(57)【要約】本発明は、バイオセンサーに関する。幾つかの実施形態では、上記バイオセンサーは修飾リガンド結合分子である。幾つかの実施形態では、上記修飾リガンド結合分子はホスフェート結合タンパク質（ＰＢＰ）である。幾つかの実施形態では、上記修飾リガンド結合分子は例えば、ＲＥＴをなしうるように標識される（例えばドナー及びアクセプター部分を含む）。本発明の幾つかの実施形態では、修飾リガンド結合分子がリガンド（例えばホスフェート）と結合及び／又はこれを放出する場合、ＲＥＴ（例えばＦＲＥＴ）に検出可能な変化がある。本発明はまた、関連する方法、反応及びアッセイ法の提供に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのドナー部分と、少なくとも１つのアクセプター部分とを含む共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）ペア部分を含むホスフェート結合タンパク質であって、
結合がＲＥＴの変化を生じさせる、ホスフェートと結合できるホスフェート結合タンパク質。
【請求項２】
ＲＥＴが増加する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
ＲＥＴが減少する、請求項１のタンパク質。
【請求項４】
前記ホスフェートが無機ホスフェート（Ｐｉ）である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項５】
前記ホスフェートと結合するとタンパク質の高次構造変化によってＲＥＴの変化が生じる、請求項１記載のタンパク質。
【請求項６】
前記ホスフェートを放出するとタンパク質の高次構造変化によってＲＥＴの変化が生じる、請求項１記載のタンパク質。
【請求項７】
前記ホスフェートと結合すると少なくとも２つの部分の間の距離が変化する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項８】
前記ホスフェートと結合すると少なくとも２つの部分の間の配向が変化する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項９】
ＲＥＴペアが、時間分解ＲＥＴ可能である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのアクセプター部分が、フルオレセイン、ローダミン、ＧＦＰ、ＧＦＰ誘導体、蛍光タンパク質、ＦＩＴＣ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボキサミド、６−クロロ−７−ヒドロキシクマリン−３−カルボキサミド，フルオレセイン−５−イソチオシアネート、ジクロロトリアジニルアミノフロレセイン、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート、テトラメチルローダミン−６−イソチオシアネート、５−カルボキシフルオレセインのスクシニミジルエステル、６−カルボキシフルオレセインのスクシニミジルエステル、５−カルボキシテトラメチルローダミン、６−カルボキシメチルローダミン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、６−ＩＡＦ、５−ＩＡＦ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬマレイミド、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬヨードアセタミド、フルオレセイン−５−マレイミド、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８ヨードアセタミド、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８マレイミド及び５−（ブロモメチル）フルオレセインからなる群から選択される、請求項１記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記ドナー部分が、発光金属錯体を含む、請求項１記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記発光金属錯体が、有機アンテナ部分、金属リガンド部分及びランタニド金属イオンを含む、請求項１１記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記発光金属錯体が、ランタニド金属錯体である、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記ランタニド金属錯体が、有機アンテナ部分、金属リガンド部分及びランタニド金属イオンを含む、請求項１３記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記ランタニド金属イオンが、Ｓｍ（ＩＩＩ）、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｔｂ（ＩＩＩ）及びＤｙ（ＩＩＩ）からなる群から選択される、請求項１４記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記ランタニドイオンが、ユーロピウムイオンである、請求項１４記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記ランタニドイオンが、テルビウムイオンである、請求項１４記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記有機アンテナ部分が、ローダミン５６０、フルオレセイン５７５、フルオレセイン５９０、２−キノロン、４−キノロン、４−トリフルオロメチルクマリン（ＴＦＣ）、７−ジエチル−アミノ−クマリン−３−カルボヒドラジド、７−アミノ−４−メチル−２−クマリン（カルボスチリル１２４）、７−アミノ−４−メチル−２−クマリン（クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチル−２−クマリン（クマリン１２４）及びアミノメチルトリメチルソラレンからなる群から選択される、請求項１４記載のタンパク質。
【請求項１９】
金属リガンド部分が、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ、ＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰ、ＤＯＴＰ、ＤＯ３Ａ、ＤＯＴＡＧＡ及びＮＯＴＡからなる群から選択される金属キレート化部分である、請求項１４記載のタンパク質。
【請求項２０】
ランタニド金属錯体が、以下の構造を有する、請求項１３記載のタンパク質：
−Ｌｎ−Ａ−Ｓｎ−ＣＭ、又は、−Ｌｎ−ＣＭ−Ｓｎ−Ａ；
式中、Ａが有機アンテナ部分を表し、Ｌがリンカーを表し、Ｓがスペーサーを表し、ｎが０又は１であってもよく、Ｃが金属キレート化部分を表し、かつＭがＣに配位するランタニド金属イオンを表す。
【請求項２１】
前記発光金属錯体がＣＳ１２４−ＤＴＰＡ−Ｐｈｅ−ＮＣＳ−Ｔｂ又はＣＳ１２４−ＤＴＰＡ−ＥＭＣＨ−Ｔｂを含む、請求項１１記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記タンパク質が、少なくとも１つの非天然システインアミノ酸を有する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項２３】
第１若しくは第２の部分が、非天然システインアミノ酸に結合する、請求項２２記載のタンパク質。
【請求項２４】
前記タンパク質が、少なくとも２つの非天然システインアミノ酸を有する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項２５】
第１及び第２の部分が、非天然システインアミノ酸に結合する、請求項２４記載のタンパク質。
【請求項２６】
少なくとも１つ又は少なくとも２つの非天然システインアミノ酸が、前記システインアミノ酸の置換又は挿入によってタンパク質に導入される、請求項２２から２５のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項２７】
前記ＰＢＰのアミノ酸配列が、ｐｈｏＳ遺伝子に由来する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項２８】
前記ｐｈｏＳ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列が、配列番号：１又は配列番号：２の配列である、請求項２７記載のタンパク質。
【請求項２９】
前記タンパク質が、少なくとも１つの非天然システインアミノ酸を有する、請求項２７記載のタンパク質。
【請求項３０】
Ａ４７Ｃ、Ａ１９７Ｃ、Ｑ２０１Ｃ及びＥ２６８Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項２７記載のタンパク質。
【請求項３１】
前記タンパク質が、少なくとも２つの非天然システインアミノ酸を有する、請求項２７記載のタンパク質。
【請求項３２】
Ａ４７Ｃ、Ａ１９７Ｃ、Ｑ２０１Ｃ及びＥ２６８Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項３１記載のタンパク質。
【請求項３３】
Ａ１９７Ｃ／Ｅ２６８Ｃ、Ａ４７Ｃ／Ａ１９７Ｃ、Ａ４７Ｃ／Ｅ２６８Ｃ、Ｑ２０１Ｃ／Ｅ２６８Ｃ、Ａ４７Ｃ／Ｑ２０１Ｃ及びＡ１９７Ｃ／Ｑ２０１Ｃからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、請求項３１記載のタンパク質。
【請求項３４】
第１若しくは第２の部分が、非天然システインアミノ酸に結合する、請求項２７記載のタンパク質。
【請求項３５】
第１及び第２の部分が、非天然のシステインアミノ酸に結合する、請求項２７記載のタンパク質。
【請求項３６】
前記ホスフェート結合タンパク質が、配列番号：１又は配列番号：２に対して９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３７】
前記ホスフェート結合タンパク質が、少なくとも１つの非天然システインアミノ酸を含む、請求項３６記載のタンパク質。
【請求項３８】
前記少なくとも１つのドナー部分が、アミン結合又はチオール結合を介して、ホスフェート結合タンパク質に連結される、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３９】
前記少なくとも１つのアクセプター部分が、アミン結合又はチオール結合を介して、ホスフェート結合タンパク質に連結される、請求項１記載のタンパク質。
【請求項４０】
（ａ）前記第１のサンプルと、請求項１から３９のいずれか１項記載のタンパク質とを接触させる段階と、
（ｂ）（ａ）を、ＲＥＴペアのドナー部分を励起する波長の光に曝露する段階と、
（ｃ）ＲＥＴペアのアクセプター部分からの放出を測定する段階と
を含む、第１のサンプル中のホスフェートを測定する方法。
【請求項４１】
前記ＲＥＴペアのドナー部分からの放出を測定する段階を含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記ＲＥＴペアのドナー部分とアクセプター部分との放出の比率を算出する段階を含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
（ｉ）第２のサンプルと、請求項１から３９記載のいずれか１項記載のタンパク質とを接触させる段階であって、前記第２のサンプルが既知量のホスフェートを含む段階と、
（ｉｉ）（ｉ）を、ＲＥＴペアのドナー部分を励起する波長の光に曝露する段階と、
（ｉｉｉ）ＲＥＴペアのアクセプター部分からの放出を測定する段階と
を更に含む、請求項４０から４２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４４】
（ｉｉ）において、ＲＥＴペアのドナー部分からの放出を測定する段階を含む、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
（ｉｉ）において、ＲＥＴペアのドナー部分とアクセプター部分との放出の比率を算出する段階を含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
（ｉ）複数のサンプルを別々に、請求項１から３９に記載のタンパク質と接触させる段階であって、前記複数のサンプルが既知量のホスフェートを含む段階と、
（ｉｉ）（ｉ）を、ＲＥＴペアのドナー部分を励起する波長の光に曝露する段階と、
（ｉｉｉ）各サンプルにおける、ＲＥＴペアのアクセプター部分からの放出を測定する段階と
を更に含む、請求項４０から４５のいずれか１項記載の方法。
【請求項４７】
第１のサンプルのホスフェートの量が、第１のサンプルからの放出と、前記複数のサンプルからの放出とを比較することにより測定される、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
（ｉｉｉ）において、ＲＥＴペアのドナー部分からの放出を測定する段階を含む、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
（ｉｉｉ）における、ＲＥＴペアのドナー部分とアクセプター部分との放出の比率を算出する段階を含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
複数の時点において、放出の測定がなされる、請求項１から４９のいずれか１項記載の方法。
【請求項５１】
ａ）前記化合物とホスホジエステラーゼ基質（例えばｃＡＭＰ）とを接触させる段階と、
ｂ）（ａ）を、もはや基質上のリン酸ジエステル結合の一部でないホスフェートを除去できるホスファターゼと接触させる段階と、
ｃ）（ｂ）を、修飾ＰＢＰと接触させる段階と、
ｄ）蛍光を測定する段階と
を含む、化合物のホスホジエステラーゼ活性を測定する方法。
【請求項５２】
前記修飾ＰＢＰが、１つの蛍光標識を含み、ホスフェートと結合している場合の前記ＰＢＰの蛍光が、それがホスフェートと結合していない場合の蛍光と異なる、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
ａ）前記化合物と、ホスホジエステラーゼ基質（例えばｃＡＭＰ）とを接触させる段階と、
ｂ）（ａ）と、もはや基質上のリン酸ジエステル結合の一部でないホスフェートを除去できるホスファターゼとを接触させる段階と、
ｃ）（ｂ）と、請求項１から３９のいずれか１項記載のホスフェート結合タンパク質とを接触させる段階と、
ｄ）ＲＥＴを測定する段階と
を含む、化合物のホスホジエステラーゼ活性を測定する方法。
【請求項５４】
（ｃ）を、ドナー部分を励起する１つ以上の波長の光に曝露する、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が同時に実施される、請求項５３又は５４記載の方法。
【請求項５６】
ＲＥＴの測定が、リアルタイムで、又は動態的測定としてなされる、請求項５２から５５のいずれか１項記載の方法。
【請求項５７】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又はそれらのいずれかの組み合わせが、ホスフェートモップを含有する、請求項５２から５６のいずれか１項記載の方法。
【請求項５８】
（ａ）が、前記化合物のホスホジエステラーゼ活性の潜在的モジュレータを含有する、請求項５２から５７のいずれか１項記載の方法。
【請求項５９】
ＲＥＴが、（ａ）、（ｂ）、又は（ａ）及び（ｂ）において測定される、請求項５２から５８のいずれか１項記載の方法。
【請求項６０】
コントロール反応を更に含む、請求項５２から５９のいずれか１項記載の方法。
【請求項６１】
ａ）前記化合物と、キナーゼ活性測定用のリン酸化基質とを接触させる段階と、
ｂ）（ａ）と、前記化合物のキナーゼ活性によって追加されたホスフェートを除去できるホスファターゼとを接触させる段階と、
ｃ）（ｂ）と、ＲＥＴペアを含む修飾ＰＢＰとを接触させる段階と、
ｄ）ＲＥＴを測定する段階と
を含む、化合物のキナーゼ活性を測定する方法。
【請求項６２】
（ｃ）を、ドナー部分を励起する１つ以上の波長の光に曝露する、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が、同時に実施される、請求項６１から６２のいずれか１項記載方法。
【請求項６４】
ＲＥＴがリアルタイムで、又は動態的測定として測定される、請求項６１から６３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６５】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又はそれらのいずれかの組み合わせが、ホスフェートモップを含有する、請求項６１から６４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６６】
（ａ）が、化合物のキナーゼ活性の潜在的モジュレータを含有する、請求項６１から６５のいずれか１項記載の方法。
【請求項６７】
ＲＥＴが、（ａ）、（ｂ）、又は（ａ）及び（ｂ）において測定される、請求項６１から６６のいずれか１項記載の方法。
【請求項６８】
コントロール反応を更に含む、請求項６１から６７のいずれか１項記載の方法。
【請求項６９】
ａ）前記化合物と、キナーゼ活性測定用のリン酸化基質と、化合物のキナーゼ活性によって追加されるホスフェートを除去できるホスファターゼと、ＲＥＴペアを含む修飾ＰＢＰとを含む溶液と、
ｂ）ＲＥＴを測定する段階と
を含む、化合物のキナーゼ活性を測定する方法。
【請求項７０】
ＲＥＴが、リアルタイムで、又は動態的測定として測定される、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
（ａ）が、ホスフェートモップを含有する、請求項６９から７０のいずれか１項記載の方法。
【請求項７２】
コントロール反応を更に含む、請求項６９から７１のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許出願は、米国特許法第１１９（ｅ）条に基づき、２００６年８月１１日に出願の米国仮特許出願第６０／８２２，２０６号の優先権を主張し、その全開示内容を本願明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明の一態様は、部分的に分子検出に関連する組成物及び分子検出アッセイ法などの分子検出方法の提供に関する。本発明はまた、分子検出アッセイ法に関連する反応、方法及びアッセイ法の提供にも関する。本発明の一態様は、分子と結合するとリガンド結合分子（例えばタンパク質）の高次構造の変化を検出するための試薬の提供にも関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
バイオセンサーとは、生体高分子の分子認識特性と、リガンド結合を検出可能な物理的変化と共役させるシグナル伝達メカニズムとを組み合わせることにより、サンプル中の特定の分子種の存在の測定に使用できる分析ツールのことを指す。一般に、バイオセンサーでは、天然に存在する高分子（例えば酵素又は抗体）と、目的の分子に特異的な適切な物理的シグナルの生成とを組み合わせる。
【０００４】
大腸菌（Escherichia coli）ペリプラズム結合タンパク質は、バイオセンサーのエンジニアリングに適することが明らかとされているタンパク質スーパーファミリーのメンバー（細菌ペリプラズム結合タンパク質）である（例えば特許文献１及び２：米国特許第５，８９８，０６９号及び第６，２７７，６２７号を参照）。細菌ペリプラズム結合タンパク質は典型的には、ヒンジ部位により連結された２つのドメインを有する（非特許文献１：ＱｕｉｏｃｈｏおよびＬｅｄｖｉｎａ，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：１７−２５，１９９６）。リガンド結合部位は典型的には、上記２つのドメイン間のインターフェースに位置する。上記タンパク質は典型的には、２つの高次構造を有する：リガンドフリーの開放された形態と、リガンドと結合した閉じた形態（リガンドの結合に応じて、ヒンジの屈曲機構を介した相互変化による）。この全体的な、リガンドの媒介による高次構造の変化を利用して、リガンド結合と蛍光強度の変化とのカップリングが行われる。その際、１つのフルオロフォアが、上記の全体的な変化と協奏的な高次構造変化を受ける部位に置かれることにより当該反応が行われる。（例えば非特許文献２：Ｂｒｕｎｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：８２６２−８２７１，１９９４、非特許文献３：Ｇｉｌａｒｄｉら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４７９−４８６，１９９７、非特許文献４：Ｇｉｌａｒｄｉら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：３８４０−３８４７，１９９４、非特許文献５：Ｍａｒｖｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４３６６−４３７１，１９９７，非特許文献６：Ｍａｒｖｉｎ  ａｎｄ  Ｈｅｌｌｉｎｇａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：７−１１，１９９８、非特許文献７：Ｔｏｌｏｓａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：１１４−１２０，１９９９、非特許文献８：ＤａｔｔｅｌｂａｕｍおよびＬａｋｏｗｉｃｚ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９１：８９−９５，２００１、非特許文献９：ＭａｒｖｉｎおよびＨｅｌｌｉｎｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：４９５５  ４９６０，２００１、非特許文献１０：Ｓａｌｉｎｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９４：１９−２６，２００１）。
【０００５】
生体系において、リン酸化状態の変化及び無機ホスフェートの濃度の変動は、多くの重要な生体イベントと関連している。無機ホスフェート（Ｐｉ）は多くの重要な生物学的プロセスに関与しているため、生体系においてＰｉ濃度及びかかる濃度変化を測定できることは通常望ましい。ホスフェートアッセイ法（Ｐｉ濃度を測定するアッセイ法）は、多くの診断法、並びに生体系における諸機能に関する研究において有用である。
【０００６】
多くの疾患及び症状において、血清中の無機ホスフェート濃度が上下する。更に、生体の主要なエネルギー要求は、ヌクレオチドのリン酸化状態の変更によるエネルギー発生によって満たされる。薬剤の探索において重要な多数の酵素は、直接的に、又は共役反応を通じて、無機ホスフェート（Ｐｉ）を消費若しくは産生する。これらの酵素としては、タンパク質及び脂質ホスファターゼ、ＡＴＰアーゼ、薬剤トランスポーター、ＧＴＰアーゼ、ホスホリラーゼ、ホスホジエステラーゼ及びプレニルトランスフェラーゼなどが挙げられる。更なるアプリケーションとしては、臨床サンプル中及び生物利用産業におけるプロセス制御でのリン酸のモニタリングなどが挙げられる。現在用いられている標準的なリン酸の定量方法は、マラカイトグリーンをベースとする吸光度アッセイ法であり、それはリン酸を約５μＭで検出可能であり約２５μＭで顕著に検出できる。このアッセイ法は、感度が限られていることに加え、吸光度ベースであるため、ハイスループットスクリーニングにおいては理想的とはいえない。第３の欠点としては、マラカイトグリーンはエンドポイントでのフォーマットでなければ使用できない点が挙げられる。動態分析法による分析は、小分子の解析及び最適化にとり有用であるが、上記方法ではそれが困難である。Ｐｉの産生又は消費を伴う生物学的及び化学的プロセスの動態をモニターするためには、反応速度の高いホスフェートアッセイ法を利用するのが望ましい。
