(57)【要約】  本開示は、対象とする遺伝子産物を生成するための核酸ベースのベクターとしての線形発現カセット（ＬＥＣ）に関する。開示されるＬＥＣを調製する方法、および対象において遺伝子産物を発現するためのその使用方法も記載される。ＬＥＣは、免疫がある状態等、対象において治療および／または免疫反応を引き起こすように、動物またはヒト対象において使用され得る。
2010511406.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線形発現カセット（ＬＥＣ）であって、ｉ）プロモータに作動式に連結される、発現最適化ＤＮＡコード配列と、ｉｉ）前記ＬＥＣのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）媒介の増幅のための末端プライマ配列と、を含む、線形発現カセット（ＬＥＣ）。
【請求項２】
線形発現カセット（ＬＥＣ）であって、ｉ）プロモータに作動式に連結される、動物またはヒト対象における発現時に免疫反応を引き起こす抗原、またはその断片をコードする、発現最適化ＤＮＡコード配列と、ｉｉ）前記ＬＥＣのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）媒介の増幅のための末端プライマ配列と、を含む、線形発現カセット（ＬＥＣ）。
【請求項３】
前記抗原、またはその断片は、病原体のものであり、前記動物またはヒト対象における発現時に保護免疫反応を引き起こす、請求項２に記載のＬＥＣ。
【請求項４】
前記コード配列は、患者特有の抗イディオタイプ生成物、抗原またはその断片を含む融合タンパク質、もしくは抗原のコンカテマーをコードする、請求項１に記載のＬＥＣ。
【請求項５】
線形発現カセット（ＬＥＣ）であって、ｉ）診断試薬をコードし、プロモータに作動式に連結される、発現最適化ＤＮＡコード配列と、ｉｉ）前記ＬＥＣのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）媒介の増幅のための末端プライマ配列と、を含む、線形発現カセット（ＬＥＣ）。
【請求項６】
前記抗原、またはその断片は、分泌シグナルを含む、請求項２に記載のＬＥＣ。
【請求項７】
前記プロモータは、超ら旋非依存性であるか、真核細胞における線形鋳型上のＣＭＶプロモータより強力であるか、真核細胞における線形鋳型上のＣＭＶプロモータより脆弱であるか、または１つ以上の調節要素を含む、請求項１に記載のＬＥＣ。
【請求項８】
前記プロモータと前記コード配列との間に非コード配列をさらに含む、請求項１または７に記載のＬＥＣ。
【請求項９】
エクソヌクレアーゼ分解に抵抗する５′部分をさらに含む、請求項１に記載のＬＥＣ。
【請求項１０】
タンパク性核局在化シグナル（ＮＬＳ）、または
細胞の核またはミトコンドリアへ前記ＬＥＣの送達を誘導する核酸部分をさらに含む、請求項１に記載のＬＥＣ。
【請求項１１】
ＤＮＡ骨格において１つ以上のホスホロチオエート連結をさらに含む、請求項１に記載のＬＥＣ。
【請求項１２】
ＬＥＣに取り外し可能に結合する粒子、ビーズ、ポリマー、または浮遊可能な固体支持体とともに、ＬＥＣを含む組成物であって、前記ＬＥＣが、ｉ）プロモータに作動式に連結されるＤＮＡコード配列と、ｉｉ）ＬＥＣのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）媒介の増幅のための末端プライマ配列と、を含む、組成物。
【請求項１３】
脂質小胞担体および発現最適化ＬＥＣを含む組成物であって、前記ＬＥＣが、ｉ）プロモータに作動式に連結されるＤＮＡコード配列と、ｉｉ）ＬＥＣのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）媒介の増幅のための末端プライマ配列と、を含む、組成物。
【請求項１４】
前記脂質小胞担体は、カチオン性脂質、および中性脂質を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記カチオン性脂質は、ＶＣ１０５２であり、前記中性脂質は、約１：１のモル比における、ＤＰｙＰＥである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ＬＥＣ対総脂質の前記モル比は、約８：１〜約１：８、または脂質の割合が高い、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記小胞は、前記ＬＥＣに結合するリポソームである、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ｉ）プロモータに作動式に連結されるＤＮＡコード配列と、ｉｉ）ＬＥＣのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）媒介の増幅のための末端プライマ配列と、を含む、約１ナノグラム〜約５ミリグラムの線形発現カセット（ＬＥＣ）、および
薬学的に許容される担体または賦形剤、ならびに任意にアジュバントを含む、
単位用量製剤または組成物。
【請求項１９】
核酸鋳型のＰＣＲ増幅によって生成される線形発現カセット（ＬＥＣ）であって、ｉ）プロモータに作動式に連結される、発現最適化ＤＮＡコード配列と、ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための末端プライマ配列と、を含む、線形発現カセット（ＬＥＣ）。
【請求項２０】
動物またはヒト対象において免疫反応を引き起こす方法であって、前記方法は、
請求項１から１９のうちのいずれか１項に記載のＬＥＣまたは組成物を投与するステップ、を含む、方法。
【請求項２１】
植物対象においてＬＥＣを発現させる方法であって、前記方法は、
請求項１から１９のうちのいずれか１項に記載のＬＥＣまたは組成物を投与するステップ、を含む、方法。
【請求項２２】
線形カセット（ＬＣ）であって、ｉ）動物またはヒト対象に導入される時、免疫反応を引き起こし、プロモータに作動式に連結される免疫刺激モチーフと、ｉｉ）前記ＬＣのポリメラーゼ連鎖反応（ｐｃｒ）媒介の増幅のための末端プライマ配列と、を含む、線形カセット（ＬＣ）。
【請求項２３】
核酸鋳型のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって生成される、線形カセット（ＬＣ）であって、ｉ）プロモータに作動式に連結されるＣｐＧモチーフと、ｉｉ）ＰＣＲのための末端プライマ配列と、を含む、線形カセット（ＬＣ）。
【請求項２４】
線形発現カセット（ＬＥＣ）と線形カセット（ＬＣ）とを含む免疫刺激組成物であって、
ｉ．）核酸鋳型のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって生成される線形発現カセット（ＬＥＣ）であって、ａ）プロモータに作動式に連結される発現ＤＮＡコード配列と、ｂ）ＰＣＲのための末端プライマ配列と、を含む、線形発現カセット（ＬＥＣ）と、
ｉｉ．）線形カセット（ＬＣ）であって、ｉ）動物またはヒト対象に導入される時、免疫反応を引き起こし、プロモータに作動式に連結される免疫刺激モチーフと、ｉｉ）ＬＣのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）媒介の増幅のための末端プライマ配列と、を含む、線形カセット（ＬＣ）と、
を含む、免疫刺激組成物。
【請求項２５】
線形発現カセット（ＬＥＣ）であって、ｉ）動物またはヒト対象における発現時に免疫反応を引き起こす抗原、またはその断片をコードし、プロモータに作動式に連結されるＤＮＡコード配列と、ｉｉ）前記ＬＥＣのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）媒介の増幅のための末端プライマ配列と、を含み、前記ＬＥＣは、ＤＮＡ骨格において１つ以上のホスホロチオエート連結をさらに含む、線形発現カセット（ＬＥＣ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
他の出願への相互参照
本出願は、２００６年１２月４日出願の米国暫定出願第ＵＳ６０／８６８，４９６号に対する優先権の利益を主張するものであり、その開示は、参照することにより本明細書に完全に組み込まれる。
【０００２】
政府援助研究および開発に基づく発明に対する権利の陳述
本明細書に記載される一部の研究は、ＤＡＲＰＡ助成、Ｗ９１１ＮＦ−０５−１−０５４５によって部分的に援助された。米国連邦政府は、開示される発明において、一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、核酸ベースの発現ベクターとしての線形発現カセット（ＬＥＣ）、およびＬＥＣを調製する方法に関する。本開示は、動物またはヒト対象等の対象において、コードされた遺伝子産物を発現させ、そこで治療および／または免疫反応を引き起こすためのＬＥＣの使用も含む。したがって、ＬＥＣの範囲は、対象において、治療および／または免疫療法反応、または免疫がある状態をもたらすためのそれらの使用を含む。
【背景技術】
【０００４】
ＤＮＡワクチンは、いくつかの動物モデルにおいて、感染性疾患の兆候において有効であることが証明されており、その感染性疾患の数は増え続けている。その動物モデルは、マウス（Ｃｈｅｎらの「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９９９，８０（Ｐｔ１０），２５５９−２５６４、Ｄａｖｉｓらの「Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｏｒｓｅ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａ  ｎｏｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙｓ．」Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００１，７５（９），４０４０−４０４７、ＭａｒｇａｌｉｔｈおよびＶｉｌａｌｔａの「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒａｂｉｅｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｉｔｅｒｓ  ａｆｔｅｒ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｐＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ．」Ｇｅｎｅｔ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６，４，２）、ウサギ（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎらの「Ａ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ  ａｎｔｈｒａｘ  ｓｐｏｒｅｓ．」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００４，１０１（３７），１３６０１−１３６０６）、イヌ（Ｂａｈｌｏｕｌらの「Ｆｉｅｌｄ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ａ  ｖｅｒｙ  ｐｏｔｅｎｔ  ｒａｂｉｅｓ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｗｈｉｃｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｏｎｇ  ｌａｓｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｏｇｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．」Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００６，２４（８），１０６３−１０７２、Ｌｏｄｍｅｌｌらの「Ｃａｎｉｎｅ  ｒａｂｉｅｓ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｓｅ  ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｅａｒ  ｐｉｎｎａｅ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．」Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００３，２１（２５−２６），３９９８−４００２、Ｌｏｄｍｅｌｌらの「Ｏｎｅ−ｔｉｍｅ  ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅａｒ  ｐｉｎｎａｅ  ｏｎｅ  ｙｅａｒ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｄｏｇｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ．」Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００６，２４（４），４１２−４１６）、サル（Ｌｏｄｍｅｌｌらの「ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ．」Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９８，４（８），９４９−９５２）、フェレット（Ｗｅｂｓｔｅｒらの「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｒｒｅｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ．」Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９４，１２（１６），１４９５−１４９８）、魚類（Ｃｏｒｂｅｉｌらの「Ｆｉｓｈ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ：ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｒｏｕｔｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ．」Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００，１０（８），７１１−７２３、Ｋｕｒａｔｈ，Ｇ．の「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｒｅｃｅｎｔ  ＤＮＡ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｆｉｓｈ．」Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ（Ｂａｓｅｌ）２００５，１２１，２０１−２１３）、およびウマ（Ｄａｖｉｓら、Ｆｉｓｃｈｅｒらの「Ｒａｂｉｅｓ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｒｓｅ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．」Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００３，２１（３１），４５９３−４５９６）を含む。現在、ＤＮＡワクチンは、特に、ＨＩＶ、マラリア、西ナイルウイルス、ＣＭＶ、ＳＡＲＳ、およびエボラを含む広範囲の兆候に対して、ヒトにおける安全性および有効性に関して試験されている。
【０００５】
さらなる例として、マウスにおけるプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）接種後のインフルエンザＡに対する保護反応が、１９９３年に初めて報告された（Ｕｌｍｅｒらの「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｂｙ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３，２５９（５１０２），１７４５−１７４９、Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｌｅｔｈａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ．」Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９３，１１（９），９５７−９６０、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙらの「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖｅｃｔｏｒｓ．ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９３，１２（９），７７７−７８３）。
【０００６】
