(57)【要約】  母体血液の分離サンプルから胎児細胞を単離する方法であって、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して、等価母体細胞におけるそのマーカーの発現様式と比較して、異なった発現様式を有する細胞を特定し、そして、特定した細胞を選択するステップを含んで成り、上記胎児マーカーが、以下の：HSP-60、モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、FLJ20202、DCN-Iタンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択されることを特徴とする前記方法を提供する。胎児細胞の培養方法、及び胎児細胞単離キットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
母体血液サンプルからの胎児細胞の単離方法であって、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して、等価母体細胞におけるそのマーカーの発現様式と比較して異なった発現様式を有する細胞を特定し、そして、その特定した細胞を選択するステップを含んで成り、それぞれの少なくとも1種類の胎児マーカーが、以下の：HSP-60、モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択されることを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記方法が、細胞表面上に少なくとも1種類の胎児マーカーを発現する細胞を特定し、そして、それらの細胞を選択するステップを含んで成る、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、細胞表面上に1種類の胎児マーカーを発現する細胞を選択するステップを含んで成る、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記の特定した細胞を、細胞表面上に胎児マーカーを発現しない細胞から分離するステップをさらに含んで成る、請求項2又は3に記載の方法。
【請求項５】
前記胎児マーカーがHSP-60である、請求項2、3、又は4のいずれか1項
に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、少なくとも1種類の胎児マーカーを発現する細胞を特定し、そして、それらの細胞を選択するステップを含んで成り、ここで、それぞれの少なくとも1種類の胎児マーカーが、モノアミン・オキシダーゼから選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記の特定した細胞を、胎児マーカーを発現しない細胞から分離するステップをさらに含んで成る、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記の選択された胎児細胞を、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して、その選択された胎児マーカー細胞と同じ発現様式を有する非等価母体細胞から分離するステップをさらに含んで成る、請求項2〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
細胞表面上にHSP-60：及び
増量した、以下の：モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57から選択される少なくとも1種類の追加的な胎児マーカー；又は
減量した、以下の：細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択される少なくとも1種類の追加的な胎児マーカー、
を発現する細胞を特定する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
モノアミン・オキシダーゼ：及び
増量した、以下の：グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57から選択される少なくとも1種類の追加的な胎児マーカー；又は
減量した、以下の：細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択される少なくとも1種類の追加的な胎児マーカー、
を発現する細胞を特定する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、モノアミン・オキシダーゼである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記モノアミン・オキシダーゼがMAOAである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記モノアミン・オキシダーゼがMAOBである、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、グルタミン合成酵素である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、Ara-70である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、Ara-54である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、FLJ20202である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、DCN-1タンパク質である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、RAB5Aである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、HSP-7Cである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、EF1A1である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、GRP78である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、MYL4である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、ビンキュリンである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、デスモプラキンである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２７】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、AMMECR1様タンパク質である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、未同定タンパク質Cxorf57である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、ペルオキシレドキシン1である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
前記の胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーが、ペルオキシレドキシン2である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
前記母体血液が、分離されたサンプルの状態である、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３３】
前記母体血液が、それを採取した対象に戻されるのに適する、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３４】
母体血液からの胎児細胞の単離方法であって、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して、等価母体細胞におけるそのマーカーの発現様式と比較して、異なった発現様式を有する細胞を特定し、そして、その特定した細胞を選択するステップを含んで成り、上記胎児マーカーが、以下の：HSP-60、モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択されることを特徴とする前記方法。
【請求項３５】
胎児細胞の培養方法であって、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して、等価母体細胞におけるそのマーカーの発現様式と比較して、異なった発現様式を有する細胞を濃縮するステップを含んで成り、上記胎児マーカーが、以下の：HSP-60、モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選ばれる前記方法。
