(57)【要約】  本発明者らは、細胞内のPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドに結合可能な抗体を提供する。ただし、この抗体は、抗体269、抗体223、または抗体318が結合するエピトープに結合可能である。そのような抗PRL抗体は、細胞内のPRL-1またはPRL-3に結合可能でありうる。それらは、癌もしくはその転移に対する療法としてまたはPRL-3陽性もしくはPRL-1陽性の患者を同定する臨床診断で使用するのに好適でありうる。
2010530735.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
PRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドに結合可能な抗体であって、抗体269、抗体223、もしくは抗体318、またはそれらの変異体、相同体、誘導体、もしくはフラグメントが結合するエピトープに結合可能である、上記抗体。
【請求項２】
前記抗体が、抗体269が結合するPRL-1ポリペプチド上のエピトープに結合可能である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、エピトープTYKNMRもしくはTLNKFIまたはその両方に結合可能な抗PRL1抗体、あるいはその変異体、相同体、誘導体、またはフラグメントを含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、抗体223または抗体318が結合するPRL-3ポリペプチド上のエピトープに結合可能である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、エピトープKAKFYNもしくはHTHKTRまたはその両方に結合可能な抗PRL3抗体、あるいはその変異体、相同体、誘導体、またはフラグメントを含む、請求項１または４に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、モノクローナル抗体269の可変領域（配列番号2、配列番号4）、モノクローナル抗体223の可変領域（配列番号6、配列番号8）、またはモノクローナル抗体318の可変領域（配列番号10、配列番号12）を含む、いずれかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体269の可変領域（配列番号2、配列番号4）を含む抗体、またはPRL-1に結合可能なその変異体、相同体、誘導体、もしくはフラグメント。
【請求項８】
モノクローナル抗体223の可変領域（配列番号6、配列番号8）を含む抗体、またはPRL-1に結合可能なその変異体、相同体、誘導体、もしくはフラグメント。
【請求項９】
モノクローナル抗体318の可変領域（配列番号10、配列番号12）を含む抗体、またはPRL-3に結合可能なその変異体、相同体、誘導体、もしくはフラグメント。
【請求項１０】
好ましくは細胞の形質膜中を通過可能であることにより、細胞内のPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドに結合しうる、いずれかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、PRL-1またはPRL-3に結合してそれらの生物活性、好ましくはプロテインチロシンホスファターゼ（PTP）活性を阻害することが可能である、いずれかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、癌、好ましくは、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、陰茎癌、子宮頸癌、脳癌、食道癌、膀胱癌、腎臓腎細胞癌、卵巣リンパ腫、および皮膚黒色腫の転移を予防することが可能である、いずれかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記癌が、PRL-1またはPRL-3を発現する癌である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である、いずれかの先行請求項に記載の抗体。
【請求項１５】
それぞれいずれかの先行請求項に記載の抗PRL-1抗体と抗PRL-3抗体とを含む組合せ。
【請求項１６】
製薬上許容される賦形剤、希釈剤、または担体と一緒に、いずれかの先行請求項に記載の抗体または組合せを含む医薬組成物。
【請求項１７】
癌またはその転移の治療または予防の方法で使用するための、PRL-1もしくはPRL-3に結合可能な抗体、好ましくは請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体、請求項１５に記載の組合せ、または請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記方法が、癌細胞を前記抗体または前記組合せに暴露することを含む、指定されたように使用するための請求項１７に記載の抗体、組合せ、または組成物。
【請求項１９】
前記方法が、癌に罹患しているかまたは罹患している疑いのある個体に治療上有効量の前記抗体、前記組合せ、または前記組成物を投与することを含む、指定されたように使用するための請求項１７または１８に記載の抗体または組合せまたは組成物。
【請求項２０】
前記癌が、転移性癌、好ましくはPRL-1またはPRL-3を発現する癌である、指定されたように使用するための請求項１７、１８、または１９に記載の抗体または組合せまたは組成物。
【請求項２１】
前記癌が、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、陰茎癌、子宮頸癌、脳癌、食道癌、膀胱癌、腎臓腎細胞癌、卵巣リンパ腫、および皮膚黒色腫を含む、指定されたように使用するための請求項１７〜２０のいずれかに記載の抗体または組合せ。
【請求項２２】
治療個体における転移性腫瘍の数が、未治療個体と比較して、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%低減される、指定されたように使用するための請求項１７〜２１のいずれかに記載の抗体または組合せ。
【請求項２３】
癌またはその転移の診断の方法で使用するための、請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体、請求項１５に記載の組合せ、または請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
癌またはその転移の診断で使用するための、請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体、請求項１５に記載の組合せ、または請求項１６に記載の医薬組成物を使用説明書と一緒に含む診断用キット。
【請求項２５】
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、もしくは配列番号12よりなる群から選択される配列を含むポリペプチド、またはPRLに結合可能なその変異体、相同体、誘導体、もしくはフラグメント。
【請求項２６】
請求項１〜１４のいずれかに記載の分子をコードしうる配列、好ましくは、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、および配列番号11よりなる群から選択される配列を含む核酸、またはPRL結合活性を有するポリペプチドをコードしうるその変異体、相同体、誘導体、もしくはフラグメント。
【請求項２７】
請求項２６に記載の核酸配列を含むかもしくはそれを用いて形質転換された細胞またはそのような細胞の子孫。
【請求項２８】
前記方法が、請求項２７に記載の細胞を提供することと、前記細胞から抗体を発現させることと、を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体を産生する方法。
【請求項２９】
個体における転移性癌のような癌の診断の方法であって、該個体に由来する生物学的サンプルを請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体に暴露することと、該抗体とPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドとの間の結合を検出することと、を含む、上記方法。
【請求項３０】
癌に罹患しているかまたは罹患している疑いのある個体における転移性癌のような癌の治療または予防の方法であって、治療上有効量の請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体、請求項１５に記載の組合せ、または請求項１６に記載の組成物を該個体に投与することを含む、上記方法。
【請求項３１】
請求項１〜１４および１８〜２２のいずれかに示された特徴を含む、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
癌に罹患しているかまたは罹患している疑いのある個体における転移性癌のような癌の治療または予防の方法であって、請求項２９または３１に記載の方法により該個体において癌を診断することと、請求項３０または３１に記載の方法により該個体を治療することと、を含む、上記方法。
【請求項３３】
転移性細胞を検出する方法であって、候補細胞を請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体に暴露することと、該細胞によるPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドの発現を検出ことと、を含む、上記方法。
【請求項３４】
転移性腫瘍に対する動物モデルを作製する方法であって、
（a）複数の転移性癌細胞、たとえば、PRL-1またはPRL-3を発現する癌細胞を第1の動物内に投与することと、
（b）該第1の動物において該細胞を転移性腫瘍に進行させることと、
（c）該第1の動物から転移性腫瘍を摘出して転移性腫瘍由来の細胞系を誘導することと、
（d）該細胞系の複数の細胞を第2の動物内に投与することと、
を含む、上記方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法により取得可能な動物モデル。
【請求項３６】
転移性腫瘍に対するモデルとしての、請求項３４に記載の方法により作製された動物モデルまたは請求項３５に記載の動物モデルの使用。
【請求項３７】
請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体を提供する工程と、該抗体をPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドに結合させる工程と、を含む方法。
【請求項３８】
前記抗体が、PRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドを発現する細胞に結合されるようにする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記PRL-1が細胞内PRL-1ポリペプチドを含むか、または前記PRL-3ポリペプチドが細胞内PRL-3ポリペプチドを含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
添付の図面の図１〜１１を参照して以上に記載されたおよび図１〜１１に示された、抗体、組合せ、医薬組成物、診断用キット、核酸、細胞、方法、または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、細胞生物学、分子生物学、および生化学の分野に関する。本発明はまた、医学の分野に関する。
【０００２】
特定的には、本発明は、疾患とくに癌の治療および診断ならびにそのような使用のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は、世界全体にわたる深刻な健康問題である。2007年には世界中で760万人の人々が癌で死亡したと推定される。たとえば英国では、癌は、1年あたり126,000人の死亡の原因である。4人に1人は癌で死亡する。
【０００４】
癌の公知の治療法としては、手術、化学療法、および放射線療法が挙げられる。多くの癌は、十分に早期に検出されれば治癒可能である。
【０００５】
100年前、「魔法の弾丸」として抗体の概念がドイツ人化学者Paul Ehrlichにより提案された。抗体は、その抗原を特異的に認識して結合することが可能であり、したがって、免疫系を介して悪性細胞を認識して破壊するのに理想的な作用剤である。このため、抗体は、最も急成長を遂げているクラスのヒト癌治療剤を構成する。
【０００６】
いくつかの潜在的な癌マーカーまたは腫瘍マーカーおよび癌抗原は、文献で同定されており、それらの一部に対して抗体療法が開発されてきた。
【０００７】
たとえば、周知の癌治療用Herceptin（トラスツズマブ）は、HER陽性癌細胞を死滅させうるモノクローナル抗体である。Herceptinは、癌細胞上のHER2（ヒト表皮増殖因子レセプター2）抗原に結合する。同様に、ベバシズマブ（AvastinTM）は、新しい血管の形成に関与する増殖因子の1つである血管内皮増殖因子（VEGF）を標的にするモノクローナル抗体である。血管新生を阻害することにより、ベバシズマブは、腫瘍細胞が血液の定常的な供給を受けて腫瘍の生存に必要な酸素や栄養素を摂取するのを防止する。
【０００８】
しかしながら、異なる癌に対する抗体療法剤の適用可能性は、普遍的ではない。抗体療法剤の一般的使用を妨げる制約の1つは、抗体分子のサイズが大きいため血漿中や細胞膜中を通過できないことである。修飾の不在下では、抗体（モノクローナル抗体を含む）は、宿主細胞の表面または外側に位置する癌抗原を標的にするのに一般に好適であるにすぎない14-15（非特許文献１、２）。以上の例では、HER2レセプターは、細胞表面上に位置し、したがって、Herceptinによる抗体結合に利用可能である。同様に、VEGFは、血流中に分泌されるので、ベバシズマブにより結合可能である。
【０００９】
PRLは、細胞内C末端プレニル化タンパク質である。プレニル化シグナルの欠如したPRLの突然変異形は、多くの場合、核内に局在する16-17（非特許文献３、４）。形質膜および初期エンドソームの内側リーフレットへのPRL-1およびPRL-3の局在化は、EMイムノゴールド標識化により明らかにされた18（非特許文献５）。PRL-3およびPRL-1の過剰発現は、さまざまなヒト癌に関連付けられることが示されている3-12,19（非特許文献６−１６）。PRL-1およびPRL-3は、腫瘍転移に関連付けられることが知られている。ほとんどの癌患者は、その原疾患ではなく転移で死亡することが知られている。
【００１０】
癌転移の予防に有効な方法が緊急に必要とされている。抗体は、細胞膜中を通過できないため抗原に接近できないので、これまで、細胞内の抗原または癌マーカーを標的にするために使用されてこなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Imai K, Takaoka A. Comparing antibody and small-molecule therapies for cancer. Nat Rev Cancer 2006;6:714-27.
【非特許文献２】Baker M. Upping the ante on antibodies. Nature Tech. 2005;23:1065-72.
【非特許文献３】Si X, Zeng Q, Ng CH, Hong W, Pallen CJ. Interaction of farnesylated PRL-2, a protein-tyrosine phosphatase, with the beta-subunit of geranylgeranyltransferase II. J Biol Chem. 2001;276:32875-82.
【非特許文献４】Wang J, Kirby CE, Herbst R. The tyrosine phosphatase PRL-1 localizes to the endoplasmic reticulum and the mitotic spindle and is required for normal mitosis. J Biol Chem. 2002;277:46659-68.
【非特許文献５】Zeng Q, Si X, Horstmann H, Xu Y, Hong W, Pallen CJ. Prenylation-dependent association of protein-tyrosine phosphatases PRL-1, -2, -3 with the plasma membrane and the early endosome. J Biol Chem. 2000; 275:21444-52.
【非特許文献６】Rouleau C, Roy A, Martin TS. et al. Protein tyrosine phosphatase PRL-3 in malignant cells and endothelial cells: expression and function. Mol Cancer Ther. 2006;5:219-29.
【非特許文献７】Wang Q, Holms DIR, Powell SM, Lu QL, Waxman J. Analysis of stromal-epithelial interactions in prostate cancer identifies PTPCAAX2 as a potential oncogene. Cancer Letters 2001;175:63-9.
【非特許文献８】Guo K, Li J, Wang HH, et al. 2006. PRL-3 initiates tumour angiogenesis by recruiting endothelial cells in vitro and in vivo .Cancer Res. 2006;66:9625-35.
【非特許文献９】Saha S, Bardelli A, Buckhaults P, et al. A phosphatase associated with metastasis of colorectal cancer. Science 2001;294:1343-6.
【非特許文献１０】Bardelli A, Saha S, Sager JA, et al. PRL-3 expression in metastatic cancer. Clin Cancer Res 2003; 9:5607-15.
【非特許文献１１】Zeng Q, Dong JM, Guo K, et al. PRL-3 and PRL-1 promote cell migration, invasion, and metastasis. Cancer Res 2003;63:2716-22.
【非特許文献１２】Polato F, Codegoni A, Fruscio R, et al. PRL-3 phosphatases is implicated in ovarian cancer growth. Clin Cancer Res 2005;11:6835-9.
【非特許文献１３】Radke I, Gotte M, Kersting C, Mattsson B, Kiesel L, Wulfing, P. Expression and prognostic impact of the protein tyrosine phosphatases PRL-1, PRL-2, and PRL-3 in breast cancer. Br J Cancer 2006;95:347-54.
【非特許文献１４】Parker BS, Argani P, Cook BP, et al. Alterations in vascular gene expression in invasive breast carcinoma. Cancer Res 2004;64:7857-66.
【非特許文献１５】Miskad UA, Semba S, Kato H, Yokozaki H. Expression of PRL-3 phosphatase in human gastric carcinomas: close correlation with invasion and metastasis. Pathobiology 2004;71:176-84.
【非特許文献１６】Li J, Guo K, Koh VWC. et al. Generation of PRL-3 and PRL-1 specific monoclonal antibodies as potential diagnostic markers for cancer metastases. Clin Cancer Res 2005;11:2195-204
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、このたび、PRL-1およびPRL-3に対する抗体が驚くべきことにそれらの細胞内標的に結合しうることを実証した。
【００１３】
文献での予想によれば、抗体を細胞内PRLにターゲッティングして癌細胞および癌転移を除去することは、細胞内に位置することが理由で、これまでは可能であるとは考えられてこなかった。本発明者らは、このことが事実とは異なることを示し、癌の治療法として、特定的には癌転移の治療法として抗PRL-1抗体および抗PRL-3抗体を提供する。
【００１４】
Li et al (2005)には、PRL-1およびPRL-3に特異的なモノクロナール抗体の生成が記載された。しかしながら、これらの抗体の配列およびこれらの抗体の可変領域の配列は、発表されていない。さらに、これらの抗体を産生するハイブリドーマは、入手可能になっておらず、これまでのところ公に入手できない。したがって、Li et al (2005)に記載の抗体は、これまでのところ一般に利用できるようにはなっていない。さらに、PRL-1およびPRL-3が細胞内に位置することを考慮して、抗体が癌の治療に使用可能であるという提案はなされていない。
【００１５】
本発明者らは、PRL-1に対する2種のマウスモノクローナル抗体（269および223）およびPRL-3に対する1種のマウスモノクローナル抗体（318）の可変領域を開示する。本発明者らは、抗PRL-1抗体269および抗PRL-3抗体318が結合するエピトープを開示する。本発明者らはさらに、これらの抗体の産生方法さらにはこれらの抗体と同一もしくは類似の結合性を有する抗体の作製方法を開示する。これらの方法はいずれも、これまで可能ではなかった。
【００１６】
本発明の第1の態様によれば、本発明者らは、PRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドに結合可能な抗体を提供する。ただし、この抗体は、抗体269、抗体223、もしくは抗体318、またはそれらの変異体、相同体、誘導体、もしくはフラグメントが結合するエピトープに結合可能である。
【００１７】
抗体は、抗体269が結合するPRL-1ポリペプチド上のエピトープに結合可能でありうる。抗体は、エピトープTYKNMRもしくはTLNKFIまたはその両方に結合可能な抗PRL1抗体、あるいはその変異体、相同体、誘導体、またはフラグメントを含みうる。
【００１８】
抗体は、抗体223または抗体318が結合するPRL-3ポリペプチド上のエピトープに結合可能でありうる。抗体は、エピトープKAKFYNもしくはHTHKTRまたはその両方に結合可能な抗PRL3抗体、あるいはその変異体、相同体、誘導体、またはフラグメントを含みうる。
【００１９】
抗体は、モノクローナル抗体269の可変領域（配列番号2、配列番号4）、モノクローナル抗体223の可変領域（配列番号6、配列番号8）、またはモノクローナル抗体318の可変領域（配列番号10、配列番号12）を含みうる。
【００２０】
本発明の第2の態様によれば、モノクローナル抗体269の可変領域（配列番号2、配列番号4）を含む抗体、またはPRL-1に結合可能なその変異体、相同体、誘導体、もしくはフラグメントが提供される。
【００２１】
本発明者らは、本発明の第3の態様によれば、モノクローナル抗体223の可変領域（配列番号6、配列番号8）を含む抗体、またはPRL-1に結合可能なその変異体、相同体、誘導体、もしくはフラグメントを提供する。
【００２２】
本発明者らは、本発明の第4の態様によれば、モノクローナル抗体318の可変領域（配列番号10、配列番号12）を含む抗体、またはPRL-3に結合可能なその変異体、相同体、誘導体、もしくはフラグメントを提供する。
【００２３】
抗体は、細胞内のPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドに結合可能でありうる。抗体は、細胞の形質膜中を通過可能でありうる。
【００２４】
抗体は、PRL-1またはPRL-3に結合してそれらの生物活性、好ましくはプロテインチロシンホスファターゼ（PTP）活性を阻害することが可能でありうる。
【００２５】
抗体は、癌、好ましくは、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、陰茎癌、子宮頸癌、脳癌、食道癌、膀胱癌、腎臓腎細胞癌、卵巣リンパ腫、および皮膚黒色腫の転移を予防することが可能でありうる。癌は、PRL-1またはPRL-3を発現する癌を含みうる。
【００２６】
抗体は、モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体を含みうる。
【００２７】
本発明の第5の態様として、それぞれ記載の抗PRL-1抗体と抗PRL-3抗体とを含む組合せが提供される。
【００２８】
本発明者らは、本発明の第6の態様によれば、製薬上許容される賦形剤、希釈剤、または担体と一緒にそのような抗体または組合せを含む医薬組成物を提供する。
【００２９】
本発明は、第7の態様では、癌またはその転移の治療または予防の方法で使用するための、PRL-1またはPRL-3に結合可能な抗体（記載の抗体を含みうる）、以上に示された組合せ、または以上に示された医薬組成物を提供する。
【００３０】
本方法は、癌細胞を抗体または組合せに暴露することを含みうる。本方法は、癌に罹患しているかまたは罹患している疑いのある個体に治療上有効量の抗体、組合せ、または組成物を投与することを含みうる。癌は、転移性癌を含みうる。癌は、PRL-1またはPRL-3を発現する癌でありうる。
【００３１】
癌は、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、陰茎癌、子宮頸癌、脳癌、食道癌、膀胱癌、腎臓腎細胞癌、卵巣リンパ腫、および皮膚黒色腫を含みうる。
【００３２】
転移性腫瘍の数は、治療個体では未治療個体と比較して少なくとも50%低減されうる。それは少なくとも60%低減されうる。それは少なくとも70%低減されうる。それは少なくとも80%低減されうる。転移性腫瘍の数は、治療個体では未治療個体と比較して少なくとも90%低減されうる。
【００３３】
本発明の第8の態様では、癌またはその転移の診断方法で使用するための、以上に示された抗体、記載の組合せ、または記載の医薬組成物が提供される。
【００３４】
本発明の第9の態様によれば、本発明者らは、癌またはその転移の診断で使用するための、そのような抗体、そのような組合せ、またはそのような医薬組成物を説明書と一緒に含む診断用キットを提供する。
【００３５】
本発明者らは、本発明の第10の態様によれば、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、もしくは配列番号12よりなる群から選択される配列を含むポリペプチド、またはPRLに結合可能なその変異体、相同体、誘導体、もしくはフラグメントを提供する。
【００３６】
本発明の第11の態様によれば、以上に示された分子をコードしうる配列、たとえば、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、および配列番号11よりなる群から選択される配列を含む核酸、またはPRL結合活性を有するポリペプチドをコードしうるその変異体、相同体、誘導体、もしくはフラグメントが提供される。
【００３７】
本発明の第12の態様として、本発明者らは、そのような核酸配列を含むかもしくはそれを用いて形質転換された細胞またはそのような細胞の子孫を提供する。
【００３８】
本発明者らは、本発明の第13の態様によれば、記載の抗体の産生方法を提供する。ただし、この方法は、そのような細胞を提供することと、細胞から抗体を発現させることと、を含む。
【００３９】
本発明の第14の態様によれば、本発明者らは、個体における癌たとえば転移性癌の診断方法を提供する。ただし、この方法は、個体由来の生物学的サンプルを以上に示された抗体に暴露することと、抗体とPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドとの間の結合を検出することと、を含む。
【００４０】
本発明の第15の態様によれば、癌に罹患しているかまたは罹患している疑いのある個体における癌たとえば転移性癌の治療または予防の方法が提供される。ただし、この方法は、治療上有効量の記載の抗体、記載の組合せ、または記載の組成物を個体に投与することを含む。
【００４１】
本方法は、以上の段落のいずれかに示された特徴を含みうる。
【００４２】
本発明の第16の態様によれば、本発明者らは、癌に罹患しているかまたは罹患している疑いのある個体における癌たとえば転移性癌の治療または予防の方法を提供する。ただし、この方法は、記載の方法により個体における癌を診断することと、記載の方法により個体を治療することと、を含む。
【００４３】
本発明の第17の態様によれば、本発明者らは、転移性細胞の検出方法を提供する。ただし、この方法は、候補細胞を以上に記載の抗体に暴露することと、細胞によるPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドの発現を検出することと、を含む。
【００４４】
本発明の第18の態様によれば、本発明者らは、転移性腫瘍に対する動物モデルの作製方法を提供する。ただし、この方法は、（a）複数の転移性癌細胞、たとえば、PRL-1またはPRL-3を発現する癌細胞を第1の動物内に投与することと、（b）第1の動物において細胞を転移性腫瘍に進行させることと、（c）第1の動物から転移性腫瘍を摘出して転移性腫瘍由来の細胞系を誘導することと、（d）細胞系の複数の細胞を第2の動物内に投与することと、を含む。
【００４５】
本発明の第19の態様によれば、本発明者らは、そのような方法により取得可能な動物モデルを提供する。
【００４６】
本発明の第20の態様によれば、本発明者らは、そのような方法により作製された動物モデルの使用または転移性腫瘍に対するモデルとしての以上に示された使用を提供する。
【００４７】
本発明の第21の態様によれば、本発明者らは、記載の抗体を提供する工程と、抗体をPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドに結合させる工程と、を含む方法を提供する。
【００４８】
抗体は、PRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドを発現する細胞に結合させることが可能である。PRL-1は、細胞内PRL-1ポリペプチドを含みうる。PRL-3ポリペプチドは、細胞内PRL-3ポリペプチドを含みうる。
【００４９】
本発明を実施する際、とくに指定がないかぎり、当業者の能力の範囲内にある化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来技術が利用されるものとする。そのような技術は、文献に説明されている。たとえば、次のものを参照されたい。J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855. Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); および Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3。これらの一般的典拠はそれぞれ、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】侵攻性肺腫瘍転移の迅速形成のための七工程動物モデル。1．細胞の50%が先に記載のEGFP-PRL-3またはEGFP-PRL-1を発現するCHO安定プールを生成する8。2．尾静脈を介して1×106個のこれらの細胞をヌードマウスの血流中に注射する。3．注射の3週間後に単一のEGFP-PRL-3肺腫瘍またはEGFP-PRL-1肺腫瘍を単離する。4．培養ディッシュ中で腫瘍を切開およびミンスして均一EGFP-PRL発現細胞系（AT-3またはAT-1）を生成する。5．ヌードマウスの尾静脈を介して1×106個のAT-3細胞またはAT-1細胞を血流中に注射する。6．未治療群：治療なし、PBSまたは無関連マウス抗体。7．AT-3細胞が注射されたマウスは、腹水または精製IgGの形態のPRL-3 mAbクローン#223または#318で治療し、一方、AT-1細胞が注射されたマウスは、PBSで治療するかまたはPRL-1 mAbクローン269腹水で治療する。
【図２Ａ】PRL-3 mAbおよびPRL-1 mAbは、それらのそれぞれの転移性肺腫瘍の形成を特異的に阻害する。A．尾静脈を介して1×106個のAT3細胞（図1に記載）をヌードマウス中に注射する。マウスは、未治療（a、n=10）、PBS治療（b、n=10）、または2種の無関連抗体で治療（c、n=5; d、n=5）のいずれかである。PRL-3 mAb 223は、精製IgG（e）または腹水（g）の形態であり、PRL-3 mAb 318は、尾静脈を介して精製IgG（f）または腹水（h）の形態で投与される。AT3細胞の接種後3日目、6日目、および9日目に異なる抗体を注射する。注射後15日目に肺を摘出し、そして蛍光顕微鏡法により写真撮影してGPF陽性転移性腫瘍を示す。画像a、b、e、およびfは、雌マウス由来の肺である。画像c、d、g、およびhは、雄マウス由来の肺である。B．Aにおける腫瘍の全数は、各群の腫瘍病巣の平均数としてY軸で定量化され、一方、X軸は、異なる治療を受けた種々のマウス群を示している。AT-3細胞が注射されたマウスの結果は、カラム1〜7に示される。AT-1細胞が注射されたマウスは、PBSで治療またはPRL-1に対するmAb 269で治療のいずれかである（カラム8〜9）。n=各群のマウス数。
【図２Ｂ】PRL-3 mAbおよびPRL-1 mAbは、それらのそれぞれの転移性肺腫瘍の形成を特異的に阻害する。A．尾静脈を介して1×106個のAT3細胞（図1に記載）をヌードマウス中に注射する。マウスは、未治療（a、n=10）、PBS治療（b、n=10）、または2種の無関連抗体で治療（c、n=5; d、n=5）のいずれかである。PRL-3 mAb 223は、精製IgG（e）または腹水（g）の形態であり、PRL-3 mAb 318は、尾静脈を介して精製IgG（f）または腹水（h）の形態で投与される。AT3細胞の接種後3日目、6日目、および9日目に異なる抗体を注射する。注射後15日目に肺を摘出し、そして蛍光顕微鏡法により写真撮影してGPF陽性転移性腫瘍を示す。画像a、b、e、およびfは、雌マウス由来の肺である。画像c、d、g、およびhは、雄マウス由来の肺である。B．Aにおける腫瘍の全数は、各群の腫瘍病巣の平均数としてY軸で定量化され、一方、X軸は、異なる治療を受けた種々のマウス群を示している。AT-3細胞が注射されたマウスの結果は、カラム1〜7に示される。AT-1細胞が注射されたマウスは、PBSで治療またはPRL-1に対するmAb 269で治療のいずれかである（カラム8〜9）。n=各群のマウス数。
【図３】PRL-1 mAbは、PRL-1転移性腫瘍を特異的にブロックするが、PRL-3転移性腫瘍を特異的にブロックしない。一方、PRL-3 mAbは、PRL-3転移性腫瘍を特異的にブロックするが、PRL-1転移性腫瘍を特異的にブロックしない。本発明者らは、1日目に尾静脈を介してEGFP-PRL-1またはEGFP-PRL-3のいずれかの100万個の癌細胞（AT-1またはAT-3）を各マウス内に注射した。次に、癌細胞注射後3日目、6日目、および9日目に尾静脈を介してそれぞれPBS、ウサギPRL抗体、PRL-1 mAb、またはPRL-3 mAbが投与される群にマウスを分ける。EGFP-PRL-1を発現するAT-1癌細胞を保有するマウスに由来する肺（パネル: a〜d）またはEGFP-PRL-3を発現するAT-3癌細胞を保有するマウスに由来する肺（e〜h）を15日目に摘出して写真撮影する。肺内のPRL-1転移性腫瘍およびPRL-3転移性腫瘍は、mock-PBS治療によりブロックされないが（a、e）、両方ともウサギ抗体により効果的にブロックされる（b、f）。PRL-1 mAbは、PRL-1が過剰発現される腫瘍の形成を阻害するが（c）、PRL-3が過剰発現される場合には腫瘍の形成を阻害しない（g）。同様に、PRL-3 mAbは、PRL-3が過剰発現される転移性腫瘍の形成をブロックするが（h）、PRL-1が過剰発現される場合には転移性腫瘍の形成をブロックしない（d）。したがって、これらのそれぞれのPRL-mAbは、それぞれ、標的抗原を発現する細胞の肺転移性腫瘍の形成を特異的にブロックする。
