(57)【要約】  本発明は、癌の検出および診断のための方法を提供する。本発明は、癌の検出のために、患者から得られた低メチル化腫瘍ＤＮＡ配列を選択的に増幅する方法を提供する。本方法は、高比率の正常な宿主ＤＮＡを含有するＤＮＡ混合物からの腫瘍特異的配列の選択的増幅を可能とするように、特異的メチル化を利用する。本発明はまた、メチル化の評価のための、増幅された腫瘍ＤＮＡ配列を使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者試料からのメチル化に敏感な代表的な低メチル化腫瘍ＤＮＡを作製するための方法であって、
ａ）患者試料からＤＮＡを単離するステップと、
ｂ）前記ＤＮＡをメチル化特異的酵素で消化するステップと、
ｃ）前記消化されたＤＮＡをリンカーにライゲーションするステップと、
ｄ）前記ライゲーションされたＤＮＡをリンカー媒介ＰＣＲ増幅に供して、ＰＣＲ産物を得るステップと、
ｅ）前記ＰＣＲ産物を環状化するステップと、
ｆ）前記環状化されたＰＣＲ産物を増幅して、前記患者ＤＮＡからメチル化に敏感な代表的な低メチル化腫瘍ＤＮＡを生成するステップと、を含む方法。
【請求項２】
前記患者試料が、血漿または血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メチル化特異的酵素が、ＨｐｙＣｈ４−ＩＶ、またはＣｌａＩ、またはＡｃｌＩ、またはＢｓｔＢＩである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記メチル化特異的酵素が、ＨｐｙＣｈ４−ＩＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リンカー媒介ＰＣＲ増幅が、約５から約１５サイクル行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記リンカー媒介ＰＣＲ増幅が、約１０サイクル行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ｄ）の前記ＰＣＲ産物が、沈殿によって精製される、請求項１に記載の方法。 
【請求項８】
前記ＰＣＲ増幅が、ビオチン化ＰＣＲプライマを用いて行われ、前記ＰＣＲ産物は、支持体に連結されたビオチン結合タンパク質を利用して精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ビオチン結合タンパク質が、ストレプトアビジンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記支持体が、アガロース、セファロース、および電磁ビーズからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＣＲ産物が、リンカー配列に部分的または完全に含有される認識部位を有する制限酵素を使用して、前記支持体から切断される、請求項８に方法。
【請求項１２】
前記環状化ＰＣＲ産物が、ローリングサークル増幅によって増幅される、請求項１に記載の方法。 
【請求項１３】
前記腫瘍が、卵巣腫瘍、または肺腫瘍、または前立腺腫瘍、または乳房腫瘍からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が、卵巣腫瘍である、請求項１３に記載の方法。 
【請求項１５】
患者試料からのメチル化に敏感な代表的な低メチル化腫瘍ＤＮＡの作製するための方法であって、
ａ）患者試料からＤＮＡを単離するステップと、
ｂ）前記ＤＮＡをＨｐｙＣｈ４−ＩＶで消化するステップと、
ｃ）前記消化されたＤＮＡへのリンカーのライゲーションによってＭｌｕＩ認識部位が形成されるように、前記消化されたＤＮＡを前記リンカーにライゲーションするステップと、
ｄ）前記消化されたＤＮＡをビオチン化プライマを用いたリンカー媒介ＰＣＲ増幅に供して、ＰＣＲ産物を得るステップと、
ｅ）支持体に連結されたビオチン結合タンパク質を使用して、前記増幅されたＰＣＲ産物を精製するステップと、
ｆ）前記ＰＣＲ産物をＭｌｕＩで消化するステップと、
ｇ）前記消化されたＤＮＡを環状化するステップと、
ｈ）ローリングサークル増幅を実施して、前記患者ＤＮＡからメチル化に敏感な代表的な低メチル化腫瘍ＤＮＡを生成するステップと、を含む方法。 
【請求項１６】
前記腫瘍が、卵巣腫瘍、または肺腫瘍、または前立腺腫瘍、または乳房腫瘍からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。 
【請求項１７】
前記腫瘍が、卵巣腫瘍である、請求項１６に記載の方法。 
【請求項１８】
腫瘍特異的低メチル化ＤＮＡ領域を同定するための方法であって、
ａ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法を使用して、腫瘍および正常なＤＮＡからメチル化に敏感な代表的なＤＮＡを別々に調製するステップと、
ｂ）前記腫瘍ＤＮＡおよび対照ＤＮＡを標識して、標識された腫瘍ＤＮＡプローブおよび標識された対照ＤＮＡプローブを生成するステップと、
ｃ）前記標識されたＤＮＡプローブを、オリゴヌクレオチドのアレイにハイブリダイズするステップであって、前記オリゴヌクレオチドのアレイは、所与のメチル化に敏感な酵素に対して、予測された制限断片、またはその一部に対応する、ステップと、
ｄ）前記正常なプローブおよび腫瘍由来のプローブからの信号の相対強度を互いに比較して、腫瘍ＤＮＡプローブの差分量を検出するオリゴヌクレオチドを同定するステップと、
ｅ）ステップｄからの前記ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを、腫瘍特異的低メチル化領域に対応するとして同定するステップと、を含む方法。
【請求項１９】
前記腫瘍ＤＮＡプローブおよび前記正常なＤＮＡプローブが、２つの異なる標識で標識され、前記標識されたプローブのハイブリダイズが、１つのアレイに行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ試料が、血漿または血清からのものである、請求項１８に記載の方法。 
【請求項２１】
患者の腫瘍の存在を検出するための方法であって、
ａ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法を使用して、患者ＤＮＡのメチル化に敏感な代表的ＤＮＡを調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の前記メチル化に敏感な代表的ＤＮＡにおける増幅されたＤＮＡの量を、同一の方法によって作製された正常なＤＮＡの前記メチル化に敏感な代表的ＤＮＡにおけるＤＮＡの量と比較するステップと、
ｃ）正常なＤＮＡからの前記メチル化に敏感な代表的ＤＮＡに対して、ステップａ）の前記メチル化に敏感な代表的ＤＮＡにおける増幅されたＤＮＡの量の増加を、腫瘍の存在を示すものとして同定するステップと、を含む方法。
【請求項２２】
前記患者ＤＮＡの代表的ＤＮＡおよび前記正常なＤＮＡの代表的ＤＮＡが、標識され、１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイズされる、請求項２１に記載の方法。 
【請求項２３】
前記腫瘍が、卵巣腫瘍、または肺腫瘍、または前立腺腫瘍、または乳房腫瘍からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍が、卵巣腫瘍である、請求項２３に記載の方法。 
【請求項２５】
腫瘍ＤＮＡおよび正常なＤＮＡを混合した試料において、低メチル化腫瘍ＤＮＡを検出するためのマイクロアレイを作製する方法であって、
ａ）請求項１８に記載の腫瘍特異的低メチル化ＤＮＡ領域を同定するステップと、
ｂ）腫瘍特異的低メチル化ＤＮＡ領域と、前記腫瘍特異的低メチル化ＤＮＡ領域にハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとを選択するステップと、
ｃ）前記選択されたオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイを調製するステップと、を含む方法。 
【請求項２６】
前記腫瘍特異的低メチル化ＤＮＡ領域が、複数の腫瘍試料において低メチル化されるものとして選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の腫瘍試料は、同一型の腫瘍を有する患者からの試料である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記複数の腫瘍試料は、異なる腫瘍型を有する患者からの試料である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記腫瘍特異的低メチル化ＤＮＡ領域にハイブリダイズする、２つ以上の異なるオリゴヌクレオチドが、ステップ（ｂ）で選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
