(57)【要約】  本発明は、臨床上重要な細菌および真菌種の検出法、ならびにそれらの特異的検出用のアッセイ、試薬およびキットに関する。本発明は、単回アッセイ中のこれらの病原菌のそれぞれの核酸の特異的検出を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原菌を検出する方法であって、病原菌を含有する試料または含有する疑いがある試料を複数のオリゴヌクレオチド種を含むオリゴヌクレオチド混合物にさらす段階を含み、それぞれのオリゴヌクレオチド種が、
【表１Ａ】
2010532665.tif 000024
【表１Ｂ】
2010532665.tif 000025
からなる群から選択される病原菌の遺伝物質と特異的に結合することができ、それぞれの前記オリゴヌクレオチド混合物が、類似した増幅条件下で遺伝物質を増幅することができ、または類似したハイブリダイゼーション条件下で遺伝物質とハイブリダイズすることができる方法。
【請求項２】
複数のオリゴヌクレオチド種が遺伝物質の特異的増幅を可能にするプライマー対の複数のセットを含み、核酸増幅に適した条件下で試料をプライマー対の複数のセットにさらす、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
複数のオリゴヌクレオチド種がプローブを含み、それぞれのプローブが1つまたは複数の病原菌種の遺伝物質とハイブリダイズすることができ、ハイブリダイゼーションに適した条件下で試料をプローブにさらす、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
遺伝物質がRNAまたはDNAである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
それぞれの病原菌の遺伝物質に特異的なオリゴヌクレオチド種を使用して試料を増幅にかける、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
増幅を別個のバイアルまたは容器中で実施する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
それぞれの病原菌の遺伝物質の増幅を同時に実施する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アシネトバクターバウマニ、アシネトバクタールヴォフィイ、エロモナスキャビエ、エロモナスヒドロフィラ、セレウス菌、枯草菌、シトロバクターブラキ、シトロバクターフロインディ、シトロバクターコゼリ、エンテロバクターエロゲネス、エンテロバクタークロアカエ、エンテロバクターサカザキ、エンテロコッカスフェシウム、ゲメラヘモリサンス、ゲメラモルビロラム、インフルエンザ菌、キンゲラキンゲ、クレブシエラオキシトカ、肺炎桿菌、モルガネラモルガニイ、淋菌、髄膜炎菌、パスツレラムルトシダ、プロピオニバクテリウムアクネス、プロテウスミラビリス、プロピデンシアレットゲリ、緑膿菌、豚コレラ菌、セラチアリクファシエンス、セラチアマルセッセンス、ストレプトコッカスアガラクティエ、ストレプトコッカスアンギノサス、ストレプトコッカスボビス、ミュータンス連鎖球菌、唾液連鎖球菌、ストレプトコッカスサングイニス、ストレプトコッカススイス、ビブリオバルニフィカス、腸炎エルシニア、ペスト菌/偽結核性エルシニア菌、大便連鎖球菌、クロストリジウムパーフリンジェンス、コリネバクテリウムジェイケイウム、およびカプノサイトファーガカニモルサスの増幅を同じバイアルまたは容器中で実施する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
シトロバクターフロインディ、シトロバクターコゼリ、エンテロバクターエロゲネス、エンテロバクタークロアカエ、エンテロバクターサカザキ、クレブシエラオキシトカ、肺炎桿菌、豚コレラ菌、リステリアモノサイトゲネス、パスツレラニューモトロピカ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカスヘモリチカス、スタフィロコッカスホミニス、スタフィロコッカスサッカロリティカス、スタフィロコッカスサプロフィティカス、スタフィロコッカスワーネリー、ストレプトコッカスディスガラクティエ、肺炎連鎖球菌、および化膿連鎖球菌の増幅を同じバイアルまたは容器中で実施する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
カンジダアルビカンス、カンジダグラブラタ、カンジダパラプシロシス、カンジダトロピカリス、カンジダクルセイ、アスペルギルスフミガーツス、アスペルギルスニガー、アスペルギルスニダランス、アスペルギルスフラバス、およびアスペルギルステレウスの増幅を同じバイアルまたは容器中で実施する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
バクテロイデスフラジリス、マルタ熱菌、バークホルデリアセパシア、ステノトロホモナスマルトフィリア、大腸菌および赤痢菌種の増幅を同じバイアルまたは容器中で実施する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
a)配列番号1の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号2の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
c)配列番号3の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
d)配列番号4の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
e)配列番号5の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
f)配列番号6の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
g)配列番号7の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
h)配列番号8の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
i)配列番号375の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、および
j)配列番号376の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸
を含むプライマーの組合せで増幅を実施する、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
a)配列番号9の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号10の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
c)配列番号11の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
d)配列番号12の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
e)配列番号13の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、および
f)配列番号14の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸
を含むプライマーの組合せで増幅を実施する、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
a)配列番号15の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号16の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
c)配列番号17の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
d)配列番号18の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
e)配列番号19の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
f)配列番号20の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、および
g)配列番号21の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸
を含むプライマーの組合せで増幅を実施する、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
a)配列番号22の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号23の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
c)配列番号24の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
d)配列番号25の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
e)配列番号26の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
f)配列番号377の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、および
g)配列番号378の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸
を含むプライマーの組合せで増幅を実施する、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
c)の核酸、d)の核酸および/またはe)の核酸を除く、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
a)配列番号22の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号23の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、および
c)配列番号26の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸
を含むプライマーの組合せで増幅を実施する、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
プローブがプライマーによって増幅したPCRアンプリコンと特異的に結合することができる、請求項12から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号27〜配列番号125、配列番号131〜配列番号237、配列番号241〜配列番号333、配列番号339〜配列番号352、配列番号356、配列番号357、配列番号364、配列番号366〜配列番号373、または配列番号374のいずれか1つの、その5'末端および/または3'末端における0〜5個のヌクレオチド付加、欠失または付加と欠失の組合せを含む核酸、それらの相補体および組合せからなる群からプローブが選択される、請求項3から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
【表２】
2010532665.tif 000026
からなる群から選択される病原菌と特異的に結合することができる10〜50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって、1つまたは複数の病原菌種の遺伝物質と結合することができるオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドが、類似したハイブリダイゼーション条件下で遺伝物質とハイブリダイズすることができる、請求項20に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項20または21に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項２３】
前記キットがアシネトバクターバウマニ、アシネトバクタールヴォフィイ、エロモナスキャビエ、エロモナスヒドロフィラ、セレウス菌、枯草菌、シトロバクターブラキ、シトロバクターフロインディ、シトロバクターコゼリ、エンテロバクターエロゲネス、エンテロバクタークロアカエ、エンテロバクターサカザキ、エンテロコッカスフェシウム、ゲメラヘモリサンス、ゲメラモルビロラム、インフルエンザ菌、キンゲラキンゲ、クレブシエラオキシトカ、肺炎桿菌、モルガネラモルガニイ、淋菌、髄膜炎菌、パスツレラムルトシダ、プロピオニバクテリウムアクネス、プロテウスミラビリス、プロピデンシアレットゲリ、緑膿菌、豚コレラ菌、セラチアリクファシエンス、セラチアマルセッセンス、ストレプトコッカスアガラクティエ、ストレプトコッカスアンギノサス、ストレプトコッカスボビス、ミュータンス連鎖球菌、唾液連鎖球菌、ストレプトコッカスサングイニス、ストレプトコッカススイス、ビブリオバルニフィカス、腸炎エルシニア、ペスト菌/偽結核性エルシニア菌、大便連鎖球菌、クロストリジウムパーフリンジェンス、コリネバクテリウムジェイケイウム、およびカプノサイトファーガカニモルサスからなる群から選択される病原菌由来の遺伝物質の特異的増幅用の複数のオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドが、それぞれが個々のオリゴヌクレオチドを含むかまたはそれぞれが特異的プライマー対を含む別個の容器中に提供されるか、あるいはそれぞれの遺伝物質の増幅用のオリゴヌクレオチドの混合物を含む単一の容器中に提供される、請求項22に記載のキット。
【請求項２４】
シトロバクターフロインディ、シトロバクターコゼリ、エンテロバクターエロゲネス、エンテロバクタークロアカエ、エンテロバクターサカザキ、クレブシエラオキシトカ、肺炎桿菌、豚コレラ菌、リステリアモノサイトゲネス、パスツレラニューモトロピカ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカスヘモリチカス、スタフィロコッカスホミニス、スタフィロコッカスサッカロリティカス、スタフィロコッカスサプロフィティカス、スタフィロコッカスワーネリー、ストレプトコッカスディスガラクティエ、肺炎連鎖球菌、および化膿連鎖球菌からなる群から選択される病原菌由来の遺伝物質の特異的増幅用の複数のオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドが、それぞれが個々のオリゴヌクレオチドを含むかまたはそれぞれが特異的プライマー対を含む別個の容器中に提供されるか、またはそれぞれの遺伝物質の増幅用のオリゴヌクレオチドの混合物を含む単一の容器中に提供される、請求項22に記載のキット。
【請求項２５】
前記キットがカンジダアルビカンス、カンジダグラブラタ、カンジダパラプシロシス、カンジダトロピカリス、カンジダクルセイ、アスペルギルスフミガーツス、アスペルギルスニガー、アスペルギルスニダランス、アスペルギルスフラバス、およびアスペルギルステレウスからなる群から選択される病原菌由来の遺伝物質の特異的増幅用の複数のオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドが、それぞれが個々のオリゴヌクレオチドを含むかまたはそれぞれが特異的プライマー対を含む別個の容器中に提供されるか、またはそれぞれの遺伝物質の増幅用のオリゴヌクレオチドの混合物を含む単一の容器中に提供される、請求項22に記載のキット。
【請求項２６】
前記キットがバクテロイデスフラジリス、マルタ熱菌、バークホルデリアセパシア、ステノトロホモナスマルトフィリア、大腸菌および赤痢菌種からなる群から選択される病原菌由来の遺伝物質の特異的増幅用の複数のオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドが、それぞれが個々のオリゴヌクレオチドを含むかまたはそれぞれが特異的プライマー対を含む別個の容器中に提供されるか、またはそれぞれの遺伝物質の増幅用のオリゴヌクレオチドの混合物を含む単一の容器中に提供される、請求項22に記載のキット。
【請求項２７】
病原菌種のそれぞれの増幅用のオリゴヌクレオチドを含む、請求項22から26のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８】
別個の容器中に、または固形支持体と結合した、それぞれの病原菌種の検出用のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項22から27のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8からなる群から選択される配列を含むかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号14からなる群から選択される配列を含むかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
c)配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20および配列番号21からなる群から選択される配列を含むかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
d)配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群から選択される配列を含むかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
e)その5'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)〜d)のいずれか1つのオリゴヌクレオチド、
f)その5'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)〜d)のいずれか1つのオリゴヌクレオチド、ならびに
g)上記のいずれか1つの相補体
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドが標識を含む、請求項29に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
標識がオリゴヌクレオチドの5'末端に位置する、請求項30に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号375、配列番号376またはそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド、ならびに
a)配列番号1の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号2の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
c)配列番号3の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
d)配列番号4の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
e)配列番号5の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
f)配列番号6の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
g)配列番号7の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
h)配列番号8の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
i)上記のいずれか1つの相補体、および
j)上記のそれらのいずれか1つの組合せ
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの混合物、組合せまたは組成物。
【請求項３３】
a)配列番号9の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号10の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
c)配列番号11の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
d)配列番号12の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
e)配列番号13の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
f)配列番号14の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
g)上記のいずれか1つの相補体、および
h)上記のそれらのいずれか1つの組合せ
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの混合物、組合せまたは組成物。
【請求項３４】
a)配列番号15の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号16の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
c)配列番号17の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
d)配列番号18の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
e)配列番号19の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
