(57)【要約】開示されるのは、表面分子および複数のクロット結合化合物を含む結合体であり、クロット結合化合物は、凝固した血漿タンパク質に選択的に結合し得、この結合体が凝固を引き起こし、そして腫瘍において上記結合体の蓄積を増幅し得る。１つの実施形態では、この結合体は、この結合体が凝固を引き起こし、そして腫瘍中のこの結合体の蓄積を増幅するように、十分な数および組成のクロット結合化合物を含み得る。また開示されるのは、クロット結合化合物に関連する組成物および方法である。開示される標的化は、癌およびその他の疾患および障害の処置のために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面分子および複数のクロット結合化合物を含む結合体であって、該クロット結合化合物が凝固した血漿タンパク質に選択的に結合し、該結合体が凝固を引き起こし、そして腫瘍における該結合体の蓄積を増幅する、結合体。
【請求項２】
前記結合体が、凝固を引き起こし、そして腫瘍における該結合体の蓄積を増幅するように、該結合体が十分な数および組成のクロット結合化合物を含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記クロット結合化合物の数および組成の十分性が、非ヒト動物中の腫瘍における凝固および前記結合体の蓄積の増幅を評価することにより決定される、請求項２に記載の結合体。
【請求項４】
前記結合体が、該結合体が凝固を引き起こし、そして腫瘍における該結合体の蓄積を増幅するように十分な密度および組成のクロット結合化合物を含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項５】
前記クロット結合化合物の密度および組成の十分性が、非ヒト動物中の腫瘍における凝固および前記結合体の蓄積の増幅を評価することにより決定される、請求項４に記載の結合体。
【請求項６】
複数の前記クロット結合化合物が、各々独立して、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸セグメント、フィブリン結合ペプチド、クロット結合抗体、およびクロット結合小有機分子から選択される、請求項１に記載の結合体。
【請求項７】
複数の前記クロット結合化合物が、各々独立して、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸セグメントを含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項８】
前記アミノ酸セグメントが、各々独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸セグメントまたはその保存的改変体、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなるアミノ酸セグメント、およびアミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸セグメントから選択される、請求項７に記載の結合体。
【請求項９】
前記アミノ酸セグメントが、各々独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸セグメントまたはその保存的改変体を含む、請求項７に記載の結合体。
【請求項１０】
前記アミノ酸セグメントが、各々独立して、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含む、請求項７に記載の結合体。
【請求項１１】
前記アミノ酸セグメントが、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなる、請求項７に記載の結合体。
【請求項１２】
前記アミノ酸セグメントが、アミノ酸配列ＲＥＫからなる、請求項７に記載の結合体。
【請求項１３】
複数の前記クロット結合化合物が各々、フィブリン結合ペプチドを含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項１４】
前記フィブリン結合ペプチドが独立して、フィブリン結合ペプチド、およびそのフィブリン結合誘導体からなる群から選択される、請求項１３に記載の結合体。
【請求項１５】
複数の前記クロット結合化合物が各々、クロット結合抗体を含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項１６】
複数の前記クロット結合化合物が各々、クロット結合小有機分子を含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項１７】
前記表面分子が、ナノ粒子である、請求項１に記載の結合体。
【請求項１８】
前記表面分子が、酸化鉄ナノ粒子である、請求項１に記載の結合体。
【請求項１９】
前記表面分子が、アルブミンナノ粒子である、請求項１に記載の結合体。
【請求項２０】
前記表面分子が、リポソームを含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項２１】
前記表面分子が、ミクロ粒子を含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項２２】
前記表面分子が、フルオロカーボンミクロバブルを含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項２３】
前記結合体が、少なくとも１００のクロット結合化合物を含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項２４】
前記結合体が、少なくとも１０００のクロット結合化合物を含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項２５】
前記結合体が、少なくとも１０，０００のクロット結合化合物を含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項２６】
前記表面分子が、検出可能である、請求項１に記載の結合体。
【請求項２７】
前記表面分子が、治療剤である、請求項１に記載の結合体。
【請求項２８】
前記治療剤が、Ａｂｒａｘａｎｅである、請求項２７に記載の結合体。
【請求項２９】
前記結合体が、１つ以上の成分をさらに含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項３０】
前記成分が、抗−血管新生剤、プロ−血管新生剤、癌化学療法剤、細胞障害剤、抗炎症剤、抗関節炎剤、ポリペプチド、核酸分子、小分子、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、カーボン−１１、およびカーボン−１３からなる群から独立して選択される、請求項２９に記載の結合体。
【請求項３１】
前記成分の少なくとも１つが、治療剤である、請求項２９に記載の結合体。
【請求項３２】
前記治療剤が、パクリタキセルである、請求項３１に記載の結合体。
【請求項３３】
前記治療剤が、タキソールである、請求項３１に記載の結合体。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの成分が、検出可能な作用物質である、請求項２９に記載の結合体。
【請求項３５】
前記結合体が、凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングする、請求項１に記載の結合体。
【請求項３６】
前記結合体が、腫瘍脈管構造、創傷部位、または両方に選択的にホーミングする、請求項１に記載の結合体。
【請求項３７】
被検体に請求項１に記載の結合体を投与する工程を包含する方法であって、該結合体が凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし、該結合体が凝固を引き起こし、そして該凝固した血漿タンパク質の部位で該結合体の蓄積を増幅する、方法。
【請求項３８】
前記結合体が、腫瘍脈管構造、創傷部位、または両方に選択的にホーミングする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記結合体が、治療効果を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記治療効果が、腫瘍負荷の増加または腫瘍負荷の減少である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記治療効果が、腫瘍サイズの増加または腫瘍サイズの減少である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記治療効果が、腫瘍における血液循環の減少または阻止である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記治療効果が、創傷部位における出血の減少または停止である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記治療効果が、創傷部位における出血が停止する時間における減少である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記治療効果が、炎症における減少、創傷治癒における速度の増加、瘢痕組織の量における減少、痛みにおける減少、腫れにおける減少、壊死における減少またはそれらの組み合わせである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記凝固が、治療効果である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記被験体が標的とされる１つ以上の部位を有し、前記結合体が該標的とされる１つ以上の部位にホーミングする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
前記被験体が腫瘍を有し、前記結合体が該腫瘍に対する治療効果を有する、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００７年１月３日に出願された米国仮出願番号第６０／８８３，２２９号および２００７年１月８日に出願された米国仮出願番号第６０／８８３，８９０号に基づく利益を主張しており、両者は、それらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（連邦政府によって保証された研究に関する陳述）
本発明は、国立癌研究所によって授与されたＣＡ１１９３３５の下の政府支援でなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般に分子医学および癌生物学の分野に、そしてより詳細には、腫瘍脈管構造に選択的にホーミングする（ｈｏｍｅ）クロット結合化合物に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
癌処置における進歩に対する主要な障害物は、正常組織は容赦しながら癌を選択的に標的にし得る薬剤の相対的欠如である。例えば、一般に、局在化された処置である、放射線治療および手術は、処置フィールドで正常組織に実質的な損傷を引き起こし得、瘢痕および正常組織の損失を生じる。比較すれば、一般に全身に投与される化学療法は、急速な細胞代謝回転および連続的細胞分裂を経験する、骨髄、粘膜、皮膚および小腸のような器官に実質的な損傷を引き起こし得る。結果として、吐き気、毛髪の損失および血液細胞数における低下のような所望されない副作用が、癌患者が化学療法薬物で静脈内処置されるとき、しばしば起こる。このような所望されない副作用は、安全に投与され得る薬物の量を制限し得、それによって、生存率を妨げ、そして患者寿命の質に衝撃を与える。
【０００５】
ナノ薬物は、疾患の診断および処置を容易にするためにナノ粒子を用いる新生の分野である。臨床における著しい初期の成功は、ＭＲＩおよびナノ粒子を基礎にする処置システム（Ｄｅｓａｉ  ２００６；Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ  １９９５）における造影剤としての超常磁性ナノ粒子の使用を含む。腫瘍処置で用いられる第一世代のナノ粒子は、腫瘍における優先的蓄積のための腫瘍血管の「漏出性（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）」に依存する；しかし、この増大した透過性および保持（ＥＰＲ）は、腫瘍血管の一定の特徴ではなく（Ｓｉｎｅｋ  ２００４）、そして存在するときでさえ、なおナノ粒子を、腫瘍中の高い間質液圧を切り抜けるようにする（Ｓｉｎｅｋ  ２００４；Ｂｏｕｃｈｅｒ  １９９０）。魅力的な代替物は、ナノ粒子が血管中の特定の分子レセプターを標的にすることである。なぜなら、それらは血流からの結合のために容易に利用可能であるからであり、そして腫瘍血管は、正常組織の血管では有意に発現されない豊富な分子を発現するからである（Ｈｏｆｆｍａｎ  ２００３；Ｏｈ２００４；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ２００２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ナノ粒子の腫瘍への特異的標的化は、種々の実験系で達成されている（ＤｅＮａｒｄｏ  ２００５；Ａｋｅｒｍａｎ  ２００２；Ｃａｉ  ２００６）が、送達の効率は、一般に低い。現実には、増幅されたホーミングは、血管損傷の部位で十分な血小板蓄積を確実にする重要な機構である。それは、標的結合、活性化、血小板−血小板結合、およびクロットの形成を含む。当該技術分野で必要なのは、ナノ粒子がそれら自体のホーミングを増幅するナノ粒子送達システムである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の簡単な要旨）
本明細書に開示されるのは、表面分子および複数のクロット結合化合物を含む結合体である。このクロット結合化合物は、凝固した血漿タンパク質に選択的に結合し得る。上記結合体は、凝固を引き起こし、そして腫瘍において上記結合体の蓄積を増幅し得る。１つの実施形態では、上記結合体は、この結合体が、凝固を引き起こし、そして腫瘍中のこの結合体の蓄積を増幅するように、十分な数および組成のクロット結合化合物を含み得る。
【０００８】
クロット結合化合物の数および組成の十分さは、非ヒト動物における腫瘍中の凝固および上記結合体の蓄積の増幅を評価することによって決定され得る。
【０００９】
上記結合体は、上記結合体が腫瘍において凝固を引き起こし、そして上記結合体の蓄積を増幅するように十分な密度および組成のクロット結合化合物を含み得る。クロット結合化合物の密度および組成の十分さは、非ヒト動物における腫瘍中の凝固および上記結合体の蓄積の増幅を評価することによって決定され得る。
【００１０】
複数のクロット結合化合物は、各々、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸セグメント、フィブリン結合ペプチド、クロット結合抗体、およびクロット結合小有機分子から独立に選択され得る。複数のクロット結合化合物は、各々、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸セグメントを独立に含み得る。
【００１１】
このアミノ酸セグメントは、各々、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸セグメントまたはその保存的改変体、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなるアミノ酸セグメント、およびアミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸セグメントから独立に選択され得る。上記アミノ酸セグメントは、各々、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸セグメントまたはその保存的改変体を含み得る。
【００１２】
上記アミノ酸セグメントはまた、各々、独立にアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含み得る。上記アミノ酸セグメントはまた、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなり得る。上記アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＲＥＫからなり得る。
【００１３】
複数のクロット結合化合物は、各々、フィブリン結合ペプチドを含み得る。このフィブリン結合ペプチドは、フィブリン結合タンパク質およびそのフィブリン結合誘導体からなる群から独立に選択され得る。別の例では、複数のクロット結合化合物は、各々、クロット結合抗体を含み得る。さらに、複数のクロット結合化合物は、各々、クロット結合小有機分子を含み得る。
【００１４】
上記表面分子は、酸化鉄ナノ粒子またはアルブミンナノ粒子のようなナノ粒子であり得る。上記表面分子はまた、リポソーム、ミクロ粒子、またはフッ化炭化水素のミクロバブルであり得る。１つの例では、上記表面分子は検出可能であり得る。別の例では、上記表面分子は治療剤であり得る。治療剤の例は、アブラキサンである。
【００１５】
上記結合体はさらに、１つ以上の成分を含み得る。例えば、これら成分は、抗血管新生剤、プロ血管新生剤、癌化学療法剤、細胞障害性剤、抗炎症剤、抗関節炎剤、ポリペプチド、核酸分子、小分子、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、カーボン−１１、およびカーボン−１３からなる群から独立に選択され得る。これら成分の少なくとも１つは治療剤であり得る。治療剤の例は、パクリタキセルおよびタキソールである。上記成分の少なくとも１つは、検出可能な作用物質であり得る。
【００１６】
上記結合体は、凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし得る。上記結合体は、腫瘍脈管構造、創傷部位、またはその両方に選択的にホーミングし得る。
【００１７】
本明細書に開示されるのは、本明細書中に開示される結合体を被験体に投与する工程を包含する方法であり、ここで、この結合体は凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし、ここで、この結合体は凝固を引き起こし、そして凝固した血漿タンパク質の部位でこの結合体の蓄積を増幅する。この結合体は、腫瘍脈管構造、創傷部位、またはその両方に選択的にホーミングし得る。
【００１８】
１つの例では、上記結合体は治療効果を有し得る。これは、この結合体のために起こる増加したクロット形成によって達成され得る。この効果は、治療剤の腫瘍の部位または創傷部位への送達によって増大され得る。
【００１９】
この治療効果は、腫瘍負荷の増加または腫瘍負荷の減少における遅延であり得る。この治療効果はまた、腫瘍における血液循環の減少または阻止であり得る。この治療効果はまた、創傷部位における出血の減少または停止であり得る。この治療効果はまた、創傷部位における出血を止めるための時間の減少であり得る。この治療効果はまた、炎症の減少、創傷治癒の速度の増加、瘢痕組織の量の減少、痛みの減少、腫れの減少、壊死の減少、またはこれらの組み合わせを含み得る。
【００２０】
さらに、凝固自体は、本明細書中のいずれかで開示されるような治療効果を有し得る。被験体は、標的にされ得る１つ以上の部位を有し得、ここで、上記結合体は、標的にされる１つ以上の部位までホーミングする。例えば、被験体は、複数の腫瘍または損傷の部位を有し得る。
【００２１】
開示される方法および組成物のさらなる利点は、以下の明細書に一部が呈示され、、そして一部は、本明細書から理解され得るか、または開示される方法および組成物の実施により学ばれ得る。開示される方法および組成物の利点は、添付の請求項で詳細に指摘される要素および組み合わせによって実現および達成される。前述の一般的説明および以下の詳細な記載の両方は例示であり、そして説明に過ぎず、そして請求項に記載の本発明の制限ではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本明細書中に援用され、そしてその一部を構成する添付の図面は、開示される方法および組成物のいくつかの実施形態を示し、そして本明細書とともに開示される方法および組成物の原理を説明するために供される。
【図１】図１は、ＣＲＥＫＡペンタペプチドの腫瘍ホーミングを示す。フルオレセイン−結合ＣＲＥＫＡペプチド（２００μｇ／マウス）を同系Ｂ１６メラノーマ腫瘍をもつマウス中に注入した。代表的な顕微鏡視野が、野生型マウスにおける腫瘍中のフィブリン様構造へのフルオレセイン−ＣＲＥＫＡのホーミング（Ａ、矢印）、およびフィブリノゲンのないマウスにおけるホーミングの欠如（Ｂ）を示すために示される。（Ｃ）ＣＲＥＫＡファージは、チューブ中の凝固した血漿タンパク質に結合し、その一方、非組み換えコントロールファージは、結合をほとんど示さない。（Ｄ）フルオレセイン−ＣＲＥＫＡと結合されたデキストラン被覆酸化鉄ナノ粒子は、凝固した血漿タンパク質に結合し、そしてこの結合は、遊離のＣＲＥＫＡペプチドによって阻害される。（Ｄ）中の挿入画は、クロットが結合したＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの顕微鏡外観を示す。倍率：Ａ−Ｂ、２００×；Ｄ、６００×。
【図２】図２は、ＣＲＥＫＡ結合酸化鉄粒子の腫瘍ホーミングを示す。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子を、直径が１〜１．５ｃｍの寸法のＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌異種移植片腫瘍をもつＢａｌｂ／ｃヌードマウス中に静脈注入（４ｍｇ  Ｆｅ／ｋｇ）した。これらマウスを、５〜６時間後に灌流によって犠牲にし、そして組織をＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ蛍光（緑色）について調べた。核をＤＡＰＩで染色した（青色）。（Ａ）２時間より早く、ＰＢＳ（Ａ、上のパネル）または２００μｌのＰＢＳ中に０．２μｍｏｌのＮｉを含むＮｉ／ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬリポソーム（Ｎｉ−リポソーム）（Ａ、下のパネル）の注入を受けたＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍マウスからの組織中のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの分布。（Ｂ）異なる処置後のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの血漿循環半減期。少なくとも４つの時点で集めた。データは、Ｐｒｉｚｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いる単指数関数的減衰に適合させ、そして半減期値を、不対ｔ−試験（＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝１０）で比較した。（Ｃ）腫瘍血管中のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子の蓄積。マウスに注入し、そして組織をパネルＡにおけるように集めた。蛍光血管内ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子は、透過光で見える酸化鉄と重複する。倍率：６００×。（Ｄ）Ｎｉ−リポソーム／ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ注入マウスのコントロール器官。時々の蛍光のスポットが腎臓および肺で観察される。心臓で見られる蛍光は、注入されないコントロールと異ならず、それは自己蛍光であることを示す。少なくとも３つの独立の実験からの代表的な結果が示される。倍率ＡおよびＤ、２００×；Ｃ、６００×。
【図３】図３は、腫瘍血管におけるＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子の蓄積を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片をもつマウスに、図２の解説に記載されたようにＮｉ−リポソームおよびＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子を注入した。これらマウスを、ナノ粒子注入後６時間灌流し、そして組織を集めた。（Ａ）上のパネル；血管中のナノ粒子蛍光のＣＤ３１染色との同時局在化；中央のパネル：腫瘍血管中のナノ粒子蛍光と抗フィブリン（フィブリノゲン（ｏｇｅｎ））染色との同時局在化。挿入図−腫瘍血管中のフィブリルに沿って分布するＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯを示す画像；下のパネル：血小板に対する抗−ＣＤ４１染色とのナノ粒子蛍光の同時局在化の欠如。（Ｂ）血流のマーカーとしてＤｉＩ染色されたて赤血球細胞を用いる腫瘍の生体共焦点顕微鏡法。矢印は、静止赤血球が血流の妨害を示す血管を示す。上の血管中の血流は妨害されていない。１分の動画（補足材料中の動画２）からの６つの連続するフレームが示される。（Ｃ）ＣＲＥＫＡ被覆リポソームは、腫瘍血管中でフィブリンと同時局在化する。結果は、３つの独立の実験の代表である。倍率：ＡおよびＣ、６００×、Ｂ、２００×。