【請求項３６】
前記胎児細胞を、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法を含んで成る方法を使用して単離する、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法を含んで成る方法によって得ることができる単離細胞を含んで成る細胞サンプル。
【請求項３８】
請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法を含んで成る方法によって得られた単離細胞を含んで成る細胞サンプル。
【請求項３９】
請求項35又は36に記載の方法によって培養した細胞を含んで成る、請求項37又は38に記載の細胞サンプル。
【請求項４０】
前記細胞が赤芽球である、請求項1〜36のいずれか1項に記載の方法、又は請求項37〜39のいずれか1項に記載の細胞サンプル。
【請求項４１】
胎児細胞単離キットであって、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して、等価母体細胞におけるそのマーカーの発現様式と比較して、異なった発現様式を有する細胞であるかどうか検出する手段、及び少なくとも1種類の胎児マーカーに関して異なった発現様式を有していない細胞から、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して異なった発現様式を有する細胞を分離する手段を含んで成り、上記胎児マーカーが、以下の：HSP-60、モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択されることを特徴とする前記キット。
【請求項４２】
出生前病気診断方法であって、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法によって単離した胎児細胞を得るステップを含んで成る前記方法。
【請求項４３】
前記の単離した胎児細胞が疾患の指標を含んでいるかどうか判定するステップをさらに含んで成る、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法に使用するための装置であって、細胞が、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して、母体細胞における発現様式と比較して、異なった発現様式を有するかどうか検出する手段、及び少なくとも1種類の胎児マーカーに関して異なった発現様式を有する細胞を、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して異なった発現様式を有していない細胞から分離する手段を含んで成り、上記胎児マーカーが、以下の：HSP-60、モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択されることを特徴とする前記装置。
【請求項４５】
細胞が胎児細胞であると断定する方法であって、その細胞において、等価母体細胞における発現様式と比較して、異なった発現様式を有する少なくとも1種類の胎児マーカーを検出するステップを含んで成り、上記胎児マーカーが、以下の：HSP-60、モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、ヒト機能未知タンパク質MGC10526若しくはMGC10233、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択されることを特徴とする前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本願発明は、出生前診断の分野、そして、特に母体の末梢血からの胎児細胞の分離に関する。具体的には、本発明は、母体血球細胞からの胎児細胞の分離方法、及び母体血球細胞から胎児血球細胞を分離するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
疾患の出生前診断の現行の方法は、侵襲的技術を必要としている。例えば、そのような技術には、羊水穿刺、絨毛膜絨毛採取、及び臍帯穿刺が含まれる。何百万というそのような分析が、毎年、ダウン症候群や他の遺伝的に受け継がれる病態などの染色体異常を検出するために観血的にサンプル採取された材料を使用して現在、実施されている。合衆国だけでも、羊水穿刺や絨毛膜絨毛採取など約200,000の観血的な胎児検診手順が、毎年、実施されている。そのような試験は、35歳を超える女性、及びその他の危険因子を有する人に対して一般に実施されるが、染色体又は遺伝子の欠陥を有するほとんどの子供が35歳より若い女性から生まれている。これらの遺伝病は、現在、侵襲的手技の間に得られた材料の使用によってのみ検出され得る。イングランドとウェールズでは、平均すると、ここ10年間、1年あたり630,000件程度の生児出産があるが、平均母体年齢は、1995年の28.5歳から2005年には29.5歳に上がっている。胎児が遺伝的異常を保有する可能性は、母体年齢に従って著しく増大し、そして、この年齢は上がり続けるであろうことが予想される。観血的な出生前診断は、すべての処置の中の1〜2%が胎児の自然発生的な流産をもたらし、母体と胎児にとって危険であることが一般に認められている。
【０００３】
疾患の出生前診断に関して現行の方法に対する非侵襲的代替手段を提供するのが望ましいことはわかっている。非侵襲的出生前診断技術が、先に概説した危険性を排除又は低減し、そして、世間一般での胎児検診の拡大を可能にすることが望まれている。単離した胎児細胞を使用した非侵襲的出生前診断もまた、羊水穿刺及び絨毛膜標本採取に比べて、より経済的（すなわち、外科的処置を必要としない）だろう。
【０００４】
妊婦の血漿が、母体と胎児の循環細胞外DNA及びRNAの両方を含むことが知られている。胎児物質の濃縮を可能にする、2つのタイプのDNAのサイズの差に基づいて前述の胎児と母体のDNAを分離することが知られている（例えば、EP-A-1524321を参照のこと）。しかしながら、循環胎児核酸の使用は、現在、高レベルの遊離母体循環DNAが原因で、父性遺伝性対立遺伝子の検出に使用されるだけである。胎児DNA、具体的には胎盤にてコードされる物質（placentally encoded species）の多形型が、出生前ダウン症候群診断に使用された。
【０００５】
何十年もの間、胎児細胞はすべての妊婦の末梢血中で見られることが知られている。従って、これらの胎児細胞の大部分が有核であるので、それらが、非侵襲的出生前診断の重要な潜在的なターゲットになる。母体血液中より特定される胎児細胞型には、赤芽球（有核赤血球）、リンパ球、間充織幹細胞、及び胎盤由来栄養膜細胞が含まれる。これらの細胞を均質になる（すなわち、母体細胞の混入を欠く）まで単離できるなら、その単離細胞に対して遺伝子検査を実施できる。これは、異数性、嚢胞性繊維症、β地中海貧血症、及び他の遺伝性単一遺伝子病のような障害に関する日常的、且つ、安全な非侵襲的遺伝子検査を可能にするだろう。
【０００６】
しかしながら、例えば、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）、密度勾配／流量活性化細胞選別装置（FACS）、及び磁性ビーズ活性化細胞選別装置（MACS）細胞単離技術などの方法を使用した、母体血液からの胎児細胞を使用した非侵襲的出生前診断の生存率を評価するための研究（例えば、Hahn, S et al., Molecular Human Reproduction (1998) 4 515-521）は、独特な胎児マーカーを使用しないが、代わりに、一部の母体細胞上に見られる細胞表面マーカーを使用した（例えば、トランスフェリン受容体、CD71、又はグリコホリンA CD235a、例えば、WO 96/09409を参照のこと）。さらに、内部の胎児特異的グロビンε及びγを使用することで胎児の赤芽球を単離する試みがなされたが、これらのタンパク質はまた、成人細胞（いわゆる「F細胞」）内ではめったに発現されないで、且つ、利用が胎児細胞の破壊を引き起こしもするので、それらの使用は限定されている。現在、胎児赤芽球を単離するのに利用される技術的なアプローチは、実際には母体と胎児赤血球系細胞において等しく発現されるグリコホリンAのようなマーカーを利用する（例えば、Al Mufti et al. (2004) Clin. Lab. Hematol. 26 123-128）。
【０００７】
ε及びγグロビン、並びにi式が胎児に特異的であるところのIi式血液型抗原に関して知られている以外に、胎児と成人の赤血球系細胞の間の有意な生化学的相違点に関して文献中にいずれの明確な詳述も存在しない。
そのため、正しい胎児細胞特異的マーカーを提供する必要性がある。
【０００８】