【図４Ａ】PRL-3 mAbは、A2780 PRL-3陽性癌細胞による転移性腫瘍形成を効果的にブロックするが、CT26 PRL-3陰性癌細胞による転移性腫瘍形成にまったく影響を及ぼさない。A．A2780細胞は内因性PRL-3を発現するが、CT26細胞は内因性PRL-3を発現しない。CT26マウス結腸癌細胞系およびA2780ヒト卵巣癌細胞系から調製された細胞溶解物をウェスタンブロッティングにより分析してPRL-3を検出する。GAPDHを充填対照として使用する。B．PRL-3抗体治療は、癌細胞接種の2週間後、CT26 PRL-3陰性細胞の肺腫瘍形成に影響を及ぼさない。すべての主要組織を腫瘍形成に関して検査する。動物の肉眼的外観ならびに治療マウス（パネルa）および未治療マウス（パネルb）の摘出肺を画像化する。黒矢印により示されたすべての肺で広範な腫瘍形成が観察される。C．PRL-3抗体治療は、癌細胞接種の1ヶ月後、実験的転移アッセイでA2780 PRL-3陽性細胞の病的外観および腫瘍形成を阻害する。すべての主要組織を腫瘍形成に関して検査する。動物の肉眼的外観および未治療動物から摘出された腫瘍（黒矢印により示される）を画像化する。治療マウスでは腫瘍は見いだされない。
【図４Ｂ】PRL-3 mAbは、A2780 PRL-3陽性癌細胞による転移性腫瘍形成を効果的にブロックするが、CT26 PRL-3陰性癌細胞による転移性腫瘍形成にまったく影響を及ぼさない。A．A2780細胞は内因性PRL-3を発現するが、CT26細胞は内因性PRL-3を発現しない。CT26マウス結腸癌細胞系およびA2780ヒト卵巣癌細胞系から調製された細胞溶解物をウェスタンブロッティングにより分析してPRL-3を検出する。GAPDHを充填対照として使用する。B．PRL-3抗体治療は、癌細胞接種の2週間後、CT26 PRL-3陰性細胞の肺腫瘍形成に影響を及ぼさない。すべての主要組織を腫瘍形成に関して検査する。動物の肉眼的外観ならびに治療マウス（パネルa）および未治療マウス（パネルb）の摘出肺を画像化する。黒矢印により示されたすべての肺で広範な腫瘍形成が観察される。C．PRL-3抗体治療は、癌細胞接種の1ヶ月後、実験的転移アッセイでA2780 PRL-3陽性細胞の病的外観および腫瘍形成を阻害する。すべての主要組織を腫瘍形成に関して検査する。動物の肉眼的外観および未治療動物から摘出された腫瘍（黒矢印により示される）を画像化する。治療マウスでは腫瘍は見いだされない。
【図４Ｃ】PRL-3 mAbは、A2780 PRL-3陽性癌細胞による転移性腫瘍形成を効果的にブロックするが、CT26 PRL-3陰性癌細胞による転移性腫瘍形成にまったく影響を及ぼさない。A．A2780細胞は内因性PRL-3を発現するが、CT26細胞は内因性PRL-3を発現しない。CT26マウス結腸癌細胞系およびA2780ヒト卵巣癌細胞系から調製された細胞溶解物をウェスタンブロッティングにより分析してPRL-3を検出する。GAPDHを充填対照として使用する。B．PRL-3抗体治療は、癌細胞接種の2週間後、CT26 PRL-3陰性細胞の肺腫瘍形成に影響を及ぼさない。すべての主要組織を腫瘍形成に関して検査する。動物の肉眼的外観ならびに治療マウス（パネルa）および未治療マウス（パネルb）の摘出肺を画像化する。黒矢印により示されたすべての肺で広範な腫瘍形成が観察される。C．PRL-3抗体治療は、癌細胞接種の1ヶ月後、実験的転移アッセイでA2780 PRL-3陽性細胞の病的外観および腫瘍形成を阻害する。すべての主要組織を腫瘍形成に関して検査する。動物の肉眼的外観および未治療動物から摘出された腫瘍（黒矢印により示される）を画像化する。治療マウスでは腫瘍は見いだされない。
【図５Ａ】AT-3癌細胞内および親CHO細胞内への抗体取込みを間接免疫蛍光法により明らかにする。A．EGFP-PRL-3は、EGFPにより検出されるようにすべての非透過性AT-3細胞内で発現される（a、d）。少数の細胞は、PRL-3 mAbで完全に標識され19（b、eパネルに示される白矢印）、非透過性細胞の40%は、PRL-3 mAbで赤色に部分的に標識され、内在化抗体は、細胞縁部に偏って分布し（fに示される単頭矢印）、いくつかは、膜突出部に分布し（fに示される双頭矢印）、一方、残りの細胞は、標識されないままであった（緑色のみのcおよびfの細胞）。B．To-pro-3ヨージドを用いてすべての親CHO細胞のDNAを青色に染色する。マウス抗GS28の取込みが可能な生細胞（10〜20%）を緑色で示す（a、b、およびc）。一晩血清飢餓状態にした生細胞の大多数（60〜70%）は、緑色で示されるマウス抗GS28の取込みが可能である（d、e、およびf）。白矢印は、抗体の取込みが不能ないくつかの細胞（おそらく細胞周期のいくつかの時期）を示す。バー、20μm。
【図５Ｂ】AT-3癌細胞内および親CHO細胞内への抗体取込みを間接免疫蛍光法により明らかにする。A．EGFP-PRL-3は、EGFPにより検出されるようにすべての非透過性AT-3細胞内で発現される（a、d）。少数の細胞は、PRL-3 mAbで完全に標識され19（b、eパネルに示される白矢印）、非透過性細胞の40%は、PRL-3 mAbで赤色に部分的に標識され、内在化抗体は、細胞縁部に偏って分布し（fに示される単頭矢印）、いくつかは、膜突出部に分布し（fに示される双頭矢印）、一方、残りの細胞は、標識されないままであった（緑色のみのcおよびfの細胞）。B．To-pro-3ヨージドを用いてすべての親CHO細胞のDNAを青色に染色する。マウス抗GS28の取込みが可能な生細胞（10〜20%）を緑色で示す（a、b、およびc）。一晩血清飢餓状態にした生細胞の大多数（60〜70%）は、緑色で示されるマウス抗GS28の取込みが可能である（d、e、およびf）。白矢印は、抗体の取込みが不能ないくつかの細胞（おそらく細胞周期のいくつかの時期）を示す。バー、20μm。
【図６】二重染色を用いた間接免疫蛍光法により正常細胞内および癌細胞内への抗体取込みの一般的現象を明らかにする。A．マウス抗GS28抗体（赤色）およびウサギ抗PTEN抗体（緑色）を非透過性MCF-10A正常細胞に添加する。B．マウス抗GS28抗体（赤色）およびウサギ抗p53抗体（緑色）を非透過性MCF-7癌細胞に添加する。C．マウス抗GS28抗体（赤色）およびウサギ抗p53抗体（緑色）を非透過性16時間血清飢餓MCF-7細胞に添加する。To-pro-3ヨージドを用いてDNAを染色する（青色）。バー、20μm。
【図７】PRL-3およびPRL-1は、複数のヒト癌で過剰発現される。A．PRL-3 mAb（クローン223または318）を用いて種々のヒト癌サンプルでPRL-3の発現を検査する。ヒト結腸癌（26件/症例158件、a）、ヒト乳癌（19件/症例96件、b）、ヒト食道癌（2件/症例13件、c）、ヒト肺癌（d、点線の上右手側の煙沈着物は黒色に染まっている）、ヒト陰茎癌（e）、およびヒト子宮頸癌（f）で、PRL-3過剰発現の例を示す。3,3'-ジアミノベンジジン色素原（DAB）を用いた免疫組織化学によりPRL-3陽性シグナルを褐色で示す。すべての画像の倍率は400倍である。B．PRL-1 mAb（クローン269）を用いて種々のヒト癌サンプルでPRL-1の発現を検査する。ヒト結腸（8件/症例128件、a、倍率200倍）、ヒト脳（5件/症例20件、b、200倍）、およびヒト食道（1件/症例13件、c、400倍）におけるPRL-1過剰発現の例を示す。
【図８Ａ】PRL-3キメラmAbおよびPRL-1キメラmAbは、それらのそれぞれの抗原にのみ特異的に反応する。A．キメラmAb構築のための主要な工程の概要を説明するためにモデルを示す。B．IFにより、EGFP-PRL-3を過剰発現するDLD-1細胞でPRL-3キメラmAb（#318）を検査し（a）、これらの細胞でPRL-3キメラmAbがEGFP-PRL-3を認識しうることを示した（b）。組合せ画像をcに示す。同様に、EGFP-PRL-1を過剰発現するDLD-1ヒト結腸直腸癌細胞でPRL-1キメラmAb（#269）をも検査し（d）、これらの細胞でPRL-1 mAbがEGFP-PRL-1を認識しうることを示した（e）。組合せ画像をfに示す。バー: 20μm。C．ウェスタンブロット分析により、EGFP-PRL-3（レーン1）を過剰発現するDLD-1細胞、およびmyc-PRL-3（レーン2）、myc-PRL-1（レーン3）、またはmyc-PRL-2（レーン4）を過剰発現するCHO細胞に由来する4種の細胞溶解物で、PRL-3キメラmAbを評価する。PRL-3キメラmAbは、EGFP-PRL-3およびmyc-PRL-3とのみ反応し、myc-PRL-1およびmyc-PRL-2とは反応しない。D．3種のGST-PRLタンパク質、すなわち、GST-PRL-1（レーン1）、GST-PRL-2（レーン2）、およびGST-PRL-3（レーン3）でPRL-1キメラmAbを評価する。PRL-1キメラmAbは、GST-PRL-1とのみ反応し、GST-PRL-2およびGST-PRL-3とは反応しない。
【図８Ｂ】PRL-3キメラmAbおよびPRL-1キメラmAbは、それらのそれぞれの抗原にのみ特異的に反応する。A．キメラmAb構築のための主要な工程の概要を説明するためにモデルを示す。B．IFにより、EGFP-PRL-3を過剰発現するDLD-1細胞でPRL-3キメラmAb（#318）を検査し（a）、これらの細胞でPRL-3キメラmAbがEGFP-PRL-3を認識しうることを示した（b）。組合せ画像をcに示す。同様に、EGFP-PRL-1を過剰発現するDLD-1ヒト結腸直腸癌細胞でPRL-1キメラmAb（#269）をも検査し（d）、これらの細胞でPRL-1 mAbがEGFP-PRL-1を認識しうることを示した（e）。組合せ画像をfに示す。バー: 20μm。C．ウェスタンブロット分析により、EGFP-PRL-3（レーン1）を過剰発現するDLD-1細胞、およびmyc-PRL-3（レーン2）、myc-PRL-1（レーン3）、またはmyc-PRL-2（レーン4）を過剰発現するCHO細胞に由来する4種の細胞溶解物で、PRL-3キメラmAbを評価する。PRL-3キメラmAbは、EGFP-PRL-3およびmyc-PRL-3とのみ反応し、myc-PRL-1およびmyc-PRL-2とは反応しない。D．3種のGST-PRLタンパク質、すなわち、GST-PRL-1（レーン1）、GST-PRL-2（レーン2）、およびGST-PRL-3（レーン3）でPRL-1キメラmAbを評価する。PRL-1キメラmAbは、GST-PRL-1とのみ反応し、GST-PRL-2およびGST-PRL-3とは反応しない。
【図８Ｃ】PRL-3キメラmAbおよびPRL-1キメラmAbは、それらのそれぞれの抗原にのみ特異的に反応する。A．キメラmAb構築のための主要な工程の概要を説明するためにモデルを示す。B．IFにより、EGFP-PRL-3を過剰発現するDLD-1細胞でPRL-3キメラmAb（#318）を検査し（a）、これらの細胞でPRL-3キメラmAbがEGFP-PRL-3を認識しうることを示した（b）。組合せ画像をcに示す。同様に、EGFP-PRL-1を過剰発現するDLD-1ヒト結腸直腸癌細胞でPRL-1キメラmAb（#269）をも検査し（d）、これらの細胞でPRL-1 mAbがEGFP-PRL-1を認識しうることを示した（e）。組合せ画像をfに示す。バー: 20μm。C．ウェスタンブロット分析により、EGFP-PRL-3（レーン1）を過剰発現するDLD-1細胞、およびmyc-PRL-3（レーン2）、myc-PRL-1（レーン3）、またはmyc-PRL-2（レーン4）を過剰発現するCHO細胞に由来する4種の細胞溶解物で、PRL-3キメラmAbを評価する。PRL-3キメラmAbは、EGFP-PRL-3およびmyc-PRL-3とのみ反応し、myc-PRL-1およびmyc-PRL-2とは反応しない。D．3種のGST-PRLタンパク質、すなわち、GST-PRL-1（レーン1）、GST-PRL-2（レーン2）、およびGST-PRL-3（レーン3）でPRL-1キメラmAbを評価する。PRL-1キメラmAbは、GST-PRL-1とのみ反応し、GST-PRL-2およびGST-PRL-3とは反応しない。
【図８Ｄ】PRL-3キメラmAbおよびPRL-1キメラmAbは、それらのそれぞれの抗原にのみ特異的に反応する。A．キメラmAb構築のための主要な工程の概要を説明するためにモデルを示す。B．IFにより、EGFP-PRL-3を過剰発現するDLD-1細胞でPRL-3キメラmAb（#318）を検査し（a）、これらの細胞でPRL-3キメラmAbがEGFP-PRL-3を認識しうることを示した（b）。組合せ画像をcに示す。同様に、EGFP-PRL-1を過剰発現するDLD-1ヒト結腸直腸癌細胞でPRL-1キメラmAb（#269）をも検査し（d）、これらの細胞でPRL-1 mAbがEGFP-PRL-1を認識しうることを示した（e）。組合せ画像をfに示す。バー: 20μm。C．ウェスタンブロット分析により、EGFP-PRL-3（レーン1）を過剰発現するDLD-1細胞、およびmyc-PRL-3（レーン2）、myc-PRL-1（レーン3）、またはmyc-PRL-2（レーン4）を過剰発現するCHO細胞に由来する4種の細胞溶解物で、PRL-3キメラmAbを評価する。PRL-3キメラmAbは、EGFP-PRL-3およびmyc-PRL-3とのみ反応し、myc-PRL-1およびmyc-PRL-2とは反応しない。D．3種のGST-PRLタンパク質、すなわち、GST-PRL-1（レーン1）、GST-PRL-2（レーン2）、およびGST-PRL-3（レーン3）でPRL-1キメラmAbを評価する。PRL-1キメラmAbは、GST-PRL-1とのみ反応し、GST-PRL-2およびGST-PRL-3とは反応しない。
【図９Ａ】PRL-3キメラmAbは、内因性PRL-3を発現するA2780細胞およびHCT116による転移性腫瘍の形成を劇的に阻害するが、内因性PRL-3を発現しないDLD-1細胞では阻害しない。A．HCT116癌細胞、A2780癌細胞、DLD-1癌細胞、およびEGFP-PRL-3を過剰発現するDLD-1細胞から全細胞溶解物を調製する。内因性PRL-3タンパク質は、HCT116およびA2780では検出されるが、DLD-1細胞では検出されない。外因性EGFP-PRL-3は、レーン4でのみ検出される。B、C、およびDでは、1日目に尾静脈を介して1×106個の癌細胞をヌードマウスに注射する。PRL-3キメラmAb（治療）またはPBS（未治療）のいずれかをマウスに投与する。各実験の期間を決めて、未治療マウスが過度に重篤になった時に終了する。各実験の終了時に写真を撮影する。B．HCT116細胞に対する治療、左側が治療マウスおよび右側が未治療マウス。C．A2780細胞に対する治療、左側が治療マウスおよび右側が未治療マウス。D．a．DLD-1細胞に対する治療、左側が治療マウスおよび右側が未治療マウス。b．EGFP-PRL-3を発現するDLD-1細胞に対する治療、左側が未治療マウスおよび右側が治療マウス。
【図９Ｂ】PRL-3キメラmAbは、内因性PRL-3を発現するA2780細胞およびHCT116による転移性腫瘍の形成を劇的に阻害するが、内因性PRL-3を発現しないDLD-1細胞では阻害しない。A．HCT116癌細胞、A2780癌細胞、DLD-1癌細胞、およびEGFP-PRL-3を過剰発現するDLD-1細胞から全細胞溶解物を調製する。内因性PRL-3タンパク質は、HCT116およびA2780では検出されるが、DLD-1細胞では検出されない。外因性EGFP-PRL-3は、レーン4でのみ検出される。B、C、およびDでは、1日目に尾静脈を介して1×106個の癌細胞をヌードマウスに注射する。PRL-3キメラmAb（治療）またはPBS（未治療）のいずれかをマウスに投与する。各実験の期間を決めて、未治療マウスが過度に重篤になった時に終了する。各実験の終了時に写真を撮影する。B．HCT116細胞に対する治療、左側が治療マウスおよび右側が未治療マウス。C．A2780細胞に対する治療、左側が治療マウスおよび右側が未治療マウス。D．a．DLD-1細胞に対する治療、左側が治療マウスおよび右側が未治療マウス。b．EGFP-PRL-3を発現するDLD-1細胞に対する治療、左側が未治療マウスおよび右側が治療マウス。
【図９Ｃ】PRL-3キメラmAbは、内因性PRL-3を発現するA2780細胞およびHCT116による転移性腫瘍の形成を劇的に阻害するが、内因性PRL-3を発現しないDLD-1細胞では阻害しない。A．HCT116癌細胞、A2780癌細胞、DLD-1癌細胞、およびEGFP-PRL-3を過剰発現するDLD-1細胞から全細胞溶解物を調製する。内因性PRL-3タンパク質は、HCT116およびA2780では検出されるが、DLD-1細胞では検出されない。外因性EGFP-PRL-3は、レーン4でのみ検出される。B、C、およびDでは、1日目に尾静脈を介して1×106個の癌細胞をヌードマウスに注射する。PRL-3キメラmAb（治療）またはPBS（未治療）のいずれかをマウスに投与する。各実験の期間を決めて、未治療マウスが過度に重篤になった時に終了する。各実験の終了時に写真を撮影する。B．HCT116細胞に対する治療、左側が治療マウスおよび右側が未治療マウス。C．A2780細胞に対する治療、左側が治療マウスおよび右側が未治療マウス。D．a．DLD-1細胞に対する治療、左側が治療マウスおよび右側が未治療マウス。b．EGFP-PRL-3を発現するDLD-1細胞に対する治療、左側が未治療マウスおよび右側が治療マウス。
【図９Ｄ】PRL-3キメラmAbは、内因性PRL-3を発現するA2780細胞およびHCT116による転移性腫瘍の形成を劇的に阻害するが、内因性PRL-3を発現しないDLD-1細胞では阻害しない。A．HCT116癌細胞、A2780癌細胞、DLD-1癌細胞、およびEGFP-PRL-3を過剰発現するDLD-1細胞から全細胞溶解物を調製する。内因性PRL-3タンパク質は、HCT116およびA2780では検出されるが、DLD-1細胞では検出されない。外因性EGFP-PRL-3は、レーン4でのみ検出される。B、C、およびDでは、1日目に尾静脈を介して1×106個の癌細胞をヌードマウスに注射する。PRL-3キメラmAb（治療）またはPBS（未治療）のいずれかをマウスに投与する。各実験の期間を決めて、未治療マウスが過度に重篤になった時に終了する。各実験の終了時に写真を撮影する。B．HCT116細胞に対する治療、左側が治療マウスおよび右側が未治療マウス。C．A2780細胞に対する治療、左側が治療マウスおよび右側が未治療マウス。D．a．DLD-1細胞に対する治療、左側が治療マウスおよび右側が未治療マウス。b．EGFP-PRL-3を発現するDLD-1細胞に対する治療、左側が未治療マウスおよび右側が治療マウス。
【図１０Ａ】PRL-3は、肺転移性腫瘍の形成および血流中の癌細胞生存能を増強する。A．治療マウスおよび未治療マウスの肺切片を示す。未治療マウスの肺切片中には、多数の微小腫瘍（微小Tで表される）が蛍光顕微鏡下で見られるが、治療マウスの肺切片中には、より少ない微小腫瘍が見いだされる。B．治療マウスおよび未治療マウスの尾静脈から得られた血液サンプルをガラススライド上に塗布し、蛍光顕微鏡下でEGFP-PRL-3癌細胞を検査する。矢印は、EGFP-PRL-3陽性癌細胞を示す。
【図１０Ｂ】PRL-3は、肺転移性腫瘍の形成および血流中の癌細胞生存能を増強する。A．治療マウスおよび未治療マウスの肺切片を示す。未治療マウスの肺切片中には、多数の微小腫瘍（微小Tで表される）が蛍光顕微鏡下で見られるが、治療マウスの肺切片中には、より少ない微小腫瘍が見いだされる。B．治療マウスおよび未治療マウスの尾静脈から得られた血液サンプルをガラススライド上に塗布し、蛍光顕微鏡下でEGFP-PRL-3癌細胞を検査する。矢印は、EGFP-PRL-3陽性癌細胞を示す。
【図１１Ａ】PRL-3キメラ抗体は、内因性PRL-3を発現するB16F0細胞による転移性腫瘍の形成を効果的に阻害するが、内因性PRL-3を発現しないB16F10細胞では阻害しない。A．B16F0癌細胞およびB16F10癌細胞から全細胞溶解物を調製する。内因性PRL-3タンパク質は、B16F0でのみ検出され、B16F10細胞では検出されない。B．1日目に1×106個のB16F0細胞をヌードマウスに注射し、続いてキメラmAb治療を行う。左側に治療マウスおよび右側に未治療マウスが示されている。腫瘍は、未治療マウスでは、副腎、肝臓、骨、および腹部に見いだされる。PRL-3 mAbは、治療マウスのほとんどの組織で腫瘍の形成を排除することが可能であった。C．1日目に1×106個のB16F10細胞をヌードマウスに注射する。上側に治療マウスおよび下側に未治療マウスが示されている。治療マウスおよび未治療マウスの両方に何十もの肺転移性腫瘍が見いだされる。
【図１１Ｂ】PRL-3キメラ抗体は、内因性PRL-3を発現するB16F0細胞による転移性腫瘍の形成を効果的に阻害するが、内因性PRL-3を発現しないB16F10細胞では阻害しない。A．B16F0癌細胞およびB16F10癌細胞から全細胞溶解物を調製する。内因性PRL-3タンパク質は、B16F0でのみ検出され、B16F10細胞では検出されない。B．1日目に1×106個のB16F0細胞をヌードマウスに注射し、続いてキメラmAb治療を行う。左側に治療マウスおよび右側に未治療マウスが示されている。腫瘍は、未治療マウスでは、副腎、肝臓、骨、および腹部に見いだされる。PRL-3 mAbは、治療マウスのほとんどの組織で腫瘍の形成を排除することが可能であった。C．1日目に1×106個のB16F10細胞をヌードマウスに注射する。上側に治療マウスおよび下側に未治療マウスが示されている。治療マウスおよび未治療マウスの両方に何十もの肺転移性腫瘍が見いだされる。
【図１１Ｃ】PRL-3キメラ抗体は、内因性PRL-3を発現するB16F0細胞による転移性腫瘍の形成を効果的に阻害するが、内因性PRL-3を発現しないB16F10細胞では阻害しない。A．B16F0癌細胞およびB16F10癌細胞から全細胞溶解物を調製する。内因性PRL-3タンパク質は、B16F0でのみ検出され、B16F10細胞では検出されない。B．1日目に1×106個のB16F0細胞をヌードマウスに注射し、続いてキメラmAb治療を行う。左側に治療マウスおよび右側に未治療マウスが示されている。腫瘍は、未治療マウスでは、副腎、肝臓、骨、および腹部に見いだされる。PRL-3 mAbは、治療マウスのほとんどの組織で腫瘍の形成を排除することが可能であった。C．1日目に1×106個のB16F10細胞をヌードマウスに注射する。上側に治療マウスおよび下側に未治療マウスが示されている。治療マウスおよび未治療マウスの両方に何十もの肺転移性腫瘍が見いだされる。
【図１１Ｄ】PRL-3キメラ抗体は、内因性PRL-3を発現するB16F0細胞による転移性腫瘍の形成を効果的に阻害するが、内因性PRL-3を発現しないB16F10細胞では阻害しない。A．B16F0癌細胞およびB16F10癌細胞から全細胞溶解物を調製する。内因性PRL-3タンパク質は、B16F0でのみ検出され、B16F10細胞では検出されない。B．1日目に1×106個のB16F0細胞をヌードマウスに注射し、続いてキメラmAb治療を行う。左側に治療マウスおよび右側に未治療マウスが示されている。腫瘍は、未治療マウスでは、副腎、肝臓、骨、および腹部に見いだされる。PRL-3 mAbは、治療マウスのほとんどの組織で腫瘍の形成を排除することが可能であった。C．1日目に1×106個のB16F10細胞をヌードマウスに注射する。上側に治療マウスおよび下側に未治療マウスが示されている。治療マウスおよび未治療マウスの両方に何十もの肺転移性腫瘍が見いだされる。
【図１２】抗PRL3抗体318は、細胞内PRL-3ポリペプチドおよび外在化／分泌型PRL-3ポリペプチドの両方に結合する。A．細胞内PRL3、B．GAPDH対照、C．外在化／分泌型PRL-3ポリペプチド。
【図１３Ａ】抗PRL1抗体269および抗PRL3抗体318のエピトープマッピング。A．ウェスタンブロットより示される抗PRL1抗体269が結合したペプチド。B．ウェスタンブロットより示される抗PRL3抗体318が結合したペプチド。
【図１３Ｂ】抗PRL1抗体269および抗PRL3抗体318のエピトープマッピング。A．ウェスタンブロットより示される抗PRL1抗体269が結合したペプチド。B．ウェスタンブロットより示される抗PRL3抗体318が結合したペプチド。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
抗PRL抗体
PRLタンパク質に対する抗体すなわち抗PRL抗体の生成および産生について実施例に記載する。そのような抗PRL抗体は、PRL-1またはPRL-3、好ましくは細胞内のPRL-1またはPRL-3に結合可能である。
【００５２】
モノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体の両方ならびにそれらの性質について本文書および実施例に詳細に記載する。抗体としては、PRL-1に結合可能なモノクローナル抗体269が挙げられる。このほかに、PRL-3に結合可能なモノクローナル抗体223およびモノクローナル抗体318も挙げられる。これらの各抗体のヒト化形態をも開示する。
【００５３】
疑問を生じないように述べておくが、特異的抗体という呼称が本文書中で参照された場合、文脈上とくに規定されないかぎり、これは、マウスモノクローナル抗体（ハイブリドーマにより分泌される）さらにはそのヒト化形態の両方の参照を含むとみなされるものとする。したがって、たとえば、抗体269が参照された場合、これは、モノクローナル抗体269（すなわち、マウスハイブリドーマにより分泌される269で示される抗体）さらにはヒト化モノクローナル抗体269の両方を含む。
【００５４】
本文書中に記載の特異的抗体は、当業者であれば、本文書中に開示された情報から、およびさらに本発明者らが詳細に記載した分子生物学的技術を利用して、産生可能である。
【００５５】
この目的のために、本発明者らは、モノクローナル抗体269、モノクローナル抗体223、およびモノクローナル抗体318の可変領域の配列を開示する。本発明者らはさらに、これらの可変領域の変異体、相同体、フラグメント、および誘導体を開示する。当業者であれば、こうした配列情報を用いて、これらの可変領域を含む抗体、またはその変異体、相同体、フラグメント、および誘導体を産生することが可能である。
【００５６】
本発明者らはさらに、これらのモノクローナル抗体を発現するための核酸構築物の配列を開示する。これらの構築物の配列は、269、223、または318と同一の配列を有するモノクローナル抗体の産生を可能にする。本発明者らはさらに、269、223、および318の変異体、相同体、フラグメント、および誘導体を開示する。
【００５７】
最後に、本発明者らは、ヒト化モノクローナル抗体269、223、または318の発現が可能な構築物の配列を開示する。本発明者らは、こうした構築物さらにはこれらのヒト化構築物の変異体、相同体、フラグメント、および誘導体でトランスフェクトされた細胞から対象の抗体を発現する方法を記載する。
【００５８】
当業者であれば、そのような配列および発現方法を用いて、適合宿主細胞を容易にトランスフェクトして、モノクロナールのもしくはヒト化された全長抗PRL-1抗体および全長抗PRL3抗体、またはそれらの変異体、相同体、フラグメント、および誘導体を発現させることが可能である。
【００５９】
本発明者らはさらに、PRL結合活性を有する一般的ポリペプチドを提供する。そのようなポリペプチドとしては、抗PRL-1抗体や抗PRL3抗体のような抗PRL抗体が挙げられる。PRL結合性ポリペプチドは、モノクローナル抗体269、223、および318と同一もしくは類似の1つ以上の性質を備えうる。こうしたポリペプチドは、便宜上、「抗PRL抗体」として一般に参照されるものとする。
【００６０】
抗体でも免疫グロブリンでもなくてもよいが（またはそのように記述されないものでもよいが）本明細書中に記載の抗PRL結合活性を備えている結合性分子を構築することは、読者の技能の範囲内にある。したがって、文脈上許容される場合、「抗PRL抗体」という用語は、PRLに結合可能であるかぎり任意の分子を含むとみなされるものとする。そのような分子としては、抗体や免疫グロブリンだけでなく、ポリペプチド、小分子が挙げられうる。また、それらは、当技術分野で公知の種々の手段を介して、たとえば、好適なライブラリーをPRL結合活性に関してスクリーニングすることにより、同定可能である。
【００６１】
抗PRL抗体（PRL結合性分子を含む）は、モノクローナル抗体269、223、および318と類似もしくは同一の性質を備えうる。そのような類似もしくは同一の性質としては、とくに結合性が挙げられうる。抗PRL抗体は、一般に、PRLポリペプチドたとえばPRL-1およびPRL-3に結合可能でありうる。
【００６２】
したがって、「抗PRL抗体」という用語は、モノクローナル抗体269、223、および318（さらにはそれらの対応するヒト化抗体）を含むとみなされるものとする。このほかに、抗体269、223、もしくは318の可変領域、またはそれらの変異体、相同体、フラグメント、および誘導体を含むポリペプチドが含まれる。この用語はまた、文脈上許容される場合、以下に記載されるような、抗PRL抗体の変異体、相同体、フラグメント、および誘導体の参照を含むとみなされるものとする。
【００６３】
PRL1およびPRL3のエピトープ
抗PRL抗体は、269、223、または318と同一もしくは類似の結合特異性、結合親和性、および／または結合親和性を有しうる。抗PRL抗体は、抗体269が結合するエピトープ、抗体223が結合するエピトープ、または抗体318が結合するエピトープに特異的に結合しうる。
【００６４】
特定の抗体が結合するエピトープを決定する方法は、当技術分野で公知である。そのようなエピトープマッピング法は、たとえば、Hanson et al., (2006). Respiratory Research, 7:126に記載されている。さらに、当業者であれば、抗体を生成して特定の性質に関してスクリーニングすることが可能であろう。そのような方法の詳細な説明を実施例27に示す。したがって、当業者であれば、269、223、および318と同一のエピトープに結合する抗PRL抗体を容易に同定することが可能であろう。
【００６５】
実施例27は、抗PRL1抗体269がエピトープTYKNMRおよびTLNKFIに結合することを示している。したがって、本発明者らは、配列TYKNMRに結合可能な抗PRL1抗体のような抗PRL抗体を提供する。本発明者らはさらに、配列TLNKFIに結合可能な抗PRL1抗体のような抗PRL抗体を提供する。抗PRL抗体は、両方の配列に結合可能でありうる。
【００６６】
さらに、実施例27は、抗PRL3抗体がエピトープKAKFYNおよびHTHKTRに結合することを示している。したがって、本発明者らは、配列KAKFYNに結合可能な抗PRL3抗体のような抗PRL抗体を提供する。本発明者らはさらに、配列HTHKTRに結合可能な抗PRL3抗体のような抗PRL抗体を提供する。抗PRL抗体は、両方の配列に結合可能でありうる。
【００６７】
抗PRL抗体は、抗体269の可変領域、抗体223の可変領域、または抗体318の可変領域を含みうる。これらのそれぞれについて以下で詳細に説明する。それらは、単一の抗体分子中に同一のもしくは異なる可変領域を含みうる。それらは、1つの可変領域または1つ超の可変領域を含みうる。したがって、本発明者らは、抗体269、223、または318と同一もしくは類似の結合反応性を備えた任意の数の抗体を産生する能力を当業者に提供する。
【００６８】
そのような抗体は、抗体の全長のもしくは実質的に完全な配列（すなわち重鎖および軽鎖）を含みうるか、または全長抗体のフラグメント（たとえば、Fv、F(ab')、およびF(ab')2フラグメント）もしくは一本鎖抗体（scFv）を含みうる。抗体はさらに、以下に詳細に記載されるような、抗体の抗原結合性部位を含む融合タンパク質または合成タンパク質を含みうる。また、自明なことであろうが、そのような抗体は、低減された宿主反応性、低減された拒絶反応などのような望ましい性質が得られるように工学的操作が可能である。
【００６９】
工学的操作は、「ヒト化」を含みうる。この用語は、マウス抗体配列のような抗体配列中への1つ以上のヒト残基またはヒト配列の組込み（または置換）を意味する。本文書に関連する「ヒト化」としては、「キメラ」抗体が挙げられる。この抗体は、マウス配列およびヒト配列の個別セクションを含む。たとえば、可変領域の一方もしくは両方がマウス配列を含み、抗体分子の残りの部分（たとえば定常領域）がヒト配列を含む。そのようなキメラ抗体では、たとえばマウス抗体またはラット抗体の可変領域の全体をヒト定常領域と一緒に発現することが可能である。これは、ヒトエフェクター機能を有するそのようなキメラ抗体を提供するとともに、ネズミFc領域により引き起こされる免疫原性（HAMA）を低減する。
【００７０】
一般的には、「キメラ抗体」とは、ネズミ免疫グロブリン遺伝子に由来するヌクレオチド配列によりコードされる重鎖および軽鎖のいずれかと、ヒト免疫グロブリン遺伝子に由来するヌクレオチド配列によりコードされる重鎖および軽鎖のいずれかと、を有する抗体を意味しうる。
【００７１】
「ヒト化」はまた、CDRグラフト化抗体または再構成抗体を含む。したがって、それは、より個別的なレベルの工学的操作、たとえば、ヒト残基を組み込んで免疫原性を低減させるようにマウス可変領域を突然変異させた抗体を含む。そのような抗体では、齧歯類抗体V領域に由来する相補性決定領域をヒトV領域に由来するフレームワーク領域と組み合わせることが可能である。そのような抗体は、キメラ抗体よりもヒトに近くかつ免疫原性が低いはずである。
【００７２】
抗PRL抗体は、一般的には、いくつかの条件でPRLポリペプチドに結合可能でありうる。
【００７３】
一実施形態では、結合環境は、細胞内条件を含む。すなわち、抗PRL抗体は、無傷細胞内または非透過性細胞内でPRLポリペプチドに結合可能でありうる。そのような非透過性細胞は、界面活性剤（たとえば、Triton X-100）やジギトニンのような透過性付与剤に暴露されていないかまたは実質的に暴露されていない細胞を含みうる。
【００７４】
本明細書中に記載の抗PRL-3抗体は、PRL-3が細胞の内部に存在するか、細胞膜内に存在するか、または細胞内に封入されている場合、PRL-3に結合可能でありうる。同様に、細胞の内部を含む環境の枠内では、本文書中に概説されるように、PRL-1ポリペプチドには記載の抗PRL-1抗体が結合しうる。抗PRL-1抗体および抗PRL3抗体は、特定的には、細胞内のPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドに結合可能でありうる。細胞内PRLポリペプチドは、1つもしくはいくつかの細胞構造体、たとえば、細胞膜の内側リーフレット、オルガネラ、細胞骨格構造体、核膜などと一体化されうる。PRLポリペプチドは、核内に位置しうる。これらの各場合には、抗PRL抗体は、細胞内環境中のPRLポリペプチドに結合可能でありうる。
【００７５】
抗PRL抗体は、いくつかの方式で細胞内環境中のPRLポリペプチドに結合可能でありうる。抗PRL抗体は、形質膜中を通過可能でありうる。それは、そのほかの方式で、たとえば細胞内取込みにより、PRLポリペプチドの結合領域に接近可能でありうる。それは、任意の手段により細胞内に内在化もしくは移行またはそのほかの方式で送達されうる。
【００７６】
他の実施形態では、結合条件は、細胞外条件を含む。したがって、抗PRL抗体は、細胞外環境中のそのコグネイトPRLポリペプチドに結合可能でありうる。
【００７７】
したがって、抗PRL抗体は、PRLポリペプチドに細胞外で結合可能でありうる。言い換えれば、本明細書中に記載の抗PRL-1抗体は、PRL-1が細胞の外部に存在する場合、PRL-1に結合可能でありうる。同様に、細胞の内部に対して外部の環境の枠内では、本文書中に概説されるように、PRL-3ポリペプチドには抗PRL-3抗体が結合しうる。抗PRL抗体は、場合に応じて、分泌されたPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドに結合可能でありうる。PRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドは、循環するPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドを含みうる。
【００７８】
