(57)【要約】  本発明は、少なくとも部分的に、骨芽細胞及び破骨細胞の分化及び／又は活性に関与する分子の同定に基づく。従って、本発明は、骨形成、石灰化及び／又は破骨細胞形成の修飾物質の同定法、及び、骨形成、石灰化及び／又は破骨細胞形成の修飾が有益であろう障害を、ここで解説する通りに同定された作用物質を用いて処置する方法を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成及び石灰化を増加させる際に有用な化合物を同定する方法であって、
ａ）TAOK2、DLG1、PIN1、LYK5、MOBKL2C、MAP4K2、PACSIN2、DCAMKL1、DOCK4、PARG1、TAOK3、TRPV6、CLK1、AAK1、PRKCA、AKAP8、DGKI、SMARCB1、CIB2、STK33、STK39、NRGN、PIK3R1、RASSF5、FRAP1、STK38、LATS1、LATS2、STK38L、GEFT、TNNI3K、STK4、RAF1、ARF1、C17orf31、EXO1、POT1、TERF2IP、MSH2、DKC1、MOBKL1A、MAP3K11、WWP2、及びSMURF2から成る群より選択される骨芽細胞調節物質、又はその生物学的に活性なフラグメントを含む指標組成物を提供するステップと；
ｂ）前記指標組成物を、検査化合物のライブラリの各メンバーに接触させるステップと；
ｃ）検査化合物の存在下及び非存在下における骨芽細胞調節物質の発現及び／又は活性を評価することで、骨形成及び石灰化を増加させる化合物を同定するステップ
とを含む、方法。
【請求項２】
前記指標組成物が細胞性組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記指標組成物が無細胞組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記骨芽細胞調節物質が正の調節物質であり、前記化合物が、前記調節物質の発現及び又は活性を増加させることにより、骨形成及び石灰化を増加させる際に有用であるとして同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記骨芽細胞調節物質が負の調節物質であり、前記化合物が、前記調節物質の発現及び／又は活性を減少させることにより、骨形成及び石灰化を増加させるとして同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
骨形成及び石灰化を増加させる際に有用な化合物を同定する方法であって、
ａ） TAOK2、DLG1、PIN1、LYK5、MOBKL2C、MAP4K2、PACSIN2、DCAMKL1、DOCK4、PARG1、TAOK3、TRPV6、CLK1、AAK1、PRKCA、AKAP8、DGKI、SMARCB1、CIB2、STK33、STK39、NRGN、PIK3R1、RASSF5、FRAP1、STK38、LATS1、LATS2、STK38L、GEFT、TNNI3K、STK4、RAF1、ARF1、C17orf31、EXO1、POT1、TERF2IP、MSH2、DKC1、MOBKL1A、MAP3K11、WWP2、及びSMURF2から成る群より選択される骨芽細胞調節物質又はその生物学的に活性な部分を含む間葉幹細胞を提供するステップと；;
ｂ）前記細胞を検査化合物のライブラリの各メンバーに接触させるステップと；
ｃ）検査化合物のライブラリから、間葉幹細胞の骨芽細胞への分化を修飾する目的化合物を選抜することにより、骨形成及び石灰化を増加させる化合物を同定するステップ
とを含む、方法。
【請求項７】
前記骨芽細胞調節物質が正の調節物質であり、前記化合物が、間葉幹細胞の骨芽細胞への分化を増加させることにより、
骨形成及び石灰化を増加させる際に有用であるとして同定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記骨芽細胞調節物質が負の調節物質であり、前記化合物が、間葉幹細胞の骨芽細胞への分化を減少させることにより、骨形成及び石灰化を増加させるとして同定される、請求項６に記載の方法。 
【請求項９】
骨形成及び石灰化を増加させる際に有用な化合物を同定する方法であって、
ａ）GCK、WASF1、PPP2CB、PPP2R1A、CREBBP、CUL3、FBXW11、MELK、PLCL1、MAP3K3、DLGH1、NEK7、IRAK3、RHOC、SLC4A2、PLCB4、B-RAF、BMPR2、MAPK3、及びNHEDC2から成る群より選択される破骨細胞調節物質、又はその生物学的に活性なフラグメントを含む指標組成物を提供するステップと；
ｂ）前記指標組成物を、検査化合物のライブラリの各メンバーと接触させるステップと；
ｃ）検査化合物の存在下及び非存在下における破骨細胞調節物質の発現及び／又は活性を評価することにより、骨形成及び石灰化を増加させる化合物を同定するステップ
とを含む、方法。
【請求項１０】
前記指標組成物が細胞性組成物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記指標組成物が無細胞組成物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記破骨細胞調節物質が正の調節物質であり、前記化合物が前記調節物質の発現及び／又は活性を減少させることにより骨形成及び石灰化を増加させる際に有用であるとして同定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記骨芽細胞調節物質が負の調節物質であり、前記化合物が前記調節物質の発現及び／又は活性を増加させることにより骨形成及び石灰化を増加させるとして同定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
骨形成及び石灰化を増加させる際に有用な化合物を同定する方法であって、
