(57)【要約】本発明は、ＴＡＴ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び微生物で目的のタンパク質を生成する方法を提供する。特に、本発明は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種宿主細胞等の宿主細胞内で、例えば、有機リン加水分解酵素（ＯＰＨ）等の有機リン酸塩分解酵素を発現するためのポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、及び方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記第一の核酸配列がＥＣ３．１．８タンパク質として分類されるリン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ＴＡＴシグナル・ペプチドが、配列番号１−５から選ばれたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記加水分解酵素が、有機リン酸塩加水分解酵素（ＯＰＨ）である、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記加水分解酵素が、配列番号１８の有機リン酸塩加水分解酵素（ＯＰＨ）又はそれの変異体である、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記加水分解酵素をコードする前記第二の核酸配列が、ストレプトミセス種宿主細胞内で前記加水分解酵素を発現するために最適化される、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記単離ポリヌクレオチドが、配列番号２３のＡ４プロモーターと操作可能に連結される、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを含む、単離宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞がストレプトミセス宿主細胞である、請求項８に記載の単離宿主細胞。
【請求項１０】
配列番号１８の有機リン酸塩加水分解酵素又はそれの変異体に連結したＴＡＴ２又はＴＡＴ３シグナル・ペプチドを含む、単離融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記ＴＡＴシグナル・ペプチドが、配列番号１又は５から選ばれる、請求項１０に記載の単離融合ポリペプチド。
【請求項１２】
有機リン酸塩分解酵素を生成する方法であって、
（ａ）宿主細胞で請求項１に記載のポリヌクレオチドを発現する工程、及び
（ｂ）前記酵素を生成する工程
を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞で生成された前記酵素が回収される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞が、ストレプトミセス宿主細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素が、有機リン酸塩加水分解酵素である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年６月１８日に出願された米国仮出願６０／９３６，１８３、及び２００７年６月１８日に出願された米国仮出願６０／９３６，１８６について優先権を主張する。
【０００２】
政府支援
本研究の一部は、米軍と共にエッジウッド化学生物学的センター（Ｅｄｇｅｗｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＥＣＢＣ）とのコンタクト・ナンバーＢＡＡ  ＥＣＢＣ−０４により資金が供給された。従って、合衆国政府は、本発明における所定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、ＴＡＴ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び微生物で目的のタンパク質を生成する方法を提供する。特に、本発明は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種宿主細胞等の宿主細胞内で、例えば、有機リン加水分解酵素（ＯＰＨ）等の有機リン酸塩分解酵素を発現するためのポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
原核生物において、細胞膜を通過するタンパク質転移に用いられる２つの経路が認識されていた。大部分の細胞において、一般的な分泌（Ｓｅｃ）経路が、タンパク質輸送における最も特性化（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）された経路である。Ｓｅｃ経路により輸送されたタンパク質は、未だ折り畳まれていない状態で、膜に埋め込まれたトランスロコン（ｔｒａｎｓｌｏｃｏｎ）を経て、膜を通過し、切断可能なＮ−端末シグナル・ペプチドにより標的とされる位置に、転移される。
【０００５】
第二の一般的な輸送経路は、双アルギニン（ｔｗｉｎ−ａｒｇｉｎｉｎｅ）転移（Ｔａｔ）経路である。Ｓｅｃシステムと異なり、Ｔａｔシステムは、既に折り畳まれたタンパク質基質の輸送に関与する。タンパク質は、Ｔａｔシグナル・ペプチドのＮ−領域で保存された双アルギニンモチーフを含むＮ−端末シグナル・ペプチドを有することでＴａｔ経路の標的とされる。
【０００６】
既に折り畳まれたタンパク質基質を分泌する機能を有するため、Ｔａｔ経路は、分泌タンパク質を生成する重要なメカニズムを示し、多様な農業用殺虫剤中やサリン、ソマン及びＶＸ（Ｏ−エチル−Ｓ−（２−ジイソプロピルアミノエチル）メチルホスホンチオ酸塩（Ｏ−ｅｔｈｙ−Ｓ−（２−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｏｔｈｉｏａｔｅ））等の化学兵器として使用される有機リン酸塩化合物の解毒に用いられるタンパク質の大量生成に有効に使われる。
【発明の概要】
【０００７】
少なくとも一部において、本願に係る開示は、細菌性宿主細胞内で特定タンパク質が、Ｔａｔ経路を用いて生成されることが出来ることの発見に基づいている。従って、本発明は、ＴＡＴ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び宿主細胞で目的のタンパク質を生成する方法を提供する。ＴＡＴ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び宿主細胞内で目的のタンパク質を作り出すための方法を提供する。特に、本発明は、ストレプトミセス種宿主細胞等の宿主細胞内で、例えば、有機リン酸塩加水分解酵素（ＯＰＨ）等の有機リン酸塩分解酵素を発現するためのポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、及び方法に関する。
【０００８】
一の実施態様において、本発明は、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記第一の核酸配列がＥＣ３．１．８タンパク質として分類されるリン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記単離ポリヌクレオチドを提供する。別の実施態様において、本発明に係る単離ポリヌクレオチドは、配列番号１−５から選ばれたアミノ酸配列を有するＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、ＥＣ３．１．８タンパク質として分類されるリン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記第一の核酸配列を含む。別の実施態様において、本発明に係る単離ポリヌクレオチドは、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、有機リン酸塩加水分解酵素（ＯＰＨ）をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記第一の核酸配列を含む。別の実施態様において、前記有機リン酸塩加水分解酵素は、配列番号１８のＯＰＨ又はそれの変異体である。別の実施態様において、本発明は、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、ＥＣ３．１．８タンパク質として分類されるリン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記第一の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記単離ポリヌクレオチドの前記第二の核酸配列が、ストレプトミセス種宿主細胞内でリン酸トリエステル加水分解酵素を発現するためにコドン最適化される、前記単離ポリヌクレオチドを提供する。さらに別の実施態様において、本発明は、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、ＥＣ３．１．８タンパク質として分類されるリン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記第一の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、さらに、配列番号２３のＡ４プロモーターと操作可能に連結される、前記単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０００９】
別の実施態様において、本発明は、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、ＥＣ３．１．８タンパク質として分類されるリン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記第一の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを提供する。いくつかの実施態様において、前記発現ベクターは、配列番号１−５のいずれかのアミノ酸配列を有するＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列、及び、ＥＣ３．１．８タンパク質として分類されるリン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列を含む。いくつかの実施態様において、前記発現ベクターは、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、有機リン酸塩加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記第一の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、前記有機リン酸塩加水分解酵素は、配列番号１８のＯＰＨ又はそれの変異体である。いくつかの実施態様において、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、リン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記第一の核酸配列を含む前記単離ポリヌクレオチドはさらに、配列番号２３のＡ４プロモーターと操作可能に連結される。他の実施態様において、前記リン酸トリエステル加水分解酵素をコードする核酸配列は、ストレプトミセス種宿主細胞内での発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施態様において、ストレプトミセス種宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞である。