(57)【要約】  エリスロポエチン（ＥＰＯ）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を共に用いて脳血管疾患を治療する方法であって、最初に、治療を必要とする対象を同定し、次に、有効な合計量のＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦを対象に投与することからなる方法。また、Ｇ−ＣＳＦを用いて対象でのＥＰＯの発現を増大させる方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳血管疾患を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、有効合計量のエリスロポエチン（ＥＰＯ）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を投与することからなる方法。
【請求項２】
脳血管疾患は虚血である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは別々に投与される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは皮下に投与される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは同時に投与される請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは皮下に投与される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
脳血管疾患は脳卒中である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは別々に投与される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは皮下に投与される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは同時に投与される請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは皮下に投与される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
脳血管疾患は脳梗塞である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは別々に投与される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは皮下に投与される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは同時に投与される請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは皮下に投与される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは同時に投与される請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは別々に投与される請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
対象でのＥＰＯの発現を増大させる方法であって、
ＥＰＯの増大を必要とする対象を同定すること、および
該対象への有効量のＧ−ＣＳＦの投与すること、
からなる方法。
【請求項２０】
対象は貧血に罹っている請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００７年２月７日出願の発明の名称が「エリスロポエチンおよび顆粒球コロニー刺激因子の併用による脳血管疾患の治療（Treating Cerebrovascular Diseases With
Erythropoeitin And Granulocyte-colony Stimulating Factor Jointly）」である米国
特許出願第１１／７０３，５７８号の優先権を主張する。かかる米国特許出願の内容は、参照により本明細書に組込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＥＰＯ（３０．４ｋＤａ糖タンパク質）は、赤血球の生産を調節する。ＥＰＯは、これらの赤血球前駆細胞表面上で発現されたＥＰＯ受容体に結合することにより赤血球前駆細胞の増殖および分化を刺激する。非特許文献１および２参照。ＥＰＯは慢性腎不全または癌化学療法に起因する貧血を治療するための治療薬として周知である。
【０００３】
