(57)【要約】本発明は、細胞シグナリングをモジュレートする化合物を同定するための方法、およびこのような化合物を使用する治療方法を提供する。本発明は、（ｉ）ホールアニマル（例えば、ゼブラフィッシュ）スクリーニングの開発、（ｉｉ）細胞ベースのＥＬＩＳＡスクリーニングの開発、および（ｉｉｉ）ＢＭＰインヒビターの新規クラスの同定に基づく。上記方法は、ゼブラフィッシュ胚と候補化合物とを接触させる工程および上記胚の表現型を観察する工程を包含し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリングまたはトランスホーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナリングを阻害する化合物を同定する方法であって、該方法は、非ヒト胚と候補化合物とを接触させる工程および該胚の表現型を観察する工程を包含し、ここで：
未処理のコントロールと比較した場合の該胚の背側化の検出が、ＢＭＰシグナリングを阻害する化合物の同定を示し；そして
未処理のコントロールと比較した場合の該胚の腹側化の検出が、ＢＭＰシグナリングを増強または開始する化合物の同定を示し；そして
未処理のコントロールと比較した場合の単眼症または頭のサイズの減少の検出が、ＴＧＦ−βシグナリングを阻害する化合物の同定を示す；
方法。
【請求項２】
前記非ヒト胚は、ゼブラフィッシュ胚、アフリカツメガエル胚、メダカ胚、およびキイロショウジョウバエ胚からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリングまたはトランスホーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナリングをモジュレートする化合物を同定する方法であって、該方法は、
細胞と候補化合物とを接触させる工程；
メタノール処理によって該細胞の原形質膜および核膜を透過性にし、そして該細胞中のタンパク質を沈殿させる工程；
グルタルアルデヒドによって沈殿したタンパク質を架橋する工程；
二官能性アミンによって該細胞由来の該グルタルアルデヒドをクエンチする工程；ならびに
未処理の細胞と比較した場合の化合物処理した細胞におけるＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化に対する該候補化合物の効果を決定する工程であって、ＳＭＡＤ１／５／８の増大したリン酸化の検出が、ＢＭＰシグナリングを活性化する化合物の同定を示し、ＳＭＡＤ１／５／８の減少したリン酸化の検出が、ＢＭＰシグナリングを阻害する化合物の同定を示し、ＳＭＡＤ２の増大したリン酸化の検出が、ＴＧＦ−βシグナリングを活性化する化合物の同定を示し、そしてＳＭＡＤ２の減少したリン酸化の検出が、ＴＧＦ−βシグナリングを阻害する化合物の同定を示す、工程；
を包含する、方法。
【請求項４】
前記メタノールは、氷冷であり、そして前記メタノール処理は、１０分間〜１５分間にわたって行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
グルタルアルデヒド溶液は、０．２５％〜２％のグルタルアルデヒドの濃度を含み、そしてグルタルアルデヒド処理は、１０分間〜１５分間にわたって行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記二官能性アミンは、２５〜２００ｍＭの濃度および８〜１０のｐＨにおいて使用されるリジン、エチレンジアミン、およびフェニレンジアミンからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ＳＭＡＤ１／５／８またはＳＭＡＤ２のリン酸化の検出は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の使用によって行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリングの阻害によって利益を得る被験体における疾患または状態を処置または予防する方法であって、該方法は、トランスホーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナリングと比較してＢＭＰシグナリングを選択的に阻害する化合物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項９】
前記化合物は、６−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）］−３−ピリジン−４−イル−ピラゾロ［１，５−ａ］−ピリミジン（化合物Ｃ／ドルソモルフィン）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物は、図１７に示される化合物から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患または状態は、家族性または散発性の原発性肺高血圧症、遺伝性出血性毛細管拡張症候群、心臓弁奇形、癌（一次治療として原発性腫瘍の増殖または転移をモジュレートすること、あるいは伝統的な癌治療に補助療法を提供することにおけるもの））、貧血、血管の石灰化、アテローム性動脈硬化症、弁の石灰化、腎性骨形成異常症、炎症性障害、ウイルスによる感染、細菌による感染、真菌による感染、結核菌による感染、寄生生物による感染、および進行性骨化性線維形成異常症からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌は、乳癌、前立腺癌、腎細胞癌、骨転移、骨肉腫、および多発性骨髄腫からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記炎症性障害は、強直性脊椎炎である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
トランスホーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナリングの阻害によって利益を得る被験体における疾患または状態を処置または予防する方法であって、該方法は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリングと比較してＴＧＦ−βシグナリングを選択的に阻害する化合物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１５】
前記疾患または状態は、線維性疾患あるいはマルファン症候群の弁または大動脈の異常である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記線維性疾患は、肝臓、腎臓、または肺の線維性疾患である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）インヒビターを含む薬学的組成物。
【請求項１８】
前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）インヒビターは、６−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）］−３−ピリジン−４−イル−ピラゾロ［１，５−ａ］−ピリミジン（化合物Ｃ／ドルソモルフィン）である、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
細胞の表現型を改変する方法であって、該方法は、該細胞と骨形成タンパク質（ＢＭＰ）インヒビターとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２０】
前記細胞は、胚性幹細胞または成体幹細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）インヒビターは、治療目的または診断目的のためにエキソビボまたはインビボで前記幹細胞の増殖または分化を可能にする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＢＭＰインヒビターは、６−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）］−３−ピリジン−４−イル−ピラゾロ［１，５−ａ］−ピリミジン（化合物Ｃ／ドルソモルフィン）である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、細胞シグナリングをモジュレートする化合物を同定するための方法、およびこのような化合物を使用する方法に関連する。
【０００２】
リガンドのトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）スーパーファミリー含むシグナリングは、細胞増殖、分化、およびアポトーシスを含む広範な細胞プロセスにとって中心的なものである。ＴＧＦシグナリングは、ＩＩ型レセプター（セリン／トレオニンキナーゼ）に対するＴＧＦリガンドの結合を含み、その結合は、Ｉ型レセプターを補充およびリン酸化する。次いで、上記Ｉ型レセプターは、共有型ＳＭＡＤに結合する特異型（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ＳＭＡＤ（Ｒ−ＳＭＡＤ；例えば、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ８またはＳＭＡＤ９）をリン酸化し、次いでＳＭＡＤ複合体は、ＳＭＡＤ複合体が転写調節において役割を果たす核に進入する。リガンドのＴＧＦスーパーファミリーは、ＴＧＦ−β／アクチビン／ｎｏｄａｌおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）によって特徴付けられる２つの主要な分岐を含む。
【０００３】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）リガンドによって媒介されるシグナルは、脊椎動物の寿命を通して種々の役割を果たす。胚発生の間に、背腹軸は、リガンド、レセプター、補助レセプター、および可溶性アンタゴニストの協調した発現によって形成されるＢＭＰシグナリング勾配によって確立される（非特許文献１）。過剰なＢＭＰシグナリングは、腹側化（背側構造の犠牲における腹側の拡大）をもたらすが、減少したＢＭＰシグナリングは、背側化（腹側構造の犠牲における背側の拡大）をもたらす（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。ＢＭＰは、原腸陥入、中胚葉誘導、器官形成、および軟骨内の骨形成の重要な調節因子であり、そして多分化能細胞集団の運命を調節する（非特許文献６）。ＢＭＰシグナルもまた、生理機能および疾患において重要な役割を果たし、そして原発性肺高血圧症、遺伝性出血性毛細管拡張症候群、進行性骨化性線維形成異常症、および若年性ポリポーシス症候群に関与する（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。
【０００４】
ＢＭＰシグナリングファミリーは、トランスホーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの多様なサブセット（非特許文献１０）である。２０種を超える公知のＢＭＰリガンドが、３種の異なるＩＩ型（ＢＭＰＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩａ、およびＡｃｔＲＩＩｂ）レセプターおよび少なくとも３種のＩ型（ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、およびＡＬＫ６）レセプターによって認識される。二量体のリガンドは、レセプターヘテロマーの構築を容易にし、構成的に活性なＩＩ型レセプターセリン／トレオニンキナーゼにＩ型レセプターセリン／トレオニンキナーゼをリン酸化させる。活性化Ｉ型レセプターは、ＢＭＰ反応性（ＢＲ−）ＳＭＡＤエフェクター（ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、およびＳＭＡＤ８）をリン酸化して、ＳＭＡＤ４（ＴＧＦシグナリングをも容易にする共有型）との複合体における核移行を容易にする。さらに、ＢＭＰシグナルは、ＳＭＡＤ依存性様式で細胞内エフェクター（例えば、ＭＡＰＫ  ｐ３８）を活性化し得る（非特許文献１１）。可溶性ＢＭＰアンタゴニスト（例えば、ノギン、コーディン、グレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）、およびフォリスタチン）は、リガンド隔離によってＢＭＰシグナリングを制限する。補助レセプター（例えば、ＲＧＭａ、ＤＲＡＧＯＮ（ＲＧＭｂ）、およびヘモジュベリン（ｈｅｍｏｊｕｖｅｌｉｎ）（ＨＪＶ，ＲＧＭｃ）を含む反発性ガイダンス分子（ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（ＲＧＭ）ファミリーのメンバー）は、補助レセプターが発現される標的組織における低レベルのＢＭＰリガンドに対する応答を増強する（非特許文献１２；非特許文献１３）。
【０００５】
ヘプシジン、ペプチドホルモンおよび全身の鉄バランスの中心的な調節因子の発現を調節することにおいてＢＭＰシグナルが果たす役割が、示唆されている（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。ヘプシジンは、結合し、そしてフェロポーチン（脊椎動物における唯一の鉄輸送体）の分解を促進する。フェロポーチン活性の喪失は、腸細胞、マクロファージ、および肝細胞における細胞内貯蔵からの血流に対する鉄の動員を妨害する（非特許文献１８）。肝臓のヘプシジン発現は、鉄の欠乏または過負荷、炎症、および低酸素の状態に応答性であるが、肝臓がこれらの刺激を感知し、そしてヘプシジン発現を調節する機構は、特に、ＨＡＭＰ遺伝子（ヘプシジンをコードする）に対するプロモーター鉄のレベルによってモジュレートされることが公知であるエレメントを有さないようであるので、不明確なままである。ＳＭＡＤ４が条件的に欠損したマウスは、鉄またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）のチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後にヘプシジンを誘導できず（非特許文献１８）、このことは、ＢＭＰ経路および／またはＴＧＦ−β経路が鉄または炎症によって媒介されるシグナルを伝達することを示唆する。さらに、Ｈｆｅ２（ＢＭＰ補助レセプターＨＪＶをコードする）の変異は、若年性ヘモクロマトーシス（鉄の過負荷がヘプシジン発現を誘発できない疾患）において同定されている（非特許文献１９）。この知見は、ＢＭＰシグナリングと鉄代謝との間の関連をさらに示唆するが、鉄または炎症によるヘプシジン発現のモジュレーションにおけるＢＭＰの役割は、依然として完全に理解されていない。
【０００６】
異常なＴＧＦ−βシグナリングは、多数のヒト疾患にも関与している。例えば、ＴＧＦ−βアップレギュレーションは、マルファン症候群患者の大動脈における病態生理学的な変化の基礎をなし得、そしてＴＧＦ−βは、腎臓、肝臓、および肺の線維性疾患において見られる線維症の重要なメディエーターであると考えられる。したがって、ＴＧＦ−βシグナリングを特異的に阻害する能力は、これらの状態を処置するためのアプローチおよびそれらの原因を決定することを提供する。
【０００７】
リガンド（現在、２５種より多い異なるリガンド）およびレセプター（ＢＭＰを認識する３種のＩ型レセプター；３種のＩＩ型レセプター）のレベルにおけるＢＭＰスーパーファミリーおよびＴＧＦ−βスーパーファミリーのおびただしい構造多様性、ならびにレセプター結合のヘテロ四量体様式を考慮すると、可溶性レセプター、内因性インヒビター、または中和抗体を介するＢＭＰシグナルを阻害するための伝統的なアプローチは、実用的でも有効でもない。内因性インヒビター（例えば、ノギンおよびフォリスタチン）は、リガンドサブクラスに対する限定的な特異性を有する。シグナルレセプターが、リガンドに対する限定的な親和性を有するが、リガンドヘテロ四量体は、特定のリガンドに対するいくぶん的確な特異性を示す。中和抗体は、特定のリガンドまたはレセプターに特異的であり、そしてまた、このシグナリング系の構造多様性によって制限される。
【０００８】
ＢＭＰシグナリング経路またはＴＧＦ−βシグナリング経路を特異的に拮抗する薬理学的因子は、治療用途または実験用途においてこれらの経路を操作するために使用され得る。しかし、ＴＧＦ−β経路またはＢＭＰ経路のいずれかに対する特異性を有する低分子を同定するための伝統的な生物化学アプローチは、ＴＧＦ−β／ＢＭＰレセプターの全体的な構造類似性によって阻まれている。例外は、ＳＢ−４３１５４２であり、ＳＢ−４３１５４２は、ＢＭＰシグナリングを媒介するレセプターに対する作用を有さないＴＧＦ−β１アクチビンレセプター様キナーゼ（ＡＬＫ）の選択的インヒビターである。ＢＭＰシグナリング経路またはＴＧＦ−βシグナリング経路に特異的である化合物の同定を可能にするアプローチは、これらの経路に関連する疾患および状態（例えば、上に記載されるもの）を処置することに使用するための治療剤の開発において有益である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍａｓｓａｇｕｅら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：１６９−１７８，２０００
【非特許文献２】Ｎｇｕｙｅｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９：９３  −１１０，１９９８
【非特許文献３】Ｆｕｒｔｈａｕｅｒら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１４：１８１−１９６，１９９９
【非特許文献４】Ｍｉｎｔｚｅｒら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８：８５９−８６９，２００１
【非特許文献５】Ｓｃｈｍｉｄら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７：９５７−９６７，２０００
【非特許文献６】Ｚｈａｏ，Ｇｅｎｅｓｉｓ  ３５：４３−５６，２００３
【非特許文献７】Ｗａｉｔｅら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４：７６３−７７３，２００３
【非特許文献８】Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６：７７−８２，２００４
【非特許文献９】Ｓｈｏｒｅら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３８：５２５−５２７，２００６
【非特許文献１０】Ｓｅｂａｌｄら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８５：６９７−７１０，２００４
【非特許文献１１】Ｎｏｈｅら，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １６：２９１−２９９，２００４
