(57)【要約】  癌の治療のための方法及び組成物が本明細書に記述してある。特に、本発明は、ファンコニー貧血経路の重要な成分としてFANCIポリペプチドを同定し、および特徴付け、FANCIの阻害剤およびこれを使用する方法を開示する。このような阻害剤は、DNA損傷修復を阻害するのに有用であり、たとえば癌の治療に有用であり得る。【選択図】      図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体が癌を有するか、もしくは癌であるリスクが高いかどうかを診断し、または決定する方法であって、前記方法は、FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片を使用してFANCIを含むフォーカスの存在について、前記被験体からの試料を試験することを含み、前記FANCIを含むフォーカスの存在は、前記被験体における癌または癌のリスクの増加を示す方法。
【請求項２】
前記抗体またはその抗原結合断片がモノクローナル抗体である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体またはその抗原結合断片がポリクローナル抗体である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合断片がBL999およびBL1000からなる群より選択される抗KIAA1794抗体である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合断片が検出可能に標識されている、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記検出可能なラベルが放射性ラベル、酵素ラベル、ビオチン化ラベおよび蛍光ラベルからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸、末梢血およびリンパ球からなる群より選択される組織に由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が被験体からの血液試料、被験体からの組織の生検試料および株化細胞からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記癌がメラノーマ、白血病、星細胞腫（astocytoma）、グリア芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病、並びに膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、下垂体、腎臓、胃、食道および直腸の癌からなる群より選択される請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
被験体が癌を有するか、もしくは癌であるリスクが高いかどうかを診断し、または決定する方法であって、前記方法は、癌に関連したコード変化の存在について、前記被験体のFANCI遺伝子を試験することを含み、前記1つまたは複数の癌に関連したコード変化の存在は、前記被験体における癌または癌のリスクの増加を示す方法。
【請求項１１】
前記癌に関連したコード変化がK523、K1269、R1285、S730、T952、S1121およびP55からなる群より選択される位置におけるFANCIポリペプチドの変化をコードする、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記位置がR1285である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記FANCIポリペプチドの変化がR1285Qである、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌がメラノーマ、白血病、星細胞腫（astocytoma）、グリア芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病、並びに膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、下垂体、腎臓、胃、食道および直腸の癌からなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
被験体が癌を有するか、または癌を発症するリスクが高いかどうかを決定する方法であって、前記方法は：
（a）前記被験体からDNA試料を提供する工程；
（b）実施例1に示したFANCI遺伝子特異的ポリヌクレオチドプライマーのいずれかで前記被験体からのFANCI遺伝子を増幅する工程；
（c）前記増幅されたFANCI遺伝子をシーケンスする工程；および、
（d）前記被験体からのFANCI遺伝子配列を参照FANCI遺伝子配列と比較する工程、
を含み、前記2つの遺伝子配列の間の相違は、癌に関連した欠陥の存在を示し、
前記1つまたは複数の癌に関連した欠陥の存在は、前記被験体が癌を有するか、または癌を発症するリスクが増加していることを示す方法。
【請求項１６】
前記患者がBRCA-1またはBRCA-2遺伝子の欠陥を生じさせる公知の癌を有さない、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌に関連したコード変化がK523、K1269、R1285、S730、T952、S1121およびP55からなる群より選択される位置におけるFANCIポリペプチドの変化をコードする、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
前記位置がR1285である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌がメラノーマ、白血病、星細胞腫（astocytoma）、グリア芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病並びに膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、下垂体、腎臓、胃、食道および直腸の癌からなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
被験体がファンコニー貧血を有するか、もしくはファンコニー貧血を発症するリスクが高いかどうかを診断し、または決定する方法であって、前記方法は、ファンコニー貧血に関連したコード変化の存在について前記被験体のFANCI遺伝子を試験することを含み、前記1つまたは複数のファンコニー貧血に関連したコード変化の存在は、前記被験体におけるファンコニー貧血またはファンコニー貧血のリスクの増加を示す方法。
【請求項２１】
前記ファンコニー貧血に関連したコード変化がK523、K1269、R1285、S730、T952、S1121およびP55からなる群より選択される位置におけるFANCIポリペプチドの変化をコードする、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記位置がR1285である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記FANCIポリペプチドにおける変化がR1285Qである、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
被験体が癌を有するか、または癌を発症するリスクが増加してしているかどうかを決定する方法であって：
（a）前記被験体からDNA試料を提供する工程；
（b）FANCI遺伝子特異的なポリヌクレオチドプライマーで前記被験体からのFANCI遺伝子を増幅する工程；
（c）増幅されたFANCI遺伝子をシーケンスする工程；および、
（d）前記被験体からのFANCI遺伝子配列を参照FANCI遺伝子配列と比較する工程、
を含み、前記2つの遺伝子配列の間の相違は、癌に関連したコード変化の存在を示し、
前記1つまたは複数の癌に関連したコード変化の存在は、前記被験体が癌を有するか、または癌を発症するリスクが増加していることを示す方法。
【請求項２５】
前記癌に関連したコード変化がK523、K1269、R1285、S730、T952、S1121およびP55からなる群より選択される位置におけるFANCIポリペプチドの変化をコードする、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記位置がR1285である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記FANCIポリペプチドの変化がR1285Qである、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌が、メラノーマ、白血病、星細胞腫（astocytoma）、グリア芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病、並びに膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、下垂体、腎臓、胃、食道および直腸の癌からなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
【請求項２９】
前記FANCI遺伝子特異的なポリヌクレオチドプライマーが配列番号：1〜8からなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
【請求項３０】
新生物障害がある被験体が遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろうかどうかを予測する方法であって、FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片を使用して前記被験体からの試料におけるFANCIを含むフォーカスのサイズまたは数を決定することを含み、前記フォーカスの数またはサイズが、対照被験体からの試料におけるフォーカスの数またはサイズと比較して減少される場合、前記被験体は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応すると予測される方法。
【請求項３１】
前記抗体またはその抗原結合断片がモノクローナル抗体である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体またはその抗原結合断片がポリクローナル抗体である、請求項30に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体またはその抗原結合断片がBL999およびBL1000からなる群より選択される抗KIAA1794抗体である、請求項30に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体またはその抗原結合断片が検出可能的に標識されている、請求項30に記載の方法。
【請求項３５】
前記検出可能なラベルが放射性ラベル、酵素ラベル、ビオチン化ラベおよび蛍光ラベルからなる群より選択される、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料が心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸、末梢血およびリンパ球からなる群より選択される組織に由来する、請求項30に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料が被験体からの血液試料、被験体からの組織の生検試料および株化細胞からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３８】
前記新生物障害がメラノーマ、白血病、星細胞腫（astocytoma）、グリア芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病、並びに膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、下垂体、腎臓、胃、食道および直腸の癌からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３９】
前記被験体が、試料が前記被験体から得られる前に、前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された、請求項30に記載の方法。
【請求項４０】
前記曝露が治療的に有効な用量以下である、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
前記曝露が治療的に有効な用量の約50%以下である、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
前記試料が、前記フォーカスの数またはサイズを決定する前に、前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された、請求項30に記載の方法。
【請求項４３】
前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が1,3-ビス（2-クロロエチル）-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンおよび電離放射線からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項４４】
前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬がシスプラチンである、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が電離放射線である、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
前記被験体からの試料における前記フォーカスの数またはサイズが対照被検体からの試料における前記フォーカスの数またはサイズの約70%未満である、請求項30に記載の方法。
【請求項４７】
新生物障害がある被験体が遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろうかどうかを予測する方法であって、前記被験体からの試料におけるFANCIポリペプチドのユビキチン化の程度を決定することを含み、前記試料における前記FANCIポリペプチドのユビキチン化の程度が、対照被検体からの試料と比較したときに減少される場合、前記被験体は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応すると予測される方法。
【請求項４８】
前記被験体が、試料が前記被験体から得られる前に、前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
前記曝露が治療的に有効な用量以下である、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
前記曝露が治療的に有効な用量の約50%以下である、請求項48に記載の方法。
【請求項５１】
前記試料がFANCIポリペプチドのユビキチン化の程度を決定する前に、前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された、請求項47に記載の方法。
【請求項５２】
前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が、1,3-ビス（2-クロロエチル）-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンおよび電離放射からなる群より選択される、請求項47に記載の方法。
【請求項５３】
前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬がシスプラチンである、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が電離放射線である、請求項52に記載の方法。
【請求項５５】
前記FANCIポリペプチドのモノユビキチン化の程度がFANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片を使用する免疫ブロット分析によって決定される、請求項47に記載の方法。
【請求項５６】
遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に感受性である腫瘍を同定する方法であって、試験被験者からの試料においてFANCIを含むフォーカスのサイズまたは数を決定することを含み、前記フォーカスの数またはサイズが対照被験体からの試料における前記フォーカスの数またはサイズと比較して減少される場合、前記試験被験者からの試料は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に感受性の腫瘍として同定される方法。
【請求項５７】
前記抗体またはその抗原結合断片がモノクローナル抗体である、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体またはその抗原結合断片がポリクローナル抗体である、請求項56に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体またはその抗原結合断片がBL999およびBL1000からなる群より選択される抗KIAA1794抗体である、請求項56に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体またはその抗原結合断片が検出可能的に標識されている、請求項56に記載の方法。
【請求項６１】
前記検出可能なラベルが放射性ラベル、酵素ラベル、ビオチン化ラベおよび蛍光ラベルからなる群より選択される、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
前記試料が心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸、末梢血およびリンパ球からなる群より選択される組織に由来する、請求項56に記載の方法。
【請求項６３】
前記試料が被験体からの血液試料、被験体からの組織の生検試料および株化細胞からなる群より選択される、請求項56に記載の方法。
【請求項６４】
前記腫瘍が、メラノーマ、星細胞腫（astocytoma）、グリア芽細胞腫、神経膠腫、並びに膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、下垂体、腎臓、胃、食道および直腸の癌からなる群より選択される、請求項56に記載の方法。
【請求項６５】
前記被験体が、試料が前記被験体から得られる前に、前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された、請求項56に記載の方法。
【請求項６６】
前記曝露が治療的に有効な用量以下である、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
前記曝露が治療的に有効な用量の約50%以下である、請求項65に記載の方法。
【請求項６８】
前記試料が前記フォーカスの数またはサイズを決定する前に、前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された、請求項56に記載の方法。
【請求項６９】
前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が、1,3-ビス（2-クロロエチル）-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンおよび電離放射線からなる群より選択される、請求項56に記載の方法。
【請求項７０】
前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬がシスプラチンである、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が電離放射線である、請求項69に記載の方法。
【請求項７２】
前記被験体からの試料における前記フォーカスの数またはサイズが、対照被検体からの試料における前記フォーカスの数またはサイズの約70%未満である、請求項56に記載の方法。
【請求項７３】
前記被験体がヒトである、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７４】
ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤を同定する方法であって、
（a）細胞を試験化合物と接触させること；
（b）工程（a）の前、後または同時に前記細胞を遺伝毒性抗新生物化合物と接触させること；
（c）FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片を使用して前記細胞におけるFANCIを含むフォーカスを定量化すること；を含み、前記フォーカスの量が、前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬と接触されたが、前記試験化合物と接触されていない対照細胞におけるよりも少ない場合、前記試験化合物は、ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤として同定される方法。
【請求項７５】
前記請求項74に記載の方法であって：
（d）工程（c）において阻害剤として同定された試験化合物について、前記細胞においてFANCIポリペプチドのモノユビキチン化の程度を決定する工程；をさらに含み、前記FANCIポリペプチドのモノユビキチン化の程度が前記対照細胞におけるよりも少ない場合、前記試験化合物は、ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤として更に同定される方法。
【請求項７６】
前記請求項75に記載の方法であって：
（e）工程（d）において阻害剤として更に同定された試験化合物について、機能的なファンコニー貧血経路を有する試験細胞を前記試験化合物および前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬と接触させること；
（f）前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する前記試験細胞の感受性を測定すること；および、
（g）前記薬剤に対する前記試験細胞の感受性を前記第2の対照細胞のものと比較すること；
をさらに含み、前記第2の対照細胞は、前記試験細胞に対して同質遺伝子的であるが、欠陥のあるファンコニー貧血経路を有し；かつ前記試験細胞の感受性が第2の対象細胞の感受性と同等である場合、前記試験化合物は、ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤として更に同定される方法。
【請求項７７】
前記FANCIを含むフォーカスの数が工程（c）において決定される、請求項74に記載の方法。
【請求項７８】
前記FANCIを含むフォーカスのサイズが工程（c）において決定される、請求項74に記載の方法。
【請求項７９】
前記工程（c）が高スループット形式で行われる、請求項74に記載の方法。
【請求項８０】
工程（d）における前記FANCIポリペプチドのモノユビキチン化の程度が免疫ブロット分析によって決定される、請求項75に記載の方法。
【請求項８１】
前記抗悪性腫瘍薬に対する前記試験細胞および前記第2の対照細胞の感受性が前記抗悪性腫瘍薬の1つまたは複数の濃度における細胞生存を測定することによって決定される、請求項76に記載の方法。
【請求項８２】
前記試験細胞および前記第2の対照細胞がヒト細胞である、請求項76に記載の方法。
【請求項８３】
前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が1,3-ビス（2-クロロエチル）-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンおよび電離放射線からなる群より選択される、請求項74に記載の方法。
【請求項８４】
非ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤を同定する方法であって、
（a）機能的なファンコニー貧血経路を有する試験細胞を試験化合物および遺伝毒性抗悪性腫瘍薬と接触させること；
（b）前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する試験細胞の感受性を測定すること；および、
（c）前記薬剤に対する前記試験細胞の感受性を対照細胞のものと比較すること、
を含み；前記対照細胞は、前記試験細胞に対して同質遺伝子的であるが、突然変異体FANCI遺伝子を有し；かつ前記試験細胞の感受性が前記対照細胞の感受性よりも高い場合、前記試験化合物は、非ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤として同定される方法。
【請求項８５】
前記抗悪性腫瘍薬に対する前記試験細胞および前記対照細胞の感受性が、前記抗悪性腫瘍薬の1つまたは複数の濃度において細胞生存を測定することによって決定される、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が1,3-ビス（2-クロロエチル）-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンおよび電離放射線からなる群より選択される、請求項84に記載の方法。
【請求項８７】
前記試験化合物がファンコニー貧血経路を阻害しない、請求項84に記載の方法。
【請求項８８】
前記突然変異体FANCI遺伝子がK523、K1269、R1285、S730、T952、S1121およびP55からなる群より選択される位置に前記FANCIポリペプチドの変化をコードするコード変化を含む、請求項84に記載の方法。
【請求項８９】
前記位置がR1285である、請求項88に記載の方法。
【請求項９０】
前記FANCIポリペプチドの変化がR1285Qである、請求項88に記載の方法。
【請求項９１】
前記試験細胞および対照細胞がヒト細胞である、請求項84に記載の方法。
【請求項９２】
癌治療的薬をスクリーニングする方法であって：
（a）1つまたは複数の癌に関連した欠陥を有するFANCI遺伝子を含む1つまたは複数の細胞を提供する工程；
（b）潜在的癌治療薬の存在下において前記細胞を増殖する工程；および、
（c）前記潜在的癌治療薬の非存在下において増殖した同等の細胞の増殖率と比較して、前記潜在的癌治療薬の存在下における前記細胞の増殖率を決定する工程、
を含み、
前記潜在的癌治療薬の非存在下において増殖した同等の細胞の増殖率と比較した、前記潜在的癌治療薬の存在下における前記細胞の増殖率の減少は、前記潜在的癌治療薬が癌治療薬であることを示す方法。
【請求項９３】
前記1つまたは複数の癌に関連した欠陥を有する前記FANCI遺伝子が、K523、K1269、R1285、S730、T952、Sl121およびP55からなる群より選択される位置に前記FANCIポリペプチドの変化をコードするコード変化を含む、請求項92に記載の方法。
【請求項９４】
前記位置がR1285である、請求項93に記載の方法。
【請求項９５】
前記FANCIポリペプチドの変化がR1285Qである、請求項93に記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞がヒト細胞である、請求項92に記載の方法。
【請求項９７】
前記細胞がBD0952細胞である、請求項92に記載の方法。
【請求項９８】
化学感作薬をスクリーニングする方法であって：
（a）FANCIの潜在的阻害剤を提供する工程；
（b）1つまたは複数の抗悪性腫瘍薬に耐性である腫瘍株を提供する工程；
（c）前記腫瘍株および前記FANCIの潜在的阻害剤を前記1つまたは複数の抗悪性腫瘍薬と接触させる工程；および、
（d）前記FANCIの阻害剤および前記抗悪性腫瘍薬の存在下において前記腫瘍株の増殖速度を測定する工程、
を含み、
前記抗悪性腫瘍薬の存在下および前記FANCIの阻害剤の非存在下における腫瘍株の細胞と比較した、前記腫瘍株の増殖速度の減少は、前記潜在的阻害剤が化学感作薬であることを示す方法。
【請求項９９】
遺伝毒性抗悪性腫瘍薬での治療に対して被験体を感作する方法であって、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬を受けているが、前記薬剤に耐性である被験体にFANCIの阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項１００】
前記FANCIの阻害剤がFANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片および抗FANCI RNA干渉薬からなる群より選択される、請求項99に記載の方法。
【請求項１０１】
前記FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片がBL999およびBL1000からなる群より選択される抗KIAA1794抗体である、請求項100に記載の方法。
【請求項１０２】
前記抗FANCI RNA干渉薬が配列番号：22、配列番号：23および配列番号：24からなる群より選択されるFANCIの配列をターゲットする、請求項100に記載の方法。
【請求項１０３】
前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が1,3-ビス（2-クロロエチル）-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンおよび電離放射線からなる群より選択される、請求項99に記載の方法。
【請求項１０４】
遺伝毒性抗悪性腫瘍薬での治療に対して被験体を感作する方法であって、
（a）遺伝毒性抗悪性腫瘍薬で治療を受けているが、前記薬剤に耐性である被験体にFANCIの阻害剤を投与する工程；および
（b）非ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤を被験体に投与する工程
を含む方法。
【請求項１０５】
前記FANCIの阻害剤がFANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片および抗FANCI RNA干渉薬からなる群より選択される、請求項104に記載の方法。
【請求項１０６】
前記FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片がBL999およびBL1000からなる群より選択される抗KIAA1794抗体である、請求項105に記載の方法。
【請求項１０７】
前記抗FANCI RNA干渉薬が配列番号：22、配列番号：23および配列番号：24からなる群より選択されるFANCIの配列をターゲットする、請求項105に記載の方法。
【請求項１０８】
非ファンコニー貧血DNA損傷修復経路の阻害剤が、PARP阻害剤、DNA-PK阻害剤、mTOR阻害剤、ERCC1阻害剤、ERCC3阻害剤、ERCC6阻害剤、ATM阻害剤、XRCC4阻害剤、Ku80阻害剤、Ku70阻害剤、XPA阻害剤、CHK1阻害剤およびCHK2阻害剤からなる群より選択される、請求項104に記載の方法。
【請求項１０９】
前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が、1,3-ビス（2-クロロエチル）-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンおよび電離放射線からなる群より選択される、請求項104に記載の方法。
【請求項１１０】
前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が前記FANCIの阻害剤および前記非ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤と同時に投与される、請求項104に記載の方法。
【請求項１１１】
癌患者における治療薬の有効性を予測する方法であって：（a）前記治療薬で治療される前記癌患者から組織試料を提供する工程；（b）前記組織試料の細胞においてDNA損傷を誘導する工程；（c）前記細胞においてユビキチン化されたFANCIタンパク質の存在を検出する工程を含み；前記ユビキチン化されたFANCIの存在は、前記癌患者における前記治療薬の有効性の減少を示す方法。
【請求項１１２】
被験体が癌を有するか、または癌のリスクが高いかどうかを決定するためのキットであって、FANCIに特異的な抗体または抗原結合断片、そのためのパッケージング材料および請求項1に記載の方法を行うための説明書を含むキット。
【請求項１１３】