Ｇ−ＣＳＦ（１９．６ｋＤ糖タンパク質）は、顆粒球細胞を生産するために骨髄を刺激する。さらに、Ｇ−ＣＳＦは、好中球の顆粒球細胞始原細胞および成熟した好中球の生存、増殖、分化および機能を促進する。Ｇ−ＣＳＦは好中球減少症の治療のために２０年以上にわたって使用されている。非特許文献３および４参照。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Krantz, Blood 77(3):419-434 (1991)
【非特許文献２】Jelkmann, Physiol Rev. 72(2):449-489 (1992)
【非特許文献３】Burgess et al., Int. J. Cancer 26(5):647-654 (1980)
【非特許文献４】Frampton, et al., Drugs 48(5):731-760 (1994)
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ＥＰＯの転写因子であるＨＩＦ１αの活性化によりＧ−ＣＳＦが内因性ＥＰＯ発現をアップレギュレートするという予期しない知見と、Ｇ−ＣＳＦおよびＥＰＯが脳血管疾患を治療するにあたって相乗的に作用するという知見とに基づいている。
【０００６】
したがって、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦを併用して脳血管疾患（例えば脳虚血、脳卒中、脳梗塞）を治療する方法が本発明の範囲内に含まれる。この方法は、最初に、治療を必要とする対象を識別し、次に、かかる対象に有効な合計量のＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦを投与することを含む。ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは、例えば皮下注射によって、別々にまたは同時に投与することができる。
【０００７】
さらに、Ｇ−ＣＳＦを用いて対象のＥＰＯレベルを増大させる方法も本発明の範囲内に含まれる。この方法は、ＥＰＯレベルの増大を必要とする対象（例えば貧血患者）を識別し、皮下経路または他の経路経由で対象に有効量のＧ−ＣＳＦを投与することを含む。
【０００８】
本発明の１または複数の実施形態の詳細を、以下の発明を実施するための形態で説明する。本発明の他の特徴、目的および効果は、説明と図面から、および請求項から明白となろう。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ＥＰＯの発現は、転写因子である低酸素症誘致可能な筆写の要因だけ上の規制することができる、低酸素症誘導因子１α（ＨＩＦ１α）により、かかる因子の低酸素症応答要素（ＥＰＯのプロモータに存在する保存配列（５’−ＲＣＧＴＧ−３’））への結合によりアップレギュレートされる。Semenza, Trends, Mol Med. 7(8):345-350, 2001参照。
【００１０】
本願発明者らは、ＨＩＦ−１ａの活性化によって、Ｇ−ＣＳＦがＥＰＯの発現を増強することを見出した。また、本願発明者らは、ＥＰＯとＧ−ＣＳＦが、併用された場合に、初代皮質細胞に神経保護の相乗効果を示すことを見出した。例えば、ＥＰＯとＧ−ＣＳＦの組み合わせは、Ｂｃｌ−２（抗アポトーシスタンパク質）の発現を増加させると共にキャスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−３（アポトーシスの主要な役割分子）の活性をブロックすることにより、アポトーシスを阻害した。この併用効果は、ニューロン細胞アポトーシスの阻害におけるＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦのいずれかの単独の効果よりも有意に大きい。さらに、ＥＰＯとＣ−ＧＳＦの同時投与は、虚血傷害を減少させる際に相乗効果を示す。ＥＰＯとＧ−ＣＳＦの組み合わせは、脳梗塞を有意に減少させ、中大脳動脈結紮の後で起こる神経機能不全を改善する。ＥＰＯとＧ−ＣＳＦの組み合わせは、さらに、虚血後に虚血部位に移動される幹細胞の数を有意に増大させる。さらに、ＥＰＯとＧ−ＣＳＦの組み合わせは、虚血した脳における血管新生および新しい脳血管形成を促進した。要するに、上述の知見は、脳血管疾患を治療する際にＥＰＯとＧ−ＣＳＦが相乗的に作用することを示している。
【００１１】
脳血管疾患の治療は、初めに、そのような治療を必要とする対象を識別し、次に、かかる対象に有効な合計量のＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦを同時投与することにより達成される。
脳血管疾患は、脳の領域が虚血または出血によって一時的にまたは永久的にに冒され、脳血管のうちの１つまたは複数が病理プロセスに関与する、すべての障害を意味する。
【００１２】