【非特許文献１２】Ｂａｂｉｔｔら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３８：５３１−５３９，２００６
【非特許文献１３】Ｂａｂｉｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２９８２０−２９８２７，２００５
【非特許文献１４】Ｐｉｇｅｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７８１１−７８１９，２００１
【非特許文献１５】Ｆｒａｅｎｋｅｌら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１５３２−１５４１，２００５
【非特許文献１６】Ｎｉｃｏｌａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：４５９６−４６０１，２００２
【非特許文献１７】Ｎｉｃｏｌａｓら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４：９７−１０１，２００３
【非特許文献１８】Ｎｅｍｅｔｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６：２０９０−２０９３，２００４
【非特許文献１９】Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６：７７−８２，２００４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、（ｉ）ホールアニマル（ｗｈｏｌｅ−ａｎｉｍａｌ）（例えば、ゼブラフィッシュ）スクリーニングの開発、（ｉｉ）細胞ベースのＥＬＩＳＡスクリーニングの開発、および（ｉｉｉ）ＢＭＰインヒビターの新規クラスの同定に基づく。したがって、第１の局面において、本発明は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリングまたはトランスホーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナリングを阻害する化合物を同定する方法を提供する。上記方法は、ゼブラフィッシュ胚と候補化合物とを接触させる工程および上記胚の表現型を観察する工程を包含し得る。このような方法において、未処理のコントロールと比較した場合の上記胚の背側化の検出が、ＢＭＰシグナリングを阻害する化合物の同定を示し、一方で、未処理のコントロールと比較した場合の単眼症または頭のサイズの減少の検出が、ＴＧＦ−βシグナリングを阻害する化合物の同定を示す。
【００１１】
第２の局面において、本発明は、ＢＭＰシグナリングまたはＴＧＦ−βシグナリングをモジュレートする化合物を同定する方法を提供し、その方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）細胞と候補化合物とを接触させる工程；（ｉｉ）メタノール処理（例えば、氷冷メタノール処理および／または１０〜１５分間のメタノール処理を使用する）によって上記細胞の原形質膜および核膜を透過性にし、そして上記細胞中のタンパク質を沈殿させる工程；（ｉｉｉ）グルタルアルデヒド（例えば、０．２５％〜２％グルタルアルデヒドの溶液および／または１０〜１５分間の処理を使用する）によって沈殿したタンパク質を架橋する工程；（ｉｖ）二官能性アミン（例えば、２５〜２００ｍＭの濃度および８〜１０のｐＨにおいて使用されるリジン、エチレンジアミン、およびフェニレンジアミン）によって上記グルタルアルデヒドをクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）する工程；ならびに（ｖ）未処理の細胞と比較した場合の化合物処理した細胞におけるＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化に対する上記候補化合物の効果を（例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）分析を使用して）決定する工程。このような方法において、ＳＭＡＤ１／５／８の増大したリン酸化の検出が、ＢＭＰシグナリングを活性化する化合物の同定を示し、ＳＭＡＤ１／５／８の減少したリン酸化の検出が、ＢＭＰシグナリングを阻害する化合物の同定を示し、ＳＭＡＤ２の増大したリン酸化の検出が、ＴＧＦ−βシグナリングを活性化する化合物の同定を示し、そしてＳＭＡＤ２の減少したリン酸化の検出が、ＴＧＦ−βシグナリングを阻害する化合物の同定を示す。
【００１２】
第３の局面において、本発明は、ＢＭＰシグナリングの阻害によって利益を得る被験体における疾患または状態を処置または予防する方法を含み、その方法は、ＴＧＦ−βシグナリングと比較してＢＭＰシグナリングを選択的に阻害する１種以上の化合物を被験体に投与する工程を包含する。１つの例において、上記化合物は、６−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）］−３−ピリジン−４−イル−ピラゾロ［１，５−ａ］−ピリミジン（本明細書中で「化合物Ｃ」および「ドルソモルフィン（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）」と称される）であるが、他の例において、上記化合物は、図１６に示される化合物から選択される。これらの方法に従って処置または予防される疾患または状態は、例えば、からなる群より選択される家族性または散発性の原発性肺高血圧症、心臓弁奇形、癌（例えば、乳癌、前立腺癌、腎細胞癌、骨転移、骨肉腫、および多発性骨髄腫）、貧血、血管の石灰化、アテローム性動脈硬化症、弁の石灰化、腎性骨形成異常症、炎症性障害（例えば、強直性脊椎炎）、および進行性骨化性線維形成異常症であり得る。本発明はまた、疾患および状態（例えば、本明細書に記載されるもの）の予防および処置における本明細書に記載されるようなＢＭＰシグナリングモジュレーターおよびＴＧＦ−βシグナリングモジュレーターの使用を含む。
【００１３】
第４の局面において、本発明は、ＴＧＦ−βシグナリングの阻害によって利益を得る被験体における疾患または状態を処置または予防する方法を含み、その方法は、ＢＭＰシグナリングと比較してＴＧＦ−βシグナリングを選択的に阻害する１種以上の化合物を被験体に投与する工程を包含する。これらの方法に従って処置または予防される疾患または状態は、例えば、線維性疾患（例えば、肝臓、腎臓、または肺の線維性疾患）あるいはマルファン症候群の弁または大動脈の異常であり得る。
【００１４】
本発明はまた、疾患および状態（例えば、本明細書に記載されるもの）の予防および処置における本明細書に記載されるようなＢＭＰシグナリングモジュレーターおよびＴＧＦ−βシグナリングモジュレーターの使用を含む。
【００１５】
第５の局面において、本発明は、本明細書に記載されるようなＢＭＰシグナリングおよびＴＧＦ−βシグナリングをモジュレートする化合物を含む薬学的組成物を含む。１つの例において、上記化合物は、ＢＭＰを阻害する６−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）］−３−ピリジン−４−イル−ピラゾロ［１，５−ａ］−ピリミジン（化合物Ｃ／ドルソモルフィン）である。
【００１６】
第６の局面において、本発明は、細胞（例えば、胚性幹細胞または成体幹細胞）の表現型を改変する方法を提供する。これらの方法は、上記細胞と骨形成タンパク質（ＢＭＰ）インヒビター（例えば、本明細書に記載される方法を使用して同定されるＢＭＰインヒビター（例えば，６−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）］−３−ピリジン−４−イル−ピラゾロ［１，５−ａ］−ピリミジン（化合物Ｃ／ドルソモルフィン）））とを接触させる工程を包含する。特定の条件下で、ＢＭＰ４シグナリングは、多能性を維持するために作用するので、胚性幹細胞におけるＢＭＰシグナリングの阻害は、分化を促すために使用され得る（Ｑｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：６０２７−６０３２，２００４）。また、他の条件下で、胚性幹細胞におけるＢＭＰシグナリングの阻害は、ＢＭＰシグナリングが分化を誘導するように作用する場合、多能性の維持を支援するために使用され得る（Ｘｕら，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：１８５−１９０，２００５；Ｘｕら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１２６１−１２６４，２００２）。
【００１７】
本発明は、いくつかの利点を提供する。例えば、本発明のスクリーニング方法は、ＢＭＰシグナリング経路またはＴＧＦ−βシグナリング経路に特異的である化合物の同定を容易にする。本明細書中の他の場所で考察される通り、ＢＭＰシグナリングまたはＴＧＦ−βシグナリングに対する特異性を有する化合物を同定することは、これらの経路の複雑性および高度の類似性に起因して、過去に挑戦されている。しかし、このような特異性を得ることは、これらの経路がいくつかの状況において反対の活性を有するので重要である。
【００１８】
ＢＭＰシグナリングまたはＴＧＦ−βシグナリングに特異的である化合物の同定を容易にすることに加えて、本発明のスクリーニング方法はまた、他の利点を提供する。例えば、処理された胚において観察される古典的な形態学の分析を含むホールアニマルベースの方法を使用すると、ＢＭＰシグナリング経路またはＴＧＦ−βシグナリング経路に対する特異性の程度がインビボで特異的作用を達成するために充分であるが、リード化合物の開発段階において早期に確保される。さらに、以下で詳細に考察される通り、細胞培養ベースの方法は、特異性、速度、および費用に関する利点を提供する。
【００１９】
本発明によって同定され得るようなＢＭＰシグナリングまたはＴＧＦ−βシグナリングの低分子モジュレーターは、ノギンおよびフォリスタチンなどの組換え内因性ＢＭＰインヒビターを上回る利点を提供する。なぜならば、組換え内因性ＢＭＰインヒビターは、インビボで投与するためには非常に高価であり、グラム量のタンパク質の静脈内投与を必要とし、疎水性であり得るか、または溶液中での安定性の懸案事項を有し得るからである。さらに、組換え内因性ＢＭＰインヒビターは、それらの特異性が多様なＢＭＰリガンドのうちの小さいサブセットに対するものに限定される。さらに、治療剤としての組換えタンパク質の使用に対する別の制限は、免疫応答を誘発する可能性であり、このことは、その組換えタンパク質の効力を制限しそして／またはレシピエントにおいて疾病を急激に引き起こす。低分子モジュレーターのさらなる利点は、その低分子モジュレーターが経口的に利用可能であり得、したがって、投与および処置のコンプライアンスを促進し得ることである。治療方法における化合物Ｃ／ドルソモルフィンの使用は、ＢＭＰシグナリングに対するその特異性だけでなく、マウスは１日あたり１０〜３０ｍｇ／ｋｇの用量を明らかな毒性を伴わずに許容し得ることが示されていることにも起因して、有利である（Ｋｉｍら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１９９７０−１９９７６，２００４）。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ゼブラフィッシュ胚の背側化を示す一連の画像である（パネルＤ〜Ｅは、Ｋｒａｍｅｒら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５０：２６３−２７９，２００２Ｓから複製および適用されている）。受精後の時間（ｈｐｆ）で３６時間における野生型胚は、正常な頭、尾、および腹びれの構造を示す（Ｂ〜Ｃ）。選択的ＢＭＰインヒビターによって処理された胚は、背側化およびＢＭＰシグナリングの特異的阻害の両方と一致して、３６ｈｐｆにおける腹びれの発達の低下を示すか、または他の例において、２４ｈｐｆの非常に減弱した尾の発達を示す（Ｄ〜Ｅ）。異なるｓｍａｄ５対立遺伝子を有する背側化した胚。選択的ＢＭＰインヒビターによって処理された胚は、ｓｍａｄ５遺伝子中の変異によってもたらされた背側化の範囲をかなり模倣する。
【図２】図２は、単眼症の表現型を示す一連の画像である（パネルＡ〜Ｂは、それぞれ、Ｔｉａｎら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０：３３３１−３３４２，２００３；およびＦｅｌｄｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：１８１−１８５，１９９８から複製および適用されている）。Ａ．単眼体（ＴＧＦ−β遺伝子）遺伝子の変異を有する胚。Ｂ．斜視および単眼体の二重変異胚。斜視遺伝子はまた、ＴＧＦ−β遺伝子ファミリーのメンバーをコードする（Ｃ〜Ｄ）。選択的ＴＧＦ−βインヒビターによって処理された胚は、単眼症および重度の頭のサイズの減少を示す。
【図３】図３は、野生型（ＷＴ）およびＢＭＰ  ＩＩ型レセプターノックアウト（ＫＯ）細胞（左のパネル）における、細胞ＥＬＩＳＡによるＢＭＰ−４媒介性ＳＭＡＤ作用の高感度な検出を示す２つのグラフである。ＫＯ細胞は、先に示される（Ｙｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２４４４３−２４４５０，２００５）通り、ＢＭＰ７の作用に対する選択性の増大を示す（右のパネル）。
【図４】図４は、細胞ＥＬＩＳＡによってアッセイされたＢＭＰ４によるＳＭＡＤ１／５／８の活性化が化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって強力かつ優先的に阻害されることを示すグラフである。化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、０．２μＭ未満のＩＣ５０でＢＭＰシグナリング経路の活性化を強力に阻害する。
【図５】図５は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンの構造の概略図である。この化合物は、約１５〜３０μＭのＩＣ５０をその経路に対して有するＡＭＰキナーゼのインヒビターとして先に記載されている（Ｚｈｏｕら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：１１６７−１１７４，２００１）。
【図６】図６は、ＢＭＰ４によるＳＭＡＤ１／５／８の活性化が化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって優先的に阻害されることを示す。
【図７】図７は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＴＧＦ−βシグナリング経路に影響を及ぼさないことを示す。
【図８】図８は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＢＭＰによって媒介されるＭＡＰキナーゼ活性化を阻害しないことを示す。ＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍｌ）は、ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化を誘導し、そして先に示される（Ｙｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２４４４３−２４４５０，２００５）通り、ｐ３８はＰＡＳＭＣにおけるウェスタンブロットによって測定される。化合物Ｃ／ドルソモルフィン（０．２μＭ〜４０μＭ）は、ｐ３８活性化を阻害することなく用量依存的にＳＭＡＤ１／５／８の活性化を阻害した。
【図９】図９は、ゼブラフィッシュ胚の発生における化合物Ｃ／ドルソモルフィンが背側化を誘導することを示す一連の画像である（パネルＡ〜Ｃは、Ｎｇｕｙｅｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９：９３−１１０，１９９８、およびＦｕｒｔｈａｕｅｒら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１４：１８１−１９６，１９９９から複製および適用されている）。Ａ．受精後の時間（ｈｐｆ）で３６時間の野生型胚は、正常な頭、尾、および腹びれの構造を示す。Ｂ．ＢＭＰ２ｂの過剰発現は、３６ｈｐｆにおいて、尾および尾びれの構造の過剰な発生を伴う腹側化、および減少した腹側の発生を示す。Ｃ．ノギン（ＢＭＰ２およびＢＭＰ４の選択的インヒビター）の過剰発現は、３６ｈｐｆにおいて、腹側の構造が保存されているが、減少した尾および腹びれの発生を伴う背側化を誘導する。Ｄ．３６ｈｐｆにおける正常な野生型胚（Ｅ〜Ｆ）。５〜２０μＭの化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって処理された胚は、背側化およびＢＭＰシグナリングの特異的阻害の両方と一致して、３６ｈｐｆにおいて低下した腹びれの発生を示すか、または別の例において、２４ｈｐｆにおいて重度に減弱した尾の発生を示す。
【図１０】図１０は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンが細胞毒性を伴わずにＣ２Ｃ１２細胞におけるＢＭＰ媒介性の骨形成分化を阻害することを示す２つのグラフである。
【図１１】図１１は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＣ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞分化転換を阻害することを示す一連のグラフである。
【図１２】図１２は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＩ型レセプターＡＬＫ２およびＡＬＫ３の活性形態を阻害することを示す一連のグラフである。
【図１３】図１３は、ゼブラフィッシュにおけるカルセイン染色を示す画像である。
【図１４】図１４は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがゼブラフィッシュにおける椎骨の鉱化作用を破壊することを示す画像である。
【図１５】図１５は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがゼブラフィッシュにおける脳顔面頭蓋骨の鉱化作用を破壊することを示す画像である。
【図１６】図１６は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンが受精後１０日目のゼブラフィッシュにおいて全体の形態を破壊することなく骨の鉱化作用を阻害することを示す画像である。
【図１７】図１７は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンおよびアナログ構造の概略図である。化合物Ｃ／ドルソモルフィン（中央）は、群が他のキナーゼ活性（ＶＥＧＦＲ２またはＫＤＲ）の阻害について同様のプロフィールを有することが先に記載されているようないくつかの誘導体構造と一緒に示される。