国際特許出願WO 2004/078999は、胎児細胞に特異的なマーカーを使用することで母体血液から胎児細胞を単離する方法を開示している。その方法は、胎児細胞のDNA内に存在しているが、母体のDNAに欠けている抗原をコードする対立遺伝子を特定し、その抗原を認識するアフィニティー試薬を胎児細胞に結合させ、そして、上記アフィニティー試薬によって細胞を選択することを含んで成る。好ましい抗原は、細胞表面タンパク質、特にヒト・リンパ球抗原（HLA）タンパク質である。しかしながら、このアプローチに対する難点が存在する。例えば、前記システムは、胎児の父親のHLAタイプの決定を必要とし（不確かな親子関係の場合を考慮すると、よく知られるように頼りにならない）、そして、その結果は、はっきりと再現性がないかもしれない。
また、母体血液から単離した胎児細胞を培養するための効率的な方法の必要性も存在する。
【０００９】
物理的分離技術を使用した母体血液からの胎児細胞の分離が知られている、例えば、密度勾配遠心分離法に関連するWO 00/060351を参照のこと。しかしながら、密度勾配に基づく現在の手順は、細胞を生理学的に変えてしまうかもしれない（Hahn, S et al. Molecular Human Reproduction (1998) 4 515-521）。これにはアポトーシスの発症が含まれるかもしれず、（核凝縮によって判断される）その兆候は、最近のある研究では、母体血液から単離した赤芽球の有意な割合に見られた（Babochkina, et al. Haematologica (2005) 90 740-745）。あるいは、胎児細胞は、例えば、WO 2004/076653で開示されているように、密度勾配分離と抗体媒介性選択の組合せによって子宮頸管吸引物から得られ、そして、濃縮され得る
Hohmannら（Fetal Diagn. Ther. (2001) 16 52-56）は、胎児起源細胞を検出するための様々な抗体の使用を評価している。
【００１０】
US-A-2006/0105353及びBianchiら（Prenatal Diagnosis (1996) 16 289-298）は、CD45抗体を使用した分離方法を開示しているWO 94/25873と共に、CD45抗体とCD71抗体を使用することによる胎児細胞の分離方法を開示している。
【発明の概要】
【００１１】
発明の概要
本発明の第1の側面によると、（好ましくは単離された）母体血液サンプルからの胎児細胞の単離方法を提供し、その方法には、少なくとも1種類の胎児マーカー（好ましくは1、2、3、4、又は5種類のマーカー）が、等価母体細胞におけるそのマーカーの発現様式と比較して、異なる発現様式をもつ細胞を特定し、そして、その特定された細胞を選択することを含んで成り、胎児マーカーが以下のものから選択されることを特徴とする：HSP-60（熱ショック・タンパク質60、ジェンバンク受入番号P10809）、モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素（受入番号PI5104）、Ara-70（アンドロゲン受容体関連タンパク質70、受入番号Q13772）、Ara-54（アンドロゲン受容体関連タンパク質54、受入番号Q9UBS8）、ヒト機能未知タンパク質MGC10526（受入番号Q5JSZ7）又はMGC10233（受入番号NP_689928）、FLJ20202（HGNC FAM46C）、DCN-1タンパク質（受入番号NM_020640）、RAB5A（受入番号P20339、HCC-10、子宮頚癌の癌遺伝子10タンパク質としても知られている）、HSP-7C（熱ショック同族71kDaタンパク質、受入番号P11142）、EF1A1（伸長因子1-α1、受入番号P68104）、GRP78（78kDaのグルコース調節タンパク質［前駆体］GRP78、受入番号P11021）、MYL4（ミオシン軽ポリペプチド4ミオシン軽鎖1、受入番号P12829）、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14（受入番号Q8TBM8）、ビンキュリン（受入番号P18206）、デスモプラキン（受入番号P15924）、AMMECR1様タンパク質（受入番号Q6DCA0）、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質（受入番号O94769）、未同定（uncharacterised）タンパク質Cxorf57（受入番号Q6NS14）、ペルオキシレドキシン1（受入番号Q06830）、ペルオキシレドキシン2（受入番号P32119）。好ましくは、前記方法は、少なくとも1種類の胎児マーカーの異なる発現様式をもたない他の細胞からの特定された細胞の分離をさらに含んで成る。
【００１２】
この明細書中で使用される用語「異なった発現様式」は、胎児細胞におけるマーカーの発現が等価母体細胞における、すなわち、母体由来の同じ細胞型（例えば、赤芽球などの赤血球系細胞）における、そのマーカーの発現と異なっていることを示す。マーカー発現における比較、例えば、母体の赤芽球における発現様式と比較した胎児赤芽球における発現様式は、母体及び胎児からの同種の細胞間でおこなわれるべきである。
【００１３】
発現様式における相違は、例えば、等価母体細胞にはない、胎児細胞における特定の細胞区画への（細胞膜などへの）マーカーの局所化；等価母体細胞のものと比較した、胎児細胞の総タンパク質量中の増量若しくは減量したマーカー・タンパク質；又は、等価母体細胞にはない、胎児細胞におけるマーカーの発現によるかもしれない。それは、また、前述のタンパク質種が能動的に関与する特定の生化学経路の活性の増大又は減少にも関連するかもしれない。
【００１４】
所定の細胞における発現様式は、この明細書に記載されているものなどの、標準的な分子生物学技術によって、例えば、細胞内のmRNAの量を測定することによって、又は細胞内、若しくは細胞膜などの細胞区画内に存在する所定のタンパク質の量をアッセイすることによって、計測されるかもしれない。
【００１５】
この明細書中で使用される用語「増量した（an increased amount）」は、着目の細胞、例えば、胎児由来赤血球系細胞、において発現された胎児マーカーの量が、着目したものでない細胞、すなわち、母体由来細胞において発現された胎児マーカーの量に比べて、より多いことを示す。好ましくは、それぞれ増量した少なくとも1種類の胎児マーカーを発現することがない細胞（すなわち、胎児由来細胞と比べて、有意に低い量を呈する細胞）が母体細胞である。
【００１６】
この明細書中で使用される用語「減量した（a decreased amount）」は、着目の細胞、例えば、胎児由来赤血球系細胞、において発現された胎児マーカーの量が、着目したものでない細胞、すなわち、母体由来細胞において発現された胎児マーカーの量に比べて、より少ないことを示す。好ましくは、それぞれ減量した少なくとも1種類の胎児マーカーを発現することがない細胞（すなわち、胎児由来細胞と比べて、有意に高い量を呈する細胞）が母体細胞である。胎児赤血球系細胞と比較して成人（母体）赤血球系細胞を上方制御することがわかっているようなバイオマーカーは、胎児と母体の赤血球系細胞の混合物から母体細胞の排除を可能にする。
【００１７】
好ましい態様において、本発明の方法には、細胞表面上の少なくとも1種類の胎児マーカーを発現する細胞を特定し、そして、それらの細胞を選択するステップが含まれる。胎児マーカーは、HSP-60、GRP 78、HSP-7C、MYL4、又はEF1A1であってよく、そして、好ましくはHSP-60である。好ましくは、前記方法は、細胞表面上に胎児マーカーを発現していない細胞から特定された細胞を分離するステップをさらに含んで成る。
【００１８】
熱ショック・タンパク質は、高度に保存された保護的な（シャペロン）タンパク質のファミリーであり、そして、それらの発現は、熱ショック、重金属への暴露、エタノールなどの毒素、UV光への暴露、感染、飢餓、脱水、及び低酸素などの様々なストレスによって引き起こされることが知られている。HSP-60の細胞表面発現は、特に、ミトコンドリアから細胞の原形質膜へのタンパク質の移行による低酸素（胎児の赤血球系細胞が晒されることが知られている低酸素環境）への細胞の暴露に特に応答する。HSP-60は、再度の酸素供給により減少し、そして、ヒト胎盤において発現されると報告されている。より興味深いことに、HSP-60を欠くマウスが胚発生が不可能であることが示され、少なくともこの種の発生中のこのタンパク質の重要性を示した。自家HSP-60は、先天性免疫反応に関する危険信号として作用し、そして、リンパ球や単球などの細胞膜へのタンパク質のその移行が疾患又はストレスに対する応答に関連する（Pfister et al. (2005) J. Cell. Sci. 118 1587-1594；Lang et al. (2005) J. Am. Soc. Nephrol. 16 383-391；Multhoff (2006) Handbook Exp. Pharmacol, 172 279-304；Romano et al. (2004) Int. Immunopharmacol. 4 1067-1073；Belles et al. (1999) Infect. Immun. 67 4191-4200）。そのため、このタンパク質が妊婦を含めた健常人において成熟赤血球の表面上に存在している可能性は非常に低い。