「有効な合計量」とは、治療される対象に対する治療効果を推測するのに必要なＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦの合計量のことを指す。当業者に理解されるように、有効な用量は、治療される疾患の種類、投与経路、担体の使用、および他の治療薬との同時使用の可能性に依存して変わるだろう。
【００１３】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは商用供給源、例えばJohnson & Johnson, and Kirin Pharmaceuticals Co. Ltd.から入手可能であるが、それらは天然源から分離してもよいし、また
は組換えＤＮＡ技術によって生産してもよい。
【００１４】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは、２つの医薬組成物として別々に、または１つの医薬組成物として一緒に、調剤することが可能である。組成物は医薬として許容される担体を含む。「許容される」とは、担体が組成物の活性成分に対して適合性であって（好ましくは活性成分を安定化でき）、治療される患者に有害でないことを意味する。１つまたは複数の可溶化剤を、医薬担体として使用することが可能である。他の担体の例には、コロイド酸化シリコン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウムおよびＤ＆Ｃイエロー１０番が含まれる。
【００１５】
上述の治療を実施するために、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは非経口経路等の種々の経路で投与され得る。本明細書に使用する場合、用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、鞘内、病巣内、または頭蓋内投与と、任意の適切な注入技術とを指す。ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは、それらが別々に調剤されても一緒に調剤されても、同時に投与してもよいし、それらが別々に調剤された場合には連続して投与されてもよい。
【００１６】
１実施例において、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは、滅菌した注射可能な組成物として一緒
に調剤される。この組成物は、１，３−ブタンジオール溶液のような非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶剤に溶かした溶液または懸濁液であってよい。使用可能な許容される賦形剤および溶剤は、マンニトール、水、リンゲル液、および等張食塩水である。さらに、溶剤または懸濁溶媒として（例えば合成モノまたはジグリセリド）従来どおり不揮発性油が使用される。脂肪酸（例えばオレイン酸）やそのグリセリド誘導体は注射液の調製において有用であり、特に天然の医薬として許容される油（オリーブ油やひまし油）、特にそのポリオキシエチル化型が有用である。これらの油溶液または懸濁液はさらに、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、カルボキシメチルセルロース、または同様の分散剤を含んでもよい。トゥイーン（Tween）またはスパン（Span）のような他の一般に用いら
れている界面活性剤や、医薬として許容される固体、液体または他の剤形の製造に一般に使用される他の同様な乳化剤または生物学的利用率（バイオアベイラビリティ）増強剤も、調剤の目的で使用することができる。
【００１７】
本発明はまた、脳血管疾患の治療のための医薬におけるＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦの併用をその特徴とする。
本発明の別の態様は、初めに、ＥＰＯの発現の増大を必要とする対象を選択し、次に、その対象に有効量のＧ−ＣＳＦを投与することにより、対象のＥＰＯの発現を増大させることに関する。対象は、例えば貧血を患っているなど、種々のシナリオでＥＰＯの発現の増大を必要とするだろう。Ｇ−ＣＳＦは上述したのと同じ方法で調剤および投与可能である。対象のＥＰＯ発現を増大させるための医薬におけるＧ−ＣＳＦの使用も、本発明の範囲内にある。
【００１８】
以下の特定の実施例は単に例示として解釈されるべきであり、いかようにも本開示の残りの部分を限定しないものと解釈される。これ以上詳細に述べなくとも、当業者には本明細書の説明に基づけば本願発明をその最大限度まで利用できる。本明細書に引用された観光物は、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１９】
実施例１．Ｇ−ＣＳＦは健康なドナーの血清ＥＰＯレベルを増加させた
健康なドナーに皮下注射で５日連続してＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／ｋｇ）を投与した。血液サンプルをドナーからＧ−ＣＳＦ投与後１日目、３日目、７日目および１４日目に収集した。これらの血液サンプル中のＥＰＯレベルを、R&D
