(57)【要約】本発明は、コンビナトリアルターゲティング法を使用した、標的細胞の選択的な殺滅を通して様々な疾病を治療するための方法および組成物を提供する。本発明は、細胞を標的とする部分を含むプロトキシン融合タンパク質と、自然に作用可能には、標的細胞内、標的細胞上、またはその近傍において認められない活性化部分により活性化される修飾可能な活性部分とを特徴とする。これらの方法はまた、特定の細胞集団を標的にし、破壊するための、プロトキシンおよびプロトキシン活性化因子を少なくとも含む、２つ以上の治療薬の併用使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の非天然の、細胞を標的とする部分、１つの選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および１つの毒素ドメインを含む、プロトキシン融合タンパク質であって、前記修飾可能な活性化ドメインが、外因性酵素に対する基質を含む、プロトキシン融合タンパク質。
【請求項２】
前記酵素が、プロテアーゼである、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項３】
前記プロテアーゼが、外因性ヒトプロテアーゼである、請求項２に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項４】
前記プロテアーゼが、非ヒトプロテアーゼである、請求項２に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項５】
前記プロテアーゼが、非哺乳類プロテアーゼである、請求項２に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項６】
前記プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼである、請求項２に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項７】
前記修飾可能な活性化ドメインが、プロテアーゼ切断部位の翻訳後修飾を含む、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項８】
前記修飾可能な活性化ドメインが、翻訳後修飾を除去することが可能な酵素に対する基質を含む、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項９】
前記修飾可能な活性化ドメインが、翻訳後修飾を除去することが可能な外因性酵素に対する基質を含む、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１０】
前記１つ以上の非天然の、細胞を標的とする部分が、癌細胞を認識する、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１１】
前記１つ以上の非天然の、細胞を標的とする部分が、造血細胞、リンパ球、および侵害受容ニューロンから成る群から選択される細胞を認識する、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１２】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、ポリペプチドである、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１３】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、受容体のためのリガンドである、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１４】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、抗体または抗体フラグメントである、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１５】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、人工的に多様化された結合タンパク質である、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１６】
前記プロトキシンが、活性化可能な毒素である、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１７】
前記活性化可能な毒素が、活性化可能な孔形成毒素または活性化可能な酵素毒素から成る群から選択される、請求項１６に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１８】
前記毒素が、ＡＢ毒素、細胞壊死因子毒素、皮膚壊死毒素、および活性化可能なＡＤＰリボシル化毒素から成る群から選択される、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項１９】
前記毒素が、アエロリジン、コレラ菌外毒素、緑膿菌外毒素、およびジフテリア毒素から成る群から選択される、請求項１に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項２０】
前記毒素が、アエロリジンである、請求項１９に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項２１】
前記毒素が、コレラ菌外毒素である、請求項１９に記載のプロトキシン融合タンパク質。
【請求項２２】
１つ以上の、細胞を標的とする部分、１つの天然で活性化可能なドメイン、および１つの修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質であって、前記修飾ドメインが、前記天然で活性化可能なドメインの活性化前には、不活性である、プロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項２３】
前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質が、標的細胞に対して非毒性である、請求項２２に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項２４】
１つ以上の、細胞を標的とする部分および１つの修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質であって、標的細胞に対して非毒性である、プロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項２５】
前記修飾ドメインが、プロテアーゼドメインである、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項２６】
前記プロテアーゼドメインが、ヒトプロテアーゼの触媒ドメインである、請求項２５に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項２７】
前記ヒトプロテアーゼが、外因性ヒトプロテアーゼである、請求項２６に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項２８】
前記プロテアーゼドメインが、非ヒトプロテアーゼの触媒ドメインである、請求項２５に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項２９】
前記非ヒトプロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼである、請求項２８に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３０】
前記ウイルスプロテアーゼが、レトロウイルスプロテアーゼ、ポティウイルスプロテアーゼ、ピコルナウイルスプロテアーゼ、およびコロナウイルスプロテアーゼから成る群から選択される、請求項２９に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３１】
前記修飾ドメインが、ホスファターゼドメインである、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３２】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、抗体または抗体フラグメントである、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３３】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、受容体のためのリガンドである、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３４】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、細菌源に由来する結合ドメインである、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３５】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、細菌毒素に由来する結合ドメインである、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３６】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、人工的に多様化された結合タンパク質である、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３７】
記プロトキシン活性化因子融合タンパク質と、プロトキシン活性化因子融合タンパク質が作用するプロトキシンとの組み合わせの、１０％未満の細胞毒性または細胞増殖抑制作用を有する、請求項２２、２３、または２４に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
【請求項３８】
１つ以上の、細胞を標的とする部分、１つの選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および１つの活性化因子ドメインを含む、プロアクチベーター融合タンパク質であって、前記修飾可能な活性化ドメインが、酵素に対する基質を含む、プロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項３９】
前記酵素が、プロテアーゼである、請求項３８に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４０】
前記修飾可能な活性化ドメインが、プロテアーゼ切断部位の翻訳後修飾を含む、請求項３８に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４１】
前記修飾可能な活性化ドメインが、翻訳後修飾を除去することが可能な酵素に対する基質を含む、請求項３８に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４２】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、癌細胞を認識する、請求項３８に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４３】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、造血細胞、および侵害受容ニューロンから成る群から選択される細胞を認識する、請求項３８に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４４】
前記１つ以上の、細胞を標的とする部分が、リンパ球を認識する、請求項４３に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４５】
前記プロテアーゼが、外因性ヒトプロテアーゼである、請求項３９に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４６】
前記プロテアーゼが、非ヒトプロテアーゼである、請求項３９に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４７】
前記プロテアーゼが、非哺乳類プロテアーゼである、請求項３９に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４８】
前記非哺乳類プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼである、請求項３９に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
【請求項４９】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、ポリペプチドである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項５０】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、受容体のためのリガンドである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項５１】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、抗体または抗体フラグメントである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項５２】
少なくとも１つの非天然の、細胞を標的とする部分が、人工的に多様化された結合タンパク質である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項５３】
標的細胞を、（ｉ）第１の、細胞を標的とする部分、選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および毒素ドメインを含む、プロトキシン融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）第２の、細胞を標的とする部分および修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質に接触させるステップを含む、標的細胞を破壊または抑制する方法であって、前記プロトキシン融合タンパク質の前記第１の細胞標的ドメインおよび前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質の前記第２の細胞標的ドメインが、それぞれ、前記標的細胞を認識し、それに結合し、前記標的細胞への双方の融合タンパク質の結合後、前記修飾可能な活性化部分が、前記修飾ドメインにより選択的に活性化され、毒素活性をもたらし、それによって、前記標的細胞を破壊または抑制する、方法。
【請求項５４】
前記選択的に修飾可能な活性化ドメインが、前記標的細胞とは異種であるプロテアーゼの切断部位である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記毒素が、ＡＢ毒素、細胞壊死因子毒素、皮膚壊死毒素、および活性化可能なＡＤＰリボシル化毒素から成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記毒素が、活性化可能な孔形成毒素および活性化可能な酵素毒素から成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記毒素が、コレラ菌外毒素である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記毒素が、アエロリジンである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記毒素が、カスパーゼ、リシン、アブリン、およびモデッシン（Ｍｏｄｅｃｃｉｎ）から成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記修飾ドメインが、前記細胞とは異種のプロテアーゼを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
前記異種プロテアーゼが、ヒトプロテアーゼを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記異種プロテアーゼが、ヒトグランザイムＢである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記異種プロテアーゼが、アミノ酸２１〜２４７を含む、前記ヒトグランザイムＢプロテアーゼのタンパク質分解ドメインを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記選択的に修飾可能な活性化ドメインが、ＩＥＰＤである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記異種プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記毒素が、ジフテリア毒素である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６７】
前記ジフテリア毒素フリン切断部位が、前記標的細胞とは異種であるプロテアーゼの切断部位により置き換えられる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記毒素ドメインが、ジフテリア毒素のアミノ酸１〜３８９を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
融合タンパク質のうちの１つまたは両方が、ＰＥＧ化、グリコシル化、またはその両方により修飾される、請求項５３に記載の方法。
【請求項７０】
前記第１の細胞を標的とする部分もしくは前記第２の細胞を標的とする部分、またはその両方が、抗体、抗体様分子、抗体フラグメント、および単一抗体ドメインから成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項７１】
前記第１の、細胞を標的とする部分、もしくは前記第２の、細胞を標的とする部分、またはその両方が、可溶性メディエーター、サイトカイン、成長因子、可溶性受容体フラグメント、人工的に多様化されたポリペプチドバインダー、およびマトリックスフラグメントから成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１の、細胞を標的とする部分、もしくは前記第２の、細胞を標的とする部分、またはその両方が、糖質、脂質、および合成リガンドから成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１の、細胞を標的とする部分、もしくは前記第２の、細胞を標的とする部分、またはその両方が、抗ＣＤ５  ＳｃＦｖ、抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖ、およびＣＤ２２  ＳｃＦｖから成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項７４】
前記標的細胞を、前記プロトキシン融合タンパク質および前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質に同時に接触させる、請求項５３に記載の方法。
【請求項７５】
前記標的細胞を、前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質との接触の前に、前記プロトキシン融合タンパク質に接触させる、請求項５３に記載の方法。
【請求項７６】
前記標的細胞を、前記プロトキシン融合タンパク質との接触の前に、前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質に接触させる、請求項５３に記載の方法。
【請求項７７】
前記標的細胞が、ヒト細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項７８】
前記標的細胞が、癌細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項７９】
前記修飾可能な活性化ドメインの選択的活性化がない場合、前記プロトキシン融合タンパク質は、前記標的細胞または前記標的細胞を取り囲む環境により天然に活性化可能ではなく、前記修飾可能な活性化ドメインの前記選択的活性化が、前記プロトキシン融合タンパク質を天然に活性化可能にする、請求項５３に記載の方法。
【請求項８０】
（ｉ）第１の、細胞を標的とする部分、選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および毒性ドメインを含む、プロトキシン融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）第２の、細胞を標的とする部分、天然で活性化可能なドメイン、および修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質を前記対象に投与するステップを含む、対象における標的細胞を破壊または抑制する方法であって、前記天然で活性化可能なドメインが、前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質を前記対象へ投与すると活性化し、それにより、前記天然で活性化可能なドメインの活性が、前記修飾ドメインの活性化をもたらし、前記プロトキシン融合タンパク質の前記第１の細胞標的ドメインおよび前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質の前記第２の細胞標的ドメインが、それぞれ、前記標的細胞を認識して結合し、両方の融合タンパク質が前記標的細胞に結合すると、前記修飾可能な活性化部分が、前記修飾ドメインにより選択的に活性化され、毒素活性をもたらし、それによって、前記標的細胞を破壊または抑制する、方法。
【請求項８１】
（ｉ）第１の、細胞を標的とする部分、選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および毒性ドメインを含む、プロトキシン融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）第２の、細胞を標的とする部分、天然で活性化可能なドメイン、および修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質を含む、組成物であって、前記修飾ドメインが、前記天然で活性化可能なドメインの活性化前には、不活性であり、前記プロトキシン融合タンパク質の前記第１の細胞標的ドメインおよび前記活性なプロトキシン活性化因子融合タンパク質の前記第２の細胞標的ドメインが、それぞれ、標的細胞を認識して結合し、両方の融合タンパク質が前記標的細胞に結合すると、前記修飾ドメインが、前記選択的に修飾可能な活性化ドメインを活性化し、毒素活性をもたらす、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
概して、本発明は、全身副作用を軽減しながら、細胞毒性剤または細胞増殖阻害剤を特定の細胞型に対する標的とするための治療方策に関する。より具体的には、本発明は、独立した標的原理を有する２つ以上の個別には不活性である成分を含む治療法の使用を含み、それらは標的細胞において、それら特有の相互作用を介して活性化される。本発明は、関連する方法および組成物もまた提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
特定の細胞型の選択的殺滅は、通常、悪性細胞の増殖および蓄積を通して現れる癌の治療を含む、様々な臨床的設定において望ましい。癌に対する従来の治療は、化学療法であり、ＤＮＡ合成を阻害する、またはＤＮＡを損傷することにより腫瘍細胞を殺滅する（ＣｈａｂｎｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５：６５（２００５）（非特許文献１））。しかしながら、このような治療は、正常細胞の無差別な殺滅によって、しばしば重度の全身毒性を引き起こす。多くの癌化学療法薬は増殖細胞の選択的な破壊を経て有効性を発揮するため、骨髄、消化管、および毛包等の増殖速度が速い正常組織への毒性の増加により、適量における使用が通常妨げられてきた。このような治療は、しばしば失敗に終わり、薬物耐性、疾病の再発、および／または転移をもたらす。全身毒性を軽減するために、特定の細胞集団を選択的に標的とするための異なる戦略が研究されている。腫瘍関連の抗原を認識する抗体および他のリガンドは、小分子の薬物またはタンパク質毒素と結合し、それぞれ、免疫複合体および抗毒素としばしば称される、コンジュゲートおよび融合タンパク質を生成する（Ａｌｌｅｎ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０（２００２）（非特許文献２））。
【０００３】
用量を制限する毒性に加えて、化学療法の別の制限は、加速した増殖を伴わず、むしろアポトーシスの欠損による悪性細胞の生存期間の延長を伴う癌の治療に対して、有効性がないことである（Ｋｉｔａｄａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：３４５９（２００２）（非特許文献３））。例えば、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、アポトーシス耐性の腫瘍性Ｂ細胞型を徐々に蓄積することにより特徴付けられる疾病であり、それに対しては、現在、治療法がない（ＭｕｎｋおよびＲｅｅｄ，  Ｌｅｕｋ．  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ４５：２３６５（２００４）（非特許文献４））。
【０００４】
癌幹細胞（ＣＳＣ）は、自己複製および無制限増殖の能力を有する腫瘍細胞の小片であり、したがって、癌を引き起こす能力において、それらの産物とは異なる（Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ  １０７：２５１２（２００６）（非特許文献５））。現在の癌治療法は、これらの癌幹細胞を特に標的とせず、ＣＳＣの持続により、薬物耐性を示す、および／または転移形成の一因となる子孫細胞を生じる、根絶不可能な細胞のサブセットをもたらすと仮定される。ＣＳＣを宿すこれらの腫瘍において、これらの細胞を除去可能であるということは、大いに興味を引く。ＣＳＣは、例えば、長い寿命、相対的な分裂休止、および活性ＤＮＡ修復能、ならびにＰ−糖タンパク質等のＡＴＰ結合カセット薬物輸送体の高い発現レベルを通じての、アポトーシスおよび薬物／毒素への耐性等の、正常幹細胞の特性に類似した多くの特性を有すると考えられている。それ故に、ＣＳＣは、従来の癌治療法によって、標的とし、破壊することが困難であると考えられている（Ｄｅａｎら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５：２７５（２００５）（非特許文献６））。逆に、正常幹細胞が正常組織の複製において不可欠な役割を果たすという理由で、ＣＳＣと正常幹細胞を区別することは、非常に重要である。
【０００５】
毒性の強い抗癌剤の選択性を増大させるため、良好に還流された組織における正常細胞の近傍には認められない、低ｐＨ、低酸素圧、または腫瘍に特異的な酵素の密度の増加等の、腫瘍の微環境に特異な特徴を利用する、様々な試みがなされてきた。固形腫瘍において高い毒性を示すことが仮定される、環境に敏感な抗癌剤が開発されている。例えば、「生体還元性のプロドラッグ」は、固形腫瘍の低酸素環境において細胞毒性薬に活性化され得る薬剤である（ＡｈｎおよびＢｒｏｗｎ，  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．  ２００７年５月１日、１２：３４８３−５０１（非特許文献７））。同様に、Ｋｏｈｃｈｉらは、腫瘍に見られる膜ジペプチダーゼによって活性化され得る化学療法薬のプロドラッグの合成について記載している（Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．  ２００７年４月１５日、１７（８）：２２４１−５（非特許文献８））。腫瘍の微環境を変えるための選択的抗体コンジュゲート型酵素の使用は、多くのグループにより研究されている。抗体指向性酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）として知られる戦略において、腫瘍に特異性を有する抗体にコンジュゲートされる酵素が、患者に送達されることが意図され、コンジュゲート型酵素の作用に曝されるまで不活性である化学療法剤が送達される（例えば、Ｂａｇｓｈａｗｅ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ２００６年１０月、６（１０）：１４２１−３１（非特許文献９）、またはＲｏｏｓｅｂｏｏｍｅら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００４年３月、５６（１）：５３−１０２（非特許文献１０）を参照）。今日まで、これらの戦略の臨床的利点は文書化されておらず、依然として治療的有用性を示すことができる、より選択的でさらに強力な薬剤の開発に、高い関心が向けられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＣｈａｂｎｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５：６５（２００５）
【非特許文献２】Ａｌｌｅｎ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０（２００２）
【非特許文献３】Ｋｉｔａｄａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：３４５９（２００２）
【非特許文献４】ＭｕｎｋおよびＲｅｅｄ，  Ｌｅｕｋ．  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ４５：２３６５（２００４）
【非特許文献５】Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ  １０７：２５１２（２００６）
【非特許文献６】Ｄｅａｎら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５：２７５（２００５）
【非特許文献７】ＡｈｎおよびＢｒｏｗｎ，  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．  ２００７年５月１日、１２：３４８３−５０１
【非特許文献８】Ｋｏｈｃｈｉら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．  ２００７年４月１５日、１７（８）：２２４１−５
【非特許文献９】Ｂａｇｓｈａｗｅ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ２００６年１０月、６（１０）：１４２１−３１
【非特許文献１０】Ｒｏｏｓｅｂｏｏｍｅら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００４年３月、５６（１）：５３−１０２
【発明の概要】
【０００７】
一局面において、本発明は、１つ以上の細胞を標的とする部分および修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質を特徴とする。本局面の一態様において、プロトキシン活性化因子融合タンパク質はまた、天然で活性化可能なドメインを含み得る。本態様において、修飾ドメインは、天然で活性化可能なドメインの活性化前は、不活性である。望ましくは、該プロトキシン活性化因子融合タンパク質は、標的細胞に対して非毒性である（例えば、該プロトキシン活性化因子融合タンパク質は、該プロトキシン活性化因子融合タンパク質と、該プロトキシン活性化因子融合タンパク質が作用するプロトキシンとの組み合わせの、１０％未満の細胞毒性または細胞増殖抑制作用を有する）。
【０００８】
上記の局面において、該修飾ドメインは、ヒトプロテアーゼ（望ましくは、外因性ヒトプロテアーゼ）、またはウイルスプロテアーゼ（例えば、レトロウイルスプロテアーゼ、ポティウイルスプロテアーゼ、ピコルナウイルスプロテアーゼ、もしくはコロナウイルスプロテアーゼ）を含む非ヒトプロテアーゼの触媒ドメインを含有するプロテアーゼであり得る。関連した局面において、該修飾ドメインは、ホスファターゼであり得る。
【０００９】
別の局面において、本発明は、１つ以上の非天然型細胞を標的とする部分、選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および毒素ドメイン（例えば、活性化可能な毒素ドメイン）を含む、プロトキシン融合タンパク質を特徴とする。本局面において、該修飾可能な活性化ドメインは、外因性酵素に対する基質を含んでもよい。
【００１０】
本局面において、該外因性酵素は、例えば、プロテアーゼまたはホスファターゼであり得る。プロテアーゼの例は、外因性ヒトプロテアーゼ、またはウイルスプロテアーゼ（例えば、レトロウイルスプロテアーゼ、ポティウイルスプロテアーゼ、ピコルナウイルスプロテアーゼ、またはコロナウイルスプロテアーゼ）を含む、非ヒト（もしくは非哺乳類）プロテアーゼを含む。
【００１１】
また、本局面において、該活性化可能な毒素ドメインは、活性化可能な孔形成毒素、または活性化可能な酵素毒素を含み得る。このようなドメインの例は、ＡＢ毒素、細胞壊死因子毒素、皮膚壊死毒素、および活性化可能なＡＤＰリボシル化毒素を含む。さらなる例は、アエロリジン、コレラ菌外毒素、緑膿菌外毒素、およびジフテリア毒素を含む。
【００１２】
上記のプロトキシン融合タンパク質において、該修飾可能な活性化ドメインは、プロテアーゼ切断部位の翻訳後修飾をさらに含んでもよい。本局面において、該修飾可能な活性化ドメインは、酵素に対する基質（例えば、外因性酵素）を含み得る。
【００１３】
別の局面において、本発明は、１つ以上の非天然型細胞を標的とする部分、選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および活性化因子ドメインを含むプロアクチベーター融合タンパク質を特徴とする。本局面において、該修飾可能な活性化ドメインは、酵素に対する基質（例えば、プロテアーゼまたはホスファターゼ）を含んでもよい。該修飾可能な活性化ドメインは、プロテアーゼ切断部位の翻訳後修飾、または翻訳後修飾を除去することが可能な酵素に対する基質を含んでもよい。
【００１４】
本局面において、該プロテアーゼは、外因性ヒトプロテアーゼ、非ヒトプロテアーゼ（例えば、非哺乳類プロテアーゼ）、またはウイルスプロテアーゼであり得る。
【００１５】
上記の組成物のいずれも、所望の標的細胞の集団を殺滅するために、対象（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウマ、またはラット）への投与用に処方することができる。
【００１６】
さらに別の局面において、本発明は、（ｉ）第１の、細胞を標的とする部分、選択的に修飾可能な活性化ドメイン（例えば、標的細胞に対して異種のプロテアーゼドメイン）、および毒素ドメインを含むプロトキシン融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）第２の、細胞を標的とする部分および修飾ドメインを含むプロトキシン活性化因子融合タンパク質に、標的細胞を接触させるステップにより、標的細胞（例えば、ヒト細胞またはヒト癌細胞）を破壊または抑制する方法を特徴とする。本局面において、該プロトキシン融合タンパク質の、該第１の、細胞を標的とする部分と、該プロトキシン活性化因子融合タンパク質の、該第２の、細胞を標的とする部分は、それぞれ、該標的細胞を認識し、結合する。該標的細胞への双方の融合タンパク質の結合後、該修飾可能な活性化部分は、該修飾ドメインにより選択的に活性化され、毒素活性をもたらし、それにより、該標的細胞を破壊または抑制する。別の態様において、該修飾可能な活性化ドメインの選択的活性化がない場合、該毒素前駆体融合タンパク質は、該標的細胞または該標的細胞を取り囲む環境により天然で活性化可能ではなく、該修飾可能な活性化ドメインの該選択的活性化は、天然で活性化可能な該プロトキシン融合タンパク質を提供する。
【００１７】
関連した局面において、本発明は、（ｉ）第１の、細胞を標的とする部分、選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および毒素ドメインを含むプロトキシン融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）第２の、細胞を標的とする部分、天然で活性化可能なドメイン、および修飾ドメインを含むプロトキシン活性化因子融合タンパク質を対象（例えば、ヒト）に投与するステップにより、標的細胞を破壊または抑制する方法を特徴とする。本局面において、該天然で活性化可能なドメインは、該対象へのプロトキシン活性化因子融合タンパク質の投与後、活性となり、それによって、該天然で活性化可能なドメインの活性化は、該修飾ドメインの活性化をもたらす。本局面において、該プロトキシン融合タンパク質の第１の細胞標的ドメインおよび該プロトキシン活性化因子融合タンパク質の第２の細胞標的ドメインは、それぞれ、該標的細胞を認識して結合し、該標的細胞への双方の融合タンパク質の結合後、該修飾可能な活性化部分は、該修飾ドメインにより選択的に活性化され、毒素活性をもたらし、それによって、前記標的細胞を破壊または抑制する。
【００１８】
上記の関連した局面において、該毒素ドメインは、ＡＢ毒素、細胞壊死因子毒素、皮膚壊死毒素、活性化可能な孔形成毒素、活性化可能な酵素毒素、活性化可能なＡＤＰリボシル化毒素を含み得る。さらなる毒素ドメインの例は、コレラ菌外毒素、アエロリジン、カスパーゼ、リシン、アブリン、およびモデッシン（Ｍｏｄｅｃｃｉｎ）を含む。
【００１９】
また、上記の関連した局面において、該異種のプロテアーゼは、外因性ヒトプロテアーゼ（例えば、ヒトグランザイムＢのアミノ酸２１〜２４７を含む、ヒトグランザイムＢ）、非ヒトプロテアーゼ、非哺乳類プロテアーゼ、またはウイルスプロテアーゼを含み得る。本局面において、該選択的に修飾可能な活性化ドメインは、ＩＥＰＤであり得る。
【００２０】
また、上記に関連した局面において、該毒素ドメインは、ジフテリア毒素（例えば、ジフテリア毒素のアミノ酸１〜３８９）を含み得、該ジフテリア毒素フリン切断部位は、標的細胞に対して異種のプロテアーゼの切断部位に置換される。
【００２１】
また、上記の関連した局面において、該プロトキシン融合タンパク質は、該プロトキシン活性化因子融合タンパク質が該細胞と接触させる前、同時、またはその後に、該標的細胞と接触され得る。
【００２２】
さらに別の局面において、本発明は、（ｉ）プロトキシン融合タンパク質、および（ｉｉ）プロトキシン活性化因子融合タンパク質、ならびに（ｉｉｉ）癌であると診断された患者への２つの融合タンパク質を投与するステップのための使用説明を有するキットを特徴とする。
【００２３】
別の関連した局面において、本発明は、（ｉ）プロトキシン融合タンパク質、および（ｉｉ）癌であると診断された患者へのプロトキシン活性化因子融合タンパク質と共に（ｉ）を投与するステップのための説明書を有するキットを特徴とする。
【００２４】
さらに別の関連した局面において、本発明は、（ｉ）プロトキシン活性化因子融合タンパク質、および（ｉｉ）癌であると診断された患者へのプロトキシン融合タンパク質と共に（ｉ）を投与するステップのための説明書を有するキットを特徴とする。
【００２５】
前述の局面のいずれにおいても、１つ以上の融合タンパク質は、ＰＥＧ化、グリコシル化、またはその双方により修飾され得る。
【００２６】
また、前述の局面のいずれにおいても、１つ以上の細胞標的ドメインまたは非天然細胞標的ドメインは、ポリペプチド、抗体（例えば、抗ＣＤ５  ＳｃＦｖ、抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖ、および抗ＣＤ２２  ＳｃＦｖを含む、抗体、抗体様分子、抗体フラグメント、および単一抗体ドメイン）、受容体のためのリガンド、マトリックスフラグメント、可溶性受容体フラグメント、サイトカイン、可溶性メディエーター、または人工的に多様化された結合タンパク質であり得る。該細胞を標的とする部分は、細菌源に由来（例えば、細菌毒素に由来）し得る。あるいは、該細胞を標的とする部分は、糖質、脂質、または合成リガンドであり得る。
【００２７】
さらに、本発明の細胞標的ドメインまたは非天然細胞標的ドメインは、癌細胞、造血細胞（例えば、リンパ球）、または侵害受容ニューロンを認識し得る。
【００２８】
本明細書において、「ａ」または「ａｎ」（１つを表す不定冠詞）とは、１つ以上を意味し、「ａｎｏｔｈｅｒ」（他の１つ）は、少なくとも２つ目またはそれ以上のものを意味し得る。
【００２９】
本明細書において、「ポリペプチド」または「ペプチド」という用語は、１つのアミノ酸のカルボキシル末端と別のアミノ酸のアミノ末端との間のアミド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸を意味する。
【００３０】
本明細書において、「アミノ酸」という用語は、天然の、または非天然のアルファまたはベータアミノ酸を意味し、該天然または非天然アミノ酸は、ハロ等の１つから４つの置換基、例えば、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌもしくはＩもしくはＣＦ３、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アリール（アリール）、またはジアリール、アリールアルキル、アリールアルキルオキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルキルオキシ、置換されてもよいアミノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アシル、アルカノイル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、シクロヘテロアルキル、アリールヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルコキシ、アリールオキシアルキル、アリールオキシアリール、アルキルアミド、アルカノイルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ニトロ、シアノ、チオール、ハロアルキル、トリハロアルキル、および／またはアルキルチオにより任意に置換され得る。
【００３１】
本明細書において、「修飾された」という用語は、遺伝子変化、または化学的置換もしくは分解を含み、アミノ酸または核酸残基等の生物学的要素もしくは置換基の付加、欠失、または変化、ならびに限定されないが、グリカン、脂質、リン酸塩、硫酸塩、メチル、アセチル、ＡＤＰ−リボシル、ユビキチニル（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｙｌ）、スモイル、ネッドイル（ｎｅｄｄｏｙｌ）、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、またはホルミル等の、タンパク質の翻訳後修飾の付加、欠失、または修飾を含む、様々な方法のいずれかにより、天然に見られる１つ以上の主な形態から変化した形態に作用可能に変えられた組成物を意味する。また、「修飾された」とは、化学的部分を付加、欠失、もしくは変化させて、１０％を超える、または１％を超える、または０．１％を超える割合を含む天然存在度で存在する場合の組成物には見られない一つの形態を提供する、化学的または酵素的置換もしくは分解による変化をも含む。「修飾される」という用語は、製造、精製、保存、または新規宿主における発現の結果として付随的に変化された組成物であり、これに関して、このような変化が、そのために組成物の特徴を作用可能に変えることはないものを意味することは、意図していない。
【００３２】
本明細書において、「融合タンパク質」、「プロトキシン融合」、「毒素融合」、「プロトキシン活性化因子融合」、「プロトキシンプロアクチベーター融合」、または「プロアクチベーター活性化融合」という用語は、少なくとも１つの追加成分に作用可能に連結されるペプチド成分を有し、そのドメインの組成物および／または組織において、天然タンパク質とは異なる、タンパク質を意味する。該追加成分は、ペプチドまたは非ペプチドの種類であり得る。追加のペプチド成分は、自然な産生または化学合成により得られ、阻害剤の部分、細胞を標的とする部分、または切断部位として作用するペプチド成分の場合には、いかなる天然の鋳型にも基づくものである必要はなく、人工的な骨格もしくはランダム配列から、または実質的にすべての一次配列の類似性は失われるが、機能的属性が保たれるように、既存の鋳型を多様化することにより、所望の目的のために選択することができる。非ペプチドの追加成分は、１つ以上の機能的な化学種を含み得る。該化学種は、リンカーまたは切断部位を含んでもよく、それぞれ、１つ以上のリンカーで置換されてもよく、そのリンカーは、該化学種の柔軟な結合をポリペプチドまたは別の化学種に提供し得る。
【００３３】
「作用可能に連結された」または「作用可能な連結」という用語は、２つ以上の化学種の共有結合的な結合、ならびに、１つ以上のペプチド成分と１つ以上の化学種の共有結合的、もしくは非共有結合的な結合、ならびに２つ以上のペプチド成分の共有結合的、もしくは非共有結合的、または双方の共有結合的、もしくは非共有結合的な結合を包含する。ペプチド成分の共有結合の好適な型のうちの１つは、直接的な翻訳融合であって、単一ポリペプチドは、ｍＲＮＡの翻訳、または翻訳後融合に応じて形成され、化学的あるいは酵素的手段を通して、作用可能な連結により、またはジスルフィド結合の形成等の天然の分子間反応を通して、作用可能な連結により、達成される。作用可能な連結は、様々な部分のドナー分子の化学的または酵素的活性化を通して実施することができ、活性化したドナー分子のレシピエント分子への付着をもたらす。作用可能な連結後、２つの部分は、それらの間で追加のリンカー種を有する、または追加の種がなくてもよく、あるいは、例えば、酵素的に誘発した作用可能な連結後生じ得るような１つ以上の部分から原子の損失をもたらす共有結合を行い得る。
【００３４】
「トランスグルタミナーゼ」という用語は、遊離アミン基（例えば、タンパク質もしくはペプチド結合リジン、または置換カダベリン等の置換アミノアルカン）とタンパク質またはペプチド結合グルタミンのガンマ−カルボキサミド基との間で共有結合の形成を触媒するタンパク質を意味する。タンパク質のこのファミリーの例は、トロンビン、因子ＸＩＩＩ、およびヒトおよび動物からの組織トランスグルタミナーゼを含む、多くの異なる起源から成るトランスグルタミナーゼである。好ましい態様は、ＬＬＱＧ（配列番号：１）等の好ましい配列内で位置するグルタミン残基を含有する第１の部分（アシルドナー）と、第１級アミン基を含む第２の部分（アシルアクセプター）との間でアシル転移反応を触媒するために、微生物のトランスグルタミナーゼの使用（Ｙｏｋｏｙａｍａら、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４（４）：４４７−４５４（２００４））を含む。反応グルタミン残基は、溶媒曝露され、構造化されていない、すなわち、柔軟性のある、ポリペプチドのセグメントに位置していることが好ましい。
【００３５】
「ソルターゼ」という用語は、保存カルボン酸分類モチーフを認識し、ペプチド転移反応を触媒して、表面タンパク質を細胞壁膜に固定し得る、グラム陽性菌からのタンパク質を意味する（Ｄｒａｍｓｉら、Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １５６（３）：２８９−２９７（２００５））。好ましい態様は、Ｃ末端で、またはその近傍で、ソルターゼＡおよびソルターゼＢのそれぞれに対してＬＰＸＴＧ（配列番号：２）またはＮＰＱＴＮ（配列番号：３）でタグ付けされる第１の部分と、Ｎ末端、または第１級アミン基にジペプチドＧＧまたはＧＫを含有する第２の部分との間でペプチド転移反応を触媒するための、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼＡまたはＢの使用を含む。
【００３６】
「固定化ソルターゼ」という用語は、アガロース等の固体担体に共有結合的または非共有結合的に吸収されている、精製された、活性ソルターゼ酵素を意味する。該酵素は、本明細書に記載のように、遊離スルフヒドリルまたはアミン等の化学的官能基を担持するマトリックスに化学的または酵素的に固定され得る。あるいは、該酵素は、修飾され、その後、いくつかの特定の相互作用を経て固定化され得る。例えば、該ソルターゼ酵素は、ビオチン化され、その後、固定化されたストレプトアビジンとの間接的な相互作用を経て固定化され得る。
【００３７】
「インテイン」という用語は、新規ペプチドまたはアミド結合の形成をもたらす自己反応を行うタンパク質を意味する。インテイン媒介のライゲーションは、タンパク質−タンパク質コンジュゲーション（ＸｕおよびＥｖａｎｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４（３）：２５７−２７７  （２００１））、ならびにタンパク質−小分子コンジュゲーション（Ｗｏｏｄら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  １５（２）：３６６−３７２（２００４））を実施するための確立された方法である。自己スプライシングインテインは、コンジュゲートされるタンパク質のＣ末端に添加され、安定したアミド結合を提供するために、アシル転移後、Ｓ−Ｎアシル転換を行うことができるシステインを含有するコンジュゲーションパートナーで処置することができる。
【００３８】
本明細書において、「毒素」または「プロトキシン」という用語は、細胞増殖を抑制する（細胞分裂停止）または細胞死を生じる（細胞毒性）、潜在（プロトキシン）または顕在（毒素）能力を有する、１つ以上の部分を含む、タンパク質を意味する。このような毒素またはプロトキシンの例は、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素Ａ、志賀毒素、および志賀様毒素、炭疽菌の致死因子毒素、炭疽菌の浮腫因子毒素、プロアエロリジン等の孔形成毒素またはプロトキシン、溶血素、肺炎球菌溶血素、Ｃｒｙ１毒素、ビブリオ属プロ細胞溶解素、またはリステリオリシン、コレラ毒素、クロストリジウムセプチカムアルファ毒素、破傷風毒素およびボツリヌス毒素を含むクロストリジウム神経毒素；ゲロニン、リボヌクレアーゼＡ、ヒト膵臓リボヌクレアーゼ、アンギオジェニン、およびピエリシン−１等の核酸変性剤、カスパーゼ等のアポトーシス誘導酵素、リシン、アブリン、およびモデッシン（Ｍｏｄｅｃｃｉｎ）等のリボソーム不活性化タンパク質（ＲｌＰ）を含むが、これらに限定されない。プロトキシンは、活性毒素になるために修飾を経なければならい、毒素の前駆細胞である。本発明のプロトキシンの好ましい型は、プロトキシン活性化因子により活性化され得るものを含む。
【００３９】
「選択的に修飾可能な活性化部分」という用語は、修飾後、天然に活性化可能になるように、プロトキシンを毒素または天然に活性化可能なプロトキシンに変換する、またはプロトキシンプロアクチベーターを活性化する、もしくはプロトキシンプロアクチベーターを修飾する、非天然、または天然には認められないプロトキシンまたはプロトキシン活性化因子の部分を意味する。選択的に修飾可能な活性化部分が、プロトキシン融合タンパク質の成分である場合、プロトキシン活性化因子による修飾可能な活性化部分の修飾は、該標的細胞に対して毒性があるプロトキシンを直接もたらす、または該標的細胞に対して毒性がある天然で活性化可能な型をとるプロトキシンをもたらし得る。選択的に修飾可能な活性化部分が、プロトキシンプロアクチベーター融合タンパク質の成分である場合、プロアクチベーター活性化因子による修飾可能な活性化部分の修飾は、該プロトキシンを修飾し得る型に活性化される前駆賦活剤を直接もたらす、または、該プロトキシンを修飾し得る型となるように、天然で活性化可能な型をとる前駆賦活剤をもたらし得る。天然で活性化可能なプロトキシンまたはプロアクチベーターは、例えば、標的細胞の内因性成分または該標的細胞を取り囲む環境に感受性があるように、修飾可能な活性化部分の修飾を含む（例えば、標的細胞の特異的プロテアーゼまたはユビキタス型プロテアーゼ）。
【００４０】
本明細書において、「細胞を標的とする部分」という用語は、１つ以上の細胞表面標的に結合し得る、したがって、プロトキシン、プロトキシン活性化因子、プロトキシンプロアクチベーター、またはプロアクチベーター活性化剤をこれらの細胞へ誘導し得る、１つ以上のタンパク質ドメインを意味する。このような細胞を標的とする部分は、特に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、単一抗体ドメイン等の抗体または抗体様分子、およびｓｃＦｖ、ダイアボディ、操作されたリポカイン、キャメルボディ、ナノボディ等の関連分子、および関連構造を含む。また、可溶性メディエーター、サイトカイン、成長因子、可溶性受容体フラグメント、マトリックスフラグメント、または標的細胞上の同族の結合構造を有することが知られる他の構造が含まれる。さらに、例えば、フィブロネクチン、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、チチン（ｔｉｔｉｎ）および他の構造からの結合原理の形成過程において、不変または多様型の骨格の多様性により選択されているタンパク質ドメインもまた含まれる。細胞を標的とする部分はまた、部分の組み合わせも含み得る（例えば、サイトカインを有するｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖを有するｓｃＦｖ）。
【００４１】
本明細書において、「人工的に多様化されたポリペプチドバインダー」という用語は、付加、欠失、および置換を含む、天然または合成突然変異体の結果として、分離され得る所望の細胞表面標識に結合することが可能な高親和性変異体からペプチドまたはポリペプチドのアンサンブルを提供するために、複数の態様を含むように作製されている少なくとも１つのドメインを含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。このような人工的に多様化されたバインダーは、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＲＮＡディスプレイ、酵母ディスプレイ、細胞表面ディスプレイ、もしくは関連方法により選択されるペプチド、または抗体可変領域模倣剤または関連結合分子を提供するために、ロバスト骨格のフレキシブルループにおいて、同様に選択され、典型的に多様化されるポリペプチドを備え得る。
【００４２】
