(57)【要約】糖の濃度を自動的に決定する方法が提供される。この方法は、１つまたはそれ以上の糖標準および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップと、この１つまたはそれ以上の糖標準および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルの一部を希釈剤とともにマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと、酸性試薬の一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと、マルチウェルプレート中の一連のウェルの内容物を混合するステップと、マルチウェルプレート中の一連のウェルの内容物を加熱および冷却するステップと、マルチウェルプレートを振とうするステップと、マルチウェルプレート中の一連のウェルの内容物の放射エネルギー吸収度を測定するステップとを含み、すべてのステップはヒトの介入なしに行なわれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖の濃度を決定する自動化された方法であって、
ａ）１つまたはそれ以上の糖標準を調製するステップを含み、このステップは
（ｉ）糖ワーキングストック溶液供給源容器から糖ワーキングストック溶液の一部を複数の糖標準受取容器に移すステップと、
（ｉｉ）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部を前記複数の糖標準受取容器に移すステップと、
（ｉｉｉ）前記複数の糖標準受取容器の内容物を混合して前記１つまたはそれ以上の糖標準を調製するステップと
を含み；この方法はさらに
ｂ）１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップを含み、このステップは
（ｉ）多糖テストサンプル供給源容器から多糖テストサンプルの一部を複数の多糖テストサンプル受取容器に移すステップと、
（ｉｉ）前記希釈剤供給源容器から前記希釈剤の一部を前記複数の多糖テストサンプル受取容器に移すステップと、
（ｉｉｉ）前記複数の多糖テストサンプル受取容器の内容物を混合して前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップと
を含み；この方法はさらに
ｃ）前記希釈剤供給源容器から前記希釈剤の一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；
ｄ）前記複数の糖標準受取容器の各々から前記１つまたはそれ以上の糖標準の一部を前記マルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；
ｅ）前記複数の多糖テストサンプル受取容器の各々から前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルの一部を前記マルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；
ｆ）酸性試薬供給源容器からの酸性試薬の一部を、前記希釈剤、前記１つまたはそれ以上の糖標準、および前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有する前記マルチウェルプレート中の前記一連のウェルのすべてに移すステップと；
ｇ）前記希釈剤、前記１つまたはそれ以上の糖標準、および前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有する前記マルチウェルプレート中の前記一連のウェルのすべての内容物を混合するステップと；
ｈ）前記マルチウェルプレートをカバーで覆うステップと；
ｉ）前記マルチウェルプレートを加熱するステップと；
ｊ）前記マルチウェルプレートを冷却するステップと；
ｋ）前記マルチウェルプレートを振とうするステップと；
ｌ）前記希釈剤、前記１つまたはそれ以上の糖標準、および前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有する前記マルチウェルプレート中の前記一連のウェルのすべての内容物の放射エネルギー吸収度を測定するステップと
を含み、ステップａ〜ｌはヒトの介入なしに行なわれる、方法。
【請求項２】
前記マルチウェルプレートを冷却するステップの後に、呈色試薬供給源容器からの呈色試薬の一部を、前記希釈剤、前記１つまたはそれ以上の糖標準、および前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有する前記マルチウェルプレート中の前記一連のウェルのすべてに移すステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記呈色試薬はメタ−ヒドロキシジフェニルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記糖ワーキングストック溶液は、ラムノース、ガラクトース、グルコース、ガラクツロン酸、ピルビン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、およびＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンからなる群より選択される１つまたはそれ以上の糖を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記多糖テストサンプルは、バクテリア莢膜多糖、活性化されたバクテリア莢膜多糖、またはバクテリア莢膜多糖−タンパク質結合体の１つまたはそれ以上を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記バクテリア莢膜多糖は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｙ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｗ１３５、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ血清型Ｉａ、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ血清型ＩＩＩ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型５、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ａ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型７Ｆ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型９Ｖ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１４、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１８Ｃ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ｆ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２３Ｆ、およびそれらの組合せからなるバクテリアの群より選択されるバクテリア莢膜多糖を