(57)【要約】本発明は、骨形成の抑制に寄与する1種または複数種のポリペプチドの活性または発現を阻害する作用物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明はまた、骨形成の抑制に寄与する1種または複数種のポリペプチドを阻害する作用物質を細胞に投与することによって、細胞における骨形成を誘導する方法も提供する。2010500567.tif 000011
2010500567.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、骨形成を促進する作用物質を同定するための方法:
(a)複数の作用物質と、表1より選択される少なくとも1種のポリペプチドとを接触させる段階;
(b)少なくとも1種のポリペプチドの活性を測定する段階;
(c)前記複数の作用物質のうちの少なくとも1種を選択する段階であって、選択した作用物質が、少なくとも1種のポリペプチドの前記活性を阻害する、段階;および
(d)前記選択した作用物質の、骨形成を促進する能力を測定し、それによって、骨形成を促進する作用物質を同定する段階。
【請求項２】
ポリペプチドが宿主細胞において発現される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
測定する段階(b)が、少なくとも1種のポリペプチドの発現を測定することを含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
発現を測定することが、転写レベルを測定することを含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項2記載の方法。
【請求項６】
測定する段階(d)がインビトロにおいて実施される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
測定する段階(d)がインビボにおいて実施される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
細胞と、表1より選択される少なくとも1種の遺伝子産物の発現を阻害するsiRNAとを接触させる段階を含む、哺乳動物細胞における骨形成を促進するための方法。
【請求項９】
細胞が幹細胞である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
幹細胞が間葉系幹細胞である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
細胞と、表1より選択されるポリペプチドの活性を阻害する作用物質とを接触させる段階を含む、哺乳動物細胞における骨形成を促進するための方法。
【請求項１２】
細胞が幹細胞である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
幹細胞が間葉系幹細胞である、請求項12記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、2006年8月11日に出願された米国特許仮出願第60/822,184号の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組織特異的(または成体)幹細胞は、正常な組織ホメオスタシスおよび組織修復の供給源とみなされている。また、これらは、増殖し、かつ様々な成熟した細胞型に分化する能力を有するため、再生医学に極めて大きな将来性も与える。ヒト間葉系幹細胞(hMSC)は、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、筋細胞、および神経細胞に分化することができる。しかしながら、これらの分化プロセスの根底にある分子メカニズムは十分に理解されていない。
【０００３】
RNAを介した干渉(RNAi)は、相同な二本鎖低分子干渉RNA(siRNA)による個々のmRNAの標的化された破壊を介して機能する、高度に保存された遺伝子サイレンシング事象である(Fire, A. et al., Nature 391:806-811 (1998))。化学合成およびベクターに基づいた発現系を介したインビトロ転写またはインビボ転写の両方によって作製されるsiRNAは、哺乳動物細胞における遺伝子の機能損失を研究する際に非常に有用な道具であることが判明している(Brummelkamp, T. R. et al., Science 296:550-553 (2002); Caplen, N. J. et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:9742-9747 (2001); Elbashir, S. M. et al., Nature 411:494-498 (2001); Lee, N. S. et al., Nat Biotechnol 20:500-505 (2002); Miyagishi, M. et al., Nat Biotechnol 20:497-500 (2002); Paddison, P. J. et al., Genes Dev 16:948-958 (2002); Paul, C. P. et al., Nat Biotechnol 20:505-508 (2002); Sui, G. et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520 (2002); Yu, J. Y. et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052 (2002))。ゲノムスケールのsiRNAライブラリーを用いたハイスループットなスクリーニングが、哺乳動物細胞において成功裡に実施されているが(Berns, K. et al., Nature 428:431-437 (2004); Paddison, P. J. et al., Nature 428:427-431 (2004); Zheng, L. et al., Proc Natl Acad Sci USA 101:135-140 (2004))、配列された合成siRNAライブラリーの幹細胞における有効な応用は報告されていない。ヒト間葉系幹細胞(hMSC)は、成人から容易に単離し、かつインビトロにおいて迅速に増殖させることができる。これらは、様々な成熟した細胞型に分化する能力を有するため(Prockop, D. J. Nat Biotechnol 20:791-792 (2002); Ryan, J. M. et al., J Inflamm (Lond) 2:8 (2005)) (Campagnoli, C. et al., Blood 98:2396-2402 (2001); Dezawa, M. et al., Science 309:314-317 (2005); Dezawa, M. et al., J Clin Invest 113:1701-1710 (2004); Pittenger, M. F. et al., Science 284:143-147 (1999); Pittenger, M. F. et al., Circ Res 95:9-20 (2004); Woodbury, D. et al., J Netirosci Res 61:364-370 (2000))、骨障害を含む変性疾患に対する細胞ベースの治療法を調査する研究者に大きな関心を持たれている(Dezawa, M. et al., Science 309:314-317 (2005); Dezawa, M. et al., J Clin Invest 113:1701-1710 (2004); Horwitz, E. M. et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:8932-8937 (2002); Pittenger, M. F. et al., Circ Res 95:9-20 (2004); Prockop, D. J. Science 276:71-74 (1997))。幹細胞の自己複製から分化への細胞運命移行は、正の調節因子だけでなく、通常は分化を抑制する負の調節因子も伴う。
【０００４】
例えば、骨芽細胞系の細胞への間葉系幹細胞の分化経路に影響する方法論が必要とされている。本発明は、このニーズおよび他のニーズに取り組む。
【発明の概要】
【０００５】
発明の簡単な概要
本発明は、表1に挙げる1種または複数種のポリペプチドの活性または発現を抑制することによって骨形成を促進する作用物質をスクリーニングするための方法を提供する。本発明はさらに、表1に挙げる1種または複数種のポリペプチドの活性または発現を抑制することによって、細胞における骨形成を促進するための方法も提供する。
【０００６】
したがって、第1の局面において、本発明は、骨形成を促進する作用物質を同定するための方法を提供する。いくつかの態様において、これらの方法は、以下の段階を含む:
(a)複数の作用物質と、表1より選択される少なくとも1種のポリペプチドまたはポリヌクレオチドとを接触させる段階;
(b)少なくとも1種のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を測定する段階;
(c)複数の作用物質のうちの少なくとも1種を選択する段階であって、選択した作用物質が、少なくとも1種のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を阻害する、段階;および
(d)選択した作用物質の、骨形成を促進する能力を測定し、それによって、骨形成を促進する作用物質を同定する段階。いくつかの態様において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、宿主細胞において発現される。
【０００７】
別の態様において、これらの方法は、以下の段階を含む:
(a)複数の作用物質と、表1より選択される少なくとも1種のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現する細胞とを接触させる段階;
(b)少なくとも1種のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現(すなわち、転写または翻訳)を測定する段階;
(c)複数の作用物質のうちの少なくとも1種を選択する段階であって、選択した作用物質が、少なくとも1種のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を阻害する、段階;および
(d)選択した作用物質の、骨形成を促進する能力を測定し、それによって、骨形成を促進する作用物質を同定する段階。
【０００８】
スクリーニング方法のいくつかの態様において、測定する段階(b)は、転写レベルを測定することを含む。
【０００９】
スクリーニング方法のいくつかの態様において、測定する段階(d)は、インビトロにおいて実施される。いくつかの態様において、測定する段階(d)は、インビボにおいて実施される。
【００１０】
接触させる段階および測定する段階において使用される細胞は、原核細胞または真核細胞でよい。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、幹細胞または間葉系幹細胞である。
【００１１】
別の局面において、本発明は、細胞における骨形成を促進するための方法を提供する。いくつかの態様において、これらの方法は、細胞と、表1より選択される少なくとも1種の遺伝子産物の発現を阻害するsiRNAとを接触させる段階を含む。
【００１２】
関連した局面において、本発明は、細胞における骨形成を促進するための方法を提供する。いくつかの態様において、これらの方法は、細胞と、表1より選択されるポリペプチドの活性を阻害する作用物質とを接触させる段階を含む。
【００１３】
哺乳動物細胞における骨形成を促進するための態様に関して、いくつかの態様において、これらの方法はインビボにおいて実施される。いくつかの態様において、これらの方法はインビトロにおいて実施される。いくつかの態様において、これらの方法はエクスビボにおいて実施される。
【００１４】
スクリーニング方法および治療方法のいくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、細胞は幹細胞である。いくつかの態様において、幹細胞は間葉系幹細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】hMSCにおけるsiRNAトランスフェクション効率が90％を上回っていたことを示す。siTOXを成功裡にトランスフェクトされた細胞はアポトーシスを経たが、非TOX siRNAをトランスフェクトされた細胞は、依然として生存していた。
【図２】hMSCの骨形成分化を誘導したsiRNAヒットの同定および確認を示す。a.染色によって示されるように、アルカリホスファターゼの活性は、対照siRNAをトランスフェクトされた細胞と比べて、ヒットsiRNAをトランスフェクトされた細胞またはOSで処理した細胞において上方調節されていた。b.初期骨形成マーカー(Cbfa1およびOsx、ただしDlx5ではない)および後期骨形成マーカー(Bsp)の発現は、トランスフェクションまたはOS処理後3日目に調製された様々なヒットsiRNA処理試料またはOS処理試料において差次的に誘導された。c.ALP活性は、ヒットsiRNAおよびsiCbfa1を同時トランスフェクトされた細胞では、ヒットsiRNAおよびsiConを同時トランスフェクトされた細胞と比べて減少していた。d.標的遺伝子の発現ノックダウンを、siRNAトランスフェクション後36時間目に観察した。OSは骨形成分化培地であり、Osxはオステリックスである。
【図３】選ばれたヒットsiRNAをトランスフェクトされたhMSCにおけるアルカリホスファターゼ活性染色が、siConをトランスフェクトされた細胞と比べて増大していることを示す。
【図４】siADKまたはsiCon、続いてOSでhMSCを順次処理することにより、骨細胞の成熟に対するsiADK対siConの促進効果が実証されたことを示す。2+6OSとは、siRNAトランスフェクション後2日目にOS処理を開始し、6日間継続したことを指す。同様の省略が3+5OSおよび4+4OSに当てはまる。リン酸カルシウム析出を調べるために、アリザリンレッド溶液で細胞を染色した。
【図５】骨形成ヒットsiRNAの大多数が骨細胞の成熟を促進したが、hMSCの脂肪生成分化を阻害したことを示す。a.アリザリンレッド染色によって実証されるように、siMJDおよびsiTBX3を除く、選択された12種のヒットsiRNAすべてが、OS処理と組み合わせられた場合に、骨細胞の成熟を促進した。b.siGNASを除く、選択された12種のヒットsiRNAすべてが、siRNAトランスフェクション後2日目に脂肪生成誘導培地で処理したhMSCの脂肪生成分化を阻害した(オイルレッドO染色に基づく)。siConは対照siRNAであり、OSは骨形成誘導培地であり、3+9OSとは、siRNAトランスフェクション後3日目にOS処理を開始し、9日間継続したことを指す。
【図６】siKCNT1およびsiSLC12a2を組み合わせたトランスフェクションが、OSによって誘導される骨細胞成熟プロセスの促進に対して相乗効果を有することを示す(アリザリンレッド染色)。1+13OSとは、siRNAトランスフェクション後1日目に細胞をOSで処理し、かつ処理を13日間継続したことを指す。OSは骨形成誘導培地である。