インフルエンザに対するＤＮＡワクチンが望ましい。呼吸管の感染性の高い病気であるインフルエンザは、オルソミクソウイルス科のＲＮＡウイルスによって引き起こされる（ＫｎｉｐｅおよびＨｏｗｌｅｙ）。主に３種類のインフルエンザウイルス、すなわち、Ａ、ＢおよびＣがある。構造的には、インフルエンザＡおよびＢは類似するが、インフルエンザＣは、表面抗原の異なるパターンを示す。インフルエンザの大発生は、インフルエンザＡまたはＢに付随するが、Ｃ型ウイルスの感染は、軽度の症状を伴う。
【０００７】
疾病管理予防センターによると、毎年、米国人の５〜２０％がインフルエンザに罹患し、感染からの合併症により年間約３万６千人の死亡が見られる。６０年以上にわたり、認可されたインフルエンザワクチンが利用可能であるにもかかわらず、インフルエンザは、米国において、上位７つの主要な死因に入り、未だに、インフルエンザ感染に対するも最も効果的な保護は、予防接種である。ウイルス表面抗原の小さな周期的変化（抗原連続変異）は、季節ごとに新規ワクチンの開発を必要とする。また、ウイルス表面タンパク質の大きな変化（抗原不連続変異）は、世界的流行を引き起こす可能性がある強毒性の菌株を生じ得る。動物におけるインフルエンザの発生は、新規ウイルス菌株をもたらす、動物およびヒトインフルエンザウイルスゲノムの転換により、世界的流行の可能性を増加させる。現在、鳥インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）の死をもたらす菌株の拡大により、潜在的世界的流行に対する懸念が高まっているため、予防接種戦略を再評価する結果となった。強毒性のインフルエンザ菌株の発生の封じ込めを成功させるためには、多量のワクチンの急速な製造を必要とすることが明らかとなった。
【０００８】
既報のデータでは、インフルエンザのヌクレオカプシド（ＮＰ）（Ｕｌｍｅｒら）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）またはヘマグルチニン（ＨＡ）（Ｃｈｅｎら）のいずれかをコードするｐＤＮＡの接種が、マウスにおける保護反応を誘導できることを示すが、保護はいくらかマウス系統による場合がある。報告では、フェレットおよび非ヒト霊長類の両方に、ｐＤＮＡから発現するインフルエンザ遺伝子を使用して、うまく接種できることも示す（Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｄｏｎｎｅｌｌｙらの「Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｒｉｆｔ  ｉｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ．」Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９５，１（６），５８３−５８７、Ｄｏｎｎｅｌｌｙらの「Ｆｕｒｔｈｅｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｒｉｆｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ａ  ｆｅｒｒｅｔ  ｍｏｄｅｌ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．」Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９７，１５（８），８６５−８６８）。その分野での一致した意見は、ＨＡに対する抗体反応が最も重要である（Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．およびＨｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１）ということだが、高度に保存されたＮＰ、Ｍ１およびＭ２タンパク質等の他の抗原を含めることによって、細胞性免疫の発展による、遺伝的浮動に対する保護を提供することができる可能性がある。
【０００９】
また、インフルエンザＡ感染に対する保護は、強い体液性反応を必要とする。ＰＢＳ中のｐＤＮＡの筋肉内注入は、強力であるが比較的低い細胞抗体反応を引き起こすことが示されている。したがって、強いＢ細胞反応を促進する製剤の使用は、核酸ベースのインフルエンザワクチンの性能を改善することが期待される。ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥおよびバクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））等の、カチオン性脂質系と、免疫原をコードするＤＮＡを錯化させることにより、ＰＢＳ中のＤＮＡによって引き起こされる体液性反応を潜在的に強化する。例えば、Ｈａｒｔｉｋｋａおよび共同研究者（「Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００１，１９（１５−１６），１９１１−１９２３）は、ＰＢＳ中のｐＤＮＡで得られた力価と比較して、バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））でｐＤＮＡを調製した場合、インフルエンザＡ  ＮＰに対する２０倍の抗体価の増加を得た。バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））製剤による免疫反応の強化は、低用量のＤＮＡ（ＭａｒｇａｌｉｔｈおよびＶｉｌａｌｔａ）を投与する場合、さらに顕著となり、これは、有意な投与量の節約に結び付く可能性がある。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎおよび共同研究者（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら）によって証明されるように、カチオン性脂質製剤は、保護免疫反応を有意に強化することができる。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎらは、ｐＤＮＡ−ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥまたはｐＤＮＡ−バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））ワクチンのいずれかでの免疫付与の後、致死量のエアロゾル化された炭疽菌の胞子からウサギの保護に成功したことを報告した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
インフルエンザに対する予防接種が、最も費用効率が高い方法として報告されているが、現在認可されているインフルエンザワクチンの開発および製造は、遅く、信頼性が低いと証明された技術の使用を必要とするため、潜在的に急変し、拡大する世界的流行の攻撃に対応するためには十分ではない。インフルエンザワクチンの急速な製造に対する必要条件を満たし得る、１つの潜在的技術は、ｐＤＮＡである。しかし、医薬品等級のｐＤＮＡの生成は、細菌発酵と、その後の長期にわたる精製および大規模な品質管理試験を必要とする。微量の抗生物質および他の発酵成分が精製後に残る場合があるという、いくつかの懸念もある。核酸ワクチンを、小分子合成過程により類似した無細胞系を使用して生成することができ得ることが理想である。
【００１１】
本明細書の文献の引用は、いかなる文献も関連する従来技術であるということの承認として意図するものではない。日付に関するすべての声明、または文献の内容に関する説明は、入手可能な情報に基づくものであり、これらの文献の日付または内容の正確性に関するいかなる承認をも構成するものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は、共有結合した環状プラスミドＤＮＡまたはｐＤＮＡとは対照的な、線形ＤＮＡ、または線形発現カセット（ＬＥＣ）、または線形非発現ＤＮＡカセット（ＬＣ）の使用を目的とする。ＬＥＣによって提供される利点として、無細胞過程による生成でき、および抗生物質抵抗性遺伝子、複製起点、およびＬＥＣでコードされた遺伝子産物の発現に無関係の他の配列が必要ないことが挙げられる。ある線形ＤＮＡの生成方法の他の潜在的利点として、本開示の一部の実施形態において、ＬＥＣでコードされた遺伝子産物が、免疫療法反応、または免疫の状態であり得る免疫反応を引き起こす抗原である場合等、明確で簡素な反応の使用、精製の簡便性及びそれによる速いワクチン生成が挙げられる。別の実施形態において、ＬＥＣは、インスリン、赤血球生成促進因子、または凝固因子ＩＶ等の治療用タンパク質をコードする遺伝子を含み得、注入された組織で発現する際、糖尿病患者においてグルコース代謝を是正する、貧血の対象において赤血球数を増加させる、または血友病患者において血液凝固を促進する等の治療効果を、それぞれ導くことができる。
【００１３】
第１の態様において、本開示は、プロモータに作動式に連結される、発現最適化ＤＮＡコード配列と、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）媒介の増幅のためのＬＥＣの各末端にある末端プライマ配列と、を有するＬＥＣを含む。本開示の実施形態は、コードされた（１又は複数の）ポリペプチドの発現を増加または改善する、発現最適化コード配列を含む。限定されない例としては、発現が所望される、宿主または宿主細胞に対する部分的または完全なコドン最適化、および／または予測二次構造を除去するための遺伝コードの縮退内における配列の変異が挙げられる。部分的なコドン最適化は、コード配列における１つ以上のコドンの変異を含み得、該変異は、コードされた配列の発現を増加または改善する。他の限定されない例としては、糖鎖付加部位の挿入、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）共役が挙げられる。さらに限定されない例としては、コードされた（１又は複数の）ポリペプチドに影響を与えない置換による、暗号スプライス供与または受容部位、有害部位、カイ構造、および／またはＧ／ＣもしくはＡ／Ｔ含有量が高い領域の除去が挙げられる。
【００１４】
一部の実施形態において、ＬＥＣは、コードされた配列の発現を容易にする、シスにおける１つ以上の成分をさらに含み得る。そのような成分の限定されない例としては、プロモータに作動式に連結される調節配列、ポリアデニル化シグナル、および／またはＬＥＣによる、コードされた遺伝子産物の発現の増加または改善によって反映されるもの等のＬＥＣの分解を減少または低減させる１つ以上の保護機能が挙げられる。場合によっては、保護機能は、ＬＥＣの一部となる、ホスホロチオエートで修飾されたオリゴヌクレオチドプライマおよび／または線形ＬＥＣ  ＤＮＡ分子の末端へのヘアピン型オリゴヌクレオチドの連結反応より選択される。
【００１５】
開示されるＬＥＣは、有利にも、その中に存在するコード配列の種類または長さによって限定されない。配列は、ＬＥＣの本来の目的に適切なように、ＲＮＡ分子またはポリペプチドをコードし得る。一部の実施形態において、遺伝子産物は、アンチセンス配列、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、またはミクロＲＮＡ等のＲＮＡ分子である。他の実施形態において、コードされた遺伝子産物は、宿主生物において発現する際に免疫反応を引き起こすポリペプチドを有益にコードする。限定されない例としては、コードされた遺伝子産物が、動物またはヒト対象における発現時に免疫反応を引き起こす抗原、またはその断片であるＬＥＣが挙げられる。さらなる実施形態において、遺伝子産物は、ＬＥＣが導入される細胞または生物によって生成される内因性（または「自己」）ポリペプチドまたはＲＮＡである。限定されない例としては、治療効果を有するポリペプチドまたはＲＮＡが挙げられる。したがって、本開示のＬＥＣは、治療用ＬＥＣであり得る。
【００１６】
場合によっては、免疫反応は、その抗原またはその断片を発現する生物に対して保護的である。したがって、免疫反応は、一部の実施形態において、免疫の状態であり得る。本開示は、抗原が、感染性細菌またはウイルス等の病原因子のものである、実施形態を含む。病原微生物の限定されない例としては、感染性細菌、菌類、および単細胞真核生物が挙げられる。当然のことながら、本明細書に開示される抗原の断片は、記載される免疫反応を引き起こす１つ以上の抗原決定基を含有し得る。
【００１７】
追加の実施形態において、開示されるＬＥＣのコード配列は、患者特有の抗イディオタイプ生成物、抗原またはその断片を含む融合タンパク質、または抗原またはその断片のコンカテマー等のポリペプチドのコンカテマーをコードする。
【００１８】
任意に、本開示のＬＥＣは、二価または多価（または複数の価数の）遺伝子産物をコードし得るため、それを発現することが可能となり得る。したがって、遺伝子産物は、動物またはヒト対象における発現後等の生物学的環境において、２つ以上の結合パートナーと反応または相互作用することが可能となるように、２以上の価数を有する。一部の実施形態において、結合パートナーは、抗体またはその断片、細胞表面受容体または分子、抗原またはその断片、または動物またはヒト対象の細胞もしくは組織内またはその上にある他の生体基質であり得る。
【００１９】
二価または多価ＬＥＣは、２つ以上の結合パートナー分子との（１又は複数の）反応または（１又は複数の）相互作用を可能にする２つ以上のドメインまたは抗原決定基を有する、コードされた遺伝子産物に単に基づくだけもよい。限定されない例は、病原因子の抗原であり、該抗原は、２つ以上の抗体、または抗体と（１又は複数の）細胞表面受容体および細胞表面抗体等の、２つ以上の生体分子と相互作用する多重ドメインまたは抗原決定基を有し得る。他の実施形態において、遺伝子産物は、通常、単一リーディングのオープンリーディングフレームにおいて共存しない配列を含む、融合またはキメラポリペプチドまたは核酸分子である。配列は、互いに対して異種とみなされ得る。
【００２０】
さらに、二価または多価ＬＥＣは、ＬＥＣにおける２つ以上のコード領域の存在、そして発現に基づいてもよい。他の実施形態において、価数の増加は、結合パートナーとの反応または相互作用のための２つ以上のドメインまたは抗原決定基を有する遺伝子産物をコードするコード領域の存在、次いで発現に基づく。
【００２１】
さらに、本開示のＬＥＣは、本明細書に記載されている２つ以上のＬＥＣのコンカテマーの形態であり得る。一部の実施形態において、コンカテマーは、コードされた遺伝子産物を発現させるためのＬＥＣの使用の前に形成され得る。他の実施形態において、ＬＥＣは、細胞または生物においてコンカテマーとなるモノマーとして、細胞または生物に導入され得る。代替的な実施形態において、導入されたＬＥＣは、モノマーとコンカテマーの混合物であり得る。
【００２２】
第２の態様において、本開示は、本明細書に記載されているＬＥＣに取り外し可能に結合する、粒子、ビーズ、ポリマーまたは浮遊可能な固体支持体を含む組成物を含む。したがって、一部の実施形態において、ＬＥＣは、プロモータに作動式に連結されるＤＮＡコード配列と、ＬＥＣのＰＣＲ媒介の増幅のための末端プライマ配列と、を含む。この態様において、ＬＥＣは、共有結合および／または非共有結合手段を介して、粒子、ビーズ、ポリマーまたは浮遊可能な固体支持体に結合し得る。一部の実施形態において、粒子またはビーズは、ＬＥＣとの結合の前に、金および／またはタングステンで作製されるか、またはコーティングされ得る。結合は、浮遊可能な固体支持体とのＬＥＣの特異的または非特異的共役を含む。付加的な実施形態は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）またはカチオン性ＳＬＮ（例えば、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２００６，６２（２）：１５５−６２を参照）、ゼラチンナノ粒子（例えば、Ｚｗｉｏｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２００５，７（４）：２２−８を参照）、ナノ粒子（例えば、Ｐｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．ＭｏＬ  Ｖｉｓ．２００６，１２：６０６−１５を参照）、および磁性粒子またはビーズ（例えば、Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９１，２７８（Ｐｔ．Ｂ）：７３５−４０を参照）を含む。さらなる実施形態は、市販の「遺伝子銃（gene gun）」等の遺伝子銃（biolistc）送達システムとの併用に適切または適合する固体支持体を含む。
【００２３】
さらなる実施形態において、ＬＥＣは、ＬＥＣを合成するために使用されるプライマの５′末端を介して、浮遊可能な固体支持体に付着し得る。場合によっては、プライマは、ＬＥＣを生成するためのＰＣＲ反応において使用されるものである。一部の実施形態において、プライマは、本開示のＬＥＣを生成するための重合反応におけるその使用の前に、固体支持体に付着される。重合反応は、ポリメラーゼ媒介であるか、またはデノボ合成によって行われ得る。