【００１９】
本発明者は、胎児赤血球膜がHSP-60を含み、それが成人赤血球膜に完全に欠けていることを独自に、且つ、驚いたことに発見した。平常時には、HSP-60はミトコンドリアに局在しているが、細胞に対してストレスが加わっている間、細胞表面に位置を変える。そのようなストレスの例は、胎児赤血球系細胞が生きる酸素欠乏状態である。E.コリ（E. coli）HSP-60に対する免疫付与は、慢性関節リウマチ治療における使用のためにこれまで提案された（Bloemendal et al. (1997) Clin. Exp. Immunol. 110 72-78；WO 2006/032216）。
【００２０】
胎児細胞又はその亜集団は、例えば、赤血球系マーカーの発現に基づいて、例えば、密度遠心分離と、それに続くMACS/FACS及び抗グリコホリンA若しくは抗Rh関連糖タンパク質（RhAG）を使用することによって、又は赤血球系細胞に特異的ないずれかのバイオマーカーを使用することによって、単離過程の前に母体細胞から部分的に精製されうる。母体末梢血からの赤血球系統細胞のこの事前の濃縮は、均質性に到達することを目的として、胎児細胞の単離及び濃縮の効果を大いに高めうる。
【００２１】
あるいは、本発明の方法において使用されるマーカーは、胎児赤芽球と母体の非赤芽球細胞の混合物を、母体赤芽球から分離するのを可能にしうる。それに続いて、グリコホリンA（GPA）などの赤芽球特異的マーカーの使用によって、胎児赤芽球が前記混合物から単離され得る。あるいは、公知の赤血球系マーカー及び本願発明で同定したマーカーの存在に基づく赤血球系細胞の同時分離は、純粋な胎児赤血球系細胞の分離をもたらすだろう。
【００２２】
選択された胎児細胞は、母体血液から分離されるか、又は免疫磁性（MACS）若しくは細胞選別の他の方法（例えば、FACS）などの従来の分離技術によって濃縮されうる。あるいは、選択された胎児細胞は、親和性作用物質（抗体、アプタマー、若しくは模倣ペプチド）などの物理的な結合剤によって分離又は濃縮されうる。好適な親和性作用物質には、これだけに制限されることなく、抗体、Affibody分子、及びドメイン抗体が含まれる。親和性作用物質は、ビーズなどの表面に取り付けられうる。好ましくは、親和性作用物質は抗体である。胎児特異的マーカーがHSP-60である場合には、抗体は、好ましくは抗HSP-60抗体、又はHSP-60と反応するアプタマーである。
【００２３】
代替の又は追加の好ましい態様において、本発明の方法は、モノアミン・オキシダーゼを発現する細胞を特定し、そして、それらの細胞を選択するステップを含んで成る。これらの胎児マーカーは、母体細胞ではなく、胎児細胞で独特に発現されることが思いがけなく見つけ出された。好ましくは、前記方法は、モノアミン・オキシダーゼを発現しない細胞から特定された細胞を分離するステップをさらに含んで成る。
【００２４】
本発明のこの側面による方法のさらに好ましい態様において、細胞表面上にHSP-60、並びに：
増量した、以下の：モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、ヒト機能未知タンパク質MGC10526若しくはMGC10233、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57から選択される少なくとも1種類の追加的な胎児マーカー；又は、
減量した、以下の：細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択される少なくとも1種類の追加的な胎児マーカー、
を発現する細胞が特定される。
【００２５】
様々なマーカーの発現、又は増強若しくは減弱された発現の識別は、すべてのマーカーに関して同時でありうる。
本発明のこの側面による方法の追加又は代替の好ましい態様において、モノアミン・オキシダーゼ、並びに：
増量した、以下の：HSP-60、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、ヒト機能未知タンパク質MGC10526若しくはMGC10233、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57から選択される少なくとも1種類の追加的な胎児マーカー；又は
減量した、以下：細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択される少なくとも1種類の追加的な胎児マーカー、
を発現する細胞が特定される。
【００２６】
様々なマーカーの発現、又は増強若しくは減少した発現の識別は、すべてのマーカーに関して同時でありうる。
あるいは、本発明のさらに好ましい態様において、2種類以上の胎児マーカーのいずれかの組合せが前記方法において使用されるかもしれず、2種類以上のマーカーのそれぞれは、以下の：HSP-60、モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、ヒト機能未知タンパク質MGC10526若しくはMGC10233、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質から選択される。好ましくは、少なくとも1種類の胎児マーカーは、HSP-60、又はモノアミン・オキシダーゼである。マーカーは、同時に、又は別々に組合せて使用されるかもしれない。
【００２７】
そのため、胎児細胞は、初めは、1つ目の胎児マーカーを使用して単離され、次に、別の胎児マーカーに基づいてさらに分離又は濃縮されうる。1つ目のマーカーは、胎児細胞の表面上で発現されているが、母体細胞の表面上で発現されていない、例えば、HSP-60であるか、又は胎児細胞内で発現されているが、母体細胞内で発現されていない、例えば、モノアミン・オキシダーゼであるところのタンパク質などのマーカーであってよい。好ましくは、1つ目のマーカーは、細胞表面上に見られるもの、例えば、HSP-60である。追加的な胎児マーカーは、例えば、酵素、例えば、モノアミン・オキシダーゼ、の発現であってよい。
【００２８】
本発明による方法で使用されるこれらのマーカーは、そのため、胎児に対して非侵襲的である手順を用いて母体細胞から胎児細胞を分離するのに有利に使用されることができ、母体血液は、胎児細胞のあらゆる操作に先立って母体から単離された。次に、胎児細胞は、最終的にその細胞がもたらされた胎児の可能性のある疾患、例えば、ダウン症候群及び他の異数性、二分脊椎症、嚢胞性繊維症、β地中海貧血症、並びに他の遺伝的に受け継がれる病態など、を検出するのに使用されうる。
【００２９】
マーカーが供給された基質を検出可能な生成物に変換する酵素である場合には、好ましくは、胎児細胞内でのみ産生される基質代謝生成物の視覚化を可能にするために、蛍光標識／プローブが用いられうる。そのような技術は、FACSベースのアプローチを胎児と母体の血球細胞の分離に利用することを可能にするだろう。
【００３０】
好ましくは、胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーは、モノアミン・オキシダーゼであり、より好ましくはMAOA（受入番号NP_000231）又はMAOB（受入番号AAB27229）である。これらの酵素は共に、生物活性アミン（例えば、セロトニン、エピネフリン、及びノルエピネフリン）の酸化的脱アミノ反応を触媒し、そしてこれにより、母体循環から胎盤を越えるこれらの生物活性アミンの動きから胎児を保護するのに役立つかもしれない。
【００３１】
代替の好ましい態様において、胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーは、グルタミン合成酵素（グルタミン酸アンモニア・リガーゼとしても知られている）である。この酵素は、アンモニアとグルタミン酸の組合せによって生物活性アミノ酸であるグルタミンの産生を触媒する。
【００３２】
さらなる代替の好ましい態様において、胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーは、Ara-70（核コアクチベーター4としても知られている）である。このタンパク質は、基本用語で特定の遺伝子発現の調節に関与する核コアクチベーター転写因子ファミリーに属する。
【００３３】
追加代替の好ましい態様において、胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーは、Ara-54（RNF14としても知られている）である。興味深いことに、ARA-70と同じように、これは、もう1つのアンドロゲン受容体関連転写コアクチベーターである。