【図７】細胞内cAMPシグナル伝達が、hMSCの骨形成分化対脂肪生成分化において相反する役割を果たすことを示す。a.アデニリルシクラーゼアゴニストであるホルスコリンは、用量依存的な様式で、hMSCに対するOS培地の骨形成効果を阻害したのに対し(a〜c)、アデノシンキナーゼ阻害物質である5-ヨードツベルシジンは、用量依存的な様式でOS培地の骨形成効果を増強し(d〜f、g〜i)、かつhMSCの脂肪生成分化を阻害した(j〜l)。a〜fはALP染色、g〜iはアリザリンレッド染色、j〜lはオイルレッドo染色である。b.特にデキサメタゾン(DEX)の存在下でのcAMP類似体(DB-cAMPおよびCPT-cAMP)またはIBMXによる処理により、hMSCが脂肪生成分化を経るのが促進された。c.CPT-cAMP、IBMX、またはPGE2の適用によるcAMPレベルの上昇により、OSで処理したhMSCにおいて細胞運命決定が骨形成分化から脂肪生成分化に切り替わる場合がある。Adipoは脂肪生成誘導培地であり、OSは骨形成誘導培地である。
【図８】CREB活性が、hMSCの骨形成分化および脂肪生成分化の両方のために必要とされていることを示す。a.ウェスタンブロットによるCREBタンパク質活性の検査により、ヒットsiRNAをトランスフェクトされた細胞におけるpCREBレベルが、siConをトランスフェクトされた細胞または未処理細胞と比べて上昇していることが実証された。b.CRE(CREB応答エレメント)デコイをトランスフェクトされた細胞は、標的遺伝子中の内因性CREと競合し、脂肪生成誘導培地(Adipo)または骨形成誘導培地(OS)の刺激に対する応答性は劣る。
【図９】hMSCの骨形成分化に関与している付加的なシグナル伝達経路を示す。a.PLZF1発現は、siRNAトランスフェクション後7日目または12日目に採取された、siMJDおよびOSで処理したが、他のヒットsiRNAでは処理していない試料においてのみ誘導された。b.ERK1/2シグナル伝達経路またはp38シグナル伝達経路をそれぞれPD98059またはSB202190によって阻害すると、hMSCに対するOSの骨形成誘導効果が抑制された。c.リン酸化型のp38は、siDUSP6をトランスフェクトされた細胞において上方調節されていた。OSは骨形成誘導培地である。
【図１０】ATPが、OSの誘導によるhMSCの骨形成、ならびにOS処理と組み合わせたsiP2RY11およびsiSLC12a2の誘導によるhMSCの骨形成に対して、投与量に依存的な阻害効果を有することを示す。siRNAトランスフェクション後3日目にOSおよびATPを添加し、1週間継続した。アルカリホスファターゼ活性に関して細胞を染色した。OSは骨形成誘導培地である。
【図１１】siCOMPがhMSCの脂肪生成分化および骨形成分化の両方を促進することを示す。上2つの列(2番目の列のパネルは、対応する上側のパネルの拡大図である)は、siCOMP処理により、脂肪生成誘導培地(Adipo)によって誘導されるhMSCの脂肪生成が促進されることを示す。siRNAトランスフェクション後3日目に細胞をAdipoで処理し、処理を12日間継続した後、オイルレッドOで細胞を染色した。一番下の列は、siCOMPがhMSCの骨形成分化を誘導することを示す。siRNAトランスフェクション後9日目に、細胞のアルカリホスファターゼ活性を分析した。OSは骨形成誘導培地である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
I.  緒言
5,000種のヒト遺伝子を対象とする合成siRNAライブラリーをスクリーニングして、サイレンシングされるとhMSCの骨芽細胞への分化を開始する、骨形成特殊化の内因性抑圧因子を同定した。このスクリーニングにより、hMSCにおける骨形成特殊化の53種の抑制因子が得られた。表1を参照されたい。さらに、cAMPは、骨形成と脂肪生成を逆行させる役割を果たすことも同定された。本発明は、骨形成を制御する遺伝子ネットワークを調節する際および骨疾患を治療する際に使用される。
【００１７】
II.  定義
「骨形成」とは、本明細書において使用される場合、未分化の幹細胞および骨芽細胞系の細胞からの、骨細胞の増殖および骨組織の成長(すなわち、新しい骨基質の合成および蓄積)を意味する。また、骨形成とは、骨細胞(すなわち骨芽細胞)への創始細胞または前駆細胞の分化または分化転換も意味する。創始細胞または前駆細胞は、例えば間葉系幹細胞を含む、多能性幹細胞であり得る。創始細胞または前駆細胞は、骨芽細胞系になるように予め拘束された細胞(例えば前骨芽細胞)または骨芽細胞系になるように予め拘束されていない細胞(例えば、前脂肪細胞もしくは筋芽細胞)でよい。
【００１８】
「作用物質」という用語は、本明細書において説明するスクリーニングアッセイ法において有用な任意の化合物を意味する。作用物質は、例えば、有機化合物、ポリペプチド(例えば、ペプチドまたは抗体)、核酸(例えば、DNA、RNA、二本鎖、一本鎖、オリゴヌクレオチド、アンチセンスRNA、低分子阻害RNA、マイクロRNA、リボザイムなど)、オリゴ糖、脂質でよい。通常、本発明のスクリーニング方法において使用される作用物質は、10,000ダルトン、例えば、8000ダルトン、6000ダルトン、4000ダルトン、2000ダルトン未満の分子量を有する。
【００１９】
本明細書において使用される用語「試験化合物」もしくは「薬物候補」もしくは「調節物質」または文法的等価物は、天然または合成いずれかの任意の分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド(例えば、約5〜約25アミノ酸長、好ましくは約10〜20または12〜18アミノ酸長、好ましくは12、15、または18アミノ酸長)、有機低分子、多糖類、脂質、脂肪酸、ポリヌクレオチド、RNAiまたはsiRNA、asRNA、オリゴヌクレオチドなどを示す。試験化合物は、十分な範囲の多様性を与えるコンビナトリアルライブラリーまたはランダム化ライブラリーなど、試験化合物のライブラリーの形態であってよい。試験化合物は、融合相手、例えば、ターゲティング化合物、レスキュー化合物、二量体化化合物、安定化化合物、位置指定可能な化合物、および他の機能的部分に機能的に連結される。従来、有用な特性を有する新しい化学単位は、何らかの望ましい特性または活性、例えば阻害活性を有する試験化合物(「リード化合物」と呼ばれる)を同定し、リード化合物の変異体を作製し、かつそれらの変異体化合物の特性および活性を評価することによって作製される。しばしば、ハイスループットスクリーニング(HTS)法がこのような解析のために使用される。
【００２０】
「低分子阻害RNA」および「siRNA」という用語は、同義的に、RNA干渉(「RNAを介した干渉」またはRNAiとも呼ばれる)を媒介する短い二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを指す。RNAiは、相同な二本鎖低分子干渉RNA(siRNA)による個々のmRNAの標的化された破壊を介して機能する、高度に保存された遺伝子サイレンシング事象である(Fire, A. et al., Nature 391:806-811 (1998))。RNAiのメカニズムは、例えば、Bayne and Allshire, Trends in Genetics (2005) 21:370-73; Morris, Cell Mol Life Sci (2005) 62:3057-66; Filipowicz, et al., Current Opinion in Structural Biology (2005) 15:331-41において概説されている。
【００２１】
「活性」という用語は、当技術分野において公知であるポリペプチドの一般に認識された機能を意味する。例えば、表1に挙げたポリペプチドは、酵素、受容体、細胞接着分子、細胞内シグナル伝達介在物質などとして一般に認識された活性を有する。酵素活性アッセイ法、受容体シグナル伝達アッセイ法、受容体-リガンド結合アッセイ法、細胞遊走アッセイ法を含む、列挙したタンパク質の活性を測定するためのアッセイ法は、当技術分野において公知である。また、タンパク質の活性は、その発現、例えば、ポリペプチドの転写または翻訳と相関関係がある場合がある。
【００２２】
「促進する」という用語は、処理された細胞(組織または対象)において測定されるパラメーター(例えば、活性、発現、骨形成)が、未処理の細胞(組織または対象)と比較して増大することを意味する。また、処理前と処理後の同じ細胞または組織もしくは対象の比較をすることもできる。増大は、検出可能となるのに十分である。いくつかの態様において、処理された細胞における増大は、未処理の細胞と比較して、少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、3倍、4倍、またはそれ以上である。
【００２３】
「阻害する」という用語は、処理された細胞(組織または対象)において測定されるパラメーター(例えば、活性、発現、骨形成)が、未処理の細胞(組織または対象)と比較して減少することを意味する。また、処理前と処理後の同じ細胞または組織もしくは対象の比較をすることもできる。減少は、検出可能となるのに十分である。いくつかの態様において、処理された細胞における減少は、未処理の細胞と比較して、少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％であるか、または完全に阻害される。いくつかの態様において、測定されるパラメーターは、未処理の細胞と比較して、処理された細胞において検出することが不可能である(すなわち、完全に阻害されている)。
【００２４】
「幹細胞」とは、本明細書において使用される場合、多数の細胞型に分化することができる任意の哺乳動物の多能性細胞もしくは多分化能細胞または創始細胞もしくは前駆細胞を意味する。本発明の方法において使用するのに適した幹細胞には、骨芽細胞系の細胞、例えば骨芽細胞に分化することができるものが含まれる。本発明の方法において使用するのに適した多分化能細胞または前駆細胞には、例えば、間葉系幹細胞、前骨芽細胞、前脂肪細胞、および筋芽細胞が含まれる。
【００２５】
「分化する」または「分化」とは、本明細書において使用される場合、前駆細胞または創始細胞(すなわち幹細胞)が特定の細胞型、例えば骨芽細胞に分化するプロセスを意味する。分化した細胞は、それらの遺伝子発現および細胞表面タンパク質発現のパターンによって同定することができる。典型的には、骨芽細胞系の細胞は、例えば、アルカリホスファターゼ、I型コラーゲン、オステオカルシン、およびオステオポニン(osteoponin)を含む遺伝子を発現する。典型的には、骨芽細胞系の細胞は、例えば、Cbfa1/Runx2およびOsxを含む、骨特異的な転写因子を発現する(例えば、Olsen, et al, 2000 前記およびNakashima et al., Cell 108(1):17-29 (2002)を参照されたい)。骨芽細胞分化に関与しているその他の転写因子には、例えば、gsc、Dlx1、Dlx5、Msx1、Cart1、Hoxa1、Hoxa2、Hoxa3、Hoxb1、rae28、Twist、AP-2、Mf1、Pax1、Pax3、Pax9、TBX3、TBX4、TBX5、およびBrachyuryが含まれる(例えば、Olsen, et al, 2000 前記を参照されたい)。
【００２６】
「分化転換」とは、1つの系統の細胞型になるように予め拘束された前駆細胞または創始細胞(すなわち幹細胞)が、別の系統の特定の細胞型に分化する、例えば、前脂肪細胞が骨芽細胞に分化転換するか、または筋芽細胞が骨芽細胞に分化転換するプロセスを意味する。分化転換した細胞は、それらの遺伝子発現および細胞表面タンパク質発現のパターンによって同定することができる。典型的には、骨芽細胞系の細胞は、例えば、アルカリホスファターゼ、I型コラーゲン、オステオカルシン、およびオステオポニンを含む遺伝子を発現する。典型的には、骨芽細胞系の細胞は、例えば、Cbfa1/Runx2およびOsxを含む、骨特異的な転写因子を発現する(例えば、Olsen, et al, 2000 前記およびNakashima et al., 前記を参照されたい)。骨芽細胞分化に関与しているその他の転写因子には、例えば、gsc、Dlx1、Dlx5、Msx1、Cart1、Hoxa1、Hoxa2、Hoxa3、Hoxb1、rae28、Twist、AP-2、Mf1、Pax1、Pax3、Pax9、TBX3、TBX4、TBX5、およびBrachyuryが含まれる(例えば、Olsen et al, 2000 前記を参照されたい)。
【００２７】
「固体支持体」とは、骨形成の誘導に関連して本明細書において使用される場合、幹細胞をその上で培養することができる三次元の基材または平面状の面を意味する。固体支持体は、天然に存在する物質(すなわち、タンパク質ベース)または合成物質に由来してよい。例えば、天然に存在する物質をベースとする基材は、自家骨断片、または例えばClokie et al., J. Craniofac. Surg. 13(1):111-21 (2002)およびIsaksson, Swed. Dent. J suppl. 84:1-46 (1992)で記述されているような市販されている骨代用物から構成され得る。適切な合成基材は、例えば、米国特許第5,041,138号、第5,512,474号、および第6,425,222号に記載されている。例えば、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、またはポリ無水物など生分解性の人工ポリマーを固体支持体用に使用することができる。炭酸カルシウム、アラレ石、および多孔質の多孔質セラミックス(例えば、高密度ヒドロキシアパタイトセラミック)もまた、固体支持体中で使用するのに適している。ポリプロピレン、ポリエチレングリコール、およびポリスチレンなどのポリマーもまた、固体支持体中で使用することができる。三次元基材である固体支持体上で培養され、かつ分化させる細胞は、典型的には、基材の全表面、例えば内部表面および外部表面で増殖する。平面状である固体支持体上で培養され、かつ分化させる細胞は、典型的には、単層で増殖する。
【００２８】
「複数」という用語は、2つまたはそれ以上を意味する。
【００２９】
III.  骨形成を促進する作用物質をスクリーニングする方法
1種または複数種のポリペプチドと1種または複数種の作用物質との接触
本発明は、表1に挙げた少なくとも1種のポリペプチドと、表1に挙げた1種または複数種のポリペプチドを阻害するための候補物である1種または複数種の作用物質とを接触させる段階を含むスクリーニング方法を提供する。いくつかの態様において、複数の様々な作用物質、例えば、50種、100種、250種、500種、1000種、10,000種、またはそれ以上の様々な作用物質がスクリーニングされる。これらのポリペプチドは、所望に応じて、宿主細胞中にあるか、細胞抽出物中にあるか、または(例えば、部分的に、実質的に、もしくは完全に)精製されていてよい。
【００３０】
宿主細胞中にない表1のポリペプチドの阻害性物質をスクリーニングするアッセイ法は、例えば、結合活性または酵素活性を測定する場合に使用することができる。例えば、候補物質が天然の基質またはリガンドの結合を阻害する能力を測定することができる。他の態様において、候補物質が基質の酵素的消費または生成物の蓄積を阻害する能力を測定することができる。
【００３１】
