(57)【要約】オルタナティブスプライシングを調節するリボスイッチに関連する方法および組成物を開示する。コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同である、調節可能な遺伝子発現構築物を本明細書中に開示する。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、両者は非相同である。発現プラットフォームドメインはイントロン中にオルタナティブスプライスジャンクションを含む。発現プラットフォームドメインはイントロンの末端にスプライスジャンクションを含む。リボスイッチを、トリガー分子（ＴＰＰ）によって活性化することができる。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを活性化、オルタナティブスプライシングを抑制、ＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節可能な遺伝子発現構築物であって、
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、該リボスイッチが該ＲＮＡのスプライシングを調節し、該リボスイッチおよび該コード領域が非相同である、調節可能な遺伝子発現構築物。
【請求項２】
オルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｉｃｉｎｇ）を調節する、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項１または請求項２に記載の構築物。
【請求項４】
前記ＲＮＡがイントロンをさらに含み、前記発現プラットフォームドメインが該イントロン中にオルタナティブスプライスジャンクションを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項５】
前記ＲＮＡがイントロンをさらに含み、前記発現プラットフォームドメインが該イントロンの末端にスプライスジャンクションを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項６】
前記オルタナティブスプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化される場合に活性である、請求項４または請求項５に記載の構築物。
【請求項７】
前記オルタナティブスプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化されない場合に活性である、請求項４または請求項５に記載の構築物。
【請求項８】
前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化される、請求項１から７のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項９】
前記トリガー分子がＴＰＰである、請求項８に記載の構築物。
【請求項１０】
前記リボスイッチがＴＰＰ応答性リボスイッチである、請求項１から９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１１】
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを活性化する、請求項１から１０のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１２】
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを抑制する、請求項１から１０のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１３】
ＲＮＡが分岐構造を有する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１４】
前記ＲＮＡがｐｒｅ−ｍＲＮＡである、請求項１から１３のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１５】
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がＰ４ステムおよびＰ５ステム中に存在する、請求項３から１３のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１６】
前記スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がループ５中にも存在する、請求項１５に記載の構築物。
【請求項１７】
前記スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がステムＰ２中にも存在する、請求項１５または請求項１６に記載の構築物。
【請求項１８】
前記スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−６と−２４との間の位置に存在する、請求項３から１７のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１９】
前記スプライス部位が配列ＧＵＡに続く、請求項３から１７のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項２０】
ＲＮＡのスプライシングを調節する方法であって、該ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程を含み、該リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができる、方法。
【請求項２１】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リボスイッチが前期ＲＮＡのイントロンにある、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化される、請求項２０から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記トリガー分子がＴＰＰである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記リボスイッチがＴＰＰ応答性リボスイッチである、請求項２０から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを活性化する、請求項２０から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを抑制する、請求項２０から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記スプライシングが天然に起こらない、請求項２０から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がループ５中に存在する、請求項２１から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がステムＰ２中に存在する、請求項２１から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−６と−２４との間の位置に存在する、請求項２１から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記スプライス部位が前記アプタマードメイン中の前記配列ＧＵＡに続く、請求項２１から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
真菌増殖を阻害する方法であって、
（ａ）真菌感染した被験体を同定する工程、
（ｂ）ＴＰＰ応答性リボスイッチを阻害する有効量の化合物を該被験体に投与し、それにより、真菌増殖を阻害する工程、
を含む、方法。
【請求項３４】
前記真菌増殖の阻害が、真菌バイオマスを１０％以上減少させる工程を含む、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願の相互参照）
本出願は、２００７年３月２２日に出願した米国仮特許出願第６０／９１９，４３３号、２００７年３月２２日に出願した米国仮特許出願第６０／９１９，４３３号の利益を請求し、本明細書中でこれによってその全体を参照として援用する。
【０００２】
（連邦政府の後援による研究に係る陳述）
本発明は、ＮＩＨによって授与された補助金番号ＧＭ０６８８１９のもと、政府の支持を受けなされた。政府は本発明に対し確実な権利を保有する。
【０００３】
発明の分野
本開示の発明は、一般に、遺伝子発現分野、具体的には、遺伝子発現の調節領域に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
細胞が種々の遺伝子発現パターンの変化による複数の生化学シグナルおよび環境信号に応答しなければならないので、正確な遺伝子調節は生物系の本質的特徴である。最も公知の遺伝子調節機構は、化学的または物理的な刺激を感知し、その後に関連するＤＮＡまたは伝令ＲＮＡ配列との選択的相互作用によって遺伝子発現を調整するタンパク質因子の使用を含む。タンパク質は、複合体形状を採用することができ、生物系がその化学的および物理的環境を正確に感知することができる種々の機能を実行する。代謝産物に応答するタンパク質因子は、典型的には、ＤＮＡに結合することによって転写開始を調整するか（例えば、ｌａｃリプレッサータンパク質；非特許文献１）、ＲＮＡに結合することによって転写終結（例えば、ＰｙｒＲタンパク質；非特許文献２）または翻訳（例えば、ＴＲＡＰタンパク質；非特許文献３）のいずれかを調節するように作用する。タンパク質因子は、アロステリック調整または翻訳後改変などの種々の機構によって環境刺激に応答し、高応答性遺伝子スイッチとしての機能を果たすためにこれらの機能を活用するのに長けている（例えば、非特許文献４を参照のこと）。
【０００５】
遺伝子調節におけるタンパク質因子の広範な関与に加えて、ＲＮＡが遺伝子調節で積極的な役割を果たし得ることも公知である。最近の研究により、小さな非コードＲＮＡが破壊のためのｍＲＮＡの選択的ターゲティングで役割を果たし、それにより、遺伝子発現が下方制御されるという実質的役割が明らかにされ始めている（例えば、非特許文献５およびそのリファレンスを参照のこと）。このＲＮＡ干渉過程は、短いＲＮＡがワトソン−クリック塩基相補性を介して意図するｍＲＮＡ標的を選択的に認識する能力を活用し、その後に結合したｍＲＮＡをタンパク質作用によって破壊する。新規であるが特異性の高いＲＮＡ結合部位を使用してタンパク質因子を生成するよりも進化過程によって新規の標的特異的ＲＮＡ因子を生成することの方がはるかに容易であるので、ＲＮＡはこの系における理想的な分子認識のための作用因子である。
【０００６】
タンパク質が、酵素、受容体、および構造機能についての、生物学が有するほとんどの要件を満たすにもかかわらず、ＲＮＡはこれらの能力でも役立ち得る。例えば、ＲＮＡは、相当な酵素力および正確な分子認識を示す多数のリボザイムドメイン（非特許文献６；非特許文献７）および受容体ドメイン（非特許文献８；非特許文献９）を形成するのに十分な構造可塑性を有する。さらに、これらの活性を組み合わせて、エフェクター分子によって選択的に調整されるアロステリックリボザイム（非特許文献１０；非特許文献１１）を作製することができる。
【０００７】
オルタナティブスプライシングは、ｍＲＮＡ前駆体上のスプライス部位の選択的使用を含む過程である。オルタナティブスプライシングにより、１つの遺伝子から多数のタンパク質を産生可能であり、それにより、異なる機能を有するタンパク質を生成可能である。オルタナティブスプライシング事象は、種々の方法（エキソンスキッピング、相互排他エキソンの使用、および５’および／または３’スプライス部位の差分選択が含まれる）によって起こり得る。多数の遺伝子（例えば、ホメオ遺伝子（ｈｏｍｅｏｇｅｎｅ）、癌遺伝子、神経ペプチド、細胞外マトリックスタンパク質、筋収縮タンパク質）について、オルタナティブスプライシングを、発生または組織特異的様式で調節する。したがって、オルタナティブスプライシングは、遺伝子発現で重要な役割を果たす。最近の研究により、複合有機体（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）の発現ストラテジーにおけるオルタナティブスプライシングの重要性が明らかになっている。
【０００８】
ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）のオルタナティブスプライシングは、哺乳動物遺伝子発現の調節で重要な役割を果たす。オルタナティブスプライシングの調節は種々の系列の細胞で起こり、多数の遺伝子の発現プログラムの一部である。最近、オルタナティブスプライシングが時折完全に異なる機能を有するタンパク質イソ型の産生を調節することが明らかとなった。細胞形質転換に対して異なる性質および時折拮抗的性質を有する癌遺伝子および癌原遺伝子のタンパク質イソ型は、オルタナティブスプライシングを介して産生される。この種の例は、非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５で見出される。また、オルタナティブスプライシングをしばしば使用して、Ｆａｓ、Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ、およびＣｅｄ−４などのプログラム細胞死に関与するタンパク質の産生を調節する（非特許文献１６）。ｐｒｅ−ｍＲＮＡのオルタナティブスプライシングはリプレッサータンパク質を産生することができる一方で、異なる条件下で同一のｐｒｅ−ｍＲＮＡからアクチベーターを産生することができる（非特許文献１７；非特許文献１８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｋ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｃ．，１９９８，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８，１２７−１６４
【非特許文献２】Ｓｗｉｔｚｅｒ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６２，３２９−３６７
【非特許文献３】Ｂａｂｉｔｚｋｅ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｇｏｌｌｎｉｃｋ，Ｐ．，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３，５７９５−５８０２
【非特許文献４】Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｇａｎｎ，Ａ．（２００２）．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
【非特許文献５】Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．２００２，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，２４４−２５１
【非特許文献６】Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ  Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，Ｔ．Ｒ．Ｃｅｃｈ，Ｊ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ，ｅｄｓ．，ｐｐ．３２１−３５０（１９９８）のＣｅｃｈ  ＆  Ｇｏｌｄｅｎ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｕｓｉｎｇ  ｏｎｌｙ  ＲＮＡ．
【非特許文献７】Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７，３７１−３９０（１９９７）
【非特許文献８】Ｏｓｂｏｒｎｅ  ＆  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７，３４９−３７０（１９９７）
【非特許文献９】Ｈｅｒｍａｎｎ  ＆  Ｐａｔｅｌ，Ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｐｔａｍｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，８２０−８２５（２０００）
【非特許文献１０】Ｓｏｕｋｕｐ  ＆  Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，３５８４−３５８９（１９９９）
【非特許文献１１】Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，３３６−３４１（２００１）
【非特許文献１２】Ｍａｋｅｌａ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：３７３
【非特許文献１３】Ｙｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５０７７
【非特許文献１４】Ｍｕｍｂｅｒｇ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１２１２
【非特許文献１５】Ｆｏｕｌｋｅｓ，Ｎ．Ｓ．ａｎｄ  Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ，Ｐ．１９９２，Ｃｅｌｌ  ６８：４１１
【非特許文献１６】Ｊｉａｎｇ，Ｚ．Ｈ．ａｎｄ  Ｗｕ  Ｊ．Ｙ．，１９９９，Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２２０：６４
【非特許文献１７】Ｂｌａｃｋ  Ｄ．Ｌ．２０００，Ｃｅｌｌ  １０３：３６７
【非特許文献１８】Ｇｒａｖｅｌｅｙ，Ｂ．Ｒ．２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１７：１００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
リボスイッチを介してオルタナティブスプライシングを調節するために使用することができる方法および組成物が当該分野で必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同である、調節可能な遺伝子発現構築物を本明細書中に開示する。リボスイッチは、ＲＮＡのオルタナティブスプライシングを調節することができる。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。ＲＮＡはイントロンをさらに含むことができ、発現プラットフォームドメインはイントロン中にオルタナティブスプライスジャンクションを含む。ＲＮＡはイントロンをさらに含むことができ、発現プラットフォームドメインはイントロンの末端にスプライスジャンクション（すなわち、５’スプライスジャンクションまたは３’スプライスジャンクション）を含む。ＲＮＡはイントロンをさらに含むことができ、発現プラットフォームドメインはイントロン中に分岐部位を含む。オルタナティブスプライスジャンクションは、リボスイッチが活性化される場合に活性であり得る。オルタナティブスプライスジャンクションは、リボスイッチが活性化されない場合に活性であり得る。リボスイッチを、トリガー分子（チアミンピロリン酸（ＴＰＰ））によって活性化することができる。リボスイッチはＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを活性化することができる。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを抑制することができる。リボスイッチは、ＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。ＲＮＡは分岐構造を有することができる。ＲＮＡはｐｒｅ−ｍＲＮＡであり得る。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、Ｐ４ステムおよびＰ５ステム中に存在し得る。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ループ５中にも見出すことができる。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ステムＰ２中にも見出すことができる。したがって、例えば、発現プラットフォームドメインは、Ｐ４およびＰ５配列、ループ５配列、および／またはＰ２配列と相互作用することができる。かかるアプタマー配列は、一般に、トリガー分子がアプタマードメインに結合しない場合に限り、発現プラットフォームドメインとの相互作用のために利用可能であり得る。スプライス部位および／または分岐部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−６と−２４との間の位置に存在することができる。スプライス部位は、例えば、配列ＧＵＡに続くことができる。
【００１２】
ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程であって、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができる導入工程を含む、ＲＮＡのスプライシングを調節する方法も開示する。リボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインが非相同である。リボスイッチはＲＮＡのイントロンにあり得る。リボスイッチを、トリガー分子（ＴＰＰなど）によって活性化することができる。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを活性化することができる。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを抑制することができる。リボスイッチは、ＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。スプライシングは非天然に起こり得る。オルタナティブスプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ループ５中に見出すことができる。オルタナティブスプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ステムＰ２中にも見出すことができる。スプライス部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−６と−２４との間の位置に存在することができる。スプライス部位は、例えば、アプタマー中の配列ＧＵＡに続くことができる。
【００１３】
真菌感染した被験体を同定する工程、有効量のＴＰＰ応答性リボスイッチを阻害する化合物を被験体に投与し、それにより、真菌増殖を阻害する工程を含む、真菌増殖阻害方法も開示する。真菌増殖の阻害は、真菌バイオマスを１０％以上減少させることを含み得る。
【００１４】
開示の方法および組成物のさらなる利点を以下の記載に一部示し、この記載から利点が一部理解される。あるいは、利点を、開示の方法および組成物の実施によって知ることができる。開示の方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘した要素および組み合わせによって理解および達成される。上記の一般的記載および以下の詳細な記載の両方は例示および説明のみであり、特許請求の範囲に記載の本発明を制限するものではないと理解すべきである。
【００１５】
本明細書中に組み込まれ、且つ本明細書の一部を構成する添付の図面は、開示の方法および組成物のいくつかの実施形態を例示し、記載と共に、開示の方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１ａ】図１は、３つのＮ．Ｃｒａｓｓａ遺伝子が５’イントロン中にＴＰＰリボスイッチを保有することを示す。ａ、ＮＭＴ１  ｍＲＮＡの前駆体５’ＵＴＲ（Ｉ−１）およびオルタナティブスプライシングされた産物（Ｉ−２およびＩ−３）。エキソンおよびイントロンは、それぞれ、暗灰色および影なし／薄灰色の長方形である。５’（ＧＵ）および３’（ＡＧ）スプライス部位、推定開始コドン（＊）、ならびにｕＯＲＦおよび主なＮＭＴ１  ＯＲＦ由来の対応する翻訳産物を示す。ｂおよびｃ、それぞれＴＨＩ４およびＮＣＵ０１９７７．１の前駆体ｍＲＮＡの５’ＵＴＲならびにそのスプライシング産物の５’ＵＴＲ。ｄ、３０μＭチアミンの非存在下（−）または存在下（＋）で増殖したＮ．Ｃｒａｓｓａ由来のｍＲＮＡ５’領域のＲＴ−ＰＣＲ検出。ＴＨＩ４のバンドＩＩ−３ａおよびＩＩ−３ｂは、上流イントロンが残存するか（３ａ）、除去された（３ｂ）スプライス形態ＩＩ−３を示す。マーカーＤＮＡ（Ｍ）は、１００塩基対単位で増加している。
【図１ｂ】図１は、３つのＮ．Ｃｒａｓｓａ遺伝子が５’イントロン中にＴＰＰリボスイッチを保有することを示す。ａ、ＮＭＴ１  ｍＲＮＡの前駆体５’ＵＴＲ（Ｉ−１）およびオルタナティブスプライシングされた産物（Ｉ−２およびＩ−３）。エキソンおよびイントロンは、それぞれ、暗灰色および影なし／薄灰色の長方形である。５’（ＧＵ）および３’（ＡＧ）スプライス部位、推定開始コドン（＊）、ならびにｕＯＲＦおよび主なＮＭＴ１  ＯＲＦ由来の対応する翻訳産物を示す。ｂおよびｃ、それぞれＴＨＩ４およびＮＣＵ０１９７７．１の前駆体ｍＲＮＡの５’ＵＴＲならびにそのスプライシング産物の５’ＵＴＲ。ｄ、３０μＭチアミンの非存在下（−）または存在下（＋）で増殖したＮ．Ｃｒａｓｓａ由来のｍＲＮＡ５’領域のＲＴ−ＰＣＲ検出。ＴＨＩ４のバンドＩＩ−３ａおよびＩＩ−３ｂは、上流イントロンが残存するか（３ａ）、除去された（３ｂ）スプライス形態ＩＩ−３を示す。マーカーＤＮＡ（Ｍ）は、１００塩基対単位で増加している。
【図１ｃ】図１は、３つのＮ．Ｃｒａｓｓａ遺伝子が５’イントロン中にＴＰＰリボスイッチを保有することを示す。ａ、ＮＭＴ１  ｍＲＮＡの前駆体５’ＵＴＲ（Ｉ−１）およびオルタナティブスプライシングされた産物（Ｉ−２およびＩ−３）。エキソンおよびイントロンは、それぞれ、暗灰色および影なし／薄灰色の長方形である。５’（ＧＵ）および３’（ＡＧ）スプライス部位、推定開始コドン（＊）、ならびにｕＯＲＦおよび主なＮＭＴ１  ＯＲＦ由来の対応する翻訳産物を示す。ｂおよびｃ、それぞれＴＨＩ４およびＮＣＵ０１９７７．１の前駆体ｍＲＮＡの５’ＵＴＲならびにそのスプライシング産物の５’ＵＴＲ。ｄ、３０μＭチアミンの非存在下（−）または存在下（＋）で増殖したＮ．Ｃｒａｓｓａ由来のｍＲＮＡ５’領域のＲＴ−ＰＣＲ検出。ＴＨＩ４のバンドＩＩ−３ａおよびＩＩ−３ｂは、上流イントロンが残存するか（３ａ）、除去された（３ｂ）スプライス形態ＩＩ−３を示す。マーカーＤＮＡ（Ｍ）は、１００塩基対単位で増加している。
【図１ｄ】図１は、３つのＮ．Ｃｒａｓｓａ遺伝子が５’イントロン中にＴＰＰリボスイッチを保有することを示す。ａ、ＮＭＴ１  ｍＲＮＡの前駆体５’ＵＴＲ（Ｉ−１）およびオルタナティブスプライシングされた産物（Ｉ−２およびＩ−３）。エキソンおよびイントロンは、それぞれ、暗灰色および影なし／薄灰色の長方形である。５’（ＧＵ）および３’（ＡＧ）スプライス部位、推定開始コドン（＊）、ならびにｕＯＲＦおよび主なＮＭＴ１  ＯＲＦ由来の対応する翻訳産物を示す。ｂおよびｃ、それぞれＴＨＩ４およびＮＣＵ０１９７７．１の前駆体ｍＲＮＡの５’ＵＴＲならびにそのスプライシング産物の５’ＵＴＲ。ｄ、３０μＭチアミンの非存在下（−）または存在下（＋）で増殖したＮ．Ｃｒａｓｓａ由来のｍＲＮＡ５’領域のＲＴ−ＰＣＲ検出。ＴＨＩ４のバンドＩＩ−３ａおよびＩＩ−３ｂは、上流イントロンが残存するか（３ａ）、除去された（３ｂ）スプライス形態ＩＩ−３を示す。マーカーＤＮＡ（Ｍ）は、１００塩基対単位で増加している。
【図２ａ】図２は、ＮＭＴ１  ＴＰＰリボスイッチによるオルタナティブスプライシングおよび遺伝子調節を示す。ａ、チアミンが存在しない培地中で増殖したＮ．ｃｒａｓｓａ培養物への３０μＭチアミンの添加後（ｔ＝０）のＮＭＴ１転写物スプライシング（ＲＴ−ＰＣＲ産物）の変化。ｂ、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）ＯＲＦの上流に融合した野生型（ＷＴ）または種々の変異ＮＭＴ１  リボスイッチ（Ｍ１〜Ｍ１０）のレポーター構築物（配列番号１および２）。ｃ、上：３０μＭチアミンの非存在下（黒丸）または存在下（白丸）で増殖したＷＴ−ＬＵＣ構築物（正規化ＲＬＵ＝１）対種々の変異ＮＭＴ１−ＬＵＣ構築物由来の相対発光量（ＲＬＵ）。値は反復した３つの独立したアッセイの平均であり、標準偏差のエラーバーは記号の直径よりも小さい。下：各形質転換体のＬＵＣ融合物（上のパネル）および天然ＮＭＴ１  ＲＮＡ（下のパネル）由来の５’ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲ分析。詳細を、図１に記載する。
【図２ｂ】図２は、ＮＭＴ１  ＴＰＰリボスイッチによるオルタナティブスプライシングおよび遺伝子調節を示す。ａ、チアミンが存在しない培地中で増殖したＮ．ｃｒａｓｓａ培養物への３０μＭチアミンの添加後（ｔ＝０）のＮＭＴ１転写物スプライシング（ＲＴ−ＰＣＲ産物）の変化。ｂ、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）ＯＲＦの上流に融合した野生型（ＷＴ）または種々の変異ＮＭＴ１  リボスイッチ（Ｍ１〜Ｍ１０）のレポーター構築物（配列番号１および２）。ｃ、上：３０μＭチアミンの非存在下（黒丸）または存在下（白丸）で増殖したＷＴ−ＬＵＣ構築物（正規化ＲＬＵ＝１）対種々の変異ＮＭＴ１−ＬＵＣ構築物由来の相対発光量（ＲＬＵ）。値は反復した３つの独立したアッセイの平均であり、標準偏差のエラーバーは記号の直径よりも小さい。下：各形質転換体のＬＵＣ融合物（上のパネル）および天然ＮＭＴ１  ＲＮＡ（下のパネル）由来の５’ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲ分析。詳細を、図１に記載する。
【図２ｃ】図２は、ＮＭＴ１  ＴＰＰリボスイッチによるオルタナティブスプライシングおよび遺伝子調節を示す。ａ、チアミンが存在しない培地中で増殖したＮ．ｃｒａｓｓａ培養物への３０μＭチアミンの添加後（ｔ＝０）のＮＭＴ１転写物スプライシング（ＲＴ−ＰＣＲ産物）の変化。ｂ、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）ＯＲＦの上流に融合した野生型（ＷＴ）または種々の変異ＮＭＴ１  リボスイッチ（Ｍ１〜Ｍ１０）のレポーター構築物（配列番号１および２）。ｃ、上：３０μＭチアミンの非存在下（黒丸）または存在下（白丸）で増殖したＷＴ−ＬＵＣ構築物（正規化ＲＬＵ＝１）対種々の変異ＮＭＴ１−ＬＵＣ構築物由来の相対発光量（ＲＬＵ）。値は反復した３つの独立したアッセイの平均であり、標準偏差のエラーバーは記号の直径よりも小さい。下：各形質転換体のＬＵＣ融合物（上のパネル）および天然ＮＭＴ１  ＲＮＡ（下のパネル）由来の５’ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲ分析。詳細を、図１に記載する。
【図３】図３は、非スプライシングおよびオルタナティブスプライシングしたｍＲＮＡ中の短いｕＯＲＦがＮＭＴ１を抑制することを示す。ａ、非スプライシングＲＮＡ（Ｉ−１Ｒ）およびスプライシングＲＮＡ（Ｉ−２ＲおよびＩ−３Ｒ）を模擬するためにＬＵＣレポーターに融合した野生型構築物および変異構築物。ｂ、（上）培地中に３０μＭチアミンの非存在下（−、黒塗りのバー）または存在下（＋、白抜きのバー）でのＬＵＣ活性。発現を、チアミンを添加しない野生型Ｉ−３Ｒ構築物の値に対して正規化した。値は反復した３つの独立したアッセイの平均であり、標準偏差のエラーバーを示す。（下）チアミンを含めないか（−）含めて（＋）増殖させたＮ．ｃｒａｓｓａのＬＵＣ融合物（上のパネル）および天然ＮＭＴ１（下のパネル）転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析。他の表記を図２ｃの説明に記載する。