Systems社（ミネソタ州ミネアポリス所在）から購入したＥＰＯ特異的抗体を使用してＥＬＩＳＡ分析により測定した。
【００２０】
Ｇ−ＣＳＦは血清ＥＰＯレベルを有意に増加させたが、Ｇ−ＣＳＦ注入後３日目にピークに達した。
実施例２．Ｇ−ＣＳＦはＨＩＦ１αを活性化し、初代皮質培養物におけるＥＰＯ発現をアップレギュレートした
ラット初代皮質細胞を、Goldberg et al.,  J. Neurosci. 13(8):3510-3524に記載の方法の後で、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの１７日目の胎児の大脳皮質から分離した。分離の４日後、初代皮質細胞を０．５ｇ／ｌ  ＢＳＡ、２％  Ｂ２７添加物、０．５ｍＭピルビン酸塩、および抗生物質（すなわち１０5ｕ／ＬのペニシリンＧおよび１００
ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン）を含む最少必須培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）で補充した。７日目に、培養培地を１ｍＭピルビン酸塩、１ｍＭグルタミン酸塩、０．５ｇ／ｌ  ＢＳＡ、２％  Ｂ２７添加物および抗生物質（つまりすなわち１０5ｕ／ＬのペニシリンＧ
および１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン）を含む無血清基本培地と置き換えた。
【００２１】
その後、初代皮質細胞を、異なる期間の間（０．５時間、１時間、４時間、１０時間および２４時間）および異なる用量（０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）でＧ−ＣＳＦにより処理した。処理後、細胞を３２０ｍＭスク
ロース、ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、１μｇ／ｍｌ  アプロチニンを含むバッファに溶解させ、１３，０００ｇで１５分間遠心した。得られたペレットを、６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％  グリセリン、２％  ＳＤＳ、０．１％  ブロモフェノールブルー、および５０ｍＭ  ＤＴＴを含むサンプルバッファに懸濁し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（４〜１２％）電気泳動にかけた。その後、ゲル上のタンパク質をＨｙｂｏｎｄ−Ｐナイロンメンブレンに写し、ＨＩＦ−１αおよびＥＰＯのレベルをR&D Systems社から購入した抗ＨＩＦ−１α抗体および抗ＥＰＯ抗体を用いてウエスタンブ
ロットにより決定した。ウエスタンブロット分析で示される各タンパク質バンドの強度を、Kodak Digital Science 1D Image Analysis System（Eastman Kodak社、ニューヨーク
州ロチェスター所在）で測定した。
【００２２】
ＨＩＦ−１αおよびＥＰＯのレベルは、初代皮質細胞がＧ−ＣＳＦで１時間および４時間処理されているときに明らかに増大したこの活性化は用量依存的であった。ＨＩＦ１αのレベルは０．１μｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦの用量でピークに達した。０．１μｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦを使用したときにＥＰＯレベルは増大し、１μｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦでピークに達した。
【００２３】
実施例３．初代皮質細胞中におけるＥＰＯとＧ−ＣＳＦの相乗的な抗アポトーシス効果
上述の方法に従ってラット初代皮質細胞を分離し、培養した。ＥＰＯとＧ−ＣＳＦの抗アポトーシス効果を調べるために、ラット初代皮質細胞を初めに、Ｇ−ＣＳＦ（２μｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ（２０Ｕ／ｍｌ）または［Ｇ−ＣＳＦ（１μｇ／ｍｌ）＋ＥＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ）］で１２時間処理し、次にアポトーシスを誘導するために酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）処理に晒した。要約すると、グルコースを含有しないＥａｒｌｅ平衡塩類溶液で培養した細胞を、４時間、低酸素チャンバ（Bug Box、Ruskinn Technology社、英国所在