【００３４】
より一層さらなる代替の好ましい態様において、胎児マーカー又は追加的な胎児マーカーは、ヒト機能未知タンパク質MGC10526若しくはMGC10233、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C（熱ショック70kDaタンパク質8としても知られている）、EF1A1（EF-1α1、伸長因子1A-1、eEF1A-1、伸長因子Tu、及びEF-Tuとしても知られている）、GRP78（免疫グロブリン重鎖結合タンパク質、BiP、小胞体内腔Ca2＋結合タンパク質grp78としても知られている）、MYL4（ミオシン軽鎖アルカリGT-1アイソフォームとしても知られている）、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57、ペルオキシレドキシン1、又はペルオキシレドキシン2である。
【００３５】
本発明による方法は、サンプル中の非等価母体細胞から選択された胎児細胞を分離するステップをさらに含んで成ってよく、このステップは、少なくとも1種類の非胎児マーカーに関して、非等価母体細胞のそのマーカーの発現様式と比較して、異なった発現様式をもつ細胞を特定し、そして、特定した細胞をサンプル中の他の細胞から分離するステップを含んで成る。選択された胎児細胞が赤芽球又は他の赤血球系細胞である場合には、そのような非胎児マーカーは、グリコホリンA、B、C、又はD、Rhタンパク質、Rh関連タンパク質、Kell糖タンパク質などの赤血球特異的マーカーであってよい。好ましくは、前記マーカーはグリコホリンAである。
【００３６】
母体血液の単離されたサンプルは、それを採取した対象に戻されるのに好適であってよい。例えば、サンプルは、例えば、アファエレシス（aphaeresis）過程の間に、血液が母体から取り出され、その後、戻されるライン・システムの一部であってよい。
【００３７】
本発明の第2の側面によると、胎児細胞の培養方法であって、その方法は、等価母体細胞におけるマーカーの発現様式と比較して、少なくとも1種類の胎児マーカーの発現様式が異なる細胞を濃縮するステップを含んで成り、上記の少なくとも1種類の胎児マーカーが、以下の：HSP-60、モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、ヒト機能未知タンパク質MGC10526若しくはMGC10233、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンカリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択される。
【００３８】
好ましくは、培養されるべき胎児細胞は、本発明の第1の側面による方法を含んで成る方法を使用することで単離された。
本発明の第3の側面によると、本発明の第1の側面による方法を含んで成る方法によって得ることができる、又は得た単離細胞を含む細胞サンプルを提供する。好ましくは、前記細胞サンプルは、本発明の第2の側面による方法によって培養された細胞を含んでいる。
【００３９】
好ましくは、本発明の第1及び第2の側面による方法の細胞、又は本発明の第3の側面によるサンプルは、赤芽球などの赤血球系細胞である。現在、胎児赤芽球は、1個の胎児細胞対1×106〜1×107個の母体有核細胞の濃度にて母体循環中に存在していると思われる。母体血液中に存在している他の胎児細胞型、例えば、リンパ球、間充織幹細胞、及び胎盤由来栄養膜細胞などが想定されるが、胎児（Y染色体を運ぶ）リンパ球はその後の妊娠も含めて何十年間も存続するので、赤芽球が特に好ましい。さらに、栄養膜は、染色体のモザイク性を示し、且つ、それらの大きなサイズのため母体の肺内に急速に捕えられる。赤芽球は、赤血球経路に沿って発生するように関係し、そして、その後の妊娠まで存続しそうにない。それらは、比較的に多量に母体循環に存在している。そのため、母体血液中に存在しているあらゆる胎児赤芽球が現在の胎児由来であるので、それらは出生前診断における使用に好適な細胞である。
【００４０】
本発明の第4の側面によると、細胞が、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して、等価母体細胞におけるそのマーカーの発現様式と比較して、異なった発現様式を有するかどうか検出する手段、及び、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して異なった発現様式を有していない細胞から、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して異なった発現様式を有する細胞を分離する手段を含んで成る胎児細胞単離キットであって、上記胎児マーカーが、以下の：HSP-60、モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、ヒト機能未知タンパク質MGC10526若しくはMGC10233、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択されることを特徴とするものを提供する。
【００４１】
本発明の第5の側面によると、出生前の病気診断方法を提供し、その方法は、本発明の第1の側面による方法を含んで成る方法によって単離した胎児細胞を得るステップを含んで成る。
【００４２】
好ましくは、その方法は、単離された胎児細胞が疾患の指標を含んでいるかどうか判定するステップをさらに含んで成る。例えば、ダウン症候群の場合には、これは、胎児細胞内の第21染色体の余分なコピーの存在によって示されるだろう。他の多数の疾患の診断は、特定の遺伝子の公知の突然変異についての遺伝分析を伴う。例えば、嚢胞性繊維症の診断において、小さな欠失、全体的な欠失、又は1つのヌクレオチド交換であるところのCTFR遺伝子内の突然変異（例えば、突然変異ΔF508）が検出されるだろう。そのような分析が、1つの又は少数の細胞から抽出されたDNAについての手作業の又は自動化された手順を使用して、単離された胎児細胞から抽出されたDNAに対して行われ、そのような手順は、当業者に周知である。抽出されたDNAは、包括的な増幅プロトコール、例えば、低コピー数分析と呼ばれる法医学的応用に使用されるもの、を使用することで増幅されうる。
【００４３】
本発明の第6の側面によると、母体血液からの胎児細胞の単離方法を提供し、その方法は、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して、等価母体細胞における発現様式と比較して、異なった発現様式をもつ細胞を特定し、特定された細胞を選択するステップを含んで成り、上記胎児マーカーが、以下の：HSP-60、モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、ヒト機能未知タンパク質MGC10526若しくはMGC10233、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択されること特徴とするものである。
【００４４】
前記方法は、サンプル中の非等価母体細胞から選択された胎児細胞を分離するステップをさらに含んで成ってよく、このステップは、少なくとも1種類の非胎児マーカーに関して、非等価母体細胞におけるマーカーの発現様式と比較して、異なった発現様式をもつ細胞を特定し、そして、サンプル中の他の細胞から特定された細胞を分離するステップを含んで成る。選択された胎児細胞が赤芽球である場合には、そのような非胎児マーカーは、グリコホリンA、B、C、又はD、Rhタンパク質、Rh関連タンパク質、Kell糖タンパク質などの赤血球特異的マーカーであってよい。好ましくは、前記マーカーはグリコホリンAである。
【００４５】
本発明の第7の側面によると、本発明の第1〜第6の側面による方法に使用するための装置を提供し、その装置は、細胞が、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して、母体細胞における発現様式と比較して、異なった発現様式をもつかどうか検出する手段、及び少なくとも1種類の胎児マーカーに関して異なった発現様式をもたない細胞から、少なくとも1種類の胎児マーカーに関して異なった発現様式をもつ細胞を分離する手段を含んで成り、上記胎児マーカーが、以下の：HSP-60、モノアミン・オキシダーゼ・グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、ヒト機能未知タンパク質MGC10526若しくはMGC10233、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択されることを特徴とする。細胞の表面膜上に少なくとも1種類の胎児マーカーを発現している細胞が検出され、そして、表面膜上にそのマーカーを発現していない細胞から分離される場合には、細胞が上記マーカーを発現しているかどうか検出する手段、及び／又は上記マーカーを発現する細胞を分離する手段が、アフィニティー分離材料を含んで成る支持体の形が取られうる。例えば、胎児マーカーがHSP-60である場合には、アフィニティー分離材料が、抗HSP-60抗体又はアプタマーでありうる。
