(57)【要約】  本発明は、試料のセクションとして得られる画像対を取得して解析するための方法及びシステムに関する。本発明は、それぞれが試料の各セクションからのものである、２つの対応する画像の登録を容易にする。本発明は、２つの画像の登録プロセスを行なうこと、これにより数学的変換規則を取得すること、及びその後、１つの画像内で特定される各画像フィールド毎に上記変換規則を使用し、他の画像内の対応する画像フィールドを同様に特定できるようにすることを含む。本発明の方法を使用して対応画像対を取得した後、例えば少なくとも１つの対応画像対内の画像フィールド上のオブジェクトの少なくとも１つのタイプに関して計数事象を、所望により自動手段を使用して特定することにより、そのセクションを評価することができる。
2010511213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の少なくとも２つの隣接するセクションＡとＢから少なくとも１つの対応画像対を取得するための方法であり、該方法は以下のステップを含む：
ａ）セクションＡの少なくとも一部のスーパー画像及びセクションＢの少なくとも一部のスーパー画像を取得するステップ、
ｂ）その２つのスーパー画像に関して、数学的変換規則を得るために、２つの関連するスーパー画像の特徴間で対応を確立することによって画像登録プロセスを実行するステップ、
ｃ）セクションＡ内の画像フィールドを特定するステップ、
ｄ）前記数学的変換規則を使用して、セクションＢ内の領域を特定するステップ、当該領域はセクションＡ内の前記画像フィールドに対応するセクションＢ内の画像フィールドを含む、
ｅ）ステップｃ）で特定されたセクションＡ内の前記画像フィールドの画像を取得し、そしてステップｄ）で特定されたセクションＢ内の前記画像フィールドの画像を取得して、対応画像対を取得するステップ、
ｆ）所望により、ステップｃ）〜ｅ）を１回以上繰り返して、２つのセクションＡ，Ｂ内の１つ以上の異なる画像フィールドの１つ以上の異なる対応画像対（複数可）を取得するステップ、及び
ｇ）前記対応画像対（複数可）のデジタルバージョンをコンピュータ可読記憶手段内に記憶させるステップ。
【請求項２】
スーパー画像は、ステップｅ）の画像を取得するために使用される分解能よりも低い分解能を使用して取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スーパー画像は、×２.５、×５又は×１０の倍率を使用して取得される、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
次の式を使用して計算されるガードゾーンなどの最小ガードゾーンが、ステップｄ）における前記領域の各境界に対して加えられ、
【数１】
2010511213.tif 000015
例えば、ステップｄ）の前記領域の面積がセクションＢ内の前記画像フィールドの面積の少なくとも１.５倍である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ガードゾーンがセクションＡ内の画像フィールドの各境界に対しても加えられる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップｅ）で取得された２つの画像に関して第２の登録プロセスを実行して登録済み対応画像対を取得する更なるステップを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
２つの対応する画像フィールド及びステップｄ）で取得されたガードゾーンに関して第２の登録プロセスを実行して登録済み対応画像対を取得する更なるステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ステップｆ）を繰り返し、少なくとも２個の画像対、例えば少なくとも３個の画像対、例えば少なくとも４個の画像対、例えば少なくとも５個の画像対、例えば少なくとも６個の画像対、例えば少なくとも７個の画像対、例えば少なくとも８個の画像対、例えば少なくとも９個の画像対、例えば少なくとも１０個の画像対、例えば少なくとも１５個の画像対、例えば少なくとも２０個の画像対、例えば少なくとも２５個の画像対、例えば少なくとも５０個の画像対を取得する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記試料が生物学的試料である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記変換規則は、セクションの少なくとも一部に関して実行される回転規則及び／又は並進規則及び／又はワープ規則を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
方法の結果から結論を自動的に決める更なるステップを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
方法の結果から薬理学的結論を自動的に決める更なるステップを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
細胞サンプルの増殖指数に関連する結論を自動的に決める更なるステップを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
グラフィカルユーザインタフェースに関するレポートを、所望により１つ以上のデジタル画像（複数可）を、自動的に提供する更なるステップを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
考慮された画像フィールド（複数可）は、組織の均一なランダムサンプルなどの隣接するセクションのランダムサンプルを示す、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記画像フィールドが試料のセミランダムサンプルである、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
第１の画像フィールドがランダムに特定され、その後の画像フィールドが定義済関数を使用して特定される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記画像フィールドが人間のオペレータによって試料中で選択される、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
取得された全ての画像対における総面積は、解析されるセクションの面積の
少なくとも０.５％、例えば少なくとも１％、例えば少なくとも２％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも８％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも２５％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも３５％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、少なくとも１つ、２つ、或いは、３つの異なるオブジェクトタイプに関して実行される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記試料が組織サンプルである、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が少なくとも１つの化学マーカで標識化される、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記試料が少なくとも１つの蛍光マーカで標識化される、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記試料が光学的特性を有する、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が、例えばＵＶ又は人間の眼に見える照明を使用して照明される、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が自動化されている、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
計数事象が、画像フィールド対の画像解析に基づいて推奨計数事象として人間のオペレータに与えられる、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
この方法のステップを１つ以上のプロセッサに実行させるための命令が記憶されるコンピュータ可読ミディアムの使用を更に含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
試料が複数の人間の細胞を含む、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
複数の人間の細胞が１つ以上の人間の癌細胞を潜在的に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
１つ以上の人間の癌細胞が乳癌細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記特徴が解剖学的構造である、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記解剖学的構造は、セクションの外形状、血管構造（複数可）、神経構造（複数可）、筋肉構造（複数可）、細胞膜（複数可）、セクション内の空間（複数可）、細胞（複数可）、腺房、粒子（複数可）又は細胞核から成るグループから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
次のステップを含む、試料の少なくとも２つの隣接するセクションを評価する方法：
ｉ）請求項１〜３０のいずれかに記載の方法に従って、少なくとも１つの対応画像対を備えるステップ、
ii）少なくとも１つの対応画像対内の前記画像フィールド上のオブジェクトの少なくとも１つのタイプに関して計数事象を、所望により自動的な手段を使用して特定するステップ。
【請求項３５】
セクションＡ内の前記画像フィールド（複数可）及びセクションＢ内の前記画像フィールド（複数可）の画像に関して前記計数事象の量或いは数を定量化する更なるステップを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
この方法は、セクション内の少なくとも２個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも３個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも４個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも５個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも６個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも７個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも８個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも９個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも１０個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも２０個の異なる画像フィールドに関して実行され、好ましくは更に、解析される全ての画像フィールドから全ての計数事象の数量が取得される、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記定量化は、計数事象及び／又はオブジェクトの数を組織の体積毎に計算すること、例えば、信頼区間と共に全試料体積における計数事象及び／又はオブジェクトの数の推算値を計算することを含む、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記定量化は、バイアスのない計数フレームの使用を伴う、請求項３５〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記定量化は、少なくとも一人の人間のオペレータが、好ましくはコンピュータインタフェースにより、例えばコンピュータマウスを使用して、特定の計数事象をマークすることを伴う、請求項３６〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれかに記載の方法を実行するための命令を含む、コンピュータ可読ミディアム。
