(57)【要約】リアルタイム核酸増幅によって分析物ポリヌクレオチドを定量するために使用される型の予め規定されたマスター検量線を作成および調整するための方法およびキット。特に、ある１つの機器において１つ以上のマスター検量線を作成し、次いで、マスター検量線を異なる機器において使用する方法を開示する。本発明によって、非常に少ない回数で検量標準反応を実施することによって得られる結果を用いて、保存マスター検量線を調整するための機構を提供する。
2010511390.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
調整後の検量線についての方程式を確立する方法であって、該方法は、
（ａ）各々が一定の出発量の内部検量物質および既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準を含む複数の標準試料を得る工程；
（ｂ）該複数の標準試料の各々における該内部検量物質および該分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程；
（ｃ）該複数の標準試料の各々に対して、同時に増幅された該内部検量物質および該分析物ポリヌクレオチド標準の増幅の兆候を決定し、それにより
該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該内部検量物質の決定した一群の増幅兆候、および
該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該分析物ポリヌクレオチド標準の決定した一群の増幅兆候
が得られる工程；
（ｄ）該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該内部検量物質の決定した一群の増幅兆候に第１の曲線を適合させるため、第１の方程式を最適化し、それにより適合した第１の方程式を得る工程；
（ｅ）該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該分析物ポリヌクレオチド標準の決定した一群の増幅兆候に第２の曲線に適合させるため、第２の方程式を最適化し、それにより適合した第２の方程式を得る工程；
（ｆ）所定量の該分析物ポリヌクレオチド標準および該一定の出発量の内部検量物質を含む調整検量物質を得る工程；
（ｇ）該調整検量物質の内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程；
（ｈ）該調整検量物質に関して、同時に増幅された該内部検量物質および該分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を決定する工程；
（ｉ）該調整検量物質の内部検量物質について決定された増幅兆候を用いて、該適合した第１の方程式を修正し、これにより、該内部検量物質の適合された増幅兆候に対する調整後の適合した第１の方程式が、該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として得られる工程；
（ｊ）該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチドに対して決定された増幅兆候を用いて、該適合した第２の方程式を修正し、これにより、該分析物ポリヌクレオチド標準の適合された増幅兆候に対する調整後の適合した第２の方程式が、該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として得られる工程；ならびに
（ｋ）該調整後の適合した第１の方程式および該調整後の適合した第２の方程式を互いに数学的に関係付けることにより、調整後の検量線についての方程式を確立する工程
を含む、方法。
【請求項２】
同時に増幅する工程（ｂ）および（ｇ）が等温での同時増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
等温での同時増幅が、ＲＮＡポリメラーゼを含む転写関連増幅反応における等温での同時増幅を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
同時に増幅する工程（ｂ）および（ｇ）が異なる機器で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
同時に増幅する工程（ｂ）が、第１の機器で行なわれる核酸増幅反応での同時増幅を含む、
同時に増幅する工程（ｇ）が、第２の機器で行なわれる核酸増幅反応での同時増幅を含む、ならびに
最適化する工程（ｄ）および（ｅ）の適合した第１および第２の方程式を該第２の機器に接続したコンピュータのメモリデバイスに保存する、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
確立する工程（ｋ）が、前記第２の機器での使用のため、前記調整後の検量線についての方程式を確立することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
同時に増幅する工程（ｂ）が、第１の機器で行なわれる等温核酸増幅反応においての同時増幅を含む、
同時に増幅する工程（ｇ）が、第２の機器で行なわれる等温核酸増幅反応での同時増幅を含む
；ならびに
最適化する工程（ｄ）および（ｅ）の適合した第１および第２の方程式を、該第２の機器に接続したコンピュータのメモリデバイスに保存する、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｄ）および（ｅ）の適合した第１および第２の方程式が、各々、複数の係数を含み、得る工程（ｆ）が、さらに、該適合した第１および第２の方程式それぞれに対する該複数の係数を得ることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
最適化する工程（ｄ）および（ｅ）の第１および第２の方程式が非線形方程式であり、各々が複数の係数を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
確立する工程（ｋ）で互いに数学的に関係付けるプロセスが、前記調整後の適合した第２の方程式を用いて計算された数値結果および前記調整後の適合した第１の方程式を用いて計算された数値結果を比として数学的に関係付けることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記同時に増幅する工程（ｂ）および（ｇ）の等温核酸増幅反応が、各々、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
同時に増幅する工程（ｂ）および（ｇ）の等温核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、該分析物ポリヌクレオチド標準または該内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
同時に増幅する工程（ｂ）および（ｇ）の等温核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
同時に増幅する工程（ｂ）および（ｇ）により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび該内部検量物質アンプリコンは異なる長さである、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
同時に増幅する工程（ｂ）および（ｇ）により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび該内部検量物質アンプリコンは異なるパーセンテージのＧ＋Ｃ塩基を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
最適化する工程（ｄ）の適合した第１の方程式が、適合した第１の方程式の複数の係数を含み、最適化する工程（ｅ）の適合した第２の方程式が、適合した第２の方程式の複数の係数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
確立する工程（ｋ）で互いを数学的に関係付けるプロセスが、前記調整後の適合した第２の方程式を用いて計算された数値結果および前記調整後の適合した第１の方程式を用いて計算された数値結果を比として数学的に関係付けることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
確立する工程（ｋ）で互いを数学的に関係付けるプロセスが、該調整後の適合した第２の方程式を用いて計算された数値結果および該調整後の適合した第１の方程式を用いて計算された数値結果を差として数学的に関係付けることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
修正する工程（ｉ）が、
前記調整検量物質の内部検量物質に対して決定した増幅兆候、および
該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の所定量に等しい該分析物ポリヌクレオチドの出発量で前記適合した第１の方程式を解くことにより計算された値
を用いて、該内部検量物質に対する調整因子を決定すること；および
該内部検量物質に対する調整因子を、該適合した第１の方程式の係数の１つに加算すること
を含み；ならびに
修正する工程（ｊ）が、
該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準について決定した増幅兆候、および
該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の所定量に等しい該分析物ポリヌクレオチドの出発量で適合した前記第２の方程式を解くことにより計算された値
を用いて、分析物ポリヌクレオチドに対する調整因子を決定すること；および
該分析物ポリヌクレオチドに対する調整因子を、該適合した第２の方程式の係数の１つに加算すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
同時に増幅する工程（ｂ）および（ｇ）が、各々、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む核酸増幅反応での同時増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
同時に増幅する工程（ｂ）および（ｇ）が、各々、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含むが該分析物ポリヌクレオチド標準または該内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない核酸増幅反応での同時増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
同時に増幅する工程（ｂ）および（ｇ）が、各々、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない核酸増幅反応中での同時増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、
第２の所定量の前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記一定量の内部検量物質を含む第２の調整検量物質を得る工程；
該第２の調整検量物質の内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程；
該第２の調整検量物質について、同時に増幅された該内部検量物質および該分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を決定する工程；ならびに
該第２の調整検量物質の内部検量物質および該第２の調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候をそれぞれ用いて、前記適合した第１および第２の方程式を修正する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記同時に増幅する工程（ｂ）および（ｇ）により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび該内部検量物質アンプリコンは異なる長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記同時に増幅する工程（ｂ）および（ｇ）により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび該内部検量物質アンプリコンは異なるパーセンテージのＧ＋Ｃ塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
最適化する工程（ｄ）および（ｅ）の第１および第２の方程式が非線形方程式であり、各々が複数の係数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｄ）および（ｅ）の適合した第１および第２の方程式が、各々、複数の係数を含み、得る工程（ｆ）が、さらに、該適合した第１および第２の方程式に対するそれぞれの複数の係数を得ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
保存マスター検量線を調整するための検量物質を備えるキットを作製するための方法であって、該方法は、
各々が一定出発量の内部検量物質および既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準を含む複数の標準試料を形成する工程；
該複数の標準試料の各々における核酸増幅反応において、該内部検量物質および該分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程；
各核酸増幅反応において同時に増幅された該内部検量物質および該分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を決定し、これにより、
該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該内部検量物質について決定した一群の増幅兆候、および
該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該分析物ポリヌクレオチド標準について決定した一群の増幅兆候
が得られる、工程；
該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該内部検量物質について決定した該一群の増幅兆候に第１の曲線を適合させるため、第１の方程式を最適化し、それにより、適合した第１の方程式の一組の係数を含む適合した第１の方程式を得る工程；
該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、該分析物ポリヌクレオチド標準について決定した該一群の増幅兆候に第２の曲線を適合させるため、第２の方程式を最適化し、それにより、適合した第２の方程式の一組の係数を含む適合した第２の方程式を得る工程；ならびに
（ａ）明確な形態の適合した第１の方程式の該一組の係数、
（ｂ）明確な形態の適合した第２の方程式の該一組の係数、および
（ｃ）所定量の該分析物ポリヌクレオチド標準と、
該一定の出発量の内部検量物質と
を含む調整検量物質
を含むパッケージ化された組合せを作製する工程
を含む、方法。
【請求項２９】
前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が等温核酸増幅反応である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記等温核酸増幅反応が、ＲＮＡポリメラーゼを含む転写関連増幅反応である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、該分析物ポリヌクレオチド標準または該内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記増幅兆候を決定する工程が時間依存性増幅兆候の決定を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記最適化する工程の第１および第２の方程式が第１および第２の非線形方程式である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記明確な形態の適合した第１および第２の方程式の係数の組が、機械可読形態の適合した該第１および第２の方程式の係数の組を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記機械可読形態の適合した第１および第２の方程式の係数の組がバーコードを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記同時に増幅する工程により、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンが生成され、該内部検量物質アンプリコンおよび該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンは異なる長さである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記同時に増幅する工程により、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンが生成され、該内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンは異なるパーセンテージのＧ＋Ｃ塩基を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
前記作製する工程のパッケージ化された組合せが、さらに、
第２の所定出発量の前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記一定出発量の内部検量物質を含む第２の調整検量物質を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が等温核酸増幅反応であり、最適化する工程の第１および第２の方程式が第１および第２の非線形方程式である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、該分析物ポリヌクレオチド標準または該内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応は、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記同時に増幅する工程により、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンが生成され、該内部検量物質アンプリコンおよび該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンは異なるパーセンテージのＧ＋Ｃ塩基を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記同時に増幅する工程により、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンが生成され、該内部検量物質アンプリコンおよび該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンは異なる長さである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、該分析物ポリヌクレオチド標準または該内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記同時に増幅する工程の核酸増幅反応は、前記分析物ポリヌクレオチド標準および前記内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
一定量の内部検量物質を含む多重核酸増幅反応において分析物ポリヌクレオチドを定量するための方程式の作成方法であって、該方法は、
核酸増幅反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を特定する保存マスター曲線の第１の方程式の複数の係数を得る工程；
核酸増幅反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての内部検量物質の増幅兆候を特定する保存マスター曲線の第２の方程式の複数の係数を得る工程；
既知量の分析物ポリヌクレオチド標準および一定の出発量の内部検量物質を含む調整検量物質を用いて核酸増幅反応を実施する工程であって、ここで、該核酸増幅反応により、該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質が同時に増幅され、該核酸増幅反応により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンが生成される、工程；