複数の腫瘍特異的低メチル化ＤＮＡ領域が、ステップ（ｂ）で選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記マイクロアレイが、腫瘍ＤＮＡの低メチル化されていないＤＮＡ領域にハイブリダイズする、１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドの対照をさらに含む、請求項２５に記載の方法。 
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドが、卵巣腫瘍、または前立腺腫瘍、または乳房腫瘍、または肺腫瘍、またはこれらの腫瘍型の任意の組み合わせからなる群より選択される腫瘍において、低メチル化されている座位を検出するように選択される、請求項２５に記載のマイクロアレイを作製する方法。 
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチドが、卵巣腫瘍の低メチル化されている座位を検出するように選択される、請求項２５に記載のマイクロアレイを作製する方法。 
【請求項３４】
請求項２５から３３のいずれか１項に記載の方法によって作製されるマイクロアレイ。
【請求項３５】
腫瘍ＤＮＡと正常なＤＮＡとの間のメチル化差異を検出するためのマイクロアレイを作製する方法であって、
ａ）患者試料からＤＮＡを単離するステップであって、前記患者は、腫瘍を有すると診断されている、ステップと、
ｂ）前記ＤＮＡをメチル化特異的酵素で消化するステップと、
ｃ）前記消化されたＤＮＡをリンカーとライゲーションさせるステップと、
ｄ）前記消化されたＤＮＡをリンカー媒介ＰＣＲ増幅に供して、増幅されたＰＣＲ産物を得るステップと、
ｅ）リンカーおよびプライマＤＮＡを前記増幅産物から除去するステップと、
ｆ）前記増幅されたＰＣＲ産物を環状化するステップと、
ｇ）ステップｆからの前記産物を、等温ローリングサークル増幅に供して、腫瘍ＤＮＡを選択的に増幅し、腫瘍ＤＮＡからメチル化に敏感な代表的腫瘍ＤＮＡを生成するステップと、
ｈ）前記腫瘍ＤＮＡを標識して、標識された腫瘍ＤＮＡプローブを生成するステップと、
ｉ）前記標識されたＤＮＡプローブをオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズするステップであって、前記オリゴヌクレオチドのアレイが、前記メチル化特異的酵素に対して予測された制限断片に対応する、ステップと、
ｊ）前記腫瘍ＤＮＡのメチル化プロファイルを生成するステップであって、前記プロファイルは、複数の座位のメチル化状態を含む、ステップと、
ｋ）複数の正常な試料および患者試料の前記メチル化プロファイルを比較して、腫瘍ＤＮＡの低メチル化されている座位を同定するステップと、
ｌ）腫瘍ＤＮＡの低メチル化されている座位を検出するように設計されたオリゴヌクレオチドを含む、マイクロアレイを生成するステップと、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の検出および診断のための方法を包含する。
【背景技術】
【０００２】
癌スクリーニングのための既存の方法は、費用がかかり、かつほとんど効果が無く、結果として、ほとんどの癌は、末期および治療の可能性の乏しい段階で検出される。これは、特に卵巣癌に当てはまる。したがって、癌のスクリーニングのための新しい方法の必要性が広く認識されている。多数の近年の刊行物では、癌患者の体液における循環核酸（ＣＮＡ）の存在が文書化されており、癌の検出、追跡、および予後診断を行うためにＣＮＡを使用するための種々の戦略が考慮されている（（Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ  ２００７）にて総説）。最も単純な手法は、癌患者と対照との間のＣＮＡの総量を比較することである。かかる研究では、概して、癌患者が癌を有しない対照よりもより多くのＣＮＡを有することが見出されているが、腫瘍サイズ、病期もしくは腫瘍型と、総ＣＮＡ濃度との間の十分な相関を示すことは不可能であった。単純な定量化は、慢性炎症および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等の多くの他の疾患が、ＣＮＡのレベルの増加に関連するという事実により、さらに複雑である。
【０００３】
ＣＮＡの使用に対するより有望な手法は、癌特異的配列の変化の検出である。Ｋ−ＲＡＳおよび／またはＰ５３における後天性の変異は、膵臓、結腸直腸、肺および卵巣癌患者のＣＮＡで確認されている（Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ  ２００７）。数人の著者は、癌スクリーニングのための方法として、既知の癌変異の検出を使用する可能性を考慮している。１つのこのような研究において、該著者らは、大腸内視鏡検査を受けた患者のＣＮＡにおけるＫ−ＲＡＳ変異のスクリーニングが、誰が結腸の悪性腫瘍を有しているかを予測する上で有用であったことを見出した（Ｋｏｐｒｅｓｋｉ，  Ｂｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００）。他の研究は、矛盾する結果を出しており、着実に癌を検出する変異は１つも無いことを明らかにしている（Ｙａｋｕｂｏｖｓｋａｙａ，  Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５、Ｔｒｏｍｂｉｎｏ，  Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）。
【０００４】
考慮されている別の手段は、マイクロサテライト不安定性の分析であり、これは、特定の既知の変異を標的とすることなく、癌関連の配列変化を見出すための手段を提供する。いくつかの研究は、マイクロサテライトの変化が、乳癌および肺癌の早期にも循環ＤＮＡに存在することを示している（Ｃｈｅｎ，  Ｂｏｎｎｅｆｏｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９、Ｓｏｚｚｉ，  Ｍｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９、Ｓｏｚｚｉ，  Ｃｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。
【０００５】
ＤＮＡ配列におけるエピジェネティックな変化は、ＣＮＡ検体からの癌ＤＮＡの特異的増幅のための第３の手段を提供する。したがって、４０をはるかに上回る刊行物が、種々の癌患者の血液および体液のＣＮＡにおけるメチル化の癌関連の変化を検出する取り組みを報告している（Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ  ２００７）。かかる研究のほぼすべてにおいて、癌において頻繁に高メチル化される、１つもしくは複数のＣｐＧアイランドに関して、メチル化特異的ＰＣＲの使用を通じて真偽が問われており（Ｈｅｒｍａｎ，  Ｇｒａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６）、ほとんどの研究が、ある程度の成功を報告した。どのＣｐＧｓが分析されたかに応じて、所与の型の癌を有する一部の患者において、癌関連の変化を検出することがほぼ常に可能であった。一般に、特定の座位の変化したメチル化が癌患者のＣＮＡに頻繁に存在するが、頑強な試験の基準となる望みがある具体的な座位は無いことを、この研究から結論付けることができる。癌のエピジェネティックの検討において、ＣＮＡにおけるメチル化の大規模な分析が、１つのみもしくはいくつかの座位を検査する課題を解決するであろうことを示唆し、メチル化分析のマイクロアレイに基づく方法が、癌検出に対する大きな有望性を保持すると結論付けている（Ｌａｉｒｄ  ２００５）。ＣＮＡにおける癌関連のメチル化の変化の大規模な検出を達成するために、メチル化に特異的なＤＮＡ増幅のための方法、ならびにメチル化差異の検出のためのマイクロアレイ技術が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Fleischhacker, M. and B. Schmidt (2007). "Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer-A survey." Biochim Biophys Acta 1775(1): 181-232