本明細書において、「細胞表面標的」という用語は、例えば、原形質膜を有する細胞内小胞の融合結果であり得、細胞を標的とする部分により特異的に認識され得る、一時的曝露を含む、細胞表面上に作用可能に曝露される、任意の構造を意味する。細胞表面標的は、１つ以上の任意に置換されたポリペプチド、糖質、核酸、ステロール、または脂質部分、またはその組み合わせ、ならびに、ポリペプチド、糖質、核酸、ステロール、または脂質部分の、別々、または組み合わせた修飾を含み得る。細胞表面標的は、任意に置換されたポリペプチドおよび任意に置換された糖質、任意に置換された糖質および任意に置換された脂質、または細胞を標的とする部分により作用可能に認識される他の構造の組み合わせを含み得る。細胞表面標的は、複合体において、１つ以上のこのような任意に置換されたポリペプチド、糖質、核酸、ステロール、または脂質、例えば、ヘテロマルチマータンパク質、グリカン置換ヘテロマルチマータンパク質、または主要組織適合性複合抗原を伴うペプチド複合体等の他の複合体を備えて得る。細胞表面標的は、別の結合媒介を介して標的細胞に作用可能に連結した型に存在し得る。細胞表面標的は、任意に置換された小分子、ポリペプチド、糖質、核酸、ステロール、または脂質で特定の細胞を修飾するいくつかの介入により作成され得る。例えば、細胞表面標的は、目的の細胞に結合する種の投与により生成することができ、それによって、本発明のプロトキシン、プロトキシン活性化因子、プロトキシンプロアクチベーター、またはプロアクチベーター活性化因子のいずれか対しても、結合表面を提供する。
【００４３】
本明細書において、「標的とされる細胞（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｅｌｌ）」または「標的細胞（ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ）」という用語は、１つ以上のプロトキシンまたはプロトキシン活性化因子またはプロトキシンプロアクチベーターまたはプロアクチベーター活性化因子の目的とする標的である、少なくとも２つの細胞表面標的を発現するいずれかの細胞を意味する。
【００４４】
本明細書において、「標的細胞に対して毒性がない」とは、本発明に記載の使用条件下で、標的細胞（すなわち、プロトキシン活性化因子の細胞を標的とする部分が導入される標的細胞）と接触する際、標的細胞の成長を有意に破壊または抑制しない、すなわち、標的集団の生存細胞の割合、または標的集団の分裂細胞の割合、または標的集団の細胞の総割合を使用の好ましい条件下で、５０％、または１０％、または１％もしくは０．１％以上、減少することがない、組成物を意味する。この語句は、対象に投与、または標的細胞と接触する際、内因性要因により活性化され、標的細胞に対して毒性を与える融合タンパク質を含まない。「標的集団」とは、本発明の細胞を標的とする部分に対する標的を発現する細胞を意味する。
【００４５】
本明細書において、「天然で活性化可能な」という用語は、標的細胞上、標的細胞内、またはその近傍に天然要因または環境変数から成る作用により、不活性型から活性型へ変換され得る組成物または状態を意味する。一態様において、「天然で活性化可能な」とは、修飾可能な活性化部分上の修飾の結果として、あるいはその結果ではないいずれかで、標的細胞上、標的細胞内、またはその近傍に天然要因または環境変数から成る作用により、不活性型から活性型へ変換する特性を有する、毒素またはプロトキシン活性化因子を意味する。一態様において、該天然で活性化可能なタンパク質は、フリン／ケキシンプロテアーゼ等の普遍的に発現するプロテアーゼに対して切断部位を有する。別の態様において、該天然で活性化可能なタンパク質は、腫瘍を多く含むプロテアーゼ等の標的細胞特異的なプロテアーゼに対して切断部位を有する。さらに別の態様において、該天然で活性化可能なタンパク質は、標的細胞内、標的細胞上、またはその近傍に低いｐＨで活性化され得る。別の態様において、該天然で活性化可能なタンパク質は、標的細胞内、標的細胞上、またはその近傍に認められる酵素により除去可能な翻訳後修飾を有する。別の態様において、該天然で活性化可能なタンパク質は、標的細胞内、標的細胞上、またはその近傍に認められる酵素により修飾され得る修飾可能な活性化部分を有する。このような非プロテアーゼ酵素の例は、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、およびグリコール酸ヒドロラーゼを含む。
【００４６】
本明細書において、「実質的に促進する」という語句は、基準作用または活性を５０％、または１００％、または３００％、または７００％以上改善することを意味する。
【００４７】
本明細書において、「天然で標的可能な毒素」という用語は、毒素の細胞表面標的への結合を可能にする天然細胞を標的とする部分を有する毒素を意味する。
【００４８】
「細菌毒素」という用語は、天然変異体、血清型、イソ型、および対立型を含む少なくとも３３９のメンバーを含み、そのうちの少なくとも１６０がグラム陽性菌由来であり、１７９がグラム陰性菌由来であるレパートリーから選択される毒素を意味する。ほとんどが、細胞外、または細胞関連であり、その残りが、細胞内である。多くの細菌毒素は、酵素であり、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ、ホスホリパーゼ、アデニル酸シクラーゼ、金属プロテアーゼ、ＲＮＡ  Ｎ−グリコシダーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、デアミダーゼ、プロテアーゼ、およびデオキシリボヌクレアーゼを含む（Ａｌｏｕｆ  ａｎｄ  Ｐｏｐｏｆｆ編、“Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｏｘｉｎｓ，  ３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．  ２００６）。
【００４９】
「細胞内細菌毒素」という用語は、様々なトラフィッキング経路を通して細胞に入り、真核細胞の細胞内区画における標的に作用する細菌毒素を意味する。
【００５０】
本明細書において、「活性化可能なＡＢ毒素」という用語は、生物学的に活性なドメイン（Ａドメイン）、ならびに細胞標的および転位ドメイン（Ｂドメイン）を含み、毒性効果を実質的に促進するために、活性化配列上に内因性標的細胞プロテアーゼの作用を必要とする、あらゆるタンパク質を意味する。ＡＢ毒素は、アクセサリータンパク質またはグラム陽性菌のＩＩＩ型分泌系等のタンパク質の送達構造に対する必要条件なしに、標的細胞を毒性化する能力を有する。ＡＢ毒素は、一般的に、ユビキタス型フリン／ケキシン様プロテアーゼの作用に感受性がある部位を含み、活性化するために切断を行わなければならない。本発明によると、「活性化可能なＡＢ毒素」という用語は、内因性細胞標的ドメインが１つ以上の異種細胞を標的とする部分により置換される、または、１つ以上の異種細胞を標的とする部分が無傷の内因性細胞標的ドメインに添加され、外因性活性化因子により修飾され得る活性化配列が修飾可能な活性化部分で置換される、修飾されたＡＢ毒素を含むことを意図している。
【００５１】
本明細書において、「リボソーム不活性化タンパク質」または「ＲＩＰ」という用語は、リボソームまたは他の基質の触媒の不活性化を引き起こす酵素を意味する。このような毒素は、多数の植物に存在し、菌類、藻類、および細菌にも見られる。ＲＩＰは、現在、２つの型のうちの１つに属するように分類される。１型は、酵素活性がある単一ポリペプチド鎖を含み、２型は、２つの異なるポリペプチド鎖、１型ＲｌＰのポリペプチドに相当するＡ鎖およびレクチン活性があるＢ鎖を含む。当業者に既知である２型のＲＩＰは、式Ａ−Ｂ、（Ａ−Ｂ）２、（Ａ−Ｂ）４および／またはＡ鎖ごとに、複数のＢ鎖を含む多量体により示され得る。Ｂ鎖を有するＡ鎖の連結は、ジスルフィド結合を通して行われる。ＲＩＰの毒性活性は、翻訳阻害、すなわち真核細胞リボソームの２８ＳｒＲＮＡの高度に保存されたループ領域において、特異的アデニン塩基のＮ−グリコシド結合の加水分解の結果によるものである（Ｇｉｒｂｅｓら、Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４（５）：４６１−７６  （２００４））。
【００５２】
「ＡＤＰリボシル化毒素」という用語は、真核性標的タンパク質にβ−ＮＡＤ＋のＡＤＰリボース部分を転移する酵素を意味する。このプロセスは、標的細胞の必須機能を低下させ、細胞分裂停止または細胞毒性をもたらす。細菌のＡＤＰリボシル化毒素の例は、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素Ａ、Ｐ．アエルギノーザ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞傷害性外毒素Ｓ、百日咳毒素、コレラ毒素、および大腸菌からの易熱性エンテロトキシンＬＴ−ＩおよびＬＴ−ＩＩを含む（ＫｒｕｅｇｅｒおよびＢａｒｂｉｅｒｉ，  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ８：３４−４７  （１９９５））。非細菌ＡＤＰリボシル化毒素の例は、ＤＮＡ  ＡＤＰリボシル化酵素ピエリシン−１、ピエリシン−２、ＣＡＲＰ−１およびアサリ（Ｒｕｄｉｔａｐｅｓ  ｐｈｉｌｉｐｐｉｎａｒｕｍ）およびヤマトシジミ（Ｃｏｒｂｉｃｕｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の関連毒素を含む（Ｎａｋａｎｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０３（３７）：１３６５２−７（２００６））。さらに、インシリコの分析の適用は、推定上のＡＤＰリボシル化毒素の予測を可能にしている（Ｐａｌｌｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９：３０２−３０７（２００１））。
【００５３】
本発明のＡＤＰリボシル化毒素は、標的細胞膜にわたってそれ自体の転位をもたらし得るものを含み、本明細書において、「自発的に作用するＡＤＰリボシル化毒素」は、注入線毛構造または関連した構造により宿主細胞質に毒素の転位を伝えるために細菌により発現したＩＩＩ型分泌系または類似の構造に対する必要条件がない。このような自発的に作用するＡＤＰリボシル化毒素は、活性化部分および細胞を標的とする部分にしたがって修飾され、当技術分野で周知のように生成され得る。
【００５４】
本明細書において、「皮膚壊死毒素」または「ＤＮＴ」という用語は、ボルデテラ皮膚壊死毒素として周知で、百日咳菌（Ｂ．  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、パラ百日咳菌（Ｂ．  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、またはブロンキセプチカ菌（Ｂ．  ｂｒｏｎｃｈｏｓｅｐｔｉｃａ）等に限定されないボルデテラ種に記載される、毒性因子を意味する。
【００５５】
本明細書において、「細胞壊死因子」または「ＣＮＦ」または「ＣＮＦ１」または「ＣＮＦ２」または「ＣＮＦＹ」という用語は、細胞壊死因子として周知で、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）または偽結核エルジニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）等だが、限定されない、グラム陰性種に記載される、任意の毒性因子を意味する。
【００５６】
本明細書において、「活性化可能なＡＤＰリボシル化毒素」または「活性化可能なＡＤＰＲＴ」という用語は、真核性標的タンパク質にβ−ＮＡＤ＋のＡＤＰリボース部分を転移する能力を共有し、毒性効果を実質的に促進するために、活性化配列上に内因性標的細胞プロテアーゼの作用を必要とする、様々な種により生成される機能的に保存される酵素である毒素を意味する。このプロセスは、標的細胞の必須機能を低下させ、細胞分裂停止または細胞毒性をもたらす。活性化可能な細菌のＡＤＰＲＴの例は、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素Ａ、百日咳毒素、コレラ毒素、および大腸菌からの易熱性エンテロトキシンＬＴ−ＩおよびＬＴ−ＩＩを含む（ＫｒｕｅｇｅｒおよびＢａｒｂｉｅｒｉ，  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ８：３４−４７  （１９９５）；、Ｈｏｌｂｏｕｒｎら、Ｔｈｅ  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７３：４５７９−４５９３（２００６））。活性化可能な非細菌ＡＤＰリボシル化毒素の例は、モンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｒａｐａｅ）（Ｋａｎａｚａｗａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９８：２２２６−２２３１（２００１））、配列相同性により、オオモンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）（Ｔａｋａｍｕｒａ−Ｅｎｙａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３２：５７９−５８２（２００４））からのＤＮＡ  ＡＤＰリボシル化酵素を含む。
【００５７】
「活性化可能な酵素的毒素」という用語は、毒性効果を実質的に促進するために、酵素作用により毒性効果を発揮し、活性化配列（例えば、天然または異種活性化配列）上に内因性標的細胞プロテアーゼの作用を必要とする毒素を意味する。該酵素作用は、例えば、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、トランスグルタミナーゼ、デアミダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、スフィンゴミエリナーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼであり得るが、これらに限定されない。
【００５８】
「孔形成毒素」という用語は、細胞の膜内でチャネル（孔）を生成する毒素を意味する。該孔は、カリウム流出、ナトリウムおよびカルシウム流入、細胞膜を介した必須小分子の通過、細胞溶解、または誘導されたアポトーシス等の事象により発生した標的細胞上の付随する悪影響を伴う、細胞外と細胞質空間との間で小分子またはイオンの交換を可能にする。いくつかの孔形成毒素は、不活性毒素「プロトキシン」として発現され、細胞表面でいくつかの手段で修飾される場合のみ、活性化するが、その一方、いくつかの孔形成毒素は細胞表面で凝集以外の他の修飾を必要としない。
【００５９】
「活性化可能な孔形成毒素」という用語は、不活性プロトキシンとして発現され、孔形成をもたらすために活性化ステップを必要とする、天然の毒素を意味する。例えば、多くの毒素は、オリゴマーおよび孔形成をもたらすために、プロドメインと活性孔形成ドメインとの間でフリン切断事象を必要とし、これはプロドメインを本質的に排除する。活性化するために修飾を必要とする典型的な孔形成毒素は、アエロモナス細菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）のアエロリジン、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のε−毒素、クロストリジウムセプチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｐｔｉｃｕｍ）のα毒素、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のプロ溶血素、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）の溶血素、および百日咳菌（Ｂ．  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のＡＣ毒素（ＣｙａＡ）を含む。真核性孔形成タンパク質のパーフォリンは、合成の段階では不活性であり、ＣＴＬおよびＮＫ細胞内での成熟中、プロドメインの切断により活性化される。
【００６０】
「再構築された活性化可能な孔形成毒素」または「ＲＡＰＦＴ」という用語は、コンビナトリアルターゲティングにおいて、特定の細胞型のみ標的とするために修飾される孔形成毒素を意味する。一般的に、孔形成剤は、病変細胞に向けて特異的に標的とせず、正常細胞に作用する。孔形成剤は、多くの場合、糖質群、膜タンパク質、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー、およびコレステロール等の一般的な細胞マーカーに結合する。ＲＡＰＦＴは、細胞溶解性孔形成毒素作用を依然として保持するが、細胞認識および活性化部位は、標的とする表面マーカーの組み合わせを有する細胞を特異的に標的とするように修飾されている。
【００６１】
本明細書に記載の態様は、２つの型の修飾を含むが、これらに限定されない。第１の修飾は、１つ以上の任意に置換された細胞標的部分を使用して特定の種類の細胞を標的とするための、毒素の天然細胞標的部分の修飾である。第２の修飾は、プロトキシンの孔形成能力に影響を及ぼし得る修飾可能な活性化部分を導入する。孔形成毒素を活性化するまたは天然で活性化可能な型に変換する方法で、修飾可能な活性化部分を修飾し得る第２の標的原理と組み合わせる場合、ＲＡＰＦＴは、透過性、細胞崩壊、またはアポトーシスの増加をもたらすイオンおよび小分子の勾配の早期喪失をもたらし得る。これらの態様は、プロトキシンを活性化毒素に変換し得る活性が、標的細胞に対して内因性である必要はないという点において、既に報告された孔形成抗毒素に対して独自性を有する（Ｂｕｃｋｌｅｙ，  ＭａｃＫｅｎｚｉｅ．  ２００６．  特許第ＷＯ２００７０５６８６７Ａ１号、Ｂｕｃｋｌｅｙ．  ２００３．  特許第ＷＯ０３０１８６１１Ａ２号）。外因性修飾部分は、１つ以上の細胞を標的とする部分と１つ以上の細胞表面標的との間で第２の相互作用を介して標的細胞にもたらされなければならない。
【００６２】
本明細書において、毒素の「転位ドメイン」という用語は、細胞質または細胞質隣接区画に毒素の活性ドメインを転位するために必要である毒素の任意ドメイン（例えば、天然または修飾毒素）を意味する。転位前に、活性ドメインは、細胞表面上に位置してもよい、または、細胞表面から、細胞質、例えば、エンドソーム、リソソーム、ゴルジ、または小胞体等の小胞区画から排除された細胞内腔に伝達されていてもよい。このようなドメインの例は、ＤＴの転位ドメイン（残基１８７〜３８９）および緑膿菌外毒素Ａの転位ドメイン（残基２５３〜３６４）である。すべての毒素は、転位ドメインを含むわけではない（例えば、孔形成毒素）。
【００６３】
本明細書において、「ジフテリア毒素」または「ＤＴ」という用語は、プロトキシンのファミリーから選択されるタンパク質を意味し、それらのプロトタイプは、ジフテリア菌の溶原バクテリオファージによりコードされる５３５のアミノ酸ポリペプチドである。プロトタイプのジフテリア毒素は、３つのドメイン、すなわち触媒ドメイン（残基１〜１８６）、転位ドメイン（残基１８７〜３８９）、および細胞を標的とする部分（残基３９０〜５３５）を含む。該触媒ドメインおよび該転位ドメインは、フリン切断部位（残基１９０〜１９５、すなわちＲＶＲＲ↓ＳＶ（配列番号：４）を通じて連結される。ジフテリア毒素は、その細胞を標的とする部分を介して、細胞表面上に発現される広範に発現した成長因子に結合し、細胞のエンドソーム区画に内在化され、そこで、フリンは、ＲＶＲＲ↓ＳＶで切断し、該触媒ドメインは、サイトゾルに転位される。サイトゾルにおいて、該触媒ドメインは、伸長因子２（ＥＦ−２）のＡＤＰ−リボシル化を触媒し、それによって、タンパク質合成を阻害し、細胞毒性または細胞分裂停止を誘導する。
【００６４】
「修飾されたＤＴ」または「操作されたＤＴ」という用語は、本明細書において、いずれかの天然ＤＴの配列と比較して、元の配列内でのアミノ酸配列の伸長、短縮、および置換を含むアミノ酸配列変化を与えるために修飾される組み換えまたは合成ＤＴを説明するために、同じ意味で使用される。特に、該用語は、フリン以外のプロテアーゼに対する認識部位である修飾可能な活性化部分を提供するフリン切断部位での配列変化を有するＤＴタンパク質、および／または天然細胞を標的とする部分が排除または他の細胞標的リガンドに変化されるＤＴ融合タンパク質を意味する場合がある。また、該用語は、グリコシル化およびＰＥＧ化等の修飾を有するＤＴを意味する場合がある。
【００６５】
本明細書において、「ＤＴ融合」という用語は、例えば、ＤＴまたは修飾されたＤＴ、および標的細胞表面に結合され得るポリペプチドを含む、融合タンパク質を意味する。ＤＴまたは修飾されたＤＴは、好ましくは、融合タンパク質のＮ末端に位置し、細胞標的ポリペプチドが、ＤＴまたは修飾されたＤＴのＣ末端に結合される。融合毒素との関連で論じられる場合、「修飾されたＤＴ」は、単に「ＤＴ」と称される場合がある。
【００６６】
本明細書において、「緑膿菌外毒素Ａ」、「ＰＥ」または「ＰＥＡ」という用語は、プロトキシンのファミリーから選択されるタンパク質を意味し、それらのプロトタイプは、緑膿菌により生成されるＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼである。プロトタイプＰＥＡは、６３８のアミノ酸を有するタンパク質であり、以下のドメイン構成を有する。Ｎ末端受容体結合部分（残基１〜２５２）、転位ドメイン（残基２５３〜３６４）、およびＣ末端触媒ドメイン（残基４０５〜６１３）。ＰＥＡは、受容体媒介のエンドサイトーシスを介して真核細胞に内在化され、ＥＲに輸送され、フリン切断部位で切断される（残基２７６〜２８１：ＲＱＰＲ↓ＧＷ（配列番号：５））。触媒ドメインは、サイトゾルに転位され、ＥＦ２のＡＤＰ−リボシル化を触媒し、細胞殺滅をもたらす。
【００６７】
「修飾されたＰＥＡ」または「操作されたＰＥＡ」という用語は、本明細書において同じ意味で使用され、修飾可能な活性化部分または細胞を標的とする部分の元の配列内でのアミノ酸配列の伸長、短縮、および置換、リンカーの付加を含む、天然ＰＥＡの配列と比較してアミノ酸配列変化を与えるために修飾される、組み換えまたは合成ＰＥＡタンパク質を表す。特に、該用語は、プロトキシン活性化因子により修飾できる修飾可能な活性化部分を提供するためのフリン切断部位での配列変化を有するＰＥＡタンパク質、および／または、天然細胞を標的とする部分が排除されたもしくは治療的に望ましい細胞を標的とする部分に変化されたＰＥＡ融合タンパク質を意味する場合がある。また、該用語は、アミノ酸共有結合修飾を有するＰＥＡもしくは非天然アミノ酸を含むＰＥＡ、ならびに／またはグリコシル化および／もしくはＰＥＧ化を誘発する等の他の部分との任意の置換により得られる変異体をも意味し得る。また、該用語は、特異性または活性を増加するためにＣ末端、例えば、Ｃ末端小胞体保持配列への変化を有するＰＥＡ、さらに具体的には、このような配列および変異体のコンセンサス型を意味し得る。
【００６８】
本明細書において、「ＰＥＡ融合」という用語は、ＰＥＡまたは修飾されたＰＥＡ、例えば、標的細胞表面に結合できる細胞を標的とする部分を含む融合タンパク質を意味する。ＰＥＡまたは修飾されたＰＥＡは、好ましくは、融合タンパク質のＣ末端に位置し、該細胞を標的とする部分は、好ましくは、ＰＥＡまたは修飾されるＰＥのＮ末端に結合される。融合毒素に関連して論じられる場合、「修飾されたＰＥＡ」は、単に「ＰＥＡ」と称される場合がある。
【００６９】
本明細書において、「コレラ菌外毒素Ａ」または「ＶＣＥ」という用語は、プロトキシンのファミリーから選択されるタンパク質を意味し、それらのプロトタイプは、コレラ菌のｔｏｘＡ遺伝子によりコードされるジフテリア特異的毒素である。プロトタイプＶＣＥは、保持されたＤＴ様ＡＤＰ−リボシル化ドメインを有し、中程度のアミノ酸配列同一性（約３３％）を有する、緑膿菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）の構造に非常に類似した総合的ドメイン構造を取り入れる。ＰＥＡのように、該ＶＣＥは、Ｎ末端の細胞を標的とする部分、続いて、転位ドメインおよびＣ末端のＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼを有する。推定上のフリン切断部位（ＲＫＰＫ↓ＤＬ（配列番号：６））は、推定上の転位ドメインのＮ末端近傍に位置する。
【００７０】
「修飾されたＶＣＥ」、「修飾されたＶＣＥ」、または「操作されたＶＣＥ」という用語は、本明細書において同じ意味で使用され、元の配列内にアミノ酸配列の伸長、短縮、および置換を含む、ＶＣＥの配列と比較してアミノ酸配列の変化を与えるために修飾される、組み換えまたは合成ＶＣＥタンパク質を表す。特に、用語は、フリン以外のプロテアーゼに対する認識部位である突然変異配列を提供するためのフリン切断部位で配列変化を有するＶＣＥタンパク質、および／または、排除されるもしくは細胞標的リガンドに変化される天然細胞を標的とする部分を有するＶＣＥ融合タンパク質を意味し得る。また、該用語は、グリコシル化およびＰＥＧ化等のアミノ酸共有結合修飾を有するＶＣＥを意味し得る。
【００７１】
本明細書において、「ＶＣＥ融合」という用語は、ＶＣＥまたは修飾されたＶＣＥ、例えば、標的細胞表面に結合され得るポリペプチドを含む、融合タンパク質を意味する。ＶＣＥまたは修飾されたＶＣＥは、好ましくは、融合タンパク質のＣ末端に位置し、細胞標的ポリペプチドが、ＶＣＥまたは修飾されたＶＣＥのＮ末端に結合される。融合毒素に関連して論じられる場合、「修飾されたＶＣＥ」は、「ＶＣＥ」と称される場合がある。
【００７２】
本明細書において、「プロアエロリジン」または「アエロリジン」という用語は、アエロモナス属によりコードされる細菌性孔形成毒素のファミリーから選択されるタンパク質を意味し、それらのプロトタイプは、アエロモナス細菌からの孔形成毒素である。プロトタイプのプロアエロリジンは、以下の４つのドメインから成る。グリコシル化ＧＰＩアンカー受容体のＮ連結グリカンに結合し得るＮ末端ドメイン１（残基１〜８２）、ＧＰＩアンカーのグリカン中心に結合するドメイン２（残基８３〜１７８および３１１〜３９８）、ならびに７量体形成および孔形成に関与する不連続ドメイン３および４（残基１７９〜４７０）。ドメイン４のＣ末端には、その認識配列の直上流でフリン切断に感受性があるプロペプチドが位置する（残基４２７〜４３２  ＫＶＲＲ↓ＡＲ（配列番号：７））。プロペプチドのフリン排除は、環状の７量体構造の形成を促進し、脂質膜に挿入して細孔を形成し、細胞死をもたらす。ドメイン１はまた、小ローブとして周知であり、ドメイン２、３、および４は、まとめて、大ローブとして周知である。
【００７３】
「修飾されたアエロリジン」または「操作されたアエロリジン」という用語は、本明細書において、同じ意味で使用され、元の配列内でのアミノ酸配列の伸長、短縮、および置換を含む、アエロリジンの配列と比較してアミノ酸配列の変化を与えるために修飾される、組み換えまたは合成アエロリジンタンパク質を表す。特に、該用語は、フリン以外のプロテアーゼに対する認識部位である突然変異配列を提供するためのフリン切断部位で配列変化を有するアエロリジンタンパク質、および／または、天然細胞標的部分１（小ローブ）が排除されるまたは細胞標的リガンドに変化されるアエロリジンタンパク質を意味し得る。また、該用語は、グリコシル化およびＰＥＧ化等のアミノ酸共有結合修飾を有するアエロリジンをも意味し得る。また、該用語は、アエロリジンの機能的フラグメントをも意味し得る。
【００７４】
本明細書において、「アエロリジン融合」という用語は、例えば、アエロリジンまたは修飾されるアエロリジン、および標的細胞表面に結合され得るポリペプチドを含む、融合タンパク質を意味する。アエロリジンまたは修飾されるアエロリジンは、好ましくは、融合タンパク質のＣ末端に位置し、細胞標的ポリペプチドが、アエロリジンまたは修飾されるアエロリジンのＮ末端に結合される。融合毒素に関連して論じられる場合、「修飾されるアエロリジン」は、「アエロリジン」として単に称される場合がある。
【００７５】
「プロトキシン活性化因子」という用語は、該毒素が細胞増殖を阻害し得る、または細胞死を生じ得るようにプロトキシンを修飾するタンパク質を含むことが意図されている。
【００７６】
本明細書において、「修飾ドメイン」という用語は、標的分子上で選択的に修飾可能な活性化ドメインを選択的に修飾するポリペプチドを意味する。このような修飾は、標的分子のポリペプチド構造の修飾または化学的部分の付加もしくは排除を含むことが意図されている。修飾ドメインの例は、プロテアーゼ活性、ホスファターゼ活性、キナーゼ活性、および本明細書に記載の他の修飾を含むポリペプチドである。
【００７７】
本明細書において、「酵素」という用語は、「基質」の特異的な化学的修飾（すなわち、化学成分の付加、排除、または置換）を媒介する触媒を意味する。酵素という用語は、プロテアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、または本明細書に記載の他の化学的修飾を含むことが意図されている。
【００７８】
本明細書において、「基質」という用語は、特定の酵素により認識され、化学的に修飾される、特異的分子または分子の一部分を意味する。
【００７９】
本明細書において、「プロテアーゼ」という用語は、タンパク質分解活性を有する組成物、好ましくは、あるペプチド配列を特異的に認識し、切断し得る組成物を意味する。一つの特定の態様において、特異的な認識部位は、４つのアミノ酸から成る天然フリン切断配列の認識部位の長さ以上であり、したがって、天然毒素の認識部位に相当するかまたはそれよりも高い活性化のストリンジェンシーを提供する。プロテアーゼは、所望のタンパク質分解活性を有する天然の、操作された、または合成の分子であり得る。タンパク質分解の特異性は、遺伝変種、インビトロ修飾、または活性を制御する結合部分の付加もしくは欠失により増強され得る。
【００８０】
本明細書において、「異種の」という用語は、非天然または天然に認められる、例えば、既存の天然組成物または状態を別の源に由来するものにより置換することで達成され得る組成物または状態を意味する。したがって、天然に存在する、例えば、フリン感受性の切断部位と別の酵素に対する切断部位との置換は、天然部位と異種部位との置換を構成する。同様に、タンパク質が天然に発現される生物以外の生物におけるタンパク質の発現は、異種発現系および異種タンパク質を構成する。
【００８１】
本明細書において、「外因性」という用語は、標的宿主細胞内、標的宿主細胞上、またはその近傍において、作用可能に存在しない任意のタンパク質を意味する。作用可能に存在するとは、タンパク質が、存在する場合、治療的に供給されるタンパク質の作用可能な様式で、作用させる型で存在しないことを意味する。存在し得るが作用可能に存在しないプロトキシン活性化部分の例は、例えば、細胞内プロテアーゼ、ホスファターゼ、またはユビキチンＣ末端ヒドロラーゼを含み、治療的に供給されるプロテアーゼ、ホスファターゼまたはユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（治療的に供給される場合、細胞の表面上、あるいは細胞外に位相同形の小胞区画のいずれかに存在する）とは異なる区画にあるため、作用可能に存在せず、その活性化を生じるであろう様式で、プロトキシンに作用し得ない。また、タンパク質は、プロトキシンまたはプロトキシンプロアクチベーターの活性化率に有意に影響しないほど低量、例えば、最低限の治療効果のある用量の外因性供給により達成され得る割合の１０％より多い、または１％より多い、または０．１％より多い割合で、標的細胞内、標的細胞上、またはその近傍で作用可能には認められない型を提供するような低量で認められる場合、存在し得るが、作用可能に存在しないとする。さらに限定されない例として、治療用タンパク質におけるフリン感受性部位と、標的宿主細胞上、標的宿主細胞内、またはその近傍で作用可能に存在することが天然に認められるプロテアーゼの部位との置換は、内因性プロテアーゼにより作用し得る異種置換を構成する。治療用タンパク質におけるフリン感受性部位と、標的宿主細胞の近傍で作用可能に存在することが天然に認められないプロテアーゼの部位との置換は、外因性プロテアーゼにより作用し得る異種置換を構成する。
【００８２】
「ＰＥＧ化」という用語は、線状、分岐、およびデンドリマー等の様々な大きさおよび形状から成る、ポリエチレングリコールポリマーを有するタンパク質の共有または非共有修飾を意味し、または修飾毒素の治療効果に有用であり得る等の、追加の機能性を有する、ポリエチレングリコールポリマーまたは修飾されるポリマーを組み込むブロック共重合体を意味し得る。例えば、ポリエチレングリコール部分は、修飾可能な活性化配列に任意の阻害配列を結びつける、または１つ以上の細胞を標的とする部分を修飾毒素に結びつけ得る。コンジュゲート型タンパク質の活性保持と合致する方法における、タンパク質のＰＥＧ化のための多くの方策は、当技術分野において記載されている。これらは、アルキル化もしくはマイケル付加によるシステイン等の遊離チオールへのコンジュゲーション、またはアシル化または還元アルキル化によるＮ末端への連結、リジン残基の側鎖アミノ基への連結、トランスグルタミナーゼを使用するグルタミン残基への連結、天然ライゲーションもしくはシュタウディンガーライゲーションによるＮ末端への連結、またはＮ連結グリカンもしくはＯ連結グリカン等の内因性グリカンへの連結等を含む。多数のグリカン付加の方策は、周知であり、過ヨウ素酸塩酸化により生成されるアルデヒドを伴うヒドラゾン形成、代謝標識により組み込まれるグリカンアジドとのシュタウディンガーライゲーション、およびグリカン置換技術を含む。非共有修飾の例は、高親和性リガンド置換されたＰＥＧと、そのようなリガンドを結合するタンパク質ドメインとの反応、例えば、ビオチン置換されたＰＥＧ部分とストレプトアビジンまたはアビジン融合タンパク質の反応を含む。
【００８３】
「ＰＥＧ」という用語は、線状、分岐、およびデンドリマー等の様々な大きさおよび形状において存在し得る任意に置換されたポリエチレングリコール部分を意味し、修飾毒素の治療効果に有用であり得る等の、追加の機能性を有するブロック共重合体または修飾されるポリマーを意味し得る。ＰＥＧ部分において、任意に置換された、または置換されないエチレングリコール部分の数は、少なくとも２つである。
【００８４】
「ＰＥＧ化された」という用語は、ＰＥＧ部分の可逆的または不可逆的連結を行っている組成物を意味する。
【００８５】
「チオールに特異的なＰＥＧ化」という用語は、タンパク質の１つ以上のチオール基またはタンパク質置換基への任意に置換されたチオール反応性ＰＥＧ部分の連結を意味する。チオールを標的としたＰＥＧ化の標的は、システイン残基、またはイミノチオランと、リジンエプシロンアミノ基もしくはＮ末端アルファアミノもしくはイミノ基との反応等の化学反応により導入されたチオール基であり得る。多くの、高度に特異的な化学物質は、チオールを標的としたＰＥＧ化のために開発されており、すなわち、ＰＥＧ−オルト−ピリジル−ジスルフィド、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン、およびＰＥＧ−ヨードアセトアミドである。チオール特異的コンジュゲーション化学の型に加えて、市販のチオール反応性ＰＥＧはまた、大きさ、線状、または分岐、および、ヒドロキシル、カルボン酸、メトキシ、または他のアルコキシ基を含む異なる末端基に関して異なる。
【００８６】
「カルボキシル反応性ＰＥＧ化」という用語は、タンパク質またはタンパク質置換基と、グルタミン酸塩もしくはアスパラギン酸塩側鎖またはタンパク質のＣ末端等のカルボキシル基と反応可能な任意に置換されたＰＥＧ部分との反応を意味する。タンパク質のカルボキシル基は、カルボキシル基が、酸性のｐＨで、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ´−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等のカップリング剤により活性化される場合、ＰＥＧ−ヒドラジドを使用してカルボキシル反応性ＰＥＧ化を受け得る。
【００８７】
「アミン反応性ＰＥＧ化」という用語は、タンパク質またはタンパク質置換基と、第１級アミンもしくは第２級アミン等のアミンと反応可能な任意に置換されたＰＥＧ部分との反応を意味する。タンパク質のアミン反応性ＰＥＧ化の一般的経路は、リジンおよび／またはＮ末端アミノもしくはイミノ基と反応する官能基を含むＰＥＧを使用することである（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．５４（４）：４５９−４７６（２００２））。アミン反応性ＰＥＧの例は、ＰＥＧジクロロトリアジン、ＰＥＧトレシレート、ＰＥＧスクシンイミジル炭酸塩、ＰＥＧベンゾトリアゾール炭酸塩、ＰＥＧ  ｐ−ニトロフェニル炭酸塩、ＰＥＧカルボニルイミダゾール、ＰＥＧこはく酸スクシンイミジル、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ＰＥＧアセトアルデヒド、およびＰＥＧ  Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミドを含む。
【００８８】
「Ｎ末端ＰＥＧ化」という用語は、タンパク質のアミノ末端への任意に置換されたＰＥＧ部分の連結を意味する。Ｎ末端ＰＥＧ化のための好ましいタンパク質融合またはタンパク質ハイブリッドは、少なくとも１つのＮ末端アミノ基を有する。Ｎ末端ＰＥＧ化は、アミン反応性ＰＥＧとタンパク質との反応、または天然化学的ライゲーションとして周知の反応におけるチオエステル末端ＰＥＧとＮ末端システインとの反応、またはヒドラジド、ヒドラジンもしくはヒドロキシルアミン末端ＰＥＧとＮ末端セリンもしくはトレオニン残基の過ヨウ素酸塩酸化により形成されたＮ末端アルデヒドとの反応により、実施され得る。好ましくは、ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートは、１〜５のＰＥＧ置換基を含み、実験的に最適化されてもよい。多重連結は、タンパク質が過度にＰＥＧ化試薬に曝露される場合、生じ得る。タンパク質対ＰＥＧの比率、ｐＨ、ならびに培養時間および温度を含む、反応条件を、連結の数および／または連結部位を制限するために調整することができる。融合タンパク質内の活性部位での修飾は、基質、可逆的阻害剤、または結合タンパク質の存在下でＰＥＧ化を行うことにより、防ぐことができる。所望のＰＥＧ置換数を有する融合タンパク質はまた、カラムクロマトグラフィー分画を使用して、さらに複雑なＰＥＧ化された融合タンパク質の混合物からの分離により得られる。
【００８９】
「非天然アミノ酸反応性ＰＥＧ化」という用語は、タンパク質またはタンパク質置換基と、修飾されたｔＲＮＡを使用してある部位でタンパク質に導入され得る反応性機能基を担持する非天然アミノ酸と反応可能な任意に置換されたＰＥＧ部分との反応を意味する。特に、パラ−アジドフェニルアラニンおよびアジドホモアラニンは、それぞれ、酵母（Ｄｅｉｔｅｒｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  １４（２３）：５７４３−５（２００４））および大腸菌（Ｋｉｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９９（ｌ）：１９−２４（２００２））における発現により、タンパク質に特異的に組み込まれ得る。これらのアジド修飾残基は、アルキン誘導体化ＰＥＧ試薬と選択的に反応し、部位に特異的なＰＥＧ化を可能にする。
【００９０】
「グリカン反応性ＰＥＧ化」という用語は、タンパク質またはタンパク質置換基と、グリコシル化タンパク質と反応可能な任意に置換されたＰＥＧ部分との反応を意味し、Ｎ末端セリンもしくはトレオニンを含む該タンパク質は、ＰＥＧ化され、続いて、選択的に酸化され得る。糖質側鎖は、酵素的に、または、反応性アルデヒド基を生成する過ヨウ素酸ナトリウムを使用して、化学的に酸化され得る。Ｎ末端セリンまたはトレオニンは、同様に、過ヨウ素酸塩酸化されて、グリオキシリルの誘導体を得ることができる。アルデヒドおよびグリオキシリル基の双方は、ＰＥＧ−ヒドラジンまたはＰＥＧ−アミンと選択的に反応し得る。
【００９１】
「酵素触媒によるＰＥＧ化」という用語は、１つ以上の酵素触媒反応を介する、タンパク質またはタンパク質置換基と任意に置換されたＰＥＧ部分との反応を意味する。このような方法の1つは、遊離アミン基とタンパク質またはペプチド結合グルタミンのガンマカルボキサミド基との間で共有結合の形成を触媒するタンパク質のファミリーのトランスグルタミナーゼを使用することである。タンパク質のこのファミリーの例は、トランビン、第ＸＩＩＩ因子、およびヒトおよび動物由来の組織トランスグルタミナーゼを含む、多くの異なる起源から成るトランスグルタミナーゼを含む。好ましい態様は、微生物のトランスグルタミナーゼを使用して、ＬＬＱＧのペプチド配列（配列番号：８）内に組み込まれたグルタミン残基を含むタンパク質基質と第１級アミノ基を含むＰＥＧ化試薬との間でコンジュゲーション反応を触媒することを含む（Ｓａｔｏ  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ５４（４）：４８７−５０４（２００２））。別の例は、ソルターゼを使用して同一のコンジュゲーションを誘発することである。したがって、ソルターゼＡおよびソルターゼＢに対して、それぞれＬＰＸＴＧ（配列番号：２）またはＮＰＱＴＮ（配列番号：３）、およびＮ末端、もしくは第１級アミノ基でジペプチドＧＧまたはＧＫ、またはリンカーに連結されるジペプチドＧＧまたはＧＫを含むポリペプチド等の第２部分を与える置換されたＰＥＧ部分を提供し、該ソルターゼＡまたはソルターゼＢは、その後、該第２の部分へのＰＥＧ部分の連結を達成するために提供される。代替として、該ＬＰＸＴＧ（配列番号：２）またはＮＰＱＴＮ（配列番号：３）は、修飾するためにポリペプチドのＣ末端に提供することができ、ＧＧもしくはＧＫまたは第１級アミンで置換されるＰＥＧ部分を供給することができ、ソルターゼ反応が行われる。
【００９２】
「グリコＰＥＧ化」という用語は、タンパク質と、原核生物宿主内で発現したタンパク質における特異的セリンおよびトレオニン残基での酵素的ＧａｌＮＡｃグリコシル化と、続く導入されたＧａｌＮＡｃにシアル酸コンジュゲート型ＰＥＧの酵素転移を介して任意に置換されたＰＥＧ部分との反応を意味する（Ｄｅｆｒｅｅｓら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．  １６（９）：８３３−８４３（２００６））。
【００９３】
「インテイン媒介ＰＥＧ化」という用語は、タンパク質と、ＰＥＧ化されたタンパク質のＣ末端に連結され得、その後、ＰＥＧ化タンパク質を得るために、システイン末端ＰＥＧで処理されるインテインドメインを介して任意に置換されたＰＥＧ部分との反応を意味する。このようなインテイン媒介タンパク質コンジュゲーション反応は、チオフェノールまたはトリアルボキシルエチルホスフィンの付加により促進される（Ｗｏｏｄら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  １５（２）：３６６−３７２（２００４））。
【００９４】
「可逆的ＰＥＧ化」という用語は、タンパク質またはタンパク質置換基と、切断または除去され得るリンカーを介して任意に置換されたＰＥＧ部分との反応で、ＰＥＧ部分を遊離する反応を意味する。可逆的ＰＥＧ化の好ましい型は、細胞表面または細胞内区画に存在する様々な活性化に感受性があるリンカーの使用を含み、ＰＥＧ置換により阻害または障害なく、内在化されたまたは細胞表面結合のプロトキシンもしくはプロトキシンプロアクチベーターもしくはプロアクチベーター活性化因子になお所望の作用を行いつつ、血中濃度半減期の有用な延長および／または免疫原性を低下させる。可逆的ＰＥＧ化リンカーの例は、カテプチン、フリン／ケキシンプロテアーゼ、およびノイラミニダーゼ、ヌクレアーゼ、グリコール酸ヒドロラーゼ等のリソゾーム加水分解酵素の作用に感受性があるリンカーを含む。
【００９５】
本明細書において、「投与」および「併用投与」という用語は、治療を必要とする生物への、同時および／または連続した、２つ以上の融合タンパク質の使用を意味する。使用の順番、時間間隔、および相対量は、最適化された選択的な細胞毒性または細胞静止作用を達成するために変化させることができる。過剰に１つの薬剤を使用する、または、類似の量で２つの薬剤を使用することが好ましい。１つの薬剤を、第２の薬剤のかなり前に投与してもよく、またはより短い間隔でまたは同時に、それらを投与してもよい。さらに、投与または併用投与は、例えば、エアロゾルおよび静脈注射、もしくは静脈注射および筋肉注射等の２つの異なる解剖学的部位への注入、または複数のモダリティーによる送達による複数の部位からの注入もしくは送達を含んでもよい。
【００９６】
「選択的殺滅」という用語は、例えば、９９：１あるいはそれ以上、９５：５あるいはそれ以上、９０：１０あるいはそれ以上、８５：１５あるいはそれ以上、８０：２０あるいはそれ以上、７５：２５あるいはそれ以上、７０：３０あるいはそれ以上、６５：３５あるいはそれ以上、または６０：４０あるいはそれ以上の差による、別集団のものよりも多いある特定集団の細胞の殺滅、破壊、または阻害を意味するために本明細書に使用される。
【００９７】
「標的細胞を破壊または阻害する」という用語は、特定の細胞型（例えば、所望の細胞表面標的を発現する細胞）の細胞分裂率を低下させる（細胞分裂停止）、または細胞死をもたらす（細胞毒性）ことを意味するために本明細書に使用される。細胞分裂停止または細胞毒性は、例えば、細胞の分化の誘導、細胞の壊死による細胞死のアポトーシス、または細胞分裂の過程の障害により達成され得る。
【００９８】
「グリコシル化」という用語は、糖質とのタンパク質の共有修飾を意味する。グリコシル化は、Ｎ−グリコシル化またはＯ−グリコシル化を通じて達成され得る。コンセンサスＮ連結グリコシル化部位の導入は、タンパク質がヒトに対して無害であるグリコシル化パターンを生成する１種または複数種の哺乳類細胞株において生成される場合、好ましい。
【００９９】
ヒト「グランザイムＢ」（ＧｒＢ）は、アポトーシスに関与することで周知のセリンプロテアーゼのグランザイムファミリーのメンバーである。具体的には、ＧｒＢは、天然基質、例えば、プロ−カスパーゼ−３およびＢｉｄ等の限定されるメンバーのみを切断することを示している。ＧｒＢは、効率的な触媒反応のための拡張ペプチド配列、すなわち、ＩＥＰＤのコンセンサス認識配列（配列番号：９）との相互作用を必要とするため、基質配列の特異性が高い酵素であることが示されている。ＧｒＢは、単鎖または単一ドメインセリンプロテアーゼであり、プロ型に合成され、ジペプチジルペプチダーゼＩ（ＤＰＰＩ）による２つのアミノ酸プロ−ペプチド（配列番号：１０）の排除により活性化される。本発明において、用語「ＧｒＢ」とは、例えば成熟型、すなわちプロペプチドのない型を意味する。
【０１００】
ヒト「グランザイムＭ」（ＧｒＭ）は、天然キラー細胞の顆粒に特異的に認められるセリンプロテアーゼのグランザイムファミリーの別のメンバーであり、標的細胞死の誘発と関係づけられている。ＧｒＭが、効率的な触媒反応のためのペプチド基質、すなわち、ＫＶＰＬの好ましい認識配列（配列番号：１１）における少なくとも４つのアミノ酸との相互作用を必要とするため、基質配列の特異性が高い酵素であることが示されている。
【０１０１】
「ポティウイルスプロテアーゼ」という用語は、植物ウイルスファミリーのポティウイルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーによりコードされる様々なプロテアーゼのいずれかを意味し、高い切断特異性を示す。「ポティウイルスプロテアーゼ」は、天然プロテアーゼ、ならびに、遺伝変種または化学的修飾により生成される操作された変異体を含有する。「タバコエッチウイルスプロテアーゼ」または「ＴＥＶプロテアーゼ」という用語は、２７ｋＤａシステインプロテアーゼの天然または操作された変異体を意味し、厳密な配列特異性を示す。ＴＥＶプロテアーゼは、組換えタンパク質の親和性タグの排除のために生物工学において広範に使用される。ＴＥＶプロテアーゼは、７つのアミノ酸認識配列ＥＸＸＹＸＱ↓Ｓ／Ｇ（配列番号：１２）を認識し、Ｘは、任意の残基である。
【０１０２】
「ピコルナウイルスプロテアーゼ」という用語は、動物ウイルスファミリーのピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーによりコードされる様々なプロテアーゼのいずれかを意味し、高い切断特異性を示す。「ピコルナウイルスプロテアーゼ」は、天然プロテアーゼ、ならびに、遺伝変種または化学的もしくは酵素的修飾により生成される操作された変異体を含有する。「ヒトライノウイルス３Ｃコンセンサスプロテアーゼ」という用語は、特定のライノウイルスプロテアーゼの複数の例に由来するコンセンサス配列の選択により生成される合成ピコルナウイルスプロテアーゼを意味する。
【０１０３】
「レトロウイルスプロテアーゼ」という用語は、ウイルスファミリーのレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーによりコードされる様々なプロテアーゼのいずれかを意味する。「ＨＩＶプロテアーゼ」は、天然プロテアーゼ、ならびに、遺伝変種または化学的もしくは酵素的修飾により生成される操作された変異体を含有する。
【０１０４】
「コロナウイルスプロテアーゼ」という用語は、動物ウイルスファミリーのコロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）のメンバーによりコードされる様々なプロテアーゼのいずれかを意味し、高い切断特異性を示す。「コロナウイルスプロテアーゼ」は、天然プロテアーゼ、ならびに、遺伝変種または化学的もしくは酵素的修飾により生成される操作された変異体を含有する。「ＳＡＲＳプロテアーゼ」という用語は、ヒト症候群ＳＡＲＳを誘導するコロナウイルスのファミリーのメンバーのいずれかによりコードされるコロナウイルスプロテアーゼを意味する。
【０１０５】
「実質的に同一」とは、例えば、下記に記載の方法を使用して、最適に整列させた際、第２の核酸またはアミノ酸配列、例えばＳＡＡ配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する、核酸またはアミノ酸配列を意図している。「実質的な同一性」とは、全長配列、エピトープまたは免疫原性ペプチド、機能ドメイン、コーディング配列および／または調節配列、エクソン、イントロン、プロモーター、ならびにゲノム配列等の、様々な型および長さの配列を意味するために使用され得る。２つのポリペプチドまたは核酸配列の間の一致率（％）は、当技術分野の範囲内の様々な方法で決定され、例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ｓｍｉｔｈ，  Ｔ．  Ｆ．およびＭ．  Ｓ．  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４７：１９５−７）、ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ  Ｐｌｕｓ（商標）に組み込まれる「ＢｅｓｔＦｉｔ」（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，  ４８２−４８９  （１９８１））、Ｓｃｈｗａｒｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆ（１９７９）  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｄａｙｈｏｆ，  Ｍ．Ｏ．編、３５３−３５８ページ、ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．，  Ｗ．  Ｇｉｓｈら（１９９０）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０）、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ，またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の一般に入手可能なコンピュータソフトウェアの使用が挙げられる。さらに、当業者は、比較される配列の長さに渡る最大のアライメントを達成するために必要なあらゆるアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することが可能である。概して、タンパク質または核酸については、比較の長さは、最大で全長を含む任意の長さであることが可能である（例えば５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％）。保存的置換は、一般的に以下の基内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、およびフェニルアラニン、チロシン。
【０１０６】
「癌細胞」という用語は、組織における不適切な蓄積により特徴付けられる細胞集団の構成要素を意味する。該不適切な蓄積とは、細胞集団のうちの１つ以上の細胞に生じる、遺伝または非遺伝変異の結果であり得る。該遺伝または非遺伝変異は、周囲の正常組織よりも、細胞集団の細胞を速く成長させる、ゆっくりと死なせる、またはゆっくりと分化させる。本明細書において、「癌細胞」という用語は、悪性細胞の成長または生存を支持する細胞もまた包含する。該支持細胞には、悪性細胞の成長または生存に有利となる、線維芽細胞、血管内皮細胞もしくはリンパ内皮細胞、炎症細胞、または共拡張型非腫瘍性細胞が含まれ得る。「癌細胞」という用語は、造血、上皮、内皮、または固形組織内由来の癌を含むことが意図されている。また、「癌細胞」という用語は、癌幹細胞を含むことが意図されている。本発明の融合タンパク質により標的とされる癌細胞は、表１に説明するものを含む。
【０１０７】
標的細胞に対する、上記のすべての手法の主な制限は内因性プロテアーゼへの依存にあり、これはすべての腫瘍に存在するとは限らず、または不適切に多量に存在する場合があり、あるいは実質的な量に減少される場合があり、したがって毒素の非特異的活性化を導く。本発明は、内因性腫瘍プロテアーゼから独立している点で、既存の方法からは異なる。本発明の組み合わせ毒素は、適切な内因性プロテアーゼ活性を有さない腫瘍細胞、または他の望ましくない細胞上で使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１Ａは、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９およびＤＴ−抗ＣＤ５融合タンパク質のための発現カセットの概略図である。ＧｒＢ−抗ＣＤ１９は、分泌タンパク質およびＮ末端ＦＬＡＧタグ（Ｎ）として２９３ＥＴＮ細胞から生成され、酵素的に活性な融合タンパク質を産出するためにエンテロキナーゼにより排除された。成熟ヒトグランザイムＢおよび抗ＣＤ−１９  ＳｃＦｖは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（Ｌ）を介して連結される。ポリヒスチジンタグ（Ｈ）は、検出および精製のためにＣ末端の抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖに追加される。ＤＴ−抗ＣＤ５融合タンパク質の発現は、ＡＯＸ１プロモーターにより促進される。融合タンパク質は、Ｎ末端（Ｓ）での、酵母α因子シグナルペプチドの結合により培地に分泌される型に構成される。該α因子シグナルペプチドは、分泌過程中、プロテアーゼＫｅｘ２により排除される。ＤＴ遺伝子の内因性フリンの切断部位は、グランザイムＢ切断部位（ＩＥＰＤ↓ＳＧ（配列番号：１３））またはＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断部位（ＡＬＦＱ↓ＧＰ（配列番号：１４））に置換される。毒素部分および抗ＣＤ５  ＳｃＦｖは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（Ｌ）を介して連結される。ポリヒスチジンタグ（Ｈ）は、検出および精製のために抗ＣＤ５  ＳｃＦｖのＣ末端に存在する。図１Ｂは、グランザイムＢのタンパク質分解活性によるＤＴ−抗ＣＤ５融合タンパク質の切断を示す電気泳動ゲルである。追加のＮ末端ＦＬＡＧタグを有する精製されたＤＴ−抗ＣＤ５融合タンパク質を、マウスグランザイムＢあるいは精製されたＧｒＢ−抗ＣＤ１９融合タンパク質のいずれかと室温で一晩インキュベートした。反応生成物を、４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫ブロットした。全長タンパク質および切断された生成物は、矢印で示される。図１Ｃは、様々なプロテアーゼを伴う、グランザイムＢ部位（１〜４レーン）、またはＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ部位（５〜８レーン）を有するＤＴ−抗ＣＤ５の切断を示す電気泳動ゲルである。反応は、室温で一晩実施された。生成物は、抗Ｈｉｓタグ抗体で検出された。全長タンパク質および切断された生成物は、矢印で示される。３および７レーンのアスタリスクは、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ試料に存在する不明のタンパク質を示す。Ｇ：グランザイムＢ、３Ｃ：ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ、Ｆ：フリン。