f)配列番号20の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
g)配列番号21の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
h)上記のいずれか1つの相補体、および
i)上記のそれらのいずれか1つの組合せ
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの混合物、組合せまたは組成物。
【請求項３５】
配列番号377、配列番号378およびそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド、ならびに
a)配列番号22の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号23の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
c)配列番号24の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
d)配列番号25の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
e)上記のいずれか1つの相補体、および
f)上記のそれらのいずれか1つの組合せ
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの混合物、組合せまたは組成物。
【請求項３６】
a)配列番号22の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号23の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
c)配列番号26の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
d)上記のいずれか1つの相補体、および
e)上記のそれらのいずれか1つの組合せ
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの混合物、組合せまたは組成物。
【請求項３７】
c)の核酸およびd)の核酸を混合物から除いた、請求項35に記載の混合物。
【請求項３８】
a)配列番号27〜配列番号125、配列番号131〜配列番号237、配列番号241〜配列番号333、配列番号339〜配列番号352、配列番号356、配列番号357、配列番号364、配列番号366〜配列番号373、または配列番号374のいずれか1つからなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)の核酸、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)の核酸、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよびその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)の核酸、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
前記核酸が標識を含む、請求項37に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
標識が核酸の5'または3'末端に位置する、請求項38に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
a)配列番号27〜配列番号125、配列番号131〜配列番号202または配列番号203からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよびその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体
からなる群から選択される、請求項37から39のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
a)配列番号204〜配列番号237、配列番号241〜配列番号293または配列番号364からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよびその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体
からなる群から選択される、請求項37から39のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
a)配列番号294〜配列番号332または配列番号333からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよびその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体
からなる群から選択される、請求項37から39のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
a)配列番号339〜配列番号352、配列番号356、配列番号357、配列番号366〜配列番号373または配列番号374からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよびその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体
からなる群から選択される、請求項37から39のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
請求項40、41、42および43のそれぞれの少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの組合せであって、前記オリゴヌクレオチドのそれぞれが、別個の容器中に提供されるか、または結合用であるか、または固形支持体上の特定の位置と結合するオリゴヌクレオチドの組合せ。
【請求項４６】
固形基材(支持体)および固形基材(支持体)と結合した複数の位置的に識別可能なプローブを含むアレイであって、それぞれのプローブが異なる核酸配列を含み、
【表３】
2010532665.tif 000027
からなる群から選択される病原菌と特異的に結合することができ、前記プローブのそれぞれが10〜50個のヌクレオチドを独立に含むアレイ。
【請求項４７】
a)配列番号27〜配列番号125、配列番号131〜配列番号202もしくは配列番号203またはそれらの相補体に対する0〜5個のヌクレオチド付加および/または欠失を含むオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーであって、付加および/または欠失が核酸配列の5'末端および/または3'末端に位置するメンバー、
b)配列番号204〜配列番号237、配列番号241〜配列番号293もしくは配列番号364またはそれらの相補体に対する0〜5個のヌクレオチド付加および/または欠失を含むオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーであって、付加および/または欠失が核酸配列の5'末端および/または3'末端に位置するメンバー、
c)配列番号294〜配列番号332もしくは配列番号333またはそれらの相補体に対する0〜5個のヌクレオチド付加および/または欠失を含むオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーであって、付加および/または欠失が核酸配列の5'末端および/または3'末端に位置するメンバー、
d)配列番号339〜配列番号352、配列番号356、配列番号357、配列番号366〜配列番号373もしくは配列番号374またはそれらの相補体に対する0〜5個のヌクレオチド付加および/または欠失を含むオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーであって、付加および/または欠失が核酸配列の5'末端および/または3'末端に位置するメンバー
を含むアレイであって、
それぞれのオリゴヌクレオチドが固形支持体と結合し、それぞれのオリゴヌクレオチドが指定可能な位置に位置するアレイ。
【請求項４８】
オリゴヌクレオチドが
a)配列番号27〜配列番号44、配列番号46〜配列番号63、配列番号65〜配列番号71、配列番号73〜配列番号77、配列番号79〜配列番号97、配列番号99〜配列番号125、配列番号131〜配列番号202および配列番号203からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよびその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体
からなる群から選択される、請求項46に記載のアレイ。
【請求項４９】
オリゴヌクレオチドが
a)配列番号204、配列番号208、配列番号211、配列番号212、配列番号214、配列番号215、配列番号219、配列番号223、配列番号226、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号236、配列番号241、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号249、配列番号253〜配列番号256、配列番号261、配列番号264〜配列番号267、配列番号270、配列番号272、配列番号279〜配列番号281、配列番号284〜配列番号288、配列番号291、配列番号292および配列番号364からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよびその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体
からなる群から選択される、請求項46または47に記載のアレイ。
【請求項５０】
オリゴヌクレオチドが
a)配列番号294、配列番号296〜配列番号309、配列番号312、配列番号314、配列番号316、配列番号317、配列番号318、配列番号320〜配列番号323、配列番号326〜配列番号330および配列番号332からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよびその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体
からなる群から選択される、請求項46から48のいずれか一項に記載のアレイ。
【請求項５１】
オリゴヌクレオチドが
a)配列番号339〜配列番号344、配列番号348、配列番号366〜配列番号373および配列番号374からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよびその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体
からなる群から選択される、請求項46から49のいずれか一項に記載のアレイ。
【請求項５２】
必要のある個体における血流感染の診断法であって、
【表４】
2010532665.tif 000028
からなる群から選択される病原菌の遺伝物質と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドで、個体から得た試料の病原菌の存在の有無を検出する段階を含み、
遺伝物質を配列番号375、配列番号376、配列番号377または配列番号378のいずれか1つまたは全て、ならびに配列番号1〜配列番号125、配列番号131〜配列番号237、配列番号241〜配列番号333、配列番号339〜配列番号352、配列番号356、配列番号357、配列番号364、配列番号366〜配列番号373および配列番号374のいずれか1つからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを用いて検出し、病原菌の存在が、検出する病原菌に関連する血流感染の指標である方法。
【請求項５３】
遺伝物質を配列番号1〜配列番号125、配列番号131〜配列番号237、配列番号241〜配列番号333、配列番号339〜配列番号352、配列番号356、配列番号357、配列番号364、配列番号366〜配列番号373および配列番号374のいずれか1つからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを用いて検出する、請求項51に記載の方法。
【請求項５４】
敗血症に関連する微生物を検出するための方法であって、
a)微生物に由来する遺伝物質を含む試料または含む疑いがある試料と、
b)請求項29から31、37から42もしくは43のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項32から36のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの混合物とを、ハイブリダイゼーションおよび/または増幅および/または検出の適切な条件下で接触させる段階を含む方法。
【請求項５５】
全ての核酸について類似した増幅条件下で増幅を実施する、請求項53に記載の方法。
【請求項５６】
全ての核酸について類似したハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションを実施する、請求項53または54に記載の方法。
【請求項５７】
全ての核酸について類似した検出条件下で検出を実施する、請求項53から55のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌性および真菌性病原菌の高感度な増幅および検出用の核酸配列および組合せを提供する。より詳細には、本発明は、血流感染に関連する細菌性および真菌性病原菌の検出法、ならびにそれらの特異的検出用のアッセイ、試薬およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
感染性疾患は、依然として世界中で死の主な原因である。しかしながら、地球に生息する数百万の微生物種の、数百種のみがヒトの病原菌として認識され、その中で細菌は500を超え真菌は約300である(Taylor、L.H.et al.、2001、Philos.Trans.R.Soc.Lond.、B、Biol.Sci.356:983〜989頁)。適切な治療介入は疾患の原因である種に応じて異なるので、これらの微生物の検出および同定は感染を制御する主な要因である。微生物の核酸の検出を利用する分子的方法は、感染性疾患の診断用の緩慢である伝統的な培養ベースの技術の迅速な代替方法となる。しかしながら、それぞれの細菌種用の一特異的分子アッセイの使用は厄介であり、貴重な臨床試料を使い果たす可能性がある。1つの解決策は、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応(マルチプレックスPCR)中などのようにマルチプレックスの形式で標的核酸を増幅するために多くのプライマーを組み合わせることによって、1つの試料に同時試験を実施することである(Chamberlain、J.S.et al.、1988、Nucleic Acids Res.16:11141〜11156頁)。その欠点は、標的増幅反応のこのような複雑化が不適当なアンプリコンを形成するより多くの機会を生み出し、したがって増幅プロセスの収率および特異性が低下することである。注意深いプライマー設計でも、これらの制約を克服することは困難である。非常に低レベルの標的鋳型核酸が試料中に存在するとき、この問題はさらに難しくなる。
【０００３】
血液1ミリリットル当たりには非常に少数の微生物がしばしば存在し(Peters、R.P.et al.、2004、Lancet Infect Dis.4:751〜760頁)、これらの血液感染は数百の遺伝的に異なる細菌および真菌種によって引き起こされ得るので、血流感染は最も困難な状況の1つとなる。
【０００４】
広く普及している核酸診断法のさらなる制約は、増幅産物の検出および同定が必要とされる検出技術である。核酸増幅反応のリアルタイムモニタリング用のいくつかの検出技術が存在する(Wittwer、C.T.et al.1997、BioTechniques 22:130〜139頁)。しかしながら、これらの一様な方法は、核酸の標識に利用可能な蛍光分子の発光スペクトル間の重複のために、多重化能は限られている。リアルタイム蛍光検出と増幅後融解曲線分析検出技術の組合せは多重化能を高めることができるが、これまでの所、実践上の用途はわずか約20の異なる標的の識別に限られている(LightCycler(登録商標)SeptiFast Test、Roche)。アガロースゲル電気泳動による核酸増幅産物の分離、次に蛍光挿入剤色素を用いた染色は、異なる長さのアンプリコンの識別に限られ、汚染を持ち越す傾向がある。塩基配列決定法は現在、臨床診断には遅すぎ、またはコストがかかりすぎる。固形(または半固形ゲル)表面上で物理的に処理した異なるプローブとの増幅後ハイブリダイゼーションは、非常に高い多重化能をもたらす(Bodrossy、L.and Sessitsch、A.、2004、Curr.Opin.Microbiol.7:245〜254頁;Loy、A.and Bodrossy、L.、2006、Clin.Chim.Acta 363:106〜119頁)。しかしながら、特異的かつ高感度なプローブ配列の入手は、固形支持体への固定、立体障害、混合した標的の解離などによって影響を受けるオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション挙動の理解の欠如が原因で難題となる。非平衡熱解離モデルは、どのプローブ配列が、どのストリンジェンシー条件下でその適合相補配列と効率良く特異的に相互作用するかを、効率良く予想することはできない(Pozhitkov、A.E.et al.、2007、Nucleic Acids Res.35:e70)。
【０００５】
したがって、敗血症関連の細菌性および真菌性病原菌の特異的かつ高感度な検出を可能にする、改善された試薬およびアッセイが必要とされる。
【０００６】
本発明は、これらおよび他の必要性に応じようとするものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2001/023604A2
【特許文献２】国際特許出願PCT/CA00/01150
【特許文献３】米国特許第3,817,837号
【特許文献４】米国特許第3,850,752号
【特許文献５】米国特許第3,939,350号
【特許文献６】米国特許第3,996,345号
【特許文献７】米国特許第4,277,437号
【特許文献８】米国特許第4,275,149号
【特許文献９】米国特許第4,366,241号
【特許文献１０】特許出願WO03087402A1
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Taylor、L.H.et al.、2001、Philos.Trans.R.Soc.Lond.、B、Biol.Sci.356:983〜989頁
【非特許文献２】Chamberlain、J.S.et al.、1988、Nucleic Acids Res.16:11141〜11156頁
【非特許文献３】Peters、R.P.et al.、2004、Lancet Infect Dis.4:751〜760頁
【非特許文献４】Wittwer、C.T.et al.1997、BioTechniques 22:130〜139頁
【非特許文献５】Bodrossy、L.and Sessitsch、A.、2004、Curr.Opin.Microbiol.7:245〜254頁
【非特許文献６】Loy、A.and Bodrossy、L.、2006、Clin.Chim.Acta 363:106〜119頁
【非特許文献７】Pozhitkov、A.E.et al.、2007、Nucleic Acids Res.35:e70
【非特許文献８】Loy、A.およびBodrossy、L.、2006、Clin.Chim.Acta 363:106〜119頁
【非特許文献９】Westin、L.et al.、2000、Nat.Biotechnol.18:199〜204頁
【非特許文献１０】Notomi、T.et al、2000、Nucleic Acids Res.28:e63
【非特許文献１１】Vincent、M.et al.、2004、EMBO reports 5:795〜800頁
【非特許文献１２】Piepenburg、O.et al.、2006、PLoS Biology 4:E204
【非特許文献１３】Yi、J.et al.、2006、Nucleic Acids Res、34:e81
【非特許文献１４】Zhang、D.et al.、2006、Clin.Chim.Acta 363:61〜70頁
【非特許文献１５】McCarthy、E.L.et al.、2007、Biosens.Biotechnol.22:126〜1244頁
【非特許文献１６】Zhou、L.et al.、2007、Anal.Chem.79:7492〜7500頁
【非特許文献１７】Coskun、S.and Alsmadi、O.、2007、Prenat.Diagn.27:297〜302頁
【非特許文献１８】Biagini、P.et al.、2007、J.Gen.Virol.88:2629〜2701頁
【非特許文献１９】Gill、P.et al.、2007、Diagn.Microbiol.Infect.Dis.59:243〜249頁
【非特許文献２０】Lasken、R.S.and Egholm、M.、2003、Trends Biotech.21:531〜535頁
【非特許文献２１】Livak K.J.et al.、1995、PCR Methods Appl.4:357〜362頁
【非特許文献２２】Wittwer、C、T.et al.、1997、BioTechniques 22:130〜138頁
【非特許文献２３】Tyagi S.and Kramer F.R.、1996、Nat.Biotech.14:303〜308頁
【非特許文献２４】Whitcombe、D.et al.、1999、Nat.Biotechnol.17:804〜807頁