【図１８】図１８は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがゼブラフィッシュ胚において背側化を誘導することを示す。（ａ）化合物Ｃ／ドルソモルフィンの構造が示される。（ｂ）３６ｈｐｆにおけるビヒクル処置の野生型（ｗｔ）ゼブラフィッシュ胚は、正常な背腹軸パターン形成を示す。胚（ｂ〜ｅ）は、側面図（左前方および右後方）において示される。（ｃ）６〜８ｈｐｆにおける１０μＭの化合物Ｃ／ドルソモルフィン（ｄｍ）によって処理されたゼブラフィッシュ胚は、３６ｈｐｆにおいて明らかな腹側尾びれ（ｖｅｎｔｒａｌ  ｔａｉｌ  ｆｉｎ）の喪失を伴う軽度の背側化を示す。（ｄ）６ｈｐｆにおける１０μＭの化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって処理された偶発的な野生型胚は、４８ｈｐｆにおいて異所性の尾（＊）を発生した。（ｅ）１〜２ｈｐｆにおける１０μＭの化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって処理された胚は、腹側性に誘導された後方の組織を４８ｈｐｆにおいて非常に欠く重度の背側化を示す。（ｆ〜ｇ）芽期（ｂｕｄ  ｓｔａｇｅ）（ｆは野生型である）において、２ｈｐｆにおいて化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって処理された胚の腹側の図は、卵形状を示す（ｇ）。（ｈ〜ｉ、左前方の側面図）１０体節期（ｈは野生型である）において、２ｈｐｆにおいて化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって処理された胚は、異常な尾芽形態を示す（ｉ）。（ｌ〜ｏ）側面図から示される１８体節期の野生型胚のインサイチュハイブリダイゼーションは、遠位の尾における腹側マーカーｅｖｅ１の代表的な発現（矢印）を示す（ｊ）。１ｈｐｆにおける化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１０μＭ）によって処理された胚は、遠位の尾におけるｅｖｅ１発現を示さない（ｋ）。（ｌ〜ｍ）６体節期（１２ｈｐｆ）の胚のインサイチュハイブリダイゼーションは、左前方および右後方の背面図によって示される。ｐａｘ２．１によって表示された中脳・後脳境界（矢印）は、１ｈｐｆにおける化合物Ｃ／ドルソモルフィン処理によって横方向に拡大する（ｌ、野生型と比較したｍ）。Ｋｒｏｘ２によって表示された菱脳節３および菱脳節５（矢印）、およびＭｙｏＤによって表示された体節中胚葉は、化合物Ｃ／ドルソモルフィン処理において横方向に拡大する（ｎ、野生型と比較したｏ）。（ｐ）単細胞期に１ｎｇのコーディンモルホリノを注射された胚は、腹側化と一致して、３６ｈｐｆにおいて拡大した尾部構造および内部細胞塊（矢印）を伴う低形質の頭部構造を示す。（ｑ）対照的に、２ｈｐｆにおいて化合物Ｃ／ドルソモルフィン（２０μＭ）によって処理されたコーディンモルファント胚は、ほとんど腹側化を示さないか、全く腹側化を示さない。
【図１９】図１９は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンが処置の段階によって変化するゼブラフィッシュ胚における背側化表現型の範囲を誘導することを示す。背側化の程度の変化は、発生初期（０〜８ｈｐｆ）の間の化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１０μＭ）による処理後に、受精後の時間（ｈｐｆ）で４８時間においてゼブラフィッシュ胚で観察された。（ａ）６〜８ｈｐｆにおいて処置され始めた胚は、軽度の背側化を示し、その背側化は、文脈において記載される尾びれの欠損に加えて、腹側尾びれの部分的な欠如（矢印）を誘導した。（ｂ）４〜６ｈｐｆにおいて処理された胚は、やや湾曲した遠位の尾を有する胚の１／３の長さよりも大きい短縮された尾の計測によって特徴付けられる中程度の背側化欠損を示した。（ｃ）２〜４ｈｐｆに処理された胚は、胚の１／３の長さよりも短い短縮かつ湾曲した尾の計測によって特徴付けられる重度の背側化欠損を示した。発生の異なる段階における化合物Ｃ／ドルソモルフィン処理の背側化効果の浸透度および重篤度は、表１に示される。
【図２０】図２０は、ＡＭＰＫ  α−サブユニットノックダウンがゼブラフィッシュ胚において背側化を引き起こさないことを示す。ゼブラフィッシュの発生における不十分なＡＭＰＫ活性の効果を評価するために、１細胞期の胚は、ヒトＡＭＰＫ、αＡ（ＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＴＴＡＣＣＴＴＴＧＡＣ）（エキソン１−イントロン１境界）およびαＢ（ＴＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＡＣＴＴＡＡＣＴＣＴＴＣＡＣ）（エキソン１−イントロン１境界）の触媒性α−サブユニットのゼブラフィッシュオルソログに対するスプライス標的モルホリノを注射され、そして２４ｈｐｆの表現型について試験された。８ｎｇのいずれかのモルホリノを単独で注射された胚は、任意の表現型を示さなかった。（ａ〜ｅ）４ｎｇの両方のモルホリノの各々を用いた胚の注射は、共に、軽度の発達遅延を引き起こすか（ｃ〜ｄ、対コントロールａ〜ｂ）、またはいくつかの場合において（８％未満の胚）、壊死性の頭および尾の表現型を引き起こした（ｅ）。上記表現型は、化合物Ｃ／ドルソモルフィン処理によって示された背側化と類似していなかった。（ｆ）ＡＭＰＫ  αＡ＋αＢモルホリノの両方を注射された胚におけるＡＭＰＫ  α−サブユニットの発現は、正常にスプライシングされた転写物の存在についてＲＴ−ＰＣＲによって試験された。コントロールとしてβ−アクチン発現を使用すると、これらのモルホリノは、ＡＭＰＫ  αＡ（９７％ノックダウン）転写物およびＡＭＰＫ  αＢ（９９％ノックダウン）転写物の発現を効率的に抑制した。
【図２１】図２１は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＢＭＰ  Ｉ型レセプター機能を阻害することによってＳＭＡＤのＢＭＰ媒介性の活性化を阻害することを示す。（ａ）３０分間にわたるＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍｌ）によるＰＡＳＭＣの処理は、イムノブロットによって検出されるＢＲ−ＳＭＡＤ（１、５、および８）およびＭＡＰＫ  ｐ３８のリン酸化を誘導した。３０分間にわたる０．２〜４０μＭの化合物Ｃ／ドルソモルフィン（ＤＭ）による前処理は、ＢＭＰ４媒介性ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化の用量依存性の阻害を誘導したが、同じ条件下で、ＭＡＰＫ  ｐ３８のＢＭＰ４媒介性リン酸化に影響を及ぼさなかった。等価のタンパク質負荷は、総ＳＭＡＤ１およびα−チューブリンの検出によって確認された。（ｂ）ＰＡＳＭＣを化合物Ｃ／ドルソモルフィン（０．１〜５０μＭ）と一緒にインキュベートすることによるＢＭＰ４刺激性のＳＭＡＤ１／５／８リン酸化の阻害のヒルプロットは、０．４７μＭの機能的ＩＣ５０を示す。（ｃ）化合物Ｃ／ドルソモルフィンとは対照的に、３０分間にわたるノギン（１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）による細胞の前処理は、ＭＡＰＫ  ｐ３８およびＳＭＡＤ１／５／８のＢＭＰ４媒介性リン酸化を阻害した。（ｄ）化合物Ｃ／ドルソモルフィン（４μＭ）による前処理は、３０分間のＰＡＳＭＣにおいてＢＭＰ２、４、６、および７（１０ｎｇ／ｍｌ）によるＳＭＡＤ１／５／８の活性化を阻害し、そしてリン酸化されたＳＭＡＤ／１／５／８のレベルを、ＢＭＰによって処理されなかった細胞における基礎レベルを下回って減少させた。（ｅ）ＴＧＦ−β１（０．５ｎｇ／ｍｌ）によるＰＡＳＭＣの処理は、ＳＭＡＤ２リン酸化を誘導した。化合物Ｃ／ドルソモルフィン（０．１〜２０μＭ）による前処理は、３０分間におけるＳＭＡＤ２のＴＧＦ−β１媒介性活性化を阻害しなかった。（ｆ）アクチビンＡ（８０ｎｇ／ｍｌ）によるＰＡＳＭＣの処理は、ＳＭＡＤ２のリン酸化を誘導した。化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ＳＭＡＤ２のアクチビンＡ媒介性活性化を１０μＭ以上の濃度で中程度にのみ阻害した。（ｇ）構成的に活性なＩ型レセプターｃＤＮＡ（ｃａＡＬＫ２、ｃａＡＬＫ３、またはｃａＡＬＫ６）によるＢＭＰＲ−ＩＩ欠損ＰＡＳＭＣの一過性トランスフェクションは、イムノブロットによって検出される細胞抽出物におけるリン酸化されたＳＭＡＤ１／５／８のレベルを増大させた。化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１０μＭ）との同時インキュベーションは、ｃａＡＬＫトランスフェクションによって見られるホスホ−ＳＭＡＤ１／５／８の増大を阻害した。（ｈ）ｃａＡＬＫ２、ｃａＡＬＫ３、またはｃａＡＬＫ６によるＢＭＰＲ−ＩＩ欠損ＰＡＳＭＣの一過性トランスフェクションは、Ｉｄ１プロモーター活性の５倍〜１２倍の増大をもたらした（ＢＲＥ−Ｌｕｃ）。構成的に活性なＩ型レセプターの各々によって媒介されるＩｄ１プロモーター活性は、用量依存様式における化合物Ｃ／ドルソモルフィン（ｃａＡＬＫ２については０．１〜５μＭ、ｃａＡＬＫ３については０．２５〜１０μＭ、およびｃａＡＬＫ６については０．５〜２０μＭ）による同時処理によって低下した。
【図２２】図２２は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＭＡＰＫ  ｐ３８、ＴＧＦ−βおよびアクチビンシグナリングの存在においてＳＭＡＤのＢＭＰ媒介性活性化を阻害することを示す。（ａ）３０分間にわたるＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍｌ）によるＰＡＳＭＣの処理は、イムノブロットによって検出されるＢＲ−ＳＭＡＤ（１、５、および８）およびＭＡＰＫ  ｐ３８のリン酸化を誘導した。３０分間にわたる０．２〜４０μＭにおける化合物Ｃ／ドルソモルフィン（ＤＭ）による前処理は、ＢＭＰ４媒介性ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化の用量依存性の阻害を誘導したが、同じ条件下でＭＡＰＫ  ｐ３８のＢＭＰ４媒介性リン酸化に影響を及ぼさなかった。等価のタンパク質負荷は、α−チューブリンの検出によって確認された。（ｂ）化合物Ｃ／ドルソモルフィンとは対照的に、３０分間にわたるノギン（１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）による細胞の前処理は、ＭＡＰＫ  ｐ３８およびＳＭＡＤ１／５／８のＢＭＰ４媒介性リン酸化を阻害した。（ｃ）化合物Ｃ／ドルソモルフィン（４μＭ）による前処理は、３０分間のＰＡＳＭＣにおいて２、４、６、および７（１０ｎｇ／ｍｌ）によるＳＭＡＤ１／５／８の活性化を阻害し、そしてリン酸化されたＳＭＡＤ／１／５／８のレベルを、ＢＭＰによって処理されなかった細胞における基礎レベルを下回って減少させた。（ｄ）ＴＧＦ−β１（０．５ｎｇ／ｍｌ）によるＰＡＳＭＣの処理は、ＳＭＡＤ２リン酸化を誘導した。化合物Ｃ／ドルソモルフィン（０．１〜２０μＭ）による前処理は、３０分間においてＳＭＡＤ２のＴＧＦ−β１媒介性活性化を阻害しなかった。（ｅ）アクチビンＡ（８０ｎｇ／ｍｌ）によるＰＡＳＭＣの処理は、ＳＭＡＤ２のリン酸化を誘導した。化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ＳＭＡＤ２のアクチビンＡ媒介性活性化を１０μＭ以上の濃度で中程度にのみ阻害した。
【図２３】図２３は、ＢＭＰＲ−ＩＩ欠損細胞におけるＢＭＰシグナリングに対する化合物Ｃ／ドルソモルフィンの効果を示す。ＢＭＰＲ−ＩＩ欠損ＰＡＳＭＣは、化合物Ｃ／ドルソモルフィンの存在または非存在において種々のＢＭＰによって処理された。抽出物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画され、次いでリン酸化されたＳＭＡＤ１／５／８およびα−チューブリンに特異的な抗体を使用してイムノブロットされた。ＢＭＰ２、４、６、および７（１０ｎｇ／ｍｌ）は、ＢＭＰＲ−ＩＩ欠損ＰＡＳＭＣにおいて３０分間でＳＭＡＤ１／５／８の活性化を誘導した。化合物Ｃ／ドルソモルフィン（４μＭ）による前処理は、ＢＭＰＲ−ＩＩ欠損細胞においてＢＭＰリガンドによるＳＭＡＤ１／５／８の活性化を阻害し、このことは、化合物Ｃ／ドルソモルフィンによるＢＭＰシグナリングの阻害がＢＭＰＲ−ＩＩを必要としなかったことを示す。
【図２４】図２４は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンが活性なＩ型レセプターＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７によって媒介される転写を阻害しないことを示す。構成的に活性なＩ型レセプター（ｃａＡＬＫ４、ｃａＡＬＫ５、またはｃａＡＬＫ７）をコードするｃＤＮＡによるＰＡＳＭＣの一過性トランスフェクションは、ＰＡＩ−１プロモーター活性（ＣＡＧＡ−Ｌｕｃ）の２倍〜５倍の増大をもたらした。ｃＤＮＡトランスフェクション単独によるＣＡＧＡ−Ｌｕｃ活性の最大レベルの％として示されるＰＡＩ−１プロモーター活性は、２０μＭまでの濃度で化合物Ｃ／ドルソモルフィンを用いた同時処理によって低下しなかった。
【図２５】図２５は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがインビトロで骨形成分化を阻害し、インビボで骨鉱化作用を阻害することを示す。（ａ）ＢＭＰ４またはＢＭＰ６によるＣ２Ｃ１２細胞の処理は、骨芽細胞の分化と一致して、５日間の培養後にアルカリホスファターゼ活性の発現をもたらした。化合物Ｃ／ドルソモルフィン（４μＭ）による前処理は、アルカリホスファターゼ活性のＢＭＰ媒介性誘導を阻害した（各条件についてｎ＝６、平均±Ｓ．Ｄとして示される結果）。（ｂ）化合物Ｃ／ドルソモルフィンによるＣ２Ｃ１２細胞の処理は、ＤＮＡ結合色素（ＣｙＱｕａｎｔ）を使用してアッセイされる細胞数に影響を及ぼさなかった。（ｃ〜ｅ）１０ｄｐｆにおけるカルセイン蛍光染色によるゼブラフィッシュの石灰化した骨格構造の可視化、左側面図。野生型のＤＭＳＯ処理された魚は、１１〜１４セグメントの正常な椎骨染色を示した（ｃ）。化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１〜４μＭ）による２４ｈｐｆにおけるゼブラフィッシュの処理は、１０ｄｐｆにおいて背側化の形跡を伴わない生存可能な魚をもたらした。しかし、椎骨セグメントおよび脳顔面頭蓋骨の石灰化の減少は、化合物Ｃ／ドルソモルフィン処理した魚  対  ビヒクル処理した魚によって観察された（ｄ〜ｅ）。（ｆ）４μＭの化合物Ｃ／ドルソモルフィン処理によって、石灰化した椎骨の数の有意な減少（Ｐ＜０．００１）が、観察された（ＤＭＳＯについてはｎ＝１９；化合物Ｃ／ドルソモルフィン処理（ＤＭ）についてはｎ＝１８、平均±Ｓ．Ｄ．として示される結果）。
【図２６】図２６は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって処理された発生中のゼブラフィッシュは、低下した椎骨および脳顔面頭蓋骨の石灰化を示すが、他の点では生存可能である。（ａ）２４ｈｐｆ（背腹軸特定の完了後）に化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１〜４μＭ）によるゼブラフィッシュの処理は、背側化をもたらさなかったが、１０ｄにおいて椎骨セグメントおよび脳顔面頭蓋骨の石灰化の形跡を減少させた。（ｂ）しかし、処理された魚は、野生型コントロールの魚と比較して、明視野顕微鏡によって形態学的に全体として正常であり、かつ生存可能であるように見える（ｃ）。
【図２７】図２７は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンが培養された肝細胞腫由来細胞においてＢＭＰ誘導性ヘプシジン発現およびＨＪＶ誘導性ヘプシジン発現を阻害することを示す。（ａ）ＢＭＰ２（２５ｎｇ／ｍｌ）によるＨｅｐ３Ｂ細胞の処理は、ヘプシジンルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｈｅｐ−Ｌｕｃ）によって測定される場合、未処理の細胞と比較してヘプシジンプロモーター活性をほぼ５０倍増大させた。化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１０μＭ）による同時処理は、ＢＭＰ２によるヘプシジンプロモーター活性の誘導を廃絶した（三連の測定値、平均±Ｓ．Ｄ．として示される結果）。（ｂ）ＨＪＶによるＨｅｐ３Ｂ細胞のトランスフェクションは、ヘプシジンプロモーター活性を１２倍増大させた。化合物Ｃ／ドルソモルフィンによる処理は、ヘプシジンプロモーター活性のＨＪＶ媒介性の増大を遮断した（三連の測定値、平均±Ｓ．Ｄ．として示される結果）。（ｃ）ヘプシジンｍＲＮＡのレベルは、ＨｅｐＧ２細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された。化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１０μＭ）による処理は、基礎のヘプシジン発現を５０分の１に減少させた。ＢＭＰ２による処理は、基礎レベルを上回ってヘプシジンを１６倍増大させた。ＢＭＰ２と組み合わせた化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１０μＭ）による処理は、ヘプシジンｍＲＮＡのレベルを基礎レベル未満に減少させた（三連の測定値、結果は平均±Ｓ．Ｄ．として示される）。（ｄ〜ｅ）Ｈｅｐ３Ｂ細胞において、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたヘプシジンｍＲＮＡおよびＩｄ１  ｍＲＮＡのレベルは、６時間にわたるＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）処理に応答して増大した。化合物Ｃ／ドルソモルフィン（４μＭ）単独またはＩＬ−６と組み合わせた化合物Ｃ／ドルソモルフィン（４μＭ）による処理は、ヘプシジンｍＲＮＡおよびＩｄ１  ｍＲＮＡのレベルを基礎レベル未満まで減少させ、コントロール遺伝子（１８Ｓ）の発現に対する効果を有さなかった（三連の測定値、結果は平均±Ｓ．Ｄ．として示される）。
