(57)【要約】  本発明は、病気の治療に適し、小胞系、特に脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼす化合物に関し、該化合物は一般式（Ｉ）で表される。2010530410.tif 000018式中、Ｘはそれぞれ独立して水素、ハロゲン、−Ｃ１−２０−アルキル、−Ｃ２−２０−アルケニル、−Ｃ２−２０−アルキニル、−Ｃ５−６−シクロアルキル、アリール、アラルキル、アダマンチル、複素環、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル又は−Ｎ−（Ｒ１、Ｒ２）基であり、ｎは０、１、２、３又は４であり、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素、直鎖又は分岐状アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル又は複素環基であり、これらの基は置換されていなくてもハロゲンで置換されていてもよく、Ｒ１及びＲ２はそれらの間に存在する窒素と共に５又は６員環を形成し、Ａは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−又は−ＮＨ−であり、ＹはＯ又はＳであり、ＺはＯ又はＳであり、Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してメチル、エチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチルであり、ただし、Ｘ（ｎ）は全てがフッ素であることはなく、Ａは単結合であり、Ｙ及びＺはＯであり、Ｒ’及びＲ’’はイソプロピルであり、かつＲ１及びＲ２は水素である。また、本発明は、上記化合物を含む医薬組成物及び病気の治療における当該化合物の使用に関する。
2010530410.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物。
【化１】
2010530410.tif 000014
式中、
Ｘはそれぞれ独立して水素、ハロゲン、−Ｃ１−２０−アルキル、−Ｃ２−２０−アルケニル、−Ｃ２−２０−アルキニル、−Ｃ５−６−シクロアルキル、アリール、アラルキル、アダマンチル、複素環、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル又は−Ｎ−（Ｒ１、Ｒ２）基であり、
ｎは０、１、２、３又は４であり、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素、直鎖又は分岐状アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル又は複素環基であり、これらの基は置換されていなくてもハロゲンで置換されていてもよく、
Ｒ１及びＲ２はそれらの間に存在する窒素と共に５又は６員環を形成し、
Ａは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−又は−ＮＨ−であり、
ＹはＯ又はＳであり、
ＺはＯ又はＳであり、
Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してメチル、エチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチルであり、
ただし、
Ｘ（ｎ）は全てがフッ素であることはなく、
Ａは単結合であり、
Ｙ及びＺはＯであり、
Ｒ’及びＲ’’はイソプロピルであり、かつ
Ｒ１及びＲ２は同時に水素である。
【請求項２】
Ａが単結合である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｙ及びＺの少なくとも１つがＯであり、より好ましくはＹ及びＺがともにＯである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が水素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
任意の３つのＸ（ｎ）がハロゲンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記ハロゲンがフッ素である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１及び／又はＲ２が非置換エチル又はハロゲン置換エチル、好ましくはエチル又はトリフルオロエチル、特にはエチル基である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１及び／又はＲ２がエチレンジアミンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
少なくともＲ’及びＲ’’の１つがイソプロピルであり、より好ましくは両方がイソプロピルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（２−アミノ−エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（２−アミノ−エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６−トリフルオロ−７−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，７−トリフルオロ−６−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（ピリジン−３−イルメチル−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（３−モルホリン−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（３−モルホリン−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（３−モルホリノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（シクロペンチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；及び
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（シクロペンチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン
から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
病気の治療及び小胞系、特に脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすために適した一般式（Ｉ）で表される化合物。
【化２】
2010530410.tif 000015
式中、
Ｘはそれぞれ独立して水素、ハロゲン、−Ｃ１−２０−アルキル、−Ｃ２−２０−アルケニル、−Ｃ２−２０−アルキニル、−Ｃ５−６−シクロアルキル、アリール、アラルキル、アダマンチル、複素環、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル又は−Ｎ−（Ｒ１、Ｒ２）基であり、
ｎは０、１、２、３又は４であり、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素、直鎖又は分岐状アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル又は複素環基であり、これらの基は置換されていなくてもハロゲンで置換されていてもよく、
Ｒ１及びＲ２はそれらの間に存在する窒素と共に５又は６員環を形成し、
Ａは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−又は−ＮＨ−であり、
ＹはＯ又はＳであり、
ＺはＯ又はＳであり、
Ｒ’及びＲ’’は独立してメチル、エチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチルであり、
ただし、前記病気が癌又は炎症のようなものである場合には、
Ｘ（ｎ）は全てがフッ素であることはなく、
Ａは単結合であり、
Ｙ及びＺはＯであり、
Ｒ’及びＲ’’はイソプロピルであり、かつ
Ｒ１及びＲ２は同時に水素である。
【請求項１２】
Ａが単結合である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｙ及びＺの少なくとも１つがＯであり、より好ましくは両方ともにＯである、請求項１１又は１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ１が水素である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
任意の３つのＸ（ｎ）がハロゲンである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記ハロゲンがフッ素である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ１及び／又はＲ２が非置換エチル又はハロゲン置換エチル、好ましくはエチル又はトリフルオロエチル、特にエチル基である、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１及び／又はＲ２がエチレンジアミンである、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
少なくともＲ’及びＲ’’の１つがイソプロピルであり、より好ましくは両方ともにイソプロピルである、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（２−アミノ−エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（２−アミノ−エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６−トリフルオロ−７−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，７−トリフルオロ−６−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（ピリジン−３−イルメチル−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（３−モルホリン−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（３−モルホリン−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（３−モルホリノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（シクロペンチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（シクロペンチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン
から選択される、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２１】
前記病気が、癌、炎症、クローン病、アテローム性動脈硬化症、細菌又はウイルス感染症からなる群から選択される、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
前記病気が癌である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
前記病気が炎症である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２４】
前記病気が細菌又はウイルス感染症である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２５】
小胞系、特に脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすことによって病気を治療するために適した医薬組成物であって、１種以上の添加剤を有し、一般式（Ｉ）で表される化合物を含む医薬組成物。
【化３】
2010530410.tif 000016
式中、
Ｘはそれぞれ独立して水素、ハロゲン、−Ｃ１−２０−アルキル、−Ｃ２−２０−アルケニル、−Ｃ２−２０−アルキニル、−Ｃ５−６−シクロアルキル、アリール、アラルキル、アダマンチル、複素環、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル又は−Ｎ−（Ｒ１、Ｒ２）基であり、
ｎは０、１、２、３又は４であり、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素、直鎖又は分岐状アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル又は複素環基であり、これらの基は置換されていなくてもハロゲンで置換されていてもよく、
Ｒ１及びＲ２はそれらの間に存在する窒素と共に５又は６員環を形成し、
Ａは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−又は−ＮＨ−であり、
ＹはＯ又はＳであり、
ＺはＯ又はＳであり、
Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してメチル、エチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチルであり、
ただし、前記病気が癌又は炎症のようなものである場合には、
Ｘ（ｎ）は全てがフッ素であることはなく、
Ａは単結合であり、
Ｙ及びＺはＯであり、
Ｒ’及びＲ’’はイソプロピルであり、かつ
Ｒ１及びＲ２は水素である。
【請求項２６】
小胞系、特に脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすことによって病気を治療するために適した化合物の使用であって、前記化合物が一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする化合物の使用。
【化４】
2010530410.tif 000017
式中、
Ｘはそれぞれ独立して水素、ハロゲン、−Ｃ１−２０−アルキル、−Ｃ２−２０−アルケニル、−Ｃ２−２０−アルキニル、−Ｃ５−６−シクロアルキル、アリール、アラルキル、アダマンチル、複素環、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル又は−Ｎ−（Ｒ１、Ｒ２）基であり、
ｎは０、１、２、３又は４であり、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素、直鎖又は分岐状アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル又は複素環基であり、これらの基は置換されていなくてもハロゲンで置換されていてもよく、
Ｒ１及びＲ２はそれらの間に存在する窒素と共に５又は６員環を形成し、
Ａは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−又は−ＮＨ−であり、
ＹはＯ又はＳであり、
ＺはＯ又はＳであり、
Ｒ’及びＲ’’は独立してメチル、エチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチルを意味し、
ただし、前記病気が癌又は炎症のようなものである場合には、
Ｘ（ｎ）は全てがフッ素であることはなく、
Ａは単結合であり、
Ｙ及びＺはＯであり、
Ｒ’及びＲ’’はイソプロピルであり、かつ
Ｒ１及びＲ２は水素である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病気の治療に適し、かつ、小胞系に、特には脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼす化合物に関し、さらに、本発明は、該化合物を含む医薬組成物、及び癌、炎症等の脂肪滴の形成及び／又は機能に関連する病気の治療、及びさまざまな細菌又はウイルス感染症の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年における新たな研究分野の１つは、細胞器官としての脂肪滴又は脂肪体（両方とも文献で見ることができる）の研究である。細胞内の脂肪滴は、主として脂質の貯蔵と輸送を担う。脂肪滴の形態とタンパク質含有量は大きく変わり得るが（Ｄｅｎｉｓ  Ｊ．  Ｍｕｒｐｈｙ他、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＴＩＢＳ  ２４、１９９９年３月、１０９〜１１５頁）、植物、動物、微生物における脂肪滴の形成はいくつかの面において類似している。ヒトの細胞内において脂肪滴の機能が損なわれると、脂肪肝、肥満、アテローム性動脈硬化症、２型糖尿病、炎症性疾患、癌等のいくつかの病気が生じ得る。通常、脂肪滴の大きさは０.１〜５０μｍである。
【０００３】
脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすことにより、脂肪滴が何らかの作用を有する病気に確実に影響を及ぼし得る。
【０００４】
脂肪滴の形成及び／又は移動を阻害する小分子は潜在的な抗癌作用を有する。これは、脂肪滴の機能と関連して、細胞内脂肪酸濃度が上昇すると以下に説明するアポプトーシスという結果になり得るためである。脂肪酸のデノボ合成は癌細胞に特有なものである。脂肪細胞以外の細胞が、飽和脂肪酸から形成されたトリグリセリドを貯蔵する能力は限られている。貯蔵以外に、細胞は酸化（β酸化）によって蓄積された脂肪酸を除去することができる。しかしながら、癌細胞に特有の低酸素条件下ではβ酸化は制限されるため、蓄積した脂肪酸の一部が脂肪滴の形で表れる。放出され、脂肪小胞に包まれていない脂肪酸は、小胞体膜に取り込まれて飽和度が上昇し、小胞体膜の構造及び完全性をついには壊すことになる。その結果、小胞体からカルシウムイオンが放出され、ミトコンドリアを介してアポプトーシスを引き起こす（Ｂｏｒｒａｄａｉｌｅ  ＮＭ、Ｈａｎ  Ｘ、Ｈａｒｐ  ＪＤ、Ｇａｌｅ  ＳＥ、Ｏｒｙ  ＤＳ、Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ＪＥ：Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｉｎ  ｌｉｐｏｔｏｘｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ２００６年１２月；４７（１２）：２７２６〜２７３７）。従って、腫瘍細胞内における脂肪滴の形成を阻害することによって係る腫瘍細胞を破壊することができる可能性がある。
【０００５】
脂肪滴の数は炎症中大きく増加する（Ｗｅｌｌｅｒ  ＰＦ  eｓ  Ｄｖｏｒａｋ  ＡＭ：Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ６５、１９８５年、１２６９〜１２７４頁；Ｗｅｌｌｅｒ  ＰＦ  eｓ  Ｄｖｏｒａｋ  ＡＭ：Ｌｉｐｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ：ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５、１９９４年、２４５〜２５０頁）。脂肪滴はエイコサノイドの代謝に重要な役割を有し、リン脂質含有アラキドン酸、及びプロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエンの合成のために必須であるシクロオキシゲナーゼ（プロスタグランジン及びエンドペルオキシダーゼシンターゼ）や５−リポキシゲナーゼ等の酵素の貯蔵庫であることが分かっている（Ｗｅｌｌｅｒ  Ｐ．Ｆ．他、Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ、１９８９年、１１３、９４７〜９５９頁）。