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記酸性試薬は硫酸およびアントロンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記酸性試薬は硫酸および四ホウ酸塩を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記糖ワーキングストック溶液供給源容器、前記糖標準受取容器、前記多糖テストサンプル供給源容器、および前記多糖テストサンプル受取容器は、ガラス試験管、プラスチック試験管、ガラスバイアル、プラスチックバイアル、プラスチック遠心管、プラスチック微量遠心管、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記希釈剤は、注射用水、通常の生理食塩水、コハク酸塩緩衝生理食塩水、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記希釈剤は注射用水である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記移すステップは、自動液体操作装置によって行なわれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記自動液体操作装置は、マルチチャンネルピペットマニホルドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記混合するステップは、反復的なピペッティングによって行なわれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記マルチウェルプレートを加熱するステップは、プレートヒーターによって行なわれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
糖の濃度を決定する自動化された方法であって、
ａ）１つまたはそれ以上の糖標準を調製するステップを含み、このステップは
（ｉ）ラムノース、ガラクトース、グルコース、ガラクツロン酸、ピルビン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、およびＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンからなる群より選択される１つまたはそれ以上の糖を含む糖ワーキングストック溶液の一部を、糖ワーキングストック溶液供給源容器から複数の糖標準受取容器に移すステップと、
（ｉｉ）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部を前記複数の糖標準受取容器に移すステップと、
（ｉｉｉ）前記複数の糖標準受取容器の内容物を混合して前記１つまたはそれ以上の糖標準を調製するステップと
を含み；この方法はさらに
ｂ）１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップを含み、このステップは
（ｉ）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからなるバクテリアの群より選択されるバクテリア莢膜多糖を含む多糖テストサンプルの一部を、多糖テストサンプル供給源容器から複数の多糖テストサンプル受取容器に移すステップと、
（ｉｉ）前記希釈剤供給源容器から前記希釈剤の一部を前記複数の多糖テストサンプル受取容器に移すステップと、
（ｉｉｉ）前記複数の多糖テストサンプル受取容器の内容物を混合して前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップと
を含み；この方法はさらに
ｃ）前記希釈剤供給源容器から前記希釈剤の一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；
ｄ）前記複数の糖標準受取容器の各々から前記１つまたはそれ以上の糖標準の一部を前記マルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；
ｅ）前記複数の多糖テストサンプル受取容器の各々から前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルの一部を前記マルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；
ｆ）硫酸−アントロン試薬供給源容器からの硫酸−アントロン試薬の一部を、前記希釈剤、前記１つまたはそれ以上の糖標準、および前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有する前記マルチウェルプレート中の前記一連のウェルのすべてに移すステップと；
ｇ）前記希釈剤、前記１つまたはそれ以上の糖標準、および前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有する前記マルチウェルプレート中の前記一連のウェルのすべての内容物を混合するステップと；
ｈ）前記マルチウェルプレートをカバーで覆うステップと；
ｉ）前記マルチウェルプレートを加熱するステップと；
ｊ）前記マルチウェルプレートを冷却するステップと；
ｋ）前記マルチウェルプレートを振とうするステップと；
ｌ）前記希釈剤、前記１つまたはそれ以上の糖標準、および前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有する前記マルチウェルプレート中の前記一連のウェルのすべての内容物の放射エネルギー吸収度を測定するステップと
を含み、ステップａ〜ｌはヒトの介入なしに行なわれる、方法。
【請求項１７】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからなるバクテリアの群より選択される前記バクテリア莢膜多糖は、活性化されたバクテリア莢膜多糖である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからなるバクテリアの群より選択される前記バクテリア莢膜多糖は、担体タンパク質に結合されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記担体タンパク質はＣＲＭ１９７である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
糖の濃度を決定する自動化された方法であって、
ａ）１つまたはそれ以上の糖標準を調製するステップを含み、このステップは
（ｉ）ガラクツロン酸を含む糖ワーキングストック溶液の一部を、糖ワーキングストック溶液供給源容器から複数の糖標準受取容器に移すステップと、
（ｉｉ）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部を前記複数の糖標準受取容器に移すステップと、
（ｉｉｉ）前記複数の糖標準受取容器の内容物を混合して前記１つまたはそれ以上の糖標準を調製するステップと
を含み；この方法はさらに
ｂ）１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップを含み、このステップは
（ｉ）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１および５からなるバクテリアの群より選択されるバクテリア莢膜多糖を含む多糖テストサンプルの一部を、多糖テストサンプル供給源容器から複数の多糖テストサンプル受取容器に移すステップと、