【図２】レポーター細胞株の発生を示す。分類されたＣＤ５を発現するＲａｊｉ細胞由来の培養細胞（ＣＤ５＋Ｒａｊｉ）は、ＣＤ５およびＣＤ１９発現の血球計算により分析された。Ｒａｊｉ細胞は、ＣＤ１９のみ発現するのに対して、ＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞は、ＣＤ５およびＣＤ１９の双方を発現する。
【図３】図３Ａは、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９のみが、細胞に対して毒性がなかったことを示すグラフである。細胞を、グラフの下に示された濃度で、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９とインキュベートした。緩衝液で処理された対照と比較した融合タンパク質の相対的な細胞毒性は、［３Ｈ］−ロイシンの取り込みにより測定された。図３Ｂは、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９の存在下で、ＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞を選択的に殺滅するＤＴ−抗ＣＤ５を示すグラフである。該細胞は、１．３ｎＭ  ＧｒＢ−抗ＣＤ１９および様々な濃度のＤＴ−抗ＣＤ５で処理された。非線形回帰分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４プログラムを使用して実施された。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、非標的Ｒａｊｉ細胞（図４Ａ）および標的ＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞（図４Ｂ）を使用した、ＤＴ−抗ＣＤ５（０．３ｎＭ、１．０ｎＭ、および３．０ｎＭ）の固定濃度の存在下で、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９のＥＣ５０を測定する細胞毒性分析を示すグラフである。非線形回帰分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４プログラムを使用して実施された。
【図５】ＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞を使用した、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９（２ｎＭ）の固定濃度の存在下で、ＤＴ−抗ＣＤ５のＥＣ５０を測定する細胞毒性分析を示すグラフである。非線形回帰分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４プログラムを使用して実施された。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、ＤＴ−抗ＣＤ５とＧｒＢ−抗ＣＤ１９との組み合わせがＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞に選択的に毒性があることを示すグラフである。緩衝液で処理された対照と比較した融合タンパク質の相対的な細胞毒性は、［３Ｈ］−ロイシンの取り込みにより測定された。図６Ａでは、グラフに示されるように、ＪｕｒｋａｔまたはＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１．０ｎＭ  ＧｒＢ−抗ＣＤ１９および様々な濃度のＤＴ−抗ＣＤ５とインキュベートした。図６Ｂでは、ＪｕｒｋａｔまたはＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を、４℃で３０分間、１．０ｎＭ  ＧｒＢ−抗ＣＤ１９で予め処理した。その後、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９を洗い流し、１０ｎＭ  ＤＴ−抗ＣＤ５の存在下および非存在下で培地を置換し、３７℃で２０時間、インキュベートした。対照実験のために、細胞を、１０ｎＭ  ＤＴ−抗ＣＤ５＋／−１．０ｎＭ  ＧｒＢ−抗ＣＤ１９で処理し、３７℃で２０時間、インキュベートした。
【図７】図７Ａは、抗ＣＤ５−ＰＥおよびＤＴ−抗ＣＤ５融合タンパク質の概略図である。人工的に合成したＰＥ遺伝子を、ＤＴ−抗ＣＤ５の構築に使用される抗ＣＤ５  ＳｃＦｖ遺伝子と融合させた。ＰＥのフリン部位を置換するグランザイムＢ部位、Ｃ末端６Ｈｉｓタグ（Ｈ）、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ（Ｎ）、および小胞体保留シグナル（ＫＤＥＬ（配列番号：１５））を含む、抗ＣＤ５−ＰＥのいくつかの重要な特徴が示されている。図７Ｂおよび図７Ｃは、それぞれ、マウスＧｒＢ処理後の、精製された抗ＣＤ５−ＰＥおよびタンパク質分解産物の４〜１２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す写真である。抗ＣＤ５−ＰＥを、大腸菌で発現させ、封入体から精製した。リフォールディング後、タンパク質は、ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ７５）により、またはＭ２抗ＦＬＡＧタグ抗体ビーズの使用によりさらに精製された。リフォールディングされた抗ＣＤ５−ＰＥを、３０℃で３時間、マウスグランザイムＢ消化とインキュベートした。
【図８】コンビナトリアルターゲティングの文脈において、抗ＣＤ５−ＰＥの使用を示すグラフである。細胞毒性分析を、１．０ｎＭ  ＧｒＢ−抗ＣＤ１９および様々な濃度の抗ＣＤ５−ＰＥで実施し、４つの異なる細胞株を使用したが、そのうち、標的細胞株としてＣＤ５＋ＲａｊｉおよびＣＤ５＋ＪＶＭ３、ならびに、非標的細胞株としてＲａｊｉおよびＪＶＭ３を使用した。非線形回帰データ分析は、上記に記載のように実施された。標的細胞株の選択的殺滅が観察された。
【図９】図９Ａは、ＢＬＡＳＴを使用した、緑膿菌外毒素Ａ（ＰＥ）（配列番号：１６）とコレラ菌環境分離株（配列番号：１７）ＴＰ由来のＰＥ様毒素との配列比較を示す配列アラインメントである。図９Ｂは、ＰＥとＶＣＥとの間の全体的な配列同一性、ならびに、ＰＥおよびＶＣＥの個別ドメインの配列同一性の分析を示す表である。図９Ｃは、ＰＥ（配列番号：１９）およびＤＴ（配列番号：２０）のフリン切断部位と比較した、ＶＣＥ（配列番号：１８）における推定上のフリン切断部位の配列を示す配列アラインメントである。効率的なインビトロフリン切断にとって重要である残基を灰色で強調表示する。
【図１０】図１０Ａは、抗ＣＤ５−ＶＣＥの概略図である。比較のために、抗ＣＤ５−ＰＥの構造も示される。図１０Ｂは、クマシーブルー染色により視覚化された、精製抗ＣＤ５−ＶＣＥおよび抗ＣＤ５−ＰＥの４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す写真である。機能的抗ＣＤ５−ＰＥを生成した同一のプロトコルの後に、抗ＣＤ５−ＶＣＥの発現、精製、およびリフォールディングが実行された。
【図１１】ＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞を使用した、ＶＣＥベースのコンビナトリアルターゲティング薬剤の細胞毒性分析の結果を示すグラフである。分析は、１．０ｎＭ  ＧｒＢ−抗ＣＤ１９および様々な濃度の抗ＣＤ５−ＶＣＥで実施された。比較のために、予測される活性部位残基のうちの１つである、グルタミン酸６１３がアラニン（抗ＣＤ５−ＶＣＥＥ６１３Ａ）で置換された、内因性フリン切断配列（抗ＣＤ５−ＶＣＥｗｔ）および突然変異体の抗ＣＤ５−ＶＣＥを担持する抗ＣＤ５−ＶＣＥの細胞毒性も測定された。非線形回帰分析は、上記に記載のように実施された。
【図１２】図１２Ａは、Ｎ−ＧＦＤ−ＶＣＥの概略図である。比較のために、抗ＣＤ５−ＶＣＥの構造も示される。Ｎ−ＧＦＤ−ＶＣＥを、大腸菌由来の可溶型で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡの親和性精製によって精製した。図１２Ｂは、ＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用した、細胞毒性分析の結果を示すグラフである。Ｎ−ＧＦＤ−ＶＣＥｗｔ、およびＮ−ＧＦＤ−ＶＣＥＧｒＢとＧｒＢ−抗ＣＤ１９との組み合わせの双方が、標的細胞に対して毒性がある。
【図１３】図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃは、Ｂ−ＣＬＬ患者由来のＰＢＭＮＣにおける、ＣＤ５＋Ｂ細胞に対するコンビナトリアルターゲティング薬剤の選択的細胞毒性を示すグラフである。図１３Ａは、Ｂ−ＣＬＬ患者由来の精製されたＰＢＭＮＣと抗ＣＤ５および抗ＣＤ１９抗体とのＦＡＣＳ分析を示す。図１３Ｂは、１．０ｎＭ  ＧｒＢ−抗ＣＤ１９のみが、ＰＢＭＮＣ、あるいはＣＤ５＋Ｒａｊｉのいずれかに対して毒性がなかったことを示す。図１３Ｃは、抗ＣＤ５−ＶＣＥが、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９の存在下でのみ、ＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞およびごく一部のＰＢＭＮＣを選択的に殺滅することを示す。
【図１４】ＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞株に対する、ＤＴＧｒＭ−抗ＣＤ１９とＧｒＭ−抗ＣＤ５との組み合わせの細胞毒性分析の結果を示すグラフである。ＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞は、２ｎＭのＧｒＭ−抗ＣＤ５および様々な濃度のＤＴＧｒＭ−抗ＣＤ１９で処理された。ＧｒＭ−抗ＣＤ５の存在により、ＤＴＧｒＭ−抗ＣＤ１９の毒性が増加した。
【図１５】ＤＴ−抗ＣＤ２２およびＧｒＢ−抗ＣＤ５（抗ＣＤ５＝ＣＴ５  ＳｃＦｖまたはＭＨ６  ＳｃＦｖ）融合タンパク質を使用した、ＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞の選択的殺滅を示すグラフである。タンパク質合成阻害を、緩衝液で処理された対照と比較した、３［Ｈ］−ロイシンの取り込みの計量により分析した。
【図１６】黄色ブドウ球菌ソルターゼＡで触媒されたライゲーション反応を介して抗ＣＤ５  ＳｃＦｖ（ＬＰＥＴＧＧＶＥ  配列番号：２１）およびＧＫ−アエロリジンＧｒＢ（ＧＫＧＧＳＮＳＡＡＳ  配列番号：２２）から調製される、抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢの概略図である。
【図１７】図１７Ａおよび図１７Ｂは、ソルターゼＡで触媒されたアエロリジン−ＳｃＦｖコンジュゲーションの４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す写真である。リフォールディングされた抗ＣＤ５  ＳｃＦｖおよび可溶性ＧＫ−アエロリジンＧｒＢを、混合し（１レーン）、固定化したソルターゼＡ（２レーン）または可溶性ソルターゼＡ（図１７Ａの３レーン）で処理し、室温で一晩インキュベートした。コンジュゲートされた混合物を、その後、３時間、室温においてマウスＧｒＢとインキュベートした（図１７Ｂの３レーン）。図１７Ｃは、ソルターゼＡコンジュゲート型抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢの、Ｑ−アニオン交換カラム上での精製プロファイルを示すグラフである。精製された融合タンパク質は、濃縮され、４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、投入材料に対して分析された。
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは、アエロリジンベースの抗毒素を使用した、細胞毒性の結果を示すグラフである。図１８Ａは、ＣＤ５＋ＲａｊｉおよびＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する、抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢの細胞毒性におけるＧｒＢ−抗ＣＤ１９（２ｎＭ）の影響を例示する。図１８Ｂは、細胞毒性に対する抗ＣＤ５  ＳｃＦｖドメインの影響、ならびに、コンビナトリアルターゲティング試薬の細胞毒性に対するＣＤ５表面抗原の必要条件を示す。
【図１９】ＣＤ５＋ＪＶＭ３およびＪｅＫｏ−１細胞を使用した、細胞毒性の結果を示すグラフである。ＣＤ５＋ＪＶＭ３またはＪｅＫｏ−１細胞を、２ｎＭのＧｒＢ−抗ＣＤ１９の存在下、および非存在下で、抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢとインキュベートした。抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢは、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９の存在下で、ＣＤ５＋ＪＶＭ３またはＪｅＫｏ−１細胞株の双方に対して毒性を示す。ＧＫ−アエロリジンＧｒＢは、ＣＤ５＋ＪＶＭ３細胞に対して毒性がない。
【図２０】図２０Ａは、酵素活性を有するＧｒＢ−（ＹＳＡ）２融合タンパク質、エンテロキナーゼの活性化が可能なＧｒＢ−（ＹＳＡ）２融合タンパク質ＤＤＤＤＫ−ＧｒＢ−ＹＳＡ（配列番号：２５）、およびフリンの活性化が可能なＲＳＲＲ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２（配列番号：２６）融合タンパク質の概略図である。プロドメインのアミノ酸配列を示す。図２０Ｂは、精製されたＤＤＤＤＫ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２（配列番号：２５）融合タンパク質はエンテロキナーゼを使用して活性化され得ることを示すグラフである。グランザイムＢ活性前（白丸）および活性後（白角）のエンテロキナーゼ処理を示す。ＧｒＢ活性は、蛍光基質Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＡＭＣを使用して、観察された。図２０Ｃは、フリンの活性化が可能なＲＳＲＲ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２融合タンパク質の生体内のフリン活性を示すグラフである。双方のプロ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２融合タンパク質は、フリンを天然に発現する２９３Ｔ細胞中で発現された。融合タンパク質を採取し、上記に記載のように、そのＧｒＢ活性を測定した。フリンの活性化が可能なＲＳＲＲ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２（配列番号：２６）は、活性であった（白角）一方、ＧｒＢ活性は、エンテロキナーゼの活性化が可能なＤＤＤＤＫ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２（配列番号：２５）に対して観察されなかった（白丸）。
【図２１】図２１Ａは、野生型または突然変異型のフリン切断部位を含む、様々なチオレドキシン−ＤＴ融合タンパク質の概略図である。図２１Ｂは、３７℃で２０分間、フリンとインキュベートすることによる、これらの融合タンパク質の部位特異的な切断を示すＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図２２】図２２Ａは、所望のリン酸化反応（上から下へ、配列番号：４、２９〜３１）を示す概略図である。図２２Ｂは、ＰＫＡおよびγ−３２Ｐ−ＡＴＰを使用したリン酸化反応後に放射性標識された融合タンパク質を示す画像である。図２２Ｃは、３７℃でフリンによって一晩処理した後の反応混合物を示す。リン酸化されたタンパク質ｐＤＴＡ、ｐＤＴＡＴ、およびｐＤＴＳがフリン切断に耐性を示すことは明白である。
【図２３】図２３Ａは、突然変異した、および／または修飾されたフリン切断部位を有するＴｒｘ−ＤＴＡ−抗ＣＤ１９融合タンパク質を示した概略図である。図２３Ｂは、リン酸化されないＴｒｘ−ＤＴＡ−抗ＣＤ１９融合体は、ＩＣ５０の約０．０１〜０．１ｎＭで、試験された細胞のすべてに対して毒性があった一方、リン酸化されたＴｒｘ−ＤＴＡ−抗ＣＤ１９融合体は、類似条件下で、これらの細胞に対して毒性がなかったことを示すグラフである。
【図２４】乳癌細胞上に過剰発現したクローディン３／４またはＥｐｈＡ２の表面抗原を標的とするために生成される融合およびハイブリッドタンパク質の概略図である。ＤＴＧｒＢ−ＣＣＰＥ融合タンパク質の、細胞を標的とする部分は、ウェルシュ菌のエンテロトキシンのＣ末端ドメインであるＣ−ＣＰＥであり、これは哺乳類のクローディン３／４の接着分子に高親和性および特異性で結合する。ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２融合タンパク質の、細胞を標的とする部分は、ＹＳＡペプチドの反復融合であり、ＥｐｈＡ２レセプターを特異的に認識し得る、１２残基のペプチド、ＹＳＡＹＰＤＳＶＰＭＭＳ（配列番号：３４）である。ハイブリッドタンパク質ＧｒＢ−（ＹＳＡ）３は、分岐した化学リンカーを介してＧｒＢに連結した３つのＹＳＡペプチドを含み、それには、１つのＧｒＢ分子および３つのＹＳＡペプチドが、Ｃ末端のカルボキシル基を介して連結される。
【図２５】図２５Ａは、融合タンパク質であるＤＴ−抗ＣＤ２２−抗ＣＤ１９およびＧｒＢ−抗ＣＤ１９−抗ＣＤ１９の設計を示す概略図である。図２５Ｂおよび図２６Ｃは、２つの融合したＳｃＦｖ結合モチーフをそれぞれ含む、融合タンパク質であるＤＴ−抗ＣＤ２２抗ＣＤ１９およびＧｒＢ−抗ＣＤ１９−抗ＣＤ１９を示すＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図２６】図２６Ａは、天然のフリン切断部位の代わりにＴＥＶ切断部位を含有し、ｕ−ＰＡＲ結合のための、細胞を標的とする部分のＮ−ＧＦＤを含有する、ＶＣＥベースのプロトキシンを含む、融合タンパク質であるＮＧＦＤ−ＶＣＥＴＥＶの概略図である。図２６Ｂは、ＬＥＰＴＧタグ付けされた抗ＣＤ５  ＳｃＦｖ部分およびＧＫＧＧタグ付けされたＴＥＶプロテアーゼの、黄色ブドウ球菌ソルターゼＡ触媒されたライゲーションを使用する、抗ＣＤ５−ＴＥＶハイブリッドタンパク質の調製法の概略図である。
【図２７】図２７Ａは、ＴＥＶプロテアーゼを含有する反応混合物における、ＮＧＦＤ−ＶＣＥＴＥＶ融合タンパク質およびその切断のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。予想通りに、プロトキシンＮＧＦＤ−ＶＣＥＴＥＶは、ＴＥＶプロテアーゼにより特異的に切断される。図２７Ｂは、様々な濃度のＮＧＦＤ−ＶＣＥＴＥＶ融合体（ＶＣＥ）、抗ＣＤ５−ＴＥＶハイブリッド（ＴＥＶ）、またはその混合物で処理されたＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ５＋／ｕＰＡＲ＋）を使用した、細胞毒性の分析結果を示すグラフである。データは、１５ｎＭのＮＧＦＤ−ＶＣＥＴＥＶと１．５ｎＭの抗ＣＤ５−ＴＥＶとの組み合わせが、同一濃度で、ＮＧＦＤ−ＶＣＥＴＥＶあるいは抗ＣＤ５−ＴＥＶのみのいずれかよりも、ＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞に対して、著しく高い毒性があることを例示する。
【図２８】構築されたＶＣＥ分子のグランザイムＢに対する感受性を示すＳＤＳゲルである。ＶＣＥＩＥＰＤ：天然のフリン切断部位ＲＫＰＲは、ＩＥＰＤで置換される。ＶＣＥＩＡＰＤ：天然のフリン切断部位は、ＩＡＰＤで置換される。Ｗ：野生型ＧｒＢ、Ｔ：ＧｒＢの突然変異Ｎ２１８Ｔ。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
発明の詳細な説明
本発明は、コンビナトリアルターゲティング法を使用して、標的となる細胞の選択的殺滅を介して様々な疾病を治療するための方法および組成物を提供する。一局面において、本発明は、細胞を標的とする部分を含むプロトキシン融合タンパク質と、標的細胞内、標的細胞上、またはその近傍において、天然に作用可能には見出されない活性化部分により活性化される修飾可能な部分とを特徴とする。これらの方法はまた、特定の細胞集団を標的にし、破壊するために、プロトキシンおよびプロトキシン活性化因子を少なくとも含む、２つ以上の治療薬の併用使用を含む。それぞれの薬剤は、標的細胞の独立した細胞表面標的に結合する少なくとも１つの、細胞を標的とする部分を含む。プロトキシンは、プロトキシン活性化因子によって作用され得る修飾可能な活性化部分を含む。プロトキシン活性化因子は、修飾可能な活性化部分に作用して、プロトキシンを活性毒素または天然で活性化可能な毒素に変換する、または変換させる、酵素活性を含む。該標的細胞は、その後、活性化毒素により抑制、または破壊される。
【０１１０】
本発明はまた、修飾されるプロトキシンおよびプロトキシン活性化因子の使用を介して、抑制または破壊されることが望ましい細胞の認識をさらに制限する、または選択的に行うための、複数の独立した標的とする事象の使用を提供する。本発明のプロトキシン活性化因子は、活性化ドメインを含み得る。プロアクチベーターによる活性化ドメインの活性化の前は、これらのプロトキシン活性化因子は不活性である（すなわち、プロトキシンを活性化できない）。このようなプロトキシンプロアクチベーターの例は、プロアクチベーターを活性化するための、酵素前駆体の切断が、第２のプロテアーゼを必要とするように、酵素前駆体の形態で存在するプロトキシンの修飾可能な活性化部分に対して特異的なプロテアーゼを含む。本発明によって提供される部分の例は、活性部位を遮断するエンテロキナーゼ感受性ペプチドを担持する標的グランザイムＢ、および活性部位を遮断するフリン感受性ペプチドを担持する標的グランザイムＢを含む。プロトキシンプロアクチベーターの適した例は、標的細胞に独立して標的とされ得、活性部位を遮断するエンテロキナーゼ感受性ペプチドを担持する標的グランザイムＢに作用する、エンテロキナーゼ融合タンパク質である。
【０１１１】
本発明はまた、プロトキシンまたはプロアクチベーターを活性化させる、または天然で活性化可能な型に変換させる修飾可能な活性化部分による、該プロトキシンまたはプロアクチベーターの活性化を提供する。修飾可能な活性化部分は、プロトキシンまたはプロアクチベーターの活性化を制限する、または選択的に行うための、ポリペプチド切断配列、ポリペプチド切断配列の構築、または開裂可能なリンカーであり得る。それぞれの修飾可能な活性化部分は、活性化させる、または天然で活性化可能な型に変換させるような、修飾可能な活性化部分を担持するプロトキシンまたはプロアクチベーターをもたらすことができるように、このような修飾可能な活性化部分を修飾できる対応する活性化因子を有さなければならない。
【０１１２】
Ｉ．疾病兆候および標的細胞表面マーカー
本発明のプロトキシン／毒素活性化因子の組み合わせは、密接に関連する細胞を回避しつつ、特定の細胞サブセットを標的とし、殺滅する。本発明の有用性は、望ましい治療効果を達成するための細胞のサブセットの選択的な排除にある。特に、本発明の組み合わせは、密接に関連する正常な細胞を回避しつつ、癌細胞を標的とすることが可能であり、これにより癌に対するさらに特定的で効果的な治療を提供する。細胞を標的とする部分は、標的とされる癌細胞上、または好ましくは治療上の利点を達成するために除去される、標的とされる非癌細胞上の細胞表面標的を標的とすることが可能である。
【０１１３】
Ａ．細胞表面標的
１つまたは両方の、細胞を標的とする部分は、例えば、細胞のサブセット上で見られ、かつ人体の様々な臓器、または該臓器内の特定の細胞種、または造血、神経、もしくは血管系細胞のマーカー等の、天然起源を表す系統特異的マーカーを認識することにより、特定の種類の細胞に特有である細胞表面標的を標的とすることが可能である。代替として、１つまたは両方の、細胞を標的とする部分は、癌細胞、または自己免疫の活性を誘発もしくは生じさせる細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、好中球、白血球、マクロファージ、血小板、マクロファージ、骨髄性細胞、および顆粒球）等の、病変組織上に異常に発現した細胞表面マーカーを標的とすることが可能である。１つまたは両方の薬剤は、癌細胞により異常に過剰発現された細胞表面マーカーを標的とすることが可能である。この複数の薬剤標的の方策は、正常な細胞、または望ましい細胞への深刻な損傷を伴わず、新生物、または望ましくない細胞を選択的に標的とするために使用され、これにより、白血病ならびにリンパ腫、例えば、Ｂ細胞性慢性白血病、マントル細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫を含む癌、ならびに黒色腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、腎癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、甲状腺癌、脳腫瘍、骨癌、睾丸癌、子宮癌、軟部組織腫瘍、神経系腫瘍および頭頚部癌を含む癌のための治療を提供する。
【０１１４】
プロトキシンおよびプロトキシン活性化タンパク質の組み合わせは、自己反応性のＢ細胞もしくはＴ細胞を含む非癌性細胞を標的にするために使用することも可能であり、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、強皮症、原発性胆汁性肝硬変、グレーブス病、橋本甲状腺炎、１型糖尿病、悪性貧血、重症筋無力症、ライター症候群、免疫性血小板減少症、炎症性腸疾患、ならびにぜんそくおよびアトピー性疾患を含む、慢性炎症性疾患のための治療を提供する。
【０１１５】
さらに、該組み合わせの治療組成物は、例えば、末梢神経系における侵害受容ニューロン等の病的または望ましくない活動に関与する神経系における細胞を除去するために、または知覚的な幻影感覚の治療のために、または糖尿病性神経障害、もしくはウイルスの再活性化による疼痛等の神経因性疼痛を制御するために使用することが可能である。
【０１１６】
また、該組み合わせは、根絶することが難しいウイルス、微生物、または寄生性病原体に感染した細胞を標的とすることが可能であり、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶまたは乳頭腫ウイルス感染症、結核症、マラリア、デング熱、シャーガス病、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、あるいはライム病ウイルス等の後天的な症候群のための治療を提供する。
【０１１７】
さらに、該組み合わせは、人体の主要組織の実質細胞、ならびに含脂肪細胞、内皮細胞、神経系の細胞、肺細胞、特定の系統のＢ細胞もしくはＴ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、好中球、白血球、マクロファージ、血小板、マクロファージ、骨髄性細胞、顆粒球、含脂肪細胞、および任意の他の特定の組織細胞を含むが、これらに限定されない、特定の細胞種を標的とすることが可能である。
【０１１８】
該組み合わせは、良性の前立腺肥大における前立腺細胞等の良性増殖を通じて、または正常な組織の過剰増殖を誘導する様々な症候群において、あるいは、例えば、肥満における含脂肪細胞等の望ましくない細胞区画の拡大において疾病を引き起こす細胞を、さらに標的にすることが可能である。
【０１１９】
腫瘍組織に対する本発明のプロトキシン、またはプロトキシン活性化因子を標的とするために使用され得る細胞表面標的が多くあることが、当業者には理解されるであろう。例えば、乳癌細胞は、クラウディン−３（Ｓｏｉｎｉ，  Ｈｕｍ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３５：１５３１（２００４））、クラウディン−４（Ｓｏｉｎｉ，  Ｈｕｍ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３５：１５３１（２００４））、ＭＵＣ１（Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕら、Ｊ．  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ．  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ７：２０９（２００２））、ＥｐＣＡＭ（Ｗｅｎｔら、Ｈｕｍ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３５：１２２（２００４））、ＣＤ２４（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｈｉｓｔｏｌ．  ３５：２５５（２００４））、およびＥｐｈＡ２（ＩｒｅｔｏｎおよびＣｈｅｎ，  Ｃｕｒｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ５：１４９（２００５）、Ｚｅｌｉｎｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１：２３０１（２００１））、ならびにＨＥＲ２（Ｓｔｅｒｎ，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２８４：８９（２００３））、ＥＧＦＲ（Ｓｔｅｒｎ，  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２８４：８９（２００３））、ＣＥＡ、およびｕＰＡＲ（Ｈａｎら、Ｏｎｃｏｌ．  Ｒｅｐ．  １４：１０５（２００５））等の過剰発現表面の抗原を使用して標的とされ得る。結腸直腸癌は、Ａ３３（Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４６：Ｓ２７（２０００））、ＥｐＣＡＭ（Ｗｅｎｔら、Ｈｕｍ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３５：１２２（２００４））、ＥｐｈＡ２（ＩｒｅｔｏｎおよびＣｈｅｎ，  Ｃｕｒｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ５：１４９（２００５）、  Ｋａｔａｏｋａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  ９５：１３６（２００４））、ＣＥＡ（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  ９：６７（１９９９））、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ（Ｗｏｎｇ，Ｃｌｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  ２７：６８４（２００５））、およびＥｐｈＢ２（Ｊｕｂｂら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１：５１８１（２００５））等の上方制御表面の抗原を使用して標的とされ得る。非小細胞肺癌は、ＥｐｈＡ２  （Ｋｉｎｃｈら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９：６１３（２００３））、ＣＤ２４（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８８：２３１（２００３））、ＥｐＣＡＭ（Ｗｅｎｔら、Ｈｕｍ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３５：１２２（２００４））、ＨＥＲ２（Ｈｉｒｓｃｈら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８６：１４４９（２００２））、およびＥＧＦＲ（Ｄａｃｉｃら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １２５：８６０  （２００６））等を使用して標的とされ得る。メソテリンは、ＮＳＣＬＣ（Ｈｏら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３（５）：１５７１（２００７））の治療のためのＰＥＡに基づく抗毒素により標的とされている。卵巣癌は、上方制御されたクラウディン−３（Ｍｏｒｉｎ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５：９６０３（２００５））、クラウディン−４（上記に同じ）、ＥｐＣＡＭ（Ｗｅｎｔら、Ｈｕｍ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３５：１２２（２００４））、ＣＤ２４（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓ���ｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｈｉｓｔｏｌ．  ３５：２５５（２００４））、ＭＵＣ１（Ｆｅｎｇら、Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ３２：５２５（２００２））、ＥｐｈＡ２（Ｉｒｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，  Ｃｕｒｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ５：１４９（２００５））、Ｂ７−Ｈ４  （Ｓｉｍｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６６：１５７０（２００６））、およびメソテリン（Ｈａｓｓａｎら、Ａｐｐｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ．  Ｍｏｒｐｈｏｌ．  １３：２４３（２００５））、ならびにＣＸＣＲ４（Ｊｉａｎｇら、Ｇｙｎｅｃｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２０：２０（２００６））、およびＭＵＣ１６／ＣＡ１２５を使用して標的とされ得る。膵臓癌は、過剰発現したメソテリン（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  ２９：２９７（２００５））、ＰＳＣＡ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  ２９：２９７（２００５））、ＣＤ２４（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｈｉｓｔｏｌ．  ３５：２５５（２００４））、ＨＥＲ２（Ｇａｒｃｅａら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４１：２２１３（２００５））、およびＥＧＦＲ（Ｇａｒｃｅａら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４１：２２１３（２００５））を使用して標的とされ得る。前立腺癌は、ＰＳＭＡ（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  ３０：６２８（２００６））、ＰＳＣＡ（Ｈａｒｉら、Ｊ．  Ｕｒｏｌ．  １７１：１１１７（２００４））、ＳＴＥＡＰ（Ｈｕｂｅｒｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：１４５２３（１９９９））、およびＥｐｈＡ２（ＩｒｅｔｏｎおよびＣｈｅｎ，  Ｃｕｒｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ５：１４９（２００５））を使用して標的とされ得る。ＥｐＣＡＭは、前立腺癌においても上方制御され、その抗体に基づく治療（Ｏｂｅｒｎｅｄｅｒら、Ｅｕ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４２：２５３０（２００６））のために標的とされている。活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ、ＣＤ１６６としてしても既知）の発現は、前立腺癌（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら、Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ２０５：３５９（２００５））、結腸直腸癌（Ｗｅｉｃｈｅｒｔら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ５７：１１６０（２００４））、および黒色腫（ｖａｎ  Ｋｅｍｐｅｎら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １５６（３）：７６９（２０００））のための予後マーカーおよび診断的マーカーである。化学療法で治療され、多剤耐性（ＭＤＲ）を発現したすべての癌は、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）、多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ１）、肺耐性タンパク質（ＬＲＰ）、および乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）（Ｔａｎら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １２：４５０（２０００））を含む、関与する膜貫通輸送タンパク質を使用して標的とされ得る。任意の上記マーカーは、本発明の融合タンパク質により標的とされ得る。
【０１２０】
対応する腫瘍細胞の大部分から区別して、様々な癌由来の癌幹細胞の固有の細胞表面マーカーの同定は、過去１０年間に飛躍的な進歩を遂げた。例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）においてＣＤ３４＋／ＣＤ３８−ＡＭＬ細胞のわずかな部分を構成するＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−ＡＭＬ細胞は、動物のモデル（Ｙｉｎら、Ｂｌｏｏｄ  １２：５００２（１９９７））において、ヒトのＡＭＬの誘導に関与することが観察されている。さらに、ＣＤ１３３は、いくつかの固形癌についての癌幹細胞表面マーカーとしても近年確認され、それらの腫瘍には、脳腫瘍（Ｓｉｎｇｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：３９５（２００４）  ａｎｄ  Ｂａｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：７５６（２００６））、結腸癌（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４５：１０６（２００７）、およびＲｉｃｃｉ−Ｖｉｔｉａｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４５：１１１（２００７））、前立腺癌（Ｒｉｚｚｏら、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．  ３８：３６３（２００５））、および肝細胞癌（Ｓｕｅｔｓｕｇｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３５１：８２０（２００６）およびＹｉｎら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １２０：１４４４（２００７））が含まれる。結腸癌の例において、ＣＤ１３３＋発癌性細胞は、ＥＳＡおよびＣＤ３２６としても既知である、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を認識する、抗体Ｂｅｒ−ＥＰ４（Ｒｉｃｃｉ−Ｖｉｔｉａｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４５：１１１（２００７））と結合することが見いだされた。さらに近年、ＣＤ４４＋は、ＣＤ１３３よりもより正確に結腸直腸癌のＣＳＣ個体数を定義し得るということが報告され、結腸直腸癌に対するＣＳＣは、ＥｐＣＡＭｈｉｇｈ／ＣＤ４４＋／ＣＤ１６６＋として同定されている（Ｄａｌｅｒｂａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０４（２４）：１０１５８（２００７））。該情報に基づき、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ１３３、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ４４、ＥｐＣＡＭ／ＣＤ１６６、およびＣＤ４４／ＣＤ１６６は、結腸癌ＣＳＣのコンビナトリアルターゲティングに対する可能な組み合わせである。ＣＤ１３３に加え、前立腺癌幹細胞は、ＣＤ４４＋として個別に同定され（Ｇｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６７：４８０７（２００７）、したがって、これらは表面マーカーのＣＤ４４／ＣＤ１３３対を使用することにより標的化可能である。さらに、ＣＸＣＲ４は、ＣＤ４４＋／ＣＤ１３３＋推定前立腺ＣＳＣにおいて検出されており、ＣＤ４４またはＣＤ１３３のいずれかとのＣＸＣＲ４の組み合わせは、コンビナトリアルターゲティング方策のための標的の有用な対を提供し得ることを示唆する。現在既知の表面抗原がＣＤ１３３のみである他のＣＳＣにおいて、さらなる表面抗原を、包括的な抗体スクリーニングを通じて同定し、その後、コンビナトリアルターゲティングスキームにおいてＣＤ１３３を補足するために使用することが可能である。同様に、乳癌の発癌性細胞は、乳癌細胞のＣＤ４４＋／ＣＤ２４下位個体群として同定されている。さらなる分析は、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ＥｐＣＡＭ＋の小部分は、さらにより高い腫瘍原性を有することを明らかにした（Ａｌ−Ｈａｊｊら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａ���ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００：３９８３  （２００３））。標的とされる表面マーカーとしてＣＤ４４＋およびＥｐＣＡＭ＋を使用するコンビナトリアルターゲティング法は、正常なＣＤ４４＋白血球／赤血球、および正常なＥｐＣＡＭ＋上皮細胞を傷つけることなく、これらのＣＳＣを特に殺滅することが可能である。別の最近の研究は、膵臓ＣＳＣは、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４＋／ＥｐＣＡＭ＋であることを示している（Ｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６７：１０３０（２００７））。したがって、膵臓ＣＳＣは、ＣＤ４４／ＣＤ２４、ＣＤ４４／ＥｐＣＡＭ、またはＣＤ２４／ＥｐＣＡＭの組み合わせを使用して標的とされることが可能である。
【０１２１】
Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、ＣＤ５＋Ｂ細胞をゆっくりと堆積することにより特徴付けられる（Ｇｕｉｐａｕｄら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．  ４：５０５（２００３））。ＣＤ５は、正常なＴ細胞、およびＢ１細胞として既知である、Ｂ細胞のわずかな部分上において認められる細胞表面タンパク質である。ＣＤ５を標的とする抗毒素は、Ｔ細胞殺滅において高い効果を示している（Ｂｅｔｔｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：１４９５１（１９９５））。本発明に記載のコンビナトリアルターゲティング法は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、またはＣＤ２２等のＢ細胞マーカーとの組み合わせにおけるＣＤ５の使用を可能にし、これによりＢ−ＣＬＬ細胞、またはＢ１サブセットにおける他のＢ細胞をＴ細胞から区別する。Ｂ１サブセットは、自己免疫疾患の状況でしばしば確認されている低親和性多反応性抗体を引き起こすと考えられており、したがって、Ｂ細胞の残りを著しく損なうことなくこの個体数を除去することは、すべてのＢ細胞の除去が引き起こすのと同程度に、個体に対する免疫反応を含むことなく、自己免疫疾患の経過に有利に影響を与え得る。
【０１２２】
本発明のプロトキシン活性因子（例えば、プロテアーゼ）融合および毒素融合タンパク質のための有用な標的であり得る表面抗原の組み合わせの例を、表１に記載する。
【０１２３】
（表１）
標的とされる癌：乳癌
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標的とされる癌：結腸直腸癌（ＣＲＣ）
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標的とされる癌：非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）
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標的とされる癌：卵巣癌
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標的とされる癌：膵臓癌
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標的とされる癌：前立腺癌（Ｐｃａ）
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標的とする発癌性幹細胞
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【０１２４】
Ｂ.細胞を標的とする部分
本発明は、それぞれが細胞を標的とする部分を含有する、プロトキシン融合タンパク質およびプロトキシン活性化因子融合タンパク質を特徴とする。本発明の該細胞を標的とする部分は、抗体、抗体模倣剤、標的細胞表面上に発現したある受容体に対して特定のリガンド、糖質、および細胞表面分子を特異的に結合するペプチドに由来するタンパク質を含む。
【０１２５】
細胞を標的とする部分の一態様は、細胞表面上で特異的に標的を認識することが可能であるタンパク質である。タンパク質による標的認識の最も一般的な形態は、抗体である。一態様は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ等の、すべてのアイソタイプにおいて無傷の抗体を用いる。代替として、細胞を標的とする部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、もしくはｓｃＦｖフラグメント等の、フラグメントまたは全長抗体の再構築型であり得る（Ｈｕｓｔｏｎら、１９９１．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２０３：４６−８８、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ８５：５８７９−８３）。一態様においては、結合抗体は、ヒト、ネズミ、ヤギ、ラット、ウサギ、またはラクダの抗体由来である。他の態様では、結合抗体は、ＣＤＲ領域をヒトの抗体フレームワークに移植した、動物の抗体のヒト化型である（ＱｕｅｅｎおよびＨａｒｏｌｄ．  １９９６．  米国特許第５５３０１０１号）。ヒトエピトープに対するヒト抗体を、ヒト抗体を担持する遺伝子導入マウス、ならびにヒト抗体に基づくファージディスプレイライブラリから分離することが可能である（ＫｅｌｌｅｒｍａｎｎおよびＧｒｅｅｎ．  ２００２．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １３：５９３−７、Ｍｅｎｄｅｚら、１９９７．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  １５：１４６−５６、Ｋｎａｐｐｉｋら、２０００．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２９６：５７−８６）。結合部分は、再構築されたＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、ＣＴＬＡ−４、単量体ＶｈまたはＶｌドメイン（ナノボディ）、およびラクダ化抗体等の、抗体と構造的に関連する、免疫系由来の分子でもよい（ＢｅｒｒｙおよびＤａｖｉｅｓ．  １９９２．  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  ５９７：２３９−４５、Ｍａｒｔｉｎら、１９９７．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １０：６０７−１４、  Ｔａｎｈａら、２００１．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７６：２４７７４−８０、  Ｎｕｔｔａｌｌら、１９９９．  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  ３６：２１７−２７）。さらなる態様は、同じ細胞上の２つの相異なるエピトープに対する特異性を有する、２つの単鎖可変フラグメントの遺伝子融合体である、ダイアボディを含有してもよい。一例として、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖを有するダイアボディを、Ｂ細胞標的に対する親和性を増すために、プロトキシン、またはプロトキシン活性化因子に対して融合することが可能である（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ．  ２００３．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０７：３２３−３３）。
【０１２６】
他の態様では、細胞を標的とする部分は、抗体模倣剤としての役割を果たす多様化されたタンパク質であり得る。多様化されたタンパク質は、異種標的と結合することが可能である配列により置換される、天然配列のタンパク質を有する。多様化されたタンパク質は、安定性、生産量、および大きさにおいて、抗体よりも優れている場合がある。１つの例は、様々な標的に対する親和性試薬を分離するために従来使用されている、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインである。（ＬｉｐｏｖｓｅｋおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ．２００４．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２９０：５１−６７、  Ｌｉｐｏｖｓｅｋら、２００７．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ３６８：１０２４−４１、  Ｌｉｐｏｖｓｅｋ、Ｗａｇｎｅｒ、およびＫｕｉｍｅｌｉｓ．  ２００４．  米国特許出願公開第２００５００３８２２９号）。リポカインは、分子の多様化および選択に使用されている（Ｓｋｅｒｒａら、２００５．  米国特許出願公開第２００６００５８５１０号）。リポカインは、血清中のステロイド、および代謝産物と結合するタンパク質の部類である。ＣＴＬＡ４およびＶＥＧＦに対する機能的なバインダーは、ファージディスプレイ技術を使用して分離されている（ＶｏｇｔおよびＳｋｅｒｒａ、２００４．  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．  ５：１９１−９）。Ｃ型レクチンドメイン、Ａ−ドメイン、およびアンキリン反復は、骨格の結合表面を増すようにオリゴマー化された構造を提供する（Ｍｏｓａｖｉら、２００４．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  １３：１４３５−４８）。他の多様化タンパク質は、ヒト血清アルブミン、緑色蛍光タンパク質、ＰＤＺドメイン、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、カリブドトキシン、植物ホメオドメイン、およびβ−ラクタマーゼを含むがこれらに限定されない。タンパク質骨格の包括的な再考は（Ｈｏｓｓｅら、２００６．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  １５：１４−２７，  Ｌｉｐｏｖｓｅｋ．  ２００５．）に記載される。多くの様々なタンパク質、またはタンパク質ドメインは、多様化される可能性があり、親和性試薬として開発および使用されてもよく、これらがコンビナトリアルターゲティング治療に関連して、細胞結合部分としての役割を果たし得るということが当業者には理解される。
【０１２７】
他の態様では、細胞を標的とする部分は、細胞表面上に発現したエピトープのための、天然のリガンド、接着分子、または受容体であり得る。リガンドの組成物は、ペプチド、レクチン、ホルモン、脂肪酸、核酸、またはステロイドであってもよい。例えば、ヒトの成長ホルモンは、ヒトの成長ホルモン受容体を発現する細胞のための、細胞を標的とする部分として使用される可能性がある。また、可溶化受容体リガンドも、天然リガンドが内在性膜タンパクである場合に使用され得る。該可溶化内在性膜タンパクは、当業者に既知であり、可溶性の活性リガンドを得るために、膜貫通の、または膜アンカードメインを除去することによる、膜タンパクの機能的フラグメントの形成によって、容易に調製される。例えば、可溶性のＣＤ７２は、操作されたプロトキシンをＣＤ５含有細胞へ局在化させるためのリガンドとして使用され得る。別の例は、ウロキナーゼ種のプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の受容体ｕＰＡＲへの結合である。ｕＰＡＲに対する高親和性結合（Ｋｄ≒０．５ｎＭ）に関与するｕ−ＰＡの領域は、Ｎ末端成長因子様ドメイン（Ｎ−ＧＦＤ）と呼ばれる最初の４６アミノ酸内で、完全に局在化される（Ａｐｐｅｌｌａら、１９８７．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２６２：４４３７−４０）。アベマーは、特定の標的に対する親和力および特異性を増すために入れ替えられた、複数の受容体バインダードメインを意味する（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：１５５６−６１）。これらの受容体結合ドメインおよびリガンドは、遺伝子的に融合され、プロトキシンまたはプロトキシン活性化因子を有する隣接ポリペプチドとして生成されるか、または別々に分離され、その後化学的にもしくは酵素的に連結され得る。またこれらは、プロトキシンまたはプロトキシン活性化因子と非共有結合的に結合されてもよい。