【図４】図４は、腫瘍におけるナノ粒子蓄積に対する血液凝固の効果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌異種移植片をもつマウスに、ＰＢＳ、または８００Ｕ／ｋｇのヘパリンのボーラス次いで１２０分後にＮｉ−リポソーム（またはＰＢＳ）およびＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ（またはコントロールナノ粒子）を静脈内注入した。これらマウスは、実験全体で、腹腔内注入によりさらなるヘパリン（合計１０００Ｕ／ｋｇ）またはＰＢＳを受けた。（Ａ）腫瘍をナノ粒子注入後６時間で取り出し、そして異なる処置後の腫瘍中の磁性信号をＳＱＵＩＤで決定した。アミネート化デキストランＳＰＩＯを粒子コントロールとして供した（コントロールＳＰＩＯ）。組織中のＳＰＩＯナノ粒子濃度は、ブランク組織の反磁性および常磁性バックグラウンドの減算の後、１Ｔ磁場における組織の飽和磁性値（電磁単位、ｅｍｕ）によって表される。この磁化値は、組織の乾燥重量に正規化した。３つの実験からの結果が示される。（Ｂ）血管中の凝固に対するヘパリンの効果の定量化。マウスを、上記のようにＰＢＳ（白棒）またはヘパリン（黒棒）で、次にＮｉリポソーム／ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子で前処理した。各処置を代表する２の腫瘍から３つのセクションを血管について抗−ＣＤ３１で染色し、そして蛍光および蛍光クロットについて陽性の血管の％を決定した。ヘパリンは粒子を含む血管の％を有意には変なかったが、蛍光で満たされる管腔の率を劇的に低減したことに注目のこと。（Ｃ）ヘパリンで処置されたマウスの腫瘍血管中のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子の外観の代表的な例。（Ｄ）ヘパリン前処理ありまたはなしの、Ｎｉ−リポソーム次いでＣｙ７−標識されたＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯを受けたマウスの近赤外画像。画像は、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ２  ＮＩＲスキャナー（Ｌｉ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を用いてＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子の注入後８時間で得た。示される画像は、２色のコンポジット、赤（７００ｎｍチャネル、本体およびチャウ（ｃｈｏｗ）自己蛍光）および緑（８００ｎｍチャネル、Ｃｙ７）である。矢印は腫瘍を示し、矢印頭は肝臓を示す。ヘパリン前処理マウス中の腫瘍からの信号における強い減少に注目のこと。３のうちの代表的な実験が示される。
【図５】図５は、ＣＲＥＫＡペプチドの腫瘍ホーミングを示す。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌異種移植片腫瘍をもつＢａｌｂ／ｃヌードマウスまたは乳房腫瘍をもつＭＭＴＶＰｙＭＴトランスジェニックマウスに、０．１ｍｇのフルオレセイン−ＣＲＥＫＡを静脈内注入した。これら動物を、注入後、灌流２４時間により犠牲にし、そして組織セクションを蛍光顕微鏡法によって調べた。右のパネル、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍マウスのコントロール器官、倍率２００×。（Ｂ）６時間先に３０μｇのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７−標識ＣＲＥＫＡを注入したＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍マウスの全体動物の画像。Ｍａｅｓｔｒｏ造影システム（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を用いて画像を獲得および処理した。矢印は腫瘍を示し、そして矢印頭は膀胱を示す。ペプチドは尿中に分泌され、そして肝臓中には蓄積しないことに注目のこと。
【図６】図６は、フルオレセイン−標識ＣＲＥＫＡペプチドでの置換の種々のレベルと結合された酸化鉄ナノ粒子（ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ）の蛍光強度を示す。結合された粒子によって発せられる蛍光は、置換のレベルに直線的に関係している。Ａ．Ｕ．＝任意単位。
【図７】図７は、非−ＲＥＳ正常組織中にではなく、腫瘍組織中にＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子の蓄積を示す。低倍率（４０×）をこれら画像を生成するために用いた。なぜなら、この倍率では、凝固がＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ蛍光を濃縮している血管のみが見えるからである。非−ＲＥＳ正常組織中にではなく、腫瘍組織中のクロット中にナノ粒子の閉じ込め（矢印）を注目のこと。これらの注入は、図２におけるように実施され、そして分析のために組織が調製された。１０のうち代表的な実験例の一つを示している。
【図８】図８は、肝臓におけるフィブリン（フィブリノゲン）染色およびＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの同時局在化の欠如を示す。フィブリン（フィブリノゲン）陽性構造は、肝臓によるフィブリノゲン産生からのバックグラウンドであり得る。なぜなら、それは、ナノ粒子と同時局在化せず（Ａ）、そして非注入マウスからの肝臓は、類似のフィブリン（フィブリノゲン）染色を示した（Ｂ）からである。倍率：６００Ｘ。
【図９】図９は、ナノ粒子ホーミングにおける血小板の役割を示す。（Ａ）血液を、マウス中への４ｍｇ／ｋｇのＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの注入後５分で抜きとり、そして５０μｌのアリコートを、磁性カラムに通した。結合したＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子をこのカラムから溶出し、スライド上に濃縮し、そして抗−ＣＤ４１抗体で染色した。粒子のいくつかは、血小板と会合しているように見える。（Ｂ）血小板枯渇マウスからの腫瘍におけるＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯホーミングおよびクロット形成を示す低倍率画像（４０×）。血小板枯渇は、記載のように（Ｖａｎ  ｄｅｒ  ＨｅｙｄｅおよびＧｒａｍａｇｌｉａ（２００５））マウスを０．１ｍｇの抗−ＣＤ４１モノクローナル抗体で処理することによって達成した。マウスは、引き続き、図２の凡例に記載のように、Ｎｉ−リポソーム／ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯを受けた。この抗−血小板処置は、（図７中の腫瘍のパネルと比較して）蛍光クロットの率を減少させなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
開示される方法および組成物は、以下の詳細な実施形態の詳細な記載および本明細書に含まれる実施例、ならびに図面およびそれらの先および後の記載を参照してより容易に理解され得る。
【００２４】
本発明の化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法が開示および記載される前に、それらは、他であることが特定されなければ特定の合成方法または特定の組み換えバイオテクノロジー方法に、または他であることが特定されなければ特定の試薬に制限されないこと、従って、勿論、変動し得ること、が理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語が特定の実施形態を記載する目的のためのみに用いられ。そして制限的であることは意図されないこともまた理解されるべきである。
【００２５】
（定義）
本明細書および添付の請求項で用いられるとき、単数形態は、文脈が他であることを明りょうに指示するのでなければ複数対象を含む。それ故、例えば、「薬学的担体」への参照は、２つ以上のこのような担体の混合物などを含む。
【００２６】
範囲は、本明細書中では「約」の１つの特定の値から、そして／または「約」の別の特定の値までとして表され得る。このような範囲が表されるとき、別の実施形態は、１つの特定の値から、そして／またはその他の特定の値までを含む。同様に、値が近似として先行詞「約」の使用によって表されるとき、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。これら範囲の各々の終点は、その他の終点に関連し、かつその他の終点とは独立であることの両方で重要であることがさらに理解される。本明細書中で開示される多くの値があり、しかも、各値がまた、本明細書では、この値自体に加え、「約」のその特定の値として開示されることが理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、そのときは「約１０」がまた開示される。値が、特定の値に「より小さいまたは等しい」、「特定の値より大きいかまたは等しい」と開示されるとき、当業者によって適切に理解されるとしてまた理解される。例えば、値「１０」が開示されるとき、「１０より小さいかまたは等しい」ならびに「１０より大きいかまたは等しい」がまた開示されている。本出願全体で、データは多くの異なるフォーマットで提供され、しかもこのデータは、終点および開始点を表し、そしてこれらデータ点の任意の組み合わせの範囲であることもまた理解される。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点１５が開示されるとき、１０および１５より大きい、大きいかまたは等しい、未満、より少ないかまたは等しい、および等しい、ならびに１０と１５との間が開示されると考えられることが理解される。２つの特定の単位間の各単位がまた開示されることが理解される。例えば、１０と１５とが開示されるとき、そのときは１１、１２、１３、および１４もまた開示されている。
【００２７】
以下の本明細書および請求項において、多くの用語への参照がなされ、これらは、以下の意味を有するとして規定される：
「随意」または「必要に応じて」は、引き続き記載される事象または状況が、生じてもよく、または生じなくてもよいこと、しかもこの記載は、上記事象または状況が生じる事例およびそれが生じない事例を含むことが意味される。
【００２８】
本出願全体で、種々の刊行物が参照される。これら刊行物の開示は、それらの全体が、本出願が関係する技術分野の状態をより完全に説明するために、本明細書によって本出願中に参考として援用される。開示される参考文献はまた、その参照が依存する文で論じられているそれら参考文献に含まれる素材について個々にそして詳細に参考として本明細書に援用される。
【００２９】
開示される方法および組成物は、他であることが特定されなければ、特定の合成方法、特定の分析技法に、または特定の試薬に制限されず、そしてそれ故、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、そして制限的であることは意図しないこともまた理解されるべきである。
【００３０】
（材料）
開示されるのは、開示される組成物を調製する調製するために用いられる成分、および本明細書中に開示される方法内で用いられるべき組成物自体である。これらの材料およびその他の材料は本明細書中に開示され、そしてこれら材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されるとき、これら化合物の各々の種々の個々のかつ集合的な組み合わせおよび順列の特定の参照は明りょうに開示され得ないが、各々が詳細に企図され、そして本明細書中に記載されていることが理解される。例えば、特定のペプチドが開示かつ論じ、そしてこのペプチドを含む多くの分子になされ得る多くの改変が論じられるとき、特定して企図されるのは、それらのペプチドの各々およびすべての組み合わせおよび順列およびそうでないと特別に示されない限り可能であるその改変である。それ故、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスが開示され、ならびに分子Ｄ、Ｅ、およびＦ、そして組み合わせ分子Ａ−Ｄの例が開示されるとき、そのときは、たとえ各々が個々に各々復唱されていなくても、各々は、個々にそして集合的に企図される意味の組み合わせ、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが開示されるとみなされる。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせがまた開示されている。それ故、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループが開示されているとみなす。この概念は、本出願のすべての局面に適用され、制限されないで、開示される組成物を作製および用いる方法の工程を含む。それ故、実施され得る種々のさらなる工程があるとき、これらさらなる工程の各々は、開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせで実施され得ることが理解される。
【００３１】
本明細書に開示されるのは、表面分子および複数のクロット結合化合物を含む結合体である。このクロット結合化合物は、凝固した血漿タンパク質に選択的に結合し得る。この結合体は、凝固を引き起こし、そして腫瘍中にこの結合体の蓄積を増幅し得る。この結合体のいくつかの形態は、表面分子および複数のクロット結合化合物を含み、このクロット結合化合物は凝固した血漿タンパク質に選択的に結合し、そしてこの結合体は凝固を引き起こし、そして腫瘍中にこの結合体の蓄積を増幅する。さらに開示されるのは、腫瘍にホーミングするのみならず、それら自体のホーミングを増幅する結合体である。このシステムは、凝固した血漿タンパク質を認識し、そして腫瘍に選択的にホーミングするクロット結合化合物に基づき、ここで、それは、血管壁および腫瘍間質に結合する。クロット結合化合物と結合される表面分子は、腫瘍血管中または創傷部位に蓄積し得、そこでそれらはさらなる局所的凝固を誘導し、それによってより多くの粒子のための新たな結合部位を生成する。このシステムは、これもまた自由に循環するが、疾患部位て蓄積し、そしてその部位でそれら自体の蓄積を増幅する血小板を模倣する。この凝固を基礎にした増幅は、腫瘍造影を多いに増大し、そして薬物担体機能もまた想定される。
【００３２】
固形腫瘍を処置するために新たな戦略を開発することで、腫瘍細胞自体よりも腫瘍の脈管構造を標的にすることを含む方法は、別個の利点を提供する。腫瘍を通る血流の詰まりを誘導することは、例えば、腫瘍脈管構造特異的なフィブリン形成により、腫瘍部位における流入プロセスおよび流出プロセスを妨害し、それ故、抗腫瘍効果を生じる。腫瘍への血液供給を制止することは、凝固剤への特異的曝露により、凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ）（凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ））プロセスに有利に腫瘍関連血管における凝血促進性−線維素溶解性バランスをシフトすることにより達成され得る。
【００３３】
クロット結合化合物を含む結合体は、腫瘍細胞自体に向けられる。そこで、それらは蓄積し、そしてさらなる凝固を誘導する。細胞上で、または腫瘍脈管構造および／もしくは間質の環境中で、特異的または優勢的に発現し、局在化し、吸着し、または誘導可能である、多くの適切なクロット結合化合物が同定された。以下により詳細に論じる。
【００３４】
（Ａ．クロット結合化合物）
上記クロット結合化合物は、凝固した血漿タンパク質のようなクロットおよび／またはクロットの成分と相互作用する能力をもつ任意の化合物であり得る。上記結合体は、この結合体が凝固を引き起こし、そして腫瘍中および損傷の部位でこの結合体の蓄積を増幅するように十分な数および組成のクロット結合化合物を含み得る。１つの例では、クロット結合化合物の数および組成の十分さは、凝固および非ヒト動物中の腫瘍におけるこの結合体の蓄積の増幅を評価することにより決定され得る。このような方法は、以下により詳細に論じる。
【００３５】
複数のクロット結合化合物は、各々独立に、例えば、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸セグメント、フィブリン結合ペプチド、クロットを結合しフィブリンは結合しないペプチド（例えばＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ（ＣＬＴ１、配列番号２）およびＣＮＡＧＥＳＳＫＮＣ（ＣＬＴ２、配列番号３））、クロット結合抗体、およびクロット結合小有機分子から選択される。複数のクロット結合化合物は、各々独立に、アミノ酸配列ＲＥＫを含むアミノ酸セグメントを含み得る。
【００３６】
この結合体は、任意の数のクロット結合化合物を含み得る。例により、この結合体は、少なくも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、６２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、７５，０００、または１００，０００、またはそれ以上のクロット結合化合物を含み得る。この結合体はまた、上記で列挙されたような数の間の任意の数を含み得る。
【００３７】
本明細書で用いられるとき、用語「ホーミング分子」は、正常組織よりも優先して特定の標的部位または組織にインビボで選択的にホーミングする任意の分子を意味する。同様に、用語「ホーミングペプチド」または「ホーミングペプチド模倣物」は、正常組織よりも優先して特定の標的部位または組織にインビボで選択的にホーミングするペプチドを意味する。例えば、腫瘍にインビボで選択的にホーミングするホーミング分子は、すべての腫瘍にホーミングし得るか、または１つまたはサブセットの腫瘍タイプへの優先的ホーミングを示し得ることが理解される。
【００３８】
「選択的にホーミングする」により、インビボで、ホーミング分子が、非標的に比較したとき標的に優先的に結合することが意味される。例えば、このホーミング分子は、非腫瘍組織または非創傷組織に比較したとき、１つ以上の腫瘍、創傷組織、または血餅の凝固した血漿に優先的に結合し得る。このようなホーミング分子は、例えば、腫瘍に選択的にホーミングし得る。例えば、腫瘍への選択的ホーミングは、一般に、非腫瘍組織のいくつかの組織タイプに比較したとき、腫瘍（またはその他の標的）内で少なくとも２倍のより大きい局在化によって特徴付けられる。ホーミング分子は、非腫瘍組織のいくつかまたは多くの組織タイプと比較したとき、または大部分のまたはすべての非腫瘍組織と比較したとき、腫瘍（またはその他の標的）への５倍、１０倍、２０倍またはそれ以上の優先的局在化によって特徴付けられ得る。それ故、いくつかの事例では、ホーミング分子は、標的組織へのホーミングに加え、一部、１つ以上の正常器官へホーミングする。選択的ホーミングはまた、標的化とも称され得る。
【００３９】
（１．ペプチド）
１つの例では、上記クロット結合化合物は、ペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。開示されるペプチドは単離れさた形態であり得る。開示されたペプチドを参照して本明細書中で用いられるとき、用語「単離された」は、夾雑ポリペプチド、脂質、核酸および細胞中でこのペプチドと通常会合するか、ライブラリー中または粗製調製物中でこのペプチドと会合するその他の細胞物質などの物質を相対的に含まない形態にあるペプチドを意味する。
【００４０】
開示されるペプチドは、任意の適切な長さを有し得る。この開示されるペプチドは、例えば、相対的に短い長さ、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５または４０未満の残基を有し得る。開示されるペプチドはまた、有意により長い配列の文脈において有用であり得る。それ故、このペプチドは、例えば、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００または２０００残基までの長さを有し得る。特定の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または２００残基の長さを有し得る。さらなる実施形態では、ペプチドは、５〜２００残基、５〜１００残基、５〜９０残基、５〜８０残基、５〜７０残基、５〜６０残基、５〜５０残基、５〜４０残基、５〜３０残基、５〜２０残基、５〜１５残基、５〜１０残基、１０〜２００残基、１０〜１００残基、１０〜９０残基、１０〜８０残基、１０〜７０残基、１０〜６０残基、１０〜５０残基、１０〜４０残基、。１０〜３０残基、１０〜２０残基、２０〜２００残基、２０〜１００残基、２０〜９０残基、２０〜８０残基、２０〜７０残基、２０〜６０残基、２０〜５０残基、２０〜４０残基または２０〜３０残基の長さを有し得る。本明細書で用いられるとき、用語「残基」は、アミノ酸またはアミノ酸アナログをいう。
【００４１】
本明細書が種々のタンパク質およびタンパク質配列を論じるとき、これらタンパク質配列をコードし得る核酸もまた開示されていることが理解される。これは、特定タンパク質配列に関連するすべての縮重配列、すなわち、１つの特定タンパク質配列コードする配列を有するすべての核酸、ならびにこのタンパク質配列の開示される改変体および誘導体をコードする縮重核酸を含む全ての核酸を含む。それ故、各々の特定の核酸配列は、本明細書中ではすべて書き出されないかも知れないが、各々およびすべての配列が開示されるタンパク質配列により本明細書中に実際開示され、かつ記載されていることが理解される。
【００４２】
ペプチドに似ているが、天然のペプチド結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を経由して連結されない分子が生成され得る。例えば、アミノ酸またはアミノ酸アナログのための結合は、ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨＨ２ＳＯ−−を含み得る（これらおよびその他は、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅ、ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６７頁（１９８３）中のＳｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ．；Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ．、Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（１９８３年３月、Ｖｏｌ．１、Ｉｓｓｓｕｅ  ３、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（一般総説）；Ｍｏｒｌｅｙ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ（１９８０）４６３〜４６８頁；Ｈｕｄｓｏｎ、Ｄら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ  １４：１７７〜１８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３８：１２４３〜１２４９（１９８６）（−−ＣＨ  Ｈ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７〜３１４（１９８２）（−−ＣＨ−ＣＨ−−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２〜１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２３：２５３３（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅら、欧州出願第ＥＰ４５６６５ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ  ２４：４４０１〜４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；およびＨｒｕｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１：１８９〜１９９（１９８２）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）に見出され得；これらの各々は、本明細書中に参考として援用される。特に好ましい非ペプチド結合は、−−ＣＨ２ＮＨ−−である。ペプチドアナログは、β−アラニン、γ−アミノ酪酸などのように、結合原子間に１を超える原子を有し得る。
【００４３】
また開示されるのは二官能性ペプチドであり、これは、別個の機能を有する第２のペプチドに融合されたクロット結合ペプチドを含む。このような二官能性ペプチドは、全長分子の異なる部分によって与えられる少なくとも２つの機能を有し、そして例えば、凝固を増大する能力に加え、抗血管新生活性またはプロアポトーシス活性を示し得る。
【００４４】