【０００７】
ホスホジエステラーゼは、リン酸ジエステルを切断してリン酸モノエステルを生じさせる。主な種類のホスホジエステラーゼとしては、環状ヌクレオチドリン酸ジエステル（ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰ）に作用するものが挙げられる。かかる活性を定量化するための現行の方法は、結合パートナー（抗体又は他の試薬）への基質（ｃＮＭＰ）若しくは生成物（ＮＭＰ）の結合に依存するものであり、その結合パートナーからの蛍光部分の置換によって検出できる。但しかかる結合パートナーは高価であり、基質と生成物との間の特異性が低く、それによりアッセイ性能が限定されたものとなる。ある基質の量の減少を検出するタイプの方法では、低レベルの酵素活性の検出が困難であるという点で、問題点を有する。本願明細書に記載されている、本発明に係る方法は、これらの欠点に影響されることがない。
【０００８】
キナーゼ活性を検出する方法として、蛍光アッセイ法及び放射性アッセイ法が存在する。しかしながら、広範囲にわたるキナーゼのアッセイ法に適用できる「一般的な」方法はほとんど存在しない。多くのキナーゼアッセイ法は、特異的にリン酸化された基質上の残基を検出する抗体の使用、又は特異的なペプチド基質のリン酸化（検定されているキナーゼに最適ではなくてもよい）に依存する。しかしながら本願明細書において記載されている本発明に係る方法は、「天然の」キナーゼ基質と共に使用でき、放射能又は抗体の使用に依存せずとも、基質の減少ではなく、むしろ生成物の形成を検出することができる。
【０００９】
ホスフェート検出試薬及びアッセイ法に対する幅広いニーズが存在する。例えば、製薬業界及び学術研究における基礎研究及び応用研究に従事する生化学者や、ハイスループットスクリーニングを行う研究機関などからのニーズである。研究者によるニーズの１つは、酵素活性のための、高感度かつ動態的なアッセイ法の提供である。ＨＴＳ（ハイスループットスクリーニングを行う研究機関）のニーズの１つは、高感度、高出力、かつ省力化が可能、更に、必須ではないが好ましくは、化合物による干渉に抵抗性を有するアッセイ法の提供である。
【００１０】
本願明細書において引用又は議論を参照するが、それらは、本発明に対する従来技術であることの承認として解釈されるべきでない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，８９８，０６９号
【特許文献２】米国特許第６，２７７，６２７号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ＱｕｉｏｃｈｏおよびＬｅｄｖｉｎａ，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：１７−２５，１９９６
【非特許文献２】Ｂｒｕｎｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：８２６２−８２７１，１９９４
【非特許文献３】Ｇｉｌａｒｄｉら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４７９−４８６，１９９７
【非特許文献４】Ｇｉｌａｒｄｉら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：３８４０−３８４７，１９９４
【非特許文献５】Ｍａｒｖｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４３６６−４３７１，１９９７
【非特許文献６】Ｍａｒｖｉｎ  ａｎｄ  Ｈｅｌｌｉｎｇａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：７−１１，１９９８
【非特許文献７】Ｔｏｌｏｓａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：１１４−１２０，１９９９
【非特許文献８】ＤａｔｔｅｌｂａｕｍおよびＬａｋｏｗｉｃｚ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９１：８９−９５，２００１
【非特許文献９】ＭａｒｖｉｎおよびＨｅｌｌｉｎｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：４９５５  ４９６０，２００１
【非特許文献１０】Ｓａｌｉｎｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９４：１９−２６，２００１
【発明の概要】
【００１３】
本発明の一実施形態は、共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）の測定（例えば時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）及び発光共鳴エネルギー転移（ＬＲＥＴ））に適するペア部分で標識されたリガンド結合分子（例えばタンパク質）に関する。ペア部分は、共有結合してもよく、又は非共有結合的にリガンド結合分子に（例えば抗体結合を介して）結合してもよい。場合によっては、部分のうちの１つは共有結合し、その他は非共有結合してもよい。
【００１４】
本発明の一実施形態は、以下の原理の１つ以上に基づくアッセイ方法に関する：（ａ）リガンド結合分子の高次構造変化の検出、又は（ｂ）最終生成物又は反応中間体の検出。
【００１５】
リガンド結合分子は基本的に、リガンドと結合し、リガンドと結合及び／又はこれを放出すると高次構造を変化させ、直接又は間接的に検出可能な部分によって標識することが可能な、いかなる分子であってもよく、検出可能なシグナルは、リガンドの結合及び／又は放出に応じて変化する。本発明のリガンド結合分子としては、タンパク質、ペプチド、核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡなど）及びポリマー（例えば天然若しくは非天然のポリマー）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
幾つかの実施形態では、リガンド−結合分子は、ペリプラズム結合タンパク質、例えばホスフェート結合タンパク質（ＰＢＰ）であり、それは特異的なリガンド（例えばホスフェート、鉄、スルフェート、グルタミン酸塩又は多くの他の小分子のうちの１つ）と結合する原核生物由来のタンパク質のファミリーである。これらのタンパク質は典型的には、ヒンジ部位（Ｑｕｉｏｃｈｏ及びＬｅｄｖｉｎａ  １９９６）により連結された２つのドメインからなる。リガンド結合部位は典型的には、２つのドメイン間のインターフェースに位置する。ペリプラズム結合タンパク質は典型的には２つの高次構造を有する：リガンドフリーの開放型、及びリガンド結合された閉鎖型（リガンド結合すると、ヒンジ屈折メカニズムを介して相互変化する）。幾つかの実施形態では、リガンド結合分子は、ヒト血漿ホスフェート結合タンパク質（ＨＰＢＰ）である。Ｍｏｒａｌｅｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｖｏｌ１４、６０１−６０９、２００６年３月を参照。
【００１７】
ＴＲ−ＦＲＥＴ測定値は、ドナーとアクセプター部分との間の距離、ドナー及びアクセプター部分の配向、及び／又は１つのフルオロフォアの環境の変化に影響を受ける。例えば、ドナー及びアクセプター部分が標識されたタンパク質の高次構造変化は、ＴＲ−ＦＲＥＴの変化を生じさせうる。かかる高次構造変化は、多くの化合物（例えばタンパク質）において、リガンド結合すると生じる。アクセプター部分は、化学的に（例えばアミン又はチオールに）結合するか、遺伝的にコードされる（例えば蛍光タンパク質と融合する）か、又は（例えば抗体、ストレプトアビジン又は他の結合タンパク質と）非共有結合的に結合することができる。ドナー部分（例えばＴｂ−キレート）は、化学的に（例えばアミン又はチオールを経て）タンパク質に結合することができ、また遺伝的にコードされる（例えば蛍光タンパク質と融合する）か、又は（例えば蛍光ラベルされた抗体、ストレプトアビジン又は他の結合タンパク質と）非共有結合的に会合することができる。ＰＢＰは組換えで調製し、精製してもよく、天然の給源から精製してもよく、又は精製しなくても（例えば細胞可溶化物から）よい。
【００１８】
幾つかの実施形態では、本発明は、特に生物学的溶液中の、ホスフェート（例えば無機ホスフェート）、鉄、スルフェート、グルタメート及び／又は小分子の検出及び定量のための組成物及び方法を提供する。本発明の幾つかの実施形態では、リガンド結合分子は例えば、マルトース結合タンパク質、アラビノース結合タンパク質、ジペプチド結合タンパク質、Ｇｌｕ／Ａｓｐ  ＢＰ、Ｆｅ（ＩＩＩ）  ＢＰ、グルコース結合タンパク質、ヒスチジン結合タンパク質、グルタミン結合タンパク質、リボース結合タンパク質又はスルフェート結合タンパク質（例えばＬｏｒｉｍｉｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，１１：２６５５−２６７５）である。幾つかの実施形態では、リガンド結合タンパク質は、単糖類（例えばアラビノース、グルコース及びリボース）、グルコースの二及び三糖（例えばマルトース）、アミノ酸（例えばグルタミン酸／アスパラギン酸、ヒスチジン及びグルタミン）、ジ及びトリペプチド、オキシアニオン（例えばホスフェート及びスルフェート）又は金属イオン（例えばＦｅ（ＩＩＩ））と結合する。幾つかの実施形態では、リガンド結合分子はホスフェート及びアルセネートと結合し、他のオキシアニオンとは結合しない。幾つかの実施形態では、リガンド結合分子はグルコース及びガラクトースと結合し、他の単糖類とは結合しない。本発明の幾つかの実施形態では、リガンド結合分子はＡＴＰ、ＮＡＤＰＨ、アミノ酸又はペプチドと結合する。幾つかの実施形態では、リガンドは原核生物、真核生物、哺乳類、霊長類、ヒト又はマウス由来のペプチド又はタンパク質である。
【００１９】
具体的実施形態では、本発明は、修飾ホスフェート結合タンパク質、及びホスフェートアッセイ法におけるかかるタンパク質の使用の提供に関する。本発明の他の実施形態は、リガンド結合の測定、検出及び／又はモニタリング方法を提供する。
【００２０】
本発明の一実施形態は、ホスフェート結合タンパク質（ＰＢＰ）を提供する。幾つかの実施形態では、ＰＢＰは、共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）のために修飾されている。幾つかの実施形態では、未結合のＰＢＰのＲＥＴと、ホスフェート結合した本発明のＰＢＰとの間で、検出可能な相違が存在する。したがって、本発明の修飾ＰＢＰは、ホスフェート（例えば無機ホスフェート（Ｐｉ））のバイオセンサーとして機能しうる。本発明の修飾ＰＢＰは、ホスフェートの検出が必要となる様々なアッセイ法において利用できる。更に、ホスフェートを使用するアッセイ法（例えばキナーゼ反応の場合）を、ホスフェート濃度の変化（例えば増減する）を生じさせる他のアッセイ法（例えばホスファターゼを使用する）と組み合わせ、それを本発明の修飾ＰＢＰで検出することができる。一実施形態では、修飾ＰＢＰは大腸菌ＰＢＰに由来し、例えば大腸菌ｐｈｏＳ遺伝子によってコードされる。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、鉄、スルフェート、グルタメート及び／又は小分子の検出に利用できる、修飾リガンド結合分子（例えばペリプラズム結合タンパク質）に関する。
【００２２】
本発明はまた、ＰＢＰ又は他のリガンド結合分子の一般的及び特異的な修正態様を提供する。幾つかの実施形態では、ＲＥＴペアの構成要素である部分（例えばドナー又はアクセプター部分）は、システインアミノ酸へのチオール結合を介して、リガンド結合タンパク質分子（例えばＰＢＰ）に結合することができる。具体的実施形態では、少なくとも１つのシステインアミノ酸で置換するか又はリガンド結合タンパク質分子（例えばＰＢＰ）のアミノ酸配列にそれを挿入することにより、ＲＥＴペアの構成要素を、当該挿入されたか若しくは置換されたシステインアミノ酸へのチオール結合を介してリガンド結合タンパク質分子（例えばＰＢＰ）と結合させることができる。幾つかの実施形態では、ドナー及びアクセプター部分は、システイン又はチオール結合を介してリガンド結合タンパク質分子（例えばＰＢＰ）に結合する。
【００２３】
具体的実施形態では、ＲＥＴペア（例えばドナー又はアクセプター部分）の構成要素である部分は、リガンド結合タンパク質分子（例えばＰＢＰ）のアミノ酸（例えばリジン）へのアミン結合を介して、リガンド結合タンパク質分子（例えばＰＢＰ）に結合することができる。幾つかの実施形態では、ドナー又はアクセプター部分は、アミン結合を介してリガンド結合タンパク質分子（例えばＰＢＰ）に結合する。具体的実施形態では、ドナー及びアクセプター部分の両方が、アミン結合を介してリガンド結合タンパク質分子（例えばＰＢＰ）に結合する。具体的実施形態では、ドナー又はアクセプター部分は、アミン結合を介してＰＢＰに結合し、他の部分はチオール結合を介して結合する。幾つかの実施形態では、ＲＥＴペアの構成要素のうちの１つは、例えばアミン結合を介してリガンド結合タンパク質分子（例えばＰＢＰ）にランダムに結合する。
【００２４】
本願明細書に記載されている修飾リガンド結合分子（例えば修飾ＰＢＰ）の特長の１つは、測定方法がＲＥＴ（例えばＴＲ−ＲＥＴ又はＴＲ−ＦＲＥＴ）を利用することである。これらの検出方法は一般に、既存のアッセイ法と比較して、ハイスループットスクリーニングに適している。一般に、ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ法は、ライブラリ化合物からの干渉を受けることが非常に少ない。また、これらのアッセイ法は比率測定に基づくものであり、より正確なデータ及びより高出力なアッセイ法が実施できる。
【００２５】
本発明は、高感度、かつ少ない酵素及び／又は他の試薬の使用量に基づくホスフェートアッセイ法を提供する。本発明は更に、エンドポイントアッセイ法（例えばマラカイトグリーンなど）のみならず、動態的アッセイ法による酵素の詳細な分析方法を可能にする。ハイスループットアッセイ法の場合、本発明の幾つかの実施形態では、例えば使用される酵素及び／又は他の試薬が少ないため、より高感度の検出方法を用いることにより、コストの削減が可能となる。また本発明の幾つかの実施形態では、化合物による干渉を排除又は減少させることにより、費用効果の高いスクリーニング及びより有意義なスクリーニングデータの入手が可能となる。更に、本願明細書に記載されている幾つかのフォーマットにより、既存の技術によっては不可能であると考えられていた新規な標的のスクリーニングが可能となる。
【００２６】
幾つかの実施形態では、本発明の修飾リガンド結合分子（例えば修飾ＰＢＰｓ）及び方法によって、１つには、ホスフェート、鉄、スルフェート、グルタメート及び／又は小分子に関連する検出アッセイ法を小型化することができ、１つには、試薬の消費量を減少させることができ、また１つには、例えば化合物による干渉の減少により（例えばＴＲ−ＦＲＥＴ関連のアッセイ法の場合）、より高出力かつ高品質のデータが得られる。
【００２７】
本発明の修飾リガンド結合分子及び方法は、限定されないがアッセイ方法の開発、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）、標的の識別、リード最適化、生物学的製造、前臨床試験及び動態的／酵素的アッセイ法などの様々な方法で利用できる。非ＴＲ−ＦＲＥＴ型の本発明の修飾リガンド結合分子（例えば修飾ＰＢＰ）もＨＴＳに使用してもよいが、ＴＲ−ＦＲＥＴを利用している修飾リガンド結合分子（例えばドナー部分としてランタニド金属錯体を利用している）は、多くの例において、ＨＴＳに適している。本発明の修飾リガンド結合分子（例えば修飾ＰＢＰ）は、多くの例において、直接又は結合反応を介して多くの酵素をアッセイするための、単純な解決方法を提供するものである。
【００２８】
本発明の一実施形態は、少なくとも１つのドナー部分及び少なくとも１つのアクセプター部分からなる部分の共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）ペア部分を含むリガンド結合分子（例えばホスフェート結合タンパク質）を提供し、当該リガンド結合分子はリガンドと結合でき、その結合によりＲＥＴの変化を生じさせる。本発明の一実施形態は、少なくとも１つのドナー部分及び少なくとも１つのアクセプター部分からなるＲＥＴペア部分を含む、ホスフェート結合タンパク質を提供し、当該ホスフェート結合タンパク質はホスフェートと結合でき、その結合によりＲＥＴの変化を生じさせる。幾つかの実施形態では、リガンドと結合するとＲＥＴが増加する。幾つかの実施形態では、リガンドと結合するとＲＥＴが減少する。幾つかの実施形態では、上記リガンドは無機ホスフェート（Ｐｉ）である。
【００２９】
本発明の幾つかの態様では、ホスフェートと結合するとタンパク質の高次構造変化によってＲＥＴの変化が生じる。幾つかの実施形態では、リガンド（例えばホスフェート）を放出させるとリガンド結合分子の高次構造変化によってＲＥＴの変化が生じる。幾つかの実施形態では、リガンド（例えばホスフェート）と結合及び／又はこれを放出すると少なくとも２つの部分間の距離が変化する。幾つかの実施形態では、リガンド（例えばホスフェート）と結合及び／又はこれを放出すると少なくとも２つの部分間の配向が変化する。
【００３０】
本発明の幾つかの態様では、ＲＥＴペアは、時間分解ＲＥＴであってもよい。本発明の幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアクセプター部分は、以下からなる群から選択される：フルオレセイン、ローダミン、ＧＦＰ、ＧＦＰ誘導体、蛍光タンパク質、ＦＩＴＣ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボキサミド、６−クロロ−７−ヒドロキシクマリン−３−カルボキサミド，フルオレセイン−５−イソチオシアネート、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート，テトラメチルローダミン−６−イソチオシアネート、５−カルボキシフルオレセインのスクシニミジルエステル、６−カルボキシフロレセインのスクシニミジルエステル、５−カルボキシテトラメチルローダミン、６−カルボキシメチルローダミン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、６−ＩＡＦ、５−ＩＡＦ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬマレイミド、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬヨードアセタミド、フロレセイン−５−マレイミド、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８ヨードアセタミド、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８マレイミド及び５−（ブロモメチル）フルオレセイン。アクセプター部分は、色素であってもよく、当該色素はキサンテン、シアニン、インドール、ベンゾフラン、クマリン、ボラポリアザインダシン又は半導体ナノクリスタルを含む色素であってもよい。
【００３１】
幾つかの実施形態では、ドナー部分は発光金属錯体を含む。本発明の幾つかの態様では、発光金属錯体は、有機アンテナ部分、金属リガンド部分及びランタニド金属イオンを含む。幾つかの実施形態では、金属錯体は、ランタニド金属錯体である。本発明の幾つかの態様では、上記ランタニド金属錯体は、有機アンテナ部分、金属リガンド部分及びランタニド金属イオンを含む。幾つかの実施形態では、ランタニド金属イオンは、以下からなる群から選択される：Ｓｍ（ＩＩＩ）、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｔｂ（ＩＩＩ）及びＤｙ（ＩＩＩ）。幾つかの実施形態では、上記ランタニドイオンはユーロピウムイオン又はテルビウムイオンである。本発明の幾つかの態様では、有機アンテナ部分は、以下からなる群から選択される：ローダミン５６０、フルオレセイン５７５、フルオレセイン５９０、２−キノロン、４−キノロン、４−トリフルオロメチルクマリン（ＴＦＣ）、７−ジエチル−アミノ−クマリン−３−カルボヒドラジド、７−アミノ−４−メチル−２−クマリン（カルボスチリル１２４）、７−アミノ−４−メチル−２−クマリン（クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチル−２−クマリン（クマリン１２４）及びアミノメチルトリメチルソラレン。本発明の幾つかの実施形態では、金属リガンド部分は、以下からなる群から選択される金属キレート化部分である：ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ、ＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰ、ＤＯＴＰ、ＤＯ３Ａ、ＤＯＴＡＧＡ及びＮＯＴＡ。本発明の幾つかの態様では、ランタニド金属錯体は以下の構造を有する：−Ｌｎ−Ａ−Ｓｎ−ＣＭ、又は、−Ｌｎ−ＣＭ−Ｓｎ−Ａ。式中、Ａは有機アンテナ部分を表し、Ｌはリンカーを表し、Ｓはスペーサーを表し、ｎは０又は１であってもよく、Ｃは金属キレート化部分を表し、ＭはＣに配位するランタニド金属イオンを表す。幾つかの実施形態では、発光金属錯体は、ＣＳ１２４−ＤＴＰＡ−Ｐｈｅ−ＮＣＳ−Ｔｂ又はＣＳ１２４−ＤＴＰＡ−ＥＭＣＨ−Ｔｂを含む。
【００３２】
本発明の幾つかの態様では、リガンド結合分子（例えばＰＢＰ）は、少なくとも１つの非天然システインアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、第１若しくは第２の部分は、非天然システインアミノ酸に結合する。本発明の幾つかの実施形態では、タンパク質は、少なくとも２つの非天然システインアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、第１及び第２の部分は、非天然システインアミノ酸に結合する。本発明の幾つかの態様では、少なくとも１つの非天然システインアミノ酸は、少なくとも１つのシステインアミノ酸で置換するか又はそれをリガンド結合分子に挿入することによって導入される。
【００３３】
本発明の幾つかの態様では、リガンド結合分子は、ＰＢＰに由来し、及び／又はＰＢＰを含む。幾つかの実施形態では、ＰＢＰのアミノ酸配列はｐｈｏＳ遺伝子に由来する。幾つかの実施形態では、ｐｈｏＳ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号：１又は配列番号：２である。本発明の幾つかの態様では、ホスフェート結合タンパク質は、配列番号：１又は配列番号：２と９０％のアミノ酸配列相同性を有する。本発明の幾つかの実施形態では、ＰＢＰに由来し、及び／又はＰＢＰを含むリガンド結合分子は、少なくとも１つの非天然システインアミノ酸を更に含む。本発明の幾つかの態様では、ＰＢＰは、Ａ４７Ｃ、Ａ１９７Ｃ、Ｑ２０１Ｃ及びＥ２６８Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ＰＢＰは、少なくとも２つの非天然システインアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つの非天然システインアミノ酸を含むＰＢＰは、Ａ４７Ｃ、Ａ１９７Ｃ、Ｑ２０１Ｃ及びＥ２６８Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。本発明の幾つかの態様では、ＰＢＰは、Ａ１９７Ｃ／Ｅ２６８Ｃ、Ａ４７Ｃ／Ａ１９７Ｃ、Ａ４７Ｃ／Ｅ２６８Ｃ、Ｑ２０１Ｃ／Ｅ２６８Ｃ、Ａ４７Ｃ／Ｑ２０１Ｃ及びＡ１９７Ｃ／Ｑ２０１Ｃからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、第１及び／又は第２の部分は、非天然システインアミノ酸に結合する。