新生物障害がある被験体が遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろうかどうかを決定するためのキットであって、FANCIに特異的な抗体または抗原結合断片、そのためのパッケージング材料および請求項30に記載の方法を行うための説明書を含むキット。
【請求項１１４】
ファンコニー貧血経路の阻害剤を同定するためのキットであって、請求項74に記載の試験細胞および対照細胞とそのためのパッケージング材料とを含むキット。
【請求項１１５】
非ファンコニー貧血経路の阻害剤を同定するためのキットであって、請求項84に記載の試験細胞および対照細胞とそのためのパッケージング材料とを含むキット。
【請求項１１６】
BD0952細胞の突然変異体FANCIヌクレオチド配列を含む単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１１７】
図9に示したBD0952細胞の突然変異体FANCIポリペプチド配列を含む単離されたポリペプチド配列。
【請求項１１８】
FANCIポリペプチドのN末端の200アミノ酸残基に融合されたGSTを含む単離されたポリペプチド配列。
【請求項１１９】
配列番号：22、配列番号：23および配列番号：24からなる群より選択されるFANCI標的に対する抗FANCI siRNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に援用される2007年3月12日に出願した米国仮特許出願第60/906,724号に関連し、かつ35U.S.C. § 119（e）の下でこれに対する優先権を主張する。
【０００２】
政府支援
本発明は、N.I.H.助成金RO1-HL52725およびRO1-DK43889の下で政府支援により為された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般に癌の治療のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
DNA損傷およびDNA複製ストレスを感知し、応答する能力は、細胞生存および生物生存のために重要である。遺伝毒性ストレスに対して適切に反応することができないと、発達障害および腫瘍形成を引き起こし得る。細胞は、遺伝毒性ストレスを検出して、特定タイプの修復を活性化すること、細胞周期を停止すること、および転写を変化させることによって反応する複雑なシグナル伝達経路を進化させてきた。このシグナル伝達経路の中核に、ATMおよびATRキナーゼがある（BakkenistおよびKastan（2004）Cell 118：9-17；Bartek et al.（2004）5：792-804；ZhouおよびElledge（2000）Nature 408：433-439）。これらのキナーゼは、損傷に応答して、Chk1およびChk2キナーゼを含む20以上の公知のタンパク質をリン酸化する。これらの経路に関する初期の理論では、これらの主要な役割が制御細胞周期移行であると考えたが、現在では、これらがDNA複製およびDNA修復の両方において必須な機能を調節するのに重要な役割を果たすことが明らかである。
【０００５】
ATM/ATRによって調節される1つの経路は、ファンコニー貧血（FA）架橋修復経路である（GurtanおよびD'Andrea（2006）DNA Repair（Amst）5：11 19-1125）。FAである患者は、多臓器欠陥を示し、ほとんどが小児期に骨髄不全を発症する（Butturini et al.（1994）84：1650-1655；ファンコニー（1967）Semin Hematol 4：233-240；Schmidおよびファンコニー（1978）Cytogenet Cell Genet 20：141149）。FA患者は、血液学的および非血液学的な悪性腫瘍の発生率が高く、これらの細胞は、マイトマイシンC（MMC）などのDNA鎖間の架橋剤に高感受性である（Alter et al. (2003) Blood 101 : 2072）。FAは、13の相補グループに入り、12のFA遺伝子が以前にクローン化されている（GurtanおよびD'Andrea（2006）DNA Repair（Amst）5：1119-1125；Reid et al.（2007）Nat Genet 39：162-164；TaniguchiおよびD'Andrea（2006）Blood 107：4223-4233；Xia et al.（2007）Nat Genet 39：159-161；Xia et al（2006）Mol Cell 22：719-729）。これらのタンパク質のうちの8つは（D2、D1、JおよびN以外の全て）、FAコア複合体、核E3ユビキチンリガーゼのサブユニットである（Machida et al.（2006）Mol Cell 23：589-596；Meetei et al.（2004）Cell Cycle 3：179-181）。このリガーゼの重要な基質は、FANCD2であり、これはリジン561上でモノユビキチン化することが示されている（Garcia-Higuera et al.（2001）Mol Cell 7：249-262）。リジンアクセプターについて、ニワトリFANCD2タンパク質突然変異体に対するユビキチンの融合により、ニワトリFANCD2突然変異体を補完することができるが、リガーゼ活性についてFA突然変異体欠陥はできないことが観察されたので、FANCD2に加えて、リガーゼのためのもう一つの重要な基質があることが仮定されてきた（Matsushita et al.（2005）Mol Cell 19：841-847）。
【０００６】
FANCD2ユビキチン化は、MMC耐性のために重要であることが同定され、またFANCD2タンパク質がクロマチン上の損傷で誘導されるフォーカスを形成するために必要とされることが観察された（Garcia-Higuera et al.（2001）Mol Cell 7：249-262）。FA経路が鎖間の架橋修復を制御するメカニズムは、不明なままであるが；しかし、1つの重要な知見は、FANCD1遺伝子が、Rad51充填（loading）および相同的組換えの制御において公知の役割を有するBRCA2であるということであった（Howlett et al.（2002）Science 297：606-609）。
【０００７】
全てのFA相補群のうち、FA-Iだけが、これまで分子レベルで特徴付けられていないままであった（Levitus et al.（2004）Blood 103：2498-2503）。FA-I突然変異細胞は、FANCD2をユビキチン化せず、フォーカスを修復するためのその局在化を妨げることが以前に同定された。FA-D2細胞の様に、FA-I株化細胞は、正常なFA E3リガーゼ複合体形成を示すことが証明された（Levitus et al.（2004）Blood 103：2498-2503）。FA経路は、特に化学療法治療に抵抗する癌に関連することが示されているので、FA-I突然変異細胞を補完する遺伝子の同定は、ファンコニー貧血、更には癌のための既存の療法の改善および新たな療法の開発のために有利であることがわかるであろう。
【０００８】
多くの種類の癌が、有効な化学療法治療に抵抗する。卵巣癌では、シスプラチンなどの化学療法薬に対して耐性が観察される。1960年代後期に最初に発見されたシスプラチン（シス-ジアミンジクロロプラチナムまたはCDDP）は、卵巣癌を含む多くの癌を治療するために使用される細胞毒である。シスプラチンは、DNAの白金化（platination）によって作用して、DNA架橋を生じる。50%までの卵巣悪性腫瘍は、シスプラチンまたはその他の関連した白金療法などの従来の化学療法薬に対して、本質的に耐性である。多くの耐性のメカニズムが仮定されてきた。しかし、化学療法に内因性および外因性の耐性の根底にある正確なメカニズムは、解明されていない。化学療法に対する耐性を逆転させる1つの方法には、感受性増強剤の使用を含む。感受性増強剤は、一般に耐性のメカニズムを阻害する。例には、ベラパミル、レセルピン、タモキシフェンおよびクレモホル、並びに多剤耐性を与える流出ポンプの阻害剤（MDR1、P糖タンパク質）を含む。しかし、このような感受性増強剤は、薬物流出が耐性の主なメカニズムである腫瘍のサブセットのみにおいて有効である。加えて、これらの感受性増強剤の多数は、望ましくない副作用を有する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、少なくとも部分的には、ファンコニー貧血（FA）経路の成分としてのFANCIの発見および特徴付けに基づいている。FA経路の欠陥は、ファンコニー貧血に対してだけでなく、癌素因においても重要なことが同定された。加えて、FA経路は、癌患者における化学療法薬、たとえばシスプラチンに対する耐性を誘導するのに重要なことが記述されてきた。FANC D2タンパク質と密接に関連するモノユビキチン化されたリンタンパク質としてのFANCIの同定は、ファンコニー貧血、神経成長（neuroplasia）および化学療法耐性の重要なマーカーを提供するだけでなく、重要な治療標的も提供する。従って、本発明は、少なくとも部分的には、予後および診断の疾患マーカー、遺伝マーカーとして、並びにFANCI活性および／またはレベルを調整することができる薬剤のスクリーニング法において使用するための治療標的としてのFANCIの使用を提供する。
【００１０】
一つの側面において、本発明は、被験体が癌を有するか、もしくは癌のリスクが高いかどうかを診断し、または決定する方法であって、FANCIに特異的な抗体を使用してFANCIを含むフォーカスの存在について、被験体からの試料を試験することを含み、FANCIを含むフォーカスの存在は、被験体における癌または癌のリスクの増加を示す方法を提供する。
【００１１】
一定の態様において、抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。一つの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、抗KIAA1794抗体BL999またはBL1000である。もう一つの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、検出可能なラベル、任意に放射性ラベル、酵素ラベル、ビオチン化ラベおよび蛍光ラベルで検出可能的にラベルされている。
【００１２】
一つの態様において、試料は、心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸、末梢血またはリンパ球に由来する。もう一つの態様において、試料は、被験体からの組織の血液試料もしくは生検試料または株化細胞である。さらなる態様において、癌は、メラノーマ、白血病、星細胞腫（astocytoma）、グリア芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病または膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、下垂体、腎臓、胃、食道もしくは直腸の癌である。
【００１３】
もう一つの側面において、本発明は、被験体が癌を有するか、もしくは癌であるリスクが高いかどうかを診断し、または決定する方法であって、癌に関連したコード変化の存在について、被験体のFANCI遺伝子を試験することを含み、1つまたは複数の癌に関連したコード変化の存在は、被験体における癌または癌のリスクの増加を示す方法を提供する。
【００１４】
一つの態様において、癌に関連したコード変化は、K523、K1269、R1285、S730、T952、S1121またはP55におけるFANCIポリペプチドの変化をコードする。関連した態様において、FANCIポリペプチドの変化は、R1285Qである。
【００１５】
さらなる側面において、本発明は、被験体が癌を有するか、または癌を発症するリスクが高いかどうかを決定する方法であって、実施例1に示したFANCI遺伝子特異的なポリヌクレオチドプライマーのいずれかで前記被験体からのFANCI遺伝子を増幅すること、増幅されたFANCI遺伝子をシーケンスすること、および被験体からのFANCI遺伝子配列を参照FANCI遺伝子配列と比較することを含み、2つの遺伝子配列の間の相違は、癌に関連した欠陥の存在を示し、1つまたは複数の癌に関連した欠陥の存在は、被験体が癌を有するか、または癌を発症するリスクが増加していることを示す方法を提供する。
【００１６】
一つの態様において、患者は、BRCA 1またはBRCA-2遺伝子の欠陥を生じさせる公知の癌を有さない。
【００１７】
さらなる側面において、本発明は、被験体がファンコニー貧血を有するか、もしくはファンコニー貧血を発症するリスクが高いかどうかを診断し、または決定する方法であって、ファンコニー貧血に関連したコード変化の存在について被験体のFANCI遺伝子を試験することを含み、1つまたは複数のファンコニー貧血に関連したコード変化の存在は、被験体におけるファンコニー貧血またはファンコニー貧血のリスクの増加を示す方法を提供する。
【００１８】
一つの態様において、ファンコニー貧血に関連したコード変化は、K523、K1269、R1285、S730、T952、S1121、およびP55におけるFANCIポリペプチドの変化をコードする。
【００１９】
もう一つの側面において、本発明は、被験体が癌を有するか、または癌を発症するリスクが増加しているかどうかを決定する方法であって、被験体からDNA試料を提供すること、FANCI遺伝子特異的なポリヌクレオチドプライマーで被験体からのFANCI遺伝子を増幅すること、増幅されたFANCI遺伝子をシーケンスすること、および被験体からのFANCI遺伝子配列を参照FANCI遺伝子配列と比較することを含み、2つの遺伝子配列の間の相違は、癌に関連したコード変化の存在を示し、1つまたは複数の癌に関連したコード変化の存在は、被験体における癌または癌を発症するリスクが増加していることを示す方法を提供する。
【００２０】
一つの態様において、FANCI遺伝子特異的なポリヌクレオチドプライマーは、配列番号：1-8からなる群より選択される。
【００２１】
さらなる側面において、本発明は、新生物障害がある被験体が遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろうかどうかを予測することで方法であって、FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片を使用して被験体からの試料におけるFANCIを含むフォーカスのサイズまたは数を決定することを含み、フォーカスの数またはサイズが、対照被験体からの試料におけるこのようなフォーカスの数またはサイズと比較して減少される場合、被験体は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応すると予測される方法を提供する。
【００２２】
一つの態様において、被験体は、試料が被験体から得られる前に、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された。関連した態様において、曝露は、治療的に有効な用量以下である。もう一つの態様において、曝露は、治療的に有効な用量の約50%以下である。さらなる態様において、試料は、フォーカスの数またはサイズを決定する前に、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された。さらなる態様において、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬は、1,3-ビス（2-クロロエチル）-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンまたは電離放射線からなる群より選択される。
【００２３】
一つの態様において、被験体からの試料における前記フォーカスの数またはサイズは、対照被検体からの試料における前記フォーカスの数またはサイズの約70%未満である。
【００２４】
もう一つの側面において、本発明は、新生物障害がある被験体が遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろうかどうかを予測する方法であって、被験体からの試料におけるFANCIポリペプチドのユビキチン化の程度を決定することを含み、試料におけるFANCIポリペプチドのユビキチン化の程度が、対照被検体からの試料と比較したときに、減少される場合、被験体は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応すると予測される方法を提供する。
【００２５】
一つの態様において、試料は、FANCIポリペプチドのユビキチン化の程度を決定する前に、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された。もう一つの態様において、FANCIポリペプチドのモノユビキチン化の程度は、FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片を使用する免疫ブロット分析によって決定される。
【００２６】
さらなる側面において、本発明は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に感受性である腫瘍を同定する方法であって、被験者からの試料におけるFANCIを含むフォーカスのサイズまたは数を決定することを含み、フォーカスの数またはサイズが対照被検体からの試料におけるフォーカスの数またはサイズと比較して減少される場合、被験者からの試料は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に感受性である腫瘍として同定される方法を提供する。
【００２７】
一つの態様において、試料は、フォーカスの数またはサイズを決定する前に、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された。
【００２８】
一定の態様において、被験体は、ヒトである。
【００２９】
もう一つの側面において、本発明は、ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤を同定する方法であって、細胞を試験化合物と接触させること；前、後または同時に細胞を遺伝毒性抗新生物化合物と接触させること；FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片を使用して細胞におけるFANCIを含むフォーカスを定量化すること；を含み、フォーカスの量が遺伝毒性抗悪性腫瘍薬と接触されたが、試験化合物と接触されていない対照細胞におけるよりも少ない場合、試験化合物は、ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤として同定される方法を提供する。
【００３０】
一つの態様において、本発明の方法は、阻害剤として同定される試験化合物について、細胞におけるFANCIポリペプチドのモノユビキチン化の程度を決定することをさらに含み、FANCIポリペプチドのモノユビキチン化の程度が対照細胞においてより少ない場合、試験化合物は、ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤として更に同定される。関連した態様において、本発明の方法は、阻害剤として更に同定された試験化合物について、機能的なファンコニー貧血経路を有する試験細胞を試験化合物および遺伝毒性抗悪性腫瘍薬と接触させること、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する試験細胞の感受性を測定すること、および薬剤に対する試験細胞の感受性を第2の対照細胞のものと比較することをさらに含み、第2の対照細胞は、試験細胞に対して同質遺伝子的であるが、欠陥のあるファンコニー貧血経路を有し、かつ試験細胞の感受性が第2の対照細胞の感受性と同等である場合、試験化合物は、ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤として更に同定される。
【００３１】
一つの態様において、FANCIを含むフォーカスを定量化すると共に、FANCIを含むフォーカスの数が決定される。もう一つの態様において、FANCIを含むフォーカスを定量化すると共に、FANCIを含むフォーカスのサイズが決定される。一定の態様において、FANCIを含むフォーカスの定量化は、高スループット形式で行われる。もう一つの態様において、FANCIポリペプチドのモノユビキチン化の程度は、免疫ブロット分析によって決定される。さらなる態様において、抗悪性腫瘍薬に対する試験細胞および第2の対照細胞の感受性は、抗悪性腫瘍薬の1つまたは複数の濃度における細胞生存を測定することによって決定される。もう一つの態様において、試験細胞および第2の対照細胞は、ヒト細胞である。
【００３２】
さらなる側面において、本発明は、非ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤を同定する方法であって、機能的なファンコニー貧血経路を有する試験細胞を試験化合物および遺伝毒性抗悪性腫瘍薬と接触させること、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する試験細胞の感受性を測定すること、および薬剤に対する試験細胞の感受性を対照細胞のものと比較することを含み、対照細胞は、試験細胞に対して同質遺伝子的であるが、突然変異体FANCI遺伝子を有し、かつ試験細胞の感受性が対照細胞の感受性よりも高い場合、試験化合物は、非ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤として同定される方法を提供する。
【００３３】
一つの態様において、抗悪性腫瘍薬に対する試験細胞および対照細胞の感受性は、抗悪性腫瘍薬の1つまたは複数の濃度における細胞生存を測定することによって決定される。もう一つの態様において、試験化合物は、ファンコニー貧血経路を阻害しない。さらなる態様において、突然変異体FANCI遺伝子は、K523、K1269、R1285、S730、T952、S1121またはP55におけるFANCIポリペプチドの変化をコードするコード変化を含む。もう一つの態様において、試験細胞および対照細胞は、ヒト細胞である。
【００３４】
もう一つの側面において、本発明は、癌治療的薬をスクリーニングする方法であって、1つまたは複数の癌に関連した欠陥を有するFANCI遺伝子を含む1つまたは複数の細胞を提供すること、潜在的癌治療薬の存在下において細胞を増殖すること、および潜在的癌治療薬の非存在下において増殖した同等の細胞の増殖率と比較して、潜在的癌治療薬の存在下における細胞の増殖率を決定することを含み、潜在的癌治療薬の非存在下において増殖した同等の細胞の増殖率と比較した、潜在的癌治療薬の存在下における細胞の増殖率の減少は、潜在的癌治療薬が癌治療薬であることを示す方法を提供する。
【００３５】
一つの態様において、1つまたは複数の癌に関連した欠陥を有するFANCI遺伝子は、K523、K1269、R1285、S730、T952、S1121またはP55におけるFANCIポリペプチドの変化をコードするコード変化を含む。もう一つの態様において、細胞は、ヒト細胞である。関連した態様において、細胞は、BD0952細胞である。
【００３６】
さらなる側面において、本発明は、化学感作薬をスクリーニングする方法であって、FANCIの潜在性阻害剤を提供すること、1つまたは複数の抗悪性腫瘍薬に耐性である腫瘍株を提供すること、FANCIの腫瘍株および潜在性阻害剤を1つまたは複数の抗悪性腫瘍薬と接触させること、並びにFANCIの阻害剤および抗悪性腫瘍薬の存在下において腫瘍株の増殖速度を測定することを含み、抗悪性腫瘍薬の存在下およびFANCIの阻害剤の非存在下における腫瘍株の細胞と比較した、腫瘍株の増殖速度の減少は、潜在的阻害剤が化学感作薬であることを示す方法を提供する。
【００３７】
さらなる側面において、本発明は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬での治療に対して被験体を感作する方法であって、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬を受けているが、薬剤に耐性である被験体にFANCIの阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００３８】
一つの態様において、FANCIの阻害剤は、FANCIに特異的な抗体もしくはその抗原結合断片または抗FANCI RNA干渉薬である。もう一つの態様において、抗FANCI RNA干渉薬は、FANCIにおける配列番号：22、配列番号：23または配列番号：24をターゲットする。
【００３９】
もう一つの側面において、本発明は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬での治療に対して被験体を感作する方法であって、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬で治療を受けているが、薬剤に耐性である被験体にFANCIの阻害剤を投与すること、および非ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。
【００４０】
一つの態様において、非ファンコニー貧血DNA損傷修復経路の阻害剤は、PARP阻害剤、DNA-PK阻害剤、mTOR阻害剤、ERCC1阻害剤、ERCC3阻害剤、ERCC6阻害剤、ATM阻害剤、XRCC4阻害剤、Ku80阻害剤、Ku70阻害剤、XPA阻害剤、CHK1阻害剤またはCHK2阻害剤である。もう一つの態様において、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬は、FANCIの阻害剤および非ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤と同時に投与される。
【００４１】
さらなる側面において、本発明は、癌患者における治療薬の有効性を予測する方法であって、治療薬で治療される癌患者から組織試料を提供すること、組織試料の細胞においてDNA損傷を誘導すること、および細胞においてユビキチン化されたFANCIタンパク質の存在を検出することを含み、ユビキチン化されたFANCIの存在は、癌患者における治療薬の有効性の減少を示す方法を提供する。
【００４２】
さらなる態様において、本発明は、被験体が癌を有するか、または癌のリスクが高いかどうかを決定するためのキットであって、FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片、そのためのパッケージング材料および被験体が癌を有するか、または癌のリスクが高いかどうかを診断し、または決定する方法を行うための説明書を含むキットを提供する。もう一つの態様において、本発明は、新生物障害がある被験体が遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろうかどうかを決定するためのキットであって、FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片、そのためのパッケージング材料および新生物障害がある被験体が遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろうかどうかを決定する方法を行うための説明書を含むキットを提供する。さらなる態様において、本発明は、ファンコニー貧血経路の阻害剤を同定するためのキットであって、本発明の方法に記載したとおりのスクリーニング法を実行するための試験細胞および対照細胞とそのためのパッケージング材料とを含むキットを提供する。
【００４３】
もう一つの側面において、本発明は、BD0952細胞の突然変異体FANCIヌクレオチド配列を含む単離されたヌクレオチドまたはポリペプチド配列を提供する。
【００４４】
さらなる側面において、本発明は、FANCIポリペプチドのN末端の200アミノ酸残基に融合されたGSTを含む単離されたポリペプチド配列を提供する。
【００４５】
さらなる側面において、本発明は、FANCIの配列番号：22、配列番号：23または配列番号：24にターゲットされる抗FANCI siRNAを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図1A〜1Dは、FANCIタンパク質としてKIAA 1794を同定するために使用した実験結果を示す。
【図２】図2A〜2Cは、KIAA 1794/FANCIの進化的に保存された領域の同定を示す。
【図３】図3A〜3Fは、FANCIのレベルが減少した細胞におけるチェックポイントおよび修復の欠陥を証明する。
【図４】図4A〜4Dは、FANCIがFANCD2と共に局在化し、かつ相互作用することが同定されことを示す。
【図５】図5A〜5Iは、FANCIユビキチン化およびファンコニー貧血（FA）経路に対するその依存性を示す。
【図６】図6A〜6Fは、KIAA 1794/FANCI遺伝子でのBD0952（FA-I）細胞の相補性を示す。
【図７】図7Aおよび7Bは、突然変異体FANCI対立遺伝子の局在化を証明する。
【図８】図8は、ATMおよびATRノックダウン後のMCAアッセイの結果を示す。
【図９】図9は、FANCI配列の異種間保存を示す。
【図１０】図10は、FANCIおよびFANCD2配列の保存を示す。
【図１１】図11A〜11Eは、FANCIがFANCD2と共存し、かつ相互作用することが同定されたことを示す。
【図１２】図12A〜12Cは、FANCIユビキチン化を示す。
【図１３】図13は、BD0952（FA-I）細胞におけるWT、P55L、R1285QおよびP55L、R1285Q変異タンパク質の局在化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、抗悪性腫瘍薬に対する癌の感受性における、FA経路によって果たされる重要な役割を示す一連の発見に基づく。FA経路におけるDNA損傷シグナリングに関するさらなる役割が発見され、DNA損傷感受性スクリーンと組み合わせたATMおよびATRキナーゼのための基質についてのプロテオミックスクリーンにより（Matsuokaら、提出済）、FANCI遺伝子が同定された。FANCIは、FANCD2パラログ（paralog）を同定し、また、リジン上でモノユビキチン化されることが、その機能にとって重要なことが示された。従って、本発明は、FANCIタンパク質が第2の重要なFAリガーゼ基質である可能性が高いことを開示し；またFANCIポリペプチドは、DNA損傷に応答して、FANCD2に結合してID複合体を形成し、クロマチン上にロードすることが示された。
【００４８】
抗悪性腫瘍薬に対する新生物障害および／または癌細胞の感受性を調整する際のその他のFA経路成分の役割は、FA経路成分が欠損した株化細胞を使用して、およびFA経路の阻害剤を使用して証明されてきた。FANC D2と密接に相互作用するFA経路の新たに同定された成分として、FANCIは、魅力的な予後の、および診断の疾患マーカー、遺伝マーカー、並びにFANCI活性および／またはレベルを調整することができる化合物を同定するためのスクリーニング法に使用するための治療標的を提供する。従って、一つの態様において、被験体が癌を有するか、もしくは癌のリスクが高いかどうかを診断し、または決定するための方法が提供される。一つのこのような方法には、FANCI活性の評価において、FANCIを含むフォーカスに対する、FANCIのユビキチン化状態および／または局在化をモニターすることを含む。その他の本発明の側面は、新生物障害および／または腫瘍がある被験体が、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろうかどうかを予測するための方法であって、被験体におけるFANCIの活性および／またはポリペプチドもしくは核酸配列の評価を含む方法を提供する。一定の態様において、本方法には、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬と組み合わせて、FANCI阻害剤の有効な用量を投与することを含む。もう一つの方法は、非FA DNA損傷修復経路の阻害剤と組み合わせて、FANCI阻害剤の有効な用量を投与することを含む。
【００４９】
また、FANCI活性を調整する薬剤を同定する方法が提供される。このような方法は、FANCIの阻害剤を同定する際に有用である。こうして同定された阻害剤は、化学感作剤および／または放射線増感剤として潜在的に有用である。また、FANCI阻害剤と組み合わせて使用するための非FA DNA損傷修復経路阻害剤を同定するための方法が、本発明において提供される。阻害剤の組み合わせは、抗悪性腫瘍薬を受けている患者に投与するために有用であろう。
【００５０】
I.定義
