(57)【要約】  例えば、限定されるものでないがコラーゲンマトリックス沈着および肺胞虚脱を包含する線維性過程と関連する前線維性マーカーの調節のためのＭＣＰ−１／ＣＣＲ２アンタゴニスト療法を挙げることができる、線維症関連疾患の制御若しくは逆転に、抗ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２アンタゴニスト療法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）を阻害する有効量の最低１種のＭＣＰ−１アンタゴニストを投与することを含んでなる、最低１種のＭＣＰ−１アンタゴニストを使用する、最低１形態の線維症を有する患者における最低１種のヒトＭＣＰ−１を阻害する方法。
【請求項２】
前記ＭＣＰ−１アンタゴニストが小分子およびタンパク質から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記小分子が、ＣＣＲ２ＢへのＣＣＬ２結合を阻害する能力、またはＣＣＲ１若しくはＣＣＬ２自身の阻害を伴う、インドール誘導体、環状アミン誘導体、ウレイド誘導体、複素環、アニリド、若しくは機能的ピロールから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、可溶性受容体、抗体、ペプチド、それらのフラグメント若しくはそれらの融合タンパク質から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、前記タンパク質の血清半減期を増大させる化合物若しくはタンパク質をさらに含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、最低１種のＨ鎖可変領域および最低１種のＬ鎖を含んでなる最低１種の可変領域を含んでなり、前記ＭＣＰ−１抗体が配列番号２７および２８を含んでなるＨ鎖およびＬ鎖双方の可変領域を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が最低１種のＨ可変領域および最低１種のＬ鎖可変領域を含んでなり、前記抗体が、配列番号６、７、９、１３、１４および１６のＨ鎖およびＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全部を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が最低１種のＨ鎖および最低１種のＬ鎖を含んでなる最低１種の可変領域を含んでなり、前記ＭＣＰ−１抗体が配列番号２７および２８を含んでなるＨ鎖およびＬ鎖双方の可変領域を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が最低１種のＨ鎖可変領域および最低１種のＬ鎖可変領域を含んでなり、前記抗体が配列番号６、７、９、１３、１４および１６のＨ鎖およびＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全部を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号６、７、９、１３、１４および１６の最低１種のアミノ酸配列を有する最低１個のＨ鎖若しくはＬ鎖ＣＤＲを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、配列番号６〜２６よりなる群から選択されるＨ若しくはＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分をさらに含んでなり；および、場合によっては、ヒト免疫グロブリンの少なくともＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２若しくはＣＨ３をさらに場合によっては含んでなる枠組み領域と機能的に関連する、配列番号２〜５の最低１種のＨ鎖若しくはＬ鎖可変領域を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、最低１０−９Ｍ、最低１０−１０Ｍ、最低１０−１１Ｍ若しくは最低１０−１２Ｍから選択される最低１種の親和性でＭＣＰ−１と結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、最低１種のＭＣＰ−１ポリペプチドの最低１種の活性を実質的に調節する
、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記小分子若しくはタンパク質が、最低１種の製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤をさらに含んでなる組成物として提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、検出可能な標識若しくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗感染薬、心血管（ＣＶ）系薬、中枢神経系（ＣＮＳ）薬、自律神経系（ＡＮＳ）薬、気道薬、胃腸（ＧＩ）管薬、ホルモン薬、液体若しくは電解質バランスのための薬物、血液製剤、抗腫瘍薬、免疫調節薬、眼、耳若しくは鼻の薬物、局所薬、栄養製品、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストの最低１種から選択される最低１種の化合物若しくはポリペプチドを投与することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記阻害する有効量が前記細胞、組織、器官若しくは動物１キログラムあたり０．００１〜５０ｍｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記投与することが、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑液胞内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病変内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮から選択される最低１様式による、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記線維症が器官特異的線維症若しくは全身性線維症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記器官特異的線維症が、肺線維症、肝線維症、腎線維症、心線維症、血管線維症、皮膚線維症、眼線維症、骨髄線維症若しくは他の線維症の最低１種を伴う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記肺線維症が、薬物誘発性肺線維症、喘息、サルコイドーシス若しくは慢性閉塞性肺疾患の最低１種を伴う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記肝線維症が肝硬変、住血吸虫症若しくは胆管炎の最低１種を伴う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記肝硬変が、Ｃ型肝炎後肝硬変、原発性胆汁性肝硬変から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記胆管炎が硬化性胆管炎である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記腎線維症がループス糸球体硬化症を伴う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記心線維症が少なくとも１つの型の心筋梗塞を伴う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記血管線維症が、血管形成術後動脈再狭窄若しくはアテローム硬化症の最低１種を伴う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記皮膚線維症が、ケロイド若しくは腎性線維化性皮膚症の最低１種を伴う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記眼線維症が、後眼窩線維症、白内障後手術若しくは増殖性硝子体網膜症の最低１種
を伴う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記骨髄線維症が、特発性骨髄線維症若しくは薬物誘発性骨髄線維症の最低１種を伴う、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記他の線維症が、ペーロニー病、デュピュイトラン拘縮若しくは皮膚筋炎から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記全身性線維症が全身性硬化症および移植片対宿主病から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
本明細書に記述されるいずれかの発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺線維症、とりわけ通常型間質性肺炎の予防および処置のためのＣＣＲ２へのＣＣＬ２結合の使用方法および抗ＣＣＬ２抗体のようなアンタゴニストに関する。
【背景技術】
【０００２】
通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）は肺内の蜂窩形成（ｈｏｎｅｙｃｏｍｂｉｎｇ）の存在を特徴としかつそれにより慣例に診断される慢性の消耗性の間質性肺疾患である。蜂窩形成はコラーゲン沈着の増大により生じ、従って肺内の弾性を低下させかつ正常な肺胞構造の収縮および究極的な虚脱を引き起こす。蜂窩形成および線維症の程度は肺内で非常に不均一であり、過剰なコラーゲンの密な領域はしばしば正常な肺実質若しくは単球肺浸潤の豊富な間質組織に隣接する。大部分の患者は診断の時点で中程度ないし進行した臨床疾患を有し、そして処置にもかかわらず悪化する。
【０００３】
ＣＸＣケモカインファミリーは、多様な白血球の輸送の促進、血管新生および血管リモデリングの調節、ならびに、肺線維症で間葉前駆細胞（線維細胞としてもまた知られる）を循環している線維細胞のような間葉前駆細胞の動員および輸送の促進に関与するサイトカインの多面的ファミリーである。
【０００４】
正常な肺内で、常在性線維芽細胞の大型プールが継続的にコラーゲンを生成かつ分解し、それにより肺が感染、炎症若しくは他の病態生理後に、および傷害後に再構築することを可能にする。線維芽細胞はＴＧＦｂ１のような多様な増殖因子に応答してコラーゲンを生成する。さらに、ＴＧＦｂ１は、ＵＩＰの肺組織で一般に見出される筋線維芽細胞への線維芽細胞分化を誘導する。筋線維芽細胞は、コラーゲンを生成し、ならびにα−平滑筋アクチンおよび従って収縮特性を有することが可能な分化した細胞である。筋線維芽細胞は従って潜在的に肺胞虚脱に寄与しうる。創傷治癒の正常な経過において、線維芽細胞は創傷閉鎖を指図するためにコラーゲンおよび増殖因子を生成する。組織構造が一旦復帰されれば、線維芽細胞のコラーゲン生成が減少しかつ該細胞がアポトーシスを受け、従って過剰な瘢痕形成を予防する。ＵＩＰ患者の肺で見出される顕著な線維芽細胞増殖が存在する。従って、ＵＩＰの線維芽細胞は線維症の部位に存続し、異常な過剰コラーゲン沈着に継続的に追加する。ＵＩＰ患者は肺移植の一般的なレシピエントの１種であり、そしてこれらの患者で移植片は最終的に線維性となりうる。
【０００５】
以前の研究は、非線維性組織から単離した線維芽細胞に比較して線維症の部位から単離した線維芽細胞での表現型の差違を示した。例えば、ＵＩＰ患者の肺から単離した線維芽細胞はＩＬ−１３受容体サブユニットの増大された発現を有する。ＣＣＲ２は肺線維細胞上で発現され、そしてＣＣＲ２は呼吸傷害後のこれらの細胞の動員および活性化の双方を調節する。受容体ノックアウトマウス若しくはリガンド中和いずれかによるｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＣＲ２シグナル伝達の阻害は、線維症の複数の動物モデルにおけるより少ないコラーゲン沈着をもたらす。ＣＣＬ２（ＣＣ−ケモカインリガンド２、単球走化性タンパク質１、ＭＣＰ１）はＣＣＲ２に結合する。ＣＣＲ２は主として単球、上皮細胞および内皮細胞上で発現される。増大されたレベルのＭＣＰ１がＵＩＰを伴う患者で記述されている。マウスにおけるＣＣＲ２受容体のリガンドはＣＣＬ２（ＪＥ若しくは単球走化性タンパク質１［ＭＣＰ］−１としてもまた知られる）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）およびＣＣＬ１２（ＭＣＰ−５）を包含し、従って、マウスモデルデータに基づく仮定は、ケモカインおよびケモカイン受容体分布に関してヒトの肺環境を正確に反映しないかもしれない。
【０００６】
７６アミノ酸残基を含有する８．６ｋＤａのタンパク質、単球走化性タンパク質１（Ｍ
ＣＰ−１、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２のリガンド、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００２９７３）は、サイトカインのケモカイン−β（若しくはＣ−Ｃ）ファミリーのメンバーである。ＭＣＰ−１は、単球、血管内皮細胞、平滑筋細胞、糸球体メサンギウム細胞、骨芽細胞およびヒト肺２型様（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｙｐｅ−２−ｌｉｋｅ）内皮細胞を包含する多様な細胞型により発現される。ＭＣＰ−１は、単球流入および組織中のその後の活性化を促進することにより炎症性疾患の開始および進行において活発な役割を演じていると考えられる。ＭＣＰ−１は単球に対し走化性であるがしかし好中球に対してはそうでない。それは、ＩＬ−２により活性化される細胞に類似であるＣＨＡＫ（ＣＣ−ケモカイン活性化型キラー）として知られるキラー細胞の増殖および活性化を誘導し得る。それは、細胞表面抗原（ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ）の発現ならびにサイトカインＩＬ１およびＩＬ６の発現を調節する。ＭＣＰ−１はヒト好塩基球の強力な活性化因子であり、脱顆粒およびヒスタミンの放出を誘導する。
【０００７】
従って、ＵＩＰとして知られる肺不全に至る病態生理の特質を表す患者についてのモニターおよび管理方法、ならびに肺移植に対する必要性を回避しかつ少なくとも異種移植片利用における安全性および生存を高めることを可能にする方法、ならびにその中でのＭＣＰ−１の病理学的作用の理解および治療方法に対する、医学分野における必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
［発明の要約］
本発明は、本明細書で定義されるところの受容体を発現する細胞においてＣＣＲ２、ＣＣＲ２Ａ若しくはＣＣＲ２Ｂを包含するそのアイソフォーム若しくはバリアントと関連する生物学的機能若しくは生物活性を予防する最低１種の単離されたＣＣＲ２アンタゴニスト、あるいは、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２若しくはＣＣＲ２を結合するかまたはその同族のリガンド（１種若しくは複数）とのＣＣＲ２の結合を予防しかつそれにより哺乳動物被験体の細胞、組織、器官におけるＣＣＲ２の生物学的機能を阻害するアンタゴニストの有効量を含んでなる組成物を接触若しくは投与することを含んでなる、被験体における線維症の予防、遅延若しくは逆転方法を提供する。本発明の方法の一局面において、被験体は間質性特発性肺炎に関する間質の病状および肺胞線維症を有する患者であり、より具体的には、患者は通常型間質性肺炎と診断されている。
【０００９】
本発明の方法は、本明細書で定義されるところの受容体を発現する細胞においてＣＣＲ２、ＣＣＲ２Ａ若しくはＣＣＲ２Ｂを包含するそのアイソフォーム若しくはバリアントと関連する生物学的機能若しくは生物活性を予防するＣＣＲ２アンタゴニストを用いて実施しうる。本発明の一局面において、ＣＣＲ２アンタゴニストは、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２若しくはＣＣＲ２を結合するかまたはその同族のリガンド（１種若しくは複数）とのＣＣＲ２の結合を予防しかつそれによりＣＣＲ２の生物学的機能を阻害する抗体、合成若しくは天然の配列のペプチドおよび小分子アンタゴニストを包含する。
