(57)【要約】過活動膀胱、良性前立腺肥大、多汗症などといった、さまざまな医学的状態を処置するための、細胞外マトリックス消化酵素および神経毒（例えばクロストリジウム神経毒）を使用する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリン作用の影響を受ける障害を有する患者を処置するための方法であって、
a）細胞外マトリックス消化酵素を含有する第1組成物を患者の表面領域に投与するステップ、
b）細胞外マトリックス消化酵素が表面領域を通して拡散してターゲットに達するように、十分な時間を経過させるステップ、
d）ボツリヌス毒素を含有する第2組成物を表面領域に投与するステップ；および
e）ボツリヌス毒素が表面領域を通して拡散してターゲットに達するのに十分な時間をとるステップ
を含み、それによって、コリン作用の影響を受ける障害に関連する少なくとも1つの症状を軽減し、コリン作用の影響を受ける障害を有する患者を処置する方法。
【請求項２】
表面領域が管腔表面領域である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
管腔表面領域が膀胱管腔表面領域である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
膀胱管腔表面領域への細胞外マトリックス消化酵素およびボツリヌス毒素の投与を、膀胱内への細胞外マトリックス消化酵素およびボツリヌス毒素の点滴注入によって行い、表面領域が膀胱管腔表面領域であり、ターゲットが排尿筋を含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
細胞外マトリックス消化酵素の投与を、膀胱の膀胱壁への第1組成物の注射によって行い、ボツリヌス毒素を含有する第2組成物の投与を膀胱内への点滴注入によって行い、ターゲットが排尿筋を含む、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
細胞外マトリックス消化酵素の投与を膀胱内への第1組成物の点滴注入によって行い、ボツリヌス毒素の投与を膀胱の膀胱壁への第2組成物の注射によって行い、ターゲットが排尿筋を含む、請求項3に記載の方法。
【請求項７】
ボツリヌス毒素を含有する第2組成物の投与を、膀胱壁への20未満の注射数で行う、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
ボツリヌス毒素を含有する第2組成物の投与を、膀胱壁への10未満の注射数で行う、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
ボツリヌス毒素を含有する第2組成物の投与を、膀胱壁への1〜5の注射数で行う、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
ボツリヌス毒素がA、B、C1、D、E、FおよびG型ボツリヌス毒素からなる群より選択される、請求項4に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（a）の前に膀胱を空にするステップ、ステップ（b）の後に膀胱を空にするステップ、およびステップ（e）の後に膀胱を空にするステップをさらに含む、請求項4に記載の方法。
【請求項１２】
コリン作用の影響を受ける障害が、膀胱障害および前立腺障害からなる群より選択される泌尿器障害である、請求項2に記載の方法。
【請求項１３】
膀胱障害が、過活動膀胱、肥大膀胱頚部および排尿筋反射亢進からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前立腺障害が、良性前立腺肥大、前立腺炎および前立腺がんからなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
場合によってはステップ（b）の後に第1組成物を除去するステップ、および場合によってはステップ（e）の後に第2組成物を除去するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
コリン作用の影響を受ける障害が多汗症であり、患者の表面領域が、腋窩皮膚表面領域、手掌皮膚表面領域および足底皮膚表面領域からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
細胞外マトリックス消化酵素が、ヒアルロニダーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子およびコラゲナーゼのファミリーのメンバーである、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
神経毒の投与を必要とする患者に神経毒を投与するための方法であって、神経毒または細胞外マトリックス消化酵素の注射を排除し、
a）少なくとも1つの細胞外マトリックス消化酵素を含有する第1組成物を患者の皮膚表面または管腔表面に投与するステップ、および
b）神経毒を含有する第2組成物を、患者の皮膚表面または管腔表面に投与するステップ
を含み、神経毒は、少なくとも1つの細胞外マトリックス消化酵素を含有する第1組成物を用いずに投与した場合よりもよく拡散し、前記投与が第1組成物と第2組成物の両方の注射を排除する方法。
【請求項１９】
皮膚表面が腋窩皮膚表面である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
神経毒がボツリヌス毒素であり、A、B、C1、D、E、FおよびG型ボツリヌス毒素からなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
細胞外マトリックス消化酵素およびボツリヌス毒素の一方または両方の投与を、患者の皮膚表面または管腔表面への噴霧または塗擦の少なくとも一方による適用によって行う、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（a）の後に皮膚表面を乾燥させるステップをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
皮膚表面を乾燥させることが、ステップ（b）を開始する前に皮膚表面から第1組成物が蒸発しうるように、十分な時間を経過させるステップを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
泌尿器障害の処置を必要とする患者の泌尿器障害を処置するための非注射的方法であって、
a）ヒアルロニダーゼを含有する第1組成物を、グリコサミノグリカン層を有する膀胱管腔表面領域に第1組成物を接触させるために、患者の膀胱内に点滴注入するステップ、
b）ヒアルロニダーゼがグリコサミノグリカン層と相互作用し膀胱管腔表面領域を通して拡散するように、第1組成物を膀胱内に維持して十分な時間を経過させるステップ、
c）場合によっては、第1組成物を膀胱から排液させるステップ、
d）先に点滴注入され場合によっては除去された第1組成物が先に接触していた膀胱管腔表面領域と接触させるように、A型ボツリヌス毒素を含有する第2組成物を、膀胱に点滴注入するステップ、および
e）十分な量のA型ボツリヌス毒素が膀胱管腔表面領域を通して拡散して固有筋層の少なくとも一層に達するように、点滴注入された第2組成物を膀胱内に十分な時間保持し、場合によっては、第2組成物を膀胱から排液させるステップ
を含み、それによって、泌尿器障害に関連する少なくとも1つの症状を軽減し、泌尿器障害の処置を必要とする患者の泌尿器障害を処置する方法。
【請求項２５】
泌尿器障害が、過活動膀胱、肥大膀胱頚部および排尿筋反射亢進からなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
神経毒の投与を必要とする患者に神経毒を投与するための方法であって、神経毒または細胞外マトリックス消化酵素の注射を排除し、
少なくとも1つの細胞外マトリックス消化酵素および神経毒を含有する組成物を、患者の皮膚表面または管腔表面に投与するステップ
を含み、神経毒は、少なくとも1つの細胞外マトリックス消化酵素を含有する第1組成物を用いずに投与した場合よりも、ターゲットへまたはターゲット全体によく拡散し、前記投与が第1組成物と第2組成物の両方の注射を排除する方法。
【請求項２７】
神経毒がボツリヌス毒素であり、A、B、C1、D、E、FおよびG型ボツリヌス毒素からなる群より選択される、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
神経毒がA型ボツリヌス毒素である、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
A型ボツリヌス毒素の量が約20単位〜約2750単位である、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも1つの細胞外マトリックス消化酵素が、ヒアルロニダーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子およびコラゲナーゼからなる群より選択される、請求項27に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過活動膀胱、過活動膀胱または不安定排尿筋括約筋による尿失禁、良性前立腺肥大および関連膀胱排尿合併症、痙攣性括約筋または肥大膀胱頚部に続発する尿閉、神経因性膀胱機能障害（例えばパーキンソン病、脊髄損傷、脳卒中または多発性硬化症に続発するもの）および多汗症などといった、さまざまな医学的状態/障害を処置するための、細胞外マトリックス消化酵素および神経毒の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経毒、特にボツリヌス毒素は、さまざまな医学的状態の処置に、ますます多くの適用例が見出されつつある。そのような処置は、通例、皮膚または臓器の内層を貫通する注射によって局所的に送達される。これは、針貫通の合併症、針恐怖症などの患者の懸念、痛みおよび医師訓練の問題に起因する、処置送達の難しさにつながりうる。ボツリヌス毒素などの神経毒は、例えば排尿切迫、頻尿および失禁などの厄介な症状を引き起こす過活動膀胱（OAB）および排尿筋反射亢進（DH）を含む、いくつかの泌尿器状態の処置に、重要な適用を獲得しつつある。過活動膀胱の処置にボツリヌス毒素を利用するための使用および技法に関する詳細な議論は、Nitti Victor W.「Botulinum toxin for the treatment of idiopathic and neurogenic overactive bladder: State of the art」Rev Urol 2006; 8(4): 198-208に見出すことができる。そこに詳述されているとおり、ボツリヌス毒素は膀胱壁中に注射され、その注射数（100〜1000単位のA型ボツリヌス毒素の15〜50の注射数、5000単位のB型ボツリヌス毒素の10の注射数）は、そこに詳述され、当技術分野において知られているとおり、利用するボツリヌス毒素の血清型間に見られる周知の効果および効力差、ならびに利用する総毒素量および利用する毒素の希釈率に依存する。
【０００３】
さまざまな泌尿器障害の一症状である失禁には、切迫性失禁および腹圧性失禁が含まれる。切迫性失禁では突然の強い尿意に続いて不適当な膀胱収縮が起こり、それが結果として尿漏れをもたらす。厄介なのは、これらの収縮が患者の膀胱中の尿量とは無関係に起こること、すなわち、膀胱は、望ましくない尿漏れを起こすほどに充満していてそこに含まれる尿からの圧力を受けているとは必ずしも限らないことがしばしばあるということである。切迫性失禁は、例えば神経損傷（例えば脊髄損傷または脳卒中）、神経学的疾患（例えば多発性硬化症）、感染、膀胱がん、膀胱結石、膀胱炎、または膀胱出口閉塞などの結果でありうる。これらの状態は男性にも女性にも見出されうるが、男性は、切迫性失禁が、例えば良性前立腺肥大（BPH）によって引き起こされる神経疾患もしくは膀胱変化または肥大した前立腺による膀胱出口閉塞に起因する可能性もあるという点で、さらなる負担を背負っている。
