(57)【要約】等電点ゲルにおける著しくより高い収率およびより良好な分解能は、接近してステップを付けられた固定化ｐＨバッファーを含むゲルの２つ以上の層（２６、２８）を有するトラップを作製することによって得られる。タンパク質は、それらが負に帯電されるｐＨから、それらが正に帯電されるアノードに向かって移動する。固定化ｐＨバッファーを含むゲル層（２６、２８）は、固定化バッファーのｐＨおよびタンパク質の等電点がほぼ同じ場合に、タンパク質を捕捉する。タンパク質は、第２層内に捕捉され、第２層の表面上または界面上には捕捉されない。
2010526301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動ゲルマトリックスの一部を形成する等電点電気泳動ゲルトラップであるか、または電気泳動ゲルマトリックスへの適用に適した等電点電気泳動ゲルトラップであって、
固定化ｐＨバッファーを含み、第１のｐＨを有する第１層と、
固定化ｐＨバッファーを含み、第２の異なるｐＨを有する第２層と
を含み、
サンプルを該第１層に適用するのに適しているトラップ。
【請求項２】
前記第１層と前記第２層との間に中性ゲル層をさらに含む、請求項１に記載のトラップ。
【請求項３】
中性ゲル層が、トレハロース、グリセロール、スクロースまたはそれらの組合せを含む、請求項１に記載のトラップ。
【請求項４】
前記層間のｐＨの差が、約０．１ｐＨ単位から約０．０５ｐＨ単位以下である、請求項１に記載のトラップ。
【請求項５】
前記第２層におけるｐＨ範囲が、前記第１層におけるｐＨ範囲に比べて、０．２単位から０．１単位の間で異なる、請求項１に記載のトラップ。
【請求項６】
等電点電気泳動ゲルにおける、請求項１に記載のトラップ。
【請求項７】
２つ以上のトラップを含むアレイにおける、請求項１に記載のトラップ。
【請求項８】
前記各トラップの前記第１層と前記第２層とは、ｐＨが約０．１ｐＨ単位から約０．０５ｐＨ単位だけ異なる、ｐＨ４．０から約ｐＨ６．０までのｐＨ範囲に及ぶトラップを含む、請求項７に記載のアレイ。
【請求項９】
等電点電気泳動ゲルにおける分解能または収率を改良する方法であって、
電気泳動ゲルマトリックスの一部を形成する等電点電気泳動ゲルトラップであるか、または電気泳動ゲルマトリックスへの適用に適した等電点電気泳動ゲルトラップであって、
固定化ｐＨバッファーを含み、第１のｐＨを有する第１層と、
固定化ｐＨバッファーを含み、第２のより低いｐＨを有する第２層と
を含み、
サンプルを該第１層に適用するのに適しているトラップを、該等電点電気泳動ゲルに提供する工程を含む方法。
【請求項１０】
等電点電気泳動ゲルにおける穴の中央に障壁層を形成する工程、次いで該障壁の片側に、第１ｐＨを有する両性電解質を含む層を形成する工程、次いで該障壁の反対側に、第２ｐＨを有する両性電解質を含む層を形成する工程を含み、該層がアクリルアミドモノマー溶液の重合によって形成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
サンプル中の分子を単離する方法であって、
電気泳動ゲルマトリックスの一部を形成する等電点電気泳動ゲルトラップであるか、または電気泳動ゲルマトリックスへの適用に適した等電点電気泳動ゲルトラップであって、
固定化ｐＨバッファーを含み、第１のｐＨを有する第１層と、
固定化ｐＨバッファーを含み、第２の異なるｐＨを有する第２層と
を含み、
該サンプルを該第１層に適用するのに適しているトラップを通って方向付けられている電場に、該分子が該第１層のｐＨ未満および該第２層のｐＨを超える等電点を有する場合の、該分子が該等電点電気泳動トラップに捕捉されるようになるまで、該サンプルを曝す工程を含む方法。
【請求項１２】
泳動バッファー中に還元剤を提供する工程を含む、ゲル電気泳動の方法。
【請求項１３】
前記還元剤が、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、メタンチオール、ジチオエリトリトール、システイン、グルタチオン、アリルメルカプタンおよび２−メルカプトインドールからなるチオール化合物の群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記還元剤が、１ｍＭから１００ｍＭの量で加えられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ゲル電気泳動が、等電点電気泳動である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
泳動バッファー中に、両性電解質または線状ポリアクリルアミドを、０．１％〜１％の間の濃度で提供する工程を含む、等電点電気泳動の方法。
【請求項１７】
前記両性電解質または前記線状ポリアクリルアミドが、前記サンプルの前記泳動バッファーに、０．２５％〜０．５％の範囲で加えられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
還元剤を前記泳動バッファーに、１ｍＭから１００ｍＭの量で加える工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１２に記載の方法に使用するための泳動バッファー。
【請求項２０】
前記還元剤が、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、メタンチオール、ジチオエリトリトール、システイン、グルタチオン、アリルメルカプタンおよび２−メルカプトインドールからなるチオール化合物の群から選択される、請求項１９に記載の泳動バッファー。
【請求項２１】
前記還元剤が、１ｍＭから１００ｍＭの間の量で存在する、請求項２０に記載の泳動バッファー。
【請求項２２】
前記ゲル電気泳動が、等電点電気泳動である、請求項１９に記載の泳動バッファー。
【請求項２３】
請求項１６に記載の方法に使用するための泳動バッファー。
【請求項２４】
前記両性電解質または前記線状ポリアクリルアミドが、０．２５％〜０．５％の範囲で存在する、請求項２３に記載の泳動バッファー。
【請求項２５】
還元剤を、１ｍＭから１００ｍＭの間の量でさらに含む、請求項２３に記載の泳動バッファー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年５月３日に出願された「Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」と題する米国特許出願第１１／７４４，０６０号に対する優先権を主張し、米国特許出願第１１／７４４，０６０号は、その全体が参考として援用されることが許される。
【０００２】
本出願は、一般に、複合体サンプル中の生体分子、特に比較的低量で存在する生体分子を、迅速で再現可能な様式で分離する方法に使用するための、システム、キットおよびそれらの構成要素の分野に属する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト血漿は、バイオマーカーが豊富であるが、大部分のバイオマーカータンパク質は、現行の方法によって検出されない。この理由は、３０００を超える種々の血漿タンパク質が存在し、アルブミンなどの豊富なタンパク質が低量の疾患バイオマーカーを隠すことによって、検出できなくなるためである。バイオマーカーの発見を成功裏に行うには、質量分析による分析前に分画し、「プロテオミクス氷山の頂点の下を潜水する」ことが必要である。
【０００４】
生体分子の混合物の分離には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ならびに分子量、電荷およびｐＨによって分離するゲルを含むゲル電気泳動など、多くの産物が利用できる。等電点電気泳動は、分子がｐＨ勾配中または異なる別々のｐＨ中および電場中に置かれる場合に、分子が中性の電荷であるｐＨまで移動するように適用される。
【０００５】
電気泳動は、薄層クロマトグラフィーと同様に、プレートまたはスラブ上で従来通り行われている。イオン性バッファー溶液をプレート上に維持するためには、ある抗対流媒質（ａｎｔｉｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｕｍ）またはゲルが必要であるため、この方法はスラブゲル電気泳動と呼ばれている。ポリアクリルアミドまたはアガロースが、ゲル材料として通常使用される。電気泳動は、電荷に基づいて分離する。ゲルの細孔寸法が、分離されるべきバイオポリマーの寸法に匹敵する場合、サイズ分離またはサイズふるいも重要な適用例でありうる。ゲルマトリックスは電場中の物質の移動を妨害し、分離は分子のサイズに基づいており、最も小さいものが最も速く移動する。この原理がＤＮＡ分子の分離に不可欠である理由は、多孔性ゲルマトリックスがなければ、これらの種を電気泳動上で分離することができないためである。本方法の重要な適用はＤＮＡ配列決定であり、この方法で、オリゴヌクレオチド分子中の４つのヌクレオチド（アデニン、シチジン、グアニンおよびチミジン）の順序が決定されるはずである。したがって、本方法は、ヒトゲノムの配列決定に役立つ。タンパク質はまた、ゲルふるいによって電気泳動上で分離することができる。通常、タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの過剰の洗浄剤で変性されたり、過剰の洗浄剤と合わされる。得られたＳＤＳ−タンパク質複合体は、同じ電荷密度と形とを有し、それ故ゲルマトリックス中でサイズに従って分割される。この方法は、タンパク質を特徴付ける際、およびそれらの純度を評価する際に有用である。
