(57)【要約】無電荷およびカチオン性の両方のサブユニット間結合を含むモルホリノオリゴマーが提供される。このオリゴマーは、塩基対形成部分の所定の配列を含むオリゴヌクレオチドアナログである。オリゴマーにおけるカチオン性サブユニット間結合の存在（代表的に、総結合の約１０〜５０％のレベルである）は、種々のアンチセンスの用途において、対応する無電荷のオリゴマーと比べて、向上したアンチセンス活性を提供する。また、ペプチド輸送体部分に結合されたこのようなオリゴマーも提供され、この場合、この輸送体は、好ましくは、天然アミノ酸サブユニットと交互になったアルギニンサブユニットまたはアルギニン二量体から構成される。
2010505741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸に対し配列特異的な様式で結合し得るようにモルホリノサブユニットの配列を含むオリゴマーであって、該モルホリノサブユニットの各々は、塩基対形成部分を支持しており、
ここで、該サブユニットは、以下の構造：
【化１１】
2010505741.tif 000049
を持つ、リン含有サブユニット間結合によって接合され、
該式において、
ＷはＳまたはＯであり、
Ｘは、ＮＲ１Ｒ２またはＯＲ６であり、
Ｙは、ＯまたはＮＲ７であり、
そして、該結合の各々は、以下：
（ａ）無電荷結合（ａ）であって、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６およびＲ７の各々は、独立して、水素および低級アルキルから選択される、無電荷結合（ａ）；
（ｂ１）カチオン性結合（ｂ１）であって、ここで、ＸはＮＲ１Ｒ２であり、かつＹはＯであり、そして、ＮＲ１Ｒ２は、Ｒ１Ｒ２が−ＣＨＲＣＨＲＮ（Ｒ３）（Ｒ４）ＣＨＲＣＨＲ−となるように必要に応じて置換されたピペラジノ基を表し、ここで、
各Ｒは、独立してＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ４は、Ｈ、ＣＨ３または電子対であり、そして
Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｚ−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および［Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ’ＮＨ］ｍＨから選択され、ここで、Ｚは、カルボニル（Ｃ（Ｏ））または直接結合であり、Ｌは、アルキル、アルコキシおよびアルキルアミノから選択される結合を有する長さ１８原子までの任意のリンカーであり、Ｒ’は、天然に存在するアミノ酸またはその一炭素もしくは二炭素のホモログの側鎖であり、そして、ｍは１〜６である、
カチオン性結合（ｂ１）；
（ｂ２）カチオン性結合（ｂ２）であって、ここで、ＸはＮＲ１Ｒ２であり、かつＹはＯであり、Ｒ１はＨまたはＣＨ３であり、そして、Ｒ２はＬＮＲ３Ｒ４Ｒ５であり、ここで、Ｌ、Ｒ３およびＲ４は、上に定義したとおりであり、そして、Ｒ５は、Ｈ、低級アルキルまたは低級（アルコキシ）アルキルである、カチオン性結合（ｂ２）；ならびに
（ｂ３）カチオン性結合（ｂ３）であって、ここで、ＹはＮＲ７であり、かつＸはＯＲ６であり、そして、Ｒ７はＬＮＲ３Ｒ４Ｒ５であり、ここで、Ｌ、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、上に定義したとおりであり、そして、Ｒ６はＨまたは低級アルキルである、カチオン性結合（ｂ３）；
から選択され、そして、
該サブユニット間結合のうち少なくとも１つは、カチオン性結合（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）から選択される、
オリゴマー。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴマーであって、前記モルホリノサブユニットが以下の構造：
【化１２】
2010505741.tif 000050
を有し、該式において、Ｐｉは、塩基対形成部分であり、そして、前記サブユニット間結合が、（ｉ）の窒素原子を隣接するサブユニットの５’炭素に連結する、オリゴマー。
【請求項３】
請求項１に記載のオリゴマーであって、該オリゴマーにおける前記カチオン性結合は全て同じタイプのものである、オリゴマー。
【請求項４】
請求項３に記載のオリゴマーであって、該オリゴマーにおける前記カチオン性結合は全てタイプ（ｂ１）のものである、オリゴマー。
【請求項５】
請求項３に記載のオリゴマーであって、該オリゴマーにおける前記カチオン性結合は全てタイプ（ｂ２）のものである、オリゴマー。
【請求項６】
請求項４に記載のオリゴマーであって、該オリゴマーにおける前記カチオン性結合は全てタイプ（ｂ３）のものである、オリゴマー。
【請求項７】
請求項１に記載のオリゴマーであって、該オリゴマーにおける前記結合の５％〜５０％がカチオン性結合である、オリゴマー。
【請求項８】
請求項７に記載のオリゴマーであって、該オリゴマーにおける前記結合の１０％〜３５％がカチオン性結合である、オリゴマー。
【請求項９】
請求項１に記載のオリゴマーであて、タイプ（ａ）の結合におけるＲ１およびＲ２の各々がメチルである、オリゴマー。
【請求項１０】
請求項１に記載のオリゴマーであって、該オリゴマーは、少なくとも２個の連続するタイプ（ａ）の結合を含む、オリゴマー。
【請求項１１】
約１０個〜４０個のサブユニットの長さを持つ、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項１２】
約１５個〜２５個のサブユニットの長さを持つ、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項１３】
請求項１に記載のオリゴマーであって、前記カチオン性結合が、各ＲがＨであり、Ｒ４がＨ、ＣＨ３または電子対であり、かつ、Ｒ３が、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＣ（Ｏ）−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択される場合のタイプ（ｂ１）のものである、オリゴマー。
【請求項１４】
請求項１３に記載のオリゴマーであって、前記カチオン性結合が、各ＲがＨであり、Ｒ４が電子対であり、かつ、Ｒ３が、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＣ（Ｏ）−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択される場合のタイプ（ｂ１）のものである、オリゴマー。
【請求項１５】
請求項１４に記載のオリゴマーであって、Ｒ３がＣ（Ｏ）−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり、かつＬが炭化水素である、オリゴマー。
【請求項１６】
請求項１５に記載のオリゴマーであって、Ｌが構造−（ＣＨ２）ｎ−を有し、ここで、ｎが１〜１２である、オリゴマー。
【請求項１７】
ｎが１〜６である、請求項１６に記載のオリゴマー。
【請求項１８】
請求項１に記載のオリゴマーであって、前記カチオン性結合が、各ＲがＨであり、かつ、Ｒ３およびＲ４の各々が独立してＨまたはＣＨ３である場合のタイプ（ｂ１）のものである、オリゴマー。
【請求項１９】
請求項１８に記載のオリゴマーであって、Ｒ３およびＲ４の各々がＨである、オリゴマー。
【請求項２０】
請求項１に記載のオリゴマーであって、前記カチオン性結合が、Ｌがアルキルおよびアルキルアミノから選択される結合を有する長さ１２原子までのリンカーである場合のタイプ（ｂ２）のものである、オリゴマー。
【請求項２１】
請求項１に記載のオリゴマーであって、該オリゴマーは、Ｒ、Ｒ３およびＲ４の各々がＨである場合のタイプ（ｂ１）の結合を含まない、オリゴマー。
【請求項２２】
請求項１に記載のオリゴマーであって、該オリゴマーの末端に結合されたペプチド輸送部分をさらに含み、該ペプチド輸送部分は、６個〜１６個のアミノ酸を含み、かつ（Ｘ’Ｙ’Ｘ’）、（Ｘ’Ｙ’）、（Ｘ’Ｚ’）および（Ｘ’Ｚ’Ｚ’）からなる群より選択される部分配列からなり、
ここで
（ａ）Ｘ’サブユニットの各々は、独立して、アルギニンまたはアルギニンアナログを表し、該アナログは、構造Ｒ１Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）Ｒ２の側鎖を含むカチオン性α−アミノ酸であり、ここで、Ｒ１はＨまたはＲであり；Ｒ２はＲ、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲ２であり、ここでＲは低級アルキルまたは低級アルケニルであり、そして、さらに、酸素または窒素を含み得；Ｒ１およびＲ２は、一緒になって環を形成し得；そして、該側鎖は、Ｒ１またはＲ２を介して該アミノ酸に連結される；
（ｂ）Ｙ’サブユニットの各々は、独立して、中性の直鎖状アミノ酸−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨＲ）ｎ−ＮＨ−を表し、ここで、ｎは１〜７であり、かつ、各Ｒは、独立して、Ｈまたはメチルである；そして
（ｃ）Ｚ’サブユニットの各々は、独立して、中性のアラルキル側鎖を持つα−アミノ酸を表す、
オリゴマー。
【請求項２３】
請求項２２に記載のオリゴマーであって、前記ペプチドが、（Ｘ’Ｙ’Ｘ’）、（Ｘ’Ｙ’）、（Ｘ’Ｚ’）および（Ｘ’Ｚ’Ｚ’）から選択される単一の部分配列の少なくとも２回の繰り返しからなる配列を含む、オリゴマー。
【請求項２４】
請求項２３に記載のオリゴマーであって、前記ペプチドが、（Ｘ’Ｙ’Ｘ’）、（Ｘ’Ｙ’）、（Ｘ’Ｚ’）および（Ｘ’Ｚ’Ｚ’）から選択される単一の部分配列の少なくとも３回の繰り返しからなる配列を含む、オリゴマー。
【請求項２５】
請求項２３に記載のオリゴマーであって、前記ペプチドが、（Ｘ’Ｙ’Ｘ’）ｐ、（Ｘ’Ｙ’）ｍおよび（Ｘ’Ｚ’Ｚ’）ｐのうち１つによって表される配列を含み、ここで、ｐは２〜５でありかつｍは２〜８である、オリゴマー。
【請求項２６】
請求項２２に記載のオリゴマーであって、Ｘ’の各々について、前記側鎖部分がグアニジルである、オリゴマー。
【請求項２７】
請求項２２に記載のオリゴマーであって、Ｙ’の各々が、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−であり、ここで、ｎは１〜７である、オリゴマー。
【請求項２８】
請求項２７に記載のオリゴマーであって、Ｙ’が、β−アラニンサブユニットおよび６−アミノヘキサン酸サブユニットから選択されるように、ｎが２および５から選択される、オリゴマー。
【請求項２９】
請求項２２に記載のオリゴマーであって、Ｚ’の各々がフェニルアラニンである、オリゴマー。
【請求項３０】
請求項２２に記載のオリゴマーであって、前記結合されたペプチドは、リンカーＡｈｘ−Ｂを介して該オリゴマーの末端に連結され、ここで、Ａｈｘは６−アミノヘキサン酸サブユニットであり、かつ、Ｂはβ−アラニンサブユニットである、オリゴマー。
【請求項３１】
モルホリノサブユニットの配列を有するオリゴマー性核酸アナログのアンチセンス活性を増強する方法であって、該モルホリノサブユニットの各々は、塩基対形成部分を支持し、そして、サブユニット間結合によって連結されており、該方法は、
少なくとも１個のサブユニット間結合をカチオン性のペンダント基を含むように修飾する工程であって、該カチオン性のペンダント基は、生理学的ｐＨにおいて正電荷を有し得る窒素原子を含む、工程
を包含する、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記サブユニット間結合が、リン含有サブユニット間結合であり、そして、前記修飾する工程が、以下の構造：
【化１３】
2010505741.tif 000051
を持つ少なくとも１個のサブユニット間結合を提供する工程を包含し、ここで、
（ａ）ＷはＳまたはＯであり、そして
（ｂ１）ＸはＮＲ１Ｒ２であり、かつＹはＯであり、そして、ＮＲ１Ｒ２が、Ｒ１Ｒ２が−ＣＨＲＣＨＲＮ（Ｒ３）（Ｒ４）ＣＨＲＣＨＲ−となるように必要に応じて置換されたピペラジノ基を表し、ここで：各Ｒは、独立してＨまたはＣＨ３であり；Ｒ４は、Ｈ、ＣＨ３または電子対であり；そして、Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｚ−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および［Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ’ＮＨ］ｍＨから選択され、ここで、Ｚは、カルボニル（Ｃ（Ｏ））または直接結合であり、Ｌは、アルキル、アルコキシおよびアルキルアミノから選択される結合を有する長さ１８原子までの任意のリンカーであり、Ｒ’は、天然に存在するアミノ酸またはその一炭素もしくは二炭素のホモログの側鎖であり、そして、ｍは１〜６であるか；あるいは
（ｂ２）ＸはＮＲ１Ｒ２であり、かつＹはＯであり、Ｒ１はＨまたはＣＨ３であり、そしてＲ２は、ＬＮＲ３Ｒ４Ｒ５であり、ここで、Ｌ、Ｒ３およびＲ４は、上に定義したとおりであり、そして、Ｒ５は、Ｈ、低級アルキルまたは低級（アルコキシ）アルキルであるか；あるいは
（ｂ３）ＹはＮＲ７であり、かつＸはＯＲ６であり、そして、Ｒ７はＬＮＲ３Ｒ４Ｒ５であり、ここで、Ｌ、Ｒ３およびＲ４は、上に定義したとおりであり、そして、Ｒ６はＨまたは低級アルキルである、
方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記モルホリノサブユニットが、以下の構造：
【化１４】
2010505741.tif 000052
を有し、ここで、Ｐｉは、塩基対形成部分であり、そして、前記サブユニット間結合が、（ｉ）の窒素原子を隣接するサブユニットの５’炭素に連結する、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記オリゴマーにおける前記カチオン性結合は全て同じタイプのものである、方法。
【請求項３５】
請求項３１に記載の方法であって、前記サブユニット間結合の５％〜５０％がこのように修飾される、方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、前記修飾結合はタイプ（ｂ１）のものである、方法。
【請求項３７】
請求項３４に記載の方法であって、前記修飾結合はタイプ（ｂ２）のものである、方法。
【請求項３８】
請求項３４に記載の方法であって、前記修飾結合はタイプ（ｂ３）のものである、方法。
【請求項３９】
請求項３６に記載の方法であって、前記修飾結合が、各ＲがＨであり、Ｒ４が電子対であり、かつ、Ｒ３がＣ（Ｏ）−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２である場合のタイプ（ｂ１）のものである、方法。
【請求項４０】
請求項３６に記載の方法であって、前記修飾結合が、Ｒ、Ｒ３およびＲ４の各々がＨである場合のタイプ（ｂ１）のものである、方法。
【請求項４１】
請求項３７に記載の方法であって、前記カチオン性結合が、Ｌがアルキルおよびアルキルアミノから選択される結合を有する長さ１２原子までのリンカーである場合のタイプ（ｂ２）のものである、方法。
【請求項４２】
請求項３１に記載の方法であって、前記オリゴマーが、Ｒ、Ｒ３およびＲ４の各々がＨである場合のタイプ（ｂ１）の結合を含まない、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アンチセンス化合物として有用なオリゴヌクレオチドアナログ（オリゴマー）に関し、より具体的には、カチオン性結合を含むオリゴマーおよびこのようなオリゴマーのアンチセンスの用途における使用に関する。特に好ましいのは、無電荷結合およびカチオン性結合の両方を含むモルホリノオリゴマーであり、ここで、これらの両方は、ホスホロジアミデート結合であり得、そして、例示的なカチオン性結合としては、（１−ピペラジノ）ホスフィニルインデンオキシ結合および（１−（４−（ω−グアニジノ−アルカノイル））−ピペラジノ）ホスフィニルインデンオキシ結合が挙げられる。
【０００２】
参考文献
Ａｒｙａ，Ｄ．Ｐ．およびＴ．Ｃ．Ｂｒｕｉｃｅ（１９９９）．「Ｔｒｉｐｌｅ−ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｕｒｅａ−ｌｉｎｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  （ＤＮｍｔ）：ａ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（８）：４３８４−９．
Ｂａｉｌｅｙ，Ｃ．Ｐ．，Ｊ．Ｍ．Ｄａｇｌｅら、（１９９８）．「Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃａｎ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅｓ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６（２１）：４８６０−７．
Ｂａｒａｗｋａｒ，Ｄ．Ａ．およびＴ．Ｃ．Ｂｒｕｉｃｅ（１９９８）．「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｉｘｅｄ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｌｉｎｋａｇｅｓ：ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｉｃ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ／ＤＮＡ  ｃｈｉｍｅｒａｓ．」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（１９）：１１０４７−５２．
Ｂｒａｙ，Ｍ．，Ｋ．Ｄａｖｉｓら、（１９９８）．「Ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｅｂｏｌａ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ．」Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １７８（３）：６５１−６１．
Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｂ．Ｍ．，Ｋ．Ｅ．Ｓｔｅｅｌｅら、（１９９９）．「Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇｓ．」Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １７９  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ２０３−１７．
Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．（２００１）．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ．
Ｄｅｍｐｃｙ，Ｒ．Ｏ．，Ｏ．Ａｌｍａｒｓｓｏｎら、（１９９４）．「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｉｃ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ：ａ  ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ＤＮＡ．」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１（１７）：７８６４−８．
Ｄｅｍｐｃｙ，Ｒ．Ｏ．，Ｊ．Ｌｕｏら、（１９９６）．「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ：ａ  ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｉｃ  ａｎａｌｏｇ  ｏｆ  ＲＮＡ．」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３（９）：４３２６−３０．
Ｅｇｌｉ，Ｍ．，Ｇ．Ｍｉｎａｓｏｖら、（２００５）．「Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｅｒｅｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ａｆｆｉｎｉｔｙ，ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｅｎ  ２’−Ｏ−ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４（２５）：９０４５−５７．
Ｌｉｎｋｌｅｔｔｅｒ，Ｂ．Ａ．およびＢｒｕｉｃｅ，Ｔ．Ｃ．（２０００）．「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｉｃ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  （ＤＮＧ）  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｕｒｅａ  ｌｉｎｋａｇｅｓ：  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｈａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ．」Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８（１１）：１８９３−１９０１．
Ｌｉｎｋｌｅｔｔｅｒ，Ｂ．Ａ．，Ｉ．Ｅ．Ｓｚａｂｏら、（２００１）．「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｐｕｒｉｎｅ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｉｃ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  （ＤＮＧ）  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９（１１）：２３７０−６．
Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．（２００１）．「Ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ８（１０）：１１５７−７９．
Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｍ．Ｈ．Ｎｅｌｓｏｎら、（２００４）．「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｏ  ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １５（２）：２９０−９．
Ｎｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｄ．Ａ．Ｓｔｅｉｎら、（２００５）．「Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １６（４）：９５９−６６．
Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．およびＤ．Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）．「Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：ｄｅｓｉｇｎ，ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．」Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ７（３）：１８７−９５．
Ｗａｒｆｉｅｌｄ，Ｋ．Ｌ．，Ｄ．Ｌ．Ｓｗｅｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．「Ｇｅｎｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｕｎｔｅｒｍｅａｓｕｒｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｂｏｌａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ  Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ．」ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ２（１）：ｅ１．
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
疾患の原因となるタンパク質の産生を防止するために、一般には、このようなタンパク質のＤＮＡもしくはＲＮＡに結合するように設計されるアンチセンス治療分子の首尾よい実施のための要件としては、（ａ）インビボでの安定性、（ｂ）十分な膜透過性および細胞への取り込み、ならびに、（ｃ）結合親和性と配列特異性との良好なバランスが挙げられる。多くのオリゴヌクレオチドアナログが開発されており、ここでは、ネイティブなＤＮＡのホスホジエステル結合が、ヌクレアーゼ消化に対し抵抗性である他の結合により置き換えられる（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３を参照のこと）。ヌクレオシド間結合に対するもの以外で種々の骨格修飾を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた調製されている（非特許文献４；非特許文献３）。さらに、オリゴヌクレオチドは、細胞への取り込みを増強するためにペプチド結合体により修飾されている（非特許文献５；非特許文献６）。
【０００４】
このような核酸アナログのアンチセンス薬物またはアンチジーン（ａｎｔｉｇｅｎｅ）薬物としての性能は、種々のアナログの特定の特徴によって妨害される。例えば、ホスホロチオエート結合したアナログを含めて、負に荷電した結合を伴うアナログは、オリゴマーの負電荷とＤＮＡもしくはＲＮＡ標的との間のかなりの静電性の反発を被る。ホスホロチオエートはまた、タンパク質のような他の細胞の成分に対する非特異的な結合を示す。これらは、ネイティブなＲＮＡ、ネイティブなＤＮＡおよび負に荷電したアナログから構成されるアンチセンスオリゴマーの、治療剤としての有用性を制限することに起因するものと考えられる（非特許文献４）。非イオン性のメチルホスホネート結合オリゴヌクレオチドアナログは、受動拡散および／または流動相エンドサイトーシスによって細胞内に輸送され得るが、これらの使用は、立体異性体の複雑さと乏しい溶解性とによって妨害される（非特許文献４；非特許文献３）。
【０００５】
いくつかのグループが、正に荷電したオリゴヌクレオチドの合成を報告している（非特許文献７；非特許文献３；非特許文献８）。例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ中のリン酸結合をアキラルなグアニジノ基で置き換えることによって形成されるグアニジニウム結合ヌクレオシド（ＤＮＧと称される）のクラスが報告されている（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１；非特許文献２）。正に荷電したメチル化チオウレア結合で連結されたオリゴマーもまた、報告されている（非特許文献１１）。これらの結合のいくつかの、中性の尿素結合での置き換えは、このような正に荷電したオリゴマーが、非配列特異的な結合に向かう傾向を低下させることが報告される（非特許文献２）。
【０００６】
しかしながら、特に、ＤＮＡおよびＲＮＡに対する親和性がより強い場において、配列選択性を損ねることなく、アンチセンスまたはアンチジーンの性能が改善されたオリゴヌクレオチドに対する必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂａｒａｗｋａｒ，Ｄ．Ａ．およびＴ．Ｃ．Ｂｒｕｉｃｅ（１９９８）．「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｉｘｅｄ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｌｉｎｋａｇｅｓ：ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｉｃ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ／ＤＮＡ  ｃｈｉｍｅｒａｓ．」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（１９）：１１０４７−５２．
【非特許文献２】Ｌｉｎｋｌｅｔｔｅｒ，Ｂ．Ａ．，Ｉ．Ｅ．Ｓｚａｂｏら、（２００１）．「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｐｕｒｉｎｅ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｉｃ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  （ＤＮＧ）  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９（１１）：２３７０−６．
【非特許文献３】Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．（２００１）．「Ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ８（１０）：１１５７−７９．
【非特許文献４】Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．（２００１）．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ．
【非特許文献５】Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｍ．Ｈ．Ｎｅｌｓｏｎら、（２００４）．「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｏ  ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １５（２）：２９０−９．
【非特許文献６】Ｎｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｄ．Ａ．Ｓｔｅｉｎら、（２００５）．「Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １６（４）：９５９−６６．
【非特許文献７】Ｂａｉｌｅｙ，Ｃ．Ｐ．，Ｊ．Ｍ．Ｄａｇｌｅら、（１９９８）．「Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃａｎ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅｓ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６（２１）：４８６０−７．
【非特許文献８】Ｅｇｌｉ，Ｍ．，Ｇ．Ｍｉｎａｓｏｖら、（２００５）．「Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｅｒｅｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ａｆｆｉｎｉｔｙ，ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｅｎ  ２’−Ｏ−ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４（２５）：９０４５−５７．
【非特許文献９】Ｄｅｍｐｃｙ，Ｒ．Ｏ．，Ｏ．Ａｌｍａｒｓｓｏｎら、（１９９４）．「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｉｃ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ：ａ  ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ＤＮＡ．」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１（１７）：７８６４−８．
【非特許文献１０】Ｄｅｍｐｃｙ，Ｒ．Ｏ．，Ｊ．Ｌｕｏら、（１９９６）．「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ：ａ  ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｉｃ  ａｎａｌｏｇ  ｏｆ  ＲＮＡ．」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３（９）：４３２６−３０．
【非特許文献１１】Ａｒｙａ，Ｄ．Ｐ．およびＴ．Ｃ．Ｂｒｕｉｃｅ（１９９９）．「Ｔｒｉｐｌｅ−ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｕｒｅａ−ｌｉｎｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  （ＤＮｍｔ）：ａ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（８）：４３８４−９．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（要旨）
本発明は、一局面では、サブユニット間結合により接合されたモルホリノ環構造の配列からなる骨格を含むオリゴマーを提供し、ここで、このような環構造の各々は塩基対形成部分を支持し、その結果、上記オリゴマーは、標的核酸に対し配列特異的な様式で結合し得、そして、２個の連続するこのような環構造間の少なくとも１個のサブユニット間結合は、カチオン性のペンダント基を含む。このペンダント基は、中性またはほぼ中性（例えば、生理学的）ｐＨにおいて正電荷を有する遠位の窒素原子を有する。
【０００９】
サブユニット間結合は、好ましくは、以下の構造：
【００１０】
【化１】
2010505741.tif 000003
を有するリン含有結合であり、上記式において、
ＷはＳまたはＯであり、そして、好ましくはＯであり、
ＸはＮＲ１Ｒ２またはＯＲ６であり、
ＹはＯまたはＮＲ７であり、
そして、オリゴマーにおける上記ヌクレオチド間結合の各々は、以下の無電荷結合（ａ）、ならびにカチオン性結合（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）から選択され、サブユニット間結合のうち少なくとも１つは、カチオン性結合（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）から選択される：
（ａ）無電荷結合（ａ）であって、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６およびＲ７の各々は、独立して、水素および低級アルキルから選択される、無電荷結合（ａ）；
（ｂ１）カチオン性結合（ｂ１）であって、ここで、ＸはＮＲ１Ｒ２であり、かつＹはＯであり、そして、ＮＲ１Ｒ２は、Ｒ１Ｒ２が−ＣＨＲＣＨＲＮ（Ｒ３）（Ｒ４）ＣＨＲＣＨＲ−となるように必要に応じて置換されたピペラジノ基を表し、ここで、
各Ｒは、独立してＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ４は、Ｈ、ＣＨ３または電子対であり、そして
Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｚ−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および［Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ’ＮＨ］ｍＨから選択され、ここで、ＺはＣ（Ｏ）または直接結合であり、Ｌは、アルキル、アルコキシおよびアルキルアミノから選択される結合を有する長さ１８原子まで、好ましくは１２原子まで、より好ましくは８原子までの任意のリンカーであり、Ｒ’は、天然に存在するアミノ酸またはその一炭素もしくは二炭素のホモログの側鎖であり、そして、ｍは１〜６、好ましくは１〜４である、
カチオン性結合（ｂ１）；
（ｂ２）カチオン性結合（ｂ２）であって、ここで、ＸはＮＲ１Ｒ２であり、かつＹはＯであり、Ｒ１はＨまたはＣＨ３であり、そして、Ｒ２はＬＮＲ３Ｒ４Ｒ５であり、ここで、Ｌ、Ｒ３およびＲ４は、上に定義したとおりであり、そして、Ｒ５は、Ｈ、低級アルキルまたは低級（アルコキシ）アルキルである、カチオン性結合（ｂ２）；ならびに
（ｂ３）カチオン性結合（ｂ３）であって、ここで、ＹはＮＲ７であり、かつＸはＯＲ６であり、そして、Ｒ７はＬＮＲ３Ｒ４Ｒ５であり、ここで、Ｌ、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、上に定義したとおりであり、そして、Ｒ６はＨまたは低級アルキルである、カチオン性結合（ｂ３）。
【００１１】
好ましくは、オリゴマーは、少なくとも２個の連続したタイプ（ａ）の結合（すなわち、無電荷結合）を含む。さらなる実施形態では、オリゴマーにおけるヌクレオチド間結合の少なくとも５％は、カチオン性結合（すなわち、タイプ（ｂ１）、（ｂ２）または（ｂ３））である；例えば、ヌクレオチド間結合の１０％〜８０％、１０％〜５０％または１０％〜３５％がカチオン性結合であり得る。
【００１２】
好ましくは、オリゴマーにおけるカチオン性結合は全て同じタイプのものである；すなわち、全てタイプ（ｂ１）のものであるか、全てタイプ（ｂ２）のものであるか、または、全てタイプ（ｂ３）のものである。
【００１３】
一実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチド間結合は、タイプ（ｂ１）のものであり、ここで、好ましくは、各ＲがＨであり、Ｒ４がＨ、ＣＨ３または電子対であり、かつ、Ｒ３が、Ｈ、低級アルキル（例えば、ＣＨ３）、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＣ（Ｏ）−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択される。Ｒ３の後者２つの実施形態は、それぞれ、ピペラジン環に直接結合されるか、または、リンカー基Ｌへのペンダントのいずれかで、グアニジノ部分を提供する。合成を容易にするために、Ｒ３における変数Ｚは、好ましくは、示されるようにＣ（Ｏ）（カルボニル）である。
【００１４】
リンカー基Ｌは、上述のように、その骨格中にアルキル（例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−）、アルコキシ（−Ｃ−Ｏ−）およびアルキルアミノ（例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−）から選択される結合を含むが、但し、Ｌにおける末端の原子（例えば、カルボニルまたは窒素に隣接する原子）は、炭素原子である。分枝状の結合（例えば、−ＣＨ２−ＣＨＣＨ３−）も可能であるが、リンカーは、好ましくは直鎖状である。一実施形態では、リンカーは、炭化水素リンカーである。このようなリンカーは、構造−（ＣＨ２）ｎ−を有し得、ここで、ｎは１〜１２、好ましくは２〜８、より好ましくは２〜６である。
【００１５】
モルホリノサブユニットは、以下の構造：
【００１６】
【化２】
2010505741.tif 000004
を有し、上記式において、Ｐｉは、塩基対形成部分であり、そして、前記されるサブユニット間結合が、（ｉ）の窒素原子を隣接するサブユニットの５’炭素に連結する。塩基対形成部分Ｐｉは、同じであっても異なっていてもよく、そして一般には、標的核酸に結合する配列を提供するように設計される。
【００１７】
上記結合のタイプ（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）の実施形態の、モルホリノサブユニットを連結するための使用は、以下のように概略的に例示され得る：
【００１８】
【化３】
2010505741.tif 000005
好ましくは、オリゴマーにおけるヌクレオチド間結合の少なくとも５％は、カチオン性結合（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）から選択され；さらなる実施形態では、ヌクレオチド間結合の１０％〜３５％は、カチオン性結合（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）から選択される。上述のように、オリゴマーにおけるカチオン性結合は全て、好ましくは、同じタイプまたは同じ構造のものである。上述のように、オリゴマーにおけるカチオン性結合は全て、好ましくは、同じタイプまたは同じ構造のものである。
【００１９】
さらなる実施形態では、カチオン性結合は、以下に示されるような結合（ｂ１’）および（ｂ１”）から選択され、ここで、（ｂ１’）は、本明細書中で「Ｐｉｐ」結合と呼ばれ、そして、（ｂ１”）は、本明細書中で、「ＧｕＸ」結合と呼ばれる：
【００２０】
【化４】
2010505741.tif 000006
上記構造において、ＷはＳまたはＯであり、そして好ましくはＯであり；Ｒ１およびＲ２の各々は、独立して、水素および低級アルキルから選択され、そして好ましくはメチルであり；そして、Ａは水素または（ｂ１’）および（ｂ１”）における１以上の炭素原子上の非干渉性置換基を表す。好ましくは、各Ａは水素である；すなわち、窒素複素環は好ましくは置換されない。さらなる実施形態では、ヌクレオチド間結合の少なくとも１０％は、タイプ（ｂ１’）または（ｂ１”）のものである；例えば、ヌクレオチド間結合の２０％〜８０％、２０％〜５０％または２０％〜３０％が、タイプ（ｂ１’）または（ｂ１”）のものであり得る。
【００２１】
他の実施形態では、オリゴマーは、タイプ（ｂ１’）の結合を含まない。あるいは、オリゴマーは、各ＲがＨであり、Ｒ３がＨまたはＣＨ３であり、かつＲ４がＨ、ＣＨ３または電子対である場合のタイプ（ｂ１）の結合を含まない。
【００２２】
なおさらなる実施形態では、カチオン性結合は、Ｌが、アルキル（例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−）、アルコキシ（−Ｃ−Ｏ−）およびアルキルアミノ（例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−）から選択される結合を含む長さ１２原子までのリンカーであるが、但し、Ｌにおける末端の原子（例えば、カルボニルまたは窒素に隣接する原子）は、炭素原子である場合のタイプ（ｂ２）のものである。
【００２３】
モルホリノサブユニットはまた、以下にさらに記載されるような非リンベースのサブユニット間結合によって連結され得、ここで、少なくとも１個のサブユニット間結合は、上述のようなカチオン性のペンダント基で修飾される。例えば、モルホリノ環上の５’窒素原子は、スルファミド結合（例えば、図２Ｇを参照のこと）、または尿素結合（この場合、リンが、それぞれ、炭素または硫黄で置換される）において用いられ得、そして、上記の構造（ｂ３）中の５’窒素原子と同様の様式で修飾され得る。
【００２４】
本発明のオリゴマーはまた、細胞内へのオリゴマーの輸送を増強するのに有効なペプチド輸送部分に結合され得る。輸送部分は、好ましくは、例えば図１Ｄならびに図２Ｐ〜２Ｑに示されるように、オリゴマーの末端に結合される。
【００２５】
好ましくは、輸送部分は、６個〜１６個のアミノ酸を含み、かつ、（Ｘ’Ｙ’Ｘ’）、（Ｘ’Ｙ’）、（Ｘ’Ｚ’）および（Ｘ’Ｚ’Ｚ’）からなる群より選択される部分配列からなり、
ここで、
（ａ）Ｘ’サブユニットの各々は、独立して、アルギニンまたはアルギニンアナログを表し、該アナログは、構造Ｒ１Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）Ｒ２の側鎖を含むカチオン性α−アミノ酸であり、ここで、Ｒ１はＨまたはＲであり；Ｒ２はＲ、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲ２であり、ここでＲは低級アルキルまたは低級アルケニルであり、そして、さらに、酸素または窒素を含み得；Ｒ１およびＲ２は、一緒になって環を形成し得；そして、この側鎖は、Ｒ１またはＲ２を介して該アミノ酸に連結される；
（ｂ）Ｙ’サブユニットの各々は、独立して、中性の直鎖状アミノ酸−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨＲ）ｎ−ＮＨ−を表し、ここで、ｎは１〜７であり、かつ、各Ｒは、独立して、Ｈまたはメチルである；そして
（ｃ）Ｚ’サブユニットの各々は、独立して、中性のアラルキル側鎖を持つα−アミノ酸を表す。
【００２６】
選択した実施形態では、ペプチドは、（Ｘ’Ｙ’Ｘ’）、（Ｘ’Ｙ’）、（Ｘ’Ｚ’）および（Ｘ’Ｚ’Ｚ’）から選択される単一の部分配列の少なくとも２回または少なくとも３回の繰り返しからなる配列を含む。例えば、ペプチドは、（Ｘ’Ｙ’Ｘ’）ｐ、（Ｘ’Ｙ’）ｍおよび（Ｘ’Ｚ’Ｚ’）ｐのうち１つによって表される配列を含み得、ここで、ｐは２〜５でありかつｍは２〜８である。
【００２７】
好ましくは、各Ｘ’について、側鎖部分はグアニジルであり；各Ｙ’は、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−であり、ここで、ｎは１〜７であり；そして、各Ｚ’は、フェニルアラニンである。Ｙ’の好ましい実施形態では、ｎは２または５であり、その結果、Ｙ’は、β−アラニンサブユニットおよび６−アミノヘキサン酸サブユニットから選択される。
【００２８】
このタイプの好ましいペプチドとしては、単一のＹ’サブユニットと交互になったアルギニン二量体を含むものが挙げられ、ここで、Ｙ’は好ましくはＡｈｘである。例としては、式（ＲＹ’Ｒ）４または式（ＲＲＹ’）４を有するペプチドが挙げられる。一実施形態では、Ｙ’は、６−アミノヘキサン酸サブユニットであり、かつｐは４である。さらなる実施形態では、各Ｚ’はフェニルアラニンであり、かつｍは３または４である。
【００２９】
結合されたペプチドは、好ましくは、例えば図１Ｄに示されるように、リンカーＡｈｘ−Ｂを介してオリゴマーの末端に連結され、ここで、Ａｈｘは６−アミノヘキサン酸サブユニットであり、かつ、Ｂはβ−アラニンサブユニットである。
【００３０】
関連する局面では、本発明は、モルホリノサブユニットの配列を有するオリゴマーのアンチセンス活性を、本明細書中に開示されるような少なくとも１個のカチオン性のサブユニット間結合を含むようにオリゴマーを修飾することによって増強する方法を提供し、モルホリノサブユニットの各々はサブユニット間結合により接合されており、そして、塩基対形成部分を支持する。一実施形態では、上記カチオン性のサブユニット間結合は、上記のようなタイプ（ｂ１’）の結合を含まない。アンチセンス活性の増強は、以下によって実証され得る：