該核酸増幅反応で同時に増幅された分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の増幅兆候を決定する工程；
該核酸増幅反応により決定された分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候、および
該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の該既知量に等しい分析物ポリヌクレオチド標準の該出発量での該保存マスター曲線の第１の方程式を解くことにより計算された値
を用いて分析物ポリヌクレオチド標準に対する調整因子を確立する工程；
該核酸増幅反応により決定された内部検量物質の増幅兆候、および
該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の該既知量に等しい分析物ポリヌクレオチド標準の該出発量での保存マスター曲線の第２の方程式を解くことにより計算された値
を用いて内部検量物質に対する調整因子を確立する工程；
分析物ポリヌクレオチド標準に対する該調整因子を用いて、該保存マスター曲線の第１の方程式の係数の１つを修正し、これにより、分析物ポリヌクレオチド標準に対する調整後の検量線を特定する方程式を得る工程；
内部検量物質に対する該調整因子を用いて、該保存マスター曲線の第２の方程式の係数の１つを修正し、これにより、内部検量物質に対する調整後の検量線を特定する方程式を得る工程；ならびに
（ａ）分析物ポリヌクレオチド標準に対する該調整後の検量線を特定する方程式、および
（ｂ）内部検量物質に対する該調整後の検量線を特定する方程式
を互いに数学的に関係付けることにより、分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程
を含む、方法。
【請求項５１】
前記核酸増幅反応を実施する工程が等温核酸増幅反応の実施を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記等温核酸増幅反応が、ＲＮＡポリメラーゼを含む転写関連増幅反応である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なる長さである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なるパーセンテージのＧ＋Ｃ塩基を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記実施する工程が、第１の核酸増幅機器での前記核酸増幅反応の実施を含み、ならびに
前記得る工程の保存マスター曲線の第１の方程式の前記複数の係数および保存マスター曲線の第２の方程式の前記複数の係数は、該第１の核酸増幅機器を用いて決定されない、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記増幅兆候を決定する工程が時間依存性増幅兆候の決定を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記保存マスター曲線の第１および第２の方程式が非線形方程式である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも１種類のプライマーを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記実施する工程の核酸増幅反応が共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
前記分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程が、比を求めるための除算による数学的関係付けを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６２】
前記分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程が、差を求めるための減算による数学的関係付けを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６３】
前記核酸増幅反応を実施する工程が等温核酸増幅反応の実施を含み、前記保存マスター曲線の第１および第２の方程式が非線形方程式である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも１種類のプライマーを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記実施する工程の核酸増幅反応が共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なるパーセンテージのＧ＋Ｃ塩基を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なる長さである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも１種類のプライマーを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記実施する工程の核酸増幅反応が共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程が、
分析物ポリヌクレオチド標準に対する前記調整後の検量線を特定する方程式を用いて計算された数値、および
内部検量物質に対する前記調整後の検量線を特定する方程式を用いて計算された数値
を数学的に関係付けることを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項７３】
前記分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程が、比を計算するための除算による数学的関係付けを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程が、差を計算するための減算による数学的関係付けを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記核酸増幅反応を実施する工程が等温核酸増幅反応の実施を含み、前記保存マスター曲線の第１および第２の方程式が非線形方程式である、請求項５０に記載の方法。
【請求項７６】
前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも１種類のプライマーを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記実施する工程の核酸増幅反応が共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なるパーセンテージのＧ＋Ｃ塩基を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なる長さである、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも１種類のプライマーを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記実施する工程の核酸増幅反応が共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない、請求項８０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００６年１１月３０日に出願された、米国仮出願第６０／８６８，００４号の利益を主張する。この先行出願の全体の開示は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より詳しくは、本発明は、核酸増幅を用いる分析物ポリヌクレオチドの定量化に関し、さらにより詳しくは、リアルタイム核酸増幅反応の結果を解析するためのファクトリー供給型検量線および調整検量物質の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
インビトロ核酸増幅の動態解析を含む方法は、分析物ポリヌクレオチドを定量するための重要なツールとなっている。「リアルタイム」増幅手順と称されることもあるこのような手順では、核酸増幅反応混合物中に存在するアンプリコンの量を増幅手順の過程にわたって時間の関数としてモニタリングする。完全に自動化されたリアルタイム核酸アッセイには、その反応中に得られた時間依存性データを解析することが可能な、機械で実行可能なアルゴリズムが必要となる。この点に関して、観察される増幅結果をもたらし得る核酸の量または濃度を正確に出力するデータ処理アルゴリズムが必要である。
【０００４】
特定の核酸標的の絶対量の定量化に伴う問題は、特許文献において認識されている。このような問題は、増幅プロセスの指数性および反応速度を制御するいずれかの変数（例えば、プライマー対の長さおよびヌクレオチド配列）の小さな相違により、アンプリコン収量に劇的な相違をもたらし得ることに起因している。Ｗａｎｇらは、特許文献１において、分析物ポリヌクレオチドを増幅するものと同じプライマーを用いて増幅した内部標準の使用について記載し、関連のないｃＤＮＡを標準として使用することにより、定量されている特定の標的核酸および関連のない第２の組のオリゴヌクレオチドプライマーが必要となることに対処した。Ｗａｎｇらによると、２組の関連のないプライマーを使用する解析では、核酸標的濃度の絶対尺度ではなく、２つの独立した増幅反応の相対比較しか得ることができない。他にも、この教示に従い、同様の配列を有することおよび共通のプライマー対を用いて増幅することで対象の標的と類似した内部標準を使用したものがある（公開された米国特許出願第１０／２３０，４８９号参照）。さらに、他にも、増幅効率の決定に依存した定量的方法が記載されている（公開された特許文献２参照）。また別のアプローチは、対照および標的配列の増幅比の決定を伴うものであった（特許文献３参照）。
【０００５】
また他のアプローチは、リアルタイム核酸増幅を用いて得られる定量結果の質を改善するため、およびアッセイ手順を単純化するための両方に使用されるものであった。アプローチの一例は、自動化解析装置のデータ処理要素にロードされ得る工場供給型検量線の使用を伴うものである。「保存マスター曲線」と称されることもあるかかる検量線の使用により、製造によって補助されなければならない検量標準反応の回数が好都合に減少し、エンドユーザーが行なわなければならない反応回数が減少する。保存マスター曲線の使用により、アッセイを行なうたびに完全な検量線を作成することが不必要となるため、そうでない場合では同時作成局所検量プロットが使用され得るバッチ試験の必要はない。
【０００６】
本明細書に記載の発明は、非常に少ない回数で検量標準反応を実施することによって得られる結果を用いて、保存マスター検量線を調整するための機構を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，２１９，７２７号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第１１３８７８４号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０６６，４５８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明の第１の態様は、調整後の検量線についての方程式を確立する方法に関する。該方法によれば、まず、各々が一定の出発量の内部検量物質および既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準を含む複数の標準試料を得る工程がある。次に、複数の標準試料の各々における内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程がある。次に、複数の標準試料の各々において同時に増幅された内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を決定する工程がある。その結果、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、内部検量物質の決定された一群の増幅兆候、および既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、分析物ポリヌクレオチド標準について決定された一群の増幅兆候が得られる。次に、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として内部検量物質について決定された一群の増幅兆候に第１の曲線を適合するため、第１の方程式を最適化し、それにより適合した第１の方程式を得る工程がある。さらに、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として分析物ポリヌクレオチド標準について決定された一群の増幅兆候に第２の曲線を適合するため、第２の方程式を最適化し、それにより適合した第２の方程式を得る工程がある。次に、所定量の分析物ポリヌクレオチド標準および一定の出発量の内部検量物質を含む調整検量物質を得る工程がある。次に、調整検量物質の内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程がある。この後、調整検量物質について、同時に増幅された内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を決定する工程が続く。次に、調整検量物質の内部検量物質について決定された増幅兆候を用いて適合した第１の方程式を修正し、これにより、内部検量物質について適合された増幅兆候に対する調整後の第１の適合した方程式を、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として得る工程がある。また、調整検量物質の分析物ポリヌクレオチドで決定された増幅兆候を用いて適合した第２の方程式を修正し、これにより、分析物ポリヌクレオチド標準について適合された増幅兆候に対する調整後の第２の適合した方程式を、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として得る工程がある。最後に、調整後の第１の適合した方程式および調整後の第２の適合した方程式を互いに数学的に関係付けることにより、調整後の検量線についての方程式を確立する工程がある。本発明との関連において、「数学的に関係付ける」とは、加算、減算、乗算または除算などの演算を行なうことを意味する。比の計算をもたらす除算プロセスが非常に好ましい。一般的に好ましい一実施形態において、同時に増幅する工程は等温での同時増幅を含む。これには、ＲＮＡポリメラーゼを含む転写関連増幅反応で等温での同時増幅が含まれ得る。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程は、各々、異なる機器で行なわれる。別の一般的に好ましい実施形態では、最初の同時に増幅する工程は、第１の機器で行なわれる核酸増幅反応での同時増幅を含み、２番目の同時に増幅する工程は、第２の機器で行なわれる核酸増幅反応での同時増幅を含む。この場合のとき、最適化する工程の適合した第１および第２の方程式は、第２の機器に接続したコンピュータのメモリデバイスに保存してもよい。より好ましくは、該確立する工程は、第２の機器での使用のため、調整後の検量線についての方程式を確立する工程を含む。また別の一般的に好ましい実施形態では、最初の同時に増幅する工程が、第１の機器で行なわれる等温核酸増幅反応での同時増幅を含み、２番目の同時に増幅する工程は、第２の機器で行なわれる等温核酸増幅反応での同時増幅を含み、最適化する工程の適合した第１および第２の方程式を、第２の機器に接続したコンピュータのメモリデバイスに保存する。この一般的に好ましい実施形態の変形型の一例では、最適化する工程の適合した第１および第２の方程式は、各々、複数の係数を含み、調整検量物質を得る工程は、さらに、適合した第１および第２の方程式それぞれに対する複数の係数を得ることを含む。この一般的に好ましい実施形態の別の変形型では、最適化する工程の第１および第２の方程式が非線形方程式であり、各々が複数の係数を有する。非常に好ましい一実施形態において、該確立する工程において互いに数学的に関係付けるプロセスは、調整後の適合した第２の方程式を用いて計算された数値結果と、調整後の適合した第１の方程式を用いて計算された数値結果とを数学的に関係付けることを含む。これは除算プロセスを伴うものでもよく、それにより比を計算する。別の非常に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程の等温核酸増幅反応は、各々、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む。別の非常に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程の等温核酸増幅反応は、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準または内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない。別の非常に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程の等温核酸増幅反応は、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない。別の非常に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なる長さである。別の非常に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンが異なるパーセンテージのＧ＋Ｃ塩基を有する。別の一般的に好ましい実施形態では、最初の最適化工程の適合した第１の方程式は、適合した第１の方程式の複数の係数を含み、２番目の最適化工程の適合した第２の方程式は、適合した第２の方程式の複数の係数を含む。別の一般的に好ましい実施形態では、最後の確立する工程において互いに数学的に関係付けるプロセスが、調整後の適合した第２の方程式を用いて計算された数値結果および調整後の適合した第１の方程式を用いて計算された数値結果を数学的に関係付けることを含む。これは除算プロセスを伴うものであり得、それにより比を計算することができる。別の一般的に好ましい実施形態では、最後の確立する工程において互いに数学的に関係付けるプロセスが、調整後の適合した第２の方程式を用いて計算された数値結果および調整後の適合した第１の方程式を用いて計算された数値結果を数学的に関係付けることを含む。これは減算プロセスを伴うものであり得、それにより差を計算することができる。別の一般的に好ましい実施形態では、最初の修正工程が、調整検量物質の内部検量物質について決定された増幅兆候、および調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の所定量に等しい分析物ポリヌクレオチドの出発量での適合した第１の方程式を解くことにより計算された値を用いて、内部検量物質に対する調整因子を決定することを含む。この後に、該内部検量物質に対する調整因子を、適合した第１の方程式の係数の１つに加算する工程を続けてもよい。同様に、２番目の修正工程は、調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準について決定された増幅兆候、および調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の所定量に等しい分析物ポリヌクレオチドの出発量での適合した第２の方程式を解くことにより計算された値を用いて、分析物ポリヌクレオチドに対する調整因子を決定することを含むものであり得る。この後に、分析物ポリヌクレオチドに対する調整因子を、適合した第２の方程式の係数の１つに加算する工程を続けてもよい。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程は、各々、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む核酸増幅反応での同時増幅を含む。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程は、各々、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準または内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない核酸増幅反応での同時増幅を含む。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程は、各々、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない核酸増幅反応での同時増幅を含む。別の一般的に好ましい実施形態では、さらにいくつかの工程がある。より具体的には、さらに、第２の所定量の分析物ポリヌクレオチド標準および一定量の内部検量物質を含む第２の調整検量物質を得る工程があり得る。この後に、内部検量物質および第２の調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程を続けてもよい。次に、第２の調整検量物質について、同時に増幅された内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を決定する工程がある。この後、第２の調整検量物質の内部検量物質および第２の調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候をそれぞれ用いて、適合した第１および第２の方程式を修正する工程が続く。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なる長さである。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンの合成がもたらされ、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンが異なるパーセンテージのＧ＋Ｃ塩基を有する。別の一般的に好ましい実施形態では、最適化する工程の第１および第２の方程式が非線形方程式であり、各々が複数の係数を有する。また別の一般的に好ましい実施形態では、最適化する工程の適合した第１および第２の方程式が、各々、複数の係数を有し、調整検量物質を得る工程が、さらに、適合した第１および第２の方程式に対する複数の係数のそれぞれを得ることを含む。
