(57)【要約】  本明細書において、イメージングレポーター遺伝子が結合されたトランス−スプライシングリボザイムを含む、分子イメージングのための組成物が開示される。該トランス−スプライシングリボザイムは、疾病に関連する特定の遺伝子をターゲットとする。該組成物を使用した分子イメージングの方法もまた開示される。【選択図】図１
2010521150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランス−スプライシングリボザイムベクターを含む、分子イメージング用組成物。
【請求項２】
前記リボザイムが、イメージングレポーター遺伝子と結合されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記イメージングレポーター遺伝子が、蛍光タンパク質又は比色酵素をコードする遺伝子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記リボザイムが、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子と結合されている、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
細胞骨格関連タンパク質２（ＣＫＡＰ２）をターゲットとするリボザイムを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記リボザイムが、トランス−スプライシンググループＩリボザイムの改変型であり、且つ、
１）ターゲットのマウス細胞骨格関連タンパク質２（ｍＣＫＡＰ２）のＲＮＡのウリジン残基（４５Ｕ）の下流領域に相補的なアンチセンス配列であり、８３ヌクレオチド（ｍＣＫＡＰ２のＲＮＡの＋５９部位から＋１４１部位のヌクレオチドに相補的）又は３００ヌクレオチド（ｍＣＫＡＰ２のＲＮＡの＋５９部位から＋３５８部位のヌクレオチドに相補的）からなるアンチセンス配列；
２）該アンチセンス配列の３’末端に連結され且つ内部ガイド配列（ＩＧＳ）、５’−ＧＡＧＣＧＴ−３’を含むＰ１ヘリックス領域；
３）該Ｐ１ヘリックス領域の３’末端に連結されたＰ１０ヘリックス領域；及び
４）該Ｐ１０ヘリックス領域の３’末端に連結され且つβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）又はルシフェラーゼ（ｌｕｃ）をコードする配列：
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記リボザイムベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記リボザイムベクターが、図２に示す遺伝地図を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
１）イメージングレポーター遺伝子を、特定の遺伝子をターゲットとするリボザイムに連結させ、得られるリボザイムをクローニングする工程；
２）クローニングされたリボザイムをベクターへ挿入し、該リボザイムを発現させる工程；及び
３）該リボザイムの発現が同定されたベクターを分離し、該リボザイムを確認する工程：
を含む、分子イメージングのためのベクターの製造方法。
【請求項１０】
トランス−スプライシングリボザイムベクターを用いた、分子イメージング方法。
【請求項１１】
前記リボザイムが、イメージングレポーター遺伝子と連結されている、請求項１０に記載の分子イメージング方法。
【請求項１２】
前記イメージングレポーター遺伝子が、蛍光タンパク質又は比色酵素をコードする遺伝子である、請求項１１に記載の分子イメージング方法。
【請求項１３】
前記蛍光レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質又は比色酵素をコードする遺伝子である、請求項１２に記載の分子イメージング方法。
【請求項１４】
前記リボザイムが、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子と連結されている、請求項１１に記載の分子イメージング方法。
【請求項１５】
細胞骨格関連タンパク質２（ＣＫＡＰ２）をターゲッティングするリボザイムを含む、請求項１０に記載の分子イメージング方法。
【請求項１６】
前記リボザイムが、トランス−スプライシンググループＩリボザイムの改変型であり、且つ、
１）ターゲットのｍＣＫＡＰ２のＲＮＡのウリジン残基（４５Ｕ）の下流領域に相補的なアンチセンス配列であり、８３ヌクレオチド（ｍＣＫＡＰ２のＲＮＡの＋５９部位から＋１４１部位のヌクレオチドに相補的）又は３００ヌクレオチド（ｍＣＫＡＰ２のＲＮＡの＋５９部位から＋３５８部位のヌクレオチドに相補的）からなるアンチセンス配列；
２）該アンチセンス配列の３’末端に連結され且つ内部ガイド配列（ＩＧＳ）、５’−ＧＡＧＣＧＴ−３’を含むＰ１ヘリックス領域；
３）該Ｐ１ヘリックス領域の３’末端に連結されたＰ１０ヘリックス領域；及び
４）該Ｐ１０ヘリックス領域の３’末端に連結され且つβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）又はルシフェラーゼ（ｌｕｃ）をコードする配列：
を含む、請求項１０に記載の分子イメージング方法。
【請求項１７】
前記リボザイムベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項１０に記載の分子イメージング方法。
【請求項１８】
前記リボザイムベクターが、図２に示す遺伝地図を有する、請求項１０に記載の分子イメージング方法。
【請求項１９】
１）イメージングレポーター遺伝子を、トランス−スプライシングリボザイムに連結させ、得られるリボザイムをクローニングすること；
２）クローニングされたリボザイムをベクターへ挿入し、該リボザイムを発現させること；及び
３）該リボザイムの発現が同定されたベクターを分離し、該リボザイムを検出すること：
を含む、分子イメージング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、リボザイムを含む分子イメージングのための組成物及び該組成物を用いた分子イメージング方法に関する。より詳しくは、本発明は、イメージングレポーター遺伝子と結合し且つ疾病に関連する特定の遺伝子をターゲットとするトランス−スプライシングリボザイムを含む分子イメージングのための組成物、及び該組成物を用いた分子イメージング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
リボザイム(ribozyme)は、酵素活性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、ＲＮＡスプライシング(RNA splicing)、ＲＮＡプロセッシング(RNA processing)、ＲＮＡゲノムの複製及びリボーソームにおけるペプチド結合の形成といった、遺伝子の発現及び調節に、能動的に関わってきた。特に、テトラヒメナ好熱菌(Tetrahymena thermophila)から分離したグループＩイントロンリボザイムの場合、イントロンに隣接する２つのエクソンを、一般的なシス−スプライシング反応を介して連結させることができ、またトランス−スプライシング反応を行うことによって、別々のＲＮＡ上に含まれる２つのエクソンを連結させることもできる。トランス−スプライシングは、２工程のトランスエステル化(transesterification)機構を通じた切断−ライゲーション反応(cleavage-ligation reaction)を介して進行する。リボザイムは、タ−ゲットＲＮＡとリボザイムの内部ガイド配列（ＩＧＳ）との間で塩基対を形成することにより、別個に存在する基質ＲＮＡ（５’エクソン）を認識し結合する。一旦結合すれば、リボザイムはタ−ゲットＲＮＡを切断して下流の切断生成物を放出し、エクソン配列を、その３末端で、基質ＲＮＡの５’エクソン切断生成物に、自己切断過程で切断された５’エクソンＲＮＡの代りに、接合（splice）する。このようなスプライシングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏだけでなく、Ｅ．ｃｏｌｉ及び哺乳動物細胞でも起こる。トランス-スプライシング反応は、特定のターゲットＲＮＡのターゲッティング及び切断、並びに所望のＲＮＡ配列との置換に、適用することができる。したがってトランス-スプライシングリボザイムは、新規の治療遺伝子としての可能性を有しており、このような新規治療遺伝子は、遺伝疾患に関連する欠陥のあるＲＮＡ転写物を正常ＲＮＡにより修繕したり、或いは特定のＲＮＡをターゲッティングして、ターゲットＲＮＡを発現する細胞内のみで所望のＲＮＡが発現されるようにすることができる。
