(57)【要約】  本発明は、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）によって引き起こされる感染の予防、治療及び診断のための物質及び方法に関する。より詳細には、本発明は、新規の特異的な可変抗体領域、その誘導体及び完全ヒト免疫グロブリンＡｂｂａ３に関する。Ａｂｂａ３は、ピロリ菌によって発現されるＢａｂＡ抗原に特異的な活性を示し、ＢａｂＡとフコシル化されたＡＢＯ／ルイスｂ血液型抗原（Ｌｅｂ）の結合に関して競合する。本発明はさらに、前記免疫グロブリンの産生、それらの単離、及び例えば疾患を引き起こすピロリ菌の検出における使用の方法に関する。本発明は、免疫感作療法、すなわち、ピロリ菌株によって引き起こされる病的感染を治療及び予防するための受動ワクチン接種にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢａｂＡタンパク質への特異性を有するヒトｓｃＦｖ抗体断片、とりわけルイスｂ抗原（Ｌｅｂ）との結合に関して競合するｓｃＦｖクローンを同定及び選択する方法であって、
ａ）ＢａｂＡによって媒介されたルイスｂ抗原と細菌の結合と競合する結合活性をその血清が示すピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染患者を選択するステップと、
ｂ）阻害陽性血清を有する患者の末梢血リンパ球から単離されたＲＮＡを単離して、抗体Ｖ領域をコードする遺伝子の増幅用に対応するｃＤＮＡを生成することによりファージディスプレイｓｃＦｖライブラリーを構築するステップと、
ｃ）ピロリ菌由来の精製された天然ＢａｂＡアドヘシンで前記ライブラリーをプロービングするステップと、
ｄ）ピロリ菌のＢａｂＡに特異的に結合するクローンを同定するステップと、
ｅ）前記クローンを完成させて、ＢａｂＡとの結合によってピロリ菌を中和する完全ヒトＩｇＧ１抗体を形成するステップと
を含む方法。
【請求項２】
粘膜部位を通して伝染するヒト感染症を予防する方法であって、
ａ）ピロリ菌によって発現されたＢａｂＡ抗原に特異的な活性を示す抗体断片又はその誘導体を発現する微生物を用意するステップと、
ｂ）経口投与を介して前記微生物を胃領域に送達して、粘膜上でのピロリ菌のコロニー形成を予防するステップと
を含む方法。
【請求項３】
ピロリ菌によって発現されたＢａｂＡ抗原に特異的な活性を示す精製及び単離された特異的な可変抗体結合領域又はその誘導体であって、前記誘導体が完全ヒト免疫グロブリンである可変抗体結合領域又はその誘導体。
【請求項４】
アミノ酸配列（配列番号１８）を有するＡｂｂａ３重鎖可変領域と、アミノ酸配列（配列番号１９）を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項３に記載の、ピロリ菌によって発現されたＢａｂＡ抗原に特異的な活性を示す精製及び単離された特異的な可変抗体結合領域又はその誘導体。
【請求項５】
ＤＳＭ１９１０１として寄託されている精製及び単離された抗体Ａｂｂａ３。
【請求項６】
糞便試料中のピロリ菌を検出するための検出キットであって、Ａｂｂａ３を含む抗体と結合した標識と組み合わせたイムノアッセイ技法を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）によって引き起こされる感染の予防、治療及び診断のための物質及び方法に関する。より詳細には、本発明は、ピロリ菌によって発現されるＢａｂＡ抗原に特異的な活性を示す新規の特異的な可変抗体領域、その誘導体及び完全ヒト免疫グロブリンＡｂｂａ３、並びに前記免疫グロブリンの産生、それらの単離、及び例えば疾患を引き起こすピロリ菌の検出における使用の方法に関する。本発明は、免疫感作療法、すなわち、ピロリ菌株によって引き起こされる病的感染を治療及び予防するための受動ワクチン接種にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロリ菌は、消化性潰瘍及び胃癌に進行しうる慢性胃炎を引き起こすヒト胃粘膜コロニーを形成するグラム陰性細菌である（６）。ピロリ菌は、胃粘膜への密接な接着性を与えるアドヘシンをその表面に発現し、それによって、これらの栄養要求性生物が宿主組織から栄養物を獲得するのを可能にする。ＢａｂＡアドヘシンは、外膜タンパク質のパラロガスファミリーのメンバーであり（２）、上皮細胞表面に発現されるフコシル化されたＡＢＯ／ルイスｂ血液型抗原に結合する（７、２２）。
【０００３】
高い割合の臨床分離株がＢａｂＡを発現することが示されているので、ＢａｂＡは潜在的なワクチン候補である（２２、２６、３３）。胃腸管では免疫活性が低いため、ピロリ菌に対する能動ワクチン接種は困難である。他の問題のひとつは、ピロリ菌の組換え率が高いことである。反対に、受動免疫感作は、Ａｂｂａ３抗体が抗原に結合して、ピロリ菌が粘膜に接着するのを困難にするため、より有利である。
【０００４】
最近の研究は、ＢａｂＡの発現と、消化性潰瘍及び胃癌の発症との間における有意な関連性も実証している（１６、３６）。現在、高度にＡＢＯ／ルイスｂフコシル化された糖化合物の送達による受動免疫療法の実現可能性が調査されている（１８、４３）。別法では、ピロリ菌に対するＩｇＧの経口投与によって（１１、２５）、又はストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）変異体に対する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を発現するラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の投与によって（３０）示されている通り、粘膜への接着性を妨害する抗体誘導体を経口投与するか、ｉｎ  ｓｉｔｕでＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）微生物によって産生させることができよう。ｓｃＦｖは、柔軟なペプチドリンカーによって連結された免疫グロブリンの可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）から成る遺伝子操作された抗体である。
【０００５】
胃の中の細菌は、それらに宿主特異的な環境条件が立ちはだかっているだけではなく、疾患進行中における粘膜のグリコシル化パターンの変化にも直面している。慢性かつ持続的な感染を確立する、ピロリ菌の驚くべき能力は、その異常に高い組換え率に起因する可能性が高い（１５）。
【０００６】
緊密な接着性と非接着性とを切り換えるピロリ菌の能力は、炎症組織から漏出する栄養物へのアクセスをこの細菌に与えるのみでなく、この細菌を炎症性の宿主反応に暴露するものでもある（３７）。
【０００７】
ＢａｂＡは、ＣＴリッチリーダー配列におけるフレームシフトベースの変動、遺伝子水平伝播、並びにｂａｂＢ及びｂａｂＣとの遺伝子転換によって、結合の柔軟性に寄与する（４、５、４０）。ｂａｂＢ及びｂａｂＣは、Ｎ末端領域及びＣ末端領域がＢａｂＡに密接に関連しているが、異なった遺伝子座に位置している外膜タンパク質（ＯＭＰ）である。ＢａｂＡは主としてｂａｂＡ遺伝子座で見出されるが、ｂａｂＢ遺伝子座に位置しているＢａｂＢとの遺伝子転換は、より弱いＢａｂＢプロモーターの制御下にある完全長ＢａｂＡか、ＢａｂＢとＢａｂＡとを区別する独自領域の上流に組換え部位を有するキメラＢａｂＡ／ＢａｂＢ遺伝子の形成をもたらす（１２）。組換えによって、ｂａｂＡ遺伝子座におけるＢａｂＢの存在がもたらされ、その後、感染したマカク及び患者におけるルイスｂ結合が減失することもある（１２、２０、４０）。第３の遺伝子座であるＢａｂＣは、以前には株２６６９５で記載されていたのみであったが、最近では、他の株でもＢａｂＡとの組換え交換に関与していることが示されている（１２、２０）。
【０００８】
Ｂａｃｋｓｔｒｏｍら（５）は、ルイスｂへのそれらの結合能を失った臨床ピロリ菌単離株のなかで、わずかな割合の微生物集団がＢａｂＢ／ＢａｂＡキメラを保持しており、ルイスｂコーティングされた磁性ビーズをｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いたパニングによって、ルイスｂ結合を再構成できたことを示している。これにより、炎症性の宿主反応の際に、細菌がグリコシル化パターンの変化に応答することが可能となる。遺伝子転換は、モザイクパターンのＢａｂＡの形成をもたらすが、ＣＢＤ（糖結合ドメイン）の変異は機能の減失をもたらし、それによって、感染の急性期におけるピロリ菌の生存の減失をもたらす。感染の急性期では、血液型抗原が上皮細胞で依然として高レベルで発現されている。
【０００９】
アカゲザルの実験的感染の終わりに、分析された株のｂａｂＡ遺伝子座にｂａｂＢが独占的に存在していたことによって、抗原性の変動が宿主免疫応答を回避するのに用いられているという仮説がもたらされた（４０）。患者血清中のピロリ菌抗原の抗原性は、２つの報告で試験されているが、タンパク質は２Ｄ分離の前に尿素で変性されたので、高次構造に依存した膜タンパク質を検出する可能性はかなり限定されていた（１９、２７）。