【請求項４１】
以下を組み合わせて含む請求項１〜３９のいずれかに記載の方法を実行するのに適した自動システム：
複数の生物学的試料の複数のデジタル画像を含むことができるデータベース、
生物学的試料のデジタル画像から複数のピクセルを解析するためのソフトウェアモジュールと、及び
請求項１〜３６の方法を実行するための命令を含む制御モジュール。
【請求項４２】
前記システムは、スライドローダ、バーコードリーダ、顕微鏡及びステージを含む、請求項４１に記載の自動システム。
【請求項４３】
請求項１〜３９のいずれかに記載の方法を実行するための命令を含む、ソフトウェアプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願で引用される全ての特許文献及び非特許文献は、それらの全体が参照することによって本願にも組み込まれる。
本発明は、画像、例えば生物学的試料の得られた画像を取得して解析するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
定量的な顕微鏡法及び立体学
ミクロ構造組織特性について定量的なステートメントを与えることができる能力は、安全薬理学及び有効性薬理学の両方に関連する様々な用途における生物薬剤学的研究及び開発において益々重要になってきている。
【０００３】
一般に、臓器の状態を反映する構造的特徴の数、長さ、表面積、及び、体積に関する定量的ステートメントを行なうことは興味深い。構造的特徴の（数又は体積加重）分布に基づいて二次特性を調べることは実に興味深い場合がある。
【０００４】
組織の３Ｄ構造的特性の正確な定量化に関連する真の課題及び問題が存在し、そのうちの幾つかは高価で且つ労働集約的な手続きに関連し、また、他の問題は、２Ｄ組織学的セクションからの３Ｄ情報を推論できる能力についての一般的な誤認に関連している。
【０００５】
ここで、２Ｄセクションによってカットされる３Ｄ空間内のオブジェクト（例えば、細胞）が、組織学的セクションと同様にプロファイルとして見られることを理解するのは重要である。そのような３Ｄオブジェクトは、それらのサイズに、具体的にはセクションに対して垂直なオブジェクトの高さに比例して、所定の確率をもって２Ｄセクションにより撃ち当てられる。したがって、対象のオブジェクトは、計数される同じ確率を有さない。これは、例えばプロファイルの計数が３Ｄ空間内のオブジェクトの数の著しく偏った測定であるとの理由からである。
【０００６】
したがって、２Ｄセクションから３Ｄオブジェクトへの推測を行なうことができる方法を使用することが重要である。これは、確かな幾何学的プローブ及び推定器を使用して行なうことができる。３Ｄでのバイアスのない幾何学的プローブのセットの適用及びとサンプリングの組み合わせは、設計に基づく立体学と総称される。
【０００７】
一般的に適用される立体学的方法は、特徴が適当な幾何学的プローブによって交差される回数の単純な計数に依拠している。交差が０次元、すなわち、交差が計数できる点となるようにするため、検査中の及び特徴とプローブの寸法は以下のように常に合計３でなければならない。
・点（複数）プローブ体積
・線（複数）プローブ表面
・面（複数）プローブ長さ
・体積（複数）プローブ数
（図１参照）
【０００８】
ダイセクタ原理は、例えば明確な基準空間内の細胞としての個々のオブジェクトの数を推算するために非常に役立つ。この原理は、幅広く使用されており、おそらく、設計に基づく立体学が今までにその最も大きい影響を及ぼした１つの領域である。また、該原理は、自動化の観点から見られる幾つかの特定の課題も表わす。
【０００９】
仮定、バイアスのない（立体学的）計数における大きなブレークスルーは、物理ダイセクタ論文（Howard & Reed）の発表によって与えられた。ダイセクタは、既知の距離だけ離間した一対の連続するセクションから成る。その方法は、粒子横断（プロファイル）が１つのセクションで見られるが次のセクションで見られない場合にそれが計数される（これが計数事象である）という原理に依拠している。
【００１０】
物理ダイセクタ原理は、多くの頻繁に起こる状況で、例えば対象の構造が非常に大きいとき、組織が光学ダイセクタの使用を可能にし得る十分な透明性をもっていない場合、或いは、どんな理由があろうとも染色液が検査中組織に十分深くまで浸透することができないときに使用される。
【００１１】
物理ダイセクタは、名前が示唆するように、検査中に組織から少なくとも２つの隣接する或いは連続する物理セクションを使用する。
【００１２】
図２は、組織の２つの登録されたセクションからサンプリングされた２つの対応する視野を示している。上側の画像を基準として使用し且つ下側の画像をルックアップ計数事象として使用することが確認される。
【００１３】
実際、物理ダイセクタを適用する際に費やされる時間の大部分が２つのセクションの登録にあてられるのが分かる。したがって、全体の効率を高めるために、計数は、両方の方法で、すなわち、基準及びルックアップを逆にすることにより、行なわれる。
【００１４】
物理ダイセクタ法のために必要とされるセクションの画像登録は、空間マッピングに依拠しており、構造／組織及び２つの画像間の強度差の両方に基づいている。多くのタイプの歪みが、登録されるべき２つのセクションの画像間に存在し得る。登録の作業は、取得の違いに起因し且つシーン特性の違いに起因しない画像間の空間的歪みのみを除去する変換方法を選択することである。幾何学的変換の助けにより、画像中のピクセル間の空間的関係を変えることができる。幾何学的変換は、２つの基本的な操作、すなわち、空間変換と濃度補間とから成る。空間変換は、入力画像中のピクセル位置にしたがって出力画像中における新たなピクセル位置のマッピングを規定する。濃度補間のために使用され得る方法が幾つかある。例えば、最近隣アプローチ、３次たたみ込み内挿法及び共１次内挿法である。濃度補間においては、新たなピクセル座標（ｘ１，ｙ１）が空間変換によって計算される。デジタル画像が使用され、したがって、当初の座標は整数値を有する。パラメータの値に応じて、新たな座標（ｘ’，ｙ’）が非整数値となる可能性がある。歪んだ画像ｉ２がデジタルであるため、そのピクセル値を整数座標でしか規定することができない。したがって、ｘ’及びｙ’に関する非整数値の使用は、階調レベルが規定されないｉ２の位置へのマッピングをもたらす。これらの非整数点の階調レベル値は、非整数点付近の整数点位置に基づいていなければならない。
【００１５】
画像フィールドの領域を含むバイアスのない計数フレームは、所与のダイセクタ対における列挙計数事象のプロセスで使用されるのが好ましい。バイアスのない計数フレームは、図１１に示されるように、受け入れ境界と“禁じられた”境界とを有する。 “禁じられた”ラインを交差する粒子は何ら計数されなくてもよい。計数フレームの内側に位置される粒子、又は、受け入れラインと交差するが“禁じられた”ラインと交差しない粒子が計数され得る。図１において、計数は、これらの簡単な規則にしたがって行なわれる。
【００１６】
物理ダイセクタとの関連で、計数事象は、これらの規則にしたがって含められる。そのため、細胞核は、それが計数事象であり且つ上述したように計数フレーム内に入る場合にだけ計数される。それは、それが基準画像で見出されるがルックアップ画像中で見出されない場合だけ計数事象である。
【００１７】
例えば細胞の数などのミクロ構造の体積の全体の量は、推算原理に基づいている。推定器は、データが与えられると推算値を与えることができるツールである。一般に、立体学で使用される推定器は、単位基準体積当たりの特徴の量の推算値を与える。一般的に、密度として一般に知られる以下の比率量が使用される。
体積密度（ＶＶ）：    基準体積内の１つの相の体積割合
面密度（ＳＶ）：      単位基準体積内の界面の面積
長さ密度（ＬＶ）：    基準体積の単位内の線形特徴の長さ
数値密度（ＮＶ）：    単位基準体積内の個々のオブジェクトの数
【００１８】
生物学的システムでは、基準空間の定義が重大である。基本サンプリング単位（ＦＳＵ）が対象の有機体／臓器に対して関連付けられる。基準空間のサイズの知識だけで、任意の変化の性質及びその欠如を完全に理解できる。
【００１９】
多くの状況において、これは、幾何学的プローブが視野内の所与の（分割された）構造と交差するか否かの簡単な検査を可能にする、先進的画像分割技術を使用して達成することができる。
【００２０】
立体学ソフトウェアは市販されている。最も広く知られたパッケージは、おそらく、MicroBrightfieldのStereoInvestigator及びVisiopharmのＣＡＳＴシステム（Olympus Denmark A/SからVisiopharm A/Sによって吸収れた）である。
【００２１】
注意深いプランニングを使用し且つ物理ダイセクタ原理を使用してさえ、設計に基づく立体学をもととする定量化を得る手続きは、依然として時間がかかるとともに、労働集約的であり、確実にスクリーニング目的又は中程度の容積のルーチン目的に理想的には適していない。
【００２２】
フィジカルスライドにアクセスし、そしてそれを顕微鏡のステージ上に装着するためには、人間のオペレータが必要とされる。体系的なランダムサンプリングを制御するソフトウェアを用いてさえ、ステージが次のサンプリング位置へ移動している間は待っている必要がある。焦点合わせにかなりの時間が費やされ、また、計数前の他の調整が始まる可能性がある。
【００２３】
したがって、大きな障害は、今までのところ、デジタル領域で顕微鏡スライドを扱うことができないことであった。
【発明の概要】
【００２４】
本発明は、試料のセクションとして得られる画像対を取得して解析するための方法及びシステムに関する。本発明は、それぞれが試料の各セクションからのものである２つの対応する画像の登録を容易にする。
【００２５】
本発明の１つの態様では、試料の少なくとも２つの隣接するセクションＡ，Ｂから少なくとも１つの対応画像対を取得するための方法が提供される。当該方法は、以下のａ）〜ｇ）のステップを含む：
ａ）セクションＡの少なくとも一部のスーパー画像及びセクションＢの少なくとも一部のスーパー画像を取得するステップ、
ｂ）数学的変換規則を得るために、２つの関連するスーパー画像の特徴間での対応を確立することによって２つのスーパー画像に関して画像登録プロセスを実行するステップ、
ｃ）セクションＡ内の画像フィールドを特定するステップ、
ｄ）上記数学的変換規則を使用してセクションＢ内の対応する領域を特定するステップであって、前記領域がセクションＡ内の上記画像フィールドに対応するセクションＢ内の画像フィールドを含むステップ、
ｅ）ステップｃ）で特定されたセクションＡ内の上記画像フィールドの画像を取得し、かつ、ステップｄ）で特定されたセクションＢ内の上記画像フィールドの画像を取得して対応画像対を取得するステップ、
ｆ）所望によりステップｃ）〜ｅ）を１回以上繰り返して、２つのセクションＡとＢ内の１つ以上の異なる画像フィールドの１つ以上の異なる対応画像対（複数可）を取得するステップ、及び