【０００４】
腹圧性失禁は、咳嗽、くしゃみ、笑い、または運動などの身体活動中に起こる不随意的な尿失禁である。患者は一方または両方のタイプの失禁に悩まされる場合があり、両方に悩まされる場合は、それを混合型失禁と呼ぶ。失禁に関連する知識を総合しても、切迫性失禁の症例の大半は特発性であり、これは具体的な原因を同定することができないことを意味する。切迫性失禁は、誰にでも、どの年齢でも、起こる可能性があり、女性および高齢者では、より一般的である。
【０００５】
膀胱の排尿筋は尿を膀胱から排出する筋である。排尿筋反射亢進の帰結には、低い膀胱コンプライアンス、高い膀胱内圧、および膀胱容量の減少が含まれ、これらはいずれも、上部尿路の劣化をもたらしうる。
【０００６】
ボツリヌス毒素は、膀胱壁中の排尿筋を麻痺させるか、あるいはおそらく膀胱における求心性経路に影響を及ぼし、尿路上皮下神経（suburothelial nerve）中の感覚受容器を減少させることによって、膀胱活動亢進にその作用を発揮すると考えられる。これらの作用は、膀胱壁にボツリヌス毒素を注射した時に見られる、尿失禁および膀胱容量の改善、ならびに膀胱排尿筋圧の低下の説明におそらくなるだろう。さまざまな泌尿器障害を処置するためのボツリヌス毒素使用の例は、Dott, C.らの「Botulinum Toxin Treatment of Spastic Bladder」米国特許出願公開第2007/0275110号A1およびDoshi, R.の「Methods for the use of neurotoxin in the treatment of urologic disorders」米国特許出願公開第2004/0067235号A1に見出すことができ、これらはどちらも、参照により本明細書に組み込まれる。神経毒に関する他の既知の潜在的泌尿器適用には、良性前立腺肥大（BPH）、前立腺炎、および前立腺がんを含む前立腺のさまざまな障害の処置が含まれる（例えば参照によりそのまま本明細書に組み込まれる米国特許第6,365,164号を参照されたい）。
【０００７】
今までに、ボツリヌス毒素は、BPHに起因する閉塞性および刺激性排尿症状を含む下部尿路症状の処置に関して、前途有望な初期結果を示している。主観的（症状）改善と客観的（流量）改善の両方が観察された。前立腺は、部分的に腺性であり部分的に線維筋性でもある、男性生殖器系の腺である。加齢により、前立腺は拡大（肥大）する傾向を示す。この前立腺拡大は尿道の閉塞および排尿機能障害につながりうる。これは、尿道が外尿道口につながるところで前立腺（尿道前立腺部）を通過するからである。前立腺の解剖学的構造（小葉、ストロマ、神経線維タイプおよび神経支配を含む）に関する詳細な議論は、「Use of neurotoxin therapy for treatment of urologic and related disorders」と題する公開された米国特許出願第09/978,982号（2001年10月15日出願）、米国特許出願公開第20020025327号A1に見出すことができ、この文献は、標準的な解剖学の教科書類と共に、参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【０００８】
ボツリヌス毒素は、前立腺中の神経終末、ならびにアセチルコリン、感覚神経ペプチド、およびノルアドレナリンを含む神経伝達物質の放出に影響を及ぼすと考えられる。これらの作用は、前立腺内での神経制御を変化させうる。予備的報告は、ボツリヌス毒素が、前立腺がんの管理において、おそらくは炎症の阻害およびCOX-2発現のダウンレギュレーションによって役割を果たしうることをも示唆している。
【０００９】
ボツリヌス毒素分子の大きなサイズは、その拡散能力を制限することができ、したがってボツリヌス毒素分子が求心性神経線維と遠心性神経線維のどちらに到達するのも妨げる。結果として、OABに関する最新の投与方法は、例えば、膀胱筋肉壁中または前立腺中へのボツリヌス毒素の数多くの注射（典型的には20〜50の注射数）を必要とする。ボツリヌス毒素使用の他の例には、頭頸部筋系への約30の注射数を必要とするボツリヌス毒素による慢性片頭痛の処置や、腋窩の皮膚層への数多くの注射（典型的には、その状態の重症度、汗を過剰産生する領域、患者のサイズならびに使用するボツリヌス毒素の濃度、量およびタイプに依存して、腋窩あたり約10〜40の注射数）を必要とする腋窩多汗症の処置が含まれる。
【００１０】
クロストリジウム属には127を越える種があり、形態学および機能に従って分類されている。嫌気性グラム陽性細菌であるボツリヌス菌（Clostridium botulinum）は、ボツリヌス中毒と呼ばれる神経麻痺性障害をヒトおよび動物において引き起こす強力なポリペプチド神経毒であるボツリヌス毒素を産生する。ボツリヌス菌の胞子は土壌中に見出され、滅菌と密閉が不適切な零細缶詰工場の食品容器内で増殖する可能性があり、これが多くのボツリヌス中毒症例の原因である。ボツリヌス中毒の影響は、通例、ボツリヌス菌の培養物または胞子で汚染された食品を飲食した18〜36時間後に現れる。ボツリヌス毒素は、消化管内を弱毒化されないで通過することができ、そして末梢運動ニューロンを攻撃することができるようである。ボツリヌス毒素中毒の症状は、歩行困難、嚥下困難および会話困難から、呼吸筋の麻痺および死にまで進行し得る。
【００１１】
市販A型ボツリヌス毒素（精製された神経毒複合体；100単位バイアルとして、BOTOX（登録商標）の商標でAllergan，Inc．（カリフォルニア州アービン）から入手可能である）の約50ピコグラムがマウスにおけるLD50（すなわち1単位）である。1単位のBOTOX（登録商標）は、約50ピコグラム（約56アトモル）のA型ボツリヌス毒素複合体を含む。興味深いことに、モル基準でA型ボツリヌス毒素の致死力はジフテリアの18億倍、シアン化ナトリウムの6億倍、コブロトキシンの3000万倍、コレラの1200万倍である。Natuaral Toxins II［B. R. Singhら編、Plenum Press、ニューヨーク（1976）］のSingh、Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins、第63〜84頁（第4章）（ここで、記載されるA型ボツリヌス毒素LD50  0.3ng＝1Uとは、BOTOX（登録商標）約0.05ng＝1Uという事実に補正される）。1単位（U）のボツリヌス毒素は、それぞれが18〜20グラムの体重を有するメスのSwiss Websterマウスに腹腔内注射されたときのLD50として定義される。
【００１２】
7種類の血清学的に異なるボツリヌス神経毒が特徴付けられており、これらは、型特異的抗体による中和によってそのそれぞれが識別されるボツリヌス神経毒血清型A、B、C1、D、E、FおよびGである。ボツリヌス毒素のこれらの異なる血清型は、それらが冒す動物種、ならびにそれらが惹起する麻痺の重篤度および継続時間が異なる。例えば、A型ボツリヌス毒素は、ラットにおいて生じる麻痺率により評価された場合、B型ボツリヌス毒素よりも500倍強力であることが確認されている。また、B型ボツリヌス毒素は、霊長類では480U/kgの投与量で非毒性であることが確認されている。この投与量は、A型ボツリヌス毒素の霊長類LD50の約12倍である。Jankovic, J.ら編、“Therapy With Botulinum Toxin”(1994)（Mercel Dekker, Inc.）の第71-85頁、第６章の、Moyer Eら、Botulinum Toxin Type B: Experimental and Clinical Experience。ボツリヌス毒素は、コリン作動性の運動ニューロンに大きな親和性で結合して、ニューロンに移動し、アセチルコリン放出を阻止するようである。低親和性受容体を介して、また食作用および飲作用によってもさらに取り込みが起こりうる。
【００１３】
型に関係なく、毒素中毒の分子メカニズムは類似し、少なくとも3つの過程または段階を含むようである。第1段階において、毒素は、重鎖（H鎖）と細胞表面受容体との特異的相互作用によって、標的ニューロンのシナプス前膜に結合する。受容体は、ボツリヌス毒素の各血清型および破傷風毒素で異なると考えられる。H鎖のカルボキシル末端セグメント(HC)は、毒素を細胞表面に指向させるのに重要であるようである。
【００１４】
第2段階において、毒素は、冒した細胞の形質膜を横切る。毒素は、初めに、受容体媒介エンドサイトーシスにより細胞に包み込まれ、毒素を含有するエンドソームが形成される。次に、毒素は、エンドソームから該細胞の細胞質中に逃れ出る。この段階は、約5.5またはそれ以下のpHに反応して毒素のコンフォメーション変化を誘発するH鎖のアミノ末端セグメント(HN)によって媒介されると考えられる。エンドソームは、エンドソーム内pHを低下させるプロトンポンプを有することが既知である。コンフォメーションのシフトは毒素中の疎水性残基を露出させ、これが、毒素をエンドソーム膜内に埋込むことを可能にする。次に、毒素（または少なくともその軽鎖）が、エンドソーム膜を通って細胞質に移動する。
【００１５】
ボツリヌス毒素活性のメカニズムの最終段階は、重鎖（H鎖）および軽鎖（L鎖）を結合するジスルフィド結合の減少を伴うようである。ボツリヌス毒素および破傷風毒素の全毒素活性は、ホロトキシンのL鎖に含まれる。L鎖は亜鉛(Zn++)エンドペプチダーゼであり、これは、神経伝達物質を含有する小胞の認識および形質膜の細胞質表面とのドッキングならびに小胞と形質膜との融合に必須であるタンパク質を選択的に開裂する。破傷風神経毒、ボツリヌス毒素B、D、FおよびG型は、シナプトソーム膜タンパク質であるシナプトブレビン[小胞関連膜タンパク質(VAMP)とも称される]の分解を引き起こす。シナプス小胞の細胞質表面に存在する大部分のVAMPは、これらの開裂現象のいずれかの結果として除去される。A型およびE型ボツリヌス毒素はSNAP-25を開裂する。C1型ボツリヌス毒素ははじめはシンタキシンを開裂すると考えられたが、シンタキシンおよびSNAP-25を開裂することがわかった。各毒素は異なる結合を特異的に開裂する。ただし、B型ボツリヌス毒素（および破傷風毒素）は同じ結合を開裂する。これら開裂はそれぞれ、小胞−膜ドッキングの過程を遮断し、それによって小胞内容物のエキソサイトーシスを阻害する。
【００１６】
ボツリヌス毒素は、活動過多な骨格筋（すなわち運動障害）によって特徴付けられる神経筋障害を処置するために臨床的状況において使用されている。A型ボツリヌス毒素は、眼瞼痙攣、斜視および片側顔面痙攣を処置するために、約20年前の1989年に米国食品医薬品局によって承認された。その後、A型ボツリヌス毒素は頸部ジストニーの処置および眉間しわの処置のためにもFDAによって承認され、B型ボツリヌス毒素は頸部ジストニーの処置のために承認された。非A型ボツリヌス毒素は、A型ボツリヌス毒素と比較して、効力が小さく、および／または活性持続が短いようである。末梢筋肉内A型ボツリヌス毒素の臨床的効果は、通常、注射後1週間以内に認められる。A型ボツリヌス毒素の単回筋肉内注射による症候緩和の典型的な継続時間は平均約3ヶ月であり得るが、顕著により長い処置活性期間も報告されている。
【００１７】