【非特許文献２５】Heller、M.J.et al.、221〜224頁、Harrison、D.J.、and van den Berg、A.、1998、Micro total analysis systems'98、Kluwer Academic Publisher、Dordrecht
【非特許文献２６】Chiu、N.H.and Cantor、C.R.、1999、Clin、Chem.45:1578
【非特許文献２７】Berkenkamp、S.et al.、1998、Science 281:260〜262頁
【非特許文献２８】Anderson、R.C.et al.、11〜16頁、Harrison、D.J.、and van den Berg、A.、1998、Micro total analysis systems'98、Kluwer Academic Publisher、Dordrecht
【非特許文献２９】Najari、A.et al.、2006、Anal.Chem.78:7896〜7899頁
【非特許文献３０】Dore、K.et al.、2006、J.Fluoresc.16:259〜265頁
【非特許文献３１】Ho、H.-A.et al.、2005 J.Am.Chem.Soc.127;12673〜12676頁
【非特許文献３２】Dore、K.et al.、2004、J.Am.Chem.Soc.126:4240〜4244頁
【非特許文献３３】Ho、H.-A.et al.、2002、Angew.Chem.Int.Ed.41:1548〜1551頁
【非特許文献３４】Boissinot K.et al.、2007、Clin.Chem.53:2020〜2023頁
【非特許文献３５】Carter、D.J.and Cary、R.B.、2007、Nucleic Acids Res.35:e74
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、細菌性および真菌性病原菌の高感度な増幅および検出用の核酸配列および組合せを提供する。より詳細には、本発明は、血流感染に関連する細菌性および真菌性病原菌の検出法、ならびにそれらの特異的検出用のアッセイ、試薬およびキットに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって本発明のいくつかの態様は、細菌性および真菌性病原菌の特異的検出を可能にする、プライマー、プローブ、プライマーもしくはプローブの組合せ、またはプライマーとプローブの組合せに関する。
【００１１】
本発明のプライマーおよびプローブは、それだけに限らないが、表4の一覧を含めた血流感染に関連する最も重要なヒトの病原菌を標的とするために特に選択している。したがって本発明は、表4中に列挙する病原菌からなる群から選択される病原菌と特異的に結合することができる、10〜50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供する。これらのオリゴヌクレオチドは、本発明の方法およびキットにおいて、個別に、または集合的に(群または亜群として)使用することができる。
【００１２】
本発明によれば、本発明のオリゴヌクレオチドのいくつかは、一病原菌種の遺伝物質と結合することができる(または好ましくは結合する)。
【００１３】
本出願人の知る限りでは、本明細書に表すプライマーおよび/またはプローブの組合せは以前に記載されていない。本発明の一実施形態によれば、前述の細菌性と真菌性病原菌の検出は同時に実施することができる。本発明のさらなる実施形態によれば、前述の細菌性と真菌性病原菌の検出は平行して実施することができる。当然ながら、望むならば、前述の細菌性と真菌性病原菌の検出は別々に(すなわち、別々の試験管中および/または別々の実験中で)実施することができる。
【００１４】
本発明の目的であるプライマーおよびプローブ配列は、WO2001/023604A2で2000年9月28日に出願され2001年4月5日に公開された国際特許出願PCT/CA00/01150中に記載されたのと同様に作製された、進化的に保存されたタンパク質コード遺伝子配列のデータベースに由来する。本発明は、温度および試薬/バッファー溶液の均一な条件下で使用するために最適化した、オリゴヌクレオチドの組合せを開示する。
【００１５】
本発明のいくつかの態様も検出法に関する。検出法は遺伝物質の増幅によって、遺伝物質とオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、または増幅とハイブリダイゼーションの組合せによって実施することができる。
【００１６】
本発明の有意な利点は、それぞれの病原菌種に関して類似したまたは均一な増幅条件下で増幅段階を実施することができることである。したがって、それぞれの病原菌種の増幅は同時に実施することができる。
【００１７】
本発明の別の有意な利点は、類似したまたは均一なハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイゼーションを実施することもできることである。
【００１８】
遺伝物質の検出は、均一な条件下で有利に実施することもできる。
【００１９】
したがって、本発明のいくつかの態様は、病原菌を検出および/または同定するための方法であって、病原菌由来の遺伝物質を含む試料または含む疑いがある試料を、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組合せと、ハイブリダイゼーション、増幅および/または検出の適切な条件下で接触させる段階を含むことができる方法に関する。
【００２０】
より詳細には、本発明は、全プライマーの組合せに関して温度および試薬/バッファー溶液の均一な条件下での効率良いマルチプレックスの広域核酸増幅反応用の、増幅プライマー配列の最適な組合せに関する。これらの組合せは、診断、同定および検出目的に特に有用である可能性がある。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載する核酸配列の組合せ、ならびに検出のキット、アレイおよび方法に関する。
【００２２】
本発明は、敗血症などの侵襲的感染の原因である臨床上重要な細菌および真菌種を検出および同定するための、核酸ベースの試験またはキットの開発を目的とする。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、病原菌を検出する方法であって、病原菌を含有する試料または含有する疑いがある試料を複数のオリゴヌクレオチド種を含むオリゴヌクレオチド混合物にさらす段階を含むことができ、それぞれのオリゴヌクレオチド種が、表4の病原菌からなる群から選択される病原菌の遺伝物質と特異的に結合することができる方法に関する。本発明によれば、それぞれのオリゴヌクレオチド混合物は類似したまたは均一な増幅条件下で遺伝物質を増幅することができ、かつ/または類似もしくは均一なハイブリダイゼーション条件下で遺伝物質とハイブリダイズすることができる。
【００２４】
本発明の方法を実施することによって、試験試料中に存在する(1種または複数種の)病原菌をしたがって適切に同定することができる。
【００２５】
本発明の特定の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチド種は、遺伝物質を特異的に増幅することができるプライマー対の複数のセットを含むことができ、核酸増幅に適した条件下で試料をプライマー対の複数のセットにさらすことによって方法を実施することができる。
【００２６】
本発明の別の特定の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチド種はプローブを含むことができる。本発明によれば、それぞれのプローブは1つまたは複数の病原菌種の遺伝物質とハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションに適した条件下で試料をプローブにさらすことができる。
【００２７】
本発明の一実施形態では、それぞれの病原菌の遺伝物質に特異的なオリゴヌクレオチド種を使用して試料を増幅にかけることができる。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、増幅段階を別個のバイアルまたは容器中で実施することができる。
【００２９】
さらなる実施形態では、それぞれの病原菌の遺伝物質の増幅を同時に実施することができる。
【００３０】
本発明によれば、遺伝物質はRNAまたはDNAであってよい。
【００３１】
逆転写(RT)酵素によってRNAをDNAに変換することができることは、当技術分野でよく知られている。あるいは、例えば、適切なプロモーター(例えば、RNAポリメラーゼプロモーター)および/または他の制御エレメントがそれと作用可能に連結しているとき、DNAをRNAに変換することができる。したがって、本発明を実施するために使用する核酸鋳型(標的)は、DNA(例えば、ゲノム断片または制限断片)、または一本鎖もしくは二本鎖のRNAのいずれかであってよい。
【００３２】
核酸標的(病原菌のゲノム、遺伝子または遺伝子断片(例えば、制限断片))は、精製、粗製形または単離形であってよい。核酸標的は、例えば患者から得た生物検体を含む試料、環境(土壌、物体など)、微生物または組織培養物、細胞系から得た試料、純粋または実質的に純粋な病原菌または病原菌混合物の調製物などの中に含有される可能性がある。本発明によれば、感染を有する患者または有する疑いがある患者から試料を得ることができる。
【００３３】
核酸鋳型は、例えば、感染を有する疑いがある患者または病原菌を保有する疑いがある患者由来の検体、土壌または水検体などの食物または動物検体などの、生物または環境試料から得ることもできる。鋳型は完全ゲノム、転写産物、増幅産物、断片などを含めた本明細書に記載する病原菌由来の遺伝物質であってよい。一実施形態では、断片は50〜1000塩基もしくは塩基対または100〜1000を超える塩基もしくは塩基対であってよく、表1の核酸のハイブリダイゼーションの領域を包含することができる。当然ながら、断片の長さは変わる可能性があり、50〜1000塩基または塩基対の間で見られる任意のサブコンビネーションを包含することができる。
【００３４】
それぞれの標的遺伝子用に、複数の配列アラインメントが、国際特許出願PCT/CA00/01150中に記載されたのと同様に作製された、進化的に保存されたタンパク質コード遺伝子配列のデータベースからの配列データを使用して作製されている。この分析に基づいて、保存された遺伝子領域を使用して、各標的微生物種、網または属の全ての代表的な菌株の増幅に有用な広域プライマーを設計した。いくつかの場合、より狭い範囲でのプライマーも含めて全ての標的種の効率良い増幅を確実にした。各標的種、網または属内の全てまたは大部分のメンバーの特異的、高感度、かつ偏在的増幅に有用であるための、各標的種の増幅用のプライマー対を選択している(表1)。細菌種に関しては、tuf遺伝子が主な標的であり、recA遺伝子も使用していくつかの連鎖球菌種の同定を容易にした。真菌種に関しては、標的は真核生物伸長因子EF1-αをコードするtef1遺伝子であった。
【００３５】
したがって本発明のいくつかの態様は、本発明の方法およびキット中で使用するための、個々のプライマー、プライマー対、またはプライマーもしくはプライマー対の組合せに関する。
【００３６】
個々のプライマー、プライマー対およびプライマーの組合せの例示的な実施形態は以下で見られる。
【００３７】
本発明は、第一の実施形態において、配列番号1の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は、配列番号2の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００３９】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号3の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００４０】
他のさらなる実施形態において、本発明は、配列番号4の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００４１】
追加の実施形態において、本発明は、配列番号5の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００４２】
他の追加の実施形態において、本発明は、配列番号6の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００４３】
別の例示的な実施形態において、本発明は、配列番号7の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００４４】
他の別の例示的な実施形態において、本発明は、配列番号8の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００４５】
さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号9の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００４６】
追加の実施形態において、本発明は、配列番号10の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００４７】
さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号11の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００４８】
本発明の追加の実施形態は、配列番号12の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸に関する。
【００４９】
本発明の他の追加の例示的な実施形態は、配列番号13の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００５０】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号14の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸に関する。
【００５１】
本発明の別の実施形態は、配列番号15の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸に関する。
【００５２】
本発明の他の別の実施形態は、配列番号16の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸に関する。
【００５３】
本発明の追加の実施形態は、配列番号17の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸に関する。
【００５４】
本発明のさらに追加の実施形態は、配列番号18の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸に関する。
【００５５】
さらなる例示的な実施形態において、本発明は、配列番号19の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００５６】
他のさらなる例示的な実施形態において、本発明は、配列番号20の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００５７】
追加の例示的実施形態において、本発明は、配列番号21の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００５８】
他の追加の例示的実施形態において、本発明は、配列番号22の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を提供する。
【００５９】
本発明の別の実施形態は、配列番号23の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸に関する。
【００６０】
本発明のさらに他の実施形態は、配列番号24の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸に関する。
【００６１】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号25の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸に関する。
【００６２】
本発明の他のさらなる実施形態は、配列番号375の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸に関する。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、配列番号376の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸に関する。
【００６４】
追加の実施形態において、本発明は、配列番号377の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸に関する。
【００６５】
他の追加の実施形態において、本発明は、配列番号378の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸に関する。
【００６６】
本発明はさらに、前に記載した核酸の少なくとも2つを含むことができるプライマー対に関する。
【００６７】
したがって本発明はプライマー対に関する。プライマーのそれぞれのセットは、遺伝物質を特異的に増幅することができる少なくとも1つのプライマーを含むことができる。したがって試験する試料は、核酸増幅に適した条件下でプライマー対の複数のセットにさらすことができる。
【００６８】
プライマー対の例示的な実施形態には以下のプライマー対がある。
【００６９】
配列番号1の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号2の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００７０】
配列番号3の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号4の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００７１】
配列番号5の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号6の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００７２】
配列番号7の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号8の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００７３】
配列番号375の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号376の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００７４】
本発明によれば、前述のプライマー対の混合物を使用して、表4中に列挙する病原菌を増幅することができる。
【００７５】
例示的な実施形態において、少なくとも以下の細菌種、アシネトバクターバウマニ(Acinetobacter baumannii)、アシネトバクタールヴォフィイ(Acinetobacter lwoffii)、エロモナスキャビエ(Aeromonas caviae)、エロモナスヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、セレウス菌(Bacillus cereus)、枯草菌(Bacillus subtilis)、シトロバクターブラキ(Citrobacter braakii)、シトロバクターフロインディ(Citrobacter freundii)、シトロバクターコゼリ(Citrobacter koseri)、エンテロバクターエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクタークロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロバクターサカザキ(Enterobacter sakazakii)、エンテロコッカスフェシウム(Enterococcus faecium)、ゲメラヘモリサンス(Gemella haemolysans)、ゲメラモルビロラム(Gemella morbillorum)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、キンゲラキンゲ(Kingella kingae)、クレブシエラオキシトカ(Klebsiella oxytoca)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、モルガネラモルガニイ(Morganella morganii)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、パスツレラムルトシダ(Pasteurella multocida)、プロピオニバクテリウムアクネス(Propionibacterium acnes)、プロテウスミラビリス(Proteus mirabilliis)、プロピデンシアレットゲリ(Providencia rettgeri)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、豚コレラ菌(Salmonella choleraesuis)、セラチアリクファシエンス(Serratia liquefaciens)、セラチアマルセッセンス(Serratia marcescens)、ストレプトコッカスアガラクティエ(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカスアンギノサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカスボビス(Streptococcus bovis)、ミュータンス連鎖球菌(Streptococcus mutans)、唾液連鎖球菌(Streptococcus salivarius)、ストレプトコッカスサングイニス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカススイス(Streptococcus suis)、ビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)、腸炎エルシニア(Yersinia enterocolitica)、ペスト菌(Yersinia pestis)/偽結核性エルシニア菌(Yersinia pseudotuberculosis)、大便連鎖球菌(Enterococcus faecalis)、クロストリジウムパーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、コリネバクテリウムジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)、およびカプノサイトファーガカニモルサス(Capnocytophaga canimorsus)を標的とするための第一の増幅マルチプレックス反応混合物を形成するために、プライマーの組合せを使用して増幅段階を実施することができる。
