(57)【要約】  この発明は、野生型Ｋｖ１１．１チャネルたんぱく質の残基４６６及び５３４に電荷反転置換をもたらすｈＥＲＧ遺伝子の二重突然変異を有する細胞に関する。この二重電荷反転突然変異により、構造的に開放されたＫｖ１１．１チャネルが得られる。この細胞は、開発段階にある薬剤及びその他の化合物のＫｖ１１．１チャネル遮断活性をテストする方法に用いられる。
2010519932.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の構造的に開放されたＫｖ１１．１チャネルを含む細胞であって、
前記Ｋｖ１１．１チャネルが、配列番号１の野生型Ｋｖ１１．１アミノ酸配列の残基４６６及び５３４における電荷が反転された少なくとも２つの突然変異（以下、「一対の電荷反転突然変異」という。）を含むものであることを特徴とする細胞。
【請求項２】
前記一対の電荷反転突然変異が、D466K/R534D及びD466K/R534Eからなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記一対の電荷反転突然変異が、D466R/R534D、D466R/R534E、D466H/R534D、及び、D466H/R534Eからなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞であることを特徴とする請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞が、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、天然心臓細胞、及び、心筋細胞からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項４に記載の細胞。
【請求項７】
請求項１に記載の細胞を１以上含むことを特徴とする細胞集団。
【請求項８】
（ａ）構造的に開放された１以上のＫｖ１１．１チャネルをテスト化合物に露出させるステップと、
（ｂ）前記露出後のＫｖ１１．１チャネル遮断活性を測定するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）の前記Ｋｖ１１．１チャネル遮断活性と、構造的に開放された１以上のＫｖ１１．１チャネルを含む露出されない細胞のＫｖ１１．１チャネル遮断活性とを比較するステップと、
を含むことを特徴とするテスト化合物のＫｖ１１．１チャネル遮断活性をスクリーニングする方法。
【請求項９】
前記ステップ（ｂ）が、チャネル電流を測定することを含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）構造的に開放された１以上のＫｖ１１．１チャネルをテスト化合物に露出させるステップと、
（ｂ）前記露出後のＫｖ１１．１チャネル電流を測定するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）の前記Ｋｖ１１．１チャネル電流と、構造的に開放された１以上のＫｖ１１．１チャネルを含む露出されない細胞のＫｖ１１．１チャネル電流とを比較するステップと、
を含むことを特徴とするテスト化合物のＫｖ１１．１チャネル遮断活性をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
（ａ）請求項１に記載の細胞をテスト化合物に露出させるステプと、
（ｂ）前記露出後のＫｖ１１．１チャネル電流を測定するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）の前記Ｋｖ１１．１チャネル電流と、構造的に開放された１以上のＫｖ１１．１チャネルを含む露出されない細胞のＫｖ１１．１チャネル電流とを比較するステップと、
を含むことを特徴とするテスト化合物のＫｖ１１．１チャネル遮断活性をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
前記細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞を、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、天然心臓細胞、及び、心筋細胞からなる群から選択することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｋｖ１１．１チャネルが、配列番号１の野生型Ｋｖ１１．１アミノ酸配列の残基４６６及び５３４における電荷が反転された少なくとも２つの突然変異（以下、「一対の電荷反転突然変異」という。）を含むものであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記一対の電荷反転突然変異を、D466K/R534D及びD466K/R534Eからなる群から選択することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記一対の電荷反転突然変異を、D466R/R534D、D466R/R534E、D466H/R534D、及び、D466H/R534Eからなる群から選択することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｋｖ１１．１チャネル電流を、パッチ・クランプ法によって測定することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｋｖ１１．１チャネル遮断活性を、ルビジウム・フラックス検定によって測定することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｋｖ１１．１チャネル遮断活性を、標識薬剤競合検定によって測定することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国仮特許出願第６０／８９２，６９１号（出願日：２００７年３月２日）に基づく優先権を伴う出願である。この米国仮特許出願の記載内容は、参考までに本明細書に含まれるものとする。
【０００２】