【図２８】図２８は、ＡＭＰＫの阻害がヘプシジンのＢＭＰ誘導性発現を阻害しないことを示す。Ｈｅｐ３Ｂ細胞において、ＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍｌ）は、４時間にわたる処理後にｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されるヘプシジンｍＲＮＡのレベルを３５倍増大させた。ＡＭＰＫ活性（２５０μＭ）を廃絶することが公知である濃度のＡｒａ−Ａまたは化合物Ｃ／ドルソモルフィン（ＤＭ、４μＭ）単独による処理は、ヘプシジン発現のベースラインレベルを、それぞれ、４０％および２７％低下させた。ＢＭＰ４による処理の３０分前のＡｒａ−Ａによる前処理は、ＢＭＰ４がヘプシジン発現を誘導する能力に著しい影響を及ぼさなかったが、化合物Ｃ／ドルソモルフィンによる前処理は、ＢＭＰ４に対する応答を完全に廃絶した（結果は平均±Ｓ．Ｄ．として示される、ＢＭＰ４単独に対して
【数１】
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）。
【図２９】図２９は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンが鉄媒介性の肝臓ＢＲ−ＳＭＡＤ活性化およびヘプシジンの発現を阻害することを示す。（ａ）成体ゼブラフィッシュにおける鉄−デキストラン（Ｆｅ−Ｄｅｘ）の腹腔内注射は、デキストラン注射した魚（Ｄｅｘ）と比較して、１時間後の肝臓抽出物においてＳＭＡＤ１／５／８リン酸化（α−チューブリンレベルに対して正規化される）のほぼ３倍の増大をもたらした（各群においてｎ＝３、Ｐ＜０．００１）。（ｂ）２３μｇ／ｇの化合物Ｃ／ドルソモルフィンと鉄−デキストラン（Ｆｅ−ｄｅｘ＋ＤＭ）との同時注射は、鉄−デキストランおよびビヒクル（Ｆｅ−ｄｅｘ＋ＤＭＳＯ）を注射された魚と比較して、ゼブラフィッシュ肝臓においてＳＭＡＤ１／５／８リン酸化をほぼ３分の１に減少させた（各群においてｎ＝３、Ｐ＜０．０３）。（ｃ）成体マウスにおける鉄−デキストランおよびビヒクル（Ｆｅ−Ｄｅｘ＋ＤＭＳＯ）の静脈内注射は、デキストランおよびビヒクル（Ｄｅｘ＋ＤＭＳＯ）を注射されたマウスと比較して、１時間後の肝臓抽出物において３倍よりも大きいＳＭＡＤ１／５／８リン酸化の増大をもたらした。鉄−デキストランおよび化合物Ｃ／ドルソモルフィン（Ｆｅ−Ｄｅｘ＋ＤＭ）を注射されたマウスは、肝臓ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化の増大を示さなかった。（ｄ）鉄−デキストランおよびビヒクル（Ｆｅ−ｄｅｘ＋ＤＭＳＯ）を腹腔内に注射されたゼブラフィッシュは、デキストランおよびビヒクル（Ｄｅｘ＋ＤＭＳＯ）を注射した魚と比較して、注射の３時間後において４倍よりも大きい肝臓ヘプシジンｍＲＮＡレベル（肝臓の脂肪酸結合タンパク質ｍＲＮＡレベルに対して正規化される）の増大を示した（各群においてｎ＝４、＊Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）。鉄−デキストランと２３μｇ／ｇの化合物Ｃ／ドルソモルフィン（Ｆｅ−ｄｅｘ＋ＤＭ）との同時注射は、鉄−デキストラン処理した魚と比較
【数２】
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して、ヘプシジンｍＲＮＡレベルをデキストラン処理した魚と有意に異ならないレベルまで減少させた。（ｅ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１０ｍｇ／ｋｇ）の尾静脈単回注射は、６時間に肝臓ヘプシジンｍＲＮＡレベルをコントロールにおける肝臓ヘプシジンｍＲＮＡレベルの３分の１まで減少させた（各群においてｎ＝６、Ｐ＜０．０ｌ、結果は平均±Ｓ．Ｄとして示される）。（ｆ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、１２時間間隔で２回の化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射は、最初の注射の２４時間後に測定された血清鉄レベルを、６０％を上回って増大させた（野生型においてｎ＝８、化合物Ｃ／ドルソモルフィンにおいてｎ＝７、Ｐ＜０．００１、結果は平均±Ｓ．Ｄとして示される）。パネルａ、ｂ、およびｆは、各々、３つの独立した実験を示す一方で、パネルｃ〜ｅは、各々、２つの独立した実験を示す。（ｇ）鉄のホメオスタシスにおけるＢＭＰシグナリングの役割についての提案されたモデル。高い血清鉄レベル、ＨＪＶ、およびＩＬ−６は、全て、ヘプシジンの転写をアップレギュレートするために肝臓においてＢＭＰシグナリングを必要とする。増大したヘプシジンレベルは、フェロポーチン分解および細胞内貯蔵から血液への鉄輸送の減少を引き起こす。化合物Ｃ／ドルソモルフィンによるＢＭＰシグナリングの阻害は、基礎ヘプシジン転写を減少させ、より高い血清鉄レベルをもたらす。したがって、ＢＭＰシグナリングは、血清における鉄のフィードバック調節に必須である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（詳細な説明）
本発明は、（ｉ）ホールアニマル（例えば、ゼブラフィッシュ）スクリーニングの開発、（ｉｉ）細胞ベースのＥＬＩＳＡスクリーニングの開発、および（ｉｉｉ）ＢＭＰインヒビターの新規クラスの同定に基づく。したがって、第１の局面において、本発明は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナリングまたはトランスホーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナリングを阻害する化合物を同定する方法を提供する。上記ゼブラフィッシュスクリーニングおよび細胞ベースのＥＬＩＳＡスクリーニングは、ＢＭＰシグナリング経路またはＴＧＦ−βシグナリング経路をモジュレートする化合物を同定するために使用され得る。以下でさらに考察される通り、ＢＭＰインヒビターの新規クラスは、ＴＧＦ−βシグナリングに対してほとんど影響を有することなくＢＭＰシグナリングを特異的に阻害する化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって例示される。このような化合物のさらなる例は、図１７において示される。
【００２３】
本発明はまた、変化したＢＭＰシグナリングまたはＴＧＦ−βシグナリングに関連する疾患および状態を処置する方法および変化したＢＭＰシグナリングまたはＴＧＦ−βシグナリングに関連する疾患および状態を予防する方法を提供し、その方法は、スクリーニング方法を使用して同定される化合物（例えば、本明細書中に記載されるもの（例えば、化合物Ｃ／ドルソモルフィン））の投与を包含する。したがって、例えば、本発明は、ＢＭＰシグナリングの阻害によって利益を得る疾患または状態を有する患者を処置する方法を含み、その方法は、ドルソモルフィンまたは関連する化合物の投与を包含する。それらの表現型を変化させるか、または維持するために培養細胞を操作する方法もまた、本発明に含まれる。例えば、化合物Ｃ／ドルソモルフィンなどの化合物は、幹細胞（例えば、胚性幹細胞または成体幹細胞）の分化を妨げるために使用され得るか、あるいは他の条件下で、所望の系統に沿って幹細胞を分化させるために使用され得る。
【００２４】
本発明は、以下のように、さらに説明される。
【００２５】
（治療方法）
ＢＭＰシグナリング経路またはＴＧＦ−βシグナリング経路をモジュレートする化合物（例えば、本明細書に記載されるスクリーニング方法を使用して同定された化合物）は、これらのシグナリング経路のモジュレーションから利益を得る疾患または状態を処置または予防する方法において使用され得る。これらの経路のモジュレーションによって処置され得る疾患および状態の例は、以下に記載されるものを含む。
【００２６】
本発明者らは、骨形成タンパク質レセプター２（ＢＭＰＲ２）の欠損が心肺の異常（例えば、肺高血圧症）を引き起こし得るＢＭＰシグナリングの増大をもたらし得る（Ｙｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２４４４３−２４４５０，２００５）ことを示した。したがって、本発明によるＢＭＰシグナリングの阻害は、心肺の疾患および状態を予防または処置するために使用され得る。例えば、本発明の方法は、罹患していない個体（例えば、肺高血圧症に対する遺伝的素因を有するもの）において家族性の原発性肺高血圧症および散発性の原発性肺高血圧症の発症を予防するために使用するためか、あるいは罹患した個体における疾患の進行を逆転するか、遅らせるか、または予防するために使用され得る。
【００２７】
特定の先天性心臓弁奇形において、過剰なＢＭＰ刺激は、心室内または弁の前駆体における過剰または不十分な組織成長をもたらし得る（Ｙｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２４４４３−２４４５０，２００５；Ｄｅｌｏｔら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０：２０９−２２０，２００３）。本発明に従って、ＢＭＰシグナリングの阻害は、過剰なＢＭＰシグナルを補正し、したがって正常な弁または心組織の成長を回復させるために行われ得る。
【００２８】
過剰なＢＭＰシグナリングは、ＢＭＰ  ＩＩ型レセプター発現の喪失、またはＢＭＰ自体の過剰発現のいずれかに起因して、乳癌、前立腺癌、および腎細胞癌を含む特定の固形腫瘍の腫瘍形成に寄与し得る（Ｙｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２４４４３−２４４５０，２００５；Ｗａｉｔｅら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４：７６３−７７３，２００３；Ａｌａｒｍｏら，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５：４１１−４１９，２００６；Ｋｉｍら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：２８４０−２８４４，２０００；Ｋｉｍら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３：７６５１−７６５９，２００４；Ｋｉｍら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．９：６０４６−６０５１，２００３）。ＴＧＦ−βおよびＢＭＰは、炎症応答または免疫応答を減弱させ得（Ｃｈｏｉ  ＫＣら，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７：１０５７−６５，２００６）、このことは、感染（すなわち，ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、または結核菌）に対抗する個体の能力を損ない得る。したがって、ＢＭＰシグナリングまたはＴＧＦ−βシグナリングは、炎症応答または免疫応答を増大させ得る。本発明にしたがって、ＢＭＰシグナリングの阻害は、補助的または一次的な化学療法のいずれかとして、臨床上の利益に関してこのような腫瘍細胞（および他の腫瘍細胞型）の増殖を遅らせるかまたは廃絶するために行われ得る。また、ＢＭＰインヒビターは、特定の型の癌（例えば、前立腺癌および乳癌などの腺癌）の骨転移特性を妨害するために使用され得る。さらに、ＢＭＰシグナリングの阻害は、骨肉腫などの骨を形成する腫瘍において骨芽細胞の活性を改善するために（補助的または一次的な化学療法として）使用され得る。さらに、ＢＭＰインヒビターは、多発性骨髄腫、および他の骨を標的とする腫瘍などの状態において病理学的に増大する破骨活性（また、その標的遺伝子ＲＡＮＫＬの作用を介してＢＭＰによって調節される）を阻害するために使用され得る。
【００２９】
別の例において、ＢＭＰシグナリングの阻害は、炎症性障害（例えば、強直性脊椎炎または他の「セロネガティブ」な脊椎関節症）における病的な骨形成／骨固定を改善するために行われ得る。
【００３０】
さらなる例において、ＢＭＰシグナリングは、本発明に従って、鉄欠乏を処置および予防することにおいて使用するために阻害され得る。特に、ＢＭＰは、鉄吸収を遮断するヘプシジンのポジティブな調節因子である。したがって、ＢＭＰを阻害することは、鉄吸収を増大させ、および貧血および鉄欠乏性貧血に対する処置に寄与するために使用され得る。したがって、本発明の治療方法は、貧血を有する患者（例えば、鉄代償療法および／またはエポゲン（ｅｐｏｇｅｎ）療法に対する不完全または緩徐な応答を有する患者）を処置するために使用され得る。
【００３１】
本発明にしたがって、特異的なＢＭＰモジュレーションはまた、治療用途のために特定の系列に対する幹細胞（例えば、胚性幹細胞）または組織の祖先細胞の分化を指揮するために使用され得る（Ｐａｒｋら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１：２７４９−２７６２，２００４；Ｐａｓｈｍｆｏｒｏｕｓｈら，Ｃｅｌｌ  １１７：３７３−３８６，２００４）。例として、ＢＭＰシグナリングを活性化することが見いだされた化合物は、脈管構造の成長を促進する方法において使用するための血管芽細胞形成を促進するために使用され得る。
【００３２】
別の例において、胚性幹細胞集団における低分子インヒビターによるＢＭＰシグナルの操作は、自己複製または調節性の分化を促すために使用され得る。なぜならば、このプロセスは、ヒト胚性幹細胞におけるＢＭＰシグナルとＦＧＦシグナルとの間のバランスによって調節され、そしてマウス胚性幹細胞においてＬＩＦと組み合わせたＢＭＰの活性によって促進されるからである。
【００３３】
ＢＭＰによって媒介される骨の異所形成または石灰化（例えば、病的な血管または心臓弁の石灰化、アテローム性動脈硬化症、および腎性骨形成異常症におけるもの）は、ＢＭＰインヒビターによって阻害され得る。補綴代用血管または補綴心臓弁の場合において、このことは、例えば、全身投与されるか、補綴材料中に直接組み込まれるによって行われ得る。
【００３４】
進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）として公知である遺伝の稀な常染色体優性疾患は、最近、レセプターキナーゼが構成的に活性である傾向にあるＡＬＫ２レセプターにおける変異から生じることが見出されている（Ｓｈｏｒｅら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３８：５２５−５２７，２００６）。不適切な骨形成（自然発生的および傷害に対して続発である）のような初期の小児期におけるこれらの疾患の発現，正常な身体中心部および四肢の骨格構成と並行に、「第２の骨格」の過剰な鉱化作用を引き起こす。ＢＭＰシグナリングの特異的インヒビターは、過剰な骨形成を予防するか、または病的な骨形成の後退を誘導するために使用され得る。望ましくないか、または病的な骨形成は、阻害され得、そして骨の後退は、ＢＭＰインヒビターの全身投与または局所投与によって達成され得る。
【００３５】
ＴＧＦ−βは、肝臓、腎臓、および肺を含むヒト線維性疾患における線維症の中心的メディエーターである。したがって、特異的ＴＧＦ−βインヒビターは、これらまたは他の疾患状況において線維症を軽減するために使用され得る。
【００３６】
マルファン症候群患者によって示される弁および大動脈の異常は、ＴＧＦ−βシグナリングの病的なアップレギュレーションから生じると考えられる。したがって、特異的ＴＧＦ−βインヒビターは、マルファン症候群の心臓血管の合併症を処置または予防するために使用され得る。
【００３７】
異常なＴＧＦ−β／ＢＭＰシグナリングはまた、大動脈瘤、アテローム性動脈硬化症、および遺伝性出血性毛細管拡張症候群などのヒト疾患に環に関与している。したがって、これらのシグナリング経路をモジュレートする化合物は、これらおよび関連する疾患および状態の処置および予防にも使用され得る。
【００３８】
ＢＭＰシグナリングまたはＴＧＦ−βシグナリングを阻害することに加えて、化合物は、これらの経路を活性化する本発明に従って同定され得る。ＢＭＰシグナリングを活性化する化合物は、例えば、骨の成長または発達の促進によって利益を得る疾患または状態の処置において使用され得る。したがって、このような化合物は、骨粗鬆症および骨減少症を処置するため、そして骨折した骨の治癒を促進するために使用され得る。さらに、ＢＭＰシグナリングを活性化する化合物は、腎臓虚血再灌流障害における急性尿細管壊死を処置するため、卒中再灌流障害を改善するため、そして炎症性腸疾患を改善するために使用され得る。ＢＭＰシグナリング経路またはＴＧＦ−βシグナリング経路をモジュレートする化合物は、当業者によって適切であると決定される投薬量および投与レジメンの使用によって被験体（例えば、ヒト、家庭内のペット、家畜、または他の動物）を処置するために使用され得、そしてこれらのパラメータは、例えば、処置される障害の型および程度、被験体の全体的な健康状態、上記化合物の治療指数および投与経路に依存して変動し得る。標準的な臨床試験は、本発明の任意の特定の薬学的組成物についての用量および投与頻度を最適化するために使用され得る。使用され得る例示的な投与経路は、経口、非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、局所、頭蓋内、眼窩内、眼、脳心室内、関節内、脊髄内、嚢内、腹腔内、鼻腔内、エーロゾル、または坐剤による投与を含む。本発明において使用され得る処方物を作製するための方法は、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２０版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００において見出され得る。
【００３９】
治療方法において患者に投与されることに加えて、本明細書で記載される化合物は、エキソビボで、患者（上記を参照のこと）に移植される細胞および組織、ならびに構造材料を処理するために使用され得る。例えば、上記化合物は、例えば、移植において使用され得る外植組織を処理するために使用され得る。
【００４０】
（機構的研究および実験的研究）
本発明はまた、研究ツールとして本明細書中で記載される化合物の使用を含む。例えば、上記化合物は、本明細書通で記載されるような活性を有する他の化合物の開発において使用され得る。これらの方法において、本明細書中に記載される化合物は、さらなる化合物の設計のためのモデルまたは他の化合物を試験することにおけるコントロールとして使用され得る。
【００４１】
さらに、本発明は、これらのシグナリングプロセスの研究において本明細書に記載される化合物（あるいは他のＢＭＰシグナリング改変因子またはＴＧＦ−βシグナリング改変因子）の使用を含む。１つの例において、ＢＭＰインヒビターおよびＴＧＦ−βインヒビターは、細胞モデルもしくは動物モデルにおいてＢＭＰシグナリングを減少させるためか、過剰なＢＭＰシグナリングを補正し、そして疾患表現型を減少させるかためか、または他の疾患表現型を模擬する不十分なＢＭＰシグナリングを誘導するために使用され得る。例えば、発生中の動物に対するＢＭＰ選択的インヒビターの投与は、ＢＭＰシグナリングに決定的に依存する心臓血管の発生および脈管形成の局面を撹乱し、したがってＢＭＰシグナリング経路の異常または不十分な機能が関与する先天性心疾患または肺血管疾患を再現し得、このことは、有益な疾患モデルおよび見識を提供する（Ｗａｉｔｅら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４：７６３−７７３，２００３；Ｄｅｌｏｔら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０：２０９−２２０，２００３）。別の例において、本発明の化合物（例えば、化合物Ｃ／ドルソモルフィン）は、インビボおよびインビトロにおいてＢＭＰ作用のＳＭＡＤ依存的機構とＳＭＡＤ非依存的機構との間を区別するために使用され得る。
