(57)【要約】  ある具体例において、本発明は、卵巣癌におけるＥｐｈＢ４活性を阻害するための組成物、及び方法を提供する。他の具体例において、本発明は、卵巣癌を治療するための方法及び組成物を提供する。
2010521467.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵巣癌を治療する方法であって、該方法は、有効量のＥｐｈＢ４インヒビターを、それを必要とする患者に、投与することを含む方法。
【請求項２】
前記のＥｐｈＢ４インヒビターが、ポリペプチド、ポリペプチド類似体、ペプチド模倣物、抗体、核酸、ＲＮＡｉ構築物、核酸類似体、及び小型分子よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記のＥｐｈＢ４インヒビターが、抗体又はその抗原結合性断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記の抗体又はその抗原結合性断片が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は抗体断片、ディアボディ、キメラ抗体又は抗体断片、ヒト化抗体又は抗体断片、脱免疫化したヒト抗体又は抗体断片、完全ヒト抗体又は抗体断片、一本鎖抗体、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆab、Ｆab'、及びＦ(ab')２よりなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記の抗体又はその抗原結合性断片が、モノクローナル抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記のモノクローナル抗体が、ヒト化抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記の抗体又はその抗原結合性断片が、ＥｐｈＢ４の細胞外部分に位置されたエピトープに結合して、ＥｐｈＢ４活性を阻害する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記の抗体又はその抗原結合性断片が、ＥｐｈＢ４配列のアミノ酸１６〜１９８、３２７〜４２７又は４２８〜５３７内に位置されたエピトープに結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記の抗体又はその抗原結合性断片が、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が、SEQ ID NO:２６１、SEQ ID NO:２６２又はSEQ ID NO:２６３よりなる群から選択するアミノ酸配列を有する一以上のＣＤＲ領域を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記の抗体又はその抗原結合性断片が、軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:２６４、SEQ ID NO:２６５又はSEQ ID NO:２６６よりなる群から選択するアミノ酸配列を有する一以上のＣＤＲ領域を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
抗体又はその抗原結合性断片が、更なる機能的部分に共有結合されている、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
更なる機能的部分が、検出可能な標識である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
検出可能な標識が、蛍光標識又は発色性標識から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記の検出可能な標識が、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
更なる機能的部分が、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
抗体又はその抗原結合性断片が、ＥｐｈＢ４活性を阻害する、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
抗体又はその抗原結合性断片が、ＥｐｈＢ４キナーゼ活性を刺激する、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記のＥｐｈＢ４インヒビターが、下記より選択される可溶性ポリペプチドである、請求項１に記載の方法：
(ｉ)ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む可溶性ポリペプチドであって、ＥｐｈＢ４ポリペプチドが単量体であり、ＥｐｈｒｉｎＢ２ポリペプチドに特異的に結合する当該可溶性ポリペプチド；及び
(ii)ＥｐｈｒｉｎＢ２タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む可溶性ポリペプチドであって、可溶性ＥｐｈｒｉｎＢ２ポリペプチドが単量体であり、ＥｐｈＢ４ポリペプチドに高い親和性で結合する当該可溶性ポリペプチド。
【請求項１９】
可溶性ポリペプチドが、ＥｐｈＢ４タンパク質の球状ドメインを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
可溶性ポリペプチドが、ＥｐｈＢ４のアミノ酸配列の残基１〜５２２に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
可溶性ポリペプチドが、ＥｐｈＢ４のアミノ酸配列の残基１〜４１２に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
可溶性ポリペプチドが、ＥｐｈＢ４のアミノ酸配列の残基１〜３１２に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
可溶性ポリペプチドが、ＥｐｈｒｉｎＢ２のアミノ酸配列の残基１〜２２５に対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
可溶性ポリペプチドが、融合タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
可溶性ポリペプチドが、少なくとも一つの改変アミノ酸残基を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
可溶性ポリペプチドが、ＥｐｈｒｉｎＢ２とＥｐｈＢ４の相互作用を阻止する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
可溶性ポリペプチドが、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４のクラスター形成を阻止する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
可溶性ポリペプチドが、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４のリン酸化を阻止する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
ＥｐｈＢ４インヒビターが、核酸化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記の核酸化合物が、約１５〜１００ヌクレオチド長であり、生理的条件下でＥｐｈＢ４核酸配列にハイブリダイズして、該ＥｐｈＢ４の発現を減じる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記の核酸が、ＲＮＡｉ構築物及びアンチセンスオリゴヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記のＲＮＡｉ構築物が、ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡよりなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記のｓｉＲＮＡが、１９〜３０ヌクレオチド長である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記のｓｉＲＮＡが、２１〜２３ヌクレオチド長である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記のｓｉＲＮＡ配列が、SEQ ID NO:１及びSEQ ID NO:２よりなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、１９〜３０ヌクレオチド長である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、SEQ ID NO:５よりなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記のＥｐｈＢ４インヒビターが、全身投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記のＥｐｈＢ４インヒビターが、局所投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記のＥｐｈＢ４インヒビターが、抗癌活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記の抗癌活性が、アポトーシスの促進、腫瘍成長の阻止、癌細胞増殖の阻止、癌細胞移動の阻止、癌細胞の転移の阻止、血管形成の阻止、及び腫瘍細胞死を引き起こすことよりなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記のＥｐｈＢ４インヒビターが、製薬上許容しうるキャリアーと配合される、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
卵巣癌が、ＥｐｈＢ４を発現する少なくとも一種の癌細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
卵巣癌細胞が、同等の組織に由来する非癌性細胞と比べて一層高レベルのＥｐｈＢ４を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
卵巣癌が、転移性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
卵巣癌が、血管形成依存性であり又は血管形成非依存性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記の患者が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
ＥｐｈＢ４インヒビターと相加的又は相乗的に卵巣癌細胞を阻止する少なくとも一種の更なる抗癌化学療法剤を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
ＥｐｈＢ４インヒビターと相加的又は相乗的に血管形成を阻止する少なくとも一種の更なる抗血管形成剤を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
ＥｐｈＢ４インヒビターの、卵巣癌の治療のための医薬の製造における利用。
【請求項５１】
卵巣癌の患者を治療する方法であって、(ａ)ＥｐｈＢ４を発現する複数の癌細胞を有する卵巣癌を患者において同定すること；及び(ｂ)その患者にＥｐｈＢ４インヒビターを投与することを含む当該方法。
【請求項５２】
前記のＥｐｈＢ４インヒビターが、ポリペプチド、ポリペプチド類似体、ペプチド模倣物、抗体、核酸、ＲＮＡｉ構築物、核酸類似体、及び小型分子よりなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
患者における卵巣癌の成長速度を減じる方法であって、卵巣癌の成長速度を減じるのに十分な量のＥｐｈＢ４インヒビターを投与することを含む当該方法。
【請求項５４】
前記のＥｐｈＢ４インヒビターが、ポリペプチド、ポリペプチド類似体、ペプチド模倣物、抗体、核酸、ＲＮＡｉ構築物、核酸類似体、及び小型分子よりなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
カスパーゼ−８の活性化を誘導する方法であって、ＥｐｈＢ４インヒビターを投与することを含む当該方法。
【請求項５６】
被験体が卵巣癌を有しているかどうかを検出する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)該被験体から試料を得ること；及び
(ｂ)その試料におけるＥｐｈＢ４タンパク質及び／又はｍＲＮＡの発現レベルを評価する
ことを含み、対照と比較してＥｐｈＢ４タンパク質及び／又はｍＲＮＡの増大したレベルが、その被験体が卵巣癌を有していることを示す当該方法。
【請求項５７】
前記の被験体が、ヒトである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記の卵巣癌が、転移性卵巣癌である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
ＥｐｈＢ４タンパク質の発現レベルが、抗体ベースのアッセイで評価される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
ＥｐｈＢ４タンパク質又はｍＲＮＡのレベルが、正常な卵巣組織におけるレベルの少なくとも２倍である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
試料が、組織試料、血液試料、及び血清試料よりなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
卵巣癌の患者の予後を示す方法であって、該方法は、下記：
(ａ)該患者から試料を得ること；
(ｂ)その試料におけるＥｐｈＢ４タンパク質及び／又はｍＲＮＡの発現レベルを評価する
ことを含み、対照と比べて高レベルのＥｐｈＢ４タンパク質及び／又はｍＲＮＡは、悪い予後を示す当該方法。
【請求項６３】
前記の哺乳動物が、ヒトである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記の卵巣癌が、転移性卵巣癌である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
ＥｐｈＢ４タンパク質又はｍＲＮＡのレベルが、正常な卵巣組織におけるレベルの少なくとも２倍である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
試料が、組織試料、血液試料、及び血清試料よりなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
卵巣癌診断用キットであって、抗ＥｐｈＢ４抗体又はその結合性抗体断片、検出用標識、及びキット使用のための指示書を含む当該卵巣癌診断用キット。
【請求項６８】
検出用標識が、蛍光標識又は発色性標識である、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
前記のキットが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼを含む、請求項６７に記載のキット。
【請求項７０】
重鎖可変領域を含むＥｐｈＢ４抗体又はその抗原結合性断片であって、重鎖可変領域がSEQ ID NO:２６１を含むＣＤＲ１、SEQ ID NO:２６２を含むＣＤＲ２及びSEQ ID NO:２６３を含むＣＤＲ３を含む当該ＥｐｈＢ４抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項７１】
重鎖可変領域が、SEQ ID NO:４２のアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の抗体。
【請求項７２】
SEQ ID NO:２６４を含むＣＤＲ１、SEQ ID NO:２６５を含むＣＤＲ２及びSEQ ID NO:２６６を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を更に含む、請求項７０に記載の抗体。
【請求項７３】
軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:３９のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の抗体。
【請求項７４】
抗体が、ヒト化抗体又はその抗体断片である、請求項７０に記載の抗体。
【請求項７５】
軽鎖可変領域を含むＥｐｈＢ４抗体又はその抗原結合性断片であって、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:２６４を含むＣＤＲ１、SEQ ID NO:２６５を含むＣＤＲ２及びSEQ ID NO:２６６を含むＣＤＲ３を含む当該ＥｐｈＢ４抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項７６】
軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:３９のアミノ酸配列を含む、請求項７５に記載の抗体。
【請求項７７】
SEQ ID NO:２６１を含むＣＤＲ１、SEQ ID NO:２６２を含むＣＤＲ２及びSEQ ID NO:２６３を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を更に含む、請求項７５に記載の抗体。
【請求項７８】
重鎖可変領域が、SEQ ID NO:４２のアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の抗体。
【請求項７９】
抗体が、ヒト化抗体又はその抗体断片である、請求項７５に記載の抗体。
【請求項８０】
軽鎖可変領域を含むＥｐｈＢ４抗体又はその抗原結合性断片であって、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:１１を含むＣＤＲ１、SEQ ID NO:１２を含むＣＤＲ２及びSEQ ID NO:１３を含むＣＤＲ３を含む当該ＥｐｈＢ４抗体又はその抗原結合性断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年３月１２日出願の米国予備特許出願６０／９０６，７２７号及び２００７年３月１２日出願の米国予備特許出願６０／９０６，７６４号の優先権の利益を請求するものである。これらの引用した特許出願の全教示をそっくりそのまま資料として本明細書中に援用する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣癌は、婦人科において二番目に最も一般的な女性の癌であり、２００５年における米国内での新たな患者は、２２，２２０人と見積もられている(米国癌学会、２００５)。卵巣癌は、他の女性生殖系の癌よりも一層多くの死を引き起こす。大多数の卵巣癌は、上皮起源のものである。卵巣癌は、ＢＲＣＡ又はミスマッチ修復による遺伝子変異を有する女性において一層高い発症率となる(Matais-Guiu, 1998)。女性ホルモンの、卵巣癌の進行における役割も又、研究されてきた。エストロゲンのある種の代謝産物が腫瘍の成長を支持しうるが、プロゲステロンは防御的役割を有しうると考えられている(Seeger, 2006)。卵巣癌に対する有効なスクリーニングツールは存在せず、８０％より多くの症例において、病気が進行するまで診断がなされず、これは、治療を特に困難なものとしている。現在、５年生存率は、４４％である。しかしながら、遠隔疾患を有する女性の相対的な５年生存率は、２９％しかない(米国癌学会、２００５)。それ故、卵巣癌の病因論において役割を演じ、新規な、標的を定めた、生物学的治療法を提供する希望を有する新規な分子マーカーを同定することへの要求がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
卵巣癌の血管形成及び腫瘍増殖を阻止する薬剤及び治療方法を提供することは、本開示の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ある面において、この開示は、卵巣癌の治療方法であって、有効量のＥｐｈＢ４インヒビターをそれを必要とする患者に投与することを含む当該治療方法を提供する。ある種の具体例においては、このインヒビターは、ポリペプチド、ポリペプチド類似体、ペプチド模倣物、抗体、核酸、ＲＮＡｉ構築物、核酸類似体、又は低分子物質であってよい。ある種の具体例においては、該ＥｐｈＢ４インヒビターは、抗体又はその抗原結合性の断片である。
【０００５】
ある種の具体例においては、該抗体又はその抗原結合性の断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は抗体断片、ディアボディ、キメラ抗体又は抗体断片、ヒト化抗体又は抗体断片、脱免疫化したヒト抗体又は抗体断片、完全ヒト抗体又は抗体断片、一本鎖抗体、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆab、Ｆab'、及びＦ(ab')２よりなる群から選択される。ある種の具体例においては、該抗体又はその抗原結合性の断片は、モノクローナル抗体である。ある種の具体例においては、該抗体又はその抗原結合性の断片は、ＥｐｈＢ４の細胞外ドメインに結合する。
【０００６】
ある種の具体例においては、ＥｐｈＢ４の存在は、ＥｐｈＢ４の検出可能なレベルである。ある種の具体例においては、試料は、組織試料、血液試料、又は血清試料よりなる群から選択される。
【０００７】
ある種の具体例においては、抗体又はその抗原結合性の断片は、更なる機能的部分に共有結合される。ある種の具体例においては、更なる機能的部分は、検出可能な標識である。ある種の具体例においては、検出可能な標識は、蛍光又は発色性標識から選択される。ある種の具体例においては、該検出可能な標識は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼから選択される。ある種の具体例においては、更なる機能的部分は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分を含む。
【０００８】
ある種の具体例においては、抗体又はその抗原結合性の断片は、ＥｐｈＢ４活性を阻害する。ある種の具体例においては、抗体又はその抗原結合性の断片は、ＥｐｈＢ４キナーゼ活性を刺激する。
【０００９】
ある種の具体例においては、抗体又はその抗原結合性の断片は、ＥｐｈＢ４の細胞外部分に位置されたエピトープに結合する。ある種の具体例においては、抗体又はその抗原結合性の断片は、ヒトＥｐｈＢ４配列のアミノ酸１６〜１９８内に位置されたエピトープに結合する。ある種の具体例においては、抗体又はその抗原結合性の断片は、ヒトＥｐｈＢ４のアミノ酸３２７〜４２７又は４２８〜５３７内に位置されたエピトープに結合する。
【００１０】
他の具体例において、抗体又はその抗原結合性の断片は、SEQ ID NO:２６１、SEQ ID NO:２６２及びSEQ ID NO:２６３よりなる群から選択するアミノ酸配列を有する一以上のＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域を含む。他の具体例において、抗体又はその抗原結合性の断片は、SEQ ID NO:２６４、SEQ ID NO:２６５及びSEQ ID NO:２６６よりなる群から選択するアミノ酸配列を有する一以上のＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１１】
ある種の具体例においては、前記のヒト化抗体又はその抗原結合性断片は、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含み、重鎖は、SEQ ID NO:８を含むＣＤＲ１、SEQ ID NO:９を含むＣＤＲ２及びSEQ ID NO:１０を含むＣＤＲ３を含み、軽鎖は、SEQ ID NO:１１を含むＣＤＲ１、SEQ ID NO:１２を含むＣＤＲ２及びSEQ ID NO:１３を含むＣＤＲ３を含む。ある具体例においては、該ヒト化抗体又はその抗原結合性断片は、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含み、重鎖は、SEQ ID NO:１４を含むＣＤＲ１、SEQ ID NO:１５を含むＣＤＲ２及びSEQ ID NO:１６を含むＣＤＲ３を含み、軽鎖は、SEQ ID NO:１７を含むＣＤＲ１、SEQ ID NO:１８を含むＣＤＲ２及びSEQ ID NO:１９を含むＣＤＲ３を含む。
【００１２】
他の具体例においては、ＥｐｈＢ４インヒビターは、(ｉ)ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む可溶性ポリペプチド(ここに、ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、単量体であって、ＥｐｈｒｉｎＢ２ポリペプチドに特異的に結合する)；及び(ii)ＥｐｈｒｉｎＢ２タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む可溶性ポリペプチド(ここに、可溶性ＥｐｈｒｉｎＢ２ポリペプチドは、単量体であって、ＥｐｈＢ４ポリペプチドと高い親和性で結合する)から選択される可溶性ポリペプチドである。ある具体例においては、この可溶性ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４タンパク質の球状ドメインを含む。他の面においては、この可溶性ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４アミノ酸配列の残基１〜５２２に対して少なくとも９０％同一である配列を含む。更に別の面においては、この可溶性ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４アミノ酸配列の残基１〜４１２に対して少なくとも９０％同一である配列を含む。更なる具体例においては、この可溶性ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４アミノ酸配列の残基１〜３１２に対して少なくとも９０％同一である配列を含む。加えて、この可溶性ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４アミノ酸配列の残基１〜２２５に対して少なくとも９０％同一である配列を含む。この可溶性ポリペプチドは、更に、融合タンパク質を含むことができ、又は少なくとも一つの改変されたアミノ酸残基を含むことができる。ある好適な具体例においては、この可溶性ポリペプチドは、ＥｐｈｒｉｎＢ２とＥｐｈＢ４との間の相互作用を阻止することができ、又はＥｐｈｒｉｎＢ２とＥｐｈＢ４のクラスター形成を阻止することができる。更なる具体例においては、この可溶性ポリペプチドは、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４のリン酸化を阻止する。
【００１３】
他の具体例においては、該ＥｐｈＢ４インヒビターは、核酸化合物及び核酸類似体よりなる群から選択される。ある具体例においては、該核酸化合物は、約１５〜１００ヌクレオチド長であり、生理的条件下で、SEQ ID NO:２６７に示したＥｐｈＢ４核酸配列とハイブリダイズして、該ＥｐｈＢ４の発現を減少させる。ある種の具体例においては、該核酸は、ＲＮＡｉ構築物及びアンチセンスオリゴヌクレオチドよりなる群から選択される。ある種の具体例においては、該ＲＮＡｉ構築物は、ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡよりなる群から選択される。ある種の具体例においては、該ｓｉＲＮＡは、およそ１９〜３０ヌクレオチド長である。ある種の具体例においては、該ｓｉＲＮＡは、およそ２１〜２３ヌクレオチド長である。ある種の具体例においては、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、およそ１９〜３０ヌクレオチド長である。ある面において、該ｓｉＲＮＡ配列は、SEQ ID NO:１及び２よりなる群から選択される。
【００１４】
ある面において、ＥｐｈＢ４インヒビターは、抗癌活性を有する。ある種の具体例においては、該抗癌活性は、腫瘍成長の阻止、癌細胞増殖の阻止、癌細胞の移動の阻止、癌細胞の転移の阻止、血管形成の阻止、及び腫瘍細胞死を引き起こすことよりなる群から選択される。ある種の具体例においては、腫瘍細胞死は、アポトーシスによるものである。ある種の具体例においては、該ＥｐｈＢ４インヒビターは、カスパーゼ−８の活性化によってアポトーシスを引き起こす。ある種の具体例においては、卵巣癌は、ＥｐｈＢ４を発現する一以上の癌細胞を含む。ある種の具体例においては、該ＥｐｈＢ４インヒビターは、製薬上許容しうるキャリアーと配合される。
【００１５】
この開示の方法のある種の具体例においては、卵巣癌細胞は、相当組織からの非癌性細胞と比較して一層高レベルのＥｐｈＢ４を発現する。ある種の具体例においては、卵巣癌は、転移性である。更なる具体例において、卵巣癌は、血管形成依存性である。他の具体例において、卵巣癌は、血管形成非依存性である。
【００１６】
ある面において、この開示の方法は、更に、ＥｐｈＢ４インヒビターと相加的又は相乗的に卵巣癌細胞を阻止する少なくとも一の更なる抗癌性化学療法剤を含む。ある種の具体例においては、該化学療法剤と該ＥｐｈＢ４インヒビターは、順次的に投与される。ある種の具体例においては、該化学療法剤と該ＥｐｈＢ４インヒビターは、同時に投与される。
【００１７】
ある種の具体例においては、この開示の方法は、更に、ＥｐｈＢ４インヒビターと相加的又は相乗的に血管形成を阻止する少なくとも一の更なる抗血管形成剤を含む。ある種の具体例においては、該抗血管形成剤と該ＥｐｈＢ４インヒビターは、順次的に投与される。ある種の具体例においては、該抗血管形成剤と該ＥｐｈＢ４インヒビターは、同時に投与される。
【００１８】
ある面において、この開示は、患者における卵巣癌の成長速度を減じる方法であって、卵巣癌の成長速度を減じる量のＥｐｈＢ４インヒビターを投与することを含む当該方法を提供する。他の面において、この開示は、卵巣癌の患者を治療する方法であって、(ａ)ＥｐｈＢ４を発現する複数の癌細胞を有する腫瘍を患者において同定すること；及び(ｂ)患者にＥｐｈＢ４インヒビターを投与することを含む当該方法を提供する。ある面において、この開示は、患者における卵巣癌の成長速度を減じる方法であって、卵巣癌の成長速度を減じるのに十分な量のＥｐｈＢ４を投与することを含む当該方法を提供する。
【００１９】
ある面において、この開示は、卵巣癌の治療のための医薬の製造におけるＥｐｈＢ４インヒビターの利用を提供する。
【００２０】
更に別の面において、この出願は、患者が卵巣癌を有しているか又は卵巣癌発生の危険にあるかどうかを検出する方法であって、該方法は(ａ)該患者から試料を得ること；及び(ｂ)その試料におけるＥｐｈＢ４タンパク質及び／又はｍＲＮＡのレベルを評価することを含み、ＥｐｈＢ４タンパク質及び／又はｍＲＮＡの増大したレベルが、その患者が卵巣癌を有しているか又は卵巣癌発生の危険にあることを示す当該方法を提供する。幾つかの具体例において、ＥｐｈＢ４タンパク質又はｍＲＮＡのレベルは、正常卵巣組織におけるレベルの少なくとも二倍である。ある種の具体例においては、哺乳動物はヒトである。ある種の具体例においては、当該卵巣癌は、転移性卵巣癌である。幾つかの面において、ＥｐｈＢ４タンパク質発現レベルは、抗体ベースのアッセイにおいて評価される。ある種の具体例においては、これらの方法は、卵巣癌発生の危険にある患者、初期ステージの病気の患者、及び後期ステージの患者を区別することができる。
【００２１】
ある面において、この開示は、卵巣癌の患者の予後を示す方法であって、(ａ)該患者から試料を得ること；(ｂ)その試料におけるＥｐｈＢ４タンパク質及び／又はｍＲＮＡの発現レベルを評価することを含み、高レベルのＥｐｈＢ４タンパク質及び／又はｍＲＮＡは、悪い予後を示す当該方法を提供する。ある種の具体例においては、高レベルのＥｐｈＢ４タンパク質及び／又はｍＲＮＡは、正常卵巣組織におけるＥｐｈＢ４のレベルの２倍である。ある種の具体例においては、高レベルのＥｐｈＢ４は、正常卵巣組織におけるＥｐｈＢ４のレベルの４倍である。ある種の具体例においては、高レベルのＥｐｈＢ４は、正常卵巣組織におけるＥｐｈＢ４のレベルの１０倍である。ある種の具体例においては、高レベルのＥｐｈＢ４は、正常卵巣組織におけるＥｐｈＢ４の検出可能なレベルである。ある種の具体例においては、試料は、組織試料、血液試料、又は血清試料よりなる群から選択される。
【００２２】
ある種の具体例においては、哺乳動物は、ヒトである。ある種の具体例においては、該卵巣癌は、転移性卵巣癌である。
【００２３】
更に別の面において、この出願は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むＥｐｈＢ４抗体又は抗原結合性断片であって、重鎖可変領域がSEQ ID NO:２６１を含むＣＤＲ１、SEQ ID NO:２６２を含むＣＤＲ２及びSEQ ID NO:２６３を含むＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域がSEQ ID NO:２６４を含むＣＤＲ１、SEQ ID NO:２６５を含むＣＤＲ２及びSEQ ID NO:２６６を含むＣＤＲ３を含む当該ＥｐｈＢ４抗体又は抗原結合性断片を提供する。ある種の具体例においては、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:４２のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:３９のアミノ酸配列を含む。ある種の具体例においては、抗体は、ヒト化され又は抗体断片である。