【００３４】
本発明の幾つかの態様では、少なくとも１つのドナー部分及び／又はアクセプター部分が、アミン又はチオール結合を介してホスフェート結合タンパク質に連結される。
【００３５】
本発明はまた、第１のサンプルにおけるホスフェートの測定方法の提供に関する。当該方法は、
（ａ）少なくとも１つのドナー部分と、ＲＥＴしうる少なくとも１つのアクセプター部分とを有する、本発明のリガンド結合分子と、第１のサンプルを接触させる段階と、
（ｂ）（ａ）をＲＥＴペアのドナー部分を励起する波長の光に曝露する段階と、
（ｃ）ＲＥＴペアのアクセプター部分からの放出を測定、及び／又はＲＥＴペアのドナー部分からの放出を測定する段階を含む。幾つかの態様では、上記方法は、ＲＥＴペアのドナー及びアクセプター部分の放出の比率を算出することを含む。本発明の幾つかの実施形態では、上記方法は更に、以下の段階を含む：
（ｉ）第２のサンプルを、少なくとも１つのドナー部分及びＲＥＴしうる少なくとも１つのアクセプター部分を有する本発明のリガンド結合分子と接触させる段階であって、上記第２のサンプルが既知量のリガンド（例えばホスフェート）を含む段階と、
（ｉｉ）（ｉ）をＲＥＴペアのドナー部分を励起する波長の光に曝露する段階と、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）における、ＲＥＴペアのアクセプター部分からの放出を測定、及び／又はＲＥＴペアのドナー部分からの放出を測定する段階。
幾つかの実施形態では、上記方法は、（ｉｉ）のＲＥＴペアのドナー部分とアクセプター部分との間の放出比率を算出する段階を含む。幾つかの実施形態では、上記方法は、以下の段階を含む：
（ｉ）複数のサンプルを別々に、本発明のリガンド結合分子（例えばＰＢＰ）と接触させる段階であって、複数のサンプルが既知量のリガンド（例えばホスフェート）を含む段階と、
（ｉｉ）（ｉ）をＲＥＴペアのドナー部分を励起する波長の光に曝露する段階と、
（ｉｉｉ）各サンプルにおけるＲＥＴペアのアクセプター部分からの放出を測定し、及び／又は（ｉｉｉ）におけるＲＥＴペアのドナー部分からの放出を測定する段階。
幾つかの実施形態では、上記方法は、（ｉｉｉ）のＲＥＴペアのドナー部分とアクセプター部分との間の放出比率を算出する段階を含む。本発明の方法はまた、複数の時点における放出の測定も提供する。本発明の幾つかの実施形態では、第１のサンプルのリガンド（例えばホスフェート）の量は、サンプルからの放出を比較する（例えば第１のサンプルからの放出と、複数のサンプルからの放出を比較する）ことにより測定される。
【００３６】
幾つかの実施形態では、ドナー部分はＧＦＰでない。幾つかの実施形態では、ドナー部分はエクオリンタンパク質でない。幾つかの実施形態では、ドナー部分はタンパク質でない。幾つかの実施形態では、アクセプター部分はＧＦＰでない。幾つかの実施形態では、アクセプター部分はエクオリンタンパク質でない。幾つかの実施形態では、アクセプター部分はタンパク質でない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
本発明を例示するために、本発明上の具体的な実施形態を図面において示す。しかしながら本発明は、図面において表される実施形態による正確な構成及び方法に限定されるものではない。
【図１】図１Ａは、ホスホジエステラーゼアッセイ法の例、及びそれをホスフェート検出アッセイ法と組み合わせる方法を示す。図１Ｂは、キナーゼアッセイ法の例、及びそれをホスフェート検出アッセイ法に組み合わせる方法を示す。
【図２】結合された、及び開放された状態のリガンド結合分子の図である。リガンド結合分子はＲＥＴペア部分で標識され、リガンドの結合及び／又は放出によりＲＥＴの変化を生じさせる。
【図３】有機アンテナ部分を含むランタニド金属キレートの構造を表し、有機アンテナ部分からランタニド金属イオンへのエネルギーの転移を示す。
【図４】ホスフェートに対するＯＧ−ＰＢＰ−Ｔｂ及びＲｄ−ＰＢＰ−Ｔｂの応答を示す。
【図５】二重変異体ホスフェートセンサーに対してホスフェートの滴定を示す。
【図６】二重変異体センサーによるホスファターゼ活性の検出を示す。
【図７】クマリン−ＰＢＰセンサーを使用した様々なホスフェートエステルからの干渉レベル（存在する場合）を示す。実験手順を実施例６．１に記載する。
【図８】ホスファターゼの存在下でのホスフェートエステルの裂開、及びホスファターゼに対するリン酸ジエステル（ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ）の無感受性を示す。実験手順を実施例６．２に記載する。
【図９】アルカリホスファターゼを、ホスフェートモノ及びジエステル（より少ないＰＮＰ）の同一セット（及びＡＴＰ）に対して滴定した結果を示す。蛍光強度は５分（図９Ａ）又は１時間（図９Ｂ）計量。実験手順を実施例６．３に記載する。
【図１０】１ユニット／ｍＬアルカリホスファターゼ及び１ユニット／ｍＬカルモジュリンの有無において、１μＭクマリン−ＰＢＰセンサー（１０μＭ  Ｃａ２＋）の存在下で、１００μＭ  ｃＡＭＰ（図１０Ａ）又はｃＧＭＰ（図１０Ｂ）とインキュベートしたウシの脳由来のカルモジュリン感受性ホスホジエステラーゼの滴定を示す。実験手順を実施例６．４に記載する。
【図１１】ホスホジエステラーゼアッセイ法との共役反応を、「動態モード」において実施した例を示す。実験手順を実施例６．４に記載する。
【図１２】本発明の１つの代表例を示す。ＬＢＤ＝リガンド結合領域。Ｍ１及びＭ２はそれぞれ部分１及び部分２を表す。図１２Ａは、両方の部分ともリガンド結合分子に直接結合することを表す。図１２Ｂは、結合パートナー（例えば抗体）を経てリガンド結合分子に結合するＭ１を表す。本発明の他の実施形態では、ここでは示さないが、両方の部分は、結合パートナーを経て結合する。
【図１３】Ｆｌ−ＰＢＰ−Ｔｂを用いたアッセイ法、及び５２０ｎｍの放出の測定結果を示す。実験手順を実施例９に記載する。
【図１４】Ｆｌ−ＰＢＰ−Ｔｂを用いたアッセイ法、及び５２０ｎｍ〜６１５ｎｍの放出比率の測定結果を示す。実験手順を実施例９に記載する。
【図１５】Ｆｌ−ＰＢＰ−Ｔｂを用いたアッセイ法、及び５２０ｎｍ〜６１５ｎｍの放出比率の測定結果を示す。実験手順を実施例９に記載する。
【００３８】
配列の簡単な説明：
配列番号：１は、大腸菌ホスフェート結合タンパク質（ｐｈｏＳ）のアミノ酸配列である。この配列はシグナル配列を有する（下線部）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ２４３７８）。
2010500417.tif 000002
【００３９】
配列番号：２は、大腸菌ホスフェート結合タンパク質（ｐｈｏＳ）のアミノ酸配列（シグナル配列を含まない）。
2010500417.tif 000003
【発明を実施するための形態】
【００４０】
詳細な説明
本願明細書を通じて一般に用いられる命名法、及び本願明細書に記載されている蛍光、発光、コンピュータ、検出、化学物質及び試験方法の多数は、従来技術において通常用いられるものである。標準的な技術を、化学合成、蛍光又は発光のモニタリング及び検出、光学、分子生物学、並びにコンピュータソフトウェア及び統合に通常どおり用いる。化学反応、細胞アッセイ法及び酵素反応は、典型的には、必要に応じて製造業者の取扱説明書に従い実施する。参照文献を以下に挙げると、蛍光技術に関しては、Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，（３  ｖｏｌｕｍｅｓ）  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）及びＬａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｔｏ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ：ｌｉｆｅｔｉｍｅ  ｉｍａｇｉｎｇ，ｍｅｔａｌ−ｌｉｇａｎｄ  ｐｒｏｂｅｓ，ｍｕｌｔｉ  ｐｈｏｔｏｎ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ，Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｓｕｐｐｌ．Ｖｏｌ．１０（１９９６）  ｐ２１３−２４；分子生物学方法に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｅｄ．（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，；細胞生物学方法に関しては、Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９８）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，；一般的な光学的方法に関しては、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｇｕｉｄｅ  Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ（登録商標）  Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ，ａｎｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  Ｔｈｅｏｒｙ，ＳｎｙｄｅｒおよびＬｏｖｅ（ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌｌによって出版）（いずれも本願明細書に援用する）。
【００４１】
発光材料を用いた様々な蛍光若しくは発光アッセイ法を実施するための一般的方法は公知技術であり、例えば以下の文献に記載されている：Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．，Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １から３，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ｈｅｒｍａｎ，Ｂ．，Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３０，ｅｄ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｌ．および  Ｗａｎｇ，Ｙ．−Ｌ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），ｐｐ．２１９−２４３；Ｔｕｒｒｏ，ＮＪ．，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ：Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｌ，Ｉｎｃ．（１９７８），ｐｐ．２９６−３６１；及びＢｅｒｎａｒｄ  Ｖａｌｅｕｒ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ，２００２。例えば、特異的な共鳴アクセプター部分の選抜及び使用に関するガイダンスは、Ｂｅｒｌｍａｎ，ＩＢ．，Ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｆ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ（１９７３）に記載されており、そこには共鳴エネルギー転移ペアの選択のための、スペクトル重なり積分の表が存在する。更なる情報源としてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ（２００３）及びウェブサイト、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｅｗ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃａｔａｌｏｇ（２００６）、Ｆｕｌｌ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔａｌｏｇ（２００５）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  カタログ（２００４）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓウェブサイト、及びＴｓｉｅｎら、１９９０  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｐｐ．１６９−１７８などが挙げられる。ＦＰ及び／又はＲＥＴ及びＴＲ−ＲＥＴアプリケーションを実行するために有用な計測器は、Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（Ｕｌｔｒａ，Ｕｌｔｒａ  ３８４，Ｕｌｔｒａ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）（Ｆｕｓｉｏｎ，ＥｎＶｉｓｉｏｎ，Ｖｉｃｔｏｒ  Ｖ，ａｎｄ  ＶｉｅｗＬｕｘ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（ＬｅａｄＳｅｅｋｅｒ）及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）（Ａｎａｌｙｓｔ  ＡＤ，ＧＴ，ａｎｄ  ＨＴ）から入手可能である。
【００４２】
用語「ＲＥＴ」は、共鳴エネルギー転移のことを指し、原子間の距離よりも顕著に大きい距離にわたる、ドナーとアクセプター種との間の共鳴相互作用による、分子中の、又は分子システム中の、吸収（ドナー）部位から利用（アクセプター）部位へのエネルギー量子の転移（例えば放射線を生じない）のことを意味する。ドナーは、最初にエネルギー（例えば光学エネルギー又は電子エネルギー）を吸収する部分である。本願明細書に記載されるように、発光金属錯体は２つのドナーを含むことができる。すなわち、１）有機アンテナ部分（（例えば光子からの）光学エネルギーを吸収する）、及び２）ランタニド金属イオン（（例えば有機アンテナ部分から転移した）電子エネルギーを吸収する）。ＲＥＴはまた、蛍光共鳴エネルギー転移又はフォースター共鳴エネルギー転移（両方ともＦＲＥＴと簡略される）とも称される。ＲＥＴには、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＦＲＥＴ及びＬＲＥＴが包含される。ＬＲＥＴには用語「発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）」を用い、これは（ＦＲＥＴなどの場合の）用語「蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）」よりも一般的である。
【００４３】
本明細書で使用される「エネルギー転移ペア」又はＲＥＴペアという用語は、エネルギー転移に関与するあらゆる２つの部分を意味する。幾つかの実施形態では、部分のうちの１つは蛍光リポータ（例えばドナー）として機能し、その他は受容体として機能し、後者はクエンチング化合物、又は検出可能なシグナル（例えば蛍光発光）の形でエネルギーを吸収及び再放出する化合物であってもよい（”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．”Ｓｅｌｖｉｎ  Ｐ．（１９９５）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２４６：３００−３３４、ｄｏｓ  Ｒｅｍｅｄｉｏｓ  Ｃ．Ｇ．（１９９５）  Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１１５：１７５−１８５、”Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．”Ｗｕ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｒａｎｄ  Ｌ．（１９９４）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２１８：１−１３）。ＲＥＴは、２つの部分間の距離依存性及び／又は配向依存性の相互作用であり、励起エネルギー（例えば光）が光子の放出を伴わずにドナーからアクセプターへ転移する。Ｄｅｕｓｃｈｌｅら、（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００５  １４：２３０４−２３１４）及びＳｍｉｔｈら、（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，１４：６４−７３）は、ＲＥＴペアの間の距離及びそれらの配向が、どのようにＲＥＴに影響を及ぼすかを記載している。
【００４４】
アクセプターは、転移されたエネルギーを長波長で発する蛍光発生物質であってもよく、又は、例えばリポーター分子の検出可能な蛍光を減弱（クエンチング）する非蛍光物質であってもよい。ＲＥＴは分子間若しくは分子内で生じてもよく、典型的にはドナーとアクセプターとの距離の逆数の６乗の関数であり、それにより、生体高分子のサイズにほぼ匹敵する距離に関して有用となる。すなわち、部分間の距離及び／又は配向が変化した場合には、エネルギー転移ペアの全体としてのスペクトル特性が変化し、それを幾つかの方法で測定できる。蛍光ドナー−非蛍光アクセプターの組合せを組み込んでいる自己クエンチングプローブが、タンパク質分解の検出用（Ｍａｔａｙｏｓｈｉ，（１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：９５４−９５８）、並びに核酸ハイブリッド形成用（”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ”Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｌ．，ｉｎ  Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｌ．Ｋｒｉｃｋａ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，（１９９２）  ｐｐ．３１１−３５２、Ｔｙａｇｉ  Ｓ．（１９９８）  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９−５３、Ｔｙａｇｉ  Ｓ．（１９９６）  Ｎａｔ．１４（８）：９４７−８）に開発されている。
【００４５】
「アクセプター」又は「アクセプター部分」という用語は、ＲＥＴを介してエネルギーを受容する化学的若しくは生物学的部分を意味する。ＲＥＴアプリケーションにおいては、例えば蛍光の場合、アクセプターはドナー部分（例えば蛍光若しくは発光部分）から転移されるエネルギーを再放出できる。幾つかの実施形態では、転移はＲＥＴ又はＴＲ−ＲＥＴを介して行われる。本発明では、ドナー部分（例えば蛍光若しくは発光部分）及びアクセプター部分（例えば蛍光部分）は「ＲＥＴペア」と呼ばれる。アクセプターの例としては、クマリン及び関連するフルオロフォア、キサンテン（例えばフルオレセイン及びフルオレセイン誘導体）、蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ及びＧＦＰ誘導体）、ロードール（ｒｈｏｄｏｌｓ）、ローダミン及びその誘導体、レゾルフィン、シアニン、ジフルオロボラジアザインダセン及びフタロシアニンが挙げられる。アクセプター（蛍光アクセプター部分を含む）はＦＰアッセイ法の蛍光プローブとして有用である。大部分のアプリケーションにおいて、ドナー及びアクセプター色素は異なり、その場合にはＲＥＴは励起したアクセプターからの蛍光の出現、又はドナー蛍光のクエンチングにより検出できる。
【００４６】
リガンド結合分子
本発明において使用するリガンド結合分子は、基本的にリガンドと結合することができ、リガンドと結合及び／又はこれを放出すると高次構造を変化させ、検出可能な部分によって直接的又は間接的に標識できる分子であれば如何なる分子であってもよい。検出可能なシグナルは、リガンドの結合及び／又は放出に応じて変化する。本発明のリガンド結合分子としては、タンパク質、ペプチド及び核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリマー（例えば非天然のポリマー）など）などが挙げられる。
【００４７】
図２及び１２は、本発明の具体的な実施形態を示す、幾つかの一般原理である。一実施形態では、リガンド結合分子は核酸である。核酸は、限定されないがタンパク質や他の核酸などの様々な分子と結合することが公知である。多くの場合、核酸と他の分子との結合により、核酸に高次構造変化が生じる。様々な転写制御因子及び核酸結合タンパク質（例えばＤＮＡ結合タンパク質）は、結合することにより高次構造変化を生じさせる。核酸は、直接的及び／又は間接的に検出可能な部分（例えばＲＥＴペアを構成する２つの部分）で標識されてもよい。多数のタンパク質において、核酸結合部位が存在することが知られている。当業者であれば、結合分子と結合及び／又はこれを放出すると検出可能なシグナル変化を適宜生じさせることができるように、少なくとも２つの検出可能な部分をどのように及びどこで核酸に標識するかを決定できる。例えば、核酸の２つの領域が分子と結合するように、核酸配列を分離するか又は設計することができる。２つの結合ドメインが、リガンドの結合により近い位置関係となり、代わりにＦＲＥＴペアのメンバーの近位関係が変化し、それにより検出可能なＦＲＥＴを変化させることができるように、ＦＲＥＴペアの２つのメンバーで標識された核酸を設計できる。
【００４８】
ＲＥＴ（例えばＦＲＥＴ）ペアのドナーとアクセプターとの間の距離は、ＲＥＴの効率に重要な影響を及ぼす（例えば、Ｂｅｒｎｅｙ  ａｎｄ  Ｄａｎｕｓｅｒ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，（２００３）  ８４：３９９２−４０１０、及びＪａｒｅｓ−Ｅｒｉｊｍａｎ  ａｎｄ  Ｊｏｖｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００３）  ２１（１１）：１３８７−１３９５を参照）。しかしながら、ドナーとアクセプターとの互いの配向、並びにそれらの周囲の環境がＲＥＴの効率に影響を及ぼすことも解っている（Ｄｅｕｓｃｈｌｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００５  １４：２３０４−２３１４、及びＳｍｉｔｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，１４：６４−７３）。
【００４９】
本発明の幾つかの実施形態では、ドナー及びアクセプター部分間の距離（リガンドに結合した場合及び／又は結合しない場合）は、０．１ｎｍ〜１００ｎｍ、１ｎｍ〜１０ｎｍ、１ｎｍ〜５ｎｍ、５ｎｍ〜１０ｎｍ及び３ｎｍ〜７ｎｍである。幾つかの場合、ＲＥＴペア（例えばアクセプター及びドナー部分）のメンバー間の距離は、フェルスター距離（例えばＲ０）と呼ばれる。
【００５０】