また開示されるのは、各々が独立にペプチド（例えば、アミノ酸配列配列番号１、またはその保存的改変体またはペプチド模倣物）を含む少なくとも２つのサブ配列を含む単離された多価ペプチドである。この多価ペプチドは、例えば、少なくとも３、少なくとも５または少なくとも１０の、各々がペプチドを独立に含むそのようなサブ配列を有し得る。特定の実施形態では、この多価ペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０の同一または非同一のサブ配列を有し得る。これは、複数のクロット結合化合物に加え、上記結合体を含み得る。さらなる実施形態では、この多価ペプチドは、配列番号１の繰り返しのような同じサブ配列を含み得る。さらなる実施形態では、この多価ペプチドは、任意の介在するアミノ酸によって分離されない、隣接する同一または非同一サブ配列を含む。
【００４５】
本明細書で用いられるとき、用語「ペプチド」は、ペプチド、タンパク質、タンパク質のフラグメントなどを意味するために広く用いられる。用語「ペプチド模倣物」は、本明細書で用いられるとき、それが構造的に基礎にするペプチドの活性を有するペプチド様分子を意味する。このようなペプチド模倣物は、化学的に改変されたペプチド、天然に存在しないアミノ酸を含むペプチド様分子、およびペプトイドを含み、そしてこのペプチド模倣物が由来するペプチドの標的との選択的相互作用のような活性を有する（例えば、「Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」、Ｖｏｌ．１（Ｍ．Ｅ．Ｗｏｌｆｆ編；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９５）、８０３〜８６１頁中のＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｏ、Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎを参照のこと）。
【００４６】
種々のペプチド模倣物が当該技術分野で公知であり、例えば、制限されたアミノ酸、ペプチド二次構造を模倣する非ペプチド成分、またはアミド結合同配体を含むペプチド様分子を含む。制限された天然に存在しないアミノ酸を含むペプチド模倣物は、例えば、α−メチル化アミノ酸；α、α−ジアルキルグリシンまたはα−アミノシクロアルカンカルボン酸；Ｎα−−Ｃα環化アミノ酸；Ｎα．−メチル化アミノ酸；β−またはγ−アミノシクロアルカンカルボン酸；α，β−不飽和アミノ酸；β，β−ジメチルまたはβ−メチルアミノ酸；β−置換−２，３−メタノアミノ酸；Ｎ−−ＣεまたはＣα−−ＣΔ環化アミノ酸；置換プロリンまたは別のアミノ酸模倣物を含み得る。ペプチド二次構造を模倣するペプチド模倣物は、例えば、非ペプチド（ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｉｃ）β−ターン模倣物；γ−ターン模倣物；β−シート構造；またはらせん構造の模倣物を含み得、これらの各々は当該技術分野で周知である。ペプチド模倣物はまた、例えば、レトロ−インバーソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）改変；還元アミド結合；メチレンチオエーテルまたは−メチレン−スルホキシド結合；メチレンエーテル結合；エチレン結合；チオアミド結合；トランス−オレフィンまたはフルオロオレフィン結合；１，５−二置換テトラゾール環；ケトメチレンまたはフルオロケトメチレン結合のようなアミド結合同配体、または別のアミド同配体を含むペプチド様分子であり得る。当業者は、これらおよびその他のペプチド模倣物が、本明細書で用いられるとき、用語「ペプチド模倣物」の意味内に包含されることを理解する。
【００４７】
ペプチド模倣物を同定するための方法は当該技術分野で周知であり、そして例えば、可能なペプチド模倣物のライブラリーを含むデータベースのスクリーニングを含む。例として、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅは、既知の結晶構造を有する３００，０００を超えるコレクションを含む（Ａｌｌｅｎら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｑｒ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ、３５：２３３１（１９７９））。この構造物寄託は、新規な結晶構造が決定されるとき継続してアップデートされ、そして適切な形状、例えば、開示されるペプチドと同じ形状、ならびに標的分子に可能な幾何学的および化学的相補性を有する化合物についてスクリーニングされ得る。ペプチドまたはペプチドに結合する標的分子の結晶構造が入手可能でない場合、構造は、例えば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤ（Ｒｕｓｉｎｋｏら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．２９：２５１（１９８９））を用いて生成され得る。別のデータベース、Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ  Ｃａｌｉｆ．）は、市販され入手可能な約１００，０００の化合物を含み、そしてまた、例えば、癌細胞と選択的に相互作用することで活性をもつペプチドの可能なペプチド模倣物を同定するためにサーチされ得る。
【００４８】
（ｉ．ホーミングペプチド）
凝固した血漿タンパク質にホーミングするペプチドの技術分野でいくつかの例がある。例は、ＲＥＫ、ＲＥＫを含むペプチド、ＣＲＥＫＡ（配列番号１）、およびＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むペプチドを含む。アミノ酸セグメントがまた、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的改変体、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含むアミノ酸セグメント、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなるアミノ酸セグメント、およびアミノ酸配列ＲＥＫからなるアミノ酸セグメントを含むアミノ酸セグメントから独立に選択され得る。これらアミノ酸セグメントは、各々独立にアミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）またはその保存的改変体を含み得る。
【００４９】
これらアミノ酸セグメントはまた、各々独立に、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を含み得る。アミノ酸セグメントはまた、アミノ酸配列ＣＲＥＫＡ（配列番号１）からなり得る。アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列ＲＥＫからなり得る。
【００５０】
（ｉｉ．フィブリン結合ペプチド）
クロット結合化合物はまた、フィブリン結合ペプチド（ＦＢＰ）を含み得る。フィブリン結合ペプチドの例は、当該技術分野で公知である（Ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊｅｎ  Ｎ、Ｓａｎｄｅｒｓ  Ａ（１９９４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７４：８３〜９３；Ｍｏｇｈｉｍｉ  ＳＭ、Ｈｕｎｔｅｒ  ＡＣ、Ｍｕｒｒａｙ  ＪＣ（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ５３：２８６〜３１８；米国特許第５，７９２，７４２号、すべて、フィブリン結合ペプチドに関するそれらの教示についてそれらの全体が参考として本明細書中に援用される。）
（ｉｉｉ．その他のクロット結合ペプチド）
クロット結合ペプチドはまた、フィブリン以外のタンパク質に結合し得る。例は、クロット中に取り込まれるようになったフィブロネクチンに結合するペプチドを含む（Ｐｉｌｃｈら、（２００６）ＰＮＡＳ、１０３：２８００〜２８０４、クロット結合ペプチドに関するその教示についてその全体が本明細書によって援用される）。クロット結合ペプチドの例は、制限されないで、ＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ（ＣＬＴ１、配列番号２）およびＣＮＡＧＥＳＳＫＮＣ（ＣＬＴ２、配列番号３）を含む。これらアミノ酸セグメントはまた、アミノ酸配列ＣＬＴ１またはＣＬＴ２（配列番号２または３）またはその保存的改変体、アミノ酸配列ＣＬＴ１またはＣＬＴ２（配列番号２または３）を含むアミノ酸セグメント、またはアミノ酸配列ＣＬＴ１またはＣＬＴ２（配列番号２または３）からなるアミノ酸セグメントを含むアミノ酸セグメントから独立に選択され得る。これらアミノ酸セグメントは、各々独立に、アミノ酸配列ＣＬＴ１またはＣＬＴ２（配列番号２または３）またはその保存的改変体を含み得る。
【００５１】
これらアミノ酸セグメントはまた、各々独立に、アミノ酸配列ＣＬＴ１またはＣＬＴ２（配列番号２または３）を含み得る。アミノ酸セグメントはまた、アミノ酸配列ＣＬＴ１またはＣＬＴ２（配列番号２または３）からなり得る。
【００５２】
（２．クロット結合抗体）
上記クロット結合化合物は、クロット結合抗体を含み得る。クロット結合抗体の例は、当該技術分野で公知である（Ｈｏｌｖｏｅｔら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、Ｖｏｌ  ８７、１００７〜１０１６、１９９３；Ｂｏｄｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．２６４、Ｉｓｓｕｅ  ２、９４４〜９４８、Ｊａｎ、１９８９；Ｈｕａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７：Ｖｏｌ．２７５．ｎｏ．５２９９、５４７〜５５０頁、これらすべては、クロット結合抗体に関するそれらの教示についてそれらの全体が本明細書中に参考として援用される）。
【００５３】
用語「抗体」は、本明細書では広い意味で用いられ、そしてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含む。インタクトな免疫グロブリン分子に加え、用語「抗体」にまた含まれるのは、それらがクロットに結合またはそうでなければクロットと相互作用するそれらの能力のために選択される限り、これら免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー、および免疫グロブリンまたはそのフラグメントのヒトまたはヒト化バージョンがある。これら抗体は、本明細書中に記載されるインビトロアッセイを用い、または類似の方法により、それらの所望の活性について試験され得、その後、それらのインビボ治療活性および／または予防活性が、公知の臨床試験方法に従って試験される。
【００５４】
本明細書で用いられるとき、用語「モノクローナル抗体」は、抗体の実質的に均一な、すなわち、この集団内の個々の抗体は、抗体分子の小サブセット中に存在し得る可能な自然に起こる変異を除き同一である集団から得られる抗体をいう。本明細書において、モノクローナル抗体は、詳細には、その重および／または軽鎖の一部分が特定の種由来の抗体中または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、その一方、その鎖（単数または複数）の残りが別の種由来の抗体中または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中、ならびにこのような抗体のフラグメント中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体を、それらが所望のアンタゴニスト活性を示す限り含む（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４）を参照のこと）。
【００５５】
開示されるモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生する任意の手順を用いて作製され得る。例えば、開示されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって記載される方法のようなハイブリドーマ法を用いて調製され得る。ハイブリドーマ法では、マウスまたはその他の適切な宿主動物が、代表的には免疫化剤で免疫され、この免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を惹起する。あるいは、リンパ球が、インビトロで、例えば、本明細書中に記載されるＨＩＶ  Ｅｎｖ−ＣＤ４−コ−レセプター複合体を用いて免疫化され得る。
【００５６】
これらモノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）に記載されるような組み換えＤＮＡ法によっても作製され得る。開示されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、そして従来手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）配列決定され得る。抗体または活性抗体フラグメントのライブラリーはまた、例えば、Ｂｕｒｔｏｎらへの米国特許第５，８０４，４４０号およびＢａｒｂｓらへの米国特許第６，０９６，４４１号に記載のように、ファージディスプレイ技法を用いて生成され、そしてスクリーニングされ得る。
【００５７】
インビトロ法もまた、一価抗体を調製するために適切である。そのフラグメント、特にＦａｂフラグメントを生成するための抗体の消化は、当該技術分野で慣用の技法を用いて達成され得る。例えば、消化はパパインを用いて実施され得る。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ９４／２９３４８および米国特許第４，３４２，５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は、代表的には、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる２つの同じ抗原結合フラグメントを生成し、各々は単一の抗原結合部位、および残りのＦｃフラグメントを備える。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、そしてなお抗原を交差連結し得るフラグメントを生じる。
【００５８】
これらフラグメントはまた、その他の配列に結合してしているか否かにかかわらず、抗体または抗体フラグメントの活性が非改変抗体または抗体フラグメントに比較して有意に変化または損なわれないことを条件に、挿入、欠失、置換、または特定領域もしくは特定のアミノ酸残基のその他の選択された改変を含み得る。これらの改変は、ジスルフィド結合し得るアミノ酸を除去／付加すること、その生体−寿命を増加すること、その分泌特性を変えることなどのような、いくつかのさらなる性質を提供し得る。いずれの場合においても、この抗体または抗体フラグメントは、その同起源抗原への特異的結合のような、生物活性特性を所有しなければならない。抗体または抗体フラグメントの機能的または活性領域は、タンパク質の特定領域変異誘発、次いで発現および発現されたポリペプチドの試験により同定され得る。このような方法は、当業者に容易に明らかであり、そして抗体または抗体フラグメントをコードする核酸の部位特異的変異誘発を含み得る（Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８〜３５４、１９９２）。
【００５９】
本明細書で用いられるとき、用語「抗体（単数）」または「抗体（複数）」はまた、ヒト抗体および／またはヒト化抗体をいい得る。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、またはウサギ由来の抗体）は、ヒトにおいては元来抗原性であり、そしてそれ故、ヒトに投与されるとき、所望されない免疫応答を生じ得る。従って、上記方法におけるヒトまたはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が所望されない免疫応答を起こす機会を少なくするために供される。
【００６０】
ヒト抗体は、任意の技法を用いて調製され得る。ヒトモノクローナル抗体産生のための技法の例は、Ｃｏｌｅら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁、１９８５）により、およびＢｏｅｒｎｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５、１９９１）により記載される方法を含む。ヒト抗体（およびそのフラグメント）はまた、ファージディスプレイライブラリーを用いて産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１、１９９１；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１、１９９１）。
【００６１】
ヒト抗体はまた、トランスジェニック動物から得られ得る。例えば、免疫化に応答してヒト抗体の完全レパートリーを産生し得るトランスジェニック変異体マウスが記載されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１〜２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５〜２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：３３（１９９３）を参照のこと）。特に、これらのキメラおよび生殖細胞系変異体マウス中の抗体重鎖連結領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を生じ、そしてヒト生殖細胞系遺伝子アレイのこのような生殖細胞系変異体マウス中への成功した移入は、抗原投与に際し、ヒト抗体の産生を生じる。所望の活性を有する抗体は、本明細書中に記載のようなＥｎｖ−ＣＤ４−コ−レセプター複合体を用いて選択される。
【００６２】
抗体ヒト化技法は、一般に、組み換えＤＮＡ技術の使用を含み、抗体分子の１つ以上のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作する。従って、非ヒト抗体（またはそのフラグメント）のヒト化形態は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワーク中に組み込まれた非ヒト（ドナー）抗体からの抗原結合部位の部分を含むキメラ抗体または抗体鎖（または、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、もしくは抗体のその他の抗原結合部分のようなそのフラグメント）である。
【００６３】
ヒト化抗体を生成するために、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基は、所望の抗原結合特徴（例えば、標的抗原に対する特定レベルの特異性および親和性）を有することが知られるドナー（非ヒト）抗体分子の１つ以上のＣＤＲからの残基によって置き換えられる。いくつかの例では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体中にも、インポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列中にも見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。実際、ヒト化抗体は、代表的には、いくつかのＣＤＲ残基および可能にはいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体中の類似の部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。ヒト化抗体は、一般に、抗体定常領域（Ｆｃ）、代表的にはヒト抗体の抗体定常領域の少なくとも一部分を含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２））。
【００６４】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ヒト化抗体は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））の方法に従って、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置き換えることにより生成され得る。ヒト化抗体を産生するために用いられ得る方法はまた、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）、米国特許第５，５６５，３３２号（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら）、米国特許第５，７２１，３６７号（Ｋａｙら）、米国特許第５，８３７，２４３号（Ｄｅｏら）、米国特許第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）、米国特許第６，１３０，３６４号（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら）、および米国特許第６，１８０，３７７号（Ｍｏｒｇａｎら）に記載されている。
【００６５】
（３．小有機分子）
クロット結合化合物はまた、小有機分子であり得る。クロットと相互作用、またはクロットに結合し得る小有機分子は、当該技術分野で公知である。これら分子はまた、コンビナトリアル化学のような当該技術分野で公知の方法によって同定され得る。小有機分子のいくつかの形態は、１０００ダルトン未満の分子量を有する有機分子であり得る。
【００６６】
コンビナトリアル化学は、制限されないで、例えば、クロットと相互作用し得る小分子、フィブリンもしくはフィブロネクチン、または凝固した血漿タンパク質のようなクロットと会合する分子を単離するすべての方法を含む。分子の大きなプールを合成し、そしてその複合混合物を、クロットとの相互作用の検出のような特定の選択および富化プロセスに供する。
【００６７】
種々のコンビナトリアルライブラリーと組み合わせ、当業者に周知の方法を用い、所望の標的に結合または相互作用するような小分子を単離および特徴付け得る。これら化合物の相対的結合親和性は、当業者に周知である競争結合研究を用いて比較され、そして最適化合物が同定され得る。例えば、ＣＲＥＫＡ（配列番号１）を用いる競争結合研究が、用いられ得る。
【００６８】
所望の標的を結合する分子を単離するためにコンビナトリアルライブラリーを作製し、そしてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための技法は、当業者に周知である。代表的な技法および方法は、制限されないで、以下の米国特許に見出され得る。第５，０８４，８２４号、第５，２８８，５１４号、第５，４４９，７５４号、第５，５０６，３３７号、第５，５３９，０８３号、第５，５４５，５６８号、第５，５５６，７６２号、第５，５６５，３２４号、第５，５６５，３３２号、第５，５７３，９０５号、第５，１６８，８２５号、第５，６１９，６８０号、第５，６２７，２１０号、第５，６４６，２８５号、第５，６６３，０４６号、第５，６７０，３２６号、第５，６７７，１９５号、第５，６８３，８９９号、第５，６８８，６９６号、第５，６８８，９９７号、第５，６９８，６８５号、第５，７１２，１４６号、第５，７２１，０９９号、第５，７２３，５９８号、第５，７４１，７１３号、第５，７９２，４３１号、第５，８０７，６８３号、第５，８０７，７５４号、第５，８２１，１３０号、第５，８３１，０１４号、第５，８３４，１９５号、第５，８３４，３１８号、第５，８３４，５８８号、第５，８４０，５００号、第５，８４７，１５０号、第５，８５６，１０７号、第５，８５６，４９６号、第５，８５９，１９０号、第５，８６４，０１０号、第５，８７４，４４３号、第５，８７７，２１４号、第５，８８０，９７２号、第５，８８６，１２６号、第５，８８６，１２７号、第５，８９１，７３７号、第５，９１６，８９９号、第５，９１９，９５５号、第５，９２５，５２７号、第５，９３９，２６８号、第５，９４２，３８７号、第５，９４５，０７０号、第５，９４８，６９６号、第５，９５８，７０２号、第５，９５８，７９２号、第５，９６２，３３７号、第５，９６５，７１９号、第５，９７２，７１９号、第５，９７６，８９４号、第５，９８０，７０４号、第５，９８０，７０４号、第５，９８５，３５６号、第５，９９９，０８６号、第６，００１，５７９号、第６，００４，６１７号、第６，００８，３２１号、第６，０１７，７６８号、第６，０２５，３７１号、第６，０３０，９１７号、第６，０４０，１９３号、第６，０４５，６７１号、第６，０４５，７５５号、第６，０６０，５９６号、および第６，０６１，６３６号。
【００６９】