【００４２】
（スクリーニング方法）
上に記載される通り、本発明は、ＢＭＰシグナリングまたはＴＧＦ−βシグナリングのいずれかを特異的にモジュレートする化合物（例えば、低分子有機分子または低分子無機分子）を同定するための方法（例えば、ハイスループット法）を提供する。ＢＭＰおよびＴＧＦ−βは、レセプターおよび下流メディエーターの異なるサブセットを活性化し、そしてまた、異なる機能、およびときとして反対の機能を有する。しかし、上で考察される通り、ＴＧＦ−β／ＢＭＰレセプターの全体的な構造類似性に起因して、伝統的な生物化学的方法によるＴＧＦ−β経路またはＢＭＰ経路に対して特異性を有する低分子の同定が、挑戦されている。本発明の方法は、下に記載される通り、これらの挑戦を克服し、そして特定のモジュレーター（アンタゴニストまたはアゴニスト）の同定を可能にする。
【００４３】
（ホールアニマルスクリーニング方法）
ゼブラフィッシュにおいて、ＴＧＦ−β依存性シグナリングカスケードおよびＢＭＰ依存性シグナリングカスケードは、胚形成パターンにおいて異なる役割を果たす。例えば、ＢＭＰシグナリングは、腹側細胞の運命を確立するために必要とされ、そしてＢＭＰシグナリングの喪失は、胚の体軸の背側化をもたらす。対照的に、新規の（ＴＧＦ−β）シグナリングは、腹側の脳および背側の中内胚葉を誘導するために背側の中胚葉において必要とされ、このようなシグナリングの減少は、単眼症および／または比較的小さい頭の形成を生じる。ゼブラフィッシュ胚におけるシグナリング経路のいずれかの阻害によってもたらされる異なる表現型は、本発明に従って、候補化合物と接触したゼブラフィッシュ胚の表現型解析によっていずれかの経路を阻害する化合物の同定を容易にする。
【００４４】
これらの原理に基づいて、本発明者らは、優先的にＢＭＰシグナリングを阻害するが、ＴＧＦ−βシグナリングを阻害しない化合物（化合物Ｃ／ドルソモルフィン）を同定した。この化合物は、以下でさらに記載される。このスクリーニング方法によって提供される特異性のさらなる支援において、本発明者らは、ＳＢ−４３１５４２（ＴＧＦ−β／アクチビン／ｎｏｄａｌの分岐の公知の特異的インヒビター）がｎｏｄａｌシグナリングの喪失と一致する表現型（例えば、単眼症）であるが、背側化ではない表現型をもたらす。ＢＭＰシグナリングまたはＴＧＦ−βシグナリングのいずれかに対する各化合物の特異性は、本発明に従って、一方または他方の表現型を引き起こすが、両方の表現型を引き起こすわけではないか否かを決定し得る。上記アッセイはまた、非特異的毒性に対して高感度であり、その非特異的毒性は、代表的に、常同的な異常または死をあまりもたらさない。したがって、本発明の表現型ベースのホールアニマルスクリーニングプラットフォームは、発見のために使用され得、そして毒性化合物を同時に選択しながら、ＢＭＰシグナリングまたはＴＧＦ−βシグナリングの特異的な選択的インヒビターの最適化をもたらす。
【００４５】
本発明のホールアニマルベースのスクリーニング方法の１つの例にしたがって、１〜２時間齢（ｈｏｕｒ  ｏｌｄ）のゼブラフィッシュ胚が、９６ウェルプレートのウェルに配置される（１ウェルあたり３個の胚）。したがって、次いで数十種から数千種の様々な低分子から構成されるケミカルライブラリーは、約２〜１０μＭの最終濃度で上記ウェルにピントランスファー（ｐｉｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）される。胚は、次の２４〜４８時間の過程にわたって観察され、ＢＭＰシグナリングの喪失（背側化した胚、図１）またはｎｏｄａｌシグナリングの喪失（単眼症、図２）と一致する表現型について手術用顕微鏡下で評点される。
【００４６】
処理された胚における軸の背側化およびｎｏｄａｌシグナリングの喪失は、領域特異的分子マーカーとのインサイチュハイブリダイゼーションを使用して確認され得る。例えば、背側化した胚において、背側マーカーＫｒｏｘ２０およびＰａｘ２．１は、大きく拡大するが、腹側外側マーカー（ｅｖｅ１）は、減少する。さらに、ｎｏｄａｌシグナリング阻害に起因する背側の中内胚葉および腹側の神経構造の喪失は、グースコイドの喪失および尾の発現がないことの各々によって確認され得る。
【００４７】
（細胞培養スクリーニング方法）
ＢＭＰシグナリング経路またはＴＧＦ−βシグナリング経路をモジュレートする化合物はまた、培養細胞を使用して同定および特徴付けられ得る。ＢＭＰ経路の阻害は、ＢＭＰ４によるＳＭＡＤ１／５／８リン酸化の誘導を妨げるが、ＴＧＦ−β経路の阻害は、ＴＧＦ−βによるＳＭＡＤ２リン酸化の誘導を遮断する。対照的に、ＢＭＰ経路の活性化は、ＢＭＰ４によるＳＭＡＤ１／５／８リン酸化の増大をもたらすが、ＴＧＦ−β経路の活性化は、ＴＧＦ−βによるＳＭＡＤ２リン酸化の増大をもたらす。この技術は、ＢＭＰまたはＴＧＦ−βに対する候補化合物の特異性を確認するために使用され得る。
【００４８】
１つの例において、本発明の細胞ベースのアッセイは、ＳＭＡＤタンパク質（ＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ１／５／８）の活性化が測定される酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。細胞内ＳＭＡＤタンパク質は、リン酸化（活性な）状態と非リン酸化（不活性な）状態との間で平衡して存在し、活性化されたタンパク質は、核に保持されている（Ｓｃｈｍｉｅｒｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：９８４５−９８５８，２００５）。上で考察される通り、ＳＭＡＤタンパク質は、リガンドによって係合される場合、Ｉ型およびＩＩ型のＢＭＰセリン−トレオニンキナーゼレセプターまたはＴＧＦ−βセリン−トレオニンキナーゼレセプターのヘテロマー複合体によってリン酸化される。これらのリガンドの主要な効果は、一般に、特定のＳＭＡＤの活性化からの遺伝子転写に寄与し得る。リン酸化されたＳＭＡＤは、ウェスタンブロッティングによって高い特異性で、市販の抗リンタンパク質抗体を使用して全細胞抽出物において検出され得る（Ｙｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２４４４３−２４４５０，２００５）。
【００４９】
本発明によって提供される改良された方法において、リン酸化されたＳＭＡＤは、上記抗体にアクセス可能なホスホ−ＳＭＡＤ抗原を固定化および与えることによって高い感度および特異性を有する全細胞に検出される。１％〜８％のパラホルムアルデヒド溶液による伝統的な固定、およびその後のメタノールまたは希薄な界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）の溶液による透過処理は、受容できない結果をもたらし、シグナルは、そのシグナルが検出される場合、バックグラウンドの１．２〜１．３倍のみである（ウェスタンブロットにおいて、これらの信号雑音比は、１０〜２０である）。この懸案事項は、核内可溶性タンパク質を架橋および固定化することができなかった固定プロセスの結果であり得、それは、パラホルムアルデヒドによって見られる表面電荷特性の大きな変化に起因して、次に、核の不完全な透過処理、固定によるネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）の形成、または固定による隠蔽のような抗原の提示へと広がる。
【００５０】
本発明は、１０分間〜１５分間にわたって氷冷メタノールを使用して最初に原形質膜および核膜を徹底的に透過性にし、そして細胞骨格構造を維持しつつタンパク質を沈殿させ、次いで１０分間〜１５分間にわたって生理食塩水中の０．２５％〜２％のグルタルアルデヒド溶液を用いて室温にて沈殿したタンパク質を架橋させることによって上に記載した固定の懸案事項を克服する。これは、単独で、１．２〜３の信号雑音比における改善を達成し、これは、大きな改善であるが、依然として、高いバックグラウンドに起因して、辛うじてハイスループットスクリーニングに十分であるにすぎない。グルタルアルデヒド固定剤は、二官能性であり、近接しないことに起因して隣接するアミンと反応しない末端アルデヒドによって置換される、標的タンパク質上の多くのアミノ窒素をもたらす。このアルデヒドは、最終的に、カルボン酸まで酸化され、このカルボン酸は、元のアミン窒素とは反対の電荷であり、したがって表面電荷特性を変化させる。この改変を防止するために、上記グルタルアルデヒドは、代わりに、ｐＨ８〜１０において２５〜２００ｍＭの濃度の二官能性アミン分子（例えば、リジン、エチレンジアミン、またはフェニレンジアミン）によって「クエンチされる」。これらの分子は、一置換されたグルタルアルデヒド分子上の自由な（ｆｒｅｅ）アルデヒドと反応してアミド結合を形成し、末端アミンまたはアミン／カルボン酸双性イオン（これらのいずれかは、元の電荷配置に近い）を脱離させる。本発明者らは、この工程が、ハイスループット用途のための多くの十分なマージンである信号雑音比を７〜１０の範囲までさらに改良することを見出した。
【００５１】
本発明者らはまた、このアッセイにおいて変異細胞を使用し、この変異細胞は、ＢＭＰＩＩ型レセプターを欠く。ウェスタンブロッティングおよび遺伝子発現研究からの結果（Ｙｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２４４４３−２４４５０，２００５）と一致して、本発明者らは、これらの変異細胞がこのアッセイにおいてＢＭＰ７および同様のリガンドに対する実質的に上昇した感度を有することを見出す（図３）。この知見は、代わりのＢＭＰレセプター（例えば、アクチビンＩＩ型レセプター）の使用によって説明され、その活性は、インタクトであり、およびＢＭＰ  ＩＩ型レセプターの非存在下で増強され得る。組換えＢＭＰ７は、いくつかの小動物疾患モデルにおいて有用なインビボ活性を有することが見出されている。野生型細胞と比較してこれらの変異細胞を使用するこのハイスループットアッセイの適用は、この代替的なシグナリング経路を標的とし、そして臨床的に有用な様式で特異的なＢＭＰ７模倣物（ｍｉｍｉｃｓ）として機能する特定の分子を示すために使用され得る。
【００５２】
このアッセイは、ＢＭＰリガンドによるＳＭＡＤ経路の活性化を優先的に阻害する化合物を同定するために首尾よく使用されており、ＢＭＰシグナリング経路をモジュレートする低分子の同定のためのスクリーニングアッセイとしてのその有用性を示す。ＴＧＦ−β媒介性ＳＭＡＤ２リン酸化およびＢＭＰ媒介性ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化を検出するこのアッセイのバージョンを使用して、本発明者らは、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＴＧＦ−βレセプター系のセリン−トレオニンキナーゼ活性に対してＢＭＰレセプターのセリン−トレオニンキナーゼ活性を優先的に阻害することを示す。したがって、このアッセイは、以前には任意の他の低分子のものと見なされていなかった新規の活性（ＢＭＰシグナリングの優先的な阻害）を有する化合物の同定を補助し、そしてこれらの２つの経路の各々に対する特異性および効力（ＩＣ５０）における定量的データを提供した（図４）。
【００５３】
上に記載されたアッセイは、いくつかの利点を提供する。例えば、それは、レポーター構築物による細胞の安定なトランスフェクションを必要とせず、したがって実質的に任意の細胞株に対する薬物選択を伴わずに初期継代の一次細胞によって実施され得る。それはまた、改良された特異性を提供する。特に、短い時間経過にわたって近位のシグナル伝達分子（ＳＭＡＤ）の活性化を測定することによって、このアッセイは、無関係の経路をモジュレートする、細胞毒性を引き起こすか、またはそうでなければ転写または翻訳を与える活性または化合物の偶発的な検出を回避する。本発明者らは、曝露の５〜６０分後に測定されたＳＭＡＤリン酸化が特定のリガンド（すなわち、ＢＭＰおよびＴＧＦ−β）またはそれらのインヒビター（すなわち、ノギンおよびフォリスタチン）によってのみモジュレートされ、そして非特異的な毒性または活性化（例えば、熱ショック、浸透圧ショック、非特異的および特異的なＭＡＰキナーゼの活性化または阻害、ならびに遺伝子転写またはタンパク質翻訳の阻害）によってモジュレートされないことを見出す。対照的に、レポーター構築物の発現に依存するアッセイは、任意のこれらの因子によって容易に撹乱され得る。これらの制限は、ＢＭＰシグナリングまたはＴＧＦ−βシグナリングのアンタゴニストを同定しようとする場合、特に厄介である。なぜならば、レポーター発現法は、多くの非特異的アンタゴニストを同定する傾向があり得るからである。特異的ＢＭＰアゴニストまたは特異的ＴＧＦ−βアゴニストの同定はまた、遺伝子転写がＳＭＡＤの厳密な機能でも、転写補助抑制因子および転写活性化補助因子の厳密な機能（それらの活性は、経路に依存しない様式で化合物によってモジュレートされ得る）でもないので、レポーター発現法に限定されない。
【００５４】
上に記載されたアッセイによって提供されるさらなる利点は、結果が細胞刺激後に３時間以内に得られ得るので、その迅速性に関係するが、しかしより高い感度が、より長い時間枠（例えば、１２時間）にわたって達成され得る。さらに、上記アッセイは、それが他のアッセイ形式よりも少量でありかつ比較的安価な試薬を必要とするので、対費用効果が高く、そのアッセイをハイスループット用途に対して特に適切にする。
【００５５】
上記アッセイはまた、任意の細胞型を使用するインビトロにおけるＢＭＰシグナリング経路またはＴＧＦ−βシグナリング経路の生物学的モジュレーターの測定のためのアッセイとして研究において使用され得る。さらに、そのアッセイは、ＢＭＰのアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいはＴＧＦ−βのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する治療可能性を有する化合物の、大きい処理量のスクリーニングのためのプラットフォームとして使用され得る。さらに、上記アッセイは、臨床的に関連し得るＢＭＰシグナルまたはＴＧＦ−βシグナルに対するエキソビボ組織における異常な応答を検出するための診断ツール、および患者由来の組織サンプルから、例えば、ＢＭＰまたはＴＧＦ−βに対する腫瘍組織の応答における予後の情報または臨床病理学的な情報をもたらし得る診断ツールとして使用され得る。さらに、上記アッセイは、他の核内タンパク質のＥＬＩＳＡ分析の構成において使用され得る。
【実施例】
【００５６】
（実施例１）
上に記載したものなどのスクリーニング法を使用して、本発明者らは、骨形成タンパク質リガンドによるＳＭＡＤの活性化を優先的に阻害する低分子を同定した。この分子（化合物Ｃ／ドルソモルフィン）は、ＡＭＰキナーゼシグナリング経路の活性化のインヒビターとして先に記載される（Ｚｈｏｕら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：１１６７−１１７４，２００１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号１７１２６０；Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ５４９９；図５）。
【００５７】
ＢＭＰ活性化およびＴＧＦ−β活性化に対する化合物Ｃ／ドルソモルフィンの効果を示す実験の結果が、図６および７に示される。図６に示される通り、本発明者らは、化合物Ｃ／ドルソモルフィンが、ＢＭＰ４によるＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、およびＳＭＡＤ８の活性化によって示されるように、０．５μＭのＩＣ５０でＢＭＰシグナリングを阻害することを見出した（図６）。本発明者らはまた、その化合物がＴＧＦ−βシグナリング経路に影響を及ぼさないを見出した（図７）。化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、約１５〜３０μＭのＩＣ５０でＡＭＰキナーゼ活性を阻害することが先に記載された（Ｚｈｏｕら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：１１６７−１１７４，２００１）。化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、したがって、ＡＭＰキナーゼシグナリング経路に対して１５倍〜６０倍よりも大きい特異性でＢＭＰシグナリングを阻害する。化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ＢＭＰ４によって媒介されるＭＡＰキナーゼｐ３８の活性化の有意な阻害を示さない（図８）。以前の報告は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがまたＰＩ−３キナーゼ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、およびそれらのそれぞれのリガンドによる種々の他の経路の活性化の有意な阻害を示さないことを示した。
【００５８】
本発明者らはまた、化合物Ｃ／ドルソモルフィンが最小限の非特異的毒性を有する特異的様式でインビボでのＢＭＰシグナリングの阻害を示すことを見出す。ＢＭＰリガンドまたはそれらの内因性インヒビターのトランスジェニック過剰発現は、背腹軸パターン形成を変化させることによって初期（受精後０〜４８時間、または０〜４８ｈｐｆ）ゼブラフィッシュ胚の発生を改変することが公知である（図９Ａ〜Ｃ）。ゼブラフィッシュ胚におけるＢＭＰの過剰発現は、腹側化として公知である、前方構造（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の低下した発生を伴う腹側構造の過大な発生を引き起こす（Ｎｇｕｙｅｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９：９３−１１０，１９９８）。ノギンまたは他のＢＭＰアンタゴニストの過剰発現は、低下した尾びれの発生から重度に減少した尾の発生までの重症度の範囲である背側化を引き起こす（Ｆｕｒｔｈａｕｅｒら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１４：１８１−１９６，１９９９）。ＢＭＰアゴニズムまたはＢＭＰアンタゴニズムから生じるこれらの古典的な形態学は、インビボでの活性の迅速な確認のための方法を提供し、提供される化合物は、上に記載したように、生物が利用可能である。このアッセイはまた、非特異的毒性に対して感度が高く。その非特異的毒性は、代表的に、あまり常同的ではない異常または死をもたらす。
【００５９】