【００４６】
本発明の第8の側面によると、細胞が胎児細胞であることを断定する方法を提供し、その方法は、その細胞（すなわち、細胞内、又は細胞表面上）において、等価母体細胞における発現様式と比較して、異なった発現様式を有する少なくとも1種類の胎児マーカーを検出するステップを含んで成り、上記胎児マーカーが、以下の：HSP-60、モノアミン・オキシダーゼ、グルタミン合成酵素、Ara-70、Ara-54、ヒト機能未知タンパク質MGC10526若しくはMGC10233、FLJ20202、DCN-1タンパク質、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ相同体サブファミリーBメンバー14、ビンキュリン、デスモプラキン、AMMECR1様タンパク質、細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質、未同定タンパク質Cxorf57、ペルオキシレドキシン1、ペルオキシレドキシン2から選択されることを特徴とする。そのため、前記方法は、例えば、細胞単離技術の陽性対照の一部として、細胞が胎児細胞であることを確認するために使用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
胎児細胞を選択し、そして、分離する方法が、ほんの一例として、添付した図1〜13に関してここで説明される：
【図１】赤血球系細胞から胎児マーカーを同定するために使用した二次元電気泳動法の結果の一例の図式による表示を示す。
【図２】追加的な二次元電気泳動実験の代表的な結果を示す。図2Aが、成人赤血球膜を用いておこなった実験の結果を示す。図2Bが、胎児赤芽球細胞膜（22週間）を用いた実験の結果を示す。図2Cが、胎児赤芽球細胞膜（26週間）を用いた実験の結果を示す。
【図３】熱ショック・タンパク質60の位置が胎児ゲル内で強調表示されている図2で示された二次元電気泳動実験の結果を示す。図3Aが、図2Aに対応する。図3Bが、図2Bに対応する。図3Cが、図2Cに対応する。
【図４】DIGE実験の結果を示す。図4Aが、熱ショック・タンパク質60である胎児特異的タンパク質を丸印で囲った、成人細胞と胎児細胞（妊娠26週間）を用いておこなった実験の結果を示す。図4Bが、熱ショック・タンパク質60である胎児特異的タンパク質が再び丸印で囲った、成人細胞と胎児細胞（妊娠22週間）を用いた実験の結果を示す。
【図５】先に記載したゲルのそれぞれについてDeCyderソフトウェア解析からの分析画像を示す。図5Aの画像は、成人と胎児（妊娠22週間）のサンプル間の熱ショック・タンパク質60のスポット分析の代表的なものである。図5Bの画像は、成人と胎児（妊娠26週間）のサンプル間の熱ショック・タンパク質60のスポット分析の代表的なものである。
【図６】成人と胎児の赤芽球細胞膜のウェスタンブロット分析の結果を示す。図6Aが、臍帯穿刺サンプル（26wks）と異なった赤毛猿（Rh）表現型をもつ6人の成人からのタンパク質のブロットを示す；図6Bが、臍帯穿刺サンプル（22wks）と6人の無作為成人献血者からのタンパク質のブロットを示す；図6Cが、臍帯穿刺（26wks）、臍帯（cord）（39wks、出産）、母体（15wks）、母体（15wks）、無作為抽出した成人からのタンパク質のブロットを示す；図6Dが、臍帯（39wks、出産）、無作為抽出した成人、臍帯穿刺（22wks）、5人の無作為抽出した成人提供者からのタンパク質のブロットを示す；図6Eが、陽性対照として同じサンプルをすべてブロットし、そして、等しいタンパク質添加濃度を管理するために使用されるハウスキーピング遺伝子であるG3PDHのブロットを示す。
【図７】成人末梢血サンプルから単離されたグリコホリンA及び熱ショック・タンパク質60標識単核細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図８】胎児臍帯血サンプルから単離した、グリコホリンA及び熱ショック・タンパク質60標識単核細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図９】赤芽球（GPA＋）及びHSP-60＋単核細胞に関する発現プロファイルを示す成人末梢血から得られた標識単核細胞のフローサイトメトリー散布図を示す。
【図１０】赤芽球（GPA＋）及びHSP-60＋単核細胞に関する発現プロファイルを示す胎児臍帯血から得られた標識単核細胞のフローサイトメトリー散布図を示す。
【図１１】胎盤、胎児、及び成人赤芽球におけるMAOA及びMAOBのリアルタイムPCR分析の結果を示す。図11Aが、MAOAに関連する実験の結果を示す。図11Bが、MAOBに関連する実験の結果を示す。
【図１２】どれが母体細胞と比べて胎児細胞において上方制御され、且つ、MALDI-TOF分析によって同定したタンパク質の位置を示す円を付けた図2の3つの2DゲルのPDQuest分析を示す。
【図１３】強調表示されている、成人細胞と比較して胎児細胞において異なった発現様式をもっているとして同定したタンパク質と、胎児及び成人の培養赤芽球から単離した原形質膜タンパク質との2D電気泳動による比較の結果を示す。
【実施例】
【００４８】
胎児細胞表面に特異的である熱ショック・タンパク質60の識別
胎児赤血球系細胞膜と成人赤血球膜によって発現されるタンパク質の比較によって、HSP-60が胎児の赤血球系細胞表面に特異的であるとして同定された。
【００４９】
具体的には、調製し、そして、−80℃にて保存した赤血球ゴースト膜を使用した。膜可溶化プロトコールの最適化後に、それぞれ0.4%及び1.2%の濃度の界面活性剤ASB-14及びCHAPSの混合物が、最も良い結果をもたらすことがわかった。25μgの可溶化膜を、それぞれの二次元電気泳動実験に使用した。固定pH勾配を使用することによって、フォーカシングを達成し、そして、サンプル・ローディング・バッファーに両性電解質（さまざまなpI値を有する両性種の混合物）を加えることによって、フォーカシングを高めた。タンパク質を陽極に添加し、そして、細片（strip）に電流を流した。タンパク質が陰極に向かって移動するにつれて、それらは、それらの実効電荷がゼロになった地点にて、すなわち、それらの等電点にてあるべき位置に保持された。そして、そのゲル片を、プレキャストSDSゲルの上部の前もって成形されたウェル内に置いた。そして、一例として、図1における様式化された形で示したとおり、タンパク質が分子量に応じて分離されるのを可能にする基本的なSDS-PAGEプロトコールを引き続きおこなった。ゲルを、Sypro Rubyで染色し、Typhoon撮影装置によりスキャンし、そして、結果を図2で示した。図2A、2B、及び2Cの比較は、それぞれ3つの細胞サンプルのプロテオーム間の類似点と相違点を示している。
【００５０】
二次元ゲル画像を比較し、そして、異なるタンパク質発現を測定するように設計されたPDQuestソフトウェア（Bio-Rad）を使用して、ゲル分析をおこなった。ゲル・アラインメントのためのタンパク質を正確に目印付けすることによって、前記ソフトウェアは、タンパク質染色の強度に基づいてタンパク質の上方又は下方調節を測定する。3つのゲル画像のPDQuest分析を、3つのゲルのすべての間で上方及び下方制御されたタンパク質を強調表示した図2に示したが、よりはっきりと、両方の胎児ゲルに存在し、且つ、成人ゲルに欠けている1つのタンパク質種を見つけた。クマシー・ブルーによる対比染色後に、タンパク質スポットを各ゲルから切り出し、そして、MALDI分析を依頼した。胎児ゲルと成人ゲルの両方に存在する1つのタンパク質種は、MALDI-TOF分析によってHSP-60であると同定された。胎児ゲル画像内のHSP-60の位置を、図3の中で強調表示した。図3Aに示した成人膜からのタンパク質のゲル内にHSP-60が存在していないことを発見することができた。
【００５１】
熱ショック・タンパク質60が胎児細胞表面に特異的であることの確認
胎児赤血球系細胞表面に特異的なマーカーとしてのHSP-60の可能性を確認するために、ディファレンシャル・ゲル電気泳動（DIGE）分析を上記サンプルに対して実施した。DIGEは、二次元電気泳動の前にタンパク質サンプルに標識するために蛍光色素を利用し、そして、1つのゲル上で最大3つのサンプルを同時に分離し、そして、可視化するのを可能にする。色素Cy2、Cy3、及びCy5が一般的に使用され、同じゲルの3つの異なったスキャンを実施できるようにそれぞれ異なった励起波長をもっていて、各画像がそれぞれの個々のタンパク質サンプルに相当している。次に、その画像を1つにまとめ、そして、DeCyder（Amersham）などの画像解析ソフトウェアを使用して、それらの相違点を断定した。各色素がタンパク質濃度の変動に線形応答することが保証されているので、この技術は定量的である。標識に偏りがないことを保証するために、相互染色が用いられる。R1R1細胞からの成人細胞サンプルを、図4に示されているようにそれぞれの胎児サンプルと一緒に泳動した。その図中に強調表示されているように、HSP-60が胎児細胞表面に特異的であることが再び示された。