コンビナトリアルライブラリーは、多くの異なる合成技法を用いて分子の広範なアレイから作製され得る。例えば、縮合２，４−ピリミジンジオン（米国特許第６，０２５，３７１号）ジヒドロベンゾピラン（米国特許第６，０１７，７６８号および同第５，８２１，１３０号）、アミドアルコール（米国特許第５，９７６，８９４号）、ヒドロキシ−アミノ酸アミド（米国特許第５，９７２，７１９号）、炭水化物（米国特許第５，９６５，７１９号）、１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン（米国特許第５，９６２，３３７号）、環状物（ｃｙｃｌｉｃ）（米国特許第５，９５８，７９２号）、ビアリールアミノ酸アミド（米国特許第５，９４８，６９６号）、チオフェン（米国特許第５，９４２，３８７号）、三環テトラヒドロキノリン（米国特許第５，９２５，５２７号）、ベンゾフラン（米国特許第５，９１９，９５５号）、イソキノリン（米国特許第５，９１６，８９９号）、ヒダントインおよびチオヒダントイン（米国特許第５，８５９，１９０号）、インドール（米国特許第５，８５６，４９６号）、イミダゾール−ピリド−インドールおよびイミダゾール−ピリド−ベンゾチオフェン（米国特許第５，８５６，１０７号）、置換２−メチレン−２，３−ジヒドロチアゾール（米国特許第５，８４７，１５０号）、キノリン（米国特許第５，８４０，５００号）、ＰＮＡ（米国特許第５，８３１，０１４号）、含有タグ（米国特許第５，７２１，０９９号）、ポリケチド（米国特許第５，７１２，１４６号）、モルホリノ−サブユニット（米国特許第５，６９８，６８５号および同第５，５０６，３３７号）、スルフアミド（米国特許第５，６１８，８２５号）、およびベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）を含む。
【００７０】
本明細書で用いられるとき、含められるコンビナトリアル方法およびライブラリーは、伝統的なスクリーニング方法およびライブラリー、ならびに反復プロセスで用いられる方法およびライブラリーである。
【００７１】
小有機分子のライブラリーは、一般に少なくとも２の有機化合物、しばしば少なくとも約２５、１００、５００の異なる有機化合物、より普通には少なくとも約１０００の異なる有機化合物、好ましくは少なくとも約２５００の異なる有機化合物、より好ましくは少なくとも約５０００の異なる有機化合物、そして最も好ましくは少なくとも約１０，０００以上の異なる有機化合物を含む。ライブラリーは、ライブラリーの各々の個々の分子がライブラリーのその他の分子から空間的に分離され得るか（例えば、ライブラリーの各々のメンバーは、別個のマイクロタイターウェルに存在する）、またはライブラリーの２つ以上のメンバーは、デコンボルーションのための方法が容易に利用可能である場合、組み合わせられ得るように選択または構築され得る。有機化合物のライブラリーが調製される方法は、本発明にとって重要ではない。
【００７２】
（Ｂ．表面分子）
本明細書中に開示される、代わりに表面粒子とも称される表面分子は、その結合体がクロットに送達されるような様式でクロット結合化合物と結合し得、そこでそれは蓄積し得、そしてさらに凝固を引き起こす。この表面分子は、クロット結合化合物とともに用いられ得る任意の物質であり得、そしてサイズまたは物質によって制限されない。例は、制限されないで、（酸化鉄ナノ粒子またはアルブミンナノ粒子のような）ナノ粒子、リポソーム、小有機分子、ミクロ粒子、フルオロカーボンミクロバブルのようなミクロバブルを含む。表面分子という用語は、開示される結合体の成分を識別するために用いられるが、制限的であることは意図されない。特に、開示される表面分子は、単一分子から構成される物質、化合物、組成物、粒子またはその他の材料に制限されない。むしろ、開示される表面分子は、少なくともいくつかのクロット結合化合物が表面分子の表面上で表現され、そして／または接近可能であるように、複数のクロット結合化合物と結合体化され得る、任意の物質、化合物、組成物、粒子および／またはその他の材料である。適切な表面分子の種々の例は、本明細書中に記載され、そして開示されている。
【００７３】
この表面分子は検出可能であり得るか、またはＡｂｒａｘａｎｅＴＭのような治療剤であり得る。検出可能または治療的であり得る成分を論じる以下のセクションもまた、この表面分子に適用される。
【００７４】
（１．ナノ粒子、ミクロ粒子、およびミクロバブル）
用語「ナノ粒子」は、ナノメートルで測定されるサイズをもつナノ粒子、例えば、約１００ｎｍより小さい少なくとも１つの寸法を有するナノ範囲（ｎａｎｏｓｃｏｐｉｃ）の粒子をいう。ナノ粒子の例は、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様物質、無機ナノチューブ、（共有結合した金属キレートをもつような）デンドリマー、ナノファイバー、ナノホム（ｎａｎｏｈｏｍ）、ナノ−オニオン（ｎａｎｏ−ｏｎｉｏｎ）、ナノロッド、ナノロープおよび量子ドットを含む。ナノ粒子は、例えば、（高周波および可視光子を含む）光子の吸収および／または放射およびプラズモン共鳴により、検出可能な信号を生成し得る。
【００７５】
ミクロスフェア（またはミクロバブル）がまた、本明細書中に開示される方法とともに用いられ得る。発色団を含むミクロスフェアは、フォトニック結晶、生物学的ラベリング、およびマイクロ流体チャネル中の流れ可視化を含む広範な種類の用途で利用されてきた。例えば、Ｙ．Ｌｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ  Ｌｅｔｔ．２００２、８１、３１３４；Ｄ．Ｗａｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２００３、１５、２７２４；Ｘ．Ｇａｏら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．２００２、７、５３２；Ｍ．Ｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００１、１９、６３１；Ｖ．Ｍ．Ｐａｉら、Ｍａｇ．＆Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｍａｔｅｒ．１９９９、１９４、２６２（これらの各々は、それらの全体が参考として援用される）を参照のこと。発色団の光安定性およびミクロスフェアの単分散性は重要であり得る。
【００７６】
例えば、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、または半導体ナノ結晶のようなナノ粒子は、ミクロスフェア中に取り込まれ得る。これらナノ粒子の光学的性質、磁気的性質、および電子的性質は、それらが、ミクロスフェアと会合している間観察されることを可能にし、そしてこれらミクロスフェアが識別され、そして空間的にモニターされることを可能にし得る。例えば、コロイド状に合成された半導体ナノ結晶の高い光安定性、良好な蛍光効率および広い放射調整可能性は、それらを発色団の優れた選択にし得る。有機色素とは異なり、異なる色（すなわち異なる波長）を発するナノ結晶は、単一光源で同時に励起され得る。（例えば、コア−シェルＣｄＳｅ／ＺｎＳおよびＣｄＳ／ＺｎＳナノ結晶のような）コロイド状に合成された半導体ナノ結晶は、ミクロスフェア中に取り込まれ得る。これらミクロスフェアは、単分散シリカミクロスフェアであり得る。
【００７７】
ナノ粒子は、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、または半導体ナノ結晶であり得る。金属ナノ粒子または金属酸化物ナノ粒子の金属は、チタン、ジルコニウム、ハウニウム、バナジウム、ニオビウム、タンタル、クロミウム、モリブデン、タングステン、マンガン、テクネチウム、レニウム、鉄、ルテニウム、オスミウム、コバルト、ロジウム、イリジウム、ニッケル、パラジウム、プラチナ、銅、銀、金、亜鉛、カドミウム、スカンジウム、イッテリウム、ランタン、ランタニドシリーズまたはアクチニドシリーズ元素（例えば、セリウム、プラセオジニウム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガトリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホロミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム、トリウム、プロタクチニウム、およびウラニウム）、ホウ素、アルミニウム、ガリウム、インジウム、タリウム、シリコン、ゲルマニウム、錫、鉛、アンチモン、ビスマス、ポロニウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、およびバリウムを含む。特定の実施形態では、上記金属は、鉄、ルテニウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、パラジウム、プラチナ、銀、金、セシウムまたはサマリウムであり得る。上記金属酸化物は、これら材料または材料の組み合わせのいずれかの酸化物であり得る。例えば、上記金属は金であり得るか、または上記金属酸化物は酸化鉄、酸化コバルト、酸化亜鉛、酸化セリウム、または酸化チタンであり得る。金属ナノ粒子および金属酸化物ナノ粒子の調製は、例えば、米国特許第５，８９７，９４５号６および米国特許第６，７５９，１９９号に記載され、これらの各々は、その全体が参考として援用される。
【００７８】
（２．リポソーム）
「リポソーム」は、この用語が本明細書中で用いられるとき、内側の水性スペースを取り囲む外側の脂質二重層または複数層の膜を含む構造をいう。リポソームは、細胞への送達のために任意の生物学的に活性な薬剤をパッケージするために用いられ得る。
【００７９】
リポソームを形成するための材料および手順は、当業者に周知である。適切な媒体中での分散に際し、広範な種類のリン脂質は膨潤し、水和し、そして脂質二重層を分離する水性媒体の層をもつ多層同心性二重層（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｂｉｌａｙｅｒ）ベシクルを形成する。これらのシステムは、マルチラメラリポソームまたはマルチラメラ脂質ベシクル（「ＭＬＶ」）と称され、そして１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内の直径を有する。これらのＭＬＶは、最初、Ｂａｎｇｈａｍら、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３８〜２５２（１９６５）によって記載された。一般に、脂質または親油性物質は、有機溶媒中に溶解される。減圧下での回転蒸発のように、この溶媒が除去されるとき、脂質残渣は、コンテナの壁上に膜を形成する。代表的には電解質または親水性の生物学的に活性な材料を含む水性溶液が、次にこの膜に添加される。大きなＭＬＶが撹拌の際に生成される。より小さなＭＬＶが所望されるとき、より大きなベシクルは、音波処理、減少するポアサイズをもつフィルターでの逐次的濾過またはその他の形態の機械的剪断により低減される。ラメラのサイズおよび数における両方でＭＬＶが低減され得る技法がまたあり、例えば、加圧押し出し（Ｂａｒｅｎｈｏｌｚら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．９９：２１０〜２１４（１９７９））による。
【００８０】
リポソームはまた、単一ラメラベシクルの形態をとり得、これはＭＬＶのより大規模な音波処理によって調製され、そして水性溶液を取り囲む単一の球形脂質二重層からなる。単一ラメラベシクル（「ＵＬＶ」）は２０〜２００ｎｍの範囲内の直径を有して小さくあり得、その一方、より大きなＵＬＶは、２００ｎｍ〜２μｍの範囲内の直径を有し得る。単一ラメラベシクルを作製するためのいくつかの周知の技法がある。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３５：６２４〜２３８（１９６８）では、リン脂質の水性分散物の音波処理は、水性溶液を取り囲む脂質二重層を有する小ＵＬＶを生成する。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、米国特許第４，０８９，８０１号は、超音波処理によるリポソーム前駆体の形成、次いで両親媒性化合物を含む水性媒体の添加、および生体分子脂質層システムを形成するための遠心分離を記載している。
【００８１】
小ＵＬＶはまた、Ｂａｔｚｒｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２９８：１０１５〜１０１９（１９７３）により記載されるエタノール注入技法、およびＤｅａｍｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４４３：６２９〜６３４（１９７６）のエーテル注入技法により調製され得る。これらの方法は、脂質の有機溶液の緩衝液溶液中への急速注入を含み、これは、単一ラメラリポソームの迅速形成を生じる。ＵＬＶを作製するための別の技法は、Ｗｅｄｅｒらにより、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ、Ｖｏｌ．Ｉ、７章、７９〜１０７頁（１９８４）中に教示されている。この溶剤除去方法は、撹拌または音波処理による溶剤での脂質および添加物の可溶化を含み、所望のベシクルを生成する。
【００８２】
Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，２３５，８７１号は、逆相蒸発技法による大ＵＬＶの調製を記載し、これは、有機溶媒中の脂質および水性緩衝液溶液中の被包化されるべき薬物の油中水エマルジョンの形成を含む。有機溶媒は圧力下で除去され、水性媒体中の撹拌または分散に際し大ＵＬＶに変換される混合物を生じる。Ｓｕｚｕｋｉら、米国特許第４，０１６，１００号は、単一ラメラベシクル中に薬剤を被包化する別の方法を記載し、それは薬剤および脂質の水性リン脂質分散物を凍結／融解することによる。
【００８３】
ＭＬＶおよびＵＬＶに加え、リポソームはまた、複数ベシクルであり得る。Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７２８：３３９〜３４８（１９８３）に記載され、これら複数ベシクルリポソームは球形であり、そして内部顆粒構造を含む。外側膜は脂質二重層であり、そして内部領域は、二重層隔壁によって分離された小区画を含む。さらになお別のタイプのリポソームは、オリゴラメラベシクル（「ＯＬＶ」）であり、これは、いくつかの周縁脂質層によって取り囲まれた大きな中心区画を有する。これらのベシクルは、２〜１５μｍの直径を有し、Ｃａｌｌｏら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２２（３）：２５１〜２６７（１９８５）に記載されている。
【００８４】
Ｍｅｚｅｉら、米国特許第４，４８５，０５４号および米国特許第４，７６１，２８８号はまた、脂質ベシクルを調製する方法を記載している。より最近、Ｈｓｕ、米国特許第５，６５３，９９６号は、エアロゾル化を利用してリポソームを調製する方法を記載し、そしてＹｉｏｕｒｎａｓら、米国特許第５，０１３，４９７号は、高速度−剪断混合チャンバーを利用してリポソームを調製する方法を記載している。ＵＬＶ（Ｗａｌｌａｃｈら、米国特許第４，８５３，２２８号）またはＯＬＶ（Ｗａｌｌａｃｈら、米国特許第５，４７４，８４８号および米国特許第５，６２８，９３６号）を生成するために特定の出発材料を用いる方法もまた記載されている。
【００８５】
すべての前述の脂質ベシクルの総合的総説およびそれらの調製のための方法は、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ」、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．、Ｖｏｌ．Ｉ、ＩＩ＆ＩＩＩ（１９８４）に記載される。本発明における使用のために適切な種々の脂質ベシクルを記載するこの参考文献および前述の参考文献は、本明細書中に参考として援用される。
【００８６】
（Ｃ．成分）
本明細書中に開示される結合体はさらに、１つ以上の成分を含み得る。例えば、これら成分は、抗血管新生剤、プロ血管新生剤、癌化学療法剤、細胞障害性剤、抗炎症剤、抗関節炎剤、ポリペプチド、核酸分子、小分子、フルオロフォア、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、インジウム−１１１、テクネチウム−９９、カーボン−１１、およびカーボン−１３からなる群から独立に選択され得る。これら成分の少なくとも１つは治療剤であり得る。治療剤の例は、パクリタキセルおよびタキソールである。上記成分の少なくとも１つは、検出可能な作用物質であり得る。
【００８７】
本明細書中で用いられるとき、用語「成分」は、連結または結合された分子に生物学的に有用な機能を一般に与える物理的、化学的、または生物学的物質を意味するために広く用いられる。本明細書で開示されるように、この成分の性質はまた、表面分子中で見出され得るか、またはこの表面分子および成分の両方は、本明細書中に開示される特徴の１つを共有し得る。例えば、表面分子は検出可能な作用物質を含み得、その一方上記成分は治療剤を含み得る。これはまた、クロット結合化合物について適用され、これもまた本明細書中に開示されるような成分の性質の１つ以上を含み得る。以下の治療剤および検出可能な作用物質の記載は、成分、表面分子、またはクロット結合化合物のいずれにも適用することが意図される。それ故、例えば、成分は、開示される表面分子、クロット結合化合物、または表面分子とクロット結合化合物の結合体に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）、結合（ｃｏｕｐｌｅｄ）、またはその一部であり得る。
【００８８】
成分は、任意の天然または非天然材料であり得、制限なくして、細胞、ファージまたはその他のウイルスのような生物学的材料；小分子のような有機化学品；放射性核種；核酸分子またはオリゴヌクレオチド；ポリペプチド；またはペプチドを含む。有用な成分は、制限されないで、癌化学療法剤のような治療剤、細胞障害性剤、プロアポトーシス剤、および抗血管新生剤；検出可能な標識および造影剤；およびタグまたはその他の不溶性支持体を含む。有用な成分はさらに、制限なくして、ファージおよびその他のウイルス、細胞、リポソーム、ポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス、または金粒子のような粒子、マイクロデバイス、ナノデバイス、およびナノスケール半導体材料を含む。当該技術分野で公知のこれらおよびその他の成分は、結合体の成分であり得る。
【００８９】
（１．治療剤）
上記成分は治療剤であり得る。本明細書で用いられるとき、用語「治療剤」は、正常または病態組織中で１つ以上の生物学的活性を有する分子を意味する。種々の治療剤が成分として用いられ得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、治療剤は、癌化学療法剤であり得る。本明細書で用いられるとき、「癌化学療法剤」は、癌細胞の増殖、成長、寿命または転移活性を阻害する化学的作用物質である。このような癌化学療法剤は、制限なくして、ドセタキセルのようなタキサン；ドキソルビシンのようなアントラサイクリン；アルキル化剤；ビンカアルカロイド；抗−代謝産物；シスプラチンまたはカルボプラチンのようなプラチナ薬剤；メトトレキセートのようなステロイド；アドリアマイシンのような抗生物質；イソファミド；または選択的エストロゲンレセプターモジュレーター；トラスツマブのような抗体であり得る。
【００９１】
タキサンは、本明細書中に開示される結合体とともに有用な化学療法剤である。有用なタキサンは、制限なくして、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ；Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）およびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ；Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）を含む。例えば、Ｃｈａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：２３４１〜２３５４（１９９９）およびＰａｒｉｄａｅｎｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１８：７２４（２０００）を参照のこと。
【００９２】
本明細書中に開示される結合体とともに有用な癌化学療法剤はまた、ドキソルビシン、イダルビシンまたはダウノルビシンのようなアントラサイクリンであり得る。ドキソルビシンは、一般に用いられる癌化学療法剤であり、そして例えば、乳癌を処置するために有用であり得る（ＳｔｅｗａｒｔおよびＲａｔａｉｎ、「Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ」、第５版、１９章（ＤｅＶｉｔａ、Ｊｒ．ら、編；Ｊ．Ｐ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  １９９７）；Ｈａｒｒｉｓら、「Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ」前述、１９９７）。さらに、ドキソルビシンは、抗−血管新生活性を有する（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ  １５：５１０（１９９７）；Ｓｔｅｉｎｅｒ、「Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｋｅｙ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ−Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、４４９〜４５４頁（Ｓｔｅｉｎｅｒら編；Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、１９９２））、これは、癌を処置することにおいてその有効性に寄与し得る。
【００９３】
メルファランまたはクロラムブシルのようなアルキル化剤もまた、有用な化学療法剤であり得る。同様に、ビンデシン、ビンブラスチンまたはビノレルビンのようなビンカアルカロイド；または５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジンまたはその誘導体のような抗代謝産物はまた、有用な癌化学療法剤であり得る。
【００９４】
プラチナ剤もまた、有用な癌化学療法剤であり得る。このようなプラチナ剤は、例えば、Ｃｒｏｗｎ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２８：２８〜３７（２００１）に記載されるようなシスプラチンまたはカルボプラチンであり得る。その他の有用な学化学療法剤は、制限なくして、メトトレキセート、マイトマイシン−Ｃ、アドリアマイシン、イホファミドおよびアンサマイシンを含む。
【００９５】
乳癌およびその他のホルモン依存性癌の処置のために有用な癌化学療法剤はまた、選択的エストロゲンレセプターモジュレーターまたは抗エストロゲンのようなエストロゲンの効果をアンタゴナイズする薬剤であり得る。この選択的エストロゲンレセプターモジュレーターである、タモキシフェンは、乳癌の処置のために結合体中で用いられ得る癌化学療法剤である（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔ．９０：１３７１〜１３８８（１９９８））。
【００９６】
上記治療剤は、ヒト化モノクローナル抗体のような抗体であり得る。例として、抗上皮成長因子レセプター２（ＨＥＲ２）抗体、トラスツマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現乳癌を処置するために有用な治療剤であり得る（Ｗｈｉｔｅら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５２：１２５−１４１（２００１））。
【００９７】
有用な治療剤はまた、細胞障害性剤であり得、これは、本明細書中で用いられるとき、細胞死滅を直接または間接的に促進する任意の分子であり得る。有用な細胞障害性剤は、制限なくして、小分子、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸−分子、細胞およびウイルスを含む。非制限的な例として、有用な細胞障害性剤は、ドキソルビシン、ドセタキセルまたはトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のような細胞障害性小分子；さらに以下に記載されるような抗微生物ペプチド；カスパーゼのようなプロ−アポトーシスポリペプチド、およびトキシン、例えば、カスパーゼ−８；ジフテリアトキシンＡ鎖、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡ、コレラトキシン、ＤＡＢ３８９ＥＧＦのようなリガンド融合トキシン、ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓトキシン（リシン）；および細胞障害性Ｔ細胞のような細胞障害性細胞を含む。例えば、Ｍａｒｔｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３２１８〜３２２４（２０００）；ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＰａｓｔａｎ、Ｂｌｏｏｄ  ９０：２５２〜２５９（１９９７）；Ａｌｌａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：２６１５〜２６１８（１９９７）；およびＯｓｂｏｒｎｅおよびＣｏｒｏｎａｄｏ−Ｈｅｉｎｓｏｈｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．２：１７５（１９９６）を参照のこと。当業者は、本明細書中に記載されるか、または当該分野で公知のこれらおよびさらなる細胞障害性剤が、開示される結合体および方法で有用であり得ることを理解する。
【００９８】