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、ＥＣ３．１．８タンパク質として分類されるリン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記第一の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを含む、単離宿主細胞を提供する。いくつかの実施態様において、前記宿主細胞は、配列番号１−５のいずれかのＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列、及び、リン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列を含む、発現ベクターを含む。別の実施態様において、前記宿主細胞は、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、有機リン酸塩加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記第一の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを含む。いくつかの実施態様において、前記有機リン酸塩加水分解酵素は、配列番号１８のＯＰＨ又はそれの変異体である。別の実施態様において、前記宿主細胞に含まれる発現ベクターは、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、リン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記第一の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、さらに、配列番号２３のＡ４プロモーターと操作可能に連結される、前記単離ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、前記リン酸トリエステル加水分解酵素をコードする核酸配列は、ストレプトミセス種宿主細胞内での発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施態様において、本発明に係る宿主細胞は、ストレプトミセス種宿主細胞、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞である。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は、配列番号１８の有機リン酸塩加水分解酵素に連結したＴＡＴ２又はＴＡＴ３シグナル・ペプチドを含む、単離融合ポリペプチドを提供する。別の実施態様において、単離融合ポリペプチド中に含まれるＴＡＴシグナル・ペプチドは、配列番号１又は５から選ばれる。
【００１２】
別の実施態様において、本発明は、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、ＥＣ３．１．８タンパク質として分類されるリン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記第一の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを発現する工程、及び前記有機リン酸塩分解酵素を生成する工程を含む、有機リン酸塩分解酵素を生成する方法を提供する。一の実施態様において、本発明に係る方法で生成される有機リン酸塩分解酵素は、有機リン酸塩加水分解酵素である。いくつかの実施態様において、前記有機リン酸塩加水分解酵素は、配列番号１８のＯＰＨ又はそれの変異体である。別の実施態様において、本発明に係る方法はさらに、宿主細胞で生成された酵素を回収する工程を含む。別の実施態様において、本発明に係る方法の宿主細胞はストレプトミセス種宿主細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
当業者は、図面が図解の目的だけのためのものであることを理解する。図面は、いかなる方法でも本発明に係る開示の範囲を限定する意図ではない。
【図１】図１は、Ａｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  Ａ４プロモーター、切断されるＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓセルラーゼ（ＣｅｌＡ）のシグナル配列、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種由来のセルラーゼ１１ＡＧ８遺伝子をコードするポリヌクレオチド、及びセルラーゼ１１ＡＧ３ターミネータ配列を含む、ｐＫＢ１０５ベクターを示す。
【図２】図２は、ＣｅｌＡシグナル・ペプチドがＴＡＴ１シグナル配列に置き換わり、セルラーゼ遺伝子がコドン最適化されたＯＰＨ遺伝子に置き換わった、図１のｐＫＢ１０５ベクターに由来するｐＫＢ２２９ベクターを示す。
【図３】図３は、ＣｅｌＡシグナル・ペプチドがＴＡＴ２シグナル配列に置き換わり、セルラーゼ遺伝子がコドン最適化されたＯＰＨ遺伝子に置き換わった、図１のｐＫＢ１０５ベクターに由来するｐＫＢ２３１ベクターを示す。
【図４】図４は、ＣｅｌＡシグナル・ペプチドがＴＡＴ３シグナル配列に置き換わり、セルラーゼ遺伝子がコドン最適化されたＯＰＨ遺伝子に置き換わった、図１のｐＫＢ１０５ベクターに由来するｐＫＢ２３３ベクターを示す。
【図５】図５は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ配列のＳｐｈＩとＥｃｏＲＩの間の制限酵素認識部位を除去した、ｐＫＢ２３３ベクターに由来するｐＫＢ２３４ベクターを示す。
【図６】図６は、ストレプトミセス内で生成され、及びＴＡＴ１、ＴＡＴ２、及びＴＡＴ３シグナル・ペプチドに融合した宿主細胞内で発現されたＯＰＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析評価を示す。
【図７】図７は、ＴＡＴ３融合タンパク質としてストレプトミセス内で発現されるＯＰＨの生成及び保存性における、Ｚｎ２＋及びＣｏ２＋の添加の効果を示す。
【図８】図８は、トリプシンゲル内（ｉｎ−ｇｅｌ）消化及びＭＡＬＤＩペプチド質量マッピングを用いた、ストレプトミセス細胞で生成される期待されるＯＰＨの同定を示す。
【図９】図９は、ストレプトミセス宿主細胞で生成されたＯＰＨのパラオキソナーゼ活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な記載
本発明は、ＴＡＴ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び宿主細胞で目的のタンパク質を生成する方法を提供する。特に、本発明は、ストレプトミセス種宿主細胞等の宿主細胞内で、有機リン酸塩加水分解酵素（ＯＰＨ）を発現するためのポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、及び方法に関する。
【００１５】
本発明に係る開示は、以下の定義及び実施例を用いてのみ言及することで、詳細に記載される。本明細書で参照される全ての特許及び公報は、特許及び公報で開示される全ての配列を含め、参照により明確に組み込まれる。
【００１６】
本明細書で別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的、科学的用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ及びＳａｉｎｓｂｕｒｙ、「微生物学及び分子生物学辞典（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ出版、ニューヨーク州（１９９４年）及びＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ、「ハーパー・コリンズ生物学辞典（Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ出版、ニューヨーク州（１９９１年）は、本発明で使用される多数の用語の意味を当業者に示す一般的な辞書である。本明細書に記載されているのと同様の又は均等の任意の方法及び物質が、本発明の実施に使用されるが、好ましい方法及び物質は、本明細書に記載される。従って、以下に定義される語は、本明細書の全体を参照することにより、より完全に説明される。また、本明細書で用いられている、単数の語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」とは、文中で別途明確な記載がない限り、複数の場合を含む。数値範囲は、その範囲を定義する数値も含む。別途記載がない限り、核酸は、左から右へ５’から３’方向で記載され、アミノ酸配列は、左から右へアミノ基からカルボキシ基方向でそれぞれ記載される。本発明は、記載された特定の手順、操作方法、及び試薬に限定されず、当業者が使用する状況に依存し、変化し得ることが理解される。
【００１７】
本明細書で示される全ての最大数値限定は、本明細書でより少ない数値限定が明確に記載されているかのように、全てのより少ない数値限定を含むことが意図される。本明細書で示される全ての最小数値限定は、本明細書でより多い数値限定が明確に記載されているかのように、全てのより多い数値限定を含む。本明細書で示される全ての数値範囲は、本明細書でより狭い数値範囲が明確に記載されているかのように、より広い数値範囲の中にある、全てのより狭い数値範囲を含む。
【００１８】
本明細書で示される見出しは、参照により全体として本明細書に含まれ得る多様な側面又は実施態様を限定しない。従って、以下に定義される語は、本明細書の全体を参照することにより、より完全に説明される。
【００１９】
定義
本明細書の「有機リン酸塩分解酵素」の語は、有機リン酸塩中のリン酸エステル結合の加水分解を触媒する酵素を示す。
【００２０】
本明細書の「リン酸トリエステル加水分解酵素」又は「リン酸トリエステル」の語は、ホスホン酸及びホスフィン酸のエステル体を含む、有機リン化合物（パラオキソン等）に働く、ＥＣ３．１．８として分類される酵素を示す。リン酸トリエステル加水分解酵素は、ＯＰＨとしても知られるアリルジアルキルホスファターゼ（ＥＣ３．１．８．１）及び、ＤＦＰ分解酵素としても知られるジイソプロピル−フルオロホスファターゼ（ＥＣ３．１．８．２）を含む。
【００２１】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」の語は、ペプチド結合で連結されたアミノ酸残基の単鎖で作られた化合物を示す。本明細書で用いられる「タンパク質」の語は、「ポリペプチド」の語と同義か、又は、さらに、２以上のポリペプチドの複合体を示すことが出来る。アミノ酸残基に用いられる従来の３文字コード又は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）及びバリン（Ｖ）の１文字コードが本明細書で用いられる。
【００２２】
本明細書で用いられる「融合ポリペプチド」又は「Ｔａｔ融合ポリペプチド」の語は、目的のタンパク質に、直接又はリンカーを介するかの、いずれかで連結されたＴａｔシグナル・ペプチドを示す。
【００２３】
本明細書で用いられる「シグナル・ペプチド」は、分泌されるためのタンパク質上のアミノ末端伸張部分を示す。つまり、全ての分泌タンパク質は、前駆体タンパク質を標的とし、前駆体タンパク質が膜を通過する転移に、極めて重要な役割を担うアミノ末端伸張部分を利用する。さらに、アミノ末端伸張部分は通常、膜輸送の間又は膜輸送の直後に、シグナル・ペプチダーゼで、タンパク質分解的に除去される。
【００２４】
「Ｔａｔシグナル・ペプチド」は、２つの連続したアルギニン残基を含み、タンパク質の分泌に、既に折り畳まれた構造で機能する、Ｎ−末端で伸張された配列を示す。「Ｔａｔシグナル・ペプチド」は、「Ｔａｔペプチド」又は「Ｔａｔポリペプチド」と置換可能に言及されることが出来る。