本発明の幾つかの実施形態では、複数のアクセプター及び／又はドナー部分が、リガンド結合分子に結合する。幾つかの実施形態では、リガンド結合分子はＦＲＥＴリレーを可能にするように修飾される（例えば、Ｗａｔｒｏｂら、２００３，Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ＦＲＥＴ  ａｓ  ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：７３３６−７３４３、及びＳｍｉｔｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，１４：６４−７３を参照のこと）。幾つかの実施形態では、リガンド結合分子は、例えば３つのフルオロフォアにより３重に修飾される。幾つかの実施形態では、修飾されるリガンドは、５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（ＩＡＦ）、Ｃｙ５  マレイミドモノ反応性色素及びテトラメチルローダミン−５−マレイミド（ＴＭＲ）で（例えば共有結合及び／又は非共有結合的、又はそれらの組み合わせにより）標識される。この３重の組合せにより、励起エネルギーがＴＭＲを介してＩＡＦからＣｙ５へ転移されるＦＲＥＴリレーが可能となる。幾つかの実施形態では、ＦＲＥＴリレーは、リガンド結合分子によるリガンドの結合又は放出の増加を示す。ＦＲＥＴリレーは、大きい距離を克服する際に有用性を発揮でき（Ｗａｔｒｏｂら、２００３）、大きいストークスシフトを提供できる。
【００５１】
更に、ＤＮＡ結合蛋白（ＤＢＰ）は、修飾してＦＲＥＴペアの２つのメンバーを（共有結合又は非共有結合的に）有する形態としてもよく、それにより、ＤＮＡ結合及び／又は放出に応じて、修飾ＤＢＰは検出可能なＲＥＴの変化を示す。これらの修飾ＤＢＰは、本願明細書に記載されているのと同様の方法及びデザイン（例えば修飾ＰＢＰに関して記載されているもの）を使用して設計できる。
【００５２】
標識（例えばドナー及びアクセプター部分）は、当業者に公知のどの方法を使ってリガンド結合分子に結合させてもよい。例えば標識は、アミン、カルボキシル残基、リガンド結合分子上のチオール結合（例えば修飾リガンド結合タンパク質）及び／又は抗体結合を介して結合させることができる。一実施形態では、少なくとも１つの標識の結合は、システイン残基上のチオール基を介して行う。幾つかの実施形態では、抗体はドナー部分の１つを提供し、リガンド結合タンパク質は他方を提供してもよい。幾つかの実施形態では、１つの抗体はドナー部分の１つを提供し、別の抗体はアクセプター部分の１つを提供してもよい。
【００５３】
適宜、リガンド結合タンパク質のアミノ酸配列中の天然システイン残基を、標識の結合に用いてもよい。しかしながら、標識の結合に利用できる適切な天然システイン残基が存在しない場合、例えば、システイン残基を、部位特異的変異導入によって、リガンド結合タンパク質の配列中に導入してもよい。部位特異的変異導入は、公知技術の方法により実施できる。例えば、リガンド結合タンパク質をコードする配列を単離し、配列決定し、オリゴヌクレオチドプローブを構築し、変異させるのが望ましいアミノ酸をコードするコドンを、（例えば組換えによって）システインをコードするコドンに変異させることにより実施できる。変異遺伝子はその後、例えば細菌若しくは真核生物発現システムで発現させ、変異タンパク質を産生する。幾つかの実施形態では、標識は、チオール反応性のリンカー基を介して、タンパク質上のシステイン残基に結合する。いかなるチオール反応性リンカー基を使用してもよい。例えば、ヨードアセトアミドリンカーを使用できる。一実施形態では、リンカー基はマレイミドリンカーを含む。
【００５４】
幾つかの実施形態では、システインは、他のアミノ酸の隣にシステインアミノ酸を挿入することによって導入される。幾つかの実施形態では、システインは、少なくとも１つの他のアミノ酸を、システインアミノ酸で置換することによって導入される（すなわち置換）。具体的な置換の例は本発明に記載されており、１つのアミノ酸をシステインアミノ酸で置換することである。本発明の他の実施形態では、幾つかの隣接するアミノ酸（例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸）を、少なくとも１つのシステインアミノ酸で置換する。
【００５５】
本発明の幾つかの実施形態では、ＲＥＴは、修飾リガンド結合分子による、リガンドの結合又は放出に応じて増加する。一実施形態では、ＲＥＴはリガンド結合すると増加する。幾つかの実施形態では、この増加は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００％超、２００％超、３００％超、４００％超、７５０％超、１０００％超、２０００％超、３０００％超又は５０００％超である。幾つかの実施形態では、ＲＥＴのこの変化は、１０％超かつ１０００％未満、１００％超かつ４００％未満、２０％超かつ２００％未満、２００％超かつ７５０％未満、４００％超かつ１０００％未満、７５０％超かつ３０００％未満、又は１０００％超かつ５０００％未満である。
【００５６】
一実施形態では、ＲＥＴは、修飾リガンド結合分子による、リガンドの結合又は放出に応じて減少する。幾つかの実施形態では、この減少は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超又は９０％超である。幾つかの実施形態では、ＲＥＴのこの変化は１０％超かつ９０％未満、２０％超かつ６０％未満、５０％超かつ９０％未満、又は１０％超かつ５０％未満である。幾つかの実施形態では、ＲＥＴペアの少なくとも１つのメンバーは、リガンド結合分子（例えば大腸菌ＰＢＰ）中の切断結合部の付近で結合する。一実施形態では、ＲＥＴペアの少なくとも１つのメンバーは、リガンド結合分子（例えば大腸菌ＰＢＰ）中の切断結合部で結合する。
【００５７】
幾つかの実施形態では、ＦＲＥＴは検出されるＲＥＴのタイプである。幾つかの実施形態では、ＴＲ−ＦＲＥＴは検出されるＲＥＴのタイプである。幾つかの実施形態では、ＴＲ−ＲＥＴは検出されるＲＥＴのタイプである。
【００５８】
本発明の幾つかの実施形態では、あらゆる方法によってＲＥＴ（例えばＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＲＥＴ又はＬＲＥＴ）を生じさせることができる（例えばＢｅｒｎｅｙ  ａｎｄ  Ｄａｎｕｓｅｒ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，（２００３）  ８４：３９９２−４０１０）を参照）。
【００５９】
一実施形態では、修飾リガンド結合分子は、テルビウムキレート及びアクセプター部分（例えば緑色フルオロフォア）で標識される。幾つかの実施形態では、修飾リガンド結合分子は、アクセプター部分及びテルビウムキレート（例えばＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）テルビウムキレート）を有する。幾つかの実施形態では、本発明の修飾リガンド結合分子は、ホスフェートと結合するとＲＥＴ比率が約１０倍変化する。幾つかの実施形態では、本発明の修飾リガンド結合分子は約２５０ｎＭで感度を示す。幾つかの実施形態では、本発明の修飾リガンド結合分子は約２．５μＭで高感度を示す。本発明の幾つかの実施形態では、修飾リガンド結合分子は、マラカイトグリーンと比較し、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍又は少なくとも１０倍の感度を示す。本発明の幾つかの実施形態では、０．５超、０．６超、０．７超、０．８超又は０．９超のｚ’値を示すアッセイ法及び方法を提供する。幾つかの実施形態では、本発明のアッセイ法又は方法において使用する修飾リガンド結合分子の純度は、９０％超である。本発明の幾つかの実施形態では、修飾リガンド結合分子は、例えば細胞可溶化物又は未精製の細胞可溶化物から実質的に精製されていない。
【００６０】
リガンドとの結合と、未結合との違いが検出できなくなったり、又は、リガンド結合分子（例えば修飾リガンド結合分子）によるリガンドの結合及び／又は放出が停止されたりしないように、リガンド結合分子（例えば修飾リガンド結合分子）中のリガンド結合領域を破壊しないように注意すべきである。幾つかの実施形態では、リガンド結合タンパク質を、結合特異性及び／又は結合アフィニティを変化させるために修飾する。
【００６１】
具体的実施形態では、リガンド結合分子はリガンド結合タンパク質の断片（例えばＰＢＰの断片）である。多くのリガンドタンパク質が（例えば結晶学研究を使用して）解析され、タンパク質結合領域が公知となり、解析されている。したがって、リガンドと結合できる、リガンド結合タンパク質の断片を決定し、調製することが可能である。本発明の幾つかの実施形態では、リガンド結合タンパク質のこれらのリガンド結合断片は、本願明細書に記載される修飾リガンド結合分子として利用できる。
【００６２】
幾つかの実施形態では、当該リガンド結合分子はホスフェートと結合しない。幾つかの実施形態では、当該リガンド結合分子はマルトースと結合しない。
【００６３】
ホスフェート結合タンパク質
ホスフェート（例えばＰｉ）と特異的に結合する多くのタンパク質が公知である。例えば、細胞及び細胞小器官における、ホスフェートの入出輸送は、特異的な輸送タンパク質により実施される。それは細菌細胞においては、ホスフェート結合タンパク質に依存性の、高親和性輸送システムによって実施される。かかるタンパク質は、無機ホスフェートを特異的に認識し、それと結合し、細胞膜又は細胞小器官間の輸送を媒介できる。かかるタンパク質の例としては、大腸菌ホスフェート結合タンパク質が挙げられ、例えば大腸菌のｐｈｏＳ遺伝子によってコードされるタンパク質である。このタンパク質は、バクテリアのＰｉ排除システムの一部として、大腸菌のペリプラズムに存在し、Ｐｉ飢餓条件下で機能する。それゆえ、Ｐｉに対するこのタンパク質の結合アフィニティは高い。
【００６４】
ｐｈｏＳ遺伝子はクローニングされ、配列決定されている（Ｍａｇｏｔａら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９８４，１５７（３）：９０９−１７、Ｓｕｒｉｎら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４、１５７（３）：７７２−７７８）。更に、ＰＢＰはＰｉと強固に結合することが明らかとなっており（Ｍｅｄｖｅｃｚｋｙ及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９６９  １９２（２）：３６９−７１）、またＰｉと結合した形態の結晶構造が高解像度で解析されている（Ｌｕｅｃｋｅ及びＱｕｉｏｃｈｏ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９０  ３４７（６２９１）：４０２−６）。これらの研究は、大腸菌ＰＢＰが２つの領域に分かれた形の３５ｋＤのモノマータンパク質からなり、それらの間にＰｉ結合溝が存在することを示している。そのＰｉ結合溝は、Ｐｉ結合及びＰｉ放出すると、開放型及び閉鎖型のポジションをとるものと仮定できる。Ｐｉ輸送タンパク質の更なる例は、Ｔｏｒｒｉａｎｉによって検討されている（Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １９９０，１２（８）：３７１−６）。第三のクラスのＰｉ−結合タンパク質としては、Ｐｉ−結合酵素が挙げられる。多くの酵素はＰｉと弱く結合し、幾つかはＰｉと強く結合することが公知である。限定されないが本願明細書に記載されているものを含む、あらゆるホスフェート結合タンパク質が、本発明の教示に従い利用できる。
【００６５】
Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇら、（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）  ３７：１０３８１−１０３８５）は、大腸菌ＰＢＰのＡ１９７Ｃ変異体及びＮ−［２−（１−マレイミジル）エチル］−７−（ジエチルアミノ）−クマリン−３−カルボキサミド（ＭＤＣＣ）で標識された同じ変異体の結晶構造を開示している。必須ではないが、上記の結晶構造を、本発明の修飾ＰＢＰの設計の際に利用できる。
【００６６】
他のホスフェート結合タンパク質は、ヒト血漿ホスフェート結合タンパク質（ＨＰＢＰ）である。幾つかの実施形態では、本発明のリガンド結合分子はヒト血漿ホスフェート結合タンパク質（ＨＰＢＰ）である。Ｍｏｒａｌｅｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ  １４，６０１−６０９，Ｍａｒｃｈ  ２００６を参照のこと。
【００６７】
幾つかの実施形態では、上記リガンド結合分子は、リガンドと結合できる原核生物由来のリガンド結合タンパク質又はその断片を含む（例えば、ｐｈｏＳ遺伝子によってコードされる大腸菌ＰＢＰなど）。幾つかの実施形態では、リガンド結合分子は、リガンドと結合できる真核生物由来のリガンド結合タンパク質又はその断片を含む（例えばＭｏｒａｌｅｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｖｏｌ１４、６０１−６０９（２００６年３月）に記載されるようなＨＰＢＰ）。幾つかの実施形態では、リガンド結合分子はリガンドと結合できるヒトリガンド結合タンパク質又はその断片を含む。
【００６８】
本発明においては、ホスフェート結合タンパク質にドナー部分（例えばランタニドキレート）及びアクセプター部分（例えば蛍光若しくは発光ラベル）を結合させる修飾により、修飾ホスフェート結合タンパク質を得る方法が示されている。上記タンパク質はホスフェート（例えばＰｉ）に対して感受性があり、Ｐｉを結合する場合に発光のシフトを生じさせる。上記の修飾タンパク質は、ホスフェートが関与する生物学的反応の動態に従うホスフェート関連アッセイ法において、並びに、臨床アッセイ法及び汚染試験などの従来公知のホスフェートアッセイ法において、使用することができる。本発明の一実施形態は、ＲＥＴペア部分を含む修飾ホスフェート結合タンパク質を提供する。
【００６９】
幾つかの実施形態では、検出可能な特徴が、ホスフェートの結合及び／又はホスフェートの放出の際に生じるタンパク質の構造変化があると変化する少なくとも１つの検出可能な標識を付与するように、上記ホスフェート結合タンパク質を修飾する。一実施形態では、検出可能な特徴の変化は、修飾ＰＢＰからのホスフェート（例えばＰｉ）の結合又は放出の際の高次構造変化によるものであり、それは例えばＦＲＥＴペアの間の距離及び／又は配向の変化である。一実施形態では、当該距離が増加する。一実施形態では、当該距離が減少する。一実施形態では、ＲＥＴペア部分の当該配向が変化する。一実施形態では、ドナー及び／又はアクセプター分子の周囲の環境が変化する。
【００７０】
本発明の修飾ホスフェート結合タンパク質は、いかなるホスフェート結合タンパク質の修飾形態でもあってもよい。一実施形態では、上記ＰＢＰは、細胞及び細胞区画におけるＰｉの転移出入を媒介する、能動輸送システムに由来するタンパク質に関与する。一実施形態では、上記ＰＢＰは大腸菌ｐｈｏＳホスフェート結合タンパク質である。ＰＢＰは、本願明細書に記載のように修飾することができ、例えば、ＰＢＰは天然若しくは非天然（例えば挿入された）システインアミノ酸を用いて修飾できる。
【００７１】
本発明の幾つかの実施形態では、修飾ＰＢＰは大腸菌ｐｈｏＳ  ＰＢＰに由来する。幾つかの実施形態では、修飾ＰＢＰは配列番号：１又は２に由来する。幾つかの実施形態では、修飾ＰＢＰは配列番号：１又は２である。
【００７２】
本発明の幾つかの実施形態では、天然のアミノ酸配列を含む大腸菌ｐｈｏＳ  ＰＢＰを使用する。一実施形態では、アクセプター及び／又はドナー部分がチオエーテル結合を介してＰＢＰに結合する。一実施形態では、アクセプター及び／又はドナー部分が混合ジスルフィド結合を介してＰＢＰに結合する。一実施形態では、アクセプター及び／又はドナー部分が抗体を介してＰＢＰに結合する。
【００７３】
幾つかの実施形態では、ＲＥＴペアのアクセプター及び／又はドナー部分は、チオエステル、チオエーテル又は混合ジスルフィド結合を介してＰＢＰに結合する。幾つかの実施形態では、アミノ酸１９７（Ｍａｇｏｔａら、（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４，１５７（３）：９０９−１７、例えば配列番号：２））に開示される成熟ＰＢＰのＮ末端からの付番）をシステインで置換することができる。ＦＲＥＴペアの１つのメンバーの結合部位は、ＰＢＰのアミノ酸配列の位置１９７（例えば配列番号：２の位置１９７）を置換したシステイン残基であってもよい。幾つかの実施形態では、ドナー又はアクセプター部分は、４７、１５４、１８５、１９７、２０１及び２６８（Ｍａｇｏｔａら、に開示される、成熟ＰＢＰのＮ末端からの付番（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４，１５７（３）：９０９−１７、例えば配列番号：２））からなる群から選択される位置のアミノ酸を置換したシステインに結合する。幾つかの実施形態では、ドナー及び／又はアクセプター部分は、以下からなる群から選択される位置で置換されるか、又はそのアミノ酸に隣接して挿入されるシステインに結合する：４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、及び２７３（Ｍａｇｏｔａら、に開示される、成熟ＰＢＰのＮ末端からの付番（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４，１５７（３）：９０９−１７、例えば配列番号：２）。念のため明確化すると、置換には、１を超える数のアミノ酸の欠失が包含される。例えば、アミノ酸１９５〜１９８の欠失は、アミノ酸１９５ないし１９８のいずれか（例えば１９７）の置換とも考えられる。幾つかの実施形態では、アミノ酸はシステインにより置換され、その部分は例えばチオール反応性ラベルと共に置換されたシステインに結合する。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのシステインが、本願明細書に記載の１つ以上のアミノ酸に隣接して追加（例えば挿入）される。例えば、システインはアミノ酸４７、１５４、１８５、１９７、２０１又は２６８（Ｍａｇｏｔａら、に開示される、成熟ＰＢＰのＮ末端からの付番（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４，１５７（３）：９０９−１７、例えば配列番号：２））に隣接して挿入されてもよい。
【００７４】
ドナー及びアクセプター部分と結合するためのアミノ酸位の様々な組合せ（Ｍａｇｏｔａら、に開示される、成熟ＰＢＰのＮ末端からの付番（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４，１５７（３）：９０９−１７、例えば配列番号：２））も、本発明の実施形態として包含される。以下は、アクセプター又はドナー部分が結合できる「領域」の例である（Ｍａｇｏｔａら、に開示される、成熟ＰＢＰのＮ末端からの付番（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４，１５７（３）：９０９−１７、例えば配列番号：２））。領域１はアミノ酸４２−５１を含む。領域２はアミノ酸１４９−１５９を含む。領域３はアミノ酸１８０−１９１を含む。領域４はアミノ酸１９２−２０１を含む。領域５はアミノ酸２６４−２７３を含む。これらの領域は典型的な領域として示されるに過ぎず、本発明はこれらの領域に限定されるものではない。本発明の幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアクセプター部分は領域１〜５のうちの１つに位置し、少なくとも１つのドナー部分は１〜５の他の領域のうちの１つに位置する。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアクセプター部分は領域１に結合し、少なくとも１つのドナー部分は領域２、３、４又は５に結合する。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアクセプター部分は領域２に結合し、少なくとも１つのドナー部分は領域１、３、４又は５に結合する。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアクセプター部分は領域３に結合し、少なくとも１つのドナー部分は領域１、２、４又は５に結合する。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアクセプター部分は領域４に結合し、少なくとも１つのドナー部分は領域１、２、３、又は５に結合する。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアクセプター部分は領域５に結合し、少なくとも１つのドナー部分は領域１、２、３、又は４に結合する。
【００７５】
幾つかの実施形態では、少なくとも１つのドナー部分は領域１に結合し、少なくとも１つのアクセプター部分は領域２、３、４又は５に結合する。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのドナー部分は領域２に結合し、少なくとも１つのアクセプター部分は領域１、３、４又は５に結合する。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのドナー部分は領域３に結合し、少なくとも１つのアクセプター部分は領域１、２、４又は５に結合する。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのドナー部分は領域４に結合し、少なくとも１つのアクセプター部分は領域１、２、３又は５に結合する。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのドナー部分は領域５に結合し、少なくとも１つのアクセプター部分は領域１、２、３又は４に結合する。
【００７６】
幾つかの実施形態では、アクセプター及びドナー部分は、同じ領域（例えば領域１、２、３、４又は５）に結合する。
【００７７】
部分は、公知技術のいかなる方法によって結合させてもよい。例えばシステインによる置換、システインの挿入又は天然のシステインを使用した、チオール結合を介した上記部分との結合が挙げられる。上記部分は、アミン基を介して結合させてもよい。更に上記部分は、限定されないが抗体、結合パートナー（例えばビオチン及びストレプトアビジン）などの非共有的結合／会合を介して結合させてもよい。
【００７８】
リン酸と結合したＰＢＰと結合していないＰＢＰとの違いが検出できなくなったり、又は、ＰＢＰによるリン酸の結合及び／又は放出が停止されたりしないように、タンパク質中のリン酸結合領域を破壊しないように注意すべきである。
【００７９】
一実施形態では、ＲＥＴはホスフェート（例えばＰｉ）結合すると増加する。幾つかの実施形態では、このＲＥＴの変化は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００％超、２００％超、４００％超、７５０％超、１０００％超又は本願明細書に記載の他のいかなるパーセンテージであってもよい。幾つかの実施形態では、このＲＥＴの変化は、１０％超かつ１０００％未満、１００％超かつ４００％未満、２０％超かつ２００％未満、２００％超かつ７５０％未満、４００％超かつ１０００％未満である。
【００８０】
一実施形態では、ＲＥＴはホスフェート（例えばＰｉ）結合すると減少する。幾つかの実施形態では、この減少は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超又は本願明細書に記載の他のいかなるパーセンテージであってもよい。幾つかの実施形態では、このＲＥＴの変化は、１０％超かつ９０％未満、２０％超かつ６０％未満、５０％超かつ９０％未満、又は１０％超かつ５０％未満である。幾つかの実施形態では、ＦＲＥＴペアの少なくとも１つのメンバーは、大腸菌ＰＢＰの結合溝の周辺（例えば結合溝の内部）において結合する。