【００１０】
ポリクローナル抗ＢａｂＡ血清は、封入体から単離された組換えＢａｂＡを用いたウサギの免疫感作によって産生され（４４）、大部分の株のＢａｂＡを認識することが示されている。これまでに、２種のＢａｂＡ特異的モノクローナルｓｃＦｖが記載されており、それらは、アミノ酸１２８から３１０までのＢａｂＡ−Ｊ９９ドメインをカバーするＢａｂＡ−ＧＳＴ融合タンパク質を用いた、齧歯類の免疫感作によって産生されたものである（２１）。分析された株の約半分しか、ウエスタンブロット分析によって陽性とならなかったが、これはおそらく、モノクローナル抗体のエピトープが、ポリクローナル血清と比較して、より限定されていたためである。加えて、ＢａｂＡにおける、いかなる特定された機能的高次構造も有しない一部分のみを含有している組換えタンパク質で、記載のｓｃＦｖのファージ選択が行われた。
【００１１】
粘膜部位を通して伝染する感染症を予防する新規のアプローチは、乳酸桿菌又は他のＧＲＡＳ微生物による抗体断片のｉｎ  ｓｉｔｕ送達から成る（３０）。
【００１２】
ＢａｂＡアドヘシンは、以前に同定されており、ピロリ菌（ＳＥ９６０２２８７−６）の細菌表面に局在していることが示されている。血液型結合活性はｐＨ依存性であることが示された。また、本発明者らは、ルイスｂ受容体への結合親和性が高い平衡定数を示すという証拠を提示する。
【００１３】
ピロリ菌によって誘発される感染の免疫学的治療及び予防に、集中的な研究が向けられている。欧州特許第０４８４１４８号（Ａｎｄｏ及びＮａｋａｍｕｒａ）は、哺乳動物の上部消化管疾患を治療及び／又は予防する方法であって、抗ピロリ菌ポリクローナル免疫グロブリン及び薬学的に許容される担体を含む、有効量の医薬組成物を、それを必要とする患者に経口投与するステップを含む方法を記載している。この記載は、抗生物質の投与と併用した前記治療の組合せについて詳述している。前述のポリクローナル抗体を産生する方法として、欧州特許第０４８４１４８号は、哺乳動物の血清及び乳からの抗ピロリ菌免疫グロブリンの単離及び精製について記載している。欧州特許第０４８４１４８号によれば、ピロリ菌自体は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ又はウマの胃の中に見出されなかったが、これらの動物種は、それらがヒトで見出されるピロリ菌株と交差反応する免疫グロブリンを有するので、ピロリ菌のものに類似した抗原決定基を備えたコロニー形成微生物を有すると考えられた。欧州特許第０４８４１４８号によれば、大型哺乳動物（例えば妊娠中の雌ウシ）をピロリ菌の全細胞で免疫感作し、その後、乳又は初乳から免疫グロブリンを抽出することが好ましい。これらの免疫感作実験では、免疫グロブリンの産生を誘発するのに、ＮＣＴＣ株１１３６２及び臨床分離株ピロリ菌１５３番が使用された。その一方、ＮＣＴＣ株１１６３７は分析目的に使用された。免疫感作によって、日用量０．０１〜０．１ｇ／日の免疫グロブリン組成物が治療の成功に十分であるような規模の抗ピロリ菌力価が乳中に産生されると主張されている。しかし、主張されている０．０１〜０．１ｇ／日という間隔は、Ａｎｄｏ及びＮａｋａｍｕｒａが提示した実験によって支持されておらず、そのような低用量で効果があるとは、これまでに臨床試験で証明されていない。実施例５及び７で実際に用いられた用量は、１ｇ／日の桁、すなわち、示された間隔の上限の１０倍である。さらに、同様な用量は他の胃腸病原体に対して有効ではないので、Ａｎｄｏ及びＮａｋａｍｕｒａによって製造されたもののような、未特定の免疫グロブリン混合物が、主張されている用量で効果的である可能性は極めて低い。開示されている免疫グロブリンが不十分であることを、上記の記載で詳細に論じられている、抗生物質の同時投与が示している。
【００１４】
欧州特許第０４６９３５９号（Ｃｏｒｄｌｅ及びＳｃｈａｌｌｅｒ）も、同様に、ホルマリン殺菌されたピロリ細菌（ＡＴＣＣ株２６６９５）を用いた哺乳動物、好ましくは妊娠中の雌ウシの免疫感作について記載している。抗ピロリ菌ポリクローナル抗体を乳から単離及び精製し、最後に免疫グロブリン約０．５ｇの量で、毎日３回、子ブタにエサとして与えた。結果は、試験後にグラム陰性細菌に関して陽性であった生検材料の数を測定することによって評価した。グラム陰性細菌は、非免疫性の栄養物をエサとして与えられた子ブタの７８％で見出されたが、いわゆる特異的抗ピロリ菌抗体を含有する栄養物をエサとして与えられた子ブタでは３５％でのみ（原文通り）見出された。
【００１５】
本明細書の発明と同じ発明者らによる特許出願である米国特許出願公開第２００４０２３４５２９号は、ＢａｂＡタンパク質を開示するものである。前記アドヘシン及び／又はＤＮＡは、ピロリ菌によって誘発された感染、例えば胃炎及び酸消化性疾患に対して行われる診断並びに治療及び／又は予防に有用であり、すなわち能動ワクチン接種に有用である。彼らは、ピロリ菌によって引き起こされる消化管疾患を治療及び／又は予防するための免疫グロブリン組成物であって、ピロリ菌アドへシンに結合するルイスｂ抗原に対する特異的な活性を示す受動ワクチン接種用の免疫グロブリン組成物も開示している。本明細書の発明とは異なり、上記抗体は、特異的な選択されたヒト抗体ではなく、動物抗体である。さらに、米国特許出願公開第２００４０２３４５２９号の出願者は糞便試料での検出に言及していない。
【００１６】
ＢａｂＡの中心部は最も不均一であり、かつ受容体結合の特異性を決定するが（４、２２）、いまだにマッピングされていない糖結合ドメイン（ＣＢＤ）は、機能減失なしに高率の変異を導入することができない。それにもかかわらず、南米大陸で支配的な血液型抗原であるＯ−ルイスｂに選択的に結合する、南米の先住民から単離されたピロリ菌株（「スペシャリスト（Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔｓ）」株と呼ばれる）のＢａｂＡの適応は、進化の過程における微調整を示した。反対に、Ａ／Ｂルイスｂ血液型抗原が、より均等に宿主集団で現れる大陸から単離された株は、Ａ／Ｂルイスｂ（Ｏ−ルイスｂが含まれる）に対して、より普遍的な結合能を示し、それゆえ「ジェネラリスト（Ｇｅｎｅｒａｌｉｓｔ）」結合体と命名された（４）。ＢａｂＡ配列のアラインメントを行ったが、ジェネラリスト対スペシャリストに対応するいかなる特異的なｂａｂＡドメインもマッピングできなかった。したがって、本発明者らは、受容体結合部位への特異性を有する抗体の開発を目標とし、ファージディスプレイ技法を用いて、その血清がルイスｂへの競合的なＢａｂＡ結合特性を表した患者から抗体を濃縮した。
【００１７】
様々なペプチドに対する、末梢血リンパ球由来のヒトｓｃＦｖライブラリーをどのようにして産生するかは、当技術分野で既に知られている。ピロリ菌の変性された直鎖状の非天然ペプチドをどのようにして選択するかも知られている。しかし、以前のいかなる文献も、天然の変性されていない三次元のＢａｂＡポリペプチドの選択する選択法は記載していない。
【００１８】
ここに、本発明者らは、ピロリ菌感染患者の末梢血リンパ球から得られたヒトｓｃＦｖライブラリーを提示する。同定及び選択されたＢａｂＡ特異的ヒト単一鎖のひとつをヒトＩｇＧ１抗体に変換し、Ａｂｂａ３と命名した。Ａｂｂａ３  ｓｃＦｖは、可変結合領域を指し、これには、その誘導体が含まれる。驚いたことに、この抗体は、ピロリ菌臨床分離株の大部分に結合し、Ａ−ルイスｂ又はＢ−ルイスｂ血液型糖抗原、すなわち、世界中に最も一般的に分布している「ジェネラリスト」タイプのＢａｂＡが優先的に認識する糖抗原に類似した結合特性を示した。Ａｂｂａ３抗体は、ＢａｂＡに結合することによってピロリ菌を中和し、この細菌が粘膜に接着するのを困難にする。その結果、細菌／抗体複合体は、胃腸系から自然に消失する。胃管に存在する免疫活性は低いので、抗体検出は、抗原検出ほど有用ではない。したがって、糞便試料中のピロリ菌を検出するための、Ａｂｂａ３抗体を用いた検出キットが好ましい。Ａｂｂａ３は完全ヒトＩｇＧ１抗体であるので、それは、補体によって誘導された細菌溶解の活性化に効果的であり、したがって免疫系を活性化するのにも効果的であるという利点を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、本発明の目的は、受動ワクチン接種に使用するための、ピロリ菌のＢａｂＡに特異的に結合する能力について選択された抗体であるＡｂｂａ３を提供することである。糞便試料中のピロリ菌抗原を検出するためのＡｂｂａ３の使用も、本発明の目的である。さらに、本発明の目的は、ピロリ菌のＢａｂＡに特異的に結合する能力について、本明細書の発明に記載の方法を用いて選択された任意の抗体を提供することである。他の目的及び利点は、以下の開示及び添付されている特許請求の範囲によって、より完全に明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