（ｉｉ）前記希釈剤供給源容器から前記希釈剤の一部を前記複数の多糖テストサンプル受取容器に移すステップと、
（ｉｉｉ）前記複数の多糖テストサンプル受取容器の内容物を混合して前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップと
を含み；この方法はさらに
ｃ）前記希釈剤供給源容器から前記希釈剤の一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；
ｄ）前記複数の糖標準受取容器の各々から前記１つまたはそれ以上の糖標準の一部を前記マルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；
ｅ）前記複数の多糖テストサンプル受取容器の各々から前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルの一部を前記マルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；
ｆ）硫酸−四ホウ酸塩試薬供給源容器からの硫酸−四ホウ酸塩試薬の一部を、前記希釈剤、前記１つまたはそれ以上の糖標準、および前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有する前記マルチウェルプレート中の前記一連のウェルのすべてに移すステップと；
ｇ）前記希釈剤、前記１つまたはそれ以上の糖標準、および前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有する前記マルチウェルプレート中の前記一連のウェルのすべての内容物を混合するステップと；
ｈ）前記マルチウェルプレートをカバーで覆うステップと；
ｉ）前記マルチウェルプレートを加熱するステップと；
ｊ）前記マルチウェルプレートを冷却するステップと；
ｋ）呈色試薬供給源容器からのメタ−ヒドロキシジフェニルを含む呈色試薬の一部を、前記希釈剤、前記１つまたはそれ以上の糖標準、および前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有する前記マルチウェルプレート中の前記一連のウェルのすべてに移すステップと；
ｌ）前記マルチウェルプレートを振とうするステップと；
ｍ）前記希釈剤、前記１つまたはそれ以上の糖標準、および前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有する前記マルチウェルプレート中の前記一連のウェルのすべての内容物の放射エネルギー吸収度を測定するステップと
を含み、ステップａ〜ｍはヒトの介入なしに行なわれる、方法。
【請求項２１】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１および５からなるバクテリアの群より選択される前記バクテリア莢膜多糖は、活性化されたバクテリア莢膜多糖である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１および５からなるバクテリアの群より選択される前記バクテリア莢膜多糖は、担体タンパク質に結合されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記担体タンパク質はＣＲＭ１９７である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖の濃度を決定するための自動化された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
さまざまなサンプル中の糖含有量の測定は、科学の多数の領域における基本的な分析動作である。糖の濃度決定のための周知の比色法は、アントロン（非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３）、フェノール試薬（非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６）、オルシノール（非特許文献７）、およびレゾルシノール（非特許文献８）を利用するアッセイを含む。アントロンアッセイは中性ヘキソースを含有する多糖中の糖の濃度を測定するために用いられるのに対し、フェノール試薬（例、メタ−ヒドロキシジフェニル（ｍｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｄｉｐｈｅｎｙｌ：ｍＨＤＰ）／３−フェニルフェノール）はガラクツロン酸またはグルクロン酸単糖を含有する多糖中の糖の濃度を測定するために用いられる。
【０００３】
糖の濃度決定のためのさまざまな比色アッセイにおける変動性の原因となるものは、ヒトの操作者によるサンプル調製および測定に関係する要素、たとえばサンプルの操作、試薬の希釈、試薬の不安定性、加熱および冷却時間の変動などを含む。サンプリングの困難さはこれらのアッセイの多くの適用に固有のものである。なぜなら、サンプルを標準に対して定量可能なレベルにするためにしばしばｍｇ／ｍｌからμｇ／ｍｌの濃度までの希釈が必要とされるためである。厳密なプロトコルにもかかわらず、サンプリングの困難さ、すなわちヒトの操作者が濃縮溶液を希釈して非常に薄い溶液にする必要があるために、これらのアッセイは薬物製品への調合およびラベルクレームを行なえるような正確で信頼性の高いアッセイに発展できない。したがって、糖の濃度を決定するための有効な自動化された方法の開発がなおも必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｄｒｅｙｗｏｏｄ，Ｒ．，Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．，Ａｎａｌ．Ｅｄ．１８：４９９，１９４６
【非特許文献２】Ｍｏｒｓｅ，Ｅ．Ｅ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９：１０１２，１９４７
【非特許文献３】Ｍｏｒｒｉｓ，Ｄ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０７：２５４，１９４８
【非特許文献４】Ｄｕｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １６８：１６７，１９５１
【非特許文献５】Ｄｕｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２８：３５０−５６，１９５６
【非特許文献６】Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚ  ａｎｄ  Ａｓｂｏｅ−Ｈａｎｓｅｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：４８４，１９７３
【非特許文献７】Ｉｒｗｉｎ  ａｎｄ  Ｌｅａｖｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  １７７：１１２６，１９５６
【非特許文献８】Ｍｏｎｓｉｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７５：５２５−３０，１９８８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