【非特許文献２】Kopreski, M. S., F. A. Benko, et al. (2000). "Somatic mutation screening: identification of individuals harboring K-ras mutations with the use of plasma DNA." J Natl Cancer Inst 92(11): 918-23
【非特許文献３】Yakubovskaya, M. S., V. Spiegelman, et al. (1995). "High frequency of K-ras mutations in normal appearing lung tissues and sputum of patients with lung cancer." Int J Cancer 63(6): 810-4
【非特許文献４】Chen, X., H. Bonnefoi, et al. (1999). "Detecting tumor-related alterations in plasma or serum DNA of patients diagnosed with breast cancer." Clin Cancer Res 5(9): 2297-303
【非特許文献５】Herman, J. G., J. R. Graff, et al. (1996). "Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands." Proc Natl Acad Sci U S A 93(18): 9821-6
【非特許文献６】Laird, P. W. (2005). "Cancer epigenetics." Hum Mol Genet 14 Spec No 1: R65-76Lisitsyn, N. A., F. S. Leach, et al. (1994). "Detection of genetic loss in tumors by representational difference analysis." Cold Spring Harb Symp Quant Biol 59: 585-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
腫瘍ＤＮＡは、種々の異なる種類の癌（卵巣癌を含む）を有する患者の細胞を含まない血漿から日常的に回収され得るので、これは、悪性腫瘍の存在を評価するのに魅力的な手段を提供する。しかしながら、癌検出のための循環ＤＮＡの使用は、２つの主要な課題によって阻止されている。第１に、循環ＤＮＡ（すなわち「ＣＮＡ」）は常に、相当量の正常な宿主ＤＮＡが混入している。したがって、腫瘍ＤＮＡを特異的に増幅する方法は、概して、癌特異的変異またはメチル化の変化等の、腫瘍と正常なＤＮＡとの間のゲノム差異の予備知識に依存する。この制約は、増幅され得る座位の数を大幅に制限する。第２に、腫瘍は多様性に富むので、１つのみもしくはいくつかの腫瘍特異的ゲノム変化の検出は、癌検出の着実な方法を提供する可能性が低い。本発明は、正常な宿主ＤＮＡと混合する際、低メチル化腫瘍ＤＮＡの一般的だが極めて選択的な差動増幅、およびより多くの数（＞１０５）の座位のメチル化の同時評価を可能にすることによって、これらの２つの課題に対する解決策を提供する。したがって、本発明は、循環ＤＮＡのメチル化の高スループット分析によって、癌スクリーニングに対する新規手法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、癌、特に卵巣癌の診断的評価および予後診断のための方法に関する。本発明は、患者の血清もしくは血漿からの低メチル化ＤＮＡの選択的増幅に対する方法を提供し、該ＤＮＡをメチル化に敏感な酵素で消化するステップと、消化されたＤＮＡをリンカーにライゲーションするステップと、消化されたＤＮＡをリンカー媒介ＰＣＲ増幅に供して、ＰＣＲ産物を得るステップと、該ＰＣＲ産物を精製するステップと、該精製されたＰＣＲ産物を増幅するステップと、を含む。一実施形態において、該精製されたＰＣＲ産物の増幅は、該増幅されたＰＣＲ産物を環状化し、該閉鎖環状分子を等温ローリングサークル増幅に供して、低メチル化ＤＮＡを選択的に増幅して、ＤＮＡ試料からメチル化に敏感な代表的ＤＮＡ試料を生成することによって達成される。
【０００９】
一実施形態において、本発明は、患者の血清もしくは血漿からの低メチル化ＤＮＡの選択的増幅のための方法を提供し、ＤＮＡをメチル化に敏感な酵素で消化するステップと、消化された該ＤＮＡをリンカーにライゲーションするするステップと、消化された該ＤＮＡをリンカー媒介ＰＣＲ増幅に供して、ＰＣＲ産物を得るステップと、リンカーおよびプライマＤＮＡを該増幅産物から除去するステップと、増幅されたＰＣＲ産物を環状化するステップと、該ＤＮＡを、該リンカーが加えられた部位で該ＤＮＡを消化する第２の制限酵素によって消化するステップと、消化された該ＤＮＡからリンカーを除去するステップと、消化された該ＤＮＡを自己ライゲーションさせて、閉鎖環状分子を形成するステップと、該環状化分子をエクソヌクレアーゼ消化に供して、いかなる非環状化ＤＮＡをも単一ヌクレオチドに低減するステップと、該閉鎖環状分子を等温ローリングサークル増幅に供して、低メチル化ＤＮＡを選択的に増幅して、ＤＮＡ試料からメチル化に敏感な代表的ＤＮＡ試料を精製するステップと、を含む。
【００１０】
次いで、上の方法によって調製されたＤＮＡは、特注のオリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイズさせることができる。一実施形態において、該アレイ上の該オリゴヌクレオチドは、メチル化に敏感な酵素を使用した第１の消化ステップ中に理論上形成される可能性があるＤＮＡ制限断片もしくはその一部のうちの１つに対応する。各アレイアドレスの信号の強度は、該アドレスに対応する、プローブ（標識されたＤＮＡ）の量に依存する。したがって、信号強度が高いアレイアドレスは、メチル化の度合いが比較的より低い。正常な対照からのマイクロアレイデータと、癌を有するものとの比較により、癌の典型的なメチル化プロファイルが導出される。癌の状態が不明な対象から得られた試料からのメチル化／マイクロアレイ結果を、正常なデータ本体と比較する。正常なデータからの偏差は、癌を示す。
【００１１】
本発明の具体的な実施形態において、対象試料に由来する腫瘍ＤＮＡの選択的増幅のための方法を提供する。本発明の方法は、（ｉ）対象試料から単離されたＤＮＡを、メチル化特異的酵素で消化するステップと、（ｉｉ）リンカーを、消化された該ＤＮＡの末端にライゲーションするステップと、（ｉｉｉ）消化された該ＤＮＡをリンカー媒介ＰＣＲ増幅に供するステップと、（ｉｖ）該ＰＣＲ産物を精製するステップと、（ｖ）精製された該ＰＣＲ産物を、リンカー内に部分的もしくは完全に含有される制限部位を認識する制限酵素で消化するステップと、（ｖｉ）精製された該ＰＣＲ産物を環状化するステップと、（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）からの該産物を等温ローリングサークル増幅に供して、腫瘍ＤＮＡを選択的に増幅して、腫瘍ＤＮＡからメチル化に敏感な表示を生成するステップと、を含む。さらなる実施形態において、該リンカー媒介ＰＣＲに使用される該ＰＣＲプライマは、該ＰＣＲ産物の後の精製に有用な部分に接合される。一実施形態において、該ＰＣＲプライマは、ビオチンに接合される。さらなる実施形態において、該ＰＣＲ産物は、該部分を支持体に結合させることによって精製される。一実施形態において、該リンカー媒介ＰＣＲプライマはビオチン化され、結果として得られたＰＣＲ産物は、支持体（例えば、アガロース、またはセファロース、または電磁ビーズ）に連結するビオチン結合タンパク質（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）を使用して、精製される。一実施形態において、該ＰＣＲ産物は、該リンカーを該メチル化に敏感な酵素で消化したＤＮＡにライゲーションすることによって形成された制限部位を認識する制限酵素で切断することによって、該支持体から解放される。一実施形態において、該リンカーはＭｌｕＩで切断される。
【００１２】