ｇ）上記対応画像対（複数可）のデジタルバージョンをコンピュータ可読記憶手段内に記憶するステップ
【００２６】
所望により、この方法は、ステップｅ）で取得された２つの画像に関して第２の登録プロセスを実行して登録済み対応画像対を取得する更なるステップを含むことができる。また、方法のステップｆ）を所望により繰り返すことができ、少なくとも２個の画像対、例えば少なくとも３個の画像対、例えば少なくとも４個の画像対、例えば少なくとも５個の画像対、例えば少なくとも６個の画像対、例えば少なくとも７個の画像対、例えば少なくとも８個の画像対、例えば少なくとも９個の画像対、例えば少なくとも１０個の画像対、例えば少なくとも１５個の画像対、例えば少なくとも２０個の画像対、例えば少なくとも２５個の画像対、例えば少なくとも５０個の画像対を取得することができる
【００２７】
試料は、組織部分などの生物学的サンプルであることが好ましい。
【００２８】
本発明の方法を使用して対応画像対が取得された後、例えば少なくとも１つの対応画像対内の画像フィールド上のオブジェクトの少なくとも１つのタイプに関して計数事象を、所望により自動手段を使用して特定することにより、そのセクションを評価することができる。計数事象は、例えば組織の体積毎に計数事象及び／又はオブジェクトの数を加えることにより、例えば基準体積におけるオブジェクト又は構造の総数などの数の推算値を、例えば推算値のための信頼区間を含む他の関連統計値と共に取得することにより、定量化されることが好ましい。
【００２９】
別の態様において、本発明は、本発明に係る方法のうちの少なくとも１つを実行するための命令を含むコンピュータ可読ミディアムに関する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、本発明に係る方法を実行するのに適した自動システムに関し、好ましくは、次との組合せを含む：
複数の生物学的試料の複数のデジタル画像を含む（記憶する及び読み出す）ことができるデータベース；
生物学的試料のデジタル画像から複数のピクセルを解析するためのソフトウェアモジュール；及び
その方法を実行するための命令を含む制御モジュール。
【００３１】
前述した物理ダイセクタは、２つの隣接するセクション間の完全な登録を必要とする。これは、現在、物理ダイセクタを使用する最も時間のかかる態様の１つである。本発明は、特に、改良された登録方法において、及び、計数を“オフラインで”行なうことができるという事実において、従来技術の物理ダイセクタを凌ぐ多くの改良を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１はプローブ及び測定された特徴における次元の和が常に３であることを示す。例えば、ラインプローブ（１次元）を用いると、表面積（２次元）を測定することができる。
【図２】図２は隣接するセクションが組織からカットされること、及び、第１のセクションから第２のセクションまで及び第２のセクションから第１のセクションまで事象を計数するために２つのセクション内の対応する位置が検査されることを示す。
【図３】図３はスライド生成及び画像登録のための作業フローの例を示す。
【図４】図４は手動及び自動の物理ダイセクタのための作業フローの例を示す。
【図５】図５は自動物理ダイセクタを使用してサンプル対を形成するための作業フローの例を示す。
【図６】図６は自動物理ダイセクタを使用する計数事象の定量化のための作業フローの例を示す。
【図７】図７は手動物理ダイセクタのための作業フローの例を示す。
【図８】図８はペアイメージャソフトウェアを使用するときのスクリーンダンプの例を示し、図８ａはスーパー画像取得であり、図８ｂはセクション検出であり、図８ｃはセクションペアリングである。
【図９】図９は図８の対１のセクション登録及びセクションペアリングにおけるスクリーンダンプを示し、図９ａは登録前を示し、図９ｂは登録前のオーバーレイを示し、図９ｃは登録後の２つのセクションを示し、そして図９ｄは登録後のオーバーレイを示す。
【図１０】図１０は図８の対２の登録のためのスクリーンダンプの例を示し、図１０ａは登録前を示し、図１０ｂは登録前のオーバーレイを示し、図１０ｃは登録後の２つのセクションを示し、図１０ｄは登録後のオーバーレイを示す。
【図１１】図１１はバイアスのない計数フレームを示す。２Ｄフィールドのバイアスのない計数フレームは幾つかの粒子を含む。チェックの付けられた粒子は計数することができ、×印の付けられた粒子は計数することができない。
【図１２】図１２は以下のネーミングの例で更に説明される２つのスライドにおけるセクションのサンプリングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
画像登録：  画像登録は、２つのデジタル画像を１つの座標系に変換するプロセスである。登録は、ダイセクタ対の２つの画像で見られる構造を比較できるようにするために必要である。１つの頻繁に使用される画像登録の手法は、２つの画像間の相互関係又は相互共分散を最大にする変換（一般的には、並進及び回転）を特定することである。
【００３４】
スーパー画像：  好ましくはスライド全体をカバーし及び／又はサンプリングされるべき全ての画像フィールドを含む、低い倍率（例えば、×２）で取得される画像。この画像は、一般的には、試料全体を覆う半ば重なり合う視野（ＦＯＶ）を体系的に取得してこれらの画像を互いに縫い合わせることによって形成される。
【００３５】
オブジェクトタイプ：  細胞、及び、血管等の画像中の他の構造の１つ以上のタイプなど、定量化されるオブジェクトのタイプ。
【００３６】
マスク：  マスクは、画像中の１つの領域又は対象領域（ＲＯＩ）を規定する。各画像毎に、幾つかのそのようなマスクが規定することができる。ＶＩＳにおいて、マスクは固有の数を有する。
【００３７】
視野（ＦＯＶ）：  顕微鏡を通じて見られる所与のセクションの一部。
【００３８】
隣接：  隣接するセクションは、セクション間の接触を示唆してもしなくてもよいが、常に、それがセクションが取得される構造の意義のある認識を可能にする最短距離であることを示唆する。大ざっぱに言えば、２つの隣接するセクション間の距離は、対象のオブジェクト／構造のサイズと比べて小さくなければならない。
【００３９】
セクション：  セクションは、解析されるべき試料のスライスであり、好ましい実施形態では、セクションは組織のセクションである。この場合、組織セクションは、顕微鏡スライドに貼り付けられる例えば約５〜１０ミクロン厚の組織の薄いスライスであり、顕微鏡下で観察される。
【００４０】
ルックアップ画像／基準画像：  対応する画像対の一方の画像が基準画像と呼ばれ、もう一方の画像がルックアップ画像と呼ばれ、該ルックアップ画像に応じて、画像が基準画像となるように指定される。
【００４１】
対応画像対：  この用語は、異なるセクションにあるが本質的に同じ構造を描いている基準セクション及びルックアップセクション内の画像、２つ以上の個々の視野又は互いに縫い合わされる多数の視野のいずれかを表わすために使用される。対応する画像対は、完全に登録されてもされなくてもよいが、基準画像において見える全ての構造がルックアップ画像中で実質的にカバーされることが求められる。
【００４２】
計数事象：  基準画像では見えるが対応するルックアップ画像では見えない全てのオブジェクト／構造が計数事象と見なされる。
【００４３】
画像フィールド：  “画像フィールド”は、情報の定量的解析を行なうことができる任意の情報領域である。ある場合では、画像フィールドは低い倍率（例えば、×１.２５〜×２）での顕微鏡視野である。そして、全顕微鏡視野を×４０〜×１００の倍率での画像取得・解析のために使用できる。画像フィールドの別の例は、特定の解析のために選択される領域である。
【００４４】
ガードゾーン：  セクションＡ又はＢ内の画像フィールドの周囲のゾーン。セクションＡ内の画像フィールドに対応する正しい画像フィールドがセクションＢ内の取得された画像領域中に完全に含まれるようにする。
【００４５】
オフライン：  本発明は、画像中のオブジェクトのオフライン定量化を可能にする。この場合、オフラインは、ハードディスクなどの記憶ミディアムに保存された画像に関して定量化プロセスが行なわれることを意味し、画像の取得中ではないことを意味する。
【００４６】
少なくとも１つの対応画像対を取得する方法
第１の態様において、本発明は、試料の少なくとも２つの隣接するセクションＡ，Ｂから少なくとも１つの対応画像対を取得するための方法に関し、該方法は次のステップを含む：
ａ）セクションＡの少なくとも一部のスーパー画像及びとセクションＢの少なくとも一部のスーパー画像を取得するステップ、
ｂ）数学的変換規則を得るために、２つの関連するスーパー画像の特徴間での対応を確立することによって２つのスーパー画像に関して画像登録プロセスを実行するステップ、
ｃ）セクションＡ内の画像フィールドを特定するステップ、
ｄ）上記数学的変換規則を使用して、セクションＢ内の領域を特定するステップ、前記領域はセクションＡ内の上記画像フィールドに対応するセクションＢ内の画像フィールドを含む、
ｅ）対応画像対を取得するために、
ステップｃ）で特定されたセクションＡ内の上記画像フィールドの画像を取得するとともに、ステップｄ）で特定されたセクションＢ内の上記画像フィールドの画像を取得するステップ、
ｆ）所望によりステップｃ）〜ｅ）を１回以上繰り返して、２つのセクションＡ、Ｂ内の１つ以上の異なる画像フィールドの１つ以上の異なる対応画像対（複数可）を取得するステップ、
ｇ）上記対応画像対（複数可）のデジタルバージョンをコンピュータ可読記憶手段内に記憶するステップ
【００４７】
セクション及び画像の取得
当業者により知られているように、生物学的セクションの顕微鏡検査のための一般的なサンプリングは階層的である。ブロックが主要な試料から取得され、ブロックからセクションがカットされ、該セクションに関してフィールドが検査され、そしてフィールドに関して測定が行なわれる。物理ダイセクタの場合には、隣接するセクション間の距離が知られていることが好ましい。これらの隣接するセクション対は、その後、それらが対であることを示すためにマーク付けすることができる。好ましくは、セクション間の距離は、計数されるべき粒子のサイズの３０％より長くなくてもよい。好ましいセクション厚は４〜５μｍ未満である。
【００４８】
セクションは、例えば、明視野顕微鏡、蛍光顕微鏡、又は、共焦点顕微鏡を使用して見ることができる。セクションの画像は、当業者に知られる任意の適切なシステムを使用して取得することができる。好ましくはデジタルカメラが使用される。画像を取得するために使用されるシステムは、所望により、オートフォーカスを使用することもできる（ソフトウェア又はハードウェアのいずれかによって実施される）。
【００４９】
例えば、顕微鏡は、電動ステージ、焦点を合わせるため、高倍率と低倍率との間での対物レンズを交換するため、及び、スライドの入射光の調整のための自動装置、及び一般的には処理システムからのコマンドに応じて電動ステージの動作を制御するための回路とを含むことができる。また、顕微鏡は、分類されるべき試料を含むスライドを電動ステージへ移動させ及び電動ステージから移動させるための自動スライド輸送システム、及びスライドからのエンコードされた情報を読み取るためのバーコードリーダとをも含むことができる。これらの機能の少なくとも一部を行なう顕微鏡の一例は、ドイツのCarl Zeiss、Leica Microsystems、ニコン、又は、オリンパスによって製造されている。
【００５０】
好ましくは、取得される画像は、白黒画像、カラー画像、又は、マルチフレーム（例えば、マルチスペクトル）画像である。画像は、ＴＩＦＦ画像として、又は、ＪＰＥＧとして、或いは、他の標準的な形式で記憶されることが好ましい。
【００５１】
