(57)【要約】  銀粒子と水を含む無色の組成物が開示される。粒子は、内部の元素銀と外部のイオン性銀酸化物とを有し、銀粒子は、水中約５〜４０ｐｐｍの濃度で存在する。組成物は、顕著な抗ウイルス性を示し、鳥類インフルエンザに対して有効である。組成物の使用方法が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約５〜４０ｐｐｍの合計濃度の銀を含む水中の銀の組成物であって、コロイド状銀粒子の形態にある前記銀は、元素銀の内部と、銀酸化物の表面を有し、ここで、コロイド状銀粒子の大部分は、０．００５マイクロメートルを超える最小直径と０．０１５マイクロメートル未満の最大直径を有する銀組成物を準備すること、及び
インフルエンザＡウイルスを組成物と接触させること
の工程を含むインフルエンザＡウイルスの撲滅方法。
【請求項２】
インフルエンザＡが、鳥類インフルエンザＡである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
鳥類インフルエンザＡが、鳥類インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ３）である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
インフルエンザＡが、ヒトインフルエンザＡである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ヒトインフルエンザＡが、ヒトインフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）である、請求項２記載の方法。
【請求項６】
約５〜４０ｐｐｍの合計濃度の銀を含む水中の銀組成物であって、コロイド状銀粒子の形態である銀は、内部の元素銀と表面の銀酸化物とを有し、コロイド状銀粒子の大部分は、０．００５マイクロメートルを超える最小直径と０．０１５マイクロメートル未満の最大直径を有する銀組成物を準備すること、及び
インフルエンザＡウイルスに感染される見込みの動物に、その感染前に組成物を投与すること、
の工程を含むインフルエンザＡウイルスによる感染を改善する方法。
【請求項７】
インフルエンザＡが、鳥類インフルエンザＡである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
鳥類インフルエンザＡが、鳥類インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ３）である、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先行出願の相互参照
本出願は、2006年10月3日に出願された米国特許出願第11/538,262号に基づき、優先権を主張している。本出願は、2001年9月4日に出願された第09/946,834号（現在は、米国特許第6,743,348号）の一部継続出願である、2003年8月15日に出願された第10/641,938号（現在は、米国特許第7,135,195号、）の一部継続出願であり、2003年6月3日に出願された分割出願60/474,657の非仮出願であり、優先権を主張しており、参照により、本出願に組み込まれる；2001年9月4日に出願された第09/946,834号（現在は、米国特許第6,743,348号）は、それ自身、1999年6月1日に出願された第09/323,310号（現在は、米国特許第6,214,299号）の継続出願である。
【０００２】
米国政府支援
適用なし。
【０００３】
本発明の背景
技術分野
本発明は、一般的には、コロイド状銀に関し、より特別にはコロイド状銀の組成物と前記組成物のヒトの健康に有害な有機体、特に、鳥類インフルエンザウイルス（「鳥風邪」（bird’flu））に対抗する剤としての使用のための方法に関する。
【０００４】
背景技術の詳細
銀のある種の調製物が殺菌性を有することはよく知られている。銀は、現代の抗生物質が開発される前は、殺菌剤及び抗生物質として使用されていた。前世紀には、水を飲むことにより銀を摂取することを目的として、使用者は飲料水中に銀粒子を削り落とすか、銀片全体を飲料水中に浸していた。銀食器（すなわち、銀製品）での摂食行為は、銀の健康に良い性質を信じることに起因しているらしく思える。
【０００５】
溶液中に懸濁した銀を投与することが、個々人の健康を向上させるであろう多くの理由があり得る。このような溶液は、細菌、ウイルスと他の望ましくない有機体の増殖を阻害すると同時に、このような存在する細菌、ウイルスと他の望ましくない有機体を根絶するために働かすことが可能である。銀の溶液は、喘息の症状を低減するに足る抗炎症作用を有し得る可能性もある。
【０００６】
本発明は、ある種のヒトの疾患を処置するための水中の銀の組成物の使用を記載する。本発明の具体例は、その粒子が水中に懸濁された、内部の金属銀と外部のイオン性銀とを含む小さい銀の粒子を含む銀組成物である。本発明の好ましい具体例は、銀の粒子を含む銀の組成物であり、５０％より多い粒子は、大きさが、０．０１５マイクロメートル未満であり、粒子はコロイド状で水中に懸濁されている。
