(57)【要約】  本発明は、EphA2およびErbB2を発現する過増殖性細胞を治療する方法に関する。本発明はさらに、治療方法のために患者集団を選択する方法に関する。【選択図】  図１−１
2010530437.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
過増殖性細胞の増殖を減少させる方法であって、
a)EphA2およびErbB2の両方を発現する過増殖性細胞の集団を同定すること、ならびに
b)EphA2を標的化する薬剤を投与すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
EphA2を標的化する薬剤を投与することを含む、EphA2およびErbB2の両方を発現する過増殖性細胞の増殖を減少させる方法。
【請求項３】
EphA2とErbB2との間の相互作用を阻害、遮断、または妨害する薬剤を投与することを含む、EphA2およびErbB2の両方を発現する過増殖性細胞の増殖を減少させる方法。
【請求項４】
前記過増殖性細胞が癌細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記癌が、皮膚、肺、結腸、乳腺、前立腺、膀胱もしくは膵臓の癌、腎細胞癌、メラノーマ、白血病、またはリンパ腫である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記過増殖性細胞疾患が、非癌性過増殖性細胞疾患である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記非癌性過増殖性細胞疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、乾癬、肺線維症、気管支過敏症、脂漏性皮膚炎、および嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、平滑筋再狭窄、内皮再狭窄、過増殖性血管疾患、ベーチェット症候群、アテローム性動脈硬化症、または黄斑変性である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ErbB2を標的化する薬剤を投与することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞がEphA2を過剰発現する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がErbB2を過剰発現する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、EphA2およびErbB2の両方を過剰発現する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記EphA2標的化剤がアゴニストである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記EphA2標的化剤がアンタゴニストである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記EphA2またはErbB2標的化剤が抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記EphA2またはErbB2標的化剤が小分子である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記EphA2またはErbB2標的化剤がペプチドである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記EphA2またはErbB2標的化剤がsiRNAである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記EphA2またはErbB2標的化剤が抗体-薬剤候補(ADC)である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記EphA2またはErbB2標的化剤のいずれかが、EphA2とErbB2との間の相互作用を阻害、遮断、または妨害する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
癌患者を治療する方法であって、
(a)該患者の癌細胞におけるEphA2およびErbB2の発現レベル、存在または量を決定すること、
(b)該患者の癌細胞がEphA2およびErbB2の両方を発現することが決定された場合、抗EphA2および／または抗ErbB2標的化剤を投与すること、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1. 連邦により支援された研究開発の下で為された発明に対する権利に関する記述
本発明は、部分的には、米国立衛生研究所からの裁定番号CA95004、CA114301、およびCA1179151-02の下で、ならびに米国防総省からの裁定番号W81XWH-05-01-0254の下で、米国政府の支援と共に為されたものである。米国政府は本発明における特定の権利を有するものとする。
【０００２】
2. 関連出願に対する相互参照
本出願は、以下の米国特許仮出願：2007年6月18日に出願された第60/929,212号の35 U.S.C.§119(e)の下での利益を請求するものである。優先権出願はあらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【０００３】
3. 発明の分野
本発明は、EphA2およびErbB2を発現する過増殖性細胞を治療する方法を提供する。本発明はさらに、治療方法のために患者集団を選択する方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
4. 発明の背景
4.1 癌
新生物、または腫瘍は、良性または悪性であってよい、異常な制御されない細胞増殖の結果もたらされる新生物塊である。一般的には、良性腫瘍は局在化されたままである。悪性腫瘍は集合的に癌と呼ばれる。用語「悪性」は、一般的には、腫瘍が近隣の体組織に侵襲し、これを破壊し、遠位の部位に拡散して死を引き起こし得ることを意味する(概説については、RobbinsおよびAngell、1976、Basic Pathology、第2版、W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp.68-122を参照されたい)。癌は体の多くの部位に生じ、その起源に依存して示差的に振る舞うことができる。癌細胞は、それらが生じる体の部分を破壊した後、体の他の部分に拡散し、そこでそれらは新しい増殖を開始し、より多くの破壊を引き起こす。
【０００５】
毎年、120万人を超える米国人が癌を発症する。癌は米国において2番目の主要な死因であり、現在の傾向が続けば、癌は2010年までに主要な死因になると予想される。肺癌および前立腺癌は、米国の男性にとって死亡率第1位の癌である。肺癌および乳癌は、米国の女性にとって死亡率第1位の癌である。米国における男性の2人に1人が、その人生の間にいつか、癌を有すると診断されるであろう。米国における女性の3人に1人が、その人生の間にいつか、癌を有すると診断されるであろう。外科手術、化学療法および放射線治療などの現在の治療選択肢は、しばしば、無効であるか、または重篤な副作用をもたらす。
【０００６】
最も命を脅かす形態の癌は、腫瘍細胞の集団が体の遠い部位および外来部位でコロニー形成する能力を獲得する場合に生じることが多い。これらの転移性細胞は、通常は似ていない組織中での細胞コロニー形成を抑制する制限を無効化することにより生存する。例えば、典型的には、乳腺上皮細胞は、一般的には、肺に移植された場合には増殖も生存もしないであろうが、肺転移は乳癌の罹患率および死亡率の主要な原因である。最近の証拠は、体を介する転移性細胞の播種は、原発腫瘍の臨床所見のかなり前に生じ得ることを示唆している。これらの微小転移性細胞は、原発腫瘍の検出および除去の後の多くの年月、休止状態のままであり得る。かくして、外来微小環境中での転移性細胞の増殖および生存を可能にする機構のより良好な理解は、転移性の癌と闘うために設計された治療剤ならびに転移の早期検出および局在化のための診断剤の改良にとって重要である。
【０００７】
癌は、異常なシグナル伝達の疾患である。異常な細胞シグナリングは、細胞の増殖および生存に対する足場依存的抑制を無効化する(Rhimら、Critical Reviews in Oncogenesis 8:305, 1997; Patarca, Critical Reviews in Oncogenesis 7:343, 1996; Malikら、Biochimica et Biophysica Acta 1287:73, 1996; Callahanら、Breast Cancer Res Treat 35:105, 1995)。チロシンキナーゼ活性は、ECM足場により誘導され、実際に、チロシンキナーゼの発現または機能は通常、悪性細胞においては増加する(Rhimら、Critical Reviews in Oncogenesis 8:305, 1997; Callahanら、Breast Cancer Res Treat 35:105, 1995; Hunter, Cell 88:333, 1997)。チロシンキナーゼが悪性細胞増殖にとって必須であるという証拠に基づいて、チロシンキナーゼが新しい治療剤に関して標的化されてきた(Levitzkiら、Science 267:1782, 1995; Kondapakaら、Molecular & Cellular Endocrinology 117:53, 1996; Fryら、Current Opinion in BioTechnology 6: 662, 1995)。不幸なことに、腫瘍細胞に対する特異的標的化に関連する障害が、これらの薬剤の適用を制限することが多い。具体的には、チロシンキナーゼは、良性組織の機能および生存にとって重要であることが多い(Levitzkiら、Science 267:1782, 1995)。致命的な毒性を最小化するためには、腫瘍細胞中で選択的に過剰発現されるチロシンキナーゼを同定した後、これを標的化することが重要である。
【０００８】
固形腫瘍の悪性的進行は、癌遺伝子シグナリングの活性化および腫瘍抑制因子経路の下方調節を含む複雑なプロセスである。さらに、例えば、血管新生を介する、腫瘍微小環境の調節は、腫瘍細胞の増殖および生存を増強し、侵襲および転移性拡散を促進する(HahnおよびWeinberg, 2002; HanahanおよびWeinberg, 2000; VogelsteinおよびKinzler, 2004に概説されている)。癌遺伝子変換またはEGF受容体ファミリーメンバーErbB2などの細胞表面受容体チロシンキナーゼ(RTK)をコードするものなどの癌原遺伝子の過剰発現が、ヒトの癌において観察されることが多く、悪性腫瘍の原因となる。p53転写因子／ゲノム監視因子などの他の経路は増殖を負に調節し、これらの経路成分の喪失は癌の原因となる(Blume-JensenおよびHunter, 2001; VogelsteinおよびKinzler, 2004に概説されている)。最近の証拠は、Eph RTKが、腫瘍柔組織および内皮などの間質微小環境の両方におけるいくつかの型の癌における腫瘍進行の原因となることを示唆している[(Brantley-Siedersら、2004a; Brantley-SiedersおよびChen, 2004); (Brantley-Siedersら、2005)に概説されている]。
【０００９】
4.1.1 受容体チロシンキナーゼ
受容体チロシンキナーゼ(RTK)は、細胞外リガンド結合ドメインと、チロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインとからなる膜貫通タンパク質である(Surawskaら、2004, Cytokine Growth Factor Rev. 15:419-433)。このファミリーのタンパク質は、構造的組織に基づいて少なくとも19個の異なるクラスに組織化される50個を超える異なるメンバーを含み、増殖因子(例えば、EGF、PDGF、FGF)およびインスリンに対する受容体を含む(Grassotら、2003, Nucl Acids Res., 31(1):353-358; Surawskaら、2004, Cytokine Growth Factor Rev. 15:419-433)。クラスIのRTKは、例えば、EGFR、ERBB2、ERBB3およびERBB4を含む；クラスIIのRTKは、例えば、INSR、IRRおよびIG1Rを含む；クラスIIIのRTKは、例えば、PDGFa、PDGFb、Fms、KitおよびFlt3を含む；クラスIVのRTKは、例えば、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4およびBFR2を含む；クラスVのRTKはFlt1、Flt2およびFlt4を含む；クラスVIのRTKはEphA1-EphA8およびEphB1-EphB6を含む；クラスVIIのRTKはTrkA、TrkBおよびTrkCを含む(Grassotら、2003, Nucl Acids Res., 31(1):353-358)。細胞内(細胞質)ドメイン中のチロシン残基の自己リン酸化は、細胞外結合ドメインに結合するリガンドにより誘導され、次いで、シグナリング複合体の形成および顆粒のシグナル伝達カスケードの活性化をもたらす(Surawskaら、2004, Cytokine Growth Factor Rev. 15:419-433)。
【００１０】
4.1.2 EphA2
Eph RTKファミリーは、ゲノム中で同定された最も大きいファミリーのRTKであり、脊椎動物において同定された少なくとも15個の受容体および9個のリガンドを含む(Brantley-SiedersおよびChen, 2004; MuraiおよびPasquale, 2003に概説されている)。このファミリーは、2つの異なる型の膜貫通エフリンリガンドに対する相同性および結合親和性に基づいてクラスAとクラスBに分割される。クラスBの受容体は、一般的には、膜貫通ドメインにより細胞膜に結合したクラスBのエフリンに結合するが、クラスAの受容体は通常、グリコシル-ホスファチジルイノシトール(GPI)結合クラスAエフリンと相互作用するが、特定のファミリーメンバーについては、いくらかのクラス間結合が観察されている(Brantley-SiedersおよびChen, 2004; MuraiおよびPasquale, 2003に概説されている)。Ephサブファミリー中の受容体は、典型的には、1個のキナーゼドメインおよびCysに富むドメインを含む細胞外領域および2個のフィブロネクチンIII型リピートを有する。Eph受容体、およびその膜に結合したエフリンリガンドは、細胞の付着、形状、および運動性を調節する細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターである。Eph RTKシグナリング事象は、特に神経系における、胚発生の複数の態様を制御する(Kullanderら、2002, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3:473およびMamlingら、2002, Trends Biochem Sci 27:514-520に概説されている)。これらの分子は、胚形成の間に機能して、血管形成再モデリングプロセス、軸索誘導、および組織境界形成を調節する(Pasquale, 2005; Poliakovら、2004に概説されている)。
【００１１】
Eph受容体の多くのメンバーが、癌の発生および進行の重要なマーカーおよび／または調節因子として同定されてきた(例えば、Thakerら、2004, Clin. Cancer Res. 10:5145; Fox BPら、2004, Biochem. Biophys. Res. Commun. 318:882; Nakadaら、2004, Cancer Res. 64:3179; Coffmanら、2003, Cancer Res. 63:7907を参照されたい;また、Dodeletら、2000, Oncogene 19:5614にも概説されている)。癌に関与することが知られるEph受容体のうち、EphA2およびEphA4の役割および発現パターンが最も特性評価されている。
【００１２】
EphA2(上皮細胞キナーゼ)は、Ephファミリーの受容体チロシンキナーゼの130 kDaのメンバーである(Zantek N.ら、1999, Cell Growth Differ. 10:629-38; Lindberg R.ら、1990,  Mol. Cell. Biol. 10:6316-24)。EphA2の機能は依然として研究されているが、結腸上皮の増殖、分化、および障壁機能(Rosenberg I.ら、1997, Am. J. Physiol. 273:G824-32)、血管ネットワーク集合、内皮細胞遊走、腫瘍血管形成、ならびに血管形成(D. M. Brantley, J. Caughron, D. Hicks, A. Pozzi, J. C. RuizおよびJ. Chen  (2004)) EphA2 receptor tyrosine kinase regulates endothelial cell migration and assembly via PI3K-mediated Rac1 activation J. Cell Sci. 117:2037-3049, D. Brantley, N. Cheng, E. Thompson, Q. Lin, R. A. Brekken, P. E. Thorpe, R. S. Muraoka,, D. Cerretti, A. Pozzi, D. Jackson, C. Lin、およびJ. Chen. (2002) Soluble EphA receptor inhibit tumor progression and angiogenesis in vivo. Oncogene 21:7011-7026, N. Cheng, D. Brantley, H. Liu, A. Lin, M. Enriquiz, D. Ceretti, N. Gale, G. Yancouplous, T. DanielおよびJ. Chen. (2002) Blockade of EphA receptor tyrosine activation inhibits VEGF-dependent angiogenesis. Mol. Cancer Res. (以前はCell Growth and Differentiation) 1:2-11, N. Cheng, D. Brantley, H. Liu, W. Fanslow, D. Cerretti, D. JacksonおよびJ. Chen. (2003) Inhibition of VEGF-dependent multi-stage carcinogenesis by soluble EphA receptors. Neoplasia 5:445-456, D.M. Brantley-Sieders,W. B. Fang, D. Hicks, T. Koyama, Y. ShyrおよびJ. Chen. (2005) Inhibition of VEGF-dependent multi-stage carcinogenesis by soluble EphA receptors. Neoplasia 5:445-456, D.M. Brantley-Sieders, W. B. Fang, D. Hicks, T. Koyama, Y. ShyrおよびJ. Chen. (2005) Impaired tumor microenvironment in EphA2-deficient mice inhibits tumor angiogenesis and metastatic progression. FASEB J. 19:1884-6, D.M. Brantley-Sieders, W. B. Fang, Y. HwangおよびJ. Chen. (2006) Ephrin-A1 facilitates tumor metastasis via an angiogenic-dependent mechanism in vivo.  Cancer Res. 66:10315-10324)、神経系の分割および軸索経路探索(Bovenkamp D.およびGreer P., 2001, DNA Cell Biol. 20:203-13)、腫瘍血管新生(Ogawa K.ら、2000, Oncogene 19:6043-52)、ならびに癌転移(国際特許公開WO 01/9411020、WO 96/36713、WO 01/12840、WO 01/12172)を調節すると提言されている。
【００１３】
EphA2の天然リガンドは、エフリンA1である(Eph Nomenclature Committee, 1997, Cell 90(3):403-4; Galeら、1997, Cell Tissue Res. 290(2): 227-41)。EphA2とエフリンA1の相互作用は、器官表面上のアンカー細胞を助け、またEphA2自己リン酸化を介してEphA2発現を低下させることにより上皮および／または内皮細胞の増殖を下方調節すると考えられる(Lindbergら、1990)。天然条件下で、この相互作用は、器官を保護する上皮細胞障壁を維持するのを助け、上皮細胞の増殖および成長を調節するのを助ける。しかしながら、上皮細胞が防御障壁を形成するのを阻害するか、または上皮および／もしくは内皮細胞の破壊および／もしくは脱落を引き起こし、かくして、発生からの適切な治癒を阻害する疾患状態が存在する。
【００１４】
EphA2は成人の上皮において発現され、そこではそれは低レベルで認められ、細胞間接着の部位内で豊富である(Zantekら、1999, Cell Growth & Diff 10:629; Lindbergら、1990, Mol & Cell Biol 10: 6316)。EphA2は細胞膜に固定されたエフリンA1〜A5に結合するため、この細胞内局在化は重要である(Eph Nomenclature Committee, 1997, Cell 90:403; Galeら、1997, Cell & Tissue Res 290: 227)。リガンド結合の主な結果は、EphA2の自己リン酸化である(Lindbergら、1990)。しかしながら、他の受容体チロシンキナーゼと違って、EphA2はリガンド結合の非存在下での酵素活性またはホスホチロシン含量を保持する(Zantekら、1999)。EphA2およびエフリンA1は、乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、皮膚癌、および食道癌などの様々な腫瘍の形質転換された細胞中で上方調節される(Ogawaら、2000, Oncogene 19:6043; Zelinskiら、2001, Cancer Res 61:2301; Walker-Danielsら、1999, Prostate 41:275; Eastyら、1995, Int J Cancer 60: 129; Nemotoら、1997, Pathobiology 65:195; Hessら、2001, Cancer Res 61(8): 3250-5)。
【００１５】
より最近では、EphA2などの、このRTKファミリーのメンバーは、腫瘍進行および血管新生に関連してきた(Brantley-Siedersら、2004に概説されている)。多くの証拠が、EphA2発現が腫瘍進行の原因として関連するかもしれないことを示唆している。EphA2受容体チロシンキナーゼの過剰発現は、原発性および移植性げっ歯類腫瘍、ヒト腫瘍異種移植片、および原発ヒト腫瘍生検などの癌のいくつかのモデルにおいて観察されている(Brantley-Siedersら、2004; Brantley-SiedersおよびChen, 2004; IretonおよびChen, 2005に概説されている)。EphA2の実験的に誘導された過剰発現は、形質転換されていないMCF10A乳腺細胞の悪性形質転換および膵臓癌細胞の悪性度の増強をもたらした(Duxburyら、2004; Zelinskiら、2001)。逆に、EphA2発現のsiRNAを介する阻害は、膵臓腫瘍細胞系、卵巣腫瘍細胞系および中皮腫腫瘍細胞系の悪性的進行を弱め、ドミナントネガティブEphA2構築物の過剰発現は、in vivoで4T1転移マウス乳腺癌細胞の増殖および転移を抑制した(Duxburyら、2004; Landenら、2005; Nasreenら、2006, Fang, 2005)。内因性受容体活性化を破壊するEphA2-Fc受容体タンパク質は、in vivoで腫瘍の増殖および血管新生を阻害した(Brantleyら、2002; Chengら、2003; Dobrzanskiら、2004)。EphA2受容体シグナリングが、腫瘍細胞系における前増殖性p42/44分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)ファミリーメンバーErkのリン酸化および活性化を誘導するという観察(PrattおよびKinch, 2002; PrattおよびKinch, 2003)に加えて、これらのデータは、癌遺伝子としてのEphA2受容体が機能することを示唆している。
【００１６】
しかしながら、他の証拠は、EphA2が腫瘍抑制因子として機能するかもしれないと示唆している。EphA2欠損遺伝子トラップマウスは、腫瘍細胞増殖の増加およびErkのリン酸化の上昇と共に、対照同腹子と比較して化学発癌物質により誘導される皮膚癌に対する高い罹患性を示した(Guoら、2006)。可溶性エフリンA1-FcリガンドによるEphA受容体の刺激は、腫瘍細胞系、線維芽細胞、および一次大動脈内皮細胞中でのErkリン酸化を低下させ、一次ケラチノサイトおよび前立腺癌細胞の増殖を抑制した(Guoら、2006; Macraeら、2005; Miaoら、2001)。Macraeらはまた、EphA2リン酸化を刺激するエフリンA1-Fcを用いるヒト乳癌細胞系の治療は、ErkのEGFを介するリン酸化を弱め、v-erbB2を発現するNIH3T3細胞の形質転換を阻害することを報告した(Macraeら、2005)。さらに、EphA2は腫瘍抑制因子p53の転写標的であると報告された(Dohnら、2001; Jinら、2006; Yangら、2006; Zhangら、2003)。肺癌および乳癌細胞系における過剰発現は、増殖を負に調節し、アポトーシスを誘導した(Dohnら、2001; Jinら、2006)。これらのデータは、EphA2が腫瘍抑制因子として機能することを示唆している。
【００１７】
4.1.3 HERファミリーのRTK
HERファミリーの受容体チロシンキナーゼは、細胞の増殖、分化および生存の重要なメディエーターである。この受容体ファミリーは、上皮増殖因子受容体(EGFR、ErbB1、もしくはHER1)、HER2(ErbB2もしくはp185neu)、HER3(ErbB3)およびHER4(ErbB4もしくはtyro2)などの4個の異なるメンバーを含む。
【００１８】
erbB1遺伝子によりコードされるEGFRは、ヒト悪性腫瘍の原因として関連している。特に、乳癌、膀胱癌、肺癌、頭部癌、頸部癌および胃癌ならびにグリオブラストーマにおいては、EGFRの発現増加が観察されている。EGFR受容体発現の増加は、自己分泌刺激経路による受容体活性化をもたらす同じ腫瘍細胞による、EGFRリガンド、トランスフォーミング増殖因子α(TGF-α)の産生の増加と関連することが多い(BaselgaおよびMendelsohn, Pharmac. Ther., 64:127-154 (1994))。EGFRまたはそのリガンド、TGF-αおよびEGFに対するモノクローナル抗体は、そのような悪性腫瘍の治療における治療剤として評価されている。例えば、BaselgaおよびMendelsohn.; Masuiら、Cancer Research, 44:1002-1007 (1984); ならびにWuら、J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995)を参照されたい。
【００１９】
HERファミリーの第2のメンバー、p185neu(HER2およびErbB2としても知られる)は、化学的に処理されたラットの神経芽細胞腫からトランスフォーミング遺伝子の産物として元々同定されたものである。活性化形態のneu癌原遺伝子は、コードされたタンパク質の膜貫通領域中に点突然変異(バリンからグルタミン酸)をもたらす。neuのヒト相同体の増幅が、乳癌および卵巣癌において観察され、予後不良と相関する(Slamonら、Science, 235:177-182 (1987); Slamonら、Science, 244:707-712 (1989); および米国特許第4,968,603号)。現在まで、neu癌原遺伝子におけるものと類似する点突然変異は、ヒト腫瘍については報告されていない。
【００２０】
HER2の過剰発現(遺伝子増幅に起因して、頻繁ではあるが、均一ではない)は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、胸腺、膵臓および膀胱の癌腫などの他の癌腫においても観察されている。特に、Kingら、Science, 229:974 (1985); Yokotaら、Lancet, 1:765-767 (1986); Fukushigeら、Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Guerinら、Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohenら、Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemuraら、Cancer Res., 51:1034 (1991); Borstら、Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weinerら、Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kernら、Cancer Res., 50:5184 (1990); Parkら、Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhauら、Mol. Carcinog., 3:254-257 (1990); Aaslandら、Br. J. Cancer, 57:358-363 (1988); Williamsら、Pathobiology, 59:46-52 (1991); ならびにMcCannら、Cancer, 65:88-92 (1990)を参照されたい。HER2は、前立腺癌において過剰発現され得る(Guら、Cancer Lett., 99:185-9 (1996); Rossら、Hum. Pathol., 28:827-33 (1997); Rossら、Cancer, 79:2162-70 (1997); ならびにSadasivanら、J. Urol., 150:126-31 (1993))。
【００２１】
HER2の増幅／過剰発現は、侵攻性疾患および予後不良と関連する乳癌における初期の事象である。HER2遺伝子増幅は、20〜25％の原発性乳腺腫瘍において認められる(Slamonら、Science, 244:707-12 (1989); Owensら、Breast Cancer Res Treat, 76:S68 abstract 236 (2002))。HER2陽性疾患は、無再発生存率および全体の生存率の低下と相関する(Slamonら、Science, 235:177-82 (1987); Paulettiら、J. Clin Oncol, 18:3651-64 (2000))。HER2遺伝子の増幅は、リンパ節陽性疾患における再発までの時間の有意な減少および低い生存率(Slamonら(1987); Paulettiら(2000))ならびにリンパ節陰性疾患における不良転帰(Pressら、J. Clin Oncol, 1997; 15:2894-904 (1997); Paulettiら(2000))と関連する。
【００２２】
RTKが癌などの過増殖性疾患の開始および進行において果たす役割を考慮すれば、これらの障害を治療する方法だけでなく、調整された療法のための候補集団を選択する方法の顕著な必要性が存在する。
【００２３】
本明細書に記載の参考文献の引用または考察は、そのようなものが本発明に対する先行技術であるという承認として解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【００２４】
5. 発明の概要
一実施形態においては、本発明は過増殖性細胞の増殖を減少させる方法であって、a)EphA2およびErbB2の両方を発現する過増殖性細胞の集団を同定すること；ならびにb)EphA2を標的化する薬剤を投与することを含む、前記方法を提供する。別の実施形態においては、本発明は、EphA2を標的化する薬剤を投与することを含む、EphA2およびErbB2の両方を発現する過増殖性細胞の増殖を減少させる方法を提供する。さらなる実施形態においては、本発明は、EphA2を標的化する薬剤を投与することを含み、ErbB2を標的化する薬剤を投与することをさらに含む、EphA2およびErbB2の両方を発現する過増殖性細胞の増殖を減少させる方法を提供する。
【００２５】
さらなる実施形態においては、本発明は、癌患者を治療する方法であって、(a)該患者の癌細胞中のEphA2およびErbB2の発現レベル、存在、もしくは量を決定すること；(b)工程(a)で評価された発現レベルもしくは量が、患者に対する臨床利益の増加もしくは低下と関連する特定の量を上回るか、もしくは下回るかどうかを決定すること；ならびに(c)該患者の癌細胞がEphA2およびErbB2の両方を発現することが決定された場合、抗EphA2および／もしくは抗ErbB2標的化剤を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００２６】
別の実施形態においては、本発明は、抗EphA2および／もしくは抗ErbB2剤を用いる治療のための患者集団を予備スクリーニングする方法であって、(a)該患者の癌細胞中のEphA2およびErbB2の発現レベル、存在、もしくは量を決定すること；(b)工程(a)で評価された発現レベルもしくは量が、患者に対する臨床利益の増加もしくは低下と関連する特定の量を上回るか、もしくは下回るかどうかを決定することを含む前記方法を提供する。
【００２７】
6. 図面の簡単な説明
本発明を例示する目的で、本発明に関する特定の実施形態を図面に示す。しかしながら、本発明は、図面に記載された実施形態の正確な配置および手段に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１−１】EphA2欠損性は、MMTV-Neuマウスの乳腺腫瘍形成、転移、増殖、および血管形成を減少させる。(A)乳腺上皮過形成および腫瘍形成は、誕生の8ヶ月後(8 mo.)に分析されたヘテロ接合(+/-)および野生型(+/+)対照雌と比較して、MMTV-Neu/EphA2 -/- 雌マウスにおいて頻度が低かった。対照と比較して、誕生の1年後(1 yr.)に分析されたMMTV-Neu/EphA2 -/-雌マウスにおいて、腫瘍形成および肺転移の頻度も低下した。(B)MMTV-Neu/EphA2 -/-雌については、対照と比較して表面肺病変数の有意な減少も観察された(p<0.05;一因子ANOVA)。データを平均±SEMとして表す。(C)誕生の8ヶ月後にEphA2 +/+、+/-、および-/-MMTV-Neu雌トランスジェニック動物から回収された第4鼠径乳腺の全載ヘマトキシリン染色は、対照と比較してEphA2 -/-腺における過形成の減少を示す。左上のパネルは、広範囲の上皮過形成を有する+/+腺を示し、中央のパネルは、局所的過形成を有する+/-腺を示す。*は鼠径リンパ節を示す。下側のパネルに描かれた対側鼠径乳腺に由来するヘマトキシリンおよびエオシン染色された切片は、+/-および+/+対照と比較して、Neu/EphA2 -/-組織サンプルにおいて上皮細胞含量の減少を示す。スケールバー＝250 mm。(D)誕生の8ヶ月後のトランスジェニック動物から回収された乳腺から調製された組織切片におけるPCNA(上側パネル、矢印)に関する核染色の定量により、増殖を評価した。PCNA+核の割合の有意な低下が、MMTV-Neu/EphA2 +/+対照と比較して、MMTV-Neu/EphA2 -/-乳腺について観察された(p<0.05；一因子ANOVA)。スケールバー＝50 mm。TUNELアッセイにより評価されたように、MMTV-Neu/EphA2 +/+対照と比較して、MMTV-Neu/EphA2 -/-乳腺において、アポトーシス核(下側パネル、矢印)の割合における有意な変化が観察されなかった。(E)BrdUの核取込み(矢印、上側パネル)により評価されたように、EphA2 -/-動物から単離された一次乳腺上皮細胞の増殖も、EphA2 +/+細胞と比較して減少した(p<0.05；両側スチューデントのT検定)。興味深いことに、対照、in situで乳腺上皮における宿主微小環境により隠すことができる表現型と比較して、EphA2欠損一次乳腺上皮細胞において、アポトーシス(下側パネルの矢印はTUNEL+核を示す)も有意に悪化した(p<0.05；両側スチューデントのT検定)。(F)誕生の1年後にトランスジェニック雌動物から回収されたMMTV-Neu腫瘍に由来するヘマトキシリンおよびエオシン染色された切片は、+/-および+/+対照と比較してEphA2 -/-腫瘍において、嚢胞様変性管腔形成の増加を示す。スケールバー＝250 mm。(G)MMTV-Neu/EphA2 +/-および+/+対照と比較して、MMTV-Neu/EphA2 -/-腫瘍について、PCNA+核(矢印頭部)の割合における有意な減少が観察された(p<0.05；一因子ANOVA)。スケールバー＝50 mm。(H)内皮特異的マーカーCD31に関する免疫組織化学染色により評価されたように、微小血管密度は、+/-および+/+対照と比較して、MMTV-Neu/EphA2 -/-腫瘍において有意に低下した(p<0.05；一因子ANOVA)。矢印は、CD31+血管を示す。スケールバー＝100 mm。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−２の続きである。
