンは二価である。３つの異なるデングウイルス血清型を含有する場合、用量、組成物またはワクチンは三価である。４つの異なるデングウイルス血清型を含有する場合、用量、組成物またはワクチンは四価である。多価組成物は一価組成物を単純に混合することで得られる。
【００５９】
「患者」という語は、デングに感染することがある個人（子どもまたは大人）を意味し、特に、感染の恐れのある個人、たとえばデングが存在する地域に旅行した個人またはそれらの地域に在住する個人を意味する。したがってこの用語は、デングウイルスに対してナイーブである個人またはナイーブでない個人を含有する。
【００６０】
解剖学的に別の部位にする逐次ワクチン接種
本発明者らは特に、解剖学的に別の部位に２回にわたる二価同時投与の形態で、４種の血清型を投与し、次いで、第一段階投与の後３０日から１２ヶ月までの間に追加免疫することにより、４種の血清型に対して効果的な相同防御を獲得できることを示している。したがって、本発明に係る方法は、デングに対するワクチン接種の方略に関して最も価値がある。
【００６１】
本発明によれば、４種のデング血清型は、別の部位に同時に対で投与されるならば（すなわち、各用量（ｉ）および（ｉｉ）、２回の一価用量または１回の二価用量）、いずれの順序でも投与され得る。
【００６２】
したがって、本発明に係る方法は、以下に記載の態様で実施され得る：
（ｉ）血清型１および２；（ｉｉ）血清型３および４；または
（ｉ）血清型１および３；（ｉｉ）血清型２および４；または
（ｉ）血清型１および４；（ｉｉ）血清型２および３；または
（ｉ）血清型２および３；（ｉｉ）血清型１および４；または
（ｉ）血清型２および４；（ｉｉ）血清型１および３；または
（ｉ）血清型３および４；（ｉｉ）血清型１および２。
【００６３】
好ましくは、本発明に係る方法は以下のワクチンデングウイルスの投与を含む：（ｉ）血清型１および２；（ｉｉ）血清型３および４または（ｉ）血清型１および３；（ｉｉ）血清型２および４。用量（ｉ）および（ｉｉ）は有利には二価の用量の形態である。
【００６４】
したがって、具体的な態様によれば、本発明は以下の方法に及ぶ：
（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−２；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−３およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４
（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４
（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３
（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４
（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３
（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−３およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−２
（ｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−２；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−３およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４
（ｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４
（ｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３
（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４
（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３
（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−３およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−２