【００８１】
一実施形態では、修飾ＰＢＰはテルビウムキレート及びアクセプター部分（例えば緑色フルオロフォア）で標識される。一実施形態では、修飾ＰＢＰはアクセプター部分及びテルビウムキレート（例えばＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）テルビウムキレート）を含む。幾つかの実施形態では、本発明の修飾ＰＢＰは、ホスフェートと結合すると、ＲＥＴ比率を約１０倍変化させる。幾つかの実施形態では、本発明の修飾ＰＢＰは約２５０ｎＭで感度を示す。幾つかの実施形態では、本発明の修飾ＰＢＰは約２．５μＭで高感度を示す。本発明の幾つかの実施形態では、修飾ＰＢＰは、マラカイトグリーンより少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍又は少なくとも１０倍感度が高い。幾つかの実施形態では、修飾ＰＢＰは、マラカイトグリーンより２〜１０倍高い、３〜５倍高い、４〜１０倍高い感度を示す。本発明の幾つかの実施形態では、０．５超、０．６超、０．７超、０．８超又は０．９超のｚ’値を有するアッセイ法及び方法が提供される。本発明の幾つかの実施形態では、０．５〜０．９、０．５〜０．７、０．６〜０．９又は０．７〜０．９９のｚ’値を有するアッセイ法及び方法が提供される。
【００８２】
幾つかの実施形態では、本発明のアッセイ法又は方法において使用する修飾ＰＢＰの純度は９０％超である。本発明の幾つかの実施形態では、修飾ＰＢＰは、例えば、細胞可溶化物又は浄化された細胞可溶化物から実質的に精製されない。
【００８３】
結合パートナー
本明細書で使用される結合パートナーとは、リガンド結合分子と結合する結合分子のことを指す（但し検出されるリガンドは含まない）。「結合パートナー」は、他の化合物（例えばリガンド結合分子）との親和性を有する化合物（例えば抗体）のことを指し、それにより、結合パートナーと化合物が結合して複合体を形成する。例えば、第１の結合パートナーは、リガンド結合領域上のエピトープを認識するモノクローナル抗体であってもよい。幾つかの実施形態では、上記エピトープはリガンド結合分子に元来存在する天然のエピトープである。幾つかの実施形態では、上記エピトープはリガンド結合分子に導入されたか又は設計されたエピトープである。使用できるエピトープとしては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ヒスチジンタグ（例えば６×ヒスチジン）、ｃ−ｍｙｃ（例えばヒトプロトオンコジーンｍｙｃのアミノ酸セグメント（例えばＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ））、ヘモグルチニンタグ（例えばインフルエンザ血球凝集素タンパク質由来（例えばＹＰＹＤＶＰＤＹＡ））、ジゴキシゲニン（タンパク質又は核酸に共有結合させることが可能な有機小分子）、及びビオチン。
【００８４】
本発明の幾つかの実施形態では、標準的なプロトコル（例えば市販のキレート試薬中に添付されている）に従い、ランタニド金属複合体（例えばＴｂキレートを含む）で標識された抗体を利用する。幾つかの実施形態では、抗リガンド結合分子抗体と結合する種特異的抗体（例えばＴｂ標識を有する抗ＩｇＧ）との会合により、抗体を”ｉｎ  ｓｉｔｕ”で標識する。幾つかの実施形態では、本発明のアッセイ法は、例えば、”ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ”（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にて説明されるような、標準的な「ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）」設定を使用して解析できる。
【００８５】
したがって、本発明の１態様は、結合パートナーを含む組成物を提供する。結合パートナーは、発光金属錯体（例えばＴｂ又はユーロピウム）で標識されてもよい。幾つかの実施形態では、結合パートナーはアクセプター部分（例えば蛍光）で標識されてもよい。本発明はまた、結合パートナーの混合物を提供する。例えば組成物は、第１の結合パートナー及び第２の結合パートナーを含んでもよい。第１の結合パートナーが発光金属錯体を含み、一方第２の結合パートナーがアクセプター部分（例えば蛍光）を含んでもよい。幾つかの実施形態では、第１の結合パートナーが蛍光アクセプター部分を含み、第２の結合パートナーが発光金属錯体を含んでもよく、その際、両方の結合パートナーが共にリガンド結合分子と結合してもよい。
【００８６】
典型的には、リガンド結合分子の第１の結合パートナーの親和性（例えば見かけのＫｄ）は、約１ｍＭ以下、例えば約１０μＭ以下、約１μＭ以下、約０．１μＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下又は０．１ｎＭ以下である。幾つかの実施形態では、リガンド結合分子の第１の結合パートナーの親和性は、約１ｍＭ〜０．１ｎＭ、約１０μＭ〜１μＭ、及び約１μＭ〜１ｎＭである。
【００８７】
当業者に自明のように、リガンド結合分子の結合パートナーのＫｄに応じて、実験パラメータ（例えばアッセイ成分、反応時間、温度及びバッファ濃度）を組織的に調整し、条件及び費用効果の所望の組合せを実現することができる。
【００８８】
結合パートナーは、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、リン脂質、多糖類又は有機分子であってもよい。具体的なタンパク質又はポリペプチド性の結合パートナーの例としては、抗体、タンパク質、又は酵素的若しくは化学的に合成若しくは修飾したポリペプチド配列（例えばタンパク質に由来するか、タンパク質から修飾されるか、又は新規に設計・合成したポリペプチド配列）が挙げられる。タンパク質又はポリペプチド結合パートナーは、直鎖状であってもよく、環状であってもよい。有機分子の結合パートナーは、有機小分子であってもよい。
【００８９】
幾つかの実施形態では、結合パートナーは、発光金属錯体又はアクセプター部分（例えば蛍光）を含む。幾つかの実施形態では、１つの結合パートナーは発光金属錯体を含み、もう一方はアクセプター部分（例えば蛍光）を含んでもよい。例えば、第１の結合パートナーは発光金属錯体を含み、第２の結合パートナーはアクセプター部分（例えば蛍光）を含む。
【００９０】
一実施形態では、抗体は発光金属キレートで標識されてもよく、抗体が結合するリガンド結合分子はアクセプター部分（例えば蛍光）で標識されてもよい。
【００９１】
結合パートナーは、当業者に公知の様々な方法で調製・精製することができる。例えば、抗体（モノクローナル抗体及び抗体断片を含む）は当業者に公知の様々な方法で調製してもよく、又は様々な商業的なベンダー（Ｓｅｒｏｔｅｃ（ローリー、ＮＣ）、Ａｂｃａｍ（ケンブリッジ、ＭＡ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ及びＣｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（デンバー、ＣＯ）など）から購入してもよい。
【００９２】
一般に、抗体にとり好ましい抗原は、例えば組換えにより、化学合成により、又は天然タンパク質の精製により調製し、動物への免疫に供される。例えば、特異的なアミノ酸配列及び／又は翻訳後修飾（例えばリン酸化）を有するポリペプチド又はタンパク質を固相化学合成により調製し、配列及び／又は翻訳後修飾に特定の抗体を産生してもよい。例えばウサギ、チキン、マウス、モルモット、ヤギ及びラットなどの様々な宿主動物を用いて、目的の抗原を注射して免疫化できる。宿主の種類に応じてアジュバントを用い、免疫応答を増強してもよい。アジュバントとしては、フロイントアジュバント（完全及び／又は不完全）、ミネラルゲル（例えば水酸化アルミニウム）、表面活性剤（例えばリゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールなどが挙げられる。ポリクローナル抗体は、免疫動物の血清中に含まれる。モノクローナル抗体は、標準的なハイブリドーマ技術を使用して調製できる。特に、モノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｏｆ  Ｋｏｓｂｏｒら、（１９８３）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２、及びＣｏｔｅら、（１９８３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０、及びｔｈｅ  ＥＢＶ−ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｏｆ  Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６（１９８３）に記載のように、細胞株の継代培養によって、抗体分子の産生を可能とするあらゆる技術によって調製してもよい。かかる抗体はいかなる免疫グロブリンであってもよく、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びそのあらゆるサブクラスが包含される。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで調製できる。キメラ抗体は、標準的な技術により作製できる。
【００９３】
抗原と特異的な結合アフィニティを有する抗体断片は、周知の技術により作製できる。かかる抗体断片としては、限定はされないが、抗体分子のペプシン処理により調製できるＦ（ａｂ’）２断片、及びＦ（ａｂ’）  ２断片のジスルファイド架橋を還元することにより調製できるＦａｂフラグメントなどが挙げられる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリを構築してもよい。Ｈｕｓｅら、（１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと。単鎖Ｆｖ抗体断片は、アミノ酸架橋（例えば１５〜１８のアミノ酸）を介して、Ｆｖ領域の重鎖と軽鎖断片とを連結することにより形成され、結果として単鎖のポリペプチドとして得られる。単鎖Ｆｖ抗体断片は、標準的な技術（例えば米国特許第４,９４６,７７８号に開示）により調製できる。
【００９４】
調製した後、抗体又はその断片を、例えば酵素結合抗体免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又はラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）などの標準的な免疫測定法によって、リガンド結合分子（例えばＰＢＰ）の認識（及び親和性）に関して試験することができる。Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照のこと。適切な抗体は典型的には、約１ｍＭ以下、例えば約１０μＭ以下、約１μＭ以下、約０．１μＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下又は約０．１ｎＭ以下の、抗原（例えばリガンド結合分子）とのＫｄ値を有する。幾つかの実施形態では、抗体は、約１ｍＭ〜０．１ｎＭ、約１０μＭ〜１μＭ、又は約１μＭ〜１ｎＭの、抗原とのＫｄ値を有する。
【００９５】
抗体以外にも、他のポリペプチドを第１若しくは第２の結合パートナーとして使用するのも有用であり、それらは標準的な方法を使用して調製・分析することができる。例えば、限定されないが、ポリペプチド、タンパク質及び抗体は、天然の供給源から（例えば単離された細胞、組織又は体液）からの抽出、タンパク質又はポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、又は化学合成によって調製することが可能である。例えばポリペプチド又はタンパク質は、タンパク質又はポリペプチドをコードする発現ベクターを用いて、標準的な組換え技術によって調製できる。得られるポリペプチドを、更に精製してもよい。ポリペプチドの小スケール若しくは大スケールでの生産に利用できる発現システムとしては、限定されないが、微生物（例えば組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換したバクテリア（例えば大腸菌及び枯草菌））、組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えばＳ．セレビシエ）、組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞によるシステム、組換えウイルス発現ベクター（例えばタバコモザイク病ウイルス）若しくは組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で感染させた植物細胞によるシステム、又は、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモータ（例えばメタロチオネインプロモータ）若しくは哺乳類のウイルス由来のプロモータ（例えばアデノウイルス後期プロモータ及びサイトメガロウイルスプロモータ）を有する組換え発現構築物を保持する哺乳動物細胞（例えばＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒーラ細胞、ヒト胚腎臓２９３細胞及び３Ｔ３  Ｌ１細胞などの初代細胞又は不死化細胞株）によるシステム、などが挙げられる。
【００９６】
本発明のポリペプチド又はタンパク質（抗体又はその結合断片を含む）を精製する適切な方法としては、例えば親和性クロマトグラフィ、免疫沈降、サイズ排除クロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィなどが挙げられる。Ｆｌｏｈｅら、（１９７０）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２２０：４６９−４７６、又はＴｉｌｇｍａｎｎら、（１９９０）  ＦＥＢＳ  ２６４：９５−９９を参照のこと。精製の純度は、任意の適切な方法で測定することができ、限定されないが、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィなどにより実施できる。
【００９７】
結合パートナーとしてのポリペプチド及びタンパク質は、固相合成法を使用して調製できる（国際公開公報第０３／０１１１５号及び米国特許第６，４１０，２５５号参照）。合成の容易さ及びコスト上の理由から、化学合成されるポリペプチドは、典型的には３〜５０アミノ酸長（例えば３〜３０、３〜２０、３〜１５、５〜３０、５〜２０、５〜１５、８〜２０、８〜１５、１０〜１０、１０〜１５又は１０〜１２のアミノ酸長）とすることができる。本発明のポリペプチド及びタンパク質においては、様々な種類のアミノ酸を使用することができる。好適なアミノ酸としては、天然、非天然及び修飾（例えばリン酸化）アミノ酸が挙げられる。適当な様々な保護基を有する、ペプチドの固相合成の際に即時使用できるアミノ酸も市販されている。
【００９８】
結合パートナーとして有用なポリヌクレオチドは標準的な技術により調製でき、一般的な分子クローニング及び化学的な核酸合成技術などが挙げられるが、これらに限定されない。例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することができる。ＰＣＲとは、目的の核酸を酵素で増幅する手順又は技術のことをいう。典型的には、目的の領域の末端又はそれを超える部分に関する配列情報を用いて、増幅されるテンプレートの反対の鎖と同一の配列を有するポリヌクレオチドプライマを設計する。ＰＣＲを用いてＤＮＡ並びにＲＮＡからの特異的な配列（全ゲノムＤＮＡ又は全細胞ＲＮＡからの配列を含む）を増幅することができる。プライマは、典型的には１４〜４０のヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチド長から数百ヌクレオチド長にわたってもよい。一般的なＰＣＲ技術（例えばＰＣＲプライマー）に関しては、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。テンプレートの供給源としてＲＮＡを使用する場合は、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成することができる。リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自己持続配列複製又は核酸配列ベース増幅などの方法を用いて、核酸を単離してもよい。Ｌｅｗｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ，１２（９）：１（１９９２）、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４−１８７８（１９９０）、及びＷｅｉｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１２９２（１９９１）を参照のこと。
【００９９】
本発明のポリヌクレオチドはまた、単一の核酸分子として（例えばホスホラミダイト技術を使用して３’〜５’方向で自動ＤＮＡ合成を使用）、又は一連の小分子ポリヌクレオチドとして化学合成してもよい。例えば、所望の配列を含む１つ以上の長いポリヌクレオチド（例えば＞１００のヌクレオチド）のペアを合成することができる。それらの各ペアは、ポリヌクレオチド対をアニールした場合デュプレックスが形成されるような短い相補性セグメント（例えば約１５のヌクレオチド）を有す。ＤＮＡポリメラーゼを用いてポリヌクレオチドを伸長させると、単一の二本鎖ポリヌクレオチドが得られる。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチドはまた、突然変異導入によって得てもよい。例えば、ＰＣＲに基づく、ポリヌクレオチド特異的突然変異生成及び部位特異的変異導入などの標準技術を使用して、ポリヌクレオチドに変異を導入できる。Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９２．を参照のこと。
【０１０１】
本発明の幾つかの実施形態では、１つ以上の結合パートナーを利用して、リガンド結合分子の近傍に、検出可能部分（例えばＲＥＴペアのメンバー）を位置させてもよい。幾つかの実施形態では、リガンド結合分子をＲＥＴペアの１つのメンバーで直接標識し、結合パートナーがＲＥＴペアの他のメンバーを提供する（例えば図１２Ｂを参照のこと）。一実施形態では、２つの結合パートナーが、リガンド結合分子にＲＥＴペアの両方のメンバーを提供する。本発明の幾つかの実施形態では、ＲＥＴ間の検出可能なエネルギー転移又はその欠如が、リガンド結合分子によるリガンドの放出及び／若しくは結合によって調整される、あるいは変化する。
【０１０２】
本発明のアッセイ法、方法及び修飾リガンド結合分子はいずれも、０、１、２又はそれ以上の結合パートナーを利用してもよい。
【０１０３】
発光金属錯体
発光金属錯体は、ＲＥＴ又はＴＲ−ＲＥＴアッセイ法のドナーフルオロフォアとして機能できる。発光金属錯体は、その励起状態のライフタイムが、典型的にはナノ秒よりも大きく、ミリ秒又は数百マイクロ秒のオーダーであるため、本発明の方法において有用である。その長い励起状態のライフタイムにより、バックグラウンド蛍光の減衰及び／又は光散乱による干渉の後において、検出をモニターすることができる。
【０１０４】
発光金属錯体を様々な分子及びタンパク質に共有結合させる方法は、当業者に公知であり、例えば国際公開公報第９６／２３５２６号、第０１／０９１８８号、第０１／０８７１２号及び第０３／０１１１１５号、米国特許出願公開第２００５００６４４８５号、並びに米国特許第５，６３９，６１５号、第５，６５６，４３３号、第５，６２２，８２１号、第５，５７１，８９７号、第５，５３４，６２２号、第５，２２０，０１２号、第５，１６２，５０８号及び第４，９２７，９２３号に記載されている。
【０１０５】
発光金属錯体は、金属リガンド部分、１つ以上のランタニド金属イオン、及び任意にリンカー、スペーサー及び有機アンテナ部分を含む。
【０１０６】
金属リガンド部分
金属リガンド部分は、１つ以上のランタニド金属イオンと配位結合し、金属錯体を形成する。典型的には、金属リガンド部分は、１つ以上の金属配位部分Ｘを含む。Ｘは、金属陽イオンと配位結合できるヘテロ原子の電子供与基（例えばＯ−、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＰＯ３２−、ＮＨＲ又はＯＲ、（式中Ｒは脂肪族基である））である。
【０１０７】
金属リガンド部分は、キレート化部分又はクリプタンド部分であってもよい。ランタニド金属イオンがキレート化部分に配位結合する場合、当該複合体は「金属キレート」と呼ばれる。ランタニド金属イオンがクリプタンド部分に配位結合する場合、当該複合体は「金属クリプタンド」と呼ばれる。
【０１０８】
金属キレートは、ランタニドイオンの交換の際に安定でなければならない。金属キレートは、全てそうではないが、ほとんどの場合、１０１０Ｍ−１超の形成定数（Ｋｆ）を示す。様々な有用なキレート化部分が、当業者に公知である。キレート化部分の典型的な例としては、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ、ＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰ、ＤＯＴＰ、ＤＯ３Ａ、ＤＯＴＡＧＡ及びＮＯＴＡなどが挙げられる。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、発光金属キレートは以下の構造を有することができる：
−Ｌｎ−Ａ−Ｓｎ−ＣＭ、又は、−Ｌｎ−ＣＭ−Ｓｎ−Ａ。
式中、Ａは有機アンテナ部分を表し、Ｌはリンカーを表し、Ｓはスペーサーを表し、ｎは０又は１であってもよく、Ｃは金属キレート化部分を表し、かつＭはＣに配位結合するランタニド金属イオンを表す。
【０１１０】
例として、発光金属キレートの例示として図３を参照のこと。
【０１１１】
クリプテートは、三次元有機空腔にランタニド陽イオンが取り込まれることにより形成され、非常に安定な複合体となる。様々な有用なクリプタンド部分は、当業者に公知である。本発明の方法で有用なクリプタンド部分の例としては、トリスビピリジン（ＴＢＰ、例えばＴＢＰペンタカルボキシレート）、及びピリジンビピリジン（例えばピリジンビピリジンテトラカルボキシレート）などが挙げられる。
【０１１２】
キレート化部分及びクリプタンド部分は、当業者に公知の様々な方法により合成できるか、又は市販品を購入してもよい。例えば米国特許第５，６３９，６１５号、第５，６５６，４３３号、第５，６２２，８２１号、第５，５７１，８９７号、第５，５３４，６２２号、第５，２２０，０１２号、第５，１６２，５０８号及び第４，９２７，９２３号、並びに国際公開公報第９６／２３５２６号及び第０３／０１１１１５号などを参照のこと。
【０１１３】
ランタニド金属イオン
金属リガンド部分は、１つ以上のランタニド金属イオンと配位結合し、金属錯体を形成する。ランタニド金属イオンは、その特別な電子配置が光学活性電子を保護するため有用であり、特徴的な線状発光を生じさせる。金属イオンの電子移行が量子力学の法則によって禁止されているため、これらのイオンの放出寿命は典型的に長い（μ秒からミリ秒）。
【０１１４】
有用なランタニド金属イオンとしては、Ｓｍ（ＩＩＩ）、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｔｂ（ＩＩＩ）及びＤｙ（ＩＩＩ）などが挙げられる。キレート化部分又はクリプタンド部分と金属イオンとを複合させる方法は、当業者に公知である。例えば国際公開公報第９６／２３５２６号及び第０３／０１１１１５を参照のこと。