【００２４】
更に別の面において、この出願は、卵巣癌の診断用キットであって、抗ＥｐｈＢ４抗体又は抗ＥｐｈＢ４結合性抗体断片、検出用標識、及びキット使用のための指示書を含む当該キットを提供する。ある種の具体例においては、検出用標識は、蛍光性であり又は発色性のものである。ある種の具体例においては、このキットは、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼを含む。ある種の具体例においては、抗体又は抗体断片は、ＥｐｈＢ４のＣ末端部分に結合する。
【００２５】
この出願は、前記の任意の面及び具体例の組合せを企図する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＥｐｈＢ４が、ヒトの卵巣癌試料において発現されること並びに進行したステージ、腹水の存在及び悪い生存率と相関することを示した図である。(Ａ)ＥｐｈＢ４についての、陰性対照(一次抗体の欠如)(ａ)、正常卵巣上皮(ｂ)及び侵襲性卵巣癌腫(ｃ)における代表的な免疫化学的ペルオキシダーゼ染色。すべての写真は、元の倍率２００倍で撮られた。(Ｂ)臨床的及び病理学的変量と卵巣癌腫におけるＥｐｈＢ４の発現との相関関係。(Ｃ)ＥｐｈＢ４染色強度に基づく、侵襲性卵巣癌を有する患者のKaplan-Meier生存率(ｌｏｇ−ｒａｎｋ統計使用)。
【図２−１】卵巣癌細胞株が、プロゲステロンによりダウンレギュレートされる機能的ＥｐｈＢ４を発現することを示した図である。（Ａ）は、各卵巣癌細胞株からの全量２０μｇの溶解物を４〜２０％トリス−グリシンゲル上で泳動させて、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーした。そのメンブレンを、抗ＥｐｈＢ４、抗ＥｐｈｒｉｎＢ２及び抗β−アクチン抗体により、順次的にプローブした。（Ｂ）は、Ｈｅｙ細胞を、一晩、血清涸渇させ、３μｇ／ｍｌのクラスター化ＥｐｈｒｉｎＢ２／Ｆｃ又はＦｃ単独で、示した時間にわたって刺激した。ＥｐｈＢ４は、１００μｇの全細胞溶解物から免疫沈降され、リン酸化状態を抗ホスホチロシン抗体免疫ブロット法により分析された(上段)。複製メンブレンを、免疫沈降の効率を示すためにＥｐｈＢ４についてプローブした(下段)。（Ｃ）は、Ｈｏｃ−７(卵巣癌)及びＭＣＶ−５０(卵巣嚢胞腺腫)細胞を、プロゲステロン及びエストロゲンで、３６時間にわたって、投与量を変えて処理し、細胞溶解物を、免疫ブロット法により、ＥｐｈＢ４、Ｅｐｈｒｉｎ２及びβ−アクチンの発現について分析した。
【図２−２】卵巣癌細胞株が、プロゲステロンによりダウンレギュレートされる機能的ＥｐｈＢ４を発現することを示したグラフである。（Ｄ）は、１×１０4のＨｏｃ−７細胞を、４８ウェルプレートの各ウェルにプレートして、７２時間にわたって、プロゲステロン及びエストロゲンで、投与量を変えて処理した。細胞生存能力を、ＭＴＴアッセイにより評価し、生存率を、吸光度の未処理細胞に対するパーセンテージとして表した。
【図３】ＥｐｈＢ４のノックダウンが腫瘍細胞のアポトーシスへと導くことを示した図である。(Ａ)Ｈｅｖ細胞を、ＥｐｈＢ４特異的ｓｉＲＮＡ(ＥｐｈＢ４−ｓｉＲＮＡ)により一時的にトランスフェクトして、４８時間後に、２０μｇの全細胞溶解物を、免疫ブロット法により、ＥｐｈＢ４及びβ−アクチンレベルについて分析した(上段パネル)。１×１０4のＨｅｙ細胞を、変異したＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡΔ又はネイティブなＥｐｈＢ４−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトして、４８ウェルプレート中にプレートした。細胞生存能力を、４８時間の時点でＭＴＴアッセイにより評価して、生存能力を、吸光度の、未処理細胞に対するパーセンテージとして表した(下段パネル)。(Ｂ)Ｈｅｙ細胞を、ＥｐｈＢ４特異的ＯＤＮ(ＡＳ−１０)で、投与量を変化させて処理した。７２時間後に、２０μｇの全細胞溶解物を、免疫ブロット法により、ＥｐｈＢ４及びβ−アクチンのレベルについて分析した(上段)。１×１０4のＨｅｙ細胞を、かき混ぜた又はＡＳ−１０ ＯＤＮにより処理した。細胞生存能力を、ＭＴＴアッセイにより、７２時間の時点で評価して、生存率を、未処理細胞に対する吸光度のパーセンテージとして表した。(Ｃ)Ｈｅｙ細胞を、ＥｐｈＢ４特異的ｓｉＲＮＡ(ＥｐｈＢ４−ｓｉＲＮＡ)又は変異したｓｉＲＮＡ(ＥｐｈＢ４−ｓｉＲＮＡΔ)で一時的にトランスフェクトした。アポトーシスを、ＥＬＩＳＡにより、方法の節に詳述したように、全細胞溶解物を用いて、細胞質ヌクレオソームについて分析した。(Ｄ)カスパーゼ−８及びカスパーゼ−９の活性化は、これらの細胞において、比色定量によりアッセイして、リポフェクタミン処理した細胞に対する活性パーセントとして表した。(Ｅ)リポフェクタミンのみで(対照)又は２５ｎＭ ＥｐｈＢ４特異的ｓｉＲＮＡ(ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ)又は変異したｓｉＲＮＡ(ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡΔ)で３６時間処理したＨｅｙ細胞の細胞周期の分析。Ｇ０、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２及びＭ期における細胞の％を示してある。類似の結果が、３つの独立した実験において得られた。
【図４】ＥｐｈＢ４が、腫瘍細胞の移動及び浸潤に好都合であることを示した図である。(Ａ)Ｈｅｙ細胞の集密培養物をプラスチック製パスツールピペットでこすって、３ｍｍ幅の無細胞域を単層中に生成した。これらの細胞の移動して傷を閉じる能力を、２５ｎＭ ＥｐｈＢ４特異的(ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ)又は変異したｓｉＲＮＡ(ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡΔ)のトランスフェクション後に、９時間にわたって評価した。(Ｂ)マトリゲルコートされたインサート中へのＨｅｙ細胞の浸潤を、方法において記載したように研究した。下方チャンバー内の１０μｇ／ｍｌ ＥＧＦに応答して、これらのインサートの下面に浸潤する細胞を固定してギムザ染色した。典型的な顕微鏡写真を示してある。
【図５】ＥｐｈＢ４特異的アンチセンスＯＤＮが、マウス卵巣癌異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を阻止することを示した図である。(Ａ)２×１０6のＨｅｙ細胞を、１０〜１２週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃ無胸腺マウスのわき腹に移植して、腫瘍の容積を、方法の節に詳述したように測定した。マウスに、ビヒクルのみ(ビヒクル)、又は１０ｍｇ／ｋｇのかき混ぜたＯＤＮ(かき混ぜた(Scrambled))又はＥｐｈＢ４特異的アンチセンスＯＤＮ(ＡＳ−１０)を、毎日、腹腔内投与した(細胞移植後４日目に開始)。５週間後に動物を犠牲にして、腫瘍を採取した。(Ｂ)ホルマリン固定してパラフィン包埋した５μｍ切片を、ヘマトキシリン／エオシンで染色して、免疫組織化学により、Ｋｉ−６７及びＣＤ３１の発現について分析した。アポトーシスを、イン・サイチューアポトーシス染色キットを用いるＴＵＮＥＬにより評価した。陽性染色された細胞数を、５つの無作為の高倍率の視野において、ブラインド観察者によって平均して、各顕微鏡写真に示した。ＡＳ−１０と対照群との間での*ｐ＜０．０５。左下パネル内のバーは、Ｈ／Ｅにおいて、２００μｍを表し、ＣＤ３１において、１００μｍを表し、そして他の顕微鏡写真においては、７５μｍを表している。
【図６】ＭＡＢ２６５軽鎖可変領域配列の生殖細胞系の配列とのアラインメントを示した図である。
【図７】ＭＡＢ２６５重鎖可変領域配列の生殖細胞系の配列とのアラインメントを示した図である。
【図８】ＥｐｈＢ４に対して生成されたモノクローナル抗体及びこれらの抗体のエピトープマッピングを示した図である。ＥｐｈＢ４の細胞外ドメインのトポロジーが示されており、それは、球状ドメイン(Ｇ)、システインリッチなドメイン(Ｃ)、及び２つの３型フィブロネクチンドメイン(Ｆ１及びＦ２)を含んでいる。
【図９】Ｂ４ＥＣｖ３タンパク質のアミノ酸配列を示した図である(未開裂のＥｐｈＢ４リーダーペプチドを含む前駆体の配列が示されている)。
【図１０】Ｂ４ＥＣｖ３ＮＴタンパク質のアミノ酸配列を示した図である(未開裂のＥｐｈＢ４リーダーペプチドを含む前駆体の配列が示されている)。
【図１１】Ｂ４ＥＣｖ３−ＦＣタンパク質のアミノ酸配列を示した図である(未開裂のＥｐｈＢ４リーダーペプチドを含む前駆体の配列が示されている)。
【図１２】Ｂ２ＥＣタンパク質のアミノ酸配列を示した図である(未開裂のＥｐｈｒｉｎＢ２リーダーペプチドを含む前駆体の配列が示されている)。
【図１３】Ｂ２ＥＣ−ＦＣタンパク質のアミノ酸配列を示した図である(未開裂のＥｐｈｒｉｎＢ２リーダーペプチドを含む前駆体の配列が示されている)。
【図１４】ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のアミノ酸配列を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
Ｉ．概要
本発明は、少なくとも部分的に、ｅｐｈｒｉｎ／ｅｐｈｒｉｎレセプター(ｅｐｈｒｉｎ／ｅｐｈ)経路を介するシグナリングが卵巣における腫瘍形成に寄与するという発見に基いている。出願人は、ＥｐｈＢ４の発現を卵巣腫瘍組織において検出し、ｅｐｈを介するシグナリングをブロックするための抗腫瘍性治療剤を開発した。従って、ある面において、この開示は、卵巣癌の治療に用いることのできる多くの化合物(薬剤)を提供する。
【００２８】
卵巣癌は、卵子又は卵及び女性ホルモンが作られる一方又は両方の卵巣生殖腺内の細胞の急速な成長及び分裂により生成する病気である。卵巣は、正常環境下で再生して組織の健康を維持する細胞を含んでいる。成長の制御が失われ、細胞分裂が多すぎ且つ速過ぎる場合には、細胞の塊又は腫瘍が形成される。もしその腫瘍が少ない細胞層例えば表面細胞内に制限されて、周囲の組織又は器官に侵入しないならば、それは良性と考えられる。もし腫瘍が周囲の組織又は器官に広がるならば、それは悪性又は癌性と考えられる。癌性細胞が元の腫瘍から離脱して、血管又はリンパ管を通って移動して、身体の他の部分で成長する場合、その過程は、転移として知られている。
【００２９】
卵巣の腫瘍は、表面の上皮に由来するもの、生殖細胞系に由来するもの及び特殊化した間質、の３つのカテゴリーに大きく分類することができる。卵巣の表面に由来する腫瘍は、卵巣の腫瘍の大部分を占め(約８０％)、表面上皮腫瘍と呼ばれる。通常「卵巣癌」と考えられているものを構成しているのはこれらの腫瘍である。表面上皮腫瘍は、更に、良性、境界線(低い潜在的悪性[ＬＭＰ]又は不規則な増殖性)及び侵襲性癌腫３つのカテゴリーに細分類される。良性腫瘍と侵襲性癌腫の振舞いは、合理的によく理解されているが、中間(境界線)型の群の診断、予後及び治療には、かなりの論争がある。これらの腫瘍は、一層若い女性に生じる傾向があり、しばしば、保存的に治療されうる。保存的治療は、女性が生殖能力を維持すること及び卵巣ホルモン産生を維持することを可能にする(これは、侵襲性癌腫の治療で行なわれるように両方の卵巣を取り去ったならば失われる)。しかしながら、保存的治療は、正確な、組織学的(病理学的)診断に依存している。卵巣の腫瘍の診断の誤りの殆どが起きるのは、「境界線」腫瘍のカテゴリーにおいてである。表面上皮腫瘍も又、細胞分化のパターン及び腫瘍の等級に基いて細分類される。最後に、外科手術後の残存腫瘍のステージと量は、振舞いを予想するため及びその後の治療を計画するために利用される重要な情報(相互参照)を与える。
【００３０】
生殖細胞の腫瘍は、最も一般的でない卵巣腫瘍であり、卵巣腫瘍の約１０〜１５％を占めている。それらは、卵母細胞(卵)に由来する。これらの腫瘍も、表面上皮腫瘍と同様に、良性又は悪性でありうる。しかしながら、中間群はない。良性腫瘍は、殆ど常に、嚢胞性奇形腫であり又はいわゆる「類皮腫」であり、かかわりのない卵巣組織を保存しての腫瘍の除去により上首尾に治療される。更なる治療は必要でない。悪性の生殖細胞の腫瘍は、それらの除去の後、強力な多剤化学療法を必要とする。その治療は、表面上皮腫瘍の外科的治療後に施与される化学療法とは全く異なるものである。
【００３１】
最後に、卵巣腫瘍の約５〜１０％を占める最も一般的でない卵巣腫瘍は、卵巣の間質成分に由来するものである。この間質ではホルモン(女性ホルモン例えばエストラジオール及びプロゲステロン並びに男性ホルモン例えばテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン[ＤＨＥＡ]及びアンドロステンジオン)の産生が起きるので、卵巣のこの部分に由来する腫瘍は、性ステロイドホルモンの異常な産生を伴いうる。これは、生殖年齢の女性及び閉経後の女性及び性的早熟児において異常な膣出血へと導きうる。男性ホルモンを産生する卵巣腫瘍は、多毛症(身体の様々な部分における増大した毛の成長)及び極端な場合には、体毛の増大、声の低音化、はげ、筋量の増大及びクリトリスの拡大を特徴とする男性化を引き起こしうる。
【００３２】
ここで用いる場合、用語「Ｅｐｈｒｉｎ」及び「Ｅｐｈ」は、それぞれ、リガンド及びレセプターを指すために用いる。それらは、様々な動物(例えば、ヒトを含む哺乳動物／非哺乳動物、脊椎動物／非脊椎動物)の何れに由来するものであってもよい。
【００３３】
ここに記載した仕事、特に実施例に記載した仕事は、ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４に言及する。しかしながら、本発明は、それぞれのファミリー内の、卵巣腫瘍で発現する任意のｅｐｈｒｉｎリガンド及び／又はＥｐｈレセプターを企図している。これらのｅｐｈｒｉｎ(リガンド)は、２つの構造型があり、それは、更に、配列の関係に基いて、機能的に、それらが２つの対応するレセプターサブグループに対して示す優先的結合に基いて細分化されうる。構造的には、次の２つの型のｅｐｈｒｉｎがある：グリセロホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)結合により膜に繋留されているもの及び膜貫通ドメインにより繋留されているもの。伝統的に、これらのリガンドは、Ｅｐｈｒｉｎ−Ａサブクラス(ＥｐｈＡレセプターに優先的に結合するＧＰＩ結合されたタンパク質)とＥｐｈｒｉｎ−Ｂサブクラス(一般にＥｐｈＢレセプターに優先的に結合する膜貫通タンパク質)に分割されている。
【００３４】
Ｅｐｈファミリーレセプターは、Ｅｐｈ(赤血球タンパク質を産生するヒトの肝実質細胞癌腫細胞株における発現につき命名されたレセプター)に関連するレセプタータンパク質−チロシンキナーゼのファミリーである。それらは、細胞外ドメインの配列に関係のあること及びＥｐｈｒｉｎ−Ａタンパク質又はＥｐｈｒｉｎ−Ｂタンパク質に優先的に結合する能力に基づいて２つのサブグループに分類される。Ｅｐｈｒｉｎ−Ａタンパク質と優先的に相互作用するレセプターは、ＥｐｈＡレセプターであり、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂタンパク質と優先的に相互作用するものは、ＥｐｈＢレセプターである(米国特許出願公開第２００５０１６４９６５号及び２００５０２４９７３６号参照)。
【００３５】
Ｅｐｈレセプターは、リガンド結合性球状ドメイン、システインリッチな領域とその後の一対のＩＩＩ型フィブロネクチンレセプターよりなる細胞外ドメインを有している。細胞質ドメインは、２つの保存されたチロシン残基；タンパク質チロシンキナーゼドメイン；無菌αモチーフ(ＳＡＭ)及びＰＤＺドメイン結合性モチーフを含む並列領域よりなる。ＥｐｈＢ４は、膜結合したリガンドＥｐｈｒｉｎＢ２に特異的である(Sakano,S.等、1996;Brambilla R.等、1995)。ＥｐｈｒｉｎＢ２は、膜貫通ドメイン並びに５つの保存されたチロシン残基及びＰＤＺを有する細胞質領域を有するＥｐｈリガンドのクラスに属する。Ｅｐｈレセプターは、クラスター化した膜結合したｅｐｈｒｉｎの結合により活性化され(Davis S等、1994)、これは、これらのレセプターを発現する細胞とこれらのリガンドを発現する細胞との接触がＥｐｈ活性化に必要であることを示している。
【００３６】
リガンドの結合に際して、Ｅｐｈレセプターは、二量体化して並列膜のチロシン残基を自己リン酸化して完全な活性化を得る(Kalo MS等、1999,Binns KS, 2000)。Ｅｐｈレセプターを介する順方向のシグナリングに加えて、逆方向のシグナリングがｅｐｈｒｉｎＢによって起こりうる。ｅｐｈｒｉｎのＥｐｈは、保存された細胞内チロシンの急速なリン酸化(Bruckner  K, 1997)を生じ、幾分遅いＰＤＺ結合性タンパク質のリクルートを生じる(Palmer A, 2002)。最近、幾つかの研究が、Ｅｐｈ／ｅｐｈｒｉｎの高発現は腫瘍成長、腫瘍形成及び転移の増大した潜在能力と関係しうることを示した(Easty DJ, 1999; Kiyokawa E, 1994; Tang XX, 1999; Vogt T, 1998; Liu W, 2002; Stephenson SA, 2001; Steube KG 1999; Berclaz G, 1996)。
【００３７】
ＩＩ．核酸治療剤
この開示は、卵巣癌におけるｅｐｈｒｉｎ及び／又はｅｐｈｒｉｎレセプター(Ｅｐｈ)の遺伝子発現を阻止し又は減じるための方法に関するものである。「阻止する」又は「減じる」とは、遺伝子の発現、又は一種以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニット例えばＥｐｈｒｉｎＢ２及び／若しくはＥｐｈＢ４をコードする核酸若しくは同等の核酸のレベルを、この開示の核酸治療剤の非存在下において認められるよりも低下させることを意味する。「遺伝子」とは、ＲＮＡをコードする核酸、例えば、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む(但し、これに限られない)核酸配列を意味する。
【００３８】
ここで用いる場合、用語「核酸治療剤」又は「核酸剤」又は「核酸化合物」は、ヌクレオチドを含み、標的遺伝子に対する所望の効果を有する任意の核酸ベースの化合物を指す。これらの核酸治療剤は、一本鎖であっても、二本鎖であっても、又は多数鎖であってもよく、修飾された又は未修飾のヌクレオチド又は非ヌクレオチド又は様々な混合物、及びこれらの組合せを含むことができる。この開示の核酸治療剤の例には、アンチセンス核酸、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び酵素的核酸化合物が含まれるが、これらに限られない。
【００３９】
一具体例において、この開示は、独立して又は組み合わせて、ＥｐｈｒｉｎＢ２タンパク質(例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号：ＮＰ＿００４０８４)をコードするＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子又はＥｐｈＢ４タンパク質(例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号：ＮＰ＿００４４３５)をコードするＥｐｈＢ４レセプター遺伝子の発現を変調する一種以上の核酸治療剤を特徴とする。この出願の方法と共に用いることのできる核酸構築物の例は、公開された米国特許出願第２００５０１６４９６５及び２００５０２４９７３６に、下記のように列記されており、それらを本明細書中に資料としてそっくりそのまま援用する。
【００４０】
【表１−１】
2010521467.tif 000003
【００４１】
【表１−２】
2010521467.tif 000004
【００４２】
【表１−３】
2010521467.tif 000005
【００４３】
【表２】
2010521467.tif 000006
【００４４】
Ａ．アンチセンス核酸
ある種の具体例においては、この開示は、アンチセンス核酸に関係する。「アンチセンス核酸」とは、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ＰＮＡ(タンパク質核酸)相互作用によって標的核酸に結合して標的核酸の活性を変化させる非酵素的核酸化合物を意味する(総説としては、Stein及びCheng, 1993 Science 261, 1004及びWoolf等の米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい)。典型的には、アンチセンス分子は、アンチセンス分子の単一の隣接配列に沿って、標的配列に相補的である。しかしながら、ある種の具体例においては、アンチセンス分子は、ループを形成し、ループを形成する基質核酸に結合することができる。従って、アンチセンス分子は、２(又はそれ以上)の非隣接基質配列に対して相補的であってよく、又はアンチセンス分子の２(又はそれ以上)の非隣接配列は、一つの標的配列又は両方に対して相補的であってよい。最新のアンチセンスストラテジーの総説としては、Schmajuk等、1999, J.Biol.Chem., 274, 21783-21789, Delihas等、1997, Nature, 15, 751-753, Stein等、1997, Antisense N. A. Drug Dev., 7, 151, Crooke, 2000, Methods Enzymol., 313, 3-45; Crooke, 1998, Biotech. Genet. Eng. Rev., 15, 121-157, Crooke, 1997, Ad. Pharmacol., 40, 1-49を参照されたい。
【００４５】
加えて、アンチセンスＤＮＡは、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によって核酸を標的とするために利用することができ、それにより、ＲＮアーゼＨを活性化し、これは、二本鎖中の標的核酸を消化する。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つ以上のＲＮアーゼＨ活性化領域を含むことができ、それは、ＲＮアーゼＨを活性化して標的核酸を開裂させることができる。アンチセンスＤＮＡは、化学合成することができ又は一本鎖発現ベクター若しくはその同等物を利用することにより発現させることができる。「ＲＮアーゼＨ活性化領域」とは、標的核酸に結合して、細胞性ＲＮアーゼＨ酵素により認識される非共有結合性複合体を形成することのできる核酸化合物の領域(一般に、４〜２５ヌクレオチド長以上であり、好ましくは、５〜１１ヌクレオチド長である)を意味する(例えば、Arrow等の米国特許第５，８４９，９０２号；Arrow等の米国特許第５，９８９，９１２号を参照されたい)。ＲＮアーゼ酵素は、核酸化合物−標的核酸複合体と結合して標的核酸配列を開裂させる。
【００４６】
ＲＮアーゼＨ活性化領域は、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、５’−チオホスフェート、ホスホルアミデート又はメチルホスホネートバックボーン化学、又はこれらの組合せを含む。少なくとも一つの上記のバックボーン化学に加えて、ＲＮアーゼＨ活性化領域は又、様々な糖化学をも含むことができる。例えば、ＲＮアーゼＨ活性化領域は、デオキシリボース、アラビノ、フルオロアラビノ又はこれらの組合せ、ヌクレオチド糖化学を含むことができる。当業者は、前述は非制限的例であること及びＲＮアーゼＨ酵素の活性を支持するホスフェート、糖及び核酸の塩基の化学がＲＮアーゼＨ活性化領域の定義の範囲及び本開示内にあることを認めるであろう。
【００４７】
従って、この開示のアンチセンス核酸は、天然型のオリゴヌクレオチド並びに、ホスホロチオエート型オリゴデオキシリボヌクレオチド、ホスホロジチオエート型オリゴデオキシリボヌクレオチド、メチルホスホネート型オリゴデオキシリボヌクレオチド、ホスホルアミデート型オリゴデオキシリボヌクレオチド、Ｈ−ホスホネート型オリゴデオキシリボヌクレオチド、トリエステル型オリゴデオキシリボヌクレオチド、α−アノマー型オリゴデオキシリボヌクレオチド、ペプチド核酸、他の人工的核酸、及び核酸修飾された化合物を含む改変されたオリゴヌクレオチドを含む。
【００４８】
他の改変は、オリゴヌクレオチド分子の内部又は末端(両端)の改変を含み、該分子へのヌクレオシド間ホスフェート結合(internucleoside phosphate linkage)例えばコレステロール、コレステリル、又はアミノ基と末端リボース、デオキシリボースとの間の様々な炭素残基数を有するジアミン化合物の付加並びに、開裂し又は対抗鎖とクロスリンクし若しくは関連酵素又は他のタンパク質(ゲノムに結合する)とクロスリンクするホスフェート改変を含む。かかる改変オリゴヌクレオチドの例には、改変塩基及び／又は糖(例えば、リボースに代えてアラビノース)を有するオリゴヌクレオチド、又は３’位置でヒドロキシル基以外の及び５’位置でホスフェート基以外の化学基に糖を(３’、５’の両位置で)結合して有する３’、５’置換されたオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００４９】
他の糖の改変の例は、リボース部分の２’位への改変を含み、これは、１〜６の飽和若しくは不飽和炭素原子を含む--Ｏ--低級アルキル基で、又は２〜６炭素原子を有する--Ｏ--アリール、又はアリル基(かかる--Ｏ--アルキル、アリール又はアリル基は、不飽和であっても飽和であってもよい)(例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチルシアノ、ニトロアシルアシルオキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルブアルコキシ、又はアミノ基)で、又はアミノ、又はハロ基で置換された２’-Ｏ-を含むが、これらに限られない。この開示の特に有用なオリゴヌクレオチドの非制限的例は、３’末端、５’末端又は３’及び５’末端に２’-Ｏ-アルキル化リボヌクレオチドを有し、少なくとも４個又は５個の隣接ヌクレオチドがそのように改変されている。２’-Ｏ-アルキル化基の例は、２’-Ｏ-メチル、２’-Ｏ-エチル、２’-Ｏ-プロピル、及び２’-Ｏ-ブチルを含むが、これらに限られない。
【００５０】
ある場合には、天然型及び改変型アンチセンス核酸の合成は、例えば、ＡＢＩ(AppliedBiosystems Inc.)製の３８１Ａ ＤＮＡ合成装置又は３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて、ホスホルアミダイト法(ＡＢＩから入手可能な指示書又はF. Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Proactical Approach, IRL Press (1991)参照)に従って、行なうことができる。ホスホルアミダイト法においては、核酸関連分子を、改変デオキシリボヌクレオシド又は改変リボヌクレオシドの３’末端と他の改変デオキシリボヌクレオシド、改変リボヌクレオシド、オリゴ−改変デオキシリボヌクレオチド又はオリゴ−改変リボヌクレオチドの５’末端との、シアノエチル基などの基によって保護されたホスホルアミダイトを含む試薬の利用による縮合により合成する。この合成の最終サイクルは、糖部分の５’末端でヒドロキシル基に結合した保護基(例えば、ジメトキシトリチル基)を有する生成物を与えて終了する。こうして室温で合成されたオリゴマーを支持体から開裂させて、そのヌクレオチド及びホスフェート部分を脱保護する。この方法において、天然型のオリゴ核酸化合物が、粗形態で得られる。ホスホロチオエート型の核酸も又、ＡＢＩの合成装置を用いるホスホルアミダイト法により上記の天然型用と類似の方法で合成することができる。合成の最終サイクル後の手順も又、天然型と同じである。
【００５１】
こうして得られた粗核酸(天然型又は改変型)は、通常の方法例えばエタノール沈殿、又は逆相クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)におけるイオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィー、超結晶流体クロマトグラフィーで精製することができ、それは更に電気泳動によって精製することができる。逆相クロマトグラフィーのためのカートリッジ例えばｔＣ１８パックトＳｅｐＰａｋＰｌｕｓ(ロングボディー／ＥＮＶ)(Waters)を利用することもできる。これらの天然型及び改変型(例えば、ホスホロチオエート型)核酸の純度は、ＨＰＬＣにより分析することができる。
【００５２】
ある種の具体例においては、この開示のアンチセンス核酸は、例えば、細胞内で転写された場合に、ｅｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４ポリペプチドをコードする細胞性ｍＲＮＡの少なくとも一つのユニーク部分に相補的であるＲＮＡを生成する発現プラスミドとして送達することができる。或は、この構築物は、生体外で生成されるオリゴヌクレオチドであり、細胞内に導入された場合に、ｅｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ及び／又はゲノム配列とハイブリダイズすることにより発現の阻害を生じるオリゴヌクレオチドである。かかるオリゴヌクレオチドプローブは、適宜改変されたオリゴヌクレオチドであり、内在性ヌクレアーゼ例えばエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼに耐性であり、それ故、イン・ビボで安定である。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての使用のための典型的な核酸化合物は、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホチオエート及びメチルホスホネート類似体である(米国特許第５，１７６，９９６号；５，２６４，５６４号；及び５，２５６，７７５号も参照されたい)。加えて、核酸療法において有用なオリゴマーを構築するための一般的アプローチは、例えば、van der Krol等、(1988) Biotechniques 6:958-976; 及びStein等、(1988)Cancer Res 48:2659-2668に総説されている。
【００５３】
Ｂ．ｄｓＲＮＡ及びＲＮＡｉ構築物
ある種の具体例においては、この開示は、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)及びＲＮＡｉ構築物に関係する。用語「ｄｓＲＮＡ」は、ここで用いる場合、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)可能な二本鎖ＲＮＡ分子を指し、ｓｉＲＮＡを含む(例えば、Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir等、2001, Nature, 411, 494-498; 及びKreutzer等、ＷＯ００／４４８９５；Zernicka-Goetz等、ＷＯ０１／３６６４６；Fire,ＷＯ９９／３２６１９；Plaetinck等、ＷＯ００／０１８４６；Mello及びFire, ＰＣＴＮｏ．公開ＷＯ０１／２９０５８；Deschamps-Depaillette,ＷＯ９９／０７４０９；及びＬｉ等、ＷＯ００／４４９１４を参照されたい)。加えて、ＲＮＡｉは、元々、植物及び蠕虫で認められた現象であって、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)が遺伝子発現を、特異的且つ転写後様式でブロックする当該現象に適用された用語である。ＲＮＡｉは、遺伝子発現をイン・ビトロ又はイン・ビボで阻害する有用な方法を提供する。
【００５４】
用語「短い干渉性ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」又は「短い干渉性核酸」は、ここで用いる場合、ＲＮＡｉを媒介することができ又は細胞による適切なプロセッシングを受けた場合に遺伝子サイレンシグを媒介することのできる任意の核酸化合物を指す。例えば、ｓｉＲＮＡは、自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であってよく、アンチセンス領域は、標的核酸化合物(例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４)に対する相補性を含む。このｓｉＲＮＡは、自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を有する一本鎖ヘアピンポリヌクレオチドであってよく、アンチセンス領域は、標的核酸化合物に対する相補性を含む。このｓｉＲＮＡは、２以上のループ構造並びに自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってよく、アンチセンス領域は、標的核酸化合物に対する相補性を含み、この環状ポリヌクレオチドは、イン・ビボ又はイン・ビトロでプロセッシングを受けてＲＮＡｉを媒介することのできる活性なｓｉＲＮＡを生成することができる。このｓｉＲＮＡは又、標的核酸化合物に対する相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含むこともでき、一本鎖ポリヌクレオチドは、更に、末端ホスフェート基例えば５’−ホスフェート(例えば、Martinez等、2002, Cell., 110, 563-574参照)、又は５’，３’−ジホスフェートを含むことができる。