（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＶＤＶ−２；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−３およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４
（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４
（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３
（ｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４
（ｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３
（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−３およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１および  ＶＤＶ−２
（ｉ）ＶＤＶ−１およびＶＤＶ−２；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−３およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４
（ｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４
（ｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３
（ｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４
（ｉ）ＶＤＶ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＶＤＶ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３、および
（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−３およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４；（ｉｉ）ＶＤＶ−１およびＶＤＶ−２。
【００６５】
好ましくは、本発明に係るワクチン接種方法は以下のワクチンデングウイルスの投与を含む：（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−２；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−３およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４；または（ｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−１およびＣＹＤ  ＤＥＮ−３；（ｉｉ）ＣＹＤ  ＤＥＮ−２およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４。用量（ｉ）および（ｉｉ）は有利には二価用量の形態である。
【００６６】
本発明に係るワクチン接種方法は、第一段階投与（ｉおよびｉｉ）の後、３０日から１２ヶ月までに、有利には３０日から３ヶ月までに、好ましくは３０日、４５日または６０日経過後に実施される第二段階投与を含み、該第二段階投与は有利には第一段階で用いたものと同じ組成物の投与を含み、有利には同じ条件下で投与される。
【００６７】
本発明において、「ワクチンウイルス用量」という用語は、「免疫効果が得られる量の」ワクチンデングウイルス、すなわち、相同的中和抗体反応を誘導するのに十分な量のデングウイルスを含む組成物の意であり、これは、たとえば、以下の実施例１に記載されているように血清中和化試験によって実証することができる。決定された中和抗体力価が１：１０（ユニット：１／希釈）と等しいかそれ以上であるとき、血清は中和抗体の存在について血清は陽性であると考えられる。
【００６８】
ワクチン株の量は、ウイルスプラーク形成単位（ＰＦＵ）または５０％組織培養感染用量または５０％細胞培養感染用量（ＣＣＩＤ５０）という用語で一般的に表される。たとえば、本発明に係る組成物は、一価または二価組成物としてワクチンデングウイルス血清型１、２、３または４を１０から１０６ＣＣＩＤ５０、特に１０３から１０５ＣＣＩＤ５０含むことができる。したがって、本発明の組成物または使用において、ワクチンデングウイルス血清型１、２、３および４用量は、１０、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５または１０６ＣＣＩＤ５０など、１０から１０６ＣＣＩＤ５０の範囲内が好ましく、特に１０３から１０５ＣＣＩＤ５０が好ましい。ワクチンウイルスは、使用されるワクチンウイルスの性質および得られる免疫応答の強度に応じて、同一または別の用量で使用され得る。