【図４ａ】図４は、Ｎ．ｃｒａｓｓａ中のｍＲＮＡのＴＰＰリボスイッチ媒介オルタナティブスプライシングの機構を示す。ａ、第２の５’スプライス部位付近の構造のＴＰＰ誘導性調整。５’３２Ｐ標識２７３  ＮＭＴ１  ＲＮＡ（−７８〜１９５ｎｔ）の自発的切断産物をＰＡＧＥによって分離し、定量して、１０μＭ  ＴＰＰ媒介された構造変化の位置を明らかにした。ｂ、いくつかのＰ４〜Ｐ５ヌクレオチドは、ＴＰＰによって調整される第２の５’スプライス部位付近のヌクレオチドに相補的である（配列番号３〜４）。ｃ、重要なスプライシング決定要因（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）がアプタマーの異なる占有状態の間に活性化または阻害されるＮＭＴ１発現のリボスイッチ調節機構。
【図４ｂ】図４は、Ｎ．ｃｒａｓｓａ中のｍＲＮＡのＴＰＰリボスイッチ媒介オルタナティブスプライシングの機構を示す。ａ、第２の５’スプライス部位付近の構造のＴＰＰ誘導性調整。５’３２Ｐ標識２７３  ＮＭＴ１  ＲＮＡ（−７８〜１９５ｎｔ）の自発的切断産物をＰＡＧＥによって分離し、定量して、１０μＭ  ＴＰＰ媒介された構造変化の位置を明らかにした。ｂ、いくつかのＰ４〜Ｐ５ヌクレオチドは、ＴＰＰによって調整される第２の５’スプライス部位付近のヌクレオチドに相補的である（配列番号３〜４）。ｃ、重要なスプライシング決定要因（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）がアプタマーの異なる占有状態の間に活性化または阻害されるＮＭＴ１発現のリボスイッチ調節機構。
【図４ｃ】図４は、Ｎ．ｃｒａｓｓａ中のｍＲＮＡのＴＰＰリボスイッチ媒介オルタナティブスプライシングの機構を示す。ａ、第２の５’スプライス部位付近の構造のＴＰＰ誘導性調整。５’３２Ｐ標識２７３  ＮＭＴ１  ＲＮＡ（−７８〜１９５ｎｔ）の自発的切断産物をＰＡＧＥによって分離し、定量して、１０μＭ  ＴＰＰ媒介された構造変化の位置を明らかにした。ｂ、いくつかのＰ４〜Ｐ５ヌクレオチドは、ＴＰＰによって調整される第２の５’スプライス部位付近のヌクレオチドに相補的である（配列番号３〜４）。ｃ、重要なスプライシング決定要因（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）がアプタマーの異なる占有状態の間に活性化または阻害されるＮＭＴ１発現のリボスイッチ調節機構。
【図５ａ】図５は、３つの細菌および２３の真菌ＴＰＰリボスイッチアプタマーの配列アラインメントを示す（配列番号５−３０）。強調した領域は、上の矢線図によって示したステムパートナーに対応する。
【図５ｂ】図５は、３つの細菌および２３の真菌ＴＰＰリボスイッチアプタマーの配列アラインメントを示す（配列番号５−３０）。強調した領域は、上の矢線図によって示したステムパートナーに対応する。
【図６】図６は、Ｎ．ｃｒａｓｓａ由来の３つのＴＰＰリボスイッチの配列コンテクストを示す。ＡＵＧは、主な開始コドンを示す。
【００１７】
【化１】
2010521977.tif 000002
は別の開始コドンを示す（主なＯＲＦ中に存在しない）。
【００１８】
【化２】
2010521977.tif 000003
は５’スプライス部位を示す。
【００１９】
【化３】
2010521977.tif 000004
は３’スプライス部位を示す。各遺伝子について、影付きのヌクレオチドはイントロンを示し、イントロンの暗色の影付き領域はＴＰＰアプタマー（配列番号３１−３３）を示す。ＡＧは、配列決定されたスプライシング産物に基づいて使用されないデータベース中に存在するＮＣＵ０１９７７．１の推定３’スプライス部位を示す。ＵＡＧは、スプライシングが起こらない場合に翻訳を終結するＮＣＵ０１９７７．１中の終止コドンを示す。
【図７】図７は、スプライシングにおけるチアミン依存性変化にはＴＰＰリボスイッチが必要であることを示す。３０μＭチアミンの非存在下（−）または存在下（＋）で最小培地中にて増殖したａ、ＦＲＥＱＵＥＮＣＹ（ＦＲＱ）およびｂ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ由来のＮＭＴ１転写物のオルタナティブスプライシングした５’領域のＲＴ−ＰＣＲ分析。各ｍＲＮＡの２つの複製物を示す。以前に報告されたＦＲＱの異なるスプライス形態（ａ、ｂ、およびｃ）は、チアミン処理後に相互比較して数は変化しない。ＦＲＱのＲＴ−ＰＣＲ産物を、プライマー５’−ＣＡＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＧＧＣＡＴＴＧＧＡ（配列番号３４）および５’−ＴＧＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＴＣＡＴＧＡＴＡＣ（配列番号３５）を使用して生成した。産物をアガロースゲル（２％）電気泳動を使用して分離した。「Ｍ」は、１００塩基対単位で増加するＤＮＡを含むサイズマーカーを示す。ＤＮＡを、臭化エチジウム染色およびＵＶ照射によって視覚化した。
【図８ａ】図８は、ＮＭＴ１  ｍＲＮＡへのＴＰＰ結合を示す。ａ、ＮＭＴ１  リボスイッチアプタマーの配列、二次構造、およびＴＰＰ誘導性調整（配列番号３６、１１５  ＮＭＴ１アプタマーを示す）。モデルを、利用可能な原子分解能構造データを反映するように以前に示したモデルから改変した。構築物１９７  ＮＭＴ１は天然のＰ３ステムを含むのに対して（図９）、構築物１１５  ＮＭＴ１中でこのステムの８２ｎｔは欠失している。構造改変部位を、ｂに記載した１１５  ＮＭＴ１のインライン探索（ｐｒｏｂｉｎｇ）によって確立した。配列番号３６のヌクレオチド３０、３１、４３、４４、５４、５６、７１、および９３に一定の切断が見出された。配列番号３６のヌクレオチド１３〜１６、２２、２７、４９〜５３、５５、６３、６５、６９、７７〜８１、８６、および８７に切断の減少が見出された。配列番号３６のヌクレオチド６２、６４、および８８に切断の増加が見出された。ｂ、１１５  ＮＭＴ１のインライン探索分析により、ＴＰＰ誘導性ＲＮＡ構造調整が明らかとなり、その部位１および２を使用してｃにおけるリガンド親和性を定量した。レーンは、反応なし後（ＮＲ）、ＲＮアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｔ１（Ｔ１）を用いた部分消化後、またはアルカリ（−ＯＨ）での部分消化後にロードした前駆体ＲＮＡを含む。Ｕ２Ｇを変化させて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写よる調製を容易にした。ｃ、ｂに示す部位１および２についての自発的に切断したＲＮＡの正規化した比率対ＴＰＰ濃度の対数を示すプロット。
【図８ｂ】図８は、ＮＭＴ１  ｍＲＮＡへのＴＰＰ結合を示す。ａ、ＮＭＴ１  リボスイッチアプタマーの配列、二次構造、およびＴＰＰ誘導性調整（配列番号３６、１１５  ＮＭＴ１アプタマーを示す）。モデルを、利用可能な原子分解能構造データを反映するように以前に示したモデルから改変した。構築物１９７  ＮＭＴ１は天然のＰ３ステムを含むのに対して（図９）、構築物１１５  ＮＭＴ１中でこのステムの８２ｎｔは欠失している。構造改変部位を、ｂに記載した１１５  ＮＭＴ１のインライン探索（ｐｒｏｂｉｎｇ）によって確立した。配列番号３６のヌクレオチド３０、３１、４３、４４、５４、５６、７１、および９３に一定の切断が見出された。配列番号３６のヌクレオチド１３〜１６、２２、２７、４９〜５３、５５、６３、６５、６９、７７〜８１、８６、および８７に切断の減少が見出された。配列番号３６のヌクレオチド６２、６４、および８８に切断の増加が見出された。ｂ、１１５  ＮＭＴ１のインライン探索分析により、ＴＰＰ誘導性ＲＮＡ構造調整が明らかとなり、その部位１および２を使用してｃにおけるリガンド親和性を定量した。レーンは、反応なし後（ＮＲ）、ＲＮアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｔ１（Ｔ１）を用いた部分消化後、またはアルカリ（−ＯＨ）での部分消化後にロードした前駆体ＲＮＡを含む。Ｕ２Ｇを変化させて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写よる調製を容易にした。ｃ、ｂに示す部位１および２についての自発的に切断したＲＮＡの正規化した比率対ＴＰＰ濃度の対数を示すプロット。
【図８ｃ】図８は、ＮＭＴ１  ｍＲＮＡへのＴＰＰ結合を示す。ａ、ＮＭＴ１  リボスイッチアプタマーの配列、二次構造、およびＴＰＰ誘導性調整（配列番号３６、１１５  ＮＭＴ１アプタマーを示す）。モデルを、利用可能な原子分解能構造データを反映するように以前に示したモデルから改変した。構築物１９７  ＮＭＴ１は天然のＰ３ステムを含むのに対して（図９）、構築物１１５  ＮＭＴ１中でこのステムの８２ｎｔは欠失している。構造改変部位を、ｂに記載した１１５  ＮＭＴ１のインライン探索（ｐｒｏｂｉｎｇ）によって確立した。配列番号３６のヌクレオチド３０、３１、４３、４４、５４、５６、７１、および９３に一定の切断が見出された。配列番号３６のヌクレオチド１３〜１６、２２、２７、４９〜５３、５５、６３、６５、６９、７７〜８１、８６、および８７に切断の減少が見出された。配列番号３６のヌクレオチド６２、６４、および８８に切断の増加が見出された。ｂ、１１５  ＮＭＴ１のインライン探索分析により、ＴＰＰ誘導性ＲＮＡ構造調整が明らかとなり、その部位１および２を使用してｃにおけるリガンド親和性を定量した。レーンは、反応なし後（ＮＲ）、ＲＮアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｔ１（Ｔ１）を用いた部分消化後、またはアルカリ（−ＯＨ）での部分消化後にロードした前駆体ＲＮＡを含む。Ｕ２Ｇを変化させて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写よる調製を容易にした。ｃ、ｂに示す部位１および２についての自発的に切断したＲＮＡの正規化した比率対ＴＰＰ濃度の対数を示すプロット。
【図９】図９は、構築物１９７  ＮＭＴ１の伸長したＰ３ステムについての配列およびインライン探索の結果を示す。影付きのヌクレオチドは、１ｍＭまでのＴＰＰの非存在下および存在下の両方で自発的切断を受けるＲＮＡ内の位置を示す（配列番号３７）。
【図１０】図１０は、２６１  ＮＭＴ１  ＲＮＡ構築物のインライン探索分析によって分岐部位で小さな構造変化を明らかにしていることを示す。ａ、５’  ３２Ｐ標識２６１  ＮＭＴ１  ＲＮＡ（ｎｔ１１〜２７０＋ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を容易にするためのさらなる５’Ｇ）を使用して行ったインライン探索アッセイ由来の自発的ＲＮＡ切断産物のＰＡＧＥ分離。バンド強度を定量して、ＲＮＡ構造の１０μＭ  ＴＰＰ媒介性変化した位置を明らかにした。さらなる詳細については、図４および図８の説明を参照のこと。
【図１１】図１１は、ＴＰＰの非存在下での２７３  ＮＭＴ１野生型（ＷＴ）およびＭ９  ＮＭＴ１  ＲＮＡ構築物のインライン探索分析によって第２の５’スプライス部位の相違を明らかにしていることを示す。ａ、表示の５’  ３２Ｐ標識ＷＴおよびＭ９  ２７３  ＮＭＴ１  ＲＮＡ（ｎｔ−７８〜１９５）を使用して行ったインライン探索アッセイ由来の自発的ＲＮＡ切断産物のＰＡＧＥ分離。ｂ、相対バンド強度を決定して、ＷＴと比較したＭ９変異の導入に起因する構造変化の位置を明らかにした。さらなる詳細については、図８および９の説明を参照のこと。ヌクレオチド−１４、−１３、および−１２がＭ９を使用した実質的な自発的切断を示し、ＷＴ構築物と比較して非対合であり得、ヌクレオチド−１３のみがＴＰＰの非存在下で非対合であると予想されることに留意のこと。
【図１２】図１２は、第２の５’スプライス部位の隣接領域と種々の真菌種由来のＮＭＴ１遺伝子のＴＰＰアプタマーとの間のオルタナティブ塩基対合を示す（配列番号３８〜４３および９６〜１０１）。ａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ由来のＮＭＴ１遺伝子の略図。ＴＰＰアプタマーおよび主なＯＲＦの位置と比較した２つのオルタナティブ５’スプライス部位、分岐点、および３’スプライス部位を示す。橙色の影を付けたヌクレオチドは、第２の５’スプライス部位に隣接する配列とアプタマー中の相同領域との間の塩基対合力を示す。ｂ〜ｆ、異なる真菌種由来のＮＭＴ１遺伝子のアプタマーおよびアプタマーの一部に隣接する推定５’スプライス部位を囲む領域の相補配列。オルタナティブ塩基対合力があるアプタマー領域は、主に、Ｐ４およびＰ５ステムの片側に存在するが、いくつかの場合、ループ５およびステムＰ２に伸長することもできる。推定オルタナティブ５’スプライス部位は、アプタマーの５’末端に対して−６と−２４との間の位置に存在する。示したスプライス部位の使用を、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ（図１を参照のこと）およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（ｂ、ＡＢ２２６２８４）由来のＮＭＴ１遺伝子の転写物データによって確認する。いくつかの遺伝子について、コンセンサス配列「ＧＵＡ」後のいくつかの潜在的５’スプライス部位が、相補領域中に見出される。
【図１３ａ】図１３は、Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ＮＣＵ０１９７７．１  ｍＲＮＡ中のＴＰＰリボスイッチによる遺伝子活性化を示す。Ｎ．Ｃｒａｓｓａ増殖培地中の３０μＭチアミンの非存在下または存在下でのＬＵＣ活性（ａ）および天然ＮＣＵ０１９７７．１およびＮＭＴ１転写物のリボスイッチ領域のＲＴ−ＰＣＲ分析（ｂ）。Ｎ．Ｃｒａｓｓａを、ＬＵＣレポーター遺伝子とインフレームで融合した開始コドンを含むＮＣＵ０１９７７．１の５’部分を含む構築物で形質転換し、チアミンの非存在下（−）で一晩増殖させた。次いで、真菌組織を、３０μＭチアミンを含まない（０時間）か含む新鮮な培地に移し、２４時間さらに増殖させた。チアミンの非存在下（−）に増殖させた培養物からいくつかの時点でおよびチアミン添加の２４時間後（＋）にサンプルを採取した。ＬＵＣ活性を、ｔ＝０時間で測定した値に対して正規化した。天然転写物に対してＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。Ｍは１００ｂｐ単位で増加するサイズマーカーを示し、下のバンドは１００ｂｐを示す。チアミン未添加における相当量のスプライシング産物ＩＩＩ−２の存在は、細胞がこれらの条件下でリボスイッチ誘導性スプライシングを主に誘発するのに十分な量のＴＰＰを作製することを示し得る。
【図１３ｂ】図１３は、Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ＮＣＵ０１９７７．１  ｍＲＮＡ中のＴＰＰリボスイッチによる遺伝子活性化を示す。Ｎ．Ｃｒａｓｓａ増殖培地中の３０μＭチアミンの非存在下または存在下でのＬＵＣ活性（ａ）および天然ＮＣＵ０１９７７．１およびＮＭＴ１転写物のリボスイッチ領域のＲＴ−ＰＣＲ分析（ｂ）。Ｎ．Ｃｒａｓｓａを、ＬＵＣレポーター遺伝子とインフレームで融合した開始コドンを含むＮＣＵ０１９７７．１の５’部分を含む構築物で形質転換し、チアミンの非存在下（−）で一晩増殖させた。次いで、真菌組織を、３０μＭチアミンを含まない（０時間）か含む新鮮な培地に移し、２４時間さらに増殖させた。チアミンの非存在下（−）に増殖させた培養物からいくつかの時点でおよびチアミン添加の２４時間後（＋）にサンプルを採取した。ＬＵＣ活性を、ｔ＝０時間で測定した値に対して正規化した。天然転写物に対してＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。Ｍは１００ｂｐ単位で増加するサイズマーカーを示し、下のバンドは１００ｂｐを示す。チアミン未添加における相当量のスプライシング産物ＩＩＩ−２の存在は、細胞がこれらの条件下でリボスイッチ誘導性スプライシングを主に誘発するのに十分な量のＴＰＰを作製することを示し得る。
【図１４ａ】図１４は、ＤＮＡプライマー配列を示す（配列番号４４〜９５）。
【図１４ｂ】図１４は、ＤＮＡプライマー配列を示す（配列番号４４〜９５）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
以下の特定の実施形態の詳細な記載およびそこに含まれる実施例、ならびに添付の図面および前および後の記載を参照して、開示の方法および組成物をより容易に理解することができる。
【００２１】
伝令ＲＮＡは、典型的には、タンパク質または小さなＲＮＡ調節因子によって、および翻訳過程の間のリボゾームによって作用する遺伝子情報の受動的キャリアと考えられている。一定のｍＲＮＡが天然のアプタマードメインを保有し、これらのＲＮＡドメインへの特異的代謝産物の直接結合によって遺伝子発現が調整されることが発見された。天然リボスイッチは、典型的には天然ＲＮＡと関連しない２つの驚くべき機能を示す。第１に、ｍＲＮＡエレメントは異なる構造状態を採用することができ、一方の構造は、その標的代謝産物の正確な結合ポケットとしての機能を果たす。第２に、構造状態間の代謝産物誘導性アロステリック相互交換により、いくつかの異なる機構のうちの１つによって遺伝子発現レベルが変化する。リボスイッチを、典型的には、以下の２つの個別のドメインに分けることができる：１つは標的に選択的に結合するドメイン（アプタマードメイン）および他方は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン（発現プラットフォーム）。これらの２ドメイン間の動的相互作用により遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節される。
【００２２】
異なるクラスのリボスイッチが同定されており、活性化化合物（本明細書中でトリガー分子と呼ぶ）を選択的に認識することが示されている。例えば、補酵素Ｂ１２、グリシン、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、およびフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）は、これらの化合物の代謝経路または輸送経路における重要な酵素をコードする遺伝子中に存在するリボスイッチを活性化する。各リボスイッチクラスのアプタマードメインは、高度に保存されたコンセンサス配列および構造に適合する。したがって、配列相同性検索を使用して、関連するリボスイッチドメインを同定することができる。リボスイッチドメインは、細菌、古細菌、および真核生物由来の種々の生物で発見されている。
【００２３】
１１種のリボスイッチの構造クラスが１０種の異なる代謝産物を感知する真正細菌で報告されている（Ｍａｎｄａｌ  ２００４；Ｗｉｎｋｌｅｒ  ２００５；Ｂｒｅａｋｅｒ  ２００６；Ｆｕｃｈｓ  ２００６；Ｒｏｔｈ）。キューオシン（ｑｕｅｕｏｓｉｎｅ）前駆体ｐｒｅＱ１に選択性を示す真正細菌リボスイッチは、通常、異常に小さなアプタマードメインを含み（Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００７））、多数の他のクラスは現在特徴づけられているところである。各リボスイッチのアプタマードメインは、そのヌクレオチド配列（Ｒｏｄｉｏｎｏｖ  ２００２；Ｖｉｔｒｅｓｃｈａｋ  ２００２；Ｖｉｔｒｅｓｃｈａｋ  ２００３）および折り畳まれた構造（Ｎａｈｖｉ  ２００４；Ｂａｔｅｙ  ２００４；Ｓｅｒｇａｎｏｖ  ２００４；Ｍｏｎｔａｎｇｅ  ２００６；Ｔｈｏｒｅ  ２００６；Ｓｅｒｇａｎｏｖ  ２００６；Ｅｄｗａｒｄｓ  ２００６）によって識別され、これらは、遠縁の生物間でさえも依然として高度に保存されている。発現プラットフォームは、配列、構造、および調節機構が広範に異なり得るにもかかわらず、リボスイッチは、通常、アプタマーによる代謝産物結合に応答して遺伝子発現を調整する発現プラットフォームを含む。
【００２４】
例外的なアプタマー保存レベルにより、バイオインフォマティクスを使用して多様な生物中の類似の代表的なリボスイッチを同定することができる。現在、ＴＰＰリボスイッチアプタマーコンセンサスに従う配列のみが、３つ全ての生物の領域で同定されている（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００３）。真菌（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００３；Ｇａｌａｇａｎ  ２００５）（図５）および植物由来のいくつかの予想される真核生物ＴＰＰアプタマーがＴＰＰに結合することが示されているにもかかわらず（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００３Ｙａｍａｕｃｈｉ）、代謝産物結合が遺伝子発現を調節する正確な機構は知られていなかった。真菌では、各ＴＰＰアプタマーは、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）またはタンパク質コード領域中のイントロン内に存在し、これは、ｍＲＮＡスプライシングが代謝産物結合によって調節されることを意味する（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ２００３；Ｋｕｂｏｄｅｒａ  ２００３）。
【００２５】
Ａ．リボスイッチＲＮＡの一般的構成
細菌リボスイッチＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの主なコード領域の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）内に主に存在する遺伝子調節エレメントである。構造探索研究（以下でさらに考察）により、リボスイッチエレメントは一般に以下の２つのドメインから構成されることが明らかである：リガンド結合ドメインとしての機能を果たす天然のアプタマー（Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，８２０；Ｌ．Ｇｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，６４，７６３）および遺伝子発現に関与するＲＮＡエレメント（例えば、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）エレメント；転写終結ステム）を妨害する「発現プラットフォーム」である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したアプタマードメインが発現プラットフォームの非存在下で適切なリガンドに結合するという観察から、これらの結論を導いている（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２、３、および６を参照のこと）。さらに、構造探索調査により、ほとんどのリボスイッチのアプタマードメインが個別に試験した場合に特定の二次構造および三次構造の折り畳みを採用し、全５’リーダーＲＮＡの関係において試験した場合にアプタマー構造と本質的に同一であることが示唆される。これは、多くの場合、アプタマードメインが発現プラットフォームと無関係に折り畳まれるモジュラー単位であることを示す（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２、３、および６を参照のこと）。
【００２６】
最終的に、アプタマードメインのリガンド結合状態または非結合状態は発現プラットフォームを介して解釈され、それは遺伝子発現の際に影響を及ぼす。モジュラーエレメントとしてのリボスイッチの投影は、アプタマードメインが種々の生物の間（およびＴＰＰリボスイッチについて認められるように、界の間でさえも）で高度に保存されるのに対して（Ｎ．Ｓｕｄａｒｓａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  ２００３，９，６４４）、発現プラットフォームは、付加された読み取り枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｌａｍｅ）の発現が調節される配列、構造、および機構で変化するという事実によってさらに支持される。例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｔｅｎＡ  ｍＲＮＡのＴＰＰリボスイッチへのリガンド結合によって転写が終結する（Ａ．Ｓ．Ｍｉｒｏｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ２００２，１１１，７４７）。この発現プラットフォームは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｔｈｉＭ  ｍＲＮＡ中のＴＰＰリボスイッチの発現プラットフォームと比較して配列および構造が異なり、ＴＰＰ結合はＳＤ遮断機構によって翻訳を阻害する（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２を参照のこと）。ＴＰＰアプタマードメインは容易に認識可能であり、これらの２つの転写単位の間で機能的特徴がほぼ同一であるが、これらを実施する遺伝子調節機構および発現プラットフォームは非常に異なる。
【００２７】
リボスイッチＲＮＡのアプタマードメインは、典型的には、約７０〜１７０ｎｔ長の範囲である（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の図１１）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化実験でかなりより短く構造が複雑である多種多様な小分子結合アプタマーが同定されたことを考慮すると、この観察はいくらか予想外であった（Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，８２０；Ｌ．Ｇｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，６４，７６３；Ｍ．Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９，９，３２４）。人工アプタマーと比較した天然アプタマー配列の複雑さおよび情報量の実質的増加についての理由が依然として証明されていないにもかかわらず、この複雑さは、高い親和性および選択性で機能するＲＮＡ受容体を形成するのに必要であるとみられる。リガンド−リボスイッチ複合体の見かけ上のＫＤ値は、低ナノモル（ｎａｎｏｍｏｌａｒ）から低マイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）までの範囲である。いくつかのアプタマードメインは、追加発現プラットフォームから単離した場合、インタクトなリボスイッチよりも改良された標的リガンドに対する親和性を示す（約１０〜１００倍）ことも注目に値する（米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２を参照のこと）。おそらく、完全にインタクトなリボスイッチＲＮＡによって必要とされる複数の異なるＲＮＡ高次構造のサンプリングにはエネルギーコストがかかり、リガンド親和性の喪失が反映される。アプタマードメインは分子スイッチとしての機能を果たさなければならないので、これは、天然のアプタマーに対する機能的要求を付加することもでき、この付加は、そのより精巧な構造を合理化するのに役立ち得る。
【００２８】
Ｂ．ＴＰＰリボスイッチ
補酵素チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）は、ビタミンＢ１（多数のタンパク質触媒反応での不可欠な関連物質（ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔ））の活性形態である。３つ全ての生物の領域（細菌、植物、および真菌が含まれる）は、チアミンおよびそのリン酸化誘導体の移入または合成を担う遺伝子を調節するためのＴＰＰ感知リボスイッチを使用する。このことがこのリボスイッチクラスを代謝産物感知ＲＮＡ調節系の最も広範に分布したメンバーにしている。構造により、折り畳まれたＲＮＡが明らかになり、このＲＮＡは、一方のサブドメインがＴＰＰの４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジン部分のための挿入ポケットを形成するのに対して、他方のサブドメインがリガンドのピロリン酸部分と接触して架橋する２価の金属イオンおよび水分子を使用するより広いポケットを形成する。２つのポケットは、広がった高次構造中のＴＴＰを認識する分子測定デバイスとして機能するように配置される。中央のチアゾール部分はＲＮＡによって認識されず、このことは、何故抗菌化合物であるピリチアミンピロリン酸がこのリボスイッチを標的にして、チアミン代謝遺伝子の発現を下方制御するのかを説明している。天然のリガンドおよびその薬物様アナログの両方は、リボスイッチによって利用される二次構造エレメントおよび三次構造エレメントを安定化して、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の合成を調整する。さらに、この構造により、どのようにして折り畳まれたＲＮＡがタンパク質遺伝因子によって形成される結合ポケットと競合する正確な結合ポケットを形成することができるのかについての実態が提供される。
【００２９】
３つのＴＰＰリボスイッチを糸状菌Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａにおいて試験し、ｍＲＮＡスプライシングの調節によって遺伝子発現を１つが活性化し、２つが抑制することが見出された。ＴＰＰ代謝に関与するタンパク質をコードする前駆体ＮＭＴ１  ｍＲＮＡについてのリボスイッチ媒介性塩基対合の変化およびオルタナティブスプライシング調節に関与する詳細な機構が解明された（実施例１）。これらの結果は、真核細胞が重要な生化学過程の調節に重要なＲＮＡスプライシング事象を調節するために代謝産物結合ＲＮＡを使用することを証明する。ＴＰＰリボスイッチは、米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号（その全体が本明細書中で援用され、特に、ＴＴＰリボスイッチの構造、機能、および使用におけるその記載のための参考としても援用される）にも記載されている。米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の任意の主題および記載ならびに、特に、米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号のＴＴＰリボスイッチの構造、機能、および使用の任意の記載を、本明細書中に開示の他の主題に含めるか排除することができることを特に意図する。
【００３０】
他で特定しない限り、開示の方法および組成物は、特定の合成方法、特定の分析技術、または特定の試薬に制限されず、それ自体、変化することができると理解するべきである。本明細書中で使用した専門用語は特定の実施形態のみを記載することを目的とし、制限することを意図しないとも理解するべきである。
【００３１】
材料