５〜２０μＭの化合物Ｃ／ドルソモルフィンに曝露されたゼブラフィッシュ胚は、ＢＭＰシグナリングの特異的阻害（図９Ｄ〜Ｆ）および他の非特異的毒性の非存在と一致する、ノギンを過剰発現するゼブラフィッシュ胚で見出される背側化の古典的な形態学の知見を伴う進行性の背側化を示す。ゼブラフィッシュにおける有効濃度が、インタクトなゼブラフィッシュ胚に対する分子のバイオアベイラビリティの違いに起因して培養細胞において見られるものとは異なり得ることに、留意すべきである。
【００６０】
ＢＭＰリガンドは、多分化能Ｃ２Ｃ１２筋線維芽細胞株を含む種々の細胞型における骨芽細胞分化および骨形成遺伝子発現を誘導することが公知である。この活性は、種々のＢＭＰリガンドの骨形成可能性についての合理的な代理である。本発明者らは、４μＭの化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＢＭＰ４またはＢＭＰ６によって誘導されたＣ２Ｃ１２細胞の骨形成分化（アルカリホスファターゼ活性によって測定される）をインビトロで完全に阻害することを見出した（図１０）。この阻害は、１００ｎｇ／ｍｌのノギン（ＢＭＰ２活性およびＢＭＰ４活性の優先的なインヒビター）による細胞の前処理によって見られる阻害よりも強力である。さらに、骨形成分化のこの阻害は、ＢＭＰ、化合物Ｃ／ドルソモルフィン、ノギン、またはそれらの種々の組合せによる処理後の細胞数によってアッセイした場合、細胞毒性を伴わなかった（下のパネル）。Ｃ２Ｃ１２分化に対する化合物Ｃ／ドルソモルフィンの効果を示すさらなる実験の結果を、図１１に示す。
【００６１】
化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、野生型細胞およびＢＭＰ  ＩＩ型レセプターを欠く変異細胞においてＢＭＰシグナリングを有効に中和する。本発明者らはまた、化合物Ｃ／ドルソモルフィンが野生型細胞およびＢＭＰ  ＩＩ型レセプターノックアウト細胞においてＢＭＰ２、４、６、７、および９の活性を有効に阻害することを見出す。これらの特質、およびＡＭＰキナーゼのセリン−トレオニンキナーゼ活性を阻害することにおける化合物Ｃ／ドルソモルフィンの公知の（あまり強力ではない）活性は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＢＭＰ  Ｉ型レセプター（ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、またはＡＬＫ６）セリン−トレオニンキナーゼの活性を阻害し得ることを示す。化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＩ型レセプターＡＬＫ２、ＡＬＫ３、およびＡＬＫ６の活性形態を阻害することを示す実験の結果を、図１２および図２１ｈに示し、そして化合物Ｃ／ドルソモルフィンが骨鉱化作用を破壊することを示す実験の結果を、図１３〜図１６に示す。
【００６２】
化合物Ｃ／ドルソモルフィンの構造アナログもまた、本発明の方法において試験および使用され得る。種々の程度の特異性および効力でＶＥＧＦＲ２を阻害すると以前に記載されているこのようなアナログの例を、図１７に示す。
【００６３】
化合物Ｃ／ドルソモルフィンを特徴付けるさらなる実験を、以下で実施例２において記載する。
【００６４】
（実施例２）
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナルは、発生パターン形成、器官形成、および組織リモデリングを協同し、そして成熟した生物において必須の生理学的役割を果たす。ここで、本発明者らは、ゼブラフィッシュにおける背腹軸形成を撹乱する化合物についてのスクリーニングにおいて同定されたＢＭＰシグナリングの最初の公知である低分子インヒビター（化合物Ｃ／ドルソモルフィン）を記載する。初期胚発生の間における化合物Ｃ／ドルソモルフィンに対する曝露は、ＢＭＰシグナリングの遺伝的破壊に関連する背側化欠損の完全な範囲を再現し、そしてまた内因性ＢＭＰアンタゴニストであるコーディンのノックダウンを代償する。化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ＢＭＰ  Ｉ型レセプターＡＬＫ２、ＡＬＫ３、およびＡＬＫ６を選択的に阻害し、したがってＢＭＰ媒介性ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化、標的遺伝子の転写、および骨形成分化を遮断することが見出されている。化合物Ｃ／ドルソモルフィンを使用して、本発明者らは、ゼブラフィッシュおよびマウスの鉄ホメオスタシスにおけるＢＭＰシグナリングの役割を試験した。インビトロにおいて、化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、全身の鉄調節因子であるヘプシジンのＢＭＰ媒介性転写、ヘモジュベリン（ｈｅｍｏｊｕｖｅｌｉｎ）媒介性転写、およびインターロイキン６媒介性転写を阻害し、このことは、ＢＭＰレセプターがこれらの刺激の全てによってヘプシジン誘導を調節することを示唆する。インビボにおいて、鉄による全身的なチャレンジは、肝臓におけるＳＭＡＤ１／５／８リン酸化およびヘプシジン発現を迅速に誘導したが、化合物Ｃ／ドルソモルフィンによる処理は、ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化、正規化されたヘプシジン発現、および増大した血清鉄レベルを遮断した。これらの知見は、鉄−ヘプシジンホメオスタシスにおける肝臓ＢＭＰシグナリングについての必須の生理学的役割および薬理学的なＢＭＰ阻害が高いヘプシジンレベルによって引き起こされる慢性疾患の貧血を処置するために使用され得ることを示唆する。
【００６５】
（結果）
（化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ゼブラフィッシュ胚において背側化を誘導する）
実施例１において上に記載される通り、ＢＭＰシグナリングの低分子インヒビターを、ＢＭＰアンタゴニストが発生中のゼブラフィッシュ胚を背側化するという前提に基づいて、インビボスクリーニングアッセイを使用して探索した。７，５００を超える化合物が、公知の生物活性分子からなる本発明者らの低分子コレクション、ＦＤＡ承認薬物、および市販の分子多様性ライブラリー、ゼブラフィッシュ胚を、９６ウェルプレートに配置し、そして受精後の時間（ｈｐｆ）で４時間において開始される化合物と一緒にインキュベートし、そして２４ｈｐｆおよび４８ｈｐｆにおいて視覚的に評価した。本発明者らが化合物Ｃ／ドルソモルフィンと称する、腹側極に由来する構造の犠牲における球状胚の背側極に由来する構造の拡大によって発現される（Ｎｇｕｙｅｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９：９３−１１０，１９９８；Ｆｕｒｔｈａｕｅｒら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１４：１８１−１９６，１９９９；Ｍｉｎｔｚｅｒら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８：８５９−８６９，２００１；Ｓｃｈｍｉｄら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７：９５７−９６７，２０００）ようなゼブラフィッシュ胚の劇的かつ再現可能な背側化をもたらす１つの化合物（図１８ａ）を、同定した（図１８ｂ〜図１８ｅ）。
【００６６】
化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって誘導された背側化の状況は、用量およびタイミングの関数として変化した。６〜８ｈｐｆにおいて添加された場合、化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ノギンを過剰発現するゼブラフィッシュおよびｌｏｓｔ−ａ−ｆｉｎ（ＡＬＫ８変異体）ゼブラフィッシュのもの（Ｍｕｌｌｉｎｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２３：８１−９３，１９９６；Ｆｕｒｔｈａｕｅｒら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１４：１８１−１９６，１９９９）に類似する腹側の尾びれの非存在として発現する軽度の背側化を引き起こした（図１８ｂ〜ｃ）。６ｈｐｆにおいて化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって処理したゼブラフィッシュは、時として、存在しない腹びれに加えて異所性の尾付属器を示し（図１８ｄ）、このことは、シールド期（ｓｈｉｅｌｄ  ｓｔａｇｅ）後に熱ショック誘導性のドミナントネガティブなＢＭＰ  Ｉ型レセプターを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュに似ている（Ｐｙａｔｉら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３２：２３３３−２３４３，２００５）。化合物Ｃ／ドルソモルフィンを１〜２ｈｐｆにて胚に添加した場合、胚の腹側極に由来する尾の尾側構造および後方構造は、より著しく破壊され（図１８ｅ）、このことは、より重度のＢＭＰシグナリング欠損を有する魚に似ている（Ｍｕｌｌｉｎｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２３：８１−９３，１９９６）。実際に、２ｈｐｆにおける化合物の添加は、芽期における卵形の背側化した形態（図１８ｆ〜図１８ｇ）、および１０体節期における異常な尾芽形態（図１８ｈ〜図１８ｉ）を有するｌｏｓｔ−ａ−ｆｉｎ魚において観察されたものと同様の変化した原腸陥入および体節形成（Ｍｕｌｌｉｎｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２３：８１−９３，１９９６）をもたらした。８ｈｐｆ以下における５μＭ以上の化合物Ｃ／ドルソモルフィンによる胚の処理は、欠損したＢＭＰシグナリングを有するゼブラフィッシュにおいて観察される高い浸透度、背側化欠損の範囲に関して表現型模写（ｐｈｅｎｏｃｏｐｙ）した（図１９ならびに表１および２）が、単眼症（欠損したＴＧＦ−βシグナリングに関連する表現型（Ｓａｍｐａｔｈら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：１８５−１８９，１９９８））をもたらさなかった。
【００６７】
化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、上に記載した通り、１０μＭ〜２０μＭの推定された機能的ＫｉでインビトロにおいてＡＭＰ活性化キナーゼ（ＡＭＰＫ）活性に拮抗することが先に示された分子である（Ｚｈｏｕら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：１１６７−１１７４，２００１）。ＡＭＰＫ阻害が背腹軸形成に対する化合物Ｃ／ドルソモルフィンの効果に寄与するか否かを試験するために、本発明者らは、Ｃ７５およびＡｒａ−ＡなどのＡＭＰＫ活性の構造的に関連しないインヒビター（Ｋｉｍら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１９９７０−１９９７６，２００４；Ｙｏｏｎら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５５：２５６２−２５７０，２００６）を試験した。これらのインヒビターは、ゼブラフィッシュ胚を背側化しなかったが、代わりに、背側化する濃度の化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって観察されなかった非特異的毒性（例えば、発達遅延および死）を引き起こさなかった（表３）。さらに、モルホリノ注射によるゼブラフィッシュにおけるＡＭＰＫ活性のノックダウンは、背側化を引き起こさなかった（図２０）。化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、レセプターチロシンキナーゼＫＤＲの活性を阻害することが示された一連の化合物（Ｆｒａｌｅｙら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２：２７６７−２７７０，２００２）に構造的に関連する。しかし、本発明者らの実験において使用した化合物Ｃ／ドルソモルフィンの用量において、本発明者らは、体節間の血管の破壊された形成などのゼブラフィッシュの血管発生に対するＫＤＲ阻害の任意の公知の効果（Ｈａｂｅｃｋら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：１４０５−１４１２，２００２）を観察しなかった（図１８ｃ〜図１８ｆ）。したがって、化合物Ｃ／ドルソモルフィン誘導性背側化は、ＡＭＰＫ阻害またはＫＤＲ阻害によって引き起こされない。
【００６８】
（化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、腹側マーカー発現を抑制し、そして背側マーカー発現を拡大させる）
背腹軸形成に対する化合物Ｃ／ドルソモルフィンの影響を確認するために、背側マーカーおよび腹側マーカーの発現が、試験される。１８体節期における腹側マーカーｅｖｅ１の発現は、背側化と一致して、化合物Ｃ／ドルソモルフィン処理した胚において減少した（Ｍｕｌｌｉｎｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２３：８１−９３，１９９６）。６体節期において、ｐａｘ２．１発現は、眼柄、中脳−後脳境界、および耳胞の境界を定める（Ｌｉｔｔｌｅら，Ｂｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｒｅｓ．Ｃ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｔｏｄａｙ  ７８：２２４−２４２，２００６）。化合物Ｃ／ドルソモルフィン処理は、これらの背側組織の拡大を誘導した（図１８１〜図１８ｍ）。同様に、化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ｋｒｏｘ２０、菱脳節３および５のマーカー、ならびにｍｙｏＤ（後方の筋節ののマーカー）の横方向への拡大を誘導した（図１８ｎ〜図１８ｏ）。したがって、化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ゼブラフィッシュＢＭＰ経路変異体において見られる背側化の効果と一致して、背側および腹側の発現マーカーの変化を誘導した（Ｌｉｔｔｌｅら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１：５８２５−５８３５，２００４）。
【００６９】
（化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、コーディンモルファント胚における腹側化を逆転させる）
化合物Ｃ／ドルソモルフィンによる処理はゼブラフィッシュにおけるＢＭＰアンタゴニズムを模擬するので、化合物Ｃ／ドルソモルフィンは内因性ＢＭＰアンタゴニストコーディンの喪失によって引き起こされる腹側化を減少させ得ることが、仮定される（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２３：１４３−１５１，１９９６；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２６：２１６−２２０，２０００）。ゼブラフィッシュに、１細胞期においてコーディンモルホリノ（１ｎｇ）を注射し、それは、尾構造および内部細胞塊（ＩＣＭ）の拡大を伴う中程度の腹側化を引き起こした（図１８ｐ）（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２６：２１６−２２０，２０００；Ｌｅｕｎｇら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７７：２３５−２５４，２００５）。２ｈｐｆにおけるコーディンモルファントの化合物Ｃ／ドルソモルフィン処理は、腹側化およびＩＣＭの拡大を妨げた（図１８ｑ）。したがって、化合物Ｃ／ドルソモルフィン処理は、ゼブラフィッシュ胚における内因性ＢＭＰアンタゴニストの喪失を代償し、このことは、ＢＭＰアンタゴニストとしてのその機能を確認する。
【００７０】
（化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ＳＭＡＤ依存性であるが、ＳＭＡＤ非依存性ではないＢＭＰシグナルを阻害する）
ＢＭＰシグナリングに対する化合物Ｃ／ドルソモルフィンの効果を、インビトロで試験した。培養したマウス肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）は、ＢＭＰレセプターの補完を発現し、そして種々のＢＭＰリガンドに対する応答において、ＳＭＡＤ１／５／８活性化、ＭＡＰＫ  ｐ３８活性化、および分化インヒビター（Ｉｄ）遺伝子（一般に、増殖を促進し、そして分化を阻害するように作用するドミナントネガティブに作用するベーシックへリックス−ループ−へリックス型転写因子の群）の転写を示す（Ｙｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２４４４３−２４４５０，２００５；Ｍｉｙａｚｏｎｏら，Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００２，ＰＥ４０，２００２）。化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ＭＡＰＫ  ｐ３８活性化に影響を及ぼすことなくＢＲ−ＳＭＡＤのＢＭＰ４誘導性リン酸化を用量依存性の様式（ＩＣ５０＝０．４７μＭ）で阻害した（図２１ａ〜図２１ｂ）。ＳＭＡＤ１／５／８活性化およびＭＡＰＫ  ｐ３８活性化を機能的に分離する化合物Ｃ／ドルソモルフィンの固有の能力は、ＢＭＰが異なる機構によってこれらのエフェクターを活性化することを示唆する。化合物Ｃ／ドルソモルフィンとは対照的に、ノギンは、ＢＭＰリガンドの隔離によるＳＭＡＤ依存性シグナリングおよびＳＭＡＤ非依存性シグナリングの阻害と一致して、ＳＭＡＤ１／５／８およびＭＡＰＫ  ｐ３８の両方のＢＭＰ４誘導性リン酸化を阻害した（図２１ｃ）。化合物Ｃ／ドルソモルフィン（４μＭ）は、構造的に多様なＢＭＰの活性を阻害し、ＢＭＰ２、４、６、および７によるＢＲ−ＳＭＡＤ活性化を遮断し（図２１ｄ）、そして未処理の細胞においてリン酸化ＳＭＡＤのレベルを基礎レベル未満まで減少させた。化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ＢＭＰシグナリングに対して阻害性である濃度以上において、ＴＧＦ−β１またはアクチビンＡによるＳＭＡＤ２活性化を阻害しなかった（図２１ｅ〜図２１ｆ）。これらの結果を、図２２ａ〜図２２ｅにおいて定量的に記載する。
【００７１】