【００６９】
本発明に係る方法の具体的な実施態様によれば、ワクチンウイルスの一価または二価用量はＣＹＤ  ＤＥＮ−１、ＣＹＤ  ＤＥＮ−２、ＣＹＤ  ＤＥＮ−３およびＣＹＤ  ＤＥＮ−４についてそれぞれ１０５ＣＣＩＤ５０含む。
【００７０】
中和抗体応答は、有利には、持続的な応答である、すなわち、第二段階投与（ｉ）および（ｉｉ）の後少なくとも６ヶ月は、それが血清中で検出され得る。
【００７１】
ワクチン第一血清型デングウイルス用量およびワクチン第二血清型デングウイルス用量（すなわち用量（ｉ））は２つの一価組成物の形態または、有利には単一の二価組成物または用量の形態で同時に投与される。
【００７２】
同様に、ワクチン第三血清型デングウイルス用量およびワクチン第四血清型デングウイルス用量（すなわち用量（ｉｉ））は２つの一価組成物の形態または、有利には単一の二価ワクチン組成物の形態で同時に投与される。
【００７３】
ワクチンウイルスは当該分野における通常の知識を有する者に知られた方法によって調製され得るワクチン組成物またはワクチンウイルス用量の形態で投与される。一般的に凍結乾燥されたウイルスは、水やリン酸塩緩衝生理食塩水、湿潤剤または安定剤など、医薬上許容される賦形剤と通常混合される。「医薬上許容される賦形剤」という用語は、ヒトまたは動物において、たとえばアレルギー反応の副作用を生じない溶剤、分散媒質、充填剤などのいずれかを意味する。賦形剤は選択された医薬形態により、そして投与方法および経路により選択される。適当な賦形剤および医薬処方に関する必要性もまた、当該分野で参考資料に相当する“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”に記載される。
【００７４】
好ましくは、ワクチン組成物は注入可能な形態で調製され、溶液、懸濁液またはエマルジョンに対応することができる。組成物は、特に、ｐＨをおよそ６ないし９（周囲温度でｐＨメーターを用いて測定される）に維持するために緩衝水溶液を含むことができる。
【００７５】
組成物にアジュバントを添加する必要はないけれども、組成物はそのような化合物、すなわち、同時に投与されたワクチン株によって誘導される細胞性または体液性免疫応答を増大、刺激または強化させる物質を含むことができる。当該分野の当業者は、本発明に適するアジュバントをワクチンの分野において通常用いられるアジュバントから選択することができる。
【００７６】
本発明に係るワクチン組成物は、たとえば非経口（特に、皮内、皮下または筋肉内）など、有利には皮下に、ワクチン接種に通常用いられるいずれかの経路によって投与され得る。好ましくは、ワクチン組成物は、左および右三角筋部の皮下に投与される注射用組成物である。
【００７７】
投与される組成物の量は投与経路に依存する。皮下注射では、その量は一般的に０．１から１．０ｍｌの間、好ましくはおよそ０．５ｍｌである。
【００７８】
血清型１から４のすべての最適投与期間は、デングウイルスへの暴露のおよそ１から３ヶ月前である。ワクチンは、大人および子どもにおいて、デングウイルスの感染予防措置として投与され得る。したがって、対象集団はデングウイルスに対してナイーブな（すなわち以前にワクチン接種していない）人またはデングウイルスに対してナイーブでない人を含む。
【００７９】
ワクチンデングウイルス血清型１から４の追加免疫投与は、また、本発明に係る第二段階投与後、６ヶ月から１０年の間に、たとえば、６ヶ月、１年、３年、５年または１０年の間に行なわれる。追加免疫投与は、有利には、同じワクチン組成物（すなわち、同じワクチンウイルス）を用いて、そして好ましくは第一および二段階投与の際と同じ投与条件（解剖学的部位および投与経路）で実施される。
【００８０】
干渉現象は他と比較して一つまたはそれ以上の血清型の優性によって説明することができ、したがって、ワクチン候補（たとえば、ＶＤＶまたはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ）を製造するために使われる技術とは独立したものである。したがって、本発明に係る方法は、一般的にワクチンデングウイルスに適用することができる。
【００８１】