本発明の別の具体的な実施形態において、患者試料に由来する腫瘍ＤＮＡの選択的増幅のための方法を提供する。本発明の方法は、（ｉ）患者試料から単離されたＤＮＡを、メチル化特異的酵素で消化するステップと、（ｉｉ）リンカーを、消化されたＤＮＡの末端にライゲーションするステップと、（ｉｉｉ）消化された該ＤＮＡをリンカー媒介ＰＣＲ増幅に供して、増幅されたＰＣＲ産物を得るステップと、（ｉｖ）該増幅された該ＰＣＲ産物を、リンカーが加えられた部位で該ＤＮＡを切断する制限酵素で消化するステップと、（ｖ）切断された該リンカーを、該ＰＣＲ産物から除去するステップと、（ｖｉ）該ＰＣＲ産物を環状化するステップと、（ｖｉｉ）該環状化ＰＣＲ産物をエクソヌクレアーゼ消化に供して、残存する線状ＤＮＡ分子を消化するステップと、（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）からの該産物を等温ローリングサークル増幅に供して、腫瘍ＤＮＡを選択的に増幅して、腫瘍ＤＮＡからメチル化に敏感な代表的腫瘍ＤＮＡを生成するステップと、を含む。
【００１３】
本発明は、腫瘍特異的低メチル化ＤＮＡ領域を同定するための方法をさらに提供し、（ｉ）上述の方法を使用して、腫瘍ＤＮＡおよび正常なＤＮＡからメチル化に敏感な代表的なＤＮＡを個別に調製するステップと、（ｉｉ）該腫瘍ＤＮＡおよび該対照ＤＮＡを標識して、標識された腫瘍ＤＮＡプローブおよび標識された正常なＤＮＡプローブを生成するステップと、（ｉｉｉ）標識された該ＤＮＡプローブをオリゴヌクレオチドのアレイにハイブリダイズするステップであって、該オリゴヌクレオチドのアレイが、所与のメチル化に敏感な酵素に対して、予測された制限断片もしくはその一部に対応する、ステップと、（ｉｖ）正常なプローブおよび腫瘍由来のプローブの相対強度を互いに比較して、腫瘍ＤＮＡプローブの差分量を検出するオリゴヌクレオチドを同定するステップと、（ｖ）ステップ（ｉｖ）からのハイブリダイズされた該オリゴヌクレオチドを、腫瘍特異的低メチル化領域に対応するものとして同定するステップと、を含む。一実施形態において、２つの代表的ＤＮＡプローブは、異なる標識（例えば、異なる蛍光色素）で標識され、同一のアレイにハイブリダイズされる。別の実施形態において、標識された該プローブは、個別のマイクロアレイにハイブリダイズされる。
【００１４】
本発明は、患者の癌を検出するための方法をさらに提供する。該方法は、上に説明する方法を使用して、患者由来の試料からメチル化に敏感な代表的ＤＮＡ試料を調製し、その後、該ＤＮＡを標識して、標識された腫瘍ＤＮＡプローブを生成するステップを含む。標識された該ＤＮＡプローブは、オリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズされ、該オリゴヌクレオチドのアレイは、メチル化特異的酵素に対して、予測された制限断片もしくはその一部に対応する。かかるハイブリダイゼーションは、該腫瘍ＤＮＡのメチル化プロファイルの生成につながり、該プロファイルは、複数の座位のメチル化状態を含む。次いで、患者試料のメチル化プロファイルを、同一の技術によって生成された正常な対照からのメチル化プロファイルと比較して、患者試料からのメチル化プロファイルが腫瘍の存在を示しているかどうかを判定する。本発明の実施形態において、該腫瘍ＤＮＡプローブおよび該正常なＤＮＡプローブは、２つの異なる標識で標識され、標識されたプローブのハイブリダイゼーションは、１つのアレイに対して行われる。
【００１５】
本発明の実施形態において、本発明の方法に使用される患者のＤＮＡ試料は、血漿もしくは血清に由来する。本発明のさらに別の実施形態において、該メチル化特異的酵素は、ＨｐｙＣｈ４−ＩＶ、またはＣｌａＩ、またはＡｃｌＩ、またはＢｓｔＢＩである。一実施形態において、該メチル化特異的酵素は、ＨｐｙＣｈ４−ＩＶである。本発明の別の実施形態において、該リンカー媒介ＰＣＲ増幅は、約５から約１５サイクル実施される。本発明の別の実施形態において、該リンカー媒介ＰＣＲ増幅は、約１０サイクル実施される。本発明の実施形態において、Ｂａｌ−３１によるエクソヌクレアーゼ消化は、環状化ステップの後に実施される。
【００１６】
本発明の一実施形態は、本発明の方法を実施するのに必要な試薬を含有するキットを、説明書とともに、提供する。一実施形態において、該キットは、腫瘍ＤＮＡにおいて低メチル化領域を検出および同定するための試薬および説明書を含む。別の実施形態において、該キットは、本発明の方法によって、腫瘍の存在について患者をスクリーニングするための試薬および説明書を提供する。一実施形態において、該キットは、該メチル化に敏感な酵素と、該リンカーＤＮＡと、該リンカー媒介ＰＣＲのためのＰＣＲプライマと、該リンカーを該ＰＣＲ産物から除去するための該制限酵素と、腫瘍関連の低メチル化領域の検出のための該マイクロアレイと、該プロセスを実施するための説明書と、を含む。
【００１７】
一実施形態は、低メチル化領域の検出のためのマイクロアレイを提供し、該マイクロアレイは、（ａ）ゲノムを、問題のメチル化に敏感な制限酵素に対して２つの部位によって結合されるセグメントに分け（ＨｐｙＣｈ４−ＩＶではＡＣＧＴ）、５００塩基対長未満とすることと、（ｂ）マイクロアレイ上の代表的オリゴヌクレオチドに好適な配列を見出すことを目的として、これらの断片の配列を分析するためのアルゴリズムを利用すること、によって選択されたオリゴヌクレオチドを含む。例えば、適切なオリゴヌクレオチドは、以下の特性のうちの１つもしくは複数の特性を有する：（ｉ）約４０ヌクレオチド超の固有の配列、もしくは約６０ヌクレオチド超の固有の配列、（ｉｉ）約４０％から約６０％のＧＣ、および（ｉｉｉ）著しい反復もしくは単純配列（例えば、一続きの約１５の単一塩基）を含有すべきではない。一実施形態において、該マイクロアレイは、腫瘍に関連する低メチル化ＤＮＡの検出に有用なこれらのオリゴヌクレオチドのサブセットを含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドのこのサブセットは、（ｉ）上述の方法を使用して、腫瘍および正常なＤＮＡからメチル化に敏感な代表的ＤＮＡを個別に調製するステップと、（ｉｉ）該腫瘍ＤＮＡおよび該対照ＤＮＡを標識して、標識された腫瘍ＤＮＡプローブおよび標識された正常なＤＮＡプローブを生成するステップと、（ｉｉｉ）標識されたＤＮＡプローブをオリゴヌクレオチドのアレイにハイブリダイズするステップであって、該オリゴヌクレオチドのアレイが、所与のメチル化に敏感な酵素に対して、予測された制限断片もしくはその一部に対応する、ステップと、（ｉｖ）該正常なプローブおよび腫瘍由来のプローブの相対強度を互いに比較して、腫瘍ＤＮＡプローブの差分量を検出するオリゴヌクレオチドを同定するステップと、（ｖ）ステップ（ｉｖ）からのハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを、腫瘍特異的低メチル化領域に対応するものとして同定するステップと、（ｖｉ）複数の患者からの同定された腫瘍特異的低メチル化領域を比較して、患者の腫瘍を検出する上で有用なオリゴヌクレオチドのサブセットを判定するステップと、によって同定される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】卵巣癌を有する患者からの血漿ＤＮＡと、正常な対照とのメチル化マイクロアレイ比較。１１２のセグメントを含有する染色体２１の約１２０ｋｂの領域を示す。正の強度比は、癌試料からのより相対的な信号を示し、負の比は、正常な試料からの相対的な信号の増加を示す。高コントラスト信号の非常に境界が明瞭なクラスタは顕著であり、内在する２つの試料間の差異をほぼ確実に反映する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、癌の検出のために、患者に由来する低メチル化腫瘍ＤＮＡ配列を選択的に増幅する方法を提供する。本方法は、特異的メチル化を利用して、高比率の正常な宿主ＤＮＡを含有するＤＮＡ混合物からの腫瘍特異的配列の選択的増幅を可能にする。本発明はまた、メチル化の評価のために、増幅された腫瘍ＤＮＡ配列を使用する方法も提供する。
【００２０】
［腫瘍および非腫瘍ＤＮＡのメチル化における差異］
前述のように、本発明は、腫瘍と対照ＤＮＡとの間のメチル化の差異に依存する。対照ＤＮＡは、正常な（癌を含まない）個人からのものであることを理解する。ＤＮＡメチル化は、遺伝子発現を変化させることによって細胞機能に影響を及ぼす後成的事象であり、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）によって触媒される、ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンの５位炭素への、メチル基の共有結合的付加を指す。
【００２１】
本発明の方法は、腫瘍ＤＮＡと非腫瘍ＤＮＡとの間のメチル化差異を利用して、患者に由来するＤＮＡ試料からの低メチル化腫瘍ＤＮＡの選択的増幅を提供する。先に記載したとおり、概して、該方法は、ＤＮＡを患者から単離するステップと、単離された該ＤＮＡをリンカー媒介ＰＣＲに供するステップと、増幅された該ＰＣＲ産物の環状化ステップと、エクソヌクレアーゼ消化ステップと、最後の等温ローリングサークル増幅ステップと、を含む。本方法は、腫瘍ＤＮＡと非腫瘍患者ＤＮＡとの間のメチル化差異に基づき、該腫瘍ＤＮＡのメチル化に敏感な代表的腫瘍ＤＮＡ、すなわち、腫瘍ＤＮＡの増幅された再現を生成する。