ａ） GCK、WASF1、PPP2CB、PPP2R1A、CREBBP、CUL3、FBXW11、MELK、PLCL1、MAP3K3、DLGH1、NEK7、IRAK3、RHOC、SLC4A2、PLCB4、B-RAF、BMPR2、MAPK3、及びNHEDC2から成る群より選択される破骨細胞調節物質又はその生物学的に活性な部分を含む造血幹細胞を提供するステップと；
ｂ）前記細胞を検査化合物のライブラリの各メンバーに接触させるステップと；
ｃ）検査化合物のライブラリから、造血幹細胞の破骨細胞への分化を修飾する目的化合物を選抜することで、骨形成及び石灰化を増加させる化合物を同定するステップ
とを含む、方法。
【請求項１５】
前記破骨細胞調節物質が正の調節物質であり、前記化合物が、造血幹細胞の破骨細胞への分化を減少させることにより骨形成及び石灰化を増加させる際に有用であるとして同定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記骨芽細胞調節物質が負の調節物質であり、前記化合物が、造血幹細胞の破骨細胞への分化を増加させることにより骨形成及び石灰化を増加させるとして同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記指標細胞が骨芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記骨芽細胞が成熟骨芽細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記指標細胞が間葉幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記指標細胞が破骨細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
前記指標細胞が造血幹細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
前記指標細胞が組換え発現ベクタを含む、請求項１、６、９、及び１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記組換え発現ベクタが、骨芽細胞調節物質に特異的なshRNA分子を含むレンチウィルスベクタである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組換え発現ベクタが、破骨細胞調節物質に特異的なshRNA分子を含むレンチウィルスベクタである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が高スループットの方法である、請求項６又は１４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が９６ウェル・フォーマットで行われる、請求項２５に記載の高スループットの方法。
【請求項２７】
間葉幹細胞分化に対する目的検査化合物の効果が、細胞内アルカリホスファターゼ（ALP）のレベルを判定することにより評価される、請求項６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞内アルカリホスファターゼ(ALP)のレベルに対する目的検査化合物の効果が、比色検定法により評価される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
アラマー・ブルー染色により、細胞数を細胞内アルカリホスファターゼ（ALP）のレベルに正規化するステップを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
石灰化に対する目的検査化合物の効果を評価するステップを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項３１】
石灰化に対する目的検査化合物の効果の評価が、キシレノール・オレンジ染色により判定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
BSP、ColI(α)1、OCN、RANKL、RSK2、RUNX2、Dlx-5、Msx-2、ALP、WWP1、及び ATF4から成る群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現のレベルを判定するステップを更に含む、請求項１又は６に記載の方法。
【請求項３３】
造血幹細胞分化に対する目的検査化合物の効果が、TRAPのレベルを判定することにより評価される、請求項１４に記載の方法。
【請求項３４】
TRAPレベルに対する目的検査化合物の効果が比色検定法により評価される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
アラマー・ブルー染色により、細胞数をTRAPのレベルに正規化するステップを更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
吸収窩の形成に対する目的検査化合物の効果を評価するステップを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３７】
吸収窩の形成に対する目的検査化合物の効果の評価が、フォン・コッサ染色により判定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
NFATc1、TRAP、カテプシンK、MMP9、β3-インテグリン、及びカルシトニンから成る群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを判定するステップを更に含む、請求項９又は１４に記載の方法。
【請求項３９】
非ヒト成体動物において骨形成及び石灰化に対する目的検査化合物の効果を判定するステップを更に含む、請求項１、６、９、及び１４のいずれかに記載の方法であって、前記動物に検査化合物を投与するステップと、前記検査化合物の存在下及び非存在下における骨形成及び石灰化に対する前記検査化合物の効果を判定するステップであって、前記非ヒト動物における骨形成及び石灰化の増加は、骨形成及び石灰化を増加させる化合物として目的検査化合物を同定するものである、方法。