）の中に配置した。この期間の間、酸素圧力が１未満ｍｍＨｇとなるように、細胞を３７℃で９５％  Ｎ2および５％ ＣＯ2で連続的に洗浄した。その後、ＯＤＧ処理細胞に２４
時間再度酸素を与え、上述したような通常の培養条件下で培養した。対照細胞は、グルコースを含有しないＥａｒｌｅ平衡塩類溶液で正常酸素圧のインキュベータで同じ期間の間培養した。
【００２４】
ＯＤＧ処理後、市販のキット（Bio-Rad社）を使用して、皮質細胞を蛍光測定分析によ
りｃａｓｐａｓｅ−３活性について調べた。これらの細胞におけるアポトーシス関連タンパク質（例えばＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂａｘ）の発現も、ウエスタンブロットにより決定した。
【００２５】
２０U／ｍｌのＥＰＯまたは２ｇｍ／ｌのＧ−ＣＳＦのいずれかで処理した初代皮質細
胞はＯＧＤ誘導神経毒性条件下で有意に低いｃａｓｐａｓｅ−３活性を呈した。ｃａｓｐａｓｅ−３活性は、［ＥＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ）＋Ｇ−ＣＳＦ（１μｇ／ｍｌ）］で処理した細胞ではさらに減少した。明らかに、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦの併用は、ＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦのいずれかの別々の治療と比較して、ＯＧＤ処理皮質細胞でのｃａｓｐａｓｅ−３活性の減少に相乗効果を示した。
【００２６】
同様に、ＥＰＯ（２０Ｕ／ｍｌ）およびＧ−ＣＳＦ（２μｇ／ｍｌ）はいずれもＯＤＧ処理皮質細胞でのＢｃｌ−２の発現を活性化した。Ｂｃｌ−２のレベルは、細胞が［ＥＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ）＋Ｇ−ＣＳＦ（１μｇ／ｍｌ）］で共に処理された場合にさらに増大した。
【００２７】
実施例４．脳虚血後の相乗的に改善された神経学的挙動
ラットを虚血の襲撃から救出する際のＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦおよび［ＥＰＯ＋Ｃ−ＧＳＦ］の効果を決定するために、身体振動テストおよび自発運動活性テストを行った。
【００２８】
生体内脳虚血／再潅流を、４０匹の成雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに対して行った（体重２５０−３００ｇ、６−７週齢）。ラットを抱水クロラール（０．４ｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、Chen et al, A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction.  Stroke, 17(4):738-743 (1986).に記載
されているように右中大脳動脈（ＭＣＡ）結紮および両側性総頚動脈（ＣＣＡ）クランプを施した。９０分間の虚血誘発後、ＭＣＡの１０−０縫合とＣＣＡの動脈クリップを取り外して再潅流した。ラットが麻酔から回復している際、体温を過熱ランプで３７℃に維持した。脳虚血の誘導の１日後に、ラットを４つのグループに分け（各グループ１０匹）、各グループをＧ−ＣＳＦ（１００μｇ／ｋｇ）ＥＰＯ（１０，０００Ｕ／ｋｇ）、［Ｇ−ＣＳＦ（５０ｍｇ／ｋｇ）＋ＥＰＯ（５，０００Ｕ／ｋｇ）］、または賦形剤対照で皮下注射により処理した。
【００２９】
ラットの行動の評価を、虚血誘発の３日前、３日後、７日後、１４日後および２８日後に行った。これらの評価には以下のものが含まれる：（ａ）Borlongan et al., Neuroreport 9(12):2837-2842に記載された方法による身体振動テストの遂行、（ｂ）Shyu et al., Circulation 110(13):1847-1854 (2004)に記載された自発運動活性の決定、および（ｃ）Dunnett et al., Neurosci Lett. 246(1):1-4 (1998)に記載されたGrip Strength Meter（修正）を用いた握力測定。ようやくすると、各前肢の握力を、治療前と治療後に別々
に測定した。その後、平均強さ（２０回の引っぱりから）を計算した。握力比は、虚血部位とは反対側の平均強さと、同じ側の平均強さとの比較を指す。
【００３０】
脳虚血誘発の数日後、賦形剤対照で処理したラットは、重度の身体非対称を示した。この異常は、ＥＰＯ（１０，０００Ｕ／ｋｇ）、Ｇ−ＣＳＦ（１００μｇ／ｋｇ）、またはＥＰＯ（５，０００Ｕ／ｋｇ）＋Ｇ−ＣＳＦ（５０μｇ／ｍｌ）で処理したラットでは有意に減少した。ＥＰＯとＧ−ＣＳＦの併用で処理したラットの回復率は、ＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦのいずれかで別々に処理したラットよりはるかに高かった。この結果は、虚血の襲撃からラットを救出する際のＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦの相乗効果を示した。