１つの実施形態では、治療剤は治療ポリペプチドであり得る。本明細書で用いられるとき、治療ポリペプチドは、生物学的に有用な機能をともなう任意のポリペプチドであり得る。有用な治療ポリペプチドは、制限なくして、サイトカイン、抗体、細胞障害性ポリペプチド；プロ−アポトーシスポリペプチド；および抗−血管新生ポリペプチドを包含する。非制限的な例として、有用な治療ポリペプチドは、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン．α（ＩＦＮ−α）；インターフェロン．γ（ＩＦＮ−γ）；インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、
インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、リンホタクチン（ＬＴＮ）または樹状細胞ケモカイン１（ＤＣ−ＣＫ１）のようなサイトカイン；抗−ＨＥＲ２抗体またはそのフラグメント；トキシンまたはカスパーゼを含む細胞障害性ポリペプチド、例えば、ジフテリアトキシンＡ鎖、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡ、コレラトキシン、ＤＡＢ３８９ＥＧＦのようなリガンド融合トキシンまたはリシン；またはアンギオスタチン、エンドスタチン、トロンボスポンジン、血小板因子４のような抗−血管新生ポリペプチド；アナステリン；または本明細書中にさらに記載されるものまたは当該技術分野で公知のようなものの１つであり得る（下記参照）。生物学的活性をともなうこれらおよびその他のポリペプチドが「治療ポリペプチド」であり得ることが理解される。
【００９９】
治療剤はまた、抗−血管新生剤であり得る。本明細書中で用いられるとき、用語「抗−血管新生剤」は血管の成長および発達である血管新生を減少または防ぐ分子を意味する。種々の抗−血管新生剤は、慣用の方法によって調製され得る。このような抗−血管新生剤は、制限なくして、小分子；血管新生因子のドミナントネガティブ形態のようなタンパク質、転写因子および抗体のようなタンパク質；ペプチド；およびリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および、例えば、血管新生因子のドミナントネガティブ形態をコードする核酸を含む核酸分子およびレセプター、転写因子、ならびに抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。例えば、ＨａｇｅｄｏｒｎおよびＢｉｋｆａｌｖｉ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４：８９〜１１０（２０００）、およびＫｉｒｓｃｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．５０：１４９〜１６３（２０００）を参照のこと。
【０１００】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、インビボでの乳癌血管新生を含む、多くのタイプの癌における血管新生のために重要であることが示されている（Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：４２１３〜４２１４（１９９９））。ＶＥＧＦの生物学的効果は、内皮細胞増殖、生存、遊走および管形成の刺激、および血管透過性の調節を含む。抗−血管新生剤は、例えば、ＶＥＧＦまたは別の血管新生因子の発現またはシグナル伝達を低減するインヒビターまたは中和抗体、例えば、抗−ＶＥＧＦ中和モノクローナル抗体（Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら、前述、１９９９）、であり得る。抗−血管新生剤はまた、ＦＧＦ−１（酸性）、ＦＧＦ−２（塩基性）、ＦＧＦ−４またはＦＧＦ−５のような線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーのような別の血管新生因子（Ｓｌａｖｉｎら、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．１９：４３１〜４４４（１９９５）；ＦｏｌｋｍａｎおよびＳｈｉｎｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７；１０９３１〜１０９３４（１９９２））、または内皮細胞−特異的Ｔｉｅ２レセプターチロシンキナーゼを通じてシグナル伝達する因子であるアンギオポエチン−１のような血管新生因子（Ｄａｖｉｓら、Ｃｅｌｌ  ８７：１１６１〜１１６９（１９９６）；およびＳｕｒｉら、Ｃｅｌｌ  ８７：１１７１〜１１８０（１９９６））、またはこれら血管新生因子の１つのレセプターを阻害し得る。種々の機構が、血管新生因子の活性を阻害するために作用し得ることが理解され、それらは、制限なくして、レセプター結合の直接阻害、血管新生因子の細胞外スペース中への分泌を低減することによる間接的阻害、または血管新生因子の発現、機能またはシグナル伝達の阻害を含む。
【０１０１】
種々のその他の分子もまた、抗−血管新生剤として機能し得、制限なくして、アンギオスタチン；アンギオスタチンのクリングルペプチド；エンドスタチン；アナステリン、フィブロネクチンのヘパリン−結合フラグメント；アンチトロンビンの改変形態；コラゲナーゼインヒビター；基底膜代謝回転インヒビター；血管新生抑制（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）ステロイド；血小板因子４およびそれらのフラグメントおよびペプチド；トロンボスポンディンおよびそのフラグメントおよびペプチド；およびドキソルビシンを含む（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ  ７９：３１５〜３２８（１９９４））；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ  ８８：２７７〜２８５（１９９７）；Ｈｏｍａｎｄｂｅｒｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１２０：３２７〜３３２（１９８５）；Ｈｏｍａｎｄｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８７４：６１〜７１（１９８６）；およびＯ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１９２６〜１９２８（１９９９）。市販され入手可能な抗−血管新生剤は、例えば、アンギオスタチン；エンドスタチン；メタスタチンおよび２ＭＥ２（ＥｎｔｒｅＭｅｄ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）；Ａｖａｓｔｉｎのような抗−ＶＥＧＦ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）；およびＳＵ５４１６のようなＶＥＧＦＲ−２インヒビター、ＶＥＧＦＲ−２の小分子インヒビター（ＳＵＧＥＮ；Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）およびＳＵ６６６８（ＳＵＧＥＮ）、ＶＥＧＦＲ−２の小分子インヒビター、血小板由来成長因子および線維芽細胞成長因子Ｉレセプターを含む。これらおよびその他の抗−血管新生剤が慣用の方法によって調製され得、そして本明細書で用いられるような用語「抗−血管新生剤」に包含されることが理解される。
【０１０２】
本明細書に開示される結合体はまた、炎症または損傷の部位で用いられ得る。この目的のために有用な成分は、いくつかの基礎的グループに属する治療剤を含み得、炎症を防ぐ抗−炎症剤、組織成長を防ぐ再狭窄予防薬物、血栓の形成を阻害または制御する抗−トロンボゲン形成薬物または血栓崩壊剤、および組織成長を調節し、そして組織の治癒を増大する生物活性剤を含む。有用な治療剤の例は、制限されないで、ステロイド、フィブロネクチン、抗−凝固薬物、抗−血小板機能薬物、血管の内表面壁上で平滑筋細胞成長を防ぐ薬物、ヘパリン、ヘパリンフラグメント、アスピリン、クマジン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ヒルジン、ストレプトキナーゼ、抗増殖剤（メトトレキセート、シスプラチン、フロオロウラシル、アドリアマイシン）、抗酸化剤（アスコルビン酸、βカロテン、ビタミンＥ）、代謝拮抗物質、トロンボキサンインヒビター、非ステロイド性およびステロイド性抗−炎症薬物、βおよびカルシウムチャネルブロッカー、ＤＮＡおよびＲＮＡフラグメントを含む遺伝材料、完全発現遺伝子、抗体、リンホカイン、成長因子、プロスタグランジン、ロイコトリエン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンおよびインテグリンを含む。
【０１０３】
有用な治療剤はまた、抗微生物ペプチドであり得る。これは、創傷またはその他の感染部位を標的にするために特に有用であり得る。それ故、例えば、また開示されるのは、抗微生物ペプチドを含む成分であり、ここで、この結合体は、選択的に内在化し、そして標的にされた領域に高い毒性を示す。有用な抗微生物ペプチドは、結合体中に取り込まれないとき、低い哺乳動物細胞障害性を有し得る。本明細書で用いられるとき、用語「抗微生物ペプチド」は、１つ以上の微生物を殺傷するか、またはその成長を遅延する能力である抗微生物活性を有する、天然に存在するか、または合成ペプチドを意味する。抗微生物ペプチドは、例えば、グラム陽性または、グラム陰性細菌を含む細菌株、または真菌もしくは原生動物の１つ以上を殺傷するか、またはその成長を遅延し得る。それ故、例えば抗微生物ペプチドは、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの１つ以上の株に対する静細菌または殺細菌活性を有し得る。以下に束縛されることは望まないが、抗微生物ペプチドは、自己凝集の結果として、膜の二重層を通るイオンチャネルを形成する能力に起因する生物学的活性を有し得る。
【０１０４】
抗微生物ペプチドは、代表的には、高度に塩基性であり、そして直線状または環状構造を有し得る。以下にさらに論じられるように、抗微生物ペプチドは、両親媒性の．α．−らせん構造を有し得る（米国特許第５，７８９，５４２号；Ｊａｖａｄｐｏｕｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３１０７〜３１１３（１９９６）；およびＢｌｏｎｄｅｌｌｅおよびＨｏｕｇｈｔｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１２６８８〜１２６９４（１９９２）を参照のこと）。抗微生物ペプチドはまた、例えば、Ｍａｎｃｈｅｎｏら、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．５１：１４２〜１４８（１９９８）に記載されるようなβ−ストランド／シート形成ペプチドであり得る。
【０１０５】
抗微生物ペプチドはまた、天然に存在するか、または合成ペプチドであり得る。天然に存在する抗微生物ペプチドは、細菌、昆虫、両生類、および哺乳動物のような生物学的供給源から単離されており、そして細菌感染から宿主生物を保護し得る誘導性防御タンパク質を代表すると考えられる。天然に存在する抗微生物ペプチドは、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシンおよびセクロピンを含む（例えば、ＭａｌｏｙおよびＫａｒｉ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３７：１０５〜１２２（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｒａｖｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０２：５３５〜５３８（１９９４）；Ｂｅｓｓａｌｌｅら、ＦＥＢＳ  ２７４：１５１〜１５５（１９９０）；およびＢｒｉｓｔｏｌ（編）におけるＢｌｏｎｄｅｌｌｅおよびＨｏｕｇｈｔｅｎ、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５９〜１６８頁  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏを参照のこと）。抗微生物ペプチドはまた、天然ペプチドのアナログ、特に両親媒性を保持または増大するアナログであり得る（下記参照）。
【０１０６】
本明細書中に開示される結合体中に取り込まれた抗微生物ペプチドは、この結合体に連結されるとき、低い哺乳動物細胞障害性を有し得る。哺乳動物細胞障害性は、慣用のアッセイを用いて容易に評価され得る。例として、哺乳動物細胞障害性は、Ｊａｖａｄｐｏｕｒら、前述、１９９６に記載のようにインビトロでヒト赤血球の溶解によりアッセイされ得る。低い哺乳動物細胞障害性を有する抗微生物ペプチドは、ヒト赤血球に対して溶解性でないか、または溶解活性のために１００μＭより大きい濃度、好ましくは２００、３００、５００または１０００μＭより大きい濃度を必要とする。
【０１０７】
１つの実施形態では、開示されるのは、抗微生物ペプチド部分が、真核生物細胞によって内在化されるとき、ミトコンドリア膜の破壊を促進する結合体である。特に、このような抗微生物ペプチドは、真核生物膜と比較したとき、ミトコンドリア膜を優先的に破壊する。ミトコンドリア膜は、細菌膜のように、しかし、真核生物原形質膜とは対照的に、高い含量の負に荷電したリン脂質を有する。抗微生物ペプチドは、例えば、ミトコンドリア膨潤のためのアッセイまたは当該技術分野で周知の別のアッセイを用いてミトコンドリア膜を破壊することにおける活性についてアッセイされ得る。
【０１０８】
例えば、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ以下で顕著なミトコンドリア膨潤を誘導する抗微生物ペプチドは、ミトコンドリア膜の破壊を促進するペプチドであるとみなす。
【０１０９】
抗微生物ペプチドは、一般に、希釈水性溶液中でランダムコイルコンフォーメーションを有し、なお高いレベルのらせん度が、ミセル、合成の二重層または細胞膜のようならせん−促進溶媒および両親媒性媒体によって誘導され得る。α−らせん構造は当該技術分野で周知であり、理想的なα−らせんは、ターンあたり３．６残基を有すること、および残基あたり１．５Åの並進（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）によって特徴付けられる（ターンあたり５．４Å；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｗ．Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）を参照のこと）。両親媒性α−らせん構造では、極性および非極性アミノ酸残基が、両親媒性らせんに整列され、これは、ペチドがらせん軸に沿って観察されるとき、疎水性アミノ酸残基が１つの面に優勢に存在し、親水性残基が対向する面に優勢に存在するα−らせんである。
【０１１０】
広範に変動する配列の抗微生物ペプチドが単離されており、共通特徴として両親媒性α−らせん構造を共有している（Ｓａｂｅｒｗａｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１９７：１０９〜１３１（１９９４））。両親媒性およびらせん度を増大することが予測されるアミノ酸置換をもつ天然ペプチドのアナログは、代表的には、増加した抗微生物活性を有する。一般に、増加した抗微生物活性をもつアナログはまた、哺乳動物細胞に対して増加した細胞障害性を有する（Ｍａｌｏｙら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３７：１０５〜１２２（１９９５））。
【０１１１】
抗微生物ペプチドを参照して本明細書中で用いられるとき、用語「両親媒性α−らせん構造」は、生理学的ｐＨでいくつかの極性残基を含む親水性面、および非極性残基を含む疎水性面をもつα−らせんを意味する。極性残基は、例えば、リジンまたはアルギニン残基であり、その一方、非極性残基は、例えば、ロイシンまたはアラニン残基であり得る。両親媒性．α．−らせん構造を有する抗微生物ペプチドは、一般に、両親媒性ドメイン内に等価な数の極性残基および非極性残基、および中性ｐＨで全体の正の荷電をこのペプチドに与えるに十分な数の塩基性残基を有する（Ｓａｂｅｒｗａｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１９７：１０９〜１３１（１９９４））。当業者は、ロイシンおよびアラニンのようならせん−促進アミノ酸が、抗微生物ペプチド中で有利に含まれ得ることを理解する（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、前述、前述、１９８４を参照のこと）。両親媒性α−らせん構造を有する合成の抗微生物ペプチドが、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎおよびＢｅｃｋｅｒによる米国特許第５，７８９，５４２号中に記載されるように、当該技術分野で公知である。
【０１１２】
医薬腫瘍学の当業者によって、これらおよびその他の薬剤が有用な治療剤であり、これらは開示される組成物および方法で別個または一緒に用いられ得ることが理解される。それ故、本明細書中に開示される結合体が、このような治療剤の１つ以上を含み得、しかも所望であれば、さらなる成分が組成物の一部分として含められ得ることが理解される。非制限的な例として、いくつかの事例では、クロット結合化合物と治療剤との間でオリゴペプチドスペーサーを利用することが所望され得る（ＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋおよびＧａｒｎｅｔｔ、Ａｎｔｉｃａｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１０：１〜９（１９９５））。
【０１１３】
その他の有用な薬剤は、血栓崩壊剤、アスピリン、抗凝固剤、鎮痛剤およびトランキライザー、β−ブロッカー、ａｃｅ−インヒビター、硝酸塩、律動−安定化薬物、および利尿薬を含む。心臓麻痺の２〜３時間内で与えられる場合、心臓への損傷を制限する薬剤が最良に作用する。血餅を破壊し、そして酸素が豊富な血液がブロックされた動脈を通って流れることを可能にする血栓崩壊剤は、心臓発作後、可能な限り速く与えられるとき、患者の生存の機会を増加する。心臓発作の２〜３時間内で与えられる血栓崩壊剤は、最も有効である。静脈内に注入されて、これらは、アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼアクティベーター複合体（ＡＰＳＡＣ）またはアニストレプラーゼ、組み換え組織型プラスミノーゲンアクティベーター（ｒ−ｔＰＡ）、およびストレプトキナーゼを含む。開示される化合物は、これらの任意または類似の薬剤を使用し得る。
【０１１４】
（２．検出可能な作用物質）
本開示される結合体中の成分はまた、検出可能な作用物質であり得る。種々の検出可能な作用物質が本開示される方法で有用である。本明細書で用いられるとき、用語「検出可能な作用物質」は、検出され得る任意の分子をいう。有用な検出可能な作用物質は、インビボで投与され、そして引き続き検出され得る化合物および分子を含む。開示される組成物および方法で有用な検出可能な作用物質はなお、制限されないで放射線標識および蛍光分子を含む。この検出可能な作用物質は、例えば、直接または間接的いずれかで、好ましくは非侵襲的および／またはインビボ可視化技法によって検出を容易にする任意の分子であり得る。例えば、検出可能な作用物質は、例えば、放射線学的技法、磁気共鳴技法、または超音波技法を含む任意の公知の造影技法によって検出可能であり得る。検出可能な作用物質は、例えば造影剤を含み得、そこで例えばその造影剤がイオン性または非イオン性である。いくつかの実施形態では、例えば、この検出可能な作用物質は、タンタル化合物および／またはバリウム化合物、例えば、硫酸バリウムを含む。いくつかの実施形態では、この検出可能な作用物質は、放射活性ヨウ素のようなヨウ素を含む。いくつかの実施形態では、例えば、検出可能な作用物質は、ヨードカルボン酸、トリヨードフェノール、ヨードホルムおよび／またはテトラヨードエチレンのような有機ヨード酸を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な作用物質は、非放射活性検出可能な作用物質、例えば、非放射活性アイソトープを含む。例えば、Ｇｄが、特定の実施形態で非放射活性検出可能な作用物質として用いられ得る。
【０１１５】
検出可能な作用物質のその他の例は、検出可能な照射を発するか、または発することを起こし得る分子（例えば、蛍光励起、放射活性崩壊、スピン共鳴励起など）、局所電磁場に影響する分子（例えば、磁性、強磁性、強磁性、常磁性、および／または超常磁性種）、放射エネルギーを吸収または散乱する分子（例えば、発色団および／または蛍光発色団）、量子ドット、重元素および／またはその化合物を含む。例えば、米国特許出願公開番号２００４／０００９１２２号に記載される検出可能な作用物質を参照のこと。検出可能な作用物質のその他の例は、プロトン放射分子、放射線不透過性分子、および／またはＴｃ−９９ｍおよび／またはＸｅ−１３のような放射性核種などの放射活性分子を含む。このような分子は、放射性医薬品として用いられ得る。なおその他の実施形態では、開示される組成物は、本明細書中に開示される検出可能な作用物質の任意の組み合わせを含む１つ以上の異なるタイプの検出可能な作用物質を含み得る。
【０１１６】
有用な蛍光成分は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロライド、ローダミン、アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリスリン、ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｙｅＴＭのようなランタニドイオンのマクロサイクリックキレート、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロダイマーのような蛍光エネルギー転移色素、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７を含む。その他の特定の蛍光標識の例は、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、Ａｃｉｄ  Ｆｕｃｈｓｉｎ、Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘｏｎ、Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ、アロフェニコシアニン（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、アミノコウマリン（Ａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ）、アンスロイルステアレート（Ａｎｔｈｒｏｙｌ  Ｓｔｅａｒａｔｅ）、Ａｓｔｒａｚｏｎ、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ４Ｇ、Ａｓｔｒａｚｏｎ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｒ、Ａｓｔｒａｚｏｎ  Ｒｅｄ  ６Ｂ、Ａｓｔｒａｓｏｎ  Ｙｅｌｌｏｗ  ７  ＧＬＬ、Ａｔａｂｒｉｎｅ、Ａｕｒａｍｉｎｅ、Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  Ｇ、ＢＡＯ  ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ  Ｓｕｌｐｈａｔｅ、ビスベンズアミド（Ｂｉｓｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ  ＦＦＧ溶液、Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ  ＳＶ、Ｂｏｄｉｐｙ  Ｆ１、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｓｕｌｐｈｏｆｌａｖｉｎ  ＦＦ、Ｃａｌｃｉｅｎ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  ＲＷ溶液、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ、Ｃａｌｃｏｐｈｏｒ  Ｗｈｉｔｅ  ＡＢＴ溶液、Ｃａｌｃｏｐｈｏｒ  Ｗｈｉｔｅ標準溶液、Ｃａｒｂｏｓｔｙｒｙｌ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ、Ｃｈｉｎａｃｒｉｎｅ、Ｃｏｒｉｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  Ｏ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ、ＣＹ３．１８、ＣＹ５．