(57)【要約】  本発明は、免疫細胞の活性を調節する新規な抗ＣＬＥＣ−６抗体及びその断片を使用するための組成物及び方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＬＥＣ−６発現性抗原提示細胞による抗原提示の有効性を高める方法であって、前記抗原提示細胞を抗ＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片と接触させるステップを含み、前記抗原提示細胞が活性化される方法。
【請求項２】
抗原提示細胞が、単離した樹状細胞、末梢血単核細胞、単球、骨髄性樹状細胞、及びそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原提示細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、インターフェロンα、抗原、並びにそれらの組合せとインビトロで培養した、単離した樹状細胞、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、骨髄性樹状細胞、及びそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４で抗原提示細胞を活性化するステップであって、ＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片との接触が、抗原提示細胞上にＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を増加させるステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片で抗原提示細胞を活性化するステップであって、抗原提示細胞上にＣＤ８６、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を増加させるステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗原提示細胞が、図４の遺伝子発現パターンを有するように、ＣＬＥＣ−６特異的抗体並びにＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４で活性化される樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗原提示細胞が、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１ａ、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、ＴＮＦａ及びそれらの組合せを分泌するように、ＣＬＥＣ−６特異的抗体で活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗原提示細胞が、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１ａ、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、ＴＮＦａ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ及びそれらの組合せを分泌するように、ＣＬＥＣ−６特異的抗体で活性化される樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗原提示細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させた樹状細胞を含み、ＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片及びＣＤ４０リガンドが、樹状細胞の活性化を高める、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗原提示細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させた樹状細胞を含み、ＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片が、樹状細胞の副刺激活性を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＬＲ９受容体を介した活性化により抗原提示細胞を共活性化するステップであって、前記細胞がサイトカイン及びケモカインの産生を増加させるステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びＴＬＲ９受容体リガンドで抗原提示細胞を活性化することにより、前記細胞を共活性化するステップであって、樹状細胞がＢ細胞の増殖を誘発するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｂ細胞の存在下にＣＬＥＣ−６及びＬＯＸ−１で抗原提示細胞を活性化することにより、前記細胞を共活性化するステップであって、抗原提示細胞がＢ細胞免疫グロブリンのクラススイッチを誘導するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＬＲ９リガンド、抗ＴＬＲ９抗体又はその断片、抗ＴＬＲ９抗ＣＬＥＣ−６ハイブリッド抗体又はその断片、抗ＴＬＲ９抗ＣＬＥＣ−６リガンドコンジュゲートの少なくとも１種を用いるＴＬＲ９受容体を介した活性化により、抗原提示細胞を共活性化するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片が、クローンの１２Ｈ７、１２Ｅ３、９Ｄ５、２０Ｈ８、及びそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＬＥＣ−６受容体を介してＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片で活性化された樹状細胞が、単球、樹状細胞、末梢血単核細胞、Ｂ細胞、及びそれらの組合せを活性化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片が、コヒーシン／ドッケリン対の半分に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片が、コヒーシン／ドッケリン対の半分に結合しており、その相補的半分が抗原に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片が、コヒーシン／ドッケリン対の半分に結合しており、その相補的半分が、分子、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、細胞、ウイルス又はその部分、細菌又はその部分、真菌又はその部分、寄生虫又はその部分から選択される抗原に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片が、コヒーシン／ドッケリン対の半分に結合しており、その対の他の半分が、インターロイキン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、造骨因子、並びにこれら成長因子の生物活性なアナログ、断片及び誘導体、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞増殖因子、マイトジェンサイトカイン、走化性サイトカイン及びケモカイン、コロニー刺激因子、血管形成因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８等、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンホトキシンβ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＶＥＧＦ、β形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合成長因子（線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）、及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含む形質転換成長因子（ＴＧＦ）スーパー遺伝子ファミリーから選択される、１又は複数のサイトカインに結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＬＥＣ−６を発現する骨髄性樹状細胞、Ｂ細胞又は単球を、ＣＬＥＣ−６を発現しない形質細胞様樹状細胞から単離するために、ＣＬＥＣ−６発現を使用するステップを含む、形質細胞様樹状細胞から骨髄性樹状細胞を分離する方法。
【請求項２２】
ＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片を発現したハイブリドーマであって、ＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片が、抗原提示細胞を活性化することにより、新たな表面マーカーを発現するか、１若しくは複数のサイトカインを分泌するか、又はその双方を行う、ハイブリドーマ。
【請求項２３】
クローンの１２Ｈ７、１２Ｅ３、９Ｄ５、２０Ｈ８、及びそれらの組合せから選択される、請求項２２に記載のハイブリドーマ。
【請求項２４】
Ｂ細胞上のＣＬＥＣ−６受容体をトリガーすることにより、抗体産生を増加させ、サイトカインを分泌させ、Ｂ細胞活性化表面マーカーの発現を増加させ、及びそれらの組合せを行うステップを含む、Ｂ細胞免疫応答を増強する方法。
【請求項２５】
Ｂ細胞が、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１ａ及びそれらの組合せを分泌する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｂ細胞が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡの産生を増加させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＬＥＣ−６特異的抗体又は断片により樹状細胞上でＣＬＥＣ−６受容体をトリガーするステップ、及びＣＬＥＣ−６活性化樹状細胞にＴ細胞を接触させ、Ｔ細胞活性化を増強するステップを含む、Ｔ細胞活性化を増強する方法。
【請求項２８】
Ｔ細胞がナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、インターフェロンα、抗原、並びにそれらの組合せと更に接触させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
Ｔ細胞が、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５の分泌を増加させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
Ｔ細胞が、４−１ＢＢＬの表面発現を増加させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
Ｔ細胞が、抗ＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片により活性化された樹状細胞に曝されると増殖する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物細胞から分泌される抗ＣＬＥＣ−６免疫グロブリン又はその部分及び免疫グロブリンに結合した抗原。
【請求項３４】
抗原特異的ドメインが、完全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの数部分を伴うＦａｂ断片を含む、請求項３３に記載の免疫グロブリン。
【請求項３５】
ＣＬＥＣ−６特異的抗体又はその断片により活性化された樹状細胞を含むワクチン。
【請求項３６】
配列番号１〜７から選択される、請求項３５に記載のワクチン。
【請求項３７】
コヒーシン−ドッケリン結合対の半分を含む１又は複数の抗原担体ドメインに連結した、ＣＬＥＣ−６特異的抗体結合ドメインを含むモジュール構成ｒＡｂ担体。
【請求項３８】
抗原特異的結合ドメインが抗体の少なくとも一部分を含む、請求項３７に記載のｒＡｂ。
【請求項３９】
抗原特異的結合ドメインが、コヒーシン−ドッケリン結合対の半分との融合タンパク質中に、抗体の少なくとも一部分を含む、請求項３７に記載のｒＡｂ。
【請求項４０】
モジュール構成ｒＡｂ担体と複合体を形成する抗原に結合した、コヒーシン−ドッケリン結合対の相補的半分を更に含む、請求項３７に記載のｒＡｂ。
【請求項４１】
抗原との融合タンパク質である、コヒーシン−ドッケリン結合対の相補的半分を更に含む、請求項３７に記載のｒＡｂ。
【請求項４２】
抗原特異的ドメインが、完全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの数部分を伴うＦａｂ断片を含む、請求項３７に記載のｒＡｂ。
【請求項４３】
単独で、又は共活性化剤と共に、免疫細胞上のＣＬＥＣ−６受容体と会合する作用剤であって、前記組合せが、治療用途のために抗原提示細胞を活性化させる作用剤の使用。
【請求項４４】
活性化剤の有無にかかわらない、免疫細胞上における、１又は複数の抗原に連結されたＣＬＥＣ−６結合剤のワクチン作製のための使用。
【請求項４５】
ＣＬＥＣ−６以外の免疫細胞上に発現される細胞表面受容体を介して指示される免疫応答の増強のための、免疫細胞の共活性化剤としての抗ＣＬＥＣ−６剤の使用。
【請求項４６】
ＣＬＥＣ−６受容体を介した免疫細胞への結合及びその活性化が可能な、抗ＣＬＥＣ−６抗体Ｖ領域配列の使用。
【請求項４７】
ＣＬＥＣ−６を介した免疫細胞の不適当な活性化から生じることが知られている、若しくは疑われている疾患に関する、又はＣＬＥＣ−６を発現する病原性細胞若しくは組織に関する、治療用の１又は複数の毒性剤にリンクされたＣＬＥＣ−６結合剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に抗原提示及び免疫細胞活性化の分野、より特定すれば、ＣＬＥＣ−６  Ｃ型レクチンを介した免疫細胞の活性化に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定せずに、その背景を樹状細胞に関連して説明する。
【０００３】
樹状細胞は、可溶性の細胞内シグナルを出した後、病原体を認識することにより、先天性及び後天性免疫の境界を制御する上で枢要な役割を果たす。ＤＣのこうした機能は、最も顕著にはトール様受容体（ＴＬＲ）及びＣ型レクチン又はレクチン様受容体（ＬＬＲ）によって代表される、特殊表面受容体である「パターン認識受容体」（ＰＲＲ）の発現に依存するところが大きい（Figdor, C. G., Y. van Kooyk, and G. J. Adema. 2002. C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells. Nat Rev Immunol 2:77-84、Pyz, E., A. S. Marshall, S. Gordon, and G. D. Brown. 2006. C-type lectin-like receptors on myeloid cells. Ann Med 38:242-251、Brown, G. D. 2006. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol 6:33-43）。現在のパラダイムでは、ＴＬＲの主たる役割は、免疫応答を開始するためにインターロイキン１２（ＩＬ−１２）及び他の炎症性サイトカインを産生するように、ＤＣに警報を発することである。Ｃ型ＬＬＲは、マクロファージ及びＤＣの強力な抗原捕捉・取込機構の成分として作動する（Figdor, C. G., Y. van Kooyk, and G. J. Adema. 2002. C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells. Nat Rev Immunol 2:77-84）。しかし、ＬＬＲは、ＴＬＲと比較して、細胞移動（Geijtenbeek, T. B., D. J. Krooshoop, D. A. Bleijs, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, V. Grabovsky, R. Alon, C. G. Figdor, and Y. van Kooyk. 2000. DC-SIGN-ICAM-2 interaction mediates dendritic cell trafficking. Nat Immunol 1:353-357）、細胞内相互作用（Geijtenbeek, T. B., R. Torensma, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, G. J. Adema, Y. van Kooyk, and C. G. Figdor. 2000. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 100:575-585）を含めた広範囲の生物学的機能を有するものとも思われる。ＬＬＲのこうした多重機能は、ＴＬＲと異なり、ＬＬＲが自己、非自己の双方を認識できるという事実によるものとも思われる。しかし、免疫細胞中に発現される多数のＬＬＲの重複性を含め、ＬＬＲの複雑さが、個々のＬＬＲの詳細な機能を理解する際の主要な障害の１つとなっている。それに加え、こうした受容体の大多数に対する天然リガンドは、未だ同定されていないままである。とは言え、最近の研究からの証拠によって、ＬＬＲは、ＴＬＲと協力して、細菌感染中に免疫細胞の活性化に寄与し得ることが示唆されている（d'Ostiani, C. F., G. Del Sero, A. Bacci, C. Montagnoli, A. Spreca, A. Mencacci, P. Ricciardi-Castagnoli, and L. Romani. 2000. Dendritic cells discriminate between yeasts and hyphae of the fungus Candida albicans. Implications for initiation of T helper cell immunity in vitro and in vivo. J Exp Med 191:1661-1674、Fradin, C., D. Poulain, and T. Jouault. 2000. beta-1,2-linked oligomannosides from Candida albicans bind to a 32-kilodalton macrophage membrane protein homologous to the mammalian lectin galectin-3. Infect Immun 68:4391-4398、Cambi, A., K. Gijzen, J. M. de Vries, R. Torensma, B. Joosten, G. J. Adema, M. G. Netea, B. J. Kullberg, L. Romani, and C. G. Figdor. 2003. The C-type lectin DC-SIGN (CD209) is an antigen-uptake receptor for Candida albicans on dendritic cells. Eur J Immunol 33:532-538、Netea, M. G., J. W. Meer, I. Verschueren, and B. J. Kullberg. 2002. CD40/CD40 ligand interactions in the host defense against disseminated Candida albicans infection: the role of macrophage-derived nitric oxide. Eur J Immunol 32:1455-1463、Lee, S. J., S. Evers, D. Roeder, A. F. Parlow, J. Risteli, L. Risteli, Y. C. Lee, T. Feizi, H. Langen, and M. C. Nussenzweig. 2002. Mannose receptor-mediated regulation of serum glycoprotein homeostasis. Science 295:1898-1901、Maeda, N., J. Nigou, J. L. Herrmann, M. Jackson, A. Amara, P. H. Lagrange, G. Puzo, B. Gicquel, and O. Neyrolles. 2003. The cell surface receptor DC-SIGN discriminates between Mycobacterium species through selective recognition of the mannose caps on lipoarabinomannan. J Biol Chem 278:5513-5516、Tailleux, L., O. Schwartz, J. L. Herrmann, E. Pivert, M. Jackson, A. Amara, L. Legres, D. Dreher, L. P. Nicod, J. C. Gluckman, P. H. Lagrange, B. Gicquel, and O. Neyrolles. 2003. DC-SIGN is the major Mycobacterium tuberculosis receptor on human dendritic cells. J Exp Med 197:121-127、Geijtenbeek, T. B., S. J. Van Vliet, E. A. Koppel, M. Sanchez-Hernandez, C. M. Vandenbroucke-Grauls, B. Appelmelk, and Y. Van Kooyk. 2003. Mycobacteria target DC-SIGN to suppress dendritic cell function. J Exp Med 197:7-17、Cooper, A. M., A. Kipnis, J. Turner, J. Magram, J. Ferrante, and I. M. Orme. 2002. Mice lacking bioactive IL-12 can generate protective, antigen-specific cellular responses to mycobacterial infection only if the IL-12 p40 subunit is present. J Immunol 168:1322-1327）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Figdor, C. G., Y. van Kooyk, and G. J. Adema. 2002. C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells. Nat Rev Immunol 2:77-84
