(57)【要約】本発明は、ヒトＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体を対象としたモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片またはモノクローナル抗体誘導体である。これらにおいて、各軽鎖の可変領域は配列識別番号Ｎｏ．５のマウス核酸配列によりコード表現され、各重鎖の可変領域は、配列識別番号Ｎｏ．７のマウス核酸配列、または配列識別番号Ｎｏ．５及びＮｏ．７の配列と性質上の十分な相同性を有し、また前記抗体がその改変されるべきでない抗原に対して結合親和性を有している核酸配列によりコード表現され、そしてその軽鎖及び重鎖の定常領域は非マウス種に由来する定常領域である。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＬＤＬ（低濃度リポタンパク質）受容体に対するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片、あるいはモノクローナル抗体誘導体において、その軽鎖のそれぞれの可変領域が配列識別番号Ｎｏ．５のマウス核酸配列によりコード表現され、その重鎖のそれぞれの可変領域が配列識別番号Ｎｏ．７のマウス核酸配列あるいはその性質及び改変されるべきでない抗原に対する前記抗体の結合親和性の上で配列識別番号Ｎｏ．５と配列識別番号Ｎｏ．７の配列と十分な相同性を有する核酸配列によってコード表現され、そして、その軽鎖とその重鎖の定常領域のそれぞれが非マウス種由来の定常領域であることを特徴とするモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片、あるいはモノクローナル抗体誘導体。
【請求項２】
その軽鎖とその重鎖の定常領域のそれぞれがヒト定常領域であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
各軽鎖の定常領域がタイプｋであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
各重鎖の定常領域がタイプγであることを特徴とする、前記請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
各重鎖の定常領域がタイプγ１であることを特徴とする、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
各重鎖の定常領域がタイプγ１であり、配列識別番号Ｎｏ．２３の核酸配列でコード表現され、そして、その各軽鎖の定常領域が配列識別番号Ｎｏ．２１の核酸配列でコード表現されることを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
各軽鎖が配列識別番号Ｎｏ．１３の核酸配列でコード表現され、さらに、各重鎖が配列識別番号Ｎｏ．１９の核酸配列でコード表現されることを特徴とする、前記請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
配列識別番号Ｎｏ．１３の核酸配列から推定されるペプチド配列が配列識別番号Ｎｏ．１４の配列であり、配列識別番号Ｎｏ．１９の核酸配列から推定されるペプチド配列が配列識別番号Ｎｏ．２０の配列であることを特徴とする、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
ラットハイブリドーマ細胞株によって生成されることを特徴とする、前記請求項１から８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
ラットハイブリドーマＹＢ２／０（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６２の番号で預託されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞）によって生成されることを特徴とする、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）にＣＮＣＭ１−３６９２によって登録預託されているクローンＲ６０４によって生成される抗体ＥＭＡＢ６０４であることを特徴とする、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の抗体の配列識別番号Ｎｏ．１２で示される軽鎖の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の抗体の配列識別番号Ｎｏ．１８で示される重鎖の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の抗体を発現する安定した細胞株。
【請求項１５】
前記抗体がその内部で発現される細胞株が、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ、ヒト黒色腫Ｎａｍａｌｗａ、ＰＥＲＣ６、ＣＨＯ株、特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、ＭｏＩｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ  １４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３で構成される群から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の安定細胞株。
【請求項１６】
請求項１２及び１３による２つの発現ベクターを組み込んだ、請求項１４あるいは１５に記載の安定細胞株。
【請求項１７】
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に登録番号ＣＮＣＭ  １−３６９２で登録預託されているクローンＲ６０４。
【請求項１８】
請求項１−１１のいずれか１項に記載の抗体の重鎖をコード表現する配列識別番号Ｎｏ．１９で示されるＤＮＡ断片。
【請求項１９】
請求項１−１１のいずれか１項に記載の抗体の軽鎖をコード表現する配列識別番号Ｎｏ．１３で示されるＤＮＡ断片。
【請求項２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでエフェクター免疫細胞のＦＣγＲＩＩＩ受容体を活性化するか、あるいはエフェクター細胞によるサイトカインあるいはケモカインの分泌のための、請求項１−１１のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項２１】
医薬品として使用するための請求項１−１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２２】
癌治療を目的とする医薬品製造のための、請求項１−１１のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項２３】
黒色腫治療用医薬品製造のための、請求項１−１１のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項２４】
黒色腫治療用医薬品製造のための、ヒトＬＤＬ受容体に対するモノクローナル抗体の使用。
【請求項２５】
黒色腫細胞で発現される１つあるいは複数の他の抗原に対する１つあるいは複数の他の抗体との組み合わせによる、請求項２３あるいは２４に記載の抗体の使用。
【請求項２６】
黒色腫細胞上で発現される前記抗原がＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、及びＣＤ４０から選択されることを特徴とする、請求項２５に記載の抗体の使用。
【請求項２７】
ＮＫ（ナチュラル・キラー）細胞、ＮＫＴ（ナチュラル・キラーＴ）細胞、Ｔγｄリンパ球、マクロファージ、単球、Ｃ１６あるいは樹枝状細胞を発現するように遺伝子工学的に改変されたいずれかの細胞などＦｃγＲをコード表現する細胞と組み合わせての、請求項２２−２５のいずれか１項記載の抗体の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏあるいはｅｘ  ｖｉｔｒｏでの請求項２２−２５に従った使用。
【請求項２８】
請求項１−１１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗体と少なくとも１つの賦形剤及び／または少なくとも１つの薬学的に受け入れ可能なビーイクルを含んでいる医薬品組成物。
【請求項２９】
前記抗体の標的細胞上に存在しているもう一つの抗原に対して向けられた少なくとも１つの抗体を含んでいることを特徴とする、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体も含んでいることを特徴とする、請求項２８及び請求項２９のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性黒色腫の治療領域を拡大することが可能な、ヒトＬＤＬ受容体に対するモノクローナル抗体に関するものである。 
【背景技術】
【０００２】
悪性黒色腫は、元来健康な皮膚において発生するかあるいは前から存在している母斑の劣化によって起きる色素系（メラミン細胞）の悪性腫瘍である。
【０００３】
黒色腫は世界中で発生頻度が急増している皮膚癌である。その発生頻度は１０年毎に倍増している。症例の多くは健康な皮膚において起きるもので、前から存在している母斑で発症するのは四分の一未満である。
【０００４】
毎年、米国では４７，０００人以上の人々が新たに黒色腫と診断され、そのうちの７，７００人がこの皮膚の進行性癌によって死亡している。
【０００５】
フランスでは毎年４，０００―５，０００人の症例が発見されており、１，０００人程度の人がこの病気で死亡している。
従って、黒色腫の初期予防と早期発見は非常に重要である。
【０００６】
実際、黒色腫の治療においては研究が行われているが、黒色腫の標準的な治療は依然として手術に依存している、この治療においては最初に切除が行われ、これには腫瘍の厚みに基づいていろいろな大きさで周辺部を切り取ったり、あるいは、必要であれば切除した周辺部を腫瘍の厚みに適合させるための修復手術を行うステップが含まれている。検査で１つあるいは複数の転移が見つかると、それらは外科的手術か化学治療によって措置しなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
黒色腫の治療における現在の希望は新しい細胞治療方式に向けられている。
その方式を用いる理由は以下の２つの知見に基づいている。それは、ひとつには未発達の黒色腫あるいは皮膚転移の自然な退縮が文献で報告されて、この腫瘍の発展に免疫システムが重要な役割を果たしているという推定をもたらしたことと、もうひとつは、ここ数年間で黒色腫瘍細胞の特異性を示す抗原が単離されたことである。
【０００８】
黒色腫治療のために用いられる細胞療法は２つのタイプの措置を含んでおり、その１つは養子免疫治療であり、これは患者に『抗腫瘍活性』を有する薬剤を投与してその患者の免疫システムを刺激し、その患者の体が『ＴＩＬ』または（腫瘍浸潤リンパ球）によって効果的に癌と戦えるよう補助するもので、もう１つはワクチン接種に代表される能動免疫治療である。
【０００９】
ＴＩＬを利用した養子免疫治療には、黒色腫抗原に特異的で、腫瘍またはその転移から分離され適正製造基準の実験室内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大させた細胞毒性Ｔ細胞を患者に大量（数十億個）注入するステップが含まれる。故にこれは自己系である。
【００１０】
米国における、黒色腫の転移段階でのＴＩＬ関する最初の臨床研究では、３５％程度の応答レベルが得られたが、しかしすぐに再発する例も多く見られ、こうした受動的な免疫治療方式の放棄が検討されるようになった。
【００１１】
しかし、『残留する』腫瘤に対してサイトカイン、特にインターフェロンαを用いた治療が有効であることから、それをＴＩＬへと適用する考え方が提起されてきた。
【００１２】
