(57)【要約】本発明は、抗体の産生を助けるための、融合パートナーの細胞同調を通じたハイブリドーマ融合効率を向上させる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリドーマ融合効率を高めるための方法において、
融合パートナーである骨髄腫細胞を同調することを含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記骨髄腫細胞が、P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7、および、S194/5XX0 Bulから成る群から選択される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記同調が、血清飢餓を通じて達成される、方法。
【請求項４】
ハイブリドーマ融合効率を高めるための方法において、
融合パートナーである抗体産生Ｂ細胞を同調することを含む、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、
前記抗体産生Ｂ細胞が、脾臓、扁桃腺、もしくは、リンパ節、または、末梢血サンプルから入手される、方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法において、
前記同調が、血清飢餓を通じて達成される、方法。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔発明の背景〕
＜発明の分野＞
本発明は、抗体の産生を助けるための融合パートナーの細胞同調を通じたハイブリドーマ融合効率を向上させる方法に関する。
【０００２】
＜関連技術＞
治療薬としてのモノクローナル抗体（mAb）の使用は、様々な疾患の治療のための有効なアプローチとなってきている。その上、mAbは、様々な疾患の免疫病原性のより深い理解を得るための強力なツールである。
【０００３】
モノクローナル抗体の生成は、KohlerとMilsteinにより、ハイブリドーマ法を用いて最初に説明され（Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)参照）、それ以来、実験室では標準的な手法となってきている。ハイブリドーマ生成のための一般的なプロトコルは、（ｉ）精製したタンパク質抗原で、動物（例えば、マウス、ラット、または、ウサギ）を免疫化すること、（ｉｉ）抗体産生Ｂ細胞を一般的には脾臓から採取すること、（ｉｉｉ）Ｂ細胞を、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼについて欠損のある非分泌性骨髄腫細胞株（例えば、BALB/cマウス系統由来のx63-Ag8.653）と融合させること、（ｉｖ）ヒポキサンチン、アミノプテリン、および、チミジン（HAT）を含有する選択培地で、ハイブリドーマを成長させること、（ｖ）望ましい抗体を産生する細胞についてスクリーニングすること、ならびに、（ｖｉ）その抗体を分泌する均質な細胞株を入手するための限界希釈クローニングすること、を伴う。
【０００４】
このような、時間を消費する複数工程プロセスにおいて、最も決定的な工程のうちの１つが、細胞融合であり、抗体分泌Ｂ細胞と骨髄腫細胞とが融合する。8〜12時間の倍加時間を有するネズミHGPRT陰性Ｂ細胞骨髄腫細胞株FOは、ハイブリドーマプロセスにおいて、標準的な融合パートナーになってきている。強い体液性免疫応答を高められているマウス由来の脾細胞と融合するときに、目的のmAbを分泌するFO由来ハイブリドーマを迅速に生成することができる。
【０００５】
しかしながら、細胞融合プロセスは、非常に非効率である。試薬の純度、温度、および、細胞の生存能力のような最もよく知られている条件下においてでさえ、脾臓の抗体分泌細胞のおよそ0.08%のみが、融合する。このような非効率は、多くの要因による。例えば、２つの脾細胞の融合は、不死化せず、成長しないだろうハイブリドーマを生み出し、２つの骨髄腫細胞の融合は、抗体を分泌せず、選択培地で死ぬだろうハイブリドーマを生み出す。その上、２つよりも多い細胞の融合は、結果的に不安定なシンシチウムを生じ、その多核細胞は生存しないだろう。
【０００６】
これらの変異性すべての結果として、初期のハイブリドーマはしばしば不安定であり、通常、低レベルの抗体を分泌するにもかかわらず、選択プロセスを生存しない。したがって、ハイブリドーマを生成し、モノクローナル抗体を作るための改良方法が必要とされている。
【０００７】
〔発明の概要〕
本発明は、ハイブリドーマ融合効率を高める方法であって、融合パートナー細胞を同調させることを含む方法を提供する。１つの態様では、本発明は、抗体産生Ｂ細胞の同調を提供する。別の態様では、本発明は、マウス骨髄腫細胞の同調を提供する。
【０００８】
１つの実施態様では、同調が、血清飢餓を通じてなされる。本発明の方法は、抗体を生成する、より効率的な手法を提供する。したがって、別の態様では、本発明は、本発明の改良方法を用いて産生された抗体を提供する。本発明を用いて産生された抗体は、治療目的、診断目的、および／または、研究目的に用いることができる。
【０００９】
〔発明の詳細な説明〕
＜引用＞