開示の方法および組成物のために使用することができるか、これらと併せて使用することができるか、これらの調製で使用することができるか、または、これらの生成物である、材料、組成物、および成分を開示する。これらおよび他の材料を本明細書中に開示し、特にこれらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などを開示する場合、これらの化合物の種々の個々および集合的組み合わせおよび順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）のそれぞれに関する特別な言及は明確に開示できず、それぞれ、本明細書中で具体的に意図および記載されると理解される。例えば、リボスイッチまたはアプタマードメインを開示および考察し、多数の分子（リボスイッチまたはアプタマードメインが含まれる）に作製することができる多数の改変物を考察する場合、それとは反対であると具体的に示されない限り、リボスイッチまたはアプタマードメインおよび可能な改変物の各々および全ての組み合わせおよび順列を特に意図する。したがって、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスを開示し、ならびに分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラス、および組み合わせ分子の例（Ａ−Ｄ）も開示する場合、各々を個別に引用しない場合でさえも、各々を個別または集合的に意図する。したがって、この例では、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆの各組み合わせを特に意図し、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；ならびに組み合わせ例Ａ−Ｄの開示から開示されると見なすべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも特に意図および開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅの下位集団（ｓｕｂ−ｇｒｏｕｐ）を特に意図し、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；および組み合わせ例Ａ−Ｄの開示から開示されると見なすべきである。この概念を、本出願の全局面（開示の組成物を作製および使用する方法における工程が含まれるが、これらに限定されない）に適用する。したがって、実施することができる種々のさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる工程の各々を開示の方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを使用して実施することができ、それぞれのかかる組み合わせが特に意図され、開示されると見なすべきであると理解される。
【００３２】
Ａ．リボスイッチ
リボスイッチは、発現するＲＮＡ分子の一部であり、トリガー分子によって結合した場合に状態が変化する発現調節エレメントである。リボスイッチを、典型的には、以下の２つの個別のドメインに分けることができる：１つは標的に選択的に結合するドメイン（アプタマードメイン）および他は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン（発現プラットフォームドメイン）である。遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節されるこれらの２ドメイン間の動的相互作用がもたらされる。単離および組換えリボスイッチ、かかるリボスイッチを含む組換え構築物、かかるリボスイッチに作動可能に連結された非相同配列、かかるリボスイッチを保有する細胞およびトランスジェニック生物、リボスイッチ組換え構築物、ならびに非相同配列に作動可能に連結されたリボスイッチを開示する。非相同配列は、例えば、目的のタンパク質またはペプチド（レポータータンパク質またはペプチドが含まれる）をコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは、天然に存在するリボスイッチであり得るか、これに由来し得る。例えば、アプタマードメインは、天然に存在するリボスイッチのアプタマードメインであり得るか、これに由来し得る。リボスイッチは、人工アプタマーを含むか、任意選択的に排除することができる。例えば、人工アプタマーには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択を介してデザインまたは選択されるアプタマーが含まれる。リボスイッチは、天然に存在するリボスイッチのコンセンサス配列を含むことができる。種々のリボスイッチのコンセンサス配列は、米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号に記載されている（図１１中など）。
【００３３】
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同である、調節可能な遺伝子発現構築物を本明細書中に開示する。リボスイッチは、ＲＮＡのオルタナティブスプライシングを調節することができる。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。ＲＮＡはイントロンをさらに含むことができ、発現プラットフォームドメインはイントロン中またはイントロンの末端（すなわち、５’スプライスジャンクションまたは３’スプライスジャンクション）にオルタナティブスプライスジャンクションを含む。ＲＮＡはイントロンをさらに含むことができ、発現プラットフォームドメインはイントロン中に分岐部位を含む。オルタナティブスプライスジャンクションは、リボスイッチが活性化される場合、または活性化されない場合に活性であり得る。リボスイッチを、トリガー分子（チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）など）によって活性化することができる。リボスイッチはＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。
【００３４】
リボスイッチは、ＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。例えば、リボスイッチの活性化により、オルタナティブスプライシングを許容または促進するか、スプライシングまたは優勢スプライシング（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｔｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）を防止または減少するか、オルタナティブスプライシングを防止または減少させるか、スプライシングまたは優勢スプライシングを許容または促進することができる。他の例として、非活性リボスイッチまたはリボスイッチの非活性化により、オルタナティブスプライシングを許容または促進するか、スプライシングまたは優勢スプライシングを防止または減少するか、オルタナティブスプライシングを防止または減少するか、スプライシングまたは優勢スプライシングを許容または促進することができる。一般に、スプライシング調節形態を、ＲＮＡ分子中のスプライスジャンクション、オルタナティブスプライスジャンクション、および分岐部位に対するリボスイッチの物理的関係によって決定することができる。例えば、リボスイッチの活性化／非活性化は、一般に、ＲＮＡにおけるオルタナティブ二次構造（例えば、塩基対合ステム）の形成および／または破壊を含み、この構造変化を使用して、機能的ＲＮＡ配列を隠すか露呈することができる。リボスイッチの発現プラットフォームドメインは、一般に、かかる機能的ＲＮＡ配列を含む。したがって、例えば、リボスイッチが活性化または非活性化されるかその逆の場合にスプライスジャンクションまたは分岐部位が交互に隠れるか露呈されるような方法でリボスイッチの発現プラットフォームドメイン中にスプライスジャンクション（ｓｌｉｃｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）または分岐配列を含めることによって、ＲＮＡのスプライシングを調節するか、影響を及ぼすことができる。
【００３５】
リボスイッチは、スプライシングを活性化または抑制することができる。「スプライシングを活性化する」は、リボスイッチが直接的または間接的のいずれかでＲＮＡに作用してスプライシングを起こさせることを意味する。これは、例えば、任意のスプライシングを起こさせること（スプライスなしに対する１つのスプライスなど）またはオルタナティブスプライシングを起こさせることを含み得る。これは、リボスイッチなしで起こるスプライシング事象数と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％またはそれを超えるスプライシングを増加することができる。
【００３６】
「スプライシングを抑制する」は、リボスイッチが直接的または間接的のいずれかでＲＮＡに作用してスプライシングを抑制することを意味する。これは、例えば、任意のスプライシングの開始防止またはスプライシングの開始の減少（１つのスプライスに対するスプライスなしなど）またはオルタナティブスプライシングの開始の防止または減少を含み得る。これは、リボスイッチなしで起こるオルタナティブスプライシング事象数と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％のオルタナティブスプライシングを減少させることができる。
【００３７】
リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを活性化または抑制することができる。「オルタナティブスプライシングを活性化する」は、リボスイッチが直接的または間接的のいずれかでＲＮＡに作用してオルタナティブスプライシングを起こさせることを意味する。これは、リボスイッチなしで起こるオルタナティブスプライシング事象数と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％またはそれを超えるオルタナティブスプライシングを増加することができる。
【００３８】
「オルタナティブスプライシングを抑制する」は、リボスイッチが直接的または間接的のいずれかでＲＮＡに作用してオルタナティブスプライシングを抑制することを意味する。これは、リボスイッチなしで起こるオルタナティブスプライシング事象数と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％のオルタナティブスプライシングを減少させることができる。
【００３９】
リボスイッチは、ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現に影響を及ぼすことができる。例えば、スプライシングまたはオルタナティブスプライシングの調節により、ＲＮＡが翻訳される能力に影響を与え得、コード領域を変化させる、または翻訳の開始または終結を変化させることができる。オルタナティブスプライシングは、例えば、開始コドンまたは終止コドン（または両方）を通常はプロセシングした転写物中に存在しないプロセシングした転写物中に出現させることができる。別の例として、オルタナティブスプライシングにより、通常の開始コドンまたは終止コドンを、プロセシングした転写物から除去することができる。ＲＮＡによってコードされたタンパク質発現を調節するためのリボスイッチ調節スプライシングの有用な使用様式は、リボスイッチをＲＮＡの５’非翻訳領域中のイントロンに導入し、イントロン中の開始コドンがオルタナティブスプライシングされたＲＮＡ中の第１の開始コドンであるようにイントロン中に開始コドンを含めるかこれを使用することである。ＲＮＡによってコードされたタンパク質発現を調節するためのリボスイッチ調節スプライシングの別の有用な使用様式は、リボスイッチをＲＮＡの５’非翻訳領域中のイントロンに導入し、読み取り枠がオルタナティブスプライシングされたＲＮＡ中に最初に出現するようにイントロン中に短い読み取り枠を含めるかこれを使用することである。
【００４０】
ＲＮＡ分子は、分岐構造を有することができる。例えば、ＴＰＰリボスイッチでは（実施例１）、ＴＰＰ濃度が低い場合、新規に転写されたｍＲＮＡは第２の５’スプライス部位を塞ぐ構造を採用する一方で、スプライシングに利用可能な分岐部位を遊離する。５’スプライス部位由来のｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングにより、ｍＲＮＡのＩ−３形態が産生され、ＮＭＴ１タンパク質が発現される。ＴＰＰ濃度が高い場合、ＴＰＰアプタマーへのリガンド結合により、ＲＮＡ折り畳みがアロステリックに変化して第２の５’スプライス部位付近の構造可塑性が増加し、分岐部位付近のヌクレオチドが塞がれる。
【００４１】
スプライス調節を有するアプタマー領域は、例えば、Ｐ４およびＰ５ステム中に存在することができる。オルタナティブスプライシング調節を有するアプタマー領域はまた、例えば、ループ５中およびステムＰ２中に見出すことができる。スプライス部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−６〜−２４の間の位置に存在することができる。したがって、例えば、発現プラットフォームドメインは、Ｐ４およびＰ５配列、ループ５配列、および／またはＰ２配列と相互作用することができる。かかるアプタマー配列は、一般に、トリガー分子がアプタマードメインに結合しない場合に限り、発現プラットフォームドメインとの相互作用に利用可能である。スプライス部位は、配列ＧＵＡに続くことができる。実施例１でリボスイッチ上のアプタマーの特異的位置を考察する。
【００４２】
多数の細菌リボスイッチについて、代謝産物結合により、タンパク質を含まないアプタマーの下流に存在する発現プラットフォームの折り畳みを変化させる（Ｗｉｎｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｍｉｒｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｓｅｒｇａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００６））。オルタナティブスプライシングを調節するＴＰＰリボスイッチ中のこれを評価するために、ＮＭＴ１  ＴＰＰリボスイッチによるスプライシング調節がアプタマー側面のタンパク質非依存性構造調整に起因するかどうかを決定するために試験した。ＮＭＴ１  ＵＴＲ構築物を、インライン探索に供した（Ｓｏｕｋｕｐ  ＆  Ｂｒｅａｋｅｒ（１９９９））。興味深いことに、ＴＰＰの添加により、分岐部位のヌクレオチドがより構造化するようになり（図１０）、第２の５’スプライス部位により可塑性の高い構造が得られる（図４ａ）。さらに、アプタマーのＰ４およびＰ５エレメントの１２ヌクレオチドが、リガンドが存在しない場合に構造的に配列決定される第２の５’スプライス部位のほとんどのヌクレオチドと相補的であることが認められた（図４ｂ）。Ｐ４およびＰ５エレメントは、ＴＰＰのピロリン酸部分の認識に必要である。したがって、ＴＰＰ結合および５’スプライス部位の閉塞は相互に排他的である（実施例１）。
【００４３】
開示のリボスイッチ（その誘導体および組換え形態が含まれる）は、一般に、任意の供給源（天然に存在するリボスイッチおよびｄｅ  ｎｏｖｏでデザインしたリボスイッチが含まれる）に由来し得る。任意のかかるリボスイッチは、これらがオルタナティブスプライシングを調節すると決定されている限り、開示の方法で使用するか開示の方法と共に使用することができる。しかし、異なるリボスイッチ型を定義することができ、いくつかのかかるサブタイプは、特定の方法で有用であるか、特定の方法と共に有用であり得る（一般に、本明細書中の他所に記載）。リボスイッチ型には、例えば、天然に存在するリボスイッチ、天然に存在するリボスイッチの誘導体および改変形態、キメラリボスイッチ、および組換えリボスイッチが含まれる。天然に存在するリボスイッチは、天然で見出されるリボスイッチの配列を有するリボスイッチである。かかる天然に存在するリボスイッチは、天然で起こる天然に存在するリボスイッチの単離形態または組換え形態であり得る。すなわち、リボスイッチは、同一の一次構造を有するが、新規の遺伝子または核酸状況で単離または操作されている。キメラリボスイッチを、例えば、任意のリボスイッチのまたは特定のクラスもしくは型のリボスイッチのリボスイッチの一部および同一のリボスイッチのまたは任意の異なるクラスもしくは型のリボスイッチの異なるリボスイッチの一部；任意のリボスイッチのまたは特定のクラスもしくは型のリボスイッチのリボスイッチの一部および任意の非リボスイッチ配列または成分で構成することができる。組換えリボスイッチは、新規の遺伝子または核酸状況で単離または操作されているリボスイッチである。
【００４４】
リボスイッチは、１つまたは複数のアプタマードメインを有することができる。複数のアプタマードメインを有するリボスイッチ中のアプタマードメインは、トリガー分子の協同的結合を示すことができるか、トリガー分子の協同的結合を示すことができない（すなわち、アプタマーは協同的結合を示す必要がない）。後者の場合、アプタマードメインは、非依存性結合剤であるということができる。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、１つまたは複数の発現プラットフォームドメインを有することができる。例えば、トリガー分子の協同的結合を示す２つのアプタマードメインを有するリボスイッチを、両方のアプタマードメインによって調節される１つの発現プラットフォームドメインに連結することができる。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、リンカーを介して結合した１つまたは複数のアプタマーを有することができる。かかるアプタマーがトリガー分子の協同的結合を示す場合、リンカーは協同的リンカーであり得る。
【００４５】
ｘとｘ−１との間のヒル係数ｎを有する場合（ｘは、協同的結合について分析されるアプタマードメイン数（またはアプタマードメイン上の結合部位数）である）、アプタマードメインは協同的結合を示すということができる。したがって、例えば、リボスイッチが２と１との間のヒル係数を有する場合、２つのアプタマードメインを有するリボスイッチ（グリシン応答性リボスイッチなど）は協同的結合を示すということができる。使用した値ｘが協同的結合について分析したアプタマードメイン数（必ずしもリボスイッチ中のアプタマードメインの存在数ではない）に依存すると理解すべきである。一部のみしか協同的結合を示さない場合にリボスイッチが複数のアプタマードメインを有することができるので、これは理解される。
【００４６】
非相同アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むキメラリボスイッチを開示する。すなわち、キメラリボスイッチは、ある供給源由来のアプタマードメインおよび別の供給源由来の発現プラットフォームドメインから構成される。非相同供給源は、例えば、異なる特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。非相同アプタマーは、非リボスイッチアプタマーにも由来し得る。非相同発現プラットフォームドメインは、非リボスイッチ供給源にも由来し得る。
【００４７】
改変リボスイッチまたは誘導体リボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択および進化技術を使用して産生することができる。一般に、リボスイッチに適用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化技術は、リボスイッチ配列の一部が変化している一方で、リボスイッチの他の部分が一定に保持されている改変（ｖａｒｉａｎｔ）リボスイッチ組の産生を含む。次いで、改変リボスイッチ組の活性化、非活性化、または遮断（または他の機能的もしくは構造的基準）を評価することができ、目的の基準を満たす改変リボスイッチを使用またはさらなる進化ラウンドのために選択する。改変体生成に有用な基盤リボスイッチは、本明細書中に開示の特異的およびコンセンサスリボスイッチである。コンセンサスリボスイッチを使用して、どのリボスイッチ部分がｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択および進化のために変化するかについての情報を提供することができる。
【００４８】
調節が変化した改変リボスイッチも開示する。リボスイッチの調節を、リボスイッチ（キメラリボスイッチである）の発現プラットフォームドメインへのアプタマードメインの作動可能な連結によって変化させることができる。次いで、アプタマードメインは、例えば、アプタマードメインのためのトリガー分子の作用によってリボスイッチの調節を媒介することができる。アプタマードメインを、任意の適切な様式で（例えば、リボスイッチの通常または天然のアプタマードメインの新規のアプタマードメインとの置換によるものが含まれる）、リボスイッチの発現プラットフォームドメインに作動可能に連結することができる。一般に、アプタマードメインが由来するリボスイッチを活性化、誘導体化、または遮断することができる任意の化合物または条件を使用して、キメラリボスイッチを活性化、誘導体化、または遮断することができる。
【００４９】
不活化リボスイッチも開示する。リボスイッチの共有結合の変化（例えば、リボスイッチの一部の架橋または化合物のリボスイッチへのカップリング）によってリボスイッチを不活化することができる。この様式でのリボスイッチの不活化は、例えば、リボスイッチに対しトリガー分子の結合を防止するか、トリガー分子の結合の際にリボスイッチの状態の変化を防止するか、リボスイッチの発現プラットフォームドメインがトリガー分子の結合の際に発現に影響を及ぼすのを防止する変化に起因し得る。
【００５０】
バイオセンサーリボスイッチも開示する。バイオセンサーリボスイッチは、その同系のトリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを産生する操作リボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、閾値レベルまたは閾値レベルを超えるトリガー分子で誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかシグナル産生に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結されたバイオセンサーリボスイッチを、細胞または生物にリボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を保有させるように操作することによってｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むリボスイッチである。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチからの或いはそれに由来するアプタマードメインを使用する。バイオセンサーリボスイッチを、種々の状況およびプラットフォームで使用することができる。例えば、バイオセンサーリボスイッチを、固体支持体（プレート、チップ、ストリップ、およびウェルなど）と共に使用することができる。
【００５１】
新規のトリガー分子を認識する改変リボスイッチまたは誘導体リボスイッチも開示する。新規のトリガー分子を認識する新規のリボスイッチおよび／または新規のアプタマーを、公知のリボスイッチのために選択するか、公知のリボスイッチからデザインするか、公知のリボスイッチから誘導することができる。例えば、リボスイッチ中のアプタマー改変体組を産生する工程、目的の化合物の存在下での改変リボスイッチの活性化を評価する工程、活性化された改変リボスイッチ（または、例えば、最高にまたは最も選択的に活性化されたリボスイッチ）の選択、および所望の活性、特異性、活性と特異性との組み合わせ、または特性の他の組み合わせの改変リボスイッチが得られるまでこれらの工程を繰り返すことによってこれを行うことができる。
【００５２】
一般に、発現プラットフォームドメイン中の調節された鎖をアプタマードメインの調節鎖に相補的であるようにデザインまたは適合させることによって、任意のアプタマードメインを任意の発現プラットフォームドメインと共に使用するために適合させることができる。あるいは、調節鎖が発現プラットフォーム中の機能的に重要な配列に相補的であるように、アプタマーの配列およびアプタマードメインの調節鎖を適合させることができる。
【００５３】
非相同リボスイッチおよびコード領域を含むＲＮＡ分子を開示する。すなわち、かかるＲＮＡ分子は、ある供給源由来のリボスイッチおよび別の供給源由来のコード領域から構成される。非相同供給源は、例えば、異なるＲＮＡ分子、異なる転写物、異なる遺伝子由来のＲＮＡまたは転写物、異なる細胞由来のＲＮＡまたは転写物、異なる生物由来のＲＮＡまたは転写物、異なる種由来のＲＮＡまたは転写物、天然の配列および人工または操作された配列、特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。
【００５４】
本明細書中に開示する場合、用語「コード領域」は、アミノ酸をコードする核酸の任意の領域をいう。これは、コドンまたはコドンのテンプレートを含む核酸鎖および二本鎖核酸分子の場合のかかる核酸鎖の相補物の両方を含むことができる。コード領域でない核酸領域を、非コード領域ということができる。転写される伝令ＲＮＡ分子は、典型的には、５’末端および３’末端の両方に非コード領域を含む。真核生物ｍＲＮＡ分子は、イントロンなどの内部非コード領域も含むことができる。いくつかのＲＮＡ分子型は、ｔＲＮＡ分子およびｒＲＮＡ分子などの機能的コード領域を含まない。
【００５５】
１．アプタマードメイン
アプタマーは、特定の化合物および化合物クラスに選択的に結合することができる核酸セグメントおよび構造である。リボスイッチは、トリガー分子の結合の際にリボスイッチの状態または構造が変化するアプタマードメインを有する。機能的リボスイッチでは、アプタマードメインに連結した発現プラットフォームドメインの状態または構造は、トリガー分子がアプタマードメインに結合した場合に変化する。リボスイッチのアプタマードメインは、任意の供給源（例えば、天然リボスイッチのアプタマードメイン、人工アプタマー、操作された、選択された、進化した、または誘導されたアプタマーまたはアプタマードメインが含まれる）に由来し得る。リボスイッチ中のアプタマーは、一般に、ステム構造の形成などによって連結した発現プラットフォームドメイン部分と相互作用することができる少なくとも１つの部分を有する。このステム構造は、トリガー分子の結合の際に形成されるか破壊されるかのいずれかである。
【００５６】
種々の天然リボスイッチのコンセンサスアプタマードメインを、米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号の図１１および本明細書中の他所に示す。これらのアプタマードメイン（本明細書中に具体化された全てのダイレクト改変体（ｄｉｒｅｃｔ  ｖａｒｉａｎｔ）が含まれる）を、リボスイッチ中で使用することができる。コンセンサス配列および構造は、配列および構造の変形を示す。示した変形内のアプタマードメインを本明細書中でダイレクト改変体という。これらのアプタマードメインを、改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）または改変（ｖａｒｉａｎｔ）アプタマードメインが産生されるように改変することができる。保存的改変には、対の中のヌクレオチドが相補性を維持するような塩基対合ヌクレオチドの任意の変化が含まれる。中等度の改変には、示した長さ範囲の２０％以下のまたは等しい（長さまたは長さの範囲を示す）ステムまたはループの長さの変化が含まれる。コンセンサス構造が特定の長さのステムまたはループを示す場合、または、長さの範囲が列挙または表示される場合、ループおよびステムの長さを、「示す」と見なす。中等度の改変には、示した長さ範囲の４０％以下のまたは等しい（長さまたは長さの範囲を示さない）ステムまたはループの長さの変化が含まれる。中等度の改変には、アプタマードメインの非特定部分の機能的改変体も含まれる。
【００５７】
開示のリボスイッチのアプタマードメインを、任意の他の目的、および任意の他の状況のためにアプタマーとして使用することもできる。例えば、アプタマーを使用して、リボザイム、他の分子スイッチ、および構造の変化がＲＮＡの機能に影響を及ぼし得る任意のＲＮＡ分子を調節することができる。
【００５８】
２．発現プラットフォームドメイン
発現プラットフォームドメインは、リボスイッチを含むＲＮＡ分子の発現に影響を及ぼすリボスイッチの一部である。発現プラットフォームドメインは、一般に、ステム構造の形成などによって連結したアプタマードメインの一部と相互作用することができる少なくとも１つの部分を有する。このステム構想は、トリガー分子の結合の際に形成されるか破壊されるかのいずれかである。ステム構造は、一般に、発現調節構造を形成するか、これの形成を防止するかのいずれかである。発現調節構造は、構造を含むＲＮＡ分子の発現を許容するか、防止するか、増強するか、阻害する構造である。例には、シャイン−ダルガルノ配列、開始コドン、転写ターミネーター、および安定性シグナル、ならびにプロセシングシグナル（ＲＮＡスプライシングジャンクションおよび調節エレメントなど）が含まれる。スプライシング調節のために、スプライスジャンクション、オルタナティブスプライスジャンクション、および／またはイントロンの分岐部位を発現プラットフォームドメイン中に含めることが有用である。プラットフォーム発現ドメインのリボスイッチのアプタマードメイン中の配列との相互作用を、発現プラットフォームドメインとアプタマードメインとの間の相補配列によって媒介することができる。
【００５９】
Ｂ．トリガー分子
トリガー分子は、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物である。これには、リボスイッチの天然または通常のトリガー分子およびリボスイッチを活性化することができる他の化合物が含まれる。天然または通常のトリガー分子は、所与の天然のリボスイッチのためのトリガー分子であるかまたはいくつかの非天然リボスイッチの場合、リボスイッチがデザインされるためのトリガー分子か、それと共にリボスイッチが選択される（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択技術またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化技術など）トリガー分子である。
【００６０】
Ｃ．化合物
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物およびかかる化合物を含む組成物も開示する。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。化合物を使用して、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる。リボスイッチのトリガー分子（ならびに他の活性化化合物）を使用して、リボスイッチを活性化することができる。トリガー分子以外の化合物を使用して、一般に、リボスイッチを非活性化または遮断することができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチの存在からのトリガー分子の除去によって非活性化することもできる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチを活性化しないトリガー分子のアナログの結合によって遮断することができる。
【００６１】
ＲＮＡ分子がリボスイッチを含む、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変化させるための化合物も開示する。化合物のＲＮＡ分子との接触によってこれを行うことができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。したがって、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する条件に応じたリボスイッチを含む目的のＲＮＡ分子を供して、ＲＮＡの発現を変化させるために使用することができる。例えば、転写の終結またはＲＮＡへのリボゾーム結合遮断の結果として発現を変化させることができる。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質に応じて、ＲＮＡ分子の発現を減少または防止することができるか、ＲＮＡ分子の発現を促進または増加することができる。ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を調節するための化合物も開示する。リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってリボスイッチを含む天然に存在する遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための化合物も開示する。遺伝子がこの遺伝子を保有する細胞または生物の生存に不可欠である場合、リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断により、細胞または生物が死滅、静止、または衰弱し得る。
【００６２】
リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってリボスイッチを含む単離遺伝子、操作遺伝子、もしくは組換え遺伝子またはＲＮＡの発現を調節するための化合物も開示する。本明細書中に開示のリボスイッチがオルタナティブスプライシング、活性化、非活性化、または遮断を調節するので、リボスイッチは遺伝子発現を調節することができる。かかる調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の一次調節（ｃｏｎｔｒｏｌ）としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチトリガー分子が小さな非抗原性分子であり得ることである。
【００６３】
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物を同定する方法も開示する。例えば、リボスイッチを活性化する化合物を、試験化合物とリボスイッチとの接触させる工程およびリボスイッチの活性化を評価する工程によって同定することができる。リボスイッチが活性化される場合、試験化合物を、リボスイッチを活性化する化合物と同定する。リボスイッチの活性化を、任意の適切な様式で評価することができる。例えば、リボスイッチをレポーターＲＮＡに連結することができ、レポーターＲＮＡの発現、発現レベル、または発現レベルの変化を、試験化合物の存在下および非存在下で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むことができる。かかるリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するか、これから誘導するアプタマードメインを使用する。認められるように、調節アッセイまたは測定を使用するか調節アッセイまたは測定を使用しないで、リボスイッチの活性化を評価することができる。リボスイッチを非活性化する化合物の同定方法を、類似の方法で行うことができる。リボスイッチを遮断する化合物の同定を、任意の適切な様式で行うことができる。例えば、リボスイッチを活性化または非活性化することが公知の化合物の存在下および試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を評価するためのアッセイを行うことができる。試験化合物の非存在下で観察されるように活性化または非活性化が認められない場合、試験化合物を、リボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定する。
【００６４】
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の同定および同定された化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物同定方法と同定された化合物の製造方法との組み合わせにより、これを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触、リボスイッチの活性化の評価、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造によって化合物を作製することができる。
【００６５】
化合物によるリボスイッチの活性化、非活性化、または遮断のチェックおよびチェックした化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物の活性化、非活性化、または遮断評価方法とチェックした化合物の製造方法との組み合わせによってこれを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触、リボスイッチの活性化の評価、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造によって化合物を作製することができる。化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する能力についての化合物のチェックは、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することを以前には知られていない化合物の同定および化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することが既に知られていた場合のリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の能力の評価の両方をいう。
【００６６】
リボスイッチを活性化するために使用することができる特異的化合物も開示する。ＴＰＰ応答性リボスイッチにとって有用な化合物には、式：
【００６７】
【化４】
2010521977.tif 000005
（式中、化合物はＴＰＰ応答性リボスイッチまたはその誘導体に結合することができ、Ｒ１は正電荷であり、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ、Ｏ、またはＳであり、Ｒ４は、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ、Ｈであるか、存在せず、Ｒ５は、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ、またはＨであり、Ｒ６はＣまたはＮであり、
【００６８】
【化５】
2010521977.tif 000006
は、それぞれ独立して、単結合または二重結合を示す）を有する化合物が含まれる。Ｒ１がホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートである上記定義の化合物も意図する。
【００６９】
上記定義内のあらゆる化合物は、本明細書中に具体的に開示されていることを意図するか、見なされるべきである。さらに、上記定義内で同定することができるあらゆる下位集団は、本明細書中に具体的に開示されていることを意図するか、見なされるべきである。結果として、任意の化合物または化合物の下位集団が特に使用のために含まれるか使用から排除されるか、化合物リスト中に含まれるか化合物リストから排除されることを特に意図する。例えば、１つの選択肢として、各化合物が上記のように定義されるが、ＴＰＰ、ＴＰ、またはチアミンではない化合物群が意図される。別の例として、各化合物が上記のように定義され、且つＴＰＰ応答性リボスイッチを活性化することができる化合物群が意図される。チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）は、ＴＰＰ応答性リボスイッチのトリガー分子であり、ＴＰＰ応答性リボスイッチを活性化することができる。ピリチアミンピロリン酸は、ＴＰＰ応答性リボスイッチを活性化することができる。ピリチアミンおよびピリチアミンピロリン酸を、本明細書中に開示の化合物、トリガー分子、および方法に独立して且つ具体的に含めるか排除することができる。チアミンおよびチアミンピロリン酸を、本明細書中に開示の化合物、トリガー分子、および方法に独立して且つ具体的に含めるか排除することができる。
【００７０】
Ｄ．構築物、ベクター、および発現系
開示のリボスイッチを、任意の適切な発現系と共に使用することができる。組換え発現を、通常、プラスミドなどのベクターを使用して行う。ベクターは、リボスイッチコード配列および発現するＲＮＡ（例えば、タンパク質をコードするＲＮＡ）に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。ベクターはまた、転写および翻訳に必要な他のエレメントを含むことができる。本明細書中で使用する場合、ベクターは、外因性ＤＮＡを含む任意のキャリアをいう。したがって、ベクターは、分解することなく細胞に外因性核酸を輸送する作用物質（ａｇｅｎｔ）であり、送達された細胞中で核酸を発現させるプロモーターを含む。ベクターには、プラスミド、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。リボスイッチ調節構築物の輸送に適切な種々の原核生物および真核生物発現ベクターを産生することができる。かかる発現ベクターには、例えば、ｐＥＴ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＲ２．１、ｐＢＡＤ、ｐＵＣ、および酵母ベクターが含まれる。ベクターを、例えば、種々のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ状況で使用することができる。
【００７１】
ウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経向性ウイルス（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルスおよび他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶバックボーンを有するこれらのウイルスが含まれる）が含まれる。ベクターとしての使用が適切となるこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーも有用である。Ｖｅｒｍａ（１９８５）に記載のレトロウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍａｌｏｎｅｙ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＬＶ）、およびベクターとしてＭＭＬＶの所望の性質を発現するレトロウイルスが含まれる。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を調節するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作する場合、ウイルスは、典型的には、１つまたは複数の初期遺伝子を除去し、除去したウイルスＤＮＡの代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットをウイルスゲノム中に挿入する。
【００７２】
「プロモーター」は、一般に、転写開始部位に対して比較的固定した位置に存在する場合に機能するＤＮＡ配列である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。
【００７３】
「エンハンサー」は、一般に、転写開始部位から固定していない距離で機能し、転写単位に対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，１９８１）または３’側（Ｌｕｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）であり得るＤＮＡ配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロン内に存在することができ（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）、コード配列自体の内部にも存在することができる（Ｏｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。これらは、通常、１０ｂｐ長と３００ｂｐ長との間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近接するプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、プロモーターと同様に、転写調節を媒介する応答エレメントをしばしば含む。エンハンサーは、しばしば、発現調節を決定する。
【００７４】
真核生物宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写終結に必要な配列を含むことができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中でポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位がポリアデニル化領域も含むことが好ましい。この領域の利点の１つは、転写単位がｍＲＮＡのようにプロセシングおよび輸送される可能性が増加することである。発現構築物中でのポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを導入遺伝子構築物中で使用することが好ましい。
【００７５】
ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含む。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達されたかどうか、および一旦送達されると発現するかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであり得る。かかる選択可能なマーカーが宿主細胞に首尾よく導入された場合、形質転換された宿主細胞は選択圧下においた場合に生存することができる。２つの広く使用されている異なるカテゴリーの選択レジメが存在する。第１のカテゴリーは、細胞の代謝および補充培地と無関係に増殖する能力を欠く変異細胞の使用に基づく。第２のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームをいい、変異細胞系統の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を使用する。新規の遺伝子を有するそれらの細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択を生き抜く。かかる優性選択の例は、薬物であるネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，１９８２）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，１９８０）、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）を使用する。
【００７７】
遺伝子材料（プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体であるが、これらに限定されない）の直接移入の使用またはカチオニックリポソームなどの細胞またはキャリア中の遺伝子材料の移入を介して、遺伝子を移入することができる。かかる方法は当該分野で周知であり、本明細書中に記載の方法での使用に容易に適応することができる。移入ベクターは、細胞に遺伝子を送達させるために使用される任意のヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）または一般的な遺伝子送達ストラテジーの一部（例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部）（Ｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８，（１９９３））であり得る。適切なトランスフェクション手段（ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、または物理的機械的方法（エレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散など）が含まれる）は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；ａｎｄ  Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）に記載されている。
【００７８】
１．ウイルスベクター
好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経向性ウイルス、シンドビスウイルスおよび他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶバックボーンを有するこれらのウイルスが含まれる）である。ベクターとしての使用が適切となるこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーも好ましい。好ましいレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、およびベクターとしてＭＭＬＶの所望の性質を発現するレトロウイルスが含まれる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより高い遺伝子負荷量（すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子）を輸送することができ、この理由のために、一般的に使用されるベクターである。しかし、これらは、非増殖細胞で有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、作業が容易であり、高力価を有し、エアゾール処方物中で送達させることができ、非分裂細胞にトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは、巨大であり、いくつかの遺伝子挿入部位を有し、熱安定性を示し、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって誘発される宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターである。この型の好ましいベクターは、インターロイキン８または１０のコード領域を保有する。
【００７９】
ウイルスベクターは、細胞に遺伝子を導入するためのほとんどの化学的方法または物理的方法よりも高い処理能力（遺伝子導入能力）を有する。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を調節するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作する場合、ウイルスは、典型的には、１つまたは複数の初期遺伝子を除去し、除去したウイルスＤＮＡの代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットをウイルスゲノム中に挿入する。この構築物型は、約８ｋｂまでの外来遺伝子材料を保有することができる。除去された初期遺伝子の必要な機能を、典型的には、トランスで初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように操作された細胞系統によって供給される。
【００８０】
ｉ．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、レトロウイルス科のウイルスファミリー（任意の型、亜科、属、向性が含まれる）に属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般に、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。遺伝子治療のためのレトロウイルスベクターの使用方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願国際公開第９０／０２８０６号および国際公開第８９／０７１３６号；およびＭｕｌｌｉｇａｎ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３））（その教示が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００８１】
レトロウイルスは、本質的に、核酸カーゴ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃａｒｇｏ）に詰められたパッケージである。核酸カーゴは、パッケージングシグナルを保有し、これらのパッケージングシグナルは、複製された娘分子がパッケージコート内に効率的に詰められることを確実にする。パッケージシグナルに加えて、複製および複製されたウイルスのパッケージングのためにシスで必要な多数の分子が存在する。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含む。これは、典型的には標的細胞に移入される外来ＤＮＡと置換されるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的には、パッケージコートへの組み込みのためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写単位の開始をシグナル伝達する配列、逆転写に必要なエレメント（逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合するプライマー結合部位が含まれる）、ＤＮＡ合成中にＲＮＡ鎖のスイッチを導く末端反復配列、第２のＤＮＡ合成鎖の合成のためのプライミング部位としての機能を果たすプリンリッチ配列である５’→３’ＬＴＲ、および宿主ゲノムに挿入するためのレトロウイルスのＤＮＡ状態を挿入することができるＬＴＲの末端付近の特異的配列を含む。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の除去により、約８ｋｂの外来配列がウイルスゲノムに挿入され、逆転写するようになり、複製の際に新規のレトロウイルス粒子に詰められる。この核酸量は、各転写物のサイズに応じて、１つから多数の遺伝子の送達に十分である。挿入物中に他の遺伝子と共に正または負の選択マーカーのいずれかを含めることが好ましい。
【００８２】
ほとんどのレトロウイルスベクター中の複製機構およびパッケージングタンパク質が除去されているので（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）、典型的には、パッケージング細胞系統へのこれらの配置によってベクターを生成する。パッケージング細胞系統は、複製およびパッケージング機構を含むが、いかなるパッケージングシグナルも欠くレトロウイルスを使用してトランスフェクションまたは形質転換した細胞系統である。選択のＤＮＡを保有するベクターをこれらの細胞系統にトランスフェクションする場合、目的の遺伝子を含むベクターを複製し、ヘルパー細胞によってシスで提供される機構によって新規のレトロウイルス粒子にパッケージングする。必要なシグナルを欠くので、この機構のゲノムはパッケージされない。
【００８３】
ｉｉ．アデノウイルスベクター
複製欠損アデノウイルスの構築は記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ  ”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ”  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２（１９９３））。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利点は、これらのウイルスが最初の感染細胞内で複製することができるが新規の感染ウイルス粒子を形成できないので、他の細胞型に拡大することができる範囲が制限されていることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、および多数の他の組織部位への直接的なｉｎ  ｖｉｖｏ送達後に高効率の遺伝子移入を達成することが示されている（Ｍｏｒｓｙ，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，  Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１（１９９３）；ａｎｄ  Ｒａｇｏｔ，  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、特異的細胞表面受容体への結合によって遺伝子形質導入を達成し、その後、野生型または複製欠損アデノウイルスと同一の様式で、受容体媒介エンドサイトーシスによってウイルスを内在化する  （Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ  ａｎｄ  Ｄａｌｅｓ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７（１９７０）；Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：３８６−３９６（１９７３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｓｏｎ，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ��．Ｂｉｏｌ．  ４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９（１９９３））。
【００８４】
好ましいウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスに基づいたウイルスベクターであり、これらのヴィロン（ｖｉｒｏｎ）をヒト２９３細胞系統などの細胞系統中で生成する。別の好ましい実施形態では、Ｅ１およびＥ３遺伝子の両方をアデノウイルスゲノムから除去する。
【００８５】
別のウイルスベクター型は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠損パルボウイルスは、多数の細胞型に感染することができ、ヒトに非病原性を示すので、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは、約４〜５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは、第１９染色体に安定に挿入されることが公知である。この部位特異的組み込み特性を含むベクターが好ましい。このベクター型の特に好ましい実施形態は、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ製のＰ４．１  Ｃベクターである。これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、および／またはマーカー遺伝子（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子など）を含むことができる。
【００８６】
ウイルスおよびレトロウイルス中の挿入遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の調節を補助するためのプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定した位置に存在する場合に機能する配列またはＤＮＡ配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。
【００８７】
２．ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を調節する好ましいプロモーターを、種々の供給源（例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスゲノム）、または非相同哺乳動物プロモーター（例えば、βアクチンプロモーター）から得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターを、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして得ることが都合が良い（Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：  １１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして得ることが都合が良い（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８：  ３５５−３６０（１９８２））。勿論、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本明細書中で有用である。
【００８８】
エンハンサーは、一般に、転写開始部位から固定していない距離で機能し、転写単位に対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：  ９９３（１９８１））または３’側（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：  １１０８（１９８３））のいずれかであり得るＤＮＡ配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロン内に存在することができ（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３３：  ７２９（１９８３））、ならびにコード配列自体の内部にも存在することができる（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：  １２９３（１９８４））。これらは、通常、１０ｂｐ長と３００ｂｐ長との間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近接するプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、転写調節を媒介する応答エレメントをしばしば含む。プロモーターはまた、転写調節を媒介する応答エレメントを含む。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現調節を決定する。哺乳動物遺伝子由来の多数のエンハンサー配列が現在知られているが（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【００８９】
プロモーターおよび／またはエンハンサーを、その機能を誘発する軽度または特異的な化学事象のいずれかによって特異的に活性化することができる。系を、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節することができる。ガンマ線照射などの照射への曝露またはアルキル化化学療法薬によってウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法も存在する。
【００９０】
プロモーターおよび／またはエンハンサー領域が全ての真核細胞型で活性であることが好ましい。この型の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
【００９１】
全ての特異的調節エレメントをクローン化し、これを使用して、黒色腫細胞などの特定の細胞型で選択的に発現する発現ベクターを構築することができることが示されている。グリア線維酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＡＰ）プロモーターを使用して、神経膠起源の細胞中の遺伝子が選択的に発現されている。
【００９２】
真核生物宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写終結に必要な配列を含むことができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中でポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位がポリアデニル化領域も含むことが好ましい。この領域の利点の１つは、転写単位がｍＲＮＡのようにプロセシングおよび輸送される可能性が増加することである。発現構築物中でのポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを導入遺伝子構築物中で使用することが好ましい。転写単位の好ましい実施形態では、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。転写された単位は、他の標準的な配列のみを含むか、上記配列と組み合わせて構築物からの発現または構築物の安定性を改善することも好ましい。
【００９３】
３．マーカー
ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達され、一旦送達されると発現するかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであり得る。哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ヒドロマイシン（ｈｙｄｒｏｍｙｃｉｎ）、およびピューロマイシンである。かかる選択可能なマーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移入された場合、形質転換された哺乳動物宿主細胞は選択圧下においた場合に生存することができる。２つの広く使用されている異なるカテゴリーの選択レジメが存在する。第１のカテゴリーは、細胞の代謝および補充培地と無関係に増殖する能力を欠く変異細胞系統の使用に基づく。２つの例は以下である：ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素を添加せずに増殖する能力を欠く。これらの細胞が完全なヌクレオチド合成経路に必要な一定の遺伝子を欠くので、これらの細胞は、補充培地中に欠けているヌクレオチドを供給しない限り生存できない。培地の補充の代替は、インタクトなＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子を各遺伝子を欠く細胞に導入し、それによってその増殖要件を変化させることである。ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子で形質転換しなかった各細胞は、非補充培地で生存できない。
【００９５】
第２のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームをいい、変異細胞系統の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を使用する。薬物耐性を伝達するタンパク質を発現する細胞は、選択を生き抜く。かかる優性選択の例は、薬物であるネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：  ３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：  １４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：  ４１０−４１３（１９８５））を使用する。３つの例は、真核生物調節下で細菌遺伝子を使用して、適切な薬物Ｇ４１８もしくはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を伝達する。他には、ネオマイシンアナログＧ４１８およびピューラマイシン（ｐｕｒａｍｙｃｉｎ）が含まれる。
【００９６】
Ｅ．バイオセンサーリボスイッチ
バイオセンサーリボスイッチも開示する。バイオセンサーリボスイッチは、その同系トリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを産生する操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、閾値レベルまたは閾値レベルを超えるトリガー分子で誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかシグナル産生に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結することができるオルタナティブスプライシングを調節するリボスイッチを、細胞または生物にリボスイッチをコードする核酸構築物を保有させるように操作することによってｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むリボスイッチである。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するか誘導されたアプタマードメインを使用する。
【００９７】
Ｆ．レポータータンパク質およびペプチド
リボスイッチの活性化の評価またはバイオセンサーリボスイッチの評価のために、レポータータンパク質またはペプチドを使用することができる。レポータータンパク質またはペプチドをＲＮＡによってコードすることができ、その発現はリボスイッチによって調節される。実施例は、いくつかの特異的レポータータンパク質の使用を記載している。レポータータンパク質およびペプチドの使用は周知であり、リボスイッチとの使用のために容易に適応することができる。レポータータンパク質は、検出することができるか検出可能なシグナルを産生する任意のタンパク質またはペプチドであり得る。好ましくは、タンパク質またはペプチドの存在を、標準的な技術（例えば、放射免疫アッセイ、放射性標識、免疫アッセイ、酵素活性のためのアッセイ、吸光度、蛍光、発光、およびウェスタンブロット）を使用して検出することができる。より好ましくは、レポータータンパク質レベルを、低レベルでさえも、標準的な技術を使用して容易に定量可能である。有用なレポータータンパク質には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、およびそれらの誘導体（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）およびＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）など）が含まれる。
【００９８】
Ｇ．高次構造依存性標識
高次構造依存性標識は、標識が会合した分子または化合物（リボスイッチなど）の形態または高次構造の変化に基づいて蛍光強度または波長が変化する全ての標識をいう。プローブおよびプライマーとの関係において使用される高次構造依存性標識の例には、分子ビーコン、アンプリフォー（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）、ＦＲＥＴプローブ、切断性ＦＲＥＴプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、スコーピオンプライマー、蛍光三重鎖オリゴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｔｒｉｐｌｅｘ  ｏｌｉｇｏ）（三重鎖分子ビーコンまたは三重鎖ＦＲＥＴプローブが含まれるが、これらに限定されない）、蛍光水溶性複合ポリマー、ＰＮＡプローブ、およびＱＰＮＡプローブが含まれる。かかる標識を、特に、その機能の原理を、リボスイッチと共に使用するために適応させることができる。いくつかの高次構造依存性標識型は、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２１−２７（２００１）中に概説されている。
【００９９】
ステム消光標識（ｓｔｅｍ  ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｌａｂｅｌ）（高次構造依存性標識の一形態）は、ステム構造を形成する場合に標識からの蛍光が消光されるように消光部分が近接するような核酸上に配置された蛍光標識である。ステムが破壊される場合（標識を含むリボスイッチが活性化する場合など）、消光部分はもはや蛍光標識に近接せず、蛍光が増加する。この効果の例を、分子ビーコン、蛍光三重鎖オリゴ、三重鎖分子ビーコン、三重鎖ＦＲＥＴプローブ、およびＱＰＮＡプローブで見出すことができ、その操作原理をリボスイッチと共に使用するために適応させることができる。
【０１００】
ステム活性化標識（高次構造依存性標識の一形態）は、ステム構造の形成によって蛍光が増加するか変化する標識または標識対である。ステム活性化標識には、受容体および供与体が近接する場合（標識を含む核酸鎖がステム構造を形成する場合）に供与体から受容体への蛍光共鳴エネルギー転移によって受容体が蛍光を発するような受容体蛍光標識および供与体部分が含まれ得る。ステム活性化標識は、典型的には、核酸分子中でステム構造を形成する場合に受容体および供与体が近接するような核酸分子（リボスイッチなど）上に配置された標識対である。ステム活性化標識の供与体部分自体が蛍光標識である場合、この標識は、受容体に近接しない場合（すなわち、ステム構造を形成しない場合）に蛍光（典型的には、受容体の蛍光よりも異なる波長で）としてエネルギーを放出することができる。ステム構造を形成する場合、全体的な効果としては、供与体蛍光が減少し、受容体蛍光が増加する。ＦＲＥＴプローブはステム活性化標識の使用例であり、その操作上の原理をリボスイッチと共に使用するために適応することができる。
【０１０１】
Ｈ．検出標識
リボスイッチの活性化、非活性化、もしくは遮断、またはリボスイッチの活性化、非活性化、もしくは遮断の際に産生された核酸またはタンパク質の発現の検出および定量を補助するために、検出標識を、検出プローブまたは検出分子に組み込むか、発現した核酸またはタンパク質に直接組み込むことができる。本明細書中で使用する場合、検出標識は、核酸またはタンパク質と直接または間接的に会合することができ、それにより、測定可能な検出シグナルが直接的または間接的のいずれかで得られる任意の分子である。多数のかかる標識は、当業者に公知である。開示の方法での使用に適切な検出標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体、およびリガンドである。
【０１０２】
適切な蛍光標識の例には、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、カスケードブルー（登録商標）、オレゴングリーン（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、クォンタムダイＴＭ（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｙｅＴＭ）などのランタニドイオンの大環状キレート、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体などの蛍光エネルギー転移染料、ならびにシアニン染料Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が含まれる。他の特定の蛍光標識の例には、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸性フクシン、アリザリンコンプレクソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、ステアリン酸アントロイル（ａｎｔｈｒｏｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン、オーロホスフィンＧ、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、硫酸ベルベリン、ビスベンズアミド、ブランコホルＦＦＧ溶液、ブランコホルＳＶ、ボディピー  Ｆ１（Ｂｏｄｉｐｙ  Ｆ１）、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、カルカインブルー（ｃａｌｃｉｅｎ  ｂｌｕｅ）、カルシウムグリーン、カルコフロールＲＷ溶液、カルコフロールホワイト、カルコホールホワイトＡＢＴ溶液、カルコホールスタンダード溶液、カルボスチリル、カスケードイエロー、カテコールアミン、キナクリン（ｃｈｉｎａｃｒｉｎｅ）、コリホスフィンＯ、クマリン−ファロイジン、ＣＹ３．１  ８、ＣＹ５．１  ８、ＣＹ７、ダンス（１−ジメチルアミノナファリン５スルホン酸）、ダンサ（ジアミノナフチルスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、ジピロメテンホウ素二フッ化物（ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅｂｏｒｏｎ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ジフェニルブリリアントフラビン７ＧＦＦ、ドーパミン、エリスロシンＩＴＣ、オイクリシン、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）、フラゾオレンジ、フルオ３、フルオレスカミン、フラ−２、ゲナクリルブリリアントレッドＢ、ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲナクリルピンク３Ｇ、ゲナクリルイエロー５ＧＦ、ｇｌｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ、グラニュラーブルー、ヘマトポルフィリン、インド−１、イントラホワイトＣｆ液、リューコフォーＰＡＦ（Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＰＡＦ）、リューコフォーＳＦ、リューコフォーＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシフェルイエローＣＨ、ルシフェルイエローＶＳ、マグダラレッド、マリーナブルー、マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ミトラマイシン、ＮＢＤ���ミン、ニトロベンゾキサジドール、ノルアドレナリン、ヌクレアーファストレッド、ヌクレアーイエロー、ナイロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ、オキサジアゾール、パシフィックブルー、パラローザニリン（ホイルゲン）、ホルウィットＡＲ溶液、ホルウィットＢＫＬ、ホルウィットＲｅｖ、ホルウィットＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、ポリアザインダセンポントクロームブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオンイエロー、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエキストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、セブロンブリリアントレッド２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）、スチルベン、スナーフ１、スルホローダミンＢ  Ｃａｎ  Ｃ、スルホローダミンＧエキストラ、テトラサイクリン、チアジンレッドＲ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、チオライト、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンＢ、ユビテックスＳＦＣ、キシレンオレンジ、およびＸＲＩＴＣが含まれる。
【０１０３】
有用な蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）、ならびにシアニン染料Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７である。これらの蛍光体の吸収および発光の極大は、ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、したがって、同時検出が可能である。フルオレセイン染料の他の例には、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−融合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）および２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）が含まれる。蛍光標識は、種々の商業供給者（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏが含まれる）から得ることができる。
【０１０４】
目的とするさらなる標識には、それらが関連するプローブが標的分子に特異的に結合する場合にのみシグナルを提供するものが含まれ、かかる標識には、Ｔｙａｇｉ  ＆  Ｋｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６）１４：３０３および欧州特許第００７０６８５  Ｂ１号に記載の「分子ビーコン」が含まれる。目的とする他の標識には、米国特許第５，５６３，０３７号、国際公開第９７／１７４７１号、および国際公開第９７／１７０７６号に記載されているものが含まれる。
【０１０５】
標識ヌクレオチドは、合成の間に発現核酸へ直接組み込むための検出標識の有用な形態である。核酸に組み込むことができる検出標識の例には、ＢｒｄＵｒｄ（５−ブロモデオキシウリジン、Ｈｏｙ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９０：２１７−２３０（１９９３））、アミノアリルデオキシウリジン（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３４５−３４８（２０００））、５−メチルシトシン（Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９５１：１５７−１６５（１９８８））、ブロモウリジン（Ｗａｎｓｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２２：２８３−２９３（１９９３））などのヌクレオチドアナログ、およびビオチン（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６６３３（１９８１））またはジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）（Ｋｅｒｋｈｏｆ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３５９−３６４（１９９２））などの適切なハプテンで改変したヌクレオチドが含まれる。適切な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネートｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰである（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：３２２６−３２３２（１９９４））。ＤＮＡに好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ブロモデオキシウリジン、ＢｒｄＵｒｄ、ＢｒｄＵ、ＢＵｄＲ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ）である。検出標識のＤＮＡへの組み込みに有用な他のヌクレオチドアナログは、ＡＡ−ｄＵＴＰ（アミノアリル−デオキシウリジントリホスフェート、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）および５−メチル−ｄＣＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。検出標識のＲＮＡへの組み込みに有用なヌクレオチドアナログは、ビオチン−１６−ＵＴＰ（ビオチン−１６−ウリジン−５’−トリホスフェート、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。フルオレセイン、Ｃｙ３およびＣｙ５は、直接標識のためにｄＵＴＰに結合することができる。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチン−またはジゴキシゲニン標識プローブの二次検出用のアビジンまたは抗ジゴキシゲニン結合体として利用可能である。
【０１０６】
ビオチンなどの核酸に組み込まれる検出標識を、その後に当該技術で周知の感度のよい方法を使用して検出することができる。例えば、ビオチンは、ビオチンに結合しているストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を使用して検出することができ、その後に適切な基質（例えば、化学発光基質ＣＳＰＤ：３−（４−メトキシスピロ−〔１，２，−ジオキセタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ〔３．３．１．１３，７〕デカン〕−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム；Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）の化学発光により検出することができる。標識はまたは、例えば、化学シグナル増幅により、または発光シグナルを生じる酵素（例えば、化学発光１，２−ジオキセタン基質）もしくは蛍光シグナルを生じる酵素への基質を使用することにより検出することができる、アルカリホスファターゼ、ダイズペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびポリメラーゼなどの酵素であり得る。
【０１０７】
２個以上のこれらの検出標識を組み合わせる分子も検出標識と見なされる。既知の検出標識のいずれかを、開示されているプローブ、タグ、分子、および方法と共に使用して、開示の方法で産生された活性化または非活性化リボスイッチ、または核酸、またはタンパク質を標識および検出することができる。検出標識により生成されたシグナルを検出および測定する方法も、当業者に公知である。例えば、放射性同位体を、シンチレーションカウンティングまたは直接可視化により検出することができ、蛍光分子を、蛍光分光光度計を使用して検出することができ、リン光分子を、分光光度計またはカメラによる直接可視化により検出することができ、酵素を、酵素により触媒された反応の産物の検出または可視化により検出することができ、抗体を、抗体に結合した二次検出標識を検出することによって検出することができる。本明細書で使用する場合、検出分子は、検出する化合物または組成物と相互作用し、１つまたは複数の検出標識をカップリングする分子である。
【０１０８】
Ｉ．配列類似性
本明細書中で考察するように、用語相同性および同一性の使用は類似性と同一であることを意味すると理解される。したがって、例えば、用語相同性を２配列間（例えば、非天然配列）で使用する場合、これは必ずしもこれら２配列間の進化的関係を示しているわけではなく、むしろ、それらの核酸配列間の類似性または関連性に注目していると理解される。２つの進化的に関連した分子間の相同性の多数の決定方法を、これらが進化的に関連するかどうかと無関係に、配列類似性を測定するために任意の２つ以上の核酸またはタンパク質に日常的に適用する。
【０１０９】
一般に、本明細書中に開示のリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子、およびタンパク質の任意の公知の改変体および誘導体または生じ得るものを定義する１つの方法は、公知の特異的配列に対する相同性に関する改変体および誘導体の定義によると理解される。本明細書中に開示の特定の配列のこの同一性も、本明細書中の他所で考察する。一般に、本明細書中に開示のリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子、およびタンパク質の改変体は、典型的には、定められた配列または天然配列に対して少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の相同性を有する。当業者は、２つのタンパク質または核酸（遺伝子など）の相同性の決定方法を容易に理解する。例えば、相同性がその最高レベルとなるような２つの配列のアラインメント後に相同性を計算することができる。
【０１１０】
相同性の別の計算方法を、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための最適な配列アラインメントを、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または調査によって行うことができる。
【０１１１】
例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９（少なくとも核酸アラインメントに関する材料について本明細書中で参考として援用される）に開示のアルゴリズムによって、核酸についての同型の相同性を得ることができる。典型的には任意の方法を使用することができると理解され、場合によってはこれらの種々の方法の結果が異なり得ると理解されるが、当業者は、これらの方法の少なくとも１つを使用して同一性を見出す場合、配列は定められた同一性を有するといわれると理解する。
【０１１２】
例えば、本明細書中で使用する場合、別の配列に対して特定の相同率を有するものとして列挙される配列は、１つまたは複数の上記の計算方法のいずれかによって計算した列挙した相同性を有する配列をいう。例えば、本明細書中で定義するように、Ｚｕｋｅｒ計算法を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、任意の他の計算法によって計算した場合に第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を持たない場合でさえ、第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する。別の例として、本明細書中で定義するように、Ｚｕｋｅｒ計算法およびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ計算法の両方を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの計算法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈの計算法、Ｊａｅｇｅｒの計算法、または任意の他の計算法によって計算した場合に第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を持たない場合でさえ、第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する。さらに別の例として、本明細書中で定義するように、各計算法を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する（しかし、実際には、異なる計算法により、しばしば、異なる相同率の計算値が得られる）。
【０１１３】
Ｊ．ハイブリッド形成および選択的ハイブリッド形成
用語「ハイブリッド形成」は、典型的には、少なくとも２つの核酸分子（プライマーまたはプローブとリボスイッチまたは遺伝子など）の間の配列駆動相互作用を意味する。配列駆動相互作用は、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体の間でヌクレオチド特異的様式にて起こる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧまたはＴと相互作用するＡは、配列駆動相互作用である。典型的には、配列駆動相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面またはフーグスティーン面上で起こる。２つの核酸のハイブリッド形成は、当業者に公知の多数の条件およびパラメータに影響を受ける。例えば、塩濃度、ｐＨ、および反応温度の全てが２つの核酸分子がハイブリッド形成するかどうかに影響を及ぼす。
【０１１４】
２つの核酸分子間の選択的ハイブリッド形成のパラメータは、当業者に周知である。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件を、ストリンジェントなハイブリッド形成条件と定義することができる。例えば、ハイブリッド形成のストリンジェンシーを、ハイブリッド形成工程および洗浄工程のいずれかまたは両方の温度および塩濃度の両方によって調節する。例えば、選択的ハイブリッド形成を達成するためのハイブリッド形成条件は、高イオン強度溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）中でＴｍ（分子の半分がそのハイブリッド形成パートナーから解離する融点）より約１２〜２５℃低い温度でのハイブリッド形成およびそれに続く洗浄温度がＴｍより約５℃〜２０℃低いように選択された温度と塩濃度との組み合わせによる洗浄を含むことができる。温度および塩条件は、フィルター上に固定した参照ＤＮＡサンプルを目的の標識核酸とハイブリッド形成させ、次いで、異なるストリンジェンシー条件下で洗浄する予備実験において実験的に容易に決定される。ハイブリッド形成温度は、典型的には、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成についてはより高い。上記の条件または当該分野で公知の条件を使用して、ストリンジェンシーを達成することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７（少なくとも核酸のハイブリッド形成に関連する材料について本明細書中で参考として援用される））。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド形成のための好ましいストリンジェントなハイブリッド形成条件は、約６８°Ｃ（水溶液中）の６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥおよびそれに続く６８℃での洗浄であり得る。ハイブリッド形成および洗浄のストリンジェンシーを、必要に応じて、所望の相補度が減少するのに合わせて、さらに、変動性が検索される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに応じて減少させることができる。同様に、ハイブリッド形成および洗浄のストリンジェンシーを、必要に応じて、所望の相同性が増加するのに合わせて、さらに、高相同性が望まれる任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに応じて増加させることができ、これらは全て当該分野で公知である。
【０１１５】
別の選択的ハイブリッド形成を定義する方法は、他の核酸に結合した核酸の１つの量（比率）の検索による。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の制限核酸が非制限核酸に結合する場合である。典型的には、非制限核酸は、例えば、１０、または１００、または１０００倍過剰である。このアッセイ型を、制限核酸および非制限核酸の両方が、例えば、それらのｋｄよりも１０倍、または１００倍、または１０００倍を下回る条件下、または核酸分子の一方のみが１０倍、または１００倍、または１０００倍である条件下、または核酸分子の一方または両方がそれらのｋｄを超える条件下で行うことができる。
【０１１６】
別の選択的ハイブリッド形成を定義する方法は、所望の酵素操作を促進するためにハイブリッド形成が必要な条件下で酵素的に操作される核酸の比率の検索による。例えば、いくつかの実施形態では、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の核酸が、酵素操作を促進する条件下で酵素的に操作される場合である。例えば、酵素操作がＤＮＡ伸長である場合、選択的ハイブリッド形成条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の核酸分子が伸長される場合である。好ましい条件には、製造者によって示唆される条件または当該分野で操作を実行する酵素に適切であることが示された条件も含まれる。
【０１１７】
相同性と同様に、２つの核酸分子の間のハイブリッド形成レベルを決定するための本明細書中に開示の種々の方法が多数存在すると理解される。これらの方法および条件により、２つの核酸分子間で異なる比率でハイブリッド形成を提供し得るが、他で示さない限り、任意の方法のパラメータを満たすことで十分であると理解される。例えば、８０％ハイブリッド形成が必要である場合、およびこれらの方法のいずれか１つにおける必要なパラメータ内でハイブリッド形成が起こる限り、本明細書中に開示されると見なされる。
【０１１８】
当業者は、組成物または方法が集合的または単独にハイブリッド形成の決定のためのこれらの基準のうちのいずれか１つを満たす場合、この組成物または方法は本明細書中に開示される組成物または方法であると理解すると理解される。
【０１１９】
Ｋ．核酸
核酸ベースである種々の分子（例えば、リボスイッチ、アプタマー、ならびにリボスイッチおよびアプタマーをコードする核酸が含まれる）を本明細書中に開示する。開示の核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換物から構成され得る。これらの分子および他の分子の制限されない例は、本明細書中に述べられている。例えば、ベクターを細胞中で発現する場合、発現したｍＲＮＡは、典型的には、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵから構成されると理解される。同様に、例えば、外因性送達によって核酸分子を細胞または細胞環境に導入する場合、細胞環境下で核酸分子の分解を減少させるヌクレオチドアナログから核酸分子が構成されることが有利であると理解される。