【００２５】
本明細書で用いられる「目的のタンパク質」又は「目的のポリペプチド」は、宿主細胞で発現及び分泌されるタンパク質を示す。目的のタンパク質は、現在まで原核生物での発現に考慮されてきた任意のタンパク質とすることが出来る。前記目的のタンパク質は、宿主に対して、同種又は異種のいずれかであることが出来る。目的のタンパク質と同種である場合、過剰発現（ｏｖｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、前記宿主での正常レベルを超えた発現である。目的のタンパク質と異種である場合、いずれの発現も過剰発現である。
【００２６】
本明細書で用いられる「異種タンパク質」の語は、宿主細胞で自然に発生しないタンパク質又はポリペプチドを示す。異種タンパク質の例は、エステラーゼ、プロテアーゼ、グリコシラーゼを含む加水分解酵素、例えば、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、又はムターゼ等の異性化酵素、リアーゼ、リガーゼ、例えば、キナーゼ、トランスアミナーゼ、及びホスホトランスフェラーゼ等のトランスフェラーゼ、酸化酵素や脱水素酵素等のオキシドレダクターゼのような酵素を含むが、それらに限られない。異種遺伝子は、ワクチン及び抗体と同様に、増殖因子、サイトカイン、リガンド、受容体、及び抑制剤等の治療法上重要なタンパク質又はペプチドをコードすることが出来る。前記遺伝子は、エステラーゼ、プロテアーゼ、例えば、アミラーゼ及びグルコアミラーゼ、セルラーゼ、酸化酵素及びリパーゼ等のカルボヒドラーゼのような商業的に重要な産業タンパク質又はペプチドをコードすることが出来る。目的の遺伝子は、自然発生の遺伝子、突然変異遺伝子、又は合成の遺伝子とすることが出来る。
【００２７】
「同種タンパク質」の語は、野生型又は宿主細胞で自然発生のタンパク質又はポリペプチドを示す。本発明は、自然発生の同種タンパク質と比べ、例えば挿入、欠損又は割り込み（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ）を含む等の変異体である、同種タンパク質を含む。
【００２８】
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」の語は、置換可能に使用され、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びｃＤＮＡ分子を含む。本明細書で用いられるように、当該語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかで、任意の長さのヌクレオチドの多量体型を示す。当該語は、分子の一次構造のみを示し、従って、二本鎖及び単鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。また、当該語は、当該技術分野で知られる標識、メチル化、「キャップ」、１以上の自然発生ヌクレオチドと類似物との置換、ポリヌクレオチドの非修飾型と同様に、例えば、非荷電性のリンケージ（例えば、メチルホスホン酸塩、ホスホトリエステル、ホスホアミド化塩、カルバミン酸塩等）を有するもの及び荷電性のリンケージ（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するもの、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナル・ペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等を含む）等の懸垂部分（ｐｅｎｄａｎｔ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含むもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）を有するもの、キレート類（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾リンケージ（例えば、アルファアノマー核酸等）を有するもの等のインターヌクレオチドの修飾を含むがそれらに限られない、既知のタイプの修飾をも含む。一般に、本発明で提供される核酸セグメントは、ゲノム及び短いオリゴヌクレオチドリンカーの断片、又は、一連のオリゴヌクレオチド、又は、個々のヌクレオチドから組み立てられ、微生物又はウイルス性のオペロン、又は真核生物の遺伝子由来の調節要素を含む、組み換え転写単位で発現されることが可能な合成核酸を提供することが出来る。遺伝情報の縮退のため、２以上のコドンが、特定のアミノ酸をコードするために使用されることができ、本発明は、特定のアミノ酸配列をコードする全てのポリヌクレオチドを包括する。
【００２９】
他の配列と、特定のパーセント（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％等）の配列同一性を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドは、並べられた場合に、２つの配列を比較し、そのパーセントの塩基又はアミノ酸残基が同一であることを意味する。当該アライメント及びパーセント相同性又は同一性は、当該技術分野で知られる、任意の適したソフトウェアプログラム、例えば、分子生物学における現代プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他（編集）１９８７年、付録３０、７．７．１８節）で記載されるものを用いて決定されることが出来る。いくつかの実施態様において、前記プログラムは、ＧＣＧパイルアップ・プログラム（ＧＣＧ  Ｐｉｌｅｕｐ  ｐｒｏｇｒａｍ）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ他（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５、２４４４−２４４８ページ）、及びＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴマニュアル、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｎａｔｌ  Ｃｅｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｉｎｆ．、Ｎａｔｌ  Ｌｉｂ．Ｍｅｄ．（ＮＣＩＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．及びＡｌｔｓｃｈｕｌ他、（１９９７年）ＮＡＲ  ２５、３３８９−３４０２ページ）を含む。他の模範的なアライメント・プログラムは、ＡＬＩＧＮプラス（ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ）（サイエンティフィック・アンド・エデュケーショナル・ソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、ペンシルバニア州）、好ましくはデフォルト・パラメーターを用いたもの、及びシークエンス・ソフトウェア・パッケージ・バージョン６．０（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．０）（ジェネティックス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン大学、マディソン、ウィスコンシン州）で入手可能なＴＦＡＳＴＡデータ・サーチング・プログラム（ＴＦＡＳＴＡ  Ｄａｔａ  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒａｍ）である。本発明で包括される配列は、厳しいハイブリダイゼーション条件下において、本発明に係るポリヌクレオチドとハイブリダイズするものを含むことが当業者に理解される。
【００３０】
「キメラ遺伝子」としても本明細書で示される、「異種」核酸構築体又は配列は、発現される細胞に対して天然ではない配列の一部を有する。制御配列に関しての異種は、現在発現を調節している遺伝子と同じ遺伝子を調節するため、自然で機能しない制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）を示す。一般に、異種核酸配列は、存在する細胞又はゲノムの一部に内因性ではなく、感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等により細胞に加えられている。「異種」核酸構築体は、野生型細胞で見られる制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同様又は異なる制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせを含むことが出来る。制御配列、例えば、転写制御配列は通常、異種タンパク質コード配列、又は、選択マーカーキメラ遺伝子において、形質転換された細胞に抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子に、操作可能に連結される。本発明に係る、典型的なキメラ遺伝子又は異種核酸構築体は、転写調節領域、シグナル・ペプチドコード配列、タンパク質コード配列、及びターミネータ配列を含む。転写調節領域は、構成的又は誘導的であることが出来る。
【００３１】
本明細書で用いられる「ベクター」の語は、１以上の細胞型へ核酸を導入するよう設計されたポリヌクレオチド配列を示す。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、カセット等を含む。
【００３２】
本明細書で用いられる「発現ベクター」の語は、外来細胞に異種ＤＮＡ断片を組み込み、発現することが可能なベクターを示す。多くの原核生物起源及び真核生物起源の発現ベクターは、商業的に入手可能である。
【００３３】
本明細書で用いられる「核酸構築体」及び「発現ベクター」の語は、置換可能に用いられ、配列を宿主細胞又は有機体内に導入するのに使用される核酸を示す。核酸は、ＰＣＲ又は当業者に既知の他の任意の適した技術によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されることが出来る。核酸構築体又は組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアの核酸、色素体核酸、ウイルス、又は核酸断片に組み込まれることが出来る。通常、発現ベクターの組み換え発現カセット部分又は核酸構築体は、他の配列の中でも、転写されるべき核酸配列及びプロモーターを含む。いくつかの実施態様において、発現ベクターは、宿主細胞内で異種核酸断片を組み込み、発現する能力を有する。多くの原核生物及び真核生物の発現ベクターが商業的に入手可能である。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００３４】
本明細書で用いられる「プラスミド」の語は、クローニングベクターとして使用される円形の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築体を示し、多くの細胞及びいくつかの真核生物で染色体外の自己複製遺伝子要素を形成する。
【００３５】
本明細書で用いられる「プロモーター」の語は、遺伝子の直接の転写に機能する核酸配列を示す。前記プロモーターは一般に、標的遺伝子が発現される宿主細胞に適切である。プロモーターと共に他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも称される）は、特定遺伝子の発現に必要である。一般に、転写調節配列及び翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、及びエンハンサー又は活性化配列を含むが、それらに限られない。
【００３６】
