(57)【要約】  ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害または増強する方法であって、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示される自己ペプチドとの間の結合をそれぞれ阻害または増強する薬剤と接触させることを含んでなり、それにより抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害または増強する方法が提供される。（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示される自己ペプチドとの間の結合をそれぞれ阻害または増強／活性化する薬剤を含んでなる組成物およびそのような薬剤を同定するための分析が提供される。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を増強する方法であって、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を増強する薬剤と接触させることを含んでなり、それにより抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を増強する方法。
【請求項２】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タイプＢ自己ペプチドは、配列番号１５に示す配列を有するモノマーである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤は、樹状細胞に由来する、タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソームである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤は、樹状細胞に由来する、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソームである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤は、ＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質またはＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞により抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を増強する方法であって、Ｑａ−１＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）Ｑａ−１＋Ｔ細胞の表面上にＱａ−１により提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を増強する薬剤と接触させることを含んでなり、それにより抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を増強する方法。
【請求項１１】
前記Ｑａ−１＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／Ｑａ−１＋Ｔ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｑａ−１＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／Ｑａ−１＋Ｔ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記タイプＢ自己ペプチドはモノマーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤は、樹状細胞に由来する、タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＱａ−１を有するエキソソームである請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤は、樹状細胞に由来する、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＱａ−１を有するエキソソームである請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記薬剤はＱａ−１／ＩｇＧ融合タンパク質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
ヒト患者において、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を増強する方法であって、（i）ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を増強する薬剤の有効量を患者に投与することを含んでなり、それにより患者において抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を増強する方法。
【請求項２１】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記タイプＢ自己ペプチドは、配列番号１５に示す配列を有するモノマーである請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤は、（i）樹状細胞に由来する、タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソームであるか、または（ii）タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有する膜結合性組成物である請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記薬剤は、（i）樹状細胞に由来する、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソームであるか、または（ii）Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有する膜結合性組成物である請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記薬剤は、ＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質またはＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーである請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記薬剤は、静脈内投与、筋肉内投与または経口投与される請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
非ヒト患者において、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞により抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を増強する方法であって、（i）Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）Ｑａ−１＋Ｔ細胞の表面上にＱａ−１により提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を増強する薬剤の有効量を患者に投与することを含んでなり、それにより患者において抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を増強する方法。
【請求項３２】
前記Ｑａ−１＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／Ｑａ−１＋Ｔ細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｑａ−１＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／Ｑａ−１＋Ｔ細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記タイプＢ自己ペプチドはモノマーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記薬剤は、（i）樹状細胞に由来する、タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＱａ−１を有するエキソソームであるか、または（ii）タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＱａ−１を有する膜結合性組成物である請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記薬剤は、（i）樹状細胞に由来する、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＱａ−１を有するエキソソームであるか、または（ii）Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＱａ−１を有する膜結合性組成物である請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項３４または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記薬剤は、静脈内投与、筋肉内投与または経口投与される請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
自己免疫疾患、移植片拒絶および細菌感染からなる群より選択される障害に苦しむヒト患者を治療する方法であって、（i）ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を増強する薬剤の治療的有効量を患者に投与することを含んでなり、それにより患者を治療する方法。
【請求項４１】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記タイプＢ自己ペプチドはモノマーである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症および１型糖尿病からなる群より選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記薬剤は、（i）樹状細胞に由来する、タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソームであるか、または（ii）タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有する膜結合性組成物である請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記薬剤は、（i）樹状細胞に由来する、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソームであるか、または（ii）Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有する膜結合性組成物である請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項４３または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記薬剤はＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記薬剤はＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーである請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記薬剤は、静脈内投与、筋肉内投与または経口投与される請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
自己免疫疾患、移植片拒絶および細菌感染からなる群より選択される障害の発症をヒト患者において阻害する方法であって、（i）ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を増強する薬剤の予防的有効量を患者に投与することを含んでなり、それにより患者を治療する方法。
【請求項５３】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、１型糖尿病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳疾患、自己免疫リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労症候群免疫欠乏症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱脊髄性多発性神経障害、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素疾患、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、ドゴー病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、本態性混合性クリオグロブリン血症、繊維筋痛−筋炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺繊維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩＧＡネフロパシー、若年性関節炎、ループス、メニエール病、混合性結合組織病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、潰瘍性結腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、またはウェゲネル肉芽腫症である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記薬剤は、（i）樹状細胞に由来する、タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソームであるか、または（ii）タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有する膜結合性組成物である請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記薬剤は、（i）樹状細胞に由来する、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソームであるか、または（ii）Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有する膜結合性組成物である請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記薬剤はＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質である、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
前記薬剤はＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーである請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記薬剤は、静脈内投与、筋肉内投与または経口投与される請求項５２に記載の方法。
【請求項６２】
樹状細胞に由来し、自己ペプチドが負荷されたＱａ−１を有するエキソソーム。
【請求項６３】
前記エキソソームにはタイプＢ自己ペプチドが負荷されている、請求項６２に記載のエキソソーム。
【請求項６４】
前記エキソソームは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドが負荷されている請求項６２に記載のエキソソーム。
【請求項６５】
樹状細胞に由来し、自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソーム。
【請求項６６】
前記エキソソームにはタイプＢ自己ペプチドが負荷されている、請求項６５に記載のエキソソーム。
【請求項６７】
前記エキソソームは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドが負荷されている請求項６５に記載のエキソソーム。
【請求項６８】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続するアミノ酸を含んでなる請求項６４または６７に記載のエキソソーム。
【請求項６９】
Ｑａ−１を有し、タイプＢ自己ペプチドを含んでなる膜結合性組成物。
【請求項７０】
前記タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
ＨＬＡ−Ｅを有し、タイプＢ自己ペプチドを含んでなる膜結合性組成物。
【請求項７２】
前記タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する方法であって、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を阻害する薬剤と接触させることを含んでなり、それにより抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害することを含んでなる方法。
【請求項７４】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記タイプＢ自己ペプチドは、熱ショックタンパク質６０（Ｈｓｐ６０ｓｐペプチド）のリーダー配列である請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記薬剤は、タイプＢ自己ペプチドおよびＨＬＡ−Ｅを含んでなる複合体に特異的に結合する抗体である請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
前記薬剤は、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドおよびＨＬＡ−Ｅを含んでなる複合体に特異的に結合する抗体である請求項７３に記載の方法。
【請求項８０】
Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞により抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する方法であって、Ｑａ−１＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）Ｑａ−１＋Ｔ細胞の表面上にＱａ−１により提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を阻害する薬剤と接触させることを含んでなり、それにより抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する方法。
【請求項８１】
前記Ｑａ−１＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／Ｑａ−１＋Ｔ細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記Ｑａ−１＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／Ｑａ−１＋Ｔ細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記薬剤は、タイプＢ自己ペプチドおよびＱａ−１を含んでなる複合体に特異的に結合する抗体である請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
前記薬剤は、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドおよびＱａ−１を含んでなる複合体に特異的に結合する抗体である請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
ヒト患者において、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する方法であって、（i）ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を阻害する薬剤の有効量を患者に投与することを含んでなり、それにより患者において抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する方法。
【請求項８７】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記薬剤は、タイプＢ自己ペプチドおよびＨＬＡ−Ｅを含んでなる複合体に特異的に結合する抗体である請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
前記薬剤は、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドおよびＨＬＡ−Ｅを含んでなる複合体に特異的に結合する抗体である請求項８６に記載の方法。
【請求項９３】
前記薬剤は、静脈内投与、筋肉内投与または経口投与される請求項８６に記載の方法。
【請求項９４】
過剰なＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される免疫抑制により特徴付けられる障害に苦しむヒト患者を治療する方法であって、（i）ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を阻害する薬剤の治療的有効量を患者に投与することを含んでなり、それにより患者を治療する方法。
【請求項９５】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記薬剤は、タイプＢ自己ペプチドおよびＨＬＡ−Ｅを含んでなる複合体に特異的に結合する抗体である請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
前記薬剤は、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドおよびＨＬＡ−Ｅを含んでなる複合体に特異的に結合する抗体である請求項９４に記載の方法。
【請求項１００】
前記患者はＡＩＤＳに苦しんでいる、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０１】
前記患者は腫瘍に苦しんでいる、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０２】
前記患者は、腫瘍ワクチンまたは自己Ｔ細胞治療により以前に治療を受けている請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記薬剤は、静脈内投与、筋肉内投与または経口投与される請求項９４に記載の方法。
【請求項１０４】
タイプＢ自己ペプチドおよびＱａ−１を含んでなる複合体に特異的に結合する単離抗体。
【請求項１０５】
前記タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである、請求項１０４に記載の抗体。
【請求項１０６】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項１０５に記載の抗体。
【請求項１０７】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１０４に記載の抗体。
【請求項１０８】
タイプＢ自己ペプチドおよびＨＬＡ−Ｅを含んでなる複合体に特異的に結合する単離抗体。
【請求項１０９】
前記タイプＢペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである請求項１０８に記載の抗体。
【請求項１１０】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項１０９に記載の抗体。
【請求項１１１】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１０８に記載の抗体。
【請求項１１２】
膜結合性または脂質可溶性のＨＬＡ−Ｅおよびそれに結合するタイプＢ自己ペプチドから本質的になる組成物。
【請求項１１３】
前記タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである請求項１１２に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項１１３に記載の組成物。
【請求項１１５】
（i）膜結合性または脂質可溶性のＨＬＡ−Ｅおよびそれに結合するタイプＢ自己ペプチド、ならびに（ii）薬学的に許容可能なキャリアから本質的になる組成物。
【請求項１１６】
膜結合性または脂質可溶性のＱａ−１およびそれに結合するタイプＢ自己ペプチドから本質的になる組成物。
【請求項１１７】
前記タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項１１７に記載の組成物。
【請求項１１９】
本質的に、（i）膜結合性または脂質可溶性のＱａ−１およびそれに結合する自己ペプチド、ならびに（ii）薬学的に許容可能なキャリアからなる組成物。
【請求項１２０】
薬学的に許容可能なキャリアおよびＱａ−１により提示されるタイプＢ自己ペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる組成物。
【請求項１２１】
前記タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである請求項１２０に記載の組成物。
【請求項１２２】
薬学的に許容可能なキャリアおよびＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる組成物。
【請求項１２３】
前記タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２４】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項１２３に記載の組成物。
【請求項１２５】
請求項６４または請求項６７に記載のエキソソームおよび薬学的に許容可能なキャリアを含んでなる組成物。
【請求項１２６】
請求項６９または７１に記載の膜結合性組成物および薬学的に許容可能なキャリアを含んでなる組成物。
【請求項１２７】
ＣＤ８＋Ｔ細胞がＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞であるかどうかを決定する方法であって、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＱａ−１により提示されるタイプＢ自己ペプチドと接触させることと、ＣＤ８＋Ｔ細胞とタイプＢ自己ペプチドとの間に結合が生じるかを決定することを含んでなり、結合することはＣＤ８＋Ｔ細胞がＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞であることを示す方法。
【請求項１２８】
前記タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記タイプＢ自己ペプチドは、（i）樹状細胞に由来し、Ｑａ−１を有するエキソソーム、または（ii）Ｑａ−１を有する膜結合性組成物上に存在するＱａ−１により提示される請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞がＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞であるかどうかを決定する方法であって、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドと接触させることと、ＣＤ８＋Ｔ細胞とタイプＢ自己ペプチドとの間に結合が生じるかを決定することを含んでなり、結合することはＣＤ８＋Ｔ細胞がＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞であることを示す方法。
【請求項１３２】
前記タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記タイプＢ自己ペプチドは、（i）樹状細胞に由来し、ＨＬＡ−Ｅを有するエキソソーム、または（ii）ＨＬＡ−Ｅを有する膜結合性組成物上に存在するＨＬＡ−Ｅにより提示される請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３５】
Ｔ細胞含有サンプル中に存在するＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する方法であって：
（ａ）タイプＢ自己ペプチドがサンプル中のＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞と結合することが可能な条件下で、サンプルを固定化されたＱａ−１に提示されるタイプＢ自己ペプチドと接触させる工程と；
（ｂ）非結合性のＴ細胞を除去する工程と；
（ｃ）固定化されたタイプＢ自己ペプチドから結合性のＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離する工程と
を含んでなり、それによりサンプルからＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する方法。
【請求項１３６】
前記タイプＢ自己ペプチドは、配列番号２に示す熱ショックタンパク質６０のシグナルペプチドを含んでなる請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
Ｔ細胞含有サンプル中に存在するＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する方法であって：
（ａ）タイプＢ自己ペプチドがサンプル中のＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞と結合することが可能な条件下で、サンプルを固定化されたＨＬＡ−Ｅに提示されるタイプＢ自己ペプチドと接触させる工程と；
（ｂ）非結合性のＴ細胞を除去する工程と；
（ｃ）固定化されたタイプＢ自己ペプチドから結合性のＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離する工程により、
サンプルからＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することを含んでなる方法。
【請求項１３８】
前記タイプＢ自己ペプチドは、配列番号２に示す熱ショックタンパク質６０のリーダー配列を含んでなる請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による、中間の結合活性の抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御に対する増強剤としての薬剤を同定する方法であって：
（ａ）抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞およびＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する工程と；
（ｂ）抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞をＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させる工程と；
（ｃ）抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を定量する工程と；
（ｄ）薬剤の存在下において、前記（ｂ）および（ｃ）の工程を繰り返す工程と；
（ｅ）工程（ｄ）において定量された下方制御と、工程（ｃ）において定量された下方制御とを比較する工程と
を含んでなり、工程（ｄ）で定量された下方制御が工程（ｃ）で定量されたものより大きい場合には、その薬剤は、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中程度の結合活性の抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御に対する増強剤であることを示す方法。
【請求項１４０】
ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞による、中間の結合活性の抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御に対する増強剤としての薬剤を同定する方法であって、
（ａ）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞およびＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する工程と；
（ｂ）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞をＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させる工程と；
（ｃ）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を定量する工程と；
（ｄ）薬剤の存在下において、前記（ｂ）および（ｃ）の工程を繰り返す工程と；
（ｅ）工程（ｄ）において定量された下方制御と、工程（ｃ）において定量された下方制御とを比較する工程と
を含んでなり、工程（ｄ）で定量された下方制御が工程（ｃ）で定量されたものより大きい場合には、その薬剤は、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中間の結合活性の抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御に対する増強剤であることを示す方法。
【請求項１４１】
Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による、中間の結合活性の抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御に対する阻害剤としての薬剤を同定する方法であって：
（ａ）活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞およびＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する工程と；
（ｂ）活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞をＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させる工程と；
（ｃ）活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を定量する工程と；
（ｄ）薬剤の存在下において、前記（ｂ）および（ｃ）の工程を繰り返す工程と；
（ｅ）工程（ｄ）において定量された下方制御と、工程（ｃ）において定量された下方制御とを比較する工程と
を含んでなり、工程（ｄ）で定量された下方制御が工程（ｃ）で定量されたものより小さい場合には、その薬剤は、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中間の結合活性の抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御に対する阻害剤であることを示す方法。
【請求項１４２】
ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞による、中間の結合活性の抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御に対する阻害剤としての薬剤を同定する方法であって、
（ａ）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞およびＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する工程と；
（ｂ）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞をＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させる工程と；
（ｃ）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を定量する工程と；
（ｄ）薬剤の存在下において、前記（ｂ）および（ｃ）の工程を繰り返す工程と；
（ｅ）工程（ｄ）において定量された下方制御と、工程（ｃ）において定量された下方制御とを比較する工程と
を含んでなり、工程（ｄ）で定量された下方制御が工程（ｃ）で定量されたものより小さい場合には、その薬剤は、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中間の結合活性の抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御に対する阻害剤であることを示す方法。
【請求項１４３】
前記Ｑａ−１＋Ｔ細胞はヒトＱａ−１＋Ｔ細胞である、請求項１３９または１４１に記載の方法。
【請求項１４４】
前記ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はヒトＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である、請求項１４０または１４２に記載の方法。
【請求項１４５】
前記薬剤はモノマーペプチドである、請求項１４０または１４２に記載の方法。
【請求項１４６】
前記モノマーペプチドは、Ｐ２にメチオニンまたはロイシンを有し、Ｐ９にロイシンを有する請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する方法であって、核酸をＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞に導入し、（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を阻害することにより、抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害することを含んでなる方法。