【０００６】
サイズによる分離に加えて、タンパク質はまた、それらの総電荷に従って分離することができる。この原理に基づく特に有用な方法は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）である。溶液の所与のｐＨでは、特定のタンパク質は等しい正電荷および負電荷を有し、それ故電場中で移動しない。このｐＨ値は、等電点と呼ばれている。スラブゲル（またはカラム）は、バッファー（両性電解質として知られている）の複合混合物で満たすことができ、この混合物は、適用された場の影響下で、それぞれの等電点（「ｐＩ」）の位置に移動し、次いで固定された状態になる。ｐＨ勾配が確立されると、次いでタンパク質は、それぞれの等電点に集束することができる。電荷（ＩＥＦ）およびサイズ（ＳＤＳ−タンパク質複合体）分離は、二次元的なアプローチで組み合わせることができる。二次元ゲル電気泳動は、現在利用できる最も強力な分割方法の１つである。追加としてまたはその代わりとして、ｐＨによって分離されるタンパク質は、質量分析、トリプシン消化、他の種類のクロマトグラフィーおよび免疫分離によって、さらに分析されうる。
【０００７】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｅｓｔは、非常に接近したｐＩ差を有する極めて少量のサンプルの等電点電気泳動のためのシステムを開発している。その技術の基礎は、米国特許第７１６６２０２号に記載されている。タンパク質は、それらのｐＩで、ｐＨ制御されたゲルプラグ中に素早く捕捉される。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｅｓｔの平行分画技術プラットフォームは、タンパク質が捕捉されるようになるまで、タンパク質が平行に全ｐＨ範囲へ近づくことを可能にする点で、従来のＩＰＧ電気泳動とは異なる。電極チャンバー中に制御されたｐＨ領域を作製することによって、タンパク質はｄＰＣＴＭに向かって移動することを余儀なくされる。タンパク質が、そのｐＩで、またはそのｐＩに非常に近いゲルプラグに出会うと、タンパク質の移動が停止する。ゲルプラグ中の、それ自体のｐＩではないタンパク質は、短期間にｄＰＣＴＭを横断し、反対の電極チャンバーに入り、ｐＨ環境の変化によって電荷を変化させ、方向を変化させ、ｄＰＣＴＭに向かって再び移動する。混合物がｐＩトラップの各々に分離されるまで、タンパク質はｄＰＣＴＭを通って循環し続ける。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｅｓｔの技術プラットフォームは、非常に特異的であり、０．１ｐＨ単位未満しか離れていない画分中にタンパク質を分離することができる。ｄＰＣＴＭは、動的な分離プロセスに頼っている。
【０００８】
プロテオミクスは、それらの生理学的機能および病理生理学的機能を決定するためのタンパク質の同定である。サンプルは、質量分析などの別の方法による分析前に、分画されねばならない何千ものタンパク質を含む。プロテオミクスは、分析する必要があるサンプルを最高で２０００万個まで含むことができる。方法は、無傷のタンパク質およびペプチド断片を分離することができるはずである。次いで、これらは、質量分析によって特徴付けられ、その後タンパク質の同定、カタログ作成およびマッピングが行われる。このプロセスにおけるボトルネックはサンプル調製の段階であり、タンパク質の損失、分解能の低さおよび／または再現性の低さおよびスループットの低さが、プロセスを大いに制限している。バイオマーカーを発見するには、質量分析の前に、タンパク質のロード量を多くし、豊富なタンパク質の除去量を高め、低量のタンパク質の濃度を高くする必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それ故、本発明の目的は、続く分析用のサンプルの迅速で高スループット分離のための、改良された方法およびシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ｐＩゲルにおける著しくより高い収率およびより良好な分解能は、接近してステップを付けられた固定化ｐＨバッファーを含むゲルの２つ以上の層を有するトラップを作製することによって得られる。タンパク質は、それらが負に帯電されるｐＨから、それらが正に帯電されるアノードに向かって移動する。固定化ｐＨバッファーを含む別々の領域は、固定化バッファーのｐＨおよびタンパク質のｐＩがほぼ同じ場合に、タンパク質を捕捉する。第１層が第１ｐＨを含み、第２隣接層が接近してステップを付けられた固定化ｐＨバッファーを含む、例えば、第１層のｐＨ未満のｐＨ０．０５単位を有する多層領域を使用して、より高い収率が得られる。この第２層はトラップとして機能し、一方、第１層はタンパク質用のゲートとして機能する。捕捉されたタンパク質は、第２層内に捕捉され、第２層の表面上または界面上には捕捉されない。
【００１１】
より良好な分解能を有する著しくより高い収率は、等電点電気泳動前に、層化したサンプル適用ゲルを使用することによって得ることができることも発見されている。層化したプラグは、例えば、２ｐＨ単位を超える範囲に及ぶ固定化ｐＨバッファーの範囲を含み、０．０５または０．１ｐＨ単位のステップを有して調製される。例によって実証されているように、層化したプラグは、単離されるタンパク質の著しくより多くの検出可能量をもたらした。このことは、血漿もしくは血清、または細菌の細胞溶解物もしくは組織溶解物などの何百または何千もの成分を含む生体液を分離する上で、特に重要である。研究者が、発現の対照レベルと比較して、薬物もしくは薬物候補の投与後の発現レベル、または疾患もしくは障害の特徴を決定しようとしている場合の分離においても重要である。各プラグが異なるｐＨ増分を有する多層プラグのアレイも提供される。アレイは、１回の実行中に、異なる等電ｐＨを有する種々のタンパク質を単離および捕捉するために使用することができる。
【００１２】
別の実施形態は、少なくとも３層、すなわちゲート層、トラップ層および出口層を有するプラグを提供する。ゲート層は、片側でカソードチャンバーと接しており、反対側でトラップ層と接している。ゲート層は、トラップ層のｐＨよりも大きいｐＨを有する。通常、トラップ層のｐＨは、ゲート層のｐＨよりも約０．１から約０．０５低い。出口層は、片側でアノードチャンバーと接しており、反対側でトラップ層と接している。出口層は、トラップ層よりも大きいｐＨを有し、普通はｐＨ７．０をわずかに超え、約ｐＨ８．０までである。
【００１３】
低導電率バッファーが、高い場の強度で分解能を増加させるためには好ましい。ジチオトレイトール（「ＤＴＴ」）および／またはβメルカプトエタノールなどの還元剤を泳動バッファー（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）に加えると、分解能が高まり、導電率が減少し、これによって所要電流が減少し、熱の発生が制限されることが発見されている。少量の両性電解質をバッファーに加えると、泳動バッファーとゲルプラグの間のイオン枯渇領域が満たされ、分解能および収率がさらに改良される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】代表的な２層ｐＩトラップの概略図である。
【図２Ａ】ｐＩトラップとして機能する多層ｐＨ領域の構造物の概略図である。
【図２Ｂ】ｐＩトラップとして機能する多層ｐＨ領域の構造物の概略図である。
【図２Ｃ】ｐＩトラップとして機能する多層ｐＨ領域の構造物の概略図である。
【図２Ｄ】ｐＩトラップとして機能する多層ｐＨ領域の構造物の概略図である。
【図２Ｅ】ｐＩトラップとして機能する多層ｐＨ領域の構造物の概略図である。
【図３Ａ】ｄＰＣＴＭデバイスおよびシステムの概略図であり、単独でならびにアノードおよびカソードバッファーチャンバー間に挿入されているプロテオームチップを描く図である。
【図３Ｂ】ｄＰＣＴＭデバイスおよびシステムの概略図であり、チップ／アノードおよびカソードバッファーチャンバーアセンブリが中に挿入されている、泳動バッファーチャンバーを示す図である。
【図３Ｃ】ゲルを泳動するための直立型電気泳動装置を示す図である。
【図４】多層ｐＩトラップを用いて（図４Ａ）、および単一層を用いて（図４Ｂ）得られた分離を並列比較した図である。
【図５Ａ】ｄＰＣＴＭ等電点電気泳動およびＳＤＳ  ＰＡＧＥ４〜２０％ゲルの第２の次元による、ｐＨ４．２から６．２の間のＥ．ｃｏｌｉ溶解物分離のプロテオーム適用範囲を比較する写真であり、泳動バッファー中にｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓおよびＤＴＴを含まずに、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物を分離したものである。