この発明は、NIH NHLBIによって第ROl HL60723号（Grant Number）と表彰され、アメリカ合衆国政府の支援を受けてなされたものである。アメリカ合衆国政府は、この発明につき一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、構造的に開放された（constitutively open）特定の突然変異である変異ｈＥＲＧ遺伝子カリウムチャネル（Ｋｖ１１．１）を有する細胞に関する。ここで、前記特定の突然変異の結果、構造的に開放されたＫｖ１１．１チャネルが生じる。また、本発明は、改良された薬剤スクリーニング検定における構造的に開放されたＫｖ１１．１チャネルを有する細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒトエーテル・ア・ゴー・ゴー（human ether-a-go-go）関連遺伝子（ｈＥＲＧ）は、心臓において迅速に活性化する遅延型整流器Ｋ+電流（Iκr）の基礎をなすＫｖ１１．１  α−サブユニッをコードする。α−サブユニットが結合されて、Ｋｖ１１．１カリウムチャネルを形成するが、それは、心筋細胞において、活性電位生成後に静止膜電位を回復する電極依存性のチャネルとして機能する。
【０００５】
薬剤性の取得されたＱＴ遅延症候群（drug-induced acquired long QT syndrome；ＬＱＴＳ）は、臨床的に利用可能な薬剤及び開発上にある化合物に対し重要な不利益（負担）となっていた。ＬＱＴＳは、心室の脱分極後に起こる再分極の延長に関係する心臓状態である。これは、心室性不整脈に起因する失神及び突然死に関係する。
【０００６】
薬剤性のＱＴ間隔（時間）の延長に対し一般に提案されたメカニズムは、Ｋｖ１１．１チャネル、又は、その天然電流、Iκr-の直接遮断である。この薬剤は、前記チャネルの孔−Ｓ６領域における構造的にユニークな受容体ドメインに結合して、カリウムイオン（Ｋ+）の透過を抑制する。このような薬剤の結合（遮断）は、通常チャネルが「開放状態」（イオン伝導性状態）にあるときに、優先的に起こる。予期しないＫｖ１１．１チャネル遮断に対するスクリーニングは、ＦＤＡなどの関係当局へのレビューのために提出された全ての新薬がその対象となり、且つ、Ｋｖ１１．１チャネル遮断スクリーニングは、新規な化合物の開発の早期段階から行われている。最近、薬剤によるＫｖ１１．１チャネルの遮断は、市場から薬剤が撤退され、且つ、開発中の誘導化合物が打ち切られる最も一般的な原因となっている。
【０００７】
正常状態において、Ｋｖ１１．１チャネルは、閉じられた状態（closed state）又は静止状態（rested state）にあり、この条件下に、薬剤は、低親和性をもってイオンチャネルに結合する。細胞脱分極の際に、Ｋｖ１１．１チャネルは、活性状態（開放状態）となり、Ｋ+イオンを案内し（伝え）、そして、薬剤は、Ｋｖ１１．１たんぱく質のチャネル孔−Ｓ６領域（部位）に存在する薬剤結合ドメインに近付いて、それに結合することができる。薬剤は、この開放された状態に高親和性をもって結合するので、この開放状態は、チャネルに対する薬剤結合（遮断）の有効性を研究するのに重要である。Ｋｖ１１．１チャネルは、不活性化され（イオンを案内することを中止する）、そして、細胞がＫｖ１１．１チャネルを再分極する際に、静止状態又は閉鎖状態（closed state）に戻るまでに再び開く。
【０００８】
Ｋｖ１１．１チャネルたんぱく質において、大部分のイオンチャネルたんぱく質と同様に、Ｓ４膜貫通セグメント（transmembrane spanning segment）は、多数の荷電したアミノ酸を有し、且つ、膜貫通電圧における変化に応答し、それにより、チャネル孔を開放して、Ｋ+イオンを案内する電位−センサ（voltage-sensor）であると考えられる。このＳ１−Ｓ３膜貫通セグメントについてはそれほど研究が進んでおらず、それらが、荷電したアミノ酸残基を有することが知られている程度に留まる。それらのセグメントは、チャネル開閉特性を変更するものと考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
この明細書では、Ｋｖ１１．１チャネルの膜貫通セグメントにおける突然変異を説明する。この突然変異によって、チャネルを常に開放状態に保持することができるという以外なことを見出した。以下に示す実施例によれば、これらの構造的に開放された突然変異Ｋｖ１１．１チャネルがチャネル遮断薬によって遮断される。したがって、本発明の突然変異Ｋｖ１１．１チャネルは、薬剤、及び、その他の化合物がＫｖ１１．１チャネルに結合してそれを遮断する傾向を研究し、かつ、薬剤性のＬＱＴＳのリスクを評価するより効率よく、且つ、有効な分析法（検定法）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、構造的に開放されたＫｖ１１．１チャネルを有する細胞及び細胞集団、並びに、この細胞又は細胞集団を用いて、化合物のＫｖＩチャネル遮断活性をスクリーニングする方法に関する。
【００１１】
一つの具体例において、本発明は、Ｋｖ１１．１チャネルたんぱく質をコードするｈＥＲＧ遺伝子における２つの電荷反転突然変異（charge reversal mutation）を有する細胞及び細胞集団に関する。特に、その突然変異は、野生型Ｋｖ１１．１アミノ酸配列（配列番号１）の残基４６６及び５３４におけるアミノ酸置換を引き起こし、それにより、これらの残基の電荷が反転される。これらの電荷反転突然変異は、生理学的に関係する全ての膜電位においてＫｖ１１．１チャネルを構造的に開放させる。
【００１２】
一対の電荷反転突然変異は、D466K/R534D、D466K/R534E、D466R/R534D、D466R/R534E、D466H/R534D、及びD466H/R534Eからなる群から選択される。ここで、これらの各組み合わせは、同様に電荷を反転させる。一対の電荷反転突然変異が、D466K/R534D又はD466K/R534Eであるのが好ましい。細胞及び細胞集団は、任意の細胞タイプで構成されても良い。細胞が、HEK293細胞、COS7細胞、または、CHO細胞のような哺乳類の細胞であるのが好ましい。
【００１３】
別の具体例において、本発明は、テスト化合物のＫｖ１１．１チャネル遮断活性をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、前述した構造的に開放されたＫｖ１１．１チャネルを有する細胞及び細胞集団を、テストしようとする化合物に露出させ、露出された細胞及び細胞集団のチャネル遮断活性を測定し、露出された細胞及び細胞集団のチャネル遮断活性を、構造的に開放されたＫｖ１１．１チャネルを有する露出されない細胞又は細胞集団のチャネル遮断活性と比較することを含む。このＫｖ１１．１チャネル遮断活性は、既知の方法、例えば、パッチ・クランプ法（patch clamping assay）、ルビジウム・フラックス分析（rubidium flux assay）、標識薬剤競合分析（labeled drug competition assay）、又は、放射性リガンド置換結合法（radioligand displacement binding）を用いて測定され得る。