病原体であるピロリ菌がヒト胃粘膜に接着するには、ピロリ菌外膜（ＨＯＰ）タンパク質ファミリーに属するアドヘシンが必要である。最も詳細に特徴付けられている相互作用は、ＢａｂＡアドヘシンと、糖化合物として胃腸（ＧＩ）の管壁に沿って発現されるフコシル化された血液型ＡＢＯ／Ｌｅｂ抗原との間の相互作用である。ここで、本発明者らは、ＢａｂＡタンパク質への特異性を有するヒトｓｃＦｖ抗体断片、とりわけルイスｂ抗原（Ｌｅｂ）との結合に関して競合するｓｃＦｖクローンの同定及び選択について記述する。ＢａｂＡによって媒介されたＬｅｂと細菌の結合と競合的な結合活性をその血清が示したピロリ菌感染患者を選択し、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離されたＲＮＡを用いて、ファージディスプレイｓｃＦｖライブラリーを構築した。精製されたピロリ菌由来の天然ＢａｂＡアドヘシンを用いてライブラリーをプロービングし、クローン（Ａｂｂａ３）を同定した。このクローンを完全ヒトＩｇＧ１抗体に完成させ、昆虫細胞で発現させた。Ｌｅｂとの競合的結合及び高次構造依存的なＢａｂＡ免疫エピトープとの結合は、天然の受容体、すなわちＡＢＨ／Ｌｅｂ抗原に類似した結合部位を示す。Ａｂｂａ３抗体は、Ａｓｐｈｏｌｍ−Ｈｕｒｔｉｇら、２００４年によって記載されたジェネラリスト（ＡＢＯ／Ｌｅｂ抗原）結合特性を有するピロリ菌株に優先的に結合した。これは、ジェネラリストタイプのＢａｂＡとスペシャリストタイプのＢａｂＡとの間の構造上及び高次構造上の相違を示唆している。
【００２１】
ＢａｂＡに結合することによってピロリ菌を中和して、この細菌が粘膜にコロニー形成することを困難にし、その結果、Ａｂｂａ３／ＢａｂＡ複合体が胃腸管から自然に消滅するＡｂｂａ３抗体を本発明者らは同定した。Ａｂｂａ３は、非免疫原性であるという利点を有する完全ヒト抗体であり、かつＩｇＧ１アイソタイプは、免疫エフェクター機能の活性化に効果的である。Ａｂｂａ３  ｓｃＦｖは、可変結合領域を指し、これには、その誘導体が含まれる。さらに、糞便試料中のピロリ菌を検出するための、Ａｂｂａ３抗体及び誘導体を用いた検出キットを開示する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＢａｂＡ結合に関してＥＬＩＳＡで分析された、個々のファージミド保持クローンによって発現されたｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合タンパク質を示す図である。検出は、抗ｐＩＩＩ  ｍＡｂで行った。括弧内の名前は、配列決定の後にクローンに与えられた。陰性対照である、同じファージミドベクター内にクローニングされた無関係な抗ｐｈＯｘ  ｓｃＦｖも、同じく検出された。
【図２】単離されたＢａｂＡ−結合体の予測ＶＨアミノ酸配列（ａ）及びＶＬアミノ酸配列（ｂ）と、それらに最も近縁なヒト生殖系列Ｖ遺伝子との配列比較を示す図である。（ａ）ＶＨ鎖がそれらの生殖系列遺伝子と比較して多数の変異を有することは、親和性成熟を示している。クローン５及び６のＶＨ配列は、ＦＲ２領域における１アミノ酸置換のみで、Ａｂｂａ３配列と異なっている。ダッシュは配列同一性を示し、点は配列中のギャップを指す（クローンＣ４のＶＨ：ＩｇＨＶ３−４８＊３、ＩｇＨＤ−１９＊０１、ＩｇＨＪ４＊０２；クローンＣ５のＶＨ：ＩｇＨＶ１−１８＊０１、ＩｇＨＤ３−１０＊０２、ＩｇＨＪ４＊０２）。Ａｂｂａ３−ＶＬは、生殖系列遺伝子ＩｇＫＶ１−３９＊０１及びＪセグメントＩｇＫＪ１＊０１から生じた。クローン６及びクローンＣ５は、同じ生殖系列及びＪ−セグメント（ＩｇＫＪ４＊０１）から発しているので、同じ前駆体から生じた可能性が最も高い。クローン５のＶＬは、ＩｇＫＪ１＊０１との組換えによって、生殖系列遺伝子ＩｇＫＶ２−３０−１から生じた。
【図３】ｓｃＦｖ−Ａｂｂａ３がピロリ菌株１７８７５／Ｌｅｂには結合するが、ＢａｂＡ遺伝子がノックアウトされている対応株ｂａｂＡ１Ａ２変異株には結合しないことを示す図である。ＩＭＡＣ精製されたｓｃＦｖ−Ａｂｂａ３をＰＢＳ中に連続希釈し、対応株でコーティングされたＥＬＩＳＡウェル上でインキュベートした。結合は、抗ｍｙｃタグｍＡｂ（９Ｅ１０）及びＨＲＰ結合抗マウスＡｂを用いて検出した。
【図４】ＳｃＦｖ−Ａｂｂａ３は、ピロリ菌株１７８７５／Ｌｅｂ溶解物由来のＢａｂＡを認識するが（レーン１）、ＢａｂＡの二重ノックアウト株ｂａｂＡ１Ａ２の溶解物とでは可視的なバンドがない（レーン２）ことを示す図である。株１７８７５／Ｌｅｂ溶解物由来のＢａｂＡは、強度な変性条件下でさえ認識される。（レーン３〜６）。対照的に、株１７８７５／Ｌｅｂから精製されたＢａｂＡは、このタンパク質が穏やかに処理された場合にのみ認識され（レーン７）、メルカプトエタノールの添加及び熱処置の後では、エピトープが破壊されている（レーン８）。これは、細菌溶解物中の安定化タンパク質の存在を示唆する。レーン１：非還元のピロリ菌溶解物（５μｌの株１７８７５／Ｌｅｂ、ＯＤ１．０）；レーン２：非還元の株ｂａｂＡ１Ａ２（５μｌ、ＯＤ１．０）；レーン３〜レーン６：強度に還元されたピロリ菌１７８７５／Ｌｅｂ溶解物（それぞれ１２μｌ、５μｌ、１μｌ、０．２μｌ、ＯＤ１．０；２．５％メルカプトエタノール、３％ＳＤＳ、及び９６℃で１５分間加熱）；レーン７：非還元の、株１７８７５／Ｌｅｂ由来の精製ＢａｂＡ（５００ｎｇ）；レーン８：還元された、株１７８７５／Ｌｅｂ由来の精製ＢａｂＡ（５００ｎｇ）。
【図５】ＩｇＧ−Ａｂｂａ３及びｓｃＦｖ誘導体がピロリ菌上での結合に関してＢａｂＡ受容体Ｌｅｂと競合することを示す図である。ピロリ菌株１７８７５／Ｌｅｂを、様々な量の競合物質の存在下で、一定量の放射標識ＨＳＡ−ルイスｂ結合体と共にインキュベートした。相対的親和性は、ピロリ菌株１７８７５／Ｌｅｂへの放射標識ルイスｂの結合を５０％に低減するのに必要な競合物質の量で表した（本文を参照）。抗体Ａｂｂａ３（４７ｐＭ）の相対的親和性は、ｓｃＦｖ  Ａｂｂａ３（２４７ｐＭ）より５倍高いことが明らかになった。Ｅ１−ＨＣＶエンベロープタンパク質への特異性を有する対照抗体、及びハプテン２−フェニルオキサゾロンへの特異性を有するｓｃＦｖは、Ｌｅｂ結合に関して競合しなかった。
【図６】Ａｂｂａ３−Ａｂによるピロリ菌株１７８７５／ＬｅｂのＢａｂＡ染色を示す電子顕微鏡写真を示す図である。細菌をヒト抗体と共にインキュベートし、結合画分をプロテインＡ標識された金で検出した。ピロリ菌株１７８７５／Ｌｅｂとの抗体Ａｂｂａ３−Ａｂのインキュベーション（Ａ、Ｂ）；ピロリ菌株ＤＭとの抗体Ａｂｂａ３のインキュベーション（Ｃ）；ピロリ菌株１７８７５／Ｌｅｂとの無関係な抗体（抗Ｅ１  ＨＣＶエンベロープ）のインキュベーション（Ｄ）。
【図７】ＥＬＩＳＡによる、様々なピロリ菌臨床分離株と結合する、Ａｂｂａ３−抗体の能力（Ａ）を示す図である。（Ａ）機能的ＢａｂＡ−発現があるかどうか、臨床ピロリ菌単離株をＥＬＩＳＡで試験した。コーティングされた株をビオチン−Ｌｅｂ結合体でプロービングし、ＡＰストレプトアビジンで検出した。（Ｂ）同じコーティング条件を用いて、ＡＰ結合抗ヒト抗体で検出することによって、Ａｂｂａ３−ＩｇＧ１結合を試験した。Ａｂｂａ３−ＩｇＧは、合計で、分析された株の７９％（５２株のうちの４１株）に結合した。スペシャリスト株は↑で印をつけている。
【図８】イムノブロットで、様々なピロリ菌臨床分離株からのＢａｂＡを認識する、Ａｂｂａ３−抗体の能力を示す図である。プレートからピロリ菌コロニーを擦り取り、ＰＢＳで２回洗浄し、０．６のＯＤに標準化する。ＳＤＳで可溶化した培養抽出物を３７℃でインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ニトロセルロース膜に転写する。検出は、Ａｂｂａ３−ＩｇＧ（６μｇ／ｍｌ）及びそれに続くＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧを用いて行った。２つの代表的なブロットを示す。
【図９】図１のＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット結合データをグラフ表示する図である。ジェネラリストのルイスｂ結合特性を有するほとんどすべての株がＡｂｂａ３抗体によって認識されたが（３１株のうちの３０株）、スペシャリストのルイスｂ結合特性を有する株の約半分（２１株のうちの１１株）のみが結合した。フィッシャーの正確確率検定は、ｐ＜０．０００２という信頼値の統計的有意性を示す。
【図１０】ＥＬＩＳＡとイムノブロットによるＡｂｂａ３抗体の結合分析を要約する表である。様々な株に対するＥＬＩＳＡ結合とイムノブロット結合との間で異なった一貫性を認めることができる。列５は、Ａｓｐｈｏｌｍ−Ｈｕｒｔｉｇら（４）による、Ｌｅｂ結合とＡ−Ｌｅｂ結合との間の比率を示す。２．５より大きい値を、スペシャリスト結合体として分類し、太字で表示した。（４）及びこの公開によって決定された株から得られたＢａｂＡ遺伝子配列の受入番号を列６に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ＢａｂＡに関して血清陽性なドナーの選択
