(57)【要約】本発明は、創傷の治療および創傷治癒、特に糖尿病性創傷治癒の促進に有用な組成物および方法を提供する。
2010505849.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象における創傷を治療する方法であって、該対象に脂肪組織由来幹細胞を投与することを含み、以下の工程を含むことにより該創傷が治療される方法:
a.該細胞を含む脂肪組織を得る工程; および、
b.該創傷を治療するために治療上有効量の該細胞を含む医薬組成物を該対象に投与する工程。
【請求項２】
該脂肪組織由来幹細胞が該対象への投与の前に培養される請求項 1の方法。
【請求項３】
該細胞が少なくとも１つの自己組織化間葉芽体の形成を誘導するように培養される請求項 2の方法。
【請求項４】
該投与される細胞が少なくとも１つの自己組織化間葉芽体を含む請求項 3の方法。
【請求項５】
該組成物がさらに送達媒体を含む請求項 2の方法。
【請求項６】
該脂肪組織が該対象から得られる請求項 5の方法。
【請求項７】
該対象がヒトである請求項 2の方法。
【請求項８】
該創傷が疾患または障害と関連している請求項 2の方法。
【請求項９】
該疾患または障害が糖尿病である請求項 8の方法。
【請求項１０】
該創傷が糖尿病性皮膚潰瘍である請求項 9の方法。
【請求項１１】
少なくとも百万個の細胞が投与される請求項 2の方法。
【請求項１２】
少なくとも百万個の細胞が少なくとも２回該対象に投与される請求項 11の方法。
【請求項１３】
該自己組織化間葉芽体が、さらに脂肪組織由来幹細胞以外の少なくとも１つの細胞タイプを含むか、または、脂肪組織由来幹細胞以外の少なくとも１つの細胞タイプとともに投与される、請求項 4の方法。
【請求項１４】
該医薬組成物がさらに少なくとも１つの薬物または化合物を含む請求項 2の方法。
【請求項１５】
該化合物が、増殖因子、ホルモン、細胞外マトリックスタンパク質、およびケモカインからなる群から選択される請求項 14の方法。
【請求項１６】
該増殖因子またはケモカインがGCSF、IL6、IL8、IL10、MCP1、MCP2、組織因子、FGFb、KGF、VEGF、PLGF、MMP1、MMP9、TIMP1、TIMP2、TGFβ1、およびHGFからなる群から選択される請求項 15の方法。
【請求項１７】
該医薬組成物が直接、局所、皮下、および非経口からなる群から選択される方法を用いて該対象に投与される請求項 16の方法。
【請求項１８】
該少なくとも１つの自己組織化間葉芽体が、少なくとも１つの自己組織化間葉芽体の代わりとなるものではないその他の細胞の活性または機能を調節することができる少なくとも１つの因子を分泌する少なくとも１つの細胞を含む請求項 4の方法。
【請求項１９】
該組成物がさらに少なくとも１つの精製抗菌剤を含む請求項 2の組成物。
【請求項２０】
さらに包帯が創傷に適用される請求項 2の方法。
【請求項２１】
該包帯が細胞が投与される前に適用される請求項 20の方法。
【請求項２２】
必要とする対象における創傷を治療する方法であって、該対象に、培養された脂肪組織由来幹細胞から得られる培養上清を投与することを含み、該方法が以下の工程を含むことにより該創傷が治療される方法:
a.該細胞を含む脂肪組織を得る工程; 
b.該細胞を培養する工程; 
c.該細胞からの培養上清を調製する工程;および
b.治療上有効量の該培養上清を含む医薬組成物を該創傷の治療のために該対象に投与する工程。
【請求項２３】
該培養上清が該対象に投与される前に濃縮または精製されている請求項 22の方法。
【請求項２４】
該医薬組成物がさらに脂肪組織由来幹細胞を含む請求項 22の方法。
【請求項２５】
創傷を治療するための医薬組成物を投与するためのキットであって、該キットが、治療上有効量の脂肪組織由来幹細胞、医薬上許容される担体を含む医薬組成物、アプリケーター、その使用指示材料、所望により少なくとも１つのさらなる治療用化合物、および所望により少なくとも１つの抗菌剤を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は 35 U.S.C. §119(e)の下、2006年10月6日出願の米国仮出願第60/850,001号からの優先権を主張し、その開示内容はその全体を引用により本明細書に含める。
【０００２】
連邦支援の研究または開発に関する記述
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた認可番号 HL72141 の下で、部分的に米国政府の支援を伴ってなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
間葉幹細胞は、様々な組織、例えば 骨髄、脂肪組織、真皮/皮膚等から単離され得る幹細胞である。これらの細胞は、熱心な科学的研究および精査の対象であり、将来の再生医療の潜在的に革新的なパラダイムの礎石であると考えられている。
【０００４】
間葉幹細胞は一般に、そして特に脂肪幹細胞は、体の自然治癒力（natural ability to heal itself）を促進する将来の臨床治療に大きな見込みを持つ。これら可能性のある治療の使用に共通する一つの障害は、ヒトにおける使用のための細胞の培地中にウシ胎児血清または他の動物の血清を使用するという現在の慣行である。動物血清の未定義かつ可変の性質、およびそれに付随する、生体異物の病原体を導入するリスクおよびいくつかの対象において重篤なアレルギー反応を引き起こすリスクは、該分野において現在解決されていない技術的問題を提示する。
【０００５】
近年、主に骨髄から得られる間葉幹細胞の同定が、組織の再増殖および分化における進歩につながった。かかる細胞は骨髄および骨膜中に見出される多能性細胞であり、様々な間葉または結合組織に分化することができる。例えば、かかる骨髄由来の幹細胞は、5-アザシチジンなどの薬剤に曝露されると、筋細胞へと発生するよう誘導され得る(Wakitani et al.、Muscle Nerve、18 (12)、1417-26 (1995))。かかる細胞が、組織、例えば軟骨、脂肪、および骨の修復に有用であること(例えば、米国特許第 5,908,784号、5,906,934号、5,827,740号、5,827,735号を参照)、およびそれらがまた遺伝的改変を通して応用もされることが示唆されている(例えば、米国特許第 5,591,625号を参照)。かかる細胞の同定が組織の再増殖および分化における進歩につながった一方、かかる細胞の使用はいくつかの技術的障害によって阻まれている。かかる細胞の使用に対する一つの欠点は、かかる細胞が非常にまれなものであることであり(わずか 2,000,000細胞につき１細胞である)、そのことが、かかる細胞を入手および単離するためのあらゆる方法を困難かつ費用のかかるものにしている。当然ながら、骨髄採取は普遍的に、ドナーにとって痛みを伴うものである。さらに、かかる細胞は、特別に(specifically)選別された血清ロットを用いない限り、分化を誘導せずに培養することが難しく、その事がかかる幹細胞の使用に対しさらなる費用と労力を加える。米国特許第 6,200,606号(Peterson et al.)は、(中胚葉起源の)CD34+の骨または軟骨の前駆細胞の、脂肪を含む組織からの単離を記載している。
【０００６】
多くの組織、例えば骨髄、血液、肝臓、筋肉、神経系、および脂肪組織において、成人の多能性“幹”細胞の存在が示されている。理論的には無限の自己複製が可能な成人“幹”細胞は、大きな細胞可塑性、すなわち、それらが運命付けられていると信じられていた組織以外の組織へと分化する能力を有する。胚性幹細胞(ES)の特性に類似している該細胞の特性は、特にその使用が ES 細胞で遭遇する適合性および倫理の問題を提起しないように、かなりの治療上の展望を開く。
【０００７】
脂肪組織は、ヒトおよび他の哺乳類の種の、通常の発生および生理機能において重要かつ見過ごされている役割を果たす。多くの異なる種類の脂肪が存在する。最もありふれた型は、皮膚の下(皮下脂肪)、腹腔内(内臓脂肪)および生殖器の周囲 (生殖腺脂肪)に位置する白色脂肪組織である。成人のヒトにおいてあまり一般的でないものは、新生児期の熱の生成において重要な役割を果たす褐色脂肪組織である; この型の脂肪は、肩甲骨の間(肩甲骨間)、主要な血管および心臓の周囲(大動脈周囲および心臓周囲)、および腎臓の上(副腎性)に位置する。
【０００８】
女性は成熟するにつれて、乳腺脂肪組織量の増大を現す。乳腺脂肪体は、授乳期におけるエネルギー源として役立つ。実際に、生殖能力および成熟は、個体の脂肪組織の貯蔵と密接に関連している。女性および男性における思春期は、脂肪組織由来のホルモンであるレプチンの産生および放出、および体脂肪組成に密接に関連する。他の脂肪組織部位は、体において構造上の役割を果たす。例えば、足裏における機械的脂肪体は、歩行の衝撃に対するクッションを提供する。この脂肪貯蔵の減少は、進行性筋骨格損傷および運動障害につながる。骨髄脂肪細胞は、髄質中で血液細胞を発生させるためのエネルギーを提供するために、骨髄中に存在する。
【０００９】
骨髄脂肪細胞は、形態、生理、生化学および様々な刺激因子、例えばインスリンに対するその応答において、脂肪組織に存在する脂肪細胞とは異なる。骨髄間質に存在する脂肪細胞は、以下の機能を果たし得る： 1) 血行力学的に活性な髄質の容積を調節する; 2) 髄質細胞の増殖において必要な脂質の貯蔵所として働く、および 3) 骨芽細胞など他の細胞系譜に発生的に関連し得る。対照的に白色脂肪組織(即ち体脂肪)は、脂質代謝およびエネルギー恒常性に関与する(Gimble、“The Function of Adipocytes in the Bone Marrow Stroma”、The New Biologist 2(4)、1990、pp. 304-312)。
【００１０】
様々な幹細胞集団に関する研究の大多数は、元々混合性のまたはクローン由来の接着細胞培養および/または単細胞懸濁液としての挙動および治療上の可能性に集中している。しかし、コンセンサスは進化しており、幹細胞は、生体内において支持的なニッチ（supportive niche）または微小環境の中に存在する可能性が最も高いという有望な証拠によってそれは支持される。
【００１１】
最近のいくつかの論文において概説された通り、新たなデータは“幹細胞の特性を形作り、かつ、その可能性を定義するのは、幹細胞の固有の特徴とその微小環境との組み合わせである”事を示唆する(Fuchs et al.、Cell、116:769-778、2004)。実質的に、特定の細胞環境またはニッチは、可溶性の環境およびマトリックス因子を創造/提供する、(幹細胞構成要素に加えて、または幹細胞構成要素を含む)多様で不均一な細胞の収集物で構成される。これらの因子は、細胞の増殖、分化、および再生を含む幹細胞リザーバーの恒常性を指揮および制御するのを助ける(Kindler、J. Leukocyte Biol.、78:836-844、2005; Fuchs et al.、Cell、116:769-778、2004)。そして、組織/ニッチが平衡状態にある場合、幹細胞の大部分は細胞周期の G0 期の中で休眠/静止状態であると現在考えられている一方、組織/ニッチの減少または損傷が、幹細胞リザーバーに対して、再生(増殖)および/または分化によって平衡状態を再確立(すなわち、修復; 再生)させるための強力な刺激を提供するとも信じられている。この能力は、非対称細胞分裂およびおそらくある程度の脱分化を含む可能性があり、その全てがニッチ微小環境によって支配されると考えられる。
【００１２】
上記の背景を考慮すると、生体外での幹細胞ニッチモデルの‘創造’は、幹細胞生物学の研究および潜在的な治療適用にとって非常に有用かつ価値があるということが明確になる。研究者は、胚性幹細胞(胚様体)および神経幹細胞(ニューロスフェア)のためのインビトロの‘ニッチ’を記載し、特性を明らかにした - それはどちらも、多細胞凝集塊の状態での該細胞の懸濁(すなわち、非接着性)培養を含む。しかし、間葉系 幹/間質 細胞、特に脂肪由来の細胞については、かかる‘系’は記載されていない。この事は、細胞の培養/付着には不向きだと推定される表面に対してさえ、これらの細胞が極度に接着性であるように、これらの細胞を懸濁液中で培養する難しさに起因する可能性が高い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
技術分野において、特に糖尿病の対象において創傷治癒および組織修復を促進する方法に対する、長年にわたる要求が存在する。本発明はこの要求を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の概要
本発明は、脂肪組織由来幹細胞亜集団を増殖および分化させる方法および組成物、および必要としている対象において創傷修復を促進するために脂肪組織由来幹細胞亜集団を使用する方法および組成物を提供する。一つの側面において、細胞はヒト細胞である。一つの側面において、対象はヒトである。一つの側面において、創傷は糖尿病の対象におけるものである。
【００１５】
一つの態様において、本発明は有効量の ASC 細胞を、それを必要としている対象における創傷に直接投与することを包含する。一つの側面において、創傷は糖尿病と関連する。一つの側面において、糖尿病に関連する創傷は皮膚病変である。一つの側面において、創傷は ASC 細胞の投与の後、包帯で覆われる。別の側面において、本発明は、ASC 細胞を包帯に直接適用し、次いで該包帯を適用することを包含する。一つの側面において、包帯はテガダーム(Tegaderm)（商標）不透過性包帯などの包帯である。テガダーム(Tegaderm)（商標）は、3M によって製造される透明な包帯である。テガダーム(Tegaderm)透明包帯は、例えば、カテーテル部位および創傷を被覆および保護するために用いられ得る。一つの側面において、包帯は、より大きな薄膜である透明包帯に結合した非接着性吸収パッドからなる無菌の防水性細菌障壁である。一つの側面において、包帯が最初に適用される時、細胞は包帯の下に注入される。一つの側面において、細胞は包帯を通して注入される。
【００１６】
一つの側面において、創傷は慢性のものである。別の側面において、それは急性のものである。
【００１７】
一つの態様において、ASC 細胞は単細胞懸濁液の状態で投与される。別の側面において、細胞は細胞の凝集塊として投与される。一つの側面において、凝集塊は SOM-B である。一つの側面において、細胞は対象に投与される前に分化するよう誘導されたものである。一つの側面において、細胞は対象に投与される前に精製されたものである。一つの側面において、ASC は不死化された。一つの側面において、２以上の群の ASC が投与される。一つの側面において、該２以上の群の ASC は同一ではない。一つの側面において、２以上の群のうち１つは異なる培養から得られ、または分化するよう誘導されたものである。一つの側面において、少なくとも１つの ASC 以外の細胞タイプが ASC と組み合わせて投与される。一つの側面において、他の細胞タイプはケラチノサイトまたは皮膚線維芽細胞である。
【００１８】
一つの態様において、少なくとも１つの ASC 以外の他の細胞タイプが SOM-B に含まれるか、または SOM-B と共に投与される。一つの側面において、他の細胞タイプはケラチノサイトまたは皮膚線維芽細胞である。例えば、SOM-B が培養において形成されている間に、少なくとも１つの他の細胞タイプが SOM-B の中に取込まれるよう、別の細胞タイプ、例えばケラチノサイトまたは皮膚線維芽細胞が培養に添加される。
【００１９】
一つの態様において、少なくとも百万の細胞が投与される。別の態様において、少なくとも１億の細胞が投与される。一つの側面において、少なくとも百万の細胞が少なくとも２回送達される。一つの側面において、それらは１日に２回送達される。別の側面において、少なくとも１億の細胞が少なくとも１日に２回送達される。
【００２０】
一つの態様において、本発明の細胞は、製品、例えばアロダーム(Alloderm)または他の無細胞足場と併用して用いられ得、または共に投与され得る。
【００２１】
一つの態様において、本発明の細胞は、製品、例えばダーマグラフト(Dermagraft)（登録商標） と併用して用いられ得る。ダーマグラフト(Dermagraft)（登録商標） は、全層糖尿病性足潰瘍の６週間を超える期間の治療における使用に適応されており、それは真皮中に広がるが、腱、筋肉、関節包、または骨への曝露はない。ダーマグラフト(Dermagraft)（登録商標）は、凍結保存されたヒト線維芽細胞由来真皮代替物である; それは線維芽細胞、細胞外マトリックス、および生体吸収性足場で構成される。ダーマグラフト(Dermagraft)（登録商標）は、新生児包皮組織由来のヒト線維芽細胞から製造される。製造過程中、ヒト線維芽細胞は生体吸収性ポリグラクチンメッシュ足場上に播種される。該線維芽細胞は、増殖してこの足場の間隙を満たし、ヒト真皮コラーゲン、マトリックスタンパク質、増殖因子、およびサイトカインを分泌して代謝的に活性な生細胞を含む三次元のヒト真皮代替物を作り出す。ダーマグラフト(Dermagraft)（登録商標）は、マクロファージ、リンパ球、血管、または毛包を含有しない。
【００２２】
一つの態様において、増殖培地中での ASC の培養から得られた培養上清は、創傷を治療するために用いられる。一つの側面において、ASC は細胞の凝集塊である。一つの側面において、凝集塊は SOM-B である。一つの側面において、培地は無血清である。一つの側面において、細胞に添加される培地は、ヒトタンパク質以外のタンパク質を含有しない。一つの側面において、培養上清は得られた後に濃縮される。一つの側面において、培養上清は、夾雑物を除去するためまたは興味の対象である因子の濃度を増大させるために、精製される。一つの側面において、培養上清は少なくとも２つの増殖因子を含有する。当業者は、細胞によって増殖培地中に分泌されるタンパク質および増殖因子を濃縮または精製するために利用できる多くの技術が存在することを理解するであろう。一つの側面において、ASC は SOM-B(すなわち、SNiM)である。一つの側面において、細胞は培養上清が調製される前に、分化するよう誘導される。一つの側面において、培養上清は ASC と組み合わせて投与される。
【００２３】
本発明の細胞は、様々な種類の送達系および培地を用いて投与され得ることが理解されるであろう。さらに、本発明の細胞は他の治療剤および化合物と併用して投与され得、他の種類の治療と共に用いられ得る。
【００２４】
一つの態様において、有効量の、創傷治癒の促進に有用な少なくとも１つの増殖因子、サイトカイン、ホルモン、または細胞外マトリックス化合物またはタンパク質が、本発明の細胞と共に投与される。一つの側面において、これらの剤の組み合わせが用いられる。一つの側面において、本発明の実施に有用な増殖因子は、これらに限定されないが、GCSF、IL6、IL8、IL10、MCP1、MCP2、組織因子、FGFb、KGF、VEGF、PLGF、MMP1、MMP9、TIMP1、TIMP2、TGFβ1、および HGF を含む。一つの側面において、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、および細胞外マトリックス化合物およびタンパク質は、ヒトのものである。
【００２５】
一つの側面において、細胞外マトリックスタンパク質はコラーゲンである。該細胞外マトリックス構成要素は、外来性の源から得られ得、または本発明の細胞によって生成され得る。
【００２６】
一つの態様において、SOM-B-生成 細胞外マトリックスは、細胞構成成分の除去および/または不活化(devitalization)の後、創傷に対して投与される。
【００２７】