【０１１５】
アンテナ部分
発光金属錯体は、アンテナ部分（例えば有機アンテナ部分）を任意に含んでもよい。有機アンテナ部分は典型的には、光を吸収できる複合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）電子構造を有する。吸収された光はアンテナ部分の励起一重項から励起三重項の状態へと、分子内で放射を伴わずに転移され、次にランタニドイオンは三重項状態から放射レベルに遷移し、次に特徴的な長寿命の発光を生じさせる（図３）。幾つかの金属リガンド部分は、有機アンテナ部分を有さなくとも光を吸収できる点に留意する必要がある。例えば、コンジュゲート型有機部分（例えばトリビピリジンペンタカルボキシレート）を含むある種のクリプタンド部分は、別の有機アンテナ部分を必要としない。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、有機アンテナ部分は、多核の複素環式芳香族化合物であってもよい。多核複素環式芳香族化合物は、２つ以上の環構造が融合した構造を有してもよい。有用な有機アンテナ部分の例としては、ローダミン５６０、フルオレセイン５７５、フルオレセイン５９０、２−キノロン、４−キノロン、４−トリフルオロメチルクマリン（ＴＦＣ）、７−ジエチル−アミノ−クマリン−３−カルボヒドラジド、７−アミノ−４−メチル−２−クマリン（カルボスチリル１２４、ＣＳ１２４）、７−アミノ−４−メチル−２−クマリン（クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチル−２−クマリン（クマリン１２４）、ＣＳ１２４−ＤＴＰＡ−Ｐｈｅ−ＮＣＳ−Ｔｂ（米国特許出願公開第２００５００６４４８５号）、ＣＳ１２４−ＤＴＰＡ−ＥＭＣＨ−Ｔｂ（米国特許出願公開第２００５００６４４８５号）及びアミノメチルトリメチルソラレンなどが挙げられる。
【０１１７】
有機アンテナ部分として有用な化合物は、当業者に公知の方法で合成してもよく、又は市販品を購入してもよい。例えば米国特許第５，６３９，６１５号、第５，６５６，４３３号、第５，６２２，８２１号、第５，５７１，８９７号、第５，５３４，６２２号、第５，２２０，０１２号、第５，１６２，５０８号及び第４，９２７，９２３を参照のこと。
【０１１８】
リンカー、スペーサー
発光金属錯体中に、リンカー及びスペーサーを任意に含有させてもよい。リンカー（Ｌ）は、発光金属錯体を分子に結合させるように機能する。例えばリンカーは、発光金属錯体とタンパク質（例えばタンパク質のアミノ酸）とを、アミン又はチオール（アミド、チオエーテル又はジスルフィド結合を生じさせる）との反応を経て結合させることができる。幾つかの実施形態では、Ｌは、金属リガンド部分上のアセテート、アミン、アミド、カルボキシレート又はメチレン官能性を、分子（例えばＰＢＰ）と結合させることができる。当業者であれば、分子（例えばタンパク質又はＰＢＰ）上の多くの官能基と反応させるためにＬを適宜設計することができ、例えばアミン、アセテート、チオール、アルコール、エーテル、エステル、ケトン及びカルボキシレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。分子がポリペプチドである幾つかの実施形態では、Ｌはアミド部分として、Ｎ末端、Ｃ末端又はＮ及びＣ末端の両方をキャップすることができる。他の典型的なＬキャッピング部分としては、スルフォンアミド、尿素、チオ尿素及びカルバメートなどが挙げられる。Ｌはまた、直鎖状、分岐鎖状若しくは環状のアルカン、アルケン若しくはアルキン、並びにホスホジエステル部分などであってもよい。Ｌは１つ以上の官能基で置換されてもよく、例えばケトン、エステル、アミド、エーテル、カーボネート、スルフォンアミド又はカルバメート官能基などが挙げられる。また、使用できる具体的なＬとしては、以下のものが挙げられる：
ＮＨ−−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（式中、ｎ＝１〜１０）、−ＮＨ−Ｐｈ−、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎ＝１〜１０）、−ＣＯ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（式中、ｎ＝１〜１０）、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、（式中、ｎ＝１〜１０）、及び−ＣＳ−ＮＨ−。Ｌの更なる例、及びそれらを金属複合体（特にポリペプチドに結合する金属複合体）に組み込むための合成方法は、国際公開公報第０１／０９１８８号、第０１／０８７１２号及び第０３／０１１１１５号に記載されている。幾つかの実施形態では、ジスルフィド結合が利用される。
【０１１９】
スペーサー（Ｓ）は、有機アンテナ部分と金属リガンド部分とを連結することができる。幾つかの実施形態では、Ｓは、金属リガンド部分上のアセテート、アミン又はメチレン官能基を、有機アンテナ部分に連結することができる。当業者であれば、有機アンテナ部分上、及び金属リガンド部分上の多くの官能基と反応させるためにＳを適宜設計することができ、例えばアミン、アセテート、チオール、アルコール、エーテル、エステル、ケトン及びカルボキシレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。Ｓはまた、直鎖状、分岐鎖状若しくは環状のアルカン、アルケン若しくはアルキン、並びにホスホジエステル部分などであってもよい。Ｓは１つ以上の官能基で置換されてもよく、例えばケトン、エステル、アミド、エーテル、カーボネート、スルフォンアミド又はカルバメート官能基などが挙げられる。また、使用できる具体的なＳとしては、以下のものが挙げられる：
ＮＨ−−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（式中、ｎ＝１〜１０）、−ＮＨ−Ｐｈ−、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎ＝１〜１０）、−ＣＯ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（式中、ｎ＝１〜１０）、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、（式中、ｎ＝１〜１０）、及び−ＣＳ−ＮＨ−。
【０１２０】
ドナー及びアクセプター部分
本発明の修飾リガンド結合分子（例えば修飾ＰＢＰ）は、アクセプター部分（例えば蛍光）を含んでもよい。アクセプター部分は、ＲＥＴ又はＴＲ−ＲＥＴベースのアッセイ法でアクセプターとして機能できる。一般的に、アクセプター部分（例えば蛍光）は、必須ではないが、良好な量子収量及び顕著な減衰係数を示すのが望ましく、必須ではないが、衝突の際のクエンチング及びブリーチングに抵抗性を示すのが望ましく、並びに、必須ではないが、当業者に公知の方法に従い、様々なリガンド結合分子（例えばＰＢＰ）と容易に共役できるのが望ましい。適切なフルオロフォアとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：フルオレセイン、ローダミン、ＦＩＴＣｓ（例えばフルオレセイン−５−イソチオシアネート）、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、５，６−カルボキシフルオレセイン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボキサミド、６−クロロ−７−ヒドロキシクマリン−３−カルボキサミド、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート、テトラメチルローダミン−６−イソチオシアネート、５−カルボキシフルオレセインのスクシニミジルエステル、６−カルボキシフルオレセインのスクシニミジルエステル、５−カルボキシテトラメチルローダミン、６−カルボキシメチルローダミン及び７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸。他の適切なフルオロフォアとしては、フルオロフォアのＣｙファミリー（Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、ＧＥヘルスケア社製、チャルフォント通りジャイルズ、英国）、Ａｌｅｘａフルーアファミリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールズバッド、ＣＡ）、ＢＯＤＩＰＹファミリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールズバッド、ＣＡ）、カルボピロニン、スクアリン、シアニン／インドシアニン、ベンゾピリリウムヘテロサイクル、及びアミド架橋ベンゾピリリウムなどが挙げられる。
【０１２１】
蛍光タンパク質及びその変異体を、蛍光アクセプター部分として用いてもよい。例としては、ホタル、細菌又はコメツキムシのルシフェラーゼ、エクオリン及び他の発光タンパク質（例えば米国特許第５，２２１，６２３号、第５，６８３，８８８号、第５，６７４，７１３号、第５，６５０，２８９号及び第５，８４３，７４６号）などが挙げられる。ＧＦＰ及びＧＦＰ変異体は、特にＴｂ（ＩＩＩ）を含む金属複合体を使用した用途において有用である。Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰの様々な変異体が開発されており、それらは改良された輝度、異なるスペクトル特性を有し、また天然のＧＦＰと比較し哺乳動物細胞における発現及びフォールディング能が強化されている（例えば米国特許第６，４１０，２５５号の表７、Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第２章、Ｓｕｌｌｉｖａｎ及びＫａｙ編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ｐ１９〜４７、及び米国特許第５，６２５，０４８号、第５，７７７，０７９号及び第５，８０４，３８７号を参照のこと）。蛍光タンパク質は化学的に結合させてもよく、又は、リガンド結合タンパク質コード領域をエンジニアリングして蛍光タンパク質からなる融合タンパク質を発現させてもよい。蛍光タンパク質は、アクセプター部分、ドナー部分又はそれらの両方として用いてもよい。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、多重アッセイ法に用いられるアクセプター部分（例えば蛍光）は、ＲＥＴ／ＴＲ−ＲＥＴ用途において有用な特徴を示す。ＴＲ−ＲＥＴアプリケーションにおいては、アクセプター部分（例えばフルオロフォア）の吸収スペクトル領域は、ドナー部分（例えば発光金属キレート）の発光スペクトル領域と重複すべきであり、一方、アクセプターの発光スペクトル領域はドナーの放出スペクトル領域と著しく重複すべきではない。例えば、有機アンテナ−Ｔｂ（ＩＩＩ）−キレート含有金属錯体の発光スペクトル領域は、フルオレセイン又はローダミンの発光スペクトルと著しく重複しない。
【０１２３】
Ｔｂ（ＩＩＩ）含有発光金属錯体を使用したＴＲ−ＲＥＴアッセイ用の適切なアクセプターフルオロフォアの例としては、以下のものが挙げられる：フルオレセイン（及びその誘導体）、ローダミン（及びその誘導体）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）、ＢＯＤＩＰＹｓ  ＦＬ、Ｒ６Ｇ及びＴＭＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）、Ｃｙ３及びＣｙ３Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、及びＩＣ３（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。Ｅｕ（ＩＩＩ）を含有する発光金属複合体を使用したＴＲ−ＲＥＴアッセイ法の適切なアクセプターフルオロフォアの例としては、以下のものが挙げられる：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ５９４、６１０、６３３、６４７及び６６０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）、ＢＯＤＩＰＹｓ  ＴＲ、６３０／６５０及び６５０／６６５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）、Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）及びＩＣ５（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）。いかなる種に由来する蛍光タンパク質も、適切なアクセプターとして機能しうる。例えば、野生型（天然若しくは組換え型）若しくは変異型のＡｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）又は黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）が挙げられる。本発明に用いられる適切なフルオロフォアは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールズバッド、ＣＡ、Ａｔｔｏｔｅｃ（ドイツ））、Ａｍｅｒｓｈａｍ社及びＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ノヴァト、ＣＡ）から市販されている。フルオロフォアをタンパク質に導入する方法は当業者に公知であり、例えば米国特許第５，８９８，０６９号及び第６，４１０，２５５号などに記載されている。
【０１２４】
幾つかの実施形態では、アクセプター部分はＧＦＰでない。幾つかの実施形態では、アクセプター部分はエクオリンタンパク質でない。幾つかの実施形態では、アクセプター部分はタンパク質でない。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、ドナー部分はＧＦＰでない。幾つかの実施形態では、ドナー部分はエクオリンタンパク質でない。幾つかの実施形態では、ドナー部分はタンパク質でない。
【０１２６】
ＲＥＴ及びＴＲ−ＲＥＴ
本発明の幾つかの実施形態では、ドナー部分（例えば発光金属キレート）及びアクセプター部分（例えば蛍光部分）との間の共鳴エネルギー転移を利用する。幾つかの実施形態では、ドナー発光金属キレートは、適当な波長及び強度の光（例えばドナーのアンテナ部分の励起スペクトル）によって、またアクセプターフルオロフォアへの直接的な励起が最小となる条件下で励起される。ドナー部分（例えば発光キレート）は更に吸収したエネルギーを（例えば非放射的に）アクセプター部分（例えば蛍光）へ転移させ、更に、例えば１つ以上の特徴的な波長の蛍光放出として、吸収されたエネルギーの一部を再放出する。ＴＲ−ＲＥＴアプリケーションにおいては、再放出された放射線は、バックグラウンド蛍光、光散乱又はマイクロタイタープレートに使用されるプラスチックによって生じるような他の発光を減衰させるのに要する適切な遅延時間（例えば２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、２５〜３００、２５〜１５０、１００〜３００又は１００〜２００マイクロ秒）の後までは測定されない。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、ＲＥＴは、ドナー部分（例えば発光金属錯体）からの発光のシグナルの強度の減少、及び／又は、アクセプター（例えば蛍光）部分からの蛍光の放射の増加として観察することができる。幾つかの実施形態では、ＲＥＴの効率は、発光金属錯体とアクセプター蛍光部分との分離距離及び／又は配向、ドナー金属イオンの発光の量子収量、アクセプター蛍光部分とのスペクトルの重なり、及びドナーの発光スペクトルと重複する波長におけるアクセプターフルオロフォアの減衰係数、に依存する。フォースターは、以下の関係式を導き出した：
Ｅ＝（Ｆ°−Ｆ）／Ｆ°＝Ｒｏ６／（Ｒ６＋Ｒｏ６）
（式中、ＥはＲＥＴ効率であり、Ｆ及びＦ°は各々、アクセプターの存在及び不在におけるドナーの蛍光強度であり、Ｒはドナーとアクセプターとの間の距離である）。Ｒｏ（エネルギー転移効率が最大の５０％となる距離（単位：Å））は、以下の式で表される：
Ｒｏ＝９．７９×１０３（Ｋ２ＱＪｎ−４）１／６
（式中、Ｋ２は自由に移動できるドナー及びアクセプターの配向因子であり、約０．６７の平均値を有し、Ｑはクエンチされていない蛍光ドナーの量子収量であり、ｎは介在する媒体の屈折率であり、Ｊは重なり積分であり、定量的であり、スペクトル重なりの程度を表す）。ＲＥＴが５０％効率となる特徴的な距離Ｒｏは、ドナーの量子収量、アクセプターの減衰係数、ドナーの発光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルとのオーバーラップ部分、及び２つのフルオロフォア間の配向因子に依存する。
【０１２８】
ＲＥＴの強度の変化は、ドナー及びアクセプター部分からの発光／蛍光量の比率変化の関数として決定することができ、そのプロセスは「比率決定」と称される。比率を算出することにより、アッセイ法は例えば、基質濃度のウェル間変動、フォトクエンチング及び励起強度の影響を受けにくくなり、それによりアッセイ感度が向上する。これは、得られるデータの質がその後の分析及び解釈にとって重要である、自動化スクリーニング用途で特に重要である（例えば米国特許第６，４１０，２５５号、第４，８２２，７３３号、第５，５２７，６８４号及び第６，３５２，６７２号を参照）。
【０１２９】
例えば、上記方法の幾つかの実施形態では、比率に基づく分析を実施し、その際、試験サンプル及びコントロールサンプル間の、２つの異なる波長における発光／蛍光放出の比率が比較される。典型的なＴＲ−ＲＥＴ−ベースのアッセイ法においては、上記２つの波長は、発光金属錯体及び蛍光アクセプター部分の最大発光に対応しうる。幾つかの実施形態では、コントロールサンプルの放出比率は、試験サンプルの放出比率よりも、約１．５、２、３、４、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１．５〜１００、１．５〜２５、１０〜４０、２０〜１００、１．５〜１００又は５０〜１００倍大きいか、又は小さい。
【０１３０】
リガンド検出アッセイ法
本発明では、幾つかのリガンド結合分子（例えばＰＢＰｓ）を用いて、あらゆる酵素活性、又はリガンド（例えばホスフェート）を生じさせるか又は消費するあらゆる反応が測定でき、当該酵素としては例えばホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ（例えば共役反応）、ホスホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、ＧＴＰアーゼ及びプレニルトランスフェラーゼ（例えばカップリング反応）などが挙げられる。したがって、本発明の幾つかの実施形態は、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ（例えば共役反応／アッセイ法）、ホスホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、ＧＴＰアーゼ、プレニルトランスフェラーゼ（例えば共役反応／アッセイ法）を伴うアッセイ法を提供する。幾つかの実施形態では、本発明の修飾ＰＢＰを用いて、直接的な生成物であるか、又は目的の反応（例えばホスファターゼ反応）によって直接消費されるホスフェートを測定する。幾つかの実施形態では、本発明の修飾ＰＢＰｓを用いて、目的の反応（例えばホスファターゼ反応と共役するキナーゼ反応（図１））の間接的な生成物であるか、又は間接的に消費されるホスフェートを測定する。
【０１３１】
本特許出願は、様々な方法、アッセイ法及びアッセイフォーマットの例を開示する。当業者であれば、本願明細書の教示に基づき、他の様々なフォーマット、アッセイ法及び組み合わせを容易に認識するであろう。本発明は、これらの実施形態を包含し企図するものである。例えば、ＰＢＰは本願明細書において例えばリガンド結合分子の例として用いられ、本願明細書に記載されているＰＢＰを用いた上記アッセイ法及びアッセイフォーマットは、他のリガンド結合分子のために利用できる。
【０１３２】
本発明の一態様では、以下の段階からなる、サンプル中のホスフェートを検出する方法が提供される：
（ａ）ＦＲＥＴペアのドナー及びアクセプター部分を含む修飾リガンド結合タンパク質（例えばＰＢＰ）とサンプルとを接触させる段階と、
（ｂ）ドナー部分を励起する波長の光で（ａ）を曝露する段階と、
（ｃ）アクセプター部分から発されるエネルギー（例えば光）を検出する段階。
一実施形態では、上記方法は、ドナー及びアクセプター部分から発されるエネルギー（例えば光／蛍光）を検出する段階を更に含む。幾つかの実施形態では、ドナー部分とアクセプター部分とから発する光間でレシオメトリックを算出することができる。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、ホスファターゼアッセイ法ではホスフェートの放出がなされ、それは更に本発明の修飾ＰＢＰ又は他のリガンド結合分子を使用して検出及び測定することができ、それにより、直接的なホスファターゼ活性の測定及び／又は検出が可能となる。本発明の実施形態を、直接ホスフェートを放出又は消費する反応において、又はホスフェートを生成又は消費する他の反応と共役しうる反応において使用することができる。
【０１３４】
幾つかの実施形態では、上記のアッセイ法は共役アッセイ法である。例えば、キナーゼアッセイ法により、タンパク質のリン酸化を生じさせてもよい。更に、そのリン酸化されたタンパク質からホスフェートを除去するホスファターゼを利用し、更に本発明の修飾ＰＢＰを、例えば除去されたホスフェートの検出及び／又は測定に利用し、それにより間接的にキナーゼ活性を測定及び／又は検出することが可能となる（図１Ｂを参照）。
【０１３５】
本発明の他の実施形態は、共役型のホスホジエステラーゼアッセイ法を提供する。例えば、ｃＡＭＰをホスホジエステラーゼによりＡＭＰに変化させる。更にＡＭＰを、適当なホスファターゼの使用によりアデノシン及びホスフェートに変化させる。ホスフェートを更に、本発明の修飾ＰＢＰを使用して検出する（例えば共役ホスホジエステラーゼアッセイ法を図示する図１Ａを参照）。例えば、上記の共役ホスホジエステラーゼアッセイ法を用いて、ホスホジエステラーゼ酵素の量若しくは活性を測定するか、又はサンプル中のｃＡＭＰの量を測定することができる。
【０１３６】
以上より、本発明の方法及びアッセイ法は、様々な化合物、反応又はイベントの測定又は検出に利用できる。
【０１３７】
本発明の一態様では、反応の進行をモニターする方法が提供される。本発明のリガンド結合タンパク質は、リガンドの結合及び／又は放出に応じて検出可能な変化を示すことができる。これらの変化は、反応のモニターに利用できる。上記の反応は、サンプル中又は反応におけるリガンドの生成又は減少に関与しうるものである。リガンドの濃度は通常、リアルタイム（例えば動態的測定）で、又は通常ある期間後の時点若しくはエンドポイントとして測定できる。本発明のリガンド結合分子を、特異的なリガンドをモニター、検出又は定量する目的の反応に直接添加できる。例えば、本発明のリガンド結合分子（例えばＰＢＰ）を、ホスファターゼ反応に（例えば反応の開始時に）直接添加することができる。幾つかの実施形態では、リガンド（例えばホスフェート）の濃度を、反応において直接測定できる。幾つかの実施形態では、反応アリコートを、所望の時点で取り出し、リガンド濃度及び／又は量を測定する。幾つかの実施形態では、本発明のリガンド結合分子を、反応の開始又は停止の後で反応液と接触させ、リガンドの濃度及び／又は量を測定する。幾つかの実施形態では、本発明に係る複数のリガンド結合分子を利用して、１又は複数のリガンドの濃度をモニターする。
