(57)【要約】  テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。該ＴＥＲＴ融合タンパク質は、易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ）の実質的部分に融合したＴＥＲＴまたはその機能的変異体を含む。本発明のＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質において有用なＴＥＲＴ変異体は、テロメラーゼ触媒活性を排除するように機能する変異を含む。本発明のポリヌクレオチドは哺乳動物において免疫応答を惹起することが可能であり、好ましい実施形態においては、該免疫応答は、野生型ＴＥＲＴにより惹起される免疫応答より強力である。ＴＥＲＴの発現は、一般に、ヒトの癌の発生に関連している。本発明は、異常なＴＥＲＴ発現が癌またはその発生に関連している場合の、ＴＥＲＴ腫瘍関連抗原により発現されるタンパク質産物に対する免疫を惹起または増強するための組成物および方法を提供する。本発明は特に、ＴＥＲＴ融合タンパク質およびＴＥＲＴ変異体をコードするポリヌクレオチドを担持するアデノウイルスベクターおよびプラスミド構築物を提供し、癌の予防および治療のためのワクチンおよび医薬組成物におけるそれらの用途を開示する。
2010505433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、該ｈＴＥＲＴ融合タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンタンパク質のＢサブユニット（ＬＴＢ）の実質的部分に融合したｈＴＥＲＴタンパク質またはその変異体を含み、該融合タンパク質は哺乳動物において免疫応答を生成しうる、核酸分子。
【請求項２】
該ヌクレオチド配列が変異体ｈＴＥＲＴタンパク質をコードし、該変異体が配列番号１２に記載の野生型ｈＴＥＲＴアミノ酸配列と比較して１以上の変異を含み、該変異が、コードされるｈＴＥＲＴタンパク質のテロメラーゼ触媒活性を排除または低減するように機能する、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
該変異がＤ７１２ＡおよびＶ７１３Ｉよりなる、請求項２記載の核酸分子。
【請求項４】
ｈＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列が、ヒト細胞における高レベル発現のためにコドン最適化されている、請求項３記載の核酸分子。
【請求項５】
コードされるＬＴＢタンパク質が、そのシグナル配列が除去されるようトランケート化されている、請求項３記載の核酸分子。
【請求項６】
ＬＴＢをコードするヌクレオチド配列が、ヒト細胞における高レベル発現のためにコドン最適化されている、請求項５記載の核酸分子。
【請求項７】
ＬＴＢをコードするヌクレオチド配列およびｈＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列が、ヒト細胞における高レベル発現のためにコドン最適化されている、請求項６記載の核酸分子。
【請求項８】
該ヌクレオチド配列が配列番号５に記載の配列である、請求項７記載の核酸分子。
【請求項９】
該ヌクレオチド配列が配列番号６に記載のｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードする、請求項３記載の核酸分子。
【請求項１０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンタンパク質のＢサブユニット（ＬＴＢ）に融合したヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）タンパク質またはその変異体を含んでなる精製された融合タンパク質。
【請求項１１】
該ｈＴＥＲＴタンパク質のＣ末端が該ＬＴＢタンパク質のＮ末端に融合している、請求項１０記載の精製された融合タンパク質。
【請求項１２】
該ｈＴＥＲＴタンパク質がテロメラーゼ触媒活性を排除するように機能する変異を含む、請求項１１記載の精製された融合タンパク質。
【請求項１３】
該タンパク質が配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１２記載の精製された融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項１５】
請求項９記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項１６】
該ベクターがプラスミドベクターまたはアデノウイルスベクターである、請求項１５記載のベクター。
【請求項１７】
該ベクターがプラスミドｐＶ１Ｊである、請求項１６記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１５記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１９】
ヌクレオチド配列が更に、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）シグナル配列をコードするリーダー配列を含む、請求項７記載の核酸分子。
【請求項２０】
該ヌクレオチド配列が配列番号１記載の配列を含む、請求項１９記載の核酸分子。
【請求項２１】
請求項２０記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項２２】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、該ヌクレオチド配列は、テロメラーゼ触媒活性を排除するように機能する変異を含む、アデノウイルスワクチンベクター。
【請求項２３】
該ヌクレオチド配列が配列番号１０に記載のｈＴＥＲＴタンパク質をコードする、請求項２２記載のアデノウイルスワクチンベクター。
【請求項２４】
該ベクターがＡｄ５ベクターまたはＡｄ６ベクターである、請求項２３記載のベクター。
【請求項２５】
（ａ）請求項１記載の核酸分子を含むベクターを適当な宿主細胞内に導入すること、
（ｂ）該ｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質の発現を可能にする条件下、該宿主細胞を培養すること
を含んでなる、組換え宿主細胞においてｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質を発現させるための方法。
【請求項２６】
癌の予防または治療を要する患者に、請求項２記載の核酸分子を含むワクチンベクターを投与することを含んでなる、癌の予防または治療方法。
【請求項２７】
該ベクターがアデノウイルスベクターまたはプラスミドベクターである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該ベクターが、アデノウイルスＥ１領域における欠失とアデノウイルスＥ１領域におけるインサートとを伴うアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであり、該インサートは、
（ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンサブユニットＢ（ＬＴＢ）の実質的部分に融合したｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質（ここで、該ｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質はｈＴＥＲＴタンパク質変異体を含み、該ｈＴＥＲＴタンパク質変異体は、テロメラーゼ触媒活性を排除する変異を含み、該融合タンパク質は哺乳動物において免疫応答を生成しうる）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および
（ｂ）該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター
を含む発現カセットを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
該ベクターが、
（ａ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンサブユニットＢ（ＬＴＢ）の実質的部分に融合したｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質（ここで、該ｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質はｈＴＥＲＴタンパク質変異体を含み、該ｈＴＥＲＴタンパク質変異体は、テロメラーゼ触媒活性を排除する変異を含み、該融合タンパク質は哺乳動物において免疫応答を生成しうる）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および
（ｂ）該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター
を含む発現可能なカセットとプラスミド部分とを含むプラスミドワクチンベクターである、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
Ｅ１領域における欠失とＥ１領域におけるインサートとを伴うアデノウイルスゲノムを含んでなり、該インサートは、
（ａ）配列番号１０に記載のヒトテロメラーゼ逆転写酵素変異体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および
（ｂ）該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター
を含む発現カセットを含む、アデノウイルスワクチンベクター。
【請求項３１】
Ａｄ５またはＡｄ６ベクターである、請求項３０記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３２】
（ａ）（ｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンサブユニットＢ（ＬＴＢ）の実質的部分に融合したｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質（ここで、該ｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質はｈＴＥＲＴタンパク質変異体を含み、該ｈＴＥＲＴタンパク質変異体は、テロメラーゼ触媒活性を排除する変異を含み、該融合タンパク質は哺乳動物において免疫応答を生成しうる）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターとを含む第１ベクターを該患者内に１回以上導入すること、
（ｂ）予め決められた長さの時間を経過させること、および
（ｃ）（ｉ）配列番号１０に記載のヒトテロメラーゼ逆転写酵素変異体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターとを含む第２ベクターを該患者内に導入することを含んでなり、
第１ベクターと第２ベクターとが同一ではない、
ＴＥＲＴ関連癌に罹患した又はその素因を有する患者の治療方法。
【請求項３３】
第１ベクターがプラスミドであり、第２ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
該アデノウイルスベクターを導入する前に、該プラスミドベクターを該患者内に２回以上導入する、請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に、癌の治療に関する。より詳しくは、本発明は、腫瘍関連ポリペプチドであるテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の少なくとも一部を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターおよび宿主、精製された融合タンパク質、ならびに本明細書中に開示されている組成物および分子を使用してＴＥＲＴ遺伝子のタンパク質産物に対する免疫応答を惹起または増強するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン接種は多数の感染症の予防のための標準的な方法になっている。分子工学における進歩および腫瘍免疫学のより深い理解のおかげで、癌のような他の疾患に対するワクチンの適用が今や、魅力的な実現可能なものとなっている。
【０００３】
癌は全世界における主要死亡原因の１つである。癌関連研究の豊富さにもかかわらず、手術、放射線および化学療法を組合せる通常の療法は定着癌を有効に治療できないことが多い。信頼しうる予防方法も依然として利用不可能である。
【０００４】
癌は、細胞周期または細胞増殖の調節に寄与する遺伝子、例えば、増殖因子およびそれらの受容体、癌遺伝子ならびに腫瘍抑制遺伝子の機能不全を典型的に含む。これらの遺伝子の多くの産物は、多種多様な腫瘍細胞の表面上で発現され、したがって、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と称される。ＴＡＡをコードする遺伝子の、対象内への直接的な導入は、多数の実験モデルにおいてＴＡＡに対する防御免疫応答を生成し、これらの分子をワクチン療法の標的にすることが示されている。しかし、これらの遺伝子産物の多くは、より低いレベルではあるものの正常細胞においても発現されるため、ＴＡＡを標的とする多数の免疫療法は、自己寛容のため、無効であることが判明している。
【０００５】
いくつかの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする遺伝子が単離され、特徴づけられ、プラスミドＤＮＡおよびウイルスベクターのような遺伝的ベクター内に挿入されている。癌の病因に関連づけられている１つの腫瘍関連抗原はテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）である。
【０００６】
テロメラーゼは、通常は染色体の末端におけるテロメアの長さを維持するよう機能するＤＮＡポリメラーゼである。正常な細胞増殖中、ＲＮＡプライマーがＤＮＡの５’末端に結合し、複製を開始させる。ＲＮＡプライマーの除去に際して、生じた娘ＤＮＡ鎖内に、長さにおける間隙が導入される。したがって、通常のポリメラーゼでのＤＮＡの直鎖の複製は複製の各進行ラウンドにおいてテロメア長の短縮化を招く。テロメア長のそのような短縮化は正常ヒト体細胞の老化または細胞老化を引き起こす。
【０００７】
テロメラーゼは、ＲＮＡ成分と触媒タンパク質成分（テロメラーゼ逆転写酵素）とを含むリボ核タンパク質である。ヒトテロメラーゼの触媒成分はＭｅｙｅｒｓｏｎら（Ｃｅｌｌ  １１９７：７８５−９５（１９９０）およびＮａｋａｍｕｒａら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：９５５−５９（１９９７））により記載された。ＴＥＲＴ酵素はそのＲＮＡ成分をテロメラーゼＤＮＡ合成のための鋳型として使用して、細胞増殖の連続世代にわたってテロメアがその長さを維持するのを可能にする。多数の増殖サイクルにわたるテロメア長のそのような維持は、細胞が正常な老化から逃れ不死化するのを可能にして、非常に長時間にわたって腫瘍が成長し転移するのを可能にする。テロメラーゼは細胞に複製不死をもたらすため、テロメラーゼ活性は癌細胞系および広範囲の腫瘍型において検出されている（Ｋｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１−１５（１９９４））。逆に、正常ヒト組織および正常体細胞培養においては、テロメラーゼは不活性である、または低レベルで一過性に発現されるに過ぎない。ほとんどの癌型におけるテロメラーゼの過剰発現と、正常細胞における低発現または無発現との組合せは、ＴＥＲＴを、異常な細胞増殖に関連する疾患（例えば、癌）の治療および／または予防のための標的にする。
【０００８】
テロメラーゼの触媒およびＲＮＡ成分が既にクローニングされ特徴づけられているため（例えば、米国特許第６，１６６，１７８号を参照されたい）、テロメラーゼ特異的ワクチンの開発が今や可能である。しかし、多数のワクチンの開発および商業化は、成功裏に形質転換された宿主生物における所望の免疫原の高い発現レベルの達成に関連した問題により妨げられている。また、ＤＮＡに基づく有効なワクチンの開発は、臨床場面で腫瘍退縮を招くのに十分な大きさの免疫応答を治療個体において生成し得ないことにより妨げられている。したがって、前記のテロメラーゼタンパク質をコードする野生型ヌクレオチド配列の同定にもかかわらず、野生型完全長ＴＥＲＴ  ｃＤＮＡに比べて増強したＴＥＲＴ特異的免疫応答を惹起しうるワクチンを開発することが非常に望ましいであろう。また、ＴＥＲＴ特異的免疫応答を安全かつ有効に増強する核酸分子またはタンパク質を使用するＴＥＲＴ関連癌の治療または予防方法を開発することも望ましいであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，１６６，１７８号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｅｙｅｒｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  １１９７：７８５−９５（１９９０）
【非特許文献２】Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：９５５−５９（１９９７）
【非特許文献３】Ｋｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１−１５（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の概括
前記のとおり、腫瘍関連抗原テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）遺伝子の発現は、一般に、結腸直腸癌を含む腺癌の発生または存在に関連している。この目的において、本発明は、ヒトＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）遺伝子により発現されるタンパク質産物に対する免疫を惹起または増強するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンの実質的部分に融合したｈＴＥＲＴタンパク質またはその変異体を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、該ポリヌクレオチドを含む組換えベクター（アデノウイルスおよびプラスミドベクターを含むが、これらに限定されるものではない）、および該組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。また、本発明においては、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる精製された融合タンパク質を提供する。ｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質および該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはテロメラーゼ関連癌の予防および／または治療のためのワクチンとして有用である。該ワクチンは、単独療法として、または第２ワクチン（例えば、ポリヌクレオチド、細胞に基づく、タンパク質、またはペプチドに基づくワクチン）の投与を含む又は放射線療法もしくは化学療法を含む治療計画の一部として有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の好ましい実施形態においては、ｈＴＥＲＴをコードするヌクレオチドの配列および／またはＬＴＢをコードするヌクレオチドの配列は、ヒト宿主細胞における高レベルの発現のために最適化されたコドンを含む。すなわち、本発明の或る実施形態においては、該ポリヌクレオチド配列のコドン使用頻度パターンは、高発現される哺乳類および／またはヒト遺伝子のものに類似している。