本発明の様々な側面および態様は、以下においてさらに詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
図面の概要
【図１】図 1 は、ASC を用いる糖尿病性創傷治癒治験の結果を図示する。黒ひし形の印が付けられた群は、糖尿病性媒体対照群(n=7)を表す。黒四角の印が付けられた群は、単細胞懸濁液状態の ASC(n=8)を表す。× の印が付けられた群は、非糖尿病性群を表す。黒三角の印が付けられた群は、SOMB の形の ASC を受け取った群を表す。縦軸は元の創傷領域の百分率を表し、横軸は操作後の時間を日数で表す。
【図２】図 2 は、ASC を用いる糖尿病性創傷治癒治験の結果を示す棒グラフを表す。４つの群が存在した。各時点での左の(最初の)棒は、糖尿病性媒体対照を表す(n=7; 棒上に横線の網掛け)。２番目の棒は、単一懸濁液状態の ASC 細胞での治療を表す(n=8; 棒上に単一の斜め線の網掛け)。３番目の棒は、SOMB の形の ASC での治療を表す(n=8; 斑点の棒)。４番目の棒は、非糖尿病性群を表す(n=8; 棒上に対角の斜め線の網掛け)。
【図３】左パネル(図3A)および右パネル(図3B)を含む図３は、治癒遅延動物モデル(db/db マウス)におけるヒトASC使用の有効性を示す。図の左パネルは、処理 0 日目(上の２つの画像)および処理 12 日目(下の２つの画像)における、ASC 処理(左の２つの画像)または媒体対照処理(右の２つの画像)を示す４つの写真の画像を含む。右のパネルは db/db マウスの、ASC凝集塊またはASC懸濁液処理の効果のグラフによる図解である。該４つの群は以下の通りである: db/- 対照、db/db 無処理、hASC 細胞凝集塊、および hASC 細胞懸濁液。
【図４】図 4 は、様々な細胞送達スキームの効果の研究に使用するための創傷床の、薬剤に基づく(agent-based)2-Dモデルの模式図である。
【図５】図 5 は、細胞で処理された糖尿病群と媒体対照とを比較する実験の結果を図示する。図中の３つの群は以下の通りである: 黒ひし形は db/- 対照を表す; 黒四角は db/db 対照を表す; そして黒三角は本発明の細胞で処理された糖尿病群を表す。縦軸は元の創傷領域の百分率を表し、横軸は処理開始からの(日数での)時間を表す。
【図６】図 6 は、細胞懸濁液または SOMB で処理された糖尿病群を比較する実験の結果を図示する。黒ひし形は db/- 対照を表す。黒四角は db/db 対照を表す。× は SOMB-処理群を表す。＊ は、細胞懸濁液で処理された群を表す。縦軸は元の創傷領域の百分率を表し、横軸は処理開始からの(日数での)時間を表す。処理された糖尿病性細胞および対照のために媒体処理された糖尿病性細胞を比較すると、12日では p<0.001 であり; そして 14日および19日では p<0.05 である。
【図７】図 7 は、糖尿病性創傷治癒に対する脂肪幹細胞の効果を実証する実験の結果を図示する。５つの群が以下の通り処理された: 細胞株 A; 細胞株 B; 細胞株 C; 媒体対照; 非糖尿病性媒体対照。縦軸は元の創傷領域の百分率を表し、横軸は処理後の日数を表す。
【図８】図 8 は、様々な培養条件において維持されたヒト ASC によるヒト肝細胞増殖因子(hHGF)の生産を示す棒グラフの描写(3日目)である。等しい数のヒト ASC を単層培養へとプレーティングし、または並行して SNiM を形成させ、そして懸濁液培養中に置いた(0日目)。細胞/SNiM を、以下の４つの培地のうち１つの中で培養した: 抗生物質を除いて他の添加剤を含まない DMEM/F12 (D0); 10% FBS を含む DMEM/F12 (D10); 増殖因子の添加剤を含む既知組成の無血清培地 (AR8(1:10)noS); および 1% ヒト血清を含む低血清培地 (AR8(1:10)(HS)。3日目に、培養上清を回収し、ELISA によって増殖因子レベルを分析した。各サンプルを複数の希釈で２回試験し、6つの別々のサンプルを合わせた平均を表す。棒は、細胞 (斑点); SOMB(斜め線の網掛け)を表す。
【図９】図 9 は、強化されていない培地中で維持された懸濁培養ヒト ASC SNiM による、増殖因子(gf)の生産(10日目)を図示する。2 日間の懸滴(hanging drop)培養の後、ヒト ASC SNiM を懸濁培養中に置き、D0 培地(即ち、無血清、増殖因子添加剤なし)中で10 日間維持した。培地を 3、6 および 10日目に交換した。10日目に、ELISA 分析のために上清を回収し、SNiM を解離させて細胞数を決定した。各々の増殖因子(hGCSF、hIL6、hIL8、hIL10、hMCP1、hKGF、および hHGF)を複数の希釈で２回試験し、6つの別々のサンプルを合わせた平均を表す。D0 培地中で接着性単層として培養された ASC は、10-日の培養条件を生き抜かなかった。縦軸は、細胞あたりの増殖因子(GF)の量を表す。棒グラフの各々の棒は、測定される増殖因子で下にラベルが付される。
【図１０】図 10 は、無血清の増殖因子強化培地中で維持された懸濁培養ヒト ASC SNiM による増殖因子生産(10日目)の図解である。2 日間の懸滴(hanging drop)培養の後、ヒト ASC SNiM を懸濁培養中に置き、1:10AR8 培地中で10 日間維持した。培地を 3、6 および 10日目に交換した。10日目に、ELISA 分析のために上清を回収し、SNiM を解離させて細胞数を決定した。各々の増殖因子(hGCSF、hIL6、hIL8、hIL10 hMCP1、hMMP9、hMCP2、ヒト組織因子(hTissue Factor)、hFGFb、hKGF、および hHGF)を複数の希釈で２回測定し、その値は 6つの別々のサンプルを合わせた平均を表す。同様の条件において接着性単層として培養された ASC は、10 日の培養期間中に繁栄しなかった。縦軸は、細胞あたりの増殖因子の量を表し、各々の棒は測定される増殖因子でラベルが付される。
【図１１】図 11 は、CD34 に基づく ASC の選別が治癒速度に影響を与えない事を実証する実験の図解である。縦軸は、開いた創傷領域を(創傷の元の大きさの % として)表し、横軸は時間を日数で表す。３つの群は、CD34-陽性 SOMB(黒ひし形)、CD34-陰性 SOMB(黒四角)、および非選別の SOMB(黒三角)である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の詳細な説明
略語および頭字語
ASC- 脂肪組織由来幹細胞
ASCB- 脂肪 幹/間質 細胞芽体
ASC-MB- ASC-メセンコイド(mesenchoid)間葉芽体またはメセンコイド体(mesenchoid body)
CB- キメラ芽体 
DMEM- ダルベッコ改変イーグル培地
ECM-  細胞外マトリックス
ES- 胚性幹細胞
FACS - 蛍光励起細胞分取
FBS- ウシ胎児血清
FGF- 線維芽細胞増殖因子
gf-  増殖因子
HSC- 造血幹細胞 
HS- ヒト血清(本明細書においては HmS とも称される)
HSA- ヒト血清アルブミン
IL-1β- インターロイキン-1 ベータ
MB- メセンコイド体(mesenchoid body)
PDGF-  血小板由来増殖因子
PLA-  加工吸引脂肪細胞（processed lipoaspirate cells）
SCGF-β-  幹細胞増殖因子-ベータ
SFM- 無血清培地(本明細書においては sf とも称される)
SNiM-  ASC凝集塊についての別の用語である、自己組織化ニッチ環境
SOM-B- 自己組織化間葉芽体(本明細書においては“自己組織化メセンコイド体(mesenchoid bodies)”および SNiM とも称される)
TNFα- 腫瘍壊死因子アルファ
ULA- 超低接着組織培養プレート
VEGF- 血管内皮増殖因子
【００３０】
定義
本発明を説明し、および請求の範囲として主張するにあたり、以下に説明される定義に従って、以下の専門用語が用いられる。
【００３１】
冠詞“ある”および“一つの”は、本明細書において１または１を超える(即ち、少なくとも１つの）、該冠詞の文法上の目的語をいうために用いられる。例として、“一つの要素”は、１つの要素または１より多い要素を意味する。
【００３２】
脂肪由来幹細胞(ASC)または“脂肪由来間質細胞”は、脂肪組織から生ずる細胞をいう。“脂肪”は、あらゆる脂肪組織を意味する。脂肪組織は、皮下、大網/内臓、乳腺、生殖腺、または他の脂肪組織部位に由来する、褐色または白色脂肪組織であり得る。好ましくは、脂肪は皮下の白色脂肪組織である。かかる細胞は、初代細胞培養または不死化細胞株を含み得る。脂肪組織は、脂肪組織を有するあらゆる生物からのものであり得る。好ましくは、脂肪組織は哺乳類のものであり、より好ましくは、脂肪組織はヒトのものである。脂肪組織の簡便な源は脂肪吸引手術からのものであるが、脂肪組織の源または脂肪組織の単離方法は本発明にとって重大ではない。ASC-SOM-B (SNiM)という用語は、本明細書で説明される通り SOM-B (SNiM)が ASC に由来するという事実を補強するよう意図される。
【００３３】
本明細書において用いる場合、“成人”という用語は、あらゆる非-胚性または非-若年性の対象をいうよう意図される。例えば“成人脂肪組織幹細胞”という用語は、胚または若年性の対象から得られるもの以外の脂肪幹細胞をいう。
【００３４】
疾患、症状、または障害の症候の重症度、またはかかる症候が対象によって経験される頻度、またはその両方が減少する場合、疾患または障害は“緩和(alleviated)”される。
【００３５】
本明細書において用いる場合、化学的化合物の“類縁体”は、例えば、構造において別の化合物に類似するが必ずしも異性体ではない化合物である(例えば、5-フルオロウラシルはチミンの類縁体である)。
【００３６】
本明細書において用いる場合、アミノ酸はその正式名称、それに対応する３文字表記、またはそれに対応する１文字表記によって、以下の表に示される通りに表される:
2010505849.tif 000003
【００３７】
本明細書において用いる場合、“アミノ酸”という語句は、天然および合成アミノ酸の両方、および D および L アミノ酸の両方を含むよう意図される。“標準アミノ酸”は、天然のペプチド中に一般に見出される２０の標準 L-アミノ酸のいずれかを意味する。“非標準アミノ酸残基”は、それが合成により調製されるか天然の源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外のあらゆるアミノ酸を意味する。本明細書において用いる場合、“合成アミノ酸”は、これらに限定されないが、塩、アミノ酸誘導体(例えばアミド)、および置換を含む、化学的修飾されたアミノ酸をも包含する。本発明のペプチド中に、特にカルボキシまたはアミノ末端において含有されるアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化またはその活性に悪影響を与えることなくペプチドの循環半減期を変化させ得る他の化学基での置換によって修飾され得る。加えて、本発明のペプチド中にジスルフィド結合は存在してもしなくても良い。
【００３８】
“アミノ酸”という用語は、“アミノ酸残基”と互換的に用いられ、遊離のアミノ酸およびペプチドのアミノ酸残基をいうことができる。該用語が遊離のアミノ酸をいうのかペプチドの残基をいうのかは、それが用いられる文脈から明らかであろう。
【００３９】
アミノ酸は以下の一般構造を有する:
【化１】
2010505849.tif 000004
アミノ酸は、側鎖 R に基づいて７つの群に分類され得る: (1) 脂肪族側鎖、(2) ヒドロキシル基(OH)を含む側鎖、(3) 硫黄原子を含む側鎖、(4) 酸性基またはアミド基を含む側鎖、(5) 塩基性基を含む側鎖、(6) 芳香環を含む側鎖、および (7) 側鎖がアミノ基に融合しているイミノ酸であるプロリン。
【００４０】
本発明のペプチド化合物を説明するために用いられる命名法は慣習に従い、各々のアミノ酸残基の左側にアミノ基が、右側にカルボキシ基が示される。選択された本発明の特定の態様を表す式中において、具体的には示さないが、アミノおよびカルボキシ末端の基は、他で特定されない限り、それが生理的 pH 値にある場合の形態であると理解されるであろう。
【００４１】
本明細書において用いる場合、“塩基性”または“正電荷の”アミノ酸という語は、pH 7.0 において R 基が正味の正電荷を有するアミノ酸をいい、これらに限定されないが、標準アミノ酸のリジン、アルギニン、およびヒスチジンを含む。
【００４２】
本明細書において用いる場合、“抗体”という用語は、抗原上の特定のエピトープに対し特異的に結合できる免疫グロブリン分子をいう。抗体は、天然の源または組換えの源に由来するインタクトな免疫グロブリンであり得、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応性の部分であり得る。抗体は通常、免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、Fab および F(ab)2、および単鎖抗体およびヒト化抗体を含む様々な形で存在し得る。
【００４３】
本明細書において用いる場合、“アンチセンスオリゴヌクレオチド”という用語またはアンチセンス核酸は、少なくともその一部が正常細胞または罹患(affected)細胞中に存在する核酸に対して相補的である核酸ポリマーを意味する。“アンチセンス”とは、特に、タンパク質をコードする２本鎖 DNA 分子の非コード鎖の核酸配列、または該非コード鎖と実質的に相同である配列をいう。本明細書において定義する場合、アンチセンス配列はタンパク質をコードする２本鎖 DNA 分子の配列に対して相補的である。アンチセンス配列は、必ずしも DNA 分子のコード鎖のコード部分に対してのみ相補的な訳ではない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするDNA 分子のコード鎖上に特定された制御配列に対し相補的であり得、ここで制御配列はコード配列の発現を制御する。本発明のアンチセンス オリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよび他のオリゴヌクレオチドの修飾を含む。
【００４４】
本明細書において用いる場合、“自家の (autologous)”という用語は、一定の型の組織または体の特定の構造において自然にかつ普通に生じるものをいう。
【００４５】
移植においては、それはドナー部位およびレシピエント部位が同じ個体中にある移植片をいい、または、通常は手術中においてドナーが予め提供しその後再び受け取る血液をいう。
【００４６】
本明細書において用いる場合、“基礎培地”という用語は、必要最小型の培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地、ハム F12、イーグル培地、RPMI、AR8 等をいい、そこに他の成分が添加され得る。該用語は、調製済みのまたは特定の用途に向けられた培地を除外しないが、それらは修飾された上で他の細胞タイプ等に用いられ得る。
【００４７】
本明細書において用いる場合、“生体適合性”という用語は、宿主において実質的に有害な反応を誘発しない材料をいう。
【００４８】
本明細書において用いる場合、“生分解性”という用語は、生物学的に分解され得ることをいう。生分解性材料は、それが生物系(biological system)から取り除かれ得る単位および/または生物系(biological system)の中へ化学的に取り込まれ得る単位へと生物学的に分解され得るという点で非生分解性材料とは異なる。
【００４９】
本明細書において用いる場合、“生体吸収性(bioresorbable)”という用語は、材料の、生体内で再吸収される能力をいう。“完全な”再吸収とは、有意な細胞外断片が残っていないことを意味する。再吸収過程は、体液、酵素、または細胞の作用を通じた元のインプラント材料の除去を含む。再吸収された炭酸カルシウムは、例えば、骨ミネラルとしてまたは体内で別に再利用されることによって再沈着され得、または排泄され得る。本明細書において用いる場合、“非常に生体吸収性(Strongly bioresorbable)”という用語は、植え込まれた材料の全量の少なくとも 80% が、１年以内に再吸収されることを意味する。
【００５０】
本明細書において用いる場合、“芽体”という用語は、とりわけ、そこから器官、組織、または部分が形成される始原的な細胞塊、および損傷したまたは切除された構造の再生を開始および/または促進する能力がある細胞のクラスターを包含する。
【００５１】
“細胞培養培地”、“培養培地”(各々の場合における複数の“培地”) および“培地 製剤”という語句は、細胞を培養するための栄養溶液をいい、互換的に用いられ得る。
【００５２】
“対照の”細胞、組織、サンプル、または対象は、被験の細胞、組織、サンプル、または対象と同じ型の細胞、組織、サンプル、または対象である。対照は、例えば、被験の細胞、組織、サンプル、または対象が試験されるのと正に同時にまたはほぼ同時に試験され得る。対照はまた、例えば、被験の細胞、組織、サンプル、または対象が試験される時から離れた時点においても試験され得、対照の試験の結果は、記録された結果が被験の細胞、組織、サンプル、または対象の試験によって得られた結果と比較され得るように記録され得る。対照はまた、別の源、または被験群または被験対象以外の同様の源からも得られ得、ここで、被験サンプルは試験が実施される疾患または障害を有すると疑われる対象から得られる。
【００５３】
“被験”細胞、組織、サンプル、または対象は、試験または処理されるものである。
【００５４】
“病気の徴候を示す(pathoindicative)”細胞、組織、またはサンプルは、それが存在する場合に、細胞、組織、またはサンプルが位置している(または組織が得られた)動物が疾患または障害を患っていることを示すものである。例えば、動物の肺組織における１以上の乳房細胞の存在は、該動物が転移性乳癌に罹患していることの徴候である。
【００５５】
疾患または障害を患っていない動物の組織中に１以上の細胞が存在する場合、組織は、細胞を“正常に含む”。
【００５６】
本明細書において用いる場合、“化合物”とは、薬物、または薬物としての使用の候補、組み合わせ、および上記のものの混合物、および本発明のポリペプチドおよび抗体であると通常考えられる、あらゆる型の物質または剤をいう。
【００５７】
本明細書において用いる場合、“サイトカイン”とは、細胞間シグナル分子をいい、その最もよく知られるものは哺乳類体細胞の制御に関与する。その効果において増殖促進性および増殖抑制性の両方の、例えば、インターロイキン、インターフェロン、および形質転換増殖因子を含む、多くのファミリーのサイトカインが特徴付けられている。他の多くのサイトカインが当業者に知られている。これらのサイトカインの源、特徴、標的およびエフェクター活性が記載されている。
【００５８】
“送達媒体”という用語は、生体内で細胞を送達するために用いられ得るまたは動物に投与される細胞を含む組成物に添加され得るあらゆる種類の装置または材料をいう。この用語は、これらに限定されないが、植込み型の装置、細胞凝集塊、マトリックス材料、ゲル等を含む。
【００５９】
本明細書において用いる場合、化合物の“誘導体”とは、アルキル、アシル、またはアミノ基による H の置換のように、１以上の工程において同様の構造の別の化合物から生成され得る化学的化合物をいう。
【００６０】
“検出する”という単語およびその文法的変形の使用は、定量を伴わない種の測定をいうよう意図され、ここで、文法的変形を伴う“決定する”または“測定する”という単語の使用は、定量を伴う種の測定をいうよう意図される。本明細書において“検出する”および“同定する”という用語は互換的に用いられる。