別の実施形態において、スーパー画像及び／又は画像フィールドは、対象のセクションを画像化する仮想顕微鏡によって得られる仮想スライドから取得することができる。この実施形態では、全組織領域が例えば仮想スライドスキャナにおいて高倍率で走査され、結果として得られる画像がハードディスクにすぐに記憶される。この場合、システムは、あたかもそれが顕微鏡、ステージ、カメラ等を制御していたかのようにこの大きな画像を取り扱う。したがって、ユーザは、まさにそのインタフェースを使用することができ、実際の顕微鏡と協働しているときのように仮想顕微鏡画像と協働することができる。この手法を用いると、可能性として研究全体（又は、幾つかの研究）からの走査セクションによってバイアスのない方法の使用を更に自動化することができ、そしてその後の全ての操作をオフラインで行なうことができる。
【００５２】
試料
任意の適切な試料を本発明の方法において使用することができる。好ましくは、該試料は生物学的試料である。したがって、上記試料は組織サンプルであってもよい。また、試料は、少なくとも１つの化学マーカ、例えば少なくとも１つの蛍光マーカなどで標識化することもできる。別の実施形態では、前記試料は光学特性を有することができる。画像が取得される間、試料は例えばＵＶ又は人間の眼に見える照明を使用して照らされることが好ましい。１つの好ましい実施形態において、試料は、複数の細胞、例えば人間の細胞、例えば場合により乳癌細胞などの１つ以上の人間の癌細胞を含む複数の人間の細胞を含む。
【００５３】
スーパー画像
本発明の方法の１つの実施形態において、スーパー画像は、ステップｅ）の画像を得るために使用される分解能よりも低い分解能を使用して取得される。別の実施形態では、スーパー画像が×２.５、×４、×５又は×１０の倍率を使用して得られる。  当業者であれば分かるように、本明細書において、“２つのスーパー画像”とは、２つのスーパー画像を１つの単一の更に大きいスーパー画像に含ませることができる実施形態をも意図している。
２つの画像は、例えば、従来の顕微鏡スライドから或いは仮想スライドから取得することができる。
【００５４】
登録
この方法のステップｂ）は、数学的変換規則を得るために、２つの関連するスーパー画像の特徴間で対応を確立することによって２つのスーパー画像に関して画像登録プロセスを実行することに関係する。
【００５５】
登録プロセスで使用される特徴（複数可）は、登録プロセスにおいて役立つと当業者によって認識される任意の適切な特徴であってもよい。特徴は、例えば、セクション又は試料の外形状又は輪郭、血管構造（複数可）、神経構造（複数可）、筋肉構造（複数可）、細胞膜（複数可）、セクション内の空間（複数可）、細胞（複数可）、腺房、粒子（複数可）又は細胞核から成るグループから選択される解剖学的構造などの解剖学的構造であってもよいが、これらに限定されない。
【００５６】
登録プロセスは、それ自体、当業者に知られる任意のプロセスを使用して実行することができる。例えば、登録は、１９９８年にＭａｉｎｚ等によって開示された方法を使用して実行することができ、或いは、相関・逐次的方法、フーリエ方法又はポイントマッピング方法のうちの１つ以上を使用することができる。したがって、セクションの画像登録は、例えば、空間マッピング、幾何学的変換、空間的変換と濃度補間との組合せの１つ以上を使用して行なうことができる。濃度補間の好ましい方法としては、例えば、最近隣アプローチ、３次たたみ込み内挿法及び共１次内挿法が挙げられる。
【００５７】
本発明の１つの好ましい実施形態において、画像登録は、以下のうちの１つ以上（好ましくは３つ全て）を含むか或いは以下のうちの１つ以上（好ましくは３つ全て）から成る：
１.  対に属する２つの画像中の組織領域の検出
２.  一方の画像を他方の画像にほぼ適合するために一方の画像の剛体ワープ
３.  画像を更に正確に適合するためにほぼ適合することに基づく非剛体ワープ
【００５８】
組織検出のため、任意の方法を使用することができる。１つの好ましい実施形態は、Visiopharm A/Sから市販されているVisioMorphセグメンテーションツールを使用する。
【００５９】
登録プロセスによって得られる変換規則は、セクションの少なくとも一部に関して行なわれる回転規則及び／又は並進規則及び／又はワープ規則を含むことが好ましい。
【００６０】
セクションＡ内の画像フィールドの特定
本発明の方法のステップｃ）は、セクションＡ内の画像フィールドを特定するステップを含む。画像フィールドは、例えば、ランダムな位置で、系統的に均一でランダムな位置で或いはユーザの規定する位置で選択される。
【００６１】
本発明の１つの実施形態において、考慮される画像フィールド（複数可）の位置（例えば、左上角として規定される）は、基準セクション及びルックアップセクションの対応する位置に基づいて、組織の均一なランダムサンプルなどのランダムサンプルを表わしている。本発明の別の実施形態において、考慮される画像フィールド（複数可）はセミランダムサンプルを表わしている。本発明の別の実施形態において、第１の画像フィールドはランダムに特定され、また、その後の画像フィールドは定義済関数を使用して特定される。本発明の別の実施形態において、考慮される画像フィールド（複数可）のうちの１つ以上は、人間のオペレータによって、例えばコンピュータマウスを使用することによって試料中で選択することができる。サンプリング原理は、例えば［Howard & Reed］に記載されている。
【００６２】
サンプリング時、オリジナル試料の全ての部分は、測定が行なわれるべき最終サンプルの一部となる同じ機会を有していなければならない。したがって、１つの実施形態では、サンプリング階層の全てのレベルで体系的な均一のランダムサンプリングを適用することが有利となり得る。
【００６３】
セクションＢ内での画像フィールドの特定
本発明の方法のステップｄ）は、上記数学的変換規則を使用して、セクションＢ内の領域を特定するステップを含み、前記領域がセクションＡ内の上記画像フィールドに対応するセクションＢ内の画像フィールドを含む。セクションＢ内の画像フィールドは、セクションＢ内の上記領域の周辺のガードゾーンと共にセクションＡ内の画像フィールドに対応する領域を含むことが好ましい。このガードゾーンの存在は、本発明を実現するのに好ましいことが本発明の発明者等によって見出された。好ましくは、ステップｄ）で上記領域の各境界に対して加えられる最小ガードゾーンは、次式を使用して計算される。
【００６４】
【数１】
2010511213.tif 000003
【００６５】
例えば、ステップｄ）の上記領域の面積は、セクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも１.１倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも１.２倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも１.３倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも１.４倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも１.５倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも１.６倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも１.７倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも１.８倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも１.９倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも２.０倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも２.５倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも３.０倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも３.５倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも４.０倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも４.５倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも５.０倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも６.０倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも７.０倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも８.０倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも９.０倍、例えばセクションＡ内の上記画像フィールドの面積の少なくとも１０倍となり得る。
【００６６】
別の実施形態において、ガードゾーンは、セクションＡ内の画像フィールドのためにも選択される。これにより、第２の登録プロセスを行なうときに、画像フィールドのみが比較される場合よりも大きな画像領域を比較することができ、それにより、第２の登録のロバスト性を向上する。
【００６７】
取得された画像対の面積
本発明に係る方法において、取得された画像対の全てにおける総面積は、解析されるセクションの面積の少なくとも０.５％、例えば少なくとも１％、例えば少なくとも２％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも８％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも２５％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも３５％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％であることが好ましい。
【００６８】
更なる任意選択的な方法のステップ
本発明の方法は、ステップｆ）を所望により更に含み、該ステップｆ）は、ステップｃ）〜ｅ）を１回以上繰り返して、２つのセクションＡとＢ内の１つ以上の異なる画像フィールドの１つ以上の異なる対応画像対（複数可）を取得することに関連する。ステップｆ）は、少なくとも２個、例えば少なくとも３個、例えば少なくとも４個、例えば少なくとも５個、例えば少なくとも６個、例えば少なくとも７個、例えば少なくとも８個、例えば少なくとも９個、例えば少なくとも１０個、例えば少なくとも１５個、例えば少なくとも２０個、例えば少なくとも２５個、例えば少なくとも５０個の画像対を取得するために繰り返すことができる。
【００６９】
本発明の方法を使用して画像が取得された後、それらの画像は、上記対応画像対（複数可）のデジタルバージョンでコンピュータ可読記憶手段に記憶されることが好ましい。
【００７０】
本発明の方法における別の任意選択的なステップは、登録された対応画像対を取得するためにステップｅ）で得られた２つの画像に関して第２の登録プロセスを行なう追加のステップを実行することを含む。これは、最適な登録を可能にし、また、本明細書中に記載された登録プロセスのいずれかなどの任意の登録プロセスを使用して行なうこともできる。好ましくは、上記登録プロセスは、A Survey of Medical Image Registration (9)に記載されるようなものである。
【００７１】