本発明の更なる具体例及び特徴は、明細書、特許請求の範囲、及び、図面の記載から明確になる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の突然変異Ｋｖ１１．１チャネルは、薬剤、及び、その他の化合物がＫｖ１１．１チャネルに結合してそれを遮断する傾向を研究し、かつ、薬剤性のＬＱＴＳのリスクを評価するより効率よく、且つ、有効な分析法（検定法）を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、細胞膜に埋もれた野生型Ｋｖ１１．１たんぱく質のαサブユニットの断面図である。アミノ酸残基の数及び同一性（identity）は、配列番号１の野生型Ｋｖ１１．１アミノ酸配列に相当する。S6およびその手前は、チャネル孔（channel pore）領域である。本発明において、図中に野生型たんぱく質に負の酸性残基（アスパラギン酸、D）として表した領域S2にあるアミノ酸残基４６６は、正の塩基性アミノ酸残基に突然変異されている。逆に、図中に野生型たんぱく質に正の塩基性残基（アルギニン、R）として表した領域S４にあるアミノ酸残基５３４は、負の酸性アミノ酸残基に突然変異されている。
【図２】図２Ａ及び２Ｂによれば、Ｋｖ１１．１二重電荷反転突然変異D466K/R531E及びD466K/R534Dは、成熟たんぱく質のように膜を通る（traffic）ことができる。この図は、野生型Ｋｖ１１．１のウエスタンブロット及びＫｖ１１．１の様々な二重電荷反転突然変異のウエスタンブロットを示すものである。未熟たんぱく質は、１３５ｋＤバンドに存在し、成熟たんぱく質は、１５５ｋＤバンドに存在する。野生型（ＷＴ）に加えて、D466K/R531E 及びD466K/R534D二重電荷反転突然変異も、１５５ｋＤバンドに存在する成熟たんぱく質である。図２Ｃでは、二重電荷突然変異体であるD466K/R534D and D466K/R534Eが連続的に電流を伝導することが示されている。言い換えれば、そのＫｖ１１．１チャネルが構造的に開放されていることが示されている。全細胞パッチ・クランプ法を用いて、Ｋｖ１１．１電流（Iκvi 1 1）を測定する。−８０ｍＶの保持電位を用いて、細胞を−８０ｍＶから−４０ｍＶまで、１０ｍＶ単位で（ずつ）プレパルスさせ（prepulse）、−５０ｍＶのテストパルスにおいてピークテイル（peak tail）Iκvi 1 1を測定した。野生型（ＷＴ）チャネルを発現する細胞のチャネルは、閉じられて、−５０ｍＶ程度の電圧（−）において電流を通さない（伝えない）が、それらをこれ（−５０ｍＶ）を超えて脱分極すると、電流を増減させる。それは、電圧依存性Ｋｖ１１．１チャネル開閉（ここで、開放状態は、活性状態である。）に相当する。D466K/R531E二重電荷反転突然変異では、電流が見られなかったが、それは、該チャネルが開放されていないことを意味する。D466K/R534D及びD466K/R534E二重電荷突然変異体では、連続的な電流が見られたが、それは、該チャネルが常に開放されていることを意味する。それらは、閉じられずに、弱い不活性状態にあるに過ぎない。
【図３】図３は、構造的に開放されたチャネルが、薬剤性のＫｖ１１．１チャネル遮断に感受性がある（敏感である）ことを示す。図３Ａは、細胞をＫｖ１１．１チャネル遮断剤であるベラパミルの異なる濃度（濃度を上げていく。）に露出したときの、野生型細胞におけるＫｖ１１．１全細胞パッチ・クランプ電流測定結果を示したものである。それぞれの濃度において、細胞は、−８０ｍＶから２０ｍＶまでプレパルスされ、そして、−５０ｍＶのテストパルスにおいてピークテイルIκvi l.i（各グラフ上に矢印で示されている。）を測定した。総実験時間は、１５分程度であった。図３Ｂは、細胞をベラパミルの異なる濃度（濃度を上げていく。）に露出したときの、定電位（細胞）−５０ｍＶにおけるD466K/R534D二重電荷突然変異細胞の全細胞パッチ・クランプ電流測定値（結果）を示す。
【図４】図４によれば、野生型及びD466K/R534D二重電荷突然変異体は、全細胞パッチ・クランプ実験において類似の薬剤遮断感度を示す。正規化されたピークテイル電流を、野生型及びD466K/R534D二重電荷突然変異体の両方に対し用いられたベラパミル濃度の関数として示した。濃度−反応関係は、ほぼ同一であり、そして、ＩＣ５０値（５０％薬剤遮断）も統計的に異ならない。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ＫＣＮＨ２又はヒト・エーテル・ア・ゴー・ゴー（human-Ether-a-go-go）関連遺伝子（ｈＥＲＧ）は、Ｋｖ１１．１α−サブユニットをコードするが、これらのサブユニットは結合（合同）して、Ｋｖ１１．１カリウムチャネルを形成する。このｈＥＲＧ遺伝子は、小胞体においてコア−グリコシル化未熟１３５ｋＤａのたんぱく質（Ｋｖ１１．１）として翻訳され、ゴルジ体において完全なグリコシル化成熟１５５ｋＤａのたんぱく質に転換される。文献［Warmke J. W., et al. A family of potassium channel genes related to eag in Drosophila and mammals. PNAS. 1994. 91 (8):3438-3442］には、ｈＥＲＧ遺伝子の配列及び構造、並びに、その野生型翻訳産物であるＫｖ１１．１が記載されている。この文献は、参考までに本明細書に含まれる。前記文献に記載されたような野生型Ｋｖ１１．１のアミノ酸配列は、この出願に記載された配列番号１と同じものであり、この出願における全てのアミノ酸残基の番号については、配列番号１を参照されたい。
【００１７】
図１は、細胞膜に埋もれている野生型Ｋｖ１１．１たんぱく質サブユニット（図面では、「liERGl」と標識されている。）の断面図である。図１に示したアミノ酸残基の番号及び同一性（identity）は、配列番号１の野生型Ｋｖ１１．１のアミノ酸配列に相当する。Ｓ６は、チャネル孔部位（領域）であり、そして、Ｓ１−４は、電位センサ部位（領域）である、