【図２−１】EphA2発現の喪失は、MMTV-Neu腫瘍細胞中での腫瘍形成および侵襲性を弱める。(A)EphA2発現は、EphA2 siRNA配列を発現するレトロウイルスで形質導入されたMMTV-Neu腫瘍細胞においては有意に低下したが、無関係の対照配列を担持するレトロウイルスで形質導入された対照腫瘍細胞においては低下しなかった。EphA2の発現の低下は、リン酸化されたErkのレベルの低下と同時に起こった。(B)細胞を、増殖因子を低下させたMatrigel上に塗布し、3次元球状培養物を作製した。培養中で8日後、親および対照siRNA腫瘍細胞は、侵襲性突起(矢印は突起を示す)を有する大きく不規則な形状の塊を形成した。対照的に、EphA2 siRNA配列を発現する腫瘍細胞は、数個の突起を有する丸い形態を維持するより小さい塊を形成したが、これは侵襲性の低下を示す。スケールバー＝200 mm(上側パネル)、50 mm(下側パネル)。本発明者らは、EphA2発現が対照細胞と比較して減少した細胞について(p<0.05；一因子ANOVA)、個々のコロニーにより占有された平均ピクセル面積を算出することにより決定されたように、コロニーサイズの有意な低下を観察した。(C)3次元培養物を、TO-PRO-3ヨウ素核染色(青)および抗E-カドヘリン(緑)を用いて染色し、共焦点顕微鏡により画像化した。親および対照siRNAを発現するNeu腫瘍細胞は侵襲性突起(矢印頭部は突起を示す)を有する多腺房構造を形成したが、EphA2 siRNA配列を発現する腫瘍細胞は、中央内腔を取り囲む単一の層の上皮細胞(矢印は内腔を示す)から構成されるより丸く均一な腺房構造を形成した。スケールバー＝20 mm。(D)FVBレシピエント雌マウスの除去された脂肪体への同所移植に際して、対照siRNA配列を発現する腫瘍細胞は、5週間で親MMTV-Neu腫瘍細胞の移植により生成された腫瘍に匹敵する容量の腫瘍を産生した。しかしながら、EphA2 siRNA配列を発現する腫瘍細胞は、腫瘍を形成しなかったか、またはほんのわずかの動物において非常に小さい、触診できない腫瘍を形成した(p<0.05；一因子ANOVA)。データを平均±SEMとして表す。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図３−１】ErbB2/HER2を過剰発現するMCF10A細胞中での上昇したEphA2発現は、in vitroでの増殖および侵襲性を増強する。(A)親MCF10Aヒト乳腺細胞およびErbB2/HER2を過剰発現するMCF10Aを、EphA2を発現するアデノウイルス(Ad-EphA2)または対照b-ガラクトシダーゼを発現するアデノウイルス(Ad-bgal)で形質導入し、増殖因子を減少させたMatrigel上に塗布して、3次元球状培養物を作製した。培養中で10日後、親MCF10A細胞およびAd-bgalを発現する細胞は小さく丸い腺房構造を形成したが、MCF10A.HER2細胞は不規則な侵襲性の突起を有するより大きいコロニーを形成した。MCF10A細胞中でのAd-EphA2の発現は、より大きい不規則なコロニーをもたらし、その効果はMCF10A.HER2細胞において増幅された(p<0.05；一因子ANOVA；矢印は侵襲性突起を示す)。スケールバー＝25 mm。(B)3次元培養物をTO-PRO-3ヨウ素核染色(赤)および抗Ki67(緑)で染色し、共焦点顕微鏡により画像化した。共焦点分析により、親およびAd-bgalを形質導入されたMCF10Aが、中央内腔を取り囲む単一の層の上皮細胞から構成される均一な腺房構造を形成するが、MCF10A.HER2細胞が侵襲性突起(矢印は突起を示す)を有する他腺房構造およびいくつかの細胞を含むきちんと定義されていない内腔を形成することが示された。Ad-EphA2で形質導入されたMCF10A細胞はまた、きちんと定義されていない内腔を含む細胞を有する他腺房構造を形成した。侵襲および内腔充填は、EphA2を過剰発現するMCF10A.HER2において増強された。スケールバー＝20 mm。増殖マーカーKi67に関して陽性の核の％の定量(矢印頭部はKi67+核を示す)により、EphA2過剰発現がMCF10AおよびMCF10A.HER2細胞により形成された腺房構造内での増殖を有意に増強することが示された(p<0.05；一因子ANOVA)。(C)アデノウイルス遺伝子産物の発現およびMCF10A/HER2細胞中でのErbB2/HER2の過剰発現を免疫ブロットにより確認し、均一なローディングをアクチンに対する免疫ブロットにより検証した。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図４−１】EphA2は、Neu/ErbB2を介する新生物との関連でRas/Erkの活性化および増殖にとって必要である。(A)BrdUの核取込み(矢印)により評価されたように、EphA2 -/-動物から単離された原発性乳腺腫瘍細胞(PMTC)の増殖は、EphA2 +/+細胞と比較して低下した(p<0.05；両側スチューデントのT検定)。スケールバー＝20 mm。(B)GST-Raf結合ドメインによる腫瘍細胞溶解物中でのGTP結合Rasの免疫沈降により測定されたように、非刺激細胞中でのRas活性は、野生型細胞と比較して、EphA2欠損性原発腫瘍細胞において低下し、Erkリン酸化も同様であった。総Ras、総Erk、およびアクチンに関する免疫ブロッティングにより、均一なローディングを確認した。EphA2欠損およびNeu/ErbB2の均一な発現を、腫瘍細胞溶解物中でのEphA2およびErbB2の免疫沈降および免疫ブロッティングにより確認した。EphA2は非刺激野生型腫瘍細胞においてリン酸化されたが、野生型対EphA2欠損性原発腫瘍細胞においてはErbB2リン酸化における変化は検出されなかった。(C)RasおよびErk活性の低下を、3つの独立した野生型またはEphA2欠損性腫瘍から単離された全腫瘍抽出物中で確認した。(D)レスキュー実験のために、EphA2欠損性MMTV-Neu原発性腫瘍細胞を、BrdU取込みアッセイの48時間前に、Erk-1または対照b-ガラクトシダーゼ(bgal)を発現するアデノウイルスで形質導入した。EphA2欠損性PMTC中でのErk-1の過剰発現は、対照bgalを発現するPMTCと比較して血清誘導性増殖を有意に上昇させた(p<0.05 -/- Ad-bgal対+/+もしくは-/- Ad-Erk-1；一因子ANOVA)。アデノウイルストランスジーンの発現を、免疫ブロットにより確認した。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図５−１】EphA2は、Neu/ErbB2を介する新生物との関連でRhoAの活性化および腫瘍細胞移動にとって必要である。(A)EphA2欠損性PMTCは、トランスウェル移動アッセイにおいて、野生型PMTCと比較して10％血清を補給した増殖培地に応答する移動の有意な減少を示した (p<0.05；両側スチューデントのT検定)。(B)GST-Rhotekin Rho結合ドメインによる腫瘍細胞溶解物および全腫瘍抽出物中でのGTP結合RhoAの免疫沈降により測定されたように、RhoA活性は、野生型細胞／腫瘍と比較して、EphA2欠損性PMTCおよび無傷の腫瘍において低下した。興味深いことに、本発明者らはまた、野生型対照と比較して、EphA2欠損性MMTV-Neu腫瘍細胞および全腫瘍抽出物において総RhoAタンパク質レベルの減少を観察した。EphA2欠損性および野生型PMTCに由来する腫瘍細胞溶解物中では、GTPに結合した、活性化されたRacまたは総Racタンパク質レベルの変化は観察されなかった。(C)レスキュー実験のために、EphA2欠損性MMTV-Neu原発腫瘍細胞を、移動アッセイの48時間前に、構成的に活性なRhoA (Q63L)または対照b-ガラクトシダーゼ(bgal)を発現するアデノウイルスで形質導入した。構成的に活性なRhoAの発現は、野生型動物から誘導された腫瘍細胞において観察されるものに匹敵するレベルまで、EphA2欠損性腫瘍細胞の血清誘導性移動を回復させたが、対照b-galは効果を有さなかった(p<0.05 -/- Ad-bgal対+/+または-/-Ad-Rho；一因子ANOVA)。アデノウイルストランスジーンの発現を、免疫ブロットおよびRho活性アッセイにより確認した。
【図５−２】図５−１の続きである。
【図６−１】EphA2は、ErbB2と物理的かつ機能的に相互作用する。(A)内因性ErbB2およびEphA2を、化学的架橋剤DSSTPで処理しなかった、または処理した野生型MMTV-Neu腫瘍細胞中で、それぞれ抗EphA2または抗ErbB2抗体を用いて同時免疫沈降させた。EphA2およびErbB2は対照IgGにより免疫沈降しなかったので、検出された相互作用は特異的であった。溶解物をEphA2およびErbB2の発現のためにプローブ化することにより、均一な入力を検証した。(B)COS7細胞を、EphA2またはErbB2の発現のためのプラスミドでトランスフェクトした。EphA2を細胞溶解物から免疫沈降させ、生成物をEphA2およびErbB2について分析した。EphA2およびErbB2の同時発現は、同時免疫沈降を許容するのに十分であった。均一なトランスフェクション効率を、入力溶解物内のEphA2およびErbB2発現に関する免疫ブロッティングにより確認した。ErbB2およびEphA2の同時発現は、刺激の非存在下で、かつEphA2単独の過剰発現により誘導されるリン酸化の基底レベルを超える、COS7細胞中でのEphA2のリン酸化を誘導するのに十分であった。(C)EphA2とHER2は、親MCF10A中ではなく、HER2を過剰発現する細胞中で、抗EphA2抗体で同時免疫沈降したので、HER2を過剰発現するMCF10A細胞中でEphA2とヒトErbB2 (HER2)との相互作用が観察された。親MCF10A細胞と比較して、HER2を過剰発現するMCF10A細胞中で、EphA2リン酸化の上昇が観察され、ErbB2キナーゼ阻害剤AG825を用いる処理により、HER2を過剰発現するMCF10A細胞中でのEphA2リン酸化ならびにErbB2リン酸化が減少した。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図７−１】EphA2欠損は、MMTV-PyV-mT腫瘍において腫瘍原性、微小血管密度、または増殖調節シグナリング経路に影響しない。(A)誕生の100日後に分析された野生型またはヘテロ接合対照と比較して、MMTV-PyV-mT/EphA2-/-雌動物において、腫瘍体積または肺転移数における有意な差異は観察されなかった。データを平均±SEMとして表す。(B)EphA2タンパク質発現の喪失を、免疫組織化学染色によりEphA2欠損PyV-mT腫瘍中で確認した。スケールバー＝50 mm。(C)内皮マーカーであるvon Willebrand因子(vWF；矢印はvWF+血管を示す)に関する免疫蛍光染色により評価されたように、微小血管密度の変化は検出されなかった。スケールバー＝100 mm。(D)野生型対照と比較してEphA2欠損MMTV-PyV-mT全腫瘍抽出物中でのGTPに結合した活性なRasまたはリン酸化されたErkのレベルの変化は観察されず、RhoAの発現レベルの変化も観察されなかった。均一なローディングを、総Ras、総Erk、およびチューブリンに関する免疫ブロッティングにより確認した。(E)MMTV-NeuおよびMMTV-PyV-mT雌マウスから単離された腫瘍組織と比較して、FVB雌マウスから単離された正常乳腺組織におけるEphA2の発現およびリン酸化を評価した。正常組織と比較して両方の腫瘍型においてEphA2の過剰発現およびリン酸化の上昇が観察されたが、MMTV-Neu腫瘍において最も高いレベルが観察された。両方の腫瘍型におけるErbB2およびエフリン-A1の過剰発現が観察されたが、MMTV-PyV-mTおよびMMTV-Neu腫瘍におけるエフリン-A1の発現は同等であり、ErbB2レベルはMMTV-Neu腫瘍においてより高かった。均一なローディングをアクチンに関する免疫ブロットにより確認した。(F)特に上皮におけるEphA2の過剰発現を、一次乳腺上皮細胞(PMEC)溶解物とMMTV-NeuおよびMMTV-PyV-mTマウスから誘導された一次乳腺腫瘍細胞(PMTC)におけるEphA2レベルを比較することにより確認した。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図７−３】図７−２の続きである。
【図８−１】抗EphA2抗体を用いる処理は、MMTV-PyV-mT腫瘍ではなく、MMTV-Neuにおいて腫瘍増殖を阻害する。(A)抗マウスEphA2抗体を用いる処理は、MMTV-NeuおよびMMTV-PyV-mTマウスから誘導された腫瘍細胞中でのEphA2発現を低下させる。腫瘍細胞を、対照IgG(10 mg/ml)または増加する濃度の抗EphA2抗体で48時間処理した。EphA2の発現を免疫ブロットにより腫瘍細胞溶解物中で評価し、均一なローディングをアクチンに関する免疫ブロットにより確認した。ブロットを剥ぎ取り、抗体特異性に関する対照として抗EphA4抗体を用いて再プローブ化した。(B)野生型MMTV-Neuマウスから誘導された細胞を、雌FVBレシピエントマウスの除去された脂肪体に同所移植した。移植の2週間後、マウスに抗EphA2抗体または対照IgG(10 mg/kg)を週に2回、3週間、腹腔内注入した。分析のために移植の5週間後に腫瘍を収穫した。対照IgGで処理されたマウスと比較して抗EphA2抗体で処理した動物において、腫瘍体積の有意な減少が観察された(p<0.05；一因子ANOVA)。データを平均±SEMとして表す。(C)核PCNA発現により評価されたように、腫瘍細胞増殖も、対照と比較して抗EphA2で処理された動物において有意に減少した(p<0.05；一因子ANOVA；黒色の矢印頭部はPCNA+核を示す)。スケールバー＝50 mm。(D)免疫組織化学(上側パネル)および免疫ブロット(下側パネル)により評価されたように、EphA2発現は、IgG対照と比較して抗EphA2で処理された腫瘍において有意に減少した。ブロットを剥ぎ取り、アクチン発現について再プローブ化して、均一なローディングを検証した。スケールバー＝50 mm。(E)vWF蛍光の定量に基づいて、対照と比較して抗EphA2で処理されたマウスから単離された腫瘍において、微小血管密度の有意な低下(p<0.05；一因子ANOVA)が観察された(白色の矢印頭部はvWF+血管を示す)。スケールバー＝100 mm。(E)MMTV-PyV-mTマウスから誘導された細胞を、FVB雌レシピエントマウスの除去された脂肪体に同所移植し、上記のように抗EphA2抗体または対照IgGで処理した。対照IgGで処理されたマウスと比較して抗EphA2抗体で処理した動物間で腫瘍体積の変化は観察されなかった。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図８−３】図８−２の続きである。
【図９】EphA2欠損は、MMTV-Neu動物のサブセットにおいて周囲の脂肪体の乳腺上皮浸透を減少させる。(A)誕生の8ヶ月後にEphA2+/+および-/-MMTV-Neu雌トランスジェニック動物から回収された第4鼠径乳腺の全載ヘマトキシリン染色は、乳腺上皮が、約30％の-/-動物において観察される表現型である、鼠径リンパ節(*)を通過した乳腺脂肪体に完全に浸透できなかったことを示す(破線は最も右側のパネルにおける浸透の程度を示す)。左および中央のパネルは、比較のための、それぞれ、+/+および独立した-/-乳腺に由来する全載調製物を示す。(B)EphA2に関する免疫組織化学染色を用いて、野生型対照と比較したEphA2欠損組織サンプル中での乳腺上皮(矢印頭部、上側パネル)および乳腺血管(矢印、下側パネル)におけるEphA2タンパク質発現の喪失を確認した。スケールバー＝50 mm。(C)ErbB2に関する免疫組織化学染色は、EphA2 +/+、+/-、もしくは-/- MMTV-Neu腫瘍間でのErbB2の発現または局在化における明らかな差異を示さなかった。スケールバー＝50 mm。
【図１０−１】部分的には宿主内皮中でのEphA2発現の喪失に起因する、MMTV-Neu/EphA2欠損腫瘍において観察された血管欠損。(A)MMTV-Neu動物から誘導された腫瘍細胞を、野生型またはEphA2欠損FVB宿主動物の除去された乳腺脂肪体に同所移植した。野生型対照と比較して、移植の5週間後にEphA2欠損宿主動物から回収された腫瘍において腫瘍体積の有意な減少が観察された(p<0.05；一因子ANOVA)。(B)以前の研究と一致して、vWF免疫蛍光の定量に基づいてEphA2欠損宿主対野生型対照から単離された腫瘍における微小血管密度の有意な低下(p<0.05；ANOVA)が観察された(矢印頭部はvWF+血管を示す)。スケールバー＝100 mm。(C)血管動員において観察される欠損が宿主内皮中でのEphA2発現の喪失に起因するかどうかを決定するために、腫瘍細胞-内皮細胞同時培養移動アッセイを実施した(図を参照)。緑色蛍光マーカーで標識された野生型MMTV-Neu腫瘍細胞を、Matrigelでコーティングされたトランスウェルの下側表面上に播種した。野生型またはEphA2欠損動物から誘導された内皮細胞を、赤色蛍光染料で標識し、トランスウェルの上側チャンバーに添加し、腫瘍由来シグナルによる下側表面への内皮細胞の動員を測定した。5時間後、対照野生型内皮細胞よりも、トランスウェルの下側表面上での有意に少ない(p<0.05；対応のある両側スチューデントT検定)EphA2欠損内皮細胞が観察された(矢印はトランスウェルの下側表面に移動した内皮細胞を示す)。
【図１０−２】図１０−１の続きである。
【図１１】EphA2の欠損は、MMTV-Neuマウスから誘導されたErkリン酸化一次乳腺上皮細胞(PMEC)および乳腺上皮中のホスホ-Erkを減少させる。(A)原発性腫瘍細胞における観察と一致して、EphA2欠損MMTV-Neu動物から単離されたPMECは、エフリン-A1リガンドの発現レベルの変化の非存在下で、野生型動物から誘導された対照PMECよりもホスホ-Erkのより低い基底レベルを示した。EphA2の欠損を、PMEC溶解物からのEphA2の免疫沈降により確認した。(B)これらの観察と一致して、EphA2欠損対野生型MMTV-Neu乳腺から調製された組織切片においてp-Erkのより低い発現が観察された。スケールバー＝50 mm。
【図１２】抗EphA2抗体を用いる処理は、MMTV-NeuおよびMMTV-PyV-mT腫瘍細胞中でのEphA2発現を下方調節するが、MMTV-Neu腫瘍中でのErbB2の発現には影響しない。(A)ErbB2に関する免疫組織化学染色により、対照IgG対抗EphA2抗体で処理された動物から収穫されたMMTV-Neu腫瘍における発現または局在化の明らかな差異はないことが示された。ErbB2に対する染色特異性を、対照ウサギIgGを用いて隣接する切片をプローブ化することにより確認した。スケールバー＝50 mm。(B)抗マウスEphA2抗体を用いる処理は、vWF蛍光に基づいて、対照と比較してMMTV-PyV-mT腫瘍における微小血管密度に対する影響を有さなかった(矢印頭部はvWF+血管を示す)。スケールバー＝100 mm。(C)抗マウスEphA2抗体を用いる処理は、IgGで処理された対照腫瘍担持動物と比較してMMTV-PyV-mT腫瘍におけるEphA2発現を減少させる。スケールバー＝50 mm。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
7. 発明の詳細な説明
多くの研究が、腫瘍原性が多段階プロセスであり、様々な癌遺伝子がしばしば協調して腫瘍進行の様々な工程を促進することを示している(HahnおよびWeinberg, 2002; HanahanおよびWeinberg, 2000; VogelsteinおよびKinzler, 2004に概説されている)。本出願人は、リガンド刺激の非存在下でEphA2受容体のリン酸化を誘導する、腫瘍細胞表面でのEphA2とErbB2との物理的相互作用を証明した。ErbB2とEphA2のこの相互作用は、同様にEphA2を発現する腫瘍細胞の増殖および運動性の増加に寄与する、Ras/ErkシグナリングおよびRho GTPase活性化を増幅する(図4および5)。この観察は、ErbB2を発現する乳癌、特に、抗ErbB2療法に対して難治性であるものをどのように治療するかに関する影響を保持する。これらの結果は、抗EphA2療法が、単独で、またはErbB2を標的化する方法と共に、ErbB2を発現する腫瘍に対して有効であり得ることを示唆している。
【００３０】
EphA2は乳腺癌などの様々な腫瘍において過剰発現されるが(Brantley-Siedersら、2004a; Brantley-SiedersおよびChen, 2004; IretonおよびChen, 2005に概説されている)、本発明は、それ自身における、およびそれ自身の過剰発現が、腫瘍原性における活発な役割を必ずしも示すわけではないことを提供する。有意なレベルのEphA2過剰発現が、この研究で乳癌発生のMMTV-NeuおよびMMTV-PyV-mTモデルの両方において生じる腫瘍において文書化された。しかしながら、EphA2の欠失はMMTV-Neu動物における腫瘍の開始および進行を有意に減少させるが、中程度のErbB2のみを発現するMMTV-PyV-mTモデルにおいては、腫瘍進行に対するEphA2欠損の効果はなかった。かくして、EphA2過剰発現の機能的重要性は、同時発現される癌遺伝子の状況に依存する。従って、EphA2の有効な治療的標的化には、EphA2が特定の腫瘍型内の同時に存在する癌遺伝子シグナリングネットワークとどのように協調し、機能的に影響するかを理解することが必要である。例えば、EphA2タンパク質レベルの下方調節はヒト卵巣腫瘍異種移植片に対する効力を示したが(Landenら、2006)、無関係の同様に設計された抗体試薬は、CT26ヒト結腸癌異種移植片またはヒト乳腺癌異種移植片に対する効果を有さなかった(Kiewlichら、2006)。興味深いことに、MMTV-PyV-mT腫瘍細胞と同様、CT26細胞はErbB2/HER2を過剰発現しないが(Penichetら、1999)、これはEphA2過剰発現が特にErbB2過剰発現の状況での悪性腫瘍の形質転換および進行を増強し、従ってそのような腫瘍における好適な標的であることを示唆している。
【００３１】
80％を超える乳癌臨床サンプルなどの様々なヒト上皮癌においてEphA2過剰発現が報告されているが(Ogawaら、2000; Pan, 2005; Zelinskiら、2001)、HER2過剰発現はわずかに約30％のヒト乳癌において観察される(Ursini-Siegelら、2007)。さらに、134個のヒト乳癌標本の最近のスクリーニングにおいては、EphA2とHER2の発現の間には相関がないことが報告された(Pan, 2005)。本発明は、EphA2がErbB2と相互作用することを提供する。上皮増殖因子受容体(EGFR/ErbB1)および発癌に関与する構成的に活性な欠失突然変異体であるEGFR変異体(EGFRvIII)などの他のEGFRファミリーメンバーも、EphA2と物理的かつ機能的に相互作用することが示された(Larsenら、2007)。
【００３２】
さらに、EGFRの活性化は、EphA2の発現を上昇させる(Larsenら、2007; Ramnarainら、2006)。EGFRvIIIの過剰発現は、ヒト腫瘍異種移植片における腫瘍原性を増強し(Tangら、2000)、トランスジェニック動物におけるEGFRの乳腺上皮特異的過剰発現は新生物を誘導する(Brandtら、2000)。さらに、EGFRおよびEGFRvIIIの過剰発現は、より広いサブセットのヒト乳癌において報告されており、分析された48％もの事例について、EGFR発現について陽性であると報告されている(Geら、2002; Klijnら、1992; Klijnら、1994; Raeら、2004; Tsutsuiら、2003; Wikstrandら、1995)。かくして、EphA2は、一般的には、ErbB2とだけではなく、EGFRファミリーの受容体チロシンキナーゼと協調して作用して、増殖および悪性腫瘍進行を増強し得る。ErbB2/HER2はオーファン受容体であるため、他のEGFRファミリーメンバーとのヘテロダイマー化は、ErbB2の活性化を誘導する(Ursini-Siegelら、2007に概説されている)。EGFRキナーゼ活性の阻害はin vitroで乳癌細胞系におけるHER2/Neuリン酸化を減少させ、異種移植片におけるハーセプチンの抗腫瘍効果を増強し、MMTV-Neu/MMTV-TGFa二遺伝子マウスにおける腫瘍原性を抑制するため、EGFRとErbB2の相互作用は、乳腺腫瘍進行に影響する(Moulderら、2001)、(Lenferinkら、2000)。かくして、EphA2とEGFRならびにErbB2との機能的相互作用が、乳腺腫瘍増殖および進行にとって必要であり得る。
【００３３】
従って、本発明は、EphA2欠損は、乳腺上皮腺癌のMMTV-PyV-mTトランスジェニックモデルではなく、MMTV-Neuにおける腫瘍進行を減少させるため、癌におけるEphA2受容体チロシンキナーゼの役割は状況依存的であることを提供する。本発明は、EphA2がErbB2と物理的かつ機能的に相互作用して、腫瘍細胞におけるRas/MAPKおよびRhoAシグナリングを増幅するという証拠を提供する。Ras/MAPKは細胞増殖の原因となるが、活性化されたRho GTPaseが腫瘍細胞の運動性にとって必要である。同時に、これらの結果は、EphA2がErbB2/Neuと協調して、腫瘍進行を促進すること、およびEphA2がErbB受容体シグナリングに依存する腫瘍のための新規標的であることを示している。
【００３４】
7.1 本発明の実施形態
本発明の実施形態を、以下の番号付けされた実施形態中で提供する。
【００３５】
1. 過増殖性細胞の増殖を減少させる方法であって、
a)EphA2とErbB2の両方を発現する過増殖性細胞の集団を同定すること；および
b)EphA2を標的化する薬剤を投与すること、
を含む前記方法。
【００３６】
2. EphA2を標的化する薬剤を投与することを含む、EphA2とErbB2の両方を発現する過増殖性細胞の増殖を減少させる方法。
【００３７】
3. EphA2とErbB2との相互作用を阻害、遮断、または妨害する薬剤を投与することを含む、EphA2とErbB2の両方を発現する過増殖性細胞の増殖を減少させる方法。
【００３８】
4. 前記過増殖性細胞が癌細胞である、実施形態1〜3のいずれかに記載の方法。
【００３９】
5. 前記癌が皮膚癌、肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌もしくは膵臓癌、腎細胞癌、メラノーマ、白血病、またはリンパ腫である、実施形態4に記載の方法。
【００４０】
6. 前記過増殖性細胞疾患が非癌性過増殖性細胞疾患である、実施形態1〜3のいずれかに記載の方法。
【００４１】
7. 前記非癌性過増殖性細胞疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、乾癬、肺線維症、気管支過敏症、脂漏性皮膚炎、および嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、平滑筋再狭窄、内皮再狭窄、過増殖性血管疾患、ベーチェット症候群、アテローム性動脈硬化症、または黄斑変性である、実施形態6に記載の方法。
【００４２】
8. ErbB2を標的化する薬剤を投与することをさらに含む、実施形態1〜7のいずれかに記載の方法。
【００４３】
9. 前記細胞がEphA2を過剰発現する、実施形態1〜8のいずれかに記載の方法。
【００４４】
10. 前記細胞がErbB2を過剰発現する、実施形態1〜8のいずれかに記載の方法。
【００４５】
11. 前記細胞がEphA2とErbB2の両方を過剰発現する、実施形態1〜10のいずれかに記載の方法。
【００４６】
12. 前記EphA2標的化剤がアゴニストである、実施形態1〜11のいずれかに記載の方法。
【００４７】
13. 前記EphA2標的化剤がアンタゴニストである、実施形態1〜11のいずれかに記載の方法。
【００４８】
14. 前記EphA2またはErbB2標的化剤が抗体である、実施形態1〜13のいずれかに記載の方法。
【００４９】
15. 前記EphA2またはErbB2標的化剤が小分子である、実施形態1〜13のいずれかに記載の方法。
【００５０】
16. 前記EphA2またはErbB2標的化剤がペプチドである、実施形態1〜13のいずれかに記載の方法。
【００５１】
17. 前記EphA2またはErbB2標的化剤がsiRNAである、実施形態1〜13のいずれかに記載の方法。
【００５２】
18. 前記EphA2またはErbB2標的化剤が抗体-薬剤コンジュゲート(ADC)である、実施形態1〜13のいずれかに記載の方法。
【００５３】
19. 前記EphA2またはErbB2標的化剤のいずれかが、EphA2とErbB2との相互作用を阻害、遮断、または妨害する、実施形態1〜18のいずれかに記載の方法。
【００５４】
20. 癌患者を治療する方法であって、
(a)該患者の癌細胞中のEphA2およびErbB2の発現レベル、存在、または量を決定すること；
(b)該患者の癌細胞がEphA2とErbB2の両方を発現することが決定された場合、抗EphA2および／または抗ErbB2標的化剤を投与すること、
を含む前記方法。
【００５５】
7.2 EphA2またはErbB2を標的化する薬剤
EphA2またはErbB2を標的化し、その発現および／もしくは活性を変化させる薬剤を、治療前のEphA2またはErbB2の発現および／もしくは活性と比較して評価することができる。典型的には、これを、当業界で公知である好適な細胞系を用いて研究室設定で評価する。本発明の方法が、EphA2またはErbB2の発現および／もしくは活性が標的細胞中で阻害される方法、または程度に限定されないことを理解すべきである。
【００５６】
EphA2またはErbB2の発現および／もしくは活性を変化させる方法としては、限定されるものではないが、EphA2またはErbB2の発現もしくは活性を変化させるもの、例えば、EphA2もしくはErbB2と拮抗する薬剤、EphA2を作動する薬剤、EphA2のリン酸化の増加を誘導する薬剤、EphA2の分解を誘導する薬剤(具体的には、癌細胞上に露出されたEphA2のエピトープに結合する薬剤およびEphA2を作動する薬剤)、ワクチンとして使用できるもの、EphA2もしくはErbB2をコードする遺伝子により産生されるmRNA転写物に対して作用するもの、タンパク質へのmRNA転写物の翻訳を妨害するもの、ならびに翻訳されたタンパク質の活性を直接的に減少させるものが挙げられる。
【００５７】
遺伝子の転写を、細胞にアンチセンスDNAもしくはRNA分子、二本鎖RNA分子を送達することにより妨害することができる。酵素の活性を阻害することができる別の方法は、遺伝子のmRNA転写産物を妨害(に干渉)することによる。例えば、リボザイム(またはリボザイムを機能し得る形でコードするDNAベクター)を細胞に送達して、標的mRNAを切断することができる。アンチセンス核酸および二本鎖RNAを用いて、翻訳を妨害することもできる。
【００５８】
ペプチド、ポリペプチド(抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質)、リガンド、リガンド模倣物質、ペプチド模倣化合物および他の小分子は、翻訳されたタンパク質の活性を直接的に障害するために用いることができるものの例である。あるいは、EphA2もしくはErbB2の発現および／もしくは活性を変化させるタンパク質性細胞内物質を、治療用ポリペプチドを該核酸によりコードさせ、それが標的哺乳動物細胞中で発現されるような調節エレメントに機能し得る形で連結する、従来の方法を用いて、核酸、例えば、RNA、DNA、またはその類似体もしくは組合せとして送達することができる。
【００５９】
EphA2もしくはErbB2の発現および／もしくは活性を変化させるのに用いるための他の治療剤または予防剤としては、限定されるものではないが、小分子、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アビマー、アプタマー、基質模倣物質(例えば、非加水分解性もしくは基質捕捉性阻害剤)およびEphA2もしくはErbB2に対する抗体を生成するワクチンとして用いることができる薬剤が挙げられる。治療剤は、基質と似ているか、またはEphA2もしくはEphA2のその基質への結合を妨害するアンタゴニスト、特に、EphA2-ErbB2相互作用を妨害するものを含んでもよい。一実施形態においては、EphA2もしくはErbB2活性を変化させる薬剤は、ErbB2がリン酸化されたEphA2に結合するのを阻害する薬剤である。別の実施形態においては、EphA2もしくはErbB2活性を変化させる薬剤は、EphA2がリン酸化されているかどうかに関わらず、ErbB2がEphA2に結合するのを阻害する薬剤である。EphA2もしくはErbB2の発現および／もしくは活性を変化させるのに用いることができる薬剤の非限定例としては、小分子、エフリンペプチド(特に、EphA2に結合するエフリンA1)またはエフリンペプチド融合タンパク質、EphA2結合抗体およびその断片、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNA干渉(RNAi)分子、アビマー、ならびにアプタマーが挙げられる。
【００６０】
7.2.1 抗体
抗体は、特定の抗原に結合する免疫学的タンパク質である。ヒトおよびマウスなどの多くの哺乳動物においては、抗体は重鎖および軽鎖ポリペプチド鎖対から構築される。それぞれの鎖は、可変(Fv)および定常(Fc)領域と呼ばれる、2個の異なる領域から作られる。軽鎖および重鎖Fv領域は、該分子の抗原結合決定基を含み、標的抗原への結合を担う。Fc領域は、抗体(例えば、IgG)のクラス(またはアイソタイプ)を定義し、重要な生化学的事象を引き出すいくつかの天然タンパク質への結合を担う。
【００６１】
抗体のFc領域は、Fc受容体および他のリガンドなどのいくつかのリガンドと相互作用し、エフェクター機能と呼ばれる数々の重要な機能的能力を与える。IgGクラスのためのFc受容体の重要なファミリーは、Fcγ受容体(FcγR)である。これらの受容体は、抗体と細胞性免疫とのコミュニケーションを媒介する(Raghavanら、1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetchら、2001, Annu Rev Immunol 19:275-290)。ヒトにおいては、このタンパク質ファミリーとしては、アイソフォームFcγRIA、FcγRIB、およびFcγRICなどのFcγRI(CID64)；アイソフォームFcγRIIA、FcγRIIB、およびFcγRIICなどのFcγRII(CD32)；ならびにアイソフォームFcγRIIIAおよびFcγRIIIBなどのFcγRIII(CID16)が挙げられる(Jefferisら、2002, Immunol Lett 82:57-65)。これらの受容体は典型的には、Fcへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内のいくつかのシグナリング事象を媒介し得る細胞内ドメインを有する。これらの様々なFcγRサブタイプは、様々な細胞型上で発現される(Ravetchら、1991, Annu Rev Immunol 9:457-492に概説されている)。例えば、ヒトにおいては、FcγRIIIBは好中球にのみ認められるが、FcγRIIIAはマクロファージ、単球、ナチュラルキラー(NK)細胞、およびT細胞のサブ集団に認められる。
【００６２】
Fc/FcγR複合体の形成は、結合した抗原の部位にエフェクター細胞を動員し、典型的には、細胞内でのシグナリング事象ならびに炎症メディエーターの放出、B細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞傷害性攻撃などの重要なその後の免疫応答をもたらす。細胞傷害機能および食作用エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的化細胞を破壊する潜在的な機構である。FcγRを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識した後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を、抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)と呼ぶ(Raghavanら、1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetieら、2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetchら、2001, Annu Rev Immunol 19:275-290)。注目すべきことに、ADCCを媒介する主要な細胞であるNK細胞はFcγRIIIAのみを発現するが、単球はFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する(Ravetchら、1991)。
【００６３】
別の重要なFcリガンドは、補体タンパク質C1qである。C1qへのFc結合は、補体依存的細胞傷害性(CDC)と呼ばれるプロセスを媒介する(Wardら、1995, Ther Immunol 2:77-94)。C1qは6個の抗体に結合することができるが、補体カスケードを活性化するには2個のIgGへの結合で十分である。C1qはC1rおよびC1sセリンプロテアーゼと複合体を形成し、補体経路のC1複合体を形成する。
【００６４】
限定されるものではないが、標的に対する特異性、免疫エフェクター機構を媒介する能力、および血清中での長い半減期などの抗体のいくつかの重要な特徴は、抗体および関連する免疫グロブリン分子を強力な治療剤にする。多くのモノクローナル抗体が現在開発中であるか、または癌などの様々な症状の治療のために治療的に用いられている。これらの例としては、Vitaxin(登録商標)(MedImmune)、ヒト化インテグリンαvβ3抗体(例えば、PCT公開WO 2003/075957)、Herceptin(登録商標)(Genentech)、乳癌治療のために認可されたヒト化抗Her2/neu抗体(例えば、米国特許第5,677,171号)、CNTO 95(Centocor)、ヒトインテグリンαv抗体(PCT公開WO 02/12501)、Rituxan(登録商標)(IDEC/Genentech/Roche)、非ホジキンリンパ腫治療のために認可されたキメラ抗CD20抗体(例えば、米国特許第5,736,137号)およびErbitux(登録商標)(ImClone)、キメラ抗EGFR抗体(例えば、米国特許第4,943,533号)が挙げられる。
【００６５】
必要とされる増殖経路の遮断を介する抗増殖、アポトーシスを誘導する細胞内シグナリング、受容体の下方調節および／もしくは代謝回転の増強、ADCC、CDC、ならびに適応免疫応答の促進などの、抗体が腫瘍細胞を破壊するいくつかの可能性のある機構が存在する(Craggら、1999, Curr Opin Immunol 11:541-547; Glennieら、2000, Immunol Today 21:403-410)。裸の抗体はその所望の治療用途において有効であってよいが、特定の例においては、抗体を変化させることは効力を増強することができる。例えば、限定されるものではないが、エフェクター機能を増加または減少させるために抗体のFc領域を変化させることである。
【００６６】
別の実施形態においては、本発明の抗体は、EphA2に特異的に結合する抗体の変異体、その誘導体、類似体およびそのエピトープ結合フラグメント、例えば、限定されるものではないが、本明細書ならびにPCT公開WO 04/014292、WO 03/094859、米国特許出願公開第2007/0134254号、第2006/0177453号、第2006/0039904号、第2004/0028685号および12月21日に提出された米国特許仮出願第60/751,964号および2006年9月7日に提出された米国特許仮出願第60/842,641号(それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)に開示されたものである。特定の実施形態においては、本発明の抗体は、上記の特許出願に開示された抗EphA2抗体3F2、1C1、1F12、1H3、1D3、2B12、5A8に由来する可変領域(例えば、1個以上のCDR)の全部または一部を含むEphA2に特異的に結合する抗体である。
【００６７】
一実施形態においては、本発明の抗体はErbB2に結合する。例としては、限定されるものではないが、米国特許第5,677,171号および第6,458,356号ならびに米国特許出願公開第2007/0037228号および第2006/0275305号に開示されたものが挙げられる。
【００６８】
本発明はさらに、少なくとも1種のEph受容体またはErbB2に対する高い結合親和性を有する本発明の抗体の使用を包含する。特定の実施形態においては、少なくとも1種のEph受容体またはErbB2に特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも105M-1s-1、少なくとも5×105M-1s-1、少なくとも106M-1s-1、少なくとも5×106M-1s-1、少なくとも107M-1s-1、少なくとも5×107M-1s-1、または少なくとも108M-1s-1の結合速度定数またはKon速度((Ab)+抗原(Ag)kon←Ab-Ag)を有する。さらなる特定の実施形態においては、少なくとも1種のEph受容体またはErbB2に特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも約105M-1s-1、少なくとも約5×105M-1s-1、少なくとも約106M-1s-1、少なくとも約5×106M-1s-1、少なくとも約107M-1s-1、少なくとも約5×107M-1s-1、または少なくとも約108M-1s-1の結合速度定数またはKon速度((Ab)+抗原(Ag)kon←Ab-Ag)を有する。別の実施形態においては、少なくとも1種のEph受容体またはErbB2に特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも2×105M-1s-1、少なくとも5×105M-1s-1、少なくとも106M-1s-1、少なくとも5×106M-1s-1、少なくとも107M-1s-1、少なくとも5×107M-1s-1、または少なくとも108M-1s-1のkonを有する。さらなる実施形態においては、少なくとも1種のEph受容体またはErbB2に特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも約2×105M-1s-1、少なくとも約5×105M-1s-1、少なくとも約106M-1s-1、少なくとも約5×106M-1s-1、少なくとも約107M-1s-1、少なくとも約5×107M-1s-1、または少なくとも約108M-1s-1のkonを有する。
【００６９】
別の実施形態においては、少なくとも1種のEph受容体またはErbB2に特異的に結合する本発明の抗体は、10-1s-1未満、5×10-1s-1未満、10-2s-1未満、5×10-2s-1未満、10-3s-1未満、5×10-3s-1未満、10-4s-1未満、5×10-4s-1未満、10-5s-1未満、5×10-5s-1未満、10-6s-1未満、5×10-6s-1未満、10-7s-1未満、5×10-7s-1未満、10-8s-1未満、5×10-8s-1未満、10-9s-1未満、5×10-9s-1未満、または10-10-1s-1未満のkoff速度((Ab)+抗原(Ag)koff←Ab-Ag)を有する。さらに別の実施形態においては、少なくとも1種のEph受容体またはErbB2に特異的に結合する本発明の抗体は、約10-1s-1未満、約5×10-1s-1未満、約10-2s-1未満、約5×10-2s-1未満、約10-3s-1未満、約5×10-3s-1未満、約10-4s-1未満、約5×10-4s-1未満、約10-5s-1未満、約5×10-5s-1未満、約10-6s-1未満、約5×10-6s-1未満、約10-7s-1未満、約5×10-7s-1未満、約10-8s-1未満、約5×10-8s-1未満、約10-9s-1未満、約5×10-9s-1未満、または約10-10-1s-1未満のkoff速度((Ab)+抗原(Ag)koff←Ab-Ag)を有する。さらなる実施形態においては、少なくとも1種のEph受容体またはErbB2に特異的に結合する本発明の抗体は、5×10-4s-1未満、10-5s-1未満、5×10-5s-1未満、10-6s-1未満、5×10-6s-1未満、10-7s-1未満、5×10-7s-1未満、10-8s-1未満、5×10-8s-1未満、10-9s-1未満、5×10-9s-1未満、または10-10s-1未満のkoffを有する。別の実施形態においては、少なくとも1種のEph受容体またはErbB2に特異的に結合する本発明の抗体は、約5×10-4s-1未満、約10-5s-1未満、約5×10-5s-1未満、約10-6s-1未満、約5×10-6s-1未満、約10-7s-1未満、約5×10-7s-1未満、約10-8s-1未満、約5×10-8s-1未満、約10-9s-1未満、約5×10-9s-1未満、または約10-10s-1未満のkoffを有する。
【００７０】