【００２４】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示されるＬＥＣに結合する担体を含む、組成物を含む。担体の限定されない例としては、イオン相互作用を介して、ＬＥＣと錯化することができるモノまたはポリカチオン性分子が挙げられる。一部の実施形態において、カチオン性分子は、担体が、カチオン性脂質を含む脂質小胞またはリポプレックスとなるように、カチオン性脂質である。他の実施形態において、カチオン性分子は、担体が、カチオン性ポリマーを含むポリプレックス担体となるように、ポリマーまたはポリペプチドである（例えば、Ｋｏｄａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６，１３（１８）：２１５５−６１を参照）。
【００２５】
本開示の組成物は、担体、およびプロモータに作動式に連結されるＤＮＡコード配列と、ＬＥＣのＰＣＲ媒介の増幅のための末端プライマ配列と、を含む、発現最適化ＬＥＣであるＬＥＣ、とを含み得る。代替的な組成物は、発現のために最適化されないＬＥＣを含む。さらなる実施形態において、組成物は、賦形剤、アジュバント、安定剤、および／または本明細書に記載されている担体であり得る薬学的に許容される担体とともに単位剤形で処方される。
【００２６】
組成物の脂質小胞担体は、それらに限定されないが、カチオン性脂質および／または中性脂質等の小胞の形成に適切な脂質を含有し得る。小胞の限定されない例としては、ミセルおよびリポソームを含む単層小胞、および多重膜小胞（ＭＬＶ）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態において、小胞は、任意に等モル量で、カチオン性および中性脂質の両方を含有する。場合によっては、カチオン性脂質は、ＶＣ１０５２であり、中性脂質は、ＤＰｙＰＥである。
【００２７】
本開示の実施形態は、小胞のルーメン内にＬＥＣを含有する脂質小胞担体、および脂質層または担体の外部に結合するＬＥＣを有する脂質小胞担体を含む。当然のことながら、そのような担体の組み合わせも、本開示の範囲内である。組成物におけるＬＥＣ対カチオン性脂質または総脂質のモル比は、約８：１〜約１：８であり、または脂質の割合がさらに高い場合がある。一部の実施形態において、モル比は、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、または約１：７である。
【００２８】
本開示のＬＥＣまたはＬＥＣ含有組成物は、保存または安定性を高める目的等で、任意に凍結乾燥またはガラス化される。凍結乾燥（フリーズドライ）およびガラス化（氷晶の形成を伴わない、ガラス様凍結固体の形成）は、当業者に周知の任意の手段で行われ得る。
【００２９】
さらなる態様として、本開示は、ＰＣＲの使用による、ＬＥＣの作製または増幅するための方法、およびそれによって生成される生成物であるＬＥＣを含む。ＰＣＲは、当業者に周知の熱サイクルまたは等温手段によって行われ得る。したがって、限定されない一実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるＬＥＣの配列を含有する核酸鋳型のＰＣＲ増幅によって生成されるＬＥＣを含む。場合によっては、鋳型は、ｉ）プロモータに作動式に連結される発現最適化ＤＮＡコード配列と、ｉｉ）ＰＣＲのための末端プライマ配列と、を含む。ＬＥＣのＰＣＲ媒介生成の選択は、ｐＤＮＡの酵素消化等のＬＥＣを生成するための他の報告された方法とは、はっきりと異なる。
【００３０】
一部の実施形態において、動物、ヒト、または植物対象において、ＬＥＣでコードされた遺伝子産物を発現するための方法が開示される。他の実施形態は、動物またはヒト対象において免疫反応を引き起こすための方法である。そのような方法は、限定されない例として、注入またはミクロ粒子送達等によって、開示されるＬＥＣまたは組成物を対象に投与するステップを含み得る。場合によっては、注入は、対象への筋肉注入である。
【００３１】
他の実施形態において、動物またはヒト対象を治療するための方法が開示され、該治療は、治療において使用される活性薬剤と組み合わせたアジュバントとしての開示されるＬＥＣまたはＬＣ（発現を有しない線形カセット）の投与を含む。ＬＥＣまたはＬＣは、それに限定されないが、ＣｐＧモチーフ等の治療用モチーフを挿入することによって、その治療効果を増加させるように、さらに改変され得る。活性薬剤は、小有機分子、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、非核酸ベースの薬物、またはワクチン等の抗原であり得る。ＬＥＣおよび活性薬剤は、共投与、または任意の順序で連続的に投与され得る。ＬＥＣおよび活性薬剤の一方または両方の反復投与も、本開示の範囲内である。付加的な送達方法が、本明細書に開示される。
【００３２】
付加的な実施形態の詳細は、添付図面および以下の説明において記載される。実施形態の他の特色、目的、および利点は、図面および詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本開示の説明のための、限定されない線形発現カセットを描く図である。ＰＣＲ生成された線形ＤＮＡを、線形化ｐＤＮＡ鋳型に対して示す。発現カセットは、ヒトＣＭＶプロモータとイントロンＡ、インフルエンザＡ血球凝集素（ＨＡ）ＯＲＦ、およびウサギベータグロビン（ＲＢＧ）ターミネータを含有する。ｐＤＮＡ鋳型におけるカナマイシン耐性（Ｋａｎ1）遺伝子も示される。
【図２】ＬＥＣの生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）における特性化を示す図である。（Ａ）の部分は、Ｈ３ＨＡおよびＨ１ＨＡ  ＬＥＣを表す代表的なアガロースゲルを示す。レーン１はＨ３ＨＡ−ＬＥＣ、レーン２はＭＯＤ−Ｈ３ＨＡ−ＬＥＣ、レーン３はＨ１ＨＡ−ＬＥＣ、レーン４はＭＯＤ−Ｈ１ＨＡ−ＬＥＣであり、Ｍと標識されるレーンは、ＤＮＡラダーを含有する。（Ｂ）の部分は、ＬＥＣとともにマウスメラノーマ細胞をトランスフェクションし、その後、細胞溶解物のウエスタンブロット分析を行うことによって試験されたＬＥＣおよびＭＯＤ−ＬＥＣの生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）活性を示す図である（本明細書の実施例１を参照）。交差反応ＨＡバンドは、矢印で示される。
【図３】ＰＢＳで処方されたＬＥＣでの接種の平均的結果を示す図である。マウス（ｎ＝１５）に、０および２１日目に、５０μｇのＨ３ＨＡ−ＬＥＣまたはＨ１ＨＡ−ＬＥＣのいずれかを接種した。Ｈ３ＨＡ−ｐＤＮＡ（１００μｇ）およびＰＢＳのみの群を、それぞれ、陽性および陰性対照として含めた。マウスは、本明細書の実施例１に記載されるように、４２日目に、致死量のマウス適合インフルエンザＡ／ＨＫ／８／６８（Ｈ３Ｎ２）で攻撃した。攻撃後の生存率データが（Ａ）の部分に提示され、また、平均的群の重量が（Ｂ）の部分に示される。
【図４】バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＬＥＣでの接種の平均的結果を示す図である。マウス（ｎ＝１０）に、０および２１日目に、ＰＢＳで処方されたＨ３ＨＡ−ＬＥＣ（５０μｇ）、またはバクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＨ３ＨＡ−ＬＥＣ（５０μｇ）、またはバクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＭＯＤ−Ｈ３ＨＡ−ＬＥＣ（５０、１０および２μｇ）のいずれかを接種した。加えて、バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＨ３ＨＡ  ｐＤＮＡ（１００μｇ）およびＰＢＳ群を、それぞれ、陽性および陰性対照として含めた。マウスは、本明細書の実施例１に記載されるように、４２日目に、マウス適合インフルエンザＡ／ＨＫ／８／６８（Ｈ３Ｎ２）で攻撃した。攻撃後の生存率データが（Ａ）の部分に提示され、平均的群の重量が（Ｂ）の部分に示される。
【図５】バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＬＥＣの単回投与の平均的結果を示す図である。ＬＥＣワクチンを、０日目に投与し、マウス（ｎ＝１０）は、本明細書の実施例１に記載されるように、４２日目に攻撃した。群は、ＰＢＳで処方されたＨ３ＨＡ−ＬＥＣ（５０μｇ）、またはバクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＨ３ＨＡ−ＬＥＣ（５０μｇ）、またはバクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＭＯＤ−Ｈ３ＨＡ−ＬＥＣ（５０、１０および２μｇ）を含んだ。加えて、バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＨ３ＨＡ  ｐＤＮＡ（１００μｇ）、およびＰＢＳ群を、それぞれ、陽性および陰性対照として含めた。生存および重量データは、それぞれ、（Ａ）および（Ｂ）の部分に示される。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
概要
本明細書に記載されているＬＥＣは、標的細胞または宿主生物においてコードされた遺伝子産物を生成するための発現基盤として使用され得る。一部の実施形態において、ＬＥＣは、宿主動物において免疫反応を誘導、促進、または引き起こすための方法として、遺伝子産物を発現するために使用される。他の実施形態において、発現した遺伝子産物は、限定されない例として、治療用ポリペプチドまたはｓｉＲＮＡ、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド等のＲＮＡである。他の実施形態において、動物またはヒト対象を治療するための方法が開示され、該治療は、治療において使用される活性薬剤と組み合わせたアジュバントとしての開示されるＬＥＣまたはＬＣ（発現を有しない線形カセット）の投与を含む。ＬＥＣまたはＬＣは、それに限定されないが、ＣｐＧモチーフ等の治療用モチーフを挿入することによって、その治療効果を増加させるように、さらに改変され得る。活性薬剤は、小有機分子、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、非核酸ベースの薬物、またはワクチン等の抗原であり得る。ＬＥＣおよび活性薬剤は、共投与、または任意の順序で連続的に投与され得る。ＬＥＣおよび活性薬剤の一方または両方の反復投与も、本開示の範囲内である。さらに他の実施形態において、ＬＥＣ自体、アジュバントとして機能し得る。後者において、ＰＣＲ生成されたＬＥＣは、熱ショックタンパク質、組織適合タンパク質、またはサイトカイン等の、アジュバント活性を有する多数のタンパク質のいずれか１つを発現するように設計される場合がある。そのようなＬＥＣは、抗原を共発現するか、または（１又は複数の）抗原をコードする１つ以上の付加的ＬＥＣ、または非ＬＥＣタンパク質、炭水化物または脂質抗原、もしくは不活性化、分裂または弱毒化ワクチンで共投与される場合もある。後者の実施形態において、ＰＣＲ生成されたＬＣ  ＤＮＡは、それ自体、（１又は複数の）抗原をコードする１つ以上の付加的なＬＥＣ、または非ＬＥＣタンパク質、炭水化物または脂質抗原、もしくは不活性化、分裂または弱毒化ワクチンで共投与することができるアジュバントである。付加的な送達方法が、本明細書に開示される。
【００３５】
場合によっては、本開示のＬＥＣは、病原因子または病状に応じて、効果的なワクチンまたは治療剤の急速な生成の一部として使用される。急速な生成への適応性は、遅い技術に依存し、新興疾患の発生または急速に進行する疾患の要求を満たすのに不十分である、ワクチンまたは治療剤を生成するための他の方法とは、はっきりと異なる。例えば、ＰＣＲの使用による生成の簡便性により、核酸ベースのＬＥＣワクチンは、卵内成長および細胞培養によるワクチンの有望な代替を提供する。
【００３６】
線形発現の構築物
本明細書に開示される、発現最適化ＤＮＡコード配列を有するＬＥＣは、標的細胞、宿主生物、または本明細書に記載されている対象において遺伝子産物を発現するために使用され得る。一部の観点からすれば、ＬＥＣは、核酸（ＤＮＡ）「ベクター」とみなされ得る。当業者にとっては当然のことながら、「ベクター」は、分子が、配列の発現等のために、配列を細胞に導入するために使用することができる核酸配列を含有する核酸分子である。ベクターに存在する核酸配列は、他のベクター配列に対して「外因性」または「異種」であり得る。外因性または異種配列は、ベクター配列に挿入、または連結反応されなければならない。さらに、外因性または異種配列は、配列がベクターを介して導入される、標的細胞、宿主生物、または対象に対して異質であり得る。あるいは、ベクターに存在する核酸配列は、標的細胞、宿主生物、または対象内で見られる（すなわち野生型である）が、それでもベクター配列に対して、外因性または異種である。
【００３７】
一部の実施形態において、ＬＥＣは、宿主生物もしくは動物またはヒトの患者の細胞等の標的細胞への導入後に細胞ゲノムに組み込まれるものである。他の実施形態において、ＬＥＣは、細胞ゲノムに対してエピソームのままである。細胞ゲノムに見られる核酸配列を含有する組み込まれたＬＥＣの場合、一体化の部位は、配列のゲノム（または野生型）複写の部位であり得る。あるいは、ゲノムにおける一体化の部位は、ベクター媒介配列が、通常見られない場所であり得る。
【００３８】
ＬＥＣが細胞においてコードされた配列を発現する場合、ＬＥＣは、発現ベクターとみなされ得る。当業者にとって当然のことながら、発現ベクターは、遺伝子産物のすべてまたは一部をコードする核酸配列を発現することが可能である。場合によっては、遺伝子産物は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを生成するために中間メッセンジャーＲＮＡ分子から翻訳されるものである。他の場合において、遺伝子産物は、翻訳されないＲＮＡ分子である。遺伝子産物としてのＲＮＡ分子の限定されない例としては、アンチセンス配列、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、またはミクロＲＮＡが挙げられる。本発明のＬＥＣは、コードされたＲＮＡ配列の長さによって制限されない。限定されない例としては、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約７５０、または約１０００個のヌクレオチド、またはそれ以上の長さのＲＮＡ分子をコードする配列を含む。
【００３９】
追加の実施形態において、ＬＥＣは、非動物または非ヒト種における発現のための成分を含み得る。そのような種へのトランスフェクションの後、ＬＥＣは、コードされた遺伝子産物の生成を促す。場合によっては、トランスフェクションは、植物においてコード配列の発現を可能にするシス因子に作動式に連結され、発現最適化ＤＮＡコード配列を含有する、ＬＥＣを有する植物種のものであり得る。そのようなシス因子の限定されない例としては、プロモータ、エンハンサ、リボザイム開始または内部侵入シグナル、ポリアデニル化シグナル、および終結シグナルが挙げられ、すべて当業者に周知である。他の場合において、トランスフェクションは、バクテリア、酵母または真菌、または他の単細胞真核生物等の微生物のものであり得る。そのような場合において、ＬＥＣは、そのような生物における発現のための成分を含み得る。あるいは、トランスフェクションは、ＬＥＣでコードされた遺伝子産物の発現を可能にする細胞または細胞株のものであり得る。場合によっては、細胞または細胞株は、真核生物、哺乳類、霊長類、および／またはヒトから供給される。
【００４０】
そのような代替種または細胞における発現は、単離および／またはその後の使用に対する遺伝子産物の生成のために使用され得る。有利にも、遺伝子産物は、治療剤、結合試薬、免疫原、またはワクチンとしての使用に対するポリペプチドであり得る。場合によっては、遺伝子産物は、抗体またはその抗原結合断片であり得る。あるいは、遺伝子産物は、本明細書に記載されているＲＮＡ分子であり得る。
【００４１】
さらなる実施形態において、ＬＥＣの生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）発現は、上述の単離および／またはその後の使用のために遺伝子産物を生成する無細胞系によって行われ得る。
【００４２】
ＤＮＡコード配列
本開示のＬＥＣは、そこに存在するＤＮＡコード配列によって制限されない。一部の実施形態において、開示されるＬＥＣにおけるＤＮＡコード配列は、翻訳されない、治療薬であるＲＮＡをコードする。限定されない例としては、本明細書に記載される、アンチセンス配列、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、またはミクロＲＮＡが挙げられる。細胞内で発現する場合、ＲＮＡは、癌を治療するための、限定されない例として、癌遺伝子等の１つ以上の細胞遺伝子の遺伝子発現を標的または調節するために使用され得る。治療され得る他の状態としては、限定されない例として、アルツハイマー病、および黄斑変性症が挙げられる。
【００４３】
