(57)【要約】生体分子を分析するための方法および装置について説明する。本方法は、一方の種のイオン化分子を線形イオントラップに注入および貯蔵するステップと、第２の種類の反対極性のイオン化分子を注入し、貯蔵された第１の種を第２の種が透過するステップとを含む。結果として生じた反応生成物は、残りの電荷値を考慮して質量分析器によって分析され得る。ある側面において、線形イオントラップは、反応容積として使用されてもよく、イオン化された種は、実質的に共線的にトラップの軸に沿って注入されてもよい。質量分析は、質量選択的軸方向射出または質量分析計によって実行されてもよい。
2010511861.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオントラップを動作する方法であって、該方法は、
該イオントラップのチャンバー内にイオントラッピング容積を形成するステップと、
第１のイオン集団を該イオントラッピング容積に注入して、該第１の集団が、該トラッピング容積に貯蔵されるステップと、
第２の荷電イオン集団を、該イオントラップに透過させて、該第１および該第２のイオン集団の物理的な重なりが発生するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１のイオン集団は、多重に荷電された陽イオンを含み、前記第２のイオン集団は、単一荷電陰イオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多数の正電荷を帯びる前記第１のイオン集団は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、および合成ポリマーから成る群から選択される物質を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
エレクトロスプレーイオン化により、多数の正電荷を帯びる前記第１のイオン集団を生成するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のイオン集団は、多重に荷電された陰イオンを含み、前記第２のイオン集団は、単一荷電陽イオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のイオン集団は、単一荷電陰イオンを含み、前記第２のイオン集団は、多重に荷電された陽イオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のイオン集団は、多重に荷電された陽イオンを含み、前記第２のイオン集団は、多重に荷電された陰イオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のイオン集団は、多重に荷電された陰イオンを含み、前記第２のイオン集団は、多重に荷電された陽イオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２のイオン集団が前記第１のイオン集団に重なる時間の後に、該第１のイオン集団は、質量対電荷依存様式で外部検出器に射出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２のイオン集団が前記第１のイオン集団に重なる時間の後に、該第１のイオン集団は、前記イオントラップに隣接する質量分析器に入ることが可能になる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記質量分析器は、イオントラップ、飛行時間型質量分析計、ＯＲＢＩＴＲＡＰ質量分析計、４重極質量フィルタ、またはイオンサイクロトロン共鳴質量分析計のうちのいずれか１つである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
質量分析器は、イオン源および前記イオントラップ間に配置され、特定の質量対電荷比のイオンが該イオントラップに入ることを選択するように構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記質量分析器は、４重極質量フィルタである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記イオントラップの前記チャンバーに蓄積される前記第１または第２のイオン集団のうちの１つの質量スペクトルを得るステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のイオン集団または前記第２のイオン集団のうちの少なくとも１つは、動力学的に冷却される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
分子を分析するための装置であって、該装置は、
第１のイオン集団を受け入れおよび貯蔵し、
第２のイオン集団を受け入れおよび透過させるように構成される線形イオントラップ（ＬＩＴ）と、
質量分析器と、
を備え、
該第１の集団または該第２の集団のうちの１つは、該質量分析器によって分析される、
装置。
【請求項１７】
前記第１または第２のイオン集団のうちの前記少なくとも１つは、静電イオン（ＥＳＩ）発生器によって生成される、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記第１または第２のイオン集団のうちの少なくとも１つは、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）発生器によって生成される、請求項１６に記載の装置。
【請求項１９】
前記第１または第２のイオン集団のうちの少なくとも１つは、サンプリンググロー放電イオン化（ＡＳＧＤＩ）源によって生成される、請求項１６に記載の装置。