すべてのボツリヌス毒素血清型が神経筋接合部における神経伝達物質アセチルコリンの放出を阻害するようであるが、そのような阻害は、種々の神経分泌タンパク質に作用し、かつ／またはこれらのタンパク質を異なる部位で切断することによって行われる。例えば、A型およびE型ボツリヌス毒素はいずれも、25キロダルトン（kD）のシナプトソーム関連タンパク質（SNAP-25）を切断するが、それぞれ異なるタンパク質内アミノ酸配列を標的とする。B型、D型、F型およびG型のボツリヌス毒素は小胞関連タンパク質（VAMP、これはまたシナプトブレビンとも呼ばれる）に作用し、それぞれの血清型によってこのタンパク質は異なる部位で切断される。最後に、C1型ボツリヌス毒素は、シンタキシンおよびSNAP-25の両者を切断することが明らかにされている。作用機序におけるこれらの相違が、様々なボツリヌス毒素血清型の相対的な効力および／または作用の継続時間に影響していると考えられる。明らかに、ボツリヌス毒素の基質は、多様な細胞種に見られる。例えばBiochem, J 1;339(pt 1): 159-65: 1999およびMov Disord, 10(3):376:1995（膵島B細胞は少なくともSNAP-25およびシナプトブレビンを含有する）参照。
【００１８】
ボツリヌス毒素タンパク質分子の分子量は、既知のボツリヌス毒素血清型の7つのすべてについて約150kDである。興味深いことに、これらのボツリヌス毒素は、会合する非毒素タンパク質とともに150kDのボツリヌス毒素タンパク質分子を含む複合体としてクロストリジウム属細菌によって放出される。例えば、A型ボツリヌス毒素複合体は、900kD、500kDおよび300kDの形態としてクロストリジウム属細菌によって産生され得る。B型およびC1型のボツリヌス毒素は700kDまたは500kDの複合体としてのみ産生されるようである。D型ボツリヌス毒素は300kDおよび500kDの両方の複合体として産生される。最後に、E型およびF型のボツリヌス毒素は約300kDの複合体としてのみ産生される。これらの複合体（すなわち、約150kDよりも大きな分子量）は、非毒素のヘマグルチニンタンパク質と、非毒素かつ非毒性の非ヘマグルチニンタンパク質とを含むと考えられる。これらの2つの非毒素タンパク質（これらは、ボツリヌス毒素分子とともに、関連する神経毒複合体を構成し得る）は、変性に対する安定性をボツリヌス毒素分子に与え、そして毒素が摂取されたときに消化酸からの保護を与えるように作用すると考えられる。また、より大きい（分子量が約150kDよりも大きい）ボツリヌス毒素複合体は、ボツリヌス毒素複合体の筋肉内注射部位からのボツリヌス毒素の拡散速度を低下させ得ると考えられる。
【００１９】
インビトロでの研究により、ボツリヌス毒素が、脳幹組織の初代細胞培養物からのアセチルコリンおよびノルエピネフリンの両方の、カリウムカチオンにより誘導される放出を阻害することが示されている。また、ボツリヌス毒素は、脊髄ニューロンの初代培養物におけるグリシンおよびグルタメートの両方の誘発された放出を阻害すること、そして脳のシナプトソーム調製物において、ボツリヌス毒素が神経伝達物質のアセチルコリン、ドーパミン、ノルエピネフリン（Habermann E.ら、Tetanus Toxin and Botulinum A and C Neurotoxins Inhibit Noradrenaline Release From Cultured Mouse Brain, J Neurochem 51(2); 522-527: 1988）、CGRP、サブスタンスPおよびグルタメート（Sanchez-Prieto, J.ら、Botulinum Toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From Guinea Pig Cerebral Cortical Synaptosomes, Eur J. Biochem 165; 675-681: 1897）のそれぞれの放出を阻害することが報告されている。すなわち、充分な濃度を用いれば、大部分の神経伝達物質の刺激により誘発される放出はボツリヌス毒素によってブロックされる。
【００２０】
例えば、Pearce, L.B., Pharmacologic Characterization of Botulinum Toxin For Basic Science and Medicine, Toxicon 35(9); 1373-1412の1393; Bigalke H.ら, Botulinum A Neurotoxin Inhibits Non-Cholinergic Synaptic Transmission in Mouse Spinal Cord Neurons in Culture, Brain Research 360; 318-324; 1985; Habermann E., Inhibition by Tetanus and Botulinum A Toxin of the release of [3H]Noradrenaline and [3H]GABA From Rat Brain Homogenate, Experientia 44; 224-226: 1988, Bigalke H.ら, Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin Inhibit Release and Uptake of Various Transmitters, as Studied with Particulate Preparations From Rat Brain and Spinal Cord, Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 316; 244-251: 1981, および；Jankovic J.ら, Therapy With Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc. (1994), 第5頁参照。
【００２１】
A型ボツリヌス毒素は、既知の手順に従って、培養槽におけるボツリヌス菌の培養を確立して、生育させ、その後、発酵混合物を集め、精製することによって得ることができる。すべてのボツリヌス毒素血清型は、神経活性となるためにはプロテアーゼによって切断またはニッキングされなければならない不活性な単鎖タンパク質として最初に合成される。A型およびG型のボツリヌス毒素血清型を産生する細菌株は内因性プロテアーゼを有するので、A型およびG型の血清型は細菌培養物から主にその活性型で回収することができる。これに対して、C1型、D型およびE型のボツリヌス毒素血清型は非タンパク質分解性菌株によって合成されるので、培養から回収されたときには、典型的には不活性型である。B型およびF型の血清型はタンパク質分解性菌株および非タンパク質分解性菌株の両方によって産生されるので、活性型または不活性型のいずれでも回収することができる。しかし、例えば、B型ボツリヌス毒素を産生するタンパク質分解性菌株でさえも、産生された毒素の一部を切断するだけである。
【００２２】
切断型分子と非切断型分子との正確な比率は培養時間の長さおよび培養温度に依存する。したがって、例えばB型ボツリヌス毒素の製剤はいずれも一定割合が不活性であると考えられ、このことが、A型ボツリヌス毒素と比較したB型ボツリヌス毒素の知られている著しく低い効力（そしてそれ故、当分野で知られているような何千単位ものB型ボツリヌス毒素のルーチンな使用（例えば“Long-term safety, efficacy, and dosing of botulinum toxin type B (MYOBLOC(R)) in cervical dystonia (CD) and other movement disorders”Kumar R and Seeberger LC. Mov Disord 2002; 17 (Suppl 5):S292-S293参照））の原因であると考えられる。臨床製剤中に存在する不活性なボツリヌス毒素分子は、その製剤の総タンパク質量の一部を占めることになるが、このことはその臨床的効力に寄与せず、抗原性の増大に関連づけられている。また、B型ボツリヌス毒素は、筋肉内注射された場合、同じ用量レベルのA型ボツリヌス毒素よりも、活性の継続期間が短く、そしてまた効力が低いことも知られている。
【００２３】
ボツリヌス菌のＨall  Ａ株から、≧３×１０７Ｕ／ｍｇ、Ａ２６０／Ａ２７８０．６０未満、およびゲル電気泳動における明確なバンドパターンという特性を示す高品質結晶Ａ型ボツリヌス毒素を生成し得る。Ｓhantz，Ｅ．Ｊ．ら、Ｐroperties  and  use  of  Ｂotulinum  toxin  and  Ｏther  Ｍicrobial  Ｎeurotoxins  in  Ｍedicine、Ｍicrobiol  Ｒev．５６：８０−９９（１９９２）に記載されているように既知のＳhanz法を用いて結晶Ａ型ボツリヌス毒素を得ることができる。通例、Ａ型ボツリヌス毒素複合体を、適当な培地中でＡ型ボツリヌス菌を培養した嫌気培養物から分離および精製し得る。この既知の方法を用い、非毒素タンパク質を分離除去して、例えば次のような純ボツリヌス毒素を得ることもできる：比効力１〜２×１０８ＬＤ５０Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の分子量約１５０ｋＤの精製Ａ型ボツリヌス毒素；比効力１〜２×１０８ＬＤ５０Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の分子量約１５６ｋＤの精製Ｂ型ボツリヌス毒素；および比効力１〜２×１０７ＬＤ５０Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の分子量約１５５ｋＤの精製Ｆ型ボツリヌス毒素。
【００２４】
ボツリヌス毒素および／またはボツリヌス毒素複合体は、Ｌist  Ｂiological  Ｌaboratories，Ｉnc．（キャンベル、カリフォルニア）；the  Ｃentre  for  Ａpplied  Ｍicrobiology  and  Ｒesearch（ポートン・ダウン、イギリス）；Ｗako（日本、大阪）；Metabiologics（マディソン、ウィスコンシン）；およびＳigma  Ｃhemicals（セントルイス、ミズーリ）から入手し得る。純粋なボツリヌス毒素を本発明に従って使用される医薬組成物の製造に使用することもできる。
【００２５】
酵素一般について言えるように、ボツリヌス毒素（細胞内ペプチダーゼ）の生物学的活性は、少なくとも部分的にはその三次元形状に依存する。すなわち、Ａ型ボツリヌス毒素は、熱、種々の化学薬品、表面の伸長および表面の乾燥によって無毒化される。しかも、既知の培養、発酵および精製によって得られた毒素複合体を、医薬組成物に使用する非常に低い毒素濃度まで希釈すると、適当な安定剤が存在しなければ毒素の無毒化が急速に起こることが知られている。毒素をｍｇ量からｎｇ／ｍｌ溶液へ希釈するのは、そのような大幅な希釈によって毒素の比毒性が急速に低下する故に、非常に難しい。毒素含有医薬組成物を製造後、何箇月も、または何年も経過してから毒素を使用することもあるので、毒素をアルブミンおよびゼラチンのような安定剤で安定化することができる。
【００２６】
市販のボツリヌス毒素含有医薬組成物は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）（カリフォルニア、アーヴィンのＡllergan，Ｉnc．から入手可能）の名称で市販されている。ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、精製Ａ型ボツリヌス毒素複合体、アルブミンおよび塩化ナトリウムから成り、無菌の減圧乾燥形態で包装されている。このＡ型ボツリヌス毒素は、Ｎ−Ｚアミンおよび酵母エキスを含有する培地中で増殖させたボツリヌス菌のＨall株の培養物から調製する。そのＡ型ボツリヌス毒素複合体を培養液から一連の酸沈殿によって精製して、活性な高分子量毒素タンパク質および結合ヘマグルチニンタンパク質から成る結晶複合体を得る。結晶複合体を、塩およびアルブミンを含有する溶液に再溶解し、滅菌濾過（０．２μ）した後、減圧乾燥する。減圧乾燥生成物は、-5℃またはそれ以下の冷凍庫内で保存する。ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、筋肉内注射前に、防腐していない無菌塩類液で再構成し得る。ＢＯＴＯＸ（登録商標）の各バイアルは、Ａ型ボツリヌス毒素精製神経毒複合体約１００単位（Ｕ）、ヒト血清アルブミン０．５ｍｇおよび塩化ナトリウム０．９ｍｇを、防腐剤不含有の無菌減圧乾燥形態で含有する。