【０００９】
本発明の第２の態様は、保存マスター検量線を調整するための検量物質を含むキットを作製するための方法に関する。該方法によれば、まず、各々が一定の出発量の内部検量物質および既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準を含む複数の標準試料を形成する工程がある。次に、複数の標準試料の各々での核酸増幅反応において、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅する工程がある。次に、各核酸増幅反応で同時に増幅された内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を決定する工程があり、これにより、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として内部検量物質について決定された一群の増幅兆候、および該既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として分析物ポリヌクレオチド標準について決定された一群の増幅兆候が得られる。この後、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として決定された一群の内部検量物質の増幅兆候に第１の曲線を適合させるため、第１の方程式を最適化する工程が続き、それにより、適合した第１の方程式の一組の係数を含む適合した第１の方程式が得られる。また、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として分析物ポリヌクレオチド標準について決定された一群の増幅兆候に第２の曲線を適合させるため、第２の方程式を最適化し、それにより、適合した第２の方程式の一組の係数を含む適合した第２の方程式が得られる。最後に、（ａ）明確な形態の適合した第１の方程式の一組の係数、（ｂ）明確な形態の適合した第２の方程式の一組の係数、および（ｃ）所定量の分析物ポリヌクレオチド標準と一定の出発量の内部検量物質とを有する調整検量物質を含むパッケージ化された組合せを作製する工程がある。一般的に好ましい一実施形態において、同時に増幅する工程の核酸増幅反応は等温核酸増幅反応である。例えば、これには、ＲＮＡポリメラーゼを含む転写関連増幅反応における等温での同時増幅が含まれ得る。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準または内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程の核酸増幅反応は、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない。別の一般的に好ましい実施形態では、増幅兆候を決定する工程が時間依存性増幅兆候の決定を含む。別の一般的に好ましい実施形態では、最適化する工程の第１および第２の方程式が第１および第２の非線形方程式である。別の一般的に好ましい実施形態では、明確な形態の適合した第１および第２の方程式の係数の組が、機械可読形態の適合した第１および第２の方程式の係数の組である。例えば、機械可読形態の適合した第１および第２の方程式の係数の組には、バーコードが含まれてもよい。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程により、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンが生成され、この場合、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンは異なる長さである。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程により、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンが生成され、この場合、内部検量物質アンプリコンおよび該分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンは異なるパーセンテージのＧ＋Ｃ塩基を有する。別の一般的に好ましい実施形態では、該作製する工程のパッケージ化された組合せが、さらに、第２の所定出発量の分析物ポリヌクレオチド標準および同じ一定の出発量の内部検量物質を含む第２の調整検量物質を含む。別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程の核酸増幅反応が等温核酸増幅反応であり、最適化する工程の第１および第２の方程式が第１および第２の非線形方程式である。非常に好ましい一実施形態において、同時に増幅する工程の核酸増幅反応は、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む。別の非常に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準または内部検量物質のみを増幅するプライマーを含まない。別の非常に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程の核酸増幅反応が、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない。別の非常に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程により、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンが生成され、この場合、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンは異なるパーセンテージのＧ＋Ｃ塩基を有する。別の非常に好ましい実施形態では、同時に増幅する工程により、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンが生成され、この場合、内部検量物質アンプリコンおよび分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンは異なる長さである。さらにより好ましくは、同時に増幅する工程の核酸増幅反応は、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含む。あるいは、同時に増幅する工程の核酸増幅反応は、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するプライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準または内部検量物質のみを増幅するプライマーは含まない。また別の択一例によれば、同時に増幅する工程の核酸増幅反応は、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方を増幅するいかなるプライマーも含まない。
【００１０】
本発明の第３の態様は、一定量の内部検量物質を含む多重核酸増幅反応において分析物ポリヌクレオチドを定量するための方程式の作製方法に関する。該方法によれば、まず、核酸増幅反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を特定する保存マスター曲線の第１の方程式の複数の係数を得る工程がある。次に、核酸増幅反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての内部検量物質の増幅兆候を特定する保存マスター曲線の第２の方程式の複数の係数を得る工程がある。次に、既知量の分析物ポリヌクレオチド標準および一定の出発量の内部検量物質を含む調整検量物質を用いて核酸増幅反応を実施する工程、ここで、核酸増幅反応により、調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質が同時に増幅され、核酸増幅反応により、分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンが生成される工程がある。次に、核酸増幅反応で同時に増幅された分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の増幅兆候を決定する工程がある。次に、核酸増幅反応により決定された分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候、および調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の既知量に等しい分析物ポリヌクレオチド標準の出発量での保存マスター曲線の第１の方程式を解くことにより計算された値を用いて分析物ポリヌクレオチド標準に対する調整因子を確立する工程がある。また、核酸増幅反応で決定された内部検量物質の増幅兆候、および該調整検量物質の分析物ポリヌクレオチド標準の既知量に等しい分析物ポリヌクレオチド標準の出発量での保存マスター曲線の第２の方程式を解くことにより計算された値を用いて内部検量物質に対する調整因子を確立する工程がある。次に、分析物ポリヌクレオチド標準に対する調整因子を用いて、保存マスター曲線の第１の方程式の係数の１つを修正する工程があり、これにより、分析物ポリヌクレオチド標準に対する調整後の検量線を特定する方程式が得られる。また、内部検量物質に対する調整因子を用いて、保存マスター曲線の第２の方程式の係数の１つを修正する工程があり、これにより、内部検量物質に対する調整後の検量線を特定する方程式が得られる。最後に、（ａ）分析物ポリヌクレオチド標準に対する調整後の検量線を特定する方程式、および（ｂ）内部検量物質に対する調整後の検量線を特定する方程式を互いに数学的に関係付けることにより、分析物ポリヌクレオチドの定量のための方程式を作成する工程がある。一般的に好ましい一実施形態において、核酸増幅反応を実施する工程が等温核酸増幅反応の実施を含む。これには、ＲＮＡポリメラーゼを含む転写関連増幅反応における等温での同時増幅が含まれ得る。別の一般的に好ましい実施形態では、該実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なる長さである。別の一般的に好ましい実施形態では、該実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なるパーセンテージのＧ＋Ｃ塩基を有する。別の一般的に好ましい実施形態では、該実施する工程が、第１の核酸増幅機器での核酸増幅反応の実施を含み、該得る工程の保存マスター曲線の第１の方程式の複数の係数および保存マスター曲線の第２の方程式の複数の係数は、第１の核酸増幅機器を用いて決定されたものではない。別の言い方をすると、係数は、第１の機器とは異なる機器で行なわれた増幅反応の結果を用いて決定されたものである。別の一般的に好ましい実施形態では、増幅兆候を決定する工程が、時間依存性増幅兆候の決定を含む。別の一般的に好ましい実施形態では、保存マスター曲線の第１および第２の方程式が非線形方程式である。別の一般的に好ましい実施形態では、該実施する工程の核酸増幅反応が、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも１種類のプライマーを含む。別の一般的に好ましい実施形態では、該実施する工程の核酸増幅反応は、共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない。別の一般的に好ましい実施形態では、該実施する工程の核酸増幅反応は、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない。別の一般的に好ましい実施形態では、分析物ポリヌクレオチドの定量のための方程式を作成する工程が、比を求めるための除算プロセスによる数学的に関係付けすることを含む。別の一般的に好ましい実施形態では、分析物ポリヌクレオチドの定量のための方程式を作成する工程が、差を求めるための減算による数学的に関係付けすることを含む。一般的に言うと、分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程が、比を求めるための除算プロセスによる数学的に関係付けすることを含む場合、核酸増幅反応を実施する工程には等温核酸増幅反応の実施が含まれ得、保存マスター曲線の第１および第２の方程式は非線形方程式であり得る。非常に好ましい一実施形態において、該実施する工程の核酸増幅反応は、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも１種類のプライマーを含む。別の非常に好ましい実施形態では、該実施する工程の核酸増幅反応は、共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない。別の非常に好ましい実施形態では、該実施する工程の核酸増幅反応は、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない。別の非常に好ましい実施形態では、核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なるパーセンテージのＧ＋Ｃ塩基を有する。別の非常に好ましい実施形態では、核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なる長さである。さらにより好ましくは、該実施する工程の核酸増幅反応は、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも１種類のプライマーを含む。あるいは、該実施する工程の核酸増幅反応は、共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない。また別の択一例によれば、該実施する工程の核酸増幅反応は、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない。別の一般的に好ましい実施形態では、分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程が、分析物ポリヌクレオチド標準に対する調整後の検量線を特定する方程式を用いて計算された数値、および内部検量物質に対する調整後の検量線を特定する方程式を用いて計算された数値を数学的に関係付けることを含む。択一例の一例によれば、分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程は、比を計算するための除算プロセスによる数学的に関係付けすることを含む。別の択一例によれば、分析物ポリヌクレオチドの定量化のための方程式を作成する工程は、差を計算するための減算による数学的関係付けを含む。別の一般的に好ましい実施形態では、核酸増幅反応を実施する工程が等温核酸増幅反応の実施を含み、保存マスター曲線の第１および第２の方程式が非線形方程式である。非常に好ましい一実施形態において、該実施する工程の核酸増幅反応は、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも１種類のプライマーを含む。別の非常に好ましい実施形態では、該実施する工程の核酸増幅反応は、共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない。別の非常に好ましい実施形態では、該実施する工程の核酸増幅反応は、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない。別の非常に好ましい実施形態では、核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なるパーセンテージのＧ＋Ｃ塩基を有する。別の非常に好ましい実施形態では、核酸増幅反応を実施する工程の分析物ポリヌクレオチド標準アンプリコンおよび内部検量物質アンプリコンは異なる長さを有する。この場合のとき、該実施する工程の核酸増幅反応には、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅する少なくとも１種類のプライマーが含まれ得る。あるいはまた、該実施する工程の核酸増幅反応は共用プライマーを含み、分析物ポリヌクレオチド標準もまた増幅することなく内部検量物質を増幅するいかなるプライマーも含まない。また別の択一例によれば、該実施する工程の核酸増幅反応は、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準の両方を増幅するいかなる共用プライマーも含まない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、４つの異なる増幅／検出機器で実施およびモニタリングされた一連の等温転写関連核酸増幅反応の結果を示すグラフプロットである。プロット上に示されたデータ点は、機器１（◇）、機器２（□）、機器３  （△）および機器４（×）での、投入された分析物ポリヌクレオチド標準の種々のレベル（すなわち、ｘ軸）での内部検量物質（ｙ軸上）の増幅兆候（すなわち、測定されたＴＴｉｍｅ値（単位：分））を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｂは、マスター検量線を作成するために使用した結果を示すグラフである。図２Ａは、一群の検量標準に含まれた分析物ポリヌクレオチドのｌｏｇコピーレベル（ｘ軸）に対してプロットされた内部検量物質シグナルの増幅兆候（すなわち、測定されたＴＴｉｍｅ値（単位：分）を示すｙ軸）を示す。図２Ａにプロットされたデータ点は、図１にプロットされたものと同じである。図２Ｂは、一群の検量標準に含まれた分析物ポリヌクレオチドのｌｏｇコピーレベル（ｘ軸）に対してプロットされた分析物ポリヌクレオチドシグナルの増幅兆候（すなわち、測定されたＴＴｉｍｅ値（単位：分）を示すｙ軸）を示す。これらのグラフに示された結果は、アンプリコン生成を実施およびモニタリングするための４つの異なる機器を用いて、時間の関数として得たものである。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｂは、マスター検量線を作成するために使用した結果を示すグラフである。図２Ａは、一群の検量標準に含まれた分析物ポリヌクレオチドのｌｏｇコピーレベル（ｘ軸）に対してプロットされた内部検量物質シグナルの増幅兆候（すなわち、測定されたＴＴｉｍｅ値（単位：分）を示すｙ軸）を示す。図２Ａにプロットされたデータ点は、図１にプロットされたものと同じである。図２Ｂは、一群の検量標準に含まれた分析物ポリヌクレオチドのｌｏｇコピーレベル（ｘ軸）に対してプロットされた分析物ポリヌクレオチドシグナルの増幅兆候（すなわち、測定されたＴＴｉｍｅ値（単位：分）を示すｙ軸）を示す。これらのグラフに示された結果は、アンプリコン生成を実施およびモニタリングするための４つの異なる機器を用いて、時間の関数として得たものである。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、一群の検量標準に含まれた分析物ポリヌクレオチドのｌｏｇコピーレベル（ｘ軸）に対してプロットされた分析物ポリヌクレオチド標準と内部検量物質の増幅兆候（すなわち、測定されたＴＴｉｍｅ値（単位：分）を示すｙ軸）を示す最良適合曲線のグラフである。図３Ａは、内部検量物質のマスター検量線、２種類の異なる調整検量物質（すなわち、Ｃａｌ＿１（ＩＣ）およびＣａｌ＿２（ＩＣ））を用いて行なわれた増幅反応の結果、ならびに２種類の調整検量物質（ΔＣａｌ＿１（ＩＣ）およびΔＣａｌ＿２（ＩＣ））各々での予測増幅兆候と測定増幅兆候との差を示す。図３Ｂは、内部検量物質のマスター検量線、２種類の異なる調整検量物質（すなわち、Ｃａｌ＿１（ＩＣ）およびＣａｌ＿２（ＩＣ））を用いて行なわれた増幅反応の結果、ならびに内部検量物質の調整後のマスター検量線の位置を示す。図３Ｃは、分析物ポリヌクレオチドのマスター検量線、２種類の異なる調整検量物質（Ｃａｌ＿１（分析物）およびＣａｌ＿２（分析物））を用いて行なわれた増幅反応の結果、ならびに分析物ポリヌクレオチドの調整後のマスター検量線の位置を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃは、一群の検量標準に含まれた分析物ポリヌクレオチドのｌｏｇコピーレベル（ｘ軸）に対してプロットされた分析物ポリヌクレオチド標準と内部検量物質の増幅兆候（すなわち、測定されたＴＴｉｍｅ値（単位：分）を示すｙ軸）を示す最良適合曲線のグラフである。図３Ａは、内部検量物質のマスター検量線、２種類の異なる調整検量物質（すなわち、Ｃａｌ＿１（ＩＣ）およびＣａｌ＿２（ＩＣ））を用いて行なわれた増幅反応の結果、ならびに２種類の調整検量物質（ΔＣａｌ＿１（ＩＣ）およびΔＣａｌ＿２（ＩＣ））各々での予測増幅兆候と測定増幅兆候との差を示す。図３Ｂは、内部検量物質のマスター検量線、２種類の異なる調整検量物質（すなわち、Ｃａｌ＿１（ＩＣ）およびＣａｌ＿２（ＩＣ））を用いて行なわれた増幅反応の結果、ならびに内部検量物質の調整後のマスター検量線の位置を示す。図３Ｃは、分析物ポリヌクレオチドのマスター検量線、２種類の異なる調整検量物質（Ｃａｌ＿１（分析物）およびＣａｌ＿２（分析物））を用いて行なわれた増幅反応の結果、ならびに分析物ポリヌクレオチドの調整後のマスター検量線の位置を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、一群の検量標準に含まれた分析物ポリヌクレオチドのｌｏｇコピーレベル（ｘ軸）に対してプロットされた分析物ポリヌクレオチド標準と内部検量物質の増幅兆候（すなわち、測定されたＴＴｉｍｅ値（単位：分）を示すｙ軸）を示す最良適合曲線のグラフである。図３Ａは、内部検量物質のマスター検量線、２種類の異なる調整検量物質（すなわち、Ｃａｌ＿１（ＩＣ）およびＣａｌ＿２（ＩＣ））を用いて行なわれた増幅反応の結果、ならびに２種類の調整検量物質（ΔＣａｌ＿１（ＩＣ）およびΔＣａｌ＿２（ＩＣ））各々での予測増幅兆候と測定増幅兆候との差を示す。図３Ｂは、内部検量物質のマスター検量線、２種類の異なる調整検量物質（すなわち、Ｃａｌ＿１（ＩＣ）およびＣａｌ＿２（ＩＣ））を用いて行なわれた増幅反応の結果、ならびに内部検量物質の調整後のマスター検量線の位置を示す。図３Ｃは、分析物ポリヌクレオチドのマスター検量線、２種類の異なる調整検量物質（Ｃａｌ＿１（分析物）およびＣａｌ＿２（分析物））を用いて行なわれた増幅反応の結果、ならびに分析物ポリヌクレオチドの調整後のマスター検量線の位置を示す。