【００３１】
虚血を患っているラットは自発運動活性が損なわれることが示された。自発運動活性は、垂直方向の活動、垂直方向への移動の回数、および各垂直方向移動が持続する時間により測定した。これらの活性は、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦまたはＥＰＯとＧ−ＳＣＦで処理した虚血ラットでは著しく回復した。例えば、処理後２８日目に、対照ラットの垂直方向移動回数は約１５０だった。ＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦのいずれかで処理したラットでは、この数は約２２５まで増加した。ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦで併用で処理したラットでは約２８０まで増加した。
【００３２】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦで共に処理した虚血ラットは、ＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦのいずれか一方で、もしくは賦形剤対照で処理したラットよりも高い握力比を示した。
実施例５．ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは脳梗塞後の梗塞部体積を縮小した
上述の方法に続いて、ラットに脳虚血を誘発した。４つのグループの虚血ラット（各グループ１０匹）を、皮下注射によりそれぞれＧ−ＣＳＦ（１００μｇ／ｋｇ）、ＥＰＯ（１０，０００Ｕ／ｋｇ）、［Ｇ−ＣＳＦ（５０ｍｇ／ｋｇ）＋ＥＰＯ（５，０００Ｕ／ｋｇ）］または賦形剤対照で処理した。誘発後の７日前に、これらの虚血ラットの右皮質の梗塞領域を、General Electric社静の画像システムを使用して３．０ＴでＭＲＩにより測定した。ラットを抱水クロラールで麻酔し、次に、各ラットの脳は６回の連続３ｍｍ厚冠画像にかけた。Ｔ２重み付けイメージング（Ｔ２ＷＩ）パルスシーケンスをスピンエコー技術（反復時間：４０００ｍｓ；エコー時間：１０５ｍｓ）を使用して得、脳虚血の誘発後１日目、７日目、１４日目および２８日目に各動物に対して逐次補捉した。右皮質の非梗塞領域を、ラット脳の左半球の皮質野の合計から引いた。梗塞部領域を、スライスから
スライスからへと手動で引いて、内部体積分析ソフトウェア（Voxtool、General Electric者、Medical Systems, コネチカット州フェアフィールド所在）により計算した。
【００３３】
ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦで共に処理したラットの梗塞部体積は、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦの一方で個々にまたは塩類対照で処理されたラットのそれより有意に小さかった。虚血誘発後７日目に、対照ラット（食塩水で処理）の梗塞部体積は１５９±３２ｍｍ3だった
が、驚いたことに［ＥＰＯ（５，０００Ｕ／ｋｇ）＋Ｇ−ＣＳＦ（５０μｇ／ｋｇ）］で処理ラットの梗塞部体積は４２±２３ｍｍ3だった。これは１０，０００Ｕ／ｋｇ  ＥＰ
Ｏ（７７±２６ｍｍ3）で処理されたラットや、１００μｇ／ｋｇ  Ｇ−ＣＳＦ（７１±
２６ｍｍ3）で別々に処理されたラットよりもずっと低かった。ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦ
で共に処理されたラットの梗塞部スライスの数も、ＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦで別々に処理されたラットのそれものよりも有意に低かった。
【００３４】
実施齢６．虚血脳の幹細胞移動および分化に対するＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦの効果
内在性神経始原細胞（ＩＮＰＣ）との骨髄由来肝細胞（ＢＭＳＣ）との両方の移動を調べるために、上述した虚血誘発の７日後にＢｒｄＵ標識化を適用した。ＢｒｄＵ（チミジンアナログ）は、ＤＮＡ合成中に分割中の細胞にＤＮＡを組み込む。ＢｒｄＵは有糸核分裂細胞の標識化のために慣例的に使用されている。標識化プロトコルとＢｒｄＵ陽性細胞の定量化はZhang, et al., Neuroscience 105(1):33-41 (2001)に記載されている。
【００３５】
