(57)【要約】  本発明は、癌に対して起こる免疫応答の種類を制御する指標として組織微小環境中の癌細胞におけるＩＬ−１３発現のレベルを検出することによる、癌の治療、診断及び予後のための組成物及び方法を含む。
2010521675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を有する疑いのある患者から採取した生体試料の組織微小環境中に存在するＩＬ−１３のレベルを決定するステップと、
前記組織微小環境中のＩＬ−１３レベルと、前記生体試料と同じ種類の正常な非癌組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較するステップと、
ＩＬ−１３のレベルの上昇が癌の存在を示す、前記患者の予後を評価するステップと
を含む、癌を示す疑いのある患者の診断方法。
【請求項２】
ＩＬ−１３のレベルを決定する方法が、ウェスタンブロット分析、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ分析、インサイチュ蛍光、インサイチュ蛍光共鳴エネルギー移動、インサイチュ免疫沈降、及びインサイチュ免疫組織染色からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組織微小環境に対するＩＬ−１３の作用がＳＴＡＴ６のリン酸化レベルを測定することにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
試料が極低温凍結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＩＬ−１３発現のレベルが経時的に追跡される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＩＬ−１３のレベルがＩＬ−１３ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション及び定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
生体試料が上皮由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
生体試料が、乳房、前立腺、肺、大腸、卵巣、子宮内膜、腎臓、膀胱、胃、膵臓及び下垂体分泌腺から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上皮由来の癌を治療する方法であって、
前記癌の治療を必要とする患者を同定するステップと、
癌組織を有する疑いのある前記患者から採取した生体試料の組織微小環境中に存在するＩＬ−１３のレベルを決定するステップと、
前記組織微小環境中のＩＬ−１３レベルと、前記生体試料中に存在するのと同じ種類の正常な非癌組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較するステップと、
前記組織微小環境中の細胞間ＩＬ−１３情報伝達を遮断するために十分な量の１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストで前記患者を治療するステップと
を含む方法。
【請求項１０】
ＩＬ−１３アンタゴニストが、乳癌細胞の微小環境中のＩＬ−１３を標的とする、抗ＩＬ−１３抗体、ヒト抗ＩＬ−１３抗体、ヒト化抗ＩＬ−１３抗体、二価抗ＩＬ−１３抗体、二価ヒト化抗ＩＬ−１３抗体、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ及び一本鎖Ｆｖ断片並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される抗ＩＬ−１３抗原結合断片、抗ＩＬ−１３結合融合タンパク質、多価抗ＩＬ−１３抗体及び抗ＩＬ−１３キメラ抗体、ポリクローナル抗ＩＬ−１３抗体のうちの少なくとも１つを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＩＬ−１３アンタゴニストが、同族受容体に結合するＩＬ−１３の二価アンタゴニストを含み、ＩＬ−１３アンタゴニストが乳癌細胞の微小環境中で結合するＩＬ−１３−ＩＬ−１３受容体を標的とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＬ−１３アンタゴニストが癌を標的とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍特異的免疫細胞で患者を治療するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
樹状細胞を含む腫瘍内ワクチン接種で患者を治療するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
抗原負荷樹状細胞を含むワクチンで患者を治療するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
ＩＬ−１３アンタゴニストが、抗ＩＬ−１３サイトカイン受容体遮断薬、抗ＩＬ−１３受容体中和抗体、抗ＩＬ−１３受容体アンタゴニスト、可溶性ＩＬ−１３受容体、抗ＩＬ−１３受容体−ＩＬ−１３結合を阻害する１又は複数の分子、ＩＬ−１３の下流の事象の１又は複数の阻害剤、不活性化ＩＬ−１３及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
乳癌を示す疑いのある患者の診断方法であって、
乳癌を有する疑いのある前記患者から採取した生体試料の組織微小環境中に存在するＩＬ−１３のレベルを決定するステップと、
前記組織微小環境中のＩＬ−１３レベルと正常な非腫瘍乳房組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較するステップであって、ＩＬ−１３のレベルの上昇が乳癌の存在を示すステップと
を含む方法。
【請求項１８】
ＩＬ−１３のレベルを決定する方法が、ウェスタンブロット分析、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ分析、インサイチュ蛍光、インサイチュ蛍光共鳴エネルギー移動、インサイチュ免疫沈降、及びインサイチュ免疫組織染色からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＩＬ−１３のレベルが、ＳＴＡＴ６のリン酸化レベルを測定することにより決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
試料が極低温凍結されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＬ−１３発現のレベルが経時的に追跡される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ＩＬ−１３のレベルがＩＬ−１３ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションにより検出される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ＩＬ−１３発現のレベルが定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
包装された組み合わせ中に、
乳房組織微小環境中のＩＬ−１３の発現レベルを検出可能な量のＩＬ−１３特異的プローブ、及び
前記ＩＬ−１３プローブの使用に関する使用説明書
を含み、前記プローブが直接的又は間接的に検出可能である、乳房試料中のＩＬ−１３を検出するための検査キット。
【請求項２５】
乳癌を治療する方法であって、
前記乳癌の治療を必要とする患者を同定するステップと、
乳癌を有する疑いのある前記患者から採取した乳房組織試料の組織微小環境中に存在するＩＬ−１３のレベルを決定するステップと、
前記試料中のＩＬ−１３レベルと正常な乳房組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較するステップと、
１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストで前記乳癌を治療するステップと
を含む方法。
【請求項２６】
前立腺癌を治療する方法であって、
前記癌の治療を必要とする患者を同定するステップと、
前立腺癌を有する疑いのある前記患者から採取した前立腺組織試料の組織微小環境中に存在するＩＬ−１３のレベルを決定するステップと、
前記生体試料中のＩＬ−１３レベルと正常な前立腺組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較するステップと、
１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストで前記前立腺癌を治療するステップと
を含む方法。
【請求項２７】
非小細胞肺癌を治療する方法であって、
前記癌の治療を必要とする患者を同定するステップと、
肺癌を有する疑いのある前記患者から採取した肺試料の組織微小環境中に存在するＩＬ−１３のレベルを決定するステップと、
前記生体試料中のＩＬ−１３レベルと正常な肺組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較するステップと、
１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストで前記肺癌を治療するステップと
を含む方法。
【請求項２８】
血管新生を抑制するために十分な有効量の１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストで患者を治療するステップ
を含む、血管新生を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に癌治療の分野に、より詳細には癌に対する新規な診断及び治療の評価及び開発に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、癌に対する宿主反応と関連して本発明の背景を記述する。癌の増殖及び成長は、癌細胞と非造血細胞（線維芽細胞、内皮細胞）並びに自然免疫系及び適応免疫系両方由来の免疫細胞からなる周囲の非悪性の間質との間の相互作用に依存する（Coussens, L. M., and Werb, Z. (2002). Inflammation and cancer. Nature 420, 860-867; Joyce, J. A. (2005). Therapeutic targeting of the tumor microenvironment. Cancer Cell 7, 513-520）。自然免疫細胞は、好中球、マクロファージ（ＭΦ）、樹状細胞（ＤＣ）、肥満細胞、及びＮＫ細胞からなる（Janeway, C. A., Jr., and Medzhitov, R. (2002). Innate immune recognition. Annu Rev Immunol 20, 197-216）。適応免疫細胞は、抗原再接触時の免疫記憶及び迅速な反応が可能なＴ及びＢリンパ球である。しかしながら、リンパ球は抗原の種類に関して教育される必要がある。これは、免疫系の２つの部門を橋渡しするＤＣの仕事となる（Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y., Pulendran, B., and Palucka, K. (2000). Immunobiology of dendritic cells. Ann Rev Immunol 18, 767-811; Banchereau, J., and Steinman, R. M. (1998). Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392, 245-252; Shortman, K., and Liu, Y. J. (2002). Mouse and human dendritic cell subtypes. Nature Rev Immunol 2, 151-161; Steinman, R. M. (1991). The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu Rev Immunol 9, 271-296）。実際に、ＤＣは免疫応答を誘導及び維持し、ＭΦとは対照的に、ナイーブリンパ球を活性化することができる。さらに、マウス及びヒトの両方における抗原負荷ＤＣを用いたワクチン接種により、ＤＣが癌に対する耐性を弱め、Ｔ細胞を教育することが可能であると示された（Banchereau, J., and Palucka, A. K. (2005). Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nat Rev Immunol 5, 296-306）。そのため、ＤＣは、腫瘍による操作のための初期標的の代表である。
【０００３】
多くの研究が、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及びそのサブセットの役割に重点を置いてきた（Balkwill, F., Charles, K. A., and Mantovani, A. (2005). Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease. Cancer Cell 7, 211-217; Condeelis, J., and Pollard, J. W. (2006). Macrophages: obligate partners for tumor cell migration, invasion, and metastasis. Cell 124, 263-266）。しかしながら、ＤＣについてはあまり注目されてこなかった。ヒトにおける多くの研究が、ＤＣによる腫瘍の浸潤を認めた（Gabrilovich, D. (2004). Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendritic-cell defects. Nat Rev Immunol 4, 941-952）。だが、ＤＣ浸潤の免疫学的重要性はあまり解明されていない。腫瘍は、ＤＣ機能を破壊することにより免疫エフェクターを回避すると考えられている（Gabrilovich, D. (2004). Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendritic-cell defects. Nat Rev Immunol 4, 941-952）。例えば、骨髄細胞中のＳＴＡＴ−３の活性化は、ＤＣ成熟を阻害する（Gabrilovich, D. I., Chen, H. L., Girgis, K. R., Cunningham, H. T., Meny, G. M., Nadaf, S., Kavanaugh, D., and Carbone, D. P. (1996). Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells. Nat Med 2, 1096-1103）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生増加をもたらす（Wang, T., Niu, G., Kortylewski, M., Burdelya, L., Shain, K., Zhang, S., Bhattacharya, R., Gabrilovich, D., Heller, R., Coppola, D., et al. (2004). Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nat Med 10, 48-54）。乳癌細胞により分泌されたＩＬ−６は、ＤＣの代わりに単球分化をＴＡＭに偏らせ（Chomarat, P., Banchereau, J., Davoust, J., and Palucka, A. K. (2000). IL-6 switches the differentiation of monocytes from dendritic cells to macrophages. Nat Immunol 1, 510-514）、それにより抗原提示から抗原分解に偏らせる（Delamarre, L., Pack, M., Chang, H., Mellman, I., and Trombetta, E. S. (2005). Differential lysosomal proteolysis in antigen-presenting cells determines antigen fate. Science 307, 1630-1634）。最後に、腫瘍は、次にＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を増大させるＤＣのサブセットを分泌するＩＬ−１０及び／又はＴＧＦ−βの分化を促進する（Enk, A. H., Jonuleit, H., Saloga, J., and Knop, J. (1997). Dendritic cells as mediators of tumor-induced tolerance in metastatic melanoma. Int J Cancer 73, 309-316; Ghiringhelli, F., Puig, P. E., Roux, S., Parcellier, A., Schmitt, E., Solary, E., Kroemer, G., Martin, F., Chauffert, B., and Zitvogel, L. (2005). Tumor cells convert immature myeloid dendritic cells into TGF-beta-secreting cells inducing CD4+CD25+ regulatory T cell proliferation. J Exp Med 202, 919-929; Levings, M. K., Gregori, S., Tresoldi, E., Cazzaniga, S., Bonini, C., and Roncarolo, M. G. (2005). Differentiation of Tr1 cells by immature dendritic cells requires IL-10 but not CD25+CD4+ Tr cells. Blood 105, 1162-1169）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Coussens, L. M., and Werb, Z. (2002). Inflammation and cancer. Nature 420, 860-867
【非特許文献２】Joyce, J. A. (2005). Therapeutic targeting of the tumor microenvironment. Cancer Cell 7, 513-520
【非特許文献３】Janeway, C. A., Jr., and Medzhitov, R. (2002). Innate immune recognition. Annu Rev Immunol 20, 197-216
【非特許文献４】Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y., Pulendran, B., and Palucka, K. (2000). Immunobiology of dendritic cells. Ann Rev Immunol 18, 767-811
【非特許文献５】Banchereau, J., and Steinman, R. M. (1998). Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392, 245-252
【非特許文献６】Shortman, K., and Liu, Y. J. (2002). Mouse and human dendritic cell subtypes. Nature Rev Immunol 2, 151-161
【非特許文献７】Steinman, R. M. (1991). The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu Rev Immunol 9, 271-296
【非特許文献８】Banchereau, J., and Palucka, A. K. (2005). Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nat Rev Immunol 5, 296-306
【非特許文献９】Balkwill, F., Charles, K. A., and Mantovani, A. (2005). Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease. Cancer Cell 7, 211-217
【非特許文献１０】Condeelis, J., and Pollard, J. W. (2006). Macrophages: obligate partners for tumor cell migration, invasion, and metastasis. Cell 124, 263-266
【非特許文献１１】Gabrilovich, D. (2004). Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendritic-cell defects. Nat Rev Immunol 4, 941-952
【非特許文献１２】Gabrilovich, D. I., Chen, H. L., Girgis, K. R., Cunningham, H. T., Meny, G. M., Nadaf, S., Kavanaugh, D., and Carbone, D. P. (1996). Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells. Nat Med 2, 1096-1103
【非特許文献１３】Wang, T., Niu, G., Kortylewski, M., Burdelya, L., Shain, K., Zhang, S., Bhattacharya, R., Gabrilovich, D., Heller, R., Coppola, D., et al. (2004). Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nat Med 10, 48-54
【非特許文献１４】Chomarat, P., Banchereau, J., Davoust, J., and Palucka, A. K. (2000). IL-6 switches the differentiation of monocytes from dendritic cells to macrophages. Nat Immunol 1, 510-514