糖の濃度を自動的に決定する方法が提供される。この方法は、（１）１つまたはそれ以上の糖標準を調製するステップを含み、このステップは（ａ）糖ワーキングストック溶液供給源容器から糖ワーキングストック溶液の一部を複数の糖標準受取容器に移すステップと、（ｂ）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部を複数の糖標準受取容器に移すステップと、（ｃ）複数の糖標準受取容器の内容物を混合して１つまたはそれ以上の糖標準を調製するステップとを含み；この方法はさらに（２）１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップを含み、このステップは（ａ）多糖テストサンプル供給源容器から多糖テストサンプルの一部を複数の多糖テストサンプル受取容器に移すステップと、（ｂ）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部を複数の多糖テストサンプル受取容器に移すステップと、（ｃ）複数の多糖テストサンプル受取容器の内容物を混合して１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップとを含み；この方法はさらに（３）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；（４）複数の糖標準受取容器の各々から１つまたはそれ以上の糖標準の一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；（５）複数の多糖テストサンプル受取容器の各々から１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルの一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；（６）酸性試薬供給源容器からの酸性試薬の一部を、希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべてに移すステップと；（７）希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべての内容物を混合するステップと；（８）マルチウェルプレートをカバーで覆うステップと；（９）マルチウェルプレートを加熱するステップと；（１０）マルチウェルプレートを冷却するステップと；（１１）マルチウェルプレートを振とうするステップと；（１２）希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべての内容物の放射エネルギー吸収度を測定するステップとを含み、ステップ１〜１２はヒトの介入なしに行なわれる。
【０００６】
実施形態の１つにおいては、マルチウェルプレートを冷却するステップの後に、呈色試薬供給源容器からの呈色試薬の一部を、希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべてに移す付加的なステップが行なわれる。
【０００７】
本発明の方法を用いて糖の濃度をアッセイするための多糖テストサンプルは、バクテリア莢膜多糖、活性化されたバクテリア莢膜多糖、またはバクテリア莢膜多糖−タンパク質結合体を含有するテストサンプルを含む。例示的なバクテリア莢膜多糖は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｎｍ）血清群ＹおよびＷ１３５；Ｂ群（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ＧＢＳ）血清型ＩａおよびＩＩＩ；ならびにＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからのバクテリア莢膜多糖を含む。
【０００８】
別の実施形態において、この方法は（１）１つまたはそれ以上の糖標準を調製するステップを含み、このステップは（ａ）ラムノース、ガラクトース、グルコース、ガラクツロン酸、ピルビン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、およびＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンからなる群より選択される１つまたはそれ以上の糖を含む糖ワーキングストック溶液の一部を、糖ワーキングストック溶液供給源容器から複数の糖標準受取容器に移すステップと、（ｂ）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部を複数の糖標準受取容器に移すステップと、（ｃ）複数の糖標準受取容器の内容物を混合して１つまたはそれ以上の糖標準を調製するステップとを含み；この方法はさらに（２）１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップを含み、このステップは（ａ）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからなるバクテリアの群より選択されるバクテリア莢膜多糖を含む多糖テストサンプルの一部を、多糖テストサンプル供給源容器から複数の多糖テストサンプル受取容器に移すステップと、（ｂ）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部を複数の多糖テストサンプル受取容器に移すステップと、（ｃ）複数の多糖テストサンプル受取容器の内容物を混合して１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップとを含み；この方法はさらに（３）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；（４）複数の糖標準受取容器の各々から１つまたはそれ以上の糖標準の一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；（５）複数の多糖テストサンプル受取容器の各々から１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルの一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；（６）硫酸−アントロン試薬供給源容器からの硫酸−アントロン試薬の一部を、希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべてに移すステップと；（７）希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべての内容物を混合するステップと；（８）マルチウェルプレートをカバーで覆うステップと；（９）マルチウェルプレートを加熱するステップと；（１０）マルチウェルプレートを冷却するステップと；（１１）マルチウェルプレートを振とうするステップと；（１２）希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべての内容物の放射エネルギー吸収度を測定するステップとを含み、ステップ１〜１２はヒトの介入なしに行なわれる。
【０００９】