【０００６】
プロスタグランジン（ＰＧ）Ｄ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２ａ、ＰＧＩ２、トロンボキサンＡ２等のプロスタノイドは、幾つかの生理的機能を調整し、慢性関節リウマチ、ぜんそく、クローン病、アテローム性動脈硬化症等の炎症性疾患を緩和する（Ｒｉｓｔｉｍａｋｉ  Ａ.，Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ２：  ｆｒｏｍ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ.，２００４年；２５６：２１５〜２２１頁）。
【０００７】
シクロオキシゲナーゼ−２によって生成したプロスタグランジンは、増殖と血管新生を刺激することによって腫瘍の成長を助け、プログラム化した細胞死と免疫反応性を抑制する（Ｍａｒｋｓ  Ｆ，Ｆｕｒｓｔｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｇ，Ｍｕｌｌｅｒ−Ｄｅｃｋｅｒ  Ｋ.，Ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Res.，２００７年；１７４：３７〜４７頁）。
【０００８】
イムノゴールドステイニングにより、結腸のクローン病の場合に、結腸の、線維芽細胞、好酸性・好中性顆粒球、マクロファージ、食細胞、吸収上皮細胞においてプロ炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αが主として脂肪滴に結合することが判明している（Ｗａｌｔｒａｕｄ  J.Ｂｅｉｌ他，Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ＴＮＦ−ａ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，J.Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５８，１９９５年，２８４〜２９８頁）。そのため、脂肪滴はクローン病の進行に重要な役割を有し得ると考えられる。
【０００９】
また、アテローム性動脈硬化症の進行も脂肪滴の形成に関連する可能性がある（Ｔｏｄａ  Ｔ，Ｌｅｓｚｃｚｙｎｓｋｉ  ＤＥ，Ｋｕｍｍｅｒｏｗ  ＦＡ，Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｗｉｎｅ  ｄｕｃｔｕｓ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ.１９８０年１０月；３７（２）：３２５〜３３０頁）。
【００１０】
また、脂肪滴は、結核を引き起こすマイコバクテリア等の幾つかの細菌のライフサイクルに重要な役割を有している（Ｇａｒｔｏｎ  ＪＮ他，Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｐｕｔｕｍ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２年），１４８，２９５１〜２９５８頁）。
【００１１】
単純ヘルぺス及びインフルエンザウイルスの脂質代謝に対する作用について研究が行われている（Ａｍｂｒｏｓｅｖａ  ＴＶ，Ｖｏｔｉａｋｏｖ  ＶＩ，Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＯＴ，Ｓｅｒｅｂｒｉａｋｏｖａ  ＥＶ，Ｖｌａｄｙｋｏ  ＧＶ，Ｓａｍａｒｉｎａ  ＭＰ，Ｂｉｕｌｌ  Ｅｋｓｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ.１９９２年９月；１１４（９）：３０２〜３０４頁）。ウサギの急性ヘルペス感染症では、典型的な異常脂血症が、総コレステロールレベル、β−コレステロールレベル及びトリグリセリドレベルの上昇を伴って生ずることが判明している。また、ヒトの大動脈培養細胞のヘルペス感染に関する研究が発表されており、遊離脂質の細胞内蓄積が検出されている。
【００１２】
上述した例から、脂肪滴はいくつかの病気の進行に役割を果たし、脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすことによってそのような病気に好ましい効果を与え得ることが分かる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、ある種の病気に好ましい効果を与えるように脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼす化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、従来技術に対して新規であると考えられる化合物を特定した。すなわち、本発明は下記一般式（Ｉ）で表される化合物に関する。
【化１】
2010530410.tif 000003
式中、
Ｘはそれぞれ独立して水素、ハロゲン、−Ｃ１−２０−アルキル、−Ｃ２−２０−アルケニル、−Ｃ２−２０−アルキニル、−Ｃ５−６−シクロアルキル、アリール、アラルキル、アダマンチル、複素環、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル又は−Ｎ−（Ｒ１、Ｒ２）基であり、
ｎは０、１、２、３又は４であり、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素、直鎖又は分岐状アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル又は複素環基であり、これらの基は置換されていなくてもハロゲンで置換されていてもよく、
Ｒ１及びＲ２はそれらの間に存在する窒素と共に５又は６員環を形成し、
Ａは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−又は−ＮＨ−であり、
ＹはＯ又はＳであり、
ＺはＯ又はＳであり、
Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してメチル、エチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチルであり、
ただし、
Ｘ（ｎ）は全てがフッ素であることはなく、
Ａは単結合であり、
Ｙ及びＺはＯであり、
Ｒ’及びＲ’’はイソプロピルであり、かつ
Ｒ１及びＲ２は同時に水素である。
【００１５】
本発明者らは、一般式（Ｉ）で表される化合物を使用して目的を実現した。すなわち、本発明は、病気の治療及び小胞系、特に脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすために適した化合物に関し、該化合物は下記一般式（Ｉ）で表される。
【化２】
2010530410.tif 000004
式中、
Ｘはそれぞれ独立して水素、ハロゲン、−Ｃ１−２０−アルキル、−Ｃ２−２０−アルケニル、−Ｃ２−２０−アルキニル、−Ｃ５−６−シクロアルキル、アリール、アラルキル、アダマンチル、複素環、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル又は−Ｎ−（Ｒ１、Ｒ２）基であり、
ｎは０、１、２、３又は４であり、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素、直鎖又は分岐状アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル又は複素環基であり、これらの基は置換されていなくてもハロゲンで置換されていてもよく、
Ｒ１及びＲ２はそれらの間に存在する窒素と共に５又は６員環を形成し、
Ａは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−又は−ＮＨ−であり、
ＹはＯ又はＳであり、
ＺはＯ又はＳであり、
Ｒ’及びＲ’’は独立してメチル、エチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチルであり、
ただし、病気が癌又は炎症のようなものである場合には、
Ｘ（ｎ）は全てがフッ素であることはなく、
Ａは単結合であり、
Ｙ及びＺはＯであり、
Ｒ’及びＲ’’はイソプロピルであり、かつ
Ｒ１及びＲ２は同時に水素である。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、Ａは単結合である。
【００１７】
本発明の好ましい別の実施形態では、Ｙ及びＺの少なくとも１つはＯであり、より好ましくはＹとＺは両方ともにＯである。
【００１８】
本発明の好ましい別の実施形態では、Ｒ１は水素である。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、任意の３つのＸ（ｎ）はハロゲンである。
【００２０】
好ましい実施形態で、前記ハロゲンはフッ素である。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、Ｒ１及び／又はＲ２は、非置換又はハロゲン置換エチル、好ましくはエチル又はトリフルオロエチル、特にはエチル基である。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態では、Ｒ１及び／又はＲ２はエチレンジアミン基である。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施形態では、Ｒ’及びＲ’’の少なくとも１つはイソプロピルであり、より好ましくはＲ’及びＲ’’は両方ともにイソプロピルである。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、脂肪滴に結合する化合物は、
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（２−アミノ−エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（２−アミノ−エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６−トリフルオロ−７−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，７−トリフルオロ−６−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（ピリジン−３−イルメチル−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（３−モルホリン−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（３−モルホリン−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（モルホリノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（１−シクロペンチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；及び
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（１−シクロペンチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン
から選択される。
【００２５】
本発明の好ましい別の実施形態では、病気は、癌、炎症、クローン病、アテローム性動脈硬化症、細菌又はウイルス感染症からなる群から選択される。
【００２６】
本発明の好ましいさらなる実施形態では、前記病気は癌である。
【００２７】
本発明の好ましいさらなる実施形態では、前記病気は炎症である。
【００２８】
本発明の好ましいさらなる実施形態では、前記病気は細菌又はウイルス感染症である。
【００２９】
本発明は、脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすことによって病気を治療するために好適な医薬組成物に関し、それらの医薬組成物は１種以上の担体を有し、一般式（Ｉ）で表される化合物を含有する。
【００３０】
医薬組成物は、経口投与、非経口投与又はその他の公知の投与方法、例えば、埋込型送達装置によって患者に投与することができる。投与経路は、病気、性別、年齢及び病気と回復の経過に影響を及ぼすその他のファクターに応じて決定することができる。入手可能な全ての状況及び情報に基づいて医師がその他の投与方法を決めることができることは、当業者に明らかであろう。
【００３１】
本発明に係る医薬組成物は、ヒト、動物、特に哺乳動物及び場合によっては鳥類（例えば、ウイルス又は細菌感染症）を治療するために使用することができる。
【００３２】
また、本発明に係る医薬組成物は、所与の病気の治療に適したその他の薬剤、化合物又は治療と組み合わせて使用することもできる。例えば、本発明に係る医薬組成物は放射線治療及び／又は化学治療と併用することができる。
【００３３】
また、本発明に係る医薬組成物は、例えば体質又は感染によって病気に罹患しやすいヒト又は動物における病気の予防に使用することもできる。
【００３４】
本発明に係る化合物は、
本発明に係る病気を引き起こす細胞、細胞株、ウイルスが存在する場所、例えば、医療施設、研究所、診断研究所等における感染／病気の予防に使用することもできる。
【００３５】
また、本発明は、上述した病気の治療における一般式（Ｉ）で表される化合物及び医薬組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１ａ】Ｘ線回折法によって測定した本発明の化合物、化合物３ａの結晶構造を示し、水素原子及び重原子の番号も示す。
【図１ｂ】Ｘ線回折法によって測定した本発明の別の化合物、化合物３ｂの結晶構造を示し、水素原子及び重原子の番号も示す。
【図２ａ】化合物３ｂによる処理後のマクロファージの基本的なＴＮＦ−αの放出の変化を示す。
【図２ｂ】化合物３ｂによる処理後のマクロファージのＬＰＳ誘発ＴＮＦ−αの放出の変化を示す。
【図３】本発明の化合物、化合物３ａ及び３ｂのＴＮＦ−αの分泌に対する作用を対数目盛で示す。
【図４】４８時間の処理後の本発明の幾つかの化合物の、ＲＶＨヒト黒色腫細胞株に対する細胞毒性作用を示す。
【図５】２４時間の処理後の本発明の幾つかの化合物の、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株に対する細胞毒性作用を示す。
【図６】２４時間の処理後の本発明の幾つかの化合物の、ＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞株に対する細胞毒性作用を示す。
【図７】脾臓／肝臓動物モデルにおける抗癌効果試験の結果を示す。
【図８】腫瘍質量検出に基づく生きている動物に対する本発明の化合物（化合物３ｂ）及び参照化合物（化合物２）の抗癌効果を示す。
【図９】仮性狂犬病ウイルスに対する本発明の化合物（化合物３ｂ）の抗ウイルス効果を示す。
【図１０】本発明の化合物（化合物９ａ）の抗癌効果作用を癌細胞接種後の生存図によって示す。
【図１１】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｓに対する本発明の化合物（化合物３ａ）の効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本明細書において「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択される置換基を意味する。
【００３８】
本明細書において「アリール基」という用語は、単独又は他の置換基と組み合わせて、１つの炭素環芳香族基又は２以上の炭素環芳香系を有する芳香環系を意味する。
例えば、「アリール」という用語はフェニル又はナフチル環系を含む。
【００３９】
本明細書において「−Ｃ１−２０−アルキル」という用語は、単独又は他の置換基と組み合わせて、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状の非環式炭化水素を意味する。「−Ｃ１−２０−アルキル」基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、へキシル、１−メチル−エチル、１−メチル−プロピル、２−メチル−プロピル、又は１，１−ジメチル−エチル基が挙げられる。
【００４０】
本明細書において「−Ｃ２−２０−アケニル」という用語は、単独又は他の置換基と組み合わせて、２〜２０個の炭素原子を有し、ビニル又はアリル基のように少なくとも１つの二重結合を含む直鎖状又は分岐状の非環式アルケニル置換基を意味する。
【００４１】
本明細書において「−Ｃ２−２０−アルキニル」という用語は、単独又は他の置換基と組み合わせて、２〜２０個の炭素原子を有し、少なくとも１つの三重結合を含む直鎖状又は分岐状の非環式アルケニル置換基を意味する。
【００４２】
本明細書において「−Ｃ５−６−シクロアルキル」は、単独又は他の置換基と組み合わせて、５又は６個の炭素原子を有するシクロアルキル置換基を意味し、例えばシクロペンチル基又はシクロヘキシル基が挙げられる。
【００４３】
「アラルキル」は、アリール置換アルキル基又はアリール置換シクロアルキル基を意味する。
【００４４】
本明細書において「複素環基」は、窒素、酸素、硫黄及びリンから選択される１以上の異種原子を含む置換又は非置換脂環式環又は芳香族環を意味する。
【００４５】
「ヒドロキシアルキル基」は、水酸基で置換されたアルキル基を意味する。
【００４６】
本発明は、脂肪滴に結合し、及び脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすことによって病気に好影響を与える化合物を開示する。
【００４７】
なお、特開平１０−０７２３４６号に提示されている２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドリン−１，３−ジオン（化合物２）も一般式（Ｉ）で表される。この化合物は腫瘍壊死因子の生成を阻害することが示されていた。特開平１０−０７２３４６号によれば、この同じ化合物（化合物２）は抗炎症作用も有する。
【化３】
2010530410.tif 000005
【実施例】
【００４８】
本発明を以下の実施例によって説明するが、以下の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００４９】
実施例１
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（３ａ）及び２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（３ｂ）
【化４】
2010530410.tif 000006
【００５０】
