(57)【要約】【課題】インターフェロンαとリバビリンとを組合せた処置に対してＨＣＶ感染患者が応答者であるか非応答者であるか調べるインビトロ方法。【解決手段】患者から予め採取した生物学的サンプル中のマーカー遺伝子ＩＦＩ２７、ＣＣＣＬ９の発現レベルを決定する段階を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンαとリバビリンとを併用した医学的治療に対してＨＣＶ感染患者が応答者であるか非応答者であるかを決定するためのインビトロ方法であって、患者から予めし採取した生物学的サンプル中のマーカー遺伝子ＩＦＩ２７、ＣＣＣＬ９の発現レベルを決定する段階(a)を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
段階(a)でマーカー遺伝子Ｇ１Ｐ２の発現レベルをさらに決定する請求項1に記載の方法。
【請求項３】
段階(a)で発現レベルが決定された各マーカー遺伝子に対して下記の(i)と(ii)とを比較する段階（b）をさらに有する請求項１または２の方法：
(i) 段階(a)で決定した発現レベル、：
(ii) 応答患者グループ、非応答患者グループまたは両方を含むグループの中から選択されるＨＣＶ感染患者からの生物学的サンプル中の遺伝子に対して以前に決定した対照基準値
【請求項４】
患者が遺伝子タイプ1のＨＣＶに感染している請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
上記のインターフェロンαとリバビリンとの組合せ中のインターフェロンαがペグインターフェロンαである請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
上記のインターフェロンαとリバビリンとの組合せ中のインターフェロンαがペグインターフェロンα2bである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
生物学的サンプルが肝臓生検、血液サンプルまたは漿液サンプルから成る群の中から選択される請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
段階(a)で、生物学的サンプル中の上記マーカー遺伝子のｍＲＮＡのレベルを定量化して発現レベルを決定する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
段階(a)が下記（a1）と（a2）とを含む請求項８に記載の方法：
（a1）生物学的サンプルから全ＲＮＡを回収し、
（a2）そのＲＮＡを増幅し、ハイブリダイゼーションして上記マーカー遺伝子に特異的なプローブにする。
【請求項１０】
段階(a)で、リアルタイムで定量的または半定量的なＲＴ−ＰＣＴを行って発現レベルを決定する請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
段階(a)で、生物学的サンプル中の上記マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを定量化して発現レベルを決定する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルの定量を各タンパク質に対する抗体のセットを用いて行う請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
固体の支持体上に固定したＩＦＩ２７、ＣＣＣＬ９遺伝子に特異的な核酸を含むＤＮＡマイクロアレー（microarray）。
【請求項１４】
Ｇ１Ｐ２遺伝子に特異的な核酸をさらに含む請求項13に記載のＤＮＡマイクロアレー。
【請求項１５】
下記（a)と（b)の段階から成る患者のＨＣＶ感染関連疾患を治療する方法：
（a) 請求項１〜12のいずれか一項に記載のインビトロ方法を実行することによってインターフェロンαとリバビリンとを併用した治療に対してＨＣＶ感染患者が応答者であるか非応答者であるかを決定し、
（b) 段階（a)でＨＣＶ感染患者が応答者であることが決定された時に、インターフェロンαとリバビリンとを併用して投与する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターフェロンαとリバビリンとを組合せた処置に対してＨＣＶ感染患者が応答者（responder）であるか非応答者（non-responder）であるか調べるインビトロ方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶはフラビビリダ（Flaviviridas）科のヘパシウイルス（Hepacivirus）に属する単一鎖のポジディプなＲＮＡウィルスである。このＨＣＶのゲノムは両端が非コード領域（NCR）と接（flanked）した約3010のアミノ酸残基のポリタンパク質をコードする単一鎖ポジティブＲＮＡから成る。5'-NCRおよびこのポリタンパク質をコードする領域の最初の部分はヘアピンループの複雑な構造および内部リボソームへの導入サイトの役目をする対を成さない領域中に折畳まれている。このことはこのウイルスゲノムの翻訳は最5’端ＡＵＧよりもむしろこのポリタンパク質の初めのＡＵＧコードンの翻訳で始まるキャップ−独立性があるということを意味している。また、ＲＮＡの二次構造からも3’-非翻訳領域であるといえる。これを示す直接の証明は現在できないが、これらがウイルスゲノムの複製に何らかの役目をしていることが考えられる。ポリタンパク質のＮ末端は３つの構造タンパク（コア、Ｅ１、Ｅ２）から成り、これらのタンパク質類のポリタンパク質からの放出は細胞の小胞体と関連したシグナルペプチターゼに依存する。このポリタンパク質の残りからの６つの非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ）の放出はウィルスNS2-NS3およびNS3-NS4Aプロテアーゼによって調整される。
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス感染は慢性肝臓病の主たる原因で、世界で約３億人の人が感染している。この病気の程度は無症候慢性感染から肝硬変および肝細胞癌まで症状が大きく変化する（Seeff et al.2002; Marcellin et al.2002)。慢性のＣ型肝炎の線維症の進行度で最終的な予後、従って治療の必要性および緊急度を決定する（NIH 2002、EASLconsensus 2002）。
【０００４】
慢性ＨＣＶ感染患者の治療の最終ゴールはウィルスを根絶して進行性肝性線維症を防ぐことにある。最近、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）の治療に進歩があり、ペグレート（pegylated）インターフェロン（PEG-IFN）(以下、ペグインターフェロン)にリバビリン（ribavirin）（1-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボアミド）をプラスした併用治療は、標準的なインターフェロンα（IFN）にリバビリンをプラスした処方よりも高い持続的ウイルス学的応答率(レスポンス レート、ＳＶＲ）が得られるということが明らかになった(Manns et al.2001 ; Fried et al.2001 ; Hadziyannis et al.2004)。患者の応答性はいくつかの副ファクタ(コファクタ)、例えば遺伝子型および進行性肝臓線維症）によって大きく影響される。事実、遺伝子型1の感染患者の場合の最適治療はペグインターフェロンのフル投与（α2a を180ug/週またはα2bを1.5ug/kg/週）とリバビリン（1000〜1200mg/日）とを組合せたものを48週間続けるもので、応答率は41〜52％になる(Manns et al.2001 ; Fried et al.2001 ; Hadziyannis et al.2004)。非-1遺伝子型（特に遺伝子型２、３）の患者の場合には、ペグインターフェロンのフル投与とリバビリンを減した（800mg/日）投与とを24週間続けるコースで、最適応答率は（75〜81％）になる。
【０００５】
こうした抗ウイルス医薬品開発の最近の進歩にもかかわらず、慢性ＨＣＶ感染患者の治療では臨床効果および費用効果の両方の面で課題を抱えている。
【０００６】
さらに、インターフェロンとリバビリンとの併用治療には多くのよく知られた有害な副作用、例えば疲労や風邪の症状、血液学的異常、精神神経症状がある。ペグインターフェロンの併用治療（ペグインターフェロンα-2a、α-2b）には、頻度は少ないが、標準インターフェロンと同様な副作用が生ずる。従って、この医薬の試験の登録参加者の10％〜14％には副作用のため治療ができなかった(Manns et al.2001 ; Fried et al.2001 ; Hadziyannis et al.2004)。
【０００７】
副作用の数および処置費用とを考えると、治療中さらには治療開始前にウイルス学的な非応答性（virologic noＮＲesponse)が予測できることは大きな利点である(NIH 2002, EASL consensus 2002)。そのため、ＨＣＶ感染患者がインターフェロンαとリバビリンとの併用治療に持続的なウイルス応答性を示すか否かを予測する新規な方法を見出すための努力が続けられている。
【０００８】
例えば、特文献１（米国特許第US 2005/0014159 A1号明細書）にはCD81遺伝子の染色体の多型プロフィルを分析して、インターフェロンαとリバビリンの併用治療に対する各患者の応答傾向を効率的に検出する方法が記載されている。
【０００９】