このＴＩＬへのアプローチと並行して、黒色腫抗原に対するクローン、具体的にはＭｅｌａｎ−Ａ及びチロシナーゼを注入するアプローチが開発されつつある。転移段階における予備的な結果が得られてはいたが、特筆すべきこととして、患者の体内に注入されたクローンが転移部位において発見され、また一方でそれらは患者の体内に注入された後増幅していることが示された。
【００１３】
ワクチン接種による能動免疫治療は、皮下照射された黒色腫細胞の溶解物の注入（多抗原性アプローチ）、またはＨＬＡ制限された状態で、特定の黒色腫抗原の同定の後に得られる特定のペプチドの注入に関連する。従って、その目的は特定の抗黒色腫免疫反応を生じさせることにある。
【００１４】
現在、黒色腫における４世代のワクチンを概略的に区別することができる。第１の世代は多抗原性ワクチンである。これらは放射線照射された腫瘍細胞のホモジェネートによって構成される。このように、これらは複数の腫瘍抗原によって構成され、結果的に患者によって提示される細胞毒性Ｔ細胞集団の１つに対応する可能性を増大させることができるという利点を有している。
【００１５】
黒色腫瘍抗原は、メラノサイト分化抗原：チロシナーゼ、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ‐Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｇｐ７５；あるいは腫瘍特異的抗原（胚抗原）：“黒色腫関連抗原”ＭＡＡ：Ｍａｇｅ‐１、Ｍａｇｅ‐２、Ｍａｇｅ‐３、Ｂａｇｅ、Ｇａｇｅ‐１、Ｇａｇｅ‐２、Ｍｕｃ‐１、Ｒａｇｅ‐１、ＮＡ‐１７である。一方これらの抗原は、通常少量存在し、それらの賦活作用が制限される。これら、患者に皮下または皮内注入される腫瘍ホモジェネートは、患者自身（自己系）あるいは異性腫瘍系に由来する。Ｔリンパ球細胞に対する腫瘍ホモジェネートの刺激作用は、前者に免疫アジュバントを加えることによって増強することができる。アジュバントの例としては、ＢＣＧ、Ｄｅｔｏｘ、ＱＳ−２１、ＭＦ−５９が提起されている。
【００１６】
第２の世代は特異抗原ワクチンである。これは患者へ単一の腫瘍抗原を注入する原理に基づいている。これらは重要な細胞毒性Ｔリンパ球の活性化を惹起する。
【００１７】
また一方でこれらの使用は２つの条件によって制限される：１つはＨＬＡ制限（Ｍａｇｅ対象のＨＬＡ−Ａ１、ＮＡ−１７対象のＨＬＡ−Ａ２、Ｍｅｌａｎ−Ａ）であり、もう１つは腫瘍の発現または注入されるペプチドに対応する抗原の転移である。
【００１８】
故に生検には細胞の損傷が必然的に伴うが、これでＰＣＲによって抗原の有無を識別することが可能となる。当然これは患者がワクチンから受ける恩恵を制限することになる。現在まで、ペプチドＭａｇｅ−３、Ｍａｇｅ−１、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｍａｒｔ−１、ＮＡ−１７、チロシナーゼ、ＮＹ−ＳＯ１を利用した臨床プロトコルが作成されてきた。
【００１９】
第３の世代のワクチンとしては、ワクチン接種用樹枝状細胞の黒色腫への使用があり、これはこれらの細胞が優れた抗原提示細胞であるという事実に基づいている。これらは、ＣＤ４＋リンパ球に対してはＨＬＡクラスＩＩ、細胞毒性リンパ球に対してはＨＬＡクラスＩという背景内で抗原を取り込み、それらをＴリンパ球に対して提示することができる。さらにこのＴリンパ球の活性化には共刺激分子ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ及びＢ７−ＣＤ２８が関与する。治療進行の原理は、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）及びＩＬ−１３（インターロイキン１３）のようなサイトカインの存在下で、患者の血液から分離（サイトアフェレーシス）したＣＤ３４細胞または単球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に基づいている。次に得られた分化樹枝状細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１種類以上のペプチドが充填される。その結果これらのいわゆる充填樹枝状細胞は、皮内または皮下、また神経節への注射により患者の体内へ再注入される時点で、前記ペプチドに特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の優れた活性化細胞となる。
【００２０】
第４の世代は改変された腫瘍細胞のワクチンである。
黒色腫瘍細胞は、免疫抑制性サイトカインを生成し、その腫瘍抗原をマスキングし、共活性化分子あるいはクラスＩまたはＩＩの抗原を発現させないことによって免疫システムを回避する。これにより細胞障害性Ｔ反応が阻止される。腫瘍細胞ワクチンの原理は、放射線照射された自己腫瘍細胞の患者への皮内または皮下注入により構成され、ここでこの自己腫瘍細胞の表現型プロファイルは、この細胞が細胞毒性Ｔリンパ球に接近することができるように改変されている。故にこの腫瘍細胞は、ＩＬ−７、ＩＬ−２、ＩＬ−１２サイトカイン；またはマクロファージを活性化するＧＭ−ＣＳＦ；またはクラスＩ、ＩＩの抗原、抗原ＢＬ７によりトランスフェクトされることが可能となり、これによって細胞毒性細胞による腫瘍抗原の識別が可能となる。
【００２１】
これら異なる第１及び第２世代のワクチンについて臨床試験（フェーズＩ−ＩＩ）が行われた。この臨床試験は、試験の時点で、平均的といえる約２０％の応答レベルを示す患者に限定して行われた。これらの反応は、他の部位よりも皮膚、神経節、肺、肝臓部位において得られる。このワクチン接種に特有の興味深い事実は、反応期間の延長（２年以上）が見られたことである。重要な点はこの臨床反応が如何に持続するかである。実際のところ、化学療法とは対照的に、臨床的退行は、３〜４ヶ月またはそれ以上持続する安定局面の直後に最も多く見られる。
【００２２】
この持続は全体的にいえば良好である。ここで実質的に見られる副作用は、注入部位における紅斑、及び白斑タイプの自己免疫反応である。
【００２３】
しかし現在の治療法におけるこの平均的応答レベルの低さは、悪性黒色腫の治療領域を拡大することが可能な新しいツールが真に必要とされていることを示している。
【００２４】
本発明は、悪性黒色腫の治療法における応答レベルを高めて、悪性黒色腫の治療領域を拡大することが可能な新しいツールであるヒトＬＤＬ受容体に対するモノクローナル抗体を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、ヒトＬＤＬ（低濃度リポタンパク質）受容体に対するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片、あるいはモノクローナル抗体誘導体において、その軽鎖のそれぞれの可変領域が配列識別番号Ｎｏ．５のマウス核酸配列によりコード表現され、その重鎖のそれぞれの可変領域が配列識別番号Ｎｏ．７のマウス核酸配列あるいはその性質及び改変されるべきでない抗原に対する前記抗体の結合親和性の上で配列識別番号Ｎｏ．５と配列識別番号Ｎｏ．７の配列と十分な相同性を有する核酸配列によってコード表現され、そして、その軽鎖とその重鎖の定常領域のそれぞれが非マウス種由来の定常領域であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のヒトＬＤＬ受容体に対するモノクローナル抗体は、悪性黒色腫の治療法における応答レベルを高めて、悪性黒色腫の治療領域を拡大することが可能な新しいツールとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】黒色腫株ＧＵＹ  １７．２における抗ＬＤＬ−Ｒ（ＥＭＡＢ６０４）及び抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＨＯ応対のＡＤＣＣ活性。結果は抗体濃度に基づく細胞溶解の割合（平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝２）で示す。
【図２】マウス抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８（２５０μｇ／ｍｌ）による、黒色腫細胞株ＧＵＹ−１７．２上での１０μｇ／ｍｌの抗ＬＤＬ−Ｒ（ＥＭＡＢ６０４）及び抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＨＯ抗体によって誘発されるＡＤＣＣ活性の抑制。
【図３】黒色腫細胞株ＨＴ−１４４における抗ＬＤＬ−Ｒ（ＥＭＡＢ６０４）及び抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＨＯ抗体のＡＤＣＣ活性。これらの結果は抗体濃度による細胞溶解の割合（平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝２）で示してある。
【図４】マウス抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８（２５０  μｇ／ｍｌ）による、黒色腫細胞株ＨＴ−１４４上での１０μｇ／ｍｌの抗ＬＤＬ−Ｒ（ＥＭＡＢ６０４）及び抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＨＯ抗体によって誘発されるＡＤＣＣ活性の抑制。
【図５】黒色腫細胞株ＧＵＹ−１７．２の存在下での抗ＬＤＬ−Ｒ（ＥＭＡＢ６０４）及び抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＨＯ抗体によって誘発されるＪｕｒｋａｔ−ＣＤ１６細胞によるＩＬ−２の分泌。
【図６】黒色腫細胞株ＨＴ−１４４の存在下での抗ＬＤＬ−Ｒ（ＥＭＡＢ６０４）及び抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＨＯ抗体によって誘発されるＪｕｒｋａｔ−ＣＤ１６細胞によるＩＬ−２の分泌。
【図７】ＮＫ細胞によって発現されるＣＤ１６受容体上でのＹＢ２／０及びＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）内で作り出される抗ＬＤＬ−Ｒ（ＥＭＡＢ６０４）、抗ＣＤ２０抗体の結合の割合。結果は抗体が１０及び５０μｇ／ｍｌの抗体濃度の場合を示す。
【図８】配列配列識別番号Ｎｏ．５：抗体の軽鎖の可変領域をコード表現するマウス核酸配列を示す。  配列識別番号Ｎｏ．７：抗体の各重鎖の可変領域をコード表現するマウス核酸配列を示す。配列識別番号Ｎｏ．１０：抗体の各軽鎖の可変領域のペプチド配列を示す。
【図８Ａ】配列識別番号Ｎｏ．１１：抗体の各重鎖の可変領域のペプチド配列を示す。  配列識別番号Ｎｏ．１２：抗体の軽鎖の発現ベクターに対応する核酸配列を示す。
【図８Ｂ】配列識別番号Ｎｏ．１２：抗体の軽鎖の発現ベクターに対応する核酸配列を示す。
【図８Ｃ】配列識別番号Ｎｏ．１２：抗体の軽鎖の発現ベクターに対応する核酸配列を示す。
【図８Ｄ】配列識別番号Ｎｏ．１３：抗体の各軽鎖の可変領域をコード表現するマウス−ヒト・キメラ性核酸配列を示す。  配列識別番号Ｎｏ．１４：配列識別番号Ｎｏ．１３の核酸配列から推定される抗体の各軽鎖のペプチド配列を示す。配列識別番号Ｎｏ．１８：本発明による抗体の重鎖の発現ベクターに対応する核酸配列を示す。
【図８Ｅ】配列識別番号Ｎｏ．１８：本発明による抗体の重鎖の発現ベクターに対応する核酸配列を示す。
【図８Ｆ】配列識別番号Ｎｏ．１８：本発明による抗体の重鎖の発現ベクターに対応する核酸配列を示す。
【図８Ｇ】配列識別番号Ｎｏ．１８：本発明による抗体の重鎖の発現ベクターに対応する核酸配列を示す。配列識別番号Ｎｏ．１９：本発明による抗体の重鎖をコード表現する核酸配列を示す。
【図８Ｈ】配列識別番号Ｎｏ．１９：本発明による抗体の重鎖をコード表現する核酸配列を示す。配列識別番号Ｎｏ．２０：配列識別番号Ｎｏ．１９の配列から推定される抗体の重鎖のペプチド配列を示す。配列識別番号Ｎｏ．２１：抗体の各掲載の定常領域をコード表現する核酸配列を示す。配列識別番号Ｎｏ．２３：γ１タイプの抗体の各重鎖の定常領域をコード表現するヒト核酸領域を示す。