【０１２０】
それらの関連する機能が維持される限り、リボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、および任意の他のオリゴヌクレオチドおよび核酸は、改変ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログ）から構成され得るかまたはそれを含むことができる。多くの改変ヌクレオチドが知られており、オリゴヌクレオチドおよび核酸で使用することができる。ヌクレオチドアナログは、いくつかの改変型（塩基部分、糖部分またはリン酸部分のいずれかに対応する）を含むヌクレオチドである。塩基部分に対する改変には、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ／Ｕ、ならびに異なるプリンまたはピリミジン塩基の天然および合成改変が含まれる（ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）および２−アミノアデニン−９−イルなど）。改変塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニジンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニジンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換のアデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換のウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれるが、これらに限定されない。さらなる塩基改変を、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３で見出すことができる。特定のヌクレオチドアナログ（５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンなど）には、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含まれる。５−メチルシトシンは、二重鎖形成の安定性を増加することができる。他の改変塩基は、ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）として機能するものである。ユニバーサル塩基には、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールが含まれる。ユニバーサル塩基は、通常の塩基の代わりになるが、塩基対合に対して偏りがない。すなわち、ユニバーサル塩基は、任意の他の塩基と塩基対合することができる。塩基改変は、しばしば、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルなどの糖改変と組み合わせて、二重鎖の安定性の増加などの特有の特性を得ることができる。塩基改変の範囲を詳述し、記載する、多数の米国特許（第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号および第５，６８１，９４１号など）が存在する。これらの特許は、それぞれその全体が、特に、塩基改変、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのオリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについて本明細書中で参照として援用される。
【０１２１】
ヌクレオチドアナログは、糖部分の改変を含むこともできる。糖部分の改変には、リボースおよびデオキシリボースの天然改変、ならびに合成改変が含まれる。糖改変には、２’位での以下の改変が含まれるが、これらに限定されない：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０置換または非置換のアルキルまたはＣ２〜Ｃ１０置換または非置換のアルケニルおよびアルキニルであり得る）。２’糖改変には、−Ｏ〔（ＣＨ２）ｎＯ〕ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（ここで、ｎおよびｍは、１〜約１０である）も含まれるが、これらに限定されない。
【０１２２】
２’位での他の改変には、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および同様な特性を有する他の置換基が含まれるが、これらに限定されない。類似の改変を、糖の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合オリゴヌクレオチド内の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。改変糖には、架橋環酸素での改変（ＣＨ２およびＳなど）を含むものも含まれる。ヌクレオチド糖アナログは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣物を有することもできる。かかる改変糖構造の調製を教示する多数の米国特許（第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号および第５，７００，９２０号など）が存在し、それぞれその全体が、特に、改変糖構造、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される。
【０１２３】
ヌクレオチドアナログは、リン酸部分を改変することもできる。改変リン酸部分には、２つのヌクレオチド間の架橋が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートが含まれる）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートが含まれる）、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートを含むように改変できるものが含まれるが、これらに限定されない。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸または改変リン酸架橋は、３’−５’架橋または２’−５’架橋を介することができ、および架橋は、３’−５’から５’−３’までまたは２’−５’から５’−２’までなどの逆の極性を含むことができることが理解される。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。多数の米国特許が改変リン酸を含むヌクレオチドをどのように作製し、使用するかを教示しており、第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号および第５，６２５，０５０号が含まれるが、これらに限定されない（それぞれその全体が、特に、改変リン酸、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される）。
【０１２４】
ヌクレオチドアナログは単一の改変しか含む必要がないが、１つの部分の中にまたは異なる部分の間に、複数の改変を含むこともできることが理解される。
【０１２５】
ヌクレオチド置換物は、ヌクレオチドと同様の機能的性質を有するが、リン酸部分を含まない分子である（ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）。ヌクレオチド置換物は、ワトソン・クリックまたはフーグスティーン様式で相補核酸を認識し、それにハイブリダイズする（塩基対合する）分子であるが、リン酸部分以外の部分を介して一緒に結合する分子である。ヌクレオチド置換物は、適切な標的核酸と相互作用する場合、二重らせん型構造に調和することもできる。
【０１２６】
ヌクレオチド置換物は、リン酸部分および／または糖部分が置換されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ヌクレオチド置換物は、標準的なリン原子を含まない。リン酸の置換物は、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間架橋、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間架橋、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間架橋であり得る。これらには、モルホリノ架橋（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成されている）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの、ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他のものが含まれる。多数の米国特許がこれらの種類のリン酸置換体をどのように作製し、使用するかを開示しており、第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が含まれるが、これらに限定されない（それぞれその全体が、特に、リン酸置換体、それらの合成、それらの使用、ならびにそれらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸への組み込みについての記載が、本明細書中で参考として援用される）。
【０１２７】
また、ヌクレオチドの糖とリン酸の両方の部分を、例えばアミド型架橋（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）で置換することができることが、核酸置換物において理解される。米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号および同第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子をどのように作製し、使用するかを教示しており、それぞれ本明細書中で参考として援用される。（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００（１９９１）も参照すること）。
【０１２８】
オリゴヌクレオチドおよび核酸をヌクレオチドから構成することができ、異なるヌクレオチド型または同一のヌクレオチド型から構成することができる。例えば、オリゴヌクレオチドにおける１つまたは複数のヌクレオチドが、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、ヌクレオチドの約１０％〜約５０％が、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、ヌクレオチドの約５０％以上が、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得るか、あるいは全てのヌクレオチドが、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であり得る。かかるオリゴヌクレオチドおよび核酸を、キメラオリゴヌクレオチドおよびキメラ核酸と呼ぶことができる。
【０１２９】
Ｌ．固体支持体
固体支持体は、分子（トリガー分子など）およびリボスイッチ（または開示の方法で使用されるか開示の方法によって産生された他の成分）を会合することができる固体状態の基質または支持体である。リボスイッチおよび他の分子を、固体支持体と直接または間接的に会合することができる。例えば、分析物（例えば、トリガー分子、試験化合物）を、固体支持体表面に結合することができるか、固体支持体上に固定した捕捉剤（例えば、分析物に結合する化合物または分子）と会合することができる。別の例として、リボスイッチを、固体支持体表面に結合することができるか、固体支持体上に固定したプローブと会合することができる。アレイは、複数のリボスイッチ、プローブ、または他の分子がアレイ、グリッド、または他の組織化されたパターンに会合された固体支持体である。
【０１３０】
固体支持体で使用する固体状態の基質には、成分を直接または間接的に会合することができる任意の固体材料が含まれ得る。これには、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンラバー、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルソエステル、官能性シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸などの材料が含まれる。固体状態の基質は、任意の有用な形態（薄膜、膜、ボトル、皿、ファイバー、織り繊維、成形ポリマー、粒子、ビーズ、微粒子、またはこれらの組み合わせが含まれる）を有することができる。固体状態の基質および固体支持体は、多孔質または非多孔質であり得る。チップは、矩形または四角の材料小片である。固体状態の基質の好ましい形態は、薄膜、ビーズ、またはチップである。有用な固体状態の基質の形態はマイクロタイターディッシュである。いくつかの実施形態では、マルチウェルガラススライドを使用することができる。
【０１３１】
アレイは、固体支持体上の規定または所定の位置に固定した複数のリボスイッチ、トリガー分子、他の分子、化合物、またはプローブを含むことができる。固体支持体上のそれぞれの所定の位置は、一般に、１種の成分型を有する（すなわち、その位置の全成分は同一である）を有する。あるいは、固体支持体上の同一の所定の位置に複数の成分型を固定することができる。各位置は、所与の成分の複数のコピーを有する。固体支持体上の異なる成分の空間的分離により、個別に検出および同定が可能である。
【０１３２】
有用であるにもかかわらず、固体支持体は単一の単位または構造である必要はない。リボスイッチ、トリガー分子、他の分子、化合物、および／またはプローブの組を、多数の固体支持体の一面に分布させることができる。例えば、ある極端な場合では、各成分を個別の反応管または反応容器中、または個別のビーズまたは微粒子上に固定することができる。
【０１３３】
オリゴヌクレオチドの固体状態の基質への固定方法は十分に確立されている。オリゴヌクレオチド（アドレスプローブおよび検出プローブが含まれる）を、確立されたカップリング法を使用して基質にカップリングすることができる。例えば、適切な付着方法は、Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）およびＫｈｒａｐｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８−７３０（１９９１）に記載されている。カゼイン被覆スライド上の３’−アミンオリゴヌクレオチドの固定方法は、Ｓｔｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６３７９−６３８３（１９９５）に記載されている。オリゴヌクレオチドの固体状態の基質への有用な付着方法は、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）に記載されている。
【０１３４】
固体支持体上に固定した各成分（例えば、リボスイッチ、トリガー分子、または他の分子）を、固体支持体の異なる所定の領域に配置することができる。異なる位置は、異なる反応チャンバーであり得る。異なる所定の領域それぞれを、相互の異なる領域から物理的に分離することができる。固体支持体の異なる所定の領域の間の距離は、固定されていても変化しても良い。例えば、アレイでは、各成分を、相互に固定した距離に配置することができる一方で、ビーズに会合した成分は固定した空間的関係にない。特に、複数の固体支持体単位（例えば、複数のビーズ）の使用により、距離が変化する。
【０１３５】
成分を、任意の密度で固体支持体上に会合または固定することができる。成分を、立方センチメートルあたり４００種を超える異なる成分を含む密度で固体支持体に固定することができる。成分アレイは、多数の成分を有することができる。例えば、アレイは、固体支持体上に固定した少なくとも１，０００種の異なる成分、固体支持体上に固定した少なくとも１０，０００種の異なる成分、固体支持体上に固定した少なくとも１００，０００種の異なる成分、または固体支持体上に固定した少なくとも１，０００，０００種の異なる成分を有することができる。
【０１３６】
Ｍ．キット
上記の材料および他の材料を、開示の方法の実施または実施の補助に有用なキットとして任意の適切な組み合わせで一緒に包装することができる。所与のキット中のキット構成成分を、開示の方法で一緒に使用するためにデザインおよび適合することが有用である。例えば、化合物検出のためのキット、１つまたは複数のバイオセンサーリボスイッチを含むキットを開示する。キットはまた、リボスイッチの活性化の検出のための試薬および標識を含むことができる。
【０１３７】
Ｎ．混合物
開示の方法の実施または実施のための調製によって形成された混合物を開示する。例えば、リボスイッチおよびトリガー分子を含む混合物を開示する。
【０１３８】
方法が組成物、または成分、または試薬の混合または接触を含むときはいつでも、方法の実施により、多数の異なる混合物が作製される。例えば、方法が３つの混合工程を含む場合、工程を個別に実施する場合にこれらの各工程後に固有の混合物が形成される。さらに、工程の実施方法と無関係に、全工程の完了時点に混合物が形成される。本開示は、開示の方法の実施によって得られたこれらの混合物および任意の開示の試薬、組成物、または成分（例えば、本明細書中に開示）を含む混合物を意図する。
【０１３９】
Ｏ．系
開示の方法の実施または実施における補助に有用な系を開示する。系は、一般に、構造、機械、およびデバイスなどならびに組成物、化合物、材料などの製品の組み合わせを含む。開示または開示から明らかなかかる組み合わせを意図する。例えば、バイオセンサーリボスイッチ、固体支持体、および信号読み取りデバイスを含む系を開示および意図する。
【０１４０】
Ｐ．データ構造およびコンピュータ制御
開示の方法で使用されるか、開示の方法によって生成されるか、開示の方法から生成されるデータ構造を開示する。データ構造は、一般に、組成物または媒体中に回収され、組織化され、保存され、そして／または統合された任意の形態のデータ、情報、および／またはオブジェクトである。電子的形態（ＲＡＭ中または保存ディスク上など）で保存されたリボスイッチ構造および活性化の測定値は、１つのデータ構造型である。
【０１４１】
開示の方法、その任意の一部、またはその調製を、コンピュータ制御によって調節、管理、または支援することができる。かかるコンピュータ制御を、コンピュータ制御されたプロセスまたは方法によって実施することができ、データ構造を使用および／または生成することができ、コンピュータプログラムを使用することができる。かかるコンピュータ制御、コンピュータ制御されたプロセス、データ構造、およびコンピュータプログラムが意図され、本明細書中に開示されると理解すべきである。
【０１４２】
方法
ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程であって、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができる、導入工程を含む、ＲＮＡのスプライシングを調節する方法を本明細書中に開示する。リボスイッチは、例えば、オルタナティブスプライシングを調節することができる。リボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインが非相同である。リボスイッチはＲＮＡのイントロンにあり得る。リボスイッチを、トリガー分子（ＴＰＰなど）によって活性化することができる。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを活性化することができる。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを抑制することができる。スプライシングは非天然で起こり得る。オルタナティブスプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ループ５中に見出すことができる。オルタナティブスプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ステムＰ２中にも見出すことができる。スプライス部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−６と−２４との間の位置に存在することができる。スプライス部位は、例えば、アプタマー中の配列ＧＵＡに続くことができる。
【０１４３】
「ＲＮＡスプライシングの調節」は、ＲＮＡのスプライシングを調節し、それにより、異なるｍＲＮＡ分子、潜在的には（しかし、常にではない）、異なるタンパク質を形成することができるリボスイッチを意味する。リボスイッチは、例えば、オルタナティブスプライシングを調節することができる。
【０１４４】
ＲＮＡのスプライシングを調節するリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する方法をさらに開示する。かかる方法は、例えば、リボスイッチと、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物またはトリガー分子とを接触させる工程を含むことができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。化合物を使用して、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる。リボスイッチのトリガー分子（ならびに他の活性化化合物）を使用して、リボスイッチを活性化することができる。トリガー分子以外の化合物を使用して、一般に、リボスイッチを非活性化または遮断することができる（ＴＰＰなど）。リボスイッチを、例えば、リボスイッチの存在からのトリガー分子の除去によって非活性化することもできる。したがって、開示のリボスイッチの非活性化方法は、例えば、リボスイッチの存在または接触からトリガー分子（または他の活性化化合物）を除去する工程を含むことができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチを活性化しないトリガー分子のアナログの結合によって遮断することができる。
【０１４５】
化合物のＲＮＡ分子との接触によってスプライシングを調節するリボスイッチをＲＮＡ分子が含む、ＲＮＡ分子の発現またはＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変化させる方法も開示する。リボスイッチは、例えば、ＲＮＡ分子のオルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｉｃｉｎｇ）を調節することができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。したがって、リボスイッチを含む目的のＲＮＡ分子を、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する条件に供して、ＲＮＡの発現を変化させるために用いることができる。例えば、転写の終結またはＲＮＡへのリボゾーム結合の遮断の結果として発現を変化させることができる。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質および生じるオルタナティブスプライシングの型に応じて、ＲＮＡ分子の発現を減少または防止することができるか、またはＲＮＡ分子の発現を促進または増加することができる。
【０１４６】
リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってスプライシングを調節するリボスイッチを含む天然に存在する遺伝子またはＲＮＡの発現を調節する方法も開示する。リボスイッチは、例えば、ＲＮＡのオルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｉｃｉｎｇ）を調節することができる。遺伝子がこの遺伝子を保有する細胞または生物の生存に不可欠である場合、リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断により、細胞または生物が死滅、静止、または衰弱し得る。例えば、微生物の生存に不可欠な天然に存在する遺伝子中の天然に存在するリボスイッチの活性化により、微生物を死滅させることができる（リボスイッチの活性化によってオルタナティブスプライシングが調節され、次いで、極めて重要なタンパク質が上方制御または下方制御される場合）。これは、抗菌効果および抗真菌効果のための開示の化合物よび方法の使用の１つの基礎である。これらの抗菌効果を有する化合物は、静菌性または殺菌性もしくは殺真菌性を示すと見なされる。  
【０１４７】
スプライシングを調節するリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物を選択および同定する方法も開示する。リボスイッチは、例えば、オルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｉｃｉｎｇ）を調節することができる。リボスイッチの活性化は、トリガー分子の結合の際のリボスイッチの状態の変化をいう。リボスイッチを、トリガー分子以外の化合物およびトリガー分子の結合以外の方法で活性化することができる。用語トリガー分子を、本明細書中で、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物をいうために使用する。これには、リボスイッチおよびリボスイッチを活性化することができる他の化合物のための天然または通常のトリガー分子が含まれる。天然または通常のトリガー分子は、所与の天然のリボスイッチのトリガー分子またはいくつかの非天然リボスイッチの場合、リボスイッチがデザインされるか、リボスイッチが選択される（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択技術またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化技術など）トリガー分子である。非天然トリガー分子を、非天然トリガー分子ということができる。
【０１４８】
真菌感染した被験体を同定する工程、有効量のＴＰＰ応答性リボスイッチを阻害する化合物を被験体に投与し、それにより、真菌増殖を阻害する工程を含む、真菌増殖阻害方法も開示する。真菌増殖の阻害は、真菌バイオマスを１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％減少させることができる。
【０１４９】
スプライシングを調節するリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物を同定する方法も開示する。例えば、リボスイッチを活性化する化合物を、試験化合物とリボスイッチとを接触させる工程、および遺伝子産物のオルタナティブスプライシングの測定またはスプライシング事象の結果として発現した異なるタンパク質レベルの測定のいずれかによってリボスイッチ活性化を評価する工程によって同定することができる。リボスイッチが活性化される場合、試験化合物を、リボスイッチを活性化する化合物と同定する。リボスイッチの活性化を、任意の適切な様式で評価することができる。例えば、リボスイッチをレポーターＲＮＡに連結することができ、レポーターＲＮＡの発現、発現レベル、または発現レベルの変化を、試験化合物の存在下および非存在下で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むことができる。かかるリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するか、これから誘導したアプタマードメインを使用する。認められるように、調節アッセイまたは測定を使用するかあるいは調節アッセイまたは測定を使用しないで、リボスイッチ活性化の評価を実施することができる。リボスイッチを非活性化する化合物の同定方法を、類似の方法で行うことができる。
【０１５０】
本明細書中の他所に開示の方法に加えて、スプライシングを調節するリボスイッチを遮断する化合物の同定を、任意の適切な様式で行うことができる。例えば、リボスイッチを活性化または非活性化することが公知の化合物の存在下および試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を評価するためのアッセイを行うことができる。試験化合物の非存在下において認められないのと同様に活性化または非活性化が認められない場合、試験化合物を、リボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定する。
【０１５１】
オルタナティブスプライシングを調節するバイオセンサーリボスイッチを使用した化合物の検出方法も開示する。本方法は、試験サンプルとバイオセンサーリボスイッチとを接触させる工程およびバイオセンサーリボスイッチの活性化を評価する工程を含むことができる。バイオセンサーリボスイッチの活性化は、試験サンプル中のバイオセンサーリボスイッチのためのトリガー分子の存在を示す。バイオセンサーリボスイッチは、その同系トリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを産生する操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、トリガー分子の閾値レベルまたは閾値レベルを超えて誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のためにデザインすることができる。例えば、オルタナティブ結合を調節するバイオセンサーリボスイッチを、細胞または生物にリボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を保有させるように操作することによってｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができるシグナルとしての機能を果たすかシグナル産生に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに作動可能に連結することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用するバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識（リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル）を含むリボスイッチである。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するＴＰＰリボスイッチに由来するか誘導したアプタマードメインを使用する。
【０１５２】
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の同定および同定された化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物同定方法と同定された化合物の製造方法との組み合わせにより、これを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触工程、リボスイッチの活性化の評価工程、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造工程によって化合物を作製することができる。
【０１５３】