【非特許文献２】Pyz, E., A. S.  Marshall, S. Gordon, and G. D. Brown. 2006. C-type lectin-like receptors on myeloid cells. Ann Med 38:242-251
【非特許文献３】Brown, G. D. 2006. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol 6:33-43
【非特許文献４】Geijtenbeek, T. B., D. J. Krooshoop, D. A. Bleijs, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, V. Grabovsky, R. Alon, C. G. Figdor, and Y. van Kooyk. 2000. DC-SIGN-ICAM-2 interaction mediates dendritic cell trafficking. Nat Immunol 1:353-357
【非特許文献５】Geijtenbeek, T. B., R. Torensma, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, G. J. Adema, Y. van Kooyk, and C. G. Figdor. 2000. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 100:575-585
【非特許文献６】d'Ostiani, C. F., G. Del Sero, A. Bacci, C. Montagnoli, A. Spreca, A. Mencacci, P. Ricciardi-Castagnoli, and L. Romani. 2000. Dendritic cells discriminate between yeasts and hyphae of the fungus Candida albicans. Implications for initiation of T helper cell immunity in vitro and in vivo. J Exp Med 191:1661-1674
【非特許文献７】Fradin, C., D. Poulain, and T. Jouault. 2000. beta-1,2-linked oligomannosides from Candida albicans bind to a 32-kilodalton macrophage membrane protein homologous to the mammalian lectin galectin-3. Infect Immun 68:4391-4398
【非特許文献８】Cambi, A., K. Gijzen, J. M. de Vries, R. Torensma, B. Joosten, G. J. Adema, M. G. Netea, B. J. Kullberg, L. Romani, and C. G. Figdor. 2003. The C-type lectin DC-SIGN (CD209) is an antigen-uptake receptor for Candida albicans on dendritic cells. Eur J Immunol 33:532-538
【非特許文献９】Netea, M. G., J. W. Meer, I.Verschueren, and B. J. Kullberg. 2002. CD40/CD40 ligand interactions in the host defense against disseminated Candida albicans infection: the role of macrophage-derived nitric oxide. Eur J Immunol 32:1455-1463
【非特許文献１０】Lee, S. J., S. Evers, D. Roeder, A. F. Parlow, J. Risteli, L. Risteli, Y. C. Lee, T. Feizi, H. Langen, and M. C. Nussenzweig. 2002. Mannose receptor-mediated regulation of serum glycoprotein homeostasis. Science 295:1898-1901
【非特許文献１１】Maeda, N., J. Nigou, J. L. Herrmann, M. Jackson, A. Amara, P. H. Lagrange, G. Puzo, B. Gicquel, and O. Neyrolles. 2003. The cell surface receptor DC-SIGN discriminates between Mycobacterium species through selective recognition of the mannose caps on lipoarabinomannan. J Biol Chem 278:5513-5516
【非特許文献１２】Tailleux, L., O. Schwartz, J. L. Herrmann, E. Pivert, M. Jackson, A. Amara, L. Legres, D. Dreher, L. P. Nicod, J. C. Gluckman, P. H. Lagrange, B. Gicquel, and O. Neyrolles. 2003. DC-SIGN is the major Mycobacterium tuberculosis receptor on human dendritic cells. J Exp Med 197:121-127
【非特許文献１３】Geijtenbeek, T. B., S. J. Van Vliet, E. A. Koppel, M. Sanchez-Hernandez, C. M. Vandenbroucke-Grauls, B. Appelmelk, and Y. Van Kooyk. 2003. Mycobacteria target DC-SIGN to suppress dendritic cell function. J Exp Med 197:7-17
【非特許文献１４】Cooper, A. M., A. Kipnis, J. Turner, J. Magram, J. Ferrante, and I. M. Orme. 2002. Mice lacking bioactive IL-12 can generate protective, antigen-specific cellular responses to mycobacterial infection only if the IL-12 p40 subunit is present. J Immunol 168:1322-1327
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、抗ヒトＣＬＥＣ−６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用するための組成物及び方法を包含し、抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂ及びその代替物の想定される治療用途の基礎をなす生物機能を特徴付けた。本発明は、ＣＬＥＣ−６を発現する樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞と接触させることを含み、ＣＬＥＣ−６が、特定のＤＣ活性化に関連する抗原を取り込み、その結果、体液性及び細胞性の免疫応答を変化させる上で、ある役割を演じることを含む。本発明者等は、ＣＬＥＣ−６を保持する細胞を活性化することができる独特な作用剤、並びにこうしたシグナルを受ける際に起こる細胞の変化が、免疫系の他の細胞に対する作用に関して示す効果を開発し、特徴付けた。こうした効果（単独、又は他のシグナル（即ち、副刺激）との協調のいずれかで）は、ある種の疾患状態に対する治療結果を高度に予測し、又はワクチン接種に関わる防御結果を増強するためになる。
【０００６】
ＬＬＲの１種であるＣＬＥＣ−６は、単独、又は他の細胞シグナルとの共同のいずれかにより、細胞（ＤＣを含む）活性化から観て機能的であることが判明した。ＣＬＥＣ−６媒介細胞活性化は、抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂで誘導されており、したがって抗ヒトＣＬＥＣ−６  ｍＡｂ又はその代替物は、疾患に対処する試薬の開発に有用となろう。
【０００７】
本発明は、当該抗原提示細胞を抗ＣＬＥＣ−６特異抗体又はその断片と接触させ、抗原提示細胞を活性化することにより、ＣＬＥＣ−６発現性抗原提示細胞による抗原提示の有効性を高めるための組成物及び方法を包含する。該抗原提示細胞は、分離した樹状細胞、末梢血単核細胞、単球、骨髄性樹状細胞、及びそれらの組合せでもよい。特定の一実施形態では、抗原提示細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、インターフェロンα、抗原、並びにそれらの組合せとインビトロで培養した、分離した樹状細胞、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、骨髄性樹状細胞、及びそれらの組合せである。この方法は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４で抗原提示細胞を活性化するステップであって、ＣＬＥＣ−６特異抗体又はその断片との接触が、抗原提示細胞上にＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を増加させるステップも含み得る。
【０００８】
本発明を使用することにより、ＣＬＥＣ−６特異抗体又はその断片で抗原提示細胞を活性化し、抗原提示細胞上にＣＤ８６、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を増加させ得ることが判明した。抗原提示細胞が樹状細胞（ＤＣ）であれば、ＣＬＥＣ−６特異抗体並びにＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４で活性化されたＤＣは、図４の遺伝子発現パターンを有する。ＣＬＥＣ−６特異抗体で活性化された抗原提示細胞は、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１ａ、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、ＴＮＦａ及びそれらの組合せを分泌し、ＡＰＣが樹状細胞であれば、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１ａ、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、ＴＮＦａ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ及びそれらの組合せを分泌する。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させた樹状細胞を活性化する際、ＣＬＥＣ−６特異抗体又はその断片及びＣＤ４０リガンドは、樹状細胞の活性化を高める。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンα、並びにＣＬＥＣ−６特異抗体又は断片と接触すると、ＤＣは副刺激活性を高めた。
【０００９】
別の実施形態では、本発明の方法を使用して、ＴＬＲ９受容体及びＣＬＥＣ−６レクチンを介して抗原提示細胞を共活性化することにより、抗原提示細胞を活性化することができ、該細胞は、サイトカイン及びケモカインの産生を増加させ、Ｂ細胞の増殖さえ誘発させる。Ｂ細胞存在下、ＣＬＥＣ−６及びＬＯＸ−１で抗原提示細胞を共活性化すると、Ｂ細胞の免疫グロブリンがクラススイッチを起こすことも判明した。ＴＬＲ９受容体は、ＴＬＲ９リガンド、抗ＴＬＲ９抗体又はその断片、抗ＴＬＲ９抗ＣＬＥＣ−６ハイブリッド抗体又はその断片、抗ＴＬＲ９抗ＣＬＥＣ−６リガンドコンジュゲートの少なくとも１つで活性化し得る。ＣＬＥＣ−６特異抗体又はその断片の例は、クローンの１２Ｈ７、１２Ｅ３、９Ｄ５、２０Ｈ８及びそれらの組合せから選択し得る。ＣＬＥＣ−６受容体を介してＣＬＥＣ−６特異抗体又はその断片で活性化される樹状細胞も、単球、樹状細胞、末梢血単核細胞、Ｂ細胞、及びそれらの組合せを活性化する。
【００１０】
本発明の更に別の実施形態は、コヘシン／ドッケリン対の半分に結合したＣＬＥＣ−６特異抗体又はその断片を包含する。ＣＬＥＣ−６特異抗体又はその断片は、コヘシン／ドッケリン対の半分に結合し得るが、その相補的半分は抗原に結合し得る。抗原は、分子、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、細胞、ウイルス又はその部分、細菌又はその部分、真菌又はその部分、寄生虫又はその部分でもよい。別の実施形態では、ＣＬＥＣ−６特異抗体又はその断片は、コヘシン／ドッケリン対の半分に結合し、その対の他の半分は、インターロイキン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、造骨因子、並びにこのような成長因子の生物活性な類縁体、断片及び誘導体、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞増殖因子、マイトジェンサイトカイン、走化性サイトカイン及びケモカイン、コロニー刺激因子、血管形成因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンホトキシンβ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＶＥＧＦ、β形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合成長因子（線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）、及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めた形質転換成長因子（ＴＧＦ）スーパー遺伝子ファミリーから選択される、１又は複数のサイトカインに結合している。
【００１１】
本発明は、ＣＬＥＣ−６を発現する骨髄性樹状細胞、Ｂ細胞又は単球を、ＣＬＥＣ−６を発現しない形質細胞様樹状細胞から分離するために、ＣＬＥＣ−６発現を使用することにより形質細胞様樹状細胞から骨髄性樹状細胞を分離する方法も包含する。
【００１２】
本発明は、抗原提示細胞を活性化して、新たな表面マーカーを発現し、１若しくは複数のサイトカインを分泌し、又はその双方を行う、ＣＬＥＣ−６特異抗体又はその断片を発現したハイブリドーマ、例えば、クローンの１２Ｈ７、１２Ｅ３、９Ｄ５、２０Ｈ８及びそれらの組合せを包含する。抗ＣＬＥＣ−６ハイブリドーマが産生する抗体は、Ｂ細胞上のＣＬＥＣ−６受容体をトリガーすることにより、抗体産生を増加させ、サイトカインを分泌させ、Ｂ細胞活性化表面マーカーの発現を増加させ、及びそれらの組合せを行うことにより、Ｂ細胞の免疫応答を増強する方法に使用し得る。Ｂ細胞は、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１ａ及びそれらの組合せを分泌し、並びに／又はＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡの産生を高める。
【００１３】
本発明は、樹状細胞上のＣＬＥＣ−６受容体をＣＬＥＣ−６特異抗体又は断片でトリガーし、ＣＬＥＣ−６活性化樹状細胞にＴ細胞を接触させることにより、Ｔ細胞の活性化を増強することによって、Ｔ細胞の活性化を増強する方法も包含する。Ｔ細胞はナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞でよく、該樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、インターフェロンα、抗原、並びにそれらの組合せと接触させ得る。ＣＬＥＣ−６活性化ＤＣで活性化されたＴ細胞は、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５のＴ細胞分泌、及び４−１ＢＢＬの表面発現、並びにそれらの組合せを増加させることが判明した。Ｔ細胞は、抗ＣＬＥＣ−６抗体又はその断片で活性化された樹状細胞に曝した際にも増殖し得る。
【００１４】
本発明は、哺乳動物細胞から分泌される抗ＣＬＥＣ−６免疫グロブリン又はその部分、及びその免疫グロブリンに結合した抗原も包含する。抗ＣＬＥＣ−６抗原特異ドメインは、全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの数部分を伴うＦａｂ断片でもよい。抗ＣＬＥＣ−６抗体は、ＣＬＥＣ−６特異抗体又はその断片で活性化された樹状細胞を含むワクチンを作製するためにも使用し得る。
【００１５】
本発明はまた、単独で、又は共活性化剤と共に、免疫細胞上のＣＬＥＣ−６受容体と会合する作用剤であって、前記組合せでは、治療用途のために抗原提示細胞を活性化させる作用剤の使用；活性化剤の有無にかかわらない、免疫細胞上における、１又は複数の抗原にリンクされたＣＬＥＣ−６結合剤のワクチン作製を目的とした使用；ＣＬＥＣ−６以外の免疫細胞上に発現される細胞表面受容体を介して指示される、免疫応答の増強を目的とした、免疫細胞の共活性化剤としての抗ＣＬＥＣ−６剤の使用；ＣＬＥＣ−６受容体を介した免疫細胞への結合及びその活性化が可能な、抗ＣＬＥＣ−６抗体Ｖ領域配列の使用、並びに／或いは、ＣＬＥＣ−６を介した免疫細胞の不適当な活性化から生じることが知られている、若しくは疑われている疾患に関する、又はＣＬＥＣ−６を発現する病原性細胞若しくは組織に関する、治療用の１又は複数の毒性剤にリンクされたＤＣ−ＣＬＥＣ−６結合剤の使用も包含する。
【００１６】
更に別の実施形態は、コヘシン−ドッケリン結合対の半分を含む１又は複数の抗原担体ドメインに連結した、ＣＬＥＣ−６特異抗体結合ドメインを含むモジュール構成ｒＡｂ担体も包含する。抗原特異結合ドメインは、抗体の少なくとも一部分、及び／又はコヘシン−ドッケリン結合対の半分との融合タンパク質中の抗体の少なくとも一部分を含み得る。一実施形態では、該ｒＡｂはまた、モジュール構成ｒＡｂ担体と複合体を形成する抗原に結合した、コヘシン−ドッケリン結合対の相補的半分、又は抗原との融合タンパク質である、コヘシン−ドッケリン結合対の相補的半分も含み得る。該ｒＡｂの該抗原特異ドメインは、全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの数部分を伴うＦａｂ断片でもよい。
【００１７】
本発明の特徴及び利点に関するより完全な理解のために、添付の図と共に、本発明の詳細な説明に以下に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】（図１Ａ及び１Ｂ）インビボ、インビトロの双方で培養したＤＣがＣＬＥＣ−６の発現を示す図である。図１Ａは、健常ドナーのＰＢＭＣを抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂと共に、抗ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９及びＣＤ３抗体で染色したことを示す。個々の抗体で染色した細胞は、ＣＬＥＣ−６の発現量を測定するためにゲート選別した。図１Ｂは、健常ドナーの単球をＧＭ−ＣＳＦの存在下、ＩＬ−４（ＩＬ−４ＤＣ）又はＩＦＮａ（ＩＦＮＤＣ）と共に培養し、細胞を抗ＬＯＸ−１  ｍＡｂ又はイソタイプ対照抗体で染色したことを示す。（Ｃ）骨髄性ＤＣ（Ｌｉｎ−ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１２３−）をＦＡＣＳ分取器により血液から精製し、抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂで染色した。白抜き及び黒塗りの柱状グラフは、イソタイプ対照及び抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂでそれぞれ染色した細胞を表す。
【図２】抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂがＤＣを活性化することを示す図である。ＩＦＮＤＣ（１×１０５個／２００μｌ／ウェル）を異なるｍＡｂクローンで被覆したプレート中、１８時間培養した。培養上清の分析で、Luminexによりサイトカイン及びケモカインを測定した。