【００７６】
プライマーのこの組合せは、
a)配列番号1の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号2の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
c)配列番号3の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
d)配列番号4の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
e)配列番号5の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
f)配列番号6の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
g)配列番号7の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
h)配列番号8の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
i)配列番号375の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、および
j)配列番号376の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸
を含むことができる。
【００７７】
より具体的な実施形態では、第一のマルチプレックス反応混合物において使用するプライマーの組合せは、配列番号375および配列番号376(国際特許出願PCT/CA00/01150中でそれぞれ配列番号636および637として同定)およびプライマー配列番号1〜8を含む。
【００７８】
プライマー対の他の例示的な実施形態には以下のプライマー対がある。
【００７９】
配列番号9の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号10の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００８０】
配列番号11の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号12の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００８１】
配列番号13の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号14の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００８２】
本発明によれば、前述のプライマー対の混合物を使用して、表4中に列挙する病原菌を増幅することができる。
【００８３】
例示的な実施形態において、少なくとも以下の細菌種、シトロバクターフロインディ(Citrobacter freundii)、シトロバクターコゼリ(Citrobacter koseri)、エンテロバクターエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクタークロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロバクターサカザキ(Enterobacter sakazakii)、クレブシエラオキシトカ(Klebsiella oxytoca)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、豚コレラ菌(Salmonella choleraesuis)、リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、パスツレラニューモトロピカ(Pasteurella pneumotropica)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカスヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカスホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフィロコッカスサッカロリティカス(Staphylococcus saccharolyticus)、スタフィロコッカスサプロフィティカス(Staphylococccus saprophyticus)、スタフィロコッカスワーネリー(Staphylococcus warneri)、ストレプトコッカスディスガラクティエ(Streptococcus dysgalactiae)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、および化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)を標的とするための第二の増幅マルチプレックス反応混合物を形成するために、プライマーの組合せを使用して増幅段階を実施することができる。
【００８４】
プライマーのこの組合せは、
a)配列番号9の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号10の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
c)配列番号11の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
d)配列番号12の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
e)配列番号13の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、および
f)配列番号14の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸
を含むことができる。
【００８５】
より具体的な実施形態では、第二のマルチプレックス反応混合物において使用するプライマーの組合せは配列番号9〜14を含む。
【００８６】
プライマー対のさらに他の例示的な実施形態には以下のプライマー対がある。
【００８７】
配列番号15の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号16の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００８８】
配列番号15の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号17の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００８９】
配列番号18の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号19の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００９０】
配列番号18の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号20の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００９１】
配列番号18の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号21の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００９２】
本発明によれば、前述のプライマー対の混合物を使用して、表4中に列挙する病原菌を増幅することができる。
【００９３】
本発明の追加の例示的実施形態は、少なくとも以下の真菌種、カンジダアルビカンス(Candida aibicans)、カンジダグラブラタ(Candida glabrata)、カンジダパラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダトロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダクルセイ(Candida krusei)、アスペルギルスフミガーツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルスニダランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルスフラバス(Aspergillus flavus)、およびアスペルギルステレウス(Aspergillus terreus)を標的とするための第三の増幅マルチプレックス反応混合物を形成するための、プライマーの組合せに関する。
【００９４】
プライマーのこの組合せは、
a)配列番号15の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号16の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
c)配列番号17の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
d)配列番号18の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
e)配列番号19の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
f)配列番号20の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、および
g)配列番号21の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸
を含むことができる。
【００９５】
より具体的な実施形態では、第三の増幅マルチプレックス反応混合物を形成するために使用するプライマーの組合せは配列番号15〜21を含む。
【００９６】
プライマー対のさらなる例示的な実施形態には以下のプライマー対がある。
【００９７】
配列番号22の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号23の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００９８】
配列番号24の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号25の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【００９９】
配列番号26の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号23の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【０１００】
配列番号377の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸および配列番号378の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含み得る核酸を含むプライマー対。
【０１０１】
本発明によれば、前述のプライマー対のいくつかの混合物を使用して、表4中に列挙する病原菌を増幅することができる。
【０１０２】
本発明の別の例示的な実施形態は、少なくとも以下の細菌種、バクテロイデスフラジリス(Bacteroides fragilis)、マルタ熱菌(Brucella melitensis)、バークホルデリアセパシア(Burkholderia cepacia)、ステノトロホモナスマルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、および大腸菌(Escherichia coil)-赤痢菌種(Shigella sp.)を標的とするための増幅マルチプレックス反応混合物番号4(バージョン1)を形成するための、プライマーの組合せに関する。
【０１０３】
プライマーのこの組合せは、
a)配列番号22の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号23の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
c)配列番号24の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
d)配列番号25の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
e)配列番号377の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、および
f)配列番号378の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸
を含むことができる。
【０１０４】
より具体的な実施形態では、プライマー配列番号22〜25とプライマー配列番号377および配列番号378(国際特許出願PCT/CA00/01150中でそれぞれ配列番号1661および1665として同定)の組合せを使用して、増幅マルチプレックス反応混合物番号4(バージョン1)を形成する。
【０１０５】
ストレプトミセス属放線菌(Streptomyces avermitilis)は病原菌種であるとは考えられないが、その増幅用のプライマーも対照目的として使用するためにこのマルチプレックス中に含め、このように配列番号24および25は除くことができる。対照を使用してアッセイを立証し、かつ有用ではあるが、任意の対照またはその関連試薬は任意選択であり、および/または容易に除くことができる、または他の対照によって置換することができることは本明細書において理解されよう。
【０１０６】
本発明の別の例示的な実施形態は、少なくとも以下の細菌種、バクテロイデスフラジリス、マルタ熱菌、バークホルデリアセパシア、ステノトロホモナスマルトフィリア、および大腸菌-赤痢菌種を標的とするための増幅マルチプレックス反応混合物番号4(バージョン2)を形成するための、プライマーの組合せに関する。
【０１０７】
プライマーのこの組合せは、
a)配列番号22の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、
b)配列番号23の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸、および
c)配列番号26の5'末端に0〜5個のヌクレオチド付加または欠失を含む核酸
を含むことができる。
【０１０８】
より具体的な実施形態では、プライマー配列番号22、23および26の組合せを使用して増幅マルチプレックス反応混合物番号4(バージョン2)を形成する。
【０１０９】
それぞれの細菌または真菌種間の区別を異なる方法で実施することができることは、本明細書において理解されよう。本発明の一実施形態では、それぞれの種に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて、それぞれの種の区別を実施することができる。
【０１１０】
したがって本発明の他の態様は、オリゴヌクレオチド捕捉プローブ配列に関する。これらのオリゴヌクレオチドは、例えば固形支持体ハイブリダイゼーションに使用することができる。これらのプローブの利点は、これらを均一なハイブリダイゼーション条件(例えばストリンジェンシー)下で使用して標的微生物種を特異的に検出および同定することができることである。
【０１１１】
さらに別の実施形態では、比較的少数のプローブ配列の組合せを細菌および真菌種の同定に使用する。
【０１１２】
例えば、本明細書に記載する増幅プライマーの組合せを使用して作製したPCRアンプリコンの内部領域を標的とする核酸ハイブリダイゼーションプローブは、本発明によって包含される。PCR生成核酸鋳型の群は、前述の1つまたは複数の標的微生物種から調製する。これらのハイブリダイゼーションプローブは、リアルタイムPCR検出(例えば、TaqManプローブ、分子指標)、または固形支持体ハイブリダイゼーション(例えば、核酸のマイクロアレイハイブリダイゼーション、ビーズベースの捕捉)のいずれかに使用することができる。
【０１１３】
プローブの例示的な実施形態には以下のプローブがある。
【０１１４】
表2中に列挙するプローブのいずれか1つのその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。簡潔にする目的で、本出願人はこのような核酸のそれぞれの具体例の完全な一覧は提供しないが、列挙する語はそれぞれの核酸配列に個別または集合的に適用されることは、本明細書において理解されよう。
【０１１５】
個々のプローブの例示的な実施形態には以下が挙げられる。
【０１１６】
配列番号27のその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。
【０１１７】
配列番号28のその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。
【０１１８】
配列番号29のその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。
【０１１９】
個々のプローブの他の具体的な実施形態は、その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失または付加と欠失の組合せを含み得る個々の核酸、表2中に列挙しマルチプレックス1と同定した核酸のいずれかに関する。
【０１２０】
さらなる実施形態は、本発明のいずれかまたは全てのプローブ配列番号27〜203を組み合わせて、第一の増幅マルチプレックス反応の増幅産物と反応させる。(本明細書で使用する対照を含まない)サブコンビネーションまたはプローブの例示的な実施形態は、配列番号27〜125および配列番号131〜203を含む。
【０１２１】
より具体的な実施形態は、本発明のプローブ配列番号27〜44、46〜63、65〜71、73〜77、79〜97、99〜125、127、129、131〜203の選択したセットを組み合わせて、増幅マルチプレックス反応混合物番号1の増幅産物と反応させる。(本明細書で使用する対照を含まない)プローブのサブコンビネーションの例示的な実施形態は、配列番号27〜44、46〜63、65〜71、73〜77、79〜97、99〜125、および131〜203を含む。
【０１２２】
他の個々のプローブの例示的な実施形態には以下のプローブがある。
【０１２３】
配列番号204のその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。
【０１２４】
配列番号205のその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。
【０１２５】
配列番号206のその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。
【０１２６】
配列番号207のその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。
【０１２７】
配列番号208のその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。
【０１２８】
個々のプローブの他の具体的な実施形態は、その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失または付加と欠失の組合せを含み得る個々の核酸、表2中に列挙しマルチプレックス2と同定した核酸のいずれかに関する。
【０１２９】
さらなる実施形態は、本発明のいずれかまたは全てのプローブ配列番号204〜293、364および365を組み合わせて、第二の増幅マルチプレックス反応の増幅産物と反応させる。(本明細書で使用する対照を含まない)サブコンビネーションまたはプローブの例示的な実施形態は、配列番号204〜237、配列番号241〜293および配列番号364を含む。
【０１３０】
具体的な実施形態は、本発明のプローブ配列番号204、208、211、212、214、215、219、223、226、227、229、231、233、236、241、242、244、246、248、249、253〜256、261、264〜267、270、272、279〜281、284〜288、291、292、364、および365の選択したセットを組み合わせて、増幅マルチプレックス反応混合物番号2の増幅産物と反応させる。(本明細書で使用する対照を含まない)プローブのサブコンビネーションの例示的な実施形態は、配列番号204、208、211、212、214、215、219、223、226、227、229、231、233、236、241、242、244、246、248、249、253〜256、261、264〜267、270、272、279〜281、284〜288、291、292、および364を含む。