【０００７】
発明の概要
本発明は、一般的には、ヒトに有害である、例えば、鳥類インフルエンザウイルスのような微生物を殺傷或いは無能化するための、水中で５〜４０ｐｐｍ濃度での銀の使用に向けられている。本発明は、特別に、銀粒子を含む組成物に向けられ、前記粒子は、内部の元素銀と外部のイオン性銀酸化物と水とを含み、ここで、銀粒子は、５〜４０ｐｐｍの合計銀濃度で、水中でコロイド懸濁液に置かれている。本発明の具体例は、水中で約５〜４０ｐｐｍの銀粒子を含み、銀粒子の５０％超は、０．０１５マイクロメートル未満の最大寸法を有する。本発明の水中の銀組成物は、有効な抗微生物剤である。本発明は、有効な抗微生物剤である水中で５〜４０ｐｐｍ濃度の銀からなる銀組成物と前記銀組成物を抗微生物剤として使用する方法に向けられる。
【０００８】
本発明の好ましい具体例は、本出願の親であり、許容される範囲で参照により組み込まれる米国特許第6,214,299号に記載されたデバイスと方法の改良法を使用して製造された水中の銀組成物に向けられる。
【０００９】
特許第6,214,299号のデバイスとプロセスは、本発明の銀組成物を提供するために改変され、改善されてきた。基本的には、特許に開示されたとおりの８つの銀電極/１つの共通電極デバイスは、改変され、７５ガロンの水チャンバに適合させるために拡大された。プロセスを始めるために、約７０ガロンの高純度の水が、チャンバ内に配される。これに対して、先立つ生産工程で製造された約５ガロンの銀組成物が添加される。高純度の水は、プロセスが適正に生じるには十分に導電性ではないが故に、これは必要である。水チャンバは、気泡流が加工中に液体を通じて流されることを可能とする空気流入口を装備されている。このアプローチは、特許に記載された翼型混合機と比べて、改善された混合をもたらすことが発見された。
【００１０】
電極デバイスは、特許に記載されたとおり、約１万ボルトの交流（各銀電極は個々の電圧供給を有する）で駆動される。これより顕著に低い電圧は、ここに記載された最適な特性を持たないより大きな粒子を有する組成物を生み出すことが見出された。顕著により高い電圧は、そこに溶解された重要なイオン性銀を有する組成物を生み出す傾向がある。本発明の組成物は、溶液中に遊離イオン性銀を基本的に有さない９７％を超える金属銀を含む。
【００１１】
銀濃度は以下に説明される方法により定量される。基本的には、デバイスは連続的に駆動され、サンプルは、所望の銀濃度が達成されるまで分析される。１０ｐｐｍの組成物は、約１日半の駆動を必要とする。２２ｐｐｍの溶液は、約３日を必要とし、３２ｐｐｍの組成物は、約６日を必要とする。プロセスの速度は、より高い濃度が達成されるにつれ遅くなるようである。より高い濃度は、法外に長い時間を必要とし、少なくとも現在のパラメータの範囲では、究極の最高濃度は約５０ｐｐｍである。
【００１２】
組成物は、全て以下に記載される寸法特性を有し、通常の銀組成物と異なり、完全に無色で、なんら添加物を使用せずに、光と温度変化に対して安定である。組成物は、添加された過酸化水素に対して非反応性である。
【００１３】
発明の詳細な説明
以下の説明は、当業者が本発明を作製し使用することを可能とし、本発明を実行する発明者により検討された最良の態様を説明するために提供される。しかしながら、ヒト病原体を生体内及び生体外の双方で殺傷或いは阻害する顕著な能力を有するコロイド状銀組成物を提供するために、本発明の一般的原理が、ここに特に明らにされたことから、種々の改変が当業者には依然として容易に明らかであろう。
【００１４】
一般的に、本発明は、５〜４０ｐｐｍの銀濃度での水中の銀粒子の使用により、ヒトに有害である微生物を殺傷し、無能化する新規なアプローチを示す。用途に応じて、銀組成物は、内服的に或いは外部から使用され得る。
【００１５】
好ましい具体例
限定されない好ましい具体例が、以下に示される。
【００１６】
組成物は、コロイド状に水中に懸濁された銀粒子を含み、銀の合計含有量は、５〜４０ｐｐｍであり、その組成物は、人体に有害であるウイルスを殺傷し、無能化する。
【００１７】
組成物は、コロイド状に水中に懸濁された銀粒子を含み、銀の合計含有量は、１０±２ｐｐｍであり、その組成物は、人体に有害であるウイルスを殺傷し、無能化する。
【００１８】
組成物は、コロイド状に水中に懸濁された銀粒子を含み、銀の合計含有量は、２２±２ｐｐｍであり、その組成物は、人体に有害であるウイルスを殺傷し、無能化する。
【００１９】
組成物は、コロイド状に水中に懸濁された銀粒子を含み、銀の合計含有量は、３２±３ｐｐｍであり、その組成物は、人体に有害であるウイルスを殺傷し、無能化する。
【００２０】
粒子組成物中の銀の合計量を特定することが、材料を完全に特定するのではないことが理解されるだろう。組成物を含む粒子がより小さく作製されると、所与の濃度の銀は、より多数の粒子に相当するだろう。加えて、所与の銀濃度のための合計表面積は、増加するだろう。したがって、粒径と粒径範囲は、有効な本発明の組成物を定義する重要なパラメーターである。