【００１０】
を含んでなる、細胞、組織、器官若しくは動物における間質性特発性肺炎に関するＭＣＰ−１関連の間質の病状および肺胞線維症の診断方法もまた提供される。
【００１１】
一態様において、該抗体のリガンド結合部分は配列番号２７および２８を含んでなる。一局面において、本発明は、配列番号２７若しくは２８を含んでなる最低１種の可変領域を含んでなる最低１種の単離された哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体を提供する。
【００１２】
別の局面において、本発明は、（ｉ）配列番号６、７および９のＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全部；若しくは（ｉｉ）配列番号１３、１４および１６のＬ鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全部のいずれかを含んでなる最低１種の単離された哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、当該技術分野で既知かつ／若しくは本明細書に記述されるところの、細胞、組織、器官、動物若しくは患者において、および／またはＭＣＰ−１関連状態の前、後若しくは間に最低１種の関連状態を調節若しくは処置するための治療上有効な量を投与するための最低１種の抗ＭＣＰ−１抗体の方法若しくは組成物を提供する。別の局面において、本発明は、（ｉ）配列番号６、７および８若しくは９のＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全部；または（ｉｉ）配列番号１３、１４および１５若しくは１６のＬ鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全部のいずれかを含んでなる最低１種の単離された哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体を提供する。
【００１４】
本発明は、本発明の最低１種の抗ＭＣＰ−１抗体の治療上若しくは予防上有効な量の最低１種の組成物、装置および／若しくは送達方法もまた提供する。
【００１５】
本発明は本明細書に記述されるいかなる発明もさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】非線維性肺組織から単離された線維芽細胞と比較した（１という値に対し正規化した）ＵＩＰ線維芽細胞中の線維症と関連する遺伝子、すなわちａＳＭＡ：ＰＣＯＬ１；ＰＣＯＬ３；ＣＴＧＦ；ＴＧＦβ−１；ＴＧＦβＲ１；ＴＧＦβＲ２；ＩＬ１３Ｒａ１；ＩＬ１３Ｒａ２の発現の倍数増大（ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ）を各棒が表す棒グラフを示す。
【図２】非線維性および線維性肺組織由来の線維芽細胞によるａＳＭＡ発現に対するＴＧＦβ１、ＰＤＧＦおよびＣＣＬ２の影響を示す棒グラフである。
【図３】非線維性および線維性肺組織由来の線維芽細胞によるプロコラーゲンＩ（Ａ）およびプロコラーゲンＩＩＩ（Ｂ）遺伝子発現に対するＴＧＦβ１、ＰＤＧＦおよびＣＣＬ２の影響を示す２個の棒グラフである。
【図４】非線維性および線維性肺組織由来の線維芽細胞によるＴＧＦｂ１遺伝子発現に対するＴＧＦβ１、ＰＤＧＦおよびＣＣＬ２の影響を示す棒グラフである。
【図５】非線維性および線維性肺組織由来の線維芽細胞によるＣＴＧＦ遺伝子発現に対するＴＧＦβ１、ＰＤＧＦおよびＣＣＬ２の影響を示す棒グラフである。
【図６】非線維性および線維性肺組織由来の線維芽細胞によるＴＧＦβＲＩ（Ａ）およびＴＧＦβＲＩＩ（Ｂ）遺伝子発現に対するＴＧＦβ１、ＰＤＧＦおよびＣＣＬ２の影響を示す２個の棒グラフである。
【図７】非線維性および線維性肺組織由来の線維芽細胞によるＩＬ１３Ｒａ１（Ａ）およびＩＬ１３Ｒａ２（Ｂ）遺伝子発現に対するＴＧＦｂ１、ＰＤＧＦおよびＣＣＬ２の影響を示す２個の棒グラフである。
【００１７】
【表１】
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【発明を実施するための形態】
【００１８】
［発明の詳細な記述］
略語
Ａｂ  抗体、ポリクローナル若しくはモノクローナル；Ｉｇ  免疫グロブリン；Ｍａｂ
モノクローナル抗体；Ｖ  抗体の可変ドメイン；Ｃ  抗体の定常ドメイン；Ｈ  抗体のＨ鎖；Ｌ  抗体のＬ鎖；ＨＲＣＴ  高解像度コンピュータ断層撮影法；ＰＤＧＦ−ＡＢ  血小板由来増殖因子α／β；ＣＴＧＦ：結合組織増殖因子；ＣＸＣ  ＣＸＣサブクラスのケモカイン；ａＳＭＡ  α−平滑筋アクチン；ＰＣＯＬ１  プロコラーゲンＩ；ＰＣＯＬ３：プロコラーゲンＩＩＩ；ＴＧＦβ１  トランスフォーミング増殖因子β−１；ＴＧＦβＲ１  ＴＧＦβ受容体Ｉ型；ＴＧＦβＲ２：ＴＧＦβ受容体ＩＩ型；ＩＬ１３Ｒａ１；インターロイキン−１３受容体α１サブユニット；ＩＬ１３Ｒａ２：インターロイキン−１３受容体α２サブユニット。
【００１９】
定義
本明細書の「抗体」という用語は最も広範な意味で使用される。本明細書で使用されるところの「抗体」は、抗体全体およびそれらのいずれかの抗原結合フラグメント若しくは一本鎖を包含する。従って、抗体は、限定されるものでないがＨ若しくはＬ鎖の最低１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそれらのリガンド結合部分、Ｈ鎖若しくはＬ鎖可変領域、Ｈ鎖若しくはＬ鎖定常領域、枠組み（ＦＲ）領域あるいはそれらのいずれかの部分、あるいは、本発明の抗体に組み込み得る結合タンパク質の少なくとも一部分を挙げることができる、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含んでなるいかなるタンパク質若しくはペプチド含有分子も包含する。「抗体」という用語は、抗体模倣物を包含する、あるいは一本鎖抗体およびそれらのフラグメントを包含する抗体またはその指定されるフラグメント若しくは部分の構造および／若しくは機能を模倣する抗体の部分を含んでなる、抗体、消化フラグメント、それらの指定される部分およびバリアントを包含することをさらに意図している。機能的フラグメントは予め選択された標的に対する抗原結合フラグメントを包含する。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインよりなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂフラグメントを含んでなる二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨドメインよりなるＦｄフラググメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインよりなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインよりなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含する。さらに、Ｆｖフラグメントの２ドメイン、ＶＬおよびＶＨが別個の遺伝子によりコードされるとは言え、それらは、組換え法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価分子を形成する単一タンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら  １９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、およびＨｕｓｔｏｎら  １９８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）としてそれらが作成されることを可能にする合成リンカーにより結合し得る。こうした一本鎖抗体もまた抗体の「抗原結合部分」という用語内に包括されることを意図している。抗体フラグメントは、当業者に既知の慣習的技術を使用して得られ、そして該フラグメントを無傷の抗体がそうであると同一の様式で利用性についてスクリーニングする。
【００２０】
「ＣＣＲ２」により、ヒトＣＣＲ２Ａ（ＭＣＰ−１ＲＡ、ＮＰ＿０００６３８）および／若しくはヒトＣＣＲ２Ｂ（ＭＣＰ−１ＲＢ、ＮＰ＿０００６３９）、ならびに天然に存在するすなわち内因性の対応する哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質のものと同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば組換えタンパク質）を意味している。ＣＣＲ２ＡすなわちアイソフォームＡは、フレームシフトをもたらすコーディング領域中の代替スプライシングおよび下流の終止コドンの使用によりＣＣＲ２ＢすなわちアイソフォームＢと異なるＣ末端を有しかつそれより１４アミノ酸より長い（Ｃｈａｒｏら  １９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（７）：２７５２−２７５６）。本明細書で定義されるところのＣＣＲ２は、哺乳動物ＣＣＲ２の成熟受容体タンパク質、多形若しくは対立遺伝子バリアントおよびアイソフォーム（例えば代替スプライシング若しくは他の細胞過程により産生される）、ならびに前述の改変若しくは未改変形態（例えばグリコシル化、未グリコシル化）を包含する。こうしたタンパク質は、例えば哺乳動物ＣＣＲ２を天然に産生する供給源から回収若しくは単離し得る。
【００２１】
「ＣＣＲ２アンタゴニスト」は、本明細書で定義されるところのＣＣＲ２Ａ若しくはＣＣＲ２Ｂまたは他のアイソフォーム若しくはバリアントを表示する細胞でＣＣＲ２Ａ若しくはＣＣＲ２Ｂと関連する生物学的機能若しくは生物活性を予防する。本発明の範囲内に包含されるアンタゴニストは、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２若しくはＣＣＲ２を結合するかまたはＣＣＲ２のその同族のリガンド（１種若しくは複数）との結合を予防しそしてそれによりＣＣＲ２の生物学的機能を阻害する抗体、合成若しくは天然の配列のペプチドおよび小分子アンタゴニストを包含する。従って、阻害剤は、受容体を結合するアンタゴニスト（例えば抗体、天然のリガンドの変異体、小分子量有機分子、リガンド結合の他の競合的阻害剤）、およびそれに結合することなく受容体機能を阻害する物質（例えば抗イディオタイプ抗体）を包含する物質を指す。
【００２２】
「通常型間質性肺炎」若しくは「ＵＩＰ」により、「特発性肺線維症」若しくは「ＩＰＦ」および「特発性線維性肺胞炎」として臨床上および組織学的にもまた既知である。それは特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）の６種の組織学的サブタイプの最も一般的なものである。他のＩＩＰは：非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ）、閉塞性細気管支炎性器質化肺炎（ＢＯＯＰ）；呼吸細気管支炎関連性間質性肺疾患（ＩＬＤ）；剥離性間質性肺炎；および急性間質性肺炎（ＡＩＰ）である。
【００２３】
「ＭＣＰ−１」により、ＮＣＢＩ記録受託番号ＮＰ＿００２９７３に参照されかつＭＣＰ（単球走化性タンパク質）、ＳＭＣ−ＣＦ（平滑筋細胞走化性因子）、ＬＤＣＦ（リンパ球由来走化性因子）、ＧＤＣＦ（神経膠腫由来単球走化性因子）、ＴＤＣＦ（腫瘍由来走化性因子）、ＨＣ１１（ヒトサイトカイン１１）、ＭＣＡＦ（単球走化活性化因子（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ））として多様に知られる７６アミノ酸配列を意味している。遺伝子記号はＳＣＹＡ２、ヒト第１７染色体上のＪＥ遺伝子であり、そして新たな呼称はＣＣＬ２である（Ｚｌｏｔｎｉｋ、Ｙｏｓｈｉｅ  ２０００．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：１２１−１２７）。ＪＥはヒトＭＣＰ−１／ＣＣＬ２のマウスホモログである。
【００２４】
ＭＣＰ−１アンタゴニスト小分子は、ＭＣＰ−１活性を阻害しかつ潜在的治療薬を使用し得るいかなる適する化合物も指す。ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９９０５２７９号（１９９９）、同第ＷＯ  ９９１６８７６号（１９９９）、同第ＷＯ  ９９１２９６８号、同第ＷＯ  ９９３４８１８号、同第ＷＯ  ９９０９１７８号、同第ＷＯ  ９９０７３５１号、同第ＷＯ  ９９０７６７８号、同第ＷＯ  ９９４０９１３号、同第ＷＯ  ９９４０９１４号、同第ＷＯ  ００４６１９５号、同第ＷＯ  ００４６１９６号、同第ＷＯ  ００４６１９７号、同第ＷＯ  ００４６１９８号、同第ＷＯ  ００４６１９９号、同第ＷＯ  ９９２５６８６号、同第ＷＯ  ００６９８１５号、同第ＷＯ  ００６９４３２号、同第ＷＯ  ９９３２４６８号、同第ＷＯ  ９８０６７０３号、同第ＷＯ    ９９０４７７０号、同第ＷＯ  ９９０４５７９１号明細書（それらのそれぞれは引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）に開示されるところの、ＣＣＲ２ＢへのＣＣＬ２結合を阻害する能力および／またはＣＣＲ１若しくはＣＣＬ２それ自身の阻害を伴う、インドール誘導体、環状アミン誘導体、ウレイド誘導体、複素環、アニリドおよび機能的ピロールのようなこうした化合物は当該技術分野で既知である。
【００２５】
本明細書で使用されるところの、本発明で使用されるところの「処置すること」は、慢性拒絶の機能的若しくは組織学的徴候を「制御すること」および「逆転すること」を含んでなる双方の処置を意味している。
【００２６】
本発明で処置しうる哺乳動物は、乳牛、ウマなどのような家畜哺乳動物（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  ｍａｍｍａｌｓ）、イヌ、ネコ、ラットのような家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）、およびヒト、好ましくはヒトを包含する。
【００２７】
引用
本明細書に引用される全部の刊行物若しくは特許は、それらが本発明の時点での従来技術を示すため、かつ／若しくは本発明の記述および実施可能性（ｅｎａｂｌｅｍｅｎｔ）を提供するために引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる。刊行物は、いかなる学術若しくは特許刊行物、または全部の記録、電子若しくは印刷形式を包含するいずれかの媒体形式で利用可能のいかなる他の情報も指す。以下の参考文献は引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる：Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７−２００６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９４−２００６；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９９７−２００６。
【００２８】
本発明の通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）および特発性肺線維症化合物
ＭＣＰ−１はケモカイン受容体ＣＣＲ２を結合しかつそれを通じてシグナルを発することが既知である。ＣＣＲ２は、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞および好塩基球を包含する多くの細胞で発現される７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体である。２種のＭＣＰ−１特異的受容体ＣＣＲ２ＡおよびＣＣＲ２Ｂがクローン化されており、それらはナノモル（ｎＭ）濃度のＭＣＰ−１に応答してシグナルを発する。ＣＣＲ２Ａ（ＣＣ−ＣＫＲ２Ａ）およびＣ