１９ｇ（５０ｍｍｏｌ）の２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドール−１，３−ジオン（２）を３０ｍｌのクロロホルム（３０ｍｌ，ａ．ｒ．，Ｍｏｌａｒ）に溶解した後、エチルアミン（２ｍｌ、７０％ｖ／ｖ水溶液、Ａｌｄｒｉｃｈ）をそこに添加した。混合物を室温で４時間撹拌し、シクロヘキサン（２０ｍｌ、Ｍｏｌａｒ）を添加した。次に、溶液をシリカゲルカラムに注入し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））で平衡化した。カラムをクロロホルム−シクロヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））で洗浄し、次いでクロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））溶液で溶出した。最初に分画した生成物３ａを蒸発によって単離し（収率：６．９ｇ、３０．１％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．３９（クロロホルム：シクロヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ）））によって測定し、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４０４．３）。２番目に分画した生成物３ｂを蒸発によって単離し（収率：５．８ｇ、２８．７％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．１９（クロロホルム：シクロヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ）））によって測定し、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４０４．２）。
【００５１】
化合物３ａ及び３ｂの結晶構造を単結晶Ｘ線回折法によって確認した。得られた化合物の分子構造を図１ａ（３ａ）及び図１ｂ（３ｂ）に示す。図面では、三次元空間における原子変位パラメータに比例した大きさを有する楕円（すなわち、楕円が大きいほど、結晶中の原子はより動的である）によって各原子を表している。
【００５２】
１Ｈ  ＮＭＲ  ３ａ（ＣＤＣｌ３）δ  １．１７（ｄ，１２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，ＣＨ３（ｉＰｒ）），１．３１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＨ３（Ｎ−Ｅｔ）），２．６２−２．７５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ（ｉＰｒ）），３．５４−３．６３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２（Ｎ−Ｅｔ）），６．３６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，ＮＨ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，ｍ−Ｐｈ），７．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，ｐ−Ｐｈ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ  ３ａ（ＣＤＣｌ３）δ  １６．５７（ＣＨ３（Ｎ−Ｅｔ））２４．４０（ＣＨ３（ｉＰｒ）），２９．７６（ＣＨ（ｉＰｒ）），４０．３９（ＣＨ２（Ｎ−Ｅｔ）），１２４．３９（ｍ−Ｐｈ），１２６．６４（Ｎ−Ｐｈ），１３０．７４（ｐ−Ｐｈ），１３５．３６（Ｅｔ−Ｎ−ｉｓｏｉｎｄｏｌｅ），１４７．７８（ｏ−Ｐｈ）．
１Ｈ  ＮＭＲ  ３ｂ（ＣＤＣｌ３）δ  １．１７（ｄ，１２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，ＣＨ３（ｉＰｒ）），１．３４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＨ３（Ｎ−Ｅｔ）），２．６４−２．７４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ（ｉＰｒ）），３．５８−３．６７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２（Ｎ−Ｅｔ）），４．３８（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ｍ−Ｐｈ），７．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，ｐ−Ｐｈ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ  ３ｂ（ＣＤＣｌ３）δ  １６．６６（ＣＨ３（Ｎ−Ｅｔ））２４．４１（ＣＨ３（ｉＰｒ）），２９．７６（ＣＨ（ｉＰｒ）），４０．８０（ＣＨ２（Ｎ−Ｅｔ）），１２４．３７（ｍ−Ｐｈ），１２５．８３（Ｎ−Ｐｈ），１３０．７０（ｐ−Ｐｈ），１４７．８１（ｏ−Ｐｈ）．  
【００５３】
実施例２
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（４ａ）及び２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（４ｂ）
【化５】
2010530410.tif 000007
【００５４】
９．５ｇ（２５ｍｍｏｌ）の２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドール−１，３−ジオン（２）を１５ｍｌのクロロホルム（ａ．ｒ．，Ｍｏｌａｒ）に溶解した後、１，２−エチレンジアミン（２．７５ｇ、２５．５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）をそこに添加した。溶液を４時間撹拌した後、シリカゲルカラムに注入し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））で平衡化した。カラムをクロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で洗浄し、クロロホルムで溶出した。最初に分画した生成物４ａを蒸発によって単離し（収率：３．２ｇ、２６．９％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．３５（クロロホルム））によって測定し、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４７７．５）。２番目に分画した生成物４ｂを蒸発によって単離し（収率：３．１ｇ、２６．０％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィーによって測定し（Ｒｆ：０．３０（クロロホルム））、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４７７．４）。
【００５５】
実施例３
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（２−アミノ−エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（５ａ）及び２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（２−アミノ−エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（５ｂ）
【化６】
2010530410.tif 000008
【００５６】
９．５ｇ（２５ｍｍｏｌ）の２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドール−１，３−ジオン（２）を１５ｍｌのクロロホルム（ａ．ｒ．，Ｍｏｌａｒ）に溶解した後、１，２−エチレンジアミン（１．５３ｇ、２５．５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）をそこに添加した。溶液を４時間撹拌した後、シリカゲルカラムに注入し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で平衡化した。カラムをクロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で洗浄し、クロロホルムで溶出した。最初に分画した生成物５ａを蒸発によって単離し（収率：３．９ｇ、３７．２％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィーによって測定し（Ｒｆ：０．２９（クロロホルム））、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４１９．６）。２番目に分画した生成物５ｂを蒸発によって単離し（収率：３．９ｇ、３７．２％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィーによって測定し（Ｒｆ：０．２４（クロロホルム））、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４１９．４）。
【００５７】
実施例４
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６−トリフルオロ−７−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドール−１，３−ジオン（６ａ）及び２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，７−トリフルオロ−６−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドール−１，３−ジオン（６ｂ）
【化７】
2010530410.tif 000009
【００５８】
９．５ｇ（２５ｍｍｏｌ）の２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドール−１，３−ジオン（２）を１５ｍｌのクロロホルム（ａ．ｒ．，Ｍｏｌａｒ）に溶解した後、２，２，２−トリフルオロエチルアミン（０．２３ｇ、２５．３ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）をそこに添加した。溶液を４時間撹拌した後、シクロヘキサン（２０ｍｌ、Ｍｏｌａｒ））を添加し、シリカゲルカラムに注入し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））で平衡化した。カラムをクロロホルム−シクロヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））で洗浄し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で溶出した。最初に分画した生成物６ａを蒸発によって単離し（収率：５１０ｍｇ、４３．３％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．４５（クロロホルム：シクロヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ）））によって測定し、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４５８．２）。２番目に分画した生成物６ｂを蒸発によって単離し（収率：２０４ｍｇ、１７．３％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．２５（クロロホルム：シクロヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ）））によって測定し、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４５８．２）。
【００５９】
実施例５
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（３−モルホリノ−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（７ａ）及び２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（３−モルホリノ−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（７ｂ）
【化８】
2010530410.tif 000010
【００６０】
９．５ｇ（２５ｍｍｏｌ）の２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドール−１，３−ジオン（２）を１５ｍｌのクロロホルム（ａ．ｒ．，Ｍｏｌａｒ）に溶解した後、４−（３−アミノプロピル）モルホリン（３．６７ｇ、２５．５ｍｍｏｌ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）をそこに添加した。溶液を１２時間撹拌した後、シリカゲルカラムに注入し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で平衡化した。カラムをクロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で洗浄し、クロロホルムで溶出した。最初に分画した生成物７ａを蒸発によって単離し（収率：３．７ｇ、２９．５％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．２６（クロロホルム））によって測定し、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：５０３．２）。２番目に分画した生成物７ｂを蒸発によって単離し（収率：３．２ｇ、２５．５％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．２３（クロロホルム））によって測定し、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：５０３．４）。
【００６１】
実施例６
予め形成されたＴＮＦ−α分泌の阻害のための抗炎症作用の検出
【００６２】
成熟したマクロファージは、細菌性リポ多糖（Ｅ.ｃｏｌｉ  ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ）に反応して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）を生成する。ＴＮＦ−αの生成は、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）、リポ多糖結合性タンパク質（ＬＢＰ）及びＣＤ１４受容体に結合したＴＮＦ−αによって誘発される。ＴＮＦ−αの分泌は二相性である。刺激後の１時間は、マクロファージは予め形成されたＴＮＦ−αの放出に応答する。ＮＦ−ｋａｐｐａＢシグナリング経路はＴＮＦ−α遺伝子転写を引き起こし、約８時間後に最大に達する。
【００６３】
我々の実験では、ＲＡＷ．２６４．７成熟マウスマクロファージの早期ＴＮＦ−α分泌について調べた。この細胞株は、大量の予め形成されたＴＮＦ−αを保持している。細胞を刺激を与える２４時間前に６００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で２４ウェルプレートにプレートし、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。実施例１の化合物３ａ及び３ｂをサンプルの一部に添加し、担体（マクロファージのＴＮＦ−α放出に影響を与えない１％エチルアルコール）を対照ウェルに添加した。培養上清を回収し、ＴＮＦ−α含有量をＲ＆Ｄ  Ｄｕｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（検出限界：＜６２．５ｐｇ／ｍｌ）で測定した。ＬＰＳによる刺激の３時間後に、ＭＴＳ試験（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、Ｐｒｏｍｅｇａ（米国ウィスコンシン州マディソン））によって細胞の活力を調べたところ、細胞死は検出されなかった。従って、ＴＮＦ−αレべルの低下は、予め形成されたＴＮＦ−αの放出の阻害によるものであり、細胞死によるものではなかった。
【００６４】
ＮＦ−ｋａｐｐａＢ活性化によって推進されるＴＮＦ−α遺伝子の転写を、ＬＰＳ刺激後、ＮＦ  ｋａｐｐａＢルシフェラーゼ指標構造によって形質転換されたＲＡＷ.２６4.７マクロファージにおいて測定した。この構造は、最小プロモータによって駆動されるルシフェラーゼ遺伝子を含む。ＬＰＳ刺激（１００ｎｇ／ｍｌ）の６時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図２ｂに示す。
【００６５】
図２ａは化合物３ｂによる処理後のマクロファージの基本的なＴＮＦ−α放出の変化を示し、図２ｂはマクロファージのＬＰＳ刺激ＴＮＦ−α放出に対する化合物３ｂの影響を示す。本実施例では、２つの対照（希釈剤のみ、エタノール培養）と４つの処理サンプルを分析した。図２ａに示すように、ＬＰＳによる誘導がなくても、化合物３ｂはマクロファージの基本的なＴＮＦ−α放出を減少することができる。図２ｂに示すように、化合物３ｂは、ＬＰＳ刺激後、誘導されたＴＮＦ−α放出を減少する。
【００６６】
実施例７
ＴＮＦ−α誘発の阻害のための抗炎症作用の検出
【００６７】
本実施例では、実施例１の化合物３ａと３ｂによる実験の結果を示す。
【００６８】
後期ＴＮＦ−α分泌の検出のために、マクロファージのＬＰＳ誘発後に放出された予め形成されたＴＮＦ−αを４時間後に洗い流し、その後の４時間に生成されたＴＮＦ−αの量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。このようにして、マクロファージに予め形成されたＴＮＦ−αを排除し、その後に合成・分泌された転写誘発ＴＮＦ−αの量のみを測定した。結果を図３に示す。化合物３ａと化合物３ｂの両方ともマクロファージの後期ＴＮＦ−α分泌を濃度依存的に阻害したことが分かる。
【００６９】
ＴＮＦ−α分泌及びＮＦ−ｋａｐｐａＢ活性化に対する化合物３ａと化合物３ｂの効果は細胞毒性に基づく可能性もある。その除外のため、処理８時間後ＭＴＳ試験によって、細胞数に比例する細胞の代謝活性を測定した。これらの試験では、化合物３ａ及び化合物３ｂは毒性を示さなかった。換言すれば、それらは細胞の代謝活性を減少しなかった。
【００７０】
実施例８
アフィニティークロマトグラフィーによる相互作用タンパク質の同定
【００７１】
アフィニティークロマトグラフィーを使用して、本発明の化合物５ｂに結合するタンパク質がどちらか調べた。化合物５ｂを、ＤＭＦ：水（６：４）混合液内において室温で１６時間シアノブロミド活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ビーズに結合した。１ｍｌのビーズを５０ｍｌのＤＭＦ：水（６：４）混合液、次いで５０ｍｌの７０％エタノール、さらにＰＢＳ（０.０１Ｍリン酸緩衝液、０.００２７Ｍ  ＫＣｌ、０.１３７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ：7.４）で洗浄した。カラムを洗浄した後、ヒトＭＣＦ−７乳癌細胞（コンプリート プロテアーゼインヒビター カクテルタブレットで均質化した１０００万の細胞、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ製）のタンパク質画分５ｍｌをカラムに添加した。カラムを、２０ｍｌの０.２Ｍ  ＮａＣｌ−ＰＢＳ溶液、次いで１５ｍｌの０.５Ｍ  ＮａＣｌ−ＰＢＳ溶液、さらに１５ｍｌの０.８Ｍ  ＮａＣｌ−ＰＢＳ溶液で順次洗浄し、２ｍｌの２Ｍ  ＮａＣｌ−ＰＢＳで溶出した。溶出液を質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析し、化合物５ｂに結合したタンパク質を決定した。
【００７２】
質量分析は、本特許出願を作成する時点で「ｈｔｔｐ：／／ｄｏｎａｔｅｌｌｏ.ｕｃｓｆ.ｅｄｕ／ｉｎｇｅｌ.ｈｔｍｌ」で公開されていたプロトコルに従って行った。