【００６１】
“疾患”とは、動物が恒常性を維持できず、疾患が改善されない場合には該動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。
【００６２】
対照的に、動物における“障害”とは、動物が恒常性を維持できるが、障害が無い状態よりも動物の健康状態が好ましくない、健康状態である。処置されないままでも、障害は動物の健康状態のさならる低下を必ずしも引き起こさない。
【００６３】
本明細書において用いる場合、“有効量”とは、選択された効果を生むのに十分な量を意味する。
【００６４】
本明細書において用いる場合、“フィーダー細胞”という単語は、第２の型の細胞が維持され得、おそらくは増殖する環境を提供するために、第２の型の細胞と共に共培養される１つの型の細胞をいう。フィーダー細胞は、それが支持している細胞とは異なる種からのものであり得る。フィーダー細胞は、それが増殖しないことおよびそれが養っている細胞と混ざらないことを保証するために、共培養される前に、その増殖を妨げるため非致死的に照射され得または処置され得る。本明細書において“フィーダー細胞”、“フィーダー”および“フィーダー層”という用語は互換的に用いられる。
【００６５】
本明細書において用いる場合、“機能的”分子とは、それによって特徴付けられる特性または活性を示す形態の分子である。
【００６６】
“断片”または“セグメント”とは、少なくとも１つのアミノ酸を含むアミノ酸配列の一部であるか、または少なくとも１つのヌクレオチドを含む核酸配列の一部である。本明細書において“断片”および“セグメント”の用語は互換的に用いられる。
【００６７】
“移植片”は、移植のためのあらゆる遊離の(付着していない)細胞、組織、または器官をいう。
【００６８】
“同種移植片”または“同種異系”とは、同じ種の別の動物に由来する移植細胞、移植組織、または移植器官をいう。
【００６９】
“異種移植片”または“異種”とは、異なる種の動物に由来する移植細胞、移植組織、または移植器官をいう。
【００７０】
本明細書において用いる場合、“相同”とは、２つのポリマー分子間、例えば、２つの核酸分子間、例えば、２つの DNA 分子または２つの RNA 分子の間、または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の類似度をいう。２つの分子の両方におけるサブユニットの位置が同じ単量体サブユニットによって占められる場合、例えば、２つの DNA 分子の各々における位置がアデニンで占められる場合、それらはその位置において相同である。２つの配列間の相同性は、一致するかまたは相同な位置の数の一次関数であり、例えば、２つの化合物配列中の位置のうち半数(例えば、長さが１０のサブユニットのポリマー中における５つの位置)が相同であれば、その２つの配列は 50% 相同であり、位置の 90%、例えば、10 のうち 9 が 一致するかまたは相同であれば、その２つの配列は 90% の相同性を有する。例えば、DNA 配列 3'ATTGCC5' と 3'TATGGC は 50% の相同性を有する。
【００７１】
本明細書において用いる場合、“相同性”は“同一性”と同義に用いられる。
【００７２】
２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。例えば、２つの配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、Karlin and Altschul(1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)の通りに改変された、Karlin および Altschul のアルゴリズム(1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)である。このアルゴリズムは、Altschul、et al. の NBLAST および XBLAST プログラム(1990、J. Mol. Biol. 215:403-410)に組み込まれており、例えば国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のワールドワイドウェブサイトにおいてアクセスされ得る。本明細書に記載される核酸と相同なヌクレオチド配列を得るため、BLAST ヌクレオチド検索は以下のパラメータを用いて、(NCBI ウェブサイトでは“blastn”と名付けられている) NBLAST プログラムで実行され得る: ギャップペナルティ(gap penalty) = 5; ギャップ伸長ペナルティ(gap extension penalty) = 2; ミスマッチペナルティ(mismatch penalty) = 3; マッチリワード(match reward) = 1; 期待値 10.0; および ワードサイズ(word size) = 11。本明細書に記載されるタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るため、BLAST タンパク質検索は、以下のパラメータを用いて、(NCBI ウェブサイトでは“blastn”と名付けられている) XBLAST プログラムまたは NCBI“blastp”プログラムで実行され得る: 期待値 10.0、BLOSUM62 スコアリングマトリックス(scoring matrix)。比較目的のためのギャップの有る整列(gapped alignment)を得るため、Altschul et al. (1997、Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)で記載される通りに Gapped BLAST が利用され得る。代わりに、分子間の遠い関連性(Id.)および共通のパターンを有する分子間の関連性を検出する反復検索を実行するために PSI-Blast または PHI-Blast が用いられ得る。BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、および PHI-Blast プログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの初期パラメータ(例えば、XBLAST および NBLAST)が用いられ得る。
【００７３】
２つの配列間のパーセント同一性は、上記と同様の技術を用いてギャップを許容してまたは許容せずに、決定され得る。パーセント同一性を計算する際には通常、完全一致が計数される。
【００７４】
本明細書において用いる場合、“説明資料”は、本明細書に記載される様々な疾患または障害の軽減をもたらすためのキットにおいて、本発明のペプチドの有用性を伝えるために用いられ得る出版物、録音物、図表、または他のあらゆる表現媒体を含む。所望により、またはそれに代えて、説明資料は、哺乳類の細胞または組織において疾患または障害を軽減する１以上の方法を記載し得る。本発明のキットの説明資料は、例えば、同定された化合物発明を包含する容器に添付され得、または同定された化合物を包含する容器と共に輸送され得る。代わりに、説明資料は、レシピエントによって説明資料と化合物が協調して用いられるという意図を伴って容器とは別に輸送され得る。
【００７５】
“単離する”および“選択する”という用語は本明細書において互換的に用いられる。
【００７６】
細胞に関して用いられる場合、“単離される”という用語は、少なくとも部分的には起源の組織(例えば、脂肪組織)中でそれが共に、自然に存在するような他の細胞タイプまたは他の細胞材料から単離された、興味の対象である単一の細胞または興味の対象である細胞集団をいう。幹細胞のサンプルは、少なくとも 60%、または少なくとも 75%、または 少なくとも 90%、そして特定の場合には少なくとも 99%、興味の対象である細胞以外の細胞を含まないとき、“実質的に純粋”である。純度は、あらゆる適切な方法、例えば、蛍光励起細胞分取(FACS)、または細胞タイプを識別する他のアッセイによって、測定され得る。
【００７７】
“単離された核酸”とは、天然の状態において隣接する配列から分離された核酸のセグメントまたは断片、例えば、通常その断片に隣接する配列、例えば、それが自然に生じるゲノム中で該断片に隣接する配列から取り除かれた DNA 断片をいう。該用語はまた、自然に核酸に付随する他の構成成分、例えば、細胞において自然に付随する RNA または DNA またはタンパク質から実質的に精製された核酸にも当てはまる。したがって該用語は、例えば、ベクター、自律的に複製するプラスミドまたはウイルス、または原核生物または真核生物のゲノム DNA の中に組み込まれている組換え DNA、または他の配列から独立した別個の分子として(例えば、PCR または制限酵素消化によって生成される cDNA またはゲノム断片または cDNA 断片として)存在する組換え DNA を含む。それはまた、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換え DNA をも含む。
【００７８】
別に特定しない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いに縮重版(degenerate versions)であり、同一のアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質および RNA をコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。
【００７９】
本明細書において用いる場合、“検出マーカー”または“レポーター分子”は、マーカーを含まない同様の化合物の存在下で、マーカーを含む化合物の特異的検出を可能にする原子または分子である。検出マーカーまたはレポーター分子は、例えば、放射性同位元素、抗原決定基、酵素、ハイブリダイゼーションに利用できる核酸、発色団、フルオロフォア、化学発光分子、電気化学的に検出可能な分子、および蛍光偏光の変化または光散乱の変化をもたらす分子を含む。
【００８０】
本明細書において用いる場合、“リガンド”とは、標的化合物に特異的に結合する化合物である。不均一な化合物サンプル中における化合物の存在の決定要因である結合反応においてリガンドが機能する場合、リガンド(例えば、抗体)は化合物と“特異的に結合する”または“特異的に免疫反応性である”。したがって、指定されたアッセイ(例えば、イムノアッセイ)条件下で、リガンドは特定の化合物に優先的に結合し、サンプル中に存在する他の化合物には有意な程度には結合しない。例えば、イムノアッセイ条件下で、抗体は、その抗体がそれに対して産生されたエピトープを有する抗原に特異的に結合する。特定の抗原と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、様々なイムノアッセイの型式が用いられ得る。例えば、抗原と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために、固相 ELISA イムノアッセイが通常用いられる。特異的免疫反応性を決定するために用いられ得るイムノアッセイの型式および条件についての記載に関しては、Harlow and Lane、1988、Antibodies、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Publications、New York を参照されたい。
【００８１】
本明細書において用いる場合、“結合”という用語は、２つの基の間の接続をいう。該接続は、共有結合性または非共有結合性であり得、これらに限定されないが、イオン結合、水素結合、および疎水性/親水性相互作用を含む。
【００８２】
本明細書において用いる場合、“リンカー”という用語は、共有結合的または非共有結合的に、例えば、イオン結合または水素結合またはファンデルワールス相互作用を通じて、別の２つの分子を連結する分子をいう。
【００８３】
本明細書において用いる場合、“調節する”という用語は、活性、機能、または工程(process)のレベルを変更することをいう。“調節する”という用語は、活性、機能、または工程(process)を阻害することおよび刺激することの両方を含む。
【００８４】
本明細書において用いる場合、幹細胞の“子孫”という用語は、幹細胞に由来し、親の幹細胞が有する全ての分化能、すなわち多分化能を未だ有し得る細胞、またはもはや多能性ではないが、今後は１つの細胞タイプ、すなわち方向付けられた細胞タイプにのみ分化し得るよう方向付けられた細胞をいう。該用語はまた、分化した細胞をもいう。
【００８５】
本明細書において用いる場合、末端アミノ基についての“保護基”とは、ペプチド合成において伝統的に採用されるあらゆる多様なアミノ末端保護基と結合している、ペプチドの末端アミノ基をいう。かかる保護基は、例えば、アシル保護基、例えばホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル、およびメトキシスクシニル; 芳香族ウレタン保護基、例えばベンジルオキシカルボニル; および脂肪族ウレタン保護基、例えば、tert-ブトキシカルボニルまたはアダマンチルオキシカルボニルを含む。適切な保護基については、Gross and Mienhofer、eds.、The Peptides、vol. 3、pp. 3-88 (Academic Press、New York、1981)を参照されたい。
【００８６】
本明細書において用いる場合、末端カルボキシ基についての“保護基”とは、あらゆる多様なカルボキシル末端保護基と結合している、ペプチドの末端カルボキシル基をいう。かかる保護基は、例えば、tert-ブチル、ベンジルまたはエステルまたはエーテル結合を通して末端カルボキシル基に結合する他の許容される基を含む。
【００８７】
本明細書において用いる場合、“精製された”という用語および同様の用語は、天然の環境において分子または化合物に通常付随する他の構成成分に対し、該分子または化合物を濃縮することに関する。“精製された”という用語は、工程中で特定の分子の完全な純度が達成されたことを必ずしも示さない。本明細書において用いる場合、“高度に精製された”化合物とは、純度が 90% を超える化合物をいう。“有意な検出可能レベル”とは、示されたデータ中に視認され、法医学的エビデンスの解析中において対処(addressed)/説明(explained)される必要のある夾雑物(contaminate)の量である。
【００８８】
本明細書において用いる場合、“医薬上許容される担体”という用語は、あらゆる標準的な医薬担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション、例えば油/水または水/油エマルション、および様々な型の湿潤剤(wetting agents)を含む。該用語はまた、米国(US)連邦政府の規制機関(regulatory agency)によって承認されているまたはヒトを含む動物における使用用として米国(US)薬局方に掲載されているあらゆる剤を包含する。
【００８９】
本明細書において用いる場合、“２次抗体”という用語は、別の抗体(１次抗体)の定常領域に結合する抗体をいう。
【００９０】
本明細書において用いる場合、“固体の支持体”という用語は、様々な化合物と結合(好ましくは共有結合)を形成し得る、溶媒に不溶性の基質をいう。該支持体は、本来生物学的なもの、例えば、これらに限定せず、細胞またはバクテリオファージ粒子、または合成のもの、例えば、これらに限定せず、アクリルアミド誘導体、アガロース、セルロース、ナイロン、シリカ、または磁化粒子であり得る。
【００９１】
本明細書において用いる場合、“阻害する”という用語は、本発明の化合物の、記載された機能を減少させまたは妨害する能力をいう。好ましくは、阻害は少なくとも 10%、より好ましくは少なくとも 25%、よりいっそう好ましくは少なくとも 50% であり、最も好ましくは、該機能が少なくとも 75% 阻害される。
【００９２】
“成分”という用語は、化学的起源のものか生物学的起源のものかにかかわらず、細胞の増殖、生存、または分化を維持または促進するために細胞培養の培地中に用いられ得るあらゆる化合物をいう。“構成成分(component)”、“栄養素(nutrient)”、“サプリメント(supplement)”、および“成分”の用語は互換的に用いられ得、全てがかかる化合物をいうよう意図される。細胞培養の培地中に用いられる典型的な非限定の成分は、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質などを含む。生体外で細胞の培養を促進または維持する他の成分は、特定の要求に従って当業者によって選択され得る。
【００９３】
本明細書において用いる場合、“阻害する”という用語は、対照の値に対しより低くあるよう活性または機能を抑制または妨害することを意味する。阻害は、直接的または間接的機構を介するものであり得る。一つの側面において、活性は、対照の値と比較して少なくとも 10%、より好ましくは少なくとも 25%、およびよりいっそう好ましくは少なくとも 50% 抑制または妨害される。
【００９４】
本明細書において用いる場合、“阻害剤”という用語は、その適用が、これらに限定されないが、分化および活性を含む興味の対象である工程または機能の阻害をもたらすあらゆる化合物または剤をいう。興味の対象である活性または機能の減少が存在すれば、阻害が推測され得る。
【００９５】
“傷害”という用語は、暴力、事故、外傷(trauma)、または骨折等により引き起こされる、体に対するあらゆる物理的損傷をいう。
【００９６】
本明細書において用いる場合、“説明資料”とは、本明細書に記載される様々な疾患または障害の軽減をもたらすためのキットにおいて、本発明のペプチドの有用性を伝えるために用いられ得る出版物、録音物、図表、または他のあらゆる表現媒体を含む。所望により、またはそれに代えて、説明資料は、哺乳類の細胞または組織において疾患または障害を軽減する１以上の方法を記載し得る。本発明のキットの説明資料は、例えば、同定された化合物発明を包含する容器に添付され得、または同定された化合物を包含する容器と共に輸送され得る。代わりに、説明資料は、レシピエントによって説明資料と化合物が協調して用いられるという意図を伴って容器とは別に輸送され得る。
【００９７】
本明細書において用いる場合、“精製された”という用語および同様の用語は、天然の環境において分子または化合物に通常付随する他の構成成分に対し、該分子または化合物を濃縮することに関する。“精製された”という用語は、工程中で特定の分子の完全な純度が達成されたことを必ずしも示さない。本明細書において用いる場合、“高度に精製された”化合物とは、純度が 90% を超える化合物をいう。
【００９８】
本明細書において用いる場合、“医薬上許容される担体”という用語は、あらゆる標準的な医薬担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション、例えば油/水または水/油エマルション、および様々な型の湿潤剤(wetting agents)を含む。該用語はまた、米国(US)連邦政府の規制機関(regulatory agency)によって承認されているまたはヒトを含む動物における使用用として米国(US)薬局方に掲載されているあらゆる剤を包含する。
【００９９】
“可逆的に植え込み可能な”装置とは、(例えば外科的にまたは動物の天然の開口部への挿入によって)動物の体内へ挿入され得、かつ、その後に動物の健康に対する重大な害を伴わずに取り除かれ得る装置である。
【０１００】