化合物によるリボスイッチの活性化、非活性化、または遮断のチェック工程およびチェックした化合物の製造工程によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示したように化合物の活性化、非活性化、または遮断の評価方法とチェックした化合物の製造方法との組み合わせによってこれを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触工程、リボスイッチ活性化の評価工程、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造工程によって化合物を作製することができる。化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する能力についての化合物のチェックは、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することを以前に知られていない化合物の同定および化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することが既に知られていた場合のリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の能力の評価の両方をいう。
【０１５４】
Ａ．抗真菌化合物の同定
化合物の非存在下での同一のリボスイッチアッセイと比較して（すなわち、コントロールアッセイと比較して）、化合物の存在下のリボスイッチアッセイにおけるシグナルが少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、または５００％増加する場合に、化合物がリボスイッチを活性化すると同定することができるか、リボスイッチ活性化活性を有すると決定することができる。リボスイッチアッセイを、任意の適切なリボスイッチ構築物を使用して行うことができる。リボスイッチ活性化アッセイに特に有用なリボスイッチ構築物を、本明細書中の他所に記載している。１つまたは複数の特定のリボスイッチ、リボスイッチ構築物、またはリボスイッチクラスに関して、化合物を、リボスイッチを活性化するかリボスイッチ活性化活性を有すると同定することができる。便宜上、オルタナティブスプライシングを調節するリボスイッチを活性化すると同定された化合物を、そのように特定のリボスイッチについて同定することができる。
【０１５５】
Ｂ．抗真菌化合物の使用方法
ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗真菌法を本明細書中に開示する。「抗真菌」は、真菌増殖の阻害もしくは防止、真菌の殺滅、または真菌数の減少を意味する。したがって、真菌を有効量の１つまたは複数の本明細書中に開示の化合物と接触させる工程を含む、真菌増殖を阻害または防止する方法を開示する。開示の化合物のさらなる構造を、本明細書中に提供する。
【０１５６】
真菌細胞増殖を阻害する方法であって、細胞をＴＰＰ応答性リボスイッチに結合する化合物と接触させる工程を含み、細胞がＴＰＰ応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、化合物が、ＴＰＰ応答性リボスイッチに結合し、それにより、ＴＰＰ産生が制限されることによって細菌細胞増殖を阻害する、真菌増殖阻害方法を開示する。本方法により、化合物と接触しない細胞と比較して、細菌細胞増殖を少なくとも１０％減少させることができる。化合物の被験体への投与によって化合物と細胞とを接触させることができる。細胞は被験体中の真菌細胞であり得、化合物は、真菌細胞を殺滅させるかその増殖を阻害する。被験体は、真菌感染を有することができる。化合物を、別の真菌化合物と組み合わせて投与することができる。
【０１５７】
真菌を以下を含む群から選択することができる：例えば、
【０１５８】
【化６】
2010521977.tif 000007
【０１５９】
【化７】
2010521977.tif 000008
。真菌増殖を、真菌が見出される任意の状況で阻害することもできる。例えば、流動物中、バイオフィルム中、および表面上の真菌増殖を阻害することができる。本明細書中に開示の化合物を、任意の他の化合物または組成物と組み合わせて投与または使用することができる。例えば、開示の化合物を、別の抗真菌化合物と組み合わせて投与または使用することができる。
【０１６０】
「真菌増殖の阻害」を、１つの真菌の娘細胞への分裂能力の減少または真菌集団の娘細胞の形成能力の減少と定義する。真菌の再生能力を、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または１００％またはそれを超えて減少させることができる。
【０１６１】
本明細書中に開示および記載された１つまたは複数の化合物と真菌を接触させる工程を含む、真菌または真菌集団の増殖を阻害し、そして／または殺滅させる方法も提供する。
【０１６２】
「真菌の殺滅」を、１つの真菌の死滅または複数の真菌（コロニー中の真菌など）の数の減少と定義する。真菌を複数の形態について言及する場合、「真菌の殺滅」を、集団の１０％、集団の２０％、集団の３０％、集団の４０％、集団の５０％、集団の６０％、集団の７０％、集団の８０％、集団の９０％、または集団の１００％未満または集団の１００％の比率での所与の真菌集団の細胞死と定義する。
【０１６３】
本明細書中に開示の化合物および組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで抗真菌活性を有し、殺真菌性も同様に示し得る他の化合物または組成物と併せて使用することができる。
【０１６４】
本明細書中に提供される化合物の、用語「治療有効量」は、非毒性であるが、１つまたは複数の症状を望ましく減少させるのに十分な化合物の量を意味する。以下に指摘するように、化合物の正確な必要量は、被験体の種、年齢、および一般的な健康状態、処置を受ける疾患の重症度、使用された特定の化合物、ならびにその投与様式などに応じて被験体によって変化する。したがって、正確な「有効量」を特定することは可能でない。しかし、当業者は、適切な有効量を、日常的な実験のみを使用して決定することができる。
【０１６５】
本明細書中に開示の組成物および化合物を、薬学的に許容可能なキャリア中にてｉｎ  ｖｉｖｏで投与することができる。「薬学的に許容可能な」は、生物学的でないか、そうでなければ望ましくないことはない材料を意味する。すなわち、材料を、いかなる望ましくない生物学的影響を引き起こすことなくまたは含有するいかなる薬学的組成物の他の成分との有害様式での相互作用も引き起こすことなく被験体に投与することができる。当業者に周知のように、キャリアを、当然のことながら、有効成分の任意の分解を最小にし、被験体における任意の有害な副作用を最小にするように選択する。
【０１６６】
本明細書中に開示の組成物または化合物を、経口、非経口（例えば、静脈内）、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮、体外、局所など（局所的鼻腔内投与または吸入剤による投与が含まれる）で投与することができる。本明細書中で使用する場合、「局所鼻腔内投与」は、外鼻孔の一方または両方を介した鼻および鼻道への組成物の送達を意味し、噴霧機構もしくは液滴機構、または核酸もしくはベクターのエアゾール化による送達を含むことができる。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達によって鼻または口を介して行うことができる。挿管によって呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接送達させることもできる。組成物の正確な必要量は、被験体の種、年齢、体重、および一般的な健康状態、処置を受けるアレルギー障害の重症度、使用された特定の核酸またはベクター、ならびにその投与様式などに応じて被験体によって変化する。したがって、全ての組成物について正確な量を特定することは可能でない。しかし、当業者は、適切な量を、本明細書中に教示された日常的な実験のみを使用して決定することができる。
【０１６７】
組成物または化合物の非経口投与は、使用する場合、一般に、注射によって特徴づけられる。注射剤を、従来の形成で、液体溶液または懸濁液、注射前に液体中に懸濁する溶液に適切な固体形態、または乳濁液として調製することができる。より最近に修正された非経口投与アプローチは、一定の投薬量を維持するような遅延放出系または徐放系の使用を含む。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１６８】
本明細書中に開示の組成物および化合物を、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて治療的に使用することができる。適切なキャリアおよびその処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。典型的には、処方物を等張にするのに適切な量の薬学的に許容可能な塩を処方物中で使用する。薬学的に許容可能なキャリアの例には、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなるキャリアには、マトリックスが成形製品の形態である（例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子）抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性調製物が含まれる。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じて、一定のキャリアがより好ましいことが当業者に明らかである。
【０１６９】
薬学的キャリアは、当業者に公知である。これらは、最も典型的には、ヒトへの薬物投与のための標準的なキャリアである（滅菌水、生理食塩水、生理学的ｐＨの緩衝化溶液などの溶液が含まれる）。組成物を、筋肉内または皮下に投与することができる。他の化合物を、当業者によって使用される標準的な手順にしたがって投与する。
【０１７０】
薬学的組成物は、選択の分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、および界面活性剤などを含むことができる。薬学的組成物はまた、１つまたは複数の有効成分（抗菌薬、抗炎症薬、および麻酔薬など）を含むことができる。
【０１７１】
薬学的組成物を、局所処置または全身処置のいずれが望ましいかおよび処置する領域に応じて多数の方法で投与することができる。投与は、局所（眼科、膣、直腸、鼻腔内が含まれる）、経口、吸入、または非経口（例えば、点滴、皮下、腹腔内、または筋肉内注射）であり得る。開示の抗体を、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮に投与することができる。
【０１７２】
非経口投与のための調製物には、滅菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）、および注射可能な有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。水性キャリアには、水、アルコール溶液／水溶液、乳濁液または懸濁液（生理食塩水および緩衝化溶媒が含まれる）が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補給液（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、および電解質補給液（リンゲルデキストロースにもとづくものなど）などが含まれる。防腐剤および他の添加物も存在し得る（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなど）。
【０１７３】
局所投与のための処方物には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の薬学的キャリア、水性、粉末、または油性ベース、および増粘剤などが必要であるか望ましくあり得る。
【０１７４】
経口投与のための組成物には、粉末または顆粒、水性媒体または非水性媒体での懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味物質、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましくあり得る。
【０１７５】
いくつかの組成物を、無機酸（塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸など）および有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸など）との反応によりまたは無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど）および有機塩基（モノ、ジ、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンなど）との反応によって形成された薬学的に許容可能な酸付加塩または塩基付加塩として潜在的に投与することができる。
【０１７６】
本明細書中に開示の治療組成物を、化合物分子をカップリングする個別のキャリアとしてのモノクローナル抗体の使用によって送達させることもできる。本開示の治療組成物を、標的化が可能な（ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ）薬物キャリアとしての可溶性ポリマーとカップリングすることもできる。かかるポリマーには、ポリビニル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドフェノール（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌ−ａｍｉｄｅｐｈｅｎｏｌ）、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル残基と置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが含まれ得るが、これらに限定されない。さらに、本開示の治療組成物を、薬物の制御放出の実施に有用な生分解性ポリマークラス（例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルソエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマー）とカップリングすることができる。
【０１７７】
好ましくは少なくとも約３％、より好ましくは約１０％、より好ましくは約２０％、より好ましくは約３０％、より好ましくは約５０％、より好ましくは７５％、およびさらにより好ましくは約１００％の真菌感染が、化合物の投与によって減少する。感染の減少を、白血球数の減少、熱の低下、炎症の減少、真菌数の減少、真菌感染の他の指標の減少などのパラメーターによって決定する。真菌感染の減少率を増加させるために、被験体に対して非毒性を保持する最も有効なレベルに投薬量を増加させることができる。
【０１７８】
全体を通して使用する場合、「被験体」は、個体をいう。好ましくは、被験体は、哺乳動物（非ヒト哺乳動物または霊長類、およびより好ましくはヒトなど）である。「被験体」には、飼い慣らされた動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ  ａｎｉｍａｌ）（ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）、および魚類が含まれ得る。
【０１７９】
「真菌感染」を、被験体またはサンプル中の真菌の存在と定義する。かかる真菌は、被験体またはサンプル中またはその上の天然に存在する真菌の増殖であり得るか、外来生物の侵入に起因し得る。
【実施例】
【０１８０】
（実施例１）真核生物リボスイッチによるオルタナティブＲＮＡスプライシングおよび遺伝子発現の調節
ＴＰＰアプタマーを保有する真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｔｈｉＡ  ｍＲＮＡの以前の研究（Ｋｕｂｏｄｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３））により、増殖培地へのチアミン（ビタミンＢ１）補充によって遺伝子発現が減少し、リボスイッチアプタマー部分の欠失によってチアミン応答性が破壊されることが明らかとなった。これらの知見は、チアミンが細胞に侵入し、リン酸化してＴＰＰを生成し、生じた補酵素が真菌におけるＲＮＡスプライシングのリボスイッチ媒介性調節のリガンドとしての機能を果たすことを示す（Ｓｕｄａｒｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３））。本研究では、Ｎ．ｃｒａｓｓａにおける３つの遺伝子中に存在するＴＰＰアプタマーの機能（図５）を試験した。３つの遺伝子のうちの２つ（ＮＭＴ１（図１ａ）およびＣｙＰＢＰ３７（図１ｂ；以後、ＴＨＩ４のホモログと呼ばれる））は、チアミン代謝遺伝子であることが公知である（ＭｃＣｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｆａｏｕ  ＆  Ｔｒｏｐｓｃｈｕｇ（２００３），Ｆａｏｕ  Ｔｒｏｐｓｃｈｕｇ（２００４））。第３の遺伝子であるＮＣＵ０１９７７．１（図１ｃ）は、未知の機能のタンパク質をコードする。
【０１８１】
実験は、主にＮＭＴ１遺伝子に注目した。この遺伝子は、Ｎ．ｃｒａｓｓａ（ＭｃＣｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００３））およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ（１９８９））において過剰なチアミンによって抑制されることが知られている。３つ全ての前駆体ｍＲＮＡは、５’末端付近に存在するイントロン中にリボスイッチを保有する（図１、図６）。逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を使用して、Ｎ．ｃｒａｓｓａをチアミンの非存在下または存在下で増殖させた場合に産生された転写産物の５’末端の相対量およびヌクレオチド配列を確立した（図１ｄ）。ＲＮＡ産物のクローニングおよび配列決定により、ゲノムＤＮＡ配列とマッチした前駆体転写物の存在および図１に示すＲＮＡスプライシング産物と一致する他の配列の存在が明らかとなった。結果により、チアミンによってＮＭＴ１およびＴＨＩ４前駆体ｍＲＮＡがオルタナティブスプライシングされ、ＮＣＵ０１９７７．１前駆体ｍＲＮＡのスプライシングが増加することが確認される。チアミンは、ＴＰＰリボスイッチを保有しないＲＮＡのスプライシングに影響を及ぼさない（図７）。
【０１８２】
ＮＭＴ１  ＲＮＡ構築物によるＴＰＰ結合を、インライン探索によって確認した（Ｓｏｕｋｕｐ  ＆  Ｂｒｅａｋｅｒ（１９９９））（図８および９）。主な構造調整を示すヌクレオチドは、ＴＰＰ結合に関与することが知られており（Ｔｈｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｓｅｒｇａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｅｄｗａｒｄｓ  ＆  Ｆｅｒｒe−Ｄ’Ａｍａｒe（２００６））、両構築物について測定した約３００ｐＭの見かけの解離定数（ＫＤ）は、細菌ＴＰＰリボスイッチによって示したＫＤに類似する（Ｗｉｎｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｗｅｌｚ  ＆  Ｂｒｅａｋｅｒ（２００７））。ＮＭＴ１  ＲＮＡオルタナティブスプライシングのチアミン調節をＲＴ−ＰＣＲの使用によってさらに調査して最小培地中で増殖させたＮ．ｃｒａｓｓａから単離した転写型および転写量を確立し、チアミン補充後の種々の時点でサンプリングした（図２ａ）。チアミン無添加では（ｔ＝０分）、転写物がプロセシングされて、スプライシング産物Ｉ−３が得られる。チアミン補充後の最初の１時間以内に、スプライシング産物Ｉ−２および非スプライシングＮＭＴ１前駆体ＲＮＡ  Ｉ−１が出現する。４時間以内に、Ｉ−３は、ほとんど完全にＩ−２およびＩ−１に取って代わられる。これらの結果は、チアミン添加後のＩ−３の急激な減少がＮＭＴ１発現の減少に関与することを示す。
【０１８３】
ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）レポーター遺伝子とインフレームで融合した主なＯＲＦの開始コドンと共にＮＭＴ１  ５’ＵＴＲまたはその改変体（図２ｂ）を保有する構築物を使用して、遺伝子調節についてのＴＰＰアプタマーの重要性を評価した。野生型（ＷＴ）ＬＵＣレポーター構築物の実質的抑制は、３０μＭチアミンを補充した培地中で一晩増殖させたＮ．ｃｒａｓｓａによって起こる（図２ｃ、上）。さらに、レポーター構築物および天然ＮＭＴ１  ｍＲＮＡ由来のＲＴ−ＰＣＲ産物は同等である（図２ｃ、下）。ほとんどの変異構築物は、細胞を無チアミン培地で増殖させた場合にＷＴと比較して、２〜４倍のレポーター活性の増加を示す。ＴＰＰ結合親和性を弱める変異はまた、潜在的に、最小培地中で増殖している細胞中のＴＰＰ合成に起因する適度なレベルの遺伝子抑制を消去する。
【０１８４】
アプタマー内の塩基対合を破壊し、その後に修復するステムＰ１〜Ｐ５の変異により（構築物Ｍ１〜Ｍ９、図２ｂ）、ほとんどに遺伝子調節特性が得られ、これは、ＲＮＡがＴＰＰに結合する能力と相関する。Ｍ５においてＰ３の伸長部分が破壊されるにもかかわらず、この変化はアプタマーのＴＰＰ結合コアの外側で起こり、遺伝子調節にほとんど影響を及ぼさない。さらに、機能を完全に失うことなく伸長Ｐ３ステムの大部分を欠失することができる（Ｍ１０、図８中の１１５  ＮＭＴ１  ＲＮＡに類似）。Ｍ１における変異によってＬＵＣ活性が劇的に減少し、典型的なｍＲＮＡ産物は検出されない（図２ｃ）。これは、アプタマー内のいくつかのヌクレオチドおよび構造が、ＴＰＰを結合するその役割に加えてｍＲＮＡの転写またはプロセシングに影響を及ぼすことができることを示す。
【０１８５】
最も明らかな結果がＭ９で見出された。Ｍ９はＭ８のＰ５ステム中の破壊変異に対する代償変異を有する。Ｍ９は、チアミン依存性遺伝子調節の部分的回復のみを示すが、ＷＴまたは他の代償変異体よりはるかに低い発現レベルである（図２ｃ）。Ｍ９のこれらの珍しい特徴は、Ｐ５内のヌクレオチドがオルタナティブスプライシングの調節に関与する機構と一致する（以下を参照のこと）。
【０１８６】
チアミン調節に及ぼすほとんどの変異の影響により、非スプライシングまたはオルタナティブスプライシングしたＲＮＡが主なＯＲＦの上流の開始コドンの存在によって不活性であることが推測される（図１ａ）。この仮説を、ＷＴまたはＮＭＴ１  ５’ＵＴＲの３つの型の変異体バージョンの下流に融合したさらなるＬＵＣレポーター構築物を試験することによって試験した（図３ａ）。得られた構築物Ｉ−３Ｒ（上流開始コドンを欠き、チアミン無添加で優勢である短い（または完全な）スプライシングｍＲＮＡを模倣する）により、活発なレポーター活性を生じる（図３ｂ）。対照的に、類似のＩ−２Ｒ構築物はレポーター活性をほとんど示さず、これは、チアミンが存在し、且つ遺伝子発現が減少する場合にこのスプライス改変体の天然の産生と一致する（図２ｃ）。構築物Ｉ−２ＲおよびＩ−３Ｒを使用したＬＵＣ発現レベルは、チアミン添加によって変化しない。これは、ＴＰＰリボスイッチが存在しないので予想通りである。
【０１８７】
主なＮＭＴ１  ＯＲＦの上流のオルタナティブスプライシングされたＩ−２構築物（図３ａ）中の第１（Ｍ１１）、第２（Ｍ１２）、または両方（Ｍ１３）の開始コドンの破壊により、レポーター発現が徐々に増加する構築物が得られる。真菌遺伝子の５’ＵＴＲ  中の短い上流ＯＲＦ（ｕＯＲＦｓ）が主なＯＲＦの発現を減少させることが認められた（Ｖｉｌｅｌａ  ＆  ＭｃＣａｒｔｈｙ（２００３））。したがって、Ｉ−２中の両方の  ｕＯＲＦ開始コドンの破壊の際のＬＵＣ発現の回復は、ｕＯＲＦ翻訳が主なＮＭＴ１  ＯＲＦ発現の減少を担うという仮説と一致する。
【０１８８】
第１の５’スプライス部位（Ｍ１４）、スプライシング分岐部位（Ｍ１５）、または３’スプライス部位（Ｍ１６）での変異を有する転写物（図３ａ）により、レポーター発現が一様に低くなる（図３ｂ、上）。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、Ｍ１４によってＩ−２Ｒ  ＲＮＡスプライシング産物が得られる一方で、Ｍ１５およびＭ１６はスプライシングされない（図３ｂ、下）ことが明らかとなった。これらの知見は、ｕＯＲＦを除去して主なＯＲＦを発現させるために適切なスプライシングが必要であることを証明する。
【０１８９】
多数の細菌リボスイッチについて、代謝産物結合により、タンパク質を含むことなくアプタマーの下流に存在する発現プラットフォームの折り畳みが変化する（Ｗｉｎｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｍｉｒｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｓｅｒｇａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００６））。ＮＭＴ１  ＴＰＰリボスイッチによるスプライシング調節がアプタマー側面（ｆｌａｎｋ）のタンパク質非依存性構造調整に起因するかどうかを評価するために、ＮＭＴ１  ＵＴＲ構築物をインライン探索に供した（Ｓｏｕｋｕｐ  ＆  Ｂｒｅａｋｅｒ（１９９９））。興味深いことに、ＴＰＰの添加によって分岐部位のヌクレオチドがより構造化するようになり（図１０）、第２の５’スプライス部位でより可塑性の高い構造が得られる（図４ａ）。さらに、アプタマーのＰ４およびＰ５エレメントの１２ヌクレオチドがリガンドが存在しない場合に構造的に配列決定される第２の５’スプライス部位でほとんどのヌクレオチドと相補的であることが認められた（図４ｂ）。Ｐ４およびＰ５エレメントはＴＰＰのピロリン酸部分の認識に必要であり、したがって、ＴＰＰ結合および５’スプライス部位閉塞は、相互に排他的である。
【０１９０】
ｉｎ  ｖｉｖｏレポーターアッセイにおける構築物Ｍ９の珍しい特徴は、このリボスイッチ機能モデルと一致する。インライン探索により、Ｍ９変異がアプタマーと第２の５’スプライス部位との間の塩基対合を破壊することを確認し（図１１）、この構造上の欠陥が、観察された長いスプライシングされたｍＲＮＡの産生およびレポーター発現の喪失に好都合であると予想される（図２ｃ）ことが確認される。さらに、類似のオルタナティブ塩基対合の可能性が他の真菌種由来のＮＭＴ１遺伝子に関連する全てのＴＰＰリボスイッチに存在し（図１２）、この保存されたオルタナティブ二次構造がＴＰＰリボスイッチ発現プラットフォームの重要な特徴であることを示す。２つの５’スプライス部位と共に存在する場合、真菌Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来のスプライソソームが３’スプライス部位に近接する部位の使用を非常に好むことが証明されている（Ｒｏｍｆｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００））。この５’スプライス部位優先を考慮すると、ＮＭＴ１  ｍＲＮＡ中のＴＰＰリボスイッチは、単にＰ４−Ｐ５アプタマー領域と第２の５’スプライス部位との間の塩基対合の調整によってオルタナティブスプライシング産物の分配の完全な調節を維持することができる。他の真菌遺伝子中のＴＰＰリボスイッチは、異なる遺伝子調節機構を使用するように現れる（図１３）。
【０１９１】
データはＴＰＰリボスイッチ媒介性スプライシング調節機構と一致し、この機構は、代謝産物結合がイントロンのオルタナティブスプライス部位および分岐部位成分の利用可能性を変化させる（図４ｃ）。ＴＰＰ濃度が低い場合、新規に転写されたｍＲＮＡは第２の５’スプライス部位を塞ぐ構造を採用する一方で、スプライシングに利用可能な分岐部位を残す。第１の５’スプライス部位由来のＰｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングにより、ｍＲＮＡのＩ−３形態が産生され、ＮＭＴ１タンパク質を発現する。ＴＰＰ濃度が高い場合、ＴＰＰアプタマーへのリガンド結合によってＲＮＡ折り畳みのアロステリック変化が起こり、それにより、第２の５’スプライス部位付近の構造柔軟性が増加し、分岐部位付近のヌクレオチドが塞がれる。これらの変化の組み合わされた効果は、Ｉ−１  ｍＲＮＡのスプライシング効率の減少およびプロセシングされたＩ−１  ｍＲＮＡの再指示であり、それにより、オルタナティブスプライシングされたＩ−２  ｍＲＮＡが得られる。Ｉ−１およびＩ−２は、主なＯＲＦの翻訳を競合してＮＭＴ１発現を抑制するｕＯＲＦを保有する。
【０１９２】
真核生物遺伝子調節におけるオルタナティブスプライシングの関与は明らかになりつつあり（Ｍａｔｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｂｌｅｎｃｏｗｅ（２００６））、これらの知見により、どのようにしてリボスイッチがタンパク質因子を必要とせずにスプライシング効率およびスプライス部位選択を調整することができるのかが明らかになっている。膨大な多様性を有するＲＮＡの折り畳み可能性を考慮すると、構造化ＲＮＡドメインは、温度（Ｃｏｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５））または代謝産物濃度の変化（Ｓｕｄａｒｓａｎ    ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｋｕｂｏｄｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｂｏｒｓｕｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７））などの物理的変化の直接的な読み取りによって、スプライシングを調節するために広く使用される可能性が高い（Ｂｕｒａｔｔｉ  ＆  Ｂａｒａｌｌｅ（２００４））。さらに、操作されたアプタマーを使用したスプライシングのリガンド媒介性調節の例は既に公表されており（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００５））、直接リガンド−ｍＲＮＡ相互作用を遺伝子調節の適用に利用することができることを証明している。真菌ＴＰＰリボスイッチを使用した知見により、別の生物界由来のリボスイッチの多用途性が明らかとなり、他の遺伝子調節過程における発見されていないリボスイッチクラスが関与する可能性が示唆される。
【０１９３】
方法の概要
オリゴヌクレオチドおよび化学物質。ＲＮＡを合成し、合成ＤＮＡ（図１４）および試薬を購入し、詳細な方法に記すようにＤＮＡ構築物を作製した。
【０１９４】
ＲＮＡ分析。０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−ヒスチジンを補充した１００ｍｌのＶｏｇｅｌ最小培地に接種した非形質転換Ｎ．ｃｒａｓｓａ由来のＲＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。培養物を、補充した３０μＭチアミンの非存在下または存在下で、１５０ｒｐｍで震盪しながら３０℃で２４時間増殖させた。補足情報に記載のプライマーおよび方法を使用して、ｃＤＮＡを、３つの遺伝子の５’領域のＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。全スプライシング産物を、クローニングおよび配列決定によって確認した。
【０１９５】
レポーター遺伝子アッセイ。新たに懸濁した大分生子（ｍａｃｒｏｃｏｎｉｄｉａ）のエレクトロポレーションを使用してＮ．ｃｒａｓｓａを形質転換し、標的遺伝子の挿入を、ゲノムＤＮＡ由来の挿入特異的プライマーを使用したＰＣＲによって検証した。ルシフェラーゼレポーター構築物の転写を、ＮＭＴ１  ５’ＵＴＲの上流に挿入したＮ．ｃｒａｓｓａ  β−チューブリン（ＢＴＵＢ）プロモーターによって構成性に駆動させた。Ｎ．ｃｒａｓｓａを、３０μＭチアミンの非存在下または存在下で２％グルコース最小培地中にて３０℃で一晩増殖させた。下記のように、サンプルを単離し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。
【０１９６】
方法
バイオインフォマティクス検索および真菌ＴＰＰリボスイッチ。公知の代表的ＴＰＰリボスイッチから適合させた手作業で入力した（ｍａｎｕａｌｌｙ  ｃｕｒａｔｅｄ）シード配列アラインメントを使用した共分散モデル検索を使用して、ＲｅｆＳｅｑデータベース（バージョン１３）の「真菌」門を試験した。共分散モデル（Ｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４））を、ｉｎｆｅｒｎａｌソフトウェアパッケージ（Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ））（バージョン０．５５）を使用して作製した。さらなる詳細については、補足情報も参照のこと。