別の実施形態においては、少なくとも1種のEph受容体またはErbB2に特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも102M-1、少なくとも5×102M-1、少なくとも103M-1、少なくとも5×103M-1、少なくとも104M-1、少なくとも5×104M-1、少なくとも105M-1、少なくとも5×105M-1、少なくとも106M-1、少なくとも5×106M-1、少なくとも107M-1、少なくとも5×107M-1、少なくとも108M-1、少なくとも5×108M-1、少なくとも109M-1、少なくとも5×109M-1、少なくとも1010M-1、少なくとも5×101M-1、少なくとも1011M-1、少なくとも5×1011M-1、少なくとも1012M-1、少なくとも5×1012M、少なくとも1013M-1、少なくとも5×1013M-1、少なくとも1014M-1、少なくとも5×1014M-1、少なくとも1015M-1、または少なくとも5×1015M-1の親和性定数またはKa(kon/koff)を有する。さらなる実施形態においては、少なくとも1種のEph受容体またはErbB2に特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも約102M-1、少なくとも約5×102M-1、少なくとも約103M-1、少なくとも約5×103M-1、少なくとも約104M-1、少なくとも約5×104M-1、少なくとも約105M-1、少なくとも約5×105M-1、少なくとも約106M-1、少なくとも約5×106M-1、少なくとも約107M-1、少なくとも約5×107M-1、少なくとも約108M-1、少なくとも約5×108M-1、少なくとも約109M-1、少なくとも約5×109M-1、少なくとも約1010M-1、少なくとも約5×101M-1、少なくとも約1011M-1、少なくとも約5×1011M-1、少なくとも約1012M-1、少なくとも約5×1012M、少なくとも約1013M-1、少なくとも約5×1013M-1、少なくとも約1014M-1、少なくとも約5×1014M-1、少なくとも約1015M-1、または少なくとも約5×1015M-1の親和性定数またはKa(kon/koff)を有する。
【００７１】
さらに別の実施形態においては、少なくとも1種のEph受容体またはErbB2に特異的に結合する抗体は、10-2M未満、5×10-2M未満、10-3M未満、5×10-3M未満、10-4M未満、5×10-4M未満、10-5M未満、5×10-5M未満、10-6M未満、5×10-6M未満、10-7M未満、5×10-7M未満、10-8M未満、5×10-8M未満、10-9M未満、5×10-9M未満、10-10M未満、5×10-10M未満、10-11M未満、5×10-11M未満、10-12M未満、5×10-12M未満、10-13M未満、5×10-13M未満、10-14M未満、5×10-14M未満、10-15M未満、または5×10-15M未満の解離定数またはKd(koff/kon)を有する。さらなる実施形態においては、少なくとも1種のEph受容体またはErbB2に特異的に結合する抗体は、約10-2M未満、約5×10-2M未満、約10-3M未満、約5×10-3M未満、約10-4M未満、約5×10-4M未満、約10-5M未満、約5×10-5M未満、約10-6M未満、約5×10-6M未満、約10-7M未満、約5×10-7M未満、約10-8M未満、約5×10-8M未満、約10-9M未満、約5×10-9M未満、約10-10M未満、約5×10-10M未満、約10-11M未満、約5×10-11M未満、約10-12M未満、約5×10-12M未満、約10-13M未満、約5×10-13M未満、約10-14M未満、約5×10-14M未満、約10-15M未満、または約5×10-15M未満の解離定数またはKd(koff/kon)を有する。
【００７２】
本発明はまた、EphA2ポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、本明細書で考察される抗体のVH CDRのいずれか1個のアミノ酸配列を有するVH CDRを含む、前記抗体も提供する。特に、本発明は、EphA2ポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、本明細書で考察される抗体のVH CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する1、2、3個以上のVH CDRを含む(またはあるいは、からなる、もしくは本質的にからなる)、前記抗体を提供する。
【００７３】
本発明はまた、EphA2ポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、本明細書で考察される抗体のVL CDRのいずれか1個のアミノ酸配列を有するVL CDRを含む前記抗体も提供する。特に、本発明は、EphA2ポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、本明細書で考察される抗体のVL CDRのいずれかのアミノ酸配列を有する1、2、3個以上のVL CDRを含む(またはあるいは、からなる、もしくは本質的にからなる)、前記抗体を提供する。
【００７４】
本発明は、EphA2ポリペプチドに特異的に結合するか、またはErbB2ポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、本明細書に開示されるVLドメイン、または他の公知のVLドメインと結合させた本明細書に開示されるVHドメインを含む前記抗体を提供する。本発明はまた、EphA2ポリペプチドに特異的に結合するか、またはErbB2ポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、本明細書に開示されるVHドメイン、または他の公知のVHドメインと結合させた本明細書に開示されるVLドメインを含む前記抗体を提供する。
【００７５】
本発明は、EphA2ポリペプチドに特異的に結合するか、またはErbB2ポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、本明細書で考察される抗体の1個以上のVH CDRおよび1個以上のVL CDRを含む前記抗体の使用を意図し、該抗体を提供する。特に、本発明は、EphA2ポリペプチドに特異的に結合するか、またはErbB2ポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、本明細書で考察される抗体のVH CDR1およびVL CDR1; VH CDR1およびVL CDR2; VH CDR1およびVL CDR3; VH CDR2およびVL CDR1; VH CDR2およびVL CDR2; VH CDR2およびVL CDR3; VH CDR3およびVH CDR1; VH CDR3およびVL CDR2; VH CDR3およびVL CDR3; VH1 CDR1、VH CDR2およびVL CDR1; VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR2; VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR3; VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2; VH CDR2、VH CDR2およびVL CDR3; VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR2; VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR3; VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2; VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3; VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2; VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3; VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1; VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2; VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR3; VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2; VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3; VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2; VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3; VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2; VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3; VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2およびVL CDR3; VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2; VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3; VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3; VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3; VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3; またはVH CDRとVL CDRの任意の組合せを含む(またはあるいは、からなる、もしくは本質的にからなる)前記抗体を提供する。
【００７６】
1個以上の可変もしくは超可変領域を含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、例えば、同様に疾患もしくは障害(例えば、癌、過増殖性もしくは低増殖性障害)に関連する1個以上の症候を予防、治療、および／もしくは軽減するのに用いることができる抗イディオタイプ抗体の製造における有用性を有する。製造される抗イディオタイプ抗体を、該抗イディオタイプ抗体の製造において用いられるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に含まれる可変もしくは超可変領域を含む抗体の検出のために、例えば、ELISAなどの免疫アッセイにおいて用いることもできる。
【００７７】
本発明は、in vivoで長い半減期を有するEphA2ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。特に、本発明は、3日以上、7日以上、10日以上、15日以上、25日以上、30日以上、35日以上、40日以上、45日以上、2ヶ月以上、3ヶ月以上、4ヶ月以上、または5ヶ月以上の、被験体、好ましくは哺乳動物および最も好ましくはヒトにおける半減期を有する、EphA2ポリペプチドに特異的に結合するか、またはErbB2ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。
【００７８】
in vivoでの抗体(例えば、モノクローナル抗体、一本鎖抗体およびFabフラグメント)の血清循環を延長するために、例えば、高分子量ポリエチレングリコール(PEG)などの不活性ポリマー分子を、抗体のNもしくはC末端へのPEGの部位特異的結合を介して、またはリジン残基上に存在するε-アミノ基を介して多官能性リンカーを含むか、もしくは含まない抗体に結合させることができる。生物学的活性の最小の喪失をもたらす線状または分枝状ポリマー誘導体を用いることができる。結合の程度を、SDS-PAGEおよび質量分析により密接にモニターして、PEG分枝と抗体との適切な結合を確保することができる。未反応のPEGを、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体-PEGコンジュゲートから分離することができる。PEGで誘導体化された抗体を、当業者にはよく知られた方法を用いて、例えば、本明細書に記載の免疫アッセイにより、結合活性ならびにin vivoでの効力について試験することができる。
【００７９】
in vivoでの半減期が増加した抗体を、IgG定常ドメイン、またはそのFcRn結合断片(例えば、FcもしくはヒンジFcドメイン断片)に1個以上のアミノ酸改変(すなわち、置換、挿入もしくは欠失)を導入することにより作製することもできる。例えば、国際特許公開WO 98/23289; 国際特許公開WO 97/34631; 国際特許公開WO 02/060919; および米国特許第6,277,375号(それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【００８０】
さらに、抗体をアルブミンにコンジュゲートさせて、in vivoでより安定であるか、またはin vivoでより長い半減期を有する抗体または抗体フラグメントを作製することができる。この技術は当業界でよく知られており、例えば、国際特許公開WO 93/15199、WO 93/15200、およびWO 01/77137; ならびに欧州特許第EP 413,622号(全て参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【００８１】
本発明の特定の抗体を必要に応じて働かせるために、選択した毒素に結合させようとする抗体の重要な態様は、抗体が、一度細胞表面の標的(例えば、EphA2)に結合したら、該細胞により内在化されるということである。一度内在化されたら、コンジュゲートした毒素を放出するか、または結合したままにして、該細胞に対してその毒性効果を発揮させることができる。
【００８２】
本発明の抗体の抗体部分としては、限定されるものではないが、合成抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、組換え生産された抗体、イントラボディ、多特異的抗体、二特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、一本鎖FvFc(scFvFc)、一本鎖Fv(scFv)、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体が挙げられる。特に、本発明の方法において用いられる抗体としては、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分が挙げられる。本発明の抗体は、免疫グロブリン分子の任意の型(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスのものであってよい。
【００８３】
本発明の抗体の抗体部分は、鳥類および哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ)などの任意の動物起源に由来するものであってよい。これらの抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体であってよい。本明細書で用いられる「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーまたはヒト遺伝子に由来する抗体を発現するマウスから単離された抗体を含む。
【００８４】
抗体などの全てのポリペプチドは、一般的にはポリペプチドが正味の電荷を担持しないpHと定義される等電点(pI)を有する。タンパク質の可溶性は、典型的には溶液のpHが該タンパク質の等電点に等しい場合に最も低いことが当業界で公知である。抗体中のイオン化可能な残基の数および位置を変化させて、pIを調整することにより、可溶性を最適化することができる。例えば、好適なアミノ酸置換(例えば、リジンなどの荷電したアミノ酸をアラニンなどの非荷電残基に置換することによる)を作製することにより、ポリペプチドのpIを操作することができる。任意の特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、前記抗体のpIの変化をもたらす抗体のアミノ酸置換は、該抗体の可溶性および／または安定性を改善し得る。当業者であれば、所望のpIを達成するために、どのアミノ酸置換が特定の抗体にとって最も好適であるかを理解するであろう。タンパク質のpIを、限定されるものではないが、等電点電気泳動法および様々なコンピューターアルゴリズム(例えば、Bjellqvistら、1993, Electrophoresis 14:1023を参照)などの様々な方法により決定することができる。一実施形態においては、本発明の抗体のpIは、約6.5、約7.0、約7.5、約8.0、約8.5、または約9.0より高い。別の実施形態においては、本発明の抗体のpIは、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、または9.0よりも高い。一実施形態においては、本発明の抗体のpIにおける変化をもたらす置換は、Eph受容体またはErbB2に対するその結合親和性を有意に減少させないであろう。本明細書で用いられるpI値は、主な電荷形態のpIと定義される。タンパク質のpIを、限定されるものではないが、等電点電気泳動法および様々なコンピューターアルゴリズム(例えば、Bjellqvistら、1993, Electrophoresis 14:1023を参照)などの様々な方法により決定することができる。
【００８５】
抗体のFabドメインのTmは、抗体の温度安定性の良好な指示因子であり、保存期限の示唆をさらに提供し得る。より低いTmはより高い凝集性／より低い安定性を示すが、より高いTmはより低い凝集性／より高い安定性を示す。かくして、より高いTmを有する抗体を用いることが多い。一実施形態においては、抗体のFabドメインは、少なくとも50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃または120℃よりも高いTm値を有する。別の実施形態においては、抗体のFabドメインは、少なくとも約50℃、少なくとも約55℃、少なくとも約60℃、少なくとも約65℃、少なくとも約70℃、少なくとも約75℃、少なくとも約80℃、少なくとも約85℃、少なくとも約90℃、少なくとも約95℃、少なくとも約100℃、少なくとも約105℃、少なくとも約110℃、少なくとも約115℃または少なくとも約120℃よりも高いTm値を有する。タンパク質ドメイン(例えば、Fabドメイン)の融点Iを、当業界で公知の任意の標準的な方法を用いて、例えば、示差走査熱量測定法により測定することができる(例えば、Vermeerら、2000, Biophys. J. 78:394-404; Vermeerら、2000, Biophys. J. 79: 2150-2154)。
【００８６】
本発明の抗体は、一特異的、二特異的、三特異的であってよく、またはより高い多特異性を有する。多特異的抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに特異的に結合するか、または標的分子ならびに異種ポリペプチドもしくは固相支持材料などの異種エピトープの両方に特異的に結合することができる。例えば、国際特許出願公開WO 94/04690; WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; およびWO 92/05793; Tuttら、1991, J. Immunol. 147:60-69; 米国特許第4,474,893号、第4,714,681号、第4,925,648号、第5,573,920号、および第5,601,819号; ならびにKostelnyら、1992, J. Immunol. 148:1547(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。一実施形態においては、一方の結合特異性はEph受容体に対するものであり、他方はErbB2に対するものである。
【００８７】
多特異的抗体は、少なくとも2種の異なる抗原(例えば、限定されるものではないが、EphA2およびErbB2)に対する結合特異性を有する。そのような分子は通常、2種の抗原(すなわち、二特異的抗体、BsAb)にのみ結合するであろうが、三特異的抗体などのさらなる特異性を有する抗体が本発明により包含される。BsAbの例としては、限定されるものではないが、EphA2に対する一方のアームおよび任意の他の抗原に対する他方のアームを有するものが挙げられる。二特異的抗体を作製する方法は当業界で公知である。完全長二特異的抗体の伝統的生産は、2個の鎖が異なる特異性を有する、2個の免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づくものである(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとするMillsteinら、1983, Nature, 305:537-539)。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の無作為組合せのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は、一方のみが正確な二特異性構造を有する、異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生する。通常はアフィニティクロマトグラフィー工程により行われる、正確な分子の精製はむしろ面倒であり、生成物の収率は低い。同様の手順はWO 93/08829およびTrauneckerら、1991, EMBO J., 10:3655-3659に開示されている。より指向性の手法は、ジ-ダイアボディ、または四価二特異的抗体の生成である。ジ-ダイアボディの製造方法は当業界で公知である(例えば、Luら、2003, J Immunol Methods 279:219-32; Marvinら、2005, Acta Pharmacolical Sinica 26:649を参照)。
【００８８】
様々な手法に従って、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体-抗原結合部位)を、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。融合物は、ヒンジの少なくとも一部、CH2、およびCH3領域を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むものであってよい。一実施形態においては、軽鎖結合にとって必要な部位を含む第1の重鎖定常領域(CH1)が、前記融合物の少なくとも1個に存在する。免疫グロブリン重鎖融合物、および必要に応じて、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを別々の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物中に同時トランスフェクトする。これは、構築物中で用いられる異なる比率の3個のポリペプチド鎖が最適な収率を提供する場合の実施形態において、3個のポリペプチド断片の相互比率を調整する際に高い可撓性を提供する。しかしながら、等しい比率の少なくとも2個のポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらすか、またはその比率が特に有意ではない場合、1個の発現ベクター中に2個または3個全部のポリペプチド鎖のコード配列を挿入することができる。
【００８９】
この手法の一実施形態においては、二特異的抗体は、一方のアームに第1の結合特異性(例えば、Eph受容体)を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第2の結合特異性を提供する)から構成される。二特異的分子の半分だけにおける免疫グロブリン重鎖の存在が容易な分離方法を提供するため、この非対称的構造により、望ましくない免疫グロブリン鎖組合せからの所望の二特異的化合物の分離が容易になる。この手法は、WO 94/04690(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に開示されている。二特異的抗体を作製するさらなる詳細については、例えば、Sureshら、1986, Methods in Enzymology, 121:210(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。WO 96/27011(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載の別の手法に従って、一対の抗体分子を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの割合を最大化することができる。一実施形態においては、接合部分は抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法においては、第1の抗体分子の接合部分に由来する1個以上の小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖(例えば、チロシンもしくはトリプトファン)と置換する。大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの(例えば、アラニンもしくはトレオニン)に置換することにより、大きい側鎖と同一の、または類似するサイズの代償的「空洞」を第2の抗体分子の接合部分上で作製する。これは、ホモダイマーなどの他の望ましくない最終生成物を超えるヘテロダイマーの収率を増加させるための機構を提供する。
【００９０】
特定の実施形態においては、本発明の方法における使用のための抗体は、二特異的T細胞エンゲージャー(BiTE)である。二特異的T細胞エンゲージャー(BiTE)は、T細胞に標的の抗原特異的消失を再指令することができる二特異的抗体である。BiTE分子は、該分子の一方の末端でT細胞抗原(例えば、CD3)に結合する抗原結合ドメインおよび標的細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメインを有する。BiTE分子は、参照により本明細書に組み入れられるものとするWO 99/54440に最近記載された。この刊行物は、CD19およびCD3抗原(CD19xCD3)に対する結合部位を含む新規一本鎖多官能性ポリペプチドを記載する。この分子は、一方がB細胞上でCD19に結合し、T細胞上でCD3に結合する抗体の2個の抗体から誘導されたものであった。これらの異なる抗体の可変領域は、ペプチド配列により連結され、かくして、1個の分子を作る。また記載されるのは、一本鎖、二特異的抗体を作るための重鎖(VH)および軽鎖(VL)可変ドメインと可撓性リンカーとの連結である。
【００９１】
本発明の一実施形態においては、目的のポリペプチド(例えば、Eph受容体および／もしくはエフリン)に特異的に結合する抗体またはリガンドは、BiTE分子の一部を含むであろう。例えば、目的のポリペプチド(例えば、Eph受容体および／もしくはErbB2)に結合する抗体のVHおよび／またはVL(例えば、scFv)を、上記の分子のものなどの抗CD3結合部分に融合し、かくして、目的のポリペプチド(例えば、Eph受容体および／もしくはErbB2)を標的化するBiTE分子を作製することができる。目的のポリペプチド(例えば、Eph受容体および／もしくはErbB2)に対する抗体の重鎖および／または軽鎖可変ドメインに加えて、目的のポリペプチド(例えば、Eph受容体および／もしくはErbB2)に結合する他の分子は、BiTE分子、例えば、受容体(例えば、Eph受容体および／もしくはErbB2)を含んでもよい。別の実施形態においては、BiTE分子は、他のT細胞抗原(CD3以外)に結合する分子を含んでもよい。例えば、CD2、CD4、CD8、CD11a、TCR、およびCD28などのT細胞抗原に特異的に結合するリガンドおよび／または抗体は、本発明の一部であると意図される。この一覧は包括的なものではなく、T細胞抗原に特異的に結合することができる他の分子をBiTE分子の一部として用いることができることを例示するものに過ぎないことを意味する。これらの分子は、前記抗体または天然リガンド(例えば、天然リガンドがCD3であるLFA3)のVHおよび／またはVL部分を含んでもよい。
【００９２】
二特異的抗体としては、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方をアビジンに結合し、他方をビオチンに結合することができる。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞に免疫系の細胞を標的化すること(米国特許第4,676,980号)、およびHIV感染の治療について(WO 91/00360、WO 92/200373、およびEP 03089)提唱されている。上記参考文献は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。ヘテロコンジュゲート抗体を、任意の都合のよい架橋方法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当業界でよく知られており、いくつかの架橋技術と共に、米国特許第4,676,980号に開示されている。上記参考文献は各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００９３】
少なくとも1個のヒンジ改変を含む3個以上の価数の抗体が意図される。例えば、三特異的抗体を調製することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとする、Tuttら、J. Immunol. 147: 60 (1991)を参照されたい。
【００９４】
本発明の抗体は、ラクダ化単一ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体を包含する(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする、Muyldermansら、2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttallら、2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253; ReichmannおよびMuyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25; 国際特許出願公開WO 94/04678およびWO 94/25591; 米国特許第6,005,079号を参照されたい)。
【００９５】
特に意図される他の抗体は、「オリゴクローナル」抗体である。本明細書で用いられる用語「オリゴクローナル抗体」とは、異なるモノクローナル抗体の所定の混合物を指す。例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとする、PCT公開WO 95/20401; 米国特許第5,789,208号および第6,335,163号を参照されたい。オリゴクローナル抗体は、単一細胞中で生成される1個以上のエピトープに対する抗体の所定の混合物からなってもよい。オリゴクローナル抗体は、共通の軽鎖と対形成して、複数の特異性を有する抗体を生成することができる複数の重鎖を含んでもよい(例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとするPCT公開WO 04/009618)。オリゴクローナル抗体は、単一の標的分子上の複数のエピトープを標的化することが望ましい場合に特に有用である。当業者であれば、どの型の抗体または抗体混合物が意図される目的および所望の必要性に適用可能であるかを知っているか、またはそれを決定することができるであろう。
【００９６】
一実施形態においては、本発明の抗体を、化学的に改変するか(例えば、1個以上の化学部分を抗体に結合させることができる)、または改変してその糖鎖を変化させ、再度、抗体の1個以上の機能的特性を変化させることができる。例えば、非糖鎖付加抗体を作製することができる(すなわち、抗体は糖鎖を欠く)。糖鎖を変化させて、例えば、標的抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。そのような炭水化物改変を、例えば、抗体配列内の1個以上の糖鎖付加部位を変化させることにより達成することができる。例えば、1個以上の可変領域フレームワーク糖鎖付加部位の消失をもたらし、それによってその部位の糖鎖を消失させる1個以上のアミノ酸置換を作製することができる。そのような非糖鎖付加は、抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。そのような手法は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許第5,714,350号および第6,350,861号にさらに詳細に記載されている。
【００９７】
さらにまたはあるいは、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体または二分割GlcNAc構造が増加した抗体などの変化した型の糖鎖を有する抗体を作製することができる。そのような変化した糖鎖パターンは、抗体のADCC能力を増加させることが証明されている。そのような炭水化物改変を、例えば、糖鎖付加機構が変化した宿主細胞中で該抗体を発現させることにより達成することができる。糖鎖付加機構が変化した細胞は当業界で記載されており、本発明の組換え抗体を発現することにより、糖鎖が変化した抗体を産生する宿主細胞として用いることができる。例えば、Shields, R.L.ら、(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umanaら(1999) Nat. Biotech. 17:176-1、ならびに欧州特許第EP 1,176,195号; PCT公開WO 03/035835; WO 99/54342、ならびに米国特許第6,946,292号および第7,214,775号(それぞれ、その全体が本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【００９８】
本発明はまた、抗体依存的細胞媒介性細胞傷害活性が増強されたFc変異体である抗体も包含する。そのようなFc変異抗体の非限定例は、米国特許出願第11/203,253号 (2005年8月15日に提出され、米国特許出願公開第US 2006/0039904 A1として公開)および第11/203,251号 (2005年8月15日に提出)、ならびに米国特許仮出願第60/674,674号 (2005年4月26日に提出)および第60/713,711号 (2005年9月6日に提出)(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に開示されている。
【００９９】
本発明は、標的化部分と抗EphA2もしくは抗ErbB2剤の両方としての融合タンパク質を作製するための、異種薬剤に組換え的に融合されるか、または化学的に結合された(共有的および非共有的コンジュゲーションの両方を含む)抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。前記異種薬剤は、ポリペプチド(もしくはその一部、例えば、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90もしくは少なくとも100個のアミノ酸のポリペプチド)、核酸、小分子(1000ダルトン未満)、または無機もしくは有機化合物であってよい。融合は直接的である必要はないが、リンカー配列を介して行ってもよい。異種薬剤に融合または結合された抗体をin vivoで用いて、当業界で公知の方法を用いて障害の進行を検出、治療、管理、またはモニターすることができる。例えば、国際特許出願公開WO 93/21232; EP 439,095; Naramuraら、1994, Immunol. Lett. 39:91-99; 米国特許第5,474,981号; Gilliesら、1992, PNAS 89:1428-1432; およびFellら、1991, J. Immunol. 146:2446-2452(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。いくつかの実施形態においては、検出、治療、管理、またはモニターしようとする障害は、EphA2を過剰発現するか、またはErbB2を発現もしくは過剰発現する悪性の癌である。他の実施形態においては、検出、治療、管理、またはモニターしようとする障害は、EphA2を過剰発現するか、またはErbB2を発現もしくは過剰発現する細胞に関連する前癌症状である。特定の実施形態においては、前癌症状は、高悪性度前立腺上皮細胞内新生物(PIN)、乳腺の線維腺腫、線維嚢胞性疾患、または複合母斑である。
【０１００】
一実施形態においては、抗体の抗腫瘍能力の増強は、細胞傷害性薬剤または毒素を、標的細胞により内在化され得るmAbに連結することを含む。これらの薬剤を、それぞれ、抗体-薬剤コンジュゲート(ADC)および免疫毒素と呼ぶ。患者への投与に際して、ADCおよび免疫毒素は、その抗体部分を介して標的細胞に結合し、内在化されるようになり、薬剤または毒素がその効果を発揮することが可能になる。例えば、WO2007/030642A2、米国特許出願公開第US2005/0180972 A1号、第US2005/0123536 A1号を参照されたい。また、例えば、Hamblettら、Clin Canc Res, 10:7063-7070, October 15, 1999, Lawら、Clin Canc Res, 10:7842-7851, December 1, 2004, Franciscoら、Neoplasia, 102(4):1458-1465, August 15, 2003, Russellら、Clin Canc Res, 11:843-852, January 15, 2005, Doroninaら、Nat Biotech, 21(7):778-784, July 2003(全てその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)も参照されたい。
【０１０１】
別の実施形態においては、本発明の抗体は、限定されるものではないが、PCT公開WO 2007/030642、2005年9月7日に提出された米国特許仮出願第60/714,362号および2005年11月14日に提出された同第60/735,966号、および2008年3月5日に提出された米国特許出願第12/065,832号(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)などの、EphA2に特異的に結合する抗体-薬剤コンジュゲート(ADC)を含む。
【０１０２】
本発明はさらに、抗体フラグメントに融合またはコンジュゲートされた異種薬剤を含む組成物を含む。例えば、異種ポリペプチドを、Fabフラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、F(ab)フラグメント、またはその一部に融合またはコンジュゲートすることができる。ポリペプチドを抗体部分に融合またはコンジュゲートする方法は、当業界で公知である。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号、および第5,112,946号; EP 307,434; EP 367,166; 国際特許公開WO 96/04388およびWO 91/06570; Ashkenaziら、1991, PNAS 88: 10535-10539; Zhengら、1995, J. Immunol. 154:5590-5600; ならびにVilら、1992, PNAS 89:11337-11341(該参考文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【０１０３】
例えば、本明細書に列挙された抗体のいずれかのさらなる融合タンパク質を、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング(集合的に「DNAシャッフリング」と呼ぶ)の技術を介して作製することができる。DNAシャッフリングを用いて、本発明の抗体またはそのフラグメント(例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体もしくはそのフラグメント)の活性を変化させることができる。一般的には、米国特許第5,605,793号; 第5,811,238号; 第5,830,721号; 第5,834,252号; および第5,837,458号、ならびにPattenら、1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76; Hanssonら、1999, J. Mol. Biol. 287:265; ならびにLorenzoおよびBlasco, 1998, BioTechniques 24:308(これらの特許および刊行物の各々はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。抗体もしくはそのフラグメント、またはコードされた抗体もしくはその断片を、組換えの前に、変異性PCRによる無作為突然変異誘発、無作為ヌクレオチド挿入または他の方法にかけることにより変化させることができる。EphA2に特異的に結合する、抗体もしくは抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドの1つ以上の部分を、1種以上の異種薬剤の1個以上の成分、モチーフ、断片、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えることができる。
【０１０４】
一実施形態においては、本発明の抗体またはそのフラグメントもしくは変異体を、ペプチドなどのマーカー配列と結合させて、精製を容易にする。特定の実施形態においては、マーカーアミノ酸配列は、特に、pQEベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)中で提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くが市販されている。Gentzら、1989, PNAS 86:821に記載のように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製を提供する。精製にとって有用な他のペプチドタグとしては、限定されるものではないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質(Wilsonら、1984, Cell 37:767)から誘導されたエピトープに対応する、ヘマグルチニン「HA」タグおよび「フラッグ」タグが挙げられる。