最近の文献（非特許文献Chen el al. 2005）では遺伝子形質発現プロファイリング（ＤＮＡ  ミクロアレー）を用い、18の遺伝子から成る分類を行って、ペグインターフェロンαとリバビリンとの併用治療に対する応答性を予測している。しかし、リバビリンにはＤＮＡミクロアレー法はルーチンでは適用できない。さらに、この研究には制限がある。第１に、評価セットなしに限られたわずかな数の患者でしか分析しておらず、第２に、遺伝子形質発現解析のために使用したミクロアレープラットフォームの解析手順に多くの改良を必要とし、評価のために大くの患者を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第US 2005/0014159 A1号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Chen el al. (2005）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、インターフェロンαとリバビリンとの併用治療に対して患者が応答者であるか否かを決定するための新規な信頼できる方法を提供することによって上記のニーズに応えることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、インターフェロンαとリバビリンとを併用した医学治療に対してＨＣＶ感染患者が応答者であるか非応答者であるかを決定するインビトロ方法であって、ＨＣＶ感染患者から予め採取した生物学的サンプル中のマーカー遺伝子ＩＦＩ２７とＣＸＣＬ９の発現レベルを決定する段階(a)を含む方法である。
【００１４】
本発明の一つの実施例では、段階(a)でＧ１Ｐ２（ＩＳＧ１５ともいわれる）マーカー遺伝子の発現レベルをさらに決定する。
【００１５】
本発明は、インビトロ方法を実施するためのキットにも関するものである。このキットはｍＲＮＡとタンパク質とを含む、試験した各マーカー遺伝子の発現産物と特異的にハイブリットしたプローブを含むＤＮＡマイクロアレーを有する。
【００１６】
本発明は、上記定義のインビトロ方法を用いて上記治療方法に対してＨＣＶ感染患者が応答するか否かを決定することからなる、インターフェロンαとリバビリンとを併用したＨＣＶ感染患者の治療方法にも関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｋ−ニアレスネーバ(nearest neighgor、最も近い隣り)とウエートボーティング(weight voting、ウエート付けた投票)とによるクラス分け法（clasifier）を用いたグループＡ（Ａ）および全データセット（69人の患者）（Ｂ）での増加サイズの管理下トレーニングモデル(supervised training model)のＬＯＯＣＶ分類精度。
【００１８】
【図２】２−遺伝子（ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９））および３−遺伝子（ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９、GIP2）の予測セットを用いた全データベース（69人の患者）でのＫＮＮおよびＷＶクラス解析結果。ＮＲに有利な信頼スコアは負の値で示され、ＳＶＲに有利なクラス帰属の信頼スコアは正の値で示される。患者の実際の出身は色（ＳＶＲ、青色；ＮＲ赤）で示される。ＫＮＮでの２−遺伝子予測を用いたクラス帰属の全精度は全サンプルの81.2％（56/69）で、23人のＮＲ中の17人はＮＲとして正しく分類され、46人のＳＶＲ中の39人はＳＶＲとして正しく分類された。ＷＶでの３−遺伝子予測の全分類精度は全サンプルの81.2％（56/69）で、２３人のＮＲ中の14人が正しくＮＲとして分類され、46人のＳＶＲ中の42人がＲとして正しく分類された。
【００１９】
【図３】ＫＮＮアルゴリズムで同定された２−遺伝子シグネチャー（signature）（ＩＦＩ２７、ＣＣＣＬ９）を用いた69人の慢性ＨＣＶ患者の非監督下階層クラスタ解析(unsupervised hierarchical clustering analysis)。２つの遺伝子の遺伝子発現パターンのヒートマップ（heat map）を表す。相対発現をキーに示すように青色（低発現）から赤（高発現）の色スケールに従って示した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明者は、慢性ＨＣＶ感染患者に対するペグインターフェロンとリバビリンとの併用治療の結果は、少なくとも２つのマーカー遺伝子、すなわちマーカー遺伝子ＩＦ１２７およびＣＸＣＬ９の発現レベルを決定することによって正確に予測できるということを見出した。
【００２１】
本発明者は、ヒトの慢性Ｃ型肝炎での肝臓遺伝子の発現に関連する各種細胞および分子機構に関与する公知の５８の遺伝子 (Chen et al.2005;Honda et al.2001 ; Smith et al.2003; Mihm et al.2004; Bieche et al, 2005; Asselah T, et al. 2005, Helbig et al. 2005, Gale et al. 2005) を選択し、ペグインターフェロンとリバビリンとの併用治療を受けた69人のＨＣＶ感染患者での選択した上記で５８の遺伝子のｍＲＮＡ発現をリアルタイムで定量ＲＴ-ＰＣＲアッセイを用いて比較した。本発明者は２つの統計モデルを用いることで上記治療に対するＨＣＶ-感染患者の応答性または非応答性を予測することができる下記の２つの特定遺伝子サインを同定した：
(i) ２つの関連マーカー遺伝子すなわちＩＦ１２７、ＣＸＣＬ９から成る遺伝子サイン、
(ii）３つの関連マーカー遺伝子すなわちＩＦ１２７、ＣＸＣＬ９、Ｇ１Ｐ２から成る遺伝子サイン。
【００２２】
最高の分類法結果は３-遺伝子（ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９、Ｇ１Ｐ２）サインを使用した時に得られた。統計モデルは69人の患者の中の56人（81.2％）に対する治療応答性を正確に予測した。
【００２３】
従って、本発明の対象は、インターフェロンαとリバビリンとの併用した医学的治療に対してＨＣＶ感染患者が応答者であるか非応答者であるかを決定するインビトロ（試験管）方法にあり、本発明方法は患者から予め採取した生物学的サンプル中のマーカー遺伝子ＩＦＩ２７、ＣＣＣＬ９の発現レベルを決定する段階(a)を含む。
【００２４】
定義
「Ｃ型肝炎ウイルス」または「ＨＣＶ」という用語は病原の歪がＣ型肝炎（非Ａ肝炎、非Ｂ肝炎ともよばれる）の原因となるウイルス種を定義するのに用いる。このＣ型肝炎ウイルス生物種はＨＣＶ単離物の遺伝的違いに基づいて６つの複数の遺伝子型（１〜６）に分類され、各遺伝子型は複数の亜型に分類される。この亜型はその遺伝的多様性に基づいてさらに準亜型（quasispecies）に分類される。各ＨＣＶ遺伝子型の優性度や分布は各国で異なっている。例えば北アメリカでは遺伝子型1ａが優性で、その次に１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａが続く。ヨーロッパでは遺伝子型１ｂが主で、それに２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａが続く。遺伝子型４と５はほぼアフリカだけで見られる。インターフェロンをベースにした治療に対するポテンシャル応答性とこの治療に必要な継続期間を決定するために遺伝子型が臨床上重要である。遺伝子型１と４は他の遺伝子型（2、3、5、6）よりもインターフェロンをベースにした治療に対する応答性が悪い(Simmonds P et al.; 2005)。
【００２５】
「暗号配列」または発現産物、例えばＲＮＡ、ポリペチド、タンパクまたは酵素を「コードする」配列は、発現した時に、そのＲＮＡ、ポリペチド、タンパクまたは酵素を生産するヌクレオチド配列、すなわち、そのポリペチド、タンパクまたは酵素のためのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。タンパクに対する暗号配列は開始コードン（通常ＡＴＧ）とストップコードンとを含むことができる。
【００２６】
「遺伝子」という用語はそれがコードするまたは対応するアミノ酸の特定のＤＮＡ配列を意味し、一つまたは複数のタンパク質または酵素の全部または一部から成り、例えば遺伝子が発現される条件を決定する調節用ＤＮＡ配列、例えばプロモータ配列を含むこともできる。構造遺伝子ではないいくつかの遺伝子はＤＮＡからＲＮＡへ転写され、アミノ酸配列へ翻訳されない。構造遺伝子の調節ファクタまたはＤＮＡ転写の調節ファクタとして機能する他の遺伝子もある。特に、遺伝子という用語は一つのタンパク、すなわち調節ファクタ、プロモータ、イントロンおよびエキソン配列から成る配列をコードするゲノム配列を意味するといえる。
【００２７】
「ＩＦＩ２７遺伝子」という用語はインターフェロンα-誘導性のタンパク27をコードする遺伝子を表す。ＩＦＩ２７（ＩＳＧ１２またはＰ２７ともよばれる）は機能が未知の小さいインターフェロン-α（ＩＦＮ−）-誘導性遺伝子のファミリーに属する。ＩＦＩ２７のｃＤＮＡは当初ヒトの上皮細胞株ＭＣＦ−７（Ｐ２７と命名された)のエストロゲン-誘導性遺伝子としてクローン化された（Rasmussen et al 1993）。多くの細胞株（B-リンパ、頸、胸上皮、SV40-トランスフォームケラチン合成細胞、繊維芽細胞）においてＩＦＩ２７はＩＦＮ−αによって強く誘発され、ＩＦＮ−γによる誘発は低いことがＲＴ-ＰＣＲによって示された（Gjermandsen et al 2000）。免疫歴史学的な解析からは、ヒーラー細胞をＩＦＮ−αで治療したときにＩＦＩ２７遺伝子生成物が核エンベロープ中に存在することが分っている。従って、ＩＦＩ２７はこの部位に局所化する最初のインターフェロン誘発タンパクである（Martensen et al, 2001)。このヒトポリヌクレオチド配列は受入れ番号NM 005532でデータベースにSEQ ID NO：1として寄託されている。
【００２８】