【００５２】
DeCyderソフトウェアは、3つのゲルの比較中に3つのサンプルすべての間で、たくさんの上方及び下方調節されたタンパク質を強調表示した。各ゲルを単独で分析した、すなわち、成人と胎児のゲルの間の相違点を判定し、そして、（その上、2つの胎児サンプル間の相違点を組み込んで）2つのゲルの相違点を互いに比較した。前と同じように、HSP-60を表すスポットは、両方の胎児サンプルに存在し、且つ、成人サンプルに存在していないものとして強調表示された。各ゲルのHSP-60に関するソフトウェア解析画面を、図5に示す。具体的には、図5Aと5Bの比較によって、当業者は、HSP-60が胎児サンプルからの膜中だけに存在していることがわかる（これらの図面の右側の3D像）。
【００５３】
熱ショック・タンパク質60の存在又は不存在を判定するための、成人及び胎児の赤血球系細胞膜のウェスタンブロット分析
先に記載したように、HSP-60が胎児にのみ存在し、且つ、成人赤血球系細胞膜中に存在していないことを2つの技術によって確認したので、より多くのサンプル中のこのタンパク質のウェスタンブロット分析を可能にするために、抗HSP-60抗体をBD Biosciencesから購入した。成熟赤血球を、成人献血者、又は妊娠期間の様々な段階の胎児赤血球系細胞のいずれかから単離した。次に、赤血球系細胞を低浸透圧による溶解にかけて、精製された膜（又は「ゴースト」）を作り出し、そして、SDS-PAGE及び抗HSP-60を使用したとウェスタンブロット分析にかけた。赤血球系細胞膜を、無作為抽出した成人、26週の胎児、39週の胎児（すなわち、臍帯血）、及び母体の成人赤血球膜（妊娠15週間）を含めた様々な起源から単離した。図6は、6人の成人献血者由来の膜と、抗HSP-60との反応性を完全に欠いていることを例証し、そして、このタンパク質の胎児特異性を裏付けている。重要なことには、HSP-60は臍帯サンプル（出産）中に非常に低レベルで発現されているらしく、HSP-60の表面発現が胎児特異的であることのさらなる証明を提供している。39週に、胎児から新生児への赤血球系細胞の移行が起こり、そして、細胞は低酸素環境下にない。
【００５４】
臍帯血からのCD34＋幹細胞の分離に続いて産生された胎児赤芽球が、HSP-60の細胞表面発現を示すことを、蛍光タンパク質標識技術を使用して実証した（データ未掲載）。成人からの等価細胞が、そのタンパク質の細胞内局所化を示す。
【００５５】
非侵襲的出生前診断向けの、母体血液サンプルからの胎児赤芽球の単離のための2種類の赤芽球マーカー−グリコホリンA（CD235a）及びHSP-60を用いた赤芽球の二重標識方法
先に明確に概説した作業が、膜局在HSP-60が成人赤芽球ではなく、胎児に特異的であることを実証した。しかしながら、膜局在HSP-60は、白血球などの成人単核細胞の有意な割合（5〜26%）で見られた（図7及び図9パネルBを参照のこと）。そのため、発明者は、それら赤血球に特異的なマーカーであるグリコホリンA（CD235a）を発現しないという事実に基づく成人単核HSP-60＋画分の排除によって、母体血液サンプルから胎児赤芽球を濃縮又は精製する方法を開発した。二重陽性GPA及びHSP-60＋細胞は、成人サンプルで基本的に不存在であるが（図7及び9を参照のこと）、しかし、胎児臍帯サンプル中に存在している、わずかであるが、有意な割合の胎児単核細胞（すなわち、赤芽球）が、HSP-60及びGPAに関して二重陽性である（図8及び10）。これらの二重標識細胞は、非侵襲的出生前診断における使用のための特異的な標的細胞型である。
【００５６】
成人白血球層サンプル及び臍帯血（胎児39週、出産）サンプルを、以下のプロトコールに従って処理した：
1）30mlのそれぞれのサンプルを、Sigma Accuspin histopaqueカラムに添加し、そして1000×g、18〜26℃にて15分間遠心分離した。
2）血漿層は取り去り、そして、単核細胞層を50ml容falconチューブに移した。
3）細胞を、25mlのPBSで洗浄し、そして、2,000rpm、18〜26℃にて10分間の遠心分離によってペレットにした。
4）細胞ペレットを、25mlの赤血球溶解バッファー（150mMの塩化アンモニウム、130μMのEDTA、10mMの重炭酸カリウム）中に再懸濁し、そして、ロッカー内に置いて、室温にて10分間の一定の混合を促した。
【００５７】
5）細胞を、2,000rpmにて10分間の遠心分離によりペレットにした。
6）細胞を、1mlのPBS中に再懸濁し、そして、細胞カウントを光学顕微鏡と血球計算器を使用して実施した。
7）各サンプルからの1×106個の細胞を、100μlの終量で、10μlのPE接合抗CD235a（GPA）及び10μlのFETC接合抗HSP-60モノクローナル抗体に加えた。
8）そして、標識反応物を冷蔵庫内に30分間置いた。
9）3,000rpmにて5分間卓上遠心分離機により細胞をペレットにし、そして、上清を取り除くことによって、非結合抗体を洗い落とした。
10）細胞を2mlのPBSで2回洗浄した。
11）細胞を、最終的に、500μlのPBS中に再懸濁し、そして、FACSマシンにより分析した。
【００５８】
FL1-Hチャンネル＝FITC
FL2-Hチャンネル＝PE
負の対照：
1）非標識細胞
2）アイソタイプ対照−マウスIgG1 FITC＋マウスIgG1 RPE
【００５９】
抗体：
FITC接合抗Hsp60（アイソタイプ・マウスIgG1）
RPE接合抗CD235a（グリコホリンA）（アイソタイプ・マウスIgG1）
【００６０】
図7には、3つの異なった成人サンプルを示し、そして、図8には、3つの異なった胎児サンプルを示し、両方のマーカーについてそれらのパーセンテージ（ゲート（gated））発現を伴う。（すなわち、有意水準のGPA及びHSP-60をもつ）成人二重標識細胞は、陰性アイソタイプ対照サンプルに対して類似したパターンを示す。5.12〜26.72%に及ぶ、成人末梢血中の非赤血球単核細胞における有意水準のHSP-60の発現がある。胎児二重標識細胞は、陰性アイソタイプ対照サンプルに対して有意に高いレベルの発現を示す。これは、知られている、胎児血液中の高い割合の循環赤芽球と一致する。
【００６１】
図9では、GPAを保有する細胞の発現様式を、FL2チャンネルにより分析しながら、FL1チャンネルによりHSP-60のそれを分析した。成人赤芽球を、パネルC及びDの左上の象限内に視覚化される。図10において、同様に、GPAを保有する細胞の発現様式を、FL2チャンネルにより分析しながら、FL1チャンネルによりHSP-60のそれを分析した。この図では、胎児赤芽球は、パネルC及びDの左上及び右上の象限内に視覚化される。有意な数の胎児赤芽球が、（それらのGPA発現によって規定されるように）HSP-60の発現を欠いている（パネルD、上部左側の象限を参照のこと）。これは妊娠中の胎児赤血球系細胞上のHSP-60の強い発現に相当するが、発現は胎児臍帯赤血球細胞膜上に減弱したレベルで存在している（図6）。
【００６２】
（フローサイトメトリーによってここで分析される）臍帯血と比較して、HSP-60発現が妊娠中に赤血球系細胞において有意に強いという知見は、二重標識アプローチが母体血液からの胎児赤芽球の単離手段であることを示している。そのため、リガンドとしてグリコホリンA及びHSP-60を使用する細胞単離プロトコール（磁気活性化セル・ソーティング、MACS、又はフロー活性化セル・ソーティング、FACS）を使用した精製戦略は、胎児赤芽球の濃縮又は精製に通じる。そして、これらの細胞が、胎児物質の起源として胎児細胞を使用した非侵襲的出生前診断をさらに開発するために、下流の診断アッセイに使用され得る。
【００６３】
赤血球に特異的である赤血球系細胞の表面又は細胞質上のあらゆる表面マーカー（炭水化物抗原若しくは赤血球タンパク質）（例えば、Rhタンパク質、Rh関連糖タンパク質、グリコホリンB、C、又はD；Kell糖タンパク質）が、HSP-60と結合するマーカーの選択を置き換えることができる。
【００６４】
胎児特異的酵素としてのモノアミン・オキシダーゼA（MAOA）とモノアミン・オキシダーゼB（MAOB）の識別
酵素MAOA及びMAOBをコードする遺伝子を、胎児赤芽球において上方制御されるものとして同定した。そして、その酵素を、成人骨髄及び胎児臍帯cDNAの定量的なリアルタイムPCR分析によって、胎児特異的なものであると確認した。
【００６５】
MAOA特異的プライマー、及びMAOB特異的プライマーを使用して、グリコホリンA＋赤芽球由来のcDNAを、増幅し、そして、SYBR緑色色素を使用することで検出した。MAOAとMAOBのmRNAの両方が、胎児臍帯から単離した赤芽球で発現されているが、成人由来の赤芽球から発現されていないことが、図11に示した結果から明らかである。MAOAとMAOBを高レベルで発現することが知られている陽性対照（胎盤cDNA）が含まれた。標準化対照であるグリセルアルデヒド-3-リン酸ヒドロゲナーゼ（G3PDH）は、3つのサンプル間で発現に差異がないことを示した。