本明細書に使用される「新生物」、「新生物障害」、「新形成」、「癌」、「腫瘍」および「増殖障害」という用語は、自律的増殖のための能力を有する細胞、すなわち、一般に構造的組織化および正常組織との機能的協調の部分的もしくは全体の欠如を示す異なる集団を形成する異常な状態または迅速に増殖している細胞増殖によって特徴づけられる状態をいう。本用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲段階にかかわらず、全てのタイプの前癌性、および癌性の増殖、または発癌過程、転移組織もしくは悪性形質転換された細胞、組織または器官を含む、造血性新生物（たとえば、リンパ腫または白血病）並びに固体新生物（たとえば、肉腫または癌腫）を包含することが意味される。造血性新生物は、骨髄球性、リンパ様または赤血球系統から生じる白血病（白血球（leukocytes）（白血球（white blood cell））並びに血液および骨髄におけるこれらの前駆体に関連した）、並びにリンパ腫（リンパ球に関連する）を含む造血性の構造（血液細胞の形成に関連する構造）および免疫系の成分に影響を及ぼす悪性腫瘍である。固体新生物には、筋肉、軟骨、血管、線維組織、脂肪または骨などの結合組織から生じる悪性新生物である肉腫を含む。また、固体新生物には、上皮構造（外部上皮（たとえば、皮膚、並びに胃腸管、肺および頸部の裏打ち）、並びに種々の腺（たとえば、乳房、膵臓、甲状腺）の内側を覆う内部上皮を含む）から生じる悪性新生物である癌腫を含む。本発明の方法による治療に特に感受性のある新生物の例は、白血病および肝細胞癌、肉腫、血管内皮癌、乳癌、中枢神経系癌（たとえば、星細胞腫、神経膠肉腫、神経芽細胞腫、乏突起細胞腫およびグリア芽細胞腫）、前立腺癌、肺および気管支癌、喉頭癌、食道癌、大腸癌、結直腸癌、胃腸癌、メラノーマ、卵巣癌および子宮体癌、腎臓癌および膀胱癌、肝臓癌、内分泌癌（たとえば、甲状腺）、並びに膵癌を含む。
【００５１】
「遺伝毒性薬」または「遺伝毒性物質」は、細胞に適用されたときに、DNA損傷を誘導する任意の化学物質または治療方法をいう。このような薬剤は、化学的または放射性であることができる。遺伝毒性薬は、化学物質（または代謝産物）の一次生物活性がDNAにおいてコードされる情報の変化であるものである。遺伝毒性薬は、それらの作用機序が異なることができ、以下を含むことができる：エチルメタンスルホナート（EMS）、ニトロソグアニンおよび塩化ビニルなどのアルキル化剤；ベンゾ（a）ピレンおよびアフラトキシンB1などのかさ高い付加物；スーパーオキシド、水酸基などの活性酸素種；5-ブロモウラシルなどの塩基類似体；アクリジンオレンジおよび臭化エチジウムなどのインターカレート剤。
【００５２】
本明細書に使用される「遺伝毒性抗悪性腫瘍薬」は、たとえば、癌を治療するための化学療法のために使用される遺伝毒性物質である。特に、「遺伝毒性抗悪性腫瘍薬」は、DNAに損傷を生じさせる化学的または他の薬剤の両方を包含する。これらの薬剤には、DNAアルキル化剤、挿入剤等を含む。「遺伝毒性抗悪性腫瘍薬」の非限定的な例には、1,3-ビ（2-クロロエチル）-1-ニトロソ尿素（BCNU）、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロロエチル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシン
C、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド（Temozolomide）およびトポテカンを含む。また、「遺伝毒性抗悪性腫瘍薬」には、被験体のDNAに損傷を生じさせるために十分な投与量の、照射、特に癌の治療のための放射線療法に使用されるタイプを含む。
【００５３】
本明細書に使用される「DNA損傷」は、メチル化、アルキル化二本鎖破壊、架橋、紫外線によって生じるチミジンダイマーおよびDNA塩基に結合する活性酸素によって形成される酸化的病変を含む、細胞におけるDNAの化学的および／または物理的な修飾をいう。
【００５４】
本明細書に使用される「感受性増強剤」および「化学感作薬」は、被験体に治療上有効量で投与されたときに、たとえば新生物疾患、良性および悪性の腫瘍、並びに癌細胞などの疾患の治療において、化学療法化合物に対する感受性を増大し、および／または化合物の治療有効性を増大させる化合物をいう。遺伝毒性抗悪性腫瘍薬を含む化学療法化合物に対する感受性の増大は、たとえば感受性増強剤の存在下において化合物に対する細胞のLD50の減少を測定することによって測定することができる。
【００５５】
同様に、本明細書に使用される「放射線増感剤」および「放射線増感薬」は、被験体に治療上有効量で投与されたときに、たとえば新生物疾患、良性および悪性の腫瘍、並びに癌細胞などの疾患の治療において、放射線療法（電磁放射線による治療）に対する感受性を増大し、および／または放射線療法の治療有効性を増大させる化合物をいう。また、本明細書に収載されないその他の疾患の電磁放射線治療が想定される。
【００５６】
「癌に関連したコード変化」は、患者において癌を生じさせることができるか、または関連する、本明細書で定義したとおりの欠陥を有する、本明細書で定義したとおりのFANC/BRCA遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の任意の配列変化をいう。
【００５７】
同様に、「ファンコニー貧血に関連したコード変化」は、患者においてファンコニー貧血を生じさせることができるか、または関連する、本明細書で定義したとおりの欠陥を有する、本明細書で定義したとおりのファンコニー貧血経路遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の任意の配列変化をいう。
【００５８】
本明細書に使用される「癌に関連した欠陥の存在についてFANCI遺伝子を試験すること」は、FANCI遺伝子によってコードされるタンパク質が、被験体において癌を生じさせることができるか、または関連する、本明細書で定義したとおりの欠陥を有するかどうかを決定する方法をいう。
【００５９】
本明細書に使用される「欠陥」という用語は、ファンコニー貧血BRCA経路内の任意の変化のない遺伝子またはタンパク質に関する、ファンコニー貧血／BRCA経路および／またはタンパク質内の遺伝子またはタンパク質の任意の変化をいう。
【００６０】
遺伝子の「変化」には、以下を含むが、限定されない：a）DNA配列それ自体の変化（すなわち、DNA突然変異、欠失、挿入、置換；b）制御領域突然変異、クロマチンに関連した修飾、mRNAスプライシングに影響を及ぼすイントロン配列の修飾、遺伝子配列のメチル化／脱メチル化状態に影響を及ぼす修飾などの遺伝子発現の制御に影響を及ぼすDNA修飾；c）タンパク質翻訳またはmRNA輸送またはmRNAスプライシングに影響を及ぼすmRNA薬物適用。
【００６１】
タンパク質の「変化」には、以下を含むが、限定されない：アミノ酸欠失、挿入、置換；タンパク質リン酸化またはグリコシル化に影響を及ぼす修飾；タンパク質輸送または局在化に影響を及ぼす修飾；1つまたは複数の関連するタンパク質とのタンパク質複合体を形成する能力に影響を及ぼす修飾またはアミノ酸をコードするDNA配列の変化によって生じるアミノ酸配列の変化。
【００６２】
本明細書に使用される「リスクの増加」または「高いリスク」という用語は、ファンコニー貧血／BRCA経路遺伝子またはタンパク質に変化がない患者と比較して、変化したファンコニー貧血／BRCA遺伝子またはタンパク質を有する患者において、より高い癌の発病率をいう。「リスクの増加」は、また、すでに癌と診断されており、かつ異なる癌形態の発病率の増加を有してもよい患者をいう。本発明によれば、癌の「リスクの増加」は、ファンコニー貧血／BRCA経路遺伝子における癌に関連した欠陥を有さない患者と比較して、癌を得る確率の50%、好ましくは90%、より好ましくは99%以上の増大に寄与するファンコニー貧血／BRCA経路遺伝子における癌に関連した欠陥をいう。
【００６３】
本明細書に使用される「DNA損傷を誘導する」という用語は、DNAに損傷を与える化学的および物理的な方法をいう。DNAに損傷を与える化学物質には、臭化エチジウム、アクリジンオレンジなどの酸／塩基および種々の変異誘発物質、並びにフリーラジカルを含むが、限定されない。物理的方法には、X線およびガンマ線などの電離放射線、並びに紫外線（UV）放射を含むが、限定されない。両方の「DNA損傷を誘導する」方法により、典型的にはDNA鎖の一本鎖破壊、二本鎖破壊、塩基の変化、挿入、欠失または架橋を含むが、限定されないDNA突然変異を生じさせることができる。
【００６４】
「試料」または「生体試料」は、被験体に由来する、任意の細胞もしくは組織、または細胞もしくは組織を含む組成物または隔離集団を意味する。試料は、心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸または結腸に由来してもよい。生体試料のもう一つのタイプは、放射線、化学物質、その他などの遺伝毒性薬に曝露された被験体におけるDNA損傷の有無を検出するために使用するための、白血球、たとえば末梢血、痰、唾液、尿、その他を含む標品であってもよい。
【００６５】
本明細書に使用される「組織生検」という用語は、患者から単離されている生物材料をいう。本明細書に使用される「組織」という用語には、生物体における特定の機能を行う細胞の集合体であり、株化細胞、並びに体液たとえば、血液、血漿、痰、尿、脳脊髄液、洗浄液およびロイコフォレシス試料を含むが、限定されない、細胞物質のその他の供与源を包含する。
【００６６】
本明細書に使用されるFANCIポリペプチドの「ユビキチン化の程度」は、一般に被験体またはそれに由来する生体試料のFANCIポリペプチドのモノユビキチン化の程度によって測定される、FA経路の活性化のレベルをいう。本明細書に使用されるFANCIポリペプチドの「ユビキチン化の程度」には、モノユビキチン化される試料内の総FANCIポリペプチドの比率を包含することができ、分数または割合に基づいて表すことができる。本明細書に使用されるFANCIポリペプチドの「ユビキチン化の程度」は、また、フォーカス形成の程度を含む、FA経路の活性化を検出するための任意の代用方法を使用して測定することができる。
【００６７】
本明細書に使用される「フォーカス形成の程度」は、試料におけるFANCIを含むフォーカスの総数または生成速度をいう。FANCIを含むフォーカスは、たとえば遺伝毒性薬に対する曝露により、FA経路の活性化に応答して形成される核タンパク質複合体である。FANCIを含むフォーカスは、更に本明細書に記述したように、たとえばFANCIポリペプチドに向けられた標識された抗体を使用する免疫蛍光顕微鏡観察によって検出することができる。一定の場合において、FANCIを含むフォーカスは、GFPおよびFANCIポリペプチドを含む機能的融合タンパク質を発現する細胞においても検出することができる。これらの細胞では、FANCIを含むフォーカスを、抗FANCI抗体を使用せずに、蛍光顕微鏡法を使用して検出することができる。フォーカス形成の程度は、たとえば細胞の総数、インタクトな核の総数、総試料体積または総試料質量に対して、一つの試料を別のものに対して規準化することができる。
【００６８】
「フォーカス形成における相違」とは、試験試料を対照試料または参照試料のいずれかと比較するときに、FANCIを含むフォーカスの数、サイズまたは残留性がより高い、またはより低い場合かの相違を意味する。相違には、また対照または参照試料と比較して、2倍以上、または2倍以下、たとえば5、10、20、100、1000倍もしくはそれ以上である増大または減少を含む。また、相違には、対照または参照試料と比較して、5%よりも多く、またはより少なく、たとえば10%、20%、30%、50%、75%、100%である増大または減少を含む。
【００６９】
本明細書に使用されるFANCIを含むフォーカスの形成を「調整する」とは、生体試料におけるFANCIを含むフォーカスの形成の変化または変質をいう。調整は、生体試料内のフォーカス数、サイズまたは残留性の増大または減少であってもよく、また対照または参照試料と比較して、2倍よりも多く、もしくはより少なく、たとえば5、10、20、100、1000倍もしくはそれ以上である増大または減少を含む。また、調整は、対照または参照試料と比較して、5%よりも多く、またはより少なく、たとえば10%、20%、30%、50%、75%、100%である増大または減少であってもよい。
【００７０】
本明細書に使用される、「低レベル」の遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する曝露は、生体試料におけるFANCIを含むフォーカスの最大数の20%以下を生じる特定の遺伝毒性抗悪性腫瘍薬の用量に対する曝露をいう。試料が曝露され得る多数の遺伝毒性抗悪性腫瘍薬、並びにこのような遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する異なる試料の様々な感受性のため、特定の遺伝毒性抗悪性腫瘍薬の絶対用量よりもむしろ、FANCIを含むフォーカスの形成に相対的に投薬量を表すことが好ましい。
【００７１】
「モジュレーター」という用語は、生体高分子（たとえば、核酸、タンパク質、非ペプチドまたは有機分子）または細菌、植物、真菌もしくは動物（特に、哺乳動物）細胞もしくは組織などの生物材料から作製される抽出物またはさらに無機元素もしくは分子などの化学化合物（天然に存在するか、または天然に存在しない）をいう。モジュレーターは、本明細書に記述したスクリーニングアッセイに包含することにより、生物学的プロセスまたはプロセス類の阻害剤または活性化因子（直接または間接的）（たとえば、アゴニスト、部分アンタゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、抗悪性腫瘍薬、細胞障害薬、新生物形質転換または細胞増殖の阻害剤、細胞増殖プロモーター等）としての潜在的活性について評価される。モジュレーターの活性類（または活性）は、公知であっても、未知であっても、または部分的に公知であってもよい。このようなモジュレーターは、本明細書に記述した方法を使用してスクリーニングすることができる。
【００７２】
「候補モジュレーター」という用語は、推定上のモジュレーターとして、本発明の1つまたは複数のスクリーニング方法（群）によって試験される化合物をいう。通常、スクリーニングのために、0.01μM、0.1μM、1.0μMおよび10.0μMなどの種々の予め定められた濃度が、下記に詳しく述べる通り、使用される。試験化合物対照には、試験化合物の非存在下または標的を調整することが知られている化合物に対する比較におけるシグナルの測定を含むことができる。
【００７３】
本明細書に使用される、「FA経路阻害剤」および「FA経路の阻害剤」とは、生体高分子（たとえば、核酸、タンパク質、非ペプチドまたは有機分子）または細菌、植物、真菌もしくは動物（特に、哺乳動物）細胞もしくは組織から作製される抽出物などの生物材料またはさらに無機元素もしくは分子などの化学化合物（天然に存在するか、または天然に存在しない）をいう。「FA経路阻害剤」および「FA経路の阻害剤」は、FA経路がDNA損傷を修復する能力を阻害する化合物を広くいう。「FA経路阻害剤」または「FA経路の阻害剤」によるFA経路の阻害は、限定されないが、FANCIを含むフォーカスの検出およびFANCIポリペプチドのモノユビキチン化の検出を含む、本明細書に記述した技術を使用して評価することができる。当業者であれば理解できるように、本方法は、FA経路の阻害の検出のための、現在知られているか、または将来知られるその他のいかなる方法も想定する。阻害は、FANCIを含むフォーカスの数、サイズまたは残留性の減少であってもよく、また対照または参照と比較して2倍以上、たとえば2、5、10、20、100、1000倍以上である減少を含む。また、阻害は、対照または参照と比較して、5%以上、たとえば5%、10%、20%、30%、50%、75%または100%までの減少であってもよい。加えて、本明細書に使用される「FA経路阻害剤」および「FA経路の阻害剤」は、薬学的に許容される塩、溶媒和物、エステル、誘導体またはプロドラッグを包含する。
【００７４】
本明細書に使用される「非FA DNA損傷修復経路」とは、直接の可逆的な、非相同的末端連結（NHEJ）、塩基除去修復（BER）、ヌクレオチド除去修復（NER）およびミスマッチ修復（MR）経路からなる群より選択される任意のDNA損傷修復経路をいう。
【００７５】
本明細書に使用される「増幅する」という用語は、核酸配列に適用されるときに、特定の核酸配列の1つまたは複数のコピーが、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応法によって鋳型核酸から産生されることによるプロセスをいう（MullisおよびFaloona、1987、Methods Enzymol., 155：335）。「ポリメラーゼ連鎖反応法」または「PCR」は、特異的な核酸鋳型配列を増幅するためのインビトロにおける方法をいう。PCR反応には、一連の温度サイクルの繰り返しを含み、典型的には50-100マイクロリットルの容積で行われる。反応混合物には、dNTP（4デオキシヌクレオチドdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPのそれぞれ）、プライマー、緩衝液、DNAポリメラーゼおよび核酸鋳型を含む。PCR反応は、第1のプライマーが核酸鋳型配列の一方の鎖の領域に対する配列相補を含み、かつ相補DNA鎖の合成をプライムし、および第2のプライマーが標的核酸配列の第2の鎖の領域に対する配列相補を含み、かつ相補DNA鎖の合成をプライムするポリヌクレオチドプライマーのセットを提供すること、並びに（i）鋳型配列内に含まれる標的核酸配列に対する増幅のために必要とされるプライマーをアニーリングする工程、（ii）核酸ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成するプライマーを延長する工程のPCRサイクリング工程を許容する条件下で鋳型依存的な重合薬として核酸ポリメラーゼを使用して核酸鋳型配列を増幅する工程を含む。「ポリヌクレオチドプライマーのセット」または「PCRプライマーのセット」は、2、3、4またはそれ以上のプライマーを含むことができる。
【００７６】
その他の増幅の方法には、リガーゼ連鎖反応（LCR）、ポリヌクレオチド特異的塩基増幅（NSBA）または当該技術分野において公知の他の任意の方法を含むが、限定されない。
【００７７】
本明細書に使用される、「ポリヌクレオチドプライマー」という用語は、核酸鋳型にハイブリダイズし、かつ核酸鋳型に対して相補であるプライマー伸長産物の合成を触媒して標的核酸鋳型に対して相補であるプライマー伸長産物を産生する条件下で、酵素的合成のための基質として作用することができるDNAまたはRNA分子をいう。開始および伸長のための条件には、適切な緩衝液（「緩衝液」には、補因子であるか、またはpH、イオン強度、その他に影響を及ぼす置換できるものを含む）中で、および適切な温度にて、4つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸およびDNAポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合を誘導する薬剤の存在を含む。プライマーは、好ましくは増幅における最大効率のために、一本鎖である。本発明に有用な「プライマー」は、一般に、長さが約10〜35ヌクレオチドの間、好ましくは長さが約15〜30ヌクレオチドの間および最も好ましくは長さが約18〜25ヌクレオチドの間である。
【００７８】
本明細書に使用される「抗体」という用語は、所与の抗原に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリンをいう。本明細書に使用される「抗体」という用語は、任意のアイソタイプ（IgG、IgA、IgM、IgEなど）の抗体全体およびまた脊椎動物、たとえば哺乳動物、タンパク質と特異的に反応性であるその断片を含むことが意図される。抗体は、従来の技術を使用して断片化することができ、断片は、抗体全体と同様に有用性についてスクリーニングされる。したがって、本用語には、タンパク質加水分解で切断され、または組換えで調製された、一定のタンパク質と選択的に反応することができる抗体分子の部分のセグメントを含む。このようなタンパク質分解性および／または組換え断片の非限定的な例には、Fab、F（ab'）2、Fab、ドメインFv、並びにペプチドリンカーによって連結されたV[L］および／またはV[H］を含む単鎖抗体（scFv）を含む。scFvは、2つ以上の結合部位を有する抗体を形成するように共有結合で、または非共有結合で連結されていてもよい。抗体は、当業者によって検出可能な部分で標識されていてもよい。一部の態様において、測定する（一次抗体）ことを望む実体に結合する抗体は、標識されていなくて、その代わりに、一次抗体に特異的に結合する標識された二次抗体の結合によって検出される。
【００７９】
患者は、本明細書に記述したような1つまたは好ましくは複数の癌の症候を除去し、もしくは重症度を減少させるか、または更に進行し、もしくは発症するのを予防される場合に、本発明に従って「治療される」。
【００８０】
本明細書に使用される「治療上有効量」という用語は、意味がある患者の利益、すなわち関連した医学的状態の治療、治癒、予防もしくは寛解またはこのような状態の治療、治癒、予防もしくは寛解の速度の増大を示すのに十分である医薬組成物または方法のそれぞれの活性成分の総量を意味する。
【００８１】
本明細書に使用される「癌治療薬」という用語は、癌の発病もしくは進行を予防し、または癌転移を予防し、または癌の症候を減少させ、遅延させ、もしくは除去する化合物をいう。
【００８２】
「ユビキチン化」は、E3モノユビキチンリガーゼによるタンパク質に対するユビキチンの共有結合として定義される。
【００８３】
本明細書に使用される「シスプラチン」という用語は、以下の化学構造をもつ薬剤をいう：
【００８４】
【化１】
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シスプラチンは、シス-ジアミンジクロロ白金（II）とも呼ばれ、最も頻繁に使用される抗癌薬の1つある。これは、種々の固形腫瘍を治療するために使用されるいくつかの異なる併用薬剤プロトコルの有効成分である。これらの薬物は、精巣癌（ブレオマイシンおよびビンブラスチンで）、膀胱癌、頭頚部癌（ブレオマイシンおよびフルオロウラシルで）、卵巣癌（シクロホスファミドまたはドキソルビシンで）および肺癌（エトポシドで）の治療に使用される。シスプラチンは、これらの腫瘍の大部分に対して最も活性な単剤であることが見いだされている。シスプラチンは、Bristol Myers Squibb Co.からプラチノール（Platinol）として市販されている。シスプラチンは、抗腫瘍活性をもつ多数の白金配位化合物のうちの1つである。白金化合物は、アルキル化剤に類似するが、同一ではないDNA架橋剤である。白金化合物は、塩化物イオンを種々の種類の求核基に換える。シスおよびトランス異性体の両者がこれを行うが、トランス異性体は、完全に理解されていない理由のために、生物学的に（bioligically）不活性であることが知られている。抗腫瘍活性を有するためには、白金化合物は、2つの相対的に不安定なシス配向の脱離基を有さなければならない。反応の主要部位は、グアニンおよびアデニンのN7原子である。主な相互作用は、薬物と隣接グアニンとの間のストランド内の架橋の形成である。ストランド内架橋結合は、シスプラチン療法に対する臨床応答と相関することが示された。また、DNA／タンパク質架橋結合も生じるが、これは、細胞障害性と相関しない。薬物の2つの基の間の交差耐性からは、通常、作用機構が同一ではないことを示していることが分からない。DNAとの架橋結合のタイプは、白金化合物と典型的なアルキル化剤との間で異なっているかもしれない。
【００８５】
本明細書に使用される「1つまたは複数の抗悪性腫瘍薬に対する耐性」は、癌細胞が抗癌薬に対する耐性を発症する能力をいう。薬物耐性のメカニズムには、薬物流出の増加または内部輸送の減少によって生じる細胞内薬物濃度の減少、薬物不活性化の増加、薬物の活性型への変換の減少、標的酵素または受容体（遺伝子増幅）の量の変化、標的酵素または受容体の薬物に対する親和性の減少、薬物で誘導される欠陥の修復の増強、死滅効果のために必要とされる酵素（トポイソメラーゼII）の活性の減少を含む。本発明の好ましい態様において、薬物耐性は、1つまたは複数の抗悪性腫瘍薬によって誘導されるDNA損傷の修復の増強をいう。本発明のもう一つの好ましい態様において、1つまたは複数の抗悪性腫瘍薬によって誘導されるDNA損傷の修復の増強は、恒常的に活性なファンコニー貧血／BRCA DNA修復経路による。
【００８６】
本明細書に使用される「抗悪性腫瘍薬」という用語は、癌を治療するために使用される化合物をいう。本発明に従った「抗悪性腫瘍薬」は、化学療法化合物、並びに当該技術分野において公知のその他の抗癌剤を包含する。好ましい態様において、「抗悪性腫瘍薬」は、シスプラチンである。また、本発明による抗新生物薬には、放射線療法および／または外科手術と組み合わせて化学療法化合物を使用する癌療プロトコルを含む。放射線療法は、細胞DNAを混乱させる電離放射線を介した癌細胞の局部的破壊に依拠する。放射線療法は、外部または内部からなされ、高または低用量であり、およびコンピュータを利用して正確に腫瘍の部位に送達される。近接照射療法または介在性（interstitial）放射線療法では、移植された「シード（seeds）」として放射線源を腫瘍内に直接置く。
【００８７】
本明細書に使用される「増殖速度の減少」という用語は、ファンコニー貧血／BRCA経路の潜在的阻害剤および1つまたは複数の化学療法化合物で治療されていない腫瘍株の細胞と比較して、ファンコニー貧血／BRCA経路の潜在的阻害剤および1つまたは複数の化学療法化合物で治療された腫瘍株の細胞の増殖の割合の50%、好ましくは90%、より好ましくは、99%および最も好ましくは100%の減少をいう。
【００８８】
本発明の医薬組成物は、薬物の治療有効性を増加させるために有効な、任意の量および任意の投与の経路を使用して投与することができる。本明細書に使用される「治療上有効量」は、感受性増強剤または放射線増感剤と組み合わせて使用されるときに、標的細胞または組織に対して所望の効果を提供するために十分な化学感作薬の量をいう。必要とされる正確な量は、被験体の種、年齢および全身状態；特定の化学感作薬；その投与様式；その他に応じて、被験体間で変化するであろう。
【００８９】
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療薬の投与のための担体をいう。この種の担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組合せを含むが、限定されない。本用語は、特に細胞培養培地を除外する。経口的に投与される薬物については、薬学的に許容される担体には、不活性希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味料、香料、着色剤および防腐剤を含むが、限定されない。適切な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、並びに乳糖を含むが、コーンスターチおよびアルギン酸も適切な崩壊剤である。結合剤には、デンプンおよびゼラチンを含んでいてもよく、一方、存在する場合、平滑剤は、一般にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであるだろう。必要に応じて、錠剤は、胃腸管における吸収を遅延させるために、モノステアリン酸グリセリンまたはグリセリルジステアレートなどの材料で被覆されていてもよい。
【００９０】
本明細書に使用される「治療上有効な用量」は、症候もしくは状態（たとえば、新生物障害）を予防し、もしくは寛解させるタンパク質もしくはその抗体、アンタゴニストまたは阻害剤のその量をいう。このような化合物の治療有効性および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な医薬品手順、たとえばED50（集団の50%において治療的に有効な用量）およびLD50（集団の50%までの致死用量）によって決定することができる。治療効果と毒性効果との間の用量比は、治療係数であり、これは、比（LD50/ED50）として表すことができる。大きな治療インデックスを示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒト使用のために投薬量の範囲を処方する際に使用される。このような化合物の投薬量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性ではないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される剤形（dosage
from）、患者の感受性および投与の経路に応じて、この範囲内で変化する。
【００９１】
正確な投薬量は、治療される患者を考慮して、個々の医師または獣医師によって選ばれる。投薬量および投与は、活性部分の十分なレベルを提供するように、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子には、疾病状態の重症度；被験体の年齢、重量および性；食餌、時間および投与の頻度、薬物併用、反応感度、並びに療法に対する寛容性／反応を含む。長時間作用性の医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、3〜4日毎に、毎週または2週毎に一度投与されるかもしれない。
【００９２】
「薬学的に許容される塩」という用語は、酸付加塩および塩基付加塩をいう。塩の性質は、それが薬学的に許容されることを条件として、重要ではない。例示的な酸付加塩には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭素、硫酸、リン酸、ギ酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、シュウ酸、リンゴ酸、グルタミン酸、プロピオン酸、グリコール酸、グルコン酸、マレイン酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、パントテン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、メシル酸、シクロヘキシルアミンスルホン酸、ステアリン酸、アルゲン酸（algenic）、β-ヒドロキシ酪酸、マロン酸、ガラクタル酸、ガラクツロン酸等を含むが、限定されない。適切な薬学的に許容される塩基付加塩には、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛から作製される金属塩またはN,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン、リジン、プロカイン等から作製される有機酸塩を含むが、限定されない。薬学的に許容される塩のさらなる例は、Journal of Pharmaceutical Science（1977）l66：2に収載されている。これらの塩の全ては、適切な酸または塩基で化合物を処理することによって、FANCIを含むフォーカスのモジュレーターから、従来の手段によって調製してもよい。
【００９３】
「被験体」という用語は、新形成を生じ得る生きた生物を含むことが意図される。被験体の例には、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそのトランスジェニック種を含むが、限定されない。
【００９４】
本明細書に使用される「RNA干渉」または「RNAi」という用語（当該技術分野において「遺伝子サイレンシング」および／または「標的サイレンシング」、たとえば「標的mRNAサイレンシング」）ともいう）は、一般に標的分子（たとえば、標的遺伝子、タンパク質またはRNA）がダウンレギュレートされることによる、配列特異的または選択的プロセスをいう。具体的態様において、「RNA干渉」または「RNAi」のプロセスは、RNA分子、たとえば細胞内RNA分子の分解を特徴とし、前記分解は、RNAi薬によってトリガーされる。分解は、酵素的に、RNAで誘導されるサイレンシング複合体（RISC）によって触媒される。RNAiは、外来RNA（たとえば、ウイルスRNA）を除去するために、細胞において天然に存在する。天然RNAiは、分解メカニズムをその他の同様のRNA配列に向ける遊離dsRNAから切断された断片を介して進行する。あるいは、RNAiは、たとえば標的遺伝子の発現をサイレンスさせるために、人の手によって開始させることができる。
【００９５】