【非特許文献１５】Delamarre, L., Pack, M., Chang, H., Mellman, I., and Trombetta, E. S. (2005). Differential lysosomal proteolysis in antigen-presenting cells determines antigen fate. Science 307, 1630-1634
【非特許文献１６】Enk, A. H., Jonuleit, H., Saloga, J., and Knop, J. (1997). Dendritic cells as mediators of tumor-induced tolerance in metastatic melanoma. Int J Cancer 73, 309-316
【非特許文献１７】Ghiringhelli, F., Puig, P. E., Roux, S., Parcellier, A., Schmitt, E., Solary, E., Kroemer, G., Martin, F., Chauffert, B., and Zitvogel, L. (2005). Tumor cells convert immature myeloid dendritic cells into TGF-beta-secreting cells inducing CD4+CD25+ regulatory T cell proliferation. J Exp Med 202, 919-929
【非特許文献１８】Levings, M. K., Gregori, S., Tresoldi, E., Cazzaniga, S., Bonini, C., and Roncarolo, M. G. (2005). Differentiation of Tr1 cells by immature dendritic cells requires IL-10 but not CD25+CD4+ Tr cells. Blood 105, 1162-1169
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、癌細胞に対して宿主が起こす免疫応答の種類を改良するための組成物及び方法が依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＩＬ−１３（インターロイキン−１３）の遮断を使用して上皮由来の腫瘍を治療できることが分かっている。本発明は、優位な免疫応答がII型サイトカインの分泌を含む、癌治療を必要とする患者を特定すること、及び、II型サイトカインアンタゴニストがII型サイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞を遮断し、患部組織中のＴｈ１Ｔ細胞の割合を増加させる１又は複数のII型サイトカインアンタゴニストで患部組織を治療することにより、癌に対するＴ細胞応答を調節する組成物及び方法を含む。
【０００７】
本発明を、例えば前立腺や乳房などの上皮由来の癌の治療のために使用し得ることも分かっている。II型サイトカインアンタゴニストは、例えばＩＬ−１３を含むが、また抗ＩＬ−４抗体、抗ＩＬ−５抗体、抗ＩＬ−９抗体、抗ＩＬ−１３抗体又は抗ＩＬ−２５抗体、ヒト化抗ＩＬ−４抗体、抗ＩＬ−５抗体、抗ＩＬ−９抗体、抗ＩＬ−１３抗体又は抗ＩＬ−２５抗体、及びこれらの組み合わせを含んでもよい。他の実施形態において、II型サイトカインアンタゴニストは、不活性化ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３又はＩＬ−２５及びこれらの組み合わせであってもよい。これらのアンタゴニストは単回又は複数回投与で提供することができる。II型サイトカインは、例えば、抗サイトカイン受容体、中和抗体、受容体アンタゴニスト、可溶性受容体、受容体−リガンド結合に干渉する分子、及びII型シグナル伝達経路の下流の事象の阻害剤などの様々な活性物質及びこれらの組み合わせを使用して妨げてもよい。
【０００８】
より詳細には、本発明は、癌を有する疑いのある患者から採取した生体試料の組織微小環境中に存在するＩＬ−１３のレベルを決定するステップと、この組織微小環境中のＩＬ−１３レベルとこの生体試料と同じ種類の正常な非癌組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較するステップと、ＩＬ−１３のレベルの上昇が癌の存在を示す、この患者の予後を評価するステップとにより、癌を有する疑いのある患者を診断及び治療するための組成物及び方法を含む。一実施形態において、ＩＬ−１３のレベルを決定する方法はウェスタンブロット分析、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ分析、インサイチュ蛍光、インサイチュ蛍光共鳴エネルギー移動、インサイチュ免疫沈降、及びインサイチュ免疫組織染色からなる群から選択される。この方法はまた、ＳＴＡＴ６のリン酸化のレベルを測定することにより決定される組織微小環境に対するＩＬ−１３の作用を測定するステップも含む。
【０００９】
本発明の方法を使用する分析用の試料は、例えば組織切片、極低温凍結された切片などを含む。ＩＬ−１３発現のレベルは経時的に追跡されてもよく、ＩＬ−１３ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲなどによるＩＬ−１３レベルの検出を含んでもよい。一般に、生体試料は上皮由来とし、乳房、前立腺、肺、大腸、卵巣、子宮内膜、腎臓、膀胱、胃、膵臓、及び下垂体分泌腺から選択される生体試料から得ることができる。
【００１０】
本発明はまた、上皮由来の癌を治療する方法であって、この癌の治療を必要とする患者を特定するステップと、癌組織を有する疑いのあるこの患者から採取した生体試料の組織微小環境中に存在するＩＬ−１３のレベルを決定するステップと、この組織微小環境中のＩＬ−１３レベルとこの生体試料中に存在するのと同じ種類の正常な非癌組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較するステップと、この組織微小環境中の細胞間ＩＬ−１３情報伝達を遮断するために十分な量の１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストでこの患者を治療するステップとによる方法も含む。本発明で使用するためのＩＬ−１３アンタゴニストの例は、例えば、乳癌細胞の微小環境中のＩＬ−１３を標的とする、抗ＩＬ−１３抗体、ヒト抗ＩＬ−１３抗体、ヒト化抗ＩＬ−１３抗体、二価抗ＩＬ−１３抗体、二価ヒト化抗ＩＬ−１３抗体、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ及び一本鎖Ｆｖ断片並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される抗ＩＬ−１３抗原結合断片、抗ＩＬ−１３結合融合タンパク質、多価抗ＩＬ−１３抗体及び抗ＩＬ−１３キメラ抗体、ポリクローナル抗ＩＬ−１３抗体のうちの少なくとも１つを含む。治療方法は、腫瘍特異的免疫細胞、例えば樹状細胞を含む腫瘍内ワクチン接種で患者を治療するステップをさらに含んでもよい。本発明の別の実施形態は、抗原負荷樹状細胞を含むワクチンで患者を治療するステップを含む。ＩＬ−１３アンタゴニストの他の例は、抗ＩＬ−１３サイトカイン受容体遮断薬、抗ＩＬ−１３受容体中和抗体、抗ＩＬ−１３受容体アンタゴニスト、可溶性ＩＬ−１３受容体、抗ＩＬ−１３受容体−ＩＬ−１３結合を阻害する１又は複数の分子、ＩＬ−１３の下流の事象の１又は複数の阻害剤、不活性化ＩＬ−１３及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む。
【００１１】
本発明のさらに別の実施形態は、乳癌を示す疑いのある患者の診断方法であって、乳癌を有する疑いのあるこの患者から採取した生体試料の組織微小環境中に存在するＩＬ−１３のレベルを決定するステップと、この組織微小環境中のＩＬ−１３レベルと正常な非腫瘍乳房組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較するステップであって、ＩＬ−１３のレベルの上昇が乳癌の存在を示すステップとによる方法を含む。ＩＬ−１３のレベルを決定する方法の例は、例えば、ウェスタンブロット分析、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ分析、インサイチュ蛍光、インサイチュ蛍光共鳴エネルギー移動、インサイチュ免疫沈降、及びインサイチュ免疫組織染色を含む。ＩＬ−１３のレベルは、例えば極低温凍結された試料の、ＳＴＡＴ６のリン酸化レベルを測定することにより決定されてもよい。
【００１２】
本発明はまた、包装された組み合わせ中に、乳房組織微小環境中のＩＬ−１３の発現レベルを検出可能な量のＩＬ−１３特異的プローブ、及びこのＩＬ−１３プローブの使用に関する使用説明書を含み、このプローブが直接的又は間接的に検出可能である、乳房試料中のＩＬ−１３を検出するための検査キットも含む。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態は、乳癌を治療する方法であって、この乳癌の治療を必要とする患者を特定するステップと、乳癌を有する疑いのあるこの患者から採取した乳房組織試料の組織微小環境中に存在するＩＬ−１３のレベルを決定するステップと、この試料中のＩＬ−１３レベルと正常な乳房組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較するステップと、１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストでこの乳癌を治療するステップとによる方法を含む。本発明はまた、乳癌を治療するために十分な有効量の１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストで患者を治療することによる乳癌の治療用に適合させた組成物も含む。
【００１４】
別の方法は、この癌の治療を必要とする患者を同定するステップと、前立腺癌を有する疑いのあるこの患者から採取した前立腺組織試料の組織微小環境中に存在するＩＬ−１３のレベルを決定するステップと、この生体試料中のＩＬ−１３レベルと正常な前立腺組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較するステップと、１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストでこの前立腺癌を治療するステップとにより、前立腺癌を治療するステップを含む。本発明はまた、前立腺癌を治療するために十分な有効量の１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストで患者を治療することによる前立腺の治療用に適合させた組成物も含む。
【００１５】
本発明のさらに別の方法は、非小細胞肺癌を治療する方法であって、この癌のための治療を必要とする患者を同定するステップと、肺癌を有する疑いのあるこの患者から採取した肺試料の組織微小環境中に存在するＩＬ−１３のレベルを決定するステップと、この生体試料中のＩＬ−１３レベルと正常な肺組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較するステップと、１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストでこの肺癌を治療するステップとを含む方法を含む。本発明はまた、非小細胞肺癌を治療するために十分な有効量の１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストで患者を治療することによる非小細胞肺癌の治療用に適合させた組成物も含む。
【００１６】
本発明の方法はまた、血管新生を抑制するために十分な有効量の１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストで患者を治療するステップにより、血管新生を阻害する方法も含む。
【００１７】
代替として又は組み合わせて、可溶性ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３又はＩＬ−２５受容体及びこれらの組み合わせであるII型サイトカインアンタゴニストを使用してもよい。実際に、本発明は、１又は複数の抗サイトカイン抗体（例えばヒト化抗体）、受容体アンタゴニスト及び不活性化サイトカインの組み合わせを使用することができる。１つの具体例は、ＩＬ−１３受容体結合抗体遮断薬、可溶性ＩＬ−１３Ｒ及びこれらの組み合わせとすることができる。他の実施形態は、II型サイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞を減少させる（且つＩ型サイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞を増加させる）ためのＩＬ−１３アンタゴニストの使用を含む。
【００１８】
特定の実施形態において、ＩＦＮ−γの作用に拮抗するために抗ＩＦＮ−γ抗体、ヒト化抗ＩＦＮ−γ抗体、可溶性ＩＦＮ−γ受容体及びこれらの組み合わせを含むこともまた有用である場合がある。さらに他の実施形態において、アンタゴニストはまた、抗ＴＮＦ抗体、ヒト化抗ＴＮＦ抗体、可溶性ＴＮＦ受容体及びこれらの組み合わせも含んでよい。
【００１９】
本発明はまた、乳癌のための治療を必要とする患者を特定するステップと、ＩＬ−１３アンタゴニストがII型サイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞を遮断する、１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストで患部組織を治療するステップとにより、乳癌に対するＴ細胞応答を改良するための組成物及び方法も含む。ＩＬ−１３アンタゴニストの例は、ＩＬ−１３受容体結合抗体遮断薬、不活性化ＩＬ−１３、可溶性ＩＬ−１３Ｒ及びこれらの組み合わせを含む。
【００２０】
本発明の組成物は、それを必要とする患者に治療的有効量の１又は複数のII型サイトカインアンタゴニストを投与することにより、乳癌に対する免疫を向上させるための方法と併用して使用してもよい。II型サイトカインアンタゴニストの例は、例えば、抗ＩＬ−４抗体、抗ＩＬ−５抗体、抗ＩＬ−９抗体、抗ＩＬ−１３抗体又は抗ＩＬ−２５抗体、ヒト化抗ＩＬ−４抗体、抗ＩＬ−５抗体、抗ＩＬ−９抗体、抗ＩＬ−１３抗体又は抗ＩＬ−２５抗体、不活性化ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３又はＩＬ−２５、及びこれらの組み合わせ、可溶性ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３又はＩＬ−２５受容体及びこれらの組み合わせ、並びに列挙されたアンタゴニストの２つ以上の組み合わせを含む。組成物はまた、抗ＩＦＮ−γ抗体、ヒト化抗ＩＦＮ−γ抗体、可溶性ＩＦＮ−γ受容体及びこれらの組み合わせ、並びに／又は、抗ＴＮＦ抗体、ヒト化抗ＴＮＦ抗体、可溶性ＴＮＦ受容体及びこれらの組み合わせも含んでよい。
【００２１】
さらに別の実施形態において、本発明の組成物及び方法はまた、癌に対するＴｈ１応答を刺激するための１又は複数のＩ型サイトカインも含んでよい。１又は複数のＩ型サイトカインは、Ｔｈ１応答を刺激する単回又は複数回投与で提供することができる。
【００２２】
本発明はまた、抗ＩＬ−４抗体、抗ＩＬ−５抗体、抗ＩＬ−９抗体、抗ＩＬ−１３抗体若しくは抗ＩＬ−２５抗体；ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３若しくはＩＬ−２５の可溶性受容体及びこれらの組み合わせ、抗ＩＦＮ−γ抗体、ヒト化抗ＩＦＮ−γ抗体、可溶性ＩＦＮ−γ受容体及びこれらの組み合わせ、並びに／又は抗ＴＮＦ抗体、ヒト化抗ＴＮＦ抗体、可溶性ＴＮＦ受容体及びこれらの組み合わせから選択される有効量の１又は複数のII型サイトカインアンタゴニストを提供することにより、ヒト乳癌によるＴｈ２分極化を抑制する方法も含む。
【００２３】
本発明はまた、それを必要とする対象又は患者に、抗ＩＬ−１３サイトカイン受容体遮断薬、抗ＩＬ−１３中和抗体、抗ＩＬ−１３受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１３可溶性受容体、抗ＩＬ−１３受容体−リガンド結合を阻害する分子、抗ＩＬ−１３の下流の事象の阻害剤、不活性化ＩＬ−１３及びこれらの組み合わせから選択される有効量の１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストを提供する、腫瘍中の血管新生を阻害するための組成物及び方法も含む。血管新生を阻害するための方法は、単独で又は本明細書中で教示及び議論されている任意の療法と組み合わせて使用してもよい。
【００２４】
代替として本発明はまた、抗ＩＬ−１３サイトカイン受容体遮断薬、抗ＩＬ−１３中和抗体、抗ＩＬ−１３受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１３可溶性受容体、抗ＩＬ−１３受容体−リガンド結合を阻害する分子、抗ＩＬ−１３の下流の事象の阻害剤、不活性化ＩＬ−１３及びこれらの組み合わせから選択される有効量の１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストを、それを必要とする患者に提供する、上皮細胞由来の癌による腫瘍関連マクロファージの機能を阻害するための組成物及び方法も含む。
【００２５】
本発明はまた、転移及び／又は腫瘍間質形成を予防するために有効な量の、抗ＩＬ−１３サイトカイン受容体遮断薬、抗ＩＬ−１３中和抗体、抗ＩＬ−１３受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１３可溶性受容体、抗ＩＬ−１３受容体−リガンド結合を阻害する分子、抗ＩＬ−１３の下流の事象の阻害剤、不活性化ＩＬ−１３及びこれらの組み合わせから選択される１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストを提供することによる、転移及び／又は腫瘍間質形成の予防のための組成物及び方法も含む。
【００２６】
本発明の特徴及び利点のより完全な理解のために、次に添付の図面と共に本発明の詳細な説明を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】患者の乳癌試料の微小環境における２型サイトカインの存在を示すグラフである。ＰＭＡ及びIonomycinで一晩活性化後の、乳房腫瘍（黒色、Ｔ）及び周囲の組織（白色、ＳＴ）（図１ａ）又は全腫瘍断片（図１ｂ）の腫瘍細胞懸濁液中の、Multiplex Cytokine Beadアッセイにより測定したサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍｌ、縦座標）。平均値±ＳＤ
【図２ａ】患者の乳癌試料中のＣＤ４＋Ｔ細胞を分泌するＩＬ−１３を示す図である。単一細胞腫瘍懸濁液のフローサイトメトリー分析。（図２ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤のゲーティング。
【図２ｂ】患者の乳癌試料中のＣＤ４＋Ｔ細胞を分泌するＩＬ−１３を示す図である。単一細胞腫瘍懸濁液のフローサイトメトリー分析。図２ｂは、乳癌腫瘍の細胞懸濁液中のＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１３及びＩＦＮ−γについての細胞質内染色の２つのパターンを示す。組換えヒトＩＬ−１３の添加により阻害可能であるため、染色は特異的である（ｂ、中央パネル）。
【図２ｃ】図２ｃは、ＣＤ３＋ＣＲＴＨ２＋Ｔ細胞（白色）が乳癌腫瘍切片において検出可能であることを示す。
【図２ｄ】図２ｄは、フローサイトメトリーによるＣＤ４＋Ｔ細胞発現ＩＬ−１３の頻度と腫瘍上清へのＩＬ−１３分泌の間の相関関係を示す。
【図３】乳癌腫瘍中のＩＬ−１３を示す写真である。
【図４ａ】ヒト化マウスにおいて発生したヒト乳癌腫瘍にＤＣが浸潤することを示す図である。ＣＤ３４＋ＨＰＣ移植の４週間後に、１０×１０６個の腫瘍細胞をヒト化マウスの脇腹に皮下接種する。図４ａは接種後４日目の相対的な腫瘍サイズを示す。
【図４ｂ】ヒト化マウスにおいて発生したヒト乳癌腫瘍にＤＣが浸潤することを示す図である。ＣＤ３４＋ＨＰＣ移植の４週間後に、１０×１０６個の腫瘍細胞をヒト化マウスの脇腹に皮下接種する。図４ｂは、Ｈｓ５７８Ｔ乳癌細胞を移植したヒト化マウスにおける腫瘍発生の代表的な動態を示す。
【図４ｃ】ヒト化マウスにおいて発生したヒト乳癌腫瘍にＤＣが浸潤することを示す図である。ＣＤ３４＋ＨＰＣ移植の４週間後に、１０×１０６個の腫瘍細胞をヒト化マウスの脇腹に皮下接種する。図４ｃは、腫瘍細胞懸濁液の代表的なＦＡＣＳ分析である：ＨＬＡ−ＤＲ（縦座標）及びLineage（横座標）ｍＡｂによる染色（左プロット）。ＣＤ１２３（縦座標）及びＣＤ１１ｃ（横座標）による染色並びにリネージュ陰性ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞のゲートにおけるｐＤＣ（ＣＤ１２３＋ＣＤ１１ｃ−）及びｍＤＣ（ＣＤ１２３−ＣＤ１１ｃ＋）による相互発現分析（右プロット）。
【図４ｄ】図４ｄは、乳癌腫瘍を排出するリンパ節における、及び対側リンパ節におけるＤＣ浸潤を示す。ＨＬＡ−ＤＲ＋Ｌｉｎ−細胞パーセント（縦座標）。Ｎ＝９マウス／群を同一実験で分析。Wilcoxon検定。
【図４ｅ】図４ｅは、凍結組織切片におけるＨＬＡ−ＤＲ（緑色）及びＤＣ−ＬＡＭＰ（赤色）染色を示す（１０×／０．４０上パネル及び４０×／１．２５下パネル）。Ｈｓ５７８Ｔ乳癌を有するＮ＝１０マウスを分析した。
【図５ａ】ＣＤ４＋Ｔ細胞による再構成が乳癌腫瘍の早期発生の促進に関連していることを示す図である。ＰＢＳ（１００μｌ）、単独又はＣＤ４＋Ｔ細胞（１０×１０６細胞／１００μｌ  ＰＢＳ）と一緒の自己ＣＤ８＋Ｔ細胞（１０×１０６細胞／１００μｌ  ＰＢＳ）を腫瘍移植後３、６及び９日目にＨｓ５７８Ｔ乳癌腫瘍に（図５ａ）注射した（それぞれ合計のｎ＝３６［ＰＢＳ］、２１［ＣＤ８＋Ｔ細胞］、及び５５[ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞]ヒト化マウスで、ｎ＝１３、６及び１５試験）；Ｈｓ５７８Ｔ腫瘍（左）又はＭＣＦ−７腫瘍（右）を有するマウスのそれぞれのコホートにおける腫瘍発生の動態。
【図５ｂ】ＣＤ４＋Ｔ細胞による再構成が乳癌腫瘍の早期発生の促進に関連していることを示す図である。図５ｂは全てのマウスにおける１２日目のそれぞれの腫瘍サイズを示し、各点は１匹のマウスを表す。
【図５ｃ】図５ｃは、Ｔ細胞再構成の１５日後にＣＤ４＋Ｔ細胞がOncoHumouseドナーの乳癌腫瘍から精製されたことを示す。４〜６匹のマウスのＴ細胞をプールし、１．５×１０６細胞を自己OncoHumouseレシピエントの腫瘍に１回注射した。対照マウスにはＰＢＳを与えた。１１日目の腫瘍サイズ。２つの独立実験においてｎ＝４マウス。対のある片側ｔ検定。
【図５ｄ】図５ｄは腫瘍の脈管化を示す。
【図５ｅ】図５ｅは腫瘍の脈管化を示す。