【請求項２０】
前記質量分析器は、質量選択的軸方向射出（ＭＳＡＥ）モードにおいて動作するＬＩＴをさらに備える、請求項１６に記載の装置。
【請求項２１】
前記質量分析器は、イオントラップ、飛行時間型質量分析計、ＯＲＢＩＴＲＡＰ質量分析計、４重極質量フィルタ、またはイオンサイクロトロン共鳴質量分析計のうちのいずれか１つである、請求項１６に記載の装置。
【請求項２２】
前記第１のイオン集団および前記第２のイオン集団は、前記ＬＩＴに実質的に軸方向に導入される、請求項１６に記載の装置。
【請求項２３】
前記第１のイオン集団は、前記ＬＩＴに半径方向に導入され、前記第２のイオン集団は、前記ＬＩＴに軸方向に導入される、請求項１６に記載の装置。
【請求項２４】
前記第１および第２のイオン集団は、同時に導入される、請求項２３に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００６年１２月１日に出願された、米国仮出願第６０／８７２，３５６号（これは、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本出願は、分子、より具体的には生体分子を分析する装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
電子捕獲解離（ＥＣＤ）および電子移動解離（ＥＴＤ）は、生体分子、具体的には、タンパク質およびペプチドを分析する構造解析ツールとして用いられている。両解離方法は、ペプチド骨格結合の広範に及ぶ開裂を示すが、例えば、リン酸化およびグリコシル化から生じる翻訳後修飾（ＰＴＭ）を保持する。ＥＣＤおよびＥＴＤの両方における主に構造情報の豊富な解離チャネルは、多くの場合、補足的なｃ型およびｚ型フラグメントイオンをもたらすが、一方、衝突誘起解離または赤外多光子解離等の従来のイオン活性化方法は、ｂ型およびｙ型フラグメントイオンをもたらす。後者の解離方法は、多くの場合、ＰＴＭを開裂する傾向により、修飾部位を同定するのが困難である。
【０００４】
効率的なＥＣＤは、一形態の質量分析、つまりフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析において主に実装されるが、電気力学的イオントラップにおけるＥＣＤの実装について説明するいくつかの実験が報告されている。イオン／イオン反応を介した電子移動により生じるＥＴＤは、４重極３次元イオントラップおよび線形イオントラップ（ＬＩＴ）を含む電気力学的イオントラップにおいて容易にもたらされる。そのイオン容量が大きく、また、注入イオンの捕獲効率が高いことから、ＬＩＴは、３次元イオントラップに勝る利点を有する。ＬＩＴ内においてイオン／イオン電子移動解離反応をもたらすいくつかの方式は、既知であり、この場合、両極性のイオンは、図１に示すように、軸方向からＬＩＴに生成および注入可能である。これは、どちらのイオン極性の貯蔵も伴わず、反対の極性のイオンがＬＩＴに連続的に入る際にその間で発生する反応に依存する（方法Ａ）。イオンの相対速度が高くなると、本モードにおけるイオン／イオン反応の可能性は低くなると予測される。
【０００５】
別の方法（方法Ｂ）は、低速度を提供すると予測される反対電荷のイオンの相互貯蔵を用いる。しかしながら、本方法は、ＬＩＴの封じ込めレンズへの無線周波数（ＲＦ）電圧の印加、または４重極配列への不平衡ＲＦ電圧の印加を必要とする。
【０００６】
ＬＩＴにおいて実行されるイオン／イオン電子移動解離反応は、相互貯蔵モードを用いている。以前の研究によると、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）および大気サンプリンググロー放電イオン化（ＡＳＧＤＩ）源を使用することによって、ＬＩＴにおけるイオン／イオン陽子移動反応のための陽イオン透過／陰イオン貯蔵モードの使用が論証されている。しかしながら、イオン／イオン電子移動反応がもたらされなかったと考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
イオントラップを動作する方法であって、イオントラップのチャンバー内にイオントラッピング容積を形成するステップと、第１のイオン集団をイオントラッピング容積に注入して、第１の集団が、トラッピング容積に貯蔵されるステップと、第２の荷電イオン集団をイオントラップに透過させて、第１および第２のイオン集団の物理的な重なりが発生するステップと、を含む方法が開示される。
【０００８】
ある側面において、分子を分析するための装置であって、第１のイオン集団を受け入れおよび貯蔵し、第２のイオン集団を受け入れおよび透過させるように構成される線形イオントラップ（ＬＩＴ）と、質量分析器とを備え、第１のイオン集団または第２のイオン集団のうちの１つは、質量分析器によって分析される装置が開示される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】線形イオントラップ（ＬＩＴ）においてイオン／イオン電子移動解離反応をもたらすための２つの既知の方法を示し、（Ａ）は、両極性のイオンの通過、（Ｂ）は、両極性のイオンの相互貯蔵を示す。
【図２】線形イオントラップ（ＬＩＴ）においてイオン／イオン電子移動解離反応をもたらすための２つの方法を示し、（Ａ）は、陽イオン貯蔵／陰イオン透過、（Ｂ）は、陽イオン透過／陰イオン貯蔵を示す。
【図３】（Ａ）は、２重ナノＥＳＩ／ＡＰＣＩ源を有するＱ  ＴＲＡＰ質量分析計の簡略図であり、（Ｂ）は、第１の方法を使用するイオン／イオン電子移動反応実験のための異なるステップ（第１のステップ＝頂部、最終ステップ＝底部）における装置軸に沿った典型的な電位である。