【００１３】
本発明のもう１つの態様は、ｈＴＥＲＴ−ＬＴＢをコードするヌクレオチドを含む発現構築物である。本発明のこの部分の好ましい実施形態においては、該構築物は、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質が分泌されることが保証されるようＴＥＲＴ遺伝子のコード配列の前にＴＰＡリーダー配列を含む。
【００１４】
本発明の追加的な好ましい実施形態において、ワクチン目的の場合にコード化ＴＥＲＴ融合タンパク質が野生型ＴＥＲＴより安全となるよう、テロメラーゼ抗原のテロメラーゼ触媒活性が不活性化される。ＴＥＲＴ融合タンパク質の酵素活性は、ＴＥＲＴコード化ヌクレオチド配列への変異の付加／欠失により不活性化されうる。本発明の具体的な典型的な実施形態においては、ヒトＴＥＲＴタンパク質配列内の特異的アミノ酸Ｄ７１２ＡおよびＶ７１３ＩならびにマウスＴＥＲＴタンパク質配列内のＤ７０２ＡおよびＶ７０３Ｉを変化させるためにヌクレオチドが変異している。
【００１５】
本発明は更に、ｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むアデノウイルスおよびプラスミドベクターを提供する。本発明はまた、ｈＴＥＲＴ関連癌の予防および／または治療のための免疫原性組成物およびワクチンにおけるアデノウイルスおよびプラスミドベクターの使用を記載する。
【００１６】
また、ヒトＴＥＲＴタンパク質またはＴＥＲＴタンパク質変異体をコードするヌクレオチドの配列を含むアデノウイルスベクターを提供する。本発明のこの態様において有用な変異体は、テロメラーゼ触媒活性を排除するように機能する変異を含む。本発明の好ましい実施形態においては、該アデノウイルスベクターはＡｄ６ベクターである。他の好ましい実施形態においては、ＡｄベクターはＡｄ５ベクターである。
【００１７】
本発明は更に、本発明により提供されるＴＥＲＴ融合体またはＴＥＲＴ融合タンパク質を含むワクチンまたは医薬組成物を投与することによりＴＥＲＴタンパク質に対する免疫応答を惹起することによる、患者における癌の発生の予防方法、またはテロメラーゼ関連腫瘍を有する患者の治療方法を提供する。この場合の方法の好ましい実施形態においては、該免疫応答は、野生型ＴＥＲＴにより惹起される応答に比べて増強される。
【００１８】
本明細書の全体および添付の特許請求の範囲において用いる単数形は、文脈と明らかに矛盾しない限り、複数形に対する言及を含む。
【００１９】
本明細書の全体および添付の特許請求の範囲においては、以下の定義および略語が適用される。
【００２０】
「プロモーター」なる語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ鎖上の認識部位を意味する。該プロモーターは、転写活性を始動および駆動するためにＲＮＡポリメラーゼとの開始複合体を形成する。該複合体は、「エンハンサー」と称される配列を活性化することにより又は「サイレンサー」と称される配列を抑制することにより修飾されうる。
【００２１】
「カセット」なる語は、ベクターから発現されるべきヌクレオチドまたは遺伝子配列、例えば、ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢ融合体をコードするヌクレオチドまたは遺伝子配列を意味する。一般に、カセットは、ベクター内に挿入されうる遺伝子配列を含み、これは、いくつかの実施形態において、ヌクレオチドまたは遺伝子配列を発現させるための調節配列を提供する。他の実施形態において、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列はその発現のための調節配列を提供する。他の実施形態において、該ベクターは幾つかの調節配列を提供し、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列は他の調節配列を提供する。例えば、該ベクターは、ヌクレオチドまたは遺伝子配列を転写するためのプロモーターを提供することが可能であり、該ヌクレオチドまたは遺伝子配列は転写終結配列を提供する。該ベクターにより提供されうる調節配列には、エンハンサー、転写終結配列、スプライス受容体および供与配列、イントロン、リボソーム結合配列、ならびにポリ（Ａ）付加配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
「ベクター」なる語は、宿主生物または宿主組織内にＤＮＡ断片を導入しうる何らかの手段を意味する。プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む）、バクテリオファージおよびコスミドを含む種々のタイプのベクターが存在する。
【００２３】
アデノウイルスベクターに関して用いる「第１世代」なる語は、複製欠損型であるアデノウイルスベクターを示すものである。第１世代アデノウイルスベクターは、典型的には、欠失した又は不活性化されたＥ１遺伝子領域を有し、好ましくは、欠失した又は不活性化されたＥ３遺伝子領域を有する。
【００２４】
「ｐＶ  １ＪｎｓＡ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ」なる語は、イントロンＡを伴うＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーター、コドン最適化ＬＴＢ遺伝子に融合した完全長コドン最適化マウスＴＥＲＴ遺伝子、およびウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化および転写終結配列を含む、本明細書中に開示されているプラスミド構築物を意味する（実施例２を参照されたい）。また、ｍＴＥＲＴ−ＬＴＢをコードするヌクレオチド配列の５’側に、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）シグナル配列をコードするリーダー配列が存在する。「ＡＩ」なる語は、テロメラーゼ触媒活性を機能的に排除するためにＴＥＲＴ配列に変異が付加されたことを示す。「ｐＶ１  ＪｎｓＡ／ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）ｏｐｔ」なる語は、ＬＴＢにもＴＰＡにも融合しなかったマウス最適化ＴＥＲＴヌクレオチド配列を該構築物が含むこと以外は前記と実質的に同じ構築物を意味する。
【００２５】
「ｐＶ１ＪｎｓＡ／ＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ」なる語は、イントロンＡを伴うＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーター、コドン最適化ＬＴＢ遺伝子に融合した完全長コドン最適化ヒトＴＥＲＴ遺伝子、およびウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化および転写終結配列を含む、本明細書中に開示されているプラスミド構築物を意味する（実施例２を参照されたい）。また、ｈＴＥＲＴ−ＬＴＢをコードするヌクレオチド配列の５’側に、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）シグナル配列をコードするリーダー配列が存在する。この構築物におけるｈＴＥＲＴ配列は、テロメラーゼ触媒活性を機能的に排除するための変異を含む。
【００２６】
「Ａｄ６／ＴＰＡｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ」および「Αｄ６／ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）」なる語は、Ｅ１およびＥ３領域が欠失したＡｄ６アデノウイルスゲノムを含む本明細書中に開示されている２つの構築物を意味する。「Αｄ６／ＴＰＡｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ」構築物において、イントロンＡを伴わないヒトＣＭＶプロモーターおよびそれに続くウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの制御下、Ｅ１領域はＥ１に平行な配向でコドン最適化マウスＴＥＲＴ−ＬＴＢ遺伝子により置換されている。ＴＥＲＴコード化配列は、テロメラーゼ触媒活性を排除するための変異を含む。該構築物は更に、ＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢコード化ヌクレオチド配列の５’側にヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）シグナル配列をコードする配列を含む。「Ａｄ６／ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）」構築物は、Ａｄ６ゲノムのＥ１領域がＴＥＲＴ  ｃＤＮＡ配列（該配列は、酵素活性を阻止する変異を含む）で置換されていること以外は前記と実質的に同じである。
【００２７】
「ＬＴＢ」なる略語は一般に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の易熱性エンテロトキシンのＢサブユニットまたはその実質的部分（Ｃ末端またはＮ末端でトランケート化されているがアジュバント活性を維持しているサブユニット、および内部アミノ酸の挿入、欠失または置換を含有するがアジュバント活性を維持しているサブユニットを含む）を意味する（Ｆｉｎｇｅｒｕｔら，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：４６８５−４６９６（２００５））。
【００２８】
本明細書中で用いる「融合タンパク質」なる語は、一方のポリペプチドが一方のタンパク質配列またはドメインに由来し、もう一方のポリペプチドがもう一方のタンパク質配列またはドメインに由来する、共有結合した少なくとも２つの異種ポリペプチドタンパク質を意味する。本発明の融合タンパク質はＴＥＲＴポリペプチドまたはその断片もしくは変異体と、ＬＴＢの実質的部分を含む第２ポリペプチドとを含む。ＴＥＲＴポリペプチド、その断片または変異体はヒトＴＥＲＴ、または別の種、例えばマウスに由来するＴＥＲＴホモログでありうる。該融合タンパク質を構成するポリペプチドは、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端に連結されている。ＴＥＲＴポリペプチドおよびＬＴＢポリペプチドは任意の順序で融合されうる。本発明の幾つかの実施形態においては、図１および２に例示されているとおり、ＴＥＲＴポリペプチドのＣ末端はＬＴＢのＮ末端に融合される。しかし、ＬＴＢサブユニットがＴＥＲＴポリペプチドのＮ末端に融合している融合タンパク質も想定される。
【００２９】
「ＴＥＲＴ融合タンパク質」または「ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質」なる語は、ＬＴＢポリペプチドに融合したＴＥＲＴポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を含む前記の融合体を意味する一般用語として本明細書中で互換的に用いられる。「ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体」なる語は、ＴＥＲＴ遺伝子の少なくとも一部が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンのＬＴＢサブユニットの実質的部分に融合している核酸配列を意味する。「ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質」なる語は、記載されているとおりのＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体によりコードされるポリペプチドを意味する。「ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体」および「ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質」なる語は、その断片、そのホモログおよびその機能的等価体（「変異体」と総称される）、例えば、１以上のアミノ酸が挿入され又は欠失しており又は他のアミノ酸により置換されているものをも意味すると理解される。本発明のＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体は、ヒトのような哺乳動物に投与されると、少なくとも「野生型」ｈＴＥＲＴ配列の場合と同程度に、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞による免疫応答を刺激しうる。本発明の好ましい実施形態においては、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体は、野生型ｈＴＥＲＴと比較して免疫応答を増強しうる。
【００３０】
「治療」なる語は治療的治療および予防的手段の両方を意味する。治療を要する者には、障害を既に有する者、および障害を有する傾向にある者、または障害が予防されるべきである者が含まれる。本明細書中で用いる「治療」は、障害を得る可能性の減少、および既に罹患している者における障害の重症度の低下をも含む。
【００３１】
「障害」は、本明細書に記載されている核酸分子および該核酸分子によりコードされる融合タンパク質を包含する本発明の分子での治療から利益を得るいずれかの状態である。「障害」なる語には、慢性および急性の障害または疾患、例えば、該哺乳動物を問題の障害に罹りやすくする病的状態が含まれる。本発明の分子は、異常な細胞増殖により特徴づけられる障害または状態（乳癌、結腸直腸癌および肺癌を含むが、これらに限定されるものではない）に対する治療手段として使用されることが意図される。
【００３２】
「有効量」なる語は、免疫応答が生じるよう該ポリペプチドの適度なレベルを得るのに十分なワクチン組成物が導入されることを意味する。このレベルは様々なものになりうる、と当業者は認識している。
【００３３】
「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が、化学的に類似した別のアミノ酸残基により置換されることを意味する。そのような保存的置換の具体例としては、１つの疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）の、別のそのような疎水性残基による置換；１つの極性残基の、同じ電荷の別の極性残基による置換（例えば、アルギニンからリシン；グルタミン酸からアスパラギン酸）が挙げられる。
【００３４】
「ｈＴＥＲＴ」は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素抗原をコードするヒトテロメラーゼ逆転写酵素抗原またはヌクレオチドを意味する。「ｈＴＥＲＴｏｐｔ」は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素抗原をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を意味する。
【００３５】
「実質的に類似」は、与えられた核酸またはアミノ酸配列が、参照配列に対して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％の同一性を有することを意味する。本発明においては、参照配列は、それぞれ配列番号１１および１２に記載の野生型ヒトＴＥＲＴヌクレオチドまたはアミノ酸配列の関連部分、あるいは本明細書の文脈により定められる配列番号１３（ｏｐｔ配列）および１４に記載のＬＴＢのヌクレオチド又はアミノ酸配列の関連部分でありうる。参照配列はまた、例えば、野生型アカゲザルまたはマウスＴＥＲＴ配列でありうる。したがって、野生型ヒトＴＥＲＴタンパク質またはその断片に「実質的に類似」しているＴＥＲＴタンパク質配列は、野生型ヒトＴＥＲＴの関連断片に対して該断片の長さに沿って少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％の同一性を有する。与えられたｍＴＥＲＴ、ｈＴＥＲＴまたはＬＴＢアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が参照配列に「実質的に類似」しているかどうかは、例えば、配列解析ソフトウェア、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム，バージョン６．０を使用して、配列情報を比較することにより決定されうる。ＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）により改訂されたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のアライメント法を用いる。
【００３６】
遺伝子、その変異体、断片またはサブユニットの「実質的部分」は、参照配列に対して少なくとも５０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％の部分を意味する。
【００３７】
「遺伝子」は、ポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を意味する。遺伝子はヌクレオチドの非分断配列であることが可能であり、あるいはそれはイントロンのような介在セグメント、プロモーター領域、スプライシング部位および反復配列を含むことが可能である。遺伝子はＲＮＡまたはＤＮＡでありうる。好ましい遺伝子は、本発明のペプチドをコードするものである。
【００３８】
「核酸」または「核酸分子」なる語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プローブ、オリゴヌクレオチド、その断片または一部、およびプライマーを意図したものである。
【００３９】
「野生型ＴＥＲＴ」または「野生型タンパク質」または「ｗｔタンパク質」は、アミノ酸またはその変異体の天然に存在する配列を含むタンパク質を意味する。野生型ヒトＴＥＲＴのアミノ酸配列を配列番号１２に記載する。野生型ヒトＴＥＲＴのアミノ酸配列は既に記載されている（米国特許第６，１６６，１７８号、米国特許第６，２６１，８３６号、米国特許第６，９２７，２８５号、米国特許出願２００３−００９６３４４、Ｍｅｙｅｒｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  ９０：７８５−９５（１９９７）；Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：９５５−５９（１９９７））。