「ＣＸＣＬ９遺伝子」という用語はケモキン（ケモキン）（Ｃ−Ｘ−Ｃ型）リガンド9をコードする遺伝子を表す。ＣＸＣＬ９タンパク（ＭＩＧともよばれる）はセル特異的発明記載ケモタキシス、細胞成長介在、炎症性応答に関係すると思われるサイトカインのファミリーに属する隠れたタンパクである。このファミリーの分子は一般に２つのＳ‐Ｓ結合に関係する４つの保存されたシステイン残基を共有する70〜100のアミノ酸の陽イオン性タンパク質である。これらのタンパク質は２つのアミノ末端システインの間隔によって２つのグループに分類できる。その最初のグループでは２つのシステインが単一残基（Ｃ−Ｘ型）によって分離され、第２のグループではシステインが互いに隣接している（Ｃ−Ｃ型）。ＣＸＣＬ９遺伝子の生産物はＣ−Ｘ−Ｃ型を示す。ＣＸＣＬ９はアンギオスタティック活性を有する活性Ｔ細胞に対してケモアトラクタント（chemoattractant）である。ＣＸＣＬ９とＣＸＣＬ１０は動物モデルでインターフェロンγ（ＩＦＮ−ガンマ）およびインターロイキン-12の抗腫瘍活性に対する重要成分と考えられる。ヒトＭＩＧはＴＨＰ−１細胞および末梢血液単核細胞でインターフェロンαではないインターフェロンγまたはリポポリサッカライドによって誘導される。ハツカネズミおよびヒトのゲノムＤＮＡの解析からヒトおよびネズミの遺伝子は真のハツカネズミ-ヒトホモログであるということを示唆している。このヒトのポリヌクレオチド配列は受入れ番号NM 002416でデータベースにSEQ ID NO：2として寄託されている。
【００２９】
「Ｇ１Ｐ２遺伝子」という用語はインターフェロンによって誘発されたタンパク15をコードする遺伝子を表す。Ｇ１Ｐ２（ＩＦＭ５、ＩＳＧ１５ともよばれる）はインターフェロンαおよびβによって活用化された時に多くの細胞のタンパク質にコンジュゲートするユビキチン様タンパクである(Zhao et al., 2005)。Ｇ１Ｐ２はインターフェロンで刺激された遺伝子によってコードされる17kDaタンパクである。ユビキチンの重要な機能は多数報告されているが、Ｇ１Ｐ２とそのコンジュゲーションの機能の大部分は未知である。Ｇ１Ｐ２とその一時変異系が自然免疫応答、インターフェロン信号の調節、妊娠およびガンで重要な役割を演じていることを示唆する証拠がある。Ｇ１Ｐ２によるタンパク質の変異はユビキチンおよび他のユビキチン様モディファイアーの変異と同様に起こる。Ｇ１Ｐ２およびその変異系の研究から有用な治療ターゲットのセットが生まれ、タンパクモディファイアーに関する認識と重要性とが増している。このヒトポリヌクレオチド配列は受入れ番号NM 005101でデータベースにSEQ ID NO：3として寄託されている。
【００３０】
「オリゴヌクレオチド」という用語は一般に少なくとも10、好ましくは少なくとも12、より好ましくは少なくとも15、さらに好ましくは少なくとも20のヌクレオチドで、好ましくは100以下、より好ましくは70以下の核酸でゲノムＤＮＡ、相補ＤＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリッドしたヌクレオチドの意味で使用する。
【００３１】
増幅プライマはターゲット配列とのハイブリッド化後のオリゴヌクレオチドの伸長またはターゲット配列とのハイブリッド化時の隣接する多重オリゴヌクレオチドのライゲーションによるターゲット配列の増幅用オリゴヌクレオチドの意味で使用する。増幅プライマの少なくとも一部がターゲットとハイブリッド化する。この部分はターゲット結合配列とよばれ、プライマのターゲット特異性を決定する。「プライマ」および「プローブ」という用語はこのオリゴヌクレオチドの機能を表す。一般に、プローブはプライマーとは逆にターゲットへのハイブリダイゼーション後のポリメラーゼまたはライゲーションによっては伸長されない。従って、捕捉または検出するのにターゲット配列を用いる場合、ハイブリダイゼーションされたオリゴヌクレオチドはプローブとして機能し、それが増幅プライマー中でターゲット結合配列として使用される時には同じオリゴヌクレオチドがプライマーとして機能する。
【００３２】
核酸分子は核酸分子の単一鎖形が適当な温度および溶液イオン強度条件下で他の核酸分子にアニールできることができれば、他の核酸分子、例えば相補ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡに「ハイブリッド化可能」である（Sambrook et al., 1989を参照のこと）。
【００３３】
ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー（厳重さ）」は温度およびイオン強度条件で決まる。類似核酸の事前スクリーニングでは55℃のＴｍ（融解温度）に対応する低ストリンジェンシー、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、ホルムアミドなし、または、３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件を使用できる。適度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件はより高いＴｍ（例えば４０％ホルムアミド）で５ｘまたは６ｘＳＣＣに対応する。高いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件は最も高いＴｍ、例えば５０％ホルムアミド、５ｘまたは６ｘＳＣＣに対応する。ＳＣＣは０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５ＭＮａ−クエン酸塩である。ハイブリダイゼーションでは２つの核酸が相補配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに従って塩基間のミスマッチが起こる。核酸をハイブリダイゼーションさせるのに適したストリンジェンシーは核酸の長さと相補性の度合いに依存し、これらは当業者に公知の変数である。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性が大きくなる程、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのTm値がより大きくなる。核酸ハイブリッド化の相対的安定性（より高いTmに対応する）は以下の順序で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。
【００３４】
長さが100ヌクレオチド以上のハイブリッドの場合には、Ｔｍを計算するための式が導かれている（Sambrook et al., 1989, 9.50-9.51)。短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションではミスマッチの位置が重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Sambrook et al., 1989 II.7- 11.8)。ハイブッド化可能な核酸の最小長さは少なくとも約10のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約15ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約20ヌクレオチドである。
【００３５】
本発明の実施例で用いる「標準ハイブリダイゼーション条件」という用語は上記条件を使用した55℃のＴｍを意味する。好ましい実施例ではＴｍは60℃であり、より好ましい実施例ではＴｍは65℃である。本発明の特定実施例での「高いストリンジェンシー」とは0.2×SSC中で68℃、50％ホルムアミド、4×SSC中で42℃でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件か、これら２つの条件のいずれで下でも観測されるハイブリダイゼーションレベルに対応する余裕を持つた条件下である。
【００３６】
遺伝子または核酸の発現に対して「発現」という用語を用いた場合には遺伝子中に含まれた情報が遺伝子生産物中に変換されたことを意味する。遺伝子生成物は遺伝子の直接の転写産物（例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、rRNA、アンチセンスRNA、リボゾーム、構造ＲＮＡ、その他任意のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって生じるタンパクでもよい。この生成物にはキャッピング、ポリアデニル化、メチル化、編集等のプロセスで変性されたｍＲＮＡや、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＡＤＰ−リボシリ化、ミリスチル化、グリコシル化等で変性したタンパク質を含む。
【００３７】
「持続するウイルス応答性」（ＳＶＲまたは「持続応答性」または、「永続的な応答」）という用語はＨＣＶ感染に対する治療に対する各患者の漿液ＨＣＶタイターでの応答を意味する。一般には「持続するウイルス応答性」とは治療停止後の少なくとも約1ヵ月間、少なくとも約２ヵ月間、少なくとも約３ヵ月間、少なくとも約４ヵ月間、少なくとも約５ヵ月間または少なくとも約６ヵ月間、患者の漿液中にＨＣＶＲＮＡが検出できない（すなわち、ゲノムのコピーが１ミリリットルの漿液当り約500以下、約200以下または約50以下）であることを意味する。
【００３８】
「応答者（responder）」患者または患者グループとはインターフェロンαとリバビリンによる治療に対して継続したウイルス応答性を示す患者または患者グループを意味する。逆の「非応答者(noＮＲesponder)」患者または患者グループはインターフェロンαとリバビリンとによる治療に対して継続したウイルス応答性を示さない患者または患者グループを意味する。
【００３９】
「インターフェロンα」または「ＩＦＮ−α」という用語はウイルス複製および細胞増殖を抑制し、免疫応答を調整する関連ポリペチドのファミリーを意味する。「ＩＦＮ−α」という用語には自然に起るＩＦＮ−α；合成ＩＦＮ−α；誘導（derivatized）ＩＦＮ−α（例えば、ペグ（EGylated）ＩＦＮ−α、グリコシル化したＩＦＮ−α等）；自然ＩＦＮ−αまたは合成ＩＦＮ−αの類縁物も含まれる。自然に起るＩＦＮ−αとは基本的に抗ウイルス特性を有する任意のＩＦＮ−αを意味する。本発明に適したインターフェロンは自然に起るＩＦＮ−α（自然に起るＩＦＮ−α2a、ＩＦＮ−α2bを含む）または組換え型インターフェロンαを含むが、これらに限定されるものではない。「ＩＦＮ−α」という用語には漿液半減期のような一定の特性が変わるように誘導（すなわち、化学的に修飾）したＩＦＮ−αの誘導体も含まれる。従って、「ＩＦＮ−α」という用語にはグリコシル化されたＩＦＮ−α；ポリエチレングリコールで変性したＩＦＮ−α（「ペグ（PEGylated）ＩＦＮ−α」）等が含まれる。「ペグ（PEGylated）ＩＦＮ−α」とその製造方法は下記文献に記載されている：