【図８Ｉ】配列識別番号Ｎｏ．２３：γ１タイプの抗体の各重鎖の定常領域をコード表現するヒト核酸領域を示す。配列識別番号Ｎｏ．３１：配列識別番号Ｎｏ．２１から推定される抗体の各軽鎖の定常領域のペプチド配列を示す。配列識別番号Ｎｏ．３４：配列識別番号Ｎｏ．２３から推定される抗体の各重鎖の定常領域のペプチド配列を示す。  配列識別番号Ｎｏ．６：Ｋａｂａｔナンバリングによる抗体の軽鎖のＣＤＲ１配列を示す。  配列識別番号Ｎｏ．８：Ｋａｂａｔナンバリングによる抗体の軽鎖のＣＤＲ２配列を示す。
【図８Ｊ】配列識別番号Ｎｏ．９：Ｋａｂａｔナンバリングによる抗体の軽鎖のＣＤＲ３配列を示す。  配列識別番号Ｎｏ．１５：ＩＭＧＴナンバリングによる抗体の軽鎖のＣＤＲ１配列を示す。  配列識別番号Ｎｏ．１６：ＩＭＧＴナンバリングによる抗体の軽鎖のＣＤＲ２配列を示す。配列識別番号Ｎｏ．１７：ＩＭＧＴナンバリングによる抗体の軽鎖のＣＤＲ３配列を示す。配列識別番号Ｎｏ．２２：Ｋａｂａｔナンバリングによる抗体の重鎖のＣＤＲ１配列を示す。配列識別番号Ｎｏ．２４：Ｋａｂａｔナンバリングによる抗体の重鎖のＣＤＲ２配列を示す。配列識別番号Ｎｏ．２５：Ｋａｂａｔナンバリングによる抗体の重鎖のＣＤＲ３配列を示す。
【図８Ｋ】配列識別番号Ｎｏ．２６：ＩＭＧＴナンバリングによる抗体の重鎖のＣＤＲ１配列を示す。配列識別番号Ｎｏ．２７：ＩＭＧＴナンバリングによる抗体の重鎖のＣＤＲ２  配列を示す。配列識別番号Ｎｏ．２８：ＩＭＧＴナンバリングによる抗体の重鎖のＣＤＲ３  配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
前記技術的問題に対処することを目的として、本出願人は、ヒトＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体を対象としたモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片またはモノクローナル抗体誘導体を開発した。これらにおいて、各軽鎖の可変領域は配列識別番号Ｎｏ．５のマウス核酸配列によりコード表現され、各重鎖の可変領域は、配列識別番号Ｎｏ．７のマウス核酸配列、または配列識別番号Ｎｏ．５及びＮｏ．７の配列と性質上の十分な相同性を有し、また前記抗体がその改変されるべきでない抗原に対して結合親和性を有している核酸配列によりコード表現され、そしてその軽鎖及び重鎖の定常領域は非マウス種に由来する定常領域である。
【００２９】
前記抗体はジスルフィド架橋により連結された重鎖及び軽鎖で構成される。Ｎ末端位置の各鎖は、抗体が向けられる抗原に特異的な可変領域（またはドメイン）（軽鎖については再配列Ｖ−Ｊ遺伝子、重鎖についてはＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子によりコード表現される）からなり、Ｃ末端位置の各鎖は、軽鎖については単一のＬＣドメインまたあるいは重鎖については複数のドメインにより構成される定常領域からなる。
【００３０】
前記２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖の全般的構造は互いに類似性を有している。軽鎖は空間的に互いに独立して折り畳まれた可変ドメインＶ及び定常ドメインＣの２つのドメインからなる。これらはＶＬ、ＣＬと示される。また重鎖はＶＨと示されるＶドメイン、及びＣＨ１〜ＣＨ４と示される３または４Ｃドメインからなる。各ドメインは約約１１０個のアミノ酸からなり、比較可能な同等の構造を有している。前記２つの重鎖はジスルフィド架橋により連結されており、また各重鎖はジスルフィド架橋により軽鎖にも連結されている。
【００３１】
抗原に対する抗体の特異性を決定する領域は可変部分内に存在し、また一方で定常部分は異なる機能特性を媒介するための補体としてエフェクター細胞または分子の受容体Ｆｃと相互作用する。
【００３２】
本発明の目的にとって、『モノクローナル抗体』または『モノクローナル抗体の組成物』なる表現は、同じまたは独自の特異性を有する抗体分子の調製物を指す。またさらに本出願の明細書本文、請求項、図面において、『モノクローナル抗体』とはこのような抗体の完全なモノクローナル抗体、断片または誘導体を意味する。
【００３３】
特に有利には、本発明の枠内において、十分な相同性（その性質及びその抗体のその改変されるべきでない抗原への結合親和性という点において）とは７０％〜ｌ００％の相同性を意味する。
【００３４】
本発明によれば、第２の参照核酸と少なくとも７０％の相同性を有する第１の核酸は、前記第２の参照核酸と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．３％、９８．６％、９９％、９９．６％のヌクレオチド同一性を有している。
【００３５】
本発明によれば、第２の参照ポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有する第１のポリペプチドは、前記第２の参照ポリペプチドと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．３％、９８．６％、９９％、９９．６％のアミノ酸同一性をを有している。
【００３６】
本発明での意味において、２つの核酸配列または２つのポリペプチド配列間の『相同性のパーセンテージ』は、比較ウィンドウ上で最適に整列させた２つの配列を比較することにより決定される。
【００３７】
比較ウィンドウ内のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部は、最適に整列させた２つの配列について、参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわちギャップ）を含むものとし得る。
【００３８】
この相同性のパーセンテージは、同一の核塩基またはアミノ酸残基が比較される両者の配列中に存在する位置の数を求めて、合致する位置の数を出し、合致した位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の合計の数で除算し、この結果に１００を乗算して前記２つの配列のヌクレオチド同一性のパーセンテージまたは前記２つの配列のアミノ酸同一性のパーセンテージを出すことにより計算する。
【００３９】
比較のための配列の最適な整列は、既知のアルゴリズムを用いてコンピューターで行うことができる。
【００４０】
最適な比較のために、前記配列の同一性のパーセンテージは、以下のパラメーターにより、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（バージョン１．８２）によって得ることができる：（１）ＣＰＵ  ＭＯＤＥ＝Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ｍｐ；（２）ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ＝ｆｕｌｌ；（３）ＯＵＴＰＵＴ  ＦＯＲＭＡＴ＝ａｌｎ  ｗ／ｎｕｍｂｅｒｓ；（４）ＯＵＴＰＵＴ  ＯＲＤＥＲ＝ａｌｉｇｎｅｄ；（５）ＣＯＬＯＲ  ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ＝ｎｏ；（６）ＫＴＵＰ（ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）＝ｄｅｆａｕｌｔ；（７）ＷＩＮＤＯＷ  ＬＥＮＧＴＨ＝ｄｅｆａｕｌｔ；（８）ＳＣＯＲＥＴＹＰＥ＝ｐｅｒｃｅｎｔ；（９）ＴＯＰＤＩＡＧ＝ｄｅｆａｕｌｔ；（１０）ＰＡＩＲＧＡＰ＝ｄｅｆａｕｌｔ；（１１）ＰＨＹＬＯＧＥＮＥＴＩＣ  ＴＲＥＥ／ＴＲＥＥ  ＴＹＰＥ＝ｎｏｎｅ；（１２）ＭＡＴＲＩＸ＝ｄｅｆａｕｌｔ；（１３）ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝ｄｅｆａｕｌｔ；（１４）ＥＮＤ  ＧＡＰＳ＝ｄｅｆａｕｌｔ；（１５）ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＳＩＯＮ＝ｄｅｆａｕｌｔ；（１６）ＧＡＰ  ＤＩＳＴＡＮＣＥＳ＝ｄｅｆａｕｌｔ；（１７）ＴＲＥＥＴＹＰＥ＝ｃｌａｄｏｇｒａｍ；及び、（１８）ＴＲＥＥ  ＧＲＡＰ  ＤＩＳＴＡＮＣＥＳ＝ｈｉｄｅ。
【００４１】
本発明によれば、『その性質及びその抗体のその抗原への結合親和性が改変されない』という表現は、一方で、各軽鎖の可変領域が配列識別番号Ｎｏ．５の配列によりコード表現され、また各重鎖の可変領域が配列識別番号Ｎｏ．７の配列によりコード表現される抗体と相同性を有する抗体は同じ抗原に結合し、また他方で、それらの結合親和性が、各軽鎖の可変領域が配列識別番号Ｎｏ．５の配列によりコード表現され、各重鎖の可変領域が配列識別番号Ｎｏ．７の配列によりコード表現される抗体の結合親和性の９０％に等しいという事実を意味する。
【００４２】
『その性質及びその抗体のその改変されるべきでない抗原への結合親和性という点で配列識別番号Ｎｏ．５及びＮｏ．７の配列と十分な相同性を有する核酸配列』という表現は、その性質及びその抗体のその改変されるべきでない抗原への結合親和性という点で配列識別番号Ｎｏ．５及びＮｏ．７の配列と十分な相同性を有する少なくとも１つの免疫グロブリンドメインまたは断片及び抗体誘導体を含む、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を意味する。
【００４３】
ここで『免疫グロブリンドメイン』とは、ドメインＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４の内のいずれか１つのドメインを意味する。本発明による抗体は、有利にはこれらのドメインの内の１つ以上のドメインを含むので、これらのドメインの全ての組み合わせが本発明の一部を構成する。
【００４４】
『免疫グロブリン断片』とは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ断片、ｓｃＦｖまたはＣＤＲ（相補性決定領域）の内から選択された１つの断片を意味する。
【００４５】
パパインによる免疫グロブリンの酵素消化により、『Ｆａｂ断片』（断片抗原結合）及び『Ｆｃ断片』（結晶化可能断片）と呼ばれる２つの同一の断片を生成する。このＦｃ断片は、この免疫グロブリンのエフェクター機能をつかさどる。
【００４６】
ペプシンで消化することによりＦ（ａｂ’）２断片が生成される。ここで２つのＦａｂ断片は２つのジスルフィド架橋により結合されたままで、Ｆｃ断片は複数のペプチドに分割される。このＦ（ａｂ’）２断片は、２つのＦａｂ’断片が鎖間のジスルフィド架橋によって結合され１つのＦ（ａｂ’）２を形成することによって形成される。
【００４７】
なお重鎖及び軽鎖の可変領域において、配列可変性は等しく分配されるわけではない。実際、可変領域は、一方では４つのフレーム（ＦＲ１〜ＦＲ４）である『フレームワーク』（ＦＲ）として知られる変化の殆どない領域により、他方では『超可変』領域、あるいは３つの領域である（ＣＤＲ１〜３）ＣＤＲとして知られる可変性の極端に高い領域により構成される。
【００４８】
このように本発明による抗体は、有利にはこれらの断片の内の１つ以上を含むことができ、上述の断片の全ての組み合わせが本発明の一部を構成する。
【００４９】
本発明の１つの具体的な実施態様で、本発明による抗体は、少なくとも１つの免疫グロブリンドメイン及び少なくとも１つの免疫グロブリン断片、例えばＦｃ断片及び１つ以上の可変または超可変領域を含む。
【００５０】
最後に、『抗体誘導体』とは、１つ以上のアミノ酸残基の１つ以上の変異、置換、欠失及び／または付加を含むことができる任意の抗体を意味する。このような付加、置換または欠失は、分子のどこに位置していてもよい。複数のアミノ酸が付加、置換または欠失している場合においては、得られる抗体が少なくとも本発明の抗体の有利な特性を依然として有しているという条件下で、付加、置換、欠失のあらゆる組合せを想定し得る。
【００５１】
本発明による抗体は、その軽鎖及び重鎖の可変領域あるいはこれらの領域の少なくとも１つのドメインまたは断片が異なる種の軽鎖及び重鎖の定常領域に属する、『キメラ』抗体であると理解される。
【００５２】
配列識別番号Ｎｏ．５及びＮｏ．７のマウス核酸配列は、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）から番号ＣＲＬ−１６９１の下で入手可能なマウスハイブリドーマＣ７によって生成される抗体の、各軽鎖の可変ドメイン及び各重鎖の可変ドメインをコードする。このハイブリドーマは、ＬＤＬ−Ｒに対するＩｇＧ２ｂアイソタイプのマウスモノクローナル抗体を生成する。
