(57)【要約】ヒトＭＤＬ−１に対する抗体ならびに、例えば、免疫障害、特に、感染症および敗血症の治療におけるその使用を提供する。一態様では、本発明は、抗体軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片を含む、配列番号４１〜４６からなる群から選択される少なくとも１種または複数のＣＤＲおよび配列番号１７〜４０からなる群から選択される少なくとも１種または複数のＣＤＲを有する、ヒトＭＤＬ−１と結合する、抗体またはその断片、例えば、ヒト化またはキメラ組換え抗体などの結合性化合物を提供する。また、本発明は、ヒト対象において免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする対象に、ＭＤＬ−１シグナル伝達を刺激するのに有効な量のＭＤＬ−１に特異的な抗体（またはその抗原結合性断片）を投与するステップを含む方法も包含する。
2010526066.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＭＤＬ−１と結合する結合性化合物であって、
ａ）配列番号４１〜６４からなる群から選択される１つまたは複数のＣＤＲ配列を有する、抗体軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と、
ｂ）配列番号１７〜４０からなる群から選択される１つまたは複数のＣＤＲ配列を有する、抗体重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
を含む結合性化合物。
【請求項２】
ａ）配列番号４１〜６４からなる群から選択される２つ以上のＣＤＲ配列を有する、抗体軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と、
ｂ）配列番号１７〜４０からなる群から選択される２つ以上のＣＤＲ配列を有する、抗体重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
を含む、請求項１に記載の結合性化合物。
【請求項３】
ａ）配列番号４１〜６４からなる群から選択される３つのＣＤＲ配列を有する、抗体軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と、
ｂ）配列番号１７〜４０からなる群から選択される３つのＣＤＲ配列を有する、抗体重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
を含む、請求項２に記載の結合性化合物。
【請求項４】
ヒトＭＤＬ−１と結合する結合性化合物であって、
ａ）配列番号４１〜４８からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＬ１、配列番号４９〜５６からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＬ２および配列番号５７〜６４からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＬ３を有する、軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
ｂ）配列番号１７〜２４からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＨ１、配列番号２５〜３２からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＨ２および配列番号３３〜４０からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＨ３を有する、重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
を含む結合性化合物。
【請求項５】
ヒトＭＤＬ−１と結合する結合性化合物であって、
ａ）配列番号９の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号１の抗体重鎖可変ドメイン、
ｂ）配列番号１０の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号２の抗体重鎖可変ドメイン、
ｃ）配列番号１１の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号３の抗体重鎖可変ドメイン、
ｄ）配列番号１２の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号４の抗体重鎖可変ドメイン、
ｅ）配列番号１３の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号５の抗体重鎖可変ドメイン、
ｆ）配列番号１４の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号６の抗体重鎖可変ドメイン、
ｇ）配列番号１５の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号７の抗体重鎖可変ドメイン、または
ｈ）配列番号１６の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号８の抗体重鎖可変ドメイン
を含む結合性化合物。
【請求項６】
クロスブロッキングアッセイにおいて、請求項５に記載の結合性化合物とヒトＭＤＬ−１との結合を妨げることができる抗体。
【請求項７】
請求項５に記載の結合性化合物の前記軽鎖可変ドメインまたは前記重鎖可変ドメインの少なくとも一方をコードする単離核酸。
【請求項８】
宿主細胞に発現ベクターがトランスフェクトされる場合、該宿主細胞によって認識される制御配列と作動可能に連結している、請求項７に記載の核酸を含む該発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
ポリペプチドを産生する方法であって、
請求項９に記載の宿主細胞を、前記核酸配列が発現される条件下、培養培地中で培養し、それにより前記軽鎖可変ドメインおよび前記重鎖可変ドメインを含むポリペプチドを産生するステップと、
該宿主細胞または該培養培地から該ポリペプチドを回収するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
ａ）前記抗体軽鎖可変ドメイン中のヒト生殖系列軽鎖フレームワーク配列と、
ｂ）前記抗体重鎖可変ドメイン中のヒト生殖系列重鎖フレームワーク配列と
を含む、請求項５に記載の結合性化合物。
【請求項１２】
γ１ヒト重鎖定常領域またはその改変体を含む重鎖定常領域をさらに含み、該定常領域改変体が最大２０個の保存的に改変されたアミノ酸置換を含む、請求項５に記載の結合性化合物。
【請求項１３】
γ４ヒト重鎖定常領域またはその改変体を含む重鎖定常領域をさらに含み、該定常領域改変体が最大２０個の保存的に改変されたアミノ酸置換を含む、請求項５に記載の結合性化合物。
【請求項１４】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびダイアボディからなる群から選択される抗体断片である、請求項５に記載の結合性化合物。
【請求項１５】
ヒト対象において免疫応答を増強する方法であって、
それを必要とする対象に、ＭＤＬ−１に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を、ＭＤＬ−１／ＤＡＰ１２の生物活性を増強するのに有効な量で投与するステップを含み、該抗体が請求項５に記載の抗体である方法。
【請求項１６】
前記免疫応答が、感染症に対するものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、微生物感染症、ウイルス感染症および真菌感染症からなる群から選択される感染症を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫応答が骨髄性の応答である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
クロスブロッキングアッセイにおいて、ヒトＭＤＬ−１と、
ａ）２００７年４月２３日に、ＰＴＡ−８３７３、ＰＴＡ−８３７４、ＰＴＡ−８３７５、ＰＴＡ−８３７６、およびＰＴＡ−８３７７からなる群から選択される受託番号のもとで、または
ｂ）２００８年４月８日に、ＰＴＡ−＿、ＰＴＡ−＿およびＰＴＡ−＿からなる群から選択される受託番号のもとで
ＡＴＣＣに寄託された少なくとも１種の抗体との結合を妨げることができる抗体。
【請求項２０】
敗血症を予防する方法であって、それを必要とする対象に、ＭＤＬ−１に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を、ＭＤＬ−１／ＤＡＰ１２の生物活性を増強するのに有効な量で投与するステップを含む方法。
【請求項２１】
敗血症を予防する方法であって、それを必要とする対象に、ＭＤＬ−１に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を、ＭＤＬ−１／ＤＡＰ１２の生物活性を増強するのに有効な量で投与するステップを含み、該抗体が請求項５に記載の抗体である方法。
【請求項２２】
請求項５に記載の抗体と製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物。
【請求項２３】
配列番号６７または配列番号６８の抗体重鎖可変ドメインと配列番号６９または配列番号７０の抗体軽鎖可変ドメインとを含むヒト化ＭＤＬ−１抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、骨髄性ＤＡＰ−１２会合レクチン（ＭＤＬ−１）に特異的な抗体およびその使用に関する。より具体的には、本発明は、特に免疫障害において、ヒトＭＤＬ−１を認識し、その活性を調節するヒト化抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血球活性化および炎症反応において役割を果たすいくつかの受容体複合体（非特許文献１）は、膜貫通アダプター糖タンパク質ＤＡＰ１２と、Ｉｇスーパーファミリー（非特許文献２；非特許文献３）またはＣ型レクチンスーパーファミリー（非特許文献４）の受容体との非共有結合性会合によって形成される。これらの会合は、ＤＡＰ１２膜貫通ドメイン中に位置する負の電荷を有するアミノ酸残基（アスパラギン酸）と、これらの受容体の膜貫通ドメイン中に位置する正の電荷を有するアミノ酸残基（リジン）との相互作用によって形成される（非特許文献１）。
【０００３】
ＤＡＰ１２は、その細胞内ドメイン中に位置する免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する、ジスルフィド結合された、ホモ二量体Ｉ型膜貫通糖タンパク質である（非特許文献５；特許文献１ならびに非特許文献６；非特許文献７）。ＤＡＰ１２の重要性は、ＩＴＡＭドメインによるものである（非特許文献１）。ＤＡＰ１２と非共有結合によって会合するＩｇスーパーファミリー（非特許文献２；非特許文献３）およびＣ型レクチンスーパーファミリー（非特許文献４）の受容体の細胞内ドメインは、その他の分子との相互作用を可能にするには短すぎるので、ＤＡＰ１２細胞質ドメインが、これらの受容体複合体のシグナル伝達サブユニットを構成する。ＤＡＰ１２細胞質ＩＴＡＭは、受容体リガンド結合性サブユニットが結合すると、Ｓｒｃキナーゼによってリン酸化される。ＤＡＰ１２のＩＴＡＭは、次いで、Ｓｙｋ細胞質チロシンキナーゼと相互作用し、これが、活性化につながる事象のカスケードを開始する（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。
【０００４】
ＤＡＰ１２は、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、顆粒球、樹状細胞および肥満細胞において発現され、そこで、少なくとも８種の別個の受容体にシグナル伝達機能を提供する（非特許文献１；非特許文献７）。ＤＡＰ１２と会合しているＣ型レクチンスーパーファミリーの骨髄性受容体は、骨髄性ＤＡＰ１２会合レクチン−１（ＭＤＬ−１）、ＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＭＤＬ−１は、同定され、クローニングされる第１のＤＡＰ１２会合分子であった（非特許文献４）。それはもっぱら単球およびマクロファージにおいて（非特許文献４）、ならびに好中球および樹状細胞などのその他の骨髄性細胞種で発現される。ＤＡＰ１２の膜貫通ドメイン中の負の電荷を有する残基の存在が、その膜貫通ドメイン中に正の電荷を有する残基を有するＭＤＬ−１などのパートナー受容体の不在下でのその細胞表面発現を妨げる。しかし、ＤＡＰ１２は単独では、細胞表面でのその発現および機能にとって十分ではない。したがって、ＭＤＬ−１などのＤＡＰ１２会合分子とＤＡＰ１２の組み合わせが、ＤＡＰ１２による特定の生理学的シグナルの伝達をもたらし得る（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９９／０６５５７号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｉｎｇｒａｓら（２００１年）Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎ．  ３８巻：８１７〜８２４頁
【非特許文献２】Ｂｏｕｃｈｏｎら（２０００年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４巻：４９９１〜４９９５頁
【非特許文献３】Ｄｉｅｔｒｉｃｈら（２０００年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４巻：９〜１２頁
【非特許文献４】Ｂａｋｋｅｒら（１９９９年）ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９６巻：９７９２〜９７９６頁
【非特許文献５】Ｌａｎｉｅｒら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１巻：７０３〜７０７頁
【非特許文献６】ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＣｏｌｏｎｎａ（１９９９年）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３１巻：６３１〜６３６頁
【非特許文献７】ＬａｎｉｅｒおよびＢａｋｋｅｒ（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ２１巻：６１１〜６１４頁
【非特許文献８】Ｎｏｃｈｉら（２００３年）Ａｍ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６２巻：１１９１〜１２０１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＭＤＬ−１に対するアゴニストの使用を介してＤＡＰ１２シグナル伝達を調節する薬剤の使用による、免疫介在性障害、特に、感染症の処置のための、改善された方法および組成物の必要性が存在する。このようなアゴニストは標的分子に対して高親和性を有し、比較的低用量でＭＤＬ−１媒介性ＤＡＰ−１２シグナル伝達を刺激できることが好ましい。このような方法および組成物は、ＭＤＬ−１に対して高度に特異的であり、ＴＲＥＭ−１などのその他の活性化または阻害性受容体の活性を干渉しないことが好ましい。このような方法および組成物は、細胞傷害性ペイロードの標的細胞への送達のための改変に適し、また非細胞傷害性使用にも適したアゴニストを用いることが好ましい。このような方法および組成物は、それを必要とする対象に投与された場合に、その抗原性を制限するよう改変された抗体を用いることが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＭＤＬ−１のアゴニスト、例えば、ヒト化抗ＭＤＬ−１抗体を提供することによって当技術分野におけるこれらの必要性をそれ以上に満たす。
【０００９】
一態様では、本発明は、抗体軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片を含む、配列番号４１〜６４からなる群から選択される少なくとも１種または複数のＣＤＲおよび配列番号１７〜４０からなる群から選択される少なくとも１種または複数のＣＤＲを有する、ヒトＭＤＬ−１と結合する、抗体またはその断片、例えば、ヒト化またはキメラ組換え抗体などの結合性化合物を提供する。
【００１０】
他の実施形態では、本発明の結合性化合物は、先の２つの段落に記載される、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、結合性化合物は、フレームワーク領域を含み、このフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列のすべてまたは実質的にすべてである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号９〜１６からなる群から選択される配列またはその改変体を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１〜８からなる群から選択される配列を含む。なおさらなる実施形態では、結合性化合物は、この段落に記載される軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片を含む。
【００１３】
他の実施形態では、本発明の結合性化合物は、配列番号９〜１６からなる群から選択される配列から本質的になる軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片および／または配列番号１〜８からなる群から選択される配列から本質的になる重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片を含む。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、クロスブロッキングアッセイにおいて、本発明の結合性化合物とヒトＭＤＬ−１との結合を妨げることができる抗体に関する。種々の実施形態では、抗体は、ヒトＭＤＬ−１と、本明細書に開示される抗体ＤＸ２３０、ＤＸ２４１、ＤＸ２４４、ＤＸ２４６、ＤＸ２９７、ＤＸ２３３、ＤＸ２３９およびＤＸ２４０のＣＤＲ配列を含む抗体との結合を妨げることができる。他の実施形態では、抗体は、クロスブロッキングアッセイにおいて、ヒトＭＤＬ−１と、２００７年４月２３日に、受託番号ＰＴＡ−８３７３、ＰＴＡ−８３７４、ＰＴＡ−８３７５、ＰＴＡ−８３７６およびＰＴＡ−８３７７のもとでＡＴＣＣに寄託された、または２００８年４月８日に受託番号ＰＴＡ−＿、ＰＴＡ−＿およびＰＴＡ−＿のもとでＡＴＣＣに寄託された抗体（クローンＤＸ２３０、ＤＸ２４１、ＤＸ２４４、ＤＸ２４６、ＤＸ２９７、ＤＸ２３３、ＤＸ２３９、ＤＸ２４０）との結合を妨げることができる。別の実施形態では、本発明は、ＭＤＬ−１媒介性活性を妨げることができる結合性化合物に関し、このような活性は、それだけには限らないが、適当な肥満細胞アッセイにおける肥満細胞の脱顆粒を媒介することを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明の結合性化合物は、本明細書に開示される抗体のＣＤＲから選択されるＣＤＲまたはその改変体を、親抗体のげっ歯類フレームワークの代わりのヒト生殖系列軽鎖および重鎖可変ドメインフレームワーク配列と組み合わせて含むヒト化抗体を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明の結合性化合物は、重鎖定常領域をさらに含み、重鎖定常領域は、γｌ、γ２、γ３またはγ４ヒト重鎖定常領域またはその改変体を含む。種々の実施形態では、軽鎖定常領域は、λまたはκヒト軽鎖定常領域を含む。
【００１７】
種々の実施形態では、本発明の結合性化合物は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗体またはその断片である。本発明はまた、抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）からなる群から選択される抗体断片であることを企図する。
【００１８】
本発明は、ヒト対象において免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする対象に、ＭＤＬ−１シグナル伝達を刺激するのに有効な量のＭＤＬ−１に特異的な抗体（またはその抗原結合性断片）を投与するステップを含む方法を包含する。いくつかの実施形態では、ＭＤＬ−１に特異的な抗体は、ヒト化またはキメラ抗体である。さらなる実施形態では、免疫応答は、抗感染反応である。
【００１９】
本発明は、本発明の結合性化合物の抗体実施形態のポリペプチド配列をコードする単離核酸を包含する。この核酸は、発現ベクター中で、ベクターがトランスフェクトされる宿主細胞によって認識される制御配列と作動可能に連結させることができる。また、ベクターを含む宿主細胞およびポリペプチドを産生する方法（該宿主細胞を核酸配列が発現される条件下で培養し、それによりポリペプチドを産生するステップと、該宿主細胞または培地からポリペプチドを回収するステップとを含む方法）も包含される。
【００２０】
種々の実施形態では、本発明は、免疫障害、例えば、感染症（例えば、慢性感染症を含めた細菌感染症、マイコバクテリア感染症、ウイルス感染症または真菌感染症および敗血症の処置のための医薬の製造における本発明の結合性化合物の使用に関する。
【００２１】
他の実施形態では、本発明は、免疫障害、例えば、感染症（例えば、慢性感染症を含めた細菌感染症、マイコバクテリア感染症、ウイルス感染症または真菌感染症）および敗血症を処置するための本発明の結合性化合物を含む薬剤組成物に関する。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、配列番号６７または配列番号６８の抗体重鎖可変ドメインおよび配列番号６９または配列番号７０の抗体軽鎖可変ドメインを含むヒト化ＭＤＬ−１抗体を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＤＸ２３０、ＤＸ２４１、ＤＸ２４４、ＤＸ２４６およびＤＸ２９７抗ＭＤＬ−１抗体可変重鎖配列の比較を示す図である。
【図２】ＤＸ２３３、ＤＸ２３９およびＤＸ２４０抗ＭＤＬ−１抗体可変重鎖配列の比較を示す図である。