【０００３】
例えばグループＩイントロンを基にしたトランス−スプライシングリボザイムは、赤血球前駆細胞において、赤血球の鎌状βＳ−グロビンの転写物を、抗鎌状タンパク質(anti-sickling protein)のγ−グロビンをコードするｍＲＮＡへと変換することが示されている(Lan, N., et al., Science 280:1593-1596, 1998)。またトランス−スプライシングリボザイムが、筋強直性ジストロフィータンパク質キナーゼの変異体の転写物、及び先天性ミオトニアの原因となるイヌ骨格筋の塩素チャネルの変異体の転写物の修正にも使用できることが報告された(Phylactou, L. A., et al., Nat. Genet. 18: 378-381, 1998; Rogers, C. S., et al., J. Clin. Invest. 110: 1783-1798, 2002)。トランス−スプライシングリボザイムは、野生型のｐ５３転写物で変異体のｐ５３転写物を修繕することにより、癌細胞の細胞死を誘導すること(Shin, K. S., et al., MoI. Ther. 10: 365-372, 2004)、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲＮＡゲノムの特定領域を認識し、該部位を抗ウイルス活性を表すＲＮＡで置き換えることにより、ＨＣＶの複製を抑制し得ることが報告されている(Ryu, K. J. , et al. , MoI. Ther. 7: 386-395, 2003)。最近では、多くの研究が、トランス−スプライシングリボザイムの遺伝疾患のための治療遺伝子としての可能性に関するものである。例えば、ｈＴＥＲＴをターゲットとするグループＩイントロンを基にしたトランス−スプライシングリボザイムを発現させると、ヒトテロメアーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）を発現する癌細胞において、選択的な細胞毒性が誘導され、ヒト癌細胞が移植された動物モデルにおいても効果的な抗癌効果を有することが示された(Kwon, B. S., et al., MoI. Ther. 12: 824-834, 2005)。しかしながら、特定のリガンドのスクリーニングのための、及び疾病の診断における使用のための、バイオセンサー分子及びイメージング剤(imaging agent)としてのリボザイムの適用について、記載している報告はない。本発明は、リボザイムの上記の使用を確立する最初のものである。
【０００４】
遺伝子治療の成功には、疾病の正確な診断が不可欠である。特に早期の診断が、疾病の治療の成功に、きわめて重大な意味を持つ。イメージング技術、並びに化学的・生物学的マーカーは、これまで疾病、とりわけ癌の早期診断に使用されてきた。しかし診断のためのイメージングは、初期の段階においては使用できないという欠点がある。化学的・生物学的マーカーは、診断の精度が劣り、従って、これらのマーカーを用いた早期診断のための標準的な方法は、確立されていない。より具体的には、癌のように遺伝子が関連する疾病は、関連する遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏでの発現をモニター可能な方法がないため、関連する遺伝子が発現を始めてから相当の時間が経過して初めて、体の疾病への反応が起こったときに、疾病を検出し得る。従って癌のような疾病は、その初期段階で治療可能なことはまれである。また、疾病の進行、又は手術若しくは治療の後の処置に対する反応は、遺伝子の発現が起こり、体内で可視的な反応が起こる場合のみモニターし得るような初期の段階において、モニターすることが不可能であるため、個人ごとに最適の治療を行うことは、非常に難しい。Ｘ線、ＣＴ、ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ及び超音波検査などの種々のイメージングの方法が、癌又は遺伝疾病の診断に使用されてきた。侵襲的な生検を用いて単離された組織の病理学的評価によって、実際に癌であるか否かを判定するために、ターゲット部位のイメージは評価される。しかしながら、組織生検が取得不可能な場合は、映像の解釈が困難である。また治療に関しても、腫瘍の切除は、外科手術によって切除し得るサイズにまで腫瘍が増大したときに行わねばならず、そのため診断が遅延し、初期段階での適切な治療を不可能にしている。
【０００５】
分子イメージングは、細胞内で起こる様々な分子現象、すなわち遺伝子の発現、生化学的プロセス及び生物学的変化を、イメージングを通じて可視化する新しいアプローチである。分子イメージングにより、医師は、ターゲットの組織のイメージに基づき、癌又は他の疾病の発症を判定することが可能であり、従って、適切な早期治療、及び組織生検をしない非外科手術的な治療を、非侵襲的にモニタリングすることができる。本発明の分子イメージングのための組成物及び分子イメージング方法は、既存の分子イメージング技術の欠点を克服する利点を有し、将来の遺伝子治療及びイメージング技術において必要とされる、位置シグナルの正確さと一時的な高い解像度を保有する。また本発明の組成物及び方法は、分子イメージングにて使用される材料が、将来技術として研究されてきた量子ドットナノ粒子を利用した分子イメージングにおいても根絶できなかった有害な副作用を有さないことから、有益に、臨床に適用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
開示
技術的な問題
そこで本願の発明者らは、トランス−スプライシングリボザイムを分子イメージングへ応用することについて、徹底的且つ集中的な研究を行った。研究の結果、特定の疾病関連遺伝子をターゲットとするトランス−スプライシングリボザイムを用いて分子イメージングを行えば、得られたイメージから、疾病の原因となる遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏでの発現を、非侵襲的且つ正確に検出できることが見出され、本発明の分子イメージング方法が、従来法よりも早期における疾病の診断において卓越していることが示されたことから、本発明が導かれた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、特定の遺伝子をターゲットとするリボザイムベクターを含む、分子イメージングのための組成物を提供することにある。
本発明の別の目的は、特定の遺伝子をターゲットとするリボザイムベクターを用いることに基づいた、分子イメージングの方法を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、リボザイムのトランス−スプライシング機構の概要図である。
【図２】図２は、癌特異遺伝子ｍＣＫＡＰ２をターゲットとし、且つルシフェラーゼ遺伝子を保有するアデノウイルスベクターＡｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃの概要図である。