【００２２】
本明細書に説明する方法は、患者からの細胞または細胞物質に由来するＤＮＡ試料に適用することができる。所望の細胞または物質の回収または単離のための当該技術分野で既知のいかなる方法も使用することができる。一実施形態において、循環核酸（ＣＮＡ）は、患者の血清または血漿に由来する。
【００２３】
［リンカー媒介ＰＣＲ］
概して、リンカー媒介ＰＣＲは、ＤＮＡを制限酵素で消化し、二本鎖リンカーを消化された末端にライゲーションすることから開始する。次いで、ＰＣＲを該リンカーに対応するプライマを用いて実施し、最大約１．５ｋｂの断片が増幅される（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９８９、Ｌｉｓｉｔｓｙｎ，  Ｌｅａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４を参照されたい）。本技術を使用して、単一細胞からのＤＮＡを増幅し、その後、増幅された産物を使用することによって、異数性を検出して、比較ハイブリダイゼーションを実施することは可能である（Ｋｌｅｉｎ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｋｉｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）。別の研究では、増幅された代表的ＤＮＡを使用して、単一ゲノムコピー数の変動を、それらをＢＡＣマイクロアレイへのハイブリダイゼーションプローブとして使用することによって、検出した（Ｇｕｉｌｌａｕｄ−Ｂａｔａｉｌｌｅ，  Ｖａｌｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４）。
【００２４】
本方法において、制限酵素の消化の頻度が、結果として得られる増幅された産物の複雑性を決定する。切断頻度の低い酵素を選択することによって、増幅された代表的産物の複雑性は、開始ゲノムＤＮＡの画分まで低減することができ、後のハイブリダイゼーションステップの実施をはるかに容易にする。本技術は、２つの複雑なゲノム源間の比較ハイブリダイゼーションの実施を望む状況において、特に有用である。顕著な例は、ヒトにおける高度のゲノムコピー数変動を明らかにする上で役立つ「ＲＯＭＡ」（リプレゼンテーショナルオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析）と呼ばれる技術である。（Ｌｕｃｉｔｏ，  Ｈｅａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３、Ｓｅｂａｔ，  Ｌａｋｓｈｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４、Ｊｏｂａｎｐｕｔｒａ，  Ｓｅｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）  Ｌｕｃｉｔｏ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １３：２２９１−３０５  （２００３）、Ｓｅｂａｔ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：５２５−８  （２００４）、Ｊｏｂａｎｐｕｔｒａ，  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｄ  ７：１１１−８  （２００５）。
【００２５】
したがって、本発明のリンカー媒介ＰＣＲステップにおいて、ＤＮＡの試料を得、ＣｐＧメチル化に敏感な酵素で消化して、消化された末端を有する消化されたＤＮＡを形成する。一実施形態において、該ＤＮＡ試料は混合され、宿主および腫瘍ＤＮＡを含む。
リンカーライゲーションの前に、ＣｐＧメチル化に敏感な制限酵素を使用して、ＤＮＡを切断することによって、非メチル化部位によって結合される断片の増幅が有利となる。１つが他方よりもより低度にメチル化されている、２つの異なる源からのＤＮＡの混合物が存在する状況では、メチル化に敏感な酵素の消化、その後のリンカーライゲーションおよび増幅により、特異的にメチル化された部位によって画定される断片の選択的増幅を可能にする。この考えは、正常な組織と癌組織との間のメチル化差異を精査するために、「代表相違点分析」と併用されている。（Ｕｓｈｉｊｉｍａ，  Ｍｏｒｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７、Ｋａｎｅｄａ，  Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３を参照されたい）。メチル化に敏感な酵素は当該技術分野で既知であり、ＨｐｙＣｈ４−ＩＶ、ＣｌａＩ、ＡｃｌＩ、およびＢｓｔＢＩが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
混合試料から得られたＤＮＡを、前述のようにメチル化特異的酵素で消化した後、次いで、該ＤＮＡを、リンカーにライゲーションする。一実施形態において、該リンカーは、組み込まれた制限部位または制限部位の一部を有し、これは、後に、精製されたＰＣＲ産物の増幅に必要な適合する付着末端を提供するように使用され、例えば、付着末端は、ローリングサークル増幅のための環状化ステップにおいて使用され得る。消化後に付着末端を生成する制限酵素部位が好ましい。例えば、ＭｌｕＩが付着末端を提供する。
【００２７】
該リンカーをライゲーションした後、結果として得られたＤＮＡを、リンカー内の部位に結合するプライマを使用して増幅する。次いで、ＰＣＲ増幅を行う。サイクルの数は変更してもよい。一実施形態において、サイクルの数は、サイズに基づいて選択された代表的な消化された断片をもたらす。本発明の一実施形態において、約５から約１５サイクルの増幅が行われる。一実施形態において、約８から約１４サイクルの増幅が行われる。一実施形態において、約１０サイクルの増幅が行われる。一実施形態において、１つもしくは複数のＰＣＲプライマが、後の精製ステップにおいて有用な部分と接合される。一実施形態において、該部分はビオチンである。
【００２８】
［リンカー媒介ＰＣＲ産物の精製］
リンカー媒介ＰＣＲのために使用されるプライマは、ＰＣＲ産物の精製に有用な部分を組み込み得る。一実施形態において、該ＰＣＲプライマはビオチン化され、該ＰＣＲ産物は、支持体に連結したビオチン結合タンパク質を使用して単離される。ビオチン結合タンパク質としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、およびニュートラアビジンが挙げられる。一実施形態において、該ビオチン結合タンパク質は、ストレプトアビジンである。一実施形態において、該支持体は、アガロース、またはセパロース、または電磁ビーズである。一実施形態において、リンカー媒介ＰＣＲのための該ＰＣＲプライマは、ビオチン化され、結果として得られたＰＣＲ産物は、電磁ビーズに連結したストレプトアビジンを使用して精製される。次いで、該支持体に結合されていない他の成分を、洗浄することができる。次いで、増幅されたＰＣＲ産物は、該リンカー内に部分的または完全に含有される制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを使用して、該支持体から解放される。一実施形態において、該制限酵素はＭｌｕＩである。
【００２９】
ＤＮＡがＨｐｙＣｈ４−ＩＶで切断され、後に５位末端に配列ＣＧＣＧＴを含むリンカーにライゲーションされる際、ＭｌｕＩに対する制限部位が形成されるように、ＭｌｕＩに対する認識配列（ＡＣＧＣＧＴ）は、メチル化に敏感な制限酵素であるＨｐｙＣｈ４−ＩＶに対する認識配列（ＡＣＧＴ）と重複する。リンカー媒介ＰＣＲおよびＰＣＲ産物の、ビオチン等の部分を介した支持体への結合の後、ＭｌｕＩを使用してＰＣＲ産物を該リンカーおよび支持体から解放する際、非特異的増幅産物は、ＭｌｕＩ認識配列全部を含有しているわけではないので、概ね該リンカーおよび支持体に結合されたままである。したがって、該特異的リンカー媒介ＰＣＲ産物は、該支持体に結合されたままである該非特異的増幅産物から精製することができる。
【００３０】