【特許文献２】米国特許第5,382、657号明細書
【特許文献３】米国特許第5,981、709号明細書
【特許文献４】米国特許第5,951、974号明細書
【００４０】
「ペグ（PEGylated）ＩＦＮ−α」には上記の任意のＩＦＮ−α分子とPEGとのコンジュゲートが含まれ、インターフェロンα-2a（Roferon、Hoffman La-Roche、Nutley、N. J.）、インターフェロンα−2b（Intron, Schering-Plough, Madison, N. J.)、インターフェロンα-2c（Berofor Alpha、Boehringer Ingelheim、Ingelheim、ドイツ）および自然に起るインターフェロンαの共通配列決定に定義のコンセンサス・インターフェロン（Infergen (InterMune, Inc. , Brisbane, Calif.）にコンジュゲートされたPEGに限定されるものではない。
【００４１】
「リバビリン」という用語は1-β-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール−3-カルボアミド化合物を意味する。このリバビリンはICN Pharmaceuticals社（Costa Mesa,Calif.）から入手可能なヌクレオシド・アナログで、メルクインデックス第Eleventh版に化合物No.8199として記載されている。その製造法および処方は下記文献に記載されている。
【特許文献５】米国特許番号4,21 1771号明細書
【００４２】
「患者」という用語はＣ型肝炎ウイルスに感染した、または、感染するヒトおよびヒト以外の哺乳類を意味する。
【００４３】
本発明のインビトロ方法：
本発明の第１の対象は、患者から予め採取した生物学的サンプル中のマーカー遺伝子ＩＦＩ２７、ＣＣＣＬ９の発現レベルを決定する段階(a)を含む、インターフェロンαとリバビリンとを併用した医学的治療に対してＨＣＶに感染した患者が応答者であるか非応答者どうかを決定するインビトロ（試験管内）方法にある。
【００４４】
本発明の一つの実施例では、本発明方法の段階(a)でさらにマーカー遺伝子Ｇ１Ｐ２の発現レベルを決定する。
【００４５】
本発明の一つの実施例では、ＨＣＶに感染した患者がインターフェロンαとリバビリンとを併用した医学的治療への応答者か非応答者を決定するのに適した本発明方法の上記インターフェロンαがペグ化（pegylated）されている。本発明の好ましい実施例ではペグインターフェロンインターフェロンα2bである(Intron, Schering-Plough, Madison, N. J.）。
【００４６】
本発明は、臨床で任意の遺伝子型のＨＣＶに感染したと診断された患者にも有益であるが、好ましい実施例では患者は遺伝子型1のＨＣＶに感染した患者である。
【００４７】
ＨＣＶ感染患者は血液中にＨＣＶ  ＲＮＡを有する、および／または、漿液中に抗ＨＣＶ抗体を有することで確認される。そうした患者には抗ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ-ポジティブな個体が含まれる。しかし、この個体は漿液アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルが上がっている必要はない。ＨＣＶに感染していると臨床的に診断される個体には先天性個体（すなわち、ＨＣＶの治療を以前に処置されていない個体）、特に、ＩＦＮ−αベースおよび／またはリバビリンベースの治療を以前に受けていない人）と、以前にＨＣＶの治療に失敗した個体（「治療失敗」患者）が含まれる。
【００４８】
本発明のインビトロ方法を実行するのに使用できる生物学的サンプルには任意の液体、組織、細胞サンプル、器官、生検、その他を含む患者から採取された任意の生物学的サンプルが含まれる。
【００４９】
本発明の一つの実施例では、生物学的サンプルは核酸を含む。そうしたサンプルの例は血液、組織、細胞サンプル、器官、生検、その他を含む。従って、サンプルは血漿、唾液、尿、精液、その他を含む。末梢血液が使用でき、単核細胞（PBMC）は好ましい細胞である。生物学的サンプルは生検、より詳しくは肝臓生検から採るこることができる。一般にインターフェロンαとリバビリンとを併用して処置しなければならないＨＣＶ感染患者は、肝臓損害がどれくらい大規模に進行しているかを調べるために治療前に肝臓生検を採る必要がある。生検検査は壊死炎症（necroinflammatory）活性（グレード）と線維症（段階）の範囲を調べる最も信頼できる方法である。線維症の程度は前兆値を有し、指数化および抗ウイルス治療のタイミングを決めるための基本的事項である。従って、本発明方法を実行するためには上記生検が有用である。
【００５０】
他の実施例では生物学的サンプルはポリペチドを含む。ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９およびＧ１Ｐ２は分泌タンパク質で、従って、これらのタンパクもインターフェロンαとリバビリンとの併用治療にＨＣＶ-感染患者の応答性を予測するための関連マーカーに成ると発明者は考える。
【００５１】
従って、本発明の特定実施例では生物学的サンプルは体液、好ましくは血液、より好ましくは漿液で、そのＩＦ１２７、ＣＸＣＬ９、Ｇ１Ｐ２タンパク質が検出されるか否かを調べる。
【００５２】
本発明のインビトロ方法の好ましい実施例では、上記方法にさらに、段階(a)で発現レベルが決定された各マーカー遺伝子に対して下記（i）と（ii）を比較する段階（b）が含まれる：
(i) 段階(a)で決定された発現レベル、
(ii) 応答者患者、非応答者患者またはその両方から成るグループの中から選択されるＨＣＶ感染患者からのサンプル中の上記遺伝子に対して以前に決定した対照値。
【００５３】
上記対照値は上記と同じ方法を使用被験者の以前に採取した生物学的サンプル中の同じマーカー遺伝子の発現レベルを決定することによって当業者が容易に求めることができる。
【００５４】
既に述べたように、第１の対照値はインターフェロンαとリバビリンとの併用治療に応答しないＨＣＶ感染患者のグループで決定された関連マーカー遺伝子の平均発現レベル値から成る。
【００５５】
第２の対照値はインターフェロンαとリバビリンとの併用治療に応答するＨＣＶ感染患者のグループで決定された関連マーカー遺伝子の平均発現レベル値から成る。
【００５６】
本発明のインビトロ方法の段階（b）の終了後に(i)被験患者のマーカー遺伝子発現レベル値と(ii)上記第１対照値とが類似している場合には被験患者はインターフェロンαとリバビリンとの併用治療に対して非応答者であることが分かる。
【００５７】
本発明のインビトロ方法の段階（b）の終了後に(i)被験患者のマーカー遺伝子発現レベル値と(ii)上記第２対照値とが類似している場合には被験患者はインターフェロンαとリバビリンとの併用治療に対して応答者であることが分かる。
【００５８】
ｍＲＮＡの定量化によるマーカー遺伝子の発現レベルの決定
全ＲＮＡまたはタンパク質は簡単に抽出できる。核酸またはタンパク質を利用できるようにするために生物学的サンプルは使用前に処置できる。細胞またはタンパクの溶解、核酸濃縮または希釈方法は当業者に公知である。
【００５９】
遺伝子の発現レベルは種々の方法で決定できる。一般に、発現レベルは相対発現度で決定される。
【００６０】
好ましくは決定方法は選択試薬、例えばプローブ、プライマーまたはリガンドをサンプルと接触させて、サンプル中にある特定のポリペチドまたは核酸の存在を検出し、または、量を測定する方法である。この接触は任意のデバイス、例えばプレート、ミクロタイタ皿、試験管、ウエル、グラス、カラム等で実行できる。本発明の特定実施例では、試薬、例えば核酸配列または特定リガンド配列を固定した基材上で接触を実行する。基材は固体または半固体で、好ましい基材は例えばガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマー等の任意の支持体である。基材は種々の形と寸法、例えばスライド、メンブレン、ビーズ、カラム、ゲル、その他にすることができる。接触は試薬とサンプル中の核酸またはポリペチドとの間に形成される核酸ハイブリッドまたは抗体−抗原複合体のような複合体を検出可能な任意の条件下で行なうことができる。
【００６１】
本発明の特定実施例ではｍＲＮＡの量を求めて形質発現レベルを決定できる。この方法は血液から単離した肝臓生検またはＰＢＭＣのような核酸サンプル中のＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９またはＧ１Ｐ２遺伝子の発現レベルを決定するのに適している。
【００６２】
ｍＲＮＡの数量を決定する方法は当業者に周知である。例えば、先ず最初にサンプル（例えば患者から調整した細胞または組織）中に含まれる核酸を標準分析法に従って抽出する。例えば、溶菌酵素または化学的溶液または核酸-結合樹脂を用い、メーカの指示に従って抽出する。抽出されたｍＲＮＡはハイブリダイゼーションして検出できる（例えば、ノーザンブロット解析）。
【００６３】
あるいは、抽出されたｍＲＮＡを逆転写と連結し増幅することができる。例えば特定のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）による逆転写／増幅によってＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９またはＧ１Ｐ２遺伝子の所定領域を増幅することができる。定量的または半定量的なＲＴ-ＰＣＲが好ましく、リアルタイムでの定量的または半定量的なＲＴ-ＰＣＲが特に有利である。抽出されたｍＲＮＡを逆転写し、増幅した後、増幅された配列を適切なプローブとハイブリダイゼーションして検出するか、直接配列決定（シークエンシング）、その他の公知方法で検出することができる。
【００６４】
他の増幅方法にはＤＮＡリガーゼ連鎖反応（LCR）、転写を介在させた増幅（TMA）、ストランド移動増幅（SDA）および核酸構造ベースの増幅（NASBA）が含まれる。