【０１０５】
他の実施形態においては、本発明の抗体またはそのフラグメントもしくは変異体を、診断剤または検出剤にコンジュゲートする。そのような抗体は、特定の療法の効力の決定などの臨床試験手順の一部として、または予備スクリーニング手順の一部として、癌の発達または進行をモニターまたは予測するのに有用であってよい。さらに、そのような抗体は、EphA2およびErbB2を発現するか、または過剰発現する細胞に関連する前癌症状の発達または進行をモニターまたは予測するのに有用であってよい。
【０１０６】
診断および検出を、限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、もしくはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素；限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドもしくはフィコエリトリンなどの蛍光材料；限定されるものではないが、ルオロウ(luorou)などの発光材料；限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光材料；限定されるものではないが、ビスマス(213Bi)、炭素(14C)、クロム(51Cr)、コバルト(57Co)、フッ素(18F)、ガドリニウム(153Gd、159Gd)、ガリウム(68Ga、67Ga)、ゲルマニウム(68Ge)、ホルミウム(166Ho)、インジウム(115In, 113In, 112In, 111In)、ヨウ素(131I, 125I, 123I, 121I)、ランタン(140La)、ルテチウム(177Lu)、マンガン(54Mn)、モリブデン(99Mo)、パラジウム(103Pd)、リン(32P)、プラセオジミウム(142Pr)、プロメチウム(149Pm)、レニウム(186Re, 188Re)、ロジウム(105Rh)、ルテミウム(97Ru)、サマリウム(153Sm)、スカンジウム(47Sc)、セレン(75Se)、ストロンチウム(85Sr)、硫黄(35S)、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、スズ(113Sn, 117Sn)、三重水素(3H)、キセノン(133Xe)、イッテルビウム(169Yb, 175Yb)、イットリウム(90Y)、亜鉛(65Zn)などの放射性材料；様々な陽電子放出トモグラフィーを用いる陽電子放出金属、ならびに非放射性常磁性金属イオンなどの検出可能物質に前記抗体をカップリングさせることにより達成することができる。
【０１０７】
他の実施形態においては、本発明の抗体またはそのフラグメントもしくは変異体を、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤などの治療剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、α放射体にコンジュゲートさせる。細胞毒素または細胞傷害剤としては、細胞に対して有害である任意の薬剤が挙げられる。例としては、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、およびシクロホスファミドならびにその類似体もしくは相同体が挙げられる。治療剤としては、限定されるものではないが、代謝拮抗物質(例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパクオラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BCNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシスジクロロジアミン白金(II)(DDP)、シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前はダウノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、ならびに抗有糸分裂剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)が挙げられる。
【０１０８】
一実施形態においては、細胞傷害剤を、エネジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、およびビンカアルカロイドからなる群より選択する。他の実施形態においては、細胞傷害剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、CC-1065、SN-38、トポテカン、モルホリノ-ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、ドラスタチン-10、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、メイタンシン、DM-1、オーリスタチンもしくは他のドラスタチン誘導体、例えば、オーリスタチンEもしくはオーリスタチンF、AEB、AEVB、AEFP、MMAE(モノメチルオーリスタチンE)、MMAF(モノメチルオーリスタチンF)、エレウテロビンもしくはネトロプシンである。
【０１０９】
さらに他の実施形態においては、本発明の抗体の細胞傷害剤は、抗チューブリン剤である。より具体的な実施形態においては、細胞傷害剤を、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、およびドラスタチンからなる群より選択する。より具体的な実施形態においては、細胞傷害剤は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、VP-16、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロンA、エピチロンB、ノコダゾール、コルヒチン、コルシミド、エストラムスチン、セマドチン、ジスコデルモリド、メイタンシン、DM-1、オーリスタチンもしくは他のドラスタチン誘導体、例えば、オーリスタチンEもしくはオーリスタチンF、AEB、AEVB、AEFP、MMAE(モノメチルオーリスタチンE)、MMAF(モノメチルオーリスタチンF)、エレウテロビンもしくはネトロプシンである。
【０１１０】
特定の実施形態においては、本発明の抗体の細胞傷害剤は、MMAEである。別の特定の実施形態においては、本発明の抗体の細胞傷害剤は、AEFPである。さらに特定の実施形態においては、本発明の抗体の細胞傷害剤は、MMAFである。毒素、スペーサー、リンカー、ストレッチャーなどのさらなる例、ならびにその構造を、米国特許出願公開第2006/0074008 A1号、第2005/0238649 A1号、第2005/0123536 A1号、第2005/0180972 A1号、第2005/0113308 A1号、第2004/0157782 A1号、米国特許第6,884,869 B2号、米国特許第5,635,483号(全てその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に見出すことができる。
【０１１１】
本明細書で考察されるように、本発明の抗体への結合に用いられる薬剤としては、ドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンC、エトポシドなどの従来の化学療法剤が挙げられる。さらに、CC-1065類似体、カリチアマイシン、メイタンシン、ドラスタチン10の類似体、リゾキシン、およびパリトキシンなどの強力な薬剤を、条件的に安定なリンカーを用いて前記抗体に連結して、強力な免疫コンジュゲートを形成させることができる。
【０１１２】
特定の実施形態においては、本発明の抗体は、EphA2発現細胞またはErbB2発現細胞上でドキソルビシンよりも少なくとも40倍以上強力な薬剤を含む。そのような薬剤としては、限定されるものではないが、エネジインおよびレキシトロプシンなどのDNA副溝結合剤、デュオカルマイシン、タキサン(パクリタキセルおよびドセタキセルなど)、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、CC-1065、SN-38、トポテカン、モルホリノ-ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エピチロンAおよびB、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、ドラスタチン、例えば、オーリスタチンE、ドラスタチン10、MMAE、MMAF、ジスコデルモリド、エレウテロビン、ならびにミトキサントロンが挙げられる。
【０１１３】
特定の実施形態においては、本発明の抗体はエネジイン部分を含む。特定の実施形態においては、エネジイン部分はカリチアマイシンである。エネジイン化合物は、Bergman環化を介してジラジカルを生成することにより二本鎖DNAを切断する。
【０１１４】
他の特定の実施形態においては、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、オーリスタチンEもしくはオーリスタチンF、またはその誘導体である。さらなる実施形態においては、オーリスタチンE誘導体は、オーリスタチンEとケト酸との間で形成されたエステルである。例えば、オーリスタチンEをパラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応させて、それぞれ、AEBおよびAEVBを作製することができる。他のオーリスタチン誘導体としては、MMAE、MMAF、およびAEFPが挙げられる。
【０１１５】
ドラスタチン-10としても当業界で知られるオーリスタチンE、およびその誘導体の合成および構造は、米国特許出願公開第2003/0083263 A1号および第2005/0009751 A1号; 国際特許出願第PCT/US02/13435号、米国特許第6,323,315号;第6,239,104号;第6,034,065号;第5,780,588号;第5,665,860号;第5,663,149号;第5,635,483号;第5,599,902号;第5,554,725号;第5,530,097号;第5,521,284号;第5,504,191号;第5,410,024号;第5,138,036号;第5,076,973号;第4,986,988号;第4,978,744号;第4,879,278号;第4,816,444号;および第4,486,414号(全て参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【０１１６】
特定の実施形態においては、前記薬剤はDNA副溝結合剤である。そのような化合物およびその合成の例は、米国特許第6,130,237号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。特定の実施形態においては、前記薬剤はCBI化合物である。
【０１１７】
本発明の特定の実施形態においては、本発明の抗体は抗チューブリン剤を含む。抗チューブリン剤は、よく確立されたクラスの癌治療化合物である。抗チューブリン剤の例としては、限定されるものではないが、タキサン(例えば、Taxol(登録商標)(パクリタキセル)、ドセタキセル)、T67(Tularik)、ビンカ、およびオーリスタチン(例えば、オーリスタチンE、AEB、AEVB、MMAE、MMAF、ADFP)が挙げられる。このクラスに含まれる抗チューブリン剤はまた、ビンクリスチンおよびビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド；パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン、ならびにバッカチン誘導体、エピチロンAおよびB、ノコダゾール、フルオロウラシルおよびコルシミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ドラスタチン、ジスコデルモリドおよびエレウテロビンである。
【０１１８】
特定の実施形態においては、前記薬剤は、抗チューブリン剤の一群であるメイタンシノイドである。より特定の実施形態においては、前記薬剤はメイタンシンである。さらに、特定の実施形態においては、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤は、DM-1(ImmunoGen, Inc.; Chariら、1992, Cancer Res 52:127-131も参照)である。天然生成物であるメイタンシンは、チューブリン重合を阻害し、有糸分裂停止および細胞死をもたらす。かくして、メイタンシンの作用機序は、ビンクリスチンおよびビンブラスチンのものと類似するようである。しかしながら、メイタンシンは、これらのビンカアルカロイドよりもin vitroで約200〜1,000倍より細胞傷害性が高い。別の特定の実施形態においては、前記薬剤はAEFPである。
【０１１９】
本発明の特定の実施形態においては、前記薬剤は50、100または200個を超えるアミノ酸のポリペプチド、例えば、毒素ではない。本発明の特定の実施形態においては、前記薬剤はリシンである。
【０１２０】
本発明の他の特定の実施形態においては、本発明の抗体は、以下の相互に排他的なクラスの薬剤：アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、抗チューブリン剤、オーリスタチン、化学療法感作物質、DNA副溝結合剤、DNA複製阻害剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線感作物質、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、プリンアンタゴニスト、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ阻害剤のうちの1種以上の細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤を含まない。より特定の実施形態においては、高い効力の薬剤は、アンドロゲン、アントラマイシン(AMC)、アスパラギナーゼ、5-アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン(BSNU)、CC-1065、クロラムブシル、シスプラチン、フルオロウラシル、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンB、ダカルバジン、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、5-フルオロデオキシウリジン、5-フルオロウラシル、グラミシジンD、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン(CCNU)、メクロレタミン、メルファラン、6-メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テノポシド、6-チオグアニン、チオTEPA、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、VP-16、VM-26、アゾチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、アシクロビル、ガンシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジンアラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカルネット、およびトリフルリジンのうちの1種以上ではない。
【０１２１】
特定の実施形態においては、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤はドラスタチンである。より特定の実施形態においては、ドラスタチンはオーリスタチンクラスのものである。本発明の特定の実施形態においては、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤はMMAEである。本発明の別の特定の実施形態においては、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤はAEFPである。本発明の別の特定の実施形態においては、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤はMMAFである。
【０１２２】
他の実施形態においては、本発明の抗体またはその断片もしくは変異体を、所与の生物応答を改変する治療剤または薬剤部分と結合させる。治療剤または薬剤部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬剤部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンA、緑膿菌外毒素、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えば、TNF-α、TNF-β、AIM I(国際特許公開WO 97/33899を参照)、AIM II(国際特許公開WO 97/34911を参照)、Fasリガンド(Takahashiら、1994, J. Immunol., 6:1567)、およびVEGF (国際特許公開WO 99/23105を参照)、血栓剤もしくは血管新生阻害剤、例えば、アンギオスタチンもしくはエンドスタチンなどのタンパク質；または例えば、リンホカイン(例えば、インターロイキン-1(「IL-1」)、インターロイキン-2(「IL-2」)、インターロイキン-4(「IL-4」)、インターロイキン-6(「IL-6」)、インターロイキン-7(「IL-7」)、インターロイキン-9(「IL-9」)、インターロイキン-15(「IL-15」)、インターロイキン-12(「IL-12」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」))、もしくは増殖因子(例えば、増殖ホルモン(「GH」))などの生物応答改変剤が挙げられる。
【０１２３】
他の実施形態においては、本発明の抗体またはその断片もしくは変異体を、放射性金属イオンの結合にとって有用な放射性物質または大環状キレート剤などの治療剤に結合する(放射性物質の例については上記参照)。特定の実施形態においては、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に結合させることができる1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N''-四酢酸(DOTA)である。本明細書の以下でさらに考察される、そのようなリンカー分子は、当業界で一般的に公知であり、Denardoら、1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Petersonら、1999, Bioconjug. Chem. 10:553; およびZimmermanら、1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50(それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【０１２４】
抗体に治療剤部分を結合させるための技術はよく知られている。限定されるものではないが、アルデヒド／シッフ結合、スルフヒドリル結合、酸不安定結合、シス-アコニチル結合、ヒドラゾン結合、酵素分解性結合などの当業界で公知の任意の方法により、部分を抗体に結合させることができる(一般的には、Garnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216を参照されたい)。抗体に治療剤部分を結合させるためのさらなる技術はよく知られており、例えば、Arnonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら(編), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug Delivery (第2版), Robinsonら(編)、pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら(編)、pp. 475-506 (1985);「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら(編)、pp. 303-16 (Academic Press 1985)、ならびにThorpeら、1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。抗体をポリペプチド部分に融合または結合させる方法は、当業界で公知である、例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号および第5,112,946号; EP 307,434; EP 367,166; 国際特許公開第WO 96/04388号および第WO 91/06570号; Ashkenaziら、1991, PNAS 88: 10535-10539; Zhengら、1995, J. Immunol. 154:5590-5600; ならびにVilら、1992, PNAS 89:11337-11341を参照されたい。抗体の部分への融合は必ずしも直接的なものである必要はなく、リンカー配列を介して行ってもよい。そのようなリンカー分子は当業界で一般的に公知であり、Denardoら、1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Petersonら、1999, Bioconjug. Chem. 10:553;  Zimmermanら、1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50; Garnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【０１２５】
本発明の抗体により標的化される細胞の外側での薬剤活性を最小化するためには、2つの手法を取ることができる：第1に、プロドラッグ変換酵素の作用により産生される薬剤などの薬剤が、活性化されたリンパ球の細胞表面で濃縮されるように、細胞膜に結合するが、可溶性のEphA2もしくはErbB2には結合しない抗体を用いることができる。本発明の抗体に結合した薬剤の活性を最小化するための別の手法は、薬剤が抗体から加水分解または切断されない限り、その活性を低下させる様式で該薬剤を結合させることである。そのような方法は、活性化されたリンパ球の細胞表面での環境(例えば、活性化されたリンパ球の細胞表面に存在するプロテアーゼの活性)またはコンジュゲートが活性化されたリンパ球により取り込まれた場合にそれが遭遇する活性化されたリンパ球の内側の環境(例えば、エンドソーム中、もしくは例えば、リソソーム環境においてはpH感受性もしくはプロテアーゼ感受性の理由で)に対して感受性であるリンカーを含む抗体に前記薬剤を結合させることを用いるであろう。本発明において用いることができるリンカーの例は、米国特許出願公開第2005/0123536 A1号、第2005/0180972 A1号、第2005/0113308 A1号、第2004/0157782 A1号、および米国特許第6,884,869 B2号に開示されている(全てその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)。あるいは、抗体を第2抗体に結合させて、Segalの米国特許第4,676,980号(参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)に記載された抗体ヘテロコンジュゲートを形成することができる。
【０１２６】
一実施形態においては、組換え発現されたイントラボディタンパク質を患者に投与する。そのようなイントラボディポリペプチドは、予防効果または治療効果を媒介するには細胞内にある必要がある。本発明のこの実施形態においては、イントラボディポリペプチドを、「膜透過性配列」と結合させる。膜透過性配列は、細胞の外側から細胞の内部へ、細胞膜を通して貫通することができるポリペプチドである。別のポリペプチドに連結される場合、膜透過性配列はまた、細胞膜を横切るそのポリペプチドの移動を指令することもできる。
【０１２７】
一実施形態においては、膜透過性配列は、シグナルペプチドの疎水性領域である(例えば、Hawiger, 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:89-94; Hawiger, 1997, Curr. Opin. Immunol. 9:189-94; 米国特許第5,807,746号および第6,043,339号(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい)。膜透過性配列の配列は、任意のシグナルペプチドの疎水性領域に基づくものであってよい。シグナルペプチドを、例えば、SIGPEPデータベースから選択することができる(例えば、von Heijne, 1987, Prot. Seq. Data Anal. 1:41-2; von HeijneおよびAbrahmsen, 1989, FEBS Lett. 224:439-46を参照されたい)。特定の細胞型をイントラボディポリペプチドの挿入のために標的化しようとする場合、膜透過性配列はその細胞型に対して内因性のシグナルペプチドに基づくものであってよい。別の実施形態においては、膜透過性配列はウイルスタンパク質(例えば、ヘルペスウイルスタンパク質VP22)またはその断片(例えば、Phelanら、1998, Nat. Biotechnol. 16:440-3を参照されたい)である。特定のイントラボディおよび／または特定の標的細胞型に関して好適な特性を有する膜透過性配列を、細胞膜を横切るイントラボディの移動を指令するそれぞれの膜透過性配列の能力を評価することにより経験的に決定することができる。
【０１２８】
別の実施形態においては、膜透過性配列は誘導体であってよい。この実施形態においては、膜透過性配列のアミノ酸配列を、アミノ酸残基の置換、欠失、付加、および／または修飾の導入により変化させた。例えば、限定されるものではないが、ポリペプチドを、例えば、糖鎖付加、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質溶解的切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への連結などにより改変することができる。膜透過性配列ポリペプチドの誘導体を、限定されるものではないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などの当業者には公知の技術を用いる化学的修飾により改変することができる。さらに、膜透過性配列ポリペプチドの誘導体は、1個以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。一実施形態においては、ポリペプチド誘導体は、変化していないポリペプチドと類似するか、または同一の機能を有する。別の実施形態においては、膜透過性配列ポリペプチドの誘導体は、変化していないポリペプチドと比較した場合、変化した活性を有する。例えば、誘導体膜透過性配列ポリペプチドは、細胞膜を通してより効率的に移動することができるか、またはタンパク質溶解に対してより抵抗性であってよい。
【０１２９】
膜透過性配列を、いくつかの方法でイントラボディに結合させることができる。一実施形態においては、膜透過性配列とイントラボディを融合タンパク質として発現させる。この実施形態においては、膜透過性配列をコードする核酸を、標準的な組換えDNA技術を用いてイントラボディをコードする核酸に結合する(例えば、Rojasら、1998, Nat. Biotechnol. 16:370-5を参照されたい)。さらなる実施形態においては、膜透過性配列をコードする核酸とイントラボディとの間に位置するスペーサーペプチドをコードする核酸配列が存在する。別の実施形態においては、それぞれを別々に組換え的に発現させた後、膜透過性配列ポリペプチドを、イントラボディポリペプチドに結合する(例えば、Zhangら、1998, PNAS 95:9184-9を参照されたい)。この実施形態においては、前記ポリペプチドを、当業界で標準的な方法により、ペプチド結合または非ペプチド結合(例えば、グルタルアルデヒドもしくはチアゾリジノ結合などの架橋試薬を用いる、例えば、Hawiger, 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:89-94を参照されたい)により連結することができる。
【０１３０】
膜透過性配列-イントラボディポリペプチドの投与は、非経口投与、例えば、標的細胞を有する組織もしくは器官を供給する血管を介する局所かん流などの静脈内注入、またはエアロゾルの吸入、皮下注射もしくは筋肉内注射、皮膚創傷および病変などへの局所投与、例えば、移植のために調製された骨髄細胞への直接的トランスフェクションおよび被験者へのその後の移植、ならびにその後被験者に移植される器官への直接的トランスフェクションによるものであってよい。さらなる投与方法としては、特に、複合体を封入する場合、経口投与、または特に、複合体が坐剤形態にある場合、直腸投与が挙げられる。製薬上許容し得る担体は、生物学的ではない、もしくはさもなければ望ましくない任意の材料を含む、すなわち、該材料を、望ましくない生物学的効果を引き起こすか、またはそれらが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、選択された複合体と共に個体に投与することができる。
【０１３１】
膜透過性配列-イントラボディポリペプチドの投与のための条件を、当業界における教示を考慮して容易に決定することができる(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第18版、E. W. Martin (編), Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990)を参照されたい)。in vivoで特定の細胞型を、例えば、器官もしくは動脈／血管の区分の局所かん流により標的化しようとする場合、標的組織に由来する細胞を生検し、その組織への複合体の輸送のための最適用量をin vitroで決定して、濃度および時間の長さなどのin vivoでの用量を最適化することができる。あるいは、同じ細胞型の培養細胞を用いて、in vivoで標的細胞のための用量を最適化することもできる。
【０１３２】
7.2.2 核酸分子
EphA2もしくはErbB2に特異的な核酸分子、特に、EphA2もしくはErbB2発現を阻害するか、またはそれを阻害する1個以上の部分をコードするものを、本発明の方法において用いることもできる。本発明は、アンチセンス核酸分子、すなわち、EphA2もしくはErbB2をコードするセンス核酸の全部もしくは一部と相補的である、例えば、二本鎖cDNAのコード鎖と相補的であるか、またはmRNA配列と相補的である分子を包含する。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合することができる。アンチセンス核酸は、コード鎖全体、またはその一部のみ、例えば、タンパク質コード領域(もしくはオープンリーディングフレーム)の全部もしくは一部と相補的であってよい。アンチセンス核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域の全部または一部に対してアンチセンスであってよい。非コード領域(「5'および3'非翻訳領域」)は、コード領域に隣接する5'および3'配列であり、アミノ酸に翻訳されない。アンチセンス核酸分子を、GenBankなどの公共的に利用可能なデータベース中のヌクレオチド配列を用いて、例えば、ヒトEphA2のヌクレオチド配列(例えば、GenBankアクセッション番号NM_004431.2)またはヒトErbB2のヌクレオチド配列(例えば、GenBankアクセッション番号M95667.1)を用いて、当業界で公知の任意の方法により決定することができる。
【０１３３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50ヌクレオチド長であってよい。本発明のアンチセンス核酸を、当業界で公知の手順を用いる化学的合成および酵素的連結反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)を、天然のヌクレオチドまたは該分子の生物学的安定性を増加させるか、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二本鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を作製するのに用いることができる改変ヌクレオチドの例としては、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルクエオシン、イノシン、N6-イソペンタニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルクエオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸を、核酸をアンチセンスの向きにサブクローニングした発現ベクターを用いて生物学的に製造することができる(すなわち、挿入された核酸から転写されるRNAは、目的の標的核酸、例えば、EphA2もしくはErbB2に対してアンチセンス方向のものであろう)。
【０１３４】
典型的には、本発明のアンチセンス核酸分子を、被験者に投与するか、またはin situで生成させて、それらが本発明の選択されたポリペプチドをコードする細胞mRNAおよび／もしくはゲノムDNAとハイブリダイズするか、もしくは結合することによって、例えば、転写および／もしくは翻訳を阻害することにより発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成させるための従来のヌクレオチド相補性によるものであるか、または例えば、DNA二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝中での特異的相互作用を介するものであってよい。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注入が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子を改変して、選択された細胞を標的化した後、全身投与することができる。例えば、全身投与のためには、例えば、アンチセンス核酸分子を細胞表面受容体もしくは抗原に結合するペプチドに連結することにより、アンチセンス分子が選択された細胞表面上に発現された受容体もしくは抗原に特異的に結合するようにそれらを改変することができる。アンチセンス核酸分子を、本明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なpol IIまたはpol IIIプロモーターの制御下に置かれたベクター構築物を用いることができる。
【０１３５】
本発明のアンチセンス核酸分子は、α-アノマー核酸分子であってよい。α-アノマー核酸分子は、通常のβユニットとは対照的に、鎖が互いに平行に走る相補的RNAとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する(Gaultierら、1987, Nucleic Acids Res. 15:6625)。アンチセンス核酸分子はまた、2'-o-メチルリボヌクレオチド(Inoueら、1987, Nucleic Acids Res. 15:6131)またはキメラRNA-DNA類似体 (Inoueら、1987, FEBS Lett. 215:327)を含んでもよい。
【０１３６】
7.2.3 リボザイム
本発明はまた、リボザイムを包含する。リボザイムは、それらが相補的領域を有する、mRNAなどの一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒的RNA分子である。かくして、リボザイム(例えば、ハンマーヘッドリボザイム；HaselhoffおよびGerlach, 1988, Nature 334:585-591に記載されている)を用いて、mRNA転写物を触媒的に切断することによって、mRNAによりコードされるタンパク質の翻訳を阻害することができる。EphA2もしくはErbB2をコードする核酸分子に対する特異性を有するリボザイムを、EphA2もしくはErbB2のヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、米国特許第4,987,071号および第5,116,742号で切断されるヌクレオチド配列と相補的である、テトラヒメナのL-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる。あるいは、本発明のポリペプチドをコードするmRNAを用いて、RNA分子のプールに由来する特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的RNAを選択することができる。例えば、BartelおよびSzostak, 1993, Science 261:1411を参照されたい。
【０１３７】
7.2.4 RNA干渉
特定の実施形態においては、RNA干渉(RNAi)分子を用いて、EphA2もしくはErbB2の発現または活性を阻害する。RNA干渉(RNAi)は、それ自身の配列に対応する遺伝子の発現を抑制する二本鎖RNA(dsRNA)の能力と定義される。RNAiは、転写後遺伝子サイレンシングまたはPTGSとも呼ばれる。細胞の細胞質中に通常認められる唯一のRNA分子は一本鎖mRNAの分子であるため、この細胞はdsRNAを認識し、これを21〜25塩基対を含む断片(二重らせんの約2回転分)に切断する酵素を有する。この断片のアンチセンス鎖は、それが内因性細胞mRNAの分子上の相補的センス配列とハイブリダイズするようにセンス鎖から十分に分離している。このハイブリダイゼーションは、二本鎖領域中でのmRNAの切断を誘発し、かくして、ポリペプチドに翻訳される能力を破壊する。かくして、特定の遺伝子に対応するdsRNAを導入することにより、特定の組織および／または選択された時間でのその遺伝子の細胞自身の発現をノックアウトする。
【０１３８】
二本鎖(ds)RNAを用いて、哺乳動物中での遺伝子発現に干渉することができる(Wianny & Zernicka-Goetz, 2000, Nature Cell Biology 2: 70-75;その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)。dsRNAを、EphA2の機能の阻害的RNAまたはRNAiとして用いて、EphA2のヌル変異体のものと同じである表現型を作製する(Wianny & Zernicka-Goetz, 2000, Nature Cell Biology 2: 70-75)。受容体チロシンキナーゼの文脈におけるsiRNAの非限定例を、米国特許出願公開第2005/0246794号に見出すことができる。
【０１３９】
7.2.5 マイクロRNA
マイクロRNA(「miRNA」とも呼ばれる)は、標的メッセンジャーRNA(mRNA)転写物上の相補的部位に結合することにより遺伝子発現を制御する植物および動物中に認められる調節分子のクラスに属する、小さい非コードRNAである(図1)。miRNAは大きいRNA前駆体(プリmiRNAと呼ばれる)から生成され、核中で約70ヌクレオチドのプレmiRNAにプロセッシングされ、不完全なステムループ構造に折り畳まれる(Lee, Y.ら、Nature (2003) 425(6956):415-9)(図1)。プレmiRNAは、細胞質内でさらなるプロセッシング工程を受け、長さ18〜25ヌクレオチドの成熟miRNAはRNase III酵素、DicerによりプレmiRNAヘアピンの一方の側から切り出される(Hutvagner, G.ら、Science (2001) 12:12およびGrishok, A.ら、Cell (2001) 106(1):23-34)。miRNAは、2つの方法で遺伝子発現を調節することが示された。第1に、miRNAと正確に相補的なタンパク質-コードmRNA配列に結合するmiRNAは、RNA媒介性干渉(RNAi)経路を誘導する。メッセンジャーRNA標的は、RISC複合体中のリボヌクレアーゼにより切断される。miRNA媒介性遺伝子サイレンシングのこの機構は、主に植物中で観察されたが(Hamilton, A. J.およびD. C. Baulcombe, Science (1999) 286(5441):950-2ならびにReinhart, B. J.ら、MicroRNAs in plants. Genes and Dev. (2002) 16:1616-1626)、一例が動物から知られている(Yekta, S., I. H. Shih、およびD. P. Bartel, Science (2004) 304(5670):594-6)。第2の機構においては、メッセンジャーRNA転写物上の不完全な相補的部位に結合するmiRNAは、転写後レベルでの遺伝子調節を指令するが、そのmRNA標的を切断しない。植物および動物の両方において同定されたmiRNAはこの機構を用いて、その遺伝子標的の翻訳制御を発揮する(Bartel, D. P., Cell (2004) 116(2):281-97)。特定の実施形態においては、EphA2および／またはErbB2標的化剤はmiRNAである。miRNAの非限定例を、米国特許出願公開第2006/0189557号に見出すことができる。
【０１４０】
7.2.6 アプタマー