それゆえ、本発明の対象は、４種のデング血清型に対する防御を誘導するワクチンの調製のためにワクチンデングウイルス用量を使用することであって、以下を含む：
（ａ）（ｉ）ワクチン第一血清型デングウイルス用量およびワクチン第二血清型デングウイルス用量、ならびに（ｉｉ）ワクチン第三血清型デングウイルス用量およびワクチン第四血清型デングウイルス用量の第一段階投与、および
（ｂ）用量（ｉ）および（ｉｉ）の第二段階投与
を含む方法であり、
用量（ｉ）および（ｉｉ）が解剖学的に別の部位に同時に投与され、
第二段階投与が第一段階投与後少なくとも３０日以上、最長で１２ヶ月以内に遂行される。
【００８２】
本発明に用いることのできるワクチンデングウイルスの記載に関して、本発明に係るワクチン接種方法に言及することができる。
【００８３】
本発明の対象は、また、４種のデングウイルス血清型に対するワクチン接種のためのキットである。本発明に係るキットは、提案したワクチン接種方法に関する上記に定義された用量を含む。したがって、本発明に係るキットは、ワクチン用量、および有利にはワクチン投与に有用な情報を含む使用説明書の入った各種容器を含むケースを含む。
【００８４】
一つの実施態様によると、本発明に係るキットは、少なくともデングウイルス血清型１、２、３および４を、
（ａ）４つの別々の容器に入った一価組成物の形態で、または
（ｂ）２つの別々の容器に入った２つの二価組成物の形態で、
収納するケースを含む。
【００８５】
他の実施態様によると、本発明に係るキットは、少なくともワクチンデングウイルス第一および第二血清型を：
（ａ）２つの別々の容器に入った２つの一価組成物の形態で、または
（ｂ）１つの容器に入った二価組成物の形態で
収納するケースを含む。
【００８６】
本発明に係るキットに用いることができるワクチンデングウイルスの記載に関して、本発明に係るワクチン接種方法に関する上記に記載されたワクチンウイルスに言及することができる。
【００８７】
したがって、具体的な実施態様によれば、本発明に係るキットは少なくとも：
（ａ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２を含む二価ワクチンが入った第一容器、および
（ｂ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を含む二価ワクチンが入った第二容器
を含む。
【００８８】
他の実施態様によれば、本発明に係るキットは少なくとも：
（ａ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３を含む二価ワクチンが入った第一容器、および
（ｂ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を含む二価ワクチンが入った第二容器
を含む。
【００８９】
他の実施態様によれば、本発明に係るキットは少なくとも：
（ａ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３を含む二価ワクチンが入った容器、または
（ｂ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を含む二価ワクチンが入った容器、または
（ｃ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−１およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−２を含む二価ワクチンが入った容器、または
（ｄ）ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−３およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘＴＭＤＥＮ−４を含む二価ワクチンが入った容器
を含む。
【００９０】
本発明に係るキットは以上に記載したとおり容器について一つまたはいくつかの例を含んでもよい。
【００９１】
使用されるワクチンが凍結乾燥された形態である場合、キットは、有利には、注入可能なワクチン用量を復元するための希釈剤を含む、少なくとも一つのさらなる容器を含む。通常水またはリン酸塩緩衝水溶液など、いずれの医薬上許容される希釈剤もこれを行うために用いることができる。
【００９２】
本発明を以下の実施例を用いて説明する。
【実施例１】
【００９３】
実施例１：２つの二価組成物を解剖学的に別の部位に同時に注射することによるサルのワクチン接種