【００２１】
更なるクラスの具体例は、何れも前記の組成物であり、５０％を超える銀粒子は、０．０１５マイクロメートル未満の最大寸法を有する。
【００２２】
更なるクラスの具体例は、何れも前記の組成物であり、銀粒子は、０価、すなわち、金属性酸化状態の銀［Ａｇ（０）］と、Ａｇ（I）、Ａｇ（II）及びＡｇ（III）から成る群より選ばれるイオン性の酸化状態での銀の被覆との双方を含む。
【００２３】
更なるクラスの具体例は、何れも前記の組成物であり、銀粒子は、０価、すなわち、金属性酸化段階の銀［Ａｇ（０）］と、Ａｇ（I）、Ａｇ（II）及びＡｇ（III）から成る群より選ばれるイオン性の酸化状態での銀の被覆との双方を含む。
【００２４】
実験結果は、本発明の粒子中のＡｇＯは、少なくとも部分的にＡｇ４Ｏ４、すなわち銀II酸化物の形態であることを示す。この材料の分子において、２個の銀原子は、１＋状態（銀I）であり、他の２個の銀分子は、３＋状態（銀III）である。ある条件下では、これら分子は、２＋状態（銀II）での銀原子を生じ得る。
【００２５】
例
１．組成物の調製
水中の銀組成物を、ここで参照により組み込まれる、米国特許第6,214,299号に記載されている方法により作製することができる。
【００２６】
本発明による銀を含む組成物を製造するための好ましい方法は、電極を含む電気化学電池を使用し、
（ａ）銀電極をある量の高純度水と接触させて配置すること、
（ｂ）銀電極を通じて電流を伝達し、それにより水内に懸濁する銀粒子の生成を引き起こすのに十分な方法で前記銀電極から銀の粒子を分離すること、
（ｃ）前記した懸濁した銀粒子の生成の間、水を撹拌し、それにより銀粒子を前記水内に、より均一な濃度で分散させ、より多量の懸濁した銀粒子をバッチにつき生成することができるようにすること
である工程を含む。
【００２７】
銀を含む組成物を製造するための別の好ましい方法は、電気化学電池を用い、
（ａ）電流源、前記電流源に電気的に接続された第１の導体、および前記電流源に電気的に接続された第２の導体を含む電気回路を設置し、ここで前記第１の導体は前記第２の導体から隔離して配置され、また導体のうちの少なくとも１つは元素銀から作製されること、
（ｂ）流体抵抗と連通させて第１の導体および第２の導体を配置することにより回路を閉じること、
（ｃ）電流源を作動させて、第１の導体および第２の導体に同時に交流を供給し、電圧は第１および第２の導体内で交互に直列状態で上昇して低下し、それにより銀粒子が第１の電極から分離して流体抵抗に入ることを引き起こし、前記の流体抵抗内に懸濁状態で配置されるようにすること、および
（ｄ）銀粒子の段階的な分離に基づく電極の長さの減少を補うように、流体抵抗に向かって移動させることにより電極を選択的に調整し、それにより電極と前記流体抵抗との間に生じるアーク放電を防止すること
である工程を含む。
【００２８】
本発明の銀組成物中の銀含有量の分析は、原子吸光法（ＡＡ）、誘導結合プラズマ原子分光分析（ＩＣＰ／ＡＥＳ）或いは適切な濃度範囲で銀を感知可能な、当業者に知られた他の技術によりなされ得る。銀組成物の粒子が小さく均一なサイズであれば（例えば、０．０１マイクロメートル以下）、適度に正確な分析が、ＡＡ或いはＩＣＰ／ＡＥＳにより直接コロイドを試験することによって、取得し得る。これは、ＡＡのためのサンプル調製は、基本的に全銀粒子をイオン化させその容易な検出を可能とするからである。
【００２９】
組成物が０．２マイクロメートル程度の大きさの粒子を含むならば、消化法（digestion procedure）を用いることが好ましい。消化法は、微粉化した銀と反応し得るハライドまたは他のアニオン種と接触して製造されまたは貯蔵され得る銀組成物、またはタンパク若しくは他のゲル状材料と組み合わされ得る銀組成物には必ずしも理想的でない。消化法の具体例は、以下のとおりである。
【００３０】
１．分析するために、１０ｍｌアリコートの十分に混合または撹拌された銀組成物を取り出し、ぴったりと閉まる蓋を有する、清潔なポリカーボネートのボトルまたは適切な材料の他の容器（一般的にボトル）内に入れる。３０〜１００ｍｌのサイズが好ましい。
【００３１】
２．マイクロピペット或いはスポイトで、ボトル中の銀組成物に、０．１ｍｌの試薬等級の硝酸を加える。
【００３２】
３．ボトルの蓋をしっかりと閉じ、銀組成物を、銀が溶解する（溶解は本質的には瞬時である）のに十分な時間の間緩やかに撹拌しながら、少なくとも８０℃まで加熱する。
【００３３】
４．生じた混合物を、蓋を閉めたまま室温にまで冷却させおく。ボトルを十分に振る。
【００３４】
５．ＡＡ、ＩＣＰ／ＡＥＳ、または銀混合物の銀含有量を分析するための同等の手段を用いる。好ましくは、新しく調製された標準、好ましくは製造者の取り扱い説明書に従って調製されたサンプルを、必要ならば適切に希釈して用いる。
【００３５】
６．結果を報告する際に、硝酸の添加による１％希釈を含む調製中のあらゆる希釈を考慮しなければならない。