【００７３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために、５μｌのサンプルを注入した。ＬＣプレカラムトラップを使用した（５分間、２０μｌのｌ０．１％トリフルオロ酢酸／水、その後ＭＳ／ＭＳ分析のために傾斜溶離法）。カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ１８、５μｍ、５×０．３ｍｍ；Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ１８、３．５μｍ、１５０×０．０７５ｍｍ。溶媒：溶媒Ａ１：９５．０％（０．１％トリフルオロ酢酸／水）、溶媒Ｂ１：５．０％（０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル）。ＭＳ法：走査：ｍ／ｚ  ３００〜１６００、ＭＳ２  走査：ｍ／ｚ  １００〜１８００。
【００７４】
これらの試験により、なによりも、Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅタンパク質との相互作用が特定された。Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅタンパク質は、脂肪滴を含む小胞の細胞内移動に影響を及ぼす。Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅタンパク質は、癌を含むいくつかの病気の進行に関与することを示している（Ｋｗａｉ  Ｗ.  Ｃｈｅｎｇ他、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＲＡＢ  ＧＴＰａｓｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；６５：（７）、２００５年４月１日、２５１６〜２５１９頁）。
【００７５】
我々の研究は、化合物３ｂも小胞移動に関与するＳＥＣ２２ｂタンパク質に結合することができることを明らかにした。ＳＥＣ２２ｂタンパク質は、レジュネラ・ニューモフィラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）によって引き起こされる、いわゆる軍団病（ｌｅｇｉｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）に対する薬の候補対象であり得る（Ｄｅｒｒｅ  Ｉ及びＩｓｂｅｒｇ  ＲＲ：Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｖａｃｕｏｌｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｖｏｌｖｅｓ  Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＩＴＹ、２００４年５月、３０４８〜３０５３頁）。
【００７６】
実施例９
黒色腫細胞株に対する抗腫瘍活性
【００７７】
ＲＶＨヒト黒色腫細胞株を、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）、１０％ウシ胎児血清とともにイーグル最少必須培地（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）内で培養した。細胞を２日毎にトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）でトリプシン処理し、６０又は１００ｍｍプレートに注入した。計画の実験に必要な細胞数（約１０６個）に達した時に、５０.００ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞を２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）２４  Ｗｅｌｌ  ＴＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）にプレートし、一晩放置してウェルの底部に付着させた。物質の添加は以下のように行った。翌日、付着した細胞から培養培地を分離し、本発明の化合物を適切な濃度で含み、よく混合した培地を前記細胞にピペットで添加した（２ｍｌ／ウェル）。試験対象物質を１００％ＤＭＳＯで希釈し、所与の試験において物質の最高濃度に対応するＤＭＳＯの量を対照ウェルの培地で測定した。４８時間の処理後、生存細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）で検出し、処理サンプル及び対照サンプル中の生存細胞の数を決定した。
【００７８】
前記試験では以下の物質を使用した。
１）ＭＴＳ：（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）
２）ＰＭＳ：フェナジンメトサルフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）
【００７９】
ＭＴＳは生存細胞中でホルマザンに変換され、生成物は培地に溶解し、その量及び吸光度を４９０ｎｍで測定することができる。
【００８０】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙの説明書は、９６ウェルプレートに言及し、試験中異なる物質と一緒に１０．０００ｃｅｌｌｓ／ウェル培養することを推奨している。次に、生存細胞の割合を決定するために、２０μｌのＭＴＳと１μｌのＰＭＳを１００μｌの培地に添加する。３７℃、５％ＣＯ２、１〜４時間の培養で酵素反応が発生する。その細胞によって生成したホルマザンをＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取り、生存細胞の数を間接的に得ることができる。発明者らは５０．０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの２４ウェルプレートを使用して実験を行ったため、プロトコルを変更する必要があった。細胞を適切な時間（化合物の種類、濃度に応じた）処理した後、対象物質を含む培地（２ｍｌ）を取り出し、上述した濃度（１ウェル当たり３３３．３μｌの培地、６６．６μｌのＭＴＳ及び３．３μｌのＰＭＳ）と同じ濃度で試薬を含む４００μｌの培地をピペットで細胞に添加した。
ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＲＣ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、米国マサチューセッツ州フランクリン）を使用することができるように、２４ウェルプレートの各単一ウェルから採取した４００μｌのサンプルをピペットで９６ウェルプレート（Ｍｉｃｒｏｍｅｔｈｏｄプレート、９６ウェル、平坦状）の４つのウェルに１００μｌずつ添加した。これにより、ばらつきがあるピペット採取による誤差をできるだけ排除することもできた。各２４ウェルプレートで４つのウェルは対照サンプルだった。３回にわたって１００μｌを９６ウェルプレートにピペットで添加した。すなわち、各９６ウェルプレートで１２の対照サンプルを用意した。残りの４つのウェルは、上述のようにＭＴＳ及びＰＭＳを含む１００μｌの培地によるバックグラウンド測定用とした。
【００８１】
結果を図４に示す。化合物３ｂ、７ｂ、５ａ、４ａ、４ｂ及び６ａは最も強い阻害作用を示したことが分かる。化合物５ｂと化合物３ａは、この種の腫瘍に対して１００μＭの濃度であっても弱い阻害効果を示した。
【００８２】
実施例１０
肝細胞癌細胞株及び乳癌細胞株に対する抗腫瘍活性
【００８３】
これらの実験では、ＨｅｐＧ２（ヒト白人肝細胞癌）細胞及びＭＣＦ７（ヒト白人乳腺腺癌）細胞を使用した。細胞は以下の培地で培養した。ＨｅｐＧ２の場合には、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）及び１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（高濃度グルコース）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、米国カリフォルニア州カールスバッド）を使用し、ＭＣＦ７の場合には、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）及び１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（高濃度グルコース）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、米国カリフォルニア州カールスバッド）と栄養分混合物Ｆ−１２Ｈａｍ（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）の１：１混合物を使用した。
【００８４】
実験は、この場合培養時間を２４時間とした以外は実施例９に記載したように行った。培養期間後、ＭＴＳ試験（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）を上述したように行った。
【００８５】
ＨｅｐＧ２細胞を使用した実験の結果を図５に示す。
【００８６】
化合物７ａ、７ｂ、４ａ及び６ａで最も強い阻害作用が検出されたことが分かる。化合物７ｂ、４ｂ及び３ｂは、すでに２０及び５０μＭの濃度で強い効果を示した。化合物５ｂ及び３ａは、この腫瘍種で試験を行った濃度範囲では弱い効果を示した。
【００８７】
ＭＣＦ７細胞を使用した実験の結果を図６に示す。化合物７ａ、４ａ及び６ａで最も強い阻害作用が検出されたことが分かる。化合物５ａ、７ｂ及び４ｂは、すでに２０及び５０μＭの濃度で強い効果を示した。化合物３ａ及び３ｂは、この腫瘍種で試験を行った濃度範囲では弱い効果示した。 
【００８８】
実施例１１
ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍作用Ｉ
【００８９】
脾臓／肝臓動物モデルを使用して研究を行った。先天性免疫不全の４０匹の雄成体ＣＢ１７／ｓｃｉｄマウスから２０匹をランダムに選択し、さらに２つのグループに分けた。マウスの耳に１疋ずつ印を付けた。選択したマウスのうちの１０匹には化合物３ｂ（４０ｍｇ／ｋｇ）を５日間与え（前処置（ＰＲＥＴＲＥＡＴＥＤ／３ｂ）、残りの１０匹には担体として機能するＤＭＳＯで適切に希釈して強制経口飼養を行った（前処置（ＰＲＥＴＲＥＡＴＥＤ）／対照）。処理５日目に、４０匹のマウス全部をネンブタール（７５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔して、ヒト黒色腫（ＨＴ１６８Ｍ１）から採取した細胞（４×１０４個）をマウスの脾臓に注入した。注入時の局所的な出血はＧｅｌａｓｐｏｎ吸収ゼラチンスポンジで処理した。注入後７日目に、処置していない２０匹のマウスを２つのグループにランダムに割り当て、耳に印を付けた。１０匹のマウスにはその後化合物３ｂ（４０ｍｇ／ｋｇ）を与え（後処置（ＰＯＳＴＲＥＡＴＥＤ）／３ｂ）、残りの１０匹には１週間に５回、１日１回、同様の頻度で担体（ＤＭＳＯ）で適切に希釈して３週間にわたって強制経口飼養を行った（後処置（ＰＯＳＴＲＥＡＴＥＤ）／対照）。前処置したグループには注入後は処置を行わなかった。各マウスについて、体重変化を１週間に一度調べた。注入後３１日目に、ネンブタール（７５ｍｇ／ｋｇ）による麻酔下でマウスを出血死した。評価は、一次脾臓腫瘍の質量及び肝臓に見出されたコロニーの数と大きさに基づいて行った。
結果を図７に示す。
【００９０】
化合物３ｂの試験を行った場合には、５回の前処置によって転移（ｐ＝０.０５）の数を大きく減少した。これは、化合物３ｂが腫瘍細胞の付着を阻害し、原発腫瘍の後に転移が発生するケースに適用することができる可能性があり得ることを意味する。化合物３ｂは、転移を生じる可能性のある循環血液中に存在する腫瘍細胞の付着を阻害する。このため、患者の生存の可能性を高めることができる。この作用は強く、４０ｍｇ／ｋｇの経口用量５回でそれを誘発するのに十分であった。
【００９１】
また、付着した細胞のさらなる転移は上記用量での化合物３ｂの連続投与でわずかに抑制された。ただし、おそらくは対照サンプルの大きなばらつきのために統計的に有意ではなかった。
【００９２】
実施例１２
ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍作用ＩＩ
【００９３】
わずかに麻酔（ジエチルエーテル昏睡）をかけた先天性免疫不全の雄成体ＣＢ１７／ｓｃｉｄマウスの皮下にｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト黒色腫細胞株（ＨＴ１６８Ｍ１）培養物から採取した細胞（８×１０５個）を埋め込んだ。腫瘍細胞の接種後、マウスを３つのグループにランダムに割り当て、耳に印を付けた。腫瘍細胞接種の７日後から、３週間にわたって週に５日、１日に１回、化合物２（４０ｍｇ／ｋｇ）又は化合物３ｂ（４０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに強制経口飼養して処理した。対照マウスは、適切に希釈した担体（ＤＭＳＯ）で同じ方法、同じ頻度で処理した。各マウスについて、体重変化を１週間に一度調べた。皮下腫瘍が明白な大きさに達した時に、腫瘍の寸法をカリパスで測定した。腫瘍の体積は式「π／６×ａ×ｂ２」（ａは長径、ｂは短径）によって推定した。注入後３０日目に、ネンブタール（７５ｍｇ／ｋｇ）による麻酔下でマウスを出血死した。評価は原発腫瘍の質量に基づいて行った。結果を図８に示す。
【００９４】
この実験では、化合物２と化合物３ｂの効果について同じ用量（４０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与で試験を行った。
【００９５】
皮下の原発腫瘍の成長に対する化合物２の効果は有意ではなかったことが明らかに分かる。対照的に、化合物３ｂは同じパラダイムで腫瘍の大きさを有意に（ｐ＝０.０５）減少した。そのため、本発明の化合物３ｂは、従来技術に係る化合物２よりも経口投与による原発腫瘍の成長の阻害に対してより効果的であると結論付けることができる。
【００９６】
実施例１３
細胞系における抗ウイルス作用の実証
【００９７】
ＰＫ−１５ブタ腎臓細胞を、Ｐｌａｔ２ウイルスゲノムに挿入された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する約０.００１ｐｆｕ／ｃｅｌｌの仮性狂犬病Ｂａｒｔｈａ型ウイルスに感染した。ＰＫ−１５細胞を８０％の密集度で調べた。３７℃、５％ＣＯ２での培養の２４時間後に、緑色の蛍光を示す細胞を蛍光顕微鏡法によって調べた。感染時に、細胞を１００μＭの化合物３ｂ（１／１００  ＤＭＳＯ  １０ｍＭ基底液）で処理し、１／１００  ＤＭＳＯを対照として培地に添加した。ＤＭＳＯはウイルス性プラーク形成に全く効果を示さなかった。
【００９８】
図９は１００μＭの化合物３ｂの抗ウイルス作用を示す。図９ａは処理を行った細胞を示し、図９ｂは未処理の対照細胞を示す。明らかに、未処理の対照細胞の場合には緑色蛍光ウイルスは大きなプラークを形成した（プラークサイズは数百個の細胞だった）が、処理を行った細胞の場合には、僅かな細胞（２〜６ｃｅｌｌｓ／プラーク）のみがウイルス陽性信号を示した。
【００９９】
この実験から、化合物３ｂはウイルスの細胞への進入を阻害しないが、ウイルスの放出及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでウイルスの拡大を阻害することが分かった。
【０１００】
実施例１４
ｉｎ  ｖｉｖｏ抗癌作用ＩＩＩ
【０１０１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物から採取した２×１０６個のヒト白血病細胞（Ｋ５６２）を、部分的に麻酔（ジエチルエーテル麻酔）をかけた先天性免疫不全の雄成体ＣＢ１７／ｓｃｉｄマウスに静脈内注射した。腫瘍細胞の接種後、マウスを２つのグループにランダムに割り当て、耳に印を付けた。腫瘍細胞接種の４日後から、３週間にわたって週に５日、１日に１回、強制経口飼養によって化合物９ａ（１００ｍｇ／ｋｇ）でマウスを処理した。対照マウスには、同じ回数で処置グループと同様にして担体（ＤＭＳＯ）で適切に希釈して与えた。耳の印に従って、各マウスについて体重変化を１週間に一度調べた。化合物の効果の評価はマウスの生存率に基づく。結果を図１０に示す。
【０１０２】
この実験では、化合物９ａの作用を同濃度（１００ｍｇ／ｋｇ）の経口投与で調べた。化合物９ａによってマウスの生存率は有意に上昇したことが明らかに分かる。この結果は、本発明の化合物９ａは白血病の治療用途に有効であることを示している。
【０１０３】
実施例１５
マクロファージ培養におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｓに対する作用
【０１０４】
この実験では、化合物３ａの作用を分析した。すなわち、マクロファージ培養におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｓの阻害について調べた。ヒトマクロファージ細胞（ＴＨＰ−１）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下でＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｓで感染させた後、化合物３ａ（３６ｍｇ／ｌ）で処理した細胞と、未処理の細胞を様々な期間の後に採取し、生存しているＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｓの数を調べた。結果を図１１に示す。化合物３ａによって細菌数は未処理グループよりも有意に少なくなっていることが分かる。
【０１０５】
この実験から、化合物３ａがマイコバクテリア感染症の治療に有効であることは明らかである。
【０１０６】
実施例１６
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（３−モルホリノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（８ａ）の合成及び様々な腫瘍細胞株対するその作用
【化９】
2010530410.tif 000011
【０１０７】
９．５ｇ（２５ｍｍｏｌ）の２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドール−１，３−ジオン（２）を１５ｍｌのクロロホルムに溶解した。その後、モルホリン（２．４ｇ、２７．５ｍｍｏｌ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を溶液に添加した。溶液を１２時間撹拌した後、シリカゲルカラムに注入し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で平衡化した。カラムをクロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で洗浄し、そしてクロロホルムで溶出した。最初に分画した生成物８ａを蒸発によって単離し（収率：３．４ｇ、２９．２％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィーによって測定し（Ｒｆ：０．２４（クロロホルム））、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４４６．１）。
【０１０８】
ヒト及びマウスの種々の腫瘍細胞株に対する化合物８ａの作用について試験を行った。結果を下記の表１に示す。化合物８ａは様々な白血病、肝臓癌及び黒色腫で有効であることが明らかになった。
【０１０９】
【表１】
2010530410.tif 000012
【０１１０】
実施例１７
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（シクロペンチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン（９ａ）及び２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（シクロペンチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン（９ｂ）