ウイルス血症および免疫原性についてサルをモデルに試験した。特にウイルス血症は、ヒトの疾病の病原性および重症度に関連する一つの要因として認定され、したがって考慮すべき重要なパラメーターを構成する。一方で、免疫原性は与えられた防御の評価において主要なパラメーターである。
【００９４】
１．１  材料および方法：
サルにおける実験は、動物実験に関する欧州指針にしたがって行われた。ワクチン接種はモーリタニア由来のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）で実施された。サルはワクチン接種前６週間隔離された。
【００９５】
サルの腕の皮下にワクチン組成物０．５ｍｌを接種して、免疫を付与した。ケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ，Ｍｅｒｉａｌ）で浅麻酔させた後、鼠径部または伏在静脈から穿刺して血液を採取した。ワクチン接種後０日目と２８日目に抗体応答反応を評価するために血液５ｍｌを採取し、一方２日目から１０日目の間、ウイルス血症を評価するために血液１ｍｌを採取した。血液を氷上に集めて、血清が分離するまで氷上で保管した。実施するために、血液を４℃で２０分間遠心分離し、回収した血清を試験まで−８０℃で保管した。
【００９６】
ウイルス血症の測定
ワクチン接種後のウイルス血症を定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によりモニターした。ＤＥＮ１およびＤＥＮ２株のＮＳ５遺伝子に位置するプライマーおよびプローブの２組のセットをＶＤＶ−１  ＲＮＡおよびＶＤＶ−２  ＲＮＡの定量にそれぞれ用いた。ＹＦウイルスのＮＳ５遺伝子に位置する２つのプライマーおよび１つのプローブの３組目のセットをＣＹＤ  ＲＮＡを定量するために用いた。最後に、ＹＦ  ＮＳ５  ＲＮＡ陽性サンプルにおける血清型を同定するために、Ｅ（ＤＥＮ）／ＮＳ１（ＹＦ）遺伝子の接合点に位置する各種ＣＹＤ血清型に特異的なプライマーおよびプローブの４組のセットを使用した（表１参照）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイの内部基準として含まれる一連の合成ＲＮＡを産生するために、各ＰＣＲによって標的とされた領域を含む７つのプラスミドを、Ｔ７プロモーターの制御下でインビトロにおいて転写した。これらの合成ＲＮＡを分光分析により測定し、得られたＲＮＡ量をＲＮＡコピー数に変換し、ＧＥＱ（ゲノム等量）として表した。
【００９７】
Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ“Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ９６ウイルスＴＭ”ＲＮＡ抽出キットを用いて、使用説明書にしたがってサル血清０．１４０ｍｌを抽出し、その後精製されたＲＮＡを、リボヌクレアーゼを含まない水０．１４０ｍｌ（０．０９０ｍｌ、次いで０．０５ｍｌ）で溶出させた。冷凍と解凍の繰り返しを避けるために、抽出後即座に、ＲＮＡ調合液５μｌで最初の定量をおこなった。残りは７０℃で冷凍した。
【００９８】
反応混合物は、“Ｑｉａｇｅｎ  ＱａｕｎｔｉｔｅｃｔＴＭプローブ”ＲＴ−ＰＣＲ定量キット（Ｑｉａｇｅｎ）の成分に加えて、各プライマー１０ピコモル、各プローブ４ピコモルおよびＲＮＡ５μｌを含んで、合計２５μｌとした。試験されるＲＮＡの場合、精製された調合液５μｌを、予め希釈することなく反応混合物に直接入れた。リボヌクレアーゼを含まない水で合成ＲＮＡを１／１０に希釈し、５μｌ中およそ１０から１０６ＧＥＱを含む７つの希釈液を、検量線を書くために平行して定量した。
【００９９】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＡＢＩＰｒｉｓｍ  ７００ＴＭ装置を用いて、以下のプログラムにて定量化反応を行なった：５０℃／３０分、９５℃／１５分、次いで９５℃／１５秒−６０℃／６０秒を４０サイクル。
【０１００】
試験におけるウイルス性ＲＮＡの定量限界はＰＣＲ対象（標準偏差：＋／−０．３ｌｏｇ１０）によって２．９から３．３ｌｏｇ１０ＧＥＱ／ｍｌ（８００から２０００ＧＥＱ／ｍｌ；４から１０ＧＥＱ／反応）である。
【０１０１】
感染力価とウイルス性ＲＮＡ定量化との相関関係は、ワクチン接種（ＣＹＤまたはＶＤＶ）に使用される既知量のウイルスの感染粒子が添加された陰性サル血清試料（ＤＯ）０．１４０ｍｌを分析することにより、アッセイと平行して確立した。該対照血清を、５μｌ中およそ１ＰＦＵと１００ＰＦＵ（それぞれ２．３および４．３ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌ）を含む２つの希釈率にて調製した。