【図５Ｂ】ｄＰＣＴＭ等電点電気泳動およびＳＤＳ  ＰＡＧＥ４〜２０％ゲルの第２の次元による、ｐＨ４．２から６．２の間のＥ．ｃｏｌｉ溶解物分離のプロテオーム適用範囲を比較する写真であり、泳動バッファー中に０．２５％ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓおよび４０ｍＭ  ＤＴＴを含めて、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物の分離を示す図である。
【図６】層化したプラグを用いて実行されたゲル（図５Ａ）と従来の単一ゲルプラグを用いて実行されたゲル（図５Ｂ）とを対比して、ゲル中の染色強度を比較する写真である。ｐＨ範囲は４．２から６．２（＋０．１０）×２層化したチップであった。２０マイクロリットルのＥ．ｃｏｌｉ細胞溶解物をカソードバッファーと１：１で混合し、続いてロードした。７Ｍ尿素／２Ｍチオ尿素；１．８％ＣＨＡＰＳ；１％ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００；０．２５％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ（２．５〜５）アノード／（５〜８）カソードを含む４０ｍＭ  ＤＴＴバッファー。３００Ｖに対し電圧ランプ６分での３０分の実行時間。４〜２０％の第２の次元のゲル。ＳＹＰＲＯ染色。１．５秒曝露。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｉ．等電点電気泳動システム
Ａ．層化したｐＩトラップ
多層化した等電点電気泳動（「ＩＥＦ」）タンパク質トラップを含む等電点電気泳動システムは、図１Ｄ〜１Ｅのシステム中に提供されている（図１Ａ〜１Ｃ）。好ましい実施形態では、ｐＩトラップは、隣接した２つ以上の層を使用して調製され、層は、層間のｐＨにおいて非常に小さい差の増分を有する固定化ｐＨバッファーを含む。ｐＩトラップは、「プラグ」とも呼ばれる。層は通常、ポリマーを架橋することによって形成される。適した層は、以下により十分に記載されるようなゲル層である。
【００１６】
層化したｐＩトラップ１０の図１を参照すると、タンパク質は最初に、カソードチャンバー２０に適用される。カソードチャンバー２０では電極が負であり、塩基性バッファーが加えられている。タンパク質は負に帯電するようになる。次いで、タンパク質は、正に帯電したアノードチャンバー２２に向かって移動する。ｐＩトラップまたはプラグ２４は、カソードとアノードとの間に位置する。カソードチャンバーに接触しているトラップのゲル層は、「ゲート」層２６と呼ばれる。トラップの第２層は、「捕捉」層２８と呼ばれ、片側でゲート層２６と接触し、反対側でアノードチャンバー２２と接触している。トラップは、規定された範囲内のｐＩを有するタンパク質を捕捉する（ｃａｐｔｕｒｅ）または捕捉する（ｔｒａｐ）ように設計されている。捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）領域は、２つの異なるｐＨ領域間の界面上の、プラグの中央領域内であり、プラグの外部表面上ではない。しかし、２層システムが対称であることに留意すべきである。したがって、タンパク質はアノードチャンバーからプラグを通ってカソードチャンバーに移動する間に捕捉されるようになりうる。
【００１７】
タンパク質は循環し、両方の方向がタンパク質を捕捉するために使用される。例えば、ｐＩトラップまたはプラグは、５．１５＜ｐＩ＜５．２０の範囲のｐＩを有するタンパク質を捕捉するように設計することができる。そのようなｐＩトラップであれば、５．２０のｐＨを有するゲート層と５．１５のｐＨを有する捕捉層（ｔｒａｐｐｉｎｇ  ｌａｙｅｒ）とを有する。５．２０またはこれを超えるｐＩを有するタンパク質であれば、ゲート層に入らない。５．２０未満のｐＩを有するタンパク質であれば、負に帯電しており、ゲート層を通り抜ける。タンパク質が５．１５未満のｐＩを有する場合、タンパク質は捕捉層を通り抜け、アノードチャンバーの中に出て行く。タンパク質が５．１５を超えるｐＩを有する場合、タンパク質はその電荷を変化させ、方向を逆にし、ゲート層に向かって動き、ゲート層で負に帯電するようになり、捕捉層に向かって戻り、これによってプラグの表面上ではなく、プラグ内に捕捉されるようになる。タンパク質がゲート層のｐＨに等しいｐＩを有する場合、タンパク質はゲート層の表面上またはゲート層の中に捕捉される。
【００１８】
ｐＩトラップは、従来の方法を使用して製造することができる。例えば、チップを製造するための基質に、穴をあけることができる。各穴の中に、第１層を注入することができ、完全にまたは部分的に重合させることができる。次いで、第２層は第１層の上部に注入されうる。一実施形態では、薄い中性の分離層が穴の中に注入され、重合させることができる。次いで、図２Ａ〜２Ｅに示されるように、活性層が中性分離層の上方および下方に注入される。
【００１９】
図２Ａを参照すると、第１層５０は、ｄＰＣＴＭ５４中のプラグ穴５２の中に注入される。１．１マイクロリットル分離層５０は、第１層（１０％グリセロールおよび５０％トレハロースを含む６％アクリルアミド）上に注入され、次いで、これは紫外線照射を使用して３０分間重合される。図２Ｂを参照すると、結果はプラグ穴５２の中央に中性分離ゲル層５０がある。
【００２０】
図２Ｃを参照すると、第２層５８は、分離ゲル層５０の上部に、ｐＨを制御するためのイモビリンバッファーを含む標準的なアクリルアミド−ビスアクリルアミド（ＡＢＭＳ）０．８マイクロリットルおよび光重合開始剤から成形される。これは紫外線照射を用いて３０分間重合される。図２Ｄは、この層５０を、反転したゲル５８の内部の固形ゲルとして示す。第２分離層５６は、わずかにシフトしたｐＨにｐＨを制御するためのイモビリンバッファーを含む標準的なアクリルアミド−ビスアクリルアミド（ＡＢＭＳ）０．８マイクロリットルおよび光重合開始剤から成形され、次いでこれは紫外光を使用して３０分間重合される。
【００２１】
完成したゲルを図２Ｅに示す。このゲルは、高収集効率および高分解能をもたらす。
【００２２】
一実施形態は、基質中に位置するタンパク質トラップのアレイを含むチップを提供する。タンパク質トラップ（「プラグ」とも呼ばれる）は各々において、異なるまたは同等でないｐＨ範囲を有するため、異なるｐＩを有するタンパク質は、異なるプラグ中に捕捉される。多くの異なるｐＨ範囲を含むプラグを有することによって、複数のタンパク質の混合物を、多くの異なる画分に分画することができる。図３Ａに示されるように、代表的なチップ１１０は、ｐＨ４．００からｐＨ６．００までの範囲に及ぶ４１個のプラグを有する。各プラグにおいて、２層間のｐＨの差は、約０．０５から０．５０ｐＨ単位であってよく、通常約０．０５から約０．１０ｐＨ単位でありうる。任意の数のプラグがチップ１１０上に含まれていてよい。チップ１１０は、サンプル中のすべてのタンパク質がチップのｐＨ範囲内に停止するようなｐＨ範囲を含むプラグを有するように設計されうる。チップ１１０は、アノードバッファーチャンバー１１４とカソードバッファーチャンバー１１２との間に置かれ、図３Ｂに示される泳動バッファーチャンバー中に挿入される。チップ１１０は、等電捕捉後取り外され、図３Ｃの第２の次元の泳動デバイス中に置かれる。
【００２３】
別の実施形態は、捕捉層とアノードバッファーとの間に位置する少なくとも１つの追加の層を有するプラグを提供する。この層は、「出口層」と呼ばれる。出口層は、捕捉層よりも大きいｐＨを有し、普通はｐＨ７．０を超えており、例えば約ｐＨ８．０である。出口層は加速装置として機能する。捕捉層のｐＨ未満のｐＩを有するタンパク質は、出口層に入り、より負に帯電するようになる。負電荷の増加は、タンパク質のアノードチャンバーへの移動を加速する。
【００２４】
別の実施形態では、チップは１つまたは複数の通過プラグを含む。通過プラグは、固定化ｐＨバッファーで架橋されたマトリックスの少なくとも単一の層を有する。通過プラグのｐＨは酸性であり、例えばｐＨ４．０未満、通常約ｐＨ３．３以下である。アノードチャンバーに入るタンパク質は、通過プラグを通り抜け、カソードに戻ることができる。一度タンパク質がカソードチャンバーに戻されると、タンパク質が、タンパク質のｐＩを包含するｐＨ範囲を有するプラグに捕捉されるようになるまで、タンパク質はその電荷を変化させ、別のプラグを通り抜ける。
【００２５】
コンピュータシミュレーションでは、ｐＩ５．１６およびｐＩ５．０４である２つのタンパク質は、現在、収集率８０％で明確に分離される。単一層領域を用いると、広がりが見られ、分解能が低く、収集率は３５％しかない。
【００２６】
別の実施形態は、異なる層に対して異なるマトリックス配合物を有するプラグを提供する。第１層の配合物はより重いことがあり、次の層はより軽いなどである。より軽い層は、より重い層の上に浮かび、より重い層と混合しない。そのような配合物は、当技術分野において知られている。例えば、Ｐ．  Ｇ  Ｒｉｇｈｅｔｔｉ、Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  （Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ）  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．（１９７６年）を参照のこと。層は次々と注入されうる。あるいは、例えば、グリセロールと混合された、スクロースまたはアクリルアミドを使用して、薄い境界層をｐＨ層間に取り付けることができる。別の実施形態では、分注針が、１回のストロークで分注されるすべての層で、予め満たされている。これは、層間の滑らかな通過領域を作製する。