また、本発明に係る方法は、薬理学的な結論などの、この方法の結果から結論を自動的に決定する更なるステップを含むこともできる。１つの好ましい結論は、例えば、増殖性細胞の相対数の推算値を表わす数など、所望により該数の統計的精度を示す値を伴う、臓器又は腫瘍の増殖指数に関連する結論であってもよい。
【００７２】
本発明の方法は、腎臓、肺、肝臓、筋肉、子宮、骨、心臓、脂肪組織、及び、胃腸組織等といった様々な臓器の組織学的部位などの任意のタイプの試料に関して実行されてもよい。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態において、この方法は、レポート、所望により１つ以上のデジタル画像（複数可）を、グラフィカルユーザインタフェースに自動的に与える更なるステップを更に含む。
【００７４】
本発明の方法は、自動化又は半自動化されていることが好ましい。次の表には、自動化され（AUTO）或いは所望により自動化され（OPTIONALLY AUTO）て実行されてもよいステップを表示した。
【００７５】
【表１】
2010511213.tif 000004
【００７６】
本発明の１つの実施形態では、少なくとも１つの、２つの、或いは、３つの異なるオブジェクトタイプに関して、例えば異なる細胞又は組織タイプ及び／又は異なる細胞構造に関して、本明細書中に記載される任意の方法を実行することができる。
【００７７】
本発明に係る方法は、１つ以上のプロセッサに本方法のステップを実行させるための命令が内部に記憶されたコンピュータ可読ミディアムを使用する態様を更に含むことができる。
【００７８】
試料の少なくとも２つの隣接するセクションを評価する方法
別の態様において、本発明は、試料の少なくとも２つの隣接するセクションを評価するための方法を提供する。該方法は、次のステップを含む：
i）上述した任意の方法に従って少なくとも１つの対応画像対を与えるステップ、及び
ii）所望により自動手段を使用して、少なくとも１つの対応画像対内の上記画像フィールド上のオブジェクトの少なくとも１つのタイプに関して計数事象を特定するステップ。
【００７９】
少なくとも２つの隣接するセクションを評価するための前記方法は、セクションＡ内の上記画像フィールド（複数可）及びセクションＢ内の上記画像フィールド（複数可）の画像に関して上記計数事象の量又は数を定量化する更なるステップを含むこともできる。かかる定量化は、例えば、信頼区間と共に試料全体の体積においてオブジェクト及び／又は計数事象の数の推算値を計算するなど、組織の体積当たりのオブジェクト及び／又は計数事象の数を計算することを含むことができる。また、前記定量化は、所望により、バイアスのない計数フレームの使用を含むこともできる。本発明の１つの実施形態において、定量化は、少なくとも一人の人間のオペレータが、好ましくはコンピュータインタフェースにより、例えばコンピュータマウスを使用して、特定の計数事象をマークすることを伴う。好ましくは、定量化は、例えばCavalieris Unbiased Estimator of Volumeなどの推定器を使用して実行される。好ましくは、定量化プロセスはオフラインで行なわれる。
【００８０】
別の実施形態において、この定量化ステップは、人間のオペレータに対して推奨する計数事象を与えるシステムを有することによって、例えば画像において各推奨する計数事象にマーク又はラベルを貼り付けることによって支援されてもよい。画像において推奨する計数事象を自動的に特定するため、解析された画像フィールド対に関して画像解析が行なわれてもよい。
【００８１】
少なくとも２つの隣接するセクションを評価するための本発明に係る方法は、セクション内の少なくとも２個の異なる画像フィールド、例えばセクション内の少なくとも３個の異なる画像フィールド、例えばセクション内の少なくとも４個の異なる画像フィールド、例えばセクション内の少なくとも５個の異なる画像フィールド、例えばセクション内の少なくとも６個の異なる画像フィールド、例えばセクション内の少なくとも７個の異なる画像フィールド、例えばセクション内の少なくとも８個の異なる画像フィールド、例えばセクション内の少なくとも９個の異なる画像フィールド、例えばセクション内の少なくとも１０個の異なる画像フィールド、例えばセクション内の少なくとも２０個の異なる画像フィールドに関して実行することができ、また、好ましくは更に、解析された全ての画像フィールドから全ての計数事象の数量が得られる。
【００８２】
好ましい実施形態
好ましくは、以下の１つ以上が本発明の方法で使用される。
（i）自動サンプリング
スライド上の１つ以上の組織領域を好ましくはスーパー画像（複数可）を使用して特定して、本発明の方法における更なるステップは、セクションＡとＢ内の１つ以上の画像フィールド（複数可）の画像及び所望により更なる画像対を生成するために、サンプリングすることである。これは、適用に応じて幾つかの方法で行なうことができる。
【００８３】
１．  画像フィールド毎に１つ以上の画像を用いた、スライド内のそれぞれの特定された画像フィールドの網羅的画像化。後者の場合、画像タイルの縫い合わせによって全ての画像を生成することができる。標準的な電動ステージの完全なアライメント（及び、精度）の欠如に起因して、相互相関に基づく画像アライメントが後処理ステップとしてしばしば必要とされる。各画像フィールドの画像は、スライド上のバーコードによって規定される研究名、研究ユニット、及び、測定結果に基づいてデータベースに記憶される。この適用は、Tissue Micro Arraysからスライド全体の網羅的走査にまで及ぶ（その後の観察及び定性／定量評価及び解釈のため）。
【００８４】
２．  ２つの領域のサンプリング：これは、特別であるが、物理ダイセクタを使用するときにしばしば起こる状況である。ここで、２つのセクションの輪郭が描かれ、そして、画像解析が２つのセクションの完全な登録を自動的に得るために使用される。その後、２つの画像スタック（基準及びルックアップ）が、２つのアライメントされたセクション内の画像フィールドの系統的なランダムサンプリングを使用して得られる。
【００８５】
３．  例えばスムーズなフラクショネータが、幾つかの埋め込み材料中に一緒に配置される幾つかの組織セクションを得るために使用され、且つその体積全体がその後に区分化されるときには、幾つかのセクションにわたってサンプリングすることが有用である。ここで、システムは、全ての画像フィールドを同時に取り囲むサンプリング領域を決定できなければならない。組織セクション間で画像フィールドがサンプリングされる場合には、この事実を認識すること及びこのフィールドに関連する画像の記憶を省くことが簡単（画像解析を使用する）でなければならない。
【００８６】
サンプリング中に行なわれる画像化は、以下の、すなわち、オートフォーカス、自動露出、及び、自動ホワイトバランスの１つ以上を含むなど、自動化されていることが好ましい。
【００８７】
（ii）画像分割
画像分割は、特定の用途に関連する組織クラス又はオブジェクトクラスに属する空間的に明確な領域又はオブジェクトに画像を分けるプロセスである。分割された画像に基づいて、オブジェクトの数、領域、周辺などの情報を測定することができる。したがって、画像分割は、画像からの情報をその後抽出することにおいて有用である。画像分割の好ましい方法としては、閾値法、ベイズ式分類法及びｋ−平均クラスタリング法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
（iii）ダイセクタ形態
当業者に知られる様々なダイセクタ形態を使用することができる。パラメータは、特定の用途に依存しており、１つの実施形態では、例えば管理者によってのみセットアップ及び変更することができない形態で記憶することができる。そのようなパラメータとしては、例えば以下を挙げることができるが、これらに限定されない：
−スーパー画像を取得するための対物レンズ
−中間分解能画像を取得するための対物レンズ
−分解能を働かせるための対物レンズ
−対物レンズのそれぞれのためのコンデンサ、フィルタなどの設定
−“登録の良さ”のための用途特有の測定基準
−計数フレームのサイズ
【００８９】
（iv）計数事象の定量化
計数事象によって表されるオブジェクトは、バイアスのない計数フレーム（上記参照）を使用して定量化されることが好ましい。
【００９０】
試料全体におけるオブジェクトの総数の推算値を得るため、フラクショネータ原理を使用することができる（例えばHoward & Reed参照）。フラクショネータの原理は、試料全体の既知のフラクション１／ｘを取得し、そしてそのフラクションにおける全てのオブジェクトｎを好ましくはバイアスのない計数フレームを使用して計数することである。その結果、オブジェクト全体における粒子の総数のバイアスのない推算値がｎ×ｘによって与えられる。
【００９１】
１つの実施形態において、人間のオペレータは、部分的にマウスを使用して事象をクリックすることにより或いは事象を手動で計数することにより、計数事象を定量化することができるが、本発明の別の実施形態は、VisioMorphなどの信号計数デバイスを使用して計数事象を数えることを可能にする。
【００９２】
更に、前述したように推奨計数事象がオペレータに対して与えられる支援計数も考えられる。
【００９３】
コンピュータ可読ミディアム
別の態様において、本発明は、本明細書中に開示される方法の１つ以上を実行するための命令を含むコンピュータ可読ミディアムを更に包含する。適切なコンピュータ可読ミディアムは、例えば、データ、データ構造、コンピュータ実行可能命令などの記憶を行なうためのハードディスクであってもよい。リムーバブル磁気ディスク、ＣＤ、磁気カセット、フラッシュメモリカード、デジタルビデオディスクなど、コンピュータによって読み取ることができる他のタイプのミディアムも使用することができる。
【００９４】
自動システム
別の態様において、本発明は、本明細書中に開示される方法の１つ以上を実行するのに適した自動システム又は半自動システムを更に包含する。
この自動システム又は半自動システムは、以下を組み合わせることを含む：
・複数の生物学的試料の複数のデジタル画像を含むことができるデータベース、
・生物学的試料のデジタル画像から複数のピクセルを解析するためのソフトウェアモジュール、
・前記方法（複数可）を実行するための命令を含む制御モジュール
かかる自動システム又は半自動システムは、スライドローダ、バーコードリーダ、顕微鏡（好ましくは電動）及びステージ（好ましくは電動）のうちの１つ以上を更に含むこともできる。
【００９５】
幾つかの自動スライドローダは、今日、市販されており、顕微鏡に装着された電動ステージ上にスライドの自動ローディングを可能にする。適切なシステムは、例えばオリンパス又はTrestle社から提供されている。そのようなローダは、標準的なウインドウズに基づくコンピュータに組み込むことができ、１００＋個のスライドを保持できる能力を有するとともに、一連のバーコード記号を読み取ることができる。
【００９６】
そのようなローダをシステムに組み込むことにより、顕微鏡スライドの無人の大容量サンプリング及びデジタル化が可能になり、また、バーコードの適用により、非常に高いレベルでのデータ管理を作業プロセスに十分に組み入れることができる。
【００９７】
しばしば、１つのスライドが幾つかの組織セクションを含んでもよい。したがって、本発明の方法を一種の物理ダイセクタとして使用することができる。この場合、例えば試料からの少なくとも２つの隣接するセクションがスライド上に並んで配置される。
【００９８】
本発明に係るシステムは、ｚ軸制御用のリニアエンコーダを含んでいてもよい。
【００９９】
全自動顕微鏡を使用すると、低倍率と高倍率との間でシステムを切り換えさせることができる。低倍率を使用することにより、スライド全体の概観を与える“スーパーレンズ”画像を得ることができ、そして画像解析を使用して組織を含むスライド上の領域をシステムに自動的に特定させることができる。
【０１００】