【００６５】
少なくとも10のヌクレオチドを有する核酸か、本発明で重要なｍＲＮＡに相補または相同な配列を有する核酸がハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとして有用であることが分かった。これらの核酸は同一である必要はなく、一般には対応寸法の相同領域の少なくとも約80％、好ましくは85％、より好ましくは90〜95％同一であると理解される。本発明の実施例では、ハイブリダイゼーションを検出するために、検出可能な標識のようなし適当な手段と核酸とを組み合わせて使用するのが有利である。これに適した指示薬としては螢光性、放射性、酵素、その他のリガンド（例えば、アビ遺伝子/ビオチン）を含む多種多様なものが公知である。
【００６６】
一般に、プローブは10〜1000、例えば10〜800、より好ましくは15〜700、一般には20〜500のヌクレオチド長さを有する一本鎖の核酸から成る。典型的なプライマは10〜25ヌクレオチドの長さを有する短い一本鎖の核酸で、求める被増幅核酸と完全またはほぼ完全にマッチするように設計される。プローブおよびプライマーはそれがハイブリダイズされる核酸に「特異」である。すなわち、高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズされるのが好ましい（最高融解温度Ｔｍ、例えば５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応。ＳＣＣは０．１５Ｍ-ＮａＣl、０．０１５Ｍ-Ｎａ−クエン酸塩である）。
【００６７】
本発明の特定実施例では、本発明の方法は患者の生物学的サンプルから得た全ＲＮＡを提供し、そのＲＮＡを増幅し、特定プローブ、特に定量的または半定量的なＲＴ-ＰＣＲによってハイブリダイゼーションする段階を含む。
【００６８】
全ＲＮＡは生物学的サンプルから簡単に抽出できる。使用前に例えば生物学的サンプルを処置して核酸が利用できるようにすることができる。細胞またはタンパク細胞の溶解、核酸の濃縮または希釈方法は当業者に公知である。
【００６９】
他の実施例では、発現レベルはＤＮＡマイクロアレー解析で決定できる。このＤＮＡマイクロアレーまたは核酸マイクロアレーは基材に化学的に付けた各種の核酸プローブから成る。基材はマイクロチップ、ガラススライドまたはミクロスフィアサイズのビーズにすることができる。マイクロチップはポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカまたはシリカベースの材料、カーボン、金属、無機グラスまたはニトロセルロース等にすることができる。プローブは例えば約10〜約60の塩基対の相補ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドのような核酸から成ることができる。発現レベルを決定するために、被験者からのサンプルを、必要に応じて先ず最初に選択的逆転写した後に、ラベル化し、ハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレーと接触させて、マイクロアレー表面に付着したプローブ配列と相補なターゲット核酸間に複合体を形成する。その後、ラベル化され、ハイブリダイゼーションされた複合体をを検出するか、定量するか、半定量する。標識化は種々の方法、例えば放射性または蛍光性の標識化を用いて実行できる。マイクロアレーハイブリダイゼーション法の変形例については下記文献が参照できる。
【非特許文献２】Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7:200-210
【００７０】
従って、本発明はさらに、ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９遺伝子の核酸発現産物に特異的な核酸（すなわち、ｍＲＮＡまたは相補ＤＮＡ）が固定された固体担体を含むＤＮＡマイクロアレーを提供する。本発明の特定実施例ではこのＤＮＡマイクロアレーがＧ１Ｐ２遺伝子核酸発現産物に特異的な核酸をさらに有することができる。
【００７１】
タンパク質の定量化によるマーカー遺伝子の発現レベルの決定
本発明のインビトロ方法の段階(a)でマーカー遺伝子の発現を決定する他の方法は、被験者のＨＣＶ感染患者から以前に回収した生物学的サンプル中に見られる遺伝子によってコードされるポリペチドの量を求める方法である。この方法は分泌されるタンパクである漿液等の生物学的サンプル中のＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９またはＧ１Ｐ２タンパク質の量を決定するのに特に適している。
【００７２】
この方法ではサンプル中に存在するマーカータンパク質と選択的に相互作用可能な結合パートナーと生物学的サンプルとを接触させる。この結合パートナーは一般にポリクローナルまたはモノクローナルン抗体で、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００７３】
タンパクの存在は標準的な電気的または免疫学的な方法、例えば競合アッセイ、直接反応またはサンドイッチアッセイ等のイムノアッセイを用いて検出できる。この種のアッセイにはウエスタンブロット、凝集検査、酵素ラベル化を介したイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ビオチン/アビ型アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫電気泳動、免疫沈降等が含まれるが、これらに限定されるものではない。上記反応には一般に螢光、化学的ルミネッセンス、放射性、酵素のラベルまたは分子染色のラベルを調べる方法、または、抗原とそれと反応した抗体との間の複合体を検出するその他の方法が含まれる。
【００７４】
上記アッセイでは一般に抗原/抗体複合体が結合した固相支持体から液相中のタンパクを分離する行程が含まれる。本発明で使用可能な固体担体にはニトロセルロース（例えばメンブレンまたはミクロタイタウエルタイプ）、ポリ塩化ビニル（例えばシートまたはミクロタイタウエル）、ポリスチレンラテックス（例えばビーズまたはミクロタイタープレート）、ポリフッ化ビニリデン、ジアゾ化ペーパ、ナイロンメンブレン、活性ビーズ、磁気応答性ビーズ等の基材が含まれる。
【００７５】
特にＥＬＩＳＡ法が使用できる。このＥＬＩＳＡ法ではミクロタイタープレートのウエルをテストするタンパク質に対する一組の抗体で被覆する。次に、マーカータンパクを含むまたは含むことが疑われる生物学的サンプルを上記の被覆ウエルに加える。プレートを抗原／抗体複合体の形成ができるのに十分な培養時間が経過した後に洗浄して非結合部分を除去し、検出可能なラベルを付けた第２の結合分子を加える。この第２の結合分子はサンプルマーカータンパクと反応して結合する。プレートを洗浄し、公知方法を使用して第２の結合分子の存在を検出する。
【００７６】
本発明の方法は上記の遺伝子の結合された発現レベルを、患者の応答者および非応答者のグループから得た対照（コントロール）値と比較する段階をさらに含むことができる。
【００７７】
本発明の特定実施例で対照値を提供する好ましい患者の応答者グループは、治療終了後６ヵ月間、ＨＣＶ  ＲＮＡが検知されないことが決定されたことで定義される継続的ウイルス応答性を示すグループである（NIH Hepatology 2002、EASL Consensus）。
【００７８】
診断キット：
本発明のさらに他の対照は、インターフェロンαとリバビリンとを併用した治療に対してＨＣＶ感染患者が応答者であるか非応答者であるかを決定するためのキットにある。このキットはＩＦＩ２７とＣＸＣＬ９の発現レベルを測定する手段を有している。本発明の特定実施例では、患者が非応答者であるか否かを決定するためのキットはＧ１Ｐ２の発現レベルを測定する手段をさらに有している。
【００７９】
本発明キットの一つの実施例では、キットが下記のコンポーネント（構成）を含んでいる：
(i) ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９（およびＧ１Ｐ２）遺伝子に対する一連のプローブ、一般にＤＮＡから成り、予めラベル化されていてもよい、
(ii) ハイブリダイゼーション試薬
【００８０】
上記プローブは「配列−特異的オリゴヌクレオチド」すなわちＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９またはＧ１Ｐ２遺伝子配列の一部と高いストレンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドまたは核酸である(Sambrook et al, 1989)。プローブとして使用可能なオリゴヌクレオチドは公知の任意の方法、例えば放射標識、蛍光剤標識、酵素標識、配列同位体トレーサ、その他でラベル化することができる。ラベル化したオリゴヌクレオチドを上記遺伝子の存在を検出するプローブとして使用できる。
【００８１】
一般にオリゴヌクレオチドは合成され、好ましくは核酸合成装置で調製される。従って、オリゴヌクレオチドは非天然のホスホエステル類似結合、例えばチオエステル結合、その他を用いて調製できる。
【００８２】
上記キットは他の最適に包装試薬と特定のハイブリダイゼーションのプロトコルに必要な材料、例えば必要に応じて用いる固体相マトリックスおよび標準品を含むことができる。
【００８３】
あるいは、プローブをラベル化しないで、標識化用成分を別の容器中に入れたキットにすることもできる。
【００８４】
本発明の他の実施例のキットは下記を含むことができる：
(i) ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９およびＧ１Ｐ２遺伝子の増幅用増幅プライマー、
(ii) 配列決定試薬または増幅試薬
【００８５】
キットはさらに、特定の配列決定増幅プロトコールに必要な他の包装試薬と材料を含むことができる。本発明の一つの好ましい実施例のキットはＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９またはＧ１Ｐ２遺伝子の領域を増幅させる配列に対応するシークエンシングまたは増幅プライマーのパネルを含む。