【０１２８】
前述の例において、デニロイキンディフィトックスは、ＤＴおよびヒトインターロイキン（ＩＬ）−２の融合タンパク質である（ＦｅｎｔｏｎおよびＰｅｒｒｙ．  ２００５  Ｄｒｕｇｓ  ６５：２４０５）。デニロイキンディフィトックスは、目的とする標的ＣＴＣＬ細胞を含む、ＩＬ−２受容体（ＩＬ２Ｒ）を発現するあらゆる細胞を標的とする。急性敏感性型反応、血液漏出症候群、および視力の損失が副作用として報告されている。間葉起源および神経外胚葉起源のヒトの正常な非造血細胞は、機能的ＩＬ２Ｒを発現する場合があるため、観察されたいくつかの細胞傷害性の効果は、ＩＬ−２と非造血組織との間の直接の相互作用のためである可能性がある。この毒性を克服するために、本発明は、例えば、ＣＤ３等のような第２の標的要素としてＴ細胞マーカーの付加を特徴とする。
【０１２９】
部分がマンノース、マンノース６−リン酸、乳糖、Ｎ−アセチルグルコサミン、またはシアリルルイスＸ等の糖質である場合、部分は、それぞれマンノース受容体、マンノース６−リン酸受容体、アシアログリコプロテイン受容体、Ｎ−アセチルグルコサミン受容体、またはＥ−セレクチンを標的とすることが可能である。部分がチロシン硫酸化ペプチドまたは硫酸化糖質と機能的に連結したシアリルルイスＸを含む場合、部分は、それぞれＰ−セレクチン、またはＬ−セレクチンを標的とすることが可能である。
【０１３０】
別の例として、結合パートナーは、病原体宿主の相互作用におけるような、異なる生物体間の既知の相互作用によるものであり得る。ウェルシュ菌のエンテロトキシンのＣ末端ドメイン（Ｃ−ＣＰＥ）は、哺乳類のクローディン３／４の接着分子に対して高親和性で特異的に結合する。クローディンは大部分の細胞密着結合の成分であるが、先端面上に一般的に曝露されない。Ｃ−ＣＰＥは、多くの種類の癌の状態である、関与していないクローディン３／４を過剰発現している細胞に対するコンビナトリアルターゲティングの成分の１つを局在化させるために、プロトキシン、または活性化因子に付加されることが可能である（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００５．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  １０８：５６−６２、Ｅｂｉｈａｒａら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．  ３１６：２５５−６０）。
【０１３１】
ペプチド部分の一例は、複合体を、アンギオテンシン受容体を発現している細胞に局在化させるためのアンギオテオシンの使用である。他の態様では、結合ペプチドは、ランダム配列ライブラリから選択された非天然ペプチドであり得る。１つのグループは、ＹＳＡと称されるファージディスプレイを使用するペプチドを同定し、とりわけＥｐｈＡ２受容体を認識することが可能である。ＥｐｈＡ２は、多くの乳癌において過剰発現される（Ｋｏｏｌｐｅら、２００５．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８０：１７３０１−１１、Ｋｏｏｌｐｅら、２００２．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７７：４６９７４−９）。結合親和性を増すために、ペプチドは、続いて起こる繰り返しの融合、またはデンドリマーへの連結を通じて多量体化されてもよく、その後、デンドリマーはプロトキシン、またはプロトキシン活性化因子へ付加され得る。
【０１３２】
他の態様では、細胞を標的とする部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの他の類似体から成る核酸であり得る。核酸アプタマーは、多くのタンパク質標的に対して同定されており、インビトロ進化の過程を通じて、非常に高い親和性で結合する（Ｇｏｌｄ．  １９９１．  米国特許第５４７５０９６号、ＷｉｌｓｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９９．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６８：６１１−４７）。ＰＳＭＡに対して特異的なＲＮＡアプタマーは、ＰＳＭＡを過剰発現している細胞に対し、コンジュゲート型ゲロニン毒素を特に局在化させることが示された（Ｃｈｕら、２００６．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６６：５９８９−９２）。核酸は、化学的に合成または、生化学的に転写され得、その後、再構築された毒素に対するコンジュゲーションのための連結基を含むように修飾される。核酸は、一般的な架橋試薬を使用し、直接コンジュゲートされるか、または当技術分野に既知の過程により酵素的に結合されてもよい。また、核酸は、プロトキシンと非共有結合的に結合することが可能である。
【０１３３】
細胞を標的とする部分は、当技術分野に記載の多くの技術を使用して同定され得る。一般に、天然のホルモン、およびペプチドリガンドは、報告される文献に報告される相互作用を通じて同定され得る。さらに、抗体模倣剤および核酸アプタマーを、癌細胞、または他の病変状態に発現されたもののような、対象のエピトープに対して希少な結合分子を分離することが可能である技術を使用して同定することができる。これらの技術は、ＳＥＬＥＸ、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、インビボ相補性、酵母ツーハイブリッド法、およびリボソームディスプレイを含む（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ．  １９９７．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９４：１２２９７−３０２、ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ．  １９９７．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５：５５３−７、ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ．  １９９０．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３４６：８１８−２２、ＴｕｅｒｋおよびＭａｃＤｏｕｇａｌ−Ｗａｕｇｈ．  １９９３．  Ｇｅｎｅ．  １３７：３３−９、Ｇｙｕｒｉｓら、１９９３．  Ｃｅｌｌ．  ７５：７９１−８０３、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ．  １９８９．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３４０：２４５−６、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓら、１９９４．  ＰｒｏｃＮａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９１：９０２２−６）。抗体は、免疫化された動物および結果として得られた抗体を分離すること、または形質細胞からモノクローナル抗体を作ることを通じ、前述に記載の技術、または、従来の方法を使用して生成することが可能である。
【０１３４】
細胞を標的とする部分の標的は、タンパク質受容体、糖質、または細胞表面上または周辺の脂質であってもよい。細胞表面標的の要素を有利に含み得る、当技術分野に既知のポリペプチド修飾の例は、グリコシル化、硫酸化、リン酸化、ＡＤＰリボシル化、およびユビキチン化を含む。細胞の特定の系統について独特であり得る糖質の修飾の例は、硫酸化、アセチル化、脱水素化、および脱水化を含む。脂質修飾の例は、グリカン置換および硫酸化を含む。特定の標的細胞について独特であり得る脂質の例は、スフィンゴ脂質および、ガングリオシド、グロボシド、セラミド、ならびにスルファチド等のその誘導体、または、グリコシルホスファジルイノシトール連結タンパク質アンカー等の脂質アンカー部分を含む。
【０１３５】
細胞を標的とする部分は、細胞を標的とする部分が、細胞表面に対し、再構築された毒素を局在化させる役割を果たす限り、細胞表面エピトープと直接結合する他の結合媒体を通じて標的細胞と非直接的に結合し得る。これらの結合モジュールの標的は、存在タンパク質、受容体、糖質、脂質、コレステロール、および標的細胞表面に対する他の修飾であり得る。細胞を標的とする部分は、両種をコードするＤＮＡが結びつけられる場合は、直接の翻訳融合を通じ、プロトキシンへ結びつくことが可能である。また、代替として、化学的なカップリング法および酵素架橋結合により、２つの成分を結びつけることが可能である。細胞を標的とする部分は、薬剤の構造または結合に関与しない配列を含有し得るが、プロトキシンとの連結または相互作用等の他の過程と関連する。
【０１３６】
標的細胞の表面に対して修飾毒素を局在化させる役割を果たす、細胞を標的とする部分が、本明細書に開示される。一態様においては、細胞を標的とする部分は、Ｂ−ＣＬＬを有する患者の細胞上のエピトープを特に認識する１つ以上の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。他の態様では、細胞を標的とする部分は、ＣＤ５を特に認識する１つ以上の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。さらにまた別の態様においては、細胞を標的とする部分は、Ｂ細胞マーカーであるＣＤ１９およびＣＤ２２を特異的に認識する、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一態様においては、ｓｃＦｖフラグメントは、ソルターゼＡにより誘導された酵素的架橋のために使用される、１つ以上の特定のタグ配列（ＬＰＥＴＧ（配列番号：３８））を含む。タグ配列は、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。他の態様では、ＬＰＥＴＧ（配列番号：３８）タグ配列は、Ｃ末端、またはその近傍に位置付けられる。ｓｃＦｖの発現および機能的再現は当技術分野で既知である。ＳｃＦｖは、機能的なｓｃＦｖを得るための報告された手順を使用し、大腸菌ペリプラズムでの発現、およびインビトロでリフォールドされることを通じて生成された。
【０１３７】
ここで、既知の天然受容体リガンドを、細胞を標的とする部分として使用する例を記載する。具体的には、ｕ−ＰＡのＮ末端ドメインを、ｕ−ＰＡＲを特に標的とするためにプロトキシンと直接融合させた。また、ウェルシュ菌のエンテロトキシン（Ｃ−ＣＰＥ）のＣ末端ドメインと、毒素との間の融合に基づいた毒素は、本明細書において説明され、それは、クローディン３／４を標的とすることが可能である。
【０１３８】
ＩＩ．プロトキシン
本発明のプロトキシンは、１つ以上の事前に選択した細胞表面標的を、独立して標的とするように設計される。活性化するためには、本発明のプロトキシンは、対応するプロトキシン活性化因子により修飾されなければならない。一態様においては、本発明は、１つの毒素の細胞傷害性ドメイン、ならびに同一あるいは別の毒素の転位ドメイン、および外因性プロテアーゼにより特異的に認識されるタンパク質分解切断の配列を含有する介在ペプチドを含有する、プロトキシンを特徴とする。代替として、またはさらに、毒素活性を、化学的部分またはペプチド部分により阻止してもよい。これらの場合において、毒素は、本化学的部分またはペプチド部分が、外因性酵素（すなわち、プロトキシン活性化因子）、または標的細胞上、あるいはその周囲に自然に存在する活性化因子のいずれかにより修飾される場合のみ、活性化する。毒素またはプロトキシン融合体は、当技術分野に既知のあらゆる毒素に由来することが可能であり、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素Ａ、志賀毒素ならびに志賀様毒素、炭疽毒素、孔形成毒素もしくはプロアエロリシン、溶血素、肺炎球菌溶血素、Ｃｒｙ１毒素、ビブリオ属のプロ細胞溶解素、もしくはリステリオリシン等のプロトキシン、コレラ毒素、クロストリジウムセプチカムα毒素，破傷風毒素ならびにボツリヌス毒素を含むクロストリジウム属神経毒、ゲロニン；ピエリシン−１等の核酸変性剤、およびリシン、アブリン、ならびにモデシン等のリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰｓ）を含むが、これらに限定されない。
【０１３９】
Ａ．タンパク質分解毒素
多くのプロテアーゼは、インビボの標的とされる細胞の死に重要な役割を果たすため、これらは本発明の毒素部分として使用され得る。例えば、グランザイムは、細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞内の細胞傷害性顆粒により放出され、ウイルス感染した細胞内でアポトーシスをもたらすことが可能で、それゆえそれらを破壊する、外因性セリンプロテアーゼである。カスパーゼは、アポトーシスの開始ならびに実行段階において中心的な役割を果たす、システインプロテアーゼである。補体活性化の間のタンパク質分解カスケードは、補体媒介性炎症、白血球遊走、および補体オプソニン化した粒子および細胞の食作用をもたらし、最終的に、膜穿通病変の結果として、標的細胞および微生物の直接溶解に至る。
【０１４０】
アポトーシスまたは補体活性に関与する大部分のプロテアーゼは、活性化されるまで酵素前駆体の形状で存在する。酵素前駆体は、通常Ｎ末端に位置する、独自の配列内のプロペプチド成分により抑制されるプロ酵素である。本発明の一態様は、プロトキシン部分としてこのようなタンパク質分解の酵素前駆体を、および酵素前駆体の活性化因子として作用する第２のタンパク質分解活性を使用する。プロトキシン融合体およびプロテアーゼ融合体の両方が細胞を標的とするドメインを含み、およびエンドサイトーシスを支持するために、任意に転位ドメインを含む。第１の酵素前駆体内の切断部位および活性融合体内のプロテアーゼの例は、因子Ｘａ、ＩＥＧＲ↓により標的とされたプロテアーゼ切断部位、およびエンテロキナーゼ、ＤＤＤＤＫ↓により標的とされたプロテアーゼ切断部位（配列番号：２５）を含むが、これらに限定されない。さらなる例は、グランザイム、カスパーゼ、エラスターゼ、カリクレイン、マトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリー、プラスミノーゲン活性化因子ファミリー、ならびに線維芽細胞活性化タンパク質を含む。
【０１４１】
グランザイム
米国特許第７，１０１，９７７号は、グランザイムＢ等のアポトーシス誘導因子を含むキメラタンパク質、および細胞特定標的部分は細胞死をもたらすことを開示する。ＧｒＢは、カスパーゼ（特にカスパーゼ−３）を切断することにより細胞死をもたらし、それに代わってカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼを活性化する。該酵素はＤＮＡを分解し、アポトーシスを起こした細胞を不可逆的に不活性化する。ＧｒＢはタンパク質Ｂｉｄをも切断し、ミトコンドリアの膜浸透性を変化させるために、他のタンパク質の中でも、タンパク質ＢａｘおよびＢａｋを採用し、シトクロムｃ（カスパーゼ９を活性化する）、Ｓｍａｃ／ＤｉａｂｌｏおよびＯｍｉ／ＨｔｒＡ２（アポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）を抑制する）の放出を生じる。
【０１４２】
本発明の好ましい態様において、アポトーシス誘導グランザイム（例えば、グランザイムＢ）は、プロトキシンの細胞傷害性部分として構成され得る。例えば、ＧｒＢに基づくプロトキシンの構成において、タンパク質分解基質の配列は、グランザイムＢの直前に位置される場合があり、タンパク質分解基質配列を特に切断することが可能なプロテアーゼ融合体による、活性化可能なＧｒＢ融合体をもたらす。
【０１４３】
カスパーゼ
２種類のアポトーシスのカスパーゼがあり、それらは、イニシエーター（アピカル）カスパーゼ、およびエフェクター（エクセキューショナー）カスパーゼである。イニシエーターカスパーゼ（例えば、カスパーゼ−２、−８、−９および−１０）は、エフェクターカスパーゼの不活性前駆体を切断し、それによって、これら前駆体を活性化する。エフェクターカスパーゼは（例えば、カスパーゼ−３、−６、−７）、代わりに細胞内の他のタンパク質基質を切断し、アポトーシス過程をもたらす。インビボにおいて、該カスケード反応の開始はカスパーゼ阻害剤により制限される。カスパーゼカスケードは、細胞傷害性Ｔリンパ球により放出され、カスパーゼ−３ならびに−７を活性化するグランザイムＢ、カスパーゼ−８ならびに−１０を活性化する細胞死受容体（ＦＡＳ、ＴＲＡＩＬ受容体、およびＴＮＦ受容体のような）、およびカスパーゼ−９を活性化するシトクロムｃならびにＢｃｌ−２ファミリーにより制限される、アポトゾームにより活性化され得る。
【０１４４】
カスパーゼは、アポトーシスの最初の刺激に関わらず、アポトーシスの後の段階に非常に関わるため、本発明は、上流細胞事象のアポトーシスカスケードを開始するための、これらの活性、特にエフェクターカスパーゼの直接的な使用を特徴とする。例えば、カスパーゼ−６に基づくポロ毒素の構成において、プロカスパーゼ−６が使用される。プロカスパーゼ−６は、成熟カスパーゼ−６配列、阻害配列、およびその間に位置するタンパク質分解基質を含む。プロカスパーゼ融合体は、タンパク質分解基質配列を特に切断することが可能であるプロテアーゼ融合体により選択的に活性化される。
【０１４５】
補体系のプロテアーゼ
補体系は、生物から病原体を取り除くことを助ける、生化学的カスケードである。補体系は、血液中に見られる数多くの低分子タンパク質を含み、標的細胞の形質膜を破裂させることにより、標的細胞を殺滅するためにともに働く。血清タンパク質、漿膜タンパク質、および細胞膜受容体を含む、２０以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントは、補体系を構成する。補体系は、適合性が無く、個体の生涯を通じて変化せず、それ自体は先天性の免疫系に属する。しかしながら、適応可能な免疫系により採用され、作用させることが可能である。
【０１４６】
補体活性化の３つの相異なる経路がある。典型的経路、レクチン経路、および代替的経路である。一連のタンパク質のタンパク質分解切断を通じ、順次的な方式で補体活性化は進み、特定の細胞受容体および他の血清タンパク質との相互作用を通じて、様々な生物学的活性を仲介する活性生成物の生成に至る。該カスケードの間に、多くの生物学的な過程が、様々な補体成分により開始され、最終的に標的細胞の直接溶解へと至る。Ｃ１−Ｃ９および因子ＢならびにＤは、補体系の反応成分である。本発明の好ましい一態様は、プロトキシン融合体内の毒素部分として、補体活性化カスケード（例えば、Ｃ１−Ｃ９および、因子ＢならびにＤ、好ましくはＣ３タンパク質分解成分）に関与する、プロテアーゼの使用に含む。
【０１４７】
Ｂ．細菌毒素
本発明のプロトキシン融合タンパク質に用いられ得る細菌毒素の例を以下に述べる。
【０１４８】
孔形成毒素
別の局面において、本発明は、孔形成毒素ドメインを含有するプロトキシン融合タンパク質を特徴とする。これらの毒素は細胞膜に結合し、活性化が起こると、必須イオンおよび代謝物が拡散し得るチャネル（孔）を生成する。活性化するために修飾を必要とする代表的な孔形成毒素には、アエロモナスハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）のアエロリジン、ウェルシュ菌ε毒素、クロストリジウムセプチカムα毒素、大腸菌誘発性溶血素、コレラ菌の溶血素、および百日咳菌のＡＣ毒素（ＣｙａＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
本発明の再構築した活性化可能な孔形成毒素「ＲＡＰＦＴ」において、毒素を不活性型から活性型へと変換するためのトリガーを、天然の機構から代替の機構へと変更することが可能である。好ましい変更の様式は、天然タンパク質分解活性の活性化部位を、通常、標的細胞上には機能的に常在しない異種性のタンパク質分解部位と置き換えることである。異種性のタンパク質分解部位は、本来の活性化部位に加えられても、またはそれと置き換えられてもよい一方で、外因性プロテアーゼによる活性化の前に内因性活性化が起こらない限り、本来の残基を突然変異させるかまたは保存する。ＲＡＰＦＴに用いることができる代替の配列または化学組成物には、これまで報告された以外の活性化部分からのプロテアーゼに対する基質を含む。これらの代替基質は、ＲＡＰＦＴにおける修飾されたタンパク質分解部位として用いられてもよい。
【０１５０】
活性化部位に対する他の修飾には、リン酸化、グリコシル化、リポイル化、ビオチン化、アセチル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、およびエステル化が含まれるが、これらに限定されない。これらの修飾は、治療的状況で用いられた場合に、ＲＡＰＦＴを不活性状態から活性な状態、または自然に活性化可能な状態に切り替えるために、これらの修飾を逆行、除去、またさらに変更することができる活性化基と対になっていなければならない。他の態様では、ＲＡＰＦＴは、その修飾が逆行されない限り、孔形成を阻害する天然の活性化部位以外の毒素の重要な部分に対する修飾を有することができる。例として、孔の一部を形成し、天然の孔形成活性を妨害する、疎水性ループにおける残基のリン酸化が挙げられるであろう。例えば、ホスファターゼでリン酸塩基が除去された場合にのみ、プロトキシンは機能的な孔を形成することが可能である。
【０１５１】
置換された細胞を標的とする部分が標的ドメインの局在化機能を機能的に置き換える限り、ＲＡＰＦＴは、天然の標的ドメインのほかに、本明細書に記載される任意選択的に置換された細胞を標的とする部分も含有することができる。さらに、天然の標的ドメインは、任意選択的に置換された細胞を標的とする部分によって、部分的または全体的に排除または置き換えることができる。当業者は、天然孔形成毒素に対して確立された分子クローン化技術を用いて、コードされたアミノ酸配列における変化としてその後現れる、コードするＤＮＡ配列内で欠失、挿入、部位特異的突然変異、およびランダム突然変異を行う方法を理解するであろう。任意選択的に置換された細胞を標的とする部分を、直接的な遺伝子融合体としてプロトキシンに付加することができ、または化学的架橋もしくは酵素的架橋を介して加えることができる。細胞を標的とする部分は、疎水性、金属結合、および他の親和性に基づく相互作用によってプロトキシンと非共有結合的に会合してもよい。細胞を標的とする部分のさらなる変異体を本明細書に記載する。
【０１５２】
ＲＡＰＦＴの他の修飾は、機能的な免疫毒素の合成において助けとなる可能性があり、溶解度、免疫原性、または薬物動態等が再構築されたタンパク質の特性を修飾する、単一アミノ酸置換または複数の置換の組み合わせを含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ２００１．  Ｃｏｌｄ−Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．  １９９７及び更新版。Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．）。
【０１５３】
修飾は、ＲＡＰＦＴの調製を目的とした精製タグを加えることを含み得る。プロトキシンは、毒素における特定の位置でシステインおよびリジン等の修飾可能なアミノ酸を含むように修飾することができる。結合ドメインまたは阻害ドメイン等の修飾基を、スルフヒドリルまたはイプシロンアミノ基のアルキル化を介して、これらのアミノ酸に付加することができる。ＲＡＰＦＴの天然の活性に影響を与える突然変異を導入することができる。例えば、アエロリジン孔形成毒素中のＧＰＩ結合部位を破壊するように、Ｃ１５９ＳおよびＷ３２４Ａ等の突然変異が行われてもよい。これらの突然変異は、再構築された毒素の非特異的結合を削減する（ＭａｃＫｅｎｚｉｅら、１９９９．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７４：２２６０４−９）。
【０１５４】
一態様においては、ＲＡＰＦＴは、インビトロまたはインビボでの翻訳後修飾を可能にする配列をコードし得る。これらの翻訳後修飾には、プロテアーゼ切断部位、リポイル化シグナル、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化部位、およびビオチン追加のためのＢｉｒＡビオチン化標的配列が含まれるが、これらに限定されない。ビオチン化は、宿主生物内でのタンパク質合成の間に起こり得、または、後にインビトロ反応時に起こり得る。ストレプトアビジンとビオチンの相互作用を、孔形成機能と他の所望の機能とを結びつけるために用いることができる。
【０１５５】
他の態様では、人工の阻害領域が天然の阻害配列と置換され得る。アエロリジンの場合、４３３〜４７０の間の残基は、類似した制御的役割を示す代替配列または化学的部分と置き換えてもよい。この領域は、代替のポリペプチド配列または小分子、糖質、脂質、もしくは核酸修飾であり得る。この非天然領域が除去または不活性化された場合にのみ、毒素は標的細胞によって容易に活性化され得る形態に活性化または変換される。例えば、その一次配列において異なる阻害ペプチドは、天然の阻害プロペプチドに付着され得、また孔形成活性は、該阻害プロペプチドが除去された時点で回復され得る。
【０１５６】
他の態様では、ＲＡＰＦＴの機能部（例えば、結合ドメイン、孔形成ドメイン、および阻害プロ領域）は、非ペプチド結合を介して連結されている。これらのドメインは、ジスルフィド結合を用いて共有結合的に接続されても、二重反応性（ｂｉｒｅａｃｔｉｖｅ）アルキル化試薬で化学的に架橋されても、またはソルターゼＡもしくはトランスグルタミナーゼとのコンジュゲーションを介して酵素的に結合されてもよい（Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙら、２００７．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  １８：４６９−７６、Ｔａｎａｋａら、２００４．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  １５：４９１−７）。代替として、孔形成毒素は、会合する孔形成剤の機能的複合体を実現するために、非共有結合的に会合した機能部（例えば、ロイシンジッパーのような疎水性相互作用、またはＳＨ２ドメインのリン酸塩相互作用のような結合相互作用）を含有し得る。
【０１５７】
他の態様は、１つ以上のアミノ酸が非天然アミノ酸で置換されるＲＡＰＦＴ（例えば、トリプトファンの代わりにｆ４−フルオロトリプトファン（ＢａｃｈｅｒおよびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ．  ２００７．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ３５２：２３−３４、ＢａｃｈｅｒおよびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ．  ２００１．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８３：５４１４−２５））を特徴とする。
【０１５８】
機能的なＲＡＰＦＴは、制限されないが、以下の修飾を１つ以上有し得る：単一または複数のアミノ酸の突然変異、変更された活性化部分、任意選択的に置換された細胞標的ドメイン、非天然阻害プロ領域、および非天然アミノ酸。
【０１５９】
好ましい一態様において、ＲＡＰＦＴはアエロリジン孔形成毒素に基づいている。アエロリジンはアエロモナス科の種によって生成され、非細胞特異的な様式で細胞溶解を引き起こす。毒素は４つの異なるドメインから成り、上部構造は非膜結合形態における二量体として存在する（Ｐａｒｋｅｒら、１９９４．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３６７：２９２−５）。いったん毒素が細胞膜に局在すると、フリンが残基４２７〜４３２の間の標的配列を切断し、存在する場合は孔形成を阻害するＣ末端プロ領域（残基４３３〜４７０）が除去されて、上記毒素は同じ細胞表面上にある他の毒素とオリゴマー形成することができる。その後、疎水性セグメントが脂質二重層を横断して挿入し、細胞外ドメインとサイトゾルとの間にチャネルを形成する。野生型アエロリジン毒素の場合、ドメイン１は、細胞に対する天然毒素を標的とするＮ−グリカン結合ドメインを含有し、ドメイン２は、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合ドメインを含有する。ドメイン３は孔形成ループを含有し、ドメイン４は、フリン認識部位を有する切断可能なリンカーによって孔形成セクションから分離されたプロドメインを含有する。
【０１６０】
本発明は、ＲＡＰＦＴの一部として孔形成毒素を投与することに対してそれらをより好適にする、孔形成毒素の修飾を特徴とする。再構築されたアエロリジン毒素の一態様においては、天然のＮ−グリカン結合ドメインであるドメイン１が除去され得る。他の態様では、ドメイン１を除去してもしなくても、ドメイン１を任意選択的に細胞を標的とする部分と置換することができる。ドメイン１が除去されない場合、毒素は、細胞表面上の標的分子に対する親和性に影響を与える結合部位中の突然変異を、含有していても含有していなくてもよい。細胞を標的とする部分は、ＲＡＰＦＴが活性化された時点での孔形成活性を妨害しないならば、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部残基に付着することができる。任意選択的に置換されたプロトキシンは、本明細書に記載される様々な方法により合成することができる。
【０１６１】
また本発明は、孔形成セクションと、天然のプロテアーゼ切断部位から修飾可能な活性化部分へと変化した孔形成（残基４２７〜４３２）を阻害するプロドメインとの間に、残基を有する修飾されたアエロリジンも特徴とする。ある態様は、天然のフリン活性化部分が、１つ以上の代替プロテアーゼ認識配列により置換された、突然変異活性化部分を含む。天然のフリン切断配列ＫＶＲＲ↓ＡＲ（配列番号：７）（残基４２７〜４３２）は、グランザイムＢの活性化部分（ＩＥＰＤ（配列番号：９））と置き換えることができる。この場合、治療計画は、プロトキシン活性化因子としてグランザイムＢ部分を有する本態様と組み合わせられる。代替として、天然のフリン配列は、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）によって置き換えることができる。異なるプロテアーゼ活性化部位は本明細書に記載される部位を含むが、それらに限定されない。天然の活性化部分をコードするＤＮＡは、標準的な分子生物学の方法を用いて、修飾された配列と置き換えることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ２００１．  Ｃｏｌｄ−Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．  １９９７および改訂版。Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）。外因性プロテアーゼによって切断され得るが、まだ基質として同定されていない配列を用いることができる。
【０１６２】
他の態様では、アエロリジンの最初の８２残基は、ＤＮＡの突然変異誘発によって除去される。ここでは、ソルターゼＡによって認識および修飾され得るペプチド配列が加えられた、ＤＮＡにコードされたリンカー配列（ＧＫＧＧＳＮＳＡＡＳ（配列番号：２２））によって、小葉が置き換えられる。Ｃ末端にソルターゼＡアクセプタ配列（ＬＰＥＴＧ（配列番号：３８））を有する細胞結合部分は、固定化ソルターゼＡを用いて変異型毒素に結びつけられる。ソルターゼＡは、単鎖ＦｖからのスレオニンのＣ末端と、ＧＫＧＧＳＮＳＡＡＳ（配列番号：２２）のＮ末端との間に、共有結合を形成する。好ましい態様において、細胞結合部分は単鎖Ｆｖフラグメントである。他の態様では、単鎖Ｆｖフラグメントは、通常Ｂ細胞ではなくＴ細胞上に見られる細胞表面受容体ＣＤ５に対する特異性を有する。Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の場合は、細胞表面上に受容体を有するＢ細胞が認められる。この突然変異に加えて、再構築されたアエロリジンが、天然のフリン活性（残基４２７〜４３２）の代わりに、ヒトグランザイムＢによって認識される代替のタンパク質分解性活性化部位を含有する。この再構築されたアエロリジンが、疾患細胞を標的とする標的分子と会合したグランザイムＢプロテアーゼを有する活性化部分と対になる場合、例として、ＣＤ１９、共通のＢ細胞マーカー、再構築されたアエロリジンを認識することができる単鎖抗体フラグメントに機能的に融合されたグランザイムＢは、活性化され、七量体の孔を形成することによりＣＤ５およびＣＤ１９の両方を発現する細胞を破壊することができる。さらに他の態様において、抗ＣＤ５および抗ＣＤ１９部分は、プロトキシンとプロトキシン活性化因子との間で交換される。アエロリジンに基づくＲＡＰＦＴは抗ＣＤ１９で修飾され、活性化プロテアーゼは抗ＣＤ５で修飾される。
【０１６３】
他の態様では、本発明は、クロストリジウムセプチカムα毒素等の、アエロリジンに対して相同である毒素に基づくＲＡＰＦＴを特徴とする。この孔形成毒素は、天然のＮ−グリカン結合領域であるドメイン１を有さないため、ＧＰＩ結合ドメインとは別の細胞を標的とする部分を有するように修飾することができる。α毒素の活性化領域に類似した突然変異は、アエロリジンについて記載される通り行うことができる。
【０１６４】
当業者は、様々な宿主系においてＲＡＰＦＴを発現させる方法を理解する。一態様においては、通常、天然毒素が見られる生物または関連する生物においてプロトキシンが生成され得る。生成過程を簡素化するために、標準的な分子生物学の手引書に記載されるように、大腸菌、酵母（例えば、ピキアパストリス、クルイベロミセスラクチス）、昆虫細胞、インビトロ翻訳系、および哺乳類細胞（すなわち、２９３、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ）等の異種の発現系において、再構築された毒素を生成することもできる。転写制御因子および転写シグナルは、様々な異種の発現系を伴う市販のベクター系内に組み込むことが可能である。プロトキシンの発現は、シグナルペプチドの操作によって、宿主細胞の細胞内または細胞外区画を標的とすることができる。再構築された毒素は、異なった発現系におけるフラグメントにおいて発現されてもよく、または合成的に生成された後で、精製された成分を用いて機能的なＲＡＰＦＴに再構成されてもよい。
【０１６５】
ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００７／０５６８６７号は、修飾された孔形成タンパク質毒素（ＭＰＰＴ）の使用を教示している。ＭＰＰＴは、アエロリジンおよびアエロリジン関連毒素等の、天然の孔形成タンパク質毒素（ｎＰＰＴ）に由来し、多様な癌種においてＭＰＰＴの活性化を可能にする修飾された活性化部分を含む。ＷＯ２００７／０５６８６７は、特定の種類の癌を選択的に標的にするよう操作されたＰＣＴ出願公開第ＷＯ０３／１０１８６１１号に記載される孔形成分子と、ＭＰＰＴとを区別している。ＷＯ２００７／０５６８６７号のＭＰＰＴは、広範囲に渡る抗癌剤として使用されることが意図され、したがって、複数の癌種に見られるタンパク質分解酵素によって活性化されるように構築される。本発明の活性化部分は、腫瘍に自然には存在しないか、または腫瘍の近くにおいて豊富であることが予測されない外因性プロテアーゼと同族である。
【０１６６】
活性化可能な細菌性ＡＤＰリボシル化毒素（ＡＤＰＲＴ）
細菌性ＡＤＰＲＴの基には、タンパク分解性に活性されることで知られているものがある。コレラ毒素、百日咳毒素および大腸菌エンテロトキシンは、小さな調節Ｇタンパク質を標的にするＡＢ５ファミリーのメンバーである。酵素的に活性なＡサブユニットは、Ｂサブユニットの五量体に非共有結合的に結合する（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２５１：５６３−５７３（１９９５））。百日咳毒素、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンおよびコレラ毒素を含むＡＤＰリボシル化毒素のＡＢ５ファミリーのメンバーは、触媒ドメイン（Ａ）が、ジスルフィド結合したＡ１−Ａ２ドメインのタンパク質分解的切断を起こすことを必要とする。Ａサブユニットのタンパク質分解的切断は、Ａ１ドメインをＡ２−Ｂ５複合体から放出し、細胞補助因子の存在下においてＡ２−Ｂ５複合体を細胞毒性にする（Ｈｏｌｂｏｕｍら、ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７３：４５７９−４５９３（２００６））。
【０１６７】
本発明におけるジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびコレラ菌外毒素は、ＡＢファミリーのメンバーである。ＡＢファミリーの毒素は、複数のドメインを有するタンパク質であり、細胞標的ドメイン、転位ドメイン、および毒素ＡＤＰが真核生物の伸長因子２上のジフタミド残基をリボシル化するＡＤＲＰＴドメインから構成される（Ｈｗａｎｇら、Ｃｅｌｌ  ４８：２２９−２３６（１９８７）、Ｃｏｌｌｉｅｒ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  Ｒｅｖ．８７：８２８−８３２（１９８０））。
【０１６８】
第３の群は、より一般的なＡＢ５組み合わせ毒素とは異なり、活性触媒ドメインと細胞標的ドメインの２つのドメインを備える、アクチンを標的とするＡＢ組み合わせ毒素を含む。この群は、ボツリヌス菌由来のＣ２毒素、ウェルシュ菌イオタ毒素、クロストリジウムスピロフォルム毒素、クロストリジウムディフィシル毒素およびセレウス菌由来の増殖型殺虫タンパク質（ＶＩＰ２）を含む広範囲のクロストリジウム毒素を含む（Ａｋｔｏｒｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：３９０−３９２（１９８６）、Ｓｔｉｌｅｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ  ５４：６８３−６８８  （１９８６）、Ｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ６：９３２−９３６  （１９９９））。組み合わせ毒素は、完全なＡ−Ｂユニットとして細胞を結合しない。その代わり、タンパク質分解活性に活性化されたＢモノマーが、細胞表面受容体にホモ７量体として結合する。これらのホモ７量体は、次いで、Ａドメインに結合し、エンドサイトーシスにより細胞内に取り入れられる。いったん酸性のエンドソーム内に入ると、低ｐＨによりＢドメイン７量体の転位機能が活性化され、７量体がエンドソーム膜中の触媒Ａドメインを細胞質に転位させ、アクチンをＡＤＰリボシル化して細胞死を引き起こす（Ｂａｒｔｈら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６８：３７３−４０２  （２００４））。
【０１６９】
本発明のＡＤＰリボシル化毒素は、本明細書において「自己作用型ＡＤＰリボシル化毒素」と称される、標的細胞膜を横断して自らの転位を誘発することができる毒素を含み、注入線毛構造または関連構造によって毒素の転位を宿主細胞質中に伝えるために、タイプＩＩＩ分泌装置または細菌によって発現された類似構造に対する必要条件を持たない。このような自己作用型のＡＤＰリボシル化毒素は、活性化部分および細胞を標的とする部分について修飾することが可能であり、当該技術分野で周知である方法を用いて生成することができる。
【０１７０】
細菌源由来の自己作用型ＡＤＰリボシル化毒素のように、モンシロチョウ由来のピエリシン−１毒素を、トリプシン感受性部位Ａｒｇ−２３３でタンパク質分解的切断することにより活性化することができる。切断によって、増強された細胞溶解活性を示すニックの入った毒素が生じ、ＨｅＬａ細胞に電気穿孔を行った場合はフラグメント１−２３３が細胞毒性を示す（Ｋａｎａｚａｗａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９８（５）：２２２６−３１（２００１））。Ａｒｇ−２３３は、第３のアルギニン残基がＡｒｇ−２３３である配列ＧＧＨＲＤＱＲＳＥＲＳＡＳＳ（配列番号：４０）の予測される不規則なループ内に位置する。ピエリシン−１は、毒素を真核生物膜の標的とするＣ末端のスフィンゴ脂質結合領域を含有し、植物毒素リシンに見られるドメインに類似した反復する４つのレクチン様ドメインから成ると考えられている（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ−Ｈｉｂｉｙａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００３  Ｍａｒ  １４；２７８（１１）：９９７２−８）。糖質結合モチーフを有すると考えられるトリプトファン残基の突然変異は、毒素の活性を減少させる（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ−Ｈｉｂｉｙａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００３  Ｍａｒ  １４；２７８（１１）：９９７２−８）。よって、新しい細胞表面標的に毒素を誘導し直すことは、外因性の細胞を標的とする部分を、操作したピエリシン−１の変異体、またはコード配列に対する変異修飾の結果として糖質結合力を欠如する関連毒素に加えることにより実現可能である。このような再誘導されたピエリシンを、アルギニンの豊富なＲＤＱＲＳＥＲ（配列番号：４１）配列をプロトキシン活性化プロテアーゼと同族の配列と交換するために、活性化部分においてさらに修飾することができる。
【０１７１】
本発明の別の局面は、以下、コレラ菌外毒素またはＶＣＥと称される、コレラ菌由来の新しいプロトキシン部分を提供することである。ジフテリア毒素やシュードモナス外毒素Ａの触媒部分のように、ＶＣＥの触媒部分はｅＥＦ２上のジフタミドを特異的にＡＤＰリボシル化する。ジフタミドのＡＤＰリボシル化はｅＥＦ２の機能を低下させ、著しい生理学的変化および最終的には細胞死を引き起こすタンパク質合成の阻害をもたらす。ＶＣＥが細胞に進入する機構は完全には理解されていないが、関連毒素ＰＥＡが、細胞表面上のα２−マクログロブリン受容体に結合して受容体媒介によるエンドサイトーシスを起こし、低ｐＨによって毒素に構造変化がもたらされるエンドソーム内部に移行して、結合ドメインを除去するフリンプロテアーゼ切断が行われる状態にする。その後、触媒ドメインは小胞体への逆行輸送を経て細胞質内に転位し、ｅＥＦ２を酵素的にリボシル化することができる。反対に、ＤＴはヘパリン結合上皮増殖因子様の増殖因子前駆体（ＨＢ−ＥＧＦ）に結合し、受容体媒介によるエンドサイトーシスによって取り込まれる前に、細胞表面上で切断される。いったん初期エンドソーム内に入ると、ＤＴ触媒フラグメントは処理されずにエンドソームの膜を透過して、宿主細胞の細胞質内に直接入り込み、ｅＥＦ２をＡＤＰリボシル化することができる。ＶＣＥの結合の原因となる受容体は、現在のところ明らかになっていない。いくつかの点において、ＶＣＥは、ＤＴよりも、より密接にＰＥＡに類似する。まず、ＶＣＥのドメイン構成が、ＰＥＡのドメイン構成に類似しているように見え、細胞標的ドメインの後に転位ドメインがあり、それから酵素ドメインがある。ＶＣＥおよびＰＥＡは両方とも、Ｃ末端にマスクされた小胞体保留シグナルを持ち、ＶＣＥおよびＰＥＡが小胞体を通って標的細胞のサイトゾルに入ることを示唆している。ＶＣＥおよびＰＥＡの両方が低量のリジンを有しており、小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）経路を介した細胞質内への毒素の導入機構と一致していると考えられる。現在のデータは、ＰＥＡおよびＶＣＥを活性化するタンパク質分解事象は、酸性のエンドソーム区画内で発生するのに対し、ＤＴのフリン切断はより中性な環境で起こる可能性があるという見方を示唆するものである。
【０１７２】
ＶＣＥのＣ末端は特徴的な小胞体保留シグナルを有し（ＫＤＥＬ（配列番号：１５））、その後に、おそらくはカルボキシペプチダーゼＢ等の遍在性のカルボキシル−ペプチダーゼの活性によって除去されるであろうリジン残基がＶＣＥの同Ｃ末端に続くことから、ＶＣＥがＰＥＡと類似した様式で標的細胞のサイトゾルに入ること、およびＶＣＥのＣ末端配列は十分な細胞毒性に不可欠であることが示唆される。好ましいＶＣＥ分子の最大細胞毒性作用については、標的細胞のサイトゾル内に分子を転位するために適切なカルボキシル末端配列が好ましい。このような好ましいアミノ酸配列には、ＫＤＥＬＫ（配列番号：４２）、ＲＤＥＬＫ（配列番号：４３）、ＫＤＥＬＲ（配列番号：４４）およびＲＤＥＬＲ（配列番号：４５）を制限なく含む。
【０１７３】
ＤＴ融合タンパク質について以下に記載する方法に類似する一般的な方法が、組換えＤＮＡ構築物を調製するため、またそれらがコードする修飾されたＶＣＥ融合タンパク質を発現するために適用されてもよい。特に、ＶＣＥの融合に関しては、野生型ＶＣＥの細胞を標的とする部分（残基１−２９５）が、選択された異なる標的細胞表面の標的に結合するポリペプチド配列によって置き換えられ、フリン切断配列（残基３２１−３２６：ＲＫＰＲ↓ＤＬ（配列番号：４６））が、ＧｒＢ、ＧｒＭ、およびＴＥＶプロテアーゼ等の外因性プロテアーゼの認識配列に取って代わられる。
【０１７４】
他の態様では、本発明は、プロトキシンの要素として、修飾されたシュードモナス外毒素Ａの使用を含む。数多くの有用なＰＥＡの改良が当該技術分野において既知である。例えば、欠失および置換解析は、ＰＥＡのＣ末端がＰＥＡの細胞毒性効果に必要不可欠な要素を含有することを示している。アミノ酸６０２と６１３との間の領域の変異解析によって、最後の５つのアミノ酸残基（ＲＤＥＬＫ（配列番号：４３））が細胞毒性に不可欠であることが判明しており、６０９の基本残基、６１０、６１１の酸性アミノ酸、そして６１２のロイシンが十分な細胞毒性に必要とされる一方で、６１３のリジンは不要であることが明らかになっている（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８７：３０８−３１２（１９９０））。Ｃ末端のＲＤＥＬＫ（配列番号：４３）配列がＫＤＥＬ（配列番号：１５）と置き換えられた変異ＰＥＡ（明確な小胞体保留シグナル）は、十分に機能的であり、ＰＥＡによる中毒が標的細胞中に存在する細胞因子を必要とすること、およびＰＥＡタンパク質が小胞体内腔まで移行することを示唆している。続いて、Ｃ末端でコンセンサスな小胞体保留シグナルを有するように操作された免疫毒素は、野生型ＰＥＡ配列を有する毒素と比較して高い毒性を示すことが明らかになっている（Ｓｅｅｔｈａｒａｍら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：１７３７６−１７３８１（１９９１）、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５７０５１６３、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５８２１２３８）。よって、本発明の一態様は、腫瘍細胞に対する毒性を有利に改良するＣ末端配列の変化を有する、修飾されたＰＥＡを含む。
【０１７５】
ＤＴ融合タンパク質について以下に記載する方法に類似する一般的な方法が、組換えＤＮＡ構築物を調製するため、またそれらがコードする修飾されたＰＥＡ融合タンパク質を発現するために適用され得る。特に、ＰＥＡの融合に関しては、野生型ＰＥＡの細胞を標的とする部分（残基１−２５２）が、選択された異なる標的細胞表面の標的に結合するポリペプチド配列によって置き換えられ、フリン切断配列（残基２７６−２８１：ＲＱＰＲ↓ＧＷ（配列番号：５））が、ＧｒＢ、ＧｒＭ、およびＴＥＶプロテアーゼ等の外因性プロテアーゼの認識配列に取って代わられる。
【０１７６】
ＰＥＡの毒性を改良した様々な修飾が当該分野において説明されてきた。これらの修飾は、ＶＣＥの免疫毒素の毒性を改良するためにも有用である。Ｍｅｒｅら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０：２１１９４−２１２０１（２００５））は、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）が内部移行中に低ｐＨエンドソームに曝露されることにより、タンパク質合成を不活性化するサイトゾルへのＰＥＡ転位に必要なプロセスである転位ドメインの膜内挿入が引き起こされると教示している。膜内挿入は、主要なトリプトファン残基（Ｔｒｐ３０５）の曝露によって促進される。中性ｐＨでは、この残基は、転位ドメインの最も小さなα−ヘリックス（Ｆヘリックス）により閉ざされた疎水性ポケットに埋没している。酸性化すると、ヘリックスのＮ−ｃａｐ残基であるＡｓｐのプロトン化がその不安定化をもたらし、側鎖のエンドソーム膜への挿入が可能になる。Ｆヘリックスの最初の２つのＮ末端アミノ酸（Ａｓｐ３５８およびＧｌｕ３５９）が非酸性のアミノ酸で置き換えられた変異ＰＥＡは、Ｆヘリックスの不安定化を示し、酸性環境の不在下においてトリプトファン３０５の分子の外側への曝露を引き起こし、野生型ＰＥＡよりも７倍高い毒性を生じる。同様に、Ｆヘリックス全体が除去された変異ＰＥＡが、野生型ＰＥＡよりも３倍高い毒性を示すことが分かっている。よって、本発明の一態様は、腫瘍細胞に対する毒性を有利に改良するＦヘリックスまたはＴｒｐ３０５に対する配列の変化を有する、修飾されたＰＥＡを含む。配列アライメントでは、ＰＥのＦヘリックスに対応するヘリックスは見つからなかったが、ＰＥＡのタンパク質分解的切断と同様に、フリンによるＶＣＥの切断がやや酸性条件において有利であることが分かり、ＶＣＥの膜内挿入中に、類似した酸がトリガーとなる構造変化が起こる可能性があることを示唆している。ＶＣＥの膜内挿入を促進する突然変異、およびそれによって強化された細胞毒性が、ランダム突然変異誘発等の手段を介して見られる可能性がある。本発明のためのＶＣＥ分子の好ましい形態は、より高い細胞毒性を引き起こす、より効率的な膜内挿入を示す形態を含む。
【０１７７】
ＰＥＡまたはＶＣＥから作られる免疫毒素の毒性を決定する重要な因子の１つは、受容体が結合する際に、免疫毒素が標的細胞によって内部移行されるか否かに依存する。内部移行は、免疫毒素媒介による細胞毒性における律速段階であると考えられている（ＬｉおよびＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：２６５２−２６５９（１９９４））。Ｈｅらは、周知の膜転位シグナルであるＡｒｇ９−ペプチドを、毒素部分と結合部分との間の位置で抗ＣＥＡ（癌胎児性抗原）の免疫毒素ＰＥ３５／ＣＥＡ（Ｆｖ）／ＫＤＥＬに融合した。この融合タンパク質の強い結合および内部移行が、検出されたすべての細胞株に観察されたが、細胞表面上のＣＥＡ分子が欠乏した細胞に対する細胞毒性はほとんど検出されなかった。しかしながら、細胞表面上で大量のＣＥＡ分子を発現する特定の腫瘍細胞に対する融合タンパク質の結合活性以外の細胞毒性が著しく向上したことから、Ａｒｇ９−ペプチドが、この免疫毒素の特定の細胞毒性の増加に結びつく、免疫毒素の受容体媒介によるエンドサイトーシスを促進する能力を持つことが示唆される（Ｈｅら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ３７：１９２−２０５（２００５））。したがって、中毒について小胞体の転位に依存するプロトキシンの好ましい一態様は、Ａｒｇ９−ペプチドまたは関連する膜転位シグナル（ＨＩＶ−Ｔａｔ、アンテナペディア、または単純ヘルペスＶＰ２２に由来する結合等）の、このようなプロトキシンへの機能的な連結を含むが、これらに限定されない。本発明のさらなる好ましい態様は、Ａｒｇ９−ペプチドまたは関連する膜転位シグナル（制限されることなくＨＩＶ−Ｔａｔ、アンテナペディア、または単純ヘルペスＶＰ２２に由来する結合に由来する）に機能的連結した、修飾されたＰＥＡまたはＶＣＥプロトキシンを含む。
【０１７８】
リガンド結合に非依存的な毒性は、ほとんどの標的毒素に観察された。これらは、肝機能検査異常の原因となる肝細胞傷害、または血管漏出症候群（ＶＬＳ）をもたらす血管内皮細胞損傷のいずれかを含む。肝病変および血管病変の両方が、正常なヒト組織による標的毒素の非特異的な取り込みに関連している可能性がある。米国特許出願公開第２００６／０１５９７０８号Ａ１および米国特許第６，５６６，５００号は、ジフテリア毒素の修飾された変異体、および血管内皮または血管内皮細胞への結合を減少させる血管漏出症候群（ＶＬＳ）の発生率を低下させ、（Ｘ）Ｄ（Ｙ）配列がＧＤＬ、ＧＤＳ、ＧＤＶ、ＩＤＬ、ＩＤＳ、ＩＤＶ、ＬＤＬ、ＬＤＳ、およびＬＤＶである免疫毒素一般に関する、方法および組成物について説明している。１つの例では、２つの（Ｘ）Ｄ（Ｙ）モチーフが突然変異しているＤＴ、Ｖ７ＡＶ２９Ａの変異体は、十分な細胞毒性を維持するが、ヒト培養血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対しては低下した結合活性を示すことが明らかになった。米国特許第５，７０５，１５６号は、動物に対する非特異的なＰＥＡの毒性を低下させるために、ドメインＩ内の４つのアミノ酸（５７，２４６，２４７，２４９）をグルタミンまたはグリシンに変異させた、修飾ＰＥＡ分子の使用を教示している。よって、本発明の一態様は、正常な組織に対して有利に毒性を低下させる配列の変化を有する、修飾されたＰＥＡ、ＶＣＥ、またはＤＴプロトキシンを含む。
【０１７９】
治療タンパク質の血漿半減期には、Ｃｏｌｌｅｎら、Ｂｏｌｌｏｄ  ７１：２１６−２１９（１９９８）、Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓら、Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．  ６０：２５５−２６１（１９８８）、Ｂｒｏｗｎｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３：１５９９−１６０２（１９８８）、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ７：１７５（１９８４））に記載されるような技術を用いて改良されたものがある。非コンジュゲート型毒素と比較して血清中の半減期が長い免疫毒素を生成するために、抗体が化学的に毒素とコンジュゲートされてきたが、その長い半減期は天然の抗体に起因するものである。ＷＯ９４／０４６８９は、免疫毒素が、哺乳類の血清タンパク質の半減期を延長する性質を有するＩｇＧ定常部ドメインに連結した、修飾免疫毒素の使用について教示している。ＩｇＧ定常部ドメインは、ＣＨ２またはそのフラグメントである。延長した血清半減期を有するＶＣＥ免疫毒素の変異体を生成するために、同様の方策を適用することができる。また、アルブミン、ポリエチレングリコール、または関連する非免疫原性ポリマーとの機能的な連結が、治療用毒素の血漿中における残留を促進する可能性がある。