【００３６】
１．銀の物理的／化学的形態の分析
Ａ．イントロダクション
水中にわずかに２２ｐｐｍの銀を含む組成物のサンプルを、組成物中の銀の形態を決定するために、飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）により分析した。銀の大半は銀（０）（すなわち金属銀）として存在し、また表面コーティングが存在し、これは平均で、銀（II）酸化物（ＡｇＯ）の組成物であるという結論である。上記したとおり、銀（II）酸化物は通常、銀（I）と銀（II）の化学量論的な組み合わせである。
【００３７】
Ｂ．実験手順
数滴の２２ｐｐｍの本発明の銀組成物が、室温においてシリコン基板上で蒸発乾固された。残渣をＴＯＦ−ＳＩＭＳにより分析し、サンプルとして表示する。参照銀（II）酸化物（ＡｇＯ）材料は、シリコン基板上にメーカーから入手した参照粉末のわずかな粒子を置くことにより分析され、参照として示す。
【００３８】
飛行時間型二次イオン質量分析技術（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）は、固体サンプルを、一次イオンのパルス化された精細に集束させたビームと衝突させた後、サンプルの表面から生じた二次イオンを飛行時間型質量分析器により分析するという原理に基づいている。この分析技術は表面感度が高く、表面下約２０〜４０Å（１オングストローム＝１×１０−４マイクロメートル）にまで及ぶ層からの情報を導きだす。ＴＯＦ−ＳＩＭＳ技術は通常、未知のサンプルの組成を同定するための調査ツールとして用いられる。適切な微量分析の標準物質がキャリブレーションに使用可能であれば、定量化も可能である。この分析は標準的な高い質量分解能条件を用いて行われた。
【００３９】
Ｃ．結果
負イオン質量が、Ａｇ（II）Ｏ参照材料と、生成物のサンプルからそれぞれ得られた。双方のスペクトルについての質量スペクトル領域は、ＡｇＯ-種の存在を示した。データは、銀（II）がサンプル粒子の表面上に存在する銀の平均的酸化状態であることを示唆する。銀酸化物（ＡｇＯ）のシグナルは、生成物サンプルと比較して参照サンプルにおいてかなり高い強度を示し、これはおそらく、金属銀がサンプル中では支配的であるためである。サンプル中の平均粒径が減少すると、より多くの銀酸化物が存在し得るにつれ銀酸化物に対する銀の比も減少し得ることが理解されるだろう。
【００４０】
２．サイズ分析
ここに記載されている銀調製物の特異な有効性は、粒子の表面性質／内部性質（例えば酸化物／金属）間の関係及び粒子の粒度分布に起因する。平均粒径が小さいほど、表面積は大きくなり、粒子界面化学の貢献も大きくなる。しかしながら、粒子が過剰に小さいと、安定性の損失及び/又は生成物に負の影響を与え得る他の相互作用が存在し得る。本発明の銀組成物は、界面活性剤等がなくとも、本質的に純粋な水中で安定であるが故に注目に値する。また、材料は本質的に無色であるのに対し、他のコロイド銀調製物（特に大きな粒径を有するもの）は通常着色を示す。これらの性質は上記した正確な製造条件の結果である。
【００４１】
組成物のデジタル解析は、０．００５マイクロメートル〜０．０８５１マイクロメートルの範囲内で、０．０１０６マイクロメートルの平均粒径が存在することを示した。しかしながら、粒度分布分析は、９５％を超える粒子が、直径約０．００５マイクロメートル〜約０．０１５マイクロメートルの間にあったことを示す。
【００４２】
３．コロイド状銀溶液の抗ウイルス特性
インビトロ
本検討の目的は、本発明の銀コロイド（１０ｐｐｍと３２ｐｐｍ）の、インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルス或いは鳥類インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルス（「鳥風邪」（bird’flu））に特定の曝露期間（懸濁液中に）曝露された際の抗ウイルス特性を評価することであった。使用されたプロトコールは、特定用途のために意図された殺ウイルス剤の効果のための標準的試験方法（Standard Test Method for Efficacy of Virucidal Agents Intended for Special Applications）（ＡＳＴＭＥ１０５２）の変形である。
【００４３】
このインビトロウイルス懸濁液検定は、生成物のインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）と（Ｈ５Ｎ１）ウイルス或いは鳥類インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスに対する抗ウイルス特性を評価するために設計された。ウイルスの存在（感染性）は、適切な指標細胞株、アカゲザル腎蔵に関して、細胞変性効果（ＣＰＥ）をモニターすることにより定量された。選ばれた指標細胞株は、ウイルス増殖をサポートすることができる。
【００４４】
プロトコール概要