【０１０２】
実施例で用いる試験において、ＧＥＱとＰＦＵとの相関関係は以下のとおりである：ＹＦまたはＣＹＤに対して陽性の血清についてＧＥＱ／ＰＦＵ比２．７ｌｏｇ１０（すなわち、１ＰＦＵ＝５００ＧＥＱ）。ＶＤＶ１またはＶＤＶ２に対して陽性の血清についてＧＥＱ／ＰＦＵ比２．５ｌｏｇ１０（すなわち、１ＰＦＵ＝３２０ＧＥＱ）。
【０１０３】
定量限界は，ｑＲＴ−ＰＣＲ  ＹＦおよびＣＹＤに対して＜３．３ｌｏｇ１０ＧＥＱ／ｍｌ（すなわち、＜４ＰＦＵ／ｍｌ）ならびにｑＲＴ−ＰＣＲ  ＶＤＶ１およびＶＤＶ２に対して＜２．９ｌｏｇ１０ＧＥＱ／ｍｌ（すなわち、＜２．５ＰＦＵ／ｍｌ）。
【０１０４】
使用されるプライマーおよびプローブを表１に示す。表中、各アッセイにつき、センスおよびアンチセンスプライマーならびにプローブが順に挙げられている。
【０１０５】
【表１】
2010505801.tif 000002
中和抗体測定（血清中和反応試験）（ＳＮ５０）
【０１０６】
慣用的に、デング抗体測定はＰＲＮＴ５０（５０％ＰＦＵ数減少中和試験）を用いて確立される。この試験は多くの時間と労力を費やし、多くの材料を使用することから、我々はＣＣＩＤ５０試験により測定されたユニットの数値の５０％減少に基づいてＳＮ５０試験を開発した。
【０１０７】
９６ウェルプレートにおいて、補体除去された血清０．１２０ｍｌを各ウェルの希釈液（ＩＳＣＯＶＥ  ４％  ＦＣＳ）０．４８０ｍｌに加える。血清０．１５０ｍｌを希釈液０．４５０ｍｌに入れることで６倍連続希釈液を調製する。２５ＣＣＩＤ５０／ウェルを得るために各ウェルに２．７ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／ｍｌでのウイルス希釈液４５０μｌを加える。プレートは３７℃にて１時間インキュベートする。次いで各希釈液０．１ｍｌを、実験開始３日前に４％ＦＣＳを含むＩＳＣＯＶＥ０．１ｍｌ中８０００細胞／ウェルの密度でベロ細胞が播種されている９６ウェルプレート中の６ウェルに分配する。６日間、３７℃でインキュベートした後、５％ＣＯ２存在中、エタノール／アセトン（７０／３０）混合液を用いて４℃、１５分間細胞を固定し、次いでＰＢＳで３回洗浄して、抗フラビウイルスモノクローナル抗体（ｍＡｂ４Ｇ２）の１／２０００希釈液０．０５ｍｌ存在下で３７℃にて１時間インキュベートする。その後、プレートを２回洗浄し、アルカリ性ホスファターゼが接合された抗マウスＩｇＧの１／１０００希釈液０．０５ｍｌの存在下で３７℃にて１時間インキュベートする。着色された基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）０．０５ｍｌを加えることで溶菌プラークを視覚化する。中和抗体力価を以下に示されるカルバーの公式（Ｋａｒｂｅｒ  ｆｏｒｍｕｌａ）を用いて算出する：
式
ｌｏｇ１０ＳＮ５０＝ｄ＋ｆ／Ｎ（Ｘ＋Ｎ／２）
式中、
ｄは１００％中和（すなわち６つの陰性複製物、すなわち感染の徴候を示さない複製物）を生じさせる希釈率であり、
ｆはｌｏｇ１０で示される希釈係数であり（たとえば、１：４の希釈係数なら、ｆ＝０．６）、
Ｎは複製物／希釈率の数であり（Ｎ＝６）、
Ｘは感染の徴候を示さないウェルの合計数、ただし希釈率ｄを除く、
ウイルス検出限界は１０ＳＮ５０（すなわち１．０ｌｏｇ１０ＳＮ５０）である。
【０１０８】
中和に用いられたウイルス株はＤＥＮ１  １６００７、ＤＥＮ２  １６６８１、ＤＥＮ３  １６５６２またはＤＥＮ４  １０３６株である。
【０１０９】
対照について、最初のウイルス希釈を再滴定した。
【０１１０】
ＳＮ５０試験で測定される中和力価とＰＲＮＴ５０試験で通常測定される中和力価との相関関係は以下である：
式
ｌｏｇ１０ＰＲＮＴ５０＝ｌｏｇ１０ＳＮ５０＋０．２
【０１１１】
平均力価（ＧＭＴ）は一次数値として表される力価の相乗平均を算出することによって確立され、その力価が検知閾値以下である試料は、慣例によりこの閾値の半分の値が割り当てられる。
【０１１２】
１．２  逐次免疫付与の評価
年齢および体重の等しい１群４匹のサル、計２群にワクチン接種した（表２参照）。
【０１１３】
ＣＹＤ  ＤＥＮ１から４までのワクチンに対応する各血清型を１０５ＣＣＩＤ５０の投与量で、２３Ｇ１針を用いて腕の皮下に接種した。
【０１１４】
各群の組成物とワクチン接種プロトコル
【表２】
2010505801.tif 000003
【０１１５】