別の本発明の実施形態において、増幅サイクルを行った後、次いで、増幅された産物を、リンカーを切断する酵素で消化する。例えば、該リンカーがＭｌｕＩ部位を導入する場合、該産物はＭｌｕＩ酵素消化に供される。該リンカーを切断するための消化の後、低分子量ＤＮＡ（リンカーおよびプライマＤＮＡ）を除去する。アガロースゲル精製またはカラム精製等の、低分子量ＤＮＡを除去するためのいかなる好適な方法も使用することができる。重ねて、前述の適切なリンカー配列をともなう、ＨｐｙＣｈ４−ＩＶおよびＭｌｕＩの併用によって、非特異的増幅産物がリンカーから解放されず、したがって、後の増幅ステップに利用可能とはならないことが確実となる。
【００３１】
［精製されたＰＣＲ産物の増幅］
リンカー媒介ＰＣＲ産物をリンカーから切断および精製すると、次いで、精製された該ＤＮＡを希釈する。次いで、このＤＮＡをＴ４  ＤＮＡリガーゼで終夜処理して、初期の酵素消化によって形成された付着末端をライゲーションさせることによって環状化させる。非常に希薄な溶液（例えば、１Ｘ  ライゲーション緩衝液中０．５ｍｌ）中で消化およびライゲーションすることによって、適合する付着末端を有する分子の分子内の自己ライゲーション（環状化）が極めて有利となる。（ＰＣＲ増幅中に）複数回融解され、部分的に再アニールされている元の開始ＤＮＡは、非常に非効率的に消化および環状化される。さらに、適切な末端を欠く、非特異的に増幅された産物はまた、共有結合的閉環を形成する可能性が極めて低い。
【００３２】
次いで、該ライゲーションが、等温ローリングサークル増幅の鋳型として使用される。等温ローリングサークル増幅は当該技術分野で既知であり、概して、エクソヌクレアーゼ耐性ランダムプライマおよび優れた処理能力を有するＤＮＡポリメラーゼを使用した環状ＤＮＡの１サイクル増幅である。いかなる等温ローリングサークル増幅手順を使用してもよい。一般的に知られるキットは、Ａｍｅｒｓｈａｍより入手可能であり、製造業者の推奨に従って使用する。該ローリングサークル増幅は、複数のコピーの環状鋳型からなる連結構造の形成をもたらす。
【００３３】
一実施形態において、精製された該ＰＣＲ産物を該リンカーから解放した後、該産物は、追加のライゲーション媒介のＰＣＲステップを使用してさらに増幅される。
【００３４】
［エクソヌクレアーゼ消化］
該環状化ＤＮＡが沈殿し（当該技術分野で一般的に既知の方法を使用して）、水等の好適な緩衝液に再懸濁した後、該ライゲーション混合物を処理して、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの末端を攻撃するエクソヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼＢａｌ−３１）で広範に消化することによって、非特異的ＰＣＲ産物を除去することができる。ライゲーションによって形成された環状分子は、消化に耐性があるが、広範な消化によって、いかなる線状分子も単一のヌクレオチドに減少させる。したがって、この消化を使用して、開始ゲノムＤＮＡ、ならびに非特異的に増幅された産物を排除する。代替として、Ｂａｌ−３１等の単一エクソヌクレアーゼの代わりに、エクソヌクレアーゼの混合物を使用することが可能である。例えば、ある酵素は一本鎖ＤＮＡを攻撃し（マング・ビーンエクソヌクレアーゼ）、別の酵素は二本鎖ＤＮＡを攻撃し（ラムダエクソヌクレアーゼ）、どちらの酵素も、エンドヌクレアーゼ活性を有さず、どちらもニックにおいて二本鎖ＤＮＡを切断しない。広範な消化という用語は、制限しないように十分な量の酵素を使用し、制限しないように消化のための時間が十分に長いことを意味する。例えば、一実施形態において、２単位のＢａｌ−３１ヌクレアーゼを消化混合物において使用し、４５分間継続させる。この単位は、線状ＤＮＡの４００の塩基を、４０ｎｇ／μｌの溶液中で１０分間で消化するのに必要とされる酵素の量として機能的に定義される。
【００３５】
［アレイ設計］
本発明は、ゲノムの腫瘍特異的低メチル化領域の同定のための、オリゴヌクレオチドマイクロアレイの使用をさらに提供する。具体的な実施形態において、該方法は、（ｉ）上に説明する方法を使用して、患者および正常な対照からの細胞を含まない血漿ＤＮＡからメチル化に敏感な代表的ＤＮＡを個別に調製するステップと、（ｉｉ）該腫瘍ＤＮＡおよび該対照ＤＮＡを標識して、標識された腫瘍ＤＮＡプローブおよび標識された正常なＤＮＡプローブを生成するステップと、（ｉｉｉ）標識された該ＤＮＡプローブを、オリゴヌクレオチドのアレイにハイブリダイズステップであって、該オリゴヌクレオチドのアレイが、所与のメチル化に敏感な酵素に対して、予測された制限断片もしくはその一部に対応する、ステップと、（ｉｖ）正常なプローブおよび腫瘍由来のプローブの相対強度を互いに比較して、腫瘍ＤＮＡプローブの差分量を検出するオリゴヌクレオチドを同定するステップと、（ｖ）ステップ（ｉｖ）からのハイブリダイズされた該オリゴヌクレオチドを、腫瘍特異的低メチル化領域に対応するものとして同定するするステップと、を含む。
【００３６】
本発明は、マイクロアレイの使用を介して、患者の癌を検出するための方法をさらに提供する。該方法は、上述の方法を使用して、患者の試料および正常な対照の試料に由来するＤＮＡの選択的増幅、その後、増幅されたＤＮＡを標識して、標識されたＤＮＡプローブを生成するステップを含み、患者由来のプローブおよび正常な対照由来のプローブが、異なる標識（例えば、異なる蛍光色素）を有する。標識されたＤＮＡプローブは、オリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズされ、該オリゴヌクレオチドのアレイは、メチル化特異的酵素に対する、予測された制限断片に対応する。該アレイデータを分析して、ハイブリダイズされたプローブからの相対信号強度を解明し、正常な対照に対して、どのセグメントが、癌患者から優先的に増幅されるかを判定する。かかる分析は、該腫瘍ＤＮＡのメチル化プロファイルの生成につながり、該プロファイルは、複数の座位のメチル化状態を含む。次いで、該患者試料のメチル化プロファイルを、同一の技術によって生成された正常な対照からのメチル化プロファイルと比較して、該患者試料からのメチル化プロファイルが、腫瘍の存在を示すかどうかを判定する。一実施形態において、該患者プローブおよび該対照プローブは、２つの個別のアレイにハイブリダイズされる。
【００３７】
本発明の実施において使用されるアレイは、当業者に公知の方法を使用して生成され得る。本発明の一実施形態において、該アレイは、選択的増幅ステップで利用されるメチル化に敏感な酵素による、ゲノムＤＮＡの酵素消化を介して生成される核酸断片を含有する。別の実施形態において、該アレイ上の該オリゴヌクレオチドは、メチル化に敏感な制限酵素によって生成される可能性がある核酸断片のすべてもしくはサブセット、またはその一部（すなわち、ＤＮＡが完全に非メチル化された場合に生成される可能性がある断片）に対応する。一実施形態において、該マイクロアレイ上の該オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で既知のいかなる様態でも製造され得、例えば、原位置で合成（マイクロアレイスライド上で）、またはマイクロアレイスライド上に配置される。
【００３８】
初期の研究は、メチル化の差異が、ゲノムの遺伝子に富む部分で顕著により見られることを示している。したがって、メチル化の差異が見出される可能性を最大限にするために、遺伝子含有量が高いゲノムの領域を標的とするアレイ設計を本発明の実施に使用することができる。
【００３９】
例えば、本発明の非限定的な実施形態において、各染色体は、１つのテロメアから開始し、もう一つのテロメアへ延在する、１０６ｂｐの瓶に分割され得る。次いで、これらの約３０００配列瓶の各々における既知の遺伝子もしくは予測された遺伝子のエクソンによって占有される全配列の割合（％）を、ＵＣＳＣブラウザからの情報を使用して測定し、すべての瓶を、この統計にしたがってランク付けする。次いで、最高のエクソン含有量を有するそれらの瓶を、アレイへの包含のために選択する。１０６ｂｐの遺伝子に富むセグメントは各々、アレイへの包含のためのサイズ基準を満たす約２０００のＨｐｙＣｈ４−ＩＶ断片を含有し、また約１２０，０００のかかる断片は、標準的な３８５０００アレイに包含することができるため、該アレイは、約６０のかかる配列瓶、または約２％のゲノムＤＮＡに対応する約６０×１０６の塩基を包含する。
【００４０】