さらなる実施形態において、この方法は（１）１つまたはそれ以上の糖標準を調製するステップを含み、このステップは（ａ）ガラクツロン酸を含む糖ワーキングストック溶液の一部を、糖ワーキングストック溶液供給源容器から複数の糖標準受取容器に移すステップと、（ｂ）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部を複数の糖標準受取容器に移すステップと、（ｃ）複数の糖標準受取容器の内容物を混合して１つまたはそれ以上の糖標準を調製するステップとを含み；この方法はさらに（２）１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップを含み、このステップは（ａ）Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１および５からなるバクテリアの群より選択されるバクテリア莢膜多糖を含む多糖テストサンプルの一部を、多糖テストサンプル供給源容器から複数の多糖テストサンプル受取容器に移すステップと、（ｂ）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部を複数の多糖テストサンプル受取容器に移すステップと、（ｃ）複数の多糖テストサンプル受取容器の内容物を混合して１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップとを含み；この方法はさらに（３）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；（４）複数の糖標準受取容器の各々から１つまたはそれ以上の糖標準の一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；（５）複数の多糖テストサンプル受取容器の各々から１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルの一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；（６）硫酸−四ホウ酸塩試薬供給源容器からの硫酸−四ホウ酸塩試薬の一部を、希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべてに移すステップと；（７）希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべての内容物を混合するステップと；（８）マルチウェルプレートをカバーで覆うステップと；（９）マルチウェルプレートを加熱するステップと；（１０）マルチウェルプレートを冷却するステップと；（１１）呈色試薬供給源容器からのメタ−ヒドロキシジフェニルを含む呈色試薬の一部を、希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべてに移すステップと；（１２）マルチウェルプレートを振とうするステップと；（１３）希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべての内容物の放射エネルギー吸収度を測定するステップとを含み、ステップ１〜１３はヒトの介入なしに行なわれる。
【００１０】
本発明の方法を用いることで、糖の濃度決定のための伝統的なアッセイにおけるヒトの操作者によるサンプル調製および測定に関係する要素（例、サンプルの操作および試薬の希釈）がなくなるため、糖の濃度決定の精度が改善する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、糖の濃度を自動的に決定することに向けられた方法を提供する。特定的には、この方法は、（１）１つまたはそれ以上の糖標準を調製するステップを含み、このステップは（ａ）糖ワーキングストック溶液供給源容器から糖ワーキングストック溶液の一部を複数の糖標準受取容器に移すステップと、（ｂ）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部を複数の糖標準受取容器に移すステップと、（ｃ）複数の糖標準受取容器の内容物を混合して１つまたはそれ以上の糖標準を調製するステップとを含み；この方法はさらに（２）１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップを含み、このステップは（ａ）多糖テストサンプル供給源容器から多糖テストサンプルの一部を複数の多糖テストサンプル受取容器に移すステップと、（ｂ）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部を複数の多糖テストサンプル受取容器に移すステップと、（ｃ）複数の多糖テストサンプル受取容器の内容物を混合して１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを調製するステップとを含み；この方法はさらに（３）希釈剤供給源容器から希釈剤の一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；（４）複数の糖標準受取容器の各々から１つまたはそれ以上の糖標準の一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；（５）複数の多糖テストサンプル受取容器の各々から１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルの一部をマルチウェルプレート中の一連のウェルに移すステップと；（６）酸性試薬供給源容器からの酸性試薬の一部を、希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべてに移すステップと；（７）希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべての内容物を混合するステップと；（８）マルチウェルプレートをカバーで覆うステップと；（９）マルチウェルプレートを加熱するステップと；（１０）マルチウェルプレートを冷却するステップと；（１１）マルチウェルプレートを振とうするステップと；（１２）希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべての内容物の放射エネルギー吸収度を測定するステップとを含み、ステップ１〜１２はヒトの介入なしに行なわれる。
【００１２】
「糖標準」とは、一連の標準の各々が既知の糖濃度を有するような一連の標準を意図するものである。こうした一連の標準は、糖の濃度の範囲、たとえば２．５ｎＭから１００ｎＭなど、たとえば２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、および１００ｎＭなどを含んでもよい。理論上の標準濃度（例、ｎＭ）が、一連の標準濃度の各々の反復試験の組において測定された平均吸収度に対してプロットされ、線形回帰分析によって勾配、ｙ切片および相関係数（ｒ）が算出されて、標準曲線が生成される。
【００１３】