【請求項１４８】
前記核酸はｓｉＲＮＡである、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４９】
ＨＬＡ−Ｅ拘束性制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に活性化する方法であって、ＨＬＡ−Ｅ拘束性制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞をＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーまたはＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質と接触させることを含んでなり、それによりＨＬＡ−Ｅ拘束性制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に活性化する方法。
【請求項１５０】
前記ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞はＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーと接触させる、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞はＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質と接触させる、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５２】
抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞を阻害する方法であって、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞をＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーまたはＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質と接触させることを含んでなり、それによりＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞を選択的に活性化する方法。
【請求項１５３】
前記ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞はＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーと接触させる、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞はＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質と接触させる、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５５】
患者において自己免疫疾患を治療する方法であって、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するのに有効な量の薬剤を患者に投与することを含んでなり、それにより患者における活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞を阻害し、自己免疫疾患を治療する方法。
【請求項１５６】
前記薬剤は、ＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーまたはＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質である請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
自己免疫疾患治療の有効性を決定する方法であって：
ａ）治療前の患者から得られる第１のサンプル中の活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞を定量する工程と；
ｂ）自己免疫疾患治療で患者を治療する工程と；
ｃ）治療後の患者から得られる第２のサンプル中の活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞を定量する工程と；
ｄ）工程ａ）およびｃ）で定量された活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞のレベルを比較する工程と
を含んでなり、工程ａ）よりも工程ｃ）で定量されたレベルが低い場合、自己免疫疾患治療が有効であることを示す方法。
【請求項１５８】
請求項１５７に記載の方法であって、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、１型糖尿病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳疾患、自己免疫リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労症候群免疫欠乏症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱脊髄性多発性神経障害、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素疾患、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、ドゴー病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、本態性混合性クリオグロブリン血症、繊維筋痛−筋炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺繊維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩＧＡネフロパシー、若年性関節炎、ループス、メニエール病、混合性結合組織病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、潰瘍性結腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、またはウェゲネル肉芽腫症である方法。
【請求項１５９】
前記活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞は、サンプルをＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーまたはＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質と接触させること、およびＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞のＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーまたはＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質との結合を定量することにより定量される、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６０】
前記ＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーまたはＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質は固定化される、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記サンプルは患者の血液または患者のリンパに由来する、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６２】
自己免疫疾患を治療するための医薬の製造方法であって：
ａ）ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞と抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞との間の結合を増強する薬剤を同定する工程と；
ｂ）工程ａ）で同定された薬剤を薬学的に許容可能なキャリアと混合することにより医薬を製造する工程と
を含んでなる方法。
【請求項１６３】
請求項１６２に記載の方法であって、i）抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞およびＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する工程と；ii）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞をＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させる工程と；iii）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を定量する工程と；iv）前記工程ii）およびiii）を薬剤の存在下で繰り返す工程と；v）工程iv）において定量された下方制御と工程iii）において定量された下方制御とを比較する工程とにより、前記工程ａ）における結合を増強する薬剤を同定し、前記工程iv）において定量された下方制御が前記工程iii）において定量されたものよりも大きい場合、薬剤は、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を増強すると同定される方法。
【請求項１６４】
膜結合性ＨＬＡ−Ｅまたは脂質可溶性ＨＬＡ−Ｅおよびそれらに結合するタイプＢ自己ペプチドを含んでなるワクチン組成物。
【請求項１６５】
前記タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである請求項１６４に記載のワクチン組成物。
【請求項１６６】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項１６５に記載のワクチン組成物。
【請求項１６７】
前記タイプＢ自己ペプチドは、配列番号１５に示す配列を有する請求項１６４に記載のワクチン組成物。
【請求項１６８】
（i）膜結合性ＨＬＡ−Ｅまたは脂質可溶性ＨＬＡ−Ｅおよびそれらに結合するタイプＢ自己ペプチド、ならびに（ii）薬学的に許容可能なキャリアから本質的になるワクチン組成物。
【請求項１６９】
前記タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである請求項１６８に記載のワクチン組成物。
【請求項１７０】
前記Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる請求項１６９に記載のワクチン組成物。
【請求項１７１】
前記タイプＢ自己ペプチドは、配列番号１５に示す配列を有する請求項１６８に記載のワクチン組成物。
【請求項１７２】
ＨＬＡ−Ｅおよびそれに結合するタイプＢ自己ペプチドを含んでなるワクチン組成物。
【請求項１７３】
ＨＬＡ−Ｅ／タイプＢ自己ペプチドテトラマーを含んでなるワクチン組成物。
【請求項１７４】
薬学的に許容可能なキャリアを含んでなる、請求項１７２または１７３に記載のワクチン組成物。
【請求項１７５】
前記タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐである、請求項１７２または１７３に記載のワクチン組成物。
【請求項１７６】
配列番号２に示す配列を有する単離ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ここで開示されている研究は、助成金番号R29 AI39630; RO1 AI44927; PO1 AI39675; RO1 AI065609; およびU19 AI46132として、国立保健研究所からの政府援助によりなされた。従って、アメリカ政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本明細書全体にわたって、種々の出版物が括弧書きの番号で参照されている。これらの参照のための引用は、特許請求の範囲の直前の明細書の終わりにある。これらの出版物の開示は、本発明が関連する技術の状況をより完全に述べるために、その全体において、本明細書の一部として援用される。
【０００３】
自己と非自己を区別し、免疫反応の規模およびクラスを制御することにより、免疫系は、実質的にいずれかの外来性の抗原に対する効果的な免疫を生じるが、自己に対する有害な免疫応答を避ける（２６および２７）。免疫学的に、関連する臨床の問題は、いずれかの工程の不全により生じることが多い。
【０００４】
免疫系がどのように自己／非自己の識別を達成するかということは、免疫学における中心的な問題である。自己／非自己の識別の周辺のメカニズムを理解することは、どのように望ましくない免疫応答を選択的に遮断し、正常な進行中の免疫応答を完全な状態で維持するのかという主要な現代の生物医学の問題を解決する鍵となる。
【０００５】
免疫系は、非自己リガンドによる活性化が炎症性分子の生成および／または隣接する細胞の死を導く場合、細胞表面認識分子を用いることにより、この課題を部分的に解決する。例えば、生得の免疫系（ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞および顆粒球）の細胞は、微生物ならびに他の非自己病原体および粒子において顕著に見られる保存された分子パターンを特異的に認識する生殖細胞系にコードされた受容体のセットを使用する。それ故、外来の病原体と自己の細胞との間の正確な相違を定義する補体制御タンパク質等または病原体関連分子パターン認識分子（ＰＡＭＰｓ）を生得的な受容体により認識することは、免疫系が自己非自己の識別を達成する１つのアプローチである（２８〜３０）。
【０００６】
対照的に、適応免疫系は、主に、体細胞性に生じる抗原受容体上で働き、Ｔ細胞およびＢ細胞に同様に分布する。これらの抗原受容体は、ランダムなプロセスにより生じ、適応免疫系は、特定の抗原特異性を有するリンパ球発現受容体のクローン選択に基づく。Ｔ細胞またはＢ細胞上の抗原受容体は、ほとんど無限の数の特有の自己と外来の抗原とを区別することができるが、それらは、応答すべき抗原および応答すべきでない抗原を決定することはできない。結果として、適応免疫系は、自己と外来の抗原との構造的な相違を認識する抗原受容体を用いることによっては、自己と非自己の識別を達成しない。実際に、抗原受容体は、何が自己で何が異物であるかの知識なく、基本的に自己と非自己の識別に関係なく、ランダムに産生される（３１および３２）。実際に、適応免疫系の個体発生の間にいくらかの傾向がある場合、自己認識に向いている。
【０００７】
胸腺において、Ｔ細胞の発生に有用な唯一のペプチドが自己ペプチドであり、Ｔ細胞は、始めから、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）／自己ペプチド複合体によりポジティブおよびネガティブに選択される。この選択は、自己と外来の抗原との識別に基づくものではないが、代わりに、もっぱら、発達中の胸腺細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲｓ）と胸腺抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）上に発現するＭＨＣ／自己ペプチド分子との間の相互作用の結合活性の識別に基づく。それ故、ＭＨＣ／自己ペプチド複合体に対して高い結合活性のＴＣＲを発現している胸腺細胞は、アポトーシスを起こし、胸腺のネガティブセレクションの間に除去される（３３−３５）。胸腺の淘汰を免れるＴ細胞は、自己に対して低いまたは中程度の結合活性を有するが、潜在的に低い、中程度のまたは高い結合活性を有する広範囲の外来の抗原に対して反応することが可能な細胞を含む。
【０００８】
「調節可能な活性化閾値説（ＴＡＴ説）」によると、反復性の相互作用は、周囲のシグナルに対するＴ細胞の感受性を修飾し、それ故、「休止している」リンパ球が活性化され、エフェクター細胞へ分化することを妨げる（３６および３７）。胸腺の逸脱者（escapee）は、それ故、末梢でそれらに反復性且つ一定に発現される内在性の自己リガンドを「無視」することができ、それらは、例えば、能動的な感染または傷害の間に産生される「危険シグナル」（３８および３９）のような、提示される自己リガンドのレベルが急増することにより機能的に活性化され得る。自己免疫疾患を惹起することができる病原性の自己反応性Ｔ細胞は、中程度の結合活性のＴ細胞のプールに含まれる（４０および４１）。
【０００９】
BurnetおよびMedawarは、新生児期に動物に外来の抗原を導入することは、外来の抗原に対して免疫学的な耐性を引き起こし、その動物は、成体期に同じ抗原を拒絶する免疫応答を生じなくなることを示した（４４、４５）。それ以来、自己寛容のメカニズムを理解することは、免疫学における生物医学的な研究の主要な焦点となっている。
【００１０】
ＭＨＣ／自己ペプチド複合体に対して高い結合活性を有するＴＣＲを発現している胸腺細胞が除去される胸腺のネガティブセレクションは（３３〜３５）、末梢における病原性の自己免疫の「差し迫った危険」を除去し、自己寛容の主要なメカニズムである。しかしながら、胸腺のネガティブセレクションは、中程度の結合活性を有するいくつかの自己反応性のＴ細胞が末梢に放出されることも可能にする（４０、４５および４６）。これらの中程度の結合活性の自己反応性Ｔ細胞は、それらが末梢において十分なレベルで提示された自己ペプチドと出会った場合に自己ペプチド駆動の増殖の能力があり、いくらかは潜在的に病原性のエフェクター細胞に分化し得る（４０，４１）。自己寛容を保証するために、末梢性の制御メカニズムは、自己反応性のＴＣＲレパートリーを細かく調節し、胸腺内で除去されるのには不十分な高さの結合活性であるが、病原性の自己免疫を引き起こすのには十分高い結合活性のＴＣＲを用いた自己反応性のクローンのクローン増殖を抑制する。それ故、正常な条件下で、末梢における自己反応性のクローンの存在量に関わらず、臨床的な自己免疫は、通常はうまく制御される。
【００１１】
末梢性の制御メカニズムは、抗原活性化ならびに抗原活性化誘発細胞死（４８）およびＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４を含む同時刺激分子の抗原誘発性の発現を含むＴ細胞の分化に内因性であるメカニズムに関与し、免疫またはアネルギーを起こすか否かを命じる（４９〜５２）。加えて、機能的な活性化、ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１およびＴｈ２サブセット（５３〜５５）またはＴｒ１およびＴｒ３サブセット（５６〜５８）への分化は、部分的に、特有のサイトカインの生成により表現型的に同定され、制御の内因性のメカニズムの重要な側面であると考えられる。内因性のメカニズムは、通常、特別な抗原により引き起こされるが、特異的または非特異的に、免疫応答に影響を及ぼす。一般的に、内因性のメカニズムは、免疫応答の規模およびクラスを制御するように進化し、過剰な反応による二次的なダメージを避けることにより、外来の抗原に対する最適な免疫応答を保証する。しかしながら、内因性のメカニズムは、全ての免疫応答を抑制することにより、病原性の自己免疫の非特異的な寛解において重要な役割を果たす（２７、５９）。
【００１２】
ホメオスタシスの調節の内因性メカニズムに上書きされるのは、調節性のＮＫＴ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の異なるＴサブセットにより媒介される外因性の制御メカニズムであり、免疫応答の規模およびクラスを制御すること、または自己と非自己を識別することにより、末梢において、潜在的に病原性の自己反応Ｔ細胞の増殖を優位に抑制し得る（２７、５９）。自己／非自己の識別および免疫応答の規模およびクラスの制御は共に、免疫系の最適な機能を保証するために、協調して機能すべきである。
【００１３】
中心的な問題は、生物学的な系のレベルにおいて、末梢性の免疫応答がどのように制御され、外来の病原体の浸入に対して反応する能力を障害されることなく自己寛容を維持するために、免疫系が自己と非自己を区別することを可能にするかということである。これに関して、近年、自己／非自己の識別を理解するための基礎となる、胸腺のネガティブセレクションと末梢性の免疫調節との間の正確な関係を特徴付ける統一された概念的な骨子はない。統一された概念的な骨子がないことは、理論的および実験的なレベルの両方において、免疫調節の分野で混乱を引き起こす。例えば、近年、免疫調節の分野を支配し、この分野における一般的な思考に非常に影響を及ぼしている支配的な理論は、固有のＴｒｅｇの役割である。固有のＴｒｅｇは、最初に、ＣＤ２５分子の発現により特徴付けられ（６０〜６２）、近年、Ｔ細胞活性化およびある一定のサイトカインの発現を制御することが既知の（６６、６７）転写因子Ｆｏｘｐ３により特徴付けられている（６３〜６５）。Ｔｒｅｇは、自然発生であり、通常のＣＤ４＋細胞と同様の多様なＴＣＲレパートリーを有する特異的なＴ細胞サブセットの系統であると仮定された（６８、６９）。胸腺の間質細胞上に発現したある一定の自己抗原によるこれらの細胞の選択は、Ｔｒｅｇの発生のためのメカニズムとして提唱されている（６８〜７１）。関与する自己ペプチドの正確な性質は、解明されていない。
【００１４】
固有のＴｒｅｇは、抑制による自己寛容を媒介する鍵となるメカニズムであると考えられている（６９、７２〜７４）。しかしながら、固有のＴｒｅｇは、自己および外来の抗原の両方により活性化および誘導されてよく、抑制の特異性は不明確であり、標的細胞、ならびに標的細胞とＴｒｅｇとの間の相互作用については知られていない（２６、２７）。実際に、固有のＴｒｅｇにより媒介される抑制のエフェクター相をモニターするために一般に使用されるインビトロ試験は、Ｔ細胞受容体が関与しておらず、制限されたＭＨＣでもないように見えるが（７５、７６）、インビトロでの抑制は、抗原特異的であることが示されている（６５、７１、７７）。
【００１５】
エフェクター相において、抑制は、少なくとも部分的に、細胞接触依存性であるが、細胞接触に関与する表面分子は同定されていない（７６）。加えて、抑制の内因性メカニズムに関与するＩＬ−１０およびＴＧＦ−βは、固有のＴｒｅｇによる抑制に結び付けられている。重要なことは、生物学的な系のレベルにおいて、自己免疫を抑制している間は、これらの細胞も、感染性の疾患における抗細菌、抗ウイルス、抗真菌および抗寄生虫反応（６９、７８、７９）ならびに臓器移植における抗他（anti-allo）反応（６９、８０〜８２）を含む、外来の抗原に対する免疫応答を抑制することが見られる。それ故、抑制は包括的であり、自己および外来の抗原の両方に対する免疫応答の完全な範囲をカバーする。
【００１６】
これらの知見は、固有のＴｒｅｇが、自己と非自己の識別により自己免疫を制御しそうにないことを強く示唆する。代わりに、証拠は、通常のＴｈ１およびＴｈ２またはＴｒ１およびＴｒ３細胞により媒介される制御のように、固有のＴｒｅｇが免疫応答の規模およびクラスを制御することにより、病原性の自己免疫を寛解させ得ることを示す（２６、２７）。現在、これらの細胞が安定な系に関与するのか、または調節性の表現型がより形成性の可逆的な状態であるのかは不明であるが（６８、８３）、最近の研究は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、ある一定の条件下で外来の抗原によりトリガーされる抗原特異的なＴｒｅｇに変換され得ることを示した（４０）。概念的なジレンマは、固有のＴｒｅｇが実際に、系特異的なＴ細胞のサブセットである場合に、それをどのように定義するかということである。それ自体が、エフェクター細胞分化６６、６７、８４、８５の間に動力学的に制御され、ある一定のＴ細胞の機能的な段階にのみ関与する誘導遺伝子である場合、Ｆｏｘｐ３は、固有のＴｒｅｇを定義するための系特異的なマーカーとして機能し得る（６３〜６５）。固有のＴｒｅｇが系特異的なＴ細胞のサブセットでない場合、固有のＴｒｅｇと制御機能を発揮する通常のＴ細胞（Ｔｈ１およびＴｈ２またはＴｒ１およびＴｒ３細胞を含む）との間の相違は何か。まとめると、インビトロにおける固有のＴｒｅｇの生物学的な機能を均一に説明するための概念的な骨子は、進行中のままであるということである（６２、８６〜８８）。
【００１７】
自己／非自己の識別または免疫応答の規模およびクラスの制御と関連して、現存する末梢性の制御メカニズムを分類することは、概念的に重要であるだけでなく、異なる免疫メカニズムにより引き起こされる臨床的な問題を解決するための正確且つ安全な治療アプローチの発達に直接的に関連する。
【００１８】
末梢性Ｔ細胞制御の「結合活性モデル」
過去数年間に、末梢性Ｔ細胞制御の「結合活性モデル」は提案され、試験されており、末梢性の免疫応答が自己および外来性の抗原に対してどのように制御されるのかを理解するための均一な概念的な骨子が提供され得る。結合活性モデルの概念は、第一に、ある一定の、しかし全てではないＭＢＰに対してより高い増殖ポテンシャルを有する脳炎惹起性のクローンに富んだ自己ペプチド１−９Ｎａｃ ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）反応性Ｔ細胞を選択的に下方制御することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞が末梢性のアレルギー性脳髄膜炎（ＥＡＥ）の寛解に関与したという知見から生じる（４０、８９）。この制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、最初に、疾患の最初の発症の間に引き起こされるＥＡＥに対する耐性に関与することが見出された（８９、９０）。後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞と標的Ｔ細胞との間の相互作用が、ＭＨＣクラスＩｂ分子であるＱａ−１により拘束されることが示された（６６〜６８）。さらに重篤な症状のＥＡＥは、なおさら制御不可能な態様で、ミエリン関連ペプチドに曝露された分子的に操作されたＣＤ８またはＱａ−１欠損マウスにおいて発達する（９０、９４）。結合活性モデルの構築に直接的に導く実験は、ＨＥＬトランスジェニック（ＴＧ）マウスにおいて通常の抗原である雌鳥卵リゾチーム（ＨＥＬ）が自己抗原として機能する場合、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞がＨＥＬに対する免疫応答を阻害することが見出されたが、野生型（ＷＴ）マウスにおいて外来の抗原として機能する場合には、同じ抗原に対する免疫応答を増強したというさらなる知見であった（１８）。それ故、Ｑａ−１依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞は、自己抗原に対する末梢性の耐性の維持と外来の抗原に対するＴ細胞の反応の最適化の両方に関与する。
【００１９】
異なる結合活性を有するＨＥＬ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のパネルを用いることにより、標的Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞による下方制御に対する感受性が、Ｔ細胞クローンを活性化する相互作用の結合活性により決定されることが示された。Ｔ細胞を活性化するために使用される広い範囲の抗原において、Ｑａ−１依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞は、クローンがＷＴに由来するかＨＥＬ ＴＧマウスに由来するかに関わらず、中程度であるが高くも低くもない結合活性のＨＥＬ特異的なこれらのクローンを選択的に下方制御する（４３）。これらの研究から、インビボにおけるこれらの課題を達成するためにＱａ−１依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞により使用される戦略は、自己および外来の抗原の両方に対して特異的な中程度の結合活性を有する活性化されたＴ細胞を選択的に下方制御することである。それ故、活性化Ｔ細胞のＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による下方制御に対する感受性は、最初のＴ細胞活性化の間の相互作用の結合活性により決定される（４３）。この制御経路は、図１に示すような一連の経時的な細胞性の事象からなると考えられている。
【００２０】
しかしながら、Ｔ細胞標的の認識は、ｍＡｂにより、Ｑａ−１、ＣＤ８およびＴＣＲに対して遮断されるが（４３、９１〜９３）、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲにより認識される実際の標的構造は既知である。
【００２１】
ここで明らかにされた一般的な標的構造の同定、およびここで開示された新規の方法は、生じた自己免疫疾患に関与する特定の自己抗原の知識に依存することなく達成され得る、自己免疫疾患の制御および／または寛解を可能にする。
【発明の概要】
【００２２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲにより認識される抗原活性化Ｑａ−１＋／ＨＬＡ−Ｅ＋ Ｔ細胞における標的構造のここでの同定は、自己免疫のみに関与する一般的なメカニズムにのみアクセスすることを可能にする。
【００２３】
それ故、ここで開示されている新規の方法は、生じた自己免疫疾患に関与する特定の自己抗原の知識に依存せずに達成され得る、自己免疫疾患の制御および／または寛解を可能にする。
【００２４】
ＨＬＡ−Ｅ拘束性またはＨＬＡ−Ｅ依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞により抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を増強するための方法が提供され、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、以下の（i）と（ii）との間の結合を増強する薬剤と接触させ、抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を増強することを含んでなる：（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチド。
【００２５】
Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞により抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を増強するための方法が提供され、Ｑａ−１＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、以下の（i）と（ii）との間の結合を増強する薬剤と接触させ、抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を増強することを含んでなる：（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、（ii）Ｑａ−１＋Ｔ細胞の表面上にＱａ−１により提示されるタイプＢ自己ペプチド。
【００２６】
自己免疫疾患、移植片拒絶および細菌性の感染から選択される障害に罹患しているヒトの患者を治療するための方法が提供され、（i）ＨＬＡ−Ｅ拘束性またはＨＬＡ−Ｅ依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合性を増強する薬剤の治療的に有効な量を患者に投与することを含んでなり、それにより患者を治療する。
【００２７】
膜結合性の組成物は、形質膜に由来してよく、または例えばリポソームのような合成品であってもよい。
【００２８】
ＨＬＡ−Ｅ拘束性またはＨＬＡ−Ｅ依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞により抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害するための方法が提供され、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、以下の（i）と（ii）との間の結合を阻害する薬剤と接触させ、抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害することを含んでなる：（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチド。
【００２９】
Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞により抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を阻害するための方法が提供され、Ｑａ−１＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、以下の（i）と（ii）との間の結合を阻害する薬剤と接触させ、抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を阻害することを含んでなる：（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、（ii）Ｑａ−１＋Ｔ細胞の表面上にＱａ−１により提示されるタイプＢ自己ペプチド。
【００３０】
タイプＢ自己ペプチドおよびＱａ−１を含んでなる複合体に特異的に結合する、単離された抗体が提供される。タイプＢ自己ペプチドおよびＨＬＡ−１を含んでなる複合体に特異的に結合する単離された抗体が提供される。
【００３１】
Ｔ細胞を含むサンプル中に存在するＨＬＡ−Ｅ拘束性またはＨＬＡ−Ｅ依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する方法が提供され、
（ａ）タイプＢ自己ペプチドがサンプル中のＨＬＡ−Ｅ拘束性またはＨＬＡ−Ｅ依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞と結合することが可能な条件下で、サンプルを、固定化されたＨＬＡ−Ｅ提示タイプＢ自己ペプチドと接触させる工程と；
（ｂ）結合しなかったＴ細胞を除去する工程と；
（ｃ）固定化されたタイプＢ自己ペプチドから、結合したＨＬＡ−Ｅ拘束性またはＨＬＡ−Ｅ依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞を分離する工程と
を含んでなり、結果として、サンプルからＨＬＡ−Ｅ拘束性またはＨＬＡ−Ｅ依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞が単離される。
【００３２】
Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による、中程度の結合活性の抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御に対する増強剤としての薬剤を同定する方法が提供され、
（ａ）抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞およびＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する工程と；
（ｂ）抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞をＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させる工程と；
（ｃ）抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を定量する工程と；
（ｄ）薬剤の存在下において、前記（ｂ）および（ｃ）の工程を繰り返す工程と；
（ｅ）工程（ｄ）において定量された下方制御と、工程（ｃ）において定量された下方制御とを比較する工程と
を含んでなり、工程（ｄ）で定量された下方制御が工程（ｃ）で定量されたものより大きい場合には、その薬剤は、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中程度の結合活性の抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御に対する増強剤であることを示す。
【００３３】
Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による、中程度の結合活性の抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御に対する阻害剤としての薬剤を同定する方法が提供され、
（ａ）活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞およびＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する工程と；
（ｂ）活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞をＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させる工程と；
（ｃ）活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を定量する工程と；
（ｄ）薬剤の存在下において、前記（ｂ）および（ｃ）の工程を繰り返す工程と；
（ｅ）工程（ｄ）において定量された下方制御と、工程（ｃ）において定量された下方制御とを比較する工程と
を含んでなり、工程（ｄ）で定量された下方制御が工程（ｃ）で定量されたものより小さい場合には、その薬剤は、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中程度の結合活性の抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御に対する阻害剤であることを示す。
【００３４】
ＨＬＡ−Ｅ拘束性またはＨＬＡ−Ｅ依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する方法が提供され、核酸をＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞に導入することにより、（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を阻害することを含んでなり、それにより、抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する。
【００３５】
抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞を阻害する方法が提供され、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞を阻害するために、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＨＬＡ−Ｅ依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する薬剤とを接触させることを含んでなる。
【００３６】
自己免疫疾患を治療するための薬剤を製造する方法が提供され：
ａ）ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞と抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞との間の結合を増強する薬剤を同定することと；
ｂ）前記ステップａ）で同定された薬剤と薬学的に許容可能なキャリアを混合し、薬剤を製造することとを含んでなる。
【００３７】
配列番号２に示す配列を有する単離ペプチド。
【００３８】
ＨＬＡ−Ｅ／タイプＢ自己ペプチド四量体を含んでなるワクチン組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】第１の免疫応答の間に、ナイーブＴ細胞の活性化により惹起され、Ｔ細胞上のＴＣＲが通常のＡＰＣにより提示されるＭＨＣ／抗原ペプチド複合体と相互作用することによる、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞が媒介する経路の細胞内での諸現象。初期のＴ細胞活性化の結果の１つは、特定の「標的抗原」の特異的な発現であり、この場合、標的Ｔ細胞の表面上の「Ｑａ−１／自己ペプチド複合体」が含まれる。重要なことは、制御性Ｔ細胞上のＴＣＲにより認識される「標的抗原」の発現が、標的Ｔ細胞がどの抗原によりトリガーされるかに関わらず、Ｔ細胞活性化の結合相互作用により決定されることである。この点に関して、Ｔ細胞は専門のＡＰＣではないため、樹状細胞のような専門のＡＰＣが補充されてよく、制御性Ｔ細胞の誘導相の間に、同時刺激のシグナルを与えるように機能する。ある一定の活性化Ｔ細胞に発現する「標的抗原」は、制御性Ｔ細胞がエフェクター細胞に分化するのをトリガーし、次いで、第２の免疫応答の間に、同じ標的抗原を発現している活性化Ｔ細胞を下方制御する。
【図２】Ｈ／Ｍ／Ｑａ−１遺伝子指数（Gene Indexes）は、高いおよび低い結合活性のクローンと比較して、中間の結合活性のＴ細胞クローンにおいて優位に高い。リアルタイムＰＣＲは、記載されているように１０μＭの特異的抗原ＨＥＬによりＴ細胞クローンが活性化された６０時間後に行われた（１）。図は、３つの別々の実験をまとめたものである。Ｈ／Ｍ／Ｑａ−１遺伝子指数は、[Ｈｓｐ６０遺伝子発現指数／ＭＨＣクラスＩａ（ｈ−２Ｄｄ）遺伝子発現指数]×Ｑａ−１遺伝子発現指数で計算され、遺伝子発現レベルでＱａ−１に対して標準化されたＨｓｐ６０とＭＨＣクラスＩａ（ｈ−２Ｄｄ）との比を意味する。遺伝子発現指数：同じ細胞における所定の遺伝子とβ−アクチンとの間の遺伝子発現の比。クローンのＥＤ５０（μＭ）：９Ｅ４および１９Ｆ６＜１μＭ；１０Ｈ９，３μＭ；１３Ｃ７，１０μＭ；１２Ｄ７，１３Ｆ２および４４Ｈ７＞２０μＭ。
【図３】ウェスタンブロッティングアッセイにより得られるＨ／Ｍ／Ｏａ−１タンパク質指数。高いおよび低い結合活性のクローンと比較して、中程度の結合活性のＴ細胞クローンにおいて有意に高い。ウェスタンブロッティングアッセイは、記載されているように１０μＭの特異的抗原ＨＥＬによりＴ細胞クローンが活性化された７２時間後に行われた（１）。図は、３つの別々の実験をまとめたものである。Ｈ／Ｍ／Ｏａ−１タンパク質指数は、[Ｈｓｐ６０タンパク質発現指数／ＭＨＣクラスＩａ（ｈ−２Ｄｄ）タンパク質発現指数]×Ｑａ−１タンパク質発現指数で計算され、タンパク質発現レベルでＱａ−１に対して標準化されたＨｓｐ６０とＭＨＣクラスＩａ（ｈ−２Ｄｄ）との比を意味する。タンパク質発現指数：同じ細胞における所定のタンパク質とβ−アクチンとの間のタンパク質発現の比。
【図４】異なるＨＥＬクローン中に発現したＨｓｐ６０、ＭＨＣクラスＩａおよびＱａ−１のタンパク質レベルを測定したウェスタンブロッティングアッセイ。図は、図３における３つの別々の実験の代表である。
【図５】１μＭ〜５０μＭの範囲の異なる濃度の抗原ＨＥＬにより活性化された、既知のＥＤ５０を有するＴ細胞クローンのＨ／Ｍ／Ｑａ−１タンパク質指数には、有意な差はない。図は、３つの別々の実験をまとめたものである。Ｈ／Ｍ／Ｑａ−１タンパク質指数を３つの用量（１、１０および５０μＭ）で刺激した各クローンについて比較した場合、試験した各クローンについて有意な差はなかったが（ｐ＞０．０５）、全ての用量について、中程度の結合活性の群と高いおよび低い結合活性の群との間には有意な差がみられた（ｐ＜０．００１）。
【００４０】
三角、丸、ダイヤは、３つの別々の実験に由来するＴ細胞クローンのＨ／Ｍ／Ｑａ−１タンパク質指数を表す；
３つの三角は、各実験において、異なる用量（１μＭ、１０μＭおよび５０μＭ）のＨＥＬで刺激したＴ細胞クローンのＨ／Ｍ／Ｑａ−１タンパク質指数を表す。
【図６】Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する特異的な標的である。Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、Ｑａ−１に結合することができる。３Ｆ４細胞をＨｓｐ６０ｓｐ、Ｑｄｍおよび対照ペプチドと２６℃および３７℃で１８時間インキュベートし、ヤギ抗マウスＰＥにより曝露された抗Ｑａ−１ａ血清で染色し、方法の節で述べたＦＡＣＳにより分析した。陰影をつけた曲線は、３７℃でペプチド負荷したサンプルのＱａ−１染色を表し、明るい曲線は、２６℃でペプチド負荷したサンプルのＱａ−１染色を表す。
【図７】Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、Ｑａ−１と結合した場合、ＮＫ死滅を阻害せず、Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐがＮＫ細胞においてＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体と相互作用しないことを示す。Ｈｓｐ６０ｓｐ、Ｑｄｍおよび対照ペプチドが負荷された３Ｆ４細胞は、方法において述べるように、標準的なＮＫ分析においてペプチド提示細胞として使用された。図は、４つの別々の実験を表す。
【図８】Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、Ｑａ−１との結合に対して、Ｑｄｍと競合することができる。Ｈｓｐ６０および対照ペプチドが、Ｑｄｍ（２０μＭ）と共に３Ｆ４に２６℃で１８時間負荷され、方法において述べるように標準的なＮＫ分析（Ｅ／Ｔ比２：１）で試験した。対照ペプチドではなくＨｓｐ６０ｓｐペプチドが、用量依存性の態様で、Ｑｄｍによる３Ｆ４の死滅の阻害を抑制し、Ｈｓｐ６０ｓｐは、Ｑａ−１との結合についてＱｄｍと競合することができることを示す。図は、４つの別々の実験を示す。
【図９】Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、Ｑａ−１発現細胞を、Ｑａ−１依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞による下方制御に対して感受性にする。Ｈｓｐ６０ｓｐ、Ｑｄｍおよび対照ペプチドが負荷された３Ｆ４細胞は、方法において述べるように、標準的なＣＤ８＋Ｔ細胞阻害分析においてペプチド提示細胞として使用された。中程度の活性の１−９ＮａｃＭＢＰ特異的な脳炎惹起性のクローン１ＡＥ１０および低い活性の１−９ＮａｃＭＢＰ特異的な非脳炎惹起性のクローン４Ｄ１０を対照として使用した。ＣＤ８＋Ｔ細胞をＥＡＥ保護されたＢ１０ＰＬマウスから単離し、ナイーブマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を（１）で述べたように対照として使用した。我々の以前および現在の研究により、ナイーブマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、クローン１ＡＥ１０およびＨｓｐ６０ｓｐペプチドを負荷した３Ｆ４細胞に影響を及ぼさないことが確立されている。図は、４つの別々の実験を示す。
【図１０】ＣＤ８＋Ｔ細胞による中程度の活性のＴ細胞の選択的な下方制御は、免疫応答の進行の間に、自己と外来の抗原の両方に対する末梢性Ｔ細胞レパートリーを形成する。自己および外来の抗原に対するナイーブ末梢性ＴＣＲレパートリーの組成は、胸腺のネガティブセレクションにより異なるため、自己および外来の抗原に対する中程度の活性のＴ細胞の選択的な下方制御の生物学的な結果も異なる。高い活性の自己応答性Ｔ細胞クローンの胸腺内の除去は、外来応答性レパートリーと比較して中程度および低い活性のクローン（高い活性のクローンは含まない）のみからなる切断された末梢性の自己応答性レパートリーを生じる。それ故、潜在的に病原性の自己応答性Ｔ細胞を含む中程度の活性のＴ細胞集団の選択的な下方制御は、効果的な抗炎症免疫にダメージを与えることなく、自己免疫疾患を特異的に制御するメカニズムを提供し、大部分は、感染性の病原体に特異的な高い活性のＴ細胞により媒介される。
【図１１】胸腺のネガティブセレクションの間にアポトーシスを受ける、胸腺細胞の活性状態の仮定上の閾値。Ｙ軸は、ＴＣＲ活性を示し、ＴＣＲの構造および各胸腺細胞上に発現したＴＣＲの密度により示される親和性により決定される。Ｘ軸は、胸腺に提示される自己抗原のレベルを示し、ＡＰＣの表面上に発現したＭＨＣ／自己ペプチド複合体の数および親和性、ならびにＡＰＣの提示能力により決定される。閾値を越える活性化状態の胸腺細胞はアポトーシスを受け、閾値以下の活性化状態の胸腺細胞はアポトーシスを受けず、末梢に放出される。
【図１２】Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による末梢性のＴ細胞制御の機能的なウィンドウ。広範な抗原提示レベルにより活性化される中間の結合活性のＴ細胞をカバーし、特に、提示される抗原のレベルが低いレベルから中間のレベルまたは中間のレベルから中上のレベルに移動する場合である。制御ウィンドウの外側に押し出されている小さな尾上の領域は、臨床的な治療によるＴ細胞活性化の間の潜在的な同時刺激により起こり得るある一定の非常にまれなケースである。
【図１３】胸腺におけるアポトーシスに対する胸腺細胞の活性化状態の低い境界と末梢に存在する末梢性の下方制御に対するＴ細胞活性化状態の高い境界との間の、末梢における結合活性の重複領域。胸腺のネガティブセレクションの間にアポトーシスを受ける胸腺細胞に対する低い境界は、末梢性のＴ細胞制御に対するＴ細胞の活性化状態の高い境界よりもずっと低い。これは、末梢において、中間の結合活性のＴ細胞が末梢に逸脱するのを可能にする、胸腺におけるアポトーシスに対する胸腺細胞の活性化状態の低い境界と、下方制御に対するＴ細胞活性化状態の高い境界との間に重複領域を作る。
【図１４】ＥＡＥおよびＴ１Ｄの自己免疫疾患モデルにおける「交差保護」減少。動物は、異なる抗原ペプチドを用いたワクチン接種により保護される。
【図１５Ａ】自己ペプチド１−９ＮａｃＭＢＰまたはｐ２７７のワクチン接種は、ＥＡＥからＢ１０ＰＬマウスを、Ｔ１ＤからＮＯＤマウスを「交差保護」し、前記保護はＣＤ８＋Ｔ細胞依存性である。図１５Ａ：１−９ＮａｃＭＢＰまたはｐ２７７ペプチドをＢ１０ＰＬマウスにワクチン接種することにより、引き続くＥＡＥの誘発からＢ１０ＰＬマウスを等しく保護した。図は、４〜５のマウス／群を用いた４つの別々の実験である。
【図１５Ｂ】１−９Ｎａｃ ＭＢＰまたはｐ２７７ペプチドを用いたＮＯＤマウスのワクチン接種は、自然に発症するＴ１ＤからＮＯＤマウスを等しく保護した。図は、４〜５のマウス／群を用いた４つの別々の実験を示す。
【図１５Ｃ】１−９Ｎａｃ ＭＢＰまたはｐ２７７ペプチドによりワクチン接種保護されたＥＡＥマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、養子的に導入された場合に、続いて誘導されるＥＡＥからさらにナイーブＢ１０ＰＬマウスを保護した。対照：ＣＤ８＋Ｔ細胞の導入なくＥＡＥの発症を誘導されたマウス。ＣＤ８Ｔ／ナイーブ：ナイーブマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を養子的に導入した後、ＥＡＥの発症を誘導されたマウス。ＣＤ８Ｔ／ＭＢＰ：ＥＡＥが誘導されるが、１−９ＭａｃＭＢＰワクチン接種により保護されたＥＡＥマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を養子的に導入した場合に保護されるマウス。ＣＤ８Ｔ／ｐ２７７：ＥＡＥが誘導されるが、ｐ２７７ワクチン接種により保護されたＥＡＥマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を養子的に導入した場合に保護されるマウス。図は、４〜５のマウス／群を用いた４つの別々の実験を示す。
【図１５Ｄ】１−９Ｎａｃ ＭＢＰまたはｐ２７７ペプチドによりワクチン接種保護されたＴ１Ｄマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、養子的に導入された場合に、自然に発症するＴ１ＤからナイーブＮＯＤマウスをさらに保護した。対照：ＣＤ８＋Ｔ細胞の導入なくＴ１Ｄを自然に発症したマウス。ＣＤ８Ｔ／ナイーブ：ナイーブマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を養子的に導入した後、Ｔ１Ｄを自然に発症したマウス。ＣＤ８Ｔ／ＭＢＰ：１−９ＭａｃＭＢＰワクチン接種により保護されたＴ１Ｄマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を養子的に導入した場合にＴ１Ｄから保護されるマウス。ＣＤ８Ｔ／ｐ２７７：ｐ２７７ワクチン接種により保護されたＴ１Ｄマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を養子的に導入した場合にＴ１Ｄから保護されるマウス。図は、４〜５のマウス／群を用いた４つの別々の実験を示す。
【図１６】１−９Ｎａｃ ＭＢＰ特異的な中間の結合活性のクローン１ＡＥ１０および低い結合活性のクローン４Ｄ１０ならびにｐ２７７特異的な中間の結合活性のクローン１５Ａ６および低い結合活性のクローン１３Ｃ４のＨ／Ｍ／Ｑａ−１タンパク質指数。図は、３つの別々の実験の概要を示す。Ｈ／Ｍ／Ｑａ−１タンパク質指数は、Ｈ／Ｍタンパク質発現比×Ｑａ−１のタンパク質発現指数として計算され、タンパク質発現レベルにおいてＱａ−１に対して標準化されたＨｓｐ６０とＭＨＣクラスＩａの比を表す。タンパク質発現指数は、同じ細胞における所定のタンパク質とβ−アクチンとの間のタンパク質発現の比であり、Ｈ／Ｍタンパク質発現比は、Ｈｓｐ６０とＭＨＣクラスＩａとの間のタンパク質発現指数の比である。
【図１７Ａ】１−９ＮａｃＭＢＰまたはｐ２７７ペプチドのワクチン接種により保護されたＥＡＥマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照の低い結合活性のクローン４Ｄ１０またはＱｄｍおよび対照ペプチドを負荷したトランスフェクタント３Ｆ４ではなく、脳炎惹起性の中間の結合活性の１−９ＮａｃＭＢＰ特異的Ｔ細胞クローン１ＡＥ１０またはＨｓｐ６０ｓｐを負荷したトランスフェクタント３Ｆ４を選択的に阻害する。ｘｘｘ／ｍは、ＭＢＰペプチドのワクチン接種により保護されたマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞について分析する実験を意味し、ｘｘｘ／ｐは、ｐ２７７ペプチドのワクチン接種により保護されたマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞について分析する実験を意味する。図は、Ｂ１０ＰＬマウスにおいて行われた４つの別々の実験を表す。
【図１７Ｂ】１−９ＮａｃＭＢＰまたはｐ２７７ペプチドのワクチン接種により保護されたＴ１Ｄマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照の低い結合活性のクローン１３Ｃ４またはＱｄｍおよび対照ペプチドを負荷されたトランスフェクタント３Ｆ４ではなく、中間の結合活性のｐ２７７特異的なＴ細胞クローン１５Ａ６またはＨｓｐ６０ｓｐを負荷したトランスフェクタント３Ｆ４を選択的に阻害する。ｘｘｘ／ｍは、ＭＢＰペプチドのワクチン接種により保護されたマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞について分析する実験を意味し、ｘｘｘ／ｐは、ｐ２７７ペプチドのワクチン処理により保護されたマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞について分析する実験を意味する。図は、ＮＯＤマウスにおいて行われた４つの別々の実験を表す。
【図１８Ａ】１−９ＮａｃＭＢＰまたはｐ２７７のワクチン接種により保護されたＢ１０ＰＬマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、養子性に導入された場合、レシピエントマウスにおけるイクスビボでの１次応答において、通常の外来抗原ＨＥＬではなく病原性の自己抗原１−９ＮａｃＭＢＰに対する全体的な免疫応答を阻害した。流入領域リンパ節に由来するＴ細胞のイクスビボでの１次応答は、インビボでの抗原曝露の１週間後に、標準のＴ細胞増殖分析において試験された。ＣＤ８Ｔ／ナイーブ／ＨＥＬ：マウスは、ＨＥＬを用いた免疫化の前に、ナイーブＢ１０ＰＬマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を受け取り、ＨＥＬ応答について試験された。ＣＤ８Ｔ／ＭＢＰ／ＨＥＬ：マウスは、ＨＥＬを用いた免疫化の前に、１−９ＮａｃＭＢＰをワクチン接種されたＢ１０ＰＬマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を受け取り、ＨＥＬ応答について試験された。ＣＤ８Ｔ／ｐ２７７／ＨＥＬ：マウスは、ＨＥＬを用いた免疫化の前に、ｐ２７７をワクチン接種されたＢ１０ＰＬマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を受け取り、ＨＥＬ応答について試験された。ＣＤ８Ｔ／ナイーブ／ＭＢＰ：マウスは、ＭＢＰを用いた免疫化の前に、ナイーブＢ１０ＰＬマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を受け取り、ＭＢＰ応答について試験された。ＣＤ８Ｔ／ＭＢＰ／ＭＢＰ：マウスは、ＭＢＰを用いた免疫化の前に、１−９ＮａｃＭＢＰをワクチン接種されたＢ１０ＰＬマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を受け取り、ＭＢＰ応答について試験された。ＣＤ８Ｔ／ｐ２７７／ＭＢＰ：マウスは、ＭＢＰを用いた免疫化の前に、ｐ２７７をワクチン接種されたＢ１０ＰＬマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を受け取り、ＭＢＰ応答について試験された。図は、４つの別々の実験を示す。
【図１８Ｂ】１−９ＮａｃＭＢＰまたはｐ２７７のワクチン接種により保護されたＮＯＤマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、養子性に導入された場合、レシピエントマウスにおけるイクスビボでの１次応答において、通常の外来抗原ＨＥＬではなく病原性の自己抗原Ｂ：９−２３に対する全体的な免疫応答を阻害した。流入領域リンパ節に由来するＴ細胞のイクスビボでの１次応答は、インビボでの抗原曝露の１週間後に、標準のＴ細胞増殖分析において試験された。ＣＤ８Ｔ／ナイーブ／ＨＥＬ：マウスは、ＨＥＬを用いた免疫化の前に、ナイーブＮＯＤマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を受け取り、ＨＥＬ応答について試験された。ＣＤ８Ｔ／ＭＢＰ／ＨＥＬ：マウスは、ＨＥＬを用いた免疫化の前に、１−９ＮａｃＭＢＰをワクチン接種されたＮＯＤマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を受け取り、ＨＥＬ応答について試験された。ＣＤ８Ｔ／ｐ２７７／ＨＥＬ：マウスは、ＨＥＬを用いた免疫化の前に、ｐ２７７をワクチン接種されたＮＯＤマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を受け取り、ＨＥＬ応答について試験された。ＣＤ８Ｔ／ナイーブ／Ｂ：９：マウスは、Ｂ：９−２３を用いた免疫化の前に、ナイーブＮＯＤマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を受け取り、Ｂ９−２３応答について試験された。ＣＤ８Ｔ／ＭＢＰ／Ｂ：９：マウスは、Ｂ：９−２３を用いた免疫化の前に、１−９ＮａｃＭＢＰをワクチン接種されたＮＯＤマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を受け取り、Ｂ：９−２３応答について試験された。ＣＤ８Ｔ／ｐ２７７／Ｂ：９：マウスは、Ｂ：９−２３を用いた免疫化の前に、ｐ２７７をワクチン接種されたＮＯＤマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を受け取り、Ｂ：９−２３応答について試験された。図は、４つの別々の実験を示す。
【図１９】Ｑａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される交差保護の細胞性の事象。Ｑａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介経路の導入相とエフェクター相との間の関係は、Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐのような共通の代理の標的構造であり、これらのＴ細胞がどの抗原によりトリガーされるかに関わらず、中間の結合活性の誘発および標的Ｔ細胞上に優位に発現される。
【発明の詳細な説明】
【００４１】
ここで使用する場合、「予防的に有効な」量とは、物質が投与されるべき患者において、ある一定の病的な状態の発症を予防または遅延するのに有効な物質の量である。
【００４２】
ここで使用する場合、「治療的に有効な」量とは、ある一定の病的な状態に苦しんでおり、物質が投与されるべき患者において、その治療、寛解、または症状および原因の緩和のために有効な物質の量である。
【００４３】
１つの実施形態において、治療的または予防的に有効な量は、投薬当り約１ｍｇの薬剤／患者〜約１ｇの薬剤／患者である。もう１つの実施形態において、治療的または予防的に有効な量は、約１０ｍｇの薬剤／患者〜５００ｍｇの薬剤／患者である。さらなる実施形態において、治療的または予防的に有効な量は、約５０ｍｇの薬剤／患者〜２００ｍｇの薬剤／患者である。さらなる実施形態において、治療的または予防的に有効な量は、約１００ｍｇの薬剤／患者である。さらなる実施形態において、治療的または予防的に有効な量は、５０ｍｇの薬剤／患者、１００ｍｇの薬剤／患者、１５０ｍｇの薬剤／患者、２００ｍｇの薬剤／患者、２５０ｍｇの薬剤／患者、３００ｍｇの薬剤／患者、４００ｍｇの薬剤／患者、および５００ｍｇの薬剤／患者から選択される。
【００４４】
ここで使用する場合、「タイプＢペプチド」または「タイプＢ自己ペプチド」とは、Ｑａ−１結合性またはＨＬＡ−Ｅ結合性のペプチドであり、適切な場合、（i）Ｑａ−１またはＨＬＡ−Ｅにそれぞれ結合した場合に、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合することによりＮＫ細胞を阻害せず、（ii）Ｑａ−１またはＨＬＡ−Ｅにそれぞれ結合した場合に、制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識され、（iii）Ｑａ−１またはＨＬＡ−Ｅのそれぞれとの結合について、ＱｄｍまたはＢ７ｓｐのようなタイプＡＱＡ−１／ＨＬＡ−Ｅ結合性ペプチドと競合し得る。
【００４５】
ここで使用する場合、「ＨＬＡ−Ｅ」は、当該分野で使用される共通の意味を有し、すなわちヒト白血球抗原系Ｅである。
【００４６】
ここで使用する場合、「Ｑａ−１またはＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、免疫系抗原提示細胞（ＡＰＣ）において、Ｑａ−１またはＨＬＡ−Ｅ分子それぞれにより提示されるペプチドを認識する制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞である。ここで包含される場合、Ｑａ−１／ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＡＰＣは、中間の結合活性のＴ細胞であり、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞に対する特異的な標的でもある。
【００４７】
薬物を「投与すること」は、当業者に既知の種々の方法および送達システムの何れかを用いて行うことができる。投与は、例えば、静脈内、経口、鼻腔、脳脊髄液を介して、インプラントにより、経粘膜、経皮、筋肉内、および皮下に行われてよい。多数の通常使用される薬学的に許容可能なキャリアを使用する以下の送達システムは、瞬時の方法に従って組成物を投与するために思いつく多くの実施形態の代表例に過ぎない。
【００４８】
注射可能な薬物送達システムには、溶液、懸濁液、ゲル、ミクロスフェアおよび高分子注射液が含まれ、溶解性変化剤（例えば、エタノール、プロピレングリコールおよびショ糖）ならびにポリマー（例えば、ポリカプリラクトン（polycaprylactone）およびＰＬＧＡ’ｓ）のような賦形剤が含まれてよい。インプラント可能なシステムには、杵状体およびディスクが含まれ、ＰＬＧＡおよびポリカプリラクトンのような賦形剤が含まれてよい。
【００４９】
経口的な送達システムには、錠剤およびカプセルが含まれる。これらには、結合剤（例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、他のセルロース系の物質およびデンプン）、希釈剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、デンプン、リン酸二カルシウムおよびセルロース系の物質）、崩壊剤（例えば、デンプン重合体およびセルロース系の物質）および滑沢剤（例えば、ステアレートおよびタルク）のような賦形剤が含まれてよい。
【００５０】
経粘膜の送達システムには、パッチ、錠剤、坐剤、ペッサリー、ゲルおよびクリームが含まれ、可溶化剤およびエンハンサー（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩およびアミノ酸）、ならびに他の媒体（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸のような親水性ポリマー）のような賦形剤が含まれてよい。
【００５１】
経皮の送達システムには、例えば、水性および非水性のゲル、クリーム、多エマルジョン（multiple emulsion）、ミクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性および非水性の溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素塩基および粉末が含まれ、可溶化剤、浸透増強剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪族アルコールおよびアミノ酸）、ならびに親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）のような賦形剤が含まれてよい。１つの実施形態において、薬学的に許容可能なキャリアは、リポソームまたは経皮的な増強剤である。
【００５２】
再構成可能な送達システムのための溶液、懸濁液および粉末には、懸濁化剤（例えば、ゴム、ザンタン（zanthan）、セルロースおよび糖）、湿潤剤（例えばソルビトール）、可溶化剤（例えば、エタノール、水、ＰＥＧおよびプロピレングリコール）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、スパン（Span）、ツイーン、およびセチルピリジン）、保存剤および酸化防止剤（例えば、パラベン、ビタミンＥおよびＣ、ならびにアスコルビン酸）、抗凝固剤、コーティング剤、およびキレート化剤（例えばＥＤＴＡ）のような媒体が含まれる。
【００５３】
ここで使用する場合、「薬学的に許容可能なキャリア」は、即時の化合物を動物またはヒトに送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁化剤または媒体である。キャリアは、液体、エアロゾル、ゲルまたは固体であってよく、頭の中で計画された投与方法に合わせて選択される。
【００５４】
「薬剤」は、いずれかの化学的な実態を意味してよく、限定するものではないが、グリコマー、タンパク質、抗体、レクチン、核酸、小分子、およびそれらの任意の組み合わせ、ならびにエキソソーム（exosome）およびリポソームのような生物学的な実体が含まれる。考えられる薬剤の例としては、限定するものではないが、モノクローナル抗体、リボザイム、ＤＮＡザイム、およびｓｉＲＮＡ分子が含まれる。
【００５５】
「ｓｉＲＮＡ」は、低分子干渉リボ核酸を意味する。標的タンパク質の発現を低下させるためにｓｉＲＮＡを設計および産生する方法は、当該分野で周知である。
【００５６】
Ｈｓｐ６０ｓｐに関して、「構造的に関連のあるペプチド」は、配列番号２に示す配列と７０〜９９％の配列同一性を有するペプチドを意味する。
【００５７】
「腫瘍」には、癌性および非癌性の腫瘍が含まれる。癌性の腫瘍には、限定するものではないが、胆管癌；グリア芽細胞腫および髄芽腫を含む脳の癌；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；大腸癌；子宮体癌；食道癌；胃癌；急性リンパ性および骨髄性白血病を含む血液学的な癌；多発性骨髄腫；ＡＩＤＳに関連する白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；ボーウェン病およびパジェット病を含む上皮内腫瘍；肝癌；肺癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽細胞腫；扁平上皮細胞癌を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞、胚細胞および間葉細胞から生じるものが含まれる卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；結腸直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、繊維肉腫および骨肉腫を含む肉腫；メラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮癌を含む皮膚癌；胚の腫瘍（精上皮腫、非精上皮腫［奇形腫、絨毛癌］）、口の腫瘍および胚細胞腫瘍を含む精巣癌；甲状腺の腺癌および髄様癌を含む甲状腺癌；ならびに腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎臓癌が含まれる。
【００５８】
ここで使用する場合、「抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞」は、適切な場合、自己応答性Ｔ細胞、すなわちここでは「抗原」自体を包含する。従って、抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞についてここで述べる各方法の実施形態において、細胞は、自己抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である。
【００５９】
ＨＬＡ−Ｅ依存性またはＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を増強または活性化するための方法が提供され、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されたタイプＢ自己ペプチドとを接触させることを含んでなり、それにより、抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御が増強または活性化される。
【００６０】
実施形態において、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞であり、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞であり、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続するアミノ酸を含んでなる。さらなる実施形態において、前記ペプチドは、Xaa-Met/Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu（配列番号１５）を有する。さらなる実施形態において、前記ペプチドは、ＨＬＡ−Ｅに結合するモノマー（nonomer）である。さらなる実施形態において、前記ペプチドは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体に結合しない。さらなる実施形態において、前記ペプチドは、ＨＬＡ−Ｅに結合した場合、制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識されない。さらなる実施形態において、前記ペプチドは、ＨＬＡ−Ｅへの結合に対して、Ｂ７ｓｐと競合することができる。
【００６１】
実施形態において、前記薬剤は、樹状細胞に由来する、タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソームであり、前記薬剤は、樹状細胞に由来する、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソームであり、前記薬剤は、ＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質であり、前記薬剤は、ＨＬＡ−ＥテトラマーまたはＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーである。融合タンパク質は、米国特許第5,116,964号および5,336,603号公報において述べられており、これらは本明細書の一部として援用される。ＨＬＡ−Ｅテトラマーは、例えば、Braud et al., Nature. 1998 Feb 19; 391(6669): 740-1, 743; およびGarcia et al., Eur. J. Immunol. 2002 Apr; 32(4): 936-44に記載されており、これらはいずれも本明細書の一部として援用される。ＨＬＡ−Ｅタンパク質配列は、ＮＣＢＩ受付番号ＣＡＡ０５５２７、ＣＡＡ４０１７２、ＢＡＢ６３３２８およびＢＡＦ３１２６０により記載されている。
【００６２】
Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を増強および活性化するための方法が提供され、Ｑａ−１＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）Ｑａ−１＋Ｔ細胞の表面上にＱａ−１により提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を増強または活性化する薬剤と接触させることを含んでなり、それにより、抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を増強および活性化する。さらなる実施形態において、前記ペプチドはXaa-Met/Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu（配列番号１５）を有する。さらなる実施形態において、前記ペプチドは、Ｑａ−１に結合するモノマーである。さらなる実施形態において、前記ペプチドは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体に結合しない。さらなる実施形態において、前記ペプチドは、Ｑａ−１に結合した場合、制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される。さらなる実施形態において、前記ペプチドは、Ｑａ−１への結合に対して、Ｑｄｍと競合することができる。
【００６３】
実施形態において、Ｑａ−１＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／Ｑａ−１＋Ｔ細胞であり、Ｑａ−１＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋／Ｑａ−１＋Ｔ細胞であり、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続するアミノ酸を含んでなる。実施形態において、前記薬剤は、樹状細胞に由来する、タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＱａ−１を有するエキソソームであり、前記薬剤は、樹状細胞に由来する、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＱａ−１を有するエキソソームである。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続するアミノ酸を含んでなる。
【００６４】
実施形態において、前記薬剤は、Ｑａ−１／ＩｇＧ融合タンパク質であり、前記薬剤はＱａ−１テトラマーまたはＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーである。Ｑａ−１テトラマーは、例えば、Salcedo et al., Eur. J. Immunol. 2000 Apr; 30(4): 1094-101に記載されており、これは本明細書の一部として援用される。
【００６５】
ヒトの患者において、ＨＬＡ−Ｅ依存性またはＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を増強または活性化するための方法が提供され、（i）ＨＬＡ−Ｅ制限性またはＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を増強または活性化する薬剤の有効量を患者に投与することを含んでなり、それにより、患者において、抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御が増強または活性化される。
【００６６】