【００２７】
減圧乾燥ＢＯＴＯＸ（登録商標）を再構成するには、防腐剤不含有の無菌生理食塩水；０．９％Ｓodium  Ｃhloride  Ｉnjectionを使用し、適量のその希釈剤を適当な大きさの注射器で吸い上げる。ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、泡立てまたは同様の激しい撹拌によって変性しうるので、そのバイアルに希釈剤を穏やかに注入する。滅菌性の理由から、ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、バイアルを冷凍庫から取り出して再構成した後４時間以内に投与することが好ましい。その４時間の間、再構成ＢＯＴＯＸ（登録商標）は冷蔵庫（約２〜８℃）内で保管しうる。再構成し冷蔵したＢＯＴＯＸ（登録商標）は、その効力を少なくとも約２週間維持することが報告されている（Neurology, 48:249-53:1997）。
【００２８】
A型ボツリヌス毒素は下記のように臨床的に使用されていることが報告されている：
（1）頸部ジストニーを処置するための筋肉内注射（多数の筋肉）あたり約75単位〜125単位のBOTOX（登録商標）；
（2）眉間のしわを処置するための筋肉内注射あたり約5単位〜10単位のBOTOX（登録商標）（5単位が鼻根筋に筋肉内注射され、10単位がそれぞれの皺眉筋に筋肉内注射される）；
（3）恥骨直腸筋の括約筋内注射による便秘を処置するための約30単位〜80単位のBOTOX（登録商標）；
（4）上瞼の外側瞼板前部眼輪筋および下瞼の外側瞼板前部眼輪筋に注射することによって眼瞼痙攣を処置するために筋肉あたり約1単位〜5単位の筋肉内注射されるBOTOX（登録商標）；
【００２９】
（5）斜視を処置するために、外眼筋に、約1単位〜5単位のBOTOX（登録商標）が筋肉内注射されている。この場合、注射量は、注射される筋肉のサイズと所望する筋肉麻痺の程度（すなわち、所望するジオプター矯正量）との両方に基づいて変化する。
（6）卒中後の上肢痙性を処置するために、下記のように5つの異なる上肢屈筋にBOTOX（登録商標）が筋肉内注射される：
（a）深指屈筋：7.5U〜30U
（b）浅指屈筋：7.5U〜30U
（c）尺側手根屈筋：10U〜40U
（d）橈側手根屈筋：15U〜60U
（e）上腕二頭筋：50U〜200U。5つの示された筋肉のそれぞれには同じ処置時に注射されるので、患者には、それぞれの処置毎に筋肉内注射によって90U〜360Uの上肢屈筋BOTOX（登録商標）が投与される。
(7)偏頭痛を治療するために、25UのBOTOX(登録商標)の頭蓋周囲注射(眉間、前頭および側頭筋に対称的に注射する)は、偏頭痛頻度、最大重症度、付随嘔吐および急性薬剤使用の減少(25U注射後の3ヶ月間にわたる)によって評価した場合に、ビヒクルと比較して、偏頭痛の予防療法として有意な利益を与える。
【００３０】
ボツリヌス毒素Ａ型は、最大１２ヶ月の有効性を有し(European J.Neurology 6(Supp 4), S111-S1150, 1999)、ある場合には２７ヶ月間にもわたる有効性を有しうることが既知である(腺の処置、例えば多汗症の処置に用いられる場合)。例えば、Bushara K., Botulinum toxin and rhinorrhea, Otolaryngol Head Neck Surg 1996; 114(3):507、およびThe Laryngoscope 109: 1344-1346: 1999参照。しかし、ＢＯＴＯＸ(登録商標)筋肉内注射の通常の効果持続期間は一般に約３〜４ヶ月間である。
【００３１】
種々の臨床症状の治療におけるボツリヌス毒素Ａ型の成功は、他のボツリヌス毒素血清型への関心を高めている。商業的に入手可能な２つのヒト用ボツリヌス毒素Ａ型調製物は、ＢＯＴＯＸ(登録商標)（カリフォルニア、アーヴィンのAllergan, Inc.から市販されている）およびＤysport(登録商標)（イギリス、ポートン・ダウンのBeaufour Ipsenから市販されている）である。Ｂ型ボツリヌス毒素の調製物(MyoBloc、登録商標）は、カリフォルニア、サンフランシスコのElan Pharmaceuticalsから市販されている。
【００３２】
ボツリヌス毒素は、次のような状態の処置にも提案され、または使用されている：中耳炎（米国特許第5766605号）、内耳障害（米国特許第6265379号、第6358926号）、緊張頭痛（米国特許第6458365号）、片頭痛（米国特許第5714468号）、術後痛および内臓痛（米国特許第6464986号）、毛髪の成長および維持（米国特許第6299893号）、乾癬および皮膚炎（米国特許第5670484号）、損傷筋肉（米国特許第6423319号）、種々の癌（米国特許第6139845号）、平滑筋疾患（米国特許第5437291号）、および神経性炎症（米国特許第6063768号）。制御放出毒素インプラント（例えば米国特許第6306423号および第6312708号参照）、また経皮ボツリヌス毒素投与（米国特許出願第10/194805号）が知られている。
【００３３】
さらに、ボツリヌス毒素は、ラットホルマリンモデルにおいて誘発した炎症性痛覚を軽減するよう作用しうる。Aoki K.ら、Mechanisms of the antinociceptive effect of subcutaneous Botox(R): Inhibition of peripheral and central nociceptive processing, Cephalalgia 2003 Sep; 23(7): 649。さらに、ボツリヌス毒素の神経遮断は、表皮厚さの減少を起こしうることが報告されている。Li Y.ら、Sensory and motor denervation influences epidermal thickness in rat foot glabrous skin, Exp Neurol 1997; 147: 452-462（第459頁参照）。最後に、次のような処置のために脚にボツリヌス毒素を投与することが知られている：脚の過剰発汗を処置する（Katsambas A.ら、Cutaneous diseases of the foot: Unapproved treatments, Clin Dermatol 2002 Nov-Dec; 20(6): 689-699; Sevim, S.ら、Botulinum toxin-A therapy for palmar and plantar hyperhidrosis, Acta Neurol Belg 2002 Dec; 102(4): 167-70）、足指痙攣を処置する（Suputtitada, A., Local botulinum toxin type A injections in the treatment of spastic toes, Am J Phys Med Rehabil 2002 Oct; 81(10): 770-5）、特発性尖足を処置する（Tacks, L.ら、Idiopathic toe walking: Treatment with botulinum toxin A injection, Dev Med Child Neurol 2002; 44(Suppl 91: 6）、および脚ジストニーを処置する（Rogers J.ら、Injections of botulinum toxin A in foot dystonia, Neurology 1993 Apr; 43 (4 Suppl 2)）。
【００３４】
破傷風毒素ならびにその誘導体（すなわち非天然ターゲティング部分を持つもの）、断片、ハイブリッドおよびキメラも、治療有効性を持ちうる。破傷風毒素はボツリヌス毒素との類似点を数多く持っている。例えば、破傷風毒素とボツリヌス毒素はどちらも、クロストリジウム属の近縁種（それぞれ破傷風菌（Clostridium tenani）およびボツリヌス菌（Clostridium botulinum））によって産生されるポリペプチドである。
【００３５】
また、破傷風毒素とボツリヌス毒素はどちらも、1つのジスルフィド結合によって重鎖（分子量約100kD）に共有結合している軽鎖（分子量約50kD）から構成される二本鎖タンパク質である。したがって、破傷風毒素の分子量と、7つの各ボツリヌス毒素（非複合体型）の分子量は、約150kDである。さらに、破傷風毒素でもボツリヌス毒素でも、軽鎖は細胞内生物活性（プロテアーゼ活性）を示すドメインを持ち、重鎖は受容体結合（免疫原）ドメインと細胞膜移行ドメインとを持っている。
【００３６】
さらに、破傷風毒素とボツリヌス毒素はどちらも、シナプス前コリン作動性ニューロンの表面にあるガングリオシド受容体に対して高い特異的親和性を示す。末梢コリン作動性ニューロンによる破傷風毒素の受容体仲介エンドサイトーシスは、逆行性軸索輸送、中枢シナプスからの抑制性神経伝達物質の放出の阻害および痙性麻痺をもたらす。これに対して、末梢コリン作動性ニューロンによるボツリヌス毒素の受容体仲介エンドサイトーシスは、逆行性輸送、中毒した末梢運動ニューロンからのアセチルコリンエキソサイトーシスの阻害、および弛緩性麻痺をもたらすことがなく、たとえあったとしても、ごくわずかである。
【００３７】
最後に、破傷風毒素とボツリヌス毒素は、その生合成および分子構造が互いに似ている。例えば、破傷風毒素とA型ボツリヌス毒素のタンパク質配列には全体で34％の一致度があり、いくつかの機能ドメインについては62％もの配列一致度がある。Binz T. ら、The Complete Sequence of Botulinum Neurotoxin Type A and Comparison with Other Clostridial Neurotoxins, J Biological Chemistry 265（16）;9153-9158:1990。
【００３８】
アセチルコリン
典型的には、単一タイプの小分子の神経伝達物質のみが、哺乳動物の神経系において各タイプのニューロンによって放出される。神経伝達物質アセチルコリンが脳の多くの領域においてニューロンによって分泌されているが、具体的には運動皮質の大錐体細胞によって、基底核におけるいくつかの異なるニューロンによって、骨格筋を神経支配する運動ニューロンによって、自律神経系（交感神経系および副交感神経系の両方）の節前ニューロンによって、副交感神経系の節後ニューロンによって、そして交感神経系の一部の節後ニューロンによって分泌されている。本質的には、汗腺、立毛筋および少数の血管に至る節後交感神経線維のみがコリン作動性であり、交感神経系の節後ニューロンの大部分は神経伝達物質のノルエピネフリンを分泌する。ほとんどの場合、アセチルコリンは興奮作用を有する。しかし、アセチルコリンは、迷走神経による心拍の抑制のように、抑制作用を一部の末梢副交感神経終末において有することが知られている。
【００３９】
自律神経系の遠心性シグナルは交感神経系または副交感神経系のいずれかを介して身体に伝えられる。交感神経系の節前ニューロンは、脊髄の中間外側角に存在する節前交感神経ニューロン細胞体から伸びている。細胞体から伸びる節前交感神経線維は、脊椎傍交感神経節または脊椎前神経節のいずれかに存在する節後ニューロンとシナプスを形成する。交感神経系および副交感神経系の両方の節前ニューロンはコリン作動性であるので、神経節にアセチルコリンを適用することにより、交感神経および副交感神経の両方の節後ニューロンが興奮し得る。
【００４０】