【００８６】
シークエンシングプライマーはプレラベル化するか、親和性精製またはアタッチメント部分を含むことができる。
【００８７】
本発明の特定実施例のキットはＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９またはＧ１Ｐ２遺伝子の全部または一部を特異的に増幅するための一連のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。好ましいキットは下記の一連のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含む：
（１）ＩＦＩ２７遺伝子増幅用のＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５、
（２）ＣＸＣＬ９遺伝子増幅用のＳＥＱＩＤ  Ｎｏ．６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７
（３) Ｇ１Ｐ２遺伝子増幅用のＳＥＱＩＤ  Ｎｏ．８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９
【００８８】
本発明の他の実施例のキットはＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９およびＧ１Ｐ２タンパク質を特異的に認識する一連の抗体から成ることができる。
【００８９】
治療の方法：
本発明のさらに他の対象は、慢性Ｃ型肝炎のようなＨＣＶ感染の治療方法または肝臓病、例えば肝臓線維症、肝硬変または肝細胞癌のようなＨＣＶ感染に関連する病気の予防方法にある。
「治療」または「処置」という用語は、この用語が適用される不全または状態の少なくとも一つの症状の進行を止め、楽にし、抑制するか、防止することを意味する。
【００９０】
本発明の上記方法の一つの実施例は下記の段階を有する：
（a) 上記のインビトロ方法を実行してインターフェロンαとリバビリンとの併用治療に対してＨＣＶ感染患者が応答者であるか非応答者であるかを決定し、
（b)上記の段階（a)で患者が応答者があることが決定された時には、インターフェロンαとリバビリンとを併用して投与する。
【００９１】
患者の分類−応答者であるか、非応答者であるかは上記の２つまたは３つの遺伝子の複合発現レベルに応じて行われる。インターフェロンαとリバビリンとの治療に対して応答または応答しない患者のサブグループをさらに定義することもできる。
【００９２】
本発明の特定実施例ではインターフェロンαはペグ化（pegylated）される。好ましい実施例ではペグインターフェロンはインターフェロンα2b（Intron, Schering-Plough、Madison, N. J.）である。
【００９３】
本発明のさらに他の対象は、上記方法によって応答者に分類されたＨＣＶ感染患者用の医薬品の製造でのインターフェロンαおよびリバビリンの使用にある。
【実施例】
【００９４】
Ａ．材料および方法
Ａ．１．患者：
慢性Ｃ型肝炎患者：
ボジョン病院（Beaujon Hospital）(Clichy, France)からの非処置の大人のＣＨＣ患者群から経皮で肝臓生検材料を採った。全てのケースで肝臓組織は直ちに凍結し（-80℃で保存）、パラフィン埋込み固定組織（組織学用）を用意した。この研究には下記ａ）〜ｄ）のクライテリアを満たす患者が含まれる：
【００９５】
a）  抗ＨＣＶ抗体が検出され、ＲＴ−ＰＣＲ（ＨＣＶ Amplicor 2.0；Rpche diagnosis, Mannheim, Germany)で血漿ＨＣＶ  ＲＮＡが検出され、肝臓生検で慢性Ｃ型肝炎に対応する所見のある、診断でＣＨＣであることが確実な患者、
b）  慢性肝臓病の他の原因のがない患者（ＨＢｓ−Ａｇ検知なし、過剰アルコール消費量の定義摂取量＞30g/日ではない、ヘモクロマトーシス、自己免疫肝炎、ウイルソン病、α-1抗トリプシン欠乏、原発性硬化性胆管炎または原発性胆管萎縮症なし）。
c）  標準治療患者：全てが天然患者、ペグインターフェロン（PEG-IFN）α-2b （Viraferon-peg，Schehng corp）を1.5μg/kg/週の投与量で投与し、且つリバビリンを体重に応じて調整した投与量（＜65kg：800mg/日；65kg〜85kg：1000mg/日、＞85kg：1200mg/日）で投与する同じ完全治療スケジュールを受けた標準治療患者。治療期間はＨＣＶ遺伝子型２または３の感染患者で24週間、ＨＣＶ遺伝子型1または４の感染患者で48週間であった。
d）  経過観察が十分可能な患者：外来患者。漿液中のＨＣＶ  ＲＮＡ検出を最後に週12行い、治療後６ヵ月後にＲＴ-ＰＣＲを実行。
【００９６】
効果のアセスメント：
継続的ウイルス応答性（ＳＶＲ）は処置（1-2）完了後の完成の後６ヵ月間、ＨＣＶ  ＲＮＡが検知されないことと定義した。非応答（ＮＲ）は治療終了後に漿液ＨＣＶ  ＲＮＡが検出されたことと定義した。
【００９７】
先ず最初に、14人の非応答者と26人の応答者とを含む継続的ＣＨＣ患者40人のトレーニング・セット（グループＡ）で遺伝子シグネチャー(signature、署名)を確認 (validate) した。次に、９人の非応答者と20人の応答者とを含む29人の継続的ＣＨＣ患者の独立確証セット（グループＢ）で遺伝子シグネチャーを確認して、新しいデータに一般化できることを確認した。グループＡとグループＢのベースライン特性は［表１］［表２］に示した。
【００９８】
組織学的通常対照：
ボジョン病院（Beaujon Hospital）（Clichy、France）に送られたアラニン アミノトランスフェラーゼ活性がわずかに高い漿液を含む他の肝臓病気の原因（薬物添加、アルコール、慢性ビールス性肝炎、自己免疫プロセスおよび代謝異常）がない８人の成人から、経皮で肝臓生検材料を得た。これらの成人では経皮局所麻酔後に肝臓生検を採った。８人の全ての肝臓組織検査材料は組織学的にノーマルであった（すなわち、炎症、線維症および異常パターンはない）。
【００９９】
Ａ．２．リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ：
我々は同じ技術的アプローチを用いた前の研究で、Ｃ型肝炎は正常肝と比較していくつかの変化した分子経路 (Bieche et al. 2005)を有し、肝臓線維症の進行（Asselah T, et al. 2005) が関係しているということを示した。
【０１００】
理論的基礎：
ＡＢＩプライマー9700シーケンス検出システム（Perkin-Elmer Applied Biosystems、Foster City, CA）のを使用しているリアルタイム定量ＲＴ-ＰＣＲの理論および実用的観点は他の文献に記載されている（Asselah et al.2005)。
【０１０１】
各反応混合物（光学濃度ベース）に加えた全ＲＮＡの正確な量とその品質（すなわち大きな劣化なし）は両方ともアッセイが難しい。そのため、我々は２つの細胞代謝経路に関係する２つの内在性ＲＮＡ対照遺伝子、すなわち、ＴＡＴＡボックス−結合タンパク（ＤＮＡ結合タンパク複合体ＴＦＩＩＤの成分）をコードするＴＢＰの転写産物（Genbank寄託  NM_003194）と、ヒトの酸性リボソーム燐タンパクＰＯをコードするＲＰＬＰＯ（36B4；NM_001002として公知）とを定量した。各サンプルはＴＢＰ（またはＲＰＬＰＯ）の含有量を基準に標準化した。
【０１０２】
結果はＴＢＰ（またはＲＰＬＰＯ）遺伝子に対するターゲット遺伝子の相対発現のＮ−倍差（「Ｎtarget」という）で表し、Ｎtarget＝２ΔCtsamplとして決定した。ここで、サンプルのΔＣの値は、ＴＢＰ（またはＲＰＬＰＯ）遺伝子の平均Ｃｔ値からターゲット遺伝子の平均Ｃｔ値を引いて決定した。
【０１０３】
各サンプルのＮtargetは通常組織学的肝臓のＮtarget 値の中央値が１となるように後で標準化した。
【０１０４】
遺伝子の選択：
我々は肝臓遺伝子発現によって応答者を非応答者から処置前に区別できると予測した。我々は文献研究によってヒト慢性Ｃ型肝炎で肝臓遺伝子の発現に関連する種々の細胞および分子機構に関係する58の遺伝子を選択した(Chen et al.2005;Honda et al.2001 ; Smith et al.2003; Mihm et al.2004; Bieche et al, 2005; Asselah T, et al. 2005, Helbig et al. 2005, Gale et al. 2005)。我々は特に、通常組織肝臓に比較してＨＣＶ感染で発現が調節不能化される（dysregulated）遺伝子（n = 37; Bieche et al.2005)、ＣＨＣ線維症の亢進に関与する遺伝子(n = 7, Asselah et al. 2005)、処置結果を伴ったもの（n = 18、Chen et al.，2005）、およびＨＣＶに対する免疫応答に関連する遺伝子（Helbig et al.，2005）に注目した。これらの遺伝子は主として免疫応答、細胞外リモデリングおよびインターフェロン信号化に関係するタンパク質をコードする（［表３］を参照）。
【０１０５】
プライマーと対照：
ＴＢＰ、ＲＰＬＰＯおよび58のターゲット遺伝子用のプライマーはOligo 5.0コンピュータープログラム（National Biosciences, Plymouth, MN) を用いて選択した。
【０１０６】
我々はｄｂＥＳＴおよびＮＲデータベースを検索してプライマーとして選択したヌクレオチド配列の全遺伝子特異性を確認し、単一ヌクレオチド多型が存在しないことを確認した。特に、密接に関連したメンバ遺伝子の配列または対応するレトロプセド遺伝子の配列に関してユニークなプライマー対を選択した。可能な場合には、ゲノムＤＮＡの汚染増幅を避けるために２つのプライマーの一つは２つのエキソン間の結合部に置いた。一般に、アンプリコンは70〜120のヌクレオチド長である。ＰＣＲアンプリコンの特異性はゲル電気泳動で確認した。
【０１０７】