【図４】図４は、「ＩＣ調整プロット（比）」を示すグラフである。グラフに示された個々のデータ点を、増幅反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の出発量のインクリメント値において、図２Ａおよび２Ｂに示した調整後のマスター検量線に対する別々の方程式の結果を用いて計算した。グラフに示された最良適合曲線は、４ＰＬ曲線適合を用いて決定した。
【図５】図５は、未処理データから計算したＩＯＡ（分析物）／ＩＯＡ（ＩＣ）の比を表すデータ点を示すグラフプロットである。また、この一群のデータ点に適合させた曲線も示す。
【図６】図６は、演算処理後の兆候のマスター検量線を示すグラフである。黒菱形（◆）は、増幅／検出機器２〜４を用いて得られた未処理データから計算したＩＯＡ（分析物）／ＩＯＡ（ＩＣ）の比を表す個々のデータ点を示す。この一群のデータ点に適合させた太い実線の曲線は、演算処理後の兆候のマスター検量線を示す。白四角（□）は、エンドユーザーのモデル機器ならびに１０４コピーの分析物ポリヌクレオチド標準および３０，０００コピーの内部検量物質を含む調整検量物質を用いて得られた結果を示す。
【図７】図７は、核酸増幅反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての分析物ポリヌクレオチドのマスター検量線標準を示すグラフである。黒菱形（◆）は、増幅／検出機器２〜４を用いて得られた個々の結果を示す。この一群のデータ点に適合させた太い実線の曲線は、マスター検量線を示す。白四角（□）は、エンドユーザーのモデル機器ならびに１０４コピーの分析物ポリヌクレオチド標準および３０，０００コピーの内部検量物質を含む調整検量物質を用いて得られた結果を示す。白四角で示されたデータ点は、マスター曲線の作成には使用せず、その後の調整手順に使用した。
【図８】図８は、核酸増幅反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての内部検量物質のマスター検量線を示すグラフである。黒菱形（◆）は、増幅／検出機器２〜４を用いて得られた個々の結果を示す。この一群のデータ点に適合させた太い実線の曲線は、マスター検量線を示す。白四角（□）は、エンドユーザーのモデル機器ならびに１０４コピーの分析物ポリヌクレオチド標準および３０，０００コピーの内部検量物質を含む調整検量物質を用いて得られた結果を示す。
【図９】図９は、演算処理後の兆候のマスター検量線の一点調整の効果を示すグラフである。太い点線の曲線（「局所」と表示）は、エンドユーザーのモデル機器で得られた結果を用いて確立された局所検量線を示す。黒菱形（◆）は、局所検量線を決定するために用いたデータ点を示す。太い実線の曲線（「マスター」と表示）は、エンドユーザーのモデル機器とは別の機器を用いて決定された演算処理後の兆候のマスター検量線（図６にも図示）を示す。白四角（□）は、エンドユーザーのモデル機器および演算処理後の兆候のマスター検量線を調整するために使用された調整検量物質を用いて得られた結果を示す。破線の曲線（「比調整後のマスター」と表示）は、局所検量線を作成するために使用された機器において処理された単一の調整検量物質（すなわち、１０４コピーの分析物ポリヌクレオチド標準および３０，０００コピーの内部検量物質含有）を用いた演算処理後の兆候のマスター検量線の調整の結果を示す。比調整後のマスター曲線の形状は、演算処理後の兆候のマスター検量線と同じである。
【図１０】図１０は、演算処理後の兆候のマスター検量線の二点調整の効果を示すグラフである。太い点線の曲線（「局所」と表示）は、エンドユーザーのモデル機器で得られた結果を用いて確立された局所検量線を示す。黒菱形（◆）は、局所検量線を決定するために用いたデータ点を示す。太い実線の曲線（「マスター」と表示）は、エンドユーザーのモデル機器とは別の機器を用いて決定された演算処理後の兆候のマスター検量線（図６にも図示）を示す。白四角（□）は、エンドユーザーのモデル機器および演算処理後の兆候のマスター検量線を調整するために使用された調整検量物質を用いて得られた結果を示す。破線の曲線（「比調整後のマスター」と表示）は、局所検量線を作成するために使用された機器において処理された２種類の調整検量物質（すなわち、１０３および１０７コピーの分析物ポリヌクレオチド標準ならびに３０，０００コピーの内部検量物質を含有）を用いた演算処理後の兆候のマスター検量線の調整の結果を示す。垂直方向にシフトしていること以外は、比調整後のマスター曲線の形状は、演算処理後の兆候のマスター検量線と同じである。
【図１１】図１１は、一点調整を用いた、２つのマスター検量線の独立した調整の効果を示すグラフである。太い点線の曲線（「局所」と表示）は、エンドユーザーのモデル機器で得られた結果を用いて確立された局所検量線を示す。黒菱形（◆）は、局所検量線を決定するために用いたデータ点を示す。太い実線の曲線（「マスター」と表示）は、図７に示した未調整マスター検量線を図８に示した未調整マスター検量線で除算した結果を示し、それにより、エンドユーザーのモデル機器とは異なる機器を用いて得られた結果を示す。白四角（□）は、エンドユーザーのモデル機器および調整検量物質を用いて得られた結果を示す。破線の曲線（「独立した調整後のマスター」と表示）は、局所検量線を作成するために使用された機器において処理された単一の調整検量物質（すなわち、１０４コピーの分析物ポリヌクレオチド標準および３０，０００コピーの内部検量物質含有）を用いた、図７〜８において決定された個々のマスター検量線の垂直次元における第１の調整の結果を示す。次いで、この２つの調整後の曲線を、分析物ポリヌクレオチド標準の調整後の曲線に対する方程式を、内部検量物質の調整後の曲線に対する方程式（各々、反応に使用された分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数として）で除算することにより互いに関係付けた。独立した調整後のマスター曲線の形状は、個々の未調整マスター検量線の比から得られる曲線の形状と異なり、局所検量線により近く近似する。
【図１２】図１２は、二点調整を用いた、２つのマスター検量線の独立した調整の効果を示すグラフである。太い点線の曲線（「局所」と表示）は、エンドユーザーのモデル機器で得られた結果を用いて確立された局所検量線を示す。黒菱形（◆）は、局所検量線を決定するために用いたデータ点を示す。太い実線の曲線（「マスター」と表示）は、図７に示した未調整マスター検量線を図８に示した未調整マスター検量線で除算した結果を示し、それにより、エンドユーザーのモデル機器とは異なる機器を用いて得られた結果を示す。白四角（□）は、エンドユーザーのモデル機器および調整検量物質を用いて得られた結果を示す。破線の曲線（「独立した調整後のマスター」と表示）は、局所検量線を作成するために使用された機器において処理された２種類の調整検量物質（すなわち、１０３および１０７コピーの分析物ポリヌクレオチド標準ならびに３０，０００コピーの内部検量物質を含有）を用いた、図７〜８において決定された個々のマスター検量線の垂直次元における第１の調整の結果を示す。次いで、この２つの調整後の曲線を、分析物ポリヌクレオチド標準の調整後の曲線に対する方程式を、内部検量物質の調整後の曲線に対する方程式（各々、反応に使用された分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数として）で除算することにより互いに関係付けた。独立した調整後のマスター曲線の形状は、個々の未調整マスター検量線の比から得られる曲線の形状と異なり、局所検量線により近く近似する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
以下の用語は、本明細書においてそうでないと明白に述べていない限り、本開示の目的のため、以下の意味を有する。
【００１３】
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含有するキメラ分子のいずれかを意味する。また、該用語には、ＲＮＡまたはＤＮＡのヌクレオチド類縁体を含有する分子が包含される。
【００１４】
「分析物ポリヌクレオチド」または「分析物核酸」とは、定量される対象のポリヌクレオチドを意味する。
【００１５】
本明細書で用いる場合、「試験試料」は、特定のポリヌクレオチド種の存在について調べられる任意の試料である。試験試料としては、ヒト、動物から得られる任意の組織もしくはポリヌクレオチド含有物質、環境由来または研究室で誘導されるもしくは合成試料が挙げられる。
【００１６】
本明細書で用いる場合、「標準試料」は、分析物ポリヌクレオチド標準を含有する試料である。
【００１７】
「分析物ポリヌクレオチド標準」とは、既知量の分析物ポリヌクレオチドまたはその断片を意味する。例えば、ＨＩＶ−Ｉ分析物ポリヌクレオチド標準は、既知数のコピーのＨＩＶ−Ｉゲノム、ＨＩＶ−Ｉ転写物、またはウイルスゲノムの一部に相当するインビトロ合成転写物を含有し得る。
【００１８】
「アンプリコン」は、標的核酸配列がポリヌクレオチドコピーまたは増幅産物の合成の鋳型として役立つ増幅反応のポリヌクレオチド産物である。
【００１９】
「増幅」または「核酸増幅」または「インビトロ核酸増幅」とは、標的核酸配列またはその相補体またはその断片の浮く数のコピー（ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物を許容する）を得るための任意の既知手順を意味する。「その断片」の増幅は、完全な標的領域核酸配列またはその相補体より短い配列を含有する増幅核酸の生成をいう。かかる断片は、標的核酸の一部を増幅することにより、例えば、標的核酸の内部位置にハイブリダイズし、該位置から重合を開始する増幅オリゴヌクレオチドを使用することにより、生成され得る。
【００２０】
本明細書で用いる場合、用語「同時に増幅する」および「同時に増幅すること」およびその語尾変化形は、異なる標的核酸配列が単一の増幅反応で増幅されるプロセスをいう。例えば、分析物ポリヌクレオチドおよび関連のない内部検量物質核酸は、両方の核酸が単一のチューブ内で行なわれる反応において増幅される場合、ならびに両方の増幅反応において、少なくとも１種類の試薬（例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、酵素、プライマー（１種類もしくは複数種）など）が共通して共用される場合、「同時に増幅」される。
【００２１】
本明細書で用いる場合、「熱サイクリング」は、反応混合物における温度の反復変更（すなわち、温度の上昇または低下）をいう。熱サイクリングを受ける試料は、ある温度から別の温度にシフトされ、その温度で安定化させ、第２の温度に移行されるか、または出発温度に戻され得る。温度サイクルは、対象の具体的な化学反応を研究または終了するのに必要なだけ多数回繰り返してもよい。
【００２２】
「標的核酸」または「標的」とは、標的核酸配列を含む核酸を意味する。一般に、増幅される標的核酸配列は、反対の位置にに配置された２つのオリゴヌクレオチドの間に位置し、該オリゴヌクレオチドの各々に相補的な標的核酸の部分を含む。
【００２３】
「標的核酸配列」または「標的配列」または「標的領域」とは、単鎖核酸分子のヌクレオチド配列の全部または一部、それに相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を含む特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。
【００２４】
「転写関連増幅」とは、ＲＮＡポリメラーゼが使用され、核酸鋳型から多数のＲＮＡ転写物が生成される任意の型の核酸増幅を意味する。慣用的に、このような増幅反応では、ＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長され得る３’末端を有する少なくとも１種類のプライマーが使用される。転写関連増幅法の一例は、「転写媒介型増幅」（ＴＭＡ）と称されるものであり、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、および標的核酸に相補的なプロモーター含有オリゴヌクレオチドが使用される。ＴＭＡの変化型は、当該技術分野でよく知られており、Ｂｕｒｇら，米国特許第５，４３７，９９０号；Ｋａｃｉａｎら，米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号；Ｋａｃｉａｎら，ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９３／２２４６１；Ｇｉｎｇｅｒａｓら，ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ８８／０１３０２；Ｇｉｎｇｅｒａｓら，ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ８８／１０３１５；Ｍａｌｅｋら，米国特許第５，１３０，２３８号；Ｕｒｄｅａら，米国特許第４，８６８，１０５号および同第５，１２４，２４６号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら，ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９４／０３４７２；ならびにＲｙｄｅｒら，ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９５／０３４３０に詳細に開示されている。ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得る単一のプライマーのみが使用される他の転写関連増幅法（出願番号が１１／２１３，５１９である米国特許出願に開示されているようなもの）は、特に該定義に包含され、本明細書に開示した方法に関連する使用に非常に好ましい。
【００２５】
本明細書で用いる場合、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも２個、一般的には約５〜約１００個の化学的サブユニットのポリマー鎖であって、各サブユニットは、ヌクレオチド塩基部分、糖部分、およびサブユニットを線形の空間的立体配置で接続する連結部分を含む。一般的なヌクレオチド塩基部分は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）であるが、水素結合が可能な他の稀な、または修飾されたヌクレオチド塩基は、当業者によく知られている。オリゴヌクレオチドは、任意選択で、糖部分、塩基部分、および主鎖構成要素のいずれかの類縁体を含むものであってもよい。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、約１０〜約１００残基のサイズの範囲に含まれるものである。オリゴヌクレオチドは、天然に存在する供給源から精製されたものであってもよいが、好ましくは、任意のさまざまなよく知られた酵素的または化学的方法を用いて合成されたものである。
【００２６】
「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」とは、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズするオリゴマーを意味し、核酸増幅反応に参与する。増幅オリゴマーの例としては、増幅プロセスの一部として伸長される３’末端を含むプライマーが挙げれれるが、ポリメラーゼによって伸長されないがプライマーからの効率的な増幅に参与するか、または該増幅を助長するオリゴマー（例えば、３’ブロック型オリゴマー）が挙げられる。増幅オリゴマーの好ましいサイズの範囲としては、約１０〜約８０ｎｔ長、または１０〜約６０ｎｔ長のものが挙げられ、標的核酸配列（またはその相補鎖）の一領域に相補的な少なくとも約１０個の連続する塩基、より好ましくは少なくとも１２個の連続する塩基を含む。連続する塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは約１００％相補的である。増幅オリゴマーは、任意選択で、修飾されたヌクレオチドもしくは類縁体含むものであってもよく、または増幅反応に参与するが標的核酸に相補的でない、もしくは標的核酸に含有されていないさらなるヌクレオチドを含むものであってもよい。３’ブロック型であるが、標的核酸にハイブリダイズでき、転写を開始させるのに役立つ上流プロモーター配列を供給する増幅オリゴマーは、「プロモーター供給体」オリゴマーと称される。
【００２７】
「プライマー」は、鋳型核酸にハイブリダイズする増幅オリゴマーであり、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得る３’ＯＨ末端を有する。プライマーの５’領域は、標的核酸（例えば、プロモーター配列）に相補的でなくてもよく、「プロモーター−プライマー」と称されるオリゴマーとなる。当業者には、プライマーとしての機能を果たし得る任意のオリゴマーが、５’プロモーター配列を含むように修飾され得、したがって、プロモーター−プライマーとしての機能を果たすものとなり得ることが認識されよう。同様に、任意のプロモーター−プライマーが、プロモーター配列の除去またはプロモーター配列なしでの合成によって修飾され得るが、依然としてプライマーとしての機能を果たす。
【００２８】
本明細書で用いる場合、増幅オリゴヌクレオチドの「組」は、協同的にインビトロ核酸増幅反応に参与してアンプリコンを合成する２つ以上の一群の増幅オリゴヌクレオチドをいう。
【００２９】
本明細書で用いる場合、「プローブ」は、ハイブリダイゼーションを促進し、検出可能なハイブリッドが形成される条件下で、核酸内の標的配列、好ましくは増幅された核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
【００３０】