【０１３１】
さらに他の個々のプローブの例示的な実施形態には以下のプローブがある。
【０１３２】
配列番号294のその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。
【０１３３】
配列番号295のその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。
【０１３４】
配列番号296のその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。
【０１３５】
個々のプローブの他の具体的な実施形態は、その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失または付加と欠失の組合せを含み得る個々の核酸、表2中に列挙しマルチプレックス3と同定した核酸のいずれかに関する。
【０１３６】
さらなる実施形態は、本発明のいずれかまたは全てのプローブ配列番号294〜338を組み合わせて、第三の増幅マルチプレックス反応の増幅産物と反応させる。(本明細書で使用する対照を含まない)サブコンビネーションまたはプローブの例示的な実施形態は、配列番号294〜333を含む。
【０１３７】
他のさらなる具体的な実施形態は、本発明のプローブ配列番号294、296〜309、312、314、316、317、318、320〜323、326〜330、332、および335の選択したセットを組み合わせて、増幅マルチプレックス反応混合物番号3の増幅産物と反応させる。(本明細書で使用する対照を含まない)プローブのサブコンビネーションの例示的な実施形態は、配列番号294、296〜309、312、314、316、317、318、320〜323、326〜330、および332を含む。
【０１３８】
個々のプローブの追加の例示的実施形態には以下のプローブがある。
【０１３９】
配列番号339のその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。
【０１４０】
配列番号340のその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。
【０１４１】
配列番号341のその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。
【０１４２】
個々のプローブの他の具体的な実施形態は、その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失または付加と欠失の組合せを含み得る個々の核酸、表2中に列挙しマルチプレックス4と同定した核酸のいずれかに関する。
【０１４３】
さらなる実施形態は、本発明のいずれかまたは全てのプローブ配列番号339〜363および366〜374を組み合わせて、第四の増幅マルチプレックス反応の増幅産物と反応させる。(本明細書で使用する対照を含まない)サブコンビネーションまたはプローブの例示的な実施形態は、配列番号339〜352、配列番号356、配列番号357および配列番号366〜374を含む。
【０１４４】
他の具体的な実施形態は、本発明のプローブ配列番号339〜344、348、353および366〜374の選択したセットを組み合わせて、増幅マルチプレックス反応混合物番号4の増幅産物と反応させる。(本明細書で使用する対照を含まない)プローブのサブコンビネーションの例示的な実施形態は、配列番号339〜344、348および366〜374を含む。
【０１４５】
別の実施形態では、本発明のプローブ配列番号27〜374を使用して、前に記載した4個の増幅マルチプレックス反応のいずれかの増幅産物と反応させる。
【０１４６】
以下のプローブの組合せは、検出目的に特に有用であることが分かった。
【０１４７】
配列番号27〜44、46〜63、65〜71、73〜77、79〜97、99〜125、127、129、131〜203のいずれかのその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。本明細書に示すように、対照プローブ配列番号127および/または129は置換または除くことができる。
【０１４８】
配列番号204、208、211、212、214、215、219、223、226、227、229、231、233、236、241、242、244、246、248、249、253〜256、261、264〜267、270、272、279〜281、284〜288、291、292、364、および365のいずれかのその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。本明細書に示すように、対照プローブ配列番号365は置換または除くことができる。
【０１４９】
配列番号294、296〜309、312、314、316、317、318、320〜323、326〜330、332、および335のいずれかのその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。本明細書に示すように、対照プローブ配列番号335は置換または除くことができる。
【０１５０】
配列番号339〜344、348、353および366〜374のいずれかのその5'末端および/もしくは3'末端に0〜5個のヌクレオチド付加、欠失もしくは付加と欠失の組合せを含み得る核酸、またはその相補体。本明細書に示すように、対照プローブ配列番号353は置換または除くことができる。
【０１５１】
本発明はさらに、固形支持体上に固定された特異的プローブとのハイブリダイゼーション(例えば、マイクロアレイハイブリダイゼーション)による増幅産物の検出に及ぶ。試験試料が標的微生物の核酸を含有するとき、特異的増幅産物が形成される可能性がある。増幅時に、蛍光色素(例えばCy-3)がアンプリコン中に取り込まれ、蛍光スキャナーで検出される。オリゴヌクレオチドプローブの配列は複数の配列アラインメントを使用して選択して、それぞれの細菌および真菌種、網または属に特有の配列または配列の組合せを同定した。標的種または属の全てまたは大部分の菌株を網羅するために、標的細菌または真菌の核酸配列の偏在種特異的/属特異的検出用のいくつかのプローブが設計されてきている。いくつかの場合、一種当たり一アンプリコンは適切な同定に十分ではなかった。したがって数種に関しては、二種以上のアンプリコンを正確な同定用に使用した。LoyおよびBodrossyは、特異性、感度および均一性の基本的特徴を示すプローブセットの組合せを得るのに必要とされる条件を近年総説した(Loy、A.およびBodrossy、L.、2006、Clin.Chim.Acta 363:106〜119頁)。非常に特異的な認識、効率良い結合および均一な熱力学的挙動という理想的な性質は、実際に到達するのが困難な相容れない目標となることを、彼らは言及する。彼らは注意深い設計ルールを使用することを提案するが、これらのルールの予測値は固形支持体ハイブリダイゼーションに関して信頼性がないことが知られており、プローブの組合せの実験検証が必要とされることを彼らは認めている。彼らが示唆する別の手法は、プローブの組合せ戦略に冗長性を加えることである。しかしながら、より多くのプローブを加えることによって、小型化および並列化能力を制限しながらコストおよび複雑性が増大する。本発明の目的は、固形支持体上での一般的なハイブリダイゼーション条件下での、侵襲性細菌および真菌種の検出および同定用の、特異性、感度および均一性の目標に到達することができるプローブ配列の最適なセットを提供することである。
【０１５２】
本発明は、前に記載したPCRプライマー対で増幅した領域から選択されるハイブリダイゼーションプローブを特徴とする。最適マルチプレックスアッセイ用に選択したプローブは表2中に列挙する。しかしながら、いくつかの実施形態では、標的アンプリコンは当たり一プローブが、対照とする病原菌を検出するのに十分である可能性がある。例えば、アシネトバクターバウマニを検出するために使用した表2のプローブの中で、配列番号27、28、29、30または31間のただ1つ、2つ、3つ、または4つのプローブを使用するアッセイがさらに機能し得る。同じことが表2中に列挙する病原菌のそれぞれに関して真であることが分かる可能性もある。したがって、表4の病原菌の検出は、表2の全ての敗血症関連病原菌用プローブ、または表2の1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の病原菌特異的プローブを含むサブセレクションを用いて実施することができる。本明細書で使用する用語「病原菌特異的プローブ」は、所与の病原菌を検出するために使用する1つまたは複数のプローブを含む。当然ながら、表2中に列挙したプローブ以外の追加の病原菌特異的プローブを使用して、表4中に列挙する病原菌を検出することができる。
【０１５３】
本発明のさらに別の態様では、増幅プライマーをCy-3などのフルオロフォアで標識し、生成したアンプリコンは属-、群(時折多種複合型と呼ばれる)-または種-特異的捕捉プローブを用いたハイブリダイゼーションによって検出する。
【０１５４】
設計戦略の一部として、ハイブリダイゼーション用の全てのオリゴヌクレオチドプローブおよびPCRによるDNA増幅用のプライマーを、Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)プログラムパッケージ、およびプライマー解析ソフトウェアOligo(商標)6.7(Molecular Biology Insights inc.)などの市販のプログラムを使用したコンピュータ解析によって、ハイブリダイゼーションまたはPCR増幅に関するそれらの適性に関して評価した。PCRプライマー対の潜在的適性も、二量体または内部二次構造を形成する可能性、または3'末端における一ヌクレオチドの長いストレッチおよび高い割合のグアニンまたはシトシン残基の保有などの、望ましくない特徴が無いことを確認することによって合成前に評価した。同じ試験管中に一緒にいくつかのプライマー対が存在することによって、誤対合およびプライマー二量体などの望ましくない非特異的増幅産物の形成の可能性が増大するので、マルチプレックスPCRプライマーは課題となる。
【０１５５】
ヌクレオチド塩基の一文字コードは、国際生化学連合(IUB)に従い本明細書で使用しており、それらはA:アデニン、C:シトシン、G:グアニン、T:チミン、U:ウリジン、およびI:イノシンである。配列縮重に関して、IUBコードはM:アデニンまたはシトシン、R:アデニンまたはグアニン、W:アデニンまたはチミン、S:シトシンまたはグアニン、Y:シトシンまたはチミン、およびK:グアニンまたはチミンである。
【０１５６】
【表１】
2010532665.tif 000002
【０１５７】
本明細書に記載する病原菌を効率良く増幅するために、いくつかのプライマーを設計している。それぞれのオリゴヌクレオチドは、このようなオリゴヌクレオチドを本明細書に記載する目的以外の目的で使用することが考えられるので、その独自の有用性を個別に有することは理解されよう。例えば、本発明のプライマーは、より長いまたはより短いアンプリコンの増幅用に他のプライマーと組み合わせることができる。本発明のプローブは、マイクロアレイなどの検出ツールにおいて他のプローブと組み合わせることができる。
【０１５８】
プライマーまたはプローブのオリゴヌクレオチド配列は、二本鎖DNAの一方の鎖に由来してよい。プライマーまたはプローブは塩基A、G、C、またはTまたは類似体からなっていてよく、かつそれらは(1つまたは複数の)選択したヌクレオチド位置で縮重状態にして、標的細菌または真菌種の全菌株のDNA増幅を確実にすることが可能である。縮重プライマーは、配列中のミスマッチ位置において相補配列とのアニーリングおよび様々な関連配列の増幅を可能にする、いくらかの可能性を有するプライマーである。例えば、以下のプライマーAYATTAGTGCTTTTAAAGCCは、プライマーACATTAGTGCTTTTAAAGCCとATATTAGTGCTTTTAAAGCCの等モル混合物である。縮重は(1つまたは複数の)プライマーの特異性を明らかに低減させ、ミスマッチの機会が増大し、かつバックグラウンドノイズが増大することを意味し、さらに、増大した縮重は、個々のプライマーの濃度は低下し、512倍を超える縮重は避けることが好ましいことを意味する。したがって、アッセイの感度および/または特異性に影響を与えるのを避けるために、縮重プライマーは注意深く設計すべきである。イノシンは、通常塩基(A、T、CまたはG)のいずれかと結合することができる修飾塩基である。イノシンを使用してオリゴヌクレオチド中の縮重の数を最小にする。
【０１５９】
本発明はさらに、前に記載したPCRプライマー対で増幅した領域から選択される、すなわち表1中に列挙するプライマーによって増幅したPCRアンプリコン内で結合する、ハイブリダイゼーションプローブを特徴とする。最適マルチプレックスアッセイ用に選択したプローブの例示的な実施形態は表2中に列挙する。超高感度バイオセンサーなどのシグナル増幅法を使用して、選択したプライマー対で増幅した標的病原菌核酸または非増幅標的病原菌核酸のいずれかとのハイブリダイズにより選択した病原菌を検出するために、これらのプローブを使用することができる。複数の病原菌の同時検出用にプローブを他のプローブと組み合わせるとき、プローブの特異性は他のプローブの存在によって実質的に影響は受けないはずである。すなわち、それは依然として標的病原菌核酸とハイブリダイズする。1つの病原菌用に選択したプローブは、別の病原菌由来の核酸とはハイブリダイズしないことが好ましい。
【０１６０】
プライマーまたはプローブは、ユーザによって決定される任意の適切な長さであってよい。本発明の一実施形態では、プライマーおよび/またはプローブは(互いに無関係に)、例えば10〜50ヌクレオチド長(全体)、10〜40、10〜35、10〜30、12〜40、12〜25ヌクレオチド長(全体)、15〜25ヌクレオチド長(全体)、15〜20ヌクレオチド長(全体)などであってよい。簡潔にする目的で、10〜50ヌクレオチド長の長さの組合せの完全な一覧は本明細書では提供しないが、10〜50ヌクレオチド(全体)の間で見られる可能性があるそれぞれおよび各々の考えられる組合せが含まれるものとする。このような考えられる組合せのわずか数例を、以下の10〜30、11〜30、10〜29、11〜29、15〜17、14〜21などとして提供する。
【０１６１】
表1中に列挙するプライマー配列に関して、5'側の配列の短い(オリゴヌクレオチドの全長の20%までの)伸長または縮小を含む変異体配列も、本発明の目的である。本発明の一実施形態によれば、したがってプライマーは、その5'末端に1〜5個のヌクレオチドの付加を含み得る。さらに本発明の一実施形態によれば、プライマーはその5'末端に1〜5個のヌクレオチドの欠失を含み得る。
【０１６２】
表2中に列挙するプローブ配列に関して、標的遺伝子断片と比較して5'および/または3'側の配列の短い(20%)伸長、縮小および/または置換を含む変異体配列も、本発明の目的である。本発明の一実施形態によれば、したがってプローブは、その5'末端に1〜5個のヌクレオチドの付加を含み得る。本発明の別の実施形態によれば、したがってプローブは、その3'末端に1〜5個のヌクレオチドの付加を含み得る。さらに本発明の一実施形態によれば、プローブはその5'末端に1〜5個のヌクレオチドの欠失を含み得る。さらに本発明の一実施形態によれば、プローブはその3'末端に1〜5個のヌクレオチドの欠失を含み得る。
【０１６３】
本明細書で使用する用語「少なくとも2個」は、「少なくとも3個」、「少なくとも4個」、「少なくとも5個」、「少なくとも6個」、「少なくとも7個」、「少なくとも8個」、「少なくとも9個」、「少なくとも10個」、「少なくとも11個」、「少なくとも12個」、「少なくとも13個」、「少なくとも14個」、「少なくとも15個」、「少なくとも16個」、「少なくとも17個」、「少なくとも18個」、「少なくとも19個」、「少なくとも20個」、「少なくとも21個」、「少なくとも22個」、「少なくとも23個」、「少なくとも24個」、「少なくとも25個」、「少なくとも26個」、「少なくとも27個」、「少なくとも28個」などを包含する。
【０１６４】
本発明の別の実施形態では、プライマーおよび/またはプローブは(互いに無関係に)、少なくとも10ヌクレオチド長、少なくとも11ヌクレオチド長、少なくとも12ヌクレオチド長、少なくとも13ヌクレオチド長、少なくとも14ヌクレオチド長、少なくとも15ヌクレオチド長、少なくとも16ヌクレオチド長、少なくとも17ヌクレオチド長、少なくとも18ヌクレオチド長、少なくとも19ヌクレオチド長、少なくとも20ヌクレオチド長、少なくとも21ヌクレオチド長、少なくとも22ヌクレオチド長、少なくとも23ヌクレオチド長、少なくとも24ヌクレオチド長、少なくとも25ヌクレオチド長、少なくとも26ヌクレオチド長などであってよい。
【０１６５】
したがって表1および表2中に記載するプライマーおよび/またはプローブは、それらの5'末端および/または3'末端に追加のヌクレオチドを含むことができる。これらのヌクレオチドの同一性は変わる可能性がある。いくつかの場合、ヌクレオチドは従来のA、T、G、またはC塩基の中から選択することができるが、一方他の場合は、ヌクレオチドは当技術分野で知られているような修飾ヌクレオチドであってよい。しかしながら、本発明の一実施形態では、追加のヌクレオチドは、公開データベース中で見られる相当する遺伝子配列のいずれかにおいて見られるヌクレオチドに相当する可能性がある。
【０１６６】
本明細書で使用する用語「その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含む」は、オリゴヌクレオチドまたは核酸が、a)その5'末端に0、1、2、3、4もしくは5個の追加のヌクレオチド、b)その3'末端に0、1、2、3、4もしくは5個の追加のヌクレオチド、またはc)その5'末端に0、1、2、3、4もしくは5個の追加のヌクレオチドおよびその3'末端に0、1、2、3、4もしくは5個の追加のヌクレオチドのいずれかを有し得ることを意味する。
【０１６７】
本明細書で使用する用語「その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含む」は、オリゴヌクレオチドまたは核酸が、a)その5'末端において欠失した0、1、2、3、4もしくは5個のヌクレオチド、b)その3'末端において欠失した0、1、2、3、4もしくは5個のヌクレオチド、またはc)その5'末端において欠失した0、1、2、3、4もしくは5個のヌクレオチドおよびその3'末端において欠失した0、1、2、3、4もしくは5個のヌクレオチドのいずれかを有し得ることを意味する。
【０１６８】
本明細書で使用する用語「5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよび/または5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチドの欠失を含む」は、オリゴヌクレオチドまたは核酸が、a)その5'末端に0、1、2、3、4もしくは5個の追加のヌクレオチドおよびその3'末端において欠失した0、1、2、3、4もしくは5個のヌクレオチド、またはb)その3'末端に0、1、2、3、4もしくは5個の追加のヌクレオチドおよびその5'末端において欠失した0、1、2、3、4もしくは5個のヌクレオチド、またはc)その5'末端に0、1、2、3、4もしくは5個の追加のヌクレオチドおよびその3'末端に0、1、2、3、4もしくは5個の追加のヌクレオチド、またはd)その5'末端において欠失した0、1、2、3、4もしくは5個のヌクレオチドおよびその3'末端において欠失した0、1、2、3、4もしくは5個のヌクレオチドのいずれかを有し得ることを意味する。
【０１６９】
用語「0〜5個を含む」は、「1〜5個を含む」、「2〜5個を含む」、「3〜5個を含む」、「4〜5個を含む」、「0〜4個を含む」、「1〜4個を含む」、「2〜4個を含む」、「3〜4個を含む」、「0〜3個を含む」、「1〜3個を含む」、「2〜3個を含む」、「0〜2個を含む」、「0〜1個を含む」、「0個を含む」、「1個を含む」、「2個を含む」、「3個を含む」、「4個を含む」、または「5個を含む」も包含する。
【０１７０】
本明細書で使用する用語、核酸分子に関する「相補体」は、例えばその一部分において完全な(例えば100%の)整合性で、別の核酸分子と塩基対形成することができる分子を指す。
【０１７１】
本発明によれば、プライマーおよび/またはプローブを標識することができる。本発明の一実施形態では、プライマーをフルオロフォアで標識することができ、したがって標識した標的アンプリコンを提供することができる。別の実施形態では、プローブをフルオロフォアで標識することができる。
【０１７２】
本発明中で使用するのに適した検出可能な標識には、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物がある。本発明中で有用な標識には、標識ストレプトアビジン複合体との染色用のビオチン、磁気ビーズ(例えば、Dynabeads(商標))、蛍光色素(例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など)、放射性標識(例えば、3H、125I、35S、14C、または32P)、リン光標識、酵素(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびELISAにおいて一般に使用される他の酵素)、およびコロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)ビーズなどの比色分析用標識がある。このような標識の使用を教示する特許には、米国特許第3,817,837号、米国特許第3,850,752号、米国特許第3,939,350号、米国特許第3,996,345号、米国特許第4,277,437号、米国特許第4,275,149号、および米国特許第4,366,241号があり、これらのそれぞれはあらゆる目的でその全容が参照により本明細書に組み込まれている。蛍光標識はin vitro転写反応中に容易に加えることができ、したがって興味深い手段となる。
【０１７３】