【００４０】
「野生型ＴＥＲＴ遺伝子」は、ヒト由来のタンパク質またはラット、マウスおよびアカゲザルのような他の哺乳動物（これらに限定されるものではない）を含む別の生物から得られたタンパク質を含む、天然に存在するＴＥＲＴタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む遺伝子を意味する。ヒトＴＥＲＴ遺伝子のヌクレオチド配列は当技術分野において入手可能である（前記）。
【００４１】
「ＴＥＲＴ（ＡＩ）」なる語は、テロメラーゼ触媒活性を排除または軽減する変異を含むテロメラーゼ逆転写酵素配列を意味する。
【００４２】
「哺乳動物（哺乳類）」なる語は、ヒトを含むいずれかの哺乳動物を意味する。
【００４３】
「Ａｇ」なる略語は抗原を意味する。
【００４４】
「ＯＲＦ」なる略語は、遺伝子のオープンリーディングフレームを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】図１は、典型的なＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ融合体のヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｂ】図１は、典型的なＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ融合体のヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｃ】図１は、典型的なＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ融合体のヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｄ】図１は、典型的なＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ融合体のヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２Ａ】図２は、典型的なＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ融合体のヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図２Ｂ】図２は、典型的なＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ融合体のヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図２Ｃ】図２は、典型的なＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ融合体のヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図２Ｄ】図２は、典型的なＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ融合体のヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図３】図３は、プラスミドｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔの反復注射でワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスでのＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔアッセイの結果を示す。ペプチドプールを使用してｍＴＥＲＴまたはＬＴＢに対する免疫応答をモニターするために、各群５匹のマウスを使用した。プロットされているデータは６匹のマウスからのものである（白抜きの丸印）。幾何平均値が示されている（黒塗の丸印）。対照処理マウスにおいては、ｍＴＥＲＴに対するＴ細胞応答は検出されなかった（非表示）。実施例７を参照されたい。
【図４】図４は、ワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾細胞上のＩＦＮγ細胞内染色からの結果を示す。該タンパク質全体に及ぶ重複ペプチドのプールを使用して、マウスＴＥＲＴに対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を測定した。ＬＴＢに対する免疫応答もモニターした。プロットされているデータは６匹のマウスからのものである（黒塗の三角）。幾何平均値が示されている（水平線）。対照処理マウスにおいては、ＴＥＲＴに対するＴ細胞応答は検出されなかった（非表示）。実施例７を参照されたい。
【図５】図５は、ＣＤ８＋Ｔ細胞特異的ペプチドｍＴＥＲＴａａ１６７（ＡＹＱＶＣＧＳＰＬ；配列番号２０）でパルスされた４Ｔ１標的細胞のエフェクターＴ細胞による５１Ｃｒ放出ＣＴＬ殺傷の結果を示す。エフェクター細胞を２匹の免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞から調製し、該特異的ペプチドでインビトロで再刺激した。結果は、種々のエフェクター／標的比における比殺傷の割合（％）として表されている。実施例８を参照されたい。
【図６】図６はマウスＴＥＲＴに対する免疫応答の誘導を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスをプラスミドｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔの５回の毎週の注射で免疫化した。マウスＴＥＲＴペプチドプールを使用するＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより、マウス脾細胞上で免疫応答を評価した。抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が、６匹の免疫化マウスから得た幾何平均値として示されており、標準偏差も示されている。実施例７を参照されたい。
【図７】図７は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｍＴＥＲＴ特異的免疫応答の誘導を示す。構築物ｐＶ１Ｊ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）ｏｐｔまたはｐＶ１Ｊ−ＴＰＡｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔの５回の毎週の注射でマウスを免疫化した。ペプチド配列ｍＴＥＲＴａａ１６７（ＡＹＱＶＣＧＳＰＬ；配列番号２０）に対応するＣＤ８＋エピトープを使用するＰＢＭＣ上のＩＦＮγ細胞内染色により、免疫応答を判定した。プロットされているデータは８匹のマウスからのものである（黒塗の三角）。幾何平均値が示されている（水平線）。
【図８】図８は、ＴＥＲＴ特異的免疫応答が、ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔを発現するアデノウイルスベクターの注射に際して増強されることを示す。１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群をｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ（５０μｇ／注射）の５回の毎週の注射に付した。プラスミドＤＮＡの最終注射の２週間後、マウスをプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡ−ＥＰ）の１回の追加的な注射または１０１０ｖｐのＡｄ６／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ（Ａｄ）で増強した。ＴＥＲＴに対する免疫応答をＰＢＭＣ上のＩＦＮγＩＣＳによりモニターした。プロットされているデータは１０匹のマウスからのものである（黒塗の菱形）。各群の幾何平均値も示されている（水平線）。実施例１０を参照されたい。
【図９】図９は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＤＭＨ誘発発癌およびワクチン接種を分析するために用いたプロトコールを示す。ＤＭＨを毎週、腹腔内投与した。示されている時点でｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔでのワクチン接種を行った。第１２週に腸病変の分析を行った。実施例１１を参照されたい。
【図１０】図１０は、ＤＭＨ誘発発癌に対するｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔの抗腫瘍効果を示す。図９に示されているとおりに、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＤＭＨおよびＤＮＡ−ＥＰで処理した。該処理の開始から第１２週の時点で、結腸におけるＡＣＦおよび腺腫形成の分析を行った。ワクチン接種されたマウスにおけるＡＣＦおよび腺腫の数を、未ワクチン接種対照において検出されたものと比較した。実施例１１を参照されたい。
【図１１】図１１は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＤＭＨ誘発発癌およびワクチン接種を分析するために用いたプロトコールを示す。ＤＭＨを毎週、腹腔内投与した。示されている時点でｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ−ＬＴＢ  ＤＮＡおよびＡｄでのワクチン接種を行った。第３０週に腸病変の分析を行った。実施例１１を参照されたい。
【図１２】図１２は、腫瘍病変に対するｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ  ＤＮＡ初回接種／Ａｄ追加接種の抗腫瘍効果を示す。図９に示されているとおりに、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＤＭＨおよびＤＮＡ−ＥＰで処理した。該処理の開始から第３０週の時点で、結腸におけるＡＣＦおよび腺腫形成の分析を行った。ワクチン接種されたマウスにおけるＡＣＦおよび腺腫の数を、未ワクチン接種対照において検出されたものと比較した。実施例１１を参照されたい。
【図１３】図１３は、腫瘍病変の体積および分化段階に対するｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ−ＬＴＢ（ＡＩ）ｏｐｔ  ＤＮＡ初回接種／Ａｄ追加接種の抗腫瘍効果を示す。示されているとおりに、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＤＭＨおよびＤＮＡ−ＥＰで処理した。ワクチン接種および対照マウスに存在する結腸腺腫の体積（パネルＡ）および組織学的分化段階（パネルＢ）を該処理の開始から第３０週の時点で分析した。腫瘍を以下のとおりに分類した：Ｇ１：よく分化している腺癌；Ｇ２：中等度に分化している腺癌；Ｇ３：十分には分化していない腺癌。実施例１１を参照されたい。
【図１４】図１４は、ヒトＴＥＲＴに対する免疫応答の誘導を示す。ＨＨＤトランスジェニックマウスを、プラスミドｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔの２回の隔週の注射（ＤＮＡ−ＤＮＡ）、またはプラスミドｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔの１回の注射およびそれに続く２週間後のＡｄ６ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）１０１０ｐｐ（ＤＮＡ／Ａｄ）の１回の注射で免疫化した。ＩＦＮγＡＣＳアッセイによりマウスＰＢＭＣ上で免疫応答を評価した。マウスＰＢＭＣをＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子ｈＴＥＲＴ８６５に関するＣＤ８免疫優性ペプチド（配列番号２２）と共に温置した。プロットされているデータは１０匹のマウスからのものである（黒塗の三角）。幾何平均値が示されている（水平線）。実施例１２および１３を参照されたい。
【図１５】図１５は、Ｃｒ５１標識標的ＨｅＬａ−ＨＨＤ細胞上のＣＴＬアッセイの結果を示す。１匹の免疫化マウスから得たＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ｈＴＥＲＴ８６５ペプチドまたはｗ／ｏペプチド（ペプチドの希釈のために使用したＤＭＳＯの存在下）で外的にローディングされたＨｅＬａ−ＨＨＤ細胞に対するＣＴＬアッセイにおいて試験した。また、ＨｅＬａ−ＨＨＤ細胞を、ｈＴＥＲＴをコードするＡｄベクター、または対照としてのＧＦＰをコードするＡｄに感染させた。実施例１４を参照されたい。
【図１６Ａ】図１６は、ＤＮＡ−ＥＰにより免疫化されたアカゲザルにおけるｈＴＥＲＴに対する細胞性免疫応答の誘導を示す。ｈＴＥＲＴで免疫化されたアカゲザル（ｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ；ＤＮＡ−ＥＰ／ＤＮＡ−ＥＰ）からのＰＢＭＣ上でＥＬＩｓｐｏｔ分析を行った。該アッセイは二重に重複して行い、該重複からの平均値が示されている。２回目のＤＮＡ−ＥＰの後に行った分析が示されている（パネルＡ）。５回目のＤＮＡ−ＥＰの後に行った分析も示されている（パネルＢ）。実施例１５を参照されたい。
【図１６Ｂ】図１６は、ＤＮＡ−ＥＰにより免疫化されたアカゲザルにおけるｈＴＥＲＴに対する細胞性免疫応答の誘導を示す。ｈＴＥＲＴで免疫化されたアカゲザル（ｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ；ＤＮＡ−ＥＰ／ＤＮＡ−ＥＰ）からのＰＢＭＣ上でＥＬＩｓｐｏｔ分析を行った。該アッセイは二重に重複して行い、該重複からの平均値が示されている。２回目のＤＮＡ−ＥＰの後に行った分析が示されている（パネルＡ）。５回目のＤＮＡ−ＥＰの後に行った分析も示されている（パネルＢ）。実施例１５を参照されたい。
【図１７】図１７は、ＤＮＡ−ＥＰでワクチン接種されｈＴＥＲＴを発現するアデノウイルスで追加接種されたアカゲザルにおいて、ｈＴＥＲＴに対する細胞性免疫応答が、ＤＮＡ−ＥＰのみでワクチン接種されたサルにおいて惹起されたＣＭＩと比べて増幅されたことを示す。５回のＤＮＡ−ＥＰ（ｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ）注射およびそれに続く２回のＡｄ（Ａｄ６−ｈＴＥＲＴ）注射を含む免疫化計画の終了時に、ｈＴＥＲＴで免疫化されたアカゲザルからのＰＢＭＣ上でＥＬＩｓｐｏｔを行った。該アッセイは二重に重複して行い、該重複からの平均値が示されている。実施例１５を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
発明の詳細な説明
テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）として公知の、テロメラーゼの触媒成分の発現が、一般に、多種多様な腫瘍型において検出される。ほとんどの癌型におけるテロメラーゼの過剰発現と、正常細胞における低発現または無発現との組合せは、ＴＥＲＴを、異常な細胞増殖に関連する疾患（例えば、癌）の治療および／または予防のための標的にする。この目的において、本発明は、異常なＴＥＲＴ発現が癌またはその発生に関連している、ＴＥＲＴ腫瘍関連抗原により発現されるタンパク質産物に対する免疫を惹起または増強するための組成物および方法に関する。癌に対する異常なＴＥＲＴ発現の関連性は、腫瘍組織においてその発生の全ての時点においてＴＥＲＴタンパク質が発現されることを要しない。なぜなら、異常なＴＥＲＴ発現は腫瘍生成開始時に生じることがあり、その後の腫瘍の進行中には検出不可能となることがあり、その逆も生じうるからである。
【００４７】
したがって、本発明は、癌の治療および／または予防のためのワクチンおよび医薬組成物において使用する、ＴＥＲＴ配列またはその変異体を含むポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞およびコード化タンパク質を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、関連ＴＥＲＴ抗原に対する免疫応答を有効にアジュバント化しうる、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ）をコードするヌクレオチド配列に融合した、ＴＥＲＴタンパク質またはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
本発明の幾つかの実施形態においては、本明細書に開示されているヌクレオチド配列は更に、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質が分泌されることが保証されるようＴＥＲＴ遺伝子のコード配列の前にＴＰＡリーダー配列を含む。本発明のこの態様の好ましい実施形態において、ＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢ融合体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする。好ましいヌクレオチド配列は配列番号１に記載されている。他の好ましい実施形態において、ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢ融合体は、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする。好ましいヌクレオチド配列は配列番号３に記載されている。
【００４９】
本発明のＴＥＲＴヌクレオチド配列はヒト由来であることが可能であり、あるいは別の種、例えばマウス由来のＴＥＲＴホモログであることが可能である。野生型ヒトＴＥＲＴヌクレオチド配列は配列番号１２に記載されており、既に報告されている（米国特許第６，１６６，１７８号、米国特許第６，２６１，８３６号、米国特許第６，９２７，２８５号、米国特許出願２００３−００９６３４４、Ｍｅｙｅｒｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  ９０：７８５−９５（１９９７）、Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：９５５−５９（１９９７））。ＴＥＲＴ融合体のＴＥＲＴ部分は完全長であることが可能であり、あるいは哺乳動物においてＴＥＲＴ特異的Ｔ細胞免疫応答を惹起するのに十分な任意の変異体でありうる。本発明のＴＥＲＴ変異体には、ＣまたはＮ末端でトランケート化された配列、保存的置換を有する配列、および内部欠失または挿入を有する配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の好ましいＴＥＲＴ変異体は、テロメラーゼ触媒活性を機能的に排除する変異を含む。本発明のコード化ＴＥＲＴ融合タンパク質は、細胞性免疫応答を要するワクチン被投与者または患者内に導入されると、細胞性免疫応答を誘導しうる。