【０１８０】
免疫毒素の治療を繰り返すと、免疫毒素を中和する、つまり有効性を低下させる抗体を、患者が生ずる可能性がある。所与の免疫毒素に対する高力価抗体の問題を回避するために、米国特許第６，０９９，８４２号は、同じ標的原理を有するが細胞毒性部分において異なる免疫毒素を組み合わせて使用することを教示している。１つの例において、ヒトの抗毒素抗体を誘発する可能性を低下するために、抗Ｔａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ４０とＤＴ（ｌ−３８８）−抗Ｔａｃ（Ｆｖ）との免疫毒素が組み合わせられて用いられる。例えば、本明細書に記載される２つ以上のプロトキシンの間で、組み合わせた方策のプロトキシンが交互に用いられる場合には、同様の方策が本発明に適用され得る。
【０１８１】
特定の型の毒素融合タンパク質であるＤＴ融合タンパク質は、ＤＴのアミノ酸残基１−３８９をコードする核酸構築物から生成することが可能であり、天然のフリン切断部位は、外因性プロテアーゼおよび細胞表面標的に結合することが可能なポリペプチドの認識配列によって置き換えられる。当業者は、ＤＴをコードする核酸配列に突然変異を導入するか、または変異ＤＴをコードする核酸配列を合成する様々な方法を認識するであろう。核酸構築物を生成するための方法は周知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００５）等の出版物において十分に立証されている。核酸構築物はＰＣＲ法を用いて生成することができる。例えば、ＤＴ融合タンパク質をコードする構築物は、突然変異誘発ＰＣＲ法によって生成させることができ、代替のプロテアーゼ認識部位をコードするプライマーが、フリン切断部位ＲＶＲＲＳＶ（配列番号：４７）をコードするＤＮＡ配列の代わりに用いられ得る。変異を含有する構築物も、オリゴヌクレオチドの配列アセンブリによって生成することができる。グランザイムＢ切断部位ＩＥＰＤ（配列番号：９）をコードする核酸配列を導入するために、いずれのアプローチもＲＶＲＲＳＶ（配列番号：４７）をコードする核酸配列の代わりに用いることができる。ＩＥＰＤ（配列番号：９）の他にも、ＧｒＢが、ＩＡＰＤ（配列番号：４８）やＩＥＴＤ（配列番号：４９）等、類似するほかのペプチド配列を高効率で認識および切断することが明らかになっている。ＧｒＢで特異的に切断可能であるこれらおよび他の配列が組み込まれ得る。プロテアーゼの正常な作用に起因する望ましくない副作用を避けるために、自然の特異性よりも高い特異性を有するか、または自然に発生するプロテアーゼとは異なる特異性を示す遺伝子組換えプロテアーゼを用いることができる。
【０１８２】
細胞標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ＰＣＲ法を用いて同様にクローン化することが可能であり、ＤＴ融合タンパク質をコードする全長構築物は、ＰＣＲ産物とＤＴ構築物の制限消化およびその後のライゲーションによって構築することができる。構築物は、翻訳開始部位近傍に修飾されたＤＴをコードする核酸配列、および翻訳開始部位近傍に細胞を標的とする部分をコードするＤＮＡ配列を配列するように設計され得る。このような配列の順序は、サイトゾルにＤＴの触媒ドメインの最適な転位効率を与えるために、天然のジフテリア毒素を用いる。
【０１８３】
ＤＴ融合タンパク質は、当業者には既知である確立された方法を用いて細菌、昆虫、酵母、または哺乳類細胞中に発現させてもよく、その多くはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃｏｌｉｇａｎら編、２００６）に記載される。これら各々の宿主に発現させることが意図されるＤＮＡ構築物は、各々の宿主に望ましいコドンを提供するように修飾されてもよく（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２：３４６（２００４））、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００５）に記載されるような確立された方法（例えば、部位特異的突然変異誘発）を用いて実現することができる。特定のＤＴ融合体の生成に適した宿主系を迅速に同定するためには、インビトロでの部位特異的な再組換えにより異なる発現ベクター間でクローン化される遺伝子を組み換えるために、Ｇａｔｅｗａｙ  ｃｌｏｎｉｎｇ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が適用され得る。
【０１８４】
コドンの変更に加えて、ＤＴ融合タンパク質の構築物に対する他の配列の修飾は、細胞毒性に著しく影響を及ぼすことのない自然に発生するＤＴ配列の変種と、標的細胞に選択的に結合する能力を失うことのない細胞標的ドメインの変異体を含み得る。
【０１８５】
さらに、細胞標的ドメインの配列は、例えば、免疫原性の低下、より高い結合親和性および／または特異性、優れた薬物動態特性、またはＤＴ融合タンパク質生成の改良等、改良された特徴を有する変異体を選択するように修飾することもできる。縮重オリゴヌクレオチドプライマーを使用した部位特異的突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ法、またはＰＣＲ法を用いて、細胞標的ドメインおよび／またはＤＴ融合体のライブラリを生成することが可能である。望ましいタンパク質の機能を維持するため、または免疫原性を低下させるため、グリコシル化の部位を導入するためのコンセンサスなグリコシル化部位を除去または追加するために、配列の修飾が必要となる可能性がある。
【０１８６】
ＤＴ融合タンパク質の高収量発現のために、コードするポリヌクレオチドは、典型的には選択可能なマーカー、制御可能な転写プロモーター、および転写／翻訳ターミネーターを含有する、数多く市販される発現ベクターの１つにサブクローン化されてもよい。また、発現したタンパク質の局在化を導くためにシグナルペプチドが頻繁に用いられ、６ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、およびｍｙｃタグ等他のペプチド配列は、融合タンパク質の検出、単離、および精製を促進するために導入されてもよい。ＤＴ融合体内で各ドメインのフォールディングを成功させるために、修飾されたＤＴドメインと発現構築物内の細胞を標的とする部分との間に可動性リンカーが挿入されてもよい。
【０１８７】
ＤＴ融合タンパク質は、細菌発現系である大腸菌中で発現させてもよい。この系では、翻訳の開始を促進するためにリボソーム結合部位が用いられる。可溶性タンパク質融合体を得る可能性を高めるためには、タンパク質のフォールディングを補助するために、その発現構築物はＭＢＰ、ＧＳＴ、またはチオレドキシン等の担体タンパク質（ＤＴ融合体に対して５’または３’のいずれか）をコードするＤＮＡを含み得る。担体タンパク質は、発現の後でタンパク質分解されて除去されてもよい。タンパク質分解的切断部位は、タンパク質またはペプチドタグを除去するため、および活性融合タンパク質を生成するために、決まって組み込まれる。ＤＴ部分を含有する融合タンパク質の大腸菌発現の成功に関するほとんどの報告は、可溶性タンパク質を得るためにリフォールディングすることができる封入体の形態である。
【０１８８】
ＤＴ融合タンパク質は、メチロトローフ酵母発現系であるピキアパストリス内で発現させてもよい。この目的のための発現ベクターは、ピキアのアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）遺伝子からのプロモーター、天然のピキアＡＯＸ１遺伝子由来の転写終結配列、ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＩＳ４）のための選択可能なマーカーの野生型遺伝子、および転写終結配列に対して３’に位置する天然遺伝子の領域に由来する３’ＡＯＸ１配列（染色体ＡＯＸ１遺伝子に対して３’の位置で遺伝子置換または遺伝子挿入することによるベクター配列の統合に必要）等、共通する特徴をいくつか含んでいる可能性がある。細胞内タンパク質または分泌タンパク質のいずれかとして幅広い異種タンパク質を発現させるためにピキアパストリスの使用に成功してきたが、ピキアは非常に低レベルの天然のタンパク質を分泌するので、分泌物がより一般的に用いられる。分泌経路へ発現したタンパク質を導くために、分泌シグナルペプチドであるＭＡＴ因子プレプロペプチド（ＭＦ−α１）が頻繁に使用される。
【０１８９】
ピキア中のＮ結合型グリコシル化等の翻訳後修飾は、側鎖あたり約８〜１４個のマンノース残基を加えることによって起こる。Ｓ．セレビシエ中の大規模な修飾と比較すると抗原性が低いと思われるが（側鎖あたり５０〜１５０個のマンノース残基）、それでも尚、このようなグリコシル化がヒトにおける免疫反応を誘発し得る可能性が存在する。したがって、発現構築物中のいかなるコンセンサスなＮ−グリコシル化部位ＮＸＳ（Ｔ）も、典型的にはグリコシル化を避けるために変異させられる。
【０１９０】
触媒ドメインがサイトゾルに転位した場合またはサイトゾルに位置する場合に、ＤＴは真核細胞に対して強い毒性を示す。ピキアはジフテリア毒素に対する感受性を有するが、他の野生型真核細胞を中毒化するために観察されたＤＴレベルに対する耐性があり、分泌経路によるＤＴ融合体の発現に成功してきた（Ｗｏｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ２５：２７０（２００２））。ピキアにおいて発現した異種タンパク質の分泌は、Ｋｅｘ２によるシグナルペプチドＭＦ−α１の切断が関与しているため、フリン様プロテアーゼ、つまり置き換えられたフリン切断部位を有するＤＴ融合タンパク質は、野生型ＤＴ融合タンパク質よりもピキアに対する毒性が低いはずである。代替として、ＤＴの触媒ドメインによるＧＤＰリボシル化に抵抗するように染色体ＥＦ−２座位を変異させたピキアの変異株内に、ＤＴ融合タンパク質を発現させることができる（Ｌｉｕら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ３０：２６２  （２００３））。
【０１９１】
ＤＴ融合タンパク質は、哺乳類細胞内に発現させることもできる。ＡＤＰリボシル化に対して抵抗を与える変異体細胞株が説明されており（ＫｏｈｎｏおよびＵｃｈｉｄａ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２：１２２９８（１９８７）、Ｌｉｕら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  １９：３０４（２０００）Ｓｈｕｌｇａ−ＭｏｒｓｋｏｙおよびＲｉｃｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．  １８：２５（２００５））、可溶性のＤＴ融合タンパク質を発現させるために用いることができる。例えば、毒素に対する抵抗を持つ細胞株ＣＨＯ−Ｋ１  ＲＥ１．２２ｃは、ＤＴ−ＳｃＦｖ融合タンパク質を発現させるために選択されて用いられ（Ｌｉｕら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  １９：３０４（２０００））、変異体２９３Ｔ細胞株は、ＤＴ−ＩＬ７融合タンパク質を発現させるために選択されて用いられてきた（Ｓｈｕｌｇａ−ＭｏｒｓｋｏｙおよびＲｉｃｈ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．  １８：２５（２００５））。ＥＦ−２遺伝子のコドン７１７の第１の位置におけるＧからＡまでの移行が、アルギニンのグリシンへの置換を引き起こし、ＤＴによるＡＤＰリボシル化の標的アミノ酸であるＥＦ−２のヒスチジン７１５におけるジフタミドの翻訳後修飾を防ぐことが確定している。変異体遺伝子によって生成されたＥＦ−２は、タンパク質の合成において完全に機能する（Ｆｏｌｅｙら、Ｓｏｍａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １８：２２７（１９９２））。この情報およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編２００５）に記載されるような確立された方法に基づいて、異なる哺乳類細胞がＥＦ−２遺伝子のＧ７１７Ａ変異体を含有するベクターでトランスフェクトされてもよく、ＤＴに対して抵抗を有する細胞のために選択されてもよい。
【０１９２】
哺乳類細胞における安定した発現も、融合タンパク質をコードする外来ＤＮＡおよび転写シグナルを、宿主細胞の染色体ＤＮＡに伝達する必要がある。様々なベクターが市販されており、典型的には、大腸菌（Ａｐｒ）およびＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ）内における選択、大腸菌の複製起点、ＳＶ４０からのポリアデニル化配列、ＳＶ４０等の真核性の複製起点、プロモーターおよびエンハンサー配列のための表現型マーカーを含有する。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｃｏｌｉｇａｎら編２００６）に記載される方法に基づき、そしてＤＴに対する抵抗を有する細胞株から開始して、ＤＴ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターが、融合タンパク質を多く生成するかどうか選別される可能性のある宿主細胞をトランスフェクトするために用いられてもよい。
【０１９３】
ヒトに無害である翻訳後修飾を利用するために、哺乳類の発現系が頻繁に用いられるが、これは、本発明に関与するＤＴ融合タンパク質には必ずしも適用されない。ＤＴは細菌起源であることから、天然ＤＴの細胞毒性の可能性を保持するために、その配列内にある潜在的なＮ−グリコシル化部位を変異させる必要がある場合がある。さらに、細胞標的ドメイン内のグリコシル化は、望ましい結合特性を維持するために回避する必要がある場合がある。しかしながら、コンセンサスなＮ−グリコシル化部位は、このようなグリコシル化がＤＴおよび細胞を標的とする部分の機能を妨げないように、リンカーまたは末端配列に導入されてもよい。
【０１９４】
タンパク質毒素
治療剤として用いられる可能性がある多くのタンパク質毒素に共通する性質は、標的細胞内に見られるか、またはその近傍に存在するフリン／ケキシン（ｋｅｘｉｎ）プロテアーゼ等の遍在性プロテアーゼの作用を介した、タンパク質分解的切断による活性化を必要条件とするということである。高活性タンパク質毒素の選択性を高めるための有望なアプローチの１つは、内因性の認識配列を、腫瘍内で濃縮されると仮定されるかまたは知られるプロテアーゼの配列と置き換えるために、タンパク質分解的切断部位を導入することである。例えば、変異型炭疽毒素は、内因性のフリン切断部位を、悪性細胞によって高度に発現されることが多いプロテアーゼであるウロキナーゼで容易に切断される部位と置き換えるために操作されてきた（Ｌｉｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００１  Ｍａｙ  ２５；２７６（２１）：１７９７６−８４）。シュードモナス外毒素ＡのＡＤＰリボシル化ドメインに融合された、炭疽菌の致死因子から構成されるキメラ毒素の形成は、腫瘍細胞を選択的に死滅させる薬剤をもたらす結果となった（Ｌｉｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００１  Ｍａｙ  ２５；２７６（２１）：１７９７６−８４．）。この場合の組換え毒素は、自然に標的にされた、すなわち、独立した腫瘍特異的な標的部分を含んでいなかった。様々なヒト固形腫瘍に幅広い適応性を持つ可能性のある、ウロキナーゼにより活性化可能な組換え炭疽毒素変異体が開示されている（Ａｂｉ−Ｈａｂｉｂら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ５（１０）：２５５６−６２（２００６））。ＳｉｎｇｈらのＡｎｔｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ．  １８（７）：８０９−１６（２００７）は、プロテアーゼ特異的抗原であるキモトリプシン様プロテアーゼにより活性化することが可能な、組換えアエロリジンの生成について開示している。
【０１９５】
炭疽菌は、適切に組み合わされると、総称して炭疽毒素と呼ばれる２つの強力な毒素を形成する、３つのタンパク質を生成する。防御抗原（ＰＡ）と浮腫因子（ＥＦ）を組み合わせると浮腫毒素（ＥＴ）が形成され、ＰＡと致死因子（ＬＦ）を組み合わせると致死毒素（ＬＴ）が形成される（Ｌｅｐｐｌａら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ  ２７７−３０２（１９９１））。これらの毒素特有の特色は、ＰＡの不在下においてＬＦとＥＦは真核細胞のサイトゾルに到達することができないため、それらは毒性を持たないということである。ＰＡは、ＬＴおよびＥＴを細胞に標的化する役割を果たし、多くの種類の細胞の表面に結合する能力を持つ。特異的な受容体に結合した後、ＰＡはフリンまたはフリン様プロテアーゼにより単一の部位で切断され、受容体／ＰＡ複合体から放出されるアミノ末端基１９ｋＤフラグメントを生成する（Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：１９１０３−１９１０７（１９８９））。このフラグメントをＰＡから除去すると、受容体に結合した６３ｋＤカルボキシル末端断片上のＬＦおよびＥＦに対する高親和性の結合部位が曝露される（ＰＡ６３）。ＰＡ６３とＬＦまたはＥＦの複合体は細胞に進入し、おそらくは酸性化エンドソームを通ってサイトゾルへと到達する。
【０１９６】
米国特許第５，６７７，２７４号は、フリン切断部位が細胞内のプロテアーゼにより活性化可能な配列で置き換えられる、修飾されたＰＡの使用について教示している。標的細胞に常在するプロテアーゼによって切断されると、切断されたＰＡは、ＰＡおよび標的細胞を死滅させるシュードモナス外毒素等の毒素部分に結合するＬＦのフラグメントから構成される第２の融合タンパク質に対して、高い親和結合性を表す。本発明の一態様においては、フリン切断部位がＨＩＶプロテアーゼ部位と置き換えられ、修飾されたＰＡタンパク質が、ＨＩＶ感染細胞またはＨＩＶプロテアーゼを発現する細胞によって特異的に活性化されるようになる。こうして、ＬＦのＰＡ結合領域およびＰＥの転位領域とＡＤＰＲＴ領域から構成される融合タンパク質が、標的細胞に進入して死滅させることが可能になる。他の態様では、修飾されたＬＦを活性化するために２つのタンパク質分解事象が必要となるように、フリン切断配列は、ＨＩＶ切断配列と置き換えられる。
【０１９７】
炭疽菌の致死毒素である炭疽菌のプロトキシンも、本発明にしたがって採用され得る。炭疽菌の致死毒素は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）に特異的なプロテアーゼである触媒部分と、細胞標的および転位部分の、２つの成分を有する。後者は、防御抗原と呼ばれ、炭疽毒素受容体として知られる広く分布した細胞表面標的中の細胞を結合させる。フリン様認識配列ＲＫＫＲ（配列番号：４９）でのタンパク質分解的切断による活性化に続いて、防御抗原の１６４〜１６７に及ぶ残基である阻害フラグメントが遊離し、残りの防御抗原フラグメントが、その後取り込まれる３つの触媒部分に結合する七量体を形成する。活性化した防御抗原は、エンドソームの酸性環境で孔を形成して有毒な触媒部分を細胞に進入させ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）の切断を引き起こし、細胞周期停止をもたらす。防御抗原は炭疽菌の浮腫因子にも結合することができ、致死毒素やＰＥＡ等他の毒素の融合タンパク質が当該技術分野において例示されている（Ｌｉｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７６（２１）：１７９７６−８４（２００１））。
【０１９８】
したがって、フリン様認識配列を外因性プロテアーゼの認識配列と交換することにより、第２のプロトキシン活性化部分によって活性化可能なプロトキシンを生じる結果となる。内因性の受容体結合ドメインを、治療目的に望ましい標的に特異的である細胞標的結合部分と交換することにより、特定の細胞を標的とするように防御抗原を生成することができる。
【０１９９】
ＡＢ毒素
当該技術分野で周知である、本発明の目的に特に適した多種類の細菌毒素は、ＡＢ毒素として知られる。ＡＢ毒素は、細胞標的および転位ドメイン（Ｂドメイン）と、酵素的に活性なドメイン（Ａドメイン）から構成され、活性化配列に対する内因性標的細胞プロテアーゼの作用に続いて、細胞質への転位を引き起こす。
【０２００】
したがって、ＡＢ毒素であるボルデテラ皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）、大腸菌細胞毒性壊死因子１または２（ＣＮＦ１またはＣＮＦ２）、およびエルシニア細胞毒性壊死因子（ＣＮＦＹ）が、本発明の目的のために用いられ得る。これらの毒素は構造および作用の機構において類似している（ＨｏｆｆｍａｎｎおよびＳｃｈｍｉｄｔ、Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １５２：４９−６３（２００４））。ＤＮＴは、ＧＴＰアーゼＲｈｏをポリアミン化または脱アミド化することにより不活性化する、トランスグルタミナーゼである（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７４（４５）：３１８７５−８１（１９９９）、ＦｕｋｕｉおよびＨｏｒｉｕｃｈｉ，  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （Ｔｏｋｙｏ）．  １３６（４）：４１５−９（２００４））。ＣＮＦ１、ＣＮＦ２およびＣＮＦＹは、Ｇｌｎ６３またはＧＴＰアーゼＲｈｏを脱アミド化するデアミダーゼである（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７（６６３４）：７２５−９（１９９７）、Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １５２：４９−６３（２００４））。ＤＮＴは、Ｂドメインとして知られるＮ末端の膜標的ドメイン、フリン様プロテアーゼ切断部位、転位ドメイン、および触媒ドメインから成り、細胞質に進入するには、ＤＮＴはその標的細胞に結合し、内部移行および切断を経て、膜を横断して転位しなくてはならない（ＦｕｋｕｉおよびＨｏｒｉｕｃｈｉ、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （Ｔｏｋｙｏ）．  １３６（４）：４１５−９（２００４））。本発明によると、Ｂドメインが異種の細胞を標的とする部分によって置き換えられたか、または異種の細胞を標的とする部分がインタクトなＢドメインに加えられた、およびフリン様プロテアーゼ切断部位を外因性活性化因子によって修飾することができる修飾可能な活性化配列と置き換えられた、修飾ＤＮＴが提供され得る。ＣＮＦＹおよびＣＮＦ１は、分子中に均一な分散パターンで、６１％の配列同定を示す。ＣＮＦＹおよびＣＮＦ１は、ＲｈｏＡの同じ残基を標的にするが、細胞に進入するためには異なる細胞表面受容体を用いる（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ７５（７）：３３４４−５３（２００７））。酸性のエンドソーム区画を通って進入が行われるようである（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ７５（７）：３３４４−５３（２００７））。本発明によると、内因性の細胞標的ドメインが異種の細胞を標的とする部分によって置き換えられたか、または異種の細胞を標的とする部分が内因性の細胞−標的ドメインに加えられ、かつフリン様プロテアーゼ切断部位が、外因性活性化因子を用いて修飾され得る修飾可能な活性化配列によって置き換えられた、修飾ＤＮＴ、ＣＮＦ１、ＣＮＦ２またはＣＮＦＹが提供され得る。
【０２０１】
クロストリジウム属のグルコシル化細胞毒素も、本発明の目的のために用いられ得る。このファミリーの毒素は、毒素の酵素部分が細胞質内への内部移行および転位に続いて、グルコースまたはＮ−アセチルグルコサミンをＲｈｏファミリーのＧＴＰアーゼに転移する（ＳｃｈｉｒｍｅｒおよびＡｋｔｏｒｉｅｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １６７３（１−２）：６６−７４（２００４））。ＡＢ毒素と同様に、グルコシル化細胞毒素は、タンパク質分解的切断を起こし、触媒のＮ末端を宿主内に転移する（Ｐｆｅｉｆｆｅｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７８（４５）：４４５３５−４１（２００３））。
【０２０２】
さらなる修飾
上記の他に、凝集を防ぐ添加剤の存在下において変性剤の急速希釈または段階的な除去を行うことにより、不溶性毒素のリフォールディングを通して機能的毒素が生成され得る（Ｍｉｄｄｅｌｂｅｒｇ．  ２００２．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：４３７−４３）。
【０２０３】
再構築した毒素は、精製されたサンプルを得るために親和性クロマトグラフィー法を用いることができるコードした親和性タグを有し得る。これらのタグは、精製のために用いることができ、またある態様の可溶性の発現においても助けとなる場合がある。例として、ヒスチジンタグ、アビジン／ストレプトアビジン相互作用配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、およびＦＬＡＧコード配列タグが含まれるが、これらに限定されない。プロトキシンは、ゲル濾過、イオン交換、金属キレート化、および親和性精製等、当該技術分野において既知である標準的な技術を用いて宿主細胞から精製され得る。任意選択的に置換された細胞を標的とする部分が、適切に機能するために孔形成剤に構造上の遊離または空間的隔離を提供するリンカーによって、孔形成剤に付着され得る。このリンカーは、ポリペプチドであり得、ＮもしくはＣ末端で、または曝露されたループ等の内部の位置で、遺伝子融合の手段によってＤＮＡ上に直接コードされてもよい。リンカーは、トランスグルタミナーゼまたはソルターゼＡ等の架橋酵素に対する標的配列等の結合または制御部分への付着を可能にする、特異的特徴を有し得る（コンジュゲーション方法を参照）。リンカーは、ポリエチレングリコール基または長鎖炭化水素等の合成物質であり得、アルキル化またはトランスグルタミナーゼ反応等の化学的または酵素的手段によって、毒素（孔形成剤）に付着され得る。リンカーは、毒素または細胞を標的とする部分のいずれかと共有結合的に会合する必要はない。その会合が活性化の際に毒素の妨害にならない限り、相互作用は、金属キレート化、疎水性相互作用、およびビオチン−ストレプトアビジン等の小分子タンパク質相互作用によるものであり得る。
【０２０４】
Ｃ．その他の毒素
ＲＩＰは、リボソームおよび他の基質の触媒の不活性化を引き起こす酵素である。このような毒素は多数の植物中に存在し、また真菌類、藻類、および細菌類にも発見されている。現在ＲＩＰは、酵素活性を有する単一ポリペプチド鎖を含む１型、および２つの異なるポリペプチド鎖（１型ＲＩＰのポリペプチドに対応するＡ鎖、およびレクチン活性を有するＢ鎖）を含む２型の２種類のうち、１つに属すると分類されている。当該技術分野において既知である２型ＲＩＰは、式Ａ−Ｂ、（Ａ−Ｂ）２、（Ａ−Ｂ）４および／またはＡ鎖１本あたり複数のＢ鎖を含むポリマー形態で表すことができる。Ａ鎖とＢ鎖との連結は、ジスルフィド結合によるものである。ＲＩＰの毒素活性は、真核生物リボソームの２８Ｓ  ｒＲＮＡの高度に保存されたループ領域における、特異的アデニン基のＮ−グリコシド結合の加水分解の結果である、翻訳阻害によるものである（Ｇｉｒｂｅｓら、Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４（５）：４６１−７６（２００４））。
【０２０５】
ＲＩＰは、最初は不活性な前駆体の形態で生成されることが多い。例えば、リシンは最初、３５アミノ酸Ｎ末端側のプレ配列と、Ａ鎖とＢ鎖の間の１２アミノ酸リンカーとを有する、単一のポリヌクレオチド（プレプロリシン（ｐｒｅｐｒｏｒｉｃｉｎ））として生成される。リシン前駆体が小胞体内に転位する間に、プレ配列が除去される。その後プロトキシンが、タンパク質粒と呼ばれる特殊な小器官内に転位され、植物プロテアーゼがＡおよびＢ鎖の間のリンカー領域で切断する。米国特許第６，８０３，３５８号は、リシンＡ鎖、リシンＢ鎖、およびペプチドリンカーを切断する腫瘍関連プロテアーゼ（例えばＭＭＰ−９）により選択的に活性化することができる異種のプロテアーゼ感受性ペプチドリンカーを含む、プロトキシンを開示している。
【０２０６】
１型ＲＩＰと２型ＲＩＰのＡ鎖は同じ触媒活性を共有するものの、動物に対するＲＩＰの毒性は極めて多様である。１型ＲＩＰの中には無細胞翻訳系において非常に活性の高いものがあるが、インビボでは、それらの毒性は２型ＲＩＰの毒性よりもはるかに低いものである可能性がある。このことは、レクチン鎖の不在によるものであると考えられ、細胞内への低浸透率の原因となる。毒性の２型ＲＩＰの中で、いくつかの最も強力な毒素が知られているが、毒性の２型ＲＩＰの致死量も、アブリンおよびリシン、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、およびボルケンシンについて報告されている通り、異なる毒素間で大きく異なる可能性がある（Ｂａｔｔｅｌｌｉ  Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４（５）：５１３−２１（２００４））。
【０２０７】
本発明の一態様は、毒素部分、細胞を標的とする部分、その２つの部分を連結する外因性プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーとして、１型ＲＩＰまたは２型ＲＩＰのＡ鎖を含むプロトキシンを用いる。このプロトキシンは、異種のプロテアーゼ切断部位および細胞標的ドメインを切断するプロテアーゼを含む活性化因子とともに使用される。
【０２０８】
本発明の別の態様は、外因性プロテアーゼ感受性部位および細胞を標的とする部分を含むように突然変異させたプレ配列を含有する１型または２型ＲＩＰのＡ鎖を含む、プロトキシンを用いることである。このプロトキシンは、異種のプロテアーゼ切断部位および細胞標的ドメインを切断することができるプロテアーゼを含む活性化因子とともに使用される。
【０２０９】
１型ＲＩＰの例にはブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）、ゲロニン、モモルジン、ＰＡＰ−Ｓ、サポリン−Ｓ６、トリコキリン（ｔｒｉｃｈｏｋｉｒｉｎ）およびモモルコチン（ｍｏｍｏｒｃｏｃｈｉｎ）−Ｓが含まれるが、これらに限定されない。毒性の２型ＲＩＰの例には、アブリン、モデシン、リシン、ビスクミン（Ｖｉｓｃｕｍｉｎ）、およびボルケンシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１０】
細菌源由来の自己作用型ＡＤＰリボシル化毒素に類似して、モンシロチョウ由来のピエリシン−１毒素は、トリプシン感受性部位Ａｒｇ−２３３でタンパク質分解的切断することにより活性化することが可能である。切断によって、増強された細胞溶解活性を示すニックの入った毒素が生じ、ＨｅＬａ細胞に電気穿孔を行った場合はフラグメント１−２３３が細胞毒性を示す（Ｋａｎａｚａｗａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９８（５）：２２２６−３１（２００１））。Ａｒｇ−２３３は、第３のアルギニン残基がＡｒｇ−２３３である配列ＧＧＨＲＤＱＲＳＥＲＳＡＳＳ（配列番号：４０）の予測される不規則なループ内に位置する。ピエリシン−１は、毒素を真核生物膜の標的にするＣ末端のスフィンゴ脂質結合領域を含有し、植物毒素リシンに見られるドメインに類似する４つの反復するレクチン様ドメインから成ると考えられている（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ−Ｈｉｂｉｙａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００３  Ｍａｒ  １４；２７８（１１）：９９７２−８）。糖質結合モチーフを有すると考えられるトリプトファン残基の突然変異は、毒素の活性を減少させる（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ−Ｈｉｂｉｙａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００３  Ｍａｒ  １４；２７８（１１）：９９７２−８）。よって、毒素を新しい細胞表面標的に再誘導することは、外因性細胞を標的とする部分を操作したピエリシン−１の変異体、またはコード配列に対する変異修飾の結果として糖質結合力を欠如する関連毒素を加えることにより、実現可能である。このような再誘導されたピエリシンは、アルギニンの豊富なＲＤＱＲＳＥＲ（配列番号：４１）配列を、外因性活性化因子によって活性化され得る修飾可能な活性化部分と交換するために、活性化部分においてさらに修飾することができる。
【０２１１】
Ｄ．毒素の修飾および融合タンパク質の発現方法
再構築した孔形成毒素を様々な宿主系において発現させることは、当該技術分野において周知である。一態様においては、通常、天然毒素が見られる生物または関連する生物においてプロトキシンが生成され得る。生成プロセスを簡素化するために、標準的な分子生物学の手引書に記載されるように、大腸菌、酵母（例えば、ピキアパストリス、クルイベロミセスラクチス）、昆虫細胞、インビトロ翻訳システム、および哺乳類細胞（例えば、２９３、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ）等の異種の発現系において、再構築された毒素を生成することもできる。転写制御因子および転写シグナルは、様々な異種の発現系を伴う市販のベクターシステム内に組み込むことが可能である。毒素の発現は、シグナルペプチドの操作によって宿主細胞の細胞内または細胞外区画を標的とすることができる。再構築された毒素は、異なった発現系におけるフラグメントにおいて発現されてもよく、または合成的に生成された後で、精製された成分を用いて機能的な再構築された孔形成毒素に再構成されてもよい。
【０２１２】
大きな融合タンパク質を可溶性の形態で発現させることが困難であるため、これらの融合タンパク質の異なるドメインを、化学的なコンジュゲーションまたは酵素的ライゲーションの後に、別個に発現させることが有利である場合がある。毒素融合またはプロテアーゼ融合のいずれかを、この方策を用いて調製することができる。例えば、アエロリジンの小葉と大葉を置き換える細胞を標的とする部分は、適切にタグ付けされたサブユニットにおいて発現され得、その後、天然の化学ライゲーション（Ｙｅｏら、Ｃｈｅｍ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  １０：４６６４（２００４））、γ−グルタミン−ε−リシル結合の形成によるトランスグルタミナーゼ触媒ライゲーション（Ｏｔａら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ５０（２）：１９３（１９９９））、および配列特異的なペプチド転移によるソルターゼ媒介ライゲーション（Ｍａｏら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２６：２６７０（２００４））等、タンパク質コンジュゲーションおよびライゲーションの様々な方法を用いて架橋することができる。
【０２１３】
他の態様では、凝集を防ぐ添加剤の存在下で変性剤の急速希釈または段階的な除去を行うことにより、不溶性毒素のリフォールディングを通して機能的毒素を生成することができる。
【０２１４】
ＩＩＩ．プロトキシン活性化因子融合タンパク質構築物
上述のように、本発明は、細胞を標的とする部分および修飾ドメインを含有する、プロトキシン活性化因子融合タンパク質を特徴とする。好ましい態様において、修飾ドメインは外因性プロテアーゼの活性を含む。
【０２１５】
Ａ．外因性プロテアーゼの選択
外因性プロテアーゼおよび対応する切断部位は、以下の検討事項に基づいて本発明のために選択することができる。プロテアーゼは、好ましくは、プロトキシンまたはプロテアーゼ自体を著しく不活性化することなく、プロトキシン活性化部分を切断することができる。プロテアーゼは、好ましくは、残すことが所望される細胞中または細胞上に天然では認められないが、例外として、天然の位置が、外的に投与されたプロトキシンを活性化することを不可能にする場合には、このような細胞に天然で認められてもよいものとする。例えば、毒素が、細胞の表面または細胞内プロテアーゼ（エンドソーム、ゴルジ、または小胞体）を天然では含有しない細胞内小胞区画で活性化されなければならない場合には、カスパーゼ等の細胞内プロテアーゼを用い得る。このような場合には、残すことが所望される細胞はプロテアーゼを含有し得るが、そのプロテアーゼはプロトキシンを活性化させない。
【０２１６】
プロテアーゼの触媒活性は、好ましくは、インビボでその治療効果を発揮するために必要な時間の間、インビボ条件に対して安定である。治療プログラムがプロテアーゼの反復投与を必要とする場合、プロテアーゼは、その機能を低下させる抗体（例えば、中和抗体）の形成による干渉に耐性を示す。ある態様において、プロテアーゼは、免疫原性が低いか、または免疫原性を低下させるために任意選択的に置換され得るか、または抗体がその活性に与える影響を減少させるために任意選択的に置換され得る。プロテアーゼは、好ましくは、それ自体が低毒性であるか、または１つまたは複数の細胞表面結合部分との作用可能な連結の形態において低い毒性を有する。プロテアーゼは、好ましくは、治療薬の製造および流通に関連する条件に対して安定であるか、または安定するようにすることができる。プロテアーゼは、好ましくは、天然プロテアーゼ、修飾プロテアーゼ、または人工酵素である。
【０２１７】
本発明の望ましいプロテアーゼは、拡張された触媒部位、または適当な特異性を有する比較的非選択的な特異的基質認識モジュールの存在のいずれかによって、高度に特異的な基質選択性を持つことで知られるプロテアーゼを含む。選択性の限られたプロテアーゼも、遺伝子の突然変異または基質結合ポケットに近い残基の化学的修飾によって、より選択的にすることも可能である。
【０２１８】
当該技術分野において既知であるように、多くのプロテアーゼが特定の切断部位を認識し、特異的な、制限されないいくつかの例を以下に示す。当業者は、列記された以外の切断部位が、列記されたプロテアーゼによって認識されること、また本発明にしたがって一般的なプロテアーゼ切断部位として用いられてもよいことを理解するだろう。
【０２１９】
免疫原性のリスクが低いことから、ヒト由来のプロテアーゼは、本発明の好ましい態様である。あらゆる酵素機構、すなわち、アミノ酸残基またはペプチドおよびタンパク質の加水分解に関与する活性部位の補助因子の性質を利用するヒトプロテアーゼ（アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、およびスレオニンプロテアーゼを含む）が、本発明に有用である可能性がある。
【０２２０】
ヒトにおける臨床治験の前に、毒性、有効性、および薬物動態等の特性を決定するために、潜在的な治療剤のモデル研究が動物において実行されなければならないので、動物の血漿におけるプロテイナーゼ阻害物質の存在も、タンパク質分解活性を有する治療薬の開発を制限することがある。動物血漿中のプロテイナーゼ阻害物質は、ヒトとは異なる阻害特性を有し得る。例えば、ヒトＧｒＢは、培養セルトリ細胞によって分泌され、マウス血漿中に存在するｓｅｒｐｉｎａ３（α１−抗キモトリプシン）の主成分であるマウスｓｅｒｐｉｎａ３ｎ（セリン／システインプロテアーゼ阻害物質）により阻害されることが分かっている（Ｓｉｐｉｏｎｅら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７：５０５１−５０５８（２００６））。しかしながら、ヒトα１−抗キモトリプシンがヒトＧｒＢの阻害物質であることは明らかになっていない。マウスとヒトの血漿プロテアーゼ阻害物質の違いは、それらの遺伝的相違に端を発する可能性がある。主要なヒト血漿プロテアーゼ阻害物質であるα１−アンチトリプシンおよびα１−抗キモトリプシンは、各々が単一の遺伝子によってコードされるのに対し、マウスにおいては、それらは、それぞれ５および１４遺伝子のクラスターによって表される。これらの阻害物質のクラスターに高度で全体的な配列類似性があったとしても、標的プロテアーゼの特異性を決定する反応中心ループ（ｒｅａｃｔｉｖｅ−ｃｅｎｔｅｒ  ｌｏｏｐ  （ＲＣＬ））ドメインが著しく多岐に富んでいる。マウスプロテアーゼによる阻害を克服するために、選択される動物モデルに存在する阻害物質による阻害に対する耐性を持つ突然変異プロテアーゼを同定するのに、本明細書に記載するスクリーニングおよび突然変異誘発方策を適用することができる。
【０２２１】
ヒトグランザイム
組換えヒトグランザイムＢ（ＧｒＢ）は、プロテアーゼ融合タンパク質内で外因性プロテアーゼとして用いられ得る。ＧｒＢは、ＩＥＰＤのコンセンサスな認識配列に対する高い基質配列特異性を有し、限定された数の天然の基質のみを切断することで知られている。ＧｒＢは細胞毒性Ｔリンパ球および天然のキラー細胞の細胞質顆粒中に認められるため、これらの細胞が標的細胞ではない限り、本発明に有用であるはずである。ＧｒＢ活性に最適なｐＨは約ｐＨ８であるが、ｐＨ５．５〜ｐＨ９．５の間でその活性を保持する（Ｆｙｎｂｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ３９：２０９（２００５））。ＧｒＢは、ＩＥＰＤを含有するペプチドを高い効率および特異性で切断する（Ｈａｒｒｉｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：２７３６４（１９９８））。ＧｒＢはプログラム細胞死の制御に関与するため、インビボにおいては厳重に制御される。また、ＧｒＢは一本鎖であり単一ドメインのセリンプロテアーゼであるため、融合タンパク質の簡素な複合構造に寄与することがあり得る。さらに、ＧｒＢは一般に非常に安定しており、異なる融合タンパク質の切断において非常によく機能することが最近明らかになっている（Ｆｙｎｂｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ３９：２０９（２００５））。
【０２２２】
セリンプロテアーゼのグランザイムファミリーのうちいずれのメンバー（例えば、グランザイムＡおよびグランザイムＭ）が、本発明におけるプロテアーゼ融合の組換えプロテアーゼ成分として用いられ得る。例えば、グランザイムＭ（ＧｒＭ）は、天然のキラー細胞の顆粒内に特異的に認められ、高い効率および特異性でペプチド配列ＫＶ（Ｙ）ＰＬ（Ｍ）を加水分解することができる（Ｍａｈｒｕｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：５４２７５（２００４））。
【０２２３】
本発明のプロテアーゼ融合物を設計および活用するにあたり、プロテイナーゼ阻害物質が、プロテアーゼ融合タンパク質のタンパク質分解活性を妨害する可能性があることを留意しなければならない。例えば、ＧｒＢは、主に細胞毒性リンパ球中に存在するセルピンスーパーファミリーのメンバーであり、ヒト血漿中に検出されている、細胞内プロテイナーゼ阻害物質９（ＰＩ−９）によって特異的に阻害される（Ｓｕｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：２７８０２（１９９６））。ＧｒＢは、ヒト血漿中に存在するα１−プロテアーゼ阻害物質（α１ＰＩ）によっても阻害され得る（Ｐｏｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：９８（１９９１））。ＧｒＭは、α１−抗キモトリプシン（ＡＣＴ）およびα１ＰＩによって阻害され（Ｍａｈｒｕｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：５４２７５（２００４））、ＧｒＡはプロテアーゼ阻害物質である抗トロンビンＩＩＩ  （ＡＴＩＩＩ）およびα２−マクログロブリン（α２Ｍ）によりインビトロで阻害される（Ｓｐａｅｎｙ−Ｄｅｋｋｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ９５：１４６５（２０００））。これらのプロテイナーゼ阻害物質は、ヒト血漿中にも存在する（ＴｒａｖｉｓおよびＳａｌｖｅｓｅｎ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５２：６５５（１９８３））。
【０２２４】
成熟したかつ活性である形態のＧｒＡが、顆粒関連プロテオグリカンであるセルグリシンとの複合体としてヒト血漿中に観察されていることから、グランザイムのタンパク質分解活性を保存するための１つのアプローチは、プロテオグリカンとの複合体形成を利用することである（Ｓｐａｅｎｙ−Ｄｅｋｋｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ９５：１４６５（２０００））。ＧｒＢのグリコサミノグリカン複合体も、タンパク質分解性に活性であることが分かっている（Ｇａｌｖｉｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６２：５３４５（１９９９））。したがって、コンドロイチンサルフェートを用いた製剤によって、血漿中でグランザイム融合タンパク質を活性に保つことができる可能性がある。
【０２２５】
カテプシンおよびカスパーゼ
カテプシンのいずれのメンバーも（Ｃｈｗｉｅｒａｌｓｋｉら、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  １１：１４３（２００６））、例えば、カテプシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｓ、Ｗ、およびＸが、本発明のための組換えプロテアーゼとして用いられ得る。カテプシンは、生理学的な条件下でリソソーム内に局在するプロテアーゼあり、したがって、酸性環境において最適な活性を有する。カテプシンは異なった酵素分類のプロテアーゼを含む。例えば、カテプシンＡおよびＧはセリンプロテアーゼであり、カテプシンＤおよびＥはアスパラギン酸プロテアーゼである。特定のカテプシンは、アポトーシスの開始および実行フェーズにおいて中心的役割を果たすシステインプロテアーゼの独特のファミリーであるカスパーゼである。既知の哺乳類プロテアーゼ全部の中で、セリンプロテアーゼグランザイムＢのみが、カスパーゼに類似した基質特異性を有する。
【０２２６】
カテプシンまたはカスパーゼは、活性化されるプロトキシンが内部移行（内部移行されなければならない毒素の場合）の前に、または活性毒素が天然で形成する間に、そのカテプシンまたはカスパーゼに曝露されていない場合にのみ、外因性の活性化因子またはプロアクチベーターとして用いられ得る。例えば、孔形成毒素のプロトキシンは、細胞表面で活性化された後にオリゴマー形成および孔形成される。孔形成毒素はリソソームに局在しないため、カテプシンおよびカスパーゼは外因性の活性化因子として適用され得る。一方、ＡＢ毒素のＤＴは、カテプシンが天然に常在するエンドソームおよび／またはリソソームを介してサイトゾルに直接的に転位されることが分かっているため、カテプシンはＤＴに基づくプロトキシン向けの外因性活性因子として用いられるべきではない。ＰＥＡ等他のＡＢ毒素は、サイトゾル内に転位する前にトランスゴルジ網およびＥＲに輸送されるため、外因性活性化因子としてのリソソームのプロテアーゼの使用に適合性を示す可能性がある。カテプシンまたは他のリソソームのプロテアーゼを外因性活性化因子として利用することができる細菌毒素には、ＰＥＡ、志賀毒素、コレラ毒素、および百日咳毒素を含むが、これらに限定されない。このような使用に適さない細菌毒素はＤＴ、炭疽毒素、およびクロストリジウム神経毒を含む（ＦａｌｎｅｓおよびＳａｎｄｖｉｇ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０００，  １２（４）：４０７−１３）。
【０２２７】
カスパーゼ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９等を含むすべてのカスパーゼは高い選択性を示し、アスパラギン酸残基に隣接するタンパク質を切断する（ＴｉｍｍｅｒおよびＳａｌｖｅｓｅｎ、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆ．  １４：６６−７２（２００７））。カスパーゼ−１、−４、−５、および−１４のための好ましい切断部位は、Ｘが任意の残基でありΦがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＡｓｎを表す（Ｗ／Ｙ）ＥＸＤ↓Φである（配列番号：５０）。カスパーゼ−８、−９、および−１０の好ましい基質は（Ｉ／Ｌ）ＥＸＤ↓Φ（配列番号：５１）の配列を含有し、カスパーゼ−３および−７の好ましい基質はＤＥＸＤ↓Φ（配列番号：５２）を含有する。カスパーゼ−６は、好ましくはＶＥＸＤ↓Φ（配列番号：５３）で切断するのに対し、カスパーゼ−２は選択的に（Ｖ／Ｌ）ＤＥＸＤ↓Φ（配列番号：５４）を標的にする。カスパーゼの天然に存在する阻害物質（例えばＩＡＰ）は通常細胞内に位置するため（ＬｅＢｌａｎｃ，  Ｐｒｏｇ．  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２７：２１５（２００３））、血漿中の阻害確率は激しく減少される。カスパーゼ−１およびカスパーゼ−４は、ＰＩ−９によって適度な速度で阻害され得るが、カスパーゼ−３を阻害しない（Ａｎｎａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３４２：６５５（１９９９））。
【０２２８】
その他のヒトプロテアーゼ
疾病細胞によって分泌される特定の疾病マーカーとして同定された、または癌の浸潤および転移に関連するプロテアーゼを含む、多くのヒトプロテアーゼは、異種のプロテアーゼとして本発明に有用である可能性がある。これらのプロテアーゼは、十分に研究されており、タンパク質分解活性および配列選択性に関する詳細な情報が入手可能である。このようなプロテアーゼの例には、ＧＳＧＲ↓ＳＡ（配列番号：５５）を認識して切断するウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、基質配列ＳＳ（Ｙ／Ｆ）Ｙ↓ＳＧ（配列番号：５６）を好むプロテアーゼ特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＰＦＨＬ↓ＶＩＨ（配列番号：５７）で切断するレニン、およびＨＰＶＧ↓ＬＬＡＲ（配列番号：５８）で切断することができるＭＭＰ−２を含む。さらなる例には、カスパーゼ、エラスターゼ、カリクレイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリー、プラスミノーゲン活性化因子ファミリー、および線維芽細胞活性化タンパク質を含む。
【０２２９】
特定の場合において、ある疾病に関与するプロテアーゼは、その過剰発現に通常は関与しない別の疾病の治療に有用である可能性がある。他の場合において、天然レベルで分泌されたプロテアーゼの濃度が、標的とする細胞死滅に必要である範囲まで、対応する毒素融合を活性化するためには十分ではない、すなわち、標的細胞上で作用可能に存在しない可能性がある。標的とするプロテアーゼ融合によって細胞に送達された追加のタンパク質分解活性は、所望の毒素活性化を提供するであろう。一態様においては、プロテアーゼ融合は、疾病細胞によって分泌されたプロテアーゼと同じ配列特異性を有することがあり得る。他の態様では、全体的な切断効率を高めるために、タンパク質分解活性のうちの少なくとも１つが標的プロテアーゼ融合により提供される、複数の異なるタンパク質分解的切断の活性化の組み合わせを用いることが望ましい可能性がある。
【０２３０】
内因性のプロテアーゼのさらなる例は、特定の疾病において上方制御された、特定の疾病マーカーとして同定されたプロテアーゼを含む。このようなプロテアーゼの制限されない例は、ＧＳＧＲ↓ＳＡ（配列番号：５５）を認識して切断するウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、基質配列ＳＳ（Ｙ／Ｆ）Ｙ↓ＳＧ（配列番号：５６）を好むプロテアーゼ特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＰＦＨＬ↓ＶＩＨ（配列番号：５７）で切断するレニン、およびＨＰＶＧ↓ＬＬＡＲ（配列番号：５８）で切断することができるＭＭＰ−２を含む。
【０２３１】
代替として、これらのプロテイナーゼ阻害因子による潜在的な合併症を避けるために、血漿中の既知であるプロテイナーゼ阻害因子またはヒト血漿との相互作用によって、潜在的な候補プロテアーゼがインビトロでスクリーニングされ得る。代替として、血漿中に同族の阻害因子が認められるプロテアーゼは、阻害に耐える突然変異形態を提供するために操作され得る。例えば、既知のＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害因子に対する耐性を示す突然変異プロテアーゼを選択するために、インビトロでの大腸菌発現スクリーニング法が開発されている（Ｍｅｌｎｉｃｋら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：３２５６（１９９８））。
【０２３２】
レトロウイルスプロテアーゼも、本発明において用いることができる。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）（Ｂｅｃｋら、２００２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）（Ｓｈｕｋｅｒら、Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １０：３７３（２００３））のそれを含むヒトレトロウイルスプロテアーゼは、抗ウイルス療法の標的として広範囲に渡って研究されてきた。これらのプロテアーゼは、長い認識配列および高い基質選択性を有することが多い。
【０２３３】
ピコルナウイルスプロテアーゼも、本発明において用いることができる。例えば、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）等のこのようなピコルナウイルスプロテアーゼは、抗ウイルス療法の標的として研究されてきた（Ｂｉｎｆｏｒｄら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４９：６１９  （２００５））。
【０２３４】