本明細書において用いる場合、“サンプル”とは、好ましくは、これらに限定されないが、正常組織サンプル、疾患組織サンプル、生検(biopsies)、血液、唾液、糞便、精液、涙、および尿を含む、対象からの生物学的サンプルをいう。サンプルはまた、興味の対象である細胞、組織、または体液(fluid)を含む対象から得られる、他のあらゆる物質(material)の源であり得る。サンプルはまた、細胞または組織の培養からも得られ得る。
【０１０１】
本明細書において用いる場合、“標準”という用語は、比較のために用いられるものをいう。例えば、標準は対照のサンプルに対して投与または添加され、被験サンプル中において該化合物を測定する際に結果を比較するために用いられる既知の標準的な剤または化合物であり得る。標準はまた、“内部標準”例えば、サンプルに対して既知の量で添加され、興味の対象であるマーカーが測定される前にサンプルが加工され、または精製または抽出の手順にさらされる場合に、精製率または回収率などを決定するのに有用な剤または化合物をもいい得る。
【０１０２】
本明細書において用いる場合、“刺激する”という用語は、対照の値に対してより高くあるよう、活性レベルまたは機能レベルを誘導することまたは増大させることを意味する。刺激は、直接的または間接的な機構を介するものであり得る。一つの側面において、活性または分化は、対照の値と比較して少なくとも 10%、より好ましくは少なくとも 25%、およびよりいっそう好ましくは少なくとも 50% 刺激される。本明細書において用いる場合、“刺激因子(stimulator)”という用語は、その適用が、これらに限定されないが、ASC 細胞の生成、分化、および活性、および ASC の子孫の生成、分化、および活性を含む、興味の対象である工程または機能の刺激をもたらすあらゆる化合物または剤をいう。
【０１０３】
分析、診断、または治療の“対象”は、動物である。かかる動物は、哺乳類、好ましくはヒトを含む。 
【０１０４】
“実質的に純粋”という用語は、化合物、例えば、天然にそれに付随する構成成分から分離されたタンパク質またはポリペプチドを表す。通常、サンプル中における全物質の(体積での、湿重量または乾燥重量での、またはモル百分率またはモル分率での)少なくとも 10%、より好ましくは少なくとも 20%、より好ましくは少なくとも 50%、より好ましくは少なくとも 60%、より好ましくは少なくとも 75%、より好ましくは少なくとも 90%、および最も好ましくは少なくとも 99% が興味の対象の化合物である場合、化合物は実質的に純粋である。純度は、あらゆる適切な方法によって、例えば、ポリペプチドの場合にはカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、または HPLC 分析によって測定され得る。化合物、例えば、タンパク質もまた、天然に付随する構成成分を基本的に含まない場合または自然状態においてそれに付随する天然の夾雑物から分離されている場合、実質的に純化されている。
【０１０５】
本明細書において用いる場合、“処置(treating)”という用語は、特定の障害または症状の予防、または特定の障害または症状に付随する症候の緩和、および/または該症候を防止または除去することを含む。“予防的”処置とは、疾患に付随する病態を進行させるリスクを減少させる目的で、疾患の徴候を示さないかまたは疾患の初期の徴候のみを示す対象に対して施される処置である。
【０１０６】
“治療的”処置とは、病気の徴候を示す対象に対し、これらの徴候を減弱させまたは除去する目的で施される処置である。
【０１０７】
化合物の“治療上有効な量”とは、化合物が投与される対象に対し有益な効果をもたらすのに十分な化合物の量である。
【０１０８】
本明細書において用いる場合、“処置(treating)”という用語は、特定の疾患、障害、または症状の予防、または特定の疾患、障害、または症状に付随する症候の緩和、および/または該症候を防止または除去することを含む。
【０１０９】
本明細書において用いる場合、“創傷”という用語は、組織または細胞層に対する物理的裂傷、切断(break)、または破裂をいう。創傷は、外科的手技を含むあらゆる物理的傷害(insult)によって、または疾患、障害状態の結果として起こり得る。
【０１１０】
態様
本出願は、脂肪組織由来細胞が、創傷の治療、即ち、創傷治癒の促進に有用であるという本明細書に開示する知見に基づく。
【０１１１】
本発明の細胞は、それらの使用において、翻訳可能性、再現性、および予測性などの利点を提供する。本発明の細胞および方法のさらなる有益な特徴には以下が含まれる:
外来タンパク質無しで(即ち、FBS無しで)所定の無血清条件において培養/製造する能力;
単層培養細胞と比較しての増殖因子の生産の促進;
ウシコラーゲンまたはその他の異種 ECM 成分を必要としない自己形成マトリックス;
トリプシン処理を必要とせず、即時に移植可能;
大きな複製能力;
単層培養として生育した細胞と比較して低い可変性、より予測可能な生物学;
堅固であり(ハイポキシア; アノイキス)、インビボでより良好に移植しても生存可能;
動的 (環境に応答する); および 
自動スケールアップが可能である。
【０１１２】
成人ヒト髄外脂肪組織由来間質細胞は、患者に対する危険または不快を最小にしつつ常套的に収集しうる間質幹細胞源を表す。病理的証拠は、脂肪由来間質細胞が複数の分化系列経路に沿って分化することができることを示唆している。脂肪組織は多くの個体において容易に接近でき豊富である。肥満は米国において蔓延率の高い症状であり、50%を超える成人が身長に基づいて推奨されるBMI を上回っている。
【０１１３】
脂肪細胞は補充可能な細胞集団であることがよく記載されている。脂肪吸引またはその他の手順による外科的除去の後においても、時間と共に個体において脂肪細胞の再発をみることは一般的である。これは、脂肪組織が自己再生可能な間質幹細胞を含むことを示唆する。
【０１１４】
脂肪組織は組織工学用途のための多くの実践的な利点を提供する。第一に、それは豊富にある。第二に、それには患者に対する危険を最小にしつつ回収する方法が利用可能である。第三に、それは補充可能である。間質細胞は骨髄の有核細胞集団の0.01%未満を表すが、脂肪組織1g当たり8.6 x 104 の間質細胞が存在する(Sen et al.、2001、Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319)。2から4週間にわたるエキソビボでの拡張の結果、0.5キログラムの脂肪組織から5億の間質細胞が得られる。これらの細胞はすぐに利用でき、または、将来の自己または同種適用のために冷凍保存できる。
【０１１５】
脂肪由来間質細胞はまた、多数の接着および表面タンパク質を発現する。これらには、以下に限定されないが、細胞表面マーカー、例えば、 CD9; CD29 (インテグリンベータ 1); CD44 (ヒアルロン酸受容体); CD49d,e (インテグリンアルファ 4、5); CD54 (ICAM1); CD55 (崩壊促進因子); CD105 (エンドグリン); CD106 (VCAM-1); CD166 (ALCAM) およびHLA-ABC (クラス I 組織適合性抗原);およびサイトカイン、例えば、 インターロイキン6、7、8、11; マクロファージコロニー刺激因子; GM-コロニー刺激因子; 顆粒球-コロニー刺激因子; 白血病抑制因子; 幹細胞因子および骨形成タンパク質が挙げられる。これらタンパク質の多くは造血支持機能を果たす能力を有し、これらすべては骨髄間質細胞に共通に共有される。 
【０１１６】
本発明の方法に有用な脂肪組織由来間質細胞は、当業者に知られた様々な方法、例えば、WO 00/53795に記載の方法によって単離することが出来る。好ましい方法において、脂肪組織は、哺乳類対象、好ましくはヒト対象から単離される。好ましい脂肪組織の源は、大網脂肪である。ヒトにおいて、脂肪は典型的には脂肪吸引によって単離される。本発明の細胞をヒト対象に移植する場合は、脂肪組織はその同じ対象から単離して自己移植を提供するのが好ましい。あるいは、移植される細胞は同種である。
【０１１７】
本発明の細胞を単離し、培養し、分化誘導し、特徴決定することを助けるのに利用できる多くの技術が当業者に知られている(Gorio et al.、2004、Neuroscience、125:179-189; Yamashita et al.、2005、J. Cell Sci.、118:665-672; Conley et al.、2004、The International Journal of Biochemistry and Cell Biology、36:555-567; Kindler、2005、Journal of Leukocyte Biology、78:836-844; Fuchs et al.、2004、Cell、116:769-778; Campos、2004、Journal of Neuroscience Research、78:761-769; Dontu et al.、2005、Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia、10:75-86)。
【０１１８】
細胞または組織損傷が存在する可能性があるあらゆる状態をすぐに治療することが重要であるが(例えば、急性創傷)、特定の状態は、慢性症状になる前に治療することが必須である。慢性疾患は、患者、医療専門家、および医療制度に対する挑戦である。それらは米国における100万の人間の生活の質を顕著に悪化させている。生産力の喪失および医療費の観点から社会に高いコストを余儀なくする集中治療が必要である。慢性疾患の管理は、医療財源に甚大な負担を与えうる。いったんは急性であったが進行して慢性となった疾患または症状、例えば、創傷はしばしば、疾患が既知の治療法で管理または治療できないためにそのようになる。それゆえ、細胞および組織損傷に特徴づけられる慢性疾患および症状を治療する改良された治療法が必要とされている。
【０１１９】
一つの側面において、本発明は、様々なサイズの SOM-Bの形成に必要な細胞の最適数を決定する方法を提供する。一つの側面において、SOM-Bは、「有効な」SOM-Bであるとみなされ、ここで有効なとは、生育、極性化、分化能力などの所望の特徴を示すことが出来ることを意味する。本発明はまた、SOM-Bにおいて、どこで細胞生育が起こるのか、どのような種類のマトリックスが生産されるのか、どこでマトリックスが生産されるのか、そしてどれだけのマトリックスが生産されるのかを判定する方法を提供する。上記の性質を判定する方法は当該技術分野において知られており、細胞生育速度などの特徴を測定する方法も当該技術分野において知られている。 
【０１２０】
どの程度の頻度でSOM-Bが接着細胞を産みだすことができるのか、および産み出された細胞の特徴、例えば、 生育速度、集密に達する能力、発生上の可塑性等を判定するのに用いられうる方法も当該技術分野において知られている。SOM-B 融合の頻度を判定するのに用いられ得る方法も利用可能であり、その結果得られるサイズ、形状、極性等を測定する方法も利用可能である。SOM-Bが多分化能または可塑性であるかを試験する方法も当該技術分野において知られており、即ち、それらが２以上の細胞タイプに分化する能力を有するか否かを試験する方法も知られている。かかる研究は、懸濁、接着、または産み出された(spawned)細胞を使用して行うことが出来る。研究しうる細胞の表現型としては、これらに限定されないが、脂肪細胞、骨、軟骨、骨格筋、心筋、神経性細胞、例えば、神経細胞、膵島細胞、および内皮細胞が挙げられる。
【０１２１】
方法および試薬もSOMBの特徴決定のために利用でき、例えば、免疫学的特徴決定を行うための方法および試薬、例えばこれらに限定されないが、マーカーおよびタンパク質: Oct 4、SSEA 3、SSEA 4、CD34、CD133、CD184、NG2、ABCG2、ネスチン、MyoD、NKx2.5、ラミニン、ベータ1インテグリン、Cbfa1、II型コラーゲン、MAPK、HLA-1 コントロール、インスリン、Gata、Pax、Wnt、およびその他の転写因子およびタンパク質が利用できる。フローサイトメトリーマーカーとしては、CD34、NG2、ABCG2、CXCR4、CD271、CD140b、CD105、ALDH およびHLA-1が挙げられる。
【０１２２】
本発明はまた、インビボでSOMBを使用する方法も提供し、インビボでSOMBを使用するための様々な技術が当業者に知られている。例えば、SOMBは様々な経路で対象に投与することが出来、例えば、局所、皮下、筋肉内、および直接投与が挙げられる。本発明のSOMBは、多様な用途を有し、例えばこれらに限定されないが、血管リモデリング、骨増殖および再生、組織/細胞のための置換使用、例えば、膵臓/島、中枢神経系、皮膚修復および創傷治癒、末梢神経系、創傷、腱、靱帯、筋肉、臓器、例えば、肝臓および腎臓、およびリンパ節における用途、ならびに移植手順における使用が挙げられる。
【０１２３】
本明細書に記載する SOM-Bおよび組成物および方法は、細胞とともにまたは細胞無しで加工処理および/または 精製されたSOM-B-由来細胞外マトリックスを利用する再生医療にも利用できる。
【０１２４】
より従来型の単細胞懸濁と比較してのいくつかの実際のまたは可能性のある利益は、3-D ニッチ (芽体)としてあらかじめ作られたASCの投与によって与えられ得る:
・細胞はよく確立された、細胞-細胞接触および細胞-マトリックス接触を有し、それゆえアノイキスを起こしにくい。アノイキスは、細胞-マトリックス相互作用の欠失、または不適切な細胞-マトリックス 相互作用により誘導されるプログラム細胞死として定義される(Valentijn et al.、2004; Michel、2003)。アノイキスは細胞送達の様々な方法に関係する低い送達および移植効率において重要な役割を果たしている可能性がある。細胞-対-細胞相互作用は、幹細胞の様々な分化系列、例えば、 心筋細胞への分化に重要であることが示されている(Li et al.、2006);
・細胞はその独自の細胞外マトリックス環境を作り、(おそらくは) 付随する増殖因子を作る(Wang et al.、2004);
・「数における強さ」: 細胞は単層培養においては単細胞にとって致死的な過酷なインビトロ条件(例えば、 無血清培養)において生存し、耐えることができる;
・細胞は拡散によって3-D 構造(培養中)として生存することが出来、おそらくは創傷/外傷環境への移植の後でも同様に生存することが出来る;および、
・細胞は、様々な外部刺激に応答して増殖、遊走および/または 変形する能力を保持しており、損傷組織環境中での動的 相互作用の能力を有することを示唆する。
【０１２５】
本明細書において用いる場合、「創傷」という語は、組織または細胞層に対する物理的裂傷または破裂に関し、潰瘍を含む。創傷はあらゆる物理的侵襲、例えば、外科手技によって起こりうる。
【０１２６】
創傷治癒の測定方法は当該技術分野において知られている。細胞生存の測定方法は当該技術分野において知られており、様々な細胞的、分子的、生化学的、および組織学的技術を含む。
【０１２７】
本発明の一つの態様によると、本発明の細胞および化合物を含む組成物は、創傷治癒の促進、および/または、創傷治癒に欠損を有する患者の治療に用いられる。
【０１２８】
既存の創傷治癒のための処方も、本明細書に記載する手順のための医薬上許容される担体として利用することが出来る。
【０１２９】
本発明の細胞は、単独でまたは創傷およびその他の欠陥の修復に有用な組成物と組み合わせて対象に投与することができる。かかる組成物としては、これらに限定されないが、骨形成タンパク質、ハイドロキシアパタイト/リン酸三カルシウム粒子 (HA/TCP)、ゼラチン、ポリ-L-リジン、およびコラーゲンが挙げられる。
【０１３０】
一つの態様において、本発明は、本明細書に記載する細胞および組成物を用いて対象における創傷の閉鎖を促進する方法を提供する。この方法によると、ホルモン、増殖因子、またはその他の物質を分泌するよう選択または改変された本発明の細胞が、細胞がホルモン、増殖因子またはその他の物質を産生するのに十分な条件下で創傷の近傍に移される。創傷の近傍でのホルモン、増殖因子、またはその他の物質の存在は、創傷の閉鎖を促進する。一つの側面において、投与した細胞の増殖は創傷の治癒を促進する。一つの側面において、投与した細胞の分化は創傷の治癒を促進する。かかる方法は、外部 (例えば、表面) および内部の創傷の両方の閉鎖を促進する。本発明の方法が閉鎖の促進において有用な創傷としては、これらに限定されないが、擦過傷、裂離、打撃創傷、火傷、挫傷、銃創、切創、開放創、穿通創、貫通創、穿刺創(puncture wound)、排液線創傷、刺創(stab wound)、手術創、皮下創傷、糖尿病性病変部または 接線方向の傷が挙げられる。かかる方法は創傷の完全な治癒または閉鎖を達成する必要はない; かかる方法は創傷閉鎖の程度を促進することで十分である。この点で、かかる方法は単独で用いてもよいし、創傷組織の治癒のための別の方法の補助として用いてもよい。
【０１３１】
本発明は、細胞療法を受け入れられる障害の治療方法を含み、かかる方法は、罹患した対象に治療上有効量の本発明の細胞を投与することを含む。
【０１３２】
一つの態様において、細胞は、将来対象が要求する細胞療法、例えば、疾患療法、組織修復、移植、細胞衰弱の治療、または細胞機能障害の治療を用いる治療的使用のための細胞を誘導および保存させるために本明細書に記載するように取得および培養される。
【０１３３】
本発明の別の態様において、対象に由来する細胞は直接インビトロまたはインビボで分化して、細胞株を作ることなく分化しつつあるまたは分化した細胞を作る。これらの細胞は、細胞療法、例えば、同種細胞療法における使用のための細胞の提供によって、医学および生物学研究および疾患の治療において有用である。
【０１３４】
上記技術によって作られた脂肪組織幹細胞および脂肪組織由来細胞は、細胞生物学、創薬に関する研究および細胞療法において利用され、これらに限定されないが、創傷治癒に加えて様々な疾患、障害および症状の治療のための細胞の生産に利用される。一つの側面において、それらは糖尿病患者における創傷治癒の促進に有用である。それらはまた、本明細書に記載する糖尿病性 創傷治癒のための使用に加えて、その他の創傷および傷害、ならびに疾患、障害および症状、例えば、火傷、皮膚の老化の治療に有用である。
【０１３５】
かかる細胞療法は、増殖因子またはケモカイン、例えば、増殖、分化系列-拘束を誘導するもの、または目的の遺伝子またはタンパク質と組み合わせての本発明の細胞の使用を含む。治療方法は、直接移植のための幹細胞または適当な前駆細胞を提供することを含み得、ここで、組織はインビボで再生されるかまたは所望の組織をインビトロで再形成し、次いで罹患している対象へ組織が提供される。
【０１３６】
本発明の複合体(composite)および/または細胞は、生理活性物質のインサイチュ送達のための媒体として利用されうる。本発明の複合体に組み込まれる、または添加剤として含まれる生理活性物質としては、これらに限定されないが、薬剤、増殖因子、ビタミン、ミネラルサプリメント、疾患または病気の治療、予防、診断、治癒または緩和のために用いられる物質、体の構造または機能に影響を与える物質または薬物が挙げられる。生理活性物質は、例えば、複合体または細胞懸濁物の対象への移植の促進、その後の組込みおよび治癒工程の促進に利用されうる。活性物質としては、これらに限定されないが、抗真菌剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、増殖因子、血管新生因子、麻酔薬、ムコ多糖、金属、細胞、およびその他の創傷治癒剤が挙げられる。加工処理条件は比較的穏やかであり得るので(生理的温度およびpH)、生細胞はその形成の際に複合体に組み込まれ得、あるいは、後で組織工学技術を介して複合体に浸潤可能とされる。 
【０１３７】