（ｉ）対応する非修飾のオリゴマーにより提供される発現と比較した、コードタンパク質の発現の低下（アンチセンスオリゴマーのその標的配列への結合が、上記コードタンパク質についての翻訳開始コドンをブロックするのに有効である場合）、または
（ｉｉ）対応する非修飾のオリゴマーにより提供される発現と比較した、コードタンパク質の発現の増加（アンチセンスオリゴマーのその標的配列への結合が、正確にスプライシングを受けたときに上記タンパク質をコードするプレｍＲＮＡ内の異常なスプライシング部位をブロックするのに有効である場合）。これらの影響の測定に適したアッセイは、以下にさらに記載される。一実施形態では、修飾は、本明細書中に記載されるような、細胞を含まない翻訳アッセイ、または、細胞培養におけるスプライシング補正・翻訳アッセイにおけるこの活性を提供する。好ましくは、活性は、少なくとも２個の因子、より好ましくは、少なくとも５個の因子、最も好ましくは、少なくとも１０個の因子によって増強される。
【００３１】
本明細書中に記載される化合物は、タンパク質の産生を阻害する方法において使用され得る。したがって、このようなタンパク質をコードする核酸は、本明細書中に開示されるように、少なくとも１個のカチオン性のサブユニット間結合を含む（好ましくは、２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含む）、アンチセンスオリゴマーに対して暴露され、ここで、塩基対形成部分Ｐｉは、タンパク質の産生を阻害するのに有効な場所で核酸の一部とハイブリダイズするのに有効な配列を形成する。この場所は、例えば、ｍＲＮＡのＡＴＧ開始コドン、プレｍＲＮＡのスプライシング部位、または、以下に記載されるようなウイルスの標的配列であり得る。
【００３２】
好ましくは、オリゴマーは、標的配列への結合に関し、約５０℃より高いＴｍを有し、そして、これは、哺乳動物細胞によって能動的に取り込まれる。オリゴマーは、このような取り込みを促進するために、本明細書中に記載されるような輸送部分に結合され得る。
【００３３】
一実施形態では、オリゴマーは、患者の冠状動脈の一領域における再狭窄のリスクを低下させる方法において使用され得、この領域は、遠位端に拡張可能なバルーンを備えるカテーテルを用いた冠状動脈血管形成術によって処置されたか、または、冠状動脈バイパス手術において形成された接合部にある。この方法は、損傷の血管部位への局所的な直接投与により、少なくとも１個のカチオン性のサブユニット間結合（好ましくは、２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合）を含み、１２個〜４０個のサブユニットを有し、かつ配列番号５９により規定されるヒトｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡのＡＵＧ開始部位領域内の少なくとも１２個の連続する塩基の標的配列に対して相補的な塩基化配列を含む、本明細書中に記載されるようなオリゴマーを、患者における再狭窄のリスクを低下させるのに有効な量で、患者に投与する工程を包含する。化合物は、以下のうちの１つにより投与される：
（ａ）血管の領域をアンチセンス化合物を含むレザバに接触させ、そして、イオン浸透療法またはエレクトロポレーションによって、レザバから血管内へと化合物を導入すること；
（ｂ）カテーテルバルーンの表面上に含まれる注入器を介して、圧力下で、血管の領域内に直接カテーテルから化合物を注入すること、ここで、上記注入器は、血管内の中膜を貫通し得る；
（ｃ）被包された（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）形態のアンチセンス化合物を含むマイクロ粒子を、血管の領域に注入するか、または、血管の領域に接触させること；
（ｄ）カテーテルバルーンの表面上に含まれ、アンチセンス化合物を拡散可能な形態で含むヒドロゲルに、血管の領域を接触させること；
（ｅ）拡散可能な形態のアンチセンス化合物を含む外側表面層を有するステントに、血管の領域を接触させること；および
（ｆ）血管内投与によって化合物を注入し、血管組織への全身送達をもたらすこと。
【００３４】
アンチセンス化合物は、配列番号４３により同定される配列に対し少なくとも９０％の相同性を有するか、あるいは、配列番号６０および６１から選択される配列に対し少なくとも９０％の相同性を有する標的化配列を有し得る。
【００３５】
別の実施形態では、オリゴマーは、プロセシングを受ける前のｍＲＮＡにおける通常のスプライスアクセプター接合部の５’側の１〜約２５塩基対下流を有するｍＲＮＡ配列に対して標的化され得る。このような標的化は、自然なｍＲＮＡのスプライシングが進行することを防止し、そして、スプライス改変体ｍＲＮＡを生じるのに有効である。
【００３６】
適切な標的タンパク質としては、例えば、転写因子、特に、癌遺伝子または癌原遺伝子のタンパク質（例えば、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ａｂｌ、ｂｃｌおよびｐ５３）；マトリクスタンパク質（例えば、インテグリンおよびカテドリン（ｃａｔｈｅｄｒｉｎ））；他の腫瘍発現タンパク質（例えば、ｈＣＧ）；テロメラーゼ；レセプタータンパク質；ウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ、ヒトパピローマウイルスおよびヒトパルボウイルスＢ１９のサブゲノムの（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）スプライシングを受けたｍＲＮＡから発現されるタンパク質）；および免疫調節性タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−２、ＰＤ−１、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦβおよびＴＮＦレセプター）が挙げられる。
【００３７】
別の実施形態では、オリゴマーは、一本鎖で、ポジティブセンスゲノムが１２ｋｂ未満であり、かつ、複数の機能を持つタンパク質を含むポリタンパク質をコードする最初のオープンリーディングフレームを持つ、ピコルナウイルス属、カリシウイルス属、トガウイルス属またはフラビウイルス属からのＲＮＡウイルスの複製を阻害するために使用され得る。したがって、ウイルス、または、代表的にはウイルスに感染した細胞は、本明細書中に開示される、少なくとも１個のカチオン性のサブユニット間結合（好ましくは、２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合）を含み、かつ、最初のオープンリーディングフレームの翻訳開始領域にわたるウイルス標的配列に対し実質的に相補的な標的化塩基配列を支持するサブユニットの配列を有するオリゴマーに対して曝露される。
【００３８】
例示的な標的化配列は、以下からなる群より選択される配列に対し、少なくとも９０％の相同性を有する：
（ｉ）Ｍａｈｏｎｅｙ株およびＳａｂｉｎ株のポリオウイルスについての配列番号６２、
（ｉｉ）Ａ型肝炎ウイルスについての配列番号６３、
（ｉｉｉ）ライノウイルス１４についての配列番号６４、
（ｉｖ）ライノウイルス１６についての配列番号６５、
（ｖ）ライノウイルス１Ｂについての配列番号６６。
【００３９】
カルシウイルスに対して指向される、他の例示的な標的化配列は、以下からなる群より選択される配列に対し、少なくとも９０％の相同性を有する：
（ｉ）血清型Ｐａｎ−１ベシウイルス（ｖｅｓｉｖｉｒｕｓ）についての配列番号６７、６８および６９、
（ｉｉ）ブタカリシウイルスについての配列番号７０、
（ｉｉｉ）ノーウォークウイルスについての配列番号７１ならびに
（ｉｖ）ネコカリシウイルスについての配列番号７２。
【００４０】
Ｅ型肝炎ウイルスの阻害における使用については、標的化配列は、配列番号７３および７４からなる群より選択される配列に対し、少なくとも９０％の相同性を有する。Ｃ型肝炎フラビウイルスの阻害における使用については、標的化配列は、配列番号７５により同定されるＨＣＶ  ＡＵＧ開始部位領域の少なくとも１２個の連続する塩基配列に対して相補的である。例示的な標的化配列としては、配列番号１８および７６に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列が挙げられる。
【００４１】
さらなる実施形態では、オリゴマーは、一本鎖で、ポジティブセンスゲノムを持ち、かつ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｉｃｏｒｎｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科またはＨｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ科のうちの１つから選択されるＲＮＡウイルスの宿主細胞内での複製の阻害に使用され得る。
【００４２】
この方法は、ウイルスの標的配列として、その配列が内部にステム−ループの二次構造を形成し得る感染性ウイルスのポジティブ鎖の５’末端の４０塩基以内にある領域を最初に同定する工程を包含する。次いで、段階的な固相合成によって、本明細書中に記載されるような少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を有し、好ましくは２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含み、かつ、内部で二重鎖構造を形成し得るウイルスのゲノム領域に相補的な少なくとも１２のサブユニットの標的化配列を有するオリゴマーが構築され、ここで、このオリゴマーは、ウイルスの標的配列と共に、ウイルスのポジティブセンス鎖とオリゴヌクレオチド化合物とから構成されるヘテロ二重鎖構造を形成し得、そして、少なくとも４５℃の解離のＴｍと、このようなステム−ループ構造の崩壊とによって特徴付けられる。
【００４３】
標的配列は、入力ＲＮＡ（ｉｎｐｕｔ  ＲＮＡ）配列の最小自由エネルギー状態についての検索に基づいて二次構造の予測を行うことができるコンピュータプログラムによって、５’末端配列、例えば、５’末端の４０塩基を解析することにより同定され得る。
【００４４】
関連する局面において、オリゴマーは、哺乳動物宿主細胞において、一本鎖のポジティブセンスゲノムを有する感染ＲＮＡウイルスであって、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｉｃｏｒｎｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科またはＨｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ科のうちの１つから選択されるＲＮＡウイルスの複製を阻害する方法において使用され得る。この方法は、感染した宿主細胞に、本明細書中に記載されるような、内部でステム−ループ二次構造を形成し得るポジティブストランドのウイルスゲノムの５’末端の４０塩基以内の領域に対して相補的な少なくとも１２のサブユニットの標的化配列を持つオリゴマーのウイルス阻害量を投与する工程を包含する。この化合物は、宿主細胞に投与されたときに、（ｉ）ウイルスのポジティブセンス鎖とオリゴヌクレオチド化合物とから構成され、そして（ｉｉ）少なくとも４５℃の解離のＴｍとこのようなステム−ループ構造の崩壊とによって特徴付けられる、ヘテロ二重鎖構造を形成させるのに有効である。この化合物は、ウイルスに感染したか、またはウイルス感染の危険性のある哺乳動物被験体に対して投与され得る。
【００４５】
フラビウイルスまたはヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）の処置について、標的化配列は、以下の配列のうちの１つ内にあるステム−ループの二次構造に関連する領域に対して相補的である：
（ｉ）Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ脳炎ウイルスについての配列番号７７；
（ｉｉ）日本脳炎ウイルスについての配列番号７８；
（ｉｉｉ）マリーバレー脳炎ウイルスについての配列番号７９；
（ｉｖ）西ナイル熱ウイルスについての配列番号８０；
（ｖ）黄熱病ウイルスについての配列番号８１；
（ｖｉ）デング熱ウイルス２型についての配列番号８２；
（ｖｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスについての配列番号８３；
（ｖｉｉｉ）ダニ媒介ウイルスについての配列番号８４；
（ｉｘ）オムスク出血性熱ウイルスについての配列番号８５；および
（ｘ）ポーワッサンウイルスについての配列番号８６。
【００４６】
これらのウイルスについての例示的な標的化配列としては、以下の配列、または、関連する標的配列における二重鎖二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分が挙げられる：
（ｉ）Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ脳炎ウイルスについての配列番号８７および８８；
（ｉｉ）日本脳炎ウイルスについての配列番号８９および９０；
（ｉｉｉ）マリーバレー脳炎ウイルスについての配列番号９１および９２；
（ｉｖ）西ナイル熱ウイルスについての配列番号９３および９４；
（ｖ）黄熱病ウイルスについての配列番号９５および９６；
（ｖｉ）デング熱ウイルスについての配列番号９７、９８；
（ｖｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスについての配列番号９９および１００；
（ｖｉｉｉ）ダニ媒介ウイルスについての配列番号１０１および１０２；
（ｉｘ）オムスク出血性熱ウイルスについての配列番号１０３および１０４；ならびに
（ｘ）ポーワッサンウイルスについての配列番号１０５および１０６。
【００４７】
エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス（Ｈｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ）またはアフトウイルス（Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ）の処置について、標的化配列は、以下の配列のうちの１つ内にあるステム−ループの二次構造に関連する領域に対して相補的である：
（ｉ）Ｍａｈｏｎｅｙ株およびＳａｂｉｎ株のポリオウイルスについての配列番号１０７；
（ｉｉ）ヒトエンテロウイルスＡについての配列番号１０８；
（ｉｉｉ）ヒトエンテロウイルスＢについての配列番号１０９；
（ｉｖ）ヒトエンテロウイルスＣについての配列番号１１０；
（ｖ）ヒトエンテロウイルスＤについての配列番号１１１；
（ｖｉ）ヒトエンテロウイルスＥについての配列番号１１２；
（ｖｉｉ）ウシエンテロウイルスについての配列番号１１３；
（ｖｉｉｉ）ヒトライノウイルス８９についての配列番号１１４；
（ｉｘ）ヒトライノウイルスＢについての配列番号１１５；
（ｘ）口蹄疫ウイルスについての配列番号１１６；および
（ｘｉ）Ａ型肝炎ウイルスについての配列番号１１７。
【００４８】
これらのウイルスについての例示的な標的化配列としては、以下の配列、または、関連する標的配列における二重鎖二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分が挙げられる：
（ｉ）Ｍａｈｏｎｅｙ株およびＳａｂｉｎ株のポリオウイルスについての配列番号１１８および１１９；
（ｉｉ）ヒトエンテロウイルスＡについての配列番号１２０および１２１；
（ｉｉｉ）ヒトエンテロウイルスＢについての配列番号１２２および１２３；
（ｉｖ）ヒトエンテロウイルスＣについての配列番号１２４および１２５；
（ｖ）ヒトエンテロウイルスＤについての配列番号１２６および１２７；
（ｖｉ）ヒトエンテロウイルスＥについての配列番号１２８および１２９；
（ｖｉｉ）ウシエンテロウイルスについての配列番号１３０および１３１；
（ｖｉｉｉ）ヒトライノウイルス８９についての配列番号１３２および１３３；
（ｉｘ）ヒトライノウイルスＢについての配列番号１３４および１３５；
（ｘ）口蹄疫ウイルスについての配列番号１３６および１３７；ならびに
（ｘｉ）Ａ型肝炎ウイルスについての配列番号１３８および１３９。
【００４９】
カリシウイルスまたはノロウイルスの処置について、標的化配列は、以下の配列のうちの１つ内にあるステム−ループの二次構造に関連する領域に対して相補的である：
（ｉ）ネコカリシウイルスについての配列番号１４０；
（ｉｉ）イヌカリシウイルスについての配列番号１４１；
（ｉｉｉ）ブタ腸ウイルスについての配列番号１４２；
（ｉｖ）カリシウイルス株ＮＢについての配列番号１４３；および
（ｖ）ノーウォークウイルスについての配列番号１４４。
【００５０】
これらのウイルスについての例示的な標的化配列としては、以下の配列、または、関連する標的配列における二重鎖二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分が挙げられる：
（ｉ）ネコカリシウイルスについての配列番号１４５および１４６；
（ｉｉ）イヌカリシウイルスについての配列番号１４７および１４８；
（ｉｉｉ）ブタ腸ウイルスについての配列番号１４９および１５０；
（ｉｖ）カリシウイルス株ＮＢについての配列番号１５１および１５２；ならびに
（ｖ）ノーウォークウイルスについての配列番号１５３および１５４。
【００５１】
へぺウイルス（Ｈｅｐｅｖｉｒｕｓ）、Ｅ型肝炎ウイルスの処置について、標的化配列は、配列番号１５５として同定される配列内にあるステム−ループの二次構造と関連する領域に対して相補的である。例示的な標的配列としては、配列番号１５６および１５７、または、関連する標的配列における二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分が挙げられる。
【００５２】
ルビウイルスまたはアルファウイルスの処置について、標的配列は、以下の配列のうちの１つ内にあるステム−ループの二次構造に関連する領域に対して相補的である：
（ｉ）風疹ウイルスについての配列番号１５８；
（ｉｉ）東部ウマ脳脊髄炎ウイルスについての配列番号１５９；
（ｉｉｉ）西部ウマ脳脊髄炎ウイルスについての配列番号１６０；および
（ｉｖ）ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスについての配列番号１６１。
【００５３】
これらのウイルスの各々についての例示的な標的配列は、以下の配列番号によって同定されるか、または、関連する標的配列における二重鎖二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分である：
（ｉ）風疹ウイルスについての配列番号１６２および１６３；
（ｉｉ）東部ウマ脳脊髄炎ウイルスについての配列番号１６４および１６５；
（ｉｉｉ）西部ウマ脳脊髄炎ウイルスについての配列番号１６６および１６７；ならびに
（ｉｖ）ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスについての配列番号１６８および１６９。
【００５４】
コロナウイルスまたはアルテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）の処置について、標的配列は、以下の配列のうちの１つ内にあるステム−ループの二次構造に関連する領域に対して相補的である：
（ｉ）ＳＡＲＳコロナウイルスＴＯＲ２についての配列番号１７０；
（ｉｉ）ブタ流行性下痢ウイルスについての配列番号１７１；
（ｉｉｉ）伝染性胃腸炎ウイルスについての配列番号１７２；
（ｉｖ）ウシコロナウイルスについての配列番号１７３；
（ｖ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅについての配列番号１７４；
（ｖｉ）マウス肝炎ウイルスについての配列番号１７５；ならびに
（ｖｉｉ）ブタ生殖器系および呼吸器系症候群ウイルスについての配列番号１７６。
【００５５】
これらのウイルスの各々についての例示的な標的配列は、以下の配列番号によって同定されるか、または、関連する標的配列における二重鎖二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分である：
（ｉ）ＳＡＲＳコロナウイルスＴＯＲ２についての配列番号１７７および１７８；
（ｉｉ）ブタ流行性下痢ウイルスについての配列番号１７９および１８０；
（ｉｉｉ）伝染性胃腸炎ウイルスについての配列番号１８１および１８２；
（ｉｖ）ウシコロナウイルスについての配列番号１８３および１８４；
（ｖ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅについての配列番号１８５および１８６；
（ｖｉ）マウス肝炎ウイルスについての配列番号１８７および１８８；ならびに
（ｖｉｉ）ブタ生殖器系および呼吸器系症候群ウイルスについての配列番号１８９および１９０。
【００５６】
ママストロウイルス（Ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、ヒトアストロウイルスの処置について、標的配列１９１は、配列番号として同定される配列内にあるステム−ループの二次構造と関連する領域に対して相補的である。例示的な標的配列は、配列番号１９３および１９４、または、関連する標的配列における二重鎖二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分である。
【００５７】
ウマ動脈炎ウイルスの処置について、標的配列は、配列番号１９２として同定される配列内にあるステム−ループの二次構造と関連する領域に対して相補的である。例示的な標的配列は、配列番号１９５、１９６、または、関連する標的配列における二重鎖二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分である。
【００５８】
活性化されたＨＩＶ感染ヒト造血細胞（例えば、マクロファージまたはＴリンパ球）においてＨＩＶ−１の複製を選択的に阻害するための方法において、このような活性化されたＨＩＶ−１感染細胞は、本明細書中に記載されるような、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を有し、好ましくは、２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を有し、好ましくは配列番号１９７〜１９９からなる群より選択される配列のうちの１つにより同定されるＨＩＶ−１のポジティブ鎖ＲＮＡの領域にある少なくとも１２の連続する塩基から構成されるウイルス標的配列に対して実質的に相補的な塩基配列を持つ、アンチセンスオリゴマーに対して曝露される。
【００５９】
一実施形態では、オリゴマーは、配列番号１９７の一領域とハイブリダイズして、感染細胞におけるＨＩＶ  Ｖｉｆタンパク質の合成を阻害し得る。この実施形態における化合物は、配列番号２００〜２０３からなる群より選択される配列のうち１つからの少なくとも１２の連続する塩基を有し得る。
【００６０】
別の実施形態では、オリゴマーは、配列番号１８の一領域とハイブリダイズして、ＨＩＶ  ｍＲＮＡ転写物の転写を阻害し得る。この実施形態の化合物は、配列番号２０４および２０５として同定される配列からの少なくとも１２の連続する塩基を有し得る。
【００６１】
別の実施形態では、オリゴマーは、配列番号１９の一領域とハイブリダイズして、マイナス鎖の転移段階をブロックすることによってウイルスＲＮＡの逆転写を阻害し得る。この実施形態における化合物は、配列番号２０６として同定される配列からの少なくとも１２の連続する塩基を有し得る。
【００６２】
別の実施形態では、オリゴマーは、本明細書中に記載され、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を含み、好ましくは２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含む、ウイルス感染細胞におけるニドウイルス（ｎｉｄｏｖｉｒｕｓ）の複製を阻害するのに十分な量のオリゴマーに対してヒト細胞を曝露することによって、ヒト細胞においてニドウイルスの感染を阻害する方法において使用され得る。オリゴマーは、配列番号２０７〜２０９の群からのニドウイルスのポジティブ鎖のゲノムＲＮＡの５’リーダー配列内の配列に含まれる少なくとも８塩基に対して相補的な配列を有し、この配列の各々は、内部リーダー転写調節配列を含む；そして
オリゴマーは、ニドウイルスのポジティブ鎖ゲノムＲＮＡと共に、少なくとも４５℃の解離のＴｍと、（２）ポジティブ鎖ウイルスゲノムの５’リーダー領域における転写調節配列とネガティブ鎖の３’部分ゲノム領域における転写調節配列との間の塩基対形成の崩壊とによって特徴付けられる二重鎖構造を形成し得る。
【００６３】
化合物の配列は、配列番号２０７〜２０９の配列のうち１つに含まれる転写調節配列の少なくとも一部分に対して相補的であり得る。この実施形態における例示的な化合物の配列としては、配列番号２１０〜２１４が挙げられる。
【００６４】
ヒトＳＡＲＳウイルスの複製の阻害における使用について、化合物は、配列番号２１３および２１４の配列のうち１つを含み得る。ヒトコロナウイルス２２９ＥまたはヒトコロナウイルスＯＣ４３の複製の阻害における使用について、化合物は、コロナウイルス２２９Ｅについては配列番号２１０または２１１の配列のうちの１つを含み得、そして、コロナウイルスＯＣ４３については、配列番号２１２の配列を含み得る。
【００６５】
ヒト被験体におけるニドウイルス感染の処置における使用について、化合物が、被験体に経口的に、または、肺送達によって投与されて、化合物をウイルス感染細胞と接触させ得る。
【００６６】
別の実施形態では、オリゴマーは、ヒト樹状細胞をＴ細胞の抗原特異的な活性化の能力が低下した状態へと、そして、細胞外ＩＬ−１０の産生が増加した成熟な樹状細胞に誘導する方法において使用され得る。この方法は、本明細書中に記載されるような、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を含み、好ましくは２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含み、かつ、そのプロセシングされた形態において、配列番号２１５によって同定されるプロセシングを受ける前かまたはプロセシングを受けた後のヒトＣＤ−８６転写物の発現感受性領域に対してハイブリダイズし、この化合物と転写物との間で、少なくとも４５℃のＴｍを有するヘテロ二重鎖構造を形成するのに有効な塩基配列を含むオリゴマーに対して、ヒト樹状細胞の集団を曝露する工程を包含する。ヘテロ二重鎖の形成は、この細胞における全長ＣＤ８６の発現をブロックし、次いで、樹状細胞の表面上での全長ＣＤ８６の発現の阻害をもたらし、そして、成熟な樹状細胞による細胞外ＩＬ−１０の発現の増強をもたらす。
【００６７】
プロセシングを受けたヒトＣＤ８６転写物の開始部位に近い発現感受性標的領域にハイブリダイズするのにアンチセンスオリゴマーが有効である場合、このオリゴマーは、配列番号２１６によって同定される、プロセシングを受けたヒトＣＤ８６転写物における少なくとも１２の連続する塩基を含む標的領域に対して相補的な塩基配列を有し得、ここで、この化合物は、プロセシングを受けた転写物の翻訳をブロックするのに有効である。アンチセンス化合物は、例えば、配列番号４８〜５０によって同定される塩基配列のうち１つを有し得る。
【００６８】
アンチセンスオリゴマーが、プロセシングを受ける前のヒトＣＤ８６のスプライシング部位にハイブリダイズするのに有効である場合、化合物は、プロセシングを受ける前のヒトＣＤ８６転写物におけるスプライシング部位の少なくとも１２の連続する塩基に対して相補的な塩基配列を有し得、ここで、この化合物は、プロセシングを受ける前のＣＤ８６転写物のプロセシングをブロックし、全長のプロセシングを受けたＣＤ８６転写物をもたらすのに有効である。プロセシングを受ける前のＣＤ８６転写物におけるスプライシング部位は、配列番号２１７〜２２０により同定される配列のうち１つを有し得る。アンチセンス化合物は、例えば、配列５１〜５４により同定される塩基配列のうち１つを有し得る。
【００６９】
同種の組織または器官の移植を受けたヒト被験体における移植拒絶の阻害における使用について、オリゴマーは、移植拒絶の進度および程度を阻害するのに有効な量で被験体に対し投与される。化合物は、被験体における同種の組織または器官の移植の前および後の両方に投与され得、そして、化合物の投与は、１週間〜３週間の選択された期間にわたり行われ得る。化合物は、必要に応じて、被験体における移植拒絶の程度を制御するために被験体に対してさらに投与され得る。
【００７０】
ヒト被験体における自己免疫状態の処置における使用について、オリゴマーは、自己免疫状態の重篤度を低下させるのに有効な量で被験体に対して投与され得る。化合物は、必要に応じて、被験体における自己免疫状態の重篤度を制御するために、長期間にわたって投与され得る。
【００７１】
別の実施形態では、オリゴマーは、一本鎖のネガティブセンスゲノムを持ち、そして、インフルエンザウイルスＡ属、インフルエンザウイルスＢ属およびインフルエンザウイルスＣ属を含むＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ属から選択されるＲＮＡウイルスの宿主細胞内での複製を阻害する方法において使用され得る。宿主細胞は、本明細書中に記載されるような、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を含み、好ましくは２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含み、かつ、以下：ｉ）インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢおよびインフルエンザウイルスＣのネガティブセンスウイルスＲＮＡセグメントの５’末端または３’末端の２５塩基、ｉｉ）インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢおよびインフルエンザウイルスＣのポジティブセンスｃＲＮＡの３’末端の末端３０塩基、ならびに、ｉｉｉ）インフルエンザウイルスｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンを周辺の５０塩基から選択される標的領域にハイブリダイズするのに有効な塩基配列を含む、オリゴマーと接触させられる。
【００７２】
このオリゴマーは、インフルエンザウイルスに感染したか、または、インフルエンザウイルス感染の危険性のある哺乳動物被験体に投与され得る。
【００７３】
インフルエンザＡウイルスの処置について、標的配列は、配列番号２２１および２２２として同定される配列の群のうちの１つと関連する領域に対してハイブリダイズする。好ましい標的配列は、配列番号２２２のマイナス鎖標的または配列番号２２１のポジティブ鎖標的のいずれかに対して相補的なものである。これらの２つの領域を標的とする例示的なアンチセンスオリゴマーは、それぞれ、配列番号２２３および２２４として列挙される。
【００７４】
別の実施形態では、本明細書中に記載されるような１以上のオリゴマーは、本明細書中に記載され、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を含み、好ましくは２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含み、かつ、配列番号２５０〜２５５からなる群より選択されるフィロウイルスｍＲＮＡのうちの１つによって同定されるポジティブ鎖ｍＲＮＡのＡＵＧ開始部位領域内の少なくとも１２の連続する塩基から構成される標的配列に対して相補的な標的塩基配列を持つ、オリゴマーに細胞を接触させることによって、エボラウイルスまたはマルブルクウイルスの宿主細胞内での複製を阻害する方法において使用され得る。
【００７５】
エボラウイルス感染の処置について、化合物は、配列番号２５０からなる群より選択される標的配列により同定されるＶＰ３５  ＡＵＧ開始部位領域内の少なくとも１２の連続する塩基から構成される標的配列に対して相補的な標的化配列を有し得る。例示的な標的化配列番号は、配列番号１により同定される。
【００７６】
エボラウイルス感染の処置についての別の実施形態では、化合物は、それぞれ配列番号２５１および２５２からなる群より選択される標的配列によって同定される、ＶＰ２４  ＡＵＧまたはＬ  ＡＵＧの開始部位領域内の少なくとも１２の連続する塩基から構成される標的配列に対して相補的な標的化配列を有し得る。例示的な標的化配列としては、それぞれ、配列番号５および１１が挙げられる。
【００７７】
マルブルクウイルス感染の処置について、化合物は、配列番号２５３によって同定される標的配列により同定されるＶＰ３５  ＡＵＧ開始部位領域内の少なくとも１２の連続する塩基から構成される標的配列に対して相補的な標的化配列を有し得る。例示的な標的化配列は、配列番号２５６および２５７からなる群より選択される。
【００７８】
マルブルクウイルス感染の処置についての別の実施形態では、化合物は、それぞれ配列番号２５４および２５５からなる群より選択される標的配列によって同定される、ＶＰ２４  ＡＵＧまたはＬ  ＡＵＧの開始部位領域内の少なくとも１２の連続する塩基から構成される標的配列に対して相補的な標的化配列を有し得る。例示的な標的化配列は、配列番号２５８〜２６０によって同定される。
【００７９】
本明細書中に開示されるオリゴマーはまた、上記のような標的化配列を有するオリゴマーの治療上有効な量を被験体に投与することによって、被験体におけるエボラまたはマルブルクのフィロウイルス感染を処置する方法において、または、本明細書中に記載され、かつ、上記のような標的化配列を有するオリゴマーを用いて被験体を予め処置し、そして、その被験体をエボラウイルス（好ましくは、弱毒化された形態）に対して曝露することによって、エボラウイルスに対して哺乳動物被験体を予防接種する方法において使用され得る。
【００８０】
別の実施形態では、本明細書中に記載されるオリゴマーは、ヒト被験体における骨格筋重量の減少を処置するための方法において使用され得る。この方法における工程は、以下を伴う：
（ａ）被験体におけるミオスタチンの血中レベルまたは組織レベルを測定する工程；
（ｂ）本明細書中に記載され、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を含み、好ましくは、２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含み、かつ、そのプロセシングを受けた形態で配列番号２２５によって同定される、プロセシングを受けたかまたはプロセシングを受ける前のヒトミオスタチンＲＮＡ転写物の発現感受性領域にハイブリダイズするのに有効な塩基配列を有するオリゴマーのミオスタチンの発現を阻害する量を被験体に投与する工程；
（ｃ）この投与によって、被験体の標的筋肉細胞内で、ヒトミオスタチンＲＮＡ転写物とアンチセンス化合物とから構成され、かつ、少なくとも４５℃の解離のＴｍを有する塩基対形成したヘテロ二重鎖構造を形成させ、それによって、上記細胞におけるミオスタチンの発現を阻害する工程；
（ｄ）アンチセンス化合物の投与後の選択した時点で、被験体におけるミオスタチンの血中レベルまたは組織レベルを測定する工程；および
（ｅ）投与されるアンチセンス化合物の量の用量または投薬計画を必要に応じて調節するために（ｄ）において測定したミオスタチンレベルを用いて投与を繰り返し、ミオスタチンの測定したレベルを最初に測定したレベルを上回って減少させ、工程（ｄ）において測定したミオスタチンのこのようなレベルを正常な健康な個体について決定した範囲内に維持する工程。
【００８１】
アンチセンスオリゴマーが、プロセシングを受ける前のヒトミオスタチン転写物のスプライシング部位にハイブリダイズするのに有効である場合、このオリゴマーは、プロセシングを受ける前のヒトミオスタチン転写物におけるスプライシング部位の少なくとも１２の連続する塩基に対して相補的な塩基配列を有し、そして、工程（ｃ）におけるヘテロ二重鎖の形成は、プロセシングを受ける前のミオスタチン転写物のプロセシングをブロックし、全長のプロセシングを受けたミオスタチン転写物をもたらすのに有効である。プロセシングを受ける前のミオスタチン転写物におけるスプライシング部位は、配列番号２２６〜２２９として同定される配列のうちの１つを有し得る。例示的なアンチセンス配列は、配列番号２３０〜２３３によって同定されるものである。
【００８２】
別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなオリゴマーは、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ属におけるエンテロウイルスまたはライノウイルスによる哺乳動物細胞におけるウイルス感染を阻害するための方法において使用され得る。この方法は、本明細書中に記載され、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を含み、好ましくは、２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含み、かつ、ウイルスのポジティブセンス鎖における配列番号５５または配列番号５６に対して相補的な少なくとも１２のサブユニットの標的化配列を有するアンチセンスオリゴマーに対して細胞を曝露し、それによって、ウイルスのポジティブセンス鎖とオリゴマーとから構成され、少なくとも４５℃の解離のＴｍによって特徴付けられるヘテロ二重鎖構造を形成させる工程を包含する。
【００８３】
オリゴマーは、配列番号２３５〜２３７によって同定される配列のうちの１つのような、配列番号２３４内に含まれる配列を有し得る。あるいは、オリゴマーは、配列番号２３９〜２４５によって同定される配列のうちの１つのような、配列番号２３８内に含まれる配列を有し得る。
【００８４】
Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ属のエンテロウイルスまたはライノウイルスにより感染された哺乳動物被験体の処置における使用について、オリゴマーは、薬学的に有効な量で被験体に投与される。化合物の投与は、ウイルス感染またはその症状の有意な減少が認められるまで継続され得る。Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ属のエンテロウイルスまたはライノウイルスによる感染の危険性がある哺乳動物被験体の処置における使用について、オリゴマーは、ウイルスによる被験体宿主細胞の感染を阻害するのに有効な量で被験体に投与される。
【００８５】
別の実施形態では、本明細書中に記載されるオリゴマーは、本明細書中に記載され、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を含み、２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含み、かつ、配列番号２４６により同定される標的配列の少なくとも１２のサブユニットに対して相補的で、哺乳動物のプロセシングを受ける前のＴ細胞抗原−４（ＣＴＬＡ−４）ｍＲＮＡのイントロン１とエキソン２との間のスプライシング接合部にまたがる、少なくとも１２のサブユニットの標的化配列を有するオリゴマーの薬学的に有効な量を被験体に投与することによって、哺乳動物被験体における免疫応答を抑制するための方法において、例えば、自己免疫状態または移植拒絶の処置または防止のために使用され得る。この化合物は、哺乳動物細胞においてプロセシングを受ける前のＣＴＬＡ−４  ｍＲＮＡと反応して、（ｉ）少なくとも４５℃の解離のＴｍによって特徴付けられ、そして（ｉｉ）これらの細胞における、リガンド非依存性のＣＴＬＡ−４をコードするプロセシングを受けたｍＲＮＡの、全長ＣＴＬＡ−４をコードするプロセシングを受けたｍＲＮＡに対する割合を高めるのに有効であるヘテロ二重鎖を形成し得る。
【００８６】
同種の器官移植を受ける予定のヒト被験体における移植拒絶の予防について、化合物の投与は、予定された移植の少なくとも１週間前に開始され得る。自己免疫状態の処置について、化合物の投与は、自己免疫状態の所望される改善が観察されるまで継続され得る。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１Ａ】図１Ａは、例示的な無電荷結合構造を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂおよび１Ｃは、本発明の例示的なカチオン性結合構造を示し、各Ｂは、独立して、塩基対形成部分である。
【図１Ｃ】図１Ｂおよび１Ｃは、本発明の例示的なカチオン性結合構造を示し、各Ｂは、独立して、塩基対形成部分である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、例示的なカチオン性のサブユニット間結合を含み、末端がアルギニンリッチなペプチド輸送部分に結合されたモルホリノオリゴマーを示す。（図１Ｃおよび１Ｄには複数のタイプのカチオン性結合が示されるが、オリゴマーは、代表的には、１つのタイプのカチオン性結合を含む）。
【図２Ａ】図２Ａは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＩの保護された認識部分Ｐｉを持つ、代表的なモルホリノサブユニット１ａ〜ｅを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、対応するリボヌクレオシドから図２Ａのサブユニットを調製するための合成スキームを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本明細書中で称されるような、結合タイプ（ａ）（無電荷）および結合タイプ（ｂ１）および（ｂ２）（荷電）を調製するための、活性化され、保護されたサブユニットの調製を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、（１−ピペラジノ）ホスフィニルインデンオキシ（「Ｐｉｐ」）結合を含むモルホリノサブユニットを作製するために使用され得る合成経路の概略図である。
【図２Ｅ】図２Ｅおよび２Ｆは、本明細書中で称されるような、タイプ（ｂ３）の結合（荷電）を調製するための、活性化され、保護されたサブユニットの調製を示す。
【図２Ｆ】図２Ｅおよび２Ｆは、本明細書中で称されるような、タイプ（ｂ３）の結合（荷電）を調製するための、活性化され、保護されたサブユニットの調製を示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、タイプ（ｂ３）に類似するが、非リン含有結合に基づく結合（荷電）（具体的には、スルホンアミド結合）を調製するために使用され得るサブユニットの調製を示す。
【図２Ｈ】図２Ｈは、モルホリノオリゴマーの段階的な調製のために使用される合成樹脂の修飾に使用するためのジスルフィドアンカーの調製を示し、これは、チオールでの処理によりオリゴマーの容易な放出を可能にする。
【図２Ｉ】図２Ｉは、合成アンチセンスオリゴマーの水溶性を高めるトリエチレングリコール含有部分（「テイル」）の導入を示す。
【図２Ｊ】図２Ｊは、モルホリノオリゴマーの固相合成に有用な樹脂の調製を示す。
【図２Ｋ】図２Ｋは、大規模なオリゴマー合成のためのＮ２，Ｏ６−保護モルホリノＧサブユニットの調製を示す。
【図２Ｌ】図２Ｌは、モルホリノオリゴマー上のアミンの直接的なグアニル化によるグアニジニウム基の導入を示す。
【図２Ｍ】図２Ｍは、アミノ酸およびグアニジノ酸の組み込みによる、モルホリノオリゴマーへのグアニジニウム基の導入を示す。
【図２Ｎ】図２Ｎは、骨格および末端位置におけるグアニジノ酸の組み込みによる、モルホリノオリゴマーへのグアニジニウム基の導入を示す。
【図２Ｏ】図２Ｏは、骨格モルホリノオリゴマーへのペプチドの導入を示す。
【図２Ｐ】図２Ｐは、骨格中に結合タイプｂ１の荷電基を有するモルホリノオリゴマーの３’末端における輸送ペプチドの導入を示す。
【図２Ｑ】図２Ｑは、骨格中にＧｕＸ結合を有するモルホリノオリゴマーの３’末端における輸送ペプチドの導入を示す。
【図２Ｒ】図２Ｒは、モルホリノオリゴマーのアミンの還元的アルキル化を示す。
【図３】図３は、無細胞の翻訳アッセイにおいて、ＥＢＯＶ  ＶＰ２４  ｍＲＮＡを標的とするカチオン性結合を持つ＋ＰＭＯのアンチセンス活性が、無電荷のＰＭＯと比較して増加したことを示す。使用した＋ＰＭＯは、それぞれ、８および６のカチオン性結合を持つＶＰ２４−８＋（配列番号１０）およびＶＰ２４５’ｔｒｍ６＋（配列番号９）であり、その無電荷ＰＭＯの相対物（それぞれ、配列番号４および４）と比較した。
【図４】図４は、無細胞の翻訳アッセイにおけるＬ遺伝子ｍＲＮＡを標的とする＋ＰＭＯのアンチセンス活性が増加したことを示す。
【図５】図５は、ＥＢＯＶ  ＶＰ３５：ルシフェラーゼｍＲＮＡを用いてプログラムされた無細胞の翻訳アッセイにおいて使用される際に、ＥＢＯＶ  Ｌ遺伝子を標的とする＋ＰＭＯの特異性を示す。グラフは、１ｍＭの＋ＰＭＯ濃度まで、標的以外に対するアンチセンス活性がないことを示す。
【図６】図６は、ＥＢＯＶ  ＶＰ２４遺伝子を標的とする３つの異なる＋ＰＭＯ（ＶＰ２４−２＋、ＶＰ２４−４ａ＋およびＶＰ２４−４ｂ＋；それぞれ、配列番号６〜８）についての、感染後１４日間の期間にわたるマウスの生存率として表し、そして、無電荷ＰＭＯコントロール（ＶＰ−２４；配列番号５）およびリン酸緩衝化生理食塩水のネガティブ処置コントロール（ＰＢＳ）と比較した、処置の効力のプロットである。
【図７】図７は、材料および方法に記載される細胞培養におけるスプライシング補正および翻訳のアッセイにおいて、カチオン性「Ｐｉｐ」結合の配置が異なる（Ｐ８−中央（ｃｅｎｔａｌｉｚｅｄ）、Ｐ８−分散（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ）、Ｐ６−分散（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ）、Ｐ４−分散（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ）およびＰ８−分極（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ））＋ＰＭＯのアンチセンス活性が、無電荷のＰＭＯ（「７０５」；配列番号２８６）に対して増加したことを示す。
【図８】図８は、図８に記載されるような細胞培養におけるスプライシング補正・翻訳のアッセイにおいて、カチオン性「ＧｕＸ」結合の配置が異なる（Ｇ８−中央（ｃｅｎｔａｌｉｚｅｄ）、Ｇ８−分散（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ）、Ｇ６−分散（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ）、Ｇ４−分散（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ）およびＧ８−分極（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）；配列番号４８〜５２）＋ＰＭＯ−ＧｕＸのアンチセンス活性が、無電荷のＰＭＯ（配列番号２８６）に対して増加したことを示す。