【００５０】
前記のとおり、本発明の好ましい実施形態において、ワクチン目的においてコード化ＴＥＲＴ融合タンパク質が野生型ＴＥＲＴより安全となるよう、テロメラーゼ抗原のテロメラーゼ触媒活性が不活性化される（本明細書中では「ＴＥＲＴ（ＡＩ）」と称される）。ＴＥＲＴ融合タンパク質の酵素活性は、ＴＥＲＴコード化ヌクレオチド配列への変異／欠失の付加により不活性化されうる。したがって、本発明は、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードし、ヌクレオチドの配列が変異体ｈＴＥＲＴをコードしており、配列番号１２に記載の野生型ｈＴＥＲＴアミノ酸配列と比較して該変異体が１以上の変異を含み、該変異は、該コード化ｈＴＥＲＴタンパク質のテロメラーゼ触媒活性を排除するよう機能する、核酸分子を含む。本発明の特定の典型的な実施形態において、ヒトＴＥＲＴタンパク質配列（配列番号１０に記載）内の特定のアミノ酸Ｄ７１２ＡおよびＶ７１３ＩならびにマウスＴＥＲＴタンパク質配列内のＤ７０２ＶおよびＶ７０３Ｉを変化させるために、ヌクレオチドが変異している。配列番号１０に記載の変異したヒトＴＥＲＴ配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号９に開示されている。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態において、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体のＴＥＲＴ部分はヒトＴＥＲＴまたはその変異体、例えばｈＴＥＲＴ（ＡＩ）である。他の好ましい実施形態においては、ＴＥＲＴ部分はマウスＴＥＲＴまたはその変異体、例えばｍＴＥＲＴ（ＡＩ）である。本発明のＴＥＲＴ変異体およびＴＥＲＴコード化ヌクレオチド配列変異体は、テロメラーゼ酵素活性を損なう変異を含む。
【００５２】
したがって、本発明は、合成ポリヌクレオチドに関し、この合成ポリヌクレオチドは、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含み、該融合タンパク質は、ＴＥＲＴタンパク質に対する免疫応答を有効に増強しうる、ＬＴＢタンパク質またはその変異体に融合したＴＥＲＴタンパク質またはＴＥＲＴタンパク質の生物学的に不活性な断片もしくは変異形態を含む。ＴＥＲＴタンパク質の該変異形態には、保存的アミノ酸置換、アミノ末端トランケート化、カルボキシ末端トランケート化、欠失または付加が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのようなＴＥＲＴ変異体、断片および／または変異形態はいずれも、配列番号１２に記載のＴＥＲＴタンパク質の免疫学的特性を少なくとも実質的に模擬するタンパク質またはタンパク質断片をコードするであろう。好ましいＴＥＲＴ変異体は触媒的に不活性であり、そのようなものとして、例えば、配列番号１０に記載のＴＥＲＴ変異体が挙げられる。
【００５３】
本発明の合成ポリヌクレオチドは、治療用または予防用癌ワクチンの開発において有用となるよう、関連ＴＥＲＴタンパク質に対する免疫応答を刺激または増強しうるＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢ融合タンパク質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。本発明のＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体のＬＴＢ部分は、共に運搬される抗原の免疫原性を強力に増強することが示されている（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５３：２１８−２６（２００１）を参照されたい）。
【００５４】
ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端トランケート化およびカルボキシ末端トランケート化を含む（これらに限定されるものではない）ＬＴＢ変異体または変異形態をコードするヌクレオチド配列も、本発明の使用において想定される。場合によっては、コード化タンパク質の毒性を低減または排除するために、ＬＴＢをコードするヌクレオチド配列に特異的点変異を付加することが有利でありうる。本発明の好ましい実施形態においては、ＴＥＲＴ配列に融合するＬＴＢ配列は、そのシグナル配列が除去されるようトランケート化されている。
【００５５】
本発明のＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体のＬＴＢタンパク質またはその変異体はＴＥＲＴ配列のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合することが可能である。さらに、ＬＴＢ配列およびＴＥＲＴ配列は、Ｎ末端−Ｎ末端、Ｃ末端−Ｃ末端、Ｃ末端−Ｎ末端またはＮ末端−Ｎ末端で融合しうる。本発明の好ましい実施形態においては、ＴＥＲＴポリペプチドのＣ末端はＬＴＢのＮ末端に融合している。
【００５６】
本発明は、新規ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質を発現するｍＲＮＡをコードするヌクレオチドの配列、例えば、配列番号６および８に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む合成核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明の特に好ましいＴＥＲＴ融合体は、配列番号５に記載のｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢ融合配列である。本発明の核酸分子は他の核酸を実質的に含有しない。
【００５７】
配列番号６に記載のｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列のような他のヌクレオチド配列もワクチン目的に有用である、と当業者は認識するであろう。本発明はまた、配列番号６に実質的に類似しているが、特に、クローニング法により作製されたＬＴＢ配列とＴＥＲＴ（ＡＩ）配列との結合部のアミノ酸の相違のために配列番号６と完全には同一ではない不活性なｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
本発明はまた、本明細書の全体に開示されている核酸分子を含有する組換えベクターおよび組換え宿主細胞（原核細胞および真核細胞の両方）に関する。本発明の合成ＤＮＡ分子、関連ベクターおよび宿主は癌ワクチンの開発に有用である。
【００５９】
本発明の典型的な核酸分子は、本発明の典型的なｈＴＥＲＴ−ＬＴＢおよびｍＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードする図１〜２に示す配列番号５および７よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む。
【００６０】
本発明はまた、典型的なＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする、配列番号５および７の生物学的に活性な断片または変異形態を含む。そのような生物学的に活性な断片および／または変異形態はいずれも、配列番号１２に記載のｈＴＥＲＴタンパク質（これに限定されるものではない）を含むｈＴＥＲＴタンパク質の免疫学的特性を少なくとも実質的に模擬するタンパク質またはタンパク質断片をコードするであろう。そのようなポリヌクレオチドには、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端トランケート化およびカルボキシ末端トランケート化が含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。本発明の好ましい変異ヌクレオチド配列は、癌ワクチン開発において有用となるよう予防的または治療的免疫応答を要する患者において予防的または治療的免疫応答を惹起しうる酵素的に不活性なＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質を真核細胞内で発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【００６１】
また、発現されるタンパク質の最終的な物理的特性を実質的に改変しない、ＤＮＡ配列内の変異も、本発明の範囲内に含まれる。例えば、バリンからロイシン、アルギニンからリシン、またはアスパラギンからグルタミンへの置換は、免疫応答の惹起能のような該ポリペプチドの所望の機能における変化を引き起こさないであろう。
【００６２】
前記のとおり、本発明は更に、本明細書の全体に開示されている核酸分子を含む組換えベクターに関する。これらのベクターはＤＮＡまたはＲＮＡから構成されうる。ほとんどのクローニング目的には、ＤＮＡベクターが好ましい。典型的なベクターには、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードしうる、プラスミド、修飾ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、およびエピソーム性または組換えＤＮＡの他の形態が含まれる。個々の遺伝子導入または他の用途のための適当なベクターを決定することは、十分に当業者の認識範囲内である。
【００６３】
本明細書の全体に開示されている核酸によりコードされる精製されたＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質、特にＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢ融合タンパク質も、本発明により提供される。本発明のこの態様の典型的な実施形態において、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質は、配列番号６および８よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。
【００６４】
ストリンジェントな条件下で配列番号５および７の相補体にハイブリド形成するＤＮＡ配列も本発明に含まれる。非限定的な一例としては、高ストリンジェンシーの条件を用いる方法は以下のとおりである。ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリド形成を、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液および１００μｇ／ｍｌ  変性サケ精子ＤＮＡを含むバッファー中、約６５℃で約２時間〜一晩行う。１００μｇ／ｍｌ  変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリド形成混合物中、フィルターを６５℃で約１２〜４８時間ハイブリド形成させる。２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳを含有する溶液中、フィルターの洗浄を３７℃で約１時間行う。この後、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、５０℃で４５分間の洗浄を行い、ついでオートラジオグラフィーを行う。高ストリンジェンシーの条件を用いる他の方法は、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、５０％  ホルムアミド中、約４２℃で約１２〜４８時間行うハイブリド形成工程、または０．２×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、６５℃で約３０〜６０分間行う洗浄工程のいずれかを含むであろう。高ストリンジェンシーのハイブリド形成を行うための前記方法において挙げた試薬は当技術分野でよく知られている。これらの試薬の組成の詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）またはＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（２００１）において見出されうる。前記のものに加えて、用いられうる高ストリンジェンシーの他の条件も当技術分野でよく知られている。
【００６５】
ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードする核酸分子を含有する発現ベクターは、組換え宿主細胞におけるＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質の高レベルの発現のために使用されうる。発現ベクターには、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスが含まれうるが、これらに限定されるものではない。また、所望により、細菌細胞内で組換えＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合配列を発現させるために、種々の細菌発現ベクターが使用されうる。また、真菌細胞内で組換えＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合配列を発現させるために、種々の真菌細胞発現ベクターが使用されうる。さらに、昆虫細胞内で組換えタンパク質を発現させるために、種々の昆虫細胞発現ベクターが使用されうる。
【００６６】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクターで形質転換または形質転換された宿主細胞に関する。組換え宿主細胞は原核性または真核性であることが可能であり、限定的なものではないが細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、真菌細胞、例えば酵母、哺乳類細胞、例えばウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類由来の細胞系（これらに限定されるものではない）、ならびに昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびカイコ由来の細胞系（これらに限定されるものではない）を包含する。そのような組換え宿主細胞を適当な条件下で培養して、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質または生物学的に同等な形態を産生させることが可能である。本発明の好ましい実施形態においては、宿主細胞はヒトである。本明細書中で定義される「宿主細胞」なる語は、トランスジェニックヒト、ヒト胎児またはヒト胚の体における宿主細胞を含むことを意図しない。
【００６７】
前記のとおり、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターは組換え宿主細胞におけるＴＥＲＴ融合タンパク質の発現のために使用されうる。したがって、本発明のもう１つの態様は、（ａ）ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質（該ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質は、ＬＴＢタンパク質の実質的部分に融合したＴＥＲＴタンパク質またはその不活性変異体を含み、該融合タンパク質は、哺乳動物において免疫応答を生成しうる）をコードするヌクレオチドの配列を含む核酸を含むベクターを適当なヒト宿主細胞内に導入し、（ｂ）該ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質の発現を可能にする条件下、該宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞においてＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質を発現させるための方法である。
【００６８】
前記のＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質を発現させる方法の好ましい実施形態においては、該ＬＴＢ配列は、そのシグナル配列が欠失している。
【００６９】
宿主細胞におけるＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体の発現の後、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質を回収して、精製ＴＥＲＴ−ＬＴ融合タンパク質を得ることが可能である。いくつかのタンパク質精製方法が利用可能であり、利用に適している。組換えタンパク質は、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの種々の組合せ又は個々の適用により、細胞ライセートおよび抽出物から精製されうる。また、組換えＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質は、ＴＥＲＴタンパク質またはＴＥＲＴタンパク質のポリペプチド断片に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用して調製された免疫アフィニティーカラムを使用することにより、他の細胞タンパク質から分離されうる。
【００７０】
本発明のＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体を含む核酸分子およびコード化融合タンパク質は、ワクチン開発に使用するために、ＴＥＲＴをコードする完全長野生型ｃＤＮＡと比較してＴＥＲＴ特異的免疫応答を増強するよう設計した。本発明のＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合配列の免疫学的特性を更に増強するために、本明細書に記載の幾つかの実施形態においては、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、後記のとおり、宿主細胞における更に高レベルの発現のための最適化コドンを含む。これらの実施形態においては、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体のコドンの少なくとも一部は、意図される宿主細胞（好ましい実施形態においては、これはヒト細胞である）にとって好ましいコドンを利用するよう設計される。最適化ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体は、細胞性免疫によりＴＥＲＴ関連癌に対する有効な免疫予防をもたらす、組換えアデノウイルスまたはプラスミドに基づくＤＮＡワクチンの開発のために使用されうる。該合成分子は免疫原性組成物として使用されうる。本発明は、霊長類およびヒトのような哺乳動物を含む脊椎動物内にインビボで直接導入されると該動物内でコード化タンパク質の発現を誘導するコドン最適化ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体ポリヌクレオチドを提供する。
【００７１】