慢性創傷は、非治癒性の皮膚創傷により特徴づけられる創傷であり、慢性静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍、動脈潰瘍、褥瘡 (例えば、臥位潰瘍)、放射線潰瘍、外傷創傷、および開放性の、複雑性非治癒創傷が含まれる。 
【０１３８】
ある態様によると、本発明の製剤は抗菌剤を含む。抗菌剤は、例えば、標準的な治療上有効量にて提供されうる。標準的な治療上有効量は、当業者によって典型的に用いられる量または規制当局 (例えば、FDAまたは 欧州の対応する当局)により認可された量である。 
【０１３９】
別の態様において、本発明の製剤は包帯材料に含浸されうる(あるいは包帯材料に含まれるか包含される)。包帯材料は医薬上許容される布である。それは、例えば、ガーゼまたはその他のタイプの医療用布または創傷の被覆および/または治療剤または組成物を患者と接触させて維持するために用いられ得る材料である。
【０１４０】
本発明の組成物はさらに単独でまたは組み合わせてさらなる治療添加剤を含んでいてもよい(例えば、2、3、または4のさらなる添加剤)。さらなる添加剤の例としては、これらに限定されないが:(a) 抗菌剤、(b) ステロイド(例えば、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン); (c) 鎮痛剤(例えば、アスピリン、NSAID、および局所麻酔薬); (d) 抗炎症薬; および(e)それらの組合せが挙げられる。
【０１４１】
本発明は、ASCおよびその子孫をそれを必要とする対象に投与する方法を提供する。一つの側面において、ASCは、目的の前駆細胞または完全に分化した状態へと分化するよう前処理されたものである。別の側面において、ASCの集団は２以上のタイプの 分化誘導剤または媒体、あるいは２以上のタイプの 分化を誘導する剤の組合せで処理されたものであり得る。別の側面において、細胞分化誘導化合物で前処理された、またはまったく処理されていない別々のASCの集団が、対象に共投与されうる。異なる群の細胞の共投与は、ASC 集団が実際に同時に投与されることまたは集団が同じ組成物中に一緒にされまたは投与されることを必ずしも意味する訳ではない。本発明はさらに、対象にASCを投与し、次いで、対象に細胞分化誘導剤を投与することによってインビボでASCの分化を誘導する組成物および方法を提供する。一つの側面において、対象はヒトである。２以上の分化剤または化合物が、特定の細胞経路に沿って細胞を誘導するために用いられる場合、またはさらなる剤を用いて第二の経路にそっていくつかの細胞の分化を誘導する場合、それら様々な剤は同時に提供される必要はない。様々な化合物および増殖因子は本発明の細胞とともに、分化または成熟を誘導または調節するために用いられ得る。
【０１４２】
本発明の細胞は、単独で、または組織、骨、および血管の損傷および欠陥の修復に有用な組成物と混合して対象に投与されうる。かかる組成物としては、これらに限定されないが、骨形成タンパク質、ハイドロキシアパタイト/リン酸三カルシウム 粒子(HA/TCP)、ゼラチン、ポリ-L-リジン、およびコラーゲンが挙げられる。
【０１４３】
体内で酵素により消化されるコラーゲン、グリコサミノグリカンおよびヒアルロン酸などの非合成マトリックス タンパク質は、送達に有用であり(米国特許第4,394,320; 4,472,840; 5,366,509; 5,606,019; 5,645,591;および5,683,459号参照)、本発明での使用に好適である。その他の移植可能な媒体および装置が本発明の細胞のインビボでの送達に利用できる。これらとしては、これらに限定されないが、スポンジ、例えば、インテグラ(Integra)、フィブリンゲル由来のもの、ポリ乳酸 グリコール酸 共重合体(PLAGA)の焼結ミクロスフェアから形成された足場、および、ネイティブなコラーゲン、ならびにその他のタンパク質から形成されたナノファイバーが挙げられる。本発明の細胞はさらに、以下と一緒にしてもよい：増殖因子、栄養因子、医薬品、カルシウム含有化合物、抗炎症薬、抗菌剤、または、骨または組織生育、安定性およびリモデリングを助長または促進することができるその他の物質。 
【０１４４】
本発明の組成物は、無機充填剤または粒子と一緒にしてもよい。例えば移植可能移植片における使用のためには、無機充填剤または粒子は、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、ガラスセラミック、非晶質リン酸カルシウム、多孔性セラミック粒子または粉末、チタンメッシュまたはチタン合金、または粒状チタンまたはチタン合金から選択されうる。
【０１４５】
一つの態様において、本発明の細胞を含む組成物は、注射によって局所投与される。細胞を含む組成物はさらに既知の薬物と一緒にされてもよく、一つの態様において、薬物が細胞に結合される。これら組成物は所望の形状に成形されうる移植可能装置の形態にて調製されうる。一つの態様において、生体適合性マトリックスおよび１以上の本発明の細胞を含む移植片構築物が調製され、ここで、マトリックスは腫瘍、損傷または疾患組織の除去によって生じるギャップまたは空間を埋めるような形状に形成される。
【０１４６】
細胞は集団を確立するために組織内の所望の部位に播種されうる。細胞は、装置、例えば、カテーテル、外套針、カニューレ、ステント (細胞内に播種されうる)等を用いてインビボで部位に移されうる。
【０１４７】
細胞は単独で用いてもよいし、生物学的に適合性の組成物中で用いてもよく、分化した組織および構造を、インビボおよびインビトロの両方で作り出すか、または組織において目的のプロセスを刺激する。さらに、細胞は、ホルモン、増殖因子、例えば、多面発現性増殖因子、サイトカインおよびケモカインを生産するよう、そして、その他の細胞集団の生育および拡張を支持するための条件培地を提供するよう、拡張および培養されうる。別の側面において、本発明は、実質的に細胞を含まず、脂肪組織からの細胞外マトリックス材料を含む脂質由来格子を包含する。格子(lattice)は、原基または成熟組織または構造へのインビボまたはインビトロでの細胞の生育および分化を促進する、ならびに、細胞の生存率を維持する環境を提供するための基質として利用できる。
【０１４８】
本発明はしたがって、信じられないほど 多数の脂肪組織由来のASC、前駆体、または分化細胞を本明細書に記載する手順および治療のために送達するための方法および組成物を提供する。さらに、細胞注入または投与を必要とする疾患のために、脂肪組織収穫物は侵襲性が最小であり、多くの細胞を生じ、繰り返し行うことが出来る。
【０１４９】
本発明は、不死化細胞株、例えば、これらに限定されないが、少なくとも１つの 細胞タイプへと分化することが出来る脂肪組織由来細胞株の調製および使用を包含する。不死化細胞株を調製するための様々な技術は当業者に知られている。 
【０１５０】
本発明はまた、脂肪組織または骨に対する効果について剤を試験または同定するための細胞株または培養物の調製および使用も包含する。本発明はさらに、本明細書に記載する方法のいずれかを用いて同定される化合物を包含する。かかる化合物は、本明細書に開示する疾患、障害、症状、および傷害の治療のために製剤され、対象に投与されうる。
【０１５１】
一つの態様において、目的の遺伝子を本発明の細胞に導入することが出来る。一つの側面において、かかる細胞を対象に投与することができる。一つの側面において、対象は疾患、障害、症状、または損傷に罹患している。一つの側面において、細胞は外来遺伝子を発現するよう改変されているか、または、内在性遺伝子の発現を抑制するよう改変されており、本発明は、かかる細胞および集団を遺伝子的に改変する方法を提供する。この方法によると、細胞は、導入遺伝子を含む核酸を含む遺伝子移入ベクターに曝され、その結果、核酸が、導入遺伝子が 細胞内で発現するのに好適な条件下で細胞に導入される。導入遺伝子は一般的に発現カセットであり、好適なプロモーターに作動可能に連結したコードポリヌクレオチドを含む。コードポリヌクレオチドはタンパク質をコードするものであってもよいし、生理活性 RNA (例えば、アンチセンス RNAまたはリボザイム)をコードするものであってもよい。したがって、例えば、コードポリヌクレオチドは、毒素に対する耐性を付与する遺伝子、ホルモン (例えば、ペプチド成長ホルモン、ホルモン放出因子、性ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、サイトカイン (例えば、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン)、細胞表面結合細胞内シグナル伝達部分(例えば、細胞接着分子、ホルモン受容体)、所与の分化系列の分化を促進する因子等をコードしうる。
【０１５２】
遺伝子的改変のための有用な標的として役立つことに加えて、本発明の多くの細胞および集団は様々なポリペプチドを分泌する。かかる細胞は、所与のホルモンの即時の源を提供するバイオリアクターとして用いることが出来、本発明は、かかる細胞からポリペプチドを取得する方法に関する。かかる方法によると、細胞はそれらがポリペプチドを培地へと分泌するのに好適な条件下で培養される。好適な期間の後、そして好ましくは定期的に、培地は回収され、培地からポリペプチドを単離するために処理される。 あらゆる標準的な方法 (例えば、ゲルまたはアフィニティークロマトグラフィー、透析、凍結乾燥等)が培地からのホルモンの精製に利用することが出来、それらの多くは当該技術分野において知られている。
【０１５３】
別の態様において、ポリペプチドを分泌する本発明の細胞 (および集団)は治療剤として利用できる。一般的に、かかる方法は、細胞を、インビトロまたはインビボで所望の組織へと、動物組織へと直接、移すことを伴う。細胞は、組織タイプによって一般的に異なる、あらゆる適当な方法によって所望の組織へと移されうる。
【０１５４】
本発明の細胞を含む組成物は、所望の組織の生育および分化を促進するためのあらゆる好適な方法で利用することが出来る。例えば、組成物は、三次元または定位的モデリング技術を用いて構築することができる。所望の構造の生育および分化を導くために、組成物は適宜、バイオリアクターまたはインキュベーター中でエキソビボで培養することができる。別の態様において、構造は、組織または構造を成長させることが望まれる部位にて直接宿主動物内に移植される。さらに別の態様において、組成物は宿主上に移植され得、ここでそれは使用時まで生育および成熟する。その後、成熟構造 (または原基)が宿主から切り出され、適宜宿主内に移植される。
【０１５５】
組成物に含めるために好適なマトリックスは、様々な起源由来であり得る。上記のように、本発明の細胞、マトリックス、および組成物は、組織工学および再生に利用することが出来る。したがって、本発明は、これら本発明の特徴のいずれかを組み込んだ移植可能な構造 (即ち、インプラント)に関する。インプラントの正確な性質は所与の用途によって変動する。インプラントは、記載されたように、成熟または未熟組織であり得、またはそれを含みうる。したがって、例えば、１つのタイプのインプラントは骨インプラントであり得、所望によりマトリックス材料内に播種された、脂肪、軟骨形成、または破骨細胞への分化を経る（または分化を予定されている）本発明の細胞の集団を含む。かかるインプラントは、対象内の成熟骨またはその他の組織の作成または再生を促進するために適用または移植されうる。
【０１５６】
当業者であれば、本発明の細胞を送達するのに有用なその他の担体が存在することを理解しているであろう。かかる担体としては、これらに限定されないが、リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、および合成または天然ポリマー、例えば、可溶性または凝集形態のコラーゲンまたはコラーゲン断片が挙げられる。一つの側面において、かかる担体は１または複数の位置へと細胞を送達する役割を果たす。別の側面において、担体および細胞は全身投与または移植によって送達されうる。移植は１または数個の部位へのものであり得る。 
【０１５７】
上記のように、細胞は本発明の有機/無機複合体の上および/または中に播種されうる。同様に、組織、例えば、軟骨は、患者への移植の前に複合体と結合されうる。かかる細胞の例としては、これらに限定されないが、骨細胞(例えば、 破骨細胞、造骨細胞および骨細胞)、血液細胞、上皮細胞、神経性細胞(例えば、神経細胞、星状細胞およびオリゴデンドロサイト)、および歯の細胞(象牙芽細胞およびエナメル芽細胞)が挙げられる。播種される細胞は、自源性、同種、または異種であり得る。播種される細胞は被包されていても被包されていなくてもよい。
【０１５８】
本発明において利用できる抗菌剤の例としては、これらに限定されないが、イソニアジド、エタンブトール、ピラジナミド、ストレプトマイシン、クロファジミン、リファブチン、フルオロキノロン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、リファンピン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ダプソン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、サイプロフロキサシン、ドキシサイクリン、アンピシリン、アンホテリシン B、ケトコナゾール、フルコナゾール、ピリメタミン、スルファジアジン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ペンタミジン、アトバコン、パロモマイシン、ジクララザリル、アシクロビル、トリフルオロウリジン、ホスカルネット、ペニシリン、ゲンタマイシン、ガンシクロビル、イアトロコナゾール、ミコナゾール、ジンクピリチオン、および銀塩、例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物、および過ヨウ素酸塩が挙げられる。
【０１５９】
本発明の複合体に組み込むことが出来る増殖因子としては、これらに限定されないが、骨増殖因子(例えば、BMP、OP-1)、塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子 (aFGF)、神経成長因子 (NGF)、上皮増殖因子 (EGF)、インスリン-様増殖因子1および2 (IGF-1およびIGF-2)、血小板由来増殖因子 (PDGF)、腫瘍血管新生因子 (TAF)、血管内皮増殖因子 (VEGF)、副腎皮質刺激ホルモン放出因子 (CRF)、トランスフォーミング増殖因子アルファおよびベータ(TGF-アルファおよび TGF-ベータ)、インターロイキン-8 (IL-8)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)、インターロイキン、およびインターフェロンが挙げられる。
【０１６０】
本発明の複合体に組み込むことが出来るその他の剤または化合物としては、酸ムコ多糖、例えば、これらに限定されないが、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパリノイド、デルマタン硫酸、多流酸ペントサン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、セルロース、アガロース、キチン、デキストラン、カラゲニン、リノール酸、およびアラントインが挙げられる。
【０１６１】
本発明の細胞を含む組成物 に組み込まれうる、またはその中に添加剤として含まれうるタンパク質およびその他の生理活性化合物としては、これらに限定されないが、コラーゲン (架橋コラーゲンを含む)、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン (架橋エラスチンを含む)、オステオポンチン、オステオネクチン、骨シアロタンパク質(Bsp)、アルファ-2HS-糖タンパク質、骨 Gla-タンパク質 (Bgp)、マトリックス Gla-タンパク質、骨リン糖タンパク質、骨リンタンパク質、骨 プロテオグリカン、プロテオリピド、骨形成タンパク質、軟骨誘導因子、血小板由来増殖因子および骨格増殖因子、酵素、またはその組合せおよび生理活性断片が挙げられる。ヒトまたはその他の哺乳類の解剖学のその他の部分に結合するその他のタンパク質が組み込まれ得、あるいは添加剤として含まれ得、例えば、軟骨に結合するタンパク質、例えば、軟骨石灰化(chondrocalcining)タンパク質、象牙質に結合するタンパク質、例えば、ホスホルリン(phosphoryin)、糖タンパク質およびその他のGla タンパク質、またはエナメル質に結合するタンパク質、例えば、アメロゲニンおよびエナメリンが挙げられる。本発明の組成物に組み込まれる剤は、骨誘導を促進または増進するものであってもしないものであってもよい。免疫応答を軽減する補助剤も本発明の複合体とともに用いることが出来る。
【０１６２】
一つの態様において、生理活性物質または化合物はまず、マイクロカプセル、ミクロスフェア、微粒子、マイクロファイバー、強化用繊維等に被包されることにより、混合および制御、延長、遅延および/または持続放出の達成が促進され得、本発明の細胞と一緒にされる。生理活性物質の被包はまた、本発明の複合体の形成の際の分解に対して剤を保護することも可能である。
【０１６３】
本発明の好ましい態様において、生理活性物質は、本発明の組成物が対象に移植される場合、細胞リモデリングに起因する時間尺度に依存する生体吸収により対象中へと制御されて放出される。一つの側面において、組成物は、組織における不連続な領域を置換するために用いられ得る。不連続な領域は、外傷、疾患、障害、または症状、手術、損傷等の結果であり得る。
【０１６４】
抗体を当該技術分野において周知の方法を用いて作成することが出来る。例えば、その内容全体を引用により本明細書に含める米国特許出願第07/481,491号は、特定のタンパク質に対する抗体の作成方法を開示している。抗体の産生のために、様々な宿主動物、例えば、これらに限定されないが、ウサギ、マウス、およびラットを、特定のポリペプチドまたはそのペプチド断片による注射によって免疫することが出来る。免疫学的応答を高めるために、様々なアジュバントを宿主種に応じて用いることが出来、例えば、これらに限定されないが、フロイント (完全および不完全)、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびヒトにおいて有用である可能性のあるアジュバント、例えば、 BCG (カルメット・ゲラン桿菌)およびコリネバクテリウム・パルバムが挙げられる。
【０１６５】
モノクローナル抗体の調製のために、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供するあらゆる技術を利用することが出来る。例えば、Kohler and Milstein (1975、Nature 256:495-497)により最初に開発されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒト B-細胞 ハイブリドーマ技術 (Kozbor et al.、1983、Immunology Today 4:72)、およびEBV-ハイブリドーマ 技術 (Cole et al.、1985、in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss、Inc.、pp. 77-96)が、ヒトモノクローナル抗体の産生に用いることが出来る。別の態様において、モノクローナル抗体は、その内容全体を引用により本明細書に含める国際出願PCT/US90/02545号に記載の技術を用いて無菌動物において産生される。
【０１６６】