【図６】乳癌発生の促進にはＣＤ４＋Ｔ細胞及び自己ＤＣが必要であることを示す図である。図６ａにおいて、ＰＢＳ（１００μｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培養液で生成された未熟単球由来ＤＣ（１×１０６細胞／１００μｌ  ＰＢＳ）、自己ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０×１０６細胞／１００μｌ  ＰＢＳ）又は両方を、ＣＤ３４＋ＨＰＣ移植をせずにＮＯＤ−ＳＣＩＤβ２ｍ−／−マウスのＨｓ５７８Ｔ乳癌腫瘍に移した。図６ｂは、腫瘍発生の動態を示す（ｎ＝３マウス／群）。
【図７】ヒト化マウスの乳癌腫瘍におけるＩＬ−１３発現ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す図である。図７ａ及び７ｂにおいて、自己ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０×１０６細胞／１００μｌ、ＣＤ８＋Ｔ細胞有り又は無し）を腫瘍移植後３、６及び９日目にOncoHumouseのＨｓ５７８Ｔ乳癌腫瘍に注射した。１５日目に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を腫瘍（図７ａ及び図７ｂ）及びＬＮ（図７ａ）から精製した。図７ａは、ＰＭＡ  Ionomycinによる一晩の再刺激後のMultiplex Bead Analysisによるサイトカイン分泌を示す（４試験）。図７ｂは、細胞内サイトカイン染色を示す（３試験の代表例、ｎ＝１０マウス）。
【図８】乳癌微小環境がｍＤＣを調節することにより２型サイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導することを示す図である。図８ａにおいて、ＨＬＡ−ＤＲ＋Ｌｉｎ−ＤＣを、Ｈｓ５７８Ｔ乳房腫瘍を排出するＬＮから選別した（４日目、８マウス／群）。４日目の腫瘍から選別され、ブレフェルジンＡ存在下においてＰＭＡイオノマイシンで５時間再刺激されたＤＣで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞による細胞内サイトカイン発現（図８ｂ）。ドットプロットはＣＤ３＋Ｔ細胞にゲートをかけた。ｎ＝８マウスの代表例。
【図９】乳癌発生の促進がＩＬ−１３アンタゴニストで阻害できることを示す図である。図９ａにおいて、ＰＢＳ（１００μｌ）又は自己ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞（１０×１０６細胞／１００μｌ  ＰＢＳ）を腫瘍移植後３及び６日目にOncoHumouseのＨｓ５７８Ｔ乳癌腫瘍に注射した。アイソタイプ対照又は抗ＩＬ−１３抗体及びｒｈＩＬ−１３Ｒα２／Ｆｃキメラの混合物（１００μｇ／注射）を腫瘍移植の４、６及び８日後に投与し（２試験、６OncoHumouse／Ｔ細胞を有する群、ＰＢＳ対照群において５Oncohumouse）；平均値及びＳＥＭ。図９ｂは腫瘍発生の動態を示す。図９ｂにおいて図９ａと同じであるが、１３日目に単一のマウスを分析した。図９ｃは図９ｂと同じであるが、マウスに抗ＩＬ−１３抗体のみを注射した。対のあるｔ検定。
【図１０】対照では再構成せずＣＤ４＋Ｔ細胞により再構成した前立腺癌腫瘍が上清中に高濃度のＩＬ−１３を示すことを示すグラフである。
【図１１】乳癌細胞についてのＩＬ−１３染色を示す図である。（ａ）凍結乳癌腫瘍切片をサイトケラチン（緑色）及びＩＬ１３（赤色）で標識した。（ｂ）異なる患者から得た腫瘍由来の切片。乳癌細胞のＩＬ１３染色はｒｈＩＬ１３により阻害可能である。
【図１２】乳癌細胞がリン酸化ＳＴＡＴ６を発現することを示す図である。パラフィン包埋組織切片（ａ〜ｃ）及び（ｄ〜ｅ）の免疫組織染色は、２人の異なる患者由来の腫瘍を表す。（ａ〜ｃ）サイトケラチンを発現する乳癌細胞巣（ａ）もまた、ＳＴＡＴ６を認識する抗体（ｂ）だけでなくリン酸化ＳＴＡＴ６（ｐＳＴＡＴ６）を認識する抗体（ｃ）で染色可能である。（ｄ〜ｅ）ｐＳＴＡＴ６染色は癌巣（ｄ）において顕著に見られ、抗体を生成するために使用されるペプチドによりブロック可能である。
【図１３ａ】図１３ａは肺腫瘍由来組織におけるＩＬ−１３の染色を示す。
【図１３ｂ】図１３ｂは肺腫瘍由来組織におけるＩＬ−１３の染色を示す。
【図１３ｃ】図１３ｃは肉眼では腫瘍の浸潤がない肺組織におけるＩＬ−１３の染色を示す。
【図１３ｄ】図１３ｄは肉眼では腫瘍の浸潤がない肺組織におけるＩＬ−１３の染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の様々な実施形態の構造及び使用を以下で詳細に論じるが、本発明が、広範な具体的文脈において具体化できる多くの適用可能な発明の概念を提供することを理解するべきである。本明細書において議論される具体的な実施形態は、本発明を行う且つ使用するための具体的方法を説明するのみであって、本発明の範囲を定めるものではない。
【００２９】
本発明の理解を容易にするために、多くの用語を以下で定義する。本明細書中で定義される用語は、本発明に関する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「この（ｔｈｅ）」などの用語は、単一の存在物のみを称することを意図するものではなく、説明のために具体例を使用する場合の一般的な種類を含む。本明細書中の専門用語は、本発明の具体的な実施形態を記述するために使用されるが、これらの用語の使用は、特許請求の範囲に概説されている場合を除き本発明の範囲を定めるものではない。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「ＩＬ−１３アンタゴニスト」は、ＩＬ−１３の活性を阻害、抑制又は除去する活性物質、例えば、一般にＩＬ−１３受容体を介する、組織微小環境中の細胞間のＩＬ−１３に誘発される情報伝達を遮断するために十分な量で供給される小分子、ペプチド及びタンパク質を指す。本発明で使用するためのＩＬ−１３アンタゴニストの非限定的な例は、例えば、乳癌細胞の微小環境中のＩＬ−１３を標的とする、抗ＩＬ−１３抗体、ヒト抗ＩＬ−１３抗体、ヒト化抗ＩＬ−１３抗体、二価抗ＩＬ−１３抗体、二価ヒト化抗ＩＬ−１３抗体、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ及び一本鎖Ｆｖ断片並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される抗ＩＬ−１３抗原結合断片、抗ＩＬ−１３結合融合タンパク質、多価抗ＩＬ−１３抗体及び抗ＩＬ−１３キメラ抗体、ポリクローナル抗ＩＬ−１３抗体のうちの少なくとも１つを含む。治療方法は、腫瘍特異的免疫細胞、例えば、樹状細胞を含む腫瘍内ワクチン接種で患者を治療するステップをさらに含んでもよい。ＩＬ−１３アンタゴニストの他の例は、抗ＩＬ−１３サイトカイン受容体遮断薬、抗ＩＬ−１３受容体中和抗体、抗ＩＬ−１３受容体アンタゴニスト、可溶性ＩＬ−１３受容体、抗ＩＬ−１３受容体−ＩＬ−１３結合を阻害する１又は複数の分子、ＩＬ−１３の下流の事象の１又は複数の阻害剤、不活性化ＩＬ−１３及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む。
【００３１】
本明細書において使用される場合、「II型サイトカインアンタゴニスト」は、通常２型ヘルパーＴ細胞の活性化に役立つはずであるサイトカインの活性を阻害、抑制又は除去する活性物質、例えば、抗ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３又はＩＬ−２５抗体、ヒト化抗ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３又はＩＬ−２５抗体、不活性化ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３又はＩＬ−２５、及びこれらの組み合わせ、可溶性ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３又はＩＬ−２５受容体及びこれらの組み合わせ、並びに上記の２つ以上の組み合わせを指す。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「オンコヒュー哺乳動物（oncohumammal）」は、ヒト免疫系が移植され、ヒト癌が移植された免疫不全の非ヒト哺乳動物を指す。当業者には明らかなように、多くの既存の動物が免疫不全動物として使用され得る。また、非致死的用量の放射線、化学的処理、１又は複数の遺伝子変異を有する動物、トランスジェニック、ノックアウト、コンディショナルノックアウト、ノックインなどを作ることによる哺乳動物の遺伝子操作を含む、免疫不全動物の非致死的な生産のための多くの方法が利用可能である。「オンコヒュー哺乳動物」の１つの例は、マウスがヒト免疫系及びヒト腫瘍の少なくとも一部の導入のためのプラットホームとして使用される「オンコヒューマウス」である。腫瘍は、１又は複数の原発腫瘍（例えば、免疫系が移植された自己由来、すなわち同一患者由来）、１又は複数の腫瘍細胞クローン及び／又は１又は複数の腫瘍細胞株であってよい。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「マーカー」、「検出可能なマーカー」及び「検出可能な標識」という用語は、例えば酵素、放射性同位体、高電子密度粒子、磁性粒子又は発色団などの、その特異的な機能特性及び／又は化学的特性のために検出可能な化合物及び／又は要素を指すために交換して使用でき、これらの使用がこれらの化合物及び／又は要素が付着する作用物質の検出、及び／又は所望の場合さらに定量を可能にする。扱いが容易で安価及び非毒性である蛍光標識を含む数多くの種類の検出可能な標識がある。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「組織微小環境(tissue microenvironment)」は、天然組織内に、例えばインビボで細胞が存在する局所環境を指す。組織微小環境において、２種以上の組織特異的細胞種が例えば、接触（接触阻害）、サイトカイン、ケモカインなどを介して互いに相互作用及び／又は影響し得る。ほとんどの場合、器官内でごく近接した細胞は、同じ組織中に２種以上の細胞を有する隣接した細胞外環境中の物質のほとんど同時の暴露をもたらすはずである。加えて、同じ微小環境に暴露された２種以上の細胞種は、微小環境中に導入された共通の作用物質に暴露すると同様に反応する場合がある。インビトロで、組織微小環境は細胞がインビボで経験する環境を模倣する。本発明の文脈において、組織微小環境は組織内のインビボ微小環境を指すことが多いはずである。
【００３５】
サイトカイン産生の直接測定。アッセイにおけるＩＬ−１３レベルの直接測定は、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、放射免疫測定法、ゲル電気泳動、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色及び生物検定法などの方法を使用する核酸又はタンパク質発現の直接測定を含む。
【００３６】
皮膚免疫応答を評価するためのＥＬＩＳＡ技術は、当技術分野においてよく知られている。ＥＬＩＳＡプロトコルは、マイクロタイター（ＥＬＩＳＡ）プレートのウェルを、対象となるサイトカインに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体、例えば、抗ＩＬ−１３抗体でコートするものである。手短に述べると、抗体溶液をウェル中でインキュベートさせ、非結合抗体を洗い流し、空いた部位を不活性タンパク質、例えばＰＢＳ中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、ウェル中で１〜３時間インキュベートさせる。ブロッキング溶液を捨て、ＩＬ−１３を有する疑いのある試料、例えばプロテアーゼ活性を最小限に抑えながらタンパク質を除去するために処理された乳癌を有する疑いのある乳房細胞の試料をＥＬＩＳＡウェルに加える。定量のために、試料溶液をＰＢＳ緩衝液中に連続的に希釈し、インキュベーション時間の後、プレートを再度洗浄し、例えばサイトカインに対する二次抗体、例えばポリクローナルウサギ抗ＩＬ−１３抗体を使用してＩＬ−１３のレベルを直接的又は間接的に検出する。インキュベーション時間の後、プレートを再度洗浄し、例えば、二次抗体に対するビオチン標識二次抗体又は三次抗体を加え（例えば、ヤギ抗ウサギ抗体）インキュベートする。非結合物質を洗浄後、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジンを加え、０．５〜１時間３７℃でインキュベートすることによって、ＩＬ−１３発現のレベルを検出する。サイトカインが抗体の２つの層の間に位置するため、このタイプのアッセイはしばしばサンドイッチＥＬＩＳＡと呼ばれる。検出用に使用される酵素に応じて検出可能な基質をウェルに加え、ＩＬ−１３の存在／非存在及び／又はレベルを決定する。特異的に結合したＩＬ−１３の量と一致する（例えば、既知の標準と比較して）シグナル強度（例えば、色、発光など）を決定する。
【００３７】
放射免疫測定。放射免疫測定は、ＥＬＩＳＡによる定量で前述したものと同様な方法で、ＩＬ−１３の産生を定量するために使用することもできる。一般に、ＩＬ−１３特異的抗体は、関連部分が参照により本明細書に組み込まれるHarlow or Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor 1989)に記載されているものなどの標準的な技術を使用して基質に結合する。結合した抗体は次いで、乳房試料から採取した上清に暴露され、この試料から生検材料又は細胞を得て、培養液中で増殖させる。１２５Ｉ修飾されたチロシンなどの放射性標識を有する二次抗体を結合したサイトカインに加え、ノイズ比に対して検出可能なシグナルを提供するであろう比放射能で上述のようにインキュベートさせる。非結合標識物質を洗い流し、標準的な技術、例えばシンチレーションカウンターを使用して残存する標識を定量する。
【００３８】
ゲル電気泳動及びウェスタンブロッティング。別法として、ウェスタンブロット分析によりＩＬ−１３の存在を判断することができる（例えば、関連部分が参照により本明細書中に組み込まれるDidieijean, et al., J. Invest. Dermatol. 92:809 (1989)を参照）。ウェスタンブロット分析は、（皮膚ホモジネート及び層状体調製物と同様に）高タンパク質濃度又は様々な洗浄剤若しくは可溶化剤の存在のためにＥＬＩＳＡ又は機能アッセイ（例えば、ＳＴＡＴ６リン酸化）において正確に試験できない試料を分析するために使用できる。
【００３９】
細胞上清試料を、標準的な電気泳動技術を使用して還元又は非還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに流す。ゲル中で分離したタンパク質を、この場合も一般的な技術を使用して、例えばニトロセルロース膜、ナイロン膜又は何らかの他の適した基材などの基材上に電気泳動的にブロットする。膜は、不活性タンパク質でブロックし、次いで、前述の抗体の１つなどの対象とするタンパク質に対する抗体を含有する溶液と一緒にインキュベートすることにより固定化タンパク質に結合することができる。抗体は、ＩＬ−１３特異的モノクローナル抗体（例えば、抗ヒトＩＬ−１３）又は変性サイトカインに対して産生された特異的抗ＩＬ−１３抗体であってもよく、又は高力価ポリクローナル抗血清であってもよい。結合したタンパク質−抗体複合体は直接的又は間接的に検出できる。間接的測定に関して、標的を、続いて一次抗体に特異的な二次標識抗体と一緒にインキュベートすることによりタンパク質−抗体−抗体複合体を形成する。例えば、二次標識抗体を比色標識、酵素標識で標識してもよく、又は放射性標識してもよい。結合した抗体−サイトカイン複合体を次いで、前述した標識のための適切な方法を使用してアッセイする。
【００４０】
免疫組織染色。免疫組織染色は、定性的及び定量的性質についての情報を提供する。インサイチュ免疫組織染色は様々な細胞種中の、又は組織の異なる領域内の特定のサイトカイン分布の可視化及び位置測定を可能にする。手短に述べると、組織試料を、例えばTissue-Tek OCT（Miles, Inc.社, Elkhart, Ind.から市販されている）などの包埋化合物中で急速凍結し、使用するまで−７０℃で保存することができる。この組織を切片、通常６μｍ切片に切り、顕微鏡スライド上に置く。アセトン中で組織を固定後、スライドを非特異的ブロッキング剤、例えばヤギ血清と一緒にインキュベートすることにより非特異的結合部位をブロックする。続いて試料を、対象とするサイトカインに対する特異的抗体と一緒にインキュベートする。十分に洗浄後、二次標識抗体、例えばビオチン化抗体を加え、結合した標識の量を標準的な技術を使用して定量する。ビオチン化抗体を使用する場合、ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼをコンジュゲートしたアビジンを加え、その後続いて比色ペルオキシダーゼ基質と一緒にインキュベートする。次いで試料をヘマトキシリンで対比染色する。確実に染色パターンを特異的にするために、抗サイトカイン抗体との比較のために対照抗体を使用してもよい。未処理の対照組織又は細胞もまた、炎症性刺激を受けた組織又は細胞と比較する。
【００４１】
サイトカイン遺伝子発現の測定。タンパク質産生レベルでサイトカインの制御を試験することに加えて、ＩＬ−１３ｍＲＮＡレベルの直接的評価はＩＬ−１３発現レベル変化の有益な指標である。ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの調節は連携して起こることが多いが、いつもそうであるとは限らない。
【００４２】
ノーザンブロッティング。ノーザンブロッティングは、サイトカイン濃度の間接的測定としてサイトカインのＩＬ−１３ｍＲＮＡ産生量を測定するために使用されてきた。乳房細胞試料のＲＮＡをアガロースゲル上で分離し、分離したＲＮＡをナイロン又は他の適した膜上にブロットする。膜に結合したＲＮＡを、対象とするサイトカインのアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡに結合するはずである特異的核酸配列でプローブする。プローブを、例えば、３２Ｐ又は化学発光で標識することにより、適切なｍＲＮＡに結合しているプローブの検出を可能にする。
【００４３】
ｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーション。インサイチュハイブリダイゼーションは、培養細胞又は組織切片において細胞のｍＲＮＡレベルの直接的な視覚化を可能にする定性的な手順である。異なる細胞集団における、又は組織の異なる領域におけるｍＲＮＡの相対的な発現を測定することができる。細胞試料を、標準的な方法及び試薬を使用して顕微鏡スライドに接着させる。固定した細胞をエタノール中でインキュベートし、少量のプローブをスライド上に載せ、スライドを覆い、スライドを一晩加湿雰囲気中でインキュベートすることにより、対象とするサイトカインに特異的なＤＮＡプローブと試料をハイブリダイズさせる。プローブは、本明細書中で前述したように、及び／又は当業者に知られるであろうように標識する。ＤＩＧ標識プローブに関して、ウェスタンブロットで使用した手順と同様の発色手順を行う。ヘマトキシリンで対比染色後、プローブの分布を光学顕微鏡レベルで可視化することができる。
【００４４】
ＲＴ−ＰＣＲ。ｍＲＮＡレベルを評価するための非常に高感度で有力な技術は、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応に基づく。試料から全ＲＮＡを単離し、逆転写酵素を使用してｍＲＮＡをＤＮＡ（ｃＤＮＡ）にコピーする。次いでｃＤＮＡを、対象とするｍＲＮＡ種を特異的に標的とするＤＮＡプライマーを用いるＰＣＲ反応に加える。次いでこのＰＣＲ産物を、様々な方法のいずれかを使用して、例えば、アガロースゲルで電気泳動し、蛍光色素で染色し、写真撮影して検出する。ＰＣＲ産物の染色強度はＰＣＲ産物の濃度に比例し、デンシトメーターを使用して定量することができる。対照として使用するため、様々な処理条件下で発現が比較的一定なハウスキーピング遺伝子β−アクチンを、サイトカイン遺伝子と並行して分析する。β−アクチン発現に基づく様々な遺伝子の発現を標準化することによって、ｍＲＮＡ濃度の半定量的測定をＲＴ−ＰＣＲにより達成することができる。
【００４５】
本発明によるアッセイキットは、ＩＬ−１３又はその下流のエフェクター（例えば、ＳＴＡＴ６のリン酸化）に対する少なくとも１つのプローブ、及びアッセイを行うための使用説明書を含む。キットはまた、アッセイ試薬、例えば、塩、緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、制限酵素及び変性剤も含んでよい。キットは、陽性対照試験のための標的又はモデル標的、及び陰性対照試験のための標的のない「試料」を含んでもよい。
【００４６】
増幅アッセイキットは、前述のものの一部又は全てに加えて、プライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼ及びアッセイ又は対照アッセイのためのポリメラーゼ鋳型を含んでもよい。生体染色キットは、プローブ及び使用説明書に加えて、透過化剤、リポソーム前駆体、緩衝液、塩、対比染色剤及び光学フィルターを含んでもよい。インサイチュキットは、プローブ及び使用説明書に加えて、固定剤、脱水剤、プロテアーゼ、対比染色剤、洗浄剤、光学フィルター及びコートした顕微鏡スライドを含んでもよい。
【００４７】
免疫不全動物宿主。本明細書中に記載の動物モデルを作製するために任意の免疫不全哺乳動物を使用することができる。本明細書において使用される場合、「免疫不全」という用語は、有効な免疫応答を起こす動物の能力を損なう変化を記述するために使用する。本明細書において使用される場合、「有効な免疫応答」は、（これらに限定されるものではないが）ウイルス、細菌、寄生生物、悪性細胞、及び／又は異種若しくは同種移植などの侵入病原体を、例えば死滅させることが可能な、宿主動物におけるヒト免疫応答を記述するために使用する。免疫不全哺乳動物の１つの例は、一般に、免疫グロブリン及び機能的Ｔ細胞抗原受容体の生成に必要なリコンビナーゼ活性を欠き、したがって機能的Ｂ及びＴリンパ球を産生しない、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスと称される免疫不全マウスである。
【００４８】
自然発生した、又は誘導された可能性のある遺伝子欠損の結果として欠陥のあるものを含む、免疫不全マウス、ラット又は他の動物を使用することができる。例えば、異種又は同種の：ヌードマウス、β２−ミクログロブリン遺伝子（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２ｍ−／−）にさらに変異を有する非肥満性糖尿病免疫不全／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス、Ｒａｇ１−／−、Ｒａｇ２−／−マウス及び／又はＰＥＰ−／−マウス、これらのマウスと交雑し免疫不全の背景を有するマウスを、本明細書中に記載のヒト免疫系及び／又は細胞を埋め込む、又は植え付けるために使用することができる。欠陥は、例えば、組換えによる遺伝子欠損、遺伝子欠損胸腺又は欠損Ｔ細胞受容体領域、ＮＫ細胞欠損、Ｔｏｌｌ受容体欠損、Ｆｃ受容体欠損、免疫グロブリン再配列欠損、代謝の欠損、これらの組み合わせなどの結果としてであってもよい。誘導された免疫不全は、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、ＦＫ−５０６の投与、胸腺除去、放射線などの結果としてであってもよい。
