(57)【要約】  本発明は、ビタミン１２利用の効率を向上させた微生物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＢ１２の取り込みの効率の増加をもたらすために遺伝子修飾されている微生物。
【請求項２】
前記効率の増加が調節解除されたビタミンＢ１２取り込み系によって達成される、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記ビタミンＢ１２取り込み系が配列番号２の少なくとも一つの負の調節タンパク質またはその機能的相同体もしくは断片ならびに／または配列番号４、６、および８のサブユニットから形成される少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質またはその機能的相同体もしくは断片をコードする核酸配列を含む、請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
少なくとも一つの負の調節タンパク質および少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質をコードする前記核酸配列が、前記少なくとも一つの負の調節タンパク質が前記少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質の発現を調節するようにオペロンとして編成される、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
前記少なくとも一つの負の調節タンパク質の量および／または活性が、遺伝子変異を示さない対応する出発生物と比較して前記遺伝子変異によって部分的に減少される、請求項３または４に記載の微生物。
【請求項６】
前記少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質の量および／または活性が、遺伝子変異を示さない対応する出発生物と比較して前記遺伝子変異によって部分的に増加される、請求項３から５までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項７】
前記微生物がグラム陽性微生物から、好ましくはアクチノバチルスから、およびより好ましくは放線菌から選択される、請求項１から５までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項８】
前記微生物がコリネバクテリウム属、および好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．グルタミクム）の種から選択される、請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
前記微生物がグラム陽性微生物であり、ならびに前記ビタミンＢ１２取り込み系が配列番号２の少なくとも一つの負の調節タンパク質またはその機能的相同体もしくは断片と、配列番号４、６、および８のサブユニットを含む少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質またはその機能的相同体もしくは断片とをコードする核酸配列を有するオペロンを含む、請求項１から８までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
前記微生物がＣ．グルタミクムの種から選択され、ならびにビタミンＢ１２取り込み系が配列番号２と少なくとも５０％の配列相同性を有する少なくとも一つの負の調節タンパク質と、配列番号４、６、および８と少なくとも５０％の配列相同性を有するサブユニットを含む少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質とをコードする核酸配列を有するオペロンを含む、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
遺伝子変異を示さない出発生物と比較して、配列番号２と少なくとも５０％の配列相同性を有する前記少なくとも一つの負の調節タンパク質の発現が前記遺伝子変異によって少なくとも部分的に減少され、ならびに配列番号４、６、および８と少なくとも５０％の配列相同性を有するサブユニットを含む前記少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質の発現が前記遺伝子変異によって少なくとも部分的に増加される、請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
遺伝子変異を示さない出発生物と比較して、配列番号２と少なくとも５０％の配列相同性を有する前記少なくとも一つの負の調節タンパク質の発現が前記遺伝子変異によって完全に減少される、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１３】
遺伝子変異を示さない出発生物と比較して、配列番号４、６、および８と少なくとも５０％の配列相同性を有するサブユニットを含む前記少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質の発現が強いプロモーターによって、ならびに／または前記サブユニットをコードする核酸配列のコピー数を増加することによって少なくとも部分的に増加される、請求項１１または１２に記載の微生物。
【請求項１４】
以下の因子、
−  ｍｅｔＡ／Ｘ、
−  ｍｅｔＺ／Ｙ、
−  ｍｅｔＦ、
−  ｍｅｔＨ、
−  ｔｈｒＡ、
−  ｍｅｔＥ
のうちの一つ以上の因子、機能的相同体、および／または機能的断片の量ならびに／または活性が遺伝子変異を示さない出発微生物と比較して前記遺伝子変異によってさらに増加され、ならびに／または以下の因子、
−  ｍｅｔＫ、
−  ｔｈｒＢ
からの一つ以上の因子、機能的相同体、および／または機能的断片の量ならびに／または活性が遺伝子変異を示さない出発微生物と比較して前記遺伝子変異によって減少される、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１５】
その生物学的合成がビタミンＢ１２を必要とするファインケミカルを得るための請求項１から１４までのいずれか１項に記載の微生物の使用。
【請求項１６】
メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、およびメチオニンスルホキシドを得るための請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
その生物学的合成がビタミンＢ１２を必要とするファインケミカルを得るための方法であって、
請求項１から１４までのいずれか１項に記載の微生物を培養するステップと、
前記ファインケミカルを得るステップと、を含む方法。
【請求項１８】
前記ファインケミカルがメチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、およびメチオニンスルホキシドからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミン１２の摂取の効率を増加させた微生物に関する。本発明はさらに、その生合成にはメチオニンを含むビタミンＢ１２を必要とするファインケミカルを得るためにそのような微生物を使用することに関する。
【０００２】
現在、メチオニンの全世界年間生産量は、約５００，０００トンである。メチオニンは、家畜の養鶏飼料における第一制限アミノ酸であり、このため主に飼料添加物として利用されている。
【０００３】
他の工業用アミノ酸とは対照的に、メチオニンは、化学合成によって生成されるＤ−メチオニンとＬ−メチオニンとのラセミ化合物としてほぼ独占的に利用されている。動物はメチオニンの両立体異性体を代謝できるので、化学生成したラセミ混合物を直接摂取することが可能である（Ｄ′Ｍｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ：  Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，  Ｒｅｃｈｇｉｇｌ  （Ｅｄ．），  ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ，  ４４１−４９０，  １９７８）。
【０００４】
しかし、現存の化学的生成を、Ｌ−メチオンだけを生成するバイオ技術プロセスに代えることに対する関心は依然として高い。これは、低レベルの補給でＬ−メチオンがＤ−メチオニンよりも含硫アミノ酸のより優れた供給源であるという事実による（Ｋａｔｚ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ（１９７５）Ｐｏｕｌｔ．  Ｓｃｉ．  ５４５：  １６６７−７４）。さらに、化学プロセスは、ある程度有害な化学薬品を使用し、かつかなりの廃液を作り出す。化学的生成に関するこれらの不利点のすべては、効率的なバイオ技術プロセスによって回避できる。
【０００５】
アミノ酸、芳香族化合物、ビタミン、および補助因子等のファインケミカルの発酵生成は、例えばコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（Ｃ．グルタミクム）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、アシュビア・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、またはグルコノバクターオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎ）等の微生物で、現在は一般的に行われている。
【０００６】
グルタミン酸等のアミノ酸は、このように発酵方法を用いて生成される。こうした目的のために、大腸菌およびコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．グルタミクム）等のいくつかの微生物は、特に適していることが判明している。発酵によるアミノ酸の生成も、とりわけ、Ｌ−アミノ酸だけが生成される利点、および化学合成では溶媒が一般的に使用されるので溶媒等の環境的に問題のある化学製品は回避される利点を有する。
【０００７】
大腸菌およびＣ．グルタミクム等の微生物中で、アミノ酸、脂質、ビタミン、または炭水化物等のファインケミカルを生成するための先行技術における一部の試みでは、例えば、それぞれのファインケミカルの生合成経路に関与する遺伝子の発現を増加させることでこの目的を達成する試みがなされてきた。
【０００８】
例えば、リシン生成の生合成経路に関与する遺伝子の発現を上方制御することでリシンの生成を増加させる試みは、国際公開第０２／１０２０９号、国際公開第２００６００８０９７号、国際公開第２００５０５９０９号、またはＣｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  （１９９１），  ５７（６），  １７４６−１７５２）に記載されている。
【０００９】
しかし、Ｃ．グルタミクム等の微生物でのメチオニンまたは他のファインケミカルの生成に有益に影響するのに使用できる代謝経路においてさらに標的を同定する強い要求が依然としてある。
【００１０】
この状況を考慮して、本発明の一つの目的は、Ｌ−メチニンを生成するのに使用できる微生物、および好ましくはコリネ型細菌を提供することである。本発明のさらなる目的は、微生物で、および好ましくはコリネ型細菌でＬ−メチオニンを生成するために用いられることができる方法を提供することである。
【００１１】
後述の説明により明らかになるように、これらの目的および他の目的は、独立請求項で説明されるように本発明によって解決される。従属請求項は、本発明の好ましい実施形態の一部に関する。
【００１２】
一実施形態において、本発明はビタミンＢ１２の取り込みの効率を高めた微生物に関する。その一態様において、本発明はビタミンＢ１２の取り込みを調節解除した系を有する微生物に関する。一般的に、そのようなＢ１２取り込み系は、少なくとも一つの負の調節タンパク質および／または少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質をコードする核酸配列を含む。そのような負の調節タンパク質の代表的な例は、配列番号２を有するＣ．グルタミクムの推定されるｂｔｕＲ２リプレッサーである。ＡＢＣ型輸送タンパク質の代表的な例は、配列番号４、６、および８のＣ．グルタミクムでＡＢＣ型輸送タンパク質を形成する３つのサブユニットである。Ｃ．グルタミクムでは、上述した遺伝子は、本明細書でｂｔｕ２オペロンと称されるオペロンによってコードされ、および３つのコード配列（配列番号３、５、および７）は、それぞれｂｔｕＦ２、ｂｔｕＣ２、およびｂｔｕＤ２と称される。
【００１３】
好ましい実施形態において、本発明は、調節解除したビタミンＢ１２取り込み系を有する微生物に関する。そのビタミンＢ１２取り込み系は、少なくとも一つの負の調節タンパク質および／または少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質をコードする核酸配列を含み、少なくとも一つの負の調節タンパク質および少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質をコードする前述の核酸配列は、前述の少なくとも一つの負の調節タンパク質が前述の少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質の発現を調節するようにオペロンとして編成される。
【００１４】
本発明の特に好ましい実施形態において、微生物は、配列番号２の少なくとも一つの負の調節タンパク質またはその機能的相同体もしくは断片と、配列番号４、６、および８のサブユニットまたはその機能的相同体もしくは断片を含む少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質とをコードする核酸配列を有するオペロンを含む調節解除したビタミンＢ１２取り込み系を含む。
【００１５】
前述の実施形態の一態様において、本発明は、前述の少なくとも一つの負の調節タンパク質の量が遺伝子変異を示さない対応する出発生物と比較して前述の遺伝子変異によって少なくとも部分的に減少する微生物に関する。好ましくは、前述の少なくとも一つの負の調節タンパク質の量および／または活性は、対応する出発生物と比較して完全に欠失されるか、または取り除かれる。
【００１６】
上述の少なくとも一つの負の調節タンパク質の量および／または活性は、前述の少なくとも一つの負の調節タンパク質をコードする微生物の内在性核酸配列を、例えば破壊することによって少なくとも部分的に減少し得る。前述の少なくとも一つの負の調節タンパク質の量および／または活性は、例えば、前述の少なくとも一つの負の調節タンパク質の発現を前述のタンパク質の発現を推進する内在性プロモーターよりも弱いプロモーターの制御下に置くことによって、ならびに／またはＡＢＣ型輸送タンパク質の発現に関してタンパク質の負の調節機能を少なくとも部分的に減少させる、好ましくは消滅させる変異を前述の少なくとも一つの負の調節タンパク質に導入することによっても減少し得る。
【００１７】
あるいはまたは本発明の上述の実施形態のこの態様に加えて、本発明は、前述の少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質の量および／または活性が遺伝子変異を示さない対応する出発生物と比較して遺伝子変異によって少なくとも部分的に増加された微生物に関する。
【００１８】
上述の少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質の量および／または活性は、前述のタンパク質をコードする核酸配列のコピー数を増やすことによって、出発生物と比較して増加され得る。核酸配列のコピー数は、例えば、ＡＢＣ型輸送タンパク質をコードする核酸配列を含む自己複製ベクターを用いて、および／またはＡＢＣ型輸送タンパク質をコードする核酸配列の追加のコピーを出発生物のゲノムに染色体組み込みすることによって増加させることができる。
【００１９】
ＡＢＣ型輸送タンパク質の量および／または活性の増加も、そのようなタンパク質の一つ以上のサブユニットをコードする核酸配列の転写および／または翻訳を増加させることで達成され得る。転写の増加は、これらの核酸配列の発現を支配する内在性プロモーターからの発現よりも強い発現を確実にするプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントを用いることで達成され得る。翻訳の増加は、前述の酵素をコードする核酸配列のコドンを利用することで宿主生物での発現が最適化される場合、または改良されたリボソームの結合部位および翻訳開始部位をコード配列の上流領域に設置する場合、達成され得る。
【００２０】
ＡＢＣ型輸送タンパク質の活性も、そのタンパク質の活性を増加させる前述のタンパク質をコードする核酸配列に変異を導入することで、出発生物と比較して増加し得る。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態の一部では、ＡＢＣ型輸送タンパク質の量および／または活性は、上述の方法を組み合わせることによって、出発生物と比較して増加する。
【００２２】
好ましい実施形態において、本発明の上述の態様の微生物は、グラム陽性微生物から、好ましくはアクチノバチルスから、およびより好ましくは放線菌から選択される。
【００２３】
さらにより好ましい実施形態において、微生物は、コリネバクテリウム属から、および好ましくはＣ．グルタミクムの種から選択される。本発明の目的で使用することができる好ましいＣ．グルタミクム株は、ＡＴＣＣ１３０３２等の野生型株またはメチオニン生成を向上させるためにすでに操作されている菌株である。そのような後者の菌株は、後述するようにＤＳＭ１７３２２、Ｍ２０１４もしくはＯＭ４６９もしくはＭ２５４３のような遺伝子変異を示す。
【００２４】
特に好ましい実施形態において、本発明は、Ｃ．グルタミクムの種から選択され、かつその調節解除されたビタミンＢ１２取り込み系が配列番号２の少なくとも一つの負の調節タンパク質またはその機能的相同体もしくは断片と、配列番号４、６、および８のサブユニットまたはその機能的相同体もしくは断片を含む少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質とをコードする核酸配列を有するオペロンを含む微生物に関する。
【００２５】
少なくとも一つの負の調節タンパク質の機能的相同体または断片は、配列番号２と少なくとも５０％の配列相同性を有し得る。少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質の機能的相同体または断片は、配列番号４、６、および８と少なくとも５０％の配列相同性を有し得る。
【００２６】
特に好ましい実施形態は、配列番号２と少なくとも５０％の配列相同性を有する配列番号１の少なくとも一つの負の調節タンパク質または機能的相同体もしくは断片の発現が、前述の遺伝子変異を示さない出発生物と比較して、遺伝子変異によって部分的に、および好ましくは完全に減少する、Ｃ．グルタミクム微生物に関する。
【００２７】
特に好ましい別の実施形態は、配列番号４、６、および８とそれぞれ少なくとも５０％の配列相同性を有する、配列番号４、６、および８またはその機能的相同体もしくは断片のサブユニットを含む少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質の発現が、前述の遺伝子変異を示さない出発生物と比較して、強力なプロモーターおよび／または前述のサブユニットをコードする、コピー数を増加させた核酸配列を用いる等の遺伝子変異によって少なくとも部分的に増加されるＣ．グルタミクム微生物に関する。
【００２８】
同様に特に好ましい実施形態は、配列番号２と少なくとも５０％の配列相同性を有する配列番号２の少なくとも一つの負の調節タンパク質またはその機能的相同体もしくは断片の発現が、遺伝子変異によって部分的におよび好ましくは完全に減少され、ならびに配列番号４、６、および８と少なくとも５０％の配列相同性を有する配列番号４、６、および８のサブユニットまたはその機能的相同体もしくは断片を含む少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質の発現の発現が、前述の遺伝子変異を示さない出発生物と比較して、強力なプロモーターおよび／または前述のサブユニットをコードする、コピー数を増加させた核酸配列を用いる等の遺伝子変異によって少なくとも部分的に増加される、Ｃ．グルタミクム微生物に関する。
【００２９】
本発明は、また、その生物学的合成がビタミンＢ１２を必要とするファインケミカルを得るために、上述の微生物を用いることおよびその特に好ましい実施例に関する。そのようなファインケミカルとして、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオン、およびメチオニンスルホキシドが挙げられる。本発明は、また、その生物学的合成がビタミンＢ１２を必要とするファインケミカルを得る方法に関し、その方法は後述するように微生物を培養するステップと、前述のファインケミカルを得るステップとを含む。そのファインケミカルは、また、上述の群から選択されることもある。