いくつかの態様において、これらのアッセイ法は、アッセイ法の工程を自動化し、かつ任意の簡便な供給源に由来する化合物をアッセイ法に提供することによって、大規模なコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするように設計され、典型的には、(例えば、ロボットアッセイ法におけるマイクロタイター形式で、またはマイクロウェルプレート中で)並行して実行される。コンビナトリアルライブラリーは完全にランダムでよく、または1種もしくは複数種の有望なリード化合物に基づいたコア構造を含むメンバーを含んでもよい。コンビナトリアルライブラリーは、完全に合成でよく、または例えば、細菌、真菌、植物、昆虫、ならびに脊椎動物(例えば、ゼノパス属(Xenopus)(カエル)もしくはアングイラ属(Anguilla)(ウナギ))および非脊椎動物(例えば、オオバフンウニ属(Strongylocentrotus)(ウニ)もしくは軟体動物)を含む、天然に存在する供給源に由来するいくつかまたはすべてのメンバーを含んでよい。Boldi, Combinatorial Synthesis of Natural Product Based Libraries, 2006, CRC Pressも参照されたい。
【００３２】
1つの態様において、ハイスループットスクリーニング方法は、多数の潜在的な治療的化合物(潜在的な調節物質またはリガンド化合物)を含むコンビナトリアルケミカルライブラリーまたはペプチドライブラリーを提供する段階を含む。その場合、本明細書において説明するように、このような「コンビナトリアルケミカルライブラリー」または「リガンドライブラリー」を1つまたは複数のアッセイ法でスクリーニングして、所望の特徴的な活性を提示するライブラリーメンバー(特定の化学種またはサブクラス)を同定する。このようにして同定された化合物は、従来の「リード化合物」となり得るか、またはそれら自体が、潜在的治療物質もしくは実際の治療物質として使用され得る。
【００３３】
コンビナトリアルケミカルライブラリーは、反応物のようないくつかの化学的「構成単位」を組み合わせることにより、化学合成または生物学的合成のいずれかによって作製された様々な化学的化合物の集合である。例えば、ポリペプチドライブラリーのような直線状のコンビナトリアルケミカルライブラリーは、所与の化合物の長さ(すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸数)に対して起こり得るあらゆる方法で1組の化学的構成単位(アミノ酸)を組み合わせることによって形成される。このような化学的構成単位の組み合わせ混合によって、数百万の化学的化合物を合成することができる。
【００３４】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者には周知である。例えば、その開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,663,046号、第5,958,792号、第6,185,506号、第6,541,211号、第6,721,665号を参照されたい。このようなコンビナトリアルケミカルライブラリーには、ペプチドライブラリーが含まれるが、それに限定されるわけではない(例えば、米国特許第5,010,175号; Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991); Houghton, et al., Nature 354:84-88 (1991);およびCombinatorial Peptide Library Protocols, Cabilly, ed., 1997, Humana Pressを参照されたい)。化学的に多様なライブラリーを作製するための他の化学的性質(chemistry)も使用され得る。このような化学的性質には、非限定的に、以下のものが含まれる:ペプトイド(例えば、PCT公報WO91/19735)、コードされたペプチド(例えば、PCT公報WO93/20242)、ランダムなバイオオリゴマー(例えば、PCT公報WO92/00091)、ベンゾジアゼピン(例えば米国特許第5,288,514号)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー(diversomer)(Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993))、ビニローグポリペプチド(Hagihara et al, J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992))、グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチドミメティック(Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992))、小さな化合物ライブラリーの類似有機合成(Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661(1994); Combinatorial Libraries: Synthesis, Screening and Application Potential, Cortese, ed., 1995, Walter De Gruyter Inc;およびObrecht and Villalgordo, Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries, 1998, Elsevier Science Ltd)、オリゴカルバメート(Cho et al., Science 261:1303 (1993))、ならびに/またはペプチジルホスホネート(Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994))、核酸ライブラリー(下記のAusubel、下記のSambrook and Russell、および米国特許第6,955,879号、第6,841,347号、第6,830,890号、第6,828,098号、第6,573,098号、および第6,399,334号を参照されたい)、ペプチド核酸ライブラリー(例えば、米国特許第5,539,083号、第5,864,010号、および第6,756,199号を参照されたい)、抗体ライブラリー(例えば、Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996)およびPCT/US96/10287を参照されたい)、炭水化物ライブラリー(例えば、Liang et al., Science, 274:1520-1522 (1996);米国特許第5,593,853号;およびSolid Support Oligosaccharide Synthesis and Combinatorial Carbohydrate Libraries, Seeberger, ed., 2004, John Wiley & Sons (E-book)を参照されたい)、有機低分子ライブラリー(例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C&EN, January 18、33頁(1993)および米国特許第5,288,514号;イソプレノイド、米国特許第5,569,588号;チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号;ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号;ならびにモルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号などを参照されたい)。同様に、Combinatorial Library Design and Evaluation: Principles, Software Tools, and Applications in Drug Discovery, Ghose, et al., ed., 2001 , Marcel Dekker; Molecular Diversity and Combinatorial Chemistry: Libraries and Drug Discovery, Chaiken and Janda, ed., 1996, Oxford Univ Pr.;およびCombinatorial Library Methods and Protocols, English, ed., 2002, Humana Pressも参照されたい。
【００３５】
コンビナトリアルライブラリーを調製するための装置は市販されている(例えば、Advanced Chem Tech, Louisville K Y.、Symphony, Rainin, Woburn, MA.、Applied Biosystems, Foster City, CA.、Millipore, Bedford, MA、およびCaliper Life Sciences, Hopkinton, MAを参照されたい)。
【００３６】
いくつかの態様において、スクリーニングアッセイ法は、マルチウェルプレート(例えば、96ウェル、384ウェルなど)中で簡便に実施することができ、スクリーニングされる各作用物質は、単一のウェル中で個別に試験される。いくつかの態様において、2種またはそれ以上の候補物質が、単一の反応混合物中で試験される。
【００３７】
作用物質
スクリーニング方法で使用される作用物質は、例えば、低分子有機化合物(例えば、分子量10,000ダルトン未満、例えば、8000ダルトン、6000ダルトン、4000ダルトン、2000ダルトン未満)、脂質、糖、ポリペプチド、核酸(例えば、オリゴヌクレオチド、DNA、RNA、リボザイム、低分子阻害RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)など)でよい。典型的には、細胞と接触させる阻害性物質の量は、約0.05nM〜約50μM、例えば、約1nM〜約1μM、約0.1μM〜約50μM、または約0.05nM、0.1nM、0.5nM、1.0nM、1.5nM、25nM、100nM、1.0μM、10μM、または50μMである。
【００３８】
有機化合物
いくつかの態様において、1種または複数種の作用物質は、低分子有機化合物である。本質的には任意の化学的化合物を、表1の1種または複数種のポリペプチドの潜在的な阻害物質として本発明のアッセイ法においてスクリーニングすることができる。一般に、水溶液または有機(特にDMSOベースの)溶液中に溶解することができる化合物およびリピンスキ(Lipinski)の「5のルール」基準の範囲に入る化合物が最も好ましい。これらのアッセイ法は、アッセイ法の工程を自動化し、かつ任意の簡便な供給源に由来する化合物をアッセイ法に提供することによって大規模な化学物質ライブラリーをスクリーニングするように設計され、典型的には、(例えば、ロボットアッセイ法におけるマイクロタイター形式で、またはマイクロウェルプレート中で)並行して実行される。Sigma-Aldrich (St.Louis, Mo.)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs Switzerland)を含む、化学的化合物の多くの供給業者、ならびにとりわけ、Chembridge Corp. (San Diego, CA)、Discovery Partners International (San Diego, CA)、Triad Therapeutics (San Diego, CA)、Nanosyn (Menlo Park, CA)、Affymax (Palo Alto, CA)、ComGenex (South San Francisco, CA)、Tripos, Inc. (St.Louis, MO)、Reaction Biology Corp. (Malvern, PA)、Biomol Intl. (Plymouth Meeting, PA)、TimTec (Newark, DE)、およびAnalytiCon (Potsdam, Germany)を含む、そのままスクリーニングできる有機低分子ライブラリーの多数の提供者があることが理解されると考えられる。
【００３９】
ポリペプチドおよび抗体
いくつかの態様において、1種または複数種の作用物質は、ポリペプチド(8個〜30個のアミノ酸を有するペプチド、抗体などを含むが、それだけには限らない)である。スクリーニングのために有用なポリペプチドライブラリーは、多数の供給業者から、例えば、Cambridge Peptides(Cambridge, United Kingdom)、JPT Peptide Technologies(Berlin, Germany)、Bio-Synthesis(Lewisville, TX)、およびPrestwick Chemical(Washington, DC)から市販されている。ペプチドライブラリーを作製するための方法もまた、当技術分野において周知である。例えば、Synthetic Peptides: A User's Guide, Grant, ed., 2002, Oxford University Press; Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis, 2005, CRC Press; Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis, 2002, Oxford University Pressを参照されたい。ペプチド合成機は、例えば、TechniKrom, Inc.(Evanston, IL)、Applied Biosystems(Foster City, CA)、およびAdvanced Automated Peptide Protein Technologies (AAPPT)(Louisville, KY)から市販されている。
【００４０】
いくつかの態様において、1種または複数種の作用物質は、コンビナトリアルライブラリーに由来する、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、Fabフラグメント、単鎖抗体(scFv)、相補領域などを含む抗体である。スクリーニング目的のために有用なコンビナトリアル抗体ライブラリーは、MorphoSys(Martinsried/Planegg, Germany)から入手可能である。抗体ライブラリーを作製するための方法は、当技術分野において公知である。
【００４１】
阻害性オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、1種または複数種の作用物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、低分子阻害RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)を含む、阻害性オリゴヌクレオチドである。ランダム化されたオリゴヌクレオチドのライブラリーは、例えば、Integrated DNA Technologies (IDT)(Coralville, IA)、Ambion(Austin, TX)、およびQiagen(Valencia, CA)から市販されている。1つの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、表1に挙げた1種または複数種のポリペプチドの活性または発現レベルを抑制する。
【００４２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
