(57)【要約】本発明は、抗アミロイド特性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。βアミロイドペプチドとヒト皮質組織のニコチン性アセチルコリン受容体との間の高親和性複合体を解離または防止する能力を有する化合物のスクリーニング方法は、神経変性疾患および特にアルツハイマー病の治癒的および／または予防的処置における使用のための化合物を迅速に同定することを可能にする。
2010505089.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト脳由来のニコチン性アセチルコリン受容体とのβアミロイドペプチドの複合体を解離または防止できる化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
同定される化合物が治癒的特性または予防的特性を有することを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ニコチン性アセチルコリン受容体がα７型のものであることを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
βアミロイドペプチドがＡβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２および／またはＡβ４３であることを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
ニコチン性アセチルコリン受容体とのβアミロイドペプチドの複合体がヒト皮質または海馬由来であることを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
βアミロイドペプチドおよびニコチン性アセチルコリン受容体の複合体の解離が免疫組織化学によって実証されることを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
以下の工程：
−  試験中の化合物の存在下または非存在下でニコチン性アセチルコリン受容体とのβアミロイドペプチドの複合体をインキュベートする工程；
−  試験中の化合物の存在下または非存在下での非解離複合体の量を決定し、そして非解離複合体の量の差異を評価する工程
を含むことを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
非解離複合体が抗βアミロイドペプチド抗体を使用して単離されることを特徴とする、請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
抗体がβアミロイドペプチドＡβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２および／またはＡβ４３に対するものであることを特徴とする、請求項８記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
非解離複合体がニコチン性アセチルコリン受容体に対する抗体を使用して実証されることを特徴とする、請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
非解離複合体が抗α７ニコチン性アセチルコリン受容体抗体を使用して実証されることを特徴とする、請求項１０記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１記載のスクリーニング方法によって同定される化合物。
【請求項１３】
前記化合物が１−（４−ブロモフェニル）−２−（１−メチル−２−ピリジニウミル）−１−エタノンであることを特徴とする、請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
１つ以上の薬学的に許容しうる賦形剤および１つ以上の請求項１２記載の化合物を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１５】
神経変性疾患の予防および／または処置に意図される医薬組成物の取得における、請求項１２記載の化合物の使用。
【請求項１６】
アルツハイマー病の予防および／または処置に意図される医薬組成物の取得における、請求項１２記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬分野に関し、そして特に薬理学研究ユニットを目的とする。事実、本発明は、抗アミロイド特性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
この目的のために、本発明は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治癒的および／または予防的処置に意図される化合物の迅速な同定を可能にする生物試料のエクスビボ分析のための生化学的技術を用いる。従って、本発明は、βアミロイドペプチドとヒト皮質組織のニコチン性アセチルコリン受容体との間の高親和性複合体を解離できる化合物のスクリーニング方法に関する。
【０００３】
アルツハイマー病は、高齢集団の高い割合を冒す進行性の神経変性疾患である。臨床的には、この疾患は記憶喪失および認知機能の低下によって特徴付けられる。神経病理学的には、アルツハイマー病は以下の２つの型の組織病理学的大脳病変の存在で示される：アミロイド斑および神経原線維変性（ＮＦＤ）。アルツハイマー病の第３の特徴は皮質萎縮であり、これは顕著なニューロン損失に対応する。
【０００４】