【図３】図３は、癌特異遺伝子ｍＣＫＡＰ２をターゲットとし、且つルシフェラーゼ遺伝子を保有する改変リボザイムの模式図である。
【図４】図４は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの様々な組織（脳、肝臓、肺、腎臓、膵臓、心臓及び小腸）並びにマウス癌細胞株ＣＴ−２６及びＨｅｐａ１−６における、ＣＫＡＰ２タンパク質の発現パターンの、ウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図５】図５は、マウス肝臓組織及び様々なマウス癌細胞株におけるＣＫＡＰ２ ｍＲＮＡの発現パターンを示す図である。
【図６】図６は、細胞にＡｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺをトランスフェクトした後の、ｍＣＫＡＰ２特異的なトランス−スプライシングを通じた、ターゲット遺伝子のレポーター遺伝子による置換を示す図である。ｍＣＫＡＰ２遺伝子を保有するＨｅｐａ１−６細胞、及びｍＣＫＡＰ２遺伝子を損失しているＨｅｐＧ２細胞について、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、トランス−スプライスされた分子（ＴＳＭ）を検出した。ネガティブコントロール（Ｍｏｃｋ）としては、等量のＰＢＳを使用した。上段のブロット（ＬａｃＺ ＲＮＡ）は、細胞にトランスフェクトされたリボザイムの初期転写物を示す。中央のブロット（ＴＳＭ）は、トランス−スプライスされた分子によって生成された転写物を示す。下段のブロット（ｍＧＡＰＤＨ）は、遺伝子発現レベルの内部コントロールを示す。
【図７】図７は、Ｈｅｐａ１−６細胞における、トランス−スプライスされた転写物のＤＮＡ配列解析を示す図である（矢印は正確なスプライス接合部位を示す）。
【図８】図８は、Ｘ−ｇａｌ染色の結果を示す図である。Ａｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺによって、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）が、ｍＣＫＡＰ２遺伝子に特異的な様式で発現している。Ｈｅｐａ１−６細胞及びＨｅｐＧ−２細胞は、１０、３０又は５０ｍｏｉ（感染の多重度（multiplicity of infection））にてＡｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺをトランスフェクトし、Ｘ−ｇａｌ染色を行った。
【図９】図９は、Ａｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺでトランスフェクトされたＨｅｐａ１−６細胞及びＨｅｐＧ２細胞における、β−ガラクトシダーゼの特異的活性を示す図である。測定は３回行い、測定値の平均を、標準誤差（ＳＥ）を表示するバーと共に、グラフとして示した（特異的活性＝加水分解されたＯＮＰＧのｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質）。
【図１０】図１０は、ウイルス量に従って、Ａｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃでトランスフェクトされたＨｅｐａ１−６細胞におけるルシフェラーゼ活性を示す図である。測定値を、標準誤差（ＳＥ）を表示するバーと共に、グラフとして示した。
【図１１】図１１は、Ａｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺのトランス−スプライシング反応によってターゲット遺伝子ｍＣＫＡＰ２の発現が低下することを示す図である。内因性のｍＣＫＡＰ２の発現パターンは、Ｈｅｐａｌ−６細胞を、Ａｄ−Ｍｏｃｋ、Ａｄ−ｌａｃＺ及びＡｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺで、３０ｍｏｉにてトランスフェクトさせてから、２４時間後に、ウエスタンブロットを通じて評価した。上段、及び下段のブロットは、抗ｍＣＫＡＰ２抗体として抗β−アクチン抗体をそれぞれプローブとした。
【図１２】図１２は、トランス−スプライシングリボザイムによる、生きたマウスでのｍＣＫＡＰ２発現のイメージング結果を示す図である。腫瘍を保有しないマウスにおいて、体系的に搬送されたＡｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃによって生成された生物発光のシグナルを、ＣＣＤカメラを用いてイメージングした（シグナル強度はフォトン／秒／ｃｍ２／ステラジアン（steridian）で表した）。
【図１３】図１３は、Ａｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃを用いた、多重肝細胞腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏイメージングの結果を示す。多重肝細胞癌を保有するマウスにＡｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃを尾静脈から注入し、イメージを得た。該マウスから切除された肝臓組織における腫瘍結節のダイレクトイメージを下段のパネルに示し、Ａｄ−Ｍｏｃｋを注入したマウスのイメージを、ネガティブコントロールとして右下のパネルに示す。
【図１４】図１４は、Ａｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃを注入したマウス腫瘍結節のルシフェラーゼ活性を示す図である。ルシフェラーゼの発現を測定し、ＲＬＵ／ｓ／μｇタンパク質にて、ログスケールにてそれを表した。測定は３回行い、測定値の平均を、標準誤差（ＳＥ）を表示するバーと共に、グラフとして示した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
最良の形態
一側面において、本発明は、特定の遺伝子をターゲットとするリボザイムベクターを含む、分子イメージングのための組成物に関する。
【００１０】
本明細書中で使用する場合、用語「リボザイム」とは、酵素活性を天然に保有するＲＮＡ分子を意味し、好ましくはトランス−スプライシング活性を有するリボザイムを意味し、更に好ましくは特定の疾病関連遺伝子をターゲットとするトランス−スプライシングリボザイムを意味する。
【００１１】
本明細書中で使用する場合、用語「トランス−スプライシングリボザイム」とは、トランス−スプライシング活性を有するリボザイムを意味し、このトランス−スプライシング活性により、リボザイムは、ターゲットＲＮＡとリボザイムの内部ガイド配列（ＩＧＳ）との間で塩基対を形成して、離れたターゲットＲＮＡ（５’エクソン）を認識し、ターゲットＲＮＡを切断し、リボザイムの３’エクソンを、ターゲットＲＮＡの５’エクソン切断生成物にライゲートさせる（図１）。また用語「特定の遺伝子をターゲットとするトランス−スプライシングリボザイム」とは、細胞内に導入されたときに、疾病に関連する特定の遺伝子を認識して選択的なトランス−スプライシング反応を起こすように遺伝的に操作されたリボザイムを意味する。トランス−スプライシングリボザイムは、当業者に広く知られている方法により作製することができる。例えば、リボザイムの５’末端に、ターゲット（基質）ＲＮＡの保存領域に相補的な特定の配列を結合させることにより、特定のＲＮＡをターゲットとする基質特異性を有するようなリボザイムを作製してもよい。
【００１２】