「アンチセンス」オリゴヌクレオチドは、アンチセンスRNAが特異的に対象とする特定のmRNA分子に対して、そのアンチセンスRNAとmRNAとの分子ハイブリダイゼーションを引き起こすのに十分に相補的であり、その結果、mRNAの翻訳が阻害されるRNA配列ならびにそれをコードするDNA配列に対応する。このようなハイブリダイゼーションは、インビトロ条件およびインビボ条件下で起こり得る。アンチセンス分子は、アンチセンスRNAが標的遺伝子(またはmRNA)にハイブリダイズでき、かつ作用がスプライシング、転写、または翻訳のレベルにあるかどうかに関わらず標的遺伝子の発現を阻害できるのに十分な、標的遺伝子に対する相補性を有していなければならない。いくつかの態様において、相補的アンチセンス配列は、所望に応じて、約15〜30ヌクレオチド長、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドであるか、またはより長いか、もしくはより短い。本発明のアンチセンス構成要素は、コード配列、3'もしくは5'の非翻訳領域、または他のイントロン配列を含む標的cDNAのいくつかの部分のうちのいずれかに、または標的mRNAにハイブリダイズ可能でよい。
【００４３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、コード配列、3'もしくは5'の非翻訳領域、または他のイントロン配列を含む標的DNAのいくつかの部分のうちのいずれかに、または標的mRNAにハイブリダイズ可能な配列を含み得る。
【００４４】
低分子阻害RNAオリゴヌクレオチド
siRNA技術は、真核細胞において発生し得る配列特異的な転写後遺伝子抑制のプロセスに関する。一般に、このプロセスは、特定の配列のmRNAの分解を含み、この分解は、その配列に相同な2本鎖RNA(dsRNA)によって誘導される。siRNAは、比較的短い相同dsRNAの導入または発現によってもたらすことができる。スクリーニング目的のために、転写レベルまたは翻訳レベルのいずれかで発現の阻害を実施するために使用される二本鎖オリゴヌクレオチドは、任意の好都合な長さのものでよい。siRNA分子は、典型的には、約15〜約30核酸長、例えば、約19〜25核酸長、例えば、約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30核酸長である。任意で、dsRNAオリゴヌクレオチドは3'オーバーハング末端を含んでよい。例示的な2-ヌクレオチド3'オーバーハングは、任意のタイプのリボヌクレオチド残基から構成されてよく、かつ2'-デオキシチミジン残基から構成されてよく、これにより、RNA合成のコストは減り、細胞培養培地中およびトランスフェクトされた細胞内部におけるsiRNAのヌクレアーゼ耐性が増強され得る(Elbashi et al., 2001, Nature 411:494-8を参照されたい)。
【００４５】
50、75、100、もしくはさらに500塩基対またはそれ以上の、より長いdsRNAもまた、本発明の特定の態様において使用することができる。阻害を実施するための例示的なdsRNA濃度は、約0.05nM、0.1nM、0.5nM、1.0nM、1.5nM、25nM、または100nMであるが、処理される細胞の性質、遺伝子標的、および当業者には容易に識別可能な他の因子に応じて他の濃度を使用することもできる。
【００４６】
例示的なdsRNAは、化学的に合成するか、または適切な発現ベクターを用いてインビトロもしくはインビボにおいて作製することができる。例示的な合成RNAには、当技術分野において公知の方法を用いて化学的に合成した21種のヌクレオチドRNAが含まれる。合成オリゴヌクレオチドは、好ましくは、当技術分野において公知の方法を用いて脱保護され、かつゲル精製される(例えば、Elbashir, et al., 2001 , Genes Dev. 15:188-200を参照されたい)。あるいは、dsRNAは、哺乳動物発現ベクターから転写させることができる。単一のRNA標的は、哺乳動物細胞において使用するために適切なプロモーターの下流に起こり得る両方の向きで置かれると、標的の両方の鎖を転写して、所望の標的配列のdsRNAオリゴヌクレオチドを生じると考えられる。上記のRNA種のいずれも、標的核酸中に表れる核酸配列の一部分を含むように設計される。
【００４７】
siRNAオリゴヌクレオチドの設計において使用される特定の配列は、標的の発現遺伝子メッセージ内に含まれるヌクレオチドの任意の連続した配列でよい。当技術分野において公知のプログラムおよびアルゴリズムを用いて、適切な標的配列を選択することができる。ambion.comでAmbion社のウェブサイトを参照されたい。さらに、最適な配列は、指定された一本鎖核酸配列の二次構造を予測するために設計されたプログラムを用いて、折り畳まれたmRNAの露出した一本鎖領域中に存在する可能性が高い配列の選択を可能にすることによって、選択することができる。適切なsiRNAオリゴヌクレオチドを設計するための方法および組成物は、例えば、その内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,251,588号において見出すことができる。
【００４８】
リボザイム
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒することができる酵素的RNA分子である。リボザイム分子の組成は、好ましくは、標的mRNAに相補的な1つまたは複数の配列、およびmRNA切断を担う周知の触媒配列または機能的に等価な配列を含む(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,093,246号を参照されたい)。また、標的mRNA転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子を用いて、対象の標的mRNAの翻訳を妨げることもできる。
【００４９】
mRNAを部位特異的な認識配列の位置で切断するリボザイムを用いて標的mRNAを破壊することができ、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的mRNAと相補的塩基対を形成する隣接領域によって規定される位置でmRNAを切断する。好ましくは、標的mRNAは、2つの塩基からなる以下の配列、すなわち5'-UG-3'を有する。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および作製は、当技術分野において周知である。
【００５０】
遺伝子ターゲティングリボザイムは、2つの領域に相補的なハイブリダイズ領域を必ず含む。これら2つの領域の長さは、標的mRNAのそれぞれ少なくとも5個、および好ましくは、それぞれ6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、または20個の連続したヌクレオチドである。さらに、リボザイムは、標的センスmRNAを自己触媒的に切断する、高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性も有する。
【００５１】
アンチセンスに関しては、siRNAまたはリボザイムオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが使用され得る。リン酸ジエステル結合ならびに複素環または糖の改変により、効率が上昇する場合がある。ホスホロチオエートは、リン酸ジエステル結合を改変するために使用される。N3'-P5'ホスホルアミデート結合は、ヌクレアーゼに対してオリゴヌクレオチドを安定化させ、かつRNAへの結合を増大させると説明されている。ペプチド核酸(PNA)結合は、リボースおよびリン酸ジエステル主鎖の完全な代用品であり、ヌクレアーゼに対して安定であり、RNAに対する結合親和力を増大させ、かつRNアーゼHによる切断を起こさせない。また、その基本構造は、アンチセンス構成要素としての最適化を可能にし得る改変を受け入れやすい。複素環の改変に関しては、いくつかの複素環改変が、RNアーゼH活性を妨害せずにアンチセンス効果を増強することが判明している。このような改変の例は、C-5チアゾール改変である。最後に、糖の改変もまた、検討することができる。2'-O-プロピルリボース改変および2'-メトキシエトキシリボース改変は、細胞培養およびインビボにおいてオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対して安定化する。
【００５２】
阻害性オリゴヌクレオチドは、直接的なトランスフェクションまたは発現ベクターを介したトランスフェクションおよび発現によって細胞に送達することができる。適切な発現ベクターには、哺乳動物発現ベクターおよびウイルスベクターが含まれ、これらのベクターの中に、宿主細胞におけるアンチセンスRNAの発現をもたらすプロモーターを含む適切な調節配列と共に、阻害性オリゴヌクレオチドがクローニングされる。適切なプロモーターは、構成的プロモーターまたは発生特異的プロモーターでよい。トランスフェクション送達は、当技術分野において公知のリポソームトランスフェクション試薬(例えば、Xtremeトランスフェクション試薬、Roche(Alameda, CA);リポフェクタミン製剤、Invitrogen(Carlsbad, CA))を用いて達成することができる。陽イオン性リポソーム、レトロウイルスベクターを介した送達および直接送達が効率的である。別の可能な送達様式は、標的細胞の細胞表面マーカーに対する抗体を用いたターゲティングである。
【００５３】
細胞
いくつかの態様において、表1の1種または複数種のポリペプチドは、宿主細胞中に存在する。表1の1種または複数種のポリペプチドの活性は、内因的にまたは組換えによってそれらの1種または複数種のポリペプチドを発現することができる任意の細胞において測定することができる。これらの細胞は、原核細胞または真核細胞でよい。例示的な細胞には、細菌細胞(例えば、大腸菌(E. coli)、バチルス(Bacillus))、植物細胞(例えば、シロイヌナズナ(Arabidopsis)、アブラナ属(Brassica)、タバコ)、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が含まれる。様々な宿主細胞系におけるポリペプチドの組換え発現は、当技術分野において公知である。例えば、SambrookおよびRussell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Cloning, 1987-2006, John Wiley Interscienceを参照されたい。表1の1種または複数種のポリペプチドの組換え発現のための適切な宿主細胞および発現ベクターは、例えば、Invitrogen(Carlsbad, CA)、Promega(Madison, WI)、およびQiagen(Valencia, CA)から市販されている。
【００５４】
いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、幹細胞、典型的には、間葉系幹細胞(MSC)、前骨芽細胞、または他の系統の細胞、例えば、前脂肪細胞もしくは筋芽細胞などでよい。ヒトおよび動物のMSCを単離し、分化させるための方法は説明されている(例えば、米国特許第5,942,225号および第5,486,359号、ならびにPittenger et al., Science 284:143 (1999)を参照されたい)。
【００５５】
間葉系幹細胞(「MSC」)は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、造血支持間質を含む間質、および腱を含む間葉系細胞系に分化することができ、かつ修復および再生において重要な役割を果たしている(例えば、Olsen, 2000, Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 16:191を参照されたい)。MSCは、例えば米国特許第5,643,736号に説明されているような独特なモノクローナル抗体を用いて同定される特異的な細胞表面マーカーによって同定される。
【００５６】
ヒト間葉系幹細胞(MSC)は、骨髄または他のMSC供給源中の他の細胞から多能性間葉系幹細胞を単離することによって得ることができる。骨髄細胞は、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨、または他の骨髄腔から得ることができる。ヒト間葉系幹細胞の他の供給源には、胎児卵黄嚢、胎盤、さい帯、胎児および若者の皮膚、血液、脂肪組織、および筋衛星細胞が含まれる。典型的には、間葉系幹細胞を含む組織標本に由来する細胞は、(1)分化させずに、間葉系幹細胞の増殖を促進し、かつ(2)基材表面に間葉系幹細胞のみが選択的に接着することを可能にする、増殖因子を含む増殖培地中で培養される。適切な時間、細胞を培養した後、非接着性の物質を基材表面から除去し、それによって、間葉系幹細胞の拡大した集団を得ることができる。したがって、均一なMSC集団は、造血細胞または分化した間葉細胞のいずれかに関連したマーカーを含まない接着性の骨髄細胞または骨膜細胞のポジティブ選択によって得ることができる。
【００５７】
骨芽細胞系の細胞に分化させる細胞は、任意の適切な哺乳動物に由来してよい。例えば、これらの細胞は、例えば、マウス、ラット、モルモット、およびウサギを含む齧歯動物、例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ、雌ウシ、およびヤギなどの非齧歯類哺乳動物、例えば、チンパンジーおよびヒトを含む霊長類から得ることができる。分化させる細胞は、初代細胞でよく、または培養状態で維持された細胞でもよい。これらの細胞が培養状態で維持されている場合、それらは、例えば、培養状態での第5代継代と第15代継代の間に、例えば本発明の化合物/組成物と接触させる。本発明の方法において使用するために細胞の初代培養物を確立するための技術および方法は、当業者には公知である(例えば、Humason, Animal Tissue Techniques, 4th Edition, W.H. Freeman and Company (1979)、およびRicciardelli, et al., (1989) In Vitro Cell Dev. Biol. 25:1016を参照されたい)。
【００５８】
一般的な培養方法
表1の1種または複数種のポリペプチドを発現する宿主細胞の培養では、細胞培養分野での慣用技術を利用する。細胞培養の適切な方法および条件は、公知の方法論を用いて当業者が決定することができる(例えば、Freshney et al., Culture of Animal Cells (4th Edition, 2000); Ausubel, et al, 前記; Sambrook and Russell, 前記; Insect Cell Cultures: Fundamental and Applied Aspects, Vlak, et al., eds., 1996, Kluwer Academic Pub.;およびEvans, et al., Plant Cell Culture, 2003, Taylor & Francisを参照されたい)。一般に、細胞培養環境は、細胞増殖のための基材、細胞密度および細胞収縮(contract)、気相、培地、ならびに温度などの因子の考慮を含む。
【００５９】
プラスチック皿、フラスコ、またはローラーボトルを用いて、本発明の方法に従って細胞を培養することができる。適切な培養容器には、例えば、マルチウェルプレート、ペトリ皿、組織培養管、フラスコ、およびローラーボトルなどが含まれる。