本明細書で用いる場合、核酸増幅の「時間依存性」モニタリング、または「リアルタイム」での核酸増幅のモニタリングは、核酸増幅反応中に存在するアンプリコンの量を、反応時間またはサイクル数の関数として測定し、次いで、これを用いて、増幅反応を開始した時点の反応混合物中に存在していた鋳型の出発量を決定するプロセスをいう。例えば、アンプリコンの量は、熱サイクリングを含む増幅反応（ＰＣＲなど）の各完全サイクルを開始する前に測定され得る。あるいは、増幅サイクル間の移行を起こすために物理的介入が必要とされない等温増幅反応を連続的に、または一定の時間間隔でモニタリングすると、存在するアンプリコンの量に関する情報が時間の関数として得ることができる。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「増殖曲線」は、時間またはサイクル数の関数としての、反応中での合成生成物（アンプリコンなど）の出現の特徴的なパターンをいう。増殖曲線は、生成物量の何らかのインジケータ（蛍光測定値など）（ｙ軸）に対する時間（ｘ軸）の２次元プロットで簡便に表される。一部の（すべてではないが）増殖曲線はＳ字形状を有する。
【００３２】
本明細書で用いる場合、増殖曲線の「ベースライン相」は該曲線の初期相をいい、この相では、生成物（アンプリコンなど）の量が実質的に一定速度で増加し、この速度は、増殖曲線の増殖相（対数線形プロフィールを有する場合があり得る）に特徴的な増加速度より小さい。増殖曲線のベースライン相は、典型的には傾きが非常に小さく、多くの場合ゼロである。
【００３３】
本明細書で用いる場合、増殖曲線の「増殖相」は、測定可能な生成物が時間とともに相当増加している該曲線の部分をいう。典型的な核酸増幅反応におけるベースライン相から増殖相への移行は、時間とともに増大する速度でのアンプリコンの出現を特徴とする。増殖曲線の増殖相からプラトー相への移行は、アンプリコン出現速度が減少し始める屈曲点から始まる。
【００３４】
本明細書で用いる場合、３相増殖曲線の「プラトー相」は、該曲線の最終相をいう。プラトー相では、測定可能な生成物の形成速度は、一般的に、対数線形相でのアンプリコン生成の速度よりも相当低く、ゼロに近づくことさえあり得る。
【００３５】
本明細書で用いる場合、語句「増幅兆候」は、核酸増幅反応において所定の進行レベルを示すリアルタイム実施曲線の特色をいう。かかる兆候は、一般に、実施曲線（場合によっては「増殖曲線」という）の数学的解析によって判定され、これは、強度が時間、サイクル数などの関数として反応混合物中に存在するアンプリコンの量と関連する測定可能なシグナル（蛍光読み値など）で表示される。
【００３６】
本明細書で用いる場合、語句「閾値に基づく増幅兆候」は、増殖曲線シグナルが自由裁量値または閾値と交差したときの時間またはサイクル数を尺度とする増幅兆候をいう。ＴＴｉｍｅ測定値は、閾値に基づく増幅兆候の一例であり、一方、ＴＡｒｃおよびＯＴＡｒｃ測定値は、閾値に基づかない増幅兆候の一例である。
【００３７】
本明細書で用いる場合、語句「時間依存性」増幅兆候は、一般的に、時間を単位（例えば、分）で測定される増幅兆候（例えば、反応進行パラメータ）をいう。時間依存性増幅兆候は、個別の「サイクル」を特徴としない等温核酸増幅反応の進行のモニタリングに一般に使用される。ＴＴｉｍｅ、ＴＡｒｃおよびＯＴＡｒｃはすべて、時間依存性増幅兆候の例である。
【００３８】
「核酸検量物質」または「内部検量物質」とは、インビトロ核酸増幅反応において増幅可能であり、同じ増幅反応で同時に増幅される分析物ポリヌクレオチドおよび識別可能なポリヌクレオチドを意味する。特定のある好ましい実施形態において、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチドは、１種類以上の異なる増幅オリゴマーまたはプライマーを用いて、インビトロ核酸増幅反応で同時に増幅される。例えば、以下に詳述するデータ収集した実施例で用いた分析物および内部検量物質ポリヌクレオチドは、共用されていない増幅オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。他の好ましい実施形態では、内部検量物質および分析物ポリヌクレオチドは、同一の増幅オリゴマーまたはプライマーを用いて、インビトロ核酸増幅反応で同時に増幅される。
【００３９】
本明細書で用いる場合、「内部検量調整」は、「核酸検量物質」または「内部検量物質」と称する同時に増幅標的核酸で得られた結果との比較によって、増幅を受けた試験試料中の分析物核酸の出発量を決定するための定量的手順をいう。
【００４０】
本明細書で用いる場合、語句「〜の関数として」は、従属変数（すなわち、１つ以上の他の変数に依存する変数）と独立変数（すなわち、任意の他の変数の値を考慮せずにその値が自由に選択され得る変数）間の関係を示し、このとき、独立変数に対する各入力値は、従属変数に対するちょうど１つの出力値に関係する。ｙ値（すなわち、従属変数）がｘ値（すなわち、独立変数）「の関数として」関係する方程式に対する慣用的な記数法は、ｙ＝ｆ（ｘ）である。
【００４１】
本明細書で用いる場合、方程式を「最適化すること」とは、数学的モデル作成または曲線適合手順で一般に行なわれているような、実験測定値を「適合」または近似するための式を得るために方程式の係数の数値を得るためのプロセスをいう。典型的には、最適化後の方程式により、最良適合曲線が規定される。
【００４２】
本明細書で用いる場合、用語「最適化された方程式」および「適合した方程式」は、最適化手順の結果、固定数値の係数を含む方程式に、互換的に言及するものである。
【００４３】
本明細書で用いる場合、「インクリメント（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ）」値は、規則的な程度で徐々に増加または減少する値をいう。
【００４４】
本明細書で用いる場合、「反復式」コンピュータ計算法は、解に対する逐次近似によって問題（例えば、方程式または方程式系）を解くことを試みるものである。
【００４５】
「検量標準」とは、一定の既知量の内部検量物質ポリヌクレオチドとの組合せた既知または所定量の分析物ポリヌクレオチド標準を含む組成物を意味する。２種類の異なる検量標準が異なる量の分析物ポリヌクレオチドまたはその断片を含んでいてもよいが、これらは同じ量の内部検量物質核酸を含む。「調整検量物質」は、保存マスター曲線を調整するためのデータを提供する（すなわち、エンドユーザーのシステムが、マスター検量線を得るのに使用されたシステムと同じ検量出力が得られるように調整され得るように）増幅反応を行なうために使用される検量標準である。
【００４６】
「キット」とは、典型的には互いに使用することが意図された材料のパッケージ化された組合せを意味する。本発明によるキットには、「明確な（ｔａｎｇｉｂｌｅ）」形態の使用説明書または他の情報（例えば、印刷された情報、コンピュータ可読媒体に電子記録されたもの、あるいは機械可読媒体に記録されたもの（数値格納バーコードなど）を含めてもよい。
【００４７】
「本質的に〜からなる」とは、本発明の基本的特徴および新規特徴を実質的に変化させないさらなる成分（１種類もしくは複数種）、組成物（１種類もしくは複数種）または方法工程（１つもしくは複数）を、本発明に含めてもよいことを意味する。本発明の基本的特徴および新規特徴に対して実質的な影響を有する成分（１種類もしくは複数種）、組成物（１種類もしくは複数種）または方法工程（１つもしくは複数）はいずれも、この用語の範囲外であり得る。
【００４８】
発明の詳細な説明
序論および概説
本明細書では、リアルタイム核酸増幅手法を用いて、分析物ポリヌクレオチドの定量化を単純化するための方法を開示する。より詳しくは、本発明は、１つ以上の機器において得られたリアルタイム増幅結果を用いてマスター検量線を作成し、次いで該マスター検量線を用いて、異なる機器において得られたリアルタイム増幅結果を評価することにより分析物ポリヌクレオチドを定量する方法に関する。これは、好ましくは、１つ以上のマスター検量線を調整することにより行なわれる。該手順により、異なるアッセイを行なうたびに完全な検量線を作成する広範な一連の核酸増幅反応を行なう必要性が少なくなる。これにより、試験試料の処理量が効果的に増加し、アッセイの製造が単純化され、材料コストが削減される。
【００４９】
開示した保存マスター検量線の調整方法の開発は、増幅反応を実施およびモニタリングする異なる機器を用いて作成された２次元検量線の形状が、時間依存性増幅兆候（例えば、閾値に基づくＴＴｉｍｅ値（時間単位で測定））を表す軸において垂直方向にシフトしていること以外は、実質的に類似していることを見い出したことにより可能となった。例えば、図１は、リアルタイム核酸増幅反応を実施およびモニタリングするための異なる機器を用いて得られた内部検量物質の増幅兆候の結果を示す。プロット上の各データ点は、異なる記号（◇、□、×、△）で示した４つの異なる機器のうちの１つでの、一定の出発量の核酸検量物質および既知量の分析物ポリヌクレオチド標準を用いて行なった単一の増幅反応の結果を表す。プロットの視覚的検討により、投入された分析物ポリヌクレオチド標準のｌｏｇコピー数の関数としての増幅兆候を表すデータ点間の一般傾向が異なる機器で実質的に類似するように、結果がクラスター化することが明らかになった。図示していないが、機器の１つでの一群のデータ点に適合させた曲線は、プロットの垂直軸上でシフトしていること以外は、異なる機器での一群のデータ点に適合させた曲線と実質的に類似した。これは、増幅反応に使用された分析物ポリヌクレオチド標準の量が約１０２〜１０６コピー／ｍｌ試験試料の範囲に含まれる場合、特にそうであった。
【００５０】
一般的に言うと、開示した方法は、アッセイを異なる機器で行なった場合、増幅兆候に関連する次元において曲線がシフトすること以外は、実質的に類似した形状を有する検量線が得られるリアルタイム核酸増幅反応の解析に有用である。より詳しくは、該方法は、投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量（例えば、ｘ軸）に対する増幅兆候のプロット（例えば、ｙ軸）において、実質的に類似した形状の検量線が確実に得られる増幅兆候を表す軸において曲線が上方に移動すること以外は、アッセイの解析に適用可能である。したがって、保存マスター検量線（１つまたは複数）の調整は、曲線の上方または下方への平行移動しか伴わず、曲線形状の調整は必要でなかった。実際、保存マスター検量線（１つまたは複数）の形状は、好ましくは、エンドユーザーによって操作されるデバイスで行なわれることが意図された本発明の調整手順によって変化しない。しかしながら、後述するように、数学演算によって２つのマスター検量線（すなわち、一方は分析物ポリヌクレオチド標準のもの、および他方は内部検量物質のもの）を互いに関係付ける検量線の形状は、本明細書に開示した調整手順によって好都合に変化され得る。曲線調整手順は、標準的な増幅反応に使用された分析物ポリヌクレオチド投入量（例えば、ｘ軸）に対応する次元における曲線の平行移動またはシフトを伴わないものであることが好ましい。
【００５１】
本明細書に記載の方法は、反応を異なる機器で行なった場合、実質的に類似した形状の曲線を有する検量線が得られる増幅系核酸アッセイとの関連において有用である。一部の一般的に好ましい場合では、該方法は、核酸増幅を行なうために温度サイクルを使用しない増幅反応との関連において使用される。実際、一部の一般的に好ましい場合では、該方法は、等温核酸増幅反応との関連において使用される。非常に好ましい場合では、該方法は、等温転写関連増幅反応との関連において使用される。
【００５２】
好都合には、本明細書に開示した方法は、分析物ポリヌクレオチドと同時に増幅され得る内部検量物質の増幅効率におけるばらつきに非常に抵抗性である。さらに、共用プライマーまたは共用されるプライマーの組を用いて分析物ポリヌクレオチドまたは分析物標準および内部検量物質を増幅する必要はない。
【００５３】
注目すべきことに、開示した定量的手順によって処理され得る同時に増幅反応で使用するプライマーの選択に柔軟性がある。一般的に好ましい一実施形態において、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質は、完全に独立したプライマーが使用される単一の増幅反応で同時に増幅される。これは、単一のプライマーは、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質核酸の両方を増幅する機能を果たさないことを意味する。別の一般的に好ましい実施形態では、少なくとも１種類のプライマーが、単一の増幅反応において、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質核酸の両方を増幅する機能を果たす。したがって、少なくとも１種類のプライマーが２種類の標的の増幅に共用される。また別の一般的に好ましい実施形態では、同時に増幅反応に参与するプライマーすべてが、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質核酸の両方の増幅に使用され得る。この後者の場合、プライマーはいずれも、２種類の標的（すなわち、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質核酸）の一方のみの増幅に特異的でない。
【００５４】
本明細書に開示した方法を使用し、まず、製造業者によって、各ロットの試薬に対するマスター検量線が作成され、検量線を特定する一組のマスター検量線のパラメータまたは係数がエンドユーザーに提供される。次いで、エンドユーザーが、製造業者によって供給された１種類、またはより好ましくは２種類の調整検量物質を用いて増幅反応を行ない、該反応の結果を用いて、ユーザーのシステムのシグナルと、試薬の製造業者がマスター曲線を作成するために使用したシステムのシグナルとを相関させる。最初に新規な試薬ロットをエンドユーザーの機器に負荷する場合、試料の結果がエンドユーザーのシステムによって報告され得る前に、マスター検量線のパラメータまたは係数を入力、保存および調整しなければならない。
【００５５】
注目すべきことに、本発明で使用され得る有用なマスター検量線の性質には柔軟性がある。増幅された分析物ポリヌクレオチドおよび内部検量物質に対して個々のマスター曲線を作成することができ、増幅された分析物ポリヌクレオチドおよび内部検量物質に対する２つの個々のマスター曲線からの未処理データまたは処理データに関する数学演算の結果に対して単一のマスター曲線を作成することができる。例えば、マスター検量線は、内部検量物質の時間依存性増幅兆候に対する分析物ポリヌクレオチドの時間依存性増幅兆候の比に対して、反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の初期量の関数として作成され得る。あるいは、個々の分析物ポリヌクレオチドのマスター検量線および内部検量物質を、エンドユーザーの機器での調整検量物質の同時に増幅から得られた結果を用いて、独立して調整し、次いで、数学演算によって２つの調整後の曲線を互いに関係付けることができる。２つの調整後の曲線を互いに関係付けるためのこの手順は、独立して調整された曲線を示す数学的方程式の関係付けを伴うものであってもよい。該方程式は互いに関係付けされ得るが（例えば、一方の方程式を他方で除算した後、単一の方程式に単純化することにより）、別のアプローチでは、電子表計算を用いて、投入された分析物ポリヌクレオチド標準のインクリメント値において、個々の方程式を解くことにより得られた数値の列を互いに関係付けること（例えば、除算によって比を得る、または減算によって差を得ることにより）を伴う。関係付けされた結果（例えば、演算処理後の増幅兆候）を表す数値の列は、標準的な曲線適合手法によって第３の方程式を規定するために使用され得る。すべての場合において、マスター検量線を確立および使用するために使用される反応に投入された内部検量物質の量は、好ましくは一定に維持される。
【００５６】
マスター検量線曲線の作成  −  独立した調整方法
マスター検量線の作成は、各々が一定量の核酸検量物質（すなわち、内部検量物質）と、異なる既知量の分析物ポリヌクレオチド標準を含む複数の標準試料を形成する工程から始める。例えば、該複数の標準試料の各々は、３０，０００コピーの内部検量物質ポリヌクレオチドを含むものであり得る。また、異なる試料が、既知量の分析物ポリヌクレオチド標準を含むものであってもよく、例えば、該標準の量は、試料の１つと次のものとで１０倍異なる。
【００５７】
次に、単一の増幅反応において、核酸検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅し、標準反応における該核酸検量物質標準および分析物ポリヌクレオチドの各々の増幅兆候を測定あるいは決定する工程がある。一般的に言うと、これらの兆候は、好ましくは、増幅反応がある時点に達するのに要する時間の値、または生成されるアンプリコンの量が特定の量もしくは閾値に達するのに要する時間の値である。かかる兆候は、熱サイクリングまたは他のサイクリングを伴う増幅反応のサイクル数、または時間インクリメントにて測定され得る。時間インクリメントを表す兆候は、増幅反応を促進するための作業者または機械介入を必要としない個別の反応サイクルを伴わない等温増幅反応に好ましい。このような手順の結果は、増幅反応を開始する前の反応混合物中に存在した既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数としての、核酸検量物質と分析物ポリヌクレオチドの各々に対する一群の増幅兆候である。
【００５８】
もちろん、増幅された分析物ポリヌクレオチド標準と増幅された内部検量物質について測定された結果得られる増幅兆候は、反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量と関連しているか、または該量と関係付けされる。これは、グラフ作成、プロット作業によって、またはより好ましくは、（ａ）既知量の分析物ポリヌクレオチド標準（Ｔｔ）を用いて行なった反応増幅兆候と、（ｂ）反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準（Ｓ）の量をコンピュータにより関係付けることによって形式化され得る。同様に、これには、グラフ作成、プロット作業、またはより好ましくは、（ａ）内部検量物質の増幅兆候（ＩＣｔ）と、（ｂ）反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準（Ｓ）の量をコンピュータにより関係付けることが含まれ得る。図２Ａ〜２Ｂの個々のデータ点は、増幅された内部検量物質と増幅された分析物ポリヌクレオチド標準について測定された増幅兆候を表し、反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量の関数としてプロットされたものである。
【００５９】
該検量線の作成方法によれば、関係付けの手順または工程は、好ましくは、（１）反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量の関数としての、増幅された分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候（２）反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量の関数としての、増幅された内部検量物質の増幅兆候に適合させる方程式の最適化を伴うものである。これは、標準的な数学的曲線適合手法をデータセットの各々に適用することにより行なわれ得、関連する曲線を規定する方程式（すなわち、「適合した方程式」）が得られる。したがって、この手順により、２種類の異なる２次元曲線の各々に対して適合した方程式が得られ得る。一実施形態では、各曲線を示すために単一の型の方程式が使用され、該２次元曲線は各々、該方程式の係数の異なる組の数値と関連している。曲線適合手順に使用される方程式は、好ましくは、曲線適合手順で最適化または決定された２つ以上の、より好ましくは３つ以上の、より好ましくは４つ以上の係数を含む非線形方程式である。一部の非常に好ましい方程式は、ちょうど４つの係数を有するものであり、一方、他の一部の非常に好ましい方程式は、ちょうど５つの係数を有するものである。決定された増幅兆候に適合させる方程式の最適化は、市販のソフトウェアパッケージ、例えば、ＳＯＬＶＥＲプログラム（これは、式に対する最適値を見出すため、および方程式を解くためのＥＸＣＥＬアドインツールとして利用可能である、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）製）などを用いて容易に行なわれ得る。この手順によって作成される曲線は、好ましくは、反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準のレベルの増大が、分析物ポリヌクレオチド標準プロットの増幅兆候の減少と相関し（例えば、出現時間が減少する）、内部検量物質の増幅兆候プロットの増大と相関する（例えば、出現時間が増大する）ような形状である。あるいはまた、この手順によって作成される曲線は、反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準のレベルの増大が分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候プロットの減少と相関し（例えば、出現時間が減少する）、反応に投入された投入分析物ポリヌクレオチド標準の範囲全体にわたって実質的に一定の内部検量物質の増幅兆候プロットと相関するような形状であり得る。図２Ａ〜２Ｂに示された曲線は、既知出発量の投入された分析物ポリヌクレオチド標準（Ｓ）のある範囲の値において適合した方程式を解いた結果のグラフを表し、本明細書では「適合された増幅兆候」という。