システムは、画像プロセッサとデジタイザ、及び印刷や記憶等のための周辺機器を有する汎用プロセッサを含んでいてもよい。汎用プロセッサは、INTEL PENTIUMマイクロプロセッサ又は同様のマイクロプロセッサベースのマイクロコンピュータであってもよいが、本明細書中に記載される機能の効率的な実行に適した別のコンピュータタイプのデバイスであってもよい。汎用プロセッサは例えば機能及びデバイスのコンポーネント間でのデータの流れを制御することができ、また、更なる主特徴信号計数アルゴリズムを実行させてもよく、また、画像の記憶及び分類情報を取り扱うことができる。汎用プロセッサは、プリンタ、光ハードディスク又は磁気ハードディスクなどの記憶装置、テープドライブなどの周辺デバイス、及び、バーコードリーダ、スライドマーカ、オートフォーカス回路、ロボットスライドハンドラ、ステージ、及び、マウスを含む他のデバイスを更に制御することができる。
【０１０１】
画像プロセッサ及びデジタイザは、デジタルカメラからの画像をデジタル化するように作用することが好ましく、また、画像に関して主アルゴリズム分類を所望により行なうことができ、望ましくない情報をフィルタ除去することができる。当業者であれば容易に分かるように、画像プロセッサ及び汎用コンピュータはそれぞれ、その処理コンポーネントに関連して前述した機能を果たすために必要なソフトウェアの記憶及び実行のため、読み出し専用メモリ及び／又はランダムアクセスメモリにアクセスすることができる。更に、各コンポーネントは、データバスにわたる通信又はデータ転送の制御のため、及び、同様のプロセッサに特有な他の機能のため、回路や集積回路チップなどを含む。
【０１０２】
システムは、定量化プロセスの全体にわたってユーザにガイダンスを提供できる機会を更に備えることができる。例えば、ユーザは、特定の対象領域を、スクリーン上でその対象領域を選択することにより指定することができる。一般に、スーパー画像が与えられ、そして、ユーザは、ポインティングデバイス（例えば、マウス）によって１つ又は複数の領域を選択することができる。そして、計数は、選択された１つ又は複数の領域のみに制限される。そのような特徴は、画像の特定の領域が対象の画像フィールドに関連することをユーザが認識するときに特に有用となり得る。
【０１０３】
また、システムは、ポインティングデバイス（例えば、マウス）によって選択される指定された１つ又は複数の領域を除去するための方法を備えることもできる。指定された１つ又は複数の領域（時として、“ゲート領域”と呼ばれる）内の画像の部分は、スポットが計数されるときに無視される。
【０１０４】
用途
本発明に係る方法は多くの用途で使用できる。好ましい実施形態において、方法は、組織学、例えば発見薬理学及び安全性薬理学の両方で使用される組織学などの組織学において用いられる。例えば、本発明の方法を使用して、生物学的試料のβ細胞の質量、体積、及び、数を正確に見積もることができる。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、生物学的試料中の肺胞の数、体積、及び、サイズ分布を正確に見積もることができる。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、生物学的試料の細胞増殖及びアポトーシスを正確に見積もることができる。本発明の方法を使用して調査できる組織としては、肝臓、肺、リンパ（例えば免疫毒性試験のため）、又は、甲状腺が挙げられるが、これらに限定されない。また、該方法を生殖毒性の解析に使用することもできる。
【０１０５】
本発明の別の実施形態では、本発明の方法を発育神経毒性の研究に使用できる。発達脳は、神経毒物質によって第一標的として或いは間接的に影響され得る。発展的な損傷は、しばしば、細胞数の微妙な定量的変化として現れる。本発明の方法を使用するニューロンのバイアスのない立体的決定は、発展的な神経毒材の潜在的作用の解明を助けることができる。すなわち、本発明の方法を使用して、規制発展的神経毒性試験の潜在的な新たな終点としてニューロンの数を研究することができる。
【０１０６】
参考文献
本発明の方法で用いるのに適する態様を開示する参考文献は以下の通りである：
（1） G. H Granlund, H. Knutsson (1995), Signal processing for computer vision, Dordrecht, Kluwer Academic Publishers. ISBN 0-7923-9530-1.
（2） C.V. Howard, M.G. Reed (1998), Unbiased Stereology Three dimen-sional measurements in microscopy, Oxford, BIOS Scientific Publishers. ISBN 1 85996 071 5
（3） B. Srinivasa Reddy, B. N. Chatterji (1996), An FFT-based technique for translation, rotation and scale invariant image registration. IEEE Transactions on Image Processing, 5(8) 1266-1271.
（4） P.R. Mouton (2002), Principles and Practices of Unbiased Stereology: An Introduction for Bioscientists. Baltimore,  MD, USA: The Johns Hopkins UniversityPress, p 9.
（5） B. Zitov´a, J. Flusser (2003), Image registration methods: a survey. Image and Vision Computing, 21 977-1000.
（6） L. Gottesfield Brown (1992), A survey of image registration techniques. ACM Computing Surveys, 24(4) 325 - 376.
（7） I. Pitas(2000), Digital image processing algorithms and applications, John Wiley & Sons, Inc. ISBN 0 471 37739 2
（8） R. C. Gonzalez, R. E. Woods, Digital Image Processing, Upper Saddle River, New Jersey, Prentice Hall, Inc. ISBN 0-201-18075-8
（9） J. B: Antoine Mainz and Max A. Viergever, A Survey of Medical Image Registration, Medical Image Analysis (1998), Volume 2, pp1-37.
【実施例】
【０１０７】
実施例１:画像取得
本発明の１つの実施形態では、ダイセクタ対の取得が自動的な方法で行なわれるようにするため、システムは、２つのモード、すなわち、準備モードと画像サンプリングモードとを実行することができる。これらのモードの例を以下に記載する。
【０１０８】
１.準備モード
【０１０９】
【表２】
2010511213.tif 000005
【０１１０】
２.画像サンプリング・登録モード
以下に記載されるステップは全て無人で実行されている。
２.１  登録の自動細緻化
多分、幾つかの実用的なユーザ用途からこのステップを省くことができることになるでしょう。
【０１１１】
【表３】
2010511213.tif 000006
【０１１２】
２.２  高分解能サンプリング及び登録
【０１１３】
【表４】
2010511213.tif 000007
【０１１４】
３．  データ管理
【０１１５】
【表５】
2010511213.tif 000008
【０１１６】
実施例２：画像定量化の例
定量化は、立体的原理に基づいて手動で行なうことができ、また、例えば、newＣＡＳＴ（Visiopharm A/S）などの様々なソフトウェアを使用して行なうことができる。
【０１１７】
【表６】
2010511213.tif 000009
【０１１８】
実施例３：一般的なシステム仕様の例
電動顕微鏡：Nikon 90i対物レンズ：×２、×１０（ドライ）、×２０（ドライ＋オイル）、及び×４０（ドライ＋オイル）カメラ出口：ｃ−マウントデジタルカメラ：オリンパスＤＰ７０電動ステージ：従前のＨ１３８試料ホルダ：８スライド
システムは、スライド毎に複数のセクションを扱うことができる。
システムは、最大で８個のスライドを保持することができる試料ホルダを有する電動ステージを含む。物理ダイセクタモジュールは、Visiopharm A/Sから市販されているＶＩＳ/newＣＡＳＴプラットフォーム上に実装されて一体化される。
【０１１９】
実施例４：画像取得、登録及びサンプリングの例
画像取得、登録及びサンプリングは、以下の作業フローによって説明されるように行なうことができる。
【０１２０】
I：Visiopharm Integrator System（ＶＩＳ）を起動させる
１）ＶＩＳを立ち上げる（デスクトップ上のＶＩＳアイコンから又は開始メニュー｜プログラム｜Visiopharm｜ＶＩＳから）。
【０１２１】
II：サンプル画像を記録する
１）ＶＩＳを立ち上げる（デスクトップ上のＶＩＳアイコンから又は開始メニュー｜プログラム｜Visiopharm｜ＶＩＳから）。
２）取得モジュールを開く。
３）起動ボタンの上側で、リスト中のAutomatedPhysicalDisectorを選択する。
４）起動ボタンを押して、自動物理ダイセクタダイアログを開く。
５）Configurationsページを選択する
ａ）正しいコンフィギュレーションを選択する。
ｂ）ロードボタンを押して、コンフィギュレーションをロードする。
６）‘スーパー画像’ページを選択する
ａ）Super Image to captureに基づいて、幾つのスライドを画像化すべきかを選択する。
【０１２２】
７）スタートボタンを押す。これは、ＶＩＳウインドウにおいてライブビューを開始し、そしてＲＯＩ取り込みウイザードダイアログを立ち上げる。以下に示すようにウィザードを通る。
ａ）Apply flat field correctionボックスをチェックする。
ｂ）Next>>を押す。
ｃ）ライブ画像に焦点を合わせて、正確に照明されるようにする。
ｄ）Next>>を押す。
ｅ）ジョイスティックを使用して、組織が見られず且つ過度の汚染及び他の背景変動が最小に維持されるスライド上の位置へと移動する。
ｆ）Next>>を押す。
ｇ）スーパー画像が自動的に取得される。取得が終了するまで待つ。
【０１２３】
８）Outliningページを選択する。
ａ）分類ボタンを押して、分類ダイアログを立ち上げる。
ｂ）正しい分類が選択されるようにする。
ｃ）分類ボタンを再び押して、目に見えるスーパー画像を組織及び背景に分割する。
ｄ）或いは、分類ボタンを押して、リスト中の全てのスーパー画像を分割する。
【０１２４】
９）Image Pairingのページを選択する。このとき、組織セクションはそれらの周囲のボックスで表示される。
ａ）対における第１のセクションを左クリックする。
ｂ）対における第２のセクションを左クリックする。
ｃ）対がリストに加えられる。
ｄ）全てのセクション対にわたって以上を繰り返す。
ｅ）リスト中の対を選択して、Renameを押し、対の名前を変える。
ｆ）リスト中の対を選択して、Deleteを押し、選択した対を削除する。
ｇ）全ての対が再規定されるべき場合には、Resetを押して、全ての対を削除し、セクションボックスを置き換える。
【０１２５】
１０）Pair Registrationページを選択する。
ａ）リスト中の対を選択する。
ｂ）Registerを押して、対における２つのセクションを一致させる。