１回ワクチン接種後（Ｄ２８）と２回ワクチン接種後（Ｄ８６）に得られた免疫原性の結果を表３に示す。
【０１１６】
ウイルス血症の結果を表４に示す。
【０１１７】
【表３】
2010505801.tif 000004
【０１１８】
【表４】
2010505801.tif 000005
【０１１９】
簡単に、結果を以下のようにまとめることができる：
本発明に係る投与方法により、四価のワクチン接種により得られる相同的中和抗体応答反応を、定性的かつ定量的に増加させることができる。
追加免疫後、ＣＹＤ−１，２二価ワクチン接種と同時にＣＹＤ−３，４ワクチン接種を解剖学的に別の部位に行うことにより、一匹の動物における血清型３を除くすべてのサルにおいて４種の血清型に対する相同的な応答を誘導する。
さらに、単一部位に四価のワクチンを接種するより、同時に二価のワクチンを接種する場合の方が血清型１および４に対する応答が高い傾向にある。
同時に二価投与した後であれ、四価投与した後であれ、ウイルス血症（表４）はＣＹＤ−４によって主に引き起こされる。したがって、血清型の分離は血清型１、２および３ウイルス血症の発生を促進させないと結論付けることができる。
したがって、本発明に係るワクチン接種方法はワクチンデングウイルスの安全性を損なうことなしに、ワクチンデングウイルスの免疫原性を向上させることを実施例は示している。
【実施例２】
【０１２０】
サルにおいて、解剖学的にまったく異なる部位に２つの二価組成物ＣＹＤ−１，４およびＣＹＤ−２，３を同時に注射するワクチン接種
実施例１で示したように、ウイルス血症および免疫原性についてサルをモデルとして試験した。本実施例において、試験される二価組成物は、それぞれ最も免疫原性の強いワクチンウイルス（ＣＹＤ−１，４）および最も免疫原性の弱いワクチンウイルス（ＣＹＤ−２，３）を含む。
【０１２１】
２．１  材料および方法：実施例１と同じ
【０１２２】
２．２  同時ワクチン接種の評価
年齢および体重の等しい１群４匹のサル、計２群を免疫付与した（表５参照）。
【０１２３】
ワクチン接種は実施例１に記載されているとおり行われる。
【０１２４】
群の組成およびワクチン接種プロトコル
【表５】
2010505801.tif 000006
【０１２５】
１回のワクチン接種後（Ｄ２８）および２回のワクチン接種後（Ｄ８６）に得られる免疫原性は表６に示される。
【０１２６】
ウイルス血症の結果は、実施例１の結果と同じであり、ウイルス血症が血清型４によって誘導されたことおよび２つの群の間で大きな違いはなかったことを示した。
【０１２７】
【表６】
2010505801.tif 000007
【０１２８】
この結果は実施例１で得られた結果を支持しており、以下のようにまとめることができる：
この投与方法により、四価ワクチン接種により得られる相同的中和抗体反応を定性的および定量的に向上させることができる。
追加免疫後、ＣＹＤ−１，４二価ワクチン接種と同時にＣＹＤ−２，３ワクチン接種を解剖学的に別の部位に行うことにより、すべてのサルにおいて４種の血清型に対する相同的な応答を誘導するが、これは、実施例１で示したとおり、従来の四価を摂取した群においてはそうではない。
実施例１で２つの二価ＣＹＤ−１，２およびＣＹＤ−３，４を摂取したサルの群と比較して、二価ＣＹＤ−１，４ワクチンとＣＹＤ−２，３ワクチンの同時接種の後得られる抗体力価は、血清型１、２および３については高く、血清型４については低く、これは、血清型４によって優勢化されない、４種の血清型の間でより均衡のとれた応答を示す。
このようなワクチン接種方法において、優勢な血清型を他と分けることで、４種の血清型に対する均衡のとれた応答を可能にした。
したがって、上記２つの実施例は、本発明に係る免疫方法がウイルス血症を測定することによって評価されるようにワクチンデングウイルスの安全性を害することなくワクチンデングウイルスの免疫原性を向上させることを示している。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年6月4日(2009.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010505801000001.app
【国際調査報告】
2010505801.tif 000020
2010505801.tif 000021
2010505801.tif 000022
2010505801.tif 000023
2010505801.tif 000024
2010505801.tif 000025
2010505801.tif 000026
2010505801.tif 000027