実施形態において、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞であり、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞であり、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。実施形態において、前記薬剤は、（i）樹状細胞に由来する、タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソーム、または（ii）タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有する膜結合性組成物であり；前記薬剤は、（i）樹状細胞に由来し、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソーム、または（ii）Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有する膜結合性組成物である。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示される配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。実施形態において、前記薬剤は、Ｑａ−１／ＩｇＧ融合タンパク質であり、前記薬剤は、Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーであり、前記薬剤は、静脈内、筋肉内または経口的に投与される。
【００６７】
ヒトの患者において、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を増強または活性化するための方法が提供され、（i）Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）Ｑａ−１＋Ｔ細胞の表面上にＱａ−１により提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を増強または活性化する薬剤の有効量を患者に投与することを含んでなり、これにより、患者において、抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を増強または活性化する。
【００６８】
実施形態において、Ｑａ−１＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／Ｑａ−１＋Ｔ細胞であり、Ｑａ−１＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／Ｑａ−１＋Ｔ細胞であり、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。実施形態において、前記薬剤は、樹状細胞に由来し、タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＱａ−１を有するエキソソーム、またはタイプＢ自己ペプチドが負荷されたＱａ−１を有する膜結合性組成物であり；前記薬剤は、樹状細胞に由来し、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＱａ−１を有するエキソソームまたはＨｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＱａ−１を有する膜結合性組成物である。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。実施形態において、前記薬剤は、静脈内、筋肉内または経口的に投与される。
【００６９】
自己免疫疾患、移植片拒絶および細菌性の感染症から選択される障害に苦しんでいるヒト患者を治療するための方法が提供され、（i）ＨＬＡ−Ｅ依存性またはＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を増強または活性化する薬剤の治療的に有効な量を患者に投与することを含んでなり、それにより、患者を治療する。
【００７０】
実施形態において、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞であり、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞であり、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。実施形態において、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、１型糖尿病、乾癬、強皮症、全身性エリテマトーデスである。実施形態において、前記自己免疫疾患は、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳疾患、自己免疫リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労症候群免疫欠乏症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱脊髄性多発性神経障害、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素疾患、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、ドゴー病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、本態性混合性クリオグロブリン血症、繊維筋痛−筋炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺繊維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩＧＡネフロパシー、インスリン依存性糖尿病（１型）、若年性関節炎、ループス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、リウマチ様動脈炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎（temporal arteritis/giant cell arteritis）、潰瘍性結腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、ウェゲネル肉芽腫症である。
【００７１】
実施形態において、前記薬剤は、樹状細胞に由来する、タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソーム、またはタイプＢ自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有する膜結合性組成物である。実施形態において、前記薬剤は、樹状細胞に由来する、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソーム、またはＨｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有する膜結合性組成物。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示された配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。実施形態において、前記薬剤はＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質であり、前記薬剤はＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーである。１つの実施形態において、前記薬剤は、静脈内、筋肉内または経口的に投与される。
【００７２】
ヒトの患者において、自己免疫疾患、移植片拒絶および細菌性の感染症からなる群より選択される障害の発症を阻害するための方法が提供され、（i）ＨＬＡ−Ｅ依存性またはＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を増強または活性化する薬剤の予防的に有効な量を患者に投与することを含んでなり、それにより、患者を治療する。
【００７３】
実施形態において、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞であり、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞であり、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症および１型糖尿病からなる群より選択される。実施形態において、前記薬剤は、樹状細胞に由来する、タイプＢ自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソーム、またはタイプＢ自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有する膜結合性組成物である。実施形態において、前記薬剤は、（i）樹状細胞に由来する、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソーム、または（ii）Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有する膜結合性組成物である。
【００７４】
実施形態において、前記薬剤はＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質であり、前記薬剤はＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーである。１つの実施形態において、前記薬剤は、静脈内、筋肉内または経口的に投与される。
【００７５】
樹状細胞に由来する、自己ペプチドが負荷されたＱａ−１を有するエキソソームが提供される。１つの実施形態において、前記樹状細胞に由来するＱａ−１を有するエキソソームは、自己ペプチドを含んでなる。１つの実施形態において、Ｑａ−１は、エキソソームの表面上に発現または提示される。
【００７６】
実施形態において、エキソソームはタイプＢ自己ペプチドが負荷され、エキソソームはＨｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷される。
【００７７】
樹状細胞に由来する、自己ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ｅを有するエキソソームが提供される。１つの実施形態において、樹状細胞に由来するＨＬＡ−Ｅを有するエキソソームは、自己ペプチドを含んでなる。１つの実施形態において、ＨＬＡ−Ｅは、エキソソームの表面上に発現または提示される。
【００７８】
実施形態において、エキソソームはタイプＢ自己ペプチドが負荷され、エキソソームはＨｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷される。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。
【００７９】
Ｑａ−１を有し、タイプＢ自己ペプチドを含んでなる膜結合性組成物が提供される。１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドである。
【００８０】
ＨＬＡ−Ｅを有し、タイプＢ自己ペプチドを含んでなる膜結合性組成物が提供される。１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドである。
【００８１】
ＨＬＡ−Ｅ依存性またはＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害するための方法が提供され、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を阻害する薬剤と接触させることを含んでなり、それにより、抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する。
【００８２】
実施形態において、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞であり、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞であり、タイプＢ自己ペプチドはヒートショックプロテイン６０のリーダー配列（Ｈｓｐ６０ｓｐペプチド）である。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示される配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。実施形態において、前記薬剤は、タイプＢ自己ペプチドおよびＨＬＡ−Ｅを含んでなる複合体に特異的に結合する抗体であり、前記薬剤は、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドおよびＨＬＡ−Ｅを含んでなる複合体に特異的に結合する抗体である。
【００８３】
ここで述べられる抗体の実施形態において、前記抗体はモノクローナル抗体であり、前記抗体はヒト化抗体である。
【００８４】
「抗体」には、限定するものではないが、２つの重鎖および２つの軽鎖を含んでなり、抗原を認識する免疫グロブリン分子が含まれる。免疫グロブリン分子は、一般に既知のいずれかのクラスに由来してよく、限定するものではないが、ＩｇＡ、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭが含まれる。ＩｇＧサブクラスは当業者に周知であり、限定するものではないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれる。「抗体」には、例えば、自然発生および非自然発生の抗体；モノクローナルおよびポリクローナル抗体；キメラおよびヒト化抗体；ヒトまたは非ヒト抗体；完全に合成の抗体；および単鎖抗体が含まれる。非ヒト抗体は、ヒトにおけるその免疫原性を低下させるために、組み換え方法によりヒト化されてよい。抗体をヒト化するための方法は、当業者に周知である。「抗体」には、限定するものではないが、上述した免疫グロブリン分子のいずれかの断片または部分が含まれ、一価または二価の断片または部分が含まれる。抗体断片には、例えば、Ｆｃ断片および抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）が含まれる。
【００８５】
「モノクローナル抗体」は、ｍＡｂとも示され、その主要な配列が本質的に同一であり、同じ抗原特異性を示す抗体分子である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、トランスジェニックまたは当業者に既知の他の技術により作られてよい。
【００８６】
「ヒト化」抗体は、ＣＤＲ領域の外にあるいくつか、ほとんど、または全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子に由来する対応するアミノ酸で置換されている抗体を意味する。抗体のヒト化形態の１つの実施形態において、ＣＤＲ領域の外にあるいくつか、ほとんど、または全てのアミノ酸がヒト免疫グロブリン分子に由来するアミノ酸で置換されているが、１以上のＣＤＲ領域内のいくつか、ほとんど、または全てのアミノ酸は変化していない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾は、ある一定の抗原に結合する抗体の能力が消えない限り、許容される。適切なヒト免疫グロブリン分子には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭ分子が含まれる。「ヒト化」抗体は、本来の抗体と同様の抗原特異性を保持する。
【００８７】
当業者は、本発明のヒト化抗体をどのように作るかを知り得るであろう。いくつかは本明細書の一部として援用される種々の出版物にも、ヒト化抗体の作り方は記載されている。例えば、米国特許第4,816,567号に記載されている方法は、１つの抗体の可変領域および他の抗体の定常領域を有するキメラ抗体の製造を含む。
【００８８】
米国特許第5,225,539には、ヒト化抗体の産生に対する他のアプローチが記載されている。この特許では、ヒト化抗体を産生するために組み換えＤＮＡ技術を使用し、１つの免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲが、異なる特異性を有する免疫グロブリンに由来するＣＤＲで置き換えられることにより、ヒト化抗体は望ましい標的を認識し得るが、かなりの方法において、ヒト患者の免疫系によっては認識されない。特に、部位特異的な変異原性は、フレームワークへのＣＤＲの移植のために使用される。
【００８９】
抗体のヒト化のための他のアプローチは、米国特許第5,585,089(73)および5,693,761(74)、ならびにWO 90/07861に記載されており、ヒト化免疫グロブリンを産生するための方法が記載されている。これらは、ドナーの免疫グロブリンに由来する１以上のＣＤＲおよび可能な付加的なアミノ酸、ならびにアクセプターのヒト免疫グロブリンに由来するフレームワーク領域を有する。これらの特許は、望ましい抗原に対する抗体の親和性を増大させる方法についても述べている。フレームワークにおけるいくつかのアミノ酸は、アクセプターではなくドナーにおける同じ位置のアミノ酸と同一であるように選択される。特に、これらの特許は、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲと、ヒト免疫グロブリンフレームワークおよび定常領域とを結合することにより、受容体に結合するヒト化抗体を産生することについて述べている。ヒトフレームワーク領域は、マウス配列との相同性を最大にするように選択されてよい。コンピュータモデルは、ＣＤＲまたは特異的抗原と相互作用する可能性があるフレーム領域におけるアミノ酸を同定するために使用され、その後、マウスアミノ酸は、これらの位置において、ヒト化抗体を作るために使用され得る。
【００９０】
上述した特許5,585,089および5,693,761、ならびにWO 90/07861（75）は、ヒト化抗体の設計において使用され得る４つの可能な基準も提案している。第１の提案は、アクセプターについて、ヒト化されるドナーの免疫グロブリンと通常相同な特定のヒト免疫グロブリンに由来するフレームワークを使用すること、または多くのヒト抗体に由来するコンセンサスフレームワークを使用することである。第２の提案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワークにおけるアミノ酸が異常であり、その位置におけるドナーアミノ酸がヒト配列に対して典型的である場合、アクセプターではなくドナーのアミノ酸が選択され得るということである。第３の提案は、ヒト化された免疫グロブリン鎖における３つのＣＤＲにすぐ隣接する位置において、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸が選択され得るということである。第４の提案は、アミノ酸が抗体の３次元モデルにおけるＣＤＲの３Ａ内の側鎖原子を有することが予想され、ＣＤＲと相互作用できることが予想されるフレームワーク位置において、ドナーアミノ酸残基を使用することである。上記方法は、当業者がヒト化抗体を作るために使用し得るいくつかの方法を例示したに過ぎない、ヒト化抗体の親和性および／または結合特異性は、Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 284:151ならびに米国特許第6,165,793; 6,365,408および6,413,774に述べられているように、定方向の進化（directed evolution）の方法を用いて増大させることができる。
【００９１】
Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する方法が提供され、Ｑａ−１＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）Ｑａ−１＋Ｔ細胞の表面上にＱａ−１により提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を阻害する薬剤と接触させることを含んでなり、それにより、抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する。
【００９２】
実施形態において、Ｑａ−１＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／Ｑａ−１＋Ｔ細胞であり、Ｑａ−１＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／Ｑａ−１＋Ｔ細胞であり、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドであり、前記薬剤は、タイプＢ自己ペプチドおよびＱａ−１を含んでなる複合体と特異的に結合する抗体であり、前記薬剤は、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドおよびＱａ−１を含んでなる複合体と特異的に結合する抗体である。
【００９３】
ヒト患者において、ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する方法が提供され、（i）ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を阻害する薬剤の有効量を患者に投与することを含んでなり、それにより、患者において、抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する。
【００９４】
実施形態において、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞であり、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞であり、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。実施形態において、前記薬剤は、タイプＢ自己ペプチドおよびＨＬＡ−Ｅを含んでなる複合体に特異的に結合する抗体であり、前記薬剤は、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドおよびＨＬＡ−Ｅを含んでなる複合体に特異的に結合する抗体であり、前記薬剤は、静脈内、筋肉内または経口的に投与される。
【００９５】
過剰なＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される免疫抑制により特徴付けられる障害に苦しんでいるヒト患者を治療するための方法が提供され、（i）ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を阻害する薬剤の治療的に有効な量を患者に投与することを含んでなり、それにより患者を治療する。
【００９６】
実施形態において、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ４＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞であり、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はＣＤ８＋／ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞であり、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドであり、前記薬剤は、タイプＢ自己ペプチドおよびＨＬＡ−Ｅを含んでなる複合体に特異的に結合する抗体であり、前記薬剤は、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドおよびＨＬＡ−Ｅを含んでなる複合体に特異的に結合する抗体である。実施形態において、前記患者はＡＩＤＳに苦しんでおり、前記患者は腫瘍に苦しんでおり、前記患者は、以前に、腫瘍ワクチンまたは自己Ｔ細胞治療を受けている。実施形態において、前記薬剤は、静脈内、筋肉内または経口的に投与される。
【００９７】
Ｑａ−１により提示されるタイプＢ自己ペプチドに特異的に結合する単離された抗体が提供される。１つの実施形態において、前記抗体は、Ｑａ−１により提示されるＨｓｐ６０ｓｐペプチドに特異的に結合する。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。１つの実施形態において、前記抗体はモノクローナル抗体である。
【００９８】
タイプＢ自己ペプチドおよびＱａ−１を含んでなる複合体に特異的に結合する単離された抗体が提供される。１つの実施形態において、前記タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。
【００９９】
ＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドに特異的に結合する単離された抗体が提供される。１つの実施形態において、前記抗体は、ＨＬＡ−Ｅにより提示されるＨｓｐ６０ｓｐペプチドに特異的に結合する。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。１つの実施形態において、前記抗体はモノクローナル抗体である。
【０１００】
タイプＢ自己ペプチドおよびＨＬＡ−Ｅを含んでなる複合体に特異的に結合する単離された抗体が提供される。１つの実施形態において、前記タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。
【０１０１】
（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上にＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を増強または活性化するような、ＨＬＡ−Ｅ／タイプＢペプチド複合体に結合する単離された抗体が提供され、それにより、抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御が増強または活性化される。
【０１０２】
本質的に、膜結合性または脂質可溶性のＨＬＡ−Ｅおよびそれに結合するタイプＢ自己ペプチドからなる組成物が提供される。１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。
【０１０３】
本質的に、（i）膜結合性または脂質可溶性のＨＬＡ−Ｅおよびそれに結合するタイプＢ自己ペプチド、ならびに（ii）薬学的に許容可能なキャリアからなる組成物が提供される。
【０１０４】
本質的に、膜結合性または脂質可溶性のＱａ−１およびそれに結合するタイプＢ自己ペプチドからなる組成物が提供される。１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。
【０１０５】
本質的に、（i）膜結合性または脂質可溶性のＱａ−１およびそれに結合する自己ペプチド、ならびに（ii）薬学的に許容可能なキャリアからなる組成物が提供される。薬学的に許容可能なキャリアおよびＱａ−１により提示されるタイプＢ自己ペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる組成物が提供される。１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。薬学的に許容可能なキャリアおよびＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなる組成物が提供される。１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。
【０１０６】
説明したエキソソームおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物が提供される。説明したエキソソームおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物が提供される。
【０１０７】
ＣＤ８＋Ｔ細胞がＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞であるかどうかを決定するための方法が提供され、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＱａ−１により提示されるタイプＢ自己ペプチドと接触させること、およびＣＤ８＋Ｔ細胞とタイプＢ自己ペプチドとの間で結合が生じるか否かを決定することを含んでなり、結合は、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞であることを示す。
【０１０８】
１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。１つの実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドは、（i）樹状細胞に由来する、Ｑａ−１を有するエキソソームまたは（ii）Ｑａ−１を有する膜結合性組成物上に存在するＱａ−１により提示される。
【０１０９】
ＣＤ８＋Ｔ細胞がＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞であるかどうかを決定するための方法が提供され、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドと接触させること、およびＣＤ８＋Ｔ細胞とタイプＢ自己ペプチドとの間で結合が生じるか否かを決定することを含んでなり、結合は、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞であることを示す。
【０１１０】
１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドはＨｓｐ６０ｓｐペプチドである。１つの実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドは、（i）樹状細胞に由来する、ＨＬＡ−Ｅを有するエキソソームまたは（ii）ＨＬＡ−Ｅを有する膜結合性組成物上に存在するＨＬＡ−Ｅにより提示される。
【０１１１】
Ｔ細胞含有サンプル中に存在するＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するための方法が提供され、
（ａ）タイプＢ自己ペプチドとサンプル中のＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞との結合が可能な条件下で、固定化されたＱａ−１提示タイプＢ自己ペプチドとサンプルとを接触させる工程と；
（ｂ）非結合性のＴ細胞を除去する工程と；
（ｃ）固定化されたタイプＢ自己ペプチドから結合性のＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離する工程と
を含んでなり、それにより、サンプルからＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する。
【０１１２】
１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドは、配列番号２で示されるヒートショックプロテイン６０のシグナルペプチドを含んでなる。
【０１１３】
Ｔ細胞含有サンプル中に存在するＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するための方法が提供され、
（ａ）タイプＢ自己ペプチドとサンプル中のＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞との結合が可能な条件下で、固定化されたＨＬＡ−Ｅ提示タイプＢ自己ペプチドとサンプルとを接触させる工程と；
（ｂ）非結合性のＴ細胞を除去する工程と；
（ｃ）固定化されたタイプＢ自己ペプチドから結合性のＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離する工程と
を含んでなり、それにより、サンプルからＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する。
【０１１４】
１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドは、配列番号２で示されるヒートショックプロテイン６０のリーダーペプチドを含んでなる。
【０１１５】
Ｈｓｐ６０ｓｐについて述べている上述した実施形態のそれぞれにおいて、構造的に関連するペプチドをＨｓｐ６０ｓｐの代わりに使用することができる。
【０１１６】
Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中間の結合活性の抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御に対する増強剤としての薬剤を同定する方法が提供され、
ａ）抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞およびＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する工程と；
ｂ）抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞をＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させる工程と；
ｃ）抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を定量化する工程と；
ｄ）薬剤の存在下で、工程ｂ）およびｃ）を繰り返す工程と；
ｅ）工程ｄ）において定量された下方制御と、工程ｃ）において定量された下方制御とを比較する工程と
を含んでなり、工程ｄ）において定量された下方制御が工程ｃ）において定量されたものよりも大きい場合、前記薬剤が、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中間の結合活性の抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御に対する増強剤であることを示す。
【０１１７】
ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中間の結合活性の抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御に対する増強剤としての薬剤を同定する方法が提供され、
ａ）抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞およびＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する工程と；
ｂ）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞をＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させる工程と；
ｃ）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を定量化する工程と；
ｄ）薬剤の存在下で、工程ｂ）およびｃ）を繰り返す工程と；
ｅ）工程ｄ）において定量された下方制御と、工程ｃ）において定量された下方制御とを比較する工程と
を含んでなり、工程ｄ）において定量された下方制御が工程ｃ）において定量されたものよりも大きい場合、前記薬剤が、ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中間の結合活性の抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御に対する増強剤であることを示す。
【０１１８】
Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中間の結合活性の抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御に対する阻害剤としての薬剤を同定する方法が提供され、
ａ）活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞およびＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する工程と；
ｂ）活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞をＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させる工程と；
ｃ）活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を定量化する工程と；
ｄ）薬剤の存在下で、工程ｂ）およびｃ）を繰り返す工程と；
ｅ）工程ｄ）において定量された下方制御と、工程ｃ）において定量された下方制御とを比較する工程と
を含んでなり、工程ｄ）において定量された下方制御が工程ｃ）において定量されたものよりも小さい場合、前記薬剤が、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中間の結合活性の抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御に対する阻害剤であることを示す。
【０１１９】
ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中間の結合活性の抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御に対する阻害剤としての薬剤を同定する方法が提供され、
ａ）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞およびＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する工程と；
ｂ）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞をＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させる工程と；
ｃ）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を定量化する工程と；
ｄ）薬剤の存在下で、工程ｂ）およびｃ）を繰り返す工程と；
ｅ）工程ｄ）において定量された下方制御と、工程ｃ）において定量された下方制御とを比較する工程と