アセチルコリンは、ムスカリン性受容体およびニコチン性受容体の2種類の受容体を活性化する。ムスカリン性受容体は、副交感神経系の節後ニューロンによって刺激されるすべてのエフェクター細胞において、また、交感神経系の節後コリン作動性ニューロンに刺激されるエフェクター細胞において見られる。ニコチン性受容体は、交感神経系および副交感神経系の両方の節前ニューロンと節後ニューロンとの間のシナプスに見られる。ニコチン性受容体はまた、多くの、神経筋接合部における骨格筋繊維の膜にも存在する。
【００４１】
アセチルコリンは、小さい透明な細胞内小胞がシナプス前のニューロン細胞膜と融合したときにコリン作動性ニューロンから放出される。非常に様々な非ニューロン分泌細胞、例えば副腎髄質（PC12細胞株と同様に）および膵臓の島細胞が、それぞれカテコールアミン類および上皮小体ホルモンを大きな高密度コア小胞から放出する。PC12細胞株は、交感神経副腎発達の研究のために組織培養モデルとして広範囲に使用されているラットのクロム親和性細胞腫細胞のクローンである。ボツリヌス毒素は、（エレクトロポレーションによるように）透過性にされた場合、または脱神経支配細胞に毒素を直接注射することによって、両タイプの細胞からの両タイプの化合物の放出をインビトロで阻害する。ボツリヌス毒素はまた、皮質シナプトソーム細胞培養物からの神経伝達物質グルタメートの放出を阻止することが知られている。
【００４２】
タンパク質分解酵素と呼ばれるさまざまな物質が、細胞外マトリックス中に見出される物質を分解または消化する。これらには、例えばヒアルロニダーゼ、プラスミノゲン活性化因子およびコラゲナーゼのファミリーが含まれる。ヒアルロニダーゼは、結合組織の細胞間マトリックス中に見出される多糖（非硫酸化グリコサミノグリカン）であるヒアルロン酸の加水分解を引き起こす。ヒアルロニダーゼは、結合組織、上皮組織および神経組織の至るところに広く分布するヒアルロン酸またはヒアルロネートを消化することにより、細胞外マトリックス（組織セメント（tissue cement））の粘度を一時的に低下させる。この作用は、麻酔剤のような他の薬物の拡散または伝播を促進する。ヒアルロニダーゼを結合組織中に注射することにより、同時に注射される薬物の作用を強化することができる。
【００４３】
ヒアルロニダーゼはさまざまな供給源から入手することができ、典型的には精巣組織抽出物から得られる。例えば、米国カリフォルニア州アービンのISTA PharmaceuticalsはVITRASE（羊由来（ヒツジ）型ヒアルロニダーゼ）を生産し、販売しているが、これは注射用ヒアルロニダーゼのほんの一例である。VITRASEは、他の注射薬に対する（他の注射薬と組み合わされる）、それらの吸収および分散を増加させるための補助薬として、米国FDAによって承認された注射可能な薬物である。前述のように、ヒアルロニダーゼは、眼科（眼）手術において局所麻酔薬と組み合わせて最もよく使用されてきた。ヒアルロニダーゼは組織透過性を増加させ、他の薬物の伝播または分散を促進して、例えば麻酔薬の作用発現を早める。VITRASEは、再水和剤に対する補助薬としての使用、および一定の造影剤との使用についても承認されている。ヒアルロニダーゼは、酵素組換えヒトヒアルロニダーゼの組換え精製調製物としても入手することができ、その一例が、Baxter Healthcare Corporation（米国イリノイ州ディアフィールド）が販売しているHYLENEXである。HYLENEX（組換えヒアルロニダーゼ）は、滅菌された無色透明の保存剤無添加即用溶液として入手することができる（1mLにつき150USP単位の組換えヒトヒアルロニダーゼを8.fmgの塩化ナトリウム、1.4mgの二塩基性リン酸ナトリウム、1.0mgのヒトアルブミン、0.9mgのエデテート、0.3mgの塩化カルシウム、およびpH調節用の水酸化ナトリウムと共に含有する）。ヒツジ精巣から製造される別のヒアルロニダーゼ製品の例は、Aventis Pharma（オーストラリア・ニューサウスウェールズ州レーンコーブ）のHYALASEである。
【００４４】
必要な機械的インパルスを供給するのに十分な局所圧があれば、ヒアルロニダーゼは間質マトリックスにおける分散を増加させる。そのようなインパルスは、通常、注射された溶液によって開始され、拡散速度は酵素の量に比例する。拡散の程度は、当技術分野では知られているとおり、溶液の体積にも比例する。
【００４５】
腋窩多汗症を処置するためにヒアルロニダーゼと一緒に投与されるボツリヌス毒素の効力の維持、作用の伝播および所要量の低下に関する調査が報告されている（Goodman G.「Diffusion and short-term efficacy of botulinum toxin A after the addition of hyaluronidase and its possible application for the treatment of axillary hyperhidrosis」Dermatol Surg 2003 May; 29(5):533-8）。ここでは、多汗症を処置するために、ボツリヌス毒素の投与およびヒアルロニダーゼの追加投与の他、ボツリヌス毒素とヒアルロニダーゼとを含有する製剤/混合物が注射される。
【００４６】
他のタンパク質分解酵素には、細胞外マトリックスタンパク質を消化するコラゲナーゼおよびプラスミノゲン活性化因子が含まれる。プラスミノゲン活性化因子（PA）は、かなりの基質特異性を有し、不活性なチモーゲンであるプラスミノゲンをプラスミンに変換する、セリンプロテアーゼのクラスに属する。プラスミンは、ラミニン、フィブロネクチンを含む多くのタンパク質を分解し、潜在性コラゲナーゼ部分を活性化する能力を有する、一般プロテアーゼである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４７】
したがって必要とされているのは、さまざまな障害を処置するための方法であって、患者に投与されるボツリヌス毒素の量を減少させるものである。より具体的には、さまざまな障害を処置するための、ボツリヌス毒素などの神経毒の注射の数または必要性を減少させ、より好ましくは排除さえする方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００４８】
概要
本開示は、患者の障害を処置するためにその患者が受ける注射の数を、そしてさらには注射の必要性を、減少させるか、さらには排除することによって、コリン作用の影響を受ける障害を処置できるようにする方法の必要性に応えるものである。
【００４９】
定義
本明細書で使用する下記の単語または用語は以下の定義を有する。
「約」とは、そのように修飾された項目、パラメータまたは用語が、該項目、パラメータまたは用語の値の上下±10％の範囲を包含することを意味する。
【００５０】
「ターゲット」または「ターゲット領域」とは、投与された神経毒の所望する作用が発揮される、患者の解剖学的構造の位置/領域または組織または腺を意味する。ターゲットには、筋、例えば膀胱の排尿筋、または過活動である腺もしくは筋を神経支配するニューロン、例えば多汗症患者の真皮における汗腺の汗産生や、排尿筋および/または尿道括約筋などのターゲットとする筋の収縮などを管理するニューロンが含まれうるが、これらに限定されない。通例、ターゲットは本発明の組成物が投与される場所から5インチ以内、好ましくは3インチ以内、より好ましくは1インチ以内にある。
【００５１】
「投与」「投与する」または「投与すること」とは、医薬組成物などの組成物を対象に与える（すなわち投与する）ステップを意味する。本明細書に開示する医薬組成物は、例えば筋肉内（i.m.）、皮内、皮下投与、腹腔内（i.p.）投与、局所（経皮）、点滴注入（例えば腔（胞）内点滴注入（intravesicular instillation））および植込み（例えばポリマーインプラントなどの徐放性デバイス）投与経路などにより、「局所投与」される。
【００５２】
「ボツリヌス毒素」とは、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）が産生する神経毒、ならびに非クロストリジウム属の種によって組換え生産されるボツリヌス毒素（またはその軽鎖もしくは重鎖）を意味する。本明細書で使用する「ボツリヌス毒素」という表現はボツリヌス毒素血清型A、B、C1、D、E、FおよびGを包含する。また、本明細書で使用するボツリヌス毒素はボツリヌス毒素複合体（すなわち300、600および900kDa複合体）ならびに精製ボツリヌス毒素（すなわち約150kDa）をどちらも包含する。「精製ボツリヌス毒素」は、ボツリヌス毒素複合体を形成するタンパク質を含む他のタンパク質から分離された、または実質的に分離された、ボツリヌス毒素と定義される。精製ボツリヌス毒素は95％を上回る純度を有することができ、好ましくは99％を上回る純度を有する。ボツリヌスC2およびC3細胞毒は、神経毒ではなく、本発明の範囲からは除外される。
【００５３】
「クロストリジウム神経毒」は、ボツリヌス菌、酪酸菌（Clostridium butyricum）またはクロストリジウム・ベラチ（Clostridium beratti）などのクロストリジウム属細菌から産生される、またはそれらにとって生得的な神経毒、ならびに非クロストリジウム属の種によって組換え生産されるクロストリジウム神経毒を意味する。
【００５４】
「修飾ボツリヌス毒素」とは、そのアミノ酸の少なくとも1つが、ネイティブボツリヌス毒素と比較して削除されるか、修飾されるか、置き換えられているボツリヌス毒素を意味する。また、修飾ボツリヌス毒素は、組換え生産された神経毒素、または組換え生産された神経毒の誘導体もしくはフラグメントであることもできる。修飾ボツリヌス毒素は、例えばボツリヌス毒素受容体に結合する能力、またはニューロンからの神経伝達物質放出を阻害する能力など、ネイティブボツリヌス毒素の生物学的活性を少なくとも1つは保持している。修飾ボツリヌス毒素の一例は、あるボツリヌス毒素血清型（例えば血清型A）からの軽鎖と、異なるボツリヌス毒素血清型（例えば血清型B）からの重鎖とを有するボツリヌス毒素である。修飾ボツリヌス毒素の別の例は、サブスタンスPなどの神経伝達物質にカップリングされたボツリヌス毒素である。
【００５５】
神経毒の「処置有効」量は、少なくとも1週間、より好ましくは1ヶ月、最も好ましくは約6〜9ヶ月もしくはそれ以上、5年までの間にわたって、ニューロン活動を阻害するのに十分な投薬量である。投与は単回投薬であるか、累積的（連続投与）であることができ、当業者はこれを容易に決定することができる。ボツリヌス毒素などの神経毒は、処置される障害の重症度に応じて最適な量の毒素が投与されて有益な結果が維持されるように、連続的に（すなわち月1回、6ヶ月ごとに1回）送達することができる。そのような投薬スケジュールは、例えば患者のサイズ、選択した神経毒、処置されるべき状態、障害の重症度および当技術分野で知られる他の条件に基づいて、当業者により容易に決定される。
【００５６】
「患者」とは、医学的ケアまたは獣医学的ケアを受けるヒトまたは非ヒト対象を意味する。したがって本明細書に開示する組成物は、哺乳動物などの任意の動物を処置する際に使用することができる。
【００５７】
「十分量」とは、その状況における必要性または提案された目的を満たすのに足りる、物質、組成物または組成物の要素の量を意味する。例えば、ある特定の障害を処置する場合、これは、所望する成果、例えば排尿筋痙直の減少または過剰な汗産生の減少をもたらすボツリヌス毒素の量である。
【００５８】
「コリン作用の影響を受ける障害（cholinergically-influenced disorder）」とは、腺、器官または組織の機能障害（腺、器官もしくは組織の過剰活動もしくは過少活動、または腺、器官もしくは組織の異常/破壊的な拡大の結果であるもの）に起因する障害であって、腺、器官または組織がアセチルコリン放出性ニューロンによる影響/神経支配を受けるものである。コリン作用の影響を受ける障害の限定的でない例には、多汗症、過活動膀胱、および良性前立腺肥大などが含まれる。「泌尿器障害」という用語は、過活動膀胱、排尿筋反射亢進、排尿筋不安定、神経因性膀胱、特発性膀胱、良性前立腺過形成および尿失禁を包含するが、これらに限定されない。