特定の実施形態においては、本発明は、EphA2またはErbB2のアプタマーを提供する。当業界で公知のように、アプタマーは、特定の分子標的(例えば、本明細書に記載のEphA2もしくはErbB2タンパク質、EphA2もしくはErbB2ポリペプチドおよび／またはEphA2もしくはErbB2エピトープ)に堅く結合する核酸(例えば、RNA、DNA)から構成される大分子である。特定のアプタマーを線状ヌクレオチド配列により記載することができ、それは典型的には約15〜60ヌクレオチドの長さである。アプタマー中のヌクレオチド鎖は、複雑な三次元形状にこの分子を折り畳む細胞内相互作用を形成し、この三次元形状により、アプタマーその標的分子の表面に堅く結合することができる。多数の全ての可能なヌクレオチド配列内に存在する分子形状の並外れた多様性を考慮すれば、アプタマーを、タンパク質および小分子などの様々な分子標的について取得することができる。高い特異性に加えて、アプタマーはその標的に対する非常に高い親和性を有する(例えば、タンパク質に対するピコモラーから低いナノモラー範囲の親和性)。アプタマーは化学的に安定であり、活性を失うことなく沸騰または凍結することができる。それらは合成分子であるため、それらは様々な改変の影響を受けやすく、特定の用途のためにその機能を最適化することができる。in vivoでの用途のためには、アプタマーを改変して、血液中の酵素による分解に対するその感受性を劇的に低下させることができる。さらに、アプタマーの改変を用いて、その生体内分布または血漿滞留時間を変化させることもできる。
【０１４１】
EphA2もしくはErbB2またはその断片に結合することができるアプタマーの選択を、当業界で公知の方法を介して達成することができる。例えば、アプタマーを、SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)法を用いて選択することができる(TuerkおよびGold, 1990, Science 249:505-510(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする))。SELEX法においては、核酸分子の大きいライブラリー(例えば、1015個の異なる分子)を製造し、および／または標的分子(例えば、本明細書に記載のEphA2もしくはErbB2タンパク質、EphA2もしくはErbB2ポリペプチドおよび／またはEphA2もしくはErbB2エピトープもしくはその断片)を用いてスクリーニングする。標的分子を、長時間に渡ってヌクレオチド配列のライブラリーと共にインキュベートさせる。次いで、いくつかの方法を用いて、混合物中の未結合の分子からアプタマー標的分子を物理的に単離し、未結合の分子を廃棄することができる。次いで、標的分子に対する最も高い親和性を有するアプタマーを、標的分子から精製し、酵素的に増幅して、標的分子に結合することができるアプタマーについて実質的に富化された分子の新しいライブラリーを製造することができる。次いで、富化されたライブラリーを用いて、選択、分配、および増幅の新しいサイクルを開始することができる。5〜15サイクルのこの選択、分配および増幅プロセスの後、ライブラリーを、標的分子に堅く結合する少数のアプタマーに減少させる。次いで、混合物中の個々の分子を単離し、そのヌクレオチド配列を決定し、結合親和性および特異性に関してその特性を測定および比較することができる。次いで、単離されたアプタマーをさらに精製して、標的結合および／またはアプタマー構造に寄与しない任意のヌクレオチドを排除することができる(すなわち、そのコア結合ドメインにトランケートされたアプタマー)。アプタマー技術の概説については、例えば、Jayasena, 1999, Clin. Chem. 45:1628-1650(その教示全体は参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【０１４２】
特定の実施形態においては、本発明のアプタマーは、本発明の抗体について本明細書に記載された結合特異性および／または機能的活性を有する。かくして、例えば、特定の実施形態においては、本発明は、本発明の抗体について本明細書に記載されたものと同じか、または類似する結合特異性(例えば、EphA2もしくはErbB2ポリペプチド、脊椎動物のEphA2もしくはErbB2ポリペプチドの断片、脊椎動物のEphA2もしくはErbB2ポリペプチドのエピトープ領域(例えば、本発明の抗体により結合したEphA2もしくはErbB2のエピトープ領域)に対する結合特異性)を有するアプタマーについて描かれる。特定の実施形態においては、本発明のアプタマーはEphA2もしくはErbB2ポリペプチドに結合し、EphA2もしくはErbB2ポリペプチドの1個以上の活性を阻害することができる。
【０１４３】
7.2.7 アビマー
一実施形態においては、本発明は、抗EphA2または抗ErbB2アビマー(Avidia, Inc.)を提供する。アビマーは、ヒト起源であり、抗体および抗体フラグメントとは関連せず、いくつかの調節可能かつ再利用可能な結合ドメインから構成され、それぞれ4.5 kDの分子量を有する個々の結合ドメインを有し、典型的には9 kD〜18 kDの範囲である分子量を有し、アンタゴニスト活性もしくはアゴニスト活性を示すように設計することができ、複数のエピトープに同時に高い親和性で結合することができ、nM以下の結合親和性(Kd)および阻害機能(IC50)を有し、糖鎖を有さず、微生物発現により製造することができ、産生の間に古典的挙動を示し、高収率で製造することができ、皮下注射により送達することができ、優れた組織浸透性を有し、カスタマイズされた薬力学的プロフィールを有し、ならびに動物において非免疫原性である、新規クラスの治療用タンパク質である(例えば、米国特許出願公開第2005/0221384号、第2005/0164301号、第2005/0053973号および第2005/0089932号、第2005/0048512号、および第2004/0175756号(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい)。
【０１４４】
7.2.8 遺伝子治療
特定の実施形態においては、EphA2またはErbB2発現を変化させる核酸(例えば、EphA2もしくはErbB2アンチセンス核酸またはEphA2もしくはErbB2 dsRNA)を投与して、遺伝子治療により、過増殖性疾患、特に、癌を治療、予防または管理する。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の被験体への投与により実施される治療を指す。本発明のこの実施形態においては、アンチセンス核酸は、予防または治療効果を産生および媒介する。
【０１４５】
当業界で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法を、本発明に従って用いることができる。例示的な方法を以下に記載する。遺伝子治療の方法の一般的概説については、Goldspielら、1993, Clinical Pharmacy 12:488; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; ならびにMorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191; May, 1993, TIBTECH 11:155を参照されたい。用いることができる組換えDNA技術の当業界で一般的に公知の方法は、Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); およびKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載されている。
【０１４６】
一実施形態においては、本発明の組成物はEphA2もしくはErbB2発現を低下させるEphA2もしくはErbB2核酸を含み、この核酸は好適な宿主中で該核酸を発現する発現ベクターの一部である。特に、そのような核酸は、プロモーター、例えば、異種プロモーターを有し、このプロモーターは誘導性または構成性であり、必要に応じて、組織特異的である。別の特定の実施形態においては、EphA2もしくはErbB2発現を低下させる核酸と任意の他の所望の配列が、ゲノム中の所望の部位での相同組換えを促進する領域により隣接し、かくして、EphA2もしくはErbB2発現を低下させる核酸の染色体内発現を提供する核酸分子を用いる(KollerおよびSmithies, 1989, PNAS 86:8932; Zijlstraら、1989, Nature 342:435)。
【０１４７】
前記核酸の被験体への送達は直接的なものであってよく、その場合、被験体を該核酸もしくは核酸を担持するベクターに直接的に曝露し、または間接的なものであってもよく、その場合、まず細胞をin vitroで該核酸を用いて形質転換した後、被験体に移植する。これらの2つの手法は、それぞれ、in vivoまたはex vivo遺伝子治療として公知である。
【０１４８】
7.2.9 他のキナーゼ阻害剤
一実施形態においては、EphA2もしくはErbB2の発現を阻害するか、または低下させることができる他のキナーゼ阻害剤を、本発明の方法において用いることができる。そのようなキナーゼ阻害剤としては、限定されるものではないが、Rasの阻害剤、ならびにEGFRおよびErbB2などの特定の他の癌原性受容体チロシンキナーゼの阻害剤が挙げられる。そのような阻害剤の非限定例は、米国特許第6,462,086号、第6,130,229号、第6,638,543号、第6,562,319号、第6,355,678号、第6,656,940号、第6,653,308号、第6,642,232号、および第6,635,640号、ならびに米国特許出願第2006/0252056号(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に開示されている。特定の実施形態においては、このキナーゼ阻害剤は、本明細書に記載のアッセイもしくは当業界で公知のアッセイ(例えば、RT-PCR、ノーザンブロットもしくはELISA、ウェスタンブロットなどの免疫アッセイ)において、対照(例えば、リン酸緩衝生理食塩水)と比較して、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、もしくは少なくとも95％、または少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも3.5倍、少なくとも4倍、少なくとも4.5倍、少なくとも5倍、少なくとも7倍もしくは少なくとも10倍、EphA2もしくはErbB2発現を阻害するか、または低下させる。
【０１４９】
特定の実施形態においては、本発明の方法は、限定されるものではないが、ABL、ACK、AFK、AKT (例えば、AKT-1、AKT-2、およびAKT-3)、ALK、AMP-PK、ATM、Auroral、Aurora2、bARK1、bArk2、 BLK、BMX、BTK、CAK、CaMキナーゼ、CDC2、CDK、CK、COT、CTD、DNA-PK、EGF-R、ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4、ERK (例えば、ERK1、ERK2、ERK3、ERK4、ERK5、ERK6、ERK7)、ERT-PK、FAK、FGR (例えば、FGF1R、FGF2R)、FLT (例えば、FLT-1、FLT-2、FLT-3、FLT-4)、FRK、FYN、GSK (例えば、GSK1、GSK2、GSK3-α、GSK3-β、GSK4、GSK5)、G-タンパク質結合受容体キナーゼ(GRKs)、HCK、HER2、HKII、JAK (例えば、JAK1、JAK2、JAK3、JAK4)、JNK (例えば、JNK1、JNK2、JNK3)、KDR、KIT、IGF-1受容体、IKK-1、IKK-2、INSR (インスリン受容体)、IRAK1、IRAK2、IRK、ITK、LCK、LOK、LYN、MAPK、MAPKAPK-1、MAPKAPK-2、MEK、MET、MFPK、MHCK、MLCK、MLK3、NEU、NIK、PDGF受容体α、PDGF受容体β、PHK、PI-3キナーゼ、PKA、PKB、PKC、PKG、PRK1、PYK2、p38キナーゼ、p135tyk2、p34cdc2、p42cdc2、p42mapk、p44mpk、RAF、RET、RIP、RIP-2、RK、RON、RSキナーゼ、SRC、SYK、S6K、TAK1、TEC、TIE1、TIE2、TRKA、TXK、TYK2、UL13、VEGFR1、VEGFR2、YES、YRK、ZAP-70、ならびにこれらのキナーゼの全てのサブタイプ(例えば、HardieおよびHanks (1995) The Protein Kinase Facts Book, I and II, Academic Press, San Diego, Calif.を参照されたい)などのキナーゼの阻害剤である1種以上の予防／治療剤の投与と組合わせた本発明の組成物の投与を包含する。特定の実施形態においては、本発明の抗体を、RTK(例えば、EphA2もしくはErbB2)の阻害剤である1種以上の予防／治療剤の投与と組合わせて投与する。一実施形態においては、本発明の抗体を、EphA2および／またはErbB2の阻害剤である1種以上の予防／治療剤の投与と組合わせて投与する。
【０１５０】
別の特定の実施形態においては、本発明の方法は、限定されるものではないが、アンギオスタチン(プラスミノゲン断片)；抗血管新生性抗トロンビンIII；アンギオザイム；ABT-627；Bay 12-9566；ベネフィン；ベバシズマブ；BMS-275291；軟骨由来阻害剤(CDI)；CAI；CD59補体断片；CEP-7055；Col 3；コンブレタスタチンA-4；エンドスタチン(コラーゲンXVIII断片)；フィブロネクチン断片；Gro-β；ハロフギノン；ヘパリナーゼ；ヘパリンヘキササッカリド断片；HMV833；ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)；IM-862；インターフェロンα／β／γ；インターフェロン誘導性タンパク質(IP-10)；インターロイキン-12；クリングル5(プラスミノゲン断片)；マリマスタット；メタロプロテイナーゼ阻害剤(TIMP)；2-メトキシエストラジオール；MMI270(CGS 27023A)；MoAb IMC-1C11；ネオバスタット；NM-3；パンゼム；PI-88；胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤；プラスミノゲン活性化因子阻害剤；血小板因子-4(PF4)；プリノマスタット；プロラクチン16 kD断片；プロリフェリン関連タンパク質(PRP)；PTK 787/ZK 222594；レチノイド；ソリマスタット；スクアラミン；SS 3304；SU 5416；SU 6668；SU 11248；テトラヒドロコルチゾール-S；テトラチオモリブデン酸；サリドマイド；トロンボスポンジン-1(TSP-1)；TNP-470；トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)；バスクロスタチン；バソスタチン(カルレチクリン断片)；ZD6126；ZD6474；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(FTI)；ならびにビスホスホナートなどの血管新生阻害剤である1種以上の予防／治療剤の投与と組合わせた本発明の組成物の投与を包含する。
【０１５１】
別の特定の実施形態においては、本発明の方法は、限定されるものではないが、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ビスナフィドジメシラート、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチメル、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴル、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、クリスナトールメシラート、シクロホスファミド、シタラビン、デカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デカルバジン、デシタビン、ドキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニンメシラート、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロキスリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルオロシタビン、フォスキドン、フォストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、塩酸イダルビシン、イフォスファミド、イルモフォスチン、インターロイキン2(組換えインターロイキン2、もしくはrIL2など)、インターフェロンα-2a、インターフェロンα-2b、インターフェロンα-n1、インターフェロンα-n3、インターフェロンβ-Ia、インターフェロンγ-Ib、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メガストロール、酢酸メランゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、マイトカルシン、マイトクロミン、マイトギリン、マイトマルシン、マイトマイシン、マイトスペル、マイトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ニトロソウレア、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルフォスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィメルナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン���ログレチミド、サフィンゴル、塩酸サフィンゴル、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォサートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフル、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾルビシンなどの抗癌剤である1種以上の予防／治療剤の投与と組合わせた本発明の組成物の投与を包含する。他の抗癌剤としては、限定されるものではないが、20エピ1,25ジヒドロキシビタミンD3,5エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ALL TKアンタゴニスト、アルトレタミン、アンバムスチン、アミドックス、アミフォスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホリド、血管新生阻害剤、アンタゴニストD、アンタゴニストG、アンタレリックス、抗背面化形態発生タンパク質-1、抗アンドロゲン剤、抗エストロゲン剤、抗ネオプラストン、アフィジコリングリシナート、アポトーシス遺伝子調節因子、アポトーシス調節因子、アプリン酸、ara-CDP-DL-PTBA、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン1、アキシナスタチン2、アキシナスタチン3、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バッカチンIII誘導体、バラノール、バチマスタット、BCR/ABLアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、βラクタム誘導体、β-アレチン、ベタクラマイシンB、ベツリン酸、bFGF阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビサリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンA、ビゼレシン、ブレフラート、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルホキシミン、カルシポトリオール、カルホスチンC、カンプトテシン誘導体、カナリポックスIL-2、カペシタビン、カルボキサミド-アミノ-トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、CaRest M3、CARN 700、軟骨由来阻害剤、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤(ICOS)、カスタノスペルミン、セクロピンB、セトロレリックス、クロロキノキサリンスルホナミド、シカプロスト、シス-ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシンA、コリスマイシンB、コンブレタスタチンA4、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン、クランベスシジン816、クリスナトール、クリプトフィシン8、クリプトフィシンA誘導体、クラシンA、シクロペンタントラキノン、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビンオクフォスフェート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒドロジ���ムニンB、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシフォスファミド、デキシラゾキサン、デキシベラパミル、ジアジクオン、ジデムニンB、ジドックス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ-5-アザシチジン、ジヒドロタキソール、ジキサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンSA、エブセレン、エコムスチン、エデルフォシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフル、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチン類似体、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エキセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン、塩酸フルオロダウノルニシン、フォルフェニメックス、フォルメスタン、フォストリエシン、フォテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリックス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビサセタミド、ハイペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモフォシン、イロマスタット、イミダゾアクリドン、イミキモッド、免疫刺激ペプチド、インスリン様増殖因子1受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール、イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンB、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドF、ラメラリン-N三酢酸、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球αインターフェロン、ロイプロリド+エストロゲン+プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミソール、リアロゾール、線状ポリアミン類似体、親油性ジサッカリドペプチド、親油性白金化合物、リソクリナミド7、ロバプラチン、ロムブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ルルトテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン、溶解ペプチド、メイタンシン、マンノスタチンA、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリリシン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、MIF阻害剤、ミフェプリストン、ミルテフォシン、ミリモスチム、不一致二本鎖RNA、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン類似体、ミトナフィド、マイトトキシン線維芽細胞増殖因子-サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、モノホスホリルリピドA+マイコバクテリウム細胞壁sk、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、複数の腫瘍抑制因子1に基づく治療、マスタード抗癌剤、マイカペロキシドB、マイコバクテリウム細胞壁抽出物、ミリアポロン、N-アセチルジナリン、N-置換ベンザミド、ナファレリン、ナグレスチップ、ナロキソン+ペ���タゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、デダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、中性エンドペプチダーゼ、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素調節因子、窒素酸化物抗酸化剤、ニトルリン、O6-ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘導因子、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキサウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ペントサンポリ硫酸ナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルフォスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、フェニル酢酸、ホスファターゼ阻害剤、パシバニル、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチンA、プラセチンB、プラスミノゲン活性化因子阻害剤、白金複合体、白金化合物、白金-トリアミン複合体、ポルフィメルナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピルビス-アクリドン、プロスタグランジンJ2、プロテアソーム阻害剤、プロテインAに基づく免疫調節因子、タンパク質キナーゼC阻害剤、タンパク質キナーゼC阻害剤、ミクロアルガル、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、パープリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート、rafアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ras阻害剤、ras-GAP阻害剤、脱メチル化レテリプチン、レニウムRe 186エチドロナート、リゾキシン、
リボザイム、RIIレチナミド、ログレチミド、ロヒツキン、ロムルチド、ロキニメックス、ルビギノンB1、ルボキシル、サフィンゴル、サイントピン、SarCNU、サルコフィトールA、サルグラモスチム、Sdi 1模倣物質、セムスチン、老化由来阻害剤1、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達調節因子、一本鎖抗原結合タンパク質、シゾフィラン、ソブゾキサン、ナトリウムボロカプテート、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルフォス酸、スピカマイシンD、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンギスタチン1、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤、スチピアミド、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン、超活性血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、スワインソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タキソール、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフル、テルラピリウム、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、サリブラスチン、サリドマイド、チオコラリン、チオグアニン、トロンボポエチン、トロンボポエチン模倣物質、チマルファシン、チモポエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、チンエチルエチオパープリン、チラパザミン、チタノセンビクロリド、トプセンチン、トレミフェン、多能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセリルウリジン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、トリホスチン、UBC阻害剤、ウベニメックス、尿生殖洞由来増殖阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンB、ベクター系、赤血球遺伝子治療、ベラレソール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、ビタキシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブ、およびジノスタチンスチマラマーが挙げられる。さらなる抗癌剤は、5-フルオロウラシルおよびロイコボリンである。
【０１５２】
本発明はまた、癌細胞を破壊するためのx線、γ線およびその他の放射線源の使用を含む放射線療法と組合わせた本発明の組成物の投与を包含する。特定の実施形態においては、放射線治療を、照射を遠隔光源から指令する外部ビーム照射または遠隔療法として投与する。他の実施形態においては、放射線治療を、放射線源を癌細胞または腫瘍塊に近い体内に置く内部療法または近接照射療法として投与する。
【０１５３】
癌療法およびその用量、投与経路ならびに推奨される使用は当業界で公知であり、Physician's Desk Reference (第61版、2007)などの文献に記載されている。
【０１５４】
7.3 送達方法およびビヒクル
本発明は、過増殖性細胞疾患、特に、癌の治療、管理、または予防のために設計された方法および組成物を提供する。抗EphA2もしくはErbB2剤または他の抗癌剤の治療もしくは予防効果を増強するために、ならびに／またはそのような薬剤の望ましくない副作用を減少させるために、本発明の方法および組成物は、特定の細胞型もしくは特定の組織、特に、EphA2およびErbB2を発現するか、もしくは過剰発現する細胞を標的化する。
【０１５５】
当業界で公知の任意の送達ビヒクルを、本発明に従って使用することができる。様々な送達系が公知であり、これを用いて1種以上の本発明の組成物を投与することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中への封入、抗体もしくは抗体フラグメントを発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス(例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照されたい)、レトロウイルスもしくは他のベクターの一部としての核酸の構築などが挙げられる。例えば、微粒子ボンバードメント(例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont)、またはEphA2もしくはErbB2標的化部分に結合させた脂質もしくはトランスフェクション剤を用いるコーティング、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル中への封入の使用によるか、または核に進入することが知られるペプチドに連結させてそれらを投与することによるか、または受容体媒介性エンドサイトーシスにかけたリガンドと連結させてそれを投与することなどにより(例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429を参照されたい)(これを用いて該受容体を特異的に発現する細胞型を標的化することができる)、核酸分子を送達することができる。
【０１５６】
特定の実施形態においては、前記核酸配列をin vivoで直接投与する。当業界で公知の任意の多くの方法により、例えば、好適な核酸発現ベクター(例えば、上記の、かつEphA2もしくはErbB2を標的化するベクター)の一部としてそれらを構築し、それらが細胞内のものとなるようにそれを投与することにより、例えば、欠損性もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクター(米国特許第4,980,286号を参照)を用いる感染により、または裸のDNAの直接注入により、または微粒子ボンバードメント(例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont)の使用により、または当業界で公知の任意の送達ビヒクルを使用し、好適な標的化部分にコンジュゲートすることによるか、または受容体媒介性エンドサイトーシスにかけたリガンドに連結してそれを投与することにより(例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429を参照されたい)(これを用いて、受容体、例えば、EphA2もしくはErbB2を特異的に発現する細胞型を標的化することができる)、これを達成することができる。別の実施形態においては、リガンドがエンドソームを破壊するための融合性ウイルスペプチドを含む核酸-リガンド複合体を形成させ、核酸がリソソーム分解を回避できるようにすることができる。さらに別の実施形態においては、特定の受容体、例えば、EphA2またはErbB2を標的化することにより、前記核酸を細胞特異的取込みおよび発現のためにin vivoで標的化することができる。あるいは、相同組換えにより、前記核酸を細胞内に導入し、発現のために宿主細胞DNA内に組込むことができる(KollerおよびSmithies, 1989, PNAS USA 86:8932; ならびにZijlstraら、1989, Nature 342:435)。
【０１５７】
一実施形態においては、前記核酸を細胞に導入した後、得られる組換え細胞をin vivoで投与する。そのような導入を、限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、前記核酸配列を含むウイルスもしくはバクテリオファージベクターを用いる感染、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、微小細胞媒介性遺伝子導入、スフェロプラスト融合などの当業界で公知の任意の方法により実行することができる。外来遺伝子の細胞への導入のための多くの技術が公知であり(例えば、LoefflerおよびBehr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599; Cohenら、1993, Meth. Enzymol. 217:618を参照されたい)、レシピエント細胞の必要な発達機能および生理学的機能が破壊されないという条件で、本発明に従って用いることができる。この技術は、前記核酸が細胞により発現可能であり、遺伝性であり、その細胞子孫により発現可能であるように、該核酸の該細胞への安定な導入を提供するべきである。
【０１５８】
得られる組換え細胞を、当業界で公知の様々な方法により被験体に送達することができる。使用を想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者により決定することができる。
【０１５９】
送達ビヒクルは、例えば、該ビヒクルの生来の特性のおかげで、または特定のサブセットの細胞に特異的に結合する、該ビヒクルに結合された部分により、例えば、標的化しようとする細胞のサブセットに特徴的な細胞表面分子に結合することにより、特定の細胞型を標的化することができる。一実施形態においては、本発明の送達ビヒクルは、EphA2および／もしくはErbB2を発現する細胞を標的化し、リガンドに結合したEphA2および／もしくはErbB2よりもリガンドに結合していないEphA2および／もしくはErbB2を発現する細胞を標的化することができる。特定の実施形態においては、EphA2またはErbB2標的化部分を、本発明の送達ビヒクルに結合させる。
【０１６０】
前記送達ビヒクルは、例えば、ペプチドベクター、ペプチド-DNA凝集物、リポソーム、ガス充填ミクロソーム、カプセル封入された大分子、ナノ懸濁液など(例えば、Torchilin, Drug Targeting. Eur. J. Phamaceutical Sciences: v. 11, pp. S81-S91 (2000); Gerasimov, Boomer, Qualls, Thompson, Cytosolic drug delivery using pH- and light-sensitive liposomes, Adv. Drug Deliv. Reviews: v. 38, pp. 317-338 (1999); Hafez, Cullis, Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery, Adv. Drug Deliv. Reviews: v. 47, pp. 139-148 (2001); Hashida, Akamatsu, Nishikawa, Fumiyoshi, Takakura, Design of polymeric prodrugs of prostaglandin E1 having galactose residue for hepatocyte targeting, J. Controlled Release: v. 62, pp. 253-262 (1999); Shah, Sadhale, Chilukuri, Cubic phase gels as drug delivery systems, Adv. Drug Deliv. Reviews: v. 47, pp.229-250 (2001); Muller, Jacobs, Kayser, Nanosuspensions as particulate drug formulations in therapy: Rationale for development and what we can expect for the future, Adv. Drug Delivery Reviews: v. 47, pp. 3-19 (2001)を参照されたい)であってよい。いくつかの実施形態においては、前記送達ビヒクルはウイルスベクターである。特定の実施形態においては、前記送達ビヒクルは、例えば、HVJ(センダイウイルス)-リポソーム遺伝子送達系(例えば、Kanedaら、Ann. N.Y. Acad. Sci. 811:299-308 (1997)を参照);「ペプチドベクター」(例えば、Vidalら、CR Acad. Sci III 32:279-287 (1997)を参照); ペプチド-DNA凝集物(例えば、Niidomeら、J. Biol. Chem. 272:15307-15312 (1997)を参照); 脂質ベクター系(例えば、Leeら、Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 14:173-206 (1997)を参照); ポリマー被覆リポソーム(Marinら、米国特許第5,213,804号; Woodleら、米国特許第5,013,556号); 陽イオンリポソーム(Epandら、米国特許第5,283,185号; Jessee, J. A.、米国特許第5,578,475号; Roseら、米国特許第5,279,833号; Gebeyehuら、米国特許第5,334,761号); ガス充填ミクロスフェア(Ungerら、米国特許第5,542,935号)、またはカプセル封入された大分子 (Lowら、米国特許第5,108,921号; Curielら、米国特許第5,521,291号; Gromanら、米国特許第5,554,386号; Wuら、米国特許第5,166,320号)(全ての参考文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)であってよい。
【０１６１】
送達ビヒクル中に治療剤または予防剤を充填する方法は、用いられる送達ビヒクルの型、または該薬剤の疎水性もしくは親水性などの種々の因子に依存する。当業界で公知の任意の充填方法を、本発明において用いることができる。
【０１６２】
7.3.1 ウイルス