他の核酸配列と機能的に関連するよう置かれるとき、核酸は、「操作可能に連結される」。例えば、ポリペプチドの分泌に加わるプレタンパク質として発現される場合、分泌リーダー（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｌｅａｄｅｒ）をコードする核酸は、前記ポリペプチドをコードする核酸に操作可能に連結される。配列の転写に影響する場合、プロモーター又はエンハンサーは、コーディング配列に操作可能に連結される。あるいは、翻訳を促進するために位置付けられている場合、リボゾーム結合部位は、コーディング配列に操作可能に連結される。一般に、「操作可能に連結される」ことは、連結される核酸配列が隣接し、また、分泌リーダーの場合、連結される核酸配列が隣接し、リーディング・フェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）内であることを意味する。しかしながら、エンハンサー及びプロモーターは、隣接することを必要としない。連結は、好都合な制限部位でライゲーションすることで達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが慣習に従って使用される。
【００３７】
第二のポリペプチドに「連結された」第一のポリペプチドは一般に、連結されるポリペプチド配列が隣接し、融合タンパク質を形成することを意味する。
【００３８】
本明細書で用いられる「遺伝子」の語は、ポリペプチド鎖の生成に関わるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡセグメント等）を示し、前記ポリヌクレオチドは、個々のコーディング・セグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）と同様に、例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）又は「リーダー」配列、及び、３’ＵＴＲ又は「トレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ）」配列等のコーディング領域の前にある領域及びその後にある領域を含むか、又は、含まないことが出来る。
【００３９】
細胞、核酸、タンパク質又はベクターに関連して使用される「組み換え」の語は、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが、異種核酸又はタンパク質の導入により、又は、野生型核酸又はタンパク質の改変により、修飾されたか、又は細胞がそのように修飾された細胞に由来するか、又は、タンパク質が非野生型系又は遺伝学的に修飾された環境、例えば、原核生物系又は真核生物系に用いられる発現ベクター内等で発現されることを示す。従って、例えば、組み換え細胞は、細胞の野生型（非組換え型）で見られない核酸又はポリペプチドを発現するか、又は他に、異常に発現する、不十分に発現する、過剰に発現する、又は全く発現しないように、野生型遺伝子を発現する。
【００４０】
本願発明で細胞に関連して用いられる「形質転換された」、「安定に形質転換された」及び「遺伝子組み換え」の語は、前記細胞が、ゲノムに統合した非野生型（例えば、異種）核酸配列を有するか、又は複数の世代に渡って維持されるエピソームプラスミドとして非野生型核酸配列を有する。
【００４１】
本明細書で用いられる「発現」の語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成される過程を示す。前記過程は、転写と翻訳の両方を含む。
【００４２】
本明細書で用いられる「操作可能に連結された」の語は、転写が開始される方法で、コーディング配列に対して転写調節核酸及び翻訳調節核酸が位置されることを意味する。一般に、これは、プロモーター及び転写開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ又はｓｔａｒｔ）配列が、コーディング領域の５’に位置することを意味する。転写調節核酸及び翻訳調節核酸は一般に、タンパク質の発現に使用される宿主細胞に適切である。多数のタイプの適切な発現ベクター、及び適した調節配列が、多様な宿主細胞の当該技術分野で知られる。
【００４３】
ＯＰＨ等の所望のタンパク質に関連して用いられる「生成」及び「分泌」の語は、発現の後に続く過程を包括し、タンパク質分泌の間に起こることが知られる、シグナル・ペプチドを取り除く過程、及び所望のタンパク質を宿主細胞外に転移する過程の処理工程を含む。
【００４４】
ＯＰＨに関連して用いられる「処理する（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」又は「処理される（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）」の語は、ＯＰＨ等の全長タンパク質が、活性成熟酵素になるために受ける、成熟過程を示す。
【００４５】
本明細書で用いられる「転写コントロール下」の語は、ポリヌクレオチド配列、通常ＤＮＡ配列の転写が、転写の開始又は促進に寄与する要素に操作可能に連結されることに依存することを示す。
【００４６】
本明細書で用いられる「翻訳コントロール下」の語は、ｍＲＮＡが形成された後に起こる調節過程を示す。
【００４７】
本明細書で用いられる「プラスミド」の語は、クローニングベクターとして使用される円形の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築体を示し、いくつかの真核生物又は原核生物で染色体外の自己複製遺伝子要素を形成するか、又は、宿主染色体に統合する。
【００４８】
細胞への核酸配列の挿入の文脈で用いられる「導入された」の語は、「トランスフェクション」、又は「形質転換」又は「形質導入」を意味し、さらに真核細胞又は原核細胞への核酸配列を組み込むことの言及を含む。ここで、前記核酸配列は、細胞ゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡ）へ組み込まれるか、自律レプリコンへ転換されるか、又は一時的に発現されることが出来る（例えば、トランスフェクトｍＲＮＡ）。
【００４９】
本明細書で用いられる「回収される」、「単離される」、及び「分離される」の語は、自然に関連付けられる少なくとも１の成分から移動される化合物、タンパク質、細胞、核酸又はアミノ酸を示す。
【００５０】
本明細書で用いられる「活性」又は「生物学的活性」の語は、例えば、酵素活性等の特定のタンパク質に関連する活性を示す。生物学的活性は、前記タンパク質に起因すると通常当業者に考えられる任意の活性を示す。
【００５１】
本明細書で用いられる「比活性」の語は、特定の条件下で単位時間あたり、酵素調製剤により、生成のために転換される基質のモル数として定義される酵素単位を意味する。比活性は通常、タンパク質の単位（Ｕ）／ｍｇとして表現される。
【００５２】
「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ）」の語は、「を起源とする（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ  ｆｒｏｍ）」、「得られた（ｏｂｔａｉｎｅｄ）」、「から得られることが出来る（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ  ｆｒｏｍ）」及び「から単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ）」の語を包括する。
【００５３】
「宿主細胞」又は「宿主株」の語は、ベクターを含み、発現構築体の複製、及び／又は転写又は転写と翻訳（発現）を支持する細胞を意味する。いくつかの実施態様において、宿主細胞又は宿主株は、ストレプトミセス細胞を含むがそれらに限られない、原核生物、例えば、細菌性細胞等である。
【００５４】
「変異体」の語は、例えば、自然発生の、又は、野生型核酸又はタンパク質等の対照核酸又はタンパク質と比べ、１以上の異なるか、追加されたか、又はより少ないヌクレオチド又はアミノ酸を含む核酸又はタンパク質の領域を示す。変異タンパク質は、対照タンパク質の機能を保有する、すなわち、前記変異タンパク質は、機能的に活性な対照タンパク質の変異体であることが意図される。いくつかの実施態様において、前記機能を果たす変異タンパク質の能力は、対照タンパク質のものと等しいか、又はそれより高い。
【００５５】
本明細書で用いられる「ストレプトミセス種」の語は、当業者に知られるように、ストレプトミセス属内の全種を含む。当該語は、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｓ．ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ｆｅｌｌｅｕｓ、Ｓ．ｆｅｒｒａｌｉｔｉｓ、Ｓ．ｆｉｌａｍｅｎｔｏｓｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｈｅｌｖａｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓ．ｌｙｓｏｓｕｐｅｒｆｉｃｕｓ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ、Ｓ．ｐｌｉｃａｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｓｃａｂｉｅｓ、Ｓ．ｓｏｍａｌｉｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ、及びＳ．ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒを含むが、それらに限られない。
【００５６】
本発明に係る開示は、細菌性宿主細胞内で特定タンパク質が、Ｔａｔ経路を用いて生成されることが出来ることの発見に基づいている。従って、本発明に係る開示は、宿主細胞で目的のタンパク質を生成する方法を提供する。本発明に係る開示はまた、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドにコードされるＴａｔシグナル・ペプチド配列及び融合ポリペプチドを提供する。特に、本発明は、ストレプトミセス種宿主細胞等の宿主細胞内で、例えば、有機リン酸塩加水分解酵素（ＯＰＨ）等の有機リン酸塩分解酵素を発現するためのポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、及び方法に関する。
【００５７】
一の側面において、本発明に係る開示は、第一の核酸配列及び第二の核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。第一の核酸配列は、Ｔａｔシグナル・ペプチドをコードし、第二の核酸配列は目的のタンパク質をコードする。第一の核酸配列は一般に、第二の核酸配列に操作可能に連結される。
【００５８】
第一の核酸によりコードされるＴａｔシグナル・ペプチドは、既知の、又は後に発見された、Ｔａｔ経路を経てポリペプチドの分泌に関わる任意のＴａｔシグナル・ペプチドとすることが出来る。通常、Ｔａｔシグナル・ペプチドは、双アルギニン（すなわち、「ＲＲ」）モチーフを含むアミノ酸配列を含む。ここで、ＲＲは、２つの隣接するアルギニンアミノ酸を表す。いくつかの実施態様において、Ｔａｔシグナル・ペプチド配列は、ポリペプチドのＮ−末端から始めの５、１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０のアミノ酸中にＲＲモチーフを含む。他の実施態様において、Ｔａｔシグナル・ペプチド配列は、ポリペプチドのＮ−末端から始めの５、１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０のアミノ酸中にないＲＲモチーフを含む。
【００５９】