【００５３】
このヒトＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−Ｒ）は、細胞外領域（１−７６８）、膜貫通領域（７６８−７９０）、細胞質領域（７９０−８３９）の３つの領域からなる、８３９アミノ酸の膜貫通タンパク質である。この細胞外領域は、２つのサブ領域‐ＬＤＬ（１−３２２）を結合する領域及びＬＤＬ（３２３−７６８）を結合する前記領域外の領域‐に分割される。
【００５４】
本発明の抗体のマウス配列は、マウス抗体Ｃ７のＬＤＬ−Ｒ抗原に対する特異性のため、本発明による抗体の可変領域あるいはこれらの領域の少なくとも１つのドメインまたは断片をコードするように選択されている。この抗体Ｃ７はウシＬＤＬ−Ｒの細胞外ドメインでの免疫化によって生成される。これはウシＬＤＬ−Ｒ以外ではヒトＬＤＬ−Ｒと結合するが、ラット、マウス、チャイニーズハムスター、ウサギ、イヌのＬＤＬ−Ｒ（Ｂｅｉｓｉｅｇｅｌら、１９８１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，１１９２３−１１９３１）とは交差反応しない。モノクローナル抗体の生成株はこれらの種に由来する株である場合が非常に多いので、この特性は有益である。このようにこの組み換え抗体は株ＹＢ２／０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＣＨＯなどに由来する細胞株において有利に生成することができる。なおここに挙げた株は例であり、これらの株に限定されるものではない。
【００５５】
また本発明の抗体は、そのペプチド配列が配列識別番号Ｎｏ．６、８、９、１５、１６、１７、２２、２４、２５、２６、２７、２８の配列から選択されるＣＤＲ領域を有する抗体をも意味する。
【００５６】
これらの配列は、マウス抗体Ｃ７に由来するＣＤＲ領域の配列、Ｋａｂａｔナンバリングによる抗体の軽鎖のＣＤＲ１配列を示す配列識別番号Ｎｏ．６の配列、Ｋａｂａｔナンバリングによる抗体の軽鎖のＣＤＲ２配列を示す配列識別番号Ｎｏ．８の配列、Ｋａｂａｔナンバリングによる抗体の軽鎖のＣＤＲ３配列を示す配列識別番号Ｎｏ．９の配列、ＩＭＧＴナンバリングによる抗体の軽鎖のＣＤＲ１配列を示す配列識別番号Ｎｏ．１５の配列、ＩＭＧＴナンバリングによる抗体の軽鎖のＣＤＲ２配列を示す配列識別番号Ｎｏ．１６の配列、ＩＭＧＴナンバリングによる抗体の軽鎖のＣＤＲ３配列を示す配列識別番号Ｎｏ．１７の配列、Ｋａｂａｔナンバリングによる抗体の重鎖のＣＤＲ１配列を示す配列識別番号Ｎｏ．２２の配列、Ｋａｂａｔナンバリングによる抗体の重鎖のＣＤＲ２配列を示す配列識別番号Ｎｏ．２４の配列、Ｋａｂａｔナンバリングによる抗体の重鎖のＣＤＲ３配列を示す配列識別番号Ｎｏ．２５の配列、ＩＭＧＴナンバリングによる抗体の重鎖のＣＤＲ１配列を示す配列識別番号Ｎｏ．２６の配列、ＩＭＧＴナンバリングによる抗体の重鎖のＣＤＲ２配列を示す配列識別番号Ｎｏ．２７の配列、ＩＭＧＴナンバリングによる抗体の重鎖のＣＤＲ３配列を示す配列識別番号Ｎｏ．２８の配列である。
【００５７】
また本発明は、各軽鎖の可変ドメイン及び各重鎖の可変ドメインが配列識別番号Ｎｏ．５及び配列識別番号Ｎｏ．７の各配列と少なくとも７０％、有利には少なくとも８０％または９０％または９９％の相同性を有している抗体をも含む。ここでこれらの配列改変により抗体の特異性が改変されることはない。また好ましくは、これらの配列改変はその標的に対する親和性を低減させない。
【００５８】
また本発明による抗体は、非マウス種に属するその軽鎖及び重鎖の定常領域をも保有している。この態様において、非マウス哺乳動物の全ての科及び種類、具体的にはヒト、サル、ネズミ科（マウスを除く）、イノシシ科、ウシ科、ウマ科、ネコ科、イヌ科の動物、そして例えば鳥類も利用することができる。
【００５９】
本発明による抗体は、本技術分野の当業者には周知の標準的組み換えＤＮＡ技術を利用し、より具体的には例えばＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，ｐｐ．６８５１−５５（１９８４）において述べられている『キメラ』抗体の構築技術を利用して構築することができ、ここで組み換えＤＮＡ技術は非ヒト哺乳動物に由来する抗体の重鎖の定常領域及び／または軽鎖の定常領域をヒト免疫グロブリンの対応する領域に置き換えるために利用される。このような抗体及びそれらの調製法は、例えば特許出願ＥＰ第１７３  ４９４号、文献Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２（５９９５）：６０４−８（１９８５）、文献ＥＰ第１２５  ０２３号においても述べられている。キメラ性抗体を生成する方法は本技術分野の当業者にとって幅広く応用することができる。例えば抗体の重鎖及び軽鎖は、各鎖に１つのベクターを用い別々に発現させることも、あるいは単一のベクター内に組み込むことも可能である。
【００６０】
発現ベクターとは、抗体の各重鎖または軽鎖の可変ドメインをコードするマウス核酸配列及び抗体の各重鎖または軽鎖の定常領域をコードする核酸配列、好ましくはヒト核酸配列が挿入され、またそれらがホスト細胞内に導入され、保持されている核酸分子である。発現ベクターは発現に不可欠な配列（プロモータ、ポリアデニル化配列、選択遺伝子）を保有しており、これによってホスト細胞内での外来核酸のこれら断片の発現が可能となる。このベクターは、例えばプラスミド、アデノウィルス、レトロウイルスまたはバクテリオファージであり、またこのホスト細胞は、任意の哺乳動物細胞、例えばＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ、ヒトミエローマ（例えば、Ｎａｍａｌｗａ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＨＯ株、特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ  １４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３である。
【００６１】
本発明によるキメラ性抗体の発現ベクターの構築のために、合成シグナル配列及び適切な制限サイトを、ＰＣＲ増幅反応によって可変領域に融合させることができる。次にこの可変領域を抗体、好ましくはヒトＩｇＧ１の定常領域と結合させる。このようにして構築された遺伝子を、２つの別々のベクター（各鎖について１つである）を使用して、プロモータ‐例えばＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＭＬＰ（主要後期プロモータ）の制御下かつポリアデニル化部位の上流にクローニングする。なおこれらのプロモータは例でありそれらへの限定を示すものではない。またこのベクターは、例えばｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸還元酵素）遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子のような本技術分野における当業者には周知の選択遺伝子とともに提供される。
【００６２】
本発明によるキメラ性抗体は、本技術分野における当業者に周知の方法（リン酸カルシウムを用いる共沈法、電気せん孔法、顕微注入法、その他）を利用して、軽鎖の発現ベクター及び重鎖の発現ベクターのホスト細胞内での同時トランスフェクションによって生成することができる。トランスフェクションの終了時に、細胞を、例えば５％透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｆ．１０６０３−０１７）、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｆ．１０１３１−０２７）、２５ｎＭのメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ，ｒｅｆ．Ｍ８４０７）を含むＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｆ．  ２１８７５−０３４）のような選択培地に配置することができる。耐性トランスフェクションウェルの上澄みは、ヒトＩｇ配列または定常部分が他の種に由来する場合その種の配列に特異的なＥＬＩＳＡ測定を用いて、キメラ免疫グロブリン（Ｉｇ）の存在についてスクリーニングされる。抗体を最も多く生成するトランスフェクタントは増幅され、そしてそれらの上澄みは、それらの生成率を見積もり、また限界希釈（４０細胞／プレート）によるクローニングにとって最も良好である３つの生成体を選択するためＥＬＩＳＡ測定により再測定される。
【００６３】
１つの具体的な実施の形態を以下に説明する。
好ましくは、本発明による抗体の各軽鎖の可変領域は配列識別番号Ｎｏ．１０のペプチド配列を保有しており、本発明による抗体の各重鎖の可変領域は配列識別番号Ｎｏ．１１のペプチド配列を保有している。配列識別番号Ｎｏ．１０のペプチド配列は配列識別番号Ｎｏ．５のヌクレオチド配列から亜推定されるペプチド配列であり、配列識別番号Ｎｏ．１１のペプチド配列は配列識別番号Ｎｏ．７のヌクレオチド配列から亜推定されるペプチド配列である。
【００６４】
好ましくは、本発明による抗体の各軽鎖及び各重鎖の定常領域はヒトの定常領域である。本発明のこの好ましい実施の形態はヒトにおける抗体の免疫源性を低下させることが可能であり、同様にヒトに対する治療的あるいは予防的投与中にその効果を改善することが可能である。
【００６５】
本発明による１つの好ましい実施の形態で、本発明による抗体の各軽鎖の定常領域はタイプκのものである。例えば、ｋｍ（１）、ｋｍ（１，２）、ｋｍ（１，２，３）あるいはｋｍ（３）など、いかなるアロタイプでも本発明を実行するために用いることが可能である。
【００６６】
本発明の別の実施の形態で、本発明による抗体の各軽鎖の定常領域はタイプλのものである。
【００６７】
本発明の１つの具体的な実施態様で、特に本発明による抗体の各軽鎖及び各重鎖の定常領域はヒトの領域である場合、その抗体の各重鎖の定常領域はタイプγのものである。この変例によれば、その抗体の各重鎖の定常領域はすべてヒトの相補体に結合する特徴を有するタイプγ１、タイプγ２、タイプγ３であってもよく、あるいはタイプγ４であってもよい。各重鎖の定常領域がタイプγであるような抗体はＩｇＧクラスに属している。タイプＧ免疫グロブリン（ＩｇＧ）はジスルフィド架橋で相互に接続された２つの重鎖と２つの軽鎖によって構成されるヘテロダイマーである。各鎖は、Ｎ末端位置では、その抗体が向き合う抗原に特異的な可変領域あるいはドメイン（軽鎖に関しては再配列されたＶ−Ｊ遺伝子、重鎖に関してはＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子でコード表現される）で構成され、Ｃ末端位置では、軽鎖に関しては単一のＬＣドメインで、重鎖に関しては３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）で構成されている。可変ドメインＶＨ及びＶＬと重鎖及び軽鎖の定常ドメインＣＨ１及びＣＬの組み合わせがＦａｂ部分を形成し、これらの部分が非常に可撓性のあるヒンジ領域によってＦｃ領域に接続されており、各Ｆａｂがその抗原標的に結合できるようにしていると同時に、その抗体のエフェクター性を媒介しているＦｃ領域がＦｃγＲ受容体、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）及びＣ１ｑなどのエフェクター分子にアクセス可能な状態のままである。２つの球状ドメインＣγ２及びＣγ３によって構成されるＦｃ領域は、その２つの鎖のそれぞれの上のＡｓｎ２９７に結合された２つの触角を有するＮ−グリカンの存在によってＣγ２ドメインでグリコシル化されている。
【００６８】
好ましくは、その抗体の各重鎖の定常領域はタイプγ１で、従って、抗体はほとんどの（ヒト）個人でＡＤＣＣ（抗体依存細胞の細胞毒性）をつくりだす能力を示すのである。こうした観点から、例えば、Ｇ１ｍ（３）、Ｇ１ｍ（１，２，１７）、ＧＩｍ（１，１７）あるいはＣ１ｍ（１，３）など、どんなアロタイプでも本発明を実行するために用いることができる。