【図９】図９は、図８に記載されるような細胞培養におけるスプライシング補正・翻訳アッセイにおいて、スクランブルの配列対応物（ＳＣＲ）を持つ「Ｐ８−中央（ｃｅｎｔａｌｉｚｅｄ）」Ｐｉｐ修飾＋ＰＭＯ（図７を参照のこと）および「Ｇ８−中央（ｃｅｎｔａｌｉｚｅｄ）」ＧｕＸ修飾＋ＰＭＯ−ＧｕＸ（図８を参照のこと）ならびに無電荷のＰＭＯのアンチセンス活性を比較する。
【図１０】図１０は、同じ配列の無電荷ＰＭＯと比較した、図７および８からの選択した＋ＰＭＯおよび＋ＰＭＯ−ＧｕＸオリゴマーの結合親和性（Ｔｍ）を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｂは、図７について記載されるような細胞培養におけるスプライシング補正・翻訳アッセイにおいて、＋ＰＭＯ、＋ＰＭＯ−ＧｕＸおよびペプチド結合無電荷ＰＭＯ（「ＰＰＭＯ」）の取り込み／アンチセンス活性が、非結合の無電荷ＰＭＯ（配列番号２８６）に対して増加したことを示す。図１１Ａは、１０μＭまでの濃度依存性の作用を示し、そして、図１１Ｂは、１００μＭまでの濃度依存性の作用を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｂは、図７について記載されるような細胞培養におけるスプライシング補正・翻訳アッセイにおいて、＋ＰＭＯ、＋ＰＭＯ−ＧｕＸおよびペプチド結合無電荷ＰＭＯ（「ＰＰＭＯ」）の取り込み／アンチセンス活性が、非結合の無電荷ＰＭＯ（配列番号２８６）に対して増加したことを示す。図１１Ａは、１０μＭまでの濃度依存性の作用を示し、そして、図１１Ｂは、１００μＭまでの濃度依存性の作用を示す。
【図１２】図１２は、無電荷のＣＹＰ３Ａ４  ＰＭＯと比較した、ＣＹＰ３Ａ２：ルシフェラーゼ融合遺伝子のｍＲＮＡの無細胞の翻訳の＋ＰＭＯによる阻害のグラフである（配列番号３５〜４２）。種々の＋ＰＭＯおよびＰＭＯについてのＥＣ５０の値もまた示す。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書中に記載されるような以下の用語は、他にそうでないと示されない限り、以下の意味を有する：
用語「アンチセンスオリゴマー」または「アンチセンス化合物」は、交換可能に使用され、そして、各々が、リボースもしくは他のペントース糖もしくはモルホリノ基から構成される骨格サブユニット上に塩基が保持され、そして、骨格基が、サブユニット間結合により連結された一連のサブユニットを指し、このサブユニット間結合は、ワトソン−クリック塩基対形成により化合物中の塩基が核酸（代表的にはＲＮＡ）中の標的配列にハイブリダイズして、標的配列内に核酸：オリゴマーへテロ二重鎖を形成することを可能にする。オリゴマーは、標的配列に対して完全に相補的な配列または、相補的に近い配列を有し得る。このようなアンチセンスオリゴマーは、標的配列を含むｍＲＮＡの翻訳をブロックまたは阻害するように設計され、そして、このアンチセンスオリゴマーがハイブリダイズする配列「に対して指向される」と言うことができ得る。
【００８９】
「モルホリノオリゴマー」は、代表的なポリヌクレオチドに水素結合し得る塩基を支持する骨格を持つポリマー性分子を指し、ここで、このポリマーには、ヌクレオチドおよびヌクレオシドには典型的なホスホジエステル結合により連結されたペントース糖骨格部分（より具体的には、リボース骨格）はなく、代わりに、環窒素を含み、環窒素を介してカップリングする。好ましい「モルホリノ」オリゴマーは、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に接合する（チオ）ホスホロアミデート結合または（チオ）ホスホロジアミデート結合によって一緒に連結されたモルホリノサブユニット構造から構成され、これらのサブユニットの各々は、塩基特異的な水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基と結合するのに有効なプリン塩基対形成部分またはピリミジン塩基対形成部分を含む。モルホリノオリゴマー（アンチセンスオリゴマーを含む）は、例えば、共有に係る国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号および同第５，５０６，３３７号（これらは全て、明示的に本明細書中に参考として援用される）において詳述される。
【００９０】
「ホスホロアミデート」基は、３つの酸素原子が結合され、かつ、１つの窒素原子が結合されたリンを含み、一方、「ホスホロジアミデート」基（例えば、図１Ａ〜Ｂを参照のこと）は、２つの酸素原子が結合され、かつ２つの窒素原子が結合されたリンを含む。本明細書中に記載されるオリゴマーの無電荷もしくはカチオン性のサブユニット間結合において、１つの窒素は、常に骨格鎖からぶら下がっている。ホスホロジアミデート結合において、第二の窒素は代表的に、モルホリノ環構造内の環窒素である（再度、図１Ａ〜Ｂを参照のこと）。
【００９１】
チオホスホロアミデート結合またはチオホスホロジアミデート結合において、１つの酸素原子、代表的には本明細書中に記載されるオリゴマー中の骨格に対してぶら下がっている酸素は、硫黄で置き換えられる。
【００９２】
用語「荷電」、「無電荷」、「カチオン性」および「アニオン性」は、本明細書中で使用される場合、中性付近のｐＨ（例えば、６〜８）における化学部分の主流を成す状態を指す。好ましくは、この用語は、生理学的ｐＨ、すなわち、約７．４における化学部分の主流を成す状態を指す。
【００９３】
「低級アルキル」は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、イソアミル、ｎ−ペンチルおよびイソペンチルにより代表されるような、１〜６個の炭素原子のアルキル基を指す。選択した実施形態において、「低級アルキル」基は、１〜４個の炭素原子、または１〜２個の炭素原子を有する（すなわち、メチルまたはエチル）。同様に、「低級アルケニル」は、アリルおよびブテニルにより代表されるような、２〜６個、好ましくは、３個または４個の炭素原子のアルケニル基を指す。
【００９４】
「非干渉性」置換基は、本明細書中に記載されるようなアンチセンスオリゴマーがその意図する標的に結合する能力に有害な影響を与えない置換基である。このような置換基としては、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ、ヒドロキシまたはフルオロのような、小さく、好ましくは、非極性の基が挙げられる。
【００９５】
オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴマーは、そのオリゴマーが、生理学的条件下で３７℃より高いＴｍで標的にハイブリダイズする場合に、標的ポリヌクレオチドに対して「特異的にハイブリダイズする」。オリゴマーの「Ｔｍ」は、５０％が相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。Ｔｍは、例えば、Ｍｉｙａｄａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：９４−１０７（１９８７）に記載されるように、生理食塩水中で標準的な条件の下で決定される。
【００９６】
ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖ポリヌクレオチド間でアンチパラレルの立体配置で生じる場合、互いに「相補的である」として記載される。相補性（１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般に容認される塩基対形成の規則に従って互いに水素結合を形成することが予測される対向する鎖中の塩基の比率の点から定量化可能である。
【００９７】
第一の配列は、その配列が第一の配列であるポリヌクレオチドが、生理学的な条件下で、第二のポリヌクレオチド配列に特異的に結合するか、または、第二のポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする場合に、第二の配列に関して「アンチセンス配列」である。
【００９８】
用語「標的化配列」は、ＲＮＡゲノム中の標的配列に対して相補的な（加えて、実質的に相補的であることも意味する）オリゴヌクレオチドアナログ内の配列である。このアナログ化合物の全配列または一部のみが、標的配列に対して相補的であり得る。例えば、２０塩基を有するアナログにおいて、１２〜１４のみが標的化配列であり得る。代表的には、標的化配列は、アナログにおいて連続塩基の形態をとるが、代替的には、例えば、アナログの反対側から一緒に並べられるときに、標的配列にまたがる配列を構成する、非連続配列の形態をとり得る。
【００９９】
標的および標的化配列は、ハイブリダイゼーションがアンチパラレルな立体配置で生じる場合に、互いに対して「相補的である」として記載される。標的化配列は、標的配列に対して「近い」または「実質的な」相補性を有し得、そしてなおも、本明細書中に記載される方法の目的のために機能し得る、すなわち、なおも「相補的で」あり得る。好ましくは、本明細書中に記載される方法において用いられるオリゴヌクレオチドアナログ化合物は、標的配列に対して、せいぜい１０ヌクレオチドのうち１個のミスマッチ、好ましくは、せいぜい２０ヌクレオチドのうち１個のミスマッチを有する。あるいは、用いられるアンチセンスオリゴマーは、本明細書中で指定される例示的な標的化配列に対し、少なくとも９０％の配列相同性、好ましくは、少なくとも９５％の配列相同性を有する。ＲＮＡ標的への相補性結合の目的について、そして、以下に考察されるように、グアニン塩基は、シトシン塩基またはウラシルＲＮＡ塩基のいずれかに対し相補的であり得る。
【０１００】
オリゴヌクレオチドアナログは、そのオリゴマーが、生理学的条件下で実質的に４５℃より高い、好ましくは少なくとも５０℃、代表的には、６０℃〜８０℃またはそれ以上のＴｍで標的にハイブリダイズする場合に、標的ポリヌクレオチドに対して「特異的にハイブリダイズする」。このようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応する。所与のイオン強度およびｐＨにおいて、Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的なポリヌクレオチドに対してハイブリダイズする温度である。再度、このようなハイブリダイゼーションは、アンチセンスオリゴマーの標的配列に対する「近い」もしくは「実質的な」相補性、ならびに、完全な相補性で生じ得る。
【０１０１】
「ヘテロ二重鎖」は、オリゴヌクレオチドアナログと、標的ＲＮＡの相補的な部分との間の二重鎖を指す。「ヌクレアーゼ抵抗性のヘテロ二重鎖」は、アンチセンスオリゴマーのその相補的な標的への結合により形成されるヘテロ二重鎖を指し、このヘテロ二重鎖は、二重鎖ＲＮＡ／ＲＮＡ複合体またはＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を切断し得るＲＮＡｓｅＨのような細胞内および細胞外のヌクレアーゼによるインビボ分解に対して実質的に抵抗性である。
【０１０２】
因子は、その因子が、細胞膜を横切る受動拡散以外の機構によって細胞に侵入し得る場合に、「哺乳動物細胞によって能動的に取り込まれる」。因子は、例えば、「能動輸送」（例えば、ＡＴＰ依存性の輸送機構によって哺乳動物の細胞膜を横切る因子の輸送を指す）によって、または、「促進輸送」（因子が輸送タンパク質に結合する（この結合が次いで、結合した因子が膜を横切る通過を促進する）ことを必要とする輸送機構により細胞膜を横切るアンチセンス因子の輸送を指す）によって輸送され得る。
【０１０３】
用語「調節性の発現」および／または「アンチセンス活性」は、ＲＮＡの発現または翻訳と干渉することによって、所与のタンパク質の発現を増強するか、または、より代表的には減少させるかのいずれかの、アンチセンスオリゴマーの能力を指す。タンパク質の発現が減少される場合、アンチセンスオリゴマーは、所与の遺伝子の発現を直接ブロックしても、その遺伝子から転写されたＲＮＡの崩壊の加速に寄与してもよい。本明細書中に記載されるようなモルホリノオリゴマーは、前者（立体的なブロック）機構によって作用するものと考えられる。他の領域が、モルホリノオリゴマーを用いて首尾よく標的化されているが、立体的にブロックするオリゴマーにとって好ましいアンチセンス標的としては、ＡＴＧ開始コドン領域、スプライシング部位、スプライシング部位に近接する領域、および、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域が挙げられる。
【０１０４】
「アミノ酸サブユニット」は、好ましくは、α−アミノ酸残基（−ＣＯ−ＣＨＲ−ＮＨ−）であり；これはまた、β−アミノ酸残基または他のアミノ酸残基（例えば、−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨＲ−ＮＨ−）でもあり得、ここで、Ｒは側鎖である。
【０１０５】
用語「天然に存在するアミノ酸」は、天然に見られるタンパク質中に存在するアミノ酸を指す。用語「天然に存在しないアミノ酸」は、天然に見られるタンパク質中には存在しないアミノ酸を指す；例としては、β−アラニン（β−Ａｌａ）および６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）が挙げられる。
【０１０６】
「有効量」または「治療上有効な量」は、代表的には、選択された標的核酸配列の翻訳を阻害することによって所望の治療効果をもたらすのに有効な、単一用量としてまたは一連の用量の一部分としてのいずれかで哺乳動物被験体に投与されるアンチセンスオリゴマーの量を指す。
【０１０７】
個体（例えば、ヒトのような哺乳動物）または細胞の「処置」は、個体または細胞の自然な経過を変更することを企図して使用されるあらゆるタイプのインターベンションである。処置としては、薬学的組成物の投与が挙げられるがこれに限定されず、そして、予防的に、または、病理学的事象の開始もしくは病因因子との接触の後に、のいずれかに行われ得る。
【０１０８】
ＩＩ．本発明のオリゴマーの構造的特徴
Ａ．カチオン性のサブユニット間結合を持つオリゴマー
本発明は、一局面では、サブユニット間結合により接合された一連のモルホリノ環構造から構成される骨格を含むオリゴマーを提供し、ここで、このような環構造の各々は、塩基対形成部分を支持し、その結果、上記オリゴマーは、配列特異的な様式で標的核酸に結合し得、そして、このような２つの連続する環構造間のサブユニット間結合のうち少なくとも１つは、カチオン性のペンダント基を含む。ペンダント基は遠位の窒素原子を有し、この窒素原子は、中性または中性付近の（例えば、生理学的）ｐＨにおいて、正の電荷を有し得る。
【０１０９】
サブユニット間結合は、好ましくは、以下の構造：
【０１１０】
【化５】
2010505741.tif 000007
を有するリン含有結合であり、上記式において、
ＷはＳまたはＯであり、好ましくは、Ｏであり、
Ｘは、ＮＲ１Ｒ２またはＯＲ６であり、
Ｙは、ＯまたはＮＲ７であり、
そして、オリゴマーにおける前記結合の各々は、以下：
（ａ）無電荷結合（ａ）であって、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６およびＲ７の各々は、独立して、水素および低級アルキルから選択される、無電荷結合（ａ）；
（ｂ１）カチオン性結合（ｂ１）であって、ここで、ＸはＮＲ１Ｒ２であり、かつＹはＯであり、そして、ＮＲ１Ｒ２は、Ｒ１Ｒ２が−ＣＨＲＣＨＲＮ（Ｒ３）（Ｒ４）ＣＨＲＣＨＲ−となるように必要に応じて置換されたピペラジノ基を表し、ここで、
各Ｒは、独立してＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ４は、Ｈ、ＣＨ３または電子対であり、そして
Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル（例えば、ＣＨ３）、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｚ−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および［Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ’ＮＨ］ｍＨから選択され、ここで、Ｚは、Ｃ（Ｏ）または直接結合であり、Ｌは、アルキル、アルコキシおよびアルキルアミノから選択される結合を有する長さ１８原子まで、好ましくは長さ１２原子まで、より好ましくは長さ８原子までの任意のリンカーであり、Ｒ’は、天然に存在するアミノ酸またはその一炭素もしくは二炭素のホモログの側鎖であり、そして、ｍは１〜６、好ましくは１〜４である、
カチオン性結合（ｂ１）；
（ｂ２）カチオン性結合（ｂ２）であって、ここで、ＸはＮＲ１Ｒ２であり、かつＹはＯであり、Ｒ１はＨまたはＣＨ３であり、そして、Ｒ２はＬＮＲ３Ｒ４Ｒ５であり、ここで、Ｌ、Ｒ３およびＲ４は、上に定義したとおりであり、そして、Ｒ５は、Ｈ、低級アルキルまたは低級（アルコキシ）アルキルである、カチオン性結合（ｂ２）；ならびに
（ｂ３）カチオン性結合（ｂ３）であって、ここで、ＹはＮＲ７であり、かつＸはＯＲ６であり、そして、Ｒ７はＬＮＲ３Ｒ４Ｒ５であり、ここで、Ｌ、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、上に定義したとおりであり、そして、Ｒ６はＨまたは低級アルキルである、カチオン性結合（ｂ３）；
から選択され、そして、
上記サブユニット間結合のうち少なくとも１つは、カチオン性結合（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）から選択される。
【０１１１】
好ましくは、オリゴマーは、少なくとも２つの連続するタイプ（ａ）の結合（すなわち、無電荷結合）を含む。さらなる実施形態では、オリゴマー中の結合の少なくとも５％は、カチオン性結合（すなわち、タイプ（ｂ１）、（ｂ２）または（ｂ３））である；例えば、結合の１０％〜８０％、１０％〜５０％、または１０％〜３５％がカチオン性結合であり得る。
【０１１２】
一実施形態では、少なくとも１つの結合がタイプ（ｂ１）の結合であり、ここで、好ましくは、各ＲはＨであり、Ｒ４はＨ、ＣＨ３または電子対であり、かつ、Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル、例えば、ＣＨ３、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＣ（Ｏ）−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択される。Ｒ３の後者２つの実施形態は、それぞれ、ピペラジン環に直接結合されるか、または、リンカー基Ｌに対してペンダントであるかのいずれかのグアニジノ部分を提供する。合成を容易にするために、Ｒ３内の変数Ｚは、好ましくは、示されるように、Ｃ（Ｏ）（カルボニル）である。
【０１１３】
リンカー基Ｌは、上述のように、その骨格中に、アルキル（例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−）、アルコキシ（−Ｃ−Ｏ−）およびアルキルアミノ（例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−）から選択される結合を含むが、但し、Ｌの末端の原子（例えば、カルボニルまたは窒素に隣接する原子）は炭素原子である。分枝した結合（例えば、−ＣＨ２−ＣＨＣＨ３−）も可能であるが、リンカーは好ましくは直鎖状である。一実施形態では、リンカーは、炭化水素リンカーである。このようなリンカーは、構造−（ＣＨ２）ｎ−を有し得、ここで、ｎは１〜１２、好ましくは、２〜８、より好ましくは２〜６である。
【０１１４】
モルホリノサブユニットは、以下の構造：
【０１１５】
【化６】
2010505741.tif 000008
を有し、上記式において、Ｐｉは、塩基対形成部分であり、そして、上記結合が、（ｉ）の窒素原子を隣接するサブユニットの５’炭素に連結する塩基対形成部分Ｐｉは、同じであっても異なっていても良く、そして、一般には、標的核酸に結合する配列を提供するように設計される。
【０１１６】
モルホリノサブユニットを連結するための上記結合タイプ（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）の実施形態の使用は、以下に図式的に示され得る：
【０１１７】
【化７】
2010505741.tif 000009
好ましくは、オリゴマー中の全てのカチオン性結合は、同じタイプのものである；すなわち、全てタイプ（ｂ１）であるか、全てタイプ（ｂ２）であるか、または、全てタイプ（ｂ３）である。
【０１１８】
さらなる実施形態では、カチオン性結合は、以下に示されるような結合（ｂ１’）および（ｂ１”）から選択され、ここで、（ｂ１’）は、本明細書において「Ｐｉｐ」結合と称され、そして、（ｂ１”）は、本明細書において、「ＧｕＸ」結合と称される：
【０１１９】
【化８】
2010505741.tif 000010
。
【０１２０】
上記の構造において、ＷはＳまたはＯであり、好ましくはＯであり；Ｒ１およびＲ２の各々は、独立して、水素および低級アルキルから選択され、好ましくはメチルであり；そして、Ａは、（ｂ１’）および（ｂ１”）中の１個以上の炭素原子上の水素または非干渉性置換基を表す。好ましくは、ピペラジン環中の環炭素は非置換であるが；これらは、メチルまたはフッ素のような非干渉性の置換基を含み得る。好ましくは、せいぜい１個または２個の炭素原子がこのように置換される。
【０１２１】
さらなる実施形態において、結合の少なくとも１０％がタイプ（ｂ１’）または（ｂ１”）のものである；例えば、結合の２０％〜８０％、２０％〜５０％または２０％〜３０％が、タイプ（ｂ１’）または（ｂ１”）のものであり得る。
【０１２２】
他の実施形態では、オリゴマーは、上記タイプ（ｂ１’）の結合を含まない。あるいは、オリゴマーは、各ＲがＨであり、Ｒ３がＨまたはＣＨ３であり、かつ、Ｒ４がＨ、ＣＨ３または電子対である場合のタイプ（ｂ１）の結合を含まない。
【０１２３】
モルホリノ置換基はまた、以下にさらに記載されるような、非リンベースのサブユニット間結合によっても連結され得、この場合、少なくとも１つの結合が、上記のように、カチオン性のペンダント基で修飾される。
【０１２４】
その非修飾状態では無電荷であるが、ペンダントのアミン置換基もまた有し得る、他のオリゴヌクレオチドアナログ結合が使用され得る。例えば、モルホリノ環上の５’窒素原子は、スルファミド結合（例えば、図２Ｇを参照のこと）または尿素結合（この場合、リンが、それぞれ、炭素または硫黄で置換される）において用いられ得、そして、上記構造（ｂ３）中の５’窒素原子と同様の様式で修飾され得る。
【０１２５】
任意の数のカチオン性結合を有するオリゴマーが提供され、これには、完全にカチオン性結合されたオリゴマーが含まれる。しかし、好ましくは、オリゴマーは、部分的に荷電されており、例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％のカチオン性結合を有する。選択された実施形態では、約１０〜８０％、約２０〜８０％、約２０〜６０％、約２０〜５０％、約２０〜４０％または約２０〜３５％の結合がカチオン性である。
【０１２６】
一実施形態では、カチオン性結合は、骨格に沿って点在する。部分的に荷電したオリゴマーは、好ましくは、少なくとも２つの連続した無電荷結合を含む；すなわち、オリゴマーは、好ましくは、その全長に沿って厳密に交互になる様式は有さない。
【０１２７】
また、カチオン性結合のブロックと、無電荷結合のブロックとを有するオリゴマーが考慮される；例えば、無電荷結合の中央のブロックがカチオン性結合のブロックで挟まれ得、また、逆の場合もあり得る。一実施形態では、オリゴマーは、およそ等しい長さの５”領域、３”領域および中央領域を有し、そして、中央領域におけるカチオン性結合の割合は、約５０％より大きく、好ましくは、約７０％よりも大きい。
【０１２８】
アンチセンスの用途において使用するためのオリゴマーは、一般に、長さが約１０〜約４０サブユニット、より好ましくは、約１５〜２５サブユニットの範囲である。例えば、アンチセンスオリゴマーにとって有用な長さである１９〜２０サブユニットを有する本発明のオリゴマーは、理論上、２〜７個、例えば、４〜６個または３〜５個のカチオン性結合を有し得、残りは無電荷結合である。１４〜１５サブユニットを有するオリゴマーは、理論上、２〜５個、例えば、３個または４個のカチオン性結合を有し得、残りは無電荷結合である。
【０１２９】
モルホリノ環構造の各々が塩基対形成部分を支持し、一連の塩基対形成部分を形成する。この塩基対形成部分は、代表的には、細胞または処置されるべき被験体内の選択されるアンチセンス標的にハイブリダイズするように設計される。塩基対形成部分は、ネイティブなＤＮＡまたはＲＮＡ（Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）に見られるプリンもしくはピリミジン、またはヒポキサンチン（ヌクレオシドイノシンの塩基成分）または５−メチルシトシンのようなアナログであり得る。
【０１３０】
上述のように、実質的に無電荷のオリゴヌクレオチドは、１以上の荷電した結合を含むように（例えば、２〜５個の無電荷結合につき約１個まで、代表的には、１０個の無電荷結合につき３〜５個）、本発明の局面に従って修飾され得る。アンチセンス活性における最適な改善は、骨格の結合のおよそ半分までがカチオン性である場合に見られる。少数、例えば、１０〜２０％のカチオン性結合を有する場合、代表的に、幾分ではあるが、最大ではない増強が見られる；この場合、カチオン性結合の数は、５０〜６０％を超えており、そして、アンチセンスのその標的に対する結合の配列特異性が弱まっているか、または、失われている場合がある。
【０１３１】
本発明の確証において行われた追加の実験は、カチオン性骨格の電荷の追加により見られる増強は、いくつかの場合、電荷の大部分をアンチセンスオリゴヌクレオチドの「中央領域」骨格近くに割り当てる（例えば、８つのカチオン性骨格結合を持つ２０マーのオリゴヌクレオチドの場合、これらの荷電した結合のうち７０％〜１００％を中央の１０の結合に局在化させる）ことによってさらに増強され得ることを示す。
【０１３２】
Ｂ．ペプチド輸送体
本発明のオリゴマーはまた、細胞内へのオリゴマーの輸送を増強するのに有効なペプチド輸送部分に結合され得る。輸送部分は、好ましくは、例えば図１Ｄならびに図２Ｐ〜２Ｑに示されるように、オリゴマーの末端に結合される。
【０１３３】
好ましくは、輸送部分は、６個〜１６個のアミノ酸を含み、かつ、（Ｘ’Ｙ’Ｘ’）、（Ｘ’Ｙ’）、（Ｘ’Ｚ’）および（Ｘ’Ｚ’Ｚ’）からなる群より選択される部分配列からなり、
ここで、
（ａ）Ｘ’サブユニットの各々は、独立して、アルギニンまたはアルギニンアナログを表し、上記アナログは、構造Ｒ１Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）Ｒ２の側鎖を含むカチオン性α−アミノ酸であり、ここで、Ｒ１はＨまたはＲであり；Ｒ２はＲ、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲ２であり、ここでＲは低級アルキルまたは低級アルケニルであり、そして、さらに、酸素または窒素を含み得；Ｒ１およびＲ２は、一緒になって環を形成し得；そして、この側鎖は、Ｒ１またはＲ２を介して上記アミノ酸に連結される；
（ｂ）Ｙ’サブユニットの各々は、独立して、中性の直鎖状アミノ酸−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨＲ）ｎ−ＮＨ−を表し、ここで、ｎは１〜７であり、かつ、各Ｒは、独立して、Ｈまたはメチルである；そして
（ｃ）Ｚ’サブユニットの各々は、独立して、中性のアラルキル側鎖を持つα−アミノ酸を表す。
【０１３４】
本明細書中で使用される場合、キャリアタンパク質は、そのアミノ酸の実質的に全てが重ならない一連の部分配列またはその位置変形、例えば、（Ｘ’Ｘ’Ｙ’）ｎ、（Ｘ’Ｙ’Ｘ’）ｎ、（Ｙ’Ｘ’Ｘ’）ｎ、（Ｙ’Ｘ’）ｎ、（Ｘ’Ｙ’）（Ｘ’Ｘ’Ｙ’）（Ｘ’Ｙ’）（Ｘ’Ｘ’Ｙ’）、（Ｘ’Ｙ’）ｎ（Ｘ’Ｘ’Ｙ’）ｍ、（Ｘ’ＦＦ）ｎまたは（ＦＦＸ’）ｎで表され得る場合、「Ｘ’Ｙ’Ｘ’、Ｘ’Ｙ’、Ｘ’Ｚ’Ｚ’およびＸ’Ｚ’で表される基から選択される部分配列から構成される」。タンパク質は、少数、例えば、１〜３個のＹ以外の天然のアミノ酸を持ち得る。
【０１３５】
選択した実施形態では、ペプチドは、（Ｘ’Ｙ’Ｘ’）、（Ｘ’Ｙ’）、（Ｘ’Ｚ’）および（Ｘ’Ｚ’Ｚ’）から選択される単一の部分配列の少なくとも２回または少なくとも３回の繰り返しからなる配列を含む。例えば、ペプチドは、（Ｘ’Ｙ’Ｘ’）ｐ、（Ｘ’Ｙ’）ｍおよび（Ｘ’Ｚ’Ｚ’）ｐのうち１つによって表される配列を含み得、ここで、ｐは２〜５でありかつｍは２〜８である。
【０１３６】
選択した実施形態では、各Ｘ’について、側鎖部分は、グアニジル（ＨＮ＝Ｃ（ＮＨ２）ＮＨ−）、アミジニル（ＨＮ＝Ｃ（ＮＨ２）Ｃ＜）、２−アミノジヒドロピリミジル、２−アミノテトラヒドロピリミジル、２−アミノピリジニルおよび２−アミノピリミドニルからなる群より独立して選択され、そして、好ましくは、グアニジルおよびアミジニルから選択される。
【０１３７】
好ましい実施形態では、各Ｘ’について、側鎖部分は、アミノ酸サブユニットアルギニン（Ａｒｇ）と同様グアニジルである。さらなる実施形態では、各Ｙ’は、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−であり、ここで、ｎは１〜７であり、かつＲはＨである。例えば、ｎが５でありかつＲがＨである場合、Ｙ’は６−アミノヘキサン酸サブユニット（本明細書中ではＡｈｘと短縮される）であり；ｎが２でありかつＲがＨである場合、Ｙ’はβ−アラニンサブユニットである。
【０１３８】
Ｚ’サブユニットのアラルキル側鎖は、好ましくは、ベンジル（−ＣＨ２Ｃ６Ｈ６）またはフェネチル（−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ６）であり、これらは、好ましくは、さらには置換されていないが、本明細書中に規定されるような非干渉性の置換基を含んでいてもよい。好ましくは、側鎖はベンジル（−ＣＨ２Ｃ６Ｈ６）であり、その結果、各Ｚ’は、フェニルアラニン（Ｆ）となる。
【０１３９】
このタイプの好ましいペプチドとしては、１つのＹ’サブユニットと交互になったアルギニン二量体を含むものが挙げられ、ここで、Ｙ’は好ましくはＡｈｘである。例としては、式（ＲＹ’Ｒ）４または式（ＲＲＹ’）４を有するペプチドが挙げられ、ここで、Ｙ’は好ましくはＡｈｘである。一実施形態では、Ｙ’は、６−アミノヘキサン酸サブユニットであり、Ｒはアルギニンであり、かつｐは４である。さらなる実施形態では、ペプチドは、（Ｘ’Ｚ’Ｚ’）ｐにより表される配列を含み、ここで、Ｒはアルギニンであり、各Ｚ’はフェニルアラニンであり、かつｐは３または４である。
【０１４０】
結合されたペプチドは、好ましくは、リンカーＡｈｘ−Ｂを介してオリゴマーの末端へと連結され、ここで、例えば、図１Ｄに示されるように、Ａｈｘは６−アミノヘキサン酸サブユニットであり、かつ、Ｂはβ−アラニンサブユニットである。
【０１４１】
Ｙ’サブユニットは、Ｙ’サブユニット間にＸ’サブユニットが入らない連続したものか、または、Ｘ’サブユニット間に１つ点在するかのいずれかである。しかし、連結するサブユニットが、Ｙ’サブユニット間にあり得る。一実施形態では、Ｙ’サブユニットは、輸送体の末端にあり；他の実施形態では、Ｙ’サブユニットは、Ｘ’サブユニットに挟まれる。
【０１４２】
さらなる好ましい実施形態では、各Ｙ’は−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨＲ−ＮＨ−であり、ここで、ｎは１〜７でありかつＲはＨである。例えば、ｎが５でありかつＲがＨである場合、Ｙ’は、６アミノヘキサン酸サブユニット（本明細書においてＡｈｘと短縮される）である。この群の選択された実施形態において、各Ｘ’は、アルギニンサブユニットにおいてと同様に、グアニジル側鎖部分を含む。このタイプの好ましいペプチドとしては、１つのＹ’サブユニットと交互になったアルギニン二量体を含むものが挙げられ、ここで、Ｙ’は好ましくはＡｈｘである。例としては、式（ＲＹ’Ｒ）４または式（ＲＲＹ’）４を有するペプチドが挙げられ、ここで、Ｙ’は好ましくはＡｈｘである。
【０１４３】
別の好ましい実施形態としては、１つのＹ’サブユニットと交互になったアルギニンサブユニット（（ＲＹ’）ｍ）が挙げられ、ここで、Ｙ’は、β−アラニンおよびＡｈｘから選択される；例は、配列番号２８５として以下に与えられる。
【０１４４】
核酸アナログは、好ましくは、例えば図１Ｄに示されるように、Ｃ末端において輸送体ペプチドに連結される。好ましいリンカーは、構造ＡｈｘＢのものであり、ここで、Ａｈｘは、６−アミノヘキサン酸サブユニットであり、そして、Ｂはβ−アラニンサブユニットである。
【０１４５】
上述のような輸送部分は、輸送部分を付着させない場合のオリゴマーの取り込みに対して、そして、疎水性サブユニットＹ’のない輸送部分を付着させることによる取り込みに対して、付着したオリゴマーの細胞への進入を大いに増強することが示されている。このような増強された取り込みは、好ましくは、疎水性サブユニットＹ’のない輸送部分を付着させることによる因子の取り込みに対する、哺乳動物細胞内への化合物の取り込みの少なくとも２倍の増加、そして好ましくは、４倍の増加によって実証される。取り込みは、好ましくは、非結合化合物に対し、少なくとも２０倍、より好ましくは４０倍増強される。
【０１４６】
輸送部分のさらなる利点は、おそらくは、正に荷電した輸送部分と負に荷電した核酸との間の静電相互作用によって、アンチセンスオリゴマーとその標的核酸配列との間の二重鎖を安定化させるというその予測される能力である。輸送体内の荷電したサブユニットの数は、上述のように１４未満であり、好ましくは、８と１１との間である。というのも、荷電したサブユニットの数が多過ぎると、配列特異性の低下につながり得るからである。
【０１４７】
リンカー（ＢまたはＡｈｘＢ）を含む例示的なペプチド輸送体が以下に与えられる：
【０１４８】
【化９】
2010505741.tif 000011
ＩＩＩ．本発明のオリゴマーのアンチセンス活性
本明細書中に示されるように、＋ＰＭＯのような部分的にカチオン性のオリゴマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して、対応する中性化合物よりも高い親和性を有し、これは、インビトロおよびインビボにおけるアンチセンス活性の増強により実証される。
【０１４９】
Ａ．無細胞アッセイにおけるインビトロ活性
本発明のオリゴマーは、種々の異なる標的に対して指向されるとき、完全に無電荷のオリゴマーに優れたアンチセンス活性を与えることが示された。第一シリーズの実験において、材料および方法に記載するように、ＥＢＯＶ（エボラウイルス）ｍＲＮＡの異なる領域（ＶＰ３５遺伝子ｍＲＮＡおよびＬ遺伝子ｍＲＮＡ、ならびに、ＶＰ２４  ｍＲＮＡの２つの異なる領域を含む）を標的とする種々のＰＭＯ（無電荷）および＋ＰＭＯ（部分的にカチオン性）を調製した。配列は、以下の配列表において配列番号１〜１５として示され、各位置のカチオン性の（１−ピペラジノ）ホスフィニルインデンオキシ結合（図１Ｂに示されるようなもの）は、配列表において「＋」で示されている。
【０１５０】
材料および方法に記載されるようにして調製した適切なＥＢＯＶ：ルシフェラーゼｍＲＮＡを入力ＲＮＡとして用いて、無細胞翻訳アッセイを行った。ＰＭＯおよび＋ＰＭＯを、ルシフェラーゼの発光に基づき、ルシフェラーゼ発現を阻害する能力について評価した（ＰＭＯ濃度ごとにｎ＝３）。
【０１５１】
ＶＰ２４：ルシフェラーゼｍＲＮＡを標的とするオリゴマー（配列番号９および１０）についての結果を図３に示す。同じ塩基配列を持つ無電荷ＰＭＯ（それぞれ、配列番号１５および５）と比較すると、６〜８個のカチオン性結合を持つ＋ＰＭＯは、１０倍〜１００倍増加したアンチセンス活性を示した。
【０１５２】
ＥＢＯＶのＶＰ３５遺伝子ｍＲＮＡ、ＶＰ２４遺伝子ｍＲＮＡおよびＬ遺伝子ｍＲＮＡを標的いとするＰＭＯおよび＋ＰＭＯ（それぞれ、配列番号２〜３、６〜８および１２〜１４、配列表に示されるように、可変の総電荷および電荷密度を持つ）を用いた同様のアッセイについての結果を図４に示す。以下の表１は、決定したＥＣ５０値を列挙する。全ての場合において、これらのオリゴマーの骨格中に２〜４個のカチオン性結合を組み込むと、アンチセンス活性がおよそ２〜３０倍増加した。
【０１５３】
【表１】
2010505741.tif 000012
さらなるシリーズのアッセイは、ＣＹＰ３Ａ２：ルシフェラーゼ融合遺伝子ｍＲＮＡ転写物の翻訳を阻害するために、ラットＣＹＰ３Ａ２遺伝子開始コドン領域を標的とするＰＭＯおよび＋ＰＭＯ（配列番号３５〜４２）を用いた。ＣＹＰ３Ａ２  ＋ＰＭＯシリーズにおけるカチオン性結合の電荷の数は、＋３〜＋６の範囲にわたった。３つのカチオン性電荷を持つ５つの＋ＰＭＯは、カチオン性結合のオリゴマー内での位置が異なった。無細胞翻訳アッセイの結果を、決定したＥＣ５０値と共に図１２に示す。全＋ＰＭＯシリーズは、無電荷のＰＭＯコントロール（配列番号３５）と比較したときに、ＥＣ５０における１１倍程度の減少を伴って、増強されたアンチセンス活性を示したことが見られ得る。
【０１５４】
さらなる実験において、Ｃ型肝炎ウイルスの開始コドン領域を標的とする一連の＋ＰＭＯ（ＨＣＶ；配列番号１９〜３５）を、ＨＣＶ：ルシフェラーゼ融合遺伝子転写物の翻訳を阻害する能力について、対応する無電荷ＰＭＯ（ＡＶＩ−４０６５と命名）と比較した。以下の配列表に示すように、ＨＣＶ  ＋ＰＭＯシリーズにおけるカチオン性結合の数は、＋２〜＋７の範囲であった。ＨＣＶ：ルシフェラーゼｍＲＮＡを入力ＲＮＡとして用いて無細胞翻訳アッセイを行い、そして、観察されたＥＣ５０値を以下の表２に与える。全ての場合において、無電荷のＡＶＩ−４０６５  ＰＭＯに対し、カチオン性結合を加えると、観察されるＥＣ５０が有意に減少された。
【０１５５】
【表２】
2010505741.tif 000013
＋ＰＭＯの増加したアンチセンス活性の配列特異性を評価するために、＋ＰＭＯをまた、入力ｍＲＮＡが＋ＰＭＯにとっての標的をコードしなかった無細胞翻訳アッセイにおいて使用した。この場合、ＥＢＯＶ  ＶＰ２４遺伝子を標的とする＋ＰＭＯを、ＥＢＯＶ  Ｌ遺伝子：ルシフェラーゼｍＲＮＡを用いるアッセイにおいて使用した。図５に示される結果は、＋ＰＭＯに対する高い程度の特異性を実証する。有意な非特異的阻害が観察されるまでに、３０μＭより高い＋ＰＭＯの濃度が必要であった。
【０１５６】
Ｂ．細胞培養におけるインビトロ活性
上述のデータが示すよに、ＰＭＯ＋オリゴマーは、無細胞アッセイにおいて、無電荷ＰＭＯオリゴマーを数倍上回るアンチセンス活性の増強をもたらした。細胞培養における輸送およびアンチセンス活性の評価のために一般に使用されるアッセイにおいて、ＨｅＬａ細胞が、プラスミドｐＬｕｃ／７０５で安定にトランスフェクトされ、このプラスミドは、ヌクレオチド７０５において変異されたヒトβ−グロブリンイントロンで中断されたルシフェラーゼ遺伝子を有し、したがって、不正確なスプライシングを起こす。誤ったスプライシングを受けた転写物は機能的なレポータータンパク質をもたらさないので、野生型のスプライシングが、スプライシングを補正するアンチセンスオリゴマーで誘導されない限り、レポーターシグナルは観察されない。有効に送達される場合、７０５スプライシング部位を標的とするアンチセンスオリゴマー（配列番号２８６を持つ）は、スプライシングを補正し、そして、ルシフェラーゼの発現を可能にする。このアッセイは、オリゴマーが細胞および核に入り、その後、プレｍＲＮＡの不正確なスプライシングをブロックし、レポーター遺伝子の発現をもたらす能力を測定する。このアッセイにおいて、オリゴマーは、細胞および細胞の核に入ってシグナルを生じなければならないので、このアッセイは、取り込みおよび送達部分の有効性（存在する場合）、ならびに、結合オリゴマーのアンチセンス活性を測定するために有用である。
【０１５７】
異なる量および分布の、本明細書中で「ＧｕＸ」結合または「Ｐｉｐ」結合と指定されるカチオン性結合を持つモルホリノオリゴマー（図１を参照のこと）を、このようなアッセイにおいて評価した。後者のオリゴマー（「Ｐｉｐ」結合を持つもの）はまた、ＰＭＯ＋またはＰＭＯプラスとも呼ばれ、一方で、前者のオリゴマー（「ＧｕＸ」結合を持つもの）は、ＰＭＯ  ＧｕＸと呼ばれる。
【０１５８】
オリゴマー内の電荷の分布は、以下に示されるとおりであった：
【０１５９】
【化１０】
2010505741.tif 000014
図７および８におけるデータに示されるように、１８マーにおいて、電荷の数を８つまで増加させると、このアッセイにおけるアンチセンス活性を無電荷のＰＭＯに比して増加させた。データはまた、「中央」位置の電荷が、「分極」および「分散」の分布に比してアンチセンス活性を増加させたこと、そして、「ＧｕＸ」結合が、「Ｐｉｐ」結合よりもかなり効率的であったことを示唆する。荷電したＰＭＯは全て、無電荷のＰＭＯよりも高いＴｍを有したが、Ｔｍに基づく結合親和性の比較は、このパターンが単に結合親和性基づくわけではないことを示す（図１０）。
【０１６０】
図９におけるデータは、図７〜８のアッセイ中にスクランブル状のコントロールを組み込む。示されるように、スクランブル状のコントロール（ＳＣＲ−Ｇ８−ＣｅｎｔおよびＳＣＲ−Ｐ８−Ｃｅｎｔ）は、アッセイにおいては本質的にアンチセンス活性を示さなかった。
【０１６１】
図１１Ａ〜Ｂにおけるデータは、「Ｇ８−中央（Ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ）」および「Ｐ８−中央（Ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ）」の荷電したオリゴマーを、式（ＲＸＲ）４を持つ輸送ペプチドに結合させた７０５コントロールＰＭＯと比較するものであり、ここで、Ｒはアルギニンであり、そして、Ｘは、６−アミノヘキサン酸である（例えば、図１Ｄを参照のこと）。この結合は、アンチセンス活性に対し劇的な作用を有し、これは、大部分が、細胞内への輸送の増強に起因するものであると考えられる。
【０１６２】
Ｃ．インビボ活性：げっ歯類におけるエボラウイルス特異的＋ＰＭＯの増加した抗ウイルス活性
エボラウイルス特異的＋ＰＭＯのインビボでの効能を決定するために、１０００プラーク形成単位（ｐｆｕ）のマウスに順応させたエボラウイルスを用いたチャレンジの２４時間前および４時間前に、マウスを、ＶＰ２４遺伝子ｍＲＮＡを標的とする３種の個別の＋ＰＭＯおよび１種の無電荷ＰＭＯ（ＶＰ２４−ＡＵＧ、ＶＰ２４−２＋、ＶＰ２４−４ａ＋およびＶＰ２４−４ｂ＋；それぞれ、配列番号５〜８）の５０μｇ用量で２回処置した。各処置群につき１０匹のマウスで、１４日の期間にわたり生存を決定した。
【０１６３】
ＶＰ２４  ＋ＰＭＯは、致死的なＥＢＯＶ感染に対し広範囲の効能を示し、図６に示されるように、４つの正電荷を含む＋ＰＭＯが、最大の保護を提供した（７０％の生存）。２つの正電荷を持つ２種の＋ＰＭＯは、中程度の作用（５０〜６０％の生存）を示し、そして、無電荷のＰＭＯは、最小の保護を提供した（わずか１０％の生存）。ネガティブコントロールの群には、ＰＢＳを与え、そして、生存者は観察されなかった。同様の有益な作用が、ＶＰ３５  ｍＲＮＡを標的とする＋ＰＭＯでも見られた。
【０１６４】
＋ＰＭＯは、Ｈａｒｔｌｅｙモルモットモデルの系における致死的なエボラウイルスチャレンジに対しても改善された保護を提供した。３種の無電荷ＰＭＯの薬物の組み合わせ（配列番号１、５および１１）、またはこれらと同じ３種のＰＭＯのペプチド結合バージョンは、モルモットモデルの系における致死的なエボラウイルスチャレンジに対して保護を提供しなかった。＋ＰＭＯ形態の同じ３種の薬物の組み合わせ（配列番号２４７、２４８および２４９）は、チャレンジを受けたモルモットの７５％に対し保護を提供した。さらに、ＰＭＯ＋の使用は、２種の薬物の組み合わせ治療（配列番号２４８および２４９）が、エボラウイルスのチャレンジを受けたモルモットの８０％に対し保護を提供することを可能にした。
【０１６５】
以前に記載されたもの（Ｗａｒｆｉｅｌｄ、Ｓｗｅｎｓｏｎら、２００６）と同様の非ヒト霊長類（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）における実験を、２種の薬物の組み合わせ形態の＋ＰＭＯ化合物（配列番号２４８および２４９）を用いて行った。エボラウイルスを感染させた動物を、感染後１０日間にわたり毎日２０ｍｇ／ｋｇの＋ＰＭＯで処置した。この処置は、全て、１０００ｐｆｕのエボラウイルスでのチャレンジを受けた動物の７５％に対し保護を提供した。
【０１６６】
ＩＶ．カチオン性のサブユニット間結合を有するオリゴマーの調製
図２Ａ〜２Ｒは、塩基対形成基が安定に保護されたモルホリノサブユニットの調製と、これらのサブユニットの、カチオン性結合を持つモルホリノオリゴマーへの変換とを示す。さらなる実験の詳細は、材料および方法において以下に提供される。荷電した結合のサブユニットは、米国特許第５，１８５，４４４号において、または、ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ，１９９７（上で援用された）においてモルホリノオリゴマーについて記載されるように、標準的な段階的なオリゴマー合成において使用され得る。
【０１６７】
図２Ａは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＩの塩基対形成部分Ｐｉを持つ代表的なモルホリノサブユニット１ａ−ｅを示す。これらのサブユニットは、図２Ｂに示され、そして、実施例１に記載されるように、対応するリボヌクレオチドから調製され得る。必要な場合、ヌクレオシド塩基について適切な保護基が使用される；たとえば、アデニンおよびシトシンについてはベンゾイル、グアニンについてはフェニルアセチル、そして、ヒポキサンチン（Ｉ）についてはピバロイルオキシメチル。ピバロイルオキシメチル基は、図２Ｂに示されるように、ヒポキサンチンの複素環塩基のＮ１位上に導入され得る。１ｆにおいてのような保護されていないヒポキサンチンサブユニットも用いられ得るが、活性化反応における収量は、塩基が保護された場合、かなり多くなる。
【０１６８】
５’−ヒドロキシ（１）の、Ｎ，Ｎ−ジメチルホスホラミドジクロリデートのような反応性酸塩化物（４）での処理は、図２Ｃに示され、そして、実施例２に記載されるように、タイプ（ａ）（無電荷結合）で活性化されたサブユニット５ａ−ｅをもたらす。１ｆにおいてのような保護されていないヒポキサンチン含有サブユニットも用いられ得るが、活性化反応における収量は、塩基が保護された場合、かなり多くなる。
【０１６９】
図２Ｃはまた、５’−ヒドロキシサブユニット１ａ−ｅをタイプ（ｂ１）（荷電した結合）で活性化されたサブユニット７ａ−ｅへと変換するための、６ａのような代替的な反応性酸塩化物の使用を示す。
【０１７０】