いくつかの実施態様において、Ｔａｔシグナル・ペプチドは、ＴＡＴ２又はＴＡＴ３シグナル・ペプチド、例えば、配列番号１−４のいずれかのアミノ酸配列を含むもの、又はＴＡＴ３（配列番号５）シグナル・ペプチド等であり、目的のタンパク質は、エステラーゼ、例えば、ホスホトリエステラーゼである。いくつかの実施態様において、Ｔａｔシグナル・ペプチドは、ＴＡＴ２又はＴＡＴ３シグナル・ペプチド、又はタンパク質のＳＣＯ２２８６（配列番号６）、ＳＣＯ３７９０長配列（配列番号７）、ＳＣＯ６５８０長配列（配列番号８）、ＳＣＯ１５９０（配列番号９）、ＳＣＯ１８２４（配列番号１０）、ＳＣＯ６５８０短配列（配列番号１１）、ＳＣＯ３７９０短配列（配列番号１２）、ＳＣＯ７３６（配列番号１３）、ＳＣＯ２０６８（配列番号１４）、ＳＣＯ３４７１（配列番号１５）、又はＳＣＯ７６７７（配列番号１６）のシグナル・ペプチドであり、目的のタンパク質は、ＯＰＨ又はそれの生物学的に活性な変異体又は断片である（例えばＰＣＴ出願番号ＧＢ／００４８１６等参照）。いくつかの実施態様において、Ｔａｔシグナル・ペプチドは、表１で示される配列番号１から配列番号１６のいずれかのアミノ酸配列と実質的に同一、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、Ｔａｔシグナル・ペプチドは、ＴＡＴ２又はＴＡＴ３シグナル・ペプチドである。いくつかの実施態様において、Ｔａｔシグナル・ペプチドは、ＴＡＴ３シグナル・ペプチドである。いくつかの実施態様において、Ｔａｔシグナル・ペプチドは、配列番号５のＴＡＴ３シグナル・ペプチドであり、目的のタンパク質は、ホスホトリエステラーゼ、例えば、フラボバクテリウム種株ＡＴＣＣ２７５５１由来のＯＰＨ（Ｍｕｌｂｒｙ  ｅｔ  Ｋａｒｎｓ  Ｊ．、上記）、シュードモナス・ディミニュータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＯＰＨ（Ｍｕｎｎｅｃｋｅ、上記）、又はアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）（Ｈｏｒｎｅ他、上記）又はそれらの生物学的に活性な変異体又は断片等である。
【００６０】
第二の核酸配列は、目的のタンパク質又はそれの断片をコードする。目的のタンパク質は、Ｔａｔ経路を経て宿主細胞で分泌されることが出来る、既知の、又は後に発見された、任意のタンパク質又はポリペプチドとすることが出来る。前記タンパク質の例は、エステラーゼ、プロテアーゼ、グリコシラーゼ等の加水分解酵素、例えば、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、又はムターゼ等の異性化酵素、リアーゼ、リガーゼ、例えば、キナーゼ、トランスアミナーゼ、及びホスホトランスフェラーゼ等のトランスフェラーゼ、酸化酵素や脱水素酵素等のオキシドレダクターゼを含むが、それらに限られない。目的のタンパク質はまた、ワクチン及び抗体と同様に、増殖因子、サイトカイン、リガンド、受容体、又は抑制剤等の治療法上重要なタンパク質又はポリペプチドとすることが出来る。目的のタンパク質は、エステラーゼ、プロテアーゼ、例えば、アミラーゼ及びグルコアミラーゼ、セルラーゼ、酸化酵素及びリパーゼ等のカルボヒドラーゼのような商業的に重要な産業タンパク質又はペプチドとすることが出来る。
【００６１】
目的のタンパク質は、自然発生のタンパク質、突然変異タンパク質、又は合成のタンパク質とすることが出来る。目的のタンパク質はまた、全長のタンパク質の生物学的に活性な断片であることが出来る。当業者は、目的のタンパク質の意図される活性又は機能に基づく前記断片を選択することが出来る。さらに、目的のタンパク質は、異種又は同種タンパク質とすることが出来る。同種タンパク質は、自然発生のタンパク質のアミノ酸配列を含むことが出来るか、又は自然発生の同種タンパク質と比べ、挿入、欠損又は割り込みを含む、配列を含むことが出来る。
【００６２】
いくつかの実施態様において、目的のタンパク質をコードする第二の核酸は、特定宿主の発現のために、コドン最適化されるが、必ずしもそうである必要はない。コドン最適化は、外来宿主細胞での異種ポリペプチドの効率的な翻訳に用いられる、当業者に周知の技術である。コドン最適化は、例えば、選択の宿主細胞での発現のため、目的の特定タンパク質をコードする遺伝子を最適化する、ジーンアート（ＧｅｎｅＡｒｔ）（トロント、カナダ）等の商業サービス等で行われることが出来る。
【００６３】
いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は、有機リン酸塩分解酵素である。一の実施態様において、有機リン酸塩分解酵素は、リン酸トリエステル加水分解酵素（ＥＣ３．１．８）、すなわち、アリルジアルキルホスファターゼ（ＥＣ３．１．８．１）又はジイソプロピルフルオロホスファターゼ（ＥＣ３．１．８．２）である。アリルジアルキルホスファターゼはまた、有機リン酸塩加水分解酵素（ＯＰＨ）、パラオキソナーゼ、Ａ−エステラーゼ、アリルトリホスファターゼ、有機リン酸塩エステラーゼ、エステラーゼＢ１、エステラーゼＥ４、パラオクソンエステラーゼ、ピリミホスメチロキソンエステラーゼ、ＯＰＡアンヒドラーゼ、有機リン酸塩加水分解酵素、ホスホトリエステラーゼ、パラオクソン加水分解酵素、ＯＰＨ、又は、有機リン酸アンヒドラーゼとしても、知られる。ジイソプロピルフルオロホスファターゼはまた、ＤＦＰ分解酵素、タブナーゼ（ｔａｂｕｎａｓｅ）、ソマナーゼ（ｓｏｍａｎａｓｅ）、有機リン酸アンヒドロラーゼ、有機リン酸塩酸アンヒドラーゼ、ＯＰＡアンヒドラーゼ、ジイソプロピルホスホフルオリダーゼ、ジアルキルフルオロホスファターゼ、ジイソプロピルホスホロフルオリデイト（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｆｌｕｏｒｉｄａｔｅ）加水分解酵素、イソプロピルホスホロフルオリダーゼ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｆｌｕｏｒｉｄａｓｅ）、及びジイソプロピルフルオロホスホネートデハロゲナーゼとしても、知られる。ホスホトリエステラーゼ（ＯＰＨ）は、アミドヒドロラーゼスーパーファミリー（Ｓｅｉｂｅｒｔ及びＲａｕｓｈｅｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４４、６３８３−６３９１ページ、２００５年）、すなわち、異なる化学的性質（ホスホエステル、エステル、アミド等）を有する広範囲の化合物の加水分解を触媒する酵素のメンバーである。本発明は、フラボバクテリウム種株ＡＴＣＣ２７５５１（Ｍｕｌｂｒｙ  ｅｔ  Ｋａｒｎｓ  Ｊ．、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１、６７４０−６７４６ページ、１９８９年）、シュードモナス・ディミニュータＯＰＨ（Ｍｕｎｎｅｃｋｅ、ＤＭ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２、７−１３ページ、１９７６年）、及びアグロバクテリウム・ラジオバクター由来の非常に類似した（９０％配列同一性）のＯｐｄＡ（Ｈｏｒｎｅ他、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２２、１−８ページ、２００３年）を含む、細菌種のＯＰＨ酵素を包括する。いくつかの実施態様において、ＯＰＨは配列番号１８、又はそれの変異体を有する。
【００６４】
有機リン酸塩加水分解酵素（ＯＰＨ、ＥＣ３．１．８．１）は、多様なホスホン酸結合を加水分解することによる、多くの有機リン神経毒を解毒する、二量体細菌性酵素である。害虫駆除を成功させた殺虫剤の使用は、農業作物生産における主要な功績をもたらした。最も人気のあるタイプの殺虫剤の一つは、その急性の神経毒で害虫を効果的に駆除する、有機リン酸塩（ＯＰ）ファミリーである。殺虫剤（ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ）及び殺虫剤（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ）としてのＯＰ化合物の有効性はまた、人体及び環境に対して危険となり得る。ＯＰ及びその化合物のファミリーは、サリン、ソマン及びＶＸ（Ｏ−エチル−Ｓ−（２−ジイソプロピルアミノエチル）メチルホスホンチオ酸塩等の化学兵器と構造的類似性を共有する強力な神経毒である。それらは、コリンエステラーゼ阻害薬として機能し、昆虫と人間の両方で次々に神経伝達を混乱させる。ＯＰＨは、一般的な殺虫剤及びサリン及びソマン等の構造的に類似の化学兵器（Ｄｕｍａｓ他、Ｊ  ｂｏｉｌ  Ｃｈｅｍ  ２６１、１９６５９−１９６６５ページ、１９８９年）を含む、多様なＯＰ神経毒を加水分解することが可能である。
【００６５】
前記酵素の天然基質及び機能は未知のままであるが、前記酵素は、ホスホトリエステル殺虫剤パラオクソンのＰ−Ｏ結合の加水分解で最も効果的であり、拡散限界に近い触媒反応速度を有する（１０８−１０９Ｍ−１Ｓ−１）。野生型ＯＰＨの活性は、デメトン−ＳのＰ−Ｓ結合（Ｋｃａｔ＝４ｓ−１）に対してより限られた有効性を示す、異なるホスホノチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｔｈｉｏａｔｅ）基質間で変化する（Ｌａｉ他、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３１８、５９−６４ページ、１９９５年、Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉ他、Ｂｉｏｃａｔａｌ．Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍ．１５、２９７−３１２ページ、１９９７年、ｄｉＳｉｏｕｄｉ他、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  １１９−１２０、２１１−２２３ページ、１９９９年）。化学兵器ＶＸ（Ｏ−エチル−Ｓ−（２−ジイソプロピルアミノエチル）メチルホスホンチオ酸塩）及びＶＲ（Ｏ−イソブチルＳ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメチルホスホノチオエート（Ｏ−ｉｓｏｂｕｔｙｌ  Ｓ−Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｏｔｈｉｏａｔｅ））が、当該分類のやや加水分解された化合物（Ｐ−Ｓ結合）に属する（Ｌａｉ他、１９９５年、上記、Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉ他、１９９７年、上記、Ｒａｓｔｏｇｉ他、１９９７年、上記）。前記ホスホノチオエート神経剤を分解する、ＯＰＨの能力を促進する試みにおいて、野生型ＯＰＨの変異体を形成することによる、ＯＰＨの触媒有効性及び基質特異性を向上させることに、研究努力が集中していた（Ｌａｉ他、１９９６年、上記、ｄｉＳｉｏｕｄｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８、２８６６−２８７２ページ、１９９９年、Ｈｉｌｌ他、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５、８９９０−８９９１ページ、２００３年）。従って、いくつかの実施態様において、目的のタンパク質はＯＰＨの変異体である。ＯＰＨの変異体は、有機リン酸塩を加水分解する能力を保有することが意図される。
【００６６】
別の実施態様において、有機リン酸塩分解酵素は、例えば、アルテロモナスの株で同定されたＯＰＡＡのような、有機リン酸アンヒドロラーゼ（ＯＰＡＡ）等のプロリダーゼである（Ｃｈｅｎｇ他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９、３１３８−３１４０ページ、１９９３年）。さらに別の実施態様において、有機リン酸塩分解酵素は、ＨＤＬ関連ヒトパラオキソナーゼ（ＨＰＯＮ）（Ｈａｒｅｌ，Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１、４１２−４１９ページ、２００４年）である。