【００３０】
図１は、ｂｔｕＲ２欠失がビタミンＢ１２の取り込みに与える影響を示す図である。
【００３１】
本発明の発明者は、驚いたことに、Ｃ．グルタミクムが負の調節タンパク質がＡＢＣ型輸送タンパク質の発現を下方制限すると思われる負の調節タンパク質およびＡＢＣ型輸送タンパク質のための核酸配列を含むオペロンからなるビタミンＢ１２取り込み系を含むことを見出した。
【００３２】
そのような系（以下に、総称的にｂｔｕ（Ｂ１２取り込みの略名）と名付けられる）は、細胞へのビタミンＢ１２の輸送を確実に行うと思われる。この系を調節解除することによって、ビタミンＢ１２をより効率的に用いる微生物を提供することが可能である。結果として、それらを合成するためにビタミンＢ１２を必要とするメチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、およびメチオニンスルホキシド等のファインケミカルを、通常使用するよりも少ないビタミンＢ１２を含む培地での生成のために広く用いられる微生物を増殖させることができる。
【００３３】
このように、以下にｂｔｕＲ２と名付けた負の調節タンパク質が変異し、Ｃ．グルタミクムで欠失される場合、細胞は、通常よりも著しく少ないビタミンＢ１２を含有する培地で増殖することができることを、本発明の発明者は見出した。これらの研究結果を考慮すると、ｂｔｕ２オペロンの部分も形成するＡＢＣ型輸送タンパク質のサブユニット（ｂｔｕＦ２、ｂｔｕＣ、およびｂｔｕＤ２と名付ける）をコードする配列の代わりにまたは加えて過剰発現させれば、同じ効果が達成できることは理にかなっていると思われる。さらに、本明細書に開示する研究結果を使用して、他のグラム陽性微生物において、および特に、アクチノバチルスの群から、より好ましくは同程度のビタミンＢ１２取り込み系を示す放線菌の群から選択される微生物の同等の機能の相同配列を同定することができる。
【００３４】
本発明の特定の態様および好ましい実施形態の一部をより詳細に説明する前に、以下の定義を示す。これらは、他に対応する文脈によって明示的に示さない限り本発明に関する記述を通して表す意味を有する。
【００３５】
以下に例示的に説明するように本発明は、本明細書に具体的に開示されないが、いかなる要素または複数の要素、限定または複数の限定のない状態で適切に実施され得る。
【００３６】
本発明は、特定の実施形態について説明されるが、本発明はそれに限定されることはなく、請求項によってのみ限定される。
【００３７】
用語「含む」が本説明および請求項で用いられる場合、それは他の要素を除外しない。本発明の目的で、用語「からなる」は、用語「で構成する」の好ましい実施形態であるとみなされる。以下に一つの群が少なくとも一定数の実施形態を含むと定義される場合、これも、好ましくはこれらの実施形態のみからなる一つの群を開示すると理解されるものとする。
【００３８】
単数名詞を参照するときに不定冠詞または定冠詞（例えば「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」）が使用される場合、これは、何か他のものを特に述べない限り、その名詞の複数形を含む本発明の文脈において、用語「約」または「おおよそ」は、該特徴の技術的効果が依然として確実にあると当業者が理解する確度の間隔を意味する。この用語は通常は、表示した数値の±１０％、および好ましくはその数値の±５％からの偏差を示す。
【００３９】
本発明の文脈において、用語「微生物」とは、いかなる原核生物型の微生物を称する。したがってこの用語は、大腸菌等のグラム陰性微生物およびＣ．グルタミクム等のグラム陽性微生物を含む。好ましくは、微生物は、グラム陽性微生物の群から、またはより好ましくはアクチノバチルスの群から、およびさらにより好ましくは放線菌群から選択される。コリネ型細遺伝子は、本発明において微生物の特に好ましいサブセットを形成する。
【００４０】
コリネ型細菌は、例えばコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ジェイケイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｉｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・メラッセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）、およびコリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）の種を含む。好ましい種は、Ｃ．グルタミクムである。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、コリネ型細菌は、Ｃ．グルタミクム  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃ．グルタミクム  ＫＦＣＣ１００６５、Ｃ．グルタミクム  ＡＴＣＣ２１６０８、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム  ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム  ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス  ＦＥＲＭＢＰ−１５３９、コリネバクテリウム・メラッセコラ  ＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・エフィシエンス  ＤＳＭ４４５４７、およびコリネバクテリウム・エフィシエンス  ＤＳＭ４４５４９を含む菌株、ならび例えば古典的突然変異誘発および選択によって、または定方向突然変異誘発によってそれらに由来する菌株に由来することもある。
【００４２】
Ｃ．グルタミクムの他の特に好ましい株は、ＡＴＣＣ１３０５８、ＡＴＣＣ１３０５９、ＡＴＣＣ１３０６０、ＡＴＣＣ２１４９２、ＡＴＣＣ２１５１３、ＡＴＣＣ２１５２６、ＡＴＣＣ２１５４３、ＡＴＣＣ１３２８７、ＡＴＣＣ２１８５１、ＡＴＣＣ２１２５３、ＡＴＣＣ２１５１４、ＡＴＣＣ２１５１６、ＡＴＣＣ２１２９９、ＡＴＣＣ２１３００、ＡＴＣＣ３９６８４、ＡＴＣＣ２１４８８、ＡＴＣＣ２１６４９、ＡＴＣＣ２１６５０、ＡＴＣＣ１９２２３、ＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ２１１５７、ＡＴＣＣ２１１５８、ＡＴＣＣ２１１５９、ＡＴＣＣ２１３５５、ＡＴＣＣ３１８０８、ＡＴＣＣ２１６７４、ＡＴＣＣ２１５６２、ＡＴＣＣ２１５６３、ＡＴＣＣ２１５６４、ＡＴＣＣ２１５６５、ＡＴＣＣ２１５６６、ＡＴＣＣ２１５６７、ＡＴＣＣ２１５６８、ＡＴＣＣ２１５６９、ＡＴＣＣ２１５７０、ＡＴＣＣ２１５７１、ＡＴＣＣ２１５７２、ＡＴＣＣ２１５７３、ＡＴＣＣ２１５７９、ＡＴＣＣ１９０４９、ＡＴＣＣ１９０５０、ＡＴＣC１９０５１、ＡＴＣＣ１９０５２、ＡＴＣＣ１９０５３、ＡＴＣＣ１９０５４、ＡＴＣＣ１９０５５、ＡＴＣＣ１９０５６、ＡＴＣＣ１９０５７、ＡＴＣＣ１９０５８、ＡＴＣＣ１９０５９、ＡＴＣＣ１９０６０、ＡＴＣＣ１９１８５、ＡＴＣＣ１３２８６、ＡＴＣＣ２１５１５、ＡＴＣＣ２１５２７、ＡＴＣＣ２１５４４、ＡＴＣＣ２１４９２、ＮＲＲＬＢ８１８３、ＮＲＲＬＷ８１８２、ＮＲＲＬＢ１２４１６、ＮＲＲＬＢ１２４１７、ＮＲＲＬＢ１２４１８、およびＮＲＲＬＢ１１４７６を含む群から選択される。
【００４３】
略称ＫＦＣＣは、Ｋｏｒｅａｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを表し、ＡＴＣＣは、Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｔｙｐｅ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを表す。略称ＤＳＭはＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎを表す。略称ＮＲＲＬは、ＡＲＳ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｐｅｏｒｅａ，  ＥＬ，  ＵＳＡを表す。
【００４４】
本発明の目的のため、好ましい野生型株は、Ｃ．グルタミクム  ＡＴＣＣ１３０３２である。
【００４５】
特に好ましいのは、メチオンを生成する能力がすでにあるＣ．グルタミクムの微生物である。したがって、以下に説明するＤＳＭｌ７３２２；Ｍ２０１４、ＯＭ４６９、またはＭ２５４３等の同様の効果を有する遺伝子変異を示す株は、特に好ましい。
【００４６】
本明細書では、特定のタンパク質は、前述のタンパク質をコードする遺伝子の名称によって称されることもある。例えば、「ｂｔｕＲ２」は、遺伝子ｂｔｕＲ２または遺伝子ｂｔｕＲ２によってコードされるタンパク質のいずれかを称することもある。
【００４７】
本発明の文脈において、用語「出発生物」とは、上述の負の調節タンパク質の量および／または活性を減少させるため、ならびに／または上述のＡＢＣ型輸送タンパク質の量および／または活性を増加させるために遺伝子修飾で用いられる微生物、および好ましくはコリネ型細菌、および特に好ましくはＣ．グルタミクム微生物に関する。
【００４８】
用語「遺伝子修飾」および「遺伝子変異」ならびに本発明の意味の範囲内でそれらの用語の文法的バリエーションは、対応する微生物中に天然に存在し得る一つ以上のタンパク質を、対応する微生物中に天然に存在しない一つ以上のタンパク質を改変させた量で発現させるために、あるいは修飾されてない対応する微生物のタンパク質と比較して改変した活性を有する一つ以上のタンパク質を発現させるために遺伝子工学の方法によって微生物が修飾されていることを意味することを意図する。修飾されてない微生物は、「出発生物」であるとみなされ、その遺伝子変異は、本発明において微生物を生じる。
【００４９】
出発生物は、したがって、例えばＡＴＣＣ１３０３２の野生型Ｃ．グルタミクム株であってもよい。
【００５０】
しかし、出発生物は、好ましくは、メチオニンの生成にすでに最適化されている、例えばＣ．グルタミクム株であってもよい。
【００５１】
メチオニンを生成するそのような出発生物は、例えば、野生型コリネ型細菌に、および好ましくは以下からの少なくとも一つの遺伝子に遺伝子変異を含有する野生型Ｃ．グルタミクム細菌に由来し得る：ａｓｋｆｂｒ、ｈｏｍｆｂｒ、およびｍｅｔＨ。これらの遺伝子における遺伝子変異は、これらの遺伝子のいずれかの過剰発現を引き起こし、それによって遺伝子変異の非存在下で生成されるメチオニンと比べてメチオニン生成の増加をもたらす。好ましい実施形態においては、そのようなメチオニンを生成する出発生物は、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、およびｍｅｔＨで遺伝子変異を同時に含有し、それによって遺伝子変異の非存在下で生成されるメチオニンと比べてメチオニン生成の増加をもたらす。
【００５２】
これらの出発生物では、ａｓｋおよびｈｏｍの内在性コピーは、通常、フィードバック耐性対立遺伝子に変えられ、それらはリシン、スレオニン、メチオニンによって、またはこれらアミノ酸の組み合わせによってフィードバック抑制をもはや受けない。これは、変異および選択によって、またはこれらの遺伝子と、減少もしくは減退したフィードバック抑制を用いてタンパク質をコードする変異型の対立遺伝子との限定された遺伝子置換によってのいずれかで行われ得る。これらの遺伝子変異を含むＣ．グルタミクム株は、例えばＣ．グルタミクムＤＳＭ１７３２２である。当業者は、Ｃ．グルタミクムＤＳＭ１７３２２の生成のために以下に説明するものに代わる遺伝子変異を用いても、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、およびｍｅｔＨの過剰発現を達成できることを認識するであろう。
【００５３】
本発明の目的で、ａｓｋfbrは、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼを表す。ｈｏｍfbrは、フィードバック耐性ホモセリン脱水素酵素を表す。ｍｅｔＨは、ビタミンＢ１２依存性メチオニン合成酵素を表す。
【００５４】
別の好ましい実施形態において、メチオニンを生成する出発生物は、野生型コリネ型細菌に、および好ましくは以下からの少なくとも一つの遺伝子に遺伝子変異を含有する野生型Ｃ．グルタミクム細菌に由来し得る：ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（ｍｅｔＸとも称する）、ｍｅｔＹ（ｍｅｔＺとも称する）、ならびにｈｓｋmutatedおよびｍｅｔＦおよびｔｋｔ。これらの遺伝子における遺伝子変異は、これらの遺伝子のいずれかの過剰発現を引き起こし、それによって遺伝子変異の非存在下で生成されるメチオニンと比べてメチオニン生成の増加をもたらす。好ましい実施形態においては、メチオニンを生成する出発生物は、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（ｍｅｔＸとも称する）、ｍｅｔＹ（ｍｅｔＺとも称する）、およびｈｓｋmutatedおよびｍｅｔＦに遺伝子変異を同時に含有し、それによって遺伝子変異の非存在下で生成されるメチオニンと比べてメチオニン生成の増加をもたらす。
【００５５】
これらの出発生物では、ａｓｋ、ｈｏｍ、およびｈｓｋの内在性コピーは、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbrに関して上述したように、通常、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、およびｈｓｋmutatedと置換される。これらの遺伝子変異を含むＣ．グルタミクム株は、例えばＣ．グルタミクムＭ２０１４である。当業者は、Ｃ．グルタミクムＭ２０１４の生成のために以下に具体的に説明するものに代わる遺伝子変異を用いても、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（ｍｅｔＸとも称する）、ｍｅｔＹ（ｍｅｔＺとも称する）、およびｈｓｋmutatedの過剰発現を達成できることを認識するであろう。
【００５６】
本発明の目的で、ｍｅｔＡは例えば大腸菌に由来するホモセリンサクシニルトランスフェラーゼを表す。ｍｅｔＹは、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドロラーゼを表す。ｈｓｋmutatedは、酵素活性を減少させるために変異されたホモセリンキナーゼを表す。これは、配列番号１９のｈｓｋのＴ１９０に対応する位置でスレオニンをセリンまたはアラニンと交換することで達成され得る。その代わりにまたは加えて、ＡＴＧ開始コドンをＴＴＧ開始コドンと置換してもよい。そのような変異は、非変異型ｈｓｋ遺伝子と比べ、結果として生じるｈｓｋタンパク質の酵素活性の減少をもたらす。
【００５７】
別の好ましい実施形態において、メチオニンを生成する出発生物は、野生型コリネ型細菌に、および好ましくは以下からの少なくとも一つの遺伝子に遺伝子変異を含有する野生型Ｃ．グルタミクム細菌に由来し得る：ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（ｍｅｔＸとも称する）、ｍｅｔＹ（ｍｅｔＺとも称する）、ｈｓｋmutated、およびｍｅｔＦ。これらの遺伝子における遺伝子変異は、次の遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子における遺伝子変異と組み合わせてこれらの遺伝子のいずれかの過剰発現をもたらす：ｍｃｂＲおよびｍｅｔＱ。これらの遺伝子における遺伝子変異は、組み合わせの非存在下でのメチオニン生成と比べて組み合わせが微生物によるメチオニン生成の増加をもたらすこれらの遺伝子のいずれかの発現の減少をもたらす。好ましい実施形態において、そのようなメチオニンを生成する出発生物は、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（ｍｅｔＸとも称する）、ｍｅｔＹ（ｍｅｔＺとも称する）、ｈｓｋmutated、およびｍｅｔＦに遺伝子変異を同時に含有する。ｍｃｂＲおよびｍｅｔＱにおける遺伝子変異は、遺伝子変異と組み合わせてこれらの遺伝子のいずれかの過剰発現をもたらす。これらの遺伝子における遺伝子変異は、組み合わせの非存在下でのメチオニン生成と比べて組み合わせが微生物によるメチオニン生成の増加をもたらすこれらの遺伝子のいずれかの発現の減少をもたらす。
【００５８】
これらの出発生物では、ａｓｋ、ｈｏｍ、およびｈｓｋの内在性コピーは、通常、上述のように置換されるが、ｍｃｂＲおよびｍｅｔＱの内在性コピーは、通常、機能的に破壊されるかまたは除去される。これらの遺伝子変異を含むＣ．グルタミクム株は、例えばＣ．グルタミクムＯＭ４６９である。当業者は、Ｃ．グルタミクムＯＭ４６９の生成のために以下に具体的に説明するものに代わる遺伝子変異を用いても、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（ｍｅｔＸとも称する）、ｍｅｔＹ（ｍｅｔＺとも称する）、ｈｓｋmutated、およびｍｅｔＦの過剰発現を達成でき、かつｍｃｂＲおよびｍｅｔＱの発現を減少させ得ることを認識するであろう。
【００５９】
本発明の目的で、ｍｅｔＦは、Ｎ５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＥＣ  １．５．１．２０）を表す。ｍｃｂＲは、硫黄代謝のＴｅｔＲ型転写制御因子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＰ４５０１０）を表す。ｍｅｔＱは、Ｄ−メチオン結合リポタンパク質を表す。
【００６０】
別の好ましい実施形態において、チオニンを生成する出発生物は、野生型コリネ型細菌に、および好ましくは以下からの少なくとも一つの遺伝子に遺伝子変異を含有する野生型Ｃ．グルタミクム細菌に由来し得る：
ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（ｍｅｔＸとも称する）、ｍｅｔＹ（ｍｅｔＺとも称する）、ｈｓｋmutated、およびｍｅｔＦおよびｔｋｔ。これらの遺伝子における遺伝子変異は、次の遺伝子のうちの少なくとも一つにおける遺伝子変異と組み合わせて、これらの遺伝子のいずれかの過剰発現をもたらす：ｍｃｂＲおよびｍｅｔＱ。これらの遺伝子における遺伝子変異は、組み合わせの非存在下でのメチオニン生成と比べて、組み合わせが微生物によるメチオニン生成の増加をもたらすこれらの遺伝子のいずれかの発現の減少をもたらす。好ましい実施形態において、メチオニンを生成する出発生物は、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（ｍｅｔＸとも称する）、ｍｅｔＹ（ｍｅｔＺとも称する）、ｈｓｋmutated、およびｍｅｔＦ、およびｔｋｔに遺伝子変異を同時に含有する。これらの遺伝子における遺伝子変異は、ｍｃｂＲおよびｍｅｔＱにおける遺伝子変異と組み合わせてこれらの遺伝子のいずれかの過剰発現をもたらす。これらの遺伝子における遺伝子変異は、組み合わせの非存在下でのメチオニン生成と比べて、その組み合わせが微生物によるメチオニン生成の増加をもたらすこれらの遺伝子のいずれかの発現の減少をもたらす。これらの出発生物では、ａｓｋ、ｈｏｍ、およびｈｓｋの内在性コピーは、通常、上述のように置換されるが、ｍｃｂＲおよびｍｅｔＱの内在性コピーは、通常、機能的に破壊されるかまたは除去される。これらの遺伝子変異を含むＣ．グルタミクム株は、例えばＣ．グルタミクムＭ２５４３である。当業者は、Ｃ．グルタミクムＭ２５４３の生成のために以下に具体的に説明するものに代わる遺伝子変異を用いても、ａｓｋfbr、ｈｏｍfbr、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＡ（ｍｅｔＸとも称する）、ｍｅｔＹ（ｍｅｔＺとも称する）、ｈｓｋmutated、およびｍｅｔＦ、およびｔｋｔの過剰発現を達成でき、かつｍｃｂＲおよびｍｅｔＱの発現を減少させ得ることを認識するであろう。
【００６１】
本発明の目的で、ｔｋｔはトランスケトラーゼを表す。
【００６２】
上述のように、本発明は、ビタミンＢ１２の取り込みの効率を高めた微生物に関する。その一態様において、本発明はビタミンＢ１２の取り込みを調節解除された系を有する微生物に関する。一般的に、そのようなＢ１２取り込み系は、少なくとも一つの負の調節タンパク質および／または少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質をコードする核酸配列含む。好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも一つの負の調節タンパク質および／または少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質をコードする核酸配列含むビタミンＢ１２取り込み系を調節解除された系を有する微生物に関する。そこでは、少なくとも一つの負の調節タンパク質および少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質をコードする前述の核酸配列は、前述の少なくとも一つの負の調節タンパク質が前述の少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質の発現を調節するようにオペロンとして編成される。