ピロリ菌に感染した３６人のスウェーデン人患者から得られた血清を、１２５Ｉ標識されたアルブミンに多価結合したＬｅｂ（Ｌｅｂ結合体）がピロリ菌株１７８７５／Ｌｅｂ細菌に結合するのを阻害するそれらの能力に関して試験した。ほとんどすべての患者は、低い阻害力価を示した（平均で１：５０）。しかし、６種の血清は、高力価のＬｅｂ阻害を示し（１：３５５から１：８３６１）、これらを、２株のスウェーデン株（Ｓｗ７、Ｓｗ４４）、１株のペルー株（Ｐ４３６）１株のアラスカ株（Ａ７１４）１株のスペイン株（Ｓ８６３）１株の中国株（Ｃｈ１）及び１株の参考株Ｊ９９（３）を用いた、Ｌｅｂ結合の阻害に関してさらに試験した。これらの血清のうち３種は、これらの株の大部分に対して高い阻害力価を示した（データは示されていない）。
【００２４】
Ｖ遺伝子レパートリー及びｓｃＦｖ−ライブラリーの産生
阻害陽性血清を有する３人の患者からのＰＢＬからＲＮＡを単離し、対応するｃＤＮＡを生成し、抗体Ｖ領域をコードする遺伝子の増幅に使用した。優勢なクローンの優先的増幅による偏りを避けるために、各患者からのＶＨ領域及びＶＬ領域をファミリー特異的プライマーで別々に増幅した。各患者からのＶｌカッパ領域をプールし、ファージミドベクターｐＳＥＸ８１にクローニングし（８）、その結果、それぞれ約７×１０５の独立なクローンを含有する３つのカッパＶＬサブライブラリーを得た。２０の個別なクローンの配列決定は、完全な多様性を示した。各患者の増幅されたＶＨ領域を、対応するＶＬカッパサブライブラリーにクローニングし、その結果、それぞれ約７×１０６の個別なクローンを有する３つの別々なｓｃＦｖライブラリーを得た。ライブラリーの品質管理のために、ｐＩＩＩドメインに対するｍＡｂ（４１）を用いて、ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合タンパク質の完全長発現をウエスタンブロットで分析した。１５の個別なクローンのうち６クローンがｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合タンパク質を発現していたので、ライブラリーの実際のサイズは、それぞれ３×１０６の機能的クローンを含むものと推定された。
【００２５】
特異的な結合体についてのパニング
ヘルパーファージと共に過剰感染させることによって、３通りのライブラリープールに由来するファージ粒子を産生し、ＢａｂＡコーティングされたイムノチューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）で３ラウンドのパニングにかけた。ＢａｂＡ特異的な結合体の増加をモニターするために、これらのファージをＢＳＡコーティングされたイムノチューブでの選択にもかけた。ＢＳＡでブロックされたのみのイムノチューブから溶出されたファージに対する、ＢａｂＡコーティングされたイムノチューブから溶出されたファージの比率によって測定される濃縮係数は、パニングの第２ラウンドでは５５であり、パニングの第３ラウンドでは２３８１であることが示された。パニングの第３ラウンドの後に得られた単一のクローンをｓｃＦｖ−ｇＩＩＩ融合タンパク質として発現させ、ＢａｂＡに結合するものを得るために、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。分析された２４クローンのうち、１４クローンは、ＢａｂＡに特異的に結合することが明らかになった。図１は、ファージミドで発現された単一クローンのスクリーニングＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【００２６】
配列分析は、ひとつのクローンの優勢な（６倍）出現、及び同様なＶ領域の組合せを示し、それゆえ、これをＡｂｂａ３（抗ｂａｂＡ）と命名した（図２）。ＩＭＧＴデータベースに対するＡｂｂａ３−ＶＨ領域のスクリーニングによって、それが、ＤセグメントＩｇＨＤ２−１５＊０１及びＪセグメントＩｇＨＪ４＊０３との生殖系列遺伝子ＩｇＨＶ３−４８＊３の組換えによって生成されたことが判明した。他の代表的な結合体のＶＨ−領域は、それらが異なった生殖系列遺伝子から生じたか、又は異なったＤセグメント若しくはＪセグメントと組換えが起こったものなので、異なったＢ細胞前駆体から生じたものであった（図２の説明を参照）。Ａｂｂａ３  ＶＬ鎖は、ＪセグメントＩｇＫＪ１＊０１とのＶＬ生殖系列遺伝子ＩｇＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１の組換えによって生じた。同様に、他の結合体のＶＬ領域は、異なったＶＬセグメント及びＪセグメントから組換えが起こったものなので、異なったＢ細胞前駆体から生じたものであった。
【００２７】
固定された株１７８７５／Ｌｅｂでも、パニングの第２ラウンドから得られたファージをパニングし、ＢａｂＡリガンド、すなわち通常のトリエチルアミン緩衝液の代わりにＬｅｂを用いてアフィニティー溶出し、その結果、Ａｂｂａ３クローンの排他的な選択を得た（データは示されていない）。
【００２８】
Ａｂｂａ３の結合特異性
優勢なｓｃＦｖ  Ａｂｂａ３を原核細胞発現ベクターにサブクローニングし、ｃ−ｍｙｃに対するモノクローナル抗体での検出及びＩＭＡＣ精製を可能にした（１３、１４）。ｓｃＦｖ−Ａｂｂａ３が細菌表面のＢａｂＡを認識できるかどうか試験するために、固定されたピロリ菌を用いたＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った。Ａｂｂａ３−ｓｃＦｖの連続希釈は、ピロリ菌株１７８７５／Ｌｅｂには結合するが、対応する陰性対照株ＤＭ、すなわち機能的ＢａｂＡ遺伝子（ＢａｂＡ２）だけでなく、転写されないＢａｂＡ遺伝子（ＢａｂＡ１）もノックアウトされている株（２２）には結合しないことを示した（図３）。イムノブロット分析は、Ａｂｂａ３−ｓｃＦｖが、細菌溶解物中の予測された分子量のバンドと、株１７８７５／Ｌｅｂから精製されたタンパク質とを認識したので、Ａｂｂａ３−ｓｃＦｖの特異性をさらに立証した（図４）。興味深いことに、記載されているルイスｂ結合特性（２２）と同様に、精製されたＢａｂＡタンパク質が穏和な条件下で処理されていた場合にのみ特異的認識が起こり、還元剤での処理及び９６℃への加熱は、Ａｂｂａ３のエピトープを破壊した（図４、レーン８）。これは、強度の還元及び変性条件でさえ、ウエスタンブロットにおけるｓｃＦｖの結合を消滅させなかった、ピロリ菌１７８７５／Ｌｅｂ溶解物からのＢａｂＡの認識と対照的である。これはおそらく、ＢａｂＡと、精製後のタンパク質調製物には存在しない他の安定化タンパク質との間の複合体形成に起因する可能性がある。ＢａｂＡのＣ末端領域には複数のＮ−グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）が位置しているので、細菌溶解物中の二重バンドの出現は、異なったグリコシル化パターンに起因する可能性がある。
【００２９】
安定性、結合活性及びより優れた取り扱いの容易さを得るために、他に記載されている発現ベクターを用いて、ｓｃＦｖを完全ヒトＩｇＧに変換した（２４）。Ａｂｂａ３抗体を昆虫細胞内で産生させたところ、ＥＬＩＳＡプレート上でコーティングされた細菌への無制限な結合を示し、これは複数の融解サイクルを経ても減失しなかった（データは示されていない）。ルイスｂとの競合的結合があるかどうか試験するために、Ａｂｂａ３−ｓｃＦｖ及びＡｂｂａ３−抗体を連続希釈し、一定量の放射標識ルイスｂの存在下でピロリ菌株１７８７５／Ｌｅｂと共にインキュベートした。ルイスｂ結合をその最大値の半分に低減するのに十分な、ｓｃＦｖ及びＩｇＧ抗体の濃度は、それぞれ０．２５μＭ及び４７ｐＭであると測定された。無関係のｓｃＦｖ（ハプテン２−フェニルオキサゾロンに対して産生されたもの）（３１）又は組換え産生された無関係なアイソタイプ一致ヒトモノクローナル抗体（ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１に対して産生されたもの（２３））を用いた場合には、ルイスｂ結合の阻害は観察されなかった（図５）。ピロリ菌株１７８７５／Ｌｅｂ上でのＡｂｂａ３−抗体のインキュベーションは、電子顕微鏡検査における細菌外膜上のＢａｂＡの染色を示すことができたが、対応するＢａｂＡノックアウト株ＤＭとのインキュベーションは示さなかった。追加の陰性対照であるアイソタイプ一致ヒト抗体は、ＢａｂＡを発現するピロリ菌株１７８７５／Ｌｅｂでいかなる染色も示さなかった（図６）。
【００３０】
ピロリ菌単離株に対する反応性