【００６９】
本発明の１つの特殊な実施態様で、上記抗体の各重鎖の定常領域はタイプγ１で、それは配列識別番号Ｎｏ．２３のヒト核酸配列によってコード表現され、その各軽鎖の定常領域は配列識別番号Ｎｏ．２１のヒト核酸配列、あるいは配列識別番号Ｎｏ．２３あるいは配列識別番号Ｎｏ．２１に類似した配列、あるいはそれらの配列の断片によってコード表現される。従って、そうした抗体はマウス可変領域とヒト定常領域を有し、その重鎖はタイプγ１である。この抗体は、従って、ＩｇＧ１サブ−クラスに属する。この抗体は２つの軽鎖を有し、その可変ドメインは配列識別番号Ｎｏ．５のマウス核酸配列によってコード表現され、さらにそのヒト定常領域は配列識別番号Ｎｏ．２１の核酸配列によってコード表現される。さらにこの抗体は２つの重鎖を含み、その可変領域は配列識別番号Ｎｏ．  ７のマウス核酸配列によってコード表現され、その定常領域は配列識別番号Ｎｏ．２３のヒト核酸配列によってコード表現される。
【００７０】
好ましくは、本発明による抗体の各軽鎖は配列識別番号Ｎｏ．１３のマウス−ヒト・キメラ性核酸配列によってコード表現され、各重鎖は配列識別番号Ｎｏ．１９のマウス−ヒト・キメラ性核酸配列によってコード表現される。この抗体の各軽鎖をコード表現する配列識別番号Ｎｏ．１３のマウス−ヒト・キメラ性核酸配列は、この抗体の各軽鎖の可変ドメインをコード表現する配列識別番号Ｎｏ．５のマウス核酸配列とその抗体の各軽鎖の定常領域をコード表現する配列識別番号Ｎｏ．２１のヒト核酸配列の融合によって得られる。この各重鎖をコード表現する配列識別番号Ｎｏ．１９のマウス−ヒト・キメラ性核酸配列は、この抗体の各重鎖の可変ドメインをコード表現する配列識別番号Ｎｏ．７のマウス核酸配列とその抗体の各重鎖の定常領域をコード表現する配列識別番号Ｎｏ．２３のヒト核酸配列の融合によって得られる。
【００７１】
本発明のそうした特殊な態様で、その抗体の各軽鎖が配列識別番号Ｎｏ．１３のマウス−ヒト・キメラ性核酸配列でコード表現され、各重鎖が配列識別番号Ｎｏ．１９のマウス−ヒト・キメラ性核酸配列によってコード表現される場合、配列識別番号Ｎｏ．１３の核酸配列から推定される各軽鎖のペプチド配列は配列識別番号Ｎｏ．１４の配列であり、配列識別番号Ｎｏ．１９の核酸配列から推定される各重鎖のペプチド配列は配列識別番号Ｎｏ．２０の配列である。
【００７２】
本発明はまた、マウス−ヒト・キメラ性核酸配列によってコード表現される各軽鎖が配列識別番号Ｎｏ．１３のマウス−ヒト・キメラ性核酸配列と少なくとも７０％の相同性を有しており、マウス−ヒト・キメラ性核酸配列によってコード表現される各重鎖が配列識別番号Ｎｏ．１９のマウス−ヒト・キメラ性核酸配列と少なくとも７０％、好適には少なくとも８０％、あるいは９０％か９９％の相同性を有している抗体に関するものであり、これらの相同性の違いは抗体の特異性にもそのエフェクター活性にも影響を及ぼさない。
【００７３】
好適に、本発明による抗体は毒素に結合される。この毒素は、例えば、ジフテリア毒素あるいはリシンであるが、これらだけに限定されるものではない。本発明による抗体とこの毒素とのあいだの結合はその毒素の身体組織からの放出を防ぐのには十分に強く、また、その毒素が標的細胞内に放出される程度には十分に不安定である。
【００７４】
本発明の別の態様で、この抗体は放射性同位元素に結合される。この放射性同位元素の存在は、細胞毒性をかなり増大させる。基本的には２つの同位元素が用いられ、その１つヨウ素１３１（ベータ線及びガンマ線放出性）で、その半減期は比較的長く（８日間）、抗体と結合した腫瘍細胞の周囲約１ｍｍ程度に殺腫瘍効果を及ぼす。ヨウ素１３１は画像形成を可能にするという利点を有しているが、放射線防護基準への適合を必要とする。もう１つはイットリウム９０（ベータ線放出性）で、その半減期はより短く（２．５日間）、５ｍｍの距離で殺腫瘍効果を示す。
【００７５】
好適に、本発明の抗体はラットハイブリドーマ細胞株内でつくられる。本発明による抗体生成株は、抗体に対してその特殊な性質を付与するので非常に特徴的である。実際、それらの抗体の発現の手段は翻訳後修飾、特にグリコシル化修飾の複製基点にあり、これはひとつの細胞株から別の細胞株に変わる場合があり、したがって最初の時点では同一の主要配列をもっていた抗体に異なった機能的性質を付与する場合がある。
【００７６】
１つの実施の形態で、抗体はラット株ＹＢ２／０（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６２の番号で預託されている細胞ＴＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０）内で生成される。
【００７７】
本発明による１つの好ましい抗体はハイブリドーマＲ６０４によってつくりだされる抗体ＥＭＡＢ６０４（ＣＮＣＭ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｅ  Ｐｒｏｆｅｓｓｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、番号Ｉ−３６９２で２００６年１１月１４日に預託）である。ハイブリドーマ細胞Ｒ６０４によってつくられるモノクローナル抗体の各軽鎖の可変領域は配列識別番号Ｎｏ．５の核酸配列によってコード表現され、そしてハイブリドーマ細胞Ｒ６０４によってつくられるモノクローナル抗体の各重鎖の可変領域は配列識別番号Ｎｏ．７の核酸配列によってつくりだされる。
【００７８】
本発明の１つの特殊な課題はＬＤＬ−Ｒに結合して、エフェクター細胞のリクルートを可能にするモノクローナル抗体に関係している。好ましくは、この抗体はＥＭＡＢ６０４あるいは抗体ＥＭＡＢ６０４と同一の機能的特徴を有するヒト化された又はヒト・キメラ性抗体である。好適に、この抗体は細胞株Ｒ６０４によってつくりだされる。
【００７９】
本発明の別の主題は配列識別番号Ｎｏ．１２の、本発明による抗体の軽鎖の発現ベクターに関連している。このベクターは、その軽鎖が配列識別番号Ｎｏ．１３の核酸配列によってコード表現される本発明による抗体の発現を可能にするベクターで、その推定されるペプチド配列は配列識別番号Ｎｏ．１４の配列である。このベクターは核酸分子で、その内部にそれらをホスト細胞内に導入してそれらを保持するために、その抗体の各軽鎖の可変ドメインをコード表現する配列識別番号Ｎｏ．５のマウス核酸配列と、その抗体の各軽鎖の定常領域をコード表現する配列識別番号Ｎｏ．２１の核酸配列が挿入されている。この核酸分子は、この発現に不可欠な配列（プロモータ、ポリアデニル化配列、選択遺伝子）を保有しているので、ホスト細胞内での外来核酸のこれらの断片の発現を可能にしてくれる。こうしたベクターは当業者には良く知られており、アデノウィルス、レトロウィルス、プラスミド、あるいはバクテリアファージなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明による抗体を発現する細胞、例えば、ＹＢ２／０、ＣＨＯ、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−（例えば、ＣＨＯ  ＤＸ  Ｂ１１、ＣＨＯ  ＤＧ４４）、ＣＨＯ  Ｌｅｃ１３、ＳＰ２／０、ＮＳ０、２９３、ＢＨＫあるいはＣＯＳなどのどんな哺乳動物細胞でもホスト細胞として用いることができる。
【００８０】
本発明のもうひとつの主題は、配列識別番号Ｎｏ．１８の、本発明による抗体の重鎖の発現ベクターに関係している。このベクターは本発明による抗体の発現を可能にするベクターで、その重鎖は配列識別番号Ｎｏ．１９の核酸配列によってコード表現され、その推定ペプチド配列は配列識別番号Ｎｏ．２０の配列である。このベクターは核酸分子で、その内部に、それらをホスト細胞内に導入してそれらを保持するために、その抗体の各重鎖の可変ドメインをコード表現する配列識別番号Ｎｏ．７のマウス核酸配列と、その抗体の各重鎖の定常領域をコード表現する配列識別番号Ｎｏ．２３の核酸配列が挿入されている。この核酸分子は、この発現に不可欠な配列（プロモータ、ポリアデニル化配列、選択遺伝子）を保有しているので、ホスト細胞内での外来核酸のこれらの断片の発現を可能にしてくれる。前にも述べたように、このベクターはアデノウィルス、レトロウィルス、プラスミド、あるいはバクテリアファージなどであってもよく、そのホスト細胞は、例えば、ＹＢ２／０、ＣＨＯ、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−（例えば、ＣＨＯ  ＤＸ  Ｂ１１、ＣＨＯ  ＤＧ４４）、ＣＨＯ  Ｌｅｃ１３、ＳＰ２／０、ＮＳ０、２９３、ＢＨＫあるいはＣＯＳなどのどんな哺乳動物細胞であってもよい。
【００８１】
細胞ＹＢ２／０内におけるこれらのベクターの共発現によって生成される抗体はクローンＲ６０４（ＣＮＣＭにＣＮＣＭ  Ｉ−３６９２の番号で預託）によって生成される抗ＬＤＬ−Ｒ抗体ＥＭＡＢ６０４によって示される。この抗体はＡＤＣＣテストの判定によると、強力な細胞毒性を有している。さらに、抗体ＥＭＡＢ６０４はＪｕｒｋａｔ−ＣＤ１６細胞株によるＩＬ−２の分泌を誘発し、このテストはこれらの抗体によってＣＤ１６受容体が活性化される可能性を実証するために用いられている。培養液内で前に述べたベクターの発現を可能にするような条件下でクローンＲ６０４を培養することでつくりだすことができる抗体ＥＭＡＢ６０４は、従って、黒色腫の治療と診断を前進させることができる最も有力なツールの１つである。
【００８２】
本発明のもうひとつの主題は、上に述べたような本発明による抗体を生成する安定した細胞株に関係している。
【００８３】
好適に、本発明による安定した細胞株は、その抗体が発現される細胞株が、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０  （アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６２の番号で預託されている細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０）、ＳＰ２／０−ＡＧ１４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）、ＩＲ９８３Ｆ、ヒト骨髄腫ナマルワ、ＰＥＲＣ６、ＣＨＯ株、特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３で構成される群から選択されることを特徴としている。
【００８４】
本発明の安定した細胞株は、前に述べた２つの発現ベクターを組み込んでいる。
【００８５】
本発明の別の主題は、フランスのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５）に預託番号ＣＮＣＭ１−３６９２で預託されているハイブリドーマＲ６０４に関連している。
【００８６】
好適に、本発明による抗体はエフェクター免疫細胞のリクルートを可能にしてくれる。
【００８７】
こうした抗体は、その特異性と親和性が優れているので、ＡＤＣＣ（抗体依存細胞媒介細胞毒性）反応の緩和に寄与することができるツールである。実際、本発明による抗体は、ＬＤＬ−Ｒに対する優れた親和性を有しており、一方、エフェクター免疫細胞のリクルートを可能にしてくれる。本発明においては、『エフェクター免疫細胞』とは本発明による抗体が結合する細胞（『標的細胞』）の破壊を引き起こす細胞を意味している。
【００８８】
抗ＬＤＬ−Ｒ抗体ＥＭＡＢ６０４はＮＫ細胞によって発現されるＦｃｇａｍｍａ受容体ＲＩＩＩａあるいはＣＤ１６と強力に相互作用する能力を有している。この結合は抗ＣＤ２０抗体Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）より強く、ＬＦＢのＥＭＡＢＬｉｎｇプラットフォームによってつくりだされる抗ＣＤ２０抗体のそれとほぼ同程度である。ＣＤ１６に対するこの強力な結合は、抗ＬＤＬ−Ｒ抗体ＥＭＡＢ６０４に対する最適化された細胞毒性の開発を可能にしてくれる。
【００８９】