同様に、８ａのような非環式の反応性酸塩化物が、５’−ヒドロキシサブユニット１ａ−ｅをタイプ（ｂ２）（荷電した結合）で活性化されたサブユニット９ａ−ｅへと変換するために使用され得る。これらの荷電した結合のサブユニットは、ホスホロジアミデート結合したモルホリノオリゴマー内に組み込まれ得、そして、塩基保護基を除去する有用な試薬（好ましくはアンモニア）で処理すると、タイプ（ｂ１）および（ｂ２）のカチオン性ホスホロジアミデート結合を含むオリゴマーをもたらし得る。
【０１７１】
（１−ピペラジノ）ホスフィニルインデンオキシ結合（タイプｂ１’；「Ｐｉｐ」）を含むモルホリノサブユニットを作製するために使用され得る合成経路の概略は、図２Ｄに示され、そして、実施例３に記載される。ピペラジンと塩化トリチル１０との反応は、トリチルピペラジンを生じ、このトリチルピペラジンは、コハク酸塩１１として単離され得る。弱塩基（例えば、ジイソプロピルエチルアミン）の存在下でのトリフルオロ酢酸エチル１３ａとの反応は、１−トリフルオロアセチル−４−トリチルピペラジン１４をもたらし、これは、ＨＣｌで処理すると、良好な収量で脱トリチル化塩１５をもたらす。空いている窒素上へのジクロロホスホリル部分の導入は、トルエン中でオキシ塩化リンを用いて行い、ピペラジン−Ｐ（Ｏ）Ｃｌ２部分６ａをもたらした。この試薬は、保護された（１−ピペラジノ）ホスフィニルインデンオキシ結合を含む活性化されたサブユニットをもたらすために、５’−ヒドロキシモルホリノサブユニットと反応され得、この結合は、以下のオリゴマー合成プロトコルを用いて、オリゴマー中に組み込まれ得る。
【０１７２】
タイプ（ｂ２）のカチオン性結合の調製のためにモルホリノサブユニット中に組み込むのに適した、選択的に保護された非環式アミンは、環式アミンについて記載および例示されるものと同様の方法により調製され得る；実施例４を参照のこと。あるいは、ジアミンの溶液を、１．６当量の反応性エステル１３ａ−ｄで処理すると、＜５％のフリーなジアミノ種を含む溶液をもたらす。この溶液を、ＰＯＣｌ３での活性化およびモルホリノサブユニット１ａ−ｅの活性化のために直接使用した。当業者は、上記方法を用いて、より複雑なカチオン性側鎖を持つオリゴマーを調製することが可能であることが分かる。
【０１７３】
オリゴマー中にタイプ（ｂ３）のカチオン性結合（すなわち、５’位に窒素を有するもの）を導入するためのサブユニットは、図２Ｅに示され、そして、実施例５に記載されるように、モルホリノサブユニットの対応するアルデヒド（１６ａ−ｅ）への酸化と、適切に保護されたジアミンでの還元的アミノ化とにより調製され得、代表的な５’−アミノモルホリノサブユニット２０ａ−ｅを生じる。しばしば、ＦＭＯＣ塩化物での処理の後、アミンを、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）誘導体２１ａ−ｅとして単離することが好ましい。フリーなアミンは、必要な際に、トリエチルアミンまたは１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）での処理によって、容易に再生され得る。アミンのエチルホスホロジクロリデートでの活性化は、タイプ（ｂ３）の活性化されたサブユニット２２ａ−ｅを生じ、これらは、タイプ（ａ）、（ｂ１）および（ｂ２）のサブユニットと同じ様式で、オリゴマー中に組み込まれ得る。
【０１７４】
５’窒素上に種々の側鎖を含む２２ａ−ｅの改変体を調製するための方法は、活性化された５’−モルホリノサブユニットの、適切に保護されたアミンでのアルキル化を必要とする。図２Ｆにおいて２つの例について示され、そして、実施例６に記載されるように、ヘキサメチレンジアミンは、最初に保護され、次いで、５’−Ｏ−ｐ−トルエンスルホン化サブユニット２３ａ−ｅと反応させられる。図２Ｅおよび２Ｆ、ならびに対応する実施例における方法を用いて、当業者は、カチオン性モルホリノオリゴマー中に組み込むのに適した広範囲な５’−アミノ置換サブユニットを調製し得る。
【０１７５】
上述のように、カチオン性結合はまた、非リン含有結合からも調製され得る。例えば、図２Ｇに示され、そして、実施例７に記載されるように、カチオン性のペンダント基を持つスルホンアミド結合を提供し得るサブユニットが、（ｂ３）タイプの結合において使用されるアミンから導入され得る。トリエチルアミンを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中での、アミノ化したサブユニットの三酸化硫黄／ピリジンとの反応は、スルファミン酸をもたらし、これは、ピリジンを含むジクロロメタン中でホスゲンで処理され、活性化された塩化スルファモイル含有サブユニットを生じる。
【０１７６】
モルホリノオリゴマーは、固体支持体上、好ましくは、例えば、米国特許第５，１８５，４４４号またはＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ，１９９７（上で援用された）に記載されるようなアミノメチルポリスチレン固体支持体上で、段階的な様式でこのようなサブユニットから調製され得る。この樹脂は、好ましくは、図２Ｈに示され、そして、実施例８に記載されるように、ジスルフィド「アンカー」との反応により修飾されており、このジスルフィドアンカーは、支持体上でのモルホリノオリゴマーの生産を可能にし、そして、チオールでの処理の際の放出を容易にする。
【０１７７】
いくつかの場合、モルホリノオリゴマーの水溶性を増すトリエチレングリコール含有部分（「テイル」）を導入することが有益である。これを達成するための１つの方法は、図２Ｉに示され、そして、実施例９に記載される。
【０１７８】
代表的な合成において、ジスルフィドアンカー３４は、図２Ｊに示されるように、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）中でアミノメチルポリスチレン樹脂と反応させられて、活性化されたサブユニットの組み込みに適した樹脂−アンカー３９を生じる。必要に応じて、このテイル部分は、ジスルフィドアンカー−樹脂の３８との反応によりオリゴマーの５’末端上に導入されて、テイル−樹脂４０をもたらし得る。樹脂４０の使用は、ＨＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）基（＝ＥＧ３）をもたらし、これは、オリゴマーの５’末端に付着される。
【０１７９】
適切なサブユニット間結合タイプを含む活性化されたサブユニットは、アンカーを含む樹脂３９上、または、必要に応じて、テイル−樹脂４０上での固相合成により段階的に導入される。自動合成装置を用いて行われる固相合成のサイクルは、ＮＭＰもしくはジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いた樹脂の洗浄と、その後の、２０％アセトニトリル／ＤＣＭ中１１％シアノ酢酸（ｖ／ｖ）での処理とから構成される。２０％イソプロパノール／ＤＣＭ中５％のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）溶液で中和した後、この樹脂を、０．４Ｍの４−エチルモルホリンを含有する１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）中の０．２Ｍの活性化されたサブユニット（または、ＮＭＰ中のテイル）の溶液と反応させる。中和溶液で洗浄した後、このサイクルを繰り返して、次のサブユニットを導入し得る。必要に応じて、最後のサブユニットを加えた後、樹脂の末端にあるトリチル基は除去され、そして、３’−メトキシトリチル化オリゴマーを調製するために塩化メトキシトリチルが導入される。より不安定なメトキシトリチル種は、水性の脱トリチル化工程と、その後の、粗オリゴマーの「トリチル−ＯＮ／トリチル−ＯＦＦ」精製において利益を提供する。
【０１８０】
かさ高い樹脂３９および４０を調製するために使用されるリアクタの設計は、モルホリノオリゴマーの大規模合成のために用いた。大規模の場合、ホスホロジアミデート結合が樹脂上に導入されるときに行われる脱トリチル化の工程は、２０％トリフルオロエタノール／ＤＣＭ中の４−シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸の溶液を使用した。これは、幾分酸不安定なホスホロジアミデート結合の、カルボン酸ベースの脱トリチル化試薬よりも少ない加水分解をもたらした。さらに、二重に保護したＧサブユニットの使用が有益であることが分かった。図２Ｋは、使用したＮ２，Ｏ６−保護Ｇ種４６の合成を例示する。
【０１８１】
合成されたオリゴマーは、ＮＭＰ中の１，４−ジチオスレイトールおよびトリエチルアミンの溶液での処理により、固体支持体から放出される。この溶液は、濃アンモニアで処理し、そして、４５℃に保持した。この混合物を、加圧容器中に密封し、そして、１６〜２４時間、４５℃に加熱した。この溶液を、０．２８％アンモニア水溶液で希釈し、そして、イオン交換樹脂を通過させて、粗メトキシトリチル化オリゴマーを捕捉した。この生成物を塩勾配で溶出し、後期に溶出したメトキシトリチルまたはトリチルを含む生成物を回収し、そして、この生成物を含む画分をプールした。さらなる修飾を必要としない３’非置換（３’−Ｈ）オリゴマーの調製について、この溶液を酸を用いてｐＨ２．５まで処理し、オリゴマーを脱メトキシトリチレートした。この脱メトキシトリチル化した混合物を、濃アンモニアで直ぐに中和し、そして、この溶液を、逆相樹脂を通した。この生成物を４５％アセトニトリル／０．２８％アンモニア水溶液の溶出により回収し、そして、凍結乾燥の後、白色の粉末として単離した。この生成物のさらなる精製は、方法の節において記載されるように、カチオン交換樹脂上で行われ得る。あるいは、以下に記載されるように、オリゴマーの３’末端とは無関係に骨格のアミン部分の修飾を行うためには、３’−メトキシトリチル／トリチル基を保持することが有益であった。この場合、酸水溶液処理を省略した以外は、上記手順に従った。
【０１８２】
カチオン性結合の一部としてモルホリノオリゴマー中に導入されたアミン基は、さらに修飾され得る。このコンセプトは、オリゴマーが比較的単純に修飾されてはいるが、モルホリノオリゴマーの骨格に沿ったあらゆる位置における複雑な部分の導入を可能にするには十分な官能性を持つサブユニットから構築されることを可能にする。
【０１８３】
（合成上の理由から、オリゴマーの５’末端結合は、代表的には、本明細書中に記載されるタイプ（ｂ１）の結合を含むことに注意されたい。例えば、図２Ｐ〜２Ｑに示されるように、オリゴマーの好ましい段階式の樹脂支持型合成は、５’末端のリン原子上にピペラジン環をもたらす；このリン上の第二のピペラジン環の存在は、立体的な理由から束縛される。）
重要な修飾は、オリゴマー中へのグアニジニウム基の組み込みである。これは、２つの方法でなされ得る。第一に、オリゴマーの骨格上のアミン部分を、図２Ｌ（これはまた、５’末端にＥＧ３テイルも示す）においてのように、炭酸ナトリウム緩衝化水溶液中での１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン塩酸塩との反応により直接グアニジニウム種へと変換した（Ｍ  Ｓ  Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ，Ｙ  Ｗｕ，Ｇ  Ｒ  Ｍａｔｓｕｅｄａ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，５７（８）、２４９７−２５０２）。第二に、カルボキシル基およびグアニジニウム基の両方を含む物質（例えば、６−グアニジノヘキサン酸）を、２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）で活性化させ、そして、アミン含有オリゴマーと反応させた（図２Ｍ）。同様の様式で、４−グアニジノブタン酸、３−グアニジノプロパン酸およびグアニジノ酢酸が導入され得る。これらのアプローチの混成物において、アミン部分を保護されたＦＭＯＣアミノ酸（例えば、ＦＭＯＣ  ６−アミノヘキサン酸）と反応させて、保護された一級アミン含有側鎖を導入し、これを、アンモニア処理によりＦＭＯＣ基を除いた後、上述のようにグアニル化した。完全にグアニル化された種を、適切なｐＨでのカチオンクロマトグラフィーによって、部分的にグアニル化されたオリゴマーから分離した。
【０１８４】
オリゴマーの末端もまた、ＰＥＧテイルを加えることなく、図２Ｎ（また、樹脂３９からもたらされる代表的なオリゴマーも示す）に示されるように、これらの方法によってグアニジニウム部分で置換され得る。
【０１８５】
注目すべき別の修飾は、骨格に沿ったペプチドの組み込みである。小さなペプチドは、商業的な供給源（例えば、Ｂａｃｈｅｍ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．３１３２  Ｋａｓｈｉｗａ  Ｓｔｒｅｅｔ  Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ  ９０５０５  ＵＳＡおよびＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．２１４９  Ｏ’Ｔｏｏｌｅ  Ａｖｅ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ  ９５１３１）から容易に入手可能である。ペプチドの組み込みは、図２Ｏに示される典型的な２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）化学に従った。オリゴマーまたはペプチド上のグアニジニウム基は干渉しない。
【０１８６】
オリゴマーはまた、３’末端において、細胞内への生成物の送達を増強するのに有用なアルギニンリッチなペプチドに結合され得る。この場合、３’−メトキシトリチル化／トリチル化オリゴマーの骨格に沿った一級および二級のアミン部分の保護は、図２Ｐに示されるように、トリフルオロアセチル化によって行った。末端のメトキシトリチル基を除去し、そして、ＨＢＴＵを用いてペプチドを結合させた。この結合反応を、アンモニアでの処理によりワークアップし、そして、トリフルオロアセチル基を除去した。この結合体を、カチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。骨格のアミン官能基が完全にグアニル化されると、ペプチドは、図２Ｑに示されるように、これらの側鎖から干渉を受けることなく導入され得る。
【０１８７】
ｂ１結合シリーズのピペラジンのメチル化は、図２Ｒに示されるように、水溶液中のホルムアルデヒドおよびホウ化水素ナトリウムを用いてモルホリノオリゴマーを処理することによって達成され得る。代替的な基を組み込むためには、他のアルデヒドが使用され得る。
【０１８８】
Ｖ．カチオン性結合を含有するモルホリノオリゴマーの用途
本明細書中に記載される化合物は、タンパク質生成を阻害する方法において使用され得る。したがって、このようなタンパク質をコードする核酸は、本明細書中に開示されるよに、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を含み、好ましくは、２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含むアンチセンスオリゴマーに対して曝露され、このアンチセンスオリゴマーにおいて、塩基対形成部分Ｐｉは、タンパク質生成を阻害するのに有効な位置にある核酸の一部に対してハイブリダイズするのに有効な配列を形成する。この位置は、例えば、ｍＲＮＡのＡＴＧ開始コドン、プレｍＲＮＡのスプライシング部位、または、以下に記載されるようなウイルスの標的配列であり得る。
【０１８９】
一般に、アンチセンスの用途について、オリゴマーは、核酸標的配列に対して１００％相補的であっても、オリゴマーと核酸標的配列との間に形成されるヘテロ二重鎖が細胞のヌクレアーゼの作用およびインビボで生じ得る他の分解様式を絶えるに十分安定である限りは、例えば、変種に適合するようにミスマッチを含んでいてもよい。ミスマッチは、存在する場合、ハイブリッド二重鎖の中央よりも、ハイブリッド二重鎖の末端領域に向かって、不安定さが少なくなる。許容されるミスマッチの数は、二重鎖の安定性の周知の原理によれば、オリゴマーの長さ、二重鎖中のＧ：Ｃ塩基対の割合、および、二重鎖中のミスマッチの位置に依存する。このようなアンチセンスオリゴマーは、必ずしも核酸標的配列に対して１００％相補的ではないが、標的配列に対し安定かつ特異的に結合し、その結果、核酸標的の生物学的活性（例えば、コードされるタンパク質の発現）が調節されるのに有効である。
【０１９０】
オリゴマーと標的配列との間に形成される二重鎖の安定性は、結合Ｔｍと、二重鎖の細胞の酵素的切断に対する感受性との関数である。相補的な配列ＲＮＡに対するアンチセンス化合物のＴｍは、Ｈａｍｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５，ｐｐ．１０７−１０８により記載されるようなもの、または、Ｍｉｙａｄａ  Ｃ．Ｇ．ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ  Ｒ．Ｂ．，１９８７，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５４  ｐｐ．９４−１０７に記載されるようなもののような従来の方法により測定され得る。
【０１９１】
各アンチセンスオリゴマーは、相補的な配列ＲＮＡに対して、体温よりも高い、そして好ましくは、５０℃より高い結合Ｔｍを有するべきである。６０℃〜８０℃の範囲またはそれより高いＴｍが好ましい。周知の原理によれば、相補性ベースのＲＮＡハイブリッドに対するオリゴマー化合物のＴｍは、二重鎖におけるＣ：Ｇ対形成する塩基の割合を高めることによって、そして／または、ヘテロ二重鎖の長さ（塩基対）を増やすことによって、高くされ得る。同時に、細胞への取り込みを最適化するために、オリゴマーのサイズを制限することが有益であり得る。この理由から、長さ２０塩基以下で高いＴｍ（５０℃以上）を示す化合物は、一般に、高いＴｍ値のために２０より多くの塩基を必要とする化合物よりも好ましい。
【０１９２】
好ましくは、オリゴマーは、哺乳動物の細胞により能動的に取り込まれる。オリゴマーは、このような取り込みを促進するために、本明細書中に記載されるような輸送部分に結合され得る。
【０１９３】
標的核酸へのアンチセンスオリゴマーの効率的な送達は、処置の重要な局面である。アンチセンスオリゴマーの送達経路としては、経口および非経口の経路を含めた種々の全身経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内および筋肉内）ならびに、吸入、経皮および局所送達が挙げられるがこれらに限定されない。適切な経路は、処置される被験体の状態に適切であるように、当業者により決定され得る。たとえば、皮膚のウイルス感染の処置におけるアンチセンスオリゴマーの送達のための適切な経路は局所送達であり、一方、ウイルスの呼吸器感染の処置のためのアンチセンスオリゴマーの送達は、吸入によるものである。オリゴマーはまた、ウイルス感染の部位に直接、または、血流へと送達され得る。
【０１９４】
アンチセンスオリゴマーは、生理学的に受容可能な任意の従来のビヒクル中で投与され得る。このような組成物は、当業者により採用される任意の種々の標準的な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。例としては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョンまたはトリグリセリドエマルジョン）、錠剤およびカプセル剤が挙げられるがこれらに限定されない。適切な生理学的に受容可能なキャリアの選択は、選択される投与様式に依存して変化する。
【０１９５】
いくつかの場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内への取り込みを促進するためにリポソームが採用され得る（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ａ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０（１２）：１９８０−１９８９，１９９６；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２３：１１９，１９９４；Ｕｈｌｍａｎｎら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ９０，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ  ５４４−５８４，１９９０；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．２８７−３４１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７９を参照のこと）。例えば、ＷＯ  ９３／０１２８６に記載されるように、ヒドロゲルもまた、アンチセンスオリゴマーの投与のためのビヒクルとして使用され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、ミクロスフェアまたは微粒子中で投与され得る（例えば、Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２，１９８７を参照のこと）。あるいは、米国特許第６，２４５，７４７号に記載されるように、アンチセンスオリゴマーと複合体を形成されたガスを充填したマイクロバブル（ｇａｓ−ｆｉｌｌｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ）の使用は、標的組織への送達を増強し得る。
【０１９６】
持続放出組成物もまた使用され得る。これらとしては、フィルムまたはマイクロカプセルのような成形された物品の形状の半透性ポリマーマトリクスが挙げられ得る。
【０１９７】
Ａ．再狭窄を処置するためのアンチセンス化合物
本発明の化合物は、再狭窄のような血管増殖性障害の処置において有用である。血管の損傷した領域としては、例えば、再狭窄（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、血管インターベンション（例えば、ステントの挿入を伴うかまたは伴わない、冠状動脈バルーン血管形成術）後の血管管腔の再狭窄（ｒｅｎａｒｒｏｗｉｎｇ）が挙げられる。再狭窄は、血管形成術により処置される病巣の約３０％〜６０％において、そして、処置後３〜６ヶ月以内にステントで処置された病巣の約２０％において生じると考えられる（例えば、Ｄｅｖｉ，Ｎ．Ｂ．ら，Ｃａｔｈｅｔ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉａｇｎ  ４５（３）：３３７−４５，１９９８を参照のこと）。狭窄はまた、詰った動脈の周辺の血液の経路を変更する、すなわち、「バイパスし」、心臓への血液および酸素の供給を改善するために心臓外科手術がなされる、冠状動脈バイパス手術後にも生じ得る。このような場合、狭窄は、移植された血管セグメントにおいて、特に、交換した血管の接合部において生じ得る。狭窄はまた、透析のためにつくった吻合接合部においても生じ得る。
【０１９８】
本発明のオリゴマーは、したがって、再狭窄を処置するための組成物および方法において使用され得る。具体的には、ｃ−ｍｙｃに対して指向されたアンチセンスモルホリノオリゴマー組成物中に含まれるカチオン性結合は、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０００／０４４８９７を参照のこと）のような経管血管形成術における再狭窄のリスクを軽減する。無電荷結合のみを有するモルホリノオリゴマーと比較すると、アンチセンスｃ−ｍｙｃ化合物の全体に点在するカチオン性結合を含むオリゴマーは、再狭窄の処置においてより低い用量でより多くの効能を提供することが予測される。
【０１９９】
したがって、この方法は、血管の損傷部位に対し直接局所投与することによって、または、血管内投与による全身投与によって、本明細書中に記載されるような、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を含み、好ましくは、２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含み、配列番号５９（ヒトｃ−ｍｙｃ、ＡＴＧに関して−１００〜＋２５：ＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣ  ＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴ  ＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧ  ＧＣＴＣＴＣＣＴＴＧ  ＣＡＧＣＴＧＣＴＴＡ  ＧＡＣＧＣＴＧＧＡＴ  ＴＴＴＴＴＴＣＧＧＧ  ＴＡＧＴＧＧＡＡＡＡ  ＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴ  ＣＣＣＧＣＧＡＣＧＡ  ＴＧＣＣＣＣＴＣＡＡ  ＣＧＴＴＡＧＣＴＴＣ  ＡＣＣＡＡ）により規定されるヒトｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡのＡＵＧ開始部位領域内の少なくとも１２の連続する塩基の標的配列に対して相補的な標的化塩基配列を含む１２〜４０のサブユニットを有するオリゴマーを、患者における再狭窄のリスクを軽減するのに有効な量で、患者に対して投与する工程を包含する。この化合物は、以下のうちの１つによって投与される：
（ａ）血管の領域をアンチセンス化合物を含むレザバに接触させ、そして、イオン浸透療法またはエレクトロポレーションによって、レザバから血管内へと化合物を導入すること；
（ｂ）カテーテルバルーンの表面上に含まれる注入器を介して、圧力下で、血管の領域内に直接カテーテルから化合物を注入すること、ここで、上記注入器は、血管内の中膜を貫通し得る；
（ｃ）被包された形態のアンチセンス化合物を含むマイクロ粒子を、血管の領域に注入するか、または、血管の領域に接触させること；
（ｄ）カテーテルバルーンの表面上に含まれ、アンチセンス化合物を拡散可能な形態で含むヒドロゲルに、血管の領域を接触させること；
（ｅ）拡散可能な形態のアンチセンス化合物を含む外側表面層を有するステントに、血管の領域を接触させること；および
（ｆ）血管内投与によって化合物を注入し、血管組織への全身送達をもたらすこと。
【０２００】
アンチセンス化合物は、配列番号４３（ＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＣＧＴＣＧＣ）により同定される配列に対し少なくとも９０％の相同性を有するか、あるいは、配列番号６０  （ＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＡＣ）および６１（ＧＧＣＡＴＣＧＴＣＧＣＧＧＧＡＧＧＣＴＣ）から選択される配列に対し少なくとも９０％の相同性を有する標的化配列を有し得る。
【０２０１】
投与されるアンチセンス化合物の量は、約０．５ｍｇ〜約３０ｍｇの間であり得る。化合物は、水性媒体中の化合物の溶解性を増強する部分で誘導体化され得、そして、この化合物は、少なくとも約３０ｍｇ／ｍｌのアンチセンス化合物を含む溶液から投与される。
【０２０２】
化合物は、生理学的条件下で、実質的に３７℃よりも高いＴｍ（例えば、少なくとも５０℃、好ましくは６０〜８０℃）でｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡに対してハイブリダイズするように設計される。化合物は、好ましくは、ＡＵＧ部位に対して相補的な内部の３塩基トリプレットと、この開始部位から５’側および３’側の１以上の塩基に対して相補的な塩基とを含む。１つの好ましい化合物の配列は、配列番号４３により同定される２０マーであり、ここで、この配列におけるＣＡＴトリプレットはＡＵＧ開始部位に結合し、ＣＡＴ配列から３’側の６塩基は、標的に対して上流（５’）方向に延び、そして、ＣＡＴ配列から５’側の１１塩基は、標的に対して下流に延びる。この化合物は、自己アニーリング領域を有さないことにより、溶解性が増強されている。
【０２０３】
このオリゴマーは、例えば、コーティングされたステントにおいて、または、伏在静脈の処置のためのエキソビボ浸漬用溶液によって用いられるか、または、他の方法で、血管の損傷部位へと送達される。別の実施形態では、アンチセンス化合物は、再狭窄の処置において使用するための粒子状組成物の一部を形成する。１つのこのような粒子は、被包されたアンチセンス化合物を含む生分解性粒子（例えば、ポリ乳酸粒子またはポリグリコール酸粒子）である。これらの粒子は、好ましくは、１〜５ミクロンの範囲であり、そして、以下に記載されるように、壁に対するバルーンからの圧力により血管壁内に押し付けられるか、または、ステントのような粒子のキャリアからの放出によってのいずれかで、血管形成術の血管部位へと粒子を直接送達することにより送達するのに有用である。
【０２０４】
オリゴマーはまた、血管内注射により血管の損傷部位へと全身送達を介して投与することによって用いられ得る。
【０２０５】
あるいは、粒子は、被包された形態の化合物を含むマイクロバブルであり得る。この粒子は、血管の部位へと直接、すなわち、粒子の懸濁物に直接、または粒子から放出される化合物に血管壁を接触させることによって、送達され得、これは、血管の領域を超音波エネルギーに曝露することによって促進され得る。マイクロバブル組成物は、オリゴヌクレオチドのような結合させた分子の、血栓または血管の損傷の領域（例えば、損傷を受けた内皮）、ならびに、肝臓および腎臓のような選択した器官への送達において特に有用であることが見出されている。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２０００／０２５８８、米国特許第６，２４５，２４７号および同第７，０９４，７６５号、ならびに、米国出願公開第２００３０２０７９０７号（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０２０６】
なお別の実施形態では、粒子は、被包されたアンチセンス化合物を含むリポソームである。リポソーム粒子は血管の部位へと直接適用されるので、このリポソームは、長い循環時間を達成するために必要とされる表面の修飾なしの従来のリポソームであり得る。
【０２０７】
Ｂ．抗ウイルスの用途
別の実施形態では、本発明のオリゴマーは、一本鎖のポジティブセンスゲノムを持ち、かつ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、ＡｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅおよびＨｅｐｅｖｉｒｉｄａｅのウイルス科のうちの１つから選択されるＲＮＡウイルスの複製を阻害するために使用され得る。
【０２０８】
Ｂ１．ｓｓＲＮＡウイルスの標的化ステム−ループ二次構造
例示的なアンチセンスの抗ウイルス化合物の１つの分類は、本発明において記載されるようなカチオン性結合を持ち、１２〜４０のサブユニットの配列と、標的とされるウイルスのポジティブセンスＲＮＡの５’末端の４０塩基以内のステム−ループ二次構造に関連する領域に対して相補的な標的化配列とを持つ、モルホリノオリゴマーである。（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００６／０３３９３３または米国出願公開第２００６０２６９９１１号および同第二００５００９６２９１号（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０２０９】
この方法は、ウイルスの標的配列として、その配列が内部にステム−ループの二次構造を形成し得る感染性ウイルスのポジティブ鎖の５’末端の４０塩基以内にある領域を最初に同定する工程を包含する。次いで、段階的な固相合成によって、本明細書中に記載されるような少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を有し、好ましくは２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含み、かつ、内部で二重鎖構造を形成し得るウイルスのゲノム領域に相補的な少なくとも１２のサブユニットの標的化配列を有するオリゴマーが構築され、ここで、このオリゴマーは、ウイルスの標的配列と共に、ウイルスのポジティブセンス鎖とオリゴヌクレオチド化合物とから構成されるヘテロ二重鎖構造を形成し得、そして、少なくとも４５℃の解離のＴｍと、このようなステム−ループ構造の崩壊とによって特徴付けられる。
【０２１０】
標的配列は、入力ＲＮＡ配列の最小自由エネルギー状態についての検索に基づいて二次構造の予測を行うことができるコンピュータプログラムによって、５’末端配列、例えば、５’末端の４０塩基を解析することにより同定され得る。
【０２１１】
関連する局面において、オリゴマーは、哺乳動物宿主細胞において、一本鎖のポジティブセンスゲノムを有する感染ＲＮＡウイルスであって、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｉｃｏｒｎｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科またはＨｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ科のうちの１つから選択されるＲＮＡウイルスの複製を阻害する方法において使用され得る。この方法は、感染した宿主細胞に、本明細書中に記載されるような、内部でステム−ループ二次構造を形成し得るポジティブストランドのウイルスゲノムの５’末端の４０塩基以内の領域に対して相補的な少なくとも１２のサブユニットの標的化配列を持つオリゴマーのウイルス阻害量を投与する工程を包含する。この化合物は、宿主細胞に投与されたときに、（ｉ）ウイルスのポジティブセンス鎖とオリゴヌクレオチド化合物とから構成され、そして（ｉｉ）少なくとも４５℃の解離のＴｍとこのようなステム−ループ構造の崩壊とによって特徴付けられる、ヘテロ二重鎖構造を形成させるのに有効である。この化合物は、ウイルスに感染したか、またはウイルス感染の危険性のある哺乳動物被験体に対して投与され得る。
【０２１２】
フラビウイルスまたはヘパシウイルスの処置について、標的配列は、以下の配列のうちの１つ内にあるステム−ループの二次構造に関連する領域に対して相補的である：
（ｉ）Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ脳炎ウイルスについての配列番号７７；
（ｉｉ）日本脳炎ウイルスについての配列番号７８；
（ｉｉｉ）マリーバレー脳炎ウイルスについての配列番号７９；
（ｉｖ）西ナイル熱ウイルスについての配列番号８０；
（ｖ）黄熱病ウイルスについての配列番号８１；
（ｖｉ）デング熱ウイルス２型についての配列番号８２；
（ｖｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスについての配列番号８３；
（ｖｉｉｉ）ダニ媒介ウイルスについての配列番号８４；
（ｉｘ）オムスク出血性熱ウイルスについての配列番号８５；および
（ｘ）ポーワッサンウイルスについての配列番号８６。
【０２１３】
これらのウイルスについての例示的な標的配列としては、以下の配列、または、関連する標的配列における二重鎖二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分が挙げられる：
（ｉ）Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ脳炎ウイルスについての配列番号８７および８８；
（ｉｉ）日本脳炎ウイルスについての配列番号８９および９０；
（ｉｉｉ）マリーバレー脳炎ウイルスについての配列番号９１および９２；
（ｉｖ）西ナイル熱ウイルスについての配列番号９３および９４；
（ｖ）黄熱病ウイルスについての配列番号９５および９６；
（ｖｉ）デング熱ウイルスについての配列番号９７，９８；
（ｖｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスについての配列番号９９および１００；
（ｖｉｉｉ）ダニ媒介ウイルスについての配列番号１０１および１０２；
（ｉｘ）オムスク出血性熱ウイルスについての配列番号１０３および１０４；ならびに
（ｘ）ポーワッサンウイルスについての配列番号１０５および１０６。
【０２１４】
エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルスまたはアフトウイルスの処置について、標的配列は、以下の配列のうちの１つ内にあるステム−ループの二次構造に関連する領域に対して相補的である：
（ｉ）Ｍａｈｏｎｅｙ株およびＳａｂｉｎ株のポリオウイルスについての配列番号１０７；
（ｉｉ）ヒトエンテロウイルスＡについての配列番号１０８；
（ｉｉｉ）ヒトエンテロウイルスＢについての配列番号１０９；
（ｉｖ）ヒトエンテロウイルスＣについての配列番号１１０；
（ｖ）ヒトエンテロウイルスＤについての配列番号１１１；
（ｖｉ）ヒトエンテロウイルスＥについての配列番号１１２；
（ｖｉｉ）ウシエンテロウイルスについての配列番号１１３；
（ｖｉｉｉ）ヒトライノウイルス８９についての配列番号１１４；
（ｉｘ）ヒトライノウイルスＢについての配列番号１１５；
（ｘ）口蹄疫ウイルスについての配列番号１１６；および
（ｘｉ）Ａ型肝炎ウイルスについての配列番号１１７。
【０２１５】
これらのウイルスについての例示的な標的配列としては、以下の配列、または、関連する標的配列における二重鎖二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分が挙げられる：
（ｉ）Ｍａｈｏｎｅｙ株およびＳａｂｉｎ株のポリオウイルスについての配列番号１１８および１１９；
（ｉｉ）ヒトエンテロウイルスＡについての配列番号１２０および１２１；
（ｉｉｉ）ヒトエンテロウイルスＢについての配列番号１２２および１２３；
（ｉｖ）ヒトエンテロウイルスＣについての配列番号１２４および１２５；
（ｖ）ヒトエンテロウイルスＤについての配列番号１２６および１２７；
（ｖｉ）ヒトエンテロウイルスＥについての配列番号１２８および１２９；
（ｖｉｉ）ウシエンテロウイルスについての配列番号１３０および１３１；
（ｖｉｉｉ）ヒトライノウイルス８９についての配列番号１３２および１３３；
（ｉｘ）ヒトライノウイルスＢについての配列番号１３４および１３５；
（ｘ）口蹄疫ウイルスについての配列番号１３６および１３７；ならびに
（ｘｉ）Ａ型肝炎ウイルスについての配列番号１３８および１３９。
【０２１６】
カリシウイルスまたはノロウイルスの処置について、標的配列は、以下の配列のうちの１つ内にあるステム−ループの二次構造に関連する領域に対して相補的である：
（ｉ）ネコカリシウイルスについての配列番号１４０；
（ｉｉ）イヌカリシウイルスについての配列番号１４１；
（ｉｉｉ）ブタ腸ウイルスについての配列番号１４２；
（ｉｖ）カリシウイルス株ＮＢについての配列番号１４３；および
（ｖ）ノーウォークウイルスについての配列番号１４４。
【０２１７】
これらのウイルスについての例示的な標的配列としては、以下の配列、または、関連する標的配列における二重鎖二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分が挙げられる：
（ｉ）ネコカリシウイルスについての配列番号１４５および１４６；
（ｉｉ）イヌカリシウイルスについての配列番号１４７および１４８；
（ｉｉｉ）ブタ腸ウイルスについての配列番号１４９および１５０；
（ｉｖ）カリシウイルス株ＮＢについての配列番号１５１および１５２；ならびに
（ｖ）ノーウォークウイルスについての配列番号１５３および１５４。
【０２１８】
ヘペウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスの処置について、標的配列は、配列番号１５５として同定される配列内にあるステム−ループの二次構造と関連する領域に対して相補的である。例示的な標的化配列としては、配列番号１５６および１５７、または、関連する標的配列における二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分が挙げられる。
【０２１９】
ルビウイルスまたはアルファウイルスの処置について、標的配列は、以下の配列のうちの１つ内にあるステム−ループの二次構造に関連する領域に対して相補的である：
（ｉ）風疹ウイルスについての配列番号１５８
（ｉｉ）東部ウマ脳脊髄炎ウイルスについての配列番号１５９；
（ｉｉｉ）西部ウマ脳脊髄炎ウイルスについての配列番号１６０；および
（ｉｖ）ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスについての配列番号１６１。
【０２２０】
これらのウイルスの各々についての例示的な標的配列は、以下の配列番号によって同定されるか、または、関連する標的配列における二重鎖二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分である：
（ｉ）風疹ウイルスについての配列番号１６２および１６３
（ｉｉ）東部ウマ脳脊髄炎ウイルスについての配列番号１６４および１６５；
（ｉｉｉ）西部ウマ脳脊髄炎ウイルスについての配列番号１６６および１６７；ならびに
（ｉｖ）ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスについての配列番号１６８および１６９。
【０２２１】
コロナウイルスまたはアルテリウイルスの処置について、標的配列は、以下の配列のうちの１つ内にあるステム−ループの二次構造に関連する領域に対して相補的である：
（ｉ）ＳＡＲＳコロナウイルスＴＯＲ２についての配列番号１７０；
（ｉｉ）ブタ流行性下痢ウイルスについての配列番号１７１；
（ｉｉｉ）伝染性胃腸炎ウイルスについての配列番号１７２；
（ｉｖ）ウシコロナウイルスについての配列番号１７３；
（ｖ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅについての配列番号１７４；
（ｖｉ）マウス肝炎ウイルスについての配列番号１７５；および
（ｖｉｉ）ブタ生殖器系および呼吸器系症候群ウイルスについての配列番号１７６。
【０２２２】
これらのウイルスの各々についての例示的な標的配列は、以下の配列番号によって同定されるか、または、関連する標的配列における二重鎖二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分である：
（ｉ）ＳＡＲＳコロナウイルスＴＯＲ２についての配列番号１７７および１７８；
（ｉｉ）ブタ流行性下痢ウイルスについての配列番号１７９および１８０；
（ｉｉｉ）伝染性胃腸炎ウイルスについての配列番号１８１および１８２；
（ｉｖ）ウシコロナウイルスについての配列番号１８３および１８４；
（ｖ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅについての配列番号１８５および１８６；
（ｖｉ）マウス肝炎ウイルスについての配列番号１８７および１８８；ならびに
（ｖｉｉ）ブタ生殖器系および呼吸器系症候群ウイルスについての配列番号１８９および１９０。
【０２２３】
ママステロウイルス、ヒトアストロウイルスの処置について、標的配列は、配列番号１９１として同定される配列内にあるステム−ループの二次構造と関連する領域に対して相補的である。例示的な標的化配列は、配列番号１９３および１９４、または、関連する標的配列における二重鎖二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分である。
【０２２４】
ウマ動脈炎ウイルスの処置について、標的配列は、配列番号１９２として同定される配列内にあるステム−ループの二次構造と関連する領域に対して相補的である。例示的な標的化配列は、配列番号１９５、１９６、または、関連する標的配列における二重鎖二次構造の１以上の領域と重なるこれらの配列の部分である。
【０２２５】
Ｂ２．ｓｓＲＮＡウイルスの最初のＯＲＦの標的化
ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科およびフラビウイルス科のウイルスの増殖の阻害において使用するための例示的なアンチセンス抗ウイルス化合物の第二の分類は、１２ｋｂ未満の一本鎖のポジティブセンスゲノムと、複数の機能性タンパク質を含むポリタンパク質をコードする最初のオープンリーディングフレームとを持つ。特定の実施形態では、ウイルスは、コロナウイルス科のＲＮＡウイルス、または、フラビウイルス科の西ナイル熱ウイルス、黄熱病ウイルスもしくはデング熱ウイルスである。阻害性の化合物は、本明細書中に記載されるような、ウイルスゲノムの最初のオープンリーディングフレームのＡＵＧ開始部位にまたがるウイルス標的配列に対して実質的に相補的な標的化塩基配列を持つ、カチオン性結合が点在したアンチセンスオリゴマーから構成される。この方法の１つの実施形態では、オリゴマーは、ウイルスに感染した哺乳動物被験体に投与される。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００５／００７８０５および米国出願公開第２００３２２４３５３号（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０２２６】
ピコルナウイルスに対して指向される例示的な抗ウイルス化合物としては、以下：（ｉ）Ｍａｈｏｎｅｙ株およびＳａｂｉｎ株のポリオウイルスについての配列番号６２、（ｉｉ）Ａ型肝炎ウイルスについての配列番号６３、（ｉｉｉ）ライノウイルス１４についての配列番号６４、（ｉｖ）ライノウイルス１６についての配列番号６５、および（ｖ）ライノウイルス１Ｂについての配列番号６６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する標的化配列を持つものが挙げられる。
【０２２７】
カリシウイルスに対して指向される例示的な抗ウイルス化合物としては、以下：（ｉ）血清型Ｐａｎ−１ベシウイルスについての配列番号６７、６８および６９、（ｉｉ）ブタカリシウイルスについての配列番号７０、（ｉｉｉ）ノーウォークウイルスについての配列番号７１ならびに（ｉｖ）ネコカリシウイルスについての配列番号７２からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する標的化配列を持つものが挙げられる。
【０２２８】
Ｃ型肝炎フラビウイルスの阻害における使用について、標的化配列は、配列番号７５により同定されるＨＣＶのＡＵＧ開始部位領域の少なくとも１２の連続する塩基の配列に対して相補的でる。例示的な標的化配列としては、配列番号１８または７６に対して少なくとも９０％の相同性を有するものが挙げられる。
【０２２９】
トガウイルスに対して指向される例示的な抗ウイルス化合物としては、Ｅ型肝炎ウイルスについて、配列番号７３および７４からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する標的化配列を持つものが挙げられる。
【０２３０】