【００５５】
適宜、この開示のｓｉＲＮＡは、細胞の生理的条件下で、阻害すべき遺伝子(「標的」遺伝子)のｍＲＮＡ転写物の少なくとも部分のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。この二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介する能力を有するのに、天然のＲＮＡに十分に似ていることのみを必要とする。従って、この開示は、遺伝子変異、株の多型又は進化的多様化のために予想されうる配列変異を許容することのできる利点を有する。標的配列とｓｉＲＮＡ配列との間の許容されうるヌクレオチドミスマッチの数は、５塩基対中１個以下、又は１０塩基対中１個以下、又は２０塩基対中１個以下、又は５０塩基対中１個以下である。二本鎖ｓｉＲＮＡの中心におけるミスマッチは、最も重要であり、本質的に、標的ＲＮＡの開裂を完全に破壊することができる。対照的に、標的ＲＮＡに相補的であるｓｉＲＮＡ鎖の３’末端のヌクレオチドは、標的認識の特異性に有意に寄与しない。配列同一性は、当分野で公知の配列の比較及びアラインメントのアルゴリズム(Gribskov及びDevereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991 及び同書における引用文献を参照されたい)並びに、ヌクレオチド配列間の差異パーセントを例えば、デフォルトパラメーター(例えば、ウィスコンシ大学 Genetic Computing Group)を用いるＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムで実行されるSmith-Watermanアルゴリズムにより計算することによって最適化されうる。このｓｉＲＮＡと標的遺伝子の部分との間では、９０％を超える同一性が好ましく、１００％の配列同一性さえ好ましい。或は、このＲＮＡの二本鎖領域は、標的遺伝子転写物の部分とハイブリダイズすることのできるヌクレオチド配列として機能的に定義することができる(例えば、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃での１２〜１６時間に及ぶハイブリダイゼーションと；その後の洗浄)。
【００５６】
ｄｓＲＮＡの二本鎖構造は、一本鎖の自己相補的ＲＮＡ鎖、２つの相補的ＲＮＡ鎖、又はＤＮＡ鎖と相補的ＲＮＡ鎖によって形成されうる。適宜、二本鎖ＲＮＡ形成は、細胞の内部又は外部において開始しうる。このＲＮＡは、細胞あたり少なくとも１コピーの送達を可能にする量で、導入することができる。一層高投与量(例えば、細胞当たり、５、１０、１００、５００又は１０００コピー)の二本鎖物質は、一層効果的な阻害を生じうるが、特殊な応用のためには、一層低投与量も又、有用でありうる。ＲＮＡの二本鎖領域に対応するヌクレオチド配列が、遺伝子阻害のために標的とされる点で、阻害は、配列特異的である。
【００５７】
ここで記載する場合、主題のｓｉＲＮＡは、約１９〜３０ヌクレオチド長であり、尚一層好ましくは、２１〜２３ヌクレオチド長である。これらのｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体をリクルートしてそれらの複合体を、特異的配列に対合することにより、標的ｍＲＮＡまで導くと理解されている。結果として、その標的ｍＲＮＡは、タンパク質複合体中のヌクレアーゼにより分解される。特定の具体例においては、これらの２１〜２３ヌクレオチドｓｉＲＮＡ分子は、３’ヒドロキシル基を含む。ある種の具体例においては、このｓｉＲＮＡは、一層長い二本鎖ＲＮＡのプロセッシングにより、例えば、酵素ｄｉｃｅｒの存在下で生成することができる。一具体例においては、キイロショウジョウバエのイン・ビトロ系が用いられる。この具体例においては、ｄｓＲＮＡを、キイロショウジョウバエの胚由来の可溶性抽出物と結合させ、それにより、組合せを生じる。この組合せは、ｄｓＲＮＡが約２１〜２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子にプロセッシングされる条件下で維持される。これらのｓｉＲＮＡ分子は、当業者に公知の幾つかの技術を用いて精製することができる。例えば、ゲル電気泳動を利用して、ｓｉＲＮＡを精製することができる。或は、非変性的方法例えば非変性的カラムクロマトグラフィーを用いて、ｓｉＲＮＡを精製することができる。加えて、クロマトグラフィー(例えば、サイズ排除クロマトグラフィー)、グリセロール勾配遠心分離、抗体を用いるアフィニティー精製を利用して、ｓｉＲＮＡを精製することができる。
【００５８】
主題のｄｓＲＮＡ(例えば、ｓｉＲＮＡ)の製造は、化学合成法により又は組換え核酸技術によって行なうことができる。処理された細胞の内在性ＲＮＡポリメラーゼは、イン・ビボで転写を媒介することができ、又はクローン化ＲＮＡポリメラーゼをイン・ビトロでの転写に利用することができる。ここで用いる場合、この開示のｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はなく、更に、化学的に改変されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドを包含する。例えば、ｄｓＲＮＡは、リン酸−糖主鎖又はヌクレオシドの何れかに、例えば、細胞核への感染性を減じ、バイオアベイラビリティーを改善し、配合物特性を改善し及び／又は他の薬物動力学的特性を変えるために改変を含むことができる。説明するために、天然のＲＮＡのホスホジエステル結合を改変して、窒素又は硫黄ヘテロ原子の少なくとも一つを含むようにすることができる。ＲＮＡ構造における改変は、ｄｓＲＮＡに対する全体的応答を回避して、特異的遺伝子阻害を可能にするように調整することができる。同様に、塩基を改変して、アデノシンデアミナーゼの活性をブロックすることができる。これらのｄｓＲＮＡは、酵素的に製造することもできるし又は部分的／全体的に有機合成により製造することもできるし、如何なる改変リボヌクレオチドもイン・ビトロでの酵素的合成又は有機合成によって導入することができる。ＲＮＡ分子を化学的に改変する方法は、ｄｓＲＮＡを改変するために適合させることができる(例えば、Heidenreich等、(1997) Nucleic Acids Res, 25:776-780; Wilson等、(1994) J Mol Recog 7:89-98; Chen等、(1995) Nucleic Acids Res 23:2661-2668; Hirschbein等、(1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7:55-61参照)。単に説明のために、ｄｓＲＮＡの主鎖は、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホジチオエート、キメラのメチルホスホネート−ホスホジエステル、ペプチド核酸、５−プロピニル−ピリミジン含有オリゴマー又は糖改変(例えば、２’−置換されたリボヌクレオシド、ａ−コンフィギュレーション)によって改変することができる。ある場合には、この開示のｄｓＲＮＡは、２’−ヒドロキシ(２’−ＯＨ)含有ヌクレオチドを欠く。
【００５９】
特別の具体例においては、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、約１〜６ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有する(２〜４ヌクレオチド長でよいが)。一層好ましくは、この３’オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド長である。ある具体例においては、一方の鎖は、３’オーバーハングを有して、他方の鎖は、鈍端化されており又はやはりオーバーハングを有している。このオーバーハングの長さは、各鎖について同じであっても異なっていてもよい。ｓｉＲＮＡの安定性を更に増進させるために、これらの３’オーバーハングを、分解に対して安定化させることができる。一具体例において、ＲＮＡは、プリンヌクレオチド例えばアデノシン又はグアノシンヌクレオチドを含有することによって安定化される。或は、ピリミジンヌクレオチドの改変アナログによる置換、例えば。ウリジンヌクレオチド３’オーバーハングの２’−デオキシチミジンによる置換は、許容されて、ＲＮＡｉの効率に影響を与えない。２’ヒドロキシルの非存在は、組織培養培地において、オーバーハングのヌクレアーゼ耐性を有意に増進させ、イン・ビボにおいて有益でありうる。
【００６０】
他の特別の具体例において、主題のｄｓＲＮＡは又、長い二本鎖ＲＮＡの形態であってもよい。例えば、このｄｓＲＮＡは、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００又は４００塩基である。幾つかの場合において、このｄｓＲＮＡは、４００〜８００塩基長である。適宜、これらのｄｓＲＮＡは、細胞内で消化されて、例えば、その細胞内でｓｉＲＮＡ配列を生成する。しかしながら、長い二本鎖ＲＮＡのイン・ビボでの利用は、おそらく、非配列依存的ｄｓＲＮＡ応答により引き起こされうる悪影響の理由のために、常に実際的である訳ではない。かかる具体例においては、局所送達用システム及び／又はインターフェロン若しくはＰＫＲの効果を減じる薬剤の利用が好ましい。
【００６１】
更なる特別な具体例において、これらのｄｓＲＮＡは、ヘアピン構造の形態である(ヘアピンＲＮＡと呼ぶ)。これらのヘアピンＲＮＡは、外因的に合成することができ、又はイン・ビボで、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから転写することにより形成することができる。哺乳動物細胞における遺伝子サイレンシングのためのかかるヘアピンＲＮＡの製造及び利用の例は、例えば、Paddison等、Genes Dev, 2002, 16:948-58; McCaffrey等、Nature, 2002, 418:38-9; McManus等、RNA, 2002, 8:842-50; Yu等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2002,99:6047-52に記載されている。好ましくは、かかるヘアピンＲＮＡは、細胞又は動物中で工作されて、所望の遺伝子の連続的で安定な抑制を確実にする。細胞中でヘアピンＲＮＡを処理することによりｓｉＲＮＡを生成することができることは、当分野で公知である。
【００６２】
ＷＯ０１／７７３５０は、親核細胞における同じ導入遺伝子のセンスＲＮＡ転写物とアンチセンスＲＮＡ転写物の両方を産生するための、導入遺伝子の二方向転写用の典型的ベクターを記載している。従って、ある種の具体例においては、本開示は、次の特性を有する組換えベクターを提供する：それは、逆向きに配置され且つ関心あるｄｓＲＮＡのための導入遺伝子に隣接する２つの重複する転写単位を有するウイルス性レプリコンを含み、これらの２つの重複する転写単位は、センス及びアンチセンスＲＮＡ転写物の両方を宿主細胞内で同じ導入遺伝子断片から生成する。
【００６３】
Ｃ．酵素的核酸化合物
ある具体例において、この開示は、酵素的核酸化合物に関係する。「酵素的核酸化合物」とは、特定の標的遺伝子に対する基質結合領域における相補性を有し且つ標的核酸を特異的に開裂する酵素活性をも有する核酸化合物を意味する。この酵素的核酸化合物は、分子間で核酸を開裂することができ、それにより標的核酸化合物を不活性化させることができるということは理解される。これらの相補的領域は、酵素的核酸化合物の標的核酸への十分なハイブリダイゼーションを与え、そうして、開裂を可能にする。１００パーセントの相補性(同一性)が好ましいが、この開示においては、５０〜７５％の低い相補性も又、有用でありうる(例えば、Werner及びUhlenbeck, 1995, Nucleic Acids Research, 23, 2092-2096; Hamman等、1999, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev., 9, 25-31を参照されたい)。これらの酵素的核酸は、塩基、糖及び／又はリン酸基において改変することができる。ここに記載する場合、用語「酵素的核酸」は、リボザイム、触媒的ＲＮＡ、酵素的ＲＮＡ、触媒的ＤＮＡ、アプタザイム又はアプタマー結合性リボザイム、調節可能なリボザイム、触媒的オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム、リードザイム、オリゴザイム又はＤＮＡ酵素などの語句と交換可能に用いる。これらのすべての専門用語は、酵素活性を有する核酸を記載している。本願に記載された特定の酵素的核酸化合物は、この開示内に限られず、当業者は、この開示の酵素的核酸化合物において重要であるすべては、それが標的核酸領域の少なくとも一つに相補的である特異的基質結合部位を有すること、及びそれが基質結合部位内又はその周囲に核酸開裂及び／又はその分子への連結活性を与えるヌクレオチド配列を有することであることを認めるであろう(Cech等、米国特許第４，９８７，０７１号；Cech等、1988, 260 JAMA 3030)。
【００６４】
様々な天然の酵素的核酸が、現在では、知られている。各々は、生理的条件下で、核酸のリン酸ジエスエル結合の加水分解を、トランスで触媒することができる(従って、他の核酸化合物を開裂することができる)。一般に、酵素的核酸は、最初に標的核酸に結合することにより作用する。かかる結合は、酵素的核酸の、標的核酸を開裂するように作用する分子の酵素的部分の近くに保持された、標的結合部分によって起きる。従って、この酵素的核酸は、先ず、標的核酸を相補的塩基対合により認識し、次いで、結合し、一度正しい部位に結合したならば、酵素的に作用して、標的核酸を切断する。かかる標的核酸の戦略的開裂は、そのコードされたタンパク質の合成を指示する能力を破壊するであろう。酵素的核酸がその核酸標的に結合して開裂した後で、それは、他の標的を探すためにその核酸から遊離されて、新たな標的に繰り返し結合して開裂することができる。
【００６５】
特別の具体例において、主題の酵素的核酸は、ｍＲＮＡ転写物を触媒的に開裂して、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するようにデザインされたリボザイムである(例えば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４；Sarver等、1990, Science 247:1222-1225;及び米国特許第５，０９３，２４６号を参照されたい)。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを開裂するリボザイムを利用して特定のｍＲＮＡを破壊することができるが、ハンマーヘッドリボザイムの利用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、ｍＲＮＡを、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域により指示された位置で開裂する。その唯一の必要条件は、標的ｍＲＮＡが次の２つの塩基の配列を有することである：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッドリボザイムの構築及び製造は、当分野で周知であり、Haseloff及びGerlach, 1988, Nature, 334:585-591に一層詳細に記載されている。本開示のリボザイムは、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ(以後、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」)例えばテトラヒメナ・サーモフィラ中に天然に存在するもの(ＩＶＳ又はＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡとして知られる)及び詳細に記載されてきたもの(Zaug等、1984, Science, 224:574-578; Zaug及びCech, 1986, Science, 231:470-475; Zaug等、1986, Nature, 324-429-433; 公開された国際特許出願Ｎｏ．ＷＯ８８／０４３００(University Patents Inc.); Been及びCech, 1986, Cell, 47:207-216参照)をも包含する。
【００６６】
他の特別の具体例において、主題の酵素的核酸は、ＤＮＡ酵素である。ＤＮＡ酵素は、アンチセンス技術とリボザイム技術の両方の機構的特徴の幾つかを組み込んでいる。ＤＮＡ酵素は、それらが、アンチセンスオリゴヌクレオチドのように特定の標的核酸配列を認識するが、リボザイムのように触媒的であって、標的核酸を特異的に開裂するようにデザインされる。簡単にいえば、標的核酸を特異的に認識して開裂させる理想的ＤＮＡ酵素をデザインするためには、当業者は、先ず、そのユニークな標的配列を同定しなければならない。好ましくは、このユニーク又は実質的にユニークな配列は、約１８〜２２ヌクレオチドのＧ／Ｃリッチな配列である。高いＧＣ含量は、ＤＮＡ酵素と標的配列との間の一層強力な相互作用を保証するのを助成する。ＤＮＡ酵素を合成する場合、酵素にメッセージを標的とさせる特異的アンチセンス認識配列は、ＤＮＡ酵素の２つのアームを含み、ＤＮＡ酵素のループが２つの特異的アームの間に位置されるように分割される。ＤＮＡ酵素の製造方法及び投与方法は、例えば、米国特許第６，１１０，４６２号に見出すことができる。
【００６７】
ある種の具体例において、この開示のこれらの核酸治療剤は、１２〜２００ヌクレオチド長であってよい。一具体例において、この開示の典型的な酵素的核酸化合物は、１５〜５０ヌクレオチド長であり、例えば、２５〜４０ヌクレオチド長を含む(例えば、Jarvis等、1996, J.Biol.Chem., 271, 29107-29112参照)。他の具体例においては、この開示の典型的なアンチセンス分子は、１５〜７５ヌクレオチド長であり、例えば、２０〜３５ヌクレオチド長を含む(例えば、Woolf等、1992, PNAS., 89, 7305-7309; Milner等、1997, Nature Biotechnology, 15, 537-541参照)。他の具体例においては、この開示の典型的なｓｉＲＮＡは、２０〜２７ヌクレオチド長であり、例えば、２１〜２３ヌクレオチド長を含む。当業者は、求められるすべては、主題の核酸治療剤が、ここで企図する反応を触媒するのに十分であり適している長さ及びコンホメーションのものであることであることを認めるであろう。本開示の核酸治療剤の長さは、一般的な限界内に限られない。
【００６８】
ＩＩＩ．核酸標的部位
この開示の有用な核酸化合物の標的(例えば、アンチセンス核酸、ｄｓＲＮＡ、及び酵素的核酸化合物)は、Draper等、３０ＷＯ９３／２３５６９；Sullivan等、ＷＯ９３／２３０５７；Thompson等、ＷＯ９４／０２５９５；Drape等、ＷＯ９５／０４８１８；McSwiggen等、米国特許第５，５２５，４６８号に開示されたように決定することができる。他の例は、次のＰＣＴ出願「病気関連遺伝子の発現の不活性化」：ＷＯ９５／２３２２５号、ＷＯ９５／１３３８０、ＷＯ９４／０２５９５を含む。それらの文献中に与えられた誘導を繰り返すよりも、むしろ、以下には、かかる方法の特別の実施例が与えられる(当分野のものに限られない)。
【００６９】
かかる標的に対する酵素的核酸化合物、ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスは、それらの応用において記載されたようにデザインされ、やはり記載されたようにイン・ビトロ及びイン・ビボで試験するために合成される。例えば、ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４ ＲＮＡの配列は、最適核酸標的部位について、コンピューターによる折り畳みアルゴリズムを利用してスクリーニングされる。潜在的な核酸結合／開裂部位が同定される。例えば、この開示の酵素的核酸化合物について、これらの核酸化合物は、コンピューターフォールディング(Jaeger等、1989 Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86, 7706)により個々に分析されて、これらの配列が適切な二次構造に折り畳まるかどうかを評価する。好ましくない分子内相互作用例えば結合アームと触媒コアとの間の相互作用を有する核酸化合物は、考察から外すことができる。
【００７０】
主題の核酸(例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、及び／又は酵素的核酸化合物)の結合／開裂部位を同定して、核酸標的中の様々な部位にアニールするようにデザインする(例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２及び／又はＥｐｈＢ４)。この開示の酵素的核酸化合物の結合アームは、上記の標的部位の配列に相補的である。アンチセンス及びＲＮＡｉ配列は、核酸標的に対する部分的な又は完全な相補性を有するようにデザインされる。これらの核酸化合物は、化学合成することができる。用いられる合成の方法は、下記に記載のような及びUsman等、1987 J Am. Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe等、1990 Nucleic Acids Res., 18, 5433;及びWincott等、1995 Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684; Caruthers等、1992, Methods in Enzymology 211,3-19に記載のような通常のＤＮＡ／ＲＮＡ合成の手順に従う。
【００７１】
加えて、ＣｐＧモチーフを有する核酸治療剤が非特異的免疫応答を引き起こすことはありそうなことであるということが予想される。一般に、ＣｐＧモチーフは、５’方向に少なくとも一つのプリンと隣接し且つ３’方向に少なくとも一つのピリミジンと隣接したＣＧ(シトシン−グアニン)配列を含む。公知のＣｐＧモチーフのリストは、当分野で利用可能である。好適な核酸治療剤は、全身的免疫応答の引き金を引くことなく標的遺伝子に対して選択効果を有する(おそらく、他の密接に関連する遺伝子に影響する)ように選択される。ＣｐＧモチーフを有する核酸治療剤を避けるためには、特定の核酸が免疫応答の引き金を引く可能性を減らすことが可能である。
【００７２】
ＩＶ．核酸治療剤の合成
１００ヌクレオチド長より大きい核酸の合成は、自動化方法を用いては困難であり、かかる分子の治療コストが禁じている。この開示においては、小さい核酸モチーフ(小さいは、約１００ヌクレオチド長、好ましくは、約８０ヌクレオチド長、一層好ましくは、約５０ヌクレオチド長より小さい核酸モチーフを指す。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、酵素的核酸、及びＲＮＡｉ構築物)が、外因的送達に好適に用いられる。これらの分子の単純な構造は、その核酸がＲＮＡ構造の標的領域に侵入する能力を増大させる。
【００７３】
本開示の典型的分子は、化学合成され、他は、同様に合成することができる。説明のために、オリゴヌクレオチド(例えば、ＤＮＡ)は、Caruthers等、1992, Methods in Enzymology 211,3-19, Thompson等、ＷＯ９９／５４４５９、Wincott等、1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684, Wincott等、1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, Brennan等、1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45, 及び Brennan, 米国特許第６，００１，３１１号に記載された当分野で公知のプロトコールを利用して合成される。オリゴヌクレオチドの合成は、一般的な核酸の保護及び基の結合を利用する(例えば、５’末端のジメトキシトリチル及び３’末端のホスホルアミダイト)。非制限的例において、小規模な合成が、Applied Biosystems, Inc. の３９４ シンセサイザーにて、２．５分間の２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドの結合工程及び４５秒間２’−デオキシヌクレオシドの結合にて行なわれる。或は、合成は、９６ウェルプレートシンセサイザー例えば Protogene (カリフォルニア、Palo Alto)製の機器にて、そのサイクルに最少の改変を加えて行なうことができる。
【００７４】
適宜、本開示の核酸化合物は、別々に合成して、合成後に、例えば連結により一緒に結合することができる(Moore等、1992, Science 256, 9923; Draper等、ＷＯ９３／２３５６９；Shabarova等、1991, Nucleic Acids Research 19, 4247; Bellon等、1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon等、1997, Bioconjugate Chem. 8, 204)。
【００７５】
好ましくは、本開示の核酸化合物は、ヌクレアーゼ耐性基例えば２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈによる改変によって安定性を増進させるために大々的に改変される(総説としては、Usman及びCedergren, 1992, TIBS 17, 34; Usman等、1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31, 163を参照されたい)。リボザイムは、一般的方法を用いるゲル電気泳動により精製され又は高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ；Wincott等、前出、その全体を、資料として本明細書中に援用する、参照)により精製されて、水中に再懸濁される。
【００７６】
Ｖ．核酸化合物の活性の最適化
改変を有する核酸化合物(例えば、塩基、糖及び／又はリン酸)は、それらの血清リボヌクレアーゼによる分解を防止し、それにより、それらの有効性を増大させることができる。当分野では、ヌクレアーゼ安定性及び効力における有意の増進を伴って核酸化合物に導入することのできる、糖、塩基及びリン酸の改変を記載する幾つかの例がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性基例えば２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基改変による改変によって、安定性を増進し及び／又は生物学的活性を増進するように改変される(総説としては、Usman及びCedergren, 1992, TIBS, 17, 34; Usman等、1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31, 163; Burgin等、1996, Biochemistry, 35, 14090を参照されたい)。核酸化合物の糖改変は、当分野で詳細に記載されてきた(Eckstein等、ＷＯ９２／０７０６５；Perrault等、Nature, 1990, 344, 565-568；Pieken等、Science, 1991, 253, 314-317； Usman及びCedergren, Trends in Biochem. Sci., 1992, 17, 334-339; Usman等、ＷＯ９３／１５１８７；Sproat, 米国特許第５，３３４，７１１号及びBeigelman等、1995, J.Biol.Chem., 270, 25702; Beigelman等、ＷＯ９７／２６２７０；Beigelman等、米国特許第５，７１６，８２４号；Usman等、米国特許第５，６２７，０５３号；Woolf等、ＷＯ９８／１３５２６；Thompson等、米国特許出願第６０／０８２，４０４号(１９９８年４月２０日出願)；Karpeisky等、1998, Tetrahedron Lett., 39, 1131; Earnshaw及びGait, 1998, Biopolymers (Nucleic acid Science), 48, 39-55; Verma及びEckstein, 1998, Annu. Rev. Biochem., 67, 99-134;及びBurlina等、1997, Bioorg.Med.Chem., 5, 1999-2010参照)。同様の改変を利用して、本開示の核酸化合物を改変することができる。
【００７７】
オリゴヌクレオチド間の結合の、ホスホロチオエート、ホスホロチオエート、及び／又は５’−メチルホスホネート結合による化学的改変は安定性を改善するが、過剰のこれらの改変は、毒性を引き起こしうる。それ故、これらのヌクレオチド結合間の量は、評価されるべきであり、核酸化合物をデザインする場合には適切に最少化されるべきである。これらの結合の濃度の減少は、毒性を低下させ、これらの分子の増大した効力及び一層高い特異性を生じる。
【００７８】
一具体例において、この開示の核酸化合物は、少なくとも一のＧ−クランプヌクレオチドを含む。Ｇ−クランプヌクレオチドは、改変されたシトシン類似体であり、それらの改変は、二重鎖内の相補的グアニンのWatson-Crick及びHoogsteen面の両方と水素結合する能力を与える(例えば、Lin及びMatteucci, 1998, J.Am.Chem.Soc., 120, 8531-8532参照)。オリゴヌクレオチド中の単一のＧ−クランプ類似体置換は、実質的に増進したらせんの温度安定性及び相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした際のミスマッチ識別力を生じうる。この開示の核酸化合物中のかかるヌクレオチドの含有は、核酸標的に対する増進した親和性及び特異性の両方を生じる。他の具体例において、この開示の核酸化合物は、少なくとも一つのＬＮＡ(ロックされた核酸)ヌクレオチド例えば２’，４’−Ｃミシレンビシクロヌクレオチド(例えば、Wengel等、ＷＯ００／６６６０４及びＷＯ９９／１４２２６参照)を含む。
【００７９】
他の具体例において、この開示は、ＥｐｈｒｉｎＢ２及び／又はＥｐｈＢ４を標的とする核酸化合物の結合体及び／又は複合体を特徴とする。かかる結合体及び／又は複合体は、核酸化合物の生物学的系例えば細胞への送達を促進するために利用することができる。本開示により与えられるこれらの結合体及び複合体は、治療用化合物を細胞膜を横切ってトランスファーし、薬物動力学を変え、及び／又はこの開示の核酸化合物の局在性を変調することによって治療活性を与える。
【００８０】
本開示は、分子の細胞膜を横切る送達のための新規な結合体及び複合体のデザイン及び合成を包含し、該分子は、小型分子、脂質、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負に帯電したポリマー及び他のポリマー例えばタンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール、又はポリアミンを含むが、これらに限られない。一般に、記載された輸送体は、分解性リンカーを伴っても伴わなくても、個々に又は多成分系の部分として用いられるようにデザインされている。これらの化合物は、この開示の核酸化合物の、異なる組織に由来する多くの種類の細胞内への、血清の存在下で又は非存在下での、送達及び／又は局在性を改善すると予想される(Sullenger及びCech, 米国特許第５，８５４，０３８号を参照されたい)。ここに記載した分子の結合体は、生物学的に活性な分子に、生物分解性リンカー例えば生物分解性核酸リンカー分子によって結合されうる。
【００８１】
用語「生物分解性核酸リンカー分子」は、ここで用いる場合、一の分子を他の分子例えば生物学的に活性な分子に接続するための生物分解性リンカーとしてデザインされた核酸分子を指す。生物分解性核酸リンカー分子の安定性は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び化学的に改変されたヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、及び他の２’−改変された又は塩基改変されたヌクレオチドの様々な組合せを利用することによって変調することができる。この生物分解性核酸リンカー分子は、二量体、三量体、四量体又は一層長い核酸化合物例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであってよく、又はリンベースの結合例えばホスホルアミデート又はホスホジエステル結合を有する単一ヌクレオチドを含むことができる。この生物分解性核酸リンカー分子は又、核酸主鎖、核酸糖、又は核酸塩基の改変を含むこともできる。用語「生物分解性」は、ここで用いる場合、生物系における分解例えば酵素的分解又は化学的分解を指す。