【図３】（図３Ａ及び３Ｂ）抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂがＤＣを活性化することを示す図である。図３Ａは、ＩＬ−４ＤＣ（１×１０５個／ウェル／２００μｌ）を抗ＣＬＥＣ−６抗体で１８時間刺激した後、細胞を抗ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色したことを示す。図３Ｂは、ＦＡＣＳ分取により血液から精製した骨髄性ＤＣを示す。ｍＤＣ（１×１０５個／ウェル／２００μｌ）を抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂで１８時間刺激し、細胞を抗ＣＤ８６、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色した。
【図４】抗ＣＬＥＣ−６抗体又は対照ｍＡｂのいずれかで１２時間刺激したＩＬ−４ＤＣの遺伝子発現プロファイルを示す図である。総ＲＮＡは、RNeasyカラム（Qiagen）で抽出し、2100 Bioanalyser（Agilent）で分析した。ビオチン標識ｃＲＮＡ標的は、Illumina totalprep標識キット（Ambion）を用いて調製し、Sentrix Human6 BeadChip（４６Ｋ転写物）にハイブリッドを形成した。こうしたマイクロアレイは、シリコンウェーハの表面にエッチングしたマイクロウェル中に留置した、３μｍのビーズに結合した５０量体のオリゴヌクレオチドプローブからなる。ストレプトアビジン−Ｃｙ３で染色後、アレイ表面を、Illumina製造のサブミクロン分解能スキャナー（Beadstation 500X）を用いて結像させる。遺伝子発現分析用ソフトウェアプログラムのGeneSpring, Version 7.1（Agilent）を用いてデータ解析を行った。
【図５】（図５Ａ及び５Ｂ）抗ＣＬＥＣ−６抗体で活性化したＤＣが、増加量のサイトカイン及びケモカインを産生することを示す図である。図１の凡例に表示したようなインビトロ培養ＩＬ−４ＤＣ及び精製ｍＤＣ（１×１０５個／２００μｌ）を、抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂ（２μｇ／ウェル）で被覆したプレート中、１８時間培養した。培養上清の分析で、Luminexによりサイトカイン及びケモカインを測定した。
【図６】（図６Ａ及び６Ｂ）抗ＣＬＥＣ−６抗体及びＣＤ４０が、相乗的に作用してＤＣを活性化することを示す図である。ＩＬ−４ＤＣ（２×１０５個／２００μｌ／ウェル）を、可溶性ＣＤ４０Ｌ（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下、抗ＣＬＥＣ−６抗体（２μｇ／ウェル）で被覆した９６ウェルプレート中、１８時間培養した。対照ｍＡｂも試験した。１８時間後、細胞を抗ＣＤ８３抗体で染色し、培養上清の分析で、Luminexによりサイトカイン及びケモカインを測定した。
【図７】（図７Ａ〜７Ｃ）ＤＣ上に発現したＣＬＥＣ−６が、体液性免疫応答の増強に寄与することを示す図である。６日目のＧＭ／ＩＬ−４  ＤＣ（５×１０３個／ウェル）を抗ＣＬＥＣ−６抗体又は対照ｍＡｂで被覆した９６ウェルプレート中、１６〜１８時間培養した後、ＣＦＳＥで染色した自己ＣＤ１９＋Ｂ細胞１×１０５個を、２０単位／ｍｌのＩＬ−２及び５０ｎＭのＣｐＧの存在下で共培養した。図７Ａ：６日目に、細胞を蛍光標識抗体で染色した。ＣＤ３＋及び７−ＡＡＤ＋の細胞には、ゲート排除を行った。ＣＤ３８＋及びＣＦＳＥ−の細胞は、ＦＡＣＳ分取器で精製し、ギームザ染色を行った。図７Ｂは、総ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡについてサンドイッチＥＬＩＳＡにより、１３日目の培養上清を分析したことを示す。図７Ｃは、６日目のＧＭ／ＩＬ−４  ＤＣをｍＡｂ被覆プレート中、４８時間培養し、ＡＰＲＩＬの発現量を細胞の細胞内染色で決定したことを示す。点線は、対照抗体で染色した細胞である。細線及び太線は、抗ＣＬＥＣ−６抗体又は対照ｍＡｂで各々被覆したプレート中でインキュベートした細胞を表す。データは、各回異なる健常ドナー３人の細胞を用いた別々の２実験を表している。
【図８】（図８Ａ及び８Ｂ）Ｂ細胞上に発現したＣＬＥＣ−６が、Ｂ細胞の活性化及び免疫グロブリン産生に寄与することを示す図である。図８Ａは、ｍＡｂで被覆したプレート中、ＣＤ１９＋Ｂ細胞（２×１０５個／ウェル／２００μｌ）を１６〜１８時間培養した後、培養上清をLuminexによりサイトカイン及びケモカインについて分析したことを示す。図８Ｂは、ＣＤ１９＋Ｂ細胞１×１０５個が、ｍＡｂで被覆したプレート中、１３日間培養されたことを示す。総Ｉｇ量をＥＬＩＳＡで測定した。データは、異なる健常ドナー３人の細胞を用いた２回の反復実験を表している。
【図９Ａ−９Ｃ】（図９Ａ〜９Ｃ）ＤＣ上に発現したＣＬＥＣ−６が、抗原特異Ｔ細胞応答の増強に寄与することを示す図である。図９Ａ：６日目のＩＦＮＤＣ（５×１０３個）を抗ＣＬＥＣ−６抗体又は対照ｍＡｂで被覆したプレート中、１６〜１８時間培養した後、精製した同種Ｔ細胞を共培養した。細胞に３［Ｈ］チミジン１μＣｉ／ウェルを１８時間パルス投与した後、採集した。３［Ｈ］チミジンの取込みは、βカウンターで測定した。図９Ｂ：ＩＬ−４  ＤＣ（５×１０３個／ウェル）を、Ｆｌｕ  Ｍ１ペプチド（ＨＬＡ−Ａ２エピトープ）１０μＭ（上側２パネル）又は組換えＦｌｕ  Ｍ１タンパク質（下側２パネル）の存在下、ｍＡｂで被覆したプレート中、１６時間インキュベートした。精製した自己ＣＤ８  Ｔ細胞（２×１０６個）を７日間、共培養した。２日目に、ＩＬ−２を２０単位／ｍｌ及びＩＬ−７を１０単位／ｍｌ、培養物へ添加した。細胞を抗ＣＤ８抗体及びＦｌｕ  Ｍ１四量体で染色した。図９Ｃ．ＩＬ−４ＤＣ（５×１０３個／ウェル）を、ｍＡｂを被覆したプレート中で、２０μＭのＭａｒｔ−１ペプチド（ＨＬＡ−Ａ２エピトープ）（上側２パネル）又は組換えＭａｒｔ−１タンパク質（下側２パネル）の存在下１６時間インキュベートした。精製した自己ＣＤ８  Ｔ細胞２×１０６個を１０日間共培養した。２日目に、ＩＬ−２を２０単位／ｍｌ及びＩＬ−７を１０単位／ｍｌ、培養物に添加した。細胞は、抗ＣＤ８抗体及びＭａｒｔ−１四量体で染色した。
【図９Ｄ−９Ｅ】（図９Ｄ〜９Ｅ）ＤＣ上に発現したＣＬＥＣ−６が、抗原特異Ｔ細胞応答の増強に寄与することを示す図である。図９Ｄ．ＩＬ−４ＤＣに、１０ｎＭの抗ＣＬＥＣ−６−Ｍａｒｔ−１複合体又は対照Ｉｇ−Ｍａｒｔ−１複合体を２時間負荷した。精製した自己ＣＤ８  Ｔ細胞２×１０６個を１０日間共培養した。細胞は、抗ＣＤ８抗体及びＦｌｕ  Ｍ１特異的四量体で染色した。下側２パネルの細胞は、大腸菌（E. coli）のＬＰＳ  ２０ｎｇ／ｍｌで刺激した。図９Ｅ．１０ｎＭの抗ＣＬＥＣ−６−Ｆｌｕ  ＨＡ１又は対照Ｉｇ−Ｆｌｕ  ＨＡ１複合体を２時間負荷した精製ｍＤＣ。ＣＦＳＥで標識した精製済み自己ＣＤ４  Ｔ細胞２×１０６個を７日間共培養した。細胞は抗ＣＤ４抗体で染色し、細胞増殖をＣＦＳＥ希釈の分析で測定した。下側２パネルの細胞は、大腸菌のＬＰＳ  ２０ｎｇ／ｍｌで刺激した。
【図１０】人間外霊長類（カニクイザル）のＰＢＭＣを抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂ及び細胞表面マーカーに対する抗体で染色し、ＦＡＣＳにより分析したことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の各種実施形態の作成及び使用を以下に詳細に考察するが、本発明は、多種多様な特定の関係において具体化できる適用可能な多くの発明概念を提供することを理解されたい。本明細書に考察する特定の実施形態は、本発明を作成し、使用する特定の方法を例示しているに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。
【００２０】
本発明の理解を深めるために、幾つもの用語を以下に定義する。本明細書に定義する用語は、本発明関連の分野の当業者が通常理解している意味を有する。「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などの用語は、単一体だけを指すことを意図しているのではなく、例示のために具体例で使用し得る部類一般を包含する。本発明における専門用語は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用するが、その用法は、特許請求の範囲で概説される場合を除き、本発明を制限するものではない。
【００２１】
デクチン−１遺伝子クラスターは、レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体（ＬＯＸ）−１、Ｃ型レクチン様受容体（ＣＬＥＣ）−１及び２、並びにＭＩＣＬを含有する。ＣＬＥＣ−１は、培養細胞中にトランスフェクトすると細胞内に発現され、そのため表面に発現するには、何らかのアダプター分子の必要性が予測された（M. Colonna et al. Eur J Immunol 30 (2000), pp.697-704）。しかし、陽イオン性アミノ酸は膜貫通部分には存在しない。代わりに、チロシン１残基が細胞質部分に存在するが、このチロシンを介したシグナル伝達効果は未知である。ＣＬＥＣ−２は、細胞質中にＤｘＹｘｘＬ（アスパラギン酸−任意−チロシン−任意−任意−ロイシン）モチーフを１つ含有し、トランスフェクトされた細胞表面上に発現される。このモチーフは、効率的なエンドサイトーシス及びＡＳＧＰＲ−１の側底部発現を促進することが知られており、デクチン−１のチロシン系第２モチーフに相同性が高い。実際、Ｓｙｋは、リガンドの蛇毒ロドシチン（アグレチン）により誘導された、ＣＬＥＣ−２のホスホチロシンへ補充される（K. Suzuki-Inoue et al. Blood 107 (2006), pp.542-549）。この観察結果によって、チロシンがリン酸化されるときのＳｙｋのドッキング部位となる、単一の独特なＹｘｘＬ配列のＣ型レクチン受容体における存在が確認される。ＭＩＣＬ（ＣＬＥＣ１２Ａ）は、デクチン−１及びＬＯＸ−１に相同なＩＴＩＭ含有分子と同定された（A. S. Marshall et al. J Biol Chem 279 (2004), pp.14792-14802）。その発現は、単球、顆粒球及び未成熟ＤＣに主に制限される。機能から観て、ＭＩＣＬは、刺激時にＳＨＰ−１及び２を補充し、ＩＴＩＭ依存性阻害効果が、細胞質性ＭＩＣＬを含有するキメラ受容体を用いて観察された（A. S. Marshall et al. J Biol Chem 279 (2004), pp.14792-14802）。しかし、最近の報告では、未成熟ＤＣ上におけるＭＩＣＬのライゲーション後、タンパク質チロシンの改変リン酸化パターン並びにｐ３８  ＭＡＰＫ及びＥＲＫのセリンリン酸化が、観察されており、更に、ＣＣＲ７の発現及びサイトカイン産生が、ＣＤ８３、８６、ＤＣ−ＬＡＭＰなどの成熟マーカーを上方調節せずに認められた（C. H. Chen et al. Blood 107 (2006), pp.1459-1467）。実際に、このようなＣＣＲ７＋（低）副刺激半成熟表現型は、定常状態移動ＤＣを表すと見なされている（L. Ohl et al. Immunity 21 (2004), pp.279-288）。未だ特性決定がなされていないが、ＣＬＥＣ９Ａ及びＣＬＥＣ１２Ｂをコードする遺伝子も、デクチン−１遺伝子クラスター中に配置されている（Brown, G. D. 2006. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol 6:33-43）。ＣＬＥＣ１２Ｂが細胞質内尾部にＩＴＩＭを含有する一方、ＣＬＥＣ９Ａは、活性化モチーフとして作用するとも思われるＥｘＹｘｘＬ（グルタミン酸−任意−チロシン−任意−任意−ロイシン）配列を保持する。こうした分子の機能は、未だ調査がなされていない。
【００２２】
Arce et al., Eur. J. Immunol. (2004) は、マウスＭｃｌ／Ｃｌｅｃｓｆ８と関連するヒトＣＬＥＣ−６タンパク質を同定し、その特性を決定した。ヒトＣＬＥＣ−６は、ヒトカルシウム依存性レクチンファミリー（Ｃ型レクチン）に属する、アミノ酸２１５個のII型膜糖タンパク質をコードする。ＣＬＥＣ−６細胞外領域は、単一の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）を示す。一過性にトランスフェクトした細胞に関するＣＬＥＣ−６の生化学分析から、３０ｋＤａの糖タンパク質が示されており、この受容体の架橋は急速な細胞内取込みを起こすことから、ＣＬＥＣ−６はエンドサイトーシス性受容体であることが示唆されている（Arce et al., 2004）。ＣＬＥＣ−１、２、９Ａ、１２Ａ及び１２Ｂと異なり、ＣＬＥＣ−６は、ＹｘｘＬモチーフ又は他のコンセンサスシグナル伝達モチーフを含有していない。ＣＬＥＣ−６の生物機能を特徴付ける研究は、全くなされていない。
【００２３】
ＤＣは、タンパク質抗原を交差提示することができる（Rock KL Immunol Rev. 2005 Oct;207:166-83）。インビボで、ＤＣは、多くの受容体によって抗原を取り込み、クラスＩ、IIの両方で抗原ペプチドを提示する。これに関しては、パターン認識受容体としてのＤＣレクチンが、抗原の効率的取込み並びに抗原の交差提示に寄与する。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「モジュール構成ｒＡｂ担体」とは、単一の組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、本例では抗ＣＬＥＣ−６モノクローナル抗体に対して、多様な抗原、活性化タンパク質又は他の抗体の制御されたモジュール式付加を行うように操作・作製された、組換え抗体系を記述するために使用される。該ｒＡｂは、標準的なハイブリドーマ技法、組換え抗体ディスプレーを用いて作製したモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体などでよい。モジュール構成ｒＡｂ担体は、例えば、多重抗原、及び／又は抗原と活性化サイトカインを、（細胞内取込性受容体、例えばヒト樹状細胞受容体に対する１つの一次組換え抗体を介して）標的とする樹状細胞（ＤＣ）に向けるために使用することができる。モジュール構成ｒＡｂ担体は、異なる２種の組換えｍＡｂを制御し、規定した様式で末端間で結合するためにも使用し得る。
【００２５】
「モジュール構成ｒＡｂ担体」の抗原結合部分は、１又は複数の可変ドメイン、１又は複数の可変ドメインと第１定常ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの数部分を伴うＦａｂ断片でもよく、Ｆｃドメインの前記数部分に対しては、同族性のモジュール構成結合部分が、アミノ酸配列に付加しており、及び／又は結合している。モジュール構成ｒＡｂ担体に使用する抗体は、任意のイソ型若しくはクラス、サブクラスでもよく、又は任意の供給源からでもよい（動物及び／又は組換え）。
【００２６】
非限定的な一例では、モジュール構成ｒＡｂ担体は、操作組換えｍＡｂに関し、特異的で規定されたタンパク質複合体を作製するために、１又は複数のモジュール構成コヘシン−ドッケリンタンパク質ドメインを有するように操作されている。該ｍＡｂは、該ｍＡｂの抗原結合ドメインからのカルボキシと共に、１又は複数のモジュール構成コヘシン−ドッケリンタンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部分である。コヘシン−ドッケリンタンパク質ドメインは、翻訳後に、例えば、化学的な架橋剤及び／又はジスルフィド結合の使用によってさえ、結合してもよい。
【００２７】
本明細書で使用する場合の用語「抗原」とは、抗原の受容者において体液性及び／又は細胞性の免疫応答を開始できる分子を指す。抗原は、本発明を用いた異なる２つの状況で、即ち、抗体又はｒＡｂの他の抗原認識ドメインに対する標的として、或いはモジュール構成ｒＡｂ担体に対するドッケリン／コヘシン−分子相補体の一部として、ｒＡｂにより細胞又は標的へ及び／又はその中へ運搬される当該分子として、使用し得る。抗原は、普通、ワクチン接種が有利な治療になると思われる疾患を起こす作用剤である。抗原がＭＨＣ上に提示されるとき、そのペプチドはしばしば約８〜約２５アミノ酸である。抗原には、例えば、単純な中間代謝物、糖類、脂質及びホルモン、並びに複合炭水化物、リン脂質、核酸、タンパク質などの高分子を含めた、任意種の生体分子が含まれる。抗原の一般的種類には、それだけに限らないが、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫及び他の寄生虫抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶に関わる抗原、並びに他の種々の抗原が挙げられる。
【００２８】
モジュール構成ｒＡｂ担体は、任意数の活性剤、例えば、抗生物質、感染症治療剤、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、解熱剤、鎮痛剤、抗炎症剤、骨粗鬆症用治療剤、酵素、サイトカイン、抗凝固剤、多糖類、コラーゲン、細胞、及び前記活性剤の２種以上の組合せを運搬することができる。本発明を用いて送達する抗生物質の例には、限定はしないが、テトラサイクリン、アミノ糖、ペニシリン、セファロスポリン、スルホンアミド薬、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、エリスロマイシン、バンコマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、アマンチジン、イドクスウリジン、ｐ−アミノサリチル酸、イソニアジド、リファンピン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、ダウノマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、イミダゾールカルボキサミドなどが挙げられる。
【００２９】
本発明を用いて送達する抗腫瘍剤の例には、限定はしないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、メソトレキセートなどが挙げられる。解熱剤及び鎮痛剤の例には、アスピリン、Motrin（登録商標）、Ibuprofen（登録商標）、ナプロシン、アセトアミノフェンなどが挙げられる。
【００３０】
本発明を用いて送達する抗炎症剤の例には、限定はしないが、ＮＳＡＩＤ、アスピリン、ステロイド、デキサメタゾン、ヒドロコーチゾン、プレドニゾロン、ジクロフェナックＮａなどが挙げられる。
【００３１】
本発明を用いて送達する、骨粗鬆症治療の治療剤並びに骨及び骨格に作用する他の因子の例には、限定はしないが、カルシウム、アレンドロネート、骨ＧＬａペプチド、甲状腺ホルモン及びその活性断片、ヒストンＨ４関連骨形成増殖ペプチド、並びにそれらの変異体、誘導体及び類縁体が挙げられる。
【００３２】
本発明を用いて送達する酵素及び酵素補因子の例には、限定はしないが、パンクレアーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、トリプシン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、パンクレアチン、コラゲナーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、アデニルシクラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）などが挙げられる。
【００３３】
本発明を用いて送達するサイトカインの例には、限定はしないが、インターロイキン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、造骨因子、並びにこのような成長因子の生物活性な類縁体、断片及び誘導体が挙げられる。サイトカインは、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞増殖因子、マイトジェンサイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンホトキシンβ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＶＥＧＦ、又はそれらの任意の断片若しくは組合せでもよい。他のサイトカインには、β形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合成長因子（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）、及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めた、形質転換成長因子（ＴＧＦ）スーパー遺伝子ファミリーの構成員が挙げられる。
【００３４】
本発明を用いて送達する成長因子の例には、限定はしないが、哺乳動物細胞などの自然源若しくは天然源から単離できる成長因子、又は組換えＤＮＡ技法若しくは各種化学法などにより合成で調製できる成長因子が挙げられる。それに加え、こうした因子の類縁体、断片又は誘導体も、その自然分子の生物活性の少なくとも一部を示す限り、使用することができる。例えば、部位特異的変異誘発又は他の遺伝子工学技法で改変した遺伝子の発現により、類縁体を調製することができる。
【００３５】
本発明を用いて送達する抗凝固剤の例には、限定はしないが、ワルファリン、ヘパリン、ヒルジンなどが挙げられる。本発明を用いて送達する、免疫系に作用する因子の例には、限定はしないが、化学走性ペプチド、ブラジキニンなど、炎症及び悪性新生物を抑制する因子、並びに感染性微生物を攻撃する因子が挙げられる。
【００３６】