他の実施形態において、開示されるＬＥＣにおけるＤＮＡコード配列は、翻訳される中間メッセンジャーＲＮＡを通ってポリペプチドをコードする。そのような場合において、コード配列は、コードされたポリペプチドを発現させるために転写および翻訳することが可能なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とみなされ得る。本開示のＬＥＣは、１つ以上のコード配列またはＯＲＦを含み得る。ＯＲＦは、一連の３つの連続ヌクレオチド（またはコドン）としての核酸分子「リード」における配列であり、それぞれ、終止コドンが存在するまで（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡが、ＤＮＡ分子内で見られ得る）、遺伝コードに従ってアミノ酸をコードする。本開示のコード配列、またはＯＲＦは、あらゆる生物またはウイルスにおいて見られるものであり得る。ＯＲＦの場合において、それは、生物またはウイルスのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のすべてまたは一部をコードし得る。
【００４４】
一部の実施形態において、開示されるＬＥＣは、免疫原をコードする配列を含有する。
「免疫原」は、抗原決定基または抗原決定基、および免疫原をコードするポリヌクレオチドの組み合わせを有するポリアミノ酸物質を含む、任意の抗原性または免疫原性ポリペプチドを包含することを意味する。加えて、「免疫原」は、免疫反応を引き起こす際に有用な任意の多糖物質を包含することも意味する。本明細書で使用される、抗原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドは、脊椎動物に導入された際、脊椎動物の免疫系分子、すなわち、抗原性のものと反応し、および／または脊椎動物における免疫反応、すなわち、免疫原性のものを誘導するポリペプチドである。免疫原性ポリペプチドは、抗原性である可能性が高いが、抗原性ポリペプチドは、その大きさまたは配座により、必ずしも免疫原性ではない。抗原性および免疫原性ポリペプチドの例としては、それらに限定されないが、バクテリア、ウイルス、寄生虫、または菌類等の感染性因子からのポリペプチド、ペットの鱗屑、サナダムシ、植物、粉塵、および他の環境要因等からのアレルゲン、ならびに特定の自己ポリペプチド、例えば、腫瘍関連抗原が挙げられる。
【００４５】
本発明の抗原性および免疫原性ポリペプチドは、ウイルス性、細菌性、真菌性、および寄生性感染性疾患を予防または治療、すなわち、治す、改善するか、その重症度を軽減させるか、またはその接触伝染を予防または減少させる、およびアレルギーを治療するために使用することができる。
【００４６】
加えて、本発明の抗原性および免疫原性ポリペプチドは、それらに限定されないが、口腔および咽頭（すなわち、舌、口、咽頭）、消化器系（すなわち、食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肛門管、肛門直腸、肝臓、胆嚢、膵臓）、呼吸器系（すなわち、喉頭、肺）、骨、間接、軟組織（心臓を含む）、皮膚、メラノーマ、胸、再生器官（すなわち、頸部、子宮内膜、卵巣、外陰部、膣、前立腺、睾丸、陰茎）、泌尿器系（すなわち、膀胱、腎臓、尿管、および他の泌尿器）、眼、脳、内分泌系（すなわち、甲状腺および他の内分泌腺）の癌、リンパ腫（すなわち、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、白血病（すなわち、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病）を含む、癌を予防または治療、すなわち、治す、改善、またはその重症度を軽減させるために使用することができる。
【００４７】
ウイルス性抗原性および免疫原性ポリペプチドの例としては、それらに限定されないが、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カルシウイルスポリペプチド、例えば、カルシウイルスカプシド抗原、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド、例えば、Ｂ型肝炎コアまたは表面抗原、ヘルペスウイルスポリペプチド、例えば、単純ヘルペスウイルスまたは水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質、免疫不全ウイルスポリペプチド、例えば、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープまたはプロテアーゼ、伝染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、インフルエンザウイルスポリペプチド、例えば、インフルエンザＡ血球凝集素、ノイラミニダーゼ、ヌクレオタンパク質、および／またはマトリックスもしくはＭ２ポリペプチド、白血病ウイルスポリペプチド、フィロウイルスポリペプチド、オルトウイルスポリペプチド、乳頭腫ウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド、例えば、血球凝集素／ノイラミニダーゼ、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコマウイルスポリペプチド、例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド、ポックスウイルスポリペプチド、例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド、狂犬病ウイルスポリペプチド、例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、およびロタウイルスポリペプチドが挙げられる。
【００４８】
細菌性抗原性および免疫原性ポリペプチドの例としては、それらに限定されないが、アクチノミセスポリペプチド、炭疽菌ＰＡおよび／またはＬＦポリペプチド等のバチルスポリペプチド、バクテロイデスポリペプチド、ボルデテラポリペプチド、バルトネラポリペプチド、ボレリアポリペプチド、例えば、Ｂ．ブルグドルフェリＯｓｐＡ、ブルセラポリペプチド、カンピロバクターポリペプチド、カプノシトファガポリペプチド、クラミジアポリペプチド、クロストリジウムポリペプチド、コリネバクテリアポリペプチド、コクシエラポリペプチド、デルマトフィルスポリペプチド、エンテロコッカスポリペプチド、エールリヒアポリペプチド、エシェリキアポリペプチド、フランシセラポリペプチド、フゾバクテリアポリペプチド、ヘモバルトネラポリペプチド、ヘモフィルスポリペプチド、例えば、ｂ型インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクターポリペプチド、クレブシエラポリペプチド、Ｌ型バクテリアポリペプチド、レプトスピラポリペプチド、リステリアポリペプチド、マイコバクテリアポリペプチド、マイコプラズマポリペプチド、ナイセリアポリペプチド、ネオリケッチアポリペプチド、ノカルジアポリペプチド、パスツレラポリペプチド、ペプトコッカスポリペプチド、ペプトストレプトコッカスポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド、プロテウスポリペプチド、シュードモナスポリペプチド、リケッチアポリペプチド、ロシャリメアポリペプチド、サルモネラポリペプチド、シゲラポリペプチド、ブドウ球菌ポリペプチド、連鎖球菌ポリペプチド、例えば、化膿連鎖球菌Ｍタンパク質、トレポネーマポリペプチド、およびエルシニアポリペプチド、例えば、Ｙ．ペスチＦｌおよびＶ抗原が挙げられる。
【００４９】
真菌性免疫原性および抗原性ポリペプチドの例としては、それらに限定されないが、アブシディアポリペプチド、アクレモニウムポリペプチド、アルテルナリアポリペプチド、アスペルギルスポリペプチド、バシディオボールスポリペプチド、ビポラリスポリペプチド、ブラストミセスポリペプチド、カンジダポリペプチド、コクシジオイデスポリペプチド、コニディオボルスポリペプチド、クリプトコッカスポリペプチド、クルバラリアポリペプチド、表皮菌ポリペプチド、エクソフィアラポリペプチド、ゲオトリクムポリペプチド、ヒストプラズマポリペプチド、マズレラポリペプチド、マラセジアポリペプチド、小胞子菌ポリペプチド、モニリエラポリペプチド、モルティエラポリペプチド、ケカビポリペプチド、ペシロミセスポリペプチド、ペニシリウムポリペプチド、フィアレモニウムポリペプチド、フィアロフォラポリペプチド、プロトセカポリペプチド、シュードアレシェリアポリペプチド、偽ミクロドチウムポリペプチド、フィチウムポリペプチド、リノスポリジウムポリペプチド、クモノスカビポリペプチド、スコレコバシディウムポリペプチド、スポロトリクスポリペプチド、ステムフィリウムポリペプチド、白癬菌ポリペプチド、トリコスポロンポリペプチド、およびキシロフィファポリペプチドが挙げられる。
【００５０】
寄生原生動物免疫原性および抗原性ポリペプチドの例としては、それらに限定されないが、バベシアポリペプチド、バランチジウムポリペプチド、ベスノイチアポリペプチド、クリプトスポリジウムポリペプチド、アイメリアポリペプチド、エンセファリトゾーンポリペプチド、エントアメーバポリペプチド、ジアルジアポリペプチド、ハモンディアポリペプチド、ヘパトゾーンポリペプチド、イソスポラポリペプチド、リーシュマニアポリペプチド、ミクロスポリジアポリペプチド、ネオスポラポリペプチド、ノセマポリペプチド、ペンタトリコモナスポリペプチド、プラスモディウムポリペプチド、例えば、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲（ＰｆＣＳＰ）、種虫表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓状態抗原１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１ｃ−末端）、および被輸送タンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１）、ニューモシスティスポリペプチド、サルコシスティスポリペプチド、シストソーマポリペプチド、タイレリアポリペプチド、トキソプラズマポリペプチド、およびトリパノソーマポリペプチドが挙げられる。
【００５１】
寄生蠕虫免疫原性および抗原性ポリペプチドの例としては、それらに限定されないが、アカントケイロネマポリペプチド、アエルロストロンギルスポリペプチド、アンシロストーマポリペプチド、アンギオストロンギルスポリペプチド、アスカリスポリペプチド、ブルギアポリペプチド、ブノストムムポリペプチド、カピラリアポリペプチド、シャベルチアポリペプチド、クーペリアポリペプチド、クレノソーマポリペプチド、ディクチオカウルスポリペプチド、ジオクトフィーマポリペプチド、ジペタロネーマポリペプチド、ジフィロボスリウムポリペプチド、ジピリディウムポリペプチド、ディロフィラリアポリペプチド、ドラクンクルスポリペプチド、エンテロビウスポリペプチド、フィラロイデスポリペプチド、ヘモンクスポリペプチド、ラゴチルアスカリスポリペプチド、ロアポリペプチド、マンソネラポリペプチド、ムエレリウスポリペプチド、ナノフィェタスポリペプチド、ネカトールポリペプチド、ネマトディルスポリペプチド、エソファゴストムポリペプチド、オンコセルカポリペプチド、オピストルキスポリペプチド、オステルタジアポリペプチド、パラフィラリアポリペプチド、パラゴニムスポリペプチド、パラスカリスポリペプチド、フィサロプテラポリペプチド、プロトストロンギルスポリペプチド、セタリアポリペプチド、スピロセルカポリペプチド、スピロメトラポリペプチド、ステファノフィラリアポリペプチド、ストロンギロイデスポリペプチド、ストロンギルスポリペプチド、テラジアポリペプチド、トキサスカリスポリペプチド、トキソカラポリペプチド、トリキネラポリペプチド、トリコストロンギルスポリペプチド、トリチュリスポリペプチド、ウンシナリアポリペプチド、およびブケレリアポリペプチドが挙げられる。
【００５２】
外部寄生虫免疫原性および抗原性ポリペプチドの例としては、それらに限定されないが、ノミ、硬ダニおよび軟ダニを含むダニ、子ハエ、蚊、サシチョウバエ、ブヨ、アブ、ノサシバエ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエ蛆症を引き起こすハエ、およびサシブヨ等のハエ、蟻、蜘蛛、シラミ、ダニ、およびトコジラミおよびサシガメ等の半翅類の昆虫からのポリペプチド（保護抗原、およびアレルゲンを含む）が挙げられる。
【００５３】
腫瘍関連抗原性および免疫原性ポリペプチドの例としては、それらに限定されないが、腫瘍特異的免疫グロブリン可変領域、ＧＭ２、Ｔｎ、ｓＴｎ、トンプソン−フリーデンライヒ抗原（ＴＦ）、ＧｌｏｂｏＨ、Ｌｅ（ｙ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、癌胎児性抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβ鎖（ｈＣＧベータ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＫＳＡ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＧＰ１００、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＰＡＰ、ＣＥＡ、ＢＡＧＥ、ＭＡＧＥ１およびＭＡＧＥ２、ＲＡＧＥ、および関連タンパク質が挙げられる。
【００５４】
他の実施形態において、ＬＥＣは、能動免疫に対する生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での抗毒素の形成を引き起こす、「トキソイド」をコードする配列を含む。限定されない例としては、ボツリヌス、破傷風、およびジフテリアの「トキソイド」（これらの微生物は、それぞれ、対応する毒素を生成する）が挙げられる。
【００５５】
代替的な実施形態において、ＬＥＣでコードされた遺伝子産物は、抗体、またはその抗原結合断片である。そのような遺伝子産物の発現は、抗体、またはその抗原結合断片によって媒介される、治療された動物またはヒト対象における免疫反応を引き起こすために使用され得る。場合によっては、免疫反応は、対象内のその同種抗原との抗体、またはその抗原結合断片の結合によって媒介される。有利にも、抗原は、本明細書に記載されている病原因子のものであり得、免疫反応は、薬剤に対するものであり得る。
【００５６】
当然のことながら、ポリペプチドは、野生型生物に存在するポリペプチド全体のすべてまたは一部であり得る。任意に、免疫反応は、ポリペプチドを発現する生物に対する保護反応である。
【００５７】
付加的な実施形態において、開示されるＬＥＣのコード配列は、患者特有の抗イディオタイプ生成物、抗原またはその断片を含む融合タンパク質、または抗原もしくはその断片のコンカテマー等のポリペプチドのコンカテマーをコードする。抗原もしくはその断片の融合タンパク質またはコンカテマーをコードする配列の生成は、組み換えまたはデノボ合成手段、もしくは当業者に周知の他の手段によって行われ得る。融合タンパク質は、複数の価数の遺伝子産物が、ＬＥＣによって生成され得るように、３つ以上等の複数の抗原および／またはトキソイドのものであり得る。限定されない例としては、ジフテリア、破傷風、および百日咳からの抗原性抗原決定基の融合が挙げられる。
【００５８】
場合によっては、ＬＥＣでコードされたポリペプチドは、アジュバントのように、免疫反応を増加または増幅することができるか、または免疫抑制剤のように、免疫反応を低減または抑制することができる免疫修飾物質である。アジュバントは、コードされた抗原またはその断片に対する免疫反応の誘導、促進、または生成を増大させる。免疫修飾物質の限定されない例としては、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子、ケモカイン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。他の場合において、ＬＥＣでコードされたポリペプチドは、血管新生因子または抗血管新生因子である。限定されない例としては、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、およびエンドスタチンが挙げられる。
【００５９】
さらなる実施形態において、ＬＥＣでコードされたポリペプチドは、治療薬である。そのようなポリペプチドの限定されない例としては、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ等の血液凝固因子、およびインスリンが挙げられる。当然のことながら、発現したポリペプチドは、ＬＥＣを投与される対象と同種からのものであり得る。したがって、ヒトの患者は、ヒトＥＰＯまたはヒト因子ＩＸを発現するＬＥＣを受け得る。
【００６０】
さらなる実施形態において、コード配列は、コードされたポリペプチドでシグナルのＯＲＦを形成する分泌シグナルをコードする配列をさらに含む。したがって、得られる融合ポリペプチドは、細胞において発現する際、該細胞から分泌される可能性が高い。動物またはヒト対象のもの等の既知の標的細胞との組み合わせに適切な分泌シグナルの選択は、当業者に周知である。場合によっては、得られたポリペプチドは、分泌シグナルを含む、抗原、またはその断片である。
【００６１】