【００８２】
治療用核酸化合物、例えばここに記載された、外因的に送達される分子は、標的ＲＮＡの翻訳が、望ましくないタンパク質のレベルを減じるように十分長く阻害されるまで、細胞中で最適に安定である。この時間は、病状によって、数時間から数日まで変化する。これらの核酸化合物は、有効な細胞内治療剤として機能するために、ヌクレアーゼに耐性であるべきである。本開示中に及び当分野で記載された核酸化合物の化学合成における改良は、核酸化合物を改変する能力を、上記のように、ヌクレオチド改変を導入して、それらのヌクレアーゼ安定性を増進することにより拡大してきた。
【００８３】
他の面において、これらの核酸化合物は、５’及び／又は３’−キャップ構造を含む。「キャップ構造」とは、オリゴヌクレオチドの何れかの末端に組み込まれた化学的改変を意味する(例えば、Wincott等、ＷＯ９７／２６２７０参照)。これらの末端改変は、核酸化合物を、エキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内の送達及び／又は局在性を助成することができる。このキャップは、５’末端(５’−キャップ)又は３’末端(３’−キャップ)に存在してよく、又は両端に存在してよい。非制限的例において、この５’−キャップは、逆向きの非塩基性(abasic)残基(部分)、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−(ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル)ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオシド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；改変された塩基のヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−ｓｅｃｏヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆方向ヌクレオチド部分；３’−３’逆方向非塩基性部分；３’−２’−逆方向ヌクレオチド部分；３’−２’−逆方向非塩基性部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホルアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；又は架橋性(bridging)若しくは非架橋性メチルホスホネート部分を包含する(更なる詳細は、Wincott等、ＷＯ９７／２６２７０を参照されたい)。他の非制限的例において、３’−キャップは、例えば、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−(ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル)ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；改変された塩基のヌクレオチド；ホスホロジチオエート；トレオペントフラノシヌクレオチド；非環式３’，４’−ｓｅｃｏヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆方向ヌクレオチド部分；５’−５’−逆方向非塩基性部分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；架橋性及び／又は非架橋性５’−ホスホルアミデート、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート、架橋性又は非架橋性メチルホスホネート及び５’−メルカプト部分(更なる詳細は、Beaucage及びIyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925を参照されたい)。
【００８４】
ＶＩ．可溶性ポリペプチド
ある面において、この発明は、ＥｐｈｒｉｎＢ２タンパク質の細胞外ドメインを構成する可溶性ポリペプチド(以後、ＥｐｈｒｉｎＢ２可溶性ポリペプチドと呼ぶ−図１２及び１３参照)又はＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外ドメインを構成する可溶性ポリペプチド(以後、ＥｐｈＢ４可溶性ポリペプチドと呼ぶ−図９〜１１参照)に関する。好ましくは、主題の可溶性ポリペプチドは、単量体であり、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４に高い親和性で結合することができる。特別の具体例において、この発明のＥｐｈＢ４可溶性ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４タンパク質の球状ドメインを構成する。特別の例としてのＥｐｈＢ４可溶性ポリペプチドは、公開された米国特許出願第２００５０２４９７３６号に与えられている。
【００８５】
ここで用いる場合、主題の可溶性ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４可溶性ポリペプチド又はＥｐｈｒｉｎＢ２可溶性ポリペプチドの断片、機能性変異体、及び改変型を含む。これらの主題の可溶性ポリペプチドの断片、機能性変異体、及び改変型は、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈｒｉｎＢ２又は両者の機能に拮抗する。
【００８６】
ある種の具体例において、主題の可溶性ポリペプチドの単離された断片は、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２ポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換え技術により生成したポリペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。加えて、断片は、当分野で公知の技術例えば慣用のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃ又はｔ−Ｂｏｃ化学を利用して化学合成することができる。これらの断片を製造(組換え又は化学合成による)して、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２の機能を阻害するように機能することのできるペプチジル断片を同定するために、これらの断片が血管形成又は腫瘍成長を阻止する能力を試験することによって試験することができる。
【００８７】
ある種の具体例において、ＥｐｈＢ４可溶性ポリペプチドの機能的変異体は、そのアミノ酸配列の残基１〜１９７、２９〜１９７、１〜３１２、２９〜１３２、１〜３２１、２９〜３２１、１〜３２６、２９〜３２６、１〜４１２、２９〜４１２、１〜４２７、２９〜４２７、１〜４２９、２９〜４２９、１〜５２６、２９〜５２６、１〜５３７及び２９〜５３７と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。かかるポリペプチドは、プロセッシングを受けた形態で利用することができ、従って、ある具体例においては、ＥｐｈＢ４可溶性ポリペプチドは、そのアミノ酸配列の残基１６〜１９７、１６〜３１２、１６〜３２１、１６〜３２６、１６〜４１２、１６〜４２７、１６〜４２９、１６〜５２６及び１６〜５３７と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８８】
他の具体例において、ＥｐｈｒｉｎＢ２可溶性ポリペプチドの機能性変異体は、そのアミノ酸配列の残基１〜２２５と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一である配列又は、プロセッシングを受けた形態例えばその配列の残基２６〜２２５と少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一である配列を含むものを含む。
【００８９】
ある種の具体例においては、本発明は、主題の可溶性ポリペプチドの構造を、治療的又は予防的効力、又は安定性(例えば、生体外での棚もち及びイン・ビボでのタンパク質分解に対する耐性)を増進する目的のために、改変することによって、機能的変異体を作成することを企図する。かかる改変された可溶性ポリペプチドは、天然のＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２可溶性ポリペプチドと同等に機能的であると考えられる。改変された可溶性ポリペプチドは、例えば、アミノ酸の置換、欠失又は付加によって製造することができる。例えば、孤立したロイシンのイソロイシン又はバリンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、スレオニンのセリンによる置換、又はアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸での動揺の置換(例えば、保存的変異)は、生成した分子の生物学的活性に主たる影響を有しないであろうと予想することは合理的である。保存的置換は、側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で生じるものである。
【００９０】
この発明は、更に、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２可溶性ポリペプチドのコンビナトリアル変異体、並びに切り詰めた変異体(truncation mutants)のセットを生成する方法を企図し、それは、機能的変異体配列を同定するのに特に有用である。かかるコンビナトリアルライブラリをスクリーニングする目的は、例えば、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ２又は両者のアンタゴニストとして作用しうる可溶性ポリペプチド変異体を生成することでありうる。コンビナトリアル的に得られる変異体は、天然の可溶性ポリペプチドと比較して選択的効力を有するものを生成することができる。かかる変異体タンパク質は、組換えＤＮＡ構築物から発現させた場合に、遺伝子治療プロトコールにて利用することができる。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型可溶性ポリペプチドと劇的に異なる細胞内半減期を有する変異体を生じうる。例えば、変化したタンパク質は、関心あるタンパク質(例えば、可溶性ポリペプチド)の破壊或は不活性化を生じるタンパク質分解又は他の細胞過程に対して一層安定に又は一層不安定になりうる。かかる変異体及びそれらをコードする遺伝子は、主題の可溶性ポリペプチドのレベルを、それらの半減期を変調することにより変えるために利用することができる。例えば、短い半減期は、一層一過性の生物学的効果を生じることができ、誘導性の発現系の部分の場合には、細胞内の組換え可溶性ポリペプチドのレベルの一層厳密な制御を可能にすることができる。上記のように、かかるタンパク質及び特にそれらの組換え核酸構築物を、遺伝子治療プロトコールにおいて利用することができる。
【００９１】
潜在的同族体のライブラリーを、縮重オリゴヌクレオチド配列から生成することのできる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動化ＤＮＡシンセサイザーにて行なうことができ、それらの合成遺伝子を、次いで、適切な発現用遺伝子内に連結することができる。遺伝子の縮重セットの目的は、一混合物中で、潜在的可溶性ポリペプチド配列の所望のセットをコードする配列のすべてを与えることである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当分野で周知である(例えば、Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura等、(1981) Recombinant DNA, Proc.第3回 Cleveland Sympos. Macromolecules, AG Walton編、Amsterdam: Elsevier p273-289; Itakura等、(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura等、(1984) Science 198:1056; Ike等、(1983) Nucleic Acids Res. 11:477を参照されたい)。かかる技術は、他のタンパク質の方向付けられた進化において採用されてきた(例えば、Scott等、(1990) Science 249:386-390; Roberts等、(1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin等、(1990) Science 249: 404-406; Cwirla等、(1990) PNAS USA 87: 6378-6382; 並びに米国特許第５，２２３，４０９号、５，１９８，３４６号及び５，０９６，８１５号を参照されたい)。
【００９２】
或は、突然変異誘発の他の形態は、コンビナトリアルライブラリを生成するために利用することができる。例えば、可溶性ポリペプチド変異体(例えば、アンタゴニスト形態)は、一つのライブラリから、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発など(Ruf等、(1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang等、(1994) J.Biol.Chem. 269:3095-3099; Balint等、(1993) Gene 137:109-118; Grodberg等、(1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima等、(1993) J.Biol.Chem. 268:2888-2892; Lowman等、(1991) Biochemistry 30:10832-10838; 及びCunningham等、(1989) Science 244:1081-1085)を利用するスクリーニングにより、リンカースキャニング突然変異誘発(Gustin等、(1993) Virology 193:653-660; Brown等、(1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight等、(1982) Science 232:316)により；飽和突然変異誘発(Meyers等、(1986) Science 232:613)により；ＰＣＲ突然変異誘発(Leung等、(1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19)により；又は化学的突然変異誘発を含むランダム突然変異誘発など(Miller等、(1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY;及びGreener等、(1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34)によって、生成され、単離されうる。リンカースキャニング突然変異誘発は、特に、コンビナトリアル設定において、切り詰められた形態の主題の可溶性ポリペプチド(生物活性)を同定するための魅力的な方法である。
【００９３】
当分野では、点突然変異と切り詰めによって作成されたコンビナトリアルライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするための、及びその問題に関して、ある特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための広範な技術が知られている。かかる技術は、一般に、主題の可溶性ポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発により生成された遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに適合可能である。大きい遺伝子ライブラリをスクリーニングするために最も広く用いられている技術は、典型的には、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、適切な細胞を生成したベクターのライブラリでトランスフォームすること、及びコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で発現させることを含む。下記の説明的アッセイの各々は、コンビナトリアル突然変異誘発技術により造られた多数の縮重配列のスクリーニングに必要な高スループット分析に従順である。
【００９４】
ある種の具体例においては、この発明の主題の可溶性ポリペプチドは、小型分子例えばペプチド及びペプチド模倣物(peptidomimetic)を含む。ここで用いる場合、用語「ペプチド模倣物」は、化学的に改変されたペプチド及び天然にないアミノ酸、ペプトイドなどを含むペプチド様分子を含む。ペプチド模倣物は、患者に投与した際の増進された安定性を含む、ペプチドを超える様々な利点を与える。ペプチド模倣物を同定する方法は、当分野で周知であり、潜在的ペプチド模倣物のライブラリを含むデータベースのスクリーニングを含む。例えば、ケンブリッジ構造データベース(Cambridge Structural Detabase)は、公知の結晶構造を有する３００，０００より多くの化合物の収集を含んでいる(Allen等、Acta Crystallogr. Section B, 35:2331 (1979))。標的分子の結晶構造が入手できない場合には、構造を、例えば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤ(Rusinko等、J.Chem.Inf.Comput.Sci. 29:251 (1989))を利用して生成することができる。他のデータベース Available Chemicals Directory (Molecular Design Limited, Informations Systems; カリフォルニア、San Leandro)は、市販の約１００，０００の化合物を含んでおり、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２可溶性ポリペプチドの潜在的ペプチド模倣物を同定するために検索することもできる。
【００９５】
説明のために、他のタンパク質への結合に関与する可溶性ポリペプチドのアミノ酸残基をマップするためにスキャニング突然変異誘発を採用することにより、結合に関与する残基を真似るペプチド模倣化合物を生成することができる。例えば、かかる残基の加水分解可能でないペプチド類似体は、ベンゾジアゼピン(例えば、Freidinger等、Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall編、ESCOM Publisher: Leiden, オランダ、1988を参照されたい)、アゼピン(例えば、Huffman等、Peptide: Chemistry and Biology, G.R. Marshall編、ESCOM Publisher: Leiden, オランダ、1988を参照されたい)、置換されたガンマラクタム環(Garvey等、Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall編、ESCOM Publisher: Leiden, オランダ、1988)、ｋｅｔｏ−メチレンシュードペプチド(Ewenson等、(1986) J. Med. Chem. 29:295; 及びEwenson等、Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985)、ｂ−ターンジペプチドコア(Nagai等(1985) Tetrahedron Lett 26:647;及びSato等(1986) J Chem Soc Perkin Trans 1:1231)、及びｂ−アミノアルコール(Gordon等(1985) Biochem Biophys Res Commun 126:419;及びDann等、(1986) Biochem Biophys Res Commun 134:71)を利用して生成することができる。
【００９６】
ある種の具体例においては、この発明の可溶性ポリペプチドは、更に、翻訳後改変を含むことができる。かかる改変は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化を含むが、これらに限られない。結果として、これらの改変された可溶性ポリペプチドは、非アミノ酸要素例えばポリエチレングリコール、脂質、多糖類若しくは単糖類、及びホスフェートを含むことができる。かかる非アミノ酸要素の可溶性ポリペプチドの官能性に対する効果は、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２の機能における拮抗的役割について試験することができる(例えば、それは、血管形成又は腫瘍成長に対する阻害的効果を有する)。
【００９７】
ある面において、主題の可溶性ポリペプチドの機能的変異体又は改変型は、可溶性ポリペプチドの少なくとも一部分及び一以上の融合ドメインを有する融合タンパク質を包含する。かかる融合ドメインの周知の例は、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、及び免疫グロブリン重鎖定常領域(Ｆｃ)、マルトース結合性タンパク質(ＭＢＰ)を含み、これらは、特に、融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィーによる単離に有用であるが、これらに限られない。アフィニティー精製の目的のために、アフィニティークロマトグラフィーに適切なマトリクス例えばグルタチオン−、アミラーゼ、及びニッケル−又はコバルト−結合した樹脂が用いられる。当分野で周知の他の融合ドメインは、グリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)である。融合ドメインは又、通常短いペプチド配列であって、それに対して特異的抗体を利用できる「エピトープタグ」をも包含する。特異的モノクローナル抗体を容易に利用できる周知のエピトープタグは、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(ＨＡ)、及びｃ−ｍｙｃタグを含む。幾つかの場合には、融合ドメインは、適切なプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化するのを可能にし、それにより組換えタンパク質をそれから遊離させるプロテアーゼ開裂部位例えば、因子Ｘａ又はトロンビンを有する。遊離されたタンパク質を、次いで、融合ドメインから、その後のクロマトグラフィー分離によって単離することができる。ある種の具体例においては、本発明の可溶性ポリペプチドは、それらの可溶性ペプチドを安定化することのできる少なくとも一種の改変を含む。例えば、かかる改変は、可溶性ポリペプチドのイン・ビトロ半減期を増進させ、可溶性ポリペプチドの循環半減期を増進させ、又は可溶性ポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。
【００９８】
ある種の具体例においては、この発明の可溶性ポリペプチド(未改変又は改変したもの)は、様々な公知の技術によって製造することができる。例えば、かかる可溶性ポリペプチドは、標準的タンパク質化学技術例えばBodansky, M. Principles of Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993)及びGrant G. A. (編)、Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman及びCompany, New Nork （1992)に記載されたようなものを利用して合成することができる。加えて、自動化ペプチドシンセサイザーが市販されている(例えば、Advanced Chem Tech Model 396; Milligen/Biosearch 9600)。或は、可溶性ポリペプチド、その断片又は変異体は、当分野で周知の様々な発現系を利用して、組換えにより製造することができる(下記も参照されたい)。
【００９９】
ＶＩＩ．可溶性ポリペプチドをコードする核酸
ある面において、この発明は、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２可溶性ポリペプチドをコードする単離された及び／又は組換えの核酸に関するものである。これらの主題の核酸は、一本鎖又は二本鎖の、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であってよい。これらの核酸は、治療剤として有用である。例えば、これらの核酸は、細胞又は個体に治療剤として投与される組換え可溶性ポリペプチドの作成において有用である。或は、これらの核酸は、直接、細胞又は個体に治療剤として例えば遺伝子治療において投与することができる。
【０１００】
ある種の具体例においては、この発明は、このヌクレオチド配列の一領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である、単離された又は組換えの核酸配列を提供する。当業者は、主題の核酸に、及び主題の核酸の変異体に相補的な核酸配列も又、この発明の範囲内にあることを認めるであろう。更なる具体例においては、この発明の核酸配列は、単離された、組換えの、及び／又は異種ヌクレオチド配列と融合されたものであってよく、又はＤＮＡライブラリ中にあってよい。
【０１０１】
他の具体例においては、この発明の核酸は又、このヌクレオチド配列又はその相補的配列に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列をも包含する。上記のように、当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェント条件は、変えることができるということを容易に理解するであろう。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェント条件は、変えることができるということを容易に理解するであろう。例えば、ハイブリダイゼーションを、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)にて、約４５℃で行ない、その後、２．０×ＳＳＣにて、５０℃で洗浄することにより行なうことができよう。例えば、この洗浄工程における塩濃度は、約２．０×ＳＳＣ、５０℃の低ストリンジェントなものから高ストリンジェントな約０．２×ＳＳＣ、５０℃までから選択することができる。加えて、洗浄工程の温度は、約２２℃の室温の低ストリンジェントな条件から約６５℃の高ストリンジェントな条件まで高めることができる。温度及び塩の両方を変えることができ、又は温度若しくは塩濃度を一定に維持しつつ他の変量を変えることができる。一具体例において、この発明は、６×ＳＳＣ、室温とその後の２×ＳＳＣ、室温での洗浄のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【０１０２】
遺伝コードの縮重のために主題の核酸と異なる単離された核酸も又、この発明の範囲内にある。例えば、幾つかのアミノ酸は、２種以上のトリプレットにより指示される。同じアミノ酸を特定するコドン、即ちシノニム(例えば、ＣＡＵ及びＣＡＣは、ヒスチジンのシノニムである)は、タンパク質のアミノ酸配列に影響しない「サイレント」変異を生じうる。しかしながら、主題のタンパク質のアミノ酸配列の変化へと導くＤＮＡ配列の多型が哺乳動物細胞間に存在するであろうということが予想される。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の一つ以上のヌクレオチド(最大で、ヌクレオチドの約３〜５％)において、これらの変異が、所定の種の個体間で、自然のアレル変異のために存在しうるということを認めるであろう。任意のそしてすべてのかかるヌクレオチド変異及びその結果生じたアミノ酸多型は、この発明の範囲内にある。
【０１０３】
ある具体例において、この発明の組換え核酸は、発現用構築物の少なくとも一つの調節用ヌクレオチド配列に操作可能に結合されうる。調節用ヌクレオチド配列は、一般に、発現に用いる宿主細胞に適している。多くの種類の適切な発現ベクター及び適した調節配列が、様々な宿主細胞用に、当分野で知られている。典型的には、前記の少なくとも一つの調節用ヌクレオチド配列は、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列を含むことができるが、これらに限られない。当分野で公知の構成的プロモーター又は誘導性プロモーターは、この発明によって企図される。これらのプロモーターは、天然のプロモーターであってよいし、又は２以上のプロモーターの要素を合せたハイブリッドプロモーターであってもよい。発現用構築物は、細胞中で、エピゾーム例えばプラスミド上に存在してよいし、又は染色体中に挿入されていてもよい。好適具体例において、発現ベクターは、トランスフォームされた宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含んでいる。選択マーカー遺伝子は、当分野で周知であり、用いる宿主細胞によって異なる。
【０１０４】
この発明のある面において、主題の核酸は、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２可溶性ポリペプチドをコードする及び少なくとも一つの調節配列に操作可能に結合されたヌクレオチド配列を含む発現ベクター中に与えられる。調節配列は、技術的に認められたものであり、可溶性ポリペプチドの発現を指示するために選択される。従って、用語調節配列は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現調節用エレメントを包含する。典型的な調節配列は、Goeddel; Gene Expression Technology: Methodss in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。例えば、広範な発現制御用配列であって、それが機能的に結合されたＤＮＡ配列の発現を制御する当該発現制御用配列の何れかを、これらのベクターにおいて、可溶性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるために用いることができる。かかる有用な発現制御用配列は、例えば、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルス又はサイトメガロウイルスの最初期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより発現が指示されるＴ７プロモーター、ラムダファージの主オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖系酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母のα交配因子のプロモーター、バキュロウイルス系のポリヘドロンプロモーター及び他の、原核又は真核細胞又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られた配列、並びにこれらの様々な組合せを包含する。発現ベクターのデザインは、トランスフォームすべき宿主細胞の選択及び／又は発現させることを所望するタンパク質の種類などの因子に依存しうるということは理解されるべきである。その上、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、及びそのベクターによりコードされる任意の他のタンパク質例えば抗生物質マーカーの発現も又、考慮すべきである。
【０１０５】
この発明は又、主題の可溶性ポリペプチドの少なくとも一つのコード配列を含む組換え遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞にも関係する。この宿主細胞は、何れの原核又は真核細胞であってもよい。例えば、この発明の可溶性ポリペプチドは、細菌細胞例えば大腸菌、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現系を使用)、酵母、又は哺乳動物細胞中で発現させることができる。他の適当な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１０６】
ＶＩＩＩ．抗体