抗PRL抗体は、外部PRLポリペプチドまたは外在化PRLポリペプチドに結合可能でありうる。それらは、血流中に分泌されたPRLポリペプチドに結合しうる。
【００７９】
抗PRL抗体とその標的との結合は、多かれ少なかれ強いかまたは弱い、一過的、半永久的、または永久的なものでありうる。
【００８０】
PRLポリペプチドへの抗PRL抗体の結合は、細胞内で生じうる。そのような結合は、PRLポリペプチドの活性を不活性化、阻害、または低減しうる。結合は、PRL活性を中和しうる。活性は、PRLポリペプチドにより引き起こされるかまたはそれに関連付けられる任意の生物活性を含みうる。活性は、他のタンパク質たとえば下流のタンパク質または因子への結合を含みうる。PRLポリペプチドへの抗PRL抗体の結合は、下流のタンパク質または因子の活性を不活性化、阻害、または低減しうる。活性は、他の細胞、たとえば、血流中の転移性癌細胞のような細胞との連絡を含みうる。したがって、抗PRL抗体は、血流中のPRLポリペプチドを中和してPRLホスファターゼと下流の因子との結合または血流中の他の細胞との連絡を妨害しうる。
【００８１】
活性は、生化学的活性または病原活性を含みうる。生化学的活性は、触媒活性を含みうる。触媒活性は、ホスファターゼ活性を含みうる。活性は、増殖調節活性、癌活性、癌原活性、または転移活性を含みうる。
【００８２】
モノクローナル抗体269、223、および318は、ヒトまたは他の動物における疾患の治療に使用可能である。本発明者らは、そのような抗PRL抗体が抗癌活性を有することを実施例で示す。特定的には、実施例は、抗PRL抗体が癌腫瘍の転移の広がりを防止しうることを示す。
【００８３】
実施例9は、マウスにおけるPRL過剰発現性腫瘍の生成を記述し、転移および癌の治療のための動物モデルを提供する。実施例10〜12は、抗PRL抗体で治療された動物が抗PRL抗体で治療されていない動物と比較して有意に少ない転移性肺腫瘍を示すことを示す。特定的には、治療動物は、未治療動物よりも約90%少ない腫瘍を示す。抗PRL抗体は、PRLポリペプチドが細胞内に局在化しているにもかかわらず、PRLポリペプチドに結合してその活性をブロックしうる。本発明者らの試験は、ホスファターゼが細胞内に局在化しているにもかかわらず、それぞれのホスファターゼに対するモノクローナル抗体を用いて転移を効果的に（約90%）ブロックする初めての例を示す。
【００８４】
本発明者らはまた、内因性PRL-3タンパク質を発現するヒト卵巣癌細胞系A2780による転移性腫瘍の生成を抗PRL-3モノクローナル抗体が効果的にブロックすることを示す。
【００８５】
したがって、本発明者らは、癌のような疾患の治療または予防における抗PRL抗体の使用を提供する。癌は、転移性癌を含みうる。抗PRL抗体は、定着腫瘍のような癌の転移を治療するために薬剤または療法として使用可能である。それは、癌またはその転移を予防するために使用可能である。
【００８６】
治療可能もしくは予防可能な癌としては、PRLタンパク質の発現または過剰発現に関連付けられる癌が挙げられうる。PRLタンパク質は、このファミリーの適合メンバーでありうる。このことは、PRL-1の発現または過剰発現に関連付けられる癌が、269のような抗PRL-1抗体または類似もしくは同一の性質を有する抗体により治療可能もしくは予防可能であることを意味する。同様に、PRL-3の発現または過剰発現に関連付けられる癌は、223や318のような抗PRL-3抗体または類似もしくは同一の性質を有する抗体により治療可能もしくは予防可能である。
【００８７】
癌としては、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、陰茎癌、子宮頸癌、脳癌、食道癌、膀胱癌、腎臓腎細胞癌、卵巣リンパ腫、および皮膚黒色腫のようないくつかの癌のうちのいずれかが挙げられうる。
【００８８】
治療は、一般的には、癌細胞または癌細胞の疑いのある細胞を抗PRL抗体に接触させることを含みうる。細胞を抗PRL-1抗体に暴露することが可能である。それを抗PRL-3抗体に暴露するかまたは追加的に暴露することが可能である。それを抗PRL-1抗体および抗PRL-3抗体の両方に暴露することが可能である。この場合、細胞を両方の抗体に一緒にまたは逐次的に個別に暴露することが可能である。暴露を何回か反復することが可能である。量または相対量のいかんにかかわらず、暴露のタイミングのいかんにかかわらず、抗PRL-1抗体と抗PRL-3抗体との任意の組合せを用いることが可能である。
【００８９】
したがって、本発明者らは、癌のような疾患の治療における以上に記載したような抗PRL-1抗体と抗PRL-3抗体との組合せの使用を提供する。
【００９０】
細胞は、個別細胞でありうるか、または癌細胞塊や腫瘍細胞塊のような細胞塊でありうる。細胞は、生物の体内に存在しうる。生物は、癌に罹患していることがわかっている生物でありうるか、または癌の疑いのある生物でありうる。治療は、1種もしくは複数種の抗体を生物に投与することを含みうる。以上のように、単一の抗体を投与することが可能であるか、または抗PRL-1抗体と抗PRL-3抗体との組合せを投与することが可能である。投与は、以上に記載したように、同時もしくは逐次的でありうる。したがって、治療は、抗PRL-1抗体を抗PRL-3抗体と同時もしくは逐次的に個体に投与することを含みうる。
【００９１】
抗PRL抗体は、一般的には、以下にさらに詳細に記載されるように、PRL分子に結合可能な任意の免疫グロブリンを含みうる。
【００９２】
PRL-1
以下の文は、OMIM登録601585に基づいて編集したものである。
【００９３】
PRL-1はまた、プロテインチロシンホスファターゼタイプ4a,1; PTP4A1、再生肝ホスファターゼ1、PTP(CAAX1)として知られる。PRL-1の染色体上の位置は、遺伝子地図の遺伝子座6q12である。
【００９４】
増殖、分化、および代謝が関与する細胞過程は、多くの場合、タンパク質のリン酸化および脱リン酸化により部分的にレギュレートされる。チロシン残基のリン酸モノエステルを加水分解するプロテインチロシンホスファターゼ（PTP）はすべて、共通の活性部位モチーフを共有し、3つのグループに分類される。
【００９５】
これらとしては、レセプター様PTP、細胞内PTP、ならびにセリン残基およびトレオニン残基さらにはチロシン残基での脱リン酸化が可能な二重特異性PTPが挙げられる。
【００９６】
Diamond et al.1994, Cell. Biol. 14: 3752-3762には、第4のクラスのメンバーであるラット再生肝由来のPTPが記載された。彼らがPrl1と称した遺伝子は、多くの前初期遺伝子の1種であり、主に核内で発現された。安定にトランスフェクトされた細胞内でのPrl1の過剰発現で形質転換された表現型を生じたことから、腫瘍形成でなんらかの役割を果たしている可能性が示唆された。
【００９７】
in vitroプレニル化スクリーニングを用いることにより、Cates et al., 1996, Cancer Lett. 110: 49-55では、哺乳類ファルネシル:プロテイントランスフェラーゼによりin vitroでファルネシル化されるPRL1相同体（PTP(CAAX1)およびPTP(CAAX2)（PRL2; 601584）と称される）をコードする2種のヒトcDNAが単離された。上皮細胞内でのこれらのPTPの過剰発現により、培養細胞では形質転換された表現型を生じ、ヌードマウスでは腫瘍増殖を生じた。著者らは、PTP(CAAX1)およびPTP(CAAX2)が新規なクラスのイソプレニル化癌原性PTPになると結論付けた。
【００９８】
Peng et al. 1998, J. Biol. Chem. 273: 17286-17295では、ヒトPTP(CAAX1)遺伝子またはPRL1が6個のエキソンで構成され、2個のプロモーターを含有すると報告された。予測されたマウス、ラット、およびヒトのPRL1タンパク質は、同一である。Zeng et al. 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 244: 421-427では、ヒトPRL1およびPRL2タンパク質が87%のアミノ酸配列同一性を共有することが確認された。FISHにより、Peng et al. (1998)では、PRL1遺伝子が6q12に位置付けられた。
【００９９】
「PRL-1」という用語が用いられる場合、これは、PRL-1タンパク質またはPRL-1核酸およびそれらの任意のフラグメント、変異相同体、誘導体、変異体をはじめとする任意のPRL-1配列を意味するとみなされるものとする。
【０１００】
PRL-1の性質および活性については、本文書中たとえば参考文献中に記載されている。
【０１０１】
［OMIMに基づいて編集された文の終り］
マウスおよびヒトのPRL-1タンパク質は、Zeng et al (1998), supraに詳細に記載された。
【０１０２】
PRL-1配列
本明細書中に記載の方法および組成物は、以下に詳細に記載されるPRL-1ポリペプチドを利用する。本明細書中で用いられる場合、「PRL-1」という用語は、以下の表D1に示される配列を意味するものとする。
【０１０３】
Unigene  内容
NM_003463.3  Homo sapiensプロテインチロシンホスファターゼタイプIVAメンバー1（PTP4A1）mRNA
CR602427.1  Homo sapiens（ヒト）のCot25均一化HeLa細胞全長cDNAクローンCS0DK012YJ03
CR599216.1  Homo sapiens（ヒト）の神経芽細胞腫全長cDNAクローンCL0BB007ZF05
CR596545.1  Homo sapiens（ヒト）のCot25均一化HeLa細胞全長cDNAクローンCS0DK010YM06
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BC045571.1  Homo sapiensプロテインチロシンホスファターゼタイプIVAメンバー1 mRNA（cDNAクローンMGC:57320 IMAGE:4826233）、完全コード配列
AJ420505.1  Homo sapiens mRNA全長インサートcDNAクローンEUROIMAGE2096405
AK312526.1  Homo sapiens cDNA、FLJ92892
BC023975.2  Homo sapiensプロテインチロシンホスファターゼ、タイプIVA、メンバー1、mRNA（cDNAクローンMGC:1659 IMAGE:2960001）、完全コード配列
U69701.1  ヒトプロテインチロシンホスファターゼhPRL-1N mRNA、部分コード配列
U48296.1  Homo sapiensプロテインチロシンホスファターゼPTPCAAX1(hPTPCAAX1) mRNA、完全コード配列
AK081491.1  Mus musculus 16日齢胎仔頭部cDNA、RIKEN全長濃縮ライブラリー、クローン:C130021B01 産物:プロテインチロシンホスファターゼ4a1、全長インサート配列
AK078120.1  Mus musculus成体雄延髄cDNA、RIKEN全長濃縮ライブラリー、クローン:6330521E18 産物:プロテインチロシンホスファターゼ4a1、全長インサート配列
BC055039.1  Mus musculusプロテインチロシンホスファターゼ4a1、mRNA（cDNAクローンMGC:62623 IMAGE:6396041）、完全コード配列
AK199907.1  Mus musculus cDNAクローン:Y1G0132L24、鎖:マイナス、参照:ENSEMBL:マウス転写産物ENST:ENSMUST00000061959、BLAT検索に基づく
AK198788.1  Mus musculus cDNAクローン:Y1G0129D05、鎖:プラス、参照:ENSEMBL:マウス転写産物ENST:ENSMUST00000061959、BLAT検索に基づく
AK192767.1  Mus musculus cDNAクローン:Y1G0109N22、鎖:プラス、参照:ENSEMBL:マウス転写産物ENST:ENSMUST00000055216、BLAT検索に基づく
AK187266.1  Mus musculus cDNAクローン:Y0G0140O11、鎖:プラス、参照:ENSEMBL:マウス転写産物ENST:ENSMUST00000061959、BLAT検索に基づく
BC086787.1  Mus musculusプロテインチロシンホスファターゼ4a1 mRNA（cDNAクローンMGC:102117 IMAGE:30538771）、完全コード配列
BC094447.1  Mus musculusプロテインチロシンホスファターゼ4a1 mRNA（cDNAクローンMGC:102501 IMAGE:3990529）、完全コード配列
AK150506.1  Mus musculus骨髄マクロファージcDNA、RIKEN全長濃縮ライブラリー、クローン:I830008L20 産物:プロテインチロシンホスファターゼ4a1、全長インサート配列
AK148288.1  Mus musculus B16 F10Y細胞cDNA、RIKEN全長濃縮ライブラリー、クローン:G370079M23 産物:プロテインチロシンホスファターゼ4a1、全長インサート配列
AK151533.1  Mus musculus骨髄マクロファージcDNA、RIKEN全長濃縮ライブラリー、クローン:I830031H07 産物:プロテインチロシンホスファターゼ4a1、全長インサート配列
U84411.1  Mus musculusプロテインチロシンホスファターゼ（PRL-1）mRNA、完全コード配列
NM_011200.2  Mus musculusプロテインチロシンホスファターゼ4a1（Ptp4a1）mRNA
BC003761.1  Mus musculusプロテインチロシンホスファターゼ4a1クローンIMAGE:3590144、mRNA
BC031734.1  Mus musculusプロテインチロシンホスファターゼ4a1クローンIMAGE:3157812、mRNA
表D1. PRL-1配列
「PRL-1ポリペプチド」は、Unigene寄託番号NM_003463.3を有する配列のようなヒトPRL-1ポリペプチドを含みうるかまたはそれよりなりうる。
【０１０４】
これらのポリペプチドのいずれか、一部、もしくは全部の相同変異体およびその誘導体もまた含まれる。たとえば、PRL-1としては、Unigene寄託番号U84411.1が挙げられる。
【０１０５】
PRL-3
以下の文は、OMIM登録606449に基づいて編集したものである。
【０１０６】
PRL-3はまた、プロテインチロシンホスファターゼタイプ4A,3; PTP4A3として知られる。PRL-3の染色体上の位置は、遺伝子地図の遺伝子座8q24.3である。
【０１０７】
心臓では、プロテインキナーゼは、収縮性、イオン輸送、代謝、および遺伝子発現をレギュレートする。ホスファターゼは、脱リン酸化におけるその役割に加えて、心臓肥大および機能不全に関与する。
【０１０８】
心臓cDNAライブラリーのデータベース検索およびスクリーニングにより、Matter et al. 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 283: 1061-1068では、PTP4A3をコードするcDNAが同定され、彼らはそれをPRL3と名付けた。推定PRL3タンパク質は、PRL1（PTP4A1; 601585）と76%同一およびマウスPrl3と96%同一である。ノーザンブロット分析では、主に心臓および骨格筋で約2.3kbのPRL3転写産物が発現され、膵臓でより少量発現されることが明らかにされた。この発現パターンは、PRL1およびPRL2（PTP4A2; 601584）のより広範な発現とは異なる。in situハイブリダイゼーション分析では、PRL3発現が心筋細胞に局在化されることが示された。Trisグリシンゲル分析では、PRL3が22kDのタンパク質として発現されることが示された。機能分析および突然変異分析では、リン酸切断がPRL3のcys104に依存することが示唆された。PRL3の過剰発現では、細胞増殖が増大された。ウェスタンブロット分析では、アンギオテンシンII（106150）に応答してp130cas（BCAR1; 602941）が脱リン酸化されることが示されたことから、アンギオテンシンIIにより引き起こされる細胞内カルシウムトランジェントのモジュレーションにおけるPRL3の役割が示唆された。
【０１０９】
転移の分子レベルでの基本原理について見識を得るために、Saha et al. 2001, Science 294: 1343-1346では、転移性結腸直腸癌の網羅的遺伝子発現プロファイルが、原発性癌、良性結腸直腸腫瘍、および正常結腸直腸上皮のものと比較された。PRL3は、試験した18例の癌転移のそれぞれで高レベルで発現されたが、非転移性腫瘍および正常結腸直腸上皮ではより低レベルで発現された。検査した12例の転移のうち3例で、PRL3遺伝子の多重コピーが、染色体8q24.3に位置する小さいアンプリコン中に見いだされた。Saha et al. (2001)では、PRL3遺伝子が結腸直腸癌転移に重要であると結論付けられた。
【０１１０】
Stanford G3放射線ハイブリッドパネルおよびデータベース配列解析を用いて、Saha et al. (2001)では、PRL3遺伝子が周囲マーカー145.20に対して位置付けられた。PRL3遺伝子はまた、8qテロメアから約3Mb離れた8q24.3に位置するマーカーSHGC-22154と密接に連鎖している。
【０１１１】
［OMIMに基づいて編集された文の終り］
マウスおよびヒトのPRL-3タンパク質については、Li et al (2005), Clin Cancer Res;11:2195-204に詳細に記載された。
【０１１２】
PRL-3配列
本明細書中に記載の方法および組成物は、以下に詳細に記載されるPRL-3ポリペプチドを利用する。本明細書中で用いられる場合、「PRL-3」という用語は、以下の表D2に示される配列を意味するものとする。
【０１１３】
Unigene  内容
AF041434.1  プレニル化されている可能性のあるHomo sapiensプロテインチロシンホスファターゼhPRL-3 mRNA、完全コード配列
BT007303.1  Homo sapiensプロテインチロシンホスファターゼタイプIVAメンバー3 mRNA、完全コード配列
AK128380.1  Homo sapiens cDNA FLJ46523 fisクローンTHYMU3034099
NM_007079.2  Homo sapiensプロテインチロシンホスファターゼタイプIVAメンバー3(PTP4A3)転写産物変異体2 mRNA
AY819648.1  Homo sapiens HCV p7トランスレギュレートタンパク質2 mRNA、完全コード配列
BC003105.1  Homo sapiensプロテインチロシンホスファターゼタイプIVAメンバー3 mRNA（cDNAクローンMGC:1950 IMAGE:3357244）、完全コード配列
NM_032611.1  Homo sapiensプロテインチロシンホスファターゼタイプIVAメンバー3（PTP4A3）転写産物変異体1 mRNA
AK311257.1  Homo sapiens cDNA、FLJ18299
U87168.1  ヒトプロテインチロシンホスファターゼ相同体hPRL-R mRNA、部分コード配列
AJ276554.1  プロテインチロシンホスファターゼhPRL-3に対するHomo sapiens mRNA、ショートフォーム
BC066043.1  Mus musculusプロテインチロシンホスファターゼ4a3 mRNA（cDNAクローンMGC:90066 IMAGE:6415021）、完全コード配列
AK190358.1  Mus musculus cDNAクローン:Y1G0102I03、鎖:プラス、参照:ENSEMBL:マウス転写産物ENST:ENSMUST00000053232、BLAT検索に基づく
CT010215.1  遺伝子Ptp4a3（プロテインチロシンホスファターゼ4a3）に対するMus musculus全長オープンリーディングフレームcDNAクローンRZPDo836H0950D; 停止コドンを含む完全コード配列
AK147489.1  Mus musculus成体雄脳UNDEFINED_CELL_LINE cDNA、RIKEN全長濃縮ライブラリー、クローン:M5C1053F14 産物:プロテインチロシンホスファターゼ4a3、全長インサート配列
AK172192.1  Mus musculus活性型脾臓cDNA、RIKEN全長濃縮ライブラリー、クローン:F830102P03 産物:プロテインチロシンホスファターゼ4a3、全長インサート配列
AK143702.1  Mus musculus 6日齢新生仔脾臓cDNA、RIKEN全長濃縮ライブラリー、クローン:F430011C20 産物:プロテインチロシンホスファターゼ4a3、全長インサート配列
AF035645.1  プレニル化されている可能性のあるMus musculusプロテインチロシンホスファターゼmPRL-3（Prl3）mRNA、完全コード配列
NM_008975.2  Mus musculusプロテインチロシンホスファターゼ4a3（Ptp4a3）mRNA
AK014601.1  Mus musculus 0日齢新生仔皮膚cDNA、RIKEN全長濃縮ライブラリー、クローン:4632430E19 産物:プロテインチロシンホスファターゼ4a3、全長インサート配列
AK004562.1  Mus musculus成体雄肺cDNA、RIKEN全長濃縮ライブラリー、クローン:1200003F10 産物:プロテインチロシンホスファターゼ、4a3、全長インサート配列
AK003954.1  Mus musculus 18日齢胎仔全身cDNA、RIKEN全長濃縮ライブラリー、クローン:1110029E17 産物:プロテインチロシンホスファターゼ4a3、全長インサート配列
BC027445.1  Mus musculusプロテインチロシンホスファターゼ4a3 mRNA（cDNAクローンMGC:36146 IMAGE:4482106）、完全コード配列
「PRL-3ポリペプチド」は、Unigene寄託番号AF041434.1を有する配列のようなヒトPRL-3ポリペプチドを含みうるかまたはそれよりなりうる。これらのポリペプチドのいずれか、一部、もしくは全部の相同変異体およびその誘導体もまた含まれる。
【０１１４】
たとえば、PRL-3としては、Unigene寄託番号BC066043.1が挙げられる。
【０１１５】
PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチド
PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドは、さまざまな手段に、たとえば、特異的なPRL-1結合剤およびPRL-3結合剤のような抗PRL-1剤および抗PRL-3剤、特定的には抗PRL抗体の産生またはスクリーニングに使用可能である。これらについては以下でさらに詳細に説明する。癌とくに乳癌の診断または検出のためにPRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドの発現を検出することが可能である。
【０１１６】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合（すなわちペプチドアイソスター）により互いに連結された2個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」とは、ペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーと一般に呼ばれる短鎖と、タンパク質と一般に呼ばれるより長い鎖と、の両方を意味する。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされた20種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有しうる。
【０１１７】
「ポリペプチド」としては、翻訳後プロセシングのような自然過程によりまたは当技術分野で周知の化学修飾技術により修飾されたアミノ酸配列が挙げられる。そのような修飾については、基本的な教科書およびより詳細な研究論文さらには多量の研究文献に詳細に記載されている。ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端をはじめとするポリペプチド中の任意の位置で修飾を行うことが可能である。同一タイプの修飾が所与のポリペプチド中のいくつかの部位に同一程度または異なる程度で存在しうることはわかるであろう。また、所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含有しうる。
【０１１８】
ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐状でありうる。また、分岐を含んでまたは含まずに環状でありうる。環状、分岐状、および分岐環状のポリペプチドは、翻訳後の自然過程から生じうるか、または合成法により作製されうる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加たとえばアルギニル化、およびユビキチン化が挙げられる。たとえば、Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 および Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983； Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-646 ならびに Rattan et al, "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62を参照されたい。
【０１１９】
「ポリペプチド」という用語は、当技術分野で公知の種々の合成ペプチド変異体、たとえば、レトロインベルソDペプチドを含む。ペプチドは、抗原決定基および／またはT細胞エピトープでありうる。ペプチドは、in vivoで免疫原性でありうる。ペプチドは、in vivoで中和抗体を誘導可能でありうる。
【０１２０】
PRL-1およびPRL-3にあてはめた場合、得られるアミノ酸配列は、1つ以上の活性、たとえば、ヒトPRL-1ポリペプチドまたはヒトPRL-3ポリペプチドなどのPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドと共通する生物活性を有しうる。たとえば、PRL-1またはPRL-3の相同体は、正常乳房細胞と比較して癌細胞での増大された発現レベルを有しうる。特定的には、「相同体」という用語は、得られるアミノ酸配列がPRL-1またはPRL-3の活性を有することを条件として構造および／または機能に関する同一性を考慮する。配列同一性（すなわち類似性）に関しては、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%の配列同一性が存在しうる。少なくとも95%、たとえば、少なくとも98%の配列同一性が存在しうる。これらの用語はまた、PRL-1またはPRL-3の核酸配列の対立遺伝子変異体であるアミノ酸に由来するポリペプチドを含む。
【０１２１】
PRL-1およびPRL-3のようなポリペプチドの「活性」または「生物活性」が参照された場合、同様の活性もしくは改善された活性または望ましくない副作用が低減されたこれらの活性を含めて、これらの用語は、PRL-1およびPRL-3の代謝機能または生理学的機能を意味するものとする。このほかに、PRL-1およびPRL-3の抗原活性および免疫原活性が挙げられる。そのような活性ならびにこれらの活性をアッセイよび定量する方法の例は、当技術分野で公知であり、本文書中の他の箇所に詳細に記載されている。
【０１２２】
抗体
本文書中で用いられる「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、文脈上許容される場合、同義的に利用可能である。これらの用語は、抗体分子のタンパク質分解により切断された部分または組換えにより調製された部分のフラグメントを含む。ただし、このフラグメントは、PRL-1もしくはPRL-3またはそれらのエピトープ、たとえば、269が結合するPRL-1のエピトープまたは223もしくは318が結合するPRL-3のエピトープと選択的に反応可能であるかまたはそれらを認識可能である。
【０１２３】
PRL-1のエピトープとしては、TYKNMRおよびTLNKFIが挙げられる。PRL-3のエピトープとしては、KAKFYNおよびHTHKTRが挙げられる。
【０１２４】
そのようなタンパク質分解フラグメントおよび／または組換えフラグメントの例としては、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント、およびペプチドリンカーにより連結されたVLドメインおよびVHドメインを含有する一本鎖抗体（scFv）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらのFvを共有結合または非共有結合で連結して2つ以上の結合部位を有する抗体を形成することが可能である。
【０１２５】
「ScFv分子」とは、VHパートナードメインとVLパートナードメインとが可撓性オリゴペプチドを介して連結されている分子を意味する。特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関係する技術の一般的レビューは、Winter & Milstein(1991) Nature 349, 293-299に見いだされる。
【０１２６】
全長抗体およびF(ab')2フラグメントは「二価」である。「二価」とは、該抗体および該F(ab')フラグメントが2つの抗原結合部位を有することを意味する。これとは対照的に、Fabフラグメント、Fvフラグメント、ScFvフラグメント、およびdAbフラグメントは、ただ1つの抗原結合部位を有するので一価である。
【０１２７】
抗PRL抗体は、10-2s-1〜10-4s-1のオフ速度を有する高親和性抗体を含みうる。オフ速度は約2×10-4s-1でありうる。
【０１２８】
本文書中で用いられる「オフ速度」という用語は、本明細書中に開示される抗PRL抗体のような抗体の解離速度（koff）を意味する。それは、BIA評価ソフトウェア（Pharmacia）を用いて測定可能である。抗原に対するFabフラグメントの親和性が反映されるので、遅いオフ速度が望ましい。
【０１２９】
「親和性」という用語は、抗PRL抗体のような抗体の解離速度またはオフ速度（koff）により定義される。オフ速度が遅いほど、抗PRL抗体のような抗体がPRL-1やPRL-3のような抗原に対して有する親和性は高い。
【０１３０】
抗PRL抗体は、ペプチド自体を含みうるかまたは融合タンパク質の一部を形成しうる。
【０１３１】
本明細書中に記載の抗PRL抗体としては、PRL-1結合活性またはPRL-3結合活性、たとえば、細胞内のPRL-1もしくはPRL-3への結合能、または場合に応じて269、223、もしくは318が結合するのと同一のエピトープ（たとえば、TYKNMR、TLNKFI、KAKFYN、およびHTHKTR）への結合性を含む任意の抗体が挙げられる。
【０１３２】
抗PRL抗体としてはまた、マウス抗体かヒト化抗体かヒト抗体かを問わず、全抗体または全長抗体、そのような抗体の誘導体および生物学的活性フラグメントが挙げられる。これらとしては、アミノ酸置換を有するかまたはアミノ酸官能基などに結合された糖もしくは他の分子を有するPRL-1結合活性またはPRL-3結合活性の抗体フラグメントが挙げられうる。
【０１３３】
抗PRL抗体は、単離された抗体または精製された抗体を含みうる。それは、天然であるか否かを問わず、任意の好適な供給源から取得可能でありうるかもしくはそのような供給源により産生されうる。またはそれは、合成抗PRL抗体、半合成抗PRL抗体、誘導体化抗PRL抗体、もしくは組換え抗PRL抗体でありうる。
【０１３４】
抗PRL抗体が非天然抗PRL抗体である場合、それは、少なくとも一部分が組換えDNA技術により調製されたものもしくは化学合成技術により生成された抗PRL抗体またはそれらの組合せを含みうる。
【０１３５】
本文書中で用いられる「誘導体」という用語は、抗PRL抗体の化学修飾を含む。そのような修飾を例示するものとしては、たとえば、アルキル基、アシル基、またはアミノ基による水素の置換が挙げられよう。抗PRL抗体の配列は、天然に存在する形のものと同一でありうるか、またはその変異体、相同体、フラグメント、もしくは誘導体でありうる。
【０１３６】
抗体可変領域
本文書中で用いられる「可変領域」という用語は、場合に応じて、PRL-1もしくはPRL-3（または変異体、相同体、フラグメント、もしくは誘導体）に対する抗体の結合認識特異性および全親和性の決定因子を含有する軽鎖（VL）および重鎖（VH）の可変領域またはドメインを意味する。
【０１３７】
軽鎖（VL）および重鎖（VH）の各対の可変ドメインは、抗原認識に関与し、かつ抗原結合部位を形成する。軽鎖および重鎖のドメインは、同一の一般構造を有し、各ドメインは、3つの相補性決定領域（CDR）により結合された4つのフレームワーク（FR）領域（その配列は比較的保存されている）を有する。FR領域は、可変ドメインの構造完全性を保持する。CDRは、抗原の結合を媒介する可変ドメイン内のポリペプチドセグメントである。
【０１３８】
本文書中で用いられる「定常領域」という用語は、構造安定性および他の生物学的機能、たとえば、抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動性、および補体結合を提供するがPRL-1エピトープまたはPRL-3エピトープとの結合には関与しない抗体（または変異体、相同体、フラグメント、もしくは誘導体）の軽（CL）鎖および重（CH）鎖のドメインを意味する。アミノ酸配列および定常領域の遺伝子中の対応するエキソン配列は、その由来源の種に依存するであろう。しかしながら、アロタイプをもたらすアミノ酸配列の変異は、種内では特定の定常領域に比較的限られている。「アロタイプ」とは、対立遺伝子を識別する抗原決定基（またはエピトープ）のことである。
【０１３９】
各鎖の可変領域は、連結ポリペプチド配列により定常領域に連結される。連結配列は、軽鎖遺伝子中の「J」配列および重鎖遺伝子中の「D」配列と「J」配列との組合せによりコードされる。
【０１４０】
抗体269、223、および318：可変領域配列
抗体269
モノクローナル抗体269の可変領域の重鎖の核酸配列は、次のとおりである（配列番号1）：
GGGAATTCATGAAATGCAGCTGGGTTATTCTCTTCCTGTTTTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAGTTTCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTTACTAGTTATCGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCACTGGTTATACTGAGTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTTCAAGCTATGGTAACTTCGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGAGAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCTTCCCCCTCGTAAGCTTGGGA
モノクローナル抗体269の可変領域の重鎖のアミノ酸配列は、次のとおりである（配列番号2）：
EFMKCSWVILFLFSVTAGVHSQVQFQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYRMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYTEYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCSSYGNFGYWGQGTTLTVSSESQSFPNVFPLVSLG
モノクローナル抗体269の可変領域の軽鎖の核酸配列は、次のとおりである(配列番号3）：
CTGTCTACTGCTCTCTGGTGAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGGCAAGTCAGGACATTGGTAGTAGCTTAAACTGGCTTCAGCAGAAAGCAGATGGAACCATTAAACGCCTGATCTATGCCACATCCAGTTTAGATTCTGGTGTCCCCAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGTAGACTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCTCACTGGAGATCCTGCAGATCACGCGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT
モノクローナル抗体269の可変領域の軽鎖のアミノ酸配列は、次のとおりである（配列番号4）：
VYCSLVRVSLTCRASQDIGSSLNWLQQKADGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYASSPWTFGGGTKLEIKRADAAPHWRSCRSRELWLHHLSSSSRHLMSS
抗体223
モノクローナル抗体223の可変領域の重鎖の核酸配列は、次のとおりである（配列番号5）：
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTATTCTCTTCCTCCTGTCAATAATTGCAGGTGTCCATTGCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTGAGTACAATGAGAAGTTCAGGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGTGAGGAGAGGAATTACCCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCACCCGTCTATCCCTTGGTCCCTGGAAGCTTGGGA
モノクローナル抗体223の可変領域の重鎖のアミノ酸配列は、次のとおりである（配列番号6）：
EFMEWSWVILFLLSIIAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNVNTEYNEKFRGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCASEERNYPWFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPPVYPLVPGSLG
モノクローナル抗体223の可変領域の軽鎖の核酸配列は、次のとおりである（配列番号7）：
TGGGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGCTCCACTGGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGAAGATGATGGTGAAAATTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGTCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGG
モノクローナル抗体223の可変領域の軽鎖のアミノ酸配列は、次のとおりである（配列番号8）：
WEFMETDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVEDDGENYMNWYQQKPGQSPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG
抗体318
モノクローナル抗体318の可変領域の重鎖の核酸配列は、次のとおりである（配列番号9）：
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTTTCCTCTTCCTCCTGTCAATAATTGCAGGTGTCCATTGCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTAATACTTATTACAATGAGAAGTTCAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGTGAGGAGAGAATTACCCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCCGTCTATCCCCTGGTCCCTGGAAGCTTGGGA
モノクローナル抗体318の可変領域の重鎖のアミノ酸配列は、次のとおりである（配列番号10）：
EFMEWSWVFLFLLSIIAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFTNYYMHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNVNTYYNEKFRARPH.LQTNPPAQPTCSSAA.PLRTLRSISVQVRRELPLVCLLGPRDSGHCLCSQNDTPIRLSPGPWKLG
モノクローナル抗体318の可変領域の軽鎖の核酸配列は、次のとおりである（配列番号11）：
ACTAGTCGACATGGAGTCAGACACACTGCTGTTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCATAAGCTTGGGA
モノクローナル抗体318の可変領域の軽鎖のアミノ酸配列は、次のとおりである（配列番号12）：
LVDMESDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK
本明細書中に記載の方法および組成物に係る抗PRL1抗体および抗PRL3抗体は、当技術分野で公知の方法により、これらの可変領域配列から生成可能である。たとえば、重鎖配列および軽鎖配列は、当業者に公知の組換え遺伝子工学技術を介して、選択された抗体の定常配列中に組換え導入可能である。
【０１４１】
定常領域配列は、当技術分野で公知であり、IMGT/LIGM-DBデータベース（Giudicelli et al, 2006, Nucleic Acids Research 34(Database Issue):D781-D784 および LeFranc et al (1995) LIGM-DB/IMGT: An Integrated Database of Ig and TcR, Part of the Immunogenetics Database. Annals of the New York Academy of Sciences 764 (1) , 47-47 doi: 10.1111/j.1749-6632.1995.tb55805.xに記載）およびIMGT/GENE-DBデータベース（Giudicelli et al, 2005, Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33(Database issue):D256-61に記載）のようないくつかのデータベースから入手可能である。IMGT/LIGM-DBおよびIMGT/GENE-DBは、www.ebi.ac.uk/imgt/にあるImMunoGeneTics Databaseの一部である。
【０１４２】
所与の配列を有する可変領域と定常領域とを組み合わせて全長抗体を産生する方法は、当技術分野で公知であり、たとえば、実施例16およびHanson et al., (2006). Respiratory Research, 7:126に記載されている。全長抗体のフラグメント、たとえば、Fvフラグメント、F(ab')フラグメント、およびF(ab')2フラグメント、または一本鎖抗体（scFv）は、当技術分野で公知の手段により産生可能である。
【０１４３】
たとえば、文献中に記載の開示された配列および方法を用いて、以上に示された配列を有する抗体318の可変領域の重鎖および軽鎖をマウスIgG定常領域配列にトランスジェニック融合してマウスモノクローナル抗PRL-3抗体を産生することが可能である。同様に、318可変領域をヒトIgG抗体の定常領域と共に組換え発現させてヒト化抗PRL-3抗体を産生することが可能である。223抗体および269抗体の可変領域をマウスまたはヒトのIgG定常領域と共に工学的に操作して、PRL-1ポリペプチドに結合可能なマウスモノクローナル抗体またはヒト化抗体を産生することが可能である。
【０１４４】
検出および診断の方法
PRL-1およびPRL-3の発現の検出
癌組織内でのPRL-1およびPRL-3の発現は、正常組織と比較した場合、アップレギュレートされる。
【０１４５】
したがって、本発明者らは、転移性、侵攻性、もしくは浸潤性の癌をはじめとする癌の診断方法を提供する。この方法は、個体の細胞内または組織内でのPRL-1およびPRL-3の発現のアップレギュレーションのようなPRL-1およびPRL-3の発現のモジュレーションを検出することを含む。
【０１４６】
本方法は、本文書中に記載の抗PRL抗体の使用を含みうる。抗PRL抗体は、生物学的サンプル中のPRL-1またはPRL-3の量を検出およびアッセイするためにイムノアッセイで使用可能であり、したがって、サンプルの由来源である細胞、組織、器官、または個体におけるPRL-1またはPRL-3の発現のレベルの指標となる。イムノアッセイとしては、ELISA、ウェスタンブロットなどが挙げられる。これらを利用してPRL-1およびPRL-3の発現を評価する方法は、熟練した読者に公知である。
【０１４７】
細胞の増殖状態を決定する方法を提供するために、PRL-1およびPRL-3の発現、活性、または量の検出を用いることが可能である。この場合、増殖細胞とは、PRL-1およびPRL-3の発現、活性、または量が正常細胞と比較して高レベルである細胞のことである。同様に、非増殖細胞とは、PRL-1およびPRL-3の発現、活性、または量が正常細胞と比較して低レベルである細胞のことである。
【０１４８】
細胞が浸潤性になるか侵攻性になるかを判断するために、そのような検出を用いることが可能である。この場合、細胞内のPRL-1およびPRL-3の発現、PRL-1およびPRL-3の量または活性が高レベルで検出されることは、細胞が侵攻性、転移性、もしくは浸潤性であるかまたはそのようになる可能性があることの指標となりうる。同様に、PRL-1およびPRL-3の発現、量、または活性が低レベルである細胞の場合、細胞は、侵攻性、転移性、浸潤性のいずれでもないかまたはいずれかである可能性はない。
【０１４９】
PRL-1およびPRL-3のレベルは腫瘍の侵攻性と共に変化するので、癌を有する個体の生存率を予測するために、PRL-1およびPRL-3の発現、量、または活性の検出を用いることが可能であることはわかるであろう。すなわち、高レベルのPRL-1およびPRL-3は、より低い生存率または生存確率の指標となり、低レベルのPRL-1およびPRL-3は、より高い生存率または生存確率の指標となる。いずれも、正常レベルのPRL-1およびPRL-3を有する個体または同族集団と比較した場合である。したがって、癌を有する個体の予後を判定する方法として、PRL-1およびPRL-3の発現、量、または活性の検出を用いることが可能である。
【０１５０】
癌を有する個体における特定の療法の成功の可能性を決定するために、PRL-1およびPRL-3の発現、量、またはレベルの検出を用いることが可能である。個体における腫瘍が浸潤性もしくは転移性の腫瘍であるかまたはそうである可能性があるかを決定する方法で、それを用いることが可能である。
【０１５１】
本文書中に記載の診断方法は、記載の治療方法との組合せが可能である。したがって、本発明者らは、個体における癌の治療、予防、または軽減の方法を提供する。この方法は、個体の細胞内でのPRL-1およびPRL-3の発現、量、または活性のモジュレーションを検出することと、腫瘍の侵攻性に基づいて適切な療法を個体に施すことと、を含む。
【０１５２】
典型的には、癌の検出のために理学的検査用X線を使用する。癌の診断のために、典型的には、組織病理学的検査用として腫瘍の生検試料を採取する。標準的な組織病理学的手順と共に癌を診断したりさらに診断を確認したりするために、PRL-1およびPRL-3の発現、量、または活性の検出を用いることが可能である。これは、組織病理学的分析で明確な結果が得られない場合にときに有用でありうる。
【０１５３】
PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドならびにPRL-1核酸およびPRL-3核酸の存在および量は、以下にさらに詳細に記載されるようなサンプルで検出可能である。この場合、異常に低減もしくは増大された発現、量、または活性、たとえば、PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドまたはPRL-1 mRNAおよびPRL-3 mRNAの増大された発現、量、または活性を被験体に由来するサンプルから決定することを含む方法により、癌をはじめとするPRL-1関連疾患およびPRL-3関連疾患を診断することが可能である。
【０１５４】
サンプルは、PRL-1およびPRL-3の発現、量または活性の増大、低減、または他の異常、たとえば、発現、量、または活性のレベルまたはパターンの空間的変化または時間的変化に関連付けられる疾患に罹患しているかまたは罹患している疑いのある生物体または個体に由来する細胞サンプルまたは組織サンプルを含みうる。そのような疾患に罹患しているかまたは罹患している疑いのある生物体内のPRL-1およびPRL-3の発現、量、または活性のレベルまたはパターンは、疾患の診断の手段として、正常生物体内の発現、量、または活性のレベルまたはパターンと有効に比較されうる。
【０１５５】
サンプルは、癌に罹患しているかまたは罹患している疑いのある個体に由来する細胞サンプルまたは組織サンプル、たとえば、適合組織サンプルまたは適合細胞サンプルを含みうる。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、PRL-1およびPRL-3の発現、量、または活性のレベルの増大は、サンプルで検出される。PRL-1およびPRL-3のレベルは、正常細胞または癌でないことがわかっている細胞と比較した場合、有意に増大されうる。そのような細胞は、被験個体または他の個体、たとえば、年齢、体重、生活習慣などを被験個体に一致させた個体から取得可能である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、PRL-1およびPRL-3の発現、量、または活性のレベルは、10%、20%、30%、もしくは40%またはそれ以上増大される。いくつかの実施形態では、PRL-1およびPRL-3の発現、量、または活性のレベルは、cDNAハイブリダイゼーションにより判断した場合、45%以上たとえば50%以上増大される。
【０１５８】
PRL-1およびPRL-3の発現、量、または活性は、当技術分野で公知であるおよび以下にさらに詳細に記載されるいくつかの方式で検出可能である。典型的には、個体に由来する組織のサンプル中のPRL-1およびPRL-3の量を測定して、非罹患個体に由来するサンプルと比較する。PRL-1核酸およびPRL-3核酸の両方さらにはPRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドのレベルを測定することが可能である。
【０１５９】
癌を類別するために、PRL-1およびPRL-3の量、活性、または発現の検出を用いることが可能である。たとえば、PRL-1およびPRL-3の量、活性、または発現のレベルが高いことは、侵攻性、浸潤性、もしくは転移性の癌の指標となりうる。同様に、PRL-1およびPRL-3の量、活性、または発現のレベルが低いことは、非侵攻性、非浸潤性、もしくは非転移性の癌の指標となりうる。そのような類別システムは、確立された類別システムと連携させて使用可能である。
【０１６０】
PRL-1およびPRL-3の遺伝子発現のレベルは、いくつかの異なる技術を用いて決定可能である。
【０１６１】
RNAレベルでのPRL-1およびPRL-3の発現の測定
PRL-1およびPRL-3の遺伝子発現をRNAレベルで検出することが可能である。
【０１６２】
したがって、一実施形態では、本発明者らは、PRL-1核酸およびPRL-3核酸に特異的な少なくとも1種の核酸プローブにサンプルを接触させてPRL-1核酸およびPRL-3核酸の存在に関して該サンプルをモニターするによりサンプル中のPRL-1核酸およびPRL-3核酸を含む核酸の存在を検出する方法を開示する。たとえば、核酸プローブは、PRL-1核酸およびPRL-3核酸またはその一部分に特異的に結合可能であり、両者の間の結合が検出される。複合体自体の存在を検出することも可能である。
【０１６３】
本明細書中に記載の抗PRL抗体の利用が可能な以下に記載のポリペプチド発現アッセイを補完するために、PRL-1およびPRL-3の発現のRNA検出を用いることが可能である。
【０１６４】
したがって、一実施形態では、PRL-1 mRNAおよびPRL-3 mRNAの形態のPRL-1核酸およびPRL-3核酸の量をサンプルで測定することが可能である。in situハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応により、PRL-1 mRNAおよびPRL-3 mRNAをアッセイすることが可能である。in situハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、一本鎖コンフォメーション多型、特異的プライマーを用いたPCR増幅＋DNAチップ分析により、核酸配列を同定することが可能である。（Kawasaki, 1990; Sambrook, 1992; Lichter et al, 1990; Orita et al, 1989; Fodor et al., 1993; Pease et al., 1994）。
【０１６５】
PRL-1 RNAおよびPRL-3 RNAは、RNA抽出技術を用いて、たとえば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（RNAzol B; Biogenesis）またはRNeasy RNA調製キット（Qiagen）を用いて、細胞から抽出可能である。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ方式としては、核ランオンアッセイ、RT-PCR、およびRNaseプロテクションアッセイ（Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035）が挙げられる。利用可能な検出方法は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、および他の好適な標識を含む。
【０１６６】
これらの各方法は、定量的測定の実施が可能であり、当技術分野で周知である。したがって、PRL-1およびPRL-3の発現、量、または活性の減少または増大は、ポリヌクレオチドの定量のための当技術分野で周知の方法のいずれかを用いてRNAレベルで測定可能である。PRL-1配列およびPRL-3配列に由来する任意の好適なプローブ、たとえば、好適なヒトPRL-1配列およびヒトPRL-3配列の任意の部分をプローブとして使用することが可能である。PRL-1プローブおよびPRL-3プローブをデザインするための配列としては、寄託番号NM_015472を有する配列またはその一部分が挙げられうる。
【０１６７】
典型的には、RNA標的を増幅するためにRT-PCRを使用する。このプロセスでは、逆転写酵素を用いてRNAを相補的DNA（cDNA）に変換し、次に、検出を容易にするために、これを増幅することが可能である。
【０１６８】
多くのDNA増幅方法が公知であり、そのほとんどは、酵素連鎖反応（たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、もしくは自己持続配列複製）またはそれがクローニングされたベクターの全部もしくは一部の複製に依拠する。
【０１６９】
多くの標的およびシグナルの増幅方法は、文献に記載されており、たとえば、Landegren, U. et al., Science 242:229-237 (1988) and Lewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990)には、これらの方法の一般的レビューが記載されている。
【０１７０】
たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応を利用してPRL-1 mRNAおよびPRL-3 mRNAを検出することが可能である。
【０１７１】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」とは、とくに米国特許第4,683,195号明細書および同第4,683,202号明細書に記載の核酸増幅方法のことである。PCRを用いて診断に関連する任意の公知の核酸を増幅することが可能である（Mok et al., 1994, Gynaecologic Oncology 52:247-252）。自己持続配列複製（3SR）は、TASの変法であり、酵素カクテルおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーにより媒介される逆転写酵素（RT）活性、ポリメラーゼ活性、およびヌクレアーゼ活性の逐次的ラウンドを介した核酸鋳型の等温増幅を含む。連結増幅反応または連結増幅システムでは、DNAリガーゼおよび4種のオリゴヌクレオチド（1本の標的鎖あたり2種のオリゴヌクレオチド）が使用される。この技術については、Wu, D. Y. and Wallace, R. B., 1989, Genomics 4:560に記載されている。Qβレプリカーゼ技術では、Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197に記載されるように、一本鎖RNAを複製するバクテリオファージQβのRNAレプリカーゼを用いて標的DNAを増幅する。
【０１７２】
PCR手順は、基本的には次のことを含む。（1）抽出されたDNAを一本鎖相補鎖が形成されるように処理する。（2）1対のオリゴヌクレオチドプライマーを添加する。ただし、この対の一方のプライマーは、センス鎖中の配列の一部分に実質的に相補的であり、各対の他方のプライマーは、相補的アンチセンス鎖中の同一配列 の異なる部分に実質的に相補的である。（3）対をなすプライマーを相補的配列にアニールする。（4）アニールされたプライマーを各プライマーの3'末端から同時に伸長させて、各プライマーにアニールされた鎖に相補的な伸長産物を合成する。ただし、該伸長産物は、相補体から分離された後、各対の他方のプライマーの伸長産物を合成するための鋳型として機能する。（5）該伸長産物を該鋳型から分離して一本鎖分子を生成する。そして（6）該アニール工程、該伸長工程、および該分離工程を少なくとも1回反復することにより、該一本鎖分子を増幅する。
【０１７３】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を利用することが可能である。定量的RT-PCRを使用することも可能である。そのようなPCR技術は、当技術分野で周知であり、PRL-1配列およびPRL-3配列に由来する任意の好適なプライマーを利用することが可能である。
【０１７４】
他の選択肢の増幅技術を活用することも可能である。たとえば、ローリングサークル増幅（Lizardi et al., 1998, Nat Genet 19:225）は、DNAポリメラーゼにより駆動されて恒温条件下で直線的もしくは幾何級数的な速度論のいずれかで環状オリゴヌクレオチドプローブを複製しうる商品化された増幅技術（RCATTM）である。さらなる技術の鎖置換増幅（SDA; Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:392）は、特定の標的に特有の特定的に規定された配列から開始される。
【０１７５】
ポリペプチドレベルでのPRL-1およびPRL-3の発現の測定
PRL-1およびPRL-3の発現は、ポリペプチドレベルで検出可能である。
【０１７６】
したがって、さらなる実施形態では、サンプル中のPRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドの存在または量を検出することにより、PRL-1およびPRL-3の発現、量、または活性を検出することが可能である。これは、PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドに結合する分子を用いることにより達成可能である。PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドに直接的もしくは間接的のいずれかで結合してその存在を検出するのに好適な分子／作用剤としては、ペプチドやタンパク質のような天然に存在する分子たとえば抗体が挙げられるか、またはそれらは合成分子でありうる。
【０１７７】
したがって、本発明者らは、ポリペプチドに結合可能な抗体に細胞サンプルを接触させて、ポリペプチドの存在に関して該サンプルをモニターすることにより、PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドの存在を検出する方法を開示する。
【０１７８】
たとえば、本明細書中に記載の抗PRL-1抗体および抗PRL-3抗体を用いて、PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドを検出することが可能である。本文書中に詳細に記載された手段により、そのような抗体を作製することが可能である。特定例では、抗PRL-1抗体は、モノクローナル抗体269と同一のエピトープに結合可能な抗体を含みうる。このようなものとしては、モノクローナル抗体269自体、抗体269の可変領域を含む抗体、またはヒト化モノクローナル抗体269が挙げられうる。
【０１７９】
同様に、抗PRL-3抗体は、モノクローナル抗体223もしくは318と同一のエピトープに結合可能な抗体を含みうる。このようなものとしては、モノクローナル抗体223もしくは318自体、抗体223もしくは318の可変領域を含む抗体、またはヒト化モノクローナル抗体223もしくは318が挙げられうる。
【０１８０】
アッセイは、適宜、抗体とポリペプチドとの間に形成される複合体の存在をモニタリングすることによりまたはポリペプチドと抗体との間の結合をモニタリングすることにより達成可能である。2つの要素間の結合を検出する方法は、当技術分野で公知であり、例としては、FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）、表面プラズモン共鳴などが挙げられる。
【０１８１】
以上に記載のイムノブロッティングのような標準的実験技術を用いることにより、同一の細胞集団内の未処置細胞と比較してPRL-1タンパク質およびPRL-3タンパク質のレベルの変化を検出することが可能である。
【０１８２】
PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドの翻訳後プロセシングまたはPRL-1核酸およびPRL-3核酸の転写後修飾の変化を検出することにより、遺伝子発現を測定することが可能である。たとえば、PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドの示差的リン酸化、PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドの切断、またはPRL-1 RNAおよびPRL-3 RNAの選択的スプライシングなどを測定することが可能である。所有権付きのタンパク質アッセイまたはタンパク質技術、たとえば、2Dポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドのような遺伝子産物の発現のレベルさらにはそれらの翻訳後修飾を検出することが可能である。
【０１８３】
宿主に由来するサンプル中のPRL-1タンパク質およびPRL-3タンパク質のレベルを決定するために使用可能なアッセイ技術は、当業者に周知である。当技術分野で公知の任意の方法により、免疫特異的結合に関して抗体をアッセイすることが可能である。
【０１８４】
使用可能な免疫アッセイとしては、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ELISA、サンドイッチ免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫ラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫アッセイ、およびプロテインA免疫アッセイのような技術を用いる競合的および非競合的なアッセイシステムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのようなアッセイは、当技術分野で常用されている（たとえば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York（参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）を参照されたい）。
【０１８５】
免疫組織化学的および免疫細胞化学的な染色（一般的には、Stites and Terr, Basic and Clinical Immunology, Appleton and Lange, 1994を参照されたい）、ELISA、RIA、イムノブロット、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、機能アッセイ、およびタンパク質トランケーション試験により、ポリペプチド／タンパク質に関して検体をアッセイすることが可能である。他のアッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびELISAアッセイが挙げられる。
【０１８６】
ELISAアッセイは当業者に周知である。ポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体は両方とも、アッセイに使用可能である。適切であれば、当業者に公知のようにラジオイムノアッセイ（RIA）のような他のイムノアッセイを使用することが可能である。利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されている。たとえば、米国特許第3,791,932号明細書、同第3,839,153号明細書、同第3,850,752号明細書、同第3,850,578号明細書、同第3,853,987号明細書、同第3,867,517号明細書、同第3,879,262号明細書、同第3,901,654号明細書、同第3,935,074号明細書、同第3,984,533号明細書、同第3,996,345号明細書、同第4,034,074号明細書、同第4,098,876号明細書、同第4,879,219号明細書、同第5,011,771号明細書、および同第5,281,521号明細書、さらにはSambrook et al, 1992を参照されたい。
【０１８７】
診断用キット
本発明者らはまた、個体における癌または個体における癌への罹患性を検出するための診断用キットを提供する。
【０１８８】
診断用キットは、本文書中に記載の任意の手段により個体におけるPRL-1またはPRL-3の発現、量、または活性を検出するための手段を含みうる。したがって、診断用キットは、次のもの：抗PRL抗体、モノクローナル抗体269、223、もしくは318と同一のエピトープに結合可能な抗体、モノクローナル抗体269、抗体269の可変領域を含む抗体、またはヒト化モノクローナル抗体269；モノクローナル抗体223、抗体223の可変領域を含む抗体、またはヒト化モノクローナル抗体223；モノクローナル抗体318、抗体318の可変領域を含む抗体、またはヒト化モノクローナル抗体318；のうちのいずれか1つ以上のを含みうる。
【０１８９】
診断用キットは、使用説明または他の指示を含みうる。診断用キットはさらに、乳癌の治療または予防のための手段、たとえば、本文書中に記載の組成物のいずれか、または乳癌を治療するための当技術分野で公知の任意の手段を含みうる。特定的には、診断用キットは、たとえばスクリーニングにより得られる記載の抗PRL1抗体または抗PRL3抗体を含みうる。
【０１９０】
予防および治療の方法
本発明者らは、過剰量のPRL-1およびPRL-3の発現または活性に関連する異常病態たとえば癌を治療する方法を開示する。癌を予防する方法（すなわち予防法）はまた、同一もしくは類似の手法を適切に利用する。
【０１９１】
一般的には、本発明者らの方法は、細胞内のPRL-1およびPRL-3の発現、量、または活性をモジュレート（たとえばダウンレギュレート）することによる癌細胞の操作を含む。本方法は、癌細胞を破壊または根絶することを含みうる。癌細胞は、PRL-1および／またはPRL-3を発現する癌細胞を含みうる。癌細胞は、非癌細胞と比較してPRL-1および／またはPRL-3を過剰発現する細胞でありうる。本発明者らの方法は、抗PRL抗体、たとえば、抗PRL-1抗体もしくは抗PRL-3抗体またはその両方に患者を暴露することを含みうる。抗PRL-1抗体は、ヒト化抗PRL-1抗体を含みうる。同様に、抗PRL-3抗体は、ヒト化抗PRL-3抗体を含みうる。
【０１９２】
癌細胞は、PRL-1陽性および／またはPRL-3陽性の癌患者に由来するものでありうる。したがって、本発明者らの方法は、PRL-3／PRL-1陽性癌患者に由来するPRL-1および／またPRL-3過剰発現癌細胞を根絶することを含みうる。
【０１９３】
したがって、本発明者らの方法は、PRL-3／PRL-1ヒト化抗体を用いてPRL-3/PRL-1陽性癌患者に由来するPRL-1および／またはPRL-3過剰発現細胞を根絶することを含みうる。
【０１９４】
細胞内のモジュレートされたPRL-1およびPRL-3の発現、量、または活性を検出する工程は、操作工程の前または後で実施可能である。検出工程は、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされたPRL-1およびPRL-3の発現、量または活性を検出しうる。本文書中の他の箇所に詳細に記載されるように、PRL-1およびPRL-3をモジュレートまたはダウンレギュレートする方法のいずれかを使用することが可能である。
【０１９５】
特定的には、本方法は、PRL-1またはPRL-3に特異的に結合可能な抗PRL-1抗体または抗PRL-3抗体に細胞を暴露することを含みうる。抗PRL抗体およびそれを投与する方法については、本文書中の他の箇所に詳細に記載されている。
【０１９６】
本発明者らの方法によれば、操作の結果として、癌細胞は、非癌性になるか、または浸潤性もしくは転移性の癌細胞は、非浸潤性もしくは非転移性になる。癌は、特定的には、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、陰茎癌、子宮頸癌、脳癌、食道癌、膀胱癌、腎臓腎細胞癌、卵巣リンパ腫、および皮膚黒色腫よりなる群から選択される浸潤性もしくは転移性の癌のような癌を含みうる。
【０１９７】
PRL-1およびPRL-3は癌の侵攻性および浸潤性に関連付けられるので、癌を有する個体の細胞内のPRL-1およびPRL-3のレベルを癌細胞または非癌細胞で検出して、癌の侵攻性を評価することが可能である。PRL-1およびPRL-3の量、発現、または活性のレベルが正常細胞と比較して高いことは、侵攻性もしくは浸潤性の癌の指標となり、したがって、より強力もしくはより過酷な療法が要求かつ選択されうる。同様に、より低いレベルは、それほど積極的でない療法またはそれほど侵襲的でない療法の指標となりうる。
【０１９８】
本明細書中に記載の手法は、任意のPRL-1関連疾患全般およびPRL-3関連疾患全般の療法に使用可能である。PRL-1関連疾患およびPRL-3関連疾患としては、増殖性疾患が挙げられ、特定的には、癌が挙げられる。たとえば、PRL-1関連疾患およびPRL-3関連疾患としては、転移性癌、浸潤性癌、または侵攻性癌が挙げられうる。
【０１９９】
本明細書中に記載の方法および組成物は、好適には、治療を受けていない個体と比較される治療の施された個体における測定可能な判定基準の改良を可能にする。
【０２００】
この目的のために、癌の進行または患者の健康を反映したいくつかの判定基準をデザインすることが可能である。有用な判定基準としては、腫瘍サイズ、腫瘍寸法、腫瘍の最大寸法、腫瘍数、腫瘍マーカー（たとえば、α-フェトプロテイン）の存在、転移物の程度または数などが挙げられうる。
【０２０１】
したがって、一例として、治療個体は、適切なアッセイまたは検査により測定した場合、腫瘍のサイズまたは数の減少を示しうる。たとえば、治療個体では、治療されていない個体と比較して、特定の腫瘍の腫瘍サイズもしくは腫瘍数またはその両方が、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、またはそれ以上の減少を示しうる。
【０２０２】