【図３】ＤＸ２３０、ＤＸ２４１、ＤＸ２４４、ＤＸ２４６およびＤＸ２９７抗ＭＤＬ−１抗体可変軽鎖配列の比較を示す図である。
【図４】ＤＸ２３３、ＤＸ２３９およびＤＸ２４０抗ＭＤＬ−１抗体可変重鎖配列の比較を示す図である。
【図５Ａ】ＤＸ２３９抗ヒトＭＤＬ−１抗体の軽鎖（図５Ａ）および重鎖（図５Ｂ）の可変領域の、ならびにＤＸ２４４抗ヒトＭＤＬ−１抗体の軽鎖（図５Ｃ）および重鎖（図５Ｄ）の可変領域のヒト化計算を示す図である。
【図５Ｂ】ＤＸ２３９抗ヒトＭＤＬ−１抗体の軽鎖（図５Ａ）および重鎖（図５Ｂ）の可変領域の、ならびにＤＸ２４４抗ヒトＭＤＬ−１抗体の軽鎖（図５Ｃ）および重鎖（図５Ｄ）の可変領域のヒト化計算を示す図である。
【図５Ｃ】ＤＸ２３９抗ヒトＭＤＬ−１抗体の軽鎖（図５Ａ）および重鎖（図５Ｂ）の可変領域の、ならびにＤＸ２４４抗ヒトＭＤＬ−１抗体の軽鎖（図５Ｃ）および重鎖（図５Ｄ）の可変領域のヒト化計算を示す図である。
【図５Ｄ】ＤＸ２３９抗ヒトＭＤＬ−１抗体の軽鎖（図５Ａ）および重鎖（図５Ｂ）の可変領域の、ならびにＤＸ２４４抗ヒトＭＤＬ−１抗体の軽鎖（図５Ｃ）および重鎖（図５Ｄ）の可変領域のヒト化計算を示す図である。
【図６】ＣＬＰ後マウスの体重測定値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
添付の特許請求の範囲を含めて本明細書において用いる場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの単数形の語句は、文脈が明確に他を示すのでない限り、その対応する複数の言及を含む。以下の表１５は、本願において使用される配列識別子の一覧を提供する。本明細書に引用されるすべての参考文献は、個々の刊行物、データベース登録（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤ登録）、特許出願または特許の各々が、具体的に、個別に、参照により組み込まれるべく示されるのと同程度に参照により組み込まれる。本明細書における参考文献の引用は、前記のいずれかが関連先行技術であるという承認として意図されるものではなく、これらの刊行物または文書の内容または日付についての何らかの承認をなすものでもない。
【００２５】
Ｉ．定義
用語「ＭＤＬ−１」、「骨髄性ＤＡＰ１２会合レクチン−１（ｍｙｅｌｏｉｄ  ＤＡＰ１２  ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｌｅｃｔｉｎ−１）」、「骨髄性ＤＡＰ１２会合型レクチン−１（ｍｙｅｌｏｉｄ  ＤＡＰ１２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｅｃｔｉｎ−１）」、「ＤＡＰ−１２」、「ＤＡＰ１２」、「ＤＮＡＸ活性化タンパク質、１２ｋＤ」は当技術分野ではよく知られている。ヒトおよびマウスＤＡＰ１２およびＭＤＬ−１ヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、ＷＯ９９／０６５５７に開示されている。ヒトＭＤＬ−１核酸配列（ＡＲ２１７５４８）およびマウスＭＤＬ−１核酸およびアミノ酸配列（それぞれ、ＡＲ２１７５４９およびＡＡＮ２１５９３）のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託物も利用可能である。
【００２６】
「増殖活性」は、例えば、正常な細胞分裂ならびに癌、腫瘍、異形成、細胞形質転換、転移および新脈管形成を促進する、それらにとって必要である、またはそれらと特異的に関連する活性を包含する。
【００２７】
「投与」および「処置」とは、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器または生体液に適用される場合、動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器または生体液への外因的な医薬品、治療薬、診断薬または組成物の接触を指す。「投与」および「処置」は、例えば、治療方法、薬物動態法、診断方法、研究方法および実験方法を指す場合もある。細胞の処置は、試薬の細胞との接触ならびに試薬の、細胞と接触している液体との接触を包含する。「投与」および「処置」はまた、試薬、診断用組成物、結合性組成物による、または別の細胞による、例えば、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ処置を意味する。「処置」とは、ヒト、獣医学の対象または研究対象に適用される場合、治療的処置、予防または防止対策、研究および診断的適用を指す。「処置」とは、ヒト、獣医学の対象または研究対象または細胞、組織または臓器に適用される場合、動物対象、細胞、組織、生理学的区画または生理液（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）との薬剤の接触を包含する。「細胞の処置」とはまた、例えば、液相またはコロイド相中で、薬剤がＭＤＬ−１（ＭＤＬ−１／ＤＡＰ１２ヘテロ二量体）と接触する状況、またアゴニストまたはアンタゴニストが細胞または受容体と接触しない状況も包含する。
【００２８】
本明細書において用いる場合、用語「抗体」とは、所望の生物活性を示す任意の形の抗体を指す。したがって、それは広い意味で用いられ、具体的には、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体（例えば、全長モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体などを網羅する。
【００２９】
本明細書において用いる場合、用語「ＭＤＬ−１結合性断片」、「その結合性断片」または「その抗原結合性断片」は、ＭＤＬ−１によって媒介されるＤＡＰ１２シグナル伝達の阻害というその生物活性を依然、実質的に保持する抗体の断片または誘導体を包含し、このような阻害は、本明細書において「ＭＤＬ−１阻害活性」と呼ばれる。ＭＤＬ−１のアンタゴニストは、ＤＡＰ１２シグナル伝達を阻害する生物活性を有するので、このようなアンタゴニストは、ＤＡＰ１２を阻害する、ＭＤＬ−１を阻害する、またはＭＤＬ−１／ＤＡＰ１２の両方を阻害すると言われる（交換可能に）。用語「抗体断片」またはＭＤＬ−１結合性断片とは、全長抗体の部分、通常、その抗原結合性領域または可変領域を指す。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖抗体；一本鎖抗体分子、例えば、ｓｃ−Ｆｖ；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。通常、結合性断片または誘導体は、そのＭＤＬ−１阻害活性の少なくとも１０％を保持する。結合性断片または誘導体は、そのＭＤＬ−１阻害活性の少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％（またはそれ以上）を保持することが好ましいが、所望の生物学的効果を発揮するのに十分な親和性を有する任意の結合性断片は有用である。また、ＭＤＬ−１結合性断片がその生物活性を実質的に変更しない保存的アミノ酸置換を有する改変体を含み得ることも意図される。
【００３０】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書において用いる場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性エピトープに対するものである。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は、通常、種々のエピトープに対する（またはそれらに特異的な）多数の抗体を含む。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られているような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするとはみなさない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初に、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６巻：４９５頁によって記載されたハイブリドーマ法によって作製してもよく、または組換えＤＮＡ法によって作製してもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２巻：６２４〜６２８頁およびＭａｒｋｓら（１９９１年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２巻：５８１〜５９７頁に記載される技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００３１】
本明細書において、モノクローナル抗体とは、具体的に、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、相同であり、一方で、所望の生物活性を示す限り、鎖（複数可）の残りの部分が、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにこのような抗体の断片を含む。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１巻：６８５１〜６８５５頁。
【００３２】
「ドメイン抗体」とは、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。いくつかの例では、２つ以上のＶＨ領域が、ペプチドリンカーを用いて共有結合によって連結され、二価のドメイン抗体を生じている。二価のドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同一または異なる抗原を標的とし得る。
【００３３】
「二価の抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。いくつかの例では、２つの結合部位は、同一抗原特異性を有する。しかし、二価の抗体は、二重特異性であり得る（以下を参照のこと）。
【００３４】
本明細書において用いる場合、用語「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体とは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片を指し、ここで、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによって、ｓＦｖが、抗原結合のための所望の構造を形成するのが可能になる。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４年）ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁参照のこと。
【００３５】
本明細書において、モノクローナル抗体はまた、ラクダ化単一ドメイン抗体を含む。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら（２００１年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２６巻：２３０頁；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら（１９９９年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１巻：２５頁；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号参照のこと）。一実施形態では、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるような改変を有する、２つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
【００３６】
本明細書において用いる場合、用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を含む小さい抗体断片を指し、これらの断片は、同一ポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間で対の形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対の形成を強いられ、２つの抗原結合部位が生じる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：６４４４〜６４４８頁に、より十分に記載されている。操作された抗体改変体の概説については、概して、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ（２００５年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３巻：１１２６〜１１３６頁を参照のこと。
【００３７】
本明細書において用いる場合、用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト（例えば、マウス）抗体ならびにヒト抗体に由来する配列を含む抗体の形を指す。このような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常、２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、場合により、少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の部分、通常、ヒト免疫グロブリンのものを含む。接頭辞「ｈｕｍ」、「ｈｕ」または「ｈ」は、ヒト化抗体を親のげっ歯類抗体と区別することが必要である場合に抗体クローン表記に加えられる。げっ歯類抗体のヒト化型は、通常、親のげっ歯類抗体の同一のＣＤＲ配列を含むが、ヒト化抗体の親和性を高めるために、安定性を高めるために、またはその他の理由で特定のアミノ酸置換を含める場合もある。
【００３８】
本発明の抗体はまた、変更されたエフェクター機能を提供するために改変された（またはブロックされた）Ｆｃ領域を有する抗体を含む。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；ＷＯ２００３／０８６３１０；ＷＯ２００５／１２０５７１；ＷＯ２００６／００５７７０２；Ｐｒｅｓｔａ（２００６年）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  ５８巻：６４０〜６５６頁を参照のこと。このような改変を用いて免疫系の種々の反応を増強または抑制でき、診断および治療において有益な効果を伴う可能性がある。Ｆｃ領域の変更は、アミノ酸変更（置換、欠失および挿入）、グリコシル化または脱グリコシル化および複数のＦｃを加えることを含む。Ｆｃの変更はまた、治療抗体における抗体の半減期を変更し得、より長い半減期は、あまり頻繁でない投薬をもたらし、同時に利便性が増大し、物質の使用が減少する。Ｐｒｅｓｔａ（２００５年）Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１６巻：７３４〜３５頁の７３１を参照のこと。
【００３９】
本発明の抗体はまた、完全なエフェクター機能を提供する、無傷のＦｃ領域を有する抗体、例えば、標的とされた細胞において補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する、アイソタイプＩｇＧ１の抗体を含む。
【００４０】
本発明の抗体はまた、細胞傷害性作用物質または放射性核種などの細胞傷害性ペイロードとコンジュゲートしている抗体を含む。このような抗体コンジュゲートは、免疫治療において、その表面にＭＤＬ−１および／またはＤＡＰ１２を発現する細胞を選択的に標的とし、死滅させるよう用いることができる。例示的細胞傷害性作用物質として、リシン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、サポリン、ジフテリア毒素、シスプラチン、ドキソルビシン、アブリン毒素、ゲロニンおよびアメリカヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質が挙げられる。本発明の抗体とともに免疫治療において使用するための例示的放射性核種として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１１Ａｔ、１７７Ｌｕ、１４３Ｐｒおよび２１３Ｂｉが挙げられる。例えば、米国特許出願公開第２００６／００１４２２５号を参照のこと。
【００４１】
用語「完全ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を指す。完全ヒト抗体は、マウスにおいて、マウス細胞において、またはマウス細胞に由来するハイブリドーマにおいて産生される場合には、マウス炭水化物鎖を含み得る。同様に「マウス抗体」または「ラット抗体」とは、それぞれ、マウスまたはラット免疫グロブリン配列のみを含む抗体を指す。完全ヒト抗体は、ヒトにおいて、ヒト免疫グロブリン生殖系列配列を有するトランスジェニック動物において、ファージディスプレイまたはその他の分子生物学的方法によって作製され得る。
【００４２】
本明細書において用いる場合、用語「超可変領域」とは、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、５０〜５６（ＣＤＲＬ２）および８９〜９７（ＣＤＲＬ３）および重鎖可変ドメイン中の残基３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、５０〜６５（ＣＤＲＨ２）および９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）（Ｋａｂａｔら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）および／または「超可変ループ」に由来する残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６巻：９０１〜９１７頁）を含む。本明細書において用いる場合、用語「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、本明細書においてＣＤＲ残基と定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を指す。上記の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに関連し、添付の配列表における配列番号付けには必ずしも詳細には対応しない。
【００４３】
「結合性化合物（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」とは、標的と結合できる、分子、小分子、高分子、ポリペプチド、抗体もしくはその断片もしくはその類似体、または可溶性受容体を指す。「結合性化合物」とは、標的と結合できる、分子の複合体、例えば、非共有結合複合体、イオン化分子、および共有結合によって、または非共有結合によって改変された（例えば、リン酸化、アシル化、架橋、環化または制限された切断によって改変された）分子を指す場合もある。抗体に関連して用いられる場合には、用語「結合性化合物」とは、抗体およびその抗原結合性断片の両方を指す。「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」とは、結合性組成物の標的との会合を指し、結合性組成物が溶液に溶解または懸濁され得る場合に、会合が結合性組成物の正常なブラウン運動の低下をもたらす。「結合性組成物」とは、標的と結合できる、安定化剤、賦形剤、塩、バッファー、溶媒または添加剤と組み合わせた、分子、例えば、結合性化合物を指す。
【００４４】
「保存的に改変された改変体」または「保存的置換」とは、当業者に公知であり、ポリペプチドの必須領域においてでさえ、得られた分子の生物活性を変更することなく、行うことができることが多いアミノ酸の置換を指す。このような例示的置換は、以下の表１に示されるものと一致して行われることが好ましい：
【００４５】
【表１】
2010526066.tif 000003
当業者ならば、一般に、ポリペプチドの非必須領域中の単一のアミノ酸置換は、生物活性を実質的に変更しない場合があるということを認識している。例えば、Ｗａｔｓｏｎら（１９８７年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．、２２４頁（第４版）参照のこと。
【００４６】
語句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの変動は、本明細書および特許請求の範囲を通じて用いられる場合、任意の列挙された要素または要素の群の包含および特定の投与計画、方法または組成物の基本的なまたは新規の特性を実質的に変更しない列挙された要素と同様のまたは異なる性質のその他の要素の任意選択の包含を示す。限定されない例として、本質的に、列挙されたアミノ酸配列からなる結合性化合物はまた、結合性化合物の特性に実質的に影響を及ぼさない、１個または複数のアミノ酸（１個または複数のアミノ酸残基の置換を含む）も含み得る。
【００４７】
「有効量」は、医学的状態の症状または徴候を回復させる、または防ぐのに十分な量を包含する。有効量はまた、診断を可能にする、または容易にするのに十分な量を意味する。個々の患者または獣医学の対象のための有効量は、処置される状態、患者の健康全般、投与の方法経路および用量および副作用（ｓｉｄｅ  ａｆｆｅｃｔ）の重症度などの因子に応じて変わり得る。例えば、米国特許第５，８８８，５３０号参照のこと。有効量は、重大な副作用（ｓｉｄｅ  ｅｆｆｅｃｔ）または毒性作用を避ける最大用量または投薬プロトコールであり得る。効果は、診断手段またはパラメータの少なくとも５％の、通常、少なくとも１０％の、より通常は、少なくとも２０％の、最も通常は、少なくとも３０％の、好ましくは、少なくとも４０％の、より好ましくは、少なくとも５０％の、最も好ましくは、少なくとも６０％の、理想的には、少なくとも７０％の、より理想的には、少なくとも８０％の、最も理想的には、少なくとも９０％の改善をもたらし、ここで、１００％は、正常な対象によって示される診断的パラメータとして定義される。例えば、Ｍａｙｎａｒｄら（１９９６年）Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１年）Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ．、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ参照のこと。