この開示は、部分的に、ポリペプチド結合因子、例えば抗体、抗体の抗原結合部分、及び免疫グロブリンでない抗原結合性足場(scaffold)によって有効に標的とされうるＥｐｈＢ４分子の限定された部分を提供する。ここに記載したＥｐｈＢ４ポリペプチド結合性因子は、様々な病気、特に癌及び望ましくない血管形成と関係する病気を治療するために利用することができる。この開示は、少なくとも一つのＥｐｈＢ４に媒介される機能例えばＥｐｈｒｉｎＢ２結合又はＥｐｈＢ４キナーゼ活性を阻害する抗体及びその抗原結合性部分を提供する。かかる結合性因子は、ＥｐｈＢ４機能をイン・ビトロ及びイン・ビボで阻止するために、好ましくは、癌又は望ましくない血管形成と関係する病気を治療するために利用することができる。この開示は又、ＥｐｈＢ４キナーゼ活性(典型的には、ＥｐｈＢ４リン酸化状態を評価することにより評価される)を活性化する抗体及びその抗原結合性部分をも提供する。驚くべきことに、かかる抗体は又、細胞ベースのアッセイ及びイン・ビボアッセイにおいて、ＥｐｈＢ４機能を阻止する。従って、かかる結合性因子は、ＥｐｈＢ４機能をイン・ビトロ及びイン・ビボで阻止するために、好ましくは、癌又は望ましくない血管形成と関係する病気を治療するために利用することができる。如何なる特定の機構に限定されることも望まないが、これらの抗体がＥｐｈＢ４キナーゼ活性を刺激するだけでなく、ＥｐｈＢ４の膜からの除去をも刺激し、そうして、全体的ＥｐｈＢ４レベルを低下させるということは予想される。
【０１０７】
ＥｐｈＢ４は、膜貫通レセプタータンパク質チロシンキナーゼのファミリーに属する。ＥｐｈＢ４の細胞外部分は、リガンド結合ドメイン(球状ドメインとも呼ばれる)、システインリッチドメイン、及び一対の３型フィブロネクチン反復よりなる。細胞質ドメインは、２つの保存されたチロシン残基を含む膜近傍領域；タンパク質チロシンキナーゼドメイン；ステライルα−モチーフ(ＳＡＭ)及びＰＤＺ−ドメイン結合性モチーフからなる。ＥｐｈＢ４は、膜に結合したリガンドＥｐｈｒｉｎＢ２に特異的である(Sakano, S.等、1996; Brambilla R.等、1995)。ＥｐｈＢ４は、クラスター化した、膜結合したｅｐｈｒｉｎリガンドの結合によって活性化され(Davis S.等、1994)、これは、このレセプターを発現している細胞とこのリガンドを発現している細胞との接触が、Ｅｐｈレセプターの活性化に必要とされていることを示している。リガンドの結合に際して、ＥｐｈＢ４レセプターは、二量体化し、膜近傍のチロシン残基を自己リン酸化して完全な活性化をもたらす。
【０１０８】
ここで用いる場合、用語「ＥｐｈＢ４」は、ヒトを含む哺乳動物に由来するＥｐｈＢ４ポリペプチドを指す。一具体例において、これらの抗体(免疫グロブリン)は、単離された及び／又は組換えにより製造された哺乳動物ＥｐｈＢ４又はその部分(例えば、ペプチド)に対して産生され、又は組換え哺乳動物ＥｐｈＢ４を発現する宿主細胞に対して産生される。ある面において、この発明の抗体は、ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外ドメイン(ここでは、ＥｐｈＢ４可溶性ポリペプチドと呼ぶ)に特異的に結合する。例えば、ＥｐｈＢ４可溶性ポリペプチドは、球状ドメインを構成し、ＥｐｈｒｉｎＢ２に結合することができる。ここで用いる場合、ＥｐｈＢ４可溶性ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４可溶性ポリペプチドの断片、機能的変異体、及び改変型を包含する。
【０１０９】
「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然の免疫グロブリンにおいて、各四量体は、２つの同じポリペプチド鎖の対からなっており、各対は、一つの「軽」鎖(約２５ｋＤａ)と一つの「重」鎖(約５０〜７０ｋＤａ)を有している。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主たる責任を負う約１００〜１１０の又は一層多くのアミノ酸の可変領域を含んでいる。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能に責任を負う定常領域を規定している。ヒトの軽鎖は、カッパー及びラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロンに分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプのＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥを規定している。軽鎖及び重鎖の内では、可変領域と定常領域が、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって繋がれており、重鎖は又、約１０アミノ酸の「Ｄ」領域をも含んでいる。特に、Fundamental Immunology の第７章(Paul, W., 編、第二版、Raven Press, N.Y. (1989))(その全内容を、すべての目的のために、そっくりそのまま資料として援用する)を参照されたい。各軽／重鎖対の可変領域は、完全な免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。免疫グロブリンは、一層高次の構造に組織化されうる。ＩｇＡは、一般に、２つの四量体の二量体である。ＩｇＭは、一般に、５つの四量体の五量体である。
【０１１０】
免疫グロブリン鎖は、３つの、相補性決定領域又はＣＤＲとも呼ばれる超可変領域により繋がれた比較的保存されたフレームワーク領域(ＦＲ)の同じ一般的構造を示す。各対の２つの鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域により整列されて、特異的エピトープへの結合が可能となる。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖と重鎖の両者は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。アミノ酸の各ドメインへの割当ては、Kabat Sequences of Protein of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. (1987及び1991))、又はChothia & Lesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987)；Chothia等、Nature 342:878-883 (1989)の規定に従っている。
【０１１１】
「抗体」は、完全な免疫グロブリン又は抗体と特異的結合について競争するその抗原結合性部分を指し、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を包含することを意図している。「単離された抗体」は、単純に、実質的に純粋な即ち、同じ標的に結合する他種の抗体を含まないように生成された抗体である。モノクローナル抗体及び殆どの組換え抗体型は、単離されているが、ポリクローナル抗体混合物中に存在する抗体種は、単離されていない。抗原結合性部分は、組換えＤＮＡ技術により又は完全な抗体の酵素若しくは化学的開裂により製造することができる。抗原結合性部分は、とりわけ、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及び相補性決定領域(ＣＤＲ)断片、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ディアボディ及び、免疫グロブリンの、特異的結合をポリペプチドに与えるのに十分な、少なくとも一部を含む当該ポリペプチドを包含する。用語「抗ＥｐｈＢ４抗体」及び「ＥｐｈＢ４抗体」は、ここでは、交換可能に用いる。
【０１１２】
Ｆab断片は、ＶＬ、ＶＨ，ＣＬ及びＣＨ１ドメインよりなる一価の断片であり；Ｆ(ab')２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド橋により結合された２つのＦab断片を含む二価の断片であり;Ｆｄ断片は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインよりなり；Ｆｖ断片は、抗体の一本のアームのＶＬ及びＶＨドメインよりなり；そしてｄＡｂ断片(Ward等、Nature 341:544-546, 1989)は、ＶＨドメインよりなる。
【０１１３】
一本鎖抗体(scＦｖ)は、ＶＬ及びＶＨ領域が、それらを単一タンパク質鎖として作成されることを可能にする合成リンカーを介して対合して一価分子を形成している抗体である(Bird等、Science 242:423-426, 1988及びHuston等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883, 1988)。ディアボディは、二価の、二重特異性抗体であって、そこにおいては、ＶＨ及びＶＬドメインは、単一ポリペプチド上に発現され、但し、同じ鎖上のドメインを対合させるには短すぎるリンカーを利用し、それにより、他の鎖の相補的ドメインと対合することを強制して、２つの抗原結合部位を造り出す(例えば、Holliger, P.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448, 1993及びPoljak, R. J.等、Structure 2:1121-1123, 1994参照)。一種以上のＣＤＲを一分子に共有結合により又は非共有結合によって組み込むことができる。
【０１１４】
抗体は、一以上の結合部位を有することができる。もし２以上の結合部位があるならば、それらの結合部位は、互いに同じであっても異なってもよい。例えば、天然の免疫グロブリンは、２つの異なる結合部位を有しており、一本鎖抗体又はＦab断片は、一つの結合部位を有しているが、「二重特異性」又は「二官能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【０１１５】
用語「ヒト抗体」は、ヒトの免疫グロブリン配列に由来する一以上の可変及び定常領域を有するすべての抗体を包含する。好適具体例において、すべての可変及び定常ドメインは、ヒトの免疫グロブリン配列に由来する(完全ヒト抗体)。これらの抗体は、下記するような様々な方法で調製することができる。
【０１１６】
用語「キメラ抗体」は、一抗体からの一以上の領域及び一以上の抗体からの一以上の領域を含む抗体を指す。好適具体例において、ＣＤＲの少なくとも一つは、抗ＥｐｈＢ４抗体に由来する。一層好適な具体例において、すべてのＣＤＲは、ヒトの抗ＥｐｈＢ４抗体に由来する。他の好適具体例において、２以上のヒトの抗ＥｐｈＢ４抗体に由来するＣＤＲを、キメラ抗体において混合し、マッチさせる。例えば、キメラ抗体は、第一のヒトの抗ＥｐｈＢ４抗体の軽鎖からのＣＤＲ１を含むことができ、それは、第二のヒトの抗ＥｐｈＢ４抗体の軽鎖からのＣＤＲ２及びＣＤＲ３と合せることができ、そして重鎖からのＣＤＲは、第三の抗ＥｐｈＢ４抗体に由来してよい。更に、フレームワーク領域は、同じ抗ＥｐｈＢ４抗体の一つに由来してよく、一以上の異なる抗体に由来してよく、又はヒト化抗体に由来してよい。
【０１１７】
「中和抗体」は、抗ＥｐｈＢ４抗体の発現がＥｐｈｒｉｎＢ２に結合したＥｐｈＢ４の量を少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも４０％、一層好ましくは６０％、尚一層好ましくは８０％、尚一層好ましくは８５％減じる場合に、ＥｐｈＢ４のＥｐｈｒｉｎＢ２への結合を阻止する抗体である。この結合の減少は、当業者に公知の任意の手段によって測定することができ、例えば、イン・ビトロの競争結合アッセイにおいて測定される。
【０１１８】
「ＥｐｈＢ４キナーゼ活性化抗体」は、ＥｐｈＢ４を発現している細胞、組織又は器官に加えた場合に、ＥｐｈＢ４キナーゼ活性を少なくとも約２０％活性化する抗体である。好適具体例において、この抗体は、ＥｐｈＢ４キナーゼ活性を、少なくとも４０％、一層好ましくは６０％、尚一層好ましくは８０％、尚一層好ましくは８５％活性化する。典型的には、キナーゼ活性は、ＥｐｈＢ４自体のリン酸化状態(チロシン自己リン酸化)として測定される。
【０１１９】
ここで用いる場合、用語「標識」又は「標識された」は、抗体における他の分子の組込みを指す。一具体例において、この標識は、検出マーカー例えば放射性標識されたアミノ酸の組込み又は、標識を付けたアビジンにより検出することのできるビオチン部分のポリペプチドへの結合である(例えば、光学的方法又は比色法によって検出することのできる蛍光マーカー又は酵素活性を含むストレプトアビジン)。他の具体例において、この標識又はマーカーは、治療用のもの例えば薬物結合体又は毒素であってよい。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が、当分野で公知であって、利用することができる。ポリペプチドのための標識の例には、次のものが含まれるが、これらに限られない：放射性同位体又は放射性核種(例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ)、蛍光標識(例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体)、酵素標識(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光マーカー、ビオチン基、二次レポーターにより認識される予め決められたポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)、磁気薬剤、例えば、ガドリニウムキレート化合物、毒素例えば、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、ロドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにこれらの類似体又は同族体。幾つかの具体例において、標識は、様々な長さのスペーサーアームによって、潜在的な立体障害を減じるように結合される。
【０１２０】
出願人は、ＥｐｈＢ４に対する幾つかの抗体並びにＥｐｈＢ４モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系統を生成してきた。これらの抗体は、更に、多くの点で、例えば、それらの、ＥｐｈＢ４の二量体形成又は多量体形成を阻止する能力、それらの、他のＥｐｈファミリーのメンバーとの交差反応性、それらの、血管形成を阻止する能力、及びそれらの、腫瘍成長を阻止する能力で特性決定された。更に、エピトープマッピングの研究は、これらのＥｐｈＢ４抗体がＥｐｈＢ４の少なくとも一つの領域(例えば、球状ドメイン、システインリッチドメイン、又はＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン)に特異的に結合しうることを示す。例えば、ＥｐｈＢ４抗体は、両方の３型フィブロネクチンドメインに結合することができる。
【０１２１】
ある面において、この発明の抗体は、ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)(ここでは、可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドとも呼ばれる；図９〜１１も参照されたい)に特異的に結合する。可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、球状(Ｇ)ドメイン(SEQ ID NO:７のアミノ酸２９〜１９７)、及び適宜更なるドメイン例えばシステインリッチドメイン(SEQ ID NO:７のアミノ酸２３９〜３２１)、第一の３型フィブロネクチンドメイン(SEQ ID NO:７のアミノ酸３２４〜４２９)及び第二の３型フィブロネクチンドメイン(SEQ ID NO:７のアミノ酸４３４〜５２６)を含む配列を含むことができる。典型的なＥｐｈＢ４可溶性ポリペプチドは、図９〜１１に与えてある。ここで用いる場合、ＥｐｈＢ４可溶性ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４可溶性ポリペプチドの断片、機能性変異体、及び改変型を包含する。
【０１２２】
ある面において、本発明は、ＥｐｈＢ４又はその一部分に対する結合特異性を有する抗体(抗ＥｐｈＢ４)を提供する。これらの抗体の例には、図８に示したように、ＥｐｈＢ４Ｍａｂ１、２３、３５、４７、５７、７９、８５Ｌ、８５Ｈ、９１、９８、１２１、１３１、及び１３８が含まれるが、これらに限られない。Ｍａｂ２６５も又、包含される(図示してない)。適宜、これらの免疫グロブリンは、ＥｐｈＢ４に、少なくとも約１×１０−６、１×１０−７、１×１０−８、１×１０−９Ｍ以下の親和性で、結合することができる。適宜、抗体及びその部分は、ＥｐｈｒｉｎＢ２に、球状リガンド結合ドメインを構成する可溶性細胞外ＥｐｈＢ４ポリペプチドとほぼ同等の親和性で結合する。ここに開示した抗体は、好ましくは、ＥｐｈＢ４に特異的であって、Ｅｐｈ又はＥｐｈｒｉｎファミリーの他のメンバーへの結合は最少となろう。
【０１２３】
この発明の他の面において、抗ＥｐｈＢ４抗体は、種選択性と分子選択性の両方を示す。一具体例において、この抗ＥｐｈＢ４抗体は、ヒト、カニクイザル又はアカゲザルのＥｐｈＢ４に結合する。好適具体例において、この抗ＥｐｈＢ４抗体は、マウス、ラット、モルモット、ブタ、イヌ又はウサギのＥｐｈＢ４には結合しない。適宜、この抗体は、異なる種例えばヒト及びマウスからの多数の異なるＥｐｈＢ４に結合する。この明細書の教示後には、当分野で周知の方法を利用して、抗ＥｐｈＢ４抗体に対する種選択性を決定することができる。例えば、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡを利用して種選択性を決定することができる。好適具体例においては、ウエスタンブロットを利用して、種選択性を決定することができる。他の具体例においては、この抗ＥｐｈＢ４抗体は、ＥｐｈＢ４に結合する傾向があり、それは、同じ種のＥｐｈＢファミリーの他のメンバーに結合する傾向の少なくとも５０倍を超えており、好ましくは、１００又は２００倍大きい。この明細書の教示後には、当分野で周知の方法を利用して、選択性を決定することができる。例えば、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡを利用して、選択性を決定することができる。好適具体例においては、ウエスタンブロットを利用して、分子選択性を決定することができる。
【０１２４】
ある具体例において、本発明の抗体は、ＥｐｈＢ４の一以上の特異的ドメインに結合する。例えば、抗体は、ＥｐｈＢ４の一以上の細胞外ドメイン(例えば、球状ドメイン、システインリッチドメイン、及び第一の３型フィブロネクチンドメイン、及び第二の３型フィブロネクチンドメイン)に結合する。例えば、ＥｐｈＢ４抗体(Ｍａｂ)Ｎｏ．１、２３、３５、及び７９は、SEQ ID NO:７中の球状ドメインにわたる配列のアミノ酸１６〜１９８に及ぶ領域内の一つのエピトープに結合する。ＥｐｈＢ４抗体Ｎｏ．８５Ｌ、８５Ｈ、９１、及び１３１は、第一の３型フィブロネクチンドメインを含むアミノ酸３２４〜４２９に及ぶ領域内の一つのエピトープに結合する。ＥｐｈＢ４抗体Ｎｏ．４７、５７、８５Ｈ、９８、１２１、及び１３８は、第二の３型フィブロネクチンドメインを含むアミノ酸４３０〜５３７に及ぶ領域内の一つのエピトープに結合する。適宜、主題の抗体(例えば、ＥｐｈＢ４抗体Ｎｏ．８５Ｈ)は、ＥｐｈＢ４の少なくとも２つのドメインに結合することができる(図８)。
【０１２５】
抗ＥｐｈＢ４抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤサブタイプであってよい。一層好適な具体例において、抗ＥｐｈＢ４抗体は、サブクラスＩｇＧ２である。ＥｐｈＢ４抗体のクラス及びサブクラスは、当分野で公知の任意の方法によって決定することができる。一般に、抗体のクラス及びサブクラスは、抗体の特定のクラス及びサブクラスに特異的な抗体を利用して決定することができる。かかる抗体は、市販されている。このクラス及びサブクラスは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット並びに他の技術によって決定することができる。或は、このクラス及びサブクラスは、抗体の重鎖及び／又は軽鎖の定常領域の全部又は一部を配列決定し、それらのアミノ酸配列を免疫グロブリンの様々なクラス及びサブクラスの公知のアミノ酸配列と比較し、そしてこれらの抗体のクラス及びサブクラスを決定することによって決定することができる。説明のために、これらの典型的なＥｐｈＢ４抗体のクラス及びサブクラスは、下記の表３に示してある。
【０１２６】
ある種の具体例においては、一本鎖抗体、及びキメラ、ヒト化又は霊長類化(primatized)(ＣＤＲグラフトした)抗体、並びに、キメラ又はＣＤＲグラフトした一本鎖抗体(異なる種に由来する部分を含む)も又、抗体の抗原結合部分として本発明に含まれる。これらの抗体の様々な部分を、慣用の技術によって化学的に一緒に結合することができ、又は遺伝子工学技術を用いて隣接するタンパク質として調製することができる。例えば、キメラの又はヒト化された鎖をコードする核酸を発現させて、隣接したタンパク質を製造することができる。例えば、Cabilly等、米国特許第４，８１６，５６７号；Cabilly等、欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号；Boss等、米国特許第４，８１６，３９７号；Boss等、欧州特許第０，１２０，６９４Ｂ１号；Neuberger, M.S.等、ＷＯ８６／０１５３３；Neuberger, M.S.等、欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号；Winter, 米国特許第５，２２５，５３９号；及びWinter, 欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号を参照されたい。霊長類化抗体に関しては、Newman, R.等、BioTechnology, 10:1455-1460 (1992)も又、参照されたい。一本鎖抗体に関しては、例えば、Ladner等、米国特許第４，９４６，７７８号；及びBird, R.E.等、Science, 242:423-426 (1988)を参照されたい。
【０１２７】
加えて、キメラ、ヒト化、霊長類化又は一本鎖抗体の断片を含む、抗体の機能的断片も又、製造することができる。主題の抗体の機能的断片は、それらが由来した完全長抗体の少なくとも一の結合機能及び／又は変調機能を維持している。好適な機能的断片は、対応する完全長抗体の抗原結合機能(例えば、ＥｐｈＢ４に対する特異性)を維持している。ある好適な機能的断片は、ＥｐｈＢ４に特徴的な少なくとも一つの機能、例えば、結合活性、シグナリング活性、及び／又は細胞応答の刺激を阻止する能力を維持している。例えば、一具体例において、ＥｐｈＢ４抗体の機能性断片は、ＥｐｈＢ４の少なくとも一つのそのリガンド(例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２)との相互作用を阻止することができ及び／又は少なくとも一つのレセプターに媒介される機能例えば細胞移動、細胞増殖、血管形成及び／若しくは腫瘍成長を阻止することができる。
【０１２８】
例えば、ＥｐｈＢ４レセプターに結合することのできる抗体断片又は、Ｆｖ、Ｆab、Ｆab'及びＦ(ab')２断片を含む(但し、これらに限られない)その部分は、この発明に含まれる。かかる断片は、酵素的開裂により又は組換え技術によって製造することができる。例えば、パパイン又はペプシン開裂は、それぞれ、Ｆab又はＦ(ab')２断片を生成することができる。抗体は又、少なくとも一つの終止コドンを天然の終止部位の上流に導入した抗体遺伝子を利用して、様々な切り詰められた形態で生成することもできる。例えば、Ｆ(ab')２の重鎖部分をコードするキメラ遺伝子を、その重鎖のＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むようにデザインすることができる。
【０１２９】
用語「ヒト化免疫グロブリン」は、ここで用いる場合、異なる起源の免疫グロブリンの部分を含む免疫グロブリンであって、少なくとも一部分はヒト起源のものである当該免疫グロブリンを指す。従って、本発明は、ＥｐｈＢ４(例えば、ヒトのＥｐｈＢ４)に対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンであって、非ヒト起源(例えば、ゲッ歯類)の抗原結合領域と少なくとも一部分のヒト起源の免疫グロブリン(例えば、ヒトのフレームワーク領域、ヒトの定常領域又はその部分)を含む当該ヒト化免疫グロブリンに言及する。例えば、ヒト化抗体は、必要な特異性を有するマウスなどの非ヒト起源の免疫グロブリンに由来する部分、及びヒト起源の免疫グロブリン配列に由来する部分を含むことができ(例えば、キメラ免疫グロブリン)、これらは、慣用の技術(例えば、合成)により化学的に一緒に繋がれ又は遺伝子工学技術(例えば、キメラ抗体のタンパク質部分をコードするＤＮＡを発現させて、隣接ポリペプチド鎖を生成することができる)を利用して隣接ポリペプチドとして製造することができる。
【０１３０】
本発明のヒト化免疫グロブリンの他の例は、非ヒト起源のＣＤＲ(例えば、非ヒト起源の抗体に由来する少なくとも一つのＣＤＲ)及びヒト起源の軽鎖及び／又は重鎖に由来するフレームワーク領域を含む少なくとも一つの免疫グロブリン鎖を含む免疫グロブリンである(例えば、フレームワーク変化を伴うか又は伴わない、ＣＤＲグラフトされた抗体)。一具体例において、ヒト化免疫グロブリンは、ＥｐｈＢ４ポリペプチドへの結合に関して、マウスのモノクローナル抗体と競争しうる。キメラの又はＣＤＲグラフトされた一本鎖抗体も又、用語ヒト化免疫グロブリンに含まれる。
【０１３１】
ある具体例においては、本発明は、ＥｐｈＢ４アンタゴニスト抗体を提供する。ここで用いる場合、用語「アンタゴニスト抗体」は、ＥｐｈＢ４の一つ以上の機能例えば結合活性(例えば、リガンド結合)及びシグナリング活性(例えば、ＥｐｈＢ４のクラスター化又はリン酸化、細胞応答の刺激、例えば、細胞の移動又は細胞増殖の刺激)を阻止することのできる抗体を指す。例えば、アンタゴニスト抗体は、ＥｐｈＢ４レセプターの天然リガンド(例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はその断片)との相互作用を阻止する(減じ又は防止する)ことができる。好ましくは、ＥｐｈＢ４に向けられたアンタゴニスト抗体は、内皮細胞の移動、細胞増殖、血管形成、及び／又は腫瘍成長を含む、ＥｐｈＢ４により媒介される機能を阻止することができる。適宜、このアンタゴニスト抗体は、ＥｐｈＢ４の細胞外ドメインに結合する。
【０１３２】
他の具体例において、本発明は、ＥｐｈＢ４キナーゼ活性化抗体を提供する。かかる抗体は、ＥｐｈＢ４キナーゼ活性を、ＥｐｈｒｉｎＢ２に無関係にさえ増進させる。幾つかの例においては、かかる抗体を利用して、ＥｐｈＢ４を刺激することができる。しかしながら、出願人は、殆どの細胞ベースのアッセイ及びイン・ビボアッセイにおいて、かかる抗体は、驚くべきことには、アンタゴニスト抗体のように振る舞ったことに注意する。かかる抗体は、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメインに、特にＥｐｈＢ４のアミノ酸３２７〜４２７の領域結合するようである。
【０１３３】
ある具体例においては、抗イディオタイプ抗体も又、提供される。抗イディオタイプ抗体は、他の抗体の抗原結合部位と会合する抗原決定基を認識する。抗イディオタイプ抗体は、二次抗体を製造するために用いられる動物として、同種の、好ましくは同系統の動物を免疫化することによる二次抗体に対して製造することができる。例えば、米国特許第４，６９９，８８０号を参照されたい。一具体例において、抗体は、レセプター又はその一部分に対して産生され、これらの抗体は、更に、抗イディオタイプ抗体を製造するために利用される。製造された抗イディオタイプ抗体は、それにより、レセプターに結合する化合物例えばレセプター機能のリガンドに結合することができ、かかる化合物を検出若しくは同定又は定量するための免疫アッセイにおいて利用することができる。かかる抗イディオタイプ抗体は又、たとえＥｐｈＢ４レセプター自体に結合しなくても、該レセプター機能のインヒビターであってもよい。かかる抗イディオタイプ抗体は又、アンタゴニスト抗体とも呼ばれる。
【０１３４】
ある面において、本発明は、ハイブリドーマ細胞系統並びにこれらのハイブリドーマ細胞系統により産生されるモノクローナル抗体を提供する。本発明の細胞系統は、モノクローナル抗体の産生以外の用途を有している。例えば、本発明のこれらの細胞系統は、他の細胞(例えば、適切に薬物で標識されたヒトミエローマ、マウスミエローマ、ヒト−マウスヘテロミエローマ又はヒトのリンパ芽球状細胞)と融合して更なるハイブリドーマを生成し、そうして、それらのモノクローナル抗体をコードする遺伝子のトランスファーを与える。加えて、これらの細胞系統は、抗ＥｐｈＢ４免疫グロブリン鎖をコードする核酸の起源として利用することができ、それらを単離して発現させることができる(例えば、他の細胞へのトランスファーに際しては、任意の適切な技術を利用する(例えば、Cabilly等、米国特許第４，８１６，５６７号；Winter, 米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい))。例えば、再配置された抗ＥｐｈＢ４の軽鎖又は重鎖を含むクローンを、単離することができ(例えば、ＰＣＲによって)、又はｃＤＮＡライブラリーをこれらの細胞系統から単離したｍＲＮＡから製造することができ、そして抗ＥｐｈＢ４免疫グロブリン鎖をコードするｃＤＮＡクローンを単離することができる。そうして、これらの抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードしている核酸又はその部分は、特異的免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその変異体(例えば、ヒト化免疫グロブリン)の製造のための組換えＤＮＡ技術に従って、様々な宿主細胞又はイン・ビトロ翻訳系で得て、利用することができる。例えば、変異体例えばヒト化免疫グロブリン又は免疫グロブリン鎖をコードするｃＤＮＡ又はそれらの誘導体を含む核酸を、適切な原核又は親核ベクター(例えば、発現ベクター)中に位置させて、適切な宿主細胞中に適切な方法(例えば、トランスフォーメーション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染)により導入し、それで、その核酸は、少なくとも一つの発現制御用エレメントに操作可能に結合される(例えば、ベクター中で、又は宿主細胞ゲノムに組み込まれる)。製造のためには、宿主細胞を、発現に適した条件下(例えば、インデューサー、適切な塩類、成長因子、抗生物質、栄養補給剤などを補われた適切な培地の存在下)に維持することができ、それにより、コードされたポリペプチドが生成される。所望であれば、コードされたタンパク質を、回収しそして／又は単離することができる(例えば、宿主細胞又は培地から)。この製造方法は、トランスジェニック動物の宿主細胞における発現を包含するということは認められよう(例えば、１９９２年３月１９日に公開されたGenPharm International, ＷＯ９２／０３９１８を参照されたい)。
【０１３５】
免疫用抗原の調製、及びポリクローナル及びモノクローナル抗体の製造は、ここに記載のように、又は他の適切な技術を利用して行なうことができる。様々な方法が記載されてきた。例えば、Kohler等、Nature, 256: 495-497 (1975)及びEur. J. Immunol. 6:511-519 (1976); Milstein等、Nature 266: 550-552 (1977); Koprowski等、米国特許第４，１７２，１２４号；Harlow, E. 及びD. Lane, 1988, 抗生物質：A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y.); Current Protocols In Molecular Biology, 第二巻(補遺27,'94年夏期), Ausubel, F.M.等編、(John Wiley & Sons: New York, N.Y.), 第11章(1991)を参照されたい。一般に、ハイブリドーマは、適当な不滅化細胞系統(例えば、ＳＰ２／０などのミエローマ細胞系統)を抗体産生細胞と融合させることにより製造することができる。抗体産生細胞(好ましくは、脾臓又はリンパ節のもの)は、関心ある抗原で免疫化した動物から得られる。融合細胞(ハイブリドーマ)は、選択培養条件を利用して単離することができ、限界希釈法によりクローン化することができる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞を、適切なアッセイ(例えば、ＥＬＩＳＡ)によって選択することができる。
【０１３６】
例えば、組換え抗体をライブラリーから選択し、又はヒト抗体の完全なレパートリーを生成することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)の免疫化に依存する方法を含む、必要な特異性の抗体を産生し又は単離する他の適切な方法を利用することができる。例えば、Jakobovits等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551-2555 (1993)；Jakobovits等、Nature, 362: 255-258 (1993); Lonberg等、米国特許第５，５４５，８０６号；Surani等、米国特許第５，５４５，８０７号を参照されたい。