【図４】（Ａ）は、実験的２重ナノＥＳＩ／ＡＰＣＩ源を有するＱ  ＴＲＡＰ質量分析計の簡略図であり、（Ｂ）は、第２の方法を使用するイオン／イオン電子移動反応実験のための異なるステップにおける装置軸に沿った典型的な電位である。
【図５】３重プロトン化ペプチドＫＧＡＩＬＫＧＡＩＬＲ［Ｍ＋３Ｈ］３＋がＱ２ＬＩＴにトラップされる一方で、アゾベンゼンラジカル陰イオンをペプチドに８０ミリ秒間通過させる透過モードのイオン／イオン電子移動反応の第１の方法を使用する実験的質量スペクトルデータを示す。
【図６】アゾベンゼンラジカル陰イオンがＱ２ＬＩＴにトラップされる一方で、３重プロトン化ＫＧＡＩＬＫＧＡＩＬＲ［Ｍ＋３Ｈ］３＋がＱ２に８０ミリ秒間透過させる透過モードのイオン／イオン電子移動反応の第２の方法を使用する実験的質量スペクトルデータを示し、イオン／イオン電子移動反応から生じる生成イオンならびに残留親イオンは、Ｑ３ＬＩＴにおいて回収された。
【図７】アゾベンゼンラジカル陰イオンのイオン強度の依存度を、Ｑ２ＬＩＴの注入ｑ値の関数として示し、陰イオン注入時間は１５ミリ秒であり、Ｑｌ  ４重極は、アゾベンゼンラジカル陰イオンを通過させるように設定された。
【図８】Ｑ２ＬＩＴにトラップされる３重プロトン化ＫＧＡＩＬＫＧＡＩＬＲの集団に陰イオンを８０ミリ秒間通過させた後の、イオン／イオン反応生成物および残留親イオンのイオン強度の依存度を、アゾベンゼンラジカル陰イオンの注入ｑ値の関数として示し、曲線１は％残留親イオン、曲線２は％全イオン／イオン、曲線３は％全ＥＴＤである。
【図９】Ｑ０およびＱ２のＤＣ電位差によって示されるように、陰イオン注入エネルギーの関数として、％全イオン／イオン寄与の依存度を示し、３重プロトン化ＫＧＡＩＬＫＧＡＩＬＲの集団の貯蔵に使用されたＱ２を、アゾベンゼンラジカル陰イオンが透過した８０ミリ秒の間に、０．６５の陰イオンｑ値を使用した。
【図１０】３重プロトン化ホスホペプチドＴＲＤＩｐＹＥＴＤＹＹＲＫがＱ２ＬＩＴにトラップされる一方で、アゾベンゼンラジカル陰イオンをホスホペプチドに１００ミリ秒間通過させる透過モードのイオン／イオン電子移動反応の第１の方法から得られた実験的質量スペクトルデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
例示的実施形態は、図面を参照することによってさらに理解され得るが、これらの実施形態は、本質を制限することを意図しない。以下の説明において、多数の具体的な詳細は、本発明を完全に理解するために記載されるが、これらの具体的な詳細の一部または全部を含まずに実践されてもよい。他の事例において、周知の過程動作については、説明を不必要に曖昧にしないように詳細に説明されていない。
【００１１】
化学的現象学は、電気力学的イオントラップにおける一方の極性のイオンを貯蔵し、反対極性のイオンをイオントラップに透過させ、反対電荷のイオン集団が空間的に重なるようにすることによって研究可能である。いくつかの透過モードのイオン／イオン反応方法について説明されており、電子移動を伴うものもあれば、他の種類の反応を伴うものもある。
【００１２】
ある側面において、線形イオントラップにおいて検体陽イオンを貯蔵させ、試薬陰イオンを陽イオンに透過させるか、または試薬陰イオンを貯蔵し、検体陽イオンを透過させることを伴う電子移動解離（ＥＴＤ）をもたらすための２つの関連方法について説明する。つまり、本方法は、一方のイオン極性を貯蔵し、反対の極性のイオンを線形イオントラップに進入させることを伴う。本明細書に開示される方法および装置において、線形イオントラップは、イオン／イオン反応が用いられたイオントラップに直列に配置される。ハイブリッド３連４重極／線形イオントラップ（ＬＩＴ）器具と合わせたパルス型２重イオン源手法が使用される。２つの手法は、ＥＴＤ生成物の正体および相対存在量に関し、類似の結果をもたらすと考えられる。また、２つの方法は、同じ反応時間において同等程度のイオン／イオン反応をもたらし得る。同じ時間における前駆イオンから生成イオンへの変換は、既知の相互イオン極性貯蔵実験により観測されるものと類似している。しかしながら、透過モード方法は、反対電荷のイオンの同時貯蔵を必要としない。
【００１３】
第１の方法において、正電荷のイオンは、加圧型線形イオントラップ（ＬＩＴ）に貯蔵されるが、電子移動試薬陰イオンは、機器を透過する。第２の方法は、線形イオントラップにおける電子移動試薬陰イオンの貯蔵を含むが、多重にプロトン化された検体イオンは、機器を透過する。ＬＩＴが陰イオン貯蔵モードで動作するため、後者の方法は、外部機器において、ＥＴＤ生成物の収集および質量分析を使用してもよい。
【００１４】
透過モードＥＴＤ反応は、検体および電子移動試薬イオンを交互に生成してＬＩＴに注入する２重ナノＥＳＩ／ＡＰＣＩ源によって促進される。ＬＩＴの一端への注入に適した検体および試薬イオンを提供するためのイオン源の他の組み合わせを使用してもよい。２つの方法のイオン／イオン反応の程度は、各方法を最適条件下で行なう場合に類似し得る。類似のイオン／イオン反応時間を使用してもよく、その結果は、効率およびスペクトルの情報量の両方に関し、既知の相互貯蔵モードを使用して得られた結果と同等であり得る。透過モードＥＴＤ方法では、両方のイオン極性の相互貯蔵を可能にするために措置を講じる必要がない。
【００１５】
別の側面において、第２の方法（つまり、試薬陰イオンを貯蔵し、検体陽イオンを透過させる方法）を、リンクした走査ビーム型方法と併用して使用してもよい。透過モードＥＴＤ方法は、イオン／イオン反応を使用してペプチドイオン構造を調査する際に、よりパラメトリックな選択肢を提供する。本方法は、本明細書においてハイブリット３連４重極／ＬＩＴ装置を使用して説明されるが、４重極衝突セルを用いる任意の種類の器具を使用することも可能である。「透過モード」方法は、ＬＩＴの封じ込めレンズに対するＲＦの重ね合わせを必要としなくてもよい。