任意に、ＬＥＣは、タンパク性核局在シグナル（ＮＬＳ）、または細胞の核へのＬＥＣの送達を促す核酸部分をコードする配列をさらに含む。限定されない例としては、ＬＥＣに付着し、核孔でのその局在および／または核内への輸送を容易にする１つ以上の核親和性タンパク質が挙げられる。付加的な実施形態においては、ＬＥＣで発現した遺伝子産物は、それらに限定されないが、ミトコンドリアまたは細胞の色素体等の細胞器官に対して遺伝子産物を標的とする部分を含み得る。部分の限定されない例としては、遺伝子産物のためのコード配列によりフレーム内で融合される配列によってコードされる、ミトコンドリア局在シグナル（ＭＬＳ）が挙げられる。ＭＬＳは、遺伝子産物のコード配列のＮ−またはＣ−末端に位置され得る。
【００６２】
他の実施形態においては、ＬＥＣは、特定の細胞表面受容体等を介して、細胞型を標的とするタンパク性部分を含む。限定されない例としては、Ｔ細胞およびＢ細胞のサブタイプ等の、特定の免疫細胞上で見られる細胞表面受容体が挙げられる。
【００６３】
本発明のポリペプチドとして、前述のポリペプチドの断片または変異形、および前述のポリペプチドの任意の組み合わせも含まれる。付加的なポリペプチドは、例えば、「Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」Ｔａｌａｒｏら、ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ（Ｏｃｔ．，１９９８）、Ｆｉｅｌｄｓら、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」３ｒｄ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ（１９９６）、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐａｒａｓｉｔｅｓ」Ｍａｒｒら、ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）、およびＤｅａｃｏｎ，Ｊ．、「Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ」Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ（１９９７）において見ることができる。
【００６４】
免疫原をコードするポリヌクレオチドは、単一の「ポリヌクレオチド」および複数の「ポリヌクレオチド」を包含することを意図し、分離分子または構築物を指す。免疫原をコードするポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列、核酸、核酸オリゴマー、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ（例えば、ｐＤＮＡ、ｐＤＮＡの誘導体、線形ＤＮＡ）、またはその任意の断片を含む。
【００６５】
免疫原をコードするポリヌクレオチドの形態は、部分的に、所望の動態および発現の期間に依存する。ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の長期送達が所望である場合、好ましい形態は、ＤＮＡである。あるいは、短期の導入遺伝子タンパク質送達が所望である場合、ポリペプチドに迅速に翻訳され得るので、好ましい形態は、ｍＲＮＡである。しかし、ＲＮＡは、ＤＮＡよりさらに速く分解され得る。
【００６６】
一実施形態においては、免疫原をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。ＲＮＡ配列を哺乳類細胞に導入するための方法は、米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。ＲＮＡを投与するために有用な非感染性ベクターである、ウイルス性アルファベクターは、ＲＮＡを哺乳類細胞に導入するために使用され得る。アルファウイルスベクターの哺乳類組織への生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）導入のための方法は、Ａｌｔｍａｎ−Ｈａｍａｍｄｚｉｃ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４，８１５−８２２（１９９７）に記載される。
【００６７】
免疫原をコードするポリヌクレオチド、例えば、ｐＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリヌクレオチド、または核酸オリゴマーは、アジュバント成分、例えば、サイトフェクチンおよび共脂質とともに混合または錯化する前に、任意の様々な緩衝液中で可溶化することができる。適切な緩衝液としては、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、通常の生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液、およびリン酸ナトリウムが挙げられる。不溶性ポリヌクレオチドは、弱酸または弱塩基中で可溶化することができ、その後、緩衝液で所望の容量に希釈される。緩衝液のｐＨは、適切に調節され得る。加えて、薬学的に許容される添加剤を、適切なオスモル濃度を提供するために使用することができる。そのような添加剤は、当業者の範囲内である。
【００６８】
本発明のＬＥＣは、コード配列の長さに制限されない。限定されない例としては、約１０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約７５０、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１０，０００個のアミノ酸、またはそれ以上の長さのポリペプチドをコードする配列が挙げられる。他の実施形態において、ＬＥＣでコードされたポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩまたはクラスII分子を介する細胞内プロセシングおよび提示に対して適切な大きさである。限定されない例としては、９個のアミノ酸長のポリペプチド、またはＭＨＣクラスＩまたはクラスII分子を介して提示されるように細胞内で処理される、より長いポリペプチドが挙げられる。
【００６９】
様々なタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドをコードする配列、およびそれらの配列は、当業者に周知であり、公的にアクセス可能なコンピュータデータベースを介して利用可能である。所望のコード配列は、単離または増幅され、その後、当業者に周知の任意の手段によって、本開示のＬＥＣへの導入が行われ得る。
【００７０】
本明細書に記載されているように、コード配列は、ＬＥＣを介して、発現に対して最適化され得る。一部の実施形態においては、コード配列は、ＬＥＣへの導入の前に、遺伝子工学または組み換え技術によって最適化される。他の実施形態において、最適化は、ＬＥＣの中で生じる。発現に対する最適化は、標的細胞、宿主生物、または対象において、その発現を改善するための、コード配列における１つ以上の塩基の変異を指す。場合によっては、塩基変異は、コードされたアミノ酸は変化せず、コード配列が変更されるように、遺伝コードの縮退内で１つ以上のコドンを変化させる。そのような変異は、コードされたポリペプチドを発現させるためによりよく使用される１つ以上のコドンを導入し、および／またはポリペプチドの発現に悪影響を及ぼす１つ以上のコドンを除去し得る。
【００７１】
限定されない例として、配列変異は、コドン選択に基づくヒト細胞において、同じアミノ酸をコードする他のコドンに対して、より頻繁または効率的に使用される１つ以上のコドンを導入するために使用され得る。得られたコード配列は、有利にも、ヒト細胞における発現のためのＬＥＣにおいて使用され得る。あるいは、限定されない例としても、配列変異は、同じアミノ酸をコードする他のコドンが導入されるように、ヒト細胞において頻繁または効率的に使用されないコドンを除去するために使用され得る。導入されたコドンは、ヒト細胞における使用に対する可能性のあるコドンの最も頻繁または効率的に使用されるものに制限される必要はない。
【００７２】
さらなる実施形態において、塩基置換は、コード配列またはそれが存在するＬＥＣから予測二次構造を除去し、その発現を改善するために使用され得る。核酸配列における二次構造の予測および除去のためのアルゴリズムは、当業者に周知であり、所望および／または必要に応じて使用され得る。コード配列における予測二次構造の除去は、当然のことながら、コードされたポリペプチドを変異させないように、遺伝コードに関し、動物またはヒト対象のもの等の、標的細胞のコドン選択に対する。さらに、予測二次構造を除去するための変異は、変異によって導入される新規二次構造を有しない変異した配列の予測によって進められ得る。
【００７３】
本発明によると、本発明の免疫原性組成物は、脊椎動物に免疫を与えるために使用することができる。「脊椎動物」という用語は、単一の「脊椎動物」、および複数の「脊椎動物」を包含することを目的とし、哺乳類、および鳥種、ならびに魚類を含む。脊椎動物に免疫を与えるための方法は、免疫原に対する免疫反応を引き起こすために十分な量の本発明の免疫原性組成物を、脊椎動物に投与するステップを含む。
【００７４】
発現最適化の他の限定されない例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）への生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）共役のための糖鎖付加部位および／または部位の開示されるＬＥＣへの導入、または添加が挙げられる。さらに限定されない例としては、コードされたポリペプチドに影響を与えない置換による、暗号スプライスドナーまたは受容部位、カイ構造、および／またはＧ／ＣもしくはＡ／Ｔ含有量が高い領域の除去が挙げられる。
【００７５】
さらに、本明細書に記載されているように、コード配列は、ＬＥＣにおいて、プロモータ、および任意に他の調節配列に作動式に結合または連結する。他の調節配列の限定されない例としては、転写エンハンサ、スプライシングシグナル、転写終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、翻訳開始コドン、翻訳終止シグナル、および内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が挙げられる。他の任意の調節配列は、細胞内でｍＲＮＡまたはタンパク質遺伝子産物を指示するものを含む。任意の付加的な要素は、５′および／または３′非翻訳配列および／または一部のＬＥＣ実施形態における非転写配列に位置され得る。
【００７６】
プロモータ
本開示のＬＥＣは、本明細書に示されるプロモータまたは他の制御配列によって制限されない。一部の実施形態において、ＬＥＣは、プロモータに対して作動式に連結または位置されるＤＮＡ配列の転写の開始および場合により比率を調節する核酸配列である、少なくとも１つのプロモータを含む。プロモータは、調節タンパク質、および限定されない例として、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子等の他の分子の結合のための配列を含有し得る。当業者にとって当然のことながら、「作動式に連結される」という用語は、プロモータによる転写の開始が、核酸配列の転写を引き起こすように、プロモータと核酸配列との間の正確な位置および／または配向を指す。そのため、核酸配列がＯＲＦである実施形態において、プロモータにより開始される転写は、コード配列に対応するｍＲＮＡの生成を引き起こす。ｍＲＮＡは、その後、コードされたタンパク質の発現を完了するために翻訳され得る。
【００７７】
一部の実施形態において、ＬＥＣのプロモータは、それに作動式に連結されるコード配列に対する組み換えまたは異種プロモータである。当業者は、自然に生じない合成プロモータを含む組み換えプロモータ、およびその自然環境において、通常、作動式に連結されたコード配列に結合しないものを含む異種プロモータを理解する。本開示のプロモータは、原核生物、ウイルス、または真核もしくは植物源から単離されるものを含む、他のコード配列のものであり得る。あるいは、プロモータは、コード配列の上流に位置する５′非コード配列に存在するプロモータ等の、その自然環境におけるコード配列で通常見られるものである。そのようなプロモータは、「内因性」とみなされ得るが、連結されたコード配列で単離されるか、または別々に単離され、その後、コード配列に組み換えによって連結され得る。
【００７８】
当然のことながら、ＬＥＣのプロモータは、動物またはヒト対象、細胞、植物種、または明細書に記載されている微生物のもの等の標的細胞において作動式に連結されるコード配列を発現するために適切なものである。当業者は、既知の細胞においてタンパク質発現を可能にする、プロモータ／細胞型の組み合わせの知識を有し、それを容易に選択する。本開示のプロモータは、連続性、組織特異性、誘導性であり得、および／またはそうでなければ、作動式に連結されたコード配列の高いレベルの発現を促すことが可能である。本発明の一部の実施形態においては、プロモータは、ヒト細胞を含む、多様な真核細胞において発現を開始することが可能なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータである。プロモータの他の限定されない例としては、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ、アクチンプロモータ、ケラチンプロモータ、ユビキチンプロモータ、またはＳＶ４０プロモータが挙げられる。
【００７９】
さらなる実施形態において、プロモータは、低酸素誘導プロモータ、腫瘍特異的プロモータ、骨格アクチンプロモータ、またはミオシンプロモータ等の、組織特異的発現を可能にするものである。
【００８０】
代替的な実施形態においては、プロモータは、超ら旋非依存性であるか、線形鋳型上のＣＭＶプロモータ（真核細胞等における）より強力であるか、または線形鋳型上のＣＭＶプロモータ（真核細胞等における）より脆弱である。
【００８１】
当然のことながら、２つ以上の遺伝子産物を調節する２つ以上のプロモータも、本開示のＬＥＣに存在し得る。得られたＬＥＣは、二シストロン性または多シストロン性である。限定されない例としては、２つ以上の遺伝子産物を発現するための、ＬＥＣにおけるＣＭＶ、ＲＳＶ、またはＳＶ４０プロモータから選択される２つ以上のプロモータの使用が挙げられる。
【００８２】
シスにおける他の配列
本開示の追加の実施形態においては、ＬＥＣは、プロモータと併せた使用のための１つ以上の調節配列または要素を含む。場合によっては、調節配列は、エンハンサであり、当業者は、転写活性に伴うシス作用因子として認識するであろう。エンハンサは、通常、その自然環境において、開示されるプロモータまたはコード配列に結合しないもの等の組み換えまたは異種エンハンサであり得る。そのようなエンハンサは、合成配列、または他のコード配列に結合する配列であり得る。開示されるＬＥＣにおける使用のためのエンハンサは、任意の他の原核生物、ウイルス、または真核源から単離され得る。あるいは、エンハンサは、その自然環境において、通常、開示されるプロモータまたはコード配列の下流または上流のいずれかに位置されるものであり得る。
【００８３】
代替的な実施形態において、追加の調節配列が、ＬＥＣからの発現を調節するために使用され得る、逆抑制因子または活性因子であり得る。限定されない例としては、Ｔｅｔ応答要素、エクジソン反応要素、抗黄体ホルモン誘導性要素、酸素レベル応答要素、または抗生物質応答要素が挙げられる。場合によっては、低酸素誘導プロモータは、低酸素状態にある、一部の腫瘍細胞等の細胞を変形するために適切なＬＥＣにおいて使用され得る。
【００８４】
開示されるＬＥＣは、転写を終了させる終結シグナルの存在を伴わずに、本明細書に記載されている発現のために使用され得る。そのような実施形態において、転写は、ＲＮＡポリメラーゼが、ＬＥＣの末端に到達するまで転写を継続する、「流出」とみなされ得る。他の実施形態においては、ＬＥＣは、１つ以上の終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナルを含む。
【００８５】
終結シグナルまたはターミネータは、ＲＮＡポリメラーゼによる転写産物の終結を指示するＤＮＡ配列である。終結シグナルの存在は、ＲＮＡ転写産物の生成を終了させる。真核細胞においては、配列の終結シグナルまたは領域は、ポリアデニル酸（ポリＡ）尾部の添加を可能にするように、転写産物上のポリアデニル化部位を露呈する配列も含み得る。これにより、細胞の核から細胞質へより安定的およびより効率的に移動し得るか、またはより効率的に真核細胞へ翻訳され得る、ポリアデニル化ｍＲＮＡの生成が生じる。したがって、ヒト細胞等の真核細胞を伴う一部の実施形態において、本開示のＬＥＣは、ポリアデニル化シグナルを含む。終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナルの限定されない例としては、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）またはサルウイルス４０（ＳＶ４０）のものが挙げられる。
【００８６】
ＬＥＣ上のシスに存在し得る配列の付加的な限定されない例としては、５′非翻訳領域等の、プロモータとコード配列との間にある非コード配列、およびコード配列内のイントロン配列が挙げられる。後者の場合、ＬＥＣは、翻訳の前にイントロンを正確に除去する、真核細胞等の細胞における使用のためのものである。さらに、適切な供与および／または受容スプライシング部位が、コードされたポリペプチドの発現のための適切なイントロンの除去および転写後過程を確実にするために、必要に応じて、導入される。