１８、ＣＹ７、Ｄａｎｓ（１−ジメチルアミノナフタリン５  スルホン酸）、Ｄａｎｓａ（ジアミノナフチルスルホン酸）、Ｄａｎｓｙｌ  ＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、ジピロメタンボロンジフルオリド（Ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅｂｏｒｏｎ  Ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）、Ｄｉｐｈｅｎｙｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎ  ７ＧＦＦ、ドーパミン（Ｄｏｐａｍｉｎｅ）、エリスロシン（Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ）  ＩＴＣ、Ｅｕｃｈｒｙｓｉｎ、ＦＩＦ（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、Ｆｌａｚｏ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｆｌｕｏ  ３、Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ、Ｆｕｒａ−２、Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  Ｂ、Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  １０ＧＦ、Ｇｅ��ａｃｒｙｌ  Ｐｉｎｋ  ３Ｇ、Ｇｅｎａｃｙｒｌ  Ｙｅｌｌｏｗ  ５ＧＦ、Ｇｌｏｘａｌｉｃ  Ａｃｉｄ、Ｇｒａｎｕｌａｒ  Ｂｌｕｅ、Ｈａｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ、Ｉｎｄｏ−１、Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ  Ｃｆ  Ｌｉｑｕｉｄ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＰＡＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＳＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＷＳ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ２００（ＲＤ２００）、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＣＨ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＶＳ、Ｍａｇｄａｌａ  Ｒｅｄ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｍａｘｉｌｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎ  １０  ＧＦＦ、Ｍａｘｉｌｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎ  ８  ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン（Ｍｅｔｈｙｌ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｙｒｏｎｉｎｅ  Ｓｔｉｌｂｅｎｅ））、Ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ、ＮＢＤ  Ａｍｉｎｅ、ニトロベンゾオキサジドール（Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｘａｄｉｄｏｌｅ）、ノルアドレナリン（Ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅ）、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｎｙｌｏｓａｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎ  Ｅ８Ｇ、Ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｒａｒｏｓａｎｉｌｉｎｅ（Ｆｅｕｌｇｅｎ）、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＡＲ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＢＫＬ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  Ｒｅｖ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＲＰＡ、Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  ３Ｒ、Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｒ、Ｐｏｌｙａｚａｉｎｄａｃｅｎｅ  Ｐｏｎｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｂｌｕｅ  Ｂｌａｃｋ、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ、Ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ、Ｐｒｏｃｉｏｎ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｐｙｒｏｎｉｎｅ、Ｐｙｒｏｎｉｎｅ  Ｂ、Ｐｙｒｏｚａｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎ  ７ＧＦ、Ｑｕｉｎａｃｒｉｎｅ  Ｍｕｓｔａｒｄ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ５  ＧＬＤ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ６Ｇ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ２００、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  Ｅｘｔｒａ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＢＢ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＢＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＷＴ、Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ２Ｂ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ４Ｇ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  Ｂ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｌ、ＳＩＴＳ（Ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ）、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸（Ｓｔｉｌｂｅｎｅ  Ｉｓｏｔｈｉｏｓｕｌｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））、スチルベン（Ｓｔｉｌｂｅｎｅ）、Ｓｎａｒｆ１、ｓｕｌｐｈｏ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  Ｃａｎ  Ｃ、Ｓｕｌｐｈｏ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇ  Ｅｘｔｒａ、テトラサイクリン（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、Ｔｈｉａｚｉｎｅ  Ｒｅｄ  Ｒ、Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  Ｓ、Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  ＴＣＮ、Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  ５、Ｔｈｉｏｌｙｔｅ、Ｔｈｉｏｚｏｌ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｔｉｎｏｐｏｌ  ＣＢＳ、Ｔｒｕｅ  Ｂｌｕｅ、Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ、Ｕｒａｎｉｎｅ  Ｂ、Ｕｖｉｔｅｘ  ＳＦＣ、キシレン（Ｘｙｌｅｎｅ）  Ｏｒａｎｇｅ、およびＸＲＩＴＣを含む。
【０１１７】
特に有用な蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７を含む。これら蛍光物について吸収および放射最大は：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ；６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、それ故、それらの同時検出を可能にする。蛍光色素のその他の例は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ），２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）２’，４’，５’，７’，１，４，−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ），２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−縮合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ），および２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を含む。蛍光標識は、種々の商業的供給源から得られ得、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ；およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏを含む。蛍光プローブおよびそれらの使用はまた、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．ＨａｕｇｌａｎｄによるＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓに記載されている。
【０１１８】
放射活性検出可能な作用物質のさらなる例は、γエミッタ、例えば、γエミッタＩｎ−１１１、Ｉ−１２５およびＩ−１３１、レニウム−１８６および１８８、ならびにＢｒ−７７を含む（例えば、Ｔｈａｋｕｒ、Ｍ．Ｌ．ら、Ｔｈｒｏｍ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．９、３４５頁（１９７６）；Ｐｏｗｅｒｓら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３２、９３８頁（１９８２）；および米国特許第５，０１１，６８６号を参照）；Ｃｕ−６４、Ｃ−１１、およびＯ−１５、ならびにＣｏ−５７、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１３ｍ、Ｈｇ−１９７、Ａｕ−１９８、およびＰｂ−２０３のようなポジトロンエミッタを含む。その他の放射活性検出可能な作用物質は、例えば、トリチウム、Ｃ−１４および／またはタリウム、ならびにＲｈ−１０５、Ｉ−１２３、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｒ−１７１および／またはＴｌ−２０１を含み得る。
【０１１９】
テクネチウム−９９ｍ（Ｔｃ−９９ｍ）の使用が好ましく、そしてその他の出願に記載されており、例えば、米国特許第４，４１８，０５２号および米国特許第５，０２４，８２９号を参照のこと。Ｔｃ−９９ｍは、γエミッタであり、１４０ｋｅＶの単一光子エネルギーおよび約６時間の半減期を有し、そしてＭｏ−９９／Ｔｃ−９９発生器から容易に得られ得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、放射活性検出可能な作用物質を含む組成物は、標的化成分を、検出に適切な放射性同位体と結合することにより調製され得る。結合は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ−，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）および／またはメタロチオネインのようなキレート剤を経由して起こり得、これらのいずれかは、標的化成分に共有結合され得る。いくつかの実施形態では、テクネチウム−９９ｍ、還元剤、および水溶性リガンドの水性混合物が調製され得、そしてそれから開示される標的化成分と反応される。このような方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、国際公開第ＷＯ９９／６４４４６号を参照のこと。いくつかの実施形態では、放射活性ヨウ素を含む組成物は、交換反応を用いて調製され得る。例えば、冷ヨウ素を熱ヨウ素で交換することは当該技術分野で周知である。あるいは、放射性−ヨウ素で標識された化合物が、トリブチルスタンニル（ｔｒｉｂｕｔｙｌｓｔａｎｎｙｌ）中間体を経由して対応する臭素化合物から調製され得る。
【０１２１】
磁性検出可能な作用物質は、常磁性造影剤、例えば、ガドリニウムジエチレントリアミンペンタ酢酸を含み、例えば、磁気共鳴造影（ＭＲＩ）とともに用いられる（例えば、Ｄｅ  Ｒｏｏｓ、Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｒｄ．Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｖｏｌ．７、１３３頁（１９９１）を参照のこと）。いくつかの好ましい実施形態は、検出可能な作用物質として、原子番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、４２、４４、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０をもつ元素の二価または三価イオンである常磁性原子を用いる。適切なイオンは、制限されないで、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジム（ＩＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）およびイッテルビウム（ＩＩＩ）、ならびにガドリニウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ディソプロシウム（ｄｙｓｏｐｒｏｓｉｕｍ）（ＩＩＩ）、ハロミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）を含む。いくつかの好ましい実施形態は、強力な磁性モーメントをもつ原子、例えば、ガドリニウム（ＩＩＩ）を用いる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、磁性検出可能な作用物質をふくむ組成物は、標的化成分を常磁性原子と結合する（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）ことによって調製され得る。例えば、適切な常磁性原子の、硝酸塩、塩化物または硫酸塩のような金属酸化物または金属塩が、メチル、エチル、および／またはイソプロピルアルコールのような、水／アルコール媒体中に溶解または懸濁され得る。この混合物は、類似の水／アルコール媒体中の等モル量の標的化成分の溶液に添加され、そして撹拌され得る。この混合物は、反応が終了またはほぼ終了するまで適度に加熱され得る。形成された不溶性組成物は濾過することにより得られ得、その一方、可溶性組成物は、溶媒を蒸発することにより得られ得る。キレート成分上の酸基が、開示される組成物中に残る場合、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウムおよび／またはリチウムの水酸化物、炭酸塩および／または重炭酸塩）、有機塩基、および／または塩基性アミノ酸が、酸性基を中和するために用いられ得、例えば、組成物の単離または精製を容易にする。
【０１２３】
好ましい実施形態では、検出可能な作用物質は、結合体に、クロット結合化合物が凝固部位と相互作用する能力を妨害しないような様式で結合し得る。いくつかの実施形態では、検出可能な作用物質は、クロット化合物に化学的に結合し得る。いくつかの実施形態では、検出可能な作用物質は、クロット結合化合物にそれ自体化学的に結合される成分に化学的に結合され得、造影および標的化成分を間接的に連結する。
【０１２４】
（Ｄ．薬学的組成物および担体）
開示される組成物は、単独または薬学的に受容可能な担体中いずれかで、インビトロ投与され得る。「薬学的に受容可能な」により、生物学的またはその他で所望されないのではない材料、すなわち、この材料は、任意の所望されない生物学的作用を引き起こすことなく、またはそれが含まれる薬学的組成物のその他の成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、本明細書中に開示される結合体とともに被験体に投与され得る。担体は、当業者に周知であるように、もちろん、活性成分の任意の分解を最小にし、そして被験体における任意の有害な副作用を最小にするように選択される。これら材料は、溶液中、懸濁物（例えば、ミクロ粒子、リポソーム、または細胞中に取り込まれる）であり得る。
【０１２５】
（１．薬学的に受容可能な担体）
本明細書中に開示される結合体は、薬学的に受容可能な担体と組み合わせて治療的に用いられ得る。
【０１２６】
適切な担体およびそれらの処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ  １９９５に記載されている。代表的には、適切な量の薬学的に受容可能な塩が処方物中で用いられ、この処方物を等張にする。薬学的に受容可能な担体の例は、制限されずに、生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液およびデキストロース溶液を含む。この溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８、そしてより好ましは約７〜約７．５である。さらに、担体は、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスのような徐放性調製物を含み、このマトリックスは、形状のある物品の形態、例えば、フィルム、リポソームまたはミクロ粒子である。当業者にとって、特定の担体が、例えば、投与の経路および投与される組成物の濃度に依存してより好ましいことは明りょうである。
【０１２７】
薬学的担体は、当業者に公知である。これらは、最も代表的には、ヒトへの薬物の投与のための標準的な担体であり得、滅菌水、生理食塩水、および生理学的ｐＨにある緩衝化溶液のような溶液を含む。これら組成物は、筋肉内または皮下に投与され得る。その他の化合物は、当業者によって用いられる標準的な手順に従って投与される。
【０１２８】
薬学的組成物は、選択の分子に加え、担体、濃化剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、表面活性剤などを含み得る。薬学的組成物はまた、抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔薬などのような１つ以上の活性成分を含み得る。
【０１２９】
薬学的組成物は、局所または全身処置が所望されるか否か、そして処置される領域に依存して多くの様式で投与され得る。投与は、局所的（眼科学的、膣、直腸、鼻腔内を含む）、口腔、吸入により、または非経口的、例えば、静脈内ドリップ、皮下、腹腔内または筋肉内注入であり得る。開示される抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、また経皮的に投与され得る。
【０１３０】
非経口的投与のための調製物は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁物、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびエチルオレエートのような注入可能な有機エステルである。水性担体は、水、アルコール性／水性溶液、生理食塩水および緩衝化媒体を含むエマルジョンまたは懸濁物を含む。非経口的ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、Ｒｉｎｇｅｒのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化Ｒｉｎｇｅｒ、または不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補給剤、電解質補給剤（Ｒｉｎｇｅｒのデキストロースに基づくもののような）などを含む。保存剤、および、例えば、抗微生物剤、抗−酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような、その他の添加剤がまた、存在し得る。
【０１３１】
局所投与のための処方物は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、液体および粉末を含み得る。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性ベース、濃化剤などが必要または所望され得る。
【０１３２】
口腔投与のための組成物は、粉末または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁物または溶液、カプセル、サシュ（ｓａｃｈｅｔ）、または錠剤を含む。濃化剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散補助物またはバインダーが所望され得る。
【０１３３】
組成物のいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸のような無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸のような有機酸との反応により、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、およびモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンのような有機塩基との反応により形成される、薬学的に受容可能な酸付加塩または塩基付加塩として投与され得る。
【０１３４】
（Ｅ．コンピューター支援薬物設計）
開示される組成物は、開示される組成物と所望の様式で相互作用する、開示される組成物の構造を識別するためか、または小分子のような可能なまたは実際の分子を識別するためかのいずれかのため、任意の分子モデリング技法の標的として用いられ得る。
【０１３５】
モデリング技法において開示される組成物を用いるとき、阻害または刺激または標的分子の機能のような所望の特定の性質を有する、高分子の分子のような分子が同定されることが理解される。開示される結合体、ペプチドなどを用いるとき、同定および単離される分子がまた開示される。それ故、開示される結合体を含む分子モデリングアプローチを用いて生成された産物がまた、本明細書中に開示されるとみなされる。
【０１３６】
それ故、選択の分子を結合する分子を単離するための１つの方法は、合理的な設計による。これは、構造情報およびコンピューターモデリングにより達成され得る。コンピューターモデリング技術は、選択された分子の三次元原子構造の可視化、および上記分子と相互作用する新規化合物の合理的設計を可能にする。三次元構築物は、代表的には、選択された分子のＸ線結晶学分析またはＮＭＲ造影からのデータに依存する。分子動力学は、力場データを必要とする。コンピューターグラフィックシステムは、新規化合物が標的分子にどのように結合する（ｌｉｎｋ）かの予測を可能にし、そして結合特異性を完全にするために上記化合物および標的分子の構造の実験的操作を可能にする。１つまたは両方に小さな変化が作製されるとき分子−化合物相互作用が何であるかの予測は、分子力学ソフトウェアおよびコンピューター的に集約的なコンピューターを必要とし、通常、分子設計プログラムとユーザーとの間のユーザーフレンドリーなメニューで駆動されるインターフェースと結合される。
【０１３７】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡである。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子動力学機能を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび分析を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、双方向性構築、改変、可視化、および分子の互いの挙動の分析を可能にする。
【０１３８】