【化１０】
2010530410.tif 000013
【０１１１】
１９ｇ（５０ｍｍｏｌ）の化合物２（２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドリン−１，３−ジオン）をクロロホルム（３０ｍｌ）に溶解した後、シクロペンチルアミン（８．３６ｇ（５５ｍｍｏｌ）、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を溶液に添加した。溶液を４時間撹拌した後、シクロヘキサン（２０ｍｌ）を添加し、次いでシリカゲルカラムに注入し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））で平衡化した。カラムをクロロホルム−シクロヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））で洗浄し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で溶出した。最初に分画した生成物９ａを蒸発によって単離し（収率：６．５ｇ、２７％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィーによって測定し（Ｒｆ：０．４４（クロロホルム：シクロヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ）））、そして生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４４５．６）。２番目に分画した生成物９ｂを蒸発によって単離し（収率：５．８ｇ、２５％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．３７（クロロホルム：シクロヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ）））によって測定し、そして生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４４５．５）。
【図１ａ】
2010530410.tif 000019
【図１ｂ】
2010530410.tif 000020
【図２ａ】
2010530410.tif 000021
【図２ｂ】
2010530410.tif 000022
【図３】
2010530410.tif 000023
【図４】
2010530410.tif 000024
【図５】
2010530410.tif 000025
【図６】
2010530410.tif 000026
【図９】
2010530410.tif 000027
【図１１】
2010530410.tif 000028
【図７】
2010530410.tif 000029
【図８】
2010530410.tif 000030
【図１０】
2010530410.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月21日(2009.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】新規化合物、小胞系に影響を及ぼす化合物、医薬組成物及びその使用
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病気の治療に適し、かつ、小胞系に、特には脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼす化合物に関し、さらに、本発明は、該化合物を含む医薬組成物、及び癌、炎症等の脂肪滴の形成及び／又は機能に関連する病気の治療、及びさまざまな細菌又はウイルス感染症の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年における新たな研究分野の１つは、細胞器官としての脂肪滴又は脂肪体（両方とも文献で見ることができる）の研究である。細胞内の脂肪滴は、主として脂質の貯蔵と輸送を担う。脂肪滴の形態とタンパク質含有量は大きく変わり得るが（Ｄｅｎｉｓ  Ｊ．  Ｍｕｒｐｈｙ他、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＴＩＢＳ  ２４、１９９９年３月、１０９〜１１５頁）、植物、動物、微生物における脂肪滴の形成はいくつかの面において類似している。ヒトの細胞内において脂肪滴の機能が損なわれると、脂肪肝、肥満、アテローム性動脈硬化症、２型糖尿病、炎症性疾患、癌等のいくつかの病気が生じ得る。通常、脂肪滴の大きさは０.１〜５０μｍである。
【０００３】
脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすことにより、脂肪滴が何らかの作用を有する病気に確実に影響を及ぼし得る。
【０００４】
脂肪滴の形成及び／又は移動を阻害する小分子は潜在的な抗癌作用を有する。これは、脂肪滴の機能と関連して、細胞内脂肪酸濃度が上昇すると以下に説明するアポプトーシスという結果になり得るためである。脂肪酸のデノボ合成は癌細胞に特有なものである。脂肪細胞以外の細胞が、飽和脂肪酸から形成されたトリグリセリドを貯蔵する能力は限られている。貯蔵以外に、細胞は酸化（β酸化）によって蓄積された脂肪酸を除去することができる。しかしながら、癌細胞に特有の低酸素条件下ではβ酸化は制限されるため、蓄積した脂肪酸の一部が脂肪滴の形で表れる。放出され、脂肪小胞に包まれていない脂肪酸は、小胞体膜に取り込まれて飽和度が上昇し、小胞体膜の構造及び完全性をついには壊すことになる。その結果、小胞体からカルシウムイオンが放出され、ミトコンドリアを介してアポプトーシスを引き起こす（Ｂｏｒｒａｄａｉｌｅ  ＮＭ、Ｈａｎ  Ｘ、Ｈａｒｐ  ＪＤ、Ｇａｌｅ  ＳＥ、Ｏｒｙ  ＤＳ、Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ＪＥ：Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｉｎ  ｌｉｐｏｔｏｘｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ２００６年１２月；４７（１２）：２７２６〜２７３７）。従って、腫瘍細胞内における脂肪滴の形成を阻害することによって係る腫瘍細胞を破壊することができる可能性がある。
【０００５】
脂肪滴の数は炎症中大きく増加する（Ｗｅｌｌｅｒ  ＰＦ  eｓ  Ｄｖｏｒａｋ  ＡＭ：Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ６５、１９８５年、１２６９〜１２７４頁；Ｗｅｌｌｅｒ  ＰＦ  eｓ  Ｄｖｏｒａｋ  ＡＭ：Ｌｉｐｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ：ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５、１９９４年、２４５〜２５０頁）。脂肪滴はエイコサノイドの代謝に重要な役割を有し、リン脂質含有アラキドン酸、及びプロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエンの合成のために必須であるシクロオキシゲナーゼ（プロスタグランジン及びエンドペルオキシダーゼシンターゼ）や５−リポキシゲナーゼ等の酵素の貯蔵庫であることが分かっている（Ｗｅｌｌｅｒ  Ｐ．Ｆ．他、Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ、１９８９年、１１３、９４７〜９５９頁）。
【０００６】
プロスタグランジン（ＰＧ）Ｄ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２ａ、ＰＧＩ２、トロンボキサンＡ２等のプロスタノイドは、幾つかの生理的機能を調整し、慢性関節リウマチ、ぜんそく、クローン病、アテローム性動脈硬化症等の炎症性疾患を緩和する（Ｒｉｓｔｉｍａｋｉ  Ａ.，Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ２：  ｆｒｏｍ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ.，２００４年；２５６：２１５〜２２１頁）。
【０００７】
シクロオキシゲナーゼ−２によって生成したプロスタグランジンは、増殖と血管新生を刺激することによって腫瘍の成長を助け、プログラム化した細胞死と免疫反応性を抑制する（Ｍａｒｋｓ  Ｆ，Ｆｕｒｓｔｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｇ，Ｍｕｌｌｅｒ−Ｄｅｃｋｅｒ  Ｋ.，Ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Res.，２００７年；１７４：３７〜４７頁）。
【０００８】
イムノゴールドステイニングにより、結腸のクローン病の場合に、結腸の、線維芽細胞、好酸性・好中性顆粒球、マクロファージ、食細胞、吸収上皮細胞においてプロ炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αが主として脂肪滴に結合することが判明している（Ｗａｌｔｒａｕｄ  J.Ｂｅｉｌ他，Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ＴＮＦ−ａ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，J.Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５８，１９９５年，２８４〜２９８頁）。そのため、脂肪滴はクローン病の進行に重要な役割を有し得ると考えられる。
【０００９】
また、アテローム性動脈硬化症の進行も脂肪滴の形成に関連する可能性がある（Ｔｏｄａ  Ｔ，Ｌｅｓｚｃｚｙｎｓｋｉ  ＤＥ，Ｋｕｍｍｅｒｏｗ  ＦＡ，Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｗｉｎｅ  ｄｕｃｔｕｓ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ.１９８０年１０月；３７（２）：３２５〜３３０頁）。
【００１０】
また、脂肪滴は、結核を引き起こすマイコバクテリア等の幾つかの細菌のライフサイクルに重要な役割を有している（Ｇａｒｔｏｎ  ＪＮ他，Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｐｕｔｕｍ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２年），１４８，２９５１〜２９５８頁）。
【００１１】
単純ヘルぺス及びインフルエンザウイルスの脂質代謝に対する作用について研究が行われている（Ａｍｂｒｏｓｅｖａ  ＴＶ，Ｖｏｔｉａｋｏｖ  ＶＩ，Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＯＴ，Ｓｅｒｅｂｒｉａｋｏｖａ  ＥＶ，Ｖｌａｄｙｋｏ  ＧＶ，Ｓａｍａｒｉｎａ  ＭＰ，Ｂｉｕｌｌ  Ｅｋｓｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ.１９９２年９月；１１４（９）：３０２〜３０４頁）。ウサギの急性ヘルペス感染症では、典型的な異常脂血症が、総コレステロールレベル、β−コレステロールレベル及びトリグリセリドレベルの上昇を伴って生ずることが判明している。また、ヒトの大動脈培養細胞のヘルペス感染に関する研究が発表されており、遊離脂質の細胞内蓄積が検出されている。
【００１２】
上述した例から、脂肪滴はいくつかの病気の進行に役割を果たし、脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすことによってそのような病気に好ましい効果を与え得ることが分かる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、ある種の病気に好ましい効果を与えるように脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼす化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、従来技術に対して新規であると考えられる化合物を特定した。すなわち、本発明は下記一般式（Ｉ）で表される化合物に関する。
【化１】
2010530410.tif 000032
式中、
ｎは４であり、
Ｘは３つがハロゲンであり、４番目の置換基は複素環又は−Ｎ−（Ｒ１、Ｒ２）基であり、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して水素、直鎖又は分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール、アラルキル又は複素環基を表し、これらの基は置換されていなくてもハロゲンで置換されていてもよく、或いはメチルピリジン基、エチルアミノ基又はモルホリノプロピル基であり、
Ｒ１及びＲ２はそれらの間に存在する窒素と共に５又は６員環を形成し、
Ａは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＨ−であり、
ＹはＯ又はＳであり、
ＺはＯ又はＳであり、
Ｒ’及びＲ’’は独立してイソプロピル基である
。
【００１５】
本発明者らは、一般式（Ｉ）で表される化合物を使用して目的を実現した。すなわち、本発明は、病気の治療及び小胞系、特に脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすために適した化合物に関し、該化合物は下記一般式（Ｉ）で表される。
【化２】
2010530410.tif 000033
式中、
ｎは４であり、
Ｘは３つがハロゲンであり、４番目の置換基は複素環又は−Ｎ−（Ｒ１、Ｒ２）基であり、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して水素、直鎖又は分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール、アラルキル又は複素環基であり、これらの基は置換されていなくてもハロゲンで置換されていてもよく、或いはメチルピリジン基、エチルアミノ基又はモルホリノプロピル基であり、
Ｒ１及びＲ２はそれらの間に存在する窒素と共に５又は６員環を形成し、
Ａは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＨ−であり、
ＹはＯ又はＳであり、
ＺはＯ又はＳであり、
Ｒ’及びＲ’’は独立してイソプロピル基である。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、Ａは単結合である。
【００１７】
本発明の好ましい別の実施形態では、Ｙ及びＺの少なくとも１つはＯであり、或いは両方ともにＯである。
【００１８】
本発明の好ましい別の実施形態では、Ｒ１は水素である。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、Ｘはハロゲン原子を表し、該ハロゲンはフッ素である。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、Ｒ１及び／又はＲ２は、非置換又はハロゲン置換エチル、エチル又はトリフルオロエチル基である。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態では、Ｒ１及び／又はＲ２はエチレン-アミン基である。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施形態では、Ｒ’及びＲ’’の両方ともにイソプロピル基である。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、脂肪滴に結合する化合物は、
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（２−アミノ−エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（２−アミノ−エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６−トリフルオロ−７−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，７−トリフルオロ−６−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（ピリジン−３−イルメチル−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（３−モルホリン−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（３−モルホリン−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（モルホリノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（１−シクロペンチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；及び
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（１−シクロペンチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン
から選択される。
【００２５】
本発明の好ましい別の実施形態では、病気は、癌、炎症、クローン病、アテローム性動脈硬化症、細菌又はウイルス感染症からなる群から選択される。
【００２６】
本発明の好ましいさらなる実施形態では、前記病気は癌である。
【００２７】
本発明の好ましいさらなる実施形態では、前記病気は炎症である。
【００２８】
本発明の好ましいさらなる実施形態では、前記病気は細菌又はウイルス感染症である。
【００２９】
本発明は、脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすことによって病気を治療するために好適な医薬組成物に関し、それらの医薬組成物は１種以上の担体を有し、一般式（Ｉ）で表される化合物を含有する。
【００３０】
医薬組成物は、経口投与、非経口投与又はその他の公知の投与方法、例えば、埋込型送達装置によって患者に投与することができる。投与経路は、病気、性別、年齢及び病気と回復の経過に影響を及ぼすその他のファクターに応じて決定することができる。入手可能な全ての状況及び情報に基づいて医師がその他の投与方法を決めることができることは、当業者に明らかであろう。
【００３１】
本発明に係る医薬組成物は、ヒト、動物、特に哺乳動物及び場合によっては鳥類（例えば、ウイルス又は細菌感染症）を治療するために使用することができる。
【００３２】
また、本発明に係る医薬組成物は、所与の病気の治療に適したその他の薬剤、化合物又は治療と組み合わせて使用することもできる。例えば、本発明に係る医薬組成物は放射線治療及び／又は化学治療と併用することができる。
【００３３】
また、本発明に係る医薬組成物は、例えば体質又は感染によって病気に罹患しやすいヒト又は動物における病気の予防に使用することもできる。
【００３４】
本発明に係る化合物は、
本発明に係る病気を引き起こす細胞、細胞株、ウイルスが存在する場所、例えば、医療施設、研究所、診断研究所等における感染／病気の予防に使用することもできる。
【００３５】