本明細書で言及する特異的オリゴヌクレオチドに加えて、方法およびキットは、例えば対照プライマー、対照プローブ、対照試料などの対照をさらに含むことができる。対照の例示的な実施形態は本明細書中に示しているが、任意の型の対照を使用して方法を実証することができることを、当業者は理解しているはずである。
【０１７４】
表3中に例示するように、相当な割合の設計プライマーおよびプローブ配列が、実験実証手順中のそれらの低下した性能のために、最終的なマルチプレックスの組合せに関して保持されなかった。表1または表2中に列挙する配列のみが保持されていた。
【０１７５】
4つのマルチプレックスへの増幅反応の分離は好都合に働くことが分かったことは、本明細書において理解されよう。しかしながら、増幅は5つ以上の反応に分離することができる。例えば、不便ではあるが、マルチプレックス1、2、3または4のそれぞれは、2、3または4の異なる増幅反応、関連がある場合合計16までの反応に細分することが可能である。
【０１７６】
遺伝物質を増幅するために現在使用されている1つの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)である。しかしながら、いくつかの場合、核酸は増幅が必要とされないほど十分な量である可能性がある。
【０１７７】
類似した実験条件で使用するために方法を設計したので、それぞれのマルチプレックスに関するPCR増幅は同じ熱サイクルプロファイルを使用して実施することができ、これによって1つの装置(例えばサーモサイクラー)中で同時に全ての核酸標的の増幅を可能にすることができる。
【０１７８】
核酸増幅はPCRまたはRT-PCRによって実施されることが多いが、他の方法が存在する。このような方法の非制限的な例には、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、転写仲介増幅(TMA)、自律的配列複製(3SR)、核酸配列ベースの増幅(NASBA)、鎖置換型増幅(SDA)、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)、ループ仲介等温性増幅(LAMP)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、ヘリカーゼ依存性等温性DNA増幅(tHDA)、分岐型DNA(bDNA)、循環プローブ技術(CPT)、固相増幅(SPA)、ローリングサークル型複製技術(RCA)、リアルタイムRCA、固相RCA、分子パドロックプローブと結び付けたRCA(MPP/RCA)、アプタマーベースのRCA(アプタマーRCA)、固定型SDA、プライマー伸長事前増幅(PEP)、縮重オリゴヌクレオチドプライマーPCR(DOP-PCR)、配列非依存性シングルプライマー増幅(SISPA)、リンカーアダプターPCR、ヌクレアーゼ依存性シグナル増幅(NDSA)、分岐型増幅(RAM)、多置換型増幅(MDA)、リアルタイムRAM、および全ゲノム増幅(WGA)がある(Westin、L.et al.、2000、Nat.Biotechnol.18:199〜204頁;Notomi、T.et al、2000、Nucleic Acids Res.28:e63;Vincent、M.et al.、2004、EMBO reports 5:795〜800頁;Piepenburg、O.et al.、2006、PLoS Biology 4:E204;Yi、J.et al.、2006、Nucleic Acids Res、34:e81;Zhang、D.et al.、2006、Clin.Chim.Acta 363:61〜70頁;McCarthy、E.L.et al.、2007、Biosens.Biotechnol.22:126〜1244頁;Zhou、L.et al.、2007、Anal.Chem.79:7492〜7500頁;Coskun、S.and Alsmadi、O.、2007、Prenat.Diagn.27:297〜302頁;Biagini、P.et al.、2007、J.Gen.Virol.88:2629〜2701頁;Gill、P.et al.、2007、Diagn.Microbiol.Infect.Dis.59:243〜249頁;Lasken、R.S.and Egholm、M.、2003、Trends Biotech.21:531〜535頁)。
【０１７９】
本発明の範囲はPCR技術による増幅の使用に限られず、そうではなくて、核酸ベースの診断法の感度および/または迅速性を増大するために使用することができる、任意の核酸増幅法または任意の他の手順の使用を含む。本発明の範囲は、リアルタイムまたは増幅後検出技術、検出と組み合わせた任意の増幅技術、任意のハイブリダイゼーション核酸チップまたはアレイ技術、任意の増幅チップまたは増幅とマイクロアレイハイブリダイゼーション技術の組合せを含めた、任意の核酸増幅法および検出技術の使用にも及ぶ。微小流体システムまたは微小化学物質分析システム(μTAS)を使用する増幅および/または検出は、本発明の範囲下にある。任意の核酸塩基配列決定法による検出および同定も、本発明の範囲下にある。
【０１８０】
増幅産物の検出
本発明の範囲が特異的検出技術に限られないことも、本明細書において理解されるはずである。古典的に、増幅した核酸の検出は、標準的なエチジウムブロマイド染色アガロースゲル電気泳動によって実施される。簡潔に言うと、10μLの増幅混合物を、0.25μg/mLのエチジウムブロマイドを含有する2%アガロースゲルにおける電気泳動により分離する。次いでアンプリコンをUVトランスイルミネーター下で目に見える状態にする。分子量ラダーとの比較によってアンプリコンの大きさを推定する。しかしながら、通常の診断に関して迅速かつより実践的であり得る、特異的増幅産物を検出するための他の方法を使用することができることは明らかである。このような方法は、増幅後または最中の蛍光の検出に基づいてよい。
【０１８１】
増幅DNAをモニターするための1つの簡潔な方法は、エチジウムブロマイドまたはSYBR(登録商標)GreenI(Molecular Probes)などの挿入剤の蛍光の増大を測定することによって、その形成率を測定することである。より特異的な検出が必要とされる場合、蛍光ベースの技術は核酸増幅反応中の特異的産物の出現をモニターすることができる。Taqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を利用する、TagMan(商標)系(Applied Biosystems)中などの二重標識蛍光発生プローブの使用は良い一例である(Livak K.J.et al.、1995、PCR Methods Appl.4:357〜362頁)。TagMan(商標)プローブは増幅中に使用し、この「リアルタイム」検出は、PCR後の試料処理を排除し、したがってアンプリコンキャリーオーバーの危険を防止するので、密閉容器中で実施する。
【０１８２】
いくつかの他の蛍光ベースの検出法はリアルタイムで実施することができる。このような蛍光ベース方法の例には、隣接ハイブリダイゼーションプローブ(Wittwer、C、T.et al.、1997、BioTechniques 22:130〜138頁)、分子指標プローブ(Tyagi S.and Kramer F.R.、1996、Nat.Biotech.14:303〜308頁)およびスコルピオンプローブ(Whitcombe、D.et al.、1999、Nat.Biotechnol.17:804〜807頁)の使用がある。隣接ハイブリダイゼーションプローブは増幅プライマーに固有であるように設計する。1つのプローブの3'末端をドナーフルオロフォアで標識し、一方の隣接プローブの5'末端はアクセプターフルオロフォアで標識する。2つのプローブが極めて接近して(1〜5ヌクレオチド隔てて)特異的にハイブリダイズするとき、外部光源によって励起したドナーフルオロフォアは、より強い蛍光を発する第二のアクセプターによって吸収される光を発し、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)シグナルを生成する。分子指標プローブはステム-および-ループ構造を有し、この場合ループはプローブであり、ステムの底部には蛍光部分が一端に存在し、一方消光部分が他端に存在する。分子指標は蛍光発生する立体配座の変化を経て、そのときそれらはそれらの標的とハイブリダイズし、したがってそのクエンチャーからフルオロフォアを分離する。FRETの原理は、内蔵式蛍光光度計を備える空気循環式サーマルサイクラーにおけるPCRアンプリコンのリアルタイム検出に使用されている(Wittwer、C.T.et al.、1997、BioTechniques 22:130〜138頁)。PCRアンプリコンのリアルタイム検出用の装置は、SYBR(登録商標)GreenIなどの蛍光挿入剤またはFRET検出のいずれかと組み合わせて、迅速なPCRサイクルを可能にする。蛍光の検出に基づく方法は、それらは非常に簡潔、迅速および定量的なので、通常の診断における使用に特に有望である。
【０１８３】
増幅条件の例示的な実施形態を実施例の項で示す。しかしながら、本明細書で使用する用語「増幅条件」は、検出可能な量の標的を得るのに適した温度および/またはインキュベーション時間を指す。したがって、用語「類似した増幅条件」は、望む場合、それぞれの標的に関して類似した温度下で、アッセイを実施することができることを意味する。用語「類似した増幅条件」は、望む場合、それぞれの標的に関して類似したインキュベーション時間下で、アッセイを実施することができることも意味する。用語「類似した増幅条件」は、いくつかの場合、増幅サイクルの数を指すこともできる。しかしながら、サイクルの数が常に重要であるわけではないことは、当技術分野でよく知られている。例えば、いくつかの試料を他の試料に先んじて除去することができ、追加の増幅サイクル用に残すことができる。他の場合、用語「類似した増幅条件」は、使用するバッファーおよび増幅試薬(酵素、ヌクレオチド、塩など)の性質を指すこともできる。用語「類似した増幅条件」は、条件(例えば、時間、バッファー、サイクルの数、温度、または他のパラメータ)はわずかに変化する可能性があるか、または同じである可能性があることも意味する。
【０１８４】
検出条件の例示的な実施形態を実施例の項で示す。しかしながら、本明細書で使用する用語「類似した検出条件」は、検出可能なシグナルを得るのに適した、温度および/またはインキュベーション時間、検出するシグナルの性質(例えば、蛍光発光、発光スペクトルなど)または他のパラメータを指す。用語「類似した検出条件」は、条件はわずかに変化する可能性があるか、または同じである可能性があることも意味する。
【０１８５】
ハイブリダイゼーション条件の例示的な実施形態を実施例の項で示す。本明細書で使用する用語「類似したハイブリダイゼーション条件」は、望む場合、それぞれの標的に関して類似した温度下で、ハイブリダイゼーションアッセイを実施することができることを意味する。用語「類似したハイブリダイゼーション条件」は、望む場合、それぞれの標的に関して類似したインキュベーション時間下で、アッセイを実施することができることも意味する。用語「類似したハイブリダイゼーション条件」は、使用するハイブリダイゼーション溶液の性質(塩、ストリンジェンシーなど)を指すこともできる。用語「類似したハイブリダイゼーション条件」は、条件(例えば、時間、溶液、温度、または他のパラメータ)はわずかに変化する可能性があるか、または同じである可能性があることも意味する。
【０１８６】
したがってアンプリコン検出は、増幅産物とハイブリダイズする種特異的内部DNAプローブを使用するハイブリダイゼーションによって実施することができる。このようなプローブは、本明細書に記載するプライマーを使用してアンプリコンと特異的にハイブリダイズするように設計することができる。オリゴヌクレオチドプローブは、ビオチンまたはジゴキシゲニンまたは任意の他のレポーター分子で標識することができる。好ましい実施形態では、本発明中に記載するプライマーをCy3フルオロフォアで標識する。固形支持体上のハイブリダイゼーションは小型化の影響を受けやすい。しかしながら、液体アッセイ中または固形または半固形支持体上のハイブリダイゼーションは本明細書に包含される。
【０１８７】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者によって容易に決定可能であり、一般にプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に応じた経験的計算値である。一般に、長いプローブは適切なアニーリングに高温を必要とし、一方短いプローブは低温を必要とする。ハイブリダイゼーションは一般に、それらの融解温度未満の環境中に相補鎖が存在するとき、再アニーリングする変性DNAの能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列の間の望ましい相同性の程度が高いほど、使用することができる相対温度は高くなる。結果として、高い相対温度は反応条件を高ストリンジェンシー状態にする傾向があり、一方低い温度は低ストリンジェンシー状態にする傾向があることになる。
【０１８８】
検出はハイブリダイゼーション技術によって実施することもできる。例えば、病原菌の検出および同定は塩基配列決定によって実施することができる。核酸物質の同時増幅および検出はリアルタイムPCRを使用して実施することもできる。液体アッセイまたは固相アッセイ中の検出(チップ、アレイ、ビーズ、フィルム、膜など)も本明細書に包含される。
【０１８９】
オリゴヌクレオチドのマイクロアレイは、マルチパラメーターアッセイに非常に有用である技術となる。利用可能な低密度〜中密度アレイ(Heller、M.J.et al.、221〜224頁、Harrison、D.J.、and van den Berg、A.、1998、Micro total analysis systems'98、Kluwer Academic Publisher、Dordrecht)は、蛍光標識アンプリコンを特異的に捕捉し得る。ハイブリダイゼーションに関する検出法は蛍光に限られず、電位差測定法、比色分析およびプラズモン共鳴は代替検出法の数例である。ハイブリダイゼーションによる検出に加えて、核酸マイクロアレイを使用してハイブリダイゼーションによる迅速な塩基配列決定を実施することができる。質量分析もアンプリコンの迅速な同定、またはさらに増幅産物の塩基配列決定に適用可能であり得る(Chiu、N.H.and Cantor、C.R.、1999、Clin、Chem.45:1578;Berkenkamp、S.et al.、1998、Science 281:260〜262頁)。
【０１９０】
前に記載した増幅プライマーセットを使用して作製したPCRアンプリコンの内部領域を標的とするプローブ(すなわち、捕捉プローブ)を、したがって設計した。
【０１９１】
捕捉プローブは、リアルタイムPCR検出(例えば、TaqManプローブ、分子指標)、固形支持体ハイブリダイゼーション(例えば、核酸のマイクロアレイハイブリダイゼーション、磁気ビーズベースの捕捉)またはその他のいずれかに使用することができる。
【０１９２】
プローブの例示的な実施形態を表2中に示す。しかしながら当業者は、他のプローブを設計して、様々な有効性または特異性ではあるが、表1のプライマー対を使用して作製したPCRアンプリコンを検出することができることを理解するはずである。このように、プローブの同一性は表2中に示す一覧に限られず、PCRアンプリコンのセンスまたはアンチセンス鎖を含めたPCRアンプリコンの他の領域と特異的に結合することができる、任意のプローブにも及ぶ。
【０１９３】
アッセイ形式の将来像に関して、試料調製、遺伝子増幅、検出、およびμTASへのデータ解析を含めた段階の統合も考えられる(Anderson、R.C.et al.、11〜16頁、Harrison、D.J.、and van den Berg、A.、1998、Micro total analysis systems'98、Kluwer Academic Publisher、Dordrecht)。さらに別の実施形態では、本発明中に記載するプローブは、事前のPCR増幅の必要なしで使用することが可能である。核酸/ポリマー複合体の光学的性質に基づくポリマー製バイオセンサーの使用などの有望な超高感度検出技術(Najari、A.et al.、2006、Anal.Chem.78:7896〜7899頁;Dore、K.et al.、2006、J.Fluoresc.16:259〜265頁;Ho、H.-A.et al.、2005 J.Am.Chem.Soc.127;12673〜12676頁;Dore、K.et al.、2004、J.Am.Chem.Soc.126:4240〜4244頁;Ho、H.-A.et al.、2002、Angew.Chem.Int.Ed.41:1548〜1551頁)は、事前のPCR増幅の必要なしで、ハイブリダイゼーションプローブを使用する標的病原菌種の捕捉および検出を可能にし得る。
【０１９４】
マルチプレックスPCR増幅
PCR反応は、それぞれの微生物種に関して入手し望ましい濃度に希釈した鋳型ゲノムDNA調製物、望ましいポリメラーゼを使用する増幅に適したバッファー、所定濃度のプライマー、ジヌクレオチド三リン酸(dNTP)混合物およびDNAポリメラーゼを含有する混合物において実施することができる。試薬および溶液からの核酸汚染レベルを最小にするために、ストック溶液をろ過することができ、溶液を滅菌しUVにさらすことができる(例えば、9999μJ/cm2〜40000μJ/cm2でSpectrolinker(商標)XL-1000(Spectronics Corp.)を使用)。UV露出は特許出願WO03087402A1中に記載されたのと同様に調節することができる。増幅効率をモニターするために設計した内部対照は(1つまたは複数の)マルチプレックスアッセイに加えることができる。増幅実験は鋳型(陰性)対照反応を含まない可能性もある。増幅は任意のサーマルサイクラー中で実施することができる。増幅条件は、適切な変性条件を使用する核酸の変性の段階、適切なハイブリダイゼーション条件を使用するハイブリダイゼーション(アニーリング)の段階、ポリメラーゼによる適切な伸長条件を使用する伸長の段階を典型的には含む。アンプリコンは典型的には60℃〜95℃の範囲で溶かした。当業者によって知られているように、反応化学および循環条件は変わる可能性があり、異なるPCR試薬の組合せおよび熱循環型デバイスに関して最適化することができる。
【０１９５】
マイクロアレイハイブリダイゼーション
典型的には、二本鎖増幅産物を95℃で1〜5分間変性させ、次いでハイブリダイゼーション前に氷上で冷却する。二本鎖アンプリコンは、プローブとハイブリダイズする代わりにそれらの相補鎖と再度会合する傾向があるので、本発明の例示的な実施形態はハイブリダイゼーション用に一本鎖核酸を使用する。一本鎖アンプリコンを生成するための1つのこのような方法は、ファージラムダ由来のエキソヌクレアーゼで一本の鎖を消化することである。一本の鎖の優先的消化は、相補鎖用に5'末端リン酸化プライマーおよび標的鎖用に蛍光標識プライマーを使用することによって実施することができる(Boissinot K.et al.、2007、Clin.Chem.53:2020〜2023頁)。簡潔に言うと、このような修飾プライマーを用いて生成したアンプリコンは、10単位のラムダエキソヌクレアーゼ(New-England Biolabs)を直接PCR反応産物に加え、それらを37℃で5分間インキュベートすることによって消化した。このように消化した増幅産物は、任意の事前熱処理なしでマイクロアレイハイブリダイゼーションに容易に使用することができる。
【０１９６】
マイクロアレイは、スライドガラス表面上にオリゴヌクレオチドプローブをピンスポットすることによって典型的には作製されるが、当業者は、他の表面および表面上にプローブを結合させるための他の方法が存在し、それらも本発明によって含まれることを知っている。側方流動マイクロアレイは、最新の迅速な固形支持体ハイブリダイゼーション技術の一例となる(Carter、D.J.and Cary、R.B.、2007、Nucleic Acids Res.35:e74)。以下に記載する例示的実施例用に、5'アミノ-リンカーで修飾したオリゴヌクレオチドプローブをMicrospotting solution plus(TeleChem International)中に懸濁し、VIRTEK SDDC-2 Arrayer(Bio-Rad Laboratories)を使用してSuper Aldehyde slides(Genetix)に30μMでスポットした。DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドに加えて、ペプチド核酸(PNA)、固定核酸(LNA)およびホスホロチオエートなどのヌクレオチド類似体をプローブとして使用することができ、これらも本発明の目的である。
【０１９７】
典型的には、標的核酸のハイブリダイゼーションは中〜高ストリンジェンシー条件下で実施する。このような高ストリンジェンシー条件は、プローブと標的の間の相互作用の高い特異性を可能にする。固形支持体と結合したプローブおよびアンプリコンを含有するハイブリダイゼーション溶液を使用して、室温(19〜25℃)でハイブリダイゼーションを実施することができる。能動的ハイブリダイゼーションは微小流体デバイスを使用して実施することができ、この場合アンプリコンを含有するハイブリダイゼーション溶液がマイクロアレイ上を流れる。洗浄段階は様々なストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションを可能にする溶液を用いて実施することができる。微小流体型の手順は、洗浄段階およびリンス段階を含めて15分以内に典型的には実施する。当業者は、核酸のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は改変することができ、全プロセスが核酸認識に関する比較可能なストリンジェンシーをもたらす限り、比較可能なレベルの感度および特異性をさらに得ることができることを十分理解している。
【０１９８】
本発明の利点は、全てのマイクロアレイハイブリダイゼーションおよび洗浄手順は、4個のマルチプレックス増幅の組合せを使用して、全てのプローブに均一な条件下で実施することができることである。
【０１９９】