多くの論文が、特定タンパク質と相互に影響する薬物のコンピューターモデリングを総説し、例えば、Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｆｅｎｎｉｃａ  ９７、１５９〜１６６；Ｒｉｐｋａ、Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ５４〜５７（１９８８年６月１６日）；ＭｃＫｉｎａｌｙおよびＲｏｓｓｍａｎｎ、１９８９  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９、１１１〜１２２；ＰｅｒｒｙおよびＤａｖｉｓ、ＱＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １８９〜１９３頁（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．１９８９）；ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ、１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６、１２５〜１４０および１４１〜１６２；そして核酸成分についてモデル酵素に関して、Ａｓｋｅｗら、１９８９  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１、１０８２〜１０９０がある。化学薬品をスクリーニングし、そしてグラフィクにより描写するその他のコンピュータープログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ、Ｉｎｃ．、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ．、Ａｌｌｅｌｉｘ、Ｉｎｃ．Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｏｎｔａｒｉｏのような会社から入手可能である。これらは、主に特定タンパク質に特異的な薬物への適用のために設計されたが、それらは、一旦ＤＮＡまたはＲＮＡの特定領域が同定されると、ＤＮＡまたはＲＮＡの特定領域と特異的に相互作用する分子の設計に応用され得る。
【０１３９】
結合を変え得る化合物の設計および生成を参照して上記に記載されたが、基質結合または酵素活性を変える化合物のために、天然産物または合成化学薬品、およびタンパク質を含む生物学的活性を含む既知化合物のライブラリーをまたスクリーニングし得る。
【０１４０】
（Ｆ．類似の機能をもつ組成物）
本明細書中に開示される組成物は、クロットに結合すること、またはクロット形成を増大することのような特定の機能を有することが理解される。本明細書に開示されるのは、開示される機能を実施するための特定の構造的要求であり、そして開示される構造に関連するのと同じ機能を実施し得る種々の構造が存在し、しかもこれらの構造は、最終的には、同じ結果、例えば、刺激または阻害を達成することが理解される。
【０１４１】
（Ｇ．キット）
本明細書中に開示されるのはキットであり、このものは、本明細書中に開示される方法を実施することで用いられ得る試薬を引き込む。これらキットは、本明細書中で論じるか、または開示される方法の実施に必要もしくは有利な任意の試薬または試薬の組み合わせを含み得る。例えば、これらキットは、本明細書中に開示される結合体を含み得る。
【０１４２】
（Ｈ．混合物）
上記方法が、混合すること、または組成物もしくは成分もしくは試薬を接触することを含むときはいつも、上記方法を実施することは、多くの異なる混合物を生成する。例えば、上記方法が、３つの混合ステップを含む場合、これらステップの各々の１つの後、これらステップが別個に実施される場合、特有の混合物が形成される。さらに、どのようにこれらステップが実施されたかにかかわらず、すべてのステップの終了のとき混合物が形成される。本開示は、開示される方法の実施により得られるこれらの混合物、ならびに、例えば、本明細書中に開示される任意の開示される試薬、組成物、または成分を含む混合物を企図する。
【０１４３】
（Ｉ．システム）
開示されるのは、開示される方法の実施するため、またはその実施を支援するために有用なシステムである。システムは、一般に、構造物、機械、デバイスなどのような製造の物品の組み合わせ、ならびに組成物、化合物、材料などを含む。開示されるか、または本開示から明らかであるこのような組み合わせが企図される。
【０１４４】
（Ｊ．コンピューター読み取り可能な媒体）
開示される核酸およびタンパク質は、アミノ酸のヌクレオチドからなる配列として表され得ることが理解される。これら配列を表示する種々の様式があり、例えば、ヌクレオチドグアノシンは、Ｇまたはｇによって表され得る。同様に、アミノ酸バリンは、ＶａｌまたはＶによって表され得る。当業者は、存在する種々の様式のいずれかで任意の核酸またはタンパク質配列を示し、そして表す方法を理解し、その各々は、開示される本明細書中で考慮されている。本明細書中で詳細に企図されるのは、市販され、入手可能なフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスク、およびビテオディスク、またはその他のコンピューター読み取り可能な媒体のような、コンピューター読み取り可能な媒体上のこれら配列の表示である。また開示されるのは、開示される配列のバイナリーコード表示である。当業者は、コンピューター読み取り可能な媒体が何であるかを理解する。それ故、コンピューター読み取り可能な媒体上に、核酸またはタンパク質配列が記録され、保存されるか、または貯蔵される。
【０１４５】
（Ｋ．ペプチド合成）
本明細書中に開示される組成物および開示される方法を実施するために必要な組成物は、そうでないことが特定して注記されなければ、その特定の試薬または化合物についての当業者に公知の任意の方法を用いて作製され得る。
【０１４６】
配列番号１のような、開示されるタンパク質を生成する１つの方法は、タンパク質化学技法により、２つ以上のペプチドまたはポリペフチドを一緒に連結することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学のいずれかを用いる現在利用可能な実験室設備（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて化学的に合成され得る。当業者は、開示されるタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドが、例えば、標準的な化学反応によって合成され得ることを容易に認識し得る。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは合成され得、そしてその合成樹脂から切断されず、その一方、ペプチドまたはタンパク質のその他のフラグメントは合成され得、そして引き続きその樹脂から切断され、それによってその他のフラグメント上で機能的にブロックされている末端基を露出する。ペプチド縮合反応により、これら２つのフラグメントは、それらのカルボキシ末端およびアミノ末端でそれぞれペプチド結合を経由して共有結合され得、抗体、またはそのフラグメントを形成する。（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏ．、Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ＭおよびＴｒｏｓｔ  Ｂ．編（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．、ＮＹ（これは、少なくともペプチド合成に関連する材料について参考として本明細書中に援用される）。あるいは、上記ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書中に記載のようにインビボで独立に合成される。一旦、単離されると、これらの独立のペプチドまたはポリペプチドは連結され得、類似のペプチド縮合反応を経由してペプチドまたはそのフラグメントを形成する。
【０１４７】
例えば、クローン化または合成ペプチドセグメントの酵素的連結は、比較的短いペプチドフラグメントが接続されて、より大きなペプチドフラグメント、ポリペプチドまたは全体のタンパク質ドメインを生成することを可能にする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドの自然の化学的連結が、より短いペプチドフラグメントから大きなペプチドまたはポリペプチドを合成により構築するために利用され得る。この方法は、２ステップの化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６：７７６〜７７９（１９９４））。第１のステップは、非保護合成ペプチド−−チオエステルの、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の非保護ペプチドセグメントとの化学選択的反応であり、初期共有結合産物としてチオエステル−連結中間体を得る。反応条件における変更なくして、この中間体は、自然の迅速な分子内反応を行い、連結部位で自然なペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７〜１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３〜３０（１９９４））。
【０１４８】
あるいは、非保護ペプチドセグメントは、化学的に連結され、ここで、化学的連結の結果としてのペプチドセグメント間に形成される結合が非天然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ、Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：２２１（１９９２））。この技法は、タンパク質ドメインのアナログおよび完全な生物学的活性をもつ大量の比較的純粋なタンパク質を合成するために用いられている（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２５７〜２６７頁（１９９２））。
【０１４９】
（方法）
本明細書中に開示されるのは、被験体に本明細書中に開示される結合体を投与する工程を包含する方法である。この結合体は、凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし得る。この結合体は、凝固を引き起こし、そして凝固した血漿タンパク質の部位でこの結合体の蓄積を増幅し得る。本発明のいくつかの形態は、被験体に、本明細書中に開示される結合体を投与する工程を包含し、ここで、この結合体は凝固した血漿タンパク質に選択的にホーミングし、ここで、この結合体は凝固を引き起こし、そして凝固した血漿タンパク質の部位でこの結合体の蓄積を増幅する。この結合体は、腫瘍脈管構造、創傷部位、または両方に選択的にホーミングし得る。
【０１５０】
１つの例では、この結合体は治療効果を有し得る。これは、この結合体のために起こる増加したクロット形成により達成され得る。この効果は、腫瘍または創傷の部位への治療剤の送達により増大され得る。
【０１５１】
この治療効果は、腫瘍負荷の増加またはその減少における遅延であり得る。この腫瘍負荷の増加またはその減少における遅延は、非処置腫瘍、または異なる方法により処置された腫瘍と比較して、その腫瘍負荷の増加、または減少における１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、もしくは１０００％以上の改善であり得る。
【０１５２】
上記治療効果はまた、腫瘍における血液循環の減少または阻止であり得る。この腫瘍における血液循環の減少または阻止は、非処置腫瘍、または異なる方法により処置された腫瘍と比較して、腫瘍中の血液循環の有効な阻止における１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、もしくは１０００％以上の改善であり得る。
【０１５３】
上記治療効果はまた、創傷部位における出血の減少または停止であり得る。この創傷部位における出血の減少または停止は、非処置創傷、または異なる方法により処置された創傷と比較して、創傷部位における出血の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、もしくは１０００％以上の減少または停止であり得る。
【０１５４】
上記治療効果はまた、創傷部位における出血が停止する時間における減少であり得る。この創傷部位における出血の減少または停止は、非処置創傷、または異なる方法により処置された創傷と比較して、創傷部位で出血が停止する時間における１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、もしくは１０００％以上の減少または停止であり得る。
【０１５５】
上記治療効果はまた、炎症における減少、創傷治癒の速度における増加、瘢痕組織の量における減少、痛みにおける減少、腫れにおける減少、壊死における減少、またはそれらの組み合わせを含み得る。この効果は、非処置被験体、または異なる方法で処置された被験体と比較して、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、もしくは１０００％以上の改善であり得る。
【０１５６】
さらに、凝固自体が、本明細書中のいずれかに開示されているように、治療効果を有し得る。被験体は、標的にされるべき１つ以上の部位を有し得、ここで、上記結合体は、標的にされるべき部位の１つ以上にホーミングする。例えば、被験体は、複数の腫瘍または損傷の部位を有し得る。
【０１５７】
開示される結合体は、癌のような制御されない細胞増殖が起こる任意の疾患を処置するために用いられ得る。癌の異なるタイプの非制限的なリストは以下のようである：リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、白血病、癌腫、固形組織の癌腫、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、神経膠腫、高度神経膠腫、芽球腫、神経芽腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、低酸素性腫瘍（ｈｙｐｏｘｉｃ  ｔｕｍｏｒ）、骨髄腫、ＡＩＤＳ関連リンパ種または肉腫、転移性癌、または癌一般。
【０１５８】
開示される組成物が処置するために用いられ得る癌の代表的ではあるが非制限的なリストは以下である：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳の癌、神経系癌、頭部および頚部癌、頭部および頚部の扁平上皮癌、腎臓癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌のような肺癌、神経芽細胞腫／グリア芽細胞腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口、咽喉、喉頭および肺の扁平上皮癌、結腸癌、頚部癌、頚部癌腫、乳癌、および上皮癌、腎臓癌、尿生殖器癌、肺癌、食道癌腫、頭部および頚部癌腫、大腸癌、造血癌；精巣癌；結腸および直腸癌、前立腺癌、または膵臓癌。
【０１５９】
開示される結合体はまた、デコイ粒子前処理後投与され得、細網内皮系（ＲＥＳ）組織による結合体の取込みを低減し得る。このようなデコイ粒子前処理は、これら粒子の血液半減期を延長し得、そして腫瘍標的化を増加する。
【実施例】
【０１６０】
（Ａ．実施例）
以下の実施例は、本明細書中請求項に記載される化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法がどのように作製および評価されるのかの完全な開示および記載を当業者に提供するように呈示され、そして純粋に例示であり、そして本開示を制限することは意図されないことが意図される。数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にする努力がなされたが、いくつかの誤りおよび偏差が考慮されるべきである。他であることが示されなければ、部は重量部であり、温度は℃であるかまたは周辺温度であり、そして圧力は大気圧または大気圧近傍である。
【０１６１】
（１．実施例１：腫瘍へのナノ粒子ホーミングの生物模倣増幅）
ナノ粒子を基礎にした診断および治療は有用である。なぜなら、複数の機能がこれら粒子中に構築され得るからである。１つのこのような機能は、身体中の特定部位にホーミングする能力である。本明細書中に記載されるのは、腫瘍にホーミングするのみならず、それら自体のホーミングを増幅する生物模倣粒子である。このシステムは、凝固した血漿タンパク質を認識し、そして腫瘍に選択的にホーミングするペプチドに基づき、ここで、それは、血管壁および腫瘍間質に結合する。この腫瘍ホーミングペプチドで被覆された酸化鉄ナノ粒子およびリポソームは、腫瘍血管に蓄積し、そこで、それらは、さらなる局所的凝固を誘導し、それによって、より多くの粒子のために新たな結合部位を生成する。このシステムは、これもまた自由に循環するが、疾患部位で蓄積し、そしてその部位でそれら自体の蓄積を増幅する血小板を模倣する。凝固を基礎にした増幅は、腫瘍造影を大いに増大し、そしてこれら粒子への薬物担体機能の付加がまた用いられ得る。
【０１６２】
（ｉ．結果）
（ＣＲＥＫＡペプチド）  腫瘍ホーミングペプチドを、目標とされたナノ粒子を構築するために用いた。このペプチドは、腫瘍保持ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴトランスジェニック乳癌マウス（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ２０００）における腫瘍ホーミングについて、ファージディスプレイされたペプチドライブラリー（Ｈｏｆｆｍａｎ  ２００３；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  １９９６）のインビボスクリーニングにより同定された。選択されたファージ調製物中で最も頻繁に表現されたペプチド配列は、ＣＲＥＫＡ（ｃｙｓ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ｌｙｓ−ａｌａ；配列番号１）であった。このＣＲＥＫＡペプチドを、Ｎ−末端に結合された蛍光色素とともに合成し、そしてこのペプチドのインビボ分布を腫瘍保持マウス中で研究した。静脈内に注入されたＣＲＥＫＡペプチドは、ＰｙＭＴ腫瘍、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌異種移植片中で、注入後数分〜数時間で容易に検出可能であった。このペプチドは、腫瘍間質中で明りょうな網（ｍｅｓｈｗｏｒｋ）を形成し（図５）、そしてまた腫瘍中の血管をはっきりさせた。このＣＲＥＫＡペプチドは、正常組織中では本質的に検出不能であった。顕微鏡結果と一致して、蛍光色素Ａｌｅｘａ６４７で標識したＣＲＥＫＡペプチドを用いる身体造影は、乳癌異種移植片中、および膀胱中でのペプチド蓄積を示し、過剰のペプチドの尿中への排泄を反映した（図５Ｂ）。
【０１６３】
腫瘍は、腫瘍間質および血管の壁中に凝固した血漿タンパク質の網を含むが、このような網は正常組織中では検出可能ではない（Ｄｖｏｒａｋ  １９８５；Ａｂｅ  １９９９；Ｐｉｌｃｈ  ２００６）。腫瘍中のＣＲＥＫＡペプチドにより生成されるこの網様パターンは、凝固した血漿タンパク質がこのペプチドの標的である得るかどうかの研究を促進した。このペプチドを、それらの腫瘍におけるフィブリン網を欠く、フィブリノゲンノックアウトマウス中で試験した。先に同定されたクロット結合ペプチド（Ｐｉｌｃｈ  ２００６）のように、静脈内に注入されたＣＲＥＫＡペプチドは、このフィブリノゲンヌル（ｎｕｌｌ）マウス中で成長したＢ１６Ｆ１黒色腫中では蓄積せず、このヌルマウスの正常同腹仔中で成長したＢ１６Ｆ１腫瘍中で明るい蛍光の網を形成した（図１ＡおよびＢ）。この結果と一致して、ＣＲＥＫＡファージは、インビトロで凝固した血漿タンパク質に結合したが、コントロールの挿入のないファージは結合しなかった（図１Ｃ）。これらの結果は、クロット結合ペプチドとしてのＣＲＥＫＡを確立する。その構造は、それを、ナノ粒子標的化で用いるために魅力的なペプチドにする。なぜなら、環状の１０アミノ酸ペプチドであるその他のクロット結合ペプチド（Ｐｉｌｃｈ  ２００６）とは異なり、ＣＲＥＫＡは線状であり、そして５アミノ酸を含むに過ぎないからである。さらに、単一のシステイン残基のスルフヒドリル基は結合活性を提供するために要求されず、そしてこのペプチドをその他の成分に結合するために用いられ得る。
【０１６４】
（ペプチドで被覆されたナノ粒子）  フルオレセイン−標識ＣＲＥＫＡまたはフルオレセインを、５０ｎｍの超常磁性のアミノデキストランで被覆された酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ粒子の表面上に結合した。このような粒子は、それらの化学、薬物動力学、および毒物学に関して広範に特徴付けられており、そしてＭＲＩ造影剤として用いられている（Ｊｕｎｇ  １９９５；Ｊｕｎｇ  １９９５；Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ  １９８９）。フルオレセイン−標識ペプチドのＳＰＩＯへの結合は、強い蛍光の粒子を生成した。これら粒子からのこのペプチドの加水分解による放出は、約３倍だけさらに蛍光を増加した。これらの結果は、粒子表面における蛍光分子の近接が、蛍光のある程度のクエンチングを引き起こすことを示す。これにもかかわらず、結合されたフロオレセインペプチドからの蛍光が、粒子上のペプチド分子の数にほぼ直線状に関係し（図６）、粒子蛍光を測定することにより粒子上のペプチド成分の数の追跡、およびサンプル中の粒子の濃度の尺度として蛍光強度の使用を可能にした。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯは、インビボ実験において粒子あたり少なくとも８，０００のペプチド分子とともに用いた。このＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子は、インビトロでマウスおよびヒト血漿クロットに結合し、そしてこの結合は、遊離のペプチドによって阻害された（図１Ｄ）。ナノ粒子は、クロット中の細繊維網に沿って分布した（図１Ｄ中の挿入）。これらの結果は、粒子結合ペプチドが、凝固した血漿タンパク質に向かうその結合活性を保持することを示す。
【０１６５】
（ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの腫瘍ホーミング  対  肝臓クリアランス）  初期実験は、静脈内に注入されたＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子が、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌異種移植片中で効率的に蓄積しなかったことを示した。対照的に、高濃度の粒子が、細網内皮系（ＲＥＳ）組織中で観察された（図２Ａ、上のパネル）。遊離のＣＲＥＫＡペプチドは、これらの腫瘍に効率的にホーミングするので（図５）、ＲＥＳ摂取がナノ粒子のホーミングの主要な障害であったと仮定した。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯのクリアリンスにおけるＲＥＳの役割は、リポソームクロドロネートで肝臓中のＲＥＳマクロファージを枯渇すること（Ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊｅｎ  １９９４）により確認された。この処置は、粒子半減期における約５倍の延長を引き起こした（図２Ｂ）。粒子状物質は循環からなくされた。なぜなら、特定の血漿タンパク質が粒子に結合し、そしてＲＥＳによるそれらの摂取を仲介するからである（オプソニン作用；Ｍｏｇｈｉｍｉ  ２００１；Ｍｏｏｒｅ  １９９７）。血漿オプソニンをなくするデコイ粒子を注入することは、ＲＥＳ摂取をブロックする別の一般に用いられる方法である（Ｓｏｕｈａｍｉ  １９８１；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｕｒｒｕｓｕｎｏ  １９９６）。キレートされたＮｉ２＋で被覆されたリポソームを可能なデコイ粒子として試験した。なぜなら、酸化鉄およびＮｉ２＋が、類似の血漿オプソニンを誘引し、そしてＮｉ−リポソームが、それ故、それらを全身循環から枯渇し得るからである。実際、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、有意により少ない血漿タンパク質が、Ｎｉ−リポソームで前処理されたマウスの血液中でＳＰＩＯに結合したことを示した。
【０１６６】
静脈内に注入されたＮｉ−リポソームは、血液中のＳＰＩＯおよびＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの半減期を、約５倍延長した（図２Ｂ）。このＮｉ−リポソーム前処理は、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの注入前５分または４８時間いずれでなされても、ナノ粒子の腫瘍ホーミングを大いに増加し、これは主に腫瘍血管中に局在化した（図２Ａの下の腫瘍パネルおよび図２Ｄ）。粒子の局所濃度は非常に高く、酸化鉄の褐色の色が光学顕微鏡で見え（図２Ｃ、右パネル）、腫瘍血管中で観察された蛍光信号が、インタクトなＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯからであったことを示した。Ｎｉ−リポソーム前処理後、より少ない粒子が肝臓で観察されたが、脾臓における蓄積は、変わらないか、またはなお増加した（図２Ａ）。その他の器官は、Ｎｉ−リポソームを用いたか否かにかかわらず、少量のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子を含むか、または粒子はまったく含まなかった（図１Ｄ）。単純リポソームをデコイ粒子として試験した。これらリポソームは、引き続き注入されたＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの血液半減期および腫瘍ホーミングを延長し（図２Ｂ）、リポソームとＳＰＩＯに対する共通クリアランス機構の存在を示した。