【００２７】
Ｂ．ポリアクリルアミドゲル
等電点電気泳動は、すべての形態および形状のセル中、特にキャピラリー、スラブおよびチューブ中で行うことができる。キャピラリーにおいて、分離媒質は、ほとんどの場合バッファー溶液自体であるが、スラブセル、チューブセルおよびゲル充填キャピラリーにおいて、分離媒質は、バッファー溶液で平衡化および飽和されたゲルである。
【００２８】
ゲル基質
ゲル用の基質として機能する好ましい材料は、ガラスおよびプラスチックを含む。カセットまたはｄＰＣＴＭチップの支持プレートを形成するために使用されるプラスチック材料は、幅広い種類のプラスチックを含む。プラスチックは、一般に射出成形可能なプラスチックであり、プラスチックが、ゲル形成溶液、ゲル自体、カセット中で分析されるべきサンプル中の溶質（通常ではタンパク質）、緩衝剤およびサンプル中に通常存在する任意の他の成分に不活性である必要性によってのみ、選択は限定される。これらのプラスチックの例は、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリルポリマー、スチレン−アクリロニトリルコポリマー（ＳＡＮ、ＮＡＳ）、ＢＡＲＥＸ（登録商標）アクリロニトリルポリマー（Ｂａｒｅｘ  Ｒｅｓｉｎｓ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンテレフタレートグリコレート（ＰＥＴＧ）およびポリ（エチレンナフタレンジカルボキシレート）（ＰＥＮ）である。好ましいプラスチックには、ポリ塩化ビニル、アクリル、アクリロニトリルブタジエンスチレン（「ＡＢＳ」）およびスチレン−アクリロニトリルコポリマー（「ＳＡＮ」）が含まれるが、接着が弱いことがある。
【００２９】
モノマー溶液
電気泳動分離に適したゲルは、米国特許第６１９７１７３号（Ｋｉｒｐａｔｒｉｃｋ）に記載されている。ゲルは、変性されている可能性があり、または変性されていない可能性がある。ゲルは、種々の細孔サイズを有しうる。ゲルは、必要に応じて、尿素、洗浄剤および還元剤などの追加の成分を含むことができる。例えば、Ｍａｌｌｏｙら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８０巻：１〜１０頁（２０００年）を参照のこと。
【００３０】
ゲルは通常、ポリアクリルアミドから前成形される。ゲルは普通、ガラスまたはプラスチックの２枚のシート間に注入される。第１の次元および／または第２の次元に使用するためのゲルを作製するために、従来のアクリルアミド／ビス−アクリルアミド溶液またはアガロース溶液に加えて、種々のモノマーが使用されうる。ヒドロキシエチルメタクリレートおよび他の低分子量アクリレート型化合物が、モノマーとして一般的に含まれる。１つまたは複数のアクリレート型基で置換されたポリマーはまた、水とアルコールまたはアセトンなどの混和性有機溶媒との混合溶媒における分離に特に適しているとして、文献（ＺｅｗｅｒｔおよびＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１３巻：８２４〜８３１頁、（１９９２年））に記載されている。ゲル形成モノマーはまた、架橋を形成しうる材料と組み合わせた、光重合可能な反応基を含む実質的に水溶性の任意の分子でありうる。ただし、この組合せは、一度重合されると、特定の型の電気泳動に適したゲルを形成する。
【００３１】
例示的な材料には、メチレン−ビス−アクリルアミドまたは他の知られている架橋剤と組み合わせたアクリルアミド；ヒドロキシエチルメタクリレート（ｈｙｄｒｏｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）ならびにアクリル酸、メタクリル酸およびそのアルキル置換誘導体、例えばクロトン酸などの他の低分子量（約３００ダルトン未満）誘導体；ビニルピロリドンならびに他の低分子量のビニル化合物およびアリル化合物；非イオン性ポリマーのビニル誘導体、アリル誘導体、アクリル誘導体およびメタクリル誘導体（例えば、アガロース（「Ａｃｒｙｌａｉｄｅ」架橋剤、ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．）、デキストランおよび他の多糖類のそのような誘導体、ならびにヒドロキシエチルセルロースを含むセルロース誘導体などのそのような誘導体）；ポリビニルアルコール；エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシドおよびそれらのコポリマーのポリマーを含む、グリコールのモノマー誘導体、オリゴマー誘導体およびポリマー誘導体；他の水混和性ポリマーのアクリル誘導体、ビニル誘導体またはアリル誘導体、例えばポリＨＥＭＡ（ポリヒドロキシエチルアクリル酸）、ポリマーＮ−イソプロピルアクリルアミド（これは温度感受性である）、マレイン酸ポリマーおよびコポリマー、部分的に加水分解されたＥＶＡＣ（エチレンと酢酸ビニルとのポリマー）、エチレンイミン、ポリアミノ酸類、ポリヌクレオチド類、ならびにこれらのサブユニットの互いとの、およびより疎水性の化合物（例えば、ピリジン、ピロリドン、オキサゾリジン、スチレンおよびヒドロキシ酸）とのコポリマーが含まれる。重合可能な材料は、特に、溶媒または界面活性剤が、ゲル形成溶液中に含まれている場合には、完全に水溶性である必要はない。
【００３２】
ゲル形成溶液は、重合可能なモノマー混合物の水溶液であり、一般にフリーラジカル反応によってポリアクリルアミドを形成する。モノマー混合物は、使用されているもの、またはポリアクリルアミドゲルを形成する際の使用について文献に開示されているものを使用することができる。モノマー混合物は、通常、アクリルアミド、架橋剤およびフリーラジカル開始剤を含む。好ましい架橋剤は、ビスアクリルアミドであり、特に都合の良い架橋剤は、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミドである。ゲル形成溶液はまた、通常、フリーラジカル開始剤系を含む。使用される最も一般的な系は、過硫酸アンモニウムと組み合わせたＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）である。他の系は、当業者には明らかである。
【００３３】
電気泳動の使用および電気泳動ゲルの調製において、当業者の間では、ポリアクリルアミドゲルは、百分率として表されるパラメータＴおよびＣによって特徴付けられている。ＴおよびＣの値は、一般にポリアクリルアミドゲルを使用する際にそれらが変化するのと同様に変化しうる。Ｔ値の好ましい範囲は、約５％から約３０％であり、最も好ましくは約１０％から約２０％である。Ｃ値の好ましい範囲は、約１％から約１０％であり（アクリルアミドとビスアクリルアミドとの重量比が約１０：１から約１００：１の範囲に相当する）、最も好ましくは約２％から約４％である（アクリルアミドとビスアクリルアミドとの重量比が約２５：１から約５０：１の範囲に相当する）。
【００３４】
一般的なポリマーの重合可能な誘導体を作製する方法は、当技術分野において知られており、例えば、アリルグリシジルエーテルのヒドロキシル基への付加が知られており、これは、酸、酸無水物または塩化アシル、例えばアクリル酸無水物などを用いたヒドロキシルのエステル化と同様である。アミンは、アシル無水物または塩化アシルを用いて容易に誘導体化される。上記の誘導体化ポリマーの多くは、２つ以上の反応基を含むため、自己架橋している。１分子当たり平均して２つ以上の反応基を含む架橋剤の付加は、アクリルアミドなどの１つだけしか反応基を有さないモノマーからゲルを形成するのに必要である。これらには、多誘導体化ポリマーに加えて、メチレンビス−アクリルアミド、エチレングリコールジアクリレートおよびアクリル、ビニルまたはアリルなどのエチレン性不飽和官能基を２つ以上有する他の小分子が含まれる。
【００３５】
非アクリルアミドモノマーの候補には、例えば、アリルアルコール、ＨＥＭＡ（ヒドロキシエチル（メタ（ｍｅｔｈ））アクリレート）、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールモノアクリレート、エチレングリコールジアクリレート、ビニルカプロラクタム、ビニルピロリドン、アリルグリシジルデキストラン、ポリビニルアルコールのアリルグリシジル誘導体、ならびにセルロースおよび誘導体のアリルグリシジル誘導体、酢酸ビニルならびに１つまたは複数のアクリル基、ビニル基またはアリル基を含む他の分子を含むことができる。ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）およびＨＥＭＡなどの線状ポリマーのモノマー溶液への付加は、ゲル強度を増加するために使用される。
【００３６】