世界中の臨床ピロリ菌株の間での、ＢａｂＡにおけるＡｂｂａ３免疫エピトープの優勢について試験するために、本発明者らは、代表的な株を用いた完全なシリーズのＥＬＩＳＡ及びイムノブロット試験を行った。Ａｂｂａ３分析には、機能的なＢａｂＡタンパク質を発現するこれらのピロリ菌株のみを考慮した。それゆえ、本発明者らは、株が血液型抗原に結合する能力に関して、ＥＬＩＳＡ結合アッセイでそれらを試験した（図７ａ）。同じＥＬＩＳＡ条件を用いて、同じ株をＡｂｂａ３結合に関して試験した（図７ｂ）。イムノブロット分析は、「穏やかなプロトコール」に従って、すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離の前に、還元条件を用いず、かつ低温によって処理されたピロリ菌全細胞抽出物を使用することによって行った（２２）（図８）。表１は、使用された臨床分離株の結合特性、すなわち、Ｌｅｂリガンド及びＡｂｂａ３−抗体への結合能を要約する。加えて、対応するｂａｂＡ遺伝子の受入番号を示す。Ａｂｂａ３抗体は、上記シリーズのＡＢＯ／Ｌｅｂ抗原に結合するピロリ菌株（（４）によってジェネラリスト（Ｇｅｎｅｒａｌｉｓｔ）と定義されている）からのＢａｂＡを最も良く認識するが、Ａｂｂａ３抗体は、スペシャリスト（ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ）株（スペシャリスト）からのＢａｂＡを、より低い効率で認識することが判明した（図９）。Ａｂｂａ３−Ａｂは、ジェネラリスト株の大部分（３１株のうち３０株）に結合したが（日本株Ｊ５０７は例外であった）、２１株のスペシャリスト株のうちの１１株のみが、Ａｂｂａ３−Ａｂによって認識された（Ｓｗ６０、Ｓｗ１０３、Ｐ３０２、Ｐ３０４、Ｐ３０８、Ｐ３２６、Ｐ３３０、Ｐ４４５、Ｐ４４９、Ｐ４５４、Ｐ４５５）。
【００３１】
Ａｂｂａ３抗体が、スペシャリストと比較して、ジェネラリストに優先的に結合するのは、それぞれＡ−ルイス及びＢ−ルイス血液型糖抗原の、より嵩高なＧａｌ及びＧａｌＮＡｃ末端基を反映する、抗体のパラトープに起因する可能性がある。（Ｈｅｎｎｉｎｇら、２００４年）に記載された抗体と比較して、Ａｂｂａ３抗体の結合がより優勢であるのは、受容体の競合的な結合特性、及びその結果であるより保存されたエピトープ認識に起因する可能性がある。高親和性抗体の選択の成功は、特定の抗体結合特性を有する適した患者血清の徹底的なスクリーニングに基づくと本発明者らは考える。
【００３２】
さらに、固定された抗原がその受容体への結合を保持する条件下でファージ選択を行った。この条件は、固定されたＢａｂＡの、ビオチン化ルイスｂとの結合をイムノチューブ内で試験することによって確かめられる（データは示されていない）。ピロリ菌感染患者由来の免疫レパートリーの利用及び救出のためにファージディスプレイを適用することは、特定の特徴を有するモノクローナル抗体を選択するのに奏功することが立証された。ドナーはすべてスウェーデン人であったので、ジェネラリスト株に感染していた可能性が高く、抗体可変領域はファージディスプレイライブラリーの構築用に再編されているが、機能の再構築の尤度は明らかに十分であった。
【００３３】
免疫活性は胃腸管では限定的なので、受動免疫感作が好ましい。Ａｂｂａ３抗体はＢａｂＡに結合して、ピロリ菌が胃粘膜に結合するのを防止する。
【００３４】
抗体が動物由来である場合、アレルギー反応により、受動免疫感作に関連した合併症がときどき起こる。Ａｂｂａ３抗体はヒト抗体であるので、副作用の危険性は低減している。
【００３５】
胃腸管の免疫活性は限定的であるため、抗体の検出によってピロリ菌感染を診断する可能性が制限されている。この理由で、検出は、糞便試料中で行うことが好ましい。
【００３６】
粘膜部位を通して伝染する感染症を予防する新規のアプローチは、乳酸桿菌又は他のＧＲＡＳ微生物による抗体断片のｉｎ  ｓｉｔｕ送達から成る（３０）。したがって、Ａｂｂａ３及びＢａｂＡに対する特異性を有するその断片を使用して、粘膜上でのピロリ菌のコロニー形成を予防することができる。
【００３７】
さらに、ますます増加している証拠によって、冠動脈疾患の発病機序におけるピロリ菌の関与が示唆されている（２９）。非ヒト抗体と比較して、Ａｂｂａ３抗体は、免疫原性反応を誘発しない完全にヒト由来のものであり、ＩｇＧ１型は、補体によって誘導される細菌溶解の活性化に効果的であり、したがって、免疫系のエフェクター機能を活性化するのに効果的であるという利点を有する。
【実施例】
【００３８】
（実施例１）
ＢａｂＡ−抗体に関して陽性なドナーの選択
ピロリ菌に感染した３６人のスウェーデン人患者から得た血清を、ピロリ菌株ＣＣＵＧ１７８７５に結合した放射標識ルイスｂ−ＨＳＡ（１７８７５／Ｌｅｂ）の結合を阻害するそれらの能力に関して試験した。ペレットの回収をより容易にするために、０．１のＯＤを有する細菌株１７８７５／Ｌｅｂを、Ｌｅｂへの結合能を失っている細菌株１７８７４で１：６０に希釈した。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％トゥイーン２０、１％ＢＳＡ）中に血清の連続希釈を行い、放射標識ルイスｂ−ＨＳＡ結合体（０．０１ｎｇ／μｌ）５０μｌを最終容積５００μｌに添加した。細菌５００μｌを添加した後、チューブをＲＴ（室温）で１７時間、穏やかに混合した。試料を遠心処理し（１３０００ｇ、１３分間）、その後、ペレット及び上清の放射能を測定し、相互に相関させて、結合体及び遊離結合体を表すものとした。試験した血清の相対力価は、いかなる血清も存在しない状態での結合体の結合によって測定した結合を最大値の半分に低減するのに十分な濃度であった。最も高い力価を有する６種の血清を、７株のピロリ菌臨床分離株（Ｓｗ７、Ｓｗ４４、Ｐ４３６、Ａ７１４、Ｓ８６３、Ｃｈ１（本明細書に記載）及びＪ９９（３））への放射標識ルイスｂ抗原結合の阻害に関してさらに試験した。
【００３９】
（実施例２）
ヒト可変領域のｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ増幅
１０ｍｌの患者血液の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール勾配で単離し、標準プロトコール（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）所在）を用いて全ＲＮＡを抽出した。第１鎖ｃＤＮＡは、オリゴ−ｄ（Ｔ）プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、英国バッキンガム（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ）所在）を用いて合成し、ｃＤＮＡ  １μｌ、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１０×反応緩衝液５μｌ、ポリメラーゼ（ＢＤ−Ａｄｖａｎｔａｇｅ２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）所在）１Ｕ、及び適切なファミリーベースのセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（５００ｎＭ）を含有する反応液５０μｌ中で、３６サイクル（９４℃での変性１５秒、６５℃でのアニーリング３０秒、７２℃で３０秒）を用いて、ヒト可変免疫グロブリン遺伝子をＰＣＲ増幅した。センスプライマー及びアンチセンスプライマーは他に記載されている（３１、４２）。可変カッパ軽鎖の増幅用には、センスプライマーが、ＭｌｕＩクローニング部位を導入するために、ＴＡＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＧＴＡ（配列番号１）という配列によって５’末端で伸長しており、アンチセンスプライマーが、ＮｏｔＩ部位を導入するために、ＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧ（配列番号２）という配列によって伸長している。可変重鎖増幅用には、センスプライマーがＧＡＡＴＡＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧ（ＮｃｏＩ）（配列番号３）という配列によって伸長し、アンチセンスプライマーがＣＡＧＴＣＡＡＧＣＴＴ（ＨｉｎｄＩＩＩ部位）（配列番号４）という配列によって伸長している。アンチセンスプライマーは、それぞれ、ＣＨ１及び定常カッパ領域の５’末端とアニールする。すべての増幅は、ファミリー特異的なセンスプライマーそれぞれに関して独立に行った。ＰＣＲ産物をプールし、ゲル抽出し（Ｑｉａｇｅｎ社）、可変軽鎖用にはＭｌｕＩ／ＮｏｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で消化し、可変重鎖のクローニング用にはＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化の後、断片を再度ゲル精製し、−２０℃で保存した。
【００４０】
（実施例３）
ｓｃＦｖライブラリーの構築