前記のとおり、本発明の幾つかの実施形態においては、該合成分子は、ヒト細胞にとって好ましいコドンを利用するようヌクレオチドの幾つかが改変されていてヒト宿主細胞における高レベルの融合体タンパク質の発現を可能にする、ヌクレオチドの配列を含む。該合成分子は、細胞性免疫によりＴＥＲＴ関連癌に対する有効な免疫予防をもたらす癌ワクチンにおいて使用されうるＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質の源として使用されうる。本明細書に開示されている核酸分子は、ＤＮＡに基づく癌ワクチンの基礎としても役立ちうる。
【００７２】
４つの可能なヌクレオチド塩基の「トリプレット」コドンは、６０種を超える様々な形態で存在しうる。これらのコドンは僅か２０種の異なるアミノ酸（ならびに転写の開始および終結）に関するメッセージを与えるため、いくつかのアミノ酸は２以上のコドンによりコードされうる（コドン縮重として公知の現象）。完全には理解されていない理由により、代替コドンは、異なる細胞型の内在性ＤＮＡ中で均一には存在しない。実際、或る細胞型における或るコドンに関する様々な自然階層または「優先性（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」が存在するらしい。一例として、アミノ酸ロイシンは、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡおよびＴＴＧを含む６種のＤＮＡコドンのいずれかにより特定される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の内在性ＤＮＡは、最も一般的には、ＣＴＧロイシン特定コドンを含有するが、酵母および粘菌のＤＮＡは、最も一般的には、ＴＴＡロイシン特定コドンを含むことを、微生物に関するゲノムコドン出現頻度の包括的な解析が明らかにしている。この階層を考慮すると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主によるロイシンに富むポリペプチドの高レベル発現の達成の可能性は、ある程度は、コドン使用頻度に左右されると一般に考えられる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、ＴＴＡコドンに富む遺伝子は発現されにくいが、ＣＴＧに富む遺伝子は、おそらく、この宿主において高発現される可能性がある。同様に、酵母宿主細胞におけるロイシンに富むポリペプチドの発現のための好ましいコドンはＴＴＡであろう。
【００７３】
コドン優先性現象が組換えＤＮＡ技術に影響を及ぼしていることは明らかであり、該現象は、成功裏に形質転換された宿主生物における外在性遺伝子の高発現レベルの達成のこれまでの多数の失敗の理由を説明するのに役立ち得よう。すなわち、挿入された遺伝子内に、それほど「好ましく」ないコドンが反復的に存在している可能性があり、発現のための宿主細胞装置がそれほど効率的に機能していない可能性がある。この現象は、意図される宿主細胞の好ましいコドンを含むよう設計された合成遺伝子が組換えＤＮＡ技術の実施のための外来遺伝物質の最適形態をもたらすことを示唆している。したがって、本発明の１つの態様は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合遺伝子である。本発明の好ましい実施形態において、同一タンパク質配列をコードする代替コドンの使用はヒト細胞における外在性ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質の発現に対する制約を除去しうることが判明している。
【００７４】
本発明の幾つかの実施形態において、Ｌａｔｈｅ，“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｄｅｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ”Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１８３：１−１２（１９８５）（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおり、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードする核酸分子は、同一翻訳配列を有するが代替コドン使用を伴うポリヌクレオチド配列に変換される。該方法論は、一般に、高発現ヒト遺伝子に一般に付随しない、野生型配列内のコドンを特定し、それらをヒト細胞における高発現のための最適コドンで置換することよりなる。ついで、その新たな遺伝子配列を、これらのコドン置換により生じた望ましくない配列（例えば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンスプライス認識部位の非意図的生成、望ましくない制限酵素部位など）に関して点検する。既存コドンを、同一アミノ酸をコードする異なるコドンで置換することにより、望ましくない配列を除去する。ついで合成遺伝子セグメントを、改善された発現に関して試験する。
【００７５】
この方法は、コドンの全てが高発現ヒトおよび／または哺乳類細胞のコドン使用頻度に従う最適コドンであるポリヌクレオチド配列を必ずしも与えるわけではない、と理解される。しかし、ＴＥＲＴおよび／またはＬＴＢのコドン最適化ポリヌクレオチド変異体が想定される本発明の実施形態においては、生じるコドンの実質的部分が高発現ヒトおよび／または哺乳類遺伝子のコドン使用頻度に類似していることが好ましい。
【００７６】
前記の方法は、ヒト細胞における高レベル発現のために最適化されたコドンを含む遺伝子を与える、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードする合成遺伝子を作製するために用いられうる。前記方法は、癌ワクチンにおける使用のためのコドン最適化遺伝子を設計するための代表的方法論の概要を示すものであるが、該方法における若干の変更または該配列における若干の変更により、類似したワクチン効力または増強された遺伝子発現が達成されうる、と当業者により理解される。
【００７７】
また、ＤＮＡ分子のコドンの一部のみがコドン最適化された、ヒト細胞における高レベルのＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体の発現をもたらす追加的な核酸分子が構築されうる、と当業者は認識するであろう。例えば、本発明の幾つかの実施形態においては、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体のＴＥＲＴ部分を含むコドンがヒト細胞における高レベル発現のために最適化されており、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体のＬＴＢ部分を含むコドンは野生型ＬＴＢに実質的に類似している。本発明の他の実施形態においては、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体のＬＴＢ部分を含むコドンがヒト細胞における高レベル発現のために最適化されており、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体のＴＥＲＴ部分を含むコドンは野生型ＴＥＲＴ遺伝子に実質的に類似している。本発明の更に他の実施形態において、例えば配列番号５に記載のｈＴＥＲＴ−ＬＴＢｏｐｔ配列のように、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体のＴＥＲＴ部分およびＬＴＢ部分の両方がヒト細胞における高レベル発現のためにコドン最適化されている。ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体のＴＥＲＴおよび／またはＬＴＢ部分内のコドンの一部分のみが最適化されているＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体も本発明で想定される。
【００７８】
本発明の核酸は、ヒト細胞における該タンパク質の効率的発現をもたらすように設計された配列を含む発現カセットへと構築されうる。該カセットは、好ましくは、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質コード化遺伝子を含有し、関連する転写および翻訳制御配列、例えばプロモーターおよび終結配列がそれに機能的に連結されている。好ましい実施形態において、該プロモーターは、イントロンＡ配列を伴うサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）であるが、当業者は、強力な免疫グロブリンまたは他の真核生物遺伝子プロモーターのような多数の他の公知プロモーターのいずれかが使用されうると認識するであろう。好ましい転写ターミネーターはウシ成長ホルモンターミネーターであるが、他の公知転写ターミネーターも使用されうる。ＣＭＶ−ＢＧＨターミネーターの組合せが特に好ましい。
【００７９】
本発明においては、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合体発現カセットがベクター内に挿入される。該ベクターは、好ましくは、アデノウイルスまたはプラスミドベクターであるが、プロモーターに連結された直鎖状ＤＮＡ、または例えばアデノ随伴ウイルスもしくは修飾ワクシニアウイルス、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターのような他のベクターも使用されうる。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態において、該ベクターはアデノウイルスベクター（本明細書においては「アデノベクター」と互換的に用いられる）である。アデノベクターは、例えばヒトまたは動物において見出されるもののような種々のアデノウイルス血清型に基づくものでありうる。動物アデノウイルスの具体例には、ウシ、ブタ、チンパンジー、マウス、イヌおよびトリ（ＣＥＬＯ）が含まれる。好ましいアデノベクターはヒト血清型に基づくものであり、より好ましくは、Ｂ、ＣまたはＤ群血清型に基づくものである。ヒトアデノウイルスＢ、Ｃ、ＤまたはＥ群血清型の具体例には、２型（「Ａｄ２」）、４型（「Ａｄ４」）、５型（「Ａｄ５」）、６型（「Ａｄ６」）、２４型（「Ａｄ２４」）、２６型（「Ａｄ２６」）、３４型（「Ａｄ３４」）および３５型（「Ａｄ３５」）が含まれる。本発明の特に好ましい実施形態においては、発現ベクターはアデノウイルス６型（Ａｄ６）ベクターである。
【００８１】
選択したベクターがアデノウイルスである場合、該ベクターは、いわゆる第１世代アデノウイルスベクターであることが好ましい。これらのアデノウイルスベクターは、非機能的なＥ１遺伝子領域、好ましくは、欠失したアデノウイルスＥ１遺伝子領域を有することにより特徴づけられる。また、第１世代ベクターは、非機能的な又は欠失したＥ３遺伝子領域を有しうる（Ｄａｎｔｈｉｎｎｅら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１７０７−１７１４（２０００）；Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１（９）：４２６−４２８（２０００））。アデノベクターにおいては、そのＥ１およびＥ３領域が完全に除去される必要はない。むしろ、トランスで供給されるＥ１タンパク質の非存在下で該ベクターを複製不能状態にするのに十分な量のＥ１領域が除去され、Ｅ１欠失、またはＥ１およびＥ３欠失の組合せは、遺伝子発現カセットを収容するに足りる十分な大きさである。
【００８２】
いくつかの実施形態においては、発現カセットは、アデノウイルスＥ１遺伝子が通常位置する位置において挿入される。また、これらのベクターは、場合によっては、非機能的な又は欠失したＥ３領域を有する。使用されるアデノウイルスゲノムは、Ｅ１およびＥ３領域の両方が欠失していること（ΔＥ１ΔＥ３）が好ましい。該アデノウイルスは、ウイルスＥ１遺伝子を発現する公知細胞系、例えば２９３細胞またはＰＥＲＣ．６細胞において、あるいは他のタンパク質を発現するよう一過性または安定に形質転換された２９３またはＰＥＲＣ．６細胞由来の細胞系において増殖されうる。例えば、テトラサイクリン調節性プロモーター系のような制御された遺伝子発現を伴う構築物を使用する場合、該細胞系は、該調節系に関与する成分を発現しうる。そのような細胞系の一例はＴ−Ｒｅｘ−２９３であり、その他は当技術分野で公知である。
【００８３】
アデノウイルスベクターの操作を簡便にするために、アデノウイルスはシャトルプラスミド形態でありうる。本発明はまた、プラスミド部分およびアデノウイルス部分を含むシャトルプラスミドベクターに関する。該アデノウイルス部分は、欠失したＥ１および場合によってはＥ３欠失を伴うアデノウイルスゲノムを含み、該アデノウイルスゲノムは、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質コード化ヌクレオチド配列を含む挿入発現カセットを有する。好ましい実施形態においては、アデノウイルスベクターが容易に除去されうるよう、該プラスミドのアデノウイルス部分に隣接して制限部位が存在する。該シャトルプラスミドは原核細胞または真核細胞内で増殖されうる。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態において、該発現カセットはＡｄ６（ΔＥ１ΔＥ３）アデノウイルスプラスミド（参照により本明細書に組み入れるＥｍｉｎｉら，ＵＳ２００４０２４７６１５を参照されたい）内に挿入される。このベクターは、Ｅ１およびＥ３領域が欠失したＡｄ６アデノウイルスゲノムを含む。本発明の他の好ましい実施形態において、該発現カセットはｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０アデノウイルスプラスミド（参照により本明細書に組み入れるＥｍｉｎｉら，ＵＳ２００３００４４４２１を参照されたい）内に挿入される。このプラスミドは、Ｅ１およびＥ３領域が欠失したＡｄ５アデノウイルスゲノムを含む。ｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０プラスミドの設計は、ウイルス増幅の改善が達成されるようウイルスパッケージングを最適化するのに重要であることが判明している要素を組込むために５’シス作用性パッケージング領域をＥ１遺伝子内に更に伸長させることにより、従来のアデノベクターに比べて改善された。好都合なことに、これらの改善されたアデノウイルスベクターは高継代増殖後に遺伝的安定性を維持しうる。
【００８５】
ＤＮＡ構築物を製造し精製するための分子生物学の標準的な技術は本発明のアデノウイルス、シャトルプラスミドおよびＤＮＡ免疫原の製造を可能にする。
【００８６】
ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔをコードするプラスミドＤＮＡでの遺伝的ワクチン接種はＢＡＬＢ／ｃおよびＢ６マウスにおける免疫寛容を破壊しうることが、本発明において確認されている（実施例７を参照されたい）。また、プラスミドＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔでの免疫化はＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて細胞傷害性免疫応答を惹起しうることが、本明細書中で示されている（実施例８を参照されたい）。さらに、この構築物は、ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）単独の場合より強力なＣＤ８＋  免疫応答を誘導しうること（実施例９を参照されたい）、および腫瘍増殖を制御しうること（実施例１１を参照されたい）が実証されている。したがって、本明細書に記載されているデータは、ＬＴＢ  ｃＤＮＡへのＴＥＲＴコード配列の融合がＴＥＲＴ特異的免疫応答の増強をもたらすことを示している。
【００８７】
また、ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔがＨＬＡ−Ａ２拘束ＣＤ８＋  免疫応答を誘導しうること（実施例１２を参照されたい）、およびこの免疫応答がＡｄ６−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）での追加接種により増強されうることが、本発明において示されている。
【００８８】
したがって、前記のベクターは、異常なＴＥＲＴ発現に関連した腫瘍の発生を予防するための、および／または既存の癌を治療するための免疫原性組成物およびワクチンにおいて使用されうる。本発明のベクターは、成功裏に形質転換された宿主生物における外在性ＴＥＲＴの高発現レベルの達成に伴う問題点を排除することにより、およびヒトのような哺乳動物に投与されると、増強された免疫応答を惹起しうるＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質を提供することにより、ワクチンの開発および商業化を可能にする。
【００８９】
この目的において、本発明の１つの態様は、ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むワクチンベクターを哺乳動物に投与することを含む、ＴＥＲＴ関連癌の予防または治療方法であり、該ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質は、ＬＴＢの実質的部分に融合した不活性なＴＥＲＴタンパク質またはその変異体を含み、該融合タンパク質が哺乳動物において免疫応答を生成しうる。
【００９０】
前記の方法において、該ワクチンベクターは、肺癌、乳癌および結腸直腸癌を含む（これらに限定されるものではない）任意の哺乳動物における癌の治療または予防のために投与されうる。本発明の好ましい実施形態においては、該哺乳動物はヒトである。
【００９１】
さらに、当業者は、記載されている治療および予防方法において使用するための任意のタイプのベクターを選択することが可能である。好ましくは、該ベクターはアデノウイルスベクターまたはプラスミドベクターである。本発明の好ましい実施形態において、該ベクターは、アデノウイルスＥ１領域における欠失とアデノウイルスＥ１領域におけるインサートとを伴うアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであり、ここで、該インサートは、（ａ）ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質（ここで、該ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合タンパク質は、ＬＴＢの実質的部分に融合した不活性なＴＥＲＴタンパク質またはその変異体を含み、該融合タンパク質は哺乳動物において免疫応答を生成しうる）をコードするヌクレオチド配列と、（ｂ）該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターとを含む発現カセットを含む。
【００９２】