【請求項４０】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
骨形成及び石灰化が小柱数を測定することにより判定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
骨形成及び石灰化が小柱の厚さを測定することにより判定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
骨形成及び石灰化が小柱の間隔を測定することにより判定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
骨形成及び石灰化が骨体積を測定することにより判定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
骨形成及び石灰化が体積的骨ミネラル密度を測定することにより判定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
骨形成及び石灰化が、小柱数を測定する、小柱の厚さを測定する、小柱の間隔を測定する、骨体積を測定する、そして体積的骨ミネラル密度を測定することにより、判定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
Trabp5b 及びデオキシピリジノリン
(Dpd)の血清レベルを判定するステップを更に含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
骨形成及び石灰化を増加させる方法であって、骨形成及び石灰化が増加するように、骨芽細胞中の負の骨芽細胞調節物質又は正の破骨細胞調節物質の発現及び／又は生物学的活性を減少させる作用物質に骨芽細胞を接触させるステップを含む、方法。
【請求項４９】
対象において骨形成及び石灰化の増加が有益であろう疾患、障害、状態、又は傷害を処置又は防止する方法であって、対象における骨形成及び石灰化が増加するように、対象由来の骨芽細胞を、骨芽細胞中の負の骨芽細胞調節物質又は正の破骨細胞調節物質の発現及び／又は生物学的活性を減少させる作用物質に接触させるステップを含む、方法。
【請求項５０】
骨形成及び石灰化が減少するように、骨芽細胞中の正の骨芽細胞調節物質又は負の破骨細胞調節物質の発現及び／又は生物学的活性を増加させる作用物質に接触させるステップを含む、骨形成及び石灰化を減少させる方法。
【請求項５１】
対象において骨形成及び石灰化の減少が有益であろう疾患、障害、状態、又は傷害を処置又は防止する方法であって、対象における骨形成及び石灰化が減少するように、対象由来の骨芽細胞を、骨芽細胞中の正の骨芽細胞調節物質又は負の破骨細胞調節物質の発現及び／又は生物学的活性を減少させる作用物質に接触させるステップを含む、方法。
【請求項５２】
前記接触させるステップがin vitroで行われる、請求項４８乃至５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記接触させるステップがin vivoで行われる、請求項４８乃至５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記作用物質が表面上に存在する、請求項４８乃至５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記疾患、障害、状態、又は傷害が、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、及び奇形性骨炎（骨のページェット病）から成る群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記疾患、障害、状態、又は傷害が、頭蓋骨癒合症及び硬化性骨炎から成る群より選択される、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、引用をもってその内容全体をここに援用することとする、２００７年５月２９日に出願された標題「造骨活性及び破骨活性の調節に関与する分子、並びにその使用法」の米国仮出願第60/932,101号に基づく優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
骨は動的な組織であり、その基質成分は、骨格の構造上の一体性を保存するために継続的にリモデルされている。骨のリモデリングは、正常な生理条件下では骨の再吸収がかつて起きた部位だけで骨の形成が起きるという周期的なプロセスである。恒常性による骨格リモデリングは、排他的ではないが主に、破骨細胞及び骨芽細胞により媒介されている (Erlebacher, A., et al. (1995).
Cell 80, 371-378)。破骨細胞は造血系由来の巨大な多核細胞であり、骨の再吸収を担う。骨芽細胞は間葉幹細胞から発生し、骨形成表面上で基質成分を合成する。これらの細胞の増殖、分化及び骨リモデリング活性には、成長因子、シグナル伝達タンパク質、及び転写因子の複雑な時間的ネットワークが関与している (Karsenty, G., and Wagner, E. F. (2002). Dev Cell 2, 389-406)。いずれか一つの成分が調節不全になるとリモデリング・プロセスが破壊され、骨粗鬆症及びページェット病などの特定の骨格障害の病理に寄与することがある。総称して大理石骨病と呼ばれる、歯骨細胞の欠陥を原因とする骨質量上昇にいたる稀な単一遺伝子障害が特定されてきた。もっと稀なのは、骨質量上昇の原因が骨芽細胞活性の内因的上昇を原因とする、総称して骨硬化症と呼ばれる、カメラチ-エンゲルマン症候群を例とする単一遺伝子障害である。
【０００３】