たとえば、PRL-1関連疾患およびPRL-3関連疾患は、疾患に関連付けられる病態が対照と比較して有意に（すなわち50%以上）阻害された場合、「治療された」として規定されうる。阻害は、対照と比較して少なくとも75%、たとえば、対照と比較して90%または100%でありうる。病態は、細胞増殖を含みうるか、または細胞周期時間、細胞数、細胞移動、細胞浸潤性、腫瘍形成、腫瘍転移、腫瘍の広がりなどを含みうる。「治療」という用語はまた、癌の予防または軽減を含みうる。
【０２０３】
増殖性障害という用語は、細胞周期の制御を必要とする任意の障害を含むように本明細書中では広義に用いられる。特定的には、増殖性障害は、悪性もしくは前新生物性の障害を含む。本明細書中に記載の方法および組成物は、腺癌、たとえば、小細胞肺癌、ならびに腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸、および乳房の癌の治療または診断との関連でとくに有用である。たとえば、治療可能でありうる悪性疾患としては、急性および慢性の白血病、リンパ腫、骨髄腫、肉腫、たとえば、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、リンパ管内皮肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、絨毛癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、精上皮腫、胎生期癌、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌腫、膀胱癌、上皮性癌、神経膠腫、星状細胞腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫が挙げられる。
【０２０４】
抗PRL抗体の使用を含む抗体治療法は、本明細書中に記載のPRL-1ポリヌクレオチドおよびPRL-3ポリヌクレオチドに対するアンチセンス構築物を発現させることとそれを腫瘍細胞に投与して遺伝子機能を阻害し腫瘍細胞の増殖または進行を予防することとを含むそのような障害の他の治療法との組合せが可能である。
【０２０５】
アンチセンス構築物は、増殖細胞において遺伝子機能を阻害し増殖または進行を予防するために使用可能である。アンチセンス構築物、すなわち、センス核酸またはmRNAに相補的な核酸構築物たとえばRNA構築物については、米国特許第6,100,090号明細書（Monia et al.）およびNeckers et al., 1992, Crit Rev Oncog 3(1-2):175-231（その文書の教示は参照により明示的に組み入れられるものとする）に詳細に記載されている。
【０２０６】
特定例では、PRL-1およびPRL-3の量、発現、または活性を全体的もしくは部分的に低減させることにより、たとえば、PRL-1 mRNAおよびPRL-3 mRNAに結合してそれらを破壊しうるsiRNAにより、癌を治療または予防することが可能である。
【０２０７】
RNA干渉（RNAi）は、二本鎖RNA（dsRNA）の直接導入により引き起される転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）の方法であり、さまざまな生物体における特定遺伝子のノックアウト発現に有用なツールとして登場した。RNAiについては、Fire et al., Nature 391:806-811 (1998)に記載されている。PTGSの他の方法は公知であり、例としては、トランスジーンまたはウイルスの導入が挙げられる。一般的には、PTGSでは、サイレンシングされる遺伝子の転写産物は、合成されるが、急速に分解されるので蓄積しない。RNAiをはじめとするPTGSの方法については、たとえば、Ambion.com world wide web siteのディレクトリー「/hottopics/」の「rnai」ファイルに記載されている。
【０２０８】
in vitro RNAiに好適な方法を本明細書中に記載する。そのような方法の1つは、siRNA（低分子干渉RNA）の導入を含む。現在のモデルでは、こうした21〜23ヌクレオチドのdsRNAがPTGSを引き起こしうることが示されている。有効なsiRNAをデザインする方法については、たとえば、以上に記載したAmbionウェブサイトに記載されている。ショートヘアピンRNA（shRNA）のようなRNA前駆体もまた、PRL-1核酸配列およびPRL-3核酸配列の全部または一部分によりコード可能である。
【０２０９】
他の選択肢として、哺乳動物において奏効することが最近示された二本鎖（ds）RNAは、広範な生物体において遺伝子発現を妨害する強力な手段である（Wianny and Zernicka-Goetz, 2000, Nat Cell Biol 2:70-75）。PRL-1ポリヌクレオチドおよびPRL-3ポリヌクレオチドの配列に対応する二本鎖RNAを卵母細胞内および候補生物体の細胞内に導入するかまたはそれらの細胞内で発現させることにより、PRL-1活性およびPRL-3活性を妨害することが可能である。
【０２１０】
PRL-1遺伝子発現およびPRL-3遺伝子発現をモジュレートする他の方法は、当業者に公知であり、例としては、ドミナントネガティブ法が挙げられる。この場合も、これらは、抗PRL抗体を用いた抗体療法との組合せが可能である。したがって、他の手法では、内因性遺伝子産物と競合して機能阻害を引き起こす本文書中のPRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドの非機能性変異体が使用される。
【０２１１】
PRL-1遺伝子発現およびPRL-3遺伝子発現はまた、遺伝子発現または機能活性を阻害するペプチドまたは小分子の導入などによりモジュレート可能である。そのようなペプチドまたは小分子は、転移性癌のような癌を治療するための抗PRL抗体と組み合わせて投与可能である。
【０２１２】
したがって、PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドに結合するものとしてまたはそれらの量、活性、もしくは発現をモジュレートたとえばダウンレギュレートするものとしてアッセイにより同定された化合物は、PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドの機能を阻害するために腫瘍細胞または増殖細胞に投与可能である。そのような化合物は、PRL-1およびPRL-3の発現もしくは活性をダウンレギュレートすることによりまたはPRL-1およびPRL-3の発現、活性、もしくは量を制御する第2のシグナルを活性化もしくはダウンレギュレートすることにより異常病態を軽減するのに有効な量で、製薬上許容される担体と共に投与可能である。
【０２１３】
他の選択肢として、被験体における癌細胞のような適合細胞によるPRL-1およびPRL-3の内因性産生を制御するために、遺伝子療法を利用することが可能である。たとえば、以下で論述されるように、PRL-1 siRNAおよびPRL-3 siRNAをコードするポリヌクレオチドまたはこれの一部分を複製欠損レトロウイルスベクターで発現されるように工学的に操作することが可能である。その際、レトロウイルス発現構築物を単離し、そして抗PRL-1 siRNAおよび抗PRL-3 siRNAをコードするRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターが形質導入されたパッケージング細胞中に導入して、パッケージング細胞がこの時点で対象の配列を含有する感染性ウイルス粒子を産生するようにすることが可能である。in vivoで細胞を工学的に操作してin vivoでPRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドの発現をレギュレートするために、こうしたプロデューサー細胞を被験体に投与することが可能である。遺伝子療法の概要については、Human Molecular Genetics, T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)中のChapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches（およびそこに引用されている参考文献）を参照されたい。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、PRL-1およびPRL-3のレベルは、癌細胞において低減される。さらに、そのような実施形態では、治療は、そのような癌細胞を標的にしうるかまたはそのような癌細胞に特異的でありうる。PRL-1およびPRL-3の発現は、疾患細胞（すなわち、癌性の細胞）でのみ特異的に低減可能であり、他の非疾患細胞では実質的に低減可能でない。こうした方法では、PRL-1およびPRL-3の発現は、他の細胞、すなわち、癌細胞でない細胞では、実質的に低減可能でない。したがって、そのような実施形態では、PRL-1およびPRL-3のレベルは、治療期間中またはその後、非癌細胞では実質的に同一もしくは類似の状態に保たれる。
【０２１５】
ポリペプチド配列
当然のことであろうが、本明細書中に開示されるポリペプチド配列は、本文書中に示される特定の配列に限定されるものではなく、場合に応じて、抗PRL抗体の生物活性の少なくとも1つを有することを条件として、任意の供給源から得られる相同配列、たとえば、関連細胞性相同体、他の種に由来する相同体、およびそれらの変異体または誘導体を含む。
【０２１６】
したがって、本開示は、本文書中に示されるアミノ酸配列の変異体、相同体、または誘導体、さらには本明細書中に開示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の変異体、相同体、または誘導体を含む。そのような配列は、一般的には、「抗PRL抗体」配列と呼ばれる。
【０２１７】
生物活性
いくつかの実施形態では、配列は、場合に応じて、抗PRL抗体の生物活性の少なくとも1つを含む。
【０２１８】
生物活性は、免疫学的活性を含みうる。抗PRL抗体は、抗体269、223、もしくは318、またはそれらのヒト化形態と比較して同一もしくは類似の免疫学的活性を含みうる。「免疫学的活性」とは、PRL-1抗原またはPRL-3抗原に結合したときに適切な動物または細胞において特異的免疫応答を引き起こす抗PRL抗体の能力を意味する。
【０２１９】
生物活性は、抗原結合活性を含みうる。抗PRL抗体は、PRL-1またはそのエピトープに結合しうる。抗PRL抗体は、抗体269が結合するのと同一のエピトープに結合しうる。抗PRL抗体は、PRL-3またはそのエピトープに結合しうる。抗PRL抗体は、抗体223が結合するのと同一のエピトープまたは抗体318が結合するのと同一のエピトープに結合しうる。
【０２２０】
抗PRL抗体は、同一の、低減された、もしくは増大された親和性または結合活性を有して、抗原またはエピトープに結合しうる。たとえば、抗PRL抗体は、コグネイト抗体、たとえば、場合に応じて、抗体269、抗体223、もしくは抗体318、またはそれらの対応するヒト化抗体と比較して、少なくとも10%、たとえば20%、たとえば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくはそれ以上の親和性または結合活性を有して、抗原またはエピトープに結合しうる。
【０２２１】
活性としては、たとえば腫瘍サイズもしくは腫瘍数の減少により測定される癌活性の阻害またはたとえば実施例中に記載のアッセイなどにより測定される転移活性の阻害が挙げられうる。被験動物において発癌を引き起こし、抗PRL抗体を動物に投与し、そしてそのように治療されていない同様の対照動物と比較して抗PRL抗体の効果を調べることにより、適宜、減少または阻害をアッセイすることが可能である。実施例には、そのようなアッセイが詳細に記載されている。
【０２２２】
抗PRL抗体は、コグネイト抗体と同一の、それよりも低減された、もしくはそれよりも増大された腫瘍阻害活性または転移阻害活性を有しうる。たとえば、抗PRL抗体は、コグネイト抗体、たとえば、場合に応じて、抗体269、抗体223、もしくは抗体318、またはそれらの対応するヒト化抗体と比較して、少なくとも10%、たとえば20%、たとえば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくはそれ以上有効でありうる。このことは、たとえば、コグネイト抗体が腫瘍数を90%低減しうる場合（実施例参照）、抗PRL抗体は、未治療動物と比較して、腫瘍数を90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%などだけ低減しうることを意味する。
【０２２３】
抗体イベントを検出する他のアッセイを記載のアッセイの代わりにまたはそれに加えて使用することも可能である。
【０２２４】
相同体
開示される抗PRL抗体ポリペプチドとしては、任意の供給源から得られる相同配列、たとえば、関連ウイルスタンパク質／関連細菌タンパク質、細胞性相同体、および合成ペプチド、さらにはそれらの変異体または誘導体が挙げられる。したがって、ポリペプチドとしてはまた、動物、たとえば、哺乳動物（たとえば、マウス、ラット、またはウサギ）、特定的にはヒトをはじめとする他の種に由来する抗PRL抗体の相同体をコードするものが挙げられる。
【０２２５】
本文書との関連では、相同配列または相同体は、たとえば、本明細書中の配列リストに示される適合ポリペプチド配列に対して、少なくとも30アミノ酸、たとえば、50、70、90、もしくは100アミノ酸にわたり、アミノ酸レベルで、少なくとも60、70、80、もしくは90%同一、たとえば、少なくとも95もしくは98%同一であるアミノ酸配列を含むとみなされる。本文書との関連では、相同配列は、適合ポリペプチドの配列に対して、少なくとも15、25、35、50、もしくは100アミノ酸、たとえば、200、300、400、もしくは500アミノ酸にわたり、アミノ酸レベルで、少なくとも15、20、25、30、40、50、60、70、80、もしくは90%同一、たとえば、少なくとも95もしくは98%同一であるアミノ酸配列を含むとみなされる。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）に基づいて考えることも可能であるが、本文書との関連では、配列同一性により相同性を表すことが可能である。配列同一性は、適合配列の長さ全体に対して、すなわち、たとえば、適合遺伝子の長さ全体または全長配列にわたり、決定されうる。
【０２２６】
相同性比較は、目測でまたはより一般的には容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施可能である。こうした市販のコンピュータープログラムを用いて、2つ以上の配列間の相同性%を計算することが可能である。
【０２２７】
相同性%は、コンティグ配列にわたり計算可能である。すなわち、一方の配列を他方の配列にアライメントし、一方の配列中のそれぞれのアミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と1回に1残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップ無し」アライメントと呼ばれる。典型的には、そのようなギャップ無しアライメントは、比較的少ない個数の残基（たとえば、50個未満のコンティグアミノ酸）にわたり行われるにすぎない。
【０２２８】
これは非常に単純かつ一貫性のある方法であるが、たとえば、1つの挿入または欠失があると、それ以外は同一である配列対であっても、それ以降のアミノ酸残基がアライメントできなくなるという点が考慮されていないので、グローバルアライメントを行った場合、相同性%が大幅に減少する可能性がある。したがって、ほとんどの配列比較法は、全相同性スコアに過度のペナルティーを課すことなく可能性のある挿入および欠失を考慮した最適アライメントを生成するようにデザインされる。これは、局所相同性を最大化するように試行して配列アライメント中に「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【０２２９】
しかしながら、これらのより複合的な方法では、同一アミノ酸の個数が同数の場合、できるかぎり少ないギャップを有する配列アライメントが、2つの比較配列間のより高い関連性を反映して、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するように、アライメント中に生じるそれぞれのギャップに「ギャップペナルティー」が割り当てられる。典型的には、ギャップの存在に比較的高いコストを課しかつギャップ中のそれぞれの後続残基により小さいペナルティーを課する「アファインギャップコスト」が使用される。これは、最もよく使用されるギャップスコアリングシステムである。当然ながら、ギャップペナルティーが高ければ、より少ないギャップを有する最適化アライメントが生成されるであろう。ほとんどのアライメントプログラムでは、ギャップペナルティーを変更できるようになっている。しかしながら、配列比較のためにそのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を用いることが可能である。たとえば、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ（下記参照）を使用する場合、アミノ酸配列に対するデフォルトギャップペナルティーは、ギャップ1つにつき-12、各伸長ごとに-4である。
【０２３０】
したがって、最大相同性%の計算では、最初に、ギャップペナルティーを考慮して最適アライメントを生成することが必要である。そのようなアライメントを行うのに好適なコンピュータープログラムは、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ（University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387）である。配列比較を行いうる他のソフトウェアの例としては、BLASTパッケージ（Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18）、FASTA（Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410を参照されたい）、およびGENEWORKS比較ツール一式が挙げられるが、これらに限定されるものではない。BLASTおよびFASTAはいずれも、オフライン検索およびオンライン検索で利用可能である（Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60を参照されたい）。GCG最良のあてはめプログラムを使用することが可能である。
【０２３１】
同一性に基づいて最終相同性%を求めることが可能であるが、アライメント法自体は、典型的には、オールオアナッシング対比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性または進化距離に基づいてそれぞれのペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケール化類似性スコアマトリックスが広く使用される。一般に使用されるそのようなマトリックスの一例は、BLOSUM62マトリックス（一連のBLASTプログラムのデフォルトマトリックス）である。GCG Wisconsinプログラムでは、一般的には、パブリックデフォルト値または供給されるのであればカスタムシンボル比較表のいずれかが使用される（さらに詳しくはユーザーマニュアルを参照されたい）。GCGパッケージではパブリックデフォルト値を、またはBLOSUM62のような他のソフトウェアの場合にはデフォルトマトリックスを、使用することが可能である。
【０２３２】
ソフトウェアを用いて最適アライメントを生成させた後、相同性%たとえば配列同一性%を計算することが可能である。典型的には、ソフトウェアにより配列比較の一部分としてこれを行い、数値結果を生成させる。
【０２３３】
変異体および誘導体
本明細書中に記載のアミノ酸配列に対する「変異体」または「誘導体」という用語は、配列からのまたは配列への1個（もしくはそれ以上）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失、または付加を含む。得られるアミノ酸配列は、非修飾型配列と実質的に同一の活性を保持することが可能であり、たとえば、本文書中たとえば配列リスト中に示される抗PRL抗体ポリペプチドと少なくとも同一の活性を有する。したがって、配列の重要な特徴（すなわち、他の箇所に記載されるようなPRLポリペプチドに結合する能力または腫瘍縮小活性）は保持されうる。
【０２３４】
実施例に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは相同体は、本明細書中に記載の方法および組成物で使用するために修飾可能である。典型的には、配列の生物活性を保持する修飾が行われる。修飾型配列が非修飾型配列の生物活性を保持することを条件として、アミノ酸置換、たとえば、1、2、もしくは3個から10、20、もしくは30個までの置換を行うことが可能である。アミノ酸置換は、たとえば、治療のために投与されるポリペプチドの血漿中半減期を増大させるために、天然に存在しない類似体の使用を含みうる。
【０２３５】
抗PRL抗体の天然の変異体は、おそらく保存的アミノ酸置換を含むであろう。保存的置換は、たとえば、以下の表に従って定義可能である。第2の列の同一の区画のアミノ酸、たとえば、第3の列の同一の行に示されるものは、互いに置換可能である。
【表１】
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【０２３６】
フラグメント
本明細書中に開示されかつマーカーとして有用であるポリペプチドとしてはまた、配列リストに示される配列のフラグメントを含めて、以上で述べた全長ポリペプチドのフラグメントおよびその変異体が挙げられる。
【０２３７】
ポリペプチドとしてはまた、抗PRL抗体ポリペプチドのいずれかの全長配列のフラグメントが挙げられる。フラグメントは、少なくとも1つのエピトープを含みうる。エピトープを同定する方法は、当技術分野で周知である。フラグメントは、典型的には、少なくとも6個のアミノ酸、たとえば、少なくとも10、20、30、50、もしくは100個またはそれ以上のアミノ酸を含むであろう。
【０２３８】
抗PRL抗体タンパク質のポリペプチドフラグメントならびにその対立遺伝子変異体および種変異体は、保存置換を含めて、1個以上（たとえば、5、10、15、もしくは20個）の置換、欠失、または挿入を含有しうる。置換、欠失、および／または挿入が行われる場合、たとえば、異なる種では、配列リストに示されるアミノ酸残基のたとえば50%未満、40%、もしくは20%が修飾される。
【０２３９】
抗PRL抗体ならびにそのフラグメント、相同体、変異体、および誘導体は、組換え手段により作製可能である。しかしながら、固相合成のような当業者に周知の技術を用いる合成手段により作製することも可能である。タンパク質はまた、たとえば、抽出および精製を支援するために、融合タンパク質として生成することも可能である。融合タンパク質パートナーの例としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、6×His、GAL4（DNA結合ドメインおよび／または転写活性化ドメイン）、ならびにβ-ガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質パートナーと対象のタンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を組み込んで融合タンパク質配列を取り出せるようにすることが便利なこともある。融合タンパク質は、対象配列のタンパク質の機能を妨害しないようなものでありうる。タンパク質はまた、動物細胞に由来する細胞抽出物の精製により取得することも可能である。
【０２４０】
本明細書中に開示される抗PRL抗体ポリペプチドならびにその変異体、相同体、フラグメント、および誘導体は、実質的に単離された形態で存在可能である。当然のことであろうが、そのようなポリペプチドは、タンパク質の所定の目的を妨害しない担体または希釈剤と混合可能であり、それでもなお実質的に単離されているとみなすことが可能である。抗PRL抗体の変異体、相同体、フラグメント、または誘導体はまた、実質的に精製された形態で存在可能であり、その場合、一般的には、製剤中にこのタンパク質を含むであろう。ただし、製剤の90%超、たとえば、95%、98%、もしくは99%は、タンパク質である。
【０２４１】
認識可能な標識は、ポリペプチドなどの検出を可能にする任意の好適な標識でありうる。好適な標識としては、放射性同位体たとえば125I、酵素、抗体、ポリヌクレオチド、およびリンカーたとえばビオチンが挙げられる。標識化ポリペプチドは、サンプル中のポリペプチドの量を決定するイムノアッセイのような診断手順で使用可能である。ポリペプチドまたは標識化ポリペプチドはまた、標準的プロトコルを用いて動物およびヒトにおける該ポリペプチドに対する免疫反応性を検出するための血清学的アッセイまたは細胞媒介免疫アッセイで使用可能である。
【０２４２】
本明細書中に開示される抗PRL抗体ポリペプチドならびにその変異体、相同体、フラグメント、および誘導体（場合により標識されていてもよい）はまた、固相、たとえば、イムノアッセイウェルまたはディップスティックの表面に固定可能である。そのような標識化および／または固定化ポリペプチドは、好適な試薬、対照、説明書などと共に、好適な容器内にキットの形態でパッケージ化可能である。そのようなポリペプチドおよびキットは、イムノアッセイによるポリペプチドに対する抗体およびその対立遺伝子変異体または種変異体の検出の方法で使用可能である。
【０２４３】
イムノアッセイ法は、当技術分野で周知であり、一般的には、（a）該タンパク質に対する抗体が結合可能なエピトープを含むポリペプチドを提供することと、（b）抗体-抗原複合体の形成を可能にする条件下で該ポリペプチドと共に生物学的サンプルをインキュベートすることと、（c）該ポリペプチドを含む抗体-抗原複合体が形成されたかどうかを決定することと、を含むであろう。 
本明細書中に開示される抗PRL抗体ポリペプチドならびにその変異体、相同体、フラグメント、および誘導体は、細胞機能におけるそれらの対応する遺伝子およびその相同体の役割を、疾患におけるそれらの機能を含めて、in vitroもしくはin vivoの細胞培養系で調べるために使用可能である。たとえば、トランケート型もしくは修飾型のポリペプチドを細胞内に導入して、細胞内で生じる正常機能を破壊することが可能である。組換え発現ベクターからポリペプチドをin situ発現させることにより、ポリペプチドを細胞内に導入することが可能である（下記参照）。発現ベクターは、場合により、ポリペプチドの発現を制御するために誘導プロモーターを保有しうる。
【０２４４】
昆虫細胞や哺乳動物細胞のような適切な宿主細胞を使用すれば、組換え発現産物に最適生物活性を付与するために必要とされうる翻訳後修飾（たとえば、ミリストイル化、グリコシル化、トランケーション、脂質化、およびチロシンリン酸化、セリンリン酸化、またはトレオニンリン酸化）が提供されると期待される。本明細書中に開示される抗PRL抗体ポリペプチド、変異体、相同体、フラグメント、および誘導体が発現されるそのような細胞培養系は、細胞内でポリペプチドの機能を阻害または増強する候補物質を同定するアッセイ系で使用可能である。
【０２４５】
ポリヌクレオチド配列
可変領域、モノクローナル抗体配列、およびヒト化抗体配列は、ポリヌクレオチドを含みうる。これらは、DNAまたはRNAを含みうる。
【０２４６】
それらは、一本鎖もしくは二本鎖でありうる。それらはまた、それらの中に合成ヌクレオチドまたは修飾型ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでありうる。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾が当技術分野で公知である。これらとしては、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格または分子の3'末端および／もしくは5'末端へのアクリジンもしくはポリリシン鎖の付加が挙げられる。本文書の目的では、当然のことながら、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法により修飾可能である。そのような修飾は、ポリヌクレオチドのin vivo活性または寿命を強化するために実施可能である。
【０２４７】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、二本鎖の両方の鎖が、単独または組合せのいずれかで、本明細書中に記載の方法および組成物に包含される。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、当然のことながら、そのポリヌクレオチドの相補的配列もまた包含される。
【０２４８】
変異体、誘導体、および相同体
本文書中に記載のヌクレオチド配列に対する「変異体」、「相同体」、または「誘導体」という用語は、配列からのまたは配列への1個（もしくはそれ以上）のヌクレオチドの任意の置換、変異、修飾、交換、欠失、または付加を含む。得られる配列は、本文書中の他の箇所に記載されるようなPRL結合活性を有するポリペプチドをコード可能でありうる。
【０２４９】
以上に述べたように、配列同一性に関して、「相同体」は、適合配列に対して、たとえば、少なくとも5%の同一性、少なくとも10%の同一性、少なくとも15%の同一性、少なくとも20%の同一性、少なくとも25%の同一性、少なくとも30%の同一性、少なくとも35%の同一性、少なくとも40%の同一性、少なくとも45%の同一性、少なくとも50%の同一性、少なくとも55%の同一性、少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性を有する。
【０２５０】
少なくとも95%の同一性、たとえば、少なくとも96%の同一性、たとえば、少なくとも97%の同一性、たとえば、少なくとも98%の同一性、たとえば、少なくとも99%の同一性が存在しうる。ヌクレオチド相同性比較は、以上に記載したように実施可能である。この目的のために、以上に記載のGCG Wisconsin最良のあてはめプログラムのような配列比較プログラムを使用することも可能である。デフォルトスコア行列は、各同一ヌクレオチドごとにマッチ値10および各ミスマッチごとに-9を有する。各ヌクレオチドごとに、デフォルトギャップ生成ペナルティーは-50であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティーは-3である。
【０２５１】
ハイブリダイゼーション
本発明者らはさらに、本明細書中に提示される配列のいずれか、たとえば、269、223、および318の可変領域、抗体、およびヒト化抗体、またはそれらの任意の変異体、フラグメント、もしくは誘導体、あるいは以上のいずれかの補体に選択的にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を記述する。ヌクレオチド配列は、少なくとも15ヌクレオチド長、たとえば、少なくとも20、30、40、もしくは50ヌクレオチド長でありうる。
【０２５２】
本明細書中で用いられる「ハイブリダイゼーション」という用語は、「核酸の鎖が塩基対形成を介して相補鎖と一体化するプロセス」さらにはポリメラーゼ連鎖反応技術で行われるような増幅のプロセスを含むものとする。
【０２５３】
本明細書中に提示されるヌクレオチド配列またはその補体に選択的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、少なくとも20個、たとえば、少なくとも25もしくは30個、たとえば、少なくとも40、60、もしくは100個またはそれ以上のコンティグヌクレオチドの領域にわたり、本明細書中に提示される対応するヌクレオチド配列に対して、一般的には少なくとも70%、たとえば、少なくとも80もしくは90%、たとえば、少なくとも95%もしくは98%相同であろう。
【０２５４】
「選択的にハイブリダイズ可能」という用語は、バックグラウンドを有意に超えるレベルで標的ポリヌクレオチドがプローブにハイブリダイズすることが見いだされる条件下で、プローブとして使用されるポリヌクレオチドが使用されることを意味する。他のポリヌクレオチドが、たとえば、スクリーニングされるcDNAライブラリー中またはゲノムDNAライブラリー中に存在するので、バックグラウンドハイブリダイゼーションが起こる可能性がある。この場合、バックグラウンドは、プローブとライブラリーの非特異的DNAメンバーとの間の相互作用により生成されるシグナルのレベルを示し、このレベルは、標的DNAを用いたときに観測される特異的相互作用の強度の1/10未満たとえば1/100未満である。相互作用の強度は、たとえば、プローブを32Pなどで放射性標識化することにより測定可能である。
【０２５５】
ハイブリダイゼーション条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)に教示されているように、核酸結合複合体の融解温度（Tm）に基づき、以下で説明されるように定義される「ストリンジェンシー」を付与する。
【０２５６】
最大ストリンジェンシーは、典型的には、約Tm-5℃（プローブのTmよりも5℃低い）で生じ、高ストリンジェンシーは、Tmよりも約5℃〜10℃低いところで生じ、中間ストリンジェンシーは、Tmよりも約10℃〜20℃低いところで生じ、そして低ストリンジェンシーは、Tmよりも約20℃〜25℃低いところで生じる。当業者であればわかるであろうが、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用可能であり、一方、中間（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、類似のもしくは関連のあるポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用可能である。
【０２５７】
本発明者らは、ストリンジェント条件下（たとえば、65℃および0.1×SSC｛1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M Na3シトレート pH7.0｝）で核酸またはそのフラグメント、相同体、変異体、もしくは誘導体にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を開示する。
【０２５８】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、二本鎖の両方の鎖が、単独または組合せのいずれかで、本開示に包含される。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、当然のことながら、それポリヌクレオチドの相補的配列もまた開示および包含される。
【０２５９】
本明細書中に開示される配列に対して100%相同ではないが本開示の範囲内に含まれるポリヌクレオチドは、いくつかの方法で取得可能である。本明細書中に記載の配列の他の変異体は、たとえば、一連の個体、たとえば、異なる集団に由来する個体から作製されたDNAライブラリーをプローブすることにより取得可能である。それに加えて、他のウイルス性／細菌性または細胞性の相同体、特定的には、哺乳動物細胞（たとえば、ラット、マウス、ウシ科動物、および霊長動物の細胞）に見いだされる細胞性相同体を取得することが可能であり、そのような相同体およびそのフラグメントは、一般的には、本明細書中の配列リストに示される配列に選択的にハイブリダイズ可能であろう。そのような配列は、他の動物種から作製されたcDNAライブラリーまたは他の動物種に由来するゲノムDNAライブラリーをプローブすることにより、および開示された配列の全部もしくは一部を含むプローブを用いて中〜高ストリンジェンシーの条件下でそのようなライブラリーをプローブすることにより、取得可能である。
【０２６０】
本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、プライマー、たとえば、PCRプライマー、他の選択肢の増幅反応用のプライマー、プローブ、たとえば、放射性もしくは非放射性の標識を用いた従来の手段により、認識可能な標識で標識されたプローブを生成するために、使用可能であるか、またはポリヌクレオチドは、ベクター中にクローニング可能である。そのようなプライマー、プローブ、および他のフラグメントは、少なくとも15、たとえば、少なくとも20、たとえば、少なくとも25、30、もしくは40ヌクレオチド長であろう。それらはまた、本明細書中で用いられるポリヌクレオチドという用語に包含される。フラグメントは、500、200、100、50、もしくは20ヌクレオチド長未満でありうる。