【００８７】
開示されるＬＥＣは、翻訳シグナルの開始および／または内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）をさらに含み得る。一部の実施形態においては、ＬＥＣは、コードされたポリペプチドの翻訳を容易にする、本明細書に記載されているコード配列のＯＲＦ内で「インフレーム」であるＡＴＧ開始コドンを含む。他の実施形態においては、ＩＲＥＳは、ＬＥＣに存在し、ＬＥＣのコード配列から発現する単一転写産物からの２つ以上のＯＲＦの発現を可能にする。したがって、ポリシストロン性ＬＥＣは、本開示の範囲内である。ｍＲＮＡ分子の内部部位で翻訳を開始することが可能なＩＲＥＳ要素が報告されている。ＩＲＥＳ要素の限定されない例としては、ピコルナウイルス科、すなわちポリオおよび脳心筋炎のメンバーからのもの、および哺乳類ＩＲＥＳ要素が挙げられる。ＩＲＥＳ要素は、異種ＯＲＦに連結することができるため、単一転写産物として発現することができるが、２つ以上のＯＲＦは、それぞれＩＲＥＳ要素によって分離され、その後、ＯＲＦによってコードされるポリペプチドを発現するためのポリシストロン性メッセージとして使用することができる。したがって、２つ以上のＯＲＦを、単一プロモータを使用して効率的に発現させることができる。例えば、米国特許第ＵＳ５，９２５，５６５号および米国特許第ＵＳ５，９３５，８１９号を参照のこと。
【００８８】
さらなる実施形態においては、ＬＥＣは、上記の要素を超えるもの等の１つ以上の付加的な制御配列を含み得、それらは、特定の宿主生物における作動式に連結されるコード配列の転写、および場合によっては翻訳を調節または指示することに関与する。プロモータおよびターミネータは、最小制御配列とみなされ得るが、転写および／または翻訳を管理する他の制御配列が使用され得る。
【００８９】
末端プライマ配列
本開示のＬＥＣは、ＬＥＣ分子のＰＣＲ媒介の増幅または生成のためのＬＥＣ分子の各末端にある末端プライマ配列をさらに含む。一部の実施形態において、末端プライマ配列は、ＬＥＣ  ＤＮＡ分子の末端に存在するか、またはそれから誘導されるものであり得る。誘導された末端プライマ配列は、ＬＥＣの末端に存在する配列に対する１つ以上の塩基挿入、削除、または置換を含有するものを含む。誘導された末端プライマ配列の生成は、本明細書に記載されているコドンを変更させるために使用されるものを含む、当業者に周知の任意の組み換えまたはデノボ合成手段であり得る。場合によっては、末端プライマ配列の誘導は、ＬＥＣに存在する他の配列、およびＰＣＲ媒介の複製を抑制する、予測二次構造の除去を考慮して行われる。他の場合においては、誘導は、得られたＬＥＣ分子における二次構造の生成の回避を考慮して行われる。
【００９０】
他の実施形態において、末端プライマ配列は、ＰＣＲによるその複製を容易にするために、ＬＥＣ分子の末端で導入されるものである。導入された配列は、当業者の知識およびＬＥＣの残りの配列に基づいて、当業者によって選択され得る。また、誘導された末端配列の場合のように、末端プライマ配列の選択は、得られたＬＥＣ分子における二次構造の生成の回避を考慮して行われる。
【００９１】
本開示のＬＥＣの実施形態は、任意の適切な長さの末端プライマ配列を有するものを含む。限定されない例としては、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約２６、約２８、約３０、または約３２の塩基またはそれ以上の長さのプライマ配列が挙げられる。当然のことながら、ＬＥＣの２つの末端のプライマ配列は、同一の配列である必要はなく、同じ長さである必要はない。
【００９２】
保護機能
本明細書に記載されているように、開示されるＬＥＣは、動物またはヒト対象内または細胞内で生じ得るもの等、ＬＥＣの分解を減少または低減させる、シスにおける１つ以上の成分をさらに含み得る。一部の実施形態においては、保護機能は、ＬＥＣの一方または両方のストランドの５′または３′末端にある部分として導入され、エクソヌクレアーゼ分解に抵抗する。一実施形態において、部分は、プロモータまたはターミネータを超えて延伸する非コードＤＮＡ配列の長さである。別の実施形態においては、部分は、デノボ合成により、またはＬＥＣを複製するために使用されるプライマ等を介して、ＬＥＣに導入されるホスホロチオエートで修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。これらの部分の両方は、エクソヌクレアーゼによる分解に対するＤＮＡの抵抗を引き起こす。限定されない例としては、２つの５′最端残基がホスホロチオエートであった、非コード、非ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド配列またはオリゴヌクレオチドプライマの使用が挙げられる。
【００９３】
他の実施形態において、５′末端の部分は、線形ＬＥＣ  ＤＮＡ分子の各末端にあるストランド間で連結反応するヘアピン型オリゴヌクレオチドの一部であり得る。
【００９４】
あるいは、ＬＥＣは、ＤＮＡ骨格において１つ以上のホスホロチオエート連結、または架橋を含み得る。
【００９５】
さらなる実施形態において、５′末端の部分は、ＬＥＣの末端を保護する、任意に、「ＰＮＡクランプ」をさらに含む、ペプチド核酸（ＰＮＡ）配列の領域である。ＰＮＡ配列は、ＬＥＣを複製するために使用されるＰＣＲプライマを介して導入され得る。限定されない例としては、本来、全体または部分的にＰＮＡであるＰＣＲプライマが挙げられる。そのようなプライマによって複製されるＬＥＣは、各５′末端でＰＮＡ尾部を含む。３′末端は、ＰＮＡクランプの添加を介して任意に保護され得る。
【００９６】
ＰＮＡ「クランプ」と称される分子は、合成され、３つの８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸単位を含有する柔軟性ヘアピン型リンカーによって接合される２つの同一ＰＮＡ配列を有する。ＰＮＡクランプが、相補的ホモプリンまたはホモピリミジンＤＮＡ標的配列と混合される場合、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡ三重ハイブリッドは形成することができ、それは、非常に安定的であることが示されている（Ｂｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：８８６３−８８６９，１９９６、Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２１７−２２２，１９９５、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：８３１−８３２，１９９５）。
【００９７】
組成物および製剤
本開示は、本明細書に記載されるＬＥＣを含む組成物および製剤を含む。一部の実施形態において、ＬＥＣが浮遊可能な固体支持体に取り外し可能に結合する組成物が開示される。限定されない例としては、粒子、ビーズ、またはポリマーが挙げられ、その取り扱いまたは移動特性を容易にするために、ＬＥＣに取り外し可能に結合する。結合は、共有結合および／または非共有結合手段によって行われ得る。共有結合によって媒介される結合の場合、結合は、組成物が送達される、標的細胞、または動物またはヒト対象に存在する酵素等の酵素活性によって開裂されるものであり得る。送達は、組成物にある微粒子銃によって行われ得る。
【００９８】
非共有結合相互作用によって媒介される結合の場合、結合は、動物またはヒト対象等における標的細胞への組成物の送達後まで留まるために十分に安定的なものであり得る。したがって、一部の実施形態において、組成物は、標的細胞への導入後まで、ＬＥＣと固体支持体の分離に抵抗するために十分に安定的である。他の実施形態においては、組成物は、ＬＥＣが標的細胞に取り込まれ得るように、動物またはヒト対象への送達後にＬＥＣおよび固体支持体の分離を可能にする。
【００９９】
各固体支持体上にあるＬＥＣの複写の数は、固体支持体の化学的性質および結合の手段によって許容されるように異なり得る。一部の実施形態においては、２つ以上のＬＥＣ分子は、各固体支持体に結合する。そのため、本発明の実施形態は、粒子、ビーズ、ポリマーまたは他の固体支持体媒体のそれぞれを有するＬＥＣの約２、約４、約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０またはそれ以上の複写を含む。
【０１００】
一部の実施形態において、浮遊可能な固体支持体は、ＬＥＣを複製するために使用されるプライマの５′末端を介してＬＥＣに付着される。限定されない例は、ＬＥＣを生成するために使用されるＰＣＲプライマである。付着は、その生成後に、固体支持体とＬＥＣとの間、または固体支持体と、ＬＥＣを合成するためにその後使用されるため、固体支持体に付着される、プライマとの間で生じ得る。後者および合成がＰＣＲを介して行われる場合、２つのＰＣＲプライマのうちの１つのみが、固体支持体に結合する必要がある。
【０１０１】
代替的な実施形態においては、浮遊可能な固体支持体は、ＬＥＣの３′末端に付着される。限定されない例としては、３′チオール連結を導入するジスルフィドチオール修飾、第一アミン部分を導入する３′アミン修飾因子、および３′末端への３′リン酸塩群の添加の使用が挙げられる。
【０１０２】
製剤
本発明によると、免疫原をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の任意の手段、例えば、ｐＤＮＡ溶液とサイトフェクチン／共脂質リポソームの溶液を混合することによって、アジュバント組成物と錯化することができる。一実施形態において、各成分溶液の濃度は、所望の最終ｐＤＮＡ／サイトフェクチン：共脂質の比率、および所望のｐＤＮＡ最終濃度が、２つの溶液を混合する時に得られるように、混合の前に調整される。例えば、所望の最終溶液が、生理食塩水（０．９重量／容量％）である場合、ｐＤＮＡおよびサイトフェクチン：共脂質リポソームの両方は、０．９％生理食塩水中で調製し、その後、所望の複合体を生成するために単に混合される。サイトフェクチン：共脂質リポソームは、当技術分野で周知の任意の手段によって調製することができる。例えば、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥと共脂質の混合物の薄膜を、適切な量の水性溶剤中で、周囲温度で約１分間ボルテックス混合することによって水和することができる。サイトフェクチンと共脂質の混合物の薄膜の調製は、当業者に周知であり、任意の適切な技術によって調製することができる。例えば、個々の成分のクロロホルム溶液を混合し、等モル量の溶質比を生成し、その後、所望の容量の溶液を適切な容器に等分することができ、該溶剤は、蒸発、例えば、最初に、アルゴン等の、乾燥不活性ガスを用い、その後、高真空処理によって除去することができる。
【０１０３】
本開示は、開示されるＬＥＣに結合する脂質小胞担体を含む組成物をさらに含む。場合によっては、小胞は、単層または多層である。したがって、ミセル、リポソーム、および多重膜小胞、またはそれらの組み合わせが、ＬＥＣを囲むために使用され得る。他の実施形態において、ＬＥＣ分子は、小胞の脂質層または外部に結合し得る。限定されない代表的な例として、本開示のＬＥＣは、共通して水性である、内部空間またはルーメンを囲むリン脂質二分子膜から成るリポソーム内に含有され得る。あるいは、ＬＥＣは、リポソームの二分子層の中、または外部上に存在し得る。当然のことながら、ＬＥＣ分子は、これらの可能性があるリポソーム位置のうちの２つ以上に存在し得る。
【０１０４】
多重膜小胞、またはリポソームは、通常水性である、層内空間内に含有される媒体によって分離される多重脂質層を有する。一部の実施形態においては、ＬＥＣは、多重膜小胞の層内空間内に含有される。一部の実施形態においては、ＬＥＣは、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で錯化される。
あるいは、ＬＥＣは、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）等のカチオン性ポリマーデンドリマーで錯化される。
【０１０５】
本開示のさらなる実施形態において、小胞は、細胞膜との融合を促進することが示されている赤血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ）で錯化され得る。これは、リポソーム封入ＬＥＣの細胞侵入を促進する。
【０１０６】
さらに、本開示は、保護反応等の免疫反応を誘導、促進、または引き起こすための単位剤形におけるＬＥＣの製剤を含む。一部の実施形態においては、製剤は、任意にアジュバントとともに、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。単位用量は、治療される動物またはヒト対象において免疫反応を誘導、促進、または引き起こすために十分および／または効果的なものである。用量は、限定されない例として、ＬＥＣにおいて使用されるプロモータ、コード配列の特徴、送達の方法、および治療される対象の体重および種類を含む、種々の要因によって異なり得る。ただし、ＬＥＣおよび対象に対する単位剤形は、当業者に周知の制限された方法および反復的研究によって容易に決定され得る。
【０１０７】
量の限定されない例としては、約１ナノグラム〜約５ミリグラムが挙げられるが、約１０ｎｇ、約２０ｎｇ、約３０ｎｇ、約４０ｎｇ、約５０ｎｇ、約７５ｎｇ、約１００ｎｇ、約１２５ｎｇ、約１５０ｎｇ、約２００ｎｇ、約２５０ｎｇ、約３００ｎｇ、約３５０ｎｇ、約４００ｎｇ、約４５０ｎｇ、約５００ｎｇ、約５５０ｎｇ、約６００ｎｇ、約６５０ｎｇ、約７００ｎｇ、約７５０ｎｇ、約８００ｎｇ、約８５０ｎｇ、約９００ｎｇ、約９００ｎｇ、約９５０ｎｇ、約１μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約７５μｇ、約１００μｇ、約１２５μｇ、約１５０μｇ、約２００μｇ、約２５０μｇ、約３００μｇ、約３５０μｇ、約４００μｇ、約４５０μｇ、約５００μｇ、約５５０μｇ、約６００μｇ、約６５０μｇ、約７００μｇ、約７５０μｇ、約８００μｇ、約８５０μｇ、約９００μｇ、約９００μｇ、約９５０μｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、または約５ｍｇ、もしくはそれ以上のＬＥＣは、本発明の実行において送達され得る。
【０１０８】
投与
本発明の免疫原性組成物は、当技術分野で周知の任意の様々な方法に従って投与され得る。例えば、米国特許第ＵＳ５，６７６，９５４号は、カチオン性脂質担体で錯化される遺伝物質のマウスへの注入を報告する。また、米国特許第ＵＳ５，５８９，４６６号、米国特許第ＵＳ５，６９３，６２２号、米国特許第ＵＳ５，５８０，８５９号、米国特許第ＵＳ５，７０３，０５５号、およびＰＣＴ国際特許出第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０６０６９号（国際公開第ＷＯ９４／２９４６９号）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳類に送達するための方法を提供する。
【０１０９】
特に、本発明の免疫原性組成物は、それらに限定されないが、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、粘膜組織、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、睾丸、卵巣、子宮、膣組織、直腸、神経系、眼、腺、舌および結合組織を含む、脊椎動物の任意の組織に投与され得る。好ましくは、組成物は、骨格筋に投与される。本発明の免疫原性組成物は、それらに限定されないが、肺、口、鼻腔、胃、腹腔、腸、心腔、静脈、動脈、毛細管、リンパ管、子宮、膣、直腸、および眼の腔を含む、体腔にも投与され得る。
【０１１０】
好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、筋肉（ｉ．ｍ．）または皮下（ｓ．ｃ．）経路によって投与される。他の適切な投与経路としては、経皮投与、鼻内投与、吸入、気管内投与、経粘膜（すなわち、粘膜を横切る）、腔内（例えば、経口、膣または直腸）、眼内、膣、直腸、腹腔内、腸内および静脈内（ｉ．ｖ．）投与が挙げられる。
【０１１１】