また本発明での使用に適した、特定の遺伝子をターゲットとする改変されたトランス−スプライシングリボザイムは、ｉｎ ｖｉｖｏで生物発光反応を起こすことでイメージングを可能にするタンパク質をコードするイメージングレポーター遺伝子(imaging reporter gene)を、リボザイムの３’エクソンに結合させることにより、作製してもよい。本発明のトランス−スプライシングリボザイムがターゲットＲＮＡを切断すると、切断部位から下流のＲＮＡ塩基が放出される。そしてリボザイムの３’領域が、ターゲットＲＮＡの切断生成物の３’末端にライゲートされて、イメージングレポーター遺伝子がリボザイムに融合される。イメージングレポーター遺伝子と融合されたリボザイムは、分子イメージングを通じて、特定の遺伝子の発現のイメージング及びモニターを可能にする。該イメージングレポーター遺伝子は、分子イメージングを通じて得られたイメージをモニターすることが可能である限り、特に限定されない。イメージングレポーター遺伝子の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、改変された緑色蛍光タンパク質(modified green fluorescent protein)、高感度緑色蛍光タンパク質(enhanced green fluorescent protein：ＥＧＦＰ)、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、高感度赤色蛍光タンパク質（ＥＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（enhanced blue fluorescent protein：ＥＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（enhanced yellow fluorescent protein：ＥＹＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、及び高感度青緑色蛍光タンパク質（enhanced cyan fluorescent protein：ＥＣＦＰ）などの蛍光タンパク質；西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）及びルシフェラーゼなどの比色酵素（colorimetric enzyme）が挙げられる。ルシフェラーゼが好ましい。
【００１３】
本明細書中で使用する場合、用語「組換えベクター」とは、適切な宿主細胞中で目的タンパク質を発現することが可能なベクターであって、必須の調節要素を含む遺伝子構築物をいい、この調節要素には、遺伝子挿入物が、宿主細胞において発現されるような様式で、作動可能に連結されている。用語「作動可能に連結された(operably linked)」とは、本明細書中で使用する場合において、核酸発現調節配列とターゲットタンパク質をコードする核酸配列との間が、一般的な機能を許容するように機能的に連結されていることをいう。例えば、リボザイムをコードする配列をプロモーターに作動可能に連結させると、リボザイムをコードする配列の発現は、このプロモーターの影響若しくは調節の下に置かれることになる。２つの核酸配列（リボザイムコード配列、及び該コード配列の５’末端に連結されたプロモーター領域の配列）は、プロモーター機能が誘導されることにより、該リボザイムコード配列が転写される場合であって、前記２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、フレームシフト変異の導入も、該発現調節配列の該リボザイムの発現を指揮する能力の阻害も招かない場合に、作動可能に連結されたという。組換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野における公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができ、部位特異的なＤＮＡの切断及びライゲーションは、当該技術分野にて公知の酵素を用いて簡単に成し得る。
【００１４】
本発明における適切な発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、終始コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどの発現調節要素、並びに膜ターゲッティング又は分泌のためのシグナル配列を含む。プロモーターは、一般に、構成的であってもよく又は誘導性であってもよい。発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする選択マーカーを含んでいてよく、複製可能な発現ベクターは、複製開始点を含んでいてよい。ベクターは、自己複製するものであってもよく、又は宿主ＤＮＡに組み込まれるものであってもよい。本発明における使用に適切なベクターの例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター及びウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターが好ましい。ウイルスベクターの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、トリ肉腫／白血症ウイルス（ＡＳＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）などのレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルスなどに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。アデノウイルスベクターが好ましい。
【００１５】
本発明の一実施形態において、イメージングレポーター遺伝子を、マウス細胞骨格関連タンパク質２（ｍＣＫＡＰ２）をターゲットとする改変リボザイム（Kim, A., et al., Oligonucleotides 17, 95-103, 2007）に結合させる。ＣＫＡＰ２は、微小管の安定化剤として働き、癌細胞などの高増殖細胞で高発現するため、癌の治療及び診断のための有用なターゲットとして考えられてきた。より具体的には、本発明の実施形態によるリボザイムは、テトラヒメナ好熱菌のトランス−スプライシンググループＩリボザイムの改変型（modified form）であって、１）ターゲットのｍＣＫＡＰ２のＲＮＡのウリジン残基（４５Ｕ）の下流領域に相補的なアンチセンス配列であり、８３ヌクレオチド（ｍＣＫＡＰ２のＲＮＡの＋５９部位から＋１４１部位のヌクレオチドに相補的）又は３００ヌクレオチド（ｍＣＫＡＰ２のＲＮＡの＋５９部位から＋３５８部位のヌクレオチドに相補的）からなるアンチセンス配列；２）該アンチセンス配列の３’末端に連結され且つ内部ガイド配列５’−ＧＡＧＣＧＴ−３’を含むＰ１ヘリックス領域；３）該Ｐ１ヘリックス領域の３’末端に連結されたＰ１０ヘリックス領域；及び４）該Ｐ１０ヘリックス領域の３’末端に連結され且つβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）又はルシフェラーゼ（ｌｕｃ）をコードする配列、を含む。該リボザイムの模式的な構造を図３に示した。しかしながら本発明は、テトラヒメナ好熱菌のグループＩイントロンに限定されず、他のグループＩイントロンであっても、上記の基準及び当該分野における情報に基づき、当業者により、本発明のリボザイムの作製に利用できる。本発明の組成物に含まれるリボザイムは、ターゲット遺伝子を置き換えることにより、すなわちトランス−スプライシング反応を通じて疾病関連遺伝子をイメージングレポーター遺伝子に置き換えることにより、分子イメージングを可能にする。従って本発明のリボザイムは、分子イメージングを用いることを通じて、遺伝子が関連する疾病の診断に、非常に有用である。
【００１６】
用語「分子イメージング」とは、細胞内で起こる様々な分子現象、すなわち遺伝子の発現、生化学的プロセス及び生物学的変化を、イメージングを通じて評価する技術をいう。より具体的には、本発明で用いられる分子イメージングは遺伝子のイメージングを示すことを意味し、この遺伝子のイメージングは、特定の遺伝子の発現を画像化する。該イメージング技術においては、イメージングレポーター遺伝子を用いてイメージを評価するため、単一の個体において繰返し実験を実施することが可能であり、また実験動物に苛酷な損害を与えることもない。