を含んでなり、工程ｄ）において定量された下方制御が工程ｃ）において定量されたものよりも小さい場合、前記薬剤が、ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中間の結合活性の抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御に対する阻害剤であることを示す。
【０１２０】
１つの実施形態において、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はヒトＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である。１つの実施形態において、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞はヒトＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞である。１つの実施形態において、前記薬剤はモノマーペプチドである。１つの実施形態において、前記モノマーペプチドは、Ｐ２にメチオニンまたはロイシン、Ｐ９にロイシンを有する。
【０１２１】
本発明は、ＨＬＡ−Ｅ依存性またはＨＬＡ−Ｅ制限性ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する方法も提供され、核酸をＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞に導入することにより、（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の表面上のＨＬＡ−Ｅにより提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を阻害することを含んでなり、それにより、抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する。１つの実施形態において、前記核酸はｓｉＲＮＡである。もう１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡは１本鎖のヘアピンｓｉＲＮＡである。もう１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡは２本鎖のｓｉＲＮＡである。１つの実施形態において、前記核酸はＤＮＡザイムである。もう１つの実施形態において、前記核酸はリボザイムである。もう１つの実施形態において、前記核酸はアンチセンス分子である。１つの実施形態において、前記核酸は、ＨＬＡ−Ｅの発現を阻害する。もう１つの実施形態において、前記核酸は、Ｔ細胞受容体の発現を阻害する。もう１つの実施形態において、前記核酸は、タイプＢ自己ペプチドの発現を阻害する。
【０１２２】
本発明は、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する方法も提供され、核酸をＱａ−１＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞に導入することにより、（i）ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（ii）Ｑａ−１＋Ｔ細胞の表面上のＱａ−１により提示されるタイプＢ自己ペプチドとの間の結合を阻害することを含んでなり、それにより、抗原活性化Ｑａ−１＋Ｔ細胞の下方制御を阻害する。１つの実施形態において、前記核酸はｓｉＲＮＡである。もう１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡは１本鎖のヘアピンｓｉＲＮＡである。もう１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡは２本鎖のｓｉＲＮＡである。１つの実施形態において、前記核酸はＤＮＡザイムである。もう１つの実施形態において、前記核酸はリボザイムである。もう１つの実施形態において、前記核酸はアンチセンス分子である。１つの実施形態において、前記核酸は、Ｑａ−１の発現を阻害する。もう１つの実施形態において、前記核酸は、Ｔ細胞受容体の発現を阻害する。もう１つの実施形態において、前記核酸は、タイプＢ自己ペプチドの発現を阻害する。
【０１２３】
１つの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなる。ＲＮＡ干渉（以下、「ＲＮＡｉ」とする）は、多くの真核生物全体にわたって保存されている転写後の遺伝子制御の方法である。ＲＮＡｉは、細胞に存在する短い（すなわち、＜３０ヌクレオチド）２本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子により誘導される（Fire, A. et al. (1998), Nature 391: 806-811）。これらの「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」と呼ばれる短いｄｓＲＮＡ分子は、配列相同性をｓｉＲＮＡと共有するメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）を１ヌクレオチド以内に分解する破壊を引き起こす（Elbashir, S. M. et al. (2001), Genes Dev, 15: 188-200）。ｓｉＲＮＡおよび標的化ｍＲＮＡは、「ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体」または「ＲＩＳＣ」と結合し、標的化ｍＲＮＡを切断すると考えられている。ｓｉＲＮＡは、明らかに、複数代謝回転の酵素のように再利用され、１のｓｉＲＮＡ分子は、約１０００のｍＲＮＡ分子の切断を引き起こすことができる。ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡに媒介されるＲＮＡｉ分解は、それ故、標的遺伝子の発現を阻害するための現在利用可能な技術よりも効率的である。
【０１２４】
上記Elbashir, S. M. et al. (2001)は、２１および２２ヌクレオチド長であり、短い３’オーバーハングを有する合成ｓｉＲＮＡが、ショウジョウバエ細胞ライセートにおいて標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを誘発できることを示している。培養された哺乳類細胞も、合成ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡｉ分解を示し（Elbashir, S. M. et al.(2001) Nature, 411: 494-498）、合成ｓｉＲＮＡにより誘発されるＲＮＡｉ分解は、近年、生きているマウスにおいても見られた（McCaffrey, A. P. et al. (2002), Nature, 418: 38-39: Xia, H. et al. (2002), Nat. Biotech., 20: 1006-1010）。ｓｉＲＮＡに誘発されるＲＮＡｉ分解の治療的なポテンシャルは、最近のいくつかのインビトロ研究において示され、ＨＩＶ−１感染のｓｉＲＮＡに方向付けられた阻害（Novina, C. D. et al. (2002), Nat. Med. 8: 681-686）および神経毒性のポリグルタミン疾患タンパク質発現の減少（上記Xia, H. et al. (2002)）が含まれる。１つの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、２１または２２ヌクレオチド長である。遺伝子サイレンシング技術に対する方法および組成物は、本明細書の一部として援用される米国特許第6,573,099; 6,506,599; 7,109,165; 7,022,828; 6,995,259; 6,617,438; 6,673,611; 6,849,726; および6,818,447に記載されている。
【０１２５】
ＨＬＡ−Ｅ拘束性制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に活性化する方法が提供され、ＨＬＡ−Ｅ拘束性制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞をＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーまたはＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質と接触させ、ＨＬＡ−Ｅ拘束性制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に活性化することを含んでなる。
【０１２６】
１つの実施形態において、ＨＬＡ−Ｅ拘束性制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーと接触させる。１つの実施形態において、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質と接触させる。
【０１２７】
抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞を阻害する方法が提供され、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞をＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーまたはＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質と接触させることを含んでなり、それによりＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞を阻害する。
【０１２８】
１つの実施形態において、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーと接触させる。１つの実施形態において、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質と接触させる。
【０１２９】
患者において、自己免疫疾患を治療する方法が提供され、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するのに有効な量の薬剤を患者に投与し、患者において活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞を阻害することを含んでなり、それにより、自己免疫疾患を治療する。
【０１３０】
１つの実施形態において、前記薬剤は、ＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーまたはＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質である。
【０１３１】
自己免疫疾患治療の効果を測定する方法が提供され：
ａ）治療前の患者から得られる第１のサンプル中の活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞を定量する工程と；
ｂ）自己免疫疾患治療で患者を治療する工程と；
ｃ）治療後の患者から得られる第２のサンプル中の活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞を定量する工程と；
ｄ）工程ａ）およびｃ）で定量された活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞のレベルを比較する工程と
を含んでなり、工程ａ）よりも工程ｃ）で定量されたレベルが低い場合、自己免疫疾患治療が有効であることを示す。
【０１３２】
１つの実施形態において、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、１型糖尿病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳疾患、自己免疫リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労症候群免疫欠乏症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱脊髄性多発性神経障害、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素疾患、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、ドゴー病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、本態性混合性クリオグロブリン血症、繊維筋痛−筋炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺繊維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩＧＡネフロパシー、若年性関節炎、ループス、メニエール病、混合性結合組織病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎（temporal arteritis/giant cell arteritis）、潰瘍性結腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、ウェゲネル肉芽腫症である。
【０１３３】
１つの実施形態において、活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞は、サンプルをＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーまたはＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質と接触させ、ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞とＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーまたはＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧ融合タンパク質との結合を定量することにより定量される。１つの実施形態において、ＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーまたはＨＬＡ−Ｅ／ＩｇＧは、固定化される。１つの実施形態において、前記サンプルは、患者の血液に由来するか、または患者のリンパに由来する。
【０１３４】
抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞および／またはＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用する上述した方法の全ての実施形態において、前記細胞はヒトのものである。上述した方法の実施形態において、前記患者はヒトである。
【０１３５】
ここで開示する方法は、自己免疫疾患の制御および／または寛解を可能にし、共通の標的構造による所定の自己免疫疾患に関与する特定の自己抗原の知識から独立して達成され得る。それ故、自己免疫疾患の標的抗原を同定することなく、疾患を治療することができる。
【０１３６】
自己免疫疾患を治療するための医薬を製造する方法が提供され：
ｃ）ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞と抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞との間の結合を増強する薬剤を同定する工程と；
ｄ）工程ａ）で同定された薬剤を薬学的に許容可能なキャリアと混合することにより医薬を製造する工程と
を含んでなる。
【０１３７】
前記方法の１つの実施形態において、i）抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞およびＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する工程と；ii）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞をＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させる工程と；iii）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を定量する工程と；iv）前記工程ii）およびiii）を薬剤の存在下で繰り返す工程と；v）工程iv）において定量された下方制御と工程iii）において定量された下方制御とを比較する工程とにより、工程ａ）における結合を増強する薬剤を同定し、工程iv）において定量された下方制御が工程iii）において定量されたものよりも大きい場合、薬剤は、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を増強すると同定される。
【０１３８】
中間の結合活性の抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞により媒介される免疫応答を増強するための医薬を製造する方法が提供され：
ｅ）ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞と抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞との間の結合を阻害する薬剤を同定する工程と；
ｄ）工程ａ）で同定された薬剤を薬学的に許容可能なキャリアと混合することにより医薬を製造する工程と
を含んでなる。
【０１３９】
前記方法の１つの実施形態において、i）抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞およびＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供する工程と；ii）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞をＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させる工程と；iii）活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を定量する工程と；iv）前記工程ii）およびiii）を薬剤の存在下で繰り返す工程と；v）工程iv）において定量された下方制御と工程iii）において定量された下方制御とを比較する工程とにより、工程ａ）における結合を阻害する薬剤を同定し、工程iv）において定量された下方制御が工程iii）において定量されたものよりも小さい場合、薬剤は、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原活性化ＨＬＡ−Ｅ＋Ｔ細胞の下方制御を阻害すると同定される。
【０１４０】
膜結合性ＨＬＡ−Ｅまたは脂質可溶性ＨＬＡ−Ｅおよびそれらに結合するタイプＢ自己ペプチドを含んでなるワクチン組成物が提供される。１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドは、配列番号１５に示す配列を有し、ここでの１および３〜８位のＸａａは、独立に、いずれかのアミノ酸である。
【０１４１】
（i）膜結合性ＨＬＡ−Ｅまたは脂質可溶性ＨＬＡ−Ｅおよびそれらに結合するタイプＢ自己ペプチド、および（ii）薬学的に許容可能なキャリアを含んでなるワクチン組成物が提供される。１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドは、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドまたは構造的に関連するペプチドである。さらなる実施形態において、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、配列番号２に示す配列を有する連続的なアミノ酸を含んでなる。１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドは、配列番号１５に示す配列を有する。
【０１４２】
上述した方法の工程は、異なる人により行われてよく、異なる場所において行われてよいと解される。
【０１４３】
上述した方法、組成物および工程において、ＨＬＡ−Ｅ／タイプＢ自己ペプチドテトラマーは、列挙したＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐテトラマーに置換されてよい。１つの実施形態において、タイプＢ自己ペプチドは、配列番号１５に示す配列を有する。
【０１４４】
Ｈｓｐ６０ｓｐは、配列ＱＭＲＰＶＳＲＡＬ（配列番号２）を有する。  
ここで述べられる方法、組成物および工程の種々の要素の全ての組み合わせは、本発明の範囲内である。
【０１４５】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することにより、より理解されるが、当業者は、特定の実験の詳細は、添付の特許請求に範囲においてより完全に記載されるように、本発明を説明するにすぎないことを容易に理解するであろう。
【０１４６】
実験の詳細
Ｑａ−１に結合する主なペプチドは、ＭＨＣクラスＩａ分子のリーダー配列に由来する疎水性ペプチドであるＱｄｍであることが既知である（９５−９８）。このペプチド（ＡＭＡＰＲＴＬＬＬ）（配列番号１）は、高い親和性で結合し、ＮＫ細胞上でＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに対して複合し、ＮＫ活性を阻害するＱａ−１に関連するペプチドの大多数を説明する（９８，９９）。全てのＧａ−１／ＨＬＡ−Ｅ結合ペプチドは、モノマーである。ＱｄｍまたはＱｄｍ様ペプチドは、タイプＡペプチドと定義される。しかしながら、Ｑａ−１は、熱ショックタンパク質（１００）およびプレプロインスリンリーダー配列（１０１）に由来するものを含む他の自己ペプチドにも結合し得る。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ（７７）に結合しないＱａ−１結合ペプチドは、タイプＢペプチドに分類される。
【０１４７】
ここで、熱ショックタンパク質６０（Ｈｓｐ６０ｓｐ）のリーダー配列に由来し、ＭＨＣクラスＩｂ分子であるＱａ−１により提示されるシグナルペプチドが、代理の標的構造であり、好ましくは、中間の活性のＴ細胞上により高いレベルで発現され、特に、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識されることが開示されている。それ故、独特のメカニズムとして、Ｔ細胞活性化の結合活性を認めることは、インビボでの末梢性Ｔ細胞制御に変換され、どのように末梢性自己寛容が維持されているかを理解する新規の概念を提供する。この概念の生物学的な有意性は、以下に、実験的なアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおいて、Ｈｓｐ６０ｓｐ負荷した適切な樹状細胞（ＤＣ）が、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される自己免疫性脳疾患からの有意な保護を引き起こすことができることにより示される。
【０１４８】
Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、最初、疾患の第１の症状により引き起こされる自己免疫性の実験的なアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対する耐性を媒介する制御因子として同定された（３および４）。ＥＡＥ進行のより重篤な症状は、ずっと制御不可能な態様で、ＣＤ８−／−におけるＥＡＥの再発（４）またはＱａ−１−／−マウスにおけるＥＡＥの再誘導の間、これらのＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、末梢性の自己寛容の維持において重要な役割を果たすことを示している。
【０１４９】
多数の自己抗原と反応する高い結合活性のＴ細胞クローンの胸腺内での除去は、中間および低い結合活性のクローンのみからなり、異物反応性のレパートリーと比較して高い結合活性のクローンを欠く、切断された末梢性の自己応答性レパートリーを生じる。潜在的に病原性の自己応答性Ｔ細胞は、胸腺において除去されたものより低い結合活性を有するが、胸腺のネガティブセレクションの閾値に近い高い末端から非常に低い末端までの広い範囲をカバーする中間の結合活性の胸腺の逸脱者のプールに含まれ、胸腺の逸脱者は、末梢で活性化され、自己免疫疾患を惹起する（７および８）。
【０１５０】
結果として生じる自己と外来の抗原に対する末梢性Ｔ細胞レパートリーの特徴的な組成は、自己および外来の抗原の両方に対して中間の結合活性を有するＴ細胞を選択的に下方制御することにより、末梢において、免疫系に対して自己と非自己を区別する特有の機会を提供する。潜在的に病原性の自己応答性Ｔ細胞を含む中間の結合活性のＴ細胞集団を選択的に下方制御することは、免疫系が、大部分が外来の病原体に特異的な高い結合活性のＴ細胞により媒介される進行中の抗感染性免疫を障害することなく、自己免疫疾患を特異的に制御することを可能にする。
【０１５１】
そのようなアクションを説明する分子および細胞のメカニズムは、中間の結合活性のＴ細胞活性化の作用として、標的細胞上に発現した特定のＱａ−１／自己ペプチド複合体を制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞が特異的に認識することであると仮定された（１および２）。
【０１５２】
この仮定を試験するために、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による下方制御に感受性が高い活性化Ｔ細胞を与えるＱａ−１結合ペプチドを同定することが重要であった。ＭＨＣクラスＩｂ分子Ｑａ−１に結合する主なペプチドは、ＭＨＣクラスＩａ分子のリーダー配列に由来する疎水性のペプチドであるＱｄｍである（９および１０）。このペプチドは、高い親和性で結合し、Ｑａ−１に関連するペプチドの大多数を説明する。Ｑａ−１／Ｑｄｍは、ＮＫ細胞上でＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａと相互作用し、ＮＫ活性を阻害する（１１）。ここで、ＱｄｍまたはＱｄｍ様ペプチドは、「タイプＡ」ペプチドに分類される。タイプＡペプチドは、Ｑａ−１またはＨＬＡ−Ｅと結合した場合にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａと相互作用し、ＮＫ活性を阻害する。しかしながら、Ｑａ−１は他の自己ペプチドとも結合することができ、熱ショックタンパク質（１２）およびプレプロインスリンリーダー配列（１３）に由来するものが含まれる。この点において、ヒトの研究は、ストレスタンパク質Ｈｓｐ６０（Ｈｓｐ６０ｓｐ）のリーダー配列に由来するシグナルペプチドが、Ｑａ−１のヒト対応物であるＨＬＡ−Ｅの占有について、Ｑｄｍのヒト対応物であるＢ７ｓｐｐｔペプチドと競合できることを示している（１４）。結果として得られるＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐ複合体は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａと相互作用せず、それ故、ＮＫ活性を阻害することはできない。
【０１５３】
ここで、Ｑａ−１と結合した場合にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａと相互作用しないＱａ−１結合ペプチドは、「タイプＢ」ペプチドに分類される。Ｑａ−１との結合についてＱｄｍと競合できるタイプＢＱａ−１結合ペプチドのいくつかは、優先的に中間の結合活性のＴ細胞上に発現し、Ｑａ−１依存性制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する特異的な標的として役立つ。
【０１５４】
Ｔ細胞クローンにおけるｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方について、Ｑａ−１ならびにＨｓｐ６０およびＭＨＣクラスＩａ（Ｈ−２Ｄｄ）分子の発現の比較が行われた。これらの分子は、Ｔ細胞活性化の間に、Ｈｓｐ６０ｓｐおよびＱｄｍ（１５）ペプチドをそれぞれ産生することができる。以前に同定されたＱａ−１ｂ株Ｂａｌｂ／ｃマウスから確立されたＨＥＬ−特異的Ｔ細胞クローンのパネル（１）が使用された。図２、３ならびに表１および２は、ＨＥＬに対する結合活性の範囲を示すために、２８のＨＥＬ特異的なクローンから選択される７の代表的なＴ細胞クローンを挙げている。以前に報告したように、前記クローンは、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による下方制御に対して異なる感受性を有する（１）。
【０１５５】
表１は、Ｈｓｐ６０ｓｐ（Ｑｄｍではない）を負荷した樹状細胞を接種されたマウスが、その後のＥＡＥの誘導から有意に保護されるという実験から得られる結果を示す。対照：接種なしで、ＥＡＥの進行を誘発されるマウス。実験３および４において、マウスは、ＥＡＥ誘発の前に、抗ＣＤ８ ｍＡＢ ５３−６．７２に対する対照として、対照ラットＩｇで処理された。ＤＣ ｗ／Ｈｓｐ６０ｓｐ：ＥＡＥ誘発の前に、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドが負荷されたＤＣを注入されたマウス。ＤＣ ｗ／Ｑｄｍ：ＥＡＥ誘発の前に、Ｑｄｍペプチドが負荷されたＤＣを注入されたマウス。ＣＤ８−ＤＣ ｗ／Ｈｓｐ６０ｓｐ：マウスは、方法に示すように、ＤＣ接種後１週間およびＥＡＥ誘発前３日間、抗ＣＤ８ ｍＡＢ ５３−６．７２の注入によりＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた。
【表１】
2010519256.tif 000002
【０１５６】
リアルタイムＰＣＲアッセイにおける、ＨＥＬ特異的なクローン間の遺伝子発現の比較。  
リアルタイムＰＣＲは、記載されているように１０μＭの特異的抗原ＨＥＬによりＴ細胞クローンを活性化した６０時間後に行った（１）。表は、３つの異なる実験の１つを表す。  
＊遺伝子発現指数：同一の細胞におけるある一定の遺伝子とβアクチンとの間の遺伝子発現の比。  
∞Ｈ／Ｍ遺伝子発現比は、Ｈｓｐ６０とＭＨＣクラスＩａ（Ｈ−２Ｄｄ）の間の遺伝子発現指数の比である。  
◇Ｈ／Ｍ／Ｑａ−１遺伝子指数は、Ｈ／Ｍ遺伝子発現比×Ｑａ−１の遺伝子発現指数で計算され、遺伝子発現レベルでＱａ−１に対して標準化されたＨｓｐ６０とＭＨＣクラスＩａ（Ｈ−２Ｄｄ）との比を表す。
【表２】
2010519256.tif 000003
【０１５７】
ウェスタンブロッティングアッセイにおけるＨＥＬ特異的クローン間のタンパク質発現の比較。  
ウェスタンブロッティングアッセイは、記載されているように１０μＭの特異的抗原ＨＥＬによりＴ細胞クローンを活性化した７２時間後に行った（１）。表は、３つの異なる実験の１つを表す。  
＊タンパク質発現指数：同一の細胞におけるある一定のタンパク質とβ−アクチンとの間のタンパク質発現の比。
【０１５８】
∞Ｈ／Ｍタンパク質発現比は、Ｈｓｐ６０とＭＨＣクラスＩａ（Ｈ−２Ｄｄ）の間のタンパク質発現指数の比である。  
◇Ｈ／Ｍ／Ｑａ−１タンパク質指数は、Ｈ／Ｍタンパク質発現比×Ｑａ−１のタンパク質発現指数で計算され、タンパク質発現レベルでＱａ−１に対して標準化されたＨｓｐ６０とＭＨＣクラスＩａ（Ｈ−２Ｄｄ）との比を表す。
【０１５９】
Ｈｓｐ６０とＭＨＣクラスＩａの発現の比は、Ｔ細胞活性化の結合活性の作用としてＱａ−１の発現に関して測定され、試験される各Ｔ細胞クローンにおけるＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐとＱａ−１／Ｑｄｍの相対的な発現を反映するために、Ｈ／Ｍ／Ｑａ−１遺伝子またはタンパク質指数が計算された。
【０１６０】
リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、Ｈ／Ｍ／Ｑａ−１遺伝子指数は、２つの高い結合活性のクローン９Ｅ４および１９Ｆ６（Ｐ＜０．００１）ならびに３つの低い結合活性のクローン１２Ｄ７、１３Ｆ２および４４Ｈ７（Ｐ＜０．００１）と比較して、２つの中間の結合活性のクローン１０Ｈ９および１３Ｃ７において有意に高かった（図２および表１）。同様に、タンパク質発現のレベルについて、Ｈ／Ｍ／Ｑａ−１タンパク質指数も、ウェスタンブロッティングにおいて、高いおよび低い結合活性のクローンよりも中間の結合活性の場合に有意に高かった（図３、４および表２）。この一連の結果は、先行するインビボおよびインビトロの研究において観察されたＴ細胞制御の特定のパターンと関連し、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、高いまたは低い結合活性のＴ細胞ではなく、中間の結合活性のＴ細胞を選択的に下方制御することを示している（１）。重要なことは、同じクローンが１μＭ〜５０μＭの範囲の異なる用量の抗原で活性化された場合に得られるＨ／Ｍ／Ｑａ−１タンパク質指数の間に有意な差がないことである（図５）。合わせて考えると、これらの知見は、Ｔ細胞におけるＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐとＱａ−１／Ｑｄｍの間のより高い発現比は、中間の結合活性のＴ細胞活性化の作用であり、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による下方制御に対するＴ細胞の感受性を決定し得るという仮説を支持する。
【０１６１】
この仮説をさらに試験するために、続いて、自己免疫疾患モデルと関連してＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞の生物学を分子レベルでより理解するために、Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐが実際に制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される特異的な標的構造であるのかどうかを、ＥＡＥ感受性Ｑａ−１ａ株Ｂ１０ＰＬにおいて決定した。Ｑａ−１ａとＱａ−１ｂとの間の違いのほとんどは、末梢から結合間隙に位置し、これら２つの分子は、構造的に類似のペプチドと会合することが既知である（１６）。Ｑｄｍ（ＡＭＡＰＲＴＬＬＬ）（配列番号１）は、Ｂ１０ＰＬマウスにおいて「タイプＢ」ペプチドの関係および機能を評価するための研究において、モデル「タイプＡ」ペプチドとして使用された。Ｑａ−１ａ発現細胞は、組み換えマウスＱａ−１ａｃＤＮＡをヒトＢ細胞株Ｃ１Ｒに形質移入することにより確立された。ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるＱａ−１ａ陽性トランスフェクタントの１つである３Ｆ４は、細胞が２６℃で外来性のＱａ−１で受動的に感作された場合、表面にＱａ−１ａを発現することが可能であった（図６）。それ故、３Ｆ４は、Ｈｓｐ６０ｓｐ（ＱＭＲＰＶＳＲＡＬ）（配列番号２）がＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する特異的な標的として役立つかどうかを試験するためのＱａ−１結合ペプチド提示細胞として選択された。
【０１６２】
ペプチドのＱａ−１に対する結合の能力は、第１に、３Ｆ４細胞上でＱａ−１の表面発現を安定化するそれらの能力により評価された。３Ｆ４細胞は、２４℃で約１８時間、Ｈｓｐ６０ｓｐまたはＱｄｍペプチドと共にインキュベートされ、Ｑａ−１非結合性ペプチドＨＥＬ７４−９６は、対照ペプチドとした（１２、１４および１７）。図６に示すように、２６℃における外来性のペプチドの結合は、ＦＡＣＳにより分析されるＱａ−１ａ表面染色の強度においてシフトを生じる。この結果は、Ｑｄｍだけでなく、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドのような他のペプチドもＱａ−１に結合し得ることを示した。
【０１６３】
かなりの数のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現するため、活性化マウスＴ細胞において産生されるＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐが機能的なＮＫアッセイにおいてＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａと相互作用できるかどうかが検討された。図７に示すように、対照のＱａ−１非結合ペプチドを負荷した３Ｆ４細胞は、ＮＫ死滅（killing）に対する感受性の標的である。対照的に、Ｈｓｐ６０ｓｐではなくＱｄｍを負荷した３Ｆ４細胞は、ＮＫ死滅に対して耐性であり、Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐ（１４）ではなくＱａ−１／Ｑｄｍ（１１）がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａと相互作用し、ＮＫ活性の阻害を生じるという先行する報告と一致する。これは、ヒト（１４）およびマウスの両方において、２つのタイプのＱａ−１／ＨＬＡ−Ｅ結合ペプチドがそのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａとの相互作用の能力により区別され得るという考えとも一致する。
【０１６４】
Ｑａ−１との結合についてＱｄｍと競合するＨｓｐ６０ｓｐの能力は、機能的なＮＫアッセイにおいてさらに試験された。図８に示すように、対照ペプチドではなくＨｓｐ６０ｓｐペプチドが、用量依存性の態様でＱｄｍによる３Ｆ４のＮＫ死滅の保護を抑制し、Ｈｓｐ６０ｓｐがＱａ−１との結合についてＱｄｍと競合できることを示す。この結果は、ヒトにおける研究において示された、ヒトＨｓｐ６０ｓｐがＨＬＡ−Ｅとの結合についてＨＬＡクラスＩａリーダー配列Ｂ７ｓｐのシグナルペプチドと競合できるという知見と一致する（１４）。
【０１６５】