（化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ＢＭＰ  Ｉ型レセプター機能を阻害する）
化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＢＭＰ  ＩＩ型レセプターの機能を阻害するか否かを試験するために、本発明者らは、ＢＭＰ  ＩＩ型レセプター（ＢＭＰＲ−ＩＩ）を欠くＰＡＳＭＣにおいて化合物Ｃ／ドルソモルフィンを試験した。ＢＭＰＲ−ＩＩ欠損細胞は、Ｉ型ＢＭＰレセプターを活性化するために、ＢＭＰＲ−ＩＩに代えてアクチビンＩＩａ型レセプター（ＡｃｔＲ−ＩＩａ）を利用する（Ｙｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２４４４３−２４４５０，２００５）。化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ＢＭＰＲ−ＩＩ欠損細胞においてＢＭＰ２、４、６、および７によるシグナリングを阻害し（図２３）、このことは、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＢＭＰＲ−ＩＩの存在下または非存在下においてＢＭＰシグナルを阻害することを示す。この知見は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＩＩ型レセプターの下流におけるＢＭＰ  Ｉ型レセプターのシグナリングを阻害し得ることを示唆した。この仮説を試験するために、細胞を、ＢＭＰ  Ｉ型レセプターＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６の構成的に活性な（ｃａ）形態によってトランスフェクトした。ｃａＡＬＫ２、ｃａＡＬＫ３、またはｃａＡＬＫ６によるトランスフェクションは、細胞抽出物においてＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化を増大させたが、化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１０μＭ）とのプレインキュベーションは、リン酸化ＳＭＡＤ１／５／８のこの増大を阻害した（図２１ｇ）。同様に、ｃａＡＬＫ２、ｃａＡＬＫ３、またはｃａＡＬＫ６によるトランスフェクションは、リガンドの非存在下でＩｄ１プロモーター（ＢＲＥ−Ｌｕｃ）活性を５倍〜１２倍増大させた。化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ｃａＡＬＫ２、ｃａＡＬＫ３、およびｃａＡＬＫ６の活性を阻害し、ｃａＡＬＫ６を上回るｃａＡＬＫ２およびｃａＡＬＫ３に対する明らかな選択性を有した（図２１ｈ）。同様の濃度において、化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、構成的に活性なＡＬＫ４、ＡＬＫ５、またはＡＬＫ７、ＴＧＦ−βレセプターおよびアクチビンＩ型レセプターの機能を阻害しなかった（図２４）。化合物Ｃ／ドルソモルフィンの、ＢＭＰ媒介性ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化を遮断する能力、およびＳＭＡＤ１／５／８をリン酸化し、そして下流の転写を誘導する活性化ＢＭＰ  Ｉ型レセプターの能力を阻害する能力は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＢＭＰ  Ｉ型レセプターキナーゼ機能を阻害することを強力に主張する。
【００７２】
（化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ＢＭＰ媒介性の骨形成分化および骨鉱化作用を阻害する）
ＢＭＰ媒介性シグナリングおよび転写活性を遮断する化合物Ｃ／ドルソモルフィンの能力は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＢＭＰ誘導性の骨芽細胞分化を遮断し得ることを示唆した。筋線維芽細胞であるＣ２Ｃ１２細胞におけるアルカリホスファターゼ活性は、５日間の培養後において、ＢＭＰ４によって効率的に誘導され、そしてＢＭＰ６によってより低い程度に誘導された（図２５ａ）。この活性は、４μＭ（細胞数に対する有意な効果が観察されなかった濃度（図２５ｂ））の化合物Ｃ／ドルソモルフィンの添加によってほぼ完全に廃絶された。これらの知見は、ＢＭＰ機能の阻害と一致して、化合物Ｃ／ドルソモルフィンが多分化能の間葉由来細胞において細胞毒性を伴わずにＢＭＰ誘導性の骨形成分化を阻害することを示唆する。
【００７３】
インビトロでの骨形成分化に対する化合物Ｃ／ドルソモルフィンの効果がインビボでの骨形成まで拡大され得るか否かを試験するために、本発明者らは、ゼブラフィッシュ胚おける骨鉱化作用を分析した。初期胚発生の間の背側化を回避するために、ゼブラフィッシュを、２４ｈｐｆに始まる背腹軸の確立後に化合物Ｃ／ドルソモルフィンに曝露した。受精後１０日目に、カルセイン染色を、骨鉱化作用を評価するために行った。化合物Ｃ／ドルソモルフィンによる処理は、コントロールの幼生と比較した場合、より少ないカルセイン染色された椎骨セグメントを伴う骨鉱化作用の阻害を生じた（図２５ｃ〜図２５ｆ）。変化した骨鉱化作用にかかわらず、化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって処理した魚は、その他の点で、明視野顕微鏡によって形態学的および機能的に正常であるようであった（図２６）。
【００７４】
（化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ＢＭＰ誘導性ヘプシジン転写、ＨＪＶ誘導性ヘプシジン転写、およびＩＬ−６誘導性ヘプシジン転写を阻害する）
ＢＭＰ、ＨＪＶ、およびＩＬ−６は、培養した肝細胞（Ｂａｂｉｔｔら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３８：５３１−５３９，２００６；Ｔｒｕｋｓａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：１０２８９−１０２９３，２００６；Ｎｅｍｅｔｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１  １３：１２７１−１２７６，２００４；Ｌｅｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：９２６３−９２６５，２００４）および培養した肝細胞腫細胞（Ｔｒｕｋｓａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：１０２８９−１０２９３，２００６；Ｂａｂｉｔｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７：１９３３−１９３９，２００７）においてヘプシジン発現を誘導する。ＨＪＶは、ＢＭＰ補助レセプターとして機能するが、ＩＬ−６誘導性ヘプシジン発現がＢＭＰシグナリングを必要とするか否かは、不明確である（Ｗａｎｇら，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．２：３９９−４０９，２００５）。ＢＭＰ２による処理（図２７ａ）またはＨＪＶをコードするｃＤＮＡによるトランスフェクション（図２７ｂ）は、肝細胞腫由来Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてヘプシジンプロモーターの転写活性を誘導した。ＢＭＰ２誘導性ヘプシジンプロモーター活性およびＨＪＶ誘導性ヘプシジンプロモーター活性は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンの添加によって両方とも有効に抑制された。ＨｅｐＧ２細胞は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞よりも高い基礎ヘプシジン発現を示す（Ｂａｂｉｔｔら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３８：５３１−５３９，２００６）。化合物Ｃ／ドルソモルフィンによる処理は、ＨｅｐＧ２細胞において基礎ヘプシジン発現を、５０分の１を上回って減少させ、そしてＢＭＰ２によるヘプシジン発現の誘導を廃絶した（図２７ｃ）。化合物Ｃ／ドルソモルフィンとは対照的に、ＡＭＰＫを阻害するために十分な濃度でのＡｒａ−ＡによるＨｅｐ３Ｂ細胞の処理（Ｃｈｅｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２９１：２２７−２３８，２００６）は、ＢＭＰ誘導性のヘプシジンｍＲＮＡ発現を損なわず、化合物Ｃ／ドルソモルフィンがＡＭＰＫに対する効果を介してヘプシジン発現を阻害しないことを疑わしくした（図２８）。ＩＬ−６による処理は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてヘプシジン発現およびＩｄ１発現を誘導したが、化合物Ｃ／ドルソモルフィンの添加は、ヘプシジンおよびＩｄ１の両方のＩＬ−６媒介性誘導を遮断した（図２１ｄ〜図２１ｅ）。これらの知見は、ＢＭＰ媒介性ヘプシジン発現、ＨＪＶ媒介性ヘプシジン発現、およびＩＬ−６媒介性ヘプシジン発現が、全て、ＢＭＰ  Ｉ型レセプターを介するシグナリングによって調節されることを示唆する。
【００７５】
（化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、肝臓において鉄媒介性のＢＲ−ＳＭＡＤ活性化を阻害する）
インビボで、鉄は、ヘプシジンの肝臓発現を誘導して、過剰なフェロポーチン媒介性の鉄輸送を適応的に抑制する（Ｆｒａｅｎｋｅｌら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１５３２−１５４１，２００５；Ｎｅｍｅｔｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６：２０９０−２０９３，２００４）が、ＢＭＰシグナリングがこのフィードバックプロセスに関与するか否かは、不明確であった。ヘプシジンの鉄フィードバック調節におけるＢＭＰシグナリングの潜在的な役割を確認するために、肝臓のＳＭＡＤ１／５／８活性化に対する全身的な鉄チャレンジの効果を、試験した。成体ゼブラフィッシュにおける鉄−デキストランの腹腔内注射は、デキストラン注射したコントロールと比較して、１時間以内に肝臓抽出物においてＳＭＡＤ１／５／８リン酸化のほぼ３倍の増大をもたらした（図２９ａ）。ゼブラフィッシュに鉄−デキストランおよびドルソモルフィンを同時注射した場合、ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化は、鉄−デキストランおよびビヒクルを注射した魚と比較して、ほぼ３分の１に低下した（図２９ｂ）。同様に、マウスにおいて、鉄−デキストランおよびビヒクルの静脈内注射は、デキストランおよびビヒクルを注射したマウスと比較して、１時間後に肝臓抽出物において３倍よりも大きいＳＭＡＤ１／５／８リン酸化の増大をもたらした（図２９ｃ）。マウスにおける化合物Ｃ／ドルソモルフィンの同時注射は、肝臓のＳＭＡＤ１／５／８リン酸化における鉄媒介性の増大を廃絶した。２つの種におけるこれらの観察は、肝臓のＳＭＡＤ１／５／８活性化が鉄によって迅速に誘導され、そして化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって有効に阻害されることを示す。
【００７６】
（化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ゼブラフィッシュにおいて鉄誘導性のヘプシジン転写を阻害する）
全身的な鉄チャレンジは、インビボでヘプシジン発現を誘導することが公知であるが、原因である機構は、ヘプシジンプロモーターが鉄レベルの変化に応答することが公知である認識可能な転写エレメントを欠くので、完全に理解されていない。鉄チャレンジが肝臓のＳＭＡＤ１／５／８活性化を生じるという観察は、ＢＭＰシグナリングが鉄に応答してヘプシジン発現を媒介するという仮説をもたらす。成体ゼブラフィッシュは、通常、比較的低いレベルのヘプシジンを発現する。３時間後、鉄−デキストランおよびビヒクルをよって処理した魚は、デキストランおよびビヒクルを注射した魚と比較して、肝臓のヘプシジンｍＲＮＡレベルにおける４倍の増大を示した（図２９ｄ）。化合物Ｃ／ドルソモルフィンによる魚の同時処理は、鉄−デキストラン注射によって見られるヘプシジン発現の増大を阻害し、このことは、鉄がＢＭＰ依存的機構によってヘプシジン発現を誘導することを示唆する。
【００７７】
（化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、基礎肝臓ヘプシジン発現を低下させ、そしてマウスにおいて高鉄血症を誘導する）
標準的な鉄が豊富な食餌を与えた野生型Ｃ５７ＢＬ／６成体マウスは、おそらく鉄の豊富な供給によって誘導された実質的なヘプシジンを発現する（Ｎｉｃｏｌａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：４５９６−４６０１，２００２）。ゼブラフィッシュにおける鉄誘導性のヘプシジン発現を遮断する化合物Ｃ／ドルソモルフィンの能力は、化合物Ｃ／ドルソモルフィンが基礎ヘプシジン発現を阻害し、そして鉄が充実したマウスにおいて血清鉄レベルを増大させ得るという仮説をもたらした。化合物Ｃ／ドルソモルフィンを静脈内に投与した６時間後、肝臓のヘプシジンｍＲＮＡレベルは、ビヒクルを注射したマウスの３分の１のレベルまで減少した（Ｐ＜０．０１）（図２９ｅ）。ヘプシジンレベルの変化は、フェロポーチンによる細胞内の鉄の変化した動員によって２４時間以内に血清鉄濃度に影響を及ぼす（Ｎｅｍｅｔｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：１２７１−１２７６，２００４）。２４時間にわたる化合物Ｃ／ドルソモルフィンの投与は、血清鉄の総濃度における６０％の増大をもたらした（図２９ｆ）。したがって、化合物Ｃ／ドルソモルフィン処理は、成体マウスにおいてヘプシジン発現の基礎レベルを減少させること、および血清鉄濃度を増大させることに有効である。
【００７８】
（方法）
（ゼブラフィッシュ胚において背腹軸撹乱する低分子についてのスクリーニング）
ゼブラフィッシュにおける低分子スクリーニングを、いくつかの改変と共に、先に記載された通り（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５９５−５９９，２００４）に行った。野生型ゼブラフィッシュの対を、交配し、そして新しい受精卵を、Ｅ３緩衝液を含む９６ウェルプレートに三連で配置した。受精後の時間（ｈｐｆ）で４時間において、化合物を、５〜１０μＭでウェルに添加した。胚を、２８．５℃でインキュベートし、そして胚の全体の形態を、先に記載される通り（Ｍｕｌｌｉｎｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２３：８１−９３，１９９６）、１２ｈｐｆ、２４ｈｐｆ、および４８ｈｐｆにおいて胚軸の背側化または腹側化について試験した。合計で、合成のスクリーニング化合物（Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、５，５８０種の低分子）および公知の生物活性化合物（Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１，８４０種の低分子およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１５０種の低分子）を含む７，５７０種の化合物を、スクリーニングした。追跡研究のために、化合物Ｃ／ドルソモルフィンおよびＡｒａ−Ａ（アデノシン９−β−Ｄ−アラビノフラノシド）を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、そしてＣ７５を、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。
【００７９】
（ホールマウントゼブラフィッシュインサイチュハイブリダイゼーション）
インサイチュハイブリダイゼーションを、先に記載される通り（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  Ｂｏｏｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，１９９３））に行った。ゼブラフィッシュｋｒｏｘ２０プローブ、ｐａｘ２．１プローブ、およびＭｙｏＤプローブを、先に記載される通り（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：２７１−２８０，１９９６）に産生した。
【００８０】
（細胞培養）
野生型ＰＡＳＭＣおよびＢＭＰＲ−ＩＩ欠損ＰＡＳＭＣを、先に記載される通り（Ｙｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２４４４３−２４４５０，２００５）に単離し、そして１０％  ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。Ｃ２Ｃ１２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、グルタミンおよび１０％  ＦＢＳを補充したＤＭＥＭにおいて培養した。ＨｅｐＧ２細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％  ＦＢＳを含み、Ｌ−グルタミンを含む最小必須α培地（α−ＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。ＳＭＡＤ活性化インビトロの研究のために、ＰＡＳＭＣを、０．５％  ＦＣＳ  ＲＰＭＩ中で２４時間にわたってインキュベートし、次いで薬物化合物、ノギン、またはビヒクルと一緒に３０分間にわたってプレインキュベートし、次いで組換えＢＭＰ２、４、６、もしくは７、またはＴＧＦ−β１またはアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を３０分間にわたって添加した。
【００８１】
（ＢＭＰ応答性のＳＭＡＤリン酸化およびＴＧＦ−β応答性のＳＭＡＤリン酸化のイムノブロット分析）
細胞抽出物または組織を、ＳＤＳ溶解緩衝液（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％  ＳＤＳ、１０％グリセロール、５０ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％ブロモフェノールブルー）中で機械的にホモジナイズし；ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し；抗ホスホ−ＳＭＡＤ１／５／８、抗ホスホ−ＳＭＡＤ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、または抗α−チューブリン（Ｕｐｓｔａｔｅ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）Ａｂによってイムノブロットし；そしてＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して可視化した。Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ免疫反応性タンパク質を、Ｓｔｏｒｍホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアによって定量した。