ニューロン内沈着物およびニューロン周囲のアミロイド斑（または老人斑）の形態のβアミロイド（Ａβ）ペプチドの蓄積は、アルツハイマー病の病因の起源にあると考えられている。関連する認知障害および神経原線維変性と協同して、アミロイド沈着物の蓄積は、家族性形態を含む全ての形態のアルツハイマー病の初期の変動しない特徴を表す。
【０００５】
神経原線維変性は、ペアードヘリカルフィラメント（またはＰＨＦ）から形成される原線維のニューロン内蓄積に対応する。ＰＨＦはτ微小管関連タンパク質の集合から構成される。これらのタンパク質の生化学的特徴付けは、異常にリン酸化されそして凝集したτタンパク質の主要な三つ組（τ６０、６４および６９）の存在を明らかにしている。正常なτタンパク質は、アルツハイマー病における５〜９回に対して、２〜３回リン酸化されており、そしてニューロン細胞骨格の微小管の重合／脱重合において、そしてまた軸索輸送において役割を担っている。
【０００６】
皮質萎縮は、１０年毎に８〜１０％の脳重量の損失で、アルツハイマー病患者において示されるが、健常対象においてはこの損失は２％のみである。皮質萎縮は脳室および皮質溝の拡張、海馬体積の低下、および特にコリン作動系を冒すニューロン損失を伴う。
【０００７】
アミロイド斑はアミロイド物質の球状沈着物から生じる。アミロイド物質は、Ａβ（βアミロイド）として知られる３９〜４３アミノ酸のポリペプチドの線維から構成される。βアミロイドペプチドは、その不溶性の特徴およびその毒性を与えるβシート構造を有する。βアミロイドペプチドはＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）として知られる大きなサイズの膜糖タンパク質の正常な異化産物である。アミロイド斑は神経突起およびグリア細胞によって取り囲まれている。アミロイド斑は、神経実質に浸潤し、そして脳の全ての領域の皮質灰白質中に拡散する。後頭皮質はこれらのアミロイド沈着物によってより頻繁に冒されるようである。βアミロイドペプチドの神経毒性はアルツハイマー病における主要な問題を構成する。
【０００８】
最近の研究は、細胞外空間に位置するアミロイド斑がリソソーム区画中のアミロイド沈着物の非常に実質的な蓄積を有するニューロンの細胞溶解の結果であることを示している。このニューロン内蓄積は、ニューロン細胞の変性、次いで細胞死およびこれらの沈着物の細胞外空間への放出を引き起こし、徐々にアミロイド斑を形成する（Nagele et al. 2002）。アミロイド斑は神経突起およびグリア細胞によって取り囲まれており、そして核の断片を含有する（斑が死滅したニューロンから生じることの証拠）。α７型ニコチン性受容体は、Ａβペプチドのニューロンへの進入において基本的な役割を担っている（D'Andrea and Nagele 2006）。
【０００９】
Wang et al.は、ニューロンの細胞外表面上に存在するα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７ｎＡＣｈＲ）にＡβペプチドが特異的に高親和性で結合することを示している（Wang et al. 2000）。Ａβペプチド、特にＡβ４２ペプチドのα７ｎＡＣｈＲ受容体との相互作用は、Ａβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体のニューロン内蓄積前の必須の段階であるようであり、ニューロンの表面上の前記複合体はエンドサイトーシスを経、その結果リソソーム区画中のその蓄積が生じる（Nagele et al. 2002）。
【００１０】
さらに、これらのＡβ−α７化合物のニューロン内蓄積は、τの異常なリン酸化（Wang et al. 2003）およびコリン作動性神経伝達の不全を含むシナプス機能不全（Roselli et al. 2005；Almeida et al. 2005；Shemer et al. 2006）を引き起こす。
【００１１】
このデータは、全体として、高齢者およびアルツハイマー病に罹患した者におけるＡβペプチド、特にＡβ４２ペプチドによるα７ｎＡＣｈＲ受容体の慢性的破壊が、それによって、原線維神経変性の起源にある、ニューロン機能不全、アミロイド斑の形成およびτタンパク質のリン酸化をＡβペプチドがもたらす中心的な機構であることを示す傾向にある。
【００１２】
その結果、Ａβ４２−α７ｎＡＣｈＲ相互作用を阻害できる化合物は、アミロイド斑の形成およびニューロン機能不全を低下させるために特に有効な薬剤であると判明しうる。
【００１３】
従って、神経変性性および加齢性病理におけるその重要性を考慮すれば、アミロイド斑の形成の起源にあるＡβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体に作用できる化合物を同定することは価値があるようである。
【００１４】
これらの化合物の同定は種々の方法によって実施することができ、それらは、状況によって、多少適切でありそして効率的であることが見出される。それらは時折単独では不十分であり、それで組み合わされた場合にのみ有用であり、いずれにせよそれらはいくらかの利点および欠点を有する。それらは本明細書中以下でまとめられ、そして以下の２つの動物モデル妥当性基準に基づいて考察される：病理の原因条件の類似性および基礎をなす神経生物学的機構に基づく、構成概念妥当性（validite de construction）；およびもたらされる行動状況の類似性に基づく、記述的妥当性（validite descriptive）。
【００１５】