【００４９】
様々なトランスジェニック免疫不全マウスが現在利用可能であるか、又は交尾若しくは交雑可能であり、従来の技術に従って選択できる。一般に、免疫不全マウスは、リンパ球の成熟を阻害する、特に免疫グロブリン及び／又はＴ細胞受容体領域、Ｔｏｌｌ受容体などを再配列する能力を欠く欠陥を有するはずである。雌の、雄の、去勢された又は去勢されていないマウスを、腫瘍増殖の経過における、例えばアンドロゲンなどの利用可能性の影響に応じて使用してもよい。マウスに加えて、免疫不全ラット又は同様なげっ歯類動物もまた、本発明の実践において採用することができる。
【００５０】
本明細書中において使用される場合、「化合物」、「作用物質」、「活性成分」、「医薬品成分」、「活性物質」、「生物活性物質」という用語は、交換して使用でき、薬剤及び／又は薬学的に活性な成分と定義される。本発明は、１又は複数のリード化合物を単離するために、例えば、試験化合物プール中の薬学的に活性な物質として以下の薬剤のいずれかを使用又は放出することができる。本発明の方法を使用して、多くの試験化合物を試験、単離、及び精製することができる。
【００５１】
試験化合物の例は、抗腫瘍剤、抗縮瞳薬、ステロイド、交感神経様作用薬、局所麻酔薬、抗菌剤、降圧剤、降圧利尿薬、強心剤、冠拡張薬、血管収縮薬、β遮断薬、抗不整脈剤、カルシウムアンタゴニスト、抗痙攣薬、眩暈剤、精神安定剤、抗精神病薬、筋弛緩薬、呼吸剤、非ステロイドホルモン、抗ホルモン、ビタミン、漢方薬、抗ムスカリン薬、ムスカリン受容体拮抗剤、散瞳薬、精神賦活剤、液性剤、鎮痙薬、抗うつ薬、抗糖尿病薬、食欲抑制薬、抗アレルギー薬、充血除去薬、解熱薬、抗片頭痛薬、抗マラリア薬、抗潰瘍薬、ペプチド、抗エストロゲン、抗ホルモン剤、抗潰瘍剤、麻酔薬、中枢神経系に作用を有する薬剤又はこれらの組み合わせを含む。加えて、１又は複数の以下の生物活性物質を１又は複数の担体及び本発明（それ自体が担体となり得る）を組み合わせてもよい。
【００５２】
免疫不全マウスの異なる系統を、本発明とともに使用することができる。一実施形態において、免疫不全マウスは、腫瘍抑制遺伝子、サイトカイン、酵素、受容体、又はアポトーシス誘導物質でもある１個又は複数個の遺伝子を用いて遺伝子導入することができる。代替として、第２の遺伝子を腫瘍遺伝子から得てもよい。腫瘍遺伝子の例は、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ  ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ｂｃｌ及びａｂｌを含む。遺伝子はまた、腫瘍抑制遺伝子を含んでもよく、腫瘍抑制遺伝子は例えば、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１、ＭＭＡＣ１、ｐ７３、ｚａｃ１、ＢＲＣＡＩ及びＲｂであってよい。他の遺伝子は、腫瘍サイトカインであってもよく、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＴＮＦ、ＧＭＣＳＦ、β−インターフェロン及びγ−インターフェロンからなる群より選択される。他の実施形態において遺伝子は、例えば、シトシンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、β−グルクロニダーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、グルコセルブロシダーゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、チミジンキナーゼ及びリソソーマルグルコシダーゼなどの酵素であってもよい。別の実施形態において遺伝子は、例えば、ＣＦＴＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＩＬ−２受容体及びエストロゲン受容体などの受容体であってもよい。別の実施形態において遺伝子は、例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘ．ｓｕｂ．ｓ、Ｂｉｋ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ、Ａｄ  Ｅ１Ｂ及びＩＣＥ−ＣＥＤ３プロテアーゼなどのアポトーシス誘導物質であってもよい。特定の実施形態において、遺伝子導入及び／又はトランスフェクトされた細胞はマウスに移植されたヒト細胞である。
【００５３】
本発明は、哺乳動物の腫瘍部位に、放射線療法の前に抗血管新生因子タンパク質を投与すること、放射線を電離することによって電離放射線療法の有効性を高める方法であって、抗血管新生因子投与及び放射線の組み合わせが放射線だけを電離するよりもより有効である方法をさらに提供する。
【００５４】
本発明はまた、例えば、薬学的に許容される担体又は希釈剤における治療化合物のプール及び／又はリードも含む。インビボ適用に関して、スクリーニング法により特定した化合物を、例えば、非経口的、経口的、又は腹腔内を含む様々な方法でオンコヒューマウスに投与することができる。非経口投与は、以下の経路による投与を含む：静脈内、筋肉内、間質、腹腔内、硬膜内、硬膜外、動脈内、皮下、眼内、滑液嚢内、経皮を含む経上皮、吸入による経肺、経眼、舌下及び口腔、眼、皮膚、眼球、直腸、膣及び吹送又は噴霧による経鼻吸入を含む局所。
【００５５】
II型サイトカインアンタゴニスト（など）は、例えば、不活性希釈剤と一緒に、又は同化可能な食用担体と一緒に経口投与することができ、硬質又は軟質ゼラチンカプセル内に封入することができ、又は錠剤に圧縮することができる。経口での治療的投与のために、活性化合物を賦形剤と混合し、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、サシェ、ロゼンジ、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用することができる。医薬組成物は、粉末剤又は顆粒剤、水性液体若しくは非水性液体中の、又は水中油若しくは油中水型エマルジョン中の液剤又は懸濁剤の形態で活性化合物を含むことができる。
【００５６】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどはまた、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチンなどの結合剤も含有することができる。第二リン酸カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、及びショ糖、乳糖若しくはサッカリンなどの甘味剤、又は香味剤もまた含むことができる。投与単位剤形がカプセルである場合、液体担体を含むことができる。様々な他の材料が、コーティングとして、又は別の方法で投与単位の物理的形態を修正するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、又はカプセルを、シェラック、糖又は両方でコートすることができる。シロップ剤又はエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてショ糖、防腐剤としてメチル及びプロピルパラベン、染料及び香味料を含んでもよい。任意の投与単位の調製において使用する任意の材料は、一般に、薬学的に純粋であり、実質的に無毒であるはずである。活性化合物は、持続放出製剤及び処方中に組み込んでもよい。
【００５７】
II型サイトカインアンタゴニスト（など）は、例えば、非経口的又は腹腔内に投与してもよい。遊離塩基としての化合物又は薬学的に許容される塩の溶液は、適した界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと混合した水中で調製することができる。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中で、及び油中で調製できる。通常の保存及び使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖及び／又は化学的変性を予防するための防腐剤及び／又は抗酸化剤を含有することができる。
【００５８】
II型サイトカインアンタゴニスト（など）の医薬品形態は、無菌水溶液又は分散液及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製用の無菌粉末剤を含むことによって、注射用途のために調製してもよい。静脈内又は他の同様な用途について、化合物は一般に無菌であり、液体懸濁剤中で及び／又は注射器による送達のために再懸濁されて提供され得る。化合物は製造及び保存条件下で安定に存在できるが、細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護しなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適した混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒とすることができる。コーティング、例えば、レシチンの使用、及び必要な大きさの粒子中に組み込むこと（分散液の場合）によって、及び当業者によく知られている界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌剤及び抗真菌剤によってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムが使用され得る。
【００５９】
無菌注射溶液を、必要量のII型サイトカインアンタゴニスト（など）を適切な溶媒中に、必要であれば上記で列挙した様々な他成分と一緒に組み込み、その後続いて濾過滅菌することによって調製する。一般に分散液は、様々な無菌活性成分を基本的な分散媒及び上記で列挙したもの以外の成分のいずれかを含む無菌媒体中に組み込むことによって調製する。無菌注射溶液調製用の無菌粉末剤の場合、調製方法は、例えば、真空乾燥、凍結噴霧、加熱真空及び／又は凍結乾燥技術を含んでもよい。鼻腔又は口腔への投与に適した医薬組成物は、例えば、粉末剤、自己推進薬並びにエアゾール、アトマイザー及びネブライザーなどのスプレー処方を含む。
【００６０】
本発明の治療用II型サイトカインアンタゴニスト（など）は、単独で、又は薬学的に許容される担体と組み合わせて、又は薬学的に許容される塩として、哺乳動物に投与することができ、その割合は化合物の溶解度及び化学的性質、選択した投与経路並びに標準的な医薬の実践により決定する。化合物はまた、通常、疾患及び障害、例えば癌の治療に通常適用される別の治療効果のある化合物も含むことができる。本発明の組成物及び別の治療効果のある化合物を使用した治療は、同時であってもよく、又は間隔をあけてもよい。
【００６１】
本明細書中に開示されたインビボ分析は、ＣＤ３４＋ＨＰＣで再構成した免疫不全マウスに基づいており、ヒト腫瘍がヒト免疫系及びヒト癌の分析において有用であることを証明することができた。適合移植されたヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）を有する又は有さない、ヒト腫瘍異種移植片を移植された免疫不全マウス（Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., and Wilson, D. B. (1988). Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature 335, 256-259）は、ヒト癌を研究するためのモデルとして（Mueller, B. M., and Reisfeld, R. A. (1991). Potential of the scid mouse as a host for human tumors. Cancer Metastasis Rev 10, 193-200）長年使用されてきた。このマウスは、血液悪性腫瘍において臨床的意義のある予後因子の同定を可能にし（Kamel-Reid, S., Letarte, M., Doedens, M., Greaves, A., Murdoch, B., Grunberger, T., Lapidot, T., Thorner, P., Freedman, M. H., Phillips, R. A., and et al. (1991). Bone marrow from children in relapse with pre-B acute lymphoblastic leukemia proliferates and disseminates rapidly in scid mice. Blood 78, 2973-2981;Kamel-Reid, S., Letarte, M., Sirard, C., Doedens, M., Grunberger, T., Fulop, G., Freedman, M. H., Phillips, R. A., and Dick, J. E. (1989). A model of human acute lymphoblastic leukemia in immune-deficient SCID mice. Science 246, 1597-1600;Palucka, A. K., Scuderi, R., Porwit, A., Jeha, S., Gruber, A., Bjorkholm, M., Beran, M., and Pisa, P. (1996). Acute lymphoblastic leukemias from relapse engraft more rapidly in SCID mice. Leukemia 10, 558-563;Uckun, F. M., Sather, H., Reaman, G., Shuster, J., Land, V., Trigg, M., Gunther, R., Chelstrom, L., Bleyer, A., Gaynon, P., and et al. (1995). Leukemic cell growth in SCID mice as a predictor of relapse in high-risk B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Blood 85, 873-878）、癌治療薬及び免疫療法の前臨床開発において重要な役割を果たしてきた（Bankert, R. B., Egilmez, N. K., and Hess, S. D. (2001). Human-SCID mouse chimeric models for the evaluation of anti-cancer therapies. Trends Immunol 22, 386-393;Kelland, L. R. (2004). Of mice and men: values and liabilities of the athymic nude mouse model in anticancer drug development. Eur J Cancer 40, 827-836）。このようなモデルはまた、充実性腫瘍における転移機構を調べるために役立ってきた（Muller, A., Homey, B., Soto, H., Ge, N., Catron, D., Buchanan, M. E., McClanahan, T., Murphy, E., Yuan, W., Wagner, S. N., et al. (2001). Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis. Nature 410, 50-56）。
【００６２】
以前のモデルの主な制約は、ヒト免疫微小環境がないことであった。実際、行われたアプローチは以下を含む：（ｉ）ヒト免疫細胞の非存在下における腫瘍異種移植（Bankert, R. B., Egilmez, N. K., and Hess, S. D. (2001). Human-SCID mouse chimeric models for the evaluation of anti-cancer therapies. Trends Immunol 22, 386-393;Mueller, B. M., and Reisfeld, R. A. (1991). Potential of the scid mouse as a host for human tumors. Cancer Metastasis Rev 10, 193-200;Reddy, S., Piccione, D., Takita, H., and Bankert, R. B. (1987). Human lung tumor growth established in the lung and subcutaneous tissue of mice with severe combined immunodeficiency. Cancer Res 47, 2456-2460）；（ii）腫瘍による刷り込みを受けた免疫細胞を有する腫瘍外科生検材料の異種移植（Anderson, T. M., Hess, S. D., Egilmez, N. K., Nwogu, C. E., Lenox, J. M., and Bankert, R. B. (2003). Comparison of human lung cancer/SCID mouse tumor xenografts and cell culture growth with patient clinical outcomes. J Cancer Res Clin Oncol 129, 565-568;Iwanuma, Y., Chen, F. A., Egilmez, N. K., Takita, H., and Bankert, R. B. (1997). Antitumor immune response of human peripheral blood lymphocytes coengrafted with tumor into severe combined immunodeficient mice. Cancer Res 57, 2937-2942;Sakakibara, T., Xu, Y., Bumpers, H. L., Chen, F. A., Bankert, R. B., Arredondo, M. A., Edge, S. B., and Repasky, E. A. (1996). Growth and Metastasis of Surgical Specimens of Human Breast Carcinomas in SCID Mice. Cancer J Sci Am 2, 291）；及び（iii）ヒトＤＣをほとんど欠いているヒト末梢血リンパ球（ＳＣＩＤ−ｈｕＰＢＬ）を用いた異種移植（Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., and Wilson, D. B. (1988). Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature 335, 256-259）。本明細書中で使用されたアプローチでは、ヒトＣＤ３４＋ＨＰＣを移植され、健常な志願者由来のヒト免疫系で再構成されたマウスが、以前に腫瘍に暴露されていないヒト免疫細胞環境中に移植された癌細胞の生態における初期の事象の分析を初めて可能とする。
［実施例］
【００６３】
ヒト化マウスの作製。Ｇ−ＣＳＦで動員した健常成人志願者のアフェレーシスからＣＤ３４＋ＨＰＣを得、前述したように精製した（Palucka, A. K., Gatlin, J., Blanck, J. P., Melkus, M. W., Clayton, S., Ueno, H., Kraus, E. T., Cravens, P., Bennett, L., Padgett-Thomas, A., et al. (2003). Human dendritic cell subsets in NOD/SCID mice engrafted with CD34+ hematopoietic progenitors. Blood 102, 3302-3310）。アフェレーシスのＣＤ３４−画分をFicoll−精製し、得られたＰＢＭＣを凍結保存し、自己Ｔ細胞の供給源として使用した。２．５×１０６個のＣＤ３４＋ＨＰＣを、致死量に近い放射線（１３７Ｃｓγ−放射線を１２ｃＧｙ／ｇ体重）を照射したＮＯＤ−ＳＣＩＤβ２ｍ−／−マウス（Jackson Laboratories社製）の静脈内に移植した。長期培養物から採取した１０×１０６乳癌細胞（Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＣＦ７、１８０６）を、マウスの脇腹に、又は乳腺部に皮下注射した。ＮＯＤ−ＳＣＩＤβ２ｍ−／−マウスを用いた実験において、腫瘍移植の前日に致死量に近い放射線（１３７Ｃｓγ−放射線を１２ｃＧｙ／ｇ体重）を照射した。腫瘍サイズを２〜３日毎にモニターした。腫瘍体積（楕円形）を、式：（短径）２×長径／２を使用して計算した。
【００６４】
単球由来樹状細胞及びＴ細胞精製：ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）（Immunex社製, Seattle, WA）及びＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ）（R&Dsystems社製, Minneapolis, MN）と一緒に培養することにより、ＰＢＭＣの付着画分から単球由来樹状細胞を作製した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、製造業者の使用説明書（Myltenyi Biotec社製, Auburn, CA）に従って磁気選別を使用して、解凍したＰＢＭＣから確実に選択した。純度は常に＞９０％であった。
【００６５】
免疫蛍光：組織をTissue-Tek （OCT, Allegiance社製, McGaw社製, IL）中で凍結し、Superfrost Plusスライド（Fisher scientific社製, Pittsburgh, PA）上で低温切片化し、冷アセトンで固定した。直接染色：ＨＬＡ−ＤＲ  ＦＩＴＣ（BD Pharmingen社製, San Diego, CA）；ＣＲＴＨ２−ＰＥ；ＩＬ−１３−ＰＥ；ＣＤ３−ＦＩＴＣ。間接染色：ＤＣ−ＬＡＭＰ（Immunotech社製, Marseille, France）に続いてTexas-Red（Jackson Immunoresearch社製, West Grove, PA）にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ。Leica TCS-NT SP（Leica社製, Deerfield, IL）を使用して共焦点顕微鏡法を行った。腫瘍脈管化を評価するために、OncoHumouseにＦＩＴＣ−レクチン（２ｍｇ／ｍｌで１５０マイクロリットル）（Vector Laboratories社製, Burlingame, CA）を、マウスに麻酔をかけ、ＰＦＡ４％を静脈内注入してから１０分後に静脈内（ｉｖ）注射した。１０μｍ腫瘍切片を固定し、ＤＡＰＩ（Vector Laboratories社製、Burlingame, CA）と一緒にVectashieldにマウントし、プランアポ対物レンズ及びPhotometrics coolsnaps HQを備えたOlympus BX51、及びMetamorphソフトウェア（UIC社製）で分析した。