【００１７】
分子イメージングを通じてイメージの取得を可能にするイメージングレポーター遺伝子は、上記記載のものと共通の似た特徴があり、イメージは当業者に広く公知の方法を用いて得ることができる。例えばルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合、高感度冷却ＣＣＤカメラ(hypersensitive cooled charge-coupled device camera)を用いてイメージを得ることができる。同様に、ルシフェラーゼの発現は、赤外蛍光イメージング、拡散光トモグラフィー、光コヒーレンストモグラフィー、及びポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）のような核医学イメージングにおいて用いられる種々の分子イメージング技術を通じてモニターし得る。
【００１８】
本明細書中で使用する場合において、用語「遺伝子が関連する疾病」としては、多発性嚢胞腎疾患、多発性内分泌腺腫症１型、神経線維腫症(neurofibromatose)、テイ・サックス病、ハンチントン病、鎌状赤血球貧血、サラセミア及びダウン症候群などの遺伝疾患（The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 7th ed., McGraw-Hill Inc., New York）；並びに、癌、高血圧、アルツハイマー病、神経変性疾患、及び双極性感情障害、若しくは妄想型統合失調症疾患などの精神神経疾患のような、遺伝子の欠陥により誘発される全ての疾病を含むことを意味するが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明のリボザイムのターゲットとなる「特定の遺伝子」とは、上記記載のような疾病の誘発、進行又は治療に直接又は間接に関与する遺伝子をいう。本発明の詳細な実施形態においてはＣＫＡＰ２を用いられるが、本発明はこの遺伝子に限定されない。
【００２０】
実際に、マウスＣＫＡＰ２をターゲットとするトランス−スプライシングリボザイムの下流にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子を結合させることにより作製されたアデノウイルスＡｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺまたはＡｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃを、肝癌細胞株Ｈｅｐａ１−６にトランスフェクトすると、ＣＫＡＰ２特異的なトランス−スプライシング反応を通じて、ターゲット遺伝子がレポーター遺伝子に置き換えられた（図６から１１）。同様に、アデノウイルスＡｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃを肝腫瘍を保有するマウスに投与すると、ルシフェラーゼの発現を通じて、マウスにおける癌の分子イメージングが得られた（図１２及び１３）。
【００２１】
別の側面において、本発明は、１）イメージングレポーター遺伝子を、特定の遺伝子をターゲットとするリボザイムに連結させ、得られたリボザイムをクローニングすること；２）クローニングされたリボザイムをベクターへ挿入し、該リボザイムを発現させること；及び３）リボザイムの発現が同定されたベクターを分離し、該リボザイムを確認すること、を含む、分子イメージングのためのベクターの製造方法に関する。
【００２２】
更なる側面において、本発明は、特定の遺伝子をターゲットとするリボザイムベクターの使用に基づく分子イメージングの方法に関する。
【００２３】
一実施形態において、本発明は、１）本発明のベクターをｉｎ ｖｉｖｏ投与し、イメージングレポーター遺伝子が活性化するようにターゲット遺伝子の発現部位にてリボザイムを機能させること；及び２）該イメージングレポーター遺伝子の活性化を、分子イメージングを通じてイメージングすること、を含む。
【００２４】
本明細書中で使用する場合において、用語「投与」は、所定量の物質を、患者に、ある適切な方法を用いて導入することを意味する。本発明の組成物は、ヒトにおける使用又は獣医学的使用のための剤形に製剤化してよく、任意の一般的経路により投与してよい。ウイルスベクターは、非経口経路、例えば血管内、静脈内、動脈内、筋肉内又は皮下に投与してよい。同様に、該組成物は、経口、鼻腔、直腸、経皮又はエアロゾルを通じての吸入経路にて投与してよい。ウイルスベクターは、ボーラス投与してよく、又は徐々に注入してよい。
【００２５】
イメージングレポーター遺伝子の活性化の分子イメージングは、種々の分子イメージングの方法を用いて行うことができ、これらの分子イメージング方法は、上記に例示的に記載されているが、本発明はこれらの例に限定されない。また本発明の分子イメージングの方法は、遺伝子が関連する種々の疾病の診断に使用し得、このような疾病は上記記載のものと同様のものである。
【実施例】
【００２６】
発明の形態
以下の実施例を通じて、本発明についてのさらなる理解が得られるが、これらの実施例は、本発明を説明するために記載されたものであって、本発明を限定するものとして解釈されるものではない。
【００２７】
実施例１：試験材料の作製
１−１．癌遺伝子特異的なトランス−スプライシングリボザイムを発現する組換えアデノウイルスの構築
癌特異遺伝子ｍＣＫＡＰ２をターゲットとするトランス−スプライシングリボザイムは、公知の技術を使用して構築した(Kim, A., et al., Oligonucleotides 17: 95-103, 2007)。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子又はルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子を、リボザイムの３’に連結させ、得られたリボザイムをクローニングした。該レポーター遺伝子と融合されたリボザイムを、ＣＭＶプロモーターを含むシャトルベクターｐＡｖＣＭＶ３．０のＢｇｌＩＩとＮｏｔＩサイトの間にサブクローニングした。該シャトルベクターを、ＨＥＫ２９３細胞内に、アデノウイルスをバックボーンとするベクターｐＪＭ１７と共に、カルシウム−リン酸塩沈降法を用いてコトランスフェクトした。続いて、トランスフェクトされた細胞は、軟寒天下で約２週間増殖させ、ウイルスプラークを形成させた。多数のクローンを分離した。組換えウイルスは、ＨＥＫ２９３細胞内にて増幅させた後、公知の方法を用いて、すなわちＣｓＣｌ勾配超遠心法を２回行うことにより、精製した(Kobayashi, K., et al . , J. Biol. Chem. 271:6852-6860, 1996)。ｍＣＫＡＰ２を特異的にターゲットとするトランス−スプライシングリボザイム及びｌａｃＺ遺伝子を含む、精製組換えアデノウイルスを、「Ａｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺ」と命名した。ｍＣＫＡＰ２特異的なトランス−スプライシングリボザイム及びｌｕｃ遺伝子を含む、別の精製組換えアデノウイルスを、「Ａｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃ」と命名した。Ａｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃの模式図を図２に示した。ネガティブコントロールとしては、アデノウイルスをバックボーンとするベクター（Ａｄ−Ｍｏｃｋ）並びにｌａｃＺ遺伝子を保有するアデノウイルスベクター（Ａｄ−ｌａｃＺ）及びｌｕｃ遺伝子を保有するアデノウイルスベクター（Ａｄ−ｌｕｃ）を使用した。分離された組換えアデノウイルスベクターの力価は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）として、ＴＣＩＤ５０法を用いて決定した。