酸素捕捉剤：接着増強剤
プラスチックゲルカセット中に前注入されるポリアクリルアミドゲルの界面の不規則さは、ゲルが注入されるゲル形成溶液中に酸素捕捉剤を含有することによって、減少または除去することができる。溶液中のモノマー混合物は、溶液中に存在する捕捉剤を用いて重合され、その結果が、実質的に完全に均一な細孔サイズを有する前注入ゲルである。次いで、カセットにおけるバンド分解能は、ガラス封入物中のポリアクリルアミドゲルを用いて得ることができるバンド分解能に匹敵する。使用されうる酸素捕捉剤には、使用されている材料、または酸素捕捉剤が腐食を減らす目的のために含まれているボイラー操作のような適用中に、酸素捕捉剤としての使用について開示されている材料の多くが含まれる。これらの材料の例は、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、リグノ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素アンモニウム、ヒドロキノン、ジエチルヒドロキシエタノール、ジエチルヒドロキシル−アミン、メチルエチルケトオキシム、アスコルビン酸、エリソルビン酸およびエリソルビン酸ナトリウムである。特定の関心対象の酸素捕捉剤には、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、リグノ硫酸ナトリウムおよび亜硫酸水素アンモニウムが含まれる。例えば、Ｐａｎａｔｔｏｎｉによる米国特許第６８４６８８１号を参照のこと。最も好ましい実施形態では、酸素捕捉剤は、ピロ亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｏ５Ｓ２）である。
【００３７】
これらは、等電点電気泳動ゲルに限定されないが、一般に任意のポリアクリルアミドゲルに適用できる。空気中に存在し、ゲル溶液に溶解し、および／または基質の表面上に吸収される酸素は、アクリルアミド重合を抑制し、極端な場合には阻止しうる。そのような抑制は、結果として区域界面の不規則さをもたらす可能性があり、その場所では、重合が不完全であるかまたは重合が起こっていないので、ゲルが基質に接着しない。さらに、基質の表面上の酸素は、それが形成するポリマーが表面に接着することを妨げることがある。
【００３８】
ゲル形成溶液中に含まれる酸素捕捉剤の量は、幅広い範囲にわたって変化しうる。ある特定のプラスチックは、他のものに比べてより多量の酸素捕捉剤を必要とする。この理由は、プラスチック中に保持される酸素量が、異なるプラスチック間およびプラスチックが形成される様式間で変化するためである。酸素捕捉剤の最適量も、捕捉剤の選択によって変化しうる。しかし、一般に、最高の結果は、水性ゲル形成溶液中の酸素捕捉剤の濃度が、約１ｍＭから約３０ｍＭ、好ましくは約３ｍＭから約１５ｍＭの範囲内である場合に得られる。使用される酸素捕捉剤の量はまた、他の成分の最適量に影響を及ぼす。例えば、ある特定の酸素捕捉剤は、フリーラジカル反応に対して触媒活性を示し、次いで、そのような捕捉剤が存在する場合、より低い濃度のフリーラジカル開始剤が使用されうる。亜硫酸塩または亜硫酸水素塩が使用される場合、例えば、ＴＥＭＥＤおよび過硫酸アンモニウム（または他のフリーラジカル開始剤系）の濃度は、使用されない場合に比べて低い可能性がある。
【００３９】
Ｃ．バッファー
ＩＥＦバッファー
ＩＥＦバッファーは、所与のｐＨ値付近の緩衝能を有する成分（緩衝剤）またはｐＨ勾配を形成するために構成する成分（例えば、両性電解質、イモビリンまたは緩衝剤の組合せ）を含む。ＩＥＦバッファーは、生体分子のｐＩがＩＥＦバッファーのｐＨ範囲内でなければ、生体分子はＩＥＦバッファーを通過することができるように、液体、スラリーまたはゲルの形態である。ＩＥＦバッファーは、必要に応じて、尿素、洗浄剤および還元剤などの他の成分を含むことができる。例えば、Ｍａｌｌｏｙら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８０巻：１〜１０頁（２０００年）を参照のこと。ＩＥＦバッファーは、電場の影響下で、機能的に安定であることが望ましい。
【００４０】
ＩＥＦバッファーまたはＩＥＦバッファーを含むセルは、手動で、または種々のデバイスによって形成することができる。例えば、ＩＥＦバッファーは、基質の表面上または基質の溝もしくはチャネル中に沈着（例えば、コート、プリントまたはスポット）されうる。基質は、以下に記載されるようなマトリックス、またはこのマトリックスと同じ材料から作製されるビーズであってよい。ＩＥＦバッファーは、酸性溶液と塩基性溶液とを混合し、所望のｐＨ値を有するバッファーを形成するデバイス（「滴定装置」）によって作製されうる。バッファーは、モノマー（例えば、アクリルアミド）および重合剤と合わせられ、マトリックス上の所望の位置にＩＥＦバッファーを配する別のデバイス（「マトリックスプリンター」）に充填される。これらのデバイスは、自動化システムに取り込むことができる。
【００４１】
アンフォラインは、両性であり（すなわち、酸性媒質中で正に帯電され、塩基性媒質中で負に帯電される）、可溶性であり、約３００から最高で１０００までのＭｒ値を有する、一連の種々のオリゴアミノ酸および／またはオリゴカルボン酸である。両性電解質は、調製または購入することができる。例えば、いくつかの担体両性電解質が、当技術分野において知られている（例えば、３１〜５０頁、Ｒｉｇｈｅｔｔｉ，  Ｐ．  Ｇ．、（１９８３年）、Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ：  Ｔｈｅｏｒｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｔ．  Ｓ．  ＷｏｒｋおよびＲ．  Ｈ．  Ｂｕｒｄｏｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．  Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；米国特許第３４８５７３６号）。あるいは、購入される両性電解質には、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅｓ（ＬＫＢ）、Ｓｅｒｖａｌｙｔｓ（登録商標）（Ｓｅｒｖａ）、ＢｉｏｌｙｔｅｓまたはＰｈａｒｍａｌｙｔｅｓＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）が含まれる。
【００４２】
イモビリンは、一般式：ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒの非両性の二官能性アクリルアミド誘導体である。イモビリンは、調製または購入することができる。例えば、イモビリンを合成する方法は、当技術分野において知られている（Ｂｊｅｌｌｑｕｉｓｔら、（１９８３年）、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、６巻：３１７頁）。イモビリンは、アクリルアミドを用いて共重合して、ＩＰＧ（固定化ｐＨ勾配）を形成することができる。ＩＰＧは、当技術分野において知られている方法によって調製されうるか、または購入されうる。
【００４３】
ｐＨ勾配は、両性または非両性のバッファーを混合することによって形成することができる。例えば、そのようなバッファーおよび組合せは、Ａｌｌｅｎ，  Ｒ  Ｃら、Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｂｅｒｌｉｎ：  Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ  ＆  Ｃｏ．（１９８４年）；および米国特許第５４４７６１２号（Ｂｉｅｒ）に記載されている。ＩＥＦ緩衝剤は、５０ｍＭグリシン、１４ｍＭ  ＮａＯＨ；５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１２ｍＭ  ＮａＯＨ；５０ｍＭ  ＴＨＭＡ、４４．６ｍＭ  ＨＣｌ；５２ｍＭクエン酸、９６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４；５０ｍＭ  ＢＩＣＩＮＥ、１８ｍＭ  ＮａＯＨ；および５０ｍＭ  ＤＭＧＡ、４０ｍＭ  ＮａＯＨを含む。各セル中のＩＥＦバッファーによって作製されるｐＨ勾配は、狭いｐＨ範囲または広いｐＨ範囲（例えば、それぞれ、ｐＨ６．８〜ｐＨ７．８またはｐＨ６．８〜ｐＨ１２．８）を有することができる。
【００４４】