【００６６】
フローサイトメトリー：コラゲナーゼＤ（２ｍｇ／ｍｌ）（Roche Diagnostics社製, Indianapolis, IN）で４５分間、３７℃で消化することにより、腫瘍、リンパ節、及び脾臓から細胞懸濁液を得た。採取した骨から骨髄細胞を洗い流した。細胞懸濁液を２回洗浄し、ＰＢＳ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ５％ＡＢ血清中で以下の抗体を使用して染色した：Ｌｉｎ、ＣＤ４５、ＩｇＤ、ＣＤ８０−ＦＩＴＣ、ＣＤ１２３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ３−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９−ＡＰＣ、（BD Pharmingen社製, San Diego, CA）及びＣＤ４０−ＰＥ（Immunotech社製, Marseille, France）。
【００６７】
Ｔ細胞サイトカイン：ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ５６及びグリコフォリンＡマイクロビーズ（Miltenyi Biotec社製, Auburn, CA）を使用して磁気枯渇した後、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を軟膜から得、ＣＤ４＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋表現型に基づいて選別した。ソートゲートからＶα２４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を除外することによってＮＫＴ細胞を枯渇させた。ＤＣを、ＨＬＡ−ＤＲ＋Ｌｉｎ−ＣＤ１１ｃ＋及びＨＬＡ−ＤＲ＋Ｌｉｎ−ＣＤ１２３＋表現型に基づいて選別した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（５×１０４個／ウェル）をＤＣ（５×１０３個／ウェル）と一緒に、１０％ヒトＡＢ血清（Gemini BioProducts社製, Woodland, CA）を添加したRPMI1640中で培養した。サイトカイン分泌をLuminexにより評価するため、Ｔ細胞を５日目に採取し、２回洗浄し、１×１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁し、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）（Sigma社製, StLouis, MO）で１６時間再刺激した。サイトカイン発現を細胞内染色により評価するため、６日目の培養からＴ細胞を採取し、２回洗浄し、ＰＭＡ及びイオノマイシンで５時間再刺激した。ブレフェルジンＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）（BD Pharmingen社製, San Diego, CA）を、最後の２．５時間加えた。Ｔ細胞を、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２（BD Pharmingen社製, San Diego, CA）に対する抗ＣＤ３及びＡｂで標識した。
【００６８】
インビボＩＬ−１３遮断：腫瘍移植の４、６及び８日目に、マウスの腫瘍内に抗ＩＬ−１３ｍＡｂ及びｒｈＩＬ−１３Ｒα２／Ｆｃキメラ又はヤギＩｇＧアイソタイプ対照（各１００μｇ／ｍｌ）（R&D systems社製, Minneapolis, MN）を注射した。
【００６９】
浸潤性又は侵襲性乳癌と診断された患者由来の腫瘍試料を、Baylor University Medical Center Tissue Bank（IRB#005-145）から得た。試料を小断片に細かく切り、コラゲナーゼ２．５ｍｇ／ｍｌ、ヒアルロニダーゼ１ｍｇ／ｍｌ、DNase２０Ｕ／ｍｌを含有する３種類の酵素ミックス中で２〜３時間、３７℃で消化した。懸濁液を濾過し、洗浄し、得られた細胞を１×１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁し、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）（Sigma社製, StLouis, MO）で１６時間活性化した。サイトカイン産生を培養上清においてLuminexにより分析した。代替として、全腫瘍断片を、ＰＭＡ及びイオノマイシンと一緒に一晩培養物中に置いた。細胞内サイトカイン染色のため、細胞をＰＭＡ及びイオノマイシンと一緒に５時間刺激した。ブレフェルジンＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）（BD Pharmingen社製, San Diego, CA）を、最後の２．５時間加えた。細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ４ｍＡｂで標識し、ＩＬ−１３及びＩＦＮγ（BD Pharmingen社製, San Diego, CA）に対するＡｂを使用して細胞内サイトカイン染色を行った。ＩＬ−１３染色を阻害するため、使用前に抗ＩＬ−１３ｍＡｂを組換えヒトＩＬ−１３（５μｇ／ｍｌ）と一緒に１時間室温でインキュベートした。細胞をＰＦＡ１％中で固定し、フローサイトメトリーにより分析した。各組織の切片１枚を、免疫蛍光分析のために凍結した。切片をＣＤ３Ａｌｅｘａ４８８ｍＡｂ（BD Pharmingen社製, San Diego, CA）で標識し、ＤＡＰＩでマウントした。
【００７０】
統計：パラメトリックｔ検定及びノンパラメトリックMann-Whitney及びWilcoxon検定を使用して観察された差異の有意性を評価した。パラメトリックなPearson Correlation及びノンパラメトリックなSpearman相関を示されたように使用した。
【００７１】
乳癌腫瘍に成熟樹状細胞（ＤＣ）が浸潤し、これがＣＤ４＋Ｔ細胞との緊密なクラスターにしばしば関与することが分かった。乳癌腫瘍微小環境において、１型（ＩＦＮ−γ）及び２型（大部分はＩＬ−１３）サイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞が見出されることが分かった。凍結組織切片の免疫蛍光染色によって、乳癌細胞におけるＩＬ−１３発現が明らかとなった。乳癌、ＤＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞偏向の間の関連を実証するために、ヒトＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）及び健常志願者由来のＴ細胞を移植し、ヒト乳癌細胞株を移植したＮＯＤ−ＳＣＩＤβ２ｍ−／−マウスを使用した。その場合、乳癌細胞はヒトＤＣを引きつけ、ヒトＤＣにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化するよう刷り込み、ＩＬ−１３を分泌する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は腫瘍発生を促進し、これはＩＬ−１３アンタゴニストで阻害可能である。したがって、乳癌は偏ったＤＣ成熟化を促進することにより癌誘発性（pro-cancer）免疫を誘発する。
【００７２】
乳癌はヒトＤＣの特定のサブセットに富む（Bell, D., Chomarat, P., Broyles, D., Netto, G., Harb, G. M., Lebecque, S., Valladeau, J., Davoust, J., Palucka, K. A., and Banchereau, J. (1999). In breast carcinoma tissue, immature dendritic cells reside within the tumor, whereas mature dendritic cells are located in peritumoral areas. J Exp Med 190, 1417-1426）ことが分かっている。これらのサブセットは、Langerhans細胞や間質ＤＣなどの大量の未熟骨髄ＤＣ（ｍＤＣ）サブセットを含む。これらの細胞の存在自体は、驚くべきことではないかもしれない。実際、上皮表面をモニターするのは未熟ＤＣの機能である。したがって腫瘍は、未熟ＤＣの浸潤などの生理学的な組織の恒常性機構を使用することができる。興味深いことに、乳癌組織の腫瘍周辺部は成熟ＤＣ−ＬＡＭＰ＋ＤＣを示し、これは正常な生理学的条件下でリンパ組織にしか見られない。リンパ器官の外側の成熟ＤＣの存在は炎症と関連しており、関節リウマチの無菌性滑膜炎において（Radstake, T. R., van Lieshout, A. W., van Riel, P. L., van den Berg, W. B., and Adema, G. J. (2005). Dendritic cells, Fc{gamma} receptors, and Toll-like receptors: potential allies in the battle against rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 64, 1532-1538；Thomas, R., MacDonald, K. P., Pettit, A. R., Cavanagh, L. L., Padmanabha, J., and Zehntner, S. (1999). Dendritic cells and the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Leukoc Biol 66, 286-292；Gordon, S., and Taylor, P. R. (2005). Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol 5, 953-964）又は全身性自己免疫患者の血液において（Banchereau, J., Pascual, V., and Palucka, A. K. (2004). Autoimmunity through Cytokine-Induced Dendritic Cell Activation. Immunity 20, 539-550；Blanco, P., Palucka, A. K., Gill, M., Pascual, V., and Banchereau, J. (2001). Induction of dendritic cell differentiation by IFN-alpha in systemic lupus erythematosus. Science 294, 1540-1543）観察できる。しかしながら、腫瘍における成熟ＤＣの存在についての免疫学的重要性は依然として不明である。
【００７３】
患者の乳癌組織試料に浸潤するＣＤ４＋Ｔ細胞の特徴を決定した。ＩＬ−１３が乳癌微小環境及び乳癌細胞のＩＬ−１３染色において見られることが分かった。これらの観察結果により本発明者らは機構研究に着手した。しかしながら、試料が入手しにくく、原因との関連を確立することが困難であり、ヒトでの研究は妨げられている。したがって、乳癌細胞株がヒューマウスにも移植されている（Palucka, A. K., Gatlin, J., Blanck, J. P., Melkus, M. W., Clayton, S., Ueno, H., Kraus, E. T., Cravens, P., Bennett, L., Padgett-Thomas, A., et al. (2003). Human dendritic cell subsets in NOD/SCID mice engrafted with CD34+ hematopoietic progenitors. Blood 102, 3302-3310）ヒト化マウスのモデルを作製した。こうしたマウスは、ヒトＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＣＤ３４＋ＨＰＣ）を移植した非肥満性糖尿病免疫不全／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）β２ミクログロブリン欠損（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２ｍ−／−）マウス（Humouse）とすることができる。こうしたマウスは、マクロファージ、ヒトＤＣの全サブセット及びヒト適応免疫系の要素、Ｂ細胞などのヒト自然免疫系の要素を発生させる（Palucka, A. K., Gatlin, J., Blanck, J. P., Melkus, M. W., Clayton, S., Ueno, H., Kraus, E. T., Cravens, P., Bennett, L., Padgett-Thomas, A., et al. (2003). Human dendritic cell subsets in NOD/SCID mice engrafted with CD34+ hematopoietic progenitors. Blood 102, 3302-3310）。自己Ｔ細胞の移植により、本発明者らはヒトＴ細胞サブセットの調節を分析できるようになる。乳癌腫瘍に浸潤するＤＣはナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ−１３の分泌に偏向させることが本明細書中で示される。
【００７４】
患者の乳癌腫瘍の微小環境は２型サイトカインに富んでいる。腫瘍周辺部において、乳癌腫瘍に、Ｔ細胞との緊密なクラスターに関与する（Bell, D., Chomarat, P., Broyles, D., Netto, G., Harb, G. M., Lebecque, S., Valladeau, J., Davoust, J., Palucka, K. A., and Banchereau, J. (1999). In breast carcinoma tissue, immature dendritic cells reside within the tumor, whereas mature dendritic cells are located in peritumoral areas. J Exp Med 190, 1417-1426）成熟ＤＣが浸潤し、免疫応答が継続していることを示唆する。乳癌腫瘍微小環境におけるこの相互作用の重要性を調べるため、乳癌患者の腫瘍生検材料におけるＴ細胞サイトカインのパターンを分析した。乳房のインサイチュ及び侵襲性の腺管癌及び／又は粘液癌、並びに小葉癌を含む、２１人の患者由来の試料を分析した。可能な限り、同じ患者から得た腫瘍部位並びに周囲の組織（肉眼では腫瘍の浸潤がない）を分析した。単一細胞懸濁液（図１ａ）又は全腫瘍断片（図１ｂ）を１６時間、ＰＭＡ／Ionomycinで活性化し、上清をCytokine Bead Arrayによってアッセイした。
【００７５】
患者の最初のコホートの単一細胞懸濁液の分析（表１のＰｔ＃１〜６）では、腫瘍試料において高レベルのＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦを示したが、周囲の組織は示さなかった（図１ａ及び表１）。さらに、高レベルのＩＬ−１３（２００ｐｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（１８０ｐｇ／ｍｌ）が４個の評価可能な試料のうち３個において検出でき、Ｔｈ２偏向を示唆した。組織処理がデータを偏らせるという可能性を除外するため、次の患者コホートにおいて、サイトカイン、全腫瘍断片を活性化してサイトカインパターンを分析した。図１ｂ及び表１に示すように、高レベルのＩＬ−２及びＩＦＮ−γが全試料において（１３／１４）、ＩＬ−１３が１１／１３試料において、及びＩＬ−４が７／１３試料において見られた（図１ｂ及び表１）。ＩＬ−２、ＴＮＦ及びＩＬ−１３のレベルは、腫瘍部位由来の上清において、腫瘍周辺組織由来の上清よりも著しく高かった（図１ｂ）。したがって、患者の乳癌試料の微小環境はＩＦＮ−γ及び２型サイトカインが富んでおり、Ｔ細胞偏向を示唆する。
【００７６】
【表１】
2010521675.tif 000003
【００７７】
患者の乳癌腫瘍に１型及び２型サイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞が浸潤する。Ｔ細胞が実際に、乳癌微小環境中で検出されるサイトカイン産生に寄与するかどうかを判断するため、単一細胞懸濁液におけるＴ細胞組成物及びサイトカイン発現パターンを測定した。フローサイトメトリーにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞が優勢であることが示される（≧７５％、図２ａ）。入手可能な分析用組織の量が限られていたため、本発明者らは最初２つのサイトカイン、すなわち、ＩＦＮ−γ（１型サイトカイン）及びＩＬ−１３（上清分析におけるレベルがＩＬ−４のレベルよりも高かった２型サイトカイン）に注目した。細胞内染色により、ＣＤ４＋Ｔ細胞の最大９％までを表す可能性がある（図２ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞を発現するＩＬ−１３の存在が示された。過剰な組換えＩＬ−１３により遮断可能であったため（図２ｂ）、染色は特異的であった。興味深いことに、異なる腫瘍試料において２種類の染色、すなわち、ＩＬ−１３及びＩＦＮ−γの両方を発現する二重陽性Ｔ細胞、及びＩＬ−１３又はＩＦＮ−γのいずれかを発現する単一陽性Ｔ細胞が観察され、後者はＴ細胞偏向の古典的定義と一致する（Mosmann, T. R., and Coffman, R. L. (1989). TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 7, 145-173）。これと一致して、Ｔｈ２細胞において発現される化学誘引物質受容体相同分子（ＣＲＴＨ２）を発現するＴ細胞（Nagata, K., Tanaka, K., Ogawa, K., Kemmotsu, K., Imai, T., Yoshie, O., Abe, H., Tada, K., Nakamura, M., Sugamura, K., and Takano, S. (1999). Selective expression of a novel surface molecule by human Th2 cells in vivo. J Immunol 162, 1278-1286）；（Cosmi, L., Annunziato, F., Galli, M. I. G., Maggi, R. M. E., Nagata, K., and Romagnani, S. (2000). CRTH2 is the most reliable marker for the detection of circulating human type 2 Th and type 2 T cytotoxic cells in health and disease. Eur J Immunol 30, 2972-2979）が、一部の腫瘍由来の凍結組織切片の免疫蛍光によって検出可能であった（図２ｃ）。分析した１１個の腫瘍試料におけるＩＬ−１３発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の平均頻度は、３．７％±ＳＥＭ０．７％、範囲０．２％〜９．３％であった。ＩＬ−１３の細胞内発現を示すＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の頻度は、腫瘍細胞上清中のＩＬ−１３濃度と高度に相関していた（ｒ２＝０．７９、ｐ＝０．００７、Pearson相関、図２ｄ）。したがって、患者の乳癌試料微小環境は、１型及び２型サイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞に富む。
【００７８】
乳癌細胞による高レベルのＩＬ−１３発現。次に、ＩＬ−１３発現ＣＤ４＋Ｔ細胞が、乳癌腫瘍に浸潤する成熟ＤＣとのクラスターに関与しているかどうかを分析した。図３ａに示すように、凍結乳癌組織切片の免疫蛍光により、ＣＤ３＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤の一部の抗ＩＬ−１３ｍＡｂによる共染色が示された（図３ａ、オーバーレイ図中の黄色の二重陽性細胞を白い矢印で示す）。これらのＣＤ３＋Ｔ細胞は腫瘍周辺部に位置していた（図３ａ）。しかしながら多くの場合、この分析は、１１個の分析された乳癌腫瘍試料の腫瘍床で観察された高レベルの相同ＩＬ−１３染色により覆された（図３ｂ、緑色のＴ細胞浸潤から離れた赤色染色された細胞）。
【００７９】
Humouseの乳癌腫瘍にヒト骨髄ＤＣが浸潤する。乳癌、ＤＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞偏向の間の関連を実証するために、ヒト免疫系及びヒト乳癌のインビボモデルを開発し、使用した。致死量に近い放射線を照射した成体ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２ｍ−マウスに、健常志願者血液アフェレーシスから単離したヒトＧ−ＣＳＦ動員ＣＤ３４＋ＨＰＣを移植した。これらのマウスはＤＣ及びＢ細胞を含むヒト免疫系の要素を獲得した（Palucka, A. K., Gatlin, J., Blanck, J. P., Melkus, M. W., Clayton, S., Ueno, H., Kraus, E. T., Cravens, P., Bennett, L., Padgett-Thomas, A., et al. (2003). Human dendritic cell subsets in NOD/SCID mice engrafted with CD34+ hematopoietic progenitors. Blood 102, 3302-3310）４週間後、１０７個のヒト腫瘍細胞を脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。異なる組織病理学的及び表現型の特徴を有する、原発性（Ｈｓ５７８Ｔ及び１８０６）及び転移性（ＭＣＦ−７）腫瘍を表す３種類の異なる乳癌細胞株（Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＣＦ−７及び１８０６）を試験した（表２）。４日目に、３つの試験した細胞株で輪郭の明瞭な腫瘍が測定可能であった（図４ａ）。腫瘍発生は、二相性で（図４ｂ）、１０日間の腫瘍定着相に続いて腫瘍体積が一時的に減少した（Aspord et al.提出済）。２０日目以降、エストロゲン非依存性であるＨｓ５７８Ｔ及び１８０６腫瘍は原発部位で進行し（図４ｂ）、動物は遠隔転移を発症した（Aspord et al.提出済）。