【００８２】
（アルカリホスファターゼ活性）
Ｃ２Ｃ１２細胞を、２％  ＦＢＳを補充したＤＭＥＭにおいて１ウェルあたり２０００個の細胞で９６ウェルプレートに播種した。ウェルを、ＢＭＰリガンドおよび化合物Ｃ／ドルソモルフィンまたはビヒクルによって四連で処理した。細胞を、５０μｌのＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水／１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００による５日間の培養後に回収した。溶解物を、９６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ）中のｐ−ニトロ−フェニルホスフェート試薬に１時間にわたって添加し、そしてアルカリホスファターゼ活性を、４０５ｎＭにおける吸光度として示した。細胞の生存率および量を、それぞれ、アルカリホスファターゼ測定に使用したものと同様に処理した再現ウェルを使用してＣｅｌｌ−タイターＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および核色素ＣｙＱｕａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の結合によって測定した。
【００８３】
（ゼブラフィッシュの骨鉱化作用）
野生型ゼブラフィッシュ胚を、フェニルチオ尿素（ＰＴＵ）を含むＥ３緩衝液中で育てた（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  Ｂｏｏｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，１９９３））。受精後の日数（ｄｐｆ）で１日目に、胚を、化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１〜４μＭ）またはＤＭＳＯビヒクルによって処理した。５ｄｐｆ以降において、幼生に、１日おきに１時間にわたって給餌した。それぞれの給餌後に、残りの食物を、洗い流し、そして培地を、化合物Ｃ／ドルソモルフィンまたはビヒクルを含むＥ３で置換した。１０ｄｐｆにおいて、幼生を、先に記載される通り（Ｄｕら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２３８：２３９−２４６，２００１）に、カルセイン（０．２％）中に３０分間にわたって浸漬した。胚を、結合していないカルセインを除去するためにＥ３緩衝液において３時間にわたって繰り返し洗浄し、そしてトリカインによって麻酔した。石灰化した骨格構造を、緑色蛍光によって可視化し、そして椎体の数を、計数した。
【００８４】
（ＢＭＰ応答性エレメントおよびヘプシジンプロモータールシフェラーゼレポーターアッセイ）
６ウェルプレート中で５０％コンフルエンスまで増殖させたマウスＰＡＳＭＣを、ＢＭＰ  Ｉ型レセプターの構成的に活性な形態を発現する０．６μｇのプラスミド（ｃａＡＬＫ２、ｃａＡＬＫ３、またはｃａＡＬＫ６、Ｄｒ．Ｋｏｈｅｉ  Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎによって親切にも提供された（Ｆｕｊｉｉら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １０：３８０１−３８１３，１９９９））との組み合わせにおいて、０．３μｇのＩｄ１プロモータールシフェラーゼレポーター構築物（ＢＲＥ−Ｌｕｃ，Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ  ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ，Ｌｅｉｄｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（Ｋｏｒｃｈｙｎｓｋｙｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４８８３−４８９１，２００２））によって、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して一過性にトランスフェクトした。アクチビンＩ型レセプター機能およびＴＧＦ−β  Ｉ型レセプター機能を評価するために、ＰＡＳＭＣを、Ｉ型レセプターの構成的に活性な形態を発現する０．６μｇのプラスミド（ｃａＡＬＫ４、ｃａＡＬＫ５、およびｃａＡＬＫ７、Ｄｒ．Ｋｏｈｅｉ  Ｍｉｙａｚｏｎｏによってまた提供された（Ｏｋａｄｏｍｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１６８７−２１６９０，１９９６；Ｓｈｉｍｉｚｕら，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ３：１２５−１３４，１９９８））との組み合わせにおいて、０．３μｇのＰＡＩ−１プロモータールシフェラーゼレポーター構築物（ＣＡＧＡ−Ｌｕｃ，Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ  ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ（Ｄｅｎｎｌｅｒら，Ｅｍｂｏ  Ｊ．１７：３０９１−３１００，１９９８））によって一過性にトランスフェクトした。両方のレポーターに対して、０．２μｇのｐＲＬ−ＴＫウミシイタケルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、トランスフェクション効率についてのコントロールとして使用した。ＰＡＳＭＣを、トランスフェクションの１時間後に開始して２４時間にわたってかまたは実験の完了まで、化合物Ｃ／ドルソモルフィン（４〜１０μＭ）またはビヒクルと一緒にインキュベートした。細胞抽出物を、回収し、そして相対的なプロモーター活性を、デュアルルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してウミシイタケルシフェラーゼ活性に対するホタルルシフェラーゼ活性の比によって定量した。ＨｅｐＧ２細胞またはＨｅｐ３Ｂ細胞を、ＦＬＡＧタグ化ヒトＨＪＶをコードする２０ｎｇのｃＤＮＡを伴ってかまたは伴わずに、トランスフェクション効率ついてのコントロールとして０．２５μｇのｐＲＬ−ＴＫとの組み合わせにおいて、２．５μｇのヘプシジンプロモータールシフェラーゼレポーター（Ｂａｂｉｔｔら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３８：５３１−５３９，２００６）によって一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、ＨｅｐＧ２細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞を、１％  ＦＢＳ  α−ＭＥＭ中で６時間にわたってインキュベートした、化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１０μＭ）またはビヒクルによって３０分間にわたって処理し、次いでＢＭＰ２（２５ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で１６時間にわたってインキュベートした。ヘプシジンプロモーター活性を、上記のようなルシフェラーゼアッセイによって測定した。
【００８５】
（鉄−デキストラン注射）
成体の魚を、トリカインによって麻酔し、そしてその魚に対して、１０μｌの鉄−デキストラン溶液（１００ｍｇ／ｍｌ、デキストランの平均ＭＷ＝５０００、Ｓｉｇｍａ）を化合物Ｃ／ドルソモルフィン（２３μｇ／ｇ）またはビヒクル（ＤＭＳＯ）と一緒に腹腔に注射した。コントロールの魚に、１０μｌのデキストラン（平均ＭＷ＝５０００、Ｓｉｇｍａ）を注射した。魚を、水中で生き返らせた。注射の１時間後に、魚を、氷上で麻酔し、そして肝臓を、２００μＬのＳＤＳ溶解緩衝液中に回収し、そして機械的にホモジナイズした。１５μＬのタンパク質抽出物を、上に記載した通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、そしてイムノブロットした。注射の３時間後に、全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して機械的にホモジナイズしたゼブラフィッシュ肝臓から抽出した。
【００８６】
標準的な食餌（Ｉｓｏｐｒｏ  ＲＭＨ  ３０００，Ｐｒｏｌａｂ）で育てた１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、尾静脈を介して０．２ｇ／ｋｇのデキストラン（平均ＭＷ＝５０００，Ｓｉｇｍａ）または０．２ｇ／ｋｇの鉄−デキストランＵＳＰ（ＤｅｘＦｅｒｒｕｍ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｇｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を注射した。デキストランは、ビヒクルのみと一緒に注射されたが、鉄−デキストランは、ビヒクルまたは化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかと一緒に注射された。注射の１時間後に、マウスを、屠殺し、そして肝臓セグメントを、５００μｌのＳＤＳ溶解緩衝液中に回収し、そして機械的にホモジナイズした。２０μＬの肝臓抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてイムノブロットした。全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌを使用して機械的にホモジナイズしたマウス肝臓から回収した（化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＤＭＳＯの単一腹腔内用量による注射の６時間後）。
【００８７】
（定量的ヘプシジンＲＴ−ＰＣＲ）
Ｈｅｐ３Ｂ細胞またはＨｅｐＧ２細胞を、化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１０μＭ）の存在下または非存在下において１％  ＦＣＳ  α−ＭＥＭ中で６時間にわたって、ＢＭＰ２（２５ｎｇ／ｍｌ）またはヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、１００ｎｇ／ｍｌ）を伴ってかまたは伴わずにインキュベートし、次いでＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌによって培養細胞から抽出した。定量的ＲＴ−ＰＣＲを、先に記載される通り（Ｂａｂｉｔｔら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３８：５３１−５３９，２００６；Ｙｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２４４４３−２４４５０，２００５）に、Ｉｄ１またはヒトヘプシジン（ＨＡＭＰ）をコードするｍＲＮＡについて行い、そして１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）レベルまたはβ−アクチンｍＲＮＡレベルに対して正規化した。
【００８８】
マウス実験およびゼブラフィッシュ実験において、定量的ＲＴ−ＰＣＲを、処理した動物の肝臓から抽出した等量のＲＮＡから生成したｃＤＮＡに対して行った。三連または四連の実験を、示した通りに行った。ゼブラフィッシュヘプシジンをコードするｍＲＮＡの発現レベルおよびマウスヘプシジン（ＨＡＭＰｌ）をコードするｍＲＮＡの発現レベルを、先に記載される通り（Ｆｒａｅｎｋｅｌら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１５３２−１５４１  ，２００５；Ｗａｎｇら，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．２：３９９−４０９，２００５）に測定し、そしてそれぞれ、肝臓の脂肪酸結合タンパク質ｍＲＮＡ（ゼブラフィッシュ）レベルまたは１８Ｓ  ｒＲＮＡ（マウス）レベルに対して正規化した。
【００８９】
（血清鉄測定）
全血を、マウスから心穿刺によってＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ血清分離チューブ（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に回収し、そして血清を、製造業者の指示書に従って単離した。血清鉄レベルを、Ｉｒｏｎ／ＵＩＢＣキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して比色定量アッセイによって測定した。
【００９０】
（統計解析）
比較した測定値の統計的有意性を、ボンフェローニ補正によるスチューデントの両側Ｔ−検定または一元配置ＡＮＯＶＡを使用して測定した。ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化の化合物Ｃ／ドルソモルフィン阻害のヒルプロット分析を、ＧｒａＦｉｔソフトウェア（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓｕｒｒｅｙ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して行った。
【００９１】
（他の実施形態）
本明細書に引用された全ての刊行物および特許は、あたかも各々の個々の刊行物または特許が参考として援用されると具体的かつ個別に示されたかのように、参考として援用される。本明細書中の単数形（例えば、「ａ」および「ｔｈｅ」）の使用は、文脈が反対のことを示さない限り、対応する複数形の表示を除外しない。本発明は、理解の明確さの目的のための例示および例によってある程度詳細に記載されているが、特定の変更および改変が添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく本発明に対して行われ得ることは、本発明の教示に鑑みて当業者に対して容易に明らかである。
【００９２】
表１−初期ゼブラフィッシュ発生の異なる期間の間における化合物Ｃ／ドルソモルフィン（１０μＭ）による処理は、種々の浸透度を有する背側化の種々の程度を誘発する。発生のより早期に開始される継続的曝露は、より重度な背側化の欠損を引き起こす。ゼブラフィッシュ胚は、受精後の種々の時間において開始される化合物Ｃ／ドルソモルフィンに継続的に曝露され、そして４８ｈｐｆにおいて規定される通りに表現型について評価された。２ｈｐｆにおいて開始される化合物Ｃ／ドルソモルフィン処理は、高い浸透度を有する重度の背側化を誘発するが、４〜６ｈｐｆにおける化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、高い浸透度を有する軽度〜中程度の背側化を誘発した。８ｈｐｆにおいて開始される化合物Ｃ／ドルソモルフィン処理は、８５％の浸透度を有する軽度の背側化を誘発したが、１０ｈｐｆ以降における処理は、背側化を誘導しなかった。毒性は、この濃度の化合物Ｃ／ドルソモルフィンによって観察されなかった。間欠曝露：ゼブラフィッシュ胚は、受精後の種々の時間において開始される化合物Ｃ／ドルソモルフィンに曝露され、次いで間欠曝露の効果を試験するために時間間隔の後で新鮮な培地に移された。２ｈｐｆにおいて開始される化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、曝露が４ｈｐｆ、６ｈｐｆ、または８ｈｐｆまで継続された場合、進行性により重度の背側化を誘発し、２〜８ｈｐｆの曝露は、２ｈｐｆ後において化合物Ｃ／ドルソモルフィンに対して継続的に曝された胚のように、同一の重症度および浸透度をもたらした（１００％で重度に背側化した）。４〜８ｈｐｆにおける化合物に対する曝露および６〜８ｈｐｆにおける化合物に対する曝露は両方とも、軽度〜中程度の背側化を誘発した。したがって、背腹軸形成に対する化合物Ｃ／ドルソモルフィンの効果は、１０ｈｐｆよりも前に限定され、そして感受性のこの期間におけるより早期かつより長い曝露によって、より浸透性かつ重度になった。
【００９３】
表２−初期の胚発生の間における種々の濃度の化合物Ｃ／ドルソモルフィン（０〜１０μＭ）によるゼブラフィッシュの処理は、種々の浸透度および重症度を伴う背側化を誘発した。ゼブラフィッシュ胚は、３ｈｐｆにおいて開始される種々の濃度の化合物Ｃ／ドルソモルフィンに継続的に曝され、そして図１９で規定される通り、４８ｈｐｆにおいて表現型について評価した。２μＭ以下の濃度の化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、これらの条件下で背側化を誘発しなかったが、５〜１０μＭの範囲の濃度は、進行性により高い割合の胚において進行性により重度の背側化を誘発し、１０μＭは、試験したほぼ全ての胚において中程度または重度の背側化を誘導した。
【００９４】
表３−化合物Ｃ／ドルソモルフィンは、ＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ）の公知のインヒビターである。化合物Ｃ／ドルソモルフィンの効果がＡＭＰＫのモジュレーションに起因したという可能性を排除するために、本発明者らは、ゼブラフィッシュ胚における背腹軸形成に対するＣ７５（ＡＭＰＫ活性を抑制することが公知である脂肪酸合成のインヒビター）の効果を試験した。３ｈｐｆにおいて開始されるＣ７５によるゼブラフィッシュ胚の処理は、試験された任意の濃度（１〜１００μｇ／ｍｌ）で背側化の形跡を伴わずに、２５μｇ／ｍｌ以上の濃度で非特異的毒性をもたらした。対照的に、化合物Ｃ／ドルソモルフィンによる処理は、同じ条件下で、高い浸透度および最小限の毒性を伴う背側化を誘導した。
【００９５】
【表１】
2010503383.tif 000004
【００９６】
【表２】
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【００９７】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２６ｃ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
2010503383.tif 000040
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2010503383.tif 000042