【０２６１】
ポリヌクレオチド、たとえば、DNAポリヌクレオチドおよびDNAプローブは、組換えにより、合成により、または当業者の利用可能な任意の手段により、生成可能である。それらはまた、標準的技術によりクローニング可能である。
【０２６２】
一般的には、プライマーは、1回に1個のヌクレオチドを用いた所望の核酸配列のステップワイズ製造を含む合成手段により生成されるであろう。自動化技術を用いてこれを達成するための技術は、当技術分野で容易に利用可能である。
【０２６３】
より長いポリヌクレオチドは、一般的には、組換え手段を用いて、たとえば、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて生成されるであろう。これは、クリーニングされることが望まれる配列の領域にフランキングする1対のプライマー（たとえば、約15〜30ヌクレオチドのプライマー）を作製することと、動物細胞またはヒト細胞から得られたmRNAまたはcDNAにプライマーを接触させることと、所望の領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行うことと、増幅されたフラグメントを単離することと（たとえば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することにより）、増幅されたDNAを回収することと、を含むであろう。増幅されたDNAを好適なクローニングベクター中にクローニングできるように、好適な制限酵素認識部位を含有するプライマーをデザインすることが可能である。
【０２６４】
PRLポリペプチドおよびPRL核酸
PRL-1ポリペプチドおよびPRL-3ポリペプチドの相同体、変異体、誘導体、およびフラグメントは、以上の段落に示されたのと同様に定義可能である。
【０２６５】
文脈上許容される場合、PRL-1ポリペプチドへの参照は、PRL-1ポリペプチドの相同体、変異体、誘導体、またはフラグメントへの参照を含むとみなされるものとする。同様に、PRL-3ポリペプチドへの参照は、PRL-3ポリペプチドの相同体、変異体、誘導体、またはフラグメントへの参照を含むとみなされるものとする。
【０２６６】
同様に文脈上許容される場合、PRL-1核酸への参照は、PRL-1核酸の相同体、変異体、誘導体、またはフラグメントへの参照を含むとみなされるものとする。同様に、PRL-3ポリペプチドへの参照は、PRL-3核酸の相同体、変異体、誘導体、またはフラグメントへの参照を含むとみなされるものとする。
【０２６７】
抗PRL抗体の生成
抗PRL抗体は、当業者に周知の組換えDNA法または合成ペプチド化学法により生成可能である。
【０２６８】
例として、抗PRL抗体は、"Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach" E. Atherton and R. C. Sheppard, IRL Press, Oxford Englandに例示されるように、当技術分野で周知の技術により合成可能である。同様に、複数のフラグメントを合成し、続いて、これらを連結一体化させることにより、より大きいフラグメントを形成することが可能である。in vitroおよびin vivoで活性を検査するために、特定の位置でアミノ酸置換を行って、これらの合成ペプチドフラグメントを作製することも可能である。
【０２６９】
抗PRL抗体は、標準的微量化学設備で合成可能であり、かつHPLCおよび質量分光測光を用いて純度検査可能である。ペプチド合成、HPLC精製、および質量分光測光の方法は、当業者に周知である。
【０２７０】
抗PRL抗体はまた、本明細書中に記載のDNA配列（たとえば可変配列）またはその対立遺伝子変異体が組み込まれたかつ癌関連疾患の予防および／または治療で使用可能な形質転換宿主細胞内でin vitroおよびin vivoの条件下で発現させることが可能である。
【０２７１】
「ベクター」という用語は、発現ベクターおよび形質転換ベクターを含む。「発現ベクター」という用語は、in vivoもしくはin vitroで発現可能な構築物を意味する。「形質転換ベクター」という用語は、一方の種から他方の種に移行可能な構築物を意味する。
【０２７２】
発現に使用可能なベクターとしては、組換えウイルスベクター、特定的には、組換えレトロウイルスベクター（RRV）、たとえば、レトロウイルスベクターの組合せを含めて、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターが挙げられる。
【０２７３】
「組換えレトロウイルスベクター」（RRV）という用語は、標的細胞に感染可能なウイルス粒子中にパッケージング成分の存在下でRNAゲノムをパッケージングできるようにするのに十分なレトロウイルス遺伝子情報を有するベクターを意味する。標的細胞への感染は、逆転写および標的細胞ゲノム中への組込みを含む。RRVは、ベクターにより標的細胞に送達される非ウイルスコード配列を保有する。RRVは、最終標的細胞内で非依存的複製により感染性レトロウイルス粒子を産生することはできない。通常、RRVは、機能性gag polおよび／またはenv遺伝子および／または複製に不可欠な他の遺伝子を欠失している。使用可能なベクターとしては、組換えポックスウイルスベクター、たとえば、鶏痘ウイルス（FPV）、エントモポックスウイルス、ワクシニアウイルス、たとえば、NYVAC、カナリア痘ウイルス、MVA、または他の非複製ウイルスベクター系、たとえば、国際公開第9530018号パンフレットに記載のものが挙げられる。
【０２７４】
組換え遺伝子発現のためにおよび二重免疫治療法で組換え生ワクチンとして使用するために、ポックスウイルスを工学的に操作することが可能である。送達媒体および／またはベクターワクチン候補としてのウイルスのような弱毒化生ウイルスを使用することの主要な論理的根拠は、細胞媒介性免疫応答を誘発するそれらの能力に基づく。以上に概説したようなウイルスベクターは、免疫応答を促進することにより、抗PRL抗体をコードするヌクレオチド配列のような対象のヌクレオチド配列（NOI）に、より高い免疫原性を付与するアジュバントとして作用する、送達媒体としておよび構成タンパク質に免疫原性があるのでベクターワクチン候補として利用可能である。
【０２７５】
ポックスウイルスワクチン接種戦略では、ポックスウイルスのゲノム中にNOIを導入するために組換え技術が使用されてきた。ウイルスの生活環に不可欠ではないウイルスDNA中の部位にNOIを組み込んだ場合、新たに生成された組換えポックスウイルスは、感染性でありうる。すなわち、外来細胞に感染させることにより、組み込まれたNOIを発現させることが可能である。このようにして作製された組換えポックスウイルスは、病的および感染性の疾患および／または癌を予防および／または治療するための生ワクチンとして使用可能である。
【０２７６】
ポックスウイルスベクター送達系に必要な他の要件としては、良好な免疫原性および安全性が挙げられる。MVAは、良好な安全性記録を有する複製障害ワクシニア株である。ほとんどの細胞タイプおよび正常ヒト組織では、MVAは複製されない。MVAの限られた複製は、BHK21細胞のような少数の形質転換細胞タイプで観察される。Carroll et al (1997 Vaccine15 : 387-394)では、防御CD8+T細胞応答の生成に関して組換えMVAが従来の組換えワクシニアベクターと同等に良好でありかつより一般的に使用される複製適格ワクシニアウイルスの有効な代替手段であることが示された。MVAに由来するワクシニアウイルス株またはMVAをワクチンで使用するのにとくに好適になるようにするMVAの特徴をもたせて独立して開発された株もまた、送達媒体として使用するのに好適である。
【０２７７】
発現が望まれる対象のヌクレオチド配列は、転写ユニットに機能しうる形で連結可能である。本明細書中に記載の「転写ユニット」という用語は、コード配列と、そのコード配列の発現を他のいかなるコード配列とも独立して達成するためのシグナルと、を含有する核酸の領域である。したがって、各転写ユニットは、一般的には、少なくとも1種のプロモーターとオプションのエンハンサーとポリアデニル化シグナルとを含む。「プロモーター」という用語は、当該技術の通常の意味で用いられ、たとえば、RNAポリメラーゼ結合部位である。プロモーターは、エンハンサーエレメントを含有しうる。「エンハンサー」という用語は、転写開始複合体の他のタンパク質成分に結合してその関連プロモーターにより指令される転写の開始を促進するDNA配列を含む。「細胞」という用語は、任意の好適な生物体を含む。細胞は、ヒト細胞のような哺乳動物細胞を含みうる。
【０２７８】
「形質転換細胞」という用語は、修飾型遺伝子構造を有する細胞を意味する。たとえば、本明細書中に記載されるように、発現ベクターのようなベクターが細胞内に導入されている場合、細胞は、修飾型遺伝子構造を有する。「生物体」という用語は、任意の好適な生物体を含む。生物体は、ヒトのような哺乳動物を含みうる。
【０２７９】
ここで、「トランスジェニック生物」という用語は、修飾型遺伝子構造を含む生物体を意味する。たとえば、発現ベクターのようなベクターが生物体内に導入されている場合、生物体は、修飾型遺伝子構造を有しうる。
【０２８０】
抗体発現
本発明者らはさらに、本文書中に記載の1種もしくは複数種のヌクレオチド配列、たとえば、269、223、もしくは318の可変領域、抗体配列、またはヒト化抗体配列を用いて宿主細胞を形質転換することを含む方法を記述する。
【０２８１】
本発明者らはまた、形質転換宿主細胞（この細胞は、1種もしくは複数種のそのようなヌクレオチド配列を用いて形質転換されたものである）を該ヌクレオチド配列によりコードされる抗PRL抗体の発現に好適な条件下で培養することを含む方法を提供する。
【０２８２】
本発明者らはさらに、形質転換宿主細胞（この細胞は、1種もしくは複数種のそのようなヌクレオチド配列を用いて形質転換されたものである）を該ヌクレオチド配列によりコードされる抗PRL抗体の発現に好適な条件下で培養することと、次に、形質転換宿主細胞培養物から該抗PRL抗体を回収することと、を含む方法を提供する。
【０２８３】
したがって、抗PRL抗体をコードするヌクレオチド配列、その融合タンパク質もしくは機能的等価体を用いて、適切な宿主細胞内でその発現を指令する組換えDNA分子を生成することが可能である。
【０２８４】
例として、組換えE. coli発現系、組換え酵母発現系、または組換え哺乳動物発現系で抗PRL抗体を産生し、そしてカラムクロマトグラフィーで精製することが可能である。
【０２８５】
特定の状況下では、全長抗体ではなく抗体フラグメントを使用することが有利である。フラグメントのサイズはより小さいので、迅速なクリアランスが可能になり、腫瘍対非腫瘍比の改善につながりうる。Fab、Fv、ScFv抗体フラグメントはすべて、E. coliでの発現およびE. coliからの分泌が可能であるので、そのようなフラグメントを多量に産生することが可能である。
【０２８６】
抗PRL抗体をコードするヌクレオチド配列は、好適な宿主細胞内で抗PRL抗体コードヌクレオチド配列の発現を指令しうるプロモーター配列に機能しうる形で連結可能である。宿主細胞内に挿入した場合、十分なレベルの抗PRL抗体が得られるまで好適な条件下で形質転換宿主細胞を培養することが可能であり、その後、細胞を溶解させることが可能であり、そして抗PRL抗体が単離される。
【０２８７】
抗PRL抗体コードヌクレオチド配列を用いて形質転換された宿主細胞は、抗PRL抗体の発現および細胞培養物からの回収に好適な条件下で培養可能である。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して、分泌されうるかまたは細胞内に含有されうる。当業者であればわかるであろうが、〜を含有する発現ベクター。
【０２８８】
抗PRL抗体コードヌクレオチド配列は、特定の原核細胞膜または真核細胞膜を介する抗PRL抗体コードヌクレオチド配列の分泌を指令するシグナル配列と共にデザイン可能である。他の組換え構築物では、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に抗PRL抗体コードヌクレオチド配列を連結することが可能である（Kroll DJ et al(1993) DNA Cell Biol 12:441- 5 3'、融合タンパク質を含有するベクターに関する以下の考察も参照されたい）。
【０２８９】
抗PRL抗体はまた、タンパク質精製を容易にするために追加された1つ以上の追加ポリペプチドドメインを有する組換えタンパク質として発現させることも可能である。そのような精製を容易にするドメインとしては、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン-トリプトファンモジュールのような金属キレート形成ペプチド（Porath J (1992) Protein Expr Purif 3-26328 1）、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインAドメイン、およびFLAGS伸長／アフィニティー精製システム（Immunex Corp, Seattle, WA）で利用されるドメインが挙げられるが、これらに限定されるものではない。精製を容易にするために、精製ドメインと抗PRL抗体との間に第XA因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）のような切断可能リンカー配列を組み込むことが有用である。
【０２９０】
本明細書中に記載のヌクレオチド配列は、さまざまな理由で抗PRL抗体コード配列に変更を加えるために、たとえば、限定されるものではないが、クローニング、プロセシング、および／または遺伝子産物の発現を改変する変更を加えるために、工学的に操作することが可能である。たとえば、部位限定突然変異誘発などのような当技術分野で周知の技術を用いて突然変異を導入することにより、新しい制限部位を挿入したり、グリコシル化パターンを変化させたり、またはコドン優先性を変化させたりすることが可能である。
【０２９１】
他の実施形態では、1種もしくは複数種の天然型、修飾型、もしくは組換え型の抗PRL抗体コードヌクレオチド配列を異種配列に連結させて融合タンパク質をコードするようにすることが可能である。例として、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、ビオチン、His6、ac-mycタグ（Emrich etal 1993 BiocemBiophys Res Commun 197(1): 21220を参照されたい）、赤血球凝集素（HA）（Wilson et al (1984 Cell 37 767に記載）、またはFLAGエピトープ（Ford etal 1991 Protein Expr Purif Apr; 2 (2):95-107）のようなアフィニティータグに連結された抗PRL抗体またはその酵素活性フラグメントもしくは誘導体を含む融合タンパク質を産生することが可能である。
【０２９２】
融合組換えタンパク質は、抗原性共タンパク質、たとえば、GST、β-ガラクトシダーゼ、または比較的大きい共タンパク質であるHaemophillls influenzae由来のリポプロテインDを含むことが可能であり、それらは、可溶化させたりその産生および精製を容易にしたりする。他の選択肢として、融合タンパク質は、担体タンパク質、たとえば、ウシ血清アルブミン（BSA）またはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）を含みうる。特定の実施形態では、マーカー配列は、ヘキサヒスチジンペプチドを含みうる。これは、pQEベクター（Qiagen Inc）の形態で提供され、Gentz et al (1989 PNAS 86: 821-824)に記載されている。そのような融合タンパク質は、酵母培養物中で容易に発現可能であり（Mitchell et al 1993 Yeast 5:715-723に記載）、アフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製可能である。また、抗PRL抗体をコードするヌクレオチド配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含有するように融合タンパク質を工学的に操作することも可能であるり、その結果、抗PRL抗体を異種部分から切り離して精製することが可能になる。他の実施形態では、結合された融合タンパク質全体を用いて標的タンパク質のアッセイを行うことが可能である。他の選択肢として、免疫系の全体的刺激を提供するという意味で、共タンパク質をアジュバントとして作用させることが可能である。共タンパク質は、第1のタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに結合可能である。
【０２９３】
マーカー遺伝子発現の存在／不在により抗PRL抗体に対するヌクレオチド配列もまた存在することが示唆されるが、その存在および発現を確認することが望ましい。たとえば、抗PRL抗体コードヌクレオチド配列をマーカー遺伝子配列内に挿入した場合、抗PRL抗体コード領域を含有する組換え細胞をマーカー遺伝子機能の不在により同定することが可能である。他の選択肢として、単一のプロモーターの制御下にマーカー遺伝子を抗PRL抗体コードヌクレオチド配列とタンデムに配置することが可能である。
【０２９４】
誘導または選択に応答するマーカー遺伝子の発現は、通常、抗PRL抗体の発現の指標にもなる。
【０２９５】
特定の分子の発現を定量する追加の方法としては、ヌクレオチドの放射能標識（Melby PC etal 1993 J Immunol Methods 159:235-44）またはビオチン化（Duplaa C et al 1993 Anal Biochem229-36）、対照核酸の共増幅、および実験結果を補間する標準曲線が挙げられる。
【０２９６】
ELISA方式でアッセイを行うことにより、複数のサンプルの定量を迅速化することが可能である。この場合、対象の抗PRL抗体は、種々の希釈度で提供され、分光測光応答または熱量測定応答は、迅速な定量を提供する。
【０２９７】
作製可能または使用可能な変更された抗PRL抗体ヌクレオチド配列は、同一もしくは機能的に等価な抗PRL抗体をコードするヌクレオチド配列をもたらすさまざまなヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換を含む。例として、発現された抗PRL抗体もまた、サイレント変化を引き起こして機能的に等価な抗PRL抗体を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を有しうる。抗PRL抗体の結合親和性が保持されるかぎり、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行うことが可能である。たとえば、負荷電アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正荷電アミノ酸としては、リシンおよびアルギニンが挙げられ、類似の親水性値を有する非荷電極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。
【０２９８】
本明細書中に記載の抗PRL抗体コードヌクレオチド配列がin vivoでレギュレートされる遺伝子療法を利用することも可能である。たとえば、抗PRL抗体コードヌクレオチド配列、抗PRL抗体コードヌクレオチド配列に関連付けられた制御領域、またはその対応するRNA転写産物に結合する化合物を投与して転写または翻訳の速度を調整することにより、発現レギュレーションを達成することが可能である。
【０２９９】
例として、本明細書中に記載の抗PRL抗体コードヌクレオチド配列は、発現調節エレメント、通常、プロモーターまたはプロモーター＋エンハンサーの発現制御下に存在可能である。抗PRL抗体コードヌクレオチド配列が、好ましくは、対象の特定の組織で、たとえば、腫瘍細胞または腫瘍塊の環境で発現されるように、エンハンサーおよび／またはプロモーターは、好ましくは、低酸素環境、虚血環境、または低グルコース環境で活性でありうる。したがって、治療される個体に及ぼす抗PRL抗体コードヌクレオチド配列のいかなる有意な生物学的作用または有害作用をも低減または排除することが可能である。レギュレートされた発現を与えるエンハンサーエレメントまたは他のエレメントは、多重コピーの形態で存在可能である。
【０３００】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、構成的に効率的でありうるか、または活性が組織限定的もしくは時間限定的でありうる。好適な組織限定的プロモーター／エンハンサーの例は、腫瘍細胞で高活性なもの、たとえば、MUC1遺伝子、CEA遺伝子、またはSTV抗原遺伝子に由来するプロモーター／エンハンサーである。時間限定的プロモーター／エンハンサーの例は、虚血および／または低酸素に応答するもの、たとえば、低酸素応答エレメントまたはagrp78もしくはagrp94遺伝子のプロモーター／エンハンサーである。αフェトプロテイン（AFP）プロモーターもまた腫瘍特異的プロモーターである。他のプロモーター-エンハンサーの組合せは、ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）主要前初期（MIE）プロモーター／エンハンサーの組合せである。
【０３０１】
プロモーターは組織特異的でありうる。すなわち、一方の組織では抗PRL抗体コードヌクレオチド配列の転写を駆動可能でありうるが、他方の組織タイプでは「サイレント」の状態を保持可能でありうる。
【０３０２】
「組織特異的」という用語は、活性が単一の組織タイプに限定されないにもかかわらず一方のグループの組織では活性でありかつ他方のグループではそれほど活性でないかもしくはサイレントであるような選択性を示すプロモーターを意味する。そのようなプロモーターの望ましい特徴は、低酸素によりレギュレートされる活性化されたエンハンサーエレメントの不在下で標的組織においてさえも比較的低い活性を有することである。これを達成する一手段は、選択されたプロモーターの活性を低酸素の不在下で抑制する「サイレンサー」エレメントを使用することである。
【０３０３】
「低酸素」という用語は、特定の器官または組織が酸素の不十分な供給を受ける条件を意味する。
【０３０４】
特定のプロモーターの制御下における1種もしくは複数種の抗PRL抗体コードヌクレオチド配列の発現のレベルは、プロモーター領域を操作することによりモジュレート可能である。たとえば、プロモーター領域内の異なるドメインは、異なる遺伝子調節活性を有しうる。これらの異なる領域の役割は、典型的には、特異的領域を欠失させたプロモーターの異なる変異体を有するベクター構築物を用いて評価される（すなわち、欠失分析）。この手法は、たとえば、組織特異性を付与しうる最小領域または低酸素感受性を付与する最小領域を同定するために使用可能である。
【０３０５】
以上に記載のいくつかの組織特異的プロモーターを使用することが可能である。ほとんどの場合、選択されたベクター中にクローニングするのに好適な制限消化フラグメントとしてこれらのプロモーターを単離することが可能である。他の選択肢として、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてプロモーターフラグメントを単離することが可能である。プライマーの5'末端に制限部位を組み込むことにより、増幅されたフラグメントのクローニングを容易にすることが可能である。
【０３０６】
組合せ療法
本明細書中に記載の抗PRL抗体は、疾患の治療のための他の組成物および手順と組み合わせて使用することが可能である。
【０３０７】
例として、癌のような疾患の従来の治療と組み合わせて、抗PRL抗体を使用することも可能である。たとえば、手術、放射線、もしくは化学療法を抗PRL抗体と組み合わて従来方式で腫瘍を治療することが可能であるか、または抗PRL抗体を後続的に患者に投与して微小転移の休止を延長させたり任意の残留する原発性腫瘍を安定化させたりすることが可能である。
【０３０８】
抗PRL抗体は、同一時点でかつ同一部位で治療上有効な作用剤と共に送達可能である。他の選択肢として、異なる時点でかつ異なる部位に抗PRL抗体および治療上有効な作用剤を送達することが可能である。癌の予防および／または治療のために、抗PRL抗体および治療上有効な作用剤を同一の送達媒体で送達することが可能である。
【０３０９】
抗PRL抗体は、血管新生および／または癌の予防および／または治療のための細胞傷害剤と組み合わせて使用することが可能である。抗PRL抗体、抗PRL抗体抗血清、抗PRL抗体レセプターアゴニスト、および抗PRL抗体アンタゴニストに連結されたリシンのような細胞傷害剤は、PRL-1またはPRL-3を発現する細胞を破壊するための手段を提供する。こうした細胞は、微小転移および原発性腫瘍（ただし、これらに限定されるものではない）を含む多くの位置に見いだされうる。
【０３１０】
抗PRL抗体は、遺伝子療法でプロドラッグ活性化酵素と組み合わせて使用することが可能である。標的組織で選択的に発現させる代わりにまたはそれに加えて、抗PRL抗体は、他の分子、たとえば、1種もしくは複数種の酵素が作用する1種以上のプロドラッグで個体が治療されるまで有意な作用または有害な作用をもたない1種もしくは複数種のプロドラッグ活性化酵素と組み合わせて使用することが可能である。プロドラッグ活性化酵素の存在下では、適切なプロドラッグで個体の積極的治療を行うと、腫瘍の増殖または生存が大きく低減される。
【０３１１】
プロドラッグ活性化酵素は、癌の治療のために腫瘍部位に送達可能である。いずれの場合も、好適なプロドラッグが、適切なプロドラッグ活性化酵素と組み合わせて患者の治療に使用される。適切なプロドラッグは、ベクターと併用して投与される。プロドラッグの例としては、リン酸エトポシド（アルカリホスファターゼと併用、Senter et al 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 48424846）、5-フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼと併用、Mullen et al 1994 Cancer Res 54: 1503-1506）、ドキソルビシン-N-p-ヒドロキシフェノキシアセトアミド（ペニシリン-V-アミダーゼと併用、Kerr et al 1990 Cancer Immunol Immunother 31: 202-206）、パラ-N-ビス(2-クロロエチル)アミノベンゾイルグルタメート（カルボキシペプチダーゼG2と併用）、セファロスポリンナイトロジェンマスタードカルバメート（β-ラクタマーゼと併用）、SR4233（P450レダクターゼと併用）、ガンシクロビル（HSVチミジンキナーゼと併用、Borrelli et al 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 7572-7576）、ニトロレダクターゼと併用されるマスタードプロドラッグ（Friedlos el al 1997 J Med Chem 40: 1270-1275）、およびシクロホスファミド（P450と併用、Chen et a/ 1996 Cancer Res 56: 1331-1340）が挙げられる。
【０３１２】
プロドラッグ活性化酵素の例としては、5-フルオロ-ウラシルプロドラッグであるカペシタビン（capcetabine）およびフルツロンを活性化するチミジンホスホリラーゼ、ガンシクロビルを活性化する単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ、シクロホスファミドのようなプロドラッグをDNA損傷剤に活性化するシトクロムP450、および5-フルオロシトシンを活性化するシトシンデアミナーゼが挙げられる。ヒト起源の酵素を使用することが可能である。
【０３１３】
他の好適な分子としては、治療用途および／または診断用途に用いられるもの、たとえば、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、工学的に操作された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、酵素、免疫共刺激分子、免疫調節分子、アンチセンスRNA、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブ突然変異体、トキシン、条件トキシン、抗原、腫瘍サプレッサータンパク質および腫瘍増殖因子、膜タンパク質、血管作動性のタンパク質およびペプチド、抗ウイルス性のタンパク質およびリボザイム、ならびにそれらの誘導体（たとえば関連レポーター基を有するもの）をコードする配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。含まれる場合、そのようなコード配列は、典型的には、好適なプロモーターに作動的に連結可能であり、このプロモーターは、リボザイムの発現を駆動するプロモーターでありうるか、または1種以上の特異的細胞タイプなどにみられるような異なる1種もしくは複数種のプロモーターでありうる。
【０３１４】
分子は、細胞から分泌されるタンパク質でありうる。他の選択肢として、分子は、分泌されずかつ細胞内で活性である。いずれにしても、分子は、バイスタンダーエフェクター効果または遠位バイスタンダー効果を呈しうる。すなわち、ある細胞内で発現産物が産生されることにより、近位もしくは遠位のいずれかの追加の関連細胞（たとえば転移細胞）の死滅が引き起こされる。これは、共通の表現型を有する。
【０３１５】
癌の治療または予防に使用するのに好適な分子としては、標的細胞を破壊するか（たとえばリボソームトキシン）、腫瘍サプレッサーとして作用するか（たとえば野生型p53）、抗腫瘍免疫機序のアクチベーターとして作用するか（たとえば、サイトカイン、共刺激分子、および免疫グロブリン）、血管新生の阻害剤として作用するか、薬剤感受性の増大を提供するか（たとえばプロドラッグ活性化酵素）、天然のエフェクター細胞による標的細胞の破壊を間接的に刺激するか（たとえば、免疫系を刺激する強力な抗原）、または標的細胞を破壊する有毒物質に前駆体物質を変換する（たとえばプロドラッグ活性化酵素）、タンパク質（またはタンパク質をコードする核酸）が挙げられる。コードタンパク質はまた、バイスタンダー腫瘍細胞を破壊しうるか（たとえば、分泌される抗腫瘍抗体-リボソームトキシン融合タンパク質を用いて）、バイスタンダー腫瘍細胞の破壊を間接的に刺激しうるか（たとえば、免疫系を刺激するサイトカインもしくは局所血管閉塞を引き起こす凝固促進タンパク質）、またはバイスタンダー腫瘍細胞を破壊する有毒物質に前駆体物質を変換しうる（たとえば、プロドラッグを拡散性薬剤に活性化する酵素）。
【０３１６】
腫瘍残存性に関する細胞遺伝子の発現を妨害するアンチセンス転写産物またはリボザイム（たとえば、Burkittsリンパ腫の異常myc転写産物または慢性骨髄性白血病のbcr-abl転写産物に対して）を送達して抗PRL抗体の癌細胞死滅機能または癌転移予防機能を増強することが可能である。そのような分子の組合せの使用もまた想定される。
【０３１７】
低酸素によりレギュレート可能な治療用分子の例は、PCT/GB95/00322（WO-A-9521927）に見いだしうる。
【０３１８】
抗PRL抗体コンジュゲート
PRL-1抗原またはPRL-3抗原を発現する細胞に本明細書中に記載の抗PRL抗体をターゲッティングするようにすれば、PRL-1またはPRL-3を発現する細胞の活性をモジュレートする薬剤の開発が容易になる。
【０３１９】
抗PRL抗体に結合する細胞の標的化死滅のために抗PRL抗体を細胞傷害剤に連結すること（ただし、これに限定されるものではない）をはじめとするいくつかの適用で使用するために、さまざまな抗PRL抗体を合成することが可能である。
【０３２０】
標準的な方法を用いて、本明細書中に記載の抗PRL抗体を他の分子にカップリングすることが可能である。多くの技術を用いて抗PRL抗体のアミノ末端およびカルボキシル末端を同位体標識または非同位体標識することが可能である。たとえば、従来技術を用いて放射性標識することが可能である（チロシン残基−クロラミンT、ヨードゲン、ラクトペルオキシダーゼ；リシン残基−Bolton-Hunter試薬）。これらカップリング技術は、当業者に周知である。カップリング技術は、アミノ酸上の利用可能な官能基、たとえば、限定されるものではないが、アミノ、スルフヒドラール、カルボキシル、アミド、フェノール、およびイミダゾールに基づいて選択される。これらのカップリングを行うために使用される種々の試薬としては、とくに、グルタルアルデヒド、ジアゾ化ベンジジン、カルボジイミド、およびp-ベンゾキノンが挙げられる。
【０３２１】
抗PRL抗体は、同位体、酵素、担体タンパク質、細胞傷害剤、蛍光分子、およびさまざまな用途に合った他の化合物に化学的にカップリングさせることが可能である。カップリング反応の効率は、特異的反応に適合するさまざまな技術を用いて決定される。たとえば、125IによるPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドの放射性標識化は、クロラミンTおよび高い比活性のNa125Iを用いて達成される。メタ重亜硫酸ナトリウムを用いて反応を停止させ、使い捨てカラムを用いて混合物を脱塩する。カラムから標識化抗体を溶出させ、画分を捕集する。各画分からアリコートを取り出し、ガンマカウンターで放射能を測定する。この方式では、未反応Na125Iは、標識されたPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドから分離される。後で使用するために、たとえば、抗PRL抗体に結合する能力を分析するために、最も高い比放射能を有するペプチド画分を貯蔵する。
【０３２２】
抗PRL抗体結合部位を有する腫瘍の位置決定を行うために、短寿命同位体で標識された抗PRL抗体を使用することにより、オートラジオグラフィー技術、最新ラジオグラフィー技術、または他の膜結合技術、たとえば、陽電子放射断層撮影法を用いて、in vivoでPRL-1結合部位またはPRL-3結合部位の可視化定量を行うをことが可能である。本出願は、重要な診断手段および研究手段を提供する。
【０３２３】
他の実施形態では、抗PRL抗体は、シンチグラフィー放射性標識、細胞傷害性化合物、もしくは放射性同位体、非毒性プロドラッグを細胞傷害薬剤に変換するための酵素、得られるコンジュゲートを結腸腫瘍にターゲッティングすべく免疫系を活性化するための化合物、または細胞刺激化合物にカップリングさせることが可能である。そのようなコンジュゲートは、抗PRL抗体よりなる「結合部分」と、放射性標識、トキシン、または酵素よりなる「機能部分」と、を有する。
【０３２４】
抗体は、他の選択肢として、特定的には他の化合物の結合を物理的に妨害することによりPRL-1抗原またはPRL-3抗原の活性を単にブロックするために単独で使用することが可能である。
【０３２５】
コンジュゲートの結合部分および機能部分（ただしペプチドまたはポリペプチドの場合）は、ポリペプチドを架橋する従来の方法のいずれかにより、たとえば、O'Sullivan et af (Anal. Biochem 1979: 100, 100-108)に概説されている方法により、連結一体化させることが可能である。たとえば、一方の部分は、チオール基で富化することが可能であり、他方の部分は、そのチオール基と反応しうる二官能性作用剤、たとえば、ヨード酢酸（NHIA）のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）と反応させることが可能である。たとえば、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて得られるアミド結合およびチオエーテル結合は、一般的には、ジスルフィド結合よりもin vivoで安定である。
【０３２６】
他の選択肢として、抗体またはいくつかの抗体フラグメントの場合に見られるように、結合部分が炭水化物を含有する場合、機能部分は、欧州特許第0 088 695号明細書中の連結技術を用いて炭水化物部分を介して連結させることが可能である。
【０３２７】
コンジュゲートの機能部分は、非毒性プロドラッグを毒性薬剤に変換するための酵素、たとえば、Bagshaweおよび彼の同僚のコンジュゲート（Bagshawe (1987) Br. 1. Cancer 56, 531; Bagshawe et af (Br. 1. Cancer 1988: 58, 700); 国際公開第88/07378号パンフレット）またはシアニド放出系（国際公開第91/11201号パンフレット）でありうる。