【００８０】
【表２】
2010521675.tif 000004
【００８１】
単一細胞懸濁液を、移植後４及び３０日目に採取した腫瘍から調製した。図４ｃに図示したようにフローサイトメトリー分析を行った。Ｈｓ５７８Ｔ腫瘍に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球及びＮＫ細胞のリネージュ（Ｌｉｎ）マーカーを発現しない、したがってＤＣを含まないＨＬＡ−ＤＲ＋細胞（ＨＬＡ−ＤＲ＋Ｌｉｎ−細胞）（Pulendran, B., Banchereau, J., Burkeholder, S., Kraus, E., Guinet, E., Chalouni, C., Caron, D., Maliszewski, C., Davoust, J., Fay, J., and Palucka, K. (2000). Flt3-ligand and granulocyte colony-stimulating factor mobilize distinct human dendritic cell subsets in vivo. J Immunol 165, 566-572）が浸潤した（単一細胞懸濁液中のＨＬＡ−ＤＲ＋Ｌｉｎ−細胞％、平均値±ＳＤ＝０．６２±０．１３）。ＨＬＡ−ＤＲ＋Ｌｉｎ−細胞はＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋骨髄ＤＣ及びＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１２３＋形質細胞様ＤＣを含有していた（図４ｃ）。３つの試験した乳癌腫瘍（Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＣＦ７及び１８０６）はＤＣ浸潤を示し、１８０６腫瘍は３つの細胞株中で最低の浸潤を示した（表３）。ＤＣ浸潤はＨｓ５７８Ｔ細胞において時間とともに増加した（表３）。最後に、ＤＣ浸潤は乳癌に特異的であり、腫瘍細胞移植の代わりにｓ．ｃ．ＰＢＳ注射を受けた対照マウスにおいて、又は移植された乳癌腫瘍のすぐ外側の部分から採取した皮膚生検材料において見られなかった（Aspord et al.提出済）。同所移植された腫瘍においてＤＣ誘引の同様なパターンが見られた（図示せず）。
【００８２】
【表３】
2010521675.tif 000005
【００８３】
乳癌腫瘍排出リンパ節もまた、図４ｄに図示するようにＨｓ５７８Ｔ細胞でＤＣ浸潤を示した（単一細胞懸濁液中のＨＬＡ−ＤＲ＋Ｌｉｎ−細胞％、平均値±ＳＤ＝５．４６±１．１６）（図４ｄ及び表２）。乳癌腫瘍排出リンパ節に、成熟ＤＣの表現型である、ＨＬＡ−ＤＲ及びＤＣ−ＬＡＭＰを共発現するヒトＤＣが浸潤した（図４ｅ）。対照的に、反対側のリンパ節はわずかなＤＣ発現ＤＣ−ＬＡＭＰを示したのみであった（図４ｅ）。したがって、本発明者らの患者の所見と同様に、ヒト化マウスに移植された乳癌腫瘍はＤＣに富み、その成熟を誘発する。
【００８４】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は乳癌腫瘍の発生を促進する。ＣＤ４＋Ｔ細胞が患者の所見と同様に偏向するかどうかを判断するため、ヒト乳癌腫瘍を有するヒト化マウスを腫瘍内注射によりＴ細胞で再構成した。Ｔ細胞は、ＣＤ３４＋ＨＰＣドナーの血中単核細胞から単離し、したがってインビボでのＣＤ３４＋ＨＰＣ移植後に発生した抗原提示細胞（ＡＰＣ、Antigen Presenting Cell）の自己由来であり、移植した腫瘍細胞と同種であった。
【００８５】
ＰＢＭＣドナーから単離されたＴ細胞によるＨｓ５７８Ｔ乳癌腫瘍（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方）の再構成は、腫瘍発生の促進をもたらした（図５ａ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞もまた、ＭＣＦ−７乳癌腫瘍の発生を促進した（図５ａ）が、１８０６乳癌細胞のＴ細胞は促進しなかった（図示せず）。この腫瘍発生の促進は、異なるドナー由来のヒト細胞で作製したマウスコホートにおいて再現可能であった（図５ｂ）。さらに、精製ＣＤ８+Ｔ細胞による再構成は腫瘍発生初期に全く影響を与えなかったので、この腫瘍発生の促進はＣＤ４＋Ｔ細胞依存的であった（図５ａ及び図５ｂ）。
【００８６】
次に、あらかじめ活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞が腫瘍発生の促進をもたらすことができるかどうかを分析した。ヒト化マウスを構築し、Ｈｓ５７８Ｔ乳癌腫瘍を移植し、次いでＰＢＭＣドナーから単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を注射した。１５日目に、乳癌腫瘍発生が最大のときに、腫瘍を採取し、数匹のマウスからプールし、ＣＤ４＋Ｔ細胞を選別した。次いでこれらのインビボで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、同じドナーからＣＤ３４＋ＨＰＣで構築されたヒト化マウスレシピエントの「Ｔ細胞ナイーブ」Ｈｓ５７８Ｔ乳癌腫瘍に注射した。対照マウスにはＰＢＳを与えた。２回の独立した実験において、マウス当たり１．５×１０６個のインビボ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を１回移すと、４匹の試験したマウスのうち３匹において乳癌腫瘍発生を促進した（ＰＢＳを与えた対照マウスにおいて平均腫瘍体積±ＳＥＭ＝５１±１７に対してＴ細胞を与えた実験マウスにおいて１６７±２７、ｐ＝０．０６；図５ｃ）。したがって、ヒト乳癌腫瘍発生はヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の存在下の方が早い。
【００８７】
腫瘍体積の増加は血管新生と関連していた。ＰＢＳを注射したＨｓ５７８Ｔ乳癌腫瘍の肉眼による分析では、１５日目に明瞭に見える腫瘍及び小さい排出リンパ節を示した（図５ｄ）。驚くべきことに、腫瘍にＣＤ４＋Ｔ細胞を注射した場合、腫瘍と排出リンパ節の両方が血管が見えるほど大きくなった（図５ｄ）。腫瘍にＣＤ４＋Ｔ細胞を注射したマウスにＦＩＴＣ−レクチンを投与することによって、脈管化の増強が示された（図５ｅ）。
【００８８】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は乳癌腫瘍発生を促進するためにＤＣを必要とする。ＣＤ４＋Ｔ細胞が乳癌腫瘍細胞に直接作用するかどうかを判断するために、乳癌腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２ｍ−マウスにおいてＣＤ４＋細胞の作用をヒト免疫細胞（ＣＤ３４＋ＨＰＣ移植無し）の非存在下で評価した。図６ａに示すように、異なるドナーから単離したＴ細胞を注射しても腫瘍体積に変化は見られなかった。このことは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の癌誘発（pro-cancer）作用がＣＤ３４＋ＨＰＣ移植により発生する細胞、おそらくＤＣを必要とすることを示唆した。そのため、ＧＭ−ＣＦＳ及びＩＬ−４と一緒に単球を培養することによってＤＣを生成し、それらを自己ＣＤ４＋Ｔ細胞と一緒にＨｓ５７８Ｔ乳癌腫瘍を有するマウスに注射した。図６ｂに示すように、ＤＣ又はＴ細胞のいずれかの注射は、腫瘍体積に変化をもたらさなかった。しかしながら、ＤＣ及びＴ細胞を一緒に注射すると、乳癌腫瘍発生の促進をもたらした（図６ｂ）。したがって、ＤＣはＣＤ４＋Ｔ細胞が乳癌腫瘍の初期発生を促進するために必要である。
【００８９】
ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ−１３を分泌するために偏向する。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞をヒト化マウスの乳癌腫瘍から単離した。乳癌腫瘍から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞は２型サイトカインの分泌に偏向することが分かった。ＣＤ４＋Ｔ細胞を腫瘍及びその排出リンパ節から１５日目に選別し、ＰＭＡ及びIonomycinで活性化し、上清中のサイトカインを評価した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は多量（＞１０ｎｇ／ｍｌ）のＩＬ−２及びＩＦＮ−γだけでなくＩＬ−４、ＩＬ−１３及びＴＮＦも分泌した（図８ａ及び図示せず）。図７ａは、特に、腫瘍に浸潤するＣＤ４＋Ｔ細胞において検出できた高レベルのＩＬ−１３（１０８０±２０ｐｇ／ｍｌ）を示す。フローサイトメトリーは、最大で１７％までのＣＤ４＋Ｔ細胞における細胞質内のＩＬ−１３発現を示した（１３％±３％、ＩＬ−１３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞；図７ｂ）。大部分のＩＬ−１３発現ＣＤ４＋Ｔ細胞はまた、ＩＦＮ−γ（図７ｂ）も発現し、患者腫瘍の一部において見られる発現パターンに類似していた。
【００９０】
乳癌腫瘍に浸潤するＤＣは２型サイトカインを分泌するためにＣＤ４＋Ｔ細胞を偏向させる。腫瘍関連ＤＣのＣＤ４＋Ｔ細胞機能に対する影響をさらに調べるために、ＣＤ３４＋ＨＰＣを移植し、Ｈｓ５７８Ｔ乳癌腫瘍を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２ｍ−マウス由来のヒトＤＣを試験した。乳癌腫瘍、その排出リンパ節、脾臓、及び骨髄から、腫瘍移植の４日後にＤＣを単離し、ナイーブ同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を偏向させる能力をインビボで試験した。５日後、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＭＡ及びIonomycinで活性化し、上清中のサイトカインを評価した。分析した全組織から単離したＤＣは、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導することにより多量（＞１０ｎｇ／ｍｌ、図示せず）のＩＬ−２及びＩＦＮ−γを分泌した。さらに、両方の乳癌腫瘍から、特にその排出リンパ節から単離したＤＣはＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化することにより高レベルのＴＮＦ、ＩＬ−１３及びＩＬ−４を分泌した（平均濃度±ＳＥＭ＝４４９１±１５９９ｐｇ／ｍｌ  ＴＮＦ、７９６１±１３４２ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−１３、及び３３４５±１５０８ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−４；図８ａ）。このサイトカイン分泌パターンは長時間持続し、３０日目の腫瘍から選別したＤＣは２型及び向炎症性サイトカインのさらに多量の分泌を誘発した（図示せず）。４日目の腫瘍から単離したＤＣにより活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析は、約９％のＩＬ−１３発現ＣＤ４＋Ｔ細胞、６％のＩＬ−４発現ＣＤ４＋Ｔ細胞及び１５％のＴＮＦ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞を示した（図８ｂ）。染色パターンはＴｈ２偏向と一致し、ＩＬ−１３及び／又はＩＬ−４発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の大部分が単一陽性であり、ＩＦＮ−γを分泌しなかった（図８ｂ）。したがって、乳癌は、２型（ＩＬ−４及びＩＬ−１３）及び向炎症性（ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ）サイトカインを産生するためのＣＤ４＋Ｔ細胞画分を活性化するためにＤＣを偏向させる。同程度の数のＩＬ−１３発現ＣＤ４＋Ｔ細胞が、全ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と、又はＶα２４＋細胞を枯渇させたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞との培養において検出された。したがって、ＤＣは乳癌による刷り込みを受けて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を型サイトカインの分泌に偏向させる。
【００９１】
ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ−１３を介して腫瘍発生を促進する。ヒト乳癌腫瘍はヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の微小環境中でより早く発生し、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＬ−１３を分泌するよう偏らせることが分かった。癌におけるＩＬ−１３の免疫調節の役割についての以前の報告（Terabe, M., Matsui, S., Noben-Trauth, N., Chen, H., Watson, C., Donaldson, D. D., Carbone, D. P., Paul, W. E., and Berzofsky, J. A. (2000). NKT cell-mediated repression of tumor immunosurveillance by IL-13 and the IL-4R-STAT6 pathway. Nat Immunol 1, 515-520）と一緒にこのことは、ＩＬ−１３が関与している可能性を示唆した。このことを明らかにするために、Ｈｓ５７８Ｔ乳癌腫瘍を有するヒト化マウスをＩＬ−１３アンタゴニスト、ＩＬ−１３を中和する抗体及び可溶性ＩＬ−１３Ｒで処理した。Ｔ細胞で再構成し、アイソタイプ対照で処理したマウスは３週間の追跡の間ずっと、腫瘍発生の促進を示すことが分かった（図９ａ）。一方、ＩＬ−１３アンタゴニストで処理したマウスは腫瘍発生の持続的な阻害を示した（図９ａ）。１３日目の腫瘍体積はＴ細胞無し（ＰＢＳ対照）の動物において３９±５ｍｍ３、及びＴ細胞有りの動物において１２８±１８であった（平均腫瘍体積±ＳＥＭ＝ｐ＝０．０１；図９ｂ）。ＩＬ−１３アンタゴニストで処理したマウスは、腫瘍発生の著しい阻害を示した（アイソタイプ対照で処理した動物において１３日目の平均腫瘍体積±ＳＥＭ＝１２８±１８及びＩＬ−１３アンタゴニストで処理した動物において１６８±５、ｐ＝０．０２；図９ｂ）。最後に、中和ＩＬ−１３ｍＡｂ単独による処理は、乳癌腫瘍発生の促進を予防するのに十分であった（アイソタイプ対照で処理した動物において１１日目の平均腫瘍体積＝１７２±１３及びＩＬ−１３中和ｍＡｂで処理した動物において７０±１１．５、ｐ＝０．０３；図９ｃ）。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞で再構成したHumouseにおける乳癌腫瘍発生の促進は、ＩＬ−１３アンタゴニスト処理によって中和することができる。
【００９２】
リンパ器官外側の成熟ＤＣの存在は、例えば感染症におけるものなどの感染性、又は例えば自己免疫疾患におけるものなどの無菌性の炎症に関連している（Blanco, P., Palucka, A. K., Gill, M., Pascual, V., and Banchereau, J. (2001). Induction of dendritic cell differentiation by IFN-alpha in systemic lupus erythematosus. Science 294, 1540-1543;Radstake, T. R., van Lieshout, A. W., van Riel, P. L., van den Berg, W. B., and Adema, G. J. (2005). Dendritic cells, Fc{gamma} receptors, and Toll-like receptors: potential allies in the battle against rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 64, 1532-1538;Thomas, R., MacDonald, K. P., Pettit, A. R., Cavanagh, L. L., Padmanabha, J., and Zehntner, S. (1999). Dendritic cells and the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Leukoc Biol 66, 286-292）。本発明は以前、患者において乳癌腫瘍への成熟ＤＣの浸潤を発見している（Bell, D., Chomarat, P., Broyles, D., Netto, G., Harb, G. M., Lebecque, S., Valladeau, J., Davoust, J., Palucka, K. A., and Banchereau, J. (1999). In breast carcinoma tissue, immature dendritic cells reside within the tumor, whereas mature dendritic cells are located in peritumoral areas. J Exp Med 190, 1417-1426）。乳癌腫瘍微小環境におけるＤＣの存在の免疫学的重要性を分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は乳癌患者の腫瘍試料において１型及び２型サイトカイン（主にＩＬ−１３）を分泌していることが分かった。患者から得ることができる腫瘍材料の量が限られ、原因究明の妨げとなったため、ヒトＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）を移植し、ヒト乳癌細胞株を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２ｍ−／−マウスを、乳癌、ＤＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞偏向の間の関連を実証するために使用した。したがって、乳癌細胞がヒトＤＣを誘引し、ＩＬ−１３を含む２型サイトカインを分泌するためにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を偏向させるようＤＣに刷り込みをすることが本明細書において実証される。ＣＤ４＋Ｔ細胞は初期腫瘍発生を促進し、これは血管新生の増強と関連している。この癌誘発性作用は、ＩＬ−１３アンタゴニストにより予防するこができる。
【００９３】
ＩＬ−１３が、ホジキン（Hodgkin's）病の場合のような（Kapp, U., Yeh, W. C., Patterson, B., Elia, A. J., Kagi, D., Ho, A., Hessel, A., Tipsword, M., Williams, A., Mirtsos, C., et al. (1999). Interleukin 13 is secreted by and stimulates the growth of Hodgkin and Reed-Sternberg cells. J Exp Med 189, 1939-1946）オートクリン、又はＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されるパラクリン、或いは肥満細胞などのアクセサリー細胞であるかどうかを明らかにするために、ＩＬ−１３の供給源を探索した。ＩＬ−１３の供給源であれば、インビボで腫瘍発生を調節する機構に影響を与える可能性がある（Fichtner-Feigl, S., Strober, W., Kawakami, K., Puri, R. K., and Kitani, A. (2006). IL-13 signalling through the IL-13alpha2 receptor is involved in induction of TGF-beta1 production and fibrosis. Nat Med 12, 99-106）。例えば、ＩＬ−１３は乳癌細胞に直接的な作用を有する可能性がある。驚くべきことに、患者の腫瘍中の乳癌細胞がＩＬ−１３を発現することが分かった。乳癌細胞株及び組換えＩＬ−１３（並びにＩＬ−４）を使用した以前のインビトロ研究では、エストロゲンに誘導される乳癌マーカー、肉眼的（gross）嚢胞性疾患液体タンパク質−１５（ＧＣＤＦＰ−１５）の増殖及び獲得の阻害が実証された（Blais, Y., Gingras, S., Haagensen, D. E., Labrie, F., and Simard, J. (1996). Interleukin-4 and interleukin-13 inhibit estrogen-induced breast cancer cell proliferation and stimulate GCDFP-15 expression in human breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol 121, 11-18;Serve, H., Oelmann, E., Herweg, A., Oberberg, D., Serve, S., Reufi, B., Mucke, C., Minty, A., Thiel, E., and Berdel, W. E. (1996). Inhibition of proliferation and clonal growth of human breast cancer cells by interleukin 13. Cancer Res 56, 3583-3588）。ＩＬ−１３はまた、副腎アンドロゲン前駆体からの性ステロイド生合成の制御においても示されている（Gingras, S., Moriggl, R., Groner, B., and Simard, J. (1999). Induction of 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase type 1 gene transcription in human breast cancer cell lines and in normal mammary epithelial cells by interleukin-4 and interleukin-13. Mol Endocrinol 13, 66-81）。肺転移を起こしやすい、乳癌の非常に侵襲性の強い変異体におけるＩＬ１３Ｒα２発現において最近見出された、インビボでのＩＬ−１３の直接的な作用の可能性と一致している（Minn, A. J., Gupta, G. P., Siegel, P. M., Bos, P. D., Shu, W., Giri, D. D., Viale, A., Olshen, A. B., Gerald, W. L., and Massague, J. (2005). Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature 436, 518-524）。間接的な経路は、ＩＬ−１３を介する腫瘍浸潤マクロファージのＭ２細胞への偏向を含む可能性がある（Sinha, P., Clements, V. K., and Ostrand-Rosenberg, S. (2005). Interleukin-13-regulated M2 macrophages in combination with myeloid suppressor cells block immune surveillance against metastasis. Cancer Res 65, 11743-11751）。これらは次に、血管新生（Mantovani, A., Sica, A., and Locati, M. (2005). Macrophage polarization comes of age. Immunity 23, 344-346）を促進し、及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の抗癌エフェクター機能を阻害する因子、例えばＴＦＧ−β（Ghiringhelli, F., Puig, P. E., Roux, S., Parcellier, A., Schmitt, E., Solary, E., Kroemer, G., Martin, F., Chauffert, B., and Zitvogel, L. (2005). Tumor cells convert immature myeloid dendritic cells into TGF-beta-secreting cells inducing CD4+CD25+ regulatory T cell proliferation. J Exp Med 202, 919-929;Li, M. O., Wan, Y. Y., Sanjabi, S., Robertson, A. K., and Flavell, R. A. (2005). Transforming Growth Factor-beta Regulation of Immune Responses. Annu Rev Immunol;Terabe, M., Matsui, S., Park, J. M., Mamura, M., Noben-Trauth, N., Donaldson, D. D., Chen, W., Wahl, S. M., Ledbetter, S., Pratt, B., et al. (2003). Transforming growth factor-beta production and myeloid cells are an effector mechanism through which CD1d-restricted T cells block cytotoxic T lymphocyte-mediated tumor immunosurveillance: abrogation prevents tumor recurrence. J Exp Med 198, 1741-1752）を分泌し、それによって腫瘍発生を増幅する。