ウイルス抗原の例には、それだけに限らないが、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、並びに他のＨＩＶ成分などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原由来レトロウイルス抗原などのレトロウイルス抗原；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ及びＬプロテイン、Ｂ型肝炎ウイルスのプレＳ抗原、並びにＣ型肝炎ウイルスＲＮＡなどの他の肝炎、例えばＡ型、Ｂ型及びＣ型肝炎のウイルス成分などの肝炎ウイルス抗原；ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ並びに他のインフルエンザウイルス成分などのインフルエンザウイルス抗原；麻疹ウイルス融合タンパク質及び他の麻疹ウイルス成分などの麻疹ウイルス抗原；プロテインＥ１及びＥ２並びに他の風疹ウイルス成分などの風疹ウイルス抗原；ＶＰ７ｓｃ及び他のロタウイルス成分などのロタウイルス抗原；エンベロープ糖タンパク質Ｂ及び他のサイトメガロウイルス抗原成分などのサイトメガロウイルス抗原；ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２プロテイン、及び他の呼吸器合胞体ウイルス抗原成分などの呼吸器合胞体ウイルス抗原；前初期タンパク質、糖タンパク質Ｄ、及び他の単純疱疹ウイルス抗原成分などの単純疱疹ウイルス抗原；ｇｐＩ、ｇｐII及び他の水疱瘡ウイルス抗原成分などの水疱瘡ウイルス抗原；プロテインＥ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ、８０％Ｅ及び他の日本脳炎ウイルス抗原成分などの日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質及び他の狂犬病ウイルス抗原成分などの狂犬病ウイルス抗原が挙げられる。ウイルス抗原の追加例については、Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991)を参照されたい。
【００３７】
本発明のｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンを用いて送達し得る抗原性標的には、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は寄生虫抗原などの抗原をコードする遺伝子が含まれる。ウイルスには、ピコルナウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビルウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、及び海綿状ウイルスが挙げられる。他のウイルス標的には、インフルエンザ、１型及び２型単純疱疹ウイルス、麻疹、デング熱、天然痘、ポリオ又はＨＩＶが挙げられる。病原体には、トリパノゾーマ、サナダムシ、回虫、蠕虫、マラリアが挙げられる。胎児性抗原や前立腺特異抗原などの腫瘍マーカーは、このようにして標的とし得る。他の例には、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質及びＢ型肝炎表面抗原が含まれる。ワクチン接種用に本発明によるベクターを投与するには、強い免疫応答が望ましいと思われる移入遺伝子の長期発現を可能とするに十分に、ベクター関連抗原が非免疫原性である必要があろう。幾つかの事例では、個人へのワクチン接種は、毎年又は２年毎など、まれにしか必要とされず、感染体から長期の免疫防御を与え得る。本発明と共にベクター中に使用し、最終的には抗原として使用する微生物、アレルゲン、並びに核酸及びアミノ酸の配列の具体例は、米国特許第６５４１０１１号明細書に見出し得るが、その関連部分、特に、本発明と共に使用し得る微生物及び特定の配列に適合する各表が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
本明細書で開示するｒＡｂワクチンと共に使用する細菌抗原には、それだけに限らないが、例えば、百日咳毒素、線維状ヘマグルチニン、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸サイクラーゼ、及び他の百日咳菌抗原成分などの細菌抗原；ジフテリア毒素又はトキソイド、及び他のジフテリア細菌抗原成分などのジフテリア細菌抗原；破傷風毒素又はトキソイド、及び他の破傷風菌抗原成分などの破傷風菌抗原；Ｍプロテイン及び他の連鎖球菌抗原成分などの連鎖球菌抗原；リポ多糖類及び他のグラム陰性細菌抗原成分などのグラム陰性バチルス菌抗原；ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａ、及び他のマイコバクテリア抗原成分などの結核菌（Mycobacterium tuberculosis）抗原；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）細菌抗原成分；ニューモリシン、肺炎球菌莢膜多糖類、及び他の肺炎球菌抗原成分などの肺炎球菌抗原；莢膜多糖類、及び他のインフルエンザ菌（haemophilus influenza）抗原成分などのインフルエンザ菌抗原；炭疽菌防御抗原、及び他の炭疽菌抗原成分などの炭疽菌抗原；ロンプＡ及び他のリケッチア細菌抗原成分などのリケッチア細菌抗原が挙げられる。他の任意の細菌、マイコバクテリア、マイコプラズマ、リケッチア又はクラミジアの抗原も、本明細書に記載の細菌抗原と共に含まれる。部分又は完全病原体としては、インフルエンザ菌、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、髄膜炎菌（neisseria meningitidis）、肺炎連鎖球菌（streptococcus pneumoniae）、淋菌（neisseria gonorrhoeae）、サルモネラ血清型チフス菌（salmonella serotype typhi）、赤痢菌（shigella）、コレラ菌（vibrio cholerae）、デング熱、脳炎、日本脳炎、ライム病、ペスト菌（Yersinia pestis）、西ナイルウイルス、黄熱病、野兎病（tularemia）、肝炎（ウイルス性、細菌性）、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）、ＨＰＩＶ１及びＨＰＩＶ３、アデノウイルス、天然痘、アレルギー並びに癌も該当し得る。
【００３９】
本発明の組成物及び方法と共に使用する真菌抗原には、それだけに限らないが、例えば、カンジダ真菌抗原成分；熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）及び他のヒストプラズマ真菌抗原成分などのヒストプラズマ真菌抗原；莢膜多糖類及び他のクリプトコッカス真菌抗原成分などのクリプトコッカス真菌抗原；小球抗原及び他のコクシジオデス（coccidiodes）真菌抗原成分などのコクシジオデス真菌抗原；並びにトリコフィチン及び他のコクシジオデス真菌抗原成分などの白癬真菌抗原が挙げられる。
【００４０】
原虫抗原及び他の寄生虫抗原の例には、それだけに限らないが、例えば、メロゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母細胞／配偶子表面抗原、血液期抗原ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ、及び他のプラスモジウム抗原成分などの熱帯熱マラリア原虫抗原；ＳＡＧ−１、ｐ３０及び他のトキソプラズマ抗原成分などのトキソプラズマ抗原；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、パラミオシン、及び他の住血吸虫抗原成分などの住血吸虫抗原；ｇｐ６３、リン脂質グリカン及びその付随タンパク質、並びに他のリーシュマニア抗原成分などのリーシュマニア主要抗原及び他のリーシュマニア抗原；更に７５〜７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原及び他のトリパノソーマ抗原成分などのトリパノゾーマ・クルージ（trypanosoma cruzi）抗原が挙げられる。
【００４１】
本発明のｒＡｂを用いて標的にできる抗原は、細胞内取込みの見込み、免疫細胞の特異性レベル、標的とする免疫細胞の型、免疫細胞の成熟度及び／又は活性化度などを含めた多数の要因に基づいて、一般に選択されよう。樹状細胞にとっての細胞表面マーカーの例には、それだけに限らないが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、Ｂ７−２、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ及び／又はＤＥＣＴＩＮ−１などが挙げられるが、同時に幾つかの事例では、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６及び／又はＣＤ５７が存在しないこともある。抗原提示細胞にとっての細胞表面マーカーの例には、それだけに限らないが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ４０、ＣＤ４５、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、及び／又はＦｃγ受容体が挙げられる。Ｔ細胞にとっての細胞表面マーカーの例には、それだけに限らないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲが挙げられる。
【００４２】
腫瘍抗原に特徴的な標的抗原を含めた、送達対象となる細胞表面上の標的抗原は、腫瘍組織細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官などに由来することになろう。本発明の抗体部分に対する腫瘍標的の例には、限定はしないが、白血病、リンパ腫などの血液癌、星状細胞種やグリア芽腫などの神経腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頚部癌、胃癌や結腸癌などの消化器癌、肝癌、膵臓癌、子宮頚部癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、睾丸癌、前立腺癌若しくは陰茎癌などの泌尿生殖器腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍、又は口唇、鼻咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆道系、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び他の神経系部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキン病リンパ腫、多発性骨髄腫及び白血病が挙げられる。
【００４３】
本発明を用いた抗原提示のために免疫細胞へ、単独又は組み合わせて送達し得る抗原の例には、腫瘍タンパク質、例えば変異した癌遺伝子；腫瘍に付随するウイルスタンパク質；並びに腫瘍のムチン及び糖脂質が挙げられる。腫瘍に付随するウイルスタンパク質とし得る抗原は、上記した部類のウイルスに由来するものとなろう。ある種の抗原は、腫瘍に特徴的なこともあり（腫瘍前駆細胞が普通発現しないタンパク質の１サブセット）、又は、腫瘍前駆細胞中で通常発現するが、腫瘍に特徴的な変異を有するタンパク質のこともある。他の抗原には、変化した活性又は細胞内分布、例えば、腫瘍抗原を生じる遺伝子の変異を有する、正常タンパク質の変異体（複数も）が含まれる。
【００４４】
腫瘍抗原の非限定的な具体例には、ＣＥＡ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１〜４、６及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２など）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（メラノーマ抗原）、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶのイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコアミニルトランスフェラーゼＶのイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａ  ｐｓｍ、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（メラノーマの遍在性変異遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（メラノーマ抗原）１、ＢＡＧＥ（メラノーマ抗原）２〜１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス核抗原）１〜６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺耐性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ−２、並びにＫｉ−６７が挙げられる。それに加え、免疫原性分子には、自己免疫疾患の開始及び／又は展開に関与する自己抗原がなることができ、その病状は、関連する標的の器官、組織又は細胞、例えばＳＬＥ若しくはＭＧが発現する分子に特異的な抗体の活性に起因するところが大きい。このような疾患では、当該自己抗原に対する進行中の抗体媒介（即ち、Ｔｈ２型）免疫応答を、細胞性（即ち、Ｔｈ１型）免疫応答へ誘導することが望ましいこともある。或いは、当該自己免疫疾患に罹ってはいないが、罹り易いと疑われる対象において、適当な自己抗原に対してＴｈ１応答を予防的に誘導することにより、自己抗原に対するＴｈ２応答の開始を予防し、又はその応答レベルを低下させることが望ましいこともある。所望の自己抗原には、限定はしないが、（ａ）ＳＬＥに関しては、Smithタンパク質、ＲＮＰリボ核タンパク質、並びにＳＳ−Ａ及びＳＳ−Ｂタンパク質と、（ｂ）ＭＧに関しては、アセチルコリン受容体とが挙げられる。１又は複数種の自己免疫応答に関与する他の種々の抗原の例には、例えば、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、テストステロン、成長ホルモン、プロラクチン及び他のホルモンなどの内因性ホルモンが挙げられる。
【００４５】
自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶に関与する抗原は、本発明の組成物及び方法において使用することができる。例えば、以下の自己免疫疾患又は障害のいずれか１又は複数に関与する抗原は、本発明において使用することができる。即ち、糖尿病、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬症、ショーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎を含むショーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物虫刺され反応によるアレルギー応答、クローン病、アフター性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病反転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血、特発性血小板減少、多発軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼球症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、及び間質性肺線維症である。自己免疫疾患に関与する抗原の例には、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、自然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体成分、サイログロブリン、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体が挙げられる。アレルギーに関与する抗原の例には、杉花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ホソムギ花粉抗原などの花粉抗原、チリダニ抗原及びネコ抗原などの動物由来抗原、組織適合性抗原、並びにペニシリン及び他の治療薬が挙げられる。移植片拒絶に関与する抗原の例には、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、及び神経の移植片成分などの、移植片受容者に移植される移植片の抗原性成分が挙げられる。この抗原は、自己免疫疾患の治療に有用な改変ペプチドリガンドの場合もある。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ（複数も）」とは、病原性ＤＮＡ又はＲＮＡがコードする多数の病原性ポリペプチドのいずれか内にあるエピトープに類似の一次、二次又は三次構造を含む、ペプチド又はタンパク質の抗原を指す。その類似度は、このようなポリペプチドに差し向けられたモノクローナル又はポリクローナル抗体も、そのペプチド又はタンパク質抗原に結合し、その抗原と反応し、又はそれ以外の方法でその抗原を認識する程度に、一般にはなろう。各種の免疫アッセイ法、例えば、全て当業者に公知のウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどが、このような抗体と共に使用し得る。ワクチンでの使用に適した病原性エピトープ及び／又はそれらの機能的等価物の同定は、本発明の一部である。分離し、同定してしまえば、機能的等価物を容易に取得し得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４５５４１０１号明細書中で教示され、親水性に基づいてアミノ酸配列からのエピトープの同定及び調製を教示するHoppの方法を採用してもよい。エピトープコア配列を同定するために、他の数件の論文に記載の方法、及びそれらに基づくソフトウェアプログラムも使用することができる（例えば、Jameson and Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; 米国特許第４５５４１０１号明細書を参照されたい）。次いで、こうした「エピトープコア配列」のアミノ酸配列は、ペプチド合成、組換え技術のいずれかを適用することにより、ペプチド中に容易に取り込み得る。
【００４７】
活性成分として本発明の抗原をコードする核酸を含んだワクチン組成物の製剤は、溶液、懸濁液いずれかの注射剤として調製し得るが、感染前の液中溶解又は懸濁に適した固形も、調製することができる。該製剤は、乳化してもよく、リポソーム中に封入してもよい。免疫原性活性成分は、薬学的に許容され、その活性成分と適合する担体と混合することがしばしばある。
【００４８】
用語「薬学的に許容される担体」とは、投与される対象においてアレルギー反応又は他の有害作用を起こさない担体を指す。薬学的に許容される適切な担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組合せの１又は複数が挙げられる。それに加え、所望であれば、ワクチンは、湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの有効性を高めるアジュバントなどの少量の補助物質を含有することができる。有効になり得るアジュバントの例には、それだけに限らないが、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、ＭＴＰ−ＰＥ、並びに細菌から抽出した３成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクワレン／Tween 80乳濁液中に含有するＲＩＢＩが挙げられる。アジュバントの他の例には、ＤＤＡ（臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム）、フロイントの完全及び不完全アジュバント、並びにＱｕｉｌＡが挙げられる。それに加え、リンホカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−１２）又はポリＩ：Ｃなどの合成ＩＦＮ−γ誘導因子などの免疫調節物質も、本明細書に記載のアジュバントと併用することができる。
【００４９】
医薬品は、本発明中に記載するように、血漿リポタンパク質上に存在するアポリポタンパク質の特異的なＤＮＡ結合部位に結合する、特定のヌクレオチド配列を単一又は多数コピーで有する裸のポリヌクレオチドを含み得る。このポリヌクレオチドは、生物活性ペプチド、アンチセンスＲＮＡ又はリボザイムをコードすることもあり、生理学的に許容される投与形態で与えられよう。本発明から生じ得る別の医薬品は、本明細書に記載の手順に従って、患者の血液又は他の供給源から単離した高精製度の血漿リポタンパク質分画と、血漿リポタンパク質上に存在するアポリポタンパク質の特異的なＤＮＡ結合部位に結合する、特定のヌクレオチド配列を単一又は多数コピーで含有し、該精製リポタンパク質分画に予め結合させたポリヌクレオチドとを生理学的に許容される投与形態で含み得る。
【００５０】
更に別の医薬品は、特定のヌクレオチド配列を単一又は多数コピーで含有するポリヌクレオチドに予め結合させた、特異的なＤＮＡ結合モチーフを単一又は多数コピーで含有する組換えアポリポタンパク質断片を含んだ、高精製度の血漿リポタンパク質分画を生理学的に許容される投与形態で含み得る。更に別の医薬品は、特定のヌクレオチド配列を単一又は多数コピーで含有するポリヌクレオチドに予め結合させた、特異的なＤＮＡ結合モチーフを単一又は多数コピーで含有する組換えアポリポタンパク質断片を含んだ、高精製度の血漿リポタンパク質分画を生理学的に許容される投与形態で含み得る。
【００５１】