スライドをスキャンすることができ、ハイブリダイゼーションシグナルは、スキャンアレイ4000XL(PerkinElmer)またはG2505Bマイクロアレイスキャナー(Agilent)およびGenepix6(MDS Analytical Technologies)などの適切な装置を使用して定量化することができる。全てのハイブリダイゼーションシグナルはバックグラウンドシグナルに補正することができ、かつ対照オリゴヌクレオチドシグナルの割合として表すことができる。
【０２００】
ハイブリダイズ種の同定は、そこから特異的プローブパターンおよびハイブリダイゼーションの統計値を決定する、事前に得た参照ハイブリダイゼーションデータを使用して実施することができる。特異的プローブパターンはいずれも所与の種に独特なハイブリダイゼーションシグナルを一緒に生成し得る1つまたは複数のプローブのセットであるので、プローブパターンはハイブリダイズ種を容易に同定することができる。対照的に、ハイブリダイゼーションの統計値は、どの種がハイブリダイズした可能性が高いかの確率的推論(ベイジアンまたは他の推論法のいずれか)を可能にする。陽性ハイブリダイゼーションシグナルおよび陰性ハイブリダイゼーションシグナルを、マイクロアレイデータ解析の考慮に入れることができる。機械学習法などのさらなるデータ精製も、ハイブリダイゼーションデータを解釈するために使用することができる。
【０２０１】
本発明の他の態様は、本明細書に記載するオリゴヌクレオチドを含むことができるキットに関する。
【０２０２】
例示的な実施形態では、キットはアシネトバクターバウマニ、アシネトバクタールヴォフィイ、エロモナスキャビエ、エロモナスヒドロフィラ、セレウス菌、枯草菌、シトロバクターブラキ、シトロバクターフロインディ、シトロバクターコゼリ、エンテロバクターエロゲネス、エンテロバクタークロアカエ、エンテロバクターサカザキ、エンテロコッカスフェシウム、ゲメラヘモリサンス、ゲメラモルビロラム、インフルエンザ菌、キンゲラキンゲ、クレブシエラオキシトカ、肺炎桿菌、モルガネラモルガニイ、淋菌、髄膜炎菌、パスツレラムルトシダ、プロピオニバクテリウムアクネス、プロテウスミラビリス、プロピデンシアレットゲリ、緑膿菌、豚コレラ菌、セラチアリクファシエンス、セラチアマルセッセンス、ストレプトコッカスアガラクティエ、ストレプトコッカスアンギノサス、ストレプトコッカスボビス、ミュータンス連鎖球菌、唾液連鎖球菌、ストレプトコッカスサングイニス、ストレプトコッカススイス、ビブリオバルニフィカス、腸炎エルシニア、ペスト菌/偽結核性エルシニア菌、大便連鎖球菌、クロストリジウムパーフリンジェンス、コリネバクテリウムジェイケイウム、およびカプノサイトファーガカニモルサスからなる群から選択される病原菌由来の遺伝物質の特異的増幅用の複数のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０２０３】
別の例示的な実施形態では、キットはシトロバクターフロインディ、シトロバクターコゼリ、エンテロバクターエロゲネス、エンテロバクタークロアカエ、エンテロバクターサカザキ、クレブシエラオキシトカ、肺炎桿菌、豚コレラ菌、リステリアモノサイトゲネス、パスツレラニューモトロピカ、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカスヘモリチカス、スタフィロコッカスホミニス、スタフィロコッカスサッカロリティカス、スタフィロコッカスサプロフィティカス、スタフィロコッカスワーネリー、ストレプトコッカスディスガラクティエ、肺炎連鎖球菌、および化膿連鎖球菌からなる群から選択される病原菌由来の遺伝物質の特異的増幅用の複数のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０２０４】
さらなる例示的な実施形態では、キットはカンジダアルビカンス、カンジダグラブラタ、カンジダパラプシロシス、カンジダトロピカリス、カンジダクルセイ、アスペルギルスフミガーツス、アスペルギルスニガー、アスペルギルスニダランス、アスペルギルスフラバス、およびアスペルギルステレウスからなる群から選択される病原菌由来の遺伝物質の特異的増幅用の複数のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０２０５】
さらに別の例示的な実施形態では、キットはバクテロイデスフラジリス、マルタ熱菌、バークホルデリアセパシア、ステノトロホモナスマルトフィリア、大腸菌および赤痢菌種からなる群から選択される病原菌由来の遺伝物質の特異的増幅用の複数のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０２０６】
本発明によればキットは、前に列挙した病原菌種または4群の1つのそれぞれの増幅用のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０２０７】
さらに本発明によれば、キットは、別個の容器中に、または固形支持体と結合した病原菌種のそれぞれの検出用のオリゴヌクレオチドをさらに含むことができる。
【０２０８】
さらに本発明によれば、オリゴヌクレオチドは、それぞれが個々のオリゴヌクレオチドを含むことができる別個の容器中に提供することができる。容器は特異的プライマー対をさらに含むことができる。オリゴヌクレオチドは、それぞれの望ましい遺伝物質の増幅用のオリゴヌクレオチドの混合物を含む単一の容器中に提供することができる。
【０２０９】
別の態様では、本発明は表4中に列挙する病原菌種の検出用プローブを含むキットに関する。本発明の一実施形態によれば、キットは表4中に列挙する病原菌種のそれぞれの検出用プローブを含むことができる。本発明の別の実施形態によれば、キットは検出/同定目的で特に有用であるプローブを含むことができる。
【０２１０】
本発明は、さらなる態様において、固形基材(支持体)および固形基材(支持体)と結合した複数の位置的に識別可能なプローブを含むことができるアレイに関する。それぞれのプローブは異なる核酸配列を含み、表4中に列挙する病原菌からなる群から選択される病原菌と特異的に結合することができる。
【０２１１】
本発明によれば、それぞれのプローブは10〜50個のヌクレオチドを独立に含むことができる。
【０２１２】
本発明のさらに特定の態様は、
a)配列番号27〜配列番号125、配列番号131〜配列番号202もしくは配列番号203またはそれらの相補体に対する0〜5個のヌクレオチド付加および/または欠失を含むオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーであって、付加および/または欠失が核酸配列の5'末端および/または3'末端に位置するメンバー、
b)配列番号204〜配列番号237、配列番号241〜配列番号293もしくは配列番号364またはそれらの相補体に対する0〜5個のヌクレオチド付加および/または欠失を含むオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーであって、付加および/または欠失が核酸配列の5'末端および/または3'末端に位置するメンバー、
c)配列番号294〜配列番号332もしくは配列番号333またはそれらの相補体に対する0〜5個のヌクレオチド付加および/または欠失を含むオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーであって、付加および/または欠失が核酸配列の5'末端および/または3'末端に位置するメンバー、
d)配列番号339〜配列番号352、配列番号356、配列番号357、配列番号364、配列番号366〜配列番号373、もしくは配列番号374またはそれらの相補体に対する0〜5個のヌクレオチド付加および/または欠失を含むオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーであって、付加および/または欠失が核酸配列の5'末端および/または3'末端に位置するメンバー
を含むことができるアレイであって、
それぞれのオリゴヌクレオチドが固形支持体と結合し、それぞれのオリゴヌクレオチドが指定可能な位置に位置するアレイに関する。
【０２１３】
プローブの亜群は検出を実施するのに適していることが分かっている。例えば、具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは
a)配列番号27〜配列番号44、配列番号46〜配列番号63、配列番号65〜配列番号71、配列番号73〜配列番号77、配列番号79〜配列番号97、配列番号99〜配列番号125、配列番号131〜配列番号202および配列番号203からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよびその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体
からなる群から選択することができる。
【０２１４】
別の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは
a)配列番号204、配列番号208、配列番号211、配列番号212、配列番号214、配列番号215、配列番号219、配列番号223、配列番号226、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号236、配列番号241、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号249、配列番号253〜配列番号256、配列番号261、配列番号264〜配列番号267、配列番号270、配列番号272、配列番号279〜配列番号281、配列番号284〜配列番号288、配列番号291、配列番号292および配列番号364からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよびその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体
からなる群から選択することができる。
【０２１５】
さらに別の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは
a)配列番号294、配列番号296〜配列番号309、配列番号312、配列番号314、配列番号316、配列番号317、配列番号318、配列番号320〜配列番号323、配列番号326〜配列番号330および配列番号332からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよびその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体
からなる群から選択することができる。
【０２１６】
別の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは
a)配列番号339〜配列番号344、配列番号348、配列番号366〜配列番号373および配列番号374からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよびその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体
からなる群から選択することができる。
【０２１７】
本発明は、必要のある個体における血流感染の診断法であって、表4中に列挙する病原菌からなる群から選択される病原菌の遺伝物質と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドで、個体から得た試料の病原菌の存在の有無を検出する段階を含み、遺伝物質を配列番号375、配列番号376、配列番号377または配列番号378のいずれか1つまたは全て、ならびに配列番号1〜配列番号125、配列番号131〜配列番号237、配列番号241〜配列番号333、配列番号339〜配列番号352、配列番号356、配列番号357、配列番号364、配列番号366〜配列番号373および配列番号374のいずれか1つからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドで検出する方法に関する。したがって試験試料中の病原菌の存在(病原菌の遺伝物質の存在)は、検出する病原菌に関連する血流感染の指標である可能性がある。本発明の方法を実施することによって、試験試料中に存在する(1種または複数種の)病原菌をしたがって適切に同定することができる。このように、患者の適切な治療を開始することができる。
【０２１８】
本発明によれば、遺伝物質は配列番号1〜配列番号125、配列番号131〜配列番号237、配列番号241〜配列番号333、配列番号339〜配列番号352、配列番号356、配列番号357、配列番号364、配列番号366〜配列番号373および配列番号374のいずれか1つからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドで検出することができる。
【０２１９】
本発明はさらに、追加の態様において、本明細書に記載する少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのライブラリーに関する。
【０２２０】
本発明によれば、それぞれのオリゴヌクレオチドは別個の容器中に提供することが可能であり、または固形支持体と結合させることが可能である。
【０２２１】
本発明の例示的な実施形態では、ライブラリーは
a)配列番号27〜配列番号125、配列番号131〜配列番号202または配列番号203からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよび/またはその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体を含むことができる。
【０２２２】
本発明の別の例示的な実施形態では、ライブラリーは
a)配列番号204〜配列番号237、配列番号241〜配列番号293または配列番号364からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチド欠失および/またはその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体を含むことができる。
【０２２３】
本発明のさらなる例示的な実施形態では、ライブラリーは
a)配列番号294〜配列番号332または配列番号333からなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよび/またはその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体を含むことができる。
【０２２４】
本発明の追加の例示的実施形態では、ライブラリーは
a)配列番号339〜配列番号352、配列番号356、配列番号357、配列番号366〜配列番号373、または配列番号374のいずれか1つからなる群から選択される配列を有するかまたはそれらからなるオリゴヌクレオチド、
b)その5'末端および/または3'末端に0〜5個の追加のヌクレオチドを含むa)のオリゴヌクレオチド、
c)その5'末端および/または3'末端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、
d)その5'末端または3'末端の一端に0〜5個の追加のヌクレオチドおよび/またはその5'末端または3'末端の他端に0〜5個のヌクレオチド欠失を含むa)のオリゴヌクレオチド、ならびに
e)上記のいずれか1つの相補体を含むことができる。
【０２２５】
本発明によれば、ライブラリーのオリゴヌクレオチドは標識を含むことができる。
【０２２６】
本発明によれば、ライブラリーのオリゴヌクレオチドは固形支持体と結合させることが可能である。
【０２２７】
本発明を、以下の非制限的な実施例によってさらに詳細に例示する。
【実施例】
【０２２８】
(実施例1)
73種の敗血症関連細菌および真菌の増殖および検出
4種類のマルチプレックスPCRアッセイを、DNA増幅装置Rotor-Gene(商標)(Corbett life science)を用いて試験した。これらのマルチプレックスPCR試験は、tuf、recA、および/またはtef1遺伝子配列に特異的なプライマーを含む。すべてのPCR反応は、混合物25μLで行った。この混合物は、試験し所望の濃度に希釈した73種(表4)のそれぞれから事前に得た精製鋳型ゲノムDNA調製物1μL、1×PC2緩衝液(Ab Peptides、inc.)(1×PC2は、50mM Tris-HCl、pH9.1、16mM(NH4)2SO4、3.5mM MgCl2、0.150mg/mLウシ血清アルブミン)、塩化マグネシウムの最終濃度が4.5mMとなるように添加したMgCl2(Promega)、BSAの最終濃度が2.15mg/mLとなるように添加したウシ血清アルブミン画分V(Sigma)、0.4〜1.2μMの各HPLC精製プライマー(各プライマーの最適濃度は、最大の増幅収量となるように調整した)、0.2mMの4種類のジヌクレオチド三リン酸(dNTPs)ミックス(GE Healthcare)、およびHot Start法(Clontech)用のTaqStart(登録商標)抗体に結合する0.05U/μL Klentaq(登録商標)DNAポリメラーゼ(Ab Peptides、inc.)を含む。可能な場合はいつも、試薬および溶液からの核酸汚染レベルを最小限にするために、ストック溶液を0.1μmポリエーテルスルホン膜(Pall)でろ過した。0.1μmのろ過に加えて、水およびTEのオートクレーブもした。DNAの汚染を制御するために、8-メトキシプソラレン(8-Mop)(Sigma)を、0.13μg/μLとなるように反応マスター混合物に添加し、Spectrolinker(商標)XL-1000(Spectronics Corp.)を用いて30,000μJ/cm2でUVを照射した。このUV照射の後、4種類のマルチプレックスの組合せのそれぞれに対して、増幅効率をモニタリングするために設計した内部コントロールのコピー10〜25個を添加した。これらのコントロールは、マルチプレックス混合物中に存在する2つのプライマー配列に相補的な配列が隣接した標的遺伝子に無関係のタグ配列を用いて作製した。このような増幅内部コントロールの設計および使用は既に開示されている(Ke,D.ら、2000、Clin.Chem.、46:324-331;Hoorfar,J.ら、2004、APMIS、112:808-814;Hoorfar,J.ら、2004、J.Clin.Microbiol.、42:1863-1868)。また、すべての増幅は、DNAを含まない水または1×TEを鋳型として用いる鋳型のない(陰性)コントロール反応を含んでいた。サーモサイクラー装置で直接、アンプリコンをPCR後に検出する場合、上記したPCR混合物に1×SYBR(登録商標)Green(Molecular Probes)を添加し、異なるアンプリコンを融解曲線解析によって識別した。Rotor-Gene(商標)装置の一様なサイクリング条件は、95℃で1分、次いで95℃で1秒を40サイクル、60℃で10秒、そして72℃で20秒である。アンプリコンは、60℃〜95℃の範囲で融解した。マルチプレックスPCRアッセイの解析感度は、73種(表4)と同等のゲノムコピー10,000〜3個の範囲で試験して決定した。
【０２２９】
第1のマルチプレックスには、プライマー配列番号375および376(国際特許出願PCT/CA00/01150の配列番号636および637に一致する)ならびに配列番号1〜8を含めた。すべてのプライマーは、0.4μMで用いた配列番号3および4を除いて1μMで用いた。
【０２３０】
第2のマルチプレックスには、プライマー配列番号9〜14を含めた。すべてのプライマーは、1μMで用いた配列番号9および10を除き、1.2μMで用いた。
【０２３１】
第3のマルチプレックスには、プライマー配列番号15〜21を含めた。プライマー配列番号15〜17は1μMで用い、配列番号18〜21は0.8μMで用いた。
【０２３２】
第4のマルチプレックス(バージョン1)には、プライマー配列番号22〜25およびプライマー配列番号377および378(国際特許出願PCT/CA00/01150の配列番号1661および1665に一致する)を含めた。すべてのプライマーは、1.0μMで用いた配列番号22および23を除き、0.6μMで用いた。
【０２３３】
これらの実験の結果は、試験した73種の細菌および真菌(表4)の検出限界が、1回のPCR反応当たり微生物ゲノムコピー3〜50個の範囲であることを示唆している。さらに、各マルチプレックスPCRの組合せに対して、PCRアッセイの特異性を、濃縮ヒトゲノムDNAのコピー10,000個を用いて検証した。一切の増幅産物を検出できなかった。
【０２３４】
したがって、上記の条件で、73種の敗血症関連細菌および真菌の増幅および検出が、一様な増幅条件を用いた4種類のマルチプレックス形式でのPCRプライマーの組合せと、アンプリコンを検出するためのPCR後のSYBR Green I融解曲線解析とによって可能になった。
【０２３５】
(実施例2)
マイクロアレイを用いた73種の細菌および真菌の検出および同定
各プライマー対の一方のプライマーの5'末端をリン酸化し、他方のプライマーの5'末端をCy-3で標識したことを除き、実施例1と同様にPCRを行った。このような改変プライマーで作製したアンプリコンを、ラムダエキソヌクレアーゼ(New-England Biolabs)10単位をPCR反応産物に直接添加し、37℃で5分間インキュベートして消化した(Boissinot K.ら、2007、Clin.Chem.、53:2020-2023)。このように消化した増幅産物は、事前に一切の熱処理をせずに、直ちにマイクロアレイハイブリダイゼーションに使用した。消化したアンプリコン4.8μLを、得られる溶液が、6×SSPE(OmniPur;EM Sciences)、0.03%ポリビニルピロリドン、30%ホルムアミド、5nMハイブリダイゼーションコントロールCy-3標識オリゴヌクレオチドbbc1(GAGTATGGTCTGCCTATCCT)、0.5μMハイブリダイゼーションコントロールCy-5標識オリゴヌクレオチドbbc2(ACACTGCGATGCGTGATGTA)、総量20μLとなるようにハイブリダイゼーション溶液に希釈した。この全20μLを用いて、受動的ハイブリダイゼーションを行った。受動的ハイブリダイゼーション(1時間)は、アンプリコンを含むハイブリダイゼーション溶液20μLが添加されたマイクロアレイスライドに並置されたガラスリフタースリップ(Erie Scientific)を用いて室温(19〜25℃)で行った。したがって、各プローブを、特定の識別可能な位置にスポットした。0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む0.2×SSPEで洗浄ステップを行い、次いで0.2×SSPEですすいだ。スライドを、ScanArray 4000XL(PerkinElmer)またはG2505B Microarray Scanner(Agilent)を用いてスキャニングし、ハイブリダイゼーションシグナルをGenepix6(MDS Analytical Technologies)用いて定量した。すべてのハイブリダイゼーションシグナルを、バックグラウンドシグナルについて補正し、コントロールオリゴヌクレオチドシグナルのパーセンテージとして表した。