ｃ）或いは、Register Allを押して、リスト中の全てのセクション対を一致させる。
【０１２６】
１１）Samplingページを選択する。
ａ）リスト中の対を選択する。
ｂ）サンプルボタンを押して、選択された対においてサンプリングを行なう。
ｃ）或いは、サンプルオールボタンを押して、リスト中の全ての対においてサンプリングを行なう。
【０１２７】
１２）Specify Sampling Nameダイアログが示される。
ａ）現在のサンプリングのためのＩＤ名を書き込む。サンプリングが異なるサンプリングＩＤを有している限り、同じ対に関して幾つかのサンプリングを行なうことができる。
ｂ）ＯＫを押す。
【０１２８】
１３）Automated Saveダイアログが示される。
ａ）サンプル画像をデータベース内に記憶させるべき場所を指定する。２つの上側の層だけをユーザによって指定することができる。３番目のレベルは、対の名前及びサンプリングＩＤに基づいて自動的に選択される。
ｂ）Enableを押す。
【０１２９】
１４）ＲＯＩ capture wizardダイアログが立ち上げられる。以下に示すようにウィザードを通る。
ａ）Apply flat field correctionボックスをチェックする。
ｂ）Next>>を押す。
ｃ）ライブ画像の焦点を合わせて、正確に照明されるようにする。
ｄ）Next>>を押す。
ｅ）ジョイスティックを使用して、組織が見られず且つ過度の汚染及び他の背景変動が最小に維持されるスライド上の位置へと移動する。
ｆ）Next>>を押す。
ｇ）サンプル画像が自動的に取得される。
取得が終了するまで待つ。
【０１３０】
１５）Image approvalページを選択する。
ａ）リスト中の第１の画像を選択する。画質がＯＫであることを確認する。
ｂ）画質がＯＫでない場合には、Retakeを押す。これは、ＲＯＩ capture wizardを立ち上げて、現在の画像の再取得を可能にする。
ｃ）Down arrow keyを使用して、画像のリストを通り、全ての画像がＯＫとなるようにする。
【０１３１】
１６）全てのサンプリングが終了した場合には、物理ダイセクタを終了する。
【０１３２】
III：サンプリングされた画像を計数する
１）ＶＩＳにおいて、new ＣＡＳＴモジュールを開く。
２）データベースにおいて、サンプリング画像が記憶された測定値（３番目のレベル）を選択する。
３）オフライン計数ボタンを押して、サンプリング画像に関して計数を開始する。
これはOffline sampling setupダイアログを立ち上げる。
ａ）計数されるべきサンプリングを選択する。
４）対にされたサンプルが分割スクリーンビュー内に並んで示される。
５）基本ビューボタンを押して、右側の画像を動き回らせることができるようにするBasic imaging viewモードを選択する。
【０１３３】
６）計数フレームが使用される場合、右側の画像内で左マウスボタンをクリックしそのまま押し続け、対応する領域が２つの計数フレーム内で見られるまで右側の画像をドラッグする。
７）計数ボタンを押して、計数マークを画像上に加えることができるようにするCount Toolモードを選択する。
８）対にされたサンプルにおける関連事象を計数する。計数を２つのウインドウのいずれかで行なうことができる。
９）nextボタンを押して、next sampling positionへ行く。
１０）prevボタンを押して、previous sampling positionへ行く。
【０１３４】
１１）最後のサンプルに既に達した場合には、nextボタンを押すと、Meander samplingボックスが立ち上がる。
ａ）Finishを押して、計数を終了する。
ｂ）或いは、Repeatを押して、最初のサンプルから計数を再び開始する。
古い計数は削除されない。
１２）測定値ビューボタンを押して、Data：View measurement Dataを開く。左側の異なる見出しを選択して、対応するデータを示す。見出しの量は、サンプリング中に行なわれた計数を示す。
１３）スタディビューボタンを押して、Data：View study dataを開く。データベースのスタディユニット（レベル２）の第１の測定値を選択して、保存された全ての測定値の合計を示す。
１４）モジュールから出るとき或いはデータベース中の新たな測定値を選択するとき、File｜Preferencesメニュー内のデータ保存オートメーションの設定に応じて保存ダイアログが現れる。
【０１３５】
実施例５：画像をどのようにしてデータベースに保存できるのかを示す例
【０１３６】
スライド画像のネーミング
画像ネーミング規則は、画像のアルファベットリストが対と対になったサンプル位置とを連続的に示すことを確保することが好ましい。各画像取得セッション毎に、多くのスライドが画像化される。これらは、次の名前を有する測定値としてデータベースに記憶される。
“Slide_ID”
・ID．  スライドを表わすユーザが規定した名前
【０１３７】
対になるセクションの画像ネーミング
各スライドでは、多くの組織セクションが見られる。これらのセクションは対にされ、また、対は、同じスライド上又は異なるスライド上に配置することができる。対にされたセクション画像は、次の名前を有する測定値としてデータベースに登録されて記憶される。
“PairN_1_ID”
“PairN_2_ID”
・Ｎ．  現在のセクション対の数。この数は、現在のスタディユニット下では一つしか存在しない。
・１及び２．  それが対の第１の画像か或いは第２の画像かどうかを表わす数。
・ＩＤ．  そのスライドを表わすユーザが規定した名前
【０１３８】
対サンプル位置名
それぞれのセクションにおいて、各セクション対毎に多くの対応する位置が画像化される。対にされたサンプル位置画像は、次の名前を有する測定値としてデータベースに登録されて記憶される。
“PairN_PosM_1_ID”
“PairN_PosM_2_ID”
・Ｎ．  現在のセクション対の数。この数は、現在のスタディユニット下では固有のものである。
・Ｍ．  セクション対Ｎにおける現在のサンプル位置の数。この数は、現在のセクション対下で固有のものである。
・１及び２．  それが対の第１の画像か或いは第２の画像かどうかを表わす数。
・ＩＤ．  スライドを表わすユーザが規定した名前
【０１３９】
ネーミングの例
以下の例は、図１２に関する２つのスライドにおけるセクションのサンプリングを示している。
【０１４０】
スライド領域は、ユーザによって“Test１”及び“Test２”とネーミングされた。スライド内には２つのセクション対が見出される。１つは同じスライド上にあり、１つは異なるスライド上にある。それぞれのセクション対では、３つの位置がサンプリングされる。登録不確実性のために、各対の第２の画像においては、より大きな領域が画像化される。
【０１４１】
データベースにおいて、対応する測定値名は以下のとおりである。
スライド画像：
・Slide_Test1
・Slide_Test2
セクション画像：
・Pair1_1_Test1
・Pair1_2_Test1
・Pair2_1_Test1
・Pair2_2_Test2
サンプル位置画像：
・Pair1_Pos1_1_Test1
・Pair1_Pos1_2_Test1
・Pair1_Pos2_1_Test1
・Pair1_Pos2_2_Test1
・Pair1_Pos3_1_Test1
・Pair1_Pos3_2_Test1
・Pair2_Pos1_1_Test1
・Pair2_Pos1_2_Test2
・Pair2_Pos2_1_Test1
・Pair2_Pos2_2_Test2
・Pair2_Pos3_1_Test1
・Pair2_Pos3_2_Test2
【０１４２】
実施例６：２段階登録プロセスの例
１）剛体ワープに登録
・組織セクションを２つの二値画像として表わす（背景に関してはピクセル値０、オブジェクトに関しては１）。
・２つのバイナリオブジェクトの質量中心（ＣｏＭ）を計算する。
【０１４３】
【数２】
2010511213.tif 000010
【０１４４】
・ＣｏＭの差として並進を計算する。
・ＣｏＭからオブジェクト境界までの距離を両方のオブジェクトにおけるサンプル角の関数として測定する。等角度でサンプリングして、２つのデジタル信号を形成する。
【０１４５】
・信号ｓ１と信号ｓ２との間の差分自乗和（ＳＳＤ）を最小にする１つの信号の変位を計算する。
【０１４６】
【数３】
2010511213.tif 000011
【０１４７】
・計算された変位を使用して、画像間の回転を計算する。
・画像変換マトリクスを使用して、画像２を並進及び回転させ、組織セクションを互いの上に適合する。回転θ及び並進（Ｔｘ，Ｔｙ）に関して、各画像ピクセルにおける変換マトリクスは次のとおりである：
【０１４８】
【数４】
2010511213.tif 000012
【０１４９】
２）非剛体ワープに登録
・剛体ワープに既に登録された画像を使用する。
・画像１の組織セクション内の等距離で離間される探索領域を規定する。
・各探索領域内で、最大ピクセル強度変動の位置を検出する。
・この位置の周囲の小さな領域を画像２と比較して、最大共分散の領域を見つける。
一致する位置を探索領域からマッチポイントのリスト内に集める。
・Ｎ個のマッチポイントから、正規方程式を作成する。
【０１５０】
【数５】
2010511213.tif 000013
【０１５１】
ここで、Ｍは、推算のために使用される異なる関数、例えばｘ，ｙ，ｘ２，ｘ２，ｘｙの数である。
・最小二乗推定を使用してαパラメータを計算し、それにより、各画像ピクセルごとに次の変換マトリクスを得る。
【０１５２】
【数６】
2010511213.tif 000014
【０１５３】
対サンプリング
・対の第１のセクションにおいてサンプリング位置が決定されたときに、剛体変換と非剛体変換とを組み合わせて、対の第２のセクションにおける対応するサンプリング位置を計算する。
・画像化された試料の高分解能サンプル画像を２つの位置で取得する。
サンプル２について更に大きな領域を取得して、サンプル１で見つけられた領域をサンプル２でも見つけることができるようにする。
・剛体ワープについて計算された回転を使用して、サンプル画像２を回転する。
【図３】
2010511213.tif 000016
【図４】
2010511213.tif 000017
【図５】
2010511213.tif 000018
【図６】
2010511213.tif 000019
【図７】
2010511213.tif 000020
【図１】
2010511213.tif 000021
【図２】
2010511213.tif 000022
【図８ａ】
2010511213.tif 000023
【図８ｂ】
2010511213.tif 000024
【図８ｃ】
2010511213.tif 000025
【図９ａ】
2010511213.tif 000026
【図９ｂ】
2010511213.tif 000027
【図９ｃ】
2010511213.tif 000028
【図９ｄ】
2010511213.tif 000029
【図１０ａ】
2010511213.tif 000030
【図１０ｂ】
2010511213.tif 000031
【図１０ｃ】
2010511213.tif 000032
【図１０ｄ】
2010511213.tif 000033
【図１１】
2010511213.tif 000034
【図１２】
2010511213.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成21年2月10日(2009.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の少なくとも２つの隣接するセクションＡとＢから少なくとも１つの対応画像対を取得するための方法であり、該方法は以下のステップを含む：