【０１３７】
説明のために、ＥｐｈＢ４ポリペプチドに由来する免疫原(例えば、抗体応答を誘出することのできるＥｐｈＢ４ポリペプチド又はその抗原性断片、又はＥｐｈＢ４融合タンパク質)は、哺乳動物例えばマウス、ハムスター又はウサギを免疫化するために利用することができる。例えば、Antibodies: A Laboratory Manual Harlow及びLane編(Cold Spring Harbor Press: 1988)を参照されたい。タンパク質又はペプチドに免疫原性を与えるための技術は、キャリアーへの結合体化又は当分野で周知の他の技術を包含する。ＥｐｈＢ４ポリペプチドの免疫原性部分を、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、血漿又は血清中の抗体力価の検出によってモニターすることができる。標準的なＥＬＩＳＡ又は他の免疫アッセイを、この免疫原を抗原として用いて、抗体のレベルを評価することができる。一具体例において、この発明の抗体は、ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外部分又はその断片に特異的である。他の具体例において、この発明の抗体は、ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞内部分又は膜貫通部分に特異的である。
【０１３８】
ＥｐｈＢ4ポリペプチドの抗原性調製物による動物の免疫後、血清を得ることができ、所望であれば、ポリクローナル抗体をその血清から単離することができる。モノクローナル抗体を製造するために、抗体産生細胞(リンパ球)を免疫化動物から収穫して、標準的な体細胞融合手順によって、ミエローマ細胞などの不滅化細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を生成することができる。かかる技術は、当分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術(最初に、Kohler及びMilstein,(1975)Nature, 256:495-497により開発された)、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbar等、(1983)Immunology Today, 4:72)、及びヒトのモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術(Cole等、(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. p77-96)を含む。ハイブリドーマ細胞をＥｐｈＢ４ポリペプチドと特異的に反応性の抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体をかかるハイブリドーマ細胞を含む培地から単離することができる。
【０１３９】
ある具体例においては、本発明の抗体は、慣用の技術を利用して断片化することができ、それらの断片は、全抗体について上記したのと同じ仕方で有用性につきスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ(ab)２断片を、抗体をペプシンで処理することによって生成することができる。生成したＦ(ab)２断片を処理して、ジスルフィド橋を還元して、Ｆab断片を製造することができる。
【０１４０】
ある具体例においては、本発明の抗体は、更に、抗体の少なくとも一つのＣＤＲ領域により与えられるＥｐｈＢ４ポリペプチドに対する親和性を有する二重官能性の、一本鎖の、及びキメラ及びヒト化分子を包含することが意図される。一本鎖抗体の製造のための技術(米国特許第４，９４６，７７８号)は又、一本鎖抗体の製造に適合させることができる。やはり、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物を包含する他の生物体を利用して、ヒト化抗体を発現することもできる。これらの抗体を生成する方法は、当分野で公知である。これらの抗体を生成する方法は、当分野で公知である。例えば、Cabilly等、米国特許第４，８１６，５６７号；Cabilly等、欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号；Queen等、欧州特許第０，４５１，２１６Ｂ１号；Boss等、米国特許第４，８１６，３９７号；Boss等、欧州特許第０，１２０，６９４Ｅ１号；Neuberger, M.S.等、ＷＯ８６／０１５３３；Neuberger, M.S.等、欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号；Winter, 米国特許第５，２２５，５３９号；Winter, 欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号；Padlan, E.A.等、欧州特許出願第０，５１９，５９６Ａ１号を参照されたい。Ladner等、米国特許第４，９４６，７７８号；Huston, 米国特許第５，４７６，７８６号；及びBird, R.E.等、Science, 242: 423-426 (1988)も参照されたい。
【０１４１】
かかるヒト化免疫グロブリンは、所望のヒト化鎖をコードする遺伝子(例えば、ｃＤＮＡ)を調製するために、合成及び／又は組換え核酸を利用して製造することができる。例えば、ヒト化可変領域をコードする核酸(例えば、ＤＮＡ)配列を、ＰＣＲ突然変異誘発法を利用して構築して、ヒトの又はヒト化した鎖、例えば以前にヒト化した可変領域からのＤＮＡテンプレートをコードするＤＮＡ配列を変えることができる(例えば、Kamman, M.等、Nucleic Acids Res., 17:5404 (1989); Sato, K.等、Cancer Research, 53:851-856 (1993); Daugherty, B.L.等、Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); 及びLewis, A.P.及びJ.S. Crowe, Gene, 101:297-302 (1991)を参照されたい)。これらの又は他の適切な方法を利用して、変異体も又、容易に製造することができる。一具体例において、クローン化した可変領域は、突然変異誘発することができ、所望の特異性を有する変異体をコードする配列を選択することができる(例えば、ファージライブラリーから；例えば、Krebber等、米国特許第５，５１４，５４８号；１９９３年４月１日公開のHoogenboom等、ＷＯ９３／０６２１３)。
【０１４２】
ある具体例においては、これらの抗体は、更に、検出されうる標識(例えば、この標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素又は酵素補助因子)に結合される。この活性部分は、放射性薬剤例えば放射性重金属例えば鉄キレート化合物、ガドリニウム又はマンガンの放射性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素又はガリウムの陽電子エミッター、43Ｋ、52Ｆｅ、57Ｃｏ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、132Ｉ、又は99Ｔｃ。かかる部位に付加された結合剤は、イメージング剤として利用することができ、診断用途に有効な量で、哺乳動物例えばヒトに投与され、次いで、このイメージング剤の局在性及び蓄積を検出する。このイメージング剤の局在性及び蓄積は、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴イメージング、コンピューター化断層撮影又は陽電子放出断層撮影によって検出することができる。ＥｐｈＢ４に向けられた抗体又は他の結合性ポリペプチドを利用するイムノシンチグラフィーを利用して、癌及び脈管構造を検出し及び／又は診断することができる。例えば、99テクネチウム、111インジウム、125ヨウ素で標識されたＥｐｈＢ４マーカーに対するモノクローナル抗体を、かかるイメージングのために効果的に利用することができる。当業者には、明らかとなろうが、投与すべき放射性同位体の量は、放射性同位体に依存している。当業者は、投与すべき量のイメージング剤を、活性部分として用いられる所定の放射性核種の比放射能及びエネルギーに基いて容易に配合することができる。典型的には、イメージング剤の投与量当たり０．１〜１００ミリキュリー、好ましくは、１〜１０ミリキュリー、最も頻繁には、２〜５ミリキュリーを投与する。従って、イメージング剤として有用な、放射性部分と結合されたターゲティング部分を含んでいる本発明に従う組成物は、０．１〜１００ミリキュリー、幾つかの具体例では、好ましくは、１〜１０ミリキュリー、幾つかの具体例においては、好ましくは、２〜５ミリキュリー、幾つかの具体例においては、一層好ましくは、１〜５ミリキュリーを含む。
【０１４３】
ある好適具体例において、この発明の抗体は、モノクローナル抗体であり、ある具体例においては、この発明は、新規な抗体を生成するための方法を利用可能にする。例えば、ＥｐｈＢ４ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するための方法は、マウスに、検出可能な免疫応答を刺激するのに有効なＥｐｈＢ４を含む量の免疫原組成物を投与すること、抗体産生細胞(例えば、脾臓由来の細胞)をそのマウスから得ること、及びそれらの抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを得ること、そしてそれらの抗体産生ハイブリドーマを試験して、ＥｐｈＢ４ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定することを含みうる。一度得られたならば、ハイブリドーマを、細胞培養において、適宜、ハイブリドーマ由来の細胞が、ＥｐｈＢ４ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する培養条件にて増殖させることができる。このモノクローナル抗体を細胞培養物から精製することができる。
【０１４４】
加えて、望ましい抗体を同定するために抗体をスクリーニングするために用いられる技術は、得られる抗体の特性に影響しうる。例えば、ある治療目的のために用いられるべき抗体は、好ましくは、特定の細胞型を標的とすることができる。従って、この型の抗体を得るためには、関心ある抗原を発現する細胞に結合する抗体についてスクリーニングすること(例えば、蛍光活性化細胞ソーティングによって)は望ましいことでありうる。同様に、抗体が溶液中の抗原への結合のために用いられるものであるならば、溶液結合を試験することは望ましいことでありうる。特に望ましい抗体を同定するために、抗体：抗原相互作用を試験するために様々な異なる技術を利用することができる。かかる技術は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ(例えば、Biacore結合アッセイ、Bia-core AB, Uppsala, スウェーデン)、サンドイッチアッセイ(例えば、IGEN International, Inc., Gaithersburg, メリーランドの常磁性ビーズシステム)、ウエスタンブロット、免疫沈降アッセイ及び免疫組織化学を包含する。
【０１４５】
本発明の抗体は、研究、診断及び治療応用を含む、様々な応用において有用である。例えば、それらを用いて、レセプター又はその部分を単離及び／又は精製することができ、レセプターの構造(例えば、コンホメーション)及び機能を研究することができる。
【０１４６】
ある面において、本発明の様々な抗体を用いて、ＥｐｈＢ４レセプターの発現を、例えば内皮細胞(例えば、血管内皮細胞)において、又はＥｐｈＢ４レセプター遺伝子でトランスフェクトされた細胞において検出又は測定することができる。従って、それらは又、診断又は研究目的のための細胞のソーティング及びイメージング(例えば、フローサイトメトリー、及び蛍光活性化細胞ソーティング)などの応用においても有用性を有する。
【０１４７】
ある具体例においては、抗体又はそれらの抗体の抗原結合性断片を、診断目的のために標識することができ又は標識しないでもよい。典型的には、ＥｐｈＢ４に対する抗体の結合から生じる複合体の形成を検出することをを要する。これらの抗体は、直接、標識することができる。放射性核種、蛍光物質、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター及びリガンド(例えば、ビオチン、ハプテン)を含む様々な標識を採用することができるが、これらに限られない。多くの適切な免疫アッセイが、当業者には知られている(例えば、米国特許第３，８１７，８２７号；３，８５０，７５２号；３，９０１，６５４号；及び４，０９８，８７６号参照)。未標識の場合には、アッセイ例えば凝集アッセイにおいて、これらの抗体を利用することができる。未標識抗体は又、他の、抗体を検出するのに用いることのできる(一種以上の)安定な試薬、例えば第一の抗体(例えば、未標識免疫グロブリンに特異的な抗イディオタイプ抗体又は他の抗体)と反応性の標識した抗体(例えば、二次抗体)又は他の適切な試薬(例えば、標識したプロテインＡ)と一緒に用いることもできる。
【０１４８】
一具体例において、本発明の抗体は、主題の抗体又は二次抗体を酵素に結合させた酵素免疫アッセイにおいて利用することができる。ＥｐｈＢ４タンパク質を含む生物学的試料を主題の抗体と合わせれば、それらの抗体とＥｐｈＢ４タンパク質との間で結合が生じる。一具体例においては、ＥｐｈＢ４タンパク質を発現する細胞(例えば、内皮細胞)を含む試料を主題の抗体と合わせて、それらの抗体とその抗体により認識されるエピトープを含むＥｐｈＢ４タンパク質を有する細胞との間で結合が生じる。これらの結合した細胞を、未結合の試薬から分離することができ、それらの細胞に特異的に結合された抗体−酵素結合体の存在を、例えば、試料を、酵素の作用を受けた場合に色又は他の検出可能な変化を生じる酵素の基質と接触させることにより測定することができる。他の具体例においては、主題の抗体は、未標識でよく、主題の抗体を認識する第二の標識した抗体を加えることができる。
【０１４９】
ある面において、生物学的試料中のＥｐｈＢ４タンパク質の存在の検出における使用のためのキットも又、製造される。かかるキットは、ＥｐｈＢ４タンパク質又は該レセプターの部分に結合する抗体、並びに抗体とＥｐｈＢ４又はその部分との複合体の存在の検出に適した少なくとも一種の補助的試薬を含むであろう。これらの抗体の例は、ＥｐｈＢ４ Ｍａｂ １、２３、３５、４７、５７、７９、８５Ｌ、８５Ｈ、９１、９８、１２１、１３１、１３８、及び２６５(公開された米国特許出願第２００５０２４９７３６号参照)を包含するが、これらに限られない。本発明の抗体組成物は、単独で又は他のエピトープに特異的な更なる抗体と一緒に、凍結乾燥形態で提供することができる。これらの標識することができ又は未標識でもよい抗体は、付属成分(例えば、緩衝剤例えばＴｒｉｓホスフェート及びカーボネート、安定剤、賦形剤、殺生物剤及び／又は不活性タンパク質例えばウシ血清アルブミン)と共に、キットに包含されうる。例えば、これらの抗体は、付属成分との凍結乾燥混合物として与えることができ、又は付属成分は、ユーザーによって、合わせるために別々に供給することもできる。一般に、これらの付属的材料は、活性な抗体の量に対して約５重量％未満で存在し、通常、抗体濃度に対して少なくとも約０．００１重量％の全量で存在する。モノクローナル抗体に結合することのできる二次抗体を採用する場合、かかる抗体を、キット内に例えば別々のバイアル又は容器内に与えることができる。この二次抗体は、存在する場合、典型的には標識され、上記の抗体配合物と同様の仕方で配合することができる。
【０１５０】
同様に、本発明は又、ＥｐｈＢ４又は該レセプターの部分の発現を検出及び／又は定量する方法にも関係し、そこでは、細胞又はその画分(例えば、膜画分)を含む組成物を、ＥｐｈＢ４又は該レセプターの部分に結合する抗体と、抗体のそれへの結合に適した条件下で接触させて、抗体の結合をモニターする。抗体の検出は、抗体とＥｐｈＢ４又はその部分との間での複合体の形成を指示しており、このレセプターの存在を示している。抗体のこの細胞への結合は、標準的な方法例えば実施例に記載したものによって測定することができる。この方法を利用して、個体からの細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を検出することができる。適宜、内皮細胞の表面上でのＥｐｈＢ４の定量的発現を、例えば、フローサイトメトリーによって評価することができ、染色強度は、病気の罹患率、進行度又は危険度と相関しうる。
【０１５１】
本発明は又、哺乳動物の特定の病気に対する罹病性を検出する方法にも関係する。説明のために、この方法を利用して、哺乳動物の、細胞に存在するＥｐｈＢ４の量及び／又は哺乳動物内のＥｐｈＢ４陽性細胞の数に基いて進行する病気に対する罹病性を検出することができる。一具体例において、この発明は、哺乳動物の腫瘍に対する罹病性を検出する方法に関係する。この具体例において、試験すべき試料を、ＥｐｈＢ４又はその部分に、該抗体のそれへの結合に適した条件下で結合する抗体と接触させ、この試料は、正常個体でＥｐｈＢ４を発現する細胞を含む。抗体の結合及び／又は結合の量が検出され、それは、その個体の腫瘍に対する罹病性を示し、一層高いレセプターのレベルは、その個体の腫瘍に対する増大した罹病性と相関する。出願人及び他のグループは、ＥｐｈＢ４の発現が、腫瘍の成長及び進行と相関を有することを見出した。本発明の抗体は又、個体におけるＥｐｈＢ４発現と血管形成と関連する病気の進行との相関を解明するためにも利用することができる。
【０１５２】
この開示の方法で用いることのできるＥｐｈＢ４抗体の例は、マウスモノクローナル抗体４７及び１３１を含み、これらは、ＵＳ２００５／０２４９７３６中に記載されて特性表示されており、それを、そっくりそのまま資料として本明細書中に援用する。
【０１５３】
マウスモノクローナル抗体(Ｍａｂ)４７の重鎖のＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:８(ＣＤＲ１)、SEQ ID NO:９(ＣＤＲ２)、及びSEQ ID NO:１０(ＣＤＲ３)として規定される。マウスモノクローナル抗体４７の軽鎖のＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:１１(ＣＤＲ１)、SEQ ID NO:１２(ＣＤＲ２)、及びSEQ ID NO:１３(ＣＤＲ３)として規定される。
【０１５４】
マウスモノクローナル抗体１３１の重鎖のＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:１４(ＣＤＲ１)、SEQ ID NO:１５(ＣＤＲ２)、及びSEQ ID NO:１６(ＣＤＲ３)として規定される。マウスモノクローナル抗体１３１の軽鎖のＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:１７(ＣＤＲ１)、SEQ ID NO:１８(ＣＤＲ２)、及びSEQ ID NO:１９(ＣＤＲ３)として規定される。
【０１５５】
下記は、この抗体の可変ドメイン及びＣＤＲの配列である。マウスモノクローナル抗体４７の重鎖(４７ＶＨ)、４７Ｈ１(SEQ ID NO:２０)、４７Ｈ２(SEQ ID NO:２１)、４７Ｈ３(SEQ ID NO:２２)、４７Ｈ４(SEQ ID NO:２３)、及び４７Ｈ５(SEQ ID NO:２４)。＃４７の軽鎖(４７ＶＬ)、４７Ｋ１(SEQ ID NO:２５)、４７Ｋ２(SEQ ID NO:２６)、４７Ｋ３(SEQ ID NO:２７)、及び４７Ｋ４(SEQ ID NO:２８)。マウスモノクローナル抗体１３１の重鎖(１３１ＶＨ)、１３１ＨＶ１(SEQ ID NO:２９)、１３１ＨＶ２(SEQ ID NO:３０)、１３１ＨＶ３(SEQ ID NO:３１)、１３１ＨＶ４(SEQ ID NO:３２)、及び１３１ＨＶ５(SEQ ID NO:３３)。＃１３１の軽鎖(１３１ＶＬ)、１３１ＫＶ１(SEQ ID NO:３４)、１３１ＫＶ２(SEQ ID NO:３５)、１３１ＫＶ３(SEQ ID NO:３６)、及び１３１ＫＶ４(SEQ ID NO:３７)。
【０１５６】
ＩＸ．小型分子
本願の発明者は又、酵素機能を有するタンパク質の活性及び／又は該タンパク質の相互作用を阻止することのできる小型分子をも包含する。当分野で「小型分子」化合物と呼ばれる化学薬剤は、典型的には、有機の、非ペプチド分子であり、１０，０００ダルトン未満の、５，０００ダルトン未満の、１，０００又は５００ダルトン未満の分子量を有する。このクラスのインヒビターは、化学合成された分子例えば、コンビナトリアル化学ライブラリーからの化合物を含む。合成の化合物は、ＥｐｈＢ４タンパク質の公知の又は推論された特性に基いて合理的にデザインされ又は同定されえて、又は化合物ライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。或は、このクラスの適切なインヒビターは、天然物であり、特に、植物又は真菌類などの生物体からの二次代謝産物であり、これらは又、化合物ライブラリーをＥｐｈＢ４阻止活性についてスクリーニングすることによっても同定することができる。化合物を生成して入手するための方法は、当分野では周知である(Schreiber SL, Science 151:1964-1969(2000); Radmann J.及びGunther J., Science 151:1947-1948 (2000))。
【０１５７】
Ｘ．診断方法
ここに開示した抗体及び核酸組成物は、病気及び障害、特にＥｐｈＢ４発現と関連した癌の診断及び予後評価において有用である。病気の各ステージにおいて、組成物を利用して、診断精度を改善して治療決定を容易にすることができる。臓器又はリンパ節の大きさ又は構造の変化に基くコンピューター断層撮影(ＣＴ)スキャンなどの標準的な腫瘍及び癌の診断方法と異なり、標識した抗体は、異常な細胞を、ＥｐｈＢ４などの腫瘍抗原の発現の故に、初期ステージで検出することができる。一度癌が診断されたならば、正確なステージ決定が、最も適した治療法の決定において重要である。一層後では、外科手術後の追跡において、腫瘍抗原の血清レベルの上昇は、慣用の方法により検出される前に、再発を指示しうる。これらの方法は、ここに記載の任意の慣用の方法と共に利用することができる。
【０１５８】
診断方法は、患者からの細胞試料(例えば、血液試料、リンパ節生検又は組織)を用いてイン・ビトロで行なうこともできるし、又はイン・ビボイメージングにより行なうこともできる。
【０１５９】
特定の具体例において、本願は、抗体結合体を提供し、該結合体中では、本願の抗体は、診断用イメージング剤と結合されている。本願の抗体を含む組成物は、ＥｐｈＢ４を検出するために、例えば、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳなどにより利用することができる。一種以上の検出用標識をこれらの抗体に結合させることができる。典型的な標識部分は、放射線不透過性染料、放射線造影剤、蛍光性分子、スピン標識分子、酵素、又は他の診断価値のある標識部分(特に、放射線医学的又は磁気共鳴イメージング技術において)を包含する。
【０１６０】
この開示による放射標識された抗体は、イン・ビトロ診断試験に利用することができる。抗体の比活性、その結合部分、プローブ又はリガンドは、半減期に依存する。放射能標識のアイソトープとしての純度、及び如何に標識を生物学的薬剤に組み込むか。免疫アッセイ試験において、比放射能が一層高いほど、一般に、感度が、一層良好である。例えば診断における利用のための標識として有用な放射性同位体には、ヨウ素(131Ｉ又は125Ｉ)、インジウム(111Ｉｎ)、テクネチウム(99Ｔｃ)、リン(32Ｐ)、炭素(14Ｃ)、及びトリチウム(3Ｈ)、又は上記の治療用同位体の一つが含まれる。
【０１６１】
放射性標識された抗体を、患者に、投与することができ、そこで、それは、該抗体が反応する抗原を有する癌細胞に局在化され、そして、例えばガンマカメラ又は放射断層撮影を利用する放射性核種スキャニングなどの公知技術を利用してイン・ビボで検出され又は「イメージングされる」。例えば、Bradwell等、「Developments in Antibody Imaging」Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwin等、(編)、p.65-85(Academic Press 1985)参照(資料として、本明細書中に援用する)。或は、陽電子放射断層撮影スキャニング、例えば、Brookhaven National Laboratoryにある指定されたＰｅｔＶＩを、放射性標識が陽電子を放射する場合(例えば、11Ｃ、18Ｆ、15Ｏ、及び13Ｎ)に利用することができる。
【０１６２】
蛍光体及び発色団で標識した生物学的薬剤を、当分野で公知の標準的部分から調製することができる。抗体及び他のタンパク質は、約３１０ｎｍ以下の波長を有する光を吸収するので、蛍光部分は、３１０ｎｍより高い波長、例えば４００ｎｍより高い波長でかなりの吸収を有するように選択することができる。様々な適切な蛍光体及び発色団が、Stryer, Science, 162:526 (1968)及びBrand等、Annual Review of Biochemistry, 41:843-868 (1972)に記載されている(これらを、資料として、本明細書中に援用する)。これらの抗体は、蛍光発色団により、米国特許第３，９４０，４７５号、４，２８９，７４７号、及び４，３７６，１１０号(これらを、資料として、本明細書中に援用する)に開示されたような慣用の手順によって標識されうる。
【０１６３】
本願は、癌を検出する方法であって、ＥｐｈＢ４のｍＲＮＡ又はタンパク質の差次的発現を、かかる検出を必要とする患者内の該癌細胞において検出することを含む当該癌を検出する方法を提供する。一つの典型的具体例において、癌を検出する方法は、ａ）患者から試料を分離すること；ｂ）前記の試料の細胞を本願の抗体と接触させること；ｃ）該試料細胞の同じ型の非癌性細胞を本願の抗体と接触させ；そしてｄ）同じ試料の細胞におけるＥｐｈＢ４の発現の、非癌性細胞との差異を検出して比較することを含む。
【０１６４】
ある具体例においては、本願における診断的利用のための抗体結合体又は核酸組成物は、イン・ビトロでの使用を意図しており、そこでは、これらの組成物は、二次的結合リガンド又は酵素(酵素タグ)に結合され、これは、発色性基質との接触に際して着色された生成物を生成するであろう。適切な酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、(セイヨウワサビ)水素ペルオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼが含まれる。ある具体例において、二次的な結合性リガンドは、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジン化合物である。
【０１６５】
ある具体例においては、この出願の診断方法を、他の卵巣癌診断試験と組み合わせて用いることができる。
【０１６６】
本願は又、ＥｐｈＢ４に結合する抗ＥｐｈＢ４抗体又は核酸組成物を含む診断用キットをも提供する。かかる診断用キットは、更に、予め決めた量の試薬のパッケージ化された組合せを、診断アッセイを実施するための指示書と共に含むことができる。抗体が酵素で標識されている場合には、このキットは、該酵素により必要とされる基質及び補因子を含むであろう。加えて、他の添加物例えば安定剤、緩衝剤などを含むことができる。様々な試薬の相対量は、これらの試薬の、アッセイの感度を実質的に最適にする溶液中の濃度を与えるために大きく変化しうる。特に、これらの試薬は、通常、賦形剤を含み、再溶解時に適切な濃度の試薬溶液を与える、凍結乾燥された乾燥粉末として与えることができる。
【０１６７】
他の面において、本願は、ＥｐｈＢ４タンパク質成分に結合し、それを精製し、定量し、或は、一般に検出する免疫アッセイに関係する。以下に詳述するように、免疫アッセイは、それらの最も単純且つ直接的意味において、結合アッセイである。ある具体例において、免疫アッセイは、当分野で公知の、様々な種類の酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)及び放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)である。組織切片を利用する免疫組織化学的検出も又、特に有用である。しかしながら、検出が、かかる技術に限られないということは容易に認められよう。ウエスタンブロッティング、ドットアンドスロットブロッティング、ＦＡＣＳ分析なども又、用いることができる。
【０１６８】
様々な有用な免疫アッセイの工程は、科学文献例えばNakamura等 Enzyme Immunoassay：Heterogeneous and Homogeneous Systems, 第27章(1987)(資料として、本明細書中に援用する)。
【０１６９】
一般に、免疫結合法は、タンパク質又はペプチド(本件の場合、ＥｐｈＢ４)を含むと思われる試料を得ること、及びその試料をＥｐｈＢ４と免疫反応性の第一の抗体と免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で接触させることを含む。
【０１７０】
免疫結合法は、ＥｐｈＢ４タンパク質を精製するための方法を含んでいる(患者の試料からのタンパク質の精製において又は組換えにより発現されたタンパク質を精製するために採用することができる)。それらは又、組織試料中のＥｐｈＢ４の量を検出し又は定量するための方法をも包含し、それは、結合過程で形成される任意の免疫複合体の検出又は定量を必要とする。
【０１７１】
分析した生物学的試料は、ＥｐｈＢ４を含むと思われる任意の試料例えばホモジェナイズした新生物卵巣組織試料であってよい。選択した生物学的試料を抗体と、一次免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で十分な時間にわたって接触させることは、一般に、抗体組成物の試料への添加及び、抗体が存在する任意のＥｐｈＢ４と免疫複合体を形成する即ち結合するのに十分な期間にわたる混合物のインキュベーションの問題である。この試料−抗体組成物を徹底的に洗って、如何なる非特異的に結合した抗体種をも除去し、一次免疫複合体内の特異的に結合した抗体のみを検出させる。
【０１７２】
一般に、免疫複合体形成の検出は、当分野で周知であり、多くのアプローチの適用により達成することができる。これらの方法は、放射性タグ、蛍光タグ、生物学的タグ又は酵素的タグの検出に基づいている。当然、二次結合リガンド例えば二次抗体又はビオチン／アビジンリガンド結合配置(当分野で公知)の利用による更なる利点を見出すことができる。
【０１７３】
この検出で用いる抗ＥｐｈＢ４抗体は、それ自体、検出可能な標識に結合することができ、その後、簡単に、この標識が検出されよう。この組成物中の一次免疫複合体の量は、それにより測定されよう。
【０１７４】
或は、第一の免疫複合体内で結合する第一の抗体は、この抗体に対する結合親和性を有する第二の結合性リガンドによって検出することができる。これらの場合には、第二の結合性リガンドは、検出可能な標識に結合することができる。第二の結合性リガンドは、それ自身しばしば抗体であり、従って、「二次」抗体と呼ばれうる。第一の免疫複合体は、標識した第二の結合性リガンド又は抗体と、第二の免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で十分な時間にわたって接触される。これらの第二の免疫複合体は、如何なる非特異的に結合した標識された二次抗体又はリガンドをも除去するために徹底的に洗われて、第二の免疫複合体中の残留標識が検出される。
【０１７５】
酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)は、結合アッセイの一種である。ＥＬＩＳＡの一種において、この出願の診断方法において使用する抗ＥｐｈＢ４抗体は、タンパク質親和性を示す選択した表面例えばポリスチレン製ミクロ滴定プレート中のウェルに固定される。次いで、疑わしい新生物組織試料を、それらのウェルに加える。結合及び洗浄を行なって非特異的に結合した免疫複合体を除去した後に、結合したＥｐｈＢ４を検出することができる。検出は、一般に、検出可能なレベルに結合した他の抗ＥｐｈＢ４抗体の添加によって達成される。この種のＥＬＩＳＡは、単純「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出は、第二の抗ＥｐｈＢ４抗体の添加とその後の、第二の抗体に対する結合親和性を有して検出用標識に結合された第三の抗体の添加によっても達成することができる。
【０１７６】
他の型のＥＬＩＳＡにおいては、新生物卵巣組織試料をウェル表面に固定してから、この出願で用いる抗ＥｐｈＢ４抗体と接触させる。結合及び洗浄して非特異的に結合した免疫複合体を除去した後に、結合した抗ＥｐｈＢ４抗体を検出する。最初の抗ＥｐｈＢ４抗体を検出用標識に結合してある場合には、免疫複合体を、直接検出することができる。或は、免疫複合体を、第一の抗ＥｐｈＢ４抗体に対する結合親和性を有し、検出用標識に結合された二次抗体を利用して検出することができる。
【０１７７】
採用した形式に関係なく、ＥＬＩＳＡは、一般に、コートすること、インキュベートし又は結合し、洗浄して非特異的に結合した種を除去して、結合した免疫複合体を検出するというある一定の特徴を有している。