好ましい標的配列は、ウイルスゲノムの最初のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）のＡＵＧ開始部位にまたがる領域である。最初のＯＲＦは一般に、ポリメラーゼ、ヘリカーゼおよびプロテアーゼのような非構造タンパク質を含むポリタンパク質をコードする。「ＡＵＧ開始部位にまたがる」とは、標的配列が、ＡＵＧ開始部位の片側の少なくとも３塩基と、反対側の少なくとも２塩基（合計少なくとも８塩基）を含むことを意味する。好ましくは、標的配列は、開始部位の両側の少なくとも４塩基（合計少なくとも１１塩基）を含む。
【０２３１】
より一般に、好ましい標的部位としては、種々のウイルス単離体間で保存されている標的が挙げられる。他の望ましい部位としては、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）、トランス転写活性促進タンパク質結合部位、および複製開始部位が挙げられる。複数の冗長な遺伝子を提供し得る複雑でかつ大きなウイルスゲノムは、ウイルスの進入と、ウイルスの存在に対する宿主の応答とをコードする宿主の細胞内遺伝子を標的とすることによって、効率的に標的化され得る。
【０２３２】
種々のウイルスゲノム配列は、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースのような周知の情報源から入手可能である。ＯＲＦ１のＡＵＧ開始部位もまた、信頼のおける遺伝子データベースまたは参考文献において同定されていても、予測されるＯＲＦ１開始部位の領域におけるＡＵＧコドンについての配列を走査することによって得られてもよい。
【０２３３】
４つのウイルス科の各々の一般的なゲノムの系統化を以下に示し、各科内の選択したメンバー（属、種または株）について得た例示的な標的配列をこれに続ける。
【０２３４】
ピコルナウイルス。ピコルナウイルスの代表として、ライノウイルスゲノムは、約７．５ｋｂの、一本鎖でポジティブセンスのポリアデニル化ＲＮＡの単一の分子である。このゲノムは、最初のポリタンパク質の上流に位置する長いＵＴＲと、その末端にＶＰｇ（ウイルスゲノムを連結する）タンパク質が共有結合された単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とを含む。ＯＲＦは、２つのセグメントに分割され、この各々がポリタンパク質をコードする。第一のセグメントは、その後切断されてウイルスタンパク質ＶＰ１〜ＶＰ４を形成するポリタンパク質をコードし、そして、第二のセグメントは、Ｃｉｓ−ｐｒｏ、プロテアーゼおよびポリメラーゼを含むウイルスタンパク質の前駆体であるポリタンパク質をコードする。ＯＲＦは、ポリＡ末端配列で終結する。
【０２３５】
標的の最初のＡＵＧ開始部位は、塩基位置６１５〜６４０の間に位置する；この領域を標的とすることは、両方のポリタンパク質セグメントの翻訳を阻害するのに有効である。
【０２３６】
カリシウイルス。カリシウイルス科のベシウイルスのゲノムは、約７．５ｋｂの、感染性で一本鎖のポジティブセンスＲＮＡの単一の分子である。このゲノムは、非修飾の最初のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）の上流のＵＴＲを含む。このゲノムの３’末端はポリアデニル化されている。このゲノムは、３つのオープンリーディングフレームを含む。第一のオープンリーディングフレームは、その後切断されて、ヘリカーゼ、プロテアーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび「ＶＰｇ」（ウイルスゲノムＲＮＡの５’末端に結合されることになるタンパク質）を含むウイルスの非構造タンパク質を形成するポリタンパク質をコードする。第二のオープンリーディングフレームは、単一のカプシドタンパク質をコードし、そして、第三のオープンリーディングフレームは、天然では塩基性であり、おそらくは、ＲＮＡと会合し得る構造タンパク質であると報告されているものをコードする。
【０２３７】
標的の最初のＡＵＧ開始部位は、塩基位置７〜３５の間に位置する；この領域を標的とすることは、最初のリーディングフレームの翻訳を阻害するのに有効である。
【０２３８】
トガウイルス。トガウイルス科の風疹ウイルスのゲノムは、感染性で、約１１．７ｋｂの、一本鎖のポジティブセンスＲＮＡの単一の直鎖状分子である。５’末端は７−メチルＧ分子でキャッピングされ、そして、３’末端はポリアデニル化されている。全長および部分ゲノムのメッセンジャーＲＮＡが示されており、そして、ポリタンパク質の翻訳後の切断は、ＲＮＡ複製の間に起こる。このゲノムは、２つのオープンリーディングフレームを含む。第一のオープンリーディングフレームは、その後４つの機能的タンパク質ｎｓＰ１〜ｎｓＰ４へと切断されるポリタンパク質をコードする。第二のオープンリーディングフレームは、ウイルスのカプシドタンパク質と３つの他のウイルスタンパク質ＰＥ２、６ＫおよびＥ１とをコードする。
【０２３９】
最初のオープンリーディングフレームについてのＡＵＧ開始部位は、塩基位置１０〜４０の間に位置する；この領域を標的とすることは、最初のオープンリーディングフレームの翻訳を阻害するのに有効である。
【０２４０】
フラビウイルス。Ｃ型肝炎ウイルスゲノムは、約１１ｋｂの、一本鎖のポジティブセンスＲＮＡの単一の直鎖状分子である。５’末端はｍ７ＧｐｐＡｍｐ分子でキャッピングされ、そして、３’末端はポリアデニル化されていない。ゲノムは、ただ１つのオープンリーディングフレームのみを含み、このオープンリーディングフレームは、６つの構造的かつ機能的なタンパク質へと分離可能な前駆体ポリタンパク質をコードする。最初のＡＵＧ開始部位は、塩基位置３４３に位置する。
【０２４１】
対応するウイルスゲノム中のＯＲＦ１開始部位を含む例示的なウイルス核酸配列についてのＧｅｎＢａｎｋの参照番号を、以下の表３に列挙する。文献または特許の情報源の利用可能な遺伝子配列データベースから入手可能であり得るように、これらの配列は、４つのウイルス科のメンバーのＯＲＦ１開始部位領域内の他の配列を代表するのみであることが理解される。
【０２４２】
最初のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）の翻訳開始部位にまたがる標的領域に対して指向される標的化配列は、これらの標的領域内のＡＵＧ部位にまたがる１以上の配列に対して相補的な配列を構築することによって選択される；以下の表３を参照のこと。
【０２４３】
【表３】
2010505741.tif 000015
。
【０２４４】
Ｂ３．インフルエンザウイルスの標的化
例示的なアンチセンス抗ウイルス化合物の第三の分類は、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの増殖の阻害、および、ウイルス感染の処置において使用される。宿主細胞は、本明細書中に記載されるような、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を含み、好ましくは、２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含み、そして、以下から選択される標的領域にハイブリダイズするのに有効な塩基配列を含むオリゴマーと接触させられる：ｉ）インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢおよびインフルエンザウイルスＣのネガティブセンスのウイルスＲＮＡセグメントの５’末端または３’末端の２５塩基、ｉｉ）インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢおよびインフルエンザウイルスＣのポジティブセンスｃＲＮＡの３’末端の末端３０塩基、ならびにｉｉｉ）インフルエンザウイルスウイルスｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドン周辺の５０塩基。（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００６／０４７６８３または米国出願公開第２００７０００４６６１号（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０２４５】
この化合物は、哺乳動物におけるインフルエンザウイルス感染の処置において特に有用である。オリゴマーは、インフルエンザウイルスに感染したか、または、インフルエンザウイルス感染の危険性のある哺乳動物被験体に投与され得る。
【０２４６】
インフルエンザＡウイルスの処置について、標的化配列は、配列番号２２１〜２２２として同定される配列の群のうちの１つに関連する領域にハイブリダイズする。好ましい標的化配列は、配列番号２２２のマイナス鎖標的または、配列番号２２１のポジティブ鎖標的のいずれかに対して相補的なものである。これら２つの領域を標的とする例示的なアンチセンスオリゴマーは、それぞれ、配列番号２２３および２２４として列挙される。
【０２４７】
これらの配列は、そのそれぞれの標的における株間の高い程度の相同性に起因して、全てではないにしても、多くのインフルエンザＡウイルス株を標的とする。
【０２４８】
以下の表４は、インフルエンザＡウイルスに対して相補的な例示的な標的化配列を、５’→３’の方向で示す。列挙される配列は、標的化配列のコレクションを提供し、ここから、上述のような一般的な分類の規則に従って標的化配列が選択され得る。
【０２４９】
【表４】
2010505741.tif 000016
。
【０２５０】
Ｂ４．Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの標的化
例示的なアンチセンス抗ウイルス化合物の第四の分類は、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの増殖の阻害、およびウイルス感染の処置において使用される。この化合物は、哺乳動物におけるエンテロウイルスおよび／またはライノウイルスの感染の処置において特に有用である。このアンチセンス抗ウイルス化合物は、配列番号５５および５６によって同定されるウイルスの５’非翻訳領域の２つの３２個の保存されたヌクレオチドの領域のうちの１つにおける、ウイルスＲＮＡ配列に関連する領域に対して相補的な標的化配列を持つ少なくとも１２のサブユニットを含めて、１２〜４０サブユニットの配列を有する、部分的に正に荷電したモルホリノオリゴマーである。（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００７／０３０５７６および同ＷＯ／２００７／０３０６９１ならびに同時係属中でかつ共有に係る仮出願番号６０／８００，１２０および同６０／８００，１４５（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０２５１】
ピコルナウイルスのゲノムＲＮＡを表す例示的なウイルス核酸配列についてのＧｅｎＢａｎｋ参照登録番号を、以下の表５に列挙する。この表は、ポリオウイルス参照配列（ＮＣ  ００２０５８）のヌクレオチド４４３〜４７４に対応し、かついくつかのピコリウイルス（ｐｉｃｏｒｉｖｉｒｕｓ）の５’ＵＴＲ領域内に含まれる、３２塩基の配列に対する標的領域を列挙する。表２に列挙されるウイルスは全て、ヒト単離株であり、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（ＩＣＴＶ）により提供される取り決めに従って、ヒトエンテロウイルスＡ〜Ｄ、ポリオウイルス、ライノウイルスＡおよびライノウイルスＢのように、エンテロウイルス属およびライノウイルス属に系統化される。
【０２５２】
エンテロウイルス続およびライノウイルス属の２つの属におけるウイルス間では、高い程度で配列が保存される。配列番号５６（ＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣ  ＣＣＴＧＡＡＴＧＹＧ  ＧＣＴＡＡＹＣＹＹＡ  ＡＣ）として同定される標的配列は、組み合わせの標的配列を表し、ここで、配列中の文字「Ｙ」は、ピリミジン塩基を表し、すなわち、ＣまたはＴのいずれかであり得る。
【０２５３】
【表５】
2010505741.tif 000017
以下の表６は、ピコルナウイルス、具体的には、エンテロウイルス属およびライノウイルス属のメンバーの広域スペクトルに対して相補的な例示的な標的化配列を示す。
【０２５４】
【表６】
2010505741.tif 000018
表７は、ポリオウイルス参照配列（ＮＣ  ００２０５８）に由来し、かついくつかのピコリウイルスの５’ＵＴＲ領域内に含まれる、第二の３２塩基の配列に対する標的領域を列挙する。配列番号５５（ＲＹＧＧＲＡＣＣＲＡ  ＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧ  ＴＧＴＣＣＧＴＧＴＴ  ＴＣ）として同定される標的配列は、組み合わせの標的配列を表し、ここで、これらの標的領域において、文字「Ｒ」により示される位置はＡまたはＧのいずれかであり得、そして、文字「Ｙ」により示される位置はＣまたはＴのいずれかであり得る。
【０２５５】
【表７】
2010505741.tif 000019
これらの標的領域にハイブリダイズするように設計された標的化配列を、表８に列挙する。
【０２５６】
【表８】
2010505741.tif 000020
。
【０２５７】
Ｂ５．フラビウイルス科のウイルスの標的化
例示的なアンチセンス抗ウイルス化合物の第五の分類は、動物細胞におけるフラビウイルスの複製の阻害において使用される。この分類の例示的なアンチセンスオリゴマーは、本発明において記載されるような、カチオン性結合を持ち、長さ８〜４０ヌクレオチド塩基の間で、かつ、配列番号５７の少なくとも一部分を含むウイルスのポジティブ鎖ＲＮＡゲノムの一領域に対して相補的な少なくとも８塩基の配列を持つ、モルホリノオリゴマーである。例えば、米国出願公開第２００５００９６２９１号（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０２５８】
標的配列は、ポジティブ鎖のフラビウイルスＲＮＡの５’環化配列（５’−ＣＳ）または３’−ＣＳ配列に隣接し、かつ、これら５’−ＣＳまたは３’−ＣＳの少なくとも一部分（例えば、少なくとも２〜８塩基）を含むものである。大いに好ましい標的は、３’−ＣＳである。対応するウイルスゲノム中の５’−ＣＳおよび３’−ＣＳの末端配列を含む例示的なウイルス核酸配列についてのＧｅｎＢａｎｋの参照番号を、以下の表１に列挙する。５’−ＣＳおよび３’−ＣＳの保存された領域を、表９において太字で示す。例示的な標的配列の別の群は、配列番号２６７〜２７７の相補体である。
【０２５９】
フラビウイルス属の選択されたウイルスについての５’−ＣＳおよび３’−ＣＳに対して指向された標的化配列は、以下の配列番号２６７〜２７７として同定される配列に対し相補的でありかつアンチパラレルな配列から誘導される。
【０２６０】
【表９】
2010505741.tif 000021
。
【０２６１】
Ｂ６．ニドウイルス科のウイルスの標的化
例示的なアンチセンス抗ウイルス化合物の第六の分類は、ウイルス感染した動物細胞におけるニドウイルスの複製の阻害において使用される。この分類の例示的なアンチセンスオリゴマーは、本発明に記載されるような、カチオン性結合を持つモルホリノオリゴマーであり、８〜２５ヌクレオチド塩基を含み、かつ、ポジティブ鎖ウイルスゲノムの５’リーダー領域における翻訳調節配列と、ネガティブ鎖の３’部分ゲノム領域との間の塩基対形成を破壊し得る配列を有する（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００５／０６５２６８または米国出願公開第２００７００３７７６３号（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０２６２】
代表的なニドウイルスを以下の表１０に列挙する。この用語「ニドウイルス（ｎｉｄｏｖｉｒｕｓ）」は、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科およびＡｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ科を含むＮｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ目のウイルスを指す。用語「コロナウイルス」は、本明細書において、コロナウイルス属およびトロウイルス属のウイルスを含むＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科の全てのメンバーを含むように使用される。用語「アルテリウイルス（ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）」は、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ属を含むＡｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーを含む。
【０２６３】
【表１０】
2010505741.tif 000022
好ましい標的配列は、ニドウイルス  ＲＮＡのポジティブＲＮＡのリーダーＴＲＳ、または、マイナス鎖のＴＲＳ本体に隣接し、かつ、これらの少なくとも一部分（例えば、少なくとも２〜８塩基）を含むものである。種々のニドウイルスゲノム配列が、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースのような周知の情報源から入手可能である。対応するウイルスゲノム中のリーダーＴＲＳを含む例示的なウイルス核酸配列についてのＧｅｎＢａｎｋ参照番号を、以下の表１１に列挙する；太字のヌクレオチドは、コアリーダーＴＲＳを識別する。
【０２６４】
【表１１】
2010505741.tif 000023
選択されたニドウイルスについてのリーダーＴＲＳに対して指向された例示的な標的化配列としては、配列番号２１０〜２１４が挙げられる。
【０２６５】
より一般には、例示的な標的化配列としては、ウイルスのネガティブ鎖の一領域、あるいは、ポジティブ鎖ＲＮＡゲノムの一領域（それぞれ、ゲノムのネガティブ鎖のリーダーＴＲＳの少なくとも一部分、または、ポジティブ鎖のリーダーＴＲＳの少なくとも一部分を含む）に対して相補的な少なくとも８塩基の配列が挙げられる。標的化配列は、ウイルスのリーダーＴＲＳ配列とＴＲＳ本体の配列との間の塩基対形成を破壊するために、ＴＲＳのいずれかにおける十分な数の塩基を含む。この構造を破壊するために必要とされる標的化配列の数は、好ましくは、コアリーダーＴＲＳまたはＴＲＳ本体（表２において太字で示される）に対して相補的な少なくとも２〜４塩基＋隣接する標的配列塩基に対して相補的な塩基である。
【０２６６】
Ｂ７．ＨＩＶ−１の標的化
活性化されたＨＩＶ感染ヒト造血細胞（例えば、マクロファージまたはＴリンパ球）においてＨＩＶ−１の複製を選択的に阻害するための方法において、このような活性化されたＨＩＶ−１感染細胞は、本明細書中に記載されるような、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を有し、好ましくは、２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含み、かつ、配列番号１９７〜１９９からなる群より選択される配列のうちの１つにより同定されるＨＩＶ−１のポジティブ鎖ＲＮＡの一領域における少なくとも１２の連続する塩基から構成されるウイルスの標的配列に対して実質的に相補的な塩基配列を有する、アンチセンスオリゴマーに対して曝露される。
【０２６７】
一実施形態では、オリゴマーは、配列番号１７の領域とハイブリダイズして、感染細胞におけるＨＩＶ  Ｖｉｆタンパク質の合成を阻害し得る。この実施形態における化合物は、配列番号２００〜２０３からなる群より選択される配列のうちの１つからの、少なくとも１２の連続する塩基を有し得る。
【０２６８】
別の実施形態では、オリゴマーは、配列番号１９８の領域とハイブリダイズして、ＨＩＶ  ｍＲＮＡ転写物の転写を阻害し得る。この実施形態における化合物は、配列番号２０４および２０５として同定される配列からの少なくとも１２の連続する塩基を有し得る。
【０２６９】
別の実施形態では、オリゴマーは、配列番号１９９の領域とハイブリダイズして、マイナス鎖の転移段階をブロックすることにより、ウイルスＲＮＡの逆転写を阻害し得る。この実施形態における化合物は、配列番号２０６として同定される配列からの少なくとも１２の連続する塩基を有し得る。
【０２７０】
Ｂ８．フィロウイルスの標的化
別の実施形態では、本明細書中に記載されるような１以上のオリゴマーは、本明細書中に記載されるような、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を含み、好ましくは、２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含み、かつ、以下にさらに記載されるように、ポジティブ鎖ｍＲＮＡのＡＵＧ開始部位領域内の少なくとも１２の連続する塩基から構成される標的配列に対して相補的な標的化塩基配列を有する、オリゴマーに、細胞を接触させることによって、エボラウイルスまたはマルブルクウイルスの宿主細胞内での複製を阻害する方法において使用され得る。
【０２７１】
フィロウイルスのウイルスゲノムは、セグメント化されておらず、かつアンチセンスの配向の、約１９０００塩基の一本鎖ＲＮＡである。ゲノムは、ｖＲＮＡに対して相補的なモノシストロニックｍＲＮＡから７つのタンパク質をコードする。
【０２７２】
標的配列は、選択したエボラウイルスタンパク質のＡＵＧ開始コドンにまたがるか、または、開始コドンのすぐ下流（２５塩基以内）もしくは上流（１００塩基以内）にあるポジティブ鎖（センス）ＲＮＡ配列、または、マイナス鎖のウイルスＲＮＡの３’末端の３０塩基である。Ｌ、核蛋白ＮＰおよびＶＰ３０もまた企図されるが、好ましいタンパク質標的は、ウイルスのポリメラーゼサブユニットＶＰ３５およびＶＰ２４である。これらの中でも、早期タンパク質が望ましい。例えば、ＶＰ３５は、後期に発現されるＬポリメラーゼよりも望ましい。
【０２７３】
別の実施形態では、本明細書中に記載される１以上のオリゴマーは、本明細書中に記載されるような、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を含み、好ましくは、２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含み、かつ、配列番号２５０〜２５５からなる群より選択されるフィロウイルスｍＲＮＡ配列のうちの１つにより同定されるポジティブ鎖ｍＲＮＡのＡＵＧ開始部位領域内の少なくとも１２の連続する塩基から構成される標的配列に対して相補的な標的化塩基配列を有する、オリゴマーに、細胞を接触させることによって、エボラウイルスまたはマルブルクウイルスの宿主細胞内での複製を阻害する方法において使用され得る。
【０２７４】
エボラウイルス感染の処置について、化合物は、配列番号２５０からなる群より選択される標的配列により同定されるＶＰ３５  ＡＵＧ開始部位領域内の少なくとも１２の連続する塩基から構成される標的配列に対して相補的な標的化配列を有し得る。例示的な標的化配列は、配列番号１により同定される。
【０２７５】
エボラウイルス感染の処置についての別の実施形態では、化合物は、それぞれ、配列番号２５１および２５２からなる群より選択される標的配列により同定されるＶＰ２４  ＡＵＧ開始部位またはＬ  ＡＵＧ開始部位領域内の少なくとも１２の連続する塩基から構成される標的配列に対して相補的な標的化配列を有し得る。例示的な標的化配列としては、それぞれ、配列番号５および１１が挙げられる。
【０２７６】
マルブルクウイルス感染の処置について、化合物は、それぞれ、配列番号２５３により選択される標的配列により同定されるＶＰ３５  ＡＵＧ開始部位内の少なくとも１２の連続する塩基から構成される標的配列に対して相補的な標的化塩基配列を有し得る。例示的な標的化配列は、配列番号２５６および２５７からなる群より選択される。
【０２７７】
マルブルクウイルス感染の処置についての別の実施形態では、化合物は、それぞれ、配列番号２５４および２５５により同定される群から選択される標的配列により同定されるＶＰ２４  ＡＵＧ開始部位またはＬ  ＡＵＧ開始部位領域内の少なくとも１２の連続する塩基から構成される標的配列に対して相補的な標的化配列を有し得る。例示的な標的化配列は、それぞれ、配列番号２５８〜２６０により同定される。
【０２７８】
本明細書中に開示されるオリゴマーはまた、上記のような標的化配列を有するオリゴマーの治療上有効な量を被験体に投与することによって、被験体におけるエボラまたはマルブルクのフィロウイルス感染を処置する方法；あるいは、本明細書中に記載され、かつ、上記のような標的化配列を有するオリゴマーを用いて被験体を事前の処置し、そして、エボラウイルス（好ましくは、弱毒化形態のもの）に対して被験体を曝露することによって、哺乳動物被験体をエボラウイルスに対してワクチン接種する方法においても使用され得る。
【０２７９】
エボラウイルスＲＮＡの配列（Ｚａｉｒｅ  Ｅｂｏｌａウイルス，Ｍａｙｉｎｇａ株）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８６８３３から得られ得る。以下に示される特定の標的化配列は、Ｅｂｏｌａ  Ｚａｉｒｅウイルス株に対する特異性について選択された。Ｅｂｏｌａ  Ｉｖｏｒｙ  Ｃｏａｓｔ、Ｅｂｏｌａ  ＳｕｄａｎおよびＥｂｏｌａ  Ｒｅｓｔｏｎ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５２２８７４）についての対応する配列は、これらのウイルスについての既知のＧｅｎＢａｎｋの登録番号から容易に決定される。好ましくは、ウイルス株（特に、Ｚａｉｒｅ株、Ｉｖｏｒｙ  Ｃｏａｓｔ株およびＳｕｄａｎ株）間の最大のコンセンサス、または、周知の塩基対形成の規則に従って、アンチセンス配列における多義的な塩基によって適合され得る塩基のミスマッチを与える標的化配列が選択される。
【０２８０】
フィロウイルスのゲノムセグメントを表す例示的なウイルス核酸配列についてのＧｅｎＢａｎｋ参照番号を、以下の表１２に列挙する。表１２におけるヌクレオチド配列の数は、Ｅｂｏｌａ  Ｚａｉｒｅ（ＡＦ０８６８３３）およびマルブルクウイルス（Ｚ２９３３７）のポジティブ鎖ＲＮＡについてのＧｅｎＢａｎｋ参照番号から誘導される。表１２は、例示的なエボラウイルス遺伝子ＶＰ３５、ＶＰ２４およびＬについての標的を列挙する。これらの遺伝子のＡＵＧ開始コドンについての標的配列は、配列番号２５０〜２５２として表される。マルブルクウイルスについての標的配列の対応するセットは、配列番号２５３〜２５５として示される。
【０２８１】
【表１２】
2010505741.tif 000024
標的化配列は、表１３に列挙されるような標的配列の一領域に対してハイブリダイズするように設計される。選択された標的化配列は、例えばより短く（例えば、１２塩基）またはより長く（例えば、４０塩基）され得、そして、その配列が、標的とのハイブリダイゼーションが可能であり、そして、ウイルスのポジティブ鎖もしくはマイナス鎖のいずれかと、４５℃以上のＴｍを有するヘテロ二重鎖を形成するのに十分に相補的である限り、少数のミスマッチを含み得る。
【０２８２】
以下の表１３は、上記のガイドラインに従って、Ｅｂｏｌａ  Ｚａｉｒｅウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８６８３３）を標的とする例示的な標的化配列を、５’→３’の方向で示す。さらなる標的化配列が、上述のような一般的な分類の規則に従って選択され得る。
【０２８３】
【表１３】
2010505741.tif 000025
以下の表１４は、上記のガイドラインに従って、マルブルクウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ２９３３７）を標的とする例示的な標的化配列を、５’→３’の方向で示す。さらなる標的化配列が、上述のような一般的な分類の規則に従って選択され得る。
【０２８４】
【表１４】
2010505741.tif 000026
。
【０２８５】
Ｂ９．アレナウイルスの標的化
別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなオリゴマーは、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科における種による哺乳動物細胞におけるウイルス感染を阻害するための方法において使用され得る。一局面では、オリゴマーは、ウイルスに感染した哺乳動物被験体の処置において使用され得る。
【０２８６】
表１５は、その旧世界または新世界のアレナウイルスの分類により系統化された、本発明により標的とされる被標的化ウイルスの例示的なリストである。
【０２８７】
【表１５】
2010505741.tif 000027
アレナウイルスのゲノムは、Ｓ（小）およびＬ（大）と呼ばれる２つの一本鎖ＲＮＡセグメントから構成される。ビリオンでは、Ｓ−セグメントＲＮＡのＬ−セグメントＲＮＡに対するモル比は、およそ２：１である。完全なＳ−セグメントＲＮＡの配列は、数種のアレナウイルスについて決定され、そして、３３６６〜３５３５ヌクレオチドの範囲である。完全なＬ−セグメントＲＮＡの配列もまた、数種のアレナウイルスについて決定され、そして、７１０２〜７２７９ヌクレオチドの範囲である。Ｓ  ＲＮＡセグメントおよびＬ  ＲＮＡセグメントの３’末端配列は、最後の１９ヌクレオチドのうちの１７個と同一である。これらの末端配列は、全ての公知のアレナウイルスの間で保存されている。各ゲノムＲＮＡの開始地点にある、５’末端の１９もしくは２０ヌクレオチドは、各々の対応する３’末端とは完全には相補的ではない。この相補性に起因して、３’末端および５’末端は、塩基対形成して、フライパンの柄の構造を形成するものと考えられる。
【０２８８】
抗原性のウイルスの相補的なＲＮＡ（ｖｃＲＮＡ）鎖を形成するための、感染性のビリオンもしくはウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の複製は、感染細胞において生じる。ｖＲＮＡおよびｖｃＲＮＡは共に、相補的なｍＲＮＡをコードする；したがって、アレナウイルスは、ネガティブセンスＲＮＡウイルスでもポジティブセンスＲＮＡウイルスでもなく、アンビセンスＲＮＡウイルスとして分類される。ウイルス遺伝子のアンビセンス配向は、Ｌ−セグメントおよびＳ−セグメントの両方においてである。ＮＰ遺伝子およびポリメラーゼ遺伝子は、それぞれ、Ｓ  ｖＲＮＡセグメントおよびＬ  ｖＲＮＡセグメントの３’末端に存在し、そして、従来のネガティブセンスでコードされる（すなわち、これらは、ｖＲＮＡまたはゲノムに相補的なｍＲＮＡの転写により発現される）。Ｓ  ｖＲＮＡセグメントおよびＬ  ｖＲＮＡセグメントの５’末端に位置する遺伝子（それぞれ、ＧＰＣおよびＺ）は、ｍＲＮＡセンスでコードされるが、ゲノムｖＲＮＡから直接翻訳されるという証拠はない。これらの遺伝子は、代わりに、アンチゲノム（すなわち、ｖｃＲＮＡ）、複製中間体として機能するゲノムｖＲＮＡの全長の相補的なコピーからのゲノムのセンスｍＲＮＡの転写によって発現される。
【０２８９】
アレナウイルスｖＲＮＡを表す例示的なウイルス核酸配列についてのＧｅｎＢａｎｋ参照登録番号を、以下の表２に列挙する。表２は、ヌクレオチド１〜１９または２〜２０に対応し、列挙されるアレナウイルスのＳ−セグメントおよびＬ−セグメントの両方の５’末端領域に含まれる、１９塩基の配列についてのアンチセンス標的を列挙する。表２に列挙されるウイルスは全て、ヒト単離株である。標的配列（配列番号２６１）は、５’−ＣＧＣＡＣＭＧＤＧＧ  ＡＴＣＣＴＡＧＧＣ−３’であり、ここで、不完全に特定された塩基についてのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＵＰＡＣ）の命名法が、配列の説明において使用される（すなわち、「Ｍ」は、ＣまたはＡのいずれかであり、そして、「Ｄ」はＡ、ＧまたはＴのいずれかである）。
【０２９０】
ｖＲＮＡとｖｃＲＮＡの５’末端において、アレナウイルスの間では、高い程度で配列が保存されている。アンチセンス標的としては、Ｓ−セグメントもしくはＬ−セグメントのｖＲＮＡ鎖もしくはｖｃＲＮＡ鎖のいずれかの５’末端、または、４種のウイルスｍＲＮＡのいずれかの５’末端が挙げられる。したがって、オリゴマーは、潜在的に、ウイルスＲＮＡ種の複製、転写または翻訳を中断させる。
【０２９１】
Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科の典型的なメンバーは、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）である。表１６は、多数の臨床的に関連のあるアレナウイルスにおける対応する標的領域およびＮＣＢＩ参照配列データベース中に存在するものを列挙する。配列番号２６１として同定される標的配列は、これらの領域の各々についての組み合わされた標的配列を表し、ここで、太字の「Ｍ」により示される位置は、ＣまたはＡのいずれかであり得、そして、「Ｄ」は、Ａ、ＧまたはＴのいずれかである。
【０２９２】
【表１６】
2010505741.tif 000028
以下の表１７は、アレナウイルスの広域スペクトルに対して相補的である例示的な標的化配列を、５’→３’の方向で示す。ＣＬ−ｔｒｍ標的化オリゴマー、ＬＳ−ｔｒｍ標的化オリゴマーおよびＳＳ−ｔｒｍ標的化オリゴマー（それぞれ、配列番号２６２〜２６４）を、Ｊｕｎｉｎ−Ｃａｎｄｉｄ−１を特異的に標的とするように設計した。以下に示すように、配列番号２６５および２６６によって表される標的化配列は、広範囲のアレナウイルス種にわたって配列が多様性に富んでいる２つの位置にイノシン（「Ｉ」）を組み込む。
【０２９３】
【表１７】
2010505741.tif 000029
。
【０２９４】
Ｂ９．抗ウイルス用途の一般的な局面
Ｂ９（ａ）．塩基のバリエーション
標的化配列の塩基は、標的配列のＲＮＡ塩基とワトソン−クリック塩基対形成し得る、通常のＤＮＡ塩基またはそのアナログ（例えば、ウラシルおよびイノシン）であり得る。
【０２９５】
オリゴマーはまた、標的ヌクレオチドがウラシル残基である場合、アデニンの代わりにグアニン塩基を組み込み得る。これは、標的配列が異なるウイルス種にまたがって変化し、そして、その任意の所定のヌクレオチド残基におけるバリエーションが、シトシンまたはウラシルのいずれかである場合に有用である。多様性に富んでいる位置のオリゴマーを標的とする際にグアニンを利用することによって、ウラシルと塩基対形成するというグアニンの周知の能力（Ｃ／Ｕ：Ｇ塩基対形成と呼ばれる）が利用され得る。これらの位置にグアニンを組み込むことによって、単一のオリゴマーが、より広範囲のＲＮＡ標的の多様性を効率的に標的とすることが可能となる。
【０２９６】
Ｂ９（ｂ）．ウイルス複製の阻害
一実施形態では、アンチセンス阻害は、ウイルスに感染した細胞を、特定のウイルスの複製を阻害するのに有効なアンチセンス因子に接触させることによって、ウイルスによる宿主動物の感染を処置するのに有効である。アンチセンス因子は、適切な薬学的に受容可能なキャリア中で、所与のウイルスに感染した哺乳動物被験体（例えば、ヒトまたは家畜動物）に対して投与される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主におけるＲＮＡう居留守の増殖を停止することが企図される。ＲＮＡウイルスは、数が減少され得るか、または、宿主の正常な成長もしくは発育に対して有害な影響をほとんど有さないか、もしくは全く有さない程度に排除され得る。
【０２９７】
Ｂ９（ｃ）．投与方法
この方法の一局面では、被験体は、ヒト被験体（例えば、局所的もしくは全身性のウイルス完成を有すると診断された患者）である。例えば、（１）免疫無防備状態である患者；（２）熱傷の犠牲者；（３）留置カテーテルを有する患者；または（４）外科手術を受けようとしているかもしくは最近外科手術を受けた患者の場合、患者の状態はまた、本発明のアンチセンスオリゴマーの予防的投与を指示し得る。１つの好ましい実施形態では、オリゴマーは、薬学的に受容可能なキャリア中に含まれるホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーであり、経口的に送達される。別の好ましい実施形態では、オリゴマーは、薬学的に受容可能なキャリア中に含まれるホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーであり、静脈内（ｉ．ｖ．）送達される。
【０２９８】
この方法の別の用途では、被験体は、家畜類の動物（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、ウシもしくはヤギなど）であり、そして、処置は、予防的もしくは治療的のいずれかである。本発明はまた、上述のタイプの抗ウイルスアンチセンス化合物の治療的な量以下の量が補充された穀粒を含む、家畜類および家禽類の食用組成物を包含する。また、抗ウイルスアンチセンス化合物の治療的な量以下の量が補充された穀粒を、家畜類および家禽類に供給する方法において、上記の抗ウイルスオリゴヌクレオチド組成物の治療的な量以下の量が穀粒に補充されるという改善も企図される。
【０２９９】
アンチセンス化合物は、一般に、少なくとも２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーのピーク血中濃度をもたらすのに有効な量および様式で投与される。代表的には、１以上の用量のアンチセンスオリゴマーが、一般に、約１〜２週間の期間にわたり、定期的な間隔で投与される。経口投与に好ましい用量は、体重７０ｋｇあたり約１〜１００ｍｇのオリゴマーである。いくつかの場合では、患者あたり１００ｍｇより多くの用量が必要とされ得る。ｉ．ｖ．投与については、好ましい用量は、体重７０ｋｇあたり約０．５ｍｇ〜１００ｍｇである。アンチセンスオリゴマーは、短期間にわたり、定期的な間隔で投与され得る（例えば、２週間以内で毎日）。しかし、いくつかの場合において、オリゴマーは、より長い期間にわたって断続的に投与される。投与は、抗生物質もしくは他の治療的処置の投与の後もしくはこれらと同時であり得る。処置レジメンは、処置中の被験体のイムノアッセイ、他の生化学検査および生理学的試験の結果に基づき、示されるように調節され得る（用量、頻度、経路など）。
【０３００】
Ｂ９（ｄ）．処置の監視
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる有効なインビボ処置レジメンは、投与の期間、用量、頻度および経路、ならびに、処置中の被験体の状態（すなわち、予防的投与に対し、局所性または全身性の感染に応じた投与）によって変化し得る。したがって、このようなインビボ治療は、しばしば、最適な治療結果を達成するために、処置中の特定のタイプのウイルス感染に適切な検査による監視と、そして、用量または処置レジメンの対応する調節を必要とする。処置は、例えば、感染の一般的な徴候（例えば、全血球数（ＣＢＣ）、核酸検出法、免疫診断検査、ウイルス培養またはヘテロ二重鎖の検出）によって監視され得る。
【０３０１】
１以上のタイプのＲＮＡウイルスの増殖の阻害または排除における、インビボ投与された本発明のアンチセンスオリゴマーの効能は、アンチセンスオリゴマー投与の前、間および後に、被験体から採った生物学的サンプル（組織、血液、尿など）から決定され得る。このようなサンプルのアッセイとしては、以下が挙げられる：（１）当業者に公知の手順（例えば、電気泳動ゲル移動度アッセイ）を用いた、標的および非標的配列とのヘテロ二重鎖形成の存在もしくは非存在の監視；（２）標準的な技術（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティング）により決定されるウイルスタンパク質生成量の監視；または、（３）例えば、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの方法によるウイルス力価に対する影響の測定（例えば、Ｐａｒｉ，Ｇ．Ｓ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ３９（５）：１１５７−１１６１，１９９５；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４０（９）：２００４−２０１１，１９９６，Ｃｏｔｔｒａｌ，Ｇ．Ｅ．（編）：Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．６０−９３，１９７８を参照のこと）。
【０３０２】
アンチセンスオリゴマー処置の効能を監視する好ましい方法は、アンチセンス−ＲＮＡヘテロ二重鎖の検出によるものである。アンチセンスオリゴマー投与後の選択した時点で、散布油中のヘテロ二重鎖の存在を検出するか、そして／または、レベルを測定するために、体液が収集される。代表的には、体液サンプルは、投与から３〜２４時間後に、好ましくは、投与から約６〜２４時間後に収集される。上に示されるように、体液サンプルは、尿、唾液、血漿、血液、脳脊髄液、または、生物起源の他の液体サンプルであり得、そして、その中に懸濁される細胞もしくは細胞断片、または、液体媒体およびその溶質を含み得る。収集されるサンプルの量は、代表的には、０．１〜１０ｍｌの範囲、好ましくは、約１ｍｌ以下である。
【０３０３】
サンプルは、サンプル中の望ましくない成分を除去するため、そして／または、サンプル中のヘテロ二重鎖種を処理して、望ましくないｓｓＲＮＡオーバーハング領域を除去するために、例えば、ＲＮａｓｅを用いた処理により処理され得る。当然のことながら、ヘテロ二重鎖の検出が、サイズ分離に依存する場合（例えば、質量分光器の電気泳動）、オーバーハングを除くことは特に重要である。
【０３０４】
種々の方法が、サンプルから望ましくない成分を除去するために利用可能である。例えば、ヘテロ二重鎖は正味の負電荷を有するので、電気泳動またはイオン交換の技術が、中性もしくは正に荷電した物質からヘテロ二重鎖を分離するために使用され得る。サンプルはまた、表面に抗体が結合されたか、または、ヘテロ二重鎖に特異的に結合し得る他の因子を持つ、固体支持体と接触させられ得る。支持体を洗浄して、非結合の物質を除去した後、ヘテロ二重鎖は、例えば、電気泳動、質量分光器またはイムノアッセイによるさらなる解析のために、実質的に純粋な形態に放出され得る。
【０３０５】
Ｂ９（ｅ）．感染性因子の同定
感染を引き起こす特定のウイルスは、当該分野で公知の方法、例えば、血清学的方法もしくは培養の方法によって、または、本発明のアンチセンスオリゴマーを用いる方法によって決定され得る。
【０３０６】
血清学的同定は、被験体の生物学的生検（例えば、便、尿、脳脊髄液、血液など）から単離したウイルスサンプルまたは培養物を用いる。ウイルスの検出のためのイムノアッセイは、一般に、当業者により慣用的に用いられる方法（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット）によって行われる。さらに、特定のウイルスの株または種に対して特異的なモノクローナル抗体も、しばしば、市販されている。
【０３０７】
培養の方法は、種々の培養条件下での増殖速度および形態のような特徴の比較を含むがこれに限定されない技術を用いることによって、特定のタイプのウイルスを単離および同定するために使用され得る。
【０３０８】
感染した被験体におけるウイルス感染性因子を同定するための別の方法は、ウイルスの広範囲の科および／または属を標的とする１以上のアンチセンスオリゴマーを用いる。任意の特徴的なウイルスＲＮＡを標的とする配列が使用され得る。所望される標的配列は、好ましくは、（ｉ）広範囲のウイルス科／属に共通し、そして、（ｉｉ）ヒトにおいては見出されない。多数の感染性ウイルスについて特徴的な核酸配列は、公的データベースにおいて利用可能であり。そして、特定のオリゴマーの設計の基礎としてはたらき得る。
【０３０９】
複数のオリゴマーの各々について、以下の工程が行われる：（ａ）オリゴマーを、被験体に投与する；（ｂ）上記投与後の選択した時点で、被験体から体液サンプルを得る；および（ｃ）サンプルを、アンチセンスオリゴマーと、ウイルスゲノムの相補的な部分とを含むヌクレアーゼ抵抗性ヘテロ二重鎖の存在についてアッセイする。工程（ａ）〜（ｃ）は、少なくとも１つのこのようなオリゴマーについて行われるか、または、ウイルスもしくはウイルスの科を同定するために必要な限り多くについて行われる。オリゴマーは、投与され、そして、その後、またはより簡便には同時にアッセイされ得る。ウイルスは、アンチセンスオリゴマーと、所与の公知のウイルスもしくはウイルスの科のウイルスゲノムの相補的な部分とを含むヘテロ二重鎖の存在（または非存在）に基づいて同定される。
【０３１０】
好ましくは、広範な科を標的とするオリゴマーの第一の群が最初に利用され、その後、それにより同定された広範な科／属内の特定の属および／もしくは種および／もしくは株に対して相補的な選択されたオリゴマーが利用される。このオリゴマーの第二の群は、広範な科／属内の特定の属および／もしくは種および／もしくは株に対して指向された標的化配列を含む。一般に、いくつかの異なる第二のオリゴマーコレクション（すなわち、第一段階において試験された広範なウイルス科／属の各々についてのもの）が提供される。配列は、（ｉ）試験される個々の属／種／株に特異的であり、かつ（ｉｉ）ヒトにおいて見出されないものが選択される。
【０３１１】
Ｃ．ＴＧＦ−βを標的とするアンチセンスオリゴマーを用いた処置後の、造血幹細胞の増殖および移植の改善
別の実施形態では、本発明は、造血系の迅速なインビボ再構築（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を可能にする造血幹細胞（ＨＳＣ）の処置のための、改善されたオリゴマーを提供する。さらに、近年の研究は、心臓血管および末梢血管の疾患のための治療としてのＨＳＣの利用を支持している。しかし、これらの研究は、注射されたＨＳＣ集団の品質およびその増殖能の重要性について強調している。ＴＧＦ−βに対するアンチセンスオリゴマーを用いるＨＳＣ操作は、循環中のＨＳＣ前駆体の数を増加させ、そして、これらの細胞の回復能を増強する。ＨＳＣが損傷部位に向かいそして付着する能力における改善を、ＨＳＣの生存および増殖の改善と組み合わせることで、心臓血管および末梢血管の疾患を持つ患者の治療にとって、重要な治療上の戦略が提示される。
【０３１２】
本発明の組成物は、本発明において記載されるように、カチオン性結合が点在したＴＧＦ−βアンチセンスオリゴマーを含み、このオリゴマーは、ＴＧＦ−β遺伝子のプロセシングを受ける前のＲＮＡのスプライシング部位、または、ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンのいずれかを標的とする。例示的な好ましいアンチセンスオリゴマーは、配列番号２４７（ＧＡＧＧＧＣＧＧＣＡ  ＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣ）、配列番号２４８（ＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣ  ＡＧＣＣＣＣＣＧＴＣ  Ｇ）または配列番号２４９（ＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣ  ＴＴＣＴＣＣＧＴＧＧ）として示される配列を有する。このようなアンチセンス因子を用いたＣＤ３４＋  ＨＳＣの処理は、機能的なＴＧＦ−βの発現をブロックし、それゆえに、幹細胞の複製および／または分化に対するＴＧＦ−βの作用をブロックするのに有効な培養条件下で行われる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００２／００４４７９または米国出願公開第２００３０１０９４６５号（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０３１３】