【０２３６】
第1のマルチプレックスPCRによって作製したアンプリコンを、プローブの組合せ:配列番号27〜203を用いてマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。
【０２３７】
第2のマルチプレックスPCRによって作製したアンプリコンを、プローブの組合せ:配列番号204〜293を用いてマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。
【０２３８】
第3のマルチプレックスPCRによって作製したアンプリコンを、プローブの組合せ:配列番号294〜338を用いてマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。
【０２３９】
第4のマルチプレックスPCR(バージョン1)によって作製したアンプリコンを、プローブの組合せ:配列番号339〜363を用いてマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。
【０２４０】
これらの実験の結果は、マイクロアレイ検出での解析感度が、ハイブリダイゼーションパターン解析および/またはハイブリダイゼーションシグナルの統計的推論解析を用いることによって、4種類のマルチプレックスPCRの組合せを用いて試験した73種の細菌および真菌のそれぞれのPCR反応当たり微生物ゲノムコピー10〜50個の範囲であったことを示している。
【０２４１】
マイクロアレイ検出の特異性を、濃縮(1〜5ng)ゲノムDNAを用いた4種類のマルチプレックスPCRの組合せを用いた73種の細菌および真菌のそれぞれの増幅によって検証した。鋳型DNAの同定を、ハイブリダイゼーションパターン解析および/またはハイブリダイゼーションシグナルの統計的推論解析を用いて行った。ある程度高い濃度の標的核酸では、近似した腸内細菌科(Enterobacteriaceae)種間の区別がいつもではないが時に容易である。したがって、同定の確かさは、大腸菌とシトロバクターフロインディと豚コレラ菌を区別するためにより識別しやすい(実施例3-5を参照)配列領域を選択して改善することができる。
【０２４２】
アッセイの特異性を、実施例1に記載したように濃縮ヒトゲノムDNAのコピー10,000個を用いて検証したが、ヒト鋳型ではハイブリダイゼーションシグナルを一切検出できなかった。
【０２４３】
したがって、マイクロアレイハイブリダイゼーションに用いる捕捉プローブにより、上記の実験条件下で、試験した73種の細菌および真菌からPCRによって作製したアンプリコンの特異的で高感度の広範な検出および同定が可能になった。
【０２４４】
(実施例3)
アッセイの改善-病原菌核酸の増幅
4種類のマルチプレックスPCRアッセイを、大腸菌の特異的な検出を改善するためにマイクロアレイ上のプローブの組合せ(実施例4を参照)を用いて第4のマルチプレックス(バージョン1)のプライマーの組合せを変更した点を除き、実施例1に記載したように行った。マイクロアレイ上のハイブリダイゼーションシグナルを増大させるために多数の内部コントロールのコピー(25〜40個)を用いてPCRも行った(実施例4を参照)。マルチプレックスPCRアッセイの解析感度を、それぞれの種に等しいゲノムコピー10,000〜10個の範囲で試験して決定した。
【０２４５】
すべてのマルチプレックスPCRには、第4のマルチプレックスでプライマー配列番号24および25をプライマーの組合せから排除し、プライマー配列番号377および378をプライマー配列番号26で置き換えた点を除き、実施例1に記載した組合せと同じプライマーの組合せを含めた。すべてのプライマーは、1μMで用いた。検出は、実施例1に記載したように行った。
【０２４６】
これらの実験の結果は、試験した73種の細菌および真菌の検出限界が、1回のPCR反応当たり微生物ゲノムコピー10〜50個の範囲であることを示唆している。各マルチプレックスPCRの組合せに対して、PCRアッセイの特異性を、濃縮ヒトゲノムDNAのコピー10,000個を用いて検証した。一切の増幅産物を検出できなかった。
【０２４７】
4種類のマルチプレックスPCRアッセイにより、アンプリコンを検出するためのPCR後のSYBR Green I融解曲線解析と組み合わせると、73種の細菌および真菌の高感度で広範な増幅が可能になった。
【０２４８】
(実施例4)
アッセイの改善-マイクロアレイを用いた病原菌核酸の検出
各プライマー対の一方のプライマーの5'末端をリン酸化し、他方のプライマーの5'末端をCy-3標識した点を除き、実施例3に記載したようにPCRを行った。ラムダエキソヌクレアーゼによるアンプリコンの消化、マイクロアレイ上の受動的ハイブリダイゼーション、およびシグナルの取得は、実施例2と同様に行った。
【０２４９】
第1のマルチプレックスPCRによって作製したアンプリコンを、プローブの組合せ:配列番号27〜203を用いてマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。
【０２５０】
第2のマルチプレックスPCRによって作製したアンプリコンを、プローブの組合せ:配列番号204〜293、364、および365を用いてマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。
【０２５１】
第3のマルチプレックスPCRによって作製したアンプリコンを、プローブの組合せ:配列番号294〜338を用いてマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。
【０２５２】
第4のマルチプレックスPCR(バージョン2)によって作製したアンプリコンは、プローブの組合せ:配列番号339〜363および366〜374を用いてマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。
【０２５３】
これらの実験の結果は、マイクロアレイ検出での解析感度が、ハイブリダイゼーションパターン解析および/またはハイブリダイゼーションシグナルの統計的推論解析を用いることによって、4種類のマルチプレックスPCRの組合せを用いて試験した73種の細菌および真菌のそれぞれに対して微生物ゲノムコピー10〜100個であったことを示している。
【０２５４】
マイクロアレイ検出の特異性を、濃縮(1〜5ng)ゲノムDNAを用いた4種類のマルチプレックスPCRの組合せを用いた73種の細菌および真菌のそれぞれの増幅によって検証した。鋳型DNAの同定を、ハイブリダイゼーションパターン解析および/またはハイブリダイゼーションシグナルの統計的推論解析を用いて行った。
【０２５５】
アッセイの特異性を、実施例1に記載したように濃縮ヒトゲノムDNAのコピー10,00個を用いて検証したが、ヒト鋳型ではハイブリダイゼーションシグナルを一切検出できなかった。
【０２５６】
このアッセイの特異性を、130の他の近似病原菌種でも検証した。PCR後のSYBR Green I融解曲線解析によってアンプリコンが検出された場合、ゲノムDNA 1ngをマルチプレックスPCR反応物に添加し、それぞれのマイクロアレイ上にハイブリダイズさせた。このアッセイの標的である細菌種および真菌種の同定を向上させるために、クロスハイブリダイゼーションシグナルをハイブリダイゼーションパターン解析および/またはハイブリダイゼーションシグナルの統計的推論解析に含めた。
【０２５７】
マイクロアレイハイブリダイゼーションに使用した捕捉プローブにより、試験した73種の細菌および真菌からPCRによって作製したアンプリコンの特異的で高感度の広範な検出および同定が可能になった。
【０２５８】
(実施例5)
マイクロ流体ハイブリダイゼーション自動システムおよびマイクロアレイを用いた病原菌の検出および同定
例示的な実施形態では、第3のマルチプレックスおよび第4のマルチプレックス(バージョン2)のみを用いて能動的ハイブリダイゼーションを行った。
【０２５９】
各プライマー対の一方のプライマーの5'末端をリン酸化し、他方のプライマーの5'末端をCy-3標識した点を除き、実施例3に記載したようにPCRを行った。ラムダエキソヌクレアーゼによるアンプリコンの消化を、実施例2と同様に行った。このように消化した増幅産物は、事前に一切の熱処理をせずに、直ちにマイクロアレイハイブリダイゼーションに使用した。消化したアンプリコン4.8μLを、得られる溶液が、6×SSPE(OmniPur;EM Sciences)、0.03%ポリビニルピロリドン、30%ホルムアミド、5nMハイブリダイゼーションコントロールCy-3標識オリゴヌクレオチドbbc1(GAGTATGGTCTGCCTATCCT)、0.5μMハイブリダイゼーションコントロールCy-5標識オリゴヌクレオチドbbc2(ACACTGCGATGCGTGATGTA)、総量20μLとなるようにハイブリダイゼーション溶液に希釈した。2μLを用いて、能動的ハイブリダイゼーションを行った。能動的ハイブリダイゼーション(5分間)は、CD系ポリジメチルシロキサンマイクロ流体装置を用いて、上記したように、室温(19〜25℃)でマイクロアレイ上に溶液を流して行った(Peytavi,R.ら、2005、Clin.Chem.、51:1836-1844)。0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む0.2×SSPEで洗浄ステップを行い、次いで0.2×SSPEですすいだ。マイクロ流体式の方法は、洗浄とすすぎを含めても15分以内で行うことができる。スライドを、ScanArray 4000XL(PerkinElmer)またはG2505B Microarray Scanner(Agilent)を用いてスキャニングし、ハイブリダイゼーションシグナルをGenepix6(MDS Analytical Technologies)用いて定量した。すべてのハイブリダイゼーションシグナルを、バックグラウンドシグナルについて補正し、コントロールオリゴヌクレオチドシグナルのパーセンテージとして表した。
【０２６０】
第3のマルチプレックスPCRによって作製したアンプリコンを、プローブの組合せ:配列番号294、296〜309、312、314、316、317、318、320〜323、326〜330、332、および335を用いてマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。
【０２６１】
第4のマルチプレックスPCR(バージョン2)によって作製したアンプリコンを、プローブの組合せ:配列番号339〜344、348、353、および366〜374を用いてマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。
【０２６２】
マイクロアレイ検出での解析感度は、第3のマルチプレックスPCRによって増幅した10種の真菌のそれぞれに対して微生物ゲノムコピー10個であり、第4のマルチプレックスPCR(バージョン2)によって増幅した5種の細菌のそれぞれに対して微生物ゲノムコピー10〜25個であった。
【０２６３】
マイクロアレイ検出の特異性を、濃縮(1〜5ng)ゲノムDNAを用いた第3および第4のマルチプレックスPCR(バージョン2)を用いた5種の細菌および10種の真菌の増幅によって検証した。鋳型DNAの同定を、ハイブリダイゼーションパターン解析および/またはハイブリダイゼーションシグナルの統計的推論解析を用いて行った。
【０２６４】
このアッセイの特異性を、40の他の近似病原菌種でも検証した。PCR後のSYBR Green I融解曲線解析によってアンプリコンが検出された場合、ゲノムDNA 1ngをPCR反応物に添加し、それぞれのマイクロアレイにハイブリダイズさせた。このアッセイの標的である細菌および真菌種の同定を向上させるために、クロスハイブリダイゼーションシグナルをハイブリダイゼーションパターン解析および/またはハイブリダイゼーションシグナルの統計的推論解析に含めた。
【０２６５】
マイクロアレイハイブリダイゼーションに使用した捕捉プローブにより、自動CD系マイクロ流体ハイブリダイゼーションシステムを用いた、試験した5種の細菌および10種の真菌からPCRによって作製したアンプリコンの特異的で高感度の広範な検出および同定が可能になった。
【０２６６】
(実施例6)
スパイクした血液からの病原菌の同定
スパイクした血液からの最も重要な血流感染病原菌の特異的同定をマルチプレックスPCRによって行った。このような病原菌は、後述するマイクロアレイおよびプローブ配列の組合せの限定的なセットを用いてマイクロ流体ハイブリダイゼーション自動システムで検出した。
【０２６７】
血液試料を、血流感染を引き起こす選択した細菌および真菌病原菌、すなわちアシネトバクターバウマニ、バクテロイデスフラジリス、シトロバクターフロインディ、シトロバクターコゼリ、エンテロバクターエロゲネス、エンテロバクタークロアカエ、大便連鎖球菌、エンテロコッカスフェシウム、大腸菌、インフルエンザ菌、クレブシエラオキシトカ、肺炎桿菌、プロテウスミラビリス、緑膿菌、セラチアマルセッセンス、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカスヘモリチカス、スタフィロコッカスホミニス、スタフィロコッカスワーネリー、ステノトロホモナスマルトフィリア、ストレプトコッカスアガラクティエ、ストレプトコッカスアンギノサス、ストレプトコッカスディスガラクティエ、ミュータンス連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカスサングイニス、アスペルギルスフミガーツス、カンジダアルビカンス、カンジダグラブラタ、カンジダクルセイ、カンジダパラプシロシス、カンジダトロピカリスからの様々な量の培養細胞を用いてスパイクした。
【０２６８】
1×TEに溶解したキラヤ樹皮からのサポニン100mg/mLを含む溶菌液15mLを、スパイクした血液試料5mLに添加し、最大速度に設定したボルテックスで10秒間混合して、DNAを抽出した。次いで、この溶液を、10,000gで5分間遠心分離して上清を捨てた。次いで、溶菌液10mLをペレットに添加し、最大速度に設定したボルテックスで10秒間混合した。次いで、懸濁液を、10,000gで5分間遠心分離して上清を捨てた。このペレットを、細菌を含む試料は1×TEで、酵母細胞を含む試料は1×PBSで2回洗浄した。1×TE(すすぎ/回収溶液)50μLを、洗浄したペレットに添加した。洗浄したペレットと1×TEを、最大速度に設定したボルテックスで15秒間混合した。ペレットを、マイクロピペットチップで取り出した。微生物細胞を含む残りの懸濁液を、微生物核酸を抽出するために、BD GeneOhm(商標)Lysis Kit(BD Diagnostics-GeneOhm)を用いてガラスビーズで機械的に溶解した。
【０２６９】
各プライマー対の一方のプライマーの5'末端をリン酸化し、他方のプライマーの5'末端をCy-3標識した点を除き、実施例3に記載したようにPCRを行った。ラムダエキソヌクレアーゼによるアンプリコンの消化、マイクロアレイ上の能動的ハイブリダイゼーション、およびシグナルの取得は、実施例2と同様に行った。
【０２７０】
第1のマルチプレックスPCRによって作製したアンプリコンを、プローブの組合せ:配列番号27〜44、46〜63、65〜71、73〜77、79〜97、99〜125、127、129、および131〜203を用いてマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。
【０２７１】
第2のマルチプレックスPCRによって作製したアンプリコンを、プローブの組合せ:配列番号204、208、211、212、214、215、219、223、226、227、229、231、233、236、241、242、244、246、248、249、253〜256、261、264〜267、270、272、279〜281、284〜288、291、292、364、および365を用いてマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。
【０２７２】
第3のマルチプレックスPCRによって作製したアンプリコンを、プローブの組合せ:配列番号294、296〜309、312、314、316、317、318、320〜323、326〜330、332、および335を用いてマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。
【０２７３】
第4のマルチプレックスPCR(バージョン2)によって作製したアンプリコンは、プローブの組合せ:配列番号339〜344、348、353、および366〜374を用いてマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。
【０２７４】
能動的マイクロアレイハイブリダイゼーションによって試験した25/28の細菌種および4/6の真菌種については、血液の感度が30CFU/mL以下で鋳型DNAの起源を特定することができたが、3/28の細菌種および2/6の真菌種は、血液の感度が31CFU/mL以上であった。ハイブリダイゼーションパターン解析および/またはハイブリダイゼーションシグナルの統計的推論解析を、実施例5に記載したように行った。
【０２７５】
それぞれのマルチプレックスPCRに対して、アッセイの特異性を、上記したように微生物細胞をスパイクしていない血液試料を用いて検証した。これらの試料から、ハイブリダイゼーションシグナルを一切検出できなかった。
【０２７６】
マイクロアレイハイブリダイゼーションに使用した捕捉プローブにより、自動CD系マイクロ流体ハイブリダイゼーションシステムを用いた、血液試料にスパイクした様々な量の培養細胞からPCRによって作製したアンプリコンの特異的で高感度の広範な検出および同定が可能になった。
【０２７７】
例示的な実施形態を用いて本明細書で本発明を記載したが、本発明は、その範囲および本質から逸脱することなく変更することができる。
【０２７８】
本記載は、多数の文献に言及したが、これらの文献は、参照によりその全容が本明細書に組み込まれている。
【０２７９】
【表２Ａ】
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【０２８０】
【表２Ｂ】
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【０２８１】
【表３Ａ】
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【０２８２】
【表３Ｂ】
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【０２８３】
【表３Ｃ】
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【０２８４】
【表３Ｄ】
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【０２８５】
【表３Ｅ】
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【０２８６】
【表３Ｆ】
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【０２８７】
【表３Ｇ】
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【０２８８】
【表３Ｈ】
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【０２８９】
【表３Ｉ】
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【０２９０】
【表３Ｊ】
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【０２９１】
【表３Ｋ】
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【０２９２】
【表３Ｌ】
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【０２９３】
【表３Ｍ】
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【０２９４】
【表３Ｎ】
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【０２９５】
【表３Ｏ】
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【０２９６】
【表３Ｐ】
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【０２９７】
【表３Ｑ】
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【０２９８】
【表４】
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【０２９９】
【表５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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