ウイルス懸濁液は、生成物の使用希釈液に曝露された。予め決められた曝露時間ごとに、アリコートは、取り出され、連続的希釈により中和され、ウイルスの存在を検定された。陽性のウイルスコントロール、細胞毒性コントロール及び中和コントロールが平行して検定された。試験生成物の抗ウイルス特性が評価され、特定の濃度と時間間隔で比較された。
【００４５】
試験パラメータ
検定されるべき希釈度      培養物/diln
細胞コントロール                                                      ４
ウイルスコントロール（各曝露時間に対して）    １０−２〜１０−７＊        ４
試験（各曝露時間及び/又は濃度に対して）      １０−２〜１０−７＊        ４
細胞毒性コントロール（各生成物濃度に対して）  １０−２〜１０−４＊        ４
中和コントロール（各生成物濃度に対して）      １０−２〜１０−４＊        ４
*交互の希釈液がウイルス株力価により定量されるように検定されてよい。
【００４６】
ウイルス株は、７５〜１００％感染した培養細胞からの培養上澄み液を収集することにより調製された。細胞は破壊され、細胞破壊屑は遠心により除去された。上澄み液は取り出され、アリコートされ、高力価のウイルス株は、使用されるまで≦−７０℃で貯蔵された。代替として、９〜１１日経過孵化受精卵で増殖したウイルスが使用された。使用日に、凍結ウイルスのアリコートが取り出され、融解され、検定に使用するまで冷蔵保存された。有機汚れ負荷試験が必要とされるならば、牛胎児血清（ＦＢＳ）がウイルス株アリコートに組み込まれ、要求される割合の汚れ負荷が得られるように調整された。
【００４７】
細胞培養物と試験媒体
アカゲザル腎蔵（ＲＭＫ）は、ViroMed Laboratories,Inc.Cell Culture Divisionから取得された。培養物は、単相組織培養ラボ製品として、３６〜３８℃で、５〜７％ＣＯ２の湿潤雰囲気中に維持され、使用された。
【００４８】
ウイルス検定のために使用される試験媒体は、１〜１０％（v/v）の熱不活性化ＦＢＳで補われた最小必須培地（MEM）であった。媒体は、１以上の次のもので補われてもよい：１０μｇ/ｍｌのゲンタマイシン、１００単位/ｍｌのペニシリンと２．５μｇ/ｍｌのアンフォテリシンＢ。
【００４９】
方法
試験物質の調製
試験物質は、曝露温度で平衡された後に直接使用された。
【００５０】
ウイルス懸濁液の処理
各濃度の試験物質の４．５ｍｌのアリコートが、別々の管に分配され、夫々は０．５ｍｌのウイルス株懸濁液アリコートと混合された。混合物は最小で１０分間渦を巻くように混合され、適当な温度で残りの特定の曝露時間保持された。各曝露期間に引き続きすぐに、０．１ｍのアリコートが各管から取り出され、混合物は１０倍の連続希釈（０．１ｍｌ＋０．９ｍｌ試験媒体）により滴定され、ウイルスの存在を検定された。注：生成物の細胞毒性を減じるために、第１の希釈が牛胎児血清中でなされてもよく或いは試験媒体での残りの希釈では他の適当な中和剤でなされてもよい。
【００５１】
指標細胞培養物への過度の細胞毒性が試験物質により引き起こされるか、それが疑われるならば、感染した希釈液は、毒性を減じることを助けるために、滴定に続き、個々のセファデックスゲルろ過カラムを通過されてもよい。このような場合、コントロールの個々の希釈液も個々のカラムを通過されねばならない。
【００５２】
ウイルスコントロールの処理
０．５ｍｌのウイルス株懸濁液のアリコートが、試験物質に代えて、４．５ｍｌの試験媒体のアリコートに曝露され、ウイルス懸濁液の処理（Treatment of Virus Suspension）に以前に記載されたとおりに処理された。ウイルスコントロールは、試験された各曝露時間に対してなされた。全てのコントロールは、試験で使用された同じ中和剤を使用した。ウイルスコントロールの力価は、試験物質への曝露に続く各試験パラメータのパーセント及び対数減少を比較するための基準線として使用された。
【００５３】
細胞毒性コントロール
試験物質の各濃度の４．５ｍｌのアリコートが、ウイルスの代わりに０．５ｍｌの任意の要求された有機汚れ負荷を含む試験媒体のアリコートと混合され、以前に記載されたとおりに処理された。細胞培養物の細胞毒性は、ウイルス-試験物質とウイルスコントロール培養物と同時に採点された。細胞毒性は、顕微鏡的に測定されるとおりの細胞生存度を基礎として類別された。毒性に起因する細胞変化は、類別され、５０％以上の単層が影響を受けるならば、毒性（Ｔ）として報告された。
【００５４】
中和コントロール
（上記）各細胞毒性コントロール混合物は、必要ならウイルス活性が保持される試験物質の希釈液を定量するために低い力価のウイルス株で検証された。ウイルス活性を示した希釈液は、試験物質によるウイルスの減少を定量することには考慮されないだろう。
【００５５】
中和