虚血ラットをＥＰＯ（１０，０００Ｕ／ｋｇ）、Ｇ−ＣＳＦ（１００μｇ／ｋｇ）、［ＥＰＯ（５，０００Ｕ／ｋｇ）＋Ｇ−ＣＳＦ（５０μｇ／ｋｇ）］、または生理食塩水で処理した。その後、これらのラットをＢｒｄＵ標識化した。ＥＰＯとＧ−ＣＳＦで処理したラットでは、別々でも併用でも、免疫組織化学的分析によると、梗塞部境界や虚血半球の脳室下領域付近の同側皮質に少数のＢｒｄｕ陽性細胞があることが明らかとなった。ＢｒｄＵ陽性細胞は、虚血半球の血管周囲部分の血管の種々の口径を有するルーメンの周囲でも見つかった。ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦを併用処理したラットで見つかったＢｒｄＵ陽性細胞の数は、ＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦのいずれかで別々に処理したラットのそれよりも有意に高かった。
【００３６】
ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、またはＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦで処理した虚血マウスでの幹細胞の分化を調べるために、骨髄移植分析を行った。骨髄は、Hess et al., Stroke 33(5):1362-1368 (2002)に記載された手順に従ってＧＦＰ遺伝子組換えドナーマウスから抽出した。要約すると、大腿骨と脛骨の両側端を２５ゲージ針を有する注射器を使用して穿刺し、骨髄を滅菌食塩水で洗浄した。１つの大腿骨から得られた骨髄を１ｍｌに希釈し、次いで３０μｍ  Spectramesh(Fisher Scientific社、ジョージア州スワニー所在に通じてろ過
した。
【００３７】
骨髄移植前に、雄レシピエントマウスはGammacell 40放射線装置（MSD Nordion社、カ
ナダ国オンタリオ州オタワ所在）を使用して、137Ｃｓでγ照射した。レシピエントマウ
スの骨髄全体をアブレーションするために総量９Ｇｙを投与した。高レベルの放射線は脳虚血の誘発中または誘発直後の死亡率を著しく増加させる可能性があるため、レシピエントマウスは照射後２４時間以内に救出用の骨髄移植を受けた。
【００３８】
その後、骨髄（１００μｌは１−１．５×１０6細胞を含む）をレシピエントマウスの
尾部に注入した。移植の３〜６週間後に、レシピエントマウスを抱水クロラール（０．３ｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、上述したように脳虚血を誘発した。虚血誘発の１日後、マウスを４つのグループに分け、各グループに、５日連続して一日一回、ＥＰＯ（１０，０００Ｕ／ｋｇ）、Ｇ−ＣＳＦ（１０μｇ／ｋｇ）、［ＥＰＯ（５，０００Ｕ／ｍｌ）＋Ｇ−ＣＳＦ（５μｇ／ｋｇ）］、または賦形剤対照を皮下注入した。ＢｒｄＵ標識化も上述
の手順に続いて各マウスに対して行なった。
【００３９】
次に、各グループからマウスの脳スライスを、ＢｒｄＵ特異的抗体と、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ−２）、ニューロン核（ＮｅｕＮ）およびＭｕｓａｓｈｉ−１にそれぞれ特異的な抗体とで、染色した。ＧＦＰ＋およびＢｒｄＵ＋細胞をレーザ走査共焦顕微鏡で検知した。
【００４０】
ＧＦＰ＋細胞は、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦおよびＥＰＯとＧ−ＣＳＦで処理したマウスでは両側線条体、海馬、およびペナンブラ領域にわたって分散しているのが分かったが、賦形剤対照で処理したマウスでは分散していなかった。ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦで共に処理したマウス由来の脳スライスは、ＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦのいずれかで個別に処理したマウスの脳スライスと比較して、ＧＦＰ＋およびＢｒｄＵ＋細胞の数が著しく増大した。さらに、ＥＰＯとＧ−ＣＳＦで処理したラットの海馬、脳室下および虚血ペナンブラ領域ではＧＦＡＰ、Ｎｅｕ−Ｎ＋およびＭＡＰ−２が同時発現したＢｒｄＵ＋細胞の増加が明らかとなった。ＧＦＰ＋−Ｍｕｓａｓｈｉ−１＋−ＢｒｄＵ＋細胞は、ほとんど海馬のみで見つかっただけだった。
【００４１】
実施例７．皮下のＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦ注入は、虚血脳での血管新生を引き起こした
大脳の微小循環を、蛍光血漿マーカであるＦＩＴＣデキストランを使用して分析した。このマーカを、ＥＰＯ（１０，０００Ｕ／ｋｇ）、Ｇ−ＣＳＦ（１００μｇ／ｋｇ）、［ＥＰＯ（５，０００Ｕ／ｋｇ）＋Ｇ−ＣＳＦ（５０μｇ／ｋｇ）］または賦形剤対照で処理した虚血ラットに静脈内注入し、Morris et al., Brain Res. Brain Res. Protoc 4(2):185-191 (1999)に記載されているように蛍光顕微鏡を使用して検知した。