幾つかのＫｖ１１．１突然変異は、チャネル生合成を妨げるので、成熟たんぱく質を形成しない（輸送欠如：trafficking-deficient）。第２の突然変異を導入して、輸送欠如表現型を正すことがしばしばある。文献［intragenic suppression; see Delisle, B.P., et al, MoI Pharmacol, 2005;68:233-240］参照。
【００１８】
我々は、Ｋｖ１１．１の電位センサ領域における輸送欠如突然変異が遺伝子内の抑制（intragenic suppression）を受けるか否かを試みた。我々は、D466K（ここでは、配列番号１の野性型Ｋｖ１１．１のアミノ酸残基４６６において、アスパラギン酸がリシンに置き換えられている。）、R534D（ここでは、配列番号１の野生型Ｋｖ１１．１のアミノ酸残基５３４において、アルギニンがアスパラギン酸に置き換えられている。）、及び、R534E（ここでは、配列番号１の野生型Ｋｖ１１．１のアミノ酸残基５３４において、アルギニンがグルタミン酸に置き換えられている。）を含めて電荷反転突然変異体を作製した。また、我々は、D466K/R534D及びD466K/R534Eを含めて多数の二重電荷反転突然変異体を作成した。我々は、ＷＴ−Ｋｖ１１．１ｃＤＮＡからこれらの突然変異体を作製し、これらの構造体をＨＥＫ２９３細胞において発現させた。文献［Zhou, Z. et al., Biophys J, 1998b;74:230-241］参照。
【００１９】
ウエスタンブロット解析の結果、Ｄ４６６Ｋ突然変異体は、専ら未熟たんぱく質を形成するが、R534D、D466K/R534D、及び、D466K/R534E突然変異体は、未熟たんぱく質及び成熟たんぱく質の両方を形成することが分かった。図２A及び図２Bでは、かかるD466K/R534D突然変異体の結果を示す。これらの図は、多くの二重電荷反転突然変異に対して得られたウエスタンブロット結果を示す。図２Ａ及び２Ｂに示した全ての二重突然変異体のウエスタンブロットのうち、D466K/R534D及びD466K/R531Eのみが成熟たんぱく質（１５５ｋＤにおけるバンド）を生じさせることが分かった。R534D及びD466K/R534Eのウエスタンブロットも類似のパターンを示した（そのデータは示さない）。
【００２０】
我々は、領域Ｓ２及びＳ４の２つの荷電した残基を残基の電荷を反転させる改質（modification）を行うことによって、Ｋｖ１１．１チャネルの挙動を著しく（dramatically）変えて、それらが静止状態において構造的に開放され、且つ、細胞膜を通る（traffic）ようにすることができることを見出した。我々が検討した特定の二重荷電突然変異（double charge mutation）は、D466K/R534D及びD466K/R534Eであった。図１に示すように、アミノ酸残基４６６は、Ｋｖ１１．１たんぱく質のＳ２領域に存在し、そして、アミノ酸残基５３４は、Ｓ４領域に存在する。この図が示すように、これらの２つのアミノ酸は、近接している。これらの二重突然変異は、２つの電荷を反転させて、原則として、アミノ酸対が依然として相互作用することを可能にする。これらの突然変異は、特定のアミノ酸位置（ここで、アミノ酸らは相互作用しているものと考えられる。）にある酸性残基を塩基性残基に（ＤからＫに）、又は、塩基性残基を酸性残基に（ＲからＤに、ＲからＥに）置き換える。全細胞（whole cell）パッチ・クランプ研究によって、これらの二重電荷突然変異体が、構造的に開放されていることが明らかになった（図２Ｃ参照）。したがって、チャネルが高親和性薬剤結合状態となるように、チャネルを活性化させる（脱分極する）必要はない。
【００２１】
全細胞パッチ・クランプ法を用いて、Ｋｖ１１．１電流（Iκvi i . i）を測定した。文献［Delisle, B.P., et al, MoI Pharmacol, 2005;68:233-240］参照。−８０ｍＶの保持電位（holding potential）を用いて、細胞を−８０ｍＶから−４０ｍＶまで、１０ｍＶ単位で（ずつ）プレパルスさせ（prepulse）、−５０ｍＶのテストパルスにおいてピークテイル（peak tail）Iκvi 1 1を測定した。テストパルスの際に測定されたピークテイルを、プレパルス電位の関数としてプロットし、そして、ボルツマン方程式に適用して、活性化中間電位（midpoint potential for activation）（V1A）及び最大活性（maximal activation）のスロープ係数（slope factor）を計算した。
【００２２】
Ｄ４６６Ｋを発現する細胞は、IK.VI I . I-をほとんど有しない。WTに比べて、Ｒ５３４Ｄは、WV2を正に（positively）移し（-17.9±1.7対O.O±l.lmV、p<0.05)、かつ、最大活性のスロープ係数を増加させた（7.0±1.0対4.8±1.0mV/e-倍変化（fold change）、p<0.05）（データは示さない。）。D466K/R534D及びD466K/R534E二重電荷突然変異を発現する細胞は、−８０ｍＶにおいて完全に活性化された。これは、図２Ｃに示されている。この図２Ｃは、これらの二重電荷突然変異体に対するパッチ・クランプデータにおける定電流（constant current）を示す。
【００２３】
我々は、Ｄ４６６Ｋが適切なＫｖ１１．１生合成を妨げること、Ｒ５３４Ｄが活性化を変えると共にＤ４６６Ｋを遺伝子内的に抑制すること、及び、D466K/R534D及びD466K/R534Eが全ての生理学的関連細胞電位（我々の実施例Ａにおいて、>-80mVである。）において構造的に開放されることと結論付けた。常に開放されたカリウムチャネルは、いかなる膜カリウム勾配（membrane potassium gradient）に対しても静止電位を与える（設定する）。
【００２４】
また、我々は、D466K/R534Dチャネルが予想される感度（sensivity）を保持して、選択的Ｋｖ１１．１ and Iκr遮断薬（例えば、Ｅ−４０３１及びベラパミル）によって遮断し、それにより、Ｋｖ１１．１チャネルの薬剤結合ドメインを無傷に（intact）することを見出した。また、D466K/R534D二重電荷反転突然変異を発現する細胞が、野生型Ｋｖ１１．１を発現する細胞よりも、チャネル遮断薬により迅速・正確に反応することが分かった。それは、より迅速かつ有効なＫｖ１１．１．１チャネル遮断検定（解析）のために本発明を使用する可能性を示すものである。
【００２５】