ＣＲ２Ｂ（ＣＣ−ＣＫＲ２Ａ）は、代替スプライスされたカルボキシル尾部をもつ２種のＭＣＰ−１特異的受容体をコードする２種のｃＤＮＡを表す。ＭＣＰ−１は高親和性で双方のアイソフォームに結合する。ＭＣＰ−１は、ＣＣＲ２Ｂを発現する細胞中のカルシウム流動を誘導するがしかしＣＣＲ２Ａを発現する細胞ではしない。５倍より少ないＭＣＰ−１は、ＣＣＲ２Ａを発現する細胞と比較してＣＣＲ２Ｂを発現する細胞で走化性を誘導する。
【００２９】
ヒトＭＣＰ−１に対するある種の機能および配列の相同性をもつ他のタンパク質が既知である。ＭＣＰ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００２９７３）にとりわけ類似であるのはＭＣＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００５６１４）およびエオタキシン（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐ＿５１６７１）であり；ＭＣＰ−２はＭＣＰ−１に対する６１．８パーセントおよびエオタキシン−１は６３．２パーセントの配列同一性を有する。ヒトの恒常性機構および病理におけるこれらのタンパク質の活性の範囲および関与の範囲はＭＣＰ−１のホモログについてほど良好に理解されていない。例えば、ＭＣＰ−２（ＣＣＬ８と改名された）はＭＣＰ−１およびＭＣＰ−３（ＣＣＬ７と改名された、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＰ＿００６２６４）に緊密に関係し、そしてその機能的受容体としてＣＣＲ１ならびにＣＣＲ２Ｂ双方を使用する。ＭＣＰ−３はＤ６と呼称される受容体に結合する。ＭＣＰ−３はＣＣＲ１０およびＣＣＲ１にもまた結合する。ＭＣＰ−３タンパク質（９７アミノ酸）の配列はＭＣＰ−１と７４パーセントの同一性およびＭＣＰ−２と５８パーセントの相同性を示す。分泌型ＭＣＰ−３はＮ−グリコシル化されることにおいてＭＣＰ−１と異なる。ＭＣＰ−４（ＣＣＬ１３と改名された、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＰ＿００５３９９）は、３種の既知の単球走化性タンパク質と５６〜６１パーセントの配列同一性を共有し、そしてエオタキシン−１と６０パーセント同一である。ＭＣＰ−４の機能はＭＣＰ−３およびエオタキシンのものに高度に類似であるようである。ＭＣＰ−３と同様、ＭＣＰ−４は単球およびＴリンパ球に対する強力な化学誘引物質である。それは好中球に対し不活性である。単球上で、ＭＣＰ−４は、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）およびエオタキシンを認識する受容体すなわちＣＣＲ１およびＣＣＲ３受容体に結合し、そしてエオタキシン−１で完全な交差脱感作を示す。ＭＣＰ−５はマウスＣＣケモカインでありかつヒトＭＣＰ−１に最も緊密に関係する（６６％アミノ酸同一性）。ＭＣＰ−５の遺伝子記号はＳＣＹＡ１２である（ＣＣＬ１２と改名された）。ケモカイン受容体ＣＣＲ２でトランスフェクトした細胞はＭＣＰ−５に応答することが示されている。サイトカインおよびケモカインに関する一般的情報は、世界的インターネットでおよび現在の分類体系について入手可能である。Ｚｌｏｔｎｉｋ  Ａ．、Ｙｏｓｈｉｅ  Ｏ．２０００．Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：１２１−１２７。
【００３０】
前述の論考は、アンタゴニストがＣＣＲ２若しくはそのリガンドＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８の１種に対するいずれかの直接の作用によりＣＣＲ２結合の生物学的機能を予防しうることを強調するようにはたらく。本発明の一態様において、該アンタゴニストはＭＣＰ−１／ＣＣＬ２に結合しかつＣＣＲ２に結合するその能力を中和する。
【００３１】
抗ＣＣＲ２抗体は米国特許第ＵＳ６０８４０７５号、同第ＵＳ６４５８３５３号および同第ＵＳ６６９６５５０号明細書に開示されている。本発明の方法の一態様において、哺乳動物ＣＣＲ２を有する細胞のケモカインとの生物学的相互作用の阻害方法は、有効量の抗体またはＣＣＲ２若しくは前記受容体の一部分に結合するその機能的フラグメントと前記細胞を接触させることを含んでなる。一態様において、該抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＬＳ１３２．１Ｄ９（１Ｄ９）すなわちヒトＣＣＲ２若しくはヒトＣＣＲ２の一部分への結合について１Ｄ９と競合し得る抗体である。前述の抗体の機能的フラグメントもまた予見される。
【００３２】
ＭＣＰ−１を結合することが可能な抗体が報告されている。すなわち、日本国特許第ＪＰ９０６７３９９号明細書は単離された血液細胞から得られる抗体を開示し、また、同第ＪＰ０５２７６９８６号明細書はＩｇＭ抗ヒトＭＣＰ−１を分泌するハイブリドーマを開示する。より最近、ＭＣＰ−１を包含する複数のβ−ケモカインを結合することが可能な抗体（第ＷＯ０３０４８０８３号明細書）およびエオタキシンもまた結合するＭＣＰ−１結合抗体（第ＵＳ２００４００４７８６０号明細書）が開示された。ヒトＭＣＰ−１／ＣＣＬ２のマウスホモログ若しくはヒトＭＣＰ−１／ＣＣＬ２を選択的に結合かつ中和する抗体が出願すなわち同時継続中の米国特許出願第１１／１７０，４５３号および同第６０／６８２，６５４号明細書（それらの内容および教示は引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００３３】
本発明の一態様において、ＣＣＲ２アンタゴニストは、出願すなわち同時継続中の米国特許出願第１１／１７０，４５３号明細書に開示されるところのＣ１１４２と呼称される細胞株により産生され得るＣ７７５と呼称される抗ヒトＭＣＰ−１／ＣＣＬ２抗体、本明細書で定義されるところのそのヒト化若しくは再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）形態、切断型、または結合フラグメントのようなバリアントである。別の態様において、ＣＣＲ２アンタゴニストは、本明細書で定義されかつ出願すなわち同時係属中の特許出願第ＷＯ２００６１２５２０２号明細書（その内容および教示は引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示されるところのＣＮＴＯ８８８と呼称される抗ヒトＭＣＰ−１／ＣＣＬ２抗体、そのバリアント、切断型若しくは結合フラグメントである。
【００３４】
一態様において、配列番号２７および２８を含んでなるＨ鎖およびＬ鎖双方の可変領域を含んでなるＭＣＰ−１抗体。該抗体は最低１種のＨ鎖可変領域および最低１種のＬ鎖可変領域を含み得、前記抗体は、配列番号６、７、９、１３、１４および１６のＨ鎖およびＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全部を含んでなる。該抗体は、最低１種のＨ鎖および最低１種のＬ鎖を含んでなる最低１種の可変領域を含んでなり、前記ＭＣＰ−１抗体は配列番号２７および２８を含んでなるＨ鎖およびＬ鎖双方の可変領域を含んでなる。該抗体は、最低１種のＨ鎖可変領域および最低１種のＬ鎖可変領域を含み得、前記抗体は配列番号６、７、９、１３、１４および１６のＨ鎖およびＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全部を含んでなる。該抗体は、配列番号６、７、９、１３、１４および１６の最低１種のアミノ酸配列を有する最低１個のＨ鎖若しくはＬ鎖ＣＤＲを含み得る。該抗体は、あるいは、配列番号６〜２６よりなる群から選択されるＨ若しくはＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分をさらに含んでなり；ならびに、場合によってはヒト免疫グロブリンの少なくともＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２若しくはＣＨ３をさらに場合によっては含んでなる枠組み領域と機能上関連する、配列番号２〜５の最低１種のＨ鎖若しくはＬ鎖可変領域を含み得る。
【００３５】
ＣＣＲ２を結合しかつ拮抗活性を有する能力を有するＭＣＰ−１／ＣＣＬ２の切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、バリアント、変異体タンパク質すなわち「ムテイン」もまた本発明の方法を実施するのに使用しうる。第ＷＯ０５０３７３０５Ａ１号明細書で教示されるところの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受容体に結合しかつアゴニスト特性を有するがしかしｉｎ
ｖｉｖｏで天然のサイトカインを拮抗し得かつ抗炎症活性を有する絶対単量体（ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｍｏｎｏｍｅｒ）をもたらすように水素結合のパターンを変える二量体界面の単一アミノ酸置換を有するＣＣＬ２のようなホモ二量体形成ケモカインのバリアントは、本発明の実施において有用なバリアントの１つである。ＭＣＰ  １のペプチドアンタゴニストは、関節炎のマウスモデルで疾患の発症を予防することおよび疾患の症状を低下させることの双方を示した切断型ＭＣＰ−１（９−７６）である（Ｊｉａｎｇ−Ｈｏｎｇ  Ｇｏｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７、１８６：１３１）。
【００３６】
ＣＣＲ２／ＣＣＬ２発現の調節
ＣＣＲ２のそのリガンドとの相互作用の代替の一拮抗方法は、例えばＲＮＡサイレンシングの方法を使用してＣＣＲ２若しくはそのリガンド、具体的にはＭＣＰ−１／ＣＣＬ２の発現をノックダウンすることによる。従って、別の態様において、本発明の方法の実施において有用な化合物は、ＭＣＰ−１配列を標的としかつＭＣＰ−１遺伝子発現を妨害するか若しくはＣＣＲ２を標的としかつＣＣＲ２遺伝子発現を妨害する、センス若しくはアンチセンスの向きのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ならびに一本鎖若しくは二本鎖核酸分子（例えばｓｉＲＮＡ）を包含する核酸である。
【００３７】
遺伝子発現は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス分子およびＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）の使用によるを包含するいくつかの異なる方法で調節し得る。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ双方はＲＮＡｉ経路を介して作動し、そして遺伝子の発現を抑制するのに成功裏に使用されている。ＲＮＡｉは最初に虫で発見され、そしてｄｓＲＮＡに関する遺伝子サイレンシングの現象はＦｉｒｅとＭｅｌｌｏ（Ｆｉｒｅら、１９９８．Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６）により植物で最初に報告され、そして植物細胞がＲＮＡウイルスへの感染と闘うための一方法であると考えられている。この経路では、長いｄｓＲＮＡウイルス産物がダイサー様酵素により長さ２１〜２５ｂｐのより小さいフラグメントにプロセシングされ、そしてその後二本鎖分子がほどかれ、そしてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に負荷される。遺伝子特異的でなくかつ細胞中のタンパク質合成の全体的停止に至るいわゆるインターフェロン応答の誘導を回避するためにｄｓＲＮＡ分子が長さ３０ｂｐより短くなければならないという顕著な差違を伴い、哺乳動物細胞で類似の経路が同定された。
【００３８】
合成ｓｉＲＮＡは１遺伝子を特異的に標的とするように設計し得、そしてそれらはｉｎ
ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に容易に送達され得る。ｓｈＲＮＡはｓｉＲＮＡ分子のＤＮＡ同等物であり、そして細胞のゲノムに取り込まれかつその後すべての分裂周期の間に複製されるという利点を有する。
【００３９】
ＤＮＡザイムもまた遺伝子発現を調節するのに使用されている。ＤＮＡザイムは一本鎖ＲＮＡを切断する触媒的ＤＮＡ分子である。それらは標的ＲＮＡ配列に高度に選択的であり、そしてそれ自体、メッセンジャーＲＮＡのターゲッティングにより特定の遺伝子を下方制御するのに使用し得る。
【００４０】
ＲＮＡ干渉は小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される動物における配列特異的翻訳後遺伝子サイレンシングの過程を指す（Ｚａｍｏｒｅら、２０００、Ｃｅｌｌ、１０１、２５−３３；Ｆｉｒｅら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３９１、８０６；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６、９５０−９５１；Ｌｉｎら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ、４０２、１２８−１２９；Ｓｈａｒｐ、１９９９、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．、１３：１３９−１４１；およびＳｔｒａｕｓｓ、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６、８８６）。細胞中のｄｓＲＮＡの存在は、未だ完全に特徴付けられてなければならない機構によりＲＮＡｉ応答を誘発する。この機構は、リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断をもたらすタンパク質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素のｄｓＲＮＡ媒介性の活性化から生じるインターフェロン応答のような二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼを必要とする他の既知の機構と異なると思われる（例えば米国特許第６，１０７，０９４号；同第５，８９８，０３１号明細書；Ｃｌｅｍｅｎｓら、１９９７、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ＆  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．、１７、５０３−５２４；Ａｄａｈら、２００１、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、８、１１８９を参照されたい）。
【００４１】
細胞中の長いｄｓＲＮＡの存在は、ダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する（Ｂａｓｓ、２０００、Ｃｅｌｌ、１０１、２３５；Ｚａｍｏｒｅら、２
０００、Ｃｅｌｌ、１０１、２５−３３；Ｈａｍｍｏｎｄら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ、４０４、２９３）。ダイサーは、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短い片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する（Ｚａｍｏｒｅら、２０００、Ｃｅｌｌ、１０１、２５−３３；Ｂａｓｓ、２０００、Ｃｅｌｌ、１０１、２３５；Ｂｅｒｓｔｅｉｎら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ、４０９、３６３）。ダイサー活性由来の小分子干渉ＲＮＡは、典型的に長さ約２１ないし約２３ヌクレオチドであり、そして約１９塩基対二重鎖を含んでなる（Ｚａｍｏｒｅら、２０００、Ｃｅｌｌ、１０１、２５−３３；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１５、１８８）。ダイサーは、翻訳制御に関係する保存された構造の前駆体ＲＮＡからの２１および２２ヌクレオチドの小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の除去にもまた関係する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３、８３４）。ＲＮＡｉ応答はまた、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般に称されるエンドヌクレアーゼ複合体も特徴とする。標的ＲＮＡの切断はｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１５、１８８）。