次に、Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐが制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する標的となるかどうかが試験された。これに関して、ＣＤ８＋Ｔ細胞が中間の結合活性のＴ細胞クローンを選択的に下方制御し（１）、ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される抑制は、種々の実験の設定において、Ｑａ−１拘束性であることが以前に示されている（１、５、８、１８および１９）。Ｑａ−１発現３Ｆ４細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞阻害アッセイにおいてＨｓｐ６０ｓｐが制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞により優先的に認識されるかどうかを試験するために、Ｑａ−１ペプチド提示細胞として使用された。インビボでＥＡＥを誘発できる（８、１９）１−９ＮａｃＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）特異的な、中間の結合活性のクローン１ＡＥ１０は、陽性対照として使用され、対照の非Ｑａ−１結合ペプチドまたはＱｄｍを負荷した非脳炎惹起性の低い結合活性のクローン４Ｄ１０ならびに３Ｆ４は、陰性対照として使用した。４Ｄ１０ではなく１ＡＥ１０クローンは、ＥＡＥ回復マウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞により効果的に下方制御された（図９）。これらのマウスは、ＥＡＥの再誘導に耐性であることが既知であり、Ｑａ−１依存性制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞を有することが示されている（３および８）。興味深いことに、Ｑｄｍまたは対照ペプチドではなくＨｓｐ６０ｓｐを負荷した３Ｆ４細胞のみが、ＣＤ８＋Ｔ細胞による下方制御に感受性の３Ｆ４細胞となった。それ故、実際に、Ｈｓｐ６０ｓｐは、Ｑａ−１により提示された場合に、ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される特異的な標的である。
【０１６６】
Ｈｓｐ６０ｓｐがインビボにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される制御に関与しているかどうかを直接的に試験するために、Ｈｓｐ６０ｓｐは、動物をＥＡＥから保護するためにＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するワクチンとしての潜在的な有用性について評価された。ナイーブＢ１０ＰＬマウスは、Ｈｓｐ６０ｓｐを負荷した骨髄由来の樹状細胞（ＤＣ）を、ＥＡＥ誘発の少なくとも１週間前に投与された。接種のために使用されるＤＣは、その表面にＱａ−１を発現するが、ＣＤ８を発現しない。ＱｄｍではなくＨｓｐ６０ｓｐを負荷されたＤＣの接種は、対照の接種しない群と比較して、ＥＡＥから動物を有意に保護した（表３および４）。
【表３】
2010519256.tif 000004
【表４】
2010519256.tif 000005
【０１６７】
重要なことは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇がインビボで保護を無効にするため、保護はＣＤ８＋Ｔ細胞依存性である。それ故、１−９ＮａｃＭＢＰ反応性脳炎惹起性ＣＤ４＋Ｔ細胞の下方制御が可能であるＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞は（３および８）、Ｈｓｐ６０ｓｐが負荷されたＤＣにより、インビボで、疾患からの動物の保護を特異的に誘導し得る。Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導に関与するＤＣの正確な細胞および分子のメカニズムは、別の研究において検討されている。
【０１６８】
ここで、「結合活性モデル」という記載において、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞がＴ細胞活性化の結合活性の結果を認識し、インビボでそれらの制御性の機能を導くことが提唱される（１および２）。ここで、分子および細胞のメカニズムが提供され、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による中間の結合活性のＴ細胞の選択的な下方制御が、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって中間の結合活性のＴ細胞上に発現したＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐが特異的に認識されることにより達成され得ることを示す。Ｈｓｐ６０タンパク質とＱｄｍ含有ＭＨＣクラスＩａタンパク質との発現の間の有意に高い比は、中間の結合活性の相互作用により活性化されるＴ細胞クローンにおいて主に優先的に生じる。ＭＨＣクラスＩａに対するＨｓｐ６０のより高い発現の結果として、制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する特異的な標的であるＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐは、Ｑａ−１／Ｑｄｍの共発現を伴い、または伴わずに、中間の結合活性のＴ細胞の表面上に主に発現される。ここで開示される知見は、中間の活性の活性化Ｔ細胞の表面上で制御性Ｔ細胞により認識されるＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐのような特定の代理の標的構造の優先的な発現によって、免疫系が、Ｔ細胞活性化の結合活性を認識することにより末梢性の免疫を制御することを可能にするという証拠を提供する。この概念の生物学的な有意性は、ＥＡＥモデルにおいて、Ｈｓｐ６０ｓｐが負荷された関連するＤＣが、ＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される自己免疫脳障害からの有意な保護を誘導できることにより示された。
【０１６９】
Ｈｓｐ６０ｓｐに加えて、３つの潜在的なＱａ−１／ＨＬＡ−Ｅ結合ペプチドがＨｓｐ６０タンパク質から産生され得ることが既知である（１４および２０）。これら３つのペプチドはいずれも、Ｑａ−１／ＨＬＡ−Ｅ（Ｈｓｐ６０．２および３ペプチド）に効率的に結合せず（１４）、またはＱａ−１（Ｈｓｐ６０．４ペプチド）の占有に対してＱｄｍと競合できないことが既知である（２１）。それ故、これらのペプチドは、活性化された中間の結合活性のＴ細胞上におけるＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐの優性の発現の全体的な生物学的な結果を妨げないように思われる。この点において、Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐペプチドは、Ｑａ−１の占有に対してＱｄｍまたはＱｄｍ様タイプＡペプチドと競合することができ、特異的な標的構造として有用なタイプＢＱａ−１結合ペプチドの一例を意味する。ここで示す研究では、Ｑａ−１依存性制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する標的として機能する他のＨｓｐ６０ｓｐ様ペプチドが存在し得るという可能性を排除しない。
【０１７０】
他の関連するＱａ−１／ＨＬＡ−Ｅ結合モノマーを同定するために、以下の基準が認められる：
１）ペプチドは、Ｐ９におけるＬｅｕ、およびＰ２におけるＬｅｕまたはＭｅｔを含むドミナントなアンカー残基を含む必要がある。これらアンカーの両方は、Ｑａ−１／ＨＬＡ−Ｅ結合に対して重要な意味を持つことが既知である（１５８，１５９）；
２）ペプチドは、真核生物のプロテアソームの３つの主な触媒的な活性に基づいて、プロテアソーム複合体によるタンパク質分解を介して産生されるべきである（１６０）。
【０１７１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の下方制御に感受性の活性化Ｔ細胞を与えるＱａ−１／ＨＬＡ−Ｅ結合ペプチドを機能的に同定および特徴付ける分析系の工程は、以下の通りである：
１）Ｑａ−１トランスフェクタント上のＱａ−１／ＨＬＡ−Ｅ表面発現を安定化するためのＱａ−１／ＨＬＡ−Ｅ結合ペプチドを試験することにより、Ｑａ−１／ＨＬＡ−Ｅに結合するためのペプチドの能力が決定される；
２）前記ペプチドは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体に結合できないため、標準的なＮＫアッセイにおいてＮＫ活性を阻害する；
３）Ｑａ−１結合についてＱｄｍまたはＱｄｍ様タイプＡペプチドと、あるいはＨＬＡ−Ｅ結合についてＢ７ｓｐとペプチド競合により競合するためのタイプＢＱａ−１結合ペプチドの能力が、例えば標準的なＮＫアッセイにより決定される；
４）ＣＤ８＋Ｔ細胞による下方制御に感受性のＱａ−１＋細胞を与えるペプチドが、ＣＤ８＋Ｔ細胞阻害アッセイにより同定される。
【０１７２】
現在の研究において、標準的なＴ細胞培養条件下で、１μＭ〜５０μＭの範囲の種々の用量の抗原ＨＥＬを用いて同じクローンが活性化された場合に得られるＨ／Ｍ／Ｑａ−１タンパク質指数の間に有意な差がないことも観察されている（図５）。この知見は、Ｔ細胞活性化の生物学的な結果であるＱａ−１／Ｑｄｍに対するＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐの特異の発現が、相対的に一定の共刺激を与える環境化でＴ細胞を活性化するために使用される広範な抗原用量で、Ｔ細胞上のＴＣＲの結合活性に主に依存していることを示す。体細胞性超変異は、末梢における胸腺選択後のＴＣＲにおいては稀であるため、活性化Ｔ細胞上のＴＣＲの結合活性により決定される末梢性Ｔ細胞活性化のこの結果の変動は、インビボにおいて、提示される抗原の生物学的な範囲内では非常に限られる（２２）。しかしながら、非常に高いおよび低い用量の抗原ならびに共刺激の強度および期間の根本的な変化が、固定されたＴＣＲ結合活性（各Ｔ細胞上に発現されるＴＣＲの親和性および密度）によるＴ細胞の活性化のこの特定の生物学的な結果にどの程度影響を与えるかは未知である。
【０１７３】
そのような標的構造の操作は、インビボにおいてＱａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される制御を特異的に増強または遮断するための治療的介入の基礎となり得る。この点において、そのような介入のヒトにおける適用は、Ｑａ−１のヒト相同体であるＨＬＡ−Ｅがヒト制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する制限要素として機能し得るという証拠に基づく（２３）。
【０１７４】
Ｑａ−１／ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞経路は、免疫応答の制御に中心的に関与するため、この経路を増強または抑制するための方法は、自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片拒絶の治療または予防、ならびに効果的な抗感染性免疫の増強のために使用され得る。活性化Ｔ細胞にＣＤ８＋Ｔ細胞による下方制御に対する感受性を与える原因であるＱａ−１またはＨＬＡ−Ｅ結合ペプチドは、ここで同定されているので、Ｑａ−１結合ペプチドを負荷したＱａ−１またはＨＬＡ−Ｅを有するエキソソームは、インビボでこの経路を活性化するために使用され得る（１６１）。この点において、一般的に使用される合成ペプチドが負荷されてよい機能的なＭＨＣクラスIおよびクラスII分子を有する樹状細胞に由来するエキソソームは、ペプチドベースのワクチンとして使用され得ることが述べられている（１６１）。あるいは、Ｑａ−１／自己ペプチドまたはＨＬＡ−Ｅ／自己ペプチドで構成される分子設計された複合体は、Ｑａ−１／ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞を特異的に活性化する抗原として使用されてもよい。この点において、ＭＨＣ多量体は、人工的な抗原提示細胞の一部として、免疫応答における抗原特異的なＴ細胞の刺激ならびに分析の両方に対して有用なツールになり得る（１６２〜１６７）。
【０１７５】
一方、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される経路は、腫瘍形成の間に寛容を導くために中心的な役割を果たし得る。それ故、ある一定の腫瘍患者において、他のアプローチと組み合わせて、中間の親和性／結合活性の抗腫瘍Ｔ細胞を救うためにＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される制御性経路を遮断することは、抗腫瘍治療において必要である。同様に、ＨＬＡ−Ｅ経路の遮断もここに包含される。加えて、ある一定のＡＩＤＳ患者において、ＡＩＤＳウイルスの効果的な制御後にＣＤ４＋Ｔ細胞の効果が生じる。１つの解釈は、Ｑａ−１／ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される経路は、正常な個体において病原性の自己免疫の制御が自然に誘導され、これらＡＩＤＳ患者においてある一定の役割を果たし得るということである。もしこの経路がある一定のＡＩＤＳ患者において不可抗力的に機能した場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＨＩＶ感染しているかどうかに関わらず、制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、新しく産生されるＣＤ４＋Ｔ細胞を絶えず死滅させ得る。それ故、これは、Ｑａ−１／ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される経路を特異的に遮断することにより、治療的介入のための経路を提供し得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される制御性の経路を遮断することは、ＨＩＶ感染の効果的なコントロールの後、ある一定のＡＩＤＳ患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数の一定の下降を避けるためにも必要である。
【０１７６】
この点において、Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐのような特異的な標的構造は、ある一定の腫瘍患者の抗腫瘍Ｔ細胞上、またはある一定のＡＩＤＳ患者において新たに産生されたＣＤ４＋Ｔ細胞上に特異的に発現し、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴＣＲにより特異的に認識される。それ故、Ｈｓｐ６０ｓｐ複合体のような標的Ｔ細胞上に発現する標的構造を特異的に認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、インビボにおいて、この制御性の経路を遮断するために使用することができる。
【０１７７】
Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐ複合体またはＨＬＡ−Ｅ均等物に対するｍＡｂを作ることは、このタイプのｍＡｂを産生する例として使用することができる。技術的なレベルにおいて、安定なＱａ−１ａトランスフェンクタントＪ２は、Ｑａ−１結合ペプチドであるＱｄｍまたはＨｓｐ６０ｓｐを受動的に負荷した場合に、相対的に高いレベルのＱａ−１を発現することが確立されている。ヒトの研究において、ＨＬＡ−ＥトランスフェクタントへのＨｓｐ６０ｓｐコード配列の共導入は、ＨＬＡ−Ｅの安定な表面発現を誘導することが示されている（１６８）。Ｑａ−１の高いレベルの表面発現および動物を免疫化するための「免疫原」としてのより効果的な機能を保証するために、我々は、Ｑａ−１およびＨｓｐ６０シグナルペプチドを共発現する付加的なＱａ−１（ＨＬＡ−Ｅ）トランスフェクタントを確立することを計画している（Ｊ２ａ）。このトランスフェクタントは、細胞表面に発現したＨｓｐ６０ｓｐと結合したＱａ−１を同定することができる抗血清を作るために、マウスを免疫化するために使用することができる。再結合したＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐ分子をコードする構築物は、ＰＣＲ法により、Ｑａ−１ａ分子の＋１０〜＋３６に由来するリーダーヌクレオチド配列を、Ｈｓｐ６０ｓｐペプチド配列をコードするヌクレオチド配列のいずれか（5’-ｃａｔｃｔａｇａｇｇａｔｇｔｔｇｃｔｔｃａａａｔｇｃｇｃｃｃｇｇｔｃａｇｃｃｇｃｇｃｔｃｔｃａｇｃｇｃｃａ-3’）（配列番号３）で置き換えることにより産生される（１６９）。産生されたヌクレオチド配列は、その後、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＶを用いて消化した後、ｐＲＫ−５−Ｃ−ＧＦＰ哺乳動物発現ベクター中にサブクローン化される。構築物は、ＤＮＡシークエンシングにより確認した後、Ｃ１Ｒ細胞株に形質移入されてよい。Ｑａ−１ａ複合体の表面発現は、記述するように、Ｑａ−１ａ特異的な抗血清を使用するＦＡＣＳにより検出されてよい。あるいは、Ｊ２細胞は、記述するように、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３発現ベクターにおけるＨｓｐ６０ｓｐのＤＮＡコード配列を形質移入されてよい（１６８）。
【０１７８】
抗Ｑａ−１ａ抗血清を産生するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスは、２×１０６／マウスのＪ２ａ（Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐ）細胞で静脈内に免疫化されてよい。マウスはその後、２週間毎に２×１０６Ｊ２細胞をＩＰ注入することにより、４回追加免疫されてよい。血清は、Ｈｓｐ６０ｓｐまたはＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐ発現Ｊ２ａトランスフェクタントおよび／またはＱａ−１ａ発現マウスＴ細胞クローン１ＡＥ１０を負荷したＪ２の染色について試験されてよい。抗Ｑａ−１ａ血清は、Ｈｓｐ６０ｓｐを同時発現するＱａ−１トランスフェクタントを用いてマウスを免疫化することにより産生されてよい。高いタイトルのマウスに由来する脾臓細胞は、融合パートナーのＳＰ２／０細胞と融合するために使用され、融合が成功した後に、９６ウェルプレートにおいて、希釈を制限することによりクローン化されてよい。各ウェルからの上清は、上清でＪ２ａおよびＣ１Ｒ細胞を染色することにより差次的にスクリーニングされ、その後、ＥＬＩＳＡ分析にかけられてよい（１７０）。簡単に言うと、５×１０４のＪ２ａトランスフェクタントおよびＣ１Ｒ細胞は、平底の９６ウェルプレート中に蒔かれ、ウサギ抗Ｃ１Ｒ抗血清（Pocono Rabbit Farm and Laboratory INC. Canadensis, PA）が各ウェルに加えられ、Ｊ２ａトランスフェクタント上のＱａ−１ａ／Ｈｓｐ６０ｓｐを除いて、Ｃ１ＲおよびＪ２ａ細胞により発現されるいずれかの抗原性決定因子を遮断するために上清が加えられる。プレートは洗浄され、上清がウェルに加えられ、ＨＲＰ標識されたウサギ抗マウスＩｇＧが加えられる。ＴＭＢ基質は、各ウェルに加えられて１０〜１５分インキュベーションされ、反応は、２ＮのＨ２ＳＯ４を加えることにより停止されてよい。吸収は、９６ウェルプレートリーダー（Molecular Devices, Menlo Park, CA）を用いて測定されてよい。染色に対する陽性対照は、抗Ｑａ−１ａ血清であってよい。上清がＪ２ａに対してのみ陽性であり、Ｃ１Ｒに対しては陰性であるウェルは、さらなるサブクローニングのために選択されてよい。これらのｍＡｂを作るための一般的な方法は、ＣＤ４０ＬおよびＶＬＡ−１に対するｍＡｂの同定において、以前に我々の研究室で首尾よく使用された（１７１、１７２）。
【０１７９】
物質および方法
リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡは、ＲＮＥasyシステム（プロメガ）を用いて単離された。逆転写およびリアルタイムＰＣＲは、ＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ）およびロシェライトサイクラーにおけるライトサイクラーファストスター（商標）ＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩシステムズ（Roche, Indianapolis, IN）を用いて行われた。サイクルパラメータ：９５℃、１０分変性；９５℃、５５〜６１℃で１０秒（Ｈ−２Ｄｄについて５５℃、Ｑａ−１ｂについて５９℃、Ｈｓｐ６０について６１℃）、７２℃で８秒、１３秒〜２０秒（Ｈｓｐ６０およびＱａ−１ｂについて１３秒、Ｈ−２Ｄｄについて１０秒）×４０サイクル。ＰＣＲプライマー：Ｑａ−１ｂフォワード、ＣＣＣＡＧＡＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＧＴ（配列番号５）；リバース、ＣＣＣＧＡＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＧＧＡＴＴＴ（配列番号６）；ｍＨｓｐ６０フォワード、ＧＧＧＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧＴＴ（配列番号７）；リバース、ＴＣＣＡＴＧＧＴＧＣＴＡＧＣＣＡＴＡＴＧＣ（配列番号８）；Ｈ−２Ｄｄフォワード、ＧＧＧＣＧＡＴＧＧＣＴＣＣＧＣＧＣＡＣＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴ（配列番号９）；リバース、ＣＣＧＴＧＴＴＧＴＣＣＡＣＧＴＡＧＣＣＧＡＣＴＴＣＣＡＴＧＴ（配列番号１０）。
【０１８０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングは、以下の標準方法により行われた。使用するＡｂｓ：抗アクチン、抗Ｈｓｐ６０、抗ＭＨＣクラスＩａ（Ｈ−２Ｄｄ）および抗Ｑａ−１ｂ、ならびに２次抗体ウサギ抗マウスＨＲＰまたはウサギ抗ラットＨＲＰ。標的タンパク質は、ＥＣＬ検出キット（アマシャムバイオサイエンス）を用いて検出された。全てのブロットは、ChemiDoc XRS Imager Quantity one-4.5.0 ソフトウェア（Bio-rad）を用いて濃度測定的に定量化された。
【０１８１】
Ｑａ−１ａトランスフェクタントおよびＴ細胞クローン
全長Ｑａ−１ａをコードするｃＤＮＡは、以下のプライマーを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、Ｂ１０ＰＬマウスのＴ細胞から単離された：フォワードＣＡＴＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＣＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＣＧ（配列番号１０）；およびリバースＡＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＴＡＧＣＡＴＣＣＴＴＴ（配列番号１１）。Ｑａ−１ａ ｃＤＮＡは、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（インビトロゲン）にサブクローン化され、エレクトロポレーション（ジーンパルサー（商標）、ビオラド）によりヒトＢ細胞株Ｃ１Ｒに形質移入され、その後、安定に形質移入されたクローンが、Ｇ４１８セレクション（インビトロゲンライフテクノロジーズ）下で希釈を制限することにより単離された。
【０１８２】
Ｑａ−１結合アッセイ
ＲＴ−ＰＣＲにより検出される選択されたＱａ−１ａ−ＰｃＤＮＡ３．１陽性トランスフェクタントは、既知のＱａ−１結合ペプチドを負荷した後、そのＱａ−１表面発現について試験された。要するに、Ｑａ−１ａトランスフェクタントは、２６度で約１８時間、Ｈｓｐ６０ｓｐまたはＱｄｍペプチドと共にインキュベートされた（１０、１２および１７）。Ｑａ−１ａの表面発現は、抗Ｑａ−１ａ血清、続いてフィコエリトリン（ＰＥ）ヤギ抗マウスＩｇを用いて染色することにより評価され、ＦＡＣＳキャンフローサイトメーターおよびセルクエスト（商標）ソフトウェア（Becton Dickinson, Mountain View, CA）において分析された（１）。全てのペプチドは、特に示さない限り、５０μＭで使用した。
【０１８３】
ＮＫ細胞株は、慣例的に、Ｂ１０ＰＬマウスから確立される（２４）。非標識３Ｆ４細胞は、２６℃で一晩試験ペプチドが負荷され、マウスＮＫ細胞による死滅に対して感受性でない等しい数のＣＦＳＥ標識ヒトＥＢＶ形質転換ＬＣＬ細胞と混合した。段階的な数のマウスＮＫ細胞が、３Ｆ４とＬＣＬ細胞の混合物に加えられ、さらに３７℃で２時間インキュベートされた。ペプチドが負荷されていないまたはＱａ−１結合ペプチドでないものが負荷された３Ｆ４細胞を対照として使用した。細胞混合物は、その後、抗マウスＨ−２ＵｍＡｂ３−８−３Ｐ−ＰＥで染色され、ＮＫ細胞と標的細胞とを区別した。ＦＡＣＳにより検出される各群において（１）、ＮＫ細胞の存在下または非存在下におけるＬＣＬ細胞に対する３Ｆ４の比における変化は、特異的なＮＫ死滅を反映する：％特異的死滅＝｛［対照ウェル（ＮＫなし）における死滅比−実験ウェル（ＮＫあり）における死滅比］／対照ウェルの死滅比｝×１００％。
【０１８４】
ペプチド競合アッセイ
ペプチドを負荷しない３Ｆ４細胞は、ＮＫ死滅に対して高い感受性を示し（Ｅ／Ｔ比２：１）、ペプチド競合アッセイにおいて陽性対照として役立った。ＮＫ死滅に対して耐性を有するＱｄｍ（２０μｍ）が負荷された３Ｆ４細胞は、競合に対する標的として役立った。５０、１００、２００μＭの競合ペプチド（Ｈｓｐ６０ｓｐまたは対照のＱａ−１結合性ペプチドでないもの）は、２６℃で１８時間、２０μＭのＱｄｍと共に３Ｆ４細胞に加えられた（１４）。等しい数のＣＦＳＥ標識ＬＣＬ細胞を３Ｆ４細胞と混合し、その後、ＮＫ細胞は、ペプチドが負荷された３Ｆ４細胞とＬＣＬ細胞の混合物に添加された。３Ｆ４細胞のＮＫ死滅のパーセントが評価された。Ｑａ−１に対する占有についてＱｄｍと効果的に競合できるが、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａと相互作用しないペプチドの存在下において、Ｑｄｍの存在下におけるＮＫ細胞による３Ｆ４標的細胞溶解の阻害の抑止は、効果的な競合の機能的なパラメータとして役立つ。
【０１８５】
ＣＤ８＋Ｔ細胞阻害アッセイ
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ８ ＭＡＣＳ磁気ビーズ（Miltenyibiotec, Inc. Auburn CA）を用いて精製された（１）。３Ｆ４細胞は、２６℃で一晩、ペプチドを受動的に負荷された。ペプチドを負荷された同数の非標識３Ｆ４細胞およびペプチドが負荷されていないＣＦＳＥ標識３Ｆ４細胞を混合し、段階的な数のＣＤ８＋Ｔ細胞が標的に加えられた。ナイーブマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞は対照として役立ち、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化標的Ｔ細胞において効果を有しないことが確立された。４日後、細胞混合物を抗マウスＣＤ８−ＰＥ ｍＡｂを用いて染色し、ＣＤ８＋Ｔ細胞と標的細胞とを区別した。ＣＤ８＋Ｔ細胞において、ペプチドが負荷された（非ＣＦＳＥ標識）３Ｆ４細胞と負荷されていない（ＣＦＳＥ標識された）３Ｆ４細胞との間の比は、特異的な阻害の％として決定された：｛［対照培養（ＣＤ８＋Ｔ細胞なし）における負荷された３Ｆ４細胞と負荷されていない３Ｆ４細胞との比−実験培養（ＣＤ８＋Ｔ細胞あり）における比］／対照培養における比｝×１００％（１）。
【０１８６】
ＥＡＥモデルにおける、Ｑａ−１結合ペプチドを負荷した樹状細胞（ＤＣ）を用いた動物のワクチン接種
骨髄に由来するＤＣは、記載のように、Ｂ１０ＰＬマウスから産生された（２５）。６日目において、細胞表面の染色により評価され、これらのＤＣは、その表面にＱａ−１を通常発現するが、ＣＤ８陰性である。６日目のＤＣは、５０μＭのＨｓｐ６０ｓｐまたはＱｄｍを、３７℃で２時間負荷された。細胞はその後、５０ｍｌのＰＢＳで１回洗浄され、ＥＡＥ導入の少なくとも１週間前に、ナイーブＢ１０ＰＬマウスに１×１０６細胞／マウスの量で注入された。
【０１８７】
考察
自己／非自己の識別の結合活性モデル
ここで提示される結果は、自己／非自己の識別の「結合活性モデル」を支持し、中枢の胸腺セレクションおよび末梢の免疫制御の両方により達成される。これらの２つの事象に関連する概念的な骨子は、胸腺および末梢の両方において、Ｔ細胞の生存または死が、いずれかの抗原に対して特異的なＴ細胞上のＴＣＲと、ＡＰＣにより提示されるＭＨＣ／抗原ペプチドとの間の相互作用の結合活性により決定されることを理解することにある。
【０１８８】
適応免疫の間に、自己と外来の抗原との間の構造的な違いを認識することによるのではなく、Ｔ細胞活性化の結合活性を感知することにより、免疫系が自己／非自己の識別の目標を達成することが描かれる。高い結合活性の自己応答性Ｔ細胞クローンの胸腺内での除去は、高い結合活性のクローンも含む外来応答性のレパートリーと比較して高い結合活性のクローンを欠いている中間および低い結合活性のクローンで構成される不完全な末梢性自己応答性レパートリーを産生する。
【０１８９】
潜在的に病原性の自己応答性Ｔ細胞は、中間の結合活性のＴ細胞のプールに含まれ、しばしば「危険なシグナル」により機能的に活性化されて自己免疫疾患を誘発するため、末梢における中間の結合活性の自己応答性Ｔ細胞の存在は、各個体に遺伝した病原性自己免疫の潜在的な危険性を表す。自己および外来の抗原に対する末梢性Ｔ細胞レパートリーの特有の組成は、末梢において、自己および外来の抗原の両方に対して中間の結合活性のＴ細胞を選択的に下方制御することにより、自己免疫に対する特有の機会を与え、自己と非自己を区別する。潜在的に病原性の自己応答性Ｔ細胞を含む中間の結合活性のＴ細胞集団の選択的な下方制御は、効果的な抗感染免疫にダメージを与えることなく、大部分が感染性の病原体に対して特異的な高い結合活性のＴ細胞により媒介される自己免疫疾患を特異的に制御するメカニズムを与える。この点において、最近、制御性Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、自己および外来の抗原の両方に対して、中間の結合活性のＴ細胞を選択的に下方制御し、その結果として特異的に自己免疫を抑制するが、外来の抗原に対する免疫応答を最適化することが示された。これは、下方制御に対して特異的に標的化される、いずれかの抗原に対して活性化された中間の結合活性を有するＴ細胞上に発現した代理のマーカーとして機能する特別なＱａ−１／自己ペプチド複合体が、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴＣＲにより特異的に認識されることを介して達成される。
【０１９０】
この制御性の経路は、それ故、自己寛容のために、胸腺のネガティブセレクションにより不完全に達成される自己と非自己の識別を完全なものにするために免疫系を発展させる末梢性メカニズムの一例である。
【０１９１】
ここで述べられる「結合活性モデル」は、適応免疫の間に、免疫系が自己と非自己の識別をどのように達成するかを理解するために、胸腺のネガティブセレクション、「活性化閾値仮説」および「危険モデル」の概念を含む。現存するいずれかのパラダイムにより均一には解釈することができない免疫学的な障害に固有の種々の表面上は無関係な生物医学的な問題を説明するために、統合された単純なパラダイムを提供する。
【０１９２】
末梢性Ｔ細胞制御の我々の理解における結合活性モデルの概念的骨子の意味
１．「結合活性モデル」は、制御の特異性が標的Ｔ細胞を活性化する抗原のレベルではないことを提唱する。特異性は、どの抗原により標的Ｔ細胞がトリガーされるかに関わらず、Ｔ細胞活性化の通常の結果を認識または感知するレベルである。それ故、活性化Ｔ細胞またはＢ細胞により産生されるＴ細胞受容体または免疫グロブリンのＶ領域に由来する無数のイディオタイプペプチドの認識を介して、各個体の抗原に対する免疫応答を区別するように機能する「イディオタイプモデル」（１０３）とは異なる（１０４〜１０６）。対照的に、「結合活性モデル」は、いずれかの抗原に対して特異的なＴ細胞上のＴＣＲとＡＰＣにより提示されるＭＨＣ／抗原ペプチドとの間の結合活性相互作用により決定される免疫応答の２つのタイプの結果のみを認識し、区別することにより、免疫応答を識別するように機能する（４２、４３）。概念的に、「結合活性モデル」は、両方のタイプの制御がＴ細胞活性化の結果を認識する「エルゴタイプ（ergotypic）制御」のいくつかの要素を含む。しかし、「エルゴタイプ制御」は、Ｔ細胞を活性化する相互作用の結合活性を考慮しないため、「エルゴタイプ制御」とは異なる（１０７〜１０８）。「結合活性モデル」は、それ故、免疫系が十分な特異性で末梢免疫を制御することを可能にするが、制御性Ｔ細胞に対する莫大なレパートリーを要求しない一般的な代替のアプローチを意味する。例えば、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞経路において、ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される実際の標的構造は、Ｔ細胞活性化の結合活性相互作用として標的Ｔ細胞上に特異的に発現するＱａ−１により提示されるある一定の自己ペプチドであるように思われる。ＣＤ８＋Ｔ細胞による下方制御を感知可能なＴ細胞を与える原因となるＱａ−１に対して結合する自己ペプチドの多様性は限られるため、前記モデルは、免疫系が、効果的に特異的であるが単純な方法で、ほとんど無限の多様な自己および外来の抗原に対する免疫応答を制御することを可能にする。
【０１９３】
２．前記モデルは、免疫系が、反対の効果を有するように思われる自己と外来抗原の両方に対する末梢性の免疫応答を制御するために、抑制の統合されたメカニズムを使用すると予測する：「外来」に対するＴ細胞親和性の成熟を促進する一方で、「自己」に対する寛容を保存する。自己および外来の抗原に対するナイーブ末梢ＴＣＲレパートリーの組成は胸腺のネガティブセレクションにより異なるため、自己および外来の抗原に対する中間の結合活性のＴ細胞の選択的な下方制御の生物学的な結果も異なる（４２、４３）（図１０を参照されたい）。このことは、生物学的な系のレベルで、免疫系が、適応免疫の間に、Ｔ細胞制御のレベルで末梢において自己と非自己の区別をする必要なく、自己と非自己の識別の目標をどのように達成するかということを説明する新しいパラダイムのための概念的な骨子を形成する。
【０１９４】
３．「結合活性モデル」の概念的な骨子は、他の末梢制御性経路、例えば「固有のＣＤ４＋Ｔｒｅｇ」にも適するであろう。これらのＣＤ４＋Ｔｒｅｇは、自己免疫応答の規模およびクラスを非特異的に制御するか（２６、２７）、または自己と非自己を識別することにより、末梢の病原性自己免疫を制御し得る。Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞のような少なくともある一定のＣＤ４＋Ｔｒｅｇのサブセットは、中間の結合活性の活性化Ｔ細胞を下方制御するが、異なる認識およびエフェクターメカニズムにより、自己と非自己の識別に関与し得る。
【０１９５】
胸腺のネガティブセレクションの間に達成される自己／非自己の識別は、適応免疫が末梢においてどのように制御されるかを決定し、自己寛容を維持する
ａ．免疫系は、自己と非自己の間の構造的な相違を認識するのではなく、Ｔ細胞活性化の異なる結合活性の結果を感知することによい、自己と非自己を識別することができる。
【０１９６】
生来の免疫を通じて自己と非自己を識別するために免疫系により用いられるメカニズムとは異なり（２８〜３０）、免疫系は、胸腺および末梢の両方において、全く異なるアプローチを利用して、適応免疫を通して自己と非自己の識別を達成するように思われる。基本的な疑問は：「免疫系は、自己の何と外来の何を区別することにより自己と非自己を識別しているのか？」ということである。胎児の間に提示される外来の抗原は、その後は自己と考えられるため（４４、４５）、免疫系は、胸腺のネガティブセレクションの間に自己抗原と外来抗原の特有の構造の間の相違を「知らない」と想像される。
【０１９７】
さらに、免疫系は、末梢性Ｔ細胞制御のレベルで、自己に対するＴ細胞免疫応答と外来抗原に対するＴ細胞免疫応答との間の相違を「知らない」。例えば、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、どの抗原により標的Ｔ細胞がトリガーされるかに関わらず、自己および外来抗原の両方に対して中間の結合活性の活性化Ｔ細胞を選択的に下方制御することにより、末梢免疫応答を制御する（４３）。自己／非自己の識別を達成するために使用される免疫系の１つの主要なメカニズムは、発展の異なる段階において、胸腺および末梢の両方において、いずれかの抗原に対して応答するＴ細胞の相互作用の結合活性を差次的に認知することであると思われる。胸腺において、免疫系は、高い結合活性のＴ細胞（３３−３５）を除去することにより、中間および低い結合活性のＴ細胞に対して陰性に選択し、一方、末梢においては、中間の結合活性のＴ細胞を除去することにより、高いおよび低い結合活性のＴ細胞について陰性に選択する（４２、４３）。低い結合活性の自己応答性Ｔ細胞の保存は、これらの細胞が胸腺および末梢のネガティブセレクションの両方で生存することを可能にすることにより、生物学的に有意である。自己ＭＨＣに対する低い結合活性が胸腺のポジティブセレクションにより達成されるＴ細胞応答におけるＭＨＣ制限に対する本質的な要求であるためのみならず、ＴＣＲの十分な柔軟性により（１１１）、これらの低い結合活性の自己応答性Ｔ細胞が外来の抗原に対して高いまたは中間の結合活性を有するという事実に頼るためである（４７、１０９、１１０）。これらの低い結合活性の自己応答性Ｔ細胞は、それ故、末梢における外来レパートリーに対するナイーブプールとして保存される（４３）。
【０１９８】
ｂ．なぜ、およびどのようにして、中間の結合活性の自己応答性Ｔ細胞は胸腺のネガティブセレクションを逸脱するのか？
胸腺における胸腺細胞の活性化状態は、胸腺セレクションに対して重要であり、２つの主要なパラメータにより決定される：ＴＣＲの結合活性および提示される自己抗原のレベル（３６、３７、１１２）。胸腺細胞の結合活性は、ＶＤＪ再構成により産生される構造により検出されるそのＴＣＲの親和性、および発現されるＴＣＲの密度により決定される。胸腺において提示される自己抗原のレベルは、ＡＰＣの表面に発現されるＭＨＣ／自己ペプチド複合体の数および親和性により決定され、循環における細胞外抗原の濃度、胸腺ＡＰＣにおける細胞内抗原の発現ならびにＡＰＣの自己抗原を処理および提示する能力により影響を受け得る。一般的に、高いレベルの抗原提示は、高い全ての範囲および中間の大部分の範囲をカバーする結合活性の広範なスペクトルで胸腺細胞を活性化する傾向にある。対照的に、低いレベルの抗原提示は、高い結合活性の胸腺細胞のみを活性化する傾向がある。中間レベルの抗原提示は、高い結合活性およびある一定範囲の中間の結合活性を有する胸腺細胞を活性化し得る（３７、１１４〜１１６）（図１１を参照されたい）。
【０１９９】