以前に記載されたとおり、０．１ｍｌの各試験及びコントロールパラメータが、曝露期間に続き、０．９ｍｌの中和剤のアリコートに添加され、すぐに引き続き、試験媒体中での１０倍の連続希釈により、試験物質の活動を停止した。検定のために選ばれた中和剤が、試験物質のウイルス活性を減少するのに有効であるかどうかを定量するために、低い力価のウイルス株が試験物質-中和剤混合物の各希釈液に加えられた。この混合物は、ウイルスの存在に対して検定された（上記中和コントロール）。
【００５６】
感染力検定
インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）或いは鳥類インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）ウイルスの存在下細胞変性効果（ＣＰＥ）を示すＲＭＫ細胞株は、感染力分析における指標細胞株として使用された。マルチウエル培養皿中の細胞は試験及びコントロール群から調製された０．１ｍｌの希釈液で４通りに接種された。非感染指標細胞株（コントロール細胞）は、試験媒体のみで接種された。培養物は、無菌の使い捨ての細胞培養ラボ製品中で、３６〜３８℃で５〜７％ＣＯ２の湿潤雰囲気中でインキュベートされた。培養物は、約７日間周期的に、ＣＰＥ、細胞毒性の不在或いは存在に対して及び生存度に対して採点された。
【００５７】
試験基準
妥当な試験は、１）ウイルス株がウイルスコントロールから回収（recover）されること、２）コントロール細胞がウイルスに対して陰性なこと、及び３）陰性な培養物が生存可能であることを必要とするだろう。
【００５８】
計算
ウイルス及び細胞毒性力価は、スピアマンカーバーの方法により計算されるとおりの、感染性（ＴＣＩＤ５０）或いは細毒毒性（ＴＣＤ５０）夫々に対する５０％滴定終末点の−ｌｏｇ１０として表現されるだろう。
【数１】
2010505871.tif 000002
【００５９】
結果
ウイルスコントロール
３７℃で２時間の曝露期間後、ウイルスコントロールの力価は、５．０ｌｏｇ１０であった。パーセント及び対数減少計算は、２時間曝露した全ての試験物質に対して、この結果から計算された。
【００６０】
３７℃で６時間の曝露期間後、ウイルスコントロールの力価は、５．２５ｌｏｇ１０であった。パーセント及び対数減少計算は、６時間曝露した全ての試験物質に対して、この結果から計算された。
【００６１】
３７℃で１２時間の曝露期間後、ウイルスコントロールの力価は、４．７５ｌｏｇ１０であった。パーセント及び対数減少計算は、１２時間曝露した全ての試験物質に対して、この結果から計算された。
【００６２】
銀１０ｐｐｍ
試験物質の細胞毒性は、分析されたどの希釈液にも観察されなかった（≦１．５ｌｏｇ１０）。中和コントロールは、試験物質が≦１．５ｌｏｇ１０で中和されたことを示した。
【００６３】
３７．０℃で２時間の曝露期間後、試験ウイルス感染が、ウイルス-試験物質混合物中で、４．５ｌｏｇ１０で検出された。この調査条件下で、有機汚染負荷の不存在下、銀１０ｐｐｍは、鳥類インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）（鳥類合併結合変異ウイルス）への２時間の曝露期間後、ウイルス力価の６８．４％の減少を示した。ウイルス力価の対数減少は、０．５ｌｏｇ１０であった。
【００６４】
３７．０℃で６時間の曝露期間後、試験ウイルス感染が、ウイルス-試験物質混合物中で、４．７５ｌｏｇ１０で検出された。この調査条件下で、有機汚染負荷の不存在下、銀１０ｐｐｍは、鳥類インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）（鳥類合併結合変異ウイルス）への６時間の曝露期間後、ウイルス力価の６８．４％の減少を示した。ウイルス力価の対数減少は、０．５ｌｏｇ１０であった。
【００６５】
３７．０℃で１２時間の曝露期間後、試験ウイルス感染が、ウイルス-試験物質混合物中で、２．７５ｌｏｇ１０で検出された。この調査条件下で、有機汚染負荷の不存在下、銀１０ｐｐｍは、鳥類インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）（鳥類合併結合変異ウイルス）への１２時間の曝露期間後、ウイルス力価の９９．０％の減少を示した。ウイルス力価の対数減少は、２．０ｌｏｇ１０であった。
【００６６】
銀３２ｐｐｍ
試験物質の細胞毒性は、分析されたどの希釈液にも観察されなかった（≦１．５ｌｏｇ１０）。中和コントロールは、試験物質が≦１．５ｌｏｇ１０で中和されたことを示した。
【００６７】
３７．０℃で２時間の曝露期間後、試験ウイルス感染が、ウイルス-試験物質混合物中で、４．５ｌｏｇ１０で検出された。この調査条件下で、有機汚染負荷の不存在下、銀３２ｐｐｍは、鳥類インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）（鳥類合併結合変異ウイルス）への２時間の曝露期間後、ウイルス力価の６８．４％の減少を示した。ウイルス力価の対数減少は、０．５ｌｏｇ１０であった。
【００６８】