【００２８】
１−２．細胞培養
マウス肝癌細胞株Ｈｅｐａ１−６、マウス大腸癌細胞株ＣＴ−２６、マウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞、マウス肝癌細胞株ＢＮＬ１ＭＥ Ａ．７Ｒ．１、及びマウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を使用した。これらの細胞株は、１０％ウシ胎仔血清（Invitrogen社）及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Gibco社）にて、３７℃、５％のＣＯ２下で、インキュベータ中で培養した。
【００２９】
１−３．肝癌の動物モデルの作製
６週〜８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ６マウスをＯｒｉｅｎｔ社（ソウル、韓国）から購入した。該動物は、韓国食品医薬品安全庁の動物実験室で無菌条件下に維持され、使用する前に少なくとも１週間、実験条件に順適応させた。該動物は、午前６時に灯をオンにし、午後６時に灯をオフにする規則的な１２時間の光／暗周期の下で飼育した。
肝癌の動物モデルはＨｅｐａ１−６細胞をマウスの脾臓に注入し、確立したが、その方法は公知の方法を若干改変して利用した(Giavazzi, R., et al., J Natl Cancer Inst 77:1303-8, 1986)。詳細には、Ｈｅｐａ１−６細胞を培養皿でコンフルエントに培養し、マウスに注射する１日前に継代培養した。Ｈｅｐａ１−６細胞を０．０２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞はトリパンブルーで染色し、生きている細胞の数を数えた。生きている細胞が９５％より多い場合に、該培養細胞をマウスに注射した。Ｈｅｐａ１−６細胞は、５０μｌ当たり２×１０６個細胞の密度で懸濁した。マウスの左脇を縦に小さく切開して脾臓を露出させ、５０μｌ量中の２×１０６個の細胞を、２９グレードの注射針を用いて脾臓に徐々に注入した。注射針を除去後、脾臓を腹腔に戻し、腹部の切開を絹縫合して閉じた。Ｈｅｐａ１−６細胞を注射の後、８〜１０日内に多数の肝癌小結節が生成されることを全体的な観察によって容易に探し出すことができた。
【００３０】
実施例２：トランス−スプライシングリボザイム（Ａｄ−ｍＣＫＡＰ２−ｌａｃＺ）を用いた分子イメージングを通じた、癌細胞のＩｎ ｖｉｔｒｏ診断
２−１．マウスの組織又は細胞株におけるｍＣＫＡＰ２の発現の評価
マウスの組織又は細胞株においてｍＣＫＡＰ２タンパク質が発現されているか否かを判定するため、ウエスタンブロット解析を行った。マウスの組織又は各臓器から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Invitrogen社）を用いてトータルＲＮＡを単離後、ＲＮａｓｅフリー水及びバッファ中にて、ＲＱ１ ＲＮＡａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ（１Ｕ／μｇＲＮＡ；Promega社）で、３７℃で３０分間処理した。ｃＤＮＡの合成に関しては、ＤＮａｓｅＩ処理したトータルＲＮＡ、４Ｕの逆転写酵素（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ−ＲＴａｓｅ、Qiagen社）、ｄＮＴＰミックス、１０×ＲＴバッファ、２５０ｎｇのランダムプライマー（Invitrogen社）、及び４０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤により反応混合液を作製した。逆転写反応を、２５℃で１０分、３７℃で１時間の条件で行った後、９５℃に加熱して酵素を非活性化させた。合成されたｃＤＮＡを鋳型として用い、下の表１にまとめられたｍＣＫＡＰ２特異的プライマー、及び下記の反応条件下の反応混合液を用いて、ｍＣＫＡＰ２を増幅した。ｍＣＫＡＰ２遺伝子の発現は、アガロースゲル電気永動を通じて検出した。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
ＰＣＲ反応混合液
水（ＨＰＬＣ級）                                             １４．４０μＬ
１０×バッファ（１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２）      ２．００μＬ
ｄＮＴＰ ミックス（Ｄａｋａｒａ）（２５ｍＭ／ごと）            １．６０μＬ
Ｔａｑ ｐｏｌ（５Ｕ／μＬ；Ｄａｋａｒａ）                      ０．２０μＬ
フォワード／リバースプライマーミックス                         ０．８０μＬ
ｃＤＮＡ                                                       １．００μＬ
全量                                                          ２０．００μＬ
【００３３】
ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間維持した後、９５℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして３０サイクル繰返し行い、しかる後に、４℃に冷却した。
その結果、マウス癌細胞株ＣＴ−２６及びＨｅｐａ１−６でｍＣＫＡＰの発現を確認することができた（図４及び５）。
【００３４】
２−２．ＲＴ−ＰＣＲを用いた、ｍＣＫＡＰ２及びトランス−スプライシングモジュールのＩｎ ｖｉｔｒｏにおける検出
トランス−スプライスされた分子（ＴＳＭ）を検出するため、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＣＫＡＰ２保有のＨｅｐａ１−６細胞、及びＣＫＡＰ２を消失したＨｅｐＧ２細胞は、トランス−スプライシングリボザイムを保有するアデノウイルスＡｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺ、Ａｄ−ｌａｃＺ及びＡｄ−Ｍｏｃｋで、３０ｍｏｉにて感染させた。トータルＲＮＡを感染細胞から単離し、上記記載と同様の方法を用いてｃＤＮＡを合成した。ＴＭＳの生成を評価するため、合成されたｃＤＮＡを鋳型として用いて、表１にまとめられたＴＳＭ特異的プライマー及び上記の反応条件下（アニーリングは６０℃で行い、変性及び伸長は上記と同じ温度にて行った）の反応混合液を用いて、ＴＳＭを増幅した。フォワード及びリバースプライマーは、ｍＣＫＡＰ２又はトランス−スプライシング分子を増幅するように設計した。より具体的には、ＴＳＭ特異的プライマーは、トランス−スプライシング接合のｍＣＫＡＰ２上流領域及び該トランス−スプライシング接合の下流領域とアニールするように設計した。
【００３５】
結果を図６に示す。図６に示すように、細胞をＡｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺでトランスフェクトすると、ｍＣＫＡＰ２特異的なトランス−スプライシングを通じて、ターゲット遺伝子がレポーター遺伝子に置き換えられたことが分かった。
【００３６】
リボザイムのトランス−スプライシング反応の特異性を評価するために、増幅された生成物を、ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ＋／−）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩサイトの間にクローニングし、Ｍａｃｒｏｇｅｎ社（韓国）に依頼して、ＤＮＡ配列の解析を行った（図７）。