第１の方法は、脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）位置においてカニューレを使用して実施される、マウスの脳中へのβアミロイドタンパク質の注入からなる。この方法（Yamada et al. 2005；Mazzola et al. 2003）は、βアミロイドペプチドの７日間の外因性導入の後に記憶欠損を有するマウスを得ることを可能にする。このマウスモデルは迅速に得られ、そしてこのモデルを神経変性病理、特にアルツハイマー病の処置について新たな見込みのある物質を試験するために使用することができる。この方法は、アルツハイマー病の病態生理を正確に表さないモデルに基づいている。事実、Ａβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体に作用する化合物を同定するこの方法は、見かけ上の妥当性を有しない。なぜなら、大脳加齢のτ病理はこのマウスモデルにおいて発達しないからである。さらに、本マウスモデルは、一方でβアミロイドペプチドが外因起源でありそして動物によって天然に産生されておらず、そして他方でモデルが動物でありそしてヒトでないという事実の点から、構成概念妥当性を満足させない。最後に、マウスの脳中への外因性βアミロイドペプチドの注入は、インビボでの作業を必要とさせる。このことは、この方法が抗アルツハイマー化合物のスクリーニングおよび同定のために日常的に使用されることの妨げとなる。
【００１６】
いくつかの他の化合物の同定方法は、アルツハイマー病のモデルとして、ＡＰＰおよび／またはＰＳ１（プレセニリン１）遺伝子上に、家族性形態のアルツハイマー病に存在する変異を保有するトランスジェニックマウスを使用する。従って、これらのモデルの構成概念妥当性は、家族性形態のためには申し分ないが、症例の９７％より多くを表す散発形態のためには非常に議論の余地がある。
【００１７】
トランスジェニックマウスの第１の型は、ＡＰＰ中の１つの変異だけ（Hsiao et al. 1996）またはＡＰＰおよびＰＳ１中の二重変異（Holcomb et al. 1998）を有する。上記のトランスジェニックモデルの記述的妥当性は完全ではない。なぜなら、それらはアルツハイマー病に関連する生理病理学的特徴を信頼性を有して再現しないからである。一方で神経原線維変性の非存在が見出され、そして他方で単一または二重トランスジェニックマウスの皮質におけるニューロン損失および老人斑の遅発性出現がほとんどまたは全く見出されない。その結果、アルツハイマー病との生理学的差異およびこの病理に関連する病変が出現するのにかかる時間の点から、単一または二重トランスジェニックマウスモデルの使用は推奨されない。
【００１８】
３つの変異遺伝子（ＡＰＰ、ＰＳ１およびτ）を保有するマウスのトランスジェニックモデル（LaFerla et al. 2003）の使用もまた不利益を有する。このモデルの構成概念妥当性は議論の余地がある。なぜなら、先行するモデルと比較して、アルツハイマー病に罹患したヒトに存在しないさらなる変異がτ遺伝子中に追加されるからである。しかし、このモデルの記述的妥当性は、アミロイド斑、神経原線維変性およびニューロン損失からなるアルツハイマー病の生理学的病変をよく模倣しているので、良好である。しかし、この方法は、アルツハイマー病に典型的な病変を有するマウスが得られるまで６ヶ月〜１２ヶ月の期間を必要とする。その結果、このトランスジェニックマウスモデルを、試験される化合物の抗アミロイド特性を確認するための方法において妥当に使用することができるが、前記モデルにかかる時間およびその実施の困難性の点から、化合物をスクリーニングするために第一に合理的に使用することはできない。
【００１９】
第３の方法（Wang et al. 2000）は、外因性に導入されたＡβペプチドとラット組織（ラット海馬および皮質シナプトソーム）中に存在するα７との間の複合体の形成を防止する化合物の能力を試験することからなる。このインビトロ方法は、上記の方法より迅速に行われるが、ラット脳抽出物が使用され、そしてＡβペプチドは外因性に導入されるので、ヒトに存在する複合体を表さないという決定を有する。その結果、このモデルは、アミロイド斑の形成の起源にあるＡβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体に作用することができる化合物のスクリーニング方法においてこのモデルを使用するために必要とされる構成概念妥当性のための条件も記述的妥当性のための条件も満足させない。
【００２０】
従って、本発明は、βアミロイド−α７ｎＡＣｈＲ複合体に作用できる化合物の同定方法の別のストラテジーを、少なくとも部分的に、前記化合物の選択方法の既知の欠点を克服するという観点で提唱するという目的を有する。従ってこの目的で、本発明は、アルツハイマー病患者に存在する生理学的条件を再現するエクスビボスクリーニングの方法を提唱する。この最適条件は、ヒト脳、特にアルツハイマー病患者から得られた前頭皮質を使用することによって得られる。定義上、このモデルは、疾患ヒト組織の直接的使用を含むので、構成概念妥当性および記述的妥当性の基準を満たす。
【００２１】
本発明によるスクリーニング方法のエクスビボ条件は、動物モデルの実行および取り扱いに関連する制約を回避することを可能にする。
【００２２】
さらに、ヒトの生物材料の使用は、動物種とヒトとの間に存在する生理学的差異に関連する全てのアーティファクトおよびエラーを回避することを可能にする。本発明によるスクリーニング方法の関連でのヒト生物材料の使用は、アルツハイマー病および神経変性病理が一般にヒト以外の種に天然に存在しないという事実の点から、特に重要である。