本明細書に使用される「RNAi薬」という用語は、RNAiに向けるために十分な、標的RNA（すなわち、分解されるRNA）に対する配列相補性を有するRNA（またはその類似体）をいう。「RNAiに向けるために十分に、標的RNA配列に相補性な配列」を有するRNAi薬は、RNAi薬がRNAi機構（たとえば、RISC）またはプロセスによって標的RNAの破壊をトリガーするために十分な配列を有することを意味する。また、「RNAiに向けるために十分に、標的RNA配列に相補性な配列」を有するRNAi薬は、RNAi薬がRNAi機構またはプロセスによって標的RNAの翻訳阻害をトリガーするために十分な配列を有することを意味することも意図される。「標的DNA配列がクロマチックに（chromatically）サイレンスされるように、標的DNA配列によってコードされる標的RNAに十分に相補的な配列」を有するRNAi薬は、RNAi薬が転写遺伝子サイレンシングを誘導するために、たとえば標的DNA配列で、又はその近くでクロマチン構造変化を誘導することにより、たとえば標的DNA配列で、又はその近くで遺伝子発現をダウンモジュレートするために、十分な配列を有することを意味する。
【００９６】
本明細書に使用される「短鎖干渉RNA」（「siRNA」）という用語（当該技術分野において「短鎖干渉RNA」ともいう）は、RNA干渉を指揮し、または媒介することができる約10-50の間のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含むRNA（またはRNA類似体）をいう。好ましくは、siRNAは、約15-30の間のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、より好ましくは約16-25の間のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、さらにより好ましくは約18-23の間のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、およびさらにより好ましくは約19-22の間のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）（たとえば、19、20、21または22ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体）を含む。
【００９７】
核酸または遺伝子配列（たとえば、対応するアミノ酸配列のアミノ酸変化をコードする塩基置換）における一置換でさえも、対応する野生型ポリペプチドまたはタンパク質と比較して、コードされるポリペプチドまたはタンパク質の活性に劇的に影響を及ぼし得ることが、当業者によって認識されるであろう。本明細書で定義したとおりの突然変異体核酸または突然変異遺伝子（たとえば、突然変異体ポリペプチドまたはタンパク質をコードする）は、突然変異体核酸または突然変異遺伝子が、野生型遺伝子もしくは核酸を発現するか、または前記変異タンパク質もしくはポリペプチドを産生する対応する微生物、細胞または生物体と比較して、変化した活性を有し、任意に前記突然変異遺伝子もしくは核酸を発現し、または前記変異タンパク質もしくはポリペプチドを産生する（すなわち、突然変異体株化細胞）微生物、細胞もしくは生物体において異なる、または特異な表現型として観察可能である、タンパク質またはポリペプチドをコードするという点で、タンパク質相同体もしくはパラログをコードする核酸または遺伝子から容易に識別可能である。対照的に、タンパク質相同体またはパラログは、微生物、細胞または生物体において産生されたときに、野生型遺伝子もしくは核酸を発現する対応する微生物、細胞または生物体と比較して、同一または実質的に同じ活性を有し、任意に表現型的に識別できない。従って、これは、たとえば、相同体（またはパラログ）と突然変異体との間を区別するために役に立つ核酸分子、遺伝子、タンパク質またはポリペプチド間の配列同一性の程度でなく、むしろ、これは、相同体と突然変異体との間を区別するコードされたタンパク質またはポリペプチドの活性であり：たとえば低い配列同一性（たとえば、30-50%の配列同一性）を有する相同体および／またはパラログは、なおも実質的に同等の機能的な活性を有し、およびたとえば99%の配列同一性を共有する突然変異体は、劇的に異なる、または変化した機能的な活性を有する。
【００９８】
本発明の種々の方法論には、値、レベル、特色、特徴、特性、その他を、本明細書において交換可能に「適切な対照」ともいわれる「適した対照」と比較する工程を含む。「適した対照」または「適切な対照」は、比較目的のために有用な、当該技術分野の当業者によく知られている任意の対照または標準である。
【００９９】
本発明の種々の側面は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記述してある。
【０１００】
II.FANCIフォーカス
DNA損傷に対する細胞の反応は、細胞周期チェックポイント、DNA修復およびアポトーシスを媒介する経路の複雑な相互作用するネットワークである。これらの経路の研究のためのモデル病変は、迅速に細胞周期チェックポイントを誘導し、および多数の異なる経路によって修復されるDNA二本鎖切断であった。哺乳動物細胞では、相同的組換えおよび非相同組換え経路が利用される。哺乳動物細胞における広範な研究では、DNA修復および細胞周期チェックポイントタンパク質の複合が電離放射線によって誘導される二本鎖切断の部位に迅速に局在化したことが示されている。これらのタンパク質は、免疫蛍光解析によって検出することができるフォーカスを生じる。
【０１０１】
ファンコニー貧血相補群I（FANCI）様のそのパラログであるFANC D2は、染色体安定性および修復に関与するタンパク質複合体の成分である。ファンコニー貧血（FA）は、部分的には、人の種々の癌に対するリスクを増加させるDNA修復メカニズムの欠陥によって特徴づけられる遺伝性疾患である。DNA損傷に応答して、FA複合体は、FANC D2を活性化し、次いでこれが乳癌1型ポリペプチド（Breast Cancer Type 1 polypeptide:BRCCA1）と会合する。FANC D2の活性化は、運動失調-毛細血管拡張症変異（Ataxia-Telangiectasia Mutated：ATM）キナーゼによるセリン222残基のリン酸化によって生じる。加えて、FA経路を経た活性化は、リジン561におけるFANC D2のモノユビキチン化を介して生じる。その修飾されていない形態では、FANC D2は、核の全体にわたって散在性に位置する。ユビキチン化されたときに、FANC D2は、核においてドットまたはフォーカスを形成する。FANC D2のユビキチン化およびその後の核フォーカスの形成は、DNA損傷に応答して生じる。免疫共沈降により、Nakanishiらは、FANC D2とナイミーヘン染色体不安定症候群1（Nijmegen Breakage Syndrome 1：NBS1）との間に構成的相互作用を見いだし、これらのタンパク質が2つの異なるアッセンブリで相互作用して、S期チェックポイントおよびマイトマイシンCで誘導される染色体損傷に対する耐性を媒介する証拠を提供した（Nakashiniら、（2002）Nat Cell Biol. 4：913-20）。ATMによってリン酸化されて、フォーカスにおいてFANC D2と共存するモノユビキチン化されたリンタンパク質としてのFANCIの本同定は、FANCI様のFANC D2も、BRCAIと相互作用し、およびNBS1と構成的に相互作用して、S期チェックポイントおよびMMCで誘導される染色体損傷に対する耐性を媒介することを示す。
【０１０２】
電離放射線で誘導されるフォーカスの少なくとも2つのタイプが観察されており：一方は、Rad51、BRCA1およびBRCA2タンパク質を含み、他方は、Mrel1-Rad50-NBS1複合体を含む。また、腫瘍抑制因子タンパク質BRCA1およびBRCA2を含むRad51フォーカスは、DNA損傷の外来性誘導の非存在下において、S期の間に現われる。
【０１０３】
Mrel 1-Rad50-NBS1フォーカスは、照射後10分という早い時期に検出することができ、DNA破壊の部位に明らかに存在し、その一方で、DNA修復が進行している。また、これらのフォーカスは、おそらくヒトRad50（hRad50）とのその物理的相互作用を介したこれらの形成のために必要とされることが示されているBRCA1タンパク質と共存する。加えて、BRCA1で行った免疫共沈降実験では、この複合体（BRCA1 -会合サーベイランス複合体と呼ばれる）における多数のさらなるタンパク質の存在を示した。これらには、ミスマッチ修復タンパク質Msh2、Msh6およびMlh1、チェックポイントキナーゼATM、ブルーム症候群遺伝子BLMの産物、並びに複製因子Cを含む。BRCA1、NBS1およびhMrel1は、全てATMキナーゼの基質であること、およびDNA破壊の存在に応答してリン酸化されることが示されている。
【０１０４】
本発明は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露した細胞が、以前に同定され、およびたとえば米国出願番号11/441,289、米国出願番号60/684,136、米国出願番号11/046,346および米国出願番号60/540,380（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記述されたFANC D2を含むフォーカスに対応するFANCIを含むフォーカスを形成するという発見に関する。DNA損傷に応答して、IRIFs（電離放射線で誘導可能なフォーカス）とも呼ばれる核フォーカスを形成する複数のDNA損傷反応タンパク質が現在同定されている。FANC D2含むフォーカスを検出する方法、並びにユビキチン化されたFANC D2ポリペプチドの相対量を検出し、および定量化する方法は、米国出願番号10/165,099および米国出願番号60/540,380（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）において記述されている。
【０１０５】
III.FANCI活性化を検出する手段
1. FANCI結合リガンドを使用する検出
本明細書に開示したように、FANCIは、FANCIに特異的に結合する抗体を使用して容易に検出することができる。FANCIに特異的に結合することが本明細書に開示された市販の抗体には、抗KIAA1794抗体BL999およびBL1000（Bethyl）を含む。たとえば、FANCIに対するモノクローナル抗体を含む、FANCIに特異的に結合するさらなる抗体は、本明細書に記述した方法によって容易に調製することができる。
【０１０６】
本発明に使用される抗体は、FANCIに特異的に結合する。抗体結合に関して本明細書に使用される場合、FANCIには、FANCIタンパク質およびその断片を含む。このような断片は、ドメイン全体であってもよく、またFANCIタンパク質の任意のドメインにおいて隣接し、および隣接しないエピトープを含んでいてもよい。FANCIに対して特異的な抗体を生じさせるために使用される抗原の例には、実施例1に記述したアミノ酸配列を含むが、限定されない。
【０１０７】
一旦FANCIに対する抗体が産生されたら、FANCIに対する抗体の結合は、ELISAなどの、当該技術分野において公知の標準的な技術を使用してアッセイしてもよく、一方、細胞内のFANCIの局在化は、実施例に開示した技術を使用してアッセイしてもよい。あるいは、このような結合を測定する任意のその他の技術を使用してもよい。
【０１０８】
本発明は、FANCIまたはその断片に対して特異的な抗体を使用する（たとえば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性／二特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体および本発明のポリペプチドを特異的に認識するCDR配列を含む化合物を含む相補性決定領域（CDR）を移植した抗体）。「特異的」および「選択的」という用語は、本発明の抗体の結合を記述するために使用されるときは、本発明の抗体の可変領域がFANCIポリペプチドを認識し、および結合することを示す。また、本発明の特異的抗体は、抗体の可変領域の外側、および特に分子の定常領域の配列との相互作用を介して、その他のタンパク質（たとえば、黄色ブドウ球菌（S.aureus）プロテインAまたはELISA技術におけるその他の抗体）と相互作用してもよいことが理解されるであろう。
【０１０９】
本発明の抗体（たとえば、FANCIエピトープに特異的に結合する抗体）の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、当該技術分野において周知であり、ルーチンで実行される。このようなアッセイの包括的な考察については、Harlow et al. (Eds.), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor
Laboratory; Cold Spring Harbor, N. Y. (1988), Chapter 6を参照されたい。また、抗体がFANCIポリペプチドに対して特異的であることを条件として、FANCIタンパク質の断片を認識し、および結合する抗体も含まれる。本発明の抗体は、当該技術分野において周知であり、ルーチンで実行される任意の方法を使用して産生することができる。
【０１１０】
以前に文献に記述されたその他のポリペプチドから産生することができ、かつFANCIと偶然に交差反応することができる（たとえば、両方のポリペプチドに同様のエピトープが偶然存在するため）抗体は、「交差反応性」抗体と考えられることが強調されるべきである。このような交差反応性の抗体は、FANCIに対して「特異的」である抗体でない。抗体がFANCIのエピトープに特異的に結合するかどうかの決定は、ウエスタンブロッティングアッセイなどの、当該技術分野において周知の任意のいくつかのアッセイを使用して行われる。FANCIを発現する細胞を同定するためには、更にFANCI活性を阻害するためには、FANCIタンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体が特に有用である。
【０１１１】
一定の態様において、本発明は、抗体の少なくとも1つがFANCIに対して特異的な抗体であるポリクローナル抗体を使用する。動物から単離された抗血清は、例示的な組成物であり、水に、または別の希釈剤、賦形剤もしくは担体に再懸濁された抗血清の抗体画分を含む組成物も同様である。
【０１１２】
その他の態様において、本発明は、モノクローナル抗体を使用する。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられる。更に、典型的には異なるエピトープに向けられた異なる抗体を含むポリクローナル標品とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に向けられる。モノクローナル抗体は、抗原抗体結合を使用する診断アッセイ放および解析アッセイ法の選択性、並びに特異性を改善するために有用である。モノクローナル抗体のもう一つの利点は、これらがハイブリドーマなどの培養細胞によって合成することができ、その他の免疫グロブリンによる混入がないということである。また、このような抗体を産生する組換え細胞およびハイブリドーマは、本発明の一定の側面内での使用が意図される。
【０１１３】
さらにその他の関連した態様において、本発明は、FANCIに対して特異的である抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体を使用することができる。抗イディオタイプ抗体のより詳細な考察については、たとえば、米国特許第6,063,379号および第5,780,029号をを参照されたい。
【０１１４】
抗体が化学的に、または組換え技術によって単離することができる比較的小さな抗原結合ドメインを含むことは、周知である。このようなドメインは、それ自体が有用なFANCI結合分子であり、更にヒト抗体に再導入しても、または化学療法薬またはポリペプチドに融合してもよい。したがって、さらにもう一つ態様において、本発明は、断片および関連する分子が、もしあれば、FANCIに結合する、FANCI特異的抗体の断片を含むポリペプチドを使用する。非限定的な例として、本発明は、単鎖抗体およびCDR移植抗体であるポリペプチドを使用することができる。CDR移植抗体のより詳細な考察については、たとえば、米国特許第5,859,205号および下記の考察を参照されたい。
【０１１５】
その他の態様において、非ヒト抗体は、当該技術分野において公知の任意の方法によってヒト化してもよい。ヒト化抗体は、インビボにおける治療的適用のために有用である。加えて、組換え「ヒト化」抗体を合成することもできる。ヒト化抗体は、まず最初にヒト以外の哺乳類に由来する抗体であり、組換えDNA技術を使用して、抗原結合のために必要とされないアミノ酸のいくつかのまたは全部がヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖の対応する領域からのアミノ酸で置換されている。すなわち、これらは、特異的な抗原結合の役割を担う領域が置換された、大部分がヒト免疫グロブリン配列を含むキメラである。
【０１１６】
抗体の種々の形態は、標準的な組換えDNA技術を使用して産生してもよい（WinterおよびMilstein、1991、Nature 349：293-99）。たとえば、本発明のモノクローナル抗体は、周知のハイブリドーマ技術によって産生することができる。たとえば、動物（たとえば、マウス、ラットまたはウサギ）は、精製した、または粗製FANCI標品、FANCIをコードするcDNA構築物をトランスフェクトした細胞、FANCIを構成的に発現する細胞等で免疫することができる。加えて、抗原は、精製したタンパク質、細胞上に発現されたタンパク質、タンパク質断片もしくはそのペプチドとして、またはタンパク質、タンパク質断片もしくはペプチドをコードする裸のDNAまたはウイルスベクターとして、送達することができる。次いで、免疫動物の血清を、抗FANCI抗体の存在について試験する。B細胞を陽性反応を示す動物から単離して、これらのB細胞でハイブリドーマを作製する。
【０１１７】
ハイブリドーマによって分泌される抗体を、これらがFANCIに特異的に結合する能力（たとえば、FANCIをトランスフェクトした細胞に結合するが、形質導入されなかった親細胞には結合しない）について、および任意のその他の所望の特徴、たとえば、所望のCDRコンセンサス配列を有すること、FANCIとFANC D2との間の結合を阻害すること（または非遮断薬の場合ではないこと）またはFANCIを含むフォーカスの形成を阻害することについてスクリーニングする。
【０１１８】
スクリーニングアッセイにおいて陽性反応を示すハイブリドーマ細胞を、細胞が培養液中にモノクローナル抗体を分泌することができる条件下で、栄養培地において培養する。次いで、ハイブリドーマ培養上清を収集して、上清に含まれる抗体を精製する。あるいは、所望の抗体を、ワクチン接種を受けていない動物（たとえば、マウス）の腹腔にハイブリドーマ細胞を注射することによって産生してもよい。ハイブリドーマ細胞は、腹腔において増殖して、抗体を分泌し、これが腹水液として蓄積する。次いで、抗体を、注射器で腹腔から腹水液を取り除くことによって収集してもよい。
【０１１９】
また、モノクローナル抗体は、所望のハイブリドーマから抗体をコードするcDNAを単離すること、該cDNAを哺乳動物宿主細胞（たとえば、CHOまたはNSO細胞）にトランスフェクトすること、トランスフェクトした宿主細胞を培養すること、および培養液から抗体を回収することによって産生することができる。
【０１２０】
また、本発明に使用されるモノクローナル抗体は、同族ハイブリドーマ（たとえば、マウス、ラットまたはウサギ）抗体を操作することによっても産生することができる。たとえば、同族抗体は、ヒンジの一部または全体、並びに／または重鎖および／もしくは軽鎖の定常領域が別の種（たとえば、ヒト）由来の抗体の対応する成分で置換されるように、組換えDNA技術によって変化させることができる。一般に、改変抗体の可変ドメインは、同族抗体の可変ドメインと同一または実質的に同一である。このような改変抗体は、キメラ抗体と呼ばれ、ヒンジおよび／または定常領域が由来する種の個体（たとえば、ヒト）に投与されたときに、同族抗体よりも抗原性がない。キメラ抗体を作製する方法は、当該技術分野において周知である。ヒト定常領域には、IgG1およびIgG4に由来するものを含む。
【０１２１】
また、本発明に使用されるモノクローナル抗体は、完全ヒト抗体を含む。これらは、Boerneら、1991、J. Immunol. 147：86-95によって記述されているようなインビトロ抗原刺激を受けたヒト脾細胞を使用して、またはたとえば米国特許第6,300,064号に記載されているように、ファージディスプレイ抗体ライブラリーを使用して調製してもよい。
【０１２２】
あるいは、完全ヒト抗体は、Perssonら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：2432-36；およびHuangおよびStollar、1991、J. Immunol. Methods 141：227-36によって記述されているような、レパートリークローニングによって調製してもよい。加えて、米国特許第5,798,230号は、ヒトB細胞からのヒトモノクローナル抗体の調製を記述しており、ヒト抗体産生B細胞をエプスタインバーウイルスまたは不死化のために必要とされるタンパク質であるエプスタインバーウイルス核抗原2（EBNA2）を発現するその誘導体での感染によって不死化させる。EBNA2機能は、その後に遮断されて、抗体産生の増大を生じる。
【０１２３】
完全ヒト抗体を産生するためのいくつかのその他の方法には、不活性化された内因性Ig座位を有し、かつ再編成されていないヒト抗体重鎖および軽鎖遺伝子を遺伝子導入したヒト以外の動物の使用を含む。このようなトランスジェニック動物を、それに由来するB細胞から作製したFANCIおよびハイブリドーマで免疫することができる。たとえば、これらの方法は、ヒトIgミニ座位（miniloci）を含むトランスジェニックマウスに関する種々のGenPharm/Medarex（Palo Alto、Calif.）刊行物／特許（たとえば、米国特許第5,789,650号）；XENOMICE（商標）に関する種々のAbgenix（Fremont、Calif.）刊行物／特許（たとえば、米国特許第6,075,181号、第6,150,584号および第6,162,963号；Greenら、1994、Nature Genetics 7：13-21；およびMendezら、1997、Nature Genetics 15：146-56）；並びに「トランソミック（transomic）」マウスに関する種々のKirin（Japan）刊行物／特許（たとえば、EP 843 961およびTomizukaら、1997、Nature Genetics 16：1433-43）に記述されている。また、たとえば、米国特許第5,569,825号、WO00076310、WO00058499およびWO00037504（その全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０１２４】
また、本発明に使用されるモノクローナル抗体は、その他の種に由来する同族の抗FANCI抗体のヒト化バージョンを含む。ヒト化抗体は、抗原結合のために必要とされないヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸（たとえば、定常領域および可変ドメインのフレームワーク領域）の一部または全体が、同族の、非ヒト抗体の軽鎖または重鎖由来の対応するアミノ酸に置換するために使用される、組換えDNA技術によって産生される抗体である。たとえば、所与の抗原に対するマウス抗体のヒト化のバージョンは、その重鎖および軽鎖の両方に、（1）ヒト抗体の定常領域；（2）ヒト抗体の可変ドメイン由来のフレームワーク領域；および（3）マウス抗体由来のCDRを有する。必要に応じて、ヒトフレームワーク領域の1つまたは複数の残基は、抗原に対するヒト化抗体の結合親和性を保存するために、マウス抗体の対応する位置の残基に変えることができる。この変化は、時に「逆突然変異」と呼ばれる。ヒト化された抗体は、かなり少しの非ヒト成分しか含まないので、一般に、キメラヒト抗体と比較して、ヒトにおける免疫応答を誘発する可能性が低い。
【０１２５】
ヒト化抗体を作製するための方法は、たとえば、Winter EP 239 400；Jonesら、1986、Nature 321：522-25；Riechmannら、1988、Nature 332：323-27（1988）；Verhoeyenら、1988、Science 239：1534-36；Queenら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：10029-33；米国特許第6,180,370号；およびOrlandiら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：3833-37に記述されている。また、たとえば、国際特許出願第94/04679号を参照されたい。霊長類化された抗体は、霊長類（たとえば、赤毛猿、ヒヒおよびチンパンジ）抗体遺伝子を使用して、同様に産生することができる。次いで、親和性または免疫原性を調整するために、さらなる変化を抗体フレームワークに導入することができる。たとえば、米国特許第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号および第6,180,370号を参照されたい。
【０１２６】
一般に、ヒト抗体に対するマウス（またはその他の非ヒト）CDRの移植は、以下の通りに達成される。重鎖および軽鎖可変ドメインをコードするcDNAをハイブリドーマから単離する。CDRを含む可変ドメインのDNA配列をシーケンシングによって決定する。CDRをコードするDNAを、部位定方向突然変異誘発によってヒト抗体重鎖または軽鎖可変ドメインコード配列の対応する領域へ移す。次いで、望まれるアイソタイプ（たとえば、CHについては、γ1およびCLについては、κ）のヒト定常域遺伝子セグメントを付加する。ヒト化重鎖および軽鎖遺伝子は、可溶性ヒト化抗体を産生するために、哺乳動物宿主細胞（たとえば、CHOまたはNSO細胞）において同時発現させる。大規模な抗体産生を促進するためには、たいてい、抗体を発現する細胞を含むバイオリアクターにおいてこのようなヒト化抗体を産生すること、または乳に抗体を発現するトランスジェニック哺乳類（たとえば、ヤギ、ウシまたはヒツジ）を産生すること（たとえば、米国特許第5,827,690号を参照されたい）が望ましい。
【０１２７】
時々、ヒトフレームワークにCDRを直接移植すると、生じる抗体の抗原結合親和性の喪失を引き起こす。これは、いくつかの同族抗体では、フレームワーク領域内の一定のアミノ酸がCDRと相互作用して、したがって、抗体の全体の抗原結合親和性に影響を及ぼすためである。このような場合、同族抗体の抗原結合活性を保持するために、「逆突然変異」（上記）をアクセプター抗体のフレームワーク領域に導入するべきである。
【０１２８】
逆突然変異を作製する一般的アプローチは、当該技術分野において公知である。たとえばQueen、ら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：10029-33、Coら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88、2869-73およびWO90/07861（Protein Design Labs Inc.）は、2つの重要な工程を含むアプローチを記述する。第1に、ヒトVフレームワーク領域を、同族マウス抗体のV領域フレームワークに対する最適のタンパク質配列相同性についてのコンピュータ解析によって選択する。次いで、マウスCDRと相互作用する可能性が高いフレームワークアミノ酸残基を視覚化するために、マウスV領域の三次構造をコンピュータによってモデル化して、次いで、これらのマウスアミノ酸残基を相同的なヒトフレームワーク上に重ねる。
【０１２９】
この二段階のアプローチの下では、ヒト化抗体をデザインするために、いくつかの基準がある。第1の基準は、ヒトアクセプターとして通常非ヒトドナー免疫グロブリンに対して相同的である特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークを使用すること、または多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークを使用することである。第2の基準は、ヒトアクセプター残基が普通ではなく、かつドナー残基がフレームワークの特定の残基にてヒト配列に典型的である場合、アクセプターよりもむしろドナーアミノ酸を使用することがである。第3の基準は、CDRにすぐ隣接した位置にて、アクセプターよりむしろドナーフレームワークアミノ酸残基を使用することである。
【０１３０】
また、たとえばTempest, 1991 , Biotechnology 9: 266-71に記述されたような、異なるアプローチを使用してもよい。このアプローチ下では、それぞれ、NEWMおよびREI重鎖および軽鎖に由来するV領域フレームワークが、マウス残基の完全な導入（radical introduction）を伴わずにCDR-移植のために使用される。このアプローチを使用する利点は、NEWMおよびREI可変領域の三次元構造がX線結晶学により知られており、したがって、CDRとV領域フレームワーク残基との間の特異的な相互作用を容易にモデル化することができることである。
【０１３１】
本発明に使用されるヒト化抗体は、抗体のエフェクター機能（たとえば、抗体がFc受容体または補体因子に結合する能力）がFANCIに結合する抗体の能力に影響を及ぼすことなく変化されるように、重鎖の一定の位置の1つまたは複数（たとえば、2、3、4、5、6、7または8）に、突然変異（たとえば、欠失、置換または付加）を含んでいてもよい（米国特許第5,648,260号）。これらの重鎖の位置は、残基234、235、236、237、297、318、320および322（EU番号付け系）を含むが、限定されない。ヒト化抗体は、たとえばその重鎖に突然変異L234A（すなわち、修飾されていない抗体の位置234のロイシンをアラニンで置換する）およびL235A（EU番号付け系）を含むことができる。
【０１３２】
加えて、本発明に使用されるヒト化抗体は、グリコシル化部位が除去されるように、グリコシル化のための部位であるアミノ酸残基に突然変異（たとえば、欠失または置換）を含んでいてもよい。このような抗体は、減少したエフェクター機能またはその他の望まれない機能を有すると共に、そのFANCI結合親和性を保持するために臨床的に有益である。また、グリコシル化部位の突然変異も、プロセス進展（たとえば、タンパク質発現および精製）のために有益であり得る。たとえば、抗体の重鎖は、重鎖がこの部位にてもはやグリコシル化されることができないように、突然変異N297Q（EU番号付け系）を含んでいてもよい。
【０１３３】
さらに他の態様において、本発明に使用される抗体の重鎖および／または軽鎖は、FANCIに結合するための親和性を壮大させ、およびこれによりFANCIを媒介した障害を治療するための能力を増大する突然変異を含む。
【０１３４】
本発明のモノクローナル抗体は、所望の機能をもたらし、または増強するためのその他の部分をさらに含んでいてもよい。たとえば、抗体は、毒素部分（たとえば、破傷風トキソイドまたはリシン）または抗体によってターゲットされる細胞の死滅のための放射性核種（たとえば、111Inまたは90Y）を含んでいてもよい（たとえば、米国特許第6,307,026号を参照されたい）。抗体は、簡便な単離または検出のための部分（たとえば、ビオチン、蛍光部分、放射性部分、ヒスチジンタグまたはその他のペプチドタグ）を含んでいてもよい。また、抗体は、それらの血清半減期を延長することができる部分、たとえばポリエチレングリコール（PEG）部分および免疫グロブリンスーパーファミリーまたはこれらの断片のメンバー（たとえば、ヒンジ、CH2およびCH3領域などのヒトIgG1重鎖定常領域の一部）を含んでいてもよい。
【０１３５】
また、抗体断片および一価抗体を、本発明の方法および組成物に使用してもよい。一価抗体には、第2の重鎖のFc（またはステム）領域に結合した重鎖／軽鎖二量体を含む。「Fab領域」は、軽鎖に対する重鎖のY枝分れ部分を含む配列と、もしくは軽鎖のその全体とだいたい同じか、または類似し、かつひとまとめになって（凝集体において）抗体活性を示すことが示された鎖の部分をいう。Fabタンパク質には、1つの重鎖および1つの軽鎖の凝集体（一般に、Fabとして知られている）、並びに抗体Yの2つの枝分れセグメントに対応する四量体（F（ab）2として、一般に知られる）を含み、上記のいずれも、凝集により特定の抗原または抗原ファミリーと特異的に反応することができる限り、共有結合または非共有結合で凝集されるかにかかわらない。
【０１３６】
2.GFP-FANCI融合タンパクを使用する検出