【００４２】
ｓｉＲＮＡは標的配列およびその相補物を包含する二本鎖ＲＮＡである。２個のウリジン残基がＲＮＡの３’端に付加される（Ｅｌｂａｓｈｉｒら  ２００１  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８）。
【００４３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は現在、特定の遺伝子の発現を低下することの機能的結果を研究するために哺乳動物細胞で慣例に使用されている。ＲＮＡｉは、目的の遺伝子に相補的である、２ｎｔの３’オーバーハングをもつ長さ約２１ｎｔの二本鎖ＲＮＡ分子（Ｅｌｂａｓｈｉｒら  ２００１  上記）若しくはヘアピンを形成する４５〜５０ｍｅｒ（ｓｈＲＮＡ）分子（Ｐａｄｄｉｓｏｎ，ＰＪら、２００２．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １６：９４８−９５８）を含んでなる小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトすることにより誘導する。哺乳動物細胞にトランスフェクトされる場合、ｓｉＲＮＡ発現プラスミドならびに内因性および外因性双方の遺伝子産物のレベルを低下させることが示されている。それらは化学合成若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写したｓｉＲＮＡより製造するためのより大きな努力を必要とするとは言え、ｓｉＲＮＡベクターは選択可能なマーカーと共発現される場合に標的遺伝子発現のより長期の低下を提供し得る（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲら、２００２．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３）。
【００４４】
非タンパク質非オリゴ核酸アンタゴニスト
小分子薬物およびペプチド模倣物もまたＣＣＲ２のアンタゴニストであり得る。例えば、第ＷＯ０４０６９８０９号、同第ＷＯ０４０６９８１０号、同第ＷＯ０５１１８５７４号、同第ＷＯ０６０１５９８６号明細書はＣＣＲ２受容体アンタゴニストとしてのメルカプトイミダゾールを教示する。所望の生物学的特性を表す他の小分子は、本明細書に記述されるもののような方法を使用するスクリーニングにより選択し得、そして慢性拒絶を予防しかつ移植片生存を延長するという特性を有することができる。
【００４５】
抗体の作成方法
本発明のＣＣＲ２アンタゴニスト抗体は、場合によっては、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術（ハイブリドーマ法）を包含する多様な技術により製造し得る。ハイブリドーマ法において、マウスまたはハムスター若しくはマカクザルのような他の適切な宿主動物を本明細書に記述されるとおり免疫して、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合することができる抗体を産生する若しくは産生することが可能であるリンパ球を導き出す。あるいは、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫しうる。リンパ球をその後、ポリエチレング
リコールのような適する融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。
【００４６】
ＣＣＲ２アンタゴニスト抗体は、場合によっては、本明細書に記述されかつ／若しくは当該技術分野で既知のところのヒト抗体のレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ヒト以外の霊長類など）の免疫化によってもまた生成し得る。例えばヒト抗ＭＣＰ−１抗体を産生する細胞をこうした動物から単離し得、そして本明細書に記述される方法のような適する方法を使用して不死化し得る。
【００４７】
それらの生殖系列配置（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）にヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を有するトランスジェニックマウスの使用は、正常なヒト免疫系が寛容であるヒト自己抗原を包含する多様な標的に向けられる高親和性の完全にヒトのモノクローナル抗体の単離を提供する（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら、第ＵＳ５５６９８２５号、同第ＵＳ６３００１２９号明細書および１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−９；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．ら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．とＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−９５；Ｌｏｎｂｅｒｇ，ＮとＨｕｓｚａｒ，Ｄ．、１９９５、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら  第ＵＳ６７１３６１０号明細書；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、１９９１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１３２３−１３２６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ら、１９９６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１；Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．ら、１９９７、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３；Ｙａｎｇ，Ｘ．ら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１２３６−１２４３；Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．とＴａｕｓｓｉｇ，Ｍ  Ｊ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−４５８、１９９７；Ｔｏｍｉｚｕｋａら  第ＷＯ０２０４３４７８号明細書）。こうしたマウス中の内因性免疫グロブリン遺伝子座は、内因性遺伝子によりコードされる抗体を産生する該動物の能力を排除するように破壊若しくは欠失し得る。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フリーモント）およびＭｅｄａｒｅｘ（カリフォルニア州サンノゼ）のような会社を、上述されたところの技術を使用する選択された抗原に向けられるヒト抗体を提供するのに従事させ得る。
【００４８】
免疫原性抗原の製造およびモノクローナル抗体製造は、組換えタンパク質製造のようないずれかの適する技術を使用して実施し得る。免疫原性抗原は、精製されたタンパク質、あるいは全細胞または細胞若しくは組織抽出物を包含するタンパク質混合物の形態で動物に投与し得るか、あるいは、抗原は前記抗原若しくはその一部分をコードする核酸から動物の体内で新たに形成し得る。抗原での免疫化は、場合によってはフロイントの完全アジュバントのようなアジュバントの添加により達成し得る。免疫応答を免疫化プロトコルの経過にわたりモニターし得、血漿サンプルを後眼窩出血により得る。血漿をＥＬＩＳＡ（下述されるところの）によりスクリーニングし得、そして抗ＭＣＰ−１免疫グロブリンの十分な力価を伴うマウスを融合に使用し得る。マウスを屠殺および脾の除去３日前に抗原で静脈内に追加免疫し得る。各抗原について２〜３種の融合が実施されることを必要としうることが期待される。数匹のマウスを各抗原について免疫化することができる。
【００４９】
モノクローナルＣＣＲ２アンタゴニスト抗体を産生するハイブリドーマを生成するため、免疫したマウスからの脾細胞およびリンパ節細胞を単離し得、そしてマウス骨髄腫細胞株のような適切な不死化細胞株に融合し得る。生じるハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングし得る。
【００５０】
免疫グロブリン鎖を産生することが不可能な適する不死細胞株、例えば、限定されるものでないがＳｐ２／０および誘導体細胞株、ＮＳ１および誘導体、とりわけＧＳ−ＮＳＯのようなＮＳＯ工作したＮＳＯ株、ＡＥ−１、Ｌ．５、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｕ９３７、ＭＬＡ  １４４、ＡＣＴ  ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ  １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ  ２Ａ、ＣＨＯ、ＰｅｒＣ．６、ＹＢ２／Ｏなど、若しくは異種骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａｓ）、それらの融合生成物またはそれら由来のいずれかの細胞若しくは融合細胞、あるいは当該技術分野で既知のところのいずれかの他の適する細胞株（Ｂｉｒｃｈら  １９９４．Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ２２：１２７−１３３）を挙げることができる骨髄腫細胞株を融合パートナーとして選択する。融合された細胞（ハイブリドーマ）若しくは組換え細胞を、選択的培養条件若しくは他の適する既知の方法を使用して単離し得、そして制限希釈若しくは細胞分取または他の既知の方法によりクローン化し得る。所望の特異性を持つ抗体を産生する細胞を適するアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）により検出し得、そして操作のため選択し得る。
【００５１】
限定されるものでないが、ペプチド若しくはタンパク質ライブラリー（例えばＣａｍｂｒｉｄｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国ケンブリッジシャー；ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ、独国マルティンスライト／プラネック；Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ、英国スコットランド・アバディーン；ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ、スウェーデン・ルント；Ｄｙａｘ
Ｃｏｒｐ．、Ｅｎｚｏｎ、Ａｆｆｙｍａｘ／Ｂｉｏｓｉｔｅ；Ｘｏｍａ、カリフォルニア州バークレー；Ｉｘｓｙｓから入手可能なところの、例えば、限定されるものでないがバクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどのディスプレイライブラリーから組換え抗体を選択する方法を挙げることができる、必須の特異性の抗体の他の適する生成若しくは単離方法を使用し得る。例えば、当該技術分野で既知かつ／若しくは本明細書に記述されるところのヒト抗体のレパートリーを産生することが可能である、欧州特許第ＥＰ  ３６８，６８４号、第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；第ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５号；第ＰＣＴ／ＧＢ９２／００２２４０号；第ＰＣＴ／ＧＢ９２／００８８３号；第ＰＣＴ／ＧＢ９３／００６０５号；米国特許第ＵＳ  ０８／３５０２６０号（５／１２／９４）；第ＰＣＴ／ＧＢ９４／０１４２２号；第ＰＣＴ／ＧＢ９４／０２６６２号；第ＰＣＴ／ＧＢ９７／０１８３５号；（ＣＡＴ／ＭＲＣ）；第ＷＯ９０／１４４４３号；第ＷＯ９０／１４４２４号；第ＷＯ９０／１４４３０号；第ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２３４号；第ＷＯ９２／１８６１９号；第ＷＯ９６／０７７５４号；（Ｓｃｒｉｐｐｓ）；第ＥＰ  ６１４  ９８９号（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）；第ＷＯ９５／１６０２７号（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ）；第ＷＯ８８／０６６３０号；第ＷＯ９０／３８０９号（Ｄｙａｘ）；米国特許第ＵＳ  ４，７０４，６９２号（Ｅｎｚｏｎ）；第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２９８９号（Ａｆｆｙｍａｘ）；第ＷＯ８９／０６２８３号；欧州特許第ＥＰ  ３７１  ９９８号；同第ＥＰ  ５５０  ４００号；（Ｘｏｍａ）；同第ＥＰ  ２２９  ０４６号；第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０７１４９号（Ｉｘｓｙｓ）；または化学量論的に生成されたペプチド若しくはタンパク質−米国特許第ＵＳ  ５７２３３２３号、同第５７６３１９２号、同第５８１４４７６号、同第５８１７４８３号、同第５８２４５１４号、同第５９７６８６２号、第ＷＯ  ８６／０５８０３号、欧州特許第ＥＰ  ５９０６８９号明細書（Ｉｘｓｙｓ、現在Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＡＭＥ）（それぞれ引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい。こうした技術は、限定されるものでないが、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：４９３７−４９４２（１９９７年５月）；Ｈａｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１４１３０−１４１３５（１９９８年１１月））；単一細胞抗体産生技術（例えば選択リンパ球抗体法（ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅｔｈｏｄ）（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号明細書、Ｗｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８８７−８９２（１９８７）；Ｂａｂｃｏｏｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−７８４８（１９９６））；ゲル微小液滴およびフローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３３３−３３７（１９９０）；Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州ケンブリッジ；Ｇｒａｙら、Ｊ．Ｉｍ���．Ｍｅｔｈ．１８２：１５５−１６３（１９９５）；Ｋｅｎｎｙら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：７８７−７９０（１９９５））；Ｂ細胞選択（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら、Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９：１２５−１３４（１９９４）；Ｊｏｎａｋら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｖｏｌ．５、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．、オランダ・アムステルダム（１９８８））を挙げることができる。