着実なハイブリダイゼーションデータを提供するために、各ゲノムＨｐｙＣｈ４−ＩＶ断片を、これらの断片とハイブリダイズする異なるオリゴヌクレオチドによって、アレイ上に代表することができる。可能な場合、通常、各ゲノム断片に対して、約３つの異なるオリゴヌクレオチドをアレイ上に含めることが有益である。ゲノムマイクロアレイに包含するための一連の基準を満たす、すべての可能な「ロングマー」オリゴヌクレオチドに関して、完全なヒトゲノム配列をスクリーンするために、商業的に利用可能なサービスが利用可能である。好適なセグメントは独特であり、一続きの単純配列を含まず、適切な予測された融解温度を有する。商業的に利用可能なサービスは、上に定義される２００，０００の断片の同程度のもので提供され得、該断片のうちのどれが、それらの先に確立された好適なオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも３つを含有するかを判定する。現在のアレイは、３８５０００個のオリゴヌクレオチドの空間を有し（例えば、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎアレイ）、各ＨｙｐＣｈ４−ＩＶ断片は、３つのオリゴヌクレオチドによって表されるため、１つのアレイは、約１２５０００個の断片を包含するのに十分である。バックグラウンドハイブリダイゼーションを判定する目的上、一連の４０００のランダム配列オリゴヌクレオチドが各アレイに含まれる。
【００４１】
［アレイハイブリダイゼーション］
アレイハイブリダイゼーションは、商業的サービスによって、それらの標準プロトコルに従って、行われ得る。本発明の一実施形態において、ハイブリダイゼーションは、１つの蛍光色素で標識された「試験」ＤＮＡ、および第２の蛍光色素で標識された「対照」ＤＮＡを用いて、２つの色「比較」として実施される。全く同一の実験条件を「試験」および「対照」試料の両方に適用するので、本手法は、人為的結果および均一性の課題を最小限にする。前述のように、各ハイブリダイゼーションのための対照は、異なる正常な患者である。該データは、比較ハイブリダイゼーションによって生成されるので、データ分析は、本態様の実験設計に制限されないことを理解されたい。各アレイアドレスに関する正規化された強度は、すべてのハイブリダイゼーションにわたり比較することができ、例えば、いかなる正常な個体においても、閾値信号を上回る可能性が低い一組のアレイアドレスを確立することを可能にする。
【００４２】
該マイクロアレイ検出は、当該技術分野において既知のいかなる方法によっても実施することができる。ＤＮＡ試料（すなわち、メチル化に敏感な代表的ＤＮＡ試料）は、蛍光標識、発光標識、金粒子標識、および電気化学標識を含むが、これらに限定されない、マイクロアレイ上での検出に有用な標識で標識することができる。
【００４３】
［データ分析］
マイクロアレイへの比較ハイブリダイゼーションは、遺伝子発現をプロファイルするため、ならびにゲノムコピー数の変動を確認するために広範に使用されており、この種のマイクロアレイデータに関するデータ分析の方法が十分に存在する。本発明において、該データを使用して、癌に特異的な特異的メチル化のゲノム分布を評価し、マイクロアレイデータセット間の相対信号強度における全体的な差異を評価をすることができる。
【００４４】
ゲノムコピー数の変化を評価するための既存の生物情報学の方法は、例えば、データ分析のために使用することができ、「閾値化」（Ｖｉｓｓｅｒｓ，  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）、隠れマルコフモデル（Ｓｅｂａｔ，  Ｌａｋｓｈｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４）、ゲノム位置を使用した階層的クラスタリング（Ｗａｎｇ，  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）、および最近では、最大事後すなわち「ＭＡＰ」として知られる技術（Ｄａｒｕｗａｌａ，  Ｒｕｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４）が含まれる。これらの方法は、メチル化差異ではなく、コピー数変動の検出のために開発されているが、全般の課題は類似しており、該方法は、我々のアレイが生成するデータの型に容易に適合可能である。
【００４５】
一旦個々のデータセットが、差分信号の信頼性のあるクラスタの存在について分析されると、癌を正常なものと区別することを目的としたデータセット間の比較を実施することができる。いくつかの公開された研究では、具体的に、マイクロアレイ／メチル化データに関連したこの型の比較を扱っている。例えば、ガラススライドに固定された８０００のＣｐＧ島座位からなる、小規模なマイクロアレイアッセイを含む研究において、階層的クラスタリングは、２つの異なる群の卵巣腫瘍を同定することができ、これは、臨床パラメータに相関した（Ｗｅｉ，  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。その後の刊行物（Ｗｅｉ，  Ｂａｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）において、報告された同一の群により、マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）（Ｔｕｓｈｅｒ，  Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）、およびマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，  Ｈａｓｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）、ならびに腫瘍メチル化におけるマイクロアレイデータを解釈するための他の生物情報の技術を使用して、この分析を拡張させた。一般に、当業者に公知の、異なるマイクロアレイデータセット間の類似性を評価するための種々の方法が存在する。
【００４６】
本明細書に言及されるすべての参考文献は、それらの全体として組み込む。
【実施例】
【００４７】
［実施例１．腫瘍関連の低メチル化領域の同定］
卵巣腫瘍を有する患者からのＣＮＡのメチル化プロファイルが、正常な対照からのものと異なるかどうかを試験するために、凍結された血清試料を、疑われる卵巣癌に対する試験開腹の前に、血液を採取した女性から得た。同様の試料を、癌を有しない女性から得た。ＤＮＡを、標準的な方法によって、１ｍｌの細胞を含まない血清から調製し、結果として得られた試料全部を、前述のようにメチル化に敏感な増幅に供した。１つのこのような試料対を、先にトロホブラストメチル化の分析に使用されたアレイへのハイブリダイゼーションのために、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎに提出した。
【００４８】
該データは、両方の増幅（癌および正常）が、約５％のアレイアドレスから測定可能な信号（バックグラウンドよりも＞３ｓｄ上回ると定義）をもたらしたことを示した。加えて、これらの事例の約７０％において、信号のｌｏｇ２比は、１．５未満であり、そのセグメントが両方の癌ならびに正常なものから増幅したとしても、差動増幅はほとんどない、もしくは全くないことを示す。このデータは、マイクロアレイから信号を得るために、血清ＤＮＡを増幅すること、および増幅された代表的血清ＤＮＡを使用することの両方において、成功を示す。非特異的増幅は、散在した、もしくはランダムに配置されたハイブリダイゼーション信号をもたらすことが予測されるが、これは観察されないことに留意されたい。さらに、差動増幅の領域は、明瞭にクラスタに生じる。図１は、癌検体からの高コントラスト信号のクラスタを含有する染色体２１上の小領域からのデータを示す。少なくとも４０の隣接するセグメントが、差動的に増幅され、ｌｏｇ２比は５と高く、３２倍の差動増幅を示すことに留意されたい。これは、実験の人為的結果によるものである可能性は極めて低く、したがって、元の試料間の真のメチル化差異の検出を表す可能性が最も高い。これは、ｌｏｇ２比が信号強度＞２である、約５０のクラスタ（＞３つの隣接するセグメント）のうちの１つである。
【００４９】
以下の実施例に説明される実験は、可能な本発明の実施形態を表すことを意図する。材料および量は、本発明の範囲を制限しないことを理解されたい。
【００５０】
［実施例２．比較パネルの開発］
本発明の方法を使用した検出および診断を容易にするために、正常な個体数および特定の癌患者の個体数を比較して、特定の型の癌に関連するメチル化プロファイルを開発することができる。本発明の方法を使用して、かかるメチル化プロファイルを作成することができる。
【００５１】
ＤＮＡを、標準的な方法を使用して、既知の癌患者および正常な対照の血清もしくは血漿から単離する（Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｋ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ５０：５１６−２１（２００４））。簡潔に述べると、１０ｍｌの患者の血液を、２回遠心分離して、細胞を除去する。結果として得られた血漿を、ＤＮＡ結合膜に通過させる。該ＤＮＡを該膜から除去し、結果として得られたＤＮＡをＨｐｙＣｈ４−ＩＶで消化する。