【００６０】
一般的に言うと、マスター検量線を作成および使用に有用な方程式は、曲線の形状に影響を及ぼすことなくベースラインが調整された１つ、好ましくは１つだけの係数を
含む。この係数は、本明細書において「ベースライン調整係数」または適合された係数と称し、これは、保存マスター曲線を、増幅兆候を特定する軸においてのみ調整し、ｙ軸上の曲線（すなわち、従属変数に相当）の位置に影響を及ぼすが、これ以外に曲線の形状には影響を及ぼさない。他の方程式が該曲線適合手順に使用され得るが、後述する方法では、以下の式：
【００６１】
【数１】
2010511390.tif 000003
を有する４パラメータロジスティック方程式を使用した。
【００６２】
これらの方程式において、従属変数Ｔｔは、反応に使用された分析物ポリヌクレオチド標準（Ｓ）の量の関数としての、既知量の分析物ポリヌクレオチドの増幅兆候を表し、従属変数ＩＣｔは、反応に使用された分析物ポリヌクレオチド標準（Ｓ）の量の関数としての、内部検量物質の増幅兆候を表す。標準的な手順によって最適化され得るこれらの方程式のこの４つの係数を、ａｎ〜ｄｎと特定する。増幅反応に投入される分析物ポリヌクレオチドのコピー数を、方程式において「Ｓ」（すなわち、独立変数）と特定する。このような方程式の係数ａｎは、上記のベースライン調整係数である。もちろん、本発明の使用における成功は、なんら特定の方程式の使用を必要としないことは理解されよう。
【００６３】
上記および図２Ａ〜２Ｂに図示した型の適合された検量線は、マスター検量線として供され得、該適合された曲線を規定する最良適合方程式を解いたものは、マスター検量線を特定する方程式として供され得る。単純にエンドユーザーに、マスター検量線を特定する方程式の係数の値を提供することにより、エンドユーザーが、製造業者により提供されたマスター曲線を用いて、解析装置またはこれに接続されたデータ処理要素のプログラムを作成することが可能になる。データ処理要素またはコンピュータのメモリデバイスに保持する場合、検量線の数学的モデルを、「保存」マスター検量線、あるいは「前規定（ｐｒｅ−ｄｅｆｉｎｅｄ）」マスター検量線と称する。
【００６４】
保存マスター検量線曲線の調整
リアルタイム核酸増幅反応を実施およびモニタリングするための２つの機器が、全く同じ増幅効率調節能力を有することはないため、ならびに２つの蛍光光度計が、同じレベルの光子入力に対して全く同じシグナル出力をもたらすことはないため、各ユーザーのシステムの出力は、ソフトウェアによって、マスター検量線を得るために使用されたシステムの較正濃度出力と同じ較正濃度出力が得られるように調整されなければならない。この調整は、エンドユーザーが、既知量の分析物ポリヌクレオチド標準と、マスター検量線を作成するために使用された反応の場合と同じ一定量の内部検量物質とを含む調整検量物質を用いて１回、またはより好ましくは２回の増幅反応を行ない、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の両方の増幅兆候を決定し、次いで、これらの結果に基づいて保存マスター検量線を調整することによってなされ得る。ユーザーが行なった反応によるデータ点（１つまたは複数）の結果を、保存マスター検量線を示すグラフ上にプロットすると、ユーザーによって決定された時間依存性増幅兆候と、保存マスター検量線を特定する方程式を用いた計算から予想される時間依存性増幅兆候との間に、ある低度の量の差がみられることが予測される。
【００６５】
エンドユーザーが、単一の調整検量物質から得られた１つのデータ点を用いて保存マスター検量線を調整する場合、調整を行なうためには、単に、保存マスター検量線を増幅兆候に相当する次元（すなわち、ｙ軸）において、データ点が重ね合うように調整すること（これ以外に曲線の形状は変化しない）で充分である。これは、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質に対して別々の調整因子を確立することにより行なわれ得る。この手順では、まず、２種類の同時に増幅された標的（すなわち、分析物ポリヌクレオチド標準と内部検量物質）の増幅兆候を決定する。もちろん、調整検量物質中に存在する分析物ポリヌクレオチド標準の出発量は既知である。次に、それぞれの保存マスター検量線方程式における独立変数として、調整検量物質中に存在する分析物ポリヌクレオチド標準の出発量を代入することにより、保存マスター曲線から予想される増幅兆候値を計算する。（ａ）マスター曲線の方程式を用いて計算された値を、（ｂ）決定された増幅兆候から減算することにより計算された差（例えば、このような差は、図３Ａにおける２種類の調整検量物質で例示される）は、調整後の検量線を特定する方程式を得るために保存マスター曲線の方程式を修正するための調整因子として使用され得る。例えば、内部検量物質に対する調整因子の数値が、分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての内部検量物質の増幅兆候を特定する保存マスター曲線の方程式のベースライン調整係数に加算され得る。同様に、分析物ポリヌクレオチド標準に対する調整因子の数値が、分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を特定する保存マスター曲線の方程式のベースライン調整係数に加算され得る。マスター曲線の方程式に対するこのような修正を、方程式６に例示する。この手順は、単一の調整検量物質による結果を用いて、どのようにして２つの保存マスター曲線が独立して調整され得るかを示す。非常に好ましい実施形態では、内部検量物質と分析物ポリヌクレオチド標準に関する独立して調整された検量線についての方程式、または該方程式から計算された数値は、数学演算（例えば、加算、減算、乗算または除算）によって互いに関係付けされる。
【００６６】
好ましくは、一点調整方法または他の調整方法が使用される場合、分析物ポリヌクレオチド標準と内部検量物質の増幅兆候（各々、投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量の関数）を別々に示す適合した方程式を関係付けるためのさらなる工程がある。これは、例えば、（ａ）分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候に対する数値および（ｂ）内部検量物質の増幅兆候に対する数値（各々、調整後のマスター検量線から決定）を関係付けることにより行なわれ得る。これには、数学演算（乗算、除算、加算または減算など）が含まれ得る。例えば、投入された分析物ポリヌクレオチド標準の異なる値における分析物ポリヌクレオチドと内部検量物質に対する調整後のマスター検量線方程式を用いて、ＩＯＡ（分析物）／ＩＯＡ（ＩＣ）比が計算され得る。これは、好ましくは、まず、マスター検量線を作成するために使用された検量標準に対応する分析物ポリヌクレオチドの投入レベルでの、または投入された分析物ポリヌクレオチドの自由裁量値を用いた計算を行なうことにより、分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候および内部検量物質の増幅兆候の値を計算することを伴うものである。この演算の結果は、増幅反応に投入される分析物ポリヌクレオチドの量に依存性である演算処理後の増幅兆候を表す一群のデータ点である。本明細書に記載の特定の例では、演算結果は、増幅反応に投入される分析物ポリヌクレオチドの量に依存性である比の値を表す一群のデータ点である。
【００６７】
エンドユーザーが２つのデータ点を用いて保存マスター検量線を調整する場合（すなわち、２種類の異なる検量標準を使用）、以下の手順が使用され得る。
【００６８】
保存マスター検量線曲線の二点調整
二点調整を用いて保存マスター曲線を調整するための手順は、上記の一点調整方法に非常に類似している。まず、異なる調整検量物質を用いて２つの核酸増幅反応を行なう。各反応は、異なる既知量の分析物ポリヌクレオチドまたはその断片（すなわち、分析物ポリヌクレオチド標準）を、保存マスター検量線を作成するために使用されたものと同じ一定量の核酸検量物質とともに含む。検量反応に使用される調整検量物質を、「第１」および「第２」調整検量物質、あるいは、それぞれ「Ｃａｌ＿１」および「Ｃａｌ＿２」と称する。
【００６９】
次に、内部検量物質（図３Ａ〜３Ｂにおいて、データ点「Ｃａｌ＿１（ＩＣ）」および「Ｃａｌ＿２（ＩＣ）」で示す）および分析物ポリヌクレオチド標準（図３Ｃにおいて、データ点「Ｃａｌ＿１（分析物）」および「Ｃａｌ＿２（分析物）」で示す）の両方の２つの検量反応増幅兆候を各々測定する。
【００７０】
次に、２つの検量反応から得られた各データ点について、測定された増幅兆候と保存マスター検量線からの増幅兆候値の差を計算する。好ましくは、これは、内部検量物質（図３Ａ〜３Ｂにおいて、「ΔＣａｌ＿１（ＩＣ）」および「ΔＣａｌ＿２（ＩＣ）」と表示））および分析物ポリヌクレオチド（図３Ｃにおいて、「ΔＣａＬｌ（分析物）」および「ΔＣａｌ＿２（分析物）」と表示）の両方について行なう。関連する保存マスター検量線上に位置する増幅兆候の値は、上記のように、２種類の調整検量物質の各々に存在する既知量の分析物ポリヌクレオチドを用いて、保存マスター検量線についての方程式を解くことにより計算され得る。
【００７１】
次に、調整される各曲線について、測定された増幅兆候（「ＩＯＡ」）と保存マスター検量線からの増幅兆候値の差の平均を計算する。これは、下記の方程式を用いて行なわれ得る。
【００７２】
【数２】
2010511390.tif 000004
次に、分析物ポリヌクレオチドおよび内部検量物質の調整後の検量線を特定する方程式を作成する。これは、ＡｖｇΔＩＯＡの計算値を、ベースライン調整係数（例えば、例示した４ＰＬ保存マスター検量線を特定する方程式の係数「ａｎ」）に加算し、他のすべての係数は変更せずに維持することにより行なわれ得る。これにより、保存マスター検量線が、単一の次元（例えば、ｙ軸上）だけにおいて有効に調整される。この手順によって、保存マスター検量線は、増幅兆候を表す次元においてのみ調整される。したがって、保存マスター検量線について、ｙ次元における増幅兆候（ＩＯＡ）を、ｘ次元における分析物ポリヌクレオチド標準（Ｓ）の出発量の関数として関係付ける方程式は、
【００７３】
【数３】
2010511390.tif 000005
で示される。そして、調整検量線についての方程式は、
【００７４】
【数４】
2010511390.tif 000006
となる。
【００７５】
この手順により、分析物ポリヌクレオチド標準に対する調整後の検量線（すなわち、投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量に対してプロットされた分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候）および内部検量物質の調整後のマスター検量線（すなわち、投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量に対してプロットされた内部検量物質の増幅兆候）が得られる。保存検量線および対応する調整後のマスター検量線のグラフプロットを、図３Ｂ（内部検量物質）と図３Ｃ（分析物ポリヌクレオチド）に示す。また、該手順に使用したＣａｌ＿１およびＣａｌ＿２データ点も図３Ｂと３Ｃに示す。
【００７６】
好ましくは、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質の増幅兆候（各々、投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量の関数）を別々に示す適合した方程式を関係付けるためのさらなる工程がある。これは、例えば、（ａ）分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候に対する数値および（ｂ）内部検量物質の増幅兆候に対する数値に対する数値（各々、調整後のマスター検量線から測定）を関係付けることにより行なわれ得る。これには、数学演算（乗算、除算、加算または減算など）が含まれ得る。例えば、投入された分析物ポリヌクレオチド標準の異なる値における分析物ポリヌクレオチドと内部検量物質に対する調整後のマスター検量線方程式を用いて、ＩＯＡ（分析物）／ＩＯＡ（ＩＣ）比が計算され得る。これは、好ましくは、まず、マスター検量線を作成するために使用された検量標準に対応する分析物ポリヌクレオチドの投入レベルでの、または投入された分析物ポリヌクレオチドの自由裁量値を用いた計算を行なうことにより、分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候と内部検量物質の増幅兆候の値を計算することを伴うものである。この演算の結果は、増幅反応に投入される分析物ポリヌクレオチドの量に依存性である演算処理後の増幅兆候を表す一群のデータ点である。本明細書に記載の特定の例では、演算結果は、増幅反応に投入される分析物ポリヌクレオチドの量に依存性である比の値を表す一群のデータ点である。図４は、このようなデータ点のプロットを示す。
【００７７】
一点および二点の独立した調整方法の好ましい実施形態では、４パラメータロジスティック（すなわち、「４ＰＬ」）方程式などの方程式を最適化し、データ点を、調整後のマスター検量線から測定された数値間の関係の計算値のプロット上に適合（例えば、表計算形式での２次元プロットの電子的表示）させるためのまた別の工程がある。例えば、方程式は、慣用的な曲線適合手順を用いて、曲線が、投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量（すなわち、ｘ軸）に対して、ＩＯＡ（分析物）／ＩＯＡ（ＩＣ）比の計算値を表すデータ点（すなわち、ｙ軸）に適合されるように最適化され得る。方程式の係数は、最良適合曲線を得るための標準的なソフトウェア曲線適合手法を用いて調整され得る。例示的な最良適合曲線を図４に示す。適合された曲線に対する方程式の一例は、下記の形態を有するものであり得、係数ａ比〜ｄ比に対する数値解を含むものであり得る。
【００７８】
【数５】
2010511390.tif 000007
この方程式において、従属変数「ｙ比」は、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準を表すＳの関数である。適合された曲線は、「ＩＣ調整プロット（比）」と称され、該適合された曲線を示す方程式と一緒に、ともに、試験試料中の未知の量の分析物ポリヌクレオチドの定量化に有用である。
【００７９】
調整後のマスター検量線曲線の使用：試験試料の解析
上記の手順によって得られるマスター検量線を特定する方程式を、マスター検量線を作成するために使用されたもの（１つまたは複数）とは異なるプロセッサまたは機械にプログラムまたは保存することができる。未知の量の分析物ポリヌクレオチドおよび同じ量の内部検量物質ポリヌクレオチドを含む試験試料を用いて増幅反応を行ない、増幅の特定の特色を決定し、次いで、決定された特色を用いて保存マスター検量線についての方程式を解くことにより、試験試料中に存在する分析物ポリヌクレオチドの量に対する数値出力が得られ得る。これは、以下の手順工程を用いて行なわれ得る。
【００８０】
まず、未知の量の分析物ポリヌクレオチドを、反応混合物中において、マスター検量線を作成および調整するために使用されたものと同じ一定量の核酸検量物質と合わせて含む試験試料を用いて、インビトロ核酸増幅反応を行なう工程がある。分析物ポリヌクレオチドと核酸検量物質を同じ増幅反応で同時に増幅し、アンプリコン合成を時間の関数としてモニタリングする。上記の手法を用いて、分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候および内部検量物質の増幅兆候（すなわち、それぞれ、ＩＯＡ（分析物）およびＩＯＡ（ＩＣ））を、試験試料を含む増幅反応増幅反応について決定し、数学演算（乗算、除算、加算または減算など）を行なって、２つの結果を互いに関係付ける。もちろん、試験試料を含む増幅反応による結果を演算処理するために使用する数学演算の性質は、独立して調整された保存マスター曲線の方程式、または（ａ）分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候の数値および（ｂ）内部検量物質の増幅兆候の数値（各々、調整後のマスター検量線とは独立して測定）を関係付ける工程で使用された数学演算と同じであるのがよい。例示的な数学演算としては、ＩＯＡ（分析物）／ＩＯＡ（ＩＣ）比の計算が挙げられる。
【００８１】
次に、試験反応の２つの結果を互いに関係付けるために行なわれた数学演算の結果を用いて、調整後のマスター検量線から測定された数値間の関係の計算値のデータ点に適合させた最適化後の方程式から、反応混合物中に存在していたはずの投入された分析物ポリヌクレオチドの出発量を計算する。例えば、適合させた比のプロット（すなわち、ＩＣ調整プロット（比））に対する方程式から、反応混合物中に存在していたはずの投入された分析物ポリヌクレオチド（すなわち、方程式７の「Ｓ」）の量が、試験試料のＩＯＡ（分析物）／ＩＯＡ（ＩＣ）の比（すなわち、方程式７の「Ｙ比」）の計算値を用いて計算され得る。図４は、試験試料中の分析物ポリヌクレオチドの量（ｌｏｇコピーが約２を示している）を測定するために、ＩＣ調整プロット（比）と試験試料のＩＯＡ（分析物）／ＩＯＡ（ＩＣ）比の計算値（約３．０を示している）がどのようにして使用され得るかをグラフによって示す。
【００８２】
前述のことは、比として、（ａ）既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数としての分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候と、（ｂ）既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数としての内部検量物質の増幅兆候の、独立して調整されたマスター検量線の結果を関係付けることによる本発明を示す。しかしながら、独立して調整されたマスター検量線の結果を差として（すなわち、数学的関係付ける工程を行なうために、除算の代わりに減算を使用）関係付けることによっても優れた結果が得られた。この後者の場合、試験試料について測定された分析物ポリヌクレオチドと内部検量物質の増幅兆候は、差の値を求める減算によって同様に互いに関係付けされる。次いで、この差の値を、差に基づいて調整された検量線と比較し、試験試料中に存在する分析物ポリヌクレオチドの出発量を求める。独立して調整されたマスター検量線を、加算および乗算によって関係付けることもまた、本明細書に詳述した定量方法とともに使用される択一的なアプローチとして想定される。
【００８３】
増幅兆候の結果の予備演算処理に基づいたマスター検量線曲線の作成
先のセクションでは、分析物ポリヌクレオチドおよび同時に増幅された核酸検量物質の増幅兆候に対するマスター曲線の独立した調整後、別々に調整された曲線の結果を用いる数学演算を伴う手順において、別々に調整された曲線を使用することを記載した。この手順を「独立した調整」方法と称する。上記の特定の例では、別々に調整されたマスター曲線の結果を用いて、ＩＯＡ（分析物）／ＩＯＡ（ＩＣ）比を計算した。
【００８４】
以下に、まず調整前のデータを用いて数学演算を行ない、次いで、その結果を用いてマスター曲線を作成する択一的な方法を記載する。比較を簡単にするため、以下、分析物ポリヌクレオチド標準および核酸検量物質の増幅の結果を比として関係付けるマスター曲線の作成に関して記載する。しかしながら、分析物ポリヌクレオチドと核酸検量物質の増幅兆候は、演算処理後の兆候のマスター検量線の作成に使用する前に、任意の数学関数、例えば、乗算、除算、加算または減算などによって互いに関係付けされ得ることは理解されよう。
【００８５】
上記のように、マスター検量線を作成する手順は、各々が一定量の核酸検量物質（すなわち、内部検量物質）および異なる既知量の分析物ポリヌクレオチド標準を含む複数の標準試料を形成する工程から始める。
【００８６】
次に、単一の増幅反応において、核酸検量物質と分析物ポリヌクレオチド標準を同時に増幅し、反応における内部検量物質と分析物ポリヌクレオチド標準の各々の増幅兆候を測定あるいは決定する工程がある。この場合も上記のように、このような手順の結果は、増幅反応を開始する前の反応混合物中に存在した既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数としての、核酸検量物質と分析物ポリヌクレオチド標準の各々に対する一群の増幅兆候である。
【００８７】