本発明によると、ヒト抗体は、ヒトハイブリドーマの使用(Cote et al.、1983、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030) またはヒト B 細胞のEBV ウイルスによるインビトロでの形質転換 (Cole et al.、1985、in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss、Inc.、pp. 77-96)により使用および取得することができる。さらに、SLLP ポリペプチドのエピトープに特異的なマウス 抗体分子からの遺伝子および適当な生理活性のヒト 抗体分子からの遺伝子をともに切り出すことによる「キメラ抗体」の産生のために開発された技術(Morrison et al.、1984、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855; Neuberger et al.、1984、Nature 312:604-608; Takeda et al.、1985、Nature 314:452-454)を利用できる; かかる抗体は本発明の範囲内である。特異的なモノクローナル抗体がいったん開発されると、常套の技術によるその突然変異体および変異体の調製も可能となる。
【０１６７】
一つの態様において、一本鎖 抗体の産生のために記載された技術(引用によりその内容全体を本明細書に含める米国特許第4,946,778号)が、タンパク質-特異的一本鎖 抗体の産生に適用される。別の態様において、 Fab 発現 ライブラリーの構築のために記載された技術(Huse et al.、1989、Science 246:1275-1281)を用いることにより、特定の抗原、タンパク質、誘導体、またはアナログに対する所望の特異性を有するモノクローナル Fab 断片の迅速かつ容易な同定が可能となる。
【０１６８】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体断片は公知の技術によって作成することが出来る。例えば、かかる断片としては、これらに限定されないが以下が挙げられる:抗体分子のペプシン消化により産生されうるF(ab')2 断片; F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を還元することにより作成しうるFab' 断片; 抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作成されうるFab 断片;およびFv 断片。
【０１６９】
ポリクローナル抗体の作成は、所望の動物に抗原を接種し、抗原に特異的に結合する抗体をそれから単離することによって達成される。
【０１７０】
タンパク質またはペプチドの全長またはペプチド断片に対するモノクローナル抗体は、周知のモノクローナル抗体調製手順のいずれかを用いて調製することが出来、例えば、Harlow et al. (1988、In: Antibodies、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、NY) およびTuszynski et al. (1988、Blood、72:109-115)に記載されている手順が挙げられる。所望のペプチドの量はまた、化学合成技術を用いて合成することも出来る。あるいは、所望のペプチドをコードするDNAをクローニングし、大量のペプチドの作成に好適な細胞において適当な プロモーター 配列から発現させることも出来る。ペプチドに対するモノクローナル抗体は、本明細書において言及するような標準的手順を用いてそのペプチドにより免疫されたマウスから作成される。
【０１７１】
本明細書に記載する手順を用いて得られるモノクローナル抗体をコードする核酸を、当該技術分野において利用可能な技術を用いてクローニングおよび配列決定することが出来、例えば、Wright et al. (1992、Critical Rev. in Immunol. 12(3,4):125-168) およびそこに引用される文献に記載されている。さらに、本発明の抗体は、Wright et al.、(前掲) およびそこに引用される文献、およびGu et al. (1997、Thrombosis and Hematocyst 77:4:755-759)に記載の技術を用いて「ヒト化」することが出来る。
【０１７２】
ファージ抗体ライブラリーを作成するためには、cDNA ライブラリーをまず、細胞、例えば、ファージ 表面上で発現すべき所望の タンパク質、例えば、所望の 抗体を発現するハイブリドーマから単離されたmRNAから得る。mRNAのcDNA コピーは、逆転写酵素を用いて生産される。免疫グロブリン断片を特定するcDNA はPCRによって得られ、その結果得られたDNAを好適な バクテリオファージ ベクターにクローニングして、免疫グロブリン遺伝子を特定するDNA を含むバクテリオファージ DNA ライブラリーを作成する。異種 DNAを含むバクテリオファージ ライブラリーの作成の手順は当該技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al. (1989、Molecular Cloning:  A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、NY)に記載されている。
【０１７３】
所望の抗体をコードするバクテリオファージは、その対応する結合タンパク質、例えば、抗体が向けられた抗原への結合にそれが利用可能なようにタンパク質がその表面に提示されるよう操作することができる。したがって、特定の抗体を発現するバクテリオファージが対応する抗原を発現する細胞の存在下でインキュベートされると、バクテリオファージはその細胞に結合する。抗体を発現しないバクテリオファージは細胞に結合しない。かかるパニング技術は当該技術分野において周知であり、例えば、Wright et al.、(前掲)に記載されている。
【０１７４】
例えば上記のようなプロセスは、M13 バクテリオファージ ディスプレーを用いるヒト抗体の産生のために開発された(Burton et al.、1994、Adv. Immunol. 57:191-280)。本質的には、cDNA ライブラリーは、抗体産生細胞の集団から得られたmRNAから作成される。mRNAは再編成された免疫グロブリン遺伝子をコードし、したがって、cDNAはそれをコードする。増幅されたcDNAをM13 発現ベクターにクローニングし、その表面にヒト Fab 断片を発現するファージのライブラリーを作成する。目的の抗体をディスプレーするファージが抗原結合により選択され、細菌中で増殖されて、可溶性 ヒト Fab 免疫グロブリンを産生する。したがって、常套のモノクローナル抗体合成とは異なり、この手順は、ヒト 免疫グロブリンを発現する細胞よりもむしろヒト 免疫グロブリンをコードするDNAを不死化する。
【０１７５】
上記の手順は、抗体分子のFab 部分をコードするファージの作成を説明する。しかし、本発明をFab 抗体をコードするファージの作成のみに限定して解釈してはならない。そうではなく、一本鎖抗体をコードするファージ(scFv/ファージ 抗体 ライブラリー) も本発明に含まれる。Fab 分子はIg 軽鎖全体を含み、即ち、それらは軽鎖の可変部および定常部の両方を含むが、重鎖の可変部および第一の定常部 ドメイン (CH1)のみを含む。一本鎖抗体分子は、Ig Fv 断片を含むタンパク質の一本鎖を含む。Ig Fv 断片は抗体の重鎖および軽鎖の可変部のみを含み、それらのなかには定常部は含まれない。scFv DNAを含むファージ ライブラリーは、Marks et al.、1991、J. Mol. Biol. 222:581-597に記載の手順にしたがって作成することが出来る。所望の抗体の単離のためにそのように作成されたファージのパニングは Fab DNAを含むファージ ライブラリーについて記載されたものと同様にして行われる。
【０１７６】
本発明はまた、重鎖および軽鎖 可変部がほぼすべての可能な特異性を含むよう合成されうる合成 ファージ ディスプレー ライブラリーを含むよう解釈すべきである(Barbas、1995、Nature Medicine 1:837-839; de Kruif et al. 1995、J. Mol. Biol.248:97-105)。
【０１７７】
抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当該技術分野において既知の技術、例えば、ELISA (酵素結合免疫吸着測定法)によって達成することが出来る。本発明によって作成される抗体には、これらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ (即ち、「ヒト化」)、および一本鎖 (組換え) 抗体、Fab 断片およびFab 発現 ライブラリーにより産生される断片が含まれうる。
【０１７８】
本発明のペプチドは、標準的なよく確立された技術、例えば、 Stewart et al.、Solid Phase Peptide Synthesis、2nd Edition、1984、Pierce Chemical Company、Rockford、Illinois; およびBodanszky and Bodanszky、The Practice of Peptide Synthesis、1984、Springer-Verlag、New Yorkに記載されるような固相 ペプチド 合成 (SPPS)によって容易に調製することが出来る。最初に、好適に保護されたアミノ酸残基がそのカルボキシル基を介して、誘導体化された不溶性 ポリマー支持体、例えば、 架橋 ポリスチレンまたはポリアミド樹脂に結合される。「好適に保護された」とは、アミノ酸のα-アミノ基、および側鎖官能基の両方の上に保護基が存在することをいう。側鎖保護基は一般的に合成中に用いられる溶媒、試薬および反応条件に対して安定であり、最終的なペプチド生成物に影響を与えない条件下で除去可能である。オリゴペプチドの段階的な合成が、最初のアミノ酸からのN-保護基の除去、および、所望の ペプチドの配列における次のアミノ酸のカルボキシル末端に対するその結合によって行われる。このアミノ酸もまた、好適に保護されている。導入するアミノ酸のカルボキシルは活性化されて支持体に結合したアミノ酸のN-末端との反応が可能となり、それは反応性基への形成、例えば、カルボジイミド、対称性 酸無水物 または「活性エステル」基、例えば、 ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはペンタフルオロフェニル エステルへの形成による。
【０１７９】
固相 ペプチド 合成 方法の例としては、tert-ブチルオキシカルボニルをα-アミノ 保護基として用いるBOC 方法、および、アミノ酸残基のα-アミノを保護するために9-フルオレニルメチルオキシカルボニルを用いるFMOC 方法が挙げられ、その両方の方法が当業者に周知である。
【０１８０】
N- および/または C- 保護基の組込みも、固相 ペプチド 合成 方法において常套のプロトコールを用いて達成することが出来る。C-末端保護基の組込みについては、例えば、所望のペプチドの合成は典型的には固相として、樹脂から切断されると所望の C-末端 保護基を有するペプチドが生じるよう化学修飾された支持体樹脂を用いて行われる。C-末端が一級アミノ 保護基を有するペプチドを提供するには、例えば、合成はp-メチルベンズヒドリルアミン (MBHA) 樹脂を用いて行われ、それによりペプチド 合成が完了すると、フッ化水素酸による処理により所望の C-末端がアミド化された ペプチドが遊離する。同様に、C-末端へのN-メチルアミン 保護基の組込みはN-メチルアミノエチル-誘導体化されたDVB、樹脂を用いて達成され、それはHF処理されると、N-メチルアミド化 C-末端を有するペプチドを遊離する。エステル化によるC-末端の遮断も常套の 手順を用いて達成することが出来る。これには側鎖 ペプチドの樹脂からの遊離を可能とする樹脂/保護基の組合せ使用が必要であり、それにより所望の アルコールとのその後の反応による、エステル官能基の形成が可能となる。メトキシアルコキシベンジル アルコールまたは同等のリンカーにより誘導体化されたDVB 樹脂と組み合わせてのFMOC 保護基はこの目的のために利用でき、ジクロロメタン中のTFAにより支持体からの切断が行われる。例えばDCCにより好適に 活性化されたカルボキシル 官能基のエステル化は、所望の アルコールの付加により進行され得、次いでエステル化されたペプチド生成物の脱保護および単離が行われる。
【０１８１】
N-末端 保護基の組込みは、合成されたペプチドが樹脂に結合された状態で、例えば好適な無水物およびニトリルでの処理により達成することが出来る。N-末端にアセチル-保護基を組み込むためには、例えば、樹脂に結合したペプチドをアセトニトリル中の20% 無水酢酸で処理するとよい。N-保護ペプチド生成物は次いで樹脂から切断され、脱保護され、次いで単離されうる。
【０１８２】
化学的または生物学的合成技術により得られたペプチドが所望の ペプチドであることを確証するために、ペプチド組成物の分析を行わなければならない。かかるアミノ酸組成分析は、ペプチドの分子量を決定する高分解能質量分析を用いて行うことが出来る。あるいは、または付加的に、ペプチドのアミノ酸内容物を、酸水溶液中でペプチドを加水分解し、分離し、HPLC、またはアミノ酸分析器を用いて混合物の成分を同定および定量することによって確認することが出来る。連続的にペプチドを分解し、次いでアミノ酸を順次同定するタンパク質 シークエネーターを用いると、明確にペプチド配列を決定することが出来る。
【０１８３】
その使用の前に、ペプチドは混入物を除くために精製される。この点に関して、ペプチドは適当な規制当局による標準的な設定を満たすように精製されることが理解されよう。多数の常套の精製手順のいずれを用いて要求される純度レベルを達成してもよく、例えば、アルキル化シリカカラム、例えば、 C4 -、C8-またはC18- シリカを用いる逆相高圧 液体クロマトグラフィー (HPLC)が挙げられる。有機物含量が徐々に上昇する勾配移動相が一般的に精製を達成するために用いられ、例えば、少量の トリフルオロ酢酸を通常含有する水性バッファー中のアセトニトリルが挙げられる。イオン交換クロマトグラフィーを用いてペプチドをその電荷に基づいて分離することも出来る。
【０１８４】
もちろん、ペプチドまたは抗体、誘導体、またはその断片も、活性に影響を与えず修飾されたアミノ酸 残基を組み込むことができることが理解されよう。例えば、末端を誘導体化して保護基、即ち、「望ましくない分解」からN-およびC-末端を保護および/または 安定化するのに好適な化学置換基を含めることが出来、「望ましくない分解」とは、その末端での化合物のあらゆるタイプの酵素的、化学的または生化学的分解であって化合物の機能に影響を与えうる分解、即ち、その末端での化合物の連続的な分解を含む意味である。
【０１８５】
保護基は、ペプチド化学の分野において常套に用いられる保護基であって、ペプチドのインビボ活性に有害な影響を与えないものを含む。例えば、好適な N-末端 保護基は N-末端のアルキル化またはアシル化によって導入することができる。好適な N-末端保護基の例としては、C1-C5 分枝または非分枝 アルキル 基、アシル 基、例えば、 ホルミルおよびアセチル 基、ならびにその置換形態、例えば、アセトアミドメチル (Acm) 基が挙げられる。アミノ酸の脱アミノ アナログもまた有用なN-末端 保護基であり、ペプチドのN-末端に結合させてもよいし、N-末端残基の代わりに用いてもよい。 C-末端のカルボキシル基が組み込まれる、または組み込まれない好適な C-末端 保護基としては、エステル、ケトンまたはアミドが挙げられる。エステルまたはケトン-形成アルキル 基、特に、低級アルキル基、例えば、 メチル、エチル およびプロピル、ならびにアミド-形成アミノ基 、例えば、 一級アミン (-NH2)、およびモノ- およびジ-アルキルアミノ基、例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ 等はC-末端保護基の例である。脱カルボキシル化 アミノ酸 アナログ、例えば、アグマチンも有用なC-末端保護基であり、ペプチドのC-末端 残基に結合させてもよいし、それの代わりに用いてもよい。さらに、末端における遊離 アミノおよびカルボキシル基はペプチドからすべて除去されてペプチド 活性に影響を与えずにその脱アミノおよび脱カルボキシル化形態を生じることができることが理解されよう。
【０１８６】
活性に悪影響を与えないその他の修飾も組み込むことができ、これらに限定されないが、天然 L-異性体における１以上のアミノ酸のD-異性体のアミノ酸による置換が挙げられる。したがって、ペプチドは１以上のD-アミノ酸残基を含み得、または、すべてD-形態であるアミノ酸を含みうる。本発明によるレトロ-インベルソ 形態のペプチドも考慮され、例えば、すべてのアミノ酸がD-アミノ酸 形態により置換されている逆位の(inverted)ペプチドが挙げられる。
【０１８７】
本発明の酸付加塩も機能的同等物として考慮される。したがって、無機酸、例えば、 塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等、または有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸等により処理されて、ペプチドの水溶性塩を提供する本発明のペプチドは、本発明における使用に好適である。
【０１８８】
本発明はまた、タンパク質のアナログも提供する。アナログは、保存的 アミノ酸 配列相違により、または配列に影響を与えない修飾により、あるいはそれらの両方により天然 タンパク質またはペプチドと異なりうる。
【０１８９】
例えば、タンパク質またはペプチドの一次配列を変化させるにも拘わらず、その機能を通常は変化させない保存的アミノ酸変化を作ることが出来る。このために、10以上の 保存的 アミノ酸変化は典型的にはペプチド機能に影響を与えない。保存的 アミノ酸 置換は典型的には以下の群のなかでの置換を含む:
グリシン、アラニン;
バリン、イソロイシン、ロイシン;
アスパラギン酸、グルタミン酸;
アスパラギン、グルタミン;
セリン、スレオニン;
リジン、アルギニン;
フェニルアラニン、チロシン。
【０１９０】
修飾(通常は一次配列を変化させない)は、ポリペプチドのインビボ、またはインビトロでの化学的誘導体化、例えば、アセチル化、またはカルボキシル化を含む。グリコシル化の修飾も含まれ、例えば、その合成およびプロセシングの際に、またはさらなるプロセシング工程において、ポリペプチドのグリコシル化 パターンを改変することによってなされるものが含まれ; 例えば、ポリペプチドをグリコシル化に影響を与える酵素、例えば、哺乳類 グリコシル化または脱グリコシル化 酵素に曝露することによって行われる。リン酸化 アミノ酸 残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンを有する配列も含まれる。
【０１９１】
タンパク分解に対するそれらの耐性を高めるため、または溶解特性を最適化するため、またはそれらを治療剤としてより好適なものとするために通常の分子生物学 技術を用いて修飾されたポリペプチドまたは抗体断片も含まれる。かかるポリペプチドのアナログとしては、天然 L-アミノ酸以外の残基、例えば、D-アミノ酸または非天然 合成 アミノ酸を含むものが挙げられる。本発明のペプチドは本明細書に例示する特定の例示的プロセスのいずれかの産物に限定されない。
【０１９２】
本明細書に記載するようにして得られる実質的に純粋な タンパク質はタンパク質精製の既知の手順にしたがうことによって精製してもよく、ここで、免疫学的、酵素的またはその他のアッセイが、かかる手順における各段階の精製をモニターするために用いられる。タンパク質 精製 方法は当該技術分野において周知であり、例えば Deutscher et al. (ed.、1990、Guide to Protein Purification、Harcourt Brace Jovanovich、San Diego)に記載されている。