いかなる由来の異種組換えプロテアーゼも、前述の品質を有するように操作され得、また本発明において用いることができる。例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼは、非常に高い基質特異性および触媒効率を有しており、組換えタンパク質からペプチドタグを除去するためのツールとして幅広く使用されている（Ｎｕｎｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３５０：１４５（２００５））。ＴＥＶプロテアーゼは、タンパク質の接合部に存在する、拡張された７つのアミノ酸残基の長いコンセンサス配列Ｅ−Ｘ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｑ↓Ｓ／Ｇ（Ｘは任意の残基である）（配列番号：５９）を認識する。当業者は、その配列特異性が別の基質配列を好むように変更されるよう、特定のプロテアーゼを操作することが可能であることを理解するであろう（Ｔｏｚｓｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７２：５１４（２００５））。
【０２３５】
プロテアーゼの活性および／または特異性を高めるために、さらなる修飾が行われ得る。これらの修飾は、血清に対する安定性を高めるまたは免疫原性を低下させるためのＰＥＧ化を含み、遺伝子操作／選択は、特定の阻害因子に対する耐性、向上した熱安定性、および改良された溶解性等、変更された特性を有する突然変異プロテアーゼを生成することができる。
【０２３６】
さらなるヒトプロテアーゼを表２に示す。
【０２３７】
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【０２３８】
レトロウイルスプロテアーゼ
組換えヒトレトロウイルスプロテアーゼも、本発明に用いられ得る。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）（Ｂｅｃｋら、２００２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）（Ｓｈｕｋｅｒら、Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １０：３７３（２００３））、および重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスのプロテアーゼを含むヒトレトロウイルスプロテアーゼは、抗ウイルス療法の標的として広範囲にわたって研究されてきた。これらのプロテアーゼは、長い認識配列および高い基質選択性を有することが多い。例えば、ＳＱＮＹ↓ＰＩＶ（配列番号：６０）は、ＨＩＶ−１プロテアーゼの好ましい切断配列として確定され（Ｂｅｃｋら、Ｃｕｒｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓｏｒｄ．  ２（ｌ）：３７−５０（２００２）、ＨＴＬＶプロテアーゼの好ましい切断配列はＰＶＩＬ↓ＰＩＱＡ（配列番号：６１）であると確定されている（Ｎａｋａら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  １６（１４）：３７６１−３７６４（２００６）。
【０２３９】
コロナウイルスプロテアーゼ
コロナウイルスまたはトロウイルスプロテアーゼは、動物ウイルスのファミリーであるコロナウイルス科のメンバーによってコードされ、高い切断特異性を示す。このようなプロテアーゼは、本発明の別の好ましい態様である。ＳＡＲＳ３Ｃ様プロテアーゼは、ＡＶＬＱ↓ＳＧＦ（配列番号：６２）で選択的に切断するということが分かっている（Ｆａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３２９（３）：９３４−９４０（２００５））。
【０２４０】
ピコルナウイルスプロテアーゼ
ピコルナウイルスプロテアーゼも、本発明に用いられ得る。例えば、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）等のこのようなピコルナウイルスプロテアーゼは、抗ウイルス療法の標的として研究されてきた（Ｂｉｎｆｏｒｄら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４９：６１９（２００５））。ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼは、ＡＬＦＱ↓ＧＰ（配列番号：６３）を認識して切断する（Ｃｏｒｄｉｎｇｌｅｙら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５（１６）：９０６２−９０６５（１９９０））。
【０２４１】
ポティウイルスプロテアーゼ
ポティウイルスプロテアーゼは、動物ウイルスのファミリーであるポティウイルス科のメンバーによってコードされ、高い切断特異性を示す、本発明の別の好ましい態様である。例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼは、非常に高い基質特異性および触媒効率を有しており、過剰発現した組換えタンパク質からペプチドタグを除去するためのツールとして幅広く使用されている（Ｎｕｎｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３５０：１４５（２００５））。ＴＥＶプロテアーゼは、タンパク質の接合部に存在する、拡張された７つのアミノ酸残基の長いコンセンサス配列Ｅ−Ｘ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｑ↓Ｓ／Ｇ（Ｘは任意の残基である）（配列番号：５９）を認識する。当業者は、その配列特異性が別の基質配列を好むように変更されるよう、特定のプロテアーゼを操作することが可能であることを理解するであろう（Ｔｏｚｓｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７２：５１４  （２００５））。
【０２４２】
その他の起源のプロテアーゼ
プロテアーゼは、生理学的に生命体にとって必要であるため、遍在性であり、植物、動物、および肉眼で見える生物等、多種多様な源に認められる（Ｒａｏら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６２（３）：５９７−６３５（１９９８））。これらのプロテアーゼはすべて、本発明のための潜在的な候補である。好ましい態様において、本発明のための融合プロテアーゼ（特に非ヒト由来である）の免疫学的潜在性を低下させるために、ＰＥＧ化が利用されてもよい。ＰＥＧ化は、血漿中残留性の改良や非特異的細胞結合の減少等、プロテアーゼ融合タンパク質に付加的な利益を与える可能性がある。
【０２４３】
Ｂ．組換えＤＮＡ構築物の設計および配列修飾
ＤＴ融合タンパク質等の融合タンパク質の構築および配列修飾について上述した方法は、特異的にジフテリア毒素向けの技術を除いて、一般にプロテアーゼ融合タンパク質の構築にも適用可能である。天然で認められる多くのプロテアーゼは、チモーゲンとして、すなわち、阻害ペプチドが活性部位に結合してその活性部位をマスクする、または阻害ペプチドの存在が活性部位の構造を変更するために活性部位が非機能的になりかねない、触媒的に不活性な形態として合成されている。チモーゲンは、典型的には、阻害ペプチドの切断および放出によって活性化される。本発明の一態様においては、プロトキシン活性化因子の外因性プロテアーゼは、チモーゲンの形態であり、別の外因性プロテアーゼまたは内因性のプロテアーゼによって活性化され得る。一次配列における阻害ペプチドの位置に依存して、このようなチモーゲンは有利にＮ末端に位置するか（阻害ペプチドがチモーゲンのＮ末端に位置する場合）またはＣ末端に位置する（阻害ペプチドがチモーゲンのＣ末端に位置する場合）かのいずれである。プロトキシン活性化因子のプロテアーゼ部分が、細胞を標的とする部分に化学的または酵素的結合によって連結している場合は、ＮまたはＣ末端以外の位置で起こる細胞を標的とする部分への作用可能な連結の結果として、末端のいずれかまたは両方が遊離している可能性があるため、阻害ペプチドはＮ末端またはＣ末端のいずれかに位置している場合がある。
【０２４４】
したがって、本発明の一態様は、別のプロテアーゼによって活性化されてもよい組換えプロトキシンプロアクチベーターを含む。このようなプロトキシンプロアクチベーターは、阻害ペプチド、修飾可能な活性化部分、プロテアーゼ部分、および細胞を標的とする部分を含む。阻害ペプチドは、活性型プロテアーゼ融合を得るために修飾可能な活性化部分を直接的または間接的に切断する、修飾可能な活性化部分の修飾によって除去される。
【０２４５】
多くのチモーゲンは、活性部位の基質結合間隙を阻害ペプチドが物理的に占有し、阻害ペプチドを放出する切断部位が間隙の遠位に位置する活性のある酵素部分を含む。活性部位がポリペプチド鎖Ｎ末端の残基から成り、αアミノ基が活性部位求核剤または酵素有効性の重要な決定因子を含むプロテアーゼ類のメンバーの中で、人工チモーゲンは、プロテアーゼ切断部位をＮ末端に直接付加することにより形成され得る。このような場合には、活性化プロテアーゼが、認識部位と所望のＮ末端残基との間の結合を切断する能力を持たなければならない。好ましい態様において、活性化プロテアーゼは、切断位置のすぐ後にある残基についての配列必要条件を持たないか、または切断位置のすぐ後にある残基が成熟プロテアーゼのＮ末端に常在する残基と同じである基質を優先的に切断する。修飾可能な活性化部分およびその対応する切断部位を直接的に切断する活性化プロテアーゼの例には、第Ｘａ因子によって標的化されるプロテアーゼ切断部位ＩＥＧＲ↓；エンテロキナーゼによって標的化されるプロテアーゼ切断部位ＤＤＤＤＫ↓（配列番号：２５）を含むが、これらに限定されない。特に、Ｎ末端にＤＤＤＤＫ（配列番号：２５）を含有するＧｒＢ融合は、エンテロキナーゼを用いた治療によって生成および活性化することができる。特に、ＧｒＢ−抗ＣＤｌ９、ＧｒＢ−抗ＣＤ５、およびＧｒＢ−（ＹＳＡ）２の融合はそのように構築される。
【０２４６】
本発明の他の態様では、プロアクチベーターは、標的細胞に内因性であるタンパク質分解活性によってインビボで活性化され得る。このような内因性プロテアーゼの一例は、様々な哺乳類細胞内に遍在的に発現するエンドソームプロテアーゼである、フリンである。特に、ＲＶＲＲ↓（配列番号：６４）等のフリン認識部位は、細胞表面の近傍にあることまたは内部移行によって活性化されるチモーゲンを提供するために、天然のチモーゲン切断部位に取って代わる可能性がある。Ｎ末端残基が活性部位の重要な決定因子を含むプロテアーゼの場合は、このようなフリン認識部位はプロアクチベーターのＮ末端に直接的に付加され得る。例えば、フリン切断部位は、天然で活性化可能なプロアクチベーターを提供するために、グランザイムＢまたはグランザイムＭのＮ末端に加えられてもよい。特に、Ｃ末端１２残基の細胞標的ＹＳＡペプチド２つおよびＮ末端フリン切断部位を含有するＧｒＢ融合構築物は、ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２の生成のために調製される（図２０）。
【０２４７】
フリン切断部位を含有するプロトキシンプロアクチベーターは、好ましくは、天然のフリン活性を含有しない発現系において（例えば、大腸菌において）生成される。内部移行プロセス中に細胞内フリンによって標的ヒト細胞内で活性化可能なプロトキシンプロアクチベーターは、天然で活性化可能なプロトキシンプロアクチベーターの一例である。プロトキシン活性化因子と比較した際のこのようなプロトキシンプロアクチベーターの重要な利点の１つは、プロトキシンプロアクチベーターは、簡素化された治療薬送達のためにプロトキシンと組み合わせてもよいということである。このようなプロトキシンとプロトキシンプロアクチベーターとの混合物は、標的細胞上に蓄積される前に、活性の低下を示す。
【０２４８】
標的細胞の内因性プロテアーゼ活性によるタンパク質分解的切断によって活性化されるプロトキシンプロアクチベータータンパク質は、タンパク質分解的切断が、細胞を標的とする部分と触媒または活性化因子部分との間の作用可能な連結を切断するように設計することができる。例えば、翻訳融合において、阻害ペプチドは、細胞を標的とする部分と触媒部分との間に位置する可能性がある。あるいは、化学的または酵素的に誘発された、酵素または活性化因子部分への細胞を標的とする部分の架橋において、酵素または活性化因子部分の阻害にとって機能的に必要とされない阻害ペプチド部分上の残基を介して、架橋が誘発される可能性がある
【０２４９】
プロテアーゼ融合の潜在的副作用を減少するための方策
選択したプロテアーゼに、設計された毒素活性化の他に意図しない生物学的作用を引き起こす能力がある場合、免疫毒素活性化のためのヒトプロテアーゼの適用が合併症を起こす可能性がある。例えば、グランザイムやカスパーゼを含む多くのプロテアーゼは、アポトーシスカスケードへの関与を通して細胞死を促進することが可能である。グランザイムＢおよび細胞表面標的ドメインから成る免疫毒素は、特定の疾病細胞集団に対する細胞毒性薬剤として開発されてきた（Ｌｉｕら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ８：１２５−１３５（２００６），  Ｄａｌｋｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．  １３：５７６−５８５，  Ｚｈａｏら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：２１３４３−２１３４８（２００４），  ＵＳ０７１０１９７７）。本発明に即してこのような潜在的副作用を排除するためには、プロテアーゼ融合タンパク質のために意図する標的として、結合の際に内部移行しない細胞表面標的を用いることが好ましい。このような場合において、プロトキシンの活性化は細胞表面上で達成されてもよいが、単独で作用するプロトキシン活性化因子によって有毒作用は生成されない。
【０２５０】
別のアプローチは、変更された配列特異性を持つように候補プロテアーゼを突然変異させることであり、それにより候補プロテアーゼは天然の切断部位に優先的に結合および切断しなくなる。このような操作されたプロテアーゼは、本来の切断配列でプロセスされるタンパク質分解から下流側の生物学的カスケードが原因となって、低い毒性を有する傾向にある。このような適用に相応しい選択法またはスクリーニング法が開発されており（例えば、Ｓｉｃｅｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：２８２８−２８３３（１９９８）およびＢａｕｍら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：１００２３−１００２７（１９９０））、元のプロテアーゼの天然のタンパク質分解部位とは異なる配列を切断する能力を持つ、突然変異プロテアーゼを選択するために用いられてきた（例えば、Ｏ’Ｌｏｕｇｈｌｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ２３：７６４−７２２（２００６），  Ｈａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３３７：１１０２−１１０６（２００５）、およびＶｅｎｅｋｅｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ９：８５−９３（１９９６））。切断部位と阻害因子ＲＣＬは配列類似性を有することが多いため、プロテアーゼのタンパク質分解特異性を変更することが、既知のプロテイナーゼ阻害因子による阻害に対して耐性をもたらす可能性がある。変更された切断部位、低細胞毒性、および変更された阻害プロフィールの選択またはスクリーニングが同時に実現される例が入手可能である（Ｏ’Ｌｏｕｇｈｌｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ２３：７６４−７２２（２００６））。特に、グランザイムＢは、変更された基質特異性によって自発毒性の低いグランザイムの変更形態を提供するために修飾される。
【０２５１】
プロテアーゼの活性および／または特異性を高めるために、さらなる修飾を行うことが可能である。これらの修飾は、血清に対する安定性を高めるまたは免疫原性を低下させるためのＰＥＧ化を含み、遺伝子操作／選択は、特定の阻害因子に対する耐性、向上した熱安定性、および改良された溶解性等の変更された特性を有する突然変異プロテアーゼを生成することができる。
【０２５２】
血漿および細胞中のプロテイナーゼ阻害物質による阻害を防ぐための方策
本発明のプロテアーゼ融合を設計および活用するにあたり、プロテイナーゼ阻害物質が、プロテアーゼ融合タンパク質のタンパク質分解活性を妨害する可能性があることを留意しなければならない。例えば、ＧｒＢは、主に細胞毒性リンパ球中に存在するセルピンスーパーファミリーのメンバーであり、ヒト血漿中に検出されてきた、細胞内プロテイナーゼ阻害物質９（ＰＩ−９）によって特異的に阻害される（Ｓｕｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：２７８０２（１９９６））。ＧｒＢは、ヒト血漿中に存在するα１−プロテアーゼ阻害物質（α１ＰＩ）によっても阻害され得る（Ｐｏｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：９８（１９９１））。ＧｒＭは、α１−抗キモトリプシン（ＡＣＴ）およびα１ＰＩによって阻害され（Ｍａｈｒｕｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：５４２７５（２００４））、ＧｒＡはプロテアーゼ阻害物質である抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）およびα２−マクログロブリン（α２Ｍ）によりインビトロで阻害される（Ｓｐａｅｎｙ−Ｄｅｋｋｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ９５：１４６５  （２０００））。これらのプロテイナーゼ阻害物質は、ヒト血漿中にも存在する（ＴｒａｖｉｓおよびＳａｌｖｅｓｅｎ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５２：６５５（１９８３））。
【０２５３】
成熟したかつ活性のある形態のＧｒＡが、顆粒関連プロテオグリカンであるセルグリシンとの複合体としてヒト血漿中に観察されていることから、グランザイムのタンパク質分解活性を保存するための１つのアプローチは、プロテオグリカンとの複合体形成を利用することである（Ｓｐａｅｎｙ−Ｄｅｋｋｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ９５：１４６５  （２０００））。ＧｒＢのグリコサミノグリカン複合体も、タンパク質分解的に活性であることが分かっている（Ｇａｌｖｉｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６２：５３４５  （１９９９））。したがって、コンドロイチンサルフェートを用いた製剤によって、血漿中でグランザイム融合タンパク質を活性に保つことが可能である可能性がある。
【０２５４】
代替として、これらのプロテイナーゼ阻害因子による潜在的な合併症を避けるために、血漿中の既知であるプロテイナーゼ阻害因子またはヒト血漿との相互作用によって、潜在的な候補プロテアーゼがインビトロでスクリーニングされてもよい。代替として、血漿中に同族の阻害因子が認められるプロテアーゼは、阻害に耐える突然変異形態を提供するために操作され得る。例えば、既知のＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害因子に対する耐性を示す突然変異プロテアーゼを選択するために、インビトロでの大腸菌発現スクリーニング法が開発されてきた（Ｍｅｌｎｉｃｋら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：３２５６（１９９８））。
【０２５５】
Ｃ．プロテアーゼ融合タンパク質の発現
大きい融合タンパク質の過剰発現のための方法は、当該技術分野において周知であり、本発明のプロテアーゼ融合タンパク質の過剰発現に適用することができる。本発明の融合タンパク質の構築において用いられてもよい発現系の例は、大腸菌、昆虫細胞におけるバキュロウイルス、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における酵母系、哺乳類細胞、およびワクシニアにおける一過性発現である。上述したＤＴ融合タンパク質の発現のための方法は、ジフテリア毒素に単独で適用可能なものを除いて、概してプロテアーゼ融合タンパク質に適用することができる。
【０２５６】
哺乳類の発現系は、特に、ヒトグランザイムＢ等、ヒト由来のプロテアーゼが融合物のプロテアーゼ部として選択される場合に、プロテアーゼ融合タンパク質を生成するために使用することができる。哺乳類細胞においてヒト由来のプロテアーゼを発現させることは特定の利点を有し、特に、免疫原性ではなく、組換えタンパク質のフォールディング、溶解性、および安定性の助けとなる可能性がある、天然の形態と同一または近似するグリコシル化パターンを提供する。
【０２５７】
タンパク質のＰＥＧ化
本発明の一態様は、ＰＥＧ化融合タンパク質の利用である。好ましい態様は、部位特異的にＰＥＧ化された融合タンパク質である。ＰＥＧ化タンパク質は、ＰＥＧ付着の部位、数、サイズ、および種類にしたがって幅広い生物活性を示すことが、当該技術分野において既知である（ＨａｒｒｉｓおよびＣｈｅｓｓ  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｕｒｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２（３）：２１４−２２１（２００３））。本発明における融合タンパク質の好ましい組成物は、所望のインビトロまたは体内生物活性に寄与する、または抗体の形成、細胞もしくは生物表面への非特異的粘着性、あるいは分解もしくは欠失等、融合タンパク質の活性を低下させる天然の作用の影響を受けにくい、ＰＥＧ化タンパク質である。
【０２５８】
ＰＥＧ部分は、Ｎ末端アミノ酸、システイン残基（天然もしくは非天然）、リジン、またはタンパク質の一次配列内にある他の天然もしくは非天然のアミノ酸に付着され得る。ペプチドおよびタンパク質のＰＥＧ化のための化学的性質は幅広く検討されてきた（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ５４（４）：４５９−４７６（２００２））。また、配列特異的な酵素反応を介して、ペプチドがＰＥＧ部分により選択的に修飾されることができるように、特異的ペプチド配列が一次配列に導入されてもよい。代替として、最初に化学的に修飾された基によって特異的ペプチド配列を修飾し、その後、修飾された基でＰＥＧ付着を行うことができる。
【０２５９】
多くのタンパク質中のシステイン残基は、ジスルフィド結合中に隔離されている可能性があり、誘導体化には好ましくないかまたは利用することができない。部位特異的突然変異誘発による挿入または置換によって、タンパク質の生物活性に実質上否定的な作用を及ぼさない位置に、追加のシステインが導入され得る。遊離システインは、ＰＥＧ分子の特異的付着のための部位としての役割を果たし、アミン特異的ＰＥＧ化にしばしば見られる生成物の不均一性を回避する。追加されたシステインのための好ましい部位は、タンパク質表面上に曝露され、ＰＥＧ化のために利用できる。融合タンパク質の末端領域、Ｃ末端領域、およびリンカー領域は、システイン置換または挿入のための潜在的部位である。
【０２６０】
ジスルフィド結合を形成することができない２つまたはそれ以上のシステインを遺伝子的に導入することも可能である。このような場合には、複数のＰＥＧ部分がタンパク質に特異的に付着され得る。代替として、天然の非必須ジスルフィド結合を低下することができ、そうすることでチオール特異的なＰＥＧ化のための遊離システインが２つ提供される。
【０２６１】
遊離チオール基も、代替として可逆性チオール遮断薬で修飾され得る、遊離システインまたはチオール基を含有する分子の化学的なコンジュゲーションによって導入されてもよい。
【０２６２】
ＰＥＧ化は、酵素触媒のコンジュゲーション反応を用いて実現されてもよい。このようなアプローチの１つは、タンパク質またはペプチド結合グルタミンの遊離アミン基とγ−カルボキサミド基との間の共有結合の形成を触媒するタンパク質のファミリーである、トランスグルタミナーゼを用いることである。このファミリーのタンパク質の例は、ヒトおよび動物由来のトロンビン、ＸＩＩＩ因子、および組織トランスグルタミナーゼを含む、数多くの異なる由来のトランスグルタミナーゼを含む。好ましい態様は、ＬＬＱＧのペプチド配列内に包埋されたグルタミン残基を含有するタンパク質基質と、一次アミノ基を含有するＰＥＧ化試薬との間のコンジュゲーション反応を触媒するための微生物トランスグルタミナーゼを含む（Ｓａｔｏ  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ５４（４）：４８７−５０４（２００２））。
【０２６３】
酵素触媒による別のＰＥＧ化の方法は、表面タンパク質を細胞壁のエンベロープにアンカリングする（ａｎｃｈｏｒ）ために、保存されたカルボキシル選別モチーフを認識し、ペプチド転移反応を触媒することができる、グラム陽性菌の酵素ファミリーであるソルターゼを使用することに関与する（Ｄｒａｍｓｉら、Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １５６（３）：２８９−２９７（２００５））。好ましい態様は、ソルターゼＡおよびＢがそれぞれＬＰＸＴＧまたはＮＰＱＴＮでタグ付けされたタンパク質と、一次アミノ基を含有するＰＥＧ化試薬との間のペプチド転移反応を触媒するための、黄色ブドウ球菌ソルターゼの使用を含む（ＷＯ０６０１３２０２Ａ２）。上に列記したペプチド基質配列は、例であって限定されるものではない。これらの酵素のファミリーが、異なった配列を基質として認識および利用できることは当該技術分野において既知であり、これらの配列は本発明のための態様として本明細書に含まれる。上に列記した好ましいペプチド基質配列は、例であって限定されるものではない。これらの酵素のファミリーが、異なった配列を基質として認識および利用できることは当該技術分野において既知であり、これらの配列は本発明のための態様として本明細書に含まれる。
【０２６４】
多官能性ＰＥＧ
現在入手可能なＰＥＧ化タンパク質のほとんどは、タンパク質あたり１つまたは複数のＰＥＧを有する一方で、ＰＥＧ部分に２つまたはそれ以上のタンパク質が付着したタンパク質のコンジュゲートを構築することも可能である。ヘテロ官能性のＰＥＧが市販されており、２つのタンパク質、またはタンパク質の任意の２つの部分を共有結合的に連結するために用い得る。
【０２６５】
好ましいＰＥＧ化部位
毒素と活性因子の両方が、それぞれの機能にとって重要な領域またはドメインを有するため、これらのドメイン上に大きなＰＥＧ置換基が付着することは、それらの機能にとって有害である可能性がある。したがって、本発明の好ましい態様は、ＰＥＧ置換基が活性化因子（プロトキシン活性化因子またはプロアクチベーターのいずれか）の触媒部位および細胞を標的とする部分の細胞表面標的認識表面から遠隔に位置するＰＥＧ化融合タンパク質であり、プロトキシンの場合は、これらのドメインは、血漿膜を介した転位に関与することおよび／または細胞質中に移入されてＰＥＧ化がこのような転位を防ぐ可能性があることが予測されるため、プロトキシンの転位および触媒ドメイン内にはＰＥＧ置換基は位置しない。
【０２６６】
本発明の一態様においては、好ましいＰＥＧ化の部位はタンパク質性の細胞を標的とする部分のＮもしくはＣ末端またはその近傍に位置する。本発明の他の態様では、ＰＥＧ化は融合タンパク質内の異なる部分の間にあるリンカー領域に誘導される。
【０２６７】
本発明の他の態様では、可逆性ＰＥＧ化が用いられ得る。
【０２６８】
Ｄ．洗浄剤
本発明は、毒素融合タンパク質を投与する前の、合成プロテアーゼ融合タンパク質の除去を促進するための洗浄剤の使用も任意選択的に含む。ＡＤＥＰＴ療法における洗浄剤の使用は、当該技術分野において周知であり（例えば、ＳｙｒｉｇｏｓおよびＥｐｅｎｅｔｏｓ，  ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９：６０５（１９９９）を参照）、本発明において利用することができる。
【０２６９】
ＩＶ．連結
本発明によると、プロトキシン融合タンパク質中の各部分（例えば、１つまたは複数の細胞を標的とする部分、１つまたは複数の選択的に修飾可能な活性ドメイン、１つまたは複数の天然で活性化可能なドメイン、および１つまたは複数の毒素ドメイン）またはプロトキシン活性化因子融合体中の各部分（例えば、１つまたは複数の細胞を標的とする部分、１つまたは複数の修飾ドメイン、１つまたは複数の天然で活性化可能なドメイン、および１つまたは複数の毒素ドメイン）は、独立して機能してもよいが、各々は作用可能に連結されている。各融合タンパク質において、２つの機能的部分の間の作用可能な連結は、共有結合的または非共有結合的であってもよい、分子の橋としての役割を果たす。各融合タンパク質の部分は、互いに任意の方向に、すなわち、１つのＣ末端から他方のＮ末端へ、または１つのＣ末端から他方のＣ末端へ、または１つのＮ末端から他方のＮ末端へ、または内側残基から末端残基へ、または内側残基から末端残基へ、作用可能に連結していてもよい。任意選択的なリンカーは、空間的独立を可能にする分離体として、または互いに追加の機能を提供するための手段として、またはそれらの組み合わせとして、２つの部分を物理的に結びつける糊の役割を果たすことができる。例えば、互いの活性を妨害することを防ぐために、作用可能に連結した酵素から細胞を標的とする部分を分離することが望ましい場合がある。この場合、リンカーは作用可能に連結した部分間における立体的競合からの解消を提供する。リンカーは、例えば、２つの部分間の接続に対する不安定性、酵素切断部位（例えば、プロテアーゼのための切断部位またはエステラーゼのための加水分解部位）、安定化配列、分子タグ、検出可能な標識、またはそれらの様々な組み合わせを提供する可能性もある。
【０２７０】
アミノ酸残基の化学的活性は、１つの分子上のアミノ酸残基の側鎖を別の分子上の残基の側鎖と結びつける結果となる当該技術分野で周知の様々な方法によって、またはαアミノ基に側鎖を結びつけることによって、または２つまたはそれ以上のαアミノ基を結びつけることによって、実行され得る。典型的には、化学的活性によって誘発された結びつきは、小分子であるか、ポリペプチドもしくはポリペプチド上の置換基に付着するために２つまたはそれ以上の末端で特定の部分に適応した、同一または非同一サブユニットの任意選択的に置換された分岐または線形のポリマーであるか、または任意選択的に置換されたポリペプチドである可能性のあるリンカーを介して実現される。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが販売を提供するもの等、一般的な共有結合タンパク質の作用可能な連結の例は公的に入手可能である。一般に、簡素で再現可能な製造物質を得るために、作用可能な成分の連結を部位特異的な様式で誘発できることが好ましい。化学的活性による作用可能な連結は、機能的に特有である特異的な残基を標的とした化学的活性の結果であり得る。すなわち、それらは活性化される部分に１度だけ存在する、または、例えば、リジン残基のεアミノユニットのｐＫにおける減少をもたらす等、独自の化学的環境のために、優先的に活性化可能である。化学的活性のための潜在的な基は、例えば、単一のシステイン残基以外、または単一のリジン残基以外はすべて除去するために、同じ特性を有する他のすべての残基を遺伝子的に除去することにより、機能的に特有にされることができる。アミノ末端残基は、αアミノ基のｐＫが低いおかげで、または、別の活性化可能な基に接近したαアミノ基の増加した反応性を利用する好適な化学的性質によって、有利に標的化され得る。後者の例は、天然の化学的ライゲーション、シュタウディンガーライゲーション、およびアルデヒド置換基を得るためのアミノ末端セリンの酸化を含む。化学的活性は、グリカンの酸化等の天然に存在するタンパク質置換基、またはビオチンもしくはリポ酸によって形成される他の天然に存在するタンパク質修飾を活性化する反応を介して行うことも可能であり、または、１本の側鎖の官能性を別のものに変換する、または所望の作用可能な連結を生成するために後に活性化され得る新しい化学反応基を導入する、化学反応に基づいていてもよい。後者の例は、リジン残基にスルフヒドリル部分を与えるためのイミノジチオラン（ｉｍｉｎｏｄｉｔｈｉｏｌａｎｅ）の使用、またはチオールの機能性を別の所望の反応部分に変化させるための、システイン部分と適切なマレイミドもしくはハロアセタミドとの反応を含む。例えば、ヒドラジド、ヒドラジン、またはヒドロキシルアミンを１つの部分に導入し、アルデヒドを他方の部分に導入する等、互いに相互作用して作用可能な連結を提供する反応種を提供するために、作用可能に連結された両方の種に化学的活性を実行することもできる。
【０２７１】
非共有結合的である作用可能な連結は、治療的使用において作用可能に連結された部分の意図する有用な持続性について安定した複合体を提供するために、１つの部分と他方の部分との間に相補的な表面を提供することにより得ることができる。このような非共有結合的結合は、同一もしくは異なっていてもよい２つまたはそれ以上のポリペプチドか、または１つまたは複数のポリペプチドおよび第２の部分に付着した小分子もしくはリガンドのいずれかから生成され得る。小分子またはリガンドの付着は、天然もしくは人工のビオチンまたはリポ酸アクセプタドメインであってもよく、体内で天然の取り込みによってまたはインビトロで酵素的ビオチン化もしくはリポイル化によって達成されてもよい、特異的なアクセプタ配列へのビオチンまたはリポ酸の取り込みのような、インビトロまたは体内プロセスによって起こり得る。代替として、タンパク質は、ビオチン誘導体を用いた化学反応によって、ビオチンまたは他の部分と置換されてもよい。タンパク質とカップリングするために用いられるビオチン誘導体の一般的な例は、アルデヒド、アミン、ハロアセタミド、ヒドラジド、マレイミド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等の活性化されたエステルを含む。一般的に採用される非共有結合的連結の例は、ビオチンおよびその誘導体またはイミノビオチン（ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）もしくはジアミノビオチン（ｄｉａｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）もしくはチオビオチン（ｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ）等のビオチン関連置換基をストレプトアビジンまたはアビジンまたはその変異体に結合すること、メトトレキサートの哺乳類ジヒドロ葉酸還元酵素への結合等の、酵素をそれらの共有結合的または非共有結合的な特異的阻害因子に結合すること、天然または人工のロイシンジッパーを互いに結合すること、酵素をアンチトリプシンまたはロイペプチンまたはα−２−マクログロブリン等の特異的または非特異的な阻害因子に結合すること、アリールビスアルセナートを適切に配置されたシステイン残基を有するαヘリックスに結合すること、核酸アプタマーとその標的との間の結合；Ｔａｔ−ＴＡＲ相互作用のようなペプチドと核酸との間の結合によって誘発された連結を含む。
【０２７２】
他方のポリペプチドとカップリングさせるための、１つのポリペプチドの酵素的活性化も採用されてもよい。基質様分子との反応により共有結合的な修飾を起こす酵素ドメインも、融合を生成するために用いることができる。このような酵素ドメインの例は、Ｏ６−アルキルグアニンＤＮＡ−アルキルトランスフェラーゼ（Ｇｒｏｎｅｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．  ２００６  １９（７）：３０９−１６）、チミジル酸生成酵素、またはＤＰＰＩＶ（配列番号：６５）と同じ程度に活性部位の共有結合的または安定した非共有結合的な修飾の影響を受け易いプロテアーゼを含む。
【０２７３】
本発明は、対向する端の近傍または端部に位置し、各々が連結された部分と結合または反応することができる少なくとも２つの相互作用性または反応性の官能基を含有する、二官能性または多官能性リンカーの使用も特徴とする。２つまたはそれ以上の官能基は同じであっても（すなわち、リンカーはホモ二官能性）、または異なっていてもよい（すなわち、リンカーはヘテロ二官能性）。当該技術分野で既知である様々な二官能性または多官能性の架橋剤が、リンカーとしての使用に適している。例えば、シスタミン、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピネート、メチルメルカプトブチルイミデート、ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、および他の多くが、例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（イリノイ州ロックフォード）から、市販されている。このような特異的な作用可能な連結反応に好適である追加の化学的に直交性の反応は、例えば、シュタウディンガーライゲーション、Ｃｕ［Ｉ］触媒［２＋３］環化付加、および天然のライゲーションを含む。
【０２７４】
二官能性または多官能性リンカーは、相互作用性であってもよいが、非反応性ではない。このようなリンカーは、上述した非共有的な相互作用の任意の例を合わせた使用を含む。
【０２７５】
分子の橋としての目的を果たすことができるならば、リンカーの長さおよび組成は著しく異なっていてもよい。リンカーの長さおよび組成は、概して、リンカーの意図する機能、また任意選択的に合成し易さ、安定性、特定の化学物質に対する耐性および／または温度パラメータ等の他の因子、および生体適合性を考慮に入れて選択される。例えば、リンカーは、毒素の標的化に関連する細胞を標的とする部分の制御能力、あるいは活性化および／または細胞毒性に関連する毒素もしくは酵素の活性を、著しく妨害すべきではない。
【０２７６】
本発明に従った使用に適したリンカーは、上述のペプチドを含む分岐、非分岐、飽和、または不飽和の炭化水素鎖である。
【０２７７】
さらに、リンカーがペプチドである場合、リンカーは、組換えＤＮＡ技術を用いて毒素部分および酵素部分および／または細胞を標的とする部分に付着され得る。
【０２７８】
本発明の一態様においては、リンカーは、分岐しているかまたは分岐していない、飽和または不飽和の、１〜１００炭素原子を有する炭化水素鎖であり、１つまたは複数の炭素原子がＯまたはＮＲによって任意選択的に置き換えられ（ＲはＨ、またはＣ１−Ｃ６アルキル）、その鎖は、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、アミド、アジド、シアノ、ニトロ、ハロ、ヒドロキシ、オキソ（＝Ｏ）、カルボキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、およびヘテロアリールオキシから成る群から選択された１つまたは複数の置換基で、炭素上で任意選択的に置換される。
【０２７９】
好適なリンカーの例には、鎖長１〜１００原子を有するペプチド、エタノールアミン、エチレングリコール、鎖長６〜１００炭素原子を有するポリエチレン、３〜３０繰り返しユニットを有するポリエチレングリコール、フェノキシエタノール、プロパノールアミド、ブチレングリコール、ブチレングリコールアミド、プロピルフェニル、エチル、プロピル、ヘキシル、ステリル、セチル等の基、およびパルミトイル化アルキル鎖に由来するリンカーを含むが、これらに限定されない。
【０２８０】
一態様においては、リンカーは、分岐しているかまたは分岐していない、飽和または不飽和の、１〜５０炭素原子を有する炭化水素鎖であり、１つまたは複数の炭素原子がＯまたはＮＲによって任意選択的に置き換えられ（Ｒは上記にて定義）、その鎖は、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、アミド、ヒドロキシ、オキソ（＝０）、カルボキシ、アリールおよびアリールオキシから成る群から選択された１つまたは複数の置換基で、炭素上で任意選択的に置換される。
【０２８１】
別の態様において、リンカーは、分岐していない、１〜５０炭素原子を有する飽和炭化水素鎖であり、１つまたは複数の炭素原子がＯまたはＮＲによって任意選択的に置き換えられ（Ｒは上記にて定義）、その鎖は、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、アミド、ヒドロキシ、オキソ（＝Ｏ）、カルボキシ、アリールおよびアリールオキシから成る群から選択された１つまたは複数の置換基で、炭素上で任意選択的に置換される。
【０２８２】
本発明の特定の態様において、リンカーは１〜５０原子の鎖長を有するペプチドである。他の態様ではリンカーは１〜４０原子の鎖長を有するペプチドである。
【０２８３】
当該技術分野では既知であるように、リンカーのプロトキシン部分に対する付着（または、リンカーエレメントの細胞を標的とする部分に対する付着、または細胞を標的とする部分のプロトキシン部分に対する付着）は、特別な様式の付着または反応である必要はない。好適な安定性および生物学的な適合性を生成物に提供する、様々な非共有的相互作用または反応が利用可能である。
【０２８４】
本発明の好ましい一態様は、プロトキシン、プロトキシン活性化因子、またはプロトキシンプロアクチベーターの部分間に作用可能な連結を提供するための酵素反応に依存する。このような作用可能な連結を生成する酵素反応のうち、トランスグルタミナーゼライゲーション、ソルターゼライゲーション、およびインテイン媒介ライゲーションが高い特異性を提供することは、当該技術分野において周知である。
【０２８５】
上に列記した好ましいペプチド基質配列は、例であって限定されるものではない。これらの酵素のファミリーが、異なった配列を基質として認識および利用できることは当該技術分野において既知であり、これらの配列は本発明のための態様として本明細書に含まれる。
【０２８６】
ある局面において、本発明は、天然で活性化可能なリンカーの使用を特徴とする。このようなリンカーは、補体系の酵素、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、プラスミン、または本発明の一態様において用いられてもよいタンパク質分解活性を有する別の酵素によって切断される。本発明の別の態様にしたがって、プロトキシンは、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミン、トロンビンまたはトリプシン等の、タンパク質分解活性を有する酵素による切断を受けやすいリンカーを介して付着される。また、プロトキシンは、ジスルフィド結合（例えば、シスチン分子上のジスルフィド結合）を介して細胞を標的とする部分に付着されてもよい。多くの腫瘍は、高レベルのグルタチオン（還元剤）を天然では放出するため、後に送達部位でプロトキシンを放出することで、ジスルフィド結合を低下させることができる。
【０２８７】
一態様においては、細胞を標的とする部分は、切断可能なリンカー領域によりプロトキシンと連結している。本発明の他の態様では、例えば、小分子によって切断可能な他のリンカーが用いられてもよいが、切断可能なリンカー領域はプロテアーゼの切断可能なリンカーである。プロテアーゼ切断部位の例は、因子Ｘａ、トロンビンおよびコラゲナーゼによって切断される部位である。本発明の一態様においては、プロテアーゼ切断部位は、上方制御された部位または一般的な癌と関連するプロテアーゼによって切断される部位である。このようなプロテアーゼの例は、ｕＰＡ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリー、カスパーゼ、エラスターゼ、およびプラスミノーゲン活性化因子ファミリー、ならびに線維芽細胞活性化タンパク質である。さらに別の態様において、切断部位は、癌関連細胞によって分泌されたプロテアーゼにより切断される。これらのプロテアーゼの例は、マトリックスメタロプロテアーゼ、エラスターゼ、プラスミン、トロンビン、およびｕＰＡを含む。他の態様では、プロテアーゼ切断部位は、上方制御された部位または特定の癌と関連する部位である。さらに別の態様において、タンパク質分解活性は、同じ細胞を標的とするプロテアーゼ融合物によって提供し得る。プロテアーゼにより認識される様々な切断部位が当該技術分野において既知であり、当業者は好適な切断部位を難なく選択するであろう。切断部位の制限されない例は本明細書の別の箇所に記載する。当該技術分野において既知であるように、これらのプロテアーゼによって認識される他のプロテアーゼ切断部位が用いられてもよい。一態様においては、切断可能なリンカー領域は、細胞外プロテアーゼによって標的化される領域である。
【０２８８】
これらのカルボキシルトランスフェラーゼによってまたは細胞を標的とする部分を有する対応する融合タンパク質によって選択的に切断できるように、化学的リンカーも、カルボキシルエステラーゼのための基質として設計することができる。好ましい一態様は、エステルリンカーの切断を活性化するためのカルボキシルトランスフェラーゼ活性の使用を含む。制限されるわけではないが、例として、分泌されたヒトカルボキシルトランスフェラーゼ−１、−２、−３をこの目的のために用い得る。追加の例は、他に由来するカルボキシルトランスフェラーゼを含む。
【０２８９】
切断可能なリンカーの別の態様は、特異的にエンドヌクレアーゼの影響を受けやすい核酸ユニットを含む。エンドヌクレアーゼはヒト血漿に高レベルで存在することで知られている。
【０２９０】
他の態様では、修飾可能な活性化部分は、ペプチドではないが、活性化因子またはプロアクチベーターによって提供される同族の酵素活性により作用される可能性のある切断可能なリンカーである。切断可能なリンカーは、好ましくは活性化可能なプロトキシン中のフリン様切断配列と同じ位置に位置するか、または活性化可能なプロアクチベーター中のチモーゲン阻害ペプチドの位置に位置する。切断可能なリンカーは、フリン様切断配列を置き換えることができるか、またはフリン様切断もしくは別の修飾可能な活性化部分に同時に付着してもよく、フリン様切断または他のタンパク質分解事象および活性化のためのリンカー切断の両方を必要とするプロトキシンを提供する。一態様においては、切断可能なリンカーは、ＤＴに基づくプロトキシンのＡＤＰリボシルトランスフェラーゼドメインを、その転位ドメインまたは別のプロトキシンに結びつける。他の態様では、切断可能なリンカーが、ＰＥＡの転位ドメインまたはＶＣＥに基づくプロトキシンを、同じまたは異なる毒素のＡＤＰリボシルトランスフェラーゼドメインに結びつける。さらに別の態様において、切断可能なリンカーは、孔形成毒素の孔形成ドメインをＣ末端阻害ペプチドに結びつける。
【０２９１】
好ましい切断可能なリンカーは、体内の条件に対して安定しているが、活性化因子の作用の影響を受けやすいリンカーである。抗体特異性酵素プロドラッグ療法を開発しようとする試みにおいて、好適な例が数多く提供されてきた。例えば、フルオロフォア等の活性部分の放出をもたらす多種類の酵素基質は、自壊的（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）リンカーとして知られるものの使用によって考案されてきた。自壊的リンカーは、上流のコンジュゲーション結合（例えば糖およびアリール部分の間の）の放出時に活性部分を遊離するために設計される。このようなリンカーは、アリールメチルエーテルの配糖体（例えば、３−ニトロ、４−ヒドロキシベンジルアルコールのフェノール配糖体、ＨｏらのＣｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，  ２００７  Ｍａｒ  ２６；８（５）：５６０−６を参照）、または４−アミノベンジルアルコールのフェノール配糖体（例えばＮｉｃｕｌｅｓｃｕ−ＤｕｖａｚらのＪ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  １９９８  Ｄｅｃ  １７；４１（２６）：５２９７−３０９またはＴｏｋｉらのＪ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．  ２００２  Ｍａｒ  ２２；６７（６）：１８６６−７２を参照）に基づくことが多い。
【０２９２】
グリコシドに基づく自壊的リンカーを生成するためには、フェノールを含むヒドロキシルをα−１−Ｂｒ乳糖またはα−１−Ｂｒグルクロン酸等の１−Ｂｒ−置換糖との反応によって糖化することで活性化酵素に基質を提供し、その後ベンジルアルコール部分をホスゲンまたはカルボニルジイミダゾール等のカルボニル化試薬で活性化させ、一次アミンと反応させてカルバミン酸連結を得る。アリールグリコシド結合またはアリールエステルの切断で、アリール部分が脱離し、入れ替わりに離脱するカルバモイル部分が残り、ＣＯ２および再生アミンが得られる。該アミンは、ポリペプチド鎖のαアミノ基またはリジン側鎖のεアミノであり得る。
【０２９３】
アミド結合に基づく自壊的リンカーを生成するためには、４−アミノベンジルアルコールのフェニールアミンを好適なペプチドまたはアミノ酸のカルボキシル基で反応させ、適切なぺプチターゼの基質となることができるフェニルアミドを生成する（例えば、カルボキシペプチダーゼＧ２  Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ４１（２６）：５２９７−３０９（１９９８））。その後、ベンジルアルコール部分をホスゲンまたはカルボニルジイミダゾール等のカルボニル化試薬で活性化させ、一次アミンと反応させてカルバミン酸連結を得る。アリールアミド結合の切断で、アリール部分が脱離し、入れ替わりに離脱するカルバモイル部分が残り、ＣＯ２および再生アミンが得られる。該アミンは、ポリペプチド鎖のαアミノ基またはリジン側鎖のεアミノであり得る。
【０２９４】
本発明に従った適切な自壊的活性化部分の生成のためには、プロトキシンまたはプロアクチベーターの１つの要素（毒素部分または転位部分または阻害ペプチド部分等）に連結を提供する反応部分で、アリール基を置換する。
【０２９５】
自壊的リンカーの類似形態も当業技術分野において周知である。例えば、ＰａｐｏｔらのＢｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．  ８（１８）：２５４５−８（１９９８）は、グルクロニダーゼによる切断でアリールリンカー部分の脱離を起こす、アリールマロンアルデヒドに基づくグルクロニドプロドラッグの生成を教示している。本発明に即したアリールマロンアルデヒドに基づく好適なリンカーは、アリール置換基が毒素部分の１つの末端（例えば、フリン切断部位の位置）に作用可能に連結され、カルバモイル官能基が転位部分または阻害部分に作用可能に連結された、修飾可能な活性化部分を提供する。Ｐａｐｏｔらに考案されたシステムでは、グルクロニダーゼによる切断が、アリールマロンアルデヒドの脱離およびプロトキシンの活性化をもたらす。同様の脱離事象が、７−アミノセファロスポラン酸に基づくリンカーのラクタム部分の加水分解後に起こることが知られており、酵素的に活性化されたβ−ラクタム系抗生物質または関連構造に基づくプロドラッグは、当該技術分野において周知である。例えば、ＡｌｄｅｒｓｏｎらのＢｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  １７（２）：４１０−８（２００６）は、カルバミン酸部分の脱離および切断が、Ｐａｐｏｔらに開示されたアリールマロンアルデヒドのものと同様の様式で起こる、７−アミノセファロスポラン酸に基づくリンカーの生成を教示している。また、ＨａｒｄｉｎｇらのＭｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ４（１１）：１７９１−８００（２００５）は、７−アミノセファロスポラン酸の核に基づくプロドラッグ部分に対する活性化因子として有利に適用され得る免疫原性を減少した、βラクタマーゼについて教示している。
【０２９６】
さらに別の態様において、修飾可能な活性化部分は、ペプチドであるが、天然のフリン様プロテアーゼ切断部位と同じ位置にある、いずれかもしくは両方の末端で可動性リンカーにより作用可能に連結しているか、または天然のフリン様切断部位に同時に連結している。このような態様において、活性化因子は、修飾可能な活性化部分のペプチドを認識する同族のプロテアーゼまたはペプチドヒドロラーゼである。二重にトリガーされたプロトキシンにおいて、フリン様切断部位は修飾可能な活性化部分によって置き換えられ、切断可能なリンカーは修飾可能な活性化部分に同時に付着する。このようなプロトキシンでは、プロトキシンを活性化させるために２つの活性化因子の作用が必要である。
【０２９７】
Ｖ．毒素融合およびプロテアーゼ融合タンパク質の単離と精製
Ａ．組換えタンパク質精製のための一般的方策
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｃｏｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．  ２００６）に記載される方策等、当業者に既知である組換えタンパク質を単離および精製するための、確立された方策が数多く存在する。所望の組換えタンパク質と混入物との物理化学的特性の違いを利用するイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用（逆相）クロマトグラフィー、およびサイズ排除（ゲル濾過）クロマトグラフィー等、従来のクロマトグラフィーが広く用いられている。ＨＰＬＣも用いることができる。
【０２９８】
組換えタンパク質の精製を促進するために、後に特異的プロテアーゼを用いて除去することができるＮ末端またはＣ末端のポリペプチド（タグ）により付加された融合タンパク質の一部として標的タンパク質を発現させるための、様々なベクター系が開発されてきた。このようなタグを用いて、タンパク質を精製するために親和性クロマトグラフィーが適用され得る。このようなタグの例は、特異的抗体のあるタンパク質およびペプチド（例えば、抗ＦＬＡＧ抗体カラムを用いて精製されたＦＬＡＧ融合物）、特異的リガンドを含有するカラムに特異的に結合することができるタンパク質（例えば、グルタチオン親和性ゲルにより精製されたＧＳＴ融合物）、固定化金属カラムに対する親和性を有するポリヒスチジンタグ（例えば、Ｎｉ２＋カラム上に固定され、イミダゾールで溶出された６Ｈｉｓタグ）、および発現中に宿主によってまたは単離後にインビトロでビオチン化され得、アビジンカラム上での精製を可能にする配列（例えばＢｉｒＡ）を含む。
【０２９９】
Ｂ．不溶性形態として発現される融合タンパク質の単離および精製
多くの組換え融合タンパク質は、大腸菌中の封入体として、すなわち、主に非天然状態にある所望の組換えタンパク質から構成される密度の高い集合体として、発現される。事実、最も多く報告されている大腸菌に発現するＤＴ−ＳｃＦｖ融合タンパク質は、不溶性の形態で得られる。通常、封入体は次の理由から形成する。（ａ）標的タンパク質が、生成された濃度では不溶性である、（ｂ）標的タンパク質が、細菌環境において正しくフォールディングする能力がない、または（ｃ）標的タンパク質が、還元する細胞内環境において正しいジスルフィド結合を形成することができない。
【０３００】