投与すべき用量は、治療する対象の体重及び健康状態、並びに投与経路及び治療頻度に大いに依存する。高精製度のリポタンパク質分画に予め結合させた裸の該ポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、ポリヌクレオチド１μｇ〜１ｍｇ及びタンパク質１μｇ〜１００ｍｇの範囲の量で投与し得る。
【００５２】
患者に対するｒＡｂ及びｒＡｂ複合体の投与は、ベクターの毒性が仮にあればそれを考慮して、化学療法剤を投与するための一般手順に従うことになろう。必要な場合、治療サイクルを繰り返すことになると予想される。各種の標準療法並びに外科的介入を、上記遺伝子療法と組み合わせて適用し得ることも想定される。
【００５３】
遺伝子療法の臨床的適用を想定する場合、意図した適用に適当な医薬組成物として、該複合体を調製することが必要となろう。一般に、これには、発熱物質、並びに人間や動物に有害な恐れがある他の任意の不純物を本質的に含まない医薬組成物の調製が伴われよう。複合体を安定化させ、複合体の標的細胞による取込みを可能とするために、適当な塩及び緩衝剤を使用することも一般に望まれよう。
【００５４】
本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体又は水性媒体中に溶解又は分散された有効量の化合物を含み得る。このような組成物は、接種液と呼ぶこともできる。医薬活性物質に対するこのような媒体及び作用剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の任意の媒体又は作用剤が、活性成分と適合しない場合を除き、治療組成物におけるその使用が想定される。補助的な活性成分も、組成物中に取り込むことができる。本発明の組成物は、古典的な医薬製剤を包含し得る。分散液は、グリセロール、液状ポリエチレングリコール及びそれらの混合物、並びに油中でも調製することができる。保存及び使用の通常の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含有している。
【００５５】
疾患状態。治療する特定の疾患に応じて、本発明による治療組成物の投与は、最大の（又は、幾つかの症例では最小の）免疫応答を受ける部位へ抗原の送達量を最大化させるために、標的組織がその経路を介して利用できる限り、任意の経路を介することになろう。投与は、一般に、同所的な皮内、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内の注射によるものとなろう。他の送達域には、経口、鼻腔、口腔、直腸、膣又は局所が挙げられる。局所投与は、皮膚癌の治療には特に有利となろう。このような組成物は、生理学的に許容される担体、緩衝剤又は他の賦形剤を含んだ、薬学的に許容される組成物として通常投与されよう。
【００５６】
本発明のワクチン又は治療組成物は、非経口的に、例えば、皮下又は筋肉内いずれかの注射により投与し得る。他の投与方式に適した追加の製剤には、坐剤、及び一部の症例では、経口製剤、又はエアロゾルとしての分配に適した製剤が含まれる。経口製剤の場合、アジュバントを用いたＴ細胞サブセットの操作、抗原パッケージング、又は個々のサイトカインの各種製剤への添加により、免疫応答が最適化された改良型経口ワクチンを生じる。坐剤の場合、従来の結合剤及び担体には、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含み得る。このような坐剤は、活性成分を０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成し得る。経口製剤は、例えば、各医薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤を含む。こうした組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放製剤又は散剤の形態を取り、活性成分を１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％含有する。
【００５７】
本発明の抗原コード核酸は、中性又は塩形態としてワクチン又は治療組成物に製剤化し得る。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）が含まれ、それらは、例えば塩酸やリン酸などの無機酸、又は酢酸、蓚酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は第二鉄の水酸化物などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
【００５８】
ワクチン又は治療組成物は、投与製剤に合致した様式、並びに予防的及び／又は治療的に有効と見込まれるような量で投与される。投与すべき量は、例えば、対象の免疫系の抗体合成能を含めた治療される対象、及び所望する防御又は治療の程度に依存する。適切な用量範囲は、約１ｍｇ〜３００ｍｇの範囲、好ましくは約１０ｍｇ〜５０ｍｇの範囲などの約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲のワクチン接種当たり、活性成分がほぼ数百μｇ程度である。初回投与及び追加抗原注射に対する適切な投与計画も変化し得るが、初回投与に続き、後続の接種又は他の投与を行うのが代表的である。投与が必要な活性成分の厳密な量は、担当医の判断次第であり、対象毎に特異な量となり得る。本発明の核酸分子又は融合ポリペプチドの有効量が、とりわけ、投与スケジュール、投与する抗原の単位用量、核酸分子又は融合ポリペプチドを他の治療剤と組み合わせて投与するか否か、受容者の免疫状態及び健康状態、並びに特定の核酸分子又は融合ポリペプチドの治療活性に依存すると見込まれることは、当業者には明らかであろう。
【００５９】
該組成物は、単回用量スケジュール又は多回用量スケジュールで投与することができる。多回用量スケジュールは、ワクチン接種の一次クールが、例えば１〜１０回の個別用量を含み、続いて免疫応答の維持及び／又は強化に必要なその後の間隔で、例えば第２用量に対して１〜４カ月に、必要であれば数カ月後にその後の用量（複数も）に対して、他の用量を投与し得るスケジュールである。１〜５年、普通は３年の間隔での周期的な追加抗原注射が、防御免疫の所望レベルを維持するために望ましい。免疫接種の期間後、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をＥＳＡＴ６又はＳＴ−ＣＦと共培養するインビトロ増殖アッセイ、及び抗原刺激を受けたリンパ球から放出されるＩＦＮ−γ量の測定を行うことができる。該アッセイは、放射性核種、酵素、蛍光標識などの従来の標識を用いて行い得る。こうした技法は、当業者に公知であり、関連部分が参照により組み込まれる米国特許第３７９１９３２号、第４１７４３８４号及び第３９４９０６４号の各明細書に見出すことができる。
【００６０】
モジュール構成ｒＡｂ担体、並びに／或いはコンジュゲートｒＡｂ担体−（コヘション／ドッケリン及び／又はドッケリン−コヘシン）−抗原複合体（ｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチン）は、核酸ベクターが使用されるか否か、最終的な精製済みタンパク質又は最終的なワクチン形態が使用されるか否かに応じて、１又は複数の「単位用量」で与え得る。単位用量は、投与、即ち適当な経路及び治療計画に伴って所望の応答を生じると計算された、治療組成物の所定量を含有するものと定義される。投与すべき量、並びに特定の経路及び製剤は、臨床技術者の技術に含まれる。治療を受ける対象も、特に、対象の免疫系の状態及び所望の防御について評価を受け得る。単位用量は、単回注射として投与する必要はなく、設定した期間に亘る連続注入を包含し得る。本発明の単位用量は、ＤＮＡ／ｋｇ（又はタンパク質／Ｋｇ）体重に換算して都合よく表現し得るが、ＤＮＡ又はタンパク質／ｋｇ体重で約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５、１、１０、５０、１００、１０００ｍｇ、又はそれより多量の間の範囲が投与される。同様に、ｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの送達量は、約０．２〜約８．０ｍｇ／ｋｇ体重で変化することができる。したがって、特定の実施形態では、ワクチン０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．８ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、４．０ｍｇ、５．０ｍｇ、５．５ｍｇ、６．０ｍｇ、６．５ｍｇ、７．０ｍｇ及び７．５ｍｇをインビボで個体へ送達し得る。投与すべきｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの用量は、治療される対象の体重及び体調、並びに投与経路及び治療頻度に大いに左右される。リポソーム又はウイルス送達ベクターに予め結合した裸のポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、ポリヌクレオチド１μｇ〜１ｍｇ乃至タンパク質１μｇ〜１００ｍｇの範囲の量で投与し得る。したがって、特定の組成物は、ポリヌクレオチド又はタンパク質約１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ又は１０００μｇの間を、ベクター１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３．０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ又は１００ｍｇに独立に結合した状態で含み得る。
【００６１】
本発明は、Ｆｌｕ抗原の標的となった樹状細胞によるヒトＦｌｕ特異的Ｔ細胞の免疫刺激を測定するインビトロ細胞系で試験した。本明細書に示す結果は、この系でそれ自体は無効である抗原の用量における、このような抗原特異細胞の特異的増殖を示している。
【００６２】
本発明は、例えば、リシン、炭疽毒素及びブドウ球菌Ｂ型エンテロトキシン由来の防御抗原と複合した組換えヒト化ｍＡｂ（ヒト樹状細胞の特異的受容体へ導かれる）である、モジュール構成ｒＡｂ担体を作製するためにも使用し得る。この構成体の潜在的市場は、全軍人のワクチン接種、及びこうした作用剤に関わる任意の生物的脅威に応じて大きな人口中核へ投与するために蓄えられる貯蔵ワクチンである。本発明は、人間、動物双方で使用するためのワクチン一般の設計に対して、広い用途を有する。所望の産業には、製薬産業及び生物工学産業が含まれる。
【００６３】
本発明は、抗原に対する効力ある広範な免疫応答を誘発するために、抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に特異的に差し向ける（送達する）組成物及び方法を、ワクチンを含めて包含する。こうした組成物は、抗原が由来した作用剤（病原体又は癌）に対する防御的又は治療的な免疫応答を誘発する。それに加え、本発明は、抗原提示細胞上に発現したＣＬＥＣ−６受容体への特異的な会合を介して、直接的に又は他の作用剤と協調して、治療性を示す作用剤も創出する。
【００６４】
材料及び方法
抗体及び四量体：イソタイプ対照Ａｂを含め、ＤＣ及びＢ細胞を表面染色する抗体（Ａｂ）は、BD Biosciences（CA）から購入した。ＥＬＩＳＡ用Ａｂは、Bethyl（TX）から購入した。抗ＢＬｙＳ抗体及び抗ＡＰＲＩＬ抗体は、PeproTech（NJ）から得た。四量体のＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（Ｆｌｕ  Ｍ１）及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（Ｍａｒｔ−１）は、Beckman Coulter（CA）から購入した。
【００６５】
細胞及び培養物：健常ドナーの単球（１×１０６個／ｍｌ）を、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）（R & D, CA）を含有するCellgenics（フランス）培地中で培養した。３日目及び６日目のために、ＤＣ、同量の各サイトカインをそれぞれ１日目及び３日目に培地中に補給した。Ｂ細胞はネガティブ分離キット（BD）で精製した。ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞は、抗ＣＤ４又はＣＤ８抗体（Milteniy, CA）で被覆した磁気ビーズで精製した。ＰＢＭＣは、密度勾配遠心分離によりPercoll（商標）勾配（GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK）を用いて軟膜から分離した。ＤＣ活性化のために、１×１０５個のＤＣをｍＡｂ被覆９６ウェルプレート中で１６〜１８時間培養した。炭酸塩緩衝液ｐＨ９．４中のｍＡｂ（１〜２μｇ／ウェル）を少なくとも３時間、３７℃でインキュベートした。培養上清を採集し、サイトカイン／ケモカインをLuminex（Biorad, CA）で測定した。遺伝子分析のために、ＤＣをｍＡｂで被覆したプレート中で８時間培養した。幾つかの実験では、可溶性のＣＤ４０Ｌ（R & D, CA）５０ｎｇ／ｍｌ又はＣｐＧ（InVivogen, CA）５０ｎＭを培養物中に添加した。ＤＣ及びＢ細胞の共培養では、１０％ＦＣＳ及び抗体（Biosource, CA）入りのＲＰＭＩ１６４０に再浮遊した５×１０３個のＤＣを、ｍＡｂで被覆したプレート中で少なくとも６時間先ず培養し、次いでＣＦＳＥ（Molecular Probes, OR）で標識した精製自己Ｂ細胞１×１０５個を添加した。幾つかの実験では、ＤＣに熱不活化インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８Ｈ１Ｎ１）を５モイ（感染多重度）、２時間でパルス接種した後、Ｂ細胞と混合した。ＤＣ及びＴ細胞の共培養では、５×１０３個のＤＣを、１×１０５個の精製自己ＣＤ８  Ｔ細胞又は混合同種Ｔ細胞と共に培養した。同種Ｔ細胞には、インキュベーションの最後１８時間に１μＣｉ／ウェルの３［Ｈ］−チミジンをパルス投与した後、ｃｐｍをβ−カウンター（Wallac, MN）で測定した。５×１０５個のＰＢＭＣ／ウェルを、ｍＡｂで被覆したプレート中で培養した。Ｍａｒｔ−１及びＦｌｕ  Ｍ１特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度は、それぞれ培養の１０日目及び７日目に抗ＣＤ８抗体及び四量体で細胞を染色することにより、測定した。Ｍａｒｔ−１ペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）１０μＭ、及びＭａｒｔ−１ペプチドを含有する組換えタンパク質（下記を参照）２０ｎＭを、ＤＣ及びＣＤ８  Ｔ細胞培養物に添加した。精製組換えＦｌｕ  Ｍ１タンパク質（下記を参照）２０ｎＭをＰＢＭＣ培養物に添加した。
【００６６】
モノクローナル抗体：マウスｍＡｂを従来技術により生成した。手短に言うと、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質２０μｇでＲｉｂｉアジュバントと共に腹腔内で免疫した後、１０日後及び１５日後に抗原２０μｇで追加免疫する。３カ月後に、マウスを再び追加免疫した後、脾臓を取り出した。代替として、マウスの足蹠に、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原１〜１０μｇを３０〜４０日の期間に亘り３〜４日毎に注射した。最終の追加免疫から３〜４日後、流入領域リンパ節を採集した。脾臓のＢ細胞又はリンパ節細胞をＳＰ２／Ｏ−Ａｇ  １４細胞と融合した。ハイブリドーマ上清のスクリーニングによって、受容体外部ドメイン融合タンパク質に対するＡｂを、その融合相手単独、又はアルカリホスファターゼに融合した受容体外部ドメインと比較して分析した（Bates, E. E., N. Fournier, E. Garcia, J. Valladeau, I. Durand, J. J. Pin, S. M. Zurawski, S. Patel, J. S. Abrams, S. Lebecque, P. Garrone, and S. Saeland. 1999. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol 163:1973-1983）。次いで、全長受容体ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドを一過性にトランスフェクトした２９３Ｆ細胞を用いたＦＡＣＳにおいて、陽性ウェルをスクリーニングした。選択したハイブリドーマに単細胞クローニングを行い、CELLineフラスコ（Integra, CA）中で増殖させた。ハイブリドーマ上清を１．５Ｍグリシン、３Ｍ  ＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．８の同容量と混合し、それをMabSelect樹脂と共に回転させた。その樹脂を結合緩衝液で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。２Ｍトリスで中和後、ｍＡｂをＰＢＳに対して透析した。
【００６７】
ＥＬＩＳＡ：ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡの総量、並びにフル（flu）特異免疫グロブリン（Ｉｇ）を測定するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。既知量のＩｇを含有する標準ヒト血清（Bethyl）及びヒトＡＢ血清を、それぞれ総Ｉｇ及びフル特異Ｉｇの標準として使用した。試料中のフル特異Ａｂ力価（単位）は、同一の光学密度を示すＡＢ血清の希釈倍率と定義した。ＢＡＦＦ及びＢＬｙＳの量は、ＥＬＩＳＡキット（Bender MedSystem, CA）で測定した。
【００６８】
ＲＮＡの精製及び遺伝子分析：総ＲＮＡは、RNeasyカラム（Qiagen）で抽出し、2100 Bioanalyzer（Agilent）で分析した。ビオチン標識ｃＲＮＡ標的は、Illumina totalprep標識キット（Ambion）を用いて調製し、Sentrix Human6 BeadChip（４６Ｋ転写物）とハイブリッドを形成させた。これらのマイクロアレイは、シリコンウェーハの表面にエッチングしたマイクロウェル中に留置した、３μｍビーズに結合した５０量体オリゴヌクレオチドプローブからなる。ストレプトアビジン−Ｃｙ３で染色後、Illuminaにより製造されたサブミクロン分解能スキャナー（Beadstation 500X）を用いてアレイ表面を結像させる。遺伝子発現分析用ソフトウェアプログラムのGeneSpring, Version 7.1（Agilent）を用いてデータ解析を行った。
【００６９】
組換えＦｌｕ  Ｍ１及びＭＡＲＴ−１タンパク質の発現及び精製：開始コドンに対して遠位にあるNhe I部位、及び終止コドンに対して遠位にあるNot I部位を取り込みながら、ＰＣＲを用いてInfluenza A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai（Ｈ１Ｎ１）Ｍ１遺伝子のＯＲＦを増幅させた。切断したその断片をpET28b(+)（Novagen）中にクローニングする際に、Ｍ１  ＯＲＦをＨｉｓ６タグとインフレームに配置し、したがってＨｉｓ．Ｆｌｕ  Ｍ１タンパク質をコードした。Nco I及びNhe I部位の間に挿入した、Ｃ．サーモセラム（C. thermocellum）由来のＮ末端１６９残基のコヘシンドメインをコードするpET28b(+)誘導体（未公表）は、Ｃｏｈ．Ｈｉｓを発現した。コヘシン−Ｆｌｅｘ−ｈＭＡＲＴ−１−ペプチドＡ−Ｈｉｓを発現させるために、上記ベクターのNhe I及びXho I部位の間に、配列GACACCACCGAGGCCCGCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCGGAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATCGGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCGGCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCG（配列番号１）（DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP（配列番号２）をコードし、陰影付き残基は免疫支配的なＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドであり、そのペプチドを囲む下線付き残基はＭＡＲＴ−１由来である）を挿入した。該タンパク質は、カナマイシン耐性（４０μｇ／ｍｌ）により選択し、ＩＰＴＧ１２０ｍｇ／Ｌを添加した対数増殖期中期まで２００回／分で振とうすることにより、ＬＢ中３７℃で増殖させた大腸菌（E. coli）BL21株（DE3）（Novagen）又はT7 Express株（NEB）中に発現させた。３時間後、細胞を遠心分離により採集し、−８０℃で保存した。各１Ｌの発酵で得た大腸菌細胞を、プロテアーゼ阻害剤Cocktail II（Calbiochem, CA）０．１ｍｌ入りの氷冷した５０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０（バッファーＢ）３０ｍｌ中に再浮遊させた。その細胞を設定１８（Fisher Sonic Dismembrator 60）で休止期間５分を入れて、氷上２×５分超音波処理し、次いで１７０００ｒｐｍで４℃、２０分間遠心した（Sorvall SA-600）。Ｈｉｓ．Ｆｌｕ  Ｍ１精製のために、細胞溶解上清５０ｍｌ分画をQ Sepharoseビーズ５ｍｌ中に通し、１６０ｍＭトリス、４０ｍＭイミダゾール、４Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．９の６．２５ｍｌをQ Sepharoseに添加して、流し通した。この液を、Ｎｉ＋＋を投入した５ｍｌのHiTrapキレートＨＰカラム上へ４ｍｌ／分で添加した。カラム結合タンパク質を２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．６（バッファーＤ）で洗浄した後、１００ｍＭ  Ｈ３ＣＯＯＮａ  ｐＨ４．０でもう１回洗浄した。結合タンパク質を１００ｍＭ  Ｈ３ＣＯＯＮａ  ｐＨ４．０で溶出した。ピーク分画をプールし、１００ｍＭ  Ｈ３ＣＯＯＮａ  ｐＨ５．５で平衡化した５ｍｌのHiTrap Sカラム上へ４ｍｌ／分で添加し、平衡緩衝液で洗浄後、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ５．５中の勾配０〜１Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。約５００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出するピーク分画をプールした。Ｃｏｈ．Ｆｌｕ  Ｍ１．Ｈｉｓ精製のために、培養物２Ｌの細胞を上記のように溶解した。遠心分離後、２．５ｍｌのTriton X114を上清へ添加し、氷上で５分間インキュベーションを行った。２５℃で５分間更にインキュベーションした後、２５℃での遠心分離後、上清をTriton X114から分離した。この抽出を繰り返し、上清をQ Sepharoseビーズ５ｍｌ中に通し、１���０ｍＭトリス、４０ｍＭイミダゾール、４Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．９の６．２５ｍｌをQ Sepharoseに添加して、流し通した。次いで、そのタンパク質を上記のようにＮｉ＋＋キレートクロマトグラフィーで精製し、バッファーＤ中の０〜５００ｍＭイミダゾールで溶出した。