我々は、野生型細胞を、Ｋｖ１１．１チャネル遮断薬であるベラパミンルの様々な濃度に露出させた上で、その野生型の細胞においてＫｖ１１．１全細胞パッチ・クランプ電流測定（whole-cell patch clamp current measurement）を行った。これらの実験の結果は、図３Ａに示されている。それぞれの濃度において、細胞は、−８０ｍＶから２０ｍＶまでプレパルスされ、そして、−５０ｍＶのテストパルスにおいてピークテイルIκvi l.i（各グラフ上に矢印で示されている。）を測定した。総実験時間は、１５分程度であった。
【００２６】
我々は、細胞を異なるベラパミルの濃度に露出した上で、定電位（細胞）−５０ｍＶにおいてD466K/R534D二重電荷突然変異細胞を対象に、全細胞パッチ・クランプ電流測定を行った。この実験の結果は、図３Ｂに示されている。図３Ｂは、０．１、１、及び１０μMのベラパミル濃度において明確且つ安定化した電流測定値を示した。また、実験にかかった時間は、１時間３０分程度であった。それは、図１Ａに示した野生型細胞を対象にした類似の実験より約１０倍速いものであった。この図面に示された結果は、より迅速、かつ有効にＫｖ１１．１遮断をテストするのに二重電荷突然変異細胞を用いる可能性を示唆するものである。
【００２７】
野生型及びD466K/R534D二重電荷突然変異体は、全細胞パッチ・クランプ実験において類似の薬剤遮断感度（drug-block sensitivity）を示す。我々は、正規化されたピークテイル電流を計算し、それを、野生型及びD466K/R534D二重電荷突然変異体の両方に対しベラパミル濃度の関数としてプロットした。この実験結果は、図４に示した。この二重電荷反転突然変異体は、野生型細胞と同程度のＫｖ１１．１チャネル薬剤遮断感度（ＩＣ５０濃度及びスロープ）を示す。
【００２８】
個別の突然変異体、例えば、D466K、R534D、及び、R534Eは、本発明に係る構造的に開放されたチャネル挙動を示さない。配列番号1の残基４６６及び５３４におけるその他の二重電荷反転アミノ酸置換体は、同様な構造的に開放されたチャネル挙動を示す。例えば、我々は、ＨＥＫ２９３細胞においてD466R/R534D二重突然変異（Ｄ４６６Ｒは電荷反転突然変異である。ここで、配列番号１の野生型Ｋｖ１１．１のアミノ酸残基４６６において、アスパラギン酸がアルギニンに置き換えられている。）を発現させ、且つ、これらの細胞がその他の構造的に開放された突然変異体の特性に類似する特性を有することを示す制限的なデータを得た。別の組み合わせ、例えば、残基４６６における電荷反転突然変異体Ｄ４６６Ｈ（ここで、配列番号１の野生型Ｋｖ１１．１におけるアミノ酸残基４６６において、アスパラギン酸がヒスチジンに置き換えられている。）は、二重電荷反転突然変異を作製するのに用いられ、それにより、構造的に開放されたＫｖ１１．１チャネルを形成する。
【００２９】
したがって、一つの具体例において、本発明は、ｈＥＲＧ遺伝子に二重突然変異を含む細胞に関する。ここで、突然変異は、配列番号１の野生型Ｋｖ１１．１たんぱく質のアミノ酸残基４６６及び５３４両方の電荷反転突然変異体を生じさせる。この突然変異体が、D466K/R534Dまたは D466K/R534Eであることが好ましい。しかしながら、それ以外の電荷反転突然変異体、例えば、D466R/R534D、D466R/R534E、D466H/R534D、及び、D466H/R534Eも可能である。
【００３０】
さらに、それ以外の別の突然変異と、本発明に係る二重電荷反転突然変異とを組み合わせることも可能である。例えば、我々は、Ｋｖ１１．１チャネルが非常に高電圧（high voltage）において開放された状態を保持するD466K/R534E/S620T突然変異体（これは、更なる突然変異を含むものである。ここで、配列番号１の野生型Ｋｖ１１．１の残基６２０にあるセリンがトレオニンに置き換えられている。）を作製した。
【００３１】
これらの突然変異は、既知の方法を用いて、野生型のＫｖ１１．１  ｃＤＮＡから作製することができる。我々は、これらの構造体をＨＥＫ２９３細胞にて発現させたが、それ以外の哺乳類細胞、例えば、ＣＯＳ７細胞、または、ＣＨＯ細胞にて発現させるのも可能である。それ以外の細胞、即ち、哺乳類細胞及び非哺乳類細胞のいずれも、突然変異体を発現させるのに適しており、細胞の静止電位において構造的に開放されたＫｖＩ  １．チャネルの表現型を同様に生じるであろう。例えば、心筋細胞を含めて天然心臓細胞、又は、ヒトＥＳ細胞系細胞（human embryonic stem cell-derived cell type）を用いることができる。或いは、アフリカツメガエル卵母細胞（Xenopus oocyte）のような非哺乳類細胞を用いることも可能である。
【００３２】
構造的に開放された特性を有するＫｖ１１．１チャネルは、未知のＫｖ１１．１チャネル遮断スクリーニングが、ＦＤＡなどによる審査のために提出された全ての新薬に対し予定され、そして、Ｋｖ１１．１スクリーニングが新薬開発の初期段階において一般的に行われていることから、有用である。このスクリーニングテストは、パッチ・クランプ法、ルビジウム・フラックス検定、標識化薬剤の競合検定（ドフェチリド（dofetilide）置換検定）、及び、突然変異体（G601 S-Ｋｖ１１．１）チャネルの救助（たんぱく質トラフィッキングの回復）といったチャネル電流測定法を用いる。最近の検定法のほとんどにおいては、薬剤結合を最適に評価するために、チャネルが開放された状態にあることが要求される一方で、効果をもたらすために非常に高濃度の薬剤が用いられる。Ｋｖ１１．１チャネル遮断を評価するための従来のパッチ・クランプ法に比べて、それ以外の方法は、定量的正確性（quantitative accuracy）を欠いている。
【００３３】
パッチ・クランプ法は、電荷の移動を電流（electric current）として測定する（ここで、カリウムイオンは、カリウム選択的膜チャネルを通って移動する。）。露出されない対照群細胞において測定された電流振幅（current amplitude）に比べて、テスト化合物に露出させた細胞における電流振幅の減少（分）は、テスト化合物によるチャネルの遮断と評価することができる。
【００３４】