【００２３】
従って、本発明は、ヒト脳由来のニコチン性アセチルコリン受容体とのβアミロイドペプチドの複合体を解離または防止できる化合物のスクリーニング方法に関する。
【００２４】
好ましくは、本発明は、ヒト脳由来のα７ニコチン性アセチルコリン受容体とのβアミロイドペプチドの複合体を解離または防止できる化合物のスクリーニング方法に関する。
【００２５】
従って、本発明によるスクリーニング方法は、化合物がＡβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体をそれぞれ解離できるかまたは防止できるかによって、治癒的または予防的特性を有する化合物を同定することを可能にする。
【００２６】
「抗アミロイド」または「抗βアミロイド」特性は、ニコチン性アセチルコリン受容体とともにＡβペプチドによって形成される複合体の解離によるのであろうと、その形成の阻害によるであろうと、βアミロイドペプチドの細胞内または細胞外沈着物を解離するかまたはその形成に対抗する化合物の能力であると理解される。
【００２７】
本発明の関連で、α７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７ｎＡＣｈＲ）は、主に皮質および海馬において発現され、そして学習および記憶において重要な役割を有する、五量体表面を有する細胞受容体を示す。
【００２８】
本発明の関連で、表現「βアミロイド」、「Ａβ」および「βアミロイドペプチド」は、ペプチドＡβ１−３９またはＡβ３９、Ａβ１−４０またはＡβ４０、Ａβ１−４１またはＡβ４１、Ａβ１−４２またはＡβ４２、Ａβ１−４３またはＡβ４３、およびそのフラグメントを含むβアミロイドペプチドの全体に関する（Glenner et al. 1984）。上記のβアミロイドペプチドフラグメントは、生物活性を有しており、そして本発明によるスクリーニング方法において使用されることができる。前記フラグメントは、例えば、フラグメントＡβ１−２８およびＡβ２５−３５である。
【００２９】
本発明の関連で使用されるβアミロイドペプチドは、特にペプチドＡβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２および／またはＡβ４３である。ペプチドＡβ４２は、α７ニコチン性アセチルコリン受容体に対する最大の親和性、およびアルツハイマー病の病因における最も重要な役割を有している。
【００３０】
本発明のスクリーニング方法は、ヒト脳、好ましくはヒトの皮質および海馬由来の試料を使用して実施される。これらの試料は、アルツハイマー病患者から死後に取られる。
【００３１】
本発明は、好ましくは、βアミロイドペプチドおよびα７ニコチン性アセチルコリン受容体の複合体の解離が免疫組織化学によって実証されることを特徴とするスクリーニング方法に関する。
【００３２】
本発明の関連で、用語「免疫組織化学」は、規定された分子の検出または単離のために抗体を使用する、抗原を明らかにする技術の全体に関する。
【００３３】
スクリーニング方法は、好ましくは、以下の工程：試験中の化合物の存在下または非存在下でニコチン性アセチルコリン受容体とのβアミロイドペプチドの複合体をインキュベートする工程、次いで試験中の化合物の存在下または非存在下での非解離複合体の量を決定し、そして非解離複合体の量の差異を評価する工程を含み、この差異は、試験中の化合物がニコチン性アセチルコリン受容体とのβアミロイドペプチドの複合体の解離を媒介することを示す。
【００３４】
本発明によるスクリーニング方法は、好ましくは、抗βアミロイドペプチド抗体を使用してニコチン性アセチルコリン受容体とのβアミロイドペプチドの非解離複合体を単離する工程も含む。
【００３５】
スクリーニング方法において使用される抗βアミロイドペプチド抗体は、好ましくはβアミロイドペプチドＡβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２および／またはＡβ４３に対するものである。これらの抗体は、マウスまたはヤギモノクローナル抗体であることができる。
【００３６】
より好ましくは、本発明のスクリーニング方法は、抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体、特に抗α７ニコチン性アセチルコリン受容体抗体を使用して、非解離複合体を、特にウエスタンブロット方法によって、明らかにすることによって特徴付けられる。
【００３７】
有利には、本発明によるスクリーニング方法は、化合物Ｓ２４７９５、すなわち１−（４−ブロモフェニル）−２−（１−メチル−２−ピリジニウミル）−１−エタノンクロリドまたはヨーダイドが、一方でβアミロイド−α７ｎＡＣｈＲ複合体の形成を阻害し、そして他方でニューロン周囲のアミロイド斑中に蓄積しそしてニューロンの内部に沈着した前記βアミロイド−α７ｎＡＣｈＲ複合体を解離することができる化合物であることを示した。本発明のスクリーニング方法によって同定された化合物Ｓ２４７９５は、従って、アルツハイマー病患者の脳中に存在するニコチン性アセチルコリン受容体とのβアミロイドペプチドの複合体を解離し、そしてまた前記複合体の形成を阻害することができる化合物である。
【００３８】
本発明はまた、本発明によるスクリーニング方法を使用して同定される各々の化合物に関する。
【００３９】
本発明はまた、１つ以上の薬学的に許容しうる賦形剤と組み合わせて、本発明によるスクリーニング方法を使用して得られる化合物を、有効成分として、含む医薬組成物に関する。
【００４０】