【０１９３】
本発明はまた、本発明の組成物および組成物の投与または使用を説明する説明材料を含むキットも含む。別の態様において、このキットは、組成物の投与の前に本発明の組成物を溶解または懸濁させるのに好適な(好ましくは無菌の) 溶媒を含む。所望により、少なくとも１つの 増殖因子 および/または 抗菌剤をキットに含めてもよい。
【０１９４】
本明細書において用いる場合、「説明材料」には、出版物、記録、図表、または脂肪幹細胞の濃縮および増殖の実施のためのキットにおける本発明の有用性を知らせるのに利用できるその他のあらゆる表現媒体が含まれる。 所望により、あるいは選択的に、説明材料は、哺乳類の細胞または組織における疾患または障害の軽減の１以上の方法を記載していてもよい。本発明のキットの説明材料は、例えば、本発明の組成物を含む容器に添付されてもよいし、抗体を含む容器と一緒に出荷されてもよい。あるいは、説明材料は、説明材料および化合物が共同してレシピエントによって使用される意図をもって容器から分離して出荷されてもよい。
【実施例】
【０１９５】
実施例 1
一般的方法
本発明の方法に有用な脂肪組織由来間質細胞は、当業者に知られている様々な方法によって単離される。脂肪組織の好ましい源は皮下脂肪である。ヒトにおいて、脂肪は典型的には脂肪吸引によって単離される。
【０１９６】
ヒト脂肪組織由来成人間質細胞は、患者にとって最小限の危険と不快感をもって常套的に回収しうる幹細胞源を表す。それらはエキソビボで拡張でき、特有の分化系列経路にそって分化し得、遺伝子操作され得、自己または同種移植として個体に再導入されうる。
【０１９７】
ヒト脂肪組織由来細胞の単離、拡張、および分化のための方法は既に報告されている。例えば、Burris et al 1999、Mol Endocrinol 13:410-7; Erickson et al 2002、Biochem Biophys Res Commun. Jan. 18、2002; 290(2):763-9; Gronthos et al 2001、Journal of Cellular Physiology、189:54-63; Halvorsen et al 2001、Metabolism 50:407-413; Halvorsen et al 2001、Tissue Eng. 7(6):729-41; Harp et al 2001、Biochem Biophys Res Commun 281:907-912; Saladin et al 1999、Cell Growth & Diff 10:43-48; Sen et al 2001、Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319; Zhou et al 1999、Biotechnol.  Techniques 13: 513-517を参照されたい。脂肪組織由来間質細胞は、刻んだヒト脂肪組織からコラゲナーゼ 消化および分画遠心法によって得られる(Halvorsen et al 2001、Metabolism 50:407-413; Hauner et al 1989、J Clin Invest 84:1663-1670; Rodbell et al 1966、J. Biol. Chem. 241:130-139)。ヒト脂肪組織由来間質細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞、および造骨細胞分化系列経路にそって分化しうることを示す文献もある(Erickson et al 2002、Biochem Biophys Res Commun. Jan. 18、2002; 290(2):763-9; Gronthos et al 2001、Journal of Cellular Physiology、189:54-63; Halvorsen et al 2001、Metabolism 50:407-413; Halvorsen et al、2001、Tissue Eng. Dec. 7、2001; (6):729-41; Harp et al 2001、Biochem Biophys Res Commun 281:907-912; Saladin et al 1999、Cell Growth & Diff 10:43-48; Sen et al 2001、Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319; Zhou et al 1999、Biotechnol. Techniques 13: 513-517; Zuk et al 2001、Tissue Eng. 7: 211-228)。
【０１９８】
WO 00/53795、WO 2007/030652、および WO 2007/019107は、ASCを取得および培養する方法を提供する。
【０１９９】
脂肪幹細胞の単離および培養
これらの研究のために、皮下脂肪組織を待機外科手技を受けた患者から得た。40名の患者(平均年齢 42.4 歳、範囲24-70歳; 平均 BMI 30.14、範囲18.4-63.6)からの廃棄切除腹壁形成(Discarded excisional abdominoplasty)標本および/または脂肪吸引液を以前に記載されているように処理した。切除標本を無菌の研究室条件下で脂肪吸引した。すべての標本をカルシウムおよびマグネシウムを含むハンクス平衡塩類溶液で軽く洗浄した。すすいだ吸引液を次いで滑らかで均一な堅さが得られるまで30-60 分間Liberase Blendzyme 1 (Roche 1 988 417、9 mg/ml)で消化した。細胞ペレットを遠心分離により単離し、250 μm ナイロンメッシュでろ過し、赤血球溶解バッファーで洗浄し、105 μm ナイロンメッシュで再びろ過し、その結果得られた細胞懸濁液を、37℃、5% CO2 で以下の培地のいずれかにおいて培養した:
1.「D-10」: 10% ウシ胎児血清および1% 抗生物質/抗真菌薬 (ABAM、Gibco Cat No. 15240-062)を追加したDMEM/F12 (Gibco カタログ番号11320-033)
2.「AR8」: Katz labにおいて開発された新規な化学的に規定された無血清培地。それは、DMEM/F12、1% ABAM、0.1 mM L-グルタミン (Gibco カタログ番号 25030-081)、0.50% ITS+3 (Sigma I-2771)、0.05% Fatty Acid Supplement (Sigma F-7050)、1% MEM 非必須アミノ酸(Gibco カタログ番号 11140-050)、100 μM アスコルビン酸 2-リン酸 (Sigma A-8960)、1 ng/ml PDGF-BB (Research Diagnostics Inc  RDI-114b)、10 ng/ml EGF (R & D Systems 236EG)、1 ng/ml SCGF-b (Research Diagnostics Inc  RDI-1022B)、1 ng/ml TNFa (Research Diagnostics Inc  RDI-301)、1 ng/ml IL-1b (Research Diagnostics Inc  RDI-201B)、1 x 10-8 M ベータ-エストラジオール (Sigma E2758-1G)、1 x 10-8 M プロゲステロン (Sigma P8783-5G)、1 x 10-8 M デキサメタゾン (Sigma D-8893)、および500 ng/ml ヒドロコルチゾン (Sigma H0888-1G)からなる。
3.「AR8-1%HS」: 1% ヒト血清を含むAR8 基本培地(CaSNiMrex 14-402E)。
4.「1:10AR8」: 1% ABAMを含むDMEM/F12に1:10に希釈されたAR8 基本培地。
5.「1:10AR8-1%HS」: 1% ヒト 血清を含む上記の希釈されたAR8 培地。
6.「D-0」: 1% ABAM を含みその他の添加剤を含まないDMEM/F12。
【０２００】
新たに単離した細胞を伝統的な培養-ウェア (Nunclon 100 dia. x 15 mm H)中に播いて単層培養とした。最初の播種を「継代 0」(P0)とした。集密すると、P0 細胞を真菌由来酵素 TrypLE (Gibco カタログ番号 12604-013)を用いて持ち上げ、トリパンブルー排除を用いて血球計数器で計数した。細胞を次いで研究に用いるか、または、2,000 細胞/cm2 でさらなる拡張のために播いた。記載するすべての研究において、継代 5 以下からのASCを用いた。いくつかの研究のためには、製造業者の指示にしたがってASCをDiIまたはDiO (Molecular Probes)で蛍光標識した。簡単に説明すると、細胞をすすいで、存在する場合は血清を除き、無血清培地中の1:200 代表的色素溶液中で15 分間37℃でインキュベートし、再びすすいで過剰の色素を除いた。
【０２０１】
ASC 凝集物(即ち、SOM-B、自己組織化ニッチ環境、またはASC 「SNiM」)の形成:
これらのASC 凝集物はSNiMと称され、SOM-B、凝集物、球、およびメセンコイド体(mesenchoid bodies)とも称される。ASCは再現性よく細胞凝集物を形成する。ASC(500-50,000)を適当な培地に懸濁して、所望の濃度を達成した。小容積(15-30 μl)の細胞溶液を、培養プレートカバーの内側表面上に分離した液滴としてピペッティングした。培養プレートカバーを次いで逆転させて裏返し(これで実際に正しい向きとなる)、その結果、「懸滴」が生じた。プレートを加湿チャンバに入れ、培地が乾燥するのを防ぎ、液滴を標準的な組織培養インキュベーター中に24-72 時間維持した。この期間の間に、細胞は癒着して懸滴のもっとも垂れ下がった部分において凝集物となった。本発明者らの研究室では、これらの凝集物を「自己組織化ニッチ環境」、または「SNiM」と呼ぶ。懸滴培養において24-72 時間後に、SNiMを次いで懸濁培養のための 超低付着 (ULA) ウェル/プレート(Corning) に移すか、または接着培養のための標準的な培養ウェアに移した。いくつかの実験においては、ASC-SNiMをヘキスト 33342 (Molecular Probes カタログ番号 H1399)で標識し、細胞核の分布を明らかにした。ASC-SNiMをPBSですすぎ、4 mM 色素溶液中で15 分間暗黒化で37℃でインキュベートした。ASC-SNiMを次いで PBSですすぎ、適切な培地に入れた。
【０２０２】
糖尿病患者においてみられる創傷治癒不全は、慢性皮膚潰瘍から足切断までの臨床成績の主な原因因子であると長い間認識されてきた。機能障害のネイティブな幹細胞および炎症性サイトカイン調節不全を含む欠陥は、このしばしば衰弱した臨床症状の根底にある可能性のある機構として提案されてきた。脂肪幹細胞 (ASC)がこの組織不全を克服するのに助けになるか否かを調べる試みにおいて、本発明者らは、1 cm の全厚さの背部生検創傷に対して局所投与されたASCのdb/db マウスに対する効果を調べた。１つの細胞株による予備的結果によると、最初の治療応答がみられ、ここで、細胞で処置された動物は対照よりもほぼ１週間はやく治癒した。３つの異なる患者の細胞株を試験する追跡研究において、１つの患者株により創傷は8.69日間で75%の閉鎖に到達したが、それに比べて対照糖尿病マウスでは11.56 日かかった(p=0.024)。この治療は非糖尿病対照(7.17日間; p=0.755)においてみられる程度にまで創傷治癒を修復させるに至った。 反復測定 ANOVAは、時間と共にこの特定の細胞株の治療効果を確認したが(p=0.03)、調べた２つのさらなる細胞株に関係する有意な効果は見いだせなかった。 
【０２０３】
術後第１日目に適用した脂肪由来幹細胞がdb/db マウスにおける背部創傷の治癒率を改善する能力についてさらに調べた。予備的試験において、元の面積のパーセントとして測定した創傷面積は細胞で処理したマウスにおいて術後12日目に8%に低下しており、それに比べて、非処理マウスでは51%であった(p< 0.001)。免疫適格性マウスモデルへと移植されたものであるがヒト細胞の効力は、拒絶によってもたらされる役割が低減されているか存在していないことを示し得、おそらくは局所使用のための幹細胞の容易に入手可能な同種源の開発のための能力を示唆している。
【０２０４】
一般的実験計画
細胞をDMEM/F12 +10% FBS +1% ABAM (抗生物質、抗真菌薬)中に2-3 継代の期間培養し、本発明者らは、単細胞懸濁および細胞クラスターの両方を試験した。単細胞懸濁- 細胞をトリプシン処理し、無菌の PBS中で洗浄し、200 μl PBSに懸濁した。ASC クラスター (SOM-B)- 細胞を、24-ウェル超低付着プレートに2.5-5.66 x 105 細胞/ウェルにて播き、細胞を細胞クラスターへと48 時間かけて癒合させ、それらを収集し、無菌の PBS中で洗浄し、200 μl PBSに懸濁した。あるいは、ASC SOM-Bを上記の懸滴方法を用いて調製した。
【０２０５】
雄性 db/db 糖尿病マウスおよびdb/- 非糖尿病同腹仔対照マウスをJackson labs (ストック番号 000642)から得た。マウスをそれらの血中ブドウ糖が >250 mg/dLとなるまで収容した。
【０２０６】
外科手技のために、マウスを麻酔、剪毛、脱毛し、ベータジンで前処理した。1 cmの全厚さの背部皮膚生検創傷を各マウスに作った。創傷をデジタルカメラを用いて撮影した。創傷にテガダームおよびベンゾインを含む包帯を巻いた。
【０２０７】
細胞を投与するために、120-140万の細胞を術後1日目に各創傷に局所適用した(細胞をテガダーム半透明不透過性包帯材の真下に注入したが、組織自体のなかには注入しなかった)。対照動物のために、200 ulの無菌の PBSを注入した。
【０２０８】
創傷のサイズを測定するために、創傷を続く3-4 週間の間連続的に 撮影した。創傷面積をNIH 画像プロセシング プログラム ImageJを用いて計算した。
【０２０９】
細胞はまた、検出可能細胞表面マーカーに関して特徴決定した (表 1)。
【０２１０】
表 1-  細胞表面マーカー
【表１】
2010505849.tif 000005
表１：創傷治癒試験IIIにおいて用いたASCの細胞表面特徴決定
ACSを糖尿病性創傷におけるそれらの使用と並行してフローサイトメトリーを用いて特徴決定した。患者ＢのASCはインビボで顕著な治癒の促進を示し、その他の２つの細胞調製物と比較してCD34＋細胞のパーセンテージがより高かった。
【０２１１】
実施例 2- SOMB (SNiM)による増殖因子の産生
材料および方法:
増殖因子研究:
懸濁培養中に維持した際にASC-SOM-B (SNiM)が増殖因子を産生するかどうかを調べるために、新たに単離した ASCをD10 培地中で接着単層培養において集密となるまで培養した。細胞を持ち上げて懸濁させ、MACS カラム(Miltenyi Biotech カタログ番号130-042-201)および 抗-CD 31PE および抗-CD 45PE 抗体 (BD Bioscience)および抗-PE ミクロビーズ (Miltenyi Biotech、#130-048-801)を用いてCD31+およびCD45+ 細胞を枯渇させた。継代 1 (P1) CD31-/CD45- ASCを次いで単層培養に 2000 細胞/cm2 にてD10 培地に播いた。集密すると、細胞を再び持ち上げて懸濁させ、アリコットをフローサイトメトリーを用いる免疫学的特徴決定に使用した(以下参照)。残りの細胞のなかで、半分を20,000 細胞のSOM-B(SNiM)を作るのに用い、残りの半分を単層培養で維持した。懸滴中で24-48 時間後、個々のSOM-B (SNiM)を6 ウェル ULA プレート中の懸濁培養に移し(0日目)、以下の4つの培地のいずれかに維持した: D0、D10、1:10AR8、または1:10AR8-1%HS。比較のために、単層-培養した ASCを 2,000 細胞/cm2 にて（再び）播き、同じ培地条件を用いて接着単層培養とした(0日目)。細胞培養上清を次いで播種後3、6、および10日目に各培養条件から収集した (そして新鮮な培地に交換した)。6 ウェルのそれぞれからの上清を一緒にし、次の増殖因子レベルの定量 ELISA 分析のために凍結させた。各サンプル (6の分離しているが同一の培養からの一緒にした上清を表す) を二連で各分析物について適当な標準曲線を用いてPierce Biotechnoloy’s Searchlight（商標）サービスにより分析した。
【０２１２】
フローサイトメトリー:
SOM-B (SNiM)を作るために用いたASCの免疫表現型を明らかにするために、本発明者らは、様々な細胞表面マーカーのフローサイトメトリー 分析を行った。フローサイトメトリーは励起のために488 nm アルゴンイオンレーザーおよび 635 nm ダイオードレーザーを用いるBecton Dickinson FACS Caliburにて行い、蛍光発光は、530/30 nm (FL1)、585/42 nm (FL2) バンドパスフィルター、670 nm (FL3) ロングパスフィルターおよび対数増幅を用いる661/16 nm (FL4) 帯域通過を用いて収集した。細胞を TrypLE Expressにより放出させ、DMEM/F12 + 10% FBSに再懸濁した。細胞を次いで遠心分離し、ウォッシュフローバッファーに1x106 細胞/mlの濃度で再懸濁した。ウォッシュフローバッファーは、2% (v/v) FBS (Invitrogen)および0.1% (w/v) アジ化ナトリウム、NaN3 (Sigma)を追加したリン酸バッファーからなる。トリパンブルー色素 (GIBCO) 排除 技術により、細胞生存率は > 98%であった。250,000 細胞を飽和濃度のフィコエリトリン- (PE)およびアロフィコシアニン (APC) またはAlexa Fluor 647 結合抗体およびアイソタイプ一致 対照により染色した。細胞を暗黒化で4℃で30 分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞をウォッシュフローバッファーで3回洗浄し、0.25 mlの冷却タンパク質非含有 PBSに再懸濁した。分析の10分前、20 μl 7-アミノ-アクチノマイシン D(7AAD)(VIA-PROBE（商標）BD Biosciences)を死細胞を標識するためにPBS バッファーに添加した。
【０２１３】
フローサイトメーター装置設定は非染色細胞を用いて設定した。細胞を前方対側方 散乱によりゲートでコントロールして細片を排除した。高度に自己蛍光性の細胞は低レベルの抗原を発現する細胞とオーバーラップしうるため、蛍光シグナルの感度をFL1 チャンネルからの自己蛍光シグナルを排除することによって高め、それにより自己蛍光の測定チャンネルにおける寄与を排除した。死細胞をFL3 チャンネルにより7AADを用いてゲートから除いた。陽性蛍光を同じ蛍光結合アイソタイプ一致対照を使用するために確立した。最小10,000の事象を各分析についてカウントした。ASCは以下の抗体により染色した:  抗-ヒト CD31、CD34 (クローン 8G12)、および CD146（BD Biosciences）; 抗-ヒト CD184 (CXCR4) （eBioscience）; 抗-ヒト CD271 （Miltenyi Biotech）; Stro-1 （R&D Systems）; NG2、およびヤギ抗-マウス Alex Fluor647（Molecular Probes）。
【０２１４】