【００５２】
類似のタンパク質若しくはフラグメントへの特異的結合について抗体をスクリーニングすることもまた、ペプチドディスプレイライブラリーを使用して便宜的に達成し得る。この方法は、所望の機能若しくは構造を有する個々のメンバーについてのペプチドの大きな集合物のスクリーニングを必要とする。ペプチドディスプレイライブラリーを使用する抗体スクリーニングは当該技術分野で公知である。表示されるペプチド配列は長さ３から５０００若しくはそれ以上までのアミノ酸、頻繁に５〜１００アミノ酸長から、およびしばしば約８から２５アミノ酸長までであり得る。ペプチドディスプレイライブラリー、ベクターおよびスクリーニングキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールズバッド）およびＣａｍｂｒｉｄｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国ケンブリッジシャー）のような供給元から商業的に入手可能である。例えば、Ｅｎｚｏｎに譲渡された米国特許第４７０４６９２号、同第４９３９６６６号、同第４９４６７７８号、同第５２６０２０３号、同第５４５５０３０号、同第５５１８８８９号、同第５５３４６２１号、同第５６５６７３０号、同第５７６３７３３号、同第５７６７２６０号、同第５８５６４５６号；Ｄｙａｘに譲渡された同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６９８号、同第５８３７５００号、Ａｆｆｙｍａｘに譲渡された同第５４２７９０８号、同第５５８０７１７号；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに譲渡された同第５８８５７９３号；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに譲渡された同第５７５０３７３号、Ｘｏｍａに譲渡された同第５６１８９２０号、同第５５９５８９８号、同第５５７６１９５号、同第５６９８４３５号、同第５６９３４９３号、同第５６９８４１７号明細書、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、上記；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；若しくはＳａｍｂｒｏｏｋ、上記（上の特許および刊行物のそれぞれは引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい。
【００５３】
抗体フラグメント
抗体フラグメントは無傷の抗体のタンパク質分解性消化を介して派生し得る（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、これらのフラグメントは今や組換え宿主細胞により直接製造し得る。Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体フラグメントは全部、哺乳動物宿主細胞若しくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現され得かつそれらから分泌され得、かように大量のこれらのフラグメントの容易な製造を可能にする。抗体フラグメントは上で論考された抗体ファージライブラリーから単離し得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収しかつ化学的に結合してＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成し得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。
【００５４】
他の態様において、の抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。第ＷＯ  ９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；および同第５，５８７，４５８号明細書を参照されたい。ＦｖおよびｓＦｖは定常領域を欠く無傷の結合部位すなわちＶＨおよびＶＬドメインをもつ種である。典型的に、ＶＨおよびＶＬドメインをクローン化しかつ単一ポリペプチド内に存するように再工作し、そして該単一ポリペプチド内での該２ドメインの相互作用を可能にするのに十分に長いフレキシブルリンカーにより結合する。あるいは、融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ若しくはカルボキシいずれかの末端でのエフェクタータンパク質の融合を生じるように構築しうる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９９５．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編を参照されたい。
【００５５】
アンタゴニストの同定方法
ＣＣＲ２の生物学的活性のアンタゴニストは、下に例示されるところの適するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルを使用して同定し得る。
【００５６】
結合阻害アッセイを使用して、ＣＣＲ２を結合しかつＣＣＲ２若しくは機能的バリアントへのリガンドのような別の化合物（例えばＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３および／若しくはＭＣＰ−４）の結合を阻害する抗体若しくはそのフラグメントを同定し得る。例えば、抗体の非存在下でのリガンドの結合に比較して（該抗体の存在下での）ＣＣＲ２のリガンドの結合の低下を検出若しくは測定する結合アッセイを実施し得る。単離されたかつ／若しくは組換えの哺乳動物ＣＣＲ２若しくはその機能的バリアントを含んでなる組成物を、リガンドおよび抗体と同時に若しくはいずれかの順序で一方の後に他方と接触し得る。抗体の存在下でのリガンドの結合の程度の低下は該抗体による結合の阻害を示す。例えばリガンドの結合が低下若しくは廃止され得る。
【００５７】
一態様において、哺乳動物ＣＣＲ２若しくはそのバリアントへのリガンド（例えばＭＣＰ−１／ＣＣＬ２のようなケモカイン）の結合の抗体若しくはフラグメントによる直接阻害をモニターする。例えば、哺乳動物ＣＣＲ２への１２５Ｉ標識ＭＣＰ−１、１２５Ｉ標識ＭＣＰ−２、１２５Ｉ標識ＭＣＰ−３若しくは１２５Ｉ標識ＭＣＰ−４の結合を阻害する抗体の能力をモニターし得る。こうしたアッセイは、例えば、単離された血液細胞（例えばＴ細胞、ＰＢＭＣ）若しくはＣＣＲ２を天然に発現する適する細胞株のようなＣＣＲ２若しくはその機能的バリアントを有する適する細胞、または哺乳動物ＣＣＲ２をコードする核酸を含有する細胞株、あるいは前記細胞からの膜画分を使用して実施し得る。
【００５８】
他の適する結合アッセイ、またはシグナル伝達機能および／若しくは細胞応答の刺激（例えば白血球輸送）を包含する受容体結合により誘発される事象をモニターする方法のような、ＣＣＲ２を結合する抗体の存在の他の同定方法が利用可能である。
【００５９】
本発明の抗体の阻害効果を結合阻害アッセイで評価し得ることが理解されるであろう。受容体結合についての抗体間の競合もまた該方法で評価し得る。この様式で同定される抗体をさらに評価して、それらが結合後にＣＣＲ２の他の機能を阻害するように作用するかどうかを決定しかつ／若しくはそれらの治療的利用性を評価し得る。
【００６０】
シグナル伝達アッセイ
ＣＣＲ２へのリガンド若しくはアゴニストのような促進因子（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の結合はこのＧタンパク質共役型受容体によるシグナル伝達をもたらし得、そしてＧタンパク質ならびに他の細胞内シグナル伝達分子の活性が刺激される。化合物（例えば抗体若しくはそのフラグメント）によるシグナル伝達機能の誘導をいずれかの適する方法を使用してモニターし得る。こうしたアッセイを使用してＣＣＲ２の抗体アゴニストを同定し得る。抗体若しくはその機能的フラグメントまたは他のＣＣＲ２アンタゴニスト化合物候補の阻
害活性は、該アッセイでリガンド若しくは促進因子を使用し、およびリガンド若しくは促進因子により誘導される活性を阻害する該抗体の能力を評価して決定し得る。
【００６１】
ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解のようなＧタンパク質活性、若しくは細胞内（サイトゾルの）遊離カルシウム［Ｃａ２＋］Ｉの濃度の迅速かつ一過性の増大の誘導のような受容体結合により誘発される後のシグナル伝達事象は、当該技術分野で既知の方法若しくは他の適する方法により評価し得る（例えば、Ｎｅｏｔｅ，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ、７２：４１５−４２５  １９９３）；Ｖａｎ  Ｒｉｐｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７：８５１−８５６（１９９３）；Ｄａｈｉｎｄｅｎ，Ｃ．Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９：７５１−７５６（１９９４）を参照されたい）。
【００６２】
例えば、ハイブリッドのＧタンパク質共役型受容体を使用するＳｌｅｄｚｉｅｗｓｋｉらの機能的アッセイを使用して、受容体を結合しかつＧタンパク質を活性化するリガンド若しくは促進因子の能力をモニターし得る（Ｓｌｅｄｚｉｅｗｓｋｉら、米国特許第５，２８４，７４６号明細書（その教示は引用することにより本明細書に組み込まれる））。
【００６３】
こうしたアッセイは評価されるべき抗体若しくはそのフラグメントの存在下で実施し得、そしてリガンド若しくは促進因子により誘導される活性を阻害する該抗体若しくはフラグメントの能力を、既知の方法および／若しくは本明細書に記述される方法を使用して決定する。
【００６４】
走化性および細胞刺激のアッセイ
走化性アッセイは、ＣＣＲ２のアンタゴニストとして作用する抗体若しくはその機能的フラグメントの能力を評価するのにもまた使用し得る。哺乳動物ＣＣＲ２若しくはその機能的バリアントへのリガンドの結合を阻害しかつ受容体への該リガンドの結合と関連する機能として走化性を阻害する、抗体若しくはその機能的フラグメントまたは他のＣＣＲ２アンタゴニスト化合物候補の阻害活性は、その点に関して有用である。これらのアッセイは化合物、この場合はＣＣＬ２若しくはＣＣＲ２を活性化することが可能な別のリガンドのいずれかにより誘導されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の機能的遊走に基づく。走化性は、例えば９６ウェル走化性プレートを利用するアッセイで、若しくは走化性の他の技術に認識された評価方法を使用して評価し得る。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ経内皮走化性アッセイの使用がＳｐｒｉｎｇｅｒら（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、１９９４年９月１５日に公開された第ＷＯ  ９４／２０１４２号明細書（その教示は引用することにより本明細書に組み込まれる）；Ｂｅｒｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．１７：６２５−６７７（１９８８）もまた参照されたい）により記述されている。内皮を横断してコラーゲンゲル中への遊走もまた記述されている（Ｋａｖａｎａｕｇｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６：４１４９−４１５６（１９９１））。例えば、マウスＩＬ−２プレＢ細胞若しくは走化性が可能な他の適する宿主細胞の安定なトランスフェクタントを走化性アッセイで使用し得る。
【００６５】
一般に、走化性アッセイは、障壁の第一の表面から相対する第二の表面への化合物の増大された濃度に向かって障壁（例えば内皮、フィルター）中へ若しくはそれらを通る適する細胞（白血球（例えばリンパ球、好酸球、好塩基球）のような）の方向性の動きすなわち遊走をモニターする。膜若しくはフィルターは便宜的な障壁を提供し、その結果、フィルターの第一の表面からフィルターの相対する第二の表面への化合物の増大された濃度に向かうフィルター中へ若しくはそれを通る適する細胞の方向性の動きすなわち遊走がモニターされる。いくつかのアッセイでは、膜をＩＣＡＭ−１、フィブロネクチン若しくはコラーゲンのような接着を助長するための物質で被覆する。こうしたアッセイは白血球の「ホーミング」のｉｎ  ｖｉｔｒｏの近似を提供する。
【００６６】
例えば、試験されるべき抗体を含有しかつ膜により第一の室から分割されている第二の室中への多孔質膜中への若しくはそれを通る第一の室からの適する容器（含有手段）中の細胞の遊走の阻害を検出若しくは測定し得る。例えばニトロセルロース、ポリカーボネートを包含する、化合物に応答しての特定の遊走をモニターするのに適する孔径を有する適する膜を選択する。例えば、約３〜８ミクロン、および好ましくは約５〜８ミクロンの孔径を使用し得る。孔径はフィルター上で均一若しくは適する孔径の範囲内にあることができる。
【００６７】
フィルター中への遊走および遊走の阻害、遊走の距離を評価するため、フィルターの第二の表面に付着したまま留まるフィルターを横断する細胞の数、および／若しくは第二の室中に蓄積する細胞の数を、標準的技術（例えば顕微鏡検査）を使用して決定し得る。一態様において、細胞を検出可能な標識（例えば放射性同位体、蛍光標識、抗原若しくはエピトープ標識）で標識し、そして、適切な方法を使用して（例えば放射活性、蛍光を検出すること、イムノアッセイにより）膜に付着しかつ／若しくは第二の室中に存在する標識の存在を決定することにより、抗体若しくはフラグメントの存在および非存在下で遊走を評価し得る。抗体アゴニストにより誘導される遊走の程度を適する対照に関して（例えば、抗体の非存在下で測定されるバックグラウンドの遊走に比較して、第二の化合物（すなわち標準）により誘導される遊走の程度に比較して、抗体により誘導されるトランスフェクトされない細胞の遊走と比較して）決定し得る。
【００６８】
とりわけＴ細胞、単球若しくは哺乳動物ＣＣＲ２を発現する細胞についての一態様において、経内皮遊走をモニターし得る。この態様において、内皮細胞層を通る遊出を評価する。細胞層を調製するため、内皮細胞を、場合によっては内皮細胞の接着を助長するためにコラーゲン、フィブロネクチン、若しくは他の細胞外マトリックスタンパク質のような物質で被覆した微孔性フィルター若しくは膜上で培養し得る。好ましくはコンフルエントな単層が形成されるまで内皮細胞を培養する。例えば静脈、動脈若しくはヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ、カリフォルニア州サンディエゴ）のような微小血管内皮細胞を包含する多様な哺乳動物内皮細胞が単層形成に利用可能であり得る。特定の哺乳動物受容体に応答しての走化性をアッセイするためには同一哺乳動物の内皮細胞が好ましいが；しかしながら異種哺乳動物種若しくは属からの内皮細胞もまた使用し得る。
【００６９】
一般に、該アッセイは、フィルターの第一の表面からフィルターの相対する第二の表面への化合物の増大された濃度への方向で膜若しくはフィルター中への若しくはそれらを通る細胞の方向性の遊走を検出することにより実施し、該フィルターは第一の表面上に内皮細胞層を含有する。方向性の遊走は、第一の表面に隣接する領域から膜中へ若しくはそれを通り該フィルターの相対する側に置かれた化合物に向かって起こる。第二の表面に隣接する領域に存在する化合物の濃度は、第一の表面に隣接する領域のものより大きい。
【００７０】