「有効成分」は、医薬組成物の薬力学的または治療的特性を担う任意の物質であると理解される。本発明の関連で、「賦形剤」は、その調製および投与を促進し、そしてその密度、形態および体積を改変するために、それとともに医薬の有効成分が組み込まれる任意の物質であると理解される。
【００４１】
無毒性の薬学的に許容しうる賦形剤の中で、例として、限定するものではないが、希釈剤、溶媒、保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、結合剤、膨潤剤、崩壊剤、遅延剤、潤滑剤、吸収剤、懸濁剤、着色剤および香料に言及しうる。
【００４２】
さらに、神経変性病理、特にアルツハイマー病の予防および／または処置に意図される医薬組成物は、経口、非経口、経鼻、経皮、直腸、経舌、眼球または呼吸投与に適切な形態であり、特に錠剤または糖衣錠、舌下錠、サシェ（sachet）、パケット（paquet）、カプセル、グロセット（glossette）、ロゼンジ、坐薬、クリーム、軟膏、皮膚ゲルおよび注射用または飲用アンプルである。
【００４３】
本発明はさらに、神経変性疾患の予防および／または処置に意図される医薬組成物の取得における、本発明によるスクリーニング方法を使用して同定される化合物の使用に関する。
【００４４】
本発明によるスクリーニング方法によって同定される化合物は、「神経変性病理」、例えばアルツハイマー病、ピック病、レビー小体型認知症、スティール−リチャードソン症候群、ダウン症候群、シャイ−ドレーガー症候群、筋萎縮性側策硬化症、神経変性性失調、ハンチントン病、パーキンソン病、原発性進行性失語、マチャド−ジョセフ病、ツレット症候群、麻痺性構語障害、ケネディ病、家族性痙攣性麻痺、ヴェルドニッヒ−ホフマン病、クーゲルベルグ−ヴェランデル病、テイ−サックス病、ザントホフ病、ヴォールファルト−クーゲルベルグ−ヴェランデル病、痙性対麻痺、進行性多巣性白質脳炎、およびプリオン関連疾患（クロイツフェルト−ヤコブ病およびゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病を含む）の処置において使用される。
【００４５】
本発明による用語「予防的」は、βアミロイドペプチドのα７ニコチン性アセチルコリン受容体への結合を阻害することによってアルツハイマー病を発達させる危険性を低下させる目的を有する予防指向の処置に対応する。この阻害は、アルツハイマー病に存在する病変である、アミロイド斑の起源にある、βアミロイド−α７ｎＡＣｈＲ複合体の形成を制限する。さらに、用語「予防的」は、疾患の進行および持続を低下させることによって有病率を低下させることが意図される、二次的予防として理解されうる。
【００４６】
「処置」は、ヒト脳中に存在し、そして老人斑を構成するβアミロイド−α７ｎＡＣｈＲ複合体を解離することによって、アルツハイマー病患者を処置する目的のために処方される治癒指向の処置であると理解される。
【００４７】
医薬組成物の取得における本発明によるスクリーニング方法から得られる化合物の使用は、アルツハイマー病患者の予防および／または処置に特に意図される。
【００４８】
「アルツハイマー病」は、特に言語の衰退、複雑な運動の障害、および時間および空間の見当識の障害を伴う、記憶および精神機能を冒す致死的神経変性疾患であると理解される。これらの認知障害は、死後にその確定診断を可能にする、２つの特徴的な神経病理学的病変−老人斑および神経原線維変性−に関連する。
【００４９】
本発明を以下の図面によって説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】アルツハイマー病患者またはコントロール対象の前頭皮質シナプトソームから死後に得られたＡβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の、Ｓ２４７９５による阻害を示すウエスタンブロット。Ａβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体を媒質（クレブス−リンゲル）中単独でかまたはＳ２４７９５（３０μM）の存在下で１０分間インキュベートし、続いてＡβ４２ペプチドの存在下で３０分間インキュベートする。
【図２】アルツハイマー病患者およびコントロール対象から死後に得られ、そしてＳ２４７９５（３０μM）とともに、またはそれなしで、次いでＡβ４２ペプチド（１００nM）とともにインキュベートされたヒト前頭皮質シナプトソームにおけるＡβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の形成の阻害の定量。＊：コントロールおよびアルツハイマー病患者についてｐ＜０．０１、多重比較のためのニューマン−クールス検定。
【図３】アルツハイマー病患者またはコントロール対象の前頭皮質シナプトソームから死後に得られたＡβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の、Ｓ２４７９５によって引き起こされる解離を示すウエスタンブロット。Ａβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体を媒質（クレブス−リンゲル）中単独でかまたはＳ２４７９５（１、１０、３０または１００μM）の存在下で１０分間、次いでＡβ４２（１００nM）の存在下または非存在下でインキュベートする。