【００７０】
抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂのＬ及びＨ可変領域に対応する特定の配列：本発明は、治療又は防御製品の望ましい成分（例えば、ヒト化組換え抗体に関して）である抗ＣＬＥＣ−６モノクローナル抗体に対応する、以下に示す特定のアミノ酸配列を包含する。以下の配列は、マウスＶ領域（下線）−ヒトＣ領域（太字）の組換えキメラ抗体に関するそのような配列である。
【００７１】
【表１】
2010519313.tif 000002
【００７２】
本発明は、例えば、ＣＬＥＣ−６に対する親和性を高めるために、熟練した当業者により修飾される、及び／又は抗原提示細胞上のＣＬＥＣ−６に結合できるタンパク質形態の発現を指示するために、発現ベクター中へ操作するようにヒトＶ領域枠組み構造配列中に組み込まれる、Ｖ領域配列及び関連配列の使用を包含する。図７Ｅは、例えば、前臨床でのインビトロ分析で使用するための操作・作製形態を示す。更に、本発明に開示される（又は、本明細書に開示される独特な生物学のための同様な方法及び篩を用いて誘導される）その他のｍＡｂは、同様な手段を介して（始めに、マウスハイブリドーマＶ領域のＰＣＲクローニング及び配列決定を介して）、同様な組換え抗体（ｒＡｂ）をコードする発現構築物にすることができる。このような抗ＣＬＥＣ−６  Ｖ領域は、治療用ｒＡｂの潜在的な免疫反応性を最小限とするように、熟練した当業者により更に「ヒト化」することができる（即ち、マウス特異結合配列をヒトＶ領域枠組み構造配列上にグラフトすることができる）。
【００７３】
作製した組換え抗ＣＬＥＣ−６組換え抗体−抗原融合タンパク質（ｒＡｂ．抗原）は、インビトロで有効な試作ワクチンであり、発現ベクターは、例えばＨ鎖コード配列にインフレームで融合した、多様なタンパク質コード配列で構築することができる。例えば、インフルエンザＨＡ５、インフルエンザＭ１、ＨＩＶ  ｇａｇ若しくは癌抗原由来の免疫支配的ペプチドなどの抗原、又はサイトカインは、ｒＡｂ．抗原又はｒＡｂ．サイトカインの融合タンパク質として後に発現できるが、こうしたものは、本発明に関しては、抗ＣＬＥＣ−６  Ｖ領域配列の使用により、ＣＬＥＣ−６を保持する抗原提示細胞へ抗原又はサイトカイン（又は毒素）を直接連れ込むことから得られる有用性をもつことができる。これにより、受容体の活性化を時々伴う、例えば抗原の細胞内取込み、及び治療又は防御作用のそれに続く開始（例えば、有効な免疫応答の開始、又は標的細胞の殺滅を介して）が可能となる。この概念に基づくワクチンは、細胞下に示すような配列をコードするＨ鎖ベクターを使用することができよう。上記の図７Ｅは、前臨床インビトロ分析用のｒＡｂの一例を示している。即ち、以下の通りである。
【００７４】
【表２】
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2010519313.tif 000004
【００７５】
抗ＣＬＥＣ−６組換え抗体に基づく試作ワクチンの構築に関する方法：
マウス／ヒトキメラｍＡｂのｃＤＮＡクローニング及び発現：総ＲＮＡをハイブリドーマ細胞（RNeasy kit, Qiagen）から調製し、ｃＤＮＡ合成、並びに受給５’プライマー及び遺伝子特異的３’プライマー：
ｍＩｇＧκ、5'ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3'（配列番号８）、
ｍＩｇＧλ、5'ctaggaacagtcagcacgggacaaactcttctccacagtgtgaccttc3'（配列番号９）、
ｍＩｇＧ１、5'gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc3'（配列番号１０）、
ｍＩｇＧ２ａ、5'ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt3'（配列番号１１）、及び
ｍＩｇＧ２ｂ、5'ggtgctggaggggacagtcactgagctgctcatagtgt3'（配列番号１２）
を用いたＰＣＲ（SMART RACE kit, BD Biosciences）のために使用した。
【００７６】
ＰＣＲ産物をクローニング（pCR2.1 TA kit, Invitrogen）し、ＤＮＡの配列決定で特徴付けた。マウスＨ及びＬ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡに対する誘導配列を用いて、特異的プライマーの使用により、下流のヒトＩｇＧκ又はＩｇＧ４Ｈ領域をコードする発現ベクター中にクローニングするための隣接制限酵素部位を取り込みながら、シグナルペプチド及びＶ領域のＰＣＲ増幅を行った。キメラｍＶκ−ｈＩｇκの発現用ベクターは、Xho I及びNot I部位に挟まれた４０１〜７３１残基（ｇｉ｜６３１０１９３７｜）を増幅し、pIRES2-DsRed2（BD Biosciences）のXho I−Not I間隔中にこれを挿入することにより、構築した。ＰＣＲを用いて開始コドンからｍＡｂ  Ｖｋ領域を増幅し、Nhe I又はSpe I部位、次いでCACCを（例えば、ｇｉ｜７６７７９２９４｜の１２６残基）をコードする領域に付け足し、Xho I部位を付け足した。次いで、そのＰＣＲ断片を上記ベクターのNhe I−Not I間隔中にクローニングした。ｍＳＬＡＭリーダー配列を用いたキメラｍＶκ−ｈＩｇκ用ベクターは、配列5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggcccactcgag3'（配列番号１３）を上記ベクターのNhe I− Xho I間隔中に挿入することにより、構築した。ＰＣＲを用いて、予測される成熟Ｎ末端コドン（SignalP3.0 Serverを用いて確定した）（Bendtsen, J. D., H. Nielsen, G. von Heijne, and S. Brunak. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J Mol Biol 340:783-795）とｍＶκ領域の末端（上記で確定したもの）との間隔を、5'tcgtacgga3'を付け足しながら増幅した。Bsi WI及びXho Iで切断した断片を上記ベクターの対応部位中に挿入した。対照ｈＩｇκ配列は、ｇｉ｜４９２５７８８７｜の２６〜８５残基及びｇｉ｜２１６６９４０２｜の６７〜７０９残基に対応する。対照ｈＩｇＧ４Ｈベクターは、ジスルフィド結合を安定化し、残存ＦｃＲ結合性を廃棄した（Reddy, Kinney et al. 2000）Ｓ２２９Ｐ及びＬ２３６Ｅの置換を有する、ｇｉ｜１９６８４０７２｜の１２〜１４７３残基であって、ｐＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄ２ベクターのBg1 II及びNot I部位の間に、終止コドンの代わりに配列5'gctagctgattaattaa3'（配列番号１４）を付加しながら挿入したものに対応する。ＰＣＲを用いて開始コドンからｍＡｂ  ＶＨ領域を増幅し、ｇｉ｜１９６８４０７２｜の４７３残基をコードする領域にCACCを、次いでBg1 II部位を付け足した。次いで、ＰＣＲ断片を上記ベクターのBg1 II−Apa I間隔中にクローニングした。ｍＳＬＡＭリーダー配列を用いたキメラｍＶＨ−ｈＩｇＧ４用ベクターは、配列5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaag ggccc3'（配列番号１５）を上記ベクターのNhe I−Apa I間隔中に挿入することにより、構築した。ＰＣＲを用いて、予測される成熟Ｎ末端コドンとｍＶＨ領域の末端との間隔を、5'tcgtacgga3'を付け足しながら増幅した。Bsi WI及びApa Iで切断した断片を上記ベクターの対応部位中に挿入した。
【００７７】
近位Nhe I部位及び遠位Not I部位に挟まれ、終止コドンに続く各種の抗原コード配列を、Ｈ鎖ベクターのNhe I−Pac I−Not I間隔中に挿入した。Ｆｌｕ  ＨＡ１−１は、近位配列5'gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaa3'（ｃｉｐＡコヘシン−コヘシンリンカー残基をコードする配列が後続するNhe I部位）、並びに遠位配列5'caccatcaccatcaccattgagcggccgc3'（Ｈｉｓ６、終止コドン及びNot I部位をコードする）を有する、Ａ型インフルエンザウイルス（A/Puerto Rico/8/34(H1N1)）ヘマグルチニンｇｉ｜２１６９３１６８｜の８２〜１０２５残基（Ｃ９８２Ｔの変換あり）によりコードされていた。Ｆｌｕ  ＨＡ５−１は、Ｆｌｕ  ＨＡ１−１と同じ各配列が結合した、ｇｉ｜５０２９６０５２｜Ａ型インフルエンザウイルス（A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)）のヘマグルチニンの４９〜９９０残基によりコードされていた。Ｄｏｃは、近位Nhe I及び遠位Not I部位を有するｇｉ｜４０６７１｜ｃｅｌＤの１９２３〜２１５０残基によりコードされていた。ＰＳＡは、近位配列5'gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaacaccgacaacaacacttctagcgc3'（配列番号１６）（Nhe I部位及びｃｉｐＡスペーサー）、並びに遠位Not I部位を有する、前立腺特異抗原ｇｉ｜３４７８４８１２｜の１０１〜８３２残基によりコードされていた。Ｆｌｕ  Ｍ１−ＰＥＰは、5'gctagccccattctgagccccctgaccaaaggcattctgggctttgtgtttaccctgaccgtgcccagcgaacgcaagggtatacttggattcgttttcacacttacttaagcggccgc3'（配列番号１７）によりコードされていた。これ及び他の全てのペプチドコード配列は、Nhe I及びNot I制限Ｈ鎖ベクター、又はNhe I−Xho I制限Ｃｏｈ．Ｈｉｓベクター中へのクローニングに末端が適合する、相補的な合成ＤＮＡ断片の混合物を介して創製された。制限酵素部位を組み込む必要がある場合、又はＣｉｐＡスペーサー配列中を除いて、好ましいヒトコドンを常に使用した。
【００７８】
ｒＡｂ発現構築物の産生量は、Ｌ鎖及びＨ鎖構築物を各々約２．５μｇ並びに上記の手順を用いた、一過性トランスフェクション体５ｍｌ中で試験した。上清は、抗ｈＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡ（AffiniPureヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Jackson ImmunoResearch）で分析した。この手順の試験では、分泌ｒＡｂの産生量は、Ｈ鎖及びＬ鎖ベクター濃度に対して、各ＤＮＡ濃度の約２倍範囲に亘り依存性がなかった（即ち、この系はＤＮＡ飽和をしていた）。
【００７９】
本発明は、新規な抗ヒトＣＬＥＣ−６抗体試薬の開発、特性決定及び使用、並びに本発明及びその想定される応用の基礎となる新規な生物学を発見するためのその使用を包含する。要約すれば、新規な抗ＣＬＥＣ−６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、抗原提示細胞上に見出されるこの細胞表面受容体に関連するこれまで未知の生物学を明らかにするために、開発され、使用された。この新規な生物学は、多様な治療及び防御用途のために、この受容体を活性化する抗ＣＬＥＣ−６抗体作用剤の応用を高度に予測する。以下に提示するデータは、当初の予測を強く支持し、この場で明らかにされる発見を臨床的応用に変換する道筋を示す。
【００８０】
ヒトＣＬＥＣ−６に対する高親和性モノクローナル抗体の開発：受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１Ｆｃ）及びＡＰ（ヒト胎盤アルカリホスファターゼ）の融合タンパク質を、それぞれマウスの免疫及びｍＡｂのスクリーニングのために生成した。ＤＣＩＲ外部ドメイン．ＩｇＧのための発現構築物は、以前に記載されており（Bates, E. E., N. Fournier, E. Garcia, J. Valladeau, I. Durand, J. J. Pin, S. M. Zurawski, S. Patel, J. S. Abrams, S. Lebecque, P. Garrone, and S. Saeland. 1999. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol 163:1973-1983）、マウスＳＬＡＭ（ｍＳＬＡＭ）シグナルペプチドを用いて分泌を誘導した（Bendtsen, J. D., H. Nielsen, G. von Heijne, and S. Brunak. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J Mol Biol 340:783-795）。ｈＤＣＩＲ外部ドメイン．ＡＰのための同様な発現構築物を、ＡＰの１３３〜１５８１残基（ｇｂ｜ＢＣ００９６４７｜）を増幅すると同時に、近位のインフレームXho I部位、並びに遠位のＴＧＡ終止コドン及びNot I部位を付加するために、ＰＣＲを用いて生成した。このXho I −Not I断片は、上記のＤＣＩＲ外部ドメイン．ＩｇＧベクターにおけるＩｇＧコード配列を置き換えた。同じＩｇ及びＡＰベクターシリーズ中のＣＬＥＣ−６外部ドメイン構築物は、ＣＬＥＣ−６（ｂｐ３１７〜８３８、ｇｉ｜３７５７７１２０｜）をコードする挿入配列を含有していた。ＣＬＥＣ−６融合タンパク質は、FreeStyle（商標）293 Expression System（Invitrogen）を用い、製造業者の手順書（トランスフェクション１Ｌ当たり総プラスミドＤＮＡ１ｍｇを293 Fectin試薬１．３ｍｌと共用）に従って生成した。ｒＡｂ産生のために、Ｈ及びＬ鎖をコードするベクターを同量、同時にトランスフェクトした。トランスフェクト済み細胞を３日間培養し、培養上清を採集し、新鮮培地を添加してインキュベーションを２日間継続した。プールした上清はろ過により清澄化した。受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧは、HiTrapプロテインＡアフィニティクロマトグラフイーにより、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７による溶出を用いて精製し、次いでＰＢＳに対して透析した。ｒＡｂ（後述する組換え抗体）は、HiTrap MabSelect（商標）カラムを使用して同様に精製した。マウスｍＡｂは、従来の細胞融合技術によって生成した。手短に言うと、６週齢のマウスの腹腔内に、受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質２０μｇをＲｉｂｉアジュバントと共に免疫接種し、次いで１０日後及び１５日後に抗原２０μｇで追加免疫した。３カ月後、マウスを再度追加免疫してから３日後に脾臓を取り出した。代替として、マウスの足蹠に、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原１〜１０μｇを３０〜４０日の期間に亘り３〜４日毎に注射した。最終の追加免疫から３〜４日後、流入領域リンパ節を採集した。脾臓のＢ細胞又はリンパ節細胞をＳＰ２／Ｏ−Ａｇ  １４細胞（Shulman, M., C. D. Wilde, G. Kohler, M. J. Shulman, N. S. Rees, D. Atefi, J. T. Horney, S. B. Eaton, W. Whaley, J. T. Galambos, H. Hengartner, L. R. Shapiro, and L. Zemek. 1978）と従来技法を用いて融合した。ＥＬＩＳＡを用いて、当該融合相手単独と比較して、又はアルカリホスファターゼに融合した受容体外部ドメインに比して、受容体外部ドメイン融合タンパク質に対するハイブリドーマ上清をスクリ��ニングした（Bates, E. E., N. Fournier, E. Garcia, J. Valladeau, I. Durand, J. J. Pin, S. M. Zurawski, S. Patel, J. S. Abrams, S. Lebecque, P. Garrone, and S. Saeland. 1999. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol 163:1973-1983）。次いで、全長受容体ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドを一過性にトランスフェクトした２９３Ｆ細胞を用いたＦＡＣＳにおいて、陽性のウェルをスクリーニングした。選択したハイブリドーマに単細胞クローニングを行い、無血清培地に適応させ、CELLineフラスコ（Integra）中で増殖させた。ハイブリドーマ上清を１．５Ｍグリシン、３Ｍ  ＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．８の同容量と混合し、それをMabSelect樹脂と共に回転させた。その樹脂を結合緩衝液で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。２Ｍトリスで中和後、ｍＡｂをＰＢＳに対して透析した。
【００８１】
精製抗ＣＬＥＣ−６モノクローナル抗体の直接及び間接ＥＬＩＳＡによる特性決定：数種の抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂの相対的親和性についてＥＬＩＳＡにより、ハイブリドーマクローンを試験した（即ち、ＣＬＥＣ−６．Ｉｇタンパク質をマイクロタイタープレート表面上に固定化し、ＣＬＥＣ−６．Ｉｇに対する結合能（抗マウスＩｇＧ．ＨＲＰコンジュゲート試薬で検出した場合）について用量滴定系列において、該抗体を試験する）。各パネルは、ＣＬＥＣ−６．Ｉｇタンパク質に対するｍＡｂ反応性、（Ａ及びＤ）、ｈＩｇＧＦｃタンパク質に対するｍＡｂ反応性、及び（Ｂ及びＥ）ＣＬＥＣ−６．アルカリホスファターゼ融合タンパク質に対するｍＡｂ反応性（Ｃ及びＦ）である。後者の場合、ｍＡｂは、プレート結合しており（抗マウスＩｇＧ抗体試薬を介して）、溶液中の一定量のＣＬＥＣ−６．ＡＰと結合する。この結果は、抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂが、高い親和性でＣＬＥＣ−６外部ドメインに特異的に反応することを示している。
【００８２】
全長ＣＬＥＣ−６を発現する２９３Ｆ細胞に対する、精製抗ＣＬＥＣ−６モノクローナル抗体ＦＡＣＳの特性決定：数種の抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂの相対的親和性に関する試験をＦＡＣＳにより行った（即ち、様々な濃度のＣＬＥＣ−６．ｍＡｂを、ＣＬＥＣ−６を発現する２９３Ｆ細胞とインキュベートした。洗浄後、細胞をＰＥで誘導体化した抗マウスＩｇＧ試薬で染色した。結果は、ＣＬＥＣ−６を発現しない２９３Ｆ細胞への染色に対して補正した平均蛍光強度である。）。示した４種のｍＡｂは全て、ＣＬＥＣ−６保持細胞を特異的に染色し、その染色力の順位は、１２Ｈ７〜１２Ｅ３＞９Ｄ５＞２０Ｈ８である。
【００８３】
インビボ及びインビトロの培養ＤＣはＣＬＥＣ−６を発現する：健常ドナーのＰＢＭＣ上におけるＣＬＥＣ−６の発現量をＦＡＣＳで測定した。図１ａに示すように、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ、ＣＤ１４＋単球、及びＣＤ１９＋Ｂ細胞を含む抗原提示細胞は、ＣＬＥＣ−６を発現する。しかし、ＣＤ３＋Ｔ細胞はＣＬＥＣ−６を発現しない。ＣＤ５６＋ＮＫ細胞はＣＬＥＣ−６を発現しなかった（データは示していない）。インビトロ培養のＤＣ、並びに精製した血中骨髄性ＤＣ（ｍＤＣ）及び形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）上のＣＬＥＣ−６の発現量も、決定した。図１ｂのデータは、ＩＬ−４ＤＣ及びＩＦＮＤＣが、共に有意量のＣＬＥＣ−６を発現することを示している。インビトロ培養のＤＣ上におけるＣＬＥＣ−６の発現量は、ＣＬＥＣ−６の機能を明らかにすることを目的とした実験でこれらの細胞の使用を可能にするので、有意な量である。ｍＤＣも多量のＣＬＥＣ−６を発現するが、ｐＤＣはＣＬＥＣ−６を発現しない（データは示していない）。後者の観察結果は、血液から直接分離された細胞に当てはまり、しかも、ＣＬＥＣ−６がＤＣ型全てに存在するわけではなく、したがって、ＣＬＥＣ−６を介して導かれる生物学が、異なる免疫機能を有することが知られている特定のＤＣ型を対象にできるとの示唆を示すので、特に重要である。