３７．０℃で６時間の曝露期間後、試験ウイルス感染が、ウイルス-験物質混合物中で、３．７５ｌｏｇ１０で検出された。この調査条件下で、有機汚染負荷の不存在下、銀３２ｐｐｍは、鳥類インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）（鳥類合併結合変異ウイルス）への６時間の曝露期間後、ウイルス力価の９６．８％の減少を示した。ウイルス力価の対数減少は、１．５ｌｏｇ１０であった。
【００６９】
３７．０℃で１２時間の曝露期間後、試験ウイルス感染が、ウイルス試験物質混合物中で、１．７５ｌｏｇ１０で検出された。この調査条件下で、有機汚染負荷の不存在下、銀１０ｐｐｍは、鳥類インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）（鳥類合併結合変異ウイルス）への１２時間の曝露期間に後、ウイルス力価の９９．９％の減少を示した。ウイルス力価の対数減少は、３．０ｌｏｇ１０であった。
【００７０】
鳥類ウイルスの結果
【表１】
2010505871.tif 000003
【００７１】
（＋）＝試験ウイルスの存在に対して陽性
（０）＝回収された試験ウイルスなし及び/又は存在する細胞毒性なし
【表２】
2010505871.tif 000004
【００７２】
（＋）＝試験ウイルスの存在に対して陽性
（０）＝回収された試験ウイルスなし及び/又は存在する細胞毒性なし
鳥類ウイルスの要約結果
【表３】
2010505871.tif 000005
【００７３】
細胞毒性及び中和コントロール
【表４】
2010505871.tif 000006
【００７４】
（＋）＝試験ウイルスの存在に対して陽性
（０）＝回収された試験ウイルスなし及び/又は存在する細胞毒性なし
コロイド状の銀は、また、ヒトインフルエンザＡ株に抗して顕著な活性を示した。
【００７５】
インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）に抗するウイルスの有効性
【表５】
2010505871.tif 000007
【００７６】
抗インフルエンザの結果は、本発明のコロイド状銀の広範な抗微生物特性が、インフルエンザウイルスと特に鳥類インフルエンザウイルスに及ぶことを示す。上記示されるとおり、コロイド状の銀は、非毒性であり、それゆえに、インフルエンザウイルスで汚染されたかもしれない表面からのウイルス駆除のための理想的な生成物である。
【００７７】
インビボ
前述したことは、本発明のコロイド状銀は、表面上のウイルスを殺傷することに有効であることを証明した。コロイド状銀のインビボ処置としての有効性は、次の実験で調査された。実験のゴールは、１０ｐｐｍか３２ｐｐｍか何れかのコロイド状の銀によりマウスを前処置すること、次いで、それらをＨ５Ｎ１鳥類インフルエンザに曝露することであった。
【００７８】
夫々１８〜２１ｇの体重を有する病原菌のない雌のＢＡＬＢ/ｃマウスが、Charles River Laboratories(Wilmington,MA)から入手された。インフルエンザＡ/Ｄｕｃｋ/ＭＮ/１５２５/８１（Ｈ５Ｎ１）が、乳離れしたばかりの動物を通じて２つの経路でマウスに適用された。適用されたウイルスのプールは、次いで、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ-Ｄａｒｂｙ犬腎臓）細胞中で増殖され、使用に先立って、元気な成体マウスに対して滴定された。
【００７９】
動脈酸素飽和（ＳａＯ２）が、Ohmeda Biox パルス酸素計の耳プローブアタッチメントを使用して測定された。プローブは、動物の腿に置かれ、読み取りは３０秒の安定化期間後になされた。実験動物の肺が除去され、計量され、次いで予め番号をつけられた区画をもつペトリ皿（区画あたり１つの肺）に置かれた。次いで、肺は、０（正常）から４（肺の１００％超の最大プラム着色）の点をつけられた。次いで、各肺は、ホモジナイズされ、ホモジネートの希釈液は感染ウイルスに対して３重に検定された。
【００８０】
１９群のマウスが、７日間１２時間毎に、３２ｐｐｍか１０ｐｐｍのコロイド状銀により経口胃管栄養法で処置された。次いで、動物は、感染性インフルエンザウイルス（陰性コントロールは、鼻投与無菌水で「感染」された。）のＬＤ７０用量で即座に感染され、２１日間維持された。コントロールとして、類似する群のマウスが、リバビリン、抗ウイルス剤（４時間の前ウイルス曝露から始めて、５日間１日に２度７５ｍｇ/ｋｇ）で処置された。ＳａＯ２測定は、３〜１１日なされた（このパラメータは通常、感染動物ではそれを超えると低下する時期である。）。生存率は、イエーツ（Yates）補正によるカイ二乗分析により統計的に評価された。死に至る平均日の増加、平均ＳａＯ２の相違、平均肺重量及び平均ウイルス力価は、スチューデントt-検定を使用して分析された。ウイルコクソン（Wilcoxon）順位付け合計分析が肺のスコアのために使用された。
【００８１】