FANCI活性化およびフォーカス形成の検出のための代わりのアプローチは、蛍光タンパク質、たとえばGFPと融合されたFANCIタンパク質の使用である。FANCIおよびGFPの機能的な融合タンパク質は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する曝露により、フォーカスを形成することができる。次いで、これらのフォーカスは、蛍光顕微鏡によって見ることができる。従って、FANCIを含むフォーカスの形成は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する曝露に応答するFA経路の活性化のための代用マーカーとして測定することができる。このような融合タンパク質構築物を発生する方法、並びにFANCIを含むフォーカスの形成を検出するための方法は、本明細書に記述した方法を使用して、並びに米国出願第60/540,380号（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されているようにFANC D2に対して以前に適用した方法の適応を介して行うことができる。
【０１３７】
3.ユビキチン化された（活性化された）FANCIに特異的なFANCI-結合リガンドを使用する検出
FANCIタンパク質の総細胞レベルは、DNA損傷に応答して有意に変化しない。むしろ、DNA損傷により、FANCIのモノユビキチン化、並びにFANCIを含むフォーカスへの漸増を生じる。FANCIを含むフォーカスの存在を測定するための代替法は、FANCIのモノユビキチン化された形態に特異的に結合するが、ユビキチン化されていない形態に結合しないリガンドを使用することであることが当業者に認識されるであろう。モノユビキチン化されたFANCIの存在を検出するためには、好ましくはリガンドを上記の通りに検出可能なラベルと結合させる。このようなリガンドを使用する主な利点は、当業者には理解されるであろうとおり、典型的にはDNA損傷を受けていない細胞におけるモノユビキチン化されたFANCIが低い基礎レベルであるため、FANCIを含むフォーカスのレベルを、代用マーカーとしてモノユビキチン化されたFANCIのレベルを使用して、生きた被験体から摂取した試料において測定することができることである。FANCIのモノユビキチン化された形態を特異的に認識する抗体（FANCI-L）は、迅速な診断としてかなりの有用性を有する。たとえば、この抗体は、以下のために使用することができる：
【０１３８】
1）免疫組織化学（IH）。この抗体は、固形腫瘍（たとえば、乳房、卵巣性、肺腫瘍）から調製した組織切片を調べるために使用することができる。IHによるポジティブシグナルにより、腫瘍がシスプラチンおよび関連構造薬に耐性であろうと予測するであろう。
【０１３９】
2）FACS解析。末梢血リンパ球（PBL）は、この抗体でスクリーニングすることができる。ポジティブシグナルは、活性化されたFANCIの存在を示唆し、IRまたは毒素に対する最近の個体の曝露に一致する。したがって、この抗体は、本出願において記述した放射線量計アッセイの有用な拡張である。
【０１４０】
3）精製したFA複合体の阻害剤をスクリーニングするためのハイスループットアッセイ。これらの阻害剤は、インビトロにおいてモノユビキチン化されたFANCIに対するFA複合体の能力を遮断するであろう。新たなモノクローナル抗体も、最終産物検出のための有用な試薬であるだろう。モノユビキチン化されたFANCIを特異的に認識するリガンドを使用してFANCIを含むフォーカスを測定するさらなる方法には、生きた被験体から収集した試料の抽出物を使用する免疫ブロット分析もしくは酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）またはFACS解析を含む（Harlow et al, 1999、Using Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY）。
【０１４１】
IR曝露の感受性測定は、FANCIのモノユビキチン化の増加である。損傷を受けていない細胞では、FANCI-L（モノユビキチン化されたアイソフォーム）対FANCI-S（ユビキチン化されていないアイソフォーム）の比率は、およそ0.5-0.6である。この比（L/S）は、ウエスタンブロットでLバンド対Sバンドの密度を比較することによって容易に算出される。FANCI モノユビキチン化およびIR曝露が増加したことの感受性の指標は、1.0以上へのL/S比の変換である。
【０１４２】
IV. FA経路の阻害剤を同定する
本発明は、FA経路の阻害剤を使用する新生物疾患の治療のために有用な方法および組成物を包含する。FA経路の阻害剤は、たとえば、本明細書に記述される方法、更には米国出願第10/165,099号および米国出願第60/540,380号（これらの内容は、参照により本明細書に援用される）において前述した方法によって、同定することができる。たとえば、FA経路の阻害剤は、米国出願第11,441,289号（この内容は、参照により本明細書に援用される）の図1に要約されたように、3段階アプローチを使用して系統的に同定することができる。
【０１４３】
スクリーニングの第1段階には、FANCIを含むフォーカスの形成を変化させる薬剤を同定するためのハイスループット法を含む。たとえば抗FANCI抗体などのFANCIリガンドまたは機能的なeGFP-FANCI融合タンパク質を発現する株化細胞を使用することによる、FANCIを含むフォーカスの検出は、米国出願第10/165,099号および米国出願第60/540,380号（これらの内容は、参照により本明細書に援用される）においてFANC D2について記述したように行うことができる。本方法には、FANCIを含むフォーカスの形成を誘導する投薬量にて、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬、たとえば電離放射線（IR）、マイトマイシンCまたはシスプラチンに対する曝露と同時に、前に、または後に、細胞または生体試料を試験化合物と接触させることを含む。次いで、FANCIを含むフォーカスの数およびサイズを細胞において検出して、試験化合物と接触しなかった対照細胞と比較する。対照細胞と比較したFANCIを含むフォーカスの数および／またはサイズの減少は、FA経路の阻害剤である薬剤を示すが、対照細胞と比較したFANCIを含むフォーカスの数および／またはサイズ増大は、FA経路のアゴニストである薬剤を示す。したがって、同定される潜在的アゴニストおよび阻害剤は、これらがFA経路に対して直接これらの効果を及ぼすか、またはたとえばDNAに直接損傷を生じさせることによって（FA経路の潜在的アゴニストの場合）、またはスクリーンに使用された遺伝毒性抗悪性腫瘍薬の効果を減少させることによって、間接的に作用するかどうかを決定するために更に試験することができる。
【０１４４】
スクリーニングの第2段階には、ユビキチン化されたFANCIポリペプチドの検出を含む。本明細書に開示したように、FA経路の活性化により、FANCIポリペプチドのモノユビキチン化を生じる。従って、FA経路の活性化は、ユビキチン化されていないFANCIポリペプチドと比較したユビキチン化されたFANCIの相対量を検出することによって測定することができる。FANCIのユビキチン化は、タンパク質抽出物の免疫ブロット分析を行うことによって検出することができる。ユビキチン化されたFANCIは、免疫ブロット分析においてより高分子量バンドに移動し、標識したFANCIリガンド（たとえば、抗FANCI抗体）を使用して検出することができる。従って、スクリーニングの第2段階には、FANCIを含むフォーカスの形成を誘導する投薬量にて、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬、たとえば電離放射線（IR）、マイトマイシンCまたはシスプラチンに対する曝露と同時に、前に、または後に、細胞または生体試料を試験化合物と接触させることを含む。ユビキチン化されていないFANCIポリペプチドと比較してユビキチン化されたFANCIポリペプチドの量を検出して、試験化合物と接触しなかった対照細胞または生体試料からの試料と比較する。対照細胞と比較したユビキチン化されたFANCIの相対量の相違は、試験化合物がFA経路のモジュレーターであることを示す。対照細胞または生体試料と比較したユビキチン化されたFANCIポリペプチドの相対量の増大は、FA経路のアゴニストを示すが、対照細胞または生体試料と比較したユビキチン化されたFANCIポリペプチドの相対量の減少は、FA経路の阻害剤を示す。したがって、以前に記述したように、同定される潜在的アゴニストおよび阻害剤は、これらがFA経路に対して直接これらの効果を及ぼすか、またはたとえばDNAに直接損傷を生じさせることによって（FA経路の潜在的アゴニストの場合）、またはスクリーンに使用された遺伝毒性抗悪性腫瘍薬の効果を減少させることによって、間接的に作用するかどうかを決定するために更に試験することができる。
【０１４５】
スクリーニングの第3段階は、インビトロでの遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する感受性について化合物の試験を含む。FA経路の阻害剤と細胞または生体試料を接触させることにより、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する試料／細胞の感受性が増大することが予想される。試験薬によるFA経路の特異的な阻害は、たとえばFA経路の1つまたは複数の成分の特異的な欠陥をもつ株化細胞と同程度まで感受性を増加させることが予想される。この種のアッセイ法のために有用な株化細胞はFANCFが欠損している、卵巣癌株化細胞（2008）を含む。FANCFが欠損した2008細胞は、たとえば、米国出願第11/441,289号に記述したように、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する感受性の増大を示し、この感受性は、FANCFの過剰発現によって野生型レベルまで回復される。次いで、遺伝毒性物質感受性の野生型レベルを回復する際のFANCFの役割は、FA経路を阻害する試験薬と接触することによって消失されるが、一方で、FANCFトランスフェクションの非存在下では、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する感受性は影響を受けないままである。
【０１４６】
上記のスクリーニングの3段階は、FA経路の潜在的モジュレーターを迅速に同定し、および特徴づけるための合理化されたアプローチを提供する。モジュレーターを同定する方法は、上記の本発明の詳細な態様に限定されず、、本態様のバリエーションを行うことができ、なおも本発明の範囲内にあることを理解すべきである。加えて、本明細書に使用した用語は、詳細な態様を記述するためのものであり、限定することは意図されない。
【０１４７】
V.FA経路の阻害剤
本発明は、FA経路の阻害剤の使用を想定する。FA経路の阻害剤には、通常はFANCIを含むフォーカスの形成を生じさせる遺伝毒性抗悪性腫瘍薬の前に、後に、または同時に投与されたときに、FANCIを含むフォーカスの形成の阻害を生じる任意の化合物を含む。FANCIを含むフォーカスの形成を誘導する遺伝毒性抗悪性腫瘍薬の例は、電離放射線（IR）およびシスプラチンまたはマイトマイシンCなどのDNAアルキル化剤を含むが、限定されない。また、FA経路の阻害剤は、通常ユビキチン化を誘導する薬剤に供された試料のユビキチン化されたFANCIポリペプチドのおよびユビキチン化されていないFANCIポリペプチドの相対量を測定することによって検出することができる。顕微鏡学的な検出手段を使用するFANCIを含むフォーカスの検出、並びにFANCIポリペプチドの相対的ユビキチン化状態の決定は、たとえば、2002年6月6日に出願の米国出願第10/165099号および2004年1月30日に出願の米国出願第60/540380号（これらの内容は、参照により本明細書に援用される）におけるFANC D2を含むフォーカスの検出のために記述したように行うことができる。簡潔には、FANCIを含むフォーカスは、抗FANCI抗体を使用する免疫蛍光顕微鏡観察を使用して検出することができる。あるいは、FANCIの蛍光タンパク質タグを付けたバージョンを関心対象の細胞にトランスフェクトして、顕微鏡によって測定されるFANCIを含むフォーカスの形成を、再び米国出願第60/540,380号においてFANC D2について記述したように、蛍光性「フォーカス」を検出することができる。ワートマニンおよびトリコスタチンAなどのFA経路を阻害する化合物は、たとえば2004年1月30日に出願の米国出願第60/540380号において、以前に開示されている。
【０１４８】
VI.その他のDNA損傷修理経路の阻害剤
細胞は、絶えず異なる種類のDNA損傷に供される。これらの損傷は、スーパーオキシド（O2-）、過酸化水素（H2O2）などの活性酸素種を含む、種々の内部および外部の化学物質、並びに照射に対する曝露によって生じ得る。加えて、ヒトは、広範な発癌物質に常に曝露されており、これらの多くは、DNAに損傷を生じさせることによって作用する。こうむった損傷の型に応じて、少なくとも6つの異なるメカニズムが、ヒトにおけるDNA損傷修復のために存在することが示されている。
【０１４９】
多くの癌は、6つの主要なDNA損傷修復経路の少なくとも1つに欠陥を有する。ゲノム不安定性の増加を生じさせることに加えて、これらのDNA修復機構のいずれかの破壊は、遺伝毒性抗新生物薬に対する感受性の増加を引き起こし得る。従って、これらの癌は、生存のために、その他の5つのDNA損傷修復経路の1つに対する依存性が増加している。それ故、たとえば小分子阻害剤による第2の、これらの新生物障害における非FA DNA損傷修復経路の破壊により、選択的な癌細胞死を生じ得る。換言すると、多くの癌は、優性（主要な）DNA損傷修復経路を有することが分かる。癌では、1つのDNA損傷修復経路がすでに消失し、または有意に減少されるので、高い増殖速度を維持するために、およびこれらの細胞のDNA損傷を防止するために、余分な負担が優性経路上に課される。従って、外来性阻害剤による、主要なDNA損傷修復経路が消失し、または減弱された癌細胞における優性経路の破壊は、腫瘍細胞に対して深刻な細胞毒性を有するが、周囲の正常細胞に対しては、比較的小さな細胞毒性を有するであろう。
【０１５０】
FA/BRCA経路の喪失は、染色体不安定性、シスプラチン感受性の増加を引き起こし、したがって、塩基除去修復（Base Excision Repair：BER）経路を含む残りの非FA DNA損傷修復経路の活性の増加を生じる。従って、非FA DNA損傷修復経路、たとえばBERの阻害剤（PARP1阻害剤またはBER経路に特異的なキナーゼの阻害剤など）は、これらの細胞にとって致死的であろうが、正常（非腫瘍）細胞に対してはほとんど効果を有さないであろう。
【０１５１】
また、本発明は、種々のその他のDNA損傷修復経路の阻害剤の使用を想定する。前述したように、DNA損傷修復のためには、非相同末端連結（NHEJ）、塩基除去修復（BER）、ヌクレオチド除去修復（NER）およびミスマッチ修復（MR）を含むが、限定されない、いくつかの主要な経路がある。これらのメカニズムは、たとえば、Hoeijmakers JHJ（2001）Nature 411：366-374、Svejstrup JQ（2002）Nat Rev Mol Cell Biol. 3：21-29に、およびPanasci, DNA Repair in Cancer Therapy Humana Press, 2004, Totowa, NJに記述されており、これらは、参照により本明細書に援用される。
【０１５２】
A.非相同末端連結（NHEJ）
DNA二本鎖破壊（DSB）は、多くの環境因子または活性酸素種、電離放射線（IR）およびブレオマイシンのような一定の抗悪性腫瘍薬を含むその他の因子によって生じ得る。DSBを修復できないと、突然変異、染色体異常および最終的には細胞死を含む多くの結果を引き起こし得る。非相同末端連結（NHEJ）は、非正統的組換えとも呼ばれ、DSB修復の1つの主要な経路である。NHEJ経路のいくつかのメンバーを表1に示してある。
【０１５３】
【表１】
2010521670.tif 000004
【０１５４】
DNA依存的プロテインキナーゼ（DNA-PK）は、触媒サブユニット（DNA-PKcs）および調節サブユニット（Ku70/Ku80ヘテロ二量体）からなる。DNA-PKcsサブユニットは、ホスファチジルイノシトール-3キナーゼファミリーに属するセリン／スレオニンキナーゼである。Ku80/Ku70ヘテロ二量体（Ku）は、二本鎖末端に対して配列非依存的親和性を示し、DNAに結合すると、DNA-PKcs触媒サブユニットを補充し、活性化する。DNA-PKのいくつかの候補阻害剤、たとえばビリジン（viridins）（Hanson, J. R. Nat. Prod. Rep., 12: 381-384, 1995）、ワートマニン、ケルシチン（quercitins）（Izzard et al. (1999) Cancer. Res., 59: 2581-2586）、LY294002（Vlahos et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 5241-5248）（これらは、参照により本明細書に援用される）が記述されている。NHEJのその他の阻害剤は、米国特許出願第2004/0002492号（これは、参照により本明細書に援用される）内に開示されたATMの阻害剤を含む。
【０１５５】
B.塩基除去修復（BER）
一本鎖DNA破壊（SSBs）は、細胞DNAにおいて生じる最も頻繁な病変の1つである。SSBsは、自発的に、または塩基除去修（BER）の間に塩基損傷の酵素の修復の中間体として生じ得る（Caldecott（2001）Bioessays 23（5）：447-55）。DNAグリコシラーゼによる、ダメージを受けた塩基の除去に続くこの修復経路において、生じる脱プリン／脱ピリミジン（AP）部位は、最初にApel APエンドヌクレアーゼによってプロセスされて、5'デオキシリボース-ホスフェートを残し；次いでAPリアーゼ活性によって、3'β-除去産物を残す。DNA ポリメラーゼβによる、またはPCNA依存的ポリメラーゼによる、これらのAP部位のその後の除去により、単一ヌクレオチド（Polβについて）またはより長い修復パッチ（Polδ/εについて）のいずれかを充填するための修復合成、および次いで再連結が可能である（Wilson（1998）Mutat Res。407：203-15）。SSB部位が効率的にプロセスされて、除去されない場合、ダメージを受けた部位および止まった複製フォークのクラスターを形成して、細胞にとって潜在的に致死結果となるDSBの形成を生じる（Chaudhry & Weinfeld (1997) J Biol Chem. 272:15650-5；Harrison, Hatahet et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26: 932- 41）。
【０１５６】
ポリ（ADPリボース）ポリメラーゼ（PARP）は、NAD+からのADPリボース残基のそれ自体および異なるクロマチン成分への転移を触媒して、分枝ADPリボース重合体を形成するDNA結合亜鉛フィンガータンパク質である。PARPの酵素活性は、DNA損傷によって誘導され、DNA修復およびDNA損傷で誘導される細胞死におけるPARPの役割を示唆している。PARPの多数の阻害剤が開示されており、その幾つかが市販されている。たとえば、PJ-34 N-（6-オキソ-5,6-ジヒドロフェナントリジン-2-イル）-N、N-ジメチルアセトアミド.Hcl、INHBP 5-ヨード-6-アミノ-1,2-ベンゾピロン、3-アミノベンズアミド、ベンズアミド、4-アミノ-1,8-ナフタルイミド、6（5H）-フェナントリジノン、5-アミノイソキノリノン（5-AIQ）.ハイドロクロライド、4-ヒドロキシキナゾリン、4-キナゾリノール、1,5-イソキノリンジオール、5-ヒドロキシ-1（2H）-イソキノリノン、3,4-ジヒドロ-5-[4-（1-ピペリジニル）ブトキシ］-1（2H）-イソキノリノン（DPQ）は、全てInotek Pharmaceuticals（Beverly、MA）から入手可能である。GPI 15427（Tentori et al. (2003) Proceedings of the AACR, 44, Abs No. 5466）およびメトキシアミン（Liuzzi et al., (1985) J. Biol. Chem. 260, 5252-5258; Rosa et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19, 5569-5574; および Horton et al. (2000) J. Biol. Chem., 275, 2211-2218）などのその他の化合物も、化学療法および放射線療法の両方の抗悪性腫瘍薬有効性を増強することが報告されている。
【０１５７】
C.ヌクレオチド除去修復（NER）
ヌクレオチド除去修復（NER）は、大部分は正常塩基対形成を妨げる外来供与源によって生じる種々のヘリックスを歪めるDNA損傷に対して作用する。人におけるNERの主な機能は、紫外線（UV）によって誘導される損傷、たとえばピリミジンダイマの除去であるようである。7つの異なる遺伝子、XPA、XPB、XPC、XPD、XPE、XPFおよびXPGを含む、その欠陥が色素性乾皮症（XP）と呼ばれる常染色体性の劣性遺伝病を生じさせ得るNER経路のメンバーが同定されており、その全てが、NER経路において機能する（Hoeijmakers（2001）Mutat Res。485：43-59）。
【０１５８】
真核生物NERは、2つの主要な枝分れである、転写連関修復（transcription-coupled repair:TCR）および包括的ゲノム修復（GGR）を含む（de Laat et al. (1999) Genes Dev. 13: 768-85, Tornaletti & Hanawalt (1999) Biochimie. 81139-46）。GGRは、損傷について全てのゲノムを詳しく調べるゆっくりとしたランダムなプロセスであり、一方で、TCRは、高度に特異的かつ効率的であり、損傷をブロックするRNAポリメラーゼII上に濃縮する。2つのメカニズムは、基質特異性および認識が異なる。GGRでは、XPC-HR23B複合体が、非転写領域に位置する損傷を認識するが（Sugasawa et al.（2001）Genes Dev. 15：507-21）、RNAポリメラーゼII（RNAPII）の停止は、TCRの認識シグナルとして役立つ。RNAPII置換の分子機構は、現在不明であるが、コカイン（Cocayne's）症候群タンパク質CSA、CSB、XPA結合タンパク質2（XAB2）、TFIIHおよびXPG（Svejstrup 2002）などの必須因子が、TCRにおいて機能することが同定された。その後、GGRおよびTCRの両方において、開いた巻き戻された構造を病変のまわりに形成する。これにより、XPGおよびERCC1-XPFヌクレアーゼに特異的な切断部位を生じて、生じるギャップが、PCNA依存的ポリメラーゼによって充填されて、DNAリガーゼによって塞がれる（de Laatら、id）。
【０１５９】
D.ミスマッチ修復
ミスマッチ修復（MMR）は、DNAポリメラーゼにより不対合となったヌクレオチドおよび反復配列の複製の間のずれによって生じる挿入／欠失ループの両方を除去する（Harfe & Jinks-Robertson (2000) Annu Rev Genet 34：359-399）。最初に、ヘテロ二量体のMSH複合体がヌクレオチドミスマッチを認識して、その後にMLH1/PMS2およびMLH1/MLH3複合体と相互作用が続く。いくつかのタンパク質は、ヌクレオチド切除および再合成の進行に関与する。ミスマッチ修復が欠陥した腫瘍細胞は、正常細胞よりも非常に高い突然変異体頻度を有する（Parsons et al.（1993）Cell
75：1227-1236、Bhattacharyya et al.（1994）Proc Natl Acad。Sci
USA 91：6319-6323）。ミスマッチ修復に関与する少なくとも6つの遺伝子MSH2、MLH1、PMS2、MSH3、MSH6およびMLH3がヒトにおいて同定された。MSH3を除くこれらの遺伝子の欠陥は、遺伝性非ポリープ性大腸癌（HNPCC）を引き起こす（Hoeijmakers 2001）。
【０１６０】
アフィジコリン（Gera (1993) J Immunol. 151 : 3746-57）、ラパマイシン（mTOR阻害剤、Sabers et al., （1995）J Biol. Chem. 270：815-22）、AGT阻害剤06-ベンジルグアニン（Bronstein et al.,（1992）Cancer Res. 52：3851-6）を含む、DNA損傷修復に対するその他の阻害剤が開示されている。
【０１６１】
VII.非FA DNA損傷修理経路の阻害剤を同定する
前述したように、一定の状況において、細胞のDNA損傷修復経路は、部分的に重複性であり得る。これは、1つの経路を特異的に遮断する薬剤を同定するのが困難なことを示す。従って、細胞が機能的DNA損傷経路を有する細胞に基づいた方法を使用して同定される阻害剤は、複数のDNA損傷修復経路に関与する複数の標的を有するであろう。従って、1つまたは複数のDNA損傷修復経路が欠損した株化細胞の使用により、新規の特異的阻害剤の同定が非常に促進されるであろう。従って、一つの側面に従って、非FA DNA損傷修復経路を阻害する薬剤を同定する方法が提供される。本方法は、FA経路に病変を有する細胞を使用する。本方法には、細胞を薬剤と接触させること、および遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する感受性について試験することを含む。機能的DNA損傷修復経路を含む対照細胞と比較ししたときに、FA経路に病変を含む試験細胞における遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する感受性の強化を与える薬剤は、該薬剤が、試験細胞が病変を含む経路以外の非FA DNA損傷修復経路を阻害することを示す。一つの態様において、試験細胞および対照細胞は、同質遺伝子的であるが、試験細胞がFA/BRCA経路の少なくとも1つ成分、たとえばとりわけFANCA、FANCB、FANCC、FANCD、FANC D2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCLおよびATRプロテインキナーゼに病変を含むことを除く。（ATRは、直接FA経路を調節するようであることに留意されたい）。ATRは、FANCD2のモノユビキチン化のために必要とされ（Andreassen et al.（2004）Genes Dev 18：1958-1963）、FANCD2機能のために必要にされるいくつかの部位に対してFANCD2をリン酸化する（Ho et al.（2006）Mol Cell
Biol 26：7005-7015；Taniguchi et al.（2002）Cell 109：459-472）。
【０１６２】
一つの態様によれば、本方法は、FA経路の機能性の異なる2つの同質遺伝子株化細胞の遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する感受性を比較することを含む。また、同質遺伝子株化細胞を利用できることにより、FA経路以外のDNA損傷修復経路に関与する遺伝子産物を同定することができる。一つの態様において、親の生存度に影響を及ぼすが、対照細胞に影響を及ぼさない遺伝子が、系統的にsiRNAライブラリーを使用する集団阻害によって試験される。たとえば、バーコード化されたsiRNAライブラリーを、2つの株化細胞の安定なトランスフェクションのために使用することができる。遺伝子は、2008細胞の生存度のために必要とされるが、修正された細胞には必要とされない。FA経路以外のDNA損傷修復経路、たとえばBER経路のために重要である遺伝子は、このような遺伝子のsiRNAノックダウンが親の2008細胞において致死的であろうが、FANCF cDNAをトランスフェクトした対照2008細胞では、致死的ではないであろうという結果を有することが予想される。
【０１６３】
1つまたは複数のDNA損傷修復経路が崩壊されている細胞を殺すことができるが、破壊が回復されている同質遺伝子株化細胞を殺さない、こうして同定された薬剤は、癌の治療に使用することができる。6つの主要なDNA損傷修復経路の2つ以上の破壊により、細胞死を生じ得る。多くの癌では、すでにノックアウトされ、または抑制された1つの経路を有するので、第2の経路、たとえばBER経路の相対的に無毒の阻害剤は、化学療法剤の非存在下でさえ、癌の細胞減少を生じさせるために十分であろう。加えて、主要なDNA損傷修復経路が無処置の腫瘍細胞において、組み合わせて2つの阻害剤を、このような組み合わせの毒性が正常（非癌）細胞に有毒でないことを条件として使用すると（たとえば、FA経路の1つの阻害剤およびBER経路の1つの阻害剤）、有意な細胞減少を生じさせるために十分であろう。この種の場合、癌細胞によるこれらの薬剤の摂取を増強するためのプロドラッグストラテジーは、必要な治療係数を提供する。
【０１６４】
VIII.抗悪性腫瘍薬
DNA損傷修復経路の阻害剤と組み合わせた抗悪性腫瘍薬の組み合わせを使用して新生物障害患者を治療する方法を本明細書に開示してある。特に有用である抗悪性腫瘍薬は、DNAに損傷を生じさせる薬を含むが、限定されない。これらの薬剤には、DNAアルキル化剤、挿入剤等を含む。従って、以下を含むが、限定されないDNA損傷化学療法的な化合物の使用がさらに想定される：1,3-ビス（2-クロロエチル）-1-ニトロソ尿素（BCNU）、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロリムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド（Temozolomide）およびトポテカン。さらにまた、本明細書に記述した方法は、新生物障害を治療する放射線療法を使用することができる。一つの態様において、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬は、投与される濃度にて、DNA損傷修復を阻害しない。
【０１６５】
IX.抗悪性腫瘍薬に対する応答者を同定する
細胞のFA経路の有効性は、化学療法薬に対する細胞の感受性と強く相関することが同定されている。従って、一つの側面において、本発明は、新生物障害または疾患をもつ被験体が遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するかどうかを予測する方法を提供する。本方法には、被験体から生体試料を得ること、および局在化（たとえば、FANCIを含むフォーカスのサイズおよび／または数を決定すること）および／または生体試料内のFANCIポリペプチドのユビキチン化の程度を決定することを含む。対照被検体からの生体試料と比較したときに減少された（たとえば、約70%未満、約50%未満、その他の）被験体の生体試料におけるFANCIポリペプチドのユビキチン化の程度は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろう被験体を示す。同様に、対照細胞と比較したときのFANCIを含むフォーカスのサイズおよび／または数の減少は、また遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろう被験体を示す。
【０１６６】
もう一つの側面において、本発明は、新生物障害または疾患をもつ被験体が、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するだろうかどうかを予測する方法であって、生体試料におけるFANCI配列の検査を使用する方法を提供する。本方法には、被験体から生体試料を得ること、並びに生体試料内のFANCI核酸および／またはポリペプチド配列を決定することを含む。、対照配列と比較した生物学的試験試料内の、突然変異、特にたとえばR1285Q突然変異などの機能的コード配列変化の発見は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろう被験体を示す。
【０１６７】
一つの態様において、新生物障害は、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、脊髄形成異常、多発性骨髄腫、ホジキン病または非ホジキンリンパ腫、小または非小細胞肺癌腫、胃、腸管または結腸直腸の癌、前立腺、卵巣癌または乳癌、頭部、脳または頚部癌、尿路の癌、腎臓または膀胱癌の癌、悪性黒色腫、肝臓癌、子宮癌または膵臓癌からなる群から選択される。
【０１６８】