上に述べたように、この抗体はそのＦｃ部分とＮＫ（ナチュラル・キラー）細胞上に発現される低親和性ＣＤ１６受容体との相互作用に基づいて、ＨＴ１４４（黒色腫）細胞及びＧＵＹ  １７．２細胞のＡＤＣＣ（抗体依存細胞媒介細胞毒性）によって細胞溶解を誘発する。実際、このＡＤＣＣは抗ＣＤ−１６抗体（クローン３Ｇ８）の存在下で抑止される。なお、ＣＤ１６はマクロファージによっても、そして単球の亜母集団内でも発現され、このことは上記単球株の細胞を介して細胞毒性を誘発することによる抗ＬＤＬ−Ｒ抗体ＥＭＡＢ６０４の作用を期待できるようにしてくれる。
【００９０】
さらに、この抗ＬＤＬ−Ｒ抗体ＥＭＡＢ６０４のＣＤ１６受容体に対する強力な結合は、ＨＴ１４４細胞の存在下で、ＣＤ１６（Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ１６）によってトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ株によるインターロイキン−２（ＩＬ−２）の分泌を誘発する能力をその受容体に対して付与する。実際、その標的（ＨＴ１４４）に結合したこの抗体のＦｃ部分は活性化信号を誘発し、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ１６によるＩＬ−２の分泌をもたらす。
【００９１】
一部精製された仔ウシＬＤＬ−Ｒによるマウスの免疫化によって抗体Ｃ７が得られた。それは優れたＬＤＬ競合因子であり、従って天然のＬＤＬ−Ｒリガンドのそれに比肩し得るＬＤＬ−Ｒに対する親和性を有していることが示されている。
【００９２】
これらの抗体はその可変断片によって標的細胞に結合し、その定常断片によってエフェクター細胞に結合する。これら標的細胞とエフェクター細胞との間の抗体の依存関係はＡＤＣＣ（抗体依存細胞媒介細胞毒性）タイプのメカニズムによって標的細胞の溶解を引き起こす。
【００９３】
好適に、本発明による標的細胞は肉腫、骨髄腫、黒色腫、リンパ腫、及び白血病などの腫瘍細胞であるが、これらに限定されるものではない。実際、研究によると、細胞によるＬＤＬ−Ｒの発現レベルの増大とある種の癌との間には相関関係が認められている。ある種の癌にかかっている患者が低コレステロール血を有していることが分かっている。この低コレステロール血は癌細胞によるコレステロールの過剰消費の結果である。それらの癌細胞は、生き残るために、腫瘍組織内でのＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−Ｒ）の発現レベルの増大を誘発する（Ｈｅｎｒｉｃｋｓｓｏｎら、１９８９）。前立腺癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、胃癌、それに白血病などの特定の癌においても同様のことが言える。
【００９４】
その結果、ＬＤＬ−Ｒを過剰に発現する癌細胞は本発明による抗体の好ましい標的となる。抗ＬＤＬ−Ｒ抗体ＥＭＡＢ６０４が黒色腫株ＨＴ１４４及びＧＵＹ  １７．２に結合することが示されている。
【００９５】
従って、本発明はヒトＬＤＬ（低濃度リポタンパク質）受容体に向けられた、黒色腫特有の細胞溶解を引き起こすことができるモノクローナル抗体に関係している。
【００９６】
本発明の別の主題は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏでエフェクター免疫細胞のＦＣγＲＩＩＩ受容体を活性化させるか、あるいはエフェクター細胞によるサイトカイン又はケモカインの分泌を起こすために、本発明による抗体を使用することである。実際、本発明による抗体はそのＦｃ領域によってＦｃγＲＩＩＩＡ受容体を活性化する能力の故に用いることができる。このことはかなりの利点を提供してくれる。というのはこの受容体は『エフェクター細胞』と呼ばれる細胞の表面に発現されるからであり、この抗体のＦｃ領域がエフェクター細胞が持っている受容体に結合すると、ＦｃγＲＩＩＩＡの活性化と標的細胞の破壊をもたらすからである。エフェクター細胞とは、例えば、ＮＫ（ナチュラル・キラー）細胞、マクロファージ、好中球、ＣＤ８リンパ球、Ｔγｄリンパ球、ＮＫＴ細胞、好エオシン球、好塩基球、あるいは肥満細胞である。
【００９７】
本発明のさらに別の特定の主題は前に述べたように医薬品として用いられる抗体である。
【００９８】
本発明の１つの特殊な態様で、用いられる抗体はヒトＬＤＬ受容体に結合され、エフェクター細胞のリクルートを可能にしてくれる。
【００９９】
本発明のさらに別の主題は、ヒトＬＤＬ受容体に向けられたモノクローナル抗体を前立腺癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、胃癌、それに白血病などの癌の治療のための医薬品の製造に用いることである。実際、本発明による抗体はＬＤＬ−Ｒを特異的に標的とする。この実施態様においては、本発明によるこの抗体は、その受容体に結合することによって、特に標的の癌細胞に対するＡＤＣＣによって標的である癌細胞の溶解反応を起こさせ、後者の溶解を可能にする。従って、溶解された細胞は準特異的癌細胞、ＬＤＬ−Ｒを過剰に発現しない、あるいはわずかにしか発現しない健康な細胞で、従って、保存される。
【０１００】
好適に、本発明による抗体を用いて措置される癌は対応する健康な細胞と比較してその癌細胞の表面にＬＤＬ受容体が過剰に発現されている癌である。
特に好適には、措置される癌は黒色腫である。
【０１０１】
従って、本発明は黒色腫治療のための医薬品生産のためにヒトＬＤＬに対するモノクローナル抗体、あるいは上に述べたような抗体を使用することにも関係している。標的の癌細胞はＡＤＣＣ抗体によってＡＤＣＣ反応中にリクルートされたエフェクター細胞によって溶解することができ、ＬＤＬ−Ｒをほとんど、あるいはまったく発現しない健康な細胞、あるいは適切であれば処理中の細胞は認識されず従って保存されるようにＬＤＬ−Ｒ標的のを内部化するためにあらかじめ処理される。
【０１０２】
措置される悪性黒色腫は皮膚表面に広がっていて種々の色や輪郭を有し、その表面が不規則であるような黒色腫、そして、悪性黒色腫の水平方向の発展段階に対応する黒色腫、あるいは腫瘍性の突起があったり、すぐに皮膚を冒してしまう明確に限局性に増殖を示す黒色腫などであってよい。
【０１０３】
好適に、本発明による抗体は株ＨＴ１４４（ＨＴＢ−６３）（ＨＬＡ  Ａ１，  Ａｗ２４，Ｂ１３，Ｂ１５，Ｃｗ３，ＤＲｗ４，ＤＲｗ７）及びＧＵＹ−１７．２から発生する黒色腫に特有な細胞溶解をＣＤ１６に基づいて誘発することができる。
【０１０４】
本発明のさらに別の主題は本発明による抗体を黒色腫上に発現された１つあるいは複数の他の抗原に対する１つあるいは複数の抗体と組み合わせて使用することに関係している。そうした抗原はリンパ細胞上に発現させることもでき、そして、ＨＬＡ−Ｄｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、及びＣＤ４０から選択される。
【０１０５】
本発明の別の主題は、本発明による抗体を細胞毒性あるいは細胞増殖抑制性の医薬品など癌の治療のために（化学療法で）一般的に用いられる１つあるいは複数の医薬品と組み合わせて使用することに関連している。これらの医薬品は当業者は周知であり、例えば、細胞毒性剤の場合であれば、アルキル化剤、窒素マスタード、プラチナ誘導体、内位添加剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ抑制剤、紡錘体毒などであり、また細胞増殖抑制剤の場合としては、チロシン・キナーゼ受容体抑制剤、特にＥＧＦ（内皮成長因子）受容体、インシュリン受容体、ＰＤＧＦ（血小板誘導成長因子）受容体、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）受容体、そしてＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）受容体などであるが、これらに限定されるものではない。
【０１０６】
本発明の１つの特殊な実施態様で、本発明による抗体の使用がｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏで、ＮＫ（ナチュラル・キラー）細胞、ＮＫＴ（ナチュラル・キラーＴ）細胞、Ｔγｄリンパ球、マクロファージ、単球、そしてＣＤ１６を発現するために遺伝子的に修飾されたいずれかの細胞、あるいは樹枝状細胞などのＦｃγＲと組み合わせて実行される。
【０１０７】
本発明の別の主題は、少なくとも１つの上に述べたような本発明による抗体と薬学的に許容される賦形剤及び／又は媒体を含む医薬品組成物に関係している。この医薬品組成物は癌細胞、特にＬＤＬ−Ｒを過剰に発現する癌細胞を標的とすることを意図している。その表面に健康な細胞によって発現される受容体の量と比較してより多い量の受容体を発現するので、従って、本発明によって調製されるこの医薬品はそれらの癌細胞によって優先的に結合される。
【０１０８】
賦形剤は医薬品としての使用が可能で、当業者に周知の、食塩水や生理学的等張性緩衝液などいずれの溶液でも、あるいはいずれの懸濁液、ゲル、粉末などであてってもよい。本発明によるこの組成物は分散剤、可溶化剤、安定剤、界面活性剤、保存剤などから選択された１つあるいは複数の薬剤を含んでいても差し支えない。
【０１０９】
好適に、本発明による組成物は、それらの抗体の標的細胞上に存在しているもう１つの抗原に対する少なくとも１つの抗体も含んでいる。
【０１１０】
好適に、本発明による前記組成物は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体も含んでいる。実際、黒色腫株ＨＴ１４４とＧＵＹ１７．２はその表面にＨＬＡ−ＤＲ抗原を発現する。抗ＬＤＬ−Ｒ及び抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体の混合物をいずれか一方の抗体をその組成物全体の重さの５、２５、５０、７５、あるいは９５％の比率で含んでいる組成物は、黒色腫患者の治療に特に好適である。
【０１１１】
さらに、その組成物はいろいろな方法と形状で投与することが可能である。投与はこの種の治療方式におけるいずれの標準的な経路によってでも行うことができ、特に、全身投与、特に静脈、皮膚内、腫瘍内、皮下、腹腔内、筋肉内、動脈内注射などの方法を用いて行うことができる。例えば、腫瘍内に注射したり、腫瘍に近い場所に注射したり、あるいは腫瘍に浴びせたりする方法も可能である。経口、粘膜経由、あるいは局所投与なども可能である。
用量は投与の回数、その他の活性成分、病状の発展程度などによって変えることができる。
【０１１２】
本発明の別の主題は、癌性の、あるいは健康な、又は肝硬変組織の免疫組織学的分析やＥＬＩＳＡ分析、さらにはｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒ定量テストで本発明による抗体の使用である。
【０１１３】
本発明のその他の実施態様や利点を以下の実施令で述べるが、これらは例示的なものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１１４】
実施例１：抗ＬＤＬ−Ｒキメラ性抗体Ｃ７の発現ベクターの構築
【０１１５】
Ａ：マウス抗体Ｃ７の可変領域のリーダー配列の判定
タイプＩｇＧ２ｂ，ｋの免疫グロブリンを生成するマウスハイブリドーマＣ７の総ＲＮＡを抽出した（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡキット  ７４０６０９．２５０）。逆転写を行った後、抗体Ｃ７の軽（Ｖｋ）及び重（ＶＨ）鎖の可変ドメインを５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）技法（５’ＲＡＣＥ  キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｆ．１８３７４，０４１）によって増幅させた。
【０１１６】
簡単に言うと、第１の逆転写ステージは先ずマウスＣｋあるいはγ２ｂ定常領域の５‘領域に位置しているプライマーを用いて行われた。その後、ポリｄｃ配列を合成ｃＤＮＡの３’位置に付加してから、ポリｄｃ配列を識別する５’プライマーと逆転写プライマーの５’位置のマウスＣｋあるいはγ２ｂ定常領域に位置している３‘プライマー用いてＶｋ及びＶＨ領域の増幅を行った。これら２つのステージに用いられたプライマーは以下の通りである。
【０１１７】