【図４】アルツハイマー病患者およびコントロール対象から死後に得られ、そしてＳ２４７９５（１〜１００μM）とともに、次いでＡβ４２（１００nM）の存在下または非存在下でインキュベートされたヒト前頭皮質シナプトソームにおけるＡβ４２と結合したα７ｎＡＣｈＲ受容体の相互作用の解離の定量。＊：コントロールおよびアルツハイマー病患者についてｐ＜０．０１、多重比較のためのニューマン−クールス検定。
【図５】アルツハイマー病患者およびコントロール対象から死後に得られ、そしてＳ２４７９５で処理されたヒト前頭皮質シナプトソーム中への４５Ｃａ２＋の流入の定量。コントロール脳切片をＡβ４２（１μM）の存在下で、またはそれなしで、Ｓ２４７９５（１０μM）での処理の前にインキュベートする。カルシウム流入がα７アゴニスト（ＰＮＵ２８２９８７）またはグリシンに添加したＮＭＤＡのいずれかによってもたらされる。
【００５１】
Ｉ．材料および方法
Ｉ．１）患者
アルツハイマー病患者および健常コントロール対象から得られた死後のヒト前頭皮質を、脳バンク（Harvard Brain Tissue Resource CenterおよびAnalytical Biological Services）から得る。
【００５２】
研究に含まれた患者およびコントロールは５０〜９０歳であった。
【００５３】
コントロールは、その生涯の間、認知障害を示さず、記憶喪失の徴候を現さなかった人であった。
【００５４】
さらに、アルツハイマー病患者を、関連する血管病理を有するかまたは有しない２つのサブグループに分割した。関連する病理を有しない患者の脳のみを本試験において使用した。
【００５５】
アルツハイマー病の診断が、臨床症状を示した患者におけるアルツハイマー病の神経学的評価のための診断基準に関するレーガン研究所ワーキンググループおよび国立老化研究所の免疫組織化学的方法によって確認されたことに留意すべきである。
【００５６】
Ｉ．２）皮質の調製
いかなる死後のアーティファクトも回避するために、研究に関して取り出された皮質は、その死亡が取り出す前１５時間以内に起こった人からのものである。取り出した皮質を、本発明によるスクリーニング方法において使用するまで−８０℃で貯蔵する。
【００５７】
Ｉ．３）皮質の貯蔵
取り出した後、皮質を、２０％（w／v）スクロースを含有する０．２Mリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＨ２ＰＯ４．２Ｈ２Ｏ／ＮａＨ２ＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．４）中で２週間凍結保護する。次いで、これらを、固体二酸化炭素中−３０℃の温度に維持したイソペンタン中で１分間凍結する。最後に、−３０℃に定温制御したクリオスタット（Super Frost Plus Fisher）中で作製した５μm厚の切片を０．０２M  ＰＢＳ緩衝液に入れ、次いで４℃で貯蔵する。
【００５８】
Ｉ．４）シナプトソームの調製
氷上で粉砕した死後の前頭皮質１００mgを、氷上に維持した１０倍容量の１０mM  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中でホモジナイズし、そして０．３２mMスクロースおよび０．１mM  ＥＤＴＡの存在下で酸素負荷し、次いでテフロン／ガラス組織グラインダー中、４℃で、２５mM  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１mM  ＥＤＴＡ、５０μg／mlのロイペプチン、１０μg／mlのアプロチニン、２μg／mlのダイズトリプシンインヒビター、０．０４mM  ＰＭＳＦ、ホスファターゼインヒビタータンパク質の混合物、および０．２％２−メルカプトエタノールを含有するホモジナイゼーション溶液中で混合する。
【００５９】
まずホモジネートを１０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離する。最初の遠心分離において得られた上清を２回目に１５０００ｇで３０分間遠心分離して、シナプトソームの沈降物を得る。
【００６０】
シナプトソームの沈降物を、２５mM  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１１８mM  ＮａＣｌ、４．８mM  ＫＣｌ、２５mM  ＮａＨＣＯ３、１．３mM  ＣａＣｌ２、１．２mM  ＭｇＳＯ４、１．２mM  ＫＨ２ＰＯ４、１０mMグルコース、１００μMアスコルビン酸、５０μg／mlのロイペプチン、１０μg／mlのアプロチニン、２μg／mlのダイズトリプシンインヒビター、０．０４mM  ＰＭＳＦおよびホスファターゼインヒビタータンパク質の混合物を含む、氷上で維持したクレブス−リンゲル液１０ml中での懸濁によって２回洗浄し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を使用して１０分間曝気し、次いで１５０００ｇで１０分間４℃で再度遠心分離する。次いで、洗浄したシナプトソームを酸素負荷したクレブス−リンゲル液１ml中に懸濁し、そして前記シナプトソーム懸濁物のタンパク質濃度をブラッドフォード法によって決定する。
【００６１】
Ｉ．５）免疫沈降