本発明は更に、Ｅ１領域における欠失とＥ１領域におけるインサートとを伴うアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターに関し、該インサートは、（ａ）ＴＥＲＴ融合タンパク質（ここで、該ＴＥＲＴ融合タンパク質は、ＬＴＢの実質的部分に融合した不活性なＴＥＲＴタンパク質またはその変異体を含み、該融合タンパク質は哺乳動物において免疫応答を生成しうる）をコードするヌクレオチド配列と、（ｂ）該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターとを含む。
【００９３】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、該アデノウイルスベクターはＡｄ６ベクターである。
【００９４】
本発明のもう１つの好ましい実施形態において、該アデノウイルスベクターはＡｄ５ベクターである。
【００９５】
さらにもう１つの実施形態において、該アデノウイルスベクターはＡｄ２４ベクターである。
【００９６】
また、チンパンジーアデノウイルスベクター（これに限定されるものではない）を含む、ヒト以外の種に自然感染するアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターも、本発明における使用において想定される。本発明のこの態様の好ましい実施形態は、チンパンジーＡｄ３ワクチンベクターである。
【００９７】
もう１つの態様において、本発明は、プラスミド部分と発現カセット部分とを含むワクチンプラスミドに関し、該発現カセット部分は、（ａ）ＴＥＲＴ融合タンパク質（ここで、該ＴＥＲＴ融合タンパク質は、ＬＴＢの実質的部分に融合した不活性なＴＥＲＴタンパク質またはその変異体を含み、該融合タンパク質は哺乳動物において免疫応答を生成しうる）をコードするヌクレオチド配列と、（ｂ）該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターとを含む。適当なプラスミドの一例として、Ｊ．Ｓｈｉｖｅｒら，ｉｎ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍ．Ｌｉｕら編，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｎ．Ｙ．，７７２：１９８−２０８（１９９６）（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている哺乳類発現プラスミドＶ１Ｊｎｓが挙げられるであろう。
【００９８】
本発明の幾つかの実施形態においては、本明細書に開示されている組換えアデノウイルスおよびプラスミドに基づくポリヌクレオチドワクチンは、増強された免疫応答を誘導するために、種々の初回接種／追加接種の組合せにおいて使用される。この場合、それらの２つのベクターを「初回接種および追加接種」計画において投与する。例えば、第１のタイプのベクターを１回以上投与し、ついで、予め決められた長さの時間、例えば２週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月または他の適当な間隔の後、第２のタイプのベクターを１回以上投与する。好ましくは、これらのベクターは、同一ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せをコードする発現カセットを運搬する。
【００９９】
プラスミドＤＮＡが使用される実施形態において、該ベクターは、哺乳類または昆虫細胞により認識される１以上のプロモーターを含有することが好ましい。好ましい実施形態においては、該プラスミドは、強力なプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター（これに限定されるものではない）を含有するであろう。本発明のＴＥＲＴ−ＬＴＢヌクレオチド配列の発現を導く目的で多数の他の公知プロモーターのいずれかが選択されうる、と当業者は認識するであろう。プロモーターの更なる具体例には、天然に存在するプロモーター、例えばＥＦ１アルファプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、およびＳＶ４０初期／後期プロモーターおよびｐ−アクチンプロモーター；ならびに人工プロモーター、例えば合成筋特異的プロモーターおよびキメラ筋特異的／ＣＭＶプロモーター（Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２４１−２４５（１９９９）；Ｈａｇｓｔｒｏｍら，Ｂｌｏｏｄ  ９５：２５３６−２５４２（２０００））が含まれる。発現されるべき合成ＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合遺伝子または他の遺伝子はそのようなプロモーターに連結されるであろう。
【０１００】
前記のとおり、アデノウイルスベクターワクチンおよびプラスミドワクチンは、免疫応答を誘導するために、単一の治療計画の一部として脊椎動物に投与されうる。この目的において、本発明は、（ａ）ｉ）ＴＥＲＴ融合タンパク質（ここで、該ＴＥＲＴ融合タンパク質は、ＬＴＢの実質的部分に融合した不活性なＴＥＲＴタンパク質またはその変異体を含み、該融合タンパク質は哺乳動物において免疫応答を生成しうる）をコードするヌクレオチド配列と、ｉｉ）該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターとを含む第１ベクターを哺乳動物内に導入し、（ｂ）予め決められた長さの時間を経過させ、（ｃ）ｉ）ＴＥＲＴ融合タンパク質（ここで、該ＴＥＲＴ融合タンパク質は、ＬＴＢの実質的部分に融合した不活性なＴＥＲＴタンパク質またはその変異体を含み、該融合タンパク質は哺乳動物において免疫応答を生成しうる）をコードするヌクレオチド配列と、ｉｉ）該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターとを含む第２ベクターを該哺乳動物内に導入することを含む、ＴＥＲＴ関連癌から哺乳動物を防御する方法に関する。
【０１０１】
前記の防御方法の１つの実施形態において、第１ベクターはプラスミドであり、第２ベクターはアデノウイルスベクターである。もう１つの実施形態においては、第１ベクターはアデノウイルスベクターであり、第２ベクターはプラスミドである。本発明の幾つかの実施形態においては、第２ベクターを投与する前に、第１ベクターを２回以上患者に投与する。
【０１０２】
前記の方法においては、第１のタイプのベクターを１回以上投与することが可能であり、該ベクターの各投与は、予め決められた長さの時間により隔てられる。第１のタイプのベクターのそのような一連の投与の後、予め決められた長さの時間の経過後、第２のタイプのベクターの投与を１回以上行うことが可能である。第１のタイプのベクターでの治療と同様に、第２のタイプのベクターも、予め決められた時間間隔の後に１回以上投与することが可能である。
【０１０３】
本発明は更に、（ａ）ｉ）ＴＥＲＴ融合タンパク質（ここで、該ＴＥＲＴ融合タンパク質は、ＬＴＢの実質的部分に融合したＴＥＲＴ（ＡＩ）タンパク質またはその変異体を含み、該融合タンパク質は哺乳動物において免疫応答を生成しうる）をコードするヌクレオチド配列と、ｉｉ）該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターとを含む第１ベクターを哺乳動物内に導入し、（ｂ）予め決められた長さの時間を経過させ、（ｃ）ｉ）ＴＥＲＴ融合タンパク質（ここで、該ＴＥＲＴ融合タンパク質は、ＬＴＢの実質的部分に融合したＴＥＲＴ（ＡＩ）タンパク質またはその変異体を含み、該融合タンパク質は哺乳動物において免疫応答を生成しうる）をコードするヌクレオチド配列と、ｉｉ）該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターとを含む第２ベクターを該患者内に導入することを含む、ＴＥＲＴ関連癌に罹患した患者の治療方法に関する。
【０１０４】
前記の治療方法の１つの実施形態において、第１ベクターはプラスミドであり、第２ベクターはアデノウイルスベクターである。もう１つの実施形態において、第１ベクターはアデノウイルスベクターであり、第２ベクターはプラスミドである。前記方法の他の好ましい実施形態においては、第２ベクターを患者に投与する前に、第１ベクターを２回以上患者に投与する。
【０１０５】
前記方法の好ましい実施形態において、該ベクターは、ＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該ＴＥＲＴ融合タンパク質は、ＬＴＢの実質的部分に融合した不活性なＴＥＲＴタンパク質を含む。
【０１０６】
ワクチン被投与者内に導入されるべき発現可能なＤＮＡまたは転写されるＲＮＡの量は、部分的には、使用するプロモーターの強度および発現される遺伝子産物の免疫原性に左右される。一般に、約１ｎｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜３００μｇのプラスミドワクチンベクターの免疫学的または予防的に有効な量を、筋組織内に直接投与する。組換えアデノウイルスに関する有効量は約１０６〜１０１２粒子、好ましくは約１０７〜１０１１粒子である。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した圧入、および他の投与方法、例えば腹腔内、静脈内、筋肉内または吸入運搬も想定される。
【０１０７】
本発明の好ましい実施形態においては、該ワクチンベクターを筋肉内注射により被投与者内に導入する。
【０１０８】
本発明のワクチンベクターは、裸のワクチンベクター、すなわち、被投与者の免疫系に影響を及ぼすいずれのタンパク質や他の物質をも伴わないワクチンベクターでありうる。この場合、該ワクチンベクターは、生理的に許容される溶液、例えば無菌食塩水（無菌塩類液）または無菌緩衝食塩水（これらに限定されるものではない）中に存在することが望ましい。あるいは、ＤＮＡの細胞取り込みを補助する物質、例えばカルシウムイオン（これに限定されるものではない）を投与することが有利でありうる。これらの物質は、一般に、トランスフェクション促進試薬および医薬上許容される担体と称される。当業者は、個々の試薬または医薬上許容される担体ならびに投与の適当な時間および方法を決定しうるであろう。
【０１０９】
本明細書に記載されている全ての刊行物を、本発明に関して用いられうる方法論および材料・資料を記載し開示する目的で、参照により本明細書に組み入れることとする。ここにおけるいずれのものも、先行発明に基づいて本発明がそのような開示に先行する権利を有さないと自認するものと解釈されるべきではない。
【０１１０】
添付図面を参照して本発明の好ましい実施形態が記載されているが、本発明はそれらの厳密な実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲において定められる本発明の範囲または精神から逸脱することなく当業者により種々の変更および修飾がそれに施されうると理解されるべきである。
【０１１１】
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１１２】
ＴＥＲＴ融合タンパク質の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン（Ｆｉｎｇｅｒｕｔら，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３（３８）：４６８５−９６（２００５）；Ｒｉｇａｎｏら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２２（７）：５０２−８（２００４））のＬＴＢサブユニットへのテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）抗原の融合体がＴＥＲＴ単体の免疫原性を増強しうるかどうかを判定するために、修飾を伴う完全長テロメラーゼ逆転写酵素をコードするベクターを構築した。まず、該ＤＮＡ配列を、ヒト宿主細胞にとって好ましいコドンを組込むようコドン最適化した。また、該コード化抗原がワクチン用途に安全であることが保証されるよう、該コード化タンパク質のテロメラーゼ触媒活性を不活性化するためにＴＥＲＴヌクレオチド配列に変異を導入した。特に、変異Ｄ７１２ＡおよびＶ７１３ＩをヒトＴＥＲＴ配列に付加し、変異Ｄ７０２ＡおよびＶ７０３ＩをマウスＴＥＲＴ配列に付加した（Ａｒａｉら，Ｔｗｏ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ａｒｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１０）：８５３８−４４（２００２））。
【０１１３】
前記の修飾ＴＥＲＴヌクレオチド配列のＣ末端を、シグナルペプチドコード配列が除去された修飾ＬＴＢ（ｎｔ６４−３７５）をコードするヌクレオチド配列に連結することにより、ＴＥＲＴ融合体を操作した。また、該ＴＥＲＴタンパク質の分泌が保証されるよう、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）シグナル配列をコードするリーダー配列をＴＥＲＴコード化ヌクレオチド配列の５’側に付加した（Ｈａｄｄａｄら，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８（３）：１９３−２０２（１９９７））。コンピューターアルゴリズムを使用して、ヒト宿主細胞にとって好ましいコドンを組込むよう該全配列をコドン最適化した。該合成コドン最適化遺伝子を合成オリゴヌクレオチドにより構築した。最終的な構築物において、クローニング法のために、該ＴＥＲＴ配列と該ＬＴＢ配列との間に２つのアミノ酸（ＳおよびＲ）を付加した。
【０１１４】
該ＴＥＲＴ融合体をコードするヌクレオチド配列を、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）／イントロンＡプロモーター＋ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルの制御下、ベクターｐＶ１ＪｎｓＡ内にクローニングした。プラスミドｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ−ＬＴＢｏｐｔは、Ｎ末端のＴＰＡシグナル配列およびＣ末端のＬＴＢのコード配列に融合したヒトＴＥＲＴのコドン最適化不活性化ｃＤＮＡを運搬する。同様に、プラスミドｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ−ＬＴＢｏｐｔは、ＴＰＡおよびＬＴＢに融合したマウスＴＥＲＴのコドン最適化不活性化ｃＤＮＡを運搬する。
【実施例２】
【０１１５】
プラスミドおよびアデノウイルス構築物
ｐＶ１ＪｎｓＡ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ：ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢ配列を含有するプラスミド０４１０４６ｐｕｃＫａｎａをＧＥＮＥＡＲＴ（Ｇｅｎｅａｒｔ  ＧｍｂＨ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。該プラスミドをＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩで消化し、得られた断片を、プラスミドｐＶ１ＪｎｓＡ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２（９）：７７７−８３（１９９３））内のＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ部位内にクローニングした。
【０１１６】
ｐＶ１ＪｎｓＡ／ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）ｏｐｔ：ｐＶ１ＪｎｓＡ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢをＸｂａＩで消化してＬＴＢコード配列（２つのＸｂａＩ部位間に存在する）を除去した。得られた構築物ｐＶ１ＪｎｓＡ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）は最終ｍＴＥＲＴアミノ酸の後かつ終止コドンの前に３個のアミノ酸（Ｓ、Ｒ、Ｎ）を有していた。ｐＶ１ＪｎｓＡ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）上でＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶ消化によりＴＰＡコード配列の除去を行った。センスプライマー（５’−ＧＡＴＣＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＴＧ−３；配列番号１５）およびアンチセンスプライマー（５’−ＡＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＡＧＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＧ−３’；配列番号１６）でｍＴＥＲＴを増幅することにより得たＰＣＲ産物により該ＴＰＡコード配列を置換し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶで消化されたベクター内に再クローニングした。
【０１１７】
ｐＶ１ＪｎｓＡ／ＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ：ＧＥＮＥＡＲＴから得たＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢに対応する合成断片を、ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ制限部位を使用してｐＶ１ＪｎｓＡ内にクローニングした。
【０１１８】
Ａｄ６−ＴＰＡｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ：ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ配列を含有するプラスミド０４１０４６ｐｕｃＫａｎａをＧＥＮＥＡＲＴから入手した。該プラスミドをＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩで消化し、該断片を、プラスミドｐＮＥＢＡｄ６−ＣＭＶｐＡシャトルベクター内のＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングした。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＮＥＢＡｄ６−ＣＭＶｐＡ−ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢを、ＣｌａＩで線状化されたプラスミドｐＭＲＫ  Ａｄ６  ΔＥ１ΔＥ３へと組換えた。該プラスミドをＰａｃＩで切断して、Ａｄ  ＩＴＲを遊離させ、Ｐｅｒｃ−６細胞内に形質導入した。Ａｄ６ベクターの増幅を連続継代により行い、それを標準的なＣｓＣｌ勾配精製により精製した。
【０１１９】