【０１９７】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび化学物質。合成ＤＮＡを、ＨＨＭＩ  Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから購入した。ＴＰＰ、チアミン、ヨード酢酸ナトリウム（ＩＡＡ）、およびＬ−ヒスチジンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入した。
【０１９８】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写。ＤＮＡテンプレートを、Ｔ７プロモーターを構築物に導入するようにデザインしたプライマーを使用したＮ．ｃｒａｓｓａのゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅によって産生した。配列ＣＣをテンプレート鎖転写開始部位に付加して効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を促進し、それにより、その５’末端にＧＧを保有するＲＮＡを産生した。製造者の説明書にしたがってＲｉｂｏＭａｘ転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＲＮＡを調製した。以前に記載のように、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）および５’３２Ｐ標識によってＲＮＡを精製した（Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１））。
【０１９９】
ＲＮＡ構築物のインライン探索。５’３２Ｐ標識ＲＮＡを、定義のＴＰＰの存在下または非存在下で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、２５°Ｃ）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１００ｍＭ  ＫＣｌ中にて２３℃で４０時間インキュベートした。切断産物を変性１０％ＰＡＧＥによって分離し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって視覚化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用して定量した。切断ＲＮＡの正規化比率対使用したリガンド濃度の対数のプロッティングによってＫＤ値を決定した。
【０２００】
株、プラスミド、および培地。Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ８７〜７４（ｂｄ；ｆｒｑ＋  ａ；ｈｉｓ−３）（Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３））を、形質転換の宿主株として使用した。プラスミドｐＬＬ０７（Ｊ．Ｃ．Ｄｕｎｌａｐの研究室から譲渡）（Ｍｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２））（ホタルルシフェラーゼ（ＬＵＣ）レポーター遺伝子を保有する）を、レポーター遺伝子構築のために使用した。ｐＬＬ０７中のＬＵＣレポーター遺伝子の開始コドンをＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）部位特異的変異誘発によって除去して、プラスミドｐＬＬ０９を得た。
【０２０１】
１〜３５５位の範囲のＮ．ｃｒａｓｓａ中のβ−チューブリン遺伝子のプロモーター（アクセッション番号  Ｍ１３６３０）（Ｏｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６））を、プライマーＤＮＡ３およびＤＮＡ４を使用したＰＣＲによってゲノムＤＮＡから増幅した。増幅したＤＮＡフラグメントをＭｆｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＬＬ０９のＥｃｏＲＩ部位に挿入してｐＬＵＣを得た。ｐＬＵＣ配列を配列決定によって確認した（ＨＨＭＩ  Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、プラスミド操作における宿主として使用した。
【０２０２】
ＮＭＴ１遺伝子（アクセッション番号  ＡＹ００７６６１）の５’ＵＴＲのクローニングを、プライマーＤＮＡ５およびＤＮＡ６を使用したＮ．ｃｒａｓｓａのゲノムＤＮＡ由来の３７８ｂｐフラグメント（注釈付きの転写開始部位から開始する）のＰＣＲ増幅によって行った。得られた野生型（ＷＴ）ＰＣＲ  ＤＮＡを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して最初にクローン化した。ＮＭＴ１フラグメントをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩの制限酵素消化によってベクターから放出させ、適切なｐＬＵＣ部位にクローン化した。
【０２０３】
アプタマー変異体Ｍ１〜Ｍ９およびスプライス部位変異体Ｍ１４〜Ｍ１６の生成のために、ＴＯＰＯベクターを含むＷＴ  ＮＭＴ１に対してＰＣＲ変異誘発を行った（プライマーリストを参照のこと）。ＤＮＡ配列決定による変異誘発の確認後、各変異ＮＭＴ１フラグメントを、ｐＬＵＣのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位にクローン化した。Ｐ３欠損構築物（Ｍ１０）のクローニングのために、プライマーＤＮＡ５／ＤＮＡ２５およびＤＮＡ２６／ＤＮＡ６（重複領域が天然のＰ３ａステムの大部分を欠失する）を使用して２つのフラグメント中にＮＭＴ１を増幅した。これら２つのフラグメントを、アウタープライマーＤＮＡ５およびＤＮＡ６を使用したその後のＰＣＲにおけるテンプレートとして使用した。得られたフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＬＵＣにクローン化した。Ｉ−２Ｒ構築物およびＩ−３Ｒ構築物ならびにＮＭＴ１改変体の調製を、プライマーＤＮＡ５およびＤＮＡ６を使用したこれら２つのオルタナティブスプライシングした産物のＲＴ−ＰＣＲ増幅によって行った。上記のように、得られたＰＣＲ産物をクローン化し、変異させた。
【０２０４】
ＮＣＵ０１９７７．１の５’領域−ＬＵＣレポーター融合物を生成するために（図１３）、推定開始コドンの９４ヌクレオチド上流から始まる４７８ヌクレオチドフラグメントを、プライマーＤＮＡ４１およびＤＮＡ４２を使用してＮ．ｃｒａｓｓａのゲノムＤＮＡから増幅し、上記のようにｐＬＵＣのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位にクローン化した。全構築物の完全性を、配列決定によって確認した（ＨＨＭＩ  Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。全構築物について、主なＯＲＦ（ＮＭＴ１またはＮＣＵ０１９７７．１）の元の開始コドンを、ＬＵＣレポーター配列とインフレームで融合した。
【０２０５】
Ｎ．ｃｒａｓｓａ増殖のために使用した標準的な液体培地は、２％グルコース、０．５％Ｌ−アルギニン、１×Ｖｏｇｅｌ最小培地、および５０ｎｇ／ｍｌビオチンを含んでいた。Ｎ．ｃｒａｓｓａ増殖のために使用した固体培地（傾斜培地）は、１×Ｖｏｇｅｌ最小培地、２％スクロース、および１．５％寒天を含んでいた。Ｎ．ｃｒａｓｓａ形質転換体の選択のために使用した培地は、１×Ｖｏｇｅｌ最小培地、２％寒天、２％Ｌ−ソルボース、０．０５％フルクトース、および  ０．０５％グルコースを含んでいた。ホモカリオン単離のために、１％ＩＡＡを含む０．１×Ｗｅｓｔｅｒｇａａｒｄ培地を使用した。
【０２０６】
Ｎ．ｃｒａｓｓａ形質転換およびレポーターアッセイ。以前に記載のように、新たに懸濁した大分生子のエレクトロポレーションを使用してＮ．ｃｒａｓｓａを形質転換した（Ｄａｖｉｓ（２０００），Ｌｏｒｏｓ．＆  Ｄｕｎｌａｐ（１９９１），Ｖａｎｎ（１９９５））。標的遺伝子の挿入を、ゲノムＤＮＡ由来の挿入特異的プライマーを使用したＰＣＲによって検証した。ホモカリオン株を以前に記載のように単離した（Ｅｂｂｏｌｅ  ＆  Ｓａｃｈｓ（１９９０））。
【０２０７】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ。ＬＵＣレポーター構築物で形質転換したＮ．ｃｒａｓｓａ由来の菌糸体を濾過によって単離し、約１００ｍｇの組織を微粉末にした。１００μｌ  １×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加後、サンプルを強く混合し、氷上で３０分間インキュベートし、その後に１３，０００ｇで１５分間遠心分離した。ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびプレートリーディングルミノメーター（Ｗａｌｌａｃ）を使用して、得られた上清についてルシフェラーゼ活性を決定した。ルシフェラーゼ活性を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ）によって決定した抽出物の総タンパク質濃度に対して正規化し、最終的に参照構築物と比較して示した。ルシフェラーゼバックグラウンド活性（非形質転換Ｎ．ｃｒａｓｓａ）は、チアミン添加せずに増殖させた細胞中の野生型ＮＭＴ１構築物と比較して０．０５％であった。
【０２０８】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析。総ＲＮＡを、製造者の説明書にしたがってＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して菌糸体から単離した。５μｇの総ＲＮＡを、無ＲＮアーゼＤＮアーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して３７℃で３０分間処理した。製造者の説明書にしたがってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＴＭ  ＩＩ  逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したポリＴプライマーでの４２℃で１時間の逆転写によってｃＤＮＡを生成した。ゲノムＤＮＡでの汚染に起因する増幅産物の可能性を排除するために、ＲＴ前にＲＮＡ調製物を使用したコントロール反応を行い、ＮＭＴ１については、コード領域中のエキソンエキソン境界にわたる逆プライマーを使用した。
【０２０９】
バイオインフォマティクス検索および真菌ＴＰＰリボスイッチ。公知の代表的ＴＰＰリボスイッチから適合させた手作業で入力した（ｍａｎｕａｌｌｙ  ｃｕｒａｔｅｄ）シード配列アラインメントを使用した共分散モデル検索を使用して、ＲｅｆＳｅｑデータベース（バージョン１３）の「真菌」門を試験した。共分散モデル（Ｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４））を、ＩＮＦＥＲＮＡＬソフトウェアパッケージ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ０．５５）を使用して作製した。
【０２１０】
既知のリボスイッチ配列が回収されたことを検証するために、最終結果をチアミン代謝産物遺伝子の包括的比較ゲノミクス分析によってコンパイルしたＴＰＰリボスイッチのリストと比較した。このアプローチにより、微生物種で以前に見出されたあらゆるリボスイッチが首尾よく同定された。さらに、１１種の糸状構造の真菌由来の２３遺伝子に関連するＴＰＰリボスイッチを同定した（図５）。
【０２１１】
このアプローチによって真菌で同定されたいくつかのリボスイッチ関連遺伝子は、チアミン代謝に関与することが知られている。その各ＯＲＦのアミノ酸配列に基づいて、このリスト中の以前に特徴づけられていない遺伝子のほとんどはチアミン代謝性タンパク質のホモログであることも見出された。真菌で見出されたＴＰＰアプタマーはほとんどがその真正細菌ホモログと同一であり、これは、機能的保存と一致する。しかし、代表的真菌ＴＰＰアプタマーは、２つの顕著な相違を有する。第１の相違はＰ３ａステムの一貫した非存在であり、これは時折代表的な真正細菌に存在するが、アプタマーによるＴＰＰ結合に必要ない。第２の相違は、糸状構造の真菌中のＰ３ステムの長さの相当な不均一性であり、この不均一性は４〜８３塩基対の範囲である。Ｎ．ｃｒａｓｓａ中の３つのＴＰＰリボスイッチの位置を、図６に示す。
【０２１２】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび化学物質。合成ＤＮＡを、ＨＨＭＩ  Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから購入した。ＴＰＰ、チアミン、ヨード酢酸ナトリウム（ＩＡＡ）、およびＬ−ヒスチジンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入した。
【０２１３】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写。ＤＮＡテンプレートを、Ｔ７プロモーターを構築物に導入するようにデザインしたプライマーを使用したＮ．ｃｒａｓｓａのゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅によって産生した。配列ＣＣをテンプレート鎖転写開始部位に付加して効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を促進し、それにより、その５’末端にＧＧを保有するＲＮＡを産生した。製造者の説明書にしたがってＲｉｂｏＭａｘ転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＲＮＡを調製した。以前に記載のように、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）および５’３２Ｐ標識によってＲＮＡを精製した（Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１））。
【０２１４】
ＲＮＡ構築物のインライン探索。５’３２Ｐ標識ＲＮＡを、定義のＴＰＰの存在下または非存在下で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、２５°Ｃ）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１００ｍＭ  ＫＣｌ中にて２３℃で４０時間インキュベートした。切断産物を変性１０％ＰＡＧＥによって分離し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって視覚化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用して定量した。切断ＲＮＡの正規化比率対使用したリガンド濃度の対数のプロッティングによってＫＤ値を決定した。１９７  ＮＭＴ１および１１５  ＮＭＴ１のインライン探索の結果を図８および図９に示し、２６１  ＮＭＴ１の結果を図１０に示し、２７３  ＮＭＴ１の結果を図１１に示す。２７３  ＮＭＴ１構築物での試験と類似するオルタナティブ塩基対合は、ＮＭＴ１  ｍＲＮＡに存在する他の真菌ＴＰＰリボスイッチで認められる（図１２）。
【０２１５】
株、プラスミド、および培地。Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ８７〜７４（ｂｄ；ｆｒｑ＋  ａ；ｈｉｓ−３）（）を、形質転換の宿主株として使用した。プラスミドｐＬＬ０７（Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ  ２００４）（ホタルルシフェラーゼ（ＬＵＣ）レポーター遺伝子を保有する）を、レポーター遺伝子構築のために使用した。ｐＬＬ０７中のＬＵＣレポーター遺伝子の開始コドンをＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）部位特異的変異誘発によって除去して、プラスミドｐＬＬ０９を得た。
【０２１６】
１〜３５５位の範囲のＮ．ｃｒａｓｓａ中のβ−チューブリン遺伝子のプロモーター（アクセッション番号  Ｍ１３６３０）を、プライマーＤＮＡ３およびＤＮＡ４を使用したＰＣＲによってゲノムＤＮＡから増幅した。増幅したＤＮＡフラグメントをＭｆｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＬＬ０９のＥｃｏＲＩ部位に挿入してｐＬＵＣを得た。ｐＬＵＣ配列を配列決定によって確認した（ＨＨＭＩ  Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、プラスミド操作における宿主として使用した。
【０２１７】
Ｎ．ｃｒａｓｓａ増殖のために使用した標準的な液体培地は、２％グルコース、０．５％Ｌ−アルギニン、１×Ｖｏｇｅｌ最小培地、および５０ｎｇ／ｍｌビオチンを含んでいた。Ｎ．ｃｒａｓｓａ増殖のために使用した固体培地（傾斜培地）は、１×Ｖｏｇｅｌ最小培地、２％スクロース、および１．５％寒天を含んでいた。Ｎ．ｃｒａｓｓａ形質転換体の選択のために使用した培地は、１×Ｖｏｇｅｌ最小培地、２％寒天、２％Ｌ−ソルボース、０．０５％フルクトース、および  ０．０５％グルコースを含んでいた。ホモカリオン単離のために、１％ＩＡＡを含む０．１×Ｗｅｓｔｅｒｇａａｒｄ培地を使用した（Ｗｅｓｔｅｒｇａａｒｄ  １９４７）。
【０２１８】
Ｎ．ｃｒａｓｓａ形質転換およびレポーターアッセイ。以前に記載のように、新たに懸濁した大分生子のエレクトロポレーションを使用してＮ．ｃｒａｓｓａを形質転換した（Ｄａｖｉｓ（２０００），Ｌｏｒｏｓ．＆  Ｄｕｎｌａｐ（１９９１），Ｖａｎｎ（１９９５））。標的遺伝子の挿入を、ゲノムＤＮＡ由来の挿入特異的プライマーを使用したＰＣＲによって検証した。ホモカリオン株を以前に記載のように単離した（Ｅｂｂｏｌｅ  １９９０）。
【０２１９】
５’ＵＴＲ−レポーター遺伝子プラスミドの構造。ＮＭＴ１遺伝子（アクセッション番号  ＡＹ００７６６１）の５’ＵＴＲのクローニングを、プライマーＤＮＡ５およびＤＮＡ６を使用したＮ．ｃｒａｓｓａのゲノムＤＮＡ由来の３７８ｂｐフラグメント（注釈付きの転写開始部位から開始する）のＰＣＲ増幅によって行った。得られた野生型（ＷＴ）ＰＣＲ  ＤＮＡを、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して最初にクローン化した。ＮＭＴ１フラグメントをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩの制限酵素消化によってベクターから放出させ、ｐＬＵＣの適切な部位にクローン化した。
【０２２０】
アプタマー変異体Ｍ１〜Ｍ９およびスプライス部位変異体Ｍ１４〜Ｍ１６の生成のために、ＴＯＰＯベクターを含むＷＴ  ＮＭＴ１に対してＰＣＲ変異誘発を行った（プライマーリストを参照のこと）。ＤＮＡ配列決定による変異誘発の確認後、各変異ＮＭＴ１フラグメントを、ｐＬＵＣのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位にクローン化した。Ｐ３欠失構築物（Ｍ１０）のクローニングのために、プライマーＤＮＡ５／ＤＮＡ２５およびＤＮＡ２６／ＤＮＡ６（重複領域が天然のＰ３ａステムの大部分を欠失する）を使用して２つのフラグメント中にＮＭＴ１を増幅した。これら２つのフラグメントを、アウタープライマーＤＮＡ５およびＤＮＡ６を使用したその後のＰＣＲにおけるテンプレートとして使用した。得られたフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＬＵＣにクローン化した。Ｉ−２Ｒ構築物およびＩ−３Ｒ構築物ならびにＮＭＴ１改変体の調製を、プライマーＤＮＡ５およびＤＮＡ６を使用したこれら２つのオルタナティブスプライシングした産物のＲＴ−ＰＣＲ増幅によって行った。上記のように、得られたＰＣＲ産物をクローン化し、変異させた。
【０２２１】
ＮＣＵ０１９７７．１の５’領域−ＬＵＣレポーター融合物を生成するために（図１２）、推定開始コドンの９４ヌクレオチド上流から始まる４７８ヌクレオチドフラグメントを、プライマーＤＮＡ４１およびＤＮＡ４２を使用してＮ．ｃｒａｓｓａのゲノムＤＮＡから増幅し、上記のようにｐＬＵＣのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位にクローン化した。全構築物の完全性を、配列決定によって確認した（ＨＨＭＩ  Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。全構築物について、主なＯＲＦ（ＮＭＴ１またはＮＣＵ０１９７７．１）の元の開始コドンを、ＬＵＣレポーター配列とインフレームで融合した。
【０２２２】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ。ＬＵＣレポーター構築物で形質転換したＮ．ｃｒａｓｓａ由来の菌糸体を濾過によって単離し、約１００ｍｇの組織を微粉末にした。１００μｌ  １×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加後、サンプルを強く混合し、氷上で３０分間インキュベートし、その後に１３，０００ｇで１５分間遠心分離した。ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびプレートリーディングルミノメーター（Ｗａｌｌａｃ）を使用して、得られた上清についてルシフェラーゼ活性を決定した。ルシフェラーゼ活性を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ）によって決定した抽出物の総タンパク質濃度に対して正規化し、最終的に参照構築物と比較して示した。ルシフェラーゼバックグラウンド活性（非形質転換Ｎ．ｃｒａｓｓａ）は、チアミン添加せずに増殖させた細胞中の野生型ＮＭＴ１構築物と比較して０．０５％であった。
【０２２３】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析。総ＲＮＡを、製造者の説明書にしたがってＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して菌糸体から単離した。５μｇの総ＲＮＡを、無ＲＮアーゼＤＮアーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して３７℃で３０分間処理した。製造者の説明書にしたがってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したポリＴプライマーでの４２℃で１時間の逆転写によってｃＤＮＡを生成した。ゲノムＤＮＡでの汚染に起因する増幅産物の可能性を排除するために、ＲＴ前にＲＮＡ調製物を使用したコントロール反応を行い、ＮＭＴ１については、コード領域中のエキソン−エキソン境界にわたる逆プライマーを使用した。ポリＴプライマーを使用したＲＴによって生成したｃＤＮＡ由来のＲＴ−ＰＣＲを行ったが、ＲＴの配列特異的プライマーを使用して同一の結果が得られた。ＮＭＴ１のコード領域の下流エキソンに結合したＲＴ−ＰＣＲの逆方向プライマーを使用しても、いかなる相違も認められなかった（データ示さず）。これは、全転写物形態がポリアデニル化され、イントロンを含むリボスイッチ下流のイントロンのスプライシングが影響を受けないことを示す。配列同定のために、全増幅産物をクローン化し、いくつかの独立したクローンの配列決定によって確認した。さらに、増殖培地へのチアミン添加によるスプライシング調節に及ぼす一般的影響（図７）は認められなかった。さらに、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＮＭＴ１中の下流イントロンからのスプライシング範囲を決定し、増殖培地へのチアミン添加の有無の両方で構成性にスプライシングすることが見出された。
【０２２４】
転写物の注釈付きの５’末端に結合する第１のプライマーおよびリボスイッチ含有イントロンのすぐ下流に結合する第２のプライマーを使用して、各遺伝子のために特異的プライマー組み合わせを使用した。ＮＭＴ１遺伝子について、ＰＣＲのために使用したプライマーはＤＮＡ３７およびＤＮＡ３８（図１４）であった。これらはそれぞれ、ＮＭＴ１  ｍＲＮＡの注釈付きの５’末端およびＴＰＰリボスイッチ含有イントロンの約５０ヌクレオチド下流の領域に対応していた。ＴＨＩ４（ＣｙＰＢＰ３７）遺伝子のために、使用したプライマーはＤＮＡ３９およびＤＮＡ４０であった。これらはそれぞれ、ｍＲＮＡの５’末端およびＴＰＰリボスイッチ含有イントロンの約１２５ヌクレオチド下流の領域に対応していた。ＮＣＵ０１９７７．１の５’領域を、それぞれ、推定開始コドンの前９４ヌクレオチドおよびリボスイッチ含有イントロンの推定３’末端の下流２２ヌクレオチドに結合するプライマーＤＮＡ４１およびＤＮＡ４２を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動によって分離し、臭化エチジウム染色によって視覚化した。製造者の説明にしたがって、異なる増幅産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。各産物についての複数のクローンの配列を、配列決定によって分析した（ＨＨＭＩ  Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。
【０２２５】
Ｎ．ｃｒａｓｓａ形質転換体中のＮＭＴ１−ＬＵＣ融合転写物の検出のために、プライマーＤＮＡ３７およびＤＮＡ４３を使用した。これらは、ＮＭＴ１転写物の５’末端および  ＬＵＣ読み取り枠開始の約１３０ヌクレオチド下流の領域に対応する。天然ＮＭＴ１転写物および示したいくつかの変異構築物は、伸長Ｐ３ステムを保有する（図１０）。
【０２２６】
他の真菌ＴＰＰリボスイッチの機構。Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ＴＨＩ４遺伝子がリボスイッチ作用、オルタナティブスプライシング、およびｕＯＲＦ翻訳の類似の相互作用を介したＴＰＰによって抑制される可能性が高い。対照的に、前駆体ＮＣＵ０１９７７．１転写物は、イントロン中に主なＯＲＦを妨害するＴＰＰリボスイッチアプタマーを保有する。非スプライシング転写物の翻訳を、イントロン中に存在する中途終止コドンによって破壊する。ＮＣＵ０１９７７．１  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析（図１ｂ）は、チアミンが存在する場合に非スプライシングｍＲＮＡに対するスプライシングされたｍＲＮＡの比が増加することを示し、そのＴＰＰリボスイッチがＴＰＰ結合の際にスプライシングおよび遺伝子発現を増加させる遺伝子の「オン」スイッチとして機能することが明らかとなった。この結論はまた、Ｎ．ｃｒａｓｓａ中で発現したＮＣＵ０１９７７．１レポーター融合構築物の分析によって支持される。この構築物は、チアミン補充に応答してＬＵＣ発現の増加をもたらす（図１３）。
【０２２７】
開示の方法および組成物が記載の特定の方法、プロトコール、および試薬に制限されず、これらは変化し得ると理解される。本明細書中で使用した専門用語が特定の実施形態の記載のみを目的とし、本発明の範囲を制限することを意図せず、本発明は添付の特許請求の範囲のみに制限されるとも理解すべきである。
【０２２８】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用する場合、他で明確に示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「ａ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ」は複数のかかるリボスイッチが含まれ、「ｔｈｅ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ」は１つまたは複数のリボスイッチおよび当業者に公知のその等価物などをいう。
【０２２９】
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、その後に記載する事象、環境、または材料が出現または存在してもしなくてもよいことを意味し、ならびに記載には、事象、環境、または材料が出現または存在する例およびそれが出現しないかまたは存在しない例が含まれることを意味する。
【０２３０】
範囲を、本明細書中で、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までと示すことができる。かかる範囲を示す場合、他で具体的に示さない限り、一方の特定の値からおよび／または他方の特定の値までの範囲も具体的に意図され、開示されると見なされる。同様に、値を先行詞「約」の使用によって近似値で示す場合、特定の値が別の具体的に意図される実施形態を形成し、他で具体的に示されない限り、開示されたと見なすべきであると理解される。他で具体的に示されない限り、各範囲の終点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）が他の終点に関して有意であり、且つ他の終点に依存しないとさらに理解される。最終的に、例示的に開示された範囲内の全ての各値および値の部分的範囲も具体的に意図され、他で具体的に示さない限り、開示されると見なすべきであると理解すべきである。特定の場合にこれらの実施形態のいくつかまたは全てが例示的に開示されるかどうかと無関係に、上記を適用する。
【０２３１】
他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、開示の方法および組成物が属する分野の当業者に一般的に理解される意味を有する。本明細書中に記載のものに類似するか等価な任意の方法および材料を本発明の方法および組成物の実施または試験で使用することができるにもかかわらず、特に有用な方法、デバイス、および材料は記載の通りである。本明細書中で引用した刊行物および刊行物が引用した材料は、特に本明細書中で参考として援用される。本発明は、先行発明によるかかる開示に先行する権利がないと承認していると解釈されない。いかなるリファレンスも先行技術を構成していると承認していない。リファレンスの考察はその著者の主張を記載し、出願人が引用した書類の正確性および適切性に挑む権利を留保する。多数の刊行物が本明細書で参照されているにもかかわらず、かかるリファレンスは任意のこれらの書類が当該分野の一般的知識の一部を形成することを承認しないことが明確に理解される。
【０２３２】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの用語の変形形態（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」など）は、「含むが、これらに限定されない」を意味し、例えば、他の添加物、成分、整数、または工程を排除することを意図しない。
【０２３３】
当業者は、日常的な実験しか使用せずに、本明細書中に記載の方法および組成物の特定の実施形態に対する多数の等価物を認識するか、確認することができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０２３４】
リファレンス
【０２３５】
【化８】
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【０２３６】
【化９】
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【０２３７】
【化１０】
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【０２３８】
【化１１】
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【０２３９】
【化１２】
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【０２４０】
【化１３】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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