【００６０】
ポリペプチドの活性レベルまたは発現レベルの測定
表1に挙げたポリペプチドのいずれかの活性は、ポリペプチドの公知の機能に基づいた公知の方法に従って測定することができる。例えば、公知の酵素活性を有するポリペプチド(例えば、アデニル酸シクラーゼ、アデノシンキナーゼ、セリン/トレオニンキナーゼ、ホスホリパーゼ)の場合、酵素反応における基質の消費および/または生成物の蓄積を測定することができる。公知の受容体であるポリペプチド(例えば、嗅覚受容体、インテグリン、カリウムチャネル)の場合、下流の細胞内シグナル伝達またはリガンドへの結合を測定することができる。このようなアッセイ法は、当技術分野において公知である。
【００６１】
表1に挙げたポリペプチドの発現レベルは、当技術分野において周知であり、本明細書において説明する方法に従って測定することができる。発現レベルは、転写レベルおよび/または翻訳レベルで測定することができる。翻訳レベルでは、表1に挙げた1種または複数種のタンパク質の発現は、特定のタンパク質またはその断片に選択的に結合する抗体を用いた、免疫組織化学的染色、ウェスタンブロット法、およびELISAなどを含むイムノアッセイ法によって測定することができる。イムノアッセイ法におけるタンパク質特異的な抗体を用いたタンパク質検出は、当技術分野において公知である(例えば、Harlow & Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998); Coligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology (1991-2006); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (3rd ed. 1996);およびKohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)を参照されたい)。転写レベルでは、mRNAは、例えば、増幅、例えば、PCR、LCR、またはハイブリダイゼーションアッセイ法、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、RNアーゼプロテクション、またはドットブロット法よって検出することができ、これらの方法はすべて当技術分野において公知である。タンパク質またはmRNAのレベルは、例えば、直接的にまたは間接的に標識された検出物質、例えば、蛍光標識または放射能標識された核酸、放射能標識または酵素標識された抗体を用いて検出される。これらのアッセイ法は当業者には周知であり、例えば、Ausubel, et al., eds., Current Protocols In Molecular Biology (1987-2006)に記載されている。
【００６２】
転写レベルの調節(例えば、上昇または低下)もまた、プロモーター-レポーター遺伝子融合構築物を用いて測定することができる。例えば、表1のポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター領域は、検出可能なシグナルを生じるポリペプチドのコード配列に融合させる(すなわち、機能的に連結する)ことができる。レポーター構築物は、当技術分野において周知である。例示的なレポーター配列には、例えば、蛍光性タンパク質(例えば、緑色、赤色、黄色)、リン光性タンパク質(例えばルシフェラーゼ)、抗生物質耐性タンパク質(例えばβ-ラクタマーゼ)、酵素(例えばアルカリホスファターゼ)が含まれる。
【００６３】
ポリペプチドの活性を阻害する作用物質の選択
表1に挙げた1種または複数種のポリペプチドのポリペプチド活性の阻害は、(細胞の内側または外側で)1種または複数種の候補物質と接触させていない同じポリペプチドのポリペプチド活性と比較することによって測定することができる。阻害されたポリペプチド活性は、処理した試料(または反応混合物)において、未処理の試料と比較して、例えば、少なくとも約10％、25％、または50％少ないと考えられる。いくつかの態様において、ポリペプチド活性は、未処理の試料におけるポリペプチド活性と比較して、少なくとも約60％、70％、80％、90％阻害されるか、またはさらに完全に阻害され得る。
【００６４】
同様に、表1に挙げた1種または複数種のポリペプチドの転写レベルまたは翻訳レベルでのポリペプチド発現の阻害は、1種または複数種の候補物質と接触させていない細胞における同じポリペプチドのポリペプチド発現レベルと比較することによって測定することができる。いくつかの態様において、阻害されたポリペプチド発現レベルは、処理した細胞において、未処理の細胞と比較して、例えば、少なくとも約10％、25％、または50％少ないと考えられる。いくつかの態様において、ポリペプチド発現レベルは、未処理の細胞におけるポリペプチド発現レベルと比較して、少なくとも約60％、70％、80％、90％阻害されるか、またはさらに完全に阻害され得る。
【００６５】
他の態様において、1種または複数種の試験物質の存在下でのポリペプチドの活性または発現の阻害は、公知の阻害物質の存在下でのポリペプチドの活性または発現レベルと比較される。この場合、ポリペプチドの活性または発現レベルが同じまたは同様である場合、それらの1種または複数種の試験物質が阻害物質であることが示唆される。
【００６６】
いくつかの態様において、阻害性物質の選択性または特異性は、表1のポリペプチドのどれも組換えによっても内因的にも発現しない細胞にその作用物質を投与することによって測定することができる。表1のポリペプチドを特異的に阻害する作用物質は、一般に、そのポリペプチドを発現しない細胞においては検出可能な応答を全く導き出さないと考えられる。
【００６７】
骨形成の検出
インビトロまたはインビボにおける骨形成の誘導は、当技術分野において公知である任意の方法を用いて検出することができる。例えば、骨芽細胞に特異的なタンパク質の発現を検出すること、骨特異的な転写因子の発現を検出すること、および骨密度の変化を検出することによる。骨芽細胞特異的なタンパク質には、例えば、アルカリホスファターゼ(ALP)、I型コラーゲン、オステオカルシン、およびオステオポニンが含まれる(例えば、Olsen et al., Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 16:191 (2000)を参照されたい)。いくつかの態様において、アルカリホスファターゼの発現は、骨形成の指標として検出される。骨特異的な転写因子には、例えば、Cbfa1/Runx2、gsc、Dlx1、Dlx5、Msx1、Cart1、Hoxa1、Hoxa2、Hoxa3、Hoxb1、rae28、Twist、AP-2、Mf1、Pax1、Pax3、Pax9、TBX3、TBX4、TBX5、およびBrachyuryが含まれる(例えば、Olsen et al, 2000、前記を参照されたい)。典型的には、Cbfa1/Runx2の発現は、骨形成の指標として検出される。
【００６８】
骨芽細胞に特異的なタンパク質の検出
骨芽細胞に特異的なタンパク質の発現は、骨芽細胞に特異的なタンパク質またはmRNAのレベルを測定することによって検出することができる。骨芽細胞に特異的な特定のタンパク質のレベルは、骨芽細胞に特異的な特定のタンパク質またはその断片に選択的に結合する抗体を用いた、免疫組織化学的染色、ウェスタンブロット法、およびELISAなどを含むイムノアッセイ法によって簡便に測定することができる。イムノアッセイ法におけるタンパク質特異的な抗体を用いたタンパク質検出は、当業者には公知である(例えば、Harlow & Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998); Coligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology (1991-2006); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (3rd Ed. 1996);およびKohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)を参照されたい)。mRNAの測定の場合、増幅、例えば、PCR、LCR、またはハイブリダイゼーションアッセイ法、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、RNアーゼプロテクション、ドットブロット法が好ましい。タンパク質またはmRNAのレベルは、例えば、直接的にまたは間接的に標識された検出物質、例えば、蛍光標識または放射能標識された核酸、放射能標識または酵素標識された抗体を用いて検出される。これらのアッセイ法は当業者には周知であり、例えば、Ausubel, et al., eds., Current Protocols In Molecular Biology (1987-2006)に記載されている。
【００６９】
典型的には、骨芽細胞に特異的なタンパク質であるアルカリホスファターゼの発現が、分化した骨芽細胞を検出するために使用される。アルカリホスファターゼ(ALP)の発現は、骨形成と相関関係がある。ALPは、無機ピロリン酸を加水分解してホスフェートにし、かつ骨基質におけるヒドロキシアパタイト結晶の形成を促進する。ALPの非活性化変異は、石灰化が不十分な骨および頻繁な骨折を特徴とする骨軟化症を引き起こし、このことから、ALPが骨形成において重要な役割を果たしていることが示唆される(例えば、Hessle, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:9445(2002)を参照されたい)。ALPは、活性が高く、かつ安定な酵素であるため、その酵素活性の直接アッセイ法は簡便である。さらに、細胞の直接的な組織化学的染色を簡便に使用して、ALPを検出することもできる。
【００７０】
骨形成はまた、細胞外基質(ECM)石灰化を検出することによって検出することもできる。ECM石灰化に付随するリン酸カルシウム沈着物は、本明細書において説明するように、アリザリンレッド溶液で細胞を染色することによって検出することができる。次いで、レッド染色の程度および強度を評価することができる。
【００７１】
酵素活性
ALP活性の直接アッセイ法の場合、細胞をマルチウェルプレート(例えば、96ウェル、384ウェル、1536ウェル)に播種し、かつ単独で、または他の増殖因子(例えばBMP-4)と共に、適切な量の1種または複数種の候補物質で処理し、次いで、5％CO2中、37℃でインキュベートすることができる。適切なインキュベーション期間の後、培地を除去し、溶解緩衝液を各ウェルに添加する。溶解緩衝液中での適切なインキュベーション期間の後、アルカリホスファターゼ基質溶液(例えば、2'-[2'-ベンゾチアゾイル]-6'-ヒドロキシベンゾチアゾールホスフェート(BBTP))を各ウェルに添加する。室温での適切なインキュベーション期間の後、当技術分野において公知の方法を用いて、これらのプレートをプレートリーダー上で読み取る。
【００７２】
免疫組織化学的検出
ALPを検出するための細胞の直接的な免疫組織化学的染色の場合、細胞をマルチウェルアッセイプレート中に適切な密度で播種し、かつ単独で、または他の増殖因子(例えばBMP-4)と共に、適切な量の候補物質で適切な時間処理する。次いで細胞を10％ホルマリン溶液中で固定する。固定した細胞を再び洗浄し、かつ当業者に公知の方法を用いて(例えば、Harlow & Lane、前記;Coligan、前記;Goding、前記;およびKohler & Milstein、前記を参照されたい)、ALPに特異的な反応物(例えば、ALPに特異的な抗体または比色定量用のALP基質)で染色する。細胞の写真画像を撮影し、画像から手作業でALP陽性細胞を計数する。
【００７３】
骨特異的な転写因子の検出
骨特異的な転写因子の発現は、レポーター遺伝子アッセイ法を用いて検出することができる。これらのアッセイ法は当業者には周知であり、例えば、Ausubel, et al., 前記に記載されている。骨特異的な転写因子Cbfa1/Runx2の発現レベルの検出を用いて、骨形成を検出することができる。Cbfa1/Runx2は、骨芽細胞分化において不可欠な役割を果たしており、Cbfa1/Runx2遺伝子を欠いているトランスジェニックマウスは、骨形成の減少が原因で、誕生後間もなく死亡する(例えば、Ducy et al., Cell 89:747 (1997)およびKomori et al., Cell 89:755 (1997)を参照されたい)。
【００７４】
例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、蛍光性タンパク質(例えば、緑色、黄色、紫色)、またはβ-ガラクトシダーゼを含むレポーター遺伝子が、レポーター遺伝子アッセイ法において使用され得る。レポーター構築物は、典型的には、細胞中に一過性または安定にトランスフェクトさせる。関連する遺伝子(例えばCbfa1/Runx2)のプロモーター領域は、典型的には、適切なプライマーを用いたPCRによって増幅する。結果として生じるPCR産物を、適切なクローニングベクター中に挿入し、増幅し、かつ配列決定する。結果として生じるプラスミドを適切な制限酵素で消化し、結果として生じる断片を、レポーター遺伝子を含むベクター中に挿入する。
【００７５】
一過性にトランスフェクトされた細胞
一過性にトランスフェクトされた細胞を用いたレポーター遺伝子アッセイ法の場合、これらの細胞をマルチウェルプレート中の増殖培地中に適切な密度(例えば、約30,000細胞/ウェル)で播種し、かつ適切な時間、インキュベートすることができる。プラスミドDNAは、適切なトランスフェクション試薬を用いて、細胞中にトランスフェクトする。適切な時間(例えば、約8時間)の後、トランスフェクトされた細胞をマルチウェルアッセイプレート(例えばCorning)中に播種し、かつ適切な量の候補物質で処理する。適切な期間(例えば、数日間、例えば、2日間、3日間、または4日間)、これらの細胞をインキュベートし、次いで、当業者に公知の方法を用いて、細胞中のレポーター遺伝子の活性を分析する。
【００７６】
安定にトランスフェクトされた細胞
安定にトランスフェクトされた細胞を用いたレポーター遺伝子アッセイ法の場合、これらの細胞をマルチウェルプレート中の増殖培地中に適切な密度(例えば、約30,000細胞/ウェル)で播種し、かつ適切な時間、インキュベートすることができる。適切なトランスフェクション試薬を用いて、適切な量のレポータープラスミドおよび選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)を含むベクターをこれらの細胞に同時トランスフェクトする。適切なインキュベーション期間の後、細胞を培養皿に播種し、かつ適切な量の抗生物質を培地に添加する。適切な間隔で、新鮮な抗生物質を添加する。抗生物質に耐性なコロニーを集めて、安定にトランスフェクトされた細胞を得る。トランスフェクトされた細胞をマルチウェルアッセイプレート(例えばCorning)中に播種し、かつ適切な量の候補物質で処理する。適切な期間(例えば、数日間、例えば、2日間、3日間、または4日間)、これらの細胞をインキュベートし、次いで、当業者に公知の方法を用いて、細胞中のレポーター遺伝子の活性を分析する。
【００７７】