各プライマー対に対するノーテンプレート（no-template）対照（NTC）およびノン逆トランスクリプターゼ対照（ＲＴネガ）アッセイを実行し、プライマ−ダイマーの形成およびゲノムＤＮＡ汚染効果を示唆する無視可能な生成信号（通常Ｃｔ値＞40）は無視した。ＲＮＡ抽出、相補ＤＮＡの合成およびＰＣＲ反応条件は他の文献に記載されている（Asselah et al., 2005）。
［表４］はＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９およびＧ１Ｐ２に特異的なプライマを示している。
【０１０８】
Ａ．４．統計解析：
有意差試験、クラスタリングおよび管理クラス予測：
ＳＶＲとＮＲとの間で異なる発現をした遺伝子は信号／雑音比とスチューデントｔテスト（Student's t-test）統計とを使用して同定した。信号／雑音比（ＳＮＲ）は２つのクラス（すなわちＳＶＲおよびＮＲグループ）の各々の平均差（信号）を測定し、標準偏差（ノイズ）の合計を目盛にした。ＳＮＲ＝（μO−μ1）/（σ０＋σ1）。ここで、μi、σiはクラスiの平均および標準偏差である。各グループを通して分散が同じであると仮定し、（μO−μ1）/（σ０＋σ1）1/2で定義されるt統計量と比較し、ＳＮＲ統計量は1つのクラスで高い分散を有し、他のクラスでは低い分散を有するものより各クラスでより高い分散を有する遺伝子にペナルティーを付ける。サンプル状態（ＳＶＲ/ＮＲ）の10,000の順列置換（permutations）を使用してＰ値を推定し、調節後のＰ値が0.05以下の遺伝子は実質的に差が発現されたと見なした。複数テストからの誤ポジティブ結果を制御するためにＰ値をベンジャ、ホックベルク（Benjamini、Hochberg）の誤り発見率（FDR）法（Benjamini、Hochberg 1995）を使用して訂正した。
【０１０９】
類似測定基準としてコサイン距離を用いた平均リンケージクラスタリングを使用して発現データの非管理階層クラスタリングを実行した。クラスタリング分析はデータベースの構造を自動的にグループ化し、見付ける方法で、遺伝子の発現プロフィルの類似性に基づいてデータをツリー構造に組織化するものである。ツリーの最も高いレベルが見いだしたクラスである。
【０１１０】
管理クラス予測解析（sipervised class prediction analysis）はｋ−ニアリストネーバ(最も近い隣人、k−nearlistneighbour，ＫＮＮ）およびウエイトニング ボーティング(ウエイト付け投票、weightning voting、ＷＶ）予測アルゴリズム使用して実行して、最小の予測セット数でサンプルのクラス分けの最適予測精度を得た。簡単にいうと、ＫＮＮクラス分け法(KNN classifer)（Vover and Hart, 1967）は観察ペアー間の距離を関数にし、トレーニングするデータベースでのｋ−ニアリストネーバを決定し、これらｋ−ニアリストネーバの最も共通のクラスを決定して被テストサンプルのクラスを同定する。我々のＫＮＮクラス分け式（classfier）ではコサイン距離と距離でウエイト付けした投票式とを使用した。ｋ−ニアリストネーバの数はトレーニングセットでクロス確認（CV）で選択し、最小ＣＶエラーレートとなるｋを保持し、このテストセットで使用した。このＷＶクラス分け法を用いることでトレーニングセットで得られる関連マーカー遺伝子のウエイト付けされたリニアーな組合から新しいサンプルに対するクラス分け式が与えられる。このクラス分け式への入力特性値はＳＮＲ統計量を計算して選択する。
【０１１１】
トレーニングセットの役目をするグループＡのサンプルからの遺伝子発現データを使用して予測モデルを構築した。遺伝子の数を増やしたモデルを用いてリーブ−ワン−アウトクロス評価(leave-one-out cross validation、ＬＯＯＣＶ） によって最も正確なクラス帰属を求めるための最小予言モデルを同定した。このＬＯＯＣＶではトレーニングセットから1つのサンプルを除き、残りのトレーニングサンプルを用いてクラス分け式を作る。そのクラス分け式を用いて残りのクラスを予測し、トレーニングセット中の各サンプルでこの操作を繰り返す。クラス分け精度のＬＯＯＣＶ評価はトレーニングセット中で正しく分類されたサンプルの全数をサンプル数で割ったものである。次に、独立したテストセット（グループＢ）でこの予測クラス分けモデルの確証解析を行い、このテストセット中のサンプルに対するクラス帰属のトタル精度を報告した。
【０１１２】
全ての解析はジーンパターン（GenePattern）の2.0バージョン（http://www.broad.mit.edu/cancer/software/genepattern）(Reich et al, 2006) を用いて行った。
【０１１３】
Ｂ．結果：
Ｂ．１．ＳＶＲとＮＲで発現に大きな差のある遺伝子の同定：
先ず最初にＳＶＲとＮＲの肝臓組織生検材料の間に遺伝子発現に大きな違いがあるか否かを調べた。［表５］と［表６］はそれぞれグループＡおよびＢに適用したときのスチューデントtテストの結果を示している。同じ発現差のある遺伝子を示すＳＮＲの統計で得られた結果も、正確に同じ順序ではないが、ほぼ同じであった。
【０１１４】
全ての遺伝子をｔ−テスト統計に従ってソートしてＳＶＲ/ＮＲ状況で関連化させた遺伝子を同定した。［表３］はグループＡを示し、非−調整Ｐ値が0.05以下の遺伝子は10である。これは厳密な有意差ではないが、これらのＰ値はさらに研究しなければならない遺伝子の同定に有用である。グループＡのデータからＳＶＲとＮＲとの間で発現が大きく異なる（ＦＤＲ＜０．０５）３つの遺伝子：Ｇ１Ｐ３（ＩＦＩ６ともよばれる）、ＩＦＩ２７、Ｇ１Ｐ２を同定した（［表５］）。Ｇ１Ｐ２とＧ１Ｐ３は独立した別のデータセットの研究でＳＶＲとＮＲとの間の遺伝子発現差（Ｐ＜０．００１）として既に同定されている(Chen et al., 2005)。
【０１１５】
グループＢからの遺伝子発現データの分析から、19の遺伝子に発現差（ＦＤＲ＜０．０５）があることが分かった（［表６］）。グループＡでは３つの遺伝子（Ｇ１Ｐ３、ＩＦＩ２７およびＧ１Ｐ２）がこの独立のサンプルのＮＲとＳＶＲとの間の発現プロフィルでの差が大きく（ＦＤＲ＜０．０５）、４つの遺伝子中で有意差が最も大きい。さらに、グループＡ中の非調整Ｐ−値が0.05以下を示す10の遺伝子の中で、６つ（ＩＦＩ２７、Ｇ１Ｐ２、Ｇ１Ｐ３、ＯＡＳ２、herc５、ＩＦＩＴ１）はグループＢで発現差（ＦＤＲ＜０．０５）を示したことは興味深い。これら６つの遺伝子の中で５つ（ＩＦＩ２７、Ｇ１Ｐ２、Ｇ１Ｐ３、ＯＡＳ２、ＩＦＩＴ１）は発現差があることはChen. et. al.,（2005）でも同定されている。
【０１１６】
Ｂ．２．遺伝子発現を基にしたクラス分けで最も有用な遺伝子サブセットの選択：
全ての遺伝子セット（58遺伝子）を使用してグループＡおよび全データベース（グループＡおよびグループＢ）で非管理(unsupervised)階層的クラスタリングを用いた診断データ分析を行った。この解析ではＳＶＲとＮＲグループとの間に特徴的なクラスタは同定されなかった。これは、考慮した大部分の遺伝子がＮＲ/ＳＶＲ状況に関係がなかったことから予想されたことである。従って、ＳＶＲおよびＮＲ患者は非管理階層的データ分析では差別化できない。
【０１１７】
遺伝子シグネチャーを発見するための２つの管理された学習クラス分け法ＫＮＮおよびＷＶを使用して予測モデルを構築した。良い予測モドルが、臨床結果がないというヌル仮定を調査した各変数に対してテストした時にロータイプのエラー１を必ずしも有することはないので(Devlin et al, 2003)、解析は統計学的に大きな差別的な遺伝子に制限せずに、全遺伝子セットを使用して実行した。トレーニングセットとして使用したグループＡのＬＯＯＣＶによって評価されるＳＶＲとＮＲとの間の遺伝子発現プロフィルの識別で最も高い全体精度（77.5％）を与える２-遺伝子クラス分け法（ＩＦＩ２７、ＣＣＣＬ９、ｋ＝３を使用）がＫＮＮアルゴリズムによって同定された（［図１］）。クラス分けセットの大きさを増やしても精度は向上しなかった。これら２−遺伝子シグネチャーは26人のＳＶＲ患者中の23人（88.5％）および14人のＮＲ患者中の8人（57.1％）を正しく分類した（［表７］）。
【０１１８】
これを29人の患者から成る独立したテストセット（グループＢ）で評価したが、23人（79.3％）が正しく分類された。治療応答性は全てのＮＲ患者（100％）と20人のＳＶＲ患者中の14人（70％）で正しく予測された。
【０１１９】
ＷＶクラス分け法では３-遺伝子サブセット（ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９、Ｇ１Ｐ３）を使用した時に最も高い分類精度（80.0％）が得られ、追加の遺伝子が含まれた場合でも結果は同じであった（［表７］）。この予測遺伝子シグネチャーは独立テストセットでも良い予測精度を示し、正しく指摘されたサンプルは72.4％（21/29）であった。
【０１２０】
クラス向け予測モデルを作るのにグループＡサンプルのみを使用するとクラス分けの能力のロスが起こるので、我々は全てのデータベース（69サンプル）を使用し、このサンプルにＬＯＯＣＶ手順を適用して識別された遺伝子シグネチャーの予測精度を推定する予測モデルを作った（［図２］）。最高の結果はＫＮＮおよびＷＶ解析を実行した時にそれぞれ２−遺伝子（ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９、k＝3）および３−遺伝子（ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９、Ｇ１Ｐ２）サブセットを使用した時に得られた。これら両方の予測モデルは慢性ＨＣＶ患者69人中の56人（81.2％）での治療応答性を正しく予測した（［表６］）。しかし、患者のＮＲおよびＳＶＲグループ内での予測エラーは２−遺伝子シグネチャーＫＮＮクラス分け法に似ている（それぞれ26.1％と15.2％）が、３-遺伝子サブセットでＷＶアルゴリズムを訓練した時にはそれらは著しくアンバランスになる（それぞれ39.1％と8.7％）（［図２］）。面白いことに、治療結果の遺伝子発現ベースのクラス分けで良い予測値として選択された遺伝子の中で、ＣＸＣＬ９はＳＶＲとＮＲ患者の間で発現に差はなかった（ＦＤＲ＞０．０５）。我々は２−遺伝子シグネチャー（ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９）を用いて全部のデータベース（69サンプル）で非管理クラスタリング解析を実行した。得られたデンドグラムではＳＶＲ患者は１つのクラスタに集まり、他のクラスタはさらに２つのサブクラス：ＳＶＲ患者を含むものと他のＮＲ患者を含むものに再分割された（［図３］）。このツリーでは６人のＮＲ患者と７人のＳＶＲ患者が間違って分類された。これはＫＮＮクラス分け法で得られた結果と一致している。さらに、遺伝子型1の感染患者グループで２−遺伝子シグネチャーをテストした。41人の患者中の31人（75.6％）がＫＮＮを使用して正しく分類され、ＮＲおよびＳＶＲ患者の予測精度はそれぞれ71.4％（15/21）および80％（16/20）であった。