ファージミドベクターｐＳＥＸ８１−ｐｈＯｘ（８）を、ＣＩＰ存在下でＭｌｕＩ／ＮｏｔＩで消化し、０．７％アガロースゲル中で分離し、抽出した（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ所在）。消化されたベクター１００ｎｇを、精製された可変軽鎖１０ｎｇと、１Ｕのリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、最終容積４０μｌ中、１６℃で終夜、連結した。プラスミドＤＮＡをエタノールで沈殿させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にエレクトロポレーションで導入し、細菌を１ｍｌのＳＯＣ培地（０．１Ｍグルコースを含有するＬＢ）中で１ｈ培養して回復させた。その後、細菌をＳＯＢＧＡＴプレート（０．１Ｍグルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン）上にプレーティングし、３７℃で終夜インキュベートした。クローンを擦り取り、ベクターＤＮＡを陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  ＆  Ｎａｇｅｌ社、ドイツ所在）で単離した。可変重鎖のクローニングには、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）でベクターＤＮＡを消化し、適切に消化されたＶＨ鎖を連結し、ＸＬ−１  ｂｌｕｅを形質転換させて、上述の通り培養した。独立したクローンを擦り取り、２５％グリセリン中で８０℃に保存し、最終ｓｃＦｖ−ライブラリーとした。
【００４１】
（実施例４）
ファージディスプレイ選択
ファージに結合した抗体は、本質的にはＳｃｈｉｅｒら、１９９６年による記載の通りにライブラリーから回収した（３９）。パニングは、精製されたＢａｂＡ（スウェーデンウメオ（Ｕｍｅａ）大学口腔生物学科）５μｇで終夜、コーティングされたＭａｘｉｓｏｒｂ（登録商標）イムノチューブ（Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）（Ｎｕｎｃ社、ドイツヴィースバーデン（Ｗｉｅｂａｄｅｎ）所在）中で、４℃で行い、２％ＭＰＢＳ（２％（ｗ／ｖ）低脂肪乾燥スキムミルクを含有するＰＢＳ）でブロッキングした。ＢＳＡでコーティングされたチューブを陰性対照として用いた。選択には、４％の乳（ｗ／ｖ）を含有する等容積のＰＢＳを添加して、ファージ（１０１２コロニー形成単位）をブロッキングし、チューブに添加し、定常的な回転の下、室温（ＲＴ）で２ｈインキュベートした。その後、この溶液を廃棄し、パニングの第１ラウンドにおいて、ＰＢＳでチューブを１０回洗浄した。パニングのラウンドを進行させながら、ＰＢＳ／０．１％トゥイーン２０で１０回ボルテックスすることによって、洗浄のストリンジェンシーを増大させた。結合したファージは、５分間、穏やかに撹拌しながらトリエチルアミン（０．１Ｍ）１ｍｌを添加し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４（１Ｍ）０．５ｍｌで中和して溶出した。中和された混合物を用いて、２ＹＴ（１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン）中、３７℃で培養された２０ｍｌの指数期の大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを感染させた。振盪させずに３７℃で１５分間インキュベートした後、細菌を４５分間振盪させ、ＳＯＢＧＡＴ−プレート（上記参照）上にプレーティングし、３７℃で終夜インキュベートした。記述した通りに細菌を採取し、０．４のＯＤで、１０ｍｌのＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、０．１Ｍグルコース）に接種することによって、以降のパニングラウンド用のファージ産生を行った。本質的にはＫｏｃｈら、２０００年（２８）の記載通りに、ヘルパーファージゲノム又はファージミドゲノムを含有する溶出ファージの力価を、それぞれＬＢカナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）プレート又はＬＢアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）プレート上でのｃｆｕの力価測定によって決定した。選択手順中における特異的な結合体の濃縮は、ＢａｂＡコーティングされたイムノチューブから溶出されたファージの数を、ＢＳＡコーティングされたイムノチューブから溶出されたファージの数で割ることによって決定した。
【００４２】
（実施例５）
ｓｃＦｖ−ｇＩＩＩ融合タンパク質を用いたＥＬＩＳＡスクリーニング
ＢａｂＡ特異的なｓｃＦｖは、ファージミドベクター中にコードされているｐＩＩＩ−タンパク質の発現を利用することによって、改変されてはいるが本質的にＭｅｒｓｍａｎｎら、１９９８年（３２）による記載の通りにスクリーニングした。簡潔には、対数成長期にある細菌におけるｓｃＦｖ−ｇＩＩＩ融合タンパク質の産生を、ＩＰＴＧ（１００μＭ）によって３０℃で１６ｈ誘導した。細菌を遠心処理し、ペレットを氷上のスフェロプラスト溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２０％ショ糖、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で２０分間インキュベートし、その後、４℃で、２００００ｇで４５分間遠心処理した。周辺質抽出物に相当する上清を等容積の４％ＭＰＢＳで希釈し、ＥＬＩＳＡアッセイで使用した。コーティング緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中、４℃において、ＥＬＩＳＡウェル（Ｎｕｎｃ社製マイクロタイタープレート、ドイツ所在）を２００ｎｇのＢａｂＡでコーティングした。２％ＭＰＢＳでブロッキングした後、周辺質抽出物を添加し、ＲＴで４ｈインキュベートした。ｐＩＩＩに特異的なマウスモノクローナル抗体（４１）；ＭｏｂｉＴｅｃ社、ドイツ所在）と共にＲＴで１ｈインキュベートし、その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス抗体（Ｄａｋｏ社、デンマーク所在）と共にＲＴで１ｈインキュベートすることによって、抗原に結合したｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合タンパク質を検出した。発色は、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｍｅｒｃｋ社、ドイツ所在）で、基質緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム／クエン酸、ｐＨ４．９／Ｈ２Ｏ２、０．００４％）中で行った。陰性結合対照として、２−フェニルオキサゾロン（抗ｐｈＯｘ）（３１）ｓｃＦｖを、同一のファージミドベクターで発現させ、ｐｈＯｘ結合ＢＳＡコーティングされたＥＬＩＳＡを用いてこのｓｃＦｖの発現を分析した。
【００４３】
（実施例６）
原核細胞発現ベクターｐＯＰＥ１０１へのサブクローニング
ファージミドベクターｐＳＥＸ８１由来のｓｃＦｖ発現カセット全体を、ＮｃｏＩ部位及びＮｏｔＩ部位で、原核細胞発現ベクターｐＯＰＥ１０１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｙ１４５８５）にサブクローニングした（このクローンは、ｐＯＰＥ１０１−Ａｂｂａ３と命名され、ブダペスト条約の下、ＤＳＭＺ−ドイツ微生物菌株保存機構（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツブラウンシュバイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）所在）に受託され、受託番号ＤＳＭ１９１０１及び受託日２００７年２月２８日を付与された）。Ｃ末端ｍｙｃタグ及び（Ｈｉｓ）６タグによって、それぞれ、検出及びＩＭＡＣ精製が可能となる。細胞膜周辺腔からの精製は、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、２００１年（９）による記載の通りに行った。
【００４４】
（実施例７）
イムノブロット