【００６３】
本発明の例は、したがって、配列番号２の少なくとも一つの負の調節タンパク質またはその機能的相同体もしくは断片と、配列番号４、６、および８のサブユニットまたはその機能的相同体もしくは断片を含む少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質とをコードする核酸配列を有するオペロンを有する調節解除されたビタミンＢ１２取り込み系を含む微生物に関する。
【００６４】
上述の微生物において、前述の少なくとも一つの負の調節タンパク質の量および／または活性は、前述の遺伝子変異を示さない対応する出発生物と比較して、遺伝子変異によって少なくとも部分的に減少され得る。あるいは、または加えて、ＡＢＣ型輸送タンパク質の少なくとも一つのサブユニットおよび好ましくはすべてのサブユニットの量ならびに／または活性は、前述の遺伝子変異を示さない対応する出発生物と比較して、遺伝子変異によって増加し得る。
【００６５】
好ましい実施形態において、本発明による微生物および方法は、以下の因子、その機能的相同体および／もしくは断片のうちの一つ以上の量ならびに／または活性が出発生物：
−  ｍｅｔＡ／Ｘ、
−  ｍｅｔＺ／Ｙ、
−  ｍｅｔＦ、
−  ｍｅｔＨ、
−  ｔｈｒＡ、
−  ｍｅｔＥ、
と比較してさらに増加し、および／または、以下の因子、その機能的相同体および／または機能的断片のうちの一つ以上の量ならびに／または活性は、出発生物：
−  ｍｅｔＫ、
−  ｔｈｒＢ
と比較して減少することを特徴とする。
【００６６】
そのような微生物および方法は、メチオニンの生成にとって特に有用である。
【００６７】
特に好ましい実施形態において、上述のすべての因子（ｍｅｔＡ／Ｘ、ｍｅｔＺ／Ｙ、ｍｅｔＦ、ｍｅｔＨ、ｔｈｒＡ、およびｍｅｔＥ）の量および／または活性は、さらに増加し、ならびにｍｅｔＫおよびｔｈｒＢの量および活性は、さらに減少する。
【００６８】
ｍｅｔＡ／Ｘは、Ｏ−アセチル−ホモセリンまたはＯ−サクシニル−ホモセリンを得るために、活性化アセチル補酵素Ａまたは対応するサクシニル補酵素ＡからホモセリンのＯＨ基へのアセチル基またはサクシニル基の転移を触媒する酵素をコードする遺伝子を示す（Gｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５２６５２）。
【００６９】
ｍｅｔＺ／Ｙは、ホモシステインを得るために、Ｏ−アセチル−ホモセリンまたはＯ−サクシニル−ホモセリンへのスルフィドまたはメチルメルカプタンの転移を触媒する酵素をコードする遺伝子を示す。酵素ｍｅｔＺ／Ｙは、補助因子としてピリドキサールリン酸を利用する（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２０１５０）。
【００７０】
ｍｅｔＦは、補助因子およびハイブリッドドナーとしてＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを利用して、メチレンテトラヒドロ葉酸のメチルテトラヒドロ葉酸への還元を触媒する酵素をコードする遺伝子に関する（ＥＣ  １．７．９９．５、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ６８５３１）。
【００７１】
ｍｅｔＨは、補助因子としてヒドロキソコバラミンおよび第２の補助因子としてＳＡＭを利用して、ホモシステイン上でメチルテトラヒドロ葉酸からのメチル転移を触媒する酵素をコードする遺伝子に関する（ＥＣ  ２．１．１．１３、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｃｇｌｌ５０７）。
【００７２】
ＴｈｒＡ（ホモセリン脱水素酵素）は、補助因子としてＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを利用して、セミアルデヒドへのアスパラギン酸の還元を触媒する酵素をコードする遺伝子に関する（ＥＣ  １．１．１．３、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｃｇ１ｌ１８３、ＡＡＴ０３３２１、ＡＡＨ６８４１７、ＡＥＢ１３１０６）。この酵素を変異型で用いることが可能である。
【００７３】
ＴｈｒＢ（ホモセリンキナーゼ）は、補助因子としてＡＴＰを利用して、ホスホホモセリンへのホモセリンのリン酸化を触媒する酵素をコードする遺伝子に関する（ＥＣ  ２．７．１．３９、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｃｇ１ｌ１８３）。この酵素を変異型で用いることが可能である。この酵素を変異型で用いることが可能である。
【００７４】
ｍｅｔＥは、補助因子としてＳＡＭを利用して、ホモシステイン上でメチルテトラヒドロ葉酸からのメチル転移を触媒する酵素をコードする遺伝子に関する（ＥＣ  ２．１．１．１４、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｃｇｌ１１３９）。
【００７５】
ｍｅｔＫは、補助因子Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素としてＡＴＰを利用して、メチオニン上でＳ−アデノシル残基の転移を触媒する酵素をコードする遺伝子に関する（ＥＣ  ２．５．１．６、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｃｇ１１６０３）。
【００７６】
当然これらの付加的な修飾も、上述の出発生物に導入できる。
【００７７】
本発明の文脈において、出発生物と比べてＣ．グルタミクムのｂｔｕオペロンの負の調節タンパク質等の少なくとも一つのタンパク質量に関する用語「量を減少させる」とは、そのようなタンパク質の量をより低く発現させるために、コリネ型細菌が遺伝子修飾されていることを意味する。これは、例えば染色体欠失（以下参照）によって達成され得る。
【００７８】
Ｃ．グルタミクムのｂｔｕオペロンの負の調節タンパク質等の少なくとも一つのタンパク質に関する用語「活性を減少させる」とは、そのようなタンパク質の対応する野生型配列に少なくとも一つの変異が導入され、そのタンパク質の変異体の生成をもたらす状態を示し、その生成では野生型タンパク質の代わりに変異型が発現される。しかし、その変異のため、変異型タンパク質は、タンパク質に関して同程度の量が発現されても、その対応するタンパク質の活性が低下するように、変異（例えば負の調節機能）を失う。
【００７９】
そのようなタンパク質の量は、内在性プロモーターを、より弱い発現をもたらすプロモーターと置換させることによって減少させてもよい。
【００８０】
本発明の文脈において、出発生物と比べて少なくとも一つのタンパク質に関する用語「量を増加させる」とは、上述のタンパク質のうちの少なくとも一つの量をより高く発現させるために、コリネ型細菌、および好ましくは Ｃ．グルタミクムが遺伝子修飾されていることを意味する。少なくとも一つのタンパク質の量を増加させることは、機能的タンパク質の量が増加する状態をいうと理解されることである。本発明の文脈におけるタンパク質は、内在性タンパク質と同じ反応を行う能力がある場合、機能的であるとみなされる。コリネ型細菌で および好ましくは Ｃ．グルタミクムでタンパク質の量を増加させるためには種々の選択肢があり、それらは当業者に周知である。これらの選択肢としては、上述のタンパク質をコードする核酸配列のコピー数を増加させること、そのような核酸配列の転写および／または翻訳を増加させることが挙げられる。これらの種々の選択肢は、以下により詳細に述べる。
【００８１】
少なくとも一つのタンパク質に関して用語「活性を増加させる」とは、上述のタンパク質の対応する野生型配列に、少なくとも一つの変異を導入させ、それによって同じ量の野生型タンパク質が発現される状態と比較して、ビタミンＢ１２の移入の向上がもたらされる状態をいう。
【００８２】
当然、少なくとも一つのタンパク質の量および／または活性を増加させるアプローチを組み合わせることもできる。したがって、例えば、コリネ型細菌で少なくとも一つのタンパク質の内在性コピーを、その変異型をコードする変異体と置換することも可能である。この変異型コピーの転写を強いプロモーターの制御下に配置する場合、対応するタンパク質の量および活性は増加する。この場合、そのタンパク質は、それが通常関与する機能を行う能力が依然としてあると理解される。
【００８３】
したがって、自己複製ベクターに由来する、もしくは染色体コピーをさらに挿入した（以下参照）ベクターに由来する配列番号４、６、および８の対応するＣ．グルタミクムを過剰発現させることによって、例えばＣ．グルタミクムにおいてＣ．グルタミクムＡＢＣ型輸送タンパク質のサブユニットの量を増加させることがでる。あるいは枯草菌もしくは大腸菌に由来する対応するタンパク質を用いて、例えば自己複製ベクターを用いることによってそのタンパク質を過剰発現させることも可能である。
【００８４】
ある状況においては、例えばＣ．グルタミクムの内在性コード配列は、発現のためにそのコドンの使用に関してすでに最適化されているので、内在性タンパク質を用いることが好ましいこともある。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態において、ビタミンＢ１２取り込み系の少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質の量および／または活性は、Ｃ．グルタミクムで増加される。
【００８６】
上述のように、本発明の好ましい実施形態は、効率を高めたビタミンＢ１２の取り込みを提供するために遺伝子修飾されている微生物に関する。この微生物では、少なくとも一つの負の調節タンパク質が少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質の発現を調節するようにオペロンとして編成されている前述の少なくとも一つの負の調節タンパク質および／または前述の少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質をコードする核酸を含むビタミンＢ１２取り込み系で調節解除されたビタミンＢ１２取り込み系によって、前記高めた効率が達成される。
【００８７】
好ましい実施形態は、コリネ型細菌から選択され、Ｃ．グルタミクムが好ましい微生物に関する。
【００８８】
本発明のこの後者の実施形態に関する特に好ましい態様では、ビタミンＢ１２取り込み系は、好ましくはＣ．グルタミクムにおいて、配列番号２の推定される負の調節タンパク質（以下ｂｔｕＲと名付ける）またはその機能的相同体もしくは断片の核酸配列と、配列番号４、６、および８に対応する３つのサブユニットで作られる少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質またはその機能的相同体もしくは断片の核酸配列とを含むオペロンである。したがって、Ｃ．グルタミクム由来の微生物に関する好ましい実施形態においては、ビタミンＢ１２取り込み系は、例えばｂｔｕＲの負の調節タンパク質をコードする一つの核酸配列と、ＡＢＣ型輸送タンパク質の成分をコードする他の３つの核酸配列とを有する４つの遺伝子からなる一つのオペロンである。負の調節タンパク質は、前述のＡＢＣ型輸送タンパク質の発現を調節する。
【００８９】
Ｃ．グルタミクムの負の調節タンパク質ｂｔｕＲ２の核酸配列は、配列番号１に示されている。対応するアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。遺伝子バンクアクセッション番号（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）はＮＣｇｌ２０３４であり、またはこの遺伝子の遺伝子ＩＤは１０２００６６、このタンパク質のＩＤはＮＰ６０１３１５．１である。
【００９０】
Ｃ．グルタミクムにおいてビタミンＢ１２取り込み系を構成するオペロンのＡＢＣ型輸送タンパク質のサブユニットＡの核酸配列は、配列番号３に示されている。その遺伝子は。ｂｔｕＦ２と名付けられている。対応するアミノ酸配列は、配列番号４に示されている。遺伝子バンクアクセッション番号は、受入ＮＣ＿００６９５８．１であり、またはその遺伝子の遺伝子ＩＤは３３４５６２５、そのタンパク質のＩＤはＮＰ６０１３１３．１である。
【００９１】
Ｃ．グルタミクムにおいてビタミンＢ１２取り込み系を構成するオペロンのＡＢＣ型輸送タンパク質のサブユニットＢの核酸配列は、配列番号５に示されている。その遺伝子は。ｂｔｕＣ２と名付けられる。そのアミノ酸配列は、配列番号６に示されている。遺伝子バンクアクセッション番号は、ＮＣｇｌ２０３２であり、またはその遺伝子の遺伝子ＩＤは１０２００６４、そのタンパク質のＩＤはＮＰ６０１３１２．１である。
【００９２】
Ｃ．グルタミクムにおいてビタミンＢ１２取り込み系を構成するオペロンのＡＢＣ型輸送タンパク質のサブユニットＣの核酸配列は、配列番号７に示されている。その遺伝子は、ｂｔｕＤ２と名付けられる。そのアミノ酸配列は、配列番号８に示されている。遺伝子バンクアクセッション番号は、ＮＣｇｌ２０３１であり、またはその遺伝子の遺伝子ＩＤは１０２００６３、そのタンパク質のＩＤはＮＰ６０１３１１．１である。
【００９３】
Ｃ．グルタミクムにおいてビタミンＢ１２取り込み系を構成する上述のＣ．グルタミクム配列の対応する機能的相同体は、他の生物の場合には当業者が相同性解析によって容易に同定することが可能である。これは、例えば、ｂｔｕＲ２、ｂｔｕＦ２、および以下に述べるものによってコードされるいかなる遺伝子およびタンパク質の核酸配列によってコードされる遺伝子またはタンパク質の配列における推定される相同体のアミノ酸配列間もしくは核酸配列間のパーセント同一性を決定することによってなされ得る。
【００９４】
パーセント同一性は、例えば、目視検査によって、または相同性に基づいたアルゴリズムを用いることで決定され得る。
【００９５】
例えば、二つのアミノ酸配列のパーセント同一性を決定するために、アルゴリズムは、最適比較の目的でそれらの配列を整列させる（例えば、別のタンパク質のアミノ酸配列との最適配列のために一つのタンパク質のアミノ酸配列に、ギャップを挿入することもできる）。次いで、対応するアミノ酸の位置でアミノ酸残基が比較される。一つの配列内の位置がもう一方の配列で対応する位置と同一のアミノ酸残基によって占有されているときは、それらの分子はその位置で同一である。これら二つの配列間のパーセント同一性は、これらの配列によって共有される同一位置の数の関数である（例えば、％同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。
【００９６】
これらの目的で、当該技術分野では種々のコンピュータプログラムが知られている。例えば、二つの核酸配列またはアミノ酸配列のパーセント同一性は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（（１９８４）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  １２：３８７）によって説明され、およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することによって決定できる。パーセント同一性は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ(登録商標)）プログラムを用いて（Ｔａｔｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９９）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  １７４：２４７）によって説明されているように）二つの核酸配列またはアミノ酸配列を整列させることで決定されることもできる。
【００９７】
本特許出願の提出日現在において、ＢＬＡＳＴプログラムを提供する標準ソフトウェアのパッケージを、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）に見つけることができる。例えば、前述の配列番号のいずれかを用いる場合、核酸配列またはアミノ酸配列のいずれかに基づいたＢＬＡＳＴ検索を実行して、例えば大腸菌、出芽酵母、枯草菌におけるそれぞれの酵素の近縁の相同体を同定することが可能である。例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標）プログラムを用いる核酸配列のアライメントの場合、デフォルト設定は以下の通りである：マッチに対するリワードは２であり、ミスマッチに対するペナルティーは−２であり、オープンギャップおよび伸長ギャップのペナルティーはそれぞれ５および２であり、ギャップ．タイム．ドロップオフは５０であり、エクスペクトは１０であり、ワードサイズは１１であり、フィルターはＯＦＦである。後者のアルゴリズムが好ましい。
【００９８】
類似配列検索および解析は、ＥＭＢＬデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ）またはＥｘｐａｓｙホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）で実行することができる。上記配列検索のすべては、本出願の提出日現在において、これはデータベースプロバイダーによってプレインストールされているので、通常、デフォルトパラメータで実行される。相同性検索も、例えばＤＮＡ  Ｓｔａｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｎｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡのレーザー遺伝子ソフトウェアのソフトウェアプログラムを用いて、日常的に実行されている。このソフトウェアは、ＣＬＵＳＴＡＬ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，  ５（２）  １５１）を使用している。
【００９９】
二つのタンパク質は、それらが上述のようにある程度の同一性を共有している場合、同じ機能（例えば同じ酵素活性をもたらす）を行う可能性があることを当業者は理解している。アミノ酸レベルの一般的な下限値は、通常、少なくとも約５０％の同一性である。核酸レベルでは、下限値は、通常少なくとも４０％である。
【０１００】
両タイプの配列に対する好ましい同一性の程度は、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％である。より好ましい同一性のレベルは、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である。これらの同一性レベルは、有意であるとみなされる。
【０１０１】
本明細書で用いるように、用語「相同性」および「相同の」とは、理論的な共通遺伝的祖先を有するタンパク質を表すことに限定されず、同様の機能を行うように、および／または同様の構造を有するように進化したにもかかわらず、遺伝学的に無関係であり得るタンパク質を含む。相同体が機能的であるべき要件は、本明細書に記載する相同体が比較基準タンパク質と同一の機能を実質的に有する複数のタンパク質を網羅することを意味する。複数のタンパク質が機能的相同性を有するためには、それらが必ずしも、それらのアミノ酸配列において有意な同一性を有することは必要ではなく、むしろ機能的相同性を有するタンパク質が同様もしくは同一の活性（例えば酵素活性）を有することによってそう定義されることが必要である。
【０１０２】
好ましくは、例えば宿主コリネ型細菌よりも別の生物に由来するタンパク質は、それが少なくとも有意な類似性（すなわちアミノ酸レベルで約５０％の配列相同性）を示し、かつコリネ型細菌においてその対応物と同じ機能を果たす場合、機能的相同体であるとみなされる。同じ酵素活性をもたらし、かつより高い程度の同一性（例えば、アミノ酸レベルで少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の配列相同性）を共有する機能的相同体は、さら好ましい機能的相同体である。
【０１０３】
コリネ型細菌に由来する上述のタンパク質およびそれらの機能的相同体を、これらの断片および変異型が同一型の機能的活性を示す限り、他の生物で用いることもできることは当業者に公知である。機能的に活性を有する典型的な断片は、Ｎ−末端欠失および／またはＣ−末端欠失を示すが、変異型は通常、欠失、挿入、または点変異を含む。
【０１０４】