１：逆転写プライマー
ａ：マウス・カッパ固有アンチセンス・プライマー５’−ＡＣＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＧＡＣ−３’（配列識別番号Ｎｏ．１）
ｂ：マウスγ２ｂ固有アンチセンス・プライマー５’−ＣＴＧＴＡＧＡＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧ−３’（配列識別番号Ｎｏ．２）
【０１１８】
２：５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲプライマー
ａ：マウス・カッパ固有アンチセンス・プライマー５’−ＴＴＧＴＴＣＡＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＧＡＧＧＣＡＣ−３’（配列識別番号Ｎｏ．３）
ｂ：マウスγ２ｂ固有アンチセンス・プライマー５’−ＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＧＧＧＡＡＧＴＡＧＣＣＣＴＴＧ−３’（配列識別番号Ｎｏ．４）
【０１１９】
このようにして得られたＶＨ及びＶｋ  ＰＣＲ生成物はベクターｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（ゼロ・ブラントＴＯＰＲ  ＰＣＲクローニング・キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋ２８７５−２０）にクローンし、次に配列決定を行った。
【０１２０】
マウス抗体Ｃ７のＶｋ領域のヌクレオチド配列を配列識別番号Ｎｏ．５の配列で示し、推定されたペプチド配列は配列識別番号Ｎｏ．１０の配列である。Ｖｋ遺伝子はＶｋ１准グループに属する［Ａｌｍａｇｒｏ  ＪＣ  ｅｔ．ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８），４７：３５５−３６３］。Ｋａｂａｔナンバリングによって定義された［Ｋａｂａｔ  ｅｔ．ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，９１−３２４２（１９９１）］マウス抗体Ｃ７のＶｋ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を、配列識別番号Ｎｏ．６、Ｎｏ．８、及びＮｏ．９にそれぞれ示す。ＩＭＧＴ（国際ＩｍＧｅｎｏＧｅｎｅｔｉｃｓデータベース）分析［Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ．ａｌ．，Ｄｅｖ．ｃｏｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）］によって定義されるマウス抗体Ｃ７のＶｋ領域のＣＤＲ１−ＩＭＧＴ、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ、及びＣＤＲ３−ＩＭＧＴ配列を、配列識別番号Ｎｏ．１５、Ｎｏ．１６、及びＮｏ．１７にそれぞれ示す。この定義は、配列可変性分析だけに完全に依存しているＫａｂａｔのそれとは違って、超可変性ループの特徴付け［Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ．及びＬｅｓｋ  Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７（１９８７）］と結晶学による抗体の構造分析を考慮に入れている。
【０１２１】
Ｃ７のＶＨ領域の核酸配列は配列識別番号Ｎｏ．７で示される配列であって、それから推定されるペプチド配列は配列識別番号Ｎｏ．１１の配列である。このＶＨ遺伝子は准グループＶＨ１［Ｈｏｎｊｏ．Ｔ及びＭａｔｓｕｄａ  Ｆ．“ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ”．Ｈｏｎｊｏ  Ｔ．ａｎｄ  Ａｌｔ  Ｆ．Ｗ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９６），  ｐｐ．１４５−１７１］に属している。Ｋａｂａｔナンバリング［Ｋａｂａｔ  ｅｔ．ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，  ９１−３２４２（１９９１）］によって定義されるマウス抗体Ｃ７のＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、配列識別番号Ｎｏ．２２、配列識別番号Ｎｏ．２４、及び配列識別番号Ｎｏ．２５でそれぞれ示してある。ＩＧＭＴ  （国際ＩｍＧｅｎｏＧｅｎｅｔｉｃｓデータベース）分析［Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ．ａｌ．，Ｄｅｖ．ｃｏｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７  （２００３）］によって定義されるマウス抗体Ｃ７のＶＨ領域のＣＤＲ１−ＩＭＧＴ、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ、ＣＤＲ３−ＩＭＧＴ配列は、配列識別番号Ｎｏ．２６、Ｎｏ．２７及びＮｏ．２８にそれぞれ示してある。この定義は、配列可変性分析だけに完全に依存しているＫａｂａｔのそれとは違って、超可変性ループの特徴付け［Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ．及びＬｅｓｋ  Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７（１９８７）］と結晶学による抗体の構造分析を考慮に入れている。
【０１２２】
Ｂ．キメラ性抗体ＥＭＡＢ６０４の軽鎖発現ベクターの重鎖及び軽鎖の構築
【０１２３】
１．カッパー軽鎖ベクター
ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ配列決定ベクターにクローンされたＶｋ配列を以下のクローニング・プライマーを用いて増幅した。
ａ）Ｖｋセンス・プライマー（配列識別番号Ｎｏ．２９）
５’−ＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴ−３’
下線を付した部分の配列はＳｐｅ  Ｉ制限サイトに対応し、ゴシック体で示した部分の配列はＫｏｚａｋコンセンサス配列に対応し、そして最初のＡＴＧはイタリック体で示してある。
ｂ）Ｖｋアンチセンス・プライマー（配列識別番号Ｎｏ．３０）
５’−ＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴＴＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴ−３’
このプライマーはマウスＶｋ配列（イタリック体）とヒト定常領域（Ｃｋ）（ゴシック体）との結合をつくりだす。下線を付した配列はＤｒａＩＩＩ制限サイトに対応している。
【０１２４】
このようにして得られたＶｋ  ＰＣＲ生成物はマウス抗体Ｃ７の天然のペプチド信号をコード表現する配列を含んでいる。このＶｋ  ＰＣＲは、従って、その核酸配列が配列識別番号Ｎｏ．２１で示され、その推定されるペプチド配列が配列識別番号Ｎｏ．３１であるヒトＣｋ定常領域の５’位置の軽鎖のキメラ化ベクターのＳｐｅ  Ｉ及びＤｒａ  ＩＩＩサイトの間でクローンされた。このキメラ化ベクターのヒトＣｋ配列はマウスＶｋ配列のクローニングを可能にするためにＤｒａ  ＩＩＩ制限サイトをつくるためにサイレント突然変異によって予め修飾された。このキメラ化ベクターはＲＳＶプロモータとｂＧＨ（仔ウシ成長ホルモン）ポリアデニル化配列、さらにｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸還元酵素）選択遺伝子を含んでいる。
【０１２５】
このベクターによってコード表現されるキメラ性抗体ＥＭＡＢ６０４の軽鎖の配列は配列識別番号Ｎｏ．１３のヌクレオチド配列にあり、配列識別番号Ｎｏ．  １４の推定されるペプチド配列に対応する。
【０１２６】
２．重鎖
同様の手順を抗体ＥＭＡＢ６０４の重鎖のキメラ化にも適用した。
ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローンされたＶＨ配列を、以下のクローニング・プライマーを用いて最初に増幅させた。
ａ）ＶＨセンス・プライマー（配列識別番号Ｎｏ．３２）
５’−ＡＴＣＧＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＣＴＴ−３’
下線を付した配列部分はＮｈｅ  Ｉ制限サイトに対応し、ゴシック体の配列部分はＫｏｚａｋコンセンサス配列に対応し、イニシエータＡＴＧをイタリック体で示してある。
ｂ）ＶＨアンチセンス・プライマー（配列識別番号Ｎｏ．３３）
５’−ＡＣＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＧＴ−３’
このプライマーはマウスＶＨ配列（イタリック体）とヒトＧ１定常領域（ゴシック体）の間の結合をつくりだす。下線を付した配列部分はＡｐａ  Ｉ制限サイトに対応する。
【０１２７】
この増幅されたＶＨ断片はマウス抗体Ｃ７の天然のペプチド信号をコードする配列を含んでいる。次にこのＶＨ  ＰＣＲ増幅生成物を、ヒトγ１定常領域の５’位置に重鎖を含むＳｐｅ  ＩとＡｐａＩサイトの間にクローンした。その核酸配列を配列識別番号Ｎｏ．２３に、そして推定されるペプチド配列を配列識別番号Ｎｏ．３４に示す。このキメラ化ベクターはＲＳＶプロモータとｂＧＨ（仔ウシ成長ホルモン）ポリアデニル化配列、そして新選択遺伝子を含んでいる。
【０１２８】
このベクターによってコード表現されるキメラ性抗体ＥＭＡＢ６０４の重鎖の配列の核酸配列を配列識別番号Ｎｏ．１９に、そして推定されるペプチド配列を配列識別番号Ｎｏ．２０に示す。
【実施例２】
【０１２９】
実施例２：キメラ性ＥＭＡＢ６０４を生成する細胞株ＹＢ２／０から誘導される細胞株の作製
【０１３０】
ラット細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−１６６２）を５％死産仔ウシ血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：１２１０３−７８ｐ）を含むＥＭＳ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：０４１−９５１８１Ｍ）内で培養した。トランスフェクションのために、Ａｖｉ  ＩＩで直線化された軽鎖ベクターＫ４６３−２６−Ｃ７を２５μｇとＮｏｔ  Ｉで直線化された重鎖ベクターＨ−４６３−２７−Ｃ７を２６．７μｇ用いて、エレクトロバッファー培養液（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ：ＥＢ−１１０）内で５００万個の細胞をエレクトロポレーションにかけた。用いられたエレクトロポレーション条件は幅が０．４ｃｍの０．５ｍｌキュベットに対して２３０ボルト及び９６０マイクロファラッドであった。このエレクトロポレーション用キュベットの内容物を９６ウェル・プレート５枚に１ウェルあたり５０００個の細胞の密度で分散させた。
【０１３１】
これらの細胞を、選択された５％透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１０６０３−０１７）を含むＲＰＭＩ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：２１８７５−０３４）、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１０１３１−０２７）、そして２５ｎＭのメソトレキセート（Ｓｉｇｍａ：Ｍ８４０７）に入れる捜査はトランスフェクションから３日後に行われた。
【０１３２】
耐性トランスフェクションウェルの上澄み液はヒトＩｇ配列に特異性を示すＥＬＩＳＡアッセイによってキメラ性免疫グロブリン（Ｉｇ）の存在に関してスクリーニングされた。ほとんどの抗体をつくりだす１６のトランスフェクション因子を２４ウェル・プレート内で増幅させて、その生成能力（生産性及び最大産出能力）とつくりだされたＩｇＧｓのフコース・レベルに関する評価を行った。