ｓｃＦｖ−ライブラリーの品質管理には、ＩＰＴＧで誘導された単一コロニー細菌から得られた周辺質抽出物１０μｌを１２％ＳＤＳ  ＮｕＰａｇｅ（登録商標）ビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州所在）で分離した。分離されたタンパク質を、２％ＭＰＢＳ（２％低脂肪乾燥スキムミルクを含有するＰＢＳ）でブロッキングされたＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｒｅｄｆｏｒｄ）所在）に転写し、抗ｇＩＩＩ  ｍＡｂ（ＭｏｂｉＴｅｃ社、ドイツゲッティンゲン（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）所在）と、それに続く、ＡＰ結合ウサギ抗マウス（Ｆａｂ）２Ａｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ）及び基質とを用いて可視化した。機能的結合分析には、ＢａｂＡ又は再懸濁されてＯＤ０．６にＰＢＳで調整された変動的な量のピロリ細菌を、１容積のＳＤＳ−試料緩衝液（６２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２５％グリセロール、２％ＳＤＳ、ブロモフェノールブルー）中に可溶化し、３７℃で１０分間加熱するか（Ｉｌｖｅｒら、１９９８年に従った）、１容積のメルカプトエタノール（５％）（又は追加の３％ＳＤＳ）を含有するＳＤＳ−試料緩衝液中に再懸濁し、９６℃で加熱した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、分離されたタンパク質をＨｙｂｏｎｄ（商標）−ＥＣＬニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に転写した。この膜を２％Ｍ−ＰＢＳでブロッキングし、ＩＭＡＣ精製されたｓｃＦｖ−Ａｂｂａ３（ＰＢＳ中に希釈されている）又はＡｂｂａ３−Ａｂ（Ｔ−ＰＢＳ  ０．０５％中に６μｇ／ｍｌ）を添加して、４℃で終夜置いた。結合したｓｃＦｖの検出は、ビオチン化されたマウス抗ｍｙｃ  ｍＡｂ  ９Ｅ１０と共に膜をインキュベートし、その後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体と共にインキュベートすることによって行った。結合したＡｂｂａ３−抗体は、Ｔ−ＰＢＳ  ０．０５％中に１：３０００に希釈されたＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ  Ａｂ（Ｄａｋｏ社、デンマーク所在）と共にインキュベートすることによって検出した。各抗体インキュベーションステップの後に、Ｔ−ＰＢＳ  ０．０５％で膜を４回洗浄した。可視化は、製造業者のプロトコールに従って、ＥＣＬ  ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システムキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で行った。
【００４５】
（実施例８）
完全ヒト抗体の産生
可変領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトカッパ鎖の定常領域をそれぞれ保持する昆虫細胞発現ベクターであるｐＭＴｈＩｇＧ１−Ｖ（２４）にクローニングした。ＰＣＲ増幅は、ＶＬ鎖用のプライマーである
【化１】
2010519901.tif 000002
と、ＶＨ鎖用である
【化２】
2010519901.tif 000003
とを用いて行った。ＰＣＲ増幅は、鋳型として１００ｎｇのファージミドベクター、それぞれ２５ｐｍｏｌのＶＬ及びＶＨプライマー対、２μＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、並びに１０ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて行った。９４℃で２分間の初期変性ステップの後に、以下の通り、すなわち９４℃で１５秒間、６２℃で３０秒、７２℃で３０秒を３２サイクル行い、最終の１伸長ステップを７２℃で５分間行った。ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎ社製ＰＣＲ精製キット（ドイツヒルデン所在）で精製し、適切な制限酵素で消化した後、クローニングした。抗体を安定して分泌するＳ２細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国所在）を、以前の記載の通りに確立し、プロテインＧカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、スウェーデンウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）所在）を用いて、培地中の抗体を精製及び濃縮した。精製された抗体の純度及び機能性は、それぞれクマシー染色及びＥＬＩＳＡによって分析した。
【００４６】
（実施例９）
抗体断片を発現する乳酸菌の産生
Ａｂｂａ３抗体の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）に由来するｓｃＦｖコード遺伝子は、センスプライマーとして、
５’ＣｌａＩ−ＡＢＢＡ３（ＴＴＴＧＣＡＴＣＧＡＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧ）（配列番号９）というプライマーと、アンチセンスプライマーとして、
【化３】
2010519901.tif 000004
とを用いて、それぞれベクターｐＬＰ５０２−１及びｐＬＰ５０２−２にクローニングするために、ＰＣＲによって増幅した。このシャトルベクターは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及びラクトバシラス両方の複製開始点と、それらのクローニング部位の上流にラクトバシラス特異的な調節配列及びプロモーターとを含有しているので、大腸菌におけるクローニング及び増殖と、ラクトバシラスにおける発現とを可能にする。ベクターｐＬＰ５０２−１では、ラクトバシラス膜タンパク質遺伝子であるｐｒｔｐへの融合体として、ｓｃＦｖ発現カセットがクローニングされており、これが細胞表面でのｓｃＦｖカセットの発現を媒介している。ベクターｐＬＰ５０２−２は、ｓｃＦｖ配列後の終止シグナルの存在により、細菌細胞外へのｓｃＦｖの分泌を可能にしている。ＳｃＦｖ発現は、同時発現されるｍｙｃ−タグに対するモノクローナル抗体とＡＰ結合抗マウス検出用抗体とを用いて、イムノブロッティングによって、又はカセイ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）（ＡＴＣＣ２９３）形質転換株の可溶性ＥＬＩＳＡアッセイによって分析した。
【００４７】
（実施例１０）
改変乳酸菌を用いた経口ワクチンの産生及び使用
実施例９の修正乳酸菌株を、当業界で知られている通りに培養、採取、及び凍結乾燥し、その後、１グラムあたりの少なくとも１０４〜１０７ＣＦＵの範囲の量で、標準的な硬ゼラチンカプセル内に充填する。そのようなカプセルを、ピロリ菌に感染していることが判っている患者群に１週間与える。この期間の後に、標準法又は本明細書に記載の方法を用いて、ピロリ菌感染に関して患者を再分析し、数人の患者で感染が消失又は軽減していることを示す。
【００４８】
（実施例１１）
ピロリ菌株上でのＥＬＩＳＡ結合
ピロリ菌の臨床分離株に結合する能力に関して、抗体−Ａｂｂａ３を試験した。株は、１０％ウシ血液及び１％Ｉｓｏ  Ｖｉｔｏｘ（Ｓｖｅｎｓｋａ  ＬＡＢＦＡＢ社、スウェーデンユスネ（Ｌｊｕｓｎｅ）所在）を補足したブルセラ寒天培地上で、１０％ＣＯ２及び５％Ｏ２の下に３７℃で４０〜４５時間培養した。細菌を擦り取り、ＰＢＳ中に懸濁し、４０００ｇで遠心処理し、ペレットをＰＢＳ中に再懸濁することによって、２回洗浄した。光学濃度を０．６のＯＤ６００ｎｍに調整し、１００μｌを用いて９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂ（登録商標）ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社、デンマーク所在）の個々のウェルをコーティングした。４℃で終夜インキュベートした後、２％Ｍ−ＰＢＳでプレートをブロッキングし、Ｔ−ＰＢＳ（ＰＢＳ、０．０５％トゥイーン２０）中に希釈された抗体を添加して、４℃で終夜置いた。抗体の検出は、ＡＰ結合抗ヒトＩｇＧ（Ｄａｋｏ社、デンマーク所在）をＲＴで１時間インキュベートし、その後、１ｍｇ／ｍｌで４−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ所在）を添加することによって行った。４０分間の発色の後、吸光度を４０５ｎｍで測定した。ルイスｂ結合アッセイには、ピロリ菌コーティングされたＥＬＩＳＡプレートのウェルに、ビオチン化されたＨＳＡルイスｂ複合糖質（Ｉｓｏｓｅｐ．社、スウェーデントゥリンゲ（Ｔｕｌｌｉｎｇｅ）所在）を添加した（０．１１５μｇ／ｍｌ、４℃で終夜）。結合した複合糖質は、ＡＰ結合ストレプトアビジンの１：２０００希釈液と共にＲＴで４５分間インキュベートすることによって検出した。ウェルをＴ−ＰＢＳ  ０．０５％で４回洗浄し、その後、１ｍｇ／ｍｌの４−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ所在）を添加した１０分後に、４０５ｎｍの色の吸光を測定した。