また、本発明は、上述した病気の治療における一般式（Ｉ）で表される化合物及び医薬組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１ａ】Ｘ線回折法によって測定した本発明の化合物、化合物３ａの結晶構造を示し、水素原子及び重原子の番号も示す。
【図１ｂ】Ｘ線回折法によって測定した本発明の別の化合物、化合物３ｂの結晶構造を示し、水素原子及び重原子の番号も示す。
【図２ａ】化合物３ｂによる処理後のマクロファージの基本的なＴＮＦ−αの放出の変化を示す。
【図２ｂ】化合物３ｂによる処理後のマクロファージのＬＰＳ誘発ＴＮＦ−αの放出の変化を示す。
【図３】本発明の化合物、化合物３ａ及び３ｂのＴＮＦ−αの分泌に対する作用を対数目盛で示す。
【図４】４８時間の処理後の本発明の幾つかの化合物の、ＲＶＨヒト黒色腫細胞株に対する細胞毒性作用を示す。
【図５】２４時間の処理後の本発明の幾つかの化合物の、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株に対する細胞毒性作用を示す。
【図６】２４時間の処理後の本発明の幾つかの化合物の、ＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞株に対する細胞毒性作用を示す。
【図７】脾臓／肝臓動物モデルにおける抗癌効果試験の結果を示す。
【図８】腫瘍質量検出に基づく生きている動物に対する本発明の化合物（化合物３ｂ）及び参照化合物（化合物２）の抗癌効果を示す。
【図９】仮性狂犬病ウイルスに対する本発明の化合物（化合物３ｂ）の抗ウイルス効果を示す。
【図１０】本発明の化合物（化合物９ａ）の抗癌効果作用を癌細胞接種後の生存図によって示す。
【図１１】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｓに対する本発明の化合物（化合物３ａ）の効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本明細書において「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択される置換基を意味する。
【００３８】
本明細書において「アリール基」という用語は、単独又は他の置換基と組み合わせて、１つの炭素環芳香族基又は２以上の炭素環芳香系を有する芳香環系を意味する。
例えば、「アリール」という用語はフェニル又はナフチル環系を含む。
【００３９】
本明細書において「−Ｃ１−２０−アルキル」という用語は、単独又は他の置換基と組み合わせて、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状の非環式炭化水素を意味する。「−Ｃ１−２０−アルキル」基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、へキシル、１−メチル−エチル、１−メチル−プロピル、２−メチル−プロピル、又は１，１−ジメチル−エチル基が挙げられる。
【００４０】
本明細書において「−Ｃ２−２０−アケニル」という用語は、単独又は他の置換基と組み合わせて、２〜２０個の炭素原子を有し、ビニル又はアリル基のように少なくとも１つの二重結合を含む直鎖状又は分岐状の非環式アルケニル置換基を意味する。
【００４１】
本明細書において「−Ｃ２−２０−アルキニル」という用語は、単独又は他の置換基と組み合わせて、２〜２０個の炭素原子を有し、少なくとも１つの三重結合を含む直鎖状又は分岐状の非環式アルケニル置換基を意味する。
【００４２】
本明細書において「−Ｃ５−６−シクロアルキル」は、単独又は他の置換基と組み合わせて、５又は６個の炭素原子を有するシクロアルキル置換基を意味し、例えばシクロペンチル基又はシクロヘキシル基が挙げられる。
【００４３】
「アラルキル」は、アリール置換アルキル基又はアリール置換シクロアルキル基を意味する。
【００４４】
本明細書において「複素環基」は、１つの窒素原子を含む非置換又はハロゲン置換脂環式環又は芳香族環、或いはメチルピリジン基又はモルホリノプロピル基を意味する。
【００４５】
「ヒドロキシアルキル基」は、水酸基で置換されたアルキル基を意味する。
【００４６】
本発明は、脂肪滴に結合し、及び脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすことによって病気に好影響を与える化合物を開示する。
【００４７】
なお、特開平１０−０７２３４６号に提示されている２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドリン−１，３−ジオン（化合物２）も一般式（Ｉ）で表される。この化合物は腫瘍壊死因子の生成を阻害することが示されていた。特開平１０−０７２３４６号によれば、この同じ化合物（化合物２）は抗炎症作用も有する。
【化３】
2010530410.tif 000034
【実施例】
【００４８】
本発明を以下の実施例によって説明するが、以下の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００４９】
実施例１
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（３ａ）及び２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（３ｂ）
【化４】
2010530410.tif 000035
【００５０】
１９ｇ（５０ｍｍｏｌ）の２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドール−１，３−ジオン（２）を３０ｍｌのクロロホルム（３０ｍｌ，ａ．ｒ．，Ｍｏｌａｒ）に溶解した後、エチルアミン（２ｍｌ、７０％ｖ／ｖ水溶液、Ａｌｄｒｉｃｈ）をそこに添加した。混合物を室温で４時間撹拌し、シクロヘキサン（２０ｍｌ、Ｍｏｌａｒ）を添加した。次に、溶液をシリカゲルカラムに注入し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））で平衡化した。カラムをクロロホルム−シクロヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））で洗浄し、次いでクロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））溶液で溶出した。最初に分画した生成物３ａを蒸発によって単離し（収率：６．９ｇ、３０．１％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．３９（クロロホルム：シクロヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ）））によって測定し、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４０４．３）。２番目に分画した生成物３ｂを蒸発によって単離し（収率：５．８ｇ、２８．７％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．１９（クロロホルム：シクロヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ）））によって測定し、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４０４．２）。
【００５１】
化合物３ａ及び３ｂの結晶構造を単結晶Ｘ線回折法によって確認した。得られた化合物の分子構造を図１ａ（３ａ）及び図１ｂ（３ｂ）に示す。図面では、三次元空間における原子変位パラメータに比例した大きさを有する楕円（すなわち、楕円が大きいほど、結晶中の原子はより動的である）によって各原子を表している。
【００５２】
１Ｈ  ＮＭＲ  ３ａ（ＣＤＣｌ３）δ  １．１７（ｄ，１２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，ＣＨ３（ｉＰｒ）），１．３１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＨ３（Ｎ−Ｅｔ）），２．６２−２．７５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ（ｉＰｒ）），３．５４−３．６３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２（Ｎ−Ｅｔ）），６．３６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，ＮＨ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，ｍ−Ｐｈ），７．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，ｐ−Ｐｈ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ  ３ａ（ＣＤＣｌ３）δ  １６．５７（ＣＨ３（Ｎ−Ｅｔ））２４．４０（ＣＨ３（ｉＰｒ）），２９．７６（ＣＨ（ｉＰｒ）），４０．３９（ＣＨ２（Ｎ−Ｅｔ）），１２４．３９（ｍ−Ｐｈ），１２６．６４（Ｎ−Ｐｈ），１３０．７４（ｐ−Ｐｈ），１３５．３６（Ｅｔ−Ｎ−ｉｓｏｉｎｄｏｌｅ），１４７．７８（ｏ−Ｐｈ）．
１Ｈ  ＮＭＲ  ３ｂ（ＣＤＣｌ３）δ  １．１７（ｄ，１２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，ＣＨ３（ｉＰｒ）），１．３４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＨ３（Ｎ−Ｅｔ）），２．６４−２．７４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ（ｉＰｒ）），３．５８−３．６７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２（Ｎ−Ｅｔ）），４．３８（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ｍ−Ｐｈ），７．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，ｐ−Ｐｈ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ  ３ｂ（ＣＤＣｌ３）δ  １６．６６（ＣＨ３（Ｎ−Ｅｔ））２４．４１（ＣＨ３（ｉＰｒ）），２９．７６（ＣＨ（ｉＰｒ）），４０．８０（ＣＨ２（Ｎ−Ｅｔ）），１２４．３７（ｍ−Ｐｈ），１２５．８３（Ｎ−Ｐｈ），１３０．７０（ｐ−Ｐｈ），１４７．８１（ｏ−Ｐｈ）．  
【００５３】
実施例２
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（４ａ）及び２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル）−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（４ｂ）
【化５】
2010530410.tif 000036
【００５４】
９．５ｇ（２５ｍｍｏｌ）の２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドール−１，３−ジオン（２）を１５ｍｌのクロロホルム（ａ．ｒ．，Ｍｏｌａｒ）に溶解した後、１，２−エチレンジアミン（２．７５ｇ、２５．５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）をそこに添加した。溶液を４時間撹拌した後、シリカゲルカラムに注入し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））で平衡化した。カラムをクロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で洗浄し、クロロホルムで溶出した。最初に分画した生成物４ａを蒸発によって単離し（収率：３．２ｇ、２６．９％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．３５（クロロホルム））によって測定し、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４７７．５）。２番目に分画した生成物４ｂを蒸発によって単離し（収率：３．１ｇ、２６．０％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィーによって測定し（Ｒｆ：０．３０（クロロホルム））、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４７７．４）。
【００５５】
実施例３
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（２−アミノ−エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（５ａ）及び２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（２−アミノ−エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（５ｂ）
【化６】
2010530410.tif 000037
【００５６】
９．５ｇ（２５ｍｍｏｌ）の２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドール−１，３−ジオン（２）を１５ｍｌのクロロホルム（ａ．ｒ．，Ｍｏｌａｒ）に溶解した後、１，２−エチレンジアミン（１．５３ｇ、２５．５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）をそこに添加した。溶液を４時間撹拌した後、シリカゲルカラムに注入し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で平衡化した。カラムをクロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で洗浄し、クロロホルムで溶出した。最初に分画した生成物５ａを蒸発によって単離し（収率：３．９ｇ、３７．２％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィーによって測定し（Ｒｆ：０．２９（クロロホルム））、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４１９．６）。２番目に分画した生成物５ｂを蒸発によって単離し（収率：３．９ｇ、３７．２％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィーによって測定し（Ｒｆ：０．２４（クロロホルム））、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４１９．４）。
【００５７】
実施例４
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６−トリフルオロ−７−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドール−１，３−ジオン（６ａ）及び２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，７−トリフルオロ−６−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドール−１，３−ジオン（６ｂ）
【化７】
2010530410.tif 000038
【００５８】
９．５ｇ（２５ｍｍｏｌ）の２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドール−１，３−ジオン（２）を１５ｍｌのクロロホルム（ａ．ｒ．，Ｍｏｌａｒ）に溶解した後、２，２，２−トリフルオロエチルアミン（０．２３ｇ、２５．３ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）をそこに添加した。溶液を４時間撹拌した後、シクロヘキサン（２０ｍｌ、Ｍｏｌａｒ））を添加し、シリカゲルカラムに注入し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））で平衡化した。カラムをクロロホルム−シクロヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））で洗浄し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で溶出した。最初に分画した生成物６ａを蒸発によって単離し（収率：５１０ｍｇ、４３．３％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．４５（クロロホルム：シクロヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ）））によって測定し、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４５８．２）。２番目に分画した生成物６ｂを蒸発によって単離し（収率：２０４ｍｇ、１７．３％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．２５（クロロホルム：シクロヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ）））によって測定し、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４５８．２）。
【００５９】
実施例５
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（３−モルホリノ−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（７ａ）及び２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（３−モルホリノ−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（７ｂ）
【化８】
2010530410.tif 000039
【００６０】
９．５ｇ（２５ｍｍｏｌ）の２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドール−１，３−ジオン（２）を１５ｍｌのクロロホルム（ａ．ｒ．，Ｍｏｌａｒ）に溶解した後、４−（３−アミノプロピル）モルホリン（３．６７ｇ、２５．５ｍｍｏｌ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）をそこに添加した。溶液を１２時間撹拌した後、シリカゲルカラムに注入し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で平衡化した。カラムをクロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で洗浄し、クロロホルムで溶出した。最初に分画した生成物７ａを蒸発によって単離し（収率：３．７ｇ、２９．５％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．２６（クロロホルム））によって測定し、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：５０３．２）。２番目に分画した生成物７ｂを蒸発によって単離し（収率：３．２ｇ、２５．５％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．２３（クロロホルム））によって測定し、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：５０３．４）。
【００６１】
実施例６
予め形成されたＴＮＦ−α分泌の阻害のための抗炎症作用の検出