【００４８】
「免疫状態」または「免疫障害」とは、例えば、病的炎症、炎症性障害および自己免疫障害または疾患を包含する。「免疫状態」はまた、感染症、持続性感染症ならびに癌、腫瘍および新脈管形成などの増殖性状態（免疫系による根絶に耐える感染症、腫瘍および癌を含む）を指す。「癌性状態」として、例えば、癌、癌細胞、腫瘍、新脈管形成および異形成などの前癌状態が挙げられる。
【００４９】
本明細書において用いる場合、「感染」とは、対象の身体の組織における微生物の侵襲および増殖である。感染または「感染症」は、臨床的に不顕性である場合もあり、または競合代謝、毒素、細胞内複製または抗原−抗体反応によって局所細胞損傷をもたらす場合もある。感染は、身体の防御機構が有効である場合には、限局化され、無症候性および一過性のままである場合もある。局所発明が持続し、拡大によって蔓延し、急性、亜急性または慢性臨床感染または病態となる場合もある。局所感染はまた、微生物がリンパ系または血管系に侵入する場合には全身性となり得る。感染症として、細菌感染症、ウイルス感染症、寄生生物感染症、日和見感染症または真菌感染が挙げられる。
【００５０】
本明細書において用いる場合、用語「癌」とは、その正常な制御機構を失っており、したがって、未制御に増殖する細胞の群（通常、単一の細胞に由来する）を指す。癌性組織または悪性腫瘍として、白血病およびリンパ腫などの血液組織および血液形成組織のものおよび癌と呼ばれることが多い固形腫瘍が挙げられる。このような癌は、癌腫または肉腫であり得る。
【００５１】
本明細書において用いる場合、用語「腫瘍」とは、異常な増殖または腫瘤を指す。腫瘍は良性または癌性（悪性）であり得る。良性腫瘍は癌ではない。良性腫瘍は、身体から除去でき、成長して元に戻ることはめったにない。良性腫瘍に由来する細胞は、周囲の組織に、または身体のその他の部分に広がらない。
【００５２】
癌性細胞は、成長し、増殖するので、それらは癌性組織の腫瘤を形成し、それが腫瘍であり、正常な隣接する組織に浸潤し、破壊する。悪性腫瘍は癌である。悪性腫瘍は、通常、除去できるが、成長して元に戻り得る。悪性腫瘍由来の細胞は、近くの組織および臓器に浸潤し、損傷を与え得る。また、癌細胞は、悪性腫瘍から離脱し、血流またはリンパ系に侵入することができ、これが、癌細胞が原発腫瘍（すなわち、元の癌）から広がって、その他の臓器で新規腫瘍を形成する方法である。身体における癌の広がりは、転移と呼ばれる（Ｗｈａｔ  Ｙｏｕ  Ｎｅｅｄ  ｔｏ  Ｋｎｏｗ  Ａｂｏｕｔ  Ｃａｎｃｅｒ−  ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ、ＮＩＨ刊行物番号００−１５６６；２０００年９月２６日に発表され、２００２年９月１６日改正された（２００２年））。
【００５３】
本明細書において用いる場合、用語「固形腫瘍」とは、通常、嚢胞または液体領域を含まない組織の異常な成長または腫瘤を指す。固形腫瘍は、良性（癌性ではない）または悪性（癌性）であり得る。種々の種類の固形腫瘍は、それを形成する細胞の種類にちなんで名づけられている。固形腫瘍の例として、肉腫、癌腫およびリンパ腫がある。白血病（血液の癌）は、一般に、固形腫瘍を形成しない（米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｅｒｍｓ）。
【００５４】
本明細書において用いる場合、用語「原発性癌」とは、元の腫瘍または最初の腫瘍を指す。癌は、身体の任意の臓器または組織で始まり得る。通常、それが始まる身体の部分または細胞の種類にちなんで名づけられる（２００４年９月１日に概説された、Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｓｗｅｒｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ６．２０、米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（２００４年））。
【００５５】
本明細書において用いる場合、用語「上皮内癌」とは、依然として、成長し始めた組織内に含まれており、まだ、浸潤性になっていない、または身体のその他の部分へ蔓延していない癌性細胞を指す。
【００５６】
本明細書において用いる場合、用語「癌腫」とは、身体の表面を覆い、ホルモンを産生し、腺を構成する細胞である、上皮細胞の癌を指す。癌腫の例として、皮膚、肺、結腸、胃、乳房、前立腺および甲状腺の癌がある。
【００５７】
本明細書において用いる場合、用語「敗血症」とは、毒素によって誘導される病的な状態を指し、毒素の誘導または蓄積は微生物感染または外傷によって引き起こされることが最も多い。敗血症の初期症状は、通常、悪寒、大量の汗、不規則な弛張熱、衰弱などを含み、それに、持続性の熱、ショックにつながる低血圧、好中球減少症、白血球減少症、播種性血管内凝固、成人呼吸窮迫症候群および多臓器不全が続く。
【００５８】
本明細書において用いる場合、「抗生物質」とは、ゲンタマイシンなどのアミノグリコシドまたはペニシリン、セファロスポリンなどのβ−ラクタムなどを指す。また、公知の抗真菌剤および抗ウイルス剤も含まれる。抗生物質は、本発明のＭＤＬ−１抗体とともに使用して、感染を取り除き、かつ／または、敗血症の発生を防ぐためのさらなる効力を提供できる。
【００５９】
本明細書において用いる場合、用語「単離核酸分子」とは、同定され、抗体核酸の天然供給源中では、通常、会合している少なくとも１種の混入物核酸分子から分離される核酸分子を指す。単離核酸分子は、天然に見られる形または状況以外にある。したがって、単離核酸分子は、天然の細胞中に存在するような核酸分子と区別される。しかし、単離核酸分子は、通常、抗体を発現する細胞中に含まれる核酸分子を含み、例えば、核酸分子は、天然の細胞のものとは異なる染色体位置にある。
【００６０】
表現「制御配列」とは、特定の宿主生物における作動可能に連結しているコード配列の発現に関与しているＤＮＡ配列を指す。原核生物にとって適している制御配列として、例えば、プロモーター、場合により、オペレーター配列およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを使用することがわかっている。
【００６１】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に位置している場合に「作動可能に連結している」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合に、ポリペプチドのＤＮＡと作動可能に連結しており；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列と作動可能に連結しており；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するよう位置される場合に、コード配列と作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結している」とは、連結しているＤＮＡ配列が隣接していること、分泌リーダーの場合には、隣接しており、リーディングフレームにあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接していなくてもよい。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、従来の実行に従って使用される。
【００６２】
本明細書において用いる場合、表現「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、同じ意味で用いられ、このような表記はすべて、子孫を含む。したがって、語句「形質転換体」および「形質転換された細胞」は、一次対象細胞および変換物の数には関係なく、それに由来する培養物を含む。また、すべての子孫は、意図的なまたは偶然の変異によって、ＤＮＡ内容物において正確には同一でない場合もあるということは理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたのと同一の機能または生物活性を有する突然改変体の子孫が含まれる。個別の表記が意図される場合には、状況から明らかとなる。
【００６３】
本明細書において用いる場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されるような微量の特定の核酸片、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡが増幅される手順または技術を指す。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計できるよう、注目する領域の末端から、またはそれを超えて得られる配列情報が利用可能である必要があり、これらのプライマーは、増幅される鋳型の反対の鎖の配列において同一または同様となる。２種のプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅された物質の末端と一致し得る。ＰＣＲを用いて、全ゲノムＤＮＡおよび全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列などから特定のＲＮＡ配列、特定のＤＮＡ配列を増幅することができる。概して、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５１巻：２６３頁；Ｅｒｌｉｃｈ編、（１９８９年）ＰＣＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．）参照のこと。本明細書において用いる場合、ＰＣＲは、特定の核酸片を増幅または作製するための、プライマーとしての公知の核酸および核酸ポリメラーゼの使用を含む、核酸試験サンプルを増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の一例であるが、唯一ではないとみなされる。
【００６４】
本明細書において用いる場合、用語「生殖系列配列」とは、再編成されていない免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列（げっ歯類（例えば、マウス）およびヒト生殖系列配列を含む）を指す。再編成されていない免疫グロブリンＤＮＡの任意の適した供給源を使用してもよい。ヒト生殖系列配列は、例えば、米国国立衛生研究所（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の国立関節炎、骨格筋、皮膚疾患研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）のウェブサイトで、例えば、ＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ（登録商標）生殖系列データベースから得ることができる。マウス生殖系列配列は、例えば、Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら（２００５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３巻：Ｄ２５６〜Ｄ２６１頁に記載されるように得ることができる。
【００６５】
ＭＤＬ−１／ＤＡＰ１２活性の増強の程度を調べるために、例えば、所与の、例えば、タンパク質、遺伝子、細胞または生物を含むサンプルまたはアッセイを、可能性ある活性化剤または阻害剤で処理し、薬剤を含まない対照サンプルと比較する。対照サンプル、すなわち、薬剤で処理されていないものに、１００％の相対活性値を割り当てる。阻害は、活性値が対照に対して、約９０％以下、通常、８５％以下、より通常は、８０％以下、最も通常は、７５％以下、一般に、７０％以下、より一般には、６５％以下、最も一般には６０％以下、通常、５５％以下、普通には、５０％以下、より普通には、４５％以下、最も普通には、４０％以下、好ましくは、３５％以下、より好ましくは、３０％以下、さらにより好ましくは、２５％以下、最も好ましくは、２０％以下である場合に達成される。活性化は、活性値が対照に対して、約１１０％、一般に、少なくとも１２０％、より一般に、少なくとも１４０％、より一般には、少なくとも１６０％、しばしば、少なくとも１８０％、よりしばしばには、少なくとも２倍、最もしばしばには、少なくとも２．５倍、普通には、少なくとも５倍、より普通には、少なくとも１０倍、好ましくは、少なくとも２０倍、より好ましくは、少なくとも４０倍、最も好ましくは、４０倍を超えて高い場合に達成される。
【００６６】
活性化または阻害におけるエンドポイントは、以下のとおりにモニターできる。例えば、細胞、生理液、組織、臓器および動物対象またはヒト対象の活性化、阻害および処置に対する反応は、エンドポイントによってモニターできる。エンドポイントは、所定の量またはパーセンテージの、例えば、炎症の兆候、発癌性もしくは細胞の脱顆粒または分泌（サイトカイン、毒性酸素もしくはプロテアーゼの放出など）を含み得る。エンドポイントは、例えば、所定の量の、イオンフラックスまたは輸送；細胞遊走；細胞接着；細胞増殖；転移の可能性；細胞分化；および表現型の変化、例えば、炎症、アポトーシス、形質転換、細胞周期または転移と関連する遺伝子の発現の変化を含み得る（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ（２０００年）Ａｎｎ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ｓｃｉ  ３０巻：１４５〜１５８頁；ＨｏｏｄおよびＣｈｅｒｅｓｈ（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２巻：９１〜１００頁；Ｔｉｍｍｅら（２００３年）Ｃｕｒｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ４巻：２５１〜２６１頁；ＲｏｂｂｉｎｓおよびＩｔｚｋｏｗｉｔｚ（２００２年）Ｍｅｄ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．  ８６巻：１４６７〜１４９５頁；ＧｒａｄｙおよびＭａｒｋｏｗｉｔｚ（２００２年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３巻：１０１〜１２８頁；Ｂａｕｅｒら（２００１年）Ｇｌｉａ  ３６巻：２３５〜２４３頁；ＳｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃおよびＳａｔｏｈ（２０００年）Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  １０巻：１１３〜１２６頁）。
【００６７】
阻害のエンドポイントは、通常、対照の７５％以下、好ましくは、対照の５０％以下、より好ましくは、対照の２５％以下、最も好ましくは、対照の１０％以下である。一般に、活性化のエンドポイントは、対照の少なくとも１５０％、好ましくは、対照の少なくとも２倍、より好ましくは、対照の少なくとも４倍、および最も好ましくは、対照の少なくとも１０倍である。
【００６８】
「小分子」は、１０ｋＤａ未満の、通常、２ｋＤａ未満の、好ましくは、１ｋＤａ未満の分子量を有する分子と定義される。小分子として、それだけには限らないが、無機分子、有機分子、無機成分を含有する有機分子、放射性原子を含む分子、合成分子、ペプチドミメティックおよび抗体ミメティックが挙げられる。小分子は、治療薬として、大きな分子よりも細胞に対してより透過性で、分解に対する感受性が低く、免疫応答を誘発する傾向が小さいものであり得る。抗体のペプチドミメティックおよびサイトカインなどの小分子ならびに小分子毒素が記載されている。例えば、Ｃａｓｓｅｔら（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３０７巻：１９８〜２０５頁；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（２００１年）Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７４巻：２７７〜３０２頁；Ｌｉ（２０００年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８巻：１２５１〜１２５６頁；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら（２００２年）Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ９巻：４１１〜４２０頁；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉら（２００２年）Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓ．  ８巻：２１８５〜２１９９頁；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓら（１９９９年）Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ６巻：６５２〜６５６頁；ＳａｔｏおよびＳｏｎｅ（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３７１巻：６０３〜６０８頁；米国特許第６，３２６，４８２号参照のこと。
【００６９】
「特異的に」または「選択的に」結合するとは、リガンド／受容体、抗体／抗原またはその他の結合対に言及する場合、タンパク質およびその他の生物製剤の不均一の集団中のタンパク質の存在を決定するような結合反応を示す。したがって、指定された条件下では、指定のリガンドが、特定の受容体と結合し、サンプル中に存在するその他のタンパク質とは相当な量では結合しない。本明細書において用いる場合、抗体は、ＭＤＬ−１の配列を含むポリペプチドと結合するが、ＭＤＬ−１の配列を欠くタンパク質と結合しない場合に、所与の配列（この場合には、ＭＤＬ−１）を含むポリペプチドと特異的に結合すると言われる。例えば、ＭＤＬ−１を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体は、ＭＤＬ−１のＦＬＡＧ（登録商標）タグをつけた形と結合し得るが、その他のＦＬＡＧ（登録商標）タグをつけたタンパク質とは結合しない。
【００７０】
企図される方法の、抗体または抗体の抗原結合部位に由来する結合性組成物は、無関係の抗原との親和性よりも、少なくとも２倍高い、好ましくは、少なくとも１０倍高い、より好ましくは、少なくとも２０倍高い、および最も好ましくは、少なくとも１００倍高い親和性でその抗原と結合する。好ましい実施形態では、抗体は、約１０９リットル／ｍｏｌよりも高い親和性を有することが、例えば、スキャッチャード分析によって求められる。Ｍｕｎｓｅｎら（１９８０年）Ａｎａｌｙｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０７巻：２２０〜２３９頁。
【００７１】
ＩＩ．概要
本発明は、操作された抗ＭＤＬ−１抗体および免疫障害、特に、感染症および癌に対する応答の障害を処置するためのその使用を提供する。
【００７２】
これまでの研究によって、ＭＤＬ−１およびその他のＤＡＰ１２会合分子は、マイコバクテリア感染症に対する宿主応答の際に異なって発現されることがわかっている（例えば、Ａｏｋｉら（２００４年）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７２巻：２４７７〜２４８３頁参照のこと）。特に、ＭＤＬ−１発現は、マイコバクテリア感染の際にマクロファージにおいてアップレギュレートされた。これらのマクロファージのＩＦＮγ処置もまた、ＭＤＬ−１発現を増大させた。
【００７３】
ＵＳ２００６／００９９１４４およびＷＯ２００６／０５２９７５は両方とも、種々の癌細胞（例えば、黒色腫、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌および胃癌）におけるマクロファージによるＭＤＬ−１の発現の増大を記載している。したがって、本発明の抗体は、感染症および癌に応じた免疫系の刺激において有用であるはずである。さらにまた、本発明の抗体を用いてこれらの微生物感染症を取り除き、それによって敗血症の発生を防ぐことができる。
【００７４】
ＩＩＩ．ＭＤＬ−１特異的抗体の作製
モノクローナル抗体を作製するための任意の適した方法を使用してよい。例えば、レシピエントをＭＤＬ−１またはその断片で免疫化してもよい。任意の適した免疫化法を使用できる。このような方法として、アジュバント、その他の免疫賦活薬、反復追加免疫および１種または複数の免疫化経路の使用を含み得る。ＭＤＬ−１の任意の適した供給源を、本明細書に開示される組成物および方法の非ヒト抗体の作製のための免疫原として使用できる。このような形として、それだけには限らないが、当技術分野で公知の組換え、合成、化学的または酵素的分解手段によって作製した、全タンパク質、ペプチド類およびエピトープが挙げられる。好ましい実施形態では、免疫原はＭＤＬ−１の細胞外部分を含む。ＭＤＬ−１のドメイン構造は、Ｂａｋｋｅｒら上記；ＷＯ９９／０６５５７；およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＦ０２４９１において論じられている。短い細胞内領域が、配列番号６５の残基１および２を包含する。膜貫通領域は、配列番号６５の、およそ残基６から残基２７に連続していると同定されている。ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）中に見られる種類のＣ型レクチン様ドメインが、配列番号６５の、およそ残基７１から残基１８４に見られる。
【００７５】
任意の形の抗原を使用して、生物学的に活性な抗体を作製するのに十分である抗体を作製できる。したがって、誘発性抗原は、単独または当技術分野で公知の１種もしくは複数の免疫原性増強剤と組み合わせた、単一エピトープ、複数のエピトープもしくは全タンパク質であり得る。誘発性抗原は、単離全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、少なくとも抗原の部分がトランスフェクトされた細胞による免疫化）または可溶性タンパク質（例えば、タンパク質の細胞外ドメイン部分のみによる免疫化）であり得る。抗原は、遺伝子改変された細胞において産生され得る。抗原をコードするＤＮＡは、ゲノムのものである場合も、非ゲノムのもの（例えば、ｃＤＮＡ）である場合もあり、少なくとも細胞外ドメインの部分をコードする。本明細書において用いる場合、用語「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」とは、注目する抗原の免疫原性エピトープを構成するための、必要に応じて最小数のアミノ酸または核酸を指す。注目する細胞の形質転換に適した任意の遺伝子ベクター、例えば、それだけには限らないが、アデノウイルスベクター、プラスミドおよび非ウイルスベクター、例えば、カチオン性脂質を用いてもよい。