一例として、枯草菌の配列は、それが配列番号２に対してアミノ酸レベルで上述の同一性レベルを示し、および例えば、配列番号２、４、および６によってコードされるようにＡＢＣ型輸送タンパク質の発現に際して同程度の抑制活性を示す場合、Ｃ．グルタミクムのｂｔｕＲ２の機能的相同体をコードするとみなされる。結果として生じるタンパク質が完全長タンパク質と同一型の活性を依然として調整する限り、これらの配列の断片または例えば点変異は用いられることも可能である。
【０１０５】
本発明において、ビタミンＢ１２取り込み系を調節解除すること、およびＣ．グルタミクムで説明したように特にｂｔｕ２オペロンの形に調節解除することで、そのような調節解除されたビタミンＢ１２取り込み系を含まない微生物と比較して、より少ないビタミンＢ１２を含有する培地での微生物の増殖および／またはメチニオン生成の向上が可能になる。
【０１０６】
したがって、本発明において遺伝子修飾された微生物は、生物がビタミンＢ１２取り込み効率を向上させるための遺伝子変異を含まない状態と比較して、約１０％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、約５０％未満、約６０％未満、約７０％未満、約８０％未満、約９０％未満、または約９５％未満のビタミンＢ１２を含有する培地を用いて、前述の遺伝子変異を示さない微生物と同じ効率まで培地で増殖され得る。
【０１０７】
好ましい実施形態において、本発明に記載のようにビタミンＢ１２取り込みを向上させるための遺伝子変異を含まない微生物に対して一般に用いられている培地と比較して、培地が５０％未満、好ましくは約６０％未満、より好ましくは約７０％未満、さらにより好ましくは約８０％未満、およびさらにより好ましくは約９０％未満のビタミンＢ１２を含有する場合、本発明において遺伝子修飾された生物は、遺伝子変異がない微生物と同程度の効率まで、および好ましくは同じ効率まで増殖できる。
【０１０８】
それらの向上したビタミンＢ１２取り込み系の結果として本発明による微生物は、したがって、より低コストで用いられ、その生合成にビタミンＢ１２を必要とするファインケミカルをもたらすことが可能となる。そのようなファインケミカルとしては、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、およびメチオニンスルホキシドが挙げられる。一部の実施形態において、本明細書に記載のように遺伝子変異の結果として向上したビタミンＢ１２取り込み効率を有する微生物は、微生物（例えばコリネ型細菌および好ましくはＣ．グルタミクム）でそれらの生合成にビタミンＢ１２を必要とするメチオニンおよび他のファインケミカルの生成を向上させることさえあり得る。
【０１０９】
コリネ型細菌でのメチオニンの生成を向上させることは、とりわけ、生成速度、最終力価、またはメチオニン合成の効率を増加させること、ならびに生成されるメチオニンの量を増加させることを意味する。
【０１１０】
用語「メチオニン合成の効率」とは、メチオニンの炭素収率を説明する。この効率は、炭素基質の形で系に入ったエネルギー入力のパーセンテージとして算出される。本発明全体を通して、この値は、パーセント値（（モル・メチオニン）（モル・炭素基質）（-1×１００））で与えられる。用語「メチオニン合成の効率の増加」とは、したがって、出発生物と実際のコリネ型細菌との比較に関し、そこではペントースリン酸経路に関する複数の酵素のうちの少なくとも一つの量および／または活性が増加されている。
【０１１１】
本発明による好ましい炭素源は、単糖、二糖、または多糖等の糖類である。例えば、グルコース、果糖、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、ラクトース、マルトース、ショ糖、ラフィノース、デンプン、またはセルロースを含む群から選択される糖は、特に好ましい炭素源として役立つこともある。
【０１１２】
本発明による方法およびコリネ型細菌は、また、出発生物と比較してより多くのメチオニンを生成するために用いられることもある。
【０１１３】
本発明による方法およびコリネ型細菌は、また、出発生物と比較してより速い速度でメチオニンを生成するために用いられることもある。例えば、通常の生成期間を考える場合、本発明の方法およびコリネ型細菌は、より速い速度でメチオニンを生成することが可能である（すなわち同じ量のメチオニンは出発生物と比較してより早い時点で生成される）。これは、特に対数増殖期にあてはまる。
【０１１４】
本発明による方法およびコリネ型細菌は、この菌株が浸盪フラスコインキュベーションでインキュベートされる場合、少なくとも約３ｇメチオニン／ｌ培養液量を生成することが可能になる。この菌株が浸盪フラスコインキュベーションでインキュベートされる場合、少なくとも約４ｇメチオニン／ｌ培養液量、少なくとも約５ｇメチオニン／ｌ培養容量、または少なくとも約７ｇメチオニン／ｌ培養液量の力価が好まれ得る。この菌株が浸盪フラスコインキュベーションでインキュベートされる場合、より好ましい値は、少なくとも約１０ｇメチオニン／ｌ培養液量に、およびさらにより好ましくは少なくとも約２０ｇメチオニン／ｌ細胞集団に達する。
【０１１５】
本発明による方法およびコリネ型細菌は、この菌株が炭素源を補給した攪拌型発酵槽を用いる発酵実験でインキュベートされる場合、少なくとも約２５ｇメチオニン／ｌ培養液量を生成することを可能にする。この菌株が炭素源を補給した攪拌型発酵槽を用いる発酵実験でインキュベートされる場合、少なくとも約３０ｇメチオニン／ｌ培養液量、少なくとも約３５ｇメチオニン／ｌ培養液量、または少なくとも約４０ｇメチオニン／ｌ培養液量の力価が好まれ得る。この菌株が炭素源を補給した攪拌型発酵槽を用いる発酵実験でインキュベートされる場合、より好ましい値は、少なくとも約５０ｇメチオニン／ｌ培養液量に、およびさらにより好ましくは少なくとも約６０ｇメチオニン／ｌ細胞集団に達する。
【０１１６】
好ましい実施形態において、本発明の方法および微生物は、出発生物と比較して、メチオニン合成の効率および／またはメチオニンの量および／またはその力価および／またはメチオニン合成の速度を、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％増加させることを可能にする。好ましい実施形態において、出発生物と比較して、メチオニン合成の効率および／またはメチオニンの量および／またはその力価および／またはその速度を、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％増加させることを可能にする。少なくとも約２因子、少なくとも約３因子、少なくとも約５因子、および少なくとも約１０因子の増加がさらにより好ましい。しかし、約５％の増加は、有意な向上であるとすでにみなされることもある。
【０１１７】
上述の配列ならびにそれらの機能的相同体および断片の量および／または活性は、好ましくはＣ．グルタミクムにおいて増加および／または減少することもあり得る。この目的を達成するために、ＡＴＣＣ１３０３２等の野生型株またはメチオニン生合成を増加および向上させるための遺伝子修飾をさらに保有する菌株のいずれかを用いることができる。
【０１１８】
そのような菌株は、例えば、フィードバック耐性ホモセリン脱水素酵素（ｈｏｍfbr）を発現させることができる。そのような菌株は、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ（ａｓｋfbr）をさらに発現させることができる。そのような菌株は、さらにメチオニン合成酵素（ｍｅｔＨ）の発現の増加を示すことが可能である。メチオニン生成に適し、かつフィードバック耐性ホモセリン脱水素酵素、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ、およびメチオニン合成酵素を過剰発現させる菌株は、例えば上述のＤＳＭ１７３２２の例である。
【０１１９】
本発明の目的で好ましくは用いることが可能な他のＣ．グルタミクム出発株は、ＤＳＭ１７３２２の上述の修飾を保有し、およびさらにメチオニン合成に関して最適化される。そのような菌株は、例えば、変異型ホモセリンキナーゼ（ｈｓｋmutated）、ホモセリンサクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ）、およびＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ（ｍｅｔＹ）を増加レベルで発現させ得る。これらすべての遺伝子変異を保有する菌株は、例えば、実施例１のＭ２０１４である。本発明の目的でＣ．グルタミクムでの特に有望な出発生物は、したがって、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＹおよびｍｅｔＡ、ｈｏｍfbr、ａｓｋfbrおよびｈｓｋmutatedの増加レベルを示す。
【０１２０】
フィードバック耐性ホモセリン脱水素酵素の例は、配列番号１７の位置３９３でＳ３９３Ｆ変異を有する。このｈｏｍfbrは、スレオニンおよび／またはメチオニンによって減少したフィードバック抑制を示す。フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼの例は、配列番号１８の位置３１１にＴ３１１Ｉ変異を有する。このａｓｋfbrは、リシンおよび／またはスレオニンによって減少したフィードバック抑制を示す。上述の機能的変異を保有するホモセリンキナーゼは、配列番号１９の位置１９０にＴ１９０Ａ変異、または位置１９０にＴ１９０Ｓ変異またはＴＴＧ開始コドンを保有する。
【０１２１】
上述の遺伝子変異（例えばＭ２０１４）を保有することもあるＣ．グルタミクム出発生物は、負の制御因子（ｍｃｂＲ）の核酸配列（Ｒｅｙ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ５６．  ８７１−８８７，  Ｒｅｙ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １０３，  ５１−６５，  米国特許出願第２００５００７４８０２号）およびＤ−メチオニン結合リポタンパク質（ｍｅｔＱ）の核酸配列を欠失させることによって、ならびにＮ５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ｍｅｔＦ）の発現を増加させることによってさらに向上することが可能である。対応する菌株は、ＯＭ４６９として実施例５に説明する。ＤＳＭ１７３２２、Ｍ２０１４、もしくはＯＭ４６９の遺伝子変異と同一、または類似する遺伝子変異を示す菌株は、Ｃ．グルタミクム出発生物として好まれ得る。
【０１２２】
好ましい出発生物になり得る他の菌株は、出発株ＤＳＭ１７３２２、Ｍ２０１４、またはＯＭ４６９の上述の遺伝子変異に加えて、活性および／または量が増加したトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）を含む。特に好ましい実施形態において、そのような出発生物は、Ｃ．グルタミクム生物に関することがあり、その生物ではＣ．グルタミクムにおいてｔｋｔに先行する内在性プロモーターは、強いプロモーターと置換される。そのようなアプローチは、トランスケトラーゼ、６−ホスホ−グルコノ−ラクトナーセ、グルコース−６−リン酸−脱水素酵素の遺伝子およびＯＰＣＡとよばれる遺伝子が単一オペロンで構成されるという理由で好ましい。したがって、ｔｋｔの前の内在性プロモーターの代わりに強いプロモーター（例えば、λＰＲプロモーター）は、トランスケトラーゼに加えてペントースリン酸経路に関与し、かつメチオニン表面にとって有益であり得る酸素量および／または活性を同時に増加させることを可能にする。同等の遺伝子変異を示す出発生物は、以下に説明するようにＭ２５４３である。
【０１２３】
コリネ型細菌におけるペントースリン酸経路の酸素量は、遺伝子のコピー数（すなわち、前述の酵素をコードする核酸配列のコピー数）を増加させることによって、転写を増加させることによって、翻訳を増加させることによって、および／またはそれらの組み合わせで増加させることができる。
【０１２４】
当業者は、核酸配列の遺伝子コピー数を増加させるために、転写を増加させるために、および／または翻訳を増加させるために必要な遺伝子変異の型に精通している。
【０１２５】
一般に、ポリペプチドをコードする核酸配列のコピー数は、前述のポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターをコリネ型細菌で発現させることによって、増加させることができる。そのようなベクターは、それらがコリネ型細菌内で安定して保持されるように、自己複製可能であり得る。Ｃ．グルタミクムにおいてポリペプチドおよびペントースリン酸経路の酵素を発現させる代表的なベクターとしては、Ｂｏｔｔ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，  Ｌ．，  ｅｄｓ．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ；  Ｄｅｂ，  Ｊ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  （１９９９），  １７５（１），  １１−２０），  Ｋｉｒｃｈｎｅｒ  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （２００３），  １０４  （１−３），  ２８７−２９９）、国際公開第２００６０６９７１１号、および国際公開第２００７０１２０７８号に記載のように、ｐＣｌｉＫ、ｐＢ、およびｐＥＫＯが挙げられる。
【０１２６】
コリネ型細菌においてポリペプチドをコードする核酸配列のコピー数を増加させる別のアプローチでは、ポリペプチド等をコードする核酸配列の追加のコピーを、Ｃ．グルタミクムの染色体に組み込むことが可能である。染色体組み込みは、例えば、対応するポリペプチドの内在性コピーが局在化している遺伝子座で起こることが可能である。さらに、および／またはあるいは、ポリペプチドをコードする核酸配列の染色体増殖は、コリネ型細菌のゲノムにおける他の遺伝子座で起こることが可能である。Ｃ．グルタミクムの場合、染色体組み込みによって遺伝子コピー数を増加させるための、当業者にとって公知の種々の方法がある。そのような方法の一つは、例えばベクターｐＫ１９  ｓａｃＢを活用することであり、Ｓｃｈａｅｆｅｒ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９４  １７６（２３）：  ７３０９−７３１９の刊行物に詳細に説明されている。ポリペプチドをコードする核酸配列の染色体組み込みのための他のベクターとして、国際公開第２００５０５９０９３号または国際公開第２００７０１１８４５号に説明されているように、ｐＣＬＩＫ  ｉｎｔ  ｓａｃＢが挙げられる。
【０１２７】
ペントースリン酸経路の少なくとも一種類の酸素量を増加させることは、それぞれの酵素をコードする核酸配列の転写を増加させることでも達成することが可能である。転写の増加は、より多くのｍＲＮＡをもたらし、最終的に翻訳されたタンパク質の量を高める。
【０１２８】
当業者は、コリネ型細菌におけるコード配列の転写が多数のアプローチによって増加できることを承知している。したがって、強いプロモーターおよび／または強いエンハンサーエレメントを用いることによって転写を増加させることが可能である。また、アプタマー等の転写活性化因子を用いることもでき、転写因子を過剰発現させることもできる。本発明の文脈において、強いプロモーターを用いることが好まれ得る。
【０１２９】
プロモーターが、野生型の状態でそれぞれの核酸配列に先行する内在性プロモーターよりも高い程度の転写をそれぞれのポリペプチドをコードする核酸配列にもたらす場合、そのプロモーターは本発明の文脈において「強いプロモーター」であるとみなされる。
【０１３０】
本発明の目的で、以下のプロモーターを用いることが考えられる：ＰSOD（配列番号９）、ＰgroES（配列番号１０）、ＰEFTu（配列番号１１）、およびλＰL（配列番号１２）。これらのプロモーターは、一般にＣ．グルタミクムで用いられてポリペプチドを過剰発現させ、およびプロモーターの強さは、必ずしもすべての状況ではなく一部の状況において、以下の順序を有するとみなされる：
λＰL＞ＰEFTu＞ＰSOD＞ＰgroES。
【０１３１】
翻訳の向上は、例えば、それぞれの酵素をコードする核酸配列のコドンの使用を最適化することによって達成できる。宿主酵素の核酸配列を用いる場合、コドン出現頻度λＰLの適応は、一般に必要ではないが、適用させることも可能である。しかし、例えばＡＢＣ型輸送タンパク質の量がＣ．グルタミクムで大腸菌のそれぞれの配列を過剰発現させることによって増加される場合、大腸菌タンパク質のコード配列をＣ．グルタミクムのコドン出現頻度に適応することは、考慮するに値することもある。
【０１３２】
本発明の一部の実施形態において、例えばＣ．グルタミクムのｂｔｕオペロンで観察されるように、ＡＢＣ型輸送タンパク質のサブユニットをコードする核酸配列のコピー数を、対応するコリネ型細菌の染色体において、および好ましくはＣ．グルタミクムにおいて内在性遺伝子の位置で複数コピーにそれぞれの核酸配列を組み込むことによって増加させることが好まれ得る。このアプローチでは、通常、ゲノムのゲノム完全性ができるだけ保存される。
【０１３３】
当業者は、核酸配列によってコードされるタンパク質（例えばＣ．グルタミクムのｂｔｕ２オペロンの負の調節タンパク質ｂｔｕＲ２）の量および／または活性を下方制御するための種々の方法にも精通している。例えばｂｔｕＲ２の量および／または活性を下方制御するための代表的なアプローチは、機能的タンパク質がもはや生成されないように、このベクターをコードする内在性遺伝子を遺伝子破壊することであろう。別の実施形態において、結果として生じるタンパク質が少なくとも一つのＡＢＣ型輸送タンパク質の発現にその負の抑制効果を及ぼさないように、または少なくともより少ない程度にするように、例えば配列番号１の内在性配列に変異を導入してもよい。内在性プロモーターよりも弱いプロモーターを、負の調節タンパク質（例えば、Ｃ．グルタミクムのｂｔｕ２オペロン内のｂｔｕＲ２）をコードする核酸配列の前に配置するアプローチも用いてもよい。
【０１３４】
プロモーターは、そのプロモーターを「−３５」または「−１０」領域でコンセンサスプロモーターと類似させないために、一度に一つの塩基を変えることによって弱くすることが可能である。コンセンサス「−３５」領域は、配列ＴＴＧＡＣＡを有することもあり、コンセンサス「−１０」領域は配列ＴＡＴＡＡＴを有する。
【０１３５】
当然、上述のアプローチを組み合わせることも可能であることを当業者は、承知している。したがって、ｂｔｕＲ２またはその対応物をコードする核酸配列が破壊され、ならびに例えば配列番号２、６、および８、またはその対応物によってコードされるＡＢＣ型輸送タンパク質の発現が例えば強いプロモーターを用いることによって過剰発現される好ましくはコリネバクテリウム属から、およびさらにより好ましくはＣ．グルタミクムから選択される微生物を想定することも可能である。
【０１３６】
以下の第１表は、以下でさらに詳細に述べる酵素またはタンパク質およびそれらをコードする遺伝子の配列に関する遺伝子バンクアクセッション番号の概要を示す。列挙した遺伝子バンクアクセッション番号は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で見つけることができる、またはアクセスすることができるＧｅｎＢａｎｋもしくは他の公開データベースを参照する。以下の表に記載される遺伝子またはタンパク質のいずれの多数の相同体も、当該技術分野では周知のように、同ウェブサイトで見つけられる「ＢＬＡＳＴ」プログラムを用いて、以下の表からの配列を「クエリー」として使用することで、見出すことが可能である。
【０１３７】
第１表  −  本明細書に特に記載されるタンパク質およびその相同体
【表１】
2010530223.tif 000002
【０１３８】
【表２】
2010530223.tif 000003
【０１３９】
【表３】
2010530223.tif 000004
【０１４０】
【表４】
2010530223.tif 000005
【０１４１】
上記のアクセッション番号は、Ｇｅｎｂａｎｋの公式のアクセッション番号であるか、またはＧｅｎｂａｎｋでクロスリファレンスを有するアクセッション番号と同義番号である。これらの番号は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で検索および見つけ出すことが可能である。
【０１４２】
Ｃ．グルタミクムでのポリペプチドおよび遺伝子の量ならびに／または活性を増加および低下させる方法についての一般概要を以下に示す。当業者は、以下の実施例に開示したもの以外の実施形態を実施するとき、この情報に頼ることができる。
【０１４３】
量および／もしくは活性の増加または導入
量の増加に関して、二つの基本的なシナリオを差別化することができる。第一のシナリオでは、酸素量は、対応するタンパク質の外因性バージョンの発現によって増加する。もう一つのシナリオでは、内在性タンパク質の発現は、例えばプロモーターおよび／またはエンハンサーのリボソーム結合部位エレメントの活性、ならびに／または転写レベル、翻訳レベル、もしくは翻訳後レベルのいずれかでそれぞれのタンパク質の活性を制御する他の制御活性に影響を与えることによって増加する。