骨格障害及び骨消失に現在利用できる処置法は、骨芽細胞による骨形成又は破骨細胞による骨吸収のいずれを標的とするかに関係なく不充分である。これらの細胞種における分子上及び細胞上の標的に関する知見が乏しいことが、新しい治療薬発見の障害となっている。このように、造骨細胞活性及び／又は破骨細胞活性に影響を与える因子を更に解明することが、骨形成及び石灰化を修飾することのできる作用物質の特定において価値があるであろう。このような作用物質や、このような作用物質の特定や、このような作用物質の使用法は、骨形成を増加又は減少させると有益であろう障害の処置において大きな利点があるであろう。
【０００４】
発明の概要
本発明は、少なくとも部分的に、骨芽細胞及び破骨細胞の分化及び／又は活性に関与する分子の特定に基づく。具体的には、RNAiベースのスクリーニングにより、骨芽細胞形成の調節分子及び破骨細胞形成の調節物質が特定された。
【０００５】
従ってある局面では、本発明は、TAOK2、DLG1、PIN1、LYK5、MOBKL2C、MAP4K2、PACSIN2、DCAMKL1、DOCK4、PARG1、TAOK3、TRPV6、CLK1、AAK1、PRKCA、AKAP8、DGKI、SMARCB1、CIB2、STK33、STK39、NRGN、PIK3R1、RASSF5、FRAP1、STK38、LATS1、LATS2、STK38L、GEFT、TNNI3K、STK4、RAF1、ARF1、C17orf31、EXO1、POT1、TERF2IP、MSH2、DKC1、MOBKL1A、MAP3K11、WWP2、及びSMURF2から成る群より選択される骨芽細胞調節物質又はその生物学的に活性なフラグメントを含む指標組成物を提供するステップと、前記指標組成物を、一ライブラリの検査化合物の各メンバーに接触させるステップと、前記検査化合物の存在下及び非存在下における前記骨芽細胞調節物質の発現及び／又は活性を評価することで、骨形成及び石灰化を増加させる化合物を特定するステップとを含む、骨形成及び石灰化を増加させる方法に関する。ある実施態様では、前記指標組成物は細胞性組成物である。別の実施態様では、前記指標組成物は無細胞組成物である。ある実施態様では、前記骨芽細胞調節物質は正の調節物質であり、前記化合物は、前記調節物質の発現及び／又は活性を増加させることにより骨形成及び石灰化を増加させる際に有用であると特定される。別の実施態様では、前記骨芽細胞調節物質は負の調節物質であり、前記化合物は、前記調節物質の発現及び／又は活性を減少させることにより骨形成及び石灰化を増加させるとして特定される。
【０００６】
更に本発明は、TAOK2、DLG1、PIN1、LYK5、MOBKL2C、MAP4K2、PACSIN2、DCAMKL1、DOCK4、PARG1、TAOK3、TRPV6、CLK1、AAK1、PRKCA、AKAP8、DGKI、SMARCB1、CIB2、STK33、STK39、NRGN、PIK3R1、RASSF5、FRAP1、STK38、LATS1、LATS2、STK38L、GEFT、TNNI3K、STK4、RAF1、ARF1、C17orf31、EXO1、POT1、TERF2IP、MSH2、DKC1、MOBKL1A、MAP3K11、WWP2、及びSMURF2、から成る群より選択される骨芽細胞調節物質又はその生物学的に活性なフラグメントを含む間葉幹細胞を提供するステップと、前記細胞を、一ライブラリの検査化合物の各メンバーに接触させるステップと、前記検査化合物のライブラリから、間葉幹細胞の骨芽細胞への分化を修飾する目的化合物を選抜することで、骨形成及び石灰化を増加させる化合物を特定するステップとを含む、骨形成及び石灰化を増加させる際に有用である化合物を特定する方法も提供する。ある実施態様では、前記骨芽細胞調節物質は正の調節物質であり、前記化合物は、間葉幹細胞の骨芽細胞への分化を増加させることにより骨形成及び石灰化を増加させる際に有用であると特定される。別の実施態様では、前記骨芽細胞調節物質は負の調節物質であり、前記化合物は、間葉幹細胞の骨芽細胞への分化を減少させることにより骨形成及び石灰化を増加させるとして特定される。
【０００７】
別の局面では、本発明は、GCK、WASF1、PPP2CB、PPP2R1A、CREBBP、CUL3、FBXW11、MELK、PLCL1、MAP3K3、DLGH1、NEK7、IRAK3、RHOC、SLC4A2、PLCB4、及びB-RAF、BMPR2、MAPK3、及びNHEDC2から成る群より選択される破骨細胞調節物質又はそれらの生物学的に活性なフラグメントを含む指標組成物を提供するステップと、
前記指標組成物を、一ライブラリの検査化合物の各メンバーに接触させるステップと、前記検査化合物の存在下及び非存在下における前記破骨細胞調節物質の発現及び／又は活性を評価することで、骨形成及び石灰化を増加させる化合物を特定するステップとを含む、骨形成及び石灰化を増加させる際に有用な化合物を特定する方法を提供するものである。ある実施態様では、前記指標組成物は細胞性組成物である。別の実施態様では、前記指標組成物は無細胞組成物である。ある実施態様では、前記破骨細胞調節物質は正の調節物質であり、前記化合物は、前記調節物質の発現及び／又は活性を減少させることにより、骨形成及び石灰化を増加させる際に有用である。別の実施態様では、前記骨芽細胞調節物質は負の調節物質であり、前記化合物は、前記調節物質の発現及び／又は活性を増加させることにより骨形成及び石灰化を増加させるとして特定される。
【０００８】
更に本発明は、GCK、WASF1、PPP2CB、PPP2R1A、CREBBP、CUL3、FBXW11、MELK、PLCL1、MAP3K3、DLGH1、NEK7、IRAK3、RHOC、SLC4A2、PLCB4、及び B-RAF、BMPR2、MAPK3、及びNHEDC2から成る群より選択される破骨細胞調節物質又はその生物学的に活性な部分を含む造血幹細胞を提供するステップと、前記細胞を、一ライブラリの検査化合物の各メンバーに接触させるステップと、前記検査化合物のライブラリから、造血幹細胞の破骨細胞への分化を修飾する目的化合物を選抜することで、骨形成及び石灰化を増加させる化合物を特定するステップとを含む、骨形成及び石灰化を増加させる際に有用である化合物を特定する方法も提供する。ある実施態様では、前記破骨細胞調節物質は正の調節物質であり、前記化合物は造血幹細胞の破骨細胞への分化を減少させることにより骨形成及び石灰化を増加させる際に有用であると特定される。別の実施態様では、前記骨芽細胞調節物質は負の調節物質であり、前記化合物は、造血幹細胞の破骨細胞への分化を増加させることにより骨形成及び石灰化を増加させる際に有用であると特定される。