【００６６】
胎児細胞におけるこれらの酵素の発現は、先に記載の胎児細胞表面マーカーHSP-60について記載した胎児細胞を選択又は濃縮する異なった方法、及び潜在的に無料の方法（potentially complimentary method）に通じ得る。選択的な培養は、胎児細胞においてこれらの酵素によって別に代謝される十分に特徴づけられた基質、例えば、セロトニン、エピネフリン、及びノルエピネフリン、の使用によって使用され得る。MAOAは、セロトニン及びアドレナリンを選択的に酸化させ；MAOBは、フェニルエチルアミン、ベンジルアミン、及びチラミンを選択的に酸化させ；両モノアミン・オキシダーゼは、ドーパミンを酸化させる。あるいは、蛍光標識／プローブが、胎児細胞内でのみ産生される基質代謝生成物の視覚化を可能にするために利用され得る。これらの基質は、胎児細胞内に存在しているモノアミン・オキシダーゼによって蛍光生成物に変換されるだろう。そのようなプローブが、最近、文献中に記載されている（Chen et al. (2005) J. Am. Chem. Soc. 127 4544-4545）。この技術は、蛍光基質を産生するモノアミン・オキシダーゼを発現する胎児赤芽球を、母体の等価物から均質に分離することを可能にするところの、FACSベースのアプローチを胎児細胞と母体細胞の分離に利用することを可能にするだろう。
【００６７】
母体細胞と比較して、胎児細胞において上方制御されるものとしての様々なマーカーの識別
図2に示した3つのゲル画像のPDQuest分析を、図12に示す。いくつかのタンパク質を、母体膜と比較して、胎膜においてより高度に発現されるものとして同定した。先に議論したHSP-60と同様に、他のタンパク質を、GRP78、HSP-7C、MYL4、及びEF1A1（丸く囲んだ）と同定した。
【００６８】
成人及び胎児の培養赤芽球の原形質膜タンパク質の分析
最も初期の造血前駆体は、細胞表面マーカーのCD34をもっている。このマーカーを、幹細胞を単離するのに利用し、そして、特定のサイトカイン・カクテルへの暴露によって、その細胞を赤血球系統に後押しした。
【００６９】
臍帯血又は成人末梢血白血球層を、Histopaque上に層状にした。遠心分離の後に、サンプルを、上部の血漿層、有核細胞を含む界面層、及び下部の赤血球層に分離させた。界面層を、取り出し、洗浄し、そして、あらゆる残留赤血球を溶解させた。次に、サンプルを、CD34に対するビオチン化抗体で磁気的に標識し、そして、MiniMACSシステムを使用して磁場内のカラムを通過させる（Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit、Miltenyi Biotec）。標識したCD34+細胞を、磁気カラム内に保持する一方で、標識されていない細胞を結合せずに貫流させた。そして、MiniMACSカラムを、磁場から取り出し、そして、CD34+細胞をカラムから溶出した。CD34+細胞を、エリスロポイエチン（3U/ml）、幹細胞因子（10ng/ml）、IL-3（1ng/ml）、低密度リポタンパク質（40μg/ml）、及びFK506/プログラフ（0.1ng/ml）を補った無血清培地（StemSpan、Stem Cell Technologies）中で培養した。それらを、1×105細胞/mlの濃度に維持し、そして、赤芽球段階を経て不確定幹細胞から赤血球系経路を経由して分化させた。
1×107個の胎児及び成人の培養赤芽球からの原形質膜タンパク質の分画を、製造業者の取扱説明書に従ってQproteome Plasma Membrane Protein Kit（QIAGEN）を使用して実施した。そして、分離したタンパク質を、TCA沈殿によって濃縮し、そして、2Dゲル電気泳動を実施した。図13は、得られたSypro Ruby染色ゲルの拡大領域を示す。
【００７０】
胎児及び成人サンプルから単離したタンパク質の数と発現レベルの明確な相違が明らかである。質量分析は、胎児赤芽球特異的タンパク質のビンキュリン（受入P18206、丸A）とDnaJ相同体サブファミリーBメンバー14（受入 Q8TBM8、丸B）の識別を可能にした。タンパク質のデスモプラキン（受入P15924、丸C）とAMMECR1様タンパク質（受入Q6DCA0、丸D）が胎児細胞において上方制御されることが示された。また、成人細胞において上方制御されることが示された細胞外マトリックス・タンパク質2前駆タンパク質（受入O94769、丸E）も同定した。
【００７１】
マーカーとしてHSP-60を使用した母体末梢血からの胎児赤芽球の単離
一例として以下に大まかに示されるように、HSP-60などの胎児細胞特異的マーカーを母体末梢血からの胎児赤芽球の単離に使用し得る：
1．母体末梢血サンプル（10〜20 mL）を採取する。
2．密度遠心分離／赤血球の溶解を実施して、Histopaque（登録商標）又はFicoll（登録商標）密度分離媒質を使用して、母体末梢血サンプルから有核細胞を単離する。あるいは、本発明によるマーカーの使用によって直接的に末梢血サンプルからのシングル・ステップ細胞単離手順を使用することで、有核血球細胞濃縮手順が必要ないかもしれない。
3．抗HSP-60被覆ビーズを使用して、胎児赤芽球のイムノ・アフィニティー分離を実施する。
【００７２】
3a．場合により、母体末梢血サンプルから（胎児と母体の両方の）赤芽球を単離するために、抗HSP-60の使用に先立って、（例えば）抗グリコホリンAビーズを使用した赤芽球の予備的な分離が実施され得る。
3b．ステップ3aに代わる手段として、抗HSP-60の使用後に、例えば、抗グリコホリンAビーズの使用によって、細胞膜上にHSP-60を発現する非赤芽球細胞から胎児赤芽球を分離し得る。
【００７３】
4．胎児赤芽球を溶出する。
5．ワンステップ洗浄剤ベースの方法を使用して、細胞を溶解させ、そして、包括的な増幅プロトコールを使用したDNAの前濃縮のあるなしにかかわらず、サーモサイクリング・プロトコールを使用して単独細胞ゲノムDNA増幅をすぐに開始する。
6．例えば、遺伝病マーカーの多重連結反応依存プローブ分析（MLPA）、定量的な蛍光PCR分析、PCR増幅手順、DNAチップ、DNA配列分析のためにこの遺伝物質を使用する。
【００７４】
マーカーとしてMAOA又はMAOBを使用した母体末梢血からの胎児赤芽球の分離
一例として以下に大まかに示されるように、MAOA又はMAOBなどの胎児細胞特異的マーカーを、母体末梢血からの胎児赤芽球の分離に使用することができる：
1．母体末梢血サンプル（10〜20mls）を採取する。
2．密度遠心分離／赤血球の溶解を実施して、有核細胞を単離する。
3．場合により、（例えば）抗グリコホリンA磁性ビーズを使用して赤芽球の予備的な単離又は濃縮を実施することができる。
4．細胞内に輸送され、そして、MAOA又はMAOBの作用によって蛍光生成物に変換される色素と共に赤芽球を、適宜インキューベートする。
【００７５】
5．フロー活性化セルソーター（又は細胞を分離する他の手段）を使用して、成人赤芽球から胎児のものを仕分ける。
6．ワンステップ洗浄剤ベースの方法を使用して、細胞を溶解させ、そして、サーモサイクリング・プロトコールを使用して単独細胞ゲノムDNA増幅をすぐに開始する。
7．例えば、遺伝病マーカーのMLPA分析、PCR増幅手順、遺伝子チップ、DNA配列分析のためにこの遺伝物質を使用する。
【図１】
2010500018.tif 000002
【図２Ａ】
2010500018.tif 000003
【図２Ｂ】
2010500018.tif 000004
【図２Ｃ】
2010500018.tif 000005
【図３Ａ】
2010500018.tif 000006
【図３Ｂ】
2010500018.tif 000007
【図３Ｃ】
2010500018.tif 000008
【図４Ａ】
2010500018.tif 000009
【図４Ｂ】
2010500018.tif 000010
【図５Ａ】
2010500018.tif 000011
【図５Ｂ】
2010500018.tif 000012
【図６】
2010500018.tif 000013
【図７】
2010500018.tif 000014
【図８】
2010500018.tif 000015
【図９】
2010500018.tif 000016
【図１０】
2010500018.tif 000017
【図１１】
2010500018.tif 000018
【図１２】
2010500018.tif 000019
【図１３】
2010500018.tif 000020
【国際調査報告】
2010500018.tif 000021
2010500018.tif 000022
2010500018.tif 000023