ルビジウム・フラックス検定では、微量のルビジウムを正確に検出することができる原子吸光分析装置によって測定された冷たいルビジウム又は放射性のルビジウム（８６Ｒｂ）のいずれかを用いて、開放されたチャネルを通じてのルビジウムの移動（カリウムチャネルは、ルビジウムに対し透過性を有する。）を測定する。先ず、細胞にルビジウムを負荷する（それを数時間浸けておく。）。露出されない対照群細胞のフラックス（flux）に比べて、テスト化合物に露出させた細胞から槽（bath）へのフラックスにおける減少は、テスト化合物によるチャネルの遮断と評価することができる。類似のフラックス検定では、カリウムチャネルの薬理学的及び毒性学的研究にカリウム−４２（４２Ｋ）放射性トレーサー（radiotracer）を用いる。
【００３５】
放射性リガンド置換検定（radioligand displacement assay）として知られている標識化薬剤競合法では、以前の高親和性結合標識化合物（放射性標識ドフェチリド、アステミゾ―ルなど）のテスト化合物置換手法を用いる。露出されない対照群細胞の細胞槽（cell bath）における放射性標識化合物の量に比べた、テスト化合物に露出された細胞の細胞槽における放射性標識化合物の量における増加は、テスト化合物によるチャネルへの結合（それにより、遮断する。）と評価することができる。
【００３６】
新規な化合物のＫｖ１１．１チャネル遮断活性を調べるために使用されているパッチ・クランププロトコールの一例を、以下に示す。ＷＴ Ｋｖ１１．１チャネルを発現する細胞を、ピペットで取って、生理学的温度に調整された研究チャンバ（study chamber）に移した。全細胞パッチ・クランプ記録コンフィギュレーション（whole cell patch clamp recording configuration）を得て、そして、直列抵抗（series resistance）及び細胞容量補償（cell capacitance compensation）を適用した。図３Ａに示したような電圧ステッププロトコール（voltage step protocol）を適用して、次の通り、テスト化合物の不在及び存在下、陽性対照群、又は、陰性対照群におけるIKVI I.Iを測定した。−８０ｍＶの保持電位から、２０ｍＶまでの電圧ステップを５秒間適用して、Ｋｖ１１．１チャネルを最大限に活性化し、その後、−５０ｍＶまでのテストステップを４秒間適用して、Ｋｖ１１．１テイル電流（tail current）を導き出す。その後、保持電位に戻る。この電圧ステッププロトコールを１５秒間隔で繰り返す。
【００３７】
パッチ・クランプ記録（recording）の際に、IKVI I .I定常レベルが得られるまでに、先ず細胞を細胞外食塩水と絶えずに(constantly)表面かん流（灌流）させる（superfuse）。その後、IKVI I .I定常レベル(steady level)が得られるまでに、低濃度のテスト化合物（細胞外食塩水中）を適用する。所定の最大濃度を得るまでに、テスト化合物の濃度を徐々に上げつつ、このプロセスを繰り返す。それぞれのテスト化合物の濃度において、４つの細胞に対し定常状態ピークテイル電流（steady-state peak tail current）を測定し、その平均値を求めて、平均値±標準偏差を得る。その後、これらの値を図４に示すようにプロットし、濃度−反応関係、及び、ＩＣ５０値（テスト化合物が、遮断させるものであれば）を求める。陽性対照群（positive control）（IKv11.1を遮断する既知の薬剤）及び、陰性対照群（negative control）をも含ませる。表面かん流（灌流）(superperfusion)は、コンピュータ制御され、且つ、電圧刺激プロトコール（voltage stimulus protocol）にリンクされる。一部のテスト化合物、特に、チャネルにゆっくりと結合するテスト化合物に対しては、細胞上で単一の濃度のみが研究されるので、テスト化合物濃度語毎に新しい細胞を使用する必要がある。
【００３８】
本発明の電荷反転突然変異によって、より簡単で、正確なハイスループット（high throughput）Ｋｖ１１．１結合検定が可能となる。それは、Ｋｖ１１．１チャネルが、常に活性状態又は開放状態（即ち、薬剤が結合できる状態）にあるからである。例えば、図３に示したデータは、改質パッチ・クランプ測定プロトコールにおいて構造的に開放されたＫｖ１１．１チャネルを有する細胞を使用できる可能性（potential）を示す。このプロトコールは、前述の標準プロトコールよりも遥かに速い。
パッチ・クランプ法、フラックス検定、又は、薬剤置換検定のうちいずれかを用いるに当たり、Ｋｖ１１．１チャネルが脱分極されてチャネルを開放するというのが前提にたつ。パッチ・クランプ法は、電位（electrical potential）を適用して直接的にこれ（前記前提）を達成し、そして、フラックス及び置換検定は、槽におけるカリウムを増加させて、細胞を脱分極することにより、これ（前記前提）を達成する。フラックス及置換検定では、カリウムの脱分極により、WT Ｋｖ１１．１チャネルの一部（a fraction）のみを開放するので、これらの検定では、パッチ・クランプ法と同様のIC５０を生じない。その結果、チャネル遮断活性を定量的に測定するにあたりそれら（即ち、フラックス及び置換検定）の有用性は劣る。
【００３９】
しかしながら、本発明の構造的に開放されたＫｖ１１．１ チャネルが常に高親和性の開放された薬剤結合状態（high-affinity open drug binding state）にあるので、細胞を脱分極する必要がなくなる。すなわち、解決の難しく、かつ時間を費やすスこのステップを省くことができる。したがって、全ての分検定が速くなるほか、構造的に開放されたＫｖ１１．１チャネルは、パッチ・クランプ研究に匹敵する正確さを有するフラックス及び置換検定を可能にする。以上に記載した内容は、これらのユニークな電荷反転突然変異がどのようにして薬剤スクリーニングに有意な影響を及ぼすのかを説明するための一部の実施例に過ぎない。
【００４０】
本発明の第２の用途は、電荷反転突然変異、好ましくは、 D466K/R534D及びD466K/R534E突然変異が、安定した細胞株において特定のイオンチャネル（例えば、カルシウムチャネル）の良好な発現を可能にすることである。ここで、開放されたＫｖ１１．１チャネルの負静止電位（−８０ｍV）により、カルシウムチャネルが開放される電圧（電位）より低い細胞電圧（cell voltage）を保持することができる。カルシウムチャネルを閉じた状態に保持することにより、細胞に致死量のカルシウムが負荷されることを回避することができる。
【００４１】
SEQUENCE LISTING
<110>  January, Craig T. et al.