【０１７８】
放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)は、抗原の、抗体分子上の抗原結合部位についての競争(親和性)に依存する分析技術である。標準曲線は、各々同じ既知濃度の標識された抗原、及び様々な、既知の濃度の未標識抗原を含む一連の試料から集めたデータから構築される。抗原は、放射性同位体トレーサーで標識される。その混合物を、抗体と接触させてインキュベートする。次いで、遊離の抗原を抗体及びそれに結合した抗原から分離する。次いで、適切な検出器例えばガンマ又はベータ放射検出器を用いることにより、結合した若しくは遊離の標識された抗原又は両者のパーセントを測定する。この手順を、様々な既知濃度の未標識抗原を含む幾つかの試料について反復して、その結果を標準グラフとしてプロットする。結合したトレーサー抗原のパーセントは、抗原濃度の関数としてプロットされる。典型的には、全抗原濃度が増すにつれて、抗体に結合したトレーサー抗原の相対量が減少する。標準グラフが準備された後に、それを用いて、分析を受けている試料中の抗原の濃度を決定する。
【０１７９】
分析においては、抗原の濃度を測定すべき試料を、既知量のトレーサー抗原と混合する。トレーサー抗原は、試料中にあることが知られた同じ抗原であるが、適切な放射性同位体で標識したものである。このトレーサーを有する試料を、次いで、抗体と接触させてインキュベートする。その後、それを、試料中に残っている遊離の抗原を計数する適切な検出器にて計数する。抗体又は免疫吸着剤に結合した抗原も又、同様に計数することができる。次いで、標準曲線から、元の試料中の抗原の濃度を決定する。
【０１８０】
ＸＩ．治療方法
ある具体例においては、本開示は、腫瘍の成長を阻止し又は減じる方法及び癌例えば卵巣癌を患っている個体を治療する方法を提供する。これらの方法は、個体に治療上有効な量の一種以上の上記のような治療剤を投与することを含む。これらの方法は、特に、動物の治療及び予防的処置を目的としており、一層特には、ヒトの治療及び予防的処置を目的としている。ある具体例においては、癌(例えば、卵巣癌)は、血管形成依存性である。他の具体例においては、癌(例えば、卵巣癌)は、血管形成非依存性である。
【０１８１】
ここに記載した場合、腫瘍は、個体内の腫瘍、腫瘍異種移植片、又はイン・ビトロで培養された腫瘍を包含する。特に、本開示の治療剤は、上皮、生殖細胞、及び性索間質を含む任意の種類の卵巣癌の治療及び予防に有用である。
【０１８２】
かかる方法のある種の具体例においては、一種以上の治療剤を、一緒に(同時に)又は異なる時点で(順次的に)投与することができる。加えて、治療剤は、癌治療のための又は血管形成を阻止するための他の種類の化合物と共に投与することができる。
【０１８３】
ある具体例においては、この開示の主題の方法は、単独で用いることができる。或は、主題の方法は、増殖性疾患(例えば、腫瘍)の治療又は予防に向けられた他の慣用の抗癌治療アプローチと組み合わせて用いることができる。例えば、かかる方法は、予防的な癌の防止、外科手術後の癌の再発及び転移の防止において、及び他の慣用の癌治療の補助的手段として用いることができる。本開示は、慣用の癌治療(例えば、化学療法、放射線療法、光線療法、及び外科手術)の効力を、主題の治療剤の利用によって増進させることができることを認める。
【０１８４】
慣用の化合物の広範な配列は、抗新生物活性を有することが示されてきた。これらの化合物は、化学療法において、固形腫瘍を萎縮させ、転移及び更なる成長を防止し、又は白血病若しくは骨髄性悪性疾患において悪性細胞の数を減じるための医薬として用いられてきた。化学療法は、様々な種類の悪性疾患の治療において有効であったが、多くの抗新生物性化合物は、望ましくない副作用を誘発する。二種以上の異なる治療剤を組み合わせた場合には、それらの治療剤は、相乗的に働いて、各治療剤の投与量の低減を可能にし、それにより、各化合物によって一層高い投薬量で起きた有害な副作用を減少させるということが示されている。他の例においては、一つの治療剤に無反応である悪性疾患が、二種以上の異なる治療剤の組合わせ治療には応答しうる。
【０１８５】
本開示の治療剤を、他の慣用の抗新生物剤と組み合わせて、同時に又は順次的に投与した場合、かかる治療剤は、抗新生物剤の治療効果を増進させ又は、細胞のかかる抗新生物剤に対する耐性を克服することが示されている。これは、抗新生物剤の投薬量の減少を可能にし、それにより、望ましくない副作用を減少させ、又は耐性細胞における抗新生物剤の効力を回復する。
【０１８６】
結合(combinatory)抗腫瘍治療に用いることのできる医薬化合物には、次ぎのものが含まれるが、これは、単に説明のためのものである：アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエンストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エクセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレクセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン。
【０１８７】
これらの化学療法用抗腫瘍性化合物は、それらの作用機構によって、例えば、次のグループに分類することができる：抗代謝産物／抗癌剤、例えば、ピリミジン類似体(５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン及びシタラビン)及びプリン類似体、フォレートアンタゴニスト及び関連インヒビター(メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン及び２−クロロデオキシアデノシン(クラドリビン))；抗増殖／抗有糸分裂剤、天然物例えばビンカアルカロイド(ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビノレルビン)、微小管崩壊剤例えばタキサン(パクリタキセル、ドセタキセル)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン及びナベルビン、エピジポドフィロトキシン(エトポシド、テニポシド)、ＤＮＡ傷害剤(アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カムプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、サイトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イフォスファミド、メルファラン、メルクロレタミン、ミトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテレ、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド及びエトポシド(ＶＰ１６))；抗生物質例えばダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ)、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)及びミトマイシン；酵素(全身でＬ−アスパラギンを代謝して、自身でアスパラギンを合成する能力を有しない細胞においてアスパラギンを涸渇させるＬ−アスパラギナーゼ)；抗血小板剤；抗増殖性／抗有糸分裂性アルキル化剤：ナイトロジェンマスタード(メクロレタミン、シクロホスファミド及び類似体、メルファラン、クロラムブシル)、エチレンイミン及びメチルメラミン(ヘキサメチルメラミン及びチオテパ)、アルキルスルホネート、ニトロソウレア(カルムスチン(ＢＣＮＵ)及び類似体、ストレプトゾシン)及び類似体、トラゼン−ダカルバジン(ＤＴＩＣ)；抗増殖性／抗有糸分裂性抗代謝剤例えば葉酸類似体(メトトレキセート)；白金錯化合物(シスプラチン、カルボプラチン)、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体(エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド)及びアロマターゼインヒビター(レトロゾール、アナストロゾール)；抗凝固剤(ヘパリン、合成ヘパリン塩及び他のトロンビンのインヒビター)；フィブリン溶解剤(例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ)、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗移動剤；抗分泌剤(ブレベルジン)；免疫抑制剤(シクロスポリン、タクロリムス(ＦＫ−５０６)、シロリムス(ラパマイシン)、アザチオプリン、ミコフェノレートモフェチル)；及び抗血管形成性化合物(ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン)及び成長因子インヒビター(血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)インヒビター、繊維���細胞成長因子(ＦＧＦ)インヒビター)；アンギオテンシンレセプターブロッカー；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体(トラスツズマブ)；細胞周期インヒビター及び分化誘導剤(トレチノイン)；ｍＴＯＲインヒビター、トポイソメラーゼインヒビター(ドキソルビシン(アドリアマイシン)、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン及びミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン)、コルチコステロイド(コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルペドニゾロン、及びプレニゾロン)；成長因子シグナル変換キナーゼインヒビター；ミトコンドリア機能不全誘発剤及びカスパーゼアクチベーター；及びクロマチン崩壊剤。
【０１８８】
ある具体例において、組合せ抗血管形成治療に用いることのできる医薬化合物には、次のものが含まれる：(１)「血管形成分子」の放出のインヒビター、例えばｂＦＧＦ(塩基性繊維芽細胞成長因子)；(２)血管形成分子の中和剤、例えば抗βｂＦＧＦ抗体；及び(３)コラーゲンインヒビター、基底膜ターンオーバーインヒビター、血管新生抑制性ステロイド、真菌由来の血管形成インヒビター、血小板因子４、トロンボスポンジン、関節炎用薬物例えばＤ−ペニシラミン及び金チオマレート、ビタミンＤ3類似体、アルファ−インターフェロンなどを含む血管形成刺激に対する内皮細胞応答のインヒビター。更なる血管形成の推奨されるインヒビターについては、Blood等、Bioch.Biophys.Acta., 1032:89-118(1990), Moses等、Science, 248:1408-1410(1990), Ingber等、Lab.Invest., 59:44-51(1988), 及び米国特許第５，０９２，８８５号、５，１１２，９４６号、５，１９２，７４４号；５，２０２，３５２号、及び６５７３２５６号を参照されたい。加えて、血管形成を阻止するために利用することのできる広範な化合物例えば、ＶＥＧＦに媒介される血管形成経路をブロックするペプチド、又は薬剤、エンドスタチンタンパク質又は誘導体、アンギオスタチンのリジン結合性断片、メラニン又はメラニン促進化合物、プラスミノーゲン断片(例えば、プラスミノーゲンのクリンゲル１−３)、トロポインサブユニット、ビトロネクチンαvβ3のアンタゴニスト、サポシンＢに由来するペプチド、抗生物質又は類似体(例えば、テトラサイクリン、又はネオマイシン)、ジエノゲスト含有組成物、ペプチドに結合したＭｅｔＡＰ−２阻止性コアを含む化合物、化合物ＥＭ−１３８、カルコン及びその類似体、及びナーラダーゼインヒビターがある。例えば、米国特許第６，３９５，７１８号、６，４６２，０７５号、６，４６５，４３１号、６，４７５，７８４号、６，４８２，８０２号、６，４８２，８１０号、６，５００，４３１号、６，５００，９２４号、６，５１８，２９８号、６，５２１，４３９号、６，５２５，０１９号、６，５３８，１０３号、６，５４４，７５８号、６，６４４，９４７号、６，５４８，４７７号、６，５５９，１２６号、及び６，５６９，８４５号を参照されたい。
【０１８９】
ある具体例において、この出願の方法は、卵巣癌に対する公知の治療と組み合わせることができる。ある具体例においては、公知の治療には、外科手術、放射線療法及び／又は化学療法が含まれうる。ある具体例においては、卵巣癌の治療に用いられる化学療法用化合物は、白金化学療法剤例えばシスプラチン又はカルボプラチンである。当業者は、現在知られている卵巣癌のための治療プロトコールを決定することができよう。
【０１９０】
組合せ治療の性質に依存して、この開示の治療剤の投与は、継続することができるが、他の治療は、施与され且つ／又はその後施与される。これらの治療剤の投与は、単一投与量で行なうこともできるし又は多数の投与量で行なうこともできる。幾つかの例においては、これらの治療剤の投与は、慣用の治療の少なくとも数日前に開始するが、投与は、慣用の治療の施与の直前又は該治療の施与時点に開始される。
【０１９１】
ＸＩＩ．投与方法及び医薬組成物
ある具体例においては、本開示の主題の組成物は、製薬上許容しうるキャリアーと配合される。かかる治療剤は、単独で投与されうるし又は医薬配合物(組成物)の成分として投与することもできる。これらの化合物は、ヒトにおける使用又は獣医学用薬剤における使用のための任意の慣用の方法における投与のために配合することができる。湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、剥離剤、被覆剤、甘味料、調味料及び芳香剤、防腐剤及び抗酸化剤も又、これらの組成物中に存在してよい。
【０１９２】
主題の薬剤の配合物には、経口／鼻、局所、非経口、直腸、及び／又は膣内投与に適したものが含まれる。これらの配合物は、便利に、単位投薬形態で提供されうるし、製薬分野で周知の任意の方法によって製造されうる。単一投薬形態を生成するためにキャリアー物質と組み合わせることのできる活性成分の量は、治療される宿主に依って、特に、投与方法に依って変化する。単一投薬形態を生成するためにキャリアー物質と組み合わせることのできる活性成分の量は、一般に、その化合物の治療効果を生じる量であろう。
【０１９３】
ある具体例において、これらの配合物又は組成物を製造する方法は、他の種類の抗腫瘍又は抗血管形成性治療剤とキャリアー及び、適宜、一種以上の付属的成分を組み合わせることを含む。一般に、これらの配合物は、液体キャリアー又は微粉固体キャリアー、又は両者を用いて製造することができ、必要であれば、生成物を成形する。
【０１９４】
経口投与のための配合物は、カプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、菓子錠剤(通常、ショ糖及びアラビアゴム又はトラガカントゴムの、風味付けした基材を使用)、粉末、顆粒の形態であってよく、又は水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として、又は水中油又は油中水液体乳液として、又はエリキシル剤又はシロップとして、又は香錠として(不活性基材例えばゼラチン及びグリセリン、又はショ糖及びアラビアゴムを使用)及び／又は口腔洗浄剤などとして、各々は、予め決めた量の主題の治療剤を活性成分として含む。
【０１９５】
経口投与のための固体投薬形態(カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末、顆粒など)において、本開示の一種以上の治療剤を、一種以上の製薬上許容しうるキャリアー例えばクエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、及び／又は次の何れかと混合することができる：(１)充填剤又は増量剤、例えば澱粉、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸；(２)結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、及び／又はアラビアゴム；(３)湿潤剤、例えばグリセロール；(４)崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカ澱粉、アルギン酸、ある種のシリケート、及び炭酸ナトリウム；(５)溶液遅延剤、例えばパラフィン；(６)吸収促進剤、例えば四級アンモニウム化合物；(７)湿潤剤、例えばセチルアルコール及びグリセロールモノステアレート；(８)吸収剤、例えばカオリン及びベントナイトクレー；(９)潤滑剤、例えばタルク、カルシウムステアレート、マグネシウムステアレート、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物；並びに(１０)着色剤。カプセル、錠剤及び丸薬の場合には、これらの医薬組成物は又、緩衝剤をも含むことができる。類似の型の固体組成物も又、ラクトース又は乳糖並びに高分子量のポリエチレングリコールなどの賦形剤を利用するソフト及びハード充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いることができる。
【０１９６】
経口投与のための液体投薬形態は、製薬上許容しうる乳液、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシル剤を含む。活性成分に加えて、これらの液体投薬形態は、一般に当分野で用いられる不活性な希釈剤例えば、水又は他の溶剤、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油類(特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及び胡麻油)、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、及びこれらの混合物を含むことができる。不活性希釈剤の他に、これらの経口組成物は又、補助剤例えば湿潤剤、乳化剤及び沈殿防止剤、甘味料、風味剤、着色剤、芳香剤、及び防腐剤をも含むことができる。
【０１９７】
これらの活性化合物に加えて、懸濁液は、沈殿防止剤例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、及びソルビタンエステル、微晶質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカントゴム、並びにこれらの混合物を含むことができる。
【０１９８】
特に、この開示の方法は、局所的に、皮膚又は粘膜例えば頸部及び膣の粘膜に施与することができる。これは、副作用を誘発する機会を最少にして、腫瘍への直接的送達の最大の機会を提供する。これらの局所用配合物は、更に、皮膚又は角質層の透過性増進剤として有効であることが知られた広範な薬剤の一種以上を含むことができる。これらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセタミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチル又はイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、及びアゾンである。この配合物を、化粧用に適合させるために、更なる薬剤を、更に含有させることができる。これらの例は、脂肪、ワックス、油類、染料、芳香剤、防腐剤、安定剤、及び表面活性剤である。角質溶解剤例えば、当分野で公知のものも又、含有させることができる。例は、サリチル酸及び硫黄である。
【０１９９】
この局所的又は経皮的投与のための投薬形態は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、及び吸入剤を含む。主題の薬剤は、無菌条件下で、必要とされうる製薬上許容しうるキャリアーと、任意の防腐剤、緩衝剤、又は噴射剤と混合することができる。これらの軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、主題の組成物に加えて、賦形剤例えば動物性及び植物性脂肪、油類、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカントゴム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物を含むことができる。
【０２００】
粉末及びスプレーは、主題の治療剤に加えて、賦形剤例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物を含むことができる。スプレーは、更に、通例の噴射剤例えばクロロフルオロ炭化水素及び揮発性不飽和炭化水素例えばブタン及びプロパンを含むことができる。
【０２０１】
非経口投与に適した医薬組成物は、一種以上の治療剤を、一種以上の製薬上許容しうる無菌の等張の水溶液又は非水性溶液、分散液、懸濁液又は乳液と、又は使用直前に無菌の注射溶液又は懸濁液中に再構成することのできる無菌の粉末と一緒に含むことができ、これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、意図する受容者の血液と等張の配合物を与える溶質又は沈殿防止剤又は増粘剤を含むことができる。この開示の医薬組成物で用いることのできる適切な水性及び非水性のキャリアーの例は、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、及びこれらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル例えばエチルオレエートを含む。適当な流動性を、例えば、レシチンなどの被覆材料の利用により、必要な粒子サイズの維持(分散液の場合)により、そして界面活性剤の利用によって維持することができる。
【０２０２】
これらの組成物は又、補助剤例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含むこともできる。微生物の作用からの防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含有することにより確実にすることができる。等張剤例えば糖類、塩化ナトリウムなどをこれらの組成物中に含有することも又、望ましいことでありうる。加えて、この注射用医薬形態の延長された吸収を、吸収を遅らせる薬剤例えばアルミニウムモノステアレート及びゼラチンを含有させることによってもたらすことができる。
【０２０３】
注射可能なデポー剤形態を、一種以上の治療剤のマイクロカプセル化マトリクスを、生物分解性ポリマー例えばポリラクチド−ポリグリコリド中に形成することにより作成することができる。薬物のポリマーに対する比、及び用いた特定のポリマーの性質によって、薬物放出速度を制御することができる。他の生物分解性ポリマーの例には、ポリ(オルトエステル)及びポリ(無水物)が含まれる。デポー剤注射可能な配合物は又、薬物を身体組織に適合性のリポソーム又はミクロエマルジョン中に捕捉することによっても製造することができる。
【０２０４】
膣内又は直腸投与のための配合物を、坐薬として提供することができ、それは、この開示の一種以上の化合物を一種以上の適切な非刺激性賦形剤又はキャリアー(例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックス又はサリチル酸塩を含む)と混合することにより製造することができ、これは、室温では固体であるが、体温では液体となり、それ故、直腸又は膣腔内で溶けて活性化合物を放出する。
【０２０５】
主題の核酸化合物を送達する方法は、当分野で公知である(例えば、Akhtar等、1992, Trends Cell Bio., 2, 139; 及びDelivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, Akhtar編、1995; Sullivan等、ＷＯ９４／０２５９５を参照されたい)。これらのプロトコールは、事実上、任意の核酸化合物の送達に用いることができる。核酸化合物は、細胞に、リポソームへの封入、イオントフォレシス、又は他のビヒクル例えばヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセル、及び生物粘着性ミクロスフェアへの組込みを含む当業者に公知の様々な方法(但し、これらに限られない)によって投与することができる。或は、この核酸／ビヒクルの組合せは、直接的注射により又は注入ポンプの利用によって、局所的に送達することができる。他の送達経路には、経口(錠剤又は丸薬形態)送達及び／又は髄腔内送達が含まれるが、これらに限られない(Gold, 1997, Neuroscience, 76, 1153-1158)。他のアプローチは、例えば、結合体及び生物分解性ポリマーによる様々な輸送及びキャリアーシステムの利用を含む。薬物送達ストラテジーについての包括的な総説は、Ho等、1999, Curr.Opin.Mol.Ther., 1, 336-343及びJain, Drug Delivery Systems: Technologies and Commercial Opportunities, Decision Resources, 1998及びGroothuis等、1997, J. Neuro Virol., 3, 387-400を参照されたい。核酸送達と投与の一層詳細な記載は、Sullivan等、前出、Draper等、ＰＣＴＷＯ９３／２３５６９、Beigelman等、ＷＯ９９／０５０９４、及びKlimuk等、ＷＯ９９／０４８１９に与えられている。
【０２０６】
ある具体例において、本開示の核酸は、それらの所望の活性に最も適した物理的配置で本開示の核酸化合物の効果的な分布を可能にする製薬上許容しうる薬剤と配合される。かかる製薬上許容しうる薬剤の非制限的例は、ＰＥＧ、リン脂質、ホスホロチオエート、薬物が様々な組織に入るのを増進することのできるＰ−糖タンパク質インヒビター(例えば、プルロニックＰ８５)、移植後の持続的放出送達のための生物分解性ポリマー、例えばポリ(ＤＬ−ラクチド−コグリコリド)ミクロスフェア(Emerich, DF等、1999, Cell Transplant, 8, 47-58)、及び薬物を血液脳関門を横切って送達することができてニューロンの取込み機構を変えることのできる充填されたナノ粒子例えばポリブチルシアノアクリレートで作られたものを含む(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999)。
【０２０７】
他の具体例において、本開示のある種の核酸化合物は、細胞内で真核生物プロモーターから発現されうる(例えば、Izant及びWeintraub, 1985, Science, 229, 345; McGarry及びLindquist, 1986, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 399; Scanlon等、1991, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88, 10591-5; Kashani-Sabet等、1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Dropulic等、1992, J. Virol., 66, 1432-41; Weerasinghe等、1991, J. Virol., 65, 5531-4; Ojwang等、1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89, 10802-6; Chen等、1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Sarver等、1990 Science, 247, 1222-1225; Thompson等、1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Good等、1997, Gene Therapy, 4, 45)。当業者は、任意の核酸が、真核細胞において、適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現されうることを理解する。かかる核酸の活性は、酵素的核酸による一次転写物からのそれらの放出により、増大されうる(Draper等、ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９、及びSullivan等、ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５；Ohkawa等、1992, Nucleic Acids Symp. Ser., 27, 15-6; Taira等、1991, Nucleic Acids Res., 19, 5125-30; Ventura等、1993, Nucleic Acids Res., 21, 3249-55; Chowrira等、1994, J.Biol.Chem., 269, 25856; これらの参考文献のすべてを、全体として、本明細書中に資料として援用する)。ＣＮＳに特異的な遺伝子治療アプローチは、Blesch等、2000, Drug News Perspect., 13, 269-280; Peterson等、2000, Cent. Nerv. Syst. Dis., 485-508; Peel及びKlein, 2000, J. Neurosci. Methods, 98, 95-104; Hagihara等、2000, Gene Ther., 7, 759-763; 及びHerrlinger等、2000, Methods Mol. Med., 35, 287-312により記載されている。ＡＡＶに媒介される、核酸の神経系の細胞への送達は、更に、Kaplitt等、米国特許第６，１８０，６１３号により記載されている。
【０２０８】
この開示の他の面において、本開示のＲＮＡ分子は、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写ユニット(例えば、Couture等、1996, TIG., 12, 510参照)から発現される。これらの組換えベクターは、好ましくは、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。リボザイムを発現するウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアルファウイルスに基づいて(但し、これらに限られない)構築することができる。好ましくは、これらの核酸化合物を発現することのできる組換えベクターは、上記のようにして送達されて、標的細胞内に存続する。或は、核酸化合物の一時的発現を与えるウイルスベクターを利用することができる。かかるベクターは、必要なときに、繰り返し投与することができる。一度発現されたならば、その核酸化合物は、標的ｍＲＮＡに結合する。核酸化合物を発現するベクターの送達は、静脈投与又は筋肉内投与、患者から外植された標的細胞への投与とその後の患者への再導入、又は所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段(総説は、Couture等、1996, TIG., 12, 510
を参照されたい)などによって、全身的であってよい。
【０２０９】
一面において、この開示は、本開示の核酸化合物の少なくとも一つをコードする核酸配列を含む発現ベクターを企図する。この核酸配列は、この開示の核酸化合物の発現を与える仕方で、操作可能に結合される。例えば、この開示は、次を含む発現ベクターを特徴とする：ａ）転写開始領域(例えば、真核生物のｐｏｌI, II又はIIIの開始領域)；ｂ）転写終結領域(例えば、真核生物のｐｏｌI, II又はIIIの終結領域)；ｃ）本開示の核酸触媒の少なくとも一つをコードする核酸配列；ここに、該配列は該開始領域及び該終結領域に、該核酸化合物の発現及び／又は送達を与える仕方で、操作可能に結合される。このベクターは、適宜、この開示の核酸触媒をコードする配列の５’側又は３’側に操作可能に結合されたタンパク質のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)；及び／又はイントロン(介在配列)を含むことができる。
【０２１０】
典型的具体例
この発明は、今や、一般的に説明されたので、下記の実施例を参照することにより、一層容易に理解されよう。これらの実施例は、単に、本発明のある面及び具体例の説明を目的とするものであり、この発明を制限することを意図するものではない。
【実施例】
【０２１１】
実施例１．ヒトの卵巣腫瘍試料におけるＥｐｈＢ４発現
ヒトの卵巣試料におけるＥｐｈＢ４の発現は、７つの正常な卵巣及び８５の侵襲性上皮性卵巣癌から分離した切片の免疫組織化学的染色によって評価された(図１Ａ)。すべての正常な卵巣は、上皮表面において殆ど又は全くＥｐｈＢ４発現を有しなかった(図１Ａｂ)。侵襲性卵巣癌では、７３(８６％)がＥｐｈＢ４を発現し、中程度又は強度の発現が、４９(５８％)の試料において示された。我々は、ＥｐｈＢ４発現を、凍結組織を入手できた１０の卵巣腫瘍試料の選択群において、ウエスタンブロットにより確認した。１０の腫瘍試料の内の７つが、ウエスタンブロッティングにおいてＥｐｈＢ４を発現し(データは、示してない)、これは、染色データを確認するものである。