【０１３３】
以下に『Ｒ６０４』と呼ぶＲ６０４  ＣＨ１０（生成率：８．１ｐｃｄ，最大生成：３８．５μｇ／ｍｌ、ＩｇＧｓのフコース・レベル：２５．５−２６．８％）を、キメラ性抗体ＥＭＡＢ６０４の生成を基準として選択した。
【０１３４】
キメラ性抗体ＥＭＡＢ６０４の生成は、２５ｃｍ２、７５ｃｍ２、及び１７５ｃｍ２のフラスコ、継いでローラー・ボトル内で２ｘ１０５細胞／ｍｌに希釈することで得られた５％仔ウシＩｇ枯渇血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１６２５０−０７８）と５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１０１３１−０２７）を含むＥＭＳ培養液内で培養することで行われた。最大体積（０．９ｌ）に達した後、細胞存続性が５０％以下になるまで、培養を継続した。生成後、タンパク質Ａ上で親和性クロマトグラフィを行うことによって精製し、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で検査した。
【実施例３】
【０１３５】
実施例３：ＡＤＣＣテスト実施手順
【０１３６】
標的細胞（ＨＴ−１４４あるいはＧＵＹ  １７．２細胞株）を異なった抗体濃度（０、０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で培養し、エフェクター細胞（ＮＫ細胞）をネガティブ枯渇キット（ＮＫ細胞単離キット、Ｍｙｌｔｅｎｙｌ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて精製した。健康なドナーから得られた抹消血液から開始した。４時間培養した後、この抗体によって誘発された細胞毒性を、溶解された細胞から放出された酵素乳酸塩デヒドロジェナーゼ（ＬＤＨ）の活性を上澄み液内で評価することによって熱量測定で測定する。その結果を、抗体濃度を基準として特定の細胞溶解の割合で表現してある。Ｅｍａｘ値（最大細胞溶解パーセンテージ）とＥＣ５０（５０％最大溶解を誘発する抗体の量）をＰＲＩＳＭソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で計算する。
【実施例４】
【０１３７】
実施例４：黒色腫ＧＵＹ１７．２細胞株上でＣＨＯ株によって生成されたＥＭＡＢ６０４  及び抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＡＤＣＣ活性（図１）
【０１３８】
抗体ＥＭＡＢ６０４はＧＵＹ−１７．２に特異的な細胞溶解をＣＨＯ内で生成される抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体と比較してより多く誘発する。
【０１３９】
最大細胞溶解値（Ｅｍａｘ）はＥＭＡＢ６０４と抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＨＯに対してそれぞれ１９及び１５％である。対応するＥＣ５０ｓ（５０％最大細胞溶解に必要な抗体の量）はそれぞれ０．４５と５．７１μｇ／ｍｌで、この事実は抗体ＥＭＡＢ６０４の活性がＣＨＯ内で生成される抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体より約１０倍強いことを示している。
【０１４０】
【表１】
2010514434.tif 000002
【０１４１】
計算はＰＲＩＳＭソフトウェアによってモデル曲線（ｓｉｇｍｏｉｄ）を作成した後にＡＤＣＣ値Ｅｍａｘ（最大細胞溶解）とＥＣ５０（Ｅｍａｘの５０％を得るために必要な抗体濃度）を計算する。
【０１４２】
マウス抗体３Ｇ８（抗ＣＤ−１６）の存在下で全ての抗体に対して示されるので、ＡＤＣＣ活性はＣＤ１６に基づいている。（図２）
【実施例５】
【０１４３】
実施例５：黒色腫細胞株ＨＴ−１４４上でＣＨＯ株によって産出されるＥＭＡＢ６０４と抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＡＤＣＣ活性（図３）
【０１４４】
本発明による抗体ＥＭＡＢ６０４はＣＨＯ内で生成される抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体によって生成される場合より多く、黒色腫細胞株ＨＴ−１４４に特異的な細胞溶解を誘発する。
【０１４５】
最大細胞溶解値（Ｅｍａｘ）はＥＭＡＢ６０４と抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＨＯに対してそれぞれ１８及び１７％である。対応するＥＣ５０ｓはそれぞれ０．４５と１．４５  μｇ／ｍｌで、この事実は抗体ＥＭＡＢ６０４の活性がＣＨＯ内で生成される抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の活性より約８倍強いことを示している。
【０１４６】
【表２】
2010514434.tif 000003
【０１４７】
計算はＰＲＩＳＭソフトウェアによってモデル曲線（ｓｉｇｍｏｉｄ）を作成した後にＡＤＣＣ値Ｅｍａｘ（最大細胞溶解）とＥＣ５０（Ｅｍａｘの５０％を得るために必要な抗体濃度）を計算する。
【０１４８】
マウス抗体３Ｇ８（抗ＣＤ−１６）の存在下ですべての抗体に対して示されるので、ＡＤＣＣ活性はＣＤ１６に基づいている。（図４）
【実施例６】
【０１４９】
実施例６：ＩＬ−２分泌テスト実施手順（図５及び６）
【０１５０】
このテストはヒトＣＤ１６受容体（ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ）をエフェクター細胞（Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ１６）によってトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞株を用いる。この技術は標的細胞（黒色腫細胞株ＨＴ−１４４あるいはＧＵＹ  １７．２）に結合したテストされる抗体とＣＤ１６との結合によって誘発されるＪｕｒｋａｔ−ＣＤ１６株によるインターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌の測定に基づいている。この目的のために、テスト対象の抗体を、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ１６細胞（５ｘ１０６細胞／ｍｌ）の存在下で２５ｎｇ／ｍｌの割合で標的細胞（１．５ｘ１０５細胞／ｍｌ）に加え、さらに１０ｎｇ／ｍｌのホルボール酢酸ミリスチン酸（ＰＭＡ）を加えて、５％ＣＯ２の雰囲気内で３７℃の温度下で１８時間培養する。その後、培養プレートを遠心分離にかける、ＩＬ−２をＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＬ−２  Ｒ＆Ｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）によって定量された培養上澄み液内に放出させる。
最終的な結果を吸着単位（ＯＤ）で示す。
【０１５１】
【表３】
2010514434.tif 000004
【０１５２】
この表の結果は図５及び図６に対応する。
【実施例７】
【０１５３】
実施例７：黒色腫ＧＵＹ  １７．２細胞株上で生成されるＥＭＡＢ６０４及び抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＪｕｒｋａｔ−ＣＤ１６株によるＩＬ−２分泌を誘発する能力（図５）
【０１５４】
抗体ＥＭＡＢ６０４はＧＵＹ  １７．２細胞株の存在下で、ＣＨＯ内で生成される同じ抗体より多くＩＬ−２の分泌を誘発する。
【０１５５】
最大細胞溶解値（Ｅｍａｘ）はＥＭＡＢ６０４と抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＨＯ抗体に対して、それぞれ１．３５及び０．２８ＯＤ単位である。
【０１５６】
ＹＢ２／０内で生成される抗ＲｈＤ抗体Ｒ２９７は、ＧＵＹ  １７．２細胞に対するネガティブ・コントロールとして寄与する。
【実施例８】
【０１５７】
実施例８：黒色腫ＨＴ−１４４細胞株上で生成されるＥＭＡＢ６０４及び抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＪｕｒｋａｔ−ＣＤ１６株によるＩＬ−２分泌を誘発する能力（図６）
【０１５８】
抗体ＥＭＡＢ６０４はＨＴ−１４４株の存在下で、ＣＨＯ内で生成される同じ抗体より多く、ＩＬ−２の分泌を誘発する。
【０１５９】
最大細胞溶解値（Ｅｍａｘ）はＥＭＡＢ６０４  と抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＨＯ抗体に対して、それぞれ１．２及び０．４９ＯＤ単位である。
【０１６０】
ＹＢ２／０内で生成される抗ＲｈＤ抗体Ｒ２９７は、ＨＴ−１４４細胞に対するネガティブ・コントロールとして寄与する。
【実施例９】
【０１６１】
実施例９：ＣＤ１６受容体結合テスト手順
【０１６２】
ＣＤ１６受容体に対する結合は、マウス抗ＣＤ１６抗体（３Ｇ８）競合テストによって評価する。
【０１６３】
エフェクター細胞（ＮＫ細胞）をネガティブ枯渇キット（ＮＫ細胞単離キット、ｍｙｌｔｅｎｙｉ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）で精製し、健康なドナーの抹消血液から開始する。次に、ＮＫ  細胞を評価される抗体の濃度を変え（０、１０、及び５０μｇ／ｍｌ）、さらにフロロクロム（３Ｇ８−ＰＥ）に結合した抗ＣＤ１６抗体（３Ｇ８）は一定の濃度に保って、ＮＫ細胞を培養する。
【０１６４】
洗浄した後、３Ｇ８−ＰＥのＮＫ細胞のＣＤ１６受容体に対する結合をフロー・サイトメトリー法で評価する。結果は結合の割合（パーセント）で示し、１００％をマウス抗ＣＤ−１６抗体（３Ｇ８）の結合の完全な抑止とする。
【０１６５】
抗体ＥＭＡＢはＮＫ細胞のＣＤ１６に対して、ＥＭＡＢｌｉｎｇプラットフォーム（特許出願ＷＯ  ２００６０６４１２１参照）によって生成される抗ＣＤ２０抗体の場合と同様、ＮＫ細胞に対して強い結合性を示す。この結合度（６２％）は５０μｇ／ｍｌの濃度で、ＣＨＯ株内で、ＲｉｔｕｘａｎRの場合（１８．５％）より約３倍も高い（図７）。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明のヒトＬＤＬ受容体に対するモノクローナル抗体は、非マウス哺乳動物の全ての科及び種類、具体的にはヒト、サル、ネズミ科（マウスを除く）、イノシシ科、ウシ科、ウマ科、ネコ科、イヌ科の動物、そして例えば鳥類も利用することができる。
【図１】
2010514434.tif 000005
【図２】
2010514434.tif 000006
【図３】
2010514434.tif 000007
【図４】
2010514434.tif 000008
【図５】
2010514434.tif 000009
【図６】
2010514434.tif 000010
【図７】
2010514434.tif 000011
【図８】
2010514434.tif 000012
【図８Ａ】
2010514434.tif 000013
【図８Ｂ】
2010514434.tif 000014
【図８Ｃ】
2010514434.tif 000015
【図８Ｄ】
2010514434.tif 000016
【図８Ｅ】
2010514434.tif 000017
【図８Ｆ】
2010514434.tif 000018
【図８Ｇ】
2010514434.tif 000019
【図８Ｈ】
2010514434.tif 000020
【図８Ｉ】
2010514434.tif 000021
【図８Ｊ】
2010514434.tif 000022
【図８Ｋ】
2010514434.tif 000023
【配列表】
2010514434000001.xml
【国際調査報告】
2010514434.tif 000046
2010514434.tif 000047
2010514434.tif 000048
2010514434.tif 000049
2010514434.tif 000050
2010514434.tif 000051