【００５９】
細胞外マトリックス消化酵素は、細胞外マトリックスの少なくとも一構成要素を消化/破壊する酵素である。典型的な細胞外マトリックス消化酵素には、ヒアルロン酸を消化し、過活動膀胱、神経因性膀胱、良性前立腺肥大、前立腺炎、および前立腺がんなどの障害に関して膀胱と前立腺の両方に潜在的適用を有するヒアルロニダーゼが含まれる。細胞外マトリックスを消化する他の酵素、例えばコラゲナーゼや、組織プラスミノゲン活性化因子およびウロキナーゼなどのプラスミノゲン活性化因子も、細胞外マトリックスを消化し、その結果として神経毒の拡散の強化することにより、類似する適用を有することができ、本教示内容の一態様に従って、神経毒の注射の数を減らし、またはその必要性を排除することができる。
【００６０】
表面領域は、単に、対象/患者の表面（例えば皮膚表面）上の、本開示の組成物が投与される特定領域をいう。表面領域の限定でない例には、腋窩皮膚表面領域、手掌皮膚表面領域および足底皮膚表面領域が含まれる。
【００６１】
患者/対象の「管腔表面領域」は、当技術分野ではよく知られているとおり、管腔に面している領域である。限定でない例には、膀胱管腔表面領域、鼻管腔表面領域、前立腺管腔表面領域、食道管腔表面領域、胃管腔表面領域、腸管腔表面領域および血管管腔表面領域などが含まれる。
【００６２】
「腔内投与された」または「腔内投与」とは、例えば任意の適切な既知手段による、管腔表面領域（例えば膀胱管腔表面領域）と接触させるための、管腔への組成物の点滴注入を意味する。ただし膀胱壁などの管腔に面した壁への注射は腔内投与から除外される。
【００６３】
「軽減する」とは、コリン作用の影響を受ける障害に関連する症状の発生を減少させることを意味する。例えば軽減には、例えば多汗症、過活動膀胱、および良性前立腺過形成または本明細書に開示する方法に従って処置される任意の障害に関連する少なくとも1つの症状の多少の減少、著しい減少、ほぼ完全な減少、および完全な減少が含まれる。多汗症の典型的症状は過剰発汗であり、過活動膀胱および良性前立腺過形成の場合、典型的症状として、例えば失禁または尿閉を挙げることができる。軽減作用は、ボツリヌス毒素などのクロストリジウム毒素を患者に投与した後、1〜7日間は臨床的に出現しないこともある。
【００６４】
「処置する」とは、コリン作用の影響を受ける障害の少なくとも1つの症状を、一時的にまたは永続的に、軽減（または排除）することを意味する。
【００６５】
本開示に従って、コリン作用の影響を受ける障害を有する患者を処置するための方法は、細胞外マトリックス消化酵素を含有する第1組成物を患者の表面領域に投与した後、細胞外マトリックス消化酵素が表面領域を通して拡散するように、十分な長さの時間を経過させ、次に、ボツリヌス毒素を含有する第2組成物を表面領域に投与し、続いてボツリヌス毒素が表面領域を通して拡散するのに十分な時間をとるステップを含み、それによって、コリン作用の影響を受ける障害に関連する少なくとも1つの症状を軽減し、そしてコリン作用の影響を受ける障害を有する患者を処置することができる。特定の例では、表面領域が膀胱管腔表面領域などの管腔表面領域である。細胞外マトリックス消化酵素は、例えばヒアルロニダーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子およびコラゲナーゼであり、一方、ボツリヌス毒素はA、B、C、D、E、F、およびG型ボツリヌス毒素からなる群より選択される。
【００６６】
本明細書に開示する方法の実施に役立つ組成物の投与には、さまざまな投与方法を利用することができる。ある例では、膀胱管腔表面領域への細胞外マトリックス消化酵素およびボツリヌス毒素の投与が、例えば膀胱内への、細胞外マトリックス消化酵素を含有する組成物の点滴注入、ならびにボツリヌス毒素を含有する組成物の点滴注入によって達成される。
【００６７】
また、本明細書に開示する教示内容に従って実施される方法がもたらす相乗作用ゆえに、細胞外マトリックス消化酵素の投与は、例えば膀胱壁への注射によって達成するか、または皮膚表面領域に（例えばわきの下（腋窩）、手掌または足底表面などに）皮下注射することができ、一方、神経毒含有第2組成物の投与は、それぞれ、膀胱内への点滴注入によって達成するか、皮膚表面領域上に噴霧、塗布または塗抹され、そうすることによって、ボツリヌス毒素を注射する必要性が回避される。逆に、細胞外マトリックス消化酵素（第1組成物）の投与は、膀胱内への第1組成物の点滴注入によって達成されうるか、皮膚表面領域上に噴霧、塗布または塗抹することができ、そしてボツリヌス毒素の投与は、それぞれ、第2組成物（ボツリヌス毒素などの神経毒を含有するもの）の膀胱壁への注射、または皮膚表面領域への真皮下注射によって達成されることも考えられる。
【００６８】
したがってボツリヌス毒素の投与は、膀胱壁への20未満の注射数、より好ましくは膀胱壁への10未満の注射数、そして最も好ましくは膀胱壁への1〜5の注射数によって達成することができる。例えば、細胞外マトリックス消化酵素を含む第1組成物の投与後に、合計5の神経毒（ボツリヌス毒素など）注射数を、以下のように投与することができる：膀胱の頂部（dome）に1注射、膀胱の腹側壁に1注射、膀胱の背側壁に1注射、および各側壁（膀胱の左右の側壁）にそれぞれ1注射で、合計5注射。特に有用なボツリヌス毒素には、A、B、C1、D、E、F、およびG型ボツリヌス毒素からなる群より選択されるボツリヌス毒素が含まれる。
【００６９】
特定の実施形態では、本明細書に開示する方法が、さらに、細胞外マトリックス消化酵素を含有する組成物の投与に先だって膀胱を空にし、そして場合によっては、細胞外マトリックス消化酵素を含有する組成物の投与後に膀胱を空にし、そして場合によっては、ボツリヌス毒素などの神経毒を含有する第2組成物の投与後に膀胱を空にするステップを含みうる。上述のように、本明細書に開示する方法は、第1組成物（少なくとも1つの細胞外マトリックス消化酵素を含有するもの）を除去すること、および第2組成物（少なくとも1つの神経毒、例えばボツリヌス毒素を含有するもの）を除去することを含みうる。
【００７０】
本開示に従って処置することができる典型的なコリン作用の影響を受ける障害には、泌尿器障害、例えば膀胱障害または前立腺障害が含まれる。典型的な膀胱障害には、例えば過活動膀胱、肥大膀胱頚部および排尿筋反射亢進が含まれる。前立腺障害の例には、良性前立腺肥大、前立腺炎および前立腺がんが含まれる。コリン作用の影響を受ける障害のさらなる例は多汗症であり、したがって処置する際に、患者の表面領域は、腋窩皮膚表面領域、手掌皮膚表面領域および足底皮膚表面領域からなる群より選択することができる。
【００７１】
特定の実施形態では、コリン作用の影響を受ける障害を処置するための注射数を減少させることに加えて、神経毒の投与を必要とする患者に神経毒を投与するための方法は、特に、神経毒または細胞外マトリックス消化酵素の注射を一切排除することもでき、その方法は、少なくとも1つの細胞外マトリックス消化酵素を含有する第1組成物を患者の皮膚表面領域または管腔表面領域上に投与し、神経毒を含有する第2組成物を患者の皮膚表面領域または管腔表面領域上に投与するステップを含み、この場合、神経毒は、少なくとも1つの細胞外マトリックス消化酵素を含有する第1組成物なしで投与した場合よりも、よく拡散し、さらにこの投与が第1組成物と第2組成物の両方の注射を排除する。そのような実施形態において、皮膚表面領域は、腋窩皮膚表面領域、足底皮膚表面領域または手掌皮膚表面領域であることができる。管腔表面領域の例としては、膀胱管腔表面領域、尿道管腔表面領域、鼻管腔表面領域または前立腺管腔表面領域を挙げることができる。
【００７２】
例えば、神経毒または細胞外マトリックス消化酵素の注射を特に排除する方法では、細胞外マトリックス消化酵素とボツリヌス毒素の一方または両方の投与が、患者の皮膚表面領域または管腔表面領域上への噴霧または塗擦の少なくとも1つによる適用によって達成される。ある方法は、皮膚表面への第1組成物（少なくとも1つの細胞外マトリックス消化酵素を含有するもの）の投与後に、皮膚表面を乾燥させるステップをさらに含みうる。皮膚表面の乾燥には、第2組成物（神経毒、例えばA、B、C1、D、E、FまたはG型ボツリヌス毒素からなる群より選択されるボツリヌス毒素を含有するもの）の皮膚表面領域への投与を開始する前に、第1組成物が皮膚表面から蒸発しうるように、十分な時間を経過させるステップが含まれうる。
【００７３】
泌尿器障害の処置を必要とする患者における泌尿器障害を処置するための別の非注射的方法が、本開示に従って提供される。この方法は、ヒアルロニダーゼを含有する第1組成物を、膀胱管腔表面領域（グリコサミノグリカン層を有するもの）に第1組成物を接触させるために、患者の膀胱内に点滴注入し、導入された（点滴注入された）ヒアルロニダーゼがグリコサミノグリカン層と相互作用し膀胱管腔表面領域を通して拡散するように、第1組成物を膀胱内に維持して十分な時間を経過させ、場合によっては、第1組成物を膀胱から排液させ、先に点滴注入され除去された第1組成物が先に接触していた膀胱管腔表面領域と接触するように、A型ボツリヌス毒素を含有する第2組成物を膀胱に点滴注入し、十分な量のA型ボツリヌス毒素が膀胱管腔表面領域を通して固有筋層の少なくとも一層（内縦層、中輪層、および外縦層の少なくとも1つ）まで拡散するように、点滴注入された第2組成物を膀胱内に十分な時間保持し、場合によっては、第2組成物を膀胱から排液させるステップを含み、それによって、泌尿器障害に関連する少なくとも1つの症状を軽減し、泌尿器障害の処置を必要とする患者の泌尿器障害を処置する。さらに、細胞外マトリックス消化酵素とボツリヌス毒素の両方が含まれている単一の組成物/混合物を膀胱内に点滴注入しうることも考えられる。
【００７４】
そのように処置することができる、すなわち注射の使用を必要としない方法によって処置することができる、典型的な泌尿器障害には、例えば過活動膀胱、肥大膀胱頚部および排尿筋反射亢進などからなる群より選択される泌尿器障害が含まれる。
【００７５】
本明細書に記載するどの特徴も、そのような特徴の2つ以上からなるどの組合せも、そのような組合せに含まれる特徴が相互に矛盾しない限り、本発明の範囲に包含される。
【００７６】
説明
本開示は、さまざまなコリン作用の影響を受ける障害、例えば泌尿器障害および多汗症を処置することができる方法を提供する。泌尿器障害には、例えば過活動膀胱、肥大膀胱頚部および排尿筋反射亢進などが含まれ、本明細書に教示するとおり、細胞外マトリックス消化酵素をボツリヌス毒素などの神経毒と併用することによって処置することができる。そのような使用は、ボツリヌス毒素の拡散を強化し、したがって、ボツリヌス毒素を使ってこれらの障害を処置する際に通例用いられる注射プロトコールの必要性を減少させ、さらには排除することができる。
【００７７】
本開示によれば、以下に詳述するように、さまざまな障害を処置するために少なくとも1つの細胞外マトリックス消化酵素を神経毒（好ましくはボツリヌス毒素）と併用することの相乗作用を利用する方法が、ここに記載される。本明細書に詳述する方法の有利な点は、処置有効量の神経毒を患者に投与し、それによって障害を処置するために行われる注射の数の減少、そしてさらにはそのような注射の排除である。
【００７８】
神経毒は、液剤、粉末剤、クリーム剤、乳剤、懸濁剤、溶液剤など、任意の薬学的に許容できる製剤/製剤群に製剤化することができる。
【００７９】