【０１４４】
したがって、タンパク質の活性および量の増加は、例えば転写レベル、翻訳レベル、およびタンパク質レベルで抑制・調節機構の切り換えを切ることによって、または出発生物と比較してこれらのタンパク質をコードする核酸の遺伝子発現を増加させることによって、例えば強いプロモーターで内在性トランスケトラーゼを誘発することによって、および／またはトランスケトラーゼをコードする核酸を導入することによって異なる方法で達成され得る。
【０１４５】
一実施形態において、第１表の酸素量および／または活性の増加は、第１表の酵素をコードする核酸をコリネ型細菌、好ましくは Ｃ．グルタミクムに導入することによって達成される。
【０１４６】
原理的には、第１表または第２表に記載したタンパク質の酵素活性を有する様々な生物のすべてのタンパク質を用いることが可能である。イントロンを含有する真核源に由来するそのような酵素のゲノム核酸配列に関して、宿主生物が対応するｍＲＮＡをスプライシングする能力がない、または能力をもつようにできない場合、対応するｃＤＮＡのようなすでにプロセスされている核酸配列が用いられることになる。説明で述べたすべての核酸は、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡの配列であり得る。
【０１４７】
本発明において、タンパク質の量を増加させるまたは導入させることは、通常は以下のステップ：
ａ）５′−３′方向に以下：
−本発明の生物での機能的なプロモーター配列
−それに作用可能なように連結された、例えば第１表のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、その機能的相同体、機能的断片、または機能的変異型
−本発明の生物において機能的な終止配列の核酸配列、好ましくはＤＮＡ配列を含むベクターの生成ステップ、
ｂ）ステップａ）からのベクターの、本発明の生物（例えばＣ．グルタミクム）への転移、および場合により、それぞれのゲノムへの組み込みステップを含む。
【０１４８】
上述のように、機能的断片は、例えば第１表または第２表の酵素をコードする核酸配列の断片に関し、その発現は、対応する完全長タンパク質の酵素活性を有するタンパク質を依然としてもたらす。
【０１４９】
上記の方法を用いて、例えば第１表の酵素またはその機能的断片をコードするＤＮＡ配列の発現を増加させることができる。プロモーターおよび終止配列のように、制御配列を含むそのようなベクターを用いることは、当業者に公知である。さらに、当業者は、ステップａ）からのベクターのＣ．グルタミクム等の生物への転移方法、およびベクターがそれら生物のゲノムに組み込まれるために持たねばならない特性を理解している。
【０１５０】
本発明において、第１表の酵素をコードする核酸の遺伝子発現を増加させることは、生物の（とりわけＣ．グルタミクムでの）それぞれの内在性酵素の発現を操作することであることも理解される。これは、例えばこれらの酵素をコードする遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列を変えることによって達成できる。これらの酵素の発現速度を変化させる、好ましくは増加させるそのような改変は、強いプロモーターとの置換によって、ならびにＤＮＡ配列の欠失および／または挿入によって達成できる。
【０１５１】
内在性遺伝子のプロモーター配列の改変は、通常、遺伝子の発現量の改変、およびしたがって細胞内または生物内で検出可能な活性の改変も引き起こす。
【０１５２】
さらに、内在性遺伝子の発現の改変および増加は、それぞれ、調節タンパク質によって達成できる。これは形質転換された生物では発生せず、およびこれらの遺伝子のプロモーターと相互作用する。そのような制御因子は、例えば国際公開第９６／０６１６６号に記載のように、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写アクチベータドメインからなるキメラタンパク質であり得る。
【０１５３】
内在性遺伝子の活性および含有量を増加させるさらなる可能性は、内在性遺伝子の転写に関与する転写制御因子を、例えば過剰発現によって上方制御することである。転写制御因子の過剰発現のための手段は、当業者に公知である。
【０１５４】
第１表に記載のもの等の内在性酵素の発現は、遺伝子のプロモーター配列に特異的に結合するアプタマーの発現により、例えば制御できる。刺激プロモーター領域または抑制プロモーター領域に結合するアプタマーに応じて、第１表の酸素量は、例えば増加できる。
【０１５５】
さらに、内在性遺伝子の活性の改変は、内在性遺伝子コピーを標的にした変異誘発によって達成できる。
【０１５６】
例えば第１表の酵素をコードする内在性遺伝子の改変は、酵素の翻訳後修飾に影響を与えることによっても達成できる。これは、例えば、過剰発現または遺伝子サイレンシング等の対応する手段の方法によって酵素の翻訳後修飾に関与するキナーゼまたはホスファターゼのような酵素の活性を制御することによって生じ得る。
【０１５７】
別の実施形態において、酵素は効率を向上させることもある、すなわち化合物の生成のフィードバック抑制が阻止されるようにそのアロステリック制御領域が破壊されることもある。同様に、分解酵素は、その分解活性が細胞の生存能を障害することなく第１表の所望の酵素を減少させるように、置換、欠失、または追加によって除去または修飾されることもある。いずれの場合も、メチオニンの全収率、生成速度、または量は増加する。
【０１５８】
例えば第１表のタンパク質でのそのような改変が、システインもしくはグルタチオンのような他の硫黄含有化合物、他のアミノ酸、ビタミン、補助因子、栄養補助食品、核酸、ヌクレオシド、およびトレハロース等の他のファインケミカルの生成を向上させ得ることも可能である。いずれか一つの化合物の代謝は、細胞内で他の生合成経路および分解経路と絡み合う可能性があり、ならびに一つの経路で必要な補助因子、中間体、または基質は別のそのような経路によって補給または限定されることもある。したがって、第１表の一つ以上のタンパク質の活性を調節することで、メチオニン以外の他のファインケミカルの量、効率、および速度は、明確に影響され得る。
【０１５９】
第１表の酸素量および／または活性を増加させるまたは導入するための上述の戦略は限定されることなく、これらの戦略のバリエーションは、当業者にとって容易に明白である。
【０１６０】
酸素量および／または活性の減少
メチオニン生成にすでに最適化されている出発生物を用いることが好まれ得ることを上記で述べてきた。Ｃ．グルタミクムでは、例えばｍｅｔＱの活性が下方制御されることもある。
【０１６１】
酸素量および／または活性を減少させるために、種々の戦略が利用可能である。
【０１６２】
第１表に記載のもの等の内在性酵素の発現は、遺伝子のプロモーター配列に特異的に結合するアプタマーの発現を経て、例えば制御できる。刺激プロモーター領域または抑制プロモーター領域に結合するアプタマーに応じて、この場合は第１表の酸素量および活性は、例えば減少できる。
【０１６３】
アプタマーは、酵素それら自体に特異的に結合して、例えば、それぞれの酵素の触媒中心に結合することによって酵素の活性を減少させるようにある程度設計されることもできる。アプタマーの発現は、通常、ベクターに基づく過剰発現（上記参照）、ならびにアプタマーの設計および選択によって達成され、これは当業者にとって周知である（Ｆａｍｕｌｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２４３，１２３−３６）。
【０１６４】
さらに、第１表の内在性酸素量および活性の減少は、当業者にとって周知である種々の実験手段の方法によって達成できる。これらの手段は、通常、用語「遺伝子サイレンシング」の下で要約される。例えば、内在性遺伝子の発現は、酵素またはその部分をコードするＤＮＡ配列をアンチセンス方向に有する上述のベクターを、Ｃ．グルタミクム等の生物に転移させることによって発現停止される。これは、細胞でのそのようなベクターの転写がＲＮＡをもたらし、ＲＮＡは内在性遺伝子によって転写されたｍＲＮＡとハイブリダイズすることができ、したがってその翻訳を阻止するという事実に基づく。
【０１６５】
原理的には、アンチセンス戦略は、リポザイム法と合わせることができる。リボザイムは触媒的に活性のＲＮＡ配列であり、それらはアンチセンス配列に連結されると、触媒的に標的配列を切断する（Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ２３  （３），  ２５７−７５）。これは、アンチセンス戦略の効率を高めることができる。
【０１６６】
相同組換え微生物を作製するために、第１表の酵素をコードする遺伝子の少なくとも一部を含有し、それによって内在性遺伝子を改変する（例えば機能的に破壊する）ための欠失、追加、または置換が導入されているベクターを製造する。
【０１６７】
一実施形態において、ベクターは、相同組換えにおいて内在性遺伝子が機能的に破壊される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない）ように、設計される。あるいは、ベクターは、相同組換えにおいて内在性遺伝子が変異される、またはさもなければ改変されるが、依然として機能的タンパク質をコードするように（例えば、それによって、例えば第１表の内在性酵素の発現を変えるために上流調節領域が改変できる）設計されることもできる。このアプローチは、酵素の発現が完全に消失されずに、必要最小限のレベルまで減少するという利点を持つことができる。当業者は、どのベクターを用いて内在性配列を置換または欠失できるかを理解している。Ｃ．グルタミクムの場合、そのようなベクターとして、ｐＫ１９およびｐＣＬＩＫ  ｉｎｔ  ｓａｃＢが挙げられる。Ｃ．グルタミクムで染色体配列を破壊させるための具体的な説明は、以下に述べる。
【０１６８】
さらに、遺伝子抑制は、転写制御因子の量を減少させることによって可能である。
【０１６９】
標的タンパク質それ自体を抑制する因子を、細胞に導入させることもできる。タンパク質結合因子は、例えば上述のアプタマーであってもよい（Ｆａｍｕｌｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４３，  １２３−３６）。
【０１７０】
その発現が第１表の酸素量および／または活性の減少を引き起こすことができる、さらなるタンパク質結合因子として、酵素特異的抗体が考慮されることもある。１本鎖抗体等の酵素特異的組換え抗体の生成は当該技術分野で公知である。抗体の発現は、文献（Ｆｉｅｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３，  ２０５−２１６；  Ｍａｙｎａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  （２０００）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  ２，  ３３９−７６）からも知られている。
【０１７１】
前記技法は、当業者にとって周知である。したがって、当業者は、例えばアンチセンス法で用いられる核酸コンストラクトが持たねばならない代表的なサイズ、およびどの相補性、相同性、または同一性をそれぞれの核酸配列が持たねばならないかも理解している。相補性、相同性、および同一性の用語は、当業者に公知である。
【０１７２】
相補性という用語は、二つの相補的塩基間の水素結合によって別の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子の能力を説明する。二つの核酸分子が互いにハイブリダイズできるために、１００％の相補性を示す必要がないことは当業者に公知である。別の核酸配列とハイブリダイズするための核酸配列は、好ましくは、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８０％、また特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも９８％または１００％、それぞれ前述の他の核酸配列と相補的である。
【０１７３】
内在性ｍＲＮＡ配列とアンチセンス配列のハイブリダイゼーションは、一般的に、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞条件下またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞条件下で起こる。本発明により、ハイブリダイゼーションは、特異的ハイブリダイゼーションを確実にするために十分にストリンジェントである条件下でｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【０１７４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、文献から選ぶこともできる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）参照）。用語「特異的ハイブリダイゼーション」とは、特定の核酸配列が例えばＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合混合物の一部である場合、分子はストリンジェント条件下でこの核酸配列に優先的に結合するケースを称する。
【０１７５】
用語「ストリンジェント条件」とは、したがって、その下で核酸配列が標的配列に優先的に結合するが、他の配列には結合しない、または少なくとも著しく減少する程度で結合する条件を称する。
【０１７６】
ストリンジェント条件は状況に依存する。より長い配列は、より高い温度で特にハイブリダイズする。通常、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度および規定のｐＨ値で、特異的配列の融点（Ｔｍ）よりもハイブリダイゼーション温度が約５℃低くなるような方法で選択される。Ｔｍは、温度（規定のｐＨ値、規定のイオン強度、および規定の核酸濃度で）であり、その温度で、標的配列と相補的である分子の５０％が前述の標的配列とハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェント条件は、０．０１〜１．０Ｍ範囲内のナトリウムイオン（もしくは別の塩のイオン）の塩濃度および７．０〜８．３範囲内のｐＨ値を含む。温度は、短分子（例えば、１０〜５０の核酸を含む分子）の場合少なくとも３０℃である。さらに、ストリンジェント条件は、例えばホルムアミドのような不安定化剤の添加を含むこともある。代表的なハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液は、以下の組成である。
【０１７７】
プレハイブリダイゼーション溶液：
０．５％ＳＤＳ
５×ＳＳＣ
５０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ６．８
０．１％Ｎａ−ピロリン酸
５×デンハート試薬
１００μｇ／サケの精子
ハイブリダイゼーション溶液：
プレハイブリダイゼーション溶液：
１×１０6ｃｐｍ／ｍｌ  プローブ（９５℃で５〜１０分間）
２０×ＳＳＣ：
３Ｍ  ＮａＣｌ
０．３Ｍ  クエン酸ナトリウム
ＨＣｌでｐＨ７に調節
５０×デンハート試薬：
５ｇ  Ｆｉｃｏｌｌ
５ｇ  ポリビニルピロリドン
５ｇ  ウシ血清アルブミン
５００ｍｌのＡ．ｄｅｓｔ．で調節
ハイブリダイゼーションの代表的な手順は以下の通りである：
随意に：  １×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６５℃で、３０分間ブロットを洗浄
プレハイブリダイゼーション：  ５０〜５５℃で、少なくとも２時間
ハイブリダイゼーション：  ５５〜６０℃で、一晩
洗浄：  ５分間  ２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
ハイブリダイゼーション温度
３０分間  ２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
ハイブリダイゼーション温度
３０分間  １×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
ハイブリダイゼーション温度
４５分間  ０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ  ６５℃
５分間  ０．１×ＳＳＣ  室温
アンチセンスの目的で、相補性が１００核酸、８０核酸、６０核酸、４０核酸、および２０核酸の配列長にわたれば十分であり得る。
【０１７８】
核酸長がより長ければ、確実に十分である。上述の方法の併用も考え得る。
【０１７９】
本発明おいて、生物内で活性のプロモーターに５’−３’方向に作用可能に連結されるＤＮＡ配列を用いる場合、生物の細胞への転移後、通常、ベクターが構築でき、コード配列の過剰発現を可能にし、または内在性核酸配列およびそれから発現されるタンパク質の抑制もしくは競合および封鎖をそれぞれ引き起こすことができる。
【０１８０】
特定の酵素の活性は、生物内でその非機能的変異体を過剰発現させることによって減少させることもある。したがって、問題の反応を触媒することができないが、例えば基質または補助因子に結合することができる非機能的変異体は、過剰発現を経て、内在性酵素を打ち負かすことができ、およびしたがってその反応を抑制することができる。宿主細胞内の酸素量および／または活性を減少させるためのさらなる方法は、当業者にとって周知である。
【０１８１】
本発明により、非機能的酵素は、機能的酵素およびその機能的断片とそれぞれ同じ核酸配列ならびにアミノ酸配列を本質的に有するが、非機能的酵素が対応する反応を触媒することができない、または極めて限定された程度までのみ触媒することができる効果を及ぼす点変異、核酸もしくはアミノ酸の挿入または欠失を一部の位置で有する。これらの非機能的酵素は、対応する反応を触媒することが依然としてできるが、もはやフィードバック調節されない酵素と混合されることはない。本発明により、用語「非機能的酵素」とは、アミノ酸レベルおよび核酸レベルのそれぞれで、それぞれの機能的酵素との実質的な配列相同性がないそのようなタンパク質を含まない。それぞれの反応を触媒できず、かつ対応する酵素と実質的な配列相同性がないタンパク質は、したがって、定義によって本発明の用語の「機能的酵素」ではない。本発明の範囲内で非機能的酵素は、不活化酵素または不活性酵素とも称する。
【０１８２】
したがって、本発明により上述の点変異、挿入、および／または欠失を有する、例えば第１表の非機能的酵素は、本発明により、例えば第１表の野生型酵素またはその機能的に同等の部分との実質的な配列相同性によって特徴づけられる。実質的な配列相同性を決定するために、上述の同一性の程度が適用される。
【０１８３】
ベクターおよび宿主細胞
本発明の一態様は、上記のように核酸配列を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で用いるように、用語「ベクター」とは、それが連結されているところに別の核酸を輸送することができる核酸分子を称する。
【０１８４】
ベクターの一つの型は、「プラスミド」であり、その中に追加のＤＮＡセグメントが連結できる環状二本鎖ＤＮＡループを称する。ベクターの別の型は、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノム内に連結できるウイルスベクターである。
【０１８５】
いくつかのベクターは、その中にそれらが導入される宿主細胞で自己複製することができる（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクターは、宿主細胞に導入されるとその宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、いくつかのベクターは、それらが作用可能に連結される遺伝子の発現を方向づけることができる。
【０１８６】
そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称する。
【０１８７】
通常、組換えＤＮＡ技術での発現ベクターの効用は、プラスミドの形であることが多い。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的にベクターの形で用いられるので、互換的に使われることができる。しかし、本発明は発現ベクターの他の形（例えば同等の機能を果たすウイルスベクター）を含むように意図される。
【０１８８】
本発明の組換え発現ベクターは、上記のように宿主細胞において対応する核酸の発現に適した形で核酸を含むこともある。これは、組換え発現ベクターが発現のために用いられる宿主細胞に基づいて選択される一つ以上の制御配列を含み、発現される核酸配列に作用可能に連結されていることを意味する。
【０１８９】