当業者は、封入体から可溶性の活性融合タンパク質を得るために用いることができる異なる方法を理解する。例えば、封入体は、ペレット画分に位置するほぼ純粋な不溶性産物を得るために、他の細胞構成物からの異なる遠心分離により分離することができる。封入体は、清浄剤と変性剤との混合物（尿素またはグアニジン−ＨＣｌのいずれか）で抽出した後に、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、または金属キレートクロマトグラフィーを変性剤の存在下における最初の精製ステップとして用いることにより、部分的に精製することができる。可溶化および部分的に精製されたタンパク質は、凝集を最低限に抑え、ジスルフィド結合の正しい形成を可能にする条件下で、変性剤の制御除去によりリフォールディングされ得る。非生産的な凝集を最小限に抑えるため、リフォールディング中は低いタンパク質濃度が用いられるべきである。非変性濃度の尿素またはグアニジン−ＨＣｌ、アルギニン、清浄剤、およびＰＥＧ等の様々な添加剤を、フォールディング中間体に存在する疎水性表面の間の分子間会合を最小限に抑えるために用いることができる。
【０３０１】
Ｃ．可溶性形態で発現される融合タンパク質の単離および精製
組換えタンパク質は、可溶性形態で発現および精製することもできる。封入体で発現されない組換えタンパク質は、細胞内で可溶性であるか、または排出ベクターを用いた場合に細胞外で可溶性である（あるいは大腸菌が宿主である場合には、おそらく周辺質である）。可溶性タンパク質は、上記で説明した従来の方法を用いて精製することができる。
【０３０２】
ＶＩ．細胞成長の阻害を測定するためのアッセイ法
細胞増殖および細胞死を測定するアッセイ法等、当該技術分野において周知である様々なアッセイ法が、本発明のタンパク質製剤の有効性を決定するために有用である。例えば、細胞のサイトゾルに導入されたジフテリア毒素触媒フラグメント（ＤＴＡ）の１つの分子が、細胞が増殖してコロニーを形成するのを防ぐために十分であることが分かっている（Ｙａｍａｉｚｕｍｉら、Ｃｅｌｌ  １５：２４５（１９７８））。以下は、本発明における試薬の細胞毒性を分析するために、単独でまたは組み合わせて用いることができる多くのアッセイ法の例である。
【０３０３】
Ａ．タンパク質合成阻害アッセイ法
多くの毒素（例えばＤＴ）が、タンパク質合成の阻害を介してそれらの細胞毒性を発揮するため、毒素に曝露された後で細胞によって合成されるタンパク質を直接的に定量化するアッセイ法が特に有用である。このアッセイ法では、細胞が毒素に曝露された後で、［３Ｈ］−Ｌｅｕ、［３５Ｓ］−Ｍｅｔもしくは［３５Ｓ］−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ等の放射性アミノ酸で一時的に培養される。どのくらいのタンパク質が合成されたかの直接測定の場合は、通常、細胞および沈殿タンパク質を１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で溶解させて、タンパク質に取り入れられる放射性アミノ酸の量が決定される。このようなアッセイ法を用いて、ＤＴの細胞への進入がタンパク質合成の即時的ブロックには関係していないものの、単一のＤＴ触媒フラグメント分子がサイトゾル中で長期間作用（４〜２４時間）することは、低い毒素濃度で完全にタンパク質合成の阻害するためには十分であることが、実証された（Ｆａｌｎｅｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：４３６３（２０００））。
【０３０４】
この方法の延長が、ルシフェラーゼに基づくアッセイ法である（Ｚｈａｏ  ａｎｄ  Ｈａｓｌａｍ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５４：１０２３（２００５））。アデノウイルス発現系を用いて、短い細胞内半減期のための追加ＰＥＳＴ配列を含有するように操作されたルシフェラーゼｃＤＮＡを、多様な哺乳類の分裂細胞または非分裂細胞に取り込み、得られた細胞でルシフェラーゼｃＤＮＡを恒常的に転写させた。本アッセイ法は、短寿命ルシフェラーゼによって触媒されたＤルシフェリン反応からの光出力により、細胞中のタンパク質合成のレベルを測定する。ルシフェラーゼｍＲＮＡを恒常的に発現する細胞において、タンパク質合成の阻害は、ルシフェラーゼ翻訳の減少および比例的な光出力の減少をもたらす。
【０３０５】
Ｂ．チミジン取り込みアッセイ法
細胞の増殖率は、［３Ｈ］−チミジンの細胞核酸への取り込みを決定することによって測定することができる。このアッセイ法は、毒素（例えば、ＤＴに基づく免疫毒素）の細胞毒性を分析するために用いられてもよい。この方法を用いて、ＤＴ−ＩＬ３免疫毒素は、骨髄性白血病の細胞株を有するＩＬ３受容体の成長の阻害において活性であることが分かった（Ｆｒａｎｋｅｌら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ．  １４：５７６（２０００））。本発明の毒素融合物およびプロテアーゼ融合タンパク質は、このようなアッセイ法を用いて別個にまたは組み合わせて、試験することができる。
【０３０６】
Ｃ．コロニー形成アッセイ法
コロニー形成は、一般的に採用される他の方法よりも、はるかに高感度な測定法を提供することができる。この感度向上の理由は、細胞が増殖状態にある間にコロニー形成が評価されるため、毒性作用をより受けやすいという事実があげられる場合がある。コロニー形成アッセイ法の感度、そして用量および時間に依存する効果が検出可能であることが、調査されるべき急性および慢性曝露期間を可能にするとともに、回復研究を可能にする。例えば、ヒト骨髄腫細胞株に対する組換えＤＴ−ＩＬ６融合タンパク質の細胞毒性を、Ｕ２６６骨髄腫細胞によるメチルセルロースコロニー形成を用いて調査した。正常な骨髄とＵ２６６細胞ＤＴ−ＩＬ−６の両方を含有する培養液中で、Ｕ２６６骨髄腫コロニーの成長を効率的に阻害したが、正常な骨髄赤血球、顆粒球および混合された赤血球／顆粒球コロニーの成長には、ほとんど影響を及ぼさなかった（Ｃｈａｄｗｉｃｋら、Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ８５：２５（１９９３））。
【０３０７】
Ｄ．ＭＴＴ細胞毒性アッセイ法
特定の融合タンパク質または融合タンパク質の連結の細胞毒性は、ＭＴＴ細胞毒性アッセイ法を用いて評価することができる。ヒトＧＭＣＳＦに高い親和性を持つ受容体を有するヒト白血病細胞株に対するＤＴ−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質の特異的細胞毒性を、このようなＭＴＴアッセイ法、コロニー形成アッセイ法、およびタンパク質阻害アッセイ法を用いて実証した（Ｂｅｎｄｅｌら、Ｌｅｕｋ．  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．  ２５：２５７（１９９７））。典型的なＭＴＴアッセイ法では、黄色テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）は、代謝的に活性のある細胞内で還元されて不溶性紫色ホルマザン結晶を形成し、界面活性剤を加えることにより可溶化され、ＵＶ−ＶＩＳ分光法を用いて定量化される。細胞は、８０〜１００％コンフルエンスまで成長した後で無血清緩衝液で洗浄され、細胞毒性薬で処理される。ＭＴＴ試薬で細胞を約２〜４時間培養した後、界面活性剤溶液を加えて細胞を溶解し、着色された結晶を可溶化する。５７０ｎｍの波長でサンプルが分析され、生成された色の量は生存細胞数に直接的に比例する。
【０３０８】
ＶＩＩ．ＤＴおよびプロテアーゼ融合タンパク質のための機能アッセイ法
Ａ．インビトロでのタンパク質合成阻害アッセイ法
真核細胞では、サイトゾルへのエンドサイトーシス後に、その触媒ドメインがＡＤＰリボシル化を触媒することによって、伸長因子２（ＥＦ−２）を不活性化することができるため、ＤＴがタンパク質の合成を阻害する。真核生物のインビトロ翻訳系（例えば、ウサギ網状赤血球溶血液と小麦胚芽抽出物を用いた）は、組換えＤＴ融合タンパク質の触媒機能を調べるのに潜在的に適している。例えば、ＴＮＴとカップリングさせた小麦胚芽抽出物（ＮＡＤ＋、アミノ酸、［３５Ｓ］−Ｍｅｔ、ＤＮＡテンプレート、およびＲＮＡポリメラーゼを添加した）が、組換えによって発現させたＤＴの触媒フラグメントによるタンパク質合成の阻害を試験するために用いられる（ＥｐｉｎａｔおよびＧｉｌｍｏｒｅ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １４７２：３４（１９９９））。３５Ｓ標識した翻訳されたタンパク質のレベルが、ＤＴ毒性の程度の目安となる。
【０３０９】
インビトロでのタンパク質合成の阻害は、全長ＤＴのエンドサイトーシスを必要としないため、そのタンパク質分解活性がＥＦ−２のＡＤＰリボシル化を増加させることが分かっている（Ｄｒａｚｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４６：１５０４（１９７１））。したがって、これらのインビトロアッセイ法は、タンパク質分解活性の存在下または不在下においてＤＴ融合の阻害効果をスクリーンする（ｓｃｒｅｅｎ）ために用いることができ、ＤＴ融合タンパク質およびプロテアーゼ融合タンパク質の機能的統合性を分析するための容易なアッセイ法を提供する。
【０３１０】
Ｂ．インビトロでのＥＦ−２ＡＤＰリボシル化アッセイ法
ＤＴは、ＮＡＤのＡＤＰ−リボース部分が、翻訳後に修飾されたジフタミドと称されるＥＦ−２のＨｉｓ７１５へと伝達されるのを触媒することにより、タンパク質合成を阻害する。よって、ＤＴ融合の機能も、その触媒活性を放射標識されたＡＤＰ−リボースが組換えＥＦ−２に伝達される速度と関係付けることにより、インビトロで直接的にアッセイすることができる。（ＰａｒｉｋｈおよびＳｃｈｒａｍｍ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１２０４（２００４））。このアッセイ法は、ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性の阻害を試験するために適用されてきており、ＤＴに基づく免疫毒素のためのアッセイ法の１つとして多く用いられる（Ｆｒａｎｋｅｌら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ．  １４：５７６（２０００））。ビオチン化ＮＡＤまたはエテノ−ＮＡＤ等の非放射標識化ＮＡＤも、基質として用いられ得る（Ｚｈａｎｇ．  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２８０：２５５−２６５（１９９７））。
【０３１１】
Ｃ．インビトロでのタンパク質分解活性アッセイ法
組換えプロテアーゼ融合タンパク質の機能活性は、プロテアーゼの認識配列を含有するペプチドまたはタンパク質基質のいずれかを用いて、インビトロでアッセイされてもよい。様々なプロトコルが当該技術分野において周知である。
【０３１２】
ＶＩＩＩ．融合タンパク質の投与
本発明の融合タンパク質は、典型的には、くも膜下腔内、皮下、粘膜下、または腔内注射によって、また静脈内もしくは動脈内注射によって、任意の投与経路を用いた注射手段によって対象に投与される。よって、融合タンパク質は、例えば、患者の血流内への融合タンパク質の皮下注射により全身に注射されてもよく、または代替として、融合タンパク質は特異的部位で直接注射されてもよい。
【０３１３】
本発明のプロトキシンは、プロトキシン活性化因子またはプロトキシンプロアクチベーターの投与前、投与後、またはそれらと同時に投与されてもよく、また任意選択的に、本発明のプロアクチベーター活性化因子の投与前、投与後、またはそれと同時に投与されてもよい。好ましい態様において、投与中の自発活性化を最小限に抑えるようなやり方で成分が投与される。別個に投与する場合は、２つまたはそれ以上の融合タンパク質の投与は、例えば、１分、１５分、３０分、１時間、２時間、６時間、１２時間、１日、２日、１週間、またはそれより長く離してもよい。さらに、１つまたは複数の本発明の融合タンパク質は、単一用量または複数用量で患者に投与されてもよい。複数用量が投与される場合、服用は、例えば１日、２日、１週間、２週間、または１ヶ月互いに離れていてもよい。例えば、融合タンパク質は、例えば、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、１０週、１５週、２０週間、またはそれより多い週数の間、１週間に１回投与されてもよい。個体のニーズおよび融合タンパク質を投与するまたは投与を監督する人間のプロフェッショナルな判断にしたがって、いかなる特別な対象に対しても、時間の経過とともに特異的な服用計画が調節されるべきであることを理解されたい。例えば、低用量が所望の標的細胞を十分に破壊しないかまたはその成長を阻害しない場合には、融合タンパク質の服用量を増加することができる。反対に、標的細胞が効率的に破壊されるかまたは阻害される場合には、融合タンパク質の服用量を減少することができる。
【０３１４】
最終的には、担当医師が適量および服薬計画を決定するが、融合タンパク質の治療上有効な量は、例えば、約０．００３５μｇ〜２０μｇ／体重（ｋｇ）／日または０．０１０μｇ〜１４０μｇ／体重（ｋｇ）／週の範囲であり得る。治療上有効な量は約０．０２５μｇ〜１０μｇ／ｋｇの範囲であってもよく、例えば、約０．０２５、０．０３５、０．０５、０．０７５、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、または９．０μｇ／体重（ｋｇ）の範囲で毎日、隔日、または週２回投与してもよい。また、治療上有効な量は、約０．０５、０．７、０．１５、０．２、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、１０．０、１２．０、１４．０、１６．０、または１８．０μｇ／体重（ｋｇ）の範囲で毎週、隔週、または１ヶ月に１回投与してもよい。さらに、融合タンパク質の治療上有効な量は、例えば、約１００μｇ／ｍ２〜１００，０００μｇ／ｍ２の範囲で隔日、週１回、または隔週で投与されてもよい。治療上有効な量は、約１０００μｇ／ｍ２〜２０，０００μｇ／ｍ２の範囲であってもよく、例えば、約１０００、１５００、４０００、または１４，０００μｇ／ｍ２の融合タンパク質が毎日、隔日、週２回、または隔週で投与されてもよい。
【０３１５】
いくつかの場合では、本発明の組み合わせ治療剤の成分の血漿半減期を修正することが望ましいことがある。治療タンパク質の血漿半減期は、Ｃｏｌｌｅｎら、Ｂｏｌｌｏｄ  ７１：２１６−２１９（１９９８）；  Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓら、Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．  ６０：２５５−２６１（１９８８）；  Ｂｒｏｗｎｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３：１５９９−１６０２（１９８８）；  Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ７：１７５（１９８４））等に記載される様々な技術を用いて延長されてきた。抗体は、非コンジュゲート型毒素と比較して血清中の半減期を有する免疫毒素を生成するために毒素と化学的にコンジュゲートされてきており、半減期の増加は天然の抗体に起因する。ＷＯ９４／０４６８９は、免疫毒素が哺乳類の血清におけるタンパク質の半減期を延長する性質を有するＩｇＧ定常領域ドメインに連結した、修飾された免疫毒素の使用を教示している。ＩｇＧ定常領域ドメインはＣＨ２またはそのフラグメントである。
【０３１６】
本発明の融合タンパク質の投与は、他の成分と組み合わせて、標的細胞を効果的に破壊するまたはその成長を阻害する、融合タンパク質の濃度をもたらすいかなる好適な手段によるものであってもよい。融合タンパク質は、任意の好適な担体物質中に任意の適量が含有されてもよく、概して、組成物の全重量の１〜９５重量％の量が存在する。組成物は、任意の非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、局所的または腹腔内）の投与経路に好適である服用形態で提供されてもよい。医薬組成物は、従来の薬剤業務にしたがって処方される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （２０版），  ｅｄ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ，  ２０００ならびにＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｅｄｓ．  Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｂｏｙｌａｎ，  １９８８−１９９９，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。
【０３１７】
ＩＸ：実験結果
Ａ．融合タンパク質および細胞株の構築
ヒトグランザイムＢ抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖ  （ＧｒＢ−抗ＣＤ１９）融合遺伝子の構築
成熟したヒトグランザイムＢ（アミノ酸２１〜２４７）に対応する配列を、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｉｎｃ．から調達した全長グランザイムＢ  ｃＤＮＡクローンから増殖して、３者ライゲーション（ｔｈｒｅｅ−ｐｉｅｃｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）を用いて、合成抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖ  ＤＮＡフラグメントとともにｐＥＡＫ１５ベクターに挿入した（ｐＥＡＫ  １５  ＧｒＢ−抗ＣＤ１９Ｌ）。融合遺伝子のプロモーターはＣＭＶ／ニワトリβ−アクチンハイブリッドポリマーであった。融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、ガウシアプリンケプス（Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ）のルシフェラーゼに由来するシグナルペプチド、合成Ｎ結合型グリコシル化部位、ＦＬＡＧタグおよび成熟したヒトグランザイムＢ配列が後に続くエンテロキナーゼ切断配列、可動性リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３、抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖ、およびＣ末端６Ｈｉｓタグの形成を司る（融合タンパク質の概略的な描写については図１Ａを参照。）。すべての融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定によって確かなものとなる。
【０３１８】
ジフテリア毒素抗ＣＤ５  ＳｃＦｖ（ＤＴ−抗ＣＤ５）融合遺伝子の構築
ピキアパストリスおよびヒトの細胞株における発現に最適化したコドンを用いて、Ｒｅｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．（サンディエゴ）でＤＴ−抗ＣＤ５融合遺伝子を人工的に生成した。フリン認識部位をコードする配列（１９０ＲＶＲＲＳＶＧ１９６（配列番号：６６））を、コンセンサスなグランザイムＢ認識配列（１９０ＩＥＰＤＳＧ１９５（配列番号：１３））で置き換えた。潜在的な２つのＮ−グリコシル化部位を、記載されるように突然変異させ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １４（１２）：１０３５−４１（２００１））、６Ｈｉｓタグ配列を検出および精製のために融合遺伝子のＣ末端に加えた。α因子ペプチドシグナルおよびＫｅｘ２切断部位を維持しつつ、融合遺伝子をｐＰＩＣ９ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＸｈｏｌおよびＮｏｔｌ部位にクローニングした。
【０３１９】
ＣＤｌ９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞、ＣＤ５＋ＪＶＭ３細胞の生成
Ｊｕｒｋａｔ  ＳＶＴ３５細胞は、ウシ胎仔血清１０％（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を添加したＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。ＪＶＭ−３（ＤＳＭＺ、ドイツ）は、ウシ胎仔血清１０％（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。
【０３２０】
組換えウイルスを調製するために、レトロウイルスベクターＭ３Ｐ−ＧＦＰ中のＧＦＰ遺伝子を、ＣＤ１９またはＣＤ５全長ｃＤＮＡで置き換えた。ウイルス粒子を生成するために、直線化Ｍ３Ｐ−ＣＤ１９プラスミドを、トランスフェクションの前日に１０ｃｍ２プレートに５ｘ１０６で播種しておいた２９３ＥＴＮ細胞に、ｐＭＤ−ＭＬＶおよびｐＭＤ−ＶＳＶＧでコトランスフェクトした。Ｍ３Ｐ−ＣＤ１９、ｐＭＤ−ＭＬＶ−Ｇ／ＰおよびｐＭＤ−ＶＳＶＧのＤＮＡ濃度は、それぞれ１０μｇ、７μｇおよび３μｇであった。ＴｒａｎｓＦｅｃｔｉｎの体積（μｌ）は、総ＤＮＡ濃度（μｇ）の２．５倍だった。トランスフェクションから４８時間後にウイルス粒子を回収し、０．４５μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通して濾過した。
【０３２１】
感染には、５  １０５Ｊｕｒｋａｔ細胞を培地１．５ｍｌに懸濁し、６ウェルプレート内で濾過したウイルス１．５ｍｌと混合した。３μｌのポリブレン８ｍｇ／ｍｌを、最終濃度８μｇ／ｍｌになるまで混合物に加えた。ＣＯ２５％を含有する３７℃のインキュベーター内で培養する前に、プレートを２０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。ＣＤ１９を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を単離するために、ＦＩＴＣコンジュゲート型抗ヒトＣＤ１９抗体で染色した後で、感染させた細胞をソートした。（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）。高濃度のＣＤ１９を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を回収して細胞毒性アッセイ法に用いた。
【０３２２】
フローサイトメトリー分析
細胞表面上でのＣＤ５およびＣＤ１９の存在を、間接蛍光免疫染色を用いて分析した。最初に、１００万細胞あたり０．５μｇの濃度で、細胞をマウス抗ヒトＣＤ５またはマウス抗ヒトＣＤ１９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でインキュベートした。ＲＰＥＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とコンジュゲートされたヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧｌを、１００万細胞あたり０．２５μｇの濃度で二次抗体として用いた。染色された細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＸＣａｌｉｂｅｒ）により分析した。
【０３２３】
Ｂ．２９３ＥＴＮ細胞からのＧｒＢ−抗ＣＤ１９融合物の発現および精製
２９３ＥＴＮ細胞を１０ｃｍプレートあたり５  １０６〜６  １０６細胞で播種し、１２μｇのｐＥＡＫ１５  ＧｒＢ−抗ＣＤＩ９Ｌおよび２５μｌのＴｒａｎｓＦｅｃｔｉｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、製造業者のプロトコルにしたがってトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３日間培養して融合タンパク質を蓄積させた。上清を収集して事前に平衡化しておいたＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてインキュベートし、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾールおよび５％グリセロールを含有する緩衝液で融合タンパク質を溶出した。精製したＧｒＢ−抗ＣＤ１９融合タンパク質をエンテロキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて室温で一晩インキュベートして、グランザイムＢのタンパク質分解活性を活性化させた。エンテロキナーゼから放出されたエンテロキナーゼおよびＮ末端ペプチドを除去するために、反応混合物をＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて親和性精製した。別の調製の形態では、エンテロキナーゼから放出されたエンテロキナーゼおよびＮ末端ペプチドをゲル濾過精製（ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で除去した。精製したペプチドを蛍光発生ペプチド基質（Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＡＭＣ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）でインキュベートすることにより、グランザイムＢ−抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖのタンパク質分解活性を測定した。蛍光産物の蓄積は、励起および発光波長３８０および４６０ｎｍで、それぞれ１５分間３０秒ごとにモニタリングした。
【０３２４】
Ｃ．ピキアパストリス由来のＤＴ−抗ＣＤ５融合物の発現および精製
電気穿孔により、ピキアパストリスＫＭ７１細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を発現プラスミドで形質転換させた。製造業者のプロトコルにしたがって、陽性クローンを選択した。大規模精製には、単一コロニーを緩衝グリセロール最小培地（ＢＭＧ）１０ｍｌ（ｐＨ６．０）中で、２８℃で一晩培養した。一晩培養液を１ＬのＢＭＧ（ｐＨ６．０）に移し、ＯＤ６００が６．０に到達するまで２８℃で培養した。タンパク質発現を誘発するために、培養液を遠心沈殿させ、１％カザミノ酸（ＢＭＭＹＣ）を含有する緩衝（ｐＨ６．６）メタノール複合培地１００ｍｌで再懸濁し、１５℃で４８時間培養した。上清を収集し、ｐＨ７．６になるまでＮａＯＨ５％で調節した。澄んだ上清をＧｒＢ−抗ＣＤ１９融合タンパク質精製のために上述の通り親和性精製した。
【０３２５】
Ｄ．大腸菌由来のＤＴ−抗ＣＤ５、抗ＣＤ５−ＰＥＡ、および抗ＣＤ５−ＶＣＥ融合タンパク質の発現および精製
αＣＤ５−ＰＥＡ、αＣＤ５−ＶＣＥおよびそれらの変異体に対応するＤＮＡ配列を、ｐＥＴ２８ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｃｏｌおよびＮｏｔｌにクローニングした。形質転換させた細菌細胞（ＢＬ２１）を、ＬＢ培地を用いて３７℃で培養した。不溶性融合タンパク質の発現を誘発するために、タンパク質発現を１ｍＭのＩＰＴＧを用いて、３７℃で４時間ＯＤ６００＝０．８〜１．０で誘発した。採取した細胞ペレット４０ｍｌを、Ｂ−ＰＥＲ  ＩＩ（Ｐｉｅｒｃｅ）５ｍｌ中で再懸濁させ、製造業者の指示にしたがってＢ−ＰＥＲ  ＩＩで封入体を精製した。精製した封入体を２０ｍＭのＴｒｉｓ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、６ＭのＧｕＣｌおよび１ｍＭのβ−ＭＥで溶解し、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂でさらに精製した。最終精製した融合タンパク質を、以前に記載されたプロトコル（Ｕｍｅｔｓｕ  Ｍ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：８９７９−８９８７（２００３））を用いて、濃度０．２ｍｇ／ｍｌでリフォールディングした。可溶性ＳｃＦｖ−ＶＣＥ融合タンパク質の発現を誘発するために、合成遺伝子をｐＥＴ２２ｂベクターのＮｃｏｌおよびＮｏｔｌにクローニングした。タンパク質の発現を０．２ｍＭのＩＰＴＧを用いて１７℃で一晩ＯＤ６００＝０．３〜０．５で誘発した。細菌の周辺質フラクションを、記載される通りに収集し（Ｍａｌｉｋら、Ｐｒｏｔ．  Ｅｘｐ．  Ｐｕｒ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（２００７））、融合タンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂で精製した。
【０３２６】
Ｅ．ＧｒＢ−抗ＣＤ１９融合タンパク質の特異的なタンパク質分解活性
精製されたＧｒＢ−抗ＣＤ１９融合タンパク質の酵素活性を評価するために、蛍光発生ペプチド基質（Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＡＭＣ）（配列番号：９）を使用して、融合タンパク質の活性をＳｉｇｍａ社より購入した精製マウスグランザイムＢの活性と比較した。精製されたＧｒＢ−抗ＣＤ１９は、市販のマウスグランザイムＢ製剤の活性と類似する活性を示し、ヒトグランザイムＢのＣ末端にＳｃＦｖ部分を加えることがタンパク質分解活性を低下させないこと、またエンテロキナーゼ処理が、成熟したグランザイムＢの最初のイソロイシンよりも前にある末端配列を効率的に除去して、融合タンパク質の酵素活性の発現を可能にすることを示唆した。
【０３２７】
グランザイムＢ切断部位を有するＤＴ−抗ＣＤ５融合タンパク質が、マウスグランザイムＢまたはＧｒＢ−抗ＣＤ１９融合タンパク質のいずれかによって基質として認識されるかどうかを確証するために、Ｎ末端ＦＬＡＧタグを含有するＤＴ−抗ＣＤ５融合タンパク質を、マウスグランザイムＢ（図１ＢおよびＣ、レーン２）またはＧｒＢ−抗ＣＤ１９融合タンパク質（図１Ｂ、レーン３）のいずれかとインキュベートした。反応により、ジフテリア毒素のＡ鎖に対応するＮ末端２５ｋＤフラグメント（図１Ｂ）、ならびにジフテリア毒素のＢ鎖に対応するＣ末端５０ｋＤフラグメントおよびＳｃＦｖ部分（図１Ｃ）が生じ、ＤＴ−抗ＣＤ５融合タンパク質は、操作されたグランザイムＢ部位ＩＥＰＤ↓ＳＧ（配列番号：１３）で特異的に切断され得るという解釈と一致するものであった。
【０３２８】
異なるプロテアーゼによる様々なＤＴ−抗ＣＤ５融合タンパク質の切断特異性をさらに研究するために、ＤＴ−抗ＣＤ５融合タンパク質のフリン切断部位を、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（ＨＲＶ  ３Ｃ）切断部位（ＡＬＦＱ↓ＧＰＬＱ）（配列番号：１４）（図１Ｃ、レーン５から８）のものと置き換えた。ＨＲＶ  ３Ｃプロテアーゼ切断配列を有するＤＴ−抗ＣＤ５は、グランザイムＢまたはフリンによってではなく、ＨＲＶ  ３Ｃプロテアーゼのみによって切断され得る（図１Ｃ、レーン６，７および８）。さらに、フリン切断部位がグランザイムＭの認識部位ＫＶＰＬ↓ＳＧ（配列番号：６７）によって置き換えられた時、得られた毒素ＤＴＧｒＭ−抗ＣＤ１９は、融合タンパク質ＧｒＭ−抗ＣＤ５〜ＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞との相乗毒性を示した（図１４）。ＤＴＧｒＭ−抗ＣＤ１９の毒性は、この特定の毒素融合体が、内因性のタンパク質分解活性による活性化の影響をより受けやすい可能性があることを示唆している。
【０３２９】
本発明の結果は、フリン切断配列を他のプロテアーゼ切断配列と交換することが、突然変異ＤＴを不活性化し（またはＧｒＭの場合は活性をより低くする）、突然変異ＤＴ融合タンパク質が操作された切断配列を認識するプロテアーゼによって選択的に活性化され得るということを実証するものである。
【０３３０】
Ｆ．変更された切断部位特異性を有するグランザイムＢの突然変異形態
触媒ポケットを取り囲む残基の突然変異変更による、プロテアーゼのタンパク質分解特異性の変換は、当技術分野において周知である。特に、グランザイムＢの部位特異的突然変異誘発に関与する以前の研究、および異なる種に由来するグランザイムＢタンパク質の研究は、酵素の基質特異性を決定する残基を同定し、変更された切断特異性を有する突然変異形態を提供してきた（Ｈａｒｒｉｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：２７３６４−２７３７３（１９９８）、Ｒｕｇｇｌｅｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：３０７５１−３０７５９（２００４）；  Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら、Ｊ  ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２：４５４５−４５５２（２００７））。同様に、マウスグランザイムＢのアイソフォームは、ヒトＢｉｄ、マウスＢｉｄおよびヒトカスパーゼ３に対して、ヒトグランザイムＢよりもはるかに低い切断活性を示すことが明らかになっている。結果として、マウスグランザイムＢは、ヒト細胞におけるアポトーシスを誘導しにくいと考えられる（Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２：４５４５−４５５２（２００７））。Ｈａｒｒｉｓらの研究におけるグランザイムＢの突然変異形態には、変更された切断配列特異性のためにアポトーシス経路を開始する能力が低下しているものがあった。本発明者らは、このようなグランザイムＢの突然変異形態の１つである、Ａｓｎ２１８がＴｈｒ（Ｎ２１８Ｔ）と置き換えられたものから融合タンパク質を生成し、Ｎ２１８ＴグランザイムＢが野生型グランザイムＢにとって好ましい基質とは認められない配列であるＩＡＰＤ（配列番号：４８）に対して切断部位選択性を示すことを示した。さらに、ＩＡＰＤ（配列番号：４８）配列に対するＮ２１８Ｔの切断活性が、ＩＥＤＰ（配列番号：９）に対する野生型グランザイムＢの切断活性よりも高いことが分かった。よって、本発明の一つの態様においては、グランザイムＢ融合タンパク質は、最適な切断配列に対する完全な（または向上した）タンパク質分解活性を所有する一方で、標的細胞のアポトーシスを誘導する能力を低下／抑止するために修飾され得る。
【０３３１】
本発明者らは、野生型ヒトグランザイムＢ配列を有するグランザイムＢ融合タンパク質の、ＩＥＰＤ（配列番号：９）またはＩＡＰＤ配列（配列番号：４８）を有する基質を切断する能力を、Ｎ２１８Ｔ突然変異を有するものと比較した。基質の２０％のみが切断されるという条件下において、Ｎ２１８Ｔが、その野生型対応物に匹敵する能力でＩＥＰＤ（配列番号：９）基質を切断することを発見した（図２８、レーン５と６を比較）。予想した通り、Ｎ２１８Ｔは、その野生型対応物と比べて、ＩＡＰＤ（配列番号：４８）基質をより効率的に切断したことが分かった（図２８、レーン５と６を比較）。インビトロでの切断結果と一致して、プロトキシンおよび２つの異なる形態のグランザイムＢプロトキシン活性化因子を有するＩＥＤＰ／ＩＡＰＤ（配列番号：４８）のすべての可能な組み合わせのうち、プロトキシンを有するＩＡＤＰ（配列番号：４８）とＮ２１８Ｔ突然変異グランザイムＢのプロトキシン活性化因子との組み合わせが、標的細胞に対して高い毒性を示したことが明らかになった（データは非表示）。
【０３３２】
Ｇ．ＤＴ、ＰＥＡ、またはＶＣＥに基づく毒素融合体の細胞毒性アッセイ
ＣＤ５およびＣＤ１９の両方を発現する細胞株および対応する親細胞株で、組み合わせ免疫毒素の細胞毒性を試験した。細胞は、ロイシン不含ＲＰＭＩ培地９０μｌ中にウェルあたり５  １０４細胞で９６ウェルプレートに配置し、様々な濃度のＧｒＢ−抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖおよび／またはＤＴ−抗ＣＤ５  ＳｃＦｖ融合タンパク質を含有するロイシン不含ＲＰＭＩ培地１０μｌと、３７℃で２０時間、５％ＣＯ２中でインキュベートした。０．３３μＣｉの［３Ｈ］−ロイシンを３７℃で１時間加えることにより、タンパク質合成の阻害を測定した。細胞ハーベスター（ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）（ＩｎｏＴｅｋ社製９６ウェル細胞ハーベスター）を用いてガラス繊維濾紙上に濾過により細胞を採取し、［３Ｈ］−ロイシン取り込みの速度をシンチレーション測定により決定した。タンパク質保存緩衝液で処理した対照ウェルに対して、細胞生存率を標準化した。［３Ｈ］−ロイシンを加える前に１ｍＭのシクロヘキシミドで細胞を３０分処理することにより、［３Ｈ］取り込みのバックグラウンドを得た。示した各ポイントは、２つ組ウェルの平均値を表す。
【０３３３】
特異的細胞毒性を示すＧｒＢ−抗ＣＤ１９およびＤＴ−抗ＣＤ５融合タンパク質の組み合わせ
プロテアーゼ融合タンパク質がインビトロで機能的であることを確立した本発明者らは、次に、一対の融合タンパク質が、ＣＤ５およびＣＤ１９の両方を発現する細胞を特異的に標的化することが可能であるかどうかを検討した。この目的のために、本発明者らは、ヒトＲａｊｉ  Ｂ細胞株由来でＣＤ５を発現する、受容体細胞のＢ細胞株であるＣＤ５＋Ｒａｊｉを生成した。抗ＣＤ５および抗ＣＤ１９抗体を用いたサイトメトリー解析により、ＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞株からＣＤ５およびＣＤ１９の両方が発現されたのに対し（図２）、親Ｒａｊｉ細胞はＣＤ１９のみを発現することが示唆された。ＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞株からのＣＤ５の発現は、長時間の培養に渡ってＣＤ５レベルにおける有意な変化は認められず、安定しているように見られた。
【０３３４】
融合タンパク質が特異的な標的細胞を死滅させる能力を評価するために、単独でまたはＲａｊｉもしくはＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞のいずれかとともに、融合タンパク質をインキュベートしてから、タンパク質合成活性を測定した。ＧｒＢ−抗ＣＤ１９単独では、すべての試験濃度でＲａｊｉまたはＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞に対して識別可能な細胞毒性を示さなかったこと、またＤＴ−抗ＣＤ５はＲａｊｉ細胞に対して毒性を持たず、ＣＤ５＋Ｒａｊｉに対しては高濃度で非常にわずかな毒性を示したのみであったことが分かった。しかしながら、ＤＴ−抗ＣＤ５とＧｒＢ−抗ＣＤ１９の融合タンパク質の組み合わせは、４２３．３ｐＭのＥＣ５０でＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞におけるタンパク質合成を停止させることができたのに対し、親Ｒａｊｉ  Ｂ細胞株は、同じ処理に対して感受性を示さなかった（図３Ｂ）。ＧｒＢ−抗ＣＤ１９は、用量依存的な様式でＤＴ−抗ＣＤ５を活性化させ（図４）、ＧｒＢが単独でアポトーシス活性を示した濃度をはるかに下回る約１．０ｎＭで、操作されたＤＴ−抗ＣＤ５を完全に活性化させた（Ｌｉｕら、Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ２（１２）：１３４１−５０（２００３））。これらの結果はともに、ＤＴ−抗ＣＤ５は、抗ＣＤ５  ＳｃＦｖドメインを通してＣＤ５＋細胞に標的化され得ること、およびＧｒＢ−抗ＣＤ１９によって効率的に活性化され得ることを実証した。
【０３３５】
ＧｒＢ−抗ＣＤ１９の抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖドメインが、グランザイムＢ活性が効率的に標的細胞を標的化するのに必要であるかどうかを検討するために、本発明者らはＪｕｒｋａｔおよびＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞株を用いて、追加の細胞毒性アッセイを行った。ＣＤ１９＋  Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＤＴ−抗ＣＤ５とＧｒＢ−抗ＣＤ１９との組み合わせに対して、Ｊｕｒｋａｔ細胞よりもはるかに感受性が高いことが分かり（図６Ａ）、ＤＴ−抗ＣＤ５は、ＣＤ１９結合相互作用を通して標的化したＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞表面に局在化されたＧｒＢ−抗ＣＤ１９によって有利に活性化されることを示唆した。観察された、これらの薬剤のＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ１９）に対する低度ではあるが有意な細胞毒性は、標的化されたＤＴ−抗ＣＤ５が、培地中の遊離ＧｒＢ−抗ＣＤ１９によって活性化される可能性があることを示唆している。この仮説は、ＪｕｒｋａｔおよびＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞の両方を最初にＧｒＢ−抗ＣＤ１９を用いて４℃で３０分間処理し、結合していないＧｒＢ−抗ＣＤ１９を培地から除去するために緩衝液で洗浄する、別個の実験により確認された。ＤＴ−抗ＣＤ５を用いて３７℃で２０時間の追加処理を行い、ＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞中に細胞毒性を誘導したが、Ｊｕｒｋａｔ細胞中には誘導されず（図６Ｂ）、ＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合したＧｒＢ−抗ＣＤ１９はＤＴ活性化の原因となることを示唆した。これらの結果は、抗ＣＤ５および抗ＣＤ１９の両方が標的細胞の選択的な死滅のために必要であることを示唆するものである。
【０３３６】
コンビナトリアルターゲティングのための細胞毒製薬としてのシュードモナス外毒素（ＰＥＡ）
コンビナトリアルターゲティングの方策の範囲を広げるために、本発明者らは、異なる細菌毒素であるシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥＡ）のこのような状況における使用について調べた。ＰＥＡは、ＤＴに類似した様式で標的細胞を中毒化する。受容体媒介のエンドサイトーシスによる内部移行時には、ＰＥＡは標的細胞でフリンによって切断される。ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼドメインが、ＰＥＡの転位ドメインの補助によりサイトゾルに転位され、ＡＤＰリボシル化伸長因子２により標的細胞のタンパク質翻訳機構を障害する。本発明者らは、出版されている方策に一部基づいて、抗ＣＤ５−ＰＥＡ融合タンパク質を設計し（Ｄｉ  Ｐａｏｌｏ  Ｃ．ら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９：２８３７−４８（２００３））、さらには、フリン切断部位（ＲＱＰＲ↓ＳＷ）をグランザイムＢ切断配列（ＩＥＰＤ↓ＳＧ）（図７Ａ）で置き換えた。Ｕｍｅｔｓｕ  Ｍ．らによって記載されたリフォールディングプロトコルを用いて細菌性封入体由来の凝集融合タンパク質をリフォールディングすることによって、抗ＣＤ５−ＰＥＡ融合タンパク質を調製した（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：８９７９−８９８７（２００３））。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりリフォールディングされた抗ＣＤ５−ＰＥＡを判断したところ、精製した抗ＣＤ５−ＰＥＡ融合タンパク質は高度に純粋であった（図７Ｂ）。マウスグランザイムＢによるタンパク質分解的切断の影響を受けやすく、予想された生成物を生じた（図７Ｃ）。
【０３３７】
抗ＣＤ５−ＰＥＡの標的細胞を死滅させる能力を評価するために、上述の通り細胞毒性アッセイを行った。抗ＣＤ５−ＰＥＡ単独では、標的（ＣＤ５＋ＲａｊｉおよびＣＤ５＋ＪＶＭ３）または非標的（ＲａｊｉおよびＪＶＭ３）細胞のいずれにも毒性を示さず（図８）、コンビナトリアルターゲティング剤の第２の成分ＧｒＢ−抗ＣＤ１９の存在下においてのみ、αＣＤ５−ＰＥＡは、ＣＤ５＋ＲａｊｉおよびＣＤ５＋ＪＶＭ３細胞についてそれぞれ１．０７ｎＭおよび０．８１ｎＭの見かけ上のＥＣ５０で、標的細胞（ＣＤ５＋ＲａｊｉおよびＣＤ５＋ＪＶＭ３）を選択的に死滅させたことが分かった（図８）。
【０３３８】
コレラ菌ＴＰ株由来のＰＥＡ様タンパク質の同定および特徴付け
抗ＣＤ５−ＰＥＡの研究を行う内に、本発明者らは、コレラ菌の環境分離株（ＴＰ株）に見られる推定上の毒素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ８７６０５３）を同定した（Ｐｕｒｄｙ  Ａ．ら、Ｊ．  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８７：２９９２−３００１（２００５））。この推定コレラ菌外毒素（ＶＣＥ）は、ＰＥＡ（同一性３３％および陽性４９％）に中程度のタンパク質配列相同性を共有するのみであるが、活性部位残基（ＰＥ中のＨ４４０、Ｙ４８１、Ｅ５５３）、ドメインＩＩ内のフリン切断部位、およびＣ末端のＥＲ保持シグナルを含む、ＰＥＡの機能に欠かせない残基はＶＣＥ中に保存される（図９）。さらに、分子シミュレーションツールを用いて、ＶＣＥ触媒ドメイン配列をＰＥＡ触媒ドメインの構造にスレッディングすることに成功し、ＶＣＥはＰＥＡの構造と類似する構造内にフォールディングするため、類似する酵素活性を有する可能性があるという考えと一致した（Ｙａｔｅｓ  Ｓ．Ｐ．，  ＴＩＢＳ  ３１：１２３−１３３（２００６））。
【０３３９】
ＶＣＥがＰＥＡ様毒素であるかどうかを試験するために、本発明者らはいくつかの抗ＣＤ５−ＶＣＥ合成遺伝子を構築して、抗ＣＤ５−ＰＥＡのための発現および精製プロトコルにしたがって、大腸菌中に抗ＣＤ５−ＶＣＥ融合タンパク質を生成した（図１０Ｂ）。抗ＣＤ５−ＰＥＡのように、グランザイムＢ部位を有する抗ＣＤ５−ＶＣＥ融合タンパク質は、マウスグランザイムＢおよびＧｒＢ−抗ＣＤ１９融合タンパク質の両方によって、グランザイムＢ切断部位で特異的に切断され得る。その後本発明者らは、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９の存在下または不在下において抗ＣＤ５−ＶＣＥが標的細胞を死滅させる能力を試験し、ＤＴ−抗ＣＤ５および抗ＣＤ５−ＰＥＡ融合タンパク質のように、抗ＣＤ５−ＶＣＥ融合タンパク質単独では標的細胞に毒性を示さず、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９融合タンパク質の存在下においてのみ、標的細胞を選択的に死滅させたことが分かった（図１１）。
【０３４０】
ＰＥＡと比較して、予想外のＶＣＥの２つの利点は、大腸菌における発現および活性に関連している。抗ＣＤ５−ＰＥＡは、不溶性形態においてのみ大腸菌中で生成することができたのに対し、抗ＣＤ５−ＶＣＥは大腸菌中で可溶性に発現され、容易なＨｉｓタグ媒介によるカラム精製を可能にした。また、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９の存在下では、抗ＣＤ５−ＶＣＥは、抗ＣＤ５−ＰＥに対するよりも高い毒性をＣＤ５＋Ｒａｊｉに対して示した。ＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞に対する抗ＣＤ５−ＶＣＥ、抗ＣＤ５−ＰＥＡ、およびＤＴ−抗ＣＤ５の細胞毒性プロファイルが同時に決定された時に、観察されたＥＣ５０値によって示された相対力は：抗ＣＤ５−ＶＣＥ（〜１．３ｎＭ）＜ＤＴ−抗ＣＤ５（〜３．０ｎＭ）＜抗ＣＤ５−ＰＥＡ（〜４．８ｎＭ）であった。ＶＣＥとＰＥＡは、類似するドメイン構造を持つために、類似する転位／中毒機構を共有することが予測できるので、ＶＣＥがはるかに有意に毒性であるというのは驚くべきことである。ＶＣＥの毒性が増加したのは、ＶＣＥ転位ドメインによるＡＤＰリボシルトランスフェラーゼのより効率的な転位、またはＡＤＰリボシルトランスフェラーゼの本質的に高めの活性が原因である場合がある。ＶＣＥ転位ドメインおよびＰＥＡ  ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼドメインを含む合成酵素は、標的細胞に対してＶＣＥ毒素よりも〜３００倍毒性が低い。
【０３４１】
コンビナトリアルターゲティング方策の有効性をさらに評価するために、グランザイムＢ切断部位を有する抗ＣＤ５−ＶＣＥ、内因性のフリン切断部位を有する抗ＣＤ５−ＶＣＥ融合タンパク質、および活性部位のうちの１つが突然変異された（グルタミン酸６１３からアラニンへ）抗ＣＤ５−ＶＣＥ融合タンパク質の、３つの融合タンパク質の細胞毒性を比較した。予想した通り、Ｅ６１３Ａ活性部位の突然変異は、試験濃度で標的細胞を死滅させられなかった（図１１）。フリン切断部位をグランザイムＢ切断部位と置き換えることで、抗ＣＤ５−ＶＣＥ融合タンパク質の毒性は実質的に減少したが、１．０ｎＭのＧｒＢ−抗ＣＤ１９を加えることにより、その細胞毒性を完全に回復した（図１１）。これらの結果は、コンビナトリアルターゲティング剤が高度に選択的であるばかりでなく、従来の免疫毒素としても有効であることを明らかに実証するものである。
【０３４２】
コンビナトリアルターゲティング方策のための標的機構としてのｕＰＡ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）のＮ末端成長因子様ドメイン
天然のペプチドは、それらの同族の受容体を高い選択性および親和性で結合することが明らかになっている。このような例の１つは、ｕＰＡの受容体であるｕＰＡＲへの結合である。ｕＰＡＲへの高親和性結合（Ｋｄ≒０．５ｎＭ）の原因であるｕ−ＰＡの領域は、Ｎ末端成長因子様ドメイン（Ｎ−ＧＦＤ）と称される最初の４６アミノ酸内に、完全に局在化されることが分かっている（Ａｐｐｅｌｌａ  Ｅ．，ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２：４４３７（１９８７））。Ｎ−ＧＦＤのような天然のタンパク質の配列が、コンビナトリアルターゲティング方策の標的原理としての役目を果たすのに適合しているかどうかを調べるために、抗ＣＤ５−ＶＣＥ融合タンパク質のＳｃＦｖドメインをＮ−ＧＦＤで置き換えてＮ−ＧＦＤ−ＶＣＥを生成し、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９融合タンパク質と組み合わせてｕＰＡＲ＋細胞の選択的死滅における有効性を試験した。Ｊｕｒｋａｔ細胞が適度なレベルのｕＰＡＲを発現すること、そしてｕＰＡＲ＋細胞を標的にするＤＴＡＴ、ジフテリア毒素／ウロキナーゼ融合タンパク質に対して感受性を有することが明らかになっているため、ＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を細胞毒性アッセイに用いることを選択した（Ｒａｍａｇｅ  Ｊ．Ｇ．ら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓ．  ２７：７９−８４（２００３））。天然のフリン切断部位を有するＮ−ＧＦＤ−ＶＣＥはＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞に毒性を示すが、ｕ−ＰＡＲ陰性のＲａｊｉ細胞には毒性を示さないことが明らかになり、細胞標的化選択性は排他的にＮ−ＧＦＤ−ＶＣＥのＮ−ＧＦＤドメインを通して達成されることを示唆するものであった。グランザイムＢ部位を有する融合タンパク質は、単独では高い濃度で限られた毒性のみを示し、Ｎ−ＧＦＤ−ＶＣＥ自体は標的細胞に毒性を示さない濃度で、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９の存在下においてＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞株を死滅させることができた（図１２）。これらの結果は、天然のリガンドが、コンビナトリアルターゲティングのための標的化機構としての役割を果たすことができることを実証するものである。
【０３４３】
抗ＣＤ５−ＶＣＥおよびＧｒＢ−抗ＣＤ１９の組み合わせを用いたＣＬＬ患者由来のＰＢＭＮＣの選択的死滅
コンビナトリアルターゲティング剤が、Ｂ細胞−慢性リンパ性白血病細胞を特異的に死滅させることができるかどうかを試験するために、Ｂ−ＣＬＬ患者由来の精製された末梢血単核球（ＰＢＭＮＣ）を用いて細胞毒性アッセイを行った。ＦＡＣＳ分析は、約３０％のＰＢＭＮＣがＣＤ５＋Ｂ細胞であることを示唆した（図１３Ａ）。ターゲティング剤のそれぞれの成分はＰＢＭＮＣに毒性を示さないことが分かった（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。さらに、コンビナトリアルターゲティング剤が、報告された細胞株（ＣＤ５＋Ｒａｊｉ）すべてのタンパク質合成活性を停止した濃度で、ＰＢＭＮＣのタンパク質合成活性全体の約３０％が停止された。重要なのは、ＤＴ−抗ＣＤ５の濃度を増加しても、それ以上はタンパク質合成の阻害が観察されなかったことであり、コンビナトリアルターゲティング剤は、標的細胞集団（すなわち、ＣＤ５＋Ｂ細胞）のタンパク質合成活性のみを停止させる可能性があるという見解と一致した。総合すると、本発明者らのデータは、細胞の異種混合物からの特異的な細胞集団を排除するために、他の細胞種にごく僅かな毒性を有するコンビナトリアルターゲティング剤が採用され得るということを示すものである。
【０３４４】
Ｈ．抗ＣＤ５−アエロリジンおよび抗ＣＤ１９−アエロリジン融合タンパク質の調製
タグ付き、修飾したアエロリジンの大葉、タグ付き抗ＣＤ５  ＳｃＦｖ、およびタグ付き抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖの遺伝子構築
アエロモナスハイドロフィラのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ：７９６５Ｄ）から、Ｆａｓｔｓｔａｒｔ  ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲミックス（Ｒｏｃｈｅ）を用いてアエロリジンを増幅した。ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩでＰＣＲ産物を消化し、ｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化した。続いてクローンの３’端を増幅によって修正し、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化して、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位を用いてｐＥＴ２２ｂに再度クローン化した。多くの異なるアエロリジンの変異体が存在するが、本発明者らが得た配列はアエロリジンクローンａｅｒ４（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ６５０４３）に最も密接に類似していた。本発明者らのクローンとａｅｒ４との間の最も有意な類似性は、成熟した孔形成毒素とプロペプチドを分離する活性化ペプチド配列中にある。これは、フリン（ＤＳＫＶＲＲＡＲ↓ＳＶＤＧ）によって活性化されると考えられる元々のａｅｒＡ遺伝子から同定された配列とは大きく異なる。本発明者らのクローンの活性化部分を、天然活性化部分（ＡＳＨＳＳＲＡＲＮＬＳ）から、ヒトグランザイムＢ（ＥＳＫＧＩＥＰＤ↓ＳＧＶＥＧ）およびタバコエッチウイルスプロテアーゼＴＥＶ（ＥＳＫＥＮＬＹＦＱ↓ＧＶＥＧ）によって認識され得る配列に突然変異させた。本発明者らは、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼに基づくＰＣＲ突然変異誘発法（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、部位特異的突然変異誘発を行った。部位特異的突然変異誘発を用いて天然タンパク質の小葉を欠失させ、ソルターゼの基質配列（ＧＫＧＧＳＮＳＡＡＳ）と置き換えるために、これらの変異体をさらに修飾した。得られたクローンは、それぞれＧＫ−アエロリジンＧｒＢおよびＧＫ−アエロリジンＴＥＶと称する。