ヒト皮質シナプトソームを、酸素負荷したクレブス−リンゲル液中、化合物Ｓ２４７９５の存在下、３７℃で３０分間、総インキュベーション容量５００μlでインキュベートする。化合物Ｓ２４７９５は反応混合物中に１μM、１０μM、３０μMまたは１００μMの濃度で存在する。実施する実験によって、シナプトソームを１００nM  Ａβ４２の存在下またはビヒクルの存在下でもインキュベートする。反応を、氷上で維持した１mM  ＥＤＴＡの溶液１．５ml−カルシウムイオンＣａ２＋−クレブス−リンゲル液なしで希釈し、次いで１０分間１５０００ｇ、４℃で遠心分離することによって停止する。上清の除去後、得られたシナプトソームの沈降物を、０．５％ジギトニン、０．２％キレート化ナトリウムおよび０．５％ＮＰ−４０を含有する免疫沈降緩衝液（２５mM  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００mM  ＮａＣｌ、１mM  ＥＤＴＡ、５０μg／mlのロイペプチン、１０μg／mlのアプロチニン、２μg／mlのダイズトリプシンインヒビター、０．０４mM  ＰＭＳＦおよびプロテインホスファターゼインヒビターの混合物）２５０μl中に取り出す。氷上で維持した免疫沈降緩衝液７５０μlでシナプトソームを希釈し、そして４℃で遠心分離して不溶性残渣を除去した後、Ａβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体を抗Ａβ４２抗体を使用する免疫沈降によって単離し、その存在下で１６時間４℃でインキュベートし、そしてＡ／Ｇコンジュゲートアガロースビーズ２５μlの存在下での２時間のインキュベーションによって濃縮する（Cai et al. 1999, Wang et al. 2000, Jin et al. 2001）。
【００６２】
Ｉ．６）電気泳動およびウエスタンブロット
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）１mlおよび続く遠心分離での３回の洗浄の後、単離したＡβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体を５分間熱状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液（６２．５mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール、０．１％ブロモフェノールブルー）１００μl中に溶解する。次いで、複合体を８〜１６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルに入れる。
【００６３】
抗α７ｎＡＣｈＲモノクローナル抗体をウエスタンブロット分析において使用し、次いで化学発光によって可視化する。存在するＡβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の量に対する、その用量に応じての、化合物の効果を定量化するために、得られるバンドの強度をデンシトメトリーによって分析する。
【００６４】
Ｉ．７）抗アミロイド化合物
化合物Ｓ２４７９５を抗アミロイド剤として本発明によるエクスビボスクリーニング方法プロトコルにおいて使用する。
【００６５】
化合物Ｓ２４７９５は、認知プロセスの改善および／または加齢に関連する認知障害の対抗をすることができる記憶認知促進剤（facilitateur mnemocognitif）として使用されるピリジン化合物である。中枢コリン作動系に対して直接的に作用する記憶認知促進剤とは対照的に、化合物Ｓ２４７９５は、体温降下活性を欠いている。この活性は、神経変性疾患に罹患した患者の処置において厄介になりうる。
【００６６】
Ｉ．８機能回復方法
機能回復実験を、Ｉ．１に従う患者から得られるＩ．２に従う脳を使用して実施する。
【００６７】
Ｓ２４７９５（１０μM）での処理によってもたらされる機能回復を、α７およびＮＭＤＡ受容体を介するカルシウム流入を参照して評価する。これを、Ａβ４２に曝露（３０分間）したコントロール脳およびアルツハイマー病患者の脳に対して、Ｓ２４７９５での処理の１時間後に試験した。Ａβ４２（１μM）およびＳ２４７９５（１０μM）を使用する処理を、脳から得た皮質の切片に対して実施する。次いで、シナプトソームをＩ．４に記載のように調製する。α７およびＮＭＤＡ受容体を介するＣａ２＋流入を評価するために、シナプトソームを４５Ｃａ２＋（５μM）の存在下５分間３７℃でクレブス−リンゲル媒質中でインキュベートする。Ｃａ２＋流を、α７選択的α７ｎＡＣｈＲ受容体アゴニスト、ＰＮＵ２８２９８７（０．１、１および１０μM）の添加によって、およびＮＭＤＡＲ受容体についてＮＭＤＡ（０．１、１および１０μM）およびグリシン（１μM）の添加によってもたらす。反応を、ＥＧＴＡを含有するがカルシウムを含有しないクレブス−リンゲル（４℃）の添加によって停止する。２回の洗浄の後、シナプトソームをエタノール（９５％）中の超音波処理によって溶解し、そして放射能を液体シンチレーション分光法によって計数する。カルシウム流入の特異性をα７受容体の選択的阻害剤（αブンガロトキシン）およびＮＭＤＡ受容体の選択的阻害剤（ＡＰ−５）の添加によってチェックする。
【００６８】
ＩＩ．結果
結果は化合物Ｓ２４７９５の２つの型の効果を実証する。
【００６９】
第１に、スクリーニング方法は、脳抽出物にＡβペプチドを添加した場合、Ａβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の形成に関するＳ２４７９５（Ａβペプチドの前に添加）の予防的特性を同定することを可能にする。実際、図１からわかるように、非疾患ヒト皮質シナプトソームへのＡβペプチドの添加は、Ａβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の量の顕著な増加をもたらす。
【００７０】