関連する方法において、培養におけるヒト幹細胞の生存時間は、幹細胞の生存性および分化状態を維持するのに有効な培養条件下で、ある期間にわたってこれらの細胞をエキソビボにてＴＧＦ−βブロッキング剤に曝露することによって延長される。これらの細胞は、延長された期間にわたり、インビトロで維持され得、そして、造血系の再構成を必要とする被験体中にインビボで転移させるために使用され得るか、または、ＴＧＦ−βブロッキング剤で処理した幹細胞が、これらの細胞の迅速な増殖と系統が拘束された先祖細胞およびその子孫への分化をもたらすのに有効な条件下で培養され得る。
【０３１４】
Ｄ．免疫応答の調節
本明細書中に記載されるオリゴマーはまた、自己免疫状態または移植拒絶の処置または予防のために、哺乳動物被験体における免疫応答を操作するために使用され得る。自己抗原に対する免疫耐性を生成するための免疫系の正常な機能を操作することによって、この方法は、移植拒絶または自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、狼瘡（ｌｕｐｉｓ）、重症筋無力症（ｍｙａｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ）、炎症性腸疾患および慢性関節リウマチ）の処置において有益な方法でＴ細胞の機能および活性を変更するのに有用である。本明細書中に記載されるような、ＣＴＬＡ−４に対して指向されたカチオン性結合を持つアンチセンスオリゴマーの使用は、成熟な樹状細胞により提示される抗原に応答したＴ細胞の活性化を変更するための改善された手段を提供する。このことは、自己免疫状態においてのように、または、免疫原性治療用タンパク質によって慢性的に活性化されている場合に、移植された組織に対して応答する、耐性のあるＴ細胞集団の生成を可能にする。
【０３１５】
自家臓器移植を受けることが予定されているヒト被験体における移植拒絶の予防について、化合物の投与は、予定される移植の少なくとも１週間前に開始され得る。投与は、１日あたり約５ｍｇ〜２００ｍｇの化合物の間に対応する用量レベルにおいて、非経口投与によりなされ得る。
【０３１６】
自己免疫状態の処置について、化合物の投与は、自己免疫状態における所望の改善が観察されるまで継続され得る。投与は、１日あたり約５ｍｇ〜２００ｍｇの化合物の間の対応する用量レベルにおいて、非経口投与によりなされ得る。
【０３１７】
この方法の好ましい用途において、被験体はヒト被験体であり、そして、本発明の方法は、免疫学的耐性の促進または免疫活性化の増強のいずれかが、処置中の被験体に対する治療結果の改善をもたらすのに有効である任意の状態の処置に適用可能である。
【０３１８】
ＣＴＬＡ遺伝子は、エキソン１〜４と名付けられる４つのエキソンと、各エキソン対を分離するイントロンとを有する。イントロンは、１〜３と名付けられ、イントロン−１は、エキソン１とエキソン２との間に介在する配列であり、イントロン−２は、エキソン２とエキソン３との間に介在する配列であり、そして、イントロン−３は、エキソン３とエキソン４との間に介在する配列である。全長ＣＴＬＡアイソフォームは、４つ全てのエキソンによってコードされ、３つ全てのイントロンの除去と、４つ全てのエキソンの維持とを必要とする。ＣＴＬＡ−４のリガンド非依存性の形態は、エキソン１、３および４から形成され、イントロン１と隣接するエキソン２、ならびにイントロン３および４の除去を必要とする。ＣＴＬＡ−４の分泌形態は、エキソン１、２および４から形成され、イントロン１と、イントロン２、エキソン３およびイントロン３を含むプロセシングを受ける前のｍＲＮＡの連続した部分との除去を必要とする。
【０３１９】
オリゴマーの標的化配列は、好ましくは、配列番号２４６によって同定される標的配列の少なくとも１２のサブユニットに対して相補的であり、被験体のプロセシングを受ける前のＴ細胞抗原−４（ＣＴＬＡ−４）ｍＲＮＡのイントロン１とエキソン２との間のスプライシング接合部にまたがる。
【０３２０】
現在のアンチセンス法は、ＣＴＬＡ−４遺伝子の特定のスプライシングを受けたｍＲＮＡアイソフォームの相対比を操作して、免疫抑制および免疫学的耐性を高めることによって、ＣＴＬＡ−４活性がナイーブなＴ細胞および活性化されたＴ細胞において調節され得るという知見み基づく。より具体的には、イントロン−１とエキソン−２との間のスプライシング領域を標的とするアンチセンス化合物の投与が、ＣＴＬＡ−４  ｍＲＮＡおよびＣＴＬＡ−４タンパク質の割合を全長からリガンド非依存性の形態へとシフトさせること、そして、このシフトが、移植手術前の被験体の前処理に関して、自己免疫状態もしくは移植拒絶を処置することにおいて、および、移植拒絶の危険性を低下させることにおいて、有効であること発見された。
【０３２１】
別の実施形態では、本発明のオリゴマーは、樹状細胞がＴ細胞から抗原特異的な免疫応答を誘発する様式を、正確かつ特異的に変更させるために使用され得る。具体的には、ＣＤ８６（Ｂ７−２）タンパク質レベルの減少は、樹状細胞を標的とするアンチセンス阻害によって達成される。研究は、ＤＣの成熟が、ＣＤ８６発現の消失の結果として、ＩＬ−１０の量の増加をもたらすことを示している。さらに、マウスホモログにおいて、エキソン１０によりコードされる細胞質領域が、このサイトカインの調節と機能的に結び付けられることが決定された。本発明において記載されるような、カチオン性結合を含み、ＣＤ８６開始コドンまたはＣＤ８６エキソンスプライシングアクセプター領域に対し標的化されたアンチセンスオリゴマーを用いることで、成熟な樹状細胞により提示される抗原に対するＴ細胞の活性化を正確かつ特異的にブロックするための改善された手段が提供される（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００５／０７２５２７を参照のこと）。このことは、自己免疫状態においてのように、または、免疫原性治療用タンパク質によって慢性的に活性化されている場合に、移植された組織に対して応答する、耐性のあるＴ細胞および樹状細胞の集団の生成を可能にする。
【０３２２】
自己抗原に対する免疫耐性の生成のための免疫系の通常の機構を操作することによって、本発明の方法は、移植拒絶または自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、狼瘡（ｌｕｐｉｓ）、重症筋無力症（ｍｙａｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ）、炎症性腸疾患および慢性関節リウマチ）の処置において有益な方法で成熟な樹状細胞の機能および活性を変更する。
【０３２３】
アンチセンス化合物は、プロセシングを受けたか、またはプロセシングを受ける前のＣＤ転写物の発現感受性領域、すなわち、アンチセンス化合物に結合したときに、樹状細胞における全長ＣＤ８６の発現を阻害するのに有効な領域に対して標的化される。１つの一般的な実施形態において、発現感受性領域は、プロセシングを受けた転写物のＡＵＧ開始部位を含むか、または、この開始部位に隣接する領域であり、ここで、アンチセンス−転写物のヘテロ二重鎖の形成は、転写物の翻訳を阻害するのに有効である。ここでは、アンチセンス化合物は、位置１にあるＡＵＧ開始部位のＡヌクレオチドに関して約−２０〜＋３０塩基の標的領域において、プロセシングを受けたヒトＣＤ８６転写物（そのプロセシングを受けた形態において、配列番号２１５により同定される）における少なくとも１２の連続する塩基を含む標的に対して相補的な塩基配列を有し、そしてこれは、配列番号２１６により同定される配列の少なくとも６つの連続する塩基を含む。例示的なアンチセンス配列としては、配列番号４８〜５０として同定されるものが挙げられる。
【０３２４】
より具体的な実施形態では、アンチセンス化合物は、３塩基＋１２塩基〜１４塩基にまたがるか、または、これに及ぶように設計される（ここで、ＡＵＧ開始部位のＡヌクレオチドは、＋１を表す）。この実施形態では、アンチセンス化合物は、これらの塩基にまたがる領域にハイブリダイズし得るか（例えば、３塩基が、標的領域の中央にある場合）、または、３塩基の主に上流の領域または３塩基を含む領域にハイブリダイズし得る（例えば、標的塩基は、−２〜＋１９に及ぶ（以下の配列番号５０））。
【０３２５】
別の一般的な実施形態では、発現感受性領域は、（ｉ）スプライシング部位のドナーもしくはアクセプター接合部に隣接する（例えば、５塩基以内の）イントロン領域、（ｉｉ）ドナーもしくはアクセプターのスプライシング部位接合部にまたがる領域、または、（ｉｉｉ）スプライシング部位のドナーもしくはアクセプター接合部に隣接する（例えば、５塩基以内の）エキソン領域を含み得る、スプライシング部位の標的領域である。標的領域は、好ましくは、プロセシングを受ける前のヒトＣＤ８６転写物における少なくとも１２の連続する塩基を含み、そして、例示的な実施形態では、配列番号２１７〜２２０によって同定される配列のうちの１つの少なくとも６つの連続する塩基を含む。例示的なアンチセンス配列としては、配列番号５１〜５４として同定されるものが挙げられる。
【０３２６】
ＣＤ８６（Ｂ７−２）遺伝子についての例示的な標的配列を、以下の表１８に列挙する。ヒトＣＤ８６  ＡＵＧ標的および標的化配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ００６８８９から誘導される。ヒトエキソン６および７のスプライシングドナー（ｓｄ）およびスプライシングアクセプター（ｓａ）標的および標的化配列は、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ１７７２０およびＵ１７７２１から誘導される。
【０３２７】
【表１８】
2010505741.tif 000030
【０３２８】
【表１９】
2010505741.tif 000031
患者においてインビボで免疫学的耐性を誘導する方法において、患者は、本明細書中に記載されるＣＤ８６アンチセンスオリゴマーの治療上有効な量を投与される。オリゴマーは、自家移植に対する免疫学的応答を調節することによって、または、自己免疫疾患の場合には、慢性的に活性化されるＴ細胞を排除することによって、患者の処置において有効であり得る。
【０３２９】
自家移植において、患者は、代表的には、移植を受ける直前（例えば、数日前）に結合体で処置され、次いで、免疫学的耐性が確立されるまで、定期的に（例えば、１４日ごとに１回）処置される。免疫学的耐性は、以下に詳述されるような標準的なインビトロ検査において、ドナーＭＨＣ抗原との反応性について患者のＴ細胞を検査することによって、処置の間に監視され得る。
【０３３０】
自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、狼瘡（ｌｕｐｉｓ）、重症筋無力症（ｍｙａｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ）、炎症性腸疾患および慢性関節リウマチ）の処置について、患者は、最初の単回用量のＣＤ８６アンチセンス結合体が与えられ、次いで、障害の改善が観察されるまで、定期ベースで（例えば、３〜１４日ごと）追加の用量が与えられる。上述のように、免疫学的耐性の発生は、インビトロで選択された関連する抗原に対して反応する能力について、血液サンプルからのＴ細胞を検査することによって、処置の間に監視され得る。
【０３３１】
アンチセンスオリゴマーの送達経路としては、吸入；経皮送達；経口および非経口経路を含む種々の全身性経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の送達）が挙げられるがこれらに限定されない。この方法の好ましい用途において、被験体はヒト被験体であり、そして、本発明の方法は、免疫学的耐性の促進が、処置中の被験体に対する治療結果の改善をもたらすのに有効である任意の状態の処置に適用可能である。
【０３３２】
この方法の別の好ましい用途において、ヒト被験体から単離した自家樹状細胞は、選択された関連する抗原の存在下で、ＣＤ８６アンチセンス化合物を用いてエキソビボで処理され得る。この方法のこの用途は、免疫系が、特定の抗原に対し不適切に反応するような自己免疫障害の処置において特に有用であり、そして、これらの抗原が、樹状細胞を調整するために使用され得る。例は、多発性硬化症（ＭＳ）におけるミエリンの免疫媒介性の破壊である。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびタンパクリピドタンパク質（ＰＬＰ）は、この自己免疫疾患の病因における重要な抗原であると考えられるホストタンパク質（ｈｏｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）である（Ｓｈｅｖａｃ  ２００２）。
【０３３３】
免疫応答の調節における別の実施形態では、本発明の化合物は、中枢性および末梢性の免疫応答のダウンレギュレーションを抑制するために使用され得る。プログラムされた死１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  １）（ＰＤ−１）タンパク質は、ＨＣＶおよびＨＩＶの感染を含む多くの慢性ウイルス感染において、消耗されたウイルス特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の表面上で顕著にアップレギュレートされる。本発明において記載されるようなカチオン性結合を含むアンチセンスオリゴマーを用いて、ＰＤ−１のプロセシングを受ける前のＲＮＡのスプライシング接合領域を標的とすることで、多くの慢性ウイルス感染および癌に関連する細胞傷害性Ｔ細胞の応答の抑制を逆行させるための新規の免疫治療的アプローチが提供される。
【０３３４】
別の実施形態では、ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ２）の発現が、本発明において記載されるようなカチオン性結合を含むアンチセンスオリゴマーを用いて変更され、選択的スプライシングを受けた可溶性のＴＮＦ−αレセプター２アイソフォーム（ｓＴＮＦＲ２）の発現を誘導し得る。この天然に存在する選択的スプライシングを受けたＴＮＦＲ２遺伝子のアイソフォームは、抗炎症特性を提供する。というのも、これは、ＴＮＦ−αの生物学的活性と拮抗するからである。本発明において記載されるようなアンチセンスオリゴマーを用いてヒトＴＮＦＲ２遺伝子のエキソン７スプライシングアクセプター領域に対して標的化されたアンチセンスオリゴマーを用いたｓＴＮＦＲ２アイソフォームの過剰発現は、炎症性関節炎、具体的には、ＴＮＦ−αにより誘導される関節炎を阻害するための免疫治療的アプローチを提供する。
【０３３５】
Ｅ．筋萎縮症の処置
別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなオリゴマーは、ヒト被験体における骨格筋重量の減損を処置するための方法において使用され得る。この方法における工程は、以下を伴う：
（ａ）被験体におけるミオスタチンの血中レベルまたは組織レベルを測定する工程；
（ｂ）本明細書中に記載され、少なくとも１つのカチオン性のサブユニット間結合を含み、好ましくは、２０％〜５０％のこのようなカチオン性結合を含み、かつ、そのプロセシングを受けた形態で配列番号２２５によって同定される、プロセシングを受けたかまたはプロセシングを受ける前のヒトミオスタチンＲＮＡ転写物の発現感受性領域にハイブリダイズするのに有効な塩基配列を有するオリゴマーのミオスタチンの発現を阻害する量を被験体に投与する工程；
（ｃ）この投与によって、被験体の標的筋肉細胞内で、ヒトミオスタチンＲＮＡ転写物とアンチセンス化合物とから構成され、かつ、少なくとも４５℃の解離のＴｍを有する塩基対形成したヘテロ二重鎖構造を形成させ、それによって、上記細胞におけるミオスタチンの発現を阻害する工程；
（ｄ）アンチセンス化合物の投与後の選択した時点で、被験体におけるミオスタチンの血中レベルまたは組織レベルを測定する工程；および
（ｅ）投与されるアンチセンス化合物の量の用量または投薬計画を必要に応じて調節するために（ｄ）において測定したミオスタチンレベルを用いて投与を繰り返し、ミオスタチンの測定したレベルを最初に測定したレベルを上回って減少させ、工程（ｄ）において測定したミオスタチンのこのようなレベルを正常な健康な個体について決定した範囲内に維持する工程。
【０３３６】
アンチセンスオリゴマーが、プロセシングを受ける前のヒトミオスタチン転写物のスプライシング部位にハイブリダイズするのに有効である場合、このオリゴマーは、プロセシングを受ける前のヒトミオスタチン転写物におけるスプライシング部位の少なくとも１２の連続する塩基に対して相補的な塩基配列を有し、そして、工程（ｃ）におけるヘテロ二重鎖の形成は、プロセシングを受ける前のミオスタチン転写物のプロセシングをブロックし、全長のプロセシングを受けたミオスタチン転写物をもたらすのに有効である。プロセシングを受ける前のミオスタチン転写物におけるスプライシング部位は、配列番号２２６〜２２９として同定される配列のうちの１つを有し得る。例示的なアンチセンス配列は、配列番号２３０〜２３３によって同定されるものである。
【０３３７】
Ｆ．スプライシング領域のアンチセンス標的化のさらなる用途
本発明のオリゴマーは、細胞における全長タンパク質の発現を阻害するための治療用組成物および方法において、そして、具体的には、プロセシングを受ける前のｍＲＮＡにおける通常のスプライシングアクセプター接合部の下流にある５’末端の１〜約２５塩基対を有するｍＲＮＡ配列に対して標的化されたアンチセンス組成物に使用され得る。このような標的化は、自然なｍＲＮＡスプライシングの進行の阻害と、スプライシング改変体ｍＲＮＡの生成とに有効である（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００１／０８３７４０または米国出願公開第２００６０２８７２６８号（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０３３８】
適切な標的タンパク質としては、例えば、転写因子、特に、癌遺伝子または癌原遺伝子のタンパク質（例えば、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ａｂｌ、ｂｃｌおよびｐ５３）；マトリクスタンパク質（例えば、インテグリンおよびカテドリン）；他の腫瘍発現タンパク質（例えば、ｈＣＧ）；テロメラーゼ；レセプタータンパク質；ウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ、ヒトパピローマウイルスおよびヒトパルボウイルスＢ１９のサブゲノムの（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）スプライシングを受けたｍＲＮＡから発現されるタンパク質）；および免疫調節性タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−２、ＰＤ−１、Ｆｏｘｐ３、ＴＧＦ−βおよびＴＮＦレセプター）が挙げられる。このようなタンパク質の修飾された形態の阻害または発現は、多数の治療上の用途を有することが理解される。これらの用途としては、例えば、細胞分裂および細胞周期の調節の種々の局面に関与する転写因子のようなタンパク質を標的化することによる抗腫瘍治療；感染性因子の複製または他の不可欠な機能に必須のタンパク質を標的化することによる抗ウイルス治療；その部位における細胞増殖を支えるタンパク質を疎外することによる、再狭窄または他の増殖性障害の阻害；ならびに、種々の自己免疫疾患に関連する免疫応答を抑制するか、または、慢性のウイルス感染の場合のように、免疫応答を増強するかのいずれかの免疫調節、が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３３９】
転写因子は、代表的には、ＤＮＡ結合領域とタンパク質−タンパク質結合領域とを有するマルチドメインタンパク質である。これらの領域のうちの１つと干渉することで、ドミナントネガティブなタンパク質を生成し得、これは、１つの活性（例えば、タンパク質結合）を維持する一方で、そのタンパク質の適切な機能にとって決定的な別の活性（例えば、ＤＮＡ結合および転写活性；また、逆も同じ）を阻害することによって、ネイティブなタンパク質の活性に対抗する。
【０３４０】
上述のように、上記標的タンパク質の多くの機能的ドメインは、広く研究されており、そして、文献において報告されている。イントロン、エキソンおよびＡＵＧ開始コドンの位置を含めた、プレｍＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースまたは当業者が容易に利用可能な他の公的な情報源において見出され得る。
【０３４１】
スプライシングアクセプタードメインの下流を標的とするアンチセンスの例は、例えば、哺乳動物被験体における免疫応答を操作する方法（すなわち、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ８６の発現を標的化することによる）について、上に示される。
【０３４２】
別の実施形態では、本発明の化合物は、中枢性および末梢性の免疫応答のダウンレギュレーションを抑制するために使用され得る。プログラムされた死１（ＰＤ−１）タンパク質は、ＨＣＶおよびＨＩＶの感染を含む多くの慢性ウイルス感染において、消耗されたウイルス特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の表面上で顕著にアップレギュレートされる。本発明において記載されるようなカチオン性結合を含むアンチセンスオリゴマーを用いて、ＰＤ−１のプロセシングを受ける前のＲＮＡのスプライシング接合領域を標的とすることで、多くの慢性ウイルス感染および癌に関連する細胞傷害性Ｔ細胞の応答の抑制を逆行させるための新規の免疫治療的アプローチが提供される。
【０３４３】
別の実施形態では、ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ２）の発現が、本発明において記載されるようなカチオン性結合を含むアンチセンスオリゴマーを用いて変更され、選択的スプライシングを受けた可溶性のＴＮＦ−αレセプター２アイソフォーム（ｓＴＮＦＲ２）の発現を誘導し得る。この天然に存在する選択的スプライシングを受けたＴＮＦＲ２遺伝子のアイソフォームは、抗炎症特性を提供する。というのも、これは、ＴＮＦ−αの生物学的活性と拮抗するからである。本発明において記載されるようなアンチセンスオリゴマーを用いてヒトＴＮＦＲ２遺伝子のエキソン７スプライシングアクセプター領域に対して標的化されたアンチセンスオリゴマーを用いたｓＴＮＦＲ２アイソフォームの過剰発現は、炎症性関節炎、具体的には、ＴＮＦ−αにより誘導される関節炎を阻害するための免疫治療的アプローチを提供する。
【０３４４】
Ｇ．ＣＹＰ３Ａ４を標的とするアンチセンスオリゴマーを用いた処置後の種々の薬物の薬物動態の改善
別の実施形態では、本発明のオリゴマーは、薬物の半減期を短縮する薬物代謝酵素をコードする遺伝子であるＣＹＰ３Ａ４に対して標的化されたアンチセンスオリゴマーを投与することによって、患者における種々の薬物の薬物動態を改善するために使用され得る。アンチセンスオリゴマーは、被験体におけるＣＹＰ３Ａ４酵素の生成を低減させて、薬物の半減期および有効性を延長し、そして、薬物の毒性を減らすのに有効である（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００１／０８７２８６または米国出願公開第２００４０２２９８２９号（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０３４５】
本発明の組成物は、本発明において記載されるような、カチオン性結合が点在したＣＹＰ３４アンチセンスオリゴマーを含み、このオリゴマーは、ｍＲＮＡにおけるＡＵＧ開始コドン領域またはＣＹＰ３Ａ４遺伝子のプロセシングを受ける前のＲＮＡにおけるスプライシング部位を標的とする。例示的な好ましいアンチセンスオリゴマーは、配列番号２９０〜２９２からなる群として示される配列を有する。
【実施例】
【０３４６】
実験
材料および方法（サブユニット）
そうでないと記されない限り、全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｆｌｕｋａから入手した。ベンゾイルアデノシン、ベンゾイルシチジンおよびフェニルアセチルグアノシンは、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＵＫから入手した。
【０３４７】
そうでないと示されない限り、溶媒の混合は、容量対容量（ｖ／ｖ）である。光学密度は、水中で、２６０ｎｍにて測定する。この節におけるオリゴマー物質の命名法は、以下の形式を用いる。ここで、＋は、ｂ１（ピペラジン）結合を示し；ＧｕＸは、６−グアニジノヘキサノイルピペラジンのタイプｂ１結合を示し；Ｒはアルギニンであり；Ｂはβ−アラニンであり；Ａｈｘは６−アミノヘキサノイルであり；ＧｕＡｈｘは、６−グアニジノヘキサノイルであり；Ａｈｘｐｉｐは、６−アミノヘキサノイルピペリジンのタイプｂ１結合であり；ＥＧ３はテイル（Ｔａｉｌ）であり；ＧｕＢｕは、４−グアニジノブタノイルであり；ＧｕＢｕｐｉｐは、４−グアニジノブタノイルピペラジンのタイプｂ１結合であり；Ａｃはアセチルであり；ＴＦＡｐｉｐは、トリフルオロアセチルピペラジンのタイプｂ１結合であり；Ｇｕｐｉｐは、グアニルピペラジンのタイプｂ１結合であり；Ｇｕは、グアニル（−−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ２）基であり；Ｍｅｐｉｐは、４−メチルピペラジンのタイプｂ１結合である。ペプチドはＮ→Ｃで書かれるが、そのＣ末端は、オリゴマーの３’末端に連結される。例として：
５’−（基）−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’−（基）：タイプａの結合を持つ無電荷骨格
５’−（ＥＧ３）−ＮＮ＋ＮＮＮ＋Ｎ＋ＮＮＮＮＮＮ−３’−（Ｈ）：ｂ１（ピペラジン）結合、５’−テイル部分を持ち、３’において置換されていない荷電された骨格
５’−（ＥＧ３）−ＮＮ＋ＮＮＮ＋Ｎ＋ＮＮＮＮＮＮ−３’−（Ａｃ（ＲＡｈｘＲ）４ＡｈｘＢ−）：ｂ１（ピペラジン）結合、５’−テイル部分およびペプチドを持ち、３’においてβ−アラニン部分に連結された荷電された骨格
５’−（ＧｕＡｈｘ）−ＮＮ（ＧｕＸ）ＮＮＮ（ＧｕＸ）Ｎ（ＧｕＸ）ＮＮＮＮＮＮ−３’−（ＧｕＡｈｘ）：両方の末端にｂ１（６−グアニジノヘキサノイルピペラジン）結合およびＧｕＡｈｘ基を持つ荷電された骨格。異なるように書かれているが、全ての荷電された位置は、６−グアニジノヘキサノイル部分を含む。
【０３４８】
実施例１：モルホリノサブユニット（図２Ｂを参照のこと）
モルホリノ塩３ａ〜ｄ、ｆの一般的な調製：メタノールの冷やした混合物（１ｇのリボヌクレオシド２につき５〜１０ｍＬ）に、メタ−過ヨウ素酸ナトリウムの温水溶液（１．０５当量）を加えた。この段階で、反応混合物の組成は、１５〜４０％水／メタノール（ｖ：ｖ）である。この混合物に、固体の１ａ〜ｄ、ｆを分けて加えた。反応が完了すると（１〜２時間）、副産物であるヨウ素酸ナトリウムケーキを濾過により除き、そして、水／メタノールで再度スラリーにして、あらゆる生成物中間体を回収した。プールした濾液に、ホウ酸アンモニウム（１４〜２．０当量）を加えた。２０℃にて４５〜１２０分撹拌した後、この混合物を冷却し、そして、ボラン−トリチルアミン（１．５〜２．０当量）を加えた。この混合物を、ｐ−トルエンスルホン酸（３ｂ、ｃ、ｄ、ｆ）または塩酸（３ａ）のいずれかのメタノール溶液（４〜５当量）を用いて、ｐＨ３．５〜４．０に調節した。混合物を、＜１０℃にて７〜１４時間、ｐＨ３．５〜４．０に保持した。３ｂ、ｃ、ｄ、ｆのｐ−トルエンスルホン酸塩を濾過により単離し、そして、再結晶／再スラリーにより精製した。
【０３４９】
３ａを含む混合物をｐＨ７に中和した。この溶液を蒸留により濃縮してメタノールを除き、そして、この生成物を１−ブタノール中に抽出させた。この溶液を、シュウ酸のメタノール溶液（０．５当量）を用いてｐＨ４に調節した。３ａのシュウ酸塩を濾過により単離し、そして、再スラリーにより精製した。３ａ〜ｄ、ｆについての収率は、３０〜７５％であった。
【０３５０】
１ａ〜ｄ、ｆの一般的な調製：化合物３ａ〜ｄ、ｆを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｇの３につき４〜６ｍＬ）中に溶解／懸濁した。この混合物に、トリエチルアミン（２．７〜３．５当量）およびトリフェニルメチル（トリチル）塩化物（１．１〜１．５当量）を加えた。反応が完了すると、過剰なトリチル塩化物をジエチルアミン（０．５当量）を用いてクエンチした。粗生成物を、酢酸エチルおよび水からの直接的な沈殿、または、抽出性のワークアップ（水、次いで、酢酸エチルまたはジクロロメタン）および沈殿のいずれかによって単離した。生成物を、トルエンからの結晶化により精製した。収率は７５〜９０％であった。
【０３５１】
１ｅの調製：化合物１ｆを、ジクロロメタン（１ｇの１ｆにつき８ｍＬ）中に懸濁した。この懸濁液に、イミダゾール（１．３当量）およびｔ−ブチルジメチルクロロシラン（１．２当量）を加えた。反応が完了すると（１〜２時間）、この溶液を、ｐＨ３のクエン酸緩衝液および水で連続して洗浄した。得られた溶液を濃縮して泡状物を生じ、これを、テトラヒドロフラン（１ｇの１ｆにつき８ｍＬ）中に溶解した。この溶液に、炭酸カルシウム（２．０当量）およびクロロメチルピバレート（１．５当量）を加え、この混合物を加熱して還流させた。反応が完了すると（１６時間）、この混合物を冷却して、ジクロロメタンで希釈した。この混合物を、ＫＨ２ＰＯ４溶液（ｐＨ４．５）および水で連続して洗浄した。得られた溶液を濃縮して泡状物を生じた。この泡状物をテトラヒドロフラン（１ｇの１ｆにつき４ｍＬ）中に溶解し、そして、三フッ化水素トリエチルアミン（２．０当量）を加えた。反応が完了すると（１６時間）、この溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および水で連続して洗浄した。溶媒をトルエンに交換し、ヘプタン中に沈殿させることでこの生成物を単離した。収率は、８０％の１ｅであった。
【０３５２】
実施例２：結合タイプ（ａ）を持つモルホリノサブユニット（図２Ｃを参照のこと）
５ａ〜ｅの一般的な調製：化合物１ａ〜ｅを、ジクロロメタン（１ｇの１につき６ｍＬ）中に溶解し、＜５℃まで冷却した。この溶液に、２，６−ルチジン（１．６当量）、Ｎ−メチルイミダゾール（０．３当量）およびＮ，Ｎ−ジメチルホスホロアミドジクロリデート４（１．６当量）を加えた。反応が完了すると（６〜１２時間）、この混合物をｐＨ３のクエン酸緩衝液で洗浄した。この粗生成物を、ヘプタン中への沈殿により単離した。この最終生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタンの勾配）により精製した。生成物を含むプールした画分を合わせ、より少ない容量までエバポレートし、そして、ヘプタンからの沈殿により単離した。収率は、４０〜６０％であった。サブユニット５ｅ、ならびに、この複素環式塩基から誘導した他のサブユニットのクロマトグラフィーの間、非極性不純物を酢酸エチル／ヘプタンで溶離させた後、ジクロロメタン中（５％イソプロパノール／酢酸エチル）の勾配を用いて、生成物を溶出した。
【０３５３】
実施例３：プロカチオン性結合タイプ（ｂ１）を持つモルホリノサブユニット（図Ｄを参照のこと）
Ｎ−トリチルピペラジンコハク酸塩（１１）の調製：トルエン／メタノール（５：１  トルエン／メタノール（ｖ：ｖ）；１ｇのピペラジンにつき５ｍＬ）中のピペラジン（１０当量）の冷溶液に、トルエン（１ｇのトリチル塩化物につき５ｍＬ）中のトリチル塩化物１０（１．０当量）の溶液をゆっくりと加えた。反応が完了すると（１〜２時間）、この溶液を、水で４回洗浄した。得られた有機溶液に、コハク酸水溶液（１．１当量；１ｇのコハク酸につき１３ｍＬの水）を加えた。この混合物を９０分間撹拌し、そして、濾過により固体の生成物を回収した。この粗製の固体を、アセトン中で２回の再度スラリーにすることにより精製した。収率は、７０％であった。
【０３５４】
１−トリフルオロアセチル−４−トリチルピペラジン（１４）の調製：１８Ｌのメタノール（１ｇの１１につき６ｍＬ）中３．０ｋｇの１１のスラリーに、３．５１Ｌのジイソプロピルエチルアミン（３．０当量）および１．０３８Ｌのトリフルオロ酢酸エチル１３ａ（１．３当量）を加えた。一晩撹拌した後、有機混合物を乾燥状態まで蒸留した。得られた油状物を、１５Ｌのジクロロメタン（１ｇの１１につき５ｍＬ）中に溶解し、そして、１５Ｌの１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４で２回、そして、１５Ｌの脱イオン水で２回洗浄した。この溶液を、３．０ｋｇのシリカプラグ（１：１  シリカ：１１）に通し、そして、９Ｌのジクロロメタン（１ｇの１１につき３ｍＬ）で洗浄し、次いで、濃縮して白色の泡状物を生じた。１４ａについて：収量は２．９９６４ｋｇ、１０５％であった。１９Ｆ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ−６８．７（ｓ）。
【０３５５】
２，２−ジフルオロプロピニルおよびヘキサフルオロイソブチリルアミドの調製について、ジクロロメタン中のコハク酸トリチルピペラジン１１を、炭酸カリウムの水溶液と反応させて、コハク酸を除去した。ジクロロメタンをエバポレートし、そして、トリチルピペラジン遊離塩基１２を、ジイソプロピルエチルアミン（１．０当量）の存在下、溶媒なしで、２当量のエステル１３ｃまたは１３ｄ（共に、Ｓｙｎｑｕｅｓｔ，Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ，ＵＳＡから入手）で処理した。混合物を、完了するまで４０℃に加熱した。この混合物を、ジクロロメタン中に溶解し、そして、シリカゲルのプラグを通過させ、酢酸エチルおよびヘプタンの混合物で溶出して、純粋なトリチルピペラジンアミドを得た。
【０３５６】
Ｎ−トリフルオロアセチルピペラジン、ＨＣｌ塩（１５）の調製：７．１６Ｌのジクロロメタン（１ｇの１４につき５ｍＬ）中の１．４３１ｋｇの１４の溶液に、３．３７Ｌの２．０Ｍ  ＨＣｌ／Ｅｔ２Ｏ（２．０当量）の溶液を滴下した。この反応混合物を１時間撹拌し、そして、生成物を濾過により回収した。濾紙上のケーキを２．０Ｌのジクロロメタンで洗浄した。この固体を、真空オーブン中４０℃にて２４時間乾燥させた。１５ａについて：収量は、７２４．２ｇ、９８．３％であった。１９Ｆ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ−６８．２（ｓ）；融点は１４０℃であった。エタノールからの少量のサンプルの再結晶化により、融点は１５４〜１５６℃まで上がった。
【０３５７】
活性化因子（６）の調製：トルエン（１ｇの１５につき１０ｍＬ）中の１５（１．０当量）の冷懸濁液に、ジイソプロピルエチルアミン（４．０当量）を加えた。この混合物を、氷浴中で１時間撹拌し、そして、濾過により塩を除いた。濾紙上のケーキをトルエン（１．５ｍＬ／ｇ）で２回洗浄した。１５の遊離塩基のトルエン溶液（１３ｍＬ／ｇ）を、トルエン中のＰＯＣｌ３（１．２当量）の氷冷溶液にゆっくりと加えた。この反応混合物を、氷浴中で１時間撹拌し、次いで、１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（１３ｍＬ／ｇ）で２回、そして、脱イオン水（１３ｍＬ／ｇ）で１回洗浄した。この溶液を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、そして、乾燥状態まで蒸留した。得られた非晶質の固体を、ジクロロメタン（１ｇの１５につき２ｍＬ）中に溶解し、再度、乾燥状態まで蒸留した。１５ａの２００ｇバッチにつき、６ａの収率は、２２６．９ｇ、７５％であった。１９Ｆ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ−６８．８５（ｓ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５．４（ｓ）。
【０３５８】
活性化されたサブユニット（７）の調製（図２Ｃを参照のこと）：ジクロロメタン（１ｇのサブユニットにつき５ｍＬ）中のモルホリノサブユニット１ａ〜ｅ（１．０当量）の冷やした溶液／スラリーに、２，６−ルチジン（１．６当量）、Ｎ−メチルイミダゾール（０．３当量）、およびジクロロメタン（１ｇの６につき２ｍｌ）中の６ａ〜ｄ（１．６当量）を連続的に加えた。この溶液を、室温まで温めた。３時間後、この溶液を、１Ｍクエン酸（ｐＨ３）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、そして、蒸留により溶媒を除去し、そして、トルエン（５ｍＬ／ｇ）を加えた。この溶液をヘプタン（１ｇのサブユニットにつき２０ｍｌ）中に滴下することによって生成物を沈殿させ、次いで、濾過により回収した。この粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタンの勾配）により精製した。溶媒を濃縮し、そして、トルエンまたはエチルベンゼン（１ｇのサブユニットにつき５ｍｌ）で置き換えた。非晶質の生成物を、ヘプタン（１ｇのサブユニットにつき２０ｍｌ）中に沈殿させ、次いで、濾過により回収した。収率は、５０〜７０％であった。１９Ｆ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３は、約δ−６８．８に、化学シフトを伴う１または２のピークを示す；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）は、代表的には、１３．０〜１３．４に、化学シフトを伴う２つの一重項のピークを示す。
【０３５９】
実施例４：プロカチオン性結合タイプ（ｂ２）を持つモルホリノサブユニット（図２Ｃを参照のこと）
側鎖を含む一級アミン：
ヘキサメチレンジアミン（１００ｇ、１当量）を、メタノール（１Ｌ）中に溶解し、そして、１５０ｍＬのメタノール中のトリフルオロ酢酸エチル（１０３ｍＬ、１当量）の溶液を滴下した。ごくわずかにこの溶液が暖かくなった。この反応を、加えた後、室温にて３０分間撹拌した。クロロホルム／メタノール／濃アンモニア（８：３：１）を用いたＴＬＣは、アミンの存在を示す。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、そして、残留物をトルエン／酢酸エチル（１：３、１Ｌ）中に溶解し、次いで、１０％飽和塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄して、過剰のジアミンを完全に除去した。エバポレーションにより、１１７ｇの粗製アミンが得られ、これを、上述のピペラジンの例のような活性化反応において使用した。粗製物８ａを、上記の条件を用いて１ａと反応させて９ａを生じた。他のサブユニットとの対応する反応は、９ｂ〜ｅを生じる。アミンの純粋な（ｎｅａｔ）エステルとの反応により形成されるエステル１３ｃ、ｄからのアミドを用いて代替的なアミド保護アミンを調製し、そして、先の実施例と同じ様式で用いた。
【０３６０】
側鎖を含む二級アミン：
Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（３６．３ｍＬ、３当量）をジクロロメタン（３００ｍＬ）中のトリチル塩化物（３１．８ｇ、１当量）と混合した。３０分後、エバポレーションにより溶媒を除去し、そして、３００ｍＬのトルエンを加えた。この溶液を、３００ｍＬの水で３回、そして最終的には、等容量の飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。エバポレーションにより形成された泡状物を、精製することなく使用した。
【０３６１】
泡状物を、４００ｍＬのメタノールおよび１００ｍＬのジクロロメタン中に溶解した。トリフルオロ酢酸エチル（１７．５ｍＬ）を加えた。３０分後、この混合物を乾燥状態までエバポレートし、３００ｍＬのジクロロメタンを加え、そして、等容量の水で３回、次いで、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、有機層を乾燥状態までエバポレートした。生成物を、１％ルチジンを含む１０％酢酸エチル  ヘプタンを用いたシリカクロマトグラフィーにより精製して、２４．８ｇの純粋なトリチルアミドを得た。
【０３６２】
このトリチルアミドをジクロロメタン（１８０ｍＬ）中に溶解し、そして、エーテル中２Ｍ  ＨＣｌ（８５ｍＬ）を滴下し、そして、室温にて３時間撹拌した。沈殿した固体を濾過し、そして、高減圧下で一晩乾燥させた。回収した生成物（１０．０６ｇ）を、１００ｍＬジクロロメタン中に再懸濁し、そして、溶液が形成された時点で、ジイソピルエチルアミン（２５．０ｍＬ）で処理した。この混合物を、氷浴中０℃にて撹拌しながら、トルエン（１００ｍＬ）中のオキシ塩化リン（４．６ｍＬ）に加えた。この反応物を、１２時間、室温に維持した。この時点で、反応物を１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（１００ｍＬ）で２回洗浄し、そして、硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過およびエバポレーションの後、褐色の固体が得られ、これを直接使用した。
【０３６３】
この褐色の固体を、２０ｍＬジクロロメタン中に溶解し、そして、２，６−ルチジン（５．２４ｍＬ）およびＮ−メチルイミダゾール（０．６７２ｍＬ）を含むジクロロメタン（４０ｍＬ）中の１ｄ（１３．６ｇ）の溶液に加えた。室温にて４時間後、この反応物を、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３）で２回洗浄した。この溶液を乾燥状態までエバポレートして、そして、生成物を、酢酸エチル／ヘプタン勾配を用いるシリカ上のクロマトグラフィーにより精製した。同様の反応により、対応する保護Ｎ−メチル−Ｎ−メチルアミノエチル置換した活性化されたサブユニットを得る。
【０３６４】
実施例５：プロカチオン性結合タイプ（ｂ３）を持つモルホリノサブユニット（図２Ｅを参照のこと）
１の酸化：全てのガラス器具をオーブンにて一晩乾燥させ、そして、減圧下で冷却させるか、または、Ｎ２気流で乾燥させた。全ての溶液は、Ｎ２下で調製および移動した。出発物質のアルコール（１）を、使用の２４時間前に、減圧下、５０℃にて乾燥させた。
【０３６５】
ＤＭＳＯ／ジクロロメタン（１：２  ＤＭＳＯ／ジクロロメタン（ｖ：ｖ）；１ｇの１につき５ｍＬ）中の１（１当量；２５ｍｍｏｌ）の溶液を、１５分かけて、Ｓｗｅｒｎ試薬（−６０℃にて、ジクロロメタン（２１ｍＬ／ｇ）中の塩化オキサリル（１．１当量）の溶液にＤＭＳＯ（２．２当量）を加え、１０分間撹拌することによって調製した）に滴下した。−６０℃にて２５分間撹拌した後、トリエチルアミン（５当量）を１０分かけて加え、この間に、白色の沈殿が形成した。追加のジクロロメタン（１ｇの１につき５ｍＬ）を加え、そして、反応混合物を、水浴中で２５分間撹拌した。
【０３６６】
この反応混合物を、イソプロパノール／ジクロロメタン（１：１５  イソプロパノール／ジクロロメタン（ｖ：ｖ）；１ｇの１につき１５ｍＬ）で希釈し、そして、１：１（ｖ：ｖ）の水／ブライン（１ｇの１につき２０ｍＬ）で２回洗浄した。この溶液を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、そして、濃縮して、淡黄色の泡状物としてアルデヒド１６ａ〜ｅを生じ、これらを、さらに精製することなく用いた。収率は＞１００％であった。
【０３６７】
１６の還元的アミノ化：
酢酸メチルアミンの溶液（１０当量；メタノール中１．１６Ｍの溶液）を、メタノール（１ｍｍｏｌの１６につき８ｍＬ）中の１６ａ〜ｅ（１当量；２５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。氷酢酸でｐＨ８に調整した後、反応混合物を室温にて１時間撹拌し、ＢＨ３．ピリジン（２当量）を加えた。さらに１時間撹拌した後、反応混合物を粘性のある油状物まで濃縮した。
【０３６８】
ジクロロメタン（１ｍｍｏｌの１６につき１０ｍＬ）中に溶解した粗生成物に、９−フルオレニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ塩化物）（１．５当量）、その後、ジイソプロピルエチルアミン（２．５当量）を加え、この溶液を室温にて３０分間撹拌した。反応混合物をジクロロメタン（８ｍＬ／ｍｍｏｌ）で希釈し、そして、１：１（ｖ：ｖ）  水／ブライン（１ｍｍｏｌの１６につき２０ｍｌ）で２回洗浄した。この溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を除去し、そして、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（アセトン／クロロホルムの勾配）により精製した。収率は、４０〜６０％の１８ａ〜ｅであった。
【０３６９】
１％  １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｇの１８につき５ｍＬ）中の１８（１当量；２．８ｍｍｏｌ）の溶液を、室温にて３０分間撹拌した。反応混合物をクロロホルム（１ｇの１８につき１５ｍＬ）で希釈し、そして、１：１（ｖ：ｖ）  水／ブライン（１ｇの１８につき１０ｍＬ）で洗浄した。水相をクロロホルム（１ｇの１８につき１０ｍＬ）で１回再抽出し、そして、合わせた有機溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させて、溶媒を除去した。残留物をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｇの１８につき１５ｍＬ）中に溶解し、ヘキサン（１ｇの１８につき１５ｍＬ）で６回洗浄して、ジベンゾフルベン副産物を除去／減少させ、そして、溶媒を除去して、オフホワイトの固体として生成物１７ａ〜ｅを生じた。収率は８５％であった。
【０３７０】
新たに蒸留したエチルホスホロジクロリデート（３当量）を、Ｎ２下０℃にて３分間かけて、乾燥ジクロロメタン（１ｇの１７につき４０ｍＬ）中の１７（１当量；２．３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（３当量）の溶液に滴下した。冷却浴を除き、そして、ＴＬＣにより完了が確認されるまで（３０分）、反応混合物を室温にて撹拌した。溶媒を除去した後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン勾配）により直接精製した。収率は５０〜６０％であった。このサブユニットは、タイプ（ａ）の無電荷結合の導入に有用である。この一般的な方法は、以下で、タイプ（ｂ３）の荷電結合の導入に適用した。
【０３７１】
Ｔサブユニットを持つ長鎖エーテルジアミンを用いた還元的アミノ化：