【０２１２】
実施例２．ＥｐｈＢ４発現は、臨床病理的特徴と相関する
侵襲性卵巣癌を有する患者の人口統計的特徴は、図１Ｂにまとめてある。表示した平均年齢は、５９．４歳(年齢範囲は、３４〜８６歳)であった。８５人の患者の内の６９人(８１％)は、進行したステージ(ＩＩＩ又はＩＶ)の病気を有し、８５人の患者の内の７４人(８７％)は、高い等級(ＩＩ又はＩＩＩ)の病気を有した。８５人の患者の内の５６人(６６％)は、最適な外科的細胞減少を受けた(外科手術完了時に残留する病気は、１ｃｍ未満)。ＥｐｈＢ４の発現と、組織学的サブタイプ、腫瘍の等級又は細胞減少の程度との間には、関係がなかった。
【０２１３】
ＥｐｈＢ４の過剰発現は、進行した病気のステージと相関した。ＥｐｈＢ４の高い発現は、高いステージの卵巣癌の６９％において検出されたのと比較して、低いステージの卵巣癌では１９％であった(ｐ＜０．００１)。ＥｐｈＢ４過剰発現を有する患者の９０％は、腹水を有したが、ＥｐｈＢ４過剰発現を有しない患者では４９％であった(ｐ＜０．００１)。侵襲性卵巣癌及びＥｐｈＢ４発現を有する患者の生存率を、Kaplan-Meier法を用いて測定した(図１Ｃ)。一変量分析においては、ＥｐｈＢ４の過剰発現は、低い発現と比較して一層悪い生存率と有意に関係している(中央値生存率７．７５年 対 ２．５８年；ｐ＜０．００１)。ＥｐｈＢ４発現、ステージ、等級、腹水、組織学及び細胞減少のレベルを含むＣｏｘ比例する危険のモデルを利用する多数の症候の緩解の分析において、進行したステージ(ｐ＝０．０４)及びＥｐｈＢ４過剰発現(ｐ＝０．００３)及び準最適な細胞減少(ｐ＝０．０１７)のみが、悪い生存率の有意な予測変量であった。
【０２１４】
実施例３．ＥｐｈＢ４レセプターは、卵巣癌腫細胞系統において高度に発現される
ＥｐｈＢ４の生物学的役割を研究するために、我々は、ＥｐｈＢ４の発現レベルを、卵巣癌腫細胞系統において、良性卵巣腫瘍細胞系統と比較して、測定することを望んだ。ウエスタンプロットは、ＥｐｈＢ４が実際に卵巣癌腫細胞系統Ｈｅｙ、ＣＡＯＶ−３、Ｈｏｃ−７及びＯＶＣＡＲ−３において高度に発現されていること及び良性卵巣細胞系統ＭＣＶ−５０及びＭＬ−５では、殆ど発現されていないことを示した(図２Ａ)。Ｈｏｃ−７は、他の卵巣細胞系統と比較して、高レベルのＥｐｈＢ４を発現した。ＥｐｈｒｉｎＢ２は、良性卵巣細胞系統(ＭＬ−５)を含むすべての卵巣細胞系統において、無視できるほど低レベルで発現する。各レーンに載せたタンパク質の等しい量を、同じブロットをβ−アクチンにつきプローブすることによって確認した(図２Ａ)。卵巣癌細胞系統で発現されたＥｐｈＢ４は、機能的である。Ｈｅｙ細胞の、３μｇ／ｍｌＥｐｈｒｉｎＢ２／Ｆｃキメラタンパク質による刺激(血清の非存在下)は、１０分のうちにＥｐｈＢ４のリン酸化を生じ(但し、Ｆｃ断片単独ではない)、これは、６０分により減少し始める(図２Ｂ)。又、ウシ胎児血清の、血清涸渇したＨｅｙ細胞への添加は、ベースラインを少し超えるＥｐｈＢ４のリン酸化を誘導する。
【０２１５】
実施例４．プロゲステロンは、ＥｐｈＢ４発現及び細胞成長を減じる
月経ホルモンは、卵巣腫瘍の発達及び進行を調節することが知られている(Danforth等、2006)。特に、プロゲステロンは、幾つかの以前の報告(Seeger, 2006)において、成長阻害性である。それ故、我々は、プロゲステロン及びエストロゲンがＥｐｈＢ４の発現に影響を有するかどうかを測定することに関心を持った。Ｈｏｃ−７細胞は、機能的プロゲステロン及びエストロゲンレセプターを発現する。Ｈｏｃ−７細胞のプロゲステロンでの処理は、ＥｐｈＢ４発現の投与量依存性の減少へと導いたが、エストロゲンは、ＥｐｈＢ４レベルに影響を有しなかった(図２Ｃ)。両ホルモンは、良性ＭＣＶ−５０細胞においてＥｐｈＢ４発現に影響を有しなかった(図２Ｃ及びデータは示してない)。プロゲステロン(エストロゲンではない)は、同様に、ＥｐｈＢ４発現をＨｅｙ細胞でも阻止した(データは、示してない)。プロゲステロンで処理したＨｏｃ−７及びＨｅｙ細胞は、細胞生存率において、投与量依存性の減少を示した。１０μＭプロゲステロンは、Ｈｏｃ−７細胞における細胞生存率の５０％近い減少を生じた(図２Ｄ)。
【０２１６】
実施例５．ＥｐｈＢ４の阻止は、減少した生存力を生じる
卵巣癌におけるＥｐｈＢ４の生物学的機能を決定するために、我々は、ＥｐｈＢ４発現をノックダウンするための幾つかのｓｉＲＮＡをデザインして、ウエスタンブロットにおいてＥｐｈＢ４発現を最も阻止した化合物を選択した(図３Ａ上段パネル)。ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡは、対応する投与量依存性のＥｐｈＢ４発現レベルの減少へと、Ｈｏｃ−７細胞においても導いた(データは、示してない)。３塩基で変異したＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ(ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡΔ)又は非特異的ＧＦＰ ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションは、ＥｐｈＢ４の発現レベルに対して効果を有しておらず(データは、示してない)、これは、ＥｐｈＢ４発現の減少がＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡの特異的効果であることを示している。ＥｐｈＢ４発現レベルの減少と同時に、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ処理は(変異したＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡΔによる処理ではない)、Ｈｅｙ細胞数の投与量依存性の減少を生じる。２５ｎＭ ｓｉＲＮＡの投与量で、９０％近い細胞数が減少する(図３Ａ、下段パネル)。５０％の細胞数の減少を達成するためのｓｉＲＮＡの投与量は、４ｎＭであった。同様に、ＨＯＣ−７細胞の、２５ｎＭ ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡでの処理は、細胞数の７５％減少を生じた(データは、示してない)。ＥｐｈＢ４陰性の腫瘍細胞系統の、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡでの処理は、腫瘍細胞数に影響しない(Xia等、2005及びデータは示してない)。
【０２１７】
イン・ビボで用いるために、我々は、ＥｐｈＢ４アンチセンスオリゴヌクレオチドのパネルを生成して、ＥｐｈＢ４レベルの最大の減少を有した分子ＡＳ−１０を、更なる研究のために選択した(図３Ｂ、上段パネル)。同様に、１０μＭ ＡＳ−１０での処理(かき混ぜたＯＤＮではない)は、細胞数の９０％減少を生じたが、ＥＤ５０は４μＭであった(図３Ｂ、下段パネル)。
【０２１８】
実施例６：ＥｐｈＢ４のノックダウンは、アポトーシス及び死のレセプターカスパーゼ経路の活性化へと導く
我々は、ＥｐｈＢ４ノックダウン後の細胞膜減少の原因を決定することに興味があった。Ｈｅｙ細胞を２５ｎＭ ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、３６時間後に、細胞周期分析にかけた(図３Ｃ)。対照用細胞の９０％及びトランスフェクトした細胞の８８％はＧ０期に入ってその細胞周期を進行し、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ処理した細胞の４８％のみが細胞周期相に進行した。
【０２１９】
細胞が細胞周期のＧ０期に入るのを防止することは、アポトーシスの誘導と一致する。更にこれを確証するために、我々は、細胞質のヌクレオソームを、ＥＬＩＳＡによって。Ｈｅｙ細胞において、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの４８時間後に定量した(図３Ｄ)。２５ｎＭ ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションは、細胞質ヌクレオソームの３倍増を生じたが、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡΔでのトランスフェクションは、何の効果も有しなかった。アポトーシスは、カスパーゼ−８を含む外部の膜起源の経路の、又はカスパーゼ−８を含まない内部のミトコンドリア経路の活性化により誘導することができる。Ｈｅｙ細胞の２５ｎＭ ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションは、カスパーゼ−８の３．２倍の活性化を生じたが、かかる効果は、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡΔによっては認められなかった(図３Ｅ)。活性なｓｉＲＮＡも変異したｓｉＲＮＡも、評価しうるカスパーゼ−９の活性化を生じなかった。ＥｐｈＢ４アンチセンスオリゴヌクレオチドは、類似の細胞周期プロフィル及びカスパーゼ−８活性化を誘導した(データは示してない)。従って、Ｈｅｙ細胞におけるＥｐｈＢ４ノックダウンは、主に外部のカスパーゼ−８経路によるアポトーシスの誘導による細胞死を生じる。
【０２２０】
実施例７．ＥｐｈＢ４は、細胞の移動及び侵入を調節する
良性細胞系統と比べての悪性細胞系統における一層高レベルのＥｐｈＢ４の発現は、一層高いＥｐｈＢ４のレベルが、細胞の移動及び細胞外マトリクスタンパク質への侵入を増大させることにより、一層悪性の挙動に寄与していることを示唆しうるものである。それ故、我々は、ＥｐｈＢ４が卵巣細胞系統の移動に関与しているかどうかを測定した。これらの実験は、ずっと短い時間(９〜１２時間)にわたって行なわれ、それらの時間では、評価できる細胞死は認められなかった。集密なＨｅｙ培養物を、無菌のプラスチック製のパスツールピペットで一回引っ掻くことにより傷つけたが、これは、明確な境界を有する３ｍｍの無細胞域を残した。この細胞除去域への、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ及びＥｐｈＢ４ ＡＳ−１０の存在下での細胞の移動を９時間にわたって評価して定量した。対照用細胞及びＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡΔでトランスフェクトされた細胞は、急速に移動してこの傷を覆い、その結果、９時間で殆ど完全に傷を治したが、２５ｎＭ ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、細胞移動並びに６時間及び９時間での傷の治癒の顕著な阻止を生じる(図４Ａ)。類似の細胞移動の減少は、ＡＳ−１０によっても認められた(データは示してない)。
【０２２１】
悪性細胞は、細胞外マトリクスを分解して組織に侵入することができる。この機能を研究するために、Ｈｅｙ細胞を、Boyden二重チャンバーの内部チャンバーに被覆させたマトリゲル上で１２時間にわたって、外部チャンバーにおける１０μｇＥＧＦの存在下で培養した。内部チャンバーの表面下へ移動する細胞は染色されて、１２時間後に可視化された。対照用細胞は、１２時間以内に、容易に、この膜の表面下に移動した(図４Ｂ)。ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡΔでのトランスフェクションは、細胞侵入に何の効果も有しなかったが、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡは、殆ど完全に基底膜を横切る細胞移動を破壊した。類似の効果が、ＡＳ−１０によっても認められた(データは示してない)。従って、ＥｐｈＢ４は、卵巣癌に、侵略的悪性として公知の、移動して基底膜に侵入する能力を与えている。
【０２２２】
実施例８．ＥｐｈＢ４アンチセンスＯＤＮは、腫瘍成長をイン・ビボで阻止する
次いで、我々は、ヒト卵巣癌異種移植片を有するマウスにおいて、全身へのアンチセンスの投与の効果を研究した。２×１０6のＨｅｙ細胞を、１０〜１２週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃ無胸腺マウスのわき腹に注射した。細胞移植の４日後に、マウスを無作為に３つのグループに分けて(グループ当りのマウス数ｎ＝６、実験は、２回反復する)、ＰＢＳ(ビヒクル)、かき混ぜたＯＤＮ又はＡＳ−１０を１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射することにより処理した。５週間後に、ＡＳ−１０処理は、ビヒクルで処理した腫瘍と比較して８５％以上小さい腫瘍を生じたが、かき混ぜたＯＤＮでの処理は、何の効果も有しなかった(図４Ａ)。これらのマウスは、全期間中、健康に見え、十分に給餌されて、活動的であった。犠牲にしたときに、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１０の血清レベル並びに脾臓重量は、３つのグループ間で類似しており、これは、ＯＤＮは、炎症性サイトカインを誘導しないことを示している(データは示してない)。収穫した腫瘍を、Ｈ／Ｅによって評価した(図４Ｂ、上段パネル)。これは、ＡＳ−１０処理した腫瘍において、大きい領域の腫瘍の壊死を示している。Ｋｉ−６７染色による免疫組織化学的評価は、増殖性細胞の１０倍の減少を示しており(図４Ｂ、第二パネル)、ＴＵＮＥＬ陽性細胞における１２倍の増加を示している(図４Ｂ、第三パネル)。これは、イン・ビトロで注目されたアポトーシスの誘導と矛盾しない。最後に、ＡＳ−１０治療は、ＣＤ３１免疫染色により、７５％少ない腫瘍微細血管を生じた(図４Ｂ、下段パネル)。従って、ＡＳ−１０の全身投与は、マウスにおけるＨｅｙ腫瘍の成長を、腫瘍細胞増殖の阻止、アポトーシスの誘導及び腫瘍の微小血管系の減少に加えて、阻止する。
【０２２３】
実施例９．ＭＡＢ２６５の配列決定
ＭＡＢ２６５ハイブリドーマクローンの可変の重鎖及び軽鎖を、NovagenからのマウスＩｇプライマーセットを利用するＰＣＲによってクローン化する。可変の重鎖は、生殖細胞系配列Ｊ５５８．１９と９８．９％同一であった。生殖細胞系の配列と可変の軽鎖及びＮ末端配列(SEQ ID NO:３９及びSEQ ID NO:４０)とのアラインメント図６に示す。生殖細胞系の配列と可変の重鎖(SEQ ID NO:４２)とのアラインメントを図７に示す。ＣＤＲは、Kabat等、1991により同定された。
【０２２４】
マウスモノクローナル抗体２６５の重鎖のこれらのＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:２６１(ＣＤＲ１)、SEQ ID NO:２６２(ＣＤＲ２)、及びSEQ ID NO:２６３(ＣＤＲ３)として規定される。マウスモノクローナル抗体２６５の軽鎖のこれらのＣＤＲ領域は、SEQ ID NO:２６４(ＣＤＲ１)、SEQ ID NO:２６５(ＣＤＲ２)、及びSEQ ID NO:２６６(ＣＤＲ３)として規定される。
【０２２５】
実施例１０．ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体の血管形成及び腫瘍成長に対する効果
抗ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体を、マウスにおいて、ＥｐｈＢ４の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)に対して産生した。ＥｐｈＢ４ＥＣＤ(例えば、図８参照)を、発現ベクター(例えば、ｐＧＥＸ)中にクローン化して、ＥｐｈＢ４ＥＣＤ融合タンパク質(例えば、ＧＳＴ−ＥＣＤ)を生成した。ＢＬ２１大腸菌内で発現されるＥｐｈＢ４ＥＣＤ融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ＧＳＴ融合タンパク質の場合には、ＧＳＴドメインは、トロンビンによって開裂された。モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ上清からプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。
【０２２６】
これらのモノクローナル抗体は、ＥｐｈＢ４抗体Ｎｏ．１、２３、３５、４７、５７、７９、８５Ｌ、８５Ｈ、９１、９８、１２１、１３１、及び１３８を含む(図８)。抗体マッピングの研究は、これらの抗体の各々についてのエピトープドメインを示した(図８)。
【０２２７】
更なる実験を行なって、これらの抗体の、結合パートナー例えばＥｐｈｒｉｎＢ２と競争する能力、ＥｐｈＢ４チロシンリン酸化を活性化する能力、ＨＵＡＥＣ中でイン・ビトロでの管の形成を阻止する能力、マトリゲルプラグアッセイによるイン・ビボで血管形成を阻止する能力、ＳＣＣ１５腫瘍細胞においてアポトーシス又は壊死を刺激する能力、及びＳＣＣ１５異種移植片の成長を阻止する能力を含む機能活性を分析した。それらの結果を、下記の表３にまとめる。
【０２２８】
【表３】
2010521467.tif 000007
【０２２９】
実施例１１  材料と方法
試薬：ＥｐｈｒｉｎＢ２(Ｐ２０)抗体を、Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA)から購入した。抗ホスホ−チロシン抗体４Ｇ１０は、Upstate(Lake Placid, NY)から、モノクローナル抗アクチン抗体はSigma Chemical Co. (St Louis, MO)から、抗ＣＤ３１(Ｍ２０)は、Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA)から、モノクローナル抗Ｋｉ−６７は、DAKO (Carpentaria, CA)から、及び抗ヒトＦｃは、Jackson Labs (Bar Harbor, ME)から購入した。ＥｐｈｒｉｎＢ２／Ｆｃキメラタンパク質は、R&D System, Inc. (Minneapolis, MN)から購入した。すべてのアンチセンスＯＤＮ及びｓｉＲＮＡは、Qiagen （Valencia, CA)から合成された。
【０２３０】
ＥｐｈＢ４の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体は、出願人Vasgene社内で生成した(ＭＡｂ１３１、ＭＡｂ４７及びＭＡｂ２６５と示される３つの異なるクローン)。これらの抗体は、発明者らが徹底的に特性決定したが、ＥｐｈＢ４レセプターの細胞外ドメインに対して極度に鋭敏且つ特異的である。それらは、Ｅｐｈファミリーのレセプターの他のメンバーと交差反応しない(データは、示してない)。ＭＡｂ２６５は、変性したヒトのＥｐｈＢ４だけをウエスタンブロットで検出し；ＭＡｂ１３１は、組織切片上でヒトＥｐｈＢ４を検出し；他方、ＭＡｂ４７は、ヒト及びマウスのＥｐｈＢ４を検出して免疫沈降実験において非常に有効である。
【０２３１】
細胞培養：ＭＬ５及びＭＬ１０細胞を、ヒト卵巣嚢胞腺腫から得て、ＳＶ４０大型Ｔ抗原でトランスフェクトして、それらのイン・ビトロでの寿命を増大させた。ＭＣＶ５０細胞を、ＭＬ１０のサブクローンから得たが、それは、培養において、自発的に不滅化細胞となった。ＨＯＣ−７卵巣癌腫細胞を、Tronto大学のR Buick博士から得た。ＯＶＣＡＲ−３細胞を、ＡＴＣＣから購入した(ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ１６１)。ＭＬ５、ＭＬ１０、及びＭＣＶ５０を、１０％ＦＣＳ、１ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン(Invitrogen, Carlsbad, CA)を補ったＭＥＭ培地中で培養した。ＨＯＣ−７及びＯＶＣＡＲ−３細胞を、１０％ＦＣＳ、１ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ培地中に維持した。Ｈｅｙ及びＣＡＯＶ−３細胞を、１０％ＦＣＳ、１ｍＭグルタミン、１ｍＭ ＭＥＭ ピルビン酸ナトリウム及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地中で培養した。
【０２３２】
ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌクレオチド：ＥｐｈＢ４特異的ｓｉＲＮＡ及びホスホロチオエート改変されたアンチセンス又はかき混ぜられたオリゴデオキシヌクレオチド(ＯＤＮ)を合成して(Qiagen, Valencia, CA)、ＥｐｈＢ４発現の特異的阻止について試験した。ＥｐｈＢ４特異的ｓｉＲＮＡは、配列5'-ＧＧＵ ＧＡＡ ＵＧＵ ＣＡＡ ＧＡＣ ＧＣＵ ＧＵＵ-3'(SEQ ID NO:１)及び3'-ＵＵＣ ＣＡＣ ＵＵＡ ＣＡＧ ＵＵＣ ＵＧＣ ＧＡＣ-5'(SEQ ID NO:２)に対応する。特異的ｓｉＲＮＡを、３つの部位で変異させて、ｓｉＲＮＡΔ、5'-ＡＧＵ ＵＡＡ ＵＡＵ ＣＡＡ ＧＡＣ ＧＣＵ ＧＵＵ-3'(SEQ ID NO:３)及び3'-ＵＵＵ ＣＡＡ ＵＵＡ ＵＡＧ ＵＵＣ ＵＧＣ ＧＡＣ-5'(SEQ ID NO:４)を生成した。これらは、ＥｐｈＢ４レベルに何の影響も有さず、対照として用いられた。ＧＦＰに向けられたｓｉＲＮＡを、更なる負の対照として利用した。用いたＡＳ−ＯＤＮ、ＡＳ−１０は、ヌクレオチド１９８０〜１９９９にわたり、配列 5'-ＡＴＧ ＧＡＧ ＧＣＣ ＴＣＧ ＣＴＣ ＡＧＡ ＡＡ-3' (SEQ ID NO:５)を有した。ＣｐＧ部位からの非特異的なサイトカイン媒介による効果を打ち消すために、このサイトカインを、ＥｐｈＢ４ノックダウン効果を失わないように、１１位でメチル化(ＡＳ−１０Ｍ)した(データは、示してない)。かき混ぜたＯＤＮ(配列 5'-ＡＡＧ ＧＧＣ ＴＡＧ ＧＡＴ ＡＧＡ ＣＣＣ ＴＣ-3' (SEQ ID NO:６))を、ＣｐＧ部位をも含むランダム配列中の同じヌクレオチドと共に、対照として用いた。
【０２３３】
免疫組織化学：すべてのヒトの試料を、Institutional Review Board for the Protection of Human Subjectsの要求に従って集めた。ホルマリン固定した、パラフィン包埋した試料を５μｍの切片にした。これらの切片を、抗原回復緩衝液(DIVAデブロッカー(BioCare Medical, Concord, CA)で改変したクエン酸緩衝液)で処理した。特に一次抗体のモノクローナルＥｐｈＢ４抗体ＭＡｂ１３１は、室温で、一晩、３０μｇ／ｍｌ(１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中)の濃度で適用された。免疫染色を、標準的技術(詳細は、請求次第入手可能)を用いて行なった。
【０２３４】
これらの試料のすべてを、患者の臨床的結果を知らない、委員会の保証した病理学者が観察した。ＥｐｈＢ４発現は、染色された腫瘍細胞のパーセンテージ及び染色の強度を評価することにより測定された。陽性細胞のパーセンテージを、次のように評点を付けた：０ポイント、０〜５％；２ポイント、６〜５０％；３ポイント、＞５０％。染色強度は、次のように評点を付けた：１ポイント、弱い強度；２ポイント、中位の強度；３ポイント、強い強度。発現及び陽性細胞のパーセンテージについてのポイントを加えて、全スコアを０〜６に割り当てた。腫瘍を次の４つのグループに分類した：陰性(全スコア＝０)；弱い発現(全スコア＝１〜２)；中位の発現(全スコア＝３〜４)；及び強い発現(全スコア＝５〜６)。異種移植片の染色については、切片を、一次抗体(ＣＤ３１ １：２５０希釈、Ｋｉ−６７ １：１００)と一晩、４℃でインキュベートした。日常的な負の対照は、一次及び二次抗体の削除、及び一次抗体に対する正常ＩｇＧアイソトープの代用を含んだ。マウスの抗ヒトＫｉ−６７抗体を用いる場合、ＭＯＭキット(Vector Labs, Burlingame, CA)を用いて、マウス組織に対する非特異的結合をブロックした。陽性に染色される細胞の数は、５つの無作為の高倍率視野内で、知らされてない観察者により計数された。
【０２３５】
ウエスタンブロット：細胞溶解物を、記載された(Masood等、2003)ように調製した。典型的には、全細胞溶解物からの１０μｇのタンパク質を、４〜２０％トリス−グリシンポリアクリルアミドゲルにて分画して、電気的にＰＶＤＦ膜に移し、一次抗体を用いて、一晩、プローブした。ブロットを、Restore(商標)Western Blot ストリッピング用緩衝液(Pierce, Rockford IL)を用いて、ストリップ化し、β−アクチンを用いて再プローブして、タンパク質の等量積載及び移動を確認した。シグナルを、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce)を利用して検出し、Fluro-S multi-Imager system(Bio-Rad)を利用するＸ線デンシトメトリーにより定量した。
【０２３６】
ＥｐｈＢ４のリン酸化分析：組換えＥｐｈｒｉｎＢ２／Ｆｃ又はＦｃタンパク質を、抗Ｆｃ抗体を利用して、１時間にわたって、４℃で、クラスター化した。Ｈｅｙ及びＨｏｃ−７細胞を、６０ｍｍ皿で、１００％集密になるまで成長させて、クラスター化ＥｐｈｒｉｎＢ２／Ｆｃ(Bar Harbor, ME)により、様々な持続時間にわたって処理した。溶解物を、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％(ｖ／ｖ)トリトン−Ｘ１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭバナジウム酸ナトリウムを含む緩衝液を用いて調製し、５０，０００×ｇで６０分間、４℃で遠心分離した。清澄化したタンパク質試料を、一晩、タンパク質Ａ／Ｇ結合した、抗ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体(＃４７)で予め被覆してあるアガロースビーズとインキュベートした。これらの免疫沈降した(ＩＰ)複合体を、抗ｐ−Ｔｙｒ特異的抗体４Ｇ１０を用いてプローブした。ＥｐｈＢ４の沈澱の効率を、ＥｐｈＢ４特異的モノクローナル抗体(＃２６５)を用いてプローブすることにより試験した。
【０２３７】
傷の治癒移動アッセイ：Ｈｅｙ細胞を、６ウェルプレートに播種して、集密になるまで培養した。ＥｐｈＢ４アンチセンス及びかき混ぜたＯＤＮ(１μＭ)又はｓｉＲＮＡを、生存力アッセイについて記載したように、これらのウェルに導入した。細胞の単層を、無菌のピペットで引っ掻くことにより傷つけた。これらの細胞の引っ掻かれた領域への経時的移動を調べて、Nikon Coolpix 5000 デジタルカメラで記録した。
【０２３８】
細胞移動アッセイ：卵巣細胞の走化性を、２４ウェルプレート(BD Biosciences)中に、８μｍ細孔寸法のマトリゲル被覆されたポリカーボネートを有する細胞培養用インサートを含む改変Boydenチャンバーを利用して評価した。２００μｌ ＤＭＥＭ／１％ＦＣＳ中のＨｅｙの懸濁液(２×１０5細胞／ｍｌ)を、ｓｉＲＮＡ導入後に又はＥｐｈＢ４ ＡＳ−１０と共に、上部チャンバーに播種した。走化性因子ＥＧＦ(２０ｎｇ／ｍｌ)を含むＤＭＥＭ／１％ＦＣＳ５００μｌを下部チャンバーに加えた。９時間３７℃でのインキュベーション後に、フィルターの上面を薬剤塗布用スポンジで擦り、フィルターを固定してDiff Quick (vWR, West Chester, PA)で染色した。
【０２３９】
細胞生存力アッセイ：Ｈｅｙ及びＨｏｃ−７細胞は、４８ウェルプレート上に、２００μｌの培地中に、約１×１０4細胞／ウェルの密度で播種された。細胞を、細胞播種の１日後及び３日後に、様々な濃度(１〜１０μＭ)のＥｐｈＢ４ ＡＳ−１０又はかき混ぜたＯＤＮで処理した。３日後に、培地を交換して、新鮮なＯＤＮを加えた。細胞生存力を、以前に記載された(Masood等、2003)ように、ＭＴＴにより評価した。ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ(１０〜１００ｎＭ)を、４８ウェルプレートの２×１０4細胞／ウェルに、２μｌのリポフェクタミン(商標)２０００を製造業者の指示に従って利用して、導入した。トランスフェクションの４時間後に、これらの細胞を成長培地に戻した。生存力を、上記のように(Masood等、2003)、４８時間後にアッセイした。
【０２４０】
細胞周期分析：６ウェルプレート中のＨｅｙ細胞の８０％集密培養物を、リポフェクタミン(商標)２０００を利用して、様々な時間にわたって、様々なｓｉＲＮＡ(１００ｎＭ)でトランスフェクトし、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ中で洗い、５０μｇ／ｍｌプロピジウムヨージド、０．１％クエン酸ナトリウム、０．１トリトンＸ−１００及び２０μｇ／ｍｌＤＮアーゼフリーのＲＮアーゼＡを含む１ｍｌの低張溶液中で、４℃で１時間にわたってインキュベートした。細胞を、リニアモードで、フローサイトメトリーにより分析した。結果を、細胞周期の種々の相、即ち、サブＧ０ピーク(アポトーシス)、Ｇ０／Ｇ１(ＤＮＡ合成なし)、Ｓ(活発なＤＮＡ合成)、Ｇ２(前有糸分裂)及びＭ(有糸分裂)において検出された要素のパーセンテージとして表示した。
【０２４１】
アポトーシス分析：アポトーシスを、細胞質のヌクレオソームを検出する細胞死検出ＥＬＩＳＡプラスキットを製造業者(Roche, Piscataway, NJ)の指示に従って利用して研究した。簡単にいえば、８０％集密まで培養した２４ウェルプレート中の細胞を、リポフェクタミン(商標)２０００を利用して、様々な濃度(０〜１００ｎＭ)のＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ(４７２)又はＧＦＰ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。１６時間後に、細胞を溶解させて、核をペレット化し、抗ヒストン−ビオチン及び抗ＤＮＡ ＰＯＤと共に、ストレプトアビジンを被覆した９６ウェルプレート中でインキュベートした。色を、ＡＢＳＴを用いて発色させて、４０５ｎｍでの吸光度をミクロプレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で読んだ。カスパーゼ−８及び−９の活性を、カスパーゼ−８及び−９ペプチド基質の開裂をモニターするカスパーゼ−８及びカスパーゼ−９比色アッセイキット(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)を利用して測定した。アポトーシスは、イン・サイチュー細胞死検出キット(Roche, Piscataway, NJ)を製造業者の指示に従って利用して、ＴＵＮＥＬアッセイにより、動物の腫瘍の脱パラフィン化した切片で検出された。
【０２４２】
マウス腫瘍異種移植片モデル：Ｈｅｙ細胞を、増殖させ、トリプシン消化により集めて、無血清培地中に再懸濁させた。２×１０6細胞を、１０〜１２週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃ無胸腺マウスのわき腹に注射した。腫瘍の成長を、一週間に３回測定して、体積を、０．５２×ａ×ｂ2(式中、ａ及びｂは、触診できる腫瘍の最大及び最小長さである)と見積もった。細胞移植の４日後に、腫瘍の体積を均一の大きさを確実にするように計算して、動物を無作為に３つのグループに分けた(グループ当りのマウス数ｎ＝６)。各グループには、毎日、腹腔内(ｉ.ｐ.)注射により、ＡＳ−１０又はかき混ぜたＯＤＮが、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与され又はビヒクル(無菌の通常の塩溶液、ｐＨ７．４)のみが投与された。４週間後に、動物を犠牲にして、腫瘍及び正常臓器を収穫した。これらの腫瘍の一部は、パラフィン包埋及び組織学的分析のためにホルマリン中で固定された。各グループの残りの腫瘍組織及び臓器は、プールされて、タンパク質抽出された。すべての手順は、我々のInstitutional Animal Care and Use Committee により承認されたものであり、Animal Welfare Act の規則に従って行なわれた。
【０２４３】
統計的分析：χ2検定を利用して、変量間の差異を、ＳＰＳＳ(SPSS Inc., Chicago, IL)を利用して測定した。生存曲線を、Kaplan-Meier法を用いて生成して、ｌｏｇランク統計と比較した。Ｃｏｘ比例する危険のモデルを多変量解析に利用した。スチューデントのｔ検定を利用して、腫瘍の体積を比較した。ｐ値＜０．０５を、統計的に有意とみなした。
【０２４４】
参考文献の援用
ここで言及したすべての刊行物及び特許を、個々の刊行物又は特許が、特別に及び個別的に援用されることを示されたように、そっくりそのまま資料として援用する。
【０２４５】
主題の発明の特別の具体例を検討してきたが、上記の詳細な説明は、説明のためのものであって、限定するものではない。この発明の多くの変形物が、当業者には、この明細書及び後記の請求の範囲を検討したならば、明らかとなろう。この発明の全範囲は、請求の範囲を、それらの同等物の全範囲と共に、並びに詳細な説明を、かかる変形物と共に参照して決定されるべきである。
【０２４６】
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【０２４７】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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