【０１６７】
（腫瘍血管におけるナノ粒子−誘導血液凝固）  リポソーム前処理後投与されたＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ粒子は、主に腫瘍血管と同時局在化し、幾分かの粒子は、周囲組織中に溢出したように見えた（図３Ａ、上のパネル）。有意に、２０％までの腫瘍血管管腔が、蛍光の塊で満たされた。これらの構造は、フィブリンに対して染色され（図３Ａ、中央のパネル）、それらは、ナノ粒子で含漬された血餅であることを示した。いくつかの血管では、このＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子は、おそらくはフィブリンから形成され、そしてタンパク質と会合している網に沿って分布し（挿入図）、、そして図１Ｄの挿入図中に示されるパターンに類似していた。
【０１６８】
非ＲＥＳ組織の中で、腎臓および肺は、少量の特異的ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ蛍光を含んでいた（図２Ｄ）。しかし、低倍率画像は、それらの中にクロットをもつ僅かな血管を示し、これら組織中では、腎臓中の非常に希なクロットを除いて凝固はなかったことを示した（図７）。肝臓中のナノ粒子の大量の蓄積にかかわらず、肝臓血管における（図８）フィブリン（フィブリノゲン）染色とＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ蛍光との間の同時局在化は観察されなかった。さらに、非注入マウスからの肝臓組織はまた、フィブリン（フィブリノゲン）について染色され（図８Ｂ）、おそらくは肝細胞によるフィブリノゲン産生を反映していた。それ故、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子により誘導される凝固は、腫瘍血管に本質的に制限される。
【０１６９】
ナノ粒子は、血小板活性化を引き起こし、そしてトロンボゲン形成を増大し得る（Ｒａｄｏｍｓｋｉ  ２００５；Ｋｈａｎｄｏｇａ  ２００４）。血液から回収されたいくらかのＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子（＜１％）は、血小板と会合したが（図９Ａ）、血小板マーカーに対する染色は、腫瘍血管における血小板とＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子との間で同時局在化はなかったことを示した（図３Ａ、下のパネル）。血小板減少症がまた、抗−ＣＤ４１モノクローナル抗体をマウスに注入することにより誘導され（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｙｄｅ  ２００５）、そしてＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍へのＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯホーミングに対する認知し得る効果は見出されなかった（図９Ｂ）。これらの結果は、血小板が、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯのホーミングパターンに関与していないことを示す。
【０１７０】
ナノ粒子によるクロットの深い浸潤は、これらクロットが、注入の前よりはむしろ、粒子が血液中で循環していたときに形成されなければならなかったことを示す。これは、流れマーカーとしてＤｉＩ−標識された赤血球を用い、生体共焦点顕微鏡法で試験した。形成するクロットにおいて、平行するＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの閉じ込めを有する、腫瘍血管における時間依存性のクロット形成および血流の妨害があった（図３Ｂ）。
【０１７１】
凝固−誘導効果がＳＰＩＯ粒子に特異的であったか、異なるＣＲＥＫＡ被覆粒子で誘導され得たか否かを次に試験した。尾部が脂質であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合されたフルオレセイン−ＣＲＥＫＡペプチドが取り込まれたリポソームを用いた。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯのように、このＣＲＥＫＡ−リポソームは、腫瘍に選択的にホーミングし、そして腫瘍血管内でフィブリンと同時局在化し（図３Ｃ）、ＣＲＥＫＡリポソームがまた腫瘍血管中で凝固を引き起こし得ることを示した。コントロールＳＰＩＯまたはコントロールリポソームを腫瘍マウスに注入したとき、凝固は観察されなかった。
【０１７２】
（凝固で増幅される腫瘍標的化）  腫瘍血管中のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ蓄積に対する凝固の寄与を調べた。Ｓｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｅｖｉｃｅ（ＳＱＵＩＤ）での腫瘍磁化の定量的分析（図４Ａ）および蛍光信号の測定は、ＰＢＳ前処理マウスと比較して、Ｎｉ−リポソーム−前処理マウスで約６倍より大きいＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの蓄積を示した。アミノ化（ａｍｉｎａｔｅｄ）ＳＰＩＯコントロール粒子は、腫瘍中に有意に蓄積しなかった（図４Ａ）。
【０１７３】
ＳＱＵＩＤ測定は、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの注入前に、強力な凝固インヒビターであるヘパリンを注入することが、ナノ粒子の腫瘍蓄積を５０％より多く低減したことを示した（図４Ａ）。顕微鏡法は、ヘパリンが腫瘍血管内のフィブリン陽性／ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯ陽性構造を低減したが、これら粒子が、血管の壁に沿って、多分予め存在するフィブリン沈着物になお結合したことを示した（代表的な画像は図４Ｂ中に示される）。ホーミングパターンの別個の定量化は、ヘパリンが血管壁に結合したナノ粒子をもつ血管の数を有意には減少しないが、本質的に血管内凝固をなくしたことを示した（図４Ｃ）。それ故、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯの腫瘍血管への結合は、これら粒子に付随する凝固活性を必要としないが、凝固が腫瘍ホーミングの効率を改善する。
【０１７４】
ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯによって誘導された凝固は、全身走査における腫瘍信号の特に強い増大を引き起こした。近赤外蛍光化合物であるＣｙ７で標識されたＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子は、同様に肝臓からの有意な信号（矢頭）とともに、腫瘍中に効率的に蓄積した（図４Ｄ、左の画像）。ヘパリンで得られた腫瘍信号における減少（図４Ｄ、右の画像）は、蛍光測定において、ＳＱＵＩＤによって決定された５０％値よりも明らかに大きく、おそらくは、クロットからの濃縮された信号が蛍光の光学的検出を増大したためである。これらの結果は、ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯによって誘導された凝固が、腫瘍造影で特定の利点を提供することを示す。
【０１７５】
（ｉｉ）考察
この実施例は、腫瘍中の粒子の有効な蓄積を提供するナノ粒子システムの例を記載する。このシステムは、４つの要素に基づく；第１は、凝固した血漿タンパク質に結合する腫瘍ホーミングペプチドでのナノ粒子の被覆が、これら粒子に腫瘍血管（および腫瘍間質）に対する特異的親和性を与える。第２は、デコイ粒子前処理が、上記粒子の血液半減期を延長し、そして腫瘍標的化を増加する。第３は、これら腫瘍を標的にするナノ粒子か、腫瘍血管における血管内凝固を引き起こす。第４に、この血管内クロットが、より多くのナノ粒子を腫瘍中に誘引し、標的化を増幅する。
【０１７６】
凝固した血漿タンパク質に特異的親和性をもつペプチドは、ナノ粒子のための標的化要素として選択された。腫瘍の間質スペースは、フィブリン、およびフィブロネクチンのような血液凝固においてフィブリンに架橋するようになるタンパク質を含む（Ｄｖｏｒａｋ  １９８５；Ｐｉｌｃｈ  ２００６）。正常組織中ではなく、腫瘍におけるこれら産物の存在は、腫瘍血管の漏れの結果であり得、これは、血漿タンパク質が血液から腫瘍組織中に入ることを可能にし、ここで漏れたフィブリノゲンが、組織プロ凝固因子によりフィブリンに変換される（Ｄｖｏｒａｋ  １９８５；Ａｂｅ  １９９９）。凝固は、合成ペプチドで識別および接近され得る新たな結合部位を生成する（Ｐｉｌｃｈ  ２００６）。現在の結果は、ＣＲＥＫＡで改変されたナノ粒子が血液および血漿クロットに結合するのみならず、局在化された腫瘍凝固を誘導し得ることを示す。粒子の性質はこの活性に制限されない。なぜなら、ＣＲＥＫＡ−被覆された酸化鉄およびミクロンサイズのＣＲＥＫＡ−被覆されたリポソームの両方が腫瘍血管において凝固を引き起こすことが見出されたからである。ＣＲＥＫＡ改変された粒子による１つ以上の凝固産物の結合は、クロット形成の方向における凝固とクロット分解とのバランスをシフトし得、そして粒子の表面におけるこの活性の存在は、接触−依存性凝固を容易にし得る。
【０１７７】
あるナノ粒子は、全身性血栓症を誘因し得るが（Ｇｏｒｂｅｔ  ２００４）、ここでＣＲＥＫＡ粒子によって誘導された血栓症は、腫瘍血管に制限された。腫瘍血管中の高濃度の標的化粒子は、腫瘍血管への血栓症の選択的局在化を説明し得る。しかし、ナノ粒子がまた高濃度で蓄積する肝臓中には検出可能な凝固は観察されなかったので、その他の因子が重要であるに違いない。腫瘍中で共通のプロ凝固環境は、凝固の腫瘍特異性に寄与する主要な因子であり得る（Ｂｏｃｃａｃｃｉｏ  ２００５）。
【０１７８】
ナノ粒子の主要な利点は、複数の機能が単一の実体に取り込まれ得ることである。本明細書に記載されるのは、ナノ粒子についてのインビボ機能；腫瘍血管中でナノ粒子で誘導された凝固によって可能にされる自己増幅する腫瘍ホーミングおよびクロットへのさらなるナノ粒子の結合である。このナノ粒子システムは、１つの粒子にいくつかのその他の機能：特異的腫瘍ホーミング、ＲＥＳの回避、および有効な腫瘍造影を組み合わせる。光学的造影をこの研究で用いたが、ＩＯプラットホームがまた、ＭＲＩ造影を可能にする。腫瘍血管中のＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯナノ粒子によって引き起こされる凝固は、顕微鏡的および全身造影技法による腫瘍検出を明らかに改善する様式でこれら粒子を病巣に濃縮するために供される。
【０１７９】
標的化粒子の別の機能は、それらが局所的塞栓症による腫瘍血管の物理的遮断を引き起こすことである。塞栓症または凝固による血管閉塞は、腫瘍増殖を低減し得る（Ｈｕａｎｇ  １９９７；Ｅｌ−Ｓｈｅｉｋｈ  ２００５）。現在まで、腫瘍血管における２０％の閉塞率が達成された。ナノ粒子設計のモジュール性質に起因して、本明細書中に記載される機能は、さらなる活性をもつ粒子に取り込まれ得る。血管を同時に閉塞しながら腫瘍血管中に蓄積し、そして薬物荷重をゆっくり放出する薬物保持ナノ粒子は、本明細書中に開示される方法および組成物とともに用いられ得る。
【０１８０】
（ｉｉｉ．材料および方法）
（ファージスクリーニング、腫瘍およびペプチド）  ＣＸ７Ｃ（配列番号４）の一般構造、ここでＣはシステインであり、そしてＸは任意のアミノ酸である、をもつペプチドライブラリーのインビボスクリーニングを、６５−〜７５−日齢のトランスジェニックＭＭＴＶ  ＰｙＭＴマウス（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ２０００）を用いて記載のように（Ｏｈ  ２００４）実施した。これらマウスは、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）の転写制御下ポリオーマウイルス中央Ｔ抗原（ＭＴ）を発現し、キャリアの１００％で多病巣性乳腺癌の誘導に至る。ヌードマウス中のＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍およびペプチド合成が記載されている（Ｌａａｋｋｏｎｅｎ  ２００２；Ｌａａｋｋｏｎｅｎ  ２００４）。Ｂ１６Ｆ１マウス黒色腫腫瘍は、フィブリノゲンヌルマウスおよびそれらの正常同腹仔で増殖され（Ｓｕｈ  １９９５）、そしてそれらが０．５〜１ｃｍサイズに到達したとき用いられた（Ｐｉｌｃｈ  ２００６）。
【０１８１】
（ナノ粒子およびリポソーム）  アミノ基−機能化デキストラン被覆超常磁性酸化鉄ナノ粒子（５０ｎｍ  ナノマグ−Ｄ−ＳＰＩＯ；Ｍｉｃｒｏｍｏｄ  Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｓｔｏｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、架橋剤を用いてＣＲＥＫＡペプチドと結合した。最終結合比は、酸化鉄ｍｇ当たり３０ｎｍｏｌのフルオレセイン標識ペプチド分子、または８，０００ペプチド／粒子であった。Ｃｙ７での近赤外標識化のために、約２０％のアミンをＣｙ７−ＮＨＳエステル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で誘導体化し、そして残りのアミンを、これらペプチドを結合体化するために用いた。ＳＰＩＯおよびリポソームの調製に関する詳細は、以下に記載される。クロドロネートはＳｉｇｍａから購入し、そして記載のように（Ｖａｎ  ＲｏｏｉｊｅｎおよびＳａｎｄｅｒ（１９９４））リポソーム中に取り込んだ。
【０１８２】
（ナノ粒子注入）  静脈内注入には、動物を、腹腔内Ａｖｅｒｔｉｎで麻酔し、そしてリポソーム（２μｍｏｌ  ＤＳＰＣ）および／またはナノ粒子（１〜４ｍｇＦｅ／ｋｇ体重）を尾静脈内に注入した。動物を、麻酔下、ＰＢＳを用い心臓灌流により注入後５〜２４時間で犠牲にし、そして器官を離断し、そして粒子ホーミングについて分析した。肝臓マクロファージを抑制するために、マウスにリポソームクロドロネート懸濁物（マウスあたり１００μｌ）を静脈内注入し、そしてマウスを２４時間後の実験のために用いた。
【０１８３】
（クロットへのファージおよびナノ粒子の結合）  凝固した血漿タンパク質へのファージ結合を記載（Ｐｉｌｃｈ  ２００６）のように決定した。ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯおよびコントロールＳＰＩＯを、遊離のＣＲＥＫＡペプチドの存在下または不在下で新鮮に形成された血漿クロットに添加した。１０分のインキュベーションの後、クロットを４回ＰＢＳ中で洗浄し、新たなチューブに移し、そして１００μｌの濃硝酸中で消化した。消化した材料を２ｍｌの蒸留水に希釈し、そして鉄濃度を誘導的に結合した血漿−光学発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を用いて決定した。
【０１８４】
（ナノ粒子調製）  高ペプチド結合密度の達成が必要なとき、さらなるアミノ基を、以下のように、商業的に得られたＳＰＩＯに添加した：最初に、アミノ化ステップの前に粒子を架橋するために、３ｍｌのコロイド（約１０ｍｇＦｅ／２回蒸留水ｍｌ）を、５ｍｌの５Ｍ  ＮａＯＨおよび２ｍｌのエピクロロヒドリン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に添加した。この混合物を室温で２４時間撹拌し、有機相（エピクロロヒドリン）と水相（デキストラン−被覆粒子コロイド）との間の相互作用を促進した。過剰のエピクロロヒドリンを除去するために、反応した混合物を、透析カセット（１０，０００Ｄａカットオフ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）を用い、２回蒸留した水に対して２４時間透析した。アミノ基を以下のように粒子の表面に付加した：０．０２ｍｌの濃水酸化アンモニウム（３０％）を１ｍｌのコロイド（約１０ｍｇＦｅ／ｍｌ）に添加した。この混合物を室温で２４時間撹拌した。反応した混合物を、２回蒸留した水に対して２４時間透析した。粒子をさらにすすぐため、コロイドを、ＭＡＣＳ（登録商標）Ｍｉｄｉ磁性分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ  ＣＡ）上に捕捉し、ＰＢＳで３回すすぎ、そしてこのカラムから１ｍｌのＰＢＳで溶出した。
【０１８５】
ＣＲＥＫＡペプチドをＳＰＩＯに結合するため、上記粒子を１ｍｇ  Ｆｅ／ｍｌの濃度で再懸濁し、そしてヘテロ二官能性リンカーＮ−［ａ−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ；Ｐｉｅｒｃｅ）を、ボルテックスしながら添加した（２．５ｍｇリンカー／２ｍｇＦｅ）。室温で４０分間のインキュベーションの後、粒子をＭＡＣＳカラム上で３回１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。遊離の末端システインをもつペプチドを、次いで添加した（１００μｇペプチド／２ｍｇＦｅ）。４℃で一晩のインキュベーションの後、粒子を再び洗浄し、そして０．３５ｍｇ／ｍｌのＦｅの濃度）でＰＢＳ中に再懸濁した。粒子に結合したペプチド分子の数を定量するために、既知量のストックまたはＡＭＡＳ−活性化粒子を変化する量のペプチドとインキュベートした。インキュベーションの終了後、粒子を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＬＡ  １００．３超遠心分離ローターを用いて１００．０００Ｇでペレット化し（３０分）、そして非結合ペプチドの量を蛍光によって定量化した。粒子から結合ペプチドを切断するために、粒子をｐＨ１０で一晩３７℃でインキュベートした。上清中の遊離ペプチドの濃度は、蛍光を読み取ることにより、そしてサンプルペプチドについて得られた較正曲線を用いることにより決定した。既知量の粒子の蛍光強度を、ペプチド結合密度の関数としてプロットし、そして傾斜等式を、異なるバッチにおける結合体密度を決定するために用いた。
【０１８６】
（リポソーム調製）  リポソームを調製するために、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−｛［Ｎ（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸］サクシニル｝（ニッケル塩）（すべてはＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ  ＡＬから）を、クロロホルム中、５７：３７：１０のモル比で混合し、そして乾燥までロータリーエバポレーター中で蒸発させた。脂質をＰＢＳ中で最終ＤＳＰＣ濃度１０ｍＭまで水和した。この脂質混合物を、５５℃で１０分間徹底的に浴で音波処理し、リポソーム形成を促進した。単純リポソームには、ＤＳＰＣおよびコレステロールのみを、５７：３７のモル比で用いた。
【０１８７】
ＣＲＥＫＡ−装飾リポソームを、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ−マレイミド（Ａｖａｎｔｉ）を２倍モル過剰のＣＲＥＫＡと反応することにより調製した。反応は、室温でＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４中窒素下で実施した。反応が２時間で終了した後、生成物（黄色沈殿物）を遠心分離により洗浄し、そしてエタノール中に溶解した。このエタノール溶液を−２０℃で貯蔵した。ＣＲＥＫＡ−ＰＥＧを、リポソーム懸濁物をＣＲＥＫＡ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの乾燥フィルムに添加すること、１時間ボルテックスしながら５５℃まで加熱することにより取り込んだ。コントロールリポソームは、上記のように、しかし代わりにＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを用いて調製した。リポソーム調製物は、用いられるまで４℃で維持した。
【０１８８】
（ナノ粒子によるタンパク質結合の分析）  可溶性血漿タンパク質のＳＰＩＯナノ粒子への結合を試験するために、粒子をクエン酸添加マウス血漿と１〜２ｍｇ鉄／ｍｌ血漿の濃度でインキュベートした。あるいは、粒子を動物中に注入し、そして血漿を注入後５〜１０分で集めた。粒子を磁性カラム上で洗浄し、非結合タンパク質を除去し、そして粒子を１０％ＳＤＳ中で２０分間煮沸した。酸化鉄を超遠心分離（１００．０００ｇ、１０分）によってペレット化し、そして上清中に溶出したタンパク質を、アセトンで一晩−２０℃で沈殿させた。タンパク質ペレットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そしてゲルを銀染色した（ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。質量分光測定による分析には、粒子から抽出されたタンパク質を水中に再構築し；タンパク質のアリコートをトリプシンで消化し、そしてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＥ  ＳＣＩＥＸ  ＱＳＴＡＲＲ、液体クロマトグラフＱ−ＴＯＦ質量分析計、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡを用いて分析した。データは、Ｍａｓｃｏｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｅｎｇｉｎｅ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて分析した。
【０１８９】
（ナノ粒子クリアランス）  ヘパリン処理キャピラリーを用いて、ナノ粒子注入後、異なる時間に眼窩周囲叢から５０μｌの血液を引き抜き、血液を３００ｇで２分間遠心分離し、そして多血小板血漿の１０μｌのアリコートを、６００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液ｐＨ８．４中に希釈した。蛍光を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）ＬＳ５０Ｂ蛍光分光光度計上で測定し、そして粒子が循環した時間の関数としてプロットした。
【０１９０】
（生体内顕微鏡法）  ＭＤＡ−ＭＢ４３５異種移植片をもつマウス中の腫瘍血流を、生体内顕微鏡法によって観察した。マウスにＮｉ−リポソームおよび５×１０８のＤｉＩ−標識赤血球を前注入した。皮膚弁を横に移動し、腫瘍を露出させ、そしてマウスに、４ｍｇ／ｋｇのフルオレセイン−ＣＲＥＫＡ−ＳＰＩＯを静脈内注入した（時間「０」）。腫瘍を、ＩＶ−ＯＢ３５Ｆ２２Ｗ２９  ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いてＩＶ−１００生体内レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で走査した。動画を１０分間隔で、注入後１２０分まで記録した。
【０１９１】
（Ｓｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｅｖｉｃｅ（ＳＱＵＩＤ）磁気計を用いる組織サンプルの磁気測定）  組織サンプルを、収集して直ぐに凍結し、凍結乾燥し、秤量し、そしてゼラチンカプセル中に置いた。これらカプセルを、１５０Ｋで作動するＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｅｓｉｇｎ  ＭＰＭＳ２  ＳＱＵＩＤ磁気計（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてなされる磁気測定のために透明のプラスチックストローの中央に挿入した。サンプルを、１Ｔｅｓｌａまで段階的増分で直流磁場に曝した。矯正を、組織、カプセルおよびストローの反磁性寄与について行った。
【０１９２】
【表１】
2010514839.tif 000002
【０１９３】
【表２】
2010514839.tif 000003
（配列）
配列番号１
ＣＲＥＫＡ
配列番号２
ＣＧＬＩＩＱＫＮＥＣ
配列番号３
ＣＮＡＧＥＳＳＫＮＣ
配列番号４
ＣＸＸＸＸＸＸＸＣ  ここで、Ｃはシステインであり、そしてＸは任意のアミノ酸である。
【図１】
2010514839.tif 000004
【図２】
2010514839.tif 000005
【図３】
2010514839.tif 000006
【図４】
2010514839.tif 000007
【図５】
2010514839.tif 000008
【図６】
2010514839.tif 000009
【図７】
2010514839.tif 000010
【図８】
2010514839.tif 000011
【図９】
2010514839.tif 000012
【配列表】
2010514839000001.app
【国際調査報告】
2010514839.tif 000013
2010514839.tif 000014