抗体阻害剤について試験するのに使用される一態様において、遊走および哺乳動物ＣＣＲ２受容体を発現することが可能な細胞を含んでなる組成物を第一の室に置くことができる。第一の室中の細胞の走化性を誘導することが可能な１種若しくはそれ以上のリガンド若しくは促進因子（化学誘引物質機能を有する）を含んでなる組成物を第二の室に置く。好ましくは細胞を第一の室に置く直前に、若しくは細胞と同時に、試験されるべき抗体を含んでなる組成物を好ましくは第一の室に置く。本アッセイにおいて哺乳動物ＣＣＲ２を発現する細胞の受容体に結合し得かつリガンド若しくは促進因子による走化性の誘導を阻害し得る抗体若しくはその機能的フラグメントは、受容体機能の阻害剤（例えば刺激機能の阻害剤）である。該抗体若しくはフラグメントの存在下でのリガンド若しくは促進因子により誘導される遊走の程度の低下は阻害活性を示す。別個の結合試験（上を参照されたい）を実施して、阻害が受容体への抗体の結合の結果であるか若しくは異なる機構を介して発生するかどちらかを決定し得る。
【００７１】
組織中の化合物（例えばケモカイン若しくは抗体）の注入に応答しての組織の白血球浸潤をモニターするｉｎ  ｖｉｖｏアッセイはｉｎ  ｖｉｖｏホーミングのモデルであり、そして、炎症の部位への遊走および走化性によりリガンド若しくは促進因子に応答しかつこの遊走を阻害する抗体若しくはそのフラグメントの能力を評価する細胞の能力を測定する。
【００７２】
記述される方法に加え、ＣＣＲ２の刺激機能に対する抗体若しくはフラグメントの効果は、受容体を含有する適する宿主細胞を使用して、活性の受容体により誘導される細胞応答をモニターすることにより評価し得る。
【００７３】
哺乳動物のＣＣＲ２機能の付加的なリガンドおよび阻害剤の同定
本発明の抗体およびフラグメントの結合および機能を評価するのに使用し得る上述されたアッセイは、哺乳動物ＣＣＲ２若しくはその機能的バリアントを結合する付加的なリガンド若しくは他の物質、ならびに哺乳動物のＣＣＲ２機能の阻害剤および／若しくは促進因子を同定するように適合し得る。例えば、本発明の抗体若しくはその機能的部分の結合特異性と同一若しくは類似の結合特異性を有する剤を、前記抗体若しくはその部分との競合アッセイにより同定し得る。従って、本発明は、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質を結合する受容体のリガンド若しくは他の物質ならびに受容体機能の阻害剤（例えばアンタゴニスト）若しくは促進因子（例えばアゴニスト）の同定方法もまた包含する。一態様において、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質若しくはその機能的バリアントを持つ細胞（例えば、前記細胞に導入された核酸によりコードされる哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質若しくは機能的バリアントを発現するように工作された白血球、細胞株若しくは適する宿主細胞）を、受容体機能の阻害剤若しくは促進因子を包含する受容体を結合するリガンド若しくは他の物質を同定しかつその有効性を評価するためのアッセイで使用する。こうした細胞は発現される受容体タンパク質若しくはポリペプチドの機能の評価においてもまた有用である。
【００７４】
本発明により、受容体を結合するリガンドおよび他の物質、受容体機能の阻害剤および促進因子を適するアッセイで同定し得、そして治療効果についてさらに評価し得る。受容体機能の阻害剤は受容体活性を阻害（低下若しくは予防）するのに使用し得、ならびにリガンドおよび／若しくは促進因子は、示される場合に正常な受容体機能を誘導（誘発若しくは増強）するのに使用し得る。従って、本発明は、受容体機能の阻害剤を個体（例えば哺乳動物）に投与することを含んでなる移植片拒絶の処置方法を提供する。
【００７５】
ＣＣＲ２アンタゴニストを含んでなる製薬学的組成物
本発明は、ＣＣＲ２の転写、発現若しくは活性を調節するための製薬学的組成物の製造方法を包含する。こうした方法は、ＣＣＲ２の発現若しくは活性を調節する剤とともに製薬学的に許容できる担体を処方することを含んでなる。こうした組成物は付加的な有効成分をさらに包含し得る。従って、本発明は、ＣＣＲ２の発現若しくは活性を調節する１剤および１種若しくはそれ以上の付加的な有効成分とともに製薬学的に許容できる担体を処方することによる製薬学的組成物の製造方法をさらに包含し得る。
【００７６】
使用される投薬量および濃度でそれに曝露される細胞若しくは哺乳動物に対し非毒性である製薬学的に許容できる担体、賦形剤若しくは安定剤。しばしば、生理学的に許容できる担体は水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容できる担体の例は、リン酸、クエン酸および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を包含する抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水ポリマー；グリシン、グルタミン、ヒスタジン（ｈｉｓｔａｄｉｎｅ）、アスパラギン、アルギニン若しくはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース若しくはデキストリンを包含する単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール若しくはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩を形成する対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（Ｒ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（Ｒ）およびヒアルロン酸（ＨＡ）のような非イオン性界面活性剤を包含する。
【００７７】
製剤はＣＣＲ２アンタゴニストの安定性を最適化するか、若しくは、加えて血流への有効成分の徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）すなわち長時間放出（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）を見込むように設計しうる。ＣＣＲ２アンタゴニストの型のそれぞれに適する製剤および投与経路は、例えば”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、ペンシルベニア州フィラデルフィア、２０００に見出しうる。
【００７８】
製剤がｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用されるために、それらは無菌でなければならない。該製剤は、凍結乾燥および再構成の前若しくは後に滅菌濾過膜を通る濾過により無菌にしうる。本明細書の治療的組成物は一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針により貫通可能な栓を有する静脈内溶液袋若しくはバイアルに入れる。治療的組成物は当該技術分野で既知の医療機器を用いて投与し得る。
【００７９】
処置方法
被験体における線維症の本発明の処置方法は器官特異的線維症若しくは全身性線維症を包含する。器官特異的線維症は、肺線維症、肝線維症、腎線維症、心線維症、血管線維症、皮膚線維症、眼線維症、骨髄線維症若しくは他の線維症の最低１種を伴い得る。肺線維症は、特発性肺線維症、薬物誘発性肺線維症、喘息、サルコイドーシス若しくは慢性閉塞性肺疾患の最低１種を伴い得る。肝線維症は肝硬変、住血吸虫症（ｓｃｈｉｓｔｏｍａｓｏｍｉａｓｉｓ）若しくは胆管炎の最低１種を伴い得る。肝硬変はアルコール性肝硬変、Ｃ型肝炎後肝硬変、原発性胆汁性肝硬変から選択され得る。胆管炎は硬化性胆管炎である。腎線維症は糖尿病性腎症若しくはループス糸球体硬化症（ｌｕｐｕｓ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｈｅｌｅｒｏｓｉｓ）の最低１種を伴い得る。心線維症は最低１型の心筋梗塞を伴い得る。血管線維症は血管形成術後動脈再狭窄若しくはアテローム硬化症の最低１種を伴い得る。皮膚線維症は火傷瘢痕、肥厚性瘢痕、ケロイド若しくは腎性線維化性皮膚症の最低１種を伴い得る。眼線維症は後眼窩線維症、白内障後手術若しくは増殖性硝子体網膜症の最低１種を伴い得る。骨髄線維症は特発性骨髄線維症若しくは薬物誘発性骨髄線維症の最低１種を伴い得る。他の線維症は、ペーロニー病、デュピュイトラン拘縮若しくは皮膚筋炎から選択され得る。全身性線維症は全身性硬化症および移植片対宿主病から選択され得る。
【００８０】
患者評価
間質性肺疾患（ＩＬＤ）は、類似の臨床、Ｘ線検査、生理学的若しくは病理学的症状発現により一緒に分類される多彩な線維性障害を包含する。より正確な用語、びまん性実質性肺疾患は、これらの障害の大部分が終末細気管支、間質および肺胞を冒すためにより少なく誤解されやすい。
【００８１】
ＩＰＦは「肺炎」と呼ばれるとは言え、炎症は比較的小さい役割を演じていると思われる。環境、遺伝若しくは他の未知の要因が肺胞上皮細胞傷害を最初に誘発すると考えられるが、しかし、自己永続性かつ異常な間質線維芽細胞および間葉細胞増殖（コラーゲン沈着および線維症を伴う）が臨床疾患の発症の原因であると考えられる。重要な組織学的所見は、正常肺組織の領域と交互の（不均一性）線維芽細胞増殖（線維芽細胞病巣）および密な瘢痕形成の部位を伴う胸膜下線維症である。散在性の間質の炎症はリンパ球、プラズマ細胞および組織球浸潤で起こる。末梢肺胞の嚢胞性拡張（蜂窩形成）が全患者で見出され、そして進行した疾患とともに増大する。Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ（第１８版）、Ｓｅｃｔｉｏｎ：Ｐｕｌｍｏｎａｒ
ｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｓｕｂｊｅｃｔ：Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｔｏｐｉｃ：Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ．２００６を参照されたい。
【００８２】
慢性閉塞性肺疾患および肺高血圧症のようなびまん性肺疾患はＩＬＤ分類から除外される。進行したＩＬＤを伴う患者は顕著な呼吸困難に苦しみ、そして最終的に呼吸不全のため死亡する。間質性肺疾患は、大きな数の患者で呼吸不全および死亡に至る不均一な障害群を包含する。肺移植は選択された候補における治療の選択肢である。一般集団におけるＩＬＤの正確な発生率および罹患率は未知のままである。ＩＬＤは以前に報告されていた（人口１０００００あたり５症例）よりはるかに高頻度であると考えられている。ニューメキシコ州ベルナリージョ郡からの集団に基づく研究は男性で１０００００あたり８０．９症例および女性で１０００００あたり６７．２症例の罹患率を報告した。特発性肺線維症（ＩＰＦ）はこの研究の全症例の約４５％を構成するもっとも一般的な形態のＩＬＤである。呼吸不全をもたらしうる他のびまん性肺疾患はサルコイドーシス、リンパ脈管筋腫症、ランゲルハン（Ｌａｎｇｅｒｈａｎ）細胞組織球増殖症若しくは好酸球性肉芽腫、剥離性間質性肺炎（ＤＩＰ）、非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ）および結合組織疾患関連の肺線維症を包含する。
【００８３】
抗ＣＣＲ２療法の必要性についての間質性特発性肺線維症患者（ＵＩＰ／ＩＰＦ若しくはＮＳＩＰ患者）の評価は、疾患の症状提示の前、同時にもしくはその後のいずれの時点でも当業者に既知の方法を使用して実施し得る。一般に、肺疾患を診断するのに使用される方法は、重症度、例えば機械的換気に対する必要性；症状、例えば咳、呼吸困難、発熱、喀血；発症の型すなわち漸進的、急性若しくは亜急性；根底にある疾患すなわち免疫不全、コラーゲン血管疾患、血管炎；環境的曝露すなわちアスベスト、トリ抗原、毒性煙霧；投薬歴すなわちコルチコステロイド、細胞傷害剤、抗生物質；臨床検査異常すなわち貧血、上昇された血清好酸球数、抗好中球細胞質抗体、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に対する血清沈降素、リウマチ因子；Ｘ線検査所見すなわち正常、びまん性若しくは局所性陰影、結節性若しくは斑状硬化、気腔若しくは間質、上若しくは下葉優勢；ならびにＸ線検査（ＨＲＣＴ）により発見可能な胸水、すりガラス陰影、気管支拡張症、気道疾患の証拠、下葉、胸膜下、小嚢胞若しくは蜂窩変化、両側上葉の嚢胞および結節、両側のびまん性嚢胞性変化を包含する。最後に、病態生理が閉塞性、拘束性、混合された閉塞性若しくは拘束性、または正常であるかどうかを決定するために患者を肺機能試験にかける。
【００８４】
ＩＰＦ（ＵＩＰ）患者での組織学的所見は不規則な直線的陰影（網状パターン）を包含する。しかしながらこの観察結果はコラーゲン血管疾患、アスベスト症および慢性過敏性肺炎で発生しうる。遠位肺実質はＵＩＰにおいて蜂窩状パターンを伴う線維症を有することができる。他の形態の間質線維症は、リンパ球性間質性肺炎、コラーゲン血管疾患、薬物反応、塵肺症（アスベスト症、ベリリウム症、珪肺症、超硬合金塵肺症、他者）、サルコイドーシス、ランゲルハンス細胞組織球増殖症（好酸球性肉芽腫）、慢性肉芽腫性感染症、慢性吸引、慢性過敏性肺炎、器質化慢性好酸球性肺炎、器質化されたおよび器質化するびまん性肺胞損傷、慢性間質性肺水腫／受動性うっ血、放射（慢性）、治癒した感染性肺炎の結果発生しうる。ＵＩＰの典型的ＨＲＣＴパターンは、蜂窩形成および拘縮性気管支拡張を伴う両底部の（ｂｉｂａｓｉｌａｒ）末梢網状構造を包含する。すりガラス陰影は該疾患の特徴でなく、そして存在する場合は通常非常にわずかに存在し、それらのいくつかは実際に線維症によることがある。ＩＰＦについて最も特徴的であることが示されている２特徴は、ＩＰＦの診断について５．３６というオッズ比を有する下葉蜂窩形成、およびＩＰＦについて６．２８というオッズ比を伴ういわゆる「上葉不規則線」である（Ｈｕｎｎｉｎｇｈａｋｅ  ２００３．Ｃｈｅｓｔ．１２４：１２１５−１２２３）。
【００８５】
筋線維芽細胞は非線維性組織に比較的存在しない。筋線維芽細胞は、創傷を閉鎖するようにはたらく収縮性表現型をこれらの細胞に与える平滑筋アクチン線維を含有する。α−平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）は筋線維芽細胞のマーカーである。ＴＧＦｂ１はａＳＭＡ発現を誘導することが以前に示されている原型の前線維性（ｐｒｏｆｉｂｒｏｔｉｃ）増殖因子である（Ｄｅｓｍｏｕｌｉｅｒｅら  １９９５  Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ３（２）：１３４−９）。ＵＩＰ患者からの培養線維芽細胞および非線維性肺からの線維芽細胞を使用して、発明者は、ＴＧＦｂ１が非線維性および線維性双方の線維芽細胞中でａＳＭＡを誘導することを発見したが、しかしながら誘導の大きさは線維性線維芽細胞でより大きい。ＰＤＧＦでの線維芽細胞の刺激はａＳＭＡ発現のわずかな増大（１０倍未満）をしかし線維性線維芽細胞中のみで誘導した。これら３種のうち、発明者のデータはＣＣＬ２のみが線維性線維芽細胞中のａＳＭＡ発現の１０倍以上の増大を誘導したことを示した。
【００８６】
コラーゲン沈着は線維症に重要な特質であり、そして２種の遺伝子プロコラーゲンＩおよびプロコラーゲンＩＩＩがＵＩＰと関連していることが以前に示されている。プロコラーゲンＩおよびＩＩＩタンパク質は肺でおよび全身での双方のＵＩＰサンプル中で上昇されていることが示された（Ｌｏｗら  １９９２  Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ  １４６（３）：７０１−６；Ｓｔｒｉｅｔｅｒら  ２００４  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １７０（２）：１３３−４０；Ｂｅｎｓａｄｏｕｎら  １９９６．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １５４（６  Ｐｔ  １）：１８１９−２８。）。発明者は、ＣＣＬ２がＵＩＰの線維芽細胞中でプロコラーゲンＩおよびプロコラーゲンＩＩＩ双方を誘導することを示した。さらに、ＣＣＬ２による遺伝子誘導の大きさは２種の前線維性サイトカインＴＧＦβ１およびＰＤＧＦ−ＡＢにより生じられるものに匹敵する。