Ａｄ６−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）：ｈＴＥＲＴの野生型配列（ｈＴＥＲＴ野生型配列は、ヒト腫瘍細胞のｍＲＮＡの逆転写によりレスキューされた）を含有するプラスミドｐＣＲｓｒｉｐｔをＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩで消化し、クレノウ酵素で埋め、ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩで消化されたｐＶ１ＪｎｓＡ内にクローニングした。オリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＧＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＣＧＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧ−３’；配列番号１７）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅクイックチャインジ多部位特異的変異誘発キット（ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ｍｕｌｔｉ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬＡ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ；Ｃａｔ：２００５１３）を使用することにより、ｐＶ１ＪｎｓＡ−ｈＴＥＲＴを変異誘発させて、ｐＶ１ＪｎｓＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）を得た。該プラスミドをＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩで消化し、該断片を、プラスミドｐＮＥＢＡｄ６−ＣＭＶｐＡシャトルベクター内のＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングした。プラスミドｐＮＥＢＡｄ６−ＣＭＶｐＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）をＰａｃＩ／ＰｍｅＩで消化し、ＣｌａＩで線状化されたプラスミドｐＭＲＫ  Ａｄ６  ΔＥ１ΔＥ３へと組換えた。該プラスミドをＰａｃＩで切断して、Ａｄ  ＩＴＲを遊離させ、Ｐｅｒｃ−６細胞内に形質導入した。Ａｄ６ベクターの増幅を連続継代により行い、それを標準的なＣｓＣｌ勾配精製により精製した。
【実施例３】
【０１２０】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＩＦＮ−γを抗原特異的に分泌するマウス脾細胞を、標準的な酵素結合イムノスポット（ＦＬＩＳＰＯＴ）アッセイ（Ｍｉｙａｈｉｒａら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８１（１）：４５−５４（１９９５））を用いて検出した。無菌ＰＢＳ中で２．５μｇ／ｍｌに希釈された１００μｌ／ウェルの精製ラット抗マウスＩＦＮ−γ（ＩｇＧ１，クローンＲ４−６Ａ２，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で９６ウェルＭＡＩＰプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を被覆した。ＰＢＳで洗浄した後、２００μｌ／ウェルのＲ１０培地でプレートのブロッキングを３７℃で２時間行った。
【０１２１】
安楽死させたマウスから無菌的に脾臓を摘出することにより脾細胞を得、ついで金属格子上ですり砕くことにより脾臓を破砕した。１ｍｌの０．１×ＰＢＳを該細胞ペレットに加え、約１５秒間渦巻撹拌することにより、浸透細胞溶解により赤血球を取り出した。ついで１ｍｌの２×ＰＢＳを加え、１×ＰＢＳで体積を４ｍｌにした。１２００ｒｐｍ、室温で１０分間の遠心分離により、細胞をペレット化し、該ペレットを１ｍｌのＲ１０培地に再懸濁させた。チュルク染色を用いて生細胞を計数した。
【０１２２】
脾細胞を５×１０５および２．５×１０５  細胞／ウェルで２通りにて平板接種し、各ペプチドの１μｇ／ｍｌ懸濁液と共に３７℃で２０時間温置した。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を５μｇ／ｍｌで各マウスに関する陽性内部対照として使用した。ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、アッセイバッファー中で１：２５００希釈された５０μｌ／ウェルのビオチン結合ラット抗マウスＩＦＮγ（ＲａｔＩｇＧ１，クローンＸＭＧ  １．２，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と共に、４℃でＯ／Ｎでプレートを温置した。十分な洗浄の後、スポットの現像が明らかに可視化されるまで５０μｌ／ウェル  ＮＢＴ／Ｂ−ＣＩＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を加えることによりプレートを現像した。プレートを蒸留水で十分に洗浄することにより、該反応を停止させた。プレートを風乾させ、ついで自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを使用してスポットを計数した。
【実施例４】
【０１２３】
細胞内サイトカイン染色
ＥＤＴＡ中の逆軌道採血（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ）により得た１〜２百万個のマウス脾細胞またはＰＢＭＣを１ｍｌのＲＰＭＩに再懸濁させた。１０％  ＦＣＳをブレフェルジンＡ（１μｇ／ｍｌ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ｃａｔ  ＃５５５０２８／２３００ｋｋ）およびペプチド（各ペプチドの最終濃度５〜６μｇ／ｍｌ）のプールと共に３７℃、５％  ＣＯ２で１２〜１６時間温置した。ついで細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ  １％  ＦＢＳ，０．０１％  ＮａＮ３）で洗浄し、精製抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２Ｆｃブロック（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ｃａｔ  ＃５５３１４２）と共に４℃で１５分間温置した。ついで細胞を洗浄し、表面抗体：ＣＤ４−ＰＥ結合抗マウス（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ｃａｔ．＃５５３０４９）、ＰｅｒｃＰ  ＣＤ８結合抗マウス（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ｃａｔ＃５５３０３６）およびＡＰＣ結合抗マウスＣＤ３ｅ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ｃａｔ＃５５３０６６）で暗所中、室温で３０分間染色した。洗浄後、細胞を固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ−Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ｃａｔ＃５５５０２８／２３００ｋｋ）で暗所中、４℃で２０分間にわたって透過性亢進させた。ＰｅｒｍＷａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ｃａｔ＃５５５０２８／２３００ｋｋ）で洗浄した後、細胞をＩＦＮγ−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に温置した。ついで細胞を洗浄し、ＰＢＳ中のホルムアルデヒド１％で固定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。
【実施例５】
【０１２４】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ
安楽死させたマウスから無菌的に脾臓を摘出することにより脾細胞を得、ついで金属格子上ですり砕くことにより脾臓を破砕した。１ｍｌの０．１×ＰＢＳを該細胞ペレットに加え、約１５秒間渦巻撹拌することにより、浸透細胞溶解により赤血球を取り出した。最終濃度１０μｇ／ｍｌの免疫原性ペプチドの存在下、Ｒ１０中の２×１０６  細胞／ｍｌの脾臓細胞を２４ウェル細胞培養プレート内で平板接種した（２ｍｌの細胞／ウェル）。プレートを３７℃、湿度９５％、５％  ＣＯ２で６日間温置した。培養の第３日に、最終濃度１０Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を加えた。
【０１２５】
対数期で増殖中の標的細胞を回収し、最終濃度１０μｇ／ｍｌの免疫原性ペプチドの存在下、１×１０６  細胞／ｍｌ／チューブとした。細胞を５０〜１００μＣｉ  ５１Ｃｒ／チューブで３７℃で２時間標識した。標的細胞を、２５０ｇ、室温で５分間の遠心分離により１０ｍｌの培地で３回洗浄し、１×１０５  細胞／ｍｌとした。
【０１２６】
エフェクター（Ｅ）／標的細胞（Ｔ）を１００：１、５０：１、２５：１および１２．５：１のＥ／Ｔ比で平板接種することにより、ＣＴＬアッセイを行った。４時間の温置の後、プレートを１２００ｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収した（３０μｌ／ウェル）。プレートを一晩乾燥させ、ベータ−プレートカウンターを使用して計数した。
【実施例６】
【０１２７】
マウスの免疫化
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌｅｃｃｏ，Ｉｔａｌｙ）から購入した。ＨＬＡ−Ａ２．１マウス（ＨＨＤ）はＦ．Ｌｅｍｍｏｎｉｅｒ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）により快く提供していただいた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌｅｃｃｏ，Ｉｔａｌｙ）から購入した。マウスを８週齢の時点で免疫化した。既に記載されているとおりに（Ｒｉｚｚｕｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（１１）：６４１７−２２（１９９９））、５０μｇのプラスミドＤＮＡを５０μｌの容量でマウスの大腿四頭筋に電気注入した。既に記載されているとおりに（Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（２４）：１１５９８−６０７（２０００）；Ｒｉｚｚｕｔｏら，前掲）、エレクトロポレーション（ＥＰ）を行った。簡潔に説明すると、電気的ショックは１０列の１０００方形両極性パルス（９０Ｖ／ｃｍ，７５ｍＡ，２００μ秒／位相）よりなるものであった。Ａｄ注入を５０μｌの容量でマウスの大腿四頭筋内に行った。示されている時点で、細胞性免疫応答を分析した。
【実施例７】
【０１２８】
ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢをコードするプラスミドＤＮＡでの遺伝的ワクチン接種は免疫寛容を破壊する。
【０１２９】
ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢでのワクチン接種が免疫寛容を破壊しうるかどうかを判定するために、２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群をプラスミドｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢの５回の毎週の注射およびそれに続くエレクトロポレーション（実施例６に記載されているとおり）により免疫化した。最終注射の１１日後、個々のマウスから脾細胞を得、それを使用して、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により細胞性免疫応答を分析した。
【０１３０】
刺激された脾細胞からの抗原特異的ＩＦＮγ分泌を、１１アミノ酸の重複を伴い全ｍＴＥＲＴタンパク質に及ぶ３プールの１５マー  ｍＴＥＲＴペプチドを使用して測定した。ｍＴＥＲＴ−１プールは、アミノ酸１−３８８のｍＴＥＲＴ領域に及ぶ９４個のペプチドから構成されていた。ｍＴＥＲＴ−２プールは、アミノ酸３７７−８１１のｍＴＥＲＴ領域に及ぶ１０６個のペプチドから構成されていた。ｍＴＥＲＴ−３プールは、アミノ酸８０１−１１２２のｍＴＥＲＴ領域に及ぶ７８個のペプチドから構成されていた。陰性対照として、ＴＥＲＴペプチドを可溶化するために使用したのと同じ濃度のＤＭＳＯでの脾細胞の刺激の際のサイトカイン産生も測定した。また、ＬＴＢアジュバントに対して誘導された免疫応答を、１１アミノ酸の重複を伴い全ＬＴＢ配列に及ぶ２４個の１５マーのペプチドを使用して検出した。ＥＬＩｓｐｏｔの結果は、ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔでのマウスのワクチン接種が、ＴＥＲＴ−１およびＴＥＲＴ−２ペプチドプール内に含まれるＴＥＲＴタンパク質のＮ末端および中央領域に対する細胞性免疫応答（ＣＭＩ）を惹起したことを示している（図３）。ＬＴＢに対するＣＭＩもＥＬＩｓｐｏｔにより検出された（図３）。
【０１３１】
プラスミドｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔにより惹起されたＴ細胞応答をより良く特徴づけ、ＩＦＮγの産生をもたらすＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞サブセットを特定するために、ワクチン接種されたマウスの脾細胞上でＩＦＮγ細胞内染色を行い、それをＦＡＣＳにより分析した。ＩＣＳにより得られたデータは、ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔでワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスの遺伝的免疫化が、（ｍＴＥＲＴ−１ペプチドプール内に含まれる）ＴＥＲＴタンパク質のＮ末端領域に対する有意なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を惹起したことを示している（図４を参照されたい）。ＴＥＲＴの中央領域（ｍＴＥＲＴ−２ペプチドプール）においてＣＤ４＋  Ｔ細胞応答がマッピングされた。これとは対照的に、該タンパク質のＣ末端領域（ｍＴＥＲＴ−３ペプチドプール）に対しては、これらのマウスにおいてＣＭＩは検出できなかった。ＬＴＢに対するＣＤ４＋  Ｔ細胞応答も検出された（図４）。
【０１３２】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を更にマッピングするために、ｍＴＥＲＴ  １５マーペプチドの中型プールを使用した。各中型プールは、それぞれが別々の中型プール内に含有される１０個の１５マーを含有していた。したがって、２個の中型プールの陽性反応は、１個の１５マーを免疫原性であると明確に特定するであろう。ＣＤ８＋  エピトープは常に９アミノ酸長であるため、２つの隣接した１１マーペプチド内には、いずれかのＣＤ８＋  ペプチドが含まれる。結果は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答が、以下の１５マーｍＴＥＲＴペプチド内に含まれるＴＥＲＴ領域に局在することを示した：ｍＴＥＲＴ−４１（ＴＥＲＴａａ１６１；ＬＶＰＰＳＣＡＹＱＶＣＧＳＰＬ（配列番号１８）およびｍＴＥＲＴ−４２（ＴＥＲＴａａ１６５；ＳＣＡＹＱＶＣＧＳＰＬＹＱＩＣ；配列番号１９）。２つの１５マーペプチド（ｍＴＥＲＴ４１およびｍＴＥＲＴ−４２）を重複させることにより、３つの可能な反応性９マーを合成し、ＩＣＳにおいて試験した。最終的に、以下の配列内でＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫優性ＣＤ８＋  エピトープが特定された（ｍＴＥＲＴａａ１６７；ＡＹＱＶＣＧＳＰＬ；配列番号２０）。これらの結果は、ｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ−ＬＴＢでのＢＡＬＢ／ｃマウスのワクチン接種が該ｍＴＥＲＴ抗原に対する免疫寛容を破壊できたことを示している。
【０１３３】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて得られたデータを証明するために、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスもプラスミドｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔの５回の毎週の注射で免疫化した。ワクチン接種されたマウスの脾細胞上でＩＦＮγ細胞内染色を行い、それをＦＡＣＳにより分析した。ＢＡＬＢ／ｃマウスで得られた結果と同様に、すべてのＢ６マウスにおいてｍＴＥＲＴに対する寛容が破壊された。また、ＩＦＮγを産生するＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞が、ＴＥＲＴペプチドでの刺激に際してＩＣＳにより検出された（図６を参照されたい）。
【０１３４】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＤＮＡワクチン接種により惹起されたＣＤ８＋  免疫応答は、主として、ＴＥＲＴタンパク質の中央領域（ペプチドプールｍＴＥＲＴ−２）に偏向していた。より弱いＣＤ８＋免疫応答はｍＴＥＲＴペプチドプール−１においても検出可能であった。前記の中型プールを使用して、Ｂ６マウスにおいてＣＤ８＋免疫応答をマッピングした。Ｂ６においては２つのＣＤ８＋エピトープが特定された。第１の免疫原性配列はアミノ酸配列ｍＴＥＲＴ１９８（ＶＧＲＮＦＴＮＬ；配列番号２１）にマッピングされ、第２のＣＤ８＋エピトープは配列ｍＴＥＲＴ４８６（ＳＬＧＫＹＧＫＬ；配列番号２２）にマッピングされた。また、ＣＤ４＋免疫応答はＴＥＲＴのＮ末端領域（ペプチドプールｍＴＥＲＴ−１）に局在化された。ｍＴＥＲＴのＣ末端領域に対する免疫応答は検出されなかった。
【０１３５】
前記のＢＡＬＢ／ｃマウスで得られた結果と同様に、Ｂ６マウスの免疫化およびそれに続く免疫応答の分析は、ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ免疫化がｍＴＥＲＴ抗原に対する免疫寛容を破壊しうることを証明した。したがって、総合すると、ＢＡＬＢ／ｃおよびＢ６マウスで得られた結果は、ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ融合体が、使用されるマウス系統には無関係に、自己コンテクスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）における強力な免疫原であることを示している。
【実施例８】
【０１３６】