次に、個々の増幅反応の既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数としての核酸検量物質および分析物ポリヌクレオチドの各々の該一群の増幅兆候を用いて、数学関数、例えば、比を求めるための除算、または差を求めるための減算を行なう。上記の例に続き、投入された分析物ポリヌクレオチド標準の特定のレベルで測定された分析物ポリヌクレオチドの増幅兆候に対する数値は、同じ増幅反応で測定された核酸検量物質の増幅兆候に対する数値で除算され得る。この手順の結果は、増幅反応を開始する前に反応混合物中に存在した既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数としての比の計算値を表す一群のデータ点である。注目すべきことに、この場合、分析物ポリヌクレオチド標準と内部検量物質の増幅兆候を関係付ける数学演算は、調整検量物質による結果を用いた検量線のいずれかの調整前に行なう。これは、独立した調整方法の実施に使用されるアプローチとは対照的である。
【００８８】
増幅兆候の結果の予備演算処理に基づいたマスター検量線の作成方法によれば、方程式は、反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量の関数としての、増幅された分析物ポリヌクレオチド標準と核酸検量物質の演算処理後の増幅兆候に適合するように最適化される。この場合も、これは、標準的な数学的曲線適合手法をデータセットに適用することにより行なわれ得、関連する曲線を規定する方程式（すなわち、「適合した方程式」）が得られる。したがって、この手順により、最良適合曲線に対する方程式が得られ得る。また、個々の増幅兆候の曲線適合（すなわち、分析物ポリヌクレオチド標準と核酸検量物質の独立した関係付け）における使用に適切であり得る任意の方程式が、演算処理後の増幅兆候に対する曲線を規定する方程式の確立に有用であり得る。例えば、マスター曲線調整方法を例証するために使用した方程式は、下記の形態を有するものであった。
【００８９】
【数６】
2010511390.tif 000008
この方程式において、従属変数（Ｐ）は、反応に使用された分析物ポリヌクレオチド（Ｓ）の量の関数としての、既知量の分析物ポリヌクレオチドの演算処理後の増幅兆候の値を表す。標準的な手順によって最適化され得るこの４つの係数を、ａｐ〜ｄｐと特定する。増幅反応に投入される分析物ポリヌクレオチドのコピー数を、方程式において「Ｓ」（すなわち、独立変数）と特定する。この方程式の係数ａｐは、上記のベースライン調整係数である。図５は、増幅反応を開始する前に反応混合物中に存在した既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数としての、比の計算値を表す一群のデータ点を示す。また、図５には、この一群のデータ点に適合させた最適化後の方程式で規定される曲線も示す。
【００９０】
演算処理後の兆候の保存マスター検量線の調整
増幅兆候の結果の予備演算処理に基づいたマスター検量線を調整するための手順は、検量線の独立した調整に使用される手順に実質的に類似している。より詳しくは、１種類または２種類の調整検量物質を用いて増幅反応を行ない、分析物ポリヌクレオチドと核酸検量物質の増幅兆候を測定する。次いで、この２種類の標的について得られた増幅兆候を、演算処理後の兆候のマスター検量線を作成するために使用されたものと同じ数学演算によって互いに関係付ける。例えば、演算処理後の兆候の検量線を、反応に使用された既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準に対してプロットされた分析物ポリヌクレオチドと核酸検量物質の増幅兆候の比を用いて作成した場合、検量標準について測定された増幅兆候は、比として同様に互いに関係付けされ得る。あるいは、演算処理後の兆候の検量線を、反応に使用された既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準に対してプロットされた分析物ポリヌクレオチドと核酸検量物質の増幅兆候の差を用いて作成した場合、調整検量物質について測定された増幅兆候は、減算によって同様に互いに関係付けされ得る。マスター検量線の一点調整を行なう場合、必要なのは、演算処理後の兆候に対応する次元において検量標準データ点が重ね合う（すなわち、分析物ポリヌクレオチドおよび核酸検量物質の増幅兆候の比を表す）ように曲線を調整することだけであり、反応に使用された既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準に対応する次元における調整は行なわない。これは、演算処理後の兆候に対応する次元における検量標準データ点と保存マスター曲線の差を計算し、次いで、この差の平均を用いて上記の手順に従って曲線を調整することにより行なわれ得る。同様に、演算処理後の兆候の保存マスター検量線の二点調整は、演算処理後の増幅兆候に対応する次元における適合された曲線と検量標準データ点の差の平均を計算し、次いで、この差の平均を用いて本質的に上記の手順に従って曲線を調整することにより行なわれ得る。
【００９１】
演算処理後の兆候の調整後のマスター検量線は、増幅反応において測定される増幅兆候を用いて、試験試料中に含まれる分析物ポリヌクレオチドの量を推測するのに有用である。上記のように、未知の量の分析物ポリヌクレオチドを、反応混合物中において、マスター検量線を作成するために使用されたものと同じ一定量の核酸検量物質と合わせて含む試験試料を用いて、インビトロ核酸増幅反応を行なう工程がある。分析物ポリヌクレオチドおよび核酸検量物質を同じ増幅反応で増幅し、アンプリコン合成を時間の関数としてモニタリングする。上記の手法を用いて、ＩＯＡ（分析物）およびＩＯＡ（ＩＣ）を試験試料について測定し、数学演算（乗算、除算、加算または減算など）を行なって、２つの結果を互いに関係付ける。例示的な数学演算としては、ＩＯＡ（分析物）／ＩＯＡ（ＩＣ）比の計算が挙げられる。次いで、この計算の結果は、調整後の演算処理後の兆候のマスター検量線と比較され、試験試料に含まれていた初期の分析物ポリヌクレオチドの量が推測され得る。
【００９２】
有用な増幅方法
本発明との関連において有用な増幅方法の例としては、限定されないが、転写媒介型増幅（ＴＭＡ）、単一プライマー核酸増幅、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、自己持続性配列複製（３ＳＲ）、ＤＮＡリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）ならびに自己複製ポリヌクレオチド分子および複製酵素（ＭＤＶ−１  ＲＮＡおよびＱ−β酵素など）を使用する増幅方法が挙げられる。これらの種々の増幅手法を行なうための方法は、それぞれ、米国特許第５，３９９，４９１号、米国特許出願第１１／２１３，５１９号、欧州特許出願公開公報ＥＰ  ０  ５２５  ８８２、米国特許第４，９６５，１８８号、米国特許第５，４５５，１６６号、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８  （１９９０）、国際特許出願番号ＷＯ  ８９／０９８３５、米国特許第５，４７２，８４０号およびＬｉｚａｒｄｉら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９：５３−５８  （１９９１）をみるとよい。どのようにして核酸増幅反応を行なうかが記載されたこれらの文献の開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
単一の伸長可能なプライマーのみが必要とされる増幅反応は、開示したアルゴリズムとの関連における使用に特に好ましい。このような反応としては、単一の伸長可能なプライマーが、核酸ポリメラーゼによって伸長され得ない３’−ブロック型オリゴヌクレオチドと組合せて使用される転写関連増幅系が挙げられる。かかる増幅反応を行なうための方法は、例えば、米国特許出願第１１／２１３，５１９号に詳述されている。
【００９４】
有用な増幅兆候の例
さまざまな増幅兆候が、開示した方法との関連において使用され得る。例えば、当業者に熟知された  数学的計算手法およびコンピュータ計算手法を用いて、リアルタイム実施曲線の一次導関数の極大の出現時間、または二次導関数の極大の出現時間が特定され得る。増殖曲線のこのような特色を規定するためのアプローチは、Ｗｉｔｔｗｅｒらによって、米国特許第６，５０３，７２０号（その開示は、引用により本明細書に組み込まれる）に詳述されている。他の有用なアプローチは、増殖曲線の導関数の計算、増殖曲線の特徴の特定、次いで、該導関数の特徴に対応する閾値時間またはサイクル数の決定を含むものである。かかる手法は、米国特許第６，７８３，９３４号（その開示は、引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている。さらに他の有用な増幅兆候としては、「ＴＴｉｍｅ」および「ＴＡｒｃ」が挙げられる。注目すべきことに、ＴＡｒｃ値を決定するための種々のアプローチで、方向性が類似したベクター  （すなわち、単純に「Ｔａｒｃ」で特定される値が得られる）と、方向性が反対のベクター（すなわち、「ＯＴＡｒｃ」で特定される値が得られる）が使用される。このような方法の一般的記載は、以下に後述する。
【００９５】
ＴＴｉｍｅ値の決定方法
簡単に記載すると、ＴＴｉｍｅ値により、リアルタイム増幅反応においてアンプリコン生成の表示が特定の閾値を超えた時間が推測される。ＴＴｉｍｅ値を計算および使用するためのアルゴリズムは、出願番号６０／６５９，８７４で特定される米国特許出願（その開示は、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。このアルゴリズムによれば、標準化およびバックグラウンド調整されたデータに対して、曲線適合手順が適用される。任意のよく知られた曲線適合方法論が使用され得るが、好ましい実施形態では、線形最小二乗（「ＬＬＳ」）曲線適合が使用される。この曲線適合は、所定の下限と上限の間の一部のデータのみに対して行なわれる。データを適合させた曲線を得た後の最終目的は、曲線またはその突出部が予め規定した閾値と交差する点に対応する時間を推測することである。一実施形態において、標準化されたデータの閾値は０．１１である。上限と下限は、曲線をさまざまな制御データセットに適合させる範囲が、与えられた閾値に関連する時間において最も少ないばらつきを示すように、実験的に決定される。一実施形態において、下限は０．０４であり、上限は０．３６である。曲線は、最初に下限より下になったデータ点から最初に上限を超えたデータ点に及ぶデータに対して適合させる。次に、該適合の傾きが統計学的に有意であるか否かの判定が行なわれる。例えば、一次係数のｐ値が０．０５未満である場合、該適合は有意であるとみなして演算処理を継続するが、そうでない場合は演算処理を終了する。あるいは、データの妥当性が、Ｒ２値によって判定され得る。適合された曲線について、直線ｙ＝ｍｘ＋ｂの傾きｍと切片ｂが決定される。この情報を用いて、Ｔｔｉｍｅは、以下のようにして決定され得る。
【００９６】
【数７】
2010511390.tif 000009
ＴＡｒｃ値の決定方法
「ＴＡｒｃ」および「ＯＴＡｒｃ」と称する時間依存性増幅兆候は、リアルタイム実施曲線のベクターに基づく解析を用いて決定される。ＴＡｒｃ値により、増殖曲線が曲線となり始める、または上方に「曲がり」始める時点が特定される。この測定点は、標準曲線を作成するため、または試験試料中の分析物ポリヌクレオチドの量または濃度に関する増幅反応のパラメータを確立するために使用され得る。ベクター解析は、実質的に均一な時間間隔にわたって分布したデータ点を有する増殖曲線を用いて最も簡便に行なわれる。ＴＡｒｃ値およびＯＴＡｒｃ値の決定および使用に関する詳細の提示は、出願番号が６０／６９３，４５５である米国特許出願（この出願の明細書および図面は、引用により本明細書に組み込まれる）に見られる。
【００９７】
マスター曲線の調整方法の曲線工程を行なうための択一的な方程式
注目すべきことに、４−パラメータロジスティック（４ＰＬ）方程式を、特に本発明の例示において使用したが、他の数学関数もまた、該手順に使用され得る。実際、ベースライン調整係数を有する実質的に任意の方程式が、リアルタイム増幅結果のモデル作成を行なうための曲線適合手順において使用され得る。上記のように、ベースライン調整係数は、標準的なプロットにおいて、曲線の形状を変更することなく曲線全体を垂直次元においてのみ調整する目的に供される。
【００９８】
当業者には、数多くの型の方程式が、本明細書に開示した手順において使用され得ることが認識されよう。リアルタイムデータ（具体的には、増幅兆候）のモデル作成のため、およびマスター検量線の調整手順において修正され得るベースライン係数を有するマスター検量線を作成するためには、ベースライン係数を含む推移関数が使用され得る。対称性推移関数の例としては、限定されないが、シグモイド、ガウス累積（Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ）、ローレンツ累積および累積的対称性ダブルシグモイドが挙げられる。非対称性推移関数の例としては、限定されないが、ロジスティック用量応答（ＬＤＲ）、Ｌｏｇ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ、極値累積、パルス累積、Ｐｏｗｅｒ  Ｔｅｒｍを伴うパルス累積、ワイブル累積、非対称性シグモイド、非対称性シグモイド逆非対称、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、およびＣｕｍｕｌａｔｉｖｅ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇａｕｓｓｉａｎが挙げられる。さらに、単純な線形および非線形方程式、例えば、高次多項式、べき関数、指数関数および対数関数が、リアルタイムデータのモデル作成のために使用され得、本明細書に詳述しているように、その後、ベースライン係数の調整が行なわれる。ベースライン係数を有する動態関数もまた、同様に使用され得る。ベースライン係数を含む例示的な基本動態方程式としては、限定されないが、Ｈａｌｆ  Ｏｒｄｅｒ  Ｄｅｃａｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｆｉｒｓｔ  Ｏｒｄｅｒ  Ｄｅｃａｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｏｒｄｅｒ  Ｄｅｃａｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｏｒｄｅｒ  Ｄｅｃａｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （双曲型）およびＴｈｉｒｄ  Ｏｒｄｅｒ  Ｄｅｃａｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｏｒｄｅｒ  Ｄｅｃａｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎが挙げられる。ベースライン係数を含む例示的な複雑な動態方程式としては、限定されないが、Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｆｉｒｓｔ  ａｎｄ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｏｒｄｅｒ  Ｄｅｃａｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｆｉｒｓｔ  Ｏｒｄｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｔｗｏ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｆｉｒｓｔ  Ｏｒｄｅｒ  Ｄｅｃａｙ、Ｔｗｏ  Ｆｉｒｓｔ  Ｏｒｄｅｒ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅｃａｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｔｗｏ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｏｒｄｅｒ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅｃａｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、およびＦｉｒｓｔ  ａｎｄ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｏｒｄｅｒ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅｃａｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎが挙げられる。ベースライン係数を含む例示的な動態均衡方程式としては、限定されないが、Ｓｉｍｐｌｅ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  （Ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｒａｔｅ）、Ｓｉｍｐｌｅ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  （Ｎｅｔ  Ｒａｔｅ  ａｎｄ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ａ＝Ｂ＋Ｃ、およびＣｏｍｐｌｅｘ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ａ＋Ｂ＝Ｃ＋Ｄが挙げられる。ベースライン係数を含む例示的な中間動態方程式としては、限定されないが、Ｆｉｒｓｔ  Ｏｒｄｅｒ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ��ｎｄ  Ｆｉｒｓｔ  Ｏｒｄｅｒ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍが挙げられる。当業者には、開示したマスター検量線の調整方法の成功が、曲線適合工程を行なうとマスター検量線の作成がもたらされるなんら特定の方程式の使用に依存しないことが容易に理解されよう。実際、曲線適合手順において最適化され得る係数、およびベースライン調整係数を含む係数を有する任意の方程式が、開示したマスター検量線の調整手順の実施に使用され得ると考えられる。
【００９９】
上記の型の方程式はすべて、リアルタイムデータの増幅兆候の曲線適合対し、優れた結果（適合度によって判定）を伴って使用されている。したがって、これらの型の各方程式は、開示した方法（例えば、独立した調整方法）を行なうために、優れた結果を伴って使用され得る。これは、該手順の成功が、使用される具体的な方程式だけでなく、データが最適に適合できる可能性にも依存するためである。さらに、単一のマスター曲線調整手順における異なる型の方程式の使用は、本発明の範囲に含まれる。これは、増幅反応に投入される分析物ポリヌクレオチド標準の量の関数としての分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候が、ある１つの型の方程式によってモデル作成され得、増幅反応に投入される分析物ポリヌクレオチド標準の量の関数としての内部検量物質の増幅兆候は、該手順において第２の型の方程式によってモデル作成され得ることを意味する。同様に、ある１つの曲線（またはこの曲線を規定する方程式）を別の曲線（この曲線を規定する方程式）に数学的に関係付けるプロセスの結果は、さらに第３の型の方程式によってモデル作成され得る。      
【０１００】
検量アルゴリズムの実行のための装置
本明細書に開示した方法は、コンピュータまたは類似した演算処理デバイス（本明細書において以下、「コンピュータ」）を用いて簡便に実行される。種々の好ましい実施形態において、アルゴリズムを実行するためのソフトウェアまたは機械で実行可能な使用説明書が、独立型のコンピュータのメモリ要素、または解析中の生成物の量を（好ましくは時間の関数として）モニタリングするために使用されるデバイスに連結されたコンピュータのメモリ要素に、ロードあるいは保持され得る。非常に好ましい実施形態において、検量アルゴリズムを実行するためのソフトウェアは、反応混合物中に存在するアンプリコンの量が時間の関数としてモニタリングされ得るデバイスに接続された、または該デバイスの一体化された一部であるコンピュータのメモリ要素に保持される。
【０１０１】
実際、リアルタイム増幅デバイスを制御するためのコントローラシステムおよび／または該リアルタイム増幅デバイスの検出システムのいずれかまたは両方が、予めプログラムされた、またはユーザーが入力した使用説明書に従ってこれらの機器を操作することを指示する機能を果たすように適切にプログラムが組み込まれたコンピュータに接続され得る。また、該コンピュータは、好ましくはこれらの機器からのデータおよび情報を受信、解釈、操作し、この情報をユーザーに報告することができるものである。
【０１０２】