【００７６】
任意の適した方法を用いて、ＭＤＬ−１／ＤＡＰ１２シグナル伝達を増強する所望の生物学的特性を有する抗体を誘発できる。種々の哺乳類宿主、例えば、マウス、ラット、その他のげっ歯類、ヒト、その他の霊長類などから、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を調製することが望ましい。このようなモノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓら（編）ＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（第４版）Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ、ＣＡおよびそれに引用される参考文献；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６年）ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹに見ることができる。したがって、モノクローナル抗体は、当技術分野の研究者によく知られている種々の技術によって得ることができる。通常、所望の抗原で免疫化された動物から得た脾臓細胞を、普通は、骨髄腫細胞との融合によって不死化する。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６巻：５１１〜５１９頁参照のこと。不死化の代替法として、エプスタインバーウイルス、癌遺伝子またはレトロウイルスを用いる形質転換または当技術分野で公知のその他の方法が挙げられる。例えば、Ｄｏｙｌｅら（編１９９４年および定期的な増補）ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ：  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ参照のこと。単一の不死化細胞から生じたコロニーを、抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングし、このような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収率は、脊椎動物宿主の腹膜腔への注射をはじめとする種々の技術によって高めることができる。あるいは、例えば、Ｈｕｓｅら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６巻：１２７５〜１２８１頁によって概説される一般手順に従って、ヒトＢ細胞由来のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片をコードするＤＮＡ配列を単離してもよい。
【００７７】
その他の適した技術として、ファージまたは同様のベクターにおける抗体のライブラリーの選択が挙げられる。例えば、Ｈｕｓｅら上記；およびＷａｒｄら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１巻：５４４〜５４６頁参照のこと。改変を含むか含まない本発明のポリペプチドおよび抗体（キメラまたはヒト化抗体）を用いてもよい。ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質を共有結合または非共有結合のいずれかによって結合することによって標識することが多い。さまざまな標識およびコンジュゲーション技術が知られており、科学文献および特許文献の両方において広く報告されている。適した標識として、放射性核種、酵素、基質、補助因子、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許として、米国特許第３，８１７，８３７号；同３，８５０，７５２号；同３，９３９，３５０号；同３，９９６，３４５号；同４，２７７，４３７号；同４，２７５，１４９号；および同４，３６６，２４１号が挙げられる。また、組換え免疫グロブリンも製造でき、Ｃａｂｉｌｌｙ米国特許第４，８１６，５６７号；およびＱｕｅｅｎら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：１００２９〜１００３３頁参照のこと；またはトランスジェニックマウスにおいて作製され得、Ｍｅｎｄｅｚら（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５巻：１４６〜１５６頁参照のこと。また、ＡｂｇｅｎｉｘおよびＭｅｄａｒｅｘ技術も参照のこと。
【００７８】
ＭＤＬ−１の所定の断片に対する抗体または結合性組成物は、ポリペプチド、断片、ペプチドまたはエピトープの、担体タンパク質とのコンジュゲートを用いる動物の免疫化によって作製することができる。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常なまたは欠損のあるＭＤＬ−１との結合についてスクリーニングできる。これらのモノクローナル抗体は、通常、ＥＬＩＳＡによって測定される、通常、少なくとも約１μＭの、より通常は、少なくとも約３００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭ、３０ｐＭまたはそれより良好なＫｄで結合する。適した非ヒト抗体はまた、以下の実施例５および６に記載される生物学的アッセイを用いて同定できる。
【００７９】
抗体クローンＤＸ２３０、ＤＸ２４１、ＤＸ２４４、ＤＸ２４６およびＤＸ２９７を発現するハイブリドーマは、ブダペスト条約に従い、２００７年４月２３日に、それぞれ、受託番号ＰＴＡ−８３７３、ＰＴＡ−８３７４、ＰＴＡ−８３７５、ＰＴＡ−８３７６およびＰＴＡ−８３７７のもと、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ−Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ）に寄託された。抗体クローンＤＸ２３０、ＤＸ２３９およびＤＸ２４０を発現するハイブリドーマは、ブダペスト条約に従い、２００８年４月８日に、それぞれ、寄託番号ＰＴＡ−＿、ＰＴＡ−＿およびＰＴＡ−＿のもとＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ−Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）に寄託された。
【００８０】
ＩＶ．ＭＤＬ−１特異的抗体のヒト化
任意の適した非ヒト抗体を、超可変領域の供給源として使用することができる。非ヒト抗体の供給源として、それだけには限らないが、マウス（例えば、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ラット（例えば、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ウサギ目（例えば、ウサギ）、ウシおよび霊長類が挙げられる。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体において、またはドナー抗体において見られない残基を含む場合もある。これらの改変は、所望の生物活性の抗体性能をさらに改良するために行われる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１巻：５２２〜５２５頁；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻：３２３〜３２９頁；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２巻：５９３〜５９６頁参照のこと。
【００８１】
抗体を組換えによって操作する方法は、例えば、Ｂｏｓｓら（米国特許第４，８１６，３９７号）、Ｃａｂｉｌｌｙら（米国特許第４，８１６，５６７号）、Ｌａｗら（欧州特許出願公開第４３８３１０号）およびＷｉｎｔｅｒ（欧州特許出願公開第２３９４００号）によって記載されている。
【００８２】
ヒト化抗ＭＤＬ−１抗体のアミノ酸配列改変体は、ヒト化抗ＭＤＬ−１抗体ＤＮＡに適当なヌクレオチド変更を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。このような改変体として、例えば、ヒト化抗ＭＤＬ−１抗体について示されるアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはそれへの挿入および／またはその置換が挙げられる。最終構築物が、所望の特徴を有するという条件で、最終構築物に達するよう、欠失、挿入および置換の任意の組み合わせが行われる。アミノ酸変更はまた、グリコシル化部位の数または位置の変更などのヒト化抗ＭＤＬ−１抗体の翻訳後プロセスを変更し得る。
【００８３】
変異誘発にとって好ましい位置にある、ヒト化抗ＭＤＬ−１抗体ポリペプチドの特定の残基または領域を同定するための有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４巻：１０８１〜１０８５頁に記載されるような、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。本明細書において、残基または標的残基の群は、同定され（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの電荷を有する残基）、アミノ酸のＭＤＬ−１抗原との相互作用に影響を及ぼすよう、中性または負の電荷を有するアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置換される。次いで、置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸残基を、置換の部位にまたはその代わりに、さらなる改変体またはその他の改変体を導入することによって改良する。したがって、アミノ酸配列変動を導入する部位は予め決定されているが、変異の性質自体は、予め決定されている必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析するために、Ａｌａスキャニングまたはランダム変異誘発を、標的コドンまたは領域で実施し、発現されたヒト化抗ＭＤＬ−１抗体改変体を、所望の活性についてスクリーニングする。
【００８４】
アミノ酸配列挿入は、１残基〜１００個以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有するヒト化抗ＭＤＬ−１抗体またはエピトープタグと融合している抗体が挙げられる。ヒト化抗ＭＤＬ−１抗体分子の他の挿入改変体として、抗体の血清半減期を増大する酵素またはポリペプチドの、ヒト化抗ＭＤＬ−１抗体のＮまたはＣ末端との融合が挙げられる。
【００８５】
別の種類の改変体として、アミノ酸置換改変体がある。これらの改変体は、除去されるヒト化抗ＭＤＬ−１抗体分子中の少なくとも１個のアミノ酸残基と、その場所に挿入される異なる残基を有する。置換変異誘発のための最も注目される部位として、超可変ループが挙げられるが、ＦＲ変更も企図される。
【００８６】
抗体の別の種類のアミノ酸改変体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、抗体中に見られる１つまたは複数の炭水化物部分を欠失することおよび／または抗体中に存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖との連結を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分の、アスパラギン側鎖との酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在によって、グリコシル化部位の可能性が生じる。Ｏ結合型グリコシル化とは、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１種の、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはトレオニンとの連結を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用できる。
【００８７】
グリコシル化部位の抗体への付加は、上記のトリペプチド配列のうち１個または複数を含むようアミノ酸配列を変更することによって達成されることが好都合である（Ｎ結合型グリコシル化部位について）。変更はまた、元の抗体の配列への１個または複数のセリンまたはトレオニン残基の付加、またはそれによる置換によって行ってもよい（Ｏ結合型グリコシル化部位について）。
【００８８】
さらに別の種類のアミノ酸改変体として、最終ヒト化抗体のより大きな化学的安定性を提供するための残基の置換がある。例えば、アスパラギン（Ｎ）残基を変更して、げっ歯類ＣＤＲ内の任意のＮＧ配列でのイソアスパルテートの形成の可能性を低下させてもよい。同様の問題がＤＧ配列でも生じ得る。ＲｅｉｓｓｎｅｒおよびＡｓｗａｄ（２００３年）Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ６０巻：１２８１頁。イソアスパルテート形成は、抗体のその標的抗原との結合を弱らせる、または完全に抑制し得る。Ｐｒｅｓｔａ（２００５年）Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１６巻：７３４頁の７３１。一実施形態では、アスパラギンをグルタミン（Ｑ）に変更する。さらに、げっ歯類ＣＤＲ中のメチオニン残基を変更して、メチオニン硫黄が酸化される可能性（これは、抗原結合親和性を低下させ、また、最終抗体調製物における分子多様性の一因となり得る）を低下させてもよい。同上文献。一実施形態では、メチオニンがアラニン（Ａ）に変更される。続いて、このような置換を有する抗体を、置換がＭＤＬ−１結合親和性を許容されないレベルに低下させていないことを確実にするためにスクリーニングする。
【００８９】
ヒト化ＭＤＬ−１特異的抗体のアミノ酸配列改変体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の種々の方法によって調製する。これらの方法として、それだけには限らないが、天然供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列改変体の場合には）またはヒト化抗ＭＤＬ−１抗体の以前に調製された改変体または非改変体バージョンのヒト化抗ＭＤＬ−１抗体の、オリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発およびカセット変異誘発による調製が挙げられる。
【００９０】
通常、ヒト化抗ＭＤＬ−１抗体のアミノ酸配列改変体は、重鎖または軽鎖いずれかの元のヒト化抗体アミノ酸配列と少なくとも７５％の、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関して同一性または相同性とは、本明細書において、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後、いずれの保存的置換も配列同一性の部分とみなさない、ヒト化抗ＭＤＬ−１残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。Ｎ末端、Ｃ末端、または内部伸長、欠失または抗体配列中への挿入はいずれも、配列同一性または相同性に影響を及ぼすとはみなされない。
【００９１】
ヒト化抗体は、任意のクラスの免疫グロブリン、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥから選択され得る。抗体は、ＩｇＧ抗体であることが好ましい。ＩｇＧの任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を使用してよい。ＩｇＧアイソタイプの改変体もまた企図される。ヒト化抗体は、２つ以上のクラスまたはアイソタイプに由来する配列を含み得る。所望の生物活性を生じるのに必要な定常ドメイン配列の最適化は、実施例に記載される生物学的アッセイにおいて抗体をスクリーニングすることによって容易に達成される。
【００９２】
同様に、軽鎖のいずれかのクラスを、本明細書の組成物および方法において用いてもよい。具体的には、κ、λまたはそれらの改変体は、本組成物および方法において有用である。
【００９３】
非ヒト抗体由来のＣＤＲ配列の任意の適した部分を使用してよい。ＣＤＲ配列は、ＣＤＲ配列が、使用されるヒトおよび非ヒト抗体配列と別個であるよう、少なくとも１残基の置換、挿入または欠失によって変異誘発してもよい。このような変異は、最小であることが企図される。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも７５％が、より多くの場合は９０％、最も好ましくは、９５％を超えて非ヒトＣＤＲ残基のものと対応する。
【００９４】
ヒト抗体に由来するＦＲ配列の任意の適した部分を使用してもよい。ＦＲ配列は、ＦＲ配列が、使用されるヒトおよび非ヒト抗体配列と別個であるよう、少なくとも１個の残基の置換、挿入または欠失によって変異誘発してもよい。このような変異は、最小であることが企図される。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも７５％が、より多くの場合は、９０％、最も好ましくは、９５％、９８％または９９％を超えてヒトＦＲ残基のものと対応する。
【００９５】
ＣＤＲおよびＦＲ残基は、Ｋａｂａｔの標準配列定義に従って決定される。Ｋａｂａｔら（１９８７年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ。配列番号１〜８は、種々のげっ歯類抗ヒトＭＤＬ−１抗体の重鎖可変ドメイン配列を示し、配列番号９〜１６は、軽鎖可変ドメイン配列を表す。図１から４は、本発明の種々の抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインの配列の陣容を提供する。ＣＤＲが、図中に示されており、表１８に示されているように、個々のＣＤＲ配列は各々、独特の配列識別子とともに提示されている（配列番号１７〜６４）。
【００９６】
【表２】
2010526066.tif 000004
【００９７】
【表３】
2010526066.tif 000005
一実施形態では、ＣＤＲは、本明細書に開示される任意の単一配列ＣＤＲ（配列番号１７〜６４）の改変体を含み、この改変体は、表１のデータを用いて調べられるような、開示される配列に比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い保存的アミノ酸置換を含む。
【００９８】
また、キメラ抗体も企図される。上記のように、通常のキメラ抗体は、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応している配列と同一であるか、または相同である重鎖および／または軽鎖の部分を含み、一方で、鎖（複数の鎖）の残部は、別の種に由来する、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびにそれらが所望の生物活性を示す限り、このような抗体の断片中の対応する配列と同一または相同である。米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１巻：６８５１〜６８５５頁を参照のこと。
【００９９】
二重特異性抗体はまた、本方法および組成物において有用である。本明細書において用いる場合、用語「二重特異性抗体」とは、抗体、通常、少なくとも２種の異なる抗原性エピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体を指す。一実施形態では、エピトープは、同一抗原に由来するものである。別の実施形態では、エピトープは、２種の異なる抗原に由来するものである。二重特異性抗体を作製する方法は、当技術分野で公知である。例えば、二重特異性抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を用いて組換えによって製造できる。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら（１９８３年）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５巻：５３７〜３９頁参照のこと。あるいは、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製できる。例えば、Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９巻：８１頁参照のこと。二重特異性抗体は、二重特異性抗体断片を含む。例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０巻：６４４４〜４８頁、Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２巻：５３６８頁参照のこと。
【０１００】
さらに他の実施形態では、本明細書に提供されるＣＤＲに由来するヒト化ＶＬおよびＶＨ領域に種々の定常ドメインを付加してもよい。例えば、本発明の抗体（または断片）の特定の意図される使用がエフェクター機能の変更を求める場合には、ＩｇＧ１以外の重鎖定常ドメインを使用してもよい。ＩｇＧ１抗体は、長い半減期および補体活性化および抗体依存性細胞傷害などのエフェクター機能を提供するが、このような活性は、抗体のすべての使用にとって望ましいものではない場合がある。このような例では、例えば、ＩｇＧ４定常ドメインを用いてもよい。
【０１０１】