【００８７】
ＴＧＦβ１の前線維性の役割は多様な組織および器官で十分に記述されている。ＴＧＦβ１の効果はオートクリン機構によりさらに増幅される。発明者は、ＴＧＦβ１で刺激した非線維性および線維性双方の肺線維芽細胞でのこの増幅機構が、双方の細胞型と同じ程度まで、ＴＧＦβ１の存在下で増大されたＴＧＦβ１を表したことを観察した。ＣＣＬ２はＴＧＦβ１遺伝子発現を高めることもまた見出され、そしてＴＧＦβ１でのように、ＣＣＬ２によるＴＧＦβ１遺伝子誘導の程度は線維性線維芽細胞中でより大きかった。ＴＧＦβ受容体は、強皮症患者からの皮膚線維芽細胞中で上昇されることが以前に見出されている（Ｋｕｂｏら  ２００２Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２９（１２）：２５５８−６４；Ｋａｗａｋａｍｉ  １９９８．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ１１０（１）：４７−５１）。ＵＩＰの線維芽細胞をＴＧＦβ１とインキュベートした際に、ＰＤＧＦおよびＣＣＬ２は非線維性線維芽細胞でのものを上回る分析したＴＧＦβ受容体サブユニットの双方の増大を有し、ＴＧＦβ１は主にＴＧＦβＲＩを増大し、そしてＣＣＬ２は双方のサブユニットを誘導し、該効果がＣＣＬ２によるＴＧＦβ１誘導のみによらないかもしれないことを示す。
【００８８】
結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）はコラーゲン産生を包含するＴＧＦβ１の効果の多くを媒介することが示されている。ＴＧＦｂ１は線維性および非線維性双方の線維芽細胞でＣＴＧＦ遺伝子発現の増大を誘導した。さらに、ＰＤＧＦおよびＣＣＬ２はＵＩＰの線維芽細胞でＣＴＧＦ遺伝子発現の増大を誘導した。
【００８９】
発明者のデータは、ＴＧＦβ１、ＰＤＧＦおよびＣＣＬ２がＵＩＰの線維芽細胞でＩＬ１３Ｒａ１発現を上昇したことを示した。ＩＬ−１３はＵＩＰ患者の肺で上昇されたレベルで見出されるＴｈ２型サイトカインである。ＩＬ−１３はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ
ｖｉｖｏモデルで前線維性である。ＩＬ−１３はコラーゲン生成および線維芽細胞の増殖を誘導する（Ｓａｉｔｏ  ２００３．Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１３２（２）：１６８−７６；Ｉｎｇｒａｍ２００４  Ｆａｓｅｂ  Ｊ
１８（１０）：１１３２−４）。多様なマウス肺線維症モデルのデータは、ＩＬ１３およびＩＬ１３Ｒａ２によるシグナル伝達が前線維性でありかつＴＧＦβ１の誘導によってもまた作用しうることを示す（Ｆｉｃｈｔｎｅｒ−Ｆｅｉｇｌ  ２００６．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２（１）：９９−１０６）。従って、ＴＧＦβ１、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＣＣＬ２が全部ＩＬ１３Ｒａ２発現において上方制御したことを示す発明者のデータは、ＣＣＬ２が直接若しくは間接的にＩＬ−１３媒介性応答に対し線維芽細胞をより感受性にしうることを示す。
【００９０】
全体として、発明者は、ＣＣＬ２に対するＵＩＰの線維芽細胞による前線維性応答の特質を初めて示し、そしてＵＩＰの線維芽細胞の応答を非線維性の肺からのものと識別した。以前の研究は、ＣＣＲ２が強皮症患者の皮膚の筋線維芽細胞様細胞上で発現されることを示し（Ｃａｒｕｌｌｉ  ２００５  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５２（１２）：３７７２−８２）、また、肺線維症の動物モデルは、線維性のＴｈ２型環境から単離された線維芽細胞上でのＣＣＲ２の上方制御、およびＣＣＲ２リガンドに対するこれらの細胞の増大された機能性を示した（Ｈｏｇａｂｏａｍ  １９９９．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１６３（４）：２１９３−２０１．）。しかしながら、これは疾患に罹った肺の線維芽細胞上のＣＣＬ２の前線維性の機能的役割を示す最初の知られた研究である。
【００９１】
ＣＣＲ２−ＣＣＬ２の阻害は線維症の有益なｉｎ  ｖｉｖｏモデルであることが示されている。機械的に、動物モデルでの線維症の阻害は、低下された線維細胞動員および減弱された炎症に帰され、それらはヒト疾患に変わることも若しくは変わらないこともある。本発明は、ＣＣＲ２リガンドＣＣＬ２が前線維性応答を駆動し得かつＵＩＰの線維芽細胞がＣＣＬ２に対し過剰応答性であることを示すためのヒト線維芽細胞の発明者の使用に基づく。従って、該データは、疾患に罹ったヒト肺線維芽細胞に対するＣＣＬ２の直接の前線維性の影響を発明者が確立したため、とりわけＣＣＲ２へのＣＣＬ２結合の拮抗作用によるＣＣＲ２の生物活性の遮断、阻害、下方制御若しくは拮抗方法が、肺機能の喪失をもたらす間質肺組織に対する迅速かつ現在不可逆的な損傷の改善において有効であろうことを示す。
【００９２】
本発明の方法において、限定されるものでないがＣＸＣＬ５、ＩＬ−６、ＣＣＬ２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦを挙げることができる、本明細書に開示されるところの選択可能なマーカーＵＩＰの発生の時点でＣＣＲ２アンタゴニストを投与し得る。
【００９３】
ＩＩＤ、とりわけＩＰＦの診断および管理に関する当該分野の現在の知識は、細胞病理学がそうであるように、線維症に至る原因および開始事象が多様であることを示す（Ｃｈａｐｍａｎ  ２００４  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３（２）：１４８−１５７）。診断された患者のどのサブセットが抗ＣＣＬ２療法により助けられうるかを決定するため、ＣＣＬ２媒介性疾患と関連するバイオマーカーの同定が重要であるとみられる。ＩＰＦ組織からの研究は、ＭＭＰ−７の上方制御の差別的調節を遺伝子発現レベルで示し、また、ＫＬ−６、ＥＮＡ−７８、ＩＰ−１０、ＣＣＬ７、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２（ｐ４０）を包含する数種のタンパク質が、気管支肺胞洗浄液および／若しくは血清中で上方制御されていることが示された。しかしながら、これらのタンパク質とＣＣＬ２減弱の間の相関は今日まで存在しない。ＩＬ−１、ＰＤＧＦ、オステオポンチン、ＴＮＦ、ＴＧＦ、ＣＣＬ３、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１のようなＣＣＬ２の他の数種のサイトカインがＩＰＦの病因に関与していることが示されている。しかしながらＣＣＬ２との関係は不明なままであり、そしてＩＰＦ患者からの線維芽細胞の遺伝子発現分析はこれまでのところ異なる実験室から異なる結果を生じている（概要に関してＳｔｕｄｅｒら  ２００７．Ｐｒｏｃ  Ａｍｅｒ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃ．４（１）：ｐ．８５−９を参照されたい）。
【００９４】
培養線維芽細胞は検出可能な基礎レベルのＣＣＬ２を有し、そして外因性に添加したＣＣＬ２がＩＬ−６産生を調節することが最近示された（Ｌｉｕ，Ｘ．ら  ２０７  Ａｍｅｒ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ．３７（１）：１２１−８）。従って、ＣＣＬ２は中心的調節物質として挙動し、そしてＩＰＦの線維芽細胞の環境中のＣＣＬ２の中和が他の遺伝子および／若しくはタンパク質の発現を調節することができる。
【００９５】
発明者は、線維症患者からの単離した常在性線維芽細胞を使用して、ＩＰＦ患者からの肺線維芽細胞が、非線維性線維芽細胞より高レベルのＣＸＣＬ５、ＩＬ−６、ＣＣＬ２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦを発現したことを決定した。発明者はまた、中和ＣＣＬ２抗体、ＣＮＴＯ  ８８８が最高レベルを発現する細胞中でこれらのタンパク質の産生を遮断することが可能であったことも決定した。
【００９６】
ＩＰＦの正確な診断は、異常な間質性肺炎について肺組織の生検および組織学的分析を必要とする。この処置の侵襲性により、疾患の進行を初期診断後に慣例にモニターすることは実際的でないとみられる。他の非侵襲性診断が利用可能であるがしかし変動性にさらされる。従って比較的非侵襲的な定量的診断ツールが必要とされる。血清若しくは気管支肺胞洗浄液のような組織液は外科的生検より少なく侵襲的にサンプリングし得る。収集した細胞からの可溶性タンパク質および細胞表面マーカー若しくは遺伝子発現を、全部疾患の進行を診断かつモニターするための既存の技術を用いて定量化し得る。これらの遺伝子および／若しくはタンパク質について組織をモニターすることを使用して、ＣＮＴＯ  ８８８によるＣＣＬ２中和の程度を決定し得る。従って、到達可能な末梢組織からのＣＸＣＬ５、ＩＬ−６、ＣＣＬ２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦの遺伝子および／若しくはタンパク質の測定は、疾患および標的の中和の新規かつ比較的非侵襲的な生体マーカーを提供するであろう。
【００９７】
患者を評価するための一態様において、５ｍｌ若しくはそれ以上の患者血液を、ＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡチューブ（ＳｙｓｔｅｍＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）のような核酸分析のため設計されたチューブに抜き出し得、そして全ＲＮＡを単離し得、そして、ＣＸＣＬ５、ＩＬ−６、ＣＣＬ２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦの最低１種に特異的な特異的プローブを包含する当該技術分野で既知のいずれかの方法によるように遺伝子発現について分析し得る。該遺伝子のいずれか若しくは全部が、患者、若しくは特発性間質性肺炎を伴う患者の症状を表さない正常被験体からの年齢および性別をマッチさせた試料の２倍以上高い発現レベルを有する場合に、患者を治療に選択しうる。別の態様において、治療のため選択した患者についての用量選択は、年齢および性別をマッチさせた正常志願者のと比較して該遺伝子のいずれか若しくは全部の２倍若しくはそれ以上の発現の変化に基づき調節し得る。本発明の方法の別の態様において、治療に対する応答を、年齢および性別をマッチさせた正常志願者に比較して該遺伝子のいずれか若しくは全部の遺伝子発現の２倍若しくはそれ以上の変化に基づきモニターし得る。
【００９８】
別の態様において、５若しくはｍｌの血液を、特発性間質性肺炎の症状を表す患者から血清収集チューブに収集し得る。血清を、商業的に入手可能な多重若しくはＥＬＩＳＡキットを使用してＣＸＣＬ５、ＩＬ−６、ＣＣＬ２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦのいずれか若しくは全部について試験し得る。該タンパク質のいずれか若しくは全部が年齢および性別をマッチさせた正常志願者の２倍以上の発現レベルを有する場合に、患者を治療のため選択しうる。別の局面において、治療のため選択した患者についての用量選択は、年齢および性別をマッチさせた正常志願者のと比較してＣＸＣＬ５、ＩＬ−６、ＣＣＬ２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦのいずれか若しくは全部の２倍若しくはそれ以上の発現の変化に基づき調節し得る。さらなる一局面において、治療に対する応答を、年齢および性別をマッチさせた正常志願者と比較してＣＸＣＬ５、ＩＬ−６、ＣＣＬ２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦのいずれか若しくは全部の２倍若しくはそれ以上の発現の変化に基づきモニターし得る。
【００９９】
投与経路
投与経路は、既知のおよび許容される方法、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内による、肝門脈を介する注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）若しくは注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）；徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）すなわち長時間放出（ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）手段による局所投与；経粘膜若しくは経皮送達による皮下注入、局所塗布、鼻スプレー、坐剤などによるに従うか、または経口で投与しうる。
【０１００】
本発明の別の局面において、該投与することは、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑液包内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病変内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻内若しくは経皮から選択される最低１様式によることができる。
【０１０１】
投薬量
それの必要な患者における慢性拒絶の進行を予防、改善、逆転若しくは停止するために適切な抗ＣＣＲ２アンタゴニストの用量は経験的に見出されることができ、そして、有効成分の効力、製剤の濃度およびレシピエントの体内の投与後の該剤の有効濃度の持続期間に依存することができる。
【０１０２】
処置の経過は、当初の治療効果（活性）を長期間維持するように急性様式と対照的に連続様式の慢性すなわち連続投与でありうる。あるいは、患者の体内で急性のアンタゴニスト活性の期間、次いでより低い若しくはアンタゴニスト活性のない期間を提供するために、処置は性質が間歇的若しくは周期的でありうる。従って、抗体がいずれかの数の週の間、週あたり１、２、３回若しくはそれ以上投与されるような投薬スケジュールを変動し得るか、または、抗体は週１回、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週ごとに１回発生する投与で１回以上（例えば２、３、４、５、６、７回）投与される。
【０１０３】
ＣＣＲ２の生物活性のモノクローナル抗体アンタゴニストの場合、該剤は一般に、受領者の体重に基づく量、例えば治療の経過あたり０．１と１００ｍｇ／ｋｇの間で投与されることができる。本発明の方法により投与される抗体の治療上若しくは予防上有効な量の例示的な制限しない一範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。一態様において、抗ＣＣＲ２若しくは抗ＣＣＬ２抗体は、約１ないし５００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約１０ないし４００ｍｇ／ｍ２、約１８ないし３５０ｍｇ／ｍ２、およびより好ましくは約２５０〜２８０ｍｇ／ｍ２の用量に達するため、１０ｍｇ／分未満、好ましくは５ｍｇ／分未満若しくはそれに等しい速度の静脈内注入により投与し得る。抗ＣＣＲ２若しくは抗ＣＣＬ２抗体は単回用量若しくは複数用量で投与し得る。
【０１０４】
併用療法
処置
いずれの特定の処置もＩＰＦに有効と判明していない。支持療法は低酸素症に対するＯ２および肺炎に対する抗生物質よりなる。終末期疾患は肺移植のための選択された患者を適格としうる。コルチコステロイド、およびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ）、アザチオプリン（ＩＭＵＲＡＮ）のような細胞傷害性薬物が、経験的に炎症の進行を停止させる試みにおいてＩＰＦ患者に伝統的に与えられているが、しかし制限されたデータがそ