<120>  Constitutively Open hERG (Kv11.1) Mutant Channels
<130>  960296.00497
<141> 
<141> 
<150>  US 60/892,691
<151>  2007-03-02
<160>  1
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  1159
<212>  PRT
<213>  Homo Sapiens
<400>  1
Met Pro Val Arg Arg Gly His Val Ala Pro Gln Asn Thr Phe Leu Asp 
1               5                   10                  15
Thr Ile Ile Arg Lys Phe Glu Gly Gln Ser Arg Lys Phe Ile Ile Ala 
20                  25                  30
Asn Ala Arg Val Glu Asn Cys Ala Val Ile Tyr Cys Asn Asp Gly Phe 
35                  40                  45
Cys Glu Leu Cys Gly Tyr Ser Arg Ala Glu Val Met Gln Arg Pro Cys 
50                  55                  60
Thr Cys Asp Phe Leu His Gly Pro Arg Thr Gln Arg Arg Ala Ala Ala 
65                  70                  75                  80
Gln Ile Ala Gln Ala Leu Leu Gly Ala Glu Glu Arg Lys Val Glu Ile 
85                  90                  95
Ala Phe Tyr Arg Lys Asp Gly Ser Cys Phe Leu Cys Leu Val Asp Val 
100                 105                 110 
Val Pro Val Lys Asn Glu Asp Gly Ala Val Ile Met Phe Ile Leu Asn 
115                 120                 125 
Phe Glu Val Val Met Glu Lys Asp Met Val Gly Ser Pro Ala His Asp 
130                 135                 140 
Thr Asn His Arg Gly Pro Pro Thr Ser Trp Leu Ala Pro Gly Arg Ala 
145                 150                 155                 160 
Lys Thr Phe Arg Leu Lys Leu Pro Ala Leu Leu Ala Leu Thr Ala Arg 
165                 170                 175 
Glu Ser Ser Val Arg Ser Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Pro Gly 
180                 185                 190 
Ala Val Val Val Asp Val Asp Leu Thr Pro Ala Ala Pro Ser Ser Glu 
195                 200                 205 
Ser Leu Ala Leu Asp Glu Val Thr Ala Met Asp Asn His Val Ala Gly 
210                 215                 220 
Leu Gly Pro Ala Glu Glu Arg Arg Ala Leu Val Gly Pro Gly Ser Pro 
225                 230                 235                 240 
Pro Arg Ser Ala Pro Gly Gln Leu Pro Ser Pro Arg Ala His Ser Leu 
245                 250                 255 
Asn Pro Asp Ala Ser Gly Ser Ser Cys Ser Leu Ala Arg Thr Arg Ser 
260                 265                 270 
Arg Glu Ser Cys Ala Ser Val Arg Arg Ala Ser Ser Ala Asp Asp Ile 
275                 280                 285 
Glu Ala Met Arg Ala Gly Val Leu Pro Pro Pro Pro Arg His Ala Ser 
290                 295                 300 
Thr Gly Ala Met His Pro Leu Arg Ser Gly Leu Leu Asn Ser Thr Ser 
305                 310                 315                 320 
Asp Ser Asp Leu Val Arg Tyr Arg Thr Ile Ser Lys Ile Pro Gln Ile 
325                 330                 335 
Thr Leu Asn Phe Val Asp Leu Lys Gly Asp Pro Phe Leu Ala Ser Pro 
340                 345                 350 
Thr Ser Asp Arg Glu Ile Ile Ala Pro Lys Ile Lys Glu Arg Thr His 
355                 360                 365 
Asn Val Thr Glu Lys Val Thr Gln Val Leu Ser Leu Gly Ala Asp Val 
370                 375                 380 
Leu Pro Glu Tyr Lys Leu Gln Ala Pro Arg Ile His Arg Trp Thr Ile 
385                 390                 395                 400 
Leu His Tyr Ser Pro Phe Lys Ala Val Trp Asp Trp Leu Ile Leu Leu 
405                 410                 415 
Leu Val Ile Tyr Thr Ala Val Phe Thr Pro Tyr Ser Ala Ala Phe Leu 
420                 425                 430 
Leu Lys Glu Thr Glu Glu Gly Pro Pro Ala Thr Glu Cys Gly Tyr Ala 
435                 440                 445 
Cys Gln Pro Leu Ala Val Val Asp Leu Ile Val Asp Ile Met Phe Ile 
450                 455                 460 
Val Asp Ile Leu Ile Asn Phe Arg Thr Thr Tyr Val Asn Ala Asn Glu 
465                 470                 475                 480 
Glu Val Val Ser His Pro Gly Arg Ile Ala Val His Tyr Phe Lys Gly 
485                 490                 495 
Trp Phe Leu Ile Asp Met Val Ala Ala Ile Pro Phe Asp Leu Leu Ile 
500                 505                 510 
Phe Gly Ser Gly Ser Glu Glu Leu Ile Gly Leu Leu Lys Thr Ala Arg 
515                 520                 525 
Leu Leu Arg Leu Val Arg Val Ala Arg Lys Leu Asp Arg Tyr Ser Glu 
530                 535                 540 
Tyr Gly Ala Ala Val Leu Phe Leu Leu Met Cys Thr Phe Ala Leu Ile 
545                 550                 555                 560 
Ala His Trp Leu Ala Cys Ile Trp Tyr Ala Ile Gly Asn Met Glu Gln 