【０１３８】
本発明のリガンド結合分子の使用により、反応及び／又はリガンド濃度の測定及び／又はモニタリングが可能となる。本発明のリガンド結合分子は、多くのタイプの測定、例えばリアルタイム（動態的測定）で、あるいは時点又はエンドポイントとして用いることができる。典型的には、リアルタイム若しくは動態的測定は、モニターされる反応液と、本発明のリガンド結合分子とを接触させることにより実施される。例えば、リガンド結合分子を、例えば反応開始時に反応混合物に添加する。次に所望の時点において直接反応液を測定する。他の方法としては、反応液から（例えば所望の時点において）アリコートを取り出し、本発明のリガンド結合分子を使用してリガンド濃度を測定する方法が挙げられる。本発明の具体的な実施形態を使用すれば、上記方法では反応時間が短いため、生物学的システムの動態学に従うことができる。
【０１３９】
ホスファターゼが関与する共役アッセイ法に関連する幾つかの実施形態では、ホスファターゼが基質分子に対して最小の活性を示し、生成物分子に対して高い活性を示すのが望ましい。例えば、キナーゼアッセイ法では、ホスファターゼはリン酸化される基質に対して最小の活性を示し、それがキナーゼによってリン酸化されたあと、ホスファターゼは基質に対してより高い活性を示すのが望ましい。幾つかの実施形態では、ホスファターゼはＡＴＰに対して最小の活性を示すのが望ましく、かかるホスファターゼは文献により公知となっている（例えばＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９７８），１９１（２），６１３−６２４）。本発明の幾つかの実施形態では、上記ホスフェートセンサーは基質の存在に無感受性であるのが望ましい。
【０１４０】
本発明の幾つかの方法では、例えば、アッセイ法において定量的及び／又は定性的な測定を行うために、コントロール反応を用いる方法も含まれる。幾つかの実施形態では、反応の結果を、以前のアッセイ法における結果と比較し、サンプルのアッセイ法と同時にコントロール反応の実施はしない。コントロール反応としては、限定されないが、アッセイ法又は反応の成分を除去した反応、及び既知量の成分を含む反応（例えば陽性コントロール及び／又は定量的測定）などが挙げられる。コントロール反応としては、全てではないが幾つかの反応成分を添加し、反応を測定し、更に残りの成分を添加し、反応を進行させ、更に反応を測定することも挙げられる。例えば、本発明のリガンド結合分子を使用してリガンドを測定するアッセイ法においては、リガンドを含むサンプルを除く全ての成分を添加する。更に、測定値を、例えば陰性コントロール及び／又はベースライン値として記録する。更にリガンドを添加し、更に（例えば一定時間後に）リガンドの量に関連する測定を実施する。
【０１４１】
幾つかの実施形態では、「ホスフェートモップ（ｍｏｐ）」はホスフェートのバックグラウンドレベルを低下させ及び／又は徐々にホスフェート結合タンパク質からホスフェートを除去するために用い、それにより、アッセイシステムに放出する可能性のあるホスフェート（例えばＰｉ）を検出できるように、結合部位をフリーの状態にする。これにより、修飾ＰＢＰによるホスフェート結合が一時的なものであることが確保されうる。永続的な結合が形成されることは、全てのホスフェート結合タンパク質の結合部位が占領され（例えば飽和され）てしまうために、アッセイシステムの利用寿命の短期化にもつながりうる。一実施形態では、ホスフェートモップは酵素的なシステムである。幾つかの実施形態では、７−メチルグアノシン及びプリンヌクレオシドのホスホリラーゼシステムが利用される。幾つかの実施形態では、ＭＥＳＧ（２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンリボヌクレオシド）が利用される。幾つかの実施形態では、リン酸デオキシリボムターゼの添加を伴う、７−メチルグアノシンベースの反応の変更バージョンを利用する。
【０１４２】
本発明の別の態様は、疾患の診断のためのリガンド（例えばＰｉなどのホスフェート）の測定に用いられる、本発明に係る修飾リガンド結合タンパク質（例えばホスフェート結合タンパク質）を提供する。本発明の幾つかの実施形態を用いて、ヒト又は動物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの診断方法において、ホスフェート（例えばＰｉ）又は他のリガンドの測定を行ってもよい。
【０１４３】
本発明の多くの方法では、リガンド結合分子（例えば修飾リガンド結合分子）からのＲＥＴの測定を行う。その際、ＲＥＴの量は、リガンドの結合したリガンド結合分子と、結合しないそれとの間で異なる。本発明の一実施形態では、
（ａ）リガンド結合分子（例えば修飾リガンド結合分子）を溶液に添加し、
（ｂ）ＲＥＴを測定し、
（ｃ）試験サンプルを溶液に添加し、かつ
（ｄ）ＲＥＴを測定する。
幾つかの実施形態では、（ｂ）で測定されるＲＥＴを、（ｄ）のそれと比較し、試験サンプル中のリガンドの存在（存在する場合）を測定する。幾つかの実施形態では、（ｃ）の試験サンプル溶液を一定時間インキュベートし、試験サンプル中の任意のリガンドに対して、リガンド結合分子（例えば修飾リガンド結合分子）を結合させる。幾つかの実施形態では、（ｄ）において、複数の時点でＲＥＴを測定（例えばリアルタイムアッセイ法を実施）する。
【０１４４】
本発明の幾つかの実施形態では、以下を含む方法を提供する：
（ａ）試験サンプル及びリガンド結合分子（例えば修飾リガンド結合分子）を含む第１の溶液と、
（ｂ）リガンド結合分子（例えば修飾リガンド結合分子）及び既知濃度のリガンドを含む少なくとも１つのコントロール反応液と、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方のＲＥＴを測定する段階。
（ｂ）の「既知濃度」とは、リガンド不含有を含むいかなる濃度であってもよい。幾つかの実施形態では、（ａ）において測定されるＲＥＴを、（ｂ）において測定されるＲＥＴと比較する。幾つかの実施形態では、上記の方法は複数のコントロールサンプル（各々様々な既知量のリガンドを含有する）を使用する。（ａ）のリガンドの濃度は、（ａ）で測定されたＲＥＴと、複数のコントロールサンプルに関して測定されたＲＥＴとを比較することにより、例えば複数のコントロールサンプルから作成される標準曲線を用いて決定することができる。幾つかの実施形態では、（ｃ）では複数の時点におけるＲＥＴ測定（例えばリアルタイムアッセイ法）を行う。幾つかの実施形態では、（ａ）及び（ｂ）を一定時間インキュベートし、試験サンプル中の任意のリガンドにリガンド結合分子を結合させる。
【０１４５】
本発明の多くの方法では、修飾リガンド結合分子（例えばＰＢＰ）からのＲＥＴの測定を行う。その際、ＲＥＴの量は、リガンド（例えばホスフェート）が結合した修飾リガンド結合分子（例えばＰＢＰ）と、結合しないそれとの間で異なる。本発明の一実施形態では、
（ａ）修飾リガンド結合分子を溶液に添加し、
（ｂ）ＲＥＴを測定し、
（ｃ）試験サンプルを溶液に添加し、かつ
（ｄ）ＲＥＴを測定する。
幾つかの実施形態では、（ｂ）で測定されるＲＥＴを、（ｄ）のそれと比較し、試験サンプル中のリガンド（例えばホスフェート）の存在（存在する場合）を測定する。幾つかの実施形態では、（ｃ）の試験サンプル溶液を一定時間インキュベートし、試験サンプル中の任意のリガンドに修飾リガンド結合分子（例えばＰＢＰ）を結合させる。幾つかの実施形態では、（ｄ）において、複数の時点でＲＥＴを測定（例えばリアルタイムアッセイ法を実施）する。
【０１４６】
本発明の幾つかの実施形態では、以下を含む方法を提供する：
（ａ）試験サンプル及び修飾リガンド結合分子（例えばＰＢＰ）を含む第１の溶液と、
（ｂ）修飾リガンド結合分子（例えばＰＢＰ）及び既知濃度のリガンド（例えばホスフェート）を含む少なくとも１つのコントロール反応液と、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方のＲＥＴを測定する段階。
（ｂ）の「既知濃度」とは、リガンド不含有を含むいかなる濃度であってもよい。幾つかの実施形態では、（ａ）において測定されるＲＥＴを、（ｂ）において測定されるＲＥＴと比較する。幾つかの実施形態では、上記の方法は複数のコントロールサンプル（各々様々な既知量のリガンドを含有する）を使用する。（ａ）のリガンド（例えばホスフェート）の濃度は、（ａ）で測定されたＲＥＴと、複数のコントロールサンプルに関して測定されたＲＥＴとを比較することにより、例えば複数のコントロールサンプルから作成される標準曲線を用いて決定することができる。幾つかの実施形態では、（ｃ）では複数の時点におけるＲＥＴ測定（例えばリアルタイムアッセイ法）を行う。幾つかの実施形態では、（ａ）及び（ｂ）を一定時間インキュベートし、試験サンプル中の任意のリガンド（例えばホスフェート）に修飾リガンド結合分子（例えばＰＢＰ）を結合させる。
【０１４７】
本願明細書に記載のように、比率測定による測定値を、本発明の幾つかの方法／アッセイ法に利用できる。一実施形態では、ドナー及びアクセプター部分の放出（例えば光の特性又は波長帯）を比較することによって比率測定を実施する。
【０１４８】
幾つかの実施形態では、ドナー部分の放出のみを測定する。（例えばホスフェート結合により）ＲＥＴが変化した場合、ドナー部分から顕著な放出が見られる。理論的な考察に拘束される訳ではないが、ＲＥＴの変化により、ドナー部分からの検出可能な放出も変化しうる。なぜなら、ＲＥＴが増加する場合に、より多くのエネルギーがドナーからアクセプターに転移（例えばドナーのクエンチング）するため、ドナーからの検出可能なエネルギー（例えば光）の直接放出が減少するからである。逆にＲＥＴが減少した場合、ドナーからアクセプターへのエネルギー転移が減少するため、ドナーからの検出可能なエネルギー（例えば光）の直接放出が増加する。
【０１４９】
幾つかの実施形態では、発光標準化合物をサンプルに添加して、分析物に特異的なシグナルを標準化合物のそれと比較するか、又は標準化合物とセンサーとからのシグナルと比較してもよい。幾つかの実施形態では、発光標準化合物は、発光テルビウムキレート又はクリプテートであってもよい。幾つかの実施形態では、発光標準化合物は、発光ユウロピウムキレート又はクリプテートであってもよい。標準フルオロフォアをサンプルに添加し、内部キャリブレータとするためのストラテジーは文献に記載されている（Ａｓｔｉｌｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３：１５５４−１５５７（１９８７））。
【０１５０】
本発明のアッセイ法及び方法は、様々なフォーマットからなってもよい。本発明の幾つかのアッセイ法及び方法は、「コントロール」を任意に含んでもよい。この態様では、コントロールは例えば、標準として用いられる、特徴が既知の、又は特徴が未知のサンプルであってもよい。上記コントロールは、複数のサンプルを含んでもよく、又は単一のサンプルのみを含んでもよい。幾つかの実施形態では、上記方法は、標準曲線の作成に使用し、試験サンプル中の化合物の濃度を測定することができる複数のコントロールを含んでもよい。幾つかの実施形態では、１つ以上のコントロール反応を、別の反応容器（例えばチューブ、ウェルなど）において実施してもよい。幾つかの実施形態では、１つ以上のコントロール反応を、試験反応容器と同じ容器において実施してもよい。例えば、ウェル中に、試験化合物を除く全てをロードし、ＲＥＴ測定を例えば陰性コントロールのウェルとして記録してもよい。次に試験化合物をウェルに添加し、その後ＲＥＴ測定値を記録する。幾つかの実施形態では、コントロールウエル又は容器を、試験反応／サンプルとは別に設ける。例えば、１枚のプレート（例えば９６穴プレート）に、様々な濃度（例えば既知濃度）の検出対象化合物（例えばホスフェート、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホジエステラーゼなど）を有する幾つかのウェルを準備してもよい。他のウェル又はウェルのセットには、検出対象化合物を含有させなくてもよい。他のウェル又はウェルのセットには、試験反応液（未知濃度の例えば検出対象化合物を含む）を添加することができる。
【０１５１】
本発明の幾つかのアッセイ法、反応及び方法では、リガンド結合分子（例えば修飾リガンド結合分子）又はＰＢＰ（例えば修飾型）の濃度は、約０．１ｎＭ〜１００ｎＭ、約１ｎＭ〜１０ｎｍ、約５ｎＭ、約７ｎＭ又は約２ｎＭである。幾つかの実施形態では、検出モードをＴＲ−ＦＲＥＴ（例えばハイスループットスクリーンにおいてホスフェートを検出する方法の提供）とする。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、本願明細書に記載のように、例えばホスフェートベースのアッセイ法に対する試験化合物の影響を測定するためのアッセイ法を含む。これらのアッセイ法は、ホスフェート（例えばＰｉ）を直接生成するか若しくは減少させるものであってもよく、又はホスフェート濃度を上昇させるか若しくは低下させるアッセイ法と組み合わせてもよい。
【０１５２】
本発明の修飾リガンド結合分子（例えばＰＢＰ）はまた、リガンド（例えばホスフェート）に関連する反応のモジュレータを同定するための試薬、方法及びアッセイ法を提供する。本発明の修飾リガンド結合分子（例えばＰＢＰ）はまた、リガンド（例えばホスフェート）に関連する反応における調節及び／又は変化を測定するための試薬、方法及びアッセイ法を提供する。ホスフェート関連の反応としては、限定されないが、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼが関与する反応、並びにホスフェート（例えばＰｉ）を産生、除去又は消費する他のいかなる反応が挙げられる。
【０１５３】
本発明の一実施形態は、化合物又はサンプルのキナーゼ活性の測定方法を提供し、当該方法は、
ａ）化合物又はサンプルと、キナーゼ活性のためのリン酸化基質を接触させる段階と、
ｂ）（ａ）と、化合物又はサンプル中のキナーゼ活性によって内生的に生じるホスフェートを除去できるホスファターゼとを接触させる段階と、
ｃ）（ｂ）と、ＲＥＴペアを含む修飾ＰＢＰとを接触させる段階と、
ｄ）ＲＥＴを測定する段階と
を含む。幾つかの実施形態では、（ｃ）を、ドナー部分を励起する１つ以上の波長の光に曝露する。幾つかの実施形態では、（ａ）（ｂ）及び（ｃ）を同時に実施する。例えば、化合物、リン酸化基質、リン酸化基質を脱リン酸化できるホスファターゼ及び修飾ＰＢＰを含む１つの溶液を用いる。この溶液を一定時間インキュベートし、更にＲＥＴを測定する。他の実施形態では、ＲＥＴを、リアルタイム又は動態的測定として測定する。幾つかの実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又はそれらのあらゆる組み合わせにおいて、ホスフェートモップ（ｍｏｐ）を使用する。幾つかの実施形態では、化合物のキナーゼ活性の潜在的モジュレータを、（ａ）に含ませてもよい。それにより、キナーゼ活性の潜在的モジュレータを、本発明の方法を利用してスクリーニング若しくは決定できる。幾つかの実施形態では、ＲＥＴを、（ａ）及び／又は（ｂ）において測定する。更にコントロール反応を、同じフォーマットで設定してもよい。コントロール反応は典型的には、反応に関与する特定の成分が既知量で含有される。
【０１５４】
本発明の一実施形態は、化合物又はサンプルのキナーゼ活性の測定方法を提供し、当該方法は、
ａ）化合物又はサンプルと、キナーゼ活性のためのリン酸化基質と、化合物又はサンプルのキナーゼ活性によって内生的に生じたホスフェートを除去できるホスファターゼと、ＲＥＴペアを含む修飾ＰＢＰとを含む溶液と、
ｂ）ＲＥＴを測定する段階と
を含む。この溶液を一定時間インキュベートし、更にＲＥＴを測定する。他の実施形態では、リアルタイム又は動態的測定としてＲＥＴを測定する。幾つかの実施形態では、（ａ）においてホスフェートモップを含有させる。幾つかの実施形態では、化合物のキナーゼ活性の潜在的モジュレータを、（ａ）において含有させてもよい。それにより、キナーゼ活性の潜在的モジュレータを、本発明の方法を利用してスクリーニング若しくは決定できる。更にコントロール反応を、同じフォーマットで設定してもよい。コントロール反応は典型的には、反応に関与する特定の成分が既知量で含有される。
【０１５５】
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）とは、リン酸ジエステル結合の加水分解を触媒する酵素である。ＰＤＥは、環状のヌクレオチドであるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの分解に関与する。ゆえにそれらは、当該分子により媒介されるシグナル伝達の重要な調節物質である。ＰＤＥの阻害剤は、これらの環状ヌクレオチドにより媒介される生理的プロセスの効果を長期化するか又は強化しうる。
【０１５６】
本発明の一実施形態は、化合物又はサンプルのホスホジエステラーゼ活性の測定方法を提供し、当該方法は、
ａ）化合物又はサンプルと、ホスホジエステラーゼ基質（例えばｃＡＭＰ）とを接触させる段階と、
ｂ）（ａ）と、ホスフェート（基質上のリン酸ジエステル結合の一部ではない）を除去できるホスファターゼとを接触させる段階と、
ｃ）（ｂ）と、ＲＥＴペアを含む修飾ＰＢＰとを接触させる段階と、
ｄ）ＲＥＴを測定する段階と
を含む。幾つかの実施形態では、（ｃ）を、ドナー部分を励起する１つ以上の波長の光に曝露する。幾つかの実施形態では、（ａ）（ｂ）及び（ｃ）を同時に実施する。例えば、化合物又はサンプル、ホスホジエステラーゼ基質、ホスファターゼ及び修飾ＰＢＰを含む１つの溶液を用いる。一実施形態では、この溶液を一定時間インキュベートし、更にＲＥＴを測定する。他の実施形態では、ＲＥＴを、リアルタイム又は動態的測定として測定する。幾つかの実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又はそれらのあらゆる組み合わせにおいて、ホスフェートモップ（ｍｏｐ）を使用する。幾つかの実施形態では、化合物のホスホジエステラーゼ活性の潜在的モジュレータを、（ａ）に含ませてもよい。それにより、ホスホジエステラーゼ活性の潜在的モジュレータを、本発明の方法を利用してスクリーニング若しくは決定できる。幾つかの実施形態では、ＲＥＴを、（ａ）及び／又は（ｂ）において測定する。更にコントロール反応を、同じフォーマットで設定してもよい。コントロール反応は典型的には、反応に関与する特定の成分が既知量で含有される。
【０１５７】
本発明はまた、リガンド結合分子及びリガンドと化合物との競合結合を測定及び／又は検出するための方法を提供する。例えば、本発明に記載のように、修飾リガンド結合分子を用いて、リガンドとの結合を検出することができる。更に、本発明のアッセイ法及び方法にある化合物含み、その化合物が、リガンドとリガンド結合分子との結合のモジュレータか否かを決定することができる。例えば、ある化合物がリガンド結合分子とリガンドとの結合を調節するか否か（例えば阻害するか又は促進する）を決定する際に好適である。上記化合物は、本発明のリガンド結合分子及びリガンドを含む反応液に添加することができる。幾つかの実施形態では、上記の調節は、当該化合物を含む反応液のＲＥＴと、非存在下でのそれとを比較することにより検出する。幾つかの実施形態では、ＲＥＴの差異を用いて、上記化合物がモジュレータか否かを決定することができる。複数の化合物を一度に（例えば１つの反応液で）試験してもよく、又は各化合物に関して別々の反応液で試験してもよい。更に本発明は、リガンド結合分子とリガンドとの結合を調節するための化合物（例えばライブラリ）のスクリーニングのための方法及びアッセイ法の提供に関する。更に本発明は、リガンド結合分子と結合する化合物（例えばライブラリ）のスクリーニングのための方法及びアッセイ法を提供する。換言すれば、必ずしも、上記化合物がリガンド結合分子とリガンドとの結合を調節するか否かを決定するのではなく、上記化合物がそれ自体、例えば周知のリガンドと同様の方法でリガンド結合分子と結合ができるか否かを決定する。
【０１５８】
本発明の一実施形態は、化合物又はサンプルのホスホジエステラーゼ活性の測定方法を提供し、当該方法は、
ａ）化合物又はサンプル、ホスホジエステラーゼ基質（例えばｃＡＭＰ）、ホスフェート（すなわち基質上のリン酸ジエステル結合のもはや一部でない）を除去できるホスファターゼ、及びＲＥＴペアからなる修飾ＰＢＰを接触させる段階と、
ｂ）ＲＥＴを測定する段階と
を含む。この溶液を一定時間インキュベートし、ＲＥＴを測定する。他の実施形態では、ＲＥＴをリアルタイムで、又は動態的測定として測定する。幾つかの実施形態では、（ａ）においてホスフェートモップを含ませる。幾つかの実施形態では、化合物のホスホジエステラーゼ活性の潜在的モジュレータを、（ａ）において含ませてもよい。従って、ホスホジエステラーゼ活性の潜在的モジュレータを、本発明の方法を利用してスクリーニングするか又は決定することができる。更に、コントロール反応を、同じフォーマットで設定してもよい。コントロール反応は典型的には、反応に関与する既知量の特定の成分を含有する。
【０１５９】
以下の実施例のセクションでは、ホスフェート結合分子及びリガンド結合分子の例として、ＰＢＰを記載する。本発明は、本発明の幾つかの実施形態に適合する唯一のリガンド結合分子として、ＰＢＰに限定することを目的とするものではい。リガンドの結合及び／又は放出に応じて高次構造変化し、検出可能な部分によって直接的及び／又は間接的に標識することができ、検出可能なシグナルがリガンドの結合及び／又は放出に応じて変化するあらゆるホスフェート又はリガンド結合分子も使用することができる。
【０１６０】
あたかも個々の刊行物、特許公報又は特許出願明細書が、具体的かつ個別的に本願明細書に取り込まれたかのように、本明細書において記載される全ての刊行物、特許公報及び特許出願明細書は、参照により本願明細書に援用される。
【０１６１】
実施例
本発明を、以下の実施例を参照しながら説明する。これらの実施例は例示のみを目的とするものであり、本発明はこれらの実施例に限定して解釈されるべきではない。むしろ、本願明細書に提供される教示の結果自明となるあらゆるバリエーションが包含されるものと解釈されるべきである。
【０１６２】
本発明の様々な具体的実施形態が説明のため本願明細書に記載されているが、詳細な多数のバリエーションが、添付の特許請求の範囲に記載に基づき、本発明から逸脱することなく実施できることは当業者にとり自明である。
【０１６３】
実施例１：修飾ＰＢＰであるＯＧ−ＰＢＰ−Ｔｂ及びＲｄ−ＰＢＰ−Ｔｂの調製