本発明のスクリーニング方法は、ハイスループットなスクリーニングに好適である。マルチウェルプレート(例えば、96ウェル、192ウェル、384ウェル、768ウェル、1536ウェルなど)および自動化システムを用いて、多数の作用物質を同時にスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法で有用な自動化システムは、例えば、Thermo LabSystems(Waltham, MA); Caliper Life Science(Hopkinton, MA); Beckman Coulter, Inc.(Fullerton, CA);およびInvitrogen Corp.(Carlsbad, CA)から購入可能である。
【００７８】
IV.  siRNAオリゴヌクレオチドを細胞に送達する方法
表1に挙げた1種または複数種のポリペプチドを阻害する1種または複数種のsiRNAオリゴヌクレオチドを含む組成物を哺乳動物細胞に送達して、骨形成を促進することができる。当技術分野において周知であり、かつ本明細書において説明する方法を用いて、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて、これらの細胞と、1種または複数種のsiRNAオリゴヌクレオチドとを接触させることができる。
【００７９】
いくつかの態様において、哺乳動物細胞と、表1に挙げた1種または複数種のポリペプチドの発現を阻害する1種または複数種のsiRNA配列を含む組成物とを接触させる。1つの態様において、哺乳動物細胞と、GNAS(ヒトGNAS複合座、転写物変異体3(2007年8月9日現在)、Gsのαサブユニットのアイソフォームb、NM_080426)、ADCY8(アデニル酸シクラーゼ8、NM_001115)、ADK(アデノシンキナーゼ、NM_001123)、P2RY11(プリン受容体P2Y、Gタンパク質共役、11、NM_002566)、TBX3(Tボックス3または尺側-乳腺(ulnar mammary)症候群、NM_005996)、BIRC4(バキュロウイルスIAPリピート含有4、NM_001167)、BCL2L2(BCL2様2、NM_004050)、SLC12A2(溶質運搬体ファミリー12、メンバー2、NM_001046)、KCNT1(カリウムチャネル、サブファミリーT、メンバー1、XM_029962.2)、GBDR1(推定上、グリア芽細胞腫細胞分化関連、NM_016172)、DUSP6(2重特異性ホスファターゼ6、NM_001946)およびMJD(マシャド・ジョセフ病またはアタキシン3、NM_004993)からなる群より選択される1種または複数種のポリペプチドの発現を阻害する1種または複数種のsiRNAオリゴヌクレオチドを含む組成物とを接触させる。いくつかの態様において、哺乳動物細胞と、表1に挙げた1種または複数種のsiRNAオリゴヌクレオチド配列を含む組成物とを接触させる。
【００８０】
細胞にインビトロ送達またはインビボ送達する場合、組成物は、例えば、二本鎖またはヘアピンの立体配置の1種または複数種のsiRNA分子を、直接的なトランスフェクションのために含んでよい。あるいは、組成物は、1種または複数種のベクター、例えば二本鎖またはヘアピンの立体配置の1種または複数種のsiRNA配列を発現する、例えば、プラスミド哺乳動物発現ベクターまたはウイルス発現ベクターを含んでよい。
【００８１】
トランスフェクションのために、(ベクター内またはベクター外に)1種または複数種のsiRNA分子を含む組成物は、対象に投与するためのリポソームを含む送達ビヒクル、担体、および希釈剤、ならびにそれらの塩を含んでよく、かつ/または薬学的に許容される製剤中に存在してもよい。核酸分子を送達するための方法は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み入れられるGilmore, et al., Curr Drug Deliveiy (2006) 3:147-5およびPatil, et al., AAPS Journal (2005) 7:E61-E77に記載されている。siRNA分子の送達もまた、例えば、各開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、第2006/0019912号、第2006/0014289号、第2005/0239687号、第2005/0222064号、および第2004/0204377号を含む、いくつかの米国特許公報に記載されている。核酸分子は、当業者に公知の様々な方法によって細胞に投与することができ、これらの方法には、リポソームへの封入、イオン導入によるもの、エレクトロポレーションよるもの、または生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン(例えば、Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; Wang et al., 国際公開PCT公報WO03/47518およびWO03/46185を参照されたい)、乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)およびPLCA マイクロスフェア(例えば、米国特許第6,447,796号および米国特許出願公開第2002/130430号を参照されたい)、生分解性ナノカプセル、および生体接着性マイクロスフェアを含む他のビヒクル中への組み込みによるもの、もしくはタンパク質性ベクターによるもの(O'HareおよびNormand、国際公開PCT公報WO00/53722)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。別の態様において、本発明の核酸分子はまた、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、例えば、ポリエチレンイミン-ポリエチレングリコール-N-アセチルガラクトサミン(PEI-PEG-GAL)誘導体またはポリエチレンイミン-ポリエチレングリコール-トリ-N-アセチルガラクトサミン(PEI-PEG-triGAL)誘導体などと共に製剤化されるか、または複合されてよい。
【００８２】
本発明と共に使用されるリポソームトランスフェクション試薬の例には、例えば、CellFectin(カチオン性脂質N,NI, NII, NIII-テトラメチル-N,NI,NII,NIII-テトラパルミット-y-スペルミンおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)の1:1.5(モル濃度比)のリポソーム製剤(GIBCO BRL);Cytofectin GSV(カチオン性脂質およびDOPEの2:1(モル濃度比)のリポソーム製剤(Glen Research);DOTAP(N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)-N,N,N-トリ-メチルアンモニウムメチルスルフェート)(Boehringer Manheim);Lipofectamine(ポリカチオン性脂質DOSPAおよび中性脂質DOPEの3:1(モル濃度比)のリポソーム製剤(GIBCO BRL);ならびに(5)siPORT(Ambion);HiPerfect(Qiagen);X-treme GENE(Roche);RNAicarrier(Epoch Biolabs)およびTransPass(New England Biolabs)が含まれる。
【００８３】
いくつかの態様において、siRNA配列は、哺乳動物発現ベクター中にクローニングされて細胞中に送達される。siRNA発現に適した哺乳動物発現ベクターは、例えば、Ambion(Austin, TX)(例えばpSilencerベクター)、Promega(Madison, WI)(例えば、GeneClip、siSTRIKE、SiLentGene)、Invitrogen(Carlsbad, CA)、InvivoGen(San Diego, CA)、およびImgenex(San Diego, CA)から市販されている。典型的には、siRNA分子を転写するための発現ベクターは、U6プロモーターを有する。
【００８４】
いくつかの態様において、siRNA配列は、ウイルス発現ベクター中にクローニングされて細胞中に送達される。siRNA分子を細胞に送達するのに適したウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、およびレトロウイルスベクター(レンチウイルスのベクターを含む)が含まれる。siRNAオリゴヌクレオチドを送達し、かつ発現させるために開発されたウイルスベクターは、例えば、GeneDetect(Bradenton, FL)、Ambion(Austin, TX)、Invitrogen(Carlsbad, CA)、Open BioSystems(Huntsville, AL)、およびImgenex(San Diego, CA)から市販されている。
【００８５】
V.  投与および処方
表1に挙げた1種または複数種のポリペプチドの活性および/または発現を阻害する作用物質(例えば、siRNA、有機化合物、ポリペプチド)を用いて、哺乳動物細胞において骨形成を誘導することができる。哺乳動物細胞と阻害性物質とを接触させると、その哺乳動物細胞は、骨芽細胞系の細胞に分化する。哺乳動物細胞は、インビボ、エクスビボ(両方とも後述する)またはインビトロ(前述)のいずれかで、阻害性物質(またはその組成物)と接触させることができる。
【００８６】
骨形成のインビボ誘導
阻害性物質ならびにそれらの組成物を簡便に使用して、インビボにおいて骨形成を誘導することができる。本発明の化合物および組成物は、個体、例えば、ヒトのような哺乳動物に、骨芽細胞系の細胞への哺乳動物細胞の分化を誘導するのに有効な量で投与される。骨形成を誘導する能力があるため、これらの阻害性物質は、骨粗しょう症、くる病、骨軟化症、マクキューン・オールブライト症候群、およびパジェット病を含む、骨の障害および疾患を治療するために有用である。1つの態様において、本発明の化合物および組成物は、骨粗しょう症を治療するために使用される。1つの態様において、本発明の化合物および組成物は、骨密度を増加させるために使用される。1つの態様において、本発明の化合物および組成物は、骨密度を増加させ、かつ骨減少を軽減するために使用される。いくつかの態様において、薬学的組成物は、表1に挙げたものより選択される1種または複数種のsiRNAオリゴヌクレオチドを含む。
【００８７】
当業者は、本発明の組成物が、単独で、または骨形成を誘導するための他の化合物および治療計画と組み合わせて使用され得ることを理解するであろう。例えば、阻害性物質は、骨形成タンパク質(「BMP」)または骨のリモデリングサイクルに影響を及ぼす他の吸収抑制薬剤と併用して投与することができる。適切な骨形成タンパク質には、例えば、BMP-2、BMP-4、およびBMP-7が含まれる。適切な吸収抑制薬剤には、例えば、ビスホスホネート製剤、例えば、アレンドロン酸ナトリウムおよびリセドロン酸ナトリウムなど;例えば、カルシトニンおよびエストロゲンを含むホルモン、ならびに例えばラロキシフェンを含む、選択的エストロゲン受容体調節物質が含まれる。
【００８８】
組成物の有効量は、組成物の投与に付随する任意の有害な副作用の存在、性質、および程度、組成物のLD50、ならびに様々な濃度における組成物の副作用に基づいて決定される。典型的には、投与される組成物の量は、約0.01mg/kg体重〜約20mg/kg体重、例えば、約0.05mg/kg体重〜約15mg/kg体重、例えば、約0.1mg/kg体重〜約10mg/kg体重の範囲である。一般に、初めは低用量を投与し、適切に有効な用量に達するまで徐々に増加させる。
【００８９】
組成物は、例えば、経口的に、または非経口的に、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、もしくは骨組織中に直接、投与することができる。経口投与が、好ましい投与方法である。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルなど単位投与または多回投与用の密閉された容器に入れて提供されてよい。いくつかの態様において、組成物は、埋め込み可能なポンプによって送達される。
【００９０】
本発明の組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体と共に製剤化された後に、個体または対象に投与される。薬学的に許容される担体は、投与される個々の組成物によって、ならびにその組成物を投与するのに使用される個々の方法によって、ある程度決定される。したがって、本発明の薬学的組成物の多種多様の適切な製剤がある(例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy, University of the Sciences in Philadelphia, 21st Edition, 2005, Lippincott, Williams & Wilkinsを参照されたい)。
【００９１】
経口投与に適した製剤は、(a)例えば、水、生理食塩水、またはPEG400を含む希釈剤中に懸濁された有効量の化合物または組成物などの溶液剤、(b)所定の量の活性成分を液体、固体、顆粒、またはゼラチンとしてそれぞれ含む、カプセル剤、サシェ剤、または錠剤、(c)適切な液体中の懸濁剤、および(d)適切な乳剤からなってよい。錠剤形態は、以下のうちの1つまたは複数を含んでよい:ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、増量剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、矯味剤、色素、崩壊剤、および薬学的に適合性のある担体。ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性基剤中に活性成分を含むトローチ剤(pastille)、乳剤、ゲル剤、および活性成分に加えて当技術分野において公知の担体を含む同種のものだけでなく、ロゼンジ形態も、矯味剤、例えばスクロース中に活性成分を含んでよい。
【００９２】
本発明の組成物は、例えば、静脈内注入、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、骨中への直接投与など他の投与経路に適した製剤中に存在してよい。これらの製剤には、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を対象受容者の血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張性無菌注射液剤、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁剤が含まれる。注射液剤および懸濁剤は、無菌の散剤、顆粒剤、および錠剤から調製することができる。
【００９３】
患者に投与される用量は、本発明において、経時的に患者の有益な治療応答をもたらすのに十分であるべきである。例えば、骨粗しょう症を治療または予防するために本発明の組成物が投与される場合、患者に投与される用量は、骨密度の減少を防止するか、遅延させるか、または回復させるのに十分であるべきである。用量は、使用される個々の組成物の有効性および患者の状態、ならびに治療される患者の体重または表面積に基づいて決定される。用量の多さはまた、個々の患者において個々の組成物の投与に付随する任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によっても決定される。
【００９４】