本発明の目的で、作用可能な連結とは、コード配列を発現させるとき、プロモーター、コード配列、ターミネーター、および場合によりさらなる調節エレメントが、それぞれの調節エレメントがその決定にしたがってその機能を果たすことのできる方法で配列編成されることと理解される。
【０１９０】
組換え発現ベクター内で、「作用可能に連結される」とは、したがって、目的の核酸配列（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系の、またはベクターが宿主細胞に導入されるとき宿主細胞の）が、核酸配列の発現を可能にする方法で制御配列（複数の）に連結されることを意味するように意図される。用語「制御配列」とは、プロモーター、リプレッサー結合部位、アクチベーター結合部位、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えばターミネーターまたはｍＲＮＡ二次構造の他のエレメント）を含むように意図される。そのような制御配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ（１９９０）に説明されている。制御配列としては、数多くのタイプの宿主細胞で核酸配列の構成的発現を方向づけるもの、およびいくつかの宿主細胞で核酸配列だけの発現を方向づけるものが挙げられる。好ましい制御配列は、例えば、ｃｏｓ−、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−、ａｒａ−、ＳＰ６−、ａｍｙ、ＳＰ０２、ファージｌａｍｂｄａＰR（λＰRとしても知られている）、ファージｌａｍｂｄａＰL（λＰLとしても知られている）、ファージＳＰ０１  Ｐ15、ファージＳＰ０１  Ｐ26、ｐＳＯＤ、ＥＦＴｕ、ＥＦＴｓ、ＧｒｏＥＬ、ＭｅｔＺ等のプロモーター（最後の５つはＣ．グルタミクムに由来する）であり、これらは好ましくは細菌で用いられる。追加の制御配列としては、例えば、酵母および真菌に由来するプロモーター（例えばＡＤＣｌ、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ、ＥＮＯ２）、植物に由来するプロモーター（例えばＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓ、またはユビキチンプロモーターもしくはファゼオリンプロモーター）がある。人工プロモーターを用いることも可能である。発現ベクターの設計は形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル等の要因に依存し得ることを当業者は認識するであろう。本発明の発現ベクターは、上述の修飾された核酸配列によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質もしくは融合ペプチドを含む）をそれによって生成するための宿主細胞に導入できる。
【０１９１】
原核生物でのタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を方向づける構成的プロモーターまたは誘導プロモーターを含有するベクターによって行われることが多い。
【０１９２】
融合ベクターは、いくつかのアミノ酸をその中にコードされたタンパク質に、通常は、組換えタンパク質のアミノ末端に付加するが、Ｃ末端に付加することもあり、またはタンパク質の適切な領域内に融合される。そのような融合ベクターは、一般的に４つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増加させる；２）組換えタンパク質の溶解性を増加させる；３）親和性精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助する；および４）タンパク質の精製後の検出のための「ｔａｇ」を提供する。融合発現ベクターでは、しばしばタンパク質切断部位は、融合タンパク質の精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離させることができるよう、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入される。そのような酵素およびそれらの同族認識配列としては、因子Ｘａ、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。
【０１９３】
代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｂ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｋ．  Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：  ３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）が挙げられる。これらはグルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）、マルトースＥ−結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ融合させる。
【０１９４】
コリネ型細菌のための適切な誘導非融合発現ベクターの例としては、ｐＨＭ１５１９、ｐＢＬＩ、ｐＳＡ７７、またはｐＡＪ６６７（Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ，  ｅｄｓ．（１９８５）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＩＢＳＮ  ０４４４９０４０１８）が挙げられる。適切なＣ．グルタミクム−大腸菌シャトルベクターの例としては、例えばｐＫ１９、ｐＣｌｉｋ５ａＭＣＳ、ｐＣＬＩＫ  ｉｎｔ  ｓａｃＢがあり、あるいはＥｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ  （Ｇｅｎｅ．（１９９１）  １０２，  ９３−８）ならびに以下の刊行物および特許出願に見出されることができる（Ｓｃｈａｆｅｒ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９４  １７６：  ７３０９−７３１９，  Ｂｏｔｔ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，  Ｌ．，  ｅｄｓ．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ、国際公開第２００６０６９７１１号、国際公開第２００６０６９７１１号）。原核細胞および真核細胞の双方のための他の適切な発現系に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ２００３の第１６章および第１７章を参照されたい。
【０１９５】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して原核細胞に導入できる。本明細書で用いるように、用語「形質転換」、「トランスフェクション」、「接合」、および「形質導入」とは、外来核酸（例えば、直鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば直鎖化ベクターまたはベクターを有さない遺伝子コンストラクト単独））またはベクターの形での核酸（例えばプラスミド、ファージ、ファスミド、ファージミド、トランスポゾン、もしくは他のＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該技術分野で認められている種々の技術を称し、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウムの共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、自然応答能、化学物質媒介転移、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ２００３または他の実験マニュアルに見出すことができる。
【０１９６】
これらの組み込み体を同定して、選択するために、選択可能なマーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、通常、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８，ハイグロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、アンピシリン、およびメトトレキサート等の薬物に対する耐性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸は、上述の修飾核酸配列をコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入でき、あるいは別のベクター上で導入されることもできる。導入された核酸を安定にトランスフェクトした細胞では、薬物選択（例えば選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）によって同定できる。
【０１９７】
別の実施形態において、導入された遺伝子の調節発現を可能にする選択された系を含有する組換え微生物が生成できる。例えば、上述の核酸配列のうちの一つをベクターに包含させ、ｌａｃオペロンの制御下に置くことで、ＩＰＴＧの存在下でのみ遺伝子の発現を可能にする。そのような制御系は当該技術分野で周知である。
【０１９８】
本発明の別の態様は、内部に本発明の組換え発現ベクターを導入させた生物または宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」とは、本明細書で互換的に用いられる。そのような用語は、特定の目的の細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も称すると理解される。いくつかの修飾は、変異または環境的影響のいずれかの理由で後の世代で生じることもあるために、そのような子孫は、実際に、親細胞と同一でないこともあるが、本明細書において用語の範囲内に依然として含まれる。
【０１９９】
Ｃ．グルタミクムの増殖、培地、および培養条件
Ｃ．グルタミクムの培養に関し、一般的教示を以下に示す。適応は当業者にとって明らかであろう。対応する情報は、大腸菌の培養のための標準テキストから検索することも可能である。
【０２００】
遺伝子修飾されたコリネバクテリウムは、一般的に、合成増殖培地または天然増殖培地で培養される。コリネバクテリウムのためのいくつかの異なる増殖培地はよく知られており、かつ容易に入手可能である（Ｌｉｅｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ３２：  ２０５−２１０；  ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｏｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １１：  １１−１６；独国特許第４，１２０，８６７号；  Ｌｉｅｂｌ（１９９２）  Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，  ｉｎ：  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ，  Ｂａｌｏｗｓ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。
【０２０１】
これらの培地は、一つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、および微量元素からなる。好ましい炭素源は、糖（例えば単糖、二糖、または多糖）である。例えばグルコース、果糖、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リボース、ラクトース、マルトース、ショ糖、ラフィノース、デンプン、またはセルロースは、極めて良好な炭素源として役立つ。
【０２０２】
糖蜜または精糖由来の他の副産物等の複合化合物によって、培地に糖を供給することも可能である。異なる炭素源の混合物を供給することも有利になり得る。他の利用可能な炭素源は、アルコールおよび有機酸（例えばメタノール、エタノール、酢酸、または乳酸）である。窒素源は、通常は、有機もしくは無機窒素化合物、またはこれらの化合物を含有する物質である。代表的な窒素源としては、アンモニアガスもしくはアンモニア塩（例えばＮＨ4Ｃｌもしくは（ＮＨ4）2ＳＯ4，ＮＨ4ＯＨ）、硝酸、尿素、アミノ酸、または複合窒素源（コーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキス、およびその他等）が挙げられる。
【０２０３】
培地に含み得る無機塩化合物としては、クロライド、カルシウムリン酸塩もしくはカルシウム硫酸塩、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅、および鉄が挙げられる。キレート化合物を培地に添加して、溶液中の金属イオンを保つこともできる。特に有用なキレート化合物としては、カテコールもしくはプロトカテク酸等のジヒドロキシフェノール、またはクエン酸等の有機酸が挙げられる。培地が他の増殖因子（例えばビタミンもしくは成長促進物質）を含有することも一般的であり、それらの例としては、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、およびピリドキシンが挙げられる。増殖因子および塩は、複合培地成分（例えば酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカー、およびその他）から生じることが多い。培地化合物の正確な組成は、直接実験に強く依存し、およびそれぞれ特定の事例に対して個々に決定される。培地の最適化に関する情報は、テキストＡｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｅｄｓ．  Ｐ．Ｍ．  Ｒｈｏｄｅｓ，  Ｐ．Ｆ．  Ｓｔａｎｂｕｒｙ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９７）  ｐｐ．  ５３−７３，  ＩＳＢＮ  ０  １９  ９６３５７７  ３）から入手可能である。増殖培地を市販品（例えば標準１（Ｍｅｒｃｋ）もしくはＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン、ＤＩＦＣＯ）もしくはその他）から選択することも可能である。
【０２０４】
培地のすべての成分は、加熱（１．５バール、１２１℃で２０分間）することによって、または滅菌ろ過によって、滅菌されなければならない。それらの成分は、必要に応じて、一緒にまたは別々に滅菌することができる。
【０２０５】
培地のすべての成分は、増殖開始時にすでに加えられていてもよく、またはそれらは場合により連続的にもしくはバッチ式に加えられることもできる。培養条件は、実験ごとに別々に規定される。
【０２０６】
温度は、１５℃〜４５℃の範囲内でなければならない。温度は、一定に保たれてもよく、または実験の間、変えられることもできる。培地のｐＨは、５〜８．５の範囲内で、好ましくは約７．０でもよく、かつ培地に緩衝液を加えることによって維持できる。この目的で代表的な緩衝液は、リン酸カリウム緩衝液である。合成緩衝液（例えばＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＥＳ、およびその他）は、交互に、または同時に用いられることもできる。増殖の間にＮａＯＨまたはＮＨ4ＯＨを加えることによって培養ｐＨを一定に維持することも可能である。酵母エキスなどの複合培地成分が利用される場合、多くの複合化合物は、高い緩衝能を有するという事実によって、緩衝液を加える必要性を減らしてもよい。発酵槽が微生物の培養に利用される場合、ｐＨは気体アンモニアを用いて調節されることもできる。
【０２０７】
インキュベーション時間は、通常、数時間から数日間の範囲内である。この時間は、最大量の生成物がブロスに蓄積されるのを可能にするために選択される。開示した増殖実験は、種々の容器（例えばマイクロタイタープレート、ガラス管、ガラスフラスコ、または種々の大きさのガラス発酵槽もしくは金属発酵槽）で実施できる。多数のクローンをスクリーニングする場合、微生物は、マイクロタイタープレート、ガラス管もしくは振盪フラスコ（バッフル付き、または無し）で培養されなければならない。好ましくは、所望の増殖培地の１０％（容量で）を満たした１００ｍｌまたは２５０ｍｌの振盪フラスコを使用する。フラスコは、回転振盪機（振幅２５ｍｍ）上で、１００〜３００ｒｐｍの速度範囲を用いて、振盪させなければならい。蒸発減は、空気の湿気を維持することによって減少させることができ、あるいは、蒸発減は数学的補正によって行われるべきである。
【０２０８】
遺伝子修飾されたクローンを検査する場合、非修飾の対照クローンまたは何ら挿入を有さない基本プラスミドを含有する対照クローンも検査されるべきである。３０℃でインキュベートされた増殖細胞を用いて、ＣＭプレート（１０ｇ／ｌ  グルコース、２．５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２ｇ／ｌ尿素、１０ｇ／ｌポリペプトン、５ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌ肉エキス、２２ｇ／ｌ寒天、２Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ６．８）等の寒天板上で、培地にＯＤ６００＝０．５〜１．５まで播種される。培地の播種は、ＣＭプレートからＣ．グルタミクム細胞の生理食塩懸濁液を導入することによって、またはこの細菌の液体前培養を添加することによってのいずれかで達成される。他のインキュベーション法は、国際公開第２００７０１２０７８から取得することができる。
【０２０９】
一般的な方法
一般的な方法のプロトコールは、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，  （２００５）  ｅｄｓ．：Ｌ．  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，  Ｍ．  Ｂｏｔｔ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ａｔ  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （１９８７）  ５，  １３７−１４６），  Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  （１９９４），  １３８，  ３５−４１），  Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｕｎｄ  Ｍｏｒｉｎａｇａ  （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （１９８８），  ６，  ４２８−４３０），  Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  （１９９１），  １０２，  ９３−９８），  欧州特許第０４７２８６９号，  米国特許第４６０１８９３号，Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ  ａｎｄ  Ｐｕｅｈｌｅｒ  （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （１９９１），  ９，  ８４−８７，  Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９４），  ６０，１２６−１３２），  ＬａＢａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  （１９９３），  １７５，  １００１−１００７），  国際公開第９６／１５２４６号，  Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  （１９９３），  １３４，  １５−２４），  ＪＰ−Ａ−１０−２２９８９１，  Ｊｅｎｓｅｎ  ｕｎｄ  Ｈａｍｍｅｒ  （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  （１９９８），  ５８，１９１−１９５），  Ｍａｋｒｉｄｅｓ  （Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （１９９６），  ６０，  ５１２−５３８）、国際公開第２００６０６９７１１号、国際公開第２００７０１２０７８号、ならびに遺伝子および分子生物学に関する周知のテキストに見出すことができる。
【０２１０】
菌株、培地、およびプラスミド
菌株は、例えば以下の一覧表から取ることができる：
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）  ＡＴＣＣ１３０３２、
コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）  ＡＴＣＣ１５８０６、
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）  ＡＴＣＣ１３８７０、
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、
コリネバクテリウム・メラッセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）  ＡＴＣＣ１７９６５、
ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）  ＡＴＣＣ１４０６７、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）  ＡＴＣＣ１３８６９、および
ブレビバクテリウム・ジバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）  ＡＴＣＣ１４０２０、もしくはそれに由来する菌株（例えばコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）  ＫＦＣＣ１００６５、ＤＳＭ１７３２２、または
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）  ＡＴＣＣ２１６０８
組換えＤＮＡ技術
プロトコールは、以下に見出すことができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２００１）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  Ｖｏｌ．  １，  ２，  ３、およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  （２００５）  ｅｄｓ．  Ｌ．  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，  Ｍ．  Ｂｏｔｔ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ。
【０２１１】
アミノ酸およびメチオニン中間体の定量化
分析は、ガードカートリッジおよびＳｙｎｅｒｇｉの４μカラム（ＭＡＸ−ＲＰ８０Å、１５０*４．６ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（ドイツ国アシャッフェンブルグ））を用いてＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００，  Ａｇｉｌｅｎｔ（ドイツ国ヴァルトブロン））で行われる。注入の前に、分析物は、還元剤（２−ＭＣＥ）として、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）およびメルカプトエタノールを用いて誘導体化される。さらに、スルフヒドリル基は、ヨード酢酸でブロックされる。分離は、極性相として４０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4（溶離液Ａ、ｐＨ＝７．８（ＮａＯＨで調節される））および非極性相としてメタノール／水混合物（１００／１）（溶離液Ｂ）を用いて、１ｍｌ／分の流速で実行される。以下の勾配が適用される：開始０％Ｂ；３９分  ３９％Ｂ；７０分  ６４％Ｂ；１００％Ｂを３．５分間；平衡化のため２分間  ０％Ｂ。室温での誘導体化は、下記のように自動化される。はじめに、ビシン（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）中の０．５μｌの０．５％２−ＭＣＥを０．５μｌの細胞抽出物と混合させる。その後、ビシン（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）中の１．５μｌの５０ｍｇ／ｍｌヨード酢酸を加え、続いて２．５μｌのビシン緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）を添加する。誘導体化は、１／４５／５４（ｖ／ｖ／ｖ）の２−ＭＣＥ／ＭｅＯＨ／ビシン（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）で溶解させた０．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌＯＰＡ試薬を加えることで行われる。最後に、この混合物を３２μｌのＨ2Ｏで希釈する。上記の各ピペット操作ステップの間に、１分間の待機時間がある。次いで、総量３７．５μｌをカラムに注入させる。試料製造の間（例えば待機時間内に）および試料製造の後、オートサンプラーのニードルを定期的に清浄されれば、分析の結果が有意に改善され得ることに注目されたい。検出は、蛍光検出器（励起波長３４０ｎｍ、発光波長４５０ｎｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ，（ドイツ国ヴァルトブロン））で行われる。定量化のため、内部標準としてα−アミノ酪酸（ＡＢＡ）がある。
【０２１２】
組換えプロトコールの定義
以下で、メチオニン生成の効率が増加したＣ．グルタミクム株をいかに構築し、上記予測の知見を実施できるかを説明する。菌株の構築を説明する前に、以下で用いられる組換え現象／プロトコールについての定義を示す。
【０２１３】
本明細書に用いるように「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」は、元の宿主細胞の形質転換体を称する。この形質転換体では、環状二本鎖ＤＮＡ分子（例えば、ｐＣＬＩＫ  ｉｎｔ  ｓａｃＢもしくはｐＫ１９に基づくプラスミド）全体が、単一の相同組換え現象（クロスイン現象）によって染色体に組み込まれていて、前述の環状ＤＮＡ分子の直鎖化型が前述の環状ＤＮＡ分子の第一のＤＮＡ配列と相同である染色体の第一のＤＮＡ配列に効果的挿入される。「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」は、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」形質転換体の染色体に組み込まれている直鎖化ＤＮＡ配列を称する。「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」は、第一の相同ＤＮＡ配列の重複を含有し、そのそれぞれのコピーは相同組換え交差点のコピーを含み、かつ囲んでいる。この名称は、この種類の組換えを最初に提案したＡｌａｎ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ教授に由来する。
【０２１４】
本明細書で用いるように「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」は、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」形質転換体に由来する細胞を称する。この細胞では、「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」ＤＮＡの直鎖化ＤＮＡ挿入断片上に含有される第２のＤＮＡ配列と、前述の直鎖化挿入断片の第２のＤＮＡ配列と相同である染色体起源の第２のＤＮＡ配列との間に第２の相同組換え現象（クロスアウト現象）が生じている。この第２の組換え現象は、組み込まれたＤＮＡ配列の部分の欠失（放棄）をもたらすが、重要なことには染色体に残存する、組み込まれた「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」ＤＮＡの部分（これはわずかに一塩基であり得る）ももたらす。その結果、元の宿主細胞と比較して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」細胞は、染色体中に一つ以上の意図的な変化（例えば、一塩基置換、複数塩基置換、異種遺伝子もしくはＤＮＡ配列の挿入、相同遺伝子もしくは修飾された相同遺伝子の一つの追加コピーもしくは複数の追加コピーの挿入、または上記に記載したこれらの上述の例からの複数の例を含むＤＮＡ配列の挿入）を含有する。
【０２１５】
「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」細胞または菌株は、通常（必ずしもではないが）、「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」ＤＮＡ配列の部分（放棄されることが望ましい部分）に含有される遺伝子（例えば、枯草菌ｓａｃＢ遺伝子（約５％〜１０％のショ糖の存在下で増殖する細胞で発現すると致命的である））に対する対抗選択によって取得される。対抗選択を用いても用いなくても、所望の「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」細胞は、任意の選別可能な表現型（これらに限定されることはないが、例えばコロニーの形態、コロニーの色、抗生物質耐性の有無、ポリメラーゼ連鎖反応による所与のＤＮＡ配列の有無、栄養素要求性の有無、酵素の有無、コロニー核酸ハイブリダイゼーション、抗体スクリーニング）を用いて、所望の細胞を求めて選別することによって取得または同定できる。用語「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」および「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」は、上記の方法またはプロセスに関して種々の時制で動詞としても使用できる。
【０２１６】
「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」または「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」をもたらす相同組換え現象は、相同ＤＮＡ配列内で一連のＤＮＡ塩基にわたって起こり得ると理解されており、この相同配列がこの範囲の少なくとも一部分に関して互いに同一であるので、クロスオーバー現象が起こった位置を正確に特定することは、通常可能ではない。言い換えると、どの配列が挿入されたＤＮＡに元来由来したものか、どの配列が染色体ＤＮＡに元来由来したものかを正確に特定することは可能ではない。さらに、第一の相同ＤＮＡ配列および第二の相同ＤＮＡ配列は、通常、部分的に非相同性の領域によって分離され、および「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」細胞の染色体に挿入されて残存するのは非相同性のこの領域である。
【０２１７】
実用性を目的として、Ｃ．グルタミクムでは、代表的な第一および第二の相同ＤＮＡ配列は、少なくとも約２００塩基対の長さであり、数千塩基対の長さまであり得る。しかし、より短いまたはより長い配列で操作するための手法を作成してもよい。例えば、第一および第二の相同配列の長さは、約５００塩基から２０００塩基にわたることができ、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」から「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」の取得は、第一および第一の相同配列をおおよそ同じ長さになるよう、好ましくは２００塩基対未満の相違に、最も好ましくは二つの配列のうち短い方が長い方の長さの塩基対の少なくとも７０％になるように編成することによって促進される。Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎおよびｏｕｔ法の説明は、国際公開第２００７０１２０７８から得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】図１は、ｂｔｕＲ２欠失がビタミンＢ１２の取り込みに与える影響を示す図である。
【０２１９】
実施例
以下の実験は、Ｃ．グルタミクムトランスケトラーゼの過剰発現がどのようにしてメチオニン生成の増加をもたらすかを示す。しかし、これらの実施例は、本発明を多少なりとも限定することを全く意図しない。
【０２２０】
振盪フラスコ実験およびＨＰＬＣアッセイ
標準糖蜜培地で振盪フラスコ実験を、菌株を用いて２通りまたは４通りで行った。１リットルの培地に含有される糖蜜培地：４０ｇのグルコース；６０ｇの糖蜜；２０ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4；０．４ｇのＭｇＳＯ4*７Ｈ2Ｏ；０．６ｇのＫＨ2ＰＯ4；１０ｇの酵母エキス（ＤＩＦＣＯ）；５ｍｌの４００ｍＭ  スレオニン；２ｍｇのＦｅＳＯ4．７Ｈ2Ｏ；２ｍｇのＭｎＳＯ4．Ｈ2Ｏ；および５０ｇのＣａＣＯ3（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）、ｄｄＨ２Ｏで全容量までにした。ｐＨを２０％ＮＨ4ＯＨで７．８に調節し、２０ｍｌの培地を攪拌させながら（ＣａＣＯ3を懸濁状態に保つため）２５０ｍｌのバッフル付きＢｅｌｌｃｏ振盪フラスコに加え、次いでこのフラスコを２０分間オートクレーブさせた。オートクレーブ後、「４Ｂ溶液」を基本培地１リットルあたり４ｍｌ（または８０μｌ／フラスコ）で加えた。「４Ｂ溶液」１リットルあたりの含有物（０．２５ｇの塩酸チアミン（ビタミンＢ１）、５０ｍｇのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、２５ｍｇのビオチン、１．２５ｇの塩酸ピリドキシン（ビタミンＢ６））を、ビオチンを溶解させるために１２．５ｍMのＫＰＯ4で緩衝し（ｐＨ７．０）、次いで濾過滅菌させた。一部の実験では、おおよその標準濃度にさせるためにビタミンＢ１２の最終濃度を変えた。培養物をバッフル付きフラスコに入れてＢｉｏｓｈｉｅｌｄ紙で覆ってそれをゴムバンドで固定し、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃフロアーシェーカーで、それを２８℃ないし３０℃、２００もしくは３００ｒｐｍで４８時間、増殖させた。２４時間および／または４８時間、試料を採取した。遠心分離によって細胞を除去し、次いで上清を等容量の６０％アセトニトリルで希釈してから、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ０．４５μｍのスピンカラムを用いて、溶液を膜濾過した。ＨＰＬＣを使用して、メチオニン、グリシン＋ホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、スレオニン、イソロイシン、リシン、および他の指示アミノ酸の濃度について、濾液をアッセイした。
【０２２１】
ＨＰＬＣアッセイのために、濾過した上清を、０．４５μｍの濾過した１ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡで１：１００に希釈し、１μｌのその溶液を、Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（８０ｍＭ  ＮａＢＯ3、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ１０．２）中のＯＰＡ試薬（ＡＧＩＬＥＮＴ）で誘導体化し、次いで２００×４．１ｍｍのＨｙｐｅｒｓｉｌ  ５μ  ＡＡ−ＯＤＳカラム上に注入し、Ｇ１３２１Ａ蛍光検出器（ＡＧＩＬＥＮＴ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣ上で操作した。励起波長は３３８ｎｍであり、モニターした発光波長は４２５ｎｍであった。アミノ酸標準溶液をクロマトグラフし、それを用いて種々のアミノ酸の保持時間および標準ピーク領域を測定した。Ａｇｉｌｅｎｔから提供されたソフトウェアパッケージに添付されているＣｈｅｍ  Ｓｔａｔｉｏｎを、測定器の制御、データ収集、およびデータ操作で使用した。ハードウェアは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｃｋ（ＳＰ６ａ）でアップデートしたＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＮＴ４．０をサポートするＨＰ  Ｐｅｎｔｉｕｍ  ４コンピュータであった。
【０２２２】
実験１−Ｍ２０１４株の生成
「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得るために、Ｃ．グルタミクム株  ＡＴＣＣ１３０３２を、ＤＮＡ  Ａ（ｐＨ２７３とも称する）（配列番号１３）で形質転換して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎ」した。次いで、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」して、フィードバック耐性ホモセリン脱水素酵素酵素（ｈｏｍｆｂｒ）をコードする遺伝子を含有する「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」株、Ｍ４４０を得た。結果として生じたホモセリン脱水素酵素タンパク質は、Ｓ３９３がＦ３９３に変わった（Ｈｓｄｈ  Ｓ３９３Ｆと称する）アミノ酸変化を含んでいた。
【０２２３】
続いて、Ｍ４４０株を、ＤＮＡ  Ｂ（ｐＨ３７３とも称する）（配列番号１４）で形質転換して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得た。次いで、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」して、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ酵素をコードする遺伝子（Ａｓｋfbr）（ｌｙｓＣによってコードされた）を含有する「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」株、Ｍ６０３を得た。結果として生じたアスパラギン酸キナーゼタンパク質では、Ｔ３１１がＩ３１１（ＬｙｓＣ  Ｔ３１１Ｉと称する）に変わった。
【０２２４】
Ｍ６０３株は約１７．４ｍＭのリシンを生成したが、ＡＴＣＣ１３０３２株は測定可能な量のリシンを生成しなかったことが分った。さらに、第２表に要約するように、ＡＴＣＣ１３０３２株によって測定可能な量が生成されなかったのと比較して、Ｍ６０３株は約０．５ｍＭのホモセリンを生成した。
【０２２５】
第２表：ＡＴＣＣ１３０３２株およびＭ６０３株によって生成されたホモセリン、O−アセチルホモセリン、メチオニン、およびリシンの量
【表５】
2010530223.tif 000006
【０２２６】
Ｍ６０３株を、ＤＮＡ  Ｃ（ｐＨ３０４とも称する）（配列番号１５）で形質転換して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得、次いでそれを「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」株、Ｍ６９０を得た。Ｍ６９０株は、ｍｅｔＨ遺伝子の上流のＰｇｒｏＥＳプロモーターを含有した（Ｐ497ｍｅｔＨとも称する）。Ｐ497プロモーターの配列を、配列番号１０に示す。以下の第３表に示すように、Ｍ６９０株は、約７７．２ｍＭのリシンおよび約４１．６ｍＭのホモセリンを生成した。
【０２２７】
第３表：Ｍ６０３株およびＭ６９０株によって生成されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニン、およびリシンの量
【表６】
2010530223.tif 000007
【０２２８】
続いて、Ｍ６９０株を以下のように変異誘発させた：ＢＨＩ培地（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）で増殖させた、Ｍ６０３の一晩培養物を、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で洗浄し、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（５０ｍＭのクエン酸（ｐＨ５．５）中に１０ｍｇ／ｍｌ）で、３０℃で２０分間処理した。処理後、それらの細胞を、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で再洗浄し、以下の成分を含有する培地上にプレーティングした：（記載したすべての量は、５００ｍｌ培地に対して算出している）１０ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4；０．５ｇのＫＨ2ＰＯ4；０．５ｇのＫ2ＨＰＯ4；０．１２５ｇのＭｇＳＯ4*７Ｈ2Ｏ；２１ｇのＭＯＰＳ；５０ｍｇのＣａＣｌ2；１５ｍｇのプロトカテク酸；０．５ｍｇのビオチン；１ｍｇのチアミン；および５ｇ／ｌのＤ，Ｌ−エチオニン（ＳＩＧＭＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ、ＣＡＴＡＬＯＧ  ＃Ｅ５１３９）（ＫＯＨでｐＨ７．０に調整した）。さらに、０．５ｍｌの微量金属溶液を含有する培地は以下のように構成される：１０ｇ／ｌのＦｅＳＯ4*７Ｈ2Ｏ；１ｇ／ｌのＭｎＳＯ4*Ｈ2Ｏ；０．１ｇ／ｌのＺｎＳＯ4*７Ｈ2Ｏ；０．０２ｇ／ｌのＣｕＳＯ4；および０．００２ｇ／ｌのＮｉＣｌ2*６Ｈ2Ｏ（すべてを０．１ＭのＨＣｌ中で溶解させた）。最終培地を濾過によって滅菌し、培地に、４０ｍｌの滅菌５０％グルコース溶液（４０ｍｌ）および滅菌寒天を１．５％の最終濃度まで加えた。培地を含有する最終的な寒天を寒天プレートに注ぎ、最少エチオニン培地とラベルした。変異誘発させた株をプレート（最少エチオニン）上に広げて、３０℃で３〜７日間インキュベートした。培地上で増殖したクローンを単離して、同じ最少エチオン培地上に再画線した。メチオニン生成分析のためにいくつかのクローンを選択した。