【００１６】
使用した実験材料は、メタノールおよび氷酢酸（ニュージャージー州、フィリップスバーグのＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ社）、入手したままの状態で使用したアゾベンゼン（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ＳｙｎＰｅｐ社（カリフォルニア州、ダブリン）によって合成されたペプチドＫＧＡＩＬＫＧＡＩＬＲ、ホスホペプチドＴＲＤＩｐＹＥＴＤＹＹＲＫ（カリフォルニア州、サンノゼのＡｎａＳｐｅｃ社）であり、さらに精製せずに使用した。ペプチド溶液は、正のナノＥＳＩのために４８／４８／２（容積／容積／容積）のメタノール／水／酢酸溶液中において１０μＭまで溶解した。
【００１７】
図３に概略的に示すように、実験的２重ナノＥＳＩ／ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）源を備えるプロトタイプ版のＱ  ＴＲＡＰ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社／カナダ、オンタリオ州、コンコルドのＭＤＳ  ＳＣＩＥＸ社）を使用して、実験を実行した。電子機器は、Ｄａｅｔａｌｙｓｔ３．１０ソフトウェアによって制御され、ソフトウェアの研究版は、ＭＤＳ  ＳＣＩＥＸ社によって提供された。
【００１８】
イオン経路は、３連４重極質量分析計の経路に基づき、最終の４重極ロッド配列は、従来のＲＦ／ＤＣ質量フィルタとして、または質量選択的軸方向射出（ＭＳＡＥ）を含むＬＩＴとして動作するように構成された。Ｑ  ＴＲＡＰは、６５０ｋＨｚの駆動ＲＦ周波数で動作した。２つのイオン源は、多様な種類のイオン化陽イオンまたは陰イオンを機器に注入するように、機器の一端に配置された。イオンは、単一に荷電されていても多重に荷電されていてもよく、電荷のセンスは、２つのイオン源について同一または異なってもよい。
【００１９】
イオンは、カーテンガスおよび差動排気領域を通って４重極イオンガイド（Ｑ０）へ移動する。Ｑ０チャンバーおよび分析器チャンバーは、差動排気開口であるＩＱ１によって分離された。分析器チャンバーは、３つの円形ロッド４重極配列、つまり、分析４重極Ｑ１、衝突セル４重極（Ｑ２）、および分析４重極（Ｑ３）を直列に含んだ。４重極の各々の長さは１２７ｍｍであり、フィールド半径は４．１７ｍｍであった。Ｑ１ＲＦ／ＤＣ４重極の前部に位置する短いＲＦのみのＢｒｕｂａｋｅｒレンズ（ＳＴ）は、Ｑ１駆動ＲＦ電源に容量的に結合された。衝突セル（Ｑ２）は、線形イオントラップ（ＬＩＴ）として使用され、その両端にＩＱ２およびＩＱ３レンズを含む。高精度弁を介して窒素ガスをＱ２に導入し、１次衝突ガスとして使用した。ＩＱ２およびＩＱ３の伝導度と、ターボ分子ポンプの既知のポンプ速度とからＱ２内のガス圧力を計算した。Ｑ２は、陽イオンおよび陰イオンのＩＱ２およびＩＱ３のＤＣ電位をそれぞれ上昇／低下させることによってＬＩＴとしての役割を果たす。
【００２０】
Ｑ３の４重極は、円形金被覆セラミックロッドにより構築された。Ｑ３の下流において、２つの追加のレンズが存在し、第１のレンズは、メッシュ被覆の直径８ｍｍの口径を有し、第２のレンズは、開放型の８ｍｍの口径を有する。これらのレンズは、図３において、それぞれ「出口レンズ」および「偏向器」と呼ばれる。一般的に、偏向器は、約２００Ｖに保持され、Ｑ３ＬＩＴからイオン検出器であるＥＴＰ社（オーストラリア、シドニー）の離散ダイノード電子倍増管へイオンを抽出するために、出口レンズに誘引されるようにする。検出器は、パルス計数モードで動作し、入口は、陽イオン検出では−６ｋＶ、陰イオン検出では＋４ｋＶに変動した。Ｑ３に印加された補助ＲＦ電圧は、分析走査中、質量／電荷（ｍ／ｚ）に比例して傾斜した。Ｑ３ＬＩＴ内にトラップされたイオンは、３８０ｋＨｚの信号によって共鳴的に励起され、質量選択的に軸方向に射出された。
【００２１】
Ｑ２およびＱ３の４重極配列は、ＬＩＴとして構成され、かつ１ＭＨｚのＲＦ駆動で動作するが、Ｑ０およびＱｌの４重極配列は、６５０ｋＨｚのＲＦ駆動で動作する。
【００２２】
ある例において、第１の透過モードのイオン／イオン電子移動方法（つまり、検体陽イオンを貯蔵し、試薬陰イオンを透過させる方法）に関する走査順序は、Ｑ２への陽イオン注入（１５ミリ秒）、Ｑ２ＬＩＴへの陰イオン注入（８０ミリ秒）、およびイオン／イオン反応の生成イオンの、質量分析のための質量分析器Ｑ３への移動（５０ミリ秒）を含む。図３は、過程におけるステップについて、システムの対象のイオン光学要素に印加される電圧をまとめる。縦座標は、距離を表し（正しい寸法比ではない）、点線は、グラフの上に図示される対応のイオン光学要素に整合している。横座標は、一連の電圧軸であり、ここで、実験順序の第１のステップは、頂部に表され、最終ステップは、底部に表される。電圧は、数値で示され、曲線は、装置軸に沿った電圧の変化を装置の物理的な面に概略的に関連付けることを意図する。
【００２３】