siRNA組成物を含む阻害作用物質は、必要に応じて、1回または繰り返し投与することができる。例えば、阻害性物質は、長期間にわたって(例えば、7日、14日、21日、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、12ヶ月またはそれ以上)、規則的な間隔で(例えば、毎日2回、毎日、毎週2回、毎週、毎月)投与することができる。阻害性物質の投与は、必要に応じて、経時的に頻度を増やすか、または減らしてよい。
【００９５】
骨形成のエクスビボ誘導
分化した骨芽細胞は、当業者に公知の任意の手段によって対象に投与することができる。本発明の1つの態様において、無傷の固体支持体(例えば、三次元の基材または平面状の面)上で分化させた骨芽細胞を、例えば、外科的移植によって、対象に投与することができる。あるいは、分化させた骨芽細胞を、基材から切り離した後、すなわち、プロテアーゼ処理した後に、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、または骨中に直接、投与することもできる。
【００９６】
本発明のいくつかの態様において、間葉系幹細胞は、ヒトから摘出し、続いて、増殖させ、骨芽細胞系の細胞に分化させるために、表1の1種または複数種のポリペプチドを阻害する作用物質と接触させる。細胞は、治療しようとする対象から摘出し、すなわち、自家性でよく(それによって、免疫に基づく移植物拒絶を回避する)、または第2の対象に由来し、すなわち異種でもよい。どちらの場合も、細胞の投与は、適切な免疫抑制処置と組み合わせることができる。
【００９７】
本発明の方法によって分化させた骨芽細胞は、当技術分野において公知の任意の手段によって対象に投与することができる。適切な投与手段には、例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、骨中への投与、および外科的移植が含まれる。
【００９８】
細胞は、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を対象受容者の血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張性無菌注射液剤、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁剤など投与に適した製剤中に存在してよい。注射液剤および懸濁剤は、無菌の散剤、顆粒剤、および錠剤から調製することができる。
【００９９】
外科的移植の場合、分化した細胞は、無傷の固体支持体(例えば、三次元の基材または平面状の面)上に残してよい。基材または平面状の面は、対象の適切な部位に外科的に移植される。例えば、骨移植を必要とする患者は、無傷の固体支持体上の分化した細胞を外科的に移植され得る。
【０１００】
骨芽細胞の減少または異常な骨芽細胞に起因する病態の治療または予防において投与する細胞の有効量を決定する際、医師は、細胞毒性、移植反応、疾患の進行、および抗細胞抗体の産生を評価する。投与にあたって、本発明の方法に従って分化させた骨芽細胞は、患者の大きさおよび全般的健康に適用されるように、様々な濃度での骨芽細胞の副作用を考慮に入れて、対象に骨芽細胞を提供するのに有効な量で投与することができる。投与は、単回投与または分割投与によって遂行することができる。
【０１０１】
骨密度の検出
骨密度に対する本発明の組成物の効果を評価するために、処置を受ける個体の骨密度のベースライン測定値を測定してよい。本発明の阻害性物質(例えば、表1に挙げたものより選択される1種または複数種のsiRNAオリゴヌクレオチド)を投与している間および投与した後、骨密度を適切な間隔で定期的に測定する。骨密度を測定するための方法および装置は、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第6,436,042号、第6,405,068号、第6,320,931号、第6,302,582号、第6,246,745号、第6,230,036号、第6,213,934号、第6,102,567号、第6,058,157号、第5,898,753号、第5,891,033号、第5,852,647号、第5,817,020号、第5,782,763号、第5,778,045号、第5,749,363号、第5,745,544号、第5,715,820号、第5,712,892号、第5,572,998号、および第5,480,439号に記載されている。
【０１０２】
VI.  治療的使用および診断的使用
本発明の方法および組成物は、不完全または不十分な骨芽細胞形成に起因する骨障害および骨疾患を治療する際に使用される。不十分または不完全な骨芽細胞分化の結果として発症する例示的な骨疾患には、例えば、骨粗しょう症、くる病、骨軟化症、マクキューン・オールブライト症候群、およびパジェット病が含まれる。例えば、Kasper, et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, 16th Edition, 2004, McGraw-Hillの333〜334章を参照されたい。
【０１０３】
本発明の方法はまた、とりわけ、インビトロの骨培養および骨形成解析にも有用である。
【０１０４】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、限定することを意図しない。
【０１０５】
実施例
実施例1
実験手順
細胞培養、トランスフェクション、およびハイスループットなスクリーニング
ヒト間葉系幹細胞(hMSC、PT-2501)をCambrex Inc.から購入し、かつ供給業者によって指示されたように培養した。細胞を第5代まで増殖させた後、siRNAライブラリースクリーニングのために使用した。手短に言えば、希釈したXtreme-siRNAトランスフェクション試薬(カタログ番号4 476 115 00、Roche)(DMEM 14μl中にXtreme 0.12μl)を、384ウェルプレートの各ウェル中に予めスポットしたsiRNA(14ng/ウェル)と1時間混合した。次いで、自動ディスペンサー(Multidrop 384、Thermo LabSystems)を用いて、培地(抗生物質を含まない)60μlに溶かした細胞(4000/ウェル)を添加した(siRNA最終濃度は約15nM)。トランスフェクションを8時間継続させた後、最初の培地更新を行った。7日間の培養後に、アルカリホスファターゼ(ALP)活性に関して細胞を染色した(カタログ番号86R-1KT、Sigma)。スクリーニング後アッセイ法を96ウェルプレート中で実施し、細胞密度8000細胞/ウェルで、濃度30nMのsiRNAをトランスフェクトした。DNA最終濃度が90nMであったことを除いては、Xtreme-siRNAトランスフェクション試薬を用いたsiRNAの場合と同様にして、CREデコイオリゴヌクレオチドおよび対照オリゴヌクレオチド(すべてのヌクレオチドにホスホロチオエート結合改変を施したもの)(Park, Y. G. et al., J Biol Chem 274:1573-1580 (1999))を、細胞中にトランスフェクトした。スクリーニングにおいて使用した対照siRNA(siCon)は、公知のヒト転写物およびESTに対して少なくとも4つのミスマッチを有し、かつヒトゲノム全体に対して少なくとも2〜3つのミスマッチを有する、50個のスクランブル配列のプールを含む。一次スクリーニング後の標的特徴付けにおいて使用するsiConは、Dharmacon社から購入し(D-001210-01-05)、公知のヒト遺伝子およびマウス遺伝子と4個以上のミスマッチを有するように生物情報学的に設計されたものであった。siTOXもまた、Dharmacon社から購入した(D-001500-01-05)。
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【０１０６】
リン酸カルシウム染色
細胞をPBSで2回すすぎ、室温で8分間、アリザリンレッド溶液(カタログ番号vw3611-2、VWR)中で染色し、PBSで再び洗浄し、10％ホルマリン溶液(カタログ番号HT-5014、Sigma)中で20分間固定し、次いで、水ですすぎ、風乾させた。
【０１０７】
オイルレッドO染色
細胞をPBSで2回すすぎ、10％ホルマリン溶液中で20分間固定し、PBSで2回および蒸留水で1回すすぎ、プロピレングリコールで5分間洗浄し、かつプロピレングリコール(I2722A, Newcomer Supply)中オイルレッドで30分間染色した。次いで、細胞を85％プロピレングリコールで5分間洗浄し、蒸留水で3回すすぎ、50％グリセロール中で保存した。
【０１０８】
化合物処理
8-CPT-cAMP、Na(カタログ番号116812)、5-ヨードツベルシジン(カタログ番号407900)、プロスタグランジンE2(PGE2、カタログ番号538904)、SB202190(カタログ番号559388)およびU0126(カタログ番号662005)をCalbiochem社から購入した。N6,2'-O-ジブチリル-cAMP(カタログ番号D0260-5MG)、ホルスコリン(カタログ番号F6886)、アスコルビン酸2-ホスフェート(カタログ番号49752-10G)、β-グリセロホスフェート(G-6251)、デキサメタゾン(D8893)、3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX、I5879)、およびインスリン(I9278)を、Sigma/Aldrich/Flukaから購入した。
【０１０９】
RNA調製およびRT-PCR
Qiagen社製RNAeasy miniキットを用いて、約5×10(4)個の細胞から、各試料に由来する全RNAを調製し、かつDNA混入を防ぐために、Turbo DNA-Free(カタログ番号1907、Ambion)でさらに処理した。RT-PCR用のSuperScript First-Strand Synthesis System(カタログ番号11904-018、Invitrogen)またはQiagen OneStep RT-PCRキット(カタログ番号210210)を指示通りに使用して、逆転写を実施した。使用したPCRプライマーは以下のとおりであった。
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【０１１０】
ウェスタンブロット
細胞溶解緩衝液は、20mM Tris pH8.0、1mM EDTA、150mM NaCl、および0.5％ NP-40を含み、かつ使用する前に、プロテアーゼインヒビターカクテル(カタログ番号p8340、Sigma、1:100希釈)およびホスファターゼインヒビターカクテル2(カタログ番号p5726、sigma、1:100希釈)を添加した。12％ Novex Tris-Glycineゲル(カタログ番号EC6008ボックス、Invitrogen)中でタンパク質(60μg/ウェル)を分離し、かつXCell IIブロットモジュールシステム(カタログ番号EI9051、Invitrogen)を用いて、ニトロセルロース膜(カタログ番号LC2001、Invitrogen)に移した。膜を室温で1時間、5％ミルク/PBST中でブロックし、一次抗体と共に4度で一晩インキュベートし、PBST(PBS中0.05％ Tween 20)で3回洗浄し、続いて、5％ミルク/PBST中の二次抗体と共に1時間インキュベートし、室温にて、PBSTで3回洗浄した。しかしながら、pCREBに対する抗体の場合は、最後の工程を除く全工程においてPBSTをPBSで置き換えた。ECLウェスタンブロット検出試薬(Amersham Biosciences)を用いて、抗体が結合したタンパク質を検出した。
【０１１１】
抗ホスホ-CREBをUpstate Biotechnologyから購入し(カタログ番号06-519)、抗ホスホ-p38をCell signaling technologyから購入した(カタログ番号9910)。
【０１１２】
結果
様々な市販されているリポフェクション試薬を試験した後、本発明者らは、Roche社製のXtreme siRNAトランスフェクション試薬がhMSCにおいて最も効果的であり、90％を超えるトランスフェクション効率および最小限の細胞毒性を与えることを発見した(図1)。次いで、この著しく効果的なsiRNAトランスフェクション方法を、骨形成分化の初期マーカーであるアルカリホスファターゼ(ALP)(Rodan, G.A. et al., Cell 89:677-680 (1997))の酵素的アッセイ法に基づいているハイスループットなスクリーニングに組み込んだ。hMSCへのsiRNAトランスフェクション後7日目にALP活性を著しく増大させた55個のヒットを同定し、確認した(図2aおよび表1)。
【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
siRNA一次ヒットのうちで、対応する遺伝子は、プロテアーゼ、キナーゼ、イオンチャネル、タンパク質受容体、リガンド、転写因子、細胞外基質タンパク質、および仮定上のタンパク質などをコードし、これらのうちのいくつかは、同じ遺伝子ファミリー(インテグリンファミリー、アンギオポエチンファミリー、アデニル酸シクラーゼファミリー、および嗅覚受容体ファミリー)のメンバーである(表1)。同定された遺伝子の大半は、骨の発達に関係があるとされていないが、2種の遺伝子、すなわちTBX3(Tボックス3)およびGNASは、それぞれマウスおよびヒトにおいて変異した場合、骨格の異常を引き起こすことが見出されている(Bianco, P. et al., J Bone Miner Res 15:120-128 (2000); Davenport, T. G. et al., Development 130:2263-2273 (2003); Eddy, M. C. et al., J Bone Miner Res 15:2074-2083 (2000); Shore, E. M. et al., N Engl J Med 346:99-106 (2002); Weinstein, L. S. et al., N Engl J Med 325:1688-1695 (1991))。スクリーニングを検証するために、本発明者らは、以下を含む12種の標的遺伝子を選んで(図3)、hMSCの骨形成分化におけるそれらの機能をさらに特徴付けた:GNAS(ヒトGNAS複合座、転写物変異体2、Gsのαサブユニットのアイソフォームb、NM_080426)、ADCY8(アデニル酸シクラーゼ8、NM_001115)、ADK(アデノシンキナーゼ、NM_001123)、P2RY11(プリン受容体P2R、Gタンパク質共役、11、NM_002566)、TBX3(Tボックス3または尺側-乳腺症候群、NM_005996)、BIRC4(バキュロウイルスIAPリピート含有4、NM_001167)、BCL2l2(BCL2様2、NM_004050)、SLC12A2(溶質運搬体ファミリー12、メンバー2、NM001046)、KCNT1(カリウムチャネル、サブファミリーT、メンバー1、XM_029962.2)、GBDR1(推定上、グリア芽細胞腫細胞分化関連、NM_016172)、DUSP6(2重特異性ホスファターゼ6、NM_001946)およびMJD(マシャド・ジョセフ病またはアタキシン3、NM_004993)。
【０１１５】