れらの有効性を裏付ける。にもかかわらず、シクロホスファミド若しくはアザチオプリン（１ないし２ｍｇ／ｋｇ  ｐｏ１日１回）と組合せたプレドニゾン（例えばＤＥＬＴＡＳＯＮＥ）（０．５ないし１．０ｍｇ／ｋｇ  ｐｏ１日１回３か月間、次の３ないし６か月にわたり０．２５ｍｇ／ｋｇ１日１回に漸減される）で処置を試みることが一般的実務である。３か月ごとに１年間、臨床、Ｘ線検査および生理学的応答を評価し、そして薬物用量を相応して増大若しくは減少する。治療は客観的応答が存在しない場合に停止する。
【０１０５】
抗線維症薬ピルフェニドン（ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ）が肺機能を安定化しかつ増悪を低下させうる。コラーゲン合成（リラキシン）、前線維性増殖因子（スラミン）およびエンドセリン−１（アンジオテンシン受容体阻害剤）を阻害する抗線維症薬はｉｎ  ｖｉｔｒｏで有効と示されたのみである。
【０１０６】
インターフェロン−γ−１ｂは患者の小グループでプレドニゾンと併用される場合に有望と示されたが、しかしより大きな二重盲検多施設共同無作為化試験は、無増悪生存期間、肺機能若しくは生活の質に対する影響を見出さなかった。
【０１０７】
本発明を一般的な用語で記述した一方、本発明の態様は以下の実施例にさらに開示されるであろう。
【実施例】
【０１０８】
［実施例１］
線維性および非線維性の線維芽細胞
ＵＩＰ患者からの線維芽細胞の固有の特性を組織病理学的に非線維性の肺組織からのものと比較して特徴付けるため、１種若しくは他の型の組織からの初代線維芽細胞を、未刺激状態で、ならびに線維症の病理学の既知のメディエーター、例えばＴＧＦβ、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＣＣＬ２に応答してのマーカーについて評価する。
【０１０９】
線維芽細胞の単離および精製
細胞株はミシガン大学のＣｏｒｙ  Ｈｏｇａｂｏａｍ博士により提供された。初代線維
芽細胞株の全部を以前に記述したとおり（Ｈｏｇａｂｏａｍら  １９９９  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３（４）：２１９３−２０１）単離した。肺線維芽細胞をＵＩＰ患者から採取した肺生検から単離し（ｎ＝４）、そしてこれらを「線維性線維芽細胞」と称する。線維芽細胞は肺腫瘍切除の間に採取した肺組織からもまた単離し（ｎ＝５）、そしてこれらのサンプルは組織学的分析により非線維性であることを確認した。これらの非線維性組織由来線維芽細胞は「非線維性線維芽細胞」と称する。
【０１１０】
線維芽細胞遺伝子発現
ヒト肺線維芽細胞を１００，０００細胞／ウェルで２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク）にプレーティングしかつ８時間接着させた。細胞をその後ＰＢＳで洗浄し、そして無血清培地（ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ）中で一夜培養した。細胞をその後、ＴＧＦｂ−１（１若しくは１０ｎｇ／ｍＬ）、ＰＤＧＦ−ＡＢ（２０若しくは２００ｎｇ／ｍＬ）またはＣＣＬ２（１若しくは１０ｎｇ／ｍＬ）の存在若しくは非存在下で２４時間刺激した。ＴＧＦｂ１、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＣＣＬ２はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。上清を除去し、そしてＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓミニキット（ＱＩＡＧＥＮ、カリフォルニア州バレンシア）を製造元の説明書に従って使用してＲＮＡをその後単離し、そしてＴａｑＭａｎａ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用してＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。前線維性遺伝子発現を、製造元の説明書に従ってＴａｑｍａｎａユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびｐｒｅ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  Ｔａｑｍａｎａ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するリアルタイムＰＣＲにより測定した。
【０１１１】
定量的遺伝子発現は、遺伝子発現が最初に検出される閾値周期数としてＣＴ値を決定する比較ＣＴ法を使用して計算した。目的の遺伝子の遺伝子発現の倍数変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を最初にハウスキーピング遺伝子１８Ｓに対し正規化してΔＣＴ値を生じた。線維性および非線維性の線維芽細胞の間の発現の倍数変化を、ΔＣＴ（非線維性）−ΔＣＴ（線維性）＝ΔΔＣＴとして計算し、ここで非線維性遺伝子発現がキャリブレーターとしてはたらいた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激による遺伝子発現の倍数変化はΔΔＣＴ＝ΔＣＴ（未刺激）−ΔＣＴ（刺激）により計算し、ここで未刺激サンプルがキャリブレーターとしてはたらいた。計算２−ΔΔＣＴはその後、キャリブレーターと比較する場合に最終の倍数変化の相対値を与える。
【０１１２】
前線維性遺伝子発現の基礎発現が非線維性（ｎ＝４）線維芽細胞に比較してＵＩＰの線維芽細胞（ｎ＝３）で異なったかどうかを決定するため、遺伝子発現を患者の双方のコホートからの未刺激細胞間で比較した。図１に示されるとおり、ＵＩＰ患者由来の線維芽細胞は分析した遺伝子の全部でより大きい基礎の線維性遺伝子発現を有する。
【０１１３】
非線維性および線維性線維芽細胞中のＴＧＦｂ１誘導性ａＳＭＡは、しかしながら誘導の大きさが線維性線維芽細胞でより大きかった（図２）。ＰＤＧＦはａＳＭＡ発現および線維性線維芽細胞でのみわずかな増大を誘導した。ＣＣＬ２もまた線維性線維芽細胞中のａＳＭＡ発現の増大のみ誘導した。
【０１１４】
ＵＩＰの線維芽細胞が高められたレベルのコラーゲン遺伝子発現を表すかどうかを決定するため、細胞をＣＣＬ２で刺激した。図３ＡおよびＢは、ＣＣＬ２がＵＩＰの線維芽細胞中のプロコラーゲンＩおよびプロコラーゲンＩＩＩ双方を誘導することを示す。さらに、ＣＣＬ２による遺伝子誘導の程度はＴＧＦｂ１およびＰＤＧＦ−ＡＢいずれかにより産生されるものに匹敵する。
【０１１５】
ＴＧＦｂ１の前線維性の役割は十分に記述されている。ＴＧＦｂ１、ＰＤＧＦおよびＣ
ＣＬ２誘導性のＴＧＦｂ１遺伝子発現（図４）。オートクリンループによるＴＧＦｂ１誘導は既知であり、そして非線維性および線維性双方の線維芽細胞での本データにより裏付けられる。この実験は、ＣＣＬ２がＴＧＦｂ１遺伝子発現もまた高めることをさらに示す。ＴＧＦｂ１でのように、ＣＣＬ２によるＴＧＦｂ１遺伝子誘導の程度は線維性線維芽細胞でより大きかった。
【０１１６】
ＴＧＦｂ１、ＰＤＧＦおよびＣＣＬ２誘導性のＣＴＧＦ遺伝子発現（図５）。ＴＧＦｂ１は線維性および非線維性双方の線維芽細胞中のＣＴＧＦ遺伝子発現の増大を誘導した。さらに、低用量のＰＤＧＦおよびＣＣＬ２はＵＩＰの線維芽細胞でＣＴＧＦ遺伝子発現の増大を誘導した。
【０１１７】
ＴＧＦｂ１、ＰＤＧＦおよびＣＣＬ−２誘導性のＴＧＦｂＲＩおよびＴＧＦｂＲＩＩ双方のサブユニット遺伝子発現を図６ＡおよびＢに示す。ＴＧＦｂ１はＴＧＦｂＲＩに対するより大きい影響を有した一方、ＣＣＬ２はＴＧＦｂＲＩＩのいくぶんより大きな増大を伴い双方を誘導した。
【０１１８】
ＴＧＦｂ１、ＰＤＧＦおよびＣＣＬ２誘導性のＩＬ１３Ｒａ１およびＩＬ１３Ｒａ２遺伝子発現を図７ＡおよびＢに示す。ＴＧＦｂ１、ＰＤＧＦおよびＣＣＬ２はＵＩＰの線維芽細胞でのＩＬ１３Ｒａ１発現を上方制御した。ＩＬ１３Ｒａ２によるシグナル伝達は最近、ＴＧＦｂ１の誘導により前線維性であることが示された。全３種のメディエーターはＩＬ１３Ｒａ２発現の上方制御を誘導し、それにより潜在的にこれらの細胞をＩＬ−１３媒介性の応答に対しより感受性にした。
【０１１９】
［実施例２］
ＩＰＦおよび非線維症患者からの肺組織を刻み、そして２０ｍｌの培地（１５％ＦＣＳ、１％ＰＳＡおよびＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ）を含むＴ７５ｃｍ組織培養フラスコに入れた。細胞コロニーが生じるまで培地を週２回交換した。細胞を剥離しかつ継代した。実験は継代数５後に実施した。
【０１２０】
ＲＮＡ単離
線維芽細胞は、２４ウェルプレートのウェルあたり５００μｌ中１×１０５細胞でＤＭＥＭ  １５％ＦＣＳ  １％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリン  ストレプトマイシン中で一夜培養した。血清を含まないＤＭＥＭ中で細胞を２４時間培養した。ヒト血清アルブミンを補充したＤＭＥＭに培地を変更し、そして培養物を２４および／若しくは４８時間インキュベートした。ＲＮＡを収集するため、製造元の説明書に従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州バレンシア）を使用して培養細胞を溶解した。ＲＮＡの質および量を２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）で測定した。
【０１２１】
ＲＴ−ＰＣＲ
逆転写反応は、ＴａｑＭａｎ（Ｒ）試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用するプロトコルに従って、２５℃１０分間、４８℃３０分間、９５℃５分間で実施した。リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（Ｒ）７９００配列検出装置とともに特注ＡＢＩ低密度アレイ（複製のＡｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄプライマーおよびプローブ）を使用して実施した。ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）の存在下で、反応を５００Ｃで２分間次いで９５℃で１０分インキュベートした。その後、反応を周期あたり１５秒、９５０Ｃおよび１分、６００Ｃで４０周期行った。内因性対照ＧＡＰＤＨを使用して、ＤＣＴ相対定量化方法を使用してサンプルを正規化した。
【０１２２】
免疫検出
線維芽細胞を上述されたとおり一夜培養した。ＬＩＮＣＯｐｌｅｘヒトサイトカイン／ケモカイン３０ｐｌｅｘパネル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＥＮＡ−７８  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット、およびＩＬ−１３ＲＡ２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する試験のため上清を分注した。
【０１２３】
結果：
７種のＩＰＦ肺線維芽細胞株および５種の非線維性肺線維芽細胞株からのｃＤＮＡを、ＣＸＣＬ５、ＣＣＬ２、ＩＬ１３ｒａ２およびＩＬ−６の相対的発現についてＲＴ−ＰＣＲにより２４時間に評価した。表１は、非線維性株の平均ｄＣｔ（標的Ｃｔ−ＧＡＰＤＨＣｔ）に対する各ＩＰＦ株の相対倍数発現（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｏｌｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を示す。
【０１２４】
ＩＰＦ細胞株１２６はＣＸＣＬ５、ＩＬ１３ｒａ２およびＩＬ−６について最高の発現を有した。ＣＣＬ２発現は、７細胞株のうち６種について非線維性細胞でよりも２倍以上若しくは２倍に等しくより高かった。ＣＸＣＬ５およびＩＬ６発現レベルは、５細胞株について非線維性細胞でよりも２倍以上若しくは２倍に等しくより高く、また、ＩＬ１３ｒａ２発現は４細胞株について非線維性細胞についてよりも２倍以上若しくは２倍に等しくより高かった。
【０１２５】
【表２】
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【０１２６】
タンパク質分析
５種のＵＩＰ株および５種の非線維性株からの上清をＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ５、Ｇ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦのタンパク質発現についてＥＬＩＳＡ若しくはｍｕｌｔｉｐｌｅｘにより試験した。表２および３は試験した全細胞株のタンパク質レベルをｐｇ／ｍｌで示す。線維性細胞株１４８はＩＬ−６、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＣＬ２およびＶＥＧＦについて最高の発現レベルを有した。細胞株１２６はＣＸＣＬ５について最高であった（１６４３０ｐｇ／ｍｌ）。ＩＬ−８発現は、全５細胞株について非線維性の発現の中央値の２倍以上若しくは２倍に等しかった。ＣＣＬ２およびＩＬ−６発現は、５細胞株のうち４種について非線維性の発現の中央値の２倍以上若しくは２倍に等しかった。Ｇ−ＣＳＦ発現は２細胞株について非線維性の発現の中央値の２倍以上若しくは２倍に等しかった。ＶＥＧＦ発現は３細胞株について非線維性の発現の中央値の２倍以上若しくは２倍に等しかった。ＣＸＣＬ５発現は２細胞株について非線維性の発現の中央値（０より上の値について）の２倍以上若しくは２倍に等しかった。線維性および非線維性細胞株についての中央値を比較することは、線維性および非線維性の細胞の間の中央値の差違の相対的大きさがＩＬ８＞ＩＬ６≧ＣＣＬ２＞ＶＥＧＦであることを示す。
【０１２７】
【表３】
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【０１２８】
【表４】
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【０１２９】
これらのメディエーター間の関係をさらに検査するため、線維性細胞株１２６を、それぞれ配列番号２７および２８により示されるＨおよびＬ鎖可変領域から構成されるＣＣＬ２中和抗体ＣＮＴＯ８８８、若しくは無関係のアイソタイプをマッチさせた抗体で処理し、そして遺伝子およびタンパク質発現レベルを抗体が存在しない同一細胞株と比較した。遺伝子発現の結果を表４に、およびタンパク質発現の結果を表５に示す。
【０１３０】
【表５】
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【０１３１】
【表６】
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【０１３２】
ＣＣＬ２は抗ＣＣＬ２抗体（ＣＮＴＯ８８８）の存在下で正確に測定し得ないとは言え、抗ＣＣＬ２の存在は治療の間にモニターしうる。ＣＮＴＯ  ８８８でのタンパク質の最高の倍数低下はＧ−ＣＳＦ（６８０３倍）であった。最低の倍数はＶＥＧＦでであった（４倍）。すなわちＧ−ＣＳＦ＞ＩＬ６＝ＣＸＣＬ５＞ＩＬ８＞ＶＥＧＦ
複数の時間点での肺生検により疾患の進行をモニターすることは実際的でないとみられる。ＣＣＬ２により減弱される前線維性マーカーの一団が同定されており、そしてＣＣＬ２活性を評価するためにｅｘ  ｖｉｖｏで測定し得る。同定されたマーカーを代理物として使用することは、用量およびタイミングのような処置の選択肢を決定するのに役立つための治療の間の抗体活性のモニタリングを可能にするとみられる。第二に、われわれは、抗ＣＣＬ２療法に潜在的に応答性の患者のサブセットを示しうる前線維性遺伝子／タンパク質のプロファイルに関して、ＩＰＦ肺線維芽細胞の集団内の大きな大きさの変動性を決定した。疾患の代理マーカーとして遺伝子／タンパク質の前線維性の一団を使用することは、疾患の進行の定量的かつ比較的非侵襲的な測定を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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