【０３４５】
抗ＣＤ５  ＳｃＦｖをＰＣＲ増幅し、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩでそれぞれ消化して、Ｈｉｓタグの上流にあるソルターゼ付着シグナルＬＰＥＴＧを有するように改変されたｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）変異体にクローン化した。抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖをＰＣＲ増幅し、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化して、Ｃ末端に周辺質シグナル配列およびソルターゼ付着シグナルを有する改変型ｐＥＴ２８ａにクローン化した。
【０３４６】
タグ付きアエロリジンタンパク質、タグ付き抗ＣＤ５  ＳｃＦｖ、およびタグ付き抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖの発現および精製
ＧＫ−アエロリジンＧｒＢ（図１６）およびＧＫ−アエロリジンＴＥＶを、０．２ｍＭのＩＰＴＧで５時間誘導した後に、ＢＬ２１  ｓｔａｒ細胞において２５℃で発現させた。細胞をペレット化して溶解緩衝液（２０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．２ｍｇ／ｍＬリゾチーム）中に再懸濁させ、４℃で１時間インキュベートした。その後、超音波処理を施して細菌細胞を溶解し、混合物を遠心沈殿させて上清をＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）でインキュベートした。ＨＳ緩衝液（２０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）および２０ｍＭイミダゾール洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）でカラムを洗浄し、２５０ｍＭのイミダゾール溶出緩衝液（２０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）を用いて溶出した。タンパク質を透析２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した。同様のプロトコルを用いてソルターゼＡを精製した。
【０３４７】
ＳｃＦｖを不溶性封入体としてＢＬ２１細胞中に発現させた。封入体を単離し、再溶解緩衝液（５Ｍ  ＧｕＣｌ、２０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭメルカプトエタノール）中に再懸濁させた。超音波処理を施して溶液を溶解してから、Ｎｉ−ＮＴＡスラリ４ｍＬと混合した。５ＭのＧｕＣｌの存在下において変性状態でタンパク質を精製し、イミダゾール（５ｍＭ  ＧｕＣｌ、２０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール、５ｍＭ  メルカプトエタノール）で溶出した。異なる量のＧｕＣｌおよびアルギニンを使用する連続的な透析アプローチを用いて、タンパク質をリフォールディングした（Ｕｍｅｔｓｕ  Ｍ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：８９７９−８９８７  （２００３））。最後に、リフォールディングしたタンパク質を２０ｍＭ  トリス（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した。
【０３４８】
ソルターゼＡコンジュゲーションを用いた抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢおよび抗ＣＤ１９−アエロリジンＧｒＢの構築
黄色ブドウ球菌のソルターゼＡは、大腸菌から可溶性形態で発現させる（Ｚｏｎｇ  Ｙ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：３１３８３（２００４））。ａｍｉｎｏｌｉｎｋ  ｐｌｕｓ  ｃｏｕｐｌｉｎｇキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、精製されたソルターゼＡを１０ｍｇ／ｍＬでアガロース上に固定化する。ＧＫ−アエロリジンタンパク質およびリフォールディングしたｓｃＦｖをそれぞれ１：２の比率で混合し、０．１Ｍ  トリス（ｐＨ９）５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０の存在下においてソルターゼＡ−アガロースとインキュベートし、室温で一晩インキュベートした。コンジュゲーション混合物を０．２ミクロンのスピンフィルターを通して濾過し、混合物をＱ−アニオン交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製してコンジュゲート型アエロリジンを余剰ＳｃＦｖから分離する（図１７Ｃ）。細胞に基づくアッセイのための調製において、タンパク質を濃縮してＵＶ光吸収により定量化する。
【０３４９】
Ｉ．アエロリジンに基づく毒素融合体の細胞毒性アッセイ（ＭＴＳアッセイ）
細胞生存率を決定するために、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙを使用した。１０％仔ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｆｅ２＋で強化済）を含む９０μｌ  ＲＰＭＩ中の９６ウェルプレートに、ウェルあたり５  １０４細胞で細胞を設置した。様々な濃度のＧｒＢ−抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖおよび／または抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢ融合タンパク質１０μｌを細胞に加え、ＣＯ２５％のインキュベーター内において３７℃で４８時間インキュベートした。ＭＴＳ試薬（２５μｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ３５８Ａ）を各ウェルに加え、４時間に渡り３７℃でインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてＡ４９０を記録した。タンパク質保存緩衝液または１ｍＭシクロヘキシミドで処理した対照ウェルに対して、細胞生存率を標準化した。報告されたデータは、２つ組ウェルからの平均的な読取り値を表す。
【０３５０】
抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢはＧｒＢ−抗ＣＤ１９により選択的に活性化される
ＧｒＢ切断部位およびＣＤ５結合部分を含有する操作されたアエロリジン融合タンパク質を、ＣＤ５＋／ＣＤ１９＋細胞のコンビナトリアルターゲティングという状況において毒素の原理として用いることができるかどうかを調べるために、抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢのＣＤ５＋ＲａｊｉおよびＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する細胞毒性を、２ｎＭのＧｒＢ−抗ＣＤＩ９の存在下または不在下においてアッセイした。図１８に示すように、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９が存在する時のみ強力な細胞毒性が観察され、ＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞およびＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞のＥＣ５０は、それぞれおよそ０．３〜０．４ｎＭおよび６．５ｎＭであった。ＧｒＢ−抗ＣＤ１９を追加しなければ、事実上毒性は観察されなかった。アエロリジンに基づくプロトキシンによるこのような程度の副作用は、細胞外タンパク質分解活性化とそれに続く細胞表面上での孔形成に関与する中毒機構に起因するものである可能性がある（Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｂｕｃｋｌｅｙ，  Ｊ．  Ｂａｔｅｒｉｏｌ．  １６３：３３６−３４０（１９８５））。それに対して、ＤＴ、ＰＥ、またはＶＣＥに基づくプロトキシンは、転位プロセス中に標的細胞内で活性化され（Ｏｇａｔａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：２５３９６−２５４０１（１９９２））、その間に細胞内における内因性のタンパク質分解活性が、標的化された活性因子によって特異的に活性化された場合よりはるかに低い程度であるが、異種のプロテアーゼ切断部位を切断して活性化する可能性がある。
【０３５１】
抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢ／ＧｒＢ−抗ＣＤ１９の細胞毒性には、特異的抗ＣＤ５  ＳｃＦｖ／ＣＤ５の細胞表面における相互作用が必要である
細胞を標的化するために、ＣＤ５が抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢと結合することが必要であることは、抗ＣＤ５  ＳｃＦｖドメインを持たないＧＫ−アエロリジンＧｒＢが、試験条件下においてＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞に対して毒性を示さないことにより確認された。抗ＣＤ５  ＳｃＦｖと細胞表面ＣＤ５との間の特異的相互作用のための必要条件は、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９と組み合わせた抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢが、ＣＤ５表面マーカーを持たないＲａｊｉ細胞に毒性を示さないことが観察されたことで、さらに証明された（図１８Ｂ）。抗ＣＤ５−ｓｃＦＶ部分が、抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢ融合タンパク質をＣＤ５＋Ｒａｊｉ細胞に誘導することができるということは驚くべきことではないが、抗ＣＤ５−ｓｃＦＶ部分が単純にアエロリジンの小葉を置き換えて、アエロリジンに不可欠な箇所として上手く機能することができるかは明白ではない。野生型アエロリジンの小葉は、ＧＰＩアンカータンパク質上のＮグリカンによって認識されること、またそれに特異的に結合することが知られており、ＮグリカンおよびＧＰＩグリカンコアの両方が結合に寄与する部位を認識することを示唆している（ＭａｃＫｅｎｚｉｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：２２６０４−２２６０９（１９９９））。反対に、アエロリジンの大葉内にあるドメイン２は、ＧＰＩコアの結合の一因であると考えられる。抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢ／ＧｒＢ−抗ＣＤ１９によって達成されるＣＤ５＋／ＣＤ１９＋細胞に対する特異的な細胞毒性は、Ｎグリカンと対応するＧＰＩグリカンコアとの結合に対する小葉の寄与は、認識するバインダーと表面抗原との間の他の相互作用によって置き換えられてもよく、表面マーカーはＧＰＩアンカータンパク質でなくてもよいということを実証した。
【０３５２】
ＣＤ５＋ＪＶＭ３およびＪｅｋｏ−１細胞株に対する細胞毒性
ＪＶＭ−３は、ＣＤ５−でありながら、Ｂ−ＣＬＬ様異種移植マウスモデルを確立するために用いられてきた細胞株である（Ｌｏｉｓｅｌ  Ｓ．ら、Ｌｅｕｋ．  Ｒｅｓ．  ２９：１３４７−１３５２（２００５））。上述の通り、コンビナトリアルターゲティング剤を試験するために、本発明者らはＣＤ５＋ＪＶＭ３細胞株を生成した。Ｊｅｋｏ−１細胞株は、ＣＤ５＋／ＣＤ１９＋のマントル細胞リンパ腫細胞株である（Ｊｅｏｎら、Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １０２：１３２３−１３２６（１９９８））。これらの細胞に対する抗ＣＤ５−アエロリジンＧｒＢの強力な細胞毒性が、２ｎＭのＧｒＢ−抗ＣＤ１９の存在下において観察され（図１９）、推定ＥＣ５０はそれぞれ２．１ｎＭおよび２２．４ｎＭであった。Ｊｅｋｏ−１細胞は、自然にＣＤ５およびＣＤ１９両方の表面抗原を有するため、これらのデータは、コンビナトリアルターゲティング試薬が、天然レベルで細胞表面上に存在する細胞表面標的を認識することによって、選択的に癌細胞を破壊する能力を持つことを示すものである。
【０３５３】
リン酸化されるとフリン切断をブロックするリン酸化部位を有する野生型および突然変異ＤＴ融合タンパク質の構築および発現
全長ＤＴをコードする遺伝子（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより合成）をｐＢＡＤ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にクローン化した。フリン切断部位での単一アミノ酸の挿入は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社の部位特異的突然変異誘発キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）  １１  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）を用いて実現した。ＰＣＲ法を用いて、ベクタープラスミド中の元々のエンテロキナーゼ認識配列をＴＥＶプロテアーゼ認識配列に変化させた。
【０３５４】
すべてのプラスミド構築物をＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）  ＴＯＰＯ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中に形質転換させた。陽性コロニーを選択した。タンパク質誘導には、単一の陽性細菌コロニーを２ｍｌのＬＢ中に播種して、一晩インキュベートした後でＬＢ１００ｍｌ中に移した。ＯＤが０．６に到達した後、培養液を１６℃のインキュベーターに移し、最終濃度２０ｐｐｍになるまでアラビノースを加え、４時間インキュベーションを続けた。細菌を２０００ｇで１０分間沈殿させてから、２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ  ＮａＣｌの緩衝液８ｍｌ（ｐＨ８．０）に細胞ペレットを懸濁させた。リゾチーム８ｍｇを用いて細胞溶液を氷浴上で３０分インキュベートした。超音波処理の後、ライセートを３，０００ｇで１５分遠心分離し、得られた上清を製造業者の推奨する手順（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にしたがってＮｉ−ＮＴＡアガロース精製により精製した。
【０３５５】
精製後、タンパク質溶液を２５ｍＭトリス、２５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０％グリセロールの緩衝液に対してｐＨ７．５で一晩透析し、フリン切断およびリン酸化反応に適合する緩衝液系を得た。生成したすべての融合タンパク質  （ＤＴ、ＤＴＡ、ＤＴＳ、ＤＴＡＴ）  を対応するフリン切断部位とともに図２１に示す。
【０３５６】
融合タンパク質のリン酸化
Ｔｒｘ−ＤＴ融合タンパク質ＤＴ、ＤＴＡ、ＤＴＳ、およびＤＴＡＴの部位特異的リン酸化の有効性および特異性を調べるために、市販される多くのキナーゼをスクリーンした。タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）が、これらの融合体に最も有効であると同定された。リン酸化反応は、タンパク質１μｇ、タンパク質キナーゼＡ１μｌ、および１ｍＭ  ＡＴＰ  （Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）２μｌを含有する、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２緩衝液（ｐＨ７．５）２０μｌ中で行われた。混合物は３０℃で２０分インキュベートした。リン酸化生成物を可視化するために、いくつかのリン酸化実験においてγ−３２Ｐ−ＡＴＰをＡＴＰに添加し（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、３２Ｐ標識Ｔｒｘ−ＤＴを得た。ＰＫＡは、すべての融合タンパク質に放射性リン酸塩基を加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で示されるように単一の生成物を生成することが分かった（図２２Ｂ、上パネル）。Ｔｒｘ−ＤＴ融合体の標識有効性（リン酸化の有効性に相当）は、ＤＴＡ＞ＤＴＳ＞ＤＴＡＴ≒ＤＴであった。
【０３５７】
Ｔｒｘ−ＤＴおよびリン酸化Ｔｒｘ−ＤＴ融合タンパク質のフリン切断
Ｔｒｘ−ＤＴ融合タンパク質内のフリン切断部位でのリン酸化が、フリン切断効率にいずれかの影響を与えるのかどうかを分析するために、非標識かつリン酸塩標識の融合タンパク質をフリンを用いて３７℃でインキュベートした。各フリン消化には、合計反応体積２０μｌ中でタンパク質２μｇを２ユニットのフリン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と３７℃で混合した。反応緩衝液は、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．５ｍＭジチオスレイトールをｐＨ７．５で含有していた。フリン処理なしのサンプルを対照として用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、反応混合物を分析した。対照サンプルは、切れ目の入った生成物（３５ｋＤおよび４１ｋＤ）をいくつか含有しており、フリン切断部位のフラグメント化と一致していることが分かった。この現象は以前にも他者によって観察されており、タンパク質精製中の望ましくないタンパク質分解的切断の結果だと考えられている。２０分のフリン処理後、ＤＴ、ＤＴＡ、ＤＴＳ、およびＤＴＡＴサンプルは、実質上より多くの切断生成物（３５ｋＤおよび４１ｋＤ）を示し（図２１Ｂ）、予想した通り、非リン酸化サンプルの部位特異的切断を実証した。しかしながら、リン酸化タンパク質ｐＤＴＡ、ｐＤＴＳ、およびｐＤＴＡＴは、フリン切断に対して感受性の低下を示した。１時間後にｐＤＴの有意な消化が見られたが、ｐＤＴＡ、ｐＤＴＳ、およびｐＤＴＡＴについては明白な消化は観察できなかった。その後、一晩消化を続けた。２０時間のフリン処理後、ｐＤＴの切断はほぼ完璧であったが、ｐＤＴＡ、ｐＤＴＡＴおよびｐＤＴＳのわずか５％、１０％、および５０％がフラグメント化されたのみであった（図２２Ｂ）。リン酸化によって、ｐＤＴＡ、ｐＤＴＡＴおよびｐＤＴＳのフリンに対する不安定さが有意に軽減したことは、それらを潜在的に、脱リン酸化により活性化され、天然に活性化可能な毒素を提供する、すなわち、内因性のフリン／ケキシン様プロテアーゼによって活性化され得るプロトキシンとして、用いることができる可能性を提案するものである。
【０３５８】
ＤＴＡ−抗ＣＤ１９およびｐＤＴＡ−抗ＣＤ１９融合タンパク質の調製
フリン切断部位１９０ＲＶＲＲ↓ＡＳＶ１９５でアラニン挿入を含有するＴｒｘ−ＤＴＡ−抗ＣＤ１９融合遺伝子を、対応するＴｒｘ−ＤＴ（図２１ＡのＤＴＡ）およびＤＴＧｒＢ−抗ＣＤ１９融合遺伝子から構築した。Ｔｒｘ−ＤＴＡ−抗ＣＤ１９融合タンパク質を大腸菌に発現させ、可溶性画分を収集し、標準的なＨｉｓタグ精製を用いて精製した。精製したＴｒｘ−ＤＴＡ−抗ＣＤ１９をＴＥＶプロテアーゼで処理してＴｒｘタグを除去し、ＤＴＡ−抗ＣＤ１９を得た。
【０３５９】
ｐＤＴＡ−抗ＣＤ１９を生成するために上述した手順を用いて、精製したＤＴＡ−抗ＣＤ１９を、ＰＫＡおよびＡＴＰでさらにリン酸化した（図２２Ａ）。
【０３６０】
ｐＤＴＡ−抗ＣＤ１９の脱リン酸化
融合タンパク質ｐＤＴＡ−抗ＣＤ１９を大腸菌中で生成した組換えタンパク質ホスファターゼ２Ｃ（ＰＰ２Ｃ）で処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてその脱リン酸化を観察した。得られたＤＴＡ−抗ＣＤ１９は、哺乳動物細胞に存在するフリンによって活性化されるＲＶＲＲ↓ＡＳ配列を含有する。ＰＰ２Ｃを脱リン酸化に選択したのは、ｐＤＴＡ−抗ＣＤ１９内の修飾されたフリン切断部位と非常に類似するＲＲＡＴＰＶＡまたはＲＲＡＳＰＶＡ上のリン酸塩基を効率的に除去することが可能だからである（Ｄｅａｎａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙ．  Ａｃｔａ，  １０５１  ：１９９−２０２（１９９０））。
【０３６１】
ＤＴＡ−抗ＣＤ１９およびｐＤＴＡ−抗ＣＤ１９融合タンパク質の細胞毒性アッセイ
ＣＤ５およびＣＤ１９表面抗原の両方を含有する細胞、すなわち、Ｊｅｋｏ−１、ＣＤ５＋ＪＶＭ３、ＣＤ５＋Ｒａｊｉ、およびＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いて、ＤＴＡ−抗ＣＤ１９およびｐＤＴＡ−抗ＣＤ１９の両方を上述の通りタンパク質合成阻害細胞毒性アッセイを用いて試験した。様々な濃度のＤＴＡ−抗ＣＤ１９およびｐＤＴＡ−抗ＣＤ１９を試験して、各細胞株にシクロヘキシミドを加えることにより陽性阻害対照を得た。その結果（図２３Ｂ）、非リン酸化ＤＴＡ−抗ＣＤ１９融合体は、試験したすべての細胞に対して非常に毒性が高い（ＩＣ５０〜０．０１〜０．１ｎＭ）のに対し、リン酸化ｐＤＴＡ−抗ＣＤｌ９融合体は同様の条件下においてこれらの細胞に毒性を示さなかったことが分かった。
【０３６２】
これらの結果は、プロトキシン（例えば、ＤＴＡ−抗ＣＤ１９）内の活性前部分（例えば、フリン切断部位ＲＶＲＲ↓ＡＳ）が、プロトキシン（例えば、ｐＤＴＡ抗ＣＤ１９）を得るために化学的修飾（例えば、セリンでのリン酸化）によってマスクされたプロトキシン活性化方策を確立することが実行可能であること；活性化因子（例えば、ホスファターゼＰＰ２Ｃ）によって、プロトキシンは、哺乳動物細胞に天然に存在するフリン活性によって活性化される、天然に活性化可能な毒素（例えば、ＤＴＡ−抗ＣＤ１９）に変換されてもよいことを実証するものである。
【０３６３】
この方策は、細胞内または細胞外のタンパク質分解によって自然に活性化される、いずれのプロトキシンにも適用可能であるべきである。このような毒素の例には、ＡＤＰリボシル化毒素（ＤＴ、ＰＥ、およびＶＣＥ等）、孔形成毒素（アエロリジンおよびウェルシュ菌ε−毒素等）プロＲＩＰ毒素（プロリシン等）、およびチモーゲンに基づく毒素（プロＧｒＢ）を含むが、これらに限定されない。プロトキシン修飾試薬およびプロトキシンプロアクチベーターとして修飾／脱修飾するために用いられてもよい酵素活性の例は、リン酸化のためのキナーゼおよび脱リン酸化のためのホスファターゼの活性；グリコシル化のためのＯ−ＧｉｃＮＡｃトランスフェラーゼおよび脱グリコシル化のためのＯ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅの活性、ならびにＳＵＭＯ化のためのＥ１／Ｅ２および脱ＳＵＭＯ化のためのＳｅｎｐ２の活性を含むが、これらに限定されない。
【０３６４】
成熟ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２およびプロテアーゼ活性化可能ｐｒｏ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２の生成
ＣＴＬおよびＮＫ細胞において、ＧｒＢは最初は不活性前駆体タンパク質として発現される。このプレプロＧｒＢは、分泌顆粒にタンパク質を内包するよう指示するＮ末端シグナルペプチドを有する。ＧｒＢの酵素活性は、貯蔵ビヒクルへの輸送中にジペプチジルペプチダーゼ／カテプシンＣによって切断される活性化ジペプチドＧｌｙ−Ｇｌｕにより厳密にコントロールされている。本発明者らは、ＧｒＢの第１の残基ＩｌｅのＮ末端に位置する余剰残基のタンパク質分解除去の個々の段階、または宿主細胞に天然に存在するプロテアーゼによって与えられるインサイチューでの活性化のいずれかによって成熟させることができる、プロ形態の組換えＧｒＢを構築した。
【０３６５】
図２０Ａに示すように、エンテロキナーゼ活性化可能ＤＤＤＤＫ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２融合タンパク質と、フリン活性化可能ＲＳＲＲ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２融合タンパク質の、２つのプロＧｒＢ−（ＹＳＡ）２融合タンパク質を設計および構築した。ＤＤＤＤＫ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２は、この融合タンパク質を発現するプラスミドで２９３Ｔ細胞をトランスフェクトすることにより生成した。プロ酵素は分泌型として生成し、最初にＮｉ親和性クロマトグラフィーで精製した。精製したＤＤＤＤＫ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２を、インビトロでエンテロキナーゼを加えることにより活性化した。蛍光発生ペプチド（Ａｃ−ＩＥＰＤ−ＡＭＣ）を用いて、自然に成熟したＧｒＢ配列（アミノ酸２１〜２４７）のＮ末端である配列をＤＤＤＤＫ↓で認識および切断する追加のエンテロキナーゼでタンパク質分解性に切断することより、酵素的に活性なＧｒＢ−（ＹＳＡ）２が得られることが実証された（図２０Ｂ）。
【０３６６】
その一方で、哺乳動物細胞中に自然に存在するフリンによって活性化されるようにフリン構築物を設計する場合は、２９３Ｔ細胞における成熟型としてＧｒＢ−（ＹＳＡ）２を単離することができる場合がある。ＲＳＲＲ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２を発現するプラスミドでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清を収集して、ＧｒＢの活性を、ＤＤＤＤＫ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２のエンテロキナーゼ処理によってインビトロで活性化されたＧｒＢ−（ＹＳＡ）２の活性と比較した。
【０３６７】
これらの実験結果は、ＧｒＢ活性の状態は外因性（例えば、エンテロキナーゼ）または内因性（例えば、フリン）のタンパク質分解活性によって、マニピュレートすることができることを実証した。このような制御された活性は、本発明に記載したコンビナトリアルターゲティングに特に有用である。例えば、第３の細胞表面標的を認識する細胞標的化部分によって外因性エンテロキナーゼが導入される場合には、ＤＴＧｒＢ−抗ＣＤ５プロトキシン融合体の活性化は、標的細胞もＤＤＤＤＫ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２融合体に結合している時のみ達成され得る。その一方で、これらの細胞は、プロアクチベーターＲＲＳＲ−ＧｒＢ−ＹＳＡを活性化することができるフリンを天然に発現するため、多くの哺乳動物細胞において、ＲＲＳＲ−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２融合体の利用可能性は、活性化ＤＴＧｒＢ−抗ＣＤ５プロトキシン融合体となるのに十分である。
【０３６８】
Ｊ．表面マーカーＥｐｈＡ２およびクローディン３／４を用いた乳癌細胞の標的化
特別な一例において、本発明のプロトキシンとプロトキシン活性化因子との融合タンパク質は、ＥｐｈＡ３およびクローディン３／４を発現する乳癌細胞に向けられた。
【０３６９】
ＤＴＧｒＢ−ＣＣＰＥ融合遺伝子の構築
ＤＴＧｒＢ−抗ＣＤ５遺伝子からのＤＴの転位ドメインおよび触媒ドメインを、Ｈｉｓ−Ｐａｔｃｈチオレドキシンを含有するｐＢＡＤ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。後に融合タンパク質からチオレドキシンを除去する機会を提供するために、第Ｘａ因子部位もＤＴのすぐ上流に導入した。Ｃ−ＣＰＥをコードする遺伝子を合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。ポリヒスチジンタグ（Ｈ６）をＣ末端で含有するＣ−ＣＰＥ挿入断片を、上述のｐＢＡＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ−ＤＴベクターにライゲーションして融合遺伝子を生成した。ＰＣＲ法に基づく突然変異誘発およびＰｈｕｓｉｏｎ（商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を導入した。使用した認識部位はＥＬＮＹＦＱ↓Ｇであり、元々の構築物中の第Ｘａ因子部位（Ｉ−Ｅ−Ｇ−Ｒ）を置き換えた。
【０３７０】
ＤＴＧｒＢ−ＣＣＰＥの発現
ｐＢＡＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ−Ｔｒｘ−ＤＴＧｒＢ−ＣＣＰＥプラスミドを含有する大腸菌培養液１Ｌを、ＬＢ含有アンピシリン中でＯＤ６００＝０．６まで増殖させた。０．０２％のアラビノースを用いて１８℃で一晩培養物を誘導した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて融合タンパク質を精製し、ＰＢＳに対して透析した。
【０３７１】
Ｔｒｘ−ＤＴＧΓＢ−ＣＣＰＥ構築物からチオレドキシンを除去するために、ＴＥＶプロテアーゼを用いた。アミロース樹脂カラム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、続いてＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＴＥＶプロテアーゼおよびチオレドキシンからＤＴＧΓＢ−ＣＣＰＥを精製した。精製したタンパク質をＰＢＳに対して透析した。
【０３７２】
ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２遺伝子融合体の構築
配列ＹＳＡＹＰＤＳＶＰＭＭＳを有する１２残基のペプチドであるＹＳＡは、ＥｐｈＡ２受容体（Ｋｏｏｌｐｅ，ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８０：１７３０１−１１（２００５））に対する特異的バインダーであると報告されており、多くの癌において過剰発現している。２つのＹＳＡペプチドの融合体をコードするＤＮＡを合成し、３者ライゲーション（３−ｐｉｅｃｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応でＧｒＢ遺伝子とともにｐＩＣ９ベクターにクローン化した。得られたプラスミドは所望のＧｒＢ−（ＹＳＡ）２ＤＮＡを含有することが確認され、その後、上述のＧｒＢ−抗ＣＤ１９融合体の哺乳動物発現に用いられたｐＥＡＫｌ５−ＧｒＢ−ＣＤ１９Ｌベクターにサブクローン化した。ｐＥＡＫｌ５−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２構築物は、発現タンパク質の分泌のためのリーダー配列、およびグランザイムＢのすぐ上流にあるエンテロキナーゼ部位を含有する。
【０３７３】
ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２の発現および精製
推奨される手順にしたがってＴｒａｎｓＦｅｃｔｉｎ（商標）脂質試薬（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、ｐＥＡＫｌ５−ＧｒＢ−（ＹＳＡ）２プラスミドを２９３ＥＴＮ細胞にトランスフェクトした。細胞をＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）内で２日間インキュベートし、上清を収集した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて分泌されたタンパク質を培地の上清から精製してから、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液に対して透析した。
【０３７４】
グランザイムＢのＮ末端側からリーダー配列およびｆｌａｇタグを除去するために、精製したプロＧｒＢ−（ＹＳＡ）２をエンテロキナーゼとインキュベートした。ＤＴＧｒＢ−ＣＣＰＥ融合体を活性化するために用いるために、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、こうして活性化されたＧｒＢ−（ＹＳＡ）２をシグナルペプチドから分離した（図２４）。
【０３７５】
この系も、エンテロキナーゼ、プロＧｒＢ−（ＹＳＡ）２、およびＤＴＧｒＢ−ＣＣＰＥの３つの要素に関与する活性化配列を例示するものであり、Ｃ−ＣＰＥおよびＹＳＡによって標的化される細胞でのＤＴ活性化という最終結果をもたらす。３成分活性化カスケードは、第３の表面抗原を認識する細胞標的化部分に連結するエンテロキナーゼを用いることにより、確立することができる場合があると予想される。例えば、ある乳癌細胞を標的化するために、クローディン３／４（Ｃ−ＣＰＥにより標的化される）およびＥｐｈＡ２（多量体を形成するＹＳＡまたは抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖにより標的化される）と組み合わせて、ＥｐＣＡＭがエンテロキナーゼのための第３の表面マーカー（抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖにより標的化される）として用いられ得る。
【０３７６】
ＧｒＢによって活性化されるプロトキシンＤＴＧｒＢ−ＣＣＰＥの細胞毒性
プロトキシンＤＴＧｒＢ−ＣＣＰＥ融合タンパク質を、細胞に曝露する前にマウスＧｒＢ（Ｓｉｇｍａ）を用いてインビトロで活性化した。クローディン−３／−４を発現する同数のＨＴ−２９細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間定着させた。０．０３ｎＭから０．６μＭまでの異なる濃度（各濃度で３つ組）の活性化したＤＴＧｒＢ−ＣＣＰＥをウェルに直接加えた。シクロヘキシミドを細胞成長阻害対照として用い、緩衝液の対照としてＰＢＳをウェルに加えた。活性化したＤＴＧｒＢ−ＣＣＰＥ融合体の存在下で細胞を４８時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  （ＭＴＳ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製品マニュアルに概説される通りに細胞毒性を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４を用いて結果を分析した。
【０３７７】
Ｋ．分岐化学リンカーＪＬ１０の多段階合成
本発明は、プロトキシンの様々なドメインとプロトキシン活性化因子融合タンパク質との間における分岐化学リンカーの使用を特徴とする。このようなリンカーの合成例を以下に示す。
【０３７８】
１４−アミノ−５−オキソ−３，９．１２−トリオキサ−６−アザテトラデカン−１−カルボン酸（ＪＬ０１）の合成
2010500967.tif 000102
ＣＨ３ＣＮ（１５ｍＬ）中の２，２’−（エタン−ｌ，２−ジイルビス（オキシ））ジエタンアミン（１．４８３０ｇ、ｌ０．０ｍｍｏｌ）溶液に、ＣＨ３ＣＮ（５ｍＬ）中の１，４−ジオキサン−２，６−ジオン（１．１５６０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）溶液を５分間かけて滴下して加え、混合物を室温で５時間撹拌した。デカンテーションにより無色の上清を処分した。５ｍＬのＣＨ３ＣＮを加えて、混合物を３０秒ボルテックスした。上清をデカントした。残りの残渣を１ＭのＨＣｌ（２０ｍＬ）に溶解させ、Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ８イオン交換樹脂（樹脂１５ｍＬ、Ｈ＋の形態）を用いてクロマトグラフィーを行った。一酸（ｍｏｎｏ−ａｃｉｄ）生成物を水で溶出し、その後０．１５ＭのＮＨ４ＯＨで溶出した。反応により、収量３７％の一塩酸生成物を淡黄色のゴムとして得た（ＪＬ０１）。
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【０３７９】
１４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−５−オキソ−３，９，１２−トリオキサ−６−アザテトラデカン−１−カルボン酸（ＪＬ０２）の合成
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水（１０ｍＬ）中の１４−アミノ−５−オキソ−３，９，１２−トリオキサ−６−アザテトラデカン−ｌ−カルボン酸（０．９６５０ｇ、３．７ｍｍｏｌ）溶液に、ＮａＨＣＯ３（０．３７３９ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１０分撹拌した。ジオキサン（５ｍＬ）中のＢｏｃ２Ｏ（０．９８３４ｇ、４．５ｍｍｏｌ）溶液を混合物に加えて、室温で一晩撹拌した。反応粗液を減圧下で濃縮した。残渣を水中で再度溶解させて、ジエチルエーテルで洗浄した。エーテル層を処分して残渣を１ＭのＨＣｌで酸性化し、酢酸エチルで抽出した。有機層を保存してＮａ２ＳＯ４上で乾燥させた。減圧下にて酢酸エチルを除去した後で、１．３１１１ｇの微黄色のゴムを生成物として得た（ＪＬ０２）。
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【０３８０】
エチル２１，２１−ビス（（３−エトキシ−３−オキソプロポキシ）メチル）−２，２−ジメチル−４，１５，１９−トリオキソ−３，８，１１，１７，２３−ペンタオキサ−５，１４，２０−トリアザペンタコサン−２５−カルボン酸塩  （ＪＬ０４）の合成
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化合物ＪＬ０２（１．２５４０ｇ、３．４４ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．５１４０ｇ、４．４７ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２ＣＩ２（１０ｍＬ）およびＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解した。混合物を室温で撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中のＤＣＣ（０．８０２０ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）溶液を加えた。混合物を一晩撹拌し、白色沈殿物を濾過によって除去した。減圧下で濾液を濃縮してＮＨＳエステルを得た。ＮＨＳエステルを再度ＤＭＦに溶解して、氷浴中で撹拌した。アミノトリエチルエステルＪＬ０５（ＪＬ０３、１．５５２０ｇ、３．６８ｍｍｏｌ）溶液をＤＭＦ（５ｍＬ）に加えた後で、氷浴を除去して混合物を室温で６３時間撹拌した。反応粗液を濾過し、酢酸エチルで洗浄して、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラム上で精製して、９４％の収量で微黄色のゴム生成物を得た（ＪＬ０４）。
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【０３８１】
２１，２１−ビス（（２−カルボキシエトキシ）メチル）−２，２−ジメチル−４，１５，１９−トリオキソ−３，８，１１，１７，２３−ペンタオキサ−５，１４，２０−トリアザペンタコサン−２５−カルボン酸（ＪＬ０６）の合成
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ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の化合物ＪＬ０４（２．２２３０ｇ、２．９０ｍｍｏｌ）の溶液に、１ＭのＮａＯＨ水溶液（１５ｍＬ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、減圧下でＴＨＦを除去した。６ＭのＨＣｌでｐＨ２まで水溶液を酸性化し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を保存してＮａ２ＳＯ４上で乾燥させた。微黄色のゴムを７６％の収量で生成物として得た（ＪＬ０６）。
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【０３８２】
１−アジド−２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタン（ＪＬ０７）の合成
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ＤＭＦ（１００ｍＬ）および水（２０ｍＬ）中の１−クロロ−２−（２−（２−（２−クロロエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタン（１３．２３１０ｇ、５７．２ｍｍｏｌ）溶液にＮａＮ３（１１．３５３ｇ、１７５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を８０℃で４０時間撹拌した。濾過の後で濾液を保存して、減圧下で濃縮した。白色スラリを酢酸エチルおよびヘキサン（ｖ／ｖ１：１、２００ｍＬ）で希釈して、沈殿物を濾過により除去した。濾液を保存して水（３０ｍＬ）と鹹水（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。微黄色の液体を９９％の収量で生成物として得た（ＪＬ０７）。
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【０３８３】
２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタンアミン（ＪＬ０８）の合成
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酢酸エチル（４５ｍＬ）およびジエチルエーテル（４５ｍＬ）中の化合物ＪＬ０７（１４．４ｇ，〜５７．２ｍｍｏｌ）の溶液に、５％のＨＣｌ（６０ｍＬ）を加えた後でＰｈ３Ｐ（１４．０４ｇ、５３．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を氷浴中で１時間撹拌した。その後氷浴を除去し、反応混合物を室温で１４時間撹拌した。反応粗液を分液ロートに移して、有機相を除去した。水相を酢酸エチルで洗浄して、氷浴中で冷却した。１ＭのＮａＯＨを加えてｐＨが１３になるまで調節した。生成物をＣＨ２Ｃｌ２中に抽出して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。微黄色の液体を、８２％の収量で生成物として得た（ＪＬ０８）。
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【０３８４】
ｔｅｒｔ−ブチル３３−アジド−１６，１６−ビス（１７−アジド−５−オキソ−２，９，１２，１５−テトラオキサ−６−アザヘプタデシル）−１０，１４，２１−トリオキソ−３，６，１２，１８，２５，２８，３１−ヘプタオキサ−９，１５，２２−トリアザトリトリアコンチルカルバミン酸塩（ＪＬ０９）の合成
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ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中の化合物ＪＬ０６（０．１３６７ｇ、０．２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中の化合物ＪＬ０８（０．２６１９ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液を加えてから、ＤＩＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中のＤＥＰＣ（１８２μＬ、ｌ．２ｍｍｏｌ）の溶液に、上記混合物を１分間滴下して加え、室温で一晩さらに撹拌した。減圧下で溶媒を除去した後、残渣をシリカゲルカラム上で精製して０．２０４７ｇ（収量８０％）の生成物ＪＬ０９を微黄色の液体として得た。
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【０３８５】
ｔｅｒｔ−ブチル３３−アミノ−１６，１６−ビス（１７−アミノ−５−オキソ−２，９，１２，１５−テトラオキサ−６−アザヘプタデシル）−１０，１４，２１−トリオキソ−３，６，１２，１８，２５，２８，３１−ヘプタオキサ−９，１５，２２−トリアザトリトリアコンチルカルバミン酸塩（ＪＬ１０）
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ＭｅＯＨ（０．６４ｍＬ）中の化合物ＪＬ０９（０．２０４７ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の溶液を、５０ｍＬの二口フラスコに加えた。真空／アルゴンのサイクルを２回行ってフラスコ内の空気をアルゴンと交換した。フラスコにＰｄ／Ｃを迅速に加えた後、真空／水素サイクルを２回行い、アルゴンを水素と交換した。反応混合物を水素圧１ａｔｍ（バルーン）下で７２時間、室温で勢いよく撹拌した。Ｐｄ／Ｃを濾過して、減圧下で微黄色のゴムを、９９％の収量で生成物として得た（ＪＬ１０、０．１９１５ｇ）。
【０３８６】
ＪＬ１０−（ＹＳＡ）３の調製および保護基の除去
ＣＨ２Ｃｌ２中の化合物ＪＬ１０（０．１２０６ｇ、０．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２中のＮ末端および側鎖保護ＹＳＡペプチド溶液（０．６ｍｍｏｌ）を加え、続いてＤＩＥＡ（１０５μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を加えてから混合物を室温で撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２中のＤＥＰＣ（９１μＬ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液を、上記混合物に１分間に渡り滴下して加え、室温で一晩撹拌した。減圧下で溶媒を除去した後、クロマトグラフィーにより残渣を精製した。ＤＥＡ（塩基不安定性の保護基を除去するため）およびＴＦＡ（酸不安定性の保護基を除去するため）の連続処理により保護基を除去し、得られたコンジュゲートを酵素ライゲーション反応に用いた。
【０３８７】
ＧｒＢ−（ＹＳＡ）３の調製
Ｃ末端タグＬＰＥＴＧまたはＬＬＱＧタグを有するグランザイムＢ融合タンパク質を構築して、上述の方法を用いて調製した。各ＧｒＢ融合体を、完全に脱保護したＪＬ１０−（ＹＳＡ）３（１：２の比率で混合）と混合し、０．１Ｍのトリス（ｐＨ９）、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０の存在下においてソルターゼＡ−アガロースとインキュベートしてから、室温で一晩インキュベートした。低ＭＷカットオフ回転濃縮器を用いて各コンジュゲーション混合物を濃縮してから、余分なＪＬ１０−（ＹＳＡ）３を除去するために緩衝液で徹底的に洗浄した。カラムクロマトグラフィーを用いてコンジュゲートをさらに精製することができる。得られた融合タンパク質は、曝露されたＮ末端を持つ３つのＹＳＡペプチド、および曝露されたＮ末端を持つ活性型ＧｒＢ部分を有する（図２４）。
【０３８８】
抗体、ｓｃＦｖ、または他のスキャフォールドに基づくバインダーと同程度の高い親和性で細胞表面標的に結合することができる短ペプチドを発見するのは困難であることが多いため、これらのペプチドの多量体を形成する必要がある場合がある。柔軟なスペーサーを有するこれらのペプチドの直接的な反復融合は、潜在的に相乗的な結合の簡便な方策である一方、内部に位置する各ペプチド部分のＮ末端またはＣ末端へ到達することを不可能にする。ファージディスプレイの選択中に、ペプチドまたはタンパク質の複数のコピーがそれらのＮ末端を曝露する構成で表示されるため（ＫｅｈｏｅおよびＫａｙ，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ２１０５（１１）：４０５６−７２（２００５））、それらを利用する標的化剤中に類似する構造が維持される場合に、選択されたペプチドまたはタンパク質は最も効果的である可能性がある。本明細書に記載されるような分岐化学リンカーの使用は、融合パートナーに対していずれの配向へも複数のペプチドを表示する機会を提供し、それはＧｒＢの活性にとって不可欠であり、またＹＳＡ−ＥｐｈＡ２の相互作用にとっても重要である可能性がある。
【０３８９】
ＤＴＧｒＢ−抗ＣＤ２２１９およびＧｒＢ−抗ＣＤ１９１９の構築および発現
二重特異性を持つｓｃＦｖ融合タンパク質ＤＴ２２１９は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を認識する２つの繰り返しｓＦｖサブユニットに融合されたジフテリア毒素の触媒および転位ドメインから構成されると、以前に報告されている。ＤＴ２２１９は、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖ単独で作られた単量体または二価の免疫毒素よりもはるかに高い抗癌活性を有することが示され、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２２の親モノクローナル抗体に比べて、患者の白血病細胞およびＣＤ１９＋ＣＤ２２＋ＤａｕｄｉまたはＲａｊｉ細胞に対して高レベルの結合を示した（Ｖａｌｌｅｒａら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１（１０）：３８７９−８８（２００５））。同様にして、標的化されたＢ−ＣＬＬ細胞（ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋）への結合を強化するために、プロトキシンＤＴＧｒＢ−抗ＣＤ２２１９およびＧｒＢ−抗ＣＤ１９１９を設計した。ＧｒＢ−抗ＣＤ１９１９は、２つの結合モチーフの単純な相乗的な結合によりＢ細胞の親和性を高めることが予測される一方で、ＤＴＧｒＢ−抗ＣＤ２２１９は、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋Ｂ細胞上のＣＤ１９およびＣＤ２２集団の両方を利用するようにも設計される。
【０３９０】
図２５は、ＤＴＧｒＢ−αＣＤ２２１９およびＧｒＢ−αＣＤ１９１９融合タンパク質の概略図を示す。ＤＴ−抗ＣＤ２２１９はＰｉｃｈｉａ  ＫＭ７１から分泌発現させた。ＤＴ遺伝子の内因性フリン切断部位は、グランザイムＢ切断部位（ＩＥＰＤ↓ＳＧ）で置き換えられている。毒素部分および抗ＣＤ５  ＳｃＦｖは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（Ｌ）を介して連結される。２つのＳｃＦｖ部分はＨＭＡタグを通して連結される（Ｖａｌｌｅｒａら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１（１０）：３８７９−８８（２００５））。ＧｒＢ−抗ＣＤ１９１９の分泌発現は２９３ＥＴＮからである。余分な抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖ部分がＧ４リンカーを介してＧｒＢ−抗ＣＤ１９と融合されたことを除けば、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９１９の構成はＧｒＢ−抗ＣＤ１９と同じである。細胞毒性実験において、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９１９は、ＤＴＧｒＢ−抗ＣＤ５と組み合わせた時に、ＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞に対して、ＧｒＢ−抗ＣＤ１９に対するよりもやや高い選択的毒性を示した。
【０３９１】
ＮＧＦＤ−ＶＣＥＴＥＶおよび抗ＣＤ５−ＴＥＶの調製
プロテアーゼ活性化因子の別の例を提供するために、内因性のフリン切断部位をＴＥＶ切断部位（ＥＮＬＹＦＱ７↓Ｇ）で置き換えることにより、ＮＧＦＤ−ＶＣＥからＮＧＦＤ−ＶＣＥＴＥＶを構築し、同様の手順を用いて発現させた。各部分は異なる条件下で最適に発現された（すなわち、それぞれ大腸菌中での周辺質および細胞質発現）ため、ＴＥＶを標的とする抗ＣＤ５  ｓｃＦｖの調製は、黄色ブドウ球菌のソルターゼＡで触媒したライゲーションを用いて実現した。図２６に示すように、ＬＰＥＴＧタグ付き抗ＣＤ５  ｓｃＦｖは、標準的なソルターゼＡライゲーションの手順を用いてＧＫＧＧタグ付きＴＥＶにコンジュゲートされた。
【０３９２】
ＮＧＦＤ−ＶＣＥＴＥＶのタンパク質分解活性化および細胞毒性アッセイ
図２７Ａに示すように、完全には精製されていないが、ＮＧＦＤ−ＶＣＥＴＥＶ融合タンパク質は組換えＴＥＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の基質であり、予想されるサイズのフラグメントを生成するために切断された。図２７Ｂは、ＣＤ１９＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いた細胞毒性試験の結果を示す。１５ｎＭのＮＧＦＤ−ＶＣＥＴＥＶと１．５ｎＭの抗ＣＤ５−ＴＥＶは、組み合わせて用いられた時に、同じ濃度で各試薬が単独で用いられた場合よりもはるかに効果的にタンパク質合成を阻害した。観察された２つの試薬の相乗効果は、ＮＧＦＤ−ＶＣＥＴＥＶが同じ細胞上の抗ＣＤ５−ＴＥＶによって選択的に活性化可能であることを実証するものであった。
【０３９３】
ＶＣＥの切断
上述の構築物およびタンパク質についてのポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表３に示す。
【０３９４】
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【０３９５】
その他の態様
すべての刊行物、特許出願、本明細書に記載の特許は、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０３９６】
当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明の記載の方法およびシステムの様々な修正および変更が、明らかであろう。本発明を、特定の望ましい態様に関して記載したが、主張される発明がこのような特定の態様に過度に制限されるべきではないことを理解されたい。医学、薬理学の分野、または関連分野における当業者には明白である、本発明を実行するために記載された形態の様々な修正は、確かに本発明の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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