【００４２】
ＦＩＴＣデキストラン潅流の結果は、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦ（ｎ＝６）による処理が、ＥＰＯ（ｎ＝６）、Ｇ−ＣＳＦ（ｎ＝６）または賦形剤対照（ｎ＝６）による処理よりもさらに多くの大脳微小血管潅流を引き起こすことを示した。
【００４３】
大脳の血管密度の量を計るために、以下の手順を行った。虚血ラットを抱水クロラールで麻酔し、食塩水で潅流した。組織切片（６μｍ）をＣＤ３１（PharMingen社、カリフォルニア州サンディエゴ所在）特異的なＣｙ−３−共役抗体で染色した。その後、Taguchi,
et al., J. Clin. Invest. 114(3):330-338 (2004)に記載されているように、大脳の血
管数を決定した。
【００４４】
ＣＤ３１の免疫染色により、ＥＰＯとＧ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦで処理した虚血ラットが、そのペナンブラ領域で新しい血管の著しい増加を示すことがわかった。ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦで共に処理されたラットの血管数は、ＥＰＯまたはＧ−ＣＳＦのいずれかで個別に処理されたラットの血管数よりはるかに多かった。
【００４５】
実施例８．ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦは虚血の脳の中で脳血流量（ＣＢＦ）を促進した
抱水クロラールで麻酔したラットを、定位フレームに配置し、基線局所大脳皮質血流（ｂＣＢＦ）を、Part et al., J. Neurosci. 25(7):1769-1777 (2005)に記載のレーザドップラー流量計を使用して、脳虚血後にモニタした。ＣＢＦ値を、ＥＰＯ（１０，０００Ｕ／ｋｇ）、Ｇ−ＣＳＦ（１００μｇ／ｋｇ）、［ＥＰＯ（５，０００Ｕ／ｋｇ）＋Ｇ−ＣＳＦ（５０μｇ／ｋｇ）］または賦形剤対照による処理後にｂＣＢＦの増加パーセンテージとして計算した。
【００４６】
ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦ、または賦形剤対照で処理した虚血ラットを、麻酔下で、レーザドップラー流量計（ＬＤＦ）を用いてモニタした。脳虚血の１週
間後、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦ（ｎ＝６）で処理したラットでは、ＥＰＯ（ｎ＝６）、Ｇ−ＣＳＦ（ｎ＝６）または賦形剤対照（ｎ＝６）で処理したラットと比較して、中大脳動脈皮質のＣＢＦ値が著しく増加した。
【００４７】
実施例９．皮下ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦ処理は生理学的パラメータに影響を及ぼさなかった
全身性の生理学的パラメータ（例えば血圧、心拍数、血糖、血液ガス）を、Lin et al., Stroke, 30(1):126-133 (1999)に記載の手順に従って、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦで処理した３１匹のラットにおいて測定した。この実施例における測定はすべて盲検で行なわれた。結果を平均値±ＳＥＭで表す。行動学的スコアを正常かどうか評価した。
【００４８】
表１は、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦで処理したラットに由来する生理学的パラメータを示す。賦形剤対照で処理したラットと、ＥＰＯ（ｎ＝８）、Ｇ−ＣＳＦ（ｎ＝８）またはＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦ（ｎ＝８）で処理したラットとの間では、全身血圧、血液ガス、血糖または血清電解質レベルに違いはなかった。
【００４９】
【表１】
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他の実施形態
本明細書に開示した特徴はすべて、任意の組み合わせで組み合わせることが可能である。本明細書に開示した各特徴は、同一の、等価なまたは同様な目的を果たす代替特徴と置換可能である。したがって、別段の明示の記載がない場合、開示した各特徴は、一連の等価なまたは同様な特徴の例にすぎない。
【００５０】
上記の説明から、当業者は、本発明の範囲の精神および範囲から逸脱せずに、本発明の本質的特性を容易に確認することが可能であり、様々な使用方法および条件に本発明を適応させるために本発明の種々の変更および改変をなし得る。したがって、他の実施形態も以下の特許請求の範囲に含まれる。
【国際調査報告】
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