これらの側面によれば、化学療法薬、特に遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する応答者を同定するために、FANCI モノユビキチン化、局在化、核酸および／またはポリペプチド配列のレベルを測定することによって定まる、生体試料がFA経路を活性化する能力が決定される。抗悪性腫瘍薬は、癌の治療のために使用することができる任意のものであり、一つの態様において、抗悪性腫瘍薬の作用機序は、DNAの損傷を介する。これらの化合物には、以下を含むが、限定されない：1,3-ビス（2-クロロエチル）-1-ニトロソ尿素（BCNU）、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシC、マイトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド（Temozolomide）およびトポテカン、並びに電離放射線。
【０１６９】
一定の態様において、被験体またはあるいは被験体から得られる生体試料は、FANCIポリペプチドのユビキチン化の程度を決定する前に、抗悪性腫瘍薬に曝露することができる。一つの態様において、被験体または被験体から得られる生体試料は、治療的に有効な用量以下である用量にて曝露される。もう一つの態様において、曝露は、抗悪性腫瘍薬の治療的に有効な用量の50%以下である。
【０１７０】
FANCIポリペプチドのユビキチン化の程度は、対照被検体のものと比較することができる。本明細書に使用される対照被検体は、抗悪性腫瘍薬に対する反応に関して正常であることが以前に決定された単一の被験体または多数の健常人であることができる。単一の対照被検体または多数の対照被検体からの生体試料を使用することができる。この側面において、被験体は、FANCIユビキチン化の割合が、被験体からの試料と比較したときに減少される場合、たとえば試験試料と同じまたは同等の用量の抗悪性腫瘍薬を受けた被験体からの試料と比較したときに約70%未満、65%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満またはそれ以下である場合、抗悪性腫瘍薬に対する応答者であると考えられる。さらに、はFANCIポリペプチドのユビキチン化の程度および／また局在化を決定する前に抗悪性腫瘍薬に対する曝露を含む態様において、対照試料は、試験試料の調製前に調製することができ、または試験試料の調製と同時に調製することができる。
【０１７１】
一つの態様において、被験体またはあるいは被験体から摂取した生体試料は、FA経路の有効性の測定の前に遺伝毒性抗悪性腫瘍薬で処理することができる。抗悪性腫瘍薬の投薬量は、健常人においてFA経路を誘導するために必要なものであろう。典型的には、抗悪性腫瘍薬の投薬量は、約5%〜100%の間の典型的な、より典型的には20%〜100%間および最も典型的には約35%〜100%の間の治療上有効な用量であろう。
【０１７２】
本明細書に記述したように、生体試料におけるFANCIポリペプチドのユビキチン化の程度および／または局在化を測定するための多数の方法がある。FANCIポリペプチドのユビキチン化の程度は、本明細書に記述したように、およびFANC D2について以前に記述したように、免疫ブロット分析を使用して測定することができる。あるいは、たとえばFANCIユビキチン化のための代用マーカーとして生体試料の免疫蛍光顕微鏡観察を使用して、FANCIを含むフォーカスの形成を検出することができる。
【０１７３】
被験体は、ユビキチン化されたFANCIポリペプチドの形成が有意に減少される場合、たとえば、ユビキチン化されたFANCIの形成が健常人と比較したときに約70%以下、健常人におけるよりも65%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下である場合、応答者であるとみなされる。
【０１７４】
X.新生物障害の治療
一定の態様において、被験体または患者は、非FA DNA損傷修復経路の阻害剤の投与と同時に、前に、または後に、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬の治療上有効な用量で投与される。多くの抗悪性腫瘍薬の治療上有効な投薬量は、十分に確立されており、たとえばCancer Chemotherapy and Biotherapy: A Reference Guide Edition Number: 2 Tenenbaum, ed. Saunders & CO (1994)（参照により本明細書に援用される）において見出すことができる。
【０１７５】
また、新生物障害を、その必要のある被験体において治療するための方法が本明細書に提供される。一つの側面において、本方法は、被験体にFANCIおよび／またはFA経路の阻害剤の有効量および遺伝毒性抗悪性腫瘍薬を投与することを含む。抗悪性腫瘍薬は、1,3-ビス（2-クロロエチル）-1-ニトロソ尿素（BCNU）、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシン
C、マイトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド（Temozolomide）およびトポテカン、並びに電離放射線からなる群より選択することができる。
【０１７６】
もう一つの側面において、新生物障害を、その必要のある被験体において治療する方法が提供される。本方法は、被験体にFANCIおよび／またはFA経路の阻害剤、並びに非FA DNA損傷修復経路の阻害剤の有効量を投与することを含む。任意の修復経路を阻害する非FA
DNA損傷修復経路の阻害剤を選択することができ、PARP阻害剤、DNA-PK阻害剤、mTOR阻害剤、ERCC1阻害剤ERCC3阻害剤、ERCC6阻害剤、ATM阻害剤、XRCC4阻害剤、Ku80阻害剤、Ku70阻害剤、XPA阻害剤、CHK1阻害剤、CHK2阻害剤またはその薬学的に許容される塩、エステル、誘導体、溶媒和物もしくはプロドラッグからなる群から選択することができる。
FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤は、非FA DNA損傷修復経路の阻害剤の投与と同時に、または後に投与することができる。阻害剤は、非経口的、経口的または腫瘍内に直接投与することができる。
【０１７７】
FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤、並びに非FA DNA損傷修復経路の阻害剤は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する新生物障害の感受性を増大するように作用し得る。従って、別の態様においては、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する新生物障害の感受性を増大する方法が提供される。本方法は、FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤および非FA DNA損傷修復経路の阻害剤の有効量の組み合わせを、薬剤の治療上有効な用量の前に、後に、または同時投与することを含む。本方法は、多くのタイプの新生物障害の治療のために有用であり得るし、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、脊髄形成異常、多発性骨髄腫、ホジキン疾患または非ホジキンリンパ腫、小または非小細胞肺癌腫、胃、腸管または結腸直腸の癌、前立腺、卵巣癌または乳癌、頭部、脳または頚部癌、尿路、腎臓または膀胱癌の癌、悪性黒色腫、肝臓癌、子宮癌または膵臓癌からなる群から選択することができる。
【０１７８】
FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する新生物障害の感受性を増大する薬剤として、更に有用である。従って、別の態様においては、本発明は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する新生物障害の感受性を増大する方法を提供する。本方法は、FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤の有効量を、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬の治療上有効な用量の前に、後に、または同時に投与することを含む。前述したように、FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤は、非FA DNA損傷修復経路の阻害剤の投与の前に、同時に、または後に投与することができ、非経口的に、経口的に、または腫瘍内に直接投与することができる。一つの態様において、本方法は、FANCIおよび／またはFA阻害剤、並びに遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に加えて、非FA DNA損傷修復経路の阻害剤を投与することをさらに含む。非FA DNA損傷修復経路の阻害剤は、FANCIおよび／またはFA経路阻害剤、並びに遺伝毒性抗悪性腫瘍薬の治療上有効な用量の前に、後に、または同時に投与することができる。
【０１７９】
新生物障害を予防し、または治療する際の本明細書に開示した組成物の有効性は、たとえば、特異的な新生物障害の動物モデルにおいて試験することができる。動物モデルの多くの例が当業者に周知であり、たとえば、Holland, Mouse Models of Cancer (Wiley-Liss 2004); Teicher, Tumor Models in Cancer Research (Humana Press; 2001); Kallman, Rodent Tumor Models in Experimental Cancer Therapy (Mcgraw- HiIl, TX, 1987); Hedrich, The Laboratory Mouse (Handbook of Experimental Animals) (Academic Press, 2004); and Arnold and Kopf-Maier, Immunodeficient Animals: Models for Cancer Research (Contributions to Oncology, VoI 51) (Karger, 1996)（これらの内容は、これらの全体が本明細書に援用される）に開示されている。
【０１８０】
XI.本発明に従った試験化合物
インビトロでまたはインビボの系であるかにかかわらず、本発明は、FANCIを含むフォーカスの形成を阻害することができる組成物、並びにFA経路以外のDNA損傷修復経路を阻害する組成物をスクリーニングする方法を包含する。合成または天然の化合物の大きなライブラリーからの候補モジュレーター化合物をスクリーニングすることができる。サッカリド、ペプチドおよび核酸をベースとする化合物のランダムおよび直接的合成のために多数の手段が現在使用されている。合成化合物ライブラリーは、Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK)、Comgenex (Princeton, NJ)、Brandon Associates (Merrimack, NH)およびMicrosource (New Milford, CT)を含む多数の会社から市販されている。珍しい化学物質ライブラリーは、Aldrich（Milwaukee、WI）から入手可能である。コンビナトリアルライブラリーを利用でき、調製することができる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーは、たとえば、Pan Lsboratory（Bothell, WA）またはMycoSearch（NC）から入手可能であり、または当該技術分野において周知の方法によって容易に生産することができる。加えて、天然および合成的に産生されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段を介して、容易に修飾される。
【０１８１】
有用な化合物が、多数の化学物質分類内で見いだされるであろうが、典型的にはこれらは、小さな有機化合物を含む有機化合物である。小さな有機化合物は、50を超える分子量であるが、約2,500ダルトン未満、好ましくは約750未満、より好ましくは約350ダルトン未満を有する。例示的な分類には、複素環、ペプチド、サッカリド、ステロイド等を含む。化合物は、有効性、安定性、医薬品適合性等を増強するために修飾してもよい。薬剤の構造の同定を、さらなる薬剤を同定し、生成し、またはスクリーニングするために使用してもよい。たとえば、ペプチド薬剤が同定される場合、これらは、たとえばアミノ基（アシル化またはアルキル化）に対して、およびカルボキシル基（エステル化またはアミジン化（amidification））またはその他に対して、アミノ末端またはカルボキシル末端に官能性をもたせることにより、D-アミノ酸、特にD-アラニンなどの、非天然のアミノ酸を使用するなど、これらの安定性を増強するためにさまざまな方法で修飾してもよい。
【０１８２】
本発明の方法に従ってスクリーニングされるであろう候補モジュレーターには、受容体、酵素、リガンド、制御因子および構造タンパク質を含む。また、候補モジュレーターには、核タンパク質、細胞質タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、分泌タンパク質、原形質膜会合タンパク質、血清タンパク質、ウイルス抗原、細菌性抗原、原生動物抗原および寄生虫抗原を含む。加えて、候補モジュレーターには、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、リンタンパク質および核酸（たとえば、リボザイム、RNAi薬またはアンチセンス核酸などのRNA）を含む。本発明の方法を使用してスクリーニングすることができるタンパク質またはポリペプチドには、ホルモン、成長因子、神経伝達物質、酵素、凝固因子、アポリポタンパク質、受容体、薬物、発癌遺伝子、腫瘍抗原、腫瘍抑制因子、構造タンパク質、ウイルス抗原、寄生虫抗原、細菌性抗原および抗体（下記を参照されたい）を含む。
【０１８３】
また、本発明に従ってスクリーニングされるであろう候補モジュレーターには、試験細胞もしくは生物体が欠損しているかもしれないか、または臨床的に正常以上の濃度において有効であるかもしれない物質、並びに望まれないタンパク質の翻訳を除去するようにデザインされているものを含む。本発明に従った有用な核酸は、上記の候補モジュレーターをコードしてもよいだけでなく、有害なタンパク質を除去する産物を除去しても、またはコードしてもよい。このような核酸配列は、RNAi薬、アンチセンスRNAおよびリボザイム、並びにこれらをコードするDNA発現構築物である。これらをコードするアンチセンスRNAi薬、RNA分子、リボザイムまたは遺伝子は、後述するように、当該技術分野において公知である核酸送達方法によって試験細胞または生物体に投与してもよいことに留意されたい。不活性化する核酸配列は、リボザイム、RNAi薬または標的mRNAに特異的なアンチセンスRNAをコードしてもよい。ハンマーヘッドクラスのリボザイムは、最も小さいことが知られており、細胞までインビトロでの産生および送達に向いている（Sullivan, (1994) J. Invest. Dermatol, 103: 85S-98S; Usman et al., (1996), Curr. Opin. Struct. Biol, 6: 527-533によって要約されている）。
【０１８４】
XII.医薬組成物
もう一つの側面において、本発明は、前述の節に記載されているような抗悪性腫瘍薬および／または非FA DNA損傷修復経路の阻害剤と組み合わせてFANCIおよび／またはFA経路の阻害剤と後述するような薬学的に許容される担体とを含む方法および医薬組成物に関する。FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤を含む医薬組成物は、癌を含む種々の疾患および障害を治療するために有用であり、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する保護剤としても有用であろう。
【０１８５】
一つの態様において、本発明は、新生物障害を、その必要における被験体における治療する方法であって、以下の有効量の組み合わせを投与することを含む方法を提供する：
a）FANCIの阻害剤またはその薬学的に許容される塩、エステル、誘導体、溶媒和物もしくはプロドラッグ、および、
b）遺伝毒性抗悪性腫瘍薬。
【０１８６】
FANCIの阻害剤の例には、本明細書に開示したsiRNA分子を含む。FA経路の以前に同定された阻害剤には、たとえばH-9、アルステルパウッォン（alsterpaullone）およびクルクミンを含む。しかし、FANCIおよび／またはFA経路のさらなる阻害剤は、たとえば本明細書に記述した方法を使用して同定することができることが当業者には認識されるであろう。この点に関しては、FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤は、小分子および抗体、リボザイムまたはRNAi薬（たとえば、siRNA分子）であることができる。
【０１８７】
本方法は、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、脊髄形成異常、多発性骨髄腫、ホジキン病または非ホジキンリンパ腫、小または非小細胞肺癌腫、胃、腸管または結腸直腸の癌、前立腺癌、卵巣癌または乳癌、頭部、脳または頚部の癌、尿路、腎臓または膀胱癌の癌、悪性黒色腫、肝臓癌、子宮癌または膵臓癌を含む種々の新生物障害の治療に使用することができる。一つの態様において、本方法は、卵巣癌を治療するために使用される。
【０１８８】
FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤の投薬量は、溶解度、生物学的利用能、血漿タンパク結合、腎臓クリアランスおよび阻害定数を含むいくつかの因子に依存する。一定の治療的適用において、FANCIおよび／またはFA経路の少なくとも部分的な阻害を達成するための適切な量は、「有効な用量」として定義される。この投薬量を達成するために必要な量は、疾患の重症度および患者の自身の免疫系の一般的な状態に依存するであろうが、一般に体重のkgあたり0.005〜5.0mgの範囲の阻害剤であり、より一般には、0.05〜2.0mg/kg/用量の用量で使用される。あるいは、被験体におけるFANCIおよび／またはFA経路の活性化は、本明細書に記述した方法を使用してFANCIポリペプチドのユビキチン化を使用して経験的に決定することができるので、投薬量は、機能的な投薬量を使用して投与することができる。加えて、および／またはあるいは、FANC D2の活性化状態、たとえばユビキチン化状態および／または局在化を使用して、FA経路の活性化を評価することができる。従って、FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤の「有効な用量」は、対照試料と比較したときに、約70%以下まで、より典型的には対照試料よりも約50%以下まで、FANCIユビキチン化のレベルを減少させるために必要とされる用量を意味することができる。この点に関しては、対照試料は、理想的には阻害剤の投与の前に同じ被験体から摂取される。
【０１８９】
遺伝毒性抗悪性腫瘍薬の投薬量に相対的なFANCIおよび／またはFA経路の阻害剤の投薬量は、比として発現することができる。FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に相対的に、モルベースで約100：1〜約1：100の間、たとえば1：100、1：50、1：10、1：5、1：2、1：1、2：1、5：1、10：1、20：1、50：1または100：1の比で投与することができる。
【０１９０】
遺伝毒性抗悪性腫瘍薬は、新生物障害を治療するために使用される薬剤であり、1,3-ビス（2-クロロエチル）-1-ニトロソ尿素（BCNU）、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、マイトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド（Temozolomide）およびトポテカンを含む。
【０１９１】
上記の抗悪性腫瘍薬の投薬量は、新生物障害の種々のタイプについて十分に確立されている。しかし、FA経路の阻害剤との同時投与により、抗悪性腫瘍薬に対する新生物障害の感受性を増大することができる。従って、抗悪性腫瘍薬の投薬量は、典型的には所与の新生物障害のために投与されるよりも少なくすることができる。より低い投薬量は、副作用の減少というさらなる利点を有し得る。しかし、典型的には、抗悪性腫瘍薬の投薬量は、所与の新生物障害のための典型的な投薬量の約20%〜100%、より典型的には約35%〜100%間であることが予想される。
【０１９２】
さらにもう一つの態様において、本発明は、新生物障害を、その必要のある被験体において治療する方法であって、被験体に以下の有効量の組み合わせを投与することを含む方法を提供する：
（a）FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤またはその薬学的に許容される塩、エステル、誘導体、溶媒和物もしくはプロドラッグ、および、
（b）DNA損傷修復経路の阻害剤。
【０１９３】
DNA損傷修復経路の阻害剤は、PARP阻害剤、DNA-PK阻害剤、FA阻害剤、mTOR阻害剤、ERCC1阻害剤、ERCC3阻害剤、ERCC6阻害剤、ATM阻害剤、XRCC4阻害剤、Ku80阻害剤、Ku70阻害剤、XPA阻害剤、CHK1阻害剤、CHK2阻害剤またはその薬学的に許容される塩、エステル、誘導体、溶媒和物もしくはプロドラッグからなる群から選択することができる。
【０１９４】
一つの態様において、非FA DNA損傷修復経路は、FA経路以外の経路である。一つの態様において、阻害剤は、非相同末端連結DNA損傷修復経路、ミスマッチ修復経路およびヌクレオチド切除術経路からなる群より選択される経路をターゲットする。もう一つの態様において、阻害剤は、非相同的末端連結DNA損傷修復経路をターゲットする。さらにもう一つの態様において、阻害剤は、直接反転経路（reversal pathway）をターゲットする。もう一つの態様において、阻害剤は、ミスマッチ修復経路をターゲットする。さらにもう一つの態様において、阻害剤は、ヌクレオチド除去修復経路をターゲットする。もう一つの態様において、阻害剤は、塩基除去修復経路をターゲットする。
【０１９５】
FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤について上記したように、DNA損傷修復経路の阻害剤の理想的な投薬量は、疾患の重症度および患者の自身の免疫系の一般的な状態に依存するだろうが、一般に体重のkgあたり0.005〜5.0mgの阻害剤の範囲であり、より一般には0.05〜2.0mg/kg/用量の用量で使用される。あるいは、適切な投薬量は、経験的に決定することができ、DNA損傷修復経路の阻害は、被験体から摂取した生体試料を使用して測定することができる。従って、DNA損傷修復経路の阻害剤の「有効な用量」は、たとえば対照試料と比較したときに、約70%以下まで、より典型的には対照試料よりも約50%以下まで、特異的な経路のレベルを減少させるために必要とされる用量を意味することができる。この点に関しては、対照試料は、理想的には阻害剤の投与の前に同じ被験体から摂取される。
【０１９６】
さらにもう一つの態様において、本発明は、新生物障害を、その必要のある被験体において治療する方法であって、前記被験体に以下の有効量の組み合わせを投与することを含む方法を提供する：
（a）FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤またはその薬学的に許容される塩、エステル、誘導体、溶媒和物もしくはプロドラッグ、
（b）非FA DNA損傷修復経路の阻害剤、および、
（c）遺伝毒性抗悪性腫瘍薬またはその薬学的に許容される塩、エステル、誘導体、溶媒和物もしくはプロドラッグ。
【０１９７】
FANCIおよび／またはFA経路の阻害剤、その投薬量および投与の方法は、以前に記述したとおりである。同様に、非FA DNA損傷修復経路の阻害剤、並びにその投薬量および投与の方法は、前述したものと同じである。しかし、前述したように、FA経路の、並びに非FA DNA損傷修復経路の阻害剤の投与により、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する感受性を高めることができる。従って、抗悪性腫瘍薬の投薬量は、典型的には所与の新生物障害のために投与されるよりも少なくすることができる。より低い投薬量は、副作用の減少というさらなる利点を有し得る。しかし、典型的には、抗悪性腫瘍薬の投薬量は、所与の新生物障害のための典型的な投薬量の約20%〜100%、より典型的には約35%〜100%の間であることが予想される。
【０１９８】
本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、誘導体、溶媒和物もしくはプロドラッグは、治療的または予防的な疾患治療のために、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所的および／または非経口的投与のために製剤化することができる。経口または非経口（parental）投与のためには、本発明の化合物を、従来の薬学的担体および賦形剤と混合することができ、錠剤、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハ等の形態で使用することができる。本発明の化合物を含む組成物は、活性化合物の重量の約0.1%〜約99.9%、約1%〜約98%、約5%〜約95%、約10%〜約80%または約15%〜約60%を含むであろう。
【０１９９】
本発明の化合物は、別々の投与の方法を使用して、別々の時間にて投与することができる。たとえば、一定の状況において、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬またはその他の薬剤の投与の前に、同時に、または後にFA経路の阻害剤を投与することが有利であろう。同様に、それぞれの化合物の投与の方法は、その投与の最適手段に依存するであろう。
【０２００】
本明細書に開示した医薬品製剤は、標準的方法に従って調製されて、癌を減少させ、予防し、もしくは排除するため、または電離放射線などの遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する保護作用を提供するために選択された投薬量にて投与される。（ヒト療法のための種々の抗菌薬を投与するための方法の一般的な記述については、たとえばRemington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA; and Goodman and Gilman, Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, N.Y.（これらの内容は、参照により本明細書に援用される）を参照されたい）。本発明の組成物は、放出制御（たとえば、カプセル）または持続放出送達系（たとえば、生体分解性マトリックス）を使用して送達することができる。本発明の組成物を投与するために適した薬物送達のための遅延性放出送達系の例は、米国特許第4,452,775号、米国特許第5,239,660号および米国特許第3,854,480号に記述されている。
【０２０１】
本発明の薬学的に許容される組成物は、1つまたは複数の非毒性の、薬学的に許容される担体および／または希釈剤および／またはアジュバントおよび／または賦形剤（ひとまとめにして本明細書において、「担体」材料と称され）、並びに必要に応じてその他の活性成分に付随して、1つまたは複数の本発明の化合物を含む。組成物には、コーンスターチまたはゼラチン、乳糖、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、二カルシウムホスフェート、塩化ナトリウムおよびアルギン酸などの、一般的担体および賦形剤を含んでいてもよい。組成物には、クロスアルメロース（crosarmellose）ナトリウム、微結晶性セルロース、ナトリウムデンプングリコラートおよびアルギン酸を含んでいてもよい。
【０２０２】
含めることができる錠剤結合剤は、アカシア、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（Providone）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、デンプンおよびエチルセルロースである。
【０２０３】
使用することができる潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウムまたはその他金属ステアレート、ステアリン酸、シリコン液、タルク、ろう、油およびコロイドシリカを含む。
【０２０４】
また、ペパーミント、ウィンターグリーン油、サクラ香味料またはその他などの香料を使用することができる。また、外見においてより美的な剤形を作製するか、または本発明の化合物を含む産物を同定するのを助けるために、着色剤を添加することも望ましいであろう。
【０２０５】
経口的使用のためには、錠剤およびカプセルなどの固体製剤が特に有用である。持放性または腸溶コーティング製剤を考えてもよい。小児科および老人適用のためには、懸濁液、シロップおよび咀嚼錠が特に適する。経口投与のためには、医薬組成物は、たとえば錠剤、カプセル、懸濁液または液体の形態である。医薬組成物は、活性成分の治療上有効量を含む用量単位の形態で、好ましくは作製される。このような用量単位の例は、錠剤およびカプセルである。治療目的では、錠剤およびカプセルは、活性成分に加えて、以下などの従来の担体を含むことができる：結合剤、たとえばアカシアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ソルビトールまたはトラガカンタ：充填剤、たとえばリン酸カルシウム、グリシン、乳糖、トウモロコシデンプン、ソルビトールまたはスクロース；潤滑剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、シリカまたはタルク：崩壊剤、たとえばジャガイモデンプン、香味料もしくは着色剤または許容される湿潤剤。経口液状製剤は、一般に水溶液または油性溶液、懸濁液、乳剤、シロップまたはエリキシルの形態であり、懸濁剤、乳化剤、非水溶薬剤、防腐剤、着色剤および香料などの従来の添加物を含んでいてもよい。液状製剤のための添加物の例には、アカシア、扁桃油、エチルアルコール、椰子油、ゼラチン、グルコースシロップ、グリセリン、水素付加された食用脂、レシチン、メチルセルロース、メチルまたはp‐ヒドロキシ安息香酸プロピル、プロピレングリコール、ソルビトールまたはソルビン酸を含む。
【０２０６】
静脈内（iv）使用のために、本発明の化合物を任意の一般に使用される静脈内補液に溶解すること、または懸濁することができ、輸液により投与されることができる。静脈内補液には、生理食塩水またはリンゲル液を含むが、限定されない。
【０２０７】
非経口（parental）投与のための製剤は、水性もしくは非水系の等張性の無菌の注射溶液または懸濁液の形態であることができる。これらの溶液または懸濁液は、経口投与のための製剤に使用するために言及した担体の1つまたは複数を有する無菌の粉末または顆粒から調製することができる。化合物は、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウムおよび／または種々の緩衝液に溶解することができる。
【０２０８】
筋肉内製剤のためには、本発明の化合物または化合物を形成する適切な可溶性塩の無菌の製剤を、注射用の水（WFI）、生理食塩水または5%のグルコースなどの医薬品希釈剤に溶解して、投与することができる。適切な化合物の不溶性形態は、水性基剤または薬学的に許容される油基剤、たとえばオレイン酸エチルなどの長鎖脂肪酸のエステル中に懸濁液として調製して、投与してもよい。
【０２０９】
局所的使用のためには、本発明の化合物は、また皮膚、または鼻部および咽喉の粘液膜に適用するために適した形態に調製することができ、クリーム、軟膏、液体スプレーもしくは吸入薬、ロゼンジまたは咽喉ペイントを採用することができる。さらなるこのような局所製剤には、活性成分の表面透過を促進するために、ジメチルスルホキシド（DMSO）などの化学物質を含むことができる。
【０２１０】
眼または耳に対する適用のためには、本発明の化合物は、軟膏、クリーム、ローション、ペイントまたは粉末として、疎水性または親水性の基剤中に製剤化された液体または準液体の形態で存在することができる。
【０２１１】
直腸投与のためには、本発明の化合物は、カカオ脂、ろうまたはその他のグリセリドなどの従来の担体と混合された坐薬の形態で投与することができる。
【０２１２】
あるいは、本発明の化合物は、送達時に適切な薬学的に許容される担体中に再構成するための粉末形態であることができる。もう一つの態様において、化合物の単位剤形は、無菌の密封したアンプル中の適切な希釈剤中の化合物またはその塩の溶液であることができる。
【０２１３】