【００６２】
成熟したマクロファージは、細菌性リポ多糖（Ｅ.ｃｏｌｉ  ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ）に反応して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）を生成する。ＴＮＦ−αの生成は、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）、リポ多糖結合性タンパク質（ＬＢＰ）及びＣＤ１４受容体に結合したＴＮＦ−αによって誘発される。ＴＮＦ−αの分泌は二相性である。刺激後の１時間は、マクロファージは予め形成されたＴＮＦ−αの放出に応答する。ＮＦ−ｋａｐｐａＢシグナリング経路はＴＮＦ−α遺伝子転写を引き起こし、約８時間後に最大に達する。
【００６３】
我々の実験では、ＲＡＷ．２６４．７成熟マウスマクロファージの早期ＴＮＦ−α分泌について調べた。この細胞株は、大量の予め形成されたＴＮＦ−αを保持している。細胞を刺激を与える２４時間前に６００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で２４ウェルプレートにプレートし、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。実施例１の化合物３ａ及び３ｂをサンプルの一部に添加し、担体（マクロファージのＴＮＦ−α放出に影響を与えない１％エチルアルコール）を対照ウェルに添加した。培養上清を回収し、ＴＮＦ−α含有量をＲ＆Ｄ  Ｄｕｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（検出限界：＜６２．５ｐｇ／ｍｌ）で測定した。ＬＰＳによる刺激の３時間後に、ＭＴＳ試験（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、Ｐｒｏｍｅｇａ（米国ウィスコンシン州マディソン））によって細胞の活力を調べたところ、細胞死は検出されなかった。従って、ＴＮＦ−αレべルの低下は、予め形成されたＴＮＦ−αの放出の阻害によるものであり、細胞死によるものではなかった。
【００６４】
ＮＦ−ｋａｐｐａＢ活性化によって推進されるＴＮＦ−α遺伝子の転写を、ＬＰＳ刺激後、ＮＦ  ｋａｐｐａＢルシフェラーゼ指標構造によって形質転換されたＲＡＷ.２６4.７マクロファージにおいて測定した。この構造は、最小プロモータによって駆動されるルシフェラーゼ遺伝子を含む。ＬＰＳ刺激（１００ｎｇ／ｍｌ）の６時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図２ｂに示す。
【００６５】
図２ａは化合物３ｂによる処理後のマクロファージの基本的なＴＮＦ−α放出の変化を示し、図２ｂはマクロファージのＬＰＳ刺激ＴＮＦ−α放出に対する化合物３ｂの影響を示す。本実施例では、２つの対照（希釈剤のみ、エタノール培養）と４つの処理サンプルを分析した。図２ａに示すように、ＬＰＳによる誘導がなくても、化合物３ｂはマクロファージの基本的なＴＮＦ−α放出を減少することができる。図２ｂに示すように、化合物３ｂは、ＬＰＳ刺激後、誘導されたＴＮＦ−α放出を減少する。
【００６６】
実施例７
ＴＮＦ−α誘発の阻害のための抗炎症作用の検出
【００６７】
本実施例では、実施例１の化合物３ａと３ｂによる実験の結果を示す。
【００６８】
後期ＴＮＦ−α分泌の検出のために、マクロファージのＬＰＳ誘発後に放出された予め形成されたＴＮＦ−αを４時間後に洗い流し、その後の４時間に生成されたＴＮＦ−αの量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。このようにして、マクロファージに予め形成されたＴＮＦ−αを排除し、その後に合成・分泌された転写誘発ＴＮＦ−αの量のみを測定した。結果を図３に示す。化合物３ａと化合物３ｂの両方ともマクロファージの後期ＴＮＦ−α分泌を濃度依存的に阻害したことが分かる。
【００６９】
ＴＮＦ−α分泌及びＮＦ−ｋａｐｐａＢ活性化に対する化合物３ａと化合物３ｂの効果は細胞毒性に基づく可能性もある。その除外のため、処理８時間後ＭＴＳ試験によって、細胞数に比例する細胞の代謝活性を測定した。これらの試験では、化合物３ａ及び化合物３ｂは毒性を示さなかった。換言すれば、それらは細胞の代謝活性を減少しなかった。
【００７０】
実施例８
アフィニティークロマトグラフィーによる相互作用タンパク質の同定
【００７１】
アフィニティークロマトグラフィーを使用して、本発明の化合物５ｂに結合するタンパク質がどちらか調べた。化合物５ｂを、ＤＭＦ：水（６：４）混合液内において室温で１６時間シアノブロミド活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ビーズに結合した。１ｍｌのビーズを５０ｍｌのＤＭＦ：水（６：４）混合液、次いで５０ｍｌの７０％エタノール、さらにＰＢＳ（０.０１Ｍリン酸緩衝液、０.００２７Ｍ  ＫＣｌ、０.１３７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ：7.４）で洗浄した。カラムを洗浄した後、ヒトＭＣＦ−７乳癌細胞（コンプリート プロテアーゼインヒビター カクテルタブレットで均質化した１０００万の細胞、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ製）のタンパク質画分５ｍｌをカラムに添加した。カラムを、２０ｍｌの０.２Ｍ  ＮａＣｌ−ＰＢＳ溶液、次いで１５ｍｌの０.５Ｍ  ＮａＣｌ−ＰＢＳ溶液、さらに１５ｍｌの０.８Ｍ  ＮａＣｌ−ＰＢＳ溶液で順次洗浄し、２ｍｌの２Ｍ  ＮａＣｌ−ＰＢＳで溶出した。溶出液を質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析し、化合物５ｂに結合したタンパク質を決定した。
【００７２】
質量分析は、本特許出願を作成する時点で「ｈｔｔｐ：／／ｄｏｎａｔｅｌｌｏ.ｕｃｓｆ.ｅｄｕ／ｉｎｇｅｌ.ｈｔｍｌ」で公開されていたプロトコルに従って行った。
【００７３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために、５μｌのサンプルを注入した。ＬＣプレカラムトラップを使用した（５分間、２０μｌのｌ０．１％トリフルオロ酢酸／水、その後ＭＳ／ＭＳ分析のために傾斜溶離法）。カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ１８、５μｍ、５×０．３ｍｍ；Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ１８、３．５μｍ、１５０×０．０７５ｍｍ。溶媒：溶媒Ａ１：９５．０％（０．１％トリフルオロ酢酸／水）、溶媒Ｂ１：５．０％（０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル）。ＭＳ法：走査：ｍ／ｚ  ３００〜１６００、ＭＳ２  走査：ｍ／ｚ  １００〜１８００。
【００７４】
これらの試験により、なによりも、Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅタンパク質との相互作用が特定された。Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅタンパク質は、脂肪滴を含む小胞の細胞内移動に影響を及ぼす。Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅタンパク質は、癌を含むいくつかの病気の進行に関与することを示している（Ｋｗａｉ  Ｗ.  Ｃｈｅｎｇ他、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＲＡＢ  ＧＴＰａｓｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；６５：（７）、２００５年４月１日、２５１６〜２５１９頁）。
【００７５】
我々の研究は、化合物３ｂも小胞移動に関与するＳＥＣ２２ｂタンパク質に結合することができることを明らかにした。ＳＥＣ２２ｂタンパク質は、レジュネラ・ニューモフィラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）によって引き起こされる、いわゆる軍団病（ｌｅｇｉｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）に対する薬の候補対象であり得る（Ｄｅｒｒｅ  Ｉ及びＩｓｂｅｒｇ  ＲＲ：Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｖａｃｕｏｌｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｖｏｌｖｅｓ  Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＩＴＹ、２００４年５月、３０４８〜３０５３頁）。
【００７６】
実施例９
黒色腫細胞株に対する抗腫瘍活性
【００７７】
ＲＶＨヒト黒色腫細胞株を、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）、１０％ウシ胎児血清とともにイーグル最少必須培地（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）内で培養した。細胞を２日毎にトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）でトリプシン処理し、６０又は１００ｍｍプレートに注入した。計画の実験に必要な細胞数（約１０６個）に達した時に、５０.００ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞を２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）２４  Ｗｅｌｌ  ＴＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）にプレートし、一晩放置してウェルの底部に付着させた。物質の添加は以下のように行った。翌日、付着した細胞から培養培地を分離し、本発明の化合物を適切な濃度で含み、よく混合した培地を前記細胞にピペットで添加した（２ｍｌ／ウェル）。試験対象物質を１００％ＤＭＳＯで希釈し、所与の試験において物質の最高濃度に対応するＤＭＳＯの量を対照ウェルの培地で測定した。４８時間の処理後、生存細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）で検出し、処理サンプル及び対照サンプル中の生存細胞の数を決定した。
【００７８】
前記試験では以下の物質を使用した。
１）ＭＴＳ：（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）
２）ＰＭＳ：フェナジンメトサルフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）
【００７９】
ＭＴＳは生存細胞中でホルマザンに変換され、生成物は培地に溶解し、その量及び吸光度を４９０ｎｍで測定することができる。
【００８０】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙの説明書は、９６ウェルプレートに言及し、試験中異なる物質と一緒に１０．０００ｃｅｌｌｓ／ウェル培養することを推奨している。次に、生存細胞の割合を決定するために、２０μｌのＭＴＳと１μｌのＰＭＳを１００μｌの培地に添加する。３７℃、５％ＣＯ２、１〜４時間の培養で酵素反応が発生する。その細胞によって生成したホルマザンをＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取り、生存細胞の数を間接的に得ることができる。発明者らは５０．０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの２４ウェルプレートを使用して実験を行ったため、プロトコルを変更する必要があった。細胞を適切な時間（化合物の種類、濃度に応じた）処理した後、対象物質を含む培地（２ｍｌ）を取り出し、上述した濃度（１ウェル当たり３３３．３μｌの培地、６６．６μｌのＭＴＳ及び３．３μｌのＰＭＳ）と同じ濃度で試薬を含む４００μｌの培地をピペットで細胞に添加した。
ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＲＣ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、米国マサチューセッツ州フランクリン）を使用することができるように、２４ウェルプレートの各単一ウェルから採取した４００μｌのサンプルをピペットで９６ウェルプレート（Ｍｉｃｒｏｍｅｔｈｏｄプレート、９６ウェル、平坦状）の４つのウェルに１００μｌずつ添加した。これにより、ばらつきがあるピペット採取による誤差をできるだけ排除することもできた。各２４ウェルプレートで４つのウェルは対照サンプルだった。３回にわたって１００μｌを９６ウェルプレートにピペットで添加した。すなわち、各９６ウェルプレートで１２の対照サンプルを用意した。残りの４つのウェルは、上述のようにＭＴＳ及びＰＭＳを含む１００μｌの培地によるバックグラウンド測定用とした。
【００８１】
結果を図４に示す。化合物３ｂ、７ｂ、５ａ、４ａ、４ｂ及び６ａは最も強い阻害作用を示したことが分かる。化合物５ｂと化合物３ａは、この種の腫瘍に対して１００μＭの濃度であっても弱い阻害効果を示した。
【００８２】
実施例１０
肝細胞癌細胞株及び乳癌細胞株に対する抗腫瘍活性
【００８３】
これらの実験では、ＨｅｐＧ２（ヒト白人肝細胞癌）細胞及びＭＣＦ７（ヒト白人乳腺腺癌）細胞を使用した。細胞は以下の培地で培養した。ＨｅｐＧ２の場合には、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）及び１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（高濃度グルコース）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、米国カリフォルニア州カールスバッド）を使用し、ＭＣＦ７の場合には、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）及び１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（高濃度グルコース）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、米国カリフォルニア州カールスバッド）と栄養分混合物Ｆ−１２Ｈａｍ（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）の１：１混合物を使用した。
【００８４】
実験は、この場合培養時間を２４時間とした以外は実施例９に記載したように行った。培養期間後、ＭＴＳ試験（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）を上述したように行った。
【００８５】
ＨｅｐＧ２細胞を使用した実験の結果を図５に示す。
【００８６】
化合物７ａ、７ｂ、４ａ及び６ａで最も強い阻害作用が検出されたことが分かる。化合物７ｂ、４ｂ及び３ｂは、すでに２０及び５０μＭの濃度で強い効果を示した。化合物５ｂ及び３ａは、この腫瘍種で試験を行った濃度範囲では弱い効果を示した。
【００８７】
ＭＣＦ７細胞を使用した実験の結果を図６に示す。化合物７ａ、４ａ及び６ａで最も強い阻害作用が検出されたことが分かる。化合物５ａ、７ｂ及び４ｂは、すでに２０及び５０μＭの濃度で強い効果を示した。化合物３ａ及び３ｂは、この腫瘍種で試験を行った濃度範囲では弱い効果示した。 
【００８８】
実施例１１
ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍作用Ｉ
【００８９】
脾臓／肝臓動物モデルを使用して研究を行った。先天性免疫不全の４０匹の雄成体ＣＢ１７／ｓｃｉｄマウスから２０匹をランダムに選択し、さらに２つのグループに分けた。マウスの耳に１疋ずつ印を付けた。選択したマウスのうちの１０匹には化合物３ｂ（４０ｍｇ／ｋｇ）を５日間与え（前処置（ＰＲＥＴＲＥＡＴＥＤ／３ｂ）、残りの１０匹には担体として機能するＤＭＳＯで適切に希釈して強制経口飼養を行った（前処置（ＰＲＥＴＲＥＡＴＥＤ）／対照）。処理５日目に、４０匹のマウス全部をネンブタール（７５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔して、ヒト黒色腫（ＨＴ１６８Ｍ１）から採取した細胞（４×１０４個）をマウスの脾臓に注入した。注入時の局所的な出血はＧｅｌａｓｐｏｎ吸収ゼラチンスポンジで処理した。注入後７日目に、処置していない２０匹のマウスを２つのグループにランダムに割り当て、耳に印を付けた。１０匹のマウスにはその後化合物３ｂ（４０ｍｇ／ｋｇ）を与え（後処置（ＰＯＳＴＲＥＡＴＥＤ）／３ｂ）、残りの１０匹には１週間に５回、１日１回、同様の頻度で担体（ＤＭＳＯ）で適切に希釈して３週間にわたって強制経口飼養を行った（後処置（ＰＯＳＴＲＥＡＴＥＤ）／対照）。前処置したグループには注入後は処置を行わなかった。各マウスについて、体重変化を１週間に一度調べた。注入後３１日目に、ネンブタール（７５ｍｇ／ｋｇ）による麻酔下でマウスを出血死した。評価は、一次脾臓腫瘍の質量及び肝臓に見出されたコロニーの数と大きさに基づいて行った。
結果を図７に示す。
【００９０】
化合物３ｂの試験を行った場合には、５回の前処置によって転移（ｐ＝０.０５）の数を大きく減少した。これは、化合物３ｂが腫瘍細胞の付着を阻害し、原発腫瘍の後に転移が発生するケースに適用することができる可能性があり得ることを意味する。化合物３ｂは、転移を生じる可能性のある循環血液中に存在する腫瘍細胞の付着を阻害する。このため、患者の生存の可能性を高めることができる。この作用は強く、４０ｍｇ／ｋｇの経口用量５回でそれを誘発するのに十分であった。
【００９１】
また、付着した細胞のさらなる転移は上記用量での化合物３ｂの連続投与でわずかに抑制された。ただし、おそらくは対照サンプルの大きなばらつきのために統計的に有意ではなかった。
【００９２】
実施例１２
ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍作用ＩＩ
【００９３】
わずかに麻酔（ジエチルエーテル昏睡）をかけた先天性免疫不全の雄成体ＣＢ１７／ｓｃｉｄマウスの皮下にｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト黒色腫細胞株（ＨＴ１６８Ｍ１）培養物から採取した細胞（８×１０５個）を埋め込んだ。腫瘍細胞の接種後、マウスを３つのグループにランダムに割り当て、耳に印を付けた。腫瘍細胞接種の７日後から、３週間にわたって週に５日、１日に１回、化合物２（４０ｍｇ／ｋｇ）又は化合物３ｂ（４０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに強制経口飼養して処理した。対照マウスは、適切に希釈した担体（ＤＭＳＯ）で同じ方法、同じ頻度で処理した。各マウスについて、体重変化を１週間に一度調べた。皮下腫瘍が明白な大きさに達した時に、腫瘍の寸法をカリパスで測定した。腫瘍の体積は式「π／６×ａ×ｂ２」（ａは長径、ｂは短径）によって推定した。注入後３０日目に、ネンブタール（７５ｍｇ／ｋｇ）による麻酔下でマウスを出血死した。評価は原発腫瘍の質量に基づいて行った。結果を図８に示す。
【００９４】
この実験では、化合物２と化合物３ｂの効果について同じ用量（４０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与で試験を行った。
【００９５】