ウイルスは、宿主細胞に感染し、外来核酸を導入するその天然の能力のため、魅力的な送達ビヒクルである。本発明の実施において有用なウイルスベクター系としては、例えば、天然の、または組換えのウイルスベクター系が挙げられる。例えば、ウイルスベクターを、ヒトもしくはウシアデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ関連ウイルス(例えば、Xiaoら、Brain Res. 756:76-83(1997)を参照されたい)、マウスの微小ウイルス(MVM)、HIV、HPVおよびHPV様粒子、シンドビスウイルス、ならびにレトロウイルス(限定されるものではないが、ラウス肉腫ウイルスなど)、ならびにMoMLV、B型肝炎ウイルス(例えば、Jiら、J. Viral Hepat. 4:167-173 (1997)を参照されたい)のゲノムから誘導することができる。典型的には、目的の遺伝子をそのようなベクターに挿入して、典型的には、ウイルスDNAと共に、遺伝子構築物のパッケージングを可能にした後、感受性宿主細胞に感染させ、目的の遺伝子を発現させる。組換えウイルスベクターの一例は、タンパク質IX遺伝子の欠失を有するアデノウイルスベクター送達系である(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする、国際特許出願第WO 95/11984号を参照されたい)。組換えウイルスベクターの別の例は、組換えパラインフルエンザウイルスベクター(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする国際特許出願公開第WO 03/072720号、MedImmune Vaccines, Inc.に開示された、組換えPIVベクター)または組換えメタニューモウイルスベクター(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする国際特許出願公開第WO 03/07219号、MedImmune Vaccines, Inc.に開示された、組換えMPVベクター)である。
【０１６３】
いくつかの例においては、予め存在する免疫応答を回避するためには、治療しようとする種とは異なる種に由来するベクターを用いることが有利であってよい。例えば、ヒト遺伝子治療のためのウマヘルペスウイルスベクターが、1998年8月5日に公開されたWO 98/27216に記載されている。前記ベクターは、ウマウイルスがヒトに対して病原性ではないため、ヒトの治療にとって有用であると記載されている。同様に、ヒツジアデノウイルスベクターはヒトアデノウイルスベクターに対する抗体を回避すると特許請求されているため、これをヒト遺伝子治療において用いることができる。そのようなベクターは、参照により本明細書に組み入れられるものとする、1997年4月10日に公開されたWO 97/06826に記載されている。
【０１６４】
前記ウイルスは、複製能力を有する(例えば、Ad d1309もしくはAd d1520などの完全に野生型もしくは本質的に野生型)、条件的に複製する(特定の条件下で複製するように設計される)、または複製欠損(欠失された機能を補うことができる細胞系の非存在下では実質的に複製することができない)であってよい。あるいは、ウイルスゲノムは、組織選択性などの特定の望ましい特性を増強するためのウイルスゲノムに対する特定の改変を有してもよい。例えば、アデノウイルスのE1a領域中の欠失は、優先的な複製および腫瘍細胞における複製の改善をもたらす。ウイルスゲノムを改変して、治療用トランスジーンを含有させることもできる。前記ウイルスは、それを「選択的に複製させる」、すなわち、それが特定の細胞型もしくは表現型細胞状態、例えば、癌状態において優先的に複製する特定の改変を有してもよい。例えば、腫瘍または組織特異的プロモーターエレメントを用いて、特定の細胞型においてのみ優先的に複製するウイルスをもたらす初期ウイルス遺伝子の発現を駆動することができる。あるいは、当業者であれば、ウイルス複製の抑制因子の発現を駆動する正常細胞において活性な経路選択的プロモーターを用いることができる。迅速に分裂する細胞中で優先的に複製する選択的に複製するアデノウイルスベクターは、国際特許出願第WO 990021451号および第WO 990021452号(それぞれ、参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【０１６５】
特定の実施形態においては、EphA2もしくはErbB2発現および／または機能を低下させる核酸配列を含むウイルスベクターを用いる。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる(Millerら、1993, Meth. Enzymol. 217:581を参照されたい)。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組込みにとって必要な成分を含む。本発明に従って用いられる核酸配列を、被験体への核酸の送達を容易にする1種以上のベクター中にクローニングする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細を、造血幹細胞を化学療法に対してより抵抗性にするために該幹細胞にmdr I遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する、Boesenら、1994, Biotherapy 6:291-302に見出すことができる。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示する他の参考文献は、Clowesら、1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Kleinら、1994, Blood 83:1467-1473; SalmonsおよびGunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; ならびにGrossmanおよびWilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics Devel. 3:110-114である。
【０１６６】
アデノウイルスは、本発明の核酸分子を送達するのに用いることができる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、気道上皮への遺伝子の送達にとって特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは気道上皮に自然に感染し、そこでそれらは軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスは非分裂細胞に感染することができる利点を有する。KozarskyおよびWilson, 1993, Current Opinion in Genetics  Development 3:499は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の概説を提供する。Boutら、1994, Human Gene Therapy 5:3-10は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクターの使用を示した。送達ビヒクルとしてのアデノウイルスの使用の他の例を、Rosenfeldら、1991, Science 252:431; Rosenfeldら、1992, Cell 68:143; Mastrangeliら、1993, J. Clin. Invest. 91:225; 国際特許公開第W094/12649号; ならびにWangら、1995, Gene Therapy 2:775に見出すことができる。一実施形態においては、アデノウイルスベクターを用いる。
【０１６７】
アデノ関連ウイルス(AAV)も、送達ビヒクルとしての使用について提唱されている(Walshら、1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300; および米国特許第5,436,146号)。
【０１６８】
標的化されたウイルスを作製するための様々な手法が、文献に記載されている。例えば、細胞標的化を、ウイルスゲノムノブおよび繊維コード配列の選択的改変によりアデノウイルスベクターを用いて達成して、例えば、EphA2もしくはErbB2標的化部分を含むように操作された、ユニークな細胞表面受容体との特定の相互作用を有する改変されたノブおよび繊維ドメインの発現を達成した。そのような改変の例は、Wickhamら(1997) J. Virol. 71(11):8221-8229 (アデノウイルス繊維タンパク質へのRGDペプチドの組込み); Arnbergら(1997) Virology 227:239-244 (眼および生殖管への屈性を達成するためのアデノウイルス繊維遺伝子の改変); HarrisおよびLemoine (1996) TIG 12(10):400-405; Stevensonら(1997) J. Virol. 71(6):4782-4790; Michaelら(1995) Gene Therapy 2:660-668 (アデノウイルス繊維タンパク質へのガストリン放出ペプチド断片の組込み); ならびにOhnoら(1997) Nature Biotechnology 15:763-767(シンドビスウイルスへのプロテインA-IgG結合ドメインの組込み)に記載されている。
【０１６９】
細胞特異的標的化の他の方法は、抗体または抗体フラグメントのエンベロープタンパク質への結合に依る(例えば、Michaelら(1993) J. Biol. Chem. 268:6866-6869, Watkinsら(1997) Gene Therapy 4:1004-1012; Douglasら(1996) Nature Biotechnology 14: 1574-1578を参照されたい)。例えば、EphA2もしくはErbB2に結合する抗体または抗体フラグメントを、該抗体中のアミノアシル側鎖(特に、リジン残基を介する)の改変により、ビリオンの表面に化学的に結合させることができる。標的化目的のためにウイルスの表面を修飾する別の非限定例は、参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許第6,635,476号に示されている。抗体の使用とは別に、他のものはビリオンの表面に標的化タンパク質を複合体化させた。例えば、Nilsonら(1996) Gene Therapy 3:280-286(レトロウイルスタンパク質へのEGFの結合)を参照されたい。
【０１７０】
いくつかの実施形態においては、EphA2もしくはErbB2標的化部分、例えば、抗EphA2もしくはErbB2抗体、EphA2もしくはErbB2リガンド、当業界で公知のペプチドまたは他の標的化部分を、ウイルスの表面に結合させ、かくして、該ウイルスを、EphA2および／もしくはErbB2を発現するか、もしくは過剰発現する細胞に指向させる。
【０１７１】
7.3.2 合成ベクター
非ウイルス合成ベクターを、本発明に従う送達ビヒクルとして用いることもできる。例えば、標的化部分を、ポリカチオン(例えば、脂質もしくはポリマー)骨格に結合させることができる。ポリカチオン骨格はまた、送達しようとする治療剤もしくは予防剤(例えば、核酸分子)との複合体を形成する。そのような送達ビヒクルの非限定例は、特定の細胞型に対して特定の受容体を選択的に標的化する多様なリガンドのセットに結合させた、ポリリジンである。例えば、Cottonら、Proc. Natl. Acad. Sci. 87:4033-4037 (1990); Furら、Receptor-mediated targeted gene delivery using asialoglycoprotein-polylysine conjugates, Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer, Wolff JA Ed, Birkhauser: Boston, pp382-390 (1994); McGrawら、Internalization and sorting of macromolecules: Endocytosis, Targeted Drug Delivery, Juliano RL(編)、Springer: New York, pp11-41 (1991); およびUikeら、Biosci Biotechnol. Biochem. 62:1247-1248 (1998)を参照されたい。いくつかの実施形態においては、EphA2もしくはErbB2標的化部分、例えば、抗EphA2もしくはErbB2抗体、EphA2もしくはErbB2リガンド、当業界で公知のペプチドまたは他の標的化部分を、ポリカチオン骨格(例えば、ポリリジン)に結合させ、それによってEphA2および／もしくはErbB2を発現するか、もしくは過剰発現する細胞に前記治療剤を指向させる。
【０１７２】
キメラマルチドメインペプチドを、本発明に従う送達ビヒクルとして用いることもできる。例えば、Fominayaら、J. Biol. Chem. 271:10560-10568 (1996); およびUherekら、J. Biol. Chem. 273:8835-8841 (1998)を参照されたい。そのような担体は、標的(すなわち、EphA2もしくはErbB2)、エンドソームエスケープ、およびDNA結合モチーフを単一の合成ペプチド分子に組込む。
【０１７３】
本発明に従って、リポソームを送達ビヒクルとして用いることができる。リポソームは、様々な治療目的のために、および特に、リポソームの全身投与により標的領域もしくは細胞に治療剤もしくは予防剤を運搬するために用いられる密閉された脂質ビヒクルである。リポソームは通常、小さい単層ベシクル(SUV)、大きい単層ベシクル(LUV)、または多層ベシクル(MLV)として分類される。SUVおよびLUVは、定義により、ただ1つの二層を有するが、MLVは多くの同心二層を含む。リポソームを用いて、水性の内部もしくは二層の間に親水性分子を捕捉することによるか、または二層内に疎水性分子を捕捉することにより、様々な材料を封入することができる。ガングリオシドは、リポソームへの血清タンパク質の非特異的吸着を阻害し、それによって、マクロファージによるリポソームの非特異的認識を阻害すると考えられる。
【０１７４】
特に、ポリエチレングリコールなどの水溶性の生体適合性ポリマーの鎖を移植された表面を有するリポソームは、重要な薬剤担体になった。これらのリポソームは、ポリマーコーティングを欠くリポソームよりも長い血液循環寿命を提供する。移植されたポリマー鎖はリポソームを保護するか、または遮蔽し、かくして、血漿タンパク質による非特異的相互作用を最小化する。リポソームはマクロファージおよび網内系の多の細胞により認識されないまま循環するため、これは次いで、リポソームがin vivoで消失するか、または排除される速度を遅らせる。さらに、いわゆる増強された浸透性および滞留効果に起因して、リポソームは損傷を受けた、または拡張された血管系の部位、例えば、腫瘍、および炎症部位に蓄積する傾向がある。
【０１７５】
長い血液循環寿命を有し、所望の時間、捕捉された薬剤を保持することができ、さらに必要に応じて該薬剤を放出することができるリポソーム組成物を製剤化するのが望ましいであろう。これらの特徴を達成するための当業界で記載された1つの手法は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)などの非ベシクル形成脂質、およびメトキシ-ポリエチレングリコール-ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(mPEG-DSPE) (Kirpotinら、FEBS Lett. 388:115-118 (1996))などの脂質二重層安定化脂質からリポソームを形成することであった。この手法においては、mPEGを、切断可能な結合を介してDSPEに結合させる。結合の切断は、リポソーム含量の迅速な放出のためにリポソームを不安定化する。
【０１７６】
リポソームにPEGポリマー鎖を連結するための不安定な結合が記載されている(米国特許第5,013,556号、第5,891,468号; WO 98/16201)。これらのリポソーム組成物中の不安定な結合は、リポソームからPEGポリマー鎖を放出して、例えば、表面に結合した標的化リガンドを露出するか、またはリポソームと標的細胞との融合を誘発する。
【０１７７】
リポソーム薬剤送達系においては、抗EphA2またはErbB2をリポソーム形成の間に捕捉させた後、治療しようとする患者に投与する。例えば、米国特許第3,993,754号、第4,145,410号、第4,224,179号、第4,356,167号、および第4,377,567号を参照されたい。本発明においては、リポソームを、その表面上に1個以上のEphA2またはErbB2標的化部分を有するように改変する。
【０１７８】
7.3.3 ハイブリッドベクター
ハイブリッドベクターは、非ウイルスベクターの可撓性と共にウイルスのエンドソームエスケープ能力を引き出す。ハイブリッドベクターを2つのサブクラス：(1)非ウイルスベクターと共に別の実体として添加される、膜破壊粒子、ウイルス粒子もしくは他の融合性ペプチド；ならびに(2)伝統的な非ウイルスベクターとの単一の複合体中に混合されたそのような粒子に分割することができる。
【０１７９】
例えば、ハイブリッドベクターは、標的化された非ウイルスベクターをトランスに含むアデノウイルス、例えば、トランスフェリン／ポリリジン、抗体／ポリリジン、またはアシアロ糖タンパク質／ポリリジンの複合体を含むアデノウイルスを用いることができる。例えば、Cottonら、Proc. Natl. Acad. Sci. 89:6094-6098 (1992); Curielら、Receptor-mediated gene delivery employing adenovirus-polylysine-DNA complexes, Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer, Wolff JA(編)、Birkhauser: Boston, pp99-116 (1994); Wagnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. 89:6099-6103 (1992); Christianoら、Proc. Natl. Acad. Sci. 90:2122-2126 (1993)(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。そのようなハイブリッドベクターの作用機構は、標的化された複合体とウイルス粒子の両方の特異的結合から、その対応する受容体まで開始する。結合に際して、標的化された複合体とウイルス粒子を、同じベシクルまたは別々のエンドソーム中に内在化させることができる。特定の実施形態においては、ウイルス粒子を、標的化されたベクターに直接結合させる。標的化された複合体へのウイルス粒子の組込みを、例えば、アデノウイルスおよびポリリジンのストレプトアビジン／ビオチン化を介して、ポリリジンに予め結合された抗体を介して、または直接的化学的結合を介して行うことができる。例えば、Vergaら、Biotechnology and Bioengineering 70(6): 593-605 (2000)を参照されたい。特定の実施形態においては、本発明は、1個以上のEphA2またはErbB2標的化部分を含むハイブリッドベクターを提供する。
【０１８０】
7.4 予防／治療方法
本発明は、被験体におけるEphA2およびErbB2の発現もしくは過剰発現に関連する疾患もしくは障害および／または細胞過増殖性障害、特に、癌を治療、予防、または管理するための方法であって、EphA2およびErbB2を発現する細胞を標的化することができ、ならびにEphA2および／もしくはErbB2発現もしくは機能を変化させ、ならびに／または過増殖性細胞疾患に対する治療もしくは予防効果を有する有効量の組成物を投与することを含む前記方法を包含する。一実施形態においては、本発明の方法は、被験体に、過増殖性細胞疾患に対する治療剤または予防剤に結合させたEphA2またはErbB2標的化部分を含む組成物を投与することを含む。別の実施形態においては、本発明の方法は、被験体に、EphA2またはErbB2標的化部分をコードするヌクレオチド配列と、過増殖性疾患に対する治療剤または予防剤をコードするヌクレオチド配列とを含む組成物を投与することを含む。別の実施形態においては、本発明の方法は、被験体に、EphA2またはErbB2標的化部分と、過増殖性疾患に対する治療剤または予防剤をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む組成物を投与することを含み、該標的化部分を、直接的に、またはEphA2および／もしくはErbB2を発現もしくは過剰発現する細胞への送達のための送達ベクターを介して該核酸と結合させる。特定の実施形態においては、EphA2またはErbB2標的化部分はまた、EphA2またはErbB2の発現または活性を阻害する。
【０１８１】
本発明は、被験体におけるEphA2および／もしくはErbB2の発現もしくは過剰発現に関連する疾患もしくは障害ならびに／または細胞過増殖性障害、特に、癌を治療、予防、または管理するための方法であって、EphA2もしくはErbB2を標的化し、および／またはEphA2もしくはErbB2の発現もしくは活性を変化させる1種以上の抗体であって、EphA2もしくはErbB2アゴニストもしくはアンタゴニスト抗体、EphA2もしくはErbB2イントラボディ、またはEphA2もしくはErbB2癌細胞表現型阻害抗体または露出されたEphA2もしくはErbB2エピトープ抗体または3 X 10-1s-1未満のKoffでEphA2に結合するEphA2もしくはErbB2抗体、またはEphA2もしくはErbB2アビマーを含む、前記抗体を投与することを含む前記方法を包含する。特定の実施形態においては、治療、予防、または管理しようとする障害は悪性の癌である。別の特定の実施形態においては、治療、予防、または管理しようとする障害は、EphA2またはErbB2を発現または過剰発現する細胞に関連する前癌状態である。より特定の実施形態においては、前癌状態は、高悪性度前立腺上皮内腫瘍(PIN)、乳腺の線維腺腫、線維嚢胞性疾患、または複合母斑である。
【０１８２】
一実施形態においては、本発明の組成物を、EphA2もしくはErbB2の発現もしくは過剰発現に関連する疾患もしくは障害、過増殖性障害、および／または癌の治療、予防または管理において有用な1種以上の他の治療剤と共に投与することができる。特定の実施形態においては、1種以上の本発明の組成物を、癌の治療にとって有用な1種以上の他の治療剤と一緒に、哺乳動物、好ましくは、ヒトに投与する。用語「一緒に」とは、正確に同じ時間での予防剤もしくは治療剤の投与に限定されず、むしろ本発明の組成物と他の薬剤を、被験者に連続的に、および本発明の組成物が他の薬剤と一緒に作用して、それらが別の方法で投与された場合よりも高い利益をもたらすことができるような時間間隔内で投与することを意味する。例えば、それぞれの予防剤または治療剤を、同時に、または異なる時点で任意の順序で連続的に投与することができる；しかしながら、同時に投与しない場合、所望の治療または予防効果を提供するように、それらを十分に近い時間内に投与すべきである。それぞれの治療剤を、任意の好適な形態で、および任意の好適な経路により別々に投与することができる。他の実施形態においては、本発明の組成物を、外科手術の前、それと同時に、またはその後に投与する。好ましくは、外科手術は、局所腫瘍を完全に除去するか、または大きい腫瘍サイズを低下させる。また、外科手術を、予防的手段として、または疼痛を軽減するために行うこともできる。
【０１８３】
本発明は、治療上もしくは予防上有効な量の1種以上の本発明の組成物を、それを必要とする被験体に投与することにより、EphA2もしくはErbB2の発現もしくは過剰発現に関連する疾患もしくは障害および／または過増殖性細胞疾患、特に、癌を治療、予防、および管理するための方法を提供する。別の実施形態においては、本発明の組成物を、1種以上の他の治療剤と共に投与することができる。前記被験体は、非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど)および霊長類(例えば、カニクイザルなどのサルおよびヒト)などの哺乳動物であるのが好ましい。特定の実施形態においては、被験体はヒトである。
【０１８４】
本発明により包含される方法により治療することができる癌の具体例としては、限定されるものではないが、EphA2および／またはErbB2を発現または過剰発現する癌が挙げられる。さらなる実施形態においては、前記癌は上皮起源のものである。そのような癌の例は、肺、結腸、前立腺、乳腺、および皮膚の癌である。他の癌としては、膀胱癌および膵臓癌ならびに腎細胞癌およびメラノーマが挙げられる。さらなる癌を、以下に非限定例として列挙する。特定の実施形態においては、本発明の方法を用いて、原発腫瘍からの転移を治療および／または予防することができる。
【０１８５】
本発明の方法および組成物は、例えば、特定の型の癌に関する遺伝的素因を有し、発癌物質に曝露されたか、または特定の癌からの寛解にある、癌に罹患するか、または癌に罹患すると予想される被験体／患者への、1種以上の本発明の組成物の投与を含む。本明細書で用いられる「癌」とは、原発性または転移性の癌を指す。そのような患者は、癌について以前に治療されていてもよい。本発明の方法および組成物を、第1または第2の癌治療として用いることができる。また、他の癌治療を受けている患者の治療も本発明に含まれ、本発明の方法および組成物を、これらの他の癌治療の任意の副作用または過敏症が起こる前に用いることができる。本発明はまた、難治性患者における症候を治療または改善するために1種以上の本発明の組成物を投与する方法も包含する。特定の実施形態においては、その癌は、癌細胞の少なくともいくつかの有意な部分が殺傷されないか、またはその細胞分裂が停止する治療手段に対して難治性である。癌細胞が難治性であるかどうかの決定を、そのような状況において「難治性」の当業界で許容される意味を用いて、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当業界で公知の任意の方法により、in vivoまたはin vitroで行うことができる。様々な実施形態においては、癌細胞数が有意に減少しないか、または増加した癌は難治性である。
【０１８６】
特定の実施形態においては、本発明の組成物を投与して、特定のホルモン療法剤、放射線療法剤および化学療法剤に対する癌細胞の耐性または低下した感受性を逆転することによって、該癌細胞を1種以上のこれらの薬剤に対して再感作した後、これを投与して(または継続的に投与して)転移を予防するなど、癌を治療または管理することができる。特定の実施形態においては、本発明の組成物を、化学療法およびホルモン療法などの、様々な治療計画に対して耐性である癌細胞の発達に関連していた、高レベルのサイトカインIL-6を有する患者に投与する。別の特定の実施形態においては、本発明の組成物を、タモキシフェン治療に対する応答性が低下したか、またはそれに対して難治性である乳癌を罹患する患者に投与する。別の特定の実施形態においては、本発明の組成物を、化学療法およびホルモン療法などの様々な治療計画に対して耐性である癌細胞の発達に関連していた、高レベルのサイトカインIL-6を有する患者に投与する。
【０１８７】
代替的な実施形態においては、本発明は、他の治療に対して難治性であると証明されているが、これらの治療についてはもはや難治性ではない患者に、任意の他の治療と組合わせて1種以上の本発明の組成物を投与することにより患者の癌を治療する方法を提供する。特定の実施形態においては、本発明の方法により治療される患者は、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、または生物学的療法／免疫療法を用いて既に治療された患者である。特に、これらの患者は、難治性の患者および存在する癌療法を用いる治療にも関わらず、癌を有する患者である。他の実施形態においては、治療され、疾患活性を有さない患者に、1種以上の本発明の組成物を投与して、癌の再発を防止する。
【０１８８】
特定の実施形態においては、存在する治療は化学療法である。特定の実施形態においては、存在する治療は、限定されるものではないが、メトトレキサート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシウレア、シタラビン、シクロホスファミド、イフォスファミド、ニトロソウレア、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン、エトポシド、カンパテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセルなどの化学療法剤の投与を含む。特に、これらの患者は、放射線療法、ホルモン療法および／または生物学的療法／免疫療法を用いて治療された患者である。また、特に、これらの患者は、癌の治療のために外科手術を受けた者である。
【０１８９】
あるいは、本発明はまた、放射線療法を受けているか、または受けた患者を治療するための方法も包含する。特に、これらの患者は、化学療法、ホルモン療法および／または生物学的療法／免疫療法を用いて治療されるか、または以前に治療された患者である。また、特に、これらの患者は、癌の治療のための外科手術を受けた者である。
【０１９０】
他の実施形態においては、本発明は、ホルモン療法および／または生物学的療法／免疫療法を受けているか、または受けた患者を治療する方法を包含する。特に、これらの患者は、化学療法および／または放射線療法を用いて治療されるか、または治療された患者である。また、特に、これらの患者は、癌の治療のための外科手術を受けた者である。
【０１９１】
さらに、本発明は、治療しようとする被験体にとって、あまりに毒性が高いと証明されたか、もしくは証明することができる、すなわち、許容されないか、もしくは耐えられない副作用をもたらす、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法／免疫療法に対する代替としての癌の治療方法も提供する。本発明の方法を用いて治療される被験体を、必要に応じて、どの治療が許容されないか、または耐えられないことがわかっているかに応じて、外科手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法または生物学的療法などの他の癌治療を用いて治療することができる。
【０１９２】
他の実施形態においては、本発明は、癌の治療のための任意の他の癌療法を用いない、そのような治療に対して難治性であることが証明されている患者への1種以上の本発明の組成物の投与を提供する。特定の実施形態においては、他の癌療法に対して難治性である患者に、癌療法の非存在下で1種以上の本発明の組成物を投与する。
【０１９３】
他の実施形態においては、EphA2およびErbB2を発現または過剰発現する細胞に関連する前癌症状を有する患者に、本発明の組成物を投与して、悪性の癌に進行するであろう可能性を有する障害および疾患を治療することができる。特定の実施形態においては、前癌症状は、悪性度前立腺上皮細胞内新生物(PIN)、乳腺の線維腺腫、線維嚢胞性疾患、または複合母斑である。
【０１９４】
さらに他の実施形態においては、本発明は、非癌過増殖性細胞障害、特に、限定されるものではないが、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、再狭窄(平滑筋および／もしくは内皮)、乾癬などの、EphA2およびErbB2の発現または過剰発現に関連するものを治療、予防および管理する方法を提供する。これらの方法としては、例えば、本発明の組成物を投与することにより、ならびに組合せ療法、特定の治療に対して難治性である患者への投与などにより、癌を治療、予防および管理するための上記のものと類似する方法が挙げられる。
【０１９５】
7.5 癌
本発明の方法および組成物により治療、予防、または管理することができる癌および関連する障害としては、限定されるものではないが、上皮細胞起源の癌が挙げられる。そのような癌の例としては、以下のもの：限定されるものではないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、例えば、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病および骨髄異形成症候群などの白血病；限定されるものではないが、慢性骨髄性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病などの慢性白血病；赤血球増加症；限定されるものではないが、ホジキン病、非ホジキン病などのリンパ腫；限定されるものではないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫などの多発性骨髄腫；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症；良性単クローン性免疫グロブリン血症；重鎖疾患；限定されるものではないが、骨の肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫瘍、骨の線維肉腫、軟骨腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫(血管肉腫)、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫などの骨および結合組織の肉腫；限定されるものではないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起膠腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、原発性脳リンパ腫などの脳腫瘍；限定されるものではないが、腺管癌、腺癌、小葉(小細胞)癌、腺管内癌、髄様乳癌、粘液乳癌、管状乳癌、乳頭乳癌、パジェット病、および炎症性乳癌などの乳癌；限定されるものではないが、褐色細胞腫および副腎皮質癌などの副腎癌；限定されるものではないが、甲状腺乳頭癌もしくは濾胞性甲状腺癌、甲状腺髄様癌および未分化甲状腺癌などの甲状腺癌；限定されるものではないが、膵島細胞腫、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドもしくは島細胞腫などの膵臓癌；限定されるものではないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症、および尿崩症などの下垂体癌；限定されるものではないが、虹彩黒色腫、脈絡膜メラノーマ、および毛様体メラノーマなどの眼のメラノーマ、ならびに網膜芽細胞腫などの眼の癌；扁平上皮細胞癌、腺癌、およびメラノーマなどの膣癌；扁平上皮細胞癌、メラノーマ、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病などの外陰癌；限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌、および腺癌などの頸部癌；限定されるものではないが、子宮内膜癌および子宮肉腫などの子宮癌；限定されるものではないが、卵巣上皮癌、境界型腫瘍、生殖細胞腫瘍、および間質腫瘍などの卵巣癌；限定されるものではないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘膜表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、メラノーマ、形質細胞腫、いぼ状癌、および燕麦細胞(小細胞)癌などの食道癌；限定されるものではないが、腺癌、菌状(ポリープ状)癌、潰瘍、表在拡大型、広範拡大型悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫などの胃癌；結腸癌；腎臓癌；限定されるも��ではないが、肝細胞癌および肝芽腫などの肝臓癌；腺癌などの胆嚢癌；限定されるものではないが、ルオロウラ(luoroura)、結節性、および広範性などの胆管癌；非小細胞肺癌、扁平上皮細胞癌(類表皮癌)、腺癌、大細胞肺癌および小細胞肺癌などの肺癌；限定されるものではないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的(典型的)、精母細胞、非精上皮腫、胎生期癌、奇形腫、絨毛癌(卵黄嚢癌)などの精巣癌；限定されるものではないが、前立腺上皮内新生物、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫などの前立腺癌；基底細胞癌；限定されるものではないが、腺癌、粘膜表皮癌、および腺様嚢胞癌などの唾液腺癌；限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌、およびいぼ状癌などの咽頭癌；限定されるものではないが、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌およびメラノーマ、表在拡大型メラノーマ、結節性メラノーマ、悪性黒子型黒色腫、末端性黒子性黒色腫などの皮膚癌；限定されるものではないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌(腎盂および／もしくは尿管)などの腎臓癌；ウィルムス腫瘍；限定されるものではないが、移行細胞癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、癌肉腫などの膀胱癌が挙げられる。さらに、癌としては、粘液肉腫、骨肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑液腫瘍、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌が挙げられる(そのような障害の概説については、Fishmanら、1985, Medicine、第2版、J.B. Lippincott Co., PhiladelphiaおよびMurphyら、1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of Americaを参照されたい)。
【０１９６】
従って、本発明の方法および組成物はまた、限定されるものではないが、以下のもの：膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、頸部癌、甲状腺癌および皮膚癌；扁平上皮細胞癌；リンパ球系列の造血幹細胞腫瘍、例えば、白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫；骨髄球系列の造血幹細胞腫瘍、例えば、急性および慢性骨髄性白血病ならびに前骨髄球性白血病；間葉細胞起源の腫瘍、例えば、線維肉腫および横紋筋肉腫；他の腫瘍、例えば、メラノーマ、精上皮腫、奇形腫、神経芽細胞腫および神経膠腫；中枢神経系および末梢神経系の腫瘍、例えば、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫；間葉細胞起源の腫瘍、例えば、線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫；ならびに他の腫瘍、例えば、メラノーマ、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌および奇形癌などの様々な癌または他の異常増殖性疾患の治療または予防においても有用である。アポトーシスの異常により引き起こされる癌を本発明の方法および組成物により治療することもできることも意図される。そのような癌としては、限定されるものではないが、濾胞性リンパ腫、p53突然変異を有する癌、乳腺、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに家族性大腸腺腫症などの前癌病変、ならびに骨髄異形成症候群が挙げられる。特定の実施形態においては、悪性腫瘍もしくは増殖異常的変化(化生および異形成など)、または過増殖性障害を、皮膚、肺、結腸、乳腺、前立腺、膀胱、腎臓、膵臓、卵巣、または子宮において治療または予防する。他の特定の実施形態においては、肉腫、メラノーマ、または白血病を治療または予防する。
【０１９７】
いくつかの実施形態においては、前記癌は悪性腫瘍であり、EphA2およびErbB2を発現または過剰発現する。他の実施形態においては、治療しようとする障害は、EphA2およびErbB2を過剰発現する細胞に関連する前癌症状である。
【０１９８】
他の実施形態においては、本発明の方法および組成物を、乳癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、および前立腺癌ならびにメラノーマの治療および／もしくは予防のために使用し、限定よりもむしろ例示により以下に提供する。
【０１９９】
7.6 医薬組成物
本発明は、医薬組成物の製造において有用なバルク薬剤組成物(例えば、純粋でないか、もしくは非滅菌性組成物)および単位投与剤形の調製において用いることができる医薬組成物(すなわち、被験体もしくは患者への投与にとって好適である組成物)を含む。そのような組成物は、予防上もしくは治療上有効な量の本明細書に開示される予防剤および／もしくは治療剤またはこれらの薬剤の組合せと、製薬上許容し得る担体とを含む。一実施形態においては、本発明の組成物は、さらなる治療剤、例えば、抗癌剤をさらに含む。
【０２００】
特定の実施形態においては、用語「製薬上許容し得る」とは、連邦政府もしくは州政府の規制当局により認可されていること、または米国薬局方もしくは動物、およびより具体的には、ヒトにおける使用に関する他の一般的に認識される薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」とは、治療剤と共に投与される、希釈剤、アジュバント(例えば、Freundのアジュバント(完全および不完全)、もしくはChiron, Emeryville, CAから入手可能なMF59C.1アジュバント)、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような製薬上の担体は、水および石油、動物、野菜もしくは合成起源のものなどの油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの滅菌液体であってよい。水は、医薬組成物を静脈内投与する場合に用いることができる担体の一例である。塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、液体担体として、特に、注射用溶液として用いることもできる。好適な製薬用賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。必要に応じて、前記組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出製剤などの形態を取ってもよい。
【０２０１】