Ｓ２４７９５をＡβペプチドの前にシナプトソームに添加する場合、形成されるＡβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の量は９２％低下し、これはＳ２４７９５（３０μM）がＡβペプチドによって引き起こされるこれらの複合体の形成を防止することを示す。
【００７１】
アルツハイマー病患者の皮質から得たシナプトソームにおいて、存在する複合体の量は、非疾患コントロールにおけるより２０倍高い。Ａβペプチドの添加は、疾患組織中に存在する複合体の量の増加を引き起こさず、ニコチン性受容体の全体は内因性Ａβペプチドによって既に飽和されている。この場合、スクリーニング方法は、Ｓ２４７９５の治癒的特性を同定することを可能にする。なぜなら、それは患者の死亡前に形成された複合体を解離するからである。Ｓ２４７９５は、疾患脳中に存在するＡβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の量の実質的な低下をもたらす。
【００７２】
図３に示す結果は、治癒的特性を有する化合物を同定するスクリーニング方法の能力を確認する。なぜなら、Ａβペプチドの添加なしで、この化合物は疾患ヒト組織中に既に存在する複合体の解離をもたらすことができるからである。実際、内因性Ａβペプチドの非存在下で、化合物Ｓ２４７９５は、１μMの濃度でさえ、疾患脳抽出物中に以前に存在するＡβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の約２２％の低下を引き起こす。この低下は１０、３０および１００μMの濃度のＳ２４７９５で実質的になり、非解離複合体は用量依存的に最高濃度で６３％のオーダーで低下する（ｐ＜０．０１  ２要因ＡＮＯＶＡ、続く多重比較のためのニューマン−クールス検定）。
【００７３】
従って、このスクリーニング方法は、一方で複合体の形成を防止でき（これは、化合物の作用が予防的である初期疾患ステージに適用可能である）、そして他方で既に存在する複合体を解離できる（これは化合物の作用が治癒的である進行したかまたはまことに重篤な疾患ステージに適用可能である）化合物を特異的に選択することを可能にする。
【００７４】
Ａβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の解離は、Ａβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の過剰なニューロン内蓄積を防止し、結果としてこれらの沈着物に起因するニューロン死に対抗する。
【００７５】
ヒト脳シナプトソームを使用する本発明によるスクリーニング方法の実施は、動物種とヒトとの間の差異に関連するアーティファクトおよび偽陽性を回避する。さらに、このスクリーニング方法のエクスビボ手順は、ニコチン性アセチルコリン受容体とのβアミロイドペプチドの複合体を解離できる化合物の同定において迅速性および反復可能性を達成することを可能にする。最後に、このスクリーニング方法は重篤な固定された固定されたステージのアルツハイマー病を表す生物材料を用いるので、従って、疾患の最終ステージで作用する化合物を選択しそして同定することを可能にする。本発明によるスクリーニング方法は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治癒的処置において使用することができる化合物を同定することを可能にする。
【００７６】
さらに、Ａβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の解離後の、可能な機能回復を評価するために、特定の実験を実施した。この実験は、Ｓ２４７９５によってもたらされるＡβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の解離が、α７ｎＡＣｈＲ受容体およびＮＭＤＡＲ型のグルタミン酸受容体の特定の機能性の回復を可能にすることを示す。コントロール対象のシナプトソームと比較して、アルツハイマー病患者のシナプトソーム中へのα７ｎＡＣｈＲおよびＮＭＤＡＲを介するカルシウムの流入は、事実、大いに低下する（コントロール値の３５％）（図５）。このカルシウムの流入の低下は、明らかにＡβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の形成に起因する。なぜなら、コントロール対象の脳切片へのＡβの添加は、患者のものに匹敵するレベルのカルシウムの流入の低下をもたらすからである。コントロール脳におけるＡβの作用に対抗することによる、Ｓ２４７９５での処理は、このＣａ２＋流入の実質的な再建を示す。
【００７７】
より顕著には、アルツハイマー病患者において既に形成された複合体の、Ｓ２４７９５での処理は、非処理アルツハイマー病患者の脳に比較して７５％のオーダーのＣａ２＋流入の実質的な増加をもたらす。図５は、アルツハイマー病患者およびＡβで前処理したコントロールの脳の、Ｓ２４７９５での処理後に、Ｃａ２＋流入がＡβなしのコントロール値の約６５％に対応する匹敵するレベルに到達することを示す。
【００７８】
従って、この実験によって、アルツハイマー病患者から得た疾患組織におけるＡβ４２−α７ｎＡＣｈＲ複合体の、Ｓ２４７９５によってもたらされる解離が、特定の細胞機能性の死後の回復（この特定の場合、カルシウム流入）を可能にすることが実証される。
【００７９】
従って、この実験は、このスクリーニング方法の治療的価値を強調する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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