【０３２８】
抗PRL抗体コンジュゲートの機能部分は、抗PRL抗体コンジュゲートを診断に使用する場合、シンチグラフィー試験のための放射性原子、たとえば、テクネチウム99m（99mTc）もしくはヨウ素-123（123I）、または核磁気共鳴（nmr）イメージング（磁気共鳴イメージングmriとしても知られる）のためのスピン標識、たとえば、この場合もヨウ素-123、ヨウ素-313、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄を含みうるかまたはそれらよりなりうる。
【０３２９】
腫瘍の選択的破壊のための化合物の形態で使用する場合、抗PRL抗体の機能部分は、隣接細胞を破壊するのに十分なエネルギーを放出する高放射性原子、たとえば、ヨウ素-131、レニウム-186、レニウム-188、イットリウム-90、もしくは鉛-212、または細胞傷害性化学化合物、たとえば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ダウノルビシン、もしくは他のインターカレート剤を含みうる。
【０３３０】
放射性標識または他の標識は、公知の方法で抗PRL抗体コンジュゲート中に組込み可能である。たとえば、ペプチドは、生合成可能であるか、またはたとえば水素の代わりにフッ素-19を含む好適なアミノ酸前駆体を用いて化学的アミノ酸合成により合成可能である。99mTc、123I、186Rh、188Rh、および111Inのような標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-90は、リシン残基を介して結合可能である。IODOGEN法（Fraker et af (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57）を用いてヨウ素-123を組み込むことが可能である。"Monoclonal Antibodies in Immunoscinigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)には、他の方法が詳細に記載されている。
【０３３１】
酵素全体をコンジュゲート中に存在させる必要がないこともあろうが、当然ながら、触媒部分は存在しなければならない。いわゆる「アブザイム」を使用することが可能であり、この場合、抗PRL抗体は、触媒することが望まれる反応に関与する化合物（通常は反応中間体状態）に対して産生される。次に、得られた抗体は、反応に対して酵素として機能することが可能である。
【０３３２】
コンジュゲートは、サイズ排除クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーにより精製可能であり、両方の生物活性に関して検査可能である。抗原免疫反応性は、固定化抗原と共に酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いておよび生細胞ラジオイムノアッセイで測定可能である。グルコース残基が加水分解されたときに吸光度が変化する基質、たとえば、405nmで分光光度法により測定される2-ニトロフェノールを遊離するoNPG（o-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド）を用いるβ-グルコシダーゼに対する酵素アッセイを使用することが可能である。
【０３３３】
コンジュゲートの安定性は、最初に血清中37℃でインキュベートし、続いてサイズ排除FPLC分析を行うことにより、in vitroで検査可能である。in vivoでの安定性は、コンジュゲートの注射後の種々の時点で血清を分析することにより、マウスで同様に検査可能である。それに加えて、コンジュゲーションの前に抗PRL抗体を125Iでかつ酵素を131Iで放射性標識し、そして動物たとえばマウスにおいてコンジュゲート、遊離抗PRL抗体、および遊離酵素の生体内分布を決定することが可能である。
【０３３４】
他の選択肢として、組換えDNA技術によりコンジュゲートを融合化合物として産生することが可能である。この場合、DNAの長さは、コンジュゲートの2つの部分をコードするそれぞれの領域を互いに隣接させてまたはコンジュゲートの所望の性質を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により分離させて含む。
【０３３５】
考えられることとして、化合物の機能部分のうちの2つを全体的もしくは部分的にオーバーラップさせることが可能である。次に、DNAを公知の方法で好適な宿主内で発現させる。
【０３３６】
診断用キット
本発明者らはまた、生体液および組織でのPRL-1またはPRL-3の検出および測定ならびに組織内のPRL-1またはPRL-3の位置特定を行う診断方法と、それらを行うためのキットと、を開示する。
【０３３７】
抗PRL抗体はまた、PRL-1またはPRL-3に結合可能な抗体の検出および定量を行う診断方法およびそれらを行うためのキットで使用することも可能である。こうしたキットを用いることにより、特定の状況下ではin situでの原発性腫瘍による微小転移の広がりの指標となりうるPRL-1またはPRL-3の検出を行うことが可能である。そのような血流中の抗PRL-1抗体またはPRL-3抗体を有する患者は、腫瘍および癌を発症する可能性がより高く、治療後または寛解期後、癌の再発を起こす可能性がより高い。
【０３３８】
PRL-1またはPRL-3の測定のためのキットも利用可能であると考えられる。高い力価および特異性を有する抗PRL抗体を用いることにより、血漿、尿、組織の抽出物においておよび細胞培養培地においてPRL-1またはPRL-3の迅速で信頼性が高く感度がよく特異的である測定および位置特定を行うのためのキットの使用が容易になりうる。
【０３３９】
これらのアッセイキットは、次の技術、すなわち、競合アッセイおよび非競合アッセイ、ラジオイムノアッセイ、生物発光アッセイおよび化学発光アッセイ、蛍光測定アッセイ、サンドイッチアッセイ、イムノラジオメトリーアッセイ、ドットブロット、ELISAをはじめとする酵素結合アッセイ、マイクロタイタープレート、尿または血液の迅速モニタリングのための抗体被覆ストリップまたは抗体被覆ディップスティック、ならびに免疫細胞化学を含むが、これらに限定されるものではない。各キットごとに、アッセイの範囲、感度、精度、信頼性、特異性、および再現性が確定される。アッセイ内変動およびアッセイ間変動は、変位または活性の標準曲線上の20%、50%および80%の点で確定される。
【０３４０】
研究および臨床で一般に使用されるアッセイキットの一例は、ラジオイムノアッセイ（RIA）キットである。抗PRL抗体の満足すべき放射性ヨウ素化および精製の後、好適な緩衝系中に比較的一定した量の放射能たとえば10,000cpmを含有するチューブに、最も高い力価を有する抗血清をいくつかの希釈度で添加する。他のチューブは、非特異的結合を決定するために緩衝液または免疫前血清を含有する。4℃で24時間インキュベートした後、プロテインAを添加し、チューブをボルテックスし、室温で90分間インキュベートし、そして4℃で約2000〜2500×gで遠心分離して標識化抗PRL抗体に結合された抗血清の複合体を沈殿させる。吸引により上清を除去し、ペレット中の放射能をガンマカウンターで計数する。非特異的結合を引き算した後、標識化抗PRL抗体の約10〜40%に結合する抗血清希釈液をさらに特徴付ける。
【０３４１】
免疫組織化学キットはまた、組織および細胞におけるPRL-1またはPRL-3の位置特定に使用することも可能である。この免疫組織化学キットは、使用説明書、抗PRL抗体、および場合によりブロッキング血清、ならびにフルオレセインイソチオシアネートのような蛍光分子に連結された二次抗血清、または一次抗血清を視覚化するために使用されるなんらかの他の試薬を提供する。免疫組織化学技術は当業者に周知である。
【０３４２】
この免疫組織化学キットを用いることにより、光学顕微鏡法および電子顕微鏡法の両方を用いて組織切片および培養細胞においてPRL-1またはPRL-3の位置特定を行うことが可能である。研究目的および臨床目的の両方で使用される。たとえば、腫瘍の生検または採取を行い、そしてミクロトームを用いて組織切片をカットしてPRL-1またはPRL-3の産生の部位を調べる。そのような情報は、癌の検出および治療において診断目的および場合により治療目的に有用である。
【０３４３】
医薬組成物
抗PRL抗体は、癌関連疾患の治療に有効でありうる。
【０３４４】
本発明者らは、有効量の本明細書中に記載の抗PRL抗体を用いて癌関連疾患を治療する方法を開示する。抗PRL抗体は、当業者に公知の製剤化方法を用いて製薬上許容される組成物中の単離されたかつ実質的に精製されたタンパク質およびタンパク質フラグメントとして提供可能である。
【０３４５】
抗PRL抗体は、医薬組成物の形態で投与可能である。そのような医薬組成物は、好適な賦形剤、希釈剤、または担体と一緒に、治療上有効量の抗PRL抗体を含みうる。
【０３４６】
抗PRL抗体は、特定的には、たとえば、静脈などを介して患者に注射することにより、患者の血流中に導入可能である。
【０３４７】
非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤と、緩衝剤と、静菌剤と、製剤を対象のレシピエントの血液と等張になるようにする溶質と、を含有しうる水性および非水性の無菌注射溶液剤、および懸濁化剤と粘稠化剤とを含みうる水性および非水性の無菌サスペンジョン剤が挙げられる。製剤は、容器中、たとえば、密封されたアンプル中およびバイアル中にユニット用量またはマルチ用量で提供可能であり、使用直前に滅菌液体担体たとえば注射用水の添加だけを必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)条件下で貯蔵可能である。即時注射用の溶液剤およびサスペンジョン剤は、先に記載した種類の滅菌粉末剤、顆粒剤、および錠剤から調製可能である。
【０３４８】
これらの組成物は、標準的経路により投与可能である。こうした経路としては、経口、直腸内、経眼（硝子体内もしくは前房内を含む）、経鼻、局所（頬腔内および舌下を含む）、子宮内、経膣、または非経口（皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内、および硬膜外を含む）、経皮、腹腔内、頭蓋内、脳室内、脳内、膣内、子宮内、または非経口（たとえば、静脈内、脊髄内、皮下、もしくは筋肉内）の経路が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０３４９】
抗PRL抗体製剤は、適宜、ユニット投与製剤の形態で提供可能であり、従来の医薬技術により調製可能である。そのような技術は、活性成分と医薬担体（複数種可）または賦形剤（複数種可）とを一体化させる工程を含む。一般的には、製剤は、活性成分を液体担体もしくは微細化固体担体またはその両方と均一かつ十分に一体化させ、次に、必要であれば、生成物を造形することにより、調製される。
【０３５０】
それに加えて、抗PRL抗体を生分解性ポリマー中に組み込んで化合物を持続放出させることが可能であり、その場合、ポリマーは、薬剤送達が望まれる部位の近傍に、たとえば、腫瘍の部位に留置されるか、または抗PRL抗体が徐々に全身に放出されるように留置される。生分解性ポリマーおよびその使用については、たとえば、Brem et af (1. Neurosurg 1991 74:441-446)に詳細に記載されている。カニューレを介して、対象の部位に、たとえば、転移増殖物に直接的にまたは血管内供給してその腫瘍に、高濃度の抗PRL抗体の制御送達を提供するために、浸透圧ミニポンプを使用することも可能である。
【０３５１】
抗PRL抗体は、所望の位置への送達を最大化するようにデザインされた形で注入される細胞傷害剤に連結することが可能である。たとえば、リシンに連結された高親和性抗PRL抗体は、カニューレを介して血管内に導入して標的部位に供給するようにまたは直接的に標的に送達される。そのような作用剤はまた、注入カニューレに結合された浸透圧ポンプを介して制御下で送達される。
【０３５２】
好ましいユニット投与製剤は、先に本明細書中で述べたように、投与成分の一日用量もしくはユニット、一日サブ用量、またはその適切な部分用量を含有するものである。当然のことながら、以上に特記される成分に加えて、本明細書中に記載の製剤は、当該製剤タイプを考慮して当技術分野で慣用される他の作用剤を含みうる。
【０３５３】
抗PRL抗体コンジュゲートは、希釈剤および担体、たとえば、等張生理食塩水（静脈内に投与する場合）を含む標準的な滅菌非発熱製剤の形態で、任意の好適な方法により、通常は非経口的に、たとえば、静脈内または腹腔内に、投与可能である。抗PRL抗体コンジュゲートが標的細胞に結合されかつ（必要であれば）血流から排除された後（典型的には1日程度かかる）、プロドラッグを通常は単回注入用量で投与し、そして腫瘍を画像化する。抗PRL抗体コンジュゲートが免疫原性である可能性があるので、所要により、より長い治療期間を提供するために、シクロスポリンまたはなんらかの他の免疫抑制剤を投与することが可能であるが、通常、この必要はない。
【０３５４】
本明細書中に記載の抗PRL抗体の投与量は、治療される疾患状態または病態および他の臨床因子、たとえば、ヒトまたは動物の体重および健康状態、ならびに化合物の投与経路に依存するであろう。
【０３５５】
特定の動物またはヒトにおける抗PRL抗体の半減期に依存して、抗PRL抗体は、1日数回〜1週間に1回の範囲で投与可能である。当然のことながら、本明細書中に記載の方法および組成物は、ヒトおよび家畜の両方の使用目的で利用される。本明細書中に記載の方法は、同時にまたは長期間にわたり行われることを考慮して、単回投与または複数回投与で利用可能と考えられる。
【０３５６】
コンジュゲートの腫瘍組織／正常組織比（少なくとも静脈内送達後）は、約4〜6日後に最も高くなるが、この時点で腫瘍に結合されているコンジュゲートの絶対量は、1グラムあたりの注射された用量に対するパーセントでみた場合、より前の時点よりも低いので、抗PRL抗体コンジュゲートの投与とプロドラッグの投与とのタイミングを慣用的な方法で最適化することが可能である。
【０３５７】
したがって、抗PRL抗体コンジュゲートの投与とプロドラッグの投与との最適間隔は、酵素のピーク腫瘍内濃度と、腫瘍組織と正常組織との間の最良分布比と、の間に妥協点を有するであろう。抗PRL抗体コンジュゲートの投与量は、通常の判定基準に従って医師により選択されるであろう。少なくともβ-グルコシダーゼのような標的化酵素と毒性プロドラッグとして静脈内アミグダリンとを利用する方法の場合、体表面積1平方メートルあたり0.1〜10.0グラム、好ましくは1.0〜5.0g/m2の一日用量で1〜50回が適切であろう。経口療法の場合、1日3回で0.05〜10.0g、好ましくは1.0〜5.0g、1〜50日間が適切であろう。抗PRL抗体コンジュゲートの投与量は、同様に、通常の判定基準に従って、特定的には、腫瘍のタイプ、病期、および位置、ならびに患者の体重に基づいて、選択されるであろう。治療持続時間は、部分的には、抗PRL抗体コンジュゲートに対する任意の免疫反応の速度および範囲に依存するであろう。
【０３５８】
疾患
本明細書中に記載の抗PRL抗体は、たとえば医薬組成物の形態で、癌の治療に使用可能である。
【０３５９】
本文書の目的では、「癌」という用語は、次のうちのいずれか1つ以上を含みうる：急性リンパ性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、血液癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、女性生殖器系の癌、男性生殖器系の癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児横紋筋肉腫、小児期肉腫、慢性リンパ性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、結腸直腸癌、結腸癌、子宮内膜癌、子宮内膜肉腫、食道癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌、胃腸管癌、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、下咽頭癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、白血病、白血病、肝臓癌、肺癌、悪性繊維性組織球腫、悪性胸腺腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、鼻腔副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経系癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、原発性CNSリンパ腫、前立腺癌、直腸癌、呼吸器系、網膜芽細胞腫、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、胃癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、泌尿器系癌、子宮肉腫、腟癌、血管系、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍。
【０３６０】
本明細書中に記載の抗PRL抗体は、たとえば医薬組成物の形態で、癌関連障害の治療に使用可能である。
【０３６１】
そのような障害としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：固形腫瘍；血行性腫瘍、たとえば、白血病；腫瘍転移；良性腫瘍、たとえば、血管腫、聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；リウマチ様関節炎；乾癬；眼性血管新生疾患、たとえば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後繊維増殖症、ルベオーシス；オスラー・ウェバー症候群；心筋血管新生；プラーク血管新生；細血管拡張症；血友病関節；血管繊維腫；創傷肉芽形成；冠側副枝；脳側副枝；動静脈奇形；虚血性肢血管新生；血管新生緑内障；水晶体後繊維増殖症；糖尿病性血管新生；ヘリコバクター関連疾患、骨折、血管形成、造血、排卵、月経、および胎盤形成。
【実施例】
【０３６２】
（実施例１）
細胞系：CHO-K1、A2780、およびCT26
CHO-K1細胞、A2780ヒト卵巣癌細胞、およびCT26マウス結腸癌細胞をATCC（Manassas, VA）から購入する。
【０３６３】
（実施例２）
EGFP-PRL-3またはEGFP-PRL-1を安定に発現するCHO細胞プールの生成
EGFP-PRL-3またはEGFP-PRL-1を安定に発現するCHO細胞プールを以前の研究に記載されるように生成する8。簡潔に述べると、10%ウシ胎仔血清が追加されたRPMI 1640培地中で細胞を培養し、そして1mg/ml G418中で20〜30日間かけて選択する。次に、細胞（106細胞/ml）をFACS Vantage、SEモード（Becton Dickinson）によるEGFP分取に付し、そして培養下で再増殖させて安定な細胞プールを樹立する。
【０３６４】
（実施例３）
EGFP-PRL-3を安定に発現するAT-3細胞またはEGFP-PRL-1を安定に発現するAT-1細胞の生成
EGFP-PRL-3腫瘍またはEGFP-PRL-1腫瘍を取得するために、8週齢のヌードマウス（Jackson Labs, USA）に尾静脈を介してEGFP-PRL-3発現細胞またはEGFP-PRL-1発現細胞（5×105個）をそれぞれ注射する。尾静脈注射の3週間後にマウスを屠殺する。EGFP-PRL-3腫瘍またはEGFP-PRL-1腫瘍を保有する肺を取り出す。EGFP-PRL腫瘍を蛍光顕微鏡（Zeiss, M2 Bio Quad）下で個別に摘出する。これらの腫瘍に由来する細胞系を生成するために、各EGFP-PRL腫瘍を無菌条件下でPBSで2回洗浄する。腫瘍を小片にカットし、そしてRPMI 1640、10% FBS、および1%抗生物質（Sigma）を用いて、37℃、5% CO2で培養する。AT-3腫瘍細胞系はEGFP-PRL-3腫瘍に由来し、一方、AT-1腫瘍細胞系はEGFP-PRL-1腫瘍に由来する。細胞をトリプシン処理し、そして1:3の比に分けて新しいディッシュに入れる。腫瘍細胞系がEGFP-PRL-3またはEGFP-PRL-1を均一に発現したことを間接免疫蛍光法により確認する。
【０３６５】
（実施例４）
特異的PRL-3 mAbクローン223、318および特異的PRL-1 mAbクローン269の生成
これらの抗体は次のように生成される（参考文献19も参照されたい）：Stemcell Technologies, Inc. (Vancouver, British Columbia, Canada)製のClonaCell-HY Hybridoma Cloning Kitを用いてハイブリドーマを生成する。手順は製造業者の使用説明書に従う。簡潔に述べると、次のように行われる：（a）それぞれGST-マウス全PRL-1融合タンパク質またはGST-マウス全PRL-3融合タンパク質によるBALB/cマウスの免疫化；（b）BALB/c親骨髄腫細胞SP2/0の増殖；（c）免疫化マウスに由来する脾臓細胞を得るためのBALB/cマウスの準備；（d）脾臓細胞とSP2/0細胞との融合；および（e）ハイブリドーマクローンの選択および特徴付け。
【０３６６】
2つの対照腹水：1．ヒトグリコホリンAに対するハイブリドーマ6A7Mに由来する腹水（ATCCから入手）。2．GS28ゴルジ複合体マーカーに対する腹水。
【０３６７】
（実施例５）
実験的転移アッセイ
参考文献20を参照されたい。すべての動物試験は、Review Board of the Institute of Molecular and Cell Biology, Singaporeにより承認された。本発明者らは、Animal Facility Center of The Agency for Science, Technology and Research (A* STAR), Singaporeの指針に従う5,8,19。1日目にヌードマウスにその尾静脈を介して100万個の癌細胞を注射する。治療マウスに尾静脈を介してPRL-mAbを週2回投与する。
【０３６８】
（実施例６）
ウェスタンブロット分析
詳細な工程については、参考文献19に記載されている。
【０３６９】
（実施例７）
EGFP-PRL-3発現癌細胞の共焦点顕微鏡観察および分析
AT-3細胞、AT-1細胞、または親CHO細胞をカバースリップ上で増殖させ、そしてPBSCM（1mM MgCl2および1mM CaCl2を含有するPBS）で1回洗浄する。次に、2.7%パラホルムアルデヒド中、室温（RT、24℃）で細胞を20分間固定する。PBSCMでさらに2回洗浄した後、PBSCM中の0.12%サポニンを用いて細胞を15分間透過化処理し（この工程は非透過性細胞では省略される）、そして抗PRL-3 mAbと共にインキュベートする。細胞をPBSCMで穏やかに3回洗浄し、そしてTexas Red（Sigma）にコンジュゲートされた抗マウスIgGと共に室温で4時間インキュベートする。AT-3細胞またはAT-1細胞を蛍光顕微鏡法で緑色に直接視覚化する。親CHO生細胞内に取り込まれた抗体を検査するために、最初に、細胞をマウス抗GS28抗体と共に4℃で2時間インキュベートする。細胞をPBSCMで穏やかに3回洗浄し、次に、0.6%パラホルムアルデヒド中、室温（RT、24℃）で20分間固定する。FITC（Sigma）にコンジュゲートされた抗マウスIgGと共に細胞を室温で4時間インキュベートする。To-pro-3ヨージドを用いてすべての親CHO細胞のDNAを青色に染色する。Zeiss LSM 510 image Browserを用いて共焦点イメージングを行う。
【０３７０】
（実施例８）
免疫組織化学（IHC）
モノクローナルマウスPRL-3抗体（クローン223もしくは318）またはモノクローナルマウスPRL-1抗体（クローン269）（1:300希釈）およびVECTASTAIN ABC kit-Peroxidases Rabbit IgG PK-4001 (Orton Southgate, Peterborough, England)を用いてIHC実験を行うために、本発明者らは、Cybrdi (Frederick, Maryland)製のヒト結腸癌検体およびヒト乳癌検体でPRL-3タンパク質およびPRL-1タンパク質の発現を調べた。低密度および高密度のマルチプルヒト悪性腫瘍アレイ（TS42040704）および（TS43040303）をBioGenex (San Ramon, CA)から購入する。ホルマリン固定パラフィン包埋スライドを54℃で10分間ベーキングし、次に、新しいキシレン中で5分間脱蝋した（2×）。逐次的に100%、95%、80%、および75%のエタノール、PBS（各変更ごとに2分間ずつ）を用いて、次に、0.01Mクエン酸ナトリウムpH6.0緩衝液中で、スライドを再水和に付し、続いて、抗原回復2100-Retriever Pick Cell Laboratories (Amsterdam, North Holland, 1098SM, NL)を15分間行う。スライドをクーラーで4時間冷却する。スライドをPBSで3回洗浄し（各5分間ずつ）、そして0.6% H2O2を含むPBS中に暗所で20分間移す。スライドをPBS中で数回洗浄し、そしてPBS-0.2% Tween 20中、224℃で20分間処理する。製造業者の使用説明書に従ってブロッキング工程および抗体インキュベーションを行う。
【０３７１】
（実施例９）
動物モデルは侵攻性転移性肺腫瘍の迅速形成を可能にする
この実施例は、マウスにおけるPRL過剰発現腫瘍の生成および将来のPRL癌治療のための動物モデルの提供を記述する。
【０３７２】
図1を参照されたい。
【０３７３】
第1に、ヌードマウスをin vivo「細胞分取器」として使用して、高い転移活性を有する細胞を選択する。1×106個のEGFP-PRL-3発現CHO細胞またはEGFP-1発現CHO細胞をヌードマウスの血流中に尾静脈を介して注射する。注射の3週間後に各ヌードマウスの肺に何十もの転移性腫瘍または病巣が形成される。
【０３７４】
第2に、次に、単一のそのような肺転移性EGFP-PRL腫瘍を摘出し、そして培養ディッシュ中でミンスしてより侵攻性かつ均一のAT-3と命名されたEGFP-PRL-3発現転移性細胞系またはAT-1と命名されたEGFP-PRL-1発現腫瘍細胞系を樹立する。
【０３７５】
第3に、1×106個のAT3細胞またはAT1細胞をヌードマウス中に尾静脈を介して再度注射する。第4に、本発明者らは、マウスを未治療群または腫瘍細胞接種の3、6、および9日後に尾静脈注射を介して投与された異なる抗体を有する治療群に分けた。
【０３７６】
PRL-3過剰発現細胞またはPRL-1過剰発現細胞が急速に転移性腫瘍を形成した動物モデルをデザインする。そのような侵攻性転移性腫瘍をバックグラウンドとして用いた場合、抗PRL-mAbによる治療が有効であれば、腫瘍原性のなんらかの抑制を観測できるはずである。
【０３７７】
本発明者らの動物モデルは、PRL発現細胞の侵攻転移活性を再現したものであり、侵入後または血管内異物侵入後に生じる転移性イベントを詳細に分析するのに有用である。
【０３７８】
（実施例１０）
PRL-3 mAbまたはPRL-1 mAbは、マウスにおけるEGFP-PRL-3転移性肺腫瘍またはEGFP-PRL-1転移性肺腫瘍の生成を約90%の有効性でブロックする。
【０３７９】
4つの対照マウス群（図2A、a、未治療；b、PBS治療；cおよびd、2種の無関連抗体）は、細胞注射の15日後にそれらの肺において大量かつ広範なEGFP-PRL-3転移性腫瘍（約140〜150ヶ所）を示した。
【０３８０】
注目すべき点として、ハイブリドーマクローン223（図2A eおよびg）またはハイブリドーマクローン318（図2A fおよびh）に由来する精製IgGまたは未精製腹水のいずれかの形態でPRL-3 mAbが3回投与された他の4つのマウス群は、それらの肺におけるEGFP-PRL-3発現腫瘍（約15〜20ヶ所）の劇的な減少を示した。
【０３８１】
同様に、PRL-1 mAbは、EGFP-PRL-1発現AT-1細胞の接種に由来する転移性腫瘍の生成を有意に減少させた（図2B、レーン9）。全体的に、PRLモノクローナル抗体で治療されたマウス（n=40）は、対照マウス（n=40）と比較して約90%の転移性肺腫瘍の阻害を示した。PRL-3 mRNA（ただし、タンパク質ではない）は、心臓で検出されている5。
【０３８２】
これに関連して、PRL-3 mAbで治療された動物が目立った心臓毒性や他の望ましくない副作用を示さなかったことは、強調する価値がある。
【０３８３】
（実施例１１）
PRL-1 mAbは、PRL-1（ただしPRL-3は対象外）転移性腫瘍の生成を特異的にブロックし、一方、PRL-3 mAbは、PRL-3（ただしPRL-1は対象外）転移性腫瘍の生成を特異的にブロックする
この実施例は、抗体の効果が特異的であることを実証する。
【０３８４】
図3を参照されたい。
【０３８５】
本発明者らは、PRL-1発現細胞およびPRL-3発現細胞による肺転移性腫瘍の生成がmock-PBS治療（a、e）によりブロックされないがウサギ抗体が3種のPRL（PRL-1、PRL-2、およびPRL-3）すべてと反応するのでウサギPRL抗体（b、f）により効果的にブロックされることを示す。
【０３８６】
本発明者らは、PRL-1 mAbが、PRL-1が過剰発現される肺転移性腫瘍（c）の生成をブロックするが、PRL-3が過剰発現される肺転移性腫瘍（g）をブロックしないことを示す。
【０３８７】
同様に、PRL-3 mAbは、PRL-3が過剰発現される肺転移性腫瘍（h）の生成を阻害するが（腫瘍数の減少）、PRL-1が過剰発現される肺転移性腫瘍（d）を阻害しない。
【０３８８】
（実施例１２）
PRL-3 mAbは、内因性PRL-3を発現するA2780細胞による転移性腫瘍の生成を効果的に阻害するが、内因性PRL-3を発現しないCT26細胞によるものは阻害しない
PRL-mAb療法の劇的な有効性は、これまでのところ、EGFP-PRLタンパク質の高レベルの発現を有する標的細胞に依存する。
【０３８９】
次に、本発明者らは、PRL-3タンパク質を天然で発現する癌細胞の転移を抗体がブロックしうるかを評価するきわめて重要な実験を行った。この実験に使用するのに理想的な候補癌細胞系は、次の2つの性質を有していなければならない。1．天然で発現されるPRL-3タンパク質を有すること。2．マウスにおいて転移性腫瘍形成を迅速に引き起こしうること。
【０３９０】
本発明者らは、A2780ヒト卵巣癌細胞系がこれらの2つの性質を有することを見いだし、かつA2780細胞がPRL-3タンパク質を天然で発現することを確認した（図4A、レーン2）。これについては、既に報告されている9。
【０３９１】
一方、本発明者らは、PRL-3タンパク質を発現しないマウス結腸癌細胞系CT26を同定した（図4A、レーン1）。癌細胞の接種の2週間後にヌードマウスの肺において強い転移活性を有することから、CT26癌細胞系をこの実験に対する陰性対照として選択する（図4B）。
【０３９２】
予想どおり、CT26細胞が投与されたマウスの治療群（図4B、a）と未治療群（図4B、b）と間に差異はみられず、すべて体重減少の病的外観を示す。
【０３９３】
CT26細胞による侵攻性肺転移性腫瘍の迅速形成は、未治療マウスの肺（図4B、下側b）と比較して、PRL-3 mAb（図4B、下側a）により阻害されないことから、PRL-mAbは、PRL-3ホスファターゼが天然で発現されない肺転移性腫瘍の生成を阻害しないことが示唆される。
【０３９４】
これとは対照的に、内因性PRL-3タンパク質を発現するA2780ヒト癌細胞の接種の1ヶ月後において治療マウスと未治療マウスとの間に有意差がみられる。A2780 PRL-3陽性細胞により形成される病的外観（非健常かつ痩身）および多数の腫瘍は、未治療マウス（図4C、右側）でのみ観察され、治療マウス（図4C、左側）では観察されない。治療マウスは、長期間にわたり健常状態を保持する。
【０３９５】
これらの結果は、PRL-3 mAbが、PRL-3を天然で発現する癌細胞の転移性腫瘍形成をブロックしうるが、内因性PRL-3を発現しない癌細胞にまったく影響を及ぼさないことを示している。
【０３９６】
（実施例１３）
PRL-3発現細胞またはPRL-1発現細胞は、それらのそれぞれのPRL抗体を取り込む
抗PRL抗体が腫瘍形成を阻害する正確な機序についてさらに調べる必要がある。腫瘍細胞がPRL mAbを取り込みうるかどうかを決定するために、本発明者らは、EGFP-PRL-3を過剰発現する非透過性AT-3細胞において間接免疫蛍光法アッセイを用いてPRL-3 mAb染色を検査した。
【０３９７】
いくつかの非透過性AT-3細胞は、抗PRL-3 mAbで十分に染色されることが判明した（図5A、bおよびeのパネルに示された白矢印）。これらの細胞の40%は、赤色に部分的に染色されるが、細胞の>50%は、完全に非標識である（図5A、b、e）。これに対して、透過性AT-3細胞は、抗PRL-3 mAbで赤色に100%染色されることがわかる（図5A、h）。
【０３９８】
データから示唆されるように、それでもなお、大きいPRL mAbは、部分的もしくは全体的のいずれかで、非透過性癌細胞内に浸透しうる。
【０３９９】
類似の結果は、EGFP-PRL-1を過剰発現するCHO細胞で抗PRL-1 mAb（クローン#269）を用いて得られる（データは示されていない）。
【０４００】
抗体が細胞の内部に入り込むことができるかをさらに確認するために、本発明者らは、ゴルジ装置マーカー（GS28）に対する抗体を選択し、GS28 mAbが培養下でCHO生細胞内に浸透しうることを示す（図5B、a〜c）。さらに、一晩血清飢餓させた生細胞の大部分（60〜70%）は、未知の機序によりマウス抗GS28を取り込むことことに関してより高い有効性を示す（図5B d〜fに緑色で示される）。
【０４０１】
抗体の取込みが一般的な細胞現象であるか否かを調べるために、3種のPRL無関連抗体を2種の他の細胞系で検査する。これらは、非透過性ヒト乳房上皮細胞（MCF-10A）上のマウス抗GS28抗体およびウサギ抗PTEN抗体ならびにヒト乳癌細胞（MCF-7）上のマウス抗GS28、およびウサギ抗p53である。
【０４０２】
この場合も、本発明者らは、抗体由来源がウサギかマウスかにかかわらず、非透過性細胞の一部（約10%）が同一の細胞内に両方の抗体の効率的な取込みを示すことを見いだした（図6A、B）。 MCF-7細胞を一晩血清飢餓させた場合、非透過性MCF-7細胞は、GS28抗体およびp53抗体の両方をきわめて効率よく取り込むことが可能である（図6C）。
【０４０３】
間接免疫蛍光二重染色により、正常細胞および癌細胞における抗体取込みが一般的な現象であることが明らかにされる。抗体は、非透過性細胞により取り込まれうる。これは、細胞の血清飢餓により促進される。こうした結果から、細胞内タンパク質もまたモノクロナール抗体療法を用いて標的になりうることが示唆される。
【０４０４】
（実施例１４）
PRL-3およびPRL-1の過剰発現は、さまざまな転移性癌に関連付けられる
PRL-3関連癌またはPRL-1関連癌に対する可能性のある薬剤としてPRL-mAbの臨床的および予後的な有意性を評価するために、本発明者らは、結腸癌、乳癌、肺癌、脳癌、卵巣癌、黒色腫、および胃癌を含む一群の公知のPRL媒介癌をさらに評価するように努めた3-12,19。
【０４０５】
PRL-3 mAbを用いてマルチプルヒト癌組織アレイ上で免疫組織化学を行うことにより、本発明者らは、PRL-3タンパク質が、結腸癌の15%（26件/症例158件）、乳癌の16.5%（19件/症例96件）、および食道癌の15%（2件/症例13件）でアップレギュレートされることを見いだした。
【０４０６】
PRL-3の過剰発現は、肺癌、陰茎癌、および子宮頸癌において扁平上皮細胞癌と密接に関連している。選択されたサンプルを図7Aに示す。
【０４０７】
PRL-1タンパク質は、結腸癌の6.2%（8件/症例128件）で、過剰発現される、脳癌の20%（5件/症例20件）で、および食道癌の7.6%（1件/症例13件）で(図7B)。これらの癌サンプルでは、PRL陽性シグナルは、主に形質膜および細胞質に局在化される。
【０４０８】
（実施例１５）
考察（実施例1〜実施例14）
転移は、癌の最も恐ろしい側面である。本発明者ららは、PRL-3およびPRL-1の過剰発現がさまざまなヒト癌に関連付けられることを示した3-12,19。この試験では、本発明者らは、PRL-3タンパク質が結腸癌、乳癌、および食道癌でアップレギュレートされることをさらに示す。PRL-3の過剰発現は、肺癌、陰茎癌、および子宮頸癌において扁平上皮細胞癌と密接に関連している。PRL-1タンパク質はまた、結腸癌、脳癌、および食道癌で過剰発現される。