565                 570                 575 
Pro His Met Asp Ser Arg Ile Gly Trp Leu His Asn Leu Gly Asp Gln 
580                 585                 590 
Ile Gly Lys Pro Tyr Asn Ser Ser Gly Leu Gly Gly Pro Ser Ile Lys 
595                 600                 605 
Asp Lys Tyr Val Thr Ala Leu Tyr Phe Thr Phe Ser Ser Leu Thr Ser 
610                 615                 620 
Val Gly Phe Gly Asn Val Ser Pro Asn Thr Asn Ser Glu Lys Ile Phe 
625                 630                 635                 640 
Ser Ile Cys Val Met Leu Ile Gly Ser Leu Met Tyr Ala Ser Ile Phe 
645                 650                 655 
Gly Asn Val Ser Ala Ile Ile Gln Arg Leu Tyr Ser Gly Thr Ala Arg 
660                 665                 670 
Tyr His Thr Gln Met Leu Arg Val Arg Glu Phe Ile Arg Phe His Gln 
675                 680                 685 
Ile Pro Asn Pro Leu Arg Gln Arg Leu Glu Glu Tyr Phe Gln His Ala 
690                 695                 700 
Trp Ser Tyr Thr Asn Gly Ile Asp Met Asn Ala Val Leu Lys Gly Phe 
705                 710                 715                 720 
Pro Glu Cys Leu Gln Ala Asp Ile Cys Leu His Leu Asn Arg Ser Leu 
725                 730                 735 
Leu Gln His Cys Lys Pro Phe Arg Gly Ala Thr Lys Gly Cys Leu Arg 
740                 745                 750 
Ala Leu Ala Met Lys Phe Lys Thr Thr His Ala Pro Pro Gly Asp Thr 
755                 760                 765 
Leu Val His Ala Gly Asp Leu Leu Thr Ala Leu Tyr Phe Ile Ser Arg 
770                 775                 780 
Gly Ser Ile Glu Ile Leu Arg Gly Asp Val Val Val Ala Ile Leu Gly 
785                 790                 795                 800 
Lys Asn Asp Ile Phe Gly Glu Pro Leu Asn Leu Tyr Ala Arg Pro Gly 
805                 810                 815 
Lys Ser Asn Gly Asp Val Arg Ala Leu Thr Tyr Cys Asp Leu His Lys 
820                 825                 830 
Ile His Arg Asp Asp Leu Leu Glu Val Leu Asp Met Tyr Pro Glu Phe 
835                 840                 845 
Ser Asp His Phe Trp Ser Ser Leu Glu Ile Thr Phe Asn Leu Arg Asp 
850                 855                 860 
Thr Asn Met Ile Pro Gly Ser Pro Gly Ser Thr Glu Leu Glu Gly Gly 
865                 870                 875                 880 
Phe Ser Arg Gln Arg Lys Arg Lys Leu Ser Phe Arg Arg Arg Thr Asp 
885                 890                 895 
Lys Asp Thr Glu Gln Pro Gly Glu Val Ser Ala Leu Gly Pro Gly Arg 
900                 905                 910 
Ala Gly Ala Gly Pro Ser Ser Arg Gly Arg Pro Gly Gly Pro Trp Gly 
915                 920                 925 
Glu Ser Pro Ser Ser Gly Pro Ser Ser Pro Glu Ser Ser Glu Asp Glu 
930                 935                 940 
Gly Pro Gly Arg Ser Ser Ser Pro Leu Arg Leu Val Pro Phe Ser Ser 
945                 950                 955                 960 
Pro Arg Pro Pro Gly Glu Pro Pro Gly Gly Glu Pro Leu Met Glu Asp 
965                 970                 975 
Cys Glu Lys Ser Ser Asp Thr Cys Asn Pro Leu Ser Gly Ala Phe Ser 
980                 985                 990 
Gly Val Ser Asn Ile Phe Ser Phe  Trp Gly Asp Ser Arg  Gly Arg Gln 
995                 1000                 1005 
Tyr Gln  Glu Leu Pro Arg Cys  Pro Ala Pro Thr Pro  Ser Leu Leu
1010                 1015                 1020
Asn Ile  Pro Leu Ser Ser Pro  Gly Arg Arg Pro Arg  Gly Asp Val
1025                 1030                 1035
Glu Ser  Arg Leu Asp Ala Leu  Gln Arg Gln Leu Asn  Arg Leu Glu
1040                 1045                 1050
Thr Arg  Leu Ser Ala Asp Met  Ala Thr Val Leu Gln  Leu Leu Gln
1055                 1060                 1065
Arg Gln  Met Thr Leu Val Pro  Pro Ala Tyr Ser Ala  Val Thr Thr
1070                 1075                 1080
Pro Gly  Pro Gly Pro Thr Ser  Thr Ser Pro Leu Leu  Pro Val Ser
1085                 1090                 1095
Pro Leu  Pro Thr Leu Thr Leu  Asp Ser Leu Ser Gln  Val Ser Gln
1100                 1105                 1110
Phe Met  Ala Cys Glu Glu Leu  Pro Pro Gly Ala Pro  Glu Leu Pro
1115                 1120                 1125
Gln Glu  Gly Pro Thr Arg Arg  Leu Ser Leu Pro Gly  Gln Leu Gly
1130                 1135                 1140
Ala Leu  Thr Ser Gln Pro Leu  His Arg His Gly Ser  Asp Pro Gly
1145                 1150                 1155
Ser 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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