【００６７】
いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は、加水分解酵素、例えば、酸化酵素等のオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、リアーゼ、異性化酵素、リガーゼ、又は商業的又は治療法上重要なタンパク質又はポリペプチドである。いくつかの実施態様において、加水分解酵素は、エステラーゼ又は金属依存型加水分解酵素である。いくつかの実施態様において、エステラーゼはホスホトリエステラーゼ、例えば、ＥＣ３．１．８タンパク質として分類されるホスホトリエステラーゼである。
【００６８】
いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は、少なくとも１の二価金属イオンに関連する金属依存型加水分解酵素である。金属依存型加水分解酵素のスーパーファミリー（アミドヒドロラーゼ・スーパーファミリーとも呼ばれる）は、３次元折り畳み構造（ＴＩＭバーレル）及び活性部位の詳細において保存されているタンパク質の大きいグループである。メンバーのかなりの大部分は、４つのヒスチジン残基及び１つのアスパラギン酸残基を伴う、保存された金属結合部位を有する。一般的な反応メカニズムにおいて、金属イオン（又は、複数の金属イオン）は、基質に対する求核攻撃のための水分子を脱プロトン化する。ファミリーは、ウレアーゼ・アルファ、アデノシン・デアミナーゼ、ホスホトリエステラーゼ、ジヒドロオロターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｏｒｏｔａｓｅ）、アラントイナーゼ、ヒダントイナーゼ（ｈｙｄａｎｔｏｉｎａｓｅ）、ＡＭＰ、アデニン及びシトシンデアミナーゼ、イミダゾロンプロピオナーゼ（ｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｅｐｒｏｐｉｏｎａｓｅ）、アリルジアルキルホスファターゼ、クロロヒドロラーゼ（ｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、ホルミルメタノフラン（ｆｏｒｍｙｌｍｅｔｈａｎｏｆｕｒａｎ）脱水素酵素等を含む。
【００６９】
いくつかの実施態様において、金属依存加水分解酵素はＯＰＨである。ＯＰＨは多くの異なる金属を機能上適応させることが出来る。ＯＰＨのＺｎ２＋型は、４０ｋｃａｌ／ｍｏｌの立体配座の安定性を有する、今まで同定された中で最も安定した二量体タンパク質の一つである。また、Ｃｏ２＋型は、最も活性な金属リガンド型である（Ｇｒｉｍｓｌｅｙ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６、１４３６６−１４３７４ページ、１９９７年）。ＯＰＨに関連付けることが出来る、二価金属イオンの例は、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、及びＣｄ２＋を含むが、それらに限られない。いくつかの実施態様において、前記二価金属イオンは、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、及びＣｄ２＋を含むが、それらに限られない。いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は、２つの二価金属イオンに関連付けられる金属依存加水分解酵素である。前記２つの二価金属イオンは同じであるか、又は異なることが出来る。いくつかの実施態様において、金属依存加水分解酵素はＯＰＨであり、ＯＰＨが関連付けられる２つの二価金属イオンは、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００７０】
いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は、有機リン酸塩加水分解酵素（「ＯＰＨ」）、ヘキソース酸化酵素（「ＨＯＸ」）、ソルビトール酸化酵素（「ＳＯＸ」）、アセチルトランスフェラーゼ（「ＡＣＴ」）、又はそれらの生物学的に活性な変異体又は断片である。いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は、ＯＰＨ又はそれの生物学的に活性な変異体又は断片である。
【００７１】
いくつかの実施態様において、目的のタンパク質はＯＰＨであり、ＯＰＨをコードする第二の核酸配列は、原核生物の宿主細胞におけるＯＰＨの発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞等のストレプトミセス種宿主細胞である。
【００７２】
いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は加水分解酵素であり、グリコシラーゼ又はグリコシド加水分解酵素ではない。いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は加水分解酵素であり、ＥＣ３．２．１タンパク質として分類される酵素ではない。いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は加水分解酵素であり、キシラナーゼＡ又はキトサナーゼではない。
【００７３】
いくつかの実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、プロモーターに操作可能に連結される。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の、又は後に発見された任意の適したプロモーターに連結することが出来る。前記プロモーターは、目的のタンパク質が発現される原核生物の宿主に、固有又は異種であることが出来る。プロモーターの例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒＡ４プロモーター（本明細書配列番号２３）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒＡ４長配列プロモーター（Ａ４長配列プロモーター）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒＡ４−５’プロモーター（米国特許公開２００６／０１０５４２５）、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓのグルコース・イソメラーゼ（ＧＩ）プロモーター及び派生ＧＩ（ＧＩＴ）プロモーター（米国特許番号６，５６２，６１２及びＥＰＡ３５１０２９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（配列番号１）由来のグルコース・イソメラーゼ（ＧＩ）プロモーター、短い野生型ＧＩプロモーター、１．５ＧＩプロモーター、１．２０ＧＩプロモーター、又はＷＯ０３／０８９６２１に記載されるような変異体ＧＩプロモーターのいずれか、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅアミノグリコシドの３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子のａｐｈプロモーター、ｓｓｉプロモーター、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓキシラナーゼｘｌｎＡプロモーターを含むが、それらに限られない。いくつかの実施態様において、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸であって、ＥＣ３．１．８として分類されるリン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸と操作可能に連結される第一の核酸を含む、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２３のＡ４プロモーターに操作可能に連結される。
【式１】
【００７４】
2010530242.tif 000003
【表１】
2010530242.tif 000004
2010530242.tif 000005
2010530242.tif 000006
2010530242.tif 000007
【００７５】
別の側面において、本願に係る開示は、Ｔａｔシグナル・ペプチド及び本発明に係る目的のタンパク質を含む、融合ポリペプチドを提供する。本明細書で列挙されるＴＡＴシグナル・ペプチドのいずれか一つは、目的のタンパク質に融合される。いくつかの実施態様において、本発明は、配列番号１８又はそれの変異体の有機リン酸塩加水分解酵素に操作可能に連結した、例えば、配列番号１−４等のＴＡＴ２、又は例えば、配列番号５等のＴＡＴ３シグナル・ペプチドを含む、単離融合ポリペプチドを提供する。他の実施態様において、ＴＡＴシグナル・ペプチドは、配列番号１又は５から選ばれる。
【００７６】
融合ポリペプチドは任意に、ＴＡＴシグナル・ペプチド及び、例えば、ＯＰＨ等の目的のタンパク質の間に位置するリンカーペプチドを含む。リンカーペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０のアミノ酸を含むが、それらに限られない、任意の適した長さとすることが出来る。いくつかの実施態様において、リンカーペプチドは、１から１０のアミノ酸、又は１から５のアミノ酸を含む。いくつかの実施態様において、リンカーペプチドは、１又は２のアミノ酸を含む。リンカーペプチドは、任意の自然発生、又は修飾されたアミノ酸を含むことが出来る。いくつかの実施態様において、リンカーペプチドはアラニンを含む。いくつかの実施態様において、リンカーは、開裂可能なリンカーであり、シグナル・ペプチドを追加的に含むプレタンパク質から、成熟タンパク質を放出するために容易に開裂される。
【００７７】
いくつかの実施態様において、本願に係る開示は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。前記ベクターは、既知の、又は後に発見された、宿主細胞で目的のタンパク質を発現するのに適した任意のベクターとすることが出来る。前記ベクターは、組込み型ベクター又は複製ベクターとすることが出来る。一般に、前記ベクターは、宿主細胞に用いられる、少なくとも一の有機体での複製機能開始点、便宜的な制限酵素部位、及び選択マーカーを含む。使用され得るベクターの例は、ｐＫＢ１０５、ｐＫＢ２２９、ｐＫＢ２３１、ｐＫＢ２３３、及びｐＫＢ２３４を含むが、それらに限られない。いくつかの実施態様において、発現ベクターは、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、例えば、有機リン酸塩加水分解酵素タンパク質等のＥＣ３．１．８として分類されるリン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記第一の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、発現ベクターは、配列番号１−５のいずれか一つのＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列、及び、リン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列を含む。いくつかの実施態様において、リン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列に操作可能に連結される、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドはさらに、配列番号２３のＡ４プロモーターに操作可能に連結される。他の実施態様において、リン酸トリエステル加水分解酵素をコードする核酸配列は、ストレプトミセス種宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施態様において、ストレプトミセス種宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞である。