４−メトキシトリフェニルメチル塩化物（１５．４ｇ、５０ｍｍｏｌ）を、トルエン中に溶解し、そして、５０ｍｍｏｌのトリエチルアミンを含むジクロロメタン中の４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンアミン（１５０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に滴下した。反応の完了は、エタノール／濃アンモニア（４：１、ｖ／ｖ）で溶離するＴＬＣによって簡便に追跡し、そして、ニンヒドリンまたはＵＶによって可視化した。反応が終わると、溶液を水で洗浄して、遊離アミンを除いた。エバポレーションにより溶媒を除去し、そして、粗生成物を精製することなく次の工程において用いた。
【０３７２】
トリフルオロ酢酸エチル（１．５当量）を、０℃にて、ジクロロメタン（１ｇのアミンにつき１２ｍＬ）中のメトキシトリチル化アミン（１当量；２５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．５当量）の溶液に加え、冷却浴を除き、そして、反応混合物を室温にて４時間撹拌した。反応が完了すると（ＴＬＣ）、反応混合物をジクロロメタン（１ｇのアミンにつき１２ｍｌ）で希釈し、１：１（ｖ：ｖ）  水／ブライン（１ｇの１につき２０ｍＬ）で２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、粘性の淡黄色の油状物まで濃縮した。粗メトキシトリチル化アミド生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／クロロホルムの勾配）により精製した。収率は、６０〜７０％であった。
【０３７３】
ｐ−トルエンスルホン酸（１．５当量）を、メタノール／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン（１：１０：８９（ｖ：ｖ：ｖ）；１ｇの２につき５ｍｌ）中のメトキシトリチル化アミド（３当量；７．５ｍｍｏｌ）の溶液に加え、そして、黄橙色の溶液を室温にて３０分間撹拌し、この時点で反応が完了した（ＴＬＣ）。反応混合物を、トリエチルアミンでｐＨ７に中和し、そして、エバポレートした。粗生成物をメタノール（１ｇのメトキシトリチル化アミドにつき５ｍＬ）中に再溶解し、そして、必要に応じてｐＨをｐＨ７に調整し、再度エバポレートした。メタノールの添加とエバポレーションを１回以上繰り返し、そして、この粗アミンをさらに精製することなく使用した。
【０３７４】
メタノール（１ｇの粗アミンにつき５ｍＬ；１ｇの１６ｄにつき１２．５ｍＬ）中の粗アミンの溶液にアルデヒド１６ｄ（１当量；２．５ｍｍｏｌ）を加え、そして、酢酸を用いてｐＨをｐＨ８に調節した。反応混合物を室温にて１時間撹拌し、そして、ボラン−ピリジン（２当量）を加えた。必要に応じて開始時のｐＨを維持するためにｐＨを調節し、反応混合物を１時間、または、ＴＬＣにより反応の完了が観察されるまで撹拌した。反応混合物をエバポレートし、残留物をジクロロメタン（１ｇの１６ｄにつき１２．５ｍＬ）および９−フルオレニルメチルクロロホルメート（２当量）中に溶解し、そして、ジイソプロピルエチルアミン（３当量）を加え、この反応混合物を室温にて４５分間撹拌した。この反応混合物を、ジクロロメタンと１：１（ｖ：ｖ）水／ブライン（１ｇの１６ｄにつき各々１２．５ｍＬ）との間で分配させ、そして、水性の相を、ジクロロメタン（１ｇの１６ｄにつき１２．５ｍＬ）で再抽出した。合わせた有機物を飽和塩化ナトリウム水溶液（１ｇの１６ｄにつき２５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、そして、溶媒を除去した。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（メタノール／クロロホルムの勾配）により精製して、白色の泡状物として生成物２１ｄを生じた。収率は、４０％であった。
【０３７５】
脱保護：
２０％  トリエチルアミン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍｍｏｌの２１ｄにつき１５ｍＬ）中の粗２１ｄ（１当量；０．９ｍｍｏｌ）の溶液を、５０℃にて３０分間加熱し、この時点で、ＴＬＣでは２１ｄが残存していることは確認されなかった。冷やした反応混合物を、ヘキサン（１ｍｍｏｌの２１ｄにつき３０ｍＬ）で４回抽出し、ジベンゾフルベン副産物を除去し、そして、溶媒を除去した。残留物をイソプロパノール（１ｍｍｏｌの２１ｄにつき１５ｍＬ）中に溶解し、泡状物になるまでエバポレートし、次いで、最小容量のジクロロメタンに溶解し、ヘキサン（１ｇの２１ｄにつき１５０ｍＬ）から沈殿させて、オフホワイトの固体として生成物２０ｄを生じた。収率は９０％であった。
【０３７６】
活性化：
２０ｄ（１当量；０．７８ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（３当量）の溶液を、窒素下で乾燥ジクロロメタン（１ｇの２０ｄにつき２０ｍＬ）中に調製し、そして、Ｎ２下０℃にて、乾燥ジクロロメタン（１ｇの２０ｄにつき２０ｍＬ）中のエチルホスホロジクロリデート（３当量）の溶液に、約３分間かけて滴下した。冷却浴を除き、そして、ＴＬＣにより反応の完了が確認されるまで（２０分）、反応混合物を室温にて撹拌した。この溶液を約半分の容量まで濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィー（アセトン／クロロホルム勾配）により直接精製した。収率は、４０〜５０％の２２ｄであった。
【０３７７】
Ｃサブユニットを持つ長鎖エーテルジアミンを用いた還元的アミノ化：
サブユニット１ｂを、代替的な方法により酸化した。ピリジン（９．１５当量）を加え、次いで、トリフルオロ酢酸（４．５８当量）を加えることによって形成した溶液に、サブユニット（５ｇ、１当量）を加えた。溶液が透明になると、ジイソプロピルカルボジイミド（７．２３当量）をゆっくりと加えた。２時間後、この溶液を８００ｍＬの飽和塩化ナトリウム水溶液に加えた。２０分間撹拌した後、この混合物を濾過した。生成物をアセトン中に溶解させ、そして、脱イオン水中に沈殿させた。この濾過した生成物を減圧下で乾燥させた。収率は７０〜８０％であった。酸化したサブユニットは、このままで使用され得るが、酢酸エチル／ジクロロメタン混合物を用いたシリカ上のクロマトグラフィーにより精製してもよい。
【０３７８】
ジアミン４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンアミン（３３ｇ、１当量）を、１５０ｍＬのジエチルエーテル中に溶解し、０℃まで冷却し、そして、この溶液を、５０ｍＬのエーテル中のトリフルオロ酢酸エチル（３２ｇ、１．５当量）の溶液でゆっくり処理した。ＴＬＣは、ごく微量のジアミンの残留と共に、反応の完了を示す。
【０３７９】
この溶液の一部（４５ｍＬ、アルデヒドに対して３当量のアミン）を、２０ｍＬのメタノール中の３．４２ｇの１６ｂの撹拌溶液に加えた。５分後に、ｐ−ニトロフェノール（２．５２ｇ）を加え、そして、２０分後に、シアノホウ化水素ナトリウム（３．２ｇ、８当量）を加えた。室温にて１６０分後、さらなるシアノホウ化水素ナトリウム（１．２ｇ）およびニトロフェノール（０．８ｇ）を加えた。この溶液を、８００ｍＬの室温の水に注ぎ、固体と粘性の油状物との懸濁物を生じた。デカンテーションにより水を除き、そして、生成物を真空にて乾燥させた。全生成物を酢酸エチル中に溶解し、そして、同じ溶媒中に充填した２５０ｍＬのシリカゲルにアプライした。カラムを、２％トリエチルアミン／酢酸エチルで洗浄し、そして、生成物を、６：１〜１０：１の酢酸エチル：エタノール混合物中の１％トリエチルアミン溶液で溶出した。生成物を含む画分をエバポレートして、真空にて乾燥させ、１．９５ｇ、３７％のアミン２０ｂを生じた。
【０３８０】
長鎖エーテル側鎖アミンを持つ活性化された５’−アミノＣサブユニットを、Ｔ化合物について上述したようにして調製した。
【０３８１】
実施例６：アルキル化による、タイプ（ｂ３）のプロカチオン性結合を持つモルホリノサブユニット（図２Ｆを参照のこと）：
ヘキサメチレンジアミン（１００ｇ）をメタノール（１Ｌ）中に溶解し、そして、１５０ｍＬのメタノール中のトリフルオロ酢酸エチル（１０３ｍＬ）の溶液を滴下して処理した。ごくわずかにこの溶液が暖かくなった。この反応を、加えた後、室温にて３０分間撹拌した。クロロホルム／メタノール／濃アンモニア（８：３：１）を用いたＴＬＣは、アミンの存在を示す。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、そして、残留物をトルエン／酢酸エチル（１：３、１Ｌ）中に溶解し、次いで、１０％飽和塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄して、過剰のジアミンを完全に除去した。エバポレーションにより、１１７ｇの粗製アミンが得られ、これを、以下で形成するトシル化サブユニットと共に直接使用した。
【０３８２】
ジクロロメタン（２００ｍＬ）中に溶解したサブユニット１ｂ（２０ｇ）を、Ｎ−メチルイミダゾール（１１ｍＬ）で処理し、そして、この混合物を氷浴中で冷却した。ｐ−トルエンスルホニル塩化物（８ｇ）を１段階で加え、この溶液を１０分間撹拌し、そして、フラスコを４℃に１６時間置いた。ＴＬＣ（ジクロロメタン中２％メタノール）は、反応の完了を示す。３００ｍＬのジクロロメタンを加えて反応をワークアップし、３００ｍＬの１０％飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄し、そして、エバポレートして、泡状物として２３ｂを生じた。
【０３８３】
トシレート２３ｂ（１７ｇ）および一保護アミン（４６．５ｇ、いくらかのビスアクリル化ジアミンを含む）を、トリエチルアミン（１５ｍＬ）と共にアセトニトリル（２００ｍＬ）中で混合した。４５℃にて１６時間置いた後、混合物をエバポレートし、そして、残留物を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）中に再懸濁した。混合物は、４５℃において均質となった。溶液を５日間加熱し、この時点で、周囲温度まで冷却させ、そして、１Ｌの１０％飽和塩化ナトリウム水溶液および８００ｍＬの酢酸エチルと混合した。有機層を１Ｌの２０％飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムと共に撹拌し、濾過し、そして、エバポレートして４８ｇのアルキル化生成物を生じた。この生成物は、ベンゾイル化複素環式塩基と脱ベンゾイル化複素環式塩基の混合物を含む。
【０３８４】
上記粗生成物の一部（９ｇ）を、ジクロロメタン中に再懸濁し、０℃まで冷却し、そして、４０ｍＬのジクロロメタン中のＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（ＦＭＯＣ−ＯＳｕ）（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ番号８２９１１−６９−１）の溶液で処理した。反応は、２０分後に完了した。この溶液に、３．３ｍＬのＮ−メチルイミダゾールを加え、次いで、１．９ｍＬの塩化ベンゾイルを加えて、脱ベンゾイル化種を再度保護した。０℃にて１０分以上置いた後、反応物を室温まで温めた。この反応物を１５０ｍＬのジクロロメタンで希釈し、２５０ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、２５０ｍＬの１０％飽和塩化ナトリウム水溶液で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、エバポレートさせた。残留物を、ジクロロメタン（３Ｌ）を用いる５００ｍＬのシリカ上に充填し、そして、ジクロロメタン中の酢酸エチルの混合物（５％、１０％、１５％を各１Ｌ、２０％を２Ｌ、４０％を２Ｌ）で溶出した。最後の溶離液は、２．９ｇの純粋なベンゾイル化ＦＭＯＣ保護５’−アミノサブユニット２４ｂをもたらした。カラムを２Ｌの５％メタノール／ジクロロメタンで洗浄すると、５．４ｇのベンゾイル化ＦＭＯＣ保護５’−アミノサブユニットが回収できた。
【０３８５】
ＤＭＦ（１４０ｍＬ）中のピペリジン（２８ｍＬ）での処理により、上記生成物（７．１ｇ）からＦＭＯＣ基を除去した。室温にて５分置いた後、反応物を、ジクロロメタン（４００ｍＬ）と水（３０ｍＬ）との間で分配させた。有機層を、４００ｍＬの１０％飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄した。エバポレーションにより、８．８ｇの粗遊離アミンが得られ、これを、ジクロロメタン（１Ｌ）、３０％酢酸エチル／ジクロロメタン（２Ｌ）、および５％メタノール／ジクロロメタン（３Ｌ）を用いるシリカ（３６０ｍＬ）上のクロマトグラフィーにより精製し、２．５ｇのアミン生成物を得た。
【０３８６】
１ｇのこのアミンを、０℃にてジクロロメタン（１０ｍＬ）中に溶解させ、そして、Ｎ−エチルモルホリン（５００ｍＬ）で、次いで、エチルホスホロジクロリデート（２３０ｍＬ）で連続して処理した。トリエチルアミン（２２７ｍＬ）を加えると、この混合物が均質となった。反応は、４時間後に完了した。通常の水性ワークアップの後、生成物を１０〜５０％の酢酸エチル／ヘプタン混合物を用いるシリカクロマトグラフィー（６０ｍＬ）により精製して、８００ｍｇの活性化されたサブユニット２５ｂを生じた。
【０３８７】
同じプロセスを用いて、５’−位に保護されたヘキサメチレンジアミン側鎖を持つ活性化されたＴサブユニットを作製した。サブユニット１ｄ（５０ｇ）を、ジクロロメタン（５００ｍＬ）およびＮ−メチルイミダゾール（１６．５ｍＬ）中のｐ−トルエンスルホニル塩化物（２３．７ｇ）と反応させた。０℃にて１時間、そして、室温にて４時間置いた後、反応物を、４００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、そして、１Ｌの１０％飽和塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥させ、エバポレーションを行った後、残留物の重量は５７ｇであった。残留物（１５ｇ）および４０ｇの粗モノ（トリフルオロアセチル化）ヘキサメチレンジアミンを、１００ｍＬのアセトニトリル中で還流にて反応させた。エバポレーションの後、残留物を２％メタノール／ジクロロメタン中に溶解させ、シリカにアプライした。カラムを、ジクロロメタン、５０％  酢酸エチル／ジクロロメタン、酢酸エチル、８０％  酢酸エチル／ジクロロメタンで、そして最後に、５％  メタノール／ジクロロメタンで溶離させて、＞９８％の純度の生成物を溶出した。１ｇのこの生成物を上述のように活性化および精製して、３００ｍｇ（２５％）の活性化されたサブユニット２５ｄを生じた。
【０３８８】
同様の様式で、１ａ〜ｅを、３，３’−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミン２６と反応させ、２７ａ〜ｅのような２つのカチオン性部分を持つ側鎖を得た。
【０３８９】
実施例７：プロカチオン性スルファミド結合を持つモルホリノサブユニット（図２Ｇを参照のこと）
ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ／ｇ）中の５’−メチルアミノサブユニット１７ａ〜ｅ（１当量）を、三酸化硫黄／ピリジン（４当量）、ピリジン（８当量）の後、トリエチルアミン（６当量）で処理した。１６時間後、反応物を、過剰の飽和塩化ナトリウム水溶液に加え、そして、乾燥させた沈殿物を、５％メタノール／クロロホルムを用い、２％のトリエチルアミンを含むシリカ上のクロマトグラフィーに供した。こうして単離したスルファミン酸２８ａ〜ｅのトリエチルアンモニウム塩を、ジクロロメタン（２０ｍＬ／ｇ）中に溶解させた。ピリジン（３．２当量）を加え、そして、この混合物を、窒素下にてドライアイスアセトン浴中で冷却した。この溶液を、トルエン溶液中の１．１当量のホスゲンを滴下して処理した。２５分後、２０分かけて溶液を室温まで温めた。この溶液を油状物までロータリーエバポレーターにかけ、この油状物をクロロホルム中に溶解させて、そして、４０％酢酸エチルおよびヘキサンを用いるシリカ上で直接クロマトグラフィーに供した。５０％の収率で得た生成物２９ａ〜ｅを、タイプ（ａ）のスルファミド結合の導入に使用した。ヘキサメチレンジアミン（２４ａ〜ｅ）からの５’−アミノサブユニットを、同様の様式で脱保護し、硫化し、そして、活性化して、３０ａ〜ｅを得た。
【０３９０】
実施例８：ジスルフィドアンカーの調製（図２Ｈを参照のこと）
左右対称なジスルフィド３２の調製：１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（１２．４０２ｇ；２．２当量）を、ジクロロメタン（５．２５ｍＬ／ｇ）中に懸濁し、そして、氷浴上で冷却させた。ヒドロキシエチルジスルフィド３１（５．３６ｇ；１当量）を、ジクロロメタン（１０ｍＬ／ｇ）およびテトラヒドロフラン（１ｍＬ／ｇ）中に溶解した。このジオール溶液を、混合物の温度が反応の間中４℃を下回ったままにとなるよう、ＣＤＩにゆっくりと加えた。反応が完了すると（一度添加が完了すると）、脱イオン水（９３．８μＬ、０．１５当量）を加えて反応をクエンチした。また別に、１１（３２．５９ｇ；２．１当量）をトルエン（１ｇの１１につき８ｍＬ）、ジクロロメタン（１ｇの１１につき２ｍＬ）およびメタノール（１ｇの１１につき２ｍＬ）中に溶解させた。Ｋ２ＣＯ３（２２．０９ｇ；４．６当量）を、脱イオン水（１０ｍＬ／ｇ）に溶解させた。このＫ２ＣＯ３溶液を１１の溶液に加えた；この混合物を撹拌し、次いで、２層に分離させた。曇った有機層を蒸留して、９０ｇを除いた；得られた水滴を分離し、そして、アセトン（１ｇの１１につき８ｍＬ）を有機層に加えた。ＣＤＩで活性化したジスルフィドジオールの溶液を、遊離塩基１２の溶液に加え、そして、２２５ｍＬまで濃縮した。アセトン（１ｇの１１につき１０ｍＬ）を加え、そして、この混合物を２２５ｍＬまで濃縮した。混合物を加熱して還流させると、固体が、溶液から結晶化し始めた。完了すると、反応混合物を冷却し、そして、固体（３２）を濾過により単離した。収量：２７．９２ｇ；９３．１％（重量ベースのアッセイに基づく）。
【０３９１】
ジスルフィドアルコール３３の調製：３２（３６．００ｇ；３２．１ｍｍｏｌ；１当量）を、アセトン（１ｇの３２につき２．８ｍＬ）中に懸濁させた。ヒドロキシエチルジスルフィド（７８．５１ｍＬ；２０当量）を加え、その後、アセトン（１ｇの３２につき１．７ｍＬ）を加えた。５％のＮａＯＨ／メタノール（２．８５ｍＬ；０．１当量）を加えた；混合物のｐＨは、ｐＨ紙によると１０であった。トリフェニルホスフィン（８．４２ｇ；１当量）を加え、その後、アセトン（１ｇの３２につき１．１ｍＬ）を加えた。全ての固体は溶液となり、次いで、生成物が結晶化して析出し始めた。１６時間後、反応混合物を酢酸（２．４ｇ；０．２当量）で中和した。粗生成物を濾過により単離した。粗製の固体３３を、還流下で、２回アセトン（５ｍＬ／ｇ）で再度スラリーにした。
【０３９２】
濾過した後、粗生成物をジクロロメタン（１ｇの３２につき７．２５ｍＬ）中に再懸濁した。この混合物を、透明な溶液が形成されるまで（３５℃）加熱した。この溶液を、等容量の脱イオン水で５回抽出し、そして、最終的な有機層を１５５ｍＬまで濃縮した。ジクロロメタンを加え（１ｇの３２につき４．３ｍＬ）、そして、この溶液を再度１５５ｍＬまで濃縮した。ＣＤＩ（９．１７ｇ；１．１当量）を加え、そして、この混合物を室温にて撹拌した。反応が完了すると（約２０分）、この反応混合物を等容量の脱イオン水で２回洗浄し、次いで、エチルベンゼン（１ｇの３２につき２．１ｍＬ）を加えた。この溶液を６５．２ｇまで濃縮して、溶液中のジクロロメタンを０．１７％まで減らし、そして、氷浴上で撹拌して、生成物を結晶化させた。生成物３４を濾過により単離した。収率：４４％。
【０３９３】
実施例９：トリエチレングリコールテイル（図２Ｉを参照のこと）
トリチルピペラジンフェニルカルバメート３５の調製：ジクロロメタン（１ｇの１１につき６ｍＬ）中の化合物１１の冷懸濁液に、水（１ｇの炭酸カルシウムにつき４ｍＬ）中の炭酸カルシウム（３．２当量）の溶液を加えた。この２相の混合物に、ジクロロメタン（１ｇのフェニルクロロホルメートにつき２ｇ）中のフェニルクロロホルメート（１．０３当量）の溶液をゆっくりと加えた。この反応混合物を２０℃まで温めた。反応が完了すると（１〜２時間）、層を分離させた。有機層を水で洗浄し、無水炭酸カリウムで乾燥させた。生成物３５を、アセトニトリルからの結晶化により単離した。収率は８０％であった。
【０３９４】
カルバメートアルコール３６の調製：水素化ナトリウム（１．２当量）を、１−メチル−２−ピロリジノン（１ｇの水素化ナトリウムにつき３２ｍＬ）中に懸濁させた。この懸濁液に、トリエチレングリコール（１０．０当量）および化合物３５（１．０当量）を加えた。得られたスラリーを、９５℃まで加熱した。反応が完了すると（１〜２時間）、この混合物を２０℃まで冷却した。この混合物に、３０％ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ｖ：ｖ）および水を加えた。生成物を含む有機層をＮａＯＨ水溶液、コハク酸水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で連続して洗浄した。生成物３６を、ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ヘプタンからの結晶化により単離した。収率は９０％であった。
【０３９５】
テイル酸３７の調製：テトラヒドロフラン（１ｇの３６につき７ｍＬ）中の化合物３６の溶液に、無水コハク酸（２．０当量）およびＤＭＡＰ（０．５当量）を加えた。この混合物を５０℃まで加熱した。反応が完了すると（５時間）、この混合物を２０℃まで冷却し、そして、ＮａＨＣＯ３水溶液を用いてｐＨ８．５に調節した。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを加え、そして、生成物を、水層中に抽出した。ジクロロメタンを加え、そして、混合物を、クエン酸水溶液を用いてｐＨ３に調節した。生成物を含む有機層を、ｐＨ３のクエン酸緩衝液と飽和演歌ナトリウム水溶液の混合物で洗浄した。この３７のジクロロメタン溶液を、単離することなく、化合物３８の調製に用いた。
【０３９６】
３８の調製：化合物３７の溶液に、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（１．０２当量）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．３４当量）、次いで、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１．１当量）を加えた。この混合物を５５℃まで加熱した。反応が完了すると（４〜５時間）、混合物を２０℃まで冷却し、そして、１：１の０．２Ｍクエン酸／ブラインおよびブラインで連続して洗浄した。ジクロロメタン溶液を、アセトンへ、次いで、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドへの溶媒交換に供し、そして、生成物を、アセトン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから飽和塩化ナトリウム水溶液中への沈殿によって単離した。粗生成物を、水中で数回再度スラリーにして、残留したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび塩を除いた。化合物３６からの収率は７０％の３８であった。活性化された「テイル」のジスルフィドアンカー−樹脂上への導入を、固相合成中のサブユニットの組み込みに使用した手順により、ＮＭＰ中で行った。
【０３９７】
実施例１０：モルホリノオリゴマーの合成のための固体支持体の調製
実施例１０ａ：アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の調製
この手順を、粗多孔度の（４０〜６０μｍ）ガラスフリットと、オーバーヘッド撹拌子と、３方向のＴｅｆｌｏｎ（登録商標）コックとを備える、シラン化した被覆物を備えるペプチド容器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ，ＮＪ，ＵＳＡによる注文生産）において行い、Ｎ２をフリットを通して泡となって表面に浮かばせるか、または、減圧下で抽出することを可能にした。反応容器における温度の制御は、循環水浴によって達成した。
【０３９８】
以下の手順における樹脂の処理／洗浄の工程は、以下の２つの基本操作から構成される：樹脂の流動化および溶媒／溶液の抽出。樹脂の流動化について、コックを、Ｎ２がフリットを通して上方に流れることを可能にするように位置決めし、そして、リアクタに特定の樹脂の処理／洗浄を加えて、樹脂を透過し、そして、樹脂を完全に湿らせることを可能にした。次いで、混合を開始し、樹脂のスラリーを、特定の時間にわたり混合した。溶媒／溶液の抽出については、混合およびＮ２の流れを停止し、そして、減圧ポンプを開始し、次いで、コックを、樹脂の処理／洗浄物を廃棄物へと排出することを可能にするように位置決めした。全ての樹脂の処理／洗浄の容量は、他に特定されない限り、樹脂１ｇにつき１５ｍＬであった。
【０３９９】
シラン化した被覆物を備えるペプチド容器中の、アミノメチルポリスチレン樹脂（１００〜２００メッシュ；約１．０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｎ２置換；７５ｇ、１当量、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ，ＵＫ，ｐａｒｔ  ＃１４６４−Ｘ７９９）に、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ；１ｇの樹脂につき２０ｍｌ）を加え、そして、この樹脂を、１〜２時間混合しながら、浸潤させた。浸潤溶媒の排出の後、樹脂を、ジクロロメタン（１〜２分を２回）、２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミン（３〜４分を２回）およびジクロロメタン（１〜２分を２回）で洗浄した。最後の洗浄物を排出した後、樹脂を、１−メチル−２−ピロリジノン（０．１７Ｍ；１ｇの樹脂につき１５ｍＬ、約２．５当量）中のジスルフィドアンカー３４の溶液で流動化し、そして、この樹脂／試薬混合物を４５℃にて６０時間加熱した。反応が完了すると、加熱をやめ、そして、アンカー溶液を排出して、樹脂を、１−メチル−２−ピロリジノン（３〜４分を４回）およびジクロロメタン（１〜２分を６回）で洗浄した。樹脂を、ジクロロメタン中の１０％（ｖ／ｖ）二炭酸ジエチル（１６ｍＬ／ｇ；５〜６分を２回）の溶液で処理し、次いで、ジクロロメタン（１〜２分を６回）で洗浄した。樹脂３９をＮ２流下で１〜３時間乾燥させ、次いで、減圧下で一定の重さまで乾燥させた（±２％）。収率：元々の樹脂の重量の１１０〜１５０％。
【０４００】
実施例１０ｂ：アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の負荷の決定
樹脂の負荷（潜在的に利用可能な反応性部位の数）は、樹脂１ｇあたりのトリフェニルメチル（トリチル）基の数についての分光アッセイにより決定される。
【０４０１】
既知重量の乾燥樹脂（２５±３ｍｇ）を、シラン化した２５ｍＬ容量測定用フラスコに移し、そして、約５ｍＬのジクロロメタン中の２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を加える。この内容物をおだやかにかき混ぜて混合し、次いで、３０分間静置させた。ジクロロメタン中の２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を追加して、容量を２５ｍＬにし、そして、内容物をおおまかに混合する。容積移送式ピペット（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｐｉｐｅｔｔｅ）を用いて、トリチルを含む溶液のアリコート（５００μＬ）を、１０ｍＬの容量測定用フラスコに移し、そして、メタンスルホン酸を用いて容量を１０ｍＬにする。
【０４０２】
最終溶液におけるトリチルカチオン含量を、４３１．７ｎｍにおけるＵＶ吸光度により測定し、そして、適切な容量、希釈、消光係数（ε：４１μｍｏｌ−１ｃｍ−１）および樹脂の重量を用いて、樹脂の負荷を、樹脂１ｇあたりのトリチル基（μｍｏｌ／ｇ）で算出する。このアッセイは、三連で行い、そして、平均の負荷を算出する。
【０４０３】
この実施例における樹脂の負荷の手順は、約５００μｍｏｌ／ｇの負荷を持つ樹脂を提供する。ジスルフィドアンカーの組み込みの工程を、室温にて２４時間行った場合、３００〜４００μｍｏｌ／ｇの負荷が得られた。
【０４０４】
実施例１０ｃ：テイルの負荷
アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の調製と同じ設定および容量を用いて、テイルを分子に導入し得る。カップリングの工程については、ジスルフィドアンカー溶液の代わりに、４−エチルモルホリン（ＮＥＭ、０．４Ｍ）を含むＮＭＰ中の３８（０．２Ｍ）の溶液を用いた。４５℃にて２時間置いた後、樹脂３９を２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミンで２回、そして、ＤＣＭで１回洗浄した。この樹脂に、無水安息香酸（０．４Ｍ）およびＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液を加えた。２５分後、リアクタの被覆物を室温まで冷却し、そして、樹脂を、２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミンで２回、そして、ＤＣＭで８回洗浄した。樹脂４０をフィルターに通し、高減圧下で乾燥させた。樹脂４０の負荷は、テイルの負荷において使用した、元々のアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂３９の負荷であると規定する。
【０４０５】
実施例１１：自動合成装置におけるモルホリノオリゴマーの調製
実施例１１ａ：固相合成
モルホリノオリゴマーを、２ｍＬのＧｉｌｓｏｎポリプロピレン反応カラム（Ｐａｒｔ  ＃  ３９８０２７０）中、Ｇｉｌｓｏｎ  ＡＭＳ−４２２自動ペプチド合成装置にて調製した。水を流すためのチャネルを備えるアルミニウムブロックを、合成装置に据えたカラムの周りに配置した。ＡＭＳ−４２２は、あるいは、試薬／洗浄溶液を加え、特定の時間にわたり保持し、そして、真空を用いてカラムから排出させる。
【０４０６】
長さ約２５サブユニットまでの範囲のオリゴマーについて、樹脂１ｇあたり５００μｍｏｌ付近の負荷を持つアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。より大きなオリゴマーについては、樹脂１ｇあたり３００〜４００μｍｏｌの負荷を持つアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。５’−テイルを持つ分子が所望される場合、テイルを負荷された樹脂は、同じ負荷ガイドラインを用いて選択される。
【０４０７】
以下の試薬溶液を調製した：
脱トリチル化溶液：４：１  ジクロロメタン／アセトニトリル中１０％のシアノ酢酸（ｗ／ｖ）；中和溶液：３：１  ジクロロメタン／イソプロパノール中５％のジイソプロピルエチルアミン；カップリング溶液：１，３−ジメチルイミダゾリジノン中の、所望の塩基および結合のタイプの０．１８Ｍ（または、２０サブユニットより長く増やすオリゴマーについては０．２４Ｍ）の活性化したモルホリノサブユニットおよび０．４ＭのＮ−エチルモルホリン。異なる試薬溶液の洗浄を分離する移行用の洗浄として、ジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いた。
【０４０８】
ブロックを４２℃に設定した合成装置において、３０ｍｇのアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂（またはテイル樹脂）を含む各カラムに、２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンを加え、そして、室温にて３０分間静置させた。２ｍＬのジクロロメタンで２回洗浄した後、以下の合成サイクルを用いた：
【０４０９】
【表２０】
2010505741.tif 000032
各カラムが、適切なカップリング溶液（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｉ）を適切な順序で受けるように、個々のオリゴマーの順序を、合成装置にプログラムした。カラム内のオリゴマーがその最後のサブユニットの組み込みを完了すると、カラムをブロックから外し、そして、０．８９Ｍの４−エチルモルホリンを含む４−メトキシトリフェニルメチル塩化物（ＤＭＩ中０．３２Ｍ）から構成されるカップリング溶液を用いて、手動で最後のサイクルを行った。
【０４１０】
実施例１１ｂ：樹脂からの切断と、塩基および骨格保護基の除去
メトキシトリチル化の後、樹脂を、２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンで８回洗浄した。１−メチル−２−ピロリジノン中の０．１Ｍの１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および０．７３Ｍのトリエチルアミンから構成される１ｍＬの切断溶液を加え、カラムに蓋をし、そして、室温にて３０分間静置させた。この後、この溶液を、１２ｍＬのＷｈｅａｔｏｎバイアル中に廃液した。大いに縮んだ樹脂を、３００μＬの切断溶液で２回洗浄した。この溶液に、４．０ｍＬの濃アンモニア水溶液（−２０℃にて保存）を加え、（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）を裏打ちしたスクリューキャップを用いて）バイアルにしっかりと蓋をし、そして、混合物をかき混ぜて、溶液を混合した。バイアルを、４５℃のオーブン中に１６〜２４時間置いて、塩基および骨格保護基の切断を達成した。
【０４１１】
実施例１１ｃ：最初のオリゴマーの単離
バイアル中の加安分解溶液をオーブンから取り出し、そして、室温まで冷却させた。この溶液を、２０ｍＬの０．２８％アンモニア水溶液で希釈し、そして、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ＨＱ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を含む２．５×１０ｃｍのカラムに通した。塩勾配（Ａ：０．２８％アンモニア＋Ｂ：０．２８％アンモニア中１Ｍの塩化ナトリウム；６０分で０〜１００％のＢ）を用いて、メトキシトリチルを含むピークを溶出した。合わせた画分をプールし、そしてさらに、所望される生成物に依存して処理した。
【０４１２】
実施例１１ｄ：モルホリノオリゴマーの脱メトキシトリチル化：メトキシトリチルを持たないオリゴマー
Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ精製からのプールした画分を、１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４で処理して、ｐＨを２．５まで下げた。最初の混合の後に、サンプルを、室温に４分間静置し、この時点で、２．８％アンモニア／水を用いてこれらをｐＨ１０〜１１に中和する。この生成物を、固相抽出（ＳＰＥ）により精製した。
【０４１３】
Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ−３００Ｍ（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）（３ｍＬ）を２０ｍＬのフリット状カラム（ＢｉｏＲａｄ  Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃクロマトグラフィーカラム（７３２−１０１１））中に充填し、そして、樹脂を、以下のもの３ｍＬでリンスした：０．２８％  ＮＨ４ＯＨ／８０％  アセトニトリル；０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；５０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４／８０％  アセトニトリル；水；０．５  ＮａＯＨ／２０％  エタノール；水；０．２８％  ＮＨ４ＯＨ。
【０４１４】
脱メトキシトリチル化からの溶液を、カラム上にロードし、そして、樹脂を、３〜６ｍＬの０．２８％アンモニア水溶液で３回リンスした。Ｗｈｅａｔｏｎバイアル（１２ｍＬ）をカラムの下に置き、そして、０．２８％アンモニア水溶液中４５％のアセトニトリル２ｍＬで２回洗浄することにより、生成物を溶出させた。この溶液をドライアイス中で凍結し、そして、バイアルを、凍結乾燥装置中に置いて、綿毛のような白色の粉末を生じた。これらのサンプルを水中に溶解し、シリンジを用いて０．２２ミクロンフィルター（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ２５ｍｍシリンジフィルター＋０．２ミクロンのＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎメンブラン）を通してフィルター処理し、そして、ＵＶ分光光度計にて光学密度（ＯＤ）を、測定して、存在するオリゴマーのＯＤ単位を決定し、同様に、解析のためにサンプルを分配した。次いで、この溶液を、凍結乾燥のために、Ｗｈｅａｔｏｎバイアルに戻した。
【０４１５】
実施例１１ｅ：モルホリノオリゴマーの解析：
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて、精製物における画分の組成を決定し、同様に、オリゴマーを識別する証拠（分子量）を提供した。希釈の後、サンプルを、マトリクスとして、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ））、３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）またはα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ）の溶液を用いて泳動させた。
【０４１６】
２５ｍＭ（ｐＨ５）酢酸ナトリウム  ２５％アセトニトリル（緩衝液Ａ）および２５ｍＭ（ｐＨ５）酢酸ナトリウム  ２５％アセトニトリル  １．５Ｍ塩化カリウム（緩衝液Ｂ）（１５分で１０〜１００％のＢの勾配）、または、２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  ２５％アセトニトリル（ｐＨ＝３．５）（緩衝液  Ａ）および２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  ２５％アセトニトリル（ｐＨ３．５）および１．５Ｍ塩化カリウム（緩衝液Ｂ）（１５分で０〜３５％のＢの勾配）を用いて、Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ  ＳＣＸ−１０，４ｘ２５０ｍｍ絡む（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用い、カチオン交換（ＳＣＸ）ＨＰＬＣを行った。前者の系は、ペプチドが結合していない正に荷電したオリゴマーに用い、一方で、後者は、ペプチド結合物について用いた。
【０４１７】
実施例１１ｆ：カチオン交換クロマトグラフィーによるモルホリノオリゴマーの精製
サンプルを、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（緩衝液Ａ）に溶解して、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０カチオン交換樹脂のカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、そして、２０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび４０％アセトニトリル（ｐＨ４．５）中０．５Ｍの塩化ナトリウムの勾配（緩衝液Ｂ）を用いて溶出させた。生成物を含むプールした画分を、濃アンモニア水溶液で中和し、そして、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＳＰＥカラムにアプライした。生成物を、上述のようにして、溶出、凍結および凍結乾燥した。
【０４１８】
以下のオリゴマーが、この方法の例である：
５’−（ＥＧ３）−Ｇ＋ＴＧＣ＋ＴＣＡ＋ＴＧＧ＋ＴＧＣＡＣＧＧ＋ＴＣ−３’−（Ｈ）、［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値＝６８６０．９ダルトン、［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝６８６１．７ダルトン、ＨＣＶに有用
５’−（ＥＧ３）−ＧＣＣ＋ＡＴＧＧＴ＋ＴＴＴ＋ＴＴＣ＋ＴＣ＋ＡＧＧ−３’−（Ｈ）、［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値＝６８２５．９ダルトン、［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝６８２７．１ダルトン、エボラに有用
５’−（ＥＧ３）−＋ＴＧＧＧＴ＋ＡＴＧ＋ＴＴＧＴ＋ＡＧＣＣ＋ＡＴ−３’−（Ｈ）、［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値＝７２４５．２ダルトン、［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝７２４６．８ダルトン、エボラに有用
５’−（ＥＧ３）−ＣＣ＋ＴＧＣＣＣ＋ＴＴＴＧＴ＋ＴＣＴ＋ＡＧＴ＋ＴＧ−３’−（Ｈ）、［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値＝７０９２．２ダルトン、［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝７０９３．８ダルトン、エボラに有用
実施例１１ｇ：３’−メトキシトリチルおよび３’−トリチルモルホリノオリゴマー
Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ精製したオリゴマーを、固相抽出カラムに直接アプライし、そして、３’−メトキシトリチル化オリゴマーを、脱メトキシトリチル化種と同様の様式で単離および精製した。
【０４１９】
実施例１２：大規模オリゴマー合成のためのＮ２，Ｏ６−保護モルホリノＧ（ＤＰＧ）の合成
４１の調製：ジクロロメタン（１ｇの１につき８ｍＬ）中の１ｃおよびイミダゾール（１．３当量）の冷溶液に、ジクロロメタン中のｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（１．２当量）の溶液を加えた。添加した後、溶液を２０℃まで温めた。反応が完了すると（１〜３時間）、この溶液を、１Ｍクエン酸緩衝液（ＮａＯＨでｐＨ３に調節）および水で連続的に洗浄した。得られた有機溶液を蒸留して、水を共沸させて除き、そして、これを次の工程に直接使用した。
【０４２０】
４２の調製：ジクロロメタン中の４１の０℃の冷溶液に、トリエチルアミン（１．２当量）、４−ジメチルアミノピリジン（０．１当量）、およびトリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（１．１当量）を連続的に加えた。この溶液を２０℃まで温めた。反応が完了すると（３〜９時間）、この溶液を、１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４および水で連続的に洗浄した。得られた有機溶液を蒸留して、水を共沸させて除き、これを、化合物４４の調製に直接使用した。
【０４２１】
４３の調製：トルエン中の４−ヒドロキシベンズアルデヒド（１．０当量）およびＮ−メチルイミダゾール（０．２当量）の溶液に、水中のＫＨＣＯ３（２．０当量）溶液を加えた。得られた２相の混合物に、トリメチルアセチルクロリド（１．４当量）を加えた。反応が完了すると（１〜２時間）、メタノール（１．０当量）を加え、そして、この混合物を１時間撹拌した。層を分離させた後、有機層を、１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４および水で連続的に洗浄した。得られた有機溶液を蒸留して、水を共沸させて除き、ＴＨＦで希釈した。この溶液に、５％  Ｐｄ／Ｃ触媒（０．００４当量、Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍａｔｔｈｅｙ，Ｗｅｓｔ  Ｄｅｐｔｆｏｒｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）を加え、そして、この混合物を、５〜３０ｐｓｉのＨ２下で、水素化した。反応が完了すると（４〜８時間）、この混合物を、Ｃｅｌｉｔｅパッドを通してフィルター処理し、そして、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液で洗浄した。生成物を、トルエン／ヘプタンから結晶化させた。収率は、８０％であった。
【０４２２】
４４の調製：ジクロロメタン中の３の冷溶液に、Ｎ−メチルピロリジン（２．０当量）を加えた。１０分後、３ａ（１．２当量）を加え、その後、ＤＢＵ（１．２当量）を加えた。試薬を添加した後、溶液を２０℃まで温めた。反応が完了すると（１〜９時間）、この溶液を、１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４および水で連続的に洗浄した。得られた有機溶液を蒸留して、水を共沸させて除き、これを次の工程に直接使用した。
【０４２３】
４５の調製：ジクロロメタン中の４４の溶液に、三フッ化水素トリエチルアミン（２．０当量）を加えた。反応が完了すると（４〜２０時間）、この溶液を、二炭酸ナトリウム溶液、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液および水で連続的に洗浄した。得られた溶液を蒸留してジクロロメタンを除き、そして、生成物を、ＴＨＦ／水から結晶化させた。収率は、１ｃからの７０％であった。
【０４２４】
４６の調製：化合物４５を、ジクロロメタン（１ｇの４５につき６ｍＬ）中に溶解し、そして、＜５℃まで冷却させた。この溶液に、２，６−ルチジン（１．６当量）、Ｎ−メチルイミダゾール（０．３当量）およびＮ，Ｎ−ジメチルホスホロアミドジクロリデート（１．６当量）を加えた。この溶液を２０℃まで温めた。反応が完了すると（６〜１２時間）、この混合物をｐＨ３のクエン酸緩衝液で洗浄した。粗生成物を沈殿／再スラリーにより単離した。二重に保護された（ＤＰＧ）生成物４６を、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタンの勾配）により精製し、そして、ヘプタン中に沈殿させることにより単離した。収率は、４０〜６０％であった。
【０４２５】
実施例１３：モルホリノオリゴマーの大規模合成