【０００９】
本発明の方法のある実施態様では、前記指標細胞は骨芽細胞である。ある実施態様では、前記骨芽細胞は成熟骨芽細胞である。ある実施態様では、前記指標細胞は間葉幹細胞である。別の実施態様では、前記指標細胞は破骨細胞である。ある実施態様では、前記指標細胞は造血幹細胞である。
【００１０】
本発明の方法のある実施態様では、前記指標細胞は組換え発現ベクタを含む。ある実施態様では、前記組換え発現ベクタは、破骨細胞調節物質shRNAを含むレンチウィルスベクタである。
【００１１】
本発明の方法のある実施態様では、前記方法は高スループットの方法である。ある実施態様では、前記方法は９６-ウェル・フォーマットで行われる。
【００１２】
ある実施態様では、間葉幹細胞分化に対する前記目的の検査化合物の効果は、細胞内アルカリホスファターゼ（ALP）のレベルを判定することにより、評価される。ある実施態様では、細胞内アルカリホスファターゼ（ALP）のレベルに対する前記目的の検査化合物の効果は、比色検定法により評価される。ある実施態様では、本発明の前記方法は、アラマー・ブルー染色法により、細胞内のアルカリホスファターゼ（ALP）のレベルに正常細胞数を正規化するステップを更に含む。ある実施態様では、本発明の方法は、石灰化に対する目的の検査化合物の効果を評価するステップを更に含む。ある実施態様では、石灰化に対する目的の検査化合物の効果の評価は、キシレノール・オレンジ染色により判定される。
【００１３】
ある実施態様では、本発明の方法は、BSP、ColI(a)1、OCN、Osterix、RANKL、RSK2、RUNX2、Dlx-5、Msx-2、ALP、WWP1、及びATF4から成る群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを判定するステップを更に含む。
【００１４】
ある実施態様では、造血幹細胞分化に対する前記目的の検査化合物の効果が、TRAPのレベルを判定することにより評価される。ある実施態様では、TRAPのレベルに対する前記目的の検査化合物の効果が、比色検定法により評価される。ある実施態様では、本発明のほほ右派、アラマー・ブルー染色法により、細胞数をTRAPのレベルに正規化するステップを更に含む。ある実施態様では、本発明の方法は、吸収窩の形成に対する前記目的化合物の効果を評価するステップを更に含む。ある実施態様では、吸収窩の形成に対する前記目的の検査化合物の効果の評価は、フォン-コッサ染色法により判定される。ある実施態様では、本発明の方法は、NFATc1、TRAP、カテプシンK、MMP9、β3-インテグリン、及びカルシトニン受容体から成る群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを判定する方法を更に含む。
【００１５】
ある実施態様では、本発明の方法は、非ヒト成熟動物において骨形成及び石灰化に対する目的の検査化合物の効果を判定するステップを更に含み、該ステップには、前記動物に前記検査化合物を投与するステップと、前記検査化合物の存在下及び非存在下における骨形成及び石灰化に対する前記検査化合物の効果を判定するステップとが含まれ、この場合、非ヒト動物における骨形成及び石灰化での増加は、前記目的の検査化合物を、骨形成及び石灰化を増加させる化合物として、特定するものである。ある実施態様では、前記非ヒト動物はマウスである。ある実施態様では、骨形成及び石灰化は小柱数を測定することにより、判定される。別の実施態様では、骨形成及び石灰化は、小柱の厚さを測定することにより、判定される。別の実施態様では、骨形成及び石灰化は、小柱の間隔を測定することにより、判定される。更に別の実施態様では、骨形成及び石灰化は、骨の体積を測定することにより、判定される。ある実施態様では、骨形成及び石灰化は、体積的骨ミネラル密度を測定することにより、判定される。別の実施態様では、骨形成及び石灰化は、小柱数を測定すること、小柱の厚さを測定すること、小柱の間隔を測定すること、骨体積を測定すること、及び体積的な骨ミネラル密度を測定することにより、判定される。ある実施態様では、本発明の方法は、Trabp5b 及びデオキシピリジノリン(Dpd)の血清レベルを判定するステップを更に含む。
【００１６】
別の局面では、本発明は、骨形成及び石灰化を増加させる方法を提供するものであり、本方法は、骨芽細胞
を、負の骨芽細胞調節物質又は正の破骨細胞調節物質の発現及び／又は生物活性を減少させる作用物質に、骨形成及び石灰化が増加するように骨芽細胞の存在下で接触させるステップを含む。
【００１７】
本発明の更に別の局面は、対象において骨形成及び石灰化が増加すると有益であろう疾患、障害、状態、又は傷害を処置又は予防する方法であり、本方法は、前記対象由来の骨芽細胞を、負の骨芽細胞調節物質又は正の破骨細胞調節物質の発現及び／又は生物活性を減少させる作用物質に、対象における骨形成及び石灰化が増加するように骨芽細胞の存在下で接触させるステップを含む。
【００１８】
更に本発明は、骨形成及び石灰化を減少させる方法も提供するものであり、本方法は、骨芽細胞を、正の骨芽細胞調節物質又は負の破骨細胞調節物質の発現及び／又は生物活性を減少させる作用物質に、骨形成及び石灰化が減少するように骨芽細胞の存在下で接触させるステップを含む。
【００１９】
別の局面では、本発明は、対象において骨形成及び石灰化が増加すると有益であろう疾患、障害、状態、又は傷害を処置又は予防する方法を提供するものであり、本方法は、前記対象由来の骨芽細胞を、正の骨芽細胞調節物質又は負の破骨細胞調節物質の発現及び／又は生物活性を増加させる作用物質に、対象における骨形成及び石灰化が増加するように骨芽細胞の存在下で接触させるステップを含む。
【００２０】