【０１２１】
Ｂ．３．結果の考察
この研究ではペグインターフェロンにリバビリンをプラスした治療を受けた慢性ＨＣＶ感染患者の治療結果を予測するために大規模なリアルタイムＰＣＲを使用した。この治療に対する応答と関連がある種々の細胞および分子機構に関係していることが公知の58の遺伝子の発現レベルを調べた。全ての患者は良く定義され、表現型が決められた（phenotyped）：全てがナイーブ患者で、同じペグインターフェロン（PEG-IFN）α-2b（Viraferon-peg、Schering corp）とリバビリンとのを有する）の完全治療スケジュールを受けていた。
【０１２２】
リアルタイムの定量的ＲＴ-ＰＣＲは遺伝子プロファイリング用の相補ＤＮＡマイクロアレーに代わり得るものである。特に、再生可能性および定量性ではリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは相補ＤＮＡマイクロアレーよりもはるか明確である。このアプローチを使用することで、我々はいくつかの変化した分子経路が慢性Ｃ型肝炎の線維症の進行に関係していることを示した(Asselah T, et al. 2005)。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはサイトカインのような弱い発現遺伝子を分析するのに有用である。
【０１２３】
最高のクラス分け結果は、全てのデータベースでそれぞれＫＮＮおよびＷＶ解析を実行した時に、２−遺伝子（ＩＦＩ２７、ＣＣＣＬ９）および３−遺伝子（ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９、Ｇ１Ｐ２）サブセット（前記遺伝子の２つを含む）を使用して得られた（［図１］）。両方の予測モデルは69人の慢性ＨＣＶ患者中56人（81.2％）の治療応答性を正確に予測した。
【０１２４】
ＨＣＶ遺伝子型1の感染患者でのウイルス応答率は50％以下である（Manns et al. 2001、Fried et al., 2002、Hadziyannis et al., 2004）。多くの患者が大きな副作用を有する最適抗ウイルス治療に対して応答しないので、患者が応答しないことを（治療前に）理想的にはベースラインで予測することは経済的な面と患者のケアーの両方で大きなメリットになる。この目的で、非応答を予測する最高シグネチャーは３−遺伝子（ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９、Ｇ１Ｐ２）サブセットである。この３遺伝子はインターフェロン刺激遺伝子ファミリーに属している。
【０１２５】
トレーニングセット（Ｇ１Ｐ３、ＩＦＩ２７、Ｇ１Ｐ２、ＭＩＸ１、ＯＡＳ２、ＩＬ８、ＩＦＩＴ１）およびＩＦＮ−誘導遺伝子に属する確証セット（ＩＦＩ２７、Ｇ１Ｐ２、Ｇ１Ｐ３、ＳＴＡＴ１、ＬＧＳ３Ｂ、ＯＡＳ２、ＦＧＦ７、ＩＳＦ３Ｇ、ＩＦＴＭ１、ＩＦＩＴ１、ＯＡＳ３、ＩＧＰ１、ＰＬＣＲ１）でＳＶＲとＮＲとの間に発現差を示す遺伝子は多数見つかっている。面白いことに、これらの遺伝子の全てが正常肝に比較してＳＶＲおよびＮＲサンプル中でアップ−レギュレートされていた。このことは、ＩＦＮ−誘導可能な遺伝子はＩＲＦ３、ＮＦＫＢ１の直接の賦活または宿主細胞でのＩＦＮに依存する信号で起こる事項を介したＪＵＮの活性化によって慢性ＨＣＶ感染時に発現されることを示唆している（Gale and Foy, 2005）。面白いことに、３つの遺伝子のシグネチャー（ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９、Ｇ１Ｐ２）は正常肝に比較して慢性肝炎（穏やかな病気）で強いアップ−レギュレートされている(Bieche et al.2005)。ＩＦＩ２７とＧ１Ｐ２はＩＦＮα/β誘導性遺伝子であり、高いヌクレオチド配列相同性を有するし、未知の機能を有している(Li et al.2001）。ＣＸＣＬ９はＩＦＮ−γ誘導性遺伝子である。
【０１２６】
最近の研究で、治療前に経皮針で採取された肝臓生検材料での発現プロファイリングが実行された(Chen et al. 2005)。15人の非応答者、16人の応答者および20人の正常肝生検材料で遺伝子発現レベルが比較された。ＩＦＮ応答遺伝子の特定セットのアップ−レギュレーションでＰＥＧ  ＩＦＮα＋リバビリンの治療に対する非応答性を予測している。面白いことに、これらの遺伝子（ＩＦＩ２７、Ｇ１Ｐ２、Ｇ１Ｐ３、０ＡＳ２、ＩＦＩＴ１）の中の５つは我々の研究でもＳＶＲとＮＲとの間に発現差があるとして同定されたものである。
【０１２７】
Hayashida et al.の他の研究ではＩＦＮまたはＩＦＮ／リバビリンを用いた治療の前に肝臓組織サンプルをマイクロアレーで分析している（Hayashida. et al., 2005）。ＩＦＮグループで発現差のある遺伝子は主としてＩＦＮ、脂質代謝、補体およびオキシドリダクターゼに関連する遺伝子であった。ＩＦＮ／リバビリン複合治療では別の遺伝子セットがシクロフィリンＡおよび多剤耐性タンパクじ同定された。インターフェロン治療の場合のＳＲ／ＴＲおよびＮＲ患者は相補ＤＮＡマイクロアレーからのホストデータだけを使用してうまく予測ができた。驚くことに、同定された弁別ファミリー遺伝子はＩＦＮまたはＩＦＮ／リバビリンを受けていた２つのグループとは異なっていた。
【０１２８】
ＩＦＮ治療時の末梢血液単核細胞の遺伝子発現パターンを分析した一つの研究はＩＦＮ−刺激遺伝子または抗原プロセスおよびプレゼンテーションに関係しているであろうと考えられる遺伝子のアップレギュレーションを確認している（Ji X, et al. 2003)。しかし、慢性Ｃ型肝炎の末梢血液単核細胞の遺伝子形現を調べる研究を治療前にする必要がある。
【０１２９】
上記３つの研究には限界がある。第一に、ほんの少人数の患者しか分析しておらず、確認セットはない。第２に、患者が受けた治療およびコンプライアンスに関するウイルス学的非応答者の定義が同じでない（ＩＦＮ単一療法、ペグインターフェロン、リバビリン...）。さらに、遺伝子発現解析およびマイクロアレーデータの多様性のために使用したマイクロアレープラットフォームの多品種は品質保証の必要性を強調している。マイクロアレー解析では高品質なＲＮＡサンプルが重要で、各ＲＮＡ製法の品質は厳しく査定しなければならない。ＲＮＡの劣化を避けるためにＲＮＡ抽出時に慎重な対策をとる必要がある。さらに、解析手順を改良し、確認のために多くの患者を用いる必要がある。遺伝子シグネチャーは将来、最適化したテーラーメードの治療に使われるであろう。
【０１３０】
多くの遺伝子が漿液中に分泌されるＮＲおよびＳＶＲコード分子間でアップ−レギュレートされ（サイトカイン、インターフェロン経路、ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９、Ｇ１Ｐ２）、治療応答性を予測するための論理的機能アプローチを漿液マーカーの開発に提供する。例えば、一つ研究ではＣＸＣケモキンリセプタ３（ＣＸＣＲ３）と結合するケモキンのレベルを調べて、これらケモキンが明らかなＨＣＶ感染に対して免疫系欠陥で何らかの役目をしているか否かを決定している(Butera et al. 2005)。続く抗ウイルス性治療でＣＸＣＬ１０とＣＸＣＬ９のレベルの減少には成功したが、治療中または治療後の最初６カ月はＣＸＣＬ１１は減少しなかった。ＣＸＣＬ１０のベースレベル（抗ウイルス治療前に測定）は治療に応答しなかったＨＣＶ患者で最も高かった。これらの結果は、ペグインターフェロン（ＩＦＮ）とリバビリンを併用した、または、併用しない抗ウイルス治療に対する応答性または非応答性は免疫応答性のＣＸＣＬ１０の血漿濃度で予測できることを示唆している。
【０１３１】
結論として、我々の研究はＮＲおよびＳＶＲが治療前に異なる遺伝子発現パターンを有することを証明した。遺伝子発現の最も顕著な変化は主としてインターフェロン刺激遺伝子で起った。我々は２つの独立した患者のグループ（トレーニングセットと確認セット）を使用した。我々は３-遺伝子シグネチャー（ＩＦＩ２７、ＣＸＣＬ９、Ｇ１Ｐ２）を用いて治療応答性を予測できた。これらの遺伝子は漿液中に分泌される分子をコードし、治療に対する応答性を予測するための漿液マーカーの開発のための論理的機能アプローチを提供する。
【０１３２】
【表１】
2010520744.tif 000002
【０１３３】
【表２】
2010520744.tif 000003
【０１３４】
【表３】
2010520744.tif 000004
【０１３５】
【表４】
2010520744.tif 000005
【０１３６】
【表５】
2010520744.tif 000006
【０１３７】
【表６】
2010520744.tif 000007
【０１３８】
【表７】
2010520744.tif 000008
【０１３９】
参考文献
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【図１】
2010520744.tif 000009
【図２】
2010520744.tif 000010
【図３】
2010520744.tif 000011
【配列表】
2010520744000001.app
【国際調査報告】
2010520744.tif 000012
2010520744.tif 000013