投与が所望の免疫応答を引き起こす限り、投与の任意の単回投与を使用することができる。本発明の投与手段は、それらに限定されないが、針注入、カテーテル注入、微粒子銃注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」または空気式「無針」注射器、例えば、Ｍｅｄ−Ｅ−Ｊｅｔ（Ｖａｈｌｓｉｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７１，１１−２２（１９９４））、Ｐｉｇｊｅｔ（Ｓｃｈｒｉｊｖｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １５，１９０８−１９１６（１９９７））、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １２，１５０３−１５０９（１９９４）、Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４，１０９−１１８（１９９８））、ＡｄｖａｎｔａＪｅｔ、Ｍｅｄｉｊｅｃｔｏｒ、ゲル形態スポンジデポー、他の市販尾デポー材料（例えば、ヒドロゲル）、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口または坐剤用固体（錠剤または丸薬）医薬品、局所的皮膚クリーム、およびデカンディング、手術中のポリヌクレオチドでコーティングされた縫合糸（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６５，２１９３−２２０３（１９９９））の使用または局所的適用を含む。好ましい投与形態は、筋肉への針による注入および水溶液としての鼻内適用である。
【０１１２】
免疫原性組成物の有効量の決定は、例えば、物質の化学構造および生物学的活性、対象の年齢および体重、ならびに投与経路を含む、多くの要因に依存する。正確な量、投薬回数、および投薬のタイミングは、当業者によって容易に決定することができる。
【０１１３】
ある実施形態において、免疫原性組成物は、医薬組成物として投与される。そのような医薬組成物は、周知の方法に従って処方することができ、それにより、送達される物質は、薬学的に許容される担体媒体と組み合わされる。適切な媒体およびそれらの調製は、例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓｏｌ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９５）に記載される。医薬組成物は、エマルジョン、ゲル、溶液、懸濁液、凍結乾燥形、または当技術分野で周知の任意の他の形態として処方することができる。加えて、医薬組成物は、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、および保存剤を含む、薬学的に許容される添加剤も含有することができる。本明細書に記載されるポリヌクレオチド構築物の薬学的に許容される塩の投与が好ましい。そのような塩は、有機塩基および無機塩基を含む、薬学的に許容される非毒性塩基から調整することができる。無機塩基由来の塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム等が挙げられる。薬学的に許容される有機非毒性塩基由来の塩としては、第一級、第二級、および第三級アミン、塩基性アミノ酸等の塩が挙げられる。
【０１１４】
生体内で使用される水性医薬組成物のために、滅菌の発熱物質非含有の水の使用が好ましい。そのような製剤は、脊椎動物への投与に適切な薬学的に許容される組成物を調製するために、有効量の免疫原性組成物を、適切な量の媒体とともに含有する。
【０１１５】
キット
本発明は、脊椎動物へのポリペプチドの送達における使用のためのキットも提供する。各キットは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での脊椎動物細胞内で免疫原を作動式にコードする、１ｎｇ〜３０ｍｇの免疫原をコードするポリヌクレオチドを有する容器を含む。さらに、各キットは、同じまたは異なる容器中に、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥおよび共脂質を含む組成物等のアジュバントを含む。医薬キットの任意の成分は、単一の容器または複数の容器中に提供することができる。好ましくは、キットは、約１ｎｇ〜約３０ｍｇの免疫原コードポリヌクレオチドを含み、より好ましくは、約１００ｎｇ〜約１０ｍｇの免疫原コードポリヌクレオチドを含む。
【０１１６】
任意の適切な容器または複数の容器は、医薬キットとともに使用され得る。容器の例としては、それらに限定されないが、ガラス容器、プラスチック容器、またはプラスチック片または紙片が挙げられる。
【０１１７】
各医薬キットは、投与手段をさらに含み得る。投与のための手段としては、それらに限定されないが、シリンジおよび針、カテーテル、微粒子銃、粒子加速器、すなわち、「遺伝子銃」、空気式「無針」注射器、ゲル形態スポンジデポー、他の市販のデポー材料、例えば、ヒドラゲル、浸透圧ポンプ、および手術中のデカンティングまたは局所的適用が挙げられる。各医薬キットは、例えば、免疫原性組成物でコーティングされた縫合糸（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９９）６５：２１９３−２２０３）をさらに含み得る。
【０１１８】
キットは、脊椎動物への組成物の投与のための説明書をさらに含み得る。医薬組成物のポリヌクレオチド成分は、好ましくは、液体溶液として提供されるか、またはそれらは、凍結乾燥形で乾燥粉末またはケーキとして提供され得る。ポリヌクレオチドが凍結乾燥形で提供される場合、乾燥粉末またはケーキは、乾燥形態の医薬組成物の、任意の塩、侵入増強、トランスフェクション促進剤、および添加剤も含み得る。そのようなキットは、医薬組成物の凍結乾燥成分の正確な再構成のために、正確な量の滅菌状態の発熱物質非含有の水を有する容器をさらに含み得る。
【０１１９】
使用の前に医薬組成物がパッケージングされる容器は、凍結乾燥された製剤またはその薬学的有効用量のために適切な製剤を含有する溶液の量、または複数の有効用量を同封する、密封された容器を含むことができる。医薬組成物は、滅菌容器にパッケージングされ、密封された容器は、医薬品の無菌性を、使用するまで保つように設計される。任意に、容器は、投与手段および／または使用のための指示に関連する場合がある。
【０１２０】
ＬＥＣ複製
本開示は、ＰＣＲの使用によってＬＥＣを複製または製造するための方法を含む。当然のことながら、本明細書に開示されるＰＣＲ媒介の方法によって生成されるＬＥＣも、本開示の範囲内である。一部の実施形態において、複製方法は、ｉ）本開示のＬＥＣ配列を含有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を変性させるステップと、ｉｉ）当該変性したＤＮＡ鋳型ストランドを、ＬＥＣの末端を画定して、一対のＰＣＲプライマが当該ストランドにアニールできるようにする末端配置に相補的な当該プライマに接触させるステップと、ｉｉｉ）アニールされたプライマを、二本鎖ＤＮＡの合成のための条件下でＤＮＡポリメラーゼに接触させるステップと、を含む。代替的な実施形態において、一本鎖鋳型が、鋳型変性の必要性を除去する場合等において使用され得る。
【０１２１】
以下の実施例の部分において例示されるように、開示されるＰＣＲ条件は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での動物研究、および本明細書に記載されている動物、ヒト、および植物対象の治療のための十分なＤＮＡを生成するために十分である。収量に加えて、本開示のＰＣＲによる方法は、突然変異がほとんどない状態で生成されるＤＮＡを含み得る。限定されない例として、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）等の校正機能を有する高度に前進する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼは、約４．４×１０-7またはＴａｑポリメラーゼに対して報告されたものより約５０倍低い誤差率を有することが報告されている。
【０１２２】
さらに、一部の実施形態においては、比較的高いレベルのＬＥＣ生成のための入力核酸鋳型は、最終生成物としてのかなりの割合の変異配列の発生を引き起こす、早期ＰＣＲ周期に生じる突然変異（例えば、「ジャックポット」突然変異）の可能性を減少させるために使用され得る。限定されない例として、ＬＥＣのための約５ｎｇの鋳型が使用され得る。
【０１２３】
使用方法
本開示は、動物またはヒト対象または植物生物において免疫反応を誘導、促進、または引き起こすために開示されるＬＥＣを使用するための方法をさらに含む。方法は、開示されるＬＥＣ、またはＬＥＣ含有組成物もしくは製剤を対象に投与するステップを含む。投与の限定されない例としては、筋肉内、皮下、髄内、静脈、腹腔内、鼻腔内、眼球内、髄腔内、心室内、膀胱内、またはくも膜下注入による投与が挙げられる。投与のさらなる経路は、経口、口腔、舌下、直腸、経皮または皮内、膣、経粘膜または粘膜、経鼻、腸内、または非経口送達を含む。動物またはヒト対象の脳または膀胱等の特定の器官への投与も使用され得る。
【０１２４】
他の実施形態において、投与は、ＬＥＣまたはＬＥＣ含有組成物の微粒子銃（ＭＢ）で行われ得る。ＭＢを含む方法は、しばしば、当業者に周知の遺伝子銃（biolistic）（または「遺伝子銃（gene gun）」）装置の使用を含み、核酸導入の成功は、繰り返し報告されている（例えば、米国特許第ＵＳ５，５３８，８８０号、米国特許第ＵＳ５，５５０，３１８号、および米国特許第ＵＳ５，６１０，０４２号、ならびに国際公開第ＷＯ９４／０９６９９号を参照）。一部の実施形態において、ＬＥＣは、ＭＢを介して皮膚細胞へ導入される。さらなる実施形態において、投与は、経皮貼布、針アレイ、無針注入、無針装置、および局所的適用によって行われ得る。他の実施形態において、ＬＥＣの流体力学的送達が使用され得る。
【０１２５】
一部の実施形態においては、本明細書に記載されている粒子またはビーズは、ＬＥＣでコーティングされ、その後、推進力によって、動物、ヒト、または植物対象のもの等の標的細胞へ送達される。粒子またはビーズの中、またはその上で使用される材料の限定されない例としては、タングステン、プラチナ、または金が挙げられる。粒子またはビーズは、金属へのＤＮＡ沈殿によってＬＥＣでコーティングされ得るが、粒子またはビーズがＬＥＣでコーティングされるのではなく、それを含有し得るため、そのようなコーティングは任意である。
【０１２６】
さらなる実施形態においては、投与は、免疫方法の分野で周知の１つ以上のアジュバントと組み合わせて行われ得る。アジュバントの効果は、抗原特異的でないため、各種のアジュバントを、開示される方法において使用することができる。
【０１２７】
アジュバントの限定されない例としては、ミョウバン、ムラミルジペプチド（Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンまたはＭＤＰ）またはその誘導体（アミノ酸誘導体スレオニル−ＭＤＰ、または脂肪酸誘導体ＭＴＰＰＥ等）、またはペプチドグリカン等のバクテリア分子、アルキルリゾリン脂質（ＡＬＰ）、ＢＣＧ（カルメットゲラン菌、マイコバクテリアの弱毒化菌株）またはＢＣＧ細胞壁骨格（ＣＷＳ）、リポテイコ酸（ＬＴＡ）、リビトールテイコ酸（ＲＴＡ）、およびグリセロールテイコ酸（ＧＴＡ）等のグラム陰性細胞からのテイコ酸、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、節足動物のヘモシアニン、または節足動物のヘムエリトリン等のヘモシアニンまたはヘムエリトリン、肺炎球菌多糖体、キチン、キトサン、または脱アセチル化キチン等の多糖アジュバント、トレハロースジミコレート、サポニンまたはＱＳ２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）等のその誘導体等の両親媒性および界面活性薬剤、Ｑｕｉｌ  Ａ、レンチネン、ＭＦ−５９（またはＭＦ５９）、ＭＰＬＡ、または米国特許第ＵＳ４，８６６，０３４号に開示されるもの等の脱毒化内毒素が挙げられる。追加の限定されない例は、Ｒｉｂｉのアジュバント系（ＲＡＳ）である。アジュバントの付加的な限定されない例は、Ｖｏｇｅｌ  ＦＲら（「Ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ．」Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５，６：１４１−２２８）によって記載され、完全に説明されるように、参照することにより本明細書に組み込まれる。開示される組成物および方法は、本明細書に記載されるアジュバントのいずれの１つ以上の使用をも含み得る。
【０１２８】
本開示の方法は、ＬＥＣまたはその組成物の複数回投与を任意に含む。一部の実施形態においては、反復投与の回数は、６回未満、４回未満、または約１回、２回、もしくは３回である。投与は、様々な時間間隔によって間隔をあけ得る。限定されない例としては、約２〜約１２週、約４〜約６週、または約８〜約１０週の間隔が挙げられる。約１、約２、約３、約４、または約５またはそれ以上の年数の間隔後の追加免疫投与も使用され得る。
【０１２９】
誘導、促進、または引き起こされた免疫反応の経過の後、投与されたＬＥＣによって発現したポリペプチドに対する抗体または免疫細胞に対するアッセイが後続し得る。アッセイは、治療される対象からの体液を含有する抗体または細胞の使用によって行われ得る。限定されない例としては、対象からの血清、血漿、または血液が挙げられる。代表的なアッセイ技術は、米国特許第ＵＳ３，７９１，９３２号、米国特許第ＵＳ３，９４９，０６４号、および米国特許第ＵＳ４，１７４，３８４号に開示される。他の免疫反応に対するアッセイも行うことができる。一部の実施形態においては、アッセイは、ポリペプチドを発現する病原体での攻撃からの保護のためである。
【０１３０】
本発明を概して説明したが、同開示は、例示のために提供され、特別の定めのない限り、開示される発明を制限する意図を有しない以下の実施例の参照によって、さらに容易に理解される。
【実施例１】
【０１３１】
材料および方法
ＬＥＣ  ＤＮＡのＰＣＲ増幅
オリゴヌクレオチドプライマ（前方５′ＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＡＴＡＣＧＴＴＧＴＡＴＣＣＡＴＡＴＣＡＴ、および逆５′ＡＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣＣ）は、増幅が、インフルエンザＡ／ＨＫ／８／６８  Ｈ３Ｎ２（Ｈ３ＨＡ）またはインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４  Ｈ１Ｎ１（Ｈ１ＨＡ）ＯＲＦのいずれかに加えて、ＣＭＶプロモータ／イントロンおよび終結配列を含有する３．５ｋｂｐ線形発現カセット（ＬＥＣ）を生成するように、ＶｉｃａｌのＨＡ発現ベクターのＣＭＶプロモータおよびウサギベータグロビン（ＲＢＧ）転写ターミネータの両側に位置するように設計された（図１）。２組のプライマを使用し（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ；Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、第１の組は、標準のデオキシリボヌクレオチドのみを有するように作製したが、第２の組は、各プライマの２つの５′最大残基が、ホスホロチオエート（ＭＯＤ）で誘導体化されるように調製した。ＰＣＲは、最終容量１００μＬの、５ｎｇの線形化インフルエンザＡ  ＨＡプラスミド、各２００μＭのｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２ＵのＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）、および１ｘＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＦ緩衝液（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ；Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して行った。ＰＣＲは、以下の熱循環条件を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ９７００熱サイクラー（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）において行った。（ａ）未修飾オリゴヌクレオチド：１×９８℃（３０秒）；３０×｛９８℃（１５秒）、５０℃（１５秒）、７２℃（９０秒）｝；１×７２℃、６００秒、および（ｂ）ＭＯＤオリゴヌクレオチド：１ｘ９８℃（３０秒）；３５ｘ｛９８℃（１５秒）、７１℃（１５秒）、７２℃（９０秒）｝；１×７２℃、６００秒。Ｈ３ＨＡおよびＨ１ＨＡ  ＯＲＦは、マウス適合Ａ／ＨＫ／６８  Ｈ３Ｎ２およびＡ／ＰＲ／３４  Ｈ１Ｎ１菌株のそれぞれから直接Ｖｉｃａｌでクローンした。
【０１３２】
増幅生成物の精製
ＰＣＲ増幅生成物は、ＤＮＡ結合樹脂カラム（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製し、Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ（登録商標）カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上の限外ろ過を使用して濃縮した。ＬＥＣ  ＤＮＡ濃度は、少なくとも２つの希釈物を使用して、Ａ260吸光光度分析によって決定した。数回のＰＲＣ実行からのＬＥＣ  ＤＮＡは、さらなる試験の前にプールした。
【０１３３】
ＬＥＣ  ＤＮＡ特性化