【０４０９】
細胞内PRLを過剰発現する癌細胞を標的にして外因性試薬により癌転移を予防することは、やりがいのある課題である。モノクローナル抗体（mAb）は、ヒト療法のうちで最も急成長を遂げているクラスを構成し、悪性細胞を認識し破壊することが明らかにされてい作用剤である。PRL媒介癌転移をブロックするために、本発明者らは、PRL発現癌細胞を除去してそのさらなる広がりを予防する必要がある。本発明者らは、マウスにおいてモノクロナール抗体療法によりこのやりがいのある目標への取組みを試みる。培養されたPRL腫瘍細胞が各マウス内にその尾を介して直接導入される実験的転移アッセイを用いて、本発明者らは、癌細胞のin vivo増殖および腫瘍形成を調べた。癌転移の過程には主要な4つの段階がある。第1に、癌細胞は、原発性腫瘍から逃散かつ離脱するために移行能力を増強しなければならない。第2に、癌細胞は、血流中に進入して生き続ける必要がある（血管内異物侵入）。第3に、癌細胞は、新しい器官に付着するために血管から漏出しなければならない（血管外遊出）。第4に、癌細胞（種）、遠位の器官（土壌）で生き続けて転移性腫瘍にまで増殖する必要がある。本発明者らは、尾静脈を介して血管内に100万個のEGFP-PRL癌細胞を直接注射することにより血管内異物侵入の段階で転移性アッセイを開始した（図1）。癌転移の過程は、長く困難な旅であり、癌細胞のわずか約0.01%（1×106個の癌細胞から約100個の腫瘍）がそれらの最終到達地をうまく達するに過ぎない推定される。実験の終了までに、本発明者らは、未治療マウスで約100〜150個の転移性肺腫瘍を観察し（図2A、a〜d）、PRL特異的mAbで治療されたマウスで約10〜15個の転移性肺腫瘍を観察した（図2A、e〜h）。本発明者らの試験は、細胞内に局在化されているにもかかわらずそれぞれのホスファターゼに対するmAbを用いることにより、マウスにおいて実験的転移を効果的に（約90%）ブロックする最初の例を表す。それに加えて、本発明者らは、PRL-mAbがそれ自体の抗原に特異的であることを示した。PRL-1 mAbは、PRL-1の生成を特異的にブロックするが、PRL-3転移性腫瘍を特異的にブロックしない。一方、PRL-3 mAbは、PRL-3の生成を特異的にブロックするが、PRL-1転移性腫瘍を特異的にブロックしない（図3）。さらに、本発明者らは、内因性PRL-3ホスファターゼが発現されないCT26マウス結腸癌細胞により、PRL-3 mAbが腫瘍形成をブロックしないことを実証した（図4A、B）。注目すべき点として、本発明者らは、内因性PRL-3タンパク質を発現するヒト卵巣癌細胞系A2780により、PRL-3 mAbが転移性腫瘍の生成を効果的にブロックすることを示す。PRL-3 mAbまたはそのヒト化抗体がPRL-3過剰発現に関連付けられるヒト癌を治療する候補になりうることが示唆されるので、PRL-3陽性の天然に存在するヒト癌細胞による転移性腫瘍形成を効果的に阻害することは重要である。A2780ヒト卵巣癌細胞に及ぼすPRL-3抗体の阻害作用とマウスCT26結腸癌細胞に及ぼす非阻害作用との比較から、抗体が、PRL-3内因的に発現する癌細胞を標的にしていることが示唆されるが、この点を説得力をもって実証するために、PRL-3の発現レベルだけが異なるアイソジェニック癌細胞を利用する今後の研究が必要とされる。
【０４１０】
実験的転移アッセイにおいて腫瘍形成のPRL-3抗体媒介阻害に関与するいくつかの可能な機序が存在する。
【０４１１】
第1に、抗体は、おそらく、PRL-3発現細胞内に進入して細胞内PRL-3を標的にしその機能を中和することが可能である。培養下のPRL-3発現癌細胞の一部によるPRL-3に対する抗体の取込みおよび血清飢餓時の抗体取込みの増強は、この作用機序を支持するように思われる。第2に、PRL-3のごく一部分は、外部に排出されてPRL-3発現細胞の表面上に提示される可能性がある。表面露出PRL-3への抗体の結合は、補体媒介細胞傷害性（CDC）、抗体依存性細胞傷害性（ADCC）、および／または補体依存性細胞傷害性（CDCC）のような免疫応答を引き起こして癌細胞を破壊する可能性がある。第3に、細胞内PRL-3は、タンパク質分解によるプロセシングを受ける可能性があり、抗原性フラグメントは、癌細胞が細胞傷害性T細胞の標的になるようにクラスI主要組織適合抗原により細胞表面上で提示される可能性がある。
【０４１２】
これらのPRL-mAbがそれらのそれぞれの細胞内抗原により駆動される癌転移をどのように阻害するかについて第1の可能性を検討するために、本発明者らは、PRL-3発現細胞またはPRL-1発現細胞によるそれらのそれぞれのPRL抗体の取込みが一般的な現象であるという証拠を提供する。なぜなら、本発明者らはまた、ゴルジ体マーカーGS28に対するPRL無関連抗体が培養下でCHO生細胞内に浸透可能でありかつ抗体取込みが細胞の血清飢餓により増強されることを見いだしたからである(図5B)。
【０４１３】
重要な問題は、抗体浸透が癌細胞で特異的に生じるかまたは非形質転換細胞タイプでも同様に生じるかということおよび他のクラスの抗体もまた細胞に進入可能であるかということである。3種のPRL無関連抗体を2種の他の細胞系で検査する。これらは、非透過性ヒト乳房上皮細胞（MCF-10A）上のマウス抗GS28抗体およびウサギ抗PTEN抗体ならびにヒト乳癌細胞(MCF-7)上のマウス抗GS28、およびウサギ抗p53である。
【０４１４】
この場合も、本発明者らは、抗体由来源がウサギかマウスかにかかわらず、非透過性細胞の一部(約10%)が同一の細胞内に両方の抗体の効率的な取込みを示すことを見いだした（図6A、B）。MCF-7細胞を一晩血清飢餓させた場合、非透過性MCF-7細胞は、GS28抗体およびp53抗体の両方を極めて効率的に取り込むことが可能である（約70%、図6C）。
【０４１５】
血清飢餓は、G1期およびG0期で細胞を停止させるために使用される21。細胞周期の特定の時期が、抗体を取り込む細胞の能力に寄与しうる可能性がある。in vivoで、癌細胞は、抗体を取り込む癌細胞の能力を増強する可能性のある低酸素ストレスおよび血清欠乏の条件下にある。
【０４１６】
こうした知見から、細胞が抗体を取り込んで細胞内抗原を中和可能であるというこれまで認識されていなかった一般的な現象が示唆される。特定的には、本発明者らは、PRL-3抗体およびPRL-1抗体がそれらのそれぞれの細胞内タンパク質を特異的に標的にし、これらの動物内で検出可能な副作用を示すことなく、腫瘍形成を除去することを実証した。PRL-3抗体により抑制される実験的転移アッセイにおける腫瘍形成の特異的段階は今後の研究により明らかにすべきこととして残されているが、本発明者らの結果によれば、肺または他の二次組織に播種される単一細胞（またはクラスター細胞よりなる微小転移）は、おそらく、腫瘍結節の数の劇的な減少に見られるようにPRL-3抗体の標的である。二次組織内での癌細胞の播種および巨大転移への微小転移の進行は癌の広がりの主要な律速段階であるので、PRL-3抗体によりこれらの時期を標的にすることは、癌転移を予防するうえで臨床的適合性のある可能性がある。
【０４１７】
ここで、本発明者らは、PRL-3 mAbがPRL-3の内因性発現を有する腫瘍を正確に標的にすることを示す証拠を提供する。本発明者らのデータは、最後に、モノクロナール抗体療法を用いて細胞内タンパク質を標的にすることにより転移性腫瘍形成を除去することも可能であることを示唆する。本発明者らは、癌研究者が抗癌療法のためにmAbの可能な標的として広範にわたる細胞内オンコプロテインの再評価を考えることを提案する。
【０４１８】
（実施例１６）
特異的PRL-3およびPRL-1マウス/ヒトキメラmAb（クローン#318、269）の生成
PRL-3キメラmAbでは、RNeasy Mini Kit (QIAGEN, cat#74104)を用いて6×106個のハイブリドーマ細胞（クロール#318）から全RNAを抽出する。RNA抽出時にDNAseを使用する。次に、SuperScript II RNase H (Invitrogen, Cat 18064-014)を用いてRNAをcDNAに逆転写する。得られた全cDNAを鋳型として使用し、30サイクルのPCR（95℃、54℃、72℃）のためにIg-Prime Kits (Novagen, cat#69831-3)を用いて「汎用的可変領域」を生成する。TAクローニングキット（Invitrogen, part#45-0640）を用いてPCRフラグメントをPCRII-TOPOベクター中にクローニングする。Mfe1およびXho1を用いてPCRフラグメントを切断し、次に、ヒトIgG1定常領域発現ベクター-pCMV-ヒトIgG1(18)のそれぞれの部位に挿入して重鎖のマウス可変領域（クローン#318）をヒトIgG1定常領域に連結する。同様のPCR手順を軽鎖のマウス可変領域について行い、ApaL1およびPst 1に対する制限部位を含有する末端を用いてマウス可変軽鎖（クローン#318）のPCRを行う。ApaLIおよびPst Iを用いてPCRフラグメントを切断し、次に、クローン#318の重鎖の可変領域を含有するヒトIgG1定常領域発現ベクターのそれぞれの部位に挿入する。完全構築物を293T細胞内に一過的にトランスフェクトし、ごく少量のIgG FBS (Gibco, 16250-078)と共に培養する。キメラmAbを培養物上清から採取し、そして遠心濾過機（Millipore, cat#UFC900596）を用いて40倍まで濃縮する。間接免疫蛍光法（IF）およびウェスタンブロット分析によりキメラmAbをその特異性に関して検査す。軽鎖のPRL-1（クローン#269）可変領域に対するPCRフラグメントを生成するために、同様に、mRNAをハイブリドーマ細胞#269から抽出し、次に、mRNAを逆転写して、重鎖および軽鎖の可変領域のコード配列を取り出すために使用されるcDNAにする。軽鎖のPRL-1可変領域に対するPCRフラグメントを生成するために、同様の手順を以上に述べたように行う。
【０４１９】
（実施例１７）
DLD-1-EGFP-PRL-3腫瘍細胞系の生成
ATCC CCL-221 (Mannassas, VA)に由来するDLD-1結腸癌細胞。Invitrogen (Carlsbad, CA)製のLipofectamine 2000を用いてEGFP-PRL-3発現構築物をDLD-1細胞内にトランスフェクトする。EGFP-PRL-3腫瘍を取得するために、8週齢のヌードマウス（Jackson Labs, USA）でヌードマウスの臀部にそれぞれ注射して異種移植腫瘍を形成する。癌細胞接種の3週間後にマウスを屠殺する。腫瘍を取り出して蛍光顕微鏡（Zeiss, M2 Bio Quad）下で検査する。DLD-1-EGFP-PRL-3腫瘍細胞系を生成するために、EGFP腫を無菌条件下でPBSで2回洗浄し、小片にカットし、RPMI 1640、10% FBS、および1%抗生物質（Sigma）を用いて、37℃、5% CO2で培養する。細胞をトリプシン処理し、そして1:3の比に分けて新しいディッシュに入れる。腫瘍細胞系がEGFP-PRL-3またはEGFP-PRL-1を均一に発現したことを間接免疫蛍光法により確認する。
【０４２０】
（実施例１８）
HCT116(CCL-247)、DLD-1(CCL-221)、B16F0(CRL-6475)、B16F10(CRL-6322)、A2780
HCT116(CCL-247)は、ヒト結腸直腸癌細胞系である。DLD-1(CCL-221)は、ヒト結腸直腸腺癌細胞系である。B16F0(CRL-6475)およびB16F10(CRL-6322)は、2種のマウス黒色腫細胞系である。すべての4つの細胞系をATCCから購入する。A2780は、ヒト卵巣癌細胞系であり、ECACC (Cat#93112519 UK)から購入される。
【０４２１】
（実施例１９）
実験動物については文献A19を参照されたい。すべての動物試験は、本発明者らのInstitute's Review Boardにより承認された。本発明者らは、Animal Facility Center of The Agency for Science, Technology and Research (A* STAR), Singaporeの指針に従う。8週齢のヌードマウス（Jackson Labs, USA）を使用する。1日目に1×106個の癌細胞をヌードマウスの血流中に尾静脈を介して注射する。3日目に治療マウスに対してキメラmAbまたは未治療マウスに対してPBSのいずれかを尾静脈内に投与する。
【０４２２】
（実施例２０）
特異的PRL-3マウス/ヒトキメラmAb(クローン#318)の生成
本発明者らは、PRL-1およびPRL-3マウスmAbがそれらのそれぞれの細胞内PRLホスファターゼを特異的に標的にして、実験動物において癌転移を阻害することが可能であるといういう事実に勇気付けられる（参照A16）。実験作業を診療用に移行する試みでは、本発明者らは、PRL-3に対するマウス/ヒトキメラmAbを工学的に操作して、ヒトにおいて起こりうるマウスmAbの抗原性を減少させた。組換えDNA技術により行われる免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック融合により、ヒトIgG分子の定常ドメイン（参考文献A18）がPRL-3 mAbクローン#318のマウス可変領域（重鎖および軽鎖）と組み合わされたPRL-3キメラmAbがうまく開発される（図8A）。シミアンウイルス40 T抗原（293T）細胞を発現するヒト胚性腎臓細胞に発現構築物をトランスフェクトしてキメラPRL-3 mAbを産生させ、次に、これを培地から採取し、さらに40倍に濃縮する。
【０４２３】
（実施例２１）
特異的PRL-1マウスヒトキメラmAb（クローン#269）の生成
本発明者らは、重鎖および軽鎖のPRL-1マウス可変領域を生成するために同様の戦略を実行し、次に、ヒトIgG発現ベクター（参考文献A18）の定常ドメイン中にそれぞれ組み込んでキメラPRL-1 mAbを生成する。
【０４２４】
（実施例２２）
PRL-3キメラmAbおよびPRL-1キメラmAbは、それらの抗原を特定的には標的にする
間接免疫蛍光法（IF）（図8B）およびウェスタンブロット分析（図8Cおよ図8D）を行うことにより、PRL-3キメラmAbおよびPRL-1キメラmAbをそれらの抗原特異性に関して確認する。データにより示されるように、PRL-3キメラmAbは、PRL-3のみを認識し、PRL-1タンパク質およびPRL-2タンパク質を認識しない。一方、PRL-1キメラmAbは、PRL-1のみに結合し、PRL-2および-3タンパク質に結合しない。
【０４２５】
（実施例２３）
PRL-3キメラ抗体は、内因性PRL-3を発現するA2780細胞およびHCT116による転移性腫瘍の生成を効果的に阻害するが、内因性PRL-3を発現しないDLD-1細胞によるものを阻害しない
PRL-3キメラmAbが、PRL-3タンパク質を天然で発現する癌細胞に由来する転移性腫瘍の生成を標的にしブロックしうるかを評価するために、きわめて重要な実験を行う。何十もの癌細胞をPRL-3発現に関してウェスタンブロット分析によりスクリーニングする。この実験に使用するのに理想的な候補癌細胞系は、次の2つの性質を有していなければならない。1．天然で発現されるPRL-3タンパク質を有すること。2．転移性腫瘍形成を迅速に引き起こしうること。本発明者らは、A2780ヒト卵巣癌細胞系およびHCT116ヒト結腸直腸癌細胞系がこれらの2つの性質を有することを見いだし、かつA2780細胞およびHCT116細胞が天然でPRL-3タンパク質を発現することを確認した（図9Aレーン1、2）。A2780細胞は、PRL-3陽性細胞系として既に報告されている（参考文献A4）。注目すべき点として、HCT116細胞（n=5）またはA2780細胞（n=8）の接種の1ヶ月後においてPRL-3キメラmAb治療マウスと未治療マウスとの間に有意差が見られる。病的外観（非健常かつ痩身）は、未治療マウス（図9Bおよび図9C、左側）のみで観察され、治療マウスでは観察されない（図9Bおよび図9C、右側）。治療マウスは、長期間にわたり健常状態を保持する。これらの結果から、PRL-3キメラmAbは、PRL-3を天然で発現する癌細胞の転移性腫瘍形成をブロックしうることが示唆される。これと対比して、本発明者らは、PRL-3タンパク質を発現しないヒト結腸癌細胞系DLD-1を同定した（図9A、レーン3）。DLD-1細胞は、この実験に対する陰性対照としての役割を果たす。予想どおり、DLD-1細胞が投与されたマウスの治療群（図9D、左側）と未治療群（図9D、右側）（n=5）との間に差異は見られず、すべて、DLD-1細胞の接種の3.5ヶ月後に健常外観を示す。注目すべき点として、EGFP-PRL-3を過剰発現するように工学的に操作されたDLD-1細胞は、細胞接種の2ヶ月後にマウスにおいて病的表現型を引き起こすことが可能であった。これらの外因性PRL-3発現癌細胞を保有するヌードマウスの肺で多数の微小転移性腫瘍が見いだされる。EGFP-PRL-3陽性細胞はまた、この時点で未治療マウス（図10A n=5）の血液塗抹中に見いだされることから
、PRL-3は、血流中の細胞生存率を延長しうることが示唆される。これとは対照的に、PRL-3キメラmAb治療を受けたマウスは、それらのサイズに有意差を示し、長期間にわたり健常外観を示した。これらの外因性PRL-3発現癌細胞を保有する治療ヌードマウスの肺には微小転移性腫瘍は見られない。EGFP-PRL-3陽性細胞は、治療マウス（図10B n=5）の血液塗抹中により少量見いだされる。これらの結果から示唆されるように、PRL-3キメラmAbは、天然で内因性PRL-3を発現するかまたは工学的に外因性に操作されたPRL-3を発現するいずれの癌細胞の転移性腫瘍形成をもブロックしうる。重要なこととして、抗体は、内因性PRL-3を発現しない癌細胞にまったく影響を及ぼさない。
【０４２６】
（実施例２４）
PRL-3キメラ抗体は、内因性PRL-3を発現するB16F0細胞による転移性腫瘍の形成を効果的に阻害するが、内因性PRL-3を発現しないB16F10細胞によるものを阻害しない
本発明者らは、抗体が、ヒト癌細胞により形成された転移性腫瘍をブロックしうることを実証した。次に、本発明者らは、2種のマウス黒色腫細胞系：B16F0およびB16F10を使用し、追加のmAb治療を行う。両方の細胞系は、マウスにおいて多数の転移性腫瘍を迅速に形成する。内因性PRL-3タンパク質を発現するB16F0癌細胞を保有する未治療マウス（図11A）では、副腎（矢印で示される）、肝臓、骨、および腹部に転移性腫瘍が見いだされる（図11B、右側）。この場合も、本発明者らは、キメラmAbが治療マウスの多くの組織において転移性腫瘍生成を効率的に排除しうることを示した（図11B、左側）。併行した対照実験では、内因性PRL-3タンパク質を発現しないB16F10癌細胞を保有する未治療マウスまたは治療マウスの肺に何十もの転移性腫瘍が見いだされ（図11A）、見てわかるように、治療マウス（図11上側パネル）と未治療マウス（下側パネル）との間に肺転移性腫瘍の数に有意差が存在しない。これまでのところ、いくつかのPRL-3陽性およびPRL-3陰性の癌細胞系でのPRL-3キメラmAb治療から得られた結果から、治療の効率は、転移性腫瘍の生成がPRL-3-過剰発現により引き起こされるかどうかに密接に関連していることが示唆される。癌細胞の転移性がPRL-3過剰発現によらない場合（B16F10細胞）、PRL-3キメラmAbの投与は、腫瘍形成をブロックすることにまったく影響を及ぼさない（図11C）。
【０４２７】
（実施例２５）
考察（実施例15〜24）
ほとんどの癌患者は、その原疾患ではなく転移で死亡する。癌転移は多段階過程である。癌転移の第1の重要な段階は、新生物性上皮細胞が細胞間接着を消失して運動性を獲得することを含み、これにより、癌細胞は、腫瘍の原発部位から離脱して隣接組織に浸潤する。第2の段階は、癌細胞が宿主の血流に進入する能力を獲得することを必要とする（血管内異物侵入）。これら2つの初期の段階は、潜伏し達成するのに長期を有する可能性がある。ここで、本発明者らは、実験的転移アッセイ（参考文献A19）を使用し、マウスの尾静脈を介して血流中に100万個の癌細胞を直接注射することにより（1日目）、血管内異物侵入の段階で実験を開始した。これは、転移過程の残りの部分を模倣する。本発明者らは、3日目にPRL-3キメラmAbを用いて動物を治療し、その後、週2回のmAb投与を行った。以前（参考文献A16）および現在の抗体治療の転帰を合わせて考えると、本発明者らの知見から、次のことが示唆される。1．癌転移の過程は、長く困難な旅であり、100万個の癌細胞(種)から開始して実験の終了までに、本発明者らは、未治療マウスで約100個の転移性肺腫瘍およびPRL特異的mAbで治療されたマウスで約10〜15個の転移性肺腫瘍を観察した（参考文献A16）。このデータは、癌細胞のわずか約0.01%がそれらの最終到達地をうまく達すると推定されることを意味する。2．この試験でも、同様に、本発明者らは、未治療マウスから得られたものと比較して治療マウスから得られた肺切片でより少ない微小腫瘍の数を見いだしたことから（図10A）、mAbは、腫瘍のサイズではなく数を減少させるように作用しうることが示唆される。3．治療の効率はまた、本発明者らがどの時点でキメラmAbの導入を始めるかに密接に関連している。治療を十分に早期に開始せずに癌細胞接種の1週間後まで遅らせた場合、結果は、早期治療（3日目）のときほど良好でないであろう。こうした知見から、PRL-3 mAbは、血液中を移動しさまよい続けている時、PRL-3癌細胞を中和し根絶する役割を果たしうることが示唆される。治療が遅れると、癌細胞は、血管を通り抜けて（血管外遊出）、播種される遠位の器官に付着する可能性があり、mAbは、PRL-3陽性癌細胞を拘束して血管外遊出および播種を阻止できる可能性が低減されるであろう。この仮説は、未治療マウスの血流中にDLD-1-EGFP-PRL-3細胞が長期間存在することおよびmAb治療を受けたマウスにおいてこれらの細胞が明瞭に低減されることにより支持される。4．最も重要なこととして、PRL-3キメラ抗体は、内因性PRL-3を発現する癌細胞に由来する転移性腫瘍の生成のみを効果的にブロックしうるが、内因性PRL-3を発現しない癌細胞に由来するものをブロックしない。したがって、本発明者らのPRL-3 mAb治療は、それ自体の抗原に非常に特異的である。注目すべきこととして、mAbは、血流を介してより良好に作用するが、局所的応答を介してより良好に作用することはなく、本発明者らは、ヌードマウスの臀部領域に局所的に100万個のPRL-3癌細胞を注射することにより異種移植腫瘍を生成し、次に、3日目から開始して週2回、類似の領域にmAbを注射したところ、、本発明者らは、mAbが、局所的異種移植腫瘍のサイズを減少させることに影響を及ぼさないことを見いだした（データは示されていない）。
【０４２８】
実験的転移アッセイにおいてPRL-3媒介転移性腫瘍形成の阻害にPRL-3 mAbが関与する詳細な細胞的および分子的な機序は、現在のところ不明であり、将来の試験により明らかにする必要がある。PRL-3キメラmAbがマウスにおいてPRL-3発現癌細胞の転移性腫瘍を除去しうるという結果は、期待のもてるものであり、診療における他の細胞内標的の考え方を示唆する。本発明者らの試験は、種々の癌および癌転移を治療するために細胞内癌遺伝子産物に対するmAbを用いる抗体療法の新しくかつかなり大きい機会の扉を開ける可能性がある。PRL-1、PRL-2、およびPRL-3は、種々の癌で過剰発現される。本発明者らは、種々のPRL細胞内ホスファターゼ関連腫瘍を駆除する新規な医薬の先駆体でありうるPRLキメラmAbが広く必要とされていると予想している。本発明者らは、原発性癌が最初に診断されてから短期間内に再発を繰り返すいくつかのタイプの癌患者（たとえば、膵臓癌の患者）を選択し治療しうる。患者の治療群と未治療群との間の差により、キメラmAbが短期間内で効果があるか否かを明らかにすることが可能であろう。
【０４２９】
（実施例２６）
細胞内PRL3ポリペプチドおよび外在化または分泌されるPRL3ポリペプチドの両方に結合する抗PRL3抗体318
次のように実験を行う。
【０４３０】
1．80%の集密度になるまで10cm培養ディッシュ中でA2780細胞、HCT116細胞、B16F0細胞、B16 F10細胞を増殖させる。
【０４３１】
2．PBS洗浄を数回行う。
【０４３２】
3．培地（8ml）をFBSなしに一晩変更する。
【０４３３】
4．*翌日、培地を採取して3Kで遠心し、ペレットを廃棄し、再び14Kで遠心し、上清を保持する（*ディッシュの細胞を溶解し、各細胞系をPRL-3発現に関して検査する、図12A）。
【０４３４】
5．細胞溶解物に対するタンパク質充填対照としてGAPDHを使用する（図12B）。
【０４３５】
6．顕微鏡観察下で培地を検査して培地中に細胞が存在しないことを確認する。
【０４３６】
7．培地を濃縮し、培地中の分泌または外在化されたPRL-3についてSDSゲル実験を行う（図12C）。
【０４３７】
結果を図12に示す。
【０４３８】
図12A。ウェスタンブロットは、A2780、HCT116、およびB16F0が、内因性PRL-3タンパク質を発現する3種の癌細胞系であり、一方、B16F10がPRL-3非発現癌細胞であることを実証する
図12B。GAPDHは、タンパク質充填対照として使用される。
【０４３９】
図12C。4種の癌細胞系から採取された4つの培地に対するウェスタンブロット分析。PRL-3ホスファターゼは、B16F0細胞から培地中に分泌されることが見いだされ、一方、PRL-3ホスファターゼは、残りの3種の細胞から分泌されることが見いだされないことから、PRL-3ホスファターゼの分泌は、細胞タイプ特異的現象でありうることが示唆される。データから示唆されるように、in vivoで、PRL-3は、癌患者において血流中に分泌されうる。ホスファターゼ分泌については、本発明者らの文献に報告されていない。
【０４４０】
（実施例２７）
抗PRL1抗体および抗PRL3抗体のエピトープマッピング
抗PRL抗体269および318のそれぞれに対するエピトープは、次のように位置付けられる。
【０４４１】
第1に、本発明者らは、3種すべてのPRL間で同一であるアミノ酸のほとんどを除外する。第2に、本発明者らは、3種のPRL間のアミノ酸配列の差を選択する。第3に、それぞれの抗体がそれ自体の特異的領域に結合することに関して互いに識別可能でありうる特異的領域に対して、28種のペプチドをする。
【０４４２】
本発明者らは、28種のPRL-1、PRL-2、およびPRL-3特異的ポリペプチドスポットをとくにデザインして、Genemed Synthesis, Inc. (www.genemedsyn.com)に注文した。28種のペプチドスポットは、以下の表E1中にマップとして配置される。これはまた、図13Aおよび13Bに対するスポットに対応する各ポリペプチド配列を示している。
【表２】
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【０４４３】
表E1。抗PRL1抗体および抗PRL3抗体に対するエピトープ結合に関して検査された28種のペプチド。表は、各ドットに対する構成を表すマップを示している。図13A中および図13B中のドットに対応するポリペプチド配列が示されている。
【０４４４】
PVDFドットブロット膜に対するプロトコル
ブロッキング膜
1）完全に湿潤させた時に乳白色から均一な半透明灰色に変わるまで、100%メタノールを用いて数秒間にわたり膜を予備湿潤させる。2）水中で膜を45分間インキュベートしてメタノールを溶出させる。3）3% BSA中、4℃で、振盪しながら一晩ブロッキングする。
【０４４５】
免疫染色
1）振盪しながらPRL-1抗体（図13A中の#269）と共にまたはPRL-3抗体（図13B中の#318）と共に4℃で一晩インキュベートする。2）PBS tween-20で各10分間ずつ4回洗浄する。3）振盪しながら室温で抗マウスHRP 1:1000と共に2時間インキュベートする。4）PBS Tween-20で各10分間ずつ4回洗浄する。
【０４４６】
ECL発色
1）室温で検出剤と共に5分間インキュベートする。2）過剰の緩衝液を排出し、プラスチック/サランラップ中に配置す。3）暗室中で発色させる。
【０４４７】
結果
結果を図13Aおよび図13Bに示す。
【０４４８】
図13Aは、PRL-1（クローン#269）mAbに対するエピトープを位置付けるウェスタンブロット分析の結果を示している。2個の陽性ドットは、PRL-1 mAbが2種のポリペプチド（1a、TYKNMR;1b、TLNKFI）に優先的に結合することを示している。
【０４４９】
図13Bは、PRL-3（クローン#318）mAbに対するエピトープを位置付けるウェスタンブロット分析の結果を示している。2個のドットは、PRL-3 mAbが2種のポリペプチド（4f、KAKFYN; 5d、HTHKTR）に優先的に結合することを示している。
【０４５０】
結果からわかるように、PRL-1 mAb（クローン#269）およびPRL-3 mAb（クローン#318）は、非線状配列により形成されたエピトープに結合しうる。
【０４５１】
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本文書中に挙げられた出願および特許のそれぞれ、ならびに出願および特許のそれぞれの追行時を含めて以上の出願および特許のそれぞれで引用または参照されたそれぞれの文書(「出願で引用された文書」)、さらには出願および特許のそれぞれでならびに出願で引用された文書のいずれかに引用されたまたは挙げられた任意の製品に対する任意の製造業者の使用説明書またはカタログは、参照により結果として本明細書に組み入れられるものとする。さらに、本文中に引用されたすべての文書、および本文中に引用された文書中に引用または参照されたすべての文、ならびに本文中に引用されたまたは挙げられた任意の製品に対する任意の製造業者の使用説明書またはカタログは、参照により結果として本明細書に組み入れられるものとする。
【０４５２】
本発明に係る記載の方法およびシステムの種々の修正形態および変更形態は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者に自明なものであろう。特定の好ましい実施形態に関連させて本発明について説明してきたが、当然のことながら、特許請求された本発明は、そのような特定の実施形態になんら限定されるものではない。実際上、本発明を実施するための記載の形態の種々の修正形態のうち分子生物学または関連分野の当業者に自明な修正形態は、特許請求の範囲内に含まれるものとみなされる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年8月12日(2009.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌またはその転移を治療、予防、検出または診断する方法において使用するための抗体であって、該抗体が以下からなる群から選択される、上記抗体：
(a)配列番号2を含む重鎖可変領域配列と配列番号4を含む軽鎖可変領域配列とを含むPRL-1に結合する抗体；
(b)配列番号6を含む重鎖可変領域配列と配列番号8を含む軽鎖可変領域配列とを含むPRL-3に結合する抗体；
(c)配列番号10を含む重鎖可変領域配列と配列番号12を含む軽鎖可変領域配列とを含むPRL-3に結合する抗体；
(d) (a), (b)または(c)の抗原結合フラグメント；および
(e) (a), (b)または(c)と少なくとも90％同一の配列を含み、かつ好ましくは細胞の形質膜中を通過可能であることにより、細胞内のPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドに結合しうる抗体。
【請求項２】
癌またはその転移の治療、予防、検出または診断する方法において使用するための核酸であって、該核酸が請求項１に記載される(a), (b), (c), (d)または(e)のいずれかの抗体をコードする、上記核酸。
【請求項３】
以下からなる群から選択される、請求項２に記載の核酸：
(a)請求項１に記載の抗体 (a)をコードし、かつ配列番号1の配列および配列番号3の配列を含む核酸；
(b) 請求項１に記載の抗体 (b)をコードし、かつ配列番号5の配列および配列番号7の配列を含む核酸；および
(c) 請求項１に記載の抗体 (c)をコードし、かつ配列番号9の配列および配列番号11の配列を含む核酸。
【請求項４】
前記抗体がモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体を含み、PRL-1またはPRL-3に結合してそれらのプロテインチロシンホスファターゼ（PTP）活性を阻害することが可能である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体または核酸。
【請求項５】
癌またはその転移の治療、予防、検出または診断する方法において使用するための、請求項１〜４のいずれか1項に記載されるPRL-1に結合する抗体およびPRL-3に結合する抗体を含む組み合わせ。
【請求項６】
製薬上許容される賦形剤、希釈剤、または担体と一緒に、請求項１〜４のいずれか1項に記載の抗体または請求項５に記載の組み合わせを含む癌またはその転移の治療、予防、検出または診断する方法において使用するための医薬組成物。
【請求項７】
前記方法が、癌細胞を前記抗体または前記組合せに暴露することを含む、指定されたように使用するための請求項１〜６のいずれか1項に記載の抗体、核酸、組み合わせまたは医薬組成物。
【請求項８】
前記方法が、癌に罹患しているかまたは罹患している疑いのある個体に治療上有効量の前記抗体、前記組合せ、または前記組成物を投与することを含む、指定されたように使用するための請求項１〜７のいずれか1項に記載の抗体、核酸、組み合わせまたは医薬組成物。
【請求項９】
前記癌が、PRL-1またはPRL-3発現癌、転移癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、陰茎癌、子宮頸癌、脳癌、食道癌、膀胱癌、腎臓腎細胞癌、卵巣リンパ腫、および皮膚黒色腫を含む、指定されたように使用するための請求項１〜８のいずれか1項に記載の抗体、核酸、組み合わせまたは医薬組成物。
【請求項１０】
治療個体における転移性腫瘍の数が、未治療個体と比較して、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%低減される、指定されたように使用するための請求項１〜９のいずれか1項に記載の抗体、核酸、組み合わせまたは医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか1項に記載の抗体、請求項５に記載の組み合わせまたは請求項６に記載の医薬組成物を提供する工程、および該抗体をPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチド、例えばPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドを発現する細胞に結合させる工程であって、ここで該PRL-1が細胞内PRL-1ポリペプチドを含むか、または該PRL-3ポリペプチドが細胞内PRL-3ポリペプチドを含む、上記工程を含む方法。
【請求項１２】
癌に罹患しているかまたは罹患している疑いのある個体における転移性癌のような癌の治療または予防の方法であって、該方法が治療有効量の請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体、核酸、組み合わせまたは医薬組成物を投与することを含む、上記方法。
【請求項１３】
癌に罹患しているかまたは罹患している疑いのある個体における転移性癌のような癌の治療または予防の方法であって、該方法が請求項１２に記載の方法により該個体において癌を診断することと、請求項１２に記載の方法により該個体を治療することと、を含む、上記方法。
【請求項１４】
個体における転移性癌のような癌の検出または診断の方法であって、該個体に由来する生物学的サンプルを請求項１〜４のいずれか1項に記載の抗体、請求項５に記載の組み合わせまたは請求項６に記載の医薬組成物に曝露することと、該抗体とPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドとの間の結合を検出することと、を含む、上記方法。
【請求項１５】
癌またはその転移の検出および診断で使用するための、請求項１〜４のいずれか1項に記載の抗体、請求項５に記載の組み合わせまたは請求項６に記載の医薬組成物を使用説明書と一緒に含む診断用キットであって、該検出および診断が該抗体とPRL-1ポリペプチドまたはPRL-3ポリペプチドとの間の結合を検出することを含む、上記診断用キット。
【国際調査報告】
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