透過モードのイオン／イオン電子移動反応実験の本例において、ナノＥＳＩワイヤに連結される正の高電圧電源をパルスして、検体イオンを生成した。検体イオンは、ＲＦ／ＤＣモードで動作するＱ１によって隔離され、約１〜８ミリトールの圧力でＱ２ＬＩＴに軸方向に注入された。これらのイオンは、３０ミリ秒間、Ｑ２において動力学的に冷却され、その間の時間、ナノＥＳＩワイヤエミッタに対する高電圧を停止した。冷却ステップ後、負極性で動作したＡＰＣＩワイヤに連結される電源をトリガして、電子移動試薬陰イオンを生成した。試薬陰イオンは、運動エネルギーが比較的低い（Ｑ２ＤＣオフセットは、およそ５Ｖであり、Ｑ０ＤＣオフセットに誘引される）Ｑ２ＬＩＴに入る前に、ＲＦ／ＤＣモードで動作するＱ１によって隔離された。また、Ｑ２ＬＩＴの閉じ込めレンズ（つまり、ＩＱ２およびＩＱ３）に印加されたＤＣ電位は、Ｑ２ＬＩＴ  ＤＣオフセットに反発する約１Ｖの値に調整された。電位における１Ｖの差異は、軸方向寸法において、冷却された検体イオンをトラップするのに十分高いものである。
【００２４】
イオン／イオン電子移動解離の反応時間は、陰イオンのＱ２ＬＩＴへの注入時間によって判断され得る。既定の陰イオン透過時間後、イオン／イオン電子移動反応により生じる正電荷の生成イオンならびに残留前駆イオンは、Ｑ２からＱ３に移動し、３８０ｋＨｚの周波数における補助ＲＦ信号を使用して、質量選択的軸方向射出（ＭＳＡＥ）を受ける前に、約５０ミリ秒間冷却された。
【００２５】
ＥＴＤ試薬陰イオンがＱ２に貯蔵される一方で、多重にプロトン化されたペプチドまたはタンパク質がＱ２を透過し、正電荷の生成物がＱ３において収集される第２の方法の典型的な走査機能について図４に示す。本実験における陰イオンおよび陽イオンの形成の順番は、第１の方法で使用した順番とは逆である。第２の方法の場合、反応ＬＩＴ（Ｑ２）は、陰イオン貯蔵モードで使用され、Ｑ３は、陽イオンＬＩＴとして動作して、ＥＴＤ生成物および未反応前駆体を蓄積する。これは、対象のＥＴＤ生成物が反応ＬＩＴ（Ｑ２）に蓄積する第１の方法とは異なる。本明細書で示されるスペクトルは、典型的には、２０〜５０の個々の走査の平均である。
【００２６】
つまり、第２の方法は、透過イオンに関連するイオン／イオン反応生成物の質量分析に割り当てられる機器を有する。この装置の機能は、反応ＬＩＴ（Ｑ２）に隣接するＬＩＴ（Ｑ３）によって果たされる。しかしながら、飛行時間型質量分析計、ＯＲＢＩＴＲＡＰ質量分析計（マサチューセッツ州、ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．により入手可能）、４重極質量フィルタ、イオンサイクロトロン共鳴質量分析計、またはその同等物を使用してもよい。
【００２７】
透過モードのイオン／イオン電子移動反応の両方法の動作は、３重プロトン化モデルペプチドＫＧＡＩＬＫＧＡＩＬＲを検体陽イオンとして使用し、アゾベンゼンラジカル陰イオンをＥＴＤ試薬として使用する実験例において示される。両極性のイオンは、交互に生成されて、２重ナノＥＳＩ／ＡＰＣＩ源によってＱ２に注入された。図５は、第１の方法を使用して、３重プロトン化ペプチドＫＧＡＩＬＫＧＡＩＬＲ［Ｍ＋３Ｈ］３＋をＱ２に貯蔵する一方で、アゾベンゼンラジカル陰イオンをＱ２ＬＩＴに８０ミリ秒間通過させることにより生じるイオン／イオン電子移動反応後の質量スペクトルを示す。
【００２８】
アゾベンゼン陰イオンの注入ｑ値（トラッピングの振幅、ＲＦ振幅、ＲＦ周波数、イオンの質量対電荷比、および４重極配列の内接半径に関連する無次元パラメータ）は、約０．６５であり、Ｑ２の両端部レンズに印加されるＤＣトラッピング電圧は、Ｑ２ＤＣオフセットに対して１Ｖであった。
【００２９】
ＲＦ周波数および内接半径は一定であったが、ＲＦ振幅は可変であり、イオンのｑ値を変更するために使用され得る。背景ガス圧力は、約８ミリトールであった。
【００３０】
この透過モードのイオン／イオンＥＴＤ反応により生じるＥＴＤフラグメントイオンの正体および相対存在量は、３次元イオントラップにおいて、および相互貯蔵モードで構成される線形イオントラップにおいて報告されるものと類似している。ｃ型およびｚ型フラグメントイオンおよび中性側鎖損失の他に、いくつかのｚラジカル酸素添加付加物（ｚ＊）およびその解離生成物（ｚ＊−ＨＯ）が観測された。後者のイオンは、酸素添加付加物を介して形成される。
【００３１】
アゾベンゼンラジカル陰イオンをＱ２に貯蔵する一方で、３重プロトン化ペプチドＫＧＡＩＬＫＧＡＩＬＲ［Ｍ＋３Ｈ］３＋をＱ２ＬＩＴに８０ミリ秒間通過させることを伴う第２の方法を使用して、同一の反応物で収集されたデータについて図７に示す。検体イオンの通過中のアゾベンゼン陰イオンの反応ｑ値は、約０．４６であり、陰イオンのためにＱ２の両端部レンズに印加されたＤＣトラッピング電圧は、Ｑ２  ＤＣオフセットに対して１Ｖであった。背景ガス圧力は、約８ミリトールであった。イオン／イオン電子移動反応により生じる生成イオンならびに残留親イオンは、Ｑ２を透過してＱ３において収集され、これは、ＬＩＴモードで動作した。
【００３２】
図５および図６のデータの収集に使用される条件下において、親イオンの生成イオンへの同等の変換が観測され、ＥＴＤ生成物の正体および存在量は、２つの方法について類似していた。
【００３３】
類似の考慮が、２つの方法の条件を最適化するために適用されてもよい。考慮される要因には、イオン／イオン反応時間にＱ２において使用されるＲＦレベル、透過イオンの運動エネルギー、Ｑ２の両側のトラッピングレンズに使用されるＤＣレベル、およびＱ２圧力が含まれてもよい。透過モードのイオン／イオン反応を表す第１の方法に重点を置いて、これらの要点について本明細書に説明する。検体イオン、つまり、ＫＧＡＩＬＫＧＡＩＬＲ［Ｍ＋３Ｈ］３＋は、最初に、最高イオン収集効率を達成するように選択されたｑ値（０．２０〜０．５０）で、Ｑ２ＬＩＴに注入された。検体イオンは、約３０ミリ秒間、動力学的に冷却され、Ｑ２ＤＣオフセットに対して１ＶのＤＣを両方の端部レンズに印加することによってＱ２においてトラップされた。次のステップは、アゾベンゼン陰イオンのＱ２への注入であり、これにより、トラップされた検体イオンの集団とのイオン／イオン反応がもたらされた。イオン／イオン電子移動反応時間中にＬＩＴのロッドに印加された駆動ＲＦ振幅のレベルは、アゾベンゼン陰イオンおよびペプチド陽イオンの両方のｑ値に関連することから、検体イオンを貯蔵する一方で陰イオンを透過して陽イオン／陰イオンの重なりにおける最大値が判断可能であるようにするのに適した条件が判断される。