また、本発明の抗体の親の、操作された形を、化学的部分にコンジュゲートしてもよい。化学的部分は、とりわけ、ポリマー、放射性核種または細胞傷害性因子であり得る。化学的部分は、対象の身体において抗体分子の半減期を増大するポリマーであることが好ましい。適したポリマーとして、それだけには限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａまたは４０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ）、デキストランおよびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が挙げられる。Ｌｅｅら、（１９９９年）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  １０巻：９７３〜９８１頁）には、ＰＥＧがコンジュゲートされた一本鎖抗体が開示されている。Ｗｅｎら、（２００１年）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  １２巻：５４５〜５５３頁）には、抗体を、放射性金属キレート剤（ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ））と結合しているＰＥＧとコンジュゲートすることが開示されている。
【０１０２】
本発明の抗体および抗体断片またはＭＤＬ−１可溶性タンパク質またはその断片はまた、９９Ｔｃ，９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈおよび４０Ｋ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒおよび５６Ｆｅなどの標識とコンジュゲートしてもよい。
【０１０３】
本発明の抗体および抗体断片またはＭＤＬ−１可溶性タンパク質またはその断片はまた、蛍光または化学発光標識、例えば、希土類キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアン酸塩、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｐｈｔｈａｌａｄｅｈｙｄｅ）、フルオレスカミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール（ｌｕｍｉｎａｌ）標識、イソルミナール（ｉｓｏｌｕｍｉｎａｌ）標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジミウム（ａｃｒｉｄｉｍｉｕｍ）塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識および安定フリーラジカルなどのフルオロフォアとコンジュゲートしてもよい。
【０１０４】
本発明の抗体分子またはタンパク質分子を種々の部分とコンジュゲートするために当技術分野で公知の任意の方法、例えば、Ｈｕｎｔｅｒら、（１９６２年）Ｎａｔｕｒｅ  １４４巻：９４５頁；Ｄａｖｉｄら、（１９７４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３巻：１０１４頁；Ｐａｉｎら、（１９８１年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ４０巻：２１９頁；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．、（１９８２年）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ３０巻：４０７頁に記載される方法を使用してよい。抗体およびタンパク質をコンジュゲートする方法は従来のものであり、当技術分野で極めてよく知られている。
【０１０５】
Ｖ．ヒト化抗ＭＤＬ−１抗体の生物活性
本明細書においてヒト化抗ＭＤＬ−１抗体において望ましいものであると同定される特徴を有する抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害性生物活性または適した結合親和性についてスクリーニングできる。アゴニスト抗体は、実施例５で提供される生物学的アッセイを用いてアンタゴニスト抗体と区別できる。アゴニスト活性を示す抗体は、ＭＤＬ−１および／またはＤＡＰ１２の活性を妨げないが、代わりに、ＭＤＬ−１によって通常引き起こされる応答を刺激する。
【０１０６】
注目する抗体によって結合されているヒトＭＤＬ−１上のエピトープと結合する抗体（例えば、ＭＤＬ−１の結合を妨げるもの）をスクリーニングするために、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編（１９８８年）に記載されるものなどの通常のクロスブロッキングアッセイを実施してよい。同一のエピトープと結合する抗体は、このようなアッセイにおいてクロスブロッキングする可能性が高いが、クロスブロッキングは、重複するエピトープまたはさらに、近くの重複しないエピトープと結合する抗体による抗体結合の立体障害に起因し得るので、すべてのクロスブロッキング抗体が必ずしも正確に同一エピトープで結合するわけではない。
【０１０７】
あるいは、例えば、Ｃｈａｍｐｅら（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０巻：１３８８〜１３９４頁に記載されるエピトープマッピングを実施して、抗体が注目するエピトープと結合するかどうかを調べることができる。ヒトＭＤＬ−１において、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４巻：１０８１〜１０８５頁によって記載される「アラニンスキャニング変異誘発」またはいくつかのその他の形のアミノ酸残基の点突然変異誘発を使用して、本発明の抗ＭＤＬ−１抗体に対する機能的エピトープを調べてもよい。しかし、変異誘発研究はまた、ＭＤＬ−１の三次元構造全体にとって極めて重要であるが、抗体−抗原接触に直接的には関与していないアミノ酸残基を明らかにする場合もあり、したがって、この方法を用いて決定された機能的エピトープを確認するのにその他の方法が必要である場合がある。
【０１０８】
特異的抗体によって結合されるエピトープはまた、抗体の、ヒトＭＤＬ−１の断片（配列番号４１）を含むペプチドとの結合を評価することによって決定することができる。ＭＤＬ−１の配列を包含する一連の重複ペプチドを合成し、例えば、直接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ（ペプチドは、抗体と、マイクロタイタープレートのウェルと結合しているＭＤＬ−１との結合を妨げるその能力について評価される）において、またはチップで結合についてスクリーニングしてもよい。このようなペプチドスクリーニング法は、いくつかの不連続の機能的エピトープ、すなわち、ＭＤＬ−１ポリペプチド鎖の一次配列に沿って連続していないアミノ酸残基を含む機能的エピトープを検出できない場合がある。
【０１０９】
本発明の抗体によって結合されるエピトープはまた、Ｘ線結晶構造決定（例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３）、分子モデリングおよび核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、例えば、遊離している場合および注目する抗体との複合体中に結合されている場合のＭＤＬ−１中の不安定なアミド水素のＨ−Ｄ交換速度のＮＭＲ測定（Ｚｉｎｎ−Ｊｕｓｔｉｎら（１９９２年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１巻：１１３３５〜１１３４７頁；Ｚｉｎｎ−Ｊｕｓｔｉｎら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２巻：６８８４〜６８９１頁）などの構造的な方法によって決定することもできる。
【０１１０】
Ｘ線結晶学に関しては、結晶化は、任意の当技術分野で公知の方法（例えば、Ｇｉｅｇｅら（１９９４年）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ５０巻：３３９〜３５０頁；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９９０年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １８９巻：１〜２３頁）、例えば、マイクロバッチ（例えばＣｈａｙｅｎ（１９９７年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５巻：１２６９〜１２７４頁）、懸滴蒸気拡散（例えば、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９７６年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５１巻：６３００〜６３０３頁）、種晶添加および透析を用いて達成すればよい。少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するタンパク質調製物を使用することが望ましい。結晶化は、ポリエチレングリコール１０００〜２０，０００（ＰＥＧ；約１０００〜約２０，０００Ｄａの範囲の平均分子量）、好ましくは、約５０００〜約７０００Ｄａ、より好ましくは、約６０００Ｄａを含有し、約１０％〜約３０％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度を有する沈殿剤溶液中で最良に達成され得る。また、タンパク質安定化剤、例えば、グリセロールを、約０．５％〜約２０％の範囲の濃度で含むことも望ましいことであり得る。塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはクエン酸ナトリウムなどの適した塩も、好ましくは、約１ｍＭ〜約１０００ｍＭの範囲の濃度で沈殿剤溶液中にあることが望ましいことであり得る。沈殿剤は、約３．０〜約５．０、好ましくは、約４．０のｐＨに緩衝化されることが好ましい。沈殿剤溶液中で有用な特定のバッファーは変わる場合があり、当技術分野では周知である。Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版（１９９４年）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。有用なバッファーの例として、それだけには限らないが、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳおよび酢酸塩が挙げられる。結晶は、広範囲の温度、例えば、２℃、４℃、８℃および２６℃で成長させてもよい。
【０１１１】
抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を用いて研究してもよく、Ｘ−ＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１９９２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．によって配布された；例えば、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８５年）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １１４＆１１５、Ｈ．Ｗ．Ｗｙｃｋｏｆｆら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；米国特許出願公開第２００４／００１４１９４号）およびＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ（１９９３年）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  Ｄ４９巻：３７〜６０頁；Ｂｒｉｃｏｇｎｅ（１９９７年）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２７６Ａ巻：３６１〜４２３頁、Ｃａｒｔｅｒ＆Ｓｗｅｅｔ編；Ｒｏｖｅｒｓｉら（２０００年）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  Ｄ５６巻：１３１３〜１３２３頁参照のこと）などのコンピュータソフトウェアを用いて改良してもよい。
【０１１２】
本発明の抗体と同一のエピトープとのさらなる抗体結合は、例えば、エピトープとの結合についての、ＭＤＬ−１に対する抗体のスクリーニングによって、またはエピトープ配列を含むヒトＭＤＬ−１の断片を含むペプチドでの動物の免疫化によって得ることができる。同一の機能的エピトープと結合する抗体は、受容体結合を妨げることなどの同様の生物活性を示すと予測され得、このような活性は、抗体の機能的アッセイによって確認することができる。
【０１１３】
抗体親和性は、標準的な分析を用いて調べることができる。好ましいヒト化抗体として、約１×１０−７以下；好ましくは、約１×１０−８以下；より好ましくは、約１×１０−９以下；最も好ましくは、約１×１０−１０以下、または１×１０−１１ＭでさえのＫｄ値でヒトＭＤＬ−１と結合するものがある。
【０１１４】
本組成物および方法において有用な抗体およびその断片は、生物学的に活性な抗体および断片である。本明細書において用いる場合、用語「生物学的に活性な」とは、所望の抗原性エピトープを結合し、生物学的効果を直接的または間接的に発揮できる抗体または抗体断片を指す。本明細書において用いる場合、用語「特異的に」とは、抗体の、標的抗原エピトープとの選択的結合を指す。抗体は、所与の条件のセット下で、ＭＤＬ−１との結合を無関係の抗原または抗原混合物との結合と比較することによって結合の特異性について試験できる。抗体が無関係の抗原または抗原混合物よりも少なくとも１０倍、好ましくは、５０倍多くＭＤＬ−１と結合する場合に、特異的であるとみなす。ＭＤＬ−１と「特異的に結合する」抗体は、ＭＤＬ−１由来配列を含まないタンパク質とは結合しない、すなわち、「特異性」とは、本明細書において用いる場合、ＭＤＬ−１特異性に関連し、問題のタンパク質中に存在し得る任意のその他の配列には関連しない。例えば、本明細書において用いる場合、ＭＤＬ−１を含むポリペプチドと「特異的に結合する」抗体は、通常、ＭＤＬ−１およびＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドタグを含む融合タンパク質であるＦＬＡＧ（登録商標）−ＭＤＬ−１と結合するが、単独またはＭＤＬ−１以外のタンパク質と融合しているＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドタグとは結合しない。
【０１１５】
アゴニスト性ＭＤＬ−１特異的抗体などの本発明のＭＤＬ−１特異的結合性化合物は、それだけには限らないが、微生物感染に対する免疫応答を増大することをはじめとするいかなる様式によってもその生物活性を増強し得る。
【０１１６】
ＶＩ．薬剤組成物
ＭＤＬ−１抗体、サイトカイン類似体またはムテインを含む薬剤組成物または滅菌組成物を調製するために、それに対する抗体またはその核酸を、製薬上許容される担体または賦形剤と混合する。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓおよび米国薬局方：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８４年）参照のこと。
【０１１７】
治療薬および診断薬の処方物は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形の、生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって調製してもよい。例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１年）ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒおよびＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００年）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ参照のこと。
【０１１８】
単独または、免疫抑制薬と組み合わせて投与される抗体組成物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効である用量）を調べるために、細胞培養物または実験動物において標準の製薬手順によって調べることができる。毒性作用および治療効果の間の用量割合は、治療指数であり、ＥＤ５０に対するＬＤ５０の割合として表すことができる。高い治療指数を示す抗体が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトにおいて使用するための投与量範囲の処方において用いることができる。このような化合物の投与量は、毒性をほとんど有さないか、全く有さないでＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用される投与剤型および投与経路に応じて、この範囲内で変わり得る。
【０１１９】
投与様式は、特に重要ではない。適した投与経路として、例えば、経口、直腸、経粘膜または腸内投与；非経口送達、例えば、筋肉内、皮下、髄内注射ならびに鞘内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、直接の室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射が挙げられる。薬剤組成物に用いられる、または本発明の方法を実施する抗体の投与は、経口摂取、吸入、局所適用または皮膚、皮下、腹腔内、非経口、動脈内または静脈内注射などの種々の従来法で実施してよい。
【０１２０】
あるいは、全身的な様式よりも局所的な様式で、例えば、関節炎の関節または免疫病理学によって特性決定される病原体によって誘発された病変への、多くは、デポー製剤または持続放出処方物中の抗体の直接的な注射によって抗体を投与してもよい。さらに、標的化薬物送達系で、例えば、関節炎の関節または免疫病理学によって特性決定される病原体によって誘発された病変を標的とする、例えば組織特異的抗体でコーティングされたリポソームで抗体を投与してもよい。リポソームは、ターゲッティングされ、罹患組織によって選択的に吸収される。
【０１２１】
治療薬のための投与計画の選択は、実体の血清または組織代謝回転速度、症状のレベル、実体の免疫原性および生物学的マトリックス中の標的細胞の到達性をはじめとするいくつかの因子に応じて変わる。投与計画は、許容されるレベルの副作用と整合性がとれる患者に送達される治療薬の量を最大にすることが好ましい。したがって、送達される生物製剤の量は、幾分かは、個々の実体および処置されている状態の重症度に応じて変わる。抗体、サイトカインおよび小分子の適当な用量の選択における指針は、入手可能である。例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６年）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．  Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）（１９９１年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｂａｃｈ（編）（１９９３年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｂａｅｒｔら（２００３年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４８巻：６０１〜６０８頁；Ｍｉｌｇｒｏｍら（１９９９年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４１巻：１９６６〜１９７３頁；Ｓｌａｍｏｎら（２００１年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４４巻：７８３〜７９２頁；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら（２０００年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４２巻：６１３〜６１９頁；Ｇｈｏｓｈら（２００３年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４８巻：２４〜３２頁；Ｌｉｐｓｋｙら（２０００年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４３巻：１５９４〜１６０２頁参照のこと。
【０１２２】
適当な用量の決定は、例えば、当技術分野で、処置に影響を及ぼすと知られている、もしくは疑われる、または処置に影響を及ぼすと予測されるパラメータまたは因子を用いることによって臨床医によって行われる。一般に、用量は、最適用量よりも幾分か少ない量で開始し、その後、任意のマイナスの副作用と比較して所望のまたは最適効果が達成されるまで少しずつ増量する。重要な診断手段として、例えば、炎症の症状のものまたは産生された炎症性サイトカインのレベルが挙げられる。使用される生物製剤は、実質的に、処置の標的とされる動物と同一の種に由来し（例えば、ヒト対象の処置のためのヒト化抗体）、それによって、試薬に対する任意の免疫応答を最小化することが好ましい。
【０１２３】
抗体、抗体断片およびサイトカインは、連続注入によって、または例えば、１日、１週間に１〜７回、１週間、２週間、１カ月、２カ月などの間隔での用量によって提供され得る。用量は、静脈内に、皮下に、局所に、経口的に、鼻腔に、直腸に、筋肉内に、脳内に、髄腔内に、または吸入によって提供してよい。好ましい用量プロトコールは、重大な望ましくない副作用を避ける最大用量または用量頻度に関するものである。総週間用量は、通常、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、０．２μｇ／ｋｇ体重、０．５μｇ／ｋｇ体重、１μｇ／ｋｇ体重、１０μｇ／ｋｇ体重、１００μｇ／ｋｇ体重、０．２ｍｇ／ｋｇ体重、１．０ｍｇ／ｋｇ体重、２．０ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重、２５ｍｇ／ｋｇ体重、５０ｍｇ／ｋｇ体重またはそれより多い。例えば、Ｙａｎｇら（２００３年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４９巻：４２７〜４３４頁；Ｈｅｒｏｌｄら（２００２年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４６巻：１６９２〜１６９８頁；Ｌｉｕら（１９９９年）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｐｓｙｃｈ．  ６７巻：４５１〜４５６頁；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ５２巻：１３３〜１４４頁参照のこと。所望の用量の小分子治療薬、例えば、ペプチドミメティック、天然産物または有機化学物質は、モル／ｋｇベースで、抗体またはポリペプチドについてとほぼ同じである。