ある実施態様では、前記接触させるステップはin vitroで行われる。別の実施態様では、前記接触させるステップは in vivoで行われる。ある実施態様では、前記作用物質は表面上に存在する。ある実施態様では、前記疾患、障害、状態、又は傷害は、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、及び
奇形性骨炎（骨のページェット病）から成る群より選択される。別の実施態様では、前記疾患、障害、状態、又は傷害は頭蓋骨癒合症及び硬化性骨炎から成る群より選択される。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、破骨細胞の分化及び／又は活性に関与する分子、即ち、破骨細胞分化に参与する分子、の特定に基づく。具体的には、RNAiベースのスクリーニングにより、破骨細胞形成の正及び負の調節物質の両者が特定された。特定された破骨細胞分化の正の調節物質には、例えば、GCK、WASF1、PPP2CB、PPP2R1A、CREBBP、MAP3K14 (NIK)、CUL3、FBXW11、MELK、PLCL1、SYK、FRAP1、MAP3K3、DLGH1、NEK7、SFPI1 (Pu.1)、IRAK3、IKBKB (IKKb)、RHOC、SLC4A2、PLCB4、及びB-RAFがある。特定された、破骨細胞分化の負の調節物質には、例えば、BMPR2、MAPK3、及びNHEDC2がある。
【００２２】
更に本発明は、少なくとも部分的に、骨芽細胞の分化及び／又は活性に関与する分子、即ち骨芽細胞分化に参与する分子、の特定にも基づく。具体的には、RNAiベースのスクリーニングにより、骨芽細胞形成の負の調節物質が特定された。特定された骨芽細胞分化の負の調節物質には、例えば、TAOK2、DLG1、PIN1、LYK5、MOBKL2C、MAP4K2、PACSIN2、DCAMKL1、DOCK4、PARG1、TAOK3、TRPV6、CLK1、AAK1、PRKCA、AKAP8、DGKI、SMARCB1、CIB2、STK33、STK39、NRGN、PIK3R1、RASSF5、FRAP1、STK38、LATS1、LATS2、STK38L、GEFT、TNNI3K、STK4、RAF1、ARF1、C17orf31、EXO1、POT1、TERF2IP、MSH2、DKC1、MOBKL1A、MAP3K11、WWP2、及びSMURF2がある。
【００２３】
従って本発明は、これらの骨芽細胞又は破骨細胞調節物質の発現及び／又は活性を修飾することにより骨形成及び石灰化の修飾物質を特定する方法や、骨芽細胞調節物質及び／又は破骨細胞調節物質の発現及び／又は活性を修飾する作用物質を用いて骨形成及び石灰化を修飾する方法を提供するものである。
【００２４】
本発明の多様な局面を以下の小項で更に詳述する。
【００２５】
Ｉ．  定義
ここで用いられる場合の用語「骨形成及び石灰化」とは、骨細胞外マトリックスのコラーゲン性前駆物質を合成したり、骨を形成するための前記マトリックスの石灰化や骨のリモデリング及び再形成したりする際のそれらの機能を調節する、骨芽細胞の細胞活性を言い、例えば骨質量は、骨を形成する骨芽細胞とそれを破壊する破骨細胞との間の活性のバランスにより維持されている。このように、ここで用いられる場合の用語「骨形成及び石灰化」には、骨性組織を吸収及び除去する、という破骨細胞の細胞活性、即ち破骨細胞形成、も含まれる。骨の石灰化は、タイプＩコラーゲン及び多種の非コラーゲン性タンパク質から成る細胞外マトリックス中の炭酸ハイドロキシアパタイト結晶の沈着により起きる。
【００２６】
ここで用いられる場合の「骨芽細胞」は間葉性骨前駆細胞を由来とする骨形成性細胞であり、骨細胞として密閉されたときに骨マトリックスを形成する。成熟骨芽細胞はin vivoで骨細胞外マトリックスを形成することのできるものであり、in vitroでは細胞外マトリックスの発生を反映するその鉱化結節形成能により同定することができる。未熟骨芽細胞は鉱化結節をin vitro で形成することができない。
【００２７】
ここで用いられる場合の「破骨細胞」は、造血幹細胞を由来とする豊富な好酸性細胞質を持つ巨大な多核細胞であり、骨性組織の吸収及び除去で機能する。破骨細胞は副甲状腺ホルモンの存在下で高度に活性になり、骨再吸収の増加及び骨塩（リン、及び特にカルシウム）の細胞外液への放出を起こさせる。破骨細胞はまた、再吸収中のアクチン環構造及び極性細胞体の形成や、カルシトニンに応答した収縮でも特定される。成熟破骨細胞は酵素酒石酸塩耐抵抗性酸性ホスファターゼ (TRAP)の分泌に基づいても特定できるが、その前駆細胞ではこれは起きない。
【００２８】
ここで用いられる場合の用語「骨芽細胞調節物質」とは、骨芽細胞形成の調節物質として特定された、ここで記載される分子を言う。「正の骨芽細胞調節物質」とは、その発現又は活性が上方調節されたときに骨芽細胞が発生し、ひいては骨形成及び石灰化を増加させるものである。正の骨芽細胞調節物質の発現及び／又は活性の下方調節は、骨芽細胞の発生の阻害を引き起こし、ひいては骨形成及び石灰化の減少をもたらす。反対に、「負の骨芽細胞調節物質」とは、その発現又は活性が下方調節されたときに骨芽細胞の発生を増加させ、ひいては骨形成及び石灰化を増加させるものである。負の骨芽細胞調節物質の発現及び／又は活性の上方修飾は、骨芽細胞の発生の阻害、ひいては骨形成及び石灰化の減少をもたらすであろう。負の骨芽細胞調節物質の例には、例えば、TAOK2、DLG1、PIN1、LYK5、MOBKL2C、MAP4K2、PACSIN2、DCAMKL1、DOCK4、PARG1、TAOK3、TRPV6、CLK1、AAK1、PRKCA、AKAP8、DGKI、SMARCB1、CIB2、STK33、STK39、NRGN、PIK3R1、RASSF5、FRAP1、STK38、LATS1、LATS2、STK38L、GEFT、TNNI3K、STK4、RAF1、ARF1、C17orf31、EXO1、POT1、TERF2IP、MSH2、DKC1、MOBKL1A、MAP3K11、WWP2、及びSMURF2がある。
【００２９】