【００７８】
いくつかの実施態様において、本願に係る開示は、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、例えば、より高等の真核生物、より下等の真核生物又は原核生物等の、目的のタンパク質を発現し、Ｔａｔ経路を経て分泌することが可能な当該技術分野で既知の、任意の細胞とすることが出来る。いくつかの実施態様において、宿主細胞は原核細胞、例えば、細菌性細胞である。細菌性宿主細胞は、グラム陽性細菌又はグラム陰性細菌に由来することが出来る。いくつかの実施態様において、宿主細胞はグラム陽性細菌に由来する。目的のタンパク質の生成に適した宿主細胞として機能することが出来る、多くのタイプのグラム陽性細胞は、例えば、ストレプトミセス、バチルス、及びラクトコッカス細胞を含む。
【００７９】
いくつかの実施態様において、宿主細胞はストレプトミセス細胞である。本明細書で用いられるストレプトミセス属は、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｓ．ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ｆｅｌｌｅｕｓ、Ｓ．ｆｅｒｒａｌｉｔｉｓ、Ｓ．ｆｉｌａｍｅｎｔｏｓｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｈｅｌｖａｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓ．ｌｙｓｏｓｕｐｅｒｆｉｃｕｓ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ、Ｓ．ｐｌｉｃａｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｓｃａｂｉｅｓ、Ｓ．ｓｏｍａｌｉｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ、及びＳ．ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒを含むが、それらに限られない、当業者に既知の全てのメンバーを含む。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、及びＢ．ｌｅｎｔｕｓ細胞を含むが、それらに限られない、バチルス細胞である。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、Ｓ．ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓ．ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｈｅｌｖａｔｉｃｕｓ、又はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞である。
【００８０】
さらに別の側面において、本願に係る開示は、宿主細胞で目的のタンパク質を生成する方法を提供する。前記方法は、宿主細胞で本発明のポリヌクレオチドを発現する工程を含む。上述のように、宿主細胞は、任意の適した細胞、例えば、ストレプトミセス又はバチルス細胞を含むが、それらに限られない、原核細胞又は細菌性細胞等とすることが出来る。いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は折り畳み構造で生成される。いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は活性型で生成される。いくつかの実施態様において、例えば、ストレプトミセス種宿主細胞等の本発明に係る宿主細胞は、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、例えば、有機リン酸塩加水分解酵素タンパク質等のＥＣ３．１．８として分類されるリン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記第一の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを含む。いくつかの実施態様において、前記発現ベクターは、配列番号１−５のいずれかのＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列、及び、リン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列を含む。別の実施態様において、ＴＡＴシグナル・ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、リン酸トリエステル加水分解酵素をコードする第二の核酸配列と操作可能に連結される、前記第一の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを含む前記発現ベクターはさらに、配列番号２３のＡ４プロモーターと操作可能に連結される。他の実施態様において、前記リン酸トリエステル加水分解酵素をコードする核酸配列は、ストレプトミセス種宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施態様において、本発明に係る宿主細胞は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞等のストレプトミセス種宿主細胞である。
【００８１】
いくつかの実施態様において、本発明に係る宿主細胞及び形質転換細胞は、従来の栄養培地で培養される。温度、ｐＨ等の適した特定培養条件は、当業者に知られる。さらに、いくつかの好ましい培養条件は、例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ（２０００年）、実用ストレプトミセス遺伝学（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｊｏｈｎ  ｌｎｎｅｓ財団、ノリッジ、イギリス、Ｈａｒｄｗｏｏｄ他、（１９９０年）、バチルスにおける分子生物学的方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）由来等の科学文献で見られることが出来る。
【００８２】
いくつかの実施態様において、例えば、ＴＡＴ−ＯＰＨ融合タンパク質等のＴＡＴ−融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、コードされるタンパク質の発現及び細胞培養からの回収に適した条件下で培養される。組み換え宿主細胞で生成されたタンパク質は、培地に分泌される。いくつかの実施態様において、他の組み換え構築体は、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に、ＴＡＴ−ＯＰＨタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチド配列を接合する（クロールＤＪ他（１９９３年）、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２、４４１−５３ページ）。
【００８３】
前記精製を促進するドメインは、例えば、固定化された金属の精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール等の金属キレート化ペプチド（Ｐｏｒａｔｈ  Ｊ（１９９２年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ３、２６３−２８１ページ）、固定化された免疫グロブリンの精製を可能にするプロテインＡドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｄｏｍａｉｎｓ）、及びＦＬＡＧＳエクステンション／アフィニティ精製システム（ＦＬＡＧＳ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ／ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｉｍｍｕｎｅｘ社、シアトル、ワシントン州）で利用されるドメインを含むが、それらに限られない。Ｆａｃｔｏｒ  ＸＡ等の開裂リンカー配列の包含又は精製ドメインと異種タンパク質との間の腸内キナーゼ（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ）（インビトロジェン、サンディエゴ、カルフォルニア州）もまた、精製の促進に用いられる。
【００８４】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係る形質転換宿主細胞は、ＯＰＨの発現を可能にする条件下、適した栄養培地で培養され、その後、結果として得られたＯＰＨを培養地から回収する。細胞の培養に使用される培地は、例えば、適切な補助栄養を含む最小培地又は複合培地等の宿主細胞の育成に適した任意の従来培地を含む。適した培地は、商業供給者から入手可能であるか、又は、公表された方法（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ内等）に従って調製されることが出来る。いくつかの実施態様において、前記細胞で生成されたＯＰＨは、遠心又は濾過で培地から宿主細胞を分離する工程、塩（例えば、硫酸アンモニウム等）、クロマトグラフィー精製（例えば、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティ等）の手段により、上清又は濾過物質のタンパク性化合物を沈殿させる工程を含むがそれらに限られない、従来の処置により培養地から回収される。従って、本発明に係るＯＰＨを回収するのに適した任意の方法も本発明で使われる。本発明が任意の特定の精製法に限定されることは、全く意図されない。
【００８５】
いくつかの実施態様において、本願に係る開示は、宿主細胞で目的のタンパク質を生成する方法を提供する。前記方法は、宿主細胞で本発明に係るポリヌクレオチドを発現する工程、培地で宿主細胞を培養する工程、及び目的のタンパク質を培地から回収する工程を含む。
【００８６】
本発明に係る方法は実施されることができ、発現されたタンパク質は、スモール・スケール又は産業スケール等のより大きいスケールで単離されることが出来る。いくつかの実施態様において、本願に係る開示は、本発明に係る方法で生成される目的のタンパク質を提供する。いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は、折り畳み構造又はその活性型である。
【００８７】
本願に係る開示の側面は、以下の実施例の観点からさらに理解されることが出来る。以下の実施例は、本願に係る開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本願に係る開示から逸脱することなく、物質及び方法の両方における多くの修飾が実施され得ることは、当業者に明らかである。
【実施例】
【００８８】
実験
以下の実験の開示において、下記の略語が適用される。ｅｑ（等価）、Ｍ（モル）、μＭ（マイクロモル）、Ｎ（正常）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｋｇ（キログラム）、μｇ（マイクログラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、ｃｍ（センチメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、℃（摂氏温度）、ｈ（時間）、ｍｉｎ（分）、ｓｅｃ（秒）、ｍｓｅｃ（ミリ秒）、ＴＹ−トリプトン／酵母エキス、Ａｐ−アンピシリン、ＤＴＴ−ジチオスレイトール、Ｅｍ−エリスロマイシン、ＨＰＤＭ−高リン酸塩合成培地、ＭＭ−最少培地、ＯＤ−光学密度、ＰＡＧＥ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＰＣＲ−ポリメラーゼ連鎖反応。