【００３７】
２−３．β−ガラクトシダーゼアッセイ
リボザイムがｍＣＫＡＰ２をターゲットとしているか、及びリボザイムが発現しているかを判定するために、リボザイム遺伝子の３’末端にｌａｃＺ遺伝子が融合されている組換えアデノウイルスＡｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺを、細胞に感染させた。β−ガラクトシダーゼの発現を、Ｘ−ｇａｌ染色及びβ−ガラクトシダーゼアッセイを通じて、定量的に分析した。Ｘ−ｇａｌ染色に関しては、Ｈｅｐａ１−６細胞及びＨｅｐＧ２細胞を２×１０５細胞／穴の密度で６穴培養プレートに播種し、３７℃で培養した。翌日、Ａｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺアデノウイルスを、０、１０、３０又は５０ｍｏｉで、細胞に感染させた。ＣＭＶプロモーターの調節下にｌａｃＺ遺伝子を保有するＡｄ−ｌａｃＺアデノウイルスを、ポジティブコントロールとして使用した。３０ｍｏｉのＡｄ−ｌａｃＺで細胞を感染させた。４８時間後、β−ガラクトシダーゼ染色キット（Invitrogen Corporation、ＣＡ、アメリカ合衆国）を用いて、細胞を染色した。
【００３８】
図８に示すように、Ｈｅｐａ１−６細胞を、ｍＣＫＡＰ遺伝子を保有するＡｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺアデノウイルスでトランスフェクトすると、ｍＣＫＡＰ２特異的なトランス−スプライシングを通じてターゲット遺伝子がｌａｃＺ遺伝子に置き換えられ、ｌａｃＺ遺伝子によってコードされているβ−ガラクトシダーゼの高い発現をもたらした。β−ガラクトシダーゼの発現は、アデノウイルス量が増加するにつれ増加した。
【００３９】
これとは別に、β−ガラクトシダーゼの活性を評価するために、溶解バッファ（lysis buffer）（Promega社）を用いて、細胞を溶解した。タンパク質の濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce、Rockford、ＩＬ、アメリカ合衆国）を用いて決定した。β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性は、β−ｇａｌアッセイキット（Invitrogen社）を用いて決定した。β−ガラクトシダーゼの特異的活性は、以下の式に従って計算した。
【００４０】
特異的活性＝加水分解されたＯＮＰＧのｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質
【００４１】
図９に示すように、β−ガラクトシダーゼ活性は、Ａｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺウイルスの用量が増加するにつれて、増加することが分かった。
【００４２】
実施例３：トランス−スプライシングリボザイム（Ａｄ−ｍＣＫＡＰ２−ｌｕｃ）を用いた分子イメージングを通じた、癌細胞のＩｎ ｖｉｔｒｏ診断
３−１．ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼの発現を評価するため、１×１０４個数のＨｅｐａ１−６細胞を、黒色の９６−ウェル培養プレートに播種し、培養した。翌日、ｍＣＫＡＰ２をターゲットとし且つルシフェラーゼを発現する組換えアデノウイルスＡｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃ、及びＣＭＶプロモーターの調節下にルシフェラーゼ遺伝子を保有するＡｄ−ｌｕｃアデノウイルスを、０、１、５、１０、１５、３０及び５０ｍｏｉで、細胞に感染させた。５時間後、溶解バッファ（Promega社）を用いて細胞を溶解した。ルシフェラーゼ活性は、Ｂｌｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega社）を用いて決定した。発光強度は、ルミノメーターを用いて、１０秒ごとの相対発光量（ＲＬＵ）で測定し、測定値をＲＬＵ／ｓ／μｇタンパク質で表した。
【００４３】
図１０に示すように、Ｈｅｐａｌ−６細胞を、ｍＣＫＡＰ遺伝子を保有するＡｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃアデノウイルスでトランスフェクトすると、ｍＣＫＡＰ２特異的なトランス−スプライシングを通じてターゲット遺伝子がｌｕｃ遺伝子に置き換えられた。ルシフェラーゼ活性は、Ａｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃのウイルス用量が増加するにつれ増加した。
【００４４】
３−２．ウエスタンブロット分析
細胞株またはマウス組織は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１０ｍＭ ＮａＦ、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１％ＮＰ−４０、ＰＭＳＦ及びプロテアーゼ阻害剤を含むタンパク質抽出溶液（Sigma社）を用いて溶解した。タンパク質は、公知の方法を用いてニトロセルロース膜に移した。より詳細には、精製されたタンパク質（２５μｇ又は５０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分子の大きさの順に分離した後、ブロット機器を用いてＮＣ膜（Millipore社）に移した。ブロットは、ブロッキングバッファ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ中の５％スキムミルク）にて３０分間ブロックした。続いてブロットを１次抗体のウサギポリクローナル抗ｍＣＫＡＰ２抗体又は抗β−アクチン抗体（Sigma社）中で室温で１時間、あるいは摂氏４℃で一晩インキュベートした。ブロットは、Ｔｗｅｅｎトリス−バッファ生理食塩水（Ｔ−ＴＢＳ）で２回洗い、結合していない１次抗体を取り除いた。結合した１次抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼが接合した抗−ウサギ抗体（Amersham社）で検出した。
【００４５】
図１１に示すように、Ｈｅｐａ１−６細胞を、ｍＣＫＡＰ遺伝子を保有するＡｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃアデノウイルスでトランスフェクトすると、ｍＣＫＡＰ２特異的なトランス−スプライシングを通じてターゲット遺伝子がｌｕｃ遺伝子に置き換えられ、ｍＣＫＡＰ２の発現が減少した。
【００４６】
実施例４：トランス−スプライシングリボザイム（Ａｄ−ｍＣＫＡＰ２−ｌｕｃ）を用いた分子イメージングを通じた、癌のＩｎ ｖｉｖｏ診断
Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ２０００冷ＣＣＤカメラ（Xenogen社、Hopkinton、ＭＡ）を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ分子イメージングを行った。Ａｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃ組換えアデノウイルス、ポジティブコントロールとしてのＡｄ−ｌｕｃアデノウイルス、及びネガティブコントロールとしてのＡｄ−ｍｏｃｋウイルスを、５０μＬのダルベッコＰＢＳ（Life Technologies社）中、１０１１個のウイルス粒子（ｖｐ）のウイルス量になるように調製した後、尾静脈注射によって、マウスに全身投与した。翌日、ルシフェラーゼの基質のＤ−ルシフェリンを、２００μＬのＰＢＳ中、マウスの体重１ｋｇ当たり１５０ｍｇの用量で、マウスの腹腔内に投与した。ｉｎ ｖｉｖｏ分子イメージングのため、イソフルラン混合酸素(isofluran-mixed oxygen)によりマウスを麻酔した。１０分後にリファレンスイメージを撮り、そしてｉｎ ｖｉｖｏイメージを１分〜５分間撮影した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Xenogene社）を用いて全身のイメージングを行い、その結果を秒当たり、ｃｍ２当たり、ステラジアン（steridian）当たりのフォトン（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）にて表した。