誘導されたALP活性が骨特異的アイソザイムALPLに由来することを確認するために(Weiss, M.J. et al., Proc Natl Acad Sci USA 83:7182-7186 (1986))、siRNAトランスフェクション後4日目に採取したhMSC試料に対して、ALPL特異的プライマーを用いたRT-PCR解析を実施した。図2bに示すように、最適な骨形成誘導培地(OS、0.05mMアスコルビン酸2-ホスフェート、10mMグリコホスフェート、および0.1μMデキサメタゾンの細胞培地中混合物)(Pittenger, M.F. et al., Science 284:143-147 (1999))で処理した試料と同様に、ヒットsiRNAをトランスフェクトした試料は、siTBX3およびsiMJDを除いて、非特異的siRNA(siCon)をトランスフェクトした対照試料と比べて、ALPL転写物の増加をもたらした。トランスフェクトされたhMSCの骨形成独自性(identity)をさらに確認するために、本発明者らはまた、いくつかのその他の初期骨形成マーカー(CBFA1、DLX5、オステリックス/OSX)および1つの後期骨形成マーカー(骨特異的シアロタンパク質またはBSP)の発現も検査した(Acampora, D. et al., Development 126:3795-3809 (1999); Ducy, P. et al., Cell 89:747-754 (1997); Nakashima, K. et al., Cell 108:17-29 (2002); Wang, D. et al., J Bone Miner Res 14:893-903 (1999))。試験した全試料のうちで不変と思われたDLX5を除いて、CBFA1、OSX、およびBSPは、siConで処理した試料と比べて、ヒットsiRNAおよびOSで処理した試料において差次的に上方調節されていたことから(図2b)、異なるヒットsiRNAによって誘導されたhMSCの骨形成特殊化は、異なる段階に進行したことが示唆される。CBFA1/RUNX2は、マウスにおける骨細胞の運命決定および成熟のために必要とされるマスター転写因子であり(Ducy, P. et al., Cell 89:747-754 (1997))、通常、hMSCにおいて発現される(図2b)。
【０１１６】
ヒットsiRNAに誘導される骨形成細胞運命の拘束が、CBFA1の機能を必要とするかどうかを検査するために、各ヒットsiRNAを、CBFA1特異的siRNAまたはsiConのいずれかと共にhMSCに同時トランスフェクトし、ALP活性を検査した。siConによる同時処理は、ヒットsiRNA単独での処理と比べて、ALP活性の目立った変化を引き起こさなかったが、CBFA1 siRNAによる同時処理は、ヒットsiRNAまたは骨形成誘導培地(OS)によって誘導されるALP活性のレベルを低下させたことから(図2c)、ヒットsiRNAに誘導されるhMSCの骨形成細胞運命の拘束はCBFA1の機能も必要とすることが示唆される。誘導されるALPL発現が、トランスフェクトされたヒットsiRNAに由来するオフターゲット効果によって引き起こされるのではないことを確認するために、siRNAトランスフェクション後36時間目に調製したRNA試料を用いて、対応するsiRNA標的遺伝子に対してRT-PCRを実施した。対照試料と比べて、対応するヒットsiRNAをトランスフェクトされたhMSC中の標的遺伝子の転写レベルが低下したことから、特異性が確認された(図2d)。さらに、標的遺伝子の発現ノックダウンもまた、siRNAトランスフェクション後72時間目に観察された。
【０１１７】
骨細胞成熟は、細胞外基質(ECM)石灰化を伴う(John Bilezikian et al., Principles of bone biology, Vol 1, 2nd edn: Academic Press) (2002))。ヒットsiRNAに誘導されたhMSCの骨形成分化が、成熟段階にさらに進行できるかどうかを検査するために、ヒットsiRNAで処理した細胞を20日間培養した。石灰化したECMの主成分であるリン酸カルシウム沈着物を検出するアリザリンレッド染色に基づいては、ECM石灰化は検出されなかったことから、ヒットsiRNAによる発現ノックダウンが、hMSCの初期の骨形成特殊化を誘導するために主に機能し、後期の骨芽細胞成熟は付加的な因子を必要とする可能性があることが示唆される。OSで処理したhMSCは2週間以内に骨芽細胞成熟を経るため、本発明者らは、ヒットsiRNA(最初の2〜4日)とそれに続くOS(さらに5〜9日)による逐次的処理がこのプロセスを促進し得るかどうかを試験した。図4に示すように、siADKおよびOS培地によるhMSCのこのような逐次的処理により、対照処理と比べてアリザリンレッド染色の強度は明らかに上昇した。siRNAトランスフェクション後3日目にOS処理を開始し、かつ9日間継続した場合、試験した12種のヒットのうち、6種(siADK、siGNAS、siP2RY11、siGBDR1、siSLC12a2、およびsiKCNT1)は、アリザリンレッド染色の強度を劇的に高め、2種(siDUSP6およびsiBCL2l2)は中程度の上昇をもたらし、2種(siBIRC4およびsiADCY8)はわずかな上昇をもたらし、2種(siTBX3およびsiMJD)は有意な効果を有さなかった(図5a)。これらの観察結果は、10種の有効なヒットsiRNAの標的遺伝子が、hMSCの骨形成特殊化だけでなく、骨細胞成熟においても阻害的な役割を果たすという結論と一致している。siSLC12A2とsiKCNT1など2種のsiRNAヒットを組み合わせて処理すると、骨形成分化プロセスはさらに亢進される(図6)。hMSCの骨形成分化および脂肪生成分化は、2つの逆のプロセスであり、一方のプロセスが他方を阻害することが示唆されている(Beresford, J. N. et al., J Cell Sci 102 (Pt 2):341-351 (1992))。さらに、骨粗しょう症患者において、骨髄中の脂肪細胞の数が増加していたことから、細胞運命の性質が骨芽細胞系から脂肪細胞系に変化していることが暗示される(Justesen, J. et al., Biogerontology 2:165-171 (2001); Meunier, P. et al., Clin Orthop Relat Res 80:147-154 (1971))。したがって、本発明者らは、脂肪生成誘導カクテル(100μg/ml IBMX、1μM DEX、および10μg/mlインスリン)を用いた組み合わせ処理によって、本発明者らのヒットsiRNAがhMSCの脂肪生成分化に与える影響を検査した。以前の研究と一致して、本発明者らのヒットsiRNAは、siGNASを除いて、hMSCの脂肪生成分化を様々な程度で阻害した(図5b)。
【０１１８】
本発明者らのスクリーニングにおいて、GNASはhMSC中の骨形成細胞運命抑制因子として同定された。主要なGNAS遺伝子産物であるGタンパク質αサブユニット(Gsα)は、アデニル酸シクラーゼに膜貫通型受容体を結合させ、かつ受容体に刺激される細胞内cAMP産生に必要とされる。この遺伝子の不活性化変異は、異所性骨化を特徴とする2つのタイプの障害(進行性の骨異形成およびオールブライト遺伝性骨形成異常症)において見出されたのに対し(Chan, I. et al., Clin Exp Dermatol 29:77-80 (2004); Eddy, M.C. et al., J Bone Miner Res 15:2074-2083 (2000); Shore, E.M. et al., N Engl J Med 346:99-106 (2002))、この遺伝子の活性化変異は、線維性骨異形成症を特徴とするマクキューン・オールブライト症候群患者において見出された (Weinstein, L.S. et al., N Engl J Med 325:1688-1695 (1991))ことから、Gsαが骨形成拘束の重要な負の調節因子であることが示唆される。これは、GNAS発現が減少すると、hMSCの骨形成細胞運命のスイッチが入るという本発明者らの観察結果ならびに他の研究者らの観察結果と一致している(Lietman, S. A. et al., Clin Orthop Relat Res, 231-238 (2005))。同時に、本発明者らのスクリーニングにより、Gsαだけでなく、ADCY8(アデニル酸シクラーゼ8)、ADK(アデノシンキナーゼ)、およびP2RY11(プリン受容体P2Y、Gタンパク質共役、11)を含む、cAMP産生に密接に関与しているいくつかのタンパク質も同定されたことから、hMSCにおける細胞内cAMPシグナル伝達と骨形成分化の密接な連関が示唆された。
【０１１９】
標的遺伝子はすべて細胞内のcAMPシグナル伝達に正に関与しているため、本発明者らは、cAMP産生に対して相反する機能を有する2種の化合物、すなわちADK阻害物質5-ヨードツベルシジンおよびADCY活性化因子ホルスコリン(Cottam, H. B. et al., J Med Chem 36:3424-3430 (1993); de Souza, N. J. et al., Med Res Rev 3:201-219 (1983))がhMSCの骨形成分化に与える影響を試験した。5-ヨードツベルシジンによる処理では、ヒットsiADKの効果が模倣され、OS処理と組み合わせた場合にはhMSCの骨形成分化が顕著に亢進したのに対し、ホルスコリンによる処理では、このプロセスが阻害された(図7a)。さらに、8-CPT-cAMPまたはN6,2'-ジブチリル-cAMP(DB-cAMP)などの細胞透過性cAMP類似体とデキサメタゾンとの組み合わせ処理は、hMSCを成熟した脂肪細胞に分化させるのに十分であった。さらに、8-CPT-cAMPは、OS培地と組み合わされた場合、細胞運命の拘束を骨形成から脂肪生成に切り替える場合があり(図7bおよび7c)、これは、骨形成および脂肪生成が互いに相互排他的であるという以前の観察結果と一致している。ATPは、P2RY11受容体のリガンドとして示されている(Communi et al., 1997)。ATP処理により、OSに誘導されたhMSC骨形成が阻害されたこと、および脂肪生成分化を経る細胞の数が投与量に依存して若干増加したことは、P2RY11がhMSCにおいて骨形成抑制因子として作用するという意見に一致している。本発明の観察結果は、細胞内cAMPレベルを低下させることにより、hMSCにおいて骨形成特殊化は促進されるが、脂肪生成の細胞運命は阻止され、逆もまた同様であるという結論と一致している。
【０１２０】
cAMPシグナル伝達経路の一般的な下流エフェクターであるCREB(cAMP応答エレメント結合タンパク質)が、cAMPシグナル伝達によって制御されるhMSC分化を媒介するのに関与しているかどうかを調査するために、本発明者らは、siP2RY11、siADK、siGNAS、siSLC12a2、またはsiConのトランスフェクション後3日目に、細胞中の活性型CREBタンパク質の発現レベルを検査した。ヒットsiRNAまたはOSで処理したこれらの試料において、pCREBタンパク質のレベルは、siConで処理した試料または未処理の試料と比べて上昇していた(図8a)ことから、CREB活性が、hMSCの骨形成分化に必要とされることが示唆される。骨形成および脂肪生成におけるCREBの役割をさらに検査するために、タンパク質の結合にあたって内因性CREエンハンサーと競合し得る合成の24量体CREデコイオリゴヌクレオチドをhMSCにトランスフェクトし(Park, Y. G. et al., J Biol Chem 274:1573-1580 (1999))、次いで、骨形成誘導培地または脂肪生成誘導培地による処理にそれらを供した。24量体CREミスマッチ対照オリゴヌクレオチドと比べて、CREデコイは、細胞が脂肪生成分化を経るのを妨げただけでなく、骨形成分化を経るのも妨げた(図8b)ことから、CREB活性が、骨形成および脂肪生成の両方に必要とされていること、ならびに骨形成分化に対するcAMPシグナル伝達の阻害効果は、hMSC中のCREB以外のエフェクターによって媒介され得ることが示唆される。
【０１２１】
スクリーニングにより、hMSCの骨形成分化を制御する、cAMPシグナル伝達経路に関与する複数のプレーヤー(player)が明らかにされたのに対し、siRNA組み合わせ処理研究によっても、異なる標的遺伝子が、同じ骨形成プロセスを制御するのに異なるメカニズムを使用することが示唆され、これらのメカニズムの1つは、骨形成の正の調節因子を作働させるものである。BMP-2、PLZF、およびTAZを含むいくつかのタンパク質は、多分化能の間葉系前駆細胞の骨形成分化を促進することが示されている(Hong, J. H. et al., Science 309:1074-1078 (2005); Ikeda, R. et al., J Biol Chem 280:8523-8530 (2005); Katagiri, T. et al., J Cell Biol 127:1755-1766 (1994))。本発明者らのsiRNAによって誘導された骨形成分化におけるそれらの役割を試験するために、これらの遺伝子に対してRT-PCRを実施した。様々な試料のうちで、BMP-2およびTAZの発現レベルは有意に変化しなかったのに対し、PLZFの発現は、siMJDまたはOSで処理した試料中では検出されたが、その他のヒットsiRNAで処理した試料中では検出されなかったことから(図9a)、MJDが、hMSCにおけるPLZFの発現を通常は抑制していることが示唆される。さらに、MAPKシグナル伝達経路は、OSで処理したhMSCにおいて活性化されていることが示され、これらの経路を阻害すると、OSによって誘導される骨形成が抑制される(図9b)(Jaiswal, R. K. et al., J Biol Chem 275:9645-9652 (2000))。DUSP6は、ERK1/2キナーゼまたはp38キナーゼを直接脱リン酸することが示されている2重特異性ホスホターゼ(phosphotase)である(Muda, M. et al., J Biol Chem 273:9323-9329 (1998))。
【０１２２】
したがって、本発明者らは、トランスフェクション後72時間目に、リン酸化型タンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロットによって、siDUSP6で処理したhMSCにおけるERK1/2およびp38の活性化状態を、他のsiRNAで処理した試料と共に検査した(図9c)。siDUSP6で処理した試料において活性p38のレベルは上昇したが、活性pERK1/2のレベルは上昇しなかったことから、DUSP6が通常は、p38シグナル伝達経路の活性化を阻害することによって、少なくとも部分的にhMSCの骨形成分化を阻害することが示唆される。
【０１２３】
同定された抑制因子の骨形成誘導効果の根底にある分子メカニズムに関する本発明者らの探索は、異なる抑制因子は別個の経路を介して機能して、正常なhMSCの骨形成分化を抑制するという結論と一致している。
【０１２４】
前述の本発明は、明確性および理解のために幾分詳しく説明してきたが、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態および細部を様々に変更できることは、本開示を読むことによって当業者には明らかになると考えられる。例えば、前述の技術、方法、組成物、装置、およびシステムはすべて、様々な組み合わせで使用してよい。本出願において引用するすべての刊行物、特許、特許出願、または他の書類は、個々の各刊行物、特許、特許出願、または他の書類が、あらゆる目的のために参照により組み入れられることが個別に示されたかのように、同じようにあらゆる目的のためにその全体が参照により組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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