【００８９】
実施例１：ストレプトミセス宿主細胞におけるＯＰＨ生成のための発現プラスミドの構築
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ｇ３ｓ３宿主細胞で発現されたＯＰＨタンパク質は、以下のアミノ酸配列を含んだ。
【式２】
【００９０】
2010530242.tif 000008
さらに、前記ＯＰＨタンパク質は、ストレプトミセス遺伝子のためのコドン最適化と共にジーンアート・インク社（トロント、カナダ）により合成された、対応するＯＰＨ遺伝子（配列番号２２）でコードされた。
【式３】
【００９１】
2010530242.tif 000009
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞でＯＰＨを発現するために、シグナル配列をコードする以下のポリヌクレオチドを用いた、
１．切断ｃｅｌＡシグナル配列
２．ＡＳＰシグナル配列、
３．ＴＡＴ１：ストレプトミセスでの発現のためにコドン最適化されたＯＰＨシグナル配列
【式４】
【００９２】
2010530242.tif 000010
４．ＴＡＴ２：修飾されたＳＣＯ６２７２の推定シグナル・ペプチド
【式５】
【００９３】
2010530242.tif 000011
、及び
５．ＴＡＴ３：ＳＣＯ６２４の推定シグナル・ペプチド。
【式６】
【００９４】
2010530242.tif 000012
ｃｅｌＡシグナル・ペプチド及びセルラーゼ触媒コアをコードするセグメントを、ＯＰＨシグナル・ペプチド（ＴＡＴ１、配列番号１９）及びＯＰＨタンパク質（配列番号１８）をコードする融合ポリヌクレオチド配列に置き換えることで、プラスミドｐＫＢ２２９をプラスミドｐＫＢ１０５から構築した。図２を参照にされたい。
【００９５】
ｃｅｌＡシグナル・ペプチド及びセルラーゼ触媒コアをコードするセグメントを、ＴＡＴ２シグナル・ペプチド（配列番号１）及びＯＰＨタンパク質（配列番号１８）をコードする融合ポリヌクレオチド配列（配列番号２０）に置き換えることで、プラスミドｐＫＢ２３１をプラスミドｐＫＢ１０５から構築した。図３を参照にされたい。
【００９６】
ｃｅｌＡシグナル・ペプチド及びセルラーゼ触媒コアをコードするセグメントを、ＴＡＴ３シグナル・ペプチド（配列番号５）及びＯＰＨタンパク質（配列番号１８）をコードする融合ポリヌクレオチド配列（配列番号２１）に置き換えることで、プラスミドｐＫＢ２３３をプラスミドｐＫＢ１０５から構築した。図４を参照にされたい。
【００９７】
発酵槽におけるＯＰＨの生成において、ｐＫＢ２３３でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ配列を除去することにより、ｐＫＢ２３３から発現ベクター、ｐＫＢ２３４を得た。Ｅｃｏｌｉ配列を除去するために、ｐＫＢ２３３を、３７℃で一晩、ＳｐｈＩ、ＥｃｏＲＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化されたＤＮＡを、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）キットを用いて精製し、次に、ストレプトミセス宿主細胞の形質転換のために再度ライゲーションした。図５は、ｐＫＢ２３４ベクターを示す。
【００９８】
実施例２：ストレプトミセス宿主細胞により生成されたＯＰＨの発現及び活性
以下の実施例は、ＯＰＨの発現及び活性における多様なＴＡＴシグナル・ペプチドの効果について説明する。
【００９９】
形質転換及び発現
発現ベクター、ｐＫＢ２２９、ｐＫＢ２３１、及びｐＫＢ２３３を、上述のように、当該実施例で用いた。
【０１００】
これらの実験において、上述のベクターを用いて宿主Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ細胞を形質転換した。形質転換の技術は、Ｈｏｐｗｏｏｄ他、ストレプトミセスの遺伝子操作、研究室マニュアル（ＧＥＮＥＴＩＣ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）、Ｊｏｈｎ  ｌｎｎｅｓ財団、ノリッジ、イギリス（１９８５年）で記載されるプロトプラスト法を用いた。
【０１０１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ細胞を上述の発現ベクターの１つを用いて形質転換した。形質転換細胞をＲ５プレートにプレートした（１リットルのＲ５プレート−８００ｍｌのＨ２Ｏ中、２０６ｇのショ糖、０．５ｇのＫ２ＳＯ４、２０．２４ｇのＭｇＣＬ２、２０ｇのブドウ糖、０．２ｇのジフコ（Ｄｉｆｃｏ）カザミノ酸、１０ｇのジフコ酵母エキス及び１１．４６ｇのＴＥＳ、４ｇのＬ−Ａｓｐ、４ｍｌの微量元素及び４４ｇのジフコ寒天）。２０ｍｌの５％Ｋ２ＨＰＯ４、８ｍｌの５Ｍ  ＣａＣＬ２・２Ｈ２Ｏ、及び１４ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨをオートクレーブ後、最終的な１リットルの溶液に加えた。３０℃で５０μｇ／ｍｌのチオストレプトンの存在下、２日間、２５０ｍｌの振盪フラスコ内の２０ｍｌのＴＳＧ中で、形質転換体を育成した。次に、抗生物質のない生成培地（５０ｍｌ）に細胞を移し、さらに３日間、育成を続けた。サンプルを、電気泳動及び酵素活性分析評価のために採取した。
【０１０２】
１６ｇのジフコトリプトン、４ｇのジフコソイトーン（Ｄｉｆｃｏ  ｓｏｙｔｏｎｅ）、２０ｇのカセイン・ハイドライセート・シグマ（ｃａｓｅｉｎｅ（ｈｙｄｏｌｙｓａｔｅ）ｓｉｇｍ）、及び５ｇのＫ２ＨＰＯ４を含むＴＳＧ培地を１リットル調製した。オートクレーブ後、５０％の濾過滅菌されたブドウ糖を最終濃度が１．５％に成るように加えた。
【０１０３】
生成培地−２．４ｇのクエン酸一水和物（Ｃｉｔｒｉｃ  Ａｃｉｄ．Ｈ２Ｏ）、８．３ｇのバイオスプリンジャー（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ）酵母エキス、２．４ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、７２．４ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｍｌのＭａｚｕ  ＤＦ２０４（泡止め剤）、５ｍｌのストレプトミセス修飾微量元素（１リットル原液は、２５０ｇのクエン酸一水和物、３．２５ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．２５ｇのＨ３ＢＯ３を含む）、１０ｇのブドウ糖を、体積が１リットルになるように調整した。ＮａＯＨで６．９になるようｐＨを調整した。いくつかの実験において、生成培地は、Ｚｎ２＋又はＣｏ２＋のいずれかで栄養を補助した。
【０１０４】
回収
各振盪フラスコから細胞培地のサンプル１ｍｌを採取し、１４，０００ｒｐｍで細胞が沈殿するように遠心分離した。培地中に分泌されたＯＰＨ酵素を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析し、酵素の活性を後述するように試験した。
【０１０５】
ＯＰＨ活性分析評価及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
（Ａ）図６に示すように、上記ベクターを用いたＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ細胞（レーン１−４及び６−９）でのＯＰＨ生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分析した。二重矢は、非還元性条件下でＯＰＨがダブレットとして移動するのを示す。レーン１−いずれのシグナル・ペプチドも用いないＡ４プロモーター下での直接的なＯＰＨ発現、レーン２−ＴＡＴ１シグナル配列を用いたＯＰＨ発現、レーン３−ＴＡＴ３シグナル配列を用いたＯＰＨ発現、レーン４−Ａ４プロモーターのみを用いた発現バックボーン（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）（ネガティブ・コントロールとしての役割）、レーン５−封入体としてのＥ．ｃｏｌｉでのＯＰＨ発現（ポジティブ・コントロールとしての役割）、レーン６−レーン３と同様、レーン７−生成培地中へのコバルトの添加（最終濃度で０．５ｍＭ）以外はレーン３と同様、レーン８−ＴＡＴ２シグナル配列を用いたＯＰＨ発現、コバルトは最終濃度で０．５ｍＭとなるように生成に加えられた、レーン９−ＴＡＴ１シグナル配列及び０．５ｍＭの最終濃度でのコバルトを用いたＯＰＨ発現。
【０１０６】
ＯＰＨがＴＡＴ２−ＯＰＨ又はＴＡＴ３−ＯＰＨ融合タンパク質として発現される場合、ＴＡＴ１−ＯＰＨの生成と比べ、細菌性宿主細胞によるＯＰＨの生成が、より高いことを結果は示している。ＴＡＴ３−ＯＰＨ融合ポリヌクレオチドの発現は、ストレプトミセス宿主細胞によるＯＰＨの最も高い生成を促した。
【０１０７】
（Ｂ）ＯＰＨ生成における、生成培地発酵槽へのＺｎ２＋及びＣｏ２＋の添加の効果を試験した。図７は、ＴＡＴ３シグナル・ペプチドを用いて発現された場合の、ＯＰＨ生成及びＯＰＨの保存性における、Ｚｎ２＋及びＣｏ２＋の添加の効果を示している。レーン１、２、及び３は、それぞれ、４℃、−２０℃、及び２０％のグリセロールと共に−２０℃で保存した後の、ＴＡＴ３−ＯＰＨとして発現されたＯＰＨの生成レベルを示している。レーン４、５、及び６は、それぞれ、４℃、−２０℃、及び２０％のグリセロールと共に−２０℃で保存した後の、０．１ｍＭ  Ｚｎ２＋の存在下で、ＴＡＴ３−ＯＰＨとして発現されたＯＰＨの生成レベルを示している。レーン７、８、及び９は、それぞれ、４℃、−２０℃、及び２０％のグリセロールと共に−２０℃で保存した後の、０．１ｍＭ  Ｃｏ２＋の存在下で、ＴＡＴ３−ＯＰＨとして発現されたＯＰＨの生成レベルを示している。期待されるＯＰＨバンドの配列は、ＭＳペプチド・マッピングで確認し、図８に示した。
【０１０８】
これらのデータは、ＯＰＨの生成レベルが金属イオンの存在又は非存在に関わらず同様であり、４℃又は−２０℃でのいずれかにおいて、前記ＯＰＨを保存することが、最も良いことを示す。
【０１０９】
（Ｃ）図７で示されるサンプル１−９に対応するサンプルを、活性について試験した。（Ｃａｌｄｗｅｌｌ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０、７４３８−７４４４ページ、１９９１年、Ｒａｓｔｏｇｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２４１、２９４−２９６ページ、１９９７年）。ＯＰＨの活性分析評価に使用されるパラオクソン及びＶＸ基質は、非常に毒性であるため、異なる振盪フラスコのサンプルの上清を特定のＯＰＨの活性分析評価のため、米軍（米国陸軍−ＥＣＢＣ、ＡＭＳＲＤ−ＥＣＢ−ＲＴ−ＢＰ、Ｅ−３１５０  Ｋｉｎｇｓｃｒｅｅｋ通りＮ．ＡＰＧ、ＭＤ２１０１０）に送付した。
【０１１０】
ＯＰＨの比活性分析評価の結果を図９に示した。ＯＰＨ１−９として示されるバーは、図７のレーン１−９のサンプルに対応している。これらのデータは、ＴＡＴ３シグナル・ペプチドを有する融合タンパク質として発現され、ストレプトミセス宿主細胞により生成されたＯＰＨが、有機リン酸塩分解活性を保有することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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