文献公知（Ｂｒｕｎｅら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，８２６２−８２７１、Ｂｒｕｎｅら、（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，１０３７０−１０３８０）の方法に従い、ホスフェート結合タンパク質（ＰＢＰ）変異体Ａ１９７Ｃを調製することができた。ＤＭＦ中の２μＬの２０ｍＭのオレゴングリーン（登録商標）４８８ヨードアセトアミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ＃  Ｏ６０１０）又はＤＭＳＯ中の２０ｍＭのローダミンレッド（登録商標）Ｃ２マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ＃  Ｒ６０２９）を、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）中の５０μＬのＰＢＰ  Ａ１９７Ｃに、２００μＭ  ７−メチルグアノシン及び０．２ユニット／ｍＬ  プリンヌクレオシドホスホリラーゼの存在下で添加し、室温で１時間インキュベートした。反応生成物を更に、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）を用いて、基本的に製造業者のプロトコルに従い、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥヘルスケア社）で脱塩し、１ｍＬの体積となるように回収し、更に一晩１００ｍＭの重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）で透析した。生成物を更に、それぞれ、オレゴングリーン及びローダミン標識形態として、２３μＬ及び１２μＬとなるまでＭｉｃｒｏｃｏｎ−５０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で濃縮し、更に各々の濃度を、６０，８８０Ｍ−１ｃｍ−１の減衰係数を使用して推定した。１つの実験において、オレゴングリーン及びローダミン標識された形態の濃度はそれぞれ、１６６μＭ及び２７６μＭであった。
【０１６４】
３倍のモル過剰のＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ａｍｉｎｅ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔｂ  Ｃｈｅｌａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ＃  ＰＶ３５８２）を、調製直後の１００ｍＭの重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）の５ｍｇ／ｍＬストックとして、各々添加した。反応液を室温で２時間インキュベートした。反応生成物を更に、２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２を用いて、基本的に製造業者のプロトコルに従い、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥヘルスケア社）で脱塩した。オレゴングリーン及びローダミン標識された形の反応生成物をそれぞれ、ＯＧ−ＰＢＰ−Ｔｂ及びＲｄ−ＰＢＰ−Ｔｂと称する。
【０１６５】
この実施例では、２つの異なるＴＲ−ＦＲＥＴベースのホスフェートセンサー（ＯＧ−ＰＢＰ−Ｔｂ及びＲｄ−ＰＢＰ−Ｔｂ）を、大腸菌ホスフェート結合タンパク質（ＰＢＰ）（配列番号：２）の蛍光標識形態に基づいて調製した。それらは一部位変異ＰＢＰ  Ａ１９７Ｃに基づくものであった。両方ともホスフェートに反応し、ＴＲ−ＦＲＥＴの増加を示した。
【０１６６】
実施例２：変異センサーＡ４７Ｃ／Ａ１９７Ｃ、Ａ１９７Ｃ／Ｅ２６８Ｃ及びＱ２０１Ｃの調製
この実施例では、第一のセンサーが修飾ＰＢＰ  Ａ４７Ｃ／Ａ１９７Ｃに基づき、第二が修飾ＰＢＰ  Ａ１９７Ｃ／Ｅ２６８Ｃに基づき、第三が修飾ＰＢＰ  Ｑ２０１Ｃに基づく。
【０１６７】
ＰＢＰ  Ａ１９７Ｃをコードする発現用プラスミドを、部位特異的変異導入により修飾し、二重変異体ＰＢＰ  Ａ４７Ｃ／Ａ１９７Ｃ及びＰＢＰ  Ａ１９７Ｃ／Ｅ２６８Ｃ及び一重変異体Ｑ２０１Ｃをコードするプラスミドを得た（Ｂｒｕｎｅら、（１９９４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，８２６２−８２７１）。ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞をプラスミドで形質転換し、テトラサイクリン（１２．５ｕｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天プレートで選抜した。テトラサイクリン（１２．５ｕｇ／ｍＬ）を含有する１０ｍＬのＬＢ培地に、プレート上のコロニーを接種し、２５０回転／分で３７℃で６時間培養した。一晩培養したこれらの培養液５ｍＬを更に、５０ｍＬの培地に接種し、２５０回転／分で３７℃で６時間、同じ培地で培養した。５０ｍＬの培養組織のうちの１０ｍＬを用いて、添加物（１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、２ｇ／Ｌのグルコース、０．２ｍＭのＣａＣｌ２、１０μＭのＦｅＳＯ４、０．２ｍＭのＭｇＳＯ４及び１０ｍｇ／Ｌのチアミン）及び６４０μＭのＫＨ２ＰＯ４を含有する５００ｍＬのＴＧ最少培地（１２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、８０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、２０ｍＭのＫＣｌ及び３ｍＭのＮａ２ＳＯ４）に接種した。これらの５００ｍＬの培養液を約６時間培養し、ＯＤ５９５＝約２となるまで増殖させ、遠心分離してペレット化し、細胞を同じ培地（但し、６４μＭ  ＫＨ２ＰＯ４を含まない）を用いて再懸濁した。培養液を更に、２５０回転／分で、３７℃で約１６時間培養した。
【０１６８】
細胞を遠心分離してペレットを回収し、−８０℃で保存し、培地を廃棄した。５００ｍＬの培養液からの細胞ペレットを、２０ｍＬの緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．２）、１ｍＭのＭｇＣｌ２）に懸濁し、４℃で１時間、約１５，０００×ｇで遠心分離した。ＰＢＰ  Ａ１９７Ｃ／Ｅ２６８Ｃ及びＰＢＰ  Ｑ２０１Ｃの場合、上澄みを、緩衝液Ａで平衡化した１００ｍＬのＱセファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社）カラムにロードした。カラムを２倍カラム体積の緩衝液Ａで洗浄し、更に２倍カラム体積の緩衝液Ａ〜緩衝液Ｂ（２００ｍＭのＮａＣｌを有する緩衝液Ａ）の勾配、更に１倍カラム体積の緩衝液Ｂで溶出した。ＰＢＰ  Ａ４７Ｃ／Ａ１９７Ｃの場合、上澄みを、緩衝液Ａで平衡化した７５ｍＬのＱセファロースカラムにロードし、１００ｍＬの緩衝液Ａで洗浄し、緩衝液Ｂで段階的に溶出した。両方のタンパク質に関して、各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、〜３５ｋＤａのタンパク質を含有する画分をプールした。
【０１６９】
ＰＢＰ  Ａ１９７Ｃ／Ｅ２６８Ｃのサンプルを、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））を用いて２００μＬ（７５μＭの最終濃度）に調製し、ＰＢＰ  Ａ４７Ｃ／Ａ１９７Ｃは２００μＬ量で２５μＭとした。１．２μＬの５０Ｕ／ｍＬのＰＮＰアーゼ、２μＬの３０ｍＭの７−メチルグアノシン及び２μＬの１００ｍＭのＭｇＣｌ２を各サンプルに添加し、室温で４５分間インキュベートした。０．８部のチオール反応性６−ヨードアセトアミドフルオレセイン（６−ＩＡＦ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ＃Ｉ−３０４５２）を、ＤＭＳＯ中の１０ｍＭのストックから添加した。反応液を室温で５時間３０分インキュベートし、更に製造業者のプロトコルに従い、ＨＢＳ中に、ＮＡＰ５カラム（ＧＥヘルスケア社、カタログ＃１７−０８５３−０２）を使用して脱塩した。ＰＢＰ  Ａ１９７Ｃ／Ｅ２６８Ｃの場合、６．２μＬの１２ｍＭのＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔｈｉｏｌ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔｂ  Ｃｈｅｌａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ＃ＰＶ３５７９）を添加した。ＰＢＰ  Ａ４７Ｃ／Ａ１９７Ｃの場合、２．１μＬの１２ｍＭのＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔｈｉｏｌ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔｂ  Ｃｈｅｌａｔｅを添加した。Ｔｂ標識した反応液を室温で１時間インキュベートし、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥヘルスケア社、カタログ＃１７−０８５３−０２）を用いて、製造業者のプロトコルに従い脱塩した。得られる生成物を、センサー（４７−１９７）及びセンサー（１９７−２６８）と称する。
【０１７０】
実施例３：ＯＧ−ＰＢＰ−Ｔｂ及びＲｄ−ＰＢＰ−Ｔｂを用いたアッセイ法
ＯＧ−ＰＢＰ−Ｔｂ及びＲｄ−ＰＢＰ−Ｔｂ（２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２）の蛍光を、ホスフェートモップ（７−メチルグアノシン及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ）、３６０μＭ  ＫＨ２ＰＯ４を含む又は追加成分含まない、２２μＬの反応液を用いて解析した。これらの反応をＯＧ−ＰＢＰ−Ｔｂの場合は１０μＭ及び２００ｎＭで、Ｒｄ−ＰＢＰ−Ｔｂの場合は９及び０．２８μＭで実施した。サンプルを３４０ｎｍ（３０ｎｍのバンドパス）で励起し、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ２ＴＭ計測器を用い２００μｓの検出ウインドウ、更に１００μｓのディレイにより、５２０ｎｍ（２５ｎｍのバンドパス）及び４９５ｎｍ（１０ｎｍのバンドパス）で蛍光強度を捕捉した。ＴＲ−ＦＲＥＴ比率は、４９５ｎｍでの放出強度で５２０ｎｍでの放出強度を除算することにより算出した。
【０１７１】
一連の実験において、ＯＧ−ＰＢＰ−Ｔｂ及びＲｄ−ＰＢＰ−Ｔｂの両シグナルは、ホスフェート（図４）の存在への強い依存性を示した。
【０１７２】
実施例４：Ｔｂ−ＰＢＰ（Ｑ２０１Ｃ）−Ｆｌを用いたアッセイ法
１０μＬのＴｂ−ＰＢＰ（Ｑ２０１Ｃ）−Ｆｌ（異なる量のＴｂキレート）の各バージョンを、ＨＢＳで１００ｎＭまで希釈し、１０μＬの２００μＭホスフェート又は１０μＬのホスフェートＭｏｐ（０．８ｍＭの７−ＭＥＧ、４Ｕ／ｍＬ  ＰＮＰアーゼ及び１ｍＭのＭｇＣｌ２）に添加した。サンプルを３４０ｎｍ（３０ｎｍのバンドパス）で励起し、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ２ＴＭ計測器を用い２００μｓの検出ウインドウ、更に１００μｓのディレイにより、５２０ｎｍ（２５ｎｍのバンドパス）及び４９５ｎｍ（１０ｎｍのバンドパス）で蛍光強度を捕捉した。
【０１７３】
一連の実験において、Ｔｂ−ＰＢＰ（Ｑ２０１Ｃ）−Ｆｌの各バージョンは、ホスフェート（表１）への強いシグナル依存を示した。
【０１７４】
【表１】
2010500417.tif 000004
【０１７５】
実施例５：二重変異体センサー（４７−１９７）及びセンサー（１９７−２６８）を用いたアッセイ法
センサーは、０．００３９ユニット／ｍＬ  プリンフクレオシドホスホリラーゼ及び０．４ｍＭの７−メチルグアノシン及び０．５ｍＭのＭｇＣｌ２で最初に１時間インキュベートし、全ての残留若しくは混入ホスフェートを除去した。各１０μＬのセンサー（約１００ｎＭ）を、１０μＬのホスフェート標準に添加した（１２５０、６２５、３１３、１５６、７８、３９、２０、９．８、２．４、１．２、０．６１、０．３１、０．１５、０．０７６、０．０３８、０．０１９、０．００９５、０．００４８、０．００２４、０．００１２、０．０００６０、０．０００３０及び０．０００１４９μＭの最終濃度とした）。サンプルを３４０ｎｍ（３０ｎｍのバンドパス）で励起し、Ｔｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ計測器を用い２００μｓの検出ウインドウ、更に１００μｓのディレイにより、５２０ｎｍ（２５ｎｍのバンドパス）及び４９５ｎｍ（１０ｎｍのバンドパス）で蛍光強度を捕捉した。ＴＲ−ＦＲＥＴ比率は、４９５ｎｍでの放出強度で５２０ｎｍでの放出強度を除算することにより算出した。
【０１７６】
一連の実験結果を、図５に示す。
【０１７７】
実施例６：ホスファターゼアッセイ法
ＰＴＰ１Ｂとは、インシュリン受容体を脱リン酸化することによって、インシュリンのシグナル伝達を負に制御するチロシンホスファターゼである。
【０１７８】
ＰＴＰ１Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｐｒｏｄｕｃｔ＃  Ｐ３０７９、組換え型のヒト全長タンパク質（ヒスチジンタグ付、昆虫細胞で発現））を、２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓプロパンを用いて、５μＬ体積でプレートを用いて連続希釈し、室温で３０分、１Ｕ／ｍＬ  ＰＮＰアーゼ、４００μＭ  ７−メチルグアノシン、及び１００ｎＭセンサー（４７−１９７）又はセンサー（１９７−２６８）の存在下でインキュベートした。更に１０μＬのＰＴＰ１Ｂ基質（Ｂｉｏｍｏｌ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ、カタログ＃Ｐ−３２３）を添加し、５０μＭの最終濃度とした。約１時間の培養の後、サンプルを３４０ｎｍ（３０ｎｍのバンドパス）で励起し、Ｔｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ計測器を用い２００μｓの検出ウインドウ、更に１００μｓのディレイにより、５２０ｎｍ（２５ｎｍのバンドパス）及び４９５ｎｍ（１０ｎｍのバンドパス）で蛍光強度を捕捉した。ＴＲ−ＦＲＥＴ比率は、４９５ｎｍでの放出強度で５２０ｎｍでの放出強度を除算することにより算出した。
【０１７９】
一連の実験結果を、図６に示す。
【０１８０】
実施例７：ホスホジエステラーゼアッセイ法
本発明の幾つかの実施形態は、ホスホジエステラーゼ活性の検出に関する。典型的なアッセイ法及びそれらの詳細及び結果を、以下に概説する。
【０１８１】
６．１  基質に対する修飾ＰＢＰ応答性の欠如の実証
陽性コントロールとしてのホスフェートに加えて、６つの異なるホスフェートエステル（ホスホセリン（ｐＳｅｒ）、ホスホスレオニン（ｐＴｈｒ）、ホスホチロシン（ｐＴｙｒ）、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）及びグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、２つのリン酸ジエステル（サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）及びサイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ））を、１μＭクマリン標識ＰＢＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ、ｐａｒｔ＃  ＰＶ４４０６）（２００μＭ化合物濃度から開始）に対して滴定し、蛍光測定した（励起：４３０／５、放出：４５０／５）。
【０１８２】
一連の実験結果を図７に示す。ホスフェートエステルもリン酸ジエステルも、アッセイ法において顕著な反応を示さなかった。
【０１８３】
６．２  ホスファターゼの存在下での、ホスフェートエステル裂開の実証
ホスファターゼの存在下でのホスフェートエステルの裂開、及びリン酸ジエステル（ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ）のホスファターゼに対する非感受性を示すため、組換えウシアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ社、Ｃａｔ＃  Ｐ８３６１）の過剰量（アッセイウェルあたり８ユニット／２０μＬ）を、＞１μＭ化合物を含有する各ウェルに添加し、５分間インキュベートし、上記のように蛍光強度を測定した。
【０１８４】
一連の実験において、全てのホスフェートモノエステルで蛍光強度の急激な増大を示した。すなわちホスファターゼによる完全な裂開が示された。結果を図８に示す。ＰＮＰは、高いホスファターゼ濃度で強度の減少を示した。脱リン酸化の生成物が強く光を吸収することがその原因である。ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰでは蛍光強度の若干の増大を示したが、増加の程度はホスフェートモノエステルと比較し、最小レベルであった。
【０１８５】
６．３  ホスフェートモノエステルを急速に切断するのに必要な、ホスファターゼの最少量の決定
ホスフェートモノエステルを急速に切断するのに必要な、ホスファターゼの最少の量を決定するために、アルカリホスファターゼを、ホスフェートモノ−及びジエステル（より少ないＰＮＰ）（及びＡＴＰ）の同一セットを用いて滴定し、蛍光強度を１時間のタイムコースで測定した。
【０１８６】
５分及び１時間の時点のデータを、それぞれ図９Ａ及び９Ｂに示す。１０ｍＵ／ｍＬのアルカリホスファターゼにより、１００μＭホスフェートモノエステル（又はＡＴＰ）が５分以内に切断されたが、リン酸ジエステル（例えばｃＡＭＰ又はｃＧＭＰ）は切断されなかったことが分かる。１時間後においても、約１Ｕ／ｍＬアルカリホスファターゼの濃度まで、ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰの検出可能な活性が見られなかった。
【０１８７】
６．４  基質としてのｃＡＭＰ又はｃＧＭＰに対するホスホジエステラーゼ活性の検出
基質としてのｃＡＭＰ又はｃＧＭＰに対するホスホジエステラーゼ活性の検出における本発明の有用性を示すため、ウシの脳由来のカルモジュリン感受性ホスホジエステラーゼ（Ｓｉｇｍａ社、Ｃａｔ＃Ｐ９５２９）の滴定溶液を、１Ｕ／ｍＬアルカリホスファターゼ及び１Ｕ／ｍＬカルモジュリン（Ｓｉｇｍａ社、Ｃａｔ＃Ｐ２２７７）の有無において、１μＭクマリン−ＰＢＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ、ｐａｒｔ＃ＰＶ４４０６）、１０μＭ  Ｃａ２＋の存在下で、１００μＭ  ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰと共にインキュベートした。プレートを測定した（例えば１時間の培養後）。
【０１８８】
ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを使用した一連の実験データを、それぞれ図１０Ａ及び１０Ｂに示す。
【０１８９】
基質としてのｃＡＭＰ又はｃＧＭＰのいずれの場合も、強度がホスホジエステラーゼの存在量、並びにアルカリホスファターゼ（必須）及びカルモジュリン（カルモジュリンの存在下で速度が増加した）の存在に感受性を示すことが観察された。この実験において使用したカルモジュリンの量は最適でなく、カルモジュリン濃度の増加により更に顕著な効果が示されると考えられる。
【０１９０】
上記の実験を「動態モード」においても実施し、プレートを２分ごとに解析した。酵素に対する反応速度（反応の最初の約３０％の傾斜）をプロットした場合、酵素の濃度と速度との間に比例関係が存在した。すなわち、ＨＴＳ、並びにホスホジエステラーゼの触媒によるホスホジエステルの加水分解のより詳細な動態的分析の両方において、このフォーマットが適合することを示唆するものである。１つの実験の結果を図１１に示す。
【０１９１】
実施例８：Ｆｌ−ＰＢＰ−Ｔｂの調製
２６８μＬの１１３μＭ  Ａ１９７Ｃ  ＰＢＰを、１１３μＬのＨＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））で希釈した。ＤＭＳＯ中の１０ｍＭの６−ヨードアセトアミドフルオレセイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社Ｐａｒｔ＃Ｉ３０４５２）１５．７５μＬを添加した。ホスフェートを除去（ｍｏｐｐｉｎｇ）する試薬（１．２μＬのＰＮＰアーゼ、２μＬの７−ＭＥＧ及び２μＬの１００ｍＭのＭｇＣｌ２）を更に添加し、ホスフェートを除去した。この反応液を室温で２．５時間インキュベートし、更に製造業者のプロトコルに従い、ＨＢＳ中に、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて脱塩した。次に、１０μＬの、１Ｍの重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）中の１ｍＭのＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）  Ａｍｉｎｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｂ  Ｃｈｅｌａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社Ｐａｒｔ＃  ＰＶ３５８２）を、脱塩された生成物２００μＬに更に添加し、室温で一晩インキュベートした。次に上記物質をＨＢＳ中に、ＮＡＰ−５カラムを用いて脱塩し、Ｆｌ−ＰＢＰ−Ｔｂ［Ｆｌ−ＰＢＰ（Ａ１９７Ｃ）−Ｔｂ（アミン）］を調製した。
【０１９２】
実施例９：Ｆｌ−ＰＢＰ−Ｔｂによるアッセイ法
２４のホスフェート標準（２ｍＭ、１ｍＭ、５００μＭ、２５０μＭ、１２５μＭ、．．．．のホスフェートを含む）１０μＬを、３８４ウエルプレート（コーニング３６７７）中の、１００ｎＭ  Ｆｌ−ＰＢＰ−Ｔｂ（１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）、０．０５％のトリトンＸ−１００）１０μＬに添加した。また同じ反応シリーズを、アミン反応性ＴＴＨＡベースのＥｕキレートを用いた標準的な方法により調製したＥｕ標識抗体１０ｎＭ若しくは１００ｎＭを含有する、１００ｎＭ  Ｆｌ−ＰＢＰ−Ｔｂを用いて実施した。サンプルを３４０ｎｍ（３０ｎｍのバンドパス）で励起し、Ｔｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ計測器を用い２００μｓの検出ウインドウ、更に１００μｓのディレイにより、５２０ｎｍ（２５ｎｍのバンドパス）、４９５ｎｍ（１０ｎｍのバンドパス）及び６１５ｎｍで蛍光強度を捕捉した。またホスフェート濃度の関数としての反応を、５２０ｎｍの放出、又は５２０ｎｍ〜６１５ｎｍの比率若しくは放出により示した。結果を図１３〜１５に示す。
【図１】
2010500417.tif 000005
【図２】
2010500417.tif 000006
【図３】
2010500417.tif 000007
【図４】
2010500417.tif 000008
【図５】
2010500417.tif 000009
【図６】
2010500417.tif 000010
【図７】
2010500417.tif 000011
【図８】
2010500417.tif 000012
【図９Ａ】
2010500417.tif 000013
【図９Ｂ】
2010500417.tif 000014
【図１０Ａ】
2010500417.tif 000015
【図１０Ｂ】
2010500417.tif 000016
【図１１】
2010500417.tif 000017
【図１２】
2010500417.tif 000018
【図１３】
2010500417.tif 000019
【図１４】
2010500417.tif 000020
【図１５】
2010500417.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月21日(2009.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010500417000001.app
【国際調査報告】
2010500417.tif 000022
2010500417.tif 000023
2010500417.tif 000024