【００４７】
図１３に示すように、ルシフェラーゼの発現は、肝癌を保有するＡｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃをトランスフェクトされたマウスから切除された、肝臓のイメージングを可能にすることが見出された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本明細書にて前述したとおり、本発明のトランス−スプライシングリボザイムを用いた分子イメージングの方法は、疾病関連遺伝子の発現の、遺伝子発現の場所におけるイメージングを提供することにより、疾病の初期段階での正確な診断を可能にする。また該分子イメージングの方法は、例えば治療効果の評価及び薬物への反応といった、遺伝子が関連する疾病の予後診断及び治療にも有用である。
【図１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年9月10日(2009.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
【図１】図１は、リボザイムのトランス−スプライシング機構の概要図である。
【図２】図２は、癌特異遺伝子ｍＣＫＡＰ２をターゲットとし、且つルシフェラーゼ遺伝子を保有するアデノウイルスベクターＡｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃの概要図である。
【図３】図３は、癌特異遺伝子ｍＣＫＡＰ２をターゲットとし、且つルシフェラーゼ遺伝子を保有する改変リボザイムの模式図である。
【図４】図４は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの様々な組織（脳、肝臓、肺、腎臓、膵臓、心臓及び小腸）並びにマウス癌細胞株ＣＴ−２６及びＨｅｐａ１−６における、ＣＫＡＰ２タンパク質の発現パターンの、ウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図５】図５は、マウス肝臓組織及び様々なマウス癌細胞株におけるＣＫＡＰ２ ｍＲＮＡの発現パターンを示す図である。
【図６】図６は、Ｘ−ｇａｌ染色の結果を示す図である。Ａｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺによって、レポーター遺伝子（ｌａｃＺ）が、ｍＣＫＡＰ２遺伝子に特異的な様式で発現している。Ｈｅｐａ１−６細胞及びＨｅｐＧ−２細胞は、１０、３０又は５０ｍｏｉ（感染の多重度（multiplicity of infection））にてＡｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺをトランスフェクトし、Ｘ−ｇａｌ染色を行った。
【図７】図７は、Ａｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺでトランスフェクトされたＨｅｐａ１−６細胞及びＨｅｐＧ２細胞における、β−ガラクトシダーゼの特異的活性を示す図である。測定は３回行い、測定値の平均を、標準誤差（ＳＥ）を表示するバーと共に、グラフとして示した（特異的活性＝加水分解されたＯＮＰＧのｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質）。
【図８】図８は、細胞にＡｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺをトランスフェクトした後の、ｍＣＫＡＰ２特異的なトランス−スプライシングを通じた、ターゲット遺伝子のレポーター遺伝子による置換を示す図である。ｍＣＫＡＰ２遺伝子を保有するＨｅｐａ１−６細胞、及びｍＣＫＡＰ２遺伝子を損失しているＨｅｐＧ２細胞について、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、トランス−スプライスされた分子（ＴＳＭ）を検出した。ネガティブコントロール（Ｍｏｃｋ）としては、等量のＰＢＳを使用した。上段のブロット（ＬａｃＺ ＲＮＡ）は、細胞にトランスフェクトされたリボザイムの初期転写物を示す。中央のブロット（ＴＳＭ）は、トランス−スプライスされた分子によって生成された転写物を示す。下段のブロット（ｍＧＡＰＤＨ）は、遺伝子発現レベルの内部コントロールを示す。
【図９】図９は、Ｈｅｐａ１−６細胞における、トランス−スプライスされた転写物のＤＮＡ配列解析を示す図である（矢印は正確なスプライス接合部位を示す）。
【図１０】図１０は、Ａｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺのトランス−スプライシング反応によってターゲット遺伝子ｍＣＫＡＰ２の発現が低下することを示す図である。内因性のｍＣＫＡＰ２の発現パターンは、Ｈｅｐａ１−６細胞を、Ａｄ−Ｍｏｃｋ、Ａｄ−ｌａｃＺ及びＡｄ−ｍＣＲ−ｌａｃＺで、３０ｍｏｉにてトランスフェクトさせてから、２４時間後に、ウエスタンブロットを通じて評価した。上段、及び下段のブロットは、抗ｍＣＫＡＰ２抗体として抗β−アクチン抗体をそれぞれプローブとした。
【図１１】図１１は、ウイルス量に従って、Ａｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃでトランスフェクトされたＨｅｐａ１−６細胞におけるルシフェラーゼ活性を示す図である。測定値を、標準誤差（ＳＥ）を表示するバーと共に、グラフとして示した。
【図１２】図１２は、トランス−スプライシングリボザイムによる、生きたマウスでのｍＣＫＡＰ２発現のイメージング結果を示す図である。腫瘍を保有しないマウスにおいて、体系的に搬送されたＡｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃによって生成された生物発光のシグナルを、ＣＣＤカメラを用いてイメージングした（シグナル強度はフォトン／秒／ｃｍ２／ステラジアン（steridian）で表した）。
【図１３】図１３は、Ａｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃを用いた、多重肝細胞腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏイメージングの結果を示す。多重肝細胞癌を保有するマウスにＡｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃを尾静脈から注入し、イメージを得た。該マウスから切除された肝臓組織における腫瘍結節のダイレクトイメージを下段のパネルに示し、Ａｄ−Ｍｏｃｋを注入したマウスのイメージを、ネガティブコントロールとして右下のパネルに示す。
【図１４】図１４は、Ａｄ−ｍＣＲ−ｌｕｃを注入したマウス腫瘍結節のルシフェラーゼ活性を示す図である。ルシフェラーゼの発現を測定し、ＲＬＵ／ｓ／μｇタンパク質にて、ログスケールにてそれを表した。測定は３回行い、測定値の平均を、標準誤差（ＳＥ）を表示するバーと共に、グラフとして示した。
【国際調査報告】
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