ＩＥＦバッファーは、極めて狭いｐＨ範囲、例えば、５．５０〜５．６０（０．１ｐＨ単位以下の差）または極端に狭いｐＨ範囲、例えば、５．５２〜５．５４（０．０２ｐＨ単位以下の差）を有することができる。このことが可能である理由は、ＩＥＦバッファーが、ある特定のｐＨ値に調整されている１つの緩衝剤であることができるためである。この場合において、ＩＥＦバッファーのｐＨ範囲は、緩衝剤が調整されたｐＨ値付近の緩衝剤の緩衝能と等しい。「間隔」という用語は、ＩＥＦバッファーによって作製されるｐＨ勾配内の、ｐＨ値の増分差を指す。「ステップ」という用語は、２つの異なるＩＥＦバッファー間のｐＨ値の増分差を指す。例えば、１つのセル内では、この間隔は、そのセルにおける全部のｐＨ範囲にわたって（例えば、そのセルにおけるｐＨ６．８、ｐＨ７．０、ｐＨ７．２など）、０．０２ｐＨ単位と小さいことがある。別の例では、セル番号１中のＩＥＦバッファーとセル番号２中のバッファーとの間のｐＨ「ステップ」は、０．１ｐＨ単位でありうる。例えば、セル番号１中のＩＥＦバッファーは、ｐＨ６．８で開始してｐＨ７．８で終了するｐＨ勾配を有することができ、セル番号２中のＩＥＦバッファーは、ｐＨ７．９で開始してｐＨ８．９で終了するｐＨ勾配を有することができる（すなわち、ｐＨ７．９−ｐＨ７．８）。「ｐＨ範囲」という用語は、ＩＥＦバッファーまたはＩＥＦバッファーを含むセル中で、最も高いｐＨ値から最も低いｐＨ値まで（例えば、ｐＨ７．９〜ｐＨ８．９）を指すか、またはＩＥＦバッファーまたはＩＥＦバッファーを含むセル中で、最も高いｐＨ値と最も低いｐＨ値との間の差（例えば、１．０ｐＨ単位）を指す。セル内の間隔は、均一または連続である必要はない。さらに、複数のセルうちの２つのセル間のｐＨステップは、均一である必要はない。
【００４５】
バッファーの例示的な種類には、以下のものが含まれる。
【００４６】
（１）１分子当たり少数の荷電基を有し、好ましくは比較的高分子量を有する緩衝剤。緩衝剤は、単一種または２種以上の組合せからなり、酸性および塩基性の両方の緩衝基をもたらすことがある。２種以上の混合物の場合には、上記言及の分子量範囲は、固有の分子量範囲を有する任意の単一種内のみならず、種間の重量を平均した分子量を指す。２０００未満の分子量を有する緩衝剤の例は、８．４４のｐＫａを有するＴＡＰＳと８．８のｐＫを有する２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールとの混合物である。約２０００およびこれを超える分子量を有する緩衝剤の例は、１分子当たり１から３個、好ましくは２個の荷電緩衝基を有する誘導体化ポリオキシエチレンである。誘導体化ポリオキシエチレンは、例えば、１分子当たり２個の塩基性緩衝基を含む１つ目のものと１分子当たり２個の酸性緩衝基を含む２つ目のものなどとを組み合わせて使用してよい。そのような組合せの一例は、それぞれ約９および５のｐＫ値を有する、ポリオキシエチレンビス（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）およびポリオキシエチレンビス（酢酸）の混合物である。
【００４７】
（２）等電点電気泳動によって狭いｐＨ範囲に分画される担体両性電解質。担体両性電解質は、電気泳動を使用する生化学者の間でよく知られており、等電点電気泳動に幅広く使用されている。「担体両性電解質」という用語は、それらの等電点で変化する分子の複合混合物を指す。等電点は、混合物中の分子間で十分な数の異なる等電点を有し、基本的に等電点の値の連続体を生み出す値の範囲に及ぶ。バッファーは、両性であるはずであり、しかるべき緩衝能を有し、電流を運ぶことができる。したがって、セルもしくは平板サンドイッチなどの容器、チューブまたはキャピラリーが、担体両性電解質の溶液で満たされ、電圧が、陽極液として酸を、陰極液として塩基を有する溶液を横切って印加される場合、個々の両性電解質分子は、電圧の方向に沿って、等電点が増加する順に、それ自体を配置する。
【００４８】
担体両性電解質は、合成物質から、または天然に存在する材料から形成することができる。種々の合成担体両性電解質が、実験室のために購入できる。例として、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎのＰＨＡＲＭＡＬＹＴＥＳ（登録商標）およびＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．のＢＩＯ−ＬＹＴＥＳ（登録商標）が挙げられる。天然に存在する物質に由来する担体両性電解質の例は、さまざまな種類のタンパク質加水分解物である。ＢＩＯ−ＬＹＴＥＳ（登録商標）は、アクリル酸を用いて誘導体化されたポリエチレンイミンであり、約２００またはこれを超える分子量を有する。等電点における変化は、出発するポリエチレンイミンの多数の異性体に起因し、その範囲は、単一の誘導体化反応で達成される。
【００４９】
担体両性電解質は、等電点に集束され、選択されるｐＨでの画分は、単離および回収される。分画および回収は、この目的のために設計された実験装置を使用して、分取用等電点電気泳動技術によって容易に行われる。分取用等電点電気泳動セルの例は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって製造されたＲＯＴＯＦＯＲ（登録商標）Ｃｅｌｌである。最良の結果を達成するために、分画は、できるだけ都合良く狭いｐＨ範囲を達成するような様式で行われることが好ましい。好ましい実施形態では、画分のｐＨ範囲は、最大でも約０．２ｐＨ単位の範囲であり、最も好ましい実施形態では、約０．１ｐＨ単位の範囲である。これらの好ましい実施形態では、ｐＨ範囲の中点は、約ｐＨ３から約ｐＨ１０までであり、最も好ましくは、約ｐＨ５から約ｐＨ９までである。
【００５０】
（３）低分子量緩衝両性電解質であって、それらの等電点において、等電点が両性電解質のｐＫ値の１つに値が接近しているもの。これらの両性電解質は、比較的低分子量化合物であり、好ましくは約５００以下の分子量を有し、塩の形に中和されているよりもむしろ、遊離の形の緩衝基を有する。両性電解質は、二酸化炭素を含まない脱イオン化水に溶解し、得られた溶液のｐＨは、その両性電解質の等電点に非常に接近している。それ故、その溶液の導電率は非常に低い。この記載を満たし、等電点にほぼ等しいｐＫ値をも有する両性電解質は、電気泳動用の泳動バッファーとして使用するのに十分な、実質的な緩衝能を有する。
【００５１】
これらの両性電解質は、３つ以上のｐＫ値を有し、そのうちの少なくとも１つが、その両性電解質の等電点から約１．０以内であることが好ましい。これらの値は、最高で７または８ｐＫ単位だけ相隔たっていることがあるか、またはそれらのうちの２つ以上は、値が非常に接近していることがある。これらの記載を満たす両性電解質の例は、リジン、アスパルチル−アスパラギン酸、グリシル−Ｌ−ヒスチジン、グリシル−アスパラギン酸、ヒドロキシリジン、グリシル−グリシル−Ｌ−ヒスチジン、Ｎ−シクロヘキシル−イミノ二酢酸、Ｎ−（１−カルボキシシクロヘキシＤ−イミノ二酢酸およびシクロブタン−１，２−ビス（Ｎ−イミノ二酢酸）である。
【００５２】
（４）酸性基および塩基性基が同じｐＫ値または非常に接近したｐＫ値を有する高分子量緩衝両性電解質。この型の好ましい両性電解質は、約２５００またはこれを超える分子量を有する誘導体化ポリマーである。ポリオキシエチレングリコールは、この目的のために効果的に使用することができるポリマーの例である。誘導体化は、例えば、ポリマーの一端をホウ酸またはホウ酸誘導体に、およびもう一端をアミノ誘導体にコンジュゲートさせることによって達成することができる。ホウ酸誘導体の例は、３−（アミノフェニル）ボロン酸であり、アミノ誘導体の例は、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールおよび２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールである。酸性基および塩基性基の実質的に等しいｐＫ値は、アミノ基残基のｐＫ値よりも幾分高いｐＫ値を有するホウ酸残基をもたらす様式で化合物を合成し、次いで、ソルビトールを加えることによって、ｐＨをアミノ基のｐＫ値に調整することによって達成することができる。
【００５３】
泳動バッファー
電気泳動は、低電気導電率の泳動バッファー中で行い得、しかも高分解能を達成することができる。低導電率のバッファーを用いると、電気泳動は高い場の強度で行うことができ、その上、従来のバッファーで出くわしていた困難をそれほど経験しない。低導電率のバッファーによって、分解能を失うことなく、キャピラリー電気泳動に通常使用されるレベルをかなり超えて、場の強度を増加させることができる。少なくとも部分的には、バッファー溶液は、ピーク分解能を実質的に失うことなく、キャピラリー電気泳動に使用される通常の電圧をかなり超えた電圧を使用してよいほど十分に低い導電率を特徴とする。どれほどの速さの分離が望まれているか、それ故どれほどの高さの電圧が必要かによって導電率は変化しうるが、ほとんどの場合、最良の結果は２５×１０−５ｏｈｍ−１ｃｍ−１以下の範囲の導電率で得られる。好ましい実施形態では、導電率は、約１×１０−５ｏｈｍ−１ｃｍ−１から約２０×１０−５ｏｈｍ−１ｃｍ−１の範囲内であり、特に好ましい実施形態では、導電率は、約２×１０−５ｏｈｍ−１ｃｍ−１から約１０×１０−５ｏｈｍ−１ｃｍ−１の範囲内である。スラブゲルの範囲の通常の電圧は、約３００ボルト／ｃｍ（電圧の方向の距離に沿って）である。キャピラリーについては、使用される電圧が他の形態よりも一般に高く、電圧は、キャピラリー長さ１ｃｍ以上当たり、約６００〜７５０ボルトの範囲であり、最高で約２０００ボルトまでである。Ｈｊｅｒｔｅｎらによる米国特許第５４６４５１７号も参照のこと。
【００５４】
ＩＩ．第２分離ゲル