アミノメチルポリスチレン樹脂へのアンカーおよびテイルの負荷のためのリアクタの設計を、モルホリノオリゴマーの大規模合成に使用する。樹脂負荷のガイドラインは、小規模合成についてのものと同じである。
【０４２６】
実施例１３ａ：固相合成
保護したオリゴマーを、１０ｇ規模（開始時の樹脂重量）のアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂（１ｇの充填につき約５００μｍｏｌ）に対する固相オリゴマー合成により手動で調製した。使用した溶液は以下のとおりであった：脱トリチル化溶液：１％エタノールを含む２０％トリフルオロエタノール／ジクロロメタン中、２％  ４−シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸（ＣＹＴＦＡ）（ｗ／ｖ）；中和溶液：２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミン；カップリング溶液：１，３−ジメチルイミダゾリジノン（ＤＭＩ）中の０．１６５Ｍ（４６（ＤＰＧ）および５ｄまたは他のＴサブユニットについて）または０．１８Ｍ（５ａおよび５ｂまたは他のＡ／Ｃサブユニットについて）の活性化されたモルホリノサブユニットおよび０．４ＭのＮ−エチルモルホリン。
【０４２７】
樹脂を合成リアクタに移した後でかつ、合成サイクルを開始する前に、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ、１ｇの樹脂につき２０ｍＬ）を加え、そして、１〜２時間静置させた。ジクロロメタン（１ｇの樹脂につき１０ｍＬ）で２回洗浄した後、各サイクルにおいて所望の塩基および所望の結合のタイプの活性化されたモルホリノサブユニットの適切なカップリング溶液を加えて、以下の合成サイクルを用い、適切な配列を生じた。
【０４２８】
【表２１】
2010505741.tif 000033
最後のサブユニットを組み込んだ後、ＤＭＩ中の０．３２Ｍの４−メトキシトリフェニルメチルクロリドおよび０．４ＭのＮ−エチルモルホリンを用いて最後のサイクル（メトキシトリチル化）を行った。メトキシトリチル化の後、樹脂を、ＮＭＰで８回洗浄し、次いで、ＮＭＰ（開始時の樹脂１ｇにつき２７ｍＬ）中の０．１Ｍ  １，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および０．７３Ｍ  トリエチルアミンから構成される切断溶液で３０分間処理した。保護したオリゴマー溶液を回収した後、樹脂（容量がかなり減っている）を、さらに２回、切断溶液（各々１５分間、開始時の樹脂１ｇにつき１３ｍＬ）で洗浄し、そして、この洗浄液をバルク溶液と合わせた。Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）プラグを備える適切なサイズの圧力ボトル（Ａｃｅ  Ｇｌａｓｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）中の保護されたオリゴマー溶液に、濃アンモニア水溶液（開始時の樹脂１ｇにつき１０６ｍＬ、前もって−２０℃に冷却）を加え、ボトルを密封し、そして、かき混ぜて内容物を混合した。このボトルを４５℃のオーブン中に１６〜２０時間置いて、塩基および骨格保護基を除去した。
【０４２９】
加安分解の後、粗オリゴマー溶液を室温まで冷却し、次いで、ＰＬＢＣ  ３ｋｄ再生セルロースメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、０．２８％アンモニア水溶液に対してダイアフィルトレーションして、イオン交換クロマトグラフィーの前に、溶媒および小さな分子を除いた。
【０４３０】
実施例１３ｂ：アニオン交換クロマトグラフィーによるモルホリノオリゴマーの精製
ダイアフィルトレーションから得られた粗オリゴマー溶液を、ｐＨ１１〜１１．５に調節し、そして、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｓｕｐｅｒ−Ｑ  ６５０Ｓアニオン交換樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のカラム上にロードする。メトキシトリチル化オリゴマーを、１７カラム容量にわたり、５〜３５％のＢの勾配（緩衝液Ａ：１０ｍＭ水酸化ナトリウム；緩衝液Ｂ：１０ｍＭ水酸化ナトリウム中１Ｍの塩化ナトリウム）を用いて溶出し、そして、容認可能な純度（アニオン交換ＨＰＬＣおよび質量分析）の画分をプールした。
【０４３１】
実施例１３ｃ：モルホリノオリゴマーの脱メトキシトリチル化
アニオン交換クロマトグラフィーからのプールした画分に、アセトニトリル（１０容量％）を加え、その後、２Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を加えて、ｐＨを３に調節した。この溶液を、４５分間混合し、次いで、濃アンモニア水溶液でｐＨ７に中和した。オリゴマー溶液を、ＰＬＢＣ  ３ｋｄ再生セルロースメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、２０ｍＭ酢酸ナトリウムに対してダイアフィルトレーションして、カチオン交換クロマトグラフィーの前に、緩衝液を交換した。
【０４３２】
実施例１３ｄ：カチオン交換クロマトグラフィーによるモルホリノオリゴマーの精製
オリゴマー溶液を、酢酸を用いてｐＨ４．５に調節し、そして、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０カチオン交換樹脂のカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカラムにロードした。オリゴマーを、１７カラム容量にわたり、０〜３５％のＢの勾配（緩衝液Ａ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５％アセトニトリル、ｐＨ４．５；緩衝液Ｂ：０．５Ｍ  塩化ナトリウム、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５％アセトニトリル、ｐＨ４．５）を用いて溶出し、そして、容認可能な純度（カチオン交換ＨＰＬＣおよび質量分析）の画分をプールした。
【０４３３】
実施例１３ｅ：モルホリノオリゴマーの単離
精製したオリゴマー溶液を、ＰＬＢＣ  ３ｋｄ再生セルロースメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて０．０２８％アンモニア水溶液に対してダイアフィルトレーションして塩を除き、そして、オリゴマーの遊離塩基を生じた。次いで、脱塩されたオリゴマー溶液を凍結および凍結乾燥して、白色の綿毛のような粉末（約１２％の水分含量）としてオリゴマーを得た。この方法により、エボラの処置に有用な化合物を調製した：
５’−（ＥＧ３）−ＧＣＣ＋ＡＴＧＧＴ＋ＴＴＴ＋ＴＴＣ＋ＴＣ＋ＡＧＧ−３’−（Ｈ）、８．４ｇ
５’−（ＥＧ３）−ＣＣ＋ＴＧＣＣＣ＋ＴＴＴＧＴ＋ＴＣＴ＋ＡＧＴ＋ＴＧ−３’−（Ｈ）、１０．０ｇ
小規模で作製した化合物と同一。
【０４３４】
実施例１３ｆ：アニオン交換ＨＰＬＣによるモルホリノオリゴマーの解析：
２０ｍＭ  塩化ナトリウム、１０ｍｍｏｌ  水酸化ナトリウム（緩衝液Ａ）および１Ｍ  塩化ナトリウム、１０ｍｍｏｌ  水酸化ナトリウム（緩衝液Ｂ）、（２０分間で１０〜５３％のＢの勾配）を用いる、Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ，４ｘ２５０ｍｍカラム（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、アニオン交換（ＳＡＸ）ＨＰＬＣを行った。
【０４３５】
実施例１４：モルホリノオリゴマーへのグアニジニウム基の導入
実施例１４ａ：アミンの直接的なグアニル化による
その骨格に３つのピペラジン二級アミンを含む１０μｍｏｌのモルホリノオリゴマーを、７５ｍｇ／ｍＬで０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３に溶解させた。７００μｍｏｌの１−Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンＨＣｌをこのモルホリノオリゴマー溶液に加え、そして、この反応物を、室温で撹拌した。３時間経過後、この反応物を水で希釈し、そして、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｍ（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）カラムを用いた固相抽出（ＳＰＥ）により精製した。ＳＰＥ精製は、２０ｍｇ／ｍＬでのサンプルのカラムへのロードと、４カラム容量の１Ｍ  ＮａＣｌでのカラムの洗浄と、次いで、３カラム容量の水でのカラムの洗浄とを伴った。３カラム容量のアセトニトリル／水（１：１  ｖ／ｖ）を用いてカラムを洗浄することにより、生成物を溶出した。このＨＣｌ塩としての生成物を、次いで、凍結乾燥した。
【０４３６】
グアニジン骨格部分を含むモルホリノオリゴマーの、ｐＨ９における強力なカチオン交換（ＳＣＸ）精製は、オリゴマーは、骨格および／または末端に少なくとも３つのグアニジン基を含む場合に達成され得る。凍結乾燥の前に、先の工程からの脱塩した溶液を、ｐＨ９におけるＳＣＸにより精製して、あらゆる残存する非誘導体化ピペラジン前駆体から、グアニジン修飾された生成物を分離した。液体クロマトグラフィーカラムは、１０×６２ｍｍ（Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍ  Ｖａｌｖｅ／Ｏｍｎｉｆｉｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の寸法を有し、そして、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ強力カチオン交換媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含んだ。移動相の組成は、以下のとおりであった：Ａ）２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、２５％アセトニトリル（ｖ／ｖ）；ｐＨ９．０およびＢ）１．０Ｍ  塩化ナトリウム、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、２５％アセトニトリル（ｖ／ｖ）；ｐＨ９．０。３４２ｃｍ／時の線形速度を用いた。４カラム容量の移動相Ａを用いたカラムの平衡化の後、オリゴマーサンプルを、約５ｍｇ／ｍＬの濃度で移動相Ａにロードした。次いで、カラムを、移動相Ａで２分間洗浄し、その後、２２分にわたる０〜２０％の移動相Ｂの線形勾配と同時に、画分の回収を開始した。画分は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより個々に解析した。選択した画分をプールし、そして、固相抽出により脱塩した。画分のプールを水で５倍に希釈し、そして、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｍカラム上にロードした。ＳＰＥ脱塩は、２０ｍｇ／ｍＬでのサンプルのカラムへのロードと、３カラム容量の水でのカラムの洗浄とを伴った。次いで、３カラム容量のアセトニトリル／水（１：１  ｖ／ｖ）でカラムを洗浄することにより、生成物を溶出させた。生成物を凍結乾燥し、そして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびＳＣＸ  ＨＰＬＣにより解析した。
【０４３７】
以下のオリゴマーがこの方法の例である：
テイルを持つ樹脂を用いて、５’−（ＥＧ３）−ＣＴＧＧＧ＋ＡＴＧ＋ＡＧ＋ＡＴＣＣ＋ＡＴＣ＋ＡＣＴ−３’−（Ｈ）を調製した。サンプル（１０００ＯＤ）を、上記の方法により以下に変換した：
５’−（ＥＧ３）−ＣＴＧＧＧ（Ｇｕｐｉｐ）ＡＴＧ（Ｇｕｐｉｐ）ＡＧ（Ｇｕｐｉｐ）ＡＴＣＣ（Ｇｕｐｉｐ）ＡＴＣ（Ｇｕｐｉｐ）ＡＣＴ−３’−（Ｇｕ）  ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値＝７４２１．５ダルトン。ＳＰＥの後に回収した粗生成物（９０７ＯＤ）（［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝７４２２．６ダルトン）を、ｐＨ９のＳＣＸイオン交換により精製して、３７８ＯＤの生成物を得た（［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝７４２０．９）。
【０４３８】
実施例１４ｂ：グアニジノアミノ酸トリフルオロ酢酸塩との反応によるグアニジニウム基の導入
グアニジノ酸トリフルオロ酢酸塩の調製
グアニジノ酸を、３３０ｍｇ／ｍＬの濃度で、穏やかに加熱および撹拌しながら、トリフルオロ酢酸中に溶解した。一度完全に溶解すると、溶液を、１０倍容量過剰なジエチルエーテルに滴下して、グアニジノ酸のトリフルオロ酢酸塩を沈殿させた。懸濁液を遠心分離し、上清をデカントして捨て、そして、固体を、新しいジエチルエーテル中にトリチュレートした。懸濁液を再度遠心分離し、上清をデカントして捨て、そして、固体を減圧下で乾燥させた。
【０４３９】
グアニジノ酸（一般的なもの）のモルホリノオリゴマーのアミンへの結合
骨格および／または末端に遊離アミノ基を含むモルホリノオリゴマーを、７５ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯ中に溶解させた。別に、１００ｍｇ／ｍＬ（グアニジノ酸に関して）のＮＭＰ中に、グアニジノ酸のトリフルオロ酢酸塩または塩酸塩（モルホリノオリゴマーアミンに関して２当量）およびＨＢＴＵ（アミンに関して１．９５当量）を溶解させることによって、活性化されたグアニジノ酸溶液を調製した。次いで、ＤＩＥＡ（グアニジノ酸に関して３当量）をグアニジノ酸溶液に加えた。活性化されたグアニジノ酸溶液を簡単に混合して、そして、直ちに、モルホリノオリゴマー溶液に加えた。室温で３時間撹拌した後、この反応物を、冷やした濃水酸化アンモニアで２．３３倍に希釈した。必要に応じて、穏やかに加熱および混合しながら、ＴＦＥをゆっくりと加え、沈殿した固体を再溶解させた。次いで、反応物を密封した容器において４５℃にて１８時間加熱し、その後、水で１５倍に希釈し、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｍ（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）カラムを用いるＳＰＥにより精製した。ＳＰＥ精製は、２０ｍｇ／ｍＬでのサンプルのカラムへのロードと、４カラム容量の１Ｍ  ＮａＣｌでのカラムの洗浄と、次いで、３カラム容量の水でのカラムの洗浄とを伴った。３カラム容量のアセトニトリル／水（１：１  ｖ／ｖ）を用いてカラムを洗浄することにより、生成物を溶出した。この結合物を凍結乾燥し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびＳＣＸ  ＨＰＬＣにより解析した。
【０４４０】
以下のオリゴマーが、この方法の例である：
テイルを持たない樹脂を用いて、５’−（Ｈ）−Ｃ＋ＴＴＣＧＡ＋ＴＡＧ＋ＴＧ−３’−（Ｈ）を調製した。サンプル（９７０ＯＤ）を、上記の方法により４−グアニジノブタン酸を用いて以下に変換した：５’−（ＧｕＢｕ）−Ｃ（ＧｕＢｕｐｉｐ）ＴＴＣＧＡ（ＧｕＢｕｐｉｐ）ＴＡＧ（ＧｕＢｕｐｉｐ）ＴＧ−３’−（ＧｕＢｕ）、［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値＝４５４１．２ダルトン。ＳＰＥの後に回収した粗生成物（８２０ＯＤ）（［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝４５４１．９ダルトン）を、ｐＨ９のＳＣＸイオン交換により精製して、３５６ＯＤの生成物を得た（［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝４５４２．１）。
【０４４１】
６−グアニジノヘキサン酸の、モルホリノオリゴマーの二級アミンへの結合
６−グアニジノヘキサン酸は、ＡｌｚＣｈｅｍ；Ｔｒｏｓｔｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。骨格中に８つの二級アミンを組み込んだ１８マーのモルホリノオリゴマー（２０μｍｏｌ、１６０μｍｏｌのアミン基）を、７５ｍｇ／ｍＬでジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させた。別に、９２０μＬの１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）中に、３２０μｍｏｌ（アミンに関して２モル当量）の６−グアニジノヘキサン酸のトリフルオロ酢酸塩および３１２μｍｏｌの２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアンモニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を溶解することによって、活性化された６−グアニジノヘキサン酸溶液を調製した。ＤＩＥＡを添加した直後に、活性化されたグアニジノ酸溶液をモルホリノオリゴマー溶液に加えた。窒素下、室温にて３時間撹拌した後、４ｍＬの濃水酸化アンモニウムをこの反応物に加えた。穏やかに加熱および混合しながら７ｍＬの２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を加え、沈殿した固体を再溶解させ、そして、溶液を４５℃にて１８時間加熱した。次いで、この溶液を、水で２００ｍＬに希釈し、そして、上に詳述されるようにＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｍ（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）カラムを用いる固相抽出（ＳＰＥ）により精製した。この結合物を凍結乾燥し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびＳＣＸ  ＨＰＬＣにより解析した。
【０４４２】
以下のオリゴマーが、この方法の例である：
テイルを持たない樹脂を用いて、５’−（Ｈ）−Ｃ＋ＴＴＣＧＡ＋ＴＡＧ＋ＴＧ−３’−（Ｈ）を調製した。サンプル（６３５ＯＤ）を、上記の方法により以下に変換した：
５’−（ＧｕＡｈｘ）−Ｃ（ＧｕＸ）ＴＴＣＧＡ（ＧｕＸ）ＴＡＧ（ＧｕＸ）ＴＧ−３’−（ＧｕＡｈｘ）、［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値＝４６８１．４ダルトン。ＳＰＥの後に回収した粗生成物（５６３ＯＤ）（［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝４６８１．２ダルトン）を、ｐＨ６．５のＳＣＸイオン交換により精製して、ＳＣＸ  ＨＰＬＣにより９３．３％純度の４２７ＯＤの生成物を得た（［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝４６８２．４）。
【０４４３】
テイルを持つ樹脂を用いて、５’−（ＥＧ３）−ＣＴＧＧＧ＋ＡＴＧ＋ＡＧ＋ＡＴＣＣ＋ＡＴＣ＋ＡＣＴ−３’−（Ｈ）を調製した。サンプル（１５００ＯＤ）を、上記の方法により以下に変換した：
５’−（ＥＧ３）−ＣＴＧＧＧ（ＧｕＸ）ＡＴＧ（ＧｕＸ）ＡＧ（ＧｕＸ）ＡＴＣＣ（ＧｕＸ）ＡＴＣ（ＧｕＸ）ＡＣＴ−３’−（ＧｕＡｈｘ）、［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値＝８１００．５ダルトン。ＳＰＥの後に回収した粗生成物（１４８６ＯＤ）（［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝８１００．４ダルトン）を、ｐＨ９のＳＣＸイオン交換により精製して、７００ＯＤの生成物を得た（［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝８１００．６）。
【０４４４】
この方法をまた、ＡｃＲＡｈｘＲＡｈｘＢ（図２ＯにおいてＡｃＮＨ−ＲＡｈｘＲＡｈｘＢ−ＯＨとより明確に記載される）のようなペプチド酸を骨格アミンに加えるために使用した。
【０４４５】
実施例１４ｃ：アミノアルカノン酸（ａｌｋａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の、モルホリノオリゴマーのアミンへの結合と、その後のグアニル化による：
骨格および／または末端に遊離アミノ基を含むモルホリノオリゴマーを、７５ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯ中に溶解させた。別に、１００ｍｇ／ｍＬ（アミノ酸に関して）のＮＭＰ中に、Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸（モルホリノオリゴマーアミンに関して２当量）およびＨＢＴＵ（アミンに関して１．９５当量）を溶解させることによって、活性化したＦｍｏｃ−アミノアルカノン酸溶液を調製した。次いで、ＤＩＥＡ（アミノ酸に関して３当量）をアミノ酸溶液に加えた。活性化されたアミノ酸溶液を簡単に混合して、そして、直ちに、モルホリノオリゴマー溶液に加えた。室温で３時間撹拌した後、この反応物を、冷やした濃水酸化アンモニアで２．３３倍に希釈した。次いで、反応物を密封した容器において４５℃にて１８時間加熱し、その後、水で１５倍に希釈し、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｍ（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）カラムを用いるＳＰＥにより精製した。ＳＰＥ精製は、２０ｍｇ／ｍＬでのサンプルのカラムへのロードと、４カラム容量の１Ｍ  ＮａＣｌでのカラムの洗浄と、次いで、３カラム容量の水でのカラムの洗浄とを伴った。３カラム容量のアセトニトリル／水（１：１  ｖ／ｖ）を用いてカラムを洗浄することにより、生成物を溶出した。この結合物を凍結乾燥し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびＳＣＸ  ＨＰＬＣにより解析した。この生成物は先の実施例と同じようにグアニル化および精製し得る。
【０４４６】
以下のオリゴマーが、この方法の例である：
テイルを持つ樹脂を用いて、５’−（ＥＧ３）−ＣＴＧＧＧ＋ＡＴＧ＋ＡＧ＋ＡＴＣＣ＋ＡＴＣ＋ＡＣＴ−３’−（Ｈ）を調製した。サンプル（２０００ＯＤ）を、上記の方法により以下に変換した：
５’−（ＥＧ３）−ＣＴＧＧＧ（Ａｈｘｐｉｐ）ＡＴＧ（Ａｈｘｐｉｐ）ＡＧ（Ａｈｘｐｉｐ）ＡＴＣＣ（Ｇ）ＡＴＣ（Ａｈｘｐｉｐ）ＡＣＴ−３’−（Ａｈｘ）、［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値＝７８４８．３ダルトン。ＳＰＥの後に回収した粗生成物（１６７２ＯＤ）（［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝７８４７．７ダルトン）。この物質の一部（８００ＯＤ）を、グアニル化により、さらに以下に変換した：
５’−（ＥＧ３）−ＣＴＧＧＧ（ＧｕＸ）ＡＴＧ（ＧｕＸ）ＡＧ（ＧｕＸ）ＡＴＣＣ（ＧｕＸ）ＡＴＣ（ＧｕＸ）ＡＣＴ−３’−（ＧｕＡｈｘ）、［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値＝８１００．５ダルトン。ＳＰＥの後に回収した粗生成物（［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝８１０１．４ダルトン）を、ＳＣＸクロマトグラフィーにより精製して、３２０ＯＤの最終生成物を生じた。
【０４４７】
実施例１５：モルホリノオリゴマーへのアルギニンリッチペプチドの導入
骨格および／または末端に遊離アミノ基を含むモルホリノオリゴマーを、７５ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯ中に溶解させた。別に、活性化されたペプチド溶液（このペプチドは、長さ１〜２５アミノ酸残基であり、Ｎ末端ブロッキング基（好ましくはアセチル）を含み、そして、グアニジニウム、炭化水素または他の非求核性側鎖を持つアミノ酸から構成された）を調製した。１００ｍｇ／ｍＬ（アミノ酸に関して）のＮＭＰ中に、ペプチド（モルホリノオリゴマーに関して２当量）およびＨＢＴＵ（アミンに関して１．９５当量）を溶解させた。次いで、ＤＩＥＡ（ペプチドに関して２当量）をペプチド溶液に加えた。活性化されたペプチド溶液を簡単に混合して、そして、直ちに、モルホリノオリゴマー溶液に加えた。室温で３時間撹拌した後、この反応物を、冷やした濃水酸化アンモニアで２．３３倍に希釈した。必要に応じて、穏やかに加熱および混合しながら、ＴＦＥをゆっくりと加え、沈殿した固体を再溶解させた。次いで、反応物を密封した容器において４５℃にて１８時間加熱し、その後、水で１５倍に希釈し、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｍ（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）カラムを用いるＳＰＥにより精製した。ＳＰＥ精製は、２０ｍｇ／ｍＬでのサンプルのカラムへのロードと、４カラム容量の１Ｍ  ＮａＣｌでのカラムの洗浄と、次いで、３カラム容量の水でのカラムの洗浄とを伴った。３カラム容量のアセトニトリル／水（１：１  ｖ／ｖ）を用いてカラムを洗浄することにより、生成物を溶出した。この結合物を凍結乾燥し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびＳＣＸ  ＨＰＬＣにより解析した。この生成物は先の実施例と同じように精製し得る。
【０４４８】
実施例１６：アルギニンリッチなペプチドおよび骨格のグアニジニウム基を持つモルホリノオリゴマーの調製
実施例１４において調製した骨格のグアニジニウム基を持つモルホリノオリゴマーを、実施例１５において調製したアルギニンリッチなペプチドと反応させた。この生成物を、実施例１３において記載されるように、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ  ＳＣＸカチオン交換樹脂上で精製した。
【０４４９】
実施例１７：アルギニンリッチなペプチドおよび骨格のアミン基を持つモルホリノオリゴマーの調製
実施例１７ａ：トリフルオロアセタミドとしてのモルホリノオリゴマー二級アミンの保護
３つの骨格中の二級アミンと、３’−トリチルまたはメトキシトリチルを持つ１１マーの４１ｍｇのモルホリノオリゴマーを、０．５００ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させた。このオリゴマー溶液に、８．２μＬ（５当量）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を加え、その後、４４μＬ（５当量）のＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）中２５０ｍｇ／ｍＬの４−ニトロフェニルトリフルオロ酢酸溶液を加えた。ＤＩＥＡおよび４−ニトロフェニルトリフルオロ酢酸の添加を、９０分間隔で４回以上繰り返し、次いで、この反応物を、室温で１５時間撹拌した。次いで、２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）中５０ｍＭの４−シアノピリジニウムトリフルオロ酢酸の溶液（３．７６ｍＬ、２０当量）を加え、４０分間撹拌することにより、３’−トリチルまたはメトキシトリチル基を除去した。次いで、この反応物を、水で４０ｍＬに希釈し、そして、０．５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５を滴下することによりｐＨを７．５に調節した。この生成物を、２ｍＬ  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｍカラムを用いる固相抽出により単離した。粗反応混合物をカラム上にロードした後、カラムを２カラム容量の水、４カラム容量の１５％アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）および４カラム容量の２０％アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）でリンスした。遊離の３’−モルホリンアミンを持つ骨格が保護された生成物を、次いで、３カラム容量の１：１  アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）で溶出して、凍結乾燥した。
【０４５０】
実施例１７ｂ：アルギニンリッチなペプチドのモルホリノオリゴマーへの結合と、その後、のオリゴマー骨格アミンの脱保護：
３００μｌのＮＭＰ中にペプチド酸（２２．６μｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（２２．３μｍｏｌ）を溶解し、ＤＩＥＡ（４０．８μｍｏｌ）を加えることにより、活性化されたペプチド溶液を調製した。ＤＩＥＡを加えた直後に、ペプチド溶液を、０．５５０ｍＬのＤＭＳＯ中の遊離の３’−モルホリンアミンを持つ骨格が保護されたモルホリノオリゴマーの溶液に加えた。室温にて１８０分置いた後、２ｍＬの濃水酸化アンモニウムをこの反応物に加えた。４ｍＬのＴＦＥを加えて得られた沈殿を再溶解させ、そして、おだやかに加熱および混合した。反応物を、４５℃のオーブン中に１５時間置いた。次いで、水を加え、反応物を４０ｍＬに希釈した。次いで、この溶液に、２Ｍのリン酸を滴下してかき混ぜることにより中和した。この生成物を、２ｍＬ  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｍカラムを用いる固相抽出により単離した。粗反応混合物をカラム上にロードした後、カラムを４カラム容量の水でリンスした。生成物を、次いで、３カラム容量の１：１  アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）で溶出して、凍結乾燥した。
【０４５１】
以下のオリゴマーが、この方法の例である：
５’−（ＥＧ３）−Ｇ＋ＴＧＣ＋ＴＣＡ＋ＴＧＧ＋ＴＧＣＡＣＧＧ＋ＴＣ−３’−（Ａｃ（ＲＡｈｘＲ）４ＡｈｘＢ−）、［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値＝８７８９．３ダルトン、［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝８７８９．９ダルトン、エボラに有用
テイルを持つ樹脂を用いて、５’−（ＥＧ３）−Ｃ＋ＴＴＣＧＡ＋ＴＡＧ＋ＴＧ−３’−（トリチル）を調製した。サンプル（９９４ＯＤ）を、上記の方法により以下に変換した：
５’−（ＥＧ３）−Ｃ（ＴＦＡｐｉｐ）ＴＴＣＧＡ（ＴＦＡｐｉｐ）ＴＡＧ（ＴＦＡｐｉｐ）ＴＧ−３’−（Ｈ）、［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値＝４３６８．６ダルトン。ＳＰＥの後に回収した粗生成物（［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝４３７１．１ダルトン）。このサンプルを、Ａｃ（ＲＡｈｘＲ）４ＡｈｘＢを用いたアクリル化によりさらに変換して、以下を生じた：
５’−（ＥＧ３）−Ｃ＋ＴＴＣＧＡ＋ＴＡＧ＋ＴＧ−３’−（Ａｃ（ＲＡｈｘＲ）４ＡｈｘＢ−）、［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値＝６０１０．０ダルトン。ＳＰＥの後に回収した粗生成物（７７０ＯＤ）（［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝６０１１．６ダルトン）。これを、ｐＨ６．５のＳＣＸイオン交換により精製して、４７８ＯＤの生成物を得た（［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝６０１０．７ダルトン、８４．７％のＳＣＸ  ＨＰＬＣ純度）。
【０４５２】
実施例１８：モルホリノオリゴマーアミンの還元的メチル化
１７ｍＬの２００ｍＭホウ素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中に０．５２ｇのパラホルムアルデヒドを溶解し、加熱および撹拌することにより、ホルムアルデヒド溶液を調製した。この溶液を、還流コンデンサーを取り付けて、おだやかに沸騰するまで１時間加熱した。この溶液を、次いで、加熱をやめ、反応混合物を室温まで冷却し、そして、メチル化反応の間中、溶液を撹拌し続けた。
【０４５３】
氷浴上で、１０ｍＬの２００ｍＭホウ素酸ナトリウム緩衝液を冷却し、次いで、その中に０．３７８ｇのホウ化水素ナトリウムを溶解させることによって、１Ｍのホウ化水素ナトリウム溶液を調製した。この溶液は、メチル化反応の間中、氷上で冷たく維持した。
【０４５４】
骨格中に５つの二級アミンを組み込み、３’末端に遊離モルホリン二級アミンを組み込んだ３３ｍｇ（４．６μｍｏｌ）の２０マーのモルホリノオリゴマーを、ガラスバイアル中で秤量した。次いで、オリゴマーを、１ｍＬの２００ｍＭホウ素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中に溶解させ、そして、撹拌しながら、氷浴上で０℃まで冷却した。上で調製した２００μＬのホルムアルデヒド溶液（約４３当量）を、モルホリノオリゴマーの撹拌溶液に加えた。ホルムアルデヒドを添加した直後に、４０μＬの１Ｍホウ化水素ナトリウム溶液（８．７当量）を加えた。ホルムアルデヒドおよびホウ化水素ナトリウムの添加を、３０分間隔で５回繰り返した。最後の添加の後、反応物を３０分間撹拌し、次いで、４ｍｇのホウ化水素ナトリウムを加えた。次いで、反応物をさらに２時間撹拌した。水を加えて反応物を５ｍＬまで希釈し、そして、１Ｍリン酸を滴下して、ｐＨを６．５に調節した。
【０４５５】
生成物を、２ｍＬ  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｍカラムを用いる固相抽出により単離した。粗反応混合物をカラム上にロードした後、カラムを４カラム容量の水でリンスした。生成物を、次いで、３カラム容量の１：１  アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）で溶出して、凍結乾燥した。
【０４５６】
以下のオリゴマーが、この方法の例である：
テイルを持つ樹脂を用いて、５’−（ＥＧ３）−ＣＴＧＧＧ＋ＡＴＧ＋ＡＧ＋ＡＴＣＣ＋ＡＴＣ＋ＡＣＴ−３’−（Ｈ）を調製した。サンプル（８８５ＯＤ）を、上記の方法により以下に変換した：
５’−（ＥＧ３）−ＣＴＧＧＧ（Ｍｅｐｉｐ）ＡＴＧ（Ｍｅｐｉｐ）ＡＧ（Ｍｅｐｉｐ）ＡＴＣＣ（Ｍｅｐｉｐ）ＡＴＣ（Ｍｅｐｉｐ）ＡＣＴ−３’−（メチル）、［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値＝７２５３．５ダルトン。ＳＰＥの後に回収した粗生成物（６２５ＯＤ）（［Ｍ＋Ｈ］＋の実測値＝７２５０．５ダルトン）。
【０４５７】
実施例１９：無細胞のインビトロ翻訳アッセイ（一般的な方法）
開始ＭｅｔコドンであるＡＴＧを含まないホタルルシフェラーゼについてのタンパク質コード配列を、プラスミドｐＣｉＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチプルクローニングサイトにサブクローニングした。その後、エボラウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８６８３３）のＶＰ３５（−９８〜＋３９、塩基３０２０〜３１５７）、エボラウイルスＶＰ２４（−８４〜＋４３、すなわち塩基１０２６１〜１０３９０）またはエボラウイルスＬ（−８０〜＋４９、すなわち、塩基１１５０１〜１１６３２）の開始コドン領域についての相補的なオリゴヌクレオチドを二連にして、Ｎｈｅ１部位およびＳａｌ１部位にサブクローニングした。ＲＮＡは、Ｔ７  Ｍｅｇａ  ｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて、Ｔ７プロモーターから生成した。
【０４５８】
ＣＹＰ３Ａ２遺伝子ｍＲＮＡを標的とする実験について、ラットのＣＹＰ３Ａ２遺伝子開始コドン領域についてのオリゴヌクレオチドを調製し（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０９７４２；−２５〜＋２２、すなわち塩基４４〜９０）、そして、上述のようにｐＣｉＮｅｏ中にクローニングした。Ｃ型肝炎ウイルスの開始コドン領域の標的とする実験については、ＨＣＶの開始コドン領域をコードするオリゴヌクレオチドを調製し（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ００９６０６；−２０〜＋３１、すなわち塩基３２２〜３７２）、そして、上述のように、ｐＣｉＮｅｏ中にクローニングした。
【０４５９】
異なる濃度のＰＭＯを６ｎＭのＲＮＡと混合することにより、無細胞のインビトロ翻訳アッセイを行った。次いで、この混合物を、ウサギの網状赤血球翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）に加え、生成されるルシフェラーゼタンパク質の量を、ルミノメーターにおいて測定される発光により決定した。ＥＣ５０値を決定するためのシグモイド曲線を、例えば、図４に示されるように、観察されたルシフェラーゼ発光（ＰＭＯの濃度ごとにｎ＝３）を、ＰＭＯに対してプロットして生成した。
【０４６０】
実施例２０：細胞培養におけるスプライシング補正・翻訳アッセイ（一般的な方法）
ＨｅＬａ細胞を、プラスミドｐＬｕｃ／７０５（このプラスミドは、ヌクレオチド７０５において変異されたヒトβ−グロブリンイントロンで中断されたルシフェラーゼ遺伝子を有し、したがって、不正確なスプライシングを起こす）で安定にトランスフェクトした。誤ったスプライシングを受けた転写物は機能的なレポータータンパク質をもたらさないので、野生型のスプライシングが、スプライシングを補正するアンチセンスオリゴマーで誘導されない限り、レポーターシグナルは観察されない。有効に送達される場合、７０５スプライシング部位を標的とするアンチセンスオリゴマー（配列番号２８６を持つ）は、スプライシングを補正し、そして、ルシフェラーゼの発現を可能にする。
【０４６１】
このアッセイは、オリゴマーが細胞および核に入り、その後、プレｍＲＮＡの不正確なスプライシングをブロックし、したがって、レポーター遺伝子の発現をもたらす能力を測定する。このアッセイにおいて、オリゴマーは、細胞および細胞の核に入ってシグナルを生じなければならないので、このアッセイは、取り込みおよび送達部分の有効性、ならびに、結合オリゴマーのアンチセンス活性を測定するために有用である。
【０４６２】
ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞における、上記のような種々のオリゴマーおよび輸送体−オリゴマー結合体の取り込みおよび活性を、蛍光分光法により研究した。実験は、一般に三連で行った。一般的な手順によれば、特定の濃度の試験物質を含む培養培地を、４８ウェルプレートにプレーティングしたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ７０５細胞に加えた。インキュベーションした後、これらの細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そして、細胞溶解物を回収した。３０μｌの細胞溶解物と５０μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬（ＬＡＲ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）とを混合し、そして、Ｆｌｘ  ８００マイクロプレート蛍光／発光リーダー（Ｂｉｏ−ｔｅｋ，Ｖｅｒｍｏｎｔ）を用いて発光を測定することにより、生成される機能的なルシフェラーゼの量を決定した。相対的な光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）を、製造業者の手順（Ｐｉｅｒｃｅ，ＩＬ）に従う二シンコニン酸（ＢＣＡ）法（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ）により決定したタンパク質のμｇに対して標準化した。
【０４６３】
実施例２１．カチオン性結合を持つＰＭＯを用いたアンチセンス活性の増加
配列番号９（＋Ｔ＋ＴＣＡＡＣＣ＋Ｔ＋ＴＧ  ＡＡＡＣＣ＋Ｔ＋ＴＧＣＧ）および配列番号１０（ＧＣＣＡ＋ＴＧＧ＋Ｔ＋Ｔ＋Ｔ＋Ｔ＋Ｔ＋ＴＣ＋ＴＣＡＧＧ）について配列表に示されるようなオリゴマー結合のサブセットのためのカチオン性結合を用いて、２種のＰＭＯを合成した。これらのオリゴマーは、図１Ｂに示されるようなカチオン性結合（１−ピペラジノホスホロアミデート）を、「＋」で示される位置に組み込んだ。これらの２種のＰＭＯは、ＥＢＯＶ  ＶＰ２４  ｍＲＮＡを標的とする。無細胞翻訳アッセイは、入力ＲＮＡとしてＶＰ２４：ルシフェラーゼｍＲＮＡを用いて行った。カチオン性結合を持つＰＭＯおよびカチオン性結合を持たないＰＭＯを、ルシフェラーゼ発現を阻害する能力について比較し、結果を図３に示した。同じ塩基配列を持つ無電荷ＰＭＯと比較すると、６〜８の間のカチオン性結合を持つＰＭＯは、このアッセイにおいて１０倍〜１００倍の間の増加したアンチセンス活性を示した。
【０４６４】
実施例２２．オリゴマーで処理した動物のエボラウイルス感染
８〜１０週齢の両方の性別のＣ５７Ｂｌ／６マウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から入手した。マウスを、小型隔離ケージで飼育し、オートクレーブした水と飼料を自由に与えた。マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈した約１０００ｐｆｕのマウスに適合させたエボラウイルス（Ｂｒａｙ，Ｄａｖｉｓら、１９９８）の腹腔内注射によりチャレンジした。マウスを、エボラウイルスチャレンジの２４時間前および４時間前の、２回の等容量に分けた、合計１００μｇのＰＭＯまたは＋ＰＭＯのいずれかで処置した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、マウスに適合させたエボラウイルス（Ｂｒａｙ，Ｄａｖｉｓら、１９９８）の１０００プラーク形成単位で腹腔内にチャレンジした。結果は、上記のとおりであり、そして、図６において図式的に示す。
【０４６５】
Ｈａｒｔｌｅｙのモルモットを、１０００ｐｆｕのモルモットに適合させたエボラウイルス（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｓｔｅｅｌｅら、１９９９）での皮下チャレンジの２４時間前または２４時間後もしくは９６時間後に、２０ｍｇ／ｋｇまでの、ＶＰ２４−ＡＵＧ、Ｌ−ＡＵＧおよびＶＰ３５のＰＭＯまたは＋ＰＭＯ（それぞれ、配列番号１、５および１１または２８７、２８８および２８９）の各々で腹腔内処置した。
【０４６６】
致死的なエボラウイルスチャレンジのための非ヒト霊長類モデルには、ＰＭＯ処置の前に１０００ｐｆｕのＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ（１９９５株）で筋肉内注射によりチャレンジした、体重３〜４ｋｇの雌性のｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓを用いた。これらのサルを、１日目〜１０日目に、非経口経路で処置した。ＰＭＯの用量は、２つの薬物の組み合わせにおける２種のＰＭＯ（配列番号２８８および２８９）の各々について２０ｍｇ／ｋｇであった。
【０４６７】
【表２２−１】
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【０４６８】
【表２２−２】
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【０４６９】
【表２２−３】
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【０４７０】
【表２２−４】
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【０４７１】
【表２２−５】
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【０４７２】
【表２２−６】
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【０４７３】
【表２２−７】
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【０４７４】
【表２２−８】
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【０４７５】
【表２２−９】
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【０４７６】
【表２２−１０】
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【０４７７】
【表２２−１１】
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【０４７８】
【表２２−１２】
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【０４７９】
【表２２−１３】
2010505741.tif 000046
【０４８０】
【表２２−１４】
2010505741.tif 000047
【０４８１】
【表２２−１５】
2010505741.tif 000048
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2010505741.tif 000060
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
2010505741.tif 000065
【図２Ｊ】
2010505741.tif 000066
【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
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【図２Ｏ】
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【図２Ｐ】
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【図２Ｑ】
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【図２Ｒ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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