同様に、用語「破骨細胞調節物質」とは、破骨細胞形成の調節物質として特定された、ここで記載される分子を言う。「正の破骨細胞調節物質」とは、その発現又は活性が下方調節されたときに
破骨細胞発生を減少させ、ひいては骨形成及び石灰化を増加させるものである。正の破骨細胞調節物質の発現及び／又は活性の上方修飾は、破骨細胞の発生の増加、ひいては骨形成及び石灰化の減少をもたらすであろう。反対に、「負の破骨細胞調節物質」とは、その発現又は活性が上方調節されたときに破骨細胞形成が減少し、ひいては骨形成及び石灰化を減少させる分子である。負の破骨細胞調節物質の発現及び／又は活性の下方修飾は
破骨細胞発生の減少、ひいては骨形成及び石灰化の増加をもたらす。正の破骨細胞調節物質の例には、例えば、GCK、WASF1、PPP2CB、PPP2R1A、CREBBP、MAP3K14 (NIK)、CUL3、FBXW11、MELK、PLCL1、SYK、FRAP1、MAP3K3、DLGH1、NEK7、SFPI1 (Pu.1)、IRAK3、IKBKB (IKKb)、RHOC、SLC4A2、PLCB4、及びB-RAFがある。負の破骨細胞調節物質の例には、例えば、BMPR2、MAPK3、及びNHEDC2がある。
【００３０】
ある実施態様では、調節物質（骨芽細胞又は破骨細胞の、正の又は負の）はキナーゼである。別の実施態様では、調節物質はホスファターゼである。別の実施態様では、調節物質はユビキチンリガーゼである。
【００３１】
ここで用いられる場合の用語「Gck」は、「グルコキナーゼ（ヘキソキナーゼ4、若年の成人発症型糖尿病２）」、「EC 2.7.1.1」、「GK」、「GLK」、「グルコキナーゼ」、「HHF3」、「HK4」、「HKIV」、「HXKP」、「ヘキソキナーゼ-4」、「ヘキソキナーゼ-D」、及び「MODY2」とも言及され、ヘキソキナーゼ、タイプＩ (142600) 乃至ＩＶ（グルコキナーゼ）と呼ばれる酵素のファミリーの構造上及び機能上固有のメンバーを言う。このファミリーの酵素は、解糖の最初のステップでグルコースの６番目の炭素位置でのリン酸化を触媒する。グルコキナーゼは哺乳動物の肝臓及びすい臓島ベータ細胞でのみ発現する。その固有の機能上の特徴のために、この酵素は糖代謝において重要な調節的役割を果たす。肝臓及びすい臓における糖代謝の速度はこの酵素の活性の関数である。グルコキナーゼ遺伝子の欠陥が、非インシュリン依存性糖尿病(NIDDM)の遺伝的易罹患性への寄与について長らく疑われてきた。レビューについては、例えばS. Baltrusch and M. Tiedge (2006) Diabetes 55:S55-S64を参照されたい。
【００３２】
ヒトGckには三つのアイソフォームがあり、そのアミノ酸配列が公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:4503951、gi:15967159、及びgi:15967161に見ることができる。ヒトGckの三つの転写産物バリアントのヌクレオチド配列は例えばGenBank登録番号gi:15967157、gi:15967158、及びgi:15967160に見ることができる。マウスGckのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号gi:118129970に見ることができる。
【００３３】
ここで用いられる場合の用語「Wasf1」は「ウィスコット-アルドリッチ症候群タンパク質ファミリーメンバー1」、「WAS タンパク質ファミリーメンバー1」、「FLJ31482」、「KIAA0269」、「SCAR1」、「WAVE」、 及び「WAVE1」とも呼ばれ、チロシン・キナーゼ受容体及び小型GTPaseからのシグナルのアクチン骨格への伝達に関与する下流エフェクタ分子を言う。このようなシグナルの伝達は細胞の形態変化及び運動性にとって重要である。レビューについては、例えば Higgs and Pollard (2001) Annu
Rev Biochem. 70:649-76を参照されたい。
【００３４】
ヒトWasf1に四つのアイソフォームがあり、そのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:68161500、gi:68161502、gi:68161504、及びgi:4507913に見ることができる。ヒトWasf1の四つの転写産物バリアントのヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 gi:68161499、gi:68161501、gi:68161503、及びgi:68161486に見ることができる。マウスWasf1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenbank 登録番号 gi:31982605に見ることができる。
【００３５】
ここで用いられる場合の用語「Ppp2cb」は「タンパク質ホスファターゼ 2 （以前の2A、触媒サブユニット、ベータ・アイソフォーム）」、「EC 3.1.3.16」、「PP2A-ベータ」、及び「PP2CB」とも呼ばれ、タンパク質ホスファターゼ2のベータ・サブユニットを言う。タンパク質ホスファターゼ2は４つの主要なセリン／スレオニンホスファターゼの一つであり、細胞成長及び分裂の負の調節に関与している。それは通常のヘテロマー核の酵素から成るが、この酵素は触媒性のサブユニットと定常調節的サブユニットから成り、この定常調節的サブユニットは多種の調節的サブユニットと結び付く。Ppp2cb遺伝子は該触媒サブユニットのベータ・アイソフォームをコードしている。例えばZhou, J., et al. (2003) Biochem J. 369(Pt 2):387-98を参照されたい。
【００３６】
ヒトPpp2cbには二つのアイソフォームがあり、そのアミノ酸配列は公知であり、例えば GenBank 登録番号 gi:57222565 及びgi:4758952に見ることができる。ヒトPpp2cbの二つの転写産物バリアントのヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 gi:57222564