【００５２】
ＤＮＡリンカーを、消化された該ＤＮＡにアニールおよびライゲーションする。該リンカーは、ＨｐｙＣｈ４−ＩＶで消化されたＤＮＡにライゲーションする際、ＭｌｕＩ制限部位を形成するように設計される。該リンカー媒介ＰＣＲを、ビオチン化プライマを利用して、１０サイクルのＰＣＲで、Ｇｕｉｌｌａｕｄ−Ｂａｔａｉｌｌｅ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２ｅ１１２  （２００４）に説明されるとおりに実施する。
【００５３】
該ＰＣＲの後、ストレプトアビジンで被覆した電磁ビーズを利用して、該産物を精製する。該ＰＣＲ産物をビーズに結合し、洗浄した後、これらをＭｌｕＩで消化して、リンカー配列（およびビーズ）を増幅されたＤＮＡから除去する。分子内ライゲーションを促進するように該ＤＮＡを希釈し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで処理することによって、増幅された該ＤＮＡを環状化する。
【００５４】
次いで、ライゲーション産物を、商業的なキット（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、製造業者の説明書に従い、等温ローリングサークル増幅のための鋳型として使用する。
【００５５】
次いで、上の方法によって調製されたＤＮＡを標識し、特注のオリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイズさせることができる。アレイ上の各オリゴヌクレオチドは、メチル化に敏感な酵素を使用した第１の消化ステップ中に理論上形成される可能性があるＤＮＡ制限断片のうちの１つに対応する。ハイブリダイゼーションは、１つの蛍光色素（例えば、Ｃｙ３）によって標識された「試験」ＤＮＡ、および第２の蛍光色素（例えば、Ｃｙ５）で標識された「対照」ＤＮＡを用いて、２つの色「比較」として実施される。各ハイブリダイゼーションの対照は、異なる正常な患者である。
【００５６】
各アレイアドレスにおける信号の強度は、該アドレスに対応するプローブの量に依存する。したがって、信号強度が高いアレイアドレスは、比較的低度にメチル化される。正常な対照と腫瘍のマイクロアレイデータの比較により、腫瘍型の典型的なメチル化プロファイルが経験的に導出される。既知の癌患者と非癌患者との比較によって確認されたメチル化の差異を使用して、基準を開発し、その基準はその基準を前向きに適用することによって確認される。本方法は、卵巣腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、および乳房腫瘍を含むがこれらに限定されない、種々の腫瘍に対するメチル化プロファイルを開発するために使用することができる。
【００５７】
［実施例３．低メチル化腫瘍関連ＤＮＡの検出のためのマイクロアレイの作製］
ゲノムは、問題のメチル化に敏感な制限酵素に対して２つの部位によって結合されるセグメントに分けられ（ＨｐｙＣｈ４−ＩＶではＡＣＧＴ）、５００塩基対長未満となる。これは、血清もしくは血漿ＤＮＡ試料から増幅される可能性のあるＤＮＡセグメントのリストを提供する。マイクロアレイ上での表示に対し、好適な配列を見出すことを目的として、これらの断片の配列の分析するために、アルゴリズムを使用する。例えば、適切なオリゴヌクレオチドは、以下の特性のうちの１つもしくは複数を有する：（ｉ）約４０ヌクレオチド超の固有の配列、もしくは約６０ヌクレオチド超の固有の配列、（ｉｉ）約４０％から約６０％のＧＣ、および（ｉｉｉ）著しい反復もしくは単純配列（例えば、一続きの約１５の単一塩基）を含有すべきではない。該アレイは、このように選択されたオリゴヌクレオチドを含有し、該アレイ上の各オリゴヌクレオチドは本発明の方法によって増幅され得る１つのゲノムセグメントを表す。かかるアレイは、腫瘍関連の低メチル化領域の検出、腫瘍のメチル化プロファイルの開発、および本発明の方法を使用した腫瘍のスクリーニングに有用である。
【００５８】
一旦上のマイクロアレイを使用して、低メチル化されているＤＮＡの腫瘍関連領域を同定すると、全種類の腫瘍、または１つもしくは複数の特定の種類の腫瘍のいずれかにおいて、典型的に、全種類の腫瘍もしくは１つもしくは複数の種類の腫瘍に関連するそれらのＤＮＡ領域のみを検出するように設計されたオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイが、実施例４の方法を使用して、それらの座位における腫瘍関連のメチル化差異の検出のために生成され得る。
【００５９】
［実施例４．本発明を使用して癌を診断する方法］
ＤＮＡを、標準的な方法を使用して患者の血清もしくは血漿から単離する（Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｋ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ５０：５１６−２１（２００４））。簡潔に述べると、１０ｍｌの患者の血液を２回遠心分離して、細胞を除去する。結果として得られた血漿を、ＤＮＡ結合膜に通過させる。該ＤＮＡを膜から除去し、結果として得られたＤＮＡをＨｐｙＣｈ４−ＩＶで消化する。
【００６０】
ＤＮＡリンカーを、消化されたＤＮＡにアニールおよびライゲーションする。該リンカーは、ＨｐｙＣｈ４−ＩＶで消化されたＤＮＡにライゲーションする際、ＭｌｕＩ制限部位を形成するように設計される。該リンカー媒介ＰＣＲを、ビオチン化プライマを利用して、１０サイクルのＰＣＲで、Ｇｕｉｌｌａｕｄ−Ｂａｔａｉｌｌｅ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２ｅ１１２  （２００４）によって説明されるとおりに実施する。
【００６１】
該ＰＣＲの後、ストレプトアビジンで被覆した電磁ビーズを利用して該産物を精製する。該ＰＣＲ産物をビーズに結合させ、洗浄した後、これらをＭｌｕＩで消化して、該リンカー配列（およびビーズ）を増幅された該ＤＮＡから除去する。分子内ライゲーションを促進するように該ＤＮＡを希釈し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで処理することによって、増幅されたＤＮＡを環状化する。
【００６２】
ライゲーションの後、次いで、これらは、商業的なキット（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、製造業者の説明書に従い、等温ローリングサークル増幅のための鋳型として使用される。
【００６３】
次いで、上の方法によって調製されたＤＮＡを標識し、特注のオリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイズさせることができる。ハイブリダイゼーションを、１つの蛍光色素で標識された患者ＤＮＡ、および第２の蛍光色素で標識された対照ＤＮＡを用いて、２つの色「比較」として実施する。該アレイ上の各オリゴヌクレオチドは、メチル化に敏感な酵素を使用した第１の消化ステップ中に理論上形成される可能性があるＤＮＡ制限断片のうちの１つに対応する。各アレイアドレスにおける信号の強度は、該アドレスに対応するプローブの量に依存する。したがって、信号強度が高いアレイアドレスは、比較的に低度にメチル化される。癌の状態が不明な患者から得られた試料からのメチル化／マイクロアレイ結果を、実施例２から導出された正常なデータおよび癌データ本体と比較する。正常なデータからの偏差は、癌を示す。マイクロアレイデータを比較するための方法は、当該技術分野で既知である。
【００６４】
陽性結果が出た後、患者は、例えば、ＭＲＩといった、癌診断を確認するための適切なスクリーンによってスクリーニングすることができる。
【００６５】
これらの方法は、卵巣腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、および乳房腫瘍を含むがこれらに限定されない、種々の腫瘍型の検出に適用可能である。さらに、本方法は、一般的なスクリーニング試験として使用することができる。
【００６６】
［参考文献］
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2010530760.tif 000003
【図１】
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【国際調査報告】
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