【０２２９】
メチオニン生成を以下のように分析した。菌株を、ＣＭ−寒天培地上で、３０℃で２日間増殖させた。培地は、１０ｇ／ｌのＤ−グルコース；２．５ｇ／ｌのＮａＣｌ；２ｇ／ｌの尿素；１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏペプトン（ＤＩＦＣＯ）；５ｇ／ｌの酵母エキス（ＤＩＦＣＯ）；５ｇ／ｌのビーフエキス（ＤＩＦＣＯ）；２２ｇ／ｌの寒天（ＤＩＦＣＯ）を含有させ、および約１２１℃で２０分間オートクレーブした。
【０２３０】
菌株を増殖させた後、細胞を擦り取り、０．１５ＭのＮａＣｌ中で再懸濁させた。本培養のために、６００ｎｍの開始ＯＤで、擦り取った細胞の懸濁液を、０．５ｇのオートクレーブした固形ＣａＣＯ3（ＲＩＥＤＥＬ  ＤＥ  ＨＡＥＮ）と共に約１．５〜１０ｍｌの培地ＩＩ（以下参照）に加え、これらの細胞をバッフル無しの１００ｍｌ振盪フラスコ中で軌道振盪プラットホーム（３０℃、約２００ｒｐｍで）上で、７２時間インキュベートした。培地ＩＩ含有物：４０ｇ／ｌのショ糖；６０ｇ／ｌの糖蜜由来の全糖（糖含有量で算出）；１０ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4；０．４ｇ／ｌのＭｇＳＯ4*７Ｈ2Ｏ；０．６ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4；０．３ｍｇ／ｌのチアミン*ＨＣｌ；１ｍｇ／ｌのビオチン；２ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ4；および２ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ4。培地をＮＨ4ＯＨでｐＨ７．８に調整して、約１２１℃で約２０分間オートクレーブした。オートクレーブおよび冷却後、濾過滅菌ストック溶液（２００μｇ／ｍｌ）からビタミンＢ１２（シアノコバラミン）（ＳＩＧＭＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ）を１００μｇ／ｌの最終濃度まで加えた。
【０２３１】
試料を培地から採取し、アミノ酸含有量についてアッセイした。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＬＣシステムＨＰＬＣ（ＡＧＩＬＥＮＴ）上でＡｇｉｌｅｎｔアミノ酸方法を用いて、メチオニンを含む生成アミノ酸を測定した。オルト−フタルアルデヒドで試料をプレカラム誘導体化することにより、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＡＡ−カラム（ＡＧＩＬＥＮＴ）上での分離後、生成アミノ酸の定量化が可能になった。
【０２３２】
Ｍ６９０におけるそれの少なくとも２倍のメチオニン力価を示すクローンを単離した。さらに実験で使用したそのようなクローンをＭ１１９７と命名し、２００５年５月１８日にＤＳＭＺカルチャー・コレクションに菌株番号ＤＳＭ１７３２２として寄託した。以下の第４表に要約するように、この菌株によるアミノ酸生成を、Ｍ６９０株のそれと比較した。
【０２３３】
第４表：Ｍ６９０株およびＭ１１９７株によって生成されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニン、およびリシンの量
【表７】
2010530223.tif 000008
【０２３４】
Ｍ１１９７株をＤＮＡ  Ｆ（ｐＨ３９９とも称する、配列番号１６）で形質転換して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得、続いてそれを「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」して、Ｍ１４９４株を得た。この菌株はホモセリンキナーゼの遺伝子に変異を含有し、そのため結果として生じるホモセリンキナーゼ酵素にＴ１９０からＡ１９０へのアミノ酸変化をもたらす（ＨｓｋＴ１９０Ａと称する）。以下の第５表に要約するように、Ｍ１４９４株によるアミノ酸生成を、Ｍ１１９７株によるアミノ酸生成と比較した。
【０２３５】
第５表：Ｍ１１９７株およびＭ１４９４株によって生成されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニン、およびリシンの量
【表８】
2010530223.tif 000009
【０２３６】
Ｍ１４９４株ＤＮＡ  Ｄ（ｐＨ４８４とも称する、配列番号１７）で形質転換して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得、続いてそれを「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」して、Ｍ１９９０株を得た。Ｍ１９９０株は、ｇｒｏＥＳプロモーターおよびＥＦＴＵ（伸長因子Ｔｕ）プロモーターの両方を使用してｍｅｔＹ対立遺伝子を発現させる（Ｐ497Ｐ1284ｍｅｔＹと称する）。Ｐ497Ｐ1284プロモーターの配列を配列番号１８に記載する。以下の第６表に要約するように、Ｍ１４９４株によるアミノ酸生成をＭ１９９０株によるアミノ酸生成と比較した。
【０２３７】
第６表：Ｍ１４９４株およびＭ１９９０株によって生成されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニン、およびリシンの量
【表９】
2010530223.tif 000010
【０２３８】
Ｍ１９９０株をＤＮＡ  Ｅ（ｐＨ４９１とも称する、配列番号１９）で形質転換して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ」株を得、次いでそれを「Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔ」して、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ」株、Ｍ２０１４株を得た。Ｍ２０１４株は、スーパーオキシドジスムターゼプロモーターを使用してｍｅｔＡ対立遺伝子を発現させる（Ｐ3119ｍｅｔＡと称する）。Ｐ3119プロモーターの配列を配列番号９に記載する。以下の第７表に要約するように、Ｍ２０１４株によるアミノ酸生成をＭ１９９０株によるアミノ酸生成と比較した。
【０２３９】
第７表：Ｍ１４９４株およびＭ１９９０株によって生成されたホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、メチオニン、およびリシンの量
【表１０】
2010530223.tif 000011
【０２４０】
実験２−Ｍ２０１４からのｍｃｂＲの欠失
ＲＸＡ００６５５欠失を含有するプラスミドｐＨ４２９（配列番号２０）を用いて、組み込みおよび切除を介してｍｃｂＲ欠失をＣ．グルタミクムに導入した（国際公開第２００４／０５０６９４Ａ１参照）。
【０２４１】
カナマイシン耐性を選択することによって、プラスミドｐＨ４２９をＭ２０１４株に形質転換させた（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｉｎ）。ｓａｃＢ対抗選択を使用して、形質転換された菌株のカナマイシン感受性誘導体を単離した。この誘導体は推定上、組み込まれたプラスミドが切除によって失われている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｏｕｔ）。形質転換された菌株は、小型コロニーおよび大型コロニーを形成したカナマイシン感受性誘導体を生成した。ｍｃｂＲ欠失の存在を検出するために、両大きさのコロニーをＰＣＲによってスクリーニングした。大きい方のコロニーのいずれにも欠失は含有されていなかったが、小さい方のコロニーの６０〜７０％に予想されたｍｃｂＲ欠失が含有されていた。
【０２４２】
最初の分離株をＢＨＩプレート上の単一コロニーに画線すると、極めて小さいコロニーおよび小型コロニーが混合して現れた。極めて小さいコロニーをＢＨＩ上に再画線すると、再び、極めて小さいコロニーおよび小型コロニーが混合して現れた。小型コロニーをＢＨＩ上に再画線すると、コロニーの大きさは、通常、小さくて均一であった。二つの小型で単一のコロニー分離株（ＯＭ４０３−４およびＯＭ４０３−８と称する）をさらなる調査のために選択した。
【０２４３】
振盪フラスコ実験（第８表）は、ＯＭ４０３−８が親Ｍ２０１４株の少なくとも２倍のメチオニンを生成したことを示した。この株は、Ｍ２０１４の５分の１未満のリシンの量も生成し、アスパラギン酸セミアルデヒドからホモセリンに向かう炭素流動の転換を示唆した。三番目の著しい相違は、Ｍ２０１４と比較してＯＭ４０３によるイソロイシンの蓄積が１０倍を超えて増加したことであった。培養物を標準糖蜜培地で４８時間増殖させた。
【０２４４】
第８表：新鮮な増殖細胞を播種した振盪フラスコ培養でのＯＭ４０３株の分離株によるアミノ酸生成
【表１１】
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【０２４５】
第９表にも示すように、Ｍ２０１４と比較してＯＭ４０３によるO-アセチルホモセリンの蓄積が１５倍を超えて増加した。この結果の最も可能性が高い説明は、Ｍ２０１４に蓄積するＯ−アセチルホモセリンのほとんどがＯＭ４０３においてメチオニン、ホモシステイン、およびイソロイシンに変換されるということである。培養物を標準糖蜜培地で４８時間増殖させた。
【０２４６】
第９表：新鮮な増殖細胞を播種した振盪フラスコ培養でのＯＭ４０３株の二つの分離株によるアミノ酸生成
【表１２】
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【０２４７】
実験３−ｍｅｔＱ発現の減少
ＯＭ４０３−８におけるメチオニンの移入を減少させるために、ｍｅｔＱのプロモーターおよび５’部分を欠失させた。ｍｅｔＱ遺伝子は、複合体が機能するために必要とされるメチニン移入複合体のサブユニットをコードする。プラスミドｐＨ４４９（配列番号２１）で標準的なＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｕｔ技術を用いて、これを達成した。振盪フラスコアッセイで、メチオニン生成に関してＯＭ４０３−８およびＯＭ４５６−２をアッセイした。結果（第１０表）は、ＯＭ４５６−２がＯＭ４０３−８よりも多くのメチオニンを生成したことを示す。培養物を標準糖蜜培地で４８時間増殖させた。
【０２４８】
第１０表：ＯＭ４５６−２に関する振盪フラスコアッセイ
【表１３】
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【０２４９】
実験４−ＯＭ４６９の構築
ＯＭ４５６−２においてｍｅｔＱの欠失と、ｍｅｔＦプロモーターをファージλＰRプロモーターと置換することによるｍｅｔＦの過剰発現との両方を含む、ＯＭ４６９と称する菌株を構築した。プラスミドｐＯＭ４２７（配列番号２２）で、標準的なＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｕｔ技術を用いて、これを達成した。振盪フラスコ培養アッセイで、ＯＭ４６９の４つの分離株をメチオニン生成に関してアッセイした。第１１表に示すように、それらすべての分離株は、ＯＭ４５６−２よりも多くのメチオニンを生成した。培養物を、２ｍＭスレオニンを含有する標準糖蜜培地で４８時間増殖させた。
【０２５０】
第１１表：ｍｅｔＦプロモーターの代わりにファージλＰRプロモーターを含有するＯＭ４５６−２の誘導体であるＯＭ４６９に関する振盪フラスコアッセイ
【表１４】
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【０２５１】
実験５−Ｍ２５４３の構築
配列番号２３示す（図１ａ）ように、ＯＭ４６９−２株を、プラスミドｐＣＬＩＫ５Ａ  ｉｎｔ  ｓａｃＢ  ＰＳＯＤ  ＴＫＴでエレクトロポレーションによって形質転換した。標準的なＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｕｔ技術を用いて、これを達成した。
【０２５２】
振盪フラスコ培養アッセイで、ＯＭ４６９  ＰＳＯＤ  ＴＫＴ（Ｍ２５４３と称する）の分離株をメチオニン生成についてアッセイした。それらの株はＯＭ４６９−２よりも多くのメチオニンを生成した。Ｍ２５４３株に関する結果を第１２表に示す。
【０２５３】
第１２表：ＯＭ４６９およびＭ２５４３に関する振盪フラスコアッセイ
【表１５】
2010530223.tif 000016
【０２５４】
実験６−ＯＭ５１３、ＯＭ５８９、ＯＭ５９０、ＯＭ５９７、およびＯＭ５９８の構築
タンパク質ｍｅｔＸ，ｍｅｔＹ、およびｍｅｔＦの発現を増加させる複製型プラスミドｐＯＭ４７４で（配列番号２４）、ＯＭ４６９株をエレクトロポレーションによって形質転換させた。結果として生じた株をＯＭ５１３と命名した。
【０２５５】
次に、ｂｔｕ２オペロンプロモーターの代わりにλＰLプロモーターでＣ．グルタミクム株の構築を可能にするために、組み込み型プラスミドｐＯＭ５１１（配列番号２５）およびｐＯＭ５１２（配列番号２６）を構築した。プラスミドｐＯＭ５１１を用いて、λＰLプロモーター置換だけを含有するＯＭ５８９株（ＯＭ４６９の誘導体）を構築した。同様に、プラスミドｐＯＭ５１２を用いて、ΔｂｔｕＲ２およびλＰLプロモーター置換を含有するＯＭ５９０株（ＯＭ４６９の誘導体）を構築した。
【０２５６】
標準的なＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｕｔ技術を用いて、上述のプラスミドｐＯＭ５１１およびｐＯＭ５１２をＯＭ４６９に形質転換させることで、これらの菌株を得た。
【０２５７】
続いて、上述の複製型プラスミドｐＯＭ４７４をそれぞれＯＭ５８９およびＯＭ５９０に形質転換させて、ＯＭ５９７およびＯＭ５９８を得た。
【０２５８】
ｂｔｕ２オペロンの発現に影響すると想定される修飾の効果を評価するための一つのアプローチは、振盪フラスコ培養における菌株の増殖およびメチオニン生成に対する濃度を下げたビタミンＢ１２の影響を調べることである。最適以下の濃度が、天然のビタミンＢ１２取り込み系の発現を抑制するために必要とされる濃度よりも高い場合、ビタミンＢ１２移入を調節解除することで、菌株が最適以下の濃度でビタミンＢ１２をより効率的に蓄積することができる。振盪フラスコアッセイで、上述のようにｂｔｕ２オペロン修飾を有する菌株を、４つの異なる濃度のビタミンＢ１２でアッセイした。第１３表に示すように、１００μｇ／ｌの濃度に低下させたビタミンＢ１２へのそれらの反応において、菌株が著しい変化を示したことを結果は示している。このビタミンＢ１２の濃度で、λＰLプロモーター修飾（ＯＭ５９７およびＯＭ５９８）を含有する二つの菌株は、この修飾が欠如しているそれら二つの菌株よりもより多くのグルコースを利用してより多くのメチオニンを生成することができた。
【０２５９】
第１３表：ＯＭ５１３、ＯＭ５９７、およびＯＭ５９８に関する振盪フラスコアッセイ
【表１６】
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【０２６０】
さらに、二つの菌株、すなわちＯＭ５９７およびＯＭ５９８を、１ｍｇ／ｌ濃度のビタミンＢ１２の発酵槽で比較した。ΔｂｔｕＲ２欠失を含有する菌株は、二つの菌株について最も高いメチオニン力価をもたらした（３６時間で２３ｇ／ｌ対２０ｇ／ｌ）。
【０２６１】
実験７−ＯＭ５９９の構築
ＯＭ５４２と称する菌株を、ＯＭ４６９からｂｔｕＲ２を欠失させることで得た。この目的を達成するために、エレクトロポレーションによってプラスミドｐＯＭ４９５（配列番号２７）をＯＭ４６９に形質転換させ、続いてＣａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔすることによってＯＭ５４２株を得た。ＯＭ５４２をｐＯＭ４７４で形質転換させて、ＯＭ４６２株を得た。
【０２６２】
さらに、プラスミドｐＯＭ５１３を電気穿孔し、ＯＭ５４２をＣａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔさせて、ＯＭ５９２株をもたらせた。この株はｔｋｔ遺伝子および下流遺伝子を推進するＰSODを含有した。最終的に、ＯＭ５９２を複製型プラスミド（ｐＯＭ４７４）で形質転換させて、ＯＭ５９９株を得た。
【０２６３】
続いて、１０ｍｇ／ｌのビタミンＢ１２を含有する標準糖蜜培地を使用して、ＯＭ５６２株およびＯＭ５９９株を、振盪フラスコでのそれらのメチオニン生成について比較した。対照はＯＭ５１３であった。この株は、ＯＭ４６９をｐＯＭ４７４で形質転換させたものである。ＯＭ５６２はＯＭ５１３よりもわずかに多くのメチオニンを生成し、ＯＭ５９９はＯＭ５６２よりも多く生成した（以下の第１４表参照）。
【０２６４】
第１４表：ＯＭ５１３、ＯＭ５６２、およびＯＭ５９９（すべてｐＯＭ４７４を含有する）に関する振盪フラスコアッセイ
【表１７】
2010530223.tif 000018
【０２６５】
第１４表から分かるように、ｂｔｕＲ２の欠失はビタミンＢ１２の蓄積の向上をもたらす。
【０２６６】
実験８−ＯＭ５６６の構築
ＯＭ５６６と称する菌株を、Ｍ２５４３からｂｔｕＲ２を欠失させることによって得た。この目的を達成するために、エレクトロポレーションによってプラスミドｐＯＭ４９５（配列番号２７）をＭ２５４３に形質転換させ、続いてＣａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｉｎおよびＣａｍｐｂｅｌｌｅｄ  ｏｕｔすることによってＯＭ５６６株を得た。
【０２６７】
ビタミンＢ１２ビタマーの取り込みの測定を目的として、シアノコバラミン１ｍｇ／ｌを添加したＢＨＩ培地、および添加してないＢＨＩ培地で細胞を増殖させた。一晩増殖後、細胞を遠心分離によって収集して、生理食塩水(０．８５％のＮａＣｌ)で２回洗浄した。これらの細胞を、製造者Ｈｙｂａｉｄの説明どおり、Ｒｉｂｏｌｙｚｅｒ方法を用いて溶解させた。溶解細胞を遠心分離させ、次いでビタミンＢ１２のＥＬＩＳＡによる分析のために上清を希釈した。Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ）からのビタミンＢ１２ＥＬＩＳＡキットを、製造者の説明にしたがって使用した。
【０２６８】
標準試料および細胞可溶化物の試料を、製造者にしたがって緩衝液に希釈した。Ｃ．グルタミクム由来の試料を、ＥＬＩＳＡで１：１００から１：８００に希釈した。ＥＬＩＳＡの線形応答曲線から値を取り、次いで含有Ｂ１２ビタマーの濃度を測定した。２５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を、Ｃ．グルタミクムのサイトゾルのための一般的な細胞内タンパク質の濃度値として取った。この値および可溶化物のタンパク質濃度から、細胞溶解後の試料希釈の値を決定した。一般に、Ｂ１２測定の誤差値は、様々な実験からおおよそ１０％であることが分っている。
【０２６９】
シアノコバラミンはヒドロキソコバラミンに変化するので、細胞内部のＢ１２ビタマーの値は、細胞内のヒドロキソコバラミン濃度を示している。
【０２７０】
ビタミンＢ１２を１ｍｇ／ｌの濃度で培地に加えると、Ｍ２５４３株は細胞内で３μＭから１９８μＭへのヒドロキソコバラミンの高い増加を示すことが分った。
【０２７１】
Ｍ２５４３株からｂｔｕＲ２が欠失されたものであるＯＭ５６６株は、ビタミンＢ１２を添加してないＢＨＩ培地ではヒドロキソコバラミンの濃度を４０倍増加させることが分った。Ｂ１２を添加すると、ＯＭ５６６におけるヒドロキソコバラミンの濃度は、１８３μＭまでさらに増加した（図１も参照）。ｂｔｕＲ２の欠失がＣ．グルタミクム株のＢ１２取り込み系を機能的に誘導することを結果は示している。
【０２７２】
以下の刊行物は、本発明の文脈において考慮される：
2010530223.tif 000019
【０２７３】
2010530223.tif 000020
【図１】
2010530223.tif 000021
【配列表】
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【国際調査報告】
2010530223.tif 000022
2010530223.tif 000023
2010530223.tif 000024