及びgi:57634540に見ることができる。マウスPpp2cbのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:119672926に見ることができる。
【００３７】
ここで用いられる場合の用語「Ppp2r1a」は「タンパク質ホスファターゼ 2 （以前の2A）、調節的 サブユニットA、アルファアイソフォーム」、「MGC786」、及び「PR65A」とも呼ばれ、タンパク質ホスファターゼ2の定常調節的サブユニットを言う。タンパク質ホスファターゼ2 は４つの主要なセリン／スレオニンホスファターゼの一つであり、細胞成長及び分裂の負の調節に関与している。それは通常のヘテロマー核の酵素から成るが、この酵素は触媒性のサブユニットと定常調節的サブユニットから成り、この定常調節的サブユニットは多種の調節的サブユニットと結び付く。定常調節的サブユニットA は触媒サブユニットと可変の調節的Bサブユニットとの集合を調和させる足場分子として役立つ。Ppp2r1a 遺伝子は定常調節的サブユニットAのアルファアイソフォームをコードしている。
【００３８】
ヒトPpp2r1a のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:21361399に見ることができる。ヒトPpp2r1のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:32455242に見ることができる。マウスPpp2cb のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:118131166に見ることができる。
【００３９】
ここで用いられる場合の用語「Crebbp」は「CREB結合タンパク質（ルービンスタイン-タイビ症候群）」、「CBP」、「EC 2.3.1.48」、「RSTS」、及び「RTS」とも呼ばれ、RNAポリメラーゼＩＩ媒介型転写の当業で公知の転写コアクチベータを言う。レビューについては例えばJohannessen, M., et al.
(2004) Cell Signal. 16(11):1211-27を参照されたい。
【００４０】
ヒトCrebbpには二つのアイソフォームがあり、そのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:119943102 及びgi:119943104に見ることができる。ヒトCrebbpの二つの転写産物バリアントのヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号
gi:119943101 及びgi:119943103に見ることができる。マウスCrebbpのヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:70995310に見ることができる。
【００４１】
ここで用いられる場合の用語「Map3k14」は「マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ14」、「EC 2.7.11.25」、「FTDCR1B」、「HS」、「HSNIK」、「HsNIK」及び「NIK」とも呼ばれ、TNF-アルファ、IL1、及びFAS 抗原に応答した転写因子NF-カッパ-Bの活性化に関与すると共にシグナル伝達因子TRAF2に結合する当業で公知のセリン／スレオニンキナーゼを言う。例えばMalinin NL et al MAP3K-related kinase involved in NF-kappaB
induction by TNF, CD95 and IL-1. Nature 385: 540-544 (1997); Matsushima A et al
Essential role of nuclear factor (NF)-kappa-B-inducing kinase and inhibitor of
kappa-B (I-kappa-B)  alpha in NF-kappa-B
activation through lymphotoxin beta receptor, but not through tumor necrosis
factor receptor I. Journal of Experimental Medicine 193: 631-636 (2001); Yin L
et al Defective lymphotoxin-beta receptor-induced NF-kappa-B transcriptional
activity in NIK-deficient mice. Science 291: 2162-2165 (2001)を参照されたい。
【００４２】
ヒトMap3k14 のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:115298645に見ることができる。ヒトMap3k14cのヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 gi:115298644に見ることができる。マウスMap3k14のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:142388182に見ることができる。
【００４３】
ここで用いられる場合の用語「Cul3」は、「cullin 3」及び「KIAA0617」とも呼ばれ、26Sプロテアソームによるユビキチン依存的分解の基質を標的とするSCF (Skp1-キューリン-F-box) E3 ユビキチンリガーゼファミリーのメンバーを言う。レビューについては例えばWillems AR, et al. (2004) Biochim Biophys Acta.1695(1-3):133-70 及びPintard L, et al. (2004) EMBO J.
23(8