本明細書に引用したすべての文献または特許は、本発明時における技術状態を示しているため、および／または、本発明の説明および実施可能性を提供するために、参照により全体を本明細書に組み入れる。文献は、任意の科学文献もしくは特許文献、または、記録された形式、電子形式、または、印刷された形式すべてを含む任意の媒体形式で利用可能な任意の他の情報について言う。以下の参照文献を、参照により全体を本明細書に組み入れる：Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2006)、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)、Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)、Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2006)、Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2006)。
【００１０】
本明細書で用いる用語「免疫原」は、被験者における免疫応答を潜在的に引き起こすことができる任意の分子を意味する。免疫原には、アジュバントが存在しないときに投与されると、免疫応答を引き起こさないものもあるため、用語「免疫原」には、アジュバントと共投与される場合にのみ、免疫応答を引き起こす分子を含む。
【００１１】
本明細書で用いる用語「モノクローナル抗体」は、単一の分子組成を持つ抗体分子の調整物を言う。モノクローナル抗体は、単一の結合特異性、および、特定のエピトープに対するアフィニティを示す。モノクローナル抗体には、ネズミモノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、および、キメラモノクローナル抗体が含まれる。
【００１２】
概して、抗体は、特異的な免疫原に対し結合特異性を示す、タンパク質、または、ポリペプチドである。完全な抗体は、２本の同一の軽鎖と２本の同一の重鎖とで構成された異質四量体の糖タンパク質である。一般的に、各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に連結しているのだが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なっている。各重鎖−軽鎖も、鎖内のジスルフィド架橋で規則的に区切られている。各重鎖は、一端に可変部（VH）を有し、いくつかの定常部が続いている。各軽鎖は、一端に可変部（VL）を有し、他端に定常部を有している。その軽鎖の定常部は、重鎖の最初の定常部に並べられ、軽鎖の可変部は、重鎖の可変部に並べられる。任意の脊椎動物種の抗体軽鎖は、それらの定常部のアミノ酸配列に基づいて、明らかに異なる２つの型（すなわち、κおよびλ）のうちの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、重鎖の定常部アミノ酸配列により、５つの主なクラス（すなわち、IgA、IgD、IgE、IgG、および、IgM）に割り当てることができる。さらに、IgAおよびIgGは、アイソタイプIgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、および、IgG4として、サブ分類される。
【００１３】
概して、抗体を調製し特徴付けするための手段が、本分野で周知である（例えば、上記のAusubel、Harlow and Lane、および、Colligan参照）。免疫原の免疫化スケジュールにしたがって、免疫原を投与する。例えば、有効な免疫応答を引き起こすのに十分な量の、免疫原の単一投与を用いてもよい。あるいは、免疫原の初期の投与後に１つ以上の増強を伴う他の療法を用いてもよい。投与は、腹膜、静脈、皮下、筋肉、皮内のような任意の適切な経路、または、フットパッド注射(footpad injection)を通じてもよい。一般的に、マウスおよびラットのようなげっ歯類を用いてもよい。
【００１４】
免疫化後、抗体を産生する能力を有する体細胞、具体的には、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）をmAb生成プロトコルにおいて用いるために選択する。これらの細胞を、脾臓、扁桃腺、あるいは、リンパ節から、または、末梢血サンプルから入手してもよい。その後、免疫化した動物由来の抗体産生Ｂ細胞を、不死化した骨髄腫細胞株と融合する。ハイブリドーマ産生融合法で用いるのに適した骨髄腫細胞株は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、望ましい融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を助けるような特定の選択培地では成長することができない酵素欠損型である。例えば、免疫化した動物がマウスの場合、P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7、および、S194/5XX0 Bulを使用してもよい。
【００１５】
抗体を産生する脾臓細胞またはリンパ節細胞と、骨髄腫細胞とのハイブリッドを生成するための方法は、本分野で周知である。概して、体細胞を、骨髄腫細胞と２：１の割合で混合するが、細胞膜の融合を促進する（化学的な、または、電気的な）試薬の存在下では、それぞれ約２０：１から約１：１まで変動してもよい。センダイウイルスを用いた融合法が、Kohler & Milstein (1975; 1976)により説明されており、ポリエチレングリコール（PEG）（例えば、37%(v/v) PEG）を用いた方法が、Gefter et al.(1977)により説明されている。電気的に誘導した融合法の使用も適切である（Goding(1986) pp. 71-74参照）。
【００１６】