結果
I.  ASCは制御された再現性のある様式で3次元 多細胞 凝集物(ASC-SOM-B(SNiM))へと編成される。
懸滴培養技術を用いて、本発明者らは複数のドナーから単離および培養された様々な数 (500から50,000の範囲)の初期継代 ASCを用いるASC スフェロイド(ASC-SOM-B(SNiM))の成功し、かつ再現性のある 形成を示した。SOM-B (SNiM) は様々な培地体積(15-30 マイクロリットル) および様々な培地タイプで形成され、培地としては、10% FBSを含むDMEM/F12(D-10)、血清または添加物を含まない DMEM/F12 (D-0)、無血清 ASC 培地 (AR8 および1:10AR8)、または低血清 ASC 培地 (AR8-1%HS; 1:10AR8-1%HS)が含まれる。懸滴方法を用いることにより、ASCは典型的には分離したスフェロイドへと24-72 時間の間で編成され、その後確かに懸濁または接着培養条件へと移すことができ、形態に損傷を与えたり、形態を失うことはなかった。複数の様々なサイズの細胞凝集物が2000より少ないASCをスフェロイド 形成に用いた場合、および/または、懸滴において費やされる時間に応じて、懸滴において形成された。一方、大きな単一の一定サイズのSOM-B (SNiM)がより多数の細胞を用いた場合に(~5,000以上)高効率で形成された。PCT/US2007/002572も参照されたい。
【０２１５】
II.  ASC-SOM-B (SNiM)は懸濁培養中で長期間維持することができ、様々な 無血清 培養条件で培養した場合堅固な生存能力を示す。
ASC-SOM-B (SNiM)は超低付着 (ULA) 培養ウェアを用いる懸濁 (即ち、浮遊) 培養中での培養が成功しうる。それらは顕微鏡像、H&E 組織学、およびそれらの接着培養に後で入れられた場合に新しい細胞を生み出す 能力に基づいて、少なくとも 6 ヶ月懸濁培養中で生育することが出来た(試験した最も長いタイムポイント)。添加物を含まないDMEM/F12 (D-0)中で培養されたASC-SOM-B(SNiM)であっても１ヶ月の間生存したままであり-コンパクトな構造を維持し、持続的な DiI 蛍光を示し、組織 培養プラスチックに容易に結合する能力および単層集密へと生育する新しい細胞を生み出す能力を示した(データ示さず)。さらに、以下に記載するように、懸濁中で培養されたASC-SOM-B(SNiM)はD0 培地に維持された場合でも検出可能な レベルの様々な増殖因子を分泌した (図8-10)。
【０２１６】
III.  ASC-SOM-B(SNiM)は、細胞および可変量の自己形成細胞外マトリックスから構成される。
懸濁中のASC-SOM-B(SNiM)の細胞性および細胞局所分布を調べるために、ヘキスト染色を用いて核を標識した。これによりASC-SOM-B(SNiM)の外側表面の上の広範かつ均一な細胞性が明らかになった。ASC-SOM-B(SNiM)の細胞性および構造をさらに評価するために、いくつかのASC-SOM-B(SNiM)を固定し、切片にし、H&E、トリクロームおよびサフラニン Oで染色した。H& E 染色により、ヒアリン陽性 マトリックスに埋め込まれた、全SOM-B (SNiM) 断面中にわたって均一な細胞 (即ち、核) 分布が明らかとなった。トリクローム染色により、広範なコラーゲンに基づくECMの存在が明らかとなった。この目的のために、ASC-SOM-B(SNiM)をその細胞成分を分離し、（再）単離する目的で様々な 酵素的および機械的戦略に供した。数日齢を超えるASC-SOM-B(SNiM)は例外的に堅固で耐久性があり、機械的分離戦略に耐えるものであることが判明した。酵素化合物(コラゲナーゼ、トリプシン、ブレンドザイム(blendzyme)等)は良好な分離を提供し、さらにASC-SOM-B (SNiM)内における確立された細胞外マトリックス 環境の存在を反映していた。
【０２１７】
IV.懸濁培養中で培養されたASC-SOM-B(SNiM)は無血清条件においてさえも、組織修復、血管新生およびマトリックス リモデリングに関連する多数の増殖因子を産生する。
ASC-SNiMを以下の4 種類の培地中で懸濁培養中に維持した: D-0、D-10、1:10AR8および1:10AR8-1%HS。様々な時点において、培養上清を収集し、増殖因子レベルをELISAに基づくアッセイによって定量した。結果は、ASC-SOM-B(SNiM)が、創傷治癒および組織修復に関連する多数の様々な増殖因子、例えば、血管新生 (例えば、VEGF、PLGF、HGF)、炎症 (例えば、IL-6、IL-8、G-CSF)、およびマトリックス リモデリング (例えば、フィブロネクチン、MMP-2、MMP-9、および TIMP 1および2)に関するものを分泌していることを示す(図8-10参照)。注目すべきことに、ASC-SOM-B(SNiM)は、単層培養において培養されたASC とは対照的に非常に多様な培地にかかわらずGF 分泌の一定のレベルを示す(図 8)。多くの場合において、SOM-B(SNiM)として培養されたASCはまた、単層培養として培養されたASC と比較して顕著に高いGF 産生レベルを示す(図8-10)。SOM-B(SNiM)として培養されたASCとは対照的に、単層培養におけるASCは、無血清条件に維持された場合に10日間をこえて生存せず(D0)、または良好に生育しなかった(1:10AR8) (図9および10)。
【０２１８】
例えば、図 8は、ヒト肝細胞増殖因子が、培養中にヒト ASCによって産生されることを示す。同じ数のヒト ASCを単層培養へと播いたか、または、並行してSOM-B (SNiM)を形成させ、懸濁培養に置いた(0日目)。細胞/ SOM-B(SNiM)を以下の４つの培地の１つにおいて培養した:抗生物質以外は他の添加物を含まないDMEM/F12 (D0); 10%FBSを含むDMEM/F12 (D10);増殖因子添加物を含む化学的に規定された無血清培地(AR8(1:10)noS); および1% ヒト 血清 (HS)を含む低血清 培地 (AR8(1:10)）。3日目に、培養上清を収集し、増殖因子 レベルについてELISAにより分析した。各サンプルは二連で複数の希釈度で試験し、6の分離したサンプルを合わせた平均を表す。
【０２１９】
図 9は、複数の増殖因子がASC-SOM-B(SNiM)の強化されていない 培地中に10日目に検出されたことを示す。2日間の懸滴 培養の後、ヒト ASC-SOM-B(SNiM)を懸濁培養に置き、10日間 D0 培地(即ち、無血清、無増殖因子添加物)に維持した。培地を3、6および10日目に交換した。10日目に、上清をELISA 分析のために収集し、SOM-B (SNiM)を分離させて細胞数を判定した。各増殖因子を二連で複数の希釈度で試験し、得られた結果は6 の分離したサンプルを合わせた平均を表す。D0 培地中に接着 単層として培養されたASCは10-日間の培養条件において生存しなかった。 
【０２２０】
図 10は、無血清、増殖因子富化培地において維持された懸濁培養されたヒト ASC-SOM-B(SNiM)による増殖因子 産生を示す。２日間の懸滴培養の後、ヒト ASC-SOM-B(SNiM)を懸濁培養に置き、1:10AR8 培地中で10日間維持した。培地を3、6および10日目に交換した。10日目に、上清をELISA 分析のために収集し、SOM-B (SNiM)を分離させて細胞数を判定した。各増殖因子は二連で複数の希釈度で試験し、6 の分離したサンプルを合わせた平均を表す。同様の条件で接着単層として培養されたASCは10日間の培養期間の間良好に生育しなかった。
【０２２１】
図1-11も参照されたい。
【０２２２】
増殖因子レベルの結果はDermagraft（登録商標）に対して比較のためにSOM-Bを用いた場合に判明した(表 2参照)。
【０２２３】
表 2.  DERMAGRAFTと比較した場合にSOM-B 増殖因子 レベルはどのようであったか？
【表２】
2010505849.tif 000006
* 120 MM３ の DERMAGRAFT片および凍結融解について得られた値; JN MANSBRIDGE ET. AL.、DIABETES、OBESITY AND METABOLISM、1999。
** SOM-B 値から外挿: SOM-B 直径を0.5 MMと仮定すると、SOM-B体積は4/3Π (0.25)３ X 6 SOM-B = 0.3925 MM３; 120/0.3925=~306; 上記 SOM-B GF 値は因子300をかけたもの。
【０２２４】
ディスカッション:
上記の実験は、ASCは特に低血清または無血清条件中で培養された場合に単層培養条件において分離した細胞の「クラスター」または「小塊」を時折自発的に形成するという観察に基づいて始めた。このことは、ASCは「ネットワーク」即ちニッチへと自己編成することにより自己の生存に必要な因子および条件を提供することが出来ることを本発明者らに示唆した。この仮定は、ASCは質素な培養条件、例えば、 D0 培地において培養された場合でさえも生存し、SOM-B(SNiM)としての生理活性を維持するという本発明者らの知見により支持される。 ASC-SOM-B(SNiM)は、用いる培地に応じて懸濁培養中で培養された場合に様々なレベルにて血管新生、マトリックス リモデリング、炎症、および細胞生育および分化 に関係する多数の 増殖因子を産生する。興味深いことに、ASC-SOM-B(SNiM)は一般に、培地に関係なく単層培養にて培養されたASCと比べてより高レベルの増殖因子を産生する。これは驚くべきことにD0 培地を用いた場合でもあてはまり、ASCはこの培地においては単層培養において生存しない。これらから、これら知見はASC-SOM-B(SNiM)は、細胞構成要素の生存率を維持することが出来、非常に厳格な培養条件においてさえその再生および生理活性を支持することができるニッチ 環境のように機能することを示唆する。
【０２２５】
無血清条件で調製および培養された場合にSOM-B(SNiM)を形成し、SOM-B(SNiM)として生存を維持するASCの能力は翻訳の意味を有する。間葉幹細胞は一般的に、そして特に脂肪幹細胞は、体が自己を治癒する天然の能力を促進する将来の臨床治療にとって非常に有望である。しかしこれらの可能な治療法の使用に対する１つの共通の問題は、 ヒトでの使用が意図される細胞の培地におけるウシ胎児血清 (またはその他の動物の血清)の使用の慣行である。動物血清の規定されていない可変性の特性、および、異物病原体の導入およびいくらかの対象における重篤なアレルギー応答の惹起に伴う危険は、重要な考慮を提示する。さらに、血清の使用は、あまり規定されていない血清の組成およびロット間での可変性により既存の動的システムをより可変性にする。少なくとも、ヒト血清がウシ血清やその他の異物源よりはヒト細胞にとってより適当であるということは論理的であろう。この目的のために、本発明者らのデータはASCは1% ヒト血清を含む培地中で、単層および懸濁中のSOM-B(SNiM)の両方として容易に生育することを示す。翻訳の目的のために、1% ヒト血清は自己パラダイムにおいて容易に利用できた。
【０２２６】
ASC-SOM-B(SNiM)はその培養環境に応じて劇的に異なる生育特徴を示す。総サイズに関してもっとも劇的な生育は、複数の増殖因子および添加物を含む無血清培地(AR8)中で懸濁されて培養された場合に得られる。本発明者らは、直径/長さにおいてほぼ1 mmのいくつかのSOM-B(SNiM)を観察し、それらは常套的にAR8 培地において直径400-700 μmまで生育する。このサイズの上限はSOM-B (SNiM)の形成にもともと用いられた細胞の数とはほとんど独立である。言い換えると、5,000 細胞によって形成されたSOM-B(SNiM)は生育して 30,000 細胞によって形成されたSOM-B(SNiM)と同じ一般的 (最大) サイズとなる。SOM-B (SNiM) の生育は培養環境と関係しているが、生育の上限はおそらく２つの主な因子、即ち形状および拡散距離によって決定される。SOM-B(SNiM)が同心円状にスフェロイド形状として大きくなると、中心の細胞は培地から等距離のところにある。400 um 直径の球においては、最大拡散距離は200 μmであろう。この距離は伝統的には拡散によって細胞を維持するには大きすぎると考えられていたが、 H&E 染色およびBrdU 染色により、かかるSOM-B(SNiM)のコアにおける生細胞が示された。細胞に加えて、H&E 染色はまた、SOM-B(SNiM)内にある細胞外マトリックスの存在も明らかにした。マトリックス沈着がニッチ内の低酸素状態と関連している可能性がある。同時に、沈着したマトリックスは、栄養、増殖因子等のシンク/貯蔵層として働いている可能性があり、低酸素状態下での細胞生存率の維持を助けている可能性がある。
【０２２７】
SOM-B(SNiM)はまた、懸濁、無血清条件中では長い形状に非対称的に生育する。これは、増殖因子勾配、ニッチ内での細胞の亜特殊化(sub-specialization)または純粋にランダムな現象に関係しうる。長い生育は時折は顕著な長さのSOM-B(SNiM)/構造を生むが、生存率に適合する拡散距離は限られた幅に維持される。ASC-SOM-B(SNiM)がそのサイズ および編成を制御する能力はまた、凝集研究においても反映される。複数の大きい懸濁培養中のSOM-B(SNiM)が互いに接触可能とされ、融合すると、その結果得られる構造/集合体は非常に大きくなる。しかし、時間が経つと、SOM-B (SNiM)凝集物はその形状および大きさを再編成し、単一の SOM-B(SNiM)にみられるものとなる。この(再)編成はアポトーシス および/または マトリックス リモデリングを伴い得、おそらくは有効な拡散距離によって規定されるアスペクト比の制限を反映する。本発明者らは続く研究においてこれらの仮説を調査する。にもかかわらず、本発明者らのデータはASC- SOM-B (SNiM)の自己制御する幹細胞ニッチとしての概念を強く支持する。
【０２２８】
幹「細胞」に対しての幹細胞「集団」という概念は微妙であるが重要なものである。インビボでは細胞は単離されて存在せず、2次元単層としても存在しない。生物学的/治療的観点から、例えば、拡張した自己再生および多分化系列への発生上の可塑性といった性質は単離された、クローナル細胞よりも特徴的な(3-D) 幹細胞「集団」を用いて(クローン的に単離された細胞よりも細胞集団との関係で)より好適に研究されると論じられる可能性がある。還元主義者のアプローチを用いる幹細胞生物学の研究は量子物理学のハイゼンベルグの不確定性原理に類似の難題を提示する。所与の細胞がより単離されると(即ち、クローナル)、細胞が通常は単離されて存在しないため培養環境はおそらくより不自然となりる。このようにして研究された細胞は、それゆえ、インサイチュ/インビボでの同じ細胞の実体および挙動をまったく反映しないであろう。幹細胞生物学に対するシステムに基づくアプローチは「人工的」にそれらを簡略化する傾向にある伝統的な還元主義者の アプローチとは対照的にインビボ条件の複雑性および現実性を包含する。システムに基づくモデルの使用はより複雑であるようだが、これは必ずしもそれらが制御されず、規定されないことを意味するわけではない。そうではなくて、ASC-SOM-B(SNiM)の場合、例えば、3-D ニッチ内の細胞の挙動および相互作用は血清の使用に関連する未知なことがなく、規定されたよく管理された培養条件を用いて研究されうる。
【０２２９】
SOM-B(SNiM) は伝統的な単層培養で培養された同じ細胞と比較して多数の遺伝子を示差的に発現する(データ示さず)。SOM-B(SNiM)は、伝統的な単層培養技術と比較してより高レベルの増殖因子を作る。SOM-B(SNiM)の生物学は単層培養として培養された細胞よりも再現性があり、一貫性があるようである。さらに、SOM-B(SNiM)は単層培養として培養され、懸濁 細胞として送達された同じ細胞よりも良好に糖尿病性 創傷を治癒させるようである。これらの結果は、細胞培養方法は用いられる細胞と同様に重要でありうることを示唆する。それゆえ、細胞ニッチのSNiMの概念は科学および治療効力についての利点および利益を提供する。
【０２３０】
実施例 3-自己組織化メセンコイド体(Mesenchoid Bodies)として送達されたCD-34-ソートおよび非ソート脂肪由来間質細胞に対する糖尿病性創傷治癒応答
方法: ヒト ASCをよく記載された方法を用いて待機脂肪吸引標本から単離した。細胞をプラスチック上で培養し、CD-34の発現についてP=3にてソートした。CD-34-陽性、CD-34-陰性、および非ソートASCを次いで無血清培地中で8日間懸濁培養中のSOMB (25,000 ASC/SOMB)として培養した。0日目に、一つの1 cm 直径の全厚さ切除皮膚創傷をホモ接合性糖尿病性ヌルマウスの背部の上に作った。各創傷をランダムに盲検で創傷後 1日目に~20 μl PBS中でテガダーム包帯材の下に局所送達された5のSOMBで処理した。その結果得られたASC 処理群は以下からなるものであった:  CD-34-陽性 ASC SOMB (N=7)、CD-34-陰性 ASC SOMB (N=9)、および非ソートASC SOMB (N=4)。デジタル画像を21日目まで２または３日おきに各創傷につき取得し、最初の創傷面積のパーセンテージとして表される開放創面積をImageJ 分析ソフトウェアを用いて定量した。
【０２３１】
結果:すべての３つの実験群における創傷面積はそれぞれの時点で統計的に互いに同様であり、CD-34 発現に基づく前向きソートは、ASCが創傷治癒に影響を与える能力に対して影響をもたないことが示唆された。さらに、ASC SOMB-処理創傷における治癒率は創傷を作った後１週間においては媒体 対照で処理された糖尿病マウスと統計的に同様であった。しかし、9日目には、ASC SOMBで処理されたすべての糖尿病性創傷は、媒体対照を受け取った糖尿病マウスよりも有意に小さく、野生型非糖尿病マウスと統計的に同様であった (過去に用いられたデータセットから) (図 11参照)。
【０２３２】
結論: SOMBとしてのASCの投与はASC 治療を受けなかった糖尿病マウスと比較して糖尿病マウスにおける創傷治癒プロセスを促進する。しかし、CD-34 発現に基づく前向きASC富化はこの治療効果を促進しなかった(図1-11および表1および2参照)。
【０２３３】
本明細書において言及する各個々の特許、特許出願および出版物の開示は その内容全体が引用により本明細書に組み込まれる。当業者は従来技術の組成物および方法と比較しての本発明の組成物および方法の優秀性は、優れた結果を説明する理論の生理学的正確性とは関係ないことを理解するであろう。 
【０２３４】
言及および特定のセクションの位置づけを助けるために本明細書に見出しを含めている。これらの見出しはその下に記載される概念の範囲を限定する意図ではなく、これらの概念は全明細書にわたってその他のセクションにおいても適用可能性を有しうる。
【０２３５】
使用したが本明細書に記載しなかったその他の方法が周知であり医学、化学、細胞学、組織化学、生化学、分子生物学、微生物学および組換え DNA 技術の当業者の能力の範囲内である。
【０２３６】
開示された態様の説明は当業者が本発明を作り、使用することができるように提供される。これら態様に対する様々な修飾が当業者に容易に明らかであり、本明細書で規定する一般原則は本発明の精神または範囲を逸脱することなくその他の態様にも適用可能である。したがって、本発明は本明細書に示した態様に限定される意図はなく、本明細書に開示する原理および新規な特徴と一致するもっとも広い範囲と一致するべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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