ａ）セクションＡの少なくとも一部のスーパー画像及びセクションＢの少なくとも一部のスーパー画像を取得するステップ、但し、スーパー画像は全ての画像フィールドを含むセクションの画像であり、また、画像フィールドは解析されるべき画像の領域であり、
ｂ）その２つのスーパー画像に関して、数学的変換規則を得るために、２つの関連するスーパー画像の特徴間で対応を確立することによって画像登録プロセスを実行するステップ、
ｃ）セクションＡ内の画像フィールドを特定するステップ、
ｄ）前記数学的変換規則を使用して、セクションＢ内の領域を特定するステップ、当該領域はセクションＡ内の前記画像フィールドに対応するセクションＢ内の画像フィールドを含む、
ｅ）ステップｃ）で特定されたセクションＡ内の前記画像フィールドの画像を取得し、そしてステップｄ）で特定されたセクションＢ内の前記画像フィールドの画像を取得し、そして、２つの画像に関して第２の登録プロセスを行い、登録された対応画像対を取得するステップ、
ｆ）所望により、ステップｃ）〜ｅ）を１回以上繰り返して、２つのセクションＡ，Ｂ内の１つ以上の異なる画像フィールドの１つ以上の異なる対応画像対（複数可）を取得するステップ、及び
ｇ）前記登録された対応画像対（複数可）のデジタルバージョンをコンピュータ可読記憶手段内に記憶させるステップ、
ここで、ステップａ）のスーパー画像は、ステップｅ）の画像を取得するために使用される分解能よりも低い分解能を使用して取得される。
【請求項２】
スーパー画像は、×２.５、×５又は×１０の倍率を使用して取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
最小ガードゾーンは次の式を使用して計算される：
【数１】
2010511213.tif 000036
例えば、ステップｄ）の前記領域の面積がセクションＢ内の前記画像フィールドの面積の少なくとも１.５倍である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ガードゾーンがセクションＡ内の画像フィールドの各境界に対しても加えられる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
２つの対応する画像フィールド及びステップｄ）で取得されたガードゾーンに関して第２の登録プロセスを実行して登録済み対応画像対を取得する更なるステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップｆ）を繰り返し、少なくとも２個の画像対、例えば少なくとも３個の画像対、例えば少なくとも４個の画像対、例えば少なくとも５個の画像対、例えば少なくとも６個の画像対、例えば少なくとも７個の画像対、例えば少なくとも８個の画像対、例えば少なくとも９個の画像対、例えば少なくとも１０個の画像対、例えば少なくとも１５個の画像対、例えば少なくとも２０個の画像対、例えば少なくとも２５個の画像対、例えば少なくとも５０個の画像対を取得する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記試料が生物学的試料である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記変換規則は、セクションの少なくとも一部に関して実行される回転規則及び／又は並進規則及び／又はワープ規則を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
方法の結果から結論を自動的に決める更なるステップを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
方法の結果から薬理学的結論を自動的に決める更なるステップを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
細胞サンプルの増殖指数に関連する結論を自動的に決める更なるステップを含む、請求項１〜１０いずれかに記載の方法。
【請求項１２】
グラフィカルユーザインタフェースに関するレポートを、所望により１つ以上のデジタル画像（複数可）を、自動的に提供する更なるステップを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
考慮された画像フィールド（複数可）は、組織の均一なランダムサンプルなどの隣接するセクションのランダムサンプルを示す、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
第１の画像フィールドがランダムに特定され、その後の画像フィールドが定義済関数を使用して特定される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
セクションＡの前記画像フィールドが人間のオペレータによって試料中で選択される、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
取得された全ての画像対における総面積は、解析されるセクションの面積の少なくとも０.５％、例えば少なくとも１％、例えば少なくとも２％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも８％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも２５％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも３５％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、少なくとも１つ、２つ、或いは、３つの異なるオブジェクトタイプに関して実行される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記試料が組織サンプルである、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が少なくとも１つの化学マーカで標識化される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が少なくとも１つの蛍光マーカで標識化される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記試料が光学的特性を有する、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が、例えばＵＶ又は人間の眼に見える照明を使用して照明される、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が自動化されている、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
計数事象が、画像フィールド対の画像解析に基づいて推奨計数事象として人間のオペレータに与えられる、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
この方法のステップを１つ以上のプロセッサに実行させるための命令が記憶されるコンピュータ可読ミディアムの使用を更に含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
試料が複数の人間の細胞を含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
複数の人間の細胞が１つ以上の人間の癌細胞を潜在的に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
１つ以上の人間の癌細胞が乳癌細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記特徴が解剖学的構造である、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記解剖学的構造は、セクションの外形状、血管構造（複数可）、神経構造（複数可）、筋肉構造（複数可）、細胞膜（複数可）、セクション内の空間（複数可）、細胞（複数可）、腺房、粒子（複数可）又は細胞核から成るグループから選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
次のステップを含む、試料の少なくとも２つの隣接するセクションを評価する方法：
ｉ）請求項１〜３０のいずれかに記載の方法に従って、少なくとも１つの対応画像対を備えるステップ、
ii）少なくとも１つの対応画像対内の前記画像フィールド上のオブジェクトの少なくとも１つのタイプに関して計数事象を、所望により自動的な手段を使用して特定するステップ。
【請求項３２】
セクションＡ内の前記画像フィールド（複数可）及びセクションＢ内の前記画像フィールド（複数可）の画像に関して前記計数事象の量或いは数を定量化する更なるステップを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
この方法は、セクション内の少なくとも２個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも３個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも４個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも５個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも６個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも７個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも８個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも９個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも１０個の異なる画像フィールドに関して、例えばセクション内の少なくとも２０個の異なる画像フィールドに関して実行され、好ましくは更に、解析される全ての画像フィールドから全ての計数事象の数量が取得される、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記定量化は、計数事象及び／又はオブジェクトの数を組織の体積毎に計算すること、例えば、信頼区間と共に全試料体積における計数事象及び／又はオブジェクトの数の推算値を計算することを含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記定量化は、バイアスのない計数フレームの使用を伴う、請求項３２〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記定量化は、少なくとも一人の人間のオペレータが、好ましくはコンピュータインタフェースにより、例えばコンピュータマウスを使用して、特定の計数事象をマークすることを伴う、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
以下を組み合わせて含む請求項１〜３６のいずれかに記載の方法を実行するのに適した自動システム：
複数の生物学的試料の複数のデジタル画像を含むことができるデータベース、
生物学的試料のデジタル画像から複数のピクセルを解析するためのソフトウェアモジュールと、及び  請求項１〜３６の方法を実行するための命令を含む制御モジュール。
【請求項３８】
前記システムは、スライドローダ、バーコードリーダ、顕微鏡及びステージを含む、請求項３７に記載の自動システム。
【請求項３９】
請求項１〜３６のいずれかに記載の方法を実行するための命令を含む、ソフトウェアプログラム。
【国際調査報告】
2010511213.tif 000037
2010511213.tif 000038