複合混合物は、さらに分離することができる。等電点分離後に非常に一般的に行われていることは、それらの分子量に従って、分析物（ａｎａｌｙｔｅ）をさらに分離することである。これを成し遂げるために、当技術分野において、多くの技術が利用されている。説明に役立つ実例として、第１の次元からのゲルデバイスは、分析物に均一な電荷密度を付与するために、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのイオン性界面活性剤を用いて平衡化される。これらの分析物−界面活性剤複合体は、制限的なスラブゲルを通るそれらの電気泳動の移動を観察することによって、それらの分子量に従って分離される。従来の等電点電気泳動では、スラブポリアクリルアミドゲルに向かって移動するのが普通である。ｄＰＣＴＭデバイスの場合には、ｐＨの特徴が直線上に並ぶアレイに配置されるか、またはその代わりとして、ｄＰＣＴＭの各ｐＨの特徴との密な接触を保証するパターンに配置された非常に多数のカラムでありうるならば、第２の次元はスラブでありうる。ｄＰＣＴＭ配置の利点は、知られているｐＨの特徴が、第２の次元の分析上の場所と１対１の一致を保持されていることである。
【００５５】
二次元電気泳動分析を最も一般的に行う際には、第２の次元は分子量に基づいた分離からなる。これを成し遂げるために、第１の次元で分離される分析物は、均一な粒子電荷密度を付与する、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤と複合される。タンパク質分析物−界面活性剤複合体は、受動拡散によって、または第１の次元の分析ゲル中への界面活性剤の電気泳動移動によって形成される。タンパク質分析物の移動度におけるいずれの矛盾も軽減する、拡張されたスタッキングゲル領域を有することは有利である。当技術分野において知られているような任意のスタッキングゲル、例えば、限定されないが、低百分率のポリアクリルアミド（約６％未満）またはアガロース（約３％未満）などが、この目的のために使用されうる。スタッキングゲルは、０．５ｍｍ厚を超えなければならず、好ましくは１から３０ｍｍの間である。
【００５６】
他の種類のデバイスは、キャピラリー電気泳動、液体クロマトグラフィー、膜移動、ウェスタンブロッティングまたは直接質量分析法デバイスを含む第２の次元に使用されてよく、この場合、第１の次元はマトリックスであり、第２の次元または質量分析は、プラグがすべて整列するように位置される。
【００５７】
迅速なサンプルスクリーニングのために、ｄＰＣＴＭは、図３Ｃに示されるような従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥフォーマットで実行されうる。ｄＰＣＴＭゲルプラグは、硬質プラスチック枠の中にあるため、ｄＰＣＴＭをスラブゲル上に移動させ整列させることは容易である。ｄＰＣＴＭ分画後の２Ｄゲル画像は、従来の２Ｄ電気泳動とは異なる。これは、ｐＩ情報が別々のｐＨゲル領域から提示されるためである。
【００５８】
第１の次元と第２の次元との間の接触の均一性および分析物移動をさらに保証するために、分析物流れに制限されず、第１の次元と第２の次元との間のいずれのギャップも埋める働きをする導電性の流体媒質を提供することは有利である。第２の次元の泳動バッファーは、当技術分野において知られている。一実施形態では、スタッキングゲルは、第１の次元と第２の次元との間の場所に、接触して注入される。あるいは、流動可能なゲル、例えば、限定されないが、線状ポリアクリルアミド、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、セルロースエーテル、キサンタン、非荷電性多糖またはポリオールまたはそれらの混合物を利用することができる。ゲルは、容易な適用のために、外見上十分に低い粘度を有していなければならないが、第２の次元の分析の期間内に、ゲルが流れ出ないような、十分に高い粘度を有していなければならない。
【００５９】
第１の次元と第２の次元との間に使用される接触媒質はいずれも、追加の成分を含んでもよく、これには、分析物の電気泳動の移動を助けるバッファーなど、および／または電気泳動の進行を可視化するのに役立つブロモフェノールブルーなどの染料などが挙げられる。
【００６０】
ＩＩＩ．ＩＥＦ−第２分離システム
第１の次元のｐＩに基づいた分離は、タンパク質複合混合物の分析において、一般的に行われている。これを成し遂げるために、一般に、可溶性タンパク質は、ｐＨ勾配の存在下で電場中で移動することを余儀なくされる。タンパク質分析物は、それらのｐＩ未満のｐＨ値で明らかな正電荷を獲得し、カソードに向かって移動するが、それらのｐＩを超えるｐＨ値ではその逆が真である。ｐＨ勾配は、最も低いｐＨ値がデバイスのアノード端の方に、最も高いｐＨ値がカソードの方にあるように配置される。タンパク質が移動を停止するのは、タンパク質の電気泳動の移動度がゼロであるｐＨ、すなわちそれらのｐＩに、タンパク質が達した時である。タンパク質は、本来の状態で、あるいは尿素もしくはチオ尿素または他の一般的に使用される変性剤のような物質を使用して変性された状態で、分析することができる。ｐＨ勾配は、一般的に、担体両性電解質として当技術分野において知られている両性バッファーの混合物の電場中におけるｐＨ順序付けによって、または固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）として知られているポリアクリルアミドゲルの構造内の酸部分と塩基部分の勾配の共重合によって確立される。
【００６１】
ＺｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎおよびＢｕｋｓｈｐａｎによる米国特許公開第７１６６２０２号は、ｄｉｇｉｔａｌ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｃｈｉｐまたはｄＰＣＴＭと呼ばれる別々のｐＨ捕捉デバイスを開示している。ｄＰＣＴＭにおいて、多数の別々のｐＨの特徴を含むアレイは、酸性アノードバッファーチャンバーと塩基性カソードバッファーチャンバーとの間の透過可能な仕切りとして機能する。アノードチャンバーにおいて、自身のｐＩ未満のタンパク質は正味の正電荷を示し、そのｐＩ未満のタンパク質を維持するｐＨの特徴を通って、カソードに向かって移動する。反対に、カソードチャンバーにおいて、そのｐＩを超えるタンパク質は正味の負電荷を示し、そのｐＩを超えるタンパク質を維持するｐＨの特徴を通って、アノードに向かって移動する。タンパク質は、それらのｐＩに最も近いｐＨの特徴に蓄積する傾向があり、そこでは、タンパク質の正味の移動がｐＩでゼロであるか、またはｐＩ近くで非常に遅い。ｄＰＣＴＭの利点は、担体両性電解質中またはＩＰＧ系中で行われているように、知られている終点から推定されることによってよりもむしろ、その別々の性質によって、任意の特定の特徴のｐＨがその配合物に応じて知られていることである。ｄＰＣＴＭシステムの特徴は、分析物の電気泳動の移動が、ｐＨ勾配に対して連続ではなく、ランダムであることである。
【００６２】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｅｓｔのｄｉｇｉｔａｌ  ＰｒｏｔｅｏｍｅＣｈｉｐＴＭ（ｄＰＣＴＭ）は、複合タンパク質混合物をそれらの等電点に従って分画する。ｄＰＣＴＭは、最高で２．２ｍｇまでのタンパク質を含む１５００μＬまでのサンプル体積を取り扱う。全分離プロセスを３０分で終えることができる。サンプルを泳動バッファーに直接加えるため、再水和処置の必要がない。ｐＨバッファーが０．１ｐＨ単位未満しか離れていないため、分画の分解能が非常に高い。別々のｐＨの特徴は、ｐＩ情報を保証する。このシステムはまた、混じり気のないタンパク質またはタンパク質混合物、ヒト細胞溶解物、細菌細胞溶解物、組織溶解物、血漿および血清を含む、すべてのサンプルの種類に適合する。結果として、ｄＰＣＴＭは、研究者らに、インタクト質量、アミノ酸配列決定、免疫ブロット法、サイズ分離またはトリプシン消化質量分析などの複雑な分析前に、それらのサンプルを強化するための、速い、使い易いおよび再生可能なツールを提供する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞溶解物６０μｇおよびｈＧＨ  １３５ｎｇの分離は、単一プラグでは８％（１３ｎｇ）を得、ｐＩプラグ中には１５〜２０％の捕捉されたタンパク質を得、カソードバッファー中に１５〜２０％、アノードバッファー中に３０〜４０％を得る。
【００６３】
図３Ｂは、縦に泳動するスラブゲルの移動デバイス１２０を描いている。移動デバイスは、ｄＰＣＴＭ１１０などの第１の次元の分析ゲルを設置する能力および第１の次元が定位置にしっかりと保持される機構を有する。図３Ｂにおいて、ｄＰＣＴＭ１１０は、トランスファーカラー１０８上の凹んだ場所にそれを置くことによって設置される。図３Ｂに描かれているデバイスの通常の利用では、分子量を分離するスラブゲルを含む第２の次元のカセット１２２は、移動デバイス１０の上部の止め具に接触して位置し、定位置に固定される。第２の次元の１２２は、スタッキングゲルが本来の場所に注入できるように、上記のような拡張されたスタッキングゲル領域またはギャップを有して成形される。