一般的には、本発明の組成物の成分を別々に供給するか、または例えば、活性薬剤の量を示すアンプルもしくはサチェットなどの密閉容器中の凍結乾燥粉末もしくは水を含まない濃縮物として、単位投与剤形中で一緒に混合する。前記組成物を輸液により投与する場合、滅菌医薬等級の水または塩水を含む輸液ボトルを用いてそれを調剤することができる。前記組成物を注射により投与する場合、注射用の滅菌水または塩水のアンプルを、前記成分を投与の前に混合することができるように提供することができる。
【０２０２】
本発明の組成物を、中性または塩の形態として製剤化することができる。製薬上許容し得る塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものなどの陰イオンを用いて形成される塩、ならびにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものなどの陽イオンを用いて形成される塩が挙げられる。
【０２０３】
本発明の予防剤もしくは治療剤を投与する方法としては、限定されるものではないが、非経口投与(例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下)、硬膜外、および粘膜(例えば、鼻内、吸入、および経口経路)が挙げられる。特定の実施形態においては、本発明の予防剤もしくは治療剤を、筋肉内、静脈内、または皮下投与する。前記予防剤または治療剤を、任意の都合のよい経路により、例えば、輸液もしくはボーラス注射により、上皮もしくは皮膚粘膜系列(例えば、経口粘膜、直腸および小腸粘膜など)を介する吸収により投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身性または局所性であってよい。
【０２０４】
特定の実施形態においては、本発明の予防剤または治療剤を、治療を必要とする領域に局所的に投与するのが望ましい；これを、例えば、限定されるものではないが、局所輸液、注射、または多孔性、非多孔性、またはシラスティック膜などの膜、もしくは繊維などのゼラチン性材料のものである埋込み物の手段により達成することができる。
【０２０５】
さらに別の実施形態においては、前記予防剤または治療剤を、制御放出系または持続放出系で送達することができる。一実施形態においては、ポンプを用いて、制御放出または持続放出を達成することができる(Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwaldら、1980, Surgery 88:507; Saudekら、1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照されたい)。別の実施形態においては、ポリマー材料を用いて、本発明の抗体またはそのフラグメントの制御放出または持続放出を達成することができる(例えば、Medical Applications of Controlled Release, LangerおよびWise (編), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenおよびBall (編), Wiley, New York (1984); RangerおよびPeppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい; また、Levyら、1985, Science 228:190; Duringら、1989, Ann. Neurol. 25:351; Howardら、1989, J. Neurosurg. 7 1:105); 米国特許第5,679,377号; 第5,916,597号; 第5,912,015号; 第5,989,463号; 第5,128,326号; 国際特許出願公開第WO 99/15154号および第WO 99/20253号も参照されたい)。持続放出製剤において用いられるポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリアンヒドリド、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)、およびポリオルトエステルが挙げられる。一実施形態においては、持続放出製剤において用いられるポリマーは、不活性であり、濾過可能な不純物を含まず、保存時に安定であり、無菌性であり、および生体分解性である。さらに別の実施形態においては、制御放出系または持続放出系を、予防または治療標的の近くに配置し、かくしてほんの少量の全身用量のみを必要とすることができる(例えば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照されたい)。
【０２０６】
制御放出系は、Langer (1990, Science 249:1527-1533)による概説に考察されている。当業者には公知の任意の技術を用いて、1種以上の本発明の治療剤を含む持続放出製剤を製造することができる。例えば、米国特許第4,526,938号; 国際特許出願公開第WO 91/05548号および第WO 96/20698号; Ningら、1996, Radiotherapy & Oncology 39:179 189; Songら、1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372 397; Cleekら、1997, Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853 854; ならびにLamら、1997,  Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759 760(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【０２０７】
7.6.1 製剤
本発明に従う使用のための医薬組成物を、1種以上の生理学的に許容し得る担体または賦形剤を用いて従来の様式で製剤化することができる。かくして、本発明の組成物を、吸入もしくは通気(口もしくは鼻を介する)または経口、非経口もしくは粘膜(頬、膣、直腸、舌下)投与による投与のために製剤化することができる。一実施形態においては、局所または全身非経口投与を用いる。
【０２０８】
経口投与のためには、前記医薬組成物は、例えば、結合剤(例えば、予備ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース)；充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム)；潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ)；崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンもしくはナトリウムスターチグリコレート)；または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの製薬上許容し得る賦形剤を用いて従来の手段により調製された錠剤またはカプセルの形態を取ってもよい。錠剤を、当業界でよく知られた方法によりコーティングすることができる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップもしくは懸濁液の形態を取ってもよく、またはそれらを使用前に水もしくは他の好適なビヒクルを用いて構成するための乾燥製品として提供することができる。そのような液体調製物を、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体もしくは水素化食用油脂)；乳化剤(例えば、レシチンもしくはアカシア)；非水性ビヒクル(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールもしくは分画野菜油)；ならびに保存剤(例えば、メチルもしくはプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸)などの製薬上許容し得る添加物を用いて従来の手段により調製することができる。前記調製物はまた、必要に応じて緩衝塩、香料、着色料および甘味料を含んでもよい。
【０２０９】
経口投与のための調製物を好適に製剤化して、活性化合物の制御放出を得ることができる。頬投与のために、前記組成物は従来の様式で製剤化された錠剤またはロゼンジ剤の形態を取ってもよい。吸入による投与のために、本発明に従う使用のための予防剤または治療剤を、好適な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の好適な気体の使用と共に、加圧包装もしくはネブライザーからエアロゾルスプレー提供物の形態で都合よく送達する。加圧されたエアロゾルの場合、一定量を送達するためのバルブを提供することにより、投与単位を決定することができる。前記化合物と、ラクトースもしくはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含む、例えば、吸入器またはインサフレーターにおける使用のための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化することができる。
【０２１０】
前記予防剤または治療剤を、注射、例えば、ボーラス注射または連続輸液による非経口投与のために製剤化することができる。注射のための製剤を、例えば、添加された保存剤を含む、アンプルまたは複数回投与容器中、単位投与形態で提供することができる。前記組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中、懸濁液、溶液もしくは乳濁液などの形態を取ってもよく、懸濁剤、安定化剤および／もしくは分散剤などの製剤化剤を含んでもよい。あるいは、前記活性成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌性の発熱源を含まない水を用いて構成するための粉末形態にあってよい。
【０２１１】
前記予防剤または治療剤を、例えば、ココアバターもしくは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含む、坐剤または停留浣腸などの直腸組成物中で製剤化することもできる。
【０２１２】
以前に記載の製剤に加えて、前記予防剤または治療剤を、デポー調製物として製剤化することもできる。そのような長時間作用製剤を、埋込み(例えば、皮下もしくは筋肉内)または筋肉内注射により投与することができる。かくして、例えば、前記予防剤または治療剤を、好適なポリマー材料もしくは疎水性材料(例えば、許容し得る油中の乳濁液として)もしくはイオン交換樹脂と共に、または難溶性誘導体、例えば、難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２１３】
本発明はまた、量を示すアンプルまたはサチェットなどの密閉容器中に充填された予防剤または治療剤を提供する。一実施形態においては、前記予防剤または治療剤を、乾燥滅菌凍結乾燥粉末もしくは水を含まない濃縮物として密閉容器中に供給し、例えば、被験体への投与にとって好適な濃度に、水もしくは塩水を用いて再構成することができる。
【０２１４】
本発明の一実施形態においては、様々な化学療法剤、生物学的薬剤／免疫療法剤およびホルモン療法剤の製剤および投与は当業界で公知であり、Physician’s Desk Reference、第56版(2002)にしばしば記載されている。例えば、本発明の特定の実施形態においては、本発明の治療剤を製剤化し、本明細書に提供されたように供給することができる。
【０２１５】
本発明の他の実施形態においては、放射性アイソトープなどの放射線療法剤を、カプセル中の液体として、または飲料として経口的に与えることができる。放射性アイソトープを、静脈内注射のために製剤化することもできる。知識を有する癌専門医であれば、好ましい製剤および投与経路を決定することができる。
【０２１６】
特定の実施形態においては、本発明の組成物を、静脈内注射については1 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、および25 mg/mlで、ならびに反復皮下投与および筋肉内注射については5 mg/ml、10 mg/ml、および80 mg/mlで製剤化する。
【０２１７】
必要に応じて、前記組成物を、活性成分を含む1個以上の単位投与形態を含んでもよい包装またはディスペンサー装置中で提供することができる。この包装は、例えば、金属またはブリスターパックなどのプラスチックホイルを含んでもよい。包装またはディスペンサー装置に、投与のための器具を添付してもよい。
【０２１８】
7.6.2 用量および投与頻度
過増殖性疾患もしくはその1種以上の症候の予防、治療、管理、および／または軽減において有効であろう療法(例えば、予防剤もしくは治療剤)または本発明の組成物の量を、標準的な臨床方法により決定することができる。頻度および用量は、投与される特定の療法(例えば、特定の治療剤もしくは予防剤)に応じた各患者にとって特異的な因子、障害、疾患、もしくは症状の重篤度、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答、および過去の病歴に従っても変化するであろう。例えば、過増殖性疾患もしくはその1種以上の症候の治療、予防、管理、および／もしくは軽減において有効であろう予防剤もしくは治療剤または本発明の組成物の用量を、例えば、本明細書に開示されるか、もしくは当業者には公知の動物モデルなどの動物モデルに該組成物を投与することにより決定することができる。さらに、必要に応じて、in vitroアッセイを用いて、最適な用量範囲を同定するのを助けることができる。当業者であれば、好適な計画を、そのような因子を考慮し、例えば、文献に報告され、Physician’s Desk Reference (第61版、2007)に推奨された用量に従うことにより、選択することができる。
【０２１９】
様々な実施形態においては、前記療法(例えば、予防剤もしくは治療剤)を、1時間未満の間隔で、約1時間の間隔で、約1時間〜約2時間の間隔で、約2時間〜約3時間の間隔で、約3時間〜約4時間の間隔で、約4時間〜約5時間の間隔で、約5時間〜約6時間の間隔で、約6時間〜約7時間の間隔で、約7時間〜約8時間の間隔で、約8時間〜約9時間の間隔で、約9時間〜約10時間の間隔で、約10時間〜約11時間の間隔で、約11時間〜約12時間の間隔で、24時間以下の間隔で、または48時間以下の間隔で投与する(施す)。特定の実施形態においては、2つ以上の成分を、同じ患者訪問内に投与する。
【０２２０】
本明細書に提供された投薬量および投与頻度は、用語「治療上有効な」および「予防上有効な」により包含される。この用量および頻度はさらに、典型的には、投与される特定の治療剤もしくは予防剤に応じた各患者に特異的な因子、癌の重篤度および型、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答、および過去の病歴に従って変化するであろう。当業者であれば、好適な計画を、そのような因子を考慮し、例えば、文献に報告され、Physician’s Desk Reference (第58版、2004)に推奨された用量に従うことにより選択することができる。
【０２２１】
小分子の例示的用量としては、被験体もしくはサンプル重量1キログラムあたり、ミリグラムもしくはマイクログラム量の小分子(例えば、約1 mg/kg〜約500 mg/kg、約100μg/kg〜約5 mg/kg、または約1μg/kg〜約50 mg/kg)が挙げられる。
【０２２２】
本発明により包含される抗体、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび融合タンパク質については、患者に投与される用量は、典型的には、0.0001 mg/kg〜100 mg/kg患者体重である。患者に投与される用量は、0.0001 mg/kg〜20 mg/kg、0.0001 mg/kg〜10 mg/kg、0.0001 mg/kg〜5 mg/kg、0.0001〜2 mg/kg、0.0001〜1 mg/kg、0.0001 mg/kg〜0.75 mg/kg、0.0001 mg/kg〜0.5 mg/kg、0.0001 mg/kg〜0.25 mg/kg、0.0001〜0.15 mg/kg、0.0001〜0.10 mg/kg、0.001〜0.5 mg/kg、0.01〜0.25 mg/kgまたは0.01〜0.10 mg/kg患者体重である。一般的には、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答に起因して、他の種に由来する抗体よりもヒト体内での半減期が長い。かくして、より低用量のヒト抗体およびより頻度の少ない投与が可能であることが多い。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントの用量および投与頻度を、例えば、脂質化などの改変により抗体の取込みおよび組織浸透を増強することにより減少させることができる。
【０２２３】
特定の実施形態においては、患者における過増殖性疾患または1種以上のその症候を予防、治療、管理、および／または軽減するのに投与される抗体の用量は、患者体重の150 μg/kg以下、125 μg/kg以下、100 μg/kg以下、95 μg/kg以下、90 μg/kg以下、85 μg/kg以下、80 μg/kg以下、75 μg/kg以下、70 μg/kg以下、65 μg/kg以下、60 μg/kg以下、55 μg/kg以下、50 μg/kg以下、45 μg/kg以下、40 μg/kg以下、35 μg/kg以下、30 μg/kg以下、25 μg/kg以下、20 μg/kg以下、15 μg/kg以下、10 μg/kg以下、5 μg/kg以下、2.5 μg/kg以下、2 μg/kg以下、1.5 μg/kg以下、1 μg/kg以下、0.5 μg/kg以下、または0.5 μg/kg以下である。別の実施形態においては、患者における過増殖性疾患または1種以上のその症候を予防、治療、管理、および／または軽減するのに投与される抗体の用量は、0.1 mg〜20 mg、0.1 mg〜15 mg、0.1 mg〜12 mg、0.1 mg〜10 mg、0.1 mg〜8 mg、0.1 mg〜7 mg、0.1 mg〜5 mg、0.1〜2.5 mg、0.25 mg〜20 mg、0.25〜15 mg、0.25〜12 mg、0.25〜10 mg、0.25〜8 mg、0.25 mg〜7m g、0.25 mg〜5 mg、0.5 mg〜2.5 mg、1 mg〜20 mg、1 mg〜15 mg、1 mg〜12 mg、1 mg〜10 mg、1 mg〜8 mg、1 mg〜7 mg、1 mg〜5 mg、または1 mg〜2.5 mgの単位用量である。
【０２２４】
他の実施形態においては、1種以上の本発明の療法(例えば、治療剤もしくは予防剤)の有効量の1回以上の用量であって、有効量の用量が、本発明の療法(例えば、治療剤もしくは予防剤)の少なくとも0.1 μg/ml、少なくとも0.5 μg/ml、少なくとも1 μg/ml、少なくとも2 μg/ml、少なくとも5 μg/ml、少なくとも6 μg/ml、少なくとも10 μg/ml、少なくとも15 μg/ml、少なくとも20 μg/ml、少なくとも25 μg/ml、少なくとも50 μg/ml、少なくとも100 μg/ml、少なくとも125 μg/ml、少なくとも150 μg/ml、少なくとも175 μg/ml、少なくとも200 μg/ml、少なくとも225 μg/ml、少なくとも250 μg/ml、少なくとも275 μg/ml、少なくとも300 μg/ml、少なくとも325 μg/ml、少なくとも350 μg/ml、少なくとも375 μg/ml、または少なくとも400 μg/mlの血清力価を達成する前記用量を被験体に投与する。さらに他の実施形態においては、少なくとも0.1 μg/ml、少なくとも0.5 μg/ml、少なくとも1 μg/ml、少なくとも2 μg/ml、少なくとも5 μg/ml、少なくとも6 μg/ml、少なくとも10 μg/ml、少なくとも15 μg/ml、少なくとも20 μg/ml、少なくとも25 μg/ml、少なくとも50 μg/ml、少なくとも100 μg/ml、少なくとも125 μg/ml、少なくとも150 μg/ml、少なくとも175 μg/ml、少なくとも200 μg/ml、少なくとも225 μg/ml、少なくとも250 μg/ml、少なくとも275 μg/ml、少なくとも300 μg/ml、少なくとも325 μg/ml、少なくとも350 μg/ml、少なくとも375 μg/ml、または少なくとも400 μg/mlの抗体の血清力価を達成する本発明の1種以上の抗体の有効量の用量を被験体に投与し、本発明の1種以上の抗体の有効量のその後の用量を投与して、少なくとも0.1 μg/ml、少なくとも0.5 μg/ml、少なくとも1 μg/ml、少なくとも2 μg/ml、少なくとも5 μg/ml、少なくとも6 μg/ml、少なくとも10 μg/ml、少なくとも15 μg/ml、少なくとも20 μg/ml、少なくとも25 μg/ml、少なくとも50 μg/ml、少なくとも100 μg/ml、少なくとも125 μg/ml、少なくとも150 μg/ml、少なくとも175 μg/ml、少なくとも200 μg/ml、少なくとも225 μg/ml、少なくとも250 μg/ml、少なくとも275 μg/ml、少なくとも300 μg/ml、少なくとも325 μg/ml、少なくとも350 μg/ml、少なくとも375 μg/ml、または少なくとも400 μg/mlの血清力価を維持する。これらの実施形態に従って、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12回以上のその後の用量を被験体に投与することができる。
【０２２５】
特定の実施形態においては、本発明は、過増殖性疾患もしくは1種以上のその症候を予防、治療、管理、または軽減する方法であって、少なくとも10 μg、少なくとも15 μg、少なくとも20 μg、少なくとも25 μg、少なくとも30 μg、少なくとも35 μg、少なくとも40 μg、少なくとも45 μg、少なくとも50 μg、少なくとも55 μg、少なくとも60 μg、少なくとも65 μg、少なくとも70 μg、少なくとも75 μg、少なくとも80 μg、少なくとも85 μg、少なくとも90 μg、少なくとも95 μg、少なくとも100 μg、少なくとも105 μg、少なくとも110 μg、少なくとも115 μg、または少なくとも120 μgの用量の本発明の1種以上の療法(例えば、治療剤もしくは予防剤)、組合せ療法、または組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、前記方法を提供する。別の実施形態においては、本発明は、過増殖性疾患もしくは1種以上のその症候を予防、治療、管理、および／または軽減する方法であって、少なくとも10 μg、少なくとも15 μg、少なくとも20 μg、少なくとも25 μg、少なくとも30 μg、少なくとも35 μg、少なくとも40 μg、少なくとも45 μg、少なくとも50 μg、少なくとも55 μg、少なくとも60 μg、少なくとも65 μg、少なくとも70 μg、少なくとも75 μg、少なくとも80 μg、少なくとも85 μg、少なくとも90 μg、少なくとも95 μg、少なくとも100 μg、少なくとも105 μg、少なくとも110 μg、少なくとも115 μg、または少なくとも120 μgの用量の本発明の1種以上の抗体、組合せ療法、または組成物を、3日毎に1回、4日毎に1回、5日毎に1回、6日毎に1回、7日毎に1回、8日毎に1回、10日毎に1回、2週間に1回、3週間に1回、または月に1回、それを必要とする被験体に投与することを含む、前記方法を提供する。
【０２２６】
本発明は、癌もしくは過増殖性疾患または1種以上のその症候を予防、治療、管理、または予防する方法であって、(a)1回以上の用量の予防上もしくは治療上有効量の本発明の1種以上の抗体、組合せ療法、もしくは組成物を、それを必要とする被験体に投与すること；ならびに(b)特定の回数の用量の該療法(例えば、治療剤もしくは予防剤)の投与後に、該被験体における該投与された抗体の血漿レベル／濃度をモニターすることを含む前記方法を提供する。さらに、前記特定回数の用量は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12回の用量の予防上または治療上有効量の本発明の1種以上の抗体、組成物、または組合せ療法である。
【０２２７】
特定の実施形態においては、本発明は、癌もしくは過増殖性疾患または1種以上のその症候を予防、治療、管理、および／または軽減する方法であって、(a)少なくとも10μg(例えば、少なくとも15μg、少なくとも20μg、少なくとも25μg、少なくとも30μg、少なくとも35μg、少なくとも40μg、少なくとも45μg、少なくとも50μg、少なくとも55μg、少なくとも60μg、少なくとも65μg、少なくとも70μg、少なくとも75μg、少なくとも80μg、少なくとも85μg、少なくとも90μg、少なくとも95μg、もしくは少なくとも100μg)の用量の本発明の1種以上の療法(例えば、治療剤もしくは予防剤)を、それを必要とする被験体に投与すること；ならびに(b)該被験体における投与された抗体の血漿レベルが0.1μg/ml未満、0.25μg/ml未満、0.5μg/ml未満、0.75μg/ml未満、もしくは1μg/ml未満である場合、該被験体に1回以上のその後の用量を投与することを含む、前記方法を提供する。別の実施形態においては、本発明は、癌もしくは過増殖性疾患または1種以上のその症候を予防、治療、管理、および／または軽減する方法であって、(a)少なくとも10μg(例えば、少なくとも15μg、少なくとも20μg、少なくとも25μg、少なくとも30μg、少なくとも35μg、少なくとも40μg、少なくとも45μg、少なくとも50μg、少なくとも55μg、少なくとも60μg、少なくとも65μg、少なくとも70μg、少なくとも75μg、少なくとも80μg、少なくとも85μg、少なくとも90μg、少なくとも95μg、もしくは少なくとも100μg)の1回以上の用量の本発明の1種以上の抗体を、それを必要とする被験体に投与すること；(b)特定の回数の用量の投与後に該被験体における投与された抗体の血漿レベルをモニターすること；ならびに(c)該被験体における投与された抗体の血漿レベルが0.1μg/ml未満、0.25μg/ml未満、0.5μg/ml未満、0.75μg/ml未満、もしくは1μg/ml未満である場合、その後の用量の本発明の抗体を投与することを含む前記方法を提供する。前記特定回数の用量は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12回の用量の有効量の1種以上の本発明の抗体であ
る。
【０２２８】
過増殖性疾患もしくは1種以上のその症候を予防、治療、管理、および／または軽減するのに用いられてきたか、もしくは現在用いられている、本発明の抗体以外の療法(例えば、予防剤もしくは治療剤)を、本発明の方法に従う1種以上の抗体と組合わせて投与して、過増殖性疾患もしくは1種以上のその症候を治療、管理、予防、および／または軽減することができる。本発明の組合せ療法において用いられる予防剤もしくは治療剤の用量は、過増殖性疾患もしくは1種以上のその症候を予防、治療、管理、および／または軽減するのに用いられてきたか、もしくは現在用いられているものよりも低い。過増殖性疾患もしくは1種以上のその症候の予防、治療、管理、または軽減に現在用いられている薬剤の推奨される用量を、限定されるものではないが、Hardmanら(編)、2001, Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics、第10版、Mc-Graw-Hill, New York; Physician’s Desk Reference (PDR)、第58版、2004, Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)などの当業界における任意の参考文献から取得することができる。
【０２２９】
様々な実施形態において、前記療法(例えば、予防剤もしくは治療剤)を、5分未満の間隔で、30分未満の間隔で、1時間間隔で、約1時間間隔で、約1〜約2時間間隔で、約2時間〜約3時間間隔で、約3時間〜約4時間間隔で、約4時間〜約5時間間隔で、約5時間〜約6時間間隔で、約6時間〜約7時間間隔で、約7時間〜約8時間間隔で、約8時間〜約9時間間隔で、約9時間〜約10時間間隔で、約10時間〜約11時間間隔で、約11時間〜約12時間間隔で、約12時間〜18時間間隔で、18時間〜24時間間隔で、24時間〜36時間間隔で、36時間〜48時間間隔で、48時間〜52時間間隔で、52時間〜60時間間隔で、60時間〜72時間間隔で、72時間〜84時間間隔で、84時間〜96時間間隔で、または96時間〜120時間間隔で投与する。特定の実施形態においては、2回以上の療法を、同じ患者訪問内に投与する。
【０２３０】
特定の実施形態においては、1種以上の本発明の抗体および1種以上の他の療法(例えば、予防剤もしくは治療剤)を、周期的に投与する。周期的療法は、一定期間の第1の療法(例えば、第1の予防剤もしくは治療剤)の投与、次いで、一定期間の第2の療法(例えば、第2の予防剤もしくは治療剤)の投与、必要に応じて、次いで、一定期間の第3の療法(例えば、予防剤もしくは治療剤)の投与など、およびこの連続的投与を反復すること、すなわち、1回の療法に対する耐性の発達を減少させ、1回の療法の副作用を回避するか、もしくは減少させ、ならびに／または該療法の効力を改善するための周期を含む。
【０２３１】
特定の実施形態においては、本発明の同じ抗体の投与を繰り返し、該投与の間隔を、少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2ヶ月、75日、3ヶ月、または少なくとも6ヶ月空けることができる。他の実施形態においては、本発明の抗体以外の同じ療法(例えば、予防剤もしくは治療剤)の投与を繰り返し、該投与の間隔を、少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2ヶ月、75日、3ヶ月、または少なくとも6ヶ月空けることができる。
【０２３２】
7.7 患者集団の選択
EphA2またはErbB2は、癌または前癌状態のマーカーとしても役立ち得る。本発明において、出願人は、癌状態においてはEphA2およびErbB2が互いに相互作用することを見出した。従って、一実施形態においては、本発明は、生物サンプルにおけるEphA2およびErbB2の存在、量または活性を検出し、必要に応じて、定量することにより、患者集団をスクリーニングもしくは選択する方法、癌もしくは前癌状態を診断する方法、または癌を段階分けする方法を提供する。本発明の診断方法を用いて、癌の初期診断を取得もしくは確認するか、または癌の局在化、癌転移、もしくは癌の予後に関する情報を提供することができる。特定の実施形態においては、EphA2およびErbB2の両方をスクリーニングし、検出するために最適化された診断キットを提供する。
【０２３３】
前記診断方法の一実施形態においては、組織、器官または体液などの生物サンプルを哺乳動物から取り出し、細胞を溶解し、溶解物をポリクローナルまたはモノクローナルEphA2および／またはErbB2抗体と接触させる。得られる抗体複合体は、それ自身検出可能であるか、または検出可能な複合体を形成する別の化合物と結合することができる。結合した抗体を、ELISAまたは同様のアッセイにおいて直接検出することができる；あるいは、診断剤は検出可能な標識を含んでもよく、検出可能な標識を当業界で公知の方法を用いて検出することができる。
【０２３４】
EphA2およびErbB2を、抗体などの検出可能に標識された診断剤の結合を介して検出する方法の実施形態において、標識としては、染料、蛍光標識および放射性標識が挙げられる。特に、最も一般的に用いられる色原体は、3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)および3,3'-ジアミノベンズイジンテトラヒドロクロリド(DAB)である。これらを、光学顕微鏡を用いて検出することができる。
【０２３５】
最も一般的に用いられる蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒドおよびフルオレスカミンである。ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンなどの化学発光化合物および生物発光化合物を用いることもできる。蛍光標識された抗体が適切な波長の光に曝露された場合、その蛍光によりその存在を検出することができる。
【０２３６】
本発明の抗体を標識するために特に有用である放射性アイソトープとしては、3H、125I、131I、35S、32P、および14Cが挙げられる。放射性アイソトープを、γカウンター、シンチレーションカウンターの使用などの手段により、またはオートラジオグラフィーにより検出することができる。
【０２３７】
抗体-抗原複合体を、様々な組織もしくは体液上でのウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、沈降、凝集、酵素免疫アッセイ(EIA)もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、免疫組織化学、in situハイブリダイゼーション、フローサイトメトリー、ならびに様々なサンドイッチアッセイを用いて検出することができる。これらの技術は当業界でよく知られている。例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許第5,876,949号を参照されたい。酵素免疫アッセイ(EIA)または酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)においては、酵素は、その後その基質に曝露された場合、該基質と反応し、例えば、分光測光手段、蛍光分析手段、または視覚的手段により検出することができる化学部分を生成する。抗体を検出可能に標識するのに用いることができる酵素としては、限定されるものではないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、δ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。抗体を標識および検出する他の方法は当業界で公知であり、本発明の範囲内にある。
【０２３８】
前記診断方法の別の実施形態においては、生物サンプルを、EphA2およびErbB2キナーゼ活性に関する生化学アッセイにかける。EphA2およびErbB2タンパク質をコードするDNAまたはRNAに結合する検出可能な試薬を用いることにより、検出を達成することもできる。
【０２３９】
EphA2およびErbB2を、生検した腫瘍組織などの様々な組織サンプルならびに血液、血漿、髄液、唾液、および尿などの様々な体液サンプル中の癌、前癌または転移性疾患のためのマーカーとして用いることができる。
【０２４０】
他の抗体をEphA2およびErbB2に結合する抗体と組合わせて用いて、癌の存在または非存在および疾患の状態に関するさらなる情報を提供することができる。例えば、ホスホチロシン特異的抗体の使用は、悪性腫瘍を決定、検出または評価するためのさらなるデータを提供する。
【０２４１】
7.8 治療的有用性の特性評価および証明
本発明の予防および／または治療プロトコルの毒性および効力を、例えば、LD50(集団の50％に対して致死的な用量)およびED50(集団の50％において治療上有効な用量)を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、それをLD50/ED50比として表すことができる。毒性的な副作用を示す予防剤および／または治療剤を用いてもよいが、そのような薬剤を罹患した組織の部位に標的化する送達系を設計して、感染していない細胞に対する損傷の可能性を最小化し、それによって、副作用を減少させるように注意を払うべきである。
【０２４２】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータを、ヒトにおける使用のための予防剤および／または治療剤の用量範囲を製剤化するのに用いることができる。そのような薬剤の用量は、毒性をほとんど有さないか、または全く有さないED50を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。前記用量は、用いられる剤形および用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化してもよい。本発明の方法において用いられる任意の薬剤について、治療上有効用量を、細胞培養アッセイから最初に見積もることができる。用量を動物モデルにおいて製剤化して、細胞培養物中で決定されたIC50(すなわち、症候の最大の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０２４３】
本発明に従って用いられる療法の抗癌活性を、SCIDマウスモデルもしくはマウスEphA2および／もしくはErbB2をヒトEphA2および／もしくはErbB2と置換したトランスジェニックマウス、ヒト異種移植片を有するヌードマウスまたは当業界で公知であり、Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, FiebigおよびBurger(編)); Contributions to Oncology (1999, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research (1991, BovenおよびWinograd(編)); ならびにAnticancer Drug Development Guide (1997、Teicher(編))(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載された任意の動物モデル(ハムスター、ウサギなど)などの癌の研究のための様々な実験動物モデルを用いることにより決定することもできる。
【０２４４】
本発明のプロトコルおよび組成物を、ヒトにおける使用の前に、所望の治療活性または予防活性について、in vitroで、次いで、in vivoで試験することができる。例えば、特定の治療プロトコルの投与が指示されるかどうかを決定するのに用いることができるin vitroアッセイとしては、患者の組織サンプルを培養物中で増殖させ、プロトコルに曝露するか、もしくはさもなければ投与し、組織サンプルに対するそのようなプロトコルの効果、例えば、EphA2のリン酸化／分解の変化、増殖の阻害もしくはその低下および／または軟寒天中のコロニー情報または三次元基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中の管状ネットワーク情報を観察する、in vitro細胞培養アッセイが挙げられる。接触した細胞のより低レベルの増殖もしくは生存は、治療剤が患者における症状を治療するのに有効であることを示す。あるいは、患者に由来する細胞を培養する代わりに、治療剤および方法を、腫瘍の細胞または悪性細胞系を用いてスクリーニングすることができる。当業界で標準的な多くのアッセイを用いて、そのような生存および／または増殖を評価することができる；例えば、細胞増殖を、3H-チミジンの取込みを測定することにより、直接的細胞計数により、癌原遺伝子(例えば、fos、myc)もしくは細胞周期マーカーなどの既知の遺伝子の転写活性の変化を検出することにより評価することができる；細胞の生存能力を、トリパンブルー染色により評価し、分化を形態変化、EphA2のリン酸化／分解の変化、増殖の低下および／または軟寒天中のコロニー情報または三次元基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中の管状ネットワーク情報などに基づいて視覚的に評価することができる。
【０２４５】
療法における使用のための化合物を、限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなど、例えば、上記の動物モデルなどの好適な動物モデル系において試験した後、ヒトにおいて試験することができる。次いで、前記化合物を好適な臨床試験において用いることができる。
【０２４６】
さらに、当業者には公知の任意のアッセイを用いて、癌の治療または予防のために、本明細書に開示された組合せ療法の予防的および／または治療的有用性を評価することができる。
【０２４７】
7.9 キット
本発明は、本発明の組成物を充填した1個以上の容器を含む医薬包装物またはキットを提供する。さらに、癌の治療にとって有用な1種以上の他の予防剤または治療剤を、医薬包装物またはキット中に含有させることもできる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の1種以上の成分を充填した1個以上の容器を含む医薬包装物またはキットも提供する。必要に応じて、そのような容器と共に、ヒトへの投与に関する製造、使用または販売の機関による認可を反映する、医薬品もしくは生物製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形態の通知書を含有させることができる。
【０２４８】
本発明はさらに、EphA2および／またはErbB2の検出に関連するスクリーニングおよび／または診断キットを提供する。特定の実施形態においては、本発明は、EphA2およびErbB2の両方を、連続的または同時的にスクリーニングし、検出するために最適化されたキットを提供する。
【０２４９】
本発明の特定の実施形態を説明のために上記のように記載してきたが、当業者であれば、詳細のいくつかの変更を、添付の特許請求の範囲に記載の本発明を逸脱することなく行うことができることを理解するであろう。
【０２５０】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み入れられると指示されたのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０２５１】
(実施例)
8. 実施例