【００３４】
図７は、アゾベンゼンラジカル陰イオンのＱ２透過の、陰イオンｑ値への依存度を示す。データは、ｍ／ｚ１８２アゾベンゼン陰イオンを、一連の駆動ＲＦ振幅において、約８ミリトール（Ｎ２）に加圧されたＱ２線形トラップに進入させることによって得られた。陰イオンは、停止電圧をＩＱ３に入力することによってＱ２にトラップされ、次に、Ｑ３に移動した。次に、ｍ／ｚ１８２イオンの信号強度を、ＭＳＡＥを介して測定した。線形イオントラップの形状により、注入されたイオンは、機器のゼロ磁場中心線に近接して入る。
【００３５】
透過ＲＦのみの４重極のイオン受け入れに関する以前の研究によると、低注入ｑ値であっても、非常に高い半径方向の封じ込め効率が提案される。したがって、アゾベンゼン陰イオンのイオン存在量は、高ＲＦ振幅の領域がサンプルされない限り、注入ｑ値の範囲にわたって極めて一定であり得る。陰イオン透過は、０．１０から０．６５のｑ値の範囲にわたってほぼ一定であることがわかる。
【００３６】
アゾベンゼンラジカル陰イオンｑ値の、陽イオンの貯蔵に対する影響についても調査し、比較的低いｑ値のアゾベンゼンを使用することによって、Ｑ２に貯蔵される高質量対電荷比の陽イオンの損失がもたらされ得るかについて判断した。３重に荷電されたイオンおよび２重に荷電されたイオンの両方のＫＧＡＩＬＫＧＡＩＬＲイオンは、アゾベンゼンのｑ値の０．１０〜１．０（データは図示せず）の範囲にわたって１０％未満の存在量偏差でＱ２に貯蔵され得る。図７のデータおよび説明された結果によると、イオン／イオン反応実験の陰イオンおよび陽イオンを収容する間に広範囲のＲＦ振幅を使用可能であることが提案される。また、イオン／イオン反応速度は、反対電荷のイオン集団間の重なりの程度にも依存する。この重なりは、イオンのトラッピングウェルの深度を判断し得るため、ＲＦ振幅の影響を受け、イオントラップの中心におけるイオン密度に影響を及ぼし得る。
【００３７】
駆動ＲＦ振幅の、イオン／イオン電子移動反応速度に対する影響について評価するために、検体イオンの充填時間は、１２ミリ秒の一定値に設定され、陰イオンの注入時間は８０ミリ秒に設定され、ＲＦ駆動電圧のみを変動させた。一連の実験において、検体イオンのトラッピング電圧は、１Ｖ（ＩＱ２−ＲＯ２＝１ＶおよびＩＱ３−ＲＯ２＝１Ｖ）に設定される一方で、５Ｖ（ＲＯ２−ＲＯ０＝５Ｖ）の比較的低い運動エネルギーでアゾベンゼン陰イオンをＱ２に通過させた。
【００３８】
図８において、残りの残留前駆イオンの割合（曲線１）、イオン／イオン反応生成物によって表される全イオン信号の割合（％Ｔｏｔａｌ  Ｉｏｎ／ｉｏｎ、曲線２）、ならびにＥＴＤに起因する全イオン信号の割合の和（％Ｔｏｔａｌ  ＥＴＤ、曲線３）が記録され、アゾベンゼンラジカル陰イオンの注入ｑ値の関数としてグラフ化された。イオン存在量は、全イオン／イオン生成物の存在量と残留親イオンの存在量との和に正規化された。曲線２の横座標値は、例えば、
【００３９】
【数１】
2010511861.tif 000003
から判断され、
曲線３の横座標値は、
【００４０】
【数２】
2010511861.tif 000004
から判断された。
【００４１】
２つの曲線間の差異は、イオン／イオンプロトン移動および解離生成物をもたらし得ない任意の電子移動からの寄与を反映し得る。後者の２つのチャネルの相対的寄与は、相当な程度のイオン／イオン反応が観測される範囲にわたる陰イオンｑ値に敏感であるとは考えられない。イオン／イオン反応について、７３±１０％（つまり、％全ＥＴＤ／（％Ｔｏｔａｌ  Ｉｏｎ／ｉｏｎ）×１００）は、反応対の認識されたＥＴＤ生成物（つまり、ＥＴＤから生じる既知のｃイオン、ｚイオン、および側鎖損失）の形成をもたらす。図９に示す結果によると、２つのイオン集団を可能な限りＬＩＴの中心線に集中させて、重なり、ひいてはイオン／イオン反応速度を最大化することが提案される。本例において、陰イオン透過の減少をもたらさない最高陰イオンｑ値（図８参照）において、少なくとも最高速度が観測される。
【００４２】
第２の方法（検体陽イオンを貯蔵し、試薬陰イオンを透過させる方法）は、３重プロトン化ペプチドを貯蔵する一方で、アゾベンゼンラジカル陰イオンをＬＩＴに連続的に通過させることによって、最初に、比較的低い圧力（３×１０−５トール）のＱ３ＬＩＴにおいて実行された。イオン／イオン反応から生じる生成イオン信号は低かった。Ｑ２ＬＩＴおよびＱ３ＬＩＴ間の差異は、背景圧力であり、これにより、圧力が、制御されるパラメータであることが提案され得る。
【００４３】
イオン／イオン反応実験は、アゾベンゼン分子陰イオンの０．６５のｑ値において、窒素の１〜１０ミリトールの到達可能圧力領域にわたって、Ｑ２において実行された。％イオン／イオン反応（または％ＥＴＤ）における大幅な変動は、観測されなかった（データは図示されない）。これにより、％イオン／イオン反応が水平域に到達する圧力が、１ミリトール未満であること（または、Ｑ３ＬＩＴにおいて比較的低い透過モードのイオン／イオン反応速度をもたらす何らかの未確認要因が存在すること）が提案される。Ｑ２ＬＩＴにおける既知の相互貯蔵モードのイオン／イオン反応速度は、概して、Ｑ３ＬＩＴよりも少なくとも一桁大きい。ゆえに、２つのＬＩＴにおける反応速度の差異は、透過モード方法に限定され得ない。
【００４４】