しかしながら、すべての細胞型は融合する可能性があるのだが、必ずしもすべてが、等しく融合するわけではないし、生存能力を有するわけではない。例えば、活発に分裂する芽球様Ｂ細胞は、骨髄腫細胞との融合に用いるのに最もよい細胞である。Ｂ細胞が芽球様細胞段階にない場合、その核は、骨髄腫細胞の核と同時に体細胞分裂には入らず、細胞融合は起こらないだろう。また、小胞体における過剰な抗体翻訳は、翻訳を抑制し、かつアポトーシスを誘導しうる小胞体ストレス応答（unfolded protein response）（UPR）を誘導する。換言すると、多量の抗体の分泌は、タンパク質分泌のために最適化された細胞でのみ起こりうる。したがって、細胞周期同調は、Ｂリンパ芽細胞と活性に分裂する骨髄腫細胞との、および、各々のうちの１つのみの的確な融合を伴う、ハイブリドーマ融合効率の主要な貢献因子である。
【００１７】
本発明は、抗体産生Ｂ細胞と骨髄腫細胞との融合効率を高めるように標準方法を操作しうるような、抗体を産生するための改良方法を提供する。１つの実施態様では、抗体産生Ｂ細胞と融合する前に、骨髄腫細胞を同調する。別の実施態様では、骨髄腫細胞と融合する前に、抗体産生Ｂ細胞を同調する。
【００１８】
哺乳類細胞の分裂周期には、４つの主な段階がある。G0/G1期は、終期の終わりとDNA合成の始まりの間の時間を言い、S期は、DNA量を倍加するために細胞がかけた時間に対応し、G2期は、DNA合成の終わりと前期の始まりの間の時間を言い、M期は有糸分裂を言う。細胞集団を同調させるために、細胞周期の特定の段階で、細胞を可逆的に妨げることができるいくつかの方法がある。例えば、ノコダゾールは、抗有糸分裂試薬であり、βチューブリンに結合し、２つの鎖間ジスルフィド結合のうちの１つの形成を阻害することにより、微小管を破壊し、それにより、微小管動態を抑制し、有糸分裂の紡錘体機能を破壊し、ゴルジ複合体を断片化する。ノコダゾールは、G2/M期で細胞周期を停止させる。他の例には、DNA複製を抑制し、細胞周期をG1/S期で妨げる、植物アミノ酸および鉄キレート剤であるミモシン、ならびに、DNAポリメラーゼの活性を妨げることにより有糸細胞分裂を阻害し、細胞周期をG1/S期でまた妨げるアフィディコリンが含まれる。その上、血清を欠く培地における細胞成長は、ほとんどの細胞型で、G1で細胞周期の停止を誘導する。
【００１９】
培養における、対数増殖期細胞の大部分が、細胞周期のG1期である。しかしながら、この段階は、細胞融合のためには最適でないかもしれない。骨髄腫細胞を、有糸分裂の中期で細胞を停止させる有糸紡錘体抑制因子であるコルセミドと処理した後、ハイブリドーマ細胞融合において、26〜570%のコロニーの増加があることが知られている。本発明にしたがって、１つ以上の細胞周期抑制因子を用いて、その後洗浄し、および／または、通常の増殖培地で回復すると、同調するよう細胞を増殖することができる。その上、回復時間の長さを変えることにより、Ｂ細胞または骨髄腫細胞が融合前である細胞周期の段階を選択することができる。
【００２０】
融合後、ハイブリドーマの集団を、選択培地で培養し、特定のハイブリドーマを選択する。一般的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートにおける単一クローン希釈により細胞を培養し、その後（約２〜３週間後）、個々のクローン浮遊物を望ましい反応性について試験することによって、実施される。アッセイは、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイ、および、同様のものであってもよい。
【００２１】
また、抗体産生細胞を、目的の抗原で免疫化したヒトまたは適切な動物の、末梢血から入手することができるし、または、好ましくは、脾臓またはリンパ節から入手することができる。任意の他の適切な宿主細胞も、抗体、特異的断片、または、それらの変異体をコードする異種の、または、内因性の核酸を発現するために用いることができる。融合細胞（ハイブリドーマ）または組換え細胞を、選択培地条件、または、他の適切な既知の方法を用いて、単離し、限外希釈もしくは細胞分画または他の既知の方法によりクローン化することができる。望ましい特異性を有する抗体を産生する細胞を、適切なアッセイ（例えば、ELISA）により選択することができる。
【００２２】
必要な特異性の抗体を産生し、または、単離する他の適切な方法を、本分野で既知のものとして用いることができる。例えば、上記のColligan、Harlow and Lane、Ausubelを参照のこと。これらは、参照により全体を本明細書に組み入れる。非ヒトの、または、ヒトの抗体を遺伝子操作し、または、ヒト化するための方法もまた、用いることができ、本分野で周知である。概して、ヒト化された、または、遺伝子操作された抗体は、非ヒト（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒトを除く霊長類、または、他の哺乳動物だが、これに限定されない）である材料由来の１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒトアミノ酸残基はしばしば、「インポート」残基と呼ばれ、一般的に、既知のヒト配列の「インポート」可変部、定常部、または、他の部位から採られている。既知のヒトIg配列は、本分野で周知であり、任意の既知の配列でありうる。例えば、これに限定されないが、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)、ならびに、国際公開第05/33029号、および、2004年6月21日に出願された米国特許出願第10/872,932号を参照のこと。これらは、参照により全体を本明細書に組み入れる。