ここで、本発明を以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、例示目的でのみ提供されるものであり、本発明はいかなる意味でもこれらの実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意かつ全ての変更を包含すると解釈されるべきである。
【０２５２】
8.1 実施例1
試薬：以下のタンパク質に対する抗体を用いた：EphA2 (Zymed Laboratories, Burlingame, CA; Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)、EphA4 (Upstate Biotechnology)、増殖性細胞核抗原 (PCNA; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)、抗Erk、抗ホスホトレオニン-202/チロシン-204 Erk、Akt、ホスホセリン-473 Akt (Cell Signaling Technology, Boston, MA)、抗チューブリン(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、ErbB2 (Neomarkers/Lab Vision Corporation, Fremont, CA)、抗βアクチン(Santa Cruz Biotechnology)、Ras (BD Biosciences)、RhoA (Santa Cruz Biotechnology; BD Biosciences)、von Willebrand因子(vWF; Zymed Laboratories, South San Francisco, CA)、E-カドヘリン(BD Biosciences)、Ki67 (Vision Biosystems Inc., Norwell, MA)、および正常ウサギIgG (Santa Cruz Biotechnology)。治療用抗EphA2(1C1)および対照(R347)抗体は、MedImmune, Inc. (Gaithersburg, MD)により提供されたものである。Raf-1 RBDアガロースRasアッセイ試薬を、Upstate Biotechnologyから購入した。5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)を、Sigma-Aldrichから購入した。BrdU検出およびApopTag Red In Situ Apoptosisキットを、それぞれ、Zymed LaboratoriesおよびChemicon/Millipore (Billerica, MA)から購入した。アビジンペルオキシダーゼ試薬をVector Laboratories (Burlingame, CA)から購入し、液体3,3'-ジアミノベンズイジンテトラヒドロクロリド(DAB)基質キットはZymed Laboratoriesから購入した。エフリン-A1-FcはR&D Systems (Minneapolis, MN)から購入した。エストロゲン、プロゲステロン、インスリン、および上皮増殖因子(EGF)は、Sigma-Aldrichから購入した。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドールジヒドロクロリド(DAPI)を、Sigma-Aldrichから購入した。TO-PRO-3インドール核株、CellTrackerオレンジCMTMRおよびCellTrackerグリーンCMFDA染料を、Molecular Probes (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)から購入した。増殖因子を減少させたMatrigelを、BD Biosciencesから購入した。AG825 ErbB2キナーゼ阻害剤を、Calbiochem (EMD Biosciences, San Diego, CA)から購入した。活性なRhoA(Q63L)およびErk-1を構成的に発現する組換えアデノウイルスを、それぞれ、Cell Biolabs (San Diego, CA)およびVector Biolabs (Philadelphia, PA)から購入した。β-ガラクトシダーゼを発現する対照アデノウイルスおよびEphA2を発現するアデノウイルスは、以前に記載されている(Brantley-Siedersら、2004; ChengおよびChen, 2001)。
【０２５３】
マウスおよびin vivo腫瘍試験：全ての動物を、病原体を含まない条件下で飼育し、実験をAAALACガイドラインおよびVanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committeeの認可に従って実施した。EphA2欠損マウスを、5〜7世代に渡ってFVB動物と戻し交配した後、同系交配のFVBバックグラウンド[Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME; (Guyら、1992a; Guyら、1992b)]上でMMTV-NeuまたはMMTV-PyV-mTマウスと交配させた。ephA2について野生型、ヘテロ接合型、またはヌル型であるMMTV-NeuまたはMMTV-PyV-mT陽性トランスジェニック動物(Brantley-Siedersら、2004b)を、以下のプライマー：5'-GGG TGC CAA AGT AGA ACT GCG-3' (フォワード) (配列番号1)、5'-GAC AGA ATA AAA CGC ACG GGT G-3' (ネオ) (配列番号2)、5'-TTC AGC CAA GCC TAT GTA GAA AGC-3' (リバース) (配列番号3)を用いて、尾生検に由来するゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)分析により同定した。neuおよびPyV-mTトランスジーンを、Jackson Laboratoriesにより推奨されたプライマーおよび条件を用いるPCRにより検出した。月齢を一致させた同腹子を、毎週触診することにより腫瘍形成についてモニターした。
【０２５４】
腫瘍および肺を、誕生の8ヶ月後および1年後に、MMTV-Neu半接合体、EphA2 +/+、+/-、および-/-動物の2つのコホートから回収した。腫瘍および肺を、誕生の100日後に、MMTV-PyV-mT半接合体、EphA1 +/+、+/-、および-/-動物から回収した。腫瘍を数え、キャリパーにより寸法を測定した。腫瘍体積を、以下の式：体積＝長さ x 幅 2 x 0.52を用いて算出した(Bergersら、2000)。肺を固定し、脱水し、表面転移を数えた。移植試験のために、3週齢のレシピエントEphA2 +/+またはEphA2 -/- FVB雌動物の左鼠径部乳腺脂肪体を、以前に記載のように(Brantleyら、2001)、内因性上皮から除去し、MMTV-Neu (Muraokaら、2003)またはMMTV-PyV-mT (Muraoka-Cookら、2004)動物に由来する106個の腫瘍細胞を注入した。得られる腫瘍を、分析のために注入の4〜5週間後に回収した。指示される場合、腫瘍細胞注入の2週間後に開始して、レシピエントマウスは、原発腫瘍の回収および分析の前に、1C1抗EphA2抗体または対照IgG(3週間に渡って、週に2回、10 mg/kg)の腹腔内注入を受けた。少なくとも10匹の動物／条件を、2〜3回の独立した実験において分析した。
【０２５５】
組織学的分析：乳腺および腫瘍を、指示された時点で回収し、4℃で24時間、10％中性緩衝化ホルマリン(Fisher Scientific, Hampton, NH)中で固定した。乳腺の全載ヘマトキシリン染色ならびに7 mmの乳腺組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色を、以前に記載のように実施した(Brantleyら、2001)。EphA2免疫組織化学のために、抗原回収を、クエン酸バッファー中で沸騰させることにより実施し、切片を以前に記載のように(Brantleyら、2002)、5 mg/mlのウサギ抗EphA2抗体(Zymed Laboratories)を用いてプローブ化した。PCNAのための免疫組織化学染色を、以前に記載のように実施し(Brantleyら、2002)、合計核と比較したPCNA陽性核の平均割合(％)を算出することにより定量した(遺伝子型あたり34個の独立した乳腺および腫瘍サンプルの4つの無作為な20Xフィールド)。アポトーシスアッセイを、製造業者のプロトコルに記載のようにApoptag red in situアポトーシス検出キットを用いて実施した。アポトーシスを、合計核と比較したTUNEL陽性核の平均割合(％)として算出した(遺伝子型あたり34個の独立した乳腺および腫瘍サンプルの4つの無作為な20Xフィールド)。ホスホ-Erkを、Cell Signaling Technologyのプロトコルに記載のようにウサギモノクローナル抗P-Erk抗体クローン20G11を用いて組織切片中で検出した。von Willebrand因子(vWF)に関する比色免疫組織化学染色を、Vanderbilt University Immunohistochemistry Core Facilityにより実施し、免疫蛍光染色を、以前に記載のように実施した(Brantley-Siedersら、2005)。微小血管密度を、少なくとも4個の腫瘍／遺伝子型の4個の無作為な20Xフィールド／サンプル中のvWF陽性血管の数を数えることにより決定した。ErbB2免疫組織化学を、5 mg/mlのウサギ抗ErbB2抗体(Neomarkers/Lab Vision Corporation)を用いて抗EphA2について上記のように実施した。
【０２５６】
細胞培養：一次乳腺上皮細胞(PMEC)を、以前に記載のように(Brantleyら、2001; Muraokaら、2002)、マウスから単離し、PMEC培地[増殖因子を減少させたMatrigel(1/20希釈)でコーティングされた組織培養皿上で、5 ng/mlエストロゲン、5 ng/mlプロゲステロン、5 ng/ml EGF、および5 mg/mlインスリン(全てSigma-Aldrichから購入)を補給したDMEM/F12培地(Mediatech, Herndon, VA)]中で維持した。一次腫瘍細胞を、以前に記載のように(Muraokaら、2003)、野生型またはEphA2欠損MMTV-Neu動物から誘導した。簡単に述べると、腫瘍組織を、PMEC消化培地(Brantleyら、2001; Muraokaら、2002)中に分散させた。細胞をペレット化し、DMEM/F12 + 10％ウシ胎仔血清(Hyclone, Logan, UT)を用いて洗浄し、無血清培地中で数回洗浄し、PMEC培地中に入れた。細胞懸濁液を3日間、24時間毎に組織培養皿上に連続的に塗布し、腫瘍細胞を回収し、塗布の3日目から増殖させた。培養物中の腫瘍細胞の富化を、neuトランスジーンの発現により検証した(Muraokaら、2003)。移植およびシグナリング試験において用いられるMMTV-Neu腫瘍由来細胞系(Muraokaら、2003)およびMMTV-PyV-mT腫瘍由来細胞系(Muraoka-Cookら、2004)を、PMEC培地中で培養した。EphA2分解試験のために、腫瘍細胞を、48時間、指示された濃度で1C1抗EphA2抗体または対照IgG(MedImmune)の存在下で培養した後、免疫ブロット分析のために溶解物を回収した。in vitroでの増殖およびアポトーシス分析を、上記のBrdUおよびTUNEL検出キットを用いて、以前に記載のように(Brantleyら、2002; Muraokaら、2002)実施した。レスキュー実験のために、BrdUアッセイの48時間前に、EphA2欠損Neu一次腫瘍細胞を、Erk-1または対照β-ガラクトシダーゼを発現する1 x 108 pfu/mlのアデノウイルスを用いて形質導入した。レスキュー実験のために、トランスウェルアッセイの48時間前に、活性なRhoA(Q63L)または対照β-ガラクトシダーゼを構成的に発現する1 x 108 pfu/mlのアデノウイルスを用いて形質導入した。腫瘍-内皮細胞同時培養移動アッセイを、以前に記載のように実施した(Brantley-Siedersら、2005; Brantley-Siedersら、2006)。
【０２５７】
マウスEphA2に関するsiRNAまたは無関係の対照配列を、pRetroSuperウイルスベクター中にクローニングし、これを用いて以前に記載のように(Brantley-Siedersら、2006; Brummelkampら、2002)MMTV-Neu腫瘍細胞の感染のためのレトロウイルスを作製した。以下の配列を用いてEphA2を標的化した：siRNA#1 5'- GCCAAAGTAGAACTGCGTT (1140-1158)-3' (配列番号4); siRNA#2 5'-GCGCTAGACAAGTTCCTTA (2211-2229)-3' (配列番号5); 対照siRNA 5'-GCACCAGTTCAGCAAGACT -3' (配列番号6)。三次元球状培養物を、以前に記載のように確立した(Debnathら、2003)。培養物を8日間維持した後、写真に記録した。デジタル画像を、Image Jソフトウェア(National Institutes of Health)を用いて、4個の無作為なフィールド、3個の培養物／フィールド中で球状培養物についてスコア化した。共焦点画像化のために、球状培養物を、10％中性緩衝化ホルマリン中で固定し、E-カドヘリンについて免疫組織化学にかけた後、以前に記載のように(Spancakeら、1999)、TO-PRO-3を用いる核染色を行った。腫瘍細胞を、上記のようにレシピエントFVBマウスの除去された脂肪体に移植した。少なくとも10匹の動物／条件を2〜3回の独立した実験において分析した。
【０２５８】
親MCF10AおよびヒトErbB2/Her2を安定に過剰発現するMCF10A細胞を、以前に記載のように維持した(Uedaら、2004)。三次元球状培養物を、以前に記載のように確立した(Debnathら、2003)。細胞を、分析の48時間前に、EphA2または対照β-ガラクトシダーゼを構成的に発現する1 x 108 pfu/mlのアデノウイルスを用いて形質導入した。共焦点分析のための染色を上記のように実施した。
【０２５９】
免疫沈降および免疫ブロット分析：EphA2の免疫沈降および免疫ブロットを、以前に記載のように実施した(Brantleyら、2002)。1 mgのウサギ抗ErbB2 + 1 mgのマウス抗ErbB2 Ab-17 (Neomarkers/Lab Vision Corporation)を用いて、ErbB2を免疫沈降させた。指示された場合、250,000個のPMEC(ウェスタンブロットのため)または250万個の一次腫瘍細胞(GTP-RasおよびRho/Racプルダウンアッセイのため)を、DMEM:F12培地 + 2％FBS中で一晩培養した。細胞を±エフリン-A1-Fc、またはEphA2-アゴニストモノクローナル抗体1C1で、指示された用量および時間で処理した。溶解物を回収し、以前に記載のように(Brantleyら、2002)、免疫ブロット分析のために用いた。濃度測定分析を、NIH Image Jソフトウェアを用いて実施した。
【０２６０】
RasおよびRho/Racプルダウンアッセイのために、腫瘍組織を回収し、重量を計測し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で機械的にホモジェナイズし、沈降化させ、製造業者により推奨されるアッセイバッファー(Upstate Biotechnology)中に再懸濁した。アッセイあたり約500 mgの腫瘍溶解物を用いた。製造業者のプロトコルに記載のように、Raf-1 Ras結合ドメイン-GSTアッセイ試薬(Upstate Biotechnology)を用いて、Rasアッセイを実施した。Rhoアッセイを、以前に記載のように(Fangら、2005)、Rhotekin結合ドメイン-GST試薬を用いて実施した。いくつかの同時免疫沈降アッセイのために、COS7細胞を、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いて、それぞれ1 mgのmyc-タグ付erbB2(pcDNA3-erbB2)およびephA2(pcDNA3-EphA2)で同時トランスフェクトした。細胞を1％NP-40バッファー(10 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl、2 mM EDTA、1％NP-40 + 50 mMプロテアーゼ阻害剤)中で溶解した。溶解物を、抗myc (Sigma-Aldrich)および抗EphA2抗体 (Santa Cruz, sc-924)抗体を用いる免疫沈降に用いた。免疫複合体をSDS-PAGE上で分解し、抗EphA2および抗myc抗体を用いてウェスタンブロットした。EphA2をMMTV-Neu細胞から免疫沈降した後、1 mMの架橋剤DTSSPでサンプルの半分を処理した。免疫沈降物を、抗ErbB2を用いるウェスタンブロット分析にかけた(Neomarkers, 1:2000)。EphA2およびErbB2を、上記のようにMCF10AおよびMCF10A.HER2細胞から免疫沈降させた。指示された場合、細胞を10 mg/mlのAG825 ErbB2キナーゼ阻害剤と共にインキュベートし、24または48時間後に免疫沈降させた。
【０２６１】
結果
EphA2欠損性はMMTV-Neuマウスにおける乳腺上皮過形成、腫瘍原性、転移、および血管動員を抑制する
野生型、ヘテロ接合型、またはEphA2欠損性であるMMTV-Neu陽性雌マウスを作製し、腫瘍形成についてモニターした。乳腺組織および／または腫瘍を、誕生の8ヶ月後および1年後に、2つのコホートの動物から回収した。野生型およびヘテロ接合型対照と比較して、EphA2欠損性MMTV-Neu雌マウスは、2〜3倍低下した頻度で、乳腺の上皮過形成および腫瘍を生じた(図1A)。全載および組織学的分析により、対照と比較して、EphA2欠損性MMTV-Neu腺に関する乳腺上皮過形成および上皮細胞含量の低下が示された(図1C)。野生型において腫瘍を生じた動物対EphA2欠損MMTV-Neu動物に関する潜伏期における有意な変化は観察されなかったが、野生型対EphA2欠損動物における腫瘍体積のほぼ3倍の減少が観察された。しかしながら、野生型およびヘテロ接合対照は、EphA2欠損動物と比較してより高い全体の腫瘍組織量を示したが、それらは誕生の1年後に2種以上の腫瘍を生じたが、EphA2欠損動物は1種の腫瘍のみを生じた。さらに、乳腺上皮は、30％のEphA2欠損MMTV-Neu乳腺において乳腺脂肪体に浸透できなかった(図9A)。
【０２６２】
EphA2欠損対野生型MMTV-Neu乳腺の上皮内の前悪性変化を試験するために、本発明者らは、それぞれ、増殖している細胞核抗原(PCNA)の染色およびTUNELアッセイにより組織切片中で増殖およびアポトーシスを評価した。EphA2 -/-対EphA2 +/+ MMTV-Neu乳腺上皮における上皮細胞増殖の5.5倍の減少が観察されたが、アポトーシスレベルは影響されなかった(図1D)。増殖欠損が乳腺上皮対周囲の宿主組織におけるEphA2欠損性に起因したかどうかを決定するために、野生型またはEphA2欠損動物から単離された精製された一次乳腺上皮細胞(PMEC)中での増殖およびアポトーシスを分析した。BrdUの組込みにより測定されるように、増殖は、野生型対照と比較して血清刺激EphA2欠損細胞中でほぼ3倍低下し(図1E)、増殖に対するEphA2を介する効果は、少なくとも部分的には、上皮細胞にとって内在性であることを示唆している。興味深いことに、in situでの乳腺上皮と違って、EphA2欠損PMEC対野生型細胞に関するアポトーシスのさらに適度に有意な増加が観察された(図1E)。同時に、これらのデータは、EphA2の喪失はErbB2により開始される乳腺上皮細胞過形成を阻害することを示している。
【０２６３】
実際に腫瘍を生じたEphA2欠損動物のうち、潜伏期の有意な変化は観察されなかった。しかしながら、野生型対照と比較して、EphA2欠損動物における腫瘍体積のほぼ3倍の低下が検出された。さらに、対照動物は誕生の1年後に2種以上の腫瘍を生じたが、EphA2欠損動物は1種のみの腫瘍を生じたため、野生型およびヘテロ接合対照は、EphA2欠損マウスと比較して、より高い全体の腫瘍組織量を示した。EphA2タンパク質発現は乳腺上皮細胞およびMMTV-Neu野生型雌における関連する血管中で検出されたが、EphA2タンパク質発現はEphA2欠損MMTV-Neuマウスに由来する組織中では検出されなかった(図9B)。MMTV-Neu腫瘍におけるErbB2の発現レベルおよび局在化は、EphA2欠損性により影響されなかった(図9C、図4C)。1年の年齢で、EphA2欠損MMTV-Neuマウスから回収された肺は、EphA2野生型またはヘテロ接合対照と比較して、表面転移の数のほぼ5倍の減少を示した(図1B)。さらに、転移の全体の頻度は、野生型およびヘテロ接合対照と比較してEphA2欠損動物において低下した(図1A)。
【０２６４】
誕生の8ヶ月後にそれぞれの遺伝子型から回収された腫瘍の組織学的試験は、in situでの両方の癌の主に良好に制限された増殖および境界に浸潤するよりもむしろ、境界を押す侵襲的癌の結合した病巣を開示した。より侵襲的な癌が、誕生の1年後の動物から回収された腫瘍において観察された。EphA2欠損MMTV-Neuマウスから単離された腫瘍は、より多い領域の嚢胞性変化および異なる内腔形成を示し、これは野生型MMTV-Neu腫瘍に認められる濃密な、固形シート様の増殖パターンと比較して、より分化した表現型と一致していた(図1F)。腫瘍組織のPCNA染色は、野生型腫瘍と比較して、EphA2欠損MMTV-Neu腫瘍の増殖におけるほぼ2倍の減少を示した(図1G)。腫瘍微小血管を、von Willebrand Factor (vWF)に対する免疫組織化学染色により評価したところ、EphA2発現の喪失が微小血管密度の有意な低下(2.9倍)と関連していることが示された(図1H)。アポトーシスのレベルは、対照と比較してEphA2欠損MMTV-Neu腫瘍において変化しなかった。
【０２６５】
EphA2は、MMTV-Neu腫瘍における血管動員にとって宿主微小環境において必要である
本明細書に提供されるデータは、EphA2欠損性がMMTV-Neu乳腺における上皮増殖を抑制することを示唆しているが、以前のデータは、EphA2が腫瘍血管形成にとって必要であることを示唆している[(Brantley-SiedersおよびChen, 2004)に概説されている]。実際、MMTV-Neu/EphA2欠損腫瘍においては、腫瘍血管形成の減少が観察された(図1H)。腫瘍微小血管密度の欠損が宿主組織対腫瘍細胞におけるEphA2欠損性から生じるかどうかを決定するために、野生型MMTV-Neu腫瘍細胞(Muraokaら、2003)を、同系野生型またはEphA2欠損FVB宿主動物の除去された脂肪体に同所移植した。EphA2欠損宿主に移植された野生型腫瘍細胞は、野生型宿主に移植されたものよりも有意に小さい腫瘍を生成した(図10A)。EphA2欠損レシピエント対野生型対照レシピエントから単離された腫瘍の微小血管密度の7倍の低下が観察された(図10B)。これらのデータと一致して、EphA2欠損動物から単離された微小血管内皮細胞は、野生型対照動物から単離された内皮細胞により示される強固な移動応答と比較して、同時培養アッセイにおいてMMTV-Neu腫瘍細胞に対する移動応答の顕著な低下を示した(図10C)。同時に、これらのデータは、EphA2シグナリングが、腫瘍原性および血管内皮などの腫瘍微小環境と、腫瘍柔組織内の両方における異なるプロセスを介する進行を促進することを示唆している。
【０２６６】
EphA2発現の喪失は、MMTV-Neu腫瘍細胞における腫瘍形成および侵襲性を弱める
EphA2欠損性が腫瘍原性に先行する内因性MMTV-Neu腫瘍内での腫瘍原性および進行におけるEphA2機能の分析に加えて、本発明者らは、確立された腫瘍細胞中でのEphA2発現を減少させる効果を試験することを望んだ。MMTV-Neu腫瘍に由来する確立された細胞系におけるRNAiノックダウン戦略を用いた(Muraokaら、2003)。図2Aに示されるように、2つの独立したsiRNA配列の安定な発現は、親細胞および対照siRNAを発現する細胞と比較して、MMTV-Neu細胞におけるEphA2発現を有意に低下させた。EphA2発現が減少した細胞のプールされた集団は、親細胞または対照siRNAを発現する細胞よりも遅い増殖速度を示した(データは示さない)。減少した増殖速度と一致して、EphA2発現の阻害は、EphA2 siRNAクローン中での、MMTV-Neuモデル[(Eccles, 2001)に概説されている]における増殖の公知の調節因子であるリン酸化されたErkのレベルを減少させた(図2A)。ヒトMCF10A細胞の三次元培養物に対するErbB2活性の効果の以前の記載(Muthuswamyら、2001)と一致して、親MMTV-Neu細胞および対照siRNAで形質導入された細胞は、大きな、多腺房構造を形成し、三次元Matrigel培養物中で管腔を形成できなかった。対照的に、EphA2発現の減少は、三次元培養物中でのMMTV-Neu細胞のErbB2/Neuにより駆動される多腺房表現型を弱めた。その代わりに、これらの細胞は、中央管腔の周囲の上皮細胞を含む小さく、組織化された腺房を主に形成した(図2Bおよび2C)。さらに、対照細胞により形成された個々の三次元コロニーのサイズは、EphA2発現が低下した細胞よりも3〜4倍高かった(図2B)。MMTV-Neu親細胞または対照siRNAを発現する細胞は、FVBレシピエント雌マウスの除去した脂肪体に同所移植された場合、腫瘍を形成したが、EphA2発現が減少したMMTV-Neu細胞は、少数の動物において非常に小さく、触診不可能な腫瘍を形成した(図2D)。これらのデータは、EphA2活性が、ErbB2/Neu癌遺伝子の状況において、腫瘍細胞に内在的な増殖および侵襲性にとって必要である。
【０２６７】
EphA2発現の上昇は、ヒトErbB2/HER2を過剰発現するMCF10A細胞の増殖および侵襲性を増加させる
EphA2がErbB2を介する増殖および侵襲性を増強するかどうかを決定するために、本発明者らは、アデノウイルス形質導入により、形質転換されていないMCF10Aヒト乳腺上皮細胞と、ErbB2、HER2のヒト相同体を安定に発現するMCF10A細胞(Uedaら、2004)の両方においてEphA2を過剰発現させた。以前の研究と一致して(Zelinskiら、2001)、三次元Matrigel培養物中でのコロニーサイズの増加が観察されたため、EphA2の過剰発現は、増殖を増強した(図3A)。親MCF10Aと比較して、HER2を過剰発現する細胞は、より大きい多腺房構造を形成したが、三次元Matrigel培養物中で管腔を形成することができず(図3A)、これは以前の報告(Muthuswamyら、2001；Uedaら、2004)と一致していた。MCF10A.HER2細胞におけるアデノウイルス形質導入によるEphA2の過剰発現は、形質導入されていない対照またはAd-β-ガラクトシダーゼウイルスで形質導入された細胞と比較して、個々のコロニーのサイズの2倍の増加をもたらした(図3A)。さらに、共焦点顕微鏡により評価されるように、EphA2の過剰発現の際にMCF10AおよびMCF10A.HER2により形成された腺房構造における管腔を充填し、侵襲性の突起の増加が存在していた(図3B)。核Ki67の定量により、MCF10AおよびMCF10A.HER2細胞におけるEphA2の過剰発現が、対照細胞において観察されるレベルと比較してほぼ3倍、増殖を増加させることが示された(図3B)。MCF10A.HER2細胞におけるHER2の過剰発現、ならびにアデノウイルス遺伝子産物の発現を、免疫ブロットにより確認した(図4C)。これらのデータは、EphA2過剰発現が、乳腺上皮の増殖および侵襲を促進するのに十分であり、ErbB2/HER2により誘導される増殖および侵襲を増加させることを示唆している。
【０２６８】
EphA2はRas/MAPKおよび腫瘍細胞増殖の活性化を促進する
増殖を調節する腫瘍細胞に対して内在的である特異的EphA2シグナリング事象を試験するために、一次MMTV-Neu腫瘍細胞(PMTC)を、EphA2欠損マウスおよび野生型対照から精製した。EphA2欠損PMTCは、EphA2欠損PMECにおいて認められる増殖の低下と同様(図1Eを参照)、野生型細胞におけるものと比較して増殖の低下を示した(図4A)。EphA2欠損PMTCの増殖低下は、ホスホ-Erkと活性なGTP結合Rasのレベルの減少と共に起こった(図4B)。EphA2欠損腫瘍細胞におけるEphA2タンパク質発現は検出されなかった(図4B)。しかしながら、EphA2欠損動物対野生型対照から誘導された腫瘍細胞におけるNeu/ErbB2タンパク質発現およびリン酸化の比較可能なレベルが観察されたが(図4B)、これは、EphA2がErbB2の発現または活性を調節しないことを示唆している。リガンド刺激の非存在下での血清欠乏野生型PMTCにおけるEphA2リン酸化は、ErbB2がEphA2の活性を調節し得ることを示唆している(図4B)。同様に、野生型MMTV-Neuマウスに由来する腫瘍と比較して、EphA2欠損動物に由来する全腫瘍溶解物におけるErkおよびRasの活性の実質的な低下が存在していた(図4C)。本発明者らはまた、野生型対照から単離されたPMECと比較して、血清欠乏EphA2欠損PMECにおけるリン酸化Erkの基底レベルの減少を観察した(図11A)。さらに、ホスホ-Erkは免疫組織化学によりEphA2欠損乳腺上皮において検出可能ではなかったが、核染色および細胞質染色が対照組織に存在していた(図11B)。対照的に、本発明者らは、本発明者らの実験条件下で、野生型対照と比較してEphA2欠損細胞においてホスホ-src、ホスホ-stat5、またはホスホ-PLCgのレベルのいかなる有意な変化も検出しなかったが、これはRas/Erkシグナリングの調節が、EphA2がNeuに媒介される腫瘍増殖に影響する一次機構であることを示唆している。この結論の支持において、外因性Erk-1の過剰発現は、対照β-ガラクトシダーゼを発現する細胞と比較して、EphA2欠損PMTCにおける増殖欠損をレスキューした(図4D)。これらのデータは、EphA2がMMTV-Neu腫瘍細胞におけるErk活性の腫瘍細胞増殖上方調節を促進することを示唆している。
【０２６９】
EphA2はRhoA GTPaseの活性化を介する腫瘍細胞移動を促進する
EphA2が腫瘍転移を促進する機構を分析するために、EphA2欠損性の状況においてMMTV-Neu腫瘍細胞の運動性を、トランスウェル移動アッセイを用いて分析した。血清刺激に応答する野生型腫瘍細胞と比較して、EphA2欠損MMTV-Neu腫瘍細胞の移動の1.5倍の低下が存在していた(図5A)。Rhoファミリーの小さいGTPaseの発現および活性は細胞移動を調節するシグナリング経路の不可欠な成分であるため、本発明者らはEphA2がRho依存的機構を介して腫瘍細胞の運動性を調節するかどうかを決定することを望んだ。活性なGTP結合RhoAのレベルの減少が、野生型対照と比較して、EphA2欠損腫瘍および精製されたEphA2欠損PMTCの両方に存在していた(図5B)。EphA2欠損腫瘍細胞はまた、総RhoAタンパク質発現の低下を示した。対照的に、本発明者らの実験条件下で、活性化されたRac1のレベルの検出可能な変化は存在しなかった。RhoAの活性化はEphA2依存的細胞移動を媒介するかどうかを決定するために、本発明者らは、EphA2欠損MMTV-Neu腫瘍細胞中で構成的に活性なRhoAを発現した。β-ガラクトシダーゼを発現する対照アデノウイルスからの発現はEphA2欠損PMTC中での移動に対する効果を有していなかったが、外因性の活性化されたRhoAの発現は野生型対照細胞と同様のレベルまで移動を回復させた(図5C)。これらの知見は、RhoA活性化が、EphA2により媒介される腫瘍細胞移動に寄与することを示唆している。
【０２７０】
また、RhoAなどのRhoファミリーのGTPaseは細胞周期進行を調節することが示されているため(Olsonら、1995; Welshら、2001)、本発明者らはまた、構成的に活性なRhoAがEphA2欠損腫瘍細胞における増殖欠損をレスキューすることができるかどうかを調査した。構成的に活性なRhoAの発現はEphA2欠損PMTCにおける増殖をレスキューしなかったが、これは、RhoA活性化が増殖よりもむしろEphA2を介する腫瘍細胞移動に特に寄与することを示唆している。逆に、Ras/MAPK活性が細胞移動に影響することができるかどうかを決定するために、本発明者らはEphA2欠損腫瘍細胞中でErk-1を過剰発現させた。Erk-1の過剰発現の際にEphA2欠損PMTCの移動の変化は観察されなかったが、これは、ErbB2/EphA2を介する腫瘍進行の状況における独立したシグナリング経路を介する増殖および運動性の調節を示している。
【０２７１】
EphA2はErbB2と物理的かつ機能的に相互作用する
EphA2がNeu/ErbB2により媒介される増殖および侵襲性を調節する分子機構を調査するために、生化学的研究を行って、両方のタンパク質を過剰発現するCOS7細胞中でのEphA2とErbB2の間ならびにMMTV-Neu由来一次腫瘍細胞(PMTC)中の内因性タンパク質の間の物理的相互作用を評価した。EphA2およびErbB2のヒトアイソフォームを過剰発現するCOS7細胞に由来する溶解物中、EphA2免疫沈降物中のErbB2/Neuの存在を検出し、同様にErbB2/Neu免疫沈降物中のEphA2の存在を検出した(図6A)。PMTCに由来する内因性タンパク質の同時免疫沈降分析により、ErbB2がEphA2と複合体を形成することが確認された(図6B)。PMTCおよびCOS7細胞の両方において、EphA2およびErbB2は高レベルで発現され、EphA2/ErbB2相互作用はリガンド刺激の非存在下でも構成的に起こった(図6C)。驚くべきことに、COS7細胞におけるErbB2とEphA2の同時発現は、リガンドまたは血清刺激の非存在下でEphA2のチロシンリン酸化を誘導するのに十分であった(図6C)。同様に、EphA2リン酸化の上昇が、親MCF10A細胞と比較して、ヒトHER2/ErbB2を過剰発現するMCF10A細胞において観察された(図6D)。COS7細胞中での同時発現データと一致して、ErbB2キナーゼ阻害剤を用いる治療は、MCF10A.HER2細胞中でのEphA2リン酸化ならびにHER2リン酸化を減少させた(図6D)。ErbB2とEphA2との物理的相互作用およびErbB2の下流のシグナリング経路の最大活性化のためのEphA2発現の機能的要求に関する証拠を考慮すれば、これらのデータは、EphA2がErbB2シグナリングに関与することを示唆している。
【０２７２】
EphA2欠損性はMMTV-PyV-mTトランスジェニック動物における腫瘍進行、血管新生、または転移に対して影響しなかった
Ras/MAPK経路に依存的でもある乳腺腫瘍原性の独立した内因性モデルにおけるEphA2機能を評価するために、野生型、ヘテロ接合型、またはEphA2欠損性である、MMTVプロモーターの制御下でポリーマウイルスミドルT抗原を発現するMMTV-PyV-mTマウスを作製した。純潔の雌マウスを、100日間、腫瘍形成についてモニターした。MMTV-PyV-mTモデルにおけるEphA2欠損性の喪失が確認されたにも関わらず(図7B、D)、EphA2欠損性は腫瘍形成の速度(データは示さない)、腫瘍体積、または表面肺病変の数、または微小血管密度に影響しなかった(図7A、C)。さらに、野生型対EphA2欠損マウスから誘導されたMMTV-PyV-mT腫瘍においては、総Ras、活性なGTP結合Ras、ホスホ-Erk、または総Rhoのレベルにおける差異は存在しなかった(図7D)。これらの知見は、驚くべきことに、MMTV-Neuモデルにおいて観察されたEphA2欠損性の効果とは対照的である。これらのデータは、EphA2がMMTV-PyV-mTモデルにおいて腫瘍原性、進行、および血管に影響せず、EphA2の喪失も、MMTV-Neuモデルにおける類似する経路に対して、このモデルにおける腫瘍進行のこれらの態様に寄与する多くのシグナリング経路に影響しないことを示唆している。
【０２７３】
FVB雌マウスから単離された正常な乳腺組織、MMTV-NeuおよびMMTV-PyV-mT腫瘍組織、ならびにMMTV-NeuおよびMMTV-PyV-mT動物の両方に由来するPMECおよびPMTCにおけるEphA2の発現および活性化も評価した。EphA2は、正常な乳腺組織と比較して、MMTV-NeuおよびMMTV-PyV-mTモデルの両方から誘導された腫瘍組織において過剰発現され、リン酸化される。さらに、エフリン-A1リガンドの発現は、正常な乳腺組織と比較して両方のモデルに由来する腫瘍溶解物中で上昇したが、エフリン-A1のレベルは野生型およびEphA2欠損腫瘍溶解物中で同等であった(図7E、D)。しかしながら、注目すべきことに、総EphA2およびリン酸化されたEphA2の両方のレベルは、MMTV-PyV-mT腫瘍と比較して、MMTV-Neu腫瘍においてより高かった(図7E)。EphA2過剰発現は、PMEC中のレベルと比較した場合、PMTC中の腫瘍上皮において特異的に検出された(図7F)。
【０２７４】
ErbB2過剰発現はMMTV-PyV-mT腫瘍において報告され(Linら、2003)、本発明者らの腫瘍溶解物中で観察されたが、MMTV-Neu腫瘍は、より高いレベルのErbB2過剰発現を示した(図7E)。これらのデータは、EphA2発現の増加が、ErbB2シグナリング経路が腫瘍中で増幅される機構であり得ることを示唆している。
【０２７５】
抗EphA2療法はMMTV-Neu腫瘍モデルにおいて効力を示す
MMTV-Neu腫瘍がin vivoで標的化された抗EphA2療法に対して応答するかどうかを決定するために、野生型Neu腫瘍細胞を、野生型FVBレシピエント動物の除去した脂肪体に移植した。移植の2週間後、動物に、分解のためにマウスEphA2を標的化する対照IgGまたは抗EphA2抗体を3週間に渡って週に2回腹腔内注射した(図8A)。関連する受容体EphA4の発現はMMTV-NeuおよびMMTV-PyV-mT動物から誘導された抗体で処理された腫瘍細胞において影響されなかったため、抗EphA2抗体はEphA2を特異的に標的化した(図8A)。抗EphA2で処理された動物から回収されたMMTV-Neu腫瘍は、IgGで処理されたマウスから単離された腫瘍と比較して、腫瘍体積の3倍の低下を示した(図8B)。さらに、腫瘍細胞増殖は、核PCNA染色を定量することにより決定されたように、対照と比較して抗EphA2処理された動物において有意に低下した(図8C)。予測されたように、EphA2タンパク質レベルは、免疫組織化学および免疫ブロットにより評価されたように、対照IgG処理された腫瘍と比較して抗EphA2処理された腫瘍において有意に低下したが(図8D)、EphA2発現の下方調節は抗EphA2処理された腫瘍におけるErbB2の発現に影響せず、対照IgG処理も腫瘍におけるErbB2発現に影響しなかった(図12A)。対照IgGで処理された動物と比較して、抗EphA2で処理された動物から回収された腫瘍における微小血管密度の有意な低下が観察された(図8E)。これらの結果と対照的に、抗EphA2処理は、抗EphA2で処理された腫瘍におけるEphA2タンパク質のレベルが下方調節されるにも関わらず、MMTV-PyV-mT腫瘍を移植された動物における腫瘍体積(図8F)または微小血管密度(図12B)に対する効果を有さなかった(図12C)。これらのデータは、抗EphA2療法の効力が、腫瘍進行が起こる癌遺伝子状況に依存するが、MMTV-PyV-mT腫瘍を担持する動物の治療は、両方の腫瘍モデルにおけるEphA2過剰発現にも関わらず、MMTV-Neu腫瘍を担持するマウスと同様、腫瘍進行に影響しないことを示唆している。
【０２７６】
本発明の特定の実施形態を説明のために上記してきたが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく、いくつかの詳細の変更を行うことができることが当業者には理解されるであろう。
【０２７７】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み入れられると示唆されたのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０２７８】
前記発明を明確性および理解のためにいくらか詳細に説明してきたが、形態および詳細の様々な変化を、本発明の範囲から逸脱することなく行うことができることが、本開示の読解から当業者には明らかとなるであろう。例えば、上記の全ての技術および装置を、様々な組合せで用いることができる。本出願に記載の全ての刊行物、特許、特許出願、または他の書類は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、特許出願、または他の書類があらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられると個別に指示されたのと同じ程度まで、あらゆる目的でその全体が参照により組み入れられるものとする。
【０２７９】
さらに、2007年6月18日に提出された米国特許仮出願第60/929,212号は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０２８０】
さらに、Brantley-Sieders, D.Mらの2008年1月に刊行されたJournal of Clinical Investigation, volume 118, number 1による「受容体チロシンキナーゼEphA2は、ErbB2シグナリングを増幅することにより、マウスにおける乳腺癌腫瘍原性および転移性進行を促進する(The receptor tyrosine kinase EphA2 promotes mammary adenocarcinoma tumorigenesis and metastatic progression in mice by amplifying ErbB2 signaling)」という表題の研究論文も、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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