単位投薬量における本発明の化合物の量には、少なくとも1つの本発明の活性化合物の治療上有効な量を含み、これは、レシピエント被験体、投与の経路および頻度に応じて変更してもよい。被験体は、羊またはヒトを含む哺乳類などの動物をいう。
【０２１４】
本発明の本態様に従って、本明細書に開示した新規組成物は、薬学的に許容される担体中に置かれ、公知の薬物送達の方法に従って、レシピエント被験体（ヒト被験者を含む）に送達される。一般に、インビボで本発明の組成物を送達するための本発明の方法は、実質的手順のみを修飾して、当該技術分野において認識されたプロトコルの薬物のための本発明の化合物に置き換えて、薬剤を送達するための当該技術分野において認識されたプロトコルを利用する。
【０２１５】
本発明の化合物は、前癌性もしくは癌性の状態を治療するための、または遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する保護剤としての使用のための方法を提供する。本明細書に使用される「単位投薬量」という用語は、望まれる治療反応を誘発する本発明の化合物の治療上有効量の量をいう。「治療すること」という用語は、前癌もしくは癌状態の、または発生を防止するため、または前癌もしくは癌状態を制御し、もしくは除去するための両方のために、本発明の少なくとも1つ化合物の治療上有効な量を被験体に投与することとして定義される。「所望の治療反応」という用語は、レシピエント被験体において前癌または癌状態が逆転し、抑えられ、または防止されるように、本発明の化合物でレシピエント被験体を治療することをいう。
【０２１６】
本発明の化合物は、単一の1日量として、または1日につき多回投与で投与することができる。治療法は、長期間にわたって、たとえば、数日間または2〜4週の間の投与が必要であってもよい。投与される用量あたりの量または投与される総量は、疾患状態の性質および重症度、レシピエント被験体の年齢および一般的健康、化合物を受けるレシピエントの寛容性および癌のタイプ、治療薬に対する癌の感受性、その他の治療薬と組み合わせて使用される場合の使用される治療薬の用量およびタイプなどの因子に依存するであろう。
【０２１７】
また、本発明に従った化合物は、患者または動物の食餌または飼料中に投与してもよい。動物のための食餌は、化合物を添加することができ、またはそれをプレミックスに添加することができる通常の食料であることができる。
【０２１８】
本発明の化合物は、このような治療を必要とするレシピエント被験体を治療するために、任意の公知の臨床的に承認された薬剤と組み合わせて、共に、または別々に摂取してもよい。
【０２１９】
他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての専門的および科学的な用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記述したものに類似し、または同じ方法、並びに材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料は、下記の記述してある。本明細書において言及した全ての刊行物、特許出願、特許およびその他の参照文献は、これらの全体が参照により援用される。矛盾する場合には、定義を含めた本明細書が優先するであろう。加えて、材料、方法および実施例は、例証するだけであり、限定することは意図されない。
【実施例】
【０２２０】
実施例1：方法
株化細胞
補完した（complemented）株化細胞PD20およびGM6914は、以前に記述してあり（Taniguchi et al.（2002）Cell 109：459-472）、DR-U2OSは、Maria Jasinによって提供された（Xia et al.（2006）Mol Cell 22：719-729）。GM02188は、Coriellから、BD0952は、ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャー（http：//www.ecacc.org.uk）から、およびU20S は、アメリカン・セル・カルチャー・コレクション（ATCC）から得た。接着株化細胞は、1mlにつき100単位のペニシリン、1mlにつき0.1mgのストレプトマイシン、L-グルタミン（2 mM）、非必須アミノ酸（0.1 mM）および株化細胞に応じて10%または15%（v/v）のFBS（Invitrogen）を補ったダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において培養し、リンパ芽球株は、同じ補充でRPMIにおいて培養した。リンパ球のレトロウイルス形質導入は、1×106を、上清1mlにつき8μgのポリブレンを補った新たに収集したウイルスと共に、室温で45分間、2500rpmにて回転させることによって行った。
【０２２１】
抗体
抗体は、以下の通りであった：KIAA1794；BL999およびBL1000（Bethyl）、ウサギFANCD2（Novus）マウスFANCD2（Santa Cruz）、FANCA（Rockland）、ORC2（BD Bioscience）、ビンキュリン（Vinculin）（Sigma）、HA（Covance）、MYC（Covance）、SMC3pS1083（Bethyl）、PhosphoH3（Upstate）、Ran（BD Bioscience）、γH2AX（Upstate）。免疫沈降のためには、抗HAアフィニティーマトリックス（Roche）、抗FLAG M2アガロース（Sigma）、c-MYC（Santa Cruz）およびプロテインA/G PLUS-アガロース（Santa Cruz）を使用した。IFのための二次抗体は、Molecular ProbesおよびAmershamから、およびウエスタンブロットのための二次抗体は、Jackson Laboratoriesより得た。
【０２２２】
FANCIクローニング
ヒトcDNAライブラリーに対して、Platinum
Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen）を使用してPCRを行った（Elledge et al.（1991）Proc Natl Acad Sci US A 88：17311735）。BD0952細胞からの総RNAは、Trizol（Invitrogen）を使用して単離した。RNAは、Superscript III（Invitrogen）およびdTプライマーを用いて逆転写した。PCR工程は、Platinum Pfx DNA Polymerase（Invitrogen）を使用して行った。ゲノムDNAは、DNeasy Tissue kit（Qiagen）を使用して調製した。KIAAl794のcDNAクローニングに使用したプライマーは、5'-CCGCTCGAGGACCAGAAGATTTTATCTCTAGCAG-3'（配列番号：1）および5'-CCGGTTAACTTAACTCAGGCATTTCATTTATTTT-3'（配列番号：2）であった。BD0952（FANCI）細胞からcDNAをクローン化するために、また同じプライマーを使用した。ゲノムのPCRプライマーは、以下の通り：第1のコードエキソン：5'-TTCAGGATTATTTTGGTTAGGTTA-3'（配列番号：3）および5'-GGTCACAAATGCCCTCAAG-3'（配列番号：4）、第3のコードエキソン：5'-TCAAAGCCCTTAACCATTGC-3'（配列番号：5）および5'-TGCCATCTTACCTCCAGCAT-3'（配列番号：6）、第36のコードエキソン：5'-TCTTGATCTGATGACCTGAACC-3'（配列番号：7）および5'-GTCGGGGCAACTTCATAGGAT-3'（配列番号：8）。
【０２２３】
突然変異誘発
FANCIの突然変異を作製するために、QuikChange（登録商標）II XL Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）またはQuikChange（登録商標）Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を使用した。K523R突然変異は、突然変異プライマー、5'-GCTTGATACTTGTCCTTCGGCGAGCTATGTTTGCCAACCAGC-3'（配列番号：9）および5'-GCTGGTTGGCAAACATAGCTCGCCGAAGGACAAGTATCAAGC-3'（配列番号：10）によって、QuikChange商標 II XL Site-Directed Mutagenesis Kitを使用して産生した。QuikChange（登録商標）Multi Site-Directed Mutagenesis Kitは、FANCIにおけるP55L突然変異（プライマー5'-CTTCAAAGGTTCCCTCTGCTCTGAGGAAGCTGG-3'（配列番号：11））およびR1285Q突然変異（5'-GCTCAGCACCTCACAAGACTTCAAGATCAAAGG-3'（配列番号：12））を作製するために使用した。
【０２２４】
siRNAs
ステルス（Stealth）siRNAs（Invitrogen）を、85 nMの総siRNAsの終濃度にて、オリゴフェクトアミン（Oligofectamine）（Invitrogen）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの48〜72時間後にアッセイを行った。別に示さない限り、同じ遺伝子に対する3つのsiRNAsの組み合わせを使用した。標的配列は以下の通りであった。siRNAsは、特に明記しない限りInvitrogenから購入した（図1Dおよび5Iに示した実験で使用したsiRNAsは、Qiagenから購入した）：
lacZ（Qiagen）5'-AACGTACGCGGAATACTTCGA-3'（配列番号：13）、
FANCI（Qiagen）5'-CTGGCTAATCACCAAGCTTAA-3'（配列番号：14）、
USP1（Qiagen）5'-TCGGCAATACTTGCTATCTTA-3'（配列番号：15）
ATM：5'-GCGCAGTGTAGCTACTTCTTCTATT-3'（配列番号：16）、
5'-GGGCCTTTGTTCTTCGAGACGTTAT-3'（配列番号：17）、
5'-GCAACATTTGCCTATATCAGCAATT-3'（配列番号：18）、
ATR：5'-GGGAAATAGTAGAACCTCATCTAAA-3'（配列番号：19）、
5'-GGTCTGGAGTAAAGAAGCCAATTTA-3'（配列番号：20）、
5'-CCACCTGAGGGTAAGAACATGTTAA-3'（配列番号：21）、
FANCI #1：5'-TCTCCTCAGTTTGTGCAGATGTTAT-3'（配列番号：22）、
FANCI #2：5'-GGCAGCTGTGTGGACACCTTGTTAA-3'（配列番号：23）、
FANCI #3：5'-GCTGGTGAAGCTGTCTGGTTCTCAT-3'（配列番号：24）、
FANCD2 #2：5'-TTAGTTGACTGACAATGAGTCGAGG-3'（配列番号：25）、
FANCD2 #3：5'-AATAGACGACAACTTATCCATCACC-3'（配列番号：26）、
BRCA1：5'-AAATGTCACTCTGAGAGGATAGCCC-3'（配列番号：27）、
5'-TTCTAACACAGCTTCTAGTTCAGCC-3'（配列番号：28）、
5'-TAGAGTGCTACACTGTCCAACACCC-3'（配列番号：29）、
FANCA：5'-GGAAGATATCCTGGCTGGCACTCTT-3'（配列番号：30）、
5'-CCAGCATATTCAGGAGGCCTTACTA-3'（配列番号：31）、
5'-TCCCTCCTCACAGACTACATCTC-3'（配列番号：32）。
【０２２５】
これらの実験において、細胞は、製造業者の説明書に従って、Hyperfectを使用して2OnMの濃度にてトランスフェクトした。
【０２２６】
免疫蛍光
オートクレーブしたカバーガラスの上で培養した細胞を処理して、リン酸緩衝食塩水（PBS）でリンスし、室温で10分間、PBSで希釈した3.7%（w/v）のホルムアルデヒド（Sigma）中で固定した。細胞をPBSで一度洗浄し、PB中の0.5%（v/v）NP40において10分間透過化処理し、PBSで再び洗浄し、PBG（PBSにおける0.2%[w/v］の冷却した魚ゼラチン、0.5%[w/v］のBSA）で20分間ブロッキングした。カバーガラスは、室温にて、または4℃にて、加湿されたチャンバーにおいて一次抗体とともに2時間一晩インキュベートし、PBGで5分間を3回洗浄した後、次いで適切な二次抗体とともにインキュベートした。さらにPBGで3回洗浄した後、DAPIを補ったVectashield（Vector Laboratories）にカバーガラスを包埋した。Tritonプレ抽出は、PBS中の0.5% Tritonで、室温にて5分間細胞をインキュベートすることによって行った。PBSによる穏やかなリンスの後、上記の様に、細胞を固定して処理した。イメージは、Axovision 4.5ソフトウェアによりサポートされたAxioCam Mrm Zeissデジタルカメラを備えたAxioplan2 Zeiss顕微鏡で取り込んだ。リンパ芽球性株化細胞におけるIFについては、製造業者によって示唆されたように、無菌のPoly-D-リジン臭化水素酸塩（分子量>300,000（Sigma））でカバーガラスを処理した。細胞を付着した後（数時間）、上記のようにカバーガラスを処理した。いずれの共染色実験にも、異なるチャンネル間のシグナルの交差（crossing）を排除するために、適当な対照を含んだ。
【０２２７】
クロマチン分画および免疫沈降
クロマチン分画は、記述したように行った（Mendez and Stillman（2000）Mol Cell Biol 20：8602-8612；Zou et al.（2002）Genes Dev 16：198-208））。免疫沈降については、細胞は、0.5% NP-40、プロテアーゼ阻害剤（Roche）、1mM PMSF、5mM NaFおよび5mM Na3VO4および1mlの溶解緩衝液につき5OUのBenzonase（Novagen）を補ったTBS（20mM Tris +150 mM NaCl）に溶解した。図11Cに示した実験は、Benzonaseを添加することなく行った。1mgのタンパク質抽出物を、2μgの示した抗体および5μlのプロテインA/G PLUS-アガロース（Santa Cruz）と共にインキュベートした。溶解緩衝液での3回の洗浄に続いて、トリス-グリシンSDS試料緩衝液中に免疫沈降物を溶出し、トリス-グリシンゲル（Invitrogen）でサイズ分画した。変性条件下でのストレプトアビジン免疫沈降は、His-精製工程を省略したことを除いて、記述したとおりに行った（Tagwerker et al., 2006）。ストレプトアビジンセファロース（GE Healthcare）は、8M 尿素、200mM NaCl、100mM Tris pH 8、0.5% SDS、0.5% NP40からなる溶解・洗浄液緩衝液とともに使用した。
【０２２８】
多色競合アッセイ
U2OS細胞をMSCVgfpまたはMSCVdsRedで感染し、これを、TransIT-293（Mirus）を使用して、VSVGベクターとの同時トランスフェクションによって293Tにパックされた。選択することなく、中間体発現についてAria Sorter（BD）を使用して細胞をソートした。gfp細胞は、rfp細胞よりわずかに速く増殖し、DNA損傷薬での処理による生存変化を算出するときに、これを考慮した。siRNAトランスフェクションは、対照siRNA（ルシフェラーゼ）でトランスフェクトされているgfp細胞および関心対象のsiRNAでトランスフェクトされたrfp細胞と共に、上記の通りに行った。トランスフェクション後3日目に、gfpおよびrfp細胞を計数し、1：1の比率で混合し、未処理のまま、またはIRもしくはMMCで処理した。非トランスフェクト細胞の約50%の生存を生じるようにMitomycin C（Sigma）の濃度を選択し、これは、U2OS細胞については約70nM MMCであった。7日の培養の後、全ての細胞を収集して、Cytomix FC500 Analyzer（Beckman Coulter）を使用して解析した。損傷後のLuc siRNA処理した細胞の相対生存率を100%とした。
【０２２９】
G2/Mチェックポイントアッセイ法
U2OS細胞は、96ウェル形式において3日間、個々のsiRNAsでトランスフェクトした。細胞を5 Gyで放射線照射し、1時間回復させた後、G2/Mチェックポイントを迂回する細胞をトラップするために培地1 mlにつき100ngノコダゾールを添加した。放射線照射の9時間後に細胞を固定して、Phospho-H3に対する抗体で染色した。プレートは、自動化されたImageXpress Micro（Molecular Dynamics）で10倍にて画像化し、有糸分裂指数をMetaExpress Softwareパッケージを使用して算出した。ウェルあたり平均1000個の細胞を計数した。対照レベル以上を記録したウェルは、ソフトウェアによる正確なスコアリングを検証するために、視覚的に検査した。
【０２３０】
放射線抵抗性のDNA合成アッセイ
S期内チェックポイントを評価するRDSアッセイ法は、以前に記述されたように行った（Silverman et al.（2004）Genes Dev 18：2108-2119）。簡潔には、U2OS細胞は、oligofectamine（Invitrogen）を使用して、対照siRNAまたはKIAA1794に対するsiRNAs（3つのsiRNAs組み合わせ、それぞれおよそ30nM）をトランスフェクトした。24時間後に、10 nCi/mLの[メチル-14C］チミジン（Amersham、CFA532）を含む培地を添加し、細胞を24時間インキュベートした。次いで、標識のない培地を24時間添加した。次いで、細胞には、5-15 Gyでの照射を受けさせた（セシウム137供与源）。37度で30分のインキュベーションに続いて、細胞を20分間、2.5μCi/mL[メチル-3H］チミジン（Amersham、TRK758）で標識して、次いで2.5mMの放射標識のないチミジン（血清なし）を含む培地で2回洗浄した。トリプシン処理によって細胞を収集し、真空マニホールドを使用してWhatman glass microfibre filters（GF/C、25mM、Fisher）でTCA沈澱を行った。エタノール洗浄に続いて、フィルタを乾燥し、液体シンチレーションカウンタ（Beckman LS6000）を使用して計数した。分毎の14Cカウントに対する分毎の3Hカウントの比は、チャンネル交差の結果である分毎のカウントについて修正し、DNA合成の測定とした。
【０２３１】
相同的組換えアッセイ
HRアッセイ法は、記述されたように行ったが（Nakanishi et al.（2005）Proc Natl Acad Sci USA 102：1110-1115；Xia et al.（2006）Mol Cell 22：719-729）、I-SceI発現プラスミドをトランスフェクトした細胞の代わりに、I-SceI酵素を発現するアデノウイルスAdNGUS24i（McMaster大学のFrank Grahamによって提供された）を使用した。対照のアデノウイルスAdCA36（Addison et al.（1997）J Gen Virol 78：1653-1661）は、β-ガラクトシダーゼを発現した。このレベルのウイルスは、100%の感染を生じたが、細胞に対して目で見える有害作用を有さなかったことから、細胞につき5または10 pfuのアデノウイルスを使用した。イベントは、任意の二重項を除外するようにゲートした。ゲートした解析およびゲートしていない解析の両方とも、同様の結果を与えた。
【０２３２】
細胞周期同調
U2OS細胞を24時間2.5mMチミジン（thymidine）で処理し、3回洗浄し、1mlにつき100ngノコダゾールを含む培地へ放出し、12時間インキュベートし、有糸分裂シェイクオフs（mitotic shakeoff）によって収集した。細胞を3回洗浄し、計数して、異なる時間にて収集するためにプレートにまいた。細胞周期解析については、収集された細胞を100μl（PBS）に再懸濁した。ボルテックスしながら、2mlの氷冷70%（v/v）のエタノールを液滴で添加し、懸濁液を少なくとも一晩40℃にて貯蔵した。FACSの30分前に、細胞を遠心沈殿し、プロピジウムヨウ素（PI）の混合物（500μl PBS、10μl RNase[10mg/mlの保存液］、25μl PI[1mg/mlの保存液］）に再懸濁して、LSR2（Becton Dickinson）を使用して解析した。細胞周期解析は、FlowJoを使用して行われた。
【０２３３】
マイトマイシンC感受性アッセイ
対数増殖している細胞を計数し、1 mlにつき2×105細胞に希釈し、それぞれの薬物用量について三連でプレートにまき、新たに作製したマイトマイシンCの異なる濃度で処理した。培養の6日後に、細胞を収集し、Z2 Coulter Counter（Beckman Coulter）を使用して計数した。薬物で処理した試料における細胞数は、未処理の試料における細胞数に規準化した。
【０２３４】
バイオインフォマティクス
BLASTを、相同性検索のために使用した（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/；Altschul et al.（1997）Nucleic Acids Res 25：3389-3402）。SCOPデータベースは、http：//scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/にて見つけることができる（Murzin et al.（1995）J
Mol Biol 247：536-540）。整列は、ClustalXにおいて行い、ESPript 2.2を使用して与えた（http：//espript.ibcp.fr；Gouet et al.（1999）Bioinformatics 15：305-308）。FANCIについてのGenBankアクセッション番号は、EF469766である。
【０２３５】
FANCIタンパク質に対する抗体
ヒトFANCIタンパク質に対するウサギポリクローナル抗血清は、BethylおよびAbcamから購入可能である。
【０２３６】
加えて、ウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗体は、（1）それぞれポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗体の産出のために、昆虫（SF9）細胞において合成してウサギおよびマウスに注射した全長ヒトFANCIタンパク質を使用して、および（2）抗原としての使用のために産出した、GSTに融合したFANCIのN末端の200アミノ酸を含むGST-FANCI融合タンパク質を使用して、FANCIに対して産出される。
【０２３７】
実施例2：KIAA1794/FANCIは、リン酸化タンパク質として同定された
KIAA1794/FANCIは、IR処理に応じてリン酸化が誘導されるタンパク質として同定された（Matsuoka et al., submitted）。その研究では、DNA損傷の前後において、リン酸化抗体とその後の質量分析を使用したSILAC（Mann（2006）Nat Rev Mol Cell Biol 7：952-958）に概説されている）およびペプチド免疫沈降（Rush et al.（2005）Nat
Biotechnol 23：94-101）を、SQまたはTQのモチーフで誘導的にリン酸化されるこれらのタンパク質を同定するために使用した。ヒトKIAA1794タンパク質の3つのリン酸化部位：S730、T952、S1121およびマウスタンパク質の2つのその他の部位S555、T558が検出された。KIAA1794タンパク質は、以下に示すように、このタンパク質をコードする座位が、ファンコニー貧血相補群Iを有する個人において変異型として同定されたので、FANCIと改名した。ホスホ-SQ抗体をでのIR後のFANCIのイムノブロッティングにより、その誘導性のリン酸化が確認され（図1Aを参照、FANCI抗体（BL999）で行ったDNA損傷の前後での293T抽出物からの免疫沈降物に対する、SMC3のリン酸化型（SMC3 pS1083）に対して作られた抗体によるウエスタン解析を示している）、したがって、ATM/ATR経路にそれを位置づけた。
【０２３８】
実施例3：DNA損傷感受性を研究するために使用した多色競合アッセイ（MCA）
種々の遺伝的混乱がある細胞のDNA損傷感受性を効率的に研究するために、単純な競合アッセイが開発され、定量的かつ迅速であることが証明された（図1Bを参照、これは、多色競合アッセイ法（MCA）を概略的に図示し−ここでは、関心対象のタンパク質のノックダウンにより、gfp細胞が、損傷の非存在下でのこれらの増殖能力に影響せずに、DNA損傷感受性となった。si処理した細胞の損傷に対する相対抵抗性は、非si処理細胞の40%であった）。その色だけが異なっているU20S（骨肉腫）細胞の2つの集団は、赤色蛍光タンパク質（RFP）または緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現によって作製された。関心対象のタンパク質のsiRNA枯渇は、緑色細胞で実施され、一方で、赤色細胞は、対照siRNAをトランスフェクトした。同等数の緑色および赤色細胞を混合し、未処理のまま、またはガンマ照射またはマイトマイシンC（MMC）で処理した。7日後に細胞を収集し、緑色細胞に対する赤色細胞の比率を、フローサイトメトリーを使用して決定した。未処理の細胞における赤色細胞に対する緑色細胞の比率は、相対的細胞増殖のための対照として作用した。アッセイは、siRNAsターゲットするATM（IR-感受性）およびATR（MMC-およびIR-感受性）を使用して確認した；図1Cおよび8を参照。図1Cは、ATMおよびATRに対するsiRNAsおよびFANCIに対する3つの異なるsiRNAsで処理したU2OS細胞におけるMCA解析の結果を表し、一方、図8は、ATMまたはATRを枯渇した細胞により行われる多色競合アッセイからの生データを示している）。
【０２３９】
一連のATMおよびATR基質を研究するためにMCAを適用した（Matsuoka et al., 投稿済）。試験されたタンパク質の一つ、FANCI（FLJ10719として知られるKIAA1794）に対する3つのsiRNAsの組み合わせで処理した細胞では、対照siRNAをトランスフェクトした細胞（データ示さず）と比較して、70nM MMCの処理の後60%の生存を、および3Gy IR処理の後91%の生存を示した。オフターゲット効果を排除するために、3つのsiRNAsを独立して試験した。3つのsiRNAsのうちの2つは、MMC-感受性の表現型を再現し、IR感受性に対するわずかな効果を有した（図1Cを参照）。FANCI siRNAでトランスフェクトし、MMCで処理した初代線維芽細胞の中期伝播により、ファンコニー貧血の特徴である、染色分体および染色体切断を含む頻繁な細胞遺伝学的な異常、並びに放射線形態（radical forms）が明らかになったため、この生存の減少は、DNA修復欠陥のためであった（図1D参照、これは、KIAAl 794またはLacZ対照に対するsiRNAをトランスフェクトし、1 mlにつき0、5または7.5ng MMCで処理したIMR90細胞における細胞遺伝学的な異常を示す；図1Dにおけるアステリスクは、t検定によって算出された平均における統計学的有意差を示す；1mlにつき7.5ng MMCによる実験を一度行った）。
【０２４０】
実施例4：FANCIは、FANCD2に相同であると同定された
FANCIでのBLAST解析により、ヒトからタマホコリカビ（Dictyostelium）の真核生物の中での高度な保存（酵母では保存されない）およびFANCD2に類似した予測された部分的エゾバフンウニ（S.purpuratus）配列までの限定的な保存が明らかになった（図2Aを参照、これは、FANCD2のエゾバフンウニ（S.p.）相同分子種の一部とヒトKIAA1794との保存を同定するBLAST整列を示している。図2Aにおける星は、FANCD2におけるK561に対応するリジンを示す）。相同性領域は、151アミノ酸にわたって及び、19%の同一性、45%の類似性をもつ。FANCIのコード領域は、ヒトリンパ球cDNAライブラリーから増幅され（Elledge et al.（1991）Proc Natl Acad Sci USA 88：17311735）、150kDaの算出分子量の1328アミノ酸のタンパク質をコードする3984ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを回収した。このcDNAは、染色体15q25-q26上のKIAA1794（Q9NVI1）座位の、推定スプライスバリアントアイソフォーム3に対応した。
【０２４１】
FANCIおよびFANCD2の整列により、全長タンパク質にわたって13%の同一性および20%の類似性が明らかになった（図2Bおよび10を参照。図2Bは、保存されたリジンK523を同定したFANCIおよびFANCD2の整列を示し、一方、図10は、ヒト（Homo sapiens）（H.s.）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）（D.r.）、ニワトリ（Gallus gallus）（G.g.）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（A.th.）、ユウレイボヤ（Ciona intestinalis）（C.i.）、Anopheles gambiae（A.g.）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）（D.m.）、線虫（Caenorhabditis elegans）（C.e.）、テトラオドン・ニグロビリディス（Tetraodon nigroviridis）（T.n.）、イネ（Oryza sativa）（O.z.）およびネッタイシマカ（Aedes aegypti）（A.d.）由来のFANCD2およびFANCIの整列を示す）。（ヒト（Homo sapiens）（H.s.）、アフリカツメガエル（Xenopus tropicalis）（X.t.）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）（D.r.）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）（D.m.）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（A.th.）、および細胞性粘菌（Dictyostelium discoideum）（D.d.）由来のFANCI配列の整列は、一致したものを強調してあり、また図9にも示したことに留意されたい）。シロイヌナズナ（A.thaliana）およびキイロショウジョウバエ（D。melanogaster）を含むその他の種において、FANCD2およびFANCI パラログとの間に、比較可能なレベルの類似性が見いだされた。種を超えたFANCIとFANCD2との間の最も顕著な保存は、FANCD2においてモノユビキチン化されること、およびFA経路の機能性に必須であることが以前に示された部位、すなわちFANCIにおけるK523およびFANCD2におけるK561を囲んだ（図2Bおよび2Cを参照；Garcia-Higuera et al.（2001）Mol Cell 7：249-262；図2Cは、FANCIおよびFANCD2の異種間整列の概略図を示す。図2C内の強調は、α-α高次らせん折りたたみ（FANCIの985-1207アミノ酸およびFANCD2の267-1163アミノ酸）およびその内部で疎水性リガンドと結合すると予測されるリポカリン（lipocalin）フォールド（612-650アミノ酸）を示すARMリピートとしてSCOPデータベース（Murzin et al.（1995）J Mol Biol 247：536-540）によって予測される2つの領域である。また、FANCIにおいて同定された推定の二連NLS（779-795アミノ酸）を示してある。明るい星は、ヒトまたはマウスタンパク質において同定されたリン酸化部位を示す（Matsuoka et al., submitted）。暗い星は、FAND2におけるATR部位を示す。また、EDGE配列は、そのタンパク質間で保存されることが同定された。矢じりは、ファンコニー貧血相補群Iの株化細胞における病原性突然変異を示す（図6を参照）。
【０２４２】
実施例5：細胞周期チェックポイントおよびDNA修復経路におけるFANCIの役割