【００２３】
このようなインポートされた配列を、本分野で知られているように、免疫原性を低減するか、または、結合性、アフィニティ、オン・レート(on-rate)、オフ・レート(off-rate)、アビディティ(avidity)、特異性、半減期、もしくは、任意の他の適切な特性を、低減するか、高めるか、もしくは、改善するために用いることができる。概して、非ヒトの、または、ヒトのCDR配列の一部または全部が維持されるが、可変部および定常部の非ヒトの配列は、ヒトまたは他のアミノ酸で置換される。また、抗原、および、他の好ましい生物学的特性に関する高いアフィニティを保有しながら、抗体を選択的にヒト化することができる。この目標を達成するために、親の配列および様々な仮想ヒト化産物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて分析するプロセスにより、ヒト化抗体を選択的に調整することができる。免疫グロブリンの三次元モデルは、一般に利用可能であり、当業者にはよく知られたものである。選択された候補免疫グロブリン配列の、考えられる三次元立体構造を例示し、表示するようなコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の確認により、候補免疫グロブリン配列を機能付ける残基の、考えられる役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンが、その抗原に結合する能力に影響を及ぼすような残基の分析が可能になる。このように、FR残基を選択し、コンセンサス配列とインポート配列から組み合わせることができ、その結果、望ましい抗体特性（例えば、標的抗原に対する高められたアフィニティ）が達成される。概して、CDR残基は、直接的に、ほとんど実質的に、抗原結合に影響を及ぼすことに関与する。本発明の抗体のヒト化、または、遺伝子操作を、既知の方法を用いて実行することができる。この方法は、例えば、Winterに記載されている方法（Jones et al., Nature 321:522 (1986)、Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)、Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)参照）、Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993)、Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)、Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992)、Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)、米国特許第5,723,323号、同第5,976,862号、同第5,824,514号、同第5,817,483号、同第5,814,476号、同第5,763,192号、同第5,723,323号、同第5,766,886号、同第5,714,352号、同第6,204,023号、同第6,180,370号、同第5,693,762号、同第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,225,539号、同第4,816,567号、国際出願番号PCT/US98/16280、PCT/US96/18978、PCT/US91/09630、PCT/US91/05939、PCT/US94/01234、PCT/GB89/01334、PCT/GB91/01134、PCT/GB92/01755、国際公開第90/14443号、同90/14424号、同90/14430号、欧州特許第229 246号、上記のColligan、Ausubel、Harlow and Laneであるが、これに限定されない。これらは、これらに引用された参照文献を含めて、参照により全体を本明細書に組み入れる。
【００２４】
また、本明細書に記載のように、および／または、本分野で知られているように、ヒト抗体のレパートリーを産生することができる形質転換動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ヒトを除く霊長類、および、同様のもの）の免疫化により、抗体を選択的に生成することができる。望ましい抗体を産生する細胞は、このような動物から単離することができるし、本明細書に記載された方法のような適切な方法を用いて、免疫化することができる。
【００２５】
ヒト抗原に結合するヒト抗体のレパートリーを産生することのできる形質転換マウスを、既知の方法により産生することができる。（この方法は、例えば、Lonberg et al.に対して特許された米国特許第5,770,428号、同第5,569,825号、同第5,545,806号、同第5,625,126号、同第5,625,825号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、同第5,789,650号、Jakobovits et al. 国際公開第98/50433号、Jakobovits et al. 同第98/24893号、Lonberg et al. 同第98/24884号、Lonberg et al. 同第97/13852号、Lonberg et al. 同第94/25585号、Kucherlapate et al. 同第96/34096号、Kucherlapate et al. 欧州特許第0 463 151 B1号、Kucherlapate et al. 