【０１２４】
本明細書において用いる場合、「阻害する」または「処置する」または「処置」とは、自己免疫疾患または病原体によって誘発された免疫病理と関連している症状の発生の延期および／または発生する、もしくは発生すると予測されるこのような症状の重症度の低下を含む。この用語は、既存の制御されない、または望まれない自己免疫関連または病原体によって誘発された免疫病理症状を回復すること、さらなる症状を予防することおよびこのような症状の根本的な原因を改善または予防することをさらに含む。したがって、この用語は、自己免疫もしくは病原体によって誘発される免疫病理疾患もしくは症状を有する、またはこのような疾患もしくは症状が発生する可能性を有する脊椎動物対象に、有益な結果が付与されたことを表す。
【０１２５】
本明細書において用いる場合、用語「治療上有効な量」または「有効量」とは、細胞、組織または対象に、単独またはさらなる治療薬と組み合わせて投与された場合に、自己免疫疾患もしくは病原体によって誘発される免疫病理関連疾患もしくは状態または疾患の進行を予防もしくは回復させるのに有効である、ＭＤＬ−１特異的結合性化合物、例えば、抗体の量を指す。治療上有効な用量とは、さらに、症状の回復、例えば、関連の医学的状態の処置、治癒、予防もしくは回復、またはこのような状態の処置、治癒、予防もしくは回復の速度の増大をもたらすのに十分な化合物の量を指す。単独で投与される個々の活性成分に適用される場合には、治療上有効な用量とは、その成分単独を指す。組み合わせに適用される場合には、治療上有効な用量とは、組み合わせて投与されるか、逐次投与されるか、または同時に投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分の組み合わせた量を指す。有効量の治療薬は、症状を、通常、少なくとも１０％、普通は、少なくとも２０％、好ましくは、少なくとも約３０％、より好ましくは、少なくとも４０％、最も好ましくは、少なくとも５０％低減する。
【０１２６】
第２の治療薬、例えば、サイトカイン、抗体、ステロイド、化学療法薬、抗生物質または放射線照射と同時投与または処置する方法は、当技術分野では周知であり、例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（編）（２００１年）ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１０版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；ＰｏｏｌｅおよびＰｅｔｅｒｓｏｎ（編）（２００１年）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａ．、ＰＡ；ＣｈａｂｎｅｒおよびＬｏｎｇｏ（編）（２００１年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａ．、ＰＡ参照のこと。抗生物質として、公知の抗菌剤、抗真菌剤および抗ウイルス剤を挙げることができる。抗菌剤として、それだけには限らないが、細胞壁合成を阻害するβラクタム剤、例えば、ペニシリン、セファロスポリン、セファマイシン、カルボペネム（ｃａｒｂｏｐｅｎｅｍｓ）、モノバクタム；および細胞壁合成を阻害する非βラクタム剤、例えば、バンコマイシンおよびテイコプラニンを挙げることができる。その他の抗生物質は、タンパク質および核酸合成などの細胞活性を阻害し得る。これらの薬剤として、それだけには限らないが、マクロライド、テトラサイクリン、アミノグリコシド、クロラムフェニコール、フシジン酸ナトリウム、スルホンアミド、キノロンおよびアゾールが挙げられる。
【０１２７】
公知の抗真菌薬として、それだけには限らないが、アリルアミンおよびその他の非アゾールエルゴステロール生合成阻害剤、例えば、テルビナフィン；代謝拮抗薬、例えば、フルシトシン；アゾール、例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾールおよびボリコナゾール；グルカン合成阻害剤、例えば、カスポファンギン、ミカファンギンおよびアニデュラファンギン；ポリエン、例えば、アンホテリシンＢ、アンホテリシンＢ脂質複合体（ＡＢＬＣ）、アンホテリシンＢコロイド分散物（ＡＢＣＤ）、リポソームアンホテリシンＢ（Ｌ−ＡＭＢ）およびリポソームナイスタチン；およびその他の全身性薬剤、例えば、グリセオフルビンが挙げられる。
【０１２８】
抗ウイルス薬として、ウイルスを破壊する任意の薬物が挙げられる。抗ウイルス薬として、ウイルスの複製を阻害するよう機能するインターフェロン、プロテアーゼ阻害剤および逆転写酵素阻害剤を挙げることができる。
【０１２９】
通常の獣医学の、実験用または研究用対象として、サル、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ウマおよびヒトが挙げられる。
【０１３０】
ＶＩＩ．抗体作製
一実施形態では、本発明の抗体の組換え製造のために、２種の鎖をコードする核酸を、単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、または発現のために、１種または複数の複製可能なベクターに挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離され、配列決定される。多数のベクターが利用可能である。ベクター成分は、通常、それだけには限らないが、以下のうち１種または複数を含む：シグナル配列、複製起点、１種または複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列。一実施形態では、本発明のヒト化抗ＭＤＬ−１抗体の軽鎖および重鎖の両方が、同一ベクター、例えば、プラスミドまたはアデノウイルスベクターから発現される。
【０１３１】
本発明の抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって製造してよい。一実施形態では、抗体は、培養物中の哺乳類細胞または昆虫細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、マウス骨髄腫ＮＳＯ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣（Ｓｆ９）細胞で発現される。一実施形態では、ＣＨＯ細胞から分泌された抗体を回収し、プロテインＡ、陽イオン交換、陰イオン交換、疎水性相互作用およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの標準的なクロマトグラフィー法によって精製する。得られた抗体を濃縮し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中で保存する。
【０１３２】
別の実施形態では、本発明の抗体を、ＷＯ２００５／０４０３９５に記載される方法に従って酵母において製造する。手短には、注目する抗体の個々の軽鎖または重鎖をコードするベクターを、種々の酵母ハプロイド細胞、例えば、種々の接合型の酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓに導入し、この酵母ハプロイド細胞は場合により、補完的栄養要求株である。次いで、形質転換されたハプロイド酵母細胞を接合し、または融合して、重鎖および軽鎖の両方を産生できる二倍体酵母細胞を得ることができる。その結果、二倍体株は、完全に構築され、生物学的に活性な抗体を分泌できる。２つの鎖の相対発現レベルは、例えば、異なるコピー数のベクターを用いること、異なる強度の転写プロモーターを用いることまたは鎖の一方または両方をコードする遺伝子の誘導可能プロモーターが駆動する転写からの発現を誘導することによって最適化することができる。
【０１３３】
一実施形態では、複数の異なる抗ＭＤＬ−１抗体（「元の」抗体）のそれぞれの重鎖および軽鎖を、酵母ハプロイド細胞に導入し、複数の軽鎖を発現する１つの接合型のハプロイド酵母株のライブラリー、および複数の重鎖を発現する異なる接合型のハプロイド酵母株のライブラリーを作製する。ハプロイド株のこれらのライブラリーを接合させ（またはスフェロプラストとして融合させ）、種々の可能性ある置換の軽鎖および重鎖からなる抗体のコンビナトリアルライブラリーを発現する一連の二倍体酵母細胞を作製できる。次いで、抗体のコンビナトリアルライブラリーを、任意の抗体が、元の抗体のものよりも優れた特性（例えば、ＭＤＬ−１に対するより高い親和性）を有するかどうかを調べるためにスクリーニングできる。例えば、ＷＯ２００５／０４０３９５を参照のこと。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明の抗体は、約１３ｋＤａの分子量のポリペプチド中に抗体可変ドメインの部分が連結しているヒトドメイン抗体である。例えば、米国特許公開第２００４／０１１０９４１号参照のこと。このような単一ドメインの、低分子量の薬剤は、合成の容易さ、安定性および投与経路の観点から多数の利点を提供する。
【０１３５】
ＶＩＩＩ．使用
本発明は、炎症性障害および状態、例えば、感染症および癌の処置および診断のために、抗ＭＤＬ−１抗体およびその断片を用いる方法を提供する。
【０１３６】
本発明は、対照から得た、好ましくは、同種の細胞、組織または体液におけるＭＤＬ−１レベルと比較した、試験細胞、組織または体液におけるＭＤＬ−１の発現レベルを分析することによって、微生物感染または癌の存在を診断する方法を提供する。本明細書において実証されるように、例えば、対照に対して、患者におけるＭＤＬ−１発現レベルの増大は、癌または微生物感染の存在と関連している。
【０１３７】
通常、定量的診断アッセイについて、試験された患者が癌または感染症を有することを示す陽性結果は、細胞、組織または体液が、少なくとも２倍高い、５倍高い、１０倍高い、１５倍高い、２０倍高い、２５倍高いＭＤＬ−１発現レベルを有するものである。
【０１３８】
宿主に由来するサンプル中の本発明のＭＤＬ−１などの遺伝子レベルおよびタンパク質発現のレベルを調べるために使用してよいアッセイ技術は、当業者には周知である。このようなアッセイ法として、ラジオイムノアッセイ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、定量的リアルタイムＰＣＲアッセイ、免疫組織化学アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイおよびフローサイトメトリーアッセイ、例えば、腫瘍関連マクロファージのＭ２対Ｍ１表現型検査のための２色ＦＡＣＳ分析（Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、（２００２年）ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３巻：５４９〜５５５頁）が挙げられる。
【０１３９】
ＥＬＩＳＡアッセイは、最初、ＭＤＬ−１に特異的な、本発明の抗体、好ましくは、ＤＸ２３０、ＤＸ２４１、ＤＸ２４４、ＤＸ２４６およびＤＸ２９７（まとめて「ＭＤＬ−１抗体」）を調製することを含む。さらに、通常、ＭＤＬ−１と特異的に結合するレポーター抗体を調製する。レポーター抗体は、放射活性、蛍光または酵素的試薬、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼなどの検出可能な試薬と結合している。
【０１４０】
ＥＬＩＳＡを実施するために、上記の少なくとも１種のＭＤＬ−１抗体を、固体支持体、例えば、抗体と結合するポリスチレンディッシュ上でインキュベートする。次いで、ウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質とともにインキュベートすることによって、ディッシュ上の任意の遊離タンパク質結合部位を覆う。次いで、分析されるべきサンプルを、ディッシュ中でインキュベートし、その時間の間にＭＤＬ−１は、ポリスチレンディッシュと結合している特異的ＭＤＬ−１抗体と結合する。結合していないサンプルを、バッファーで洗浄除去する。ＭＤＬ−１に特異的に向けられ、西洋ワサビペルオキシダーゼに連結されているレポーター抗体をディッシュ中に入れ、その結果、レポーター抗体の、ＭＤＬ−１と結合している任意のモノクローナル抗体との結合が得られる。次いで、結合していないレポーター抗体を洗浄除去する。次いで、ペルオキシダーゼ活性のための試薬、例えば、熱量測定基質をディッシュに加える。ＭＤＬ−１抗体と連結している固定化されたペルオキシダーゼは、有色の反応生成物を生成する。所与の期間に発生した発色量は、サンプル中に存在するＭＤＬ−１タンパク質の量に比例する。定量的結果は、通常、標準曲線に対する参照によって得られる。
【０１４１】
競合アッセイを用いてもよく、ＭＤＬ−１に特異的な抗体が固体支持体に結合されており、標識されたＭＤＬ−１および宿主由来のサンプルを固体支持体上を通過させ、固体支持体に結合された検出された標識の量は、サンプル中のＭＤＬ−１の量と相関があり得る。
【０１４２】
上記の試験を、種々の細胞、体液および／または組織抽出物に由来するサンプル、例えば、患者から得たホモジネートまたは可溶化した組織で実施してよい。組織抽出物は、組織生検および剖検材料から日常的に得られる。本発明において有用な体液として、血液、尿、唾液または任意のその他の体分泌液またはその誘導体が挙げられる。用語「血液」とは、全血、血漿、血清または任意の血液の誘導体を含むものを意味する。
【０１４３】
本発明の広い範囲は、以下の実施例を参照して最良に理解されるが、これは本発明を特定の実施形態に制限しようとするものではない。本明細書に記載される特定の実施形態は、単に例示目的として提示されるのであって、本発明は、添付の特許請求の範囲の用語およびこのような特許請求の範囲に与えられる等価物の全範囲によって制限されるべきである。
【実施例】
【０１４４】
（実施例１）
一般法
分子生物学における標準法は記載されている。Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ｗｕ（１９９３年）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、第２１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ。標準法はまた、Ａｕｓｂｅｌら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１〜４巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹにも掲載されており、これには、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ変異誘発（第１巻）、哺乳類細胞および酵母におけるクローニング（第２巻）、複合糖質およびタンパク質発現（第３巻）およびバイオインフォマティクス（第４巻）が記載されている。
【０１４５】
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化をはじめとするタンパク質精製のための方法が記載されている。Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の製造、タンパク質のグリコシル化が記載されている。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ、１６．０．５〜１６．２２．１７頁；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃｏ．（２００１年）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；４５〜８９頁；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１年）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、３８４〜３９１頁参照のこと。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造、精製および断片化が記載されている。Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９年）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記。リガンド／受容体相互作用を特性決定するための標準技術は利用可能である。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照のこと。
【０１４６】
蛍光活性化セルソーター検出システム（ＦＡＣＳ（登録商標））をはじめとするフローサイトメトリーのための方法が利用可能である。例えば、Ｏｗｅｎｓら（１９９４年）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１年）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、第２版；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３年）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ参照のこと。たとえば診断試薬として使用するための、核酸プライマーおよびプローブを含めた核酸、ポリペプチドならびに抗体を改変するために適した蛍光試薬が利用可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００３年）カタログ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３年）カタログ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ。
【０１４７】
免疫系の組織学の標準法が記載されている。例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（編）（１９８６年）Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｈｉａｔｔら（２０００年）Ｃｏｌｏｒ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａ、ＰＡ；Ｌｏｕｉｓら（２００２年）Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ａｔｌａｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ参照のこと。
【０１４８】
例えば、抗原性断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能性ドメイン、グリコシル化部位および配列アラインメントを調べるためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが利用可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ベクターＮＴＩ（登録商標）一式（Ｉｎｆｏｒｍａｘ、Ｉｎｃ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）；ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ  Ｃｏｒｐ．、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂａｙ、Ｎｅｖａｄａ）；Ｍｅｎｎｅら（２０００年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６巻：７４１〜７４２頁；Ｍｅｎｎｅら（２０００年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｎｏｔｅ  １６巻：７４１〜７４２頁；Ｗｒｅｎら（２００２年）Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄ．  ６８巻：１７７〜１８１頁；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３３巻：１７〜２１頁；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４巻：４６８３〜４６９０頁参照。
【０１４９】
（実施例２）
抗ヒトＭＤＬ−１抗体のヒト化
抗体のヒト化は、例えば、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００５／０４７３２４およびＷＯ２００５／０４７３２６に大まかに記載されている。
【０１５０】
手短には、非ヒトＶＨドメインのアミノ酸配列（例えば、配列番号１〜５）を、５種のヒトＶＨ生殖系列アミノ酸配列の群；亜群ＩＧＨＶ１およびＩＧＨＶ４に由来する１種の代表および亜群ＩＧＨＶ３に由来する３種の代表の群に対して比較する。ＶＨ亜群は、Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ（２００１年）「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｅａｖｙ  （ＩＧＨ）  Ｇｅｎｅｓ」、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８巻：１００〜１１６頁に列挙されている。最も密接なマッチを有するヒト生殖系列配列のフレームワーク配列を用いてヒト化ＶＨドメインを構築する。
【０１５１】