ATM/ATR経路は、複数の細胞反応を制御する。FANCIが細胞周期の制御、DNA合成の制御またはDNA損傷に続いて起こる相同的組換えに関与するかどうかを調べた。FANCIに対するsiRNAは、U2OS細胞におけるG2/Mチェックポイントを抑止して（図3Aを参照）、更にS期内チェックポイントにおいて、小さいが再現性のある効果を有した（図3Bを参照）。（図3Aは、FANCIを枯渇した細胞がチェックポイント欠陥を有することを示す。図3Aでに示した実験については、U2OS細胞を概略に示したように処理した。2つの別の細胞の範囲を調べた。2つの範囲からの平均値および標準偏差を示してあり、siRNAにつき平均1000個の細胞を記録した。図3Bは、放射線抵抗性のDNA合成におけるFANCI枯渇の効果を示す。図3Aに示した実験については、3つの異なるsiRNAsの示した組み合わせをトランスフェクトしたU2OS細胞を、実験に応じてγ-IRの5Gyまたは10Gyで照射し、30分間回復させ、そしてDNA合成について三回アッセイした。4回の別の実験の平均値および標準偏差を示してある。比較のために、ATM siRNA-トランスフェクト細胞のIR処理により、未処理の細胞において見られるレベルの70-80%のDNA合成が生じた）。興味深いことに、非照射細胞では、FANCI枯渇により、ゲノムの安定性の維持における役割を示す、γ-H2AXによって判断される損傷の基礎レベルの増加が生じた（図3Cを参照、これは、FANCIの減少により自発滴DNA損傷が生じたことを示す。図3Cにおいて、3つの異なるsiRNAsの示した組み合わせをトランスフェクトしたU2OS細胞を3日後に収集し、γ-H2AXのレベルを、なんら外来性損傷を伴わずにアッセイした。Ran抗体によるウエスタン解析をローディング対照として作用した）。
【０２４３】
FA経路は、以前に相同的組換えに関連づけられた（HR；Nakanishi et al.（2005）Proc Natl Acad sci USA 102：1110- 1115；Niedzwiedz et al.（2004）Mol Cell 15：607-620；Yamamoto et al.（2005）Mol Cell Biol 25：34-43）。FANCIを、HR修復における役割について調べた。このアッセイ（Xia et al.（2006）Mol Cell 22：719-729）に使用したDR-U2OS細胞は、組み込まれたHRリポータを有する。12%のGFP陽性細胞の出現によって証明されるように、二本鎖切断の誘導により強い修復が生じた（図3Dを参照、これは、I-Scel（I-Scel-Ad）を有するAdNgus24iアデノウイルスまたはβ-ガラクトシダーゼ（β-gal-Ad）を有するAdCA36を感染させていない、または感染させたDR U2OS細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図3Dの実験については、感染をM.O.I=5にて実施し、gfp陽性細胞の解析は、感染後の36時間にて行った）。FANCIに対する全ての4つのsiRNAsは、対照の78%から47%にまで組換えを減少させ、これは、ATR、FANCAおよびFANCD2に対するsiRNAsも同様であったが（Nakanishi et al.（2005）Proc Natl Acad Sci USA \02：1110-1115）、BRCA1およびBRCA2に対するsiRNAsよりも少なく、これは、組換えプロセスにより直接に関与したことが考えられる（図3Eおよび3Fを参照、これは、FANCIが相同的組換えのために必要であったことを示している。図3Eに示した実験結果については、DR U2OS細胞には、3つの異なるsiRNAsの示した組み合わせをトランスフェクトし、3日後に、10pfu/細胞のI-Scelを有するアデノウイルスを感染させた。gfp陽性細胞のフローサイトメトリー解析は、感染後の36時間に実施した。8回の実験（ATM）、7回の実験（ATR）、4回の実験（Brca2）および3回の実験（FANCI）の平均値および標準偏差を図3Eに示してある。図3Fに示した実験結果については、DR U2OS細胞には、示した個々のsiRNAsをトランスフェクトし、5pfu/細胞のI-SceIを有するアデノウイルス（AdNgus24i）で感染させて、24時間後に解析した）。これらの結果は、FANCIがHR修復経路の重要な成分であることを証明した。
【０２４４】
実施例6：FANCIは、多くの細胞のタイプにおいて、損傷により誘導されたフォーカスに局在する
FANCIの局在を評価するために、形質転換（U2OS、HeLaおよび293T）および初代（BJ）株化細胞に対して免疫蛍光実験を行った。2つの抗体、BL999およびBL1000を使用した解析により、未処理の一部の細胞およびDNA損傷後のほとんど全ての細胞におけるフォーカスが明らかになった。いくつかの実験において、核端染色をまた検出した。それらはFANCD2染色と共存したので、これらのFANCIのフォーカスは、損傷により誘導されたフォーカスに対応した（図4Aを参照、これは、BL999およびBL1000抗体を使用した内因性FANCIの局在化を示しいる；Garcia-Higuera et al.（2001）Mol Cell 7：249-262；図4Aに示した結果については、1μMマイトマイシンCで24時間処理したU2OS細胞を、抗FANCI（BL999またはBL1000）および抗FANCD2抗体で共染色する前にTritonで抽出した）。抗体の特異性の確認は、トランスフェクトしたMyc-FANCIおよび抗Myc抗体を使用して達成した（図11Aを参照、これは、外来性のmycタグの付いたFANCIの局在を示している。図11Aに示した結果については、U2OS細胞に、Myc-タグの付いたFANCI を有するレトロウイルスを導入して、1μMマイトマイシンCで処理した。24時間後に、細胞を、Tritonプレ抽出無しで、9E10抗体（myc）およびヒトFANCD2に対するウサギ抗体で共染色した）。siRNA処理した細胞は、Tritonプレ抽出の後に、BL999およびBL1000抗体で染色される損傷誘導されたフォーカスの減少を示した（データ示さず）。
【０２４５】
実施例7：FANCIおよびFANCD2は、FANCD2が損傷誘導性のフォーカスに局在するために必要な複合体を形成すると同定された
3つの別々のsiRNAsを使用したU2OSにおけるFANCIの枯渇により、損傷におけるFANCD2のユビキチン化の減弱を生じ（図4Cを参照、これは、FANCIに対する個々のsiRNAsをトランスフェクトしたU2OS細胞におけるFANCD2のウエスタン解析を示している）、この修飾の喪失は、損傷誘導されたフォーカスにおけるFANCD2シグナルの顕著な減少、並びに目に見えるFANCD2フォーカスのない細胞の出現に対応した（図4Bを参照、これは、FANCIに対する個々のsiRNAsをトランスフェクトした細胞におけるFANCD2の局在を示している）。（図4Bに示した実験結果については、U2OS細胞に、FANCIに対する示した個々のsiRNAsをトランスフェクトし、1μMマイトマイシンCで処理した。24時間後に、Triton抽出に続いて、細胞をFANCD2およびH2AXに対する抗体で共染色した。図4Cに示した結果については、「L」は、長い（モノユビキチン化した）形態を指示し、一方、「S」は、短い形態のタンパク質を示す。図4Cのアステリスク（*）は、交差反応のバンドを示す）。そのうえ、FANCD2の定常状態量は、FANCIの枯渇により減少した（図4Cを参照）。FANCD2のノックダウンにより、FANCIのフォーカス形成の減少をも引き起こしたので、FANCD2およびFANCIの相互関係も存在した（図11 B上部パネルを参照、これは、FANCD2に対する2つの異なるsiRNAsをトランスフェクトした細胞におけるFANCIの局在を示している。図11B示した結果については、U2OS細胞に、FANCD2に対する示した個々のsiRNAsをトランスフェクトし、1μMマイトマイシンCで処理した。24時間後に、0.5% Triton抽出に続いて、細胞をFANCI、FANCD2またはH2AXに対する抗体で染色した）。FANCIの枯渇によるFANCD2の喪失は、複合体において見いだされている2つのタンパク質に、恐らく起因していた。HAまたはFLAGに対する抗体のいずれかによる、293T細胞に発現したHA-FLAGタグを付けたFANCIの免疫沈降により、内因性FANCD2の免疫共沈降が生じたが、MYCでは生じなかった（図11Cを参照、これは、HA-FLAG FANCIのレトロウイルスを安定に導入した293T細胞を10Gyのγ-IRで処理した結果を示している。図11Cに示した結果については、1mgの総タンパク質を、HA、FLAGまたはMyc抗体で免疫沈降した。免疫沈降物は、ウサギ抗FANCD2抗体によるウエスタンブロッティングによって解析した）。FANCIおよびFANCD2の相互作用は、DNA損傷とは無関係であり、かつ強く、総FANCD2の15-20%を免疫沈降させた。また、内因性FANCIの免疫沈降により、FANCD2を免疫共沈降することができ（図11Dを参照、これは、FANCD2および内因性FANCIの相互作用を示している）、FANCD2抗体での免疫沈降により、FANCIを回収した（図11Eを参照、これは、FANCD2 IP内のFANCD2およびFANCIの相互作用を示している）。（図11Dに示した結果については、FANCD2のWTまたはK561R対立遺伝子を発現するPD20線維芽細胞からの0.5mgの総タンパク質を、非損傷条件下において抗FANCI抗体（BL1000）で免疫沈降した。免疫沈降物は、ウサギ抗FANCD2またはウサギ抗FANCD2抗体でのウエスタンブロッティングによって解析した。図11 Eに示した結果については、FANCD2のWTまたはK561R対立遺伝子を発現しており、かつ更にHAFLAGタグを付けたWTまたはK523R対立遺伝子を発現するPD20線維芽細胞からの0.5mgの総タンパク質を、非損傷条件下において抗FANCD2抗体で免疫沈降した。免疫沈降物は、ウサギ抗FANCD2またはマウス抗HA抗体でのウエスタンブロッティングによって解析した）。FANCD2のモノユビキ��ン化がこの相互作用に必要とされるかどうかを試験するために、WT FANCD2またはFANCD2のK561R突然変異体（これは、モノユビキチン化されない；Garcia-Higuera et a1, 2001）を補ったPD20細胞を免疫沈降実験に使用した。これらの細胞に発現されるHA-FLAGタグを付けたFANCIの免疫沈降により、WT FANCD2およびK561R突然変異体FANCD2の両方が回収され（図4D、レーン8および9を参照、これは、FANCD2およびFANCIの相互作用を示す）、これは、FANCD2のユビキチン化がFANCIとFANCD2の相互作用に必要ではなかったことを示している。（図4Dに示した結果については、示した構築物を発現するPD20線維芽細胞からの総タンパク質（0.5mg）を、非損傷条件下でFLAGまたは対照Myc抗体で免疫沈降した。免疫沈降物は、ウサギ抗FANCD2またはマウス抗HA抗体でのウエスタンブロッティングによって解析した）。
【０２４６】
実施例8：ユビキチン化FANCIは、乱ていない（unperturb）S期の間の損傷後に出現した
FANCIが、FANCD2のユビキチン化部位に対応するFANCIにおいて保存されたリジン残基にて、ユビキチン化されるかどうかを調べた。U2OS細胞、並びに初代BJ線維芽細胞（図5を参照、データ示さず）を含むその他の株化細胞において、2つの非オーバーラップ抗ペプチド抗体で行ったウエスタンブロットに存在するより遅く移動するバンド（図5Aを参照、これは、U20S細胞におけるFANCIのウエスタンブロット分析を示している）は、FANCIの修飾型がこれらの細胞に存在することを指示している。より遅く移動するバンド（長い形態、L）は、未処理の細胞に存在するが、MMC（図5Aを参照）またはHU（図5GおよびHを参照、これらは、それぞれ、USP1およびLacZ対照に対するsiRNAをトランスフェクトし、2mM HUで処理し、15時間後に収集したPD20（FA-D2）線維芽細胞におけるユビキチン化、およびHeLa細胞におけるFANCD2およびFANCIのユビキチン化の解析を示している）によって与えられるDNA損傷後に強度が増加した。長い形態および短い形態（S）間の分子量の差は、モノユビキチン化と一致していた。ユビキチン化について直接試験するために、HAタグを付けたユビキチンを発現する293T細胞からFANCIを免疫沈降して、HA-抗体でイムノブロットした（図5Bを参照、これは、FANCIのインビボでのユビキチン化を示している）。適切なサイズのバンドが同定され、FANCIの長い形態に一致したバンドが、対照細胞においてでなく、HAタグを付けたユビキチンをトランスフェクトした細胞においてのみ見いだされた。図5Bにおいて見られたモノユビキチン化したタンパク質がFANCIに関連したタンパク質であったという可能性を排除するために、His-ビオチン-ユビキチンを発現するHeLa抽出物からのプルダウンを、完全変性条件下でストレプトアビジンにより行った（Tagwerker et al.（2006）Mol Cell Proteomics 5：737-748）。これらの条件において、WT FANCIタンパク質は、沈殿したが、K523R FANCI変異タンパク質は、沈殿しなかった（下記参照）（図5Cを参照、これは、HeLa細胞におけるFANCIのインビボでのユビキチン化を示している）。従って、FANCIタンパク質は、FANCD2タンパク質のように、インビボでモノユビキチン化されることが同定された。（図5Aに示した結果については、U2OS細胞を1μM MMCで処理して、24時間後に細胞は2×Laemmlie緩衝液に直接溶解した。FANCIの長い（L）および短い（S）形態を図5 Aに示してあり、アステリスクは、交差反応バンドを示す。図5Bに示した結果については、HAタグを付けたユビキチンまたはdsRedマーカーを有する対照プラスミドを一過性にトランスフェクトした293T細胞の細胞全体の抽出物を、FANCIに対して作製した抗体を使用して免疫沈降し、FANCI抗体（左）およびHAタグを認識する抗体（右）によるウエスタンブロットによって解析した。図5Cについては、Hisおよびビオチン化シグナルでタグを付けたユビキチンを発現するHela細胞を、2mM HUで16時間処理し、8M尿素に溶解し、変性条件下でストレプトアビジンビーズを使用して沈殿させた。図5Gについては、ベクター、K561R突然変異体またはWT FANCD2を発現する細胞を、2mM HUで処理して、15時間後に収集した。FANCD2タンパク質の非存在（レーン1および2）または存在（レーン3、4、5、および6）を確認するために、FANCD2抗体を含む示した抗体でウエスタンブロッティングを行い、図5Gのアステリスクは、交差反応バンドを示す。図5Hについては、L/Sは、非ユビキチン化FANCIまたはFANCD2に対するモノユビキチン化の比を示す）。
【０２４７】
クロマチン分画実験により、FANCIのユビキチン化形態は、FANCD2のように（Montes de Oca et al.（2005）Blood 105、1003-1009）クロマチンに濃縮されたことが明らかになった（図5Dを参照、これは、U2OS細胞におけるFANCIのクロマチン分画を示している。図5Dに示した結果については、細胞を1μM MMCで処理し、24時間後に細胞を収集し、細胞画分に処理した。細胞全体の抽出物（WCE）、細胞質タンパク質（S1）、無傷の核（P1）、可溶性核タンパク質（S2）、クロマチン濃縮されたペレット（P2）、球菌ヌクレアーゼ処理後の可溶性および不溶性画分、（S2'およびP2'）を示してある。Orc2抗体は、クロマチン画分を追跡するために使用した）。FANCIが細胞周期の間に修飾されたかどうかを調べるために、U2OS細胞を同調して、有糸分裂ブロックから放出した。細胞周期の有糸分裂およびG1期の細胞は、ユビキチン化したFANCIまたはFANCD2タンパク質を欠いていた（図5Eを参照、これは、FANCIユビキチン化の細胞周期解析を示している；図5Eに示した結果について、ノコダゾールからの解放後、細胞を、ウエスタン解析（上部パネル）およびフローサイトメトリーを使用する細胞周期解析（下方パネル）のために、示した時間に収集した）。解放の9時間後まで、大部分の細胞が初期のS期に存在するときに、FANCIは、ユビキチン化されたように見えた。実験は、外来性損傷の非存在下で行われたので、内因性FANCIは、乱れていないS期において修飾されると結論した。
【０２４８】
実施例9：FANCIのユビキチン化は、FANCAおよびFANCD2に依存的であると同定された
FANCIのE3ユビキチンリガーゼを捜すために、FANCI修飾を、コアE3リガーゼ複合体について欠陥のあるFANCA突然変異体において調べた。FANCAを欠いているFA-A細胞GM6914細胞は、内因性またはHAタグの付いたFANCIのユビキチン化が無いことを示したが（図5F、レーン1、2、5、および6を参照、これは、GM6914（FAA）線維芽細胞におけるユビキチン化の解析を示している）、ユビキチン化は、WT FANCAの補完後に回復した（図5F、レーン3、4、7、8を参照）。（図5Fに示した結果については、ベクターまたはWT FANCAを発現する細胞に、空のベクターまたはHAタグを付けたWT FANCIを安定に導入した。1μM
MMC処理の24時間後に細胞を収集し、示した抗体でウエスタンブロッティングを行った）。
【０２４９】
FANCD2およびFANCIは、相互のユビキチン化の依存性を示した。FANCD2を欠いているPD20線維芽細胞（Jakobs et al.（1996）Somat Cell Mol Genet 22：151-157）は、ユビキチン化に欠陥のあるFANCD2 K561R突然変異体をトランスフェクトした時に、また、FANCIをユビキチン化することができなかった（図5G、レーン3および4を参照）。WT FANCD2を補った同じ細胞は、FANCI修飾を回復した（図5G、レーン5および6を参照）。また、WTまたはK561R FANCD2を発現するPD20細胞は、FANCIのレベルの増加を示し（図5Gを参照）、非ユビキチン化形態のタンパク質が、ヘテロ二量体（または多量体）のファンコニー貧血ID複合体において構成的に結合したことを示している。
【０２５０】
USPlは、FANCD2に対する脱ユビキチン化酵素として、以前に同定された（Nijman et al.（2005）Mol Cell 17：331-339）。また、USPlがFANCIのモノユビキチン化に影響を及ぼし得るかどうかを試験するために、HeLa細胞に、USPlに対するsiRNAをトランスフェクトした。USPlの減少は、基本条件下およびHU処理の後、FANCIおよびFANCD2の両者について、L対Sの比（ユビキチン化形態対脱ユビキチン化形態の比）を増大した（図5Hを参照）。
【０２５１】
実施例10：リシン523がFANCIユビキチン化に重要であると同定された
FANCIの保存されたリシン523が、ユビキチン化に必要であるかどうかを決定するために、HAタグの付いたWTまたはK523R突然変異体FANCIを、GM6914（図5Fを参照）および293T細胞において安定に発現させた（図12Aを参照、これは、K523R FANCIのユビキチン化が無いことを示している）。WT FANCIを発現した細胞においてのみL型（ユビキチン化形態）が、HA抗体で検出されたが、K523R突然変異体では、検出されなかった（図5F、レーン7、8、11、12および図12Aを参照）。面白いことに、FANCI K523R突然変異体を過剰発現する細胞は、FANCD2の減弱したモノユビキチン化を示したが、WTでは示さず（図5F、レーン11、12および図12Aを参照）、突然変異体FANCIがドミナントネガティブ活性を示すことを示している。（図12Aに示した結果については、293T細胞に、HA-FLAG-タグを付けたWTまたはK523R FANCI対立遺伝子を安定に導入した。15Gy IRまたは1μM MMC処理の8.5時間後に、細胞を収集し、Laemmli緩衝液に溶解した）。
【０２５２】
FANCD2のユビキチン化の役割と一致して、FANCI K523R突然変異体は、その過剰産生にもかかわらず（データ示さず）、DNA損傷フォーカスを形成できなかった（図51+TRITONパネルを参照）。K523R FANCI対立遺伝子を発現する細胞は、核細胞質区画（pan-nucleoplasmic）FANCD2染色を示し、Tritonプレ抽出後に、最もよく可視化されたDNA損傷に誘導されたフォーカスへの局在化を大幅に減弱させた（図5Iを参照、これは、WTおよびK523R FANCIを発現するU20S細胞におけるFANCIおよびFANCD2の局在を示している）。これらのデータは、K523R突然変異体がFANCD2のフォーカス形成においてドミナントネガティブ効果を有することを示した。（図5Iに示した実験結果については、HAタグを付けたFANCIのWTまたはK523R変異誘発遺伝子を安定に挿入した細胞を1μM MMCで処理し、免疫蛍光のために24時間後に処理した。下方パネルにおけるK523Rを発現していない細胞（K523R-Triton）は、FANCD2染色のための対照として含めたことに留意されたい。下の右パネル（+triton）における2つのFANCD2陽性細胞は、K523R FANCI発現を有しないと推定されたが、Tritonが核細胞質のFANCIを除去するので、これを直接試験することはできない。同様の結果は、HUで処理したK523R突然変異体を発現するU2OS細胞においても観察された）。
【０２５３】
実施例11：FANCIは、ファンコニー貧血相補群I由来の細胞における変異として同定された
MMCは顕著だが軽度のIR感受性のみを含む、ファンコニー貧血患者からの細胞と、FANCIのレベルが減少した細胞との表現型の類似性は（図IBを参照）、FANCIの突然変異がヒト疾患の原因である可能性が高いことを示した。公開された報告には、責任遺伝子が未知の残りの相補群、すなわちファンコニー貧血相補群Iのみを含んだ（Levitus et al.（2004）Blood 103：2498-2503）。このグループからの株化細胞が得られ、BD0952と命名され、これは、ファンコニー貧血の古典的症状を有する患者の末梢リンパ球由来のEBV-形質転換細胞株であった。BD0952は、対照細胞と比較して、正常レベルで全長FANCIタンパク質を発現することが同定された（GM03288；図6Aを参照、これは、WT FANCIの発現によるFA-I細胞におけるFANCD2ユビキチン化欠陥の相補を示している）。しかし、このタンパク質は、マイトマイシン
C処理の後でさえ、BD0952細胞においてユビキチン化されない（図6Aを参照およびデータを示さず）。（図6Aに示した結果については、空ベクター、HAタグを付けたWTまたはK523R FANCIを安定に導入した細胞を、100nM MMCで処理または未処理のままで、24時間後にLaemmli緩衝液に溶解することによって収集した。FANCD2、FANCIおよびHA抗体によるウエスタン解析を行った。GM02188（WT対照）細胞は、FANCD2およびFANCIの長い（L、ユビキチン化）形態の存在のための対照として作用し、補完していないBD0952細胞には存在しなかった。導入されたタンパク質の形態は、内因性（E）形態よりもわずかにゆっくり移動するため、T（タグの付いた）として示してある。また、図12Bを参照されたい。これは、WTのHAタグの付いたFANCIがユビキチン化されたことを示す同様の実験を示している。FANCI抗体で行ったウエスタンブロットの露光は、このブロットにおけるFANCIの長い形態を見るのには十分高くはなかった。しかし、導入したタンパク質の形態は、内因性（E）形態よりもわずかにゆっくり移動したので、同定可能であった（タグの付いたというT）。FANCIの長い形態は、HAタグを認識する抗体でプローブしたときに見えた。
【０２５４】
FANCD2がFA-I細胞においてユビキチン化されなかったことが、以前に示された（図6Aおよび（Levitus et al.（2004）Blood 103：2498-2503））。したがって、FANCD2のユビキチン化の回復は、ファンコニー貧血経路の機能的な相補性のための代用マーカーとして使用された。BD0952細胞におけるFANCI cDNAの発現により、FANCD2ユビキチン化が回復することを見いだした（図6Aを参照）。また、この外来性FANCIは、モノユビキチン化されていた（図6Aおよび12Bを参照）。モノユビキチン化の出現は、FANCIを発現する細胞の細胞周期における変化のためではなかった（図12Cを参照、これは、空ベクターで、またはWT FANCIを補ったBD0952の細胞周期解析を示しており、この場合、HAタグの付いたWT FANCIを、または空ベクターを安定に導入した細胞がPIで染色され、細胞周期のステージをフローサイトメトリーによって評価した）。また、外来性タンパク質の発現のレベルは、内因性タンパク質と同等であった（図6Aおよび12BにおけるT[タグ付き］対E[内因性］を比較する）。BD0952におけるWT FANCIの発現により、また、これらのMMC耐性がWTレベルにまで補完された（図6Bを参照、これは、空ベクターではなく、WT FANCIの発現によるBD0952細胞のMMC感受性の相補を示している）。（図6Bに示した実験結果については、示した遺伝子型の対数増殖細胞を、0から100nMまでの範囲のMMCの異なるレベルで、三連で処理した。細胞を6日間培養させ、その時にこれらを収集し、総細胞数をコルターカウンターを使用して計数した。生存率を出すために、それぞれの用量での総細胞数を、未処理の試料における細胞数で割った。）
【０２５５】
BD0952細胞におけるFANCI突然変異を探すために、BD0952 mRNAからのcDNAを増幅して、シーケンスし、BD0952細胞におけるファンコニー貧血を生じさせている突然変異の候補として2つの塩基置換の同定を行った。これらの突然変異には、アミノ酸55のPro のLeuへの変化を生じたC からTへの移行およびタンパク質のC末端の絶対に保存されるArgl285でのArg におけるGIuへの置換を生じたG からAへの塩基転換を含んだ。これらの突然変異は、ゲノムDNAからのエキソン3およびエキソン36を増幅することによって確認した。シーケンシングにより、ホモ接合型のゲノムDNAにおける両方の突然変異の存在を確認した（図6Cを参照、これは、BD0952（FA-I）細胞におけるFANCIのゲノム座位の配列解析を示している）。細胞が由来する患者は、両親がFANCIの疾患対立遺伝子が患者に寄与すると予測される血縁一族の一員であるため、ホモ接合性は、BD0952細胞の疾患座位に存在することが予想された（図6Cの配列解析については、ゲノムコンティグの配列（ref］NT_010274.16|Hsl5_l 0431： 4714523-4889523ヒト染色体15ゲノムコンティグ、参照構築（reference assembly））およびBD0952細胞からのゲノムDNAの配列および配列トレースを、DNA配列データから予測される生じるアミノ酸配列と共に示してある）。
【０２５６】
どの突然変異がファンコニー貧血を引き起こしたかについて同定するために、P55L、R1285QおよびP55L&R1285Q置換を含む発現構築物を作製した。WT FANCIおよびP55L FANCI対立遺伝子だけが、BD0952細胞のFANCD2 モノユビキチン化欠陥（図6D を参照、これは、WT FANCIまたはP55L FANCIの発現によるFANCD2ユビキチン化の補完を示しているが、R1285QまたはP55L、R1285QのFANCI突然変異体による補完は示さない；これらの実験において、FANCIの示した対立遺伝子を安定に導入した細胞を、未処理のまま、または100nM MMCで処理し、24時間後にパネルAに指示されるように処理した）、およびMMC感受性（図6Eを参照、これは、WT FANCIまたはP55L FANCIの発現によるBD0952細胞のMMC感受性の補完を示しているが、R1285QまたはP55L、R1285QのFANCI突然変異体による補完は示さない；実験は、図6Bに示さした結果について記述したように行った）を補完することが観察された。これらの2つのタンパク質は、BD0952細胞において、またそれら自体モノユビキチン化されていた。U2OS細胞またはBD0952細胞に導入されると、P55L対立遺伝子は、FANCD2と共にフォーカスに見いだされた（図7Aおよび13を参照）。R1285QまたはP55L&R1285Q対立遺伝子を発現する細胞は、FANCD2のモノユビキチン化を示さず（図6Dを参照）、MMC-耐性を回復することができなかった（図6Eを参照）。BD0952細胞において観察される破壊された表現型を補完することができるWT FANCI対立遺伝子とは異なり、R1285Q対立遺伝子を発現する細胞は、MMCでの処理後に多数の異常を示した（図6Fを参照）。U2OSまたはBD0952細胞に導入したときに、R1285QまたはP55L&R1285Q対立遺伝子は、Triton抽出の非存在下における免疫蛍光染色によって判断されるように、変異タンパク質の強い発現レベルにもかかわらず（図7A-TRITONパネルを参照）、損傷誘導されたフォーカスに局在することができなかった（図7A+TRITONパネルを参照、これは、U2OS細胞におけるWT、P55L、R1285QおよびP55L、R1285Q変異タンパク質の局在を示しており、および図13を参照、これは、BD0952（FA-I）細胞における同様の局在を示している）。合わせると、これらの研究は、BD0952細胞において、R1285Q変化が疾患を生じさせている突然変異であることを証明した。（図7Aに示した結果について、示したFANCIの対立遺伝子を導入したU20S細胞を100nM MMCで処理し、24時間後に免疫蛍光について処理した。図7Bは、ファンコニー貧血ID複合体の制御および機能のモデルを示していることに留意されたい。リン酸化-ユビキチン化カスケードは、ファンコニー貧血ID複合体のクロマチンへの積み込み（loading）を生じ、これが下流の修復イベントを指揮する。図13に示した結果については、FANCIのWTおよび変異対立遺伝子を導入したBD0952を100nM MMCで処理し、24時間後に免疫蛍光のために処理した。補完されていないBD0952は、なおもいくつかのFANCD2フォーカスを含んだことに留意されたい。しかし、これらの細胞は、数の上では非常により少なく、WTまたはP55L FANCI対立遺伝子を補完した後に形成されたフォーカスとは異なり、これらは大きく、明確な形のないものであった。）
【０２５７】
予想外にも、K523RのFANCI対立遺伝子は、BD0952細胞におけるFANCD2のモノユビキチン化欠陥（図6A、レーン7および8を参照）およびMMC感受性欠陥を部分的に補完することが同定された（図6Fを参照、これは、WT、K523RまたはR1285QのFANCI対立遺伝子を発現するBD0952細胞における細胞遺伝学的異常を示している）。（図6Fに示した結果について、示した細胞は、培地1mlにつき0、20または40ng MMCで処理して、48時間後に染色体異常の存在について解析した。K523R突然変異体は、1mlにつき20ng MMCでは評価されなかった。解析は、1mlにつき40ng MMCにて、一度だけした。30-50の中期を、それぞれの株化細胞について評価した）。これは、FANCIのK523R突然変異体がユビキチン化されなかったこと、または損傷誘導されるフォーカスを形成できなかったこと、およびK523R対立遺伝子が過剰発現されたときに、FANCD2ユビキチン化およびフォーカス形成に対してドミナントネガティブとして作用することと対照的である。これらの結果は、この対立遺伝子が部分的に欠陥があるだけであるか、またはより可能性が高いが、これは、BD0952細胞に存在するFANCIのR1285Q突然変異体による対立遺伝子内（interalleleic）補完を表していることを示した。
【０２５８】
実施例12：FANCIユビキチン化およびフォーカス形成の可能性のある阻害剤の同定と性質決定
上記に記述した顕微鏡観察方法、およびたとえば標識したFANCIポリペプチドおよび/または抗FANCI抗体（たとえば、BL999またはBL1000（Bethyl））を使用して、試験化合物（たとえば、Institute of Chemistry and Cell Biology（ICCB）、Harvard Medicalのコレクション中の489の公知の生物活性化合物）を、IRを媒介したFANCIフォーカス形成の阻害についてスクリーニングする。一次スクリーンを使用して陽性のものを同定し、これは、ハイスループット蛍光顕微鏡観察を使用して、電離放射線への曝露におけるFANCIを含むフォーカスの形成を遮断する薬剤を同定する。たとえば米国特許出願番号11/441,289（参照により本明細書に援用される）に記述されているように、候補化合物を同定し、特徴づける。
【０２５９】
均等物
当業者であれば、本明細書に記述した本発明の具体的態様に対する多くの均等物、またはルーチン試験のみを使用して確認することができることを認識するであろう。このような均等物は、特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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