【００９４】
ＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン発現を２パターン観察した。１つは、ＩＬ−１３又はＩＦＮ−γのいずれかを発現する単一陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在下で、２型偏向の古典的定義と一致する（Mosmann, T. R., and Coffman, R. L. (1989). TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 7, 145-173）。発現パターンは、乳癌腫瘍微小環境において真正のＴｈ１及びＴｈ２細胞を示唆する。第２のパターンは、ＩＬ−１３発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の２つのサブセット：単一陽性（真正のＴｈ２）及び二重陽性ＩＬ−１３及びＩＦＮ−γを実際に示した。後者のパターンは、成熟ＮＫＴ細胞において観察されたＩＬ−４及びＩＦＮ−γを連想させる（Kadowaki, N., Antonenko, S., Ho, S., Rissoan, M. C., Soumelis, V., Porcelli, S. A., Lanier, L. L., and Liu, Y. J. (2001). Distinct cytokine profiles of neonatal natural killer T cells after expansion with subsets of dendritic cells. J Exp Med 193, 1221-1226）。これらの結果は、乳癌腫瘍にＮＫＴ細胞が浸潤するという可能性を提起する。しかしながら、インビトロ試験においてＶα２４発現細胞の枯渇によりＩＬ−１３の誘導が消失しなかったので、Ｖα２４−陰性ＮＫＴ細胞の非古典的役割の可能性が考慮されなければならない。にもかかわらず、これらの結果は乳癌微小環境における２型サイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞の２つのタイプの存在を示している。
【００９５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞を産生するＴＮＦと一緒に２型サイトカインが存在することは、ＴＳＬＰ活性化ＤＣにより誘導され（Soumelis, V., Reche, P. A., Kanzler, H., Yuan, W., Edward, G., Homey, B., Gilliet, M., Ho, S., Antonenko, S., Lauerma, A., et al. (2002). Human epithelial cells trigger dendritic cell mediated allergic inflammation by producing TSLP. Nat Immunol 3, 673-680）、ＯＸ４０リガンドに仲介される（Ito, T., Wang, Y. H., Duramad, O., Hori, T., Delespesse, G. J., Watanabe, N., Qin, F. X., Yao, Z., Cao, W., and Liu, Y. J. (2005). TSLP-activated dendritic cells induce an inflammatory T helper type 2 cell response through OX40 ligand. J Exp Med 202, 1213-1223）向炎症性サイトカイン２型応答に似ている。これらの分子は乳癌微小環境中に存在する可能性がある。代替の経路としては、骨髄ＤＣの誘引及びＴｈ２偏向における潜在的役割がインビトロ研究で示唆されているＭＵＣ−１（Carlos, C. A., Dong, H. F., Howard, O. M., Oppenheim, J. J., Hanisch, F. G., and Finn, O. J. (2005). Human tumor antigen MUC1 is chemotactic for immature dendritic cells and elicits maturation but does not promote Th1 type immunity. J Immunol 175, 1628-1635）を誘導できるだろう。それにもかかわらず、ＣＤ４＋Ｔ細胞の移植はヒト化マウスにおいて腫瘍発生を全く促進しなかったため、インビボでのこれらＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は自己ＤＣによる抗原提示に依存する。本発明者らによる他の研究は、エフェクター相、すなわちインビボ活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞をナイーブマウスに移植することによる腫瘍発生の促進は、Ｔ細胞の自己腫瘍浸潤ＤＣの存在にも依存することを示唆している。
【００９６】
ＰＣ３細胞株を使用して前立腺癌腫瘍を確立し、３及び６日目にＴ細胞で再構成した（ＣＤ４＋及びＣＤ８+Ｔ細胞の混合物）。対照マウスはＴ細胞の移動後２０日目にＰＢＳを与え、腫瘍を採取し、ＰＭＡ及びIonomycinと一緒に一晩培養した。図１０に示すように、対照ではなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞で再構成した腫瘍が上清中に高レベルのＩＬ−１３を示した。これらの結果は、乳癌腫瘍の観察結果が前立腺癌、上皮由来の別の腫瘍にまで適用範囲を拡大できることを示す。
【００９７】
乳癌細胞はＩＬ−１３及びリン酸化ＳＴＡＴ６染色を示す。ＩＬ−１３発現をインサイチュで測定するために、乳癌組織切片を特異的ｍＡｂで染色し、免疫蛍光により分析した。癌細胞の非常に顕著で均一なＩＬ−１３染色が見られた（図１１ａ、赤色）。この染色は過剰量のｒｈＩＬ−１３により消失し（図１１ｂ）、特異性を示した。ＩＬ−１３染色は、いくつかの腫瘍床及び全腫瘍構造を含む、分析した１１／１１乳癌腫瘍試料において検出可能であった（図１１ａ及びｂ）。
【００９８】
ＳＴＡＴ６リン酸化はＩＬ−１３（及び／又はＩＬ−４）のサインと考えられる。分析した全乳癌腫瘍試料は、癌細胞によるＳＴＡＴ６の発現を示した（図１２ａ、１２ｂ）。１１個の腫瘍のうち３個がリン酸化ＳＴＡＴ６（ｐＳＴＡＴ６：図１２ｃ、１２ｄ）の強い細胞質発現を示した。抗ｐＳＴＡＴ６抗体を生成するために使用されるペプチドの過剰量によって染色はブロックされ、特異性を示した（図１２ｅ）。癌細胞におけるｐＳＴＡＴ６染色はまた、強度は弱いものの、他の５個の分析した腫瘍において存在した。したがって、乳癌細胞はＩＬ−１３を発現し、リン酸化ＳＴＡＴ６はＩＬ−１３が実際にシグナルを癌細胞に送達することを示す。
【００９９】
図１３ａ及び１３ｂは肺腫瘍の組織切片の肺組織を示し、図１３ｃ及び１３ｄは肉眼では腫瘍の浸潤がない肺組織を示す。図１３ａ及び１３ｂで示すように、腫瘍組織（しかし肉眼では腫瘍の浸潤がない）はＩＬ−１３による染色並びにＩＬ−１３及びサイトケラチンの二重染色細胞の存在を示す。サイトケラチン染色では、サイトケラチン−ＦＩＴＣコンジュゲートを二次抗体の後に加え、１時間インキュベートした。手短に述べると、肺組織（ＯＣＴ中に凍結）を約６ミクロンに切ってスライド上に載せ、−８０℃アセトン中で５分間固定した。凍結切片を１×ＰＢＳ中で３回、各５分間ずつすすぎ、５％ＢＳＡ／０．１％サポニンで２０分間ブロックした。抗ＩＬ−１３Ａｂ（R&D社製）をブロック中で５μｇ／ｍＬまで希釈し、１時間インキュベートした。組織切片をＰＢＳ／０．１％サポニンで２回、各５分間ずつ洗浄し、二次Ａｂ（Molecular Probes社製）ヤギ抗マウス−５６８を加え、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩで染色し、マウントした。
【０１００】
結論として、患者試料のエキソビボ分析を使用するヒト癌の研究とヒト免疫系及びヒト癌のモデルにおけるインビボ分析を組み合わせることにより、乳癌がヒトＤＣを誘引し、このＤＣにＣＤ４＋Ｔ細胞を癌誘発性２型免疫へ活性化するよう刷り込みを行うことが本明細書において実証されている。これは、ＩＬ−１３産生に依存する、例えば乳癌などの癌における療法の標的としてのＩＬ−１３アンタゴニストで予防することができる。
【０１０１】
このモデルは、基礎及び臨床レベルの両方で使用できる。基礎レベルでは、腫瘍が免疫系を回避するため、及び標的として療法に使用し得る分子を特定するために使用する機構の決定を可能にするはずである。臨床レベルでは、OncoHumouseにより本発明者らにはいずれ、従来の化学療法レジメンと結合させた又はさせない、ワクチン接種、抗体療法、及び適合移植などの免疫系の操作によって腫瘍細胞を排除するための戦略が設計可能となるはずである。
【０１０２】
この明細書において論じた任意の実施形態を、本発明の任意の方法、キット、試薬又は組成物に対して実施可能であり、逆の場合も同じであることが意図される。さらに、本発明の組成物は本発明の方法を達成するために使用できる。
【０１０３】
本明細書中の特定の実施形態は説明の目的で示しており、本発明を限定するものではないことを理解されたい。本発明の主な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく様々な実施形態において利用可能であることである。当業者であれば、ごく通常の実験を使用して、本明細書中に記載の特定の手順の多くの等価物を認識する、又は確認できるはずである。このような等価物は本発明の範囲内であると考えられ、特許請求の範囲に含まれる。
【０１０４】
本明細書中で言及した全ての出版物及び特許出願は、本発明が関連する分野の当業者の技術水準を示すものである。全ての出版物及び特許出願は、各個別の出版物又は特許出願が参照により具体的及び個別に組み込まれていることが示されているものと同程度まで、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１０５】
「１つの（a）」又は「１つの（an）」という語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書中で「含んでいる（comprising）」という用語と組み合わせて使用する場合、「１つの」を意味し得るが、「１又は複数の」、「少なくとも１つの」及び「１又は２以上の」の意味とも一致する。特許明細の範囲中の「又は」という用語の使用は、二者択一のみを指す、又は二者択一が相互排他的であることが明確に示されない限り、「及び／又は」を意味するために使用するが、本開示は二者択一及び「及び／又は」のみを指す定義を支持する。本出願全体にわたって、「約」という用語は、値が、値を決定するために利用される装置、方法に固有の誤差変動、又は研究対象中に存在する変動を含むことを示すために使用する。
【０１０６】
本明細書及び特許請求の範囲中で使用される場合、「含んでいる（comprising）」（及び「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などの任意の形態の含んでいる（comprising））、「有している（having）」（及び「有する（have）」及び「有する（has）」などの任意の形態の有している（having））、「含んでいる（including）」（及び「含む（includes）」及び「含む（include）」などの任意の形態の含んでいる（including））、又は「含有している（containing）」（及び「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」などの任意の形態の含有している（containing））という語は、包含的又は制限のないものであり、追加の、列挙されていない要素又は方法ステップを除外しない。
【０１０７】
本明細書中で使用される場合、「又はこれらの組み合わせ」という用語は、その用語の前に列挙された項目の全ての順列と組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はこれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣ、及び特定の文脈において順序が重要な場合は、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢのうちの少なくとも１つを含むことを意図する。この例を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの１つ又は複数の項目又は用語の繰り返しを含有する組み合わせを明確に含む。当業者であれば、別途文脈から明らかでない限り、任意の組み合わせにおいて項目又は用語の数に制限はないことを通常は理解するはずである。
【０１０８】
本明細書において開示及び特許請求した全ての組成物及び／又は方法は、本開示に照らして不適切な実験をすることなく、行う及び実施することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態の観点から説明したが、本明細書中で説明された組成物及び／又は方法、並びに方法のステップにおいて、又は一連のステップにおいて、本発明の概念、精神及び範囲を逸脱することなく、変形形態が適用されてもよいことが当業者には明らかなはずである。当業者に明らかな全てのこれらの置換物及び修正形態が、添付の特許請求の範囲により定義した通り、本発明の精神、範囲及び概念の範囲内に入ると見なされる。
【０１０９】
参考文献
Anderson, T. M., Hess, S. D., Egilmez, N. K., Nwogu, C. E., Lenox, J. M., and Bankert, R. B. (2003). Comparison of human lung cancer/SCID mouse tumor xenografts and cell culture growth with patient clinical outcomes. J Cancer Res Clin Oncol 129, 565-568.
Balkwill, F., Charles, K. A., and Mantovani, A. (2005). Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease. Cancer Cell 7, 211-217.
Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y., Pulendran, B., and Palucka, K. (2000). Immunobiology of dendritic cells. Ann Rev Immunol 18, 767-811.
Banchereau, J., and Palucka, A. K. (2005). Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nat Rev Immunol 5, 296-306.
Banchereau, J., Pascual, V., and Palucka, A. K. (2004). Autoimmunity through Cytokine-Induced Dendritic Cell Activation. Immunity 20, 539-550.
Banchereau, J., and Steinman, R. M. (1998). Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392, 245-252.
Bankert, R. B., Egilmez, N. K., and Hess, S. D. (2001). Human-SCID mouse chimeric models for the evaluation of anti-cancer therapies. Trends Immunol 22, 386-393.
Bell, D., Chomarat, P., Broyles, D., Netto, G., Harb, G. M., Lebecque, S., Valladeau, J., Davoust, J., Palucka, K. A., and Banchereau, J. (1999). In breast carcinoma tissue, immature dendritic cells reside within the tumor, whereas mature dendritic cells are located in peritumoral areas. J Exp Med 190, 1417-1426.
Blais, Y., Gingras, S., Haagensen, D. E., Labrie, F., and Simard, J. (1996). Interleukin-4 and interleukin-13 inhibit estrogen-induced breast cancer cell proliferation and stimulate GCDFP-15 expression in human breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol 121, 11-18.
Blanco, P., Palucka, A. K., Gill, M., Pascual, V., and Banchereau, J. (2001). Induction of dendritic cell differentiation by IFN-alpha in systemic lupus erythematosus. Science 294, 1540-1543.
Carlos, C. A., Dong, H. F., Howard, O. M., Oppenheim, J. J., Hanisch, F. G., and Finn, O. J. (2005). Human tumor antigen MUC1 is chemotactic for immature dendritic cells and elicits maturation but does not promote Th1 type immunity. J Immunol 175, 1628-1635.
Chomarat, P., Banchereau, J., Davoust, J., and Palucka, A. K. (2000). IL-6 switches the differentiation of monocytes from dendritic cells to macrophages. Nat Immunol 1, 510-514.
Condeelis, J., and Pollard, J. W. (2006). Macrophages: obligate partners for tumor cell migration, invasion, and metastasis. Cell 124, 263-266.
Cosmi, L., Annunziato, F., Galli, M. I. G., Maggi, R. M. E., Nagata, K., and Romagnani, S. (2000). CRTH2 is the most reliable marker for the detection of circulating human type 2 Th and type 2 T cytotoxic cells in health and disease. Eur J Immunol 30, 2972-2979.
Coussens, L. M., and Werb, Z. (2002). Inflammation and cancer. Nature 420, 860-867.