ＬＥＣ  ＤＮＡは、ＴＡＥ−ＥｔＢｒ１％アガロースゲル上で実行し、予期される３．５ｋｂｐバンドの存在および組み込まれていないプライマおよび外部ＤＮＡバンドの非存在を確認した（図２）。ＤＮＡの長さは、１ｋｂｐＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）との比較によって予測した。ＬＥＣ製剤は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）研究の前にＤＮＡ配列によって、さらに特徴付けた。ＤＮＡ配列情報は、標準蛍光標識二本鎖ジデオキシ配列解析技術（Ｒｅｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して得た。シークエンシングは、両ストランド上で約５００ｂｐごとにプライマを使用して行った。配列は、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（Ｖｅｒ４．１．４，Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して組み立てた。
【０１３４】
生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）抗原発現試験
ウエスタンブロットアッセイを使用して、正確な免疫学的特異性および大きさのインフルエンザウイルスＨ１ＨＡおよびＨ３ＨＡタンパク質が、ＬＥＣから発現したことを確認した。タンパク質は、ＬＥＣでマウスメラノーマ細胞をトランスフェクトし、ウエスタンブロットによって細胞溶解物を分析し、免疫学的に特異的なタンパク質バンドが、予期された見掛けの分子量であったことを実証することによって同定した。ＬＥＣを、５μＬ／ｍＬのＥｘＧｅｎ５００（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）で錯化された１．５μｇ／ｍＬの用量で細胞に導入した。陽性および陰性対照のために、導入遺伝子特異的ＯＲＦを有するか、または有しないプラスミドを、１０μＬ／ｍＬのＥｘＧｅｎ５００で錯化された３μｇ／ｍＬの用量で細胞に導入した。トランスフェクション後４８時間に、細胞を、Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して採取し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１０％グリセリン、０．５％ＮＰ−４０、および１つのプロテアーゼ抑制錠剤（Ｒｏｃｈｅ；Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を含有する溶解緩衝液で溶解した。細胞溶解物は、ウエスタンブロット分析の前に−７０℃で保存した。サンプルは、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で、還元／変性ゲル電気泳動条件の下、分析した。タンパク質は、０．２μｍのＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に移動させ、一次抗体（ウサギ接種；２．６．１）、その後、アルカリホスファターゼ共役二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ）で精査した。ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（ＫＰＬ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、可視的タンパク質バンドを生成した。
【０１３５】
処方設計
バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））は、ＶＣ１０５２（（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ミリストレイルオキシ）−１−プロパナミニウムブロマイド）と、ＤＰｙＰＥ（ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン）の等モル量の混合物から成る。バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））の調製およびその製剤は、Ｈａｒｔｉｋｋａおよび共同研究者（「Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．」Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００１，１９（１５−１６），１９１１−１９２３）によって最初に記載された。修正されたプロトコルを、以下のように簡潔に要約する。ＶＣ１０５２とＤＰｙＰＥの両方は、クロロホルムで再懸濁し、１：１のモル比で混合し、バイアルに等分し、バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））試薬乾燥脂質膜を作成するために乾燥させる。注入の日、脂質膜バイアルは、１ｍＬの０．９％生理食塩水中に再懸濁し、必要に応じて希釈する。ＬＥＣおよびｐＤＮＡは、０．９％生理食塩水、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２中で調製した。ＬＥＣは、脂質を同量のＬＥＣにゆっくりと流し込むことによって、バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方する。すべての必要な用量は、０．２〜０．５ｍｇ／ｍＬの範囲で処方し、必要に応じて低濃度に希釈することによって調製する。
【０１３６】
Ｈ３ＨＡおよびＨ１ＨＡ発現プラスミドでのウサギの接種
ＨＡ  ＬＥＣ特徴付けのための抗体試薬は、ウサギの接種によって得た。この目的のために、２匹のニュージーランド白ウサギ（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ；Ｏｘｆｏｒｄ，ＭＩ）を、バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＨ３ＨＡ  ｐＤＮＡで接種した。加えて、２匹のウサギを、バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＨ１ＨＡ  ｐＤＮＡで接種した。１ミリグラムのｐＤＮＡは、０、２８および５６日目に、１ｍｇ／ｍＬで、筋肉注射（大腿直筋）により投与し、最終出血は、耳静脈穿刺によって７８日目に行った。
【０１３７】
ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫付与およびウイルス攻撃
インフルエンザＡ攻撃モデルは、Ｕｌｍｅｒおよび共同研究者（Ｕｌｍｅｒら）によって最初に記載された、マウス適合Ａ／ＨＫ／８／６８菌株を使用した。マウス適合ウイルスは、ウイルスストック（５０ｐｆｕ）の１：１０，０００の希釈で、ケタミン麻酔下で鼻腔内感染したマウスの大多数において致命的感染を引き起こす。この用量で、ほとんどのマウスは、攻撃後１０日目までに死亡する。典型的には、未投与マウスの２０％より多くが、このウイルス攻撃用量での感染から生き残ることはない。生後６〜８週の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＮ）は、インフルエンザウイルス攻撃研究に使用された。ＤＮＡ接種は、５０ｐｆｕ（１ＬＤ90）のウイルスでの接種後３〜６週間に、両側の大腿直筋注入、その後、鼻腔内ウイルス攻撃で与えた。マウスは、ウイルス攻撃後３週間、疾病率および体重減少に対してモニタした。平均体重減少は、動物の３０％以上を失った群に対して求めなかった。
【０１３８】
統計分析
マウスの体重は、マンホイットニーノンパラメトリック統計試験を使用して分析した。マウスの生き残りは、カプランマイヤー生存プロット、その後、ログランク（マンテルコックス）試験を使用して分析した。ｐ≦０．０５である場合、差は、統計的に有意であるとみなした。
【実施例２】
【０１３９】
ＰＣＲ増幅ＬＥＣは、インフルエンザＡ致死的ウイルス攻撃に対して保護することができる。
ＬＥＣベースのインフルエンザＡワクチンを、マウス適合ウイルスの致死量を使用してマウスにおいて研究した。研究は、同型Ｈ３ＨＡ−ＬＥＣワクチン対異型ワクチンＨ１ＨＡ−ＬＥＣの優位性を試験するために設計された。マウスの４つの群を、０および２１日目に接種し、４２日目にＨ３Ｎ２インフルエンザＡ／ＨＫ／８／６８マウス適合ウイルスで攻撃した。群は、（１）Ｈ３ＨＡ−ＬＥＣワクチン試験（５０μｇ／１回分、マウス１５匹）、（２）Ｈ１ＨＡ−ＬＥＣワクチンコンパレータ（５０μｇ／１回分、マウス１５匹）、（３）ＶＲ４７５０  Ｈ３ＨＡ−ｐＤＮＡ（１００μｇ／１回分、陽性対照、マウス１０匹）、および（４）ＰＢＳ、ＤＮＡなし（マウス１５匹、陰性対照媒体のみ）であった。主要研究評価項目は、生存であり、副次的評価項目は、体重であった。
【０１４０】
各試験群１５匹のマウスにおいて、この研究の８０％は、Ｈ３ＨＡ−ＬＥＣ群とＨ１ＨＡ−ＬＥＣ群との間の優位性を試験するためであった。この研究からのデータを図３に要約する。Ｈ３ＨＡ−ＬＥＣおよびＨ３ＨＡ−ｐＤＮＡの両群のマウスは、致死的ウイルス攻撃から生き残るか、体重を減少させないか、または不健康に見えなかった。対照的に、すべてのＨ１ＨＡ−ＬＥＣおよびＰＢＳのみを注射されたマウスは、それらの体重の４０％までの減少を示し、１８日目までに死亡した。
【実施例３】
【０１４１】
低用量の、バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＬＥＣは、インフルエンザウイルス攻撃に対して保護することができる。
インフルエンザＬＥＣワクチンの有効性は、２つの用量反応研究において調査した。第１の研究においては、マウスは、ＰＢＳで処方されたＨ３ＨＡ−ＬＥＣ（５０μｇ）、またはバクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＨ３ＨＡ−ＬＥＣ（５０μｇ）、またはバクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＭＯＤ−Ｈ３ＨＡ−ＬＥＣ（５０、１０および２μｇ）のいずれかで接種した（０および２１日目、各群マウス１０匹）。加えて、バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＨ３ＨＡ  ｐＤＮＡ（１００μｇ）およびＰＢＳ群を、それぞれ、陽性および陰性対照として含めた。研究の終了時（最初の接種後９週）には、同型（Ｈ３ＨＡ）群におけるすべてのマウスは、ウイルス攻撃から生き残り、ＰＢＳおよびＨ１ＨＡ−ＬＥＣ群におけるマウスの攻撃は、それぞれ、１０％および２０％の生存という結果になった。平均して約７％の最大体重減少が８日目に見られた、２μｇのバクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＭＯＤ−Ｈ３ＨＡ−ＬＥＣを除いて、同型ワクチン群における動物に関して、明らかな体重減少は見られなかった。
【０１４２】
この最後の群におけるすべての動物は、研究の終了時までにそれらの体重が回復した。異型（Ｈ１ＨＡ）および陰性対照群における動物は、平均で、それらの体重の２５％までの減少を示し、攻撃から生き残った動物は、研究の終了時までにそれらの体重のほとんどが回復した。この研究の生存および体重データを図４に要約する。攻撃後２８日目の生き残りは、Ｈ３ＨＡ−ＬＥＣおよびＭＯＤ−Ｈ３ＨＡ−ＬＥＣ群と、ＰＢＳ対照またはＨ１ＨＡ−ＬＥＣのいずれかとの間に統計的有意性を示した。
【実施例４】
【０１４３】
ＬＥＣインフルエンザワクチンの単回投与は、インフルエンザ攻撃に対して保護的であり得る。
第２の研究は、３．２に記載される同じ試験および対照群を使用したが、マウスは、０日目に接種を１回のみ受けた。ウイルス攻撃は、接種後６週に行われ、研究は、接種後９週で終了した。２μｇのバクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＭＯＤ−Ｈ３ＨＡ  ＬＥＣの単回注入のみを受けたマウスは、Ｈ３Ｎ２ウイルス攻撃から１００％保護され、ＭＯＤ−Ｈ１ＨＡ−ＬＥＣ群のマウスの４０％、およびＰＢＳのみの群の動物の２０％が、ウイルス攻撃から生き残った。生存および体重データを図５に示す。
【実施例５】
【０１４４】
例示的な結果
本明細書に開示されるＰＣＲ増幅条件の有効性は、ＰＣＲ増幅ＬＥＣのＤＮＡ配列分析によって裏付けられた（データは図示せず）。さらに、得られたＬＥＣを、コードされたインフルエンザＨＡ抗原の発現に対して生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で試験した。ウエスタンブロット分析は、予期された大きさのタンパク質の発現および交差反応性を示した（図２）。
【０１４５】
本明細書に記載されているように、よく特徴付けられたマウス適合インフルエンザＡ／ＨＫ／８／６８（Ｈ３Ｎ２）ウイルスの致死量を使用して、ＬＥＣ接種の有効性を試験した。図３のデータは、同型ＬＥＣ接種が、ＰＢＳ中の１回分当たり５０μｇで０および２１日目に投与する場合、マウスを完全に保護することを示す。同型ＬＥＣ群（Ｈ３ＨＡ）に対する生き残りおよび体重減少の両方のデータは、Ｈ３ＨＡ−ｐＤＮＡ陽性対照と区別がつかない。一方、異型ＬＥＣ群およびＰＢＳ群のマウスは１匹も攻撃から生き残らず、それぞれ、異型干渉効果の不足を示し、使用したウイルス用量の致死性を確認した。
【０１４６】
本開示のＬＥＣを生成するエクソヌクレアーゼ耐性ＰＣＲプライマの使用効果は、２つの５′最大残基がホスホロチオエートである、オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマを使用することによって試験された。得られたＬＥＣ（ＭＯＤ−ＬＥＣ）は、このカチオン性脂質系のアジュバント効果から利益を得るように、バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方した。マウスは、５０μｇ〜２μｇの範囲の用量を使用して、バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＭＯＤ−ＬＥＣで接種した。また、バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＭＯＤ−ＬＥＣの単回用量を使用した接種の有効性を試験した。
【０１４７】
図４に示される生き残りおよび体重減少データは、ＬＥＣワクチンの２回の投与は、ウイルス攻撃からマウスを完全に保護することを示す。注目すべきは、試験された最低用量でのＬＥＣ  Ｈ３ＨＡワクチンの単回投与（２μｇ）が、ウイルス攻撃に保護を与えるために十分であった。マウスは、活発で健康的に見え、この群における病気の唯一の兆候は、９日目までの平均体重におけるわずかな（＜１０％）統計的に有意ではない減少であった。この群のすべての動物は、研究の終了時までそれらの体重が回復した。
【０１４８】
したがって、データは、インフルエンザＡウイルスの致死量から保護するための線形ＤＮＡベースのワクチンの使用の実行可能性を証明する。低用量でのバクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標））で処方されたＬＥＣの有効性は、カチオン性脂質で処方されたＤＮＡの強化された免疫反応を示す既刊データと一致する。製造の有効性および簡便性は、急速なワクチン開発への有望な取り組みとしてＬＥＣベースのインフルエンザワクチンの評価をさらに支持する。
【０１４９】
特許、特許出願、および出版物を含む、本明細書に挙げられるすべての参照文献は、上記に特別に組み込まれたか否かに関わらず、それらの全体として参照することにより本明細書によって組み込まれる。
【０１５０】
本開示はここで完全に提供されたが、当業者にとって当然のことながら、同開示は、本開示の精神および範囲から逸脱せず、および不適切な実験を伴わずに、広範囲の同等のパラメータ、濃度、および条件内で行うことができる。
【０１５１】
本開示は、その特定の実施形態に関連して説明されたが、当然のことながら、さらなる修正が可能であることが理解される。本出願は、本開示のいかなる変化、使用、または適応をも対象とするように意図され、概して、開示される原理に従い、本開示が属する当該技術内での周知または通常の慣習内で、以上に説明される本質的特色に適用され得る、本開示からのそのような逸脱を含む。
【図１】
2010511406.tif 000003
【図２Ａ】
2010511406.tif 000004
【図２Ｂ】
2010511406.tif 000005
【図３】
2010511406.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【配列表】
2010511406000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月5日(2009.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２０】
動物またはヒト対象において免疫反応を引き起こすための製剤であって、請求項１から１９のうちのいずれか１項に記載のＬＥＣまたは組成物を投与することを含む、製剤。
【国際調査報告】
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