本明細書の開示範囲に含まれる方法に従って投与されるボツリヌス毒素などのクロストリジウム毒素の量は、当技術分野では知られているとおり、処置される障害（例えば泌尿器障害または多汗症）に特有の特徴、例えば重症度、および他のさまざまな患者の条件、例えばサイズ、体重、年齢、および処置に対する応答性などに応じて変動しうる。医師への指針として、毒素が注射される場合、通例、1回の患者処置セッションにつき、注射部位1ヶ所あたり約1単位以上約2500単位以下のA型ボツリヌス毒素（例えばBOTOX（登録商標））が投与される。DYSPORT（登録商標）などのA型ボツリヌス毒素の場合、注射されるのであれば、1回の患者処置セッションにつき、注射部位1ヶ所あたり約2単位以上約4000単位以下のA型ボツリヌス毒素が投与される。MYOBLOC（登録商標）などのB型ボツリヌス毒素の場合、1回の患者処置セッションにつき、注射部位1ヶ所あたり約40単位以上約25,000単位以下のB型ボツリヌス毒素が投与される。細胞外マトリックス消化酵素を含有する組成物が注射または注射以外の方法によって投与されたかまたは投与される/投与されるであろう領域への、神経毒含有組成物の点滴注入、塗布または噴霧などといった、毒素の注射を用いない方法でも、同様の量の毒素を用いることができる。もちろん、特定の障害/状態を処置するために特定の患者に用いられる神経毒および細胞外マトリックス消化酵素の量は、医学分野で知られているとおり、担当医によって決定されるだろう。例えば、患者の膀胱への神経毒の投与によって泌尿器障害を処置する場合、溶液/分散系の体積および神経毒の濃度は、患者のサイズ、障害の重症度、膀胱壁の厚さ、投与される細胞外マトリックス消化酵素および筋の濃度/量、併存症、ならびに他の因子に依存しうる。
【００８０】
例えば、腋窩多汗症などの多汗症を患う患者を処置する場合は、最初に、処置すべき領域を決定するために簡単なマイナー（Minor）のデンプンヨウ素試験を行うことにより、処置すべき多汗性表面領域（ここではわきの下）を決定する。その領域を画定し、細胞外マトリックス消化酵素を含有する組成物（例えばヒアルロニダーゼを含有する溶液）を、その多汗性領域に適用する。例えば、そのように適用される組成物は、約150Uのヒアルロニダーゼを含有することができ、ヒアルロニダーゼを吸収させるために、患者の皮膚表面上に放置される。そのような適用は、単に、細胞外マトリックス消化酵素を含有する第1組成物を所望の領域上にはけ塗り、噴霧または塗布することによって達成することができる。いくつかの例では、皮膚表面領域を乾燥させるために、十分な時間を経過させる。次に、ボツリヌス毒素などの神経毒を含有する組成物をその領域に適用する。そのような組成物は、例えば約50〜約200単位のボツリヌス毒素を含有することができる。好ましくは、ボツリヌス毒素を含有する組成物は、同様に、処置すべき表面領域にはけ塗り、噴霧または塗布され、患者は約2〜約7日で過剰な発汗の減少と正常発汗への復帰とを報告しうる。
【００８１】
あるいは、例えばボツリヌス毒素は、注射によって、例えば皮下注射によって投与することができる。しかし、ヒアルロニダーゼなどの細胞外マトリックス消化酵素の局所適用ゆえに、腋窩多汗症を処置するために用いられるボツリヌス毒素の典型的注射数と比較して、必要な注射数が著しく減少する。一例として、約5〜約10ヶ所の注射部位で、各部位につき約5〜約25単位のBOTOX（登録商標）（A型ボツリヌス毒素）を、細胞外マトリックス消化酵素が投与される領域に投与することができる。好ましくは、ボツリヌス毒素約5注射までが、細胞外マトリックス消化酵素が投与される領域に投与される。通例、注射は、多汗性領域の最大量をカバーするように、互いに均等に離して行われる。
【００８２】
別の例においては、本明細書に開示する方法は、例えば、細胞外マトリックス消化酵素を含有する組成物が投与された膀胱の管腔表面領域にボツリヌス毒素などの神経毒を投与することによって、さまざまな泌尿器障害を処置するための方法を提供する。膀胱の管腔へのアクセスは、当技術分野で知られているとおり、尿道および膀胱へのカテーテルまたはカニューレの挿入によって、容易に達成される。
【００８３】
カテーテルがそのように配置されたら、ヒアルロニダーゼなどの細胞外マトリックス消化酵素を含有する第1組成物1〜1000mlを膀胱内に点滴注入する。この溶液は、概ね約25〜約50単位の範囲内のヒアルロニダーゼを含有することができ、組成物（例えば溶液）の体積およびヒアルロニダーゼの濃度は、患者のサイズ、膀胱壁および膀胱筋の厚さ、併存症、泌尿器障害の重症度、患者の体重、ならびに、特定患者の処置に適した投薬量/パラメータを決定する際に医学分野で考慮される他の標準的因子に依存しうる。次に、十分な量の時間（例えば約5分〜約2時間）を経過させた後、膀胱から第1組成物を排液させることができる。例えば約10ml〜約50mlの第1組成物が膀胱中に点滴注入されるいくつかの実施形態では、組成物が吸収されうるので、膀胱を排液する必要がない場合がある。この間、患者には、第1組成物の膀胱管腔表面との接触が十分に確保されるような体位をとらせる（横臥、伏臥および仰臥させる）ことができる。次に、第1組成物を膀胱から排液させることができる（これには、既知の排液技法を利用し、例えば外からの膀胱の用手押下が含まれうる）。次に、神経毒（好ましくはボツリヌス毒素、最も好ましくはA型ボツリヌス毒素）を含有する第2組成物を、膀胱内に点滴注入によって投与して、細胞外マトリックス消化酵素を含有する第1組成物が先に投与された膀胱管腔表面と接触させる。約25〜約3000単位、より好ましくは約100〜約2500単位のA型ボツリヌス毒素をそのように点滴注入することができ、約500〜約50,000単位、より好ましくは約1000〜約25,000単位のB型ボツリヌス毒素を、または当業者に知られるように他のボツリヌス毒素血清型の場合は臨床的に等価な量を、膀胱内にそのように点滴注入することができる。
【００８４】
患者に腔内投与される神経毒剤の投薬量は、所望する処置成果を達成するのに治療的に有効な投薬量である。ボツリヌス毒素の場合、患者に投与される典型的な用量は、毒性用量未満（例えば70kgの男性に対して3000単位未満のBOTOX（登録商標）A型ボツリヌス毒素）の任意の用量、例えば、患者1人につき処置1回あたり1〜1,500単位、より好ましくは50〜500単位でありうるが、必要に応じて、それより低用量または高用量を投与することもできる。用量は単回投与として投与するか、または、ある期間にわたって、例えば数日または数週間または数ヶ月にわたって、分割投与として投与することができる（特定の神経毒調製物の作用の長さによる）。
【００８５】
第1組成物と同様に、ボツリヌス毒素を含有する第2組成物約1〜約1000mlを膀胱内に点滴注入し、上に詳述したように患者にさまざまな体位をとらせることができる。患者はこの手順に先だって、おそらく膀胱を空にしておくように指導されるだろうから、膀胱が満杯になることも著しく膨張することもないだろう。特定の実施形態では、約1〜約100mlの溶液/分散系、より好ましくは10〜50mlの溶液/分散系の点滴注入で、膀胱の内側（膀胱管腔表面）を覆うには十分だろう。また、膀胱内に第2組成物を点滴注入してから十分な長さの時間（例えば約5分〜約2時間）が経過した後に、ボツリヌス毒素を含有する第2組成物を、膀胱から排液させることができる。ただし、小体積の第2組成物を点滴注入する場合（例えば約1〜約10ml）は、担当医が膀胱からの排液を望まず、むしろ患者に自然に排液（排出）させる場合がある。本開示の教示内容に従う膀胱注入用の組成物（ボツリヌス毒素または細胞外マトリックス消化酵素のいずれかを含有するもの）は、通例、約80〜約100ml、より好ましくは80mlの体積を有する。もちろん、担当医は、神経毒含有組成物および細胞外マトリックス消化酵素組成物の濃度ならびに点滴注入される組成物の体積を、患者の膀胱サイズ（小児および青少年の膀胱は成人よりも小さい）および処置される障害の重症度に応じて増減することができる。
【００８６】
点滴注入された組成物の排液は、カテーテルによって達成するか、もちろん神経毒含有組成物の可処分量に関連して適切な注意を払った上で、自然に排出させることができる。約2〜約7日以内に、患者は泌尿器の改善を報告し、さらには、正常な泌尿器状態（これは、成人の場合、約25cc/秒の流量と約400ccの排尿量とを有することである）への復帰さえ報告しうる。
【００８７】
膀胱内への点滴注入に関して、第1組成物（細胞外マトリックス消化酵素を含有するもの）および第2組成物の排液を上に説明した。患者の消化管の一部または鼻管腔内に点滴注入する場合は、適当な除去/排液経路を使用することができ、例えば、鼻管腔表面領域において組成物が点滴注入または除去されるように患者の頭部を単に傾斜/配置させることができる。
【００８８】
第1および第2組成物を腔内投与するための方法の一例では、尿道を通って膀胱内に延びる尿路カテーテルを利用する。このカテーテルは、単一の管腔を有する「ストレートカテーテル」（単なる直線的流路）であるか、あるいは、場合によってはバルーンまたは他の機構を使用して膀胱内に固定するカテーテル（例えばフォリーカテーテル）であることができる。そのようなカテーテルの標準サイズは当技術分野では知られており、例えば10〜16フレンチ（3〜5mm）だが、患者のサイズおよびその解剖学的構造に応じて、それより大きいサイズまたは小さいサイズが使用されてもよい。
【００８９】
カテーテルを所定の位置に配置したら、そのカテーテルを通して、典型的には、約1〜1000mlの神経毒含有溶液/分散系、より好ましくは10〜50mlの範囲の神経毒含有溶液/分散系を、膀胱内に点滴注入することができる。溶液/分散系の体積および神経毒の濃度は、患者のサイズ、膀胱壁および膀胱筋の厚さ、併存症、ならびに他の因子に依存しうる。
【００９０】
神経毒を腔内投与する別の代表的手段では、腹壁を通して、患者の膀胱内に直接、恥骨上針または恥骨上カテーテルが設置される。これは、より侵襲的な方法であり、膀胱への好ましいアクセス方法ではないが、尿路感染、尿路閉塞などのせいで、担当医にとってはこれが膀胱管腔表面にアクセスするために利用できる最善の経路である場合がある。次に、必要な体積の細胞外マトリックス消化酵素含有組成物および神経毒含有組成物を、当技術分野で知られているように、直視、内視鏡または蛍光透視ガイドを使って、膀胱内に導入することができる。本開示に従って行われる腔内投与は、組成物の腔内送達の視認を容易にする膀胱鏡を利用して達成することもできる。この場合、組成物は、膀胱鏡の作業流路を通して、または膀胱鏡内を通過するまたは膀胱鏡と併走するカテーテルもしくは他の管状構造を通して、膀胱管腔内に導入することができる。
【００９１】
いくつかの例では、尿道または恥骨上カテーテル/針は、膀胱内で膨張させて尿道または恥骨上カテーテル/針をしかるべき位置に「ロック」し、その移動を防ぐことができる可膨張性構成要素を有しうる。バルーンまたは他の可膨張性デバイスを膨張させると膀胱内で体積をとり、それによって、投与されるべき細胞外マトリックス消化酵素組成物および神経毒含有組成物の必要量を減らすことができる。
【００９２】
ある態様によれば、細胞外マトリックス消化酵素およびボツリヌス毒素は連続的に投与するか、同時に投与することができる。表面領域に点滴注入または伝播させるための典型的混合物は、例えば、9mlの保存剤添加食塩水で希釈された100単位のA型ボツリヌス毒素（BOTOX）と、1mlのヒアルロニダーゼ（1500単位、ここではHYALASE）とを含有しうる。
【００９３】
投与経路および投薬量の例を挙げたが、適当な投与経路および投薬量は、一般に、症例ごとに担当医によって決定される。そのような決定は当業者にとって日常的作業である（例えばAnthony Fauciら編「Harrison's Principles of Internal Medicine」（1998、14版、McGraw Hill発行）を参照されたい）。例えば、開示する本発明に従ってボツリヌス毒素などのクロストリジウム毒素を投与するための経路および投薬量は、選択した神経毒の溶解度特性ならびに処置される障害の強さなどといった基準に基づいて選択することができる。