％全イオン／イオンに対する陰イオン注入エネルギーの影響について、Ｑ０およびＱ２間のＤＣオフセット差異によって定義されるように、図９に示す。かなり広範な最大値が、３Ｖおよび１０Ｖ間で観測され、これは、単一荷電陰イオンの３〜１０ｅＶに相当する。要因の組み合わせが、観測された挙動に寄与すると考えられる。これらは、例えば、エネルギー依存性の陰イオンＱ２透過、イオンの相対速度へのイオン／イオン反応速度の依存度、および反対電荷のイオンの重複に対する任意の相対並進エネルギーの影響を含んでもよい。
【００４５】
図示されるデータは、陰イオンのエネルギー依存性の透過（データは図示されない）を定性的に追跡する。３ｅＶの値よりも低い１．０ｅＶにおける％全イオン／イオンは、例えば、１．０ｅＶにおける陰イオン透過効率の低下によって説明され得る。しかしながら、より高いエネルギー、例えば、１２ｅＶ以上において、％全イオン／イオン値は、観測された陰イオン透過よりも急速に下降する。イオン／イオン重複の減少は、より高い陰イオン注入エネルギーにおいて観測されたイオン／イオン反応の程度の減少に対する寄与要因として排除不可能であるが、イオン／イオン反応の断面の減少が、反応物の相対速度が増加する際に予測され得る。
【００４６】
Ｑ２に入るイオンは、多数の衝突を受け、陰イオン運動エネルギーの主要画分が、Ｑ２の通過中に損失することが予測され得る。しかしながら、Ｑ２におけるイオン反応物の相対的速度の分布は、陰イオン注入エネルギーとの何らかの相関を示すと予測され得る。図９に示す結果は、第１の方法を実行するための３〜１０ｅＶの注入エネルギーを使用する経験的支持を提供し得る。
【００４７】
ＬＩＴにおける透過モードＥＴＤの実行に影響を及ぼし得る別のパラメータは、アゾベンゼン陰イオンの透過時間中に、Ｑ２ＬＩＴの端部レンズ（ＩＱ２およびＩＱ３）に印加される検体イオンのトラッピング電位であり得る。トラッピング電位は、動力学的に冷却された検体イオンならびにイオン／イオン電子移動反応から生じる生成イオンをトラップするのに十分大きい電位であるべきである。しかしながら、比較的高い電位がこれらのレンズ要素に印加されると、陰イオンの透過に不要な光学影響がもたらされ得る。陰イオン透過時間中に端部レンズに印加される電位の最適値は、本例において、ＲＯ２ＤＣオフセットに対して０．５Ｖから２Ｖの間であった。
【００４８】
表１は、本装置によりＱ２において第１の方法を使用して、イオン／イオンＥＴＤ反応をもたらすのに適切な条件を表す動作条件組を概説する。
【００４９】
【表１】
2010511861.tif 000005
開裂がペプチド骨格に沿って発生する傾向があることから、修飾された残留物の位置に関する情報が保持されるため、ＥＴＤは、リン酸化の部位等の翻訳後修飾の部位を同定するためのツールとして使用され得る。透過モードＥＴＤ方法では、少なくとも最初に、相対並進エネルギーが大きいため、透過モードＥＴＤ方法は、相互貯蔵モードのＥＴＤ実験とは異なる。より高い相対並進エネルギーの一部が、イオン／イオン反応生成物の内部モードに結合される場合、透過モードおよび相互貯蔵モードのＥＴＤ方法が、解離挙動に差異をもたらし得ることが可能であり得る。しかしながら、これは、特定の実験的装置およびパラメータのＫＧＡＩＬＫＧＡＩＬＲイオンでは観測されなかった。しかしながら、他の検体イオンでは、透過モードおよび相互貯蔵モードのＥＴＤ間の任意の差異が、翻訳後修飾種について観測されるかについて判断することが重要であり得る。
【００５０】
図１０は、第１の方法の透過モードにおいて実行されたＥＴＤのホスホペプチドに対する適用により生じるデータを示す。スペクトルは、３重プロトン化ＴＲＤＩｐＹＥＴＤＹＹＲＫをＱ２ＬＩＴに貯蔵し、貯蔵されたイオンにアゾベンゼン陰イオンを１００ミリ秒間通過させることによって得られた。アゾベンゼン陰イオンからの電子移動は、２つのチロシン間の結合を除く残留物内結合からｃ型および／またはｚ型フラグメントと、アルギニン側鎖損失からフラグメントとをもたらした。いくつかの酸素添加付加物およびその解離生成物（ＨＯの損失）は、ＥＴＤフラグメントからのｚラジカルについて、および＋１荷電種について観測された。リン酸基の位置は、対応する未修飾ペプチドよりも高い８０質量単位であるチロシン（ｃ４−ｃ５）に対するｃ型フラグメントイオンＮ末端およびチロシン（ｚ７−ｚ８）に対するｚ型フラグメントイオンＣ末端によって示される。ｂ９イオンからのリン酸基の損失が観測され、これは、加圧Ｑ２ＬＩＴへの陽イオン注入過程中の衝突誘起解離に起因し得る。リン酸塩の損失の証拠は、ＥＴＤから生じると予測される解離生成物から明白にならないと考えられる。したがって、透過モードＥＴＤ方法は、ホスホペプチドの相互貯蔵モードＥＴＤを介して得られる情報と同等の構造情報を提供し得る。
【００５１】
さらに別の側面において、タンパク質のトリプシン消化物によって得られる混合物等の、多重にプロトン化されたイオンの混合物は、イオントラップに蓄積および貯蔵可能である。次に、貯蔵されたイオンは、負電荷の電子移動試薬の集団を貯蔵する第２のイオントラップを通って、質量選択的軸方向射出（ＭＳＡＥ）を介して軸方向に放出可能である。電子移動解離からの生成物および未反応前駆イオンを含む第２のイオントラップを透過する正電荷のイオンは、飛行時間型質量分析計等の別の質量分析器に送られることが可能である。本方法は、陽イオンの最初の混合物がパルス型イオン源から生じる際に、イオンを効率的に使用してもよい。第１のイオントラップが充填される時間にイオンが形成される場合、第１のイオントラップに貯蔵される実質的に全てのイオンは、新しいイオン集団が次のイオン化によって形成される前に構造解析を受けることが可能である。
【００５２】