実験の結果は、ウイルス曝露が、２０匹の偽薬処置動物のうち１４匹が死に至り、死に至る平均日が８．４日であったことを示す次の表に要約される。３２ｐｐｍのコロイド状銀による処置は、死に至る平均日で半日の遅れが見られるが、インフルエンザで死ぬ動物の数に影響しないようであった。処置マウスのこの群でのＳａＯ２の減少は、最初の日にこのパラメータが検定され、非常に顕著な（Ｐ＜０．００１）相違が見られたことに興味があるけれども、偽薬コントロールでのそれと殆ど同じ比率であった。ＳａＯ２の減少は、肺機能の減少の証拠であり、肺中の肺の硬化が、偽薬コントロールで見られるほどには、コロイド状の銀で処置された動物では進行しなかったことを示唆している。処置は、評価された各回でのより低い肺スコアにより見られるとおり、肺の硬化をほどよく低下するらしく、６日平均肺スコアが、偽薬処置コントロールより顕著に低かった（Ｐ＜０．０５）。動物での肺炎を引き起こす肺で生じる流体の別の指標である、肺重量は、また、偽薬で見られるよりも、各時点でよりかった。３２ｐｐｍのコロイド状銀により処置されたマウス中の平均肺ウイルス力価は、感染３日と６日での偽薬コントロールより低かった。１０ｐｐｍのコロイド状銀による処置は、また、いくつかのおもしろい結果を提供した。偽薬処置コントロールの３０％と比べて、１０ｐｐｍ溶液で処置された感染マウスの６０％が生き残ったという顕著な生存の改善があった。後者のコントロールで生き残った数の故に、統計的には顕著ではないが、この効果は、疾病抑制効果が生じたかもしれないことを強く示唆している。ＳａＯ２分析の２時点、３日と６日で、低下は、通常顕著に小さくなる（Ｐ＜０．０１）ことが見られ、分析の期間を通じて、一般的な減少の低下があった。肺スコアでの穏やかな抑制は、この群で、同様に、特に６日で見られた。３２ｐｐｍ処置でのように、肺ウイルス力価の僅かな抑制が見られた。
【００８２】
インフルエンザ感染マウスの実験結果
【表６】
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【００８３】
コロイド状の銀溶液の何れからも不都合な副作用は示されなかった。両試験材料は、直接鼻吸入により感染された動物に経口投与されたことから、この実験で見られる効果をウイルス不活性に全体的に帰することは困難である。処置はウイルス曝露１週前に始まったことから、コロイド状銀のいくつかの部分はウイルス曝露した肺組織付近に到達したかもしれない。コロイド状銀の作用と有効性のメカニズムのための多くの仮説があるが、その中には、この材料が、動物に穏やかな免疫調節作用を発揮し、感染に抗する穏やかな保護を提供することを含む。このようなメカニズムが、観察された活性に真に関連するならば、そのときは、あまりにも頻繁な投薬は免疫系に無理を強いるかもしれないことが認識されることから、異なる処置スケジュール、おそらく処置数を１日１回或いは隔日に１回に制限することが、なんらかの免疫調節効果を向上するかもしれない。最大の免疫作用は、必ずしも最高の使用量とは限らないことから、１０ｐｐｍの材料により見られるより大きい保護が、このような免疫調節により説明され得るだろう。
【００８４】
銀材料がこれらの検討でインフルエンザウイルスの感染を阻害したかもしれない他のメカニズムは、単純に、付着と侵入を防止するコロイド状銀によるウィルス粒子を被覆することの一つであるかもしれない。さらにまた、銀材料は、感染が始まった時には、肺組織付近に存在する必要があるだろう。おそらく、投与量或いは一般的な投薬計画は、動物体内の銀コロイドを再配分する能力に影響を与える。コロイド状銀材料は、また、急性肺炎の間に誘起された肺の上皮の内側のアポトーシスを制限する役割を果たす可能性もある。アポトーシスは、上皮細胞損失に起因する部分的な急性肺損傷の原因となる役割を果たす。銀材料の経口投与とウイルス曝露時近辺での鼻腔内注入との組み合わせ使用の考慮は、観察された作用が、銀材料の直接的殺ウイルス作用に真に関連するかどうかを決定するであろう。
【００８５】
コロイド状の銀が、インビトロではインフルエンザウイルスに抗して非常に効果的であるのに、インビボではより効果的ではないらしいという観察により、インビボ投与での投薬量と経路が問題となる。コロイド状の銀は、本質的に非毒性であるから、インフルエンザウイルスの侵入或いは複製場所での材料の十分に高い濃度を達成することは、副作用を引き起こさずに有効であろうことはありそうなことである。この点で、コロイド状の銀を含む噴霧による鼻通路と肺の周期的な処置が、良好な処置オプションであろうことはありそうなことである。
【００８６】
次の特許請求の範囲は、それゆえ、上記特別に説明され記載されたもの、概念的に等価なもの、自明に置き換えることができるもの、また本発明の本質的考えを基本的に取り入れるものを含むことを理解せねばならない。当業者は、適切に記載された好ましい具体例の種々な適用と改変は、本発明の範囲を逸脱せずに、構成することができることを理解するだろう。説明された具体例は、例の目的のためにだけ明らかにされたのであり、本発明を限定するものと解されてはならない。したがって、特許請求の範囲の範囲内で、特にここに記載された以外にも実施され得ることが理解されねばならない。