【００９４】
以下の実施例は、当業者に、本発明の範囲に包含される方法を実施するための好ましい具体的方法を提示するものであるが、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
実施例
【実施例１】
【００９５】
64歳の患者が過活動膀胱を有し、結果として、切迫性および腹圧性失禁を有する。彼は、残念なことに、1日に約5〜8回の尿漏れを経験し、彼の状態ゆえに着用を余儀なくされている成人用おむつを交換する必要がある。泌尿器科医を受診した時に、ボツリヌス毒素と細胞外マトリックス消化酵素とを利用する膀胱点滴注入のレジメンが決定される。
【００９６】
患者に、排尿してから、可動テーブルまたはベッドに仰臥するように求め、その後、尿道カテーテルを患者の尿道内に、膀胱まで挿入する。細胞外マトリックス消化酵素を含有する第1組成物（ここでは保存剤無添加食塩水50ml中の保存剤無添加ヒアルロニダーゼ（例えばHYLENEX）150USP単位）を、その男性の膀胱内に点滴注入する。次に、カテーテルを取り除き、第1組成物を膀胱頂部において膀胱管腔表面と接触させるために、患者が横たわっている面を彼の頭部が彼の足よりも低くなるように傾ける。患者をそのような体位に10分間保った後、今度は第1組成物を膀胱の底部と十分に接触させるために、彼の足が彼の頭より低くなるように傾ける。患者をその状態でさらに10分間保った後、膀胱の側面管腔表面領域の全てが、細胞外マトリックス消化酵素を含む第1組成物に、より完全にばく露されるように、左右に横臥（それぞれ各10分間）、次に伏臥するように患者に求める。次に、患者に再びカテーテルを挿入し、患者を直立させて、膀胱を排液する。次に、50mlの保存剤無添加食塩水に再構成した500単位のA型ボツリヌス毒素（例えばBOTOX（登録商標））を含有する第2組成物を、患者の膀胱内に点滴注入した後、第1組成物の場合と同じ体位取りレジメンに付す。次に、患者から第2組成物を排液させ、帰宅させる。
【００９７】
週1回の経過観察来院において、患者は今や自身の排尿を制御でき、念のために依然として成人用おむつは着用しているものの、点滴注入処置以降、不慮の尿漏れエピソードはなく、腹圧性失禁ゆえに避けざるをえなかったランニングや他の身体活動も楽しめることが示される。
【実施例２】
【００９８】
72歳の男性が、彼のパーキンソン病に続発する神経因性膀胱機能障害による切迫性失禁を有する。この患者は、その状態ゆえに、排尿のために日に平均20回以上トイレに行かざるを得ない。主治医はこの状況を診察して、患者の膀胱壁への細胞外マトリックス消化酵素とボツリヌス毒素の投与を決定する。
【００９９】
患者に、まず、排尿するよう求め、次に、適当なサイズのカテーテル（3〜5mm）を患者の尿道に挿入する。溶液2ml中に300USP単位の保存剤無添加ヒアルロニダーゼ（例えばHYLENEX）を含有する第1組成物を膀胱内に点滴注入し、体位取りルーチンに付すが、ここでは、患者にさまざまな体位を5分間ずつ保たせる。患者の膀胱の排液後に、膀胱鏡を利用して、膀胱の頂部、背側壁、腹側壁および側壁のそれぞれに1ヶ所ずつ、膀胱三角部を残して、ボツリヌス毒素を注射する。したがって、各注射部位につき約10単位のA型ボツリヌス毒素複合体を合計5注射して、合計約50単位のA型ボツリヌス毒素（例えばBOTOX（登録商標）、または各部位に約40単位のDYSPORT（登録商標）で合計200単位のA型ボツリヌス毒素）を、このように送達し、毒素のみを利用する以前の方法での典型的には20〜40という注射数からは著しく減少する。膀胱内および膀胱管腔表面への細胞外マトリックス消化酵素の点滴注入は、固有筋層全体（すなわち膀胱の筋層の内縦筋、中輪筋、および外縦筋の三層）への毒素のより大きな拡散を容易にすると同時に、実施する必要がある注射の量を減少させる。
【０１００】
処置後の休憩を終えた後、患者を帰宅させる。経過観察来院時に、患者は望ましくない全身的または局所的副作用を訴えず、主観的（尿意切迫の減少）にも客観的（今やわずか平均4回/日の排尿）にも、膀胱機能の改善を示す。
【０１０１】
注射部位1ヶ所あたり1000単位で、5000単位までのB型ボツリヌス毒素の注射も行うことができ、患者のパーキンソン症に続発する神経因性膀胱機能障害が同様に処置される。
【実施例３】
【０１０２】
58歳の女性が、痙攣性括約筋に続発する尿閉を有し、肥大膀胱頚部を有する。患者は通常週に2〜3回しか排尿せず、排尿する際も、1回の用便につき約50mlの尿をかろうじて排泄するに過ぎない。彼女の介護者は、結果として生じる高い膀胱内圧と膀胱容量の減少とが上部尿路の劣化を招くことを恐れる。
【０１０３】
そこで、彼女の泌尿器科医は、膀胱鏡および可撓性内視鏡針を彼女の尿道および膀胱内に挿入する。合計100単位のヒアルロニダーゼ（例えばVITRASE）を含む第1組成物を、排尿筋の合計10ヶ所、背側、腹側および側方膀胱壁にそれぞれ2ヶ所（膀胱壁へは合計8注射）、そして膀胱頚部の2ヶ所に注射し、膀胱鏡を取り除く。10分後に、750単位のA型ボツリヌス毒素（例えばDYSPORT（登録商標））を含有する保存剤無添加食塩水100mlの第2組成物を膀胱内に点滴注入し、そこに30分間保った後、患者に再びカテーテルを挿入し、第2組成物を排泄させる。7日以内に、介護者が排尿頻度の改善（1日あたり1〜2回）と、排泄される尿量の増加（1回の用便につき約300〜400ml）とを報告する。
【実施例４】
【０１０４】
23歳の大学生が、彼女の皮膚科医に、過剰な腋窩発汗のために自意識が過剰となり、その結果成績が低下し、時が経つにつれてますます内向的になると訴える。皮膚科医は患者が多汗症を有すると判断し、回転塗布式制汗剤は彼女の過剰発汗には効果がないので、多汗症の処置に神経毒を利用することを提案する。
【０１０５】
患者の腋窩をペーパータオルで拭って乾燥させてから、マイナーのヨウ素-デンプン試験を行って、処置すべき多汗性皮膚表面領域を（例えば植物性インクを利用して）画定する。この腋窩皮膚表面領域に、細胞外マトリックス消化酵素を含有する第1組成物（ここでは150USP単位の保存剤無添加ヒアルロニダーゼ（HYLENEXなど）を含有する1ml）を適用する（この第1組成物は、画定した領域に綿棒などの塗布具で塗布することによって適用する）。次に、その領域を約10分間風乾させる。その後、腋窩皮膚表面領域に、約25単位のA型ボツリヌス毒素（例えばBOTOX（登録商標）、または約100単位のDYSPORT（登録商標）、または約1250単位のMYOBLOC（登録商標））を、別の綿棒を利用して適用し、乾燥させる。同じ手順を患者の他方の腋窩にも実施する。
【０１０６】
1週間以内に、患者は、以前には頻繁に見られた過剰な発汗をもはや経験しないこと、および過剰な局所的緊張低下も全身的有害作用もないことを報告する。
【０１０７】
同様に多汗性でありうる他の皮膚表面領域、例えば手のひら（手掌皮膚表面領域）および/または足の裏（足底皮膚表面領域）を処置するために、同様のアプローチを利用することができる。
【実施例５】
【０１０８】
42歳の独身男性が、過剰な腋窩発汗のために自意識が過剰となり、もはや異性とは交流できないほどであると皮膚科医に訴える。皮膚科医は、患者が多汗症を有すると判断し、彼が試した局所制汗剤はいずれも有効ではなかったので、多汗症の処置に神経毒を利用することを提案する。
【０１０９】
患者の腋窩をペーパータオルで拭って乾燥させてから、マイナーのヨウ素-デンプン試験を行って、処置すべき多汗性皮膚表面領域を（例えば植物性インクを利用して）画定する。この腋窩皮膚表面領域に、細胞外マトリックス消化酵素を含有する第1組成物（ここでは300USP単位の保存剤無添加ヒアルロニダーゼ（HYLENEXなど）を含有する2ml）を適用する（この第1組成物は、画定した領域に非エアロゾルポンプなどの噴霧アプリケータで噴霧することによって適用する）。次にその領域を約10分間風乾させる。その後、その腋窩皮膚表面領域に、約1000単位のB型ボツリヌス毒素（MYOBLOC（登録商標）など）を、噴霧アプリケータを利用して噴霧し、乾燥させる。同じ処置を患者の他方の腋窩にも行う。
【０１１０】
10日以内に、患者は、孤独だった以前には頻繁に見られた過剰な発汗をもはや経験しないことを報告し、さらに、過剰な局所的緊張低下も全身的有害作用もないことも報告する。患者は、この処置が約2〜約6ヶ月は有効であったと報告し、その時点で彼は、もう1回処置を受けるために、皮膚科医を再受診する。
【実施例６】
【０１１１】
15歳の高校生が、彼の家庭医に、多汗の手が、大きな困惑の種であることを訴える。そこで医師は、処置すべき領域を画定するために、マイナーのヨウ素-デンプン試験を行うことにする。過剰な発汗は、主に、その患者の手首と指の付け根のと間の領域から生じるようである。 
【０１１２】
そこで、150USP単位を含有する1mlのヒアルロニダーゼを、手首から指の付け根までに適用し（片手につき1ml/150USP単位）、乾燥させる。乾燥後に、手掌の4つの注射点（手首の付け根の正中、中指の付け根、親指の付け根と人差し指の付け根との間、および小指の付け根と手首の付け根との間）のそれぞれに、約40単位のA型ボツリヌス毒素（例えばBOTOX（登録商標）、または約80単位のDYSPORT（登録商標）、または200単位のB型ボツリヌス毒素、例えばMYOBLOC（登録商標））を皮内注射する。
【０１１３】
5日後に、患者は、手掌がもはや多汗でないことを報告し、過剰な緊張低下や全身的作用の報告はない。多汗症は8ヶ月まで軽減され、その時点で、患者は再処置を受けるために再び来院する。必要であれば、処置を患者の指の腹部分にも（過剰な発汗を示すのであれば）適用する。
【実施例７】
【０１１４】
76歳の男性が、良性前立腺肥大による前立腺の拡大に起因する慢性尿閉を有する。彼の医師は、彼の尿閉を軽減し、良性前立腺肥大を処置するために、前立腺へのボツリヌス毒素の投与を、患者に受けさせることにする。前立腺へのボツリヌス毒素の注射数を最小限に抑えるために、ヒアルロニダーゼなどの細胞外マトリックス酵素を、前立腺の側葉の移行域および中葉に、注射または点滴注入する。注射膀胱鏡および23ゲージ針を利用して、ヒアルロニダーゼ（注射点に50単位）の3注射（側葉のそれぞれに1注射と、中葉に1注射）を行う。5分後に、A型ボツリヌス毒素の3注射を同様に投与する。この場合、各注射は50単位のA型ボツリヌス毒素（BOTOX（登録商標））を含有し、合計で150単位である。
【０１１５】
約7日後に、患者は、この処置後の自発的排尿の改善を報告し、排尿後残尿量および圧力が低下する。これらの有益な作用が、この患者の場合は、約5ヶ月間維持され、有害作用は報告されない。例えば1注射部位あたり約250単位〜1000単位のB型ボツリヌス毒素も使用することができる。
【０１１６】
本発明を一定の好ましい方法に関して詳細に説明したが、本発明の範囲内で他の実施形態、変形および変更も可能である。例えば本発明の方法では、クロストリジウム神経毒の代わりに広範囲にわたる多様な神経毒を有効に使用することができる。また本発明は、同時投与または逐次投与される2つ以上の異なるクロストリジウム毒素成分およびターゲティング部分の投与も包含する。例えば、膀胱管腔表面領域または多汗性皮膚表面領域への、A型ボツリヌス毒素を含有する特定の第2組成物の投与を患者に施し、その作用に対する耐性抵抗性の増加が認められたら、その後の適用では、血清型の異なるボツリヌス毒素、例えばB型またはF型ボツリヌス毒素を利用して、コリン作用の影響を受ける障害を処置することができる。本発明のさまざまな具体例および実施形態に関して説明したが、本発明はそれらに限定されず、本発明は特許請求項の範囲内でさまざまに実施することができると理解すべきである。
【国際調査報告】
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