皮下の原発腫瘍の成長に対する化合物２の効果は有意ではなかったことが明らかに分かる。対照的に、化合物３ｂは同じパラダイムで腫瘍の大きさを有意に（ｐ＝０.０５）減少した。そのため、本発明の化合物３ｂは、従来技術に係る化合物２よりも経口投与による原発腫瘍の成長の阻害に対してより効果的であると結論付けることができる。
【００９６】
実施例１３
細胞系における抗ウイルス作用の実証
【００９７】
ＰＫ−１５ブタ腎臓細胞を、Ｐｌａｔ２ウイルスゲノムに挿入された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する約０.００１ｐｆｕ／ｃｅｌｌの仮性狂犬病Ｂａｒｔｈａ型ウイルスに感染した。ＰＫ−１５細胞を８０％の密集度で調べた。３７℃、５％ＣＯ２での培養の２４時間後に、緑色の蛍光を示す細胞を蛍光顕微鏡法によって調べた。感染時に、細胞を１００μＭの化合物３ｂ（１／１００  ＤＭＳＯ  １０ｍＭ基底液）で処理し、１／１００  ＤＭＳＯを対照として培地に添加した。ＤＭＳＯはウイルス性プラーク形成に全く効果を示さなかった。
【００９８】
図９は１００μＭの化合物３ｂの抗ウイルス作用を示す。図９ａは処理を行った細胞を示し、図９ｂは未処理の対照細胞を示す。明らかに、未処理の対照細胞の場合には緑色蛍光ウイルスは大きなプラークを形成した（プラークサイズは数百個の細胞だった）が、処理を行った細胞の場合には、僅かな細胞（２〜６ｃｅｌｌｓ／プラーク）のみがウイルス陽性信号を示した。
【００９９】
この実験から、化合物３ｂはウイルスの細胞への進入を阻害しないが、ウイルスの放出及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでウイルスの拡大を阻害することが分かった。
【０１００】
実施例１４
ｉｎ  ｖｉｖｏ抗癌作用ＩＩＩ
【０１０１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物から採取した２×１０６個のヒト白血病細胞（Ｋ５６２）を、部分的に麻酔（ジエチルエーテル麻酔）をかけた先天性免疫不全の雄成体ＣＢ１７／ｓｃｉｄマウスに静脈内注射した。腫瘍細胞の接種後、マウスを２つのグループにランダムに割り当て、耳に印を付けた。腫瘍細胞接種の４日後から、３週間にわたって週に５日、１日に１回、強制経口飼養によって化合物９ａ（１００ｍｇ／ｋｇ）でマウスを処理した。対照マウスには、同じ回数で処置グループと同様にして担体（ＤＭＳＯ）で適切に希釈して与えた。耳の印に従って、各マウスについて体重変化を１週間に一度調べた。化合物の効果の評価はマウスの生存率に基づく。結果を図１０に示す。
【０１０２】
この実験では、化合物９ａの作用を同濃度（１００ｍｇ／ｋｇ）の経口投与で調べた。化合物９ａによってマウスの生存率は有意に上昇したことが明らかに分かる。この結果は、本発明の化合物９ａは白血病の治療用途に有効であることを示している。
【０１０３】
実施例１５
マクロファージ培養におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｓに対する作用
【０１０４】
この実験では、化合物３ａの作用を分析した。すなわち、マクロファージ培養におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｓの阻害について調べた。ヒトマクロファージ細胞（ＴＨＰ−１）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下でＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｓで感染させた後、化合物３ａ（３６ｍｇ／ｌ）で処理した細胞と、未処理の細胞を様々な期間の後に採取し、生存しているＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｓの数を調べた。結果を図１１に示す。化合物３ａによって細菌数は未処理グループよりも有意に少なくなっていることが分かる。
【０１０５】
この実験から、化合物３ａがマイコバクテリア感染症の治療に有効であることは明らかである。
【０１０６】
実施例１６
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（３−モルホリノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドール−１，３−ジオン（８ａ）の合成及び様々な腫瘍細胞株対するその作用
【化９】
2010530410.tif 000040
【０１０７】
９．５ｇ（２５ｍｍｏｌ）の２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドール−１，３−ジオン（２）を１５ｍｌのクロロホルムに溶解した。その後、モルホリン（２．４ｇ、２７．５ｍｍｏｌ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を溶液に添加した。溶液を１２時間撹拌した後、シリカゲルカラムに注入し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で平衡化した。カラムをクロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で洗浄し、そしてクロロホルムで溶出した。最初に分画した生成物８ａを蒸発によって単離し（収率：３．４ｇ、２９．２％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィーによって測定し（Ｒｆ：０．２４（クロロホルム））、生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４４６．１）。
【０１０８】
ヒト及びマウスの種々の腫瘍細胞株に対する化合物８ａの作用について試験を行った。結果を下記の表１に示す。化合物８ａは様々な白血病、肝臓癌及び黒色腫で有効であることが明らかになった。
【０１０９】
【表１】
2010530410.tif 000041
【０１１０】
実施例１７
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（シクロペンチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン（９ａ）及び２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（シクロペンチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン（９ｂ）
【化１０】
2010530410.tif 000042
【０１１１】
１９ｇ（５０ｍｍｏｌ）の化合物２（２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６，７−テトラフルオロイソインドリン−１，３−ジオン）をクロロホルム（３０ｍｌ）に溶解した後、シクロペンチルアミン（８．３６ｇ（５５ｍｍｏｌ）、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を溶液に添加した。溶液を４時間撹拌した後、シクロヘキサン（２０ｍｌ）を添加し、次いでシリカゲルカラムに注入し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））で平衡化した。カラムをクロロホルム−シクロヘキサン（１：３（ｖ／ｖ））で洗浄し、クロロホルム−シクロヘキサン（１：１（ｖ／ｖ））で溶出した。最初に分画した生成物９ａを蒸発によって単離し（収率：６．５ｇ、２７％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィーによって測定し（Ｒｆ：０．４４（クロロホルム：シクロヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ）））、そして生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４４５．６）。２番目に分画した生成物９ｂを蒸発によって単離し（収率：５．８ｇ、２５％）、生成物の純度を薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ：０．３７（クロロホルム：シクロヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ）））によって測定し、そして生成物の質量を質量分析法によって確認した（ＭＷ＋１：４４５．５）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物。
【化１】
2010530410.tif 000043
式中、
ｎは４であり、
Ｘは３つがハロゲンであり、４番目の置換基は複素環又は−Ｎ−（Ｒ１、Ｒ２）基であり、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して水素、直鎖又は分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール、アラルキル又は複素環基を表し、これらの基は置換されていなくてもハロゲンで置換されていてもよく、或いはメチルピリジン基、エチルアミノ基又はモルホリノプロピル基であり、
Ｒ１及びＲ２はそれらの間に存在する窒素と共に５又は６員環を形成し、
Ａは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＨ−であり、
ＹはＯ又はＳであり、
ＺはＯ又はＳであり、
Ｒ’及びＲ’’は独立してイソプロピル基である。
【請求項２】
Ａが単結合である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｙ及びＺの少なくとも１つがＯであり、或いは両方ともにＯである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が水素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘがハロゲン原子を表し、該ハロゲンがフッ素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１及び／又はＲ２が非置換エチル又はハロゲン置換エチル又はトリフルオロエチル基である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１及び／又はＲ２がエチレン−アミンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ’及びＲ’’の両方がイソプロピルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（２−アミノ−エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（２−アミノ−エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６−トリフルオロ−７−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，７−トリフルオロ−６−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（ピリジン−３−イルメチル−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（３−モルホリン−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（３−モルホリン−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（３−モルホリノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（シクロペンチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；及び
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（シクロペンチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン
から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
病気の治療及び小胞系、特に脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすために適した請求項１の一般式（Ｉ）で表される化合物。
【化２】
2010530410.tif 000044
式中、
ｎは４であり、
Ｘは３つがハロゲンであり、４番目の置換基は複素環又は−Ｎ−（Ｒ１、Ｒ２）基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して水素、直鎖又は分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール、アラルキル又は複素環基を表し、これらの基は置換されていなくてもハロゲンで置換されていてもよく、或いはメチルピリジン基、エチルアミノ基又はモルホリノプロピル基であり、
Ｒ１及びＲ２はそれらの間に存在する窒素と共に５又は６員環を形成し、
Ａは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＨ−であり、
ＹはＯ又はＳであり、
ＺはＯ又はＳであり、
Ｒ’及びＲ’’はイソプロピル基である。
【請求項１１】
Ａが単結合である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｙ及びＺの少なくとも１つがＯであり、或いはは両方ともにＯである、請求項１０又は１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１が水素である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘがハロゲンを表し、該ハロゲンがフッ素である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ１及び／又はＲ２が非置換エチル又はハロゲン置換エチル、エチル又はトリフルオロエチル基である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ１及び／又はＲ２がエチレン−アミンである、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ’及びＲ’’が両方ともにイソプロピルである、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（２−アミノ−エチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（２−アミノ−エチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，６−トリフルオロ−７−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４，５，７−トリフルオロ−６−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）イソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（ピリジン−３−イルメチル−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（ピリジン−３−イルメチル−アミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（３−モルホリン−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（３−モルホリン−４−イル−プロピルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（３−モルホリノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−４−（シクロペンチルアミノ）−５，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−５−（シクロペンチルアミノ）−４，６，７−トリフルオロイソインドリン−１，３−ジオン
から選択される、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記病気が、癌、炎症、クローン病、アテローム性動脈硬化症、細菌又はウイルス感染症からなる群から選択される、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
前記病気が癌である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
前記病気が炎症である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２２】
前記病気が細菌又はウイルス感染症である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２３】
小胞系の形成及び／又は機能、特に脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすことによって病気を治療するために適した医薬組成物であって、１種以上の添加剤を有し、請求項１の一般式（Ｉ）で表される化合物を含む医薬組成物。
式中、
Ｘは３つがハロゲンであり、４番目の置換基は複素環又は−Ｎ−（Ｒ１、Ｒ２）基であり、ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素、直鎖又は分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール、アラルキル又は複素環基を表し、これらの基は置換されていなくてもハロゲンで置換されていてもよく、或いはメチルピリジン基、エチルアミノ基又はモルホリノプロピル基であり、
Ｒ１及びＲ２はそれらの間に存在する窒素と共に５又は６員環を形成し、
Ａは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＨ−であり、
ＹはＯ又はＳであり、
ＺはＯ又はＳであり、
Ｒ’及びＲ’’は独立してイソプロピル基である。
【請求項２４】
小胞系の形成及び／又は機能、特に脂肪滴の形成及び／又は機能に影響を及ぼすことによって病気を治療するために適した化合物の使用であって、前記化合物が請求項１の一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする化合物の使用。
【化３】
2010530410.tif 000045
式中、
ｎは４であり、
Ｘは３つがハロゲンであり、４番目の置換基は複素環又は−Ｎ−（Ｒ１、Ｒ２）基を表し、ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素、直鎖又は分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール、アラルキル又は複素環基を表し、これらの基は置換されていなくてもハロゲンで置換されていてもよく、或いはメチルピリジン基、エチルアミノ基又はモルホリノプロピル基であり、
Ｒ１及びＲ２はそれらの間に存在する窒素と共に５又は６員環を形成し、
Ａは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＨ−であり、
ＹはＯ又はＳであり、
ＺはＯ又はＳであり、
Ｒ’及びＲ’’は独立してイソプロピル基である。
【国際調査報告】
2010530410.tif 000046
2010530410.tif 000047
2010530410.tif 000048
2010530410.tif 000049