さらに別の側面において、検体イオンが透過種である透過モードのイオン／イオン反応は、いわゆる「リンク走査」手法をもたらし、これは、混合物のスクリーニング目的に有用であり得る。
【００５３】
例えば、いわゆる「親イオン走査」は、共通フラグメントをもたらすように反応する前駆イオンを同定するものである。親イオン走査は、透過イオンが対象の多重にプロトン化された種である透過モードＥＴＤ方法に関連して実装可能である。タンデム質量分析計の第２の質量分析器が、対象の残留物に関連するｃ１型イオンの質量対電荷比のイオンを通過させるように設定される場合、Ｎ末端における特定の残留物を有する任意のペプチドを同定することが可能であり得る。このように、タンデム質量分析計の第１の質量分析器を走査し、対象の種々のペプチド陽イオンを、貯蔵された電子移動試薬陰イオンを含有するイオントラップに質量依存様式で透過させることによって、特定のｃ１＋フラグメントをもたらすように解離する前駆イオンのスペクトルが記録可能である。
【００５４】
さらなる側面において、検体イオンの電荷の反転は、多重に荷電された試薬イオンをイオントラップに貯蔵し、検体イオンを透過させることによって、透過モードのイオン／イオン方法において達成可能である。いくつかの単一プロトン化検体イオンは、例えば、多重に荷電された脱プロトン化試薬種との多重プロトン移動反応を受けて、陰イオンを形成してもよい。このような検体イオンは、貯蔵された陰の試薬イオンとともにトラップされてもよく、その後、質量分析されることが可能である。
【００５５】
さらに別の側面において、第１の極性イオンは、上述のように、ＬＩＴに軸方向に導入されてもよく、第２の極性のイオンは半径方向に導入されてもよい。本配置において、時間順のイオン注入は必要とされない。つまり、両極性のイオンは、ＬＩＴに同時に進入することが可能である（例えば、試薬イオンは、側面から連続的に入り、ＬＩＴＱ２に貯蔵されることが可能であり、一方、検体イオンは、連続的にＬＩＴを透過する）。不断の検体透過は、タンデム質量分析と併用するインライン液体クロマトグラフィー等の過程に適切であり得る。代替的に、イオン源のうちの１つ以上は、時間順であり得る。
【００５６】
多種多様の他の透過モードのイオン／イオン反応実験も実行可能であり、電子移動を伴うものもあれば、他の種類の反応を伴うものもある。例えば、
１）タンパク質のトリプシン消化物によって得られる混合物等の、多重にプロトン化されたイオンの混合物は、イオントラップに蓄積および貯蔵可能である。次に、貯蔵されたイオンは、負電荷の電子移動試薬の集団を貯蔵する第２のイオントラップを通って、質量選択的軸方向射出を介して軸方向に放出可能である。電子移動解離からの生成物および未反応前駆イオンを含む第２のイオントラップを透過する正電荷のイオンは、飛行時間型質量分析計等の別の質量分析器に送られることが可能である。本実験は、陽イオンの最初の混合物がパルス型イオン源から生じる際に、イオンを効率的に使用してもよい。第１のイオントラップが充填される時間にイオンが形成される場合、第１のイオントラップに貯蔵される実質的に全てのイオンは、新しいイオン集団が次のイオン化によって形成される前に構造解析を受け得る；
２）検体イオンが透過種である透過モードのイオン／イオン反応は、いわゆる「リンク走査」実験に適用可能であり、これは、混合物のスクリーニング目的に有用であることが示されている。例えば、いわゆる「親イオン走査」は、共通フラグメントをもたらすように反応する全ての前駆イオンを観測するものである。親イオン走査は、透過イオンが対象の多重にプロトン化された種である透過モードＥＴＤ実験で実装可能である。Ｎ末端における特定の残留物を有する任意のペプチドを同定することに関心がある場合、タンデム質量分析計の第２の質量分析器が、対象の残留物にのみ関連するｃ１型イオンの質量対電荷比のイオンを通過させるように設定可能である。このように、タンデム質量分析計の第１の質量分析器を走査し、対象の種々のペプチド陽イオンを、貯蔵された電子移動試薬陰イオンを含有するイオントラップに質量依存様式で透過させることによって、特定のｃ１＋フラグメントをもたらすように解離する前駆イオンのスペクトルは記録可能である；
３）検体イオンの電荷の反転は、多重に荷電された試薬イオンをイオントラップに貯蔵し、検体イオンを透過させることによって、透過モードのイオン／イオン方法において達成可能である。例えば、いくつかの単一プロトン化検体イオンは、多重に荷電された脱プロトン化試薬種との多重プロトン移動反応を受けて、陰イオンを形成することが可能である。このような検体イオンは、貯蔵された陰の試薬イオンとともにトラップされてもよく、その後、質量分析されることが可能である。
【００５７】
本発明のほんの数例について上に詳細に説明したが、当業者は、本発明の新規の教示および利点から実質的に逸脱することなく多くの修正が可能であることを容易に理解するだろう。したがって、このような多くの修正は、以下の請求項において定義されるように、本発明の範囲内に含まれると意図される。
【図１】
2010511861.tif 000006
【図２】
2010511861.tif 000007
【図３】
2010511861.tif 000008
【図４】
2010511861.tif 000009
【図５】
2010511861.tif 000010
【図６】
2010511861.tif 000011
【図７】
2010511861.tif 000012
【図８】
2010511861.tif 000013
【図９】
2010511861.tif 000014
【図１０】
2010511861.tif 000015
【国際調査報告】
2010511861.tif 000016
2010511861.tif 000017
2010511861.tif 000018