Delamarre, L., Pack, M., Chang, H., Mellman, I., and Trombetta, E. S. (2005). Differential lysosomal proteolysis in antigen-presenting cells determines antigen fate. Science 307, 1630-1634.
Enk, A. H., Jonuleit, H., Saloga, J., and Knop, J. (1997). Dendritic cells as mediators of tumor-induced tolerance in metastatic melanoma. Int J Cancer 73, 309-316.
Fichtner-Feigl, S., Strober, W., Kawakami, K., Puri, R. K., and Kitani, A. (2006). IL-13 signalling through the IL-13alpha2 receptor is involved in induction of TGF-beta1 production and fibrosis. Nat Med 12, 99-106.
Gabrilovich, D. (2004). Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendritic-cell defects. Nat Rev Immunol 4, 941-952.
Gabrilovich, D. I., Chen, H. L., Girgis, K. R., Cunningham, H. T., Meny, G. M., Nadaf, S., Kavanaugh, D., and Carbone, D. P. (1996). Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells. Nat Med 2, 1096-1103.
Ghiringhelli, F., Puig, P. E., Roux, S., Parcellier, A., Schmitt, E., Solary, E., Kroemer, G., Martin, F., Chauffert, B., and Zitvogel, L. (2005). Tumor cells convert immature myeloid dendritic cells into TGF-beta-secreting cells inducing CD4+CD25+ regulatory T cell proliferation. J Exp Med 202, 919-929.
Gingras, S., Moriggl, R., Groner, B., and Simard, J. (1999). Induction of 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase type 1 gene transcription in human breast cancer cell lines and in normal mammary epithelial cells by interleukin-4 and interleukin-13. Mol Endocrinol 13, 66-81.
Gordon, S., and Taylor, P. R. (2005). Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol 5, 953-964.
Ito, T., Wang, Y. H., Duramad, O., Hori, T., Delespesse, G. J., Watanabe, N., Qin, F. X., Yao, Z., Cao, W., and Liu, Y. J. (2005). TSLP-activated dendritic cells induce an inflammatory T helper type 2 cell response through OX40 ligand. J Exp Med 202, 1213-1223.
Iwanuma, Y., Chen, F. A., Egilmez, N. K., Takita, H., and Bankert, R. B. (1997). Antitumor immune response of human peripheral blood lymphocytes coengrafted with tumor into severe combined immunodeficient mice. Cancer Res 57, 2937-2942.
Janeway, C. A., Jr., and Medzhitov, R. (2002). Innate immune recognition. Annu Rev Immunol 20, 197-216.
Joyce, J. A. (2005). Therapeutic targeting of the tumor microenvironment. Cancer Cell 7, 513-520.
Kadowaki, N., Antonenko, S., Ho, S., Rissoan, M. C., Soumelis, V., Porcelli, S. A., Lanier, L. L., and Liu, Y. J. (2001). Distinct cytokine profiles of neonatal natural killer T cells after expansion with subsets of dendritic cells. J Exp Med 193, 1221-1226.
Kamel-Reid, S., Letarte, M., Doedens, M., Greaves, A., Murdoch, B., Grunberger, T., Lapidot, T., Thorner, P., Freedman, M. H., Phillips, R. A., and et al. (1991). Bone marrow from children in relapse with pre-B acute lymphoblastic leukemia proliferates and disseminates rapidly in scid mice. Blood 78, 2973-2981.
Kamel-Reid, S., Letarte, M., Sirard, C., Doedens, M., Grunberger, T., Fulop, G., Freedman, M. H., Phillips, R. A., and Dick, J. E. (1989). A model of human acute lymphoblastic leukemia in immune-deficient SCID mice. Science 246, 1597-1600.
Kapp, U., Yeh, W. C., Patterson, B., Elia, A. J., Kagi, D., Ho, A., Hessel, A., Tipsword, M., Williams, A., Mirtsos, C., et al. (1999). Interleukin 13 is secreted by and stimulates the growth of Hodgkin and Reed-Sternberg cells. J Exp Med 189, 1939-1946.
Kelland, L. R. (2004). Of mice and men: values and liabilities of the athymic nude mouse model in anticancer drug development. Eur J Cancer 40, 827-836.
Levings, M. K., Gregori, S., Tresoldi, E., Cazzaniga, S., Bonini, C., and Roncarolo, M. G. (2005). Differentiation of Tr1 cells by immature dendritic cells requires IL-10 but not CD25+CD4+ Tr cells. Blood 105, 1162-1169.
Li, M. O., Wan, Y. Y., Sanjabi, S., Robertson, A. K., and Flavell, R. A. (2005). Transforming Growth Factor-beta Regulation of Immune Responses. Annu Rev Immunol.
Mantovani, A., Sica, A., and Locati, M. (2005). Macrophage polarization comes of age. Immunity 23, 344-346.
Minn, A. J., Gupta, G. P., Siegel, P. M., Bos, P. D., Shu, W., Giri, D. D., Viale, A., Olshen, A. B., Gerald, W. L., and Massague, J. (2005). Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature 436, 518-524.
Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., and Wilson, D. B. (1988). Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature 335, 256-259.
Mosmann, T. R., and Coffman, R. L. (1989). TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 7, 145-173.
Mueller, B. M., and Reisfeld, R. A. (1991). Potential of the scid mouse as a host for human tumors. Cancer Metastasis Rev 10, 193-200.
Muller, A., Homey, B., Soto, H., Ge, N., Catron, D., Buchanan, M. E., McClanahan, T., Murphy, E., Yuan, W., Wagner, S. N., et al. (2001). Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis. Nature 410, 50-56.
Nagata, K., Tanaka, K., Ogawa, K., Kemmotsu, K., Imai, T., Yoshie, O., Abe, H., Tada, K., Nakamura, M., Sugamura, K., and Takano, S. (1999). Selective expression of a novel surface molecule by human Th2 cells in vivo. J Immunol 162, 1278-1286.
Palucka, A. K., Gatlin, J., Blanck, J. P., Melkus, M. W., Clayton, S., Ueno, H., Kraus, E. T., Cravens, P., Bennett, L., Padgett-Thomas, A., et al. (2003). Human dendritic cell subsets in NOD/SCID mice engrafted with CD34+ hematopoietic progenitors. Blood 102, 3302-3310.
Palucka, A. K., Scuderi, R., Porwit, A., Jeha, S., Gruber, A., Bjorkholm, M., Beran, M., and Pisa, P. (1996). Acute lymphoblastic leukemias from relapse engraft more rapidly in SCID mice. Leukemia 10, 558-563.
Pulendran, B., Banchereau, J., Burkeholder, S., Kraus, E., Guinet, E., Chalouni, C., Caron, D., Maliszewski, C., Davoust, J., Fay, J., and Palucka, K. (2000). Flt3-ligand and granulocyte colony-stimulating factor mobilize distinct human dendritic cell subsets in vivo. J Immunol 165, 566-572.
Radstake, T. R., van Lieshout, A. W., van Riel, P. L., van den Berg, W. B., and Adema, G. J. (2005). Dendritic cells, Fc{gamma} receptors, and Toll-like receptors: potential allies in the battle against rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 64, 1532-1538.
Reddy, S., Piccione, D., Takita, H., and Bankert, R. B. (1987). Human lung tumor growth established in the lung and subcutaneous tissue of mice with severe combined immunodeficiency. Cancer Res 47, 2456-2460.
Sakakibara, T., Xu, Y., Bumpers, H. L., Chen, F. A., Bankert, R. B., Arredondo, M. A., Edge, S. B., and Repasky, E. A. (1996). Growth and Metastasis of Surgical Specimens of Human Breast Carcinomas in SCID Mice. Cancer J Sci Am 2, 291.
Serve, H., Oelmann, E., Herweg, A., Oberberg, D., Serve, S., Reufi, B., Mucke, C., Minty, A., Thiel, E., and Berdel, W. E. (1996). Inhibition of proliferation and clonal growth of human breast cancer cells by interleukin 13. Cancer Res 56, 3583-3588.
Shortman, K., and Liu, Y. J. (2002). Mouse and human dendritic cell subtypes. Nature Rev Immunol 2, 151-161.
Sinha, P., Clements, V. K., and Ostrand-Rosenberg, S. (2005). Interleukin-13-regulated M2 macrophages in combination with myeloid suppressor cells block immune surveillance against metastasis. Cancer Res 65, 11743-11751.
Soumelis, V., Reche, P. A., Kanzler, H., Yuan, W., Edward, G., Homey, B., Gilliet, M., Ho, S., Antonenko, S., Lauerma, A., et al. (2002). Human epithelial cells trigger dendritic cell mediated allergic inflammation by producing TSLP. Nat Immunol 3, 673-680.
Steinman, R. M. (1991). The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu Rev Immunol 9, 271-296.
Terabe, M., Matsui, S., Noben-Trauth, N., Chen, H., Watson, C., Donaldson, D. D., Carbone, D. P., Paul, W. E., and Berzofsky, J. A. (2000). NKT cell-mediated repression of tumor immunosurveillance by IL-13 and the IL-4R-STAT6 pathway. Nat Immunol 1, 515-520.
Terabe, M., Matsui, S., Park, J. M., Mamura, M., Noben-Trauth, N., Donaldson, D. D., Chen, W., Wahl, S. M., Ledbetter, S., Pratt, B., et al. (2003). Transforming growth factor-beta production and myeloid cells are an effector mechanism through which CD1d-restricted T cells block cytotoxic T lymphocyte-mediated tumor immunosurveillance: abrogation prevents tumor recurrence. J Exp Med 198, 1741-1752.
Thomas, R., MacDonald, K. P., Pettit, A. R., Cavanagh, L. L., Padmanabha, J., and Zehntner, S. (1999). Dendritic cells and the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Leukoc Biol 66, 286-292.
Uckun, F. M., Sather, H., Reaman, G., Shuster, J., Land, V., Trigg, M., Gunther, R., Chelstrom, L., Bleyer, A., Gaynon, P., and et al. (1995). Leukemic cell growth in SCID mice as a predictor of relapse in high-risk B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Blood 85, 873-878.
Wang, T., Niu, G., Kortylewski, M., Burdelya, L., Shain, K., Zhang, S., Bhattacharya, R., Gabrilovich, D., Heller, R., Coppola, D., et al. (2004). Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nat Med 10, 48-54.
【図１】
2010521675.tif 000006
【図２ａ】
2010521675.tif 000007
【図２ｂ】
2010521675.tif 000008
【図２ｃ】
2010521675.tif 000009
【図２ｄ】
2010521675.tif 000010
【図３】
2010521675.tif 000011
【図４ａ】
2010521675.tif 000012
【図４ｂ】
2010521675.tif 000013
【図４ｃ】
2010521675.tif 000014
【図４ｄ】
2010521675.tif 000015
【図４ｅ】
2010521675.tif 000016
【図５ａ】
2010521675.tif 000017
【図５ｂ】
2010521675.tif 000018
【図５ｃ】
2010521675.tif 000019
【図５ｄ】
2010521675.tif 000020
【図５ｅ】
2010521675.tif 000021
【図６】
2010521675.tif 000022
【図７】
2010521675.tif 000023
【図８】
2010521675.tif 000024
【図９】
2010521675.tif 000025
【図１０】
2010521675.tif 000026
【図１１】
2010521675.tif 000027
【図１２】
2010521675.tif 000028
【図１３ａ】
2010521675.tif 000029
【図１３ｂ】
2010521675.tif 000030
【図１３ｃ】
2010521675.tif 000031
【図１３ｄ】
2010521675.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月8日(2009.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から除去した生体試料の組織微小環境中に存在するＩＬ−１３のレベルを決定するステップと、
前記組織微小環境中のＩＬ−１３レベルと、前記生体試料と同じ種類の正常な非癌組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較するステップと、
ＩＬ−１３のレベルの上昇が癌の存在を示す、ＩＬ−１３レベルを評価するステップと
を含む、由来の生体試料のインビトロでの分析方法。
【請求項２】
ＩＬ−１３のレベルが、ウェスタンブロット分析、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ分析、インサイチュ蛍光、インサイチュ蛍光共鳴エネルギー移動、インサイチュ免疫沈降、及びインサイチュ免疫組織染色からなる群から選択される技術によって決定される、請求項１に記載の方法。  
【請求項３】
組織微小環境中のＩＬ−１３のレベルがＳＴＡＴ６のリン酸化レベルを測定することにより決定される、請求項１に記載の方法。  
【請求項４】
生体試料が極低温凍結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＩＬ−１３発現のレベルが経時的に追跡される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＩＬ−１３のレベルがＩＬ−１３ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション及び定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
生体試料が上皮由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
生体試料が、乳房、前立腺、肺、大腸、卵巣、子宮内膜、腎臓、膀胱、胃、膵臓及び下垂体分泌腺から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上皮由来の癌の治療に使用される、ＩＬ−１３から作製される薬剤であって、
組織微小環境中の細胞間ＩＬ−１３情報伝達を遮断するために十分な量の１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストを含み、
前記細胞間ＩＬ−１３情報伝達を遮断するために十分な量が、生体試料中のインビトロでのＩＬ−１３のレベルと、前記生体試料と同じ種類の正常な非癌組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較することによって決定されることを含む薬剤。
【請求項１０】
１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストが、乳癌細胞の微小環境中のＩＬ−１３を標的とする、抗ＩＬ−１３抗体、ヒト抗ＩＬ−１３抗体、ヒト化抗ＩＬ−１３抗体、二価抗ＩＬ−１３抗体、二価ヒト化抗ＩＬ−１３抗体、抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ及び一本鎖Ｆｖ断片並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される抗ＩＬ−１３抗原結合断片、抗ＩＬ−１３結合融合タンパク質、多価抗ＩＬ−１３抗体及び抗ＩＬ−１３キメラ抗体、ポリクローナル抗ＩＬ−１３抗体のうちの少なくとも１つを含む、請求項９に記載の薬剤。    
【請求項１１】
１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストが同族受容体に結合するＩＬ−１３の二価アンタゴニストを含み、ＩＬ−１３アンタゴニストが乳癌細胞の微小環境中で結合するＩＬ−１３−ＩＬ−１３受容体を標的とする、請求項９に記載の薬剤。    
【請求項１２】
１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストが癌を標的とする、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１３】
１又は複数の腫瘍特異的免疫細胞をさらに含む、請求項９に記載の薬剤。  
【請求項１４】
樹状細胞を含む腫瘍内ワクチン接種をさらに含む、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１５】
抗原負荷樹状細胞を含むワクチンをさらに含む、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１６】
ＩＬ−１３アンタゴニストが、抗ＩＬ−１３サイトカイン受容体遮断薬、抗ＩＬ−１３受容体中和抗体、抗ＩＬ−１３受容体アンタゴニスト、可溶性ＩＬ−１３受容体、抗ＩＬ−１３受容体−ＩＬ−１３結合を阻害する１又は複数の分子、ＩＬ−１３の下流の事象の１又は複数の阻害剤、不活性化ＩＬ−１３及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、請求項９に記載の薬剤。  
【請求項１７】
生体試料の分析のためのインビトロでの方法であって、  
乳癌を有する疑いのある前記患者から採取した生体試料の組織微小環境中に存在するＩＬ−１３のレベルを決定するステップと、
前記組織微小環境中のＩＬ−１３レベルと正常な非腫瘍乳房組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較するステップであって、ＩＬ−１３のレベルの上昇が乳癌の存在を示すステップと
を含む方法。
【請求項１８】
ＩＬ−１３のレベルが、ウェスタンブロット分析、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ分析、インサイチュ蛍光、インサイチュ蛍光共鳴エネルギー移動、インサイチュ免疫沈降、及びインサイチュ免疫組織染色からなる群から選択される方法によって決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＩＬ−１３のレベルが、ＳＴＡＴ６のリン酸化レベルを測定することにより決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
生体試料が極低温凍結されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＬ−１３発現のレベルが経時的に追跡される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ＩＬ−１３のレベルがＩＬ−１３ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションにより検出される、請求項１７に記載の方法。  
【請求項２３】
ＩＬ−１３発現のレベルが定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
包装された組み合わせ中に、
乳房組織微小環境中のＩＬ−１３の発現レベルを検出可能な量のＩＬ−１３特異的プローブ、及び
前記ＩＬ−１３プローブの使用に関する使用説明書
を含み、前記プローブが直接的又は間接的に検出可能である、乳房試料中のＩＬ−１３を検出するための検査キット。
【請求項２５】
乳癌の治療に使用される、ＩＬ−１３から作製される薬剤であって、
組織微小環境中の細胞間ＩＬ−１３情報伝達を遮断するために十分な量の１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストを含み、
前記細胞間ＩＬ−１３情報伝達を遮断するために十分な量が、生体試料中のインビトロでのＩＬ−１３のレベルと、前記生体試料と同じ種類の正常な非癌乳房組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較することによって決定されることを含む薬剤。
【請求項２６】
前立腺癌の治療に使用される、ＩＬ−１３から作製される薬剤であって、
組織微小環境中の細胞間ＩＬ−１３情報伝達を遮断するために十分な量の１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストを含み、
前記細胞間ＩＬ−１３情報伝達を遮断するために十分な量が、生体試料中のインビトロでのＩＬ−１３のレベルと、前記生体試料と同じ種類の正常な非癌前立腺組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルとを比較することによって決定されることを含む薬剤。
【請求項２７】
非小細胞癌の治療に使用されるＩＬ−１３から作製される薬剤であって、
組織微小環境中の細胞間ＩＬ−１３情報伝達を遮断するために十分な量の１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストを含み、
細胞間ＩＬ−１３情報伝達を遮断するために十分な量は、生体試料中のインビトロでのＩＬ−１３のレベルと、前記生体試料と同じ種類の正常な非癌肺組織中に存在することが知られているＩＬ−１３のレベルを比較することによって決定されることを含む薬剤。
【請求項２８】
血管新生を抑制するために十分な有効量の１又は複数のＩＬ−１３アンタゴニストを含む、血管新生を阻害する治療に使用される、ＩＬ−１３から作製される薬剤。  
【国際調査報告】
2010521675.tif 000033