一般に、該コンピュータは、典型的には、ユーザー使用説明書を受容するための適切なソフトウェアを、ユーザーが一組のパラメータフィールドに入力した形態、または予めプログラムされた使用説明書（例えば、さまざまな異なる特定の演算のために予めプログラムされたもの）の形態のいずれかで含む。次いで、所望の演算が行われるようにリアルタイム増幅コントローラの演算を指示するため、該ソフトウェアにより、このような使用説明書が適切な言語に変換される。また、該コンピュータは、システム内に含まれた１つ以上のセンサー／検出器からのデータを受信し、プログラムに従って該データを解釈できるものである。該システムは、好ましくは、時間の関数として増幅された目的の核酸コピーの量（検出器によって検出）を示す増殖曲線の特色を、試験試料中に存在する目的の核酸のコピー数に相関させるソフトウェアを含む。
【０１０３】
好ましくは、開示した検量アルゴリズムの実行に使用されるコンピュータが、リアルタイム核酸増幅反応を実行および解析するための装置の一体化された一部の要素である場合、該装置は、好ましくは、温度制御されたインキュベータ、シグナルを収集するための検出デバイス、シグナルを解析するための解析デバイス（例えば、コンピュータまたはプロセッサ）、および解析デバイスによって取得または生成されたデータを表示するための出力デバイスを含む。解析デバイスは、当該技術分野で知られた入力デバイスを介して温度制御されたインキュベータに接続されていてもよい、および／またはデータ表示のための当該技術分野で知られた出力デバイスに接続されていてもよい。一実施形態において、温度制御されたインキュベータは、温度サイクリングが可能なものである。
【０１０４】
一般的に言うと、開示した方法との関連において有用なリアルタイム核酸増幅を行なうための装置の種々の要素は、当業者に熟知された慣用的な要素である。リアルタイム核酸増幅を実施および解析するために使用される温度制御されたインキュベータは、複数の反応チューブまたは反応試料を、標準的な増幅反応チューブまたはマルチウェルプレートのウェルの温度制御されたブロック内に収容することができる慣用的な設計のものであり得る。一態様において、検出システムは、１つ以上の蛍光標識からの光信号の検出に適したものである。検出システムの出力（例えば、増幅反応中に生じたものに対応するシグナル）は、データの保存と操作のためにコンピュータに供給され得る一実施形態において、該システムは、多数の異なる型の光信号（多数の異なる型の蛍光標識など）を検出し、マイクロプレート蛍光リーダーの能力を有するするものである。検出システムは、好ましくは、励起光源（これは、可視光レーザーまたは紫外線ランプまたはハロゲンランプであり得る）、励起光を個々の反応チューブに分散させ、該反応チューブからの蛍光を受けるためのマルチプレクサデバイス、波長によって蛍光を励起光から分離するためのフィルタリング手段、および蛍光強度を測定するための検出手段を含む多重型蛍光計である。好ましくは、温度制御されたインキュベータの検出システムは、フルオロフォア選択の柔軟性、高感度および優れた信号対雑音比を許容する広い検出範囲を提供するものである。検出システムによって受信された光信号は、一般的に、プロセッサと連通しているユーザーデバイスのディスプレイ上でユーザーが見ることができるデータが得られるように、該プロセッサで操作され得るシグナルに変換される。ユーザーデバイスは、ユーザーインターフェースを含むものであってもよく、キーボードとビデオモニターを有する慣用的な市販のコンピュータシステムであってもよい。ユーザーデバイスに表示され得るデータの例としては、増幅プロット、散布図、アセンブリ内のすべてのチューブまたは反応槽および使用したすべての標識に対する標本値スクリーン、光信号強度スクリーン（例えば、蛍光シグナル強度スクリーン）、ファイナルコールの結果、テキストレポートなどが挙げられる。
【０１０５】
種々のマスター検量線曲線調整方法の比較
以下に、上記の方法によってマスター検量線を調整するための２種類の異なるアプローチの比較を例示する。各場合において、マスター検量線は、第１の組の増幅／検出機器で得られた結果を用いて作成した（すなわち、アッセイ製造業者によるマスター曲線の作成をシミュレーション）。次いで、作成されたマスター曲線（１つまたは複数）を、異なる増幅／検出機器で得られた結果の解析に使用した（すなわち、エンドユーザーまたはカスタマーによって操作された機器でシミュレーション）。
【０１０６】
第１のアプローチでは、分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候の結果を、内部検量物質の増幅兆候で除算して比を計算した。曲線適合を行ない、例示した４ＰＬ方程式係数を最適化し、増幅反応に使用された分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数として比の値を示した。次いで、この単一のマスター検量線（「演算処理後の兆候のマスター検量線」と称する）を、エンドユーザーのシミュレーション機器での１種類または２種類の調整検量物質いずれかの増幅によって得られた結果を用いて調整した。重要なことに、演算処理後の兆候のマスター検量線の調整によって得られた結果を、エンドユーザーのシミュレーション機器において作成された完全な検量線（すなわち、「局所」検量線）と比較すると、金標準検量線が示された。
【０１０７】
第２のアプローチでは、２つのマスター検量線（すなわち、第１は、分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候のもの、第２は、分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての内部検量物質の増幅兆候のもの）は、製造業者のシミュレーション機器において得られた結果を用いて、例示した４ＰＬ方程式の係数を最適化するための曲線適合によって作成された。次いで、この２つの曲線を、エンドユーザーのシミュレーション機器での１種類または２種類の調整検量物質いずれかの増幅によって得られた結果を用いて独立して調整した。次いで、独立して調整された検量線を特定する方程式を、数学演算によって互いに関係付けた。実施例では、分析物ポリヌクレオチド標準に対する調整後の曲線を規定する方程式を、内部検量物質に対する方程式で除算し、独立して調整された検量線についての方程式を得た（すなわち、この場合も、２つの方程式を、比を得る除算プロセスによって関係付ける）。第１のアプローチの場合のように、独立して調整された検量線を用いて得られた結果を、エンドユーザーのシミュレーション機器において作成された完全な検量線（すなわち、「局所」検量線）と比較すると、この場合も、金標準検量線が示された。
【０１０８】
以下の実施例では、等温単一プライマー転写関連増幅系を用いてマスター検量線の調整方法を示した。該手順に使用した分析物ポリヌクレオチド標準は、モデルウイルスポリヌクレオチドであった。同時に増幅反応において分析物ポリヌクレオチド標準と関連のない内部検量物質の増幅に使用したオリゴヌクレオチド（すなわち、プライマー）は完全に独立したものとし、これは、単一の反応槽で行なわれた２つの増幅反応において、個々の増幅反応のプライマーが共用されなかったことを意味する。さらに、２種類のアンプリコンは、異なる長さおよび異なるＧ＋Ｃ含有率（％）を有した。このようなストリンジェントアッセイ条件下で優れた結果が得られたことにより、両方の核酸標的を増幅する１種類以上のプライマーを使用すること、ならびに分析物ポリヌクレオチド標準と同じ長さとＧ＋Ｃ含有率（％）を有するアンプリコンをもたらす内部検量物質を使用することによってもまた、優れた結果が予測され得ることが示された。
【０１０９】
注目すべきことに、以下の実施例に示した定量的リアルタイムの結果は、図１、２Ａ〜２Ｂおよび５に示したデータのサブセットに相当する。より詳しくは、これらの図は、単一プライマー増幅反応を、４つの異なる増幅／検出機器（すなわち、機器１〜４）において実施およびモニターした場合に得られる結果の集合体を提示する。以下の記載において、機器１をエンドユーザーのモデル機器とした。したがって、後述するエンドユーザーデータは、例えば、局所検量線（１つまたは複数）との関連において、機器１のみを用いて得られた図２Ａ〜２Ｂおよび５に示されたデータ点のサブセットに相当する。機器２〜４は、異なる機器で得られるデータの解析に有用なマスター検量線を作成するために使用され得るモデル機器とした。したがって、後述するマスター検量線を作成するために使用した結果は、機器２〜４のみを用いて得られた図２Ａ〜２Ｂおよび５に示されたデータ点のサブセットを示した。もちろん、単一の核酸増幅／検出機器だけを使用し、本明細書に開示した方法によるマスター検量線の作成、調整および使用もまた、本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【０１１０】
実施例１
保存マスター検量線曲線の作成および使用
まず、米国特許出願公開公報番号２００６／００４６２６５Ａ１に開示された一般的な方法に従って行なわれる標準的な単一プライマー等温核酸増幅反応のための一群の標準試料を調製した。試料は、１０２〜１０８コピー／試料にわたる範囲の出発量の分析物ポリヌクレオチド標準を含むものとした。さらに、各試料には、分析物ポリヌクレオチド標準と関連のない一定の出発量の３０，０００コピーの内部検量物質核酸を含む。この場合、内部検量物質は、分析物ポリヌクレオチド標準内の増幅対象の配列の長さとは異なるある長さのＨＩＶ−１核酸（すなわち、分析物ポリヌクレオチド標準と異なるウイルス標的）内に提示される複数の塩基のスクランブル型配列からなる人工標的配列とした。したがって、増幅反応で合成された内部検量物質および分析物ポリヌクレオチド標準のアンプリコンは、長さとＧ＋Ｃ含有率（％）の両方が異なった。さらに、分析物ポリヌクレオチド標準と内部検量物質は、異なるオリゴヌクレオチドを用いた核酸増幅反応において同時に増幅した（すなわち、２種類の標的は、共用プライマーを用いて増幅されたものではなかった）。
【０１１１】
分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質のアンプリコンの時間依存性合成を、２種類のアンプリコン特異的分子トーチハイブリダイゼーションプローブの蛍光発光をモニタリングすることにより評価した。リアルタイム増殖曲線は、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質のアンプリコンの各々の増幅兆候を測定するための閾値に基づくＴＴｉｍｅアルゴリズムを用いて解析した。分析物ポリヌクレオチド標準の出発量は、各反応で既知であるため、解析の結果により、（ａ）分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候、および（ｂ）分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての内部検量物質の増幅兆候が得られた。結果を、３つの異なるマスター検量線の作成に使用した。
【０１１２】
マスター検量線の作成に使用しなかったエンドユーザーのモデル増幅／検出機器において得られた結果を用いて、局所検量線を作成した。簡単には、上記の完全な一群の標準試料（すなわち、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質を含む）を用いて、分析物ポリヌクレオチドの増幅兆候を内部検量物質の増幅兆候に比として関係付ける検量線を作成した。この局所曲線は、エンドユーザー機器で行なわれた定量に対して予測された結果であり、そのため、調整手順の目的である金標準を示す。局所検量線を、図９〜１２に太い点線で示す。各グラフ上の黒菱形は、局所曲線を作成（この場合も、４ＰＬ方程式を最適化するための標準的な曲線手法によって）するために使用した反復結果を示す。
【０１１３】
演算処理後の兆候のマスター検量線は、分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候値を内部検量物質の増幅兆候値で除算することにより作成した（得られる各比は、それぞれの反応で使用された分析物ポリヌクレオチド標準の投入量と関連する）。当業者に熟知された標準的な曲線適合手法を用いて、本明細書に示した型の４ＰＬ方程式の係数を最適化した。方程式を解くと、エンドユーザーのモデル機器において得られた結果を用いて調整され得る演算処理後の兆候のマスター検量線が示された。図６は、３つの増幅／検出機器を用いて得られた個々のデータ点、およびマスター検量線に対応する適合された曲線（太い実線の曲線で示す）を示す。もちろん、マスター検量線を特定する適合された係数を有する方程式を、その後の調整手順に使用した。注目すべきことに、図６に示した演算処理後の兆候のマスター検量線を作成するために使用したデータは、機器２〜４を用いて得られた図５の結果に対応する。また、演算処理後の兆候のマスター検量線を、図９と１０にも太い実線の曲線（すなわち、「マスター」と表示）で示す。
【０１１４】
また、異なる手順では、分析物ポリヌクレオチド標準および内部検量物質に対する別々のマスター検量線を作成した。当業者に熟知された標準的な曲線適合手法を別々に使用し、（ａ）該一群の分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候  （すなわち、上記の方程式１）、および（ｂ）該一群の分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての内部検量物質の増幅兆候（すなわち、上記の方程式２）に適合されるように４ＰＬ方程式の係数を最適化した。該手順に使用した内部検量物質の増幅兆候のデータ点は、機器２〜４を用いて得られた図２Ａのデータ点のサブセットに相当する。該手順に使用した分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候のデータ点は、機器２〜４を用いて得られた図２Ｂのデータ点のサブセットに相当する。図７は、３つの機器によるデータ点、および増幅反応に使用された分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての分析物ポリヌクレオチドのマスター検量線標準の増幅兆候を表す適合された曲線を示す。図８は、３つの機器によるデータ点、および増幅反応に使用された分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての内部検量物質のマスター検量線の増幅兆候を表す適合された曲線を示す。図７〜８の曲線に対する適合した方程式により、エンドユーザーのモデル機器において得られた結果を用いて独立して調整され得る２つのマスター検量線が規定された。次いで、この２つの調整後の検量線または調整後の曲線を表す方程式は、数学演算によって互いに関係付けされ得る。図１１および１２に示した太い実線の曲線（すなわち、「マスター」と表示）は、（ａ）分析物ポリヌクレオチド標準の未調整検量線についての方程式を（ｂ）内部検量物質の未調整検量線についての方程式で除算した結果を表す。
【０１１５】
図６に示した演算処理後の兆候のマスター検量線、および図７〜８に示した独立したマスター検量線は、エンドユーザーのモデル機器で増幅させた１種類または２種類の調整検量物質いずれかの増幅の増幅による結果を用いて調整した。試行は、１０４コピーの分析物ポリヌクレオチド標準および３０，０００コピーの内部検量物質を含む単独の調整検量物質を用いて行なった。試行は、同じ一定量の内部検量物質および１０３コピーまたは１０７コピーいずれかの分析物ポリヌクレオチド標準を含む調整検量物質が使用される二点検量方法を用いて行なった。また、調整検量物質中の分析物ポリヌクレオチド標準と内部検量物質の同時に増幅には、マスター検量線および局所検量線を作成するために使用されたものと同じ核酸増幅手順を使用した。決定された分析物ポリヌクレオチド標準と内部検量物質の増幅兆候は、上記の一点または二点調整を行なうために使用した。グラフ表示を単純にするため、図６〜８に示した白四角は、一点調整検量物質を用いて得られた結果を示す。したがって、これらの図は、マスター検量線およびその決定に使用されたデータ点を示し、さらに、本明細書に開示した方法によるその後の調整工程に使用された調整検量物質による結果を示す。図９および１０の白四角は、決定された分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候を、内部検量物質の増幅兆候で除算した結果を示す。これらのデータ点は、グラフの垂直次元における演算処理後の兆候のマスター検量線の調整に使用し、図９および１０において「比調整後のマスター」と表示した破線が得られた。エンドユーザーのモデル機器での調整検量物質増幅反応により測定された（ａ）分析物ポリヌクレオチド標準および（ｂ）内部検量物質の別々の増幅兆候を、独立して２つのマスター検量線調整に使用したが（例えば、図７〜８参照）、これらの値の比の計算値を表す白四角は、図１１および１２において単一のプロット上に示される。これは、局所検量線上に含まれる結果を独立した調整手順に使用したことを示すことを意図するが、比の値を有する表示したデータ点をマスター曲線の修正に使用したことは示さない。独立して調整されたマスター検量線（例えば、任意の調整前の独立したマスター検量線を示す図７および８）に対する方程式を、市販の電子表計算ソフトウェアプログラムを用いて互いに除算した（すなわち、分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての分析物ポリヌクレオチド標準調整後のプロットを表す方程式を、分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての内部検量物質の調整後のプロットを表す方程式で除算した）。得られた適合された曲線を、図１１および１２において「独立した調整後のマスター」と特定する。
【０１１６】
図９と１１の比較、および図１０と１２の比較により、演算処理後の兆候のマスター検量線に基づいた調整手順と、別々のマスター曲線（すなわち、第１は、分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての分析物ポリヌクレオチド標準の増幅兆候のもの、第２は、分析物ポリヌクレオチド標準の出発量の関数としての内部検量物質の増幅兆候のもの）の独立した調整との根本的な違いが明らかとなった。より具体的には、演算処理後の兆候のマスター検量線の調整に基づいた方法では、予測どおり、演算処理後の兆候のマスター検量線の形状が変化することなく、単に曲線が垂直次元において調整された。対照的に、２つのマスター検量線の独立した調整に基づいた方法の後、調整後の曲線を関係付ける工程を行なうと（例えば、調整後の曲線を表す方程式）、予想外なことに、結果が局所検量線に、より近く近似するようにマスター検量線の形状が変化した。この効果による改善は、表１〜２の結果から明白である。
【０１１７】
表１は、単一の調整検量物質のみを用いてマスター検量線を調整することにより得られた結果を示す。表の第１の欄は、各増幅反応（ｎ＝４）で使用された分析物ポリヌクレオチド標準のｌｏｇコピー数を示す。表中の残りの欄は、（ａ）局所検量線、（ｂ）比での関係を確立するための除算プロセスによって互いに関係付けされた独立して調整されたマスター曲線、および（ｃ）調整後の演算処理後の兆候のマスター検量線の各々を用いて計算された定量値での、「決定されたＬｏｇコピー」数（すなわち、適合した方程式を用いて計算された値）、および回収率（％）（すなわち、決定された値を予測値で除算することによって計算された値）を示す。表に示したデータを検討すると明白なように、独立した調整方法により、投入された分析物ポリヌクレオチド標準量の試験範囲において卓越した定量が得られた。実際、独立した調整方法を用いて測定された結果は、局所検量線を用いて計算された結果に、より近く近似し、回収率（％）は予想ｌｏｇコピー数から、１００コピーレベルで２分の１ｌｏｇコピー数をちょうど超える分だけ逸れた。より高いレベルの出発分析物ポリヌクレオチド標準で、顕著な結果が得られた。独立した調整方法に特徴的な相対的改善は、システムが、未調整曲線と比べて調整後の曲線の形状を変化させる能力に起因する。
【０１１８】
【表１】
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表２に示された結果により、独立した調整方法は、演算処理後の兆候の検量線の調整方法と比べ、局所検量線に、より近く近似する卓越した結果が得られることが確認された。一点調整試行と比べて、二点独立した調整プロトコルでは、投入された分析物ポリヌクレオチド標準の最低レベルでの回収の改善が示されたとともに、全試験範囲において非常に良好な結果が得られた。
【０１１９】
【表２】
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本発明をそのいくつかの具体的な実施例および実施形態に関して記載した。もちろん、前述の詳細説明を検討すると、当業者には本発明のいくつかの異なる実施形態が示唆されよう。したがって、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲を参照して決定される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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