本明細書において用いられる「糖ワーキングストック溶液」という用語は、特定のバクテリアの莢膜多糖からの多糖繰り返し単位の組成を反映した糖組成を有する溶液を含む。例示的なバクテリアは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｙ（グルコース繰り返し単位）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｗ１３５（ガラクトース繰り返し単位）、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ血清型Ｉａ（グルコース／ガラクトース繰り返し単位）、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ血清型ＩＩＩ（グルコース／ガラクトース繰り返し単位）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１（ガラクツロン酸繰り返し単位）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３（グルコース繰り返し単位）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４（ガラクトース／Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン／Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン／ピルビン酸繰り返し単位）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型５（ガラクツロン酸繰り返し単位）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ａ（ガラクトース／グルコース／ラムノース繰り返し単位）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ（ガラクトース／グルコース／ラムノース繰り返し単位）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型７Ｆ（ガラクトース／グルコース／ラムノース繰り返し単位）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型９Ｖ（グルコース／ガラクトース／ガラクツロン酸繰り返し単位）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１４（グルコース／ガラクトース繰り返し単位）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１８Ｃ（ガラクトース／グルコース／ラムノース繰り返し単位）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａ（グルコース／ラムノース繰り返し単位）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ｆ（グルコース／ラムノース繰り返し単位）、およびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２３Ｆ（ガラクトース／ラムノース／グルコース繰り返し単位）を含む。
【００１４】
（糖ワーキングストック溶液供給源容器、糖標準受取容器、多糖テストサンプル供給源容器、および多糖テストサンプル受取容器などにおける）「供給源容器」とは、保存および操作の際に液体溶液を入れておくために有用なあらゆる容器を意図するものである。こうした容器は当該技術分野において周知であり、ガラス試験管、プラスチック試験管、ガラスバイアル、プラスチックバイアル、プラスチック遠心管、およびプラスチック微量遠心管を含むが、これらに限定されない。
【００１５】
本明細書において用いられる（糖ワーキングストック溶液の一部を移す、希釈剤の一部を移す、多糖テストサンプルの一部を移す、前記１つまたはそれ以上の糖標準の一部を移す、前記１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルの一部を移す、および酸性試薬の一部を移すなどにおける）「移す（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）」とは、供給源容器から受取容器への液体の運搬もしくは移動、または供給源容器／受取容器からマルチウェルプレートのウェルへの液体の運搬もしくは移動を含む。当業者に周知であるとおり、液体の移動は自動液体操作装置によって達成されてもよい。こうした装置は一般的に、複数の液体サンプルを同時に移すことができる１つまたはそれ以上のマルチチャンネルピペットマニホルドを利用する。
【００１６】
「希釈剤」とは、たとえば糖ワーキングストック溶液または多糖テストサンプルなどの希釈をもたらすために用いられる薬剤、および放射エネルギー吸収度測定による糖濃度決定に対する「ブランク」（すなわち糖／多糖を含有しない）として働く薬剤を意図するものである。本発明における使用が見出される希釈剤は、たとえば注射用水（ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：ＷＦＩ）、通常の生理食塩水（すなわち０．９％のＮａＣｌ）およびコハク酸塩緩衝生理食塩水などを含む。「混合する」とは、受取容器またはマルチウェルプレートのウェルの中のさまざまな成分を混和または調合することを意図するものである。当業者に周知であるとおり、液体成分の混合は、たとえば反復的なピペッティング（たとえば自動液体操作装置によって行なわれるものなど）および振とう（たとえばプレートシェーカーによって行なわれるものなど）などを含むいくつかの手段によって達成されてもよい。
【００１７】
本明細書において用いられる「多糖テストサンプル」は、既知の組成の多糖（類）を含有するサンプルを含む。テストサンプル中の多糖（類）の組成は既知である必要がある。なぜなら糖濃度は、適切な糖標準からの吸収度データによって生成される線形回帰線から得られる等式を用いて、存在する糖繰り返し単位の量（例、ナノモル）を定めることによって見出されるためである。特定の血清型の多糖繰り返し単位の分子量に、適切な線形回帰線から得られた多糖繰り返し単位のナノモル数を掛けると、多糖テストサンプル中に存在する多糖繰り返し単位のナノグラム数が得られる。
【００１８】
既知の組成の多糖の例は、バクテリア莢膜多糖、たとえばＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｙ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｗ１３５、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ血清型Ｉａ、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ血清型ＩＩＩ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型５、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ａ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型７Ｆ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型９Ｖ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１４、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１８Ｃ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ｆ、およびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２３Ｆからのものなどを含む。テストサンプルに含有される多糖は、非修飾であっても、活性化されていても（すなわちその結合を容易にするために修飾されている）、（例、ＣＲＭ１９７などの担体タンパク質に）結合されていても、またはそれらのあらゆる組合せであってもよい。「希釈多糖テストサンプル」とは、希釈剤を加えた後の多糖テストサンプルを意図するものである。