【００６４】
第１の次元の分析ゲル１１は、液体を介して、第２の次元のスラブゲル１２２の開口部と電気通信状態であるように、すなわち、流動可能な接触媒質または本来の場所に注入されたスタッキングゲルのいずれかを通じて、ｄＰＣＴＭ１１０と第２の次元のゲル１２２との間に完全な接触があるように、ポジショニングデバイスに置かれる。移動デバイスは、最低限の外側の開口部を用いて設計されているため、第２の次元の電気泳動分離中、電場は第１の次元の分析ゲルの周りを通り過ぎるのではなく、実質的に貫通する。第１の次元の分析ゲルのアセンブリ、トランスファーカラーおよび第２の次元のスラブは、図３Ｃに示されている適した電気泳動槽１２４中で、当技術分野において知られている様式で実行される。
【００６５】
迅速なサンプルスクリーニングのために、ｄＰＣＴＭは、従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥフォーマット中で実行されうる。ｄＰＣＴＭゲルプラグは、硬質プラスチック枠の中にあるため、ｄＰＣＴＭをスラブゲル上に移動させ整列させることは容易である。
【００６６】
分画されたタンパク質は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦｏｒｅｓｔのｄＰＣＴＭＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅｒ中の液相に移すことができる。電気溶出器はｄＰＣＴＭと同じアレイフォーマットであるため、全ｄＰＣＴＭが直ちに処理できる。受け取りチャンバー、約１０μＬは、不必要な希釈を行うことなく、液相にタンパク質を回収する。迅速な分画は、３０分以下で起こりうる。これは、分析時間を８０％縮小する。サンプルを泳動バッファーに直接加えるため、再水和処置の必要がない。
【００６７】
本発明は、以下の限定されない実施例を参照することによって、さらに理解される。
【実施例】
【００６８】
（実施例１）
トラップなし０に対する０．１ステップｐＩトラップを使用した回収の比較
ｄＰＣＴＭ製造。４１個の１ｍｍ×２ｍｍ穴を有する未完成のガラスを、ガラスがポリマーに確実に接着するために、シランで処理した。アクリルアミドバッファーを混合することによって、ｐＨ４．２から６．２の範囲の間で、０．１ｐＨステップの、ｐＨのアレイを作製した。ｐＨ４．２〜６．２の範囲を、チップ中で２回繰り返す。イモビリンバッファーの最終濃度は、１２〜３０ｍＭの間で、６％Ｃ、８％Ｔである。自動分注器（ｒｏｂｏｔｉｃ  ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ）を使用して、２．２ｕｌのアクリルアミドバッファー溶液を各穴に分注した後、ＵＶ光重合を、メチレンブルー／ＤＰＩＣ／ＳＴＳ系で８分間行った。４．２０、４．３０、４．４０から６．２０までの範囲に及ぶ２０個のプラグは、最初の２０個のプラグの中に入れ、次いで、次の２０個のプラグに関して繰り返した。２つのｐＨ層化したチップを作製するために、０．２ｕｌのアクリルアミドバッファーｐｋ３．６をゲルプラグの片側に加えた後、追加の光重合を２２分間行った。追加のアクリルアミドバッファーを単一層プラグには加えなかった。重合後、チップを洗浄し、２０％グリセロール中、中性のｐＨで保存した。
【００６９】
ｄＰＣＴＭ泳動。サンプルを以下のように前処理する。すなわち、２０μｌ／３０μｇのＥ．ｃｏｌｉ細胞溶解物をＴＢＰによって還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、次いで５０ｍＭリン酸ＮａバッファーｐＨ７．４中で保存する。次いで、サンプルを２０μｌの変性バッファー（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、１．８％ＣＨＡＰＳ、１％ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００  ４０ｍＭ  ＤＴＴ）に加え、１０分間インキュベートする。サンプルを、０．２５％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ５〜８を含む追加の変性バッファー７１０μｌを有するカソードチャンバーに加える。アノードバッファーは、変性バッファー７５０μｌおよび０．２５％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ２．５〜５である。電圧ランプは、６分間に０〜３００ボルトであり、その後追加の２４分の泳動時間がある。温度は、冷却ブロックを通して１０℃に維持し、全システムを相互振盪によって穏やかに混合する。
【００７０】
ｄＰＣＴＭＳＤＳ  ＰＡＧＥ。ｄＰＣＴＭチップを、ＳＤＳバッファー中で１０分間前インキュベートし、第２の次元の４〜２０％ゲルＳＤＳ  ＰＡＧＥに、そのカラーを介して結合させる。従来の装置上、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー系、３５〜１００ｍＡ／ゲルを使用して、第２の次元を実行する。製品使用説明書に従って、ゲルをＳＹＰＲＯルビー染料で一晩染色する。
【００７１】
図４Ａおよび４Ｂによって実証されているように、トラップを使用すると、トラップがない場合の同ゲルと比較して、分離されるサンプルの量が２倍になる。
【００７２】
（実施例２）
泳動バッファー中にｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓを使用した回収の比較
ｄＰＣＴＭ製造：ｄＰＣＴＭチップを実施例１と同様に製造した。ただし、第２ｐＨ層を適用せず、ｐＨ範囲はｐＨ４．２〜６．２であり、ステップは０．０５ｐＨであった。サンプルを、実施例１と同様に、アノード中に０．２５％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ  ｐＨ２．５〜５を、およびカソード中に０．２５％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓ  ｐＨ５〜８を含むかまたは含まずに前処理し、実行した。ｄＰＣＴＭで分離したタンパク質を、先に記載のように第２の次元のゲルに移し、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ染色した。
【００７３】
図５Ａおよび５Ｂは、ｄＰＣＴＭ等電点電気泳動およびＳＤＳ  ＰＡＧＥ４〜２０％ゲルの第２の次元による、ｐＨ４．２から６．２の間のＥ．ｃｏｌｉ溶解物分離のプロテオーム適用範囲を比較する写真である。図６Ａは、泳動バッファー中にｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓおよびＤＴＴを含まない、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物の分離である。図６Ｂは、泳動バッファー中に０．２５％ｐｈａｒｍａｌｙｔｅｓおよび４０ｍＭ  ＤＴＴを含めた、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物の分離を示す。この比較は、泳動バッファーにＰｈａｒｍａｌｙｔｅｓを加えることによって、より高いタンパク質収率とより高い分解能とが得られることを、明らかに示している。
【００７４】
（実施例３）
バッファーに加えた両性電解質を有する０．１ステップｐＩトラップを使用した回収とトラップなしの回収との比較
ｄＰＣＴＭを、実施例１と同様に製造および実行した。サンプルは、還元およびアルキル化した［１２５Ｉ］−オボアルブミンを、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物３０μｇに添加したものであった。等電捕捉後、個々のゲルプラグをガラスチップから押し出し、１００μｌのＳＯＬＶＡＢＬＥＴＭＰａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ中に入れ、室温で一晩保存した。１０μｌを３００ｕｌのＵＬＴＩＭＡＧＯＬＤＴＭ液体シンチレーションカクテルに加えた後、等電［１２５Ｉ］−オボアルブミンの放射能計数を行った。
【００７５】
図６Ａおよび６Ｂによって示されているように、捕捉収集率は、ｐＩ０．１ステップトラップを用いて７０％増加した。
【００７６】
（実施例４）
還元剤を用いる泳動中の電流の比較
ｄＰＣＴＭを、実施例１と同様に製造および実行した。実行したサンプルは、還元およびアルキル化したＥ．ｃｏｌｉ溶解物３０ｕｇであった。泳動バッファーは、還元剤を加えたことを除いては、実施例１に記載した通りであった。還元剤の濃度および測定された電流（ｍＡ）は、還元剤０では３．９ｍＡ、４ｍＭ  ＤＴＴでは３．６８ｍＡ、４０ｍＭ  ＤＴＴでは２．４６ｍＡおよび８０ｍＭβメルカプトエタノールでは２．０８ｍＡであった。還元剤を加えると、収集効率および分解能も改善された。
【００７７】
本発明の変更例および改変例は、当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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