【００８４】
ＤＣを活性化できる抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂの選択：マウス抗ヒトＣＬＥＣ−６  ｍＡｂを産生する１２種の異なるハイブリドーマクローンを分離し、産生されるｍＡｂのＤＣ活性化能を、ＤＣ表現型、並びにＤＣから分泌されるサイトカイン及びケモカインを測定することにより試験した。図２のデータは、ＤＣを活性化するそのようなｍＡｂの特定を可能にする一例を示す。４種の抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂのうち、Ａｂ４９は、ＤＣを活性化し、有意量の分泌ＩＬ−６、ＭＩＰ−１ａ、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０及びＴＮＦａを産生するように、ＤＣを誘導することができた。こうした抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂは、ＤＣを刺激することにより、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１ａ及びＩＬ−１ｂも産生する（データは示していない）。他の３種の抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂもＤＣを活性化し、各ｍＡｂは、ＤＣを刺激することにより、異なる量のサイトカイン及びケモカインを産生する。
【００８５】
以上のデータは、ある種の高親和性抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂだけがヒトＤＣを活性化できるという、これまで未知の生物学を示している。ＤＣによりサイトカイン分泌を誘発するこの能力は、このような抗ＣＬＥＣ−６抗体剤が、インビボで免疫応答に影響し得ることを示唆している。
【００８６】
ＣＬＥＣ−６を介したシグナル伝達はＤＣ細胞表面マーカーを活性化する：ＤＣは、活性化に応じて免疫応答の結果、誘導又は寛容のいずれかを決定する、一次免疫細胞である（Banchereau, J., F. Briere, C. Caux, J. Davoust, S. Lebecque, Y. J. Liu, B. Pulendran, and K. Palucka. 2000. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 18:767-811）。この研究で生成した抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂの幾つかは、インビトロ培養のＩＦＮＤＣを活性化することができ（図２）、異なるＤＣサブセット（ＩＬ−４ＤＣ及び血中ｍＤＣ．ＩＬ−４ＤＣ）の活性化におけるＣＬＥＣ−６の役割も試験した。ＩＬ−４ＤＣを抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂで刺激したが、図３ａのデータは、ＣＬＥＣ−６を介したシグナルが、ＩＬ−４ＤＣを活性化し、その結果、細胞表面マーカーのＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲの発現量が増加することを示す。抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂはインビボのＤＣも活性化する：精製ｍＤＣを抗ＣＬＥＣ−６抗体で１８時間刺激した後、細胞を抗ＣＤ８６、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色した。図３ｂに示すように、抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂは、ｍＤＣを活性化することにより増加量のＣＤ８６、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲを発現する。図３Ａ及び３Ｂのデータは、特異的な抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂによるＤＣの活性化によって、ＤＣ機能において重要なことがよく知られている細胞表面分子の上方調節を含むことを示している。
【００８７】
ＣＬＥＣ−６を介したシグナル伝達はＤＣ遺伝子を特異的に活性化する：抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂで刺激したＤＣは、副刺激性分子並びにケモカイン及びサイトカイン関連遺伝子を含めた、多数の遺伝子の増加量を一貫して発現する（図４）。ＤＣ−ＡＳＧＰＲ及びＬＯＸ−１を含む他のレクチンを介したシグナル（データは示していない）と比較して、抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂは独特な様式でＤＣを活性化し、これは、ＣＬＥＣ−６を介して活性化されたＤＣが、独特な体液性及び細胞性の免疫応答を生じることを示唆している。
【００８８】
ＣＬＥＣ−６を介したシグナル伝達は異なるＤＣサブセットの遺伝子を活性化する：インビトロ培養のＩＬ−４ＤＣ及びｍＤＣの双方は、抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂで刺激した際、分泌ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１及びＩＬ−８の有意増加量を産生する。ＴＮＦａ、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１ａ、ＩＬ−１ａ及びＩＬ−１ｂを含む、他のサイトカイン及びケモカインの増加量も、抗ＣＬＥＣ−６抗体で刺激したＤＣの培養上清中に観察された（データは示していない）。このようなサイトカインは、免疫応答の重要なメディエーターであることがよく知られており、特定の抗ＣＬＥＣ−６抗体剤がそれらの産生を誘発するとの発見は、このような作用剤の見込みある治療的応用への連携を与える。
【００８９】
ＣＬＥＣ−６を介したシグナル伝達はＣＤ４０を介したシグナル伝達を増強する：ＣＬＥＣ−６を介したシグナルは、ＤＣの活性化を高めるために、ＣＤ４０を介したシグナルと相乗的に作用する（図６）。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用中のＣＬＥＣ−６の関与は、細胞表面ＣＤ８３の発現量（図６Ａ）、並びに分泌ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１２ｐ４０の産生量（図６Ｂ）を劇的に増加させる。ＴＮＦａ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＩＬ−１ａ及びＩＬ−１ｂを含む、他のサイトカイン及びケモカインも、有意に増加した（データは示していない）。これは、ＣＬＥＣ−６が、インビボでのＤＣ活性化中に副刺激性分子として働き得るので、重要である。まとめると、図１から図６までに提示したデータは、ＣＬＥＣ−６を介したシグナル伝達が、ＤＣを活性化できること、及びＣＬＥＣ−６が、ＤＣ活性化の強力な副刺激性分子として働くことを証明している。
【００９０】
ＣＬＥＣ−６を介して刺激されたＤＣは強力な体液性免疫応答を誘導する：ＤＣは、Ｔ依存性及びＴ非依存性のＢ細胞応答のためにシグナルを供給すること（Wykes, M., and G. MacPherson. 2000. Dendritic cell-B-cell interaction: dendritic cells provide B cells with CD40-independent proliferation signals and CD40-dependent survival signals. Immunology 100:1-3、Balazs, M., F. Martin, T. Zhou, and J. Kearney. 2002. Blood dendritic cells interact with splenic marginal zone B cells to initiate T-independent immune responses. Immunity 17:341-352、Kikuchi, T., S. Worgall, R. Singh, M. A. Moore, and R. G. Crystal. 2000. Dendritic cells genetically modified to express CD40 ligand and pulsed with antigen can initiate antigen-specific humoral immunity independent of CD4+ T cells. Nat Med 6:1154-1159、Dubois, B., J. M. Bridon, J. Fayette, C. Barthelemy, J. Banchereau, C. Caux, and F. Briere. 1999. Dendritic cells directly modulate B cell growth and differentiation. J Leukoc Biol 66:224-230）、並びに抗原をＢ細胞に移動させること（Qi, H., J. G. Egen, A. Y. Huang, and R. N. Germain. 2006. Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells. Science 312:1672-1676、Bergtold, A., D. D. Desai, A. Gavhane, and R. Clynes. 2005. Cell surface recycling of internalized antigen permits dendritic cell priming of B cells. Immunity 23:503-514）により、体液性免疫応答において重要な役割を演じる。ＤＣの他に、第３シグナルとしてのＴＬＲ９を介したシグナル伝達が、効率的なＢ細胞応答にとって必要である（Ruprecht, C. R., and A. Lanzavecchia. 2006. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur J Immunol 36:810-816、Bernasconi, N. L., E. Traggiai, and A. Lanzavecchia. 2002. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science 298:2199-2202）。そこで、本発明者等は、ＴＬＲ９リガンドのＣｐＧの存在下で、ＤＣ媒介体液性免疫応答におけるＣＬＥＣ−６の役割を試験した。６日目のＧＭ／ＩＬ−４  ＤＣを抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂで刺激した後、精製Ｂ細胞を共培養した。図７ａに示すように、抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂで活性化したＤＣは、ＣｐＧの存在下で、対照ｍＡｂで刺激したＤＣと比較して、Ｂ細胞の増殖（ＣＦＳＥ希釈により測定）及び形質細胞の分化（ＣＤ３８＋ＣＤ２０−集団の増加）を顕著に増強した。ＣＤ３８＋ＣＤ２０−Ｂ細胞は、形質細胞の典型的形態を有するが、ＣＤ１３８を発現しない（データは示していない）。増殖細胞の大半は、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６又はＣＣＲ７を発現しない（データは示していない）。
【００９１】
総免疫グロブリン（Ｉｇ）の産生量はＥＬＩＳＡで測定した（図７ｂ）。抗ＣＬＥＣ−６抗体を、他のレクチン、ＬＯＸ−１及びＤＣ−ＡＳＧＰＲに対するｍＡｂと比較した。図７ａのデータと一貫して、総ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡの産生を有意に増加させるための抗ＣＬＥＣ−６抗体刺激ＤＣと培養したＢ細胞。抗ＬＯＸ−１抗体で刺激したＤＣは、Ｂ細胞からのＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡの類似した産生量を生じた。抗ＣＬＥＣ−６及び抗ＬＯＸ−１  ｍＡｂで刺激したＤＣと異なり、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ  ｍＡｂで刺激したＤＣは、ＩｇＧ及びＩｇＡの有意減少量を生じており、ＣＬＥＣ−６及びＬＯＸ−１を介したシグナルが、Ｂ細胞免疫グロブリンのクラススイッチを誘導することが示唆される。総Ｉｇ以外に、ＬＯＸ−１のトリガーで活性化されたＤＣは、インフルエンザウイルス特異的なＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡの産生について、対照ｍＡｂで刺激したＤＣより強力である（データは示していない）。
【００９２】
抗ＣＬＥＣ−６抗体で活性化されたＤＣがＢ細胞応答を増強させる機構は、増殖誘導性リガンド（ＡＰＲＩＬ）を伴う。ＤＣ由来のＢリンパ球刺激タンパク質（ＢＬｙｓ、ＢＡＦＦ）及びＡＰＲＩＬは、ＤＣがヒトＢ細胞の増殖及び機能を直接調節できるようにする重要な分子である（Moore, P. A., O. Belvedere, A. Orr, K. Pieri, D. W. LaFleur, P. Feng, D. Soppet, M. Charters, R. Gentz, D. Parmelee, Y. Li, O. Galperina, J. Giri, V. Roschke, B. Nardelli, J. Carrell, S. Sosnovtseva, W. Greenfield, S. M. Ruben, H. S. Olsen, J. Fikes, and D. M. Hilbert. 1999. BLyS: member of the tumor necrosis factor family and B lymphocyte stimulator. Science 285:260-263、Gross, J. A., J. Johnston, S. Mudri, R. Enselman, S. R. Dillon, K. Madden, W. Xu, J. Parrish-Novak, D. Foster, C. Lofton-Day, M. Moore, A. Littau, A. Grossman, H. Haugen, K. Foley, H. Blumberg, K. Harrison, W. Kindsvogel, and C. H. Clegg. 2000. TACI and BCMA are receptors for a TNF homologue implicated in B-cell autoimmune disease. Nature 404:995-999、Craxton, A., D. Magaletti, E. J. Ryan, and E. A. Clark. 2003. Macrophage- and dendritic cell--dependent regulation of human B-cell proliferation requires the TNF family ligand BAFF. Blood 101:4464-4471、MacLennan, I., and C. Vinuesa. 2002. Dendritic cells, BAFF, and APRIL: innate players in adaptive antibody responses. Immunity 17:235-238）。図７ｃのデータは、ＣＬＥＣ−６を介して刺激されたＤＣが、細胞内ＡＰＲＩＬ並びに分泌ＡＰＲＩＬの増加量を発現したことを示しているが、ＢＬｙｓについてはそうならなかった（データは示していない）。混合培養におけるＢ細胞上のＢＬｙｓ及びＡＰＲＩＬ受容体の発現量を測定したが、有意な変化はなかった（データは示していない）。
【００９３】
抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂはヒトＢ細胞に対して直接効果を及ぼす：ＣＤ１９＋Ｂ細胞はＣＬＥＣ−６を発現し（図１）、Ｂ細胞生物学におけるＣＬＥＣ−６の役割を示唆する。図８ａのデータは、Ｂ細胞上においてＣＬＥＣ−６をトリガーすることが、分泌ＩＬ−８及びＭＩＰ−１ａの産生を増加させることを示しており、ＣＬＥＣ−６がＢ細胞の活性化にも寄与できることを示す。ＩＬ−８及びＭＩＰ−１ａ以外に、Ｂ細胞を抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂで刺激した際、対照ｍＡｂと比較して、ＩＬ−６及びＴＮＦａの若干の増加も観察された（データは示していない）。抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂで活性化したＢ細胞は、総ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡの増加量を分泌した（図８ｂ）。
【００９４】
こうした観察結果は、抗ＣＬＥＣ−６抗体剤のＢ細胞生物学に対する間接効果（即ち、ＤＣを介して作用する）に関する上記研究において、ＣＬＥＣ−６の直接作用を実証している。まとめると、こうしたデータは、インビボで投与されるこのような作用剤が、例えば、ワクチン接種におけるアジュバントとして、又は（以下に示すように）強力な抗原特異的抗体応答を誘発するために、ＤＣ及び他の抗原提示細胞へ抗原を差し向けるための直接媒体として、抗体産生を刺激する高い可能性を明らかにしている。
【００９５】
Ｔ細胞応答におけるＣＬＥＣ−６の役割：ＣＬＥＣ−６を介して刺激されたＤＣは、副刺激性分子の増大量を発現し、サイトカイン及びケモカインの増加量を産生する（図１、２及び３）ため、ＣＬＥＣ−６が、細胞性免疫応答並びに体液性免疫応答に寄与していることが示唆される。これを混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で試験した。精製された同種Ｔ細胞の増殖は、ＣＬＥＣ−６に特異的なｍＡｂで刺激したＤＣにより有意に高められた（図９ａ）。
【００９６】
ＣＬＥＣ−６を介して活性化されたＤＣは、Ｆｌｕ  Ｍ１（図９Ｂの上側２パネル）並びに組換えＦｌｕ  Ｍ１タンパク質（図９Ｂの下側２パネル）のＨＬＡ−Ａ２エピトープをＤＣにパルス投与した際、Ｆｌｕ  Ｍ１特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の応答も増強するため、抗ＣＬＥＣ−６抗体で活性化されたＤＣは、タンパク質抗原の交差提示を増強することが示唆される。ワクチンなどの治療用途にとって、ＣＬＥＣ−６を介したシグナル伝達が、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞の初回抗原刺激及び初回交差抗原刺激に対するＤＣの能力を改変するならば、有益となろう。実際のところ、図９ｃのデータは、抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂで活性化されたＤＣが、Ｍａｒｔ−１特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の初回抗原刺激（図９Ｃの上側２パネル）並びに初回交差抗原刺激（図９Ｃの下側２パネル）の有意に増強することを示す。まとめると、図９Ａ、Ｂ及びＣのデータは、ＣＬＥＣ−６が、ＤＣ機能の増強に重要な役割を演じる結果、抗原特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の応答を増強することを示している。
【００９７】
ワクチン関連におけるＣＬＥＣ−６の潜在的有用性を検証するために、抗原特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の応答について、抗ＣＬＥＣ−６  ｒＡｂ−抗原複合体を対照ｒＡｂ−抗原複合体と比較した。ＩＦＮＤＣにｒＡｂ−Ｍａｒｔ−１融合タンパク質１０ｎＭを負荷し、自己ＣＤ８  Ｔ細胞を１０日間共培養した。次いで、細胞を抗ＣＤ８抗体及びＭａｒｔ−１四量体で染色した。図９ｄのデータは、抗ＣＬＥＣ−６  ｒＡｂ−抗原が、対照と比較して、有意に増強されたＭａｒｔ−１特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の応答を誘導したことを示す（図９Ｄの上側２パネル）。図９Ｄの下側２パネルのデータは、ＬＰＳ（大腸菌由来）２０ｎｇ／ｍｌの存在下で生成した。ワクチン接種用途に対する抗ＣＬＥＣ−６  ｒＡｂの適用性を更に試験するために、抗ＣＬＥＣ−６−Ｆｌｕ  ＨＡ１複合体又は対照ｒＡｂ−Ｆｌｕ  ＨＡ１複合体をｍＤＣに負荷した。精製した自己ＣＤ４  Ｔ細胞を７日間共培養した後、ＨＡ１特異的なＣＤ４  Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥ希釈の測定で評価した。図９Ｅ（上側２パネル）に示すように、抗ＣＬＥＣ−６  ｒＡｂ−ＨＡ１は、対照ｒＡｂ−ＨＡ１より大きなＨＡ１特異的なＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を誘導した。図９Ｅの下側２パネルのデータは、ＣＬＥＣ−６特異的な効果をマスクするＬＰＳ（大腸菌由来）２０ｎｇ／ｍｌの存在下で生成した。
【００９８】