各個体の胸腺細胞は、胸腺内で陰性に選択され、免疫系が実質的にいずれかの抗原に応答するが、末梢において自己に対して有害に反応することを避けることを可能にする。胸腺細胞の育成プロセスは、原理的には、胸腺における全ての末梢性自己抗原を提示し得る１または一連の「共通の」ペプチドを認識することにより、または胸腺に発現される実際の末梢の、組織拘束性の、もしくは年齢依存性の自己ペプチドを「認識する」ことにより（１１８、１１９）、あるいはこれら両方により、達成され得る。自己免疫制御性（Ａｉｒｅ）遺伝子の発見は（１２０、１２１）、後者の仮説に対する第１の直接的な証拠を提供した。それ故、胸腺の延髄上皮細胞における特定の臓器の組に由来するＡｉｒｅは、末梢性組織拘束性抗原の異所性の発現を促進する転写因子として機能し（１２２、１２３）、これらの細胞の抗原提示能力も増強する（１２４）。「Ａｉｒｅ」が、単離された特有の事象であるか、または胸腺において、全ての提示可能な末梢性自己抗原の発現および提示を制御する遺伝子のクラスの一例を意味するのかということは不明である。それにもかかわらず、Ａｉｒｅ遺伝子の発見は、Ａｉｒｅまたは他の未だ同定されていないＡｉｒｅ様遺伝子の存在下で、胸腺ＡＰＣが、胸腺のネガティブセレクションの間に胸腺細胞が接近できない末梢組織拘束性または年齢依存性の自己抗原の全配列を発現および提示することを予測することを可能にする。
【０２００】
末梢性自己抗原が胸腺細胞によりどのように「認識される」かということとは無関係に、胸腺のネガティブセレクションは、病原性の自己免疫の「切迫した危険」を除去するために、末梢において潜在的に機能的に活性化され得る全ての自己応答性Ｔ細胞を消去するように発展している。これは、胸腺における末梢よりも高いレベルの自己抗原の提示（１２５）、または胸腺におけるアポトーシスに対する胸腺細胞の活性状態の、末梢におけるこれらの細胞の活性化機能よりも「より厳密でない」閾値（３５）により達成され得る。それ故、末梢における内在性の自己抗原により機能的に活性化され得る自己応答性Ｔ細胞は、胸腺において活性化されるように保証され、アポトーシスおよび除去を起こす。自己抗原の不十分な提示により胸腺において十分に活性化されず、胸腺のネガティブセレクションを逸脱する自己応答性Ｔ細胞は、同じ理由で、内在性の自己抗原により末梢で機能的に活性化され得る。加えて、「調整できる活性化閾値メカニズム」は、胸腺の逸脱者が、末梢においてそれらに反復して且つ一定に提示される内在性の自己リガンドを「無視する」ことを可能にする（３６、３７）。例えば活性のある感染または傷害の間に産生される「危険シグナル」（３８、３９）により系が乱されない限り、生物学的に正常な条件下で、末梢において病原性の自己免疫は存在し得ない。
【０２０１】
一方、胸腺のネガティブセレクションは、外来抗原に対して効果的に応答するために、十分に大きなサイズおよび最大の適応性を有する末梢性Ｔ細胞レパートリーを提供するように発展した。胸腺細胞の活性化のための閾値は、それ故、胸腺のネガティブセレクションの間に確立され、アポトーシス細胞死が起こることを可能にし得る活性化の程度を決定すべきである。免疫系は、自己抗原を、この閾値を確立するための標準として使用する。一般的に、いずれかのレベルで提示された自己抗原に特異的な高い結合活性の胸腺細胞は除去されるべきであり、いずれかのレベルで提示された自己抗原に対して特異的な低い結合活性の胸腺細胞は、ベースラインまたは非常に低いレベルで活性化され、保存されるべきである。弾力的な領域は、中間の結合活性の自己応答性胸腺細胞であってよい。それ故、高いレベルで発現される自己抗原に対して特異的な中間の結合活性の胸腺細胞は除去され、一方、低いレベルで発現される自己抗原に対して特異的な中間の結合活性の胸腺細胞は保存され得る。図１１において、低いＴＣＲ結合活性の高い側の端と提示される抗原の最も高い生物学的レベルとの交点と、高いＴＣＲ結合活性の低い側の端と提示される抗原の最も低いレベルとの交点との間に描かれた線は、活性化状態の仮定上の閾値を意味する。閾値を超える活性化状態の胸腺細胞はアポトーシスを起こし、閾値未満の活性化状態の胸腺細胞はアポトーシスを起こさない。それ故、胸腺のネガティブセレクションを免れる胸腺細胞は、全てが低い結合活性の胸腺細胞であり、自己抗原に対して特異的である中間の結合活性の胸腺細胞の少なくとも半分は、低い〜ある一定範囲の中間から高いレベルで提示される。
【０２０２】
この点において、考慮されるべき第３のパラメータは、同時刺激性の分子（１２６，１２７）ならびにサイトカイン、ケモカイン、インテグリンおよびそれらのＴ細胞活性化に関与するぞれぞれの受容体の影響である。これらの分子の胸腺と末梢における機能的な関係を評価するために利用可能な情報は、現在ほとんどない。この点において、我々の基本的な考えは、同じテーマに従う。原理的には、ＣＤ２８／Ｂ７およびＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌのような活性化に関与する分子相互作用は、末梢よりも胸腺の方が高いか少なくとも匹敵するように思われるが、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７のような不活性化に関与する分子相互作用の場合、末梢よりも胸腺の方が低いか同じであり得る。胸腺細胞の活性化状態に影響を与える別々のパラメータとしてこれらの分子を定義するための原理は、ＴＣＲ結合活性および末梢における免疫応答の間に提示される抗原のレベルの操作よりも適している。前者は、ＴＣＲ ＶＤＪ再構成により相対的に「固定される」ことが既知であり（１２８〜１３１）、後者は、通常、免疫学的な疾患の主要な原因である。この第３のパラメータは、それ故、治療的な目的のためのある一定種類の末梢性免疫応答を実際に増強または遮断する潜在的なウィンドウを提供し得るが、払うべき代償は、免疫応答が進行中の正常体におけるそのような治療の非特異的な影響であり得る。
【０２０３】
合わせると、自己と非自己の識別が胸腺のネガティブセレクションおよび末梢の免疫応答の両方に関与している連続的な工程であるという見解は、これら２つの一般的な事象がどのように関連しているかということを理解する必要がある。「結合活性モデル」は、胸腺のネガティブセレクションと末梢の免疫制御との間の関連の生物学的な必要性を理解するために、統一された概念的な骨子を提供する。これら２つの事象の間の物理学的な関連は、潜在的に病原性の自己応答性Ｔ細胞（４０、４１）を含む中間の結合活性の自己応答性Ｔ細胞を末梢に放出することは、胸腺のネガティブセレクションの生物学的な結果であり、末梢性の制御メカニズムにより特異的に扱われるべきであるという事実である。
【０２０４】
ｃ．胸腺のネガティブセレクションから放出され、末梢において活性化される中間の結合活性の自己応答性Ｔ細胞は、末梢性の下方制御を逸脱するために増加した結合活性を得ることができるか？
自己と外来抗原に対する末梢性Ｔ細胞レパートリーの特有の組成は、自己および外来抗原に対して中間の結合活性のＴ細胞を選択的に下方制御することにより、末梢において、自己と非自己を区別する特有の機会を免疫系に与える。潜在的に病原性の自己応答性Ｔ細胞を含む中間の結合活性のＴ細胞集団の選択的な下方制御は、感染性の病原体に特異的な高い結合活性のＴ細胞により大部分が媒介される効果的な抗炎症免疫にダメージを与えることなく、自己免疫疾患を特異的に制御するように進化した免疫系のメカニズムである。Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞経路は、そのようなメカニズムの１つを表す。このタイプのメカニズムは、末梢での活性化により増大した結合活性を得て、末梢性の下方制御を逸脱することが可能となり得る、中間の結合活性のＴ細胞により引き起こされる病原性の自己免疫を制御するのに十分な力を有するかどうかという疑問を扱うべきである。この点において、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞経路は、中間の結合活性のＴ細胞が末梢において活性化された場合に、結合活性がある一定に増大し得る可能性を特に扱うための十分な適応性と共に本質的に構築されたことが示されている。
【０２０５】
第１に、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、広範な抗原量により活性化される中間の結合活性のＴ細胞を下方制御することが示されている（４３）。それ故、特に提示される抗原のレベルが低いレベルから中間レベルまたは中間レベルから中高レベルに移動する場合に、制御のウィンドウが、生理学的に関連性のある抗原提示のレベルのある一定範囲を超えて活性化される中間の結合活性のＴ細胞をカバーする可能性がある（図１２）。この点において、重要な制御因子は、末梢において活性化された場合に自己応答性Ｔ細胞の結合活性の増大の範囲を効果的に限定する、ＴＣＲポスト胸腺セレクションにおける高頻度の体細胞性超変異の欠如である（１２８〜１３０）。変数は、自己抗原の濃度および自己抗原を提示するＡＰＣの能力であってよく、関与する同時刺激性の分子の機能的な段階により主に影響される。本来相対的に非常に低い結合活性を有し、高レベルの提示抗原によってのみ機能的に活性化されるＴ細胞により占有され、制御ウィンドウの外に押し出される小さなテール領域があってもよい。このテール領域にあるＴ細胞は、最も高い生物学的な限界に近い高いレベルの抗原提示によってのみ機能的に活性化され得るため、より高い範囲に移動する抗原提示レベルに対する部屋は小さい。それ故、制御のウィンドウの外側のテール領域に押し出すことができる状況は、ある一定の例外的な状況でのみ生じ、稀であり、例えば、免疫学的な治療の間に誘導される非常に潜在的な同時刺激の場合である（以下を参照されたい）。原理的には、感染または傷害の間に獲得した中間の結合活性のＴ細胞の増大した結合活性は、これらのＴ細胞を末梢性制御のウィンドウの外側へ押し出すことはありそうもない。
【０２０６】
第２に、胸腺におけるアポトーシスに対する胸腺細胞の活性化状態の低い境界と末梢性下方制御に対するＴ細胞の活性化状態の高い境界との間の結合活性の重複領域は、末梢に存在し、自己寛容のセーフガードとして機能する。ＨＥＬ ＴＧおよびＷＴマウスにおけるＨＥＬ応答性レパートリーの分析において、共通の標準のＴＣＲ ＶβモチーフＧＴＧＱを有するＨＥＬ応答性クローンは、末梢におけるＣＤ８＋Ｔ細胞による下方制御に感受性であることが観察された（４３）。興味深いことに、ＧＴＧＱモチーフは、しばしばＨＥＬが外来抗原として機能するＷＴマウスにおいてＨＥＬ応答性レパートリー中に現れるが（４３）、このモチーフは、ＨＥＬが自己抗原として機能するＨＥＬ ＴＧマウスにおけるＨＥＬ応答性レパートリー中には全く見られない（公表されていない知見）。この知見は、ＧＴＧＱモチーフを有するクローンが、自己応答性であり、胸腺のネガティブセレクションの間に除去されることを示唆する。ＥＤ５０により測定されるＧＴＧＱを有する実際のＴ細胞クローンの結合活性は３μＭであるが（４３）、胸腺内で除去されるＨＥＬ応答性胸腺細胞の活性化状態に対する結合活性の低い境界は、少なくとも３μＭ以下であるように思われる。それ故、これらの知見は、胸腺のネガティブセレクションの間にアポトーシスを起こす胸腺細胞に対する結合活性の低い境界は、末梢性Ｔ細胞制御に対するＴ細胞活性化状態の結合活性の高い境界よりもずっと低い可能性があることを示す。このことは、末梢において、中間の結合活性のＴ細胞が末梢に逸脱することを可能にする胸腺におけるアポトーシスに対する胸腺細胞の活性化状態の低い境界と、下方制御に対するＴ細胞活性化状態の高い境界との間に重複領域を作る（図１３）。そのような重複領域の存在は、胸腺でのセレクションと末梢での制御との間の機能的な関係を理解するために重要である。例えば、胸腺のネガティブセレクションを免れる中間の結合活性の自己応答性Ｔ細胞が末梢において機能的に活性化される場合、これらのクローンはある一定の増大した結合活性を得るにもかかわらず、それらは重複領域をほとんど通過せず、末梢性の下方制御を免れ得る。重複領域は、それ故、上述した制御性ウィンドウの十分な柔軟性に上書きされる第２のレベルのセーフガードを提供し、末梢性自己寛容を維持する。自己応答性Ｔ細胞が、制御性ウィンドウの外側に押し出されるだけでなく、これらのクローンが末梢性下方制御を免れることを可能にする非常に潜在的な同時刺激により、重複領域の高い境界も超えるといういくつかの例外があり得る。そのようなケースは、腫瘍ワクチン療法における抗ＣＴＬＡ−４治療のように、同時刺激経路を刺激する免疫学的な治療の間に生じ、腫瘍の制御と臓器特異的な病原性自己免疫の増大する傾向との間の逆の関係の可能な翻訳を提供する（１３２〜１３４）。一般的に、重複する制御領域に入るＴ細胞クローンは、主に外来応答性であり、胸腺でのネガティブセレクションの間の低い境界に本来近い結合活性を有する自己応答性クローンはほとんどないが、末梢において偶発的に活性化された場合に増大した結合活性を有する。
【０２０７】
ｄ．自己／非自己の識別および自己免疫疾患
「結合活性モデル」の概念的骨子に基づいて、中枢または末梢のレベルでの自己／非自己の識別の欠損は、特有の機構で末梢において病原性自己免疫疾患を引き起こし得る。
【０２０８】
中枢の胸腺セレクションの不全の結果としての自己免疫疾患の発達
主に胸腺のネガティブセレクションに関与する遺伝子または胸腺における一般的なホメオスタシスを制御するいくつかの遺伝子の欠損は、複数の臓器において発現される広いアレイに対して特異的な、胸腺に由来する高い結合活性の自己応答性Ｔ細胞の放出を引き起こし得る。これらの高い結合活性の自己応答性Ｔ細胞は、任意のレベルで提示され、末梢において生物学的に利用可能な内在性自己抗原により機能的に活性化され得る。異なる程度のより即時且つ全体的な自己免疫は、自己免疫性多内分泌腺症候群１型（ＡＰＥＣＥＤ）（９５）またはＡｉｒｅ欠損マウス（１２１、１３５）において見られる症状のように、末梢における高い結合活性の自己応答性Ｔ細胞の活性化の直接的な結果として発達する。一般的に、通常はまれな遺伝的欠損である胸腺のネガティブセレクションの不全による病原性自己免疫は、自然に且つ人生の早期に発達し、より全体に現れ、複数の臓器に影響を与える自己免疫を拡散する。
【０２０９】
高い結合活性の自己応答性Ｔ細胞の放出による胸腺のネガティブセレクションの不全の１つの結果は、外来応答性レパートリーから識別不能な組成を有する自己応答性Ｔ細胞レパートリーの形成である。末梢性制御メカニズムが、このタイプのまれな遺伝的欠損を特異的に扱うように進化するとは思われず、自己と外来抗原に特異的な高い結合活性のＴ細胞を区別することを可能にするメカニズムを必要とし、研究の仮説は、この問題を扱うためには今までに提案されていない。それにもかかわらず、Ｔｈ１とＴｈ２またはＴｒ１およびＴｒ３細胞のように、免疫応答の規模およびクラスを制御する内因性のメカニズムは、胸腺のネガティブセレクションの遺伝的欠損により引き起こされる不可抗力的な全体的な病原性自己免疫の非特異的な寛解において、主要な役割を果たし得る（２７）。
【０２１０】
臓器特異的な自己免疫疾患の発達および制御において中心的な役割を果たす「危険シグナル」および末梢性の制御
一方、胸腺のネガティブセレクションの結果として、末梢性Ｔ細胞レパートリーは、中間および低い結合活性の自己応答性Ｔ細胞で構成される。上述したように、低い結合活性の自己応答性Ｔ細胞は、「無害」であり、外来抗原に対するナイーブ末梢性Ｔ細胞レパートリーの主要な部分を構成する。各個体において遺伝した病原性自己免疫の潜在的な危険を表すため、中間の結合活性の自己応答性Ｔ細胞が自然に形成される末梢性Ｔ細胞レパートリーの一部であるという事実は、生物学的に有意である。一般的に、自己抗原の不十分な提示により、除去されるほど十分に胸腺内で活性化されることができない中間の結合活性の自己応答性Ｔ細胞は、プロフェッショナルＡＰＣにより十分高いレベルで提示される「自己ペプチド」と出会わない限り、末梢においても機能的に活性化されない（３６、３７）。「自己ペプチド」の十分な提示は、感染性の媒体と自己抗原との間の分子擬態により、ある一定の感染の間に（１３６、１３７）、または「危険シグナル」の１つのタイプである大量の自己抗原が、無関係な感染または傷害の結果として炎症部位において損傷された細胞から放出される場合（３８、３９）に、末梢において生じ得る。加えて、γ−ＩＮＦのようなある一定のサイトカインが炎症部位から放出される結果としての、プロフェッショナルＡＰＣ上の同時刺激性のＭＨＣ分子の発現の増大は、中間の結合活性の自己応答性Ｔ細胞の偶発的な活性化において重大な役割を果たし得る。感染症または傷害は通常、影響を受ける臓器内に限局するため、そのような傷害により生物学的に正常な末梢性Ｔ細胞レパートリーから惹起される活性自己免疫は、臓器特異的であるように思われる。
【０２１１】
潜在的に病原性の自己応答性Ｔ細胞は、中間の結合活性の自己応答性Ｔ細胞のプールに含まれるので（４０、４１）、感染または傷害の間の病原性自己免疫に対する潜在性は大きい。中間の結合活性のＴ細胞の選択的な下方制御は、正常な抗炎症性免疫に代償を払うことなく、生物学的に遺伝したこの問題を特異的に扱うように免疫系が進化する１つのメカニズムである（３３）。それ故、適切な末梢性制御の非存在下において、感染または傷害の間に「危険性の自己」から産生される「危険シグナル」は（３８、３９）、臓器特異的な病原性自己免疫に対して中心的な役割を果たす。
【０２１２】
要約すると、「結合活性モデル」は、病原性自己免疫の発達および制御を理解するための細胞および分子の基礎の統一された概念的骨子を提供する。免疫系は、生物学的に入手可能な自己抗原が、胸腺のネガティブセレクションを逸脱するいずれかの自己応答性Ｔ細胞を機能的に活性化するのに十分なレベルで末梢に発現されない方法に関与するように進化するため、末梢性の自己寛容は、実際に、胸腺のネガティブセレクションにより確立され、「調節可能な活性化閾値メカニズム」により強化される（３６、３７）。しかしながら、末梢性制御メカニズムは、胸腺のネガティブセレクションの生物学的な結果として胸腺から放出され、感染または傷害のような環境的な侵襲の間にしばしば機能的に活性化され得る中間の結合活性の自己応答性Ｔ細胞を選択的に下方制御することにより、末梢性の自己寛容を維持するようにも進化してきた。この点において、「危険モデル」の概念的骨子（３８、３９）は、逸脱した中間の結合活性の自己応答性Ｔ細胞が末梢においてどのように機能的に活性化され、自己免疫疾患を誘発するのかという中心的な質問に答えるための解決策を提供する。それ故、中間の結合活性のＴ細胞の選択的な下方制御の末梢性制御メカニズムは、感染または傷害の間に「危険シグナル」により通常トリガーされる臓器特異的な自己免疫疾患（多発性硬化症、１型糖尿病、関節リウマチを含む）の制御において中心的な役割を果たすことが示唆されている（３８、３９）。
【０２１３】
「自己／非自己の識別の結合活性モデル」および免疫学的に関連性のある臨床的な問題
「結合活性モデル」は免疫系に適用される「組織生物学的な仮説」の一例を表し、自己／非自己の識別の過程を理解するための統一された単純な概念的骨子を提供し、新規の臨床的な適用に対するこの概念の翻訳を可能にする。例として、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される制御経路を用いて、免疫学的に関連性のある臨床的な問題における「結合活性モデル」の潜在的な影響が以下に示されている。この点において、ヒトにおけるこの経路の将来の適用は、Ｑａ−１のヒト相同体であるＨＬＡ−Ｅがヒト制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する制限要素として機能し得るという証拠に基づく（１３８、１３９）。
【０２１４】
ａ．自己免疫疾患
上述したように、一般的に見られる臓器特異的な自己免疫疾患は、末梢性自己免疫の脱制御の結果であるように思われる。これらの疾患は、Ｑａ−１／ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介経路のような末梢性制御メカニズムを活性化し、中間の結合活性のＴ細胞集団を選択的に抑制することにより治療され得る。制御の特異性は、標的Ｔ細胞を活性化する抗原のレベルにおいてはないため、このアプローチは、現在は大部分が決定されていない所定の自己免疫疾患に関与する特定の自己抗原の知識に頼ることなく、自己免疫疾患を治療および予防するための理論的な基礎を提供する。感染は、末梢での制御なしで臓器特異的な自己免疫疾患において中心的な役割を果たし得るため、これらの患者における感染の制御は、免疫学的な治療が考えられる場合に第１の治療であるべきである。
【０２１５】
ｂ．感染と自己免疫疾患およびアレルギー
この制御性経路の臨床的な影響は、前記経路がいずれかの抗原により活性化された中間の結合活性のＴ細胞により引き起こされ、その主要な働きとして病原性自己免疫疾患を制御し得るという事実に頼り、さらに増強するか、または少なくとも抗感染免疫に損傷を与えることがない。それ故、「結合活性モデル」は、抗免疫と抗感染症免疫との間の関係をイメージするための独特のウィンドウを提供し、異なる仮説に加えて、よく確立された「衛生仮説」に対する単純な答えを提供し得る（１４０）。高度に発展した先進国において、自己免疫疾患およびアレルギーの増大は、しばしば、抗生剤、ワクチン、またはより単純に、改善された衛生およびよりよい社会経済的な状況の結果として感染症が減少することと関連する（１４０）。「結合活性モデル」に基づいて、早期の幼児期の間のある一定の自然な感染は、中間の、さらに高い結合活性のＴ細胞を活性化し、次に自己抗原により活性化される中間の結合活性のＴ細胞を抑制し得る制御性の経路を誘発し、成人における末梢性の自己寛容を保証する。Ｔｈ２細胞により媒介されるアレルギーと関連して、インビトロでの研究は、ＴＣＲシグナリング（結合活性相互作用）の強さの変化が、ナイーブＴ細胞集団におけるヘルパーＴ細胞分極化に強く影響を与え得る（１４１〜１４３）。より低い結合活性のＴＣＲリガンドで刺激した後、ＴｅｃキナーゼであるＩｔｋが活性化され、Ｔｈ１分化に対して必要であることが既知であるＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡ発現を陰性に制御することにより、Ｔｈ２分化を促進する（１４４）。アレルギー反応の発生がしばしば末梢性の粘膜抗原浸入に関連するという知見と、Ｔｈ２表現型とのより低い結合活性の反応とＴｈ１表現型とのより高い結合活性の反応との会合との関係は、「結合活性モデル」に基づいて、アレルギーに対する仮説に導く。アレルゲンは外来抗原であるが、アレルゲンに対する免疫応答は、アレルギー性Ｔ細胞におけるＴＣＲと粘膜環境において局在性のＡＰＣにより提示されるＭＨＣ／アレルゲンペプチド複合体との間の中間の結合活性の相互作用により活性化されるＴｈ２により支配されてよい。それ故、アレルギーは、通常、病原性自己免疫の制御においても主要な役割を果たす中間の結合活性のＴ細胞の選択的な下方制御の末梢性制御メカニズムにより制御され得る。
【０２１６】
感染と自己免疫およびアレルギーとの間の逆の関係は、動物の感受性の系における自己免疫疾患が、通常の環境よりも病原体のない環境で育った動物の間でより早く、より高い割合で発達するという一貫した知見によりさらに強調される（１４０）。加えて、ミコバクテリアのような感染性の媒体またはウイルスで感受性の動物を処理することは、Ｔ１Ｄ（１４５）、ＥＡＥ（１４６、１４７）およびループス（１４８、１４９）、さらに喘息（１５０〜１５２）を含む種々の自己免疫疾患から動物を保護するだけでない。
【０２１７】
ｃ．臓器移植
移植片の免疫学的な拒絶は、外来抗原を排除するための健康な免疫系の正常な機能である。不可避な挑戦は、非特異的な免疫抑制剤を長期間使用することなく、どのように外来移植抗原を自己抗原に生物学的に変換するのかということである。この点において、「活性化モデル」は、適応免疫の間の自己抗原と外来抗原の免疫学的な定義を提供し、抗原自体でなく自己と外来抗原に対する末梢性ＴＣＲレパートリーの特有の組成により定義される。外来レパートリーとは異なり、自己レパートリーは、中間および低い結合活性の自己応答性Ｔ細胞のみからなり、自己抗原と定義されてきた。「結合活性モデル」は、それ故、外来抗原を自己抗原に変換するための革新的なアプローチを提供し、抗原を操作するのではなく、移植片に特異的なアロ反応性のＴ細胞の結合活性に基づいてホストＴＣＲレパートリーを修飾する。急性の拒絶相の間に現在使用されている免疫応答の非特異的な抑制の臨床的な操作は、おそらく、高い結合活性であろう最も活性化されたクローン移植片に対するＴ細胞レパートリーを再構築する。これは、免疫系に関して、外来抗原と自己抗原との間の独特の位置に移植片を配置してよい。それ故、抗アロジェニックなＴ細胞の結合活性に基づいてホストＴＣＲレパートリーをモニタリングすることにより、移植後の異なるステージにおける移植片の免疫学的な性質が評価される場合、免疫系が移植片を自己抗原として扱うことを可能にすることができる。例えば、免疫抑制剤の使用により移植片が急性の拒絶を生き残った場合、その後の慢性の拒絶は、主に、インビボで受け入れられた移植片により常に活性化されている中間の結合活性を有する残留するアロ反応性のＴ細胞により媒介され得る。これらの細胞を下方制御するための効果的なアプローチは、急性の拒絶反応相の間の抗拒絶前処理により障害され得るＱａ−１／ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される制御経路を再活性化することである。
【０２１８】
ｄ．腫瘍免疫学
腫瘍免疫学における中心的な問題は、免疫系による腫瘍抗原の認識が活性化（すなわち免疫監視）または寛容のどちらに導くかということであり、腫瘍抗原の性質に依存する（１５３）。「結合活性モデル」の概念的骨子は、腫瘍の発達および治療を理解するための異なる展望を提供し得る。腫瘍抗原が、高い結合活性と中間の結合活性の両方の抗腫瘍Ｔ細胞からなる効果的な抗腫瘍免疫を誘発することができる外来抗原のように振る舞う場合、腫瘍は、腫瘍に対する免疫監視の結果として排除されるであろう。しかしながら、腫瘍抗原が自己抗原のように振る舞う場合、腫瘍は、活性化しないか、または中間の結合活性のＴ細胞のみを活性化する。これは、特定の自己抗原に対して高い結合活性のＴ細胞が胸腺のネガティブセレクションにより除去されることにより生じ得る。あるいは、特定の腫瘍抗原は、腫瘍抗原の不十分な提示により、低いまたは中間の結合活性の相互作用を伴う抗腫瘍反応を示す「不十分な」免疫応答のみを誘発し得る（１５４〜１５７）。腫瘍形成の間に中間の結合活性の抗腫瘍免疫を誘発する生物学的な有意性は、そのような免疫が「結合活性モデル」の概念的骨子に基づいて寛容を誘発するという結果により無視され得ない。それ故、中間の結合活性の抗腫瘍Ｔ細胞は、潜在的に病原性の自己免疫を制御するように展開する正常な末梢性制御メカニズムにより阻害され得る。例えば、ある一定の感染の間に早期の幼児期から自然に誘導されるＱａ−１／ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される経路は、腫瘍抗原および自己抗原を含むいずれかの抗原により活性化される中間の結合活性のＴ細胞を下方制御し得る。そのような患者において、抗腫瘍免疫は、寛容の状態を導く正常な制御メカニズムにより阻害され得る。中間の結合活性を有する抗腫瘍Ｔ細胞は、ある一定の腫瘍患者において唯一の抗腫瘍免疫であり得るため、これらの抗腫瘍Ｔ細胞を救うためのＱａ−１／ＨＬＡ−Ｅ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞のような制御経路の遮断は、他のアプローチと組み合わせて、潜在的に必要な治療となり得る。しかしながら、そのような治療の潜在的な問題は、特定の自己抗原を提示している腫瘍細胞を用いたある一定の感染またはワクチン接種の間にのみトリガーされ得る臓器特異的な自己免疫疾患の進行に対する感受性が増大することである。
【０２１９】
この予測との一致は、明らかな臨床的な抗腫瘍効果に加えて、Ｂ１６メラノーマＧＭ−ＣＳＦワクチンおよび抗ＣＴＬＡ−４でのマウスの治療が、メラニン細胞に拘束された自己免疫応答である白斑を結果として生じたという知見である。同様に、前立腺癌−ＧＭ−ＣＳＦワクチンおよび抗ＣＴＬＡ−４を受けているマウスは、前立腺炎を発症するが、全体的な自己免疫のサインは生じない（１３２〜１３４）。「結合活性モデル」の概念的骨子に基づいて、抗ＣＴＬＡ−４は、ワクチン腫瘍細胞により提示される十分なレベルの特定の「自己抗原」により初めに活性化される抗腫瘍Ｔ細胞の結合活性を潜在的に高めることにより、これらの細胞が末梢性の下方制御を免れるようにする（図１２および１３を参照されたい）。これは、末梢において提示される生物学的に有用な自己抗原が、自然な胸腺のネガティブセレクションから放出されるいずれかの自己応答性Ｔ細胞を機能的に活性化するのに十分でなく、機能的な活性化はより高いレベルの抗原トリガーを必要とするという仮説を支持する証拠である。さもなければ、この場合、ＣＴＬＡ−４経路自体の遮断は、より全体的であるが臓器特異的でない病原性自己免疫を誘発する可能性が高い。
【０２２０】
合わせて考えると、「結合活性モデル」の概念的骨子は、新規の臨床的な介入が、中間の結合活性のＴ細胞を選択的に阻害することにより、現在使用されている免疫治療剤の主要な副作用である正常な抗感染および抗腫瘍免疫への損傷なく、自己免疫疾患およびアレルギーを治療し、または臓器移植の拒絶反応を制御することを可能にする。
【０２２１】
自己免疫疾患における交差保護
以下の研究は、２つの異なる自己免疫疾患モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）および１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）における「交差保護（cross-protection）」現象を引き起こす抗ペプチドワクチン接種のメカニズムを研究することにより、「結合活性モデル」の概念的骨子に関連して、Ｔ細胞制御の特異性を理解する助けとなる。ここでは、異なるペプチドを動物にワクチン接種する間に引き起こされるＱａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、外来抗原に対する全体的な免疫応答を抑制することなく、ＥＡＥまたはＴ１Ｄから動物を交差保護することを示す。これは、抗原特異性に関係なく、特異的に下方制御されるべき一般的な代理の標的構造をその表面に優先的に発現することができる中間の結合活性のＴ細胞のプールに含まれる、潜在的に病原性の自己応答性Ｔ細胞を選択的に下方制御するＱａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により達成される。それ故、これらの研究は、末梢において、自己と非自己を識別する必要なく、免疫系は、自己と外来抗原の両方に対して中間の結合活性のＴ細胞を選択的に下方制御することにより自己と非自己を識別し、自己寛容を維持するという実験的な証拠を提供する。
【０２２２】
ＥＡＥとＴ１Ｄとの間の「交差保護」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される
中間の結合活性のＴ細胞上に発現され、Ｑａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞（上記および１７２に記載されている）により認識される代理の標的構造であるＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐの同定は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による制御の特異性が標的Ｔ細胞を活性化する抗原のレベルではないという予測を可能にする。前記特異性は、どの抗原により標的Ｔ細胞がトリガーされるかに関わらず、発現される共通の代理の標的構造を認識することによる中間の結合活性のＴ細胞活性化の特定の生物学的な結果を認識するレベルである。
【０２２３】
病原性自己免疫に関連してこの予測を試験するために、実験プロトコルが、Ｑａ−１ａ株の２つの自己免疫疾患モデル（Ｂ１０ＰＬマウスにおけるＥＡＥおよびＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄ）において、Ｑａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される交差保護を調べるために設計された。Ｂ１０ＰＬマウスまたはＮＯＤマウスは、１−９Ｎａｃ ＭＢＰ（ペプチドＸ）またはｐ２７７（ペプチドＹ）をワクチン接種され、Ｂ１０ＰＬマウスにおいて１−９Ｎａｃ ＭＢＰでＥＡＥが誘発され、またはＮＯＤマウスにおいてインスリン（ペプチドＺ）に由来するペプチドＢ：９−２３を含むいくつかの自己抗原により誘発され得る自然に発症したＴ１Ｄが誘発される（１７３）。予測が正しい場合、ペプチドＸまたはＹにより活性化される中間の結合活性のＴ細胞により初回抗原刺激されるＱａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ペプチドＸまたはＺにより活性化される中間の結合活性のＴ細胞を抑制し、自己ペプチドＸまたはＺにより誘発される自己免疫疾患から動物を保護できるべきである（図１４）。
【０２２４】
Ｂ１０ＰＬマウスは、ＭＢＰに由来するＭＨＣクラスII結合性ペプチドである１−９ＮａｃＭＢＰまたはＨｓｐ６０に由来するＭＨＣクラスII結合性ペプチドであるｐ２７７をワクチン接種された。この点において、１−９ＮａｃＭＢＰがＢ１０ＰＬマウスにおいて病原性のペプチドであり、ｐ２７７がある一定のマウス系においてＴ１Ｄの原因に関与し（１７４）、ＥＡＥとは無関係であることは周知である。図１５ａに示すように、動物は、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）のみをワクチン接種された対照マウスと比較して、１−９Ｎａｃ ＭＢＰまたはｐ２７７ワクチン接種により均等に効果的に保護された。それ故、無関係なペプチドをワクチン接種された場合でさえ、Ｂ１０ＰＬマウスは、おそらく、臨床的なＥＡＥの原因である１−９Ｍａｃ ＭＢＰ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を交差下方制御することが可能なＱａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を導入することにより、ＥＡＥから効果的に保護され得る（以下を参照されたい）。
【０２２５】
ＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄモデルは、その後検討された。この点において、ｐ２７７は、ワクチンとして使用する場合に、おそらく特定の自己抗原に対するＴｈ１からＴｈ２の応答のシフトの導入により、ＮＯＤマウスをＴ１Ｄから効果的に保護する（１７５）。ＮＯＤマウスは、ＩＦＡで乳化されたｐ２７７ペプチドをワクチン接種され、ＩＦＡをワクチン接種されたのみの対照マウスと比較して、３５週齢まで自然に発症したＴ１ＤからＮＯＤマウスを完全に保護した。相互に、ＮＯＤマウスは、ＩＦＡで乳化された１−９Ｎａｃ ＭＢＰもワクチン接種され、ＮＯＤマウスは自然に発症したＴ１Ｄから等しく保護された（図１５ｂ）。ＥＡＥまたはＴ１Ｄ疾患モデルの保護における１−９Ｎａｃ ＭＢＰおよびｐ２７７の両方の効果は、ここでは交差保護として定義される。
【０２２６】
制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞のインビトロでの誘導が、Ｂ１０ＰＬマウスにおけるＭＢＰまたはｐ２７７によるＥＡＥの交差保護を説明するかどうかを試験するために、１−９Ｎａｃ ＭＢＰまたはｐ２７７をワクチン接種されたＢ１０ＰＬマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、ナイーブＢ１０ＰＬマウスに養子的に導入され、その後ＥＡＥが誘発された。図１５ｃに示すように、１−９Ｎａｃ ＭＢＰまたはｐ２７７をワクチン接種された対照ナイーブマウスでないマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、養子的に導入された場合に、続いて誘発されるＥＡＥからレシピエントマウスを有意に保護した。自然に発生したＴ１Ｄからの等しい保護は、ｐ２７７または１−９Ｎａｃ ＭＢＰをワクチン接種されたＮＯＤマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞がナイーブＮＯＤマウスに養子的に導入された場合に得られた（図１５ｄ）。それ故、保護されたマウスにおける異なるペプチドを用いたワクチン接種の間に初回抗原刺激されるＣＤ８＋Ｔ細胞は、さらに、ドナー動物のワクチン接種のためにどのペプチドが使用されるかに関わらず、引き続くインビボでのＥＡＥまたはＴ１Ｄの発症から動物を保護することが可能である。
【０２２７】
この点において、外来抗原ＨＥＬまたはＨＥＬペプチド（ＩＦＡ中）を用いたＢ１０ＰＬまたはＮＯＤマウスの免疫化は、１−９Ｎａｃ ＭＢＰまたはｐ２７７を用いた免疫化と同じ効果で、ＥＡＥまたはＴ１ＤからのＣＤ８＋Ｔ細胞依存性の保護を誘導した（データは示さない）。ＩＦＡのみで免疫化された対照動物は、疾患から動物を保護する制御性ＣＤ８細胞を誘導しなかった。これらの知見は、「結合活性モデル」の概念的骨子と一致する。
【０２２８】
Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐは、交差保護されたＥＡＥおよびＴ１Ｄマウスの両方から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される共通の標的構造である
観察される「交差保護」は、制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、インビボでＥＡＥおよびＴ１Ｄの両方の原因である感受性の標的Ｔ細胞により発現されるある一定の共通の標的構造を認識することを提唱する。中間の結合活性のＴ細胞上に優先的に発現され、Ｑａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により特異的に認識されるＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐは、「交差保護」を媒介するＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される標的構造の１つを意味し得ると考えられる。この仮説を試験するために、Ｑａ−１ａ発現細胞３Ｆ４は、１−９Ｎａｃ ＭＢＰまたはｐ２７７をワクチン接種された保護されたＢ１０ＰＬおよびＮＯＤマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞の特異性を決定するためのペプチド提示細胞として使用された。
【０２２９】