欧州出願公開第0 710 719 A1号、Surani et al. 米国特許第5,545,807号、Bruggemann et al. 国際公開第90/04036号、Bruggemann et al. 欧州特許第0 438 474 B1号、Lonberg et al. 欧州出願公開第0 814 259 A2号、Lonberg et al. 独国出願公開第2 272 440 A号、Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994)、Taylor et al., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994)、Green et al, Nature Genetics 7:13-21 (1994)、Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997)、Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992)、Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993)、Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995)、および、Fishwald et al., Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996)であるが、これに限定されない。これらは、参照により全体を本明細書に組み入れる。）概して、これらのマウスは、機能的に再構成されているか、機能的な再構成を受けうるような、少なくとも１つのヒト免疫グロブリン遺伝子座のＤＮＡを含むような少なくとも１つの導入遺伝子を含む。このようなマウスにおける内在免疫グロブリン遺伝子座を、内在遺伝子によりコードされた抗体を産生するような動物の能力を取り除くために、破壊したり、欠失したりすることができる。
【００２６】
本発明の方法は、このように、抗体を生成するより効率的な方法を提供する。したがって、本発明は、本発明の改良方法を用いて産生された抗体をも提供する。本発明を用いて産生された抗体を、治療目的、診断目的、および／または、研究目的に用いることができる。
【００２７】
発明を概説的に説明してきたが、以下の実施例を参照することにより、同じことがより容易に理解されるであろう。実施例は例示として提供され、限定を意図するものではない。
【００２８】
〔実施例１〕
＜FO骨髄腫細胞の血清飢餓によりハイブリドーマ融合効率が改善される＞
骨髄腫細胞の細胞周期の段階が、ハイブリドーマ融合効率に任意の効果を有するか否か決定するために、血清飢餓（1% FBS）により、FO細胞を一定の期間同調した。その後、同調したFO細胞を、脾臓Ｂ細胞に直接融合するか、または、融合前に完全培地で一定期間回復させるかした。簡単に説明すると、５匹のBalb/Cマウスを、Titermaxの中でニワトリ卵リゾチームにより免疫化し、２週間で増強し、４週間で採取した。脾臓を入手し、単一細胞懸濁液をプールし、lympholyte Mカラムを通して、計数した。未処理の脾臓を別に採取して、陰性対照として用いた。FO骨髄腫細胞を、DMEM＋1% FBS中で、様々な時間成長させ、洗浄し、その後、融合前にDMEM＋10%FBS中で、指定時間回復した。各サンプルについて、60×106個の脾臓細胞を60×106個のFO細胞と混ぜ（未処理対照として、15×106個の脾臓細胞およびFO細胞）、50% PEGで融合させ、HAT培地を入れた96穴プレートに、プレート当たり4×106個脾臓細胞の密度でまいた。融合後7〜11日で細胞コロニーを評価した。回復期間の全くない血清飢餓では、融合効率は高まらないことが示された。他方、完全培地でインキュベーションしたFO細胞と比較して、血清飢餓の後の回復により融合効率が高められた。FO骨髄腫細胞について、最適な飢餓時間は13時間であり、最適な回復時間も13時間であることを決定した。融合前のこのような処理により、融合効率が45%向上した。
【００２９】
処理前に、13時間の血清飢餓の直後に、および、13時間の回復後に入手した骨髄腫細胞サンプルを、ヨウ化プロピジウムで染色し、DNA量についてフローサイトメーターで分析した。処理しない場合、細胞の49〜52%がG0/G1期であり、23〜25%がS期であり、22%がG2/M期であった。血清飢餓は、処理直後にはこの比率を顕著に変化させないが、回復後S期の細胞集団を38%まで顕著に増加させた。このことは、細胞をM期に同調したときに、ハイブリドーマ融合効率が高まることを示唆した従来の報告と相反する。要約すると、本発明は、ハイブリドーマ融合効率を、高い効率で、かつ、最小の副作用で、または、全く副作用が誘導されることなく、うまく向上させている。
【００３０】
本発明は、以上の説明および実施例で特に説明したものとは別の態様でも実施できることは明確だろう。本発明の多くの改良および変更が、以上に記した観点で可能であり、したがって、それらは本発明の範囲内にある。
【００３１】
〔参考文献〕
2010511379.tif 000002
2010511379.tif 000003
【国際調査報告】
2010511379.tif 000004
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2010511379.tif 000006
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