本明細書に開示されるげっ歯類抗ｈｕＭＤＬ−１抗体は、すべてＶＬのκサブクラスである。非ヒトＶＬドメインのアミノ酸配列（例えば、配列番号６〜１０）を、４種のヒトＶＬκ生殖系列アミノ酸配列の群に対して比較する。４種の群は、Ｖ．Ｂａｒｂｉｅ＆Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ（１９９８年）「Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｋａｐｐａ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  （ＩＧＫＶ）  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｉｎｇ  （ＩＧＫＪ）  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ」、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５巻：１７１〜１８３頁およびＭ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ（２００１年）「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｋａｐｐａ（ＩＧＫ）  Ｇｅｎｅｓ」、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８巻：１６１〜１７４頁に列挙される４種の確立されたヒトＶＬ亜群の各々に由来する１種の代表からなる。４種の亜群はまた、Ｋａｂａｔら（１９９１年第５版）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」米国保険社会福祉省（Ｕ．  Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ刊行物９１−３２４２、１０３〜１３０頁に列挙される４種の亜群に対応する。最も密接なマッチを有するヒト生殖系列配列のフレームワーク配列を用いて、ヒト化ＶＬドメインを構築する。
【０１５２】
可変重鎖および可変軽鎖の標的アミノ酸配列が決定されると、全長ヒト化抗体をコードするプラスミドを作製できる。プラスミド配列は、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発を用いて変更し（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ  Ｔ  Ａ．（１９８５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  ８２巻：４８８〜４９２頁参照のこと）、標的ヒト化抗体配列に対するＤＮＡ配列を変更してもよい。同時に、コドン最適化を実施して、潜在的に最適の発現を提供してもよい。
【０１５３】
（実施例３）
ＫｉｎＥｘＡ技術を用いた抗ヒトＭＤＬ−１抗体の平衡解離定数（Ｋｄ）の決定
ＫｉｎＥｘＡ３０００、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｉｓｅ  Ｉｄａｈｏ、ＵＳＡ機器を用いて、抗ヒトＭＤＬ−１抗体の平衡解離定数（Ｋｄ）を決定する。ＫｉｎＥｘＡは、抗体、抗原および抗体−抗原複合体の混合物中の複合体を形成していない抗体の濃度を測定することに基づく結合平衡除外（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）アッセイ法の原則を用いている。遊離抗体の濃度は、混合物を、固相に固定化された抗原に極めて短期間曝露することによって測定する。実際には、これは、液相抗原−抗体混合物を、フローセル中に捕獲された抗原がコーティングされた粒子に流すことによって達成される。機器によって作成されたデータを、カスタムソフトウェアを用いて分析する。以下の仮説に基づく数学理論を用いて平衡定数を算出する：
１．結合は、平衡についての可逆性結合方程式に従う：
ｋｏｎ［Ａｂ］［Ａｇ］＝ｋｏｆｆ［ＡｂＡｇ］
２．抗体および抗原は、１：１結合し、総抗体は、抗原−抗体複合体および遊離抗体に等しい。
【０１５４】
３．機器シグナルは、遊離抗体の濃度と直線的に相関している。
【０１５５】
ＰＭＭＡ粒子（Ｓａｐｉｄｙｎｅ、カタログ番号４４０１９８）を、ビオチン化ＭＤＬ−１（またはその断片、例えば、細胞外ドメイン）を用い、Ｓａｐｉｄｙｎｅ「Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏａｔｉｎｇ  ＰＭＭＡ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｓｈｏｒｔ  ｏｒ  ｎｏｎｅｘｉｓｔｅｎｔ  ｌｉｎｋｅｒ  ａｒｍｓ」に従ってコーティングする。ＭＤＬ−１のビオチン化にはＥＺ連結ＴＦＰ  ＰＥＯ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１２１９）を、製造業者の推奨（Ｐｉｅｒｃｅ報告書（ｂｕｌｌｅｔｉｎ）０８７４）の通りに用いる。
【０１５６】
（実施例４）
ＢＩＡｃｏｒｅ技術を用いるヒト化抗ヒトＭＤＬ−１抗体の平衡解離定数（Ｋｄ）の測定
ＢＩＡｃｏｒｅ測定は、本質的に、同時係属の同一出願人による米国特許出願第１１／５１１，６３５号（２００６年８月２９日に出願された）の実施例４に記載されるように実施する。手短には、リガンド（抗ＭＤＬ−１−ｈＩｇ）を、標準アミンカップリング手順を用いてＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップ上に固定化する。種々の相互作用の速度論定数（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）をＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．１を用いて求める。Ｋｄを、算出された解離および会合速度定数を用いて求める。
【０１５７】
抗体ＤＸ２３０、ＤＸ２４１、ＤＸ２４４、ＤＸ２４６、ＤＸ２３３、ＤＸ２３９およびＤＸ２４０は、以下のＫｄ値を有していた：
【０１５８】
【表４】
2010526066.tif 000006
抗体ＤＸ２３３、ＤＸ２３９およびＤＸ２４０については、抗体を、捕捉試薬として用い、ＭＤＬ−１−ｈＩｇリガンドを分析物として用いた。ＤＸ２３３、ＤＸ２３９およびＤＸ２４０の親和性測定値は以下のとおりであった。
【０１５９】
【表５】
2010526066.tif 000007
（実施例５）
ＤＸ２３９およびＤＸ２４４のヒト化
本発明の抗体は、ヒト化抗体のアクセプター生殖系列配列を同定する方法を用いてヒト化することができ、この方法は、以下のステップを含む：ａ）所望の生物活性を有する非ヒト抗体を同定するステップと；ｂ）非ヒト抗体ＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を決定するステップと；ｃ）非ヒト抗体配列を、ヒト生殖系列配列の群と比較するステップ（ここで、比較は、以下のサブステップを含む：１）Ｋａｂａｔ上記にしたがって、非ヒトＶ配列残基に数を割り当てるステップと；２）配列中のＣＤＲおよびＦＲ領域を、Ｋａｂａｔ上記にしたがって正確に描写するステップと；３）非ヒトおよびヒト抗体生殖系列配列が同一である特定の残基位置に所定の数値スコアを割り当てるステップと；４）残基スコアのすべてを合計して、各ヒト生殖系列配列の総スコアを作製するステップ）；およびｄ）最高の総残基スコアを有するヒト生殖系列配列をアクセプター生殖系列配列として同定するステップ。一実施形態では、この方法は、以下のサブステップをさらに含む：５）サブステップ（４）後に同一の総残基スコアを有する生殖系列配列に、サブステップ（３）においてスコアされなかった、非ヒトおよびヒト抗体生殖系列配列が同一である各ＦＲ残基位置に１の数値スコアを割り当てるステップと；６）残基スコアのすべてを合計して、各ヒト生殖系列配列の総スコアを作製するステップ。特定の実施形態では、非ヒト抗体は、ＭＤＬ−１に特異的であり、ＭＤＬ−１の生物活性を阻害する。また、上記の方法によって作製された抗体も本明細書において提供される。
【０１６０】
一実施形態では、ＭＤＬ−１抗体は、以下の方法を用いてヒト化される。まず、ＭＤＬ−１抗体の非ヒトＶＬおよびＶＨドメインをクローニングし、配列決定し、アミノ酸配列を決定する。次いで、非ヒトＶＨ配列を、３種のヒトＶＨ生殖系列アミノ酸配列の群と比較する。３つの群は、亜群ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ３およびＩＧＨＶ４の各々に由来する１種の代表を含む。ＶＨ亜群は、Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１８巻：１００〜１１６頁（２００１年）に列挙されている。具体的には、３種の生殖系列配列を用いる比較は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、非ヒトＶＨ配列に残基番号を割り当てることで始まる。Ｋａｂａｔら、米国保険社会福祉省（Ｕ．  Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ刊行物９１−３２４２（第５版、１９９１年）参照のこと。次いで、非ヒトＶＨ配列を、３種のヒト生殖系列配列の各々とアラインする。Ｖ遺伝子は、ＶＨ残基１〜９４のみを含むので、アラインメントにおいてこれらの残基のみが考慮される。次いで、配列中の相補性決定（ＣＤＲ）およびフレームワーク（ＦＲ）領域を正確に描写する。ＣＤＲおよびＦＲを、米国保険社会福祉省（Ｕ．  Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ刊行物９１−３２４２（第５版、１９９１年）およびＣ．Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ、１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年）において提供される定義の組み合わせに従って正確に描写する。したがって、用いられるＣＤＲ定義は、ＶＨドメインの、ＣＤＲ１については残基２６〜３５、ＣＤＲ２については残基５０〜６５であり、ＣＤＲ３は、ＣＤＲ３の残基９５〜１０２である。次のステップは、非ヒトおよびヒト配列が同一である同定された残基位置に数値スコアを割り当てることを含む。このスコア化の一例が、以下の表６に示されている。
【０１６１】
【表６−１】
2010526066.tif 000008
【０１６２】
【表６−２】
2010526066.tif 000009
残基位置に数値スコアを割り当てた後、残基スコアのすべてを合計する。アクセプター生殖系列配列は、最高の総スコアを有するものである。２種以上の生殖系列配列が同一スコアを有する場合には、以下のＦＲ残基について非ヒトおよびヒト配列が同一（ＩＤＥＮＴＩＣＡＬ）である各位置について合計に１を加える：１〜２３、２５、３６、３８〜４７、６６、６８、７０、７２、７４、７５、７７および７９〜９３（最大６０）。残基スコアを再度合計し、アクセプター生殖系列配列は、最高総スコアを有するものである。２種以上の生殖系列配列が依然として同一スコアを有する場合には、いずれか一方をアクセプター生殖系列配列として使用してよい。
【０１６３】
ＶＬ配列が、ＶＬのκサブクラスのメンバーである場合には、ＭＤＬ−１特異的抗体由来の非ヒトＶＬ配列を、４種のヒトＶＬκ生殖系列アミノ酸配列群と比較する。４種の配列は、Ｖ．Ｂａｒｂｉｅ＆Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５巻：１７１〜１８３頁（１９９８年）およびＭ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８巻：１６１〜１７４頁（２００１年）に列挙される４種の確立されたヒトＶＬ亜群の各々に由来する１種の代表からなる。４種の配列はまた、Ｋａｂａｔら、米国保険社会福祉省（Ｕ．  Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ刊行物９１−３２４２、１０３〜１３０頁（第５版、１９９１年）に列挙される４種の亜群に対応している。非ヒト配列の４種の生殖系列配列との比較は、Ｋａｂａｔら、米国保険社会福祉省（Ｕ．  Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ刊行物９１−３２４２（第５版、１９９１年）に従って、非ヒトＶＬ配列に残基番号を割り当てることで始まる。次いで、非ヒトＶＬ配列を、４種のヒト生殖系列配列の各々とアラインする。Ｖ遺伝子はＶＬ残基１〜９５のみを含むので、アラインメントにおいてこれらの残基のみが考慮される。次いで、配列中の相補性決定（ＣＤＲ）およびフレームワーク（ＦＲ）領域を正確に描写する。ＣＤＲおよびＦＲは、Ｋａｂａｔら、米国保険社会福祉省（Ｕ．  Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ刊行物９１−３２４２（第５版、１９９１年）およびＣ．Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ、１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年）において提供される定義の組み合わせに従って正確に描写する。したがって、用いられるＣＤＲ定義は、ＶＬドメインの、ＣＤＲ１については残基２４〜３４であり、ＣＤＲ２については残基５０〜５６であり、ＣＤＲ３については残基８９〜９７である。次のステップは、非ヒトおよびヒト配列が同一である同定された残基位置に数値スコアを割り当てることを含む。このスコア化の一例が、以下の表７に示されている。
【０１６４】
【表７】
2010526066.tif 000010
残基位置に数値スコアを割り当てた後、残基スコアのすべてを合計する。アクセプター生殖系列配列は、最高の総スコアを有するものである。２種以上の生殖系列配列が同一スコアを有する場合には、以下のＦＲ残基について非ヒトおよびヒト配列が同一（ＩＤＥＮＴＩＣＡＬ）である各位置について合計に１を加える：１〜３、５〜２３、３５〜４２、４４〜４９、５７、５９〜８８（最大６７）。残基スコアを再度合計し、アクセプター生殖系列配列は、最高総スコアを有するものである。２種以上の生殖系列配列が依然として同一スコアを有する場合には、いずれか一方をアクセプター生殖系列配列として使用してよい。
【０１６５】
抗ヒトＭＤＬ−１抗体、ＤＸ２３９のヒト化を、上記のとおりに実施した。図１は、残基番号の割り当ておよび調べられている生殖系列配列と同一である残基位置の対応する数値スコアを示す。計算は、ＤＸ２３９抗ヒトＭＤＬ−１抗体の軽鎖（図５Ａ）および重鎖（図５Ｂ）の可変領域について、ならびにＤＸ２４４抗ヒトＭＤＬ−１抗体の軽鎖（図５Ｃ）および重鎖（図５Ｄ）の可変領域について示されている。
【０１６６】
（実施例６）
抗ＭＤＬ−１抗体の活性化の評価のためのバイオアッセイ
モノクローナル抗体の、ＭＤＬ−１／ＤＡＰ１２活性を生物学的増強する能力を、肥満細胞脱顆粒アッセイによって評価した。
【０１６７】
マウス肥満細胞培養物を、２〜３週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスから確立した。骨髄を２〜３匹のマウスの大腿骨から排出させ、続いて、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。細胞を、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、グルタミン、１０〜１５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１００ｎｇ／ｍｇ  ｒＳＣＦおよび１００ｎｇ／ｍｌのｒＩＬ−３を補給したダルベッコの最小必須培地（ＭＥＭ）１５ｍｌに再懸濁した。細胞は、Ｔ２５フラスコ中、３７℃でインキュベートした。１週間隔で、接着していない細胞に、新鮮培地を再供給し、新規フラスコに移した。２週間の時点で、培養培地に、５．０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を補給した。４週間までに、非接着細胞の大部分が、ＩｇＥ  ＦｃＲを発現する通常のマウス肥満細胞であると見込まれた。４週間の時点から、細胞は、ｒＩＬ−３およびｒＩＬ−４のみを補給して維持した。
【０１６８】
マウス肥満細胞にヒトＭＤＬ−１（ＤＴ８０８）をトランスフェクトし、１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を用いて刺激し、続いて、１．０時間で、分泌されたβ−ヘキソサミニダーゼを測定した。対照細胞インキュベーションは、ラットアイソタイプ対照ｍＡｂ（ｒＩｇＧ１；陰性対照）ならびに陽性対照としてＤＸ８７およびＤＸ８９、２種の抗ｍＣＤ２００Ｒ抗体を用いて実施した。ＤＸ８７には、機能のために架橋が必要である。β−ヘキソサミニダーゼ測定のために上清を採取した後、架橋抗体を加えた。１時間後、上清をβ−ヘキソサミニダーゼについて再度評価した。
【０１６９】
結果は、抗ＭＤＬ−１抗体のうち８種での処理は、肥満細胞脱顆粒を増強したことを実証した。１種のｍＡｂ、ＤＸ２４５は、機能に架橋を必要とした。陰性対照アイソタイプ抗体は、分泌に検出可能には影響を与えなかった。同様の脱顆粒バイオアッセイを、ヒト好中球を用いて実施し、抗ＭＤＬ−１抗体のサブセットに応じて、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ６６ｂの表面発現の増大が測定された（表１０参照のこと）。
【０１７０】
【表８】
2010526066.tif 000011
【０１７１】
【表９】
2010526066.tif 000012
【０１７２】
【表１０】
2010526066.tif 000013
（実施例７）
Ｌ−セレクチン脱落アッセイ
循環血流好中球は、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）を発現し、Ｌ−セレクチンは、好中球の内皮細胞分子との相互作用を媒介し、活性化好中球から脱落され得る。したがって、上記の特定のＭＤＬ−１抗体がＬ−セレクチン脱落を引き起こすかどうかを調査した。好中球を、先に記載されたように（Ｂａｄｗｅｙら（１９８２年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１０６巻：１７０〜１７４頁）、デキストラン沈降、赤血球の低張性溶解およびフィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）による遠心分離によって健常なドナーの末梢血から精製した。
【０１７３】
ＭＤＬ−１活性化のために、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０に１０７個細胞／ｍｌで懸濁した、新たに単離した好中球を、抗ＭＤＬ−１抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプ対照ＩｇＧ１とともに、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）において３７℃および５％  ＣＯ２で１時間インキュベートした。ＲＰＭＩで２回洗浄した後、細胞が結合している抗ｈＭＤＬ−１抗体を、９μｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体と、３７℃および５％  ＣＯ２で３０分間架橋した。次いで、細胞を２回洗浄し、２０μｇ／ｍｌのｃｈｒｏｍｐｕｒｅマウスＩｇＧ抗体とともに４℃で２０分間インキュベートし、結合していない架橋抗体をブロッキングした。
【０１７４】
未処理の細胞または刺激した細胞（１０７個細胞／ｍｌ）を、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５％  ＢＳＡを含有するＰＢＳに再懸濁した。Ｌ−セレクチンの表面発現の変化を測定するために、細胞を、ＰＥがコンジュゲートしている抗ＣＤ６２Ｌ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）（２μｇ／ｍｌ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。
【０１７５】
２回洗浄した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でサンプルを分析した。データを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０１７６】
表１１は、抗ＭＤＬ−１抗体で処理した好中球のＣＤ６２Ｌ染色（平均蛍光強度；ＭＦＩ）の減少を示す（アイソタイプ対照による処理−抗ｈＭＤＬ−１による処理によって算出したＭＦＩ）。
【０１７７】
【表１１】
2010526066.tif 000014
（実施例８）
盲腸結紮と穿孔（ｐｕｎｃｔｉｏｎ）（ＣＬＰ）モデル
麻酔した７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１０〜１２ｍｍの正中切開を行い、盲腸を露出させた。盲腸を遠位末端から約１０〜１２ｍｍで結紮した。次いで、結紮した盲腸に、１９〜２７ゲージのニードルを用いて穿刺し、生存を評価した。最初に、１９ゲージのニードルを用いた穿刺によって最も劇的な敗血症型の状態が生じることがわかった。
【０１７８】
別のセットのＣＬＰマウス（７〜１１週齢）を上記のとおりに作製した。３つの群を以下のとおりに処置した：
【０１７９】
【表１２】
2010526066.tif 000015
表１３は、上記の処置の結果を示す。Ｎ／Ｄ＝調べていない
【０１８０】
【表１３−１】
2010526066.tif 000016
【０１８１】
【表１３−２】
2010526066.tif 000017
（実施例９）
ＣＬＰマウスにおける菌血症および体重の測定
ＣＬＰの２４時間後に血液を合計１０匹のマウスから採取した（アイソタイプ対照処置に由来する５匹のマウスおよびＤＸ１６３処置に由来する５匹のマウス（ｉｃｅ）。段階希釈物を血液寒天の場所上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーをカウントした。ＣＬＰ後の２４時間毎にマウスの体重を測定した。
【０１８２】
【表１４】
2010526066.tif 000018
図６は、ＣＬＰ後マウスの体重測定値を示す。
【０１８３】
（実施例１０）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌負荷の減少
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、グラム陽性細胞外細菌であり、軟部組織および血液媒介感染症および肺炎を引き起こす重要なヒト病原体である。重篤なＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症の発生数は、多くは、該生物のメチシリン耐性株の（ＭＲＳＡ）の結果である。米国疾病対策予防センター（Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）は最近、ＭＲＳＡのために２００５年に米国では、９４，０００人の重篤な感染症および１８，０００人の死亡が生じたと見積もった（Ｋｌｅｖｅｎｓら、ＪＡＭＡ、２００７年、２９８巻：１７６３〜１７７１頁）。
【０１８４】