３Ｆ４は、ヒトＢ細胞株Ｃ１Ｒに組み換えマウスＱａ−１ａ ｃＤＮＡを形質移入することによりＱａ−１ａ発現細胞として確立され、この研究室の先の研究においてＨｓｐ６０ｓｐがＱａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する特異的な標的であるかどうかを試験するために、Ｑａ−１結合性ペプチド発現細胞として首尾よく使用された。ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能および特異性を評価するために、生理学的な標的Ｔ細胞である中間の結合活性のＢ１０ＰＬマウスに由来する１−９Ｎａｃ ＭＢＰ特異的クローン１ＡＥ１０およびＮＯＤマウスに由来するｐ２７７特異的クローン１５Ａ６は、陽性対照として役立ち、低い結合活性のＭＢＰ特異的クローン４Ｄ１０およびｐ２７７特異的クローン１３Ｃ４は陰性対照として役立った。Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐとＱａ−１／Ｑｄｍの間の「量的」ではなく「質的」な違いは、ＣＤ８＋Ｔによる下方制御に対する感受性を決定するＴ細胞の結合活性の機能である。
【０２３０】
中間の結合活性のＴ細胞におけるＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐとＱａ−１／Ｑｄｍの有意に高い比は、Ｍ／Ｈ／Ｑａ−１タンパク質指数により示され、Ｑａ−１依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞による下方制御に対する中間の結合活性のＴ細胞の感受性に対して基礎となる分子である。
【０２３１】
現在の研究において、図１６に示すように、有意に高いＭ／Ｈ／Ｑａ−１タンパク質指数は、２つの低い結合活性のクローン４Ｄ１０および１３Ｃ４と比較して、２つの中間の結合活性のクローン１ＡＥ１０および１５Ａ６により発現され、ＣＤ８＋Ｔ細胞による下方制御に対するそれらの感受性と一致する。示されるように、陽性対照クローン１ＡＥ１０を阻害するが陰性対照クローン４Ｄ１０を阻害しない、１−９Ｎａｃ ＭＢＰまたはｐ２７７をワクチン接種された保護されたＢ１０ＰＬマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｑｄｍまたは対照の無関係なペプチドではなくＨｓｐ６０ｓｐで感作された３Ｆ４細胞を効果的に下方制御した（図１７ａ）。
【０２３２】
同様に、ｐ２７７または１−９Ｎａｃ ＭＢＰのワクチン接種により保護されたＮＯＤマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、陽性対照クローン１５Ａ６を阻害したが、陰性対照クローン１３Ｃ４を阻害せず、Ｑｄｍまたは対照の無関係なペプチドではなくＨｓｐ６０ｓｐで感作された３Ｆ４細胞を効果的に下方制御した（図１７ｂ）。ナイーブＢ１０ＰＬまたはＮＯＤマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、標的細胞において何らの効果も示さなかった（データは示さない）。
【０２３３】
この一連の実験は、Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐが、異なる抗原ペプチドを用いたマウスのワクチン接種の間に誘導されるＱａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により特異的に認識される共通の標的構造を意味することを明確に示した。それ故、細胞表面に発現されるＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐは、最も重要であり、ＥＡＥおよびＴ１Ｄの両方のインビボでの寛解を説明するＣＤ８＋Ｔ細胞の支配下にある。これらの結果は、Ｑａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞がＨｓｐ６０ｓｐ負荷したＤＣにより直接的に誘導され、続いて誘導されるＥＡＥから動物を保護し得るという知見と一致する。
【０２３４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、外来抗原ではなく、自己に対する全体的な免疫応答を抑制する
ＥＡＥおよびＴ１Ｄの「交差保護」を説明するＣＤ８＋Ｔ細胞が、末梢において自己と非自己を識別することができるかを決定することが好ましい。これは、Ｔ細胞制御の特異性と自己と非自己の識別との間の関係を理解するために重要である。ペプチドワクチン接種の間に誘導されるＱａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞による下方制御が、自己および外来抗原の両方に対する全体的な免疫応答を非特異的に阻害する内因性のメカニズムであるか、または進行中の外来抗原に対する免疫応答に損傷を与えることなく自己免疫を特異的に抑制するかどうかは、ここで取り組まれた（１７８）。
【０２３５】
自己と外来抗原に対する全体的な免疫応答におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の効果は、Ｔ細胞の養子性導入実験により評価された。インビボでの自己免疫応答を評価するために選択された２つの自己ペプチドは、Ｂ１０ＰＬマウスにおけるＥＡＥに対して病原性のペプチドである１−９Ｎａｃ ＭＢＰおよびＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄの病原性に関与することが既知であるインスリンに由来するＢ：９−２３であった（１７３）。それ故、１−９Ｎａｃ ＭＢＰまたはｐ２７７をワクチン接種されたマウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、続いてインビボで自己または外来抗原に曝露されたナイーブマウスに養子性に導入された。自己と外来抗原に対する免疫応答における導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞の効果は、イクスビボアッセイにより評価され、比較された。
【０２３６】
対照的に、養子的に導入された場合、同じ制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｂ１０ＰＬ（図１８ａ）およびＮＯＤ（図１８ｂ）マウスの両方における通常の外来抗原ＨＥＬに対する全体的な１次免疫応答を増強し、制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞を受けたマウスと比較して、増大した全体的な結合活性と組み合わせてＴ細胞増殖のより高い規模により示され、より低いＥＤ５０により示される。それ故、Ｑａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される「交差保護」において観察される抑制の全体的な阻害効果は、外来抗原ではなく自己に対する免疫応答の中に選択的に限局している。
【０２３７】
ヒトでの研究
ヒトでの研究において得られたデータは、マウスでの研究において確立された概念を支持する。ＨＬＡ−Ｅ／Ｈｓｐ６０ｓｐが、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される特異的な抗原であることも見出された。データは、精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞をＨｓｐ６０ｓｐ（実験）またはＢ７ｓｐ（対照）を負荷した樹状細胞ＣＤ８（Ｈ）またはＣＤ８（Ｂ）を用いてインビトロで初回抗原刺激することにより、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞がインビトロで産生され得ることを示した。ＣＤ８（Ｂ）ではなくＣＤ８（Ｈ）が、Ｂ７ｓｐではなくＨｓｐ６０ｓｐが負荷されたＨＬＡ−Ｅ形質移入クローンを特異的に阻害することが分かった。
【０２３８】
考察
これらの研究は、自己免疫疾患の制御における末梢性免疫制御の特異性と自己と非自己の識別との間の関係に取り組むものである。これらの研究において述べられているインビボでの「交差保護」の興味のある特徴は、同じ抗原ペプチドを用いたワクチン接種が２つの異なる自己免疫疾患から動物を効果的に保護し、前記疾患の原因である病原性自己抗原は相互に異なり、自己免疫の過程で攻撃される標的臓器も異なるという知見である。同じように興味深いのは、ワクチンペプチドが所定の自己免疫疾患の原因であろうとなかろうと関係なく、異なる抗原ペプチドをワクチン接種した動物は、同じ自己免疫疾患から動物を効果的に保護するという知見である。さらに、交差保護現象を媒介する抑制は、外来抗原に対する通常の進行中の免疫応答に損傷を与えることなく、自己抗原に対する全体的な免疫応答の中にのみ限局される。
【０２３９】
交差保護現象は、自己免疫の過程の間のＴ細胞活性化の結果として発現される潜在的に病原性の自己応答性Ｔ細胞上の共通の標的構造が、Ｑａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識されることを強く指し示し、観察される自己免疫疾患のインビボでの効果的な寛解を説明する。潜在的に病原性の自己応答性Ｔ細胞が中間の結合活性の自己応答性Ｔ細胞のプールに含まれることを考慮に入れて、ある一定の活性化Ｔ細胞上におけるＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐの優先的な発現は、それらのＴＣＲ−リガンド相互作用の結合活性の作用であることを上記で示している。さらに、現在の研究において、Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐは、実際に、交差保護されたＥＡＥまたはＴ１Ｄマウスから単離されたＱａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される共通の標的構造を意味する（図１７ａおよび１７ｂ）。潜在的に病原性の自己応答性Ｔ細胞は、中間の結合活性のＴ細胞のプールに含まれ、活性化された場合にそれらの表面にＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐを優先的に発現させることが可能であり、標的Ｔ細胞がどの自己抗原によりトリガーされるかに関わらず、結果としてＣＤ８＋Ｔ細胞により下方制御されるため、「交差保護」は生じる。
【０２４０】
インビボでの所定の自己免疫疾患の原因である自己抗原により活性化された中間の結合活性のＴ細胞上にＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐのような共通の標的構造を優先的に発現することは、交差保護に対する分子および細胞の基礎を確立する。我々は、自己ペプチドワクチン接種について、産生される共通の標的構造は、制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞により発現される共通の標的構造に特異的なＴＣＲをトリガーし、インビボでエフェクター細胞に分化するために必要不可欠であることを思い描いた（導入相）。初回抗原刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、その後、いずれかの自己抗原による中間の結合活性のＴ細胞活性化の結果として優先的に発現される共通の標的構造を認識することにより、潜在的に病原性の自己応答性Ｔ細胞を下方制御する（エフェクター相）。動物は、それ故、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞により、ある一定の自己免疫疾患の発症から保護される。それ故、一次応答の間にワクチンペプチドにより活性化される中間の結合活性のＴ細胞により初回抗原刺激された制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビボにおいて、その後の免疫応答の間に、ある一定の自己免疫疾患の原因である異なる組の自己抗原により活性化される中間の結合活性のＴ細胞を選択的に下方制御し得る（図１９）。
【０２４１】
Ｔ細胞は、専門のＡＰＣではないため、樹状細胞のような専門のＡＰＣが補充され、経路の導入相の間に制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞を初回抗原刺激するための共刺激シグナルを提供するように機能してもよい。あるいは、制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、感染または傷害により惹起される１次免疫応答の間に、障害された細胞から放出されるＨｓｐ６０タンパク質を飲み込み、加工することにより、Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐのような共通の標的構造を交差提示することが可能である、関連するＱａ−１発現ＤＣにより直接的に初回抗原刺激され得る。上述した他の研究において、制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビボで、Ｈｓｐ６０ｓｐを負荷したＱａ−１発現ＤＣにより直接的に誘導され、引き続いて誘発されるＥＡＥから動物を保護する。Ｑａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞経路の初回抗原刺激におけるＤＣの正確な機能は、さらに研究する必要がある。
【０２４２】
ここで提示する研究において、効果的なワクチンとして機能する２つの自己ペプチドは、Ｂ１０ＰＬおよびＮＯＤマウスの両方においてＭＨＣクラスII応答を効果的に誘発することができる両方のＭＨＣクラスII結合ペプチドである。１−９ＮａｃＭＢＰは、Ｂ１０ＰＬマウスにおける病原性自己免疫ＥＡＥの原因となる自己ペプチドであり（１７９）、ｐ２７７は、ある一定のマウス系においてＴ１Ｄを誘発することができ（１７４）、ＮＯＤマウスにおいてＴ１Ｄに関連し得るが、ｐ２７７がＢ１０ＰＬマウスにおいてＥＡＥを誘発し得ること、または１−９ＮａｃＭＢＰがＮＯＤマウスにおいてＴ１Ｄを誘発し得ることの証拠はない。興味深いことに、両方のペプチドは、ワクチン接種された動物において、ＥＡＥまたはＴ１Ｄを等しく妨げることができる。この鍵となる知見は、ワクチンペプチドがある一定の自己免疫疾患に対して病原性であるかどうかに関わらず、それらが免疫応答を惹起し、Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐのような共通の標的構造を提供し、Ｑａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を初回抗原刺激する限り、それらは交差保護できることを示す（図１９）。それ故、共通の標的構造の特異的な認識を介して、交差保護は、ワクチンペプチドに関連するか、または無関係であるインビボにおいてある一定の自己免疫疾患の原因となる特定の自己抗原により活性化される、関連する病原性の自己応答性Ｔ細胞の下方制御により達成される。
【０２４３】
概念的に、「結合活性モデル」において述べられている中間の結合活性のＴ細胞が、胸腺において除去されるものよりも低い結合活性を有するが広範な結合活性をカバーする胸腺の逸脱者のより大きなプールを意味することを強調することは重要である。胸腺のネガティブセレクションの閾値の低い境界線に近い高い端から低い端まで拡張することが可能であり、胸腺のポジティブセレクションの閾値の高い境界線に近くなり得る。「中間の結合活性」の正確な生物学的な閾値は、まだ同定されていない。異なる実験系においては、ある一定の範囲で変化し得る。この点において、いくつかの研究で、「低い結合活性」（おそらく、中間の結合活性の低い末端にも適用される）を有するある一定の自己応答性Ｔ細胞は、末梢において活性化されて自己免疫疾患を惹起し、例えば、Ｂ１０ＰＬマウスにおける１−９ＮａｃＭＢＰ特異的な脳炎惹起性のクローンである。一方、いくつかの自己免疫疾患において、病原性の自己応答性Ｔ細胞は、自己抗原に対してずっと高い結合活性（おそらく中間の結合活性の範囲の高い末端にも適用される）を有するように思われ、例えば、ＮＯＤマウスにおけるある一定の病原性糖尿病クローンである（１４）。我々の現在の研究におけるＱａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞がＥＡＥおよびＴ１Ｄから動物を保護するという知見は、この制御経路が、末梢におけるより広範な結合活性によりカバーされる中間の結合活性の自己応答性Ｔ細胞を選択的に下方制御するという知見と一致する。
【０２４４】
特有の自己免疫疾患にまたがる「交差保護」は、Ｔ細胞活性化の結合活性を認知することにより、末梢性Ｔ細胞制御に翻訳され、制御されるＴ細胞の抗原特異性に依存せず、末梢において自己と非自己を識別するという仮説に対する生物学的な証拠を提供する。この点において、「結合活性モデル」は、「エルゴタイプの制御」の重要な概念的要素を含み、どの抗原が標的Ｔ細胞を活性化するかに関わらず、両方のタイプの制御がＴ細胞活性化の結果を認識する。しかしながら、「エルゴタイプの制御」はＴ細胞活性化の結合活性を考慮しないため、「エルゴタイプの制御」とも異なる（１８０、１８１）。
【０２４５】
切断された自己応答性レパートリーは、高い結合活性のＴ細胞が含まれない胸腺のネガティブセレクションにより産生され、自己と非自己の識別が、自己および外来抗原の両方に対して中間の結合活性のＴ細胞の選択的な下方制御の単純な統合されたメカニズムにより末梢において達成され得るという概念に対する生物学的な基礎となる。高い結合活性ではなく、中間の結合活性のＴ細胞上に優先的に発現される共通の代理の標的構造の特異的な認識の結果として、いずれかの自己または外来抗原により活性化される中間の結合活性のＴ細胞は、下方制御を誘導するのみならず、下方制御の標的となることができる一方で、いずれかの外来抗原により活性化される高い結合活性のＴ細胞は、下方制御を免れ得る（図１９）。このことは、インビボにおける交差保護を説明するＱａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、自己抗原１−９ＮａｃＭＢＰおよびＢ：９−２３に対する全体的な免疫応答を特異的に阻害するが、外来抗原ＨＥＬに対しては阻害しないことが現在の研究で見出された理由である（図１８）。この一連のデータは、Ｑａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＥＬ ＴＧマウスにおける自己抗原の生物学的な状況においてＨＥＬに対する全体的な免疫応答を阻害するが、ＱＴマウスにおける外来抗原の生物学的な状況においては、同じ抗原に対する免疫応答を増強するという先行する知見と一致する。それ故、研究は、中間の結合活性のＴ細胞の選択的な下方制御の統一されたメカニズムは、自己と外来抗原に対する免疫応答において反対の全体的な効果を有するということを一貫して明らかにし：少なくともダメージを与えることなく、外来抗原に対する免疫応答、自己と非自己の識別の機能的な状態を最適化しながら自己寛容を維持する。これは、外来抗原により活性化されるＴ細胞の中で、中間の結合活性のもののみがＣＤ８＋Ｔ細胞により下方制御される一方、外来抗原に対して高い結合活性を有するＴ細胞は、下方制御を免れるだけでなく、スペースおよび栄養に対する競合がほとんどないことにより、間接的に成長も促進され得ることによる。一方、自己応答性レパートリーは、主に中間および低い結合活性のＴ細胞で構成され、高い結合活性のＴ細胞は含まれないため、自己抗原に関連する中間の結合活性のＴ細胞の下方制御の全体的な効果は、自己免疫の絶対的な抑制である。
【０２４６】
合わせて考えると、自己と外来抗原に対するナイーブ末梢性Ｔ細胞レパートリーの特有の組成は、自己と外来抗原に対する中間の結合活性のＴ細胞の選択的な下方制御の反対の全体的な生物学的な結果を決定する。これは、Ｔ細胞制御のレベルで末梢において自己と非自己を識別する必要なく、適応免疫の間に免疫系が自己と非自己の識別をどのように達成するかということを生物学的な系のレベルで説明するための新しいパラダイムに対する概念的骨子を形成する「結合活性モデル」の中心的な価値である。それ故、免疫系は、自己と外来抗原との間の構造的な違いを認識するのではなく、Ｔ細胞活性化の結合活性を認知することにより、適応免疫の間に、自己と非自己を区別する。一般的に、高い結合活性のＴ細胞を含まない切断されたレパートリーに関して、いずれかの抗原に対して特異的な中間の結合活性のＴ細胞の選択的な下方制御は、免疫系が末梢性の自己寛容を達成する生物学的なアプローチである。しかしながら、高い結合活性のＴ細胞を含む完全なレパートリーに関して、いずれかの抗原に対して特異的な中間の結合活性のＴ細胞の選択的な下方制御の同じメカニズムは、高い結合活性のＴ細胞の支配を促進し、特定の免疫応答を促進し得る。末梢において中間の結合活性のＴ細胞の選択的な下方制御により達成される自己と非自己の識別は、胸腺のネガティブセレクションにより産生される完全な外来応答性レパートリーと切断された自己応答性レパートリーの特有の組成によってのみ維持され得る。
【０２４７】
要約すると、Ｔ細胞活性化の結合活性を「認知する」ことが、末梢性Ｔ細胞制御に翻訳され得るという知見は、「結合活性モデル」の本質であり、末梢において適応免疫がどのように制御されて自己／非自己の識別を達成するかということを胸腺のネガティブセレクションの結果が決定するという生物学的な必然性を理解するための概念的骨子を提供する。胸腺のネガティブセレクションと末梢性の免疫制御との間の身体的な関連は、潜在的に病原性の自己応答性Ｔ細胞を含む中間の結合活性の自己応答性Ｔ細胞の末梢への放出が、胸腺のネガティブセレクションの生物学的な結果であり、末梢性の制御メカニズムにより特異的に扱われるべきであるという事実である。Ｑａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される制御経路は、自己寛容を維持するために胸腺のネガティブセレクションにより不完全に達成される自己と非自己の識別を完成するように免疫系が進化した、末梢性メカニズムの一例を示す。これらの制御メカニズムは、例えば、抗原活性化誘導性の細胞死もしくは同時刺激分子の発現のような免疫応答の規模およびクラス、またはＣＤ４＋Ｔ細胞の機能的な活性化およびＴｈ１とＴｈ２もしくはＴｒ１およびＴｒ３制御性細胞への分化を制御する内因性のメカニズムとは異なる（１７８）。それらは、自己および外来抗原の両方に対する全体的な免疫応答を陰性に制御する「自然に発生するＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓ」とも異なる（１８２）。
【０２４８】
特に、制御の特異性は、標的Ｔ細胞を活性化する抗原のレベルではないため、自己免疫疾患の制御は、いずれかの所定の自己免疫疾患に関与する特定の自己抗原（抗原は、大部分が現在において決定されていない）の知識とは無関係に達成され得る。
【０２４９】
交差保護研究のための物質および方法
動物
使用した全てのマウス（ジャクソンラボ）は、コロンビア大学の比較医学（Comparative Medicine）の分野と関連する病原体のない動物施設で飼われている。コロンビア大学における施設内動物管理および使用委員会は、全ての動物研究に対して認可を与えた。
【０２５０】
試薬：
抗Ｑａ−１ａ抗血清は、D. Axelrod公衆衛生研究所のDr. Lorraine Flahertyから譲り受けたものである。染色試薬であるフルオレセイン（Ｆ１）５３−６．７２（抗マウスＣＤ８）、フィコエリトリン（ＰＥ）−ＧＫ１．５（抗マウスＣＤ４）は、Pharmingenから購入した。ペプチドＨｓｐ６０ｓｐ（ＱＭＲＰＶＳＲＡＬ）（配列番号２）、Ｂ：９−２３（ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧ）（配列番号１２）は、ジーンスクリプトコーポレーションにより合成される。ペプチドＱｄｍ（ＡＭＡＰＲＴＬＬＬ）、ｐ２７７（配列番号１）、（ＶＬＧＧＧＶＡＬＬＲＶＩＰＡＬＤＳＬＴＰＡＮＥＤ）（配列番号１３）および１−９ＮａｃＭＢＰ（ＡｃＡＳＧＬＡＰＳＧＡ）（配列番号１４）は、コロンビア大学において、タンパク質コア施設により合成される。
【０２５１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングは、標準方法に従って行われた。異なる結合活性を有する１−９Ｎａｃ ＭＢＰまたはｐ２７７特異的なＣＤ４＋クローンは、照射された脾細胞（ＡＰＣ）および抗原ペプチド（１〜５０μＭ）で７２時間刺激された。使用したＡｂｓは、抗アクチン、抗Ｈｓｐ６０、抗ＭＨＣクラスＩａ Ｍ１／４２および抗Ｑａ−１ａ血清であり、２次Ａｂウサギ抗マウスＨＲＰまたはウサギ抗ラットＨＲＰと共にインキュベートされた。標的タンパク質は、ＥＣＬ検出キット（アマシャムバイオサイエンス）を用いて検出された。全てのブロットは、ChemiDoc XRS Imager Quantity one-4.5.0ソフトウェア（ビオ−ラド）を用いて濃度測定的に定量された。
【０２５２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞阻害アッセイ
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ８ ＭＡＣＳ磁気ビーズ（Miltenyibiotec, Inc. Auburn CA）を用いて精製された。３Ｆ４細胞は、２６℃で一晩、ペプチドを受動的に負荷された。等しい数のペプチドを負荷した非標識の３Ｆ４細胞とペプチドを負荷していないＣＦＳＥ標識３Ｆ４細胞とを混合し、段階的な数のＣＤ８＋Ｔ細胞が標的に加えられた。ナイーブマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞は対照として使用され、我々は、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化標的Ｔ細胞において効果を有さないことを確立した。陽性対照および陰性対照としての、Ｑａ−１拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞の生理学的な標的である実際の１−９Ｎａｃ ＭＢＰ特異的な中間の結合活性のＴ細胞クローン１ＡＥ１０および低い結合活性のクローン４Ｄ１０は、Ｂ１０ＰＬマウスにおける全ての機能分析に組み込まれ、ｐ２７７特異的な中間の結合活性のＴ細胞クローン１５Ａ６および低い結合活性のクローン１３Ｃ４は、ＮＯＤマウスにおける分析に組み込まれた。加えて、全ての分析において、試験されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｈｓｐ６０ｓｐまたはＱｄｍでパルスされたＣ１Ｒ細胞において効果を有さない。４日後、細胞混合物は、抗マウスＣＤ８−ＰＥ ｍＡｂで染色され、ＣＤ８＋Ｔ細胞と標的細胞とを区別し、２つのタイプの標的の間の比が計算される場合、分析の間にＣＤ８＋Ｔ細胞が除かれた。ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下におけるペプチド負荷した（ＣＦＳＥ標識なしの）３Ｆ４細胞と負荷されていない（ＣＦＳＥ標識された）３Ｆ４細胞との間の比は、特異的な阻害の％として決定された：｛［対照培地（ＣＤ８＋Ｔ細胞なし）における負荷された３Ｆ４細胞と負荷されていない３Ｆ４細胞との比−実験培地（ＣＤ８＋Ｔ細胞あり）における比］／対照培地における比｝×１００％。
【０２５３】
ＥＡＥおよびＴ１Ｄモデルにおけるペプチドワクチン接種ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入
この研究を通して使用される標準的なプロトコルにおいて、雌の８〜１０週齢のＢ１０ＰＬまたは３〜４週齢のＮＯＤマウスは、ＩＦＡで乳化された１−９Ｎａｃ ＭＢＰまたはｐ２７７を、１００μＭ／マウスの量で皮下に免疫化された。ＥＡＥは、ペプチドワクチン接種の少なくとも１週間後に誘発された。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ８ ＭＡＣＳ磁気ビーズ（Miltenyibiotec, Inc. Auburn CA）を用いたポジティブセレクションにより、ペプチドワクチン接種により保護されたＥＡＥ／Ｂ１０ＰＬマウスまたはＴ１Ｄ／ＮＯＤマウスの脾臓または流入領域リンパ節から精製された。ＣＤ８＋Ｔ細胞の純度は、常に＞９５％である。２−５×１０６ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ナイーブＮＯＤマウスまたはＢ１０ＰＬマウスの静脈内に養子性に導入され、その１週間後にＥＡＥを誘発された。
【０２５４】
ペプチドワクチン接種またはＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入の効果は、レシピエントマウスにおいて臨床的なＥＡＥ（１８１）またはＴ１Ｄを評価することにより評価された。自然に発症したＴ１Ｄは、１日おきにグルコースの血清レベルを測定することにより評価された。２回の測定について２５０ｄｇ／ｍｌを超えるグルコースレベルを有するマウスは、糖尿病であると判断された。
【０２５５】
自己と外来抗原に対する免疫応答におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の効果を評価するためのイクスビボアッセイ
Ｂ１０ＰＬまたはＮＯＤマウスは、１−９ＮａｃＭＢＰまたはｐ２７７ワクチン接種保護されたマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を、２〜５×１０６細胞／マウスで養子移入された１日後、自己抗原（Ｍ１０ＰＬマウスにおける１−９ＭａｃＭＢＰもしくはＮＯＤマウスにおけるＢ：９−２３）または外来抗原（ＨＥＬ）を曝露された。７〜９日目に、単細胞懸濁液が流入領域リンパ節から調製され、１×１０６ＬＮＣまたは０．２５×１０６精製ＣＤ４＋Ｔ細胞＋１×１０６照射脾細胞が、平底９６ウェルプレートにおいて、１ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＡＩＭ−Ｖ血清を含まないリンパ球培地（ＧＩＢＣＯ）中に蒔かれた。抗原は、０．０３〜３００μＭの範囲の濃度で添加された。４日間の培養の最後の１８時間の間に、３Ｈチミジンが添加され（１ｕＣｉ／ウェル）、標識の結合が液体シンチレーションカウンティングにより測定された。細胞増殖は、１分当りの計数として、抗原濃度に対してプロットされ、ＥＤ５０値は、最大増殖の半分となる抗原濃度の切片を計算することにより導かれた（１８３、１８４）。
【参考文献１】
【０２５６】
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【参考文献２】
【０２５７】
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【参考文献３】
【０２５８】
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【参考文献４】
【０２５９】
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【参考文献５】
【０２６０】
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【参考文献６】
【０２６１】
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【参考文献７】
【０２６２】
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【参考文献８】
【０２６３】
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【参考文献９】
【０２６４】
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【参考文献１０】
【０２６５】
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【参考文献１１】
【０２６６】
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【参考文献１２】
【０２６７】
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【参考文献１３】
【０２６８】
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【参考文献１４】
【０２６９】
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【参考文献１５】
【０２７０】
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【参考文献１６】
【０２７１】
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【参考文献１７】
【０２７２】
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【参考文献１８】
【０２７３】
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【参考文献１９】
【０２７４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【配列表】
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【誤訳訂正書】
【提出日】平成22年1月15日(2010.1.15)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７８】
抗Ｑａ−１ａ抗血清を産生するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスは、２×１０６／マウスのＪ２ａ（Ｑａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐ）細胞で静脈内に免疫化されてよい。マウスはその後、２週間毎に２×１０６Ｊ２細胞をＩＰ注入することにより、４回追加免疫されてよい。血清は、Ｈｓｐ６０ｓｐまたはＱａ−１／Ｈｓｐ６０ｓｐ発現Ｊ２ａトランスフェクタントおよび／またはＱａ−１ａ発現マウスＴ細胞クローン１ＡＥ１０を負荷したＪ２の染色について試験されてよい。抗Ｑａ−１ａ血清は、Ｈｓｐ６０ｓｐを同時発現するＱａ−１トランスフェクタントを用いてマウスを免疫化することにより産生されてよい。高いタイトルのマウスに由来する脾臓細胞は、融合パートナーのＳＰ２／０細胞と融合するために使用され、融合が成功した後に、９６ウェルプレートにおいて、希釈を制限することによりクローン化されてよい。各ウェルからの上清は、上清でＪ２ａおよびＣ１Ｒ細胞を染色することにより差次的にスクリーニングされ、その後、ＥＬＩＳＡ分析にかけられてよい（１７０）。簡単に言うと、５×１０４のＪ２ａトランスフェクタントおよびＣ１Ｒ細胞は、平底の９６ウェルプレート中に蒔かれ、ウサギ抗Ｃ１Ｒ抗血清（Pocono Rabbit Farm and Laboratory INC. Canadensis, PA）が各ウェルに加えられ、Ｊ２ａトランスフェクタント上のＱａ−１ａ／Ｈｓｐ６０ｓｐを除いて、Ｃ１ＲおよびＪ２ａ細胞により発現されるいずれかの抗原性決定因子を遮断するために上清が加えられる。プレートは洗浄され、上清がウェルに加えられ、ＨＲＰ標識されたウサギ抗マウスＩｇＧが加えられる。ＴＭＢ基質は、各ウェルに加えられて１０〜１５分インキュベーションされ、反応は、２ＮのＨ２ＳＯ４を加えることにより停止されてよい。吸収は、９６ウェルプレートリーダー（Molecular Devices, Menlo Park, CA）を用いて測定されてよい。染色に対する陽性対照は、抗Ｑａ−１ａ血清であってよい。上清がＪ２ａに対してのみ陽性であり、Ｃ１Ｒに対しては陰性であるウェルは、さらなるサブクローニングのために選択されてよい。これらのｍＡｂを作るための一般的な方法は、ＣＤ４０ＬおよびＶＬＡ−１に対するｍＡｂの同定において、以前に我々の研究室で首尾よく使用された（１７１、１７２）。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２５３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２５３】
ＥＡＥおよびＴ１Ｄモデルにおけるペプチドワクチン接種ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入
この研究を通して使用される標準的なプロトコルにおいて、雌の８〜１０週齢のＢ１０ＰＬまたは３〜４週齢のＮＯＤマウスは、ＩＦＡで乳化された１−９Ｎａｃ ＭＢＰまたはｐ２７７を、１００μＭ／マウスの量で皮下に免疫化された。ＥＡＥは、ペプチドワクチン接種の少なくとも１週間後に誘発された。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ８ ＭＡＣＳ磁気ビーズ（Miltenyibiotec, Inc. Auburn CA）を用いたポジティブセレクションにより、ペプチドワクチン接種により保護されたＥＡＥ／Ｂ１０ＰＬマウスまたはＴ１Ｄ／ＮＯＤマウスの脾臓または流入領域リンパ節から精製された。ＣＤ８＋Ｔ細胞の純度は、常に＞９５％である。２−５×１０６ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ナイーブＮＯＤマウスまたはＢ１０ＰＬマウスの静脈内に養子性に導入され、その１週間後にＥＡＥを誘発された。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２５５】
自己と外来抗原に対する免疫応答におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の効果を評価するためのイクスビボアッセイ
Ｂ１０ＰＬまたはＮＯＤマウスは、１−９ＮａｃＭＢＰまたはｐ２７７ワクチン接種保護されたマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を、２〜５×１０６細胞／マウスで養子移入された１日後、自己抗原（Ｍ１０ＰＬマウスにおける１−９ＭａｃＭＢＰもしくはＮＯＤマウスにおけるＢ：９−２３）または外来抗原（ＨＥＬ）を曝露された。７〜９日目に、単細胞懸濁液が流入領域リンパ節から調製され、１×１０６ＬＮＣまたは０．２５×１０６精製ＣＤ４＋Ｔ細胞＋１×１０６照射脾細胞が、平底９６ウェルプレートにおいて、１ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＡＩＭ−Ｖ血清を含まないリンパ球培地（ＧＩＢＣＯ）中に蒔かれた。抗原は、０．０３〜３００μＭの範囲の濃度で添加された。４日間の培養の最後の１８時間の間に、３Ｈチミジンが添加され（１ｕＣｉ／ウェル）、標識の結合が液体シンチレーションカウンティングにより測定された。細胞増殖は、１分当りの計数として、抗原濃度に対してプロットされ、ＥＤ５０値は、最大増殖の半分となる抗原濃度の切片を計算することにより導かれた（１８３、１８４）。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１７Ｂ
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１７Ｂ】
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【国際調査報告】
2010519256.tif 000051
2010519256.tif 000052
2010519256.tif 000053