ＴＥＲＴ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞溶解活性
ｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔでのＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化により惹起されるＴＥＲＴ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞溶解活性を検出するために、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイを用いた。プラスミドｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔの５回の毎週の注射およびそれに続くエレクトロポレーションによりマウスを免疫化した。２匹のマウスから得たマウス脾細胞を最終免疫化の１０日後に集めた。これらの脾細胞を免疫原性ペプチドｍＴＥＲＴａａ１６７（ＡＹＱＶＣＧＳＰＬ；配列番号２０）で１週間刺激して、インビトロ活性化Ｔ細胞を得た。ＢＡＬＢ／ｃ同系腫瘍細胞系４Ｔ１（Ａｓｌａｋｓｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２（６）：１３９９−４０５（１９９２））を標的として使用した。４Ｔ１細胞を免疫反応性ペプチドでローディングし、ＣＴＬアッセイのための標的として使用するＣｒ５１で標識した。活性化Ｔ細胞を標的４Ｔ１細胞と共に、種々のエフェクター／標的比で、同時温置した。マウス＃１およびマウス＃２の両方から得た活性化Ｔ細胞が、免疫原性ペプチドｍＴＥＲＴａａ１６７（ＡＹＱＶＣＧＳＰＬ；配列番号２０）でローディングされた場合の標的細胞上で細胞溶解活性を示した。それらの２匹のマウスは、５０／１のエフェクター／標的比で、８０％（マウス＃１）〜２５％（マウス＃２）の範囲の、異なる度合の細胞傷害性活性を示した。
【０１３７】
結果は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける自己抗原としてのＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔでのＤＮＡ免疫化に際して細胞傷害性免疫応答が誘導されたことを示している（図５）。
【実施例９】
【０１３８】
ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ構築物の免疫原性の比較
ｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔによりコードされる、ＬＴＢに融合した分泌ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）タンパク質の免疫原性を、ＬＴＢに融合していないｍＴＥＲＴ（ＡＩ）の非分泌形態と比較するために、実施例２に記載されているとおりに、ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）を担持するプラスミドｐＶ１Ｊ誘導体を構築した。
【０１３９】
６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群をプラスミドｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔまたはｐＶ１Ｊ／ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）ｏｐｔの５回の毎週の注射で免疫化した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに関して既に特定されているｍＴＥＲＴａａ１６７  ＣＤ８＋免疫優性エピトープ配列（ＡＹＱＶＣＧＳＰＬ；配列番号２０）を使用するＩＦＮγ細胞内染色により免疫応答をモニターした。
【０１４０】
結果は、ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔが、マウステロメラーゼに対するＣＤ８＋免疫応答の誘導のための、ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）より良好な構築物であることを示している（図７）。ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ−ＬＴＢ（ＡＩ）ｏｐｔにより免疫化された群において誘導されたＣＤ８＋  Ｔ細胞応答において観察された相違は、ＤＮＡ免疫化の場合にｍＴＥＲＴ（ＡＩ）ｏｐｔを使用して得られたものと統計的に異なる（ｐ＝０．０４；スチューデントｔ検定）。
【実施例１０】
【０１４１】
免疫化計画の比較
ＤＮＡ  ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔでのＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化および電気的刺激のみにより惹起された抗ｍＴＥＲＴ細胞性免疫応答を、免疫応答の初回抗原刺激としてＤＮＡ  ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔおよび電気的刺激を用い免疫応答の最終追加抗原刺激としてＡｄ６  ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔを用いる多様化された初回／追加免疫化計画により誘導された免疫応答と比較した。
【０１４２】
１０匹のマウスの群をプラスミドｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔの５回の毎週の注射で免疫化した。１週間後、５０μｇのＤＮＡの１回の追加的な注射およびエレクトロポレーション（ＥＰ）よりなる、または１０１０  ｖｐのＡｄ６／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔでの追加注射を行った。生じた細胞性免疫応答を評価するために、マウスＰＢＭＣ上でＩＦＮγ細胞内染色を行った。ＴＥＲＴのＮ末端領域に既にマッピングされているＣＤ８＋  Ｔ細胞特異的エピトープｍＴＥＲＴ  １６７（ＡＹＱＶＣＧＳＰＬ；配列番号２０）を含むペプチドを抗原として使用した。結果は、ＤＮＡ−ＥＰ／Ａｄの組合せにより惹起された免疫応答の大きさは、ＤＮＡ−ＥＰ法のみの処理を受けたマウスにおいて観察されたものより４．６倍大きかったことを示している（図８を参照されたい）。
【実施例１１】
【０１４３】
ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ−ＬＴＢでのワクチン接種は腫瘍増殖を抑制する
ｍＴＥＲＴ特異的免疫応答が抗腫瘍効果をもたらしうるかどうかを判定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ワクチン接種前に、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により化学発癌物質ジメチルヒドラジンで処理した。この発癌物質でのマウスの処理は、異常な陰窩形成、腺腫および最終的な癌により特徴づけられる結腸内の進行性腫瘍発生を招く。ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔでの免疫化は、未処理マウスにおいて既に見出されているものに比較しうる免疫応答を惹起したため（データ非表示）、これらのマウスの化学的処理はそれらを免疫無防備状態にしなかった。
【０１４４】
ＤＭＨ誘発性発癌の初期段階に対する遺伝的免疫化の影響を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＤＭＨで処理し、図９に記載されている計画に従いｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔを使用して、ＤＮＡ処理およびそれに続くエレクトロポレーション（ＤＮＡ−ＥＰ）により免疫化した。
【０１４５】
ＤＭＨ処理の開始の１２週間後、２０匹のマウスを安楽死させて、形成したＡＣＦ（異常陰窩病巣）の数および腺腫の数を計数した。ワクチン接種されたマウスにおいては、未ワクチン接種マウスと比較して、存在するＡＣＦの数および腺腫の数の両方の有意な減少が観察された（図１０）。
【０１４６】
より後期の腫瘍発生に対するｍＴＥＲＴワクチン接種の効力もモニターした。ｍＴＥＲＴに対する免疫応答を増強し維持するために、マウスを、反復されるＤＮＡ−ＥＰ  ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔおよびＡｄ６ＴＰＡ−ｍＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔに付した（図１１）。これらのマウスにおいて惹起された免疫応答は、同じＤＮＡ／Ａｄ計画でワクチン接種されておりＤＭＨでは処理されていないＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて検出されたものに匹敵した。
【０１４７】
ＤＭＨ処理の開始の３０週間後、２０匹のマウスを安楽死させて、形成したＡＣＦ（異常陰窩病巣）および腺腫の数を計数した。初期段階の腫瘍発生で見られた結果と同様に、ワクチン接種されたマウスにおいては、未ワクチン接種マウスと比較して、ＡＣＦおよび腺腫の数の有意な減少が観察された（図１２）。
【０１４８】
最後に、ワクチン接種されたマウスにおいて見出された腫瘍は、未ワクチン接種マウスにおいて見出されたものと比較して、体積において、より小さかった（図１３Ａ）。さらに、ワクチン接種されたマウスにおいて存在する腫瘍は、未ワクチン接種動物における腫瘍と比較して、それほど進行していない段階のものであることを、組織学的分析は示した（図１３Ｂ）。
【実施例１２】
【０１４９】
ｐＶ１ＪＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔの特徴づけ
ｈＴＥＲＴに関してトランスジェニックであるマウスが入手できなかったため、ｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔの免疫原性能力を非自己コンテクストにおいて評価した。ヒトＨＬＡクラスＩのコンテクストにおいてＴＥＲＴ免疫原性ペプチドが提示されるよう、ヒトＨＬＡ−Ａ２に関してトランスジェニックであるＣ５７ＢＬ／６マウス（ＨＨＤトランスジェニックマウス）を使用した。ＨＨＤトランスジェニックマウスを５０μｇのプラスミドｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔの２回の隔週の注射でのＤＮＡ−ＥＰによりワクチン接種した。誘導された免疫応答をマウスＰＢＭＣ上でＩＣＳにより評価した。ｈＴＥＲＴ８６５エピトープＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（配列番号２３）に対応するｈＴＥＲＴ免疫原性ペプチドを免疫原として使用した。このエピトープ配列は、Ｔ細胞インビトロ感作実験におけるＣＴＬ活性の誘導物質およびＨＬＡ−Ａ２に対する強力な結合体として既に記載されている（Ｄｕｐｏｎｔら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５（１２）：５４１７−２７（２００５））。
【０１５０】
１０匹のマウスから得られた結果は、平均して、ＣＤ８＋細胞の１２％が、免疫原性ｈＴＥＲＴ８６５ペプチドで刺激された場合にＩＦＮγを産生することを示した（図１４）。結果は、ｐＶ１ＪＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔワクチン候補が免疫原性であり、ＨＬＡ−Ａ２拘束ＣＤ８免疫応答を誘導したことを示している。
【実施例１３】
【０１５１】
Ａｄ６−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）追加接種後のワクチン接種マウスにおける免疫応答の特徴づけ
Ａｄ６  ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）構築物を実施例２に記載のとおりに構築した。この構築物は、テロメラーゼ触媒活性を阻害するために付加された２つの変異以外は野生型コドンを含む。Ａｄ６  ｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ融合構築物も調製したが、レスキューできなかったため、更なる試験はＡｄ６ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）のみで行った。
【０１５２】
Ａｄ６  ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）構築物を、ＨＨＤトランスジェニックマウスにおいてＤＮＡ−ＥＰにより誘導された免疫応答に対するその追加抗原刺激能に関して試験した。１０匹のマウスの群を５０μｇのプラスミドｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔの１回の注射でのＤＮＡ−ＥＰによりワクチン接種し、この１回目のＤＮＡ注射の２週間後に、２回目のＤＮＡ注射またはＡｄ６  ｈＴＥＲＴ（１０１０  ｐｐ）のいずれかで追加接種した。誘導された免疫応答を、既に特定されているＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子ｈＴＥＲＴ８６５に関する免疫優性ペプチドを使用して測定した。ＩＦＮγを産生する反応性ＣＤ８＋  Ｔ細胞が高頻度で検出された。図１４に示されているとおり、ＤＮＡ−ＥＰ／Ａｄの組合せにより惹起された免疫応答の大きさは、ＤＮＡ−ＥＰ計画のみが適用されたマウスにおいて観察されたものより３倍大きかった。
【０１５３】
結果は、ｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）−ＬＴＢｏｐｔ  ＤＮＡの注射により初回抗原刺激されたｈＴＥＲＴ特異的免疫応答が、それをＡｄ６−ｈＴＥＲＴ（ＡＩ）で追加抗原刺激することにより増幅されることを示した。
【実施例１４】
【０１５４】
ｈＴＥＲＴでの免疫化により誘導されたＣＴＬ活性の特徴づけ
ワクチン接種されたマウスにおいて惹起されたｈＴＥＲＴに対するＣＤ８−  Ｔ細胞応答を、腫瘍標的細胞に対する活性化Ｔ細胞の細胞傷害性活性（ＣＴＬ）を試験することにより更に特徴づけした。免疫化マウスからの脾細胞を、ｈＴＥＲＴ８６５ペプチド（配列番号２３；実施例１２を参照されたい）およびＩＬ−２の存在下、培養内で６日間刺激した。ついで、活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、Ｃｒ５１遊離アッセイにおけるその細胞溶解活性に関して標的細胞に対して試験した。ＨＨＤマウス上に存在するキメラＭＨＣクラスＩ分子を発現するよう安定に形質導入されたＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ−ＨＨＤ）を標的細胞として使用した。ＨｅＬａ−ＨＨＤ標的細胞を免疫原性ペプチドｈＴＥＲＴ８６５で外的にローディングするか、あるいは２４時間前に、ｈＴＥＲＴをコードするＡｄ６ベクターに感染させて、該ＴＥＲＴ抗原を内因的に過剰発現させた。対照として、標的細胞を、ＧＦＰをコードするＡｄ６ベクターに感染させた。結果は、記載されているワクチン接種により誘導されたＣＤ８＋  Ｔ細胞が、ｈＴＥＲＴ抗原を過剰発現する標的細胞を殺すことが可能であったことを示している（図１５）。
【実施例１５】
【０１５５】
アカゲザルにおけるヒトＴＥＲＴワクチンの免疫原性の特徴づけ
ＤＮＡ初回接種、Ａｄ追加接種（ｈＴＥＲＴを伴う）に基づく遺伝的ワクチン接種方式の免疫原性をアカゲザルにおいて評価した。ヒトＴＥＲＴおよびアカゲザルＴＥＲＴ配列の相同性は９６％であるため、ワクチン接種の効力の決定において寛容が主な役割を果たしていると予想された。
【０１５６】
該ワクチン接種プロトコールは、２週間ごとに投与されるＤＮＡ−ＥＰ（ｐＶ１Ｊ／ＴＰＡ−ｈＴＥＲＴ−ＬＴＢ，５ｍｇ／注射）の５回の注射よりなるものであった。最終のＤＮＡ−ＥＰ処理の４週間後、ｈＴＥＲＴを発現するＡｄベクター（Ａｄ６−ｈＴＥＲＴ，１０１１  ｖｐ）で、２週間間隔で２回、サルを追加抗原刺激した。体重および臨床徴候に関するデータを毎週集めた。動物の体重または臨床徴候の出現に対する負の効果は観察されなかった。
【０１５７】
実施例７に記載されているものに類似したｈＴＥＲＴペプチドプールおよびＬＴＢ配列に及ぶペプチドプールを使用するＰＢＭＣのＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、誘導された免疫応答をモニターした。得られたシグナルがバックグラウンド反応性（ＤＭＤＯ）より少なくとも４倍高い場合に、免疫応答を陽性と評価した。誘導されたＣＭＩのＥＬＩｓｐｏｔ分析は、ワクチン接種されたサル４頭のうちの４頭において、最初の２回のＤＮＡ−ＥＰ処理の後に、検出可能な免疫応答が存在することを示した（図１６Ａ）。５回目のＤＮＡ−ＥＰの後、該応答の若干の増加が観察された（図１６Ｂ）。また、２回のＡｄ追加接種の後の、完全な免疫化プロトコールの終了時に、免疫応答を測定した。結果は、Ａｄ追加接種が、ＣＭＩの大きさにおける一貫した増加を誘導したことを示している（図１７）。したがって、異種の初回接種／追加接種方式の効力がこの実験により更に証明された。
【図１Ａ】
2010505433.tif 000003
【図１Ｂ】
2010505433.tif 000004
【図１Ｃ】
2010505433.tif 000005
【図１Ｄ】
2010505433.tif 000006
【図２Ａ】
2010505433.tif 000007
【図２Ｂ】
2010505433.tif 000008
【図２Ｃ】
2010505433.tif 000009
【図２Ｄ】
2010505433.tif 000010
【図３】
2010505433.tif 000011
【図４】
2010505433.tif 000012
【図５】
2010505433.tif 000013
【図６】
2010505433.tif 000014
【図７】
2010505433.tif 000015
【図８】
2010505433.tif 000016
【図９】
2010505433.tif 000017
【図１０】
2010505433.tif 000018
【図１１】
2010505433.tif 000019
【図１２】
2010505433.tif 000020
【図１３】
2010505433.tif 000021
【図１４】
2010505433.tif 000022
【図１５】
2010505433.tif 000023
【図１６Ａ】
2010505433.tif 000024
【図１６Ｂ】
2010505433.tif 000025
【図１７】
2010505433.tif 000026
【配列表】
2010505433000001.app
【国際調査報告】
2010505433.tif 000027
2010505433.tif 000028
2010505433.tif 000029
2010505433.tif 000030
2010505433.tif 000031