【００１９】
本明細書において用いられる「酸性試薬」は、酸性のｐＨを有する試薬を含む。好ましい実施形態において、酸性試薬は硫酸を含む。いくつかの実施形態においては、硫酸に加えて、酸性試薬はアントロンを含む。他の実施形態においては、硫酸に加えて、酸性試薬は四ホウ酸塩を含む。
【００２０】
「前記マルチウェルプレートを加熱する」とは、マルチウェルプレートのウェルの内容物の温度を上げることを意図するものである。酸性ｐＨ（すなわち酸性試薬によって与えられるものなど）と熱との組合せによって、多糖を分解してそれを構成する単糖にする。本発明の方法に対して、マルチウェルプレートは周囲温度よりも高い温度から最高１００℃の温度まで、たとえば７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、および９９℃などで加熱される。好ましい実施形態において、マルチウェルプレートは９５±５℃にて１０±２分間加熱される。当業者に周知であるとおり、多糖のそれを構成する単糖への分解を達成するために必要とされる加熱時間の量は、とりわけ多糖の加熱温度に依存する；温度が低いほど長い加熱時間が必要となる。使用される温度に基づいて加熱時間を調整することは、当業者の能力の範囲内である。マルチウェルプレートの加熱は、たとえばマルチウェルプレートを水浴内または加熱プレート上に置くことなど、当該技術分野において周知のあらゆる数の方法によって達成されてもよい。
【００２１】
「前記マルチウェルプレートを冷却する」とは、マルチウェルプレートのウェルの内容物の温度を下げることを意図するものである。マルチウェルプレートの冷却は、たとえばプレートを熱源から取出して周囲温度で冷ますことなど、当該技術分野において周知のあらゆる数の方法によって達成されてもよい。代替的には、プレートを周囲温度よりも低い温度（たとえば４℃など）の環境（例、冷蔵庫または水浴）に移してもよい。
【００２２】
本明細書において用いられる「前記マルチウェルプレートを振とうする」とは、マルチウェルプレートを撹拌してそのウェルの内容物を混合することを含む。本発明の方法において、マルチウェルプレートの振とうは、当該技術分野において周知のあらゆる数の装置、たとえばプレートシェーカーなどを用いて達成されてもよい。「前記マルチウェルプレート中の前記一連のウェルのすべての内容物の吸収度を測定する」とは、分光光度計を用いて、ブランクを含有する一連のウェルと、糖標準を含有する一連のウェルと、多糖テストサンプルを含有する一連のウェルとの吸収度を測定することを意図するものである。繰り返し単位に、たとえばガラクトース、グルコースおよびラムノースなどの中性ヘキソースを含有する多糖（例、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆ；Ｎｍ血清型ＹおよびＷ１３５；ならびにＧＢＳ血清型ＩａおよびＩＩＩ）に対しては、硫酸−アントロン試薬を用いて吸収度が定められる。いくつかの実施形態において、６２５ｎｍにおける吸収度が定められる。繰り返し単位にガラクツロン酸またはグルクロン酸を含有する多糖（例、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１および５）に対しては、硫酸−四ホウ酸塩試薬をｍＨＤＰとともに用いて吸収度が定められる。いくつかの実施形態において、５２０ｎｍにおける吸収度が定められる。本発明の方法においては、ブランクと、糖標準と、多糖テストサンプルとの反復試験、たとえば２、３、４、５、６つまたはそれ以上の反復試験を含むことによって精度が増す。次いで、ブランクと、糖標準と、多糖テストサンプルとに対する一組の反復試験の平均吸収度が定められる。
【００２３】
特定の実施形態においては、本発明の方法は、マルチウェルプレートを冷却するステップの後に、呈色試薬供給源容器からの呈色試薬の一部を、希釈剤、１つまたはそれ以上の糖標準、および１つまたはそれ以上の希釈多糖テストサンプルを含有するマルチウェルプレート中の一連のウェルのすべてに移すステップを含む。「呈色試薬」とは、糖との反応の際に（例、分光測光法によって）検出可能な色を形成する物質を含む組成物を意図するものである。例示的な色形成物質は、アントロン、ｍＨＤＰおよびカルバゾールを含む。
【００２４】
以下の実施例は、例示として提供されるものであって限定するためのものではない。
【実施例】
【００２５】
（実施例１）
実施例１．糖含有量の決定のための自動化されたアントロンアッセイ
アントロンアッセイを用いて、繰り返し単位にガラクトース、グルコースおよびラムノースなどの中性ヘキソースを含有する多糖（例、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆ；Ｎｍ血清型ＹおよびＷ１３５；ならびにＧＢＳ血清型ＩａおよびＩＩＩ）に対する糖含有量を決定する。硫酸と熱との作用によって、多糖はそれを構成する単糖に分解される。アントロン試薬はヘキソースと反応して黄緑色の複合体を形成し、その吸収度が分光測光法によって読取られる（例、６２５ｎｍにて）；アッセイの範囲にわたって、吸収度は存在するヘキソースの量に比例する。
【００２６】
試薬の調製
次の式を用いて各血清型ストックに対して必要な糖の重量を算出することによって、５０ｍＭの糖ストック溶液を調製した：
計量すべき糖のｍｇ数＝５０ｍＭ×体積（ｍｌ）×ＭＷ
１０００ｍｌ／Ｌ×標準純度
分子量を表Ｉに示す。
【００２７】
【表１】
2010521677.tif 000002
５０ｍＭの糖ストック溶液を用いて、１．０ｍＭ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆ、Ｎｍ血清型ＹおよびＷ１３５、ならびにＧＢＳ血清型ＩａおよびＩＩＩ）および０．５ｍＭ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１８Ｃ）の糖ワーキングストック溶液を調製し、各血清型の多糖繰り返し単位の組成を反映させた（表ＩＩおよび表ＩＩＩ）。
【００２８】
【表２】
2010521677.tif 000003
【００２９】
【表３】
2010521677.tif 000004
酸性試薬（０．２％のアントロン−硫酸）は、１．０ｇのアントロンを５００ｍｌの硫酸と混合することによって調製した。
【００３０】
標準の調製
すべてのＮｍ、ＧＢＳおよびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型（１８Ｃを除く）に対して、１５ｎＭ、３０ｎＭ、４５ｎＭ、および６０ｎＭの糖標準（１ｍｌアリコートで）を調製し、これはＪａｎｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）自動液体操作システムによって、各濃度に対する５本の微量遠心管の組において調製され、アッセイされる血清型に対して適切な１．０ｍＭのワーキングストック溶液が、希釈剤としてのＷＦＩとともに用いられる。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１８Ｃに対しては、０．５ｍＭのワーキングストック溶液を用いて、７．５ｎＭ、１５ｎＭ、２２．５ｎＭおよび３０ｎＭの糖標準（１ｍｌアリコートで）を調製する。これらの体積を用いてデフォルト標準曲線を調製する。
【００３１】