【００４９】
（実施例１２）
ＢａｂＡのヌクレオチド配列分析
株を上述の通りに培養し、コロニーをプレートから擦り取り、洗浄し、ＰＢＳ中にＯＤ１の光学濃度に再懸濁した。この懸濁液のうち１ｍｌを用いて、製造業者の指示に従って（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ所在）ゲノムＤＮＡを単離した。鋳型である４μｌの細菌ゲノムＤＮＡ、及び順方向プライマーｂａｂＡ２−２７１（４）（５’−ＡＴＣＣＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡ−３’）（配列番号１２）／ｂａｂＡ２−リーダー（５’−ＧＣＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＴＧＡＧ−３’）（配列番号１３）のいずれかひとつと、逆方向プライマーＪ１１Ｒ（５’−ＴＧＴＧＴＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＣＣＡＧＣ−３’）（配列番号１４）又はＡ２６Ｒ（５’−ＴＴＧＣＴＣＣＡＣＡＴＡＧＧＣＧＣＡ−３’）（配列番号１５）のひとつとの組合せを使用し、第１ヌクレオチドからヌクレオチド約１２００までをカバーするＢａｂＡ断片をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ断片をＴ−ベクター中に連結し、Ｔ７プロモーター特異的プライマー及びＳＰ６プロモーター特異的プライマーで配列決定した。
【００５０】
（実施例１３）
配列決定及びＤＮＡ分析
ヌクレオチド配列は、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターサイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国カリフォルニア州フォスターシティ所在）を用いてＳａｎｇｅｒのジデオキシ鎖終止法で決定するか、又はＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ社、ドイツエーバースベルク（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）所在のサービスを用いて決定した。ヒトＶ−Ｄ−ＪセグメントのＩｇＧ生殖系列配列は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒを用いて決定した。構築及び配列分析は、ベクターＮＴＩ１０プログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州所在）を用いて行った。
【００５１】
（実施例１４）
事前免疫電子顕微鏡（ｐ−ｉＥＭ）
ピロリ菌株１７８７５／Ｌｅｂ及びＤＭ（ＢａｂＡ２及びＢａｂＡの二重ノックアウト）を上述の通り培養し、プレートから擦り取り、再懸濁し、ＰＢＳ中に１のＯＤ６００ｎｍに調整した。２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ画分Ｖ）を含む０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｃａｃｏ）中に、各株のアリコートを１５分間再懸濁した。その後、細菌を遠心処理し、０．１Ｍ  ｃａｃｏ＋０．１％ＢＳＡ中に（１＋１）に希釈された１次ヒト抗体Ａｂｂａ３又は同じアイソタイプの無関係なヒト抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体（ＨＣＶ）と共に再懸濁し、６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、０．１Ｍ  ｃａｃｏ＋０．１％ＢＳＡ中で細菌を２回洗浄し、１０ｎｍ金粒子（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、英国所在）に結合したプロテインＡを含有する同一の緩衝液中に再懸濁し、４５分間インキュベートした。インキュベーションは、グルタルアルデヒドを最終濃度１％まで添加することによって終了させた。この試料を４℃で終夜固定した。その後、細菌を遠心処理してペレットにし、他（１７）に記載されている通り、従来の電子顕微鏡用に包埋し、Ｔｅｃｎａｉ（商標）１０透過電子顕微鏡（Ｆｅｉ社、オランダ所在）で８０ｋＶで検査し、Ｍｅｇａｖｉｅｗ  ＩＩＩカメラ（ＡｎａｌｙＳｉＳ社、ドイツミュンスター所在）によってデジタル画像を収集した。
【００５２】
（実施例１５）
直接免疫電子顕微鏡法（ｄ−ｉＥＭ）
包埋の前に、ペレットの少量のアリコートを取り、蒸留水中に再懸濁した。少量の液滴（３μｌ）をホルムバールコーティングされたグリッド上に置き、５分間付着させた。過剰な水を濾紙で除去し、グリッドを５分間空気乾燥させ、Ｔｅｃｎａｉ（商標）１０電子顕微鏡で１００ｋＶで検査し、画像を写真フィルムに記録した。
【００５３】
（実施例１６）
ピロリ菌又はＢａｂＡを検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断使用のためのイムノアッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断使用には、糞便試料中の病原因子のひとつとして、ピロリ菌又はＢａｂＡを定量測定するための酵素イムノアッセイとしてＡｂｂａ３を使用することができる。この試験では、サンドイッチ型の方法で、特異的抗体によってピロリ菌を捕捉する。すなわち、ポリクローナル抗ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）血清をマイクロウェルプレートのウェルに固定し、ブロッキング及びＰＢＳでの洗浄ステップの後に、当技術分野で知られている通り、検査する糞便試料の懸濁液及び対照をインキュベーション用に常温でピペッティングする。結合した細菌の検出は、酵素（例えばペルオキシダーゼ）に結合したＡｂｂａ３抗体を室温でマイクロウェルプレートに添加し、その後、さらなる洗浄ステップを行い、基質を添加して発色させることによって行う。消衰は、試料中に存在しているピロリ菌の濃度に比例する。
【００５４】
（実施例１７）
試験キットの生産
イムノアッセイ技法を用いたキットは、抗原と対応する抗体、例えばＡｂｂａ３との間の特異的な結合作用に依存しており、標本中の病原体、この場合は糞便試料中のピロリ菌の存在（又は不在）を判定するための信頼できる方法であることが立証されている。
【００５５】
イムノクロマトグラフィー検査（ＩＣＴ）装置として知られているクラスの装置は、抗体に結合した標識と組み合わせたイムノアッセイ技法を使用するもので、現在、特定の分析物の存在又は不在を判定するための、迅速かつ信頼できる現地試験に一般的に用いられている。この標識は、次に特定の限定された領域内に共に集められる抗体／抗原分子に結合した場合、ヒトの裸眼によって、又は使用される標識のタイプに応じた走査装置によって容易に検出できるようになる。一般的には、この標識は、ラテックス、金若しくは炭素の粒子、放射性粒子、磁性粒子であるか、特定の確定された領域にそれが固定又は誘引されることを可能にする他の物理的若しくは化学的特性を有するものでありうる。サンドイッチ技法を用いたＩＣＴ装置は、使用するのがとりわけ容易である。この技法を用いる場合、アッセイする特定の抗原に結合する標識抗体を、特定の抗原を含有していると思われる試料と混合する。試料中に抗原が存在している場合には、標識抗体が抗原と結合して、標識−抗体−抗原複合体を形成させる。試験ゾーンに不動に固定され、かつ上記特異的抗原にも結合する２次抗体が、試験ゾーンで、この標識−抗体−抗原複合体に結合する。陽性の結果は、試験ゾーンに標識が蓄積することによって可視化される。そのような装置は、標準的製品であり、容易に利用可能であり、経済的であり、かつ未熟練作業員によっても使用できる。
【００５６】
（実施例１８）
ＡｂｂａＶＨ及びＡｂｂａＶＬの配列
本明細書には、ＡｂｂａＶＨ（配列番号１６）及びＡｂｂａＶＬ（配列番号１７）のヌクレオチド配列、並びにＡｂｂａＶＨ（配列番号１８）及びＡｂｂａＶＬ（配列番号１９）のアミノ酸配列を示す配列表が添付されている。
【００５７】
（参考文献）
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2010519901.tif 000006
2010519901.tif 000007
2010519901.tif 000008
2010519901.tif 000009
【００５８】
【表１−１】
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【表１−２】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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