以下に示すデータは、ワクチン接種のために抗ＣＬＥＣ−６−抗原複合体を使用することの前臨床検証として役立つ。まとめると、該データは、このような試作ワクチンは、抗原を誘導して、ＤＣを標的とし、恐らくは関与するＣＬＥＣ−６を介した付随する活性化と共に、抗原を取り込み、プロセシングし、特定の記憶及びナイーブＴ細胞へ提示し、続いてそれらの増殖を誘発できることを示している。この性質だけで、癌ワクチン（癌細胞を死滅させる）又はウイルスワクチン（感染細胞を一掃する）の重要な要素である、抗原特異的な細胞応答を誘発するのに十分である。更に、ＨＡ１特異的なＣＤ４細胞の増殖は、抗ＣＬＥＣ−６試作ワクチンが、抗原特異的な体液性（抗体）応答の誘発にとって鍵となる型のＴ細胞集団を増殖させることを教示している。上記のデータは、抗ＣＬＥＣ−６抗体剤のＩｇクラススイッチに対する作用が、このようなワクチンの高い潜在性の独特な性質を更に強化することを示している。
【００９９】
非ヒト霊長類におけるインビボＤＣはＣＬＥＣ−６を発現する：非ヒト霊長類（カニクイザル）における血中ＤＣが、抗ヒトＣＬＥＣ−６  ｍＡｂに対して反応性であるか否かを試験するために、サルのＰＢＭＣを、抗ＣＬＥＣ−６  ｍＡｂ並びに他の細胞マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２７、ＣＤ５６及びＣＤ１６に対する抗体で染色した。図１０のデータは、ＣＤ１４及びＣＤ１１ｃ＋細胞が共に、抗ＬＯＸ−１  ｍＡｂで染色したことを示す。しかし、ＣＤ３＋、ＣＤ１６＋、ＣＤ２７＋、及びＣＤ５６＋細胞は、ＣＬＥＣ−６を発現しなかった。
【０１００】
こうしたデータは、本発明で想定される多様な治療用抗ＣＬＥＣ−６抗体剤の有効性及び安全性に関する前臨床試験の適正なモデルとして、サルを正当化しているので重要である。
【０１０１】
本明細書で考察した任意の実施形態は、本発明の任意の方法、キット、試薬又は組成物に関して実施することができ、その逆もできることを企図している。更に、本発明の組成物は、本発明の方法を実現するために使用することができる。
【０１０２】
本明細書に記載の特定の実施形態は、例示のために示しており、本発明の限定として示しているのでないことは理解されよう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱せずに多様な実施形態で使用することができる。当業者であれば、本明細書に記載の特定の手順に等価な多数の手順を認識し、又は単なる日常的実験を用いて確認することができよう。このような等価な手順は、本発明の範囲に入ると考えられ、特許請求の範囲で網羅されている。
【０１０３】
本明細書で言及した全ての刊行物及び特許出願は、本発明が関係する技術分野における技術者の技術水準を示している。全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願の各々が、参照により組み込まれると明確に個別に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
特許請求の範囲及び／又は本明細書において、用語「含む（comprising）」と共に使用される場合の単語「ａ」又は「ａｎ」の使用は、「１」を意味し得るが、「１又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１又は２以上」の意味とも合致する。特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物だけを指すことを明確に示していない限り、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物だけ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。本出願を通して、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために使用されている装置、方法の固有の誤差変化、又は試験対象の間に存在する変動を包含することを示すために、使用される。
【０１０５】
本明細書及び請求項（複数も）で使用する場合、単語「含む（comprising）」（及び「comprise」、「comprises」などのcomprisingの任意の形態）、「有する（having）」（及び「have」、「has」などのhavingの任意の形態）、「含む（including）」（及び「includes」、「include」などのincludingの任意の形態）、又は「含有する（containing）」（及び「contains」、「contain」などのcontainingの任意の形態）は、包括的又は非制限的であり、挙げられていない追加の要素又は方法ステップを排除しない。
【０１０６】
本明細書で使用する場合の用語「又はそれらの組合せ」は、その用語に先立つ列挙項目のあらゆる順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣの少なくとも１つを含み、特定の文脈において順序が重要な場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢの少なくとも１つを含むことも意図している。この例を続ければ、１又は複数の項目又は用語の繰返しを含有する、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの組合せも、明らかに含まれる。当業者であれば、文脈からそうではないことが明らかでない限り、任意の組合せにおいて項目又は用語の数に制限が通常ないことは理解されよう。
【０１０７】
本明細書に開示し、主張する組成物及び／又は方法は全て、本開示に照らせば過度の実験をせずに作製し、実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明してきたが、組成物及び／又は方法に対して、並びに本明細書に記載の方法のステップ又は一連のステップにおいて、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱せずに変更を加え得ることは、当業者には明らかとなろう。当業者には明らかなそのような全ての類似した代用及び改変は、付随する特許請求の範囲に規定するような本発明の趣旨、範囲及び概念に入ると見なされる。
【０１０８】
（参考文献）
1.  Figdor, C. G., Y. van Kooyk, and G. J. Adema. 2002. C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells. Nat Rev Immunol 2:77-84
2.  Pyz, E., A. S. Marshall, S. Gordon, and G. D. Brown. 2006. C-type lectin-like receptors on myeloid cells. Ann Med 38:242-251
3.  Brown, G. D. 2006. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol 6:33-43
4.  Geijtenbeek, T. B., D. J. Krooshoop, D. A. Bleijs, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, V. Grabovsky, R. Alon, C. G. Figdor, and Y. van Kooyk. 2000. DC-SIGN-ICAM-2 interaction mediates dendritic cell trafficking. Nat Immunol 1:353-357
5.  Geijtenbeek, T. B., R. Torensma, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, G. J. Adema, Y. van Kooyk, and C. G. Figdor. 2000. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 100:575-585
6.  d'Ostiani, C. F., G. Del Sero, A. Bacci, C. Montagnoli, A. Spreca, A. Mencacci, P. Ricciardi-Castagnoli, and L. Romani. 2000. Dendritic cells discriminate between yeasts and hyphae of the fungus Candida albicans. Implications for initiation of T helper cell immunity in vitro and in vivo. J Exp Med 191:1661-1674
7.  Fradin, C., D. Poulain, and T. Jouault. 2000. beta-1,2-linked oligomannosides from Candida albicans bind to a 32-kilodalton macrophage membrane protein homologous to the mammalian lectin galectin-3. Infect Immun 68:4391-4398
8.  Cambi, A., K. Gijzen, J. M. de Vries, R. Torensma, B. Joosten, G. J. Adema, M. G. Netea, B. J. Kullberg, L. Romani, and C. G. Figdor. 2003. The C-type lectin DC-SIGN (CD209) is an antigen-uptake receptor for Candida albicans on dendritic cells. Eur J Immunol 33:532-538
9.  Netea, M. G., J. W. Meer, I.Verschueren, and B. J. Kullberg. 2002. CD40/CD40 ligand interactions in the host defense against disseminated Candida albicans infection: the role of macrophage-derived nitric oxide. Eur J Immunol 32:1455-1463
10.  Lee, S. J., S. Evers, D. Roeder, A. F. Parlow, J. Risteli, L. Risteli, Y. C. Lee, T. Feizi, H. Langen, and M. C. Nussenzweig. 2002. Mannose receptor-mediated regulation of serum glycoprotein homeostasis. Science 295:1898-1901
11.  Maeda, N., J. Nigou, J. L. Herrmann, M. Jackson, A. Amara, P. H. Lagrange, G. Puzo, B. Gicquel, and O. Neyrolles. 2003. The cell surface receptor DC-SIGN discriminates between Mycobacterium species through selective recognition of the mannose caps on lipoarabinomannan. J Biol Chem 278:5513-5516
12.  Tailleux, L., O. Schwartz, J. L. Herrmann, E. Pivert, M. Jackson, A. Amara, L. Legres, D. Dreher, L. P. Nicod, J. C. Gluckman, P. H. Lagrange, B. Gicquel, and O. Neyrolles. 2003. DC-SIGN is the major Mycobacterium tuberculosis receptor on human dendritic cells. J Exp Med 197:121-127
13.  Geijtenbeek, T. B., S. J. Van Vliet, E. A. Koppel, M. Sanchez-Hernandez, C. M. Vandenbroucke-Grauls, B. Appelmelk, and Y. Van Kooyk. 2003. Mycobacteria target DC-SIGN to suppress dendritic cell function. J Exp Med 197:7-17
14.  Cooper, A. M., A. Kipnis, J. Turner, J. Magram, J. Ferrante, and I. M. Orme. 2002. Mice lacking bioactive IL-12 can generate protective, antigen-specific cellular responses to mycobacterial infection only if the IL-12 p40 subunit is present. J Immunol 168:1322-1327
15.  Bates, E. E., N. Fournier, E. Garcia, J. Valladeau, I. Durand, J. J. Pin, S. M. Zurawski, S. Patel, J. S. Abrams, S. Lebecque, P. Garrone, and S. Saeland. 1999. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol 163:1973-1983
16.  Bendtsen, J. D., H. Nielsen, G. von Heijne, and S. Brunak. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J Mol Biol 340:783-795
17.  Shulman, M., C. D. Wilde, G. Kohler, M. J. Shulman, N. S. Rees, D. Atefi, J. T. Horney, S. B. Eaton, W. Whaley, J. T. Galambos, H. Hengartner, L. R. Shapiro, and L. Zemek. 1978
18.  Banchereau, J., F. Briere, C. Caux, J. Davoust, S. Lebecque, Y. J. Liu, B. Pulendran, and K. Palucka. 2000. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 18:767-811
19.  Jeannin, P., B. Bottazzi, M. Sironi, A. Doni, M. Rusnati, M. Presta, V. Maina, G. Magistrelli, J. F. Haeuw, G. Hoeffel, N. Thieblemont, N. Corvaia, C. Garlanda, Y. Delneste, and A. Mantovani. 2005. Complexity and complementarity of outer membrane protein A recognition by cellular and humoral innate immunity receptors. Immunity 22:551-560
20.  Wykes, M., and G. MacPherson. 2000. Dendritic cell-B-cell interaction: dendritic cells provide B cells with CD40-independent proliferation signals and CD40-dependent survival signals. Immunology 100:1-3
21.  Balazs, M., F. Martin, T. Zhou, and J. Kearney. 2002. Blood dendritic cells interact with splenic marginal zone B cells to initiate T-independent immune responses. Immunity 17:341-352
22.  Kikuchi, T., S. Worgall, R. Singh, M. A. Moore, and R. G. Crystal. 2000. Dendritic cells genetically modified to express CD40 ligand and pulsed with antigen can initiate antigen-specific humoral immunity independent of CD4+ T cells. Nat Med 6:1154-1159
23.  Dubois, B., J. M. Bridon, J. Fayette, C. Barthelemy, J. Banchereau, C. Caux, and F. Briere. 1999. Dendritic cells directly modulate B cell growth and differentiation. J Leukoc Biol 66:224-230
24.  Qi, H., J. G. Egen, A. Y. Huang, and R. N. Germain. 2006. Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells. Science 312:1672-1676
25.  Bergtold, A., D. D. Desai, A. Gavhane, and R. Clynes. 2005. Cell surface recycling of internalized antigen permits dendritic cell priming of B cells. Immunity 23:503-514
26.  Ruprecht, C. R., and A. Lanzavecchia. 2006. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur J Immunol 36:810-816
27.  Bernasconi, N. L., E. Traggiai, and A. Lanzavecchia. 2002. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science 298:2199-2202
28.  Moore, P. A., O. Belvedere, A. Orr, K. Pieri, D. W. LaFleur, P. Feng, D. Soppet, M. Charters, R. Gentz, D. Parmelee, Y. Li, O. Galperina, J. Giri, V. Roschke, B. Nardelli, J. Carrell, S. Sosnovtseva, W. Greenfield, S. M. Ruben, H. S. Olsen, J. Fikes, and D. M. Hilbert. 1999. BLyS: member of the tumor necrosis factor family and B lymphocyte stimulator. Science 285:260-263
29.  Gross, J. A., J. Johnston, S. Mudri, R. Enselman, S. R. Dillon, K. Madden, W. Xu, J. Parrish-Novak, D. Foster, C. Lofton-Day, M. Moore, A. Littau, A. Grossman, H. Haugen, K. Foley, H. Blumberg, K. Harrison, W. Kindsvogel, and C. H. Clegg. 2000. TACI and BCMA are receptors for a TNF homologue implicated in B-cell autoimmune disease. Nature 404:995-999
30.  Craxton, A., D. Magaletti, E. J. Ryan, and E. A. Clark. 2003. Macrophage- and dendritic cell--dependent regulation of human B-cell proliferation requires the TNF family ligand BAFF. Blood 101:4464-4471
31.  MacLennan, I., and C. Vinuesa. 2002. Dendritic cells, BAFF, and APRIL: innate players in adaptive antibody responses. Immunity 17:235-238
【図１】
2010519313.tif 000005
【図２】
2010519313.tif 000006
【図３】
2010519313.tif 000007
【図４】
2010519313.tif 000008
【図５】
2010519313.tif 000009
【図６】
2010519313.tif 000010
【図７】
2010519313.tif 000011
【図８】
2010519313.tif 000012
【図９Ａ−９Ｃ】
2010519313.tif 000013
【図９Ｄ−９Ｅ】
2010519313.tif 000014
【図１０】
2010519313.tif 000015
【配列表】
2010519313000001.app
【国際調査報告】
2010519313.tif 000016
2010519313.tif 000017
2010519313.tif 000018