サンプルの調製
サンプル（例、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆ；Ｎｍ血清型ＹおよびＷ１３５；ならびにＧＢＳ血清型ＩａおよびＩＩＩ）をアッセイの範囲にするために必要な希釈は、Ｊａｎｕｓ自動液体操作システムによって、各希釈に対する５本の微量遠心管の組において調製される。すべてのＮｍ、ＧＢＳおよびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型（１８Ｃを除く）に対して、次の計算を用いてサンプルの量を予測してもよい：
【００３２】
【化１】
2010521677.tif 000005
サンプルの予想濃度がよく確立されていないときには、少なくとも１つがアッセイの範囲内に来るように希釈の範囲を選択する（例、１：５０、１：７５、１：１００、１：１５０、および１：２００）。
【００３３】
手順
読取装置の統合、温度制御および混合のための統合された実験器具移動アームおよび補助機器を有するＪａｎｕｓ自動液体操作システムを用いて、１００μｌの希釈剤（例、ＷＦＩ）における５つの反復試験がマルチウェルプレートの５つのウェルに分配される；希釈剤はブランクとして働く。各々の適切な標準（例、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆ；Ｎｍ血清型ＹおよびＷ１３５；ならびにＧＢＳ血清型ＩａおよびＩＩＩ）の１００μｌにおける５つの反復試験がマルチウェルプレートの５つのウェルに分配され、同様に各テストサンプル１００μｌにおける５つの反復試験がマルチウェルプレートの５つのウェルに分配される。
【００３４】
各ウェルに２００マイクロリットルの酸性試薬を加えて、ウェルの内容物を反復的なピペッティングによって十分に混合する。マルチウェルプレートに（手動で、または実験器具移動アームを介して）カバーをかけて、９５±５℃にて１０±２分間加熱した後、周囲温度にて≧１０分間冷却する。実験器具移動アームによってマルチウェルプレートをプレート読取装置の上に置き、軽く振とうして、ウェルの内容物の放射エネルギー吸収度を６２５ｎｍにて決定する。
【００３５】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ａの糖標準およびテストサンプルを用いて行なった自動運転の代表的な例を表ＩＶおよび表Ｖに示す。
【００３６】
【表４】
2010521677.tif 000006
【００３７】
【表５】
2010521677.tif 000007
（実施例２）
実施例２：糖含有量の決定のための自動化されたウロン酸アッセイ
ウロン酸アッセイを用いて、繰り返し単位にガラクツロン酸またはグルクロン酸単糖を含有する多糖（例、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１および５）に対する糖含有量を決定する。硫酸と、四ホウ酸ナトリウムと、熱との作用によって、多糖はそれを構成する単糖に分解される。ｍＨＤＰを加えることによって赤紫色の複合体が形成され、その吸収度が分光測光法によって読取られる（例、５２０ｎｍにて）；アッセイの範囲にわたって、吸収度は存在するウロン酸の量に比例する。
【００３８】
試薬の調製
次の式を用いて必要なガラクツロン酸の重量を算出することによって、５０ｍＭのガラクツロン酸ストック溶液を調製した：
【００３９】
【化２】
2010521677.tif 000008
５０ｍＭのガラクツロン酸ストック溶液を用いて、１．０ｍＭのガラクツロン酸ワーキングストック溶液を調製した。
【００４０】
酸性試薬（１２．５ｍＭの四ホウ酸ナトリウム−硫酸）は、２．３８ｇの四ホウ酸ナトリウム十水化物を５００ｍｌの硫酸と混合することによって調製した。
【００４１】
標準の調製
２ナノモル、４ｎＭ、８ｎＭ、１２ｎＭ、および１６ｎＭの糖標準（１ｍｌアリコートで）を調製し、これはＪａｎｕｓ自動液体操作システムによって、各濃度に対する５本の微量遠心管の組において調製され、１．０ｍＭのガラクツロン酸ワーキングストック溶液が、希釈剤としてのＷＦＩとともに用いられる。これらの体積を用いてデフォルト標準曲線を調製する。
【００４２】
サンプルの調製
サンプル（例、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１および５）をアッセイの範囲にするために必要な希釈は、Ｊａｎｕｓ自動液体操作システムによって、各希釈に対する５本の微量遠心管の組において調製される。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの両方の血清型に対して、次の計算を用いてサンプルの量を予測してもよい：
【００４３】
【化３】
2010521677.tif 000009
サンプルの予想濃度がよく確立されていないときには、少なくとも１つがアッセイの範囲内に来るように希釈の範囲を選択する（例、１：５０、１：７５、１：１００、１：１５０、および１：２００）。
【００４４】
手順
読取装置の統合、温度制御および混合のための統合された実験器具移動アームおよび補助機器を有するＪａｎｕｓ自動液体操作システムを用いて、４０μｌの希釈剤（例、ＷＦＩ）における５つの反復試験がマルチウェルプレートの５つのウェルに分配される；希釈剤はブランクとして働く。各々の適切な標準（例、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１および５）の４０μｌにおける５つの反復試験がマルチウェルプレートの５つのウェルに分配され、同様に各テストサンプル４０μｌにおける５つの反復試験がマルチウェルプレートの５つのウェルに分配される。
【００４５】
各ウェルに２５０マイクロリットルの酸性試薬を加えて、ウェルの内容物を反復的なピペッティングによって十分に混合する。マルチウェルプレートに（手動で、または実験器具移動アームを介して）カバーをかけて、９０℃にて２０分間加熱した後、周囲温度にて≧２０分間冷却する。各ウェルに５マイクロリットルの０．１５％ｍＨＤＰを加えて、ウェルの内容物を反復的なピペッティングによって十分に混合する。マルチウェルプレートの内容物を周囲温度にて１５〜２０分間反応させた後に、実験器具移動アームによってマルチウェルプレートをプレート読取装置の上に置き、軽く振とうして、ウェルの内容物の放射エネルギー吸収度を５２０ｎｍにて決定する。
【００４６】
本明細書において、冠詞の「ａ」および「ａｎ」は、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を示すために用いられる。たとえば、「構成要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは１つまたはそれ以上の構成要素を意味する。
【００４７】
本明細書において言及したすべての出版物および特許出願は、本発明が関係する技術分野の当業者のレベルを示す。すべての出版物および特許出願は、各個別の出版物または特許出願が引用により援用されることを特定的かつ個別に示されたのと同程度に、本明細書において引用により援用される。
【００４８】
前述の発明は、理解を明瞭にする目的のために例示および実施例によっていくらか詳細に説明されたが、添付の請求項の範囲内で特定の変更および修正が行なわれてもよいことが明らかになるだろう。
【国際調査報告】
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