ＭＤＬ−１抗体は、ヒト好中球の抗微生物機能を増強し得るという知見に基づいて、抗ｍＭＤＬ−１抗体（ＤＸ１６３）を活性化することが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ肺炎のマウスモデルにおいて細菌負荷に影響を及ぼし得るかどうかを調べた。このモデルを、例えば、Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇら（２００７年）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７５巻：１０４０〜１０４４頁によって記載されるとおりに確立した。感染用量は、表に詳述されるように１〜５×１０８の範囲のコロニー形成単位（ＣＦＵ）のＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２７２１７であった。予防設定では、マウスにアイソタイプ対照またはＤＸ１６３抗体を用いて、感染の２または１２時間前のいずれかに皮下に投与した（表１５および１６）。治療設定では、マウスに、対照またはＤＸ１６３抗体を用いて、感染の２時間後に静脈内に投与した（表１７）。感染の２４または４８時間後のいずれかに、肺を安楽死させたマウスから切り取り、ホモジネーション、段階希釈およびプレーティングによって総肺ＣＦＵについて分析した。ＤＸ１６３の投与は、アイソタイプ対照で処置したマウスと比較して肺細菌負荷を一貫して低下させた。
【０１８５】
【表１５】
2010526066.tif 000019
【０１８６】
【表１６】
2010526066.tif 000020
【０１８７】
【表１７】
2010526066.tif 000021
【０１８８】
【表１８−１】
2010526066.tif 000022
【０１８９】
【表１８−２】
2010526066.tif 000023
【０１９０】
【表１８−３】
2010526066.tif 000024
【図１】
2010526066.tif 000025
【図２】
2010526066.tif 000026
【図３】
2010526066.tif 000027
【図４】
2010526066.tif 000028
【図５Ａ】
2010526066.tif 000029
【図５Ｂ】
2010526066.tif 000030
【図５Ｃ】
2010526066.tif 000031
【図５Ｄ】
2010526066.tif 000032
【図６】
2010526066.tif 000033
【配列表】
2010526066000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年12月15日(2009.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
一実施形態では、本発明は、クロスブロッキングアッセイにおいて、本発明の結合性化合物とヒトＭＤＬ−１との結合を妨げることができる抗体に関する。種々の実施形態では、抗体は、ヒトＭＤＬ−１と、本明細書に開示される抗体ＤＸ２３０、ＤＸ２４１、ＤＸ２４４、ＤＸ２４６、ＤＸ２９７、ＤＸ２３３、ＤＸ２３９およびＤＸ２４０のＣＤＲ配列を含む抗体との結合を妨げることができる。他の実施形態では、抗体は、クロスブロッキングアッセイにおいて、ヒトＭＤＬ−１と、２００７年４月２３日に、受託番号ＰＴＡ−８３７３、ＰＴＡ−８３７４、ＰＴＡ−８３７５、ＰＴＡ−８３７６およびＰＴＡ−８３７７のもとでＡＴＣＣに寄託された、または２００８年４月８日に受託番号ＰＴＡ−９１３４およびＰＴＡ−９１３６のもとでＡＴＣＣに寄託された、または２００８年４月１１日に受託番号ＰＴＡ−９１３５のもとでＡＴＣＣに寄託された抗体（クローンＤＸ２３０、ＤＸ２４１、ＤＸ２４４、ＤＸ２４６、ＤＸ２９７、ＤＸ２３３、ＤＸ２３９、ＤＸ２４０）との結合を妨げることができる。別の実施形態では、本発明は、ＭＤＬ−１媒介性活性を妨げることができる結合性化合物に関し、このような活性は、それだけには限らないが、適当な肥満細胞アッセイにおける肥満細胞の脱顆粒を媒介することを含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、配列番号６７または配列番号６８の抗体重鎖可変ドメインおよび配列番号６９または配列番号７０の抗体軽鎖可変ドメインを含むヒト化ＭＤＬ−１抗体を包含する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒトＭＤＬ−１と結合する結合性化合物であって、
ａ）配列番号４１〜６４からなる群から選択される１つまたは複数のＣＤＲ配列を有する、抗体軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と、
ｂ）配列番号１７〜４０からなる群から選択される１つまたは複数のＣＤＲ配列を有する、抗体重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
を含む結合性化合物。
（項目２）
ａ）配列番号４１〜６４からなる群から選択される２つ以上のＣＤＲ配列を有する、抗体軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と、
ｂ）配列番号１７〜４０からなる群から選択される２つ以上のＣＤＲ配列を有する、抗体重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
を含む、項目１に記載の結合性化合物。
（項目３）
ａ）配列番号４１〜６４からなる群から選択される３つのＣＤＲ配列を有する、抗体軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と、
ｂ）配列番号１７〜４０からなる群から選択される３つのＣＤＲ配列を有する、抗体重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
を含む、項目２に記載の結合性化合物。
（項目４）
ヒトＭＤＬ−１と結合する結合性化合物であって、
ａ）配列番号４１〜４８からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＬ１、配列番号４９〜５６からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＬ２および配列番号５７〜６４からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＬ３を有する、軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
ｂ）配列番号１７〜２４からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＨ１、配列番号２５〜３２からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＨ２および配列番号３３〜４０からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＨ３を有する、重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
を含む結合性化合物。
（項目５）
ヒトＭＤＬ−１と結合する結合性化合物であって、
ａ）配列番号９の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号１の抗体重鎖可変ドメイン、
ｂ）配列番号１０の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号２の抗体重鎖可変ドメイン、
ｃ）配列番号１１の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号３の抗体重鎖可変ドメイン、
ｄ）配列番号１２の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号４の抗体重鎖可変ドメイン、
ｅ）配列番号１３の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号５の抗体重鎖可変ドメイン、
ｆ）配列番号１４の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号６の抗体重鎖可変ドメイン、
ｇ）配列番号１５の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号７の抗体重鎖可変ドメイン、または
ｈ）配列番号１６の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号８の抗体重鎖可変ドメイン
を含む結合性化合物。
（項目６）
クロスブロッキングアッセイにおいて、項目５に記載の結合性化合物とヒトＭＤＬ−１との結合を妨げることができる抗体。
（項目７）
項目５に記載の結合性化合物の前記軽鎖可変ドメインまたは前記重鎖可変ドメインの少なくとも一方をコードする単離核酸。
（項目８）
宿主細胞に発現ベクターがトランスフェクトされる場合、該宿主細胞によって認識される制御配列と作動可能に連結している、項目７に記載の核酸を含む該発現ベクター。
（項目９）
項目８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目１０）
ポリペプチドを産生する方法であって、
項目９に記載の宿主細胞を、前記核酸配列が発現される条件下、培養培地中で培養し、それにより前記軽鎖可変ドメインおよび前記重鎖可変ドメインを含むポリペプチドを産生するステップと、
該宿主細胞または該培養培地から該ポリペプチドを回収するステップと
を含む方法。
（項目１１）
ａ）前記抗体軽鎖可変ドメイン中のヒト生殖系列軽鎖フレームワーク配列と、
ｂ）前記抗体重鎖可変ドメイン中のヒト生殖系列重鎖フレームワーク配列と
を含む、項目５に記載の結合性化合物。
（項目１２）
γ１ヒト重鎖定常領域またはその改変体を含む重鎖定常領域をさらに含み、該定常領域改変体が最大２０個の保存的に改変されたアミノ酸置換を含む、項目５に記載の結合性化合物。
（項目１３）
γ４ヒト重鎖定常領域またはその改変体を含む重鎖定常領域をさらに含み、該定常領域改変体が最大２０個の保存的に改変されたアミノ酸置換を含む、項目５に記載の結合性化合物。
（項目１４）
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびダイアボディからなる群から選択される抗体断片である、項目５に記載の結合性化合物。
（項目１５）
ヒト対象において免疫応答を増強する方法であって、
それを必要とする対象に、ＭＤＬ−１に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を、ＭＤＬ−１／ＤＡＰ１２の生物活性を増強するのに有効な量で投与するステップを含み、該抗体が項目５に記載の抗体である方法。
（項目１６）
前記免疫応答が、感染症に対するものである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記対象が、微生物感染症、ウイルス感染症および真菌感染症からなる群から選択される感染症を有する、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記免疫応答が骨髄性の応答である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
クロスブロッキングアッセイにおいて、ヒトＭＤＬ−１と、
ａ）２００７年４月２３日に、ＰＴＡ−８３７３、ＰＴＡ−８３７４、ＰＴＡ−８３７５、ＰＴＡ−８３７６、およびＰＴＡ−８３７７からなる群から選択される受託番号のもとで、または
ｂ）２００８年４月８日に、ＰＴＡ−＿、ＰＴＡ−＿およびＰＴＡ−＿からなる群から選択される受託番号のもとで
ＡＴＣＣに寄託された少なくとも１種の抗体との結合を妨げることができる抗体。
（項目２０）
敗血症を予防する方法であって、それを必要とする対象に、ＭＤＬ−１に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を、ＭＤＬ−１／ＤＡＰ１２の生物活性を増強するのに有効な量で投与するステップを含む方法。
（項目２１）
敗血症を予防する方法であって、それを必要とする対象に、ＭＤＬ−１に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を、ＭＤＬ−１／ＤＡＰ１２の生物活性を増強するのに有効な量で投与するステップを含み、該抗体が項目５に記載の抗体である方法。
（項目２２）
項目５に記載の抗体と製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物。
（項目２３）
配列番号６７または配列番号６８の抗体重鎖可変ドメインと配列番号６９または配列番号７０の抗体軽鎖可変ドメインとを含むヒト化ＭＤＬ−１抗体。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
抗体クローンＤＸ２３０、ＤＸ２４１、ＤＸ２４４、ＤＸ２４６およびＤＸ２９７を発現するハイブリドーマは、ブダペスト条約に従い、２００７年４月２３日に、それぞれ、受託番号ＰＴＡ−８３７３、ＰＴＡ−８３７４、ＰＴＡ−８３７５、ＰＴＡ−８３７６およびＰＴＡ−８３７７のもと、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ−Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ）に寄託された。抗体クローンＤＸ２３０、ＤＸ２３９およびＤＸ２４０を発現するハイブリドーマは、ブダペスト条約に従い、２００８年４月８日に、それぞれ、寄託番号ＰＴＡ−９１３４およびＰＴＡ−９１３６のもと、または２００８年４月１１日に受託番号ＰＴＡ−９１３５のもとＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ−Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）に寄託された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＭＤＬ−１と結合する結合性化合物であって、
ａ）配列番号４１〜６４からなる群から選択される１つまたは複数のＣＤＲ配列を有する、抗体軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と、
ｂ）配列番号１７〜４０からなる群から選択される１つまたは複数のＣＤＲ配列を有する、抗体重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
を含む結合性化合物。
【請求項２】
ａ）配列番号４１〜６４からなる群から選択される２つ以上のＣＤＲ配列を有する、抗体軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と、
ｂ）配列番号１７〜４０からなる群から選択される２つ以上のＣＤＲ配列を有する、抗体重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
を含む、請求項１に記載の結合性化合物。
【請求項３】
ａ）配列番号４１〜６４からなる群から選択される３つのＣＤＲ配列を有する、抗体軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と、
ｂ）配列番号１７〜４０からなる群から選択される３つのＣＤＲ配列を有する、抗体重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
を含む、請求項２に記載の結合性化合物。
【請求項４】
ヒトＭＤＬ−１と結合する結合性化合物であって、
ａ）配列番号４１〜４８からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＬ１、配列番号４９〜５６からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＬ２および配列番号５７〜６４からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＬ３を有する、軽鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
ｂ）配列番号１７〜２４からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＨ１、配列番号２５〜３２からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＨ２および配列番号３３〜４０からなる群からの少なくとも１つのＣＤＲＨ３を有する、重鎖可変ドメインまたはその抗原結合性断片と
を含む結合性化合物。
【請求項５】
ヒトＭＤＬ−１と結合する結合性化合物であって、
ａ）配列番号９の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号１の抗体重鎖可変ドメイン、
ｂ）配列番号１０の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号２の抗体重鎖可変ドメイン、
ｃ）配列番号１１の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号３の抗体重鎖可変ドメイン、
ｄ）配列番号１２の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号４の抗体重鎖可変ドメイン、
ｅ）配列番号１３の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号５の抗体重鎖可変ドメイン、
ｆ）配列番号１４の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号６の抗体重鎖可変ドメイン、
ｇ）配列番号１５の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号７の抗体重鎖可変ドメイン、または
ｈ）配列番号１６の抗体軽鎖可変ドメインと配列番号８の抗体重鎖可変ドメイン
を含む結合性化合物。
【請求項６】
クロスブロッキングアッセイにおいて、請求項５に記載の結合性化合物とヒトＭＤＬ−１との結合を妨げることができる抗体。
【請求項７】
請求項５に記載の結合性化合物の前記軽鎖可変ドメインまたは前記重鎖可変ドメインの少なくとも一方をコードする単離核酸。
【請求項８】
宿主細胞に発現ベクターがトランスフェクトされる場合、該宿主細胞によって認識される制御配列と作動可能に連結している、請求項７に記載の核酸を含む該発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
ポリペプチドを産生する方法であって、
請求項９に記載の宿主細胞を、前記核酸配列が発現される条件下、培養培地中で培養し、それにより前記軽鎖可変ドメインおよび前記重鎖可変ドメインを含むポリペプチドを産生するステップと、
該宿主細胞または該培養培地から該ポリペプチドを回収するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
ａ）前記抗体軽鎖可変ドメイン中のヒト生殖系列軽鎖フレームワーク配列と、
ｂ）前記抗体重鎖可変ドメイン中のヒト生殖系列重鎖フレームワーク配列と
を含む、請求項５に記載の結合性化合物。
【請求項１２】
γ１ヒト重鎖定常領域またはその改変体を含む重鎖定常領域をさらに含み、該定常領域改変体が最大２０個の保存的に改変されたアミノ酸置換を含む、請求項５に記載の結合性化合物。
【請求項１３】
γ４ヒト重鎖定常領域またはその改変体を含む重鎖定常領域をさらに含み、該定常領域改変体が最大２０個の保存的に改変されたアミノ酸置換を含む、請求項５に記載の結合性化合物。
【請求項１４】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびダイアボディからなる群から選択される抗体断片である、請求項５に記載の結合性化合物。
【請求項１５】
ヒト対象において免疫応答を増強するための組成物であって、
ＭＤＬ−１に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を含み、該組成物が、ＭＤＬ−１／ＤＡＰ１２の生物活性を増強するのに有効な量で、それを必要とする対象に投与されることで特徴付けられ、該抗体が請求項５に記載の抗体である組成物。
【請求項１６】
前記免疫応答が、感染症に対するものである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記対象が、微生物感染症、ウイルス感染症および真菌感染症からなる群から選択される感染症を有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫応答が骨髄性の応答である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
クロスブロッキングアッセイにおいて、ヒトＭＤＬ−１と、
ａ）２００７年４月２３日に、ＰＴＡ−８３７３、ＰＴＡ−８３７４、ＰＴＡ−８３７５、ＰＴＡ−８３７６、およびＰＴＡ−８３７７からなる群から選択される受託番号のもとで、または
ｂ）２００８年４月８日に、ＰＴＡ−９１３４、およびＰＴＡ−９１３６からなる群から選択される受託番号のもとで、または
ｃ）２００８年４月１１日に、ＰＴＡ−９１３５からなる受託番号のもとで、
ＡＴＣＣに寄託された少なくとも１種の抗体との結合を妨げることができる抗体。
【請求項２０】
敗血症を予防するための組成物であって、ＭＤＬ−１に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を含み、該組成物が、ＭＤＬ−１／ＤＡＰ１２の生物活性を増強するのに有効な量で、それを必要とする対象に投与されることで特徴付けられる、組成物。
【請求項２１】
敗血症を予防するための組成物であって、ＭＤＬ−１に特異的な抗体またはその抗原結合性断片を含み、該組成物が、ＭＤＬ−１／ＤＡＰ１２の生物活性を増強するのに有効な量で、それを必要とする対象に投与されることで特徴付けられ、該抗体が請求項５に記載の抗体である組成物。
【請求項２２】
請求項５に記載の抗体と製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物。
【請求項２３】
配列番号６７または配列番号６８の抗体重鎖可変ドメインと配列番号６９または配列番号７０の抗体軽鎖可変ドメインとを含むヒト化ＭＤＬ−１抗体。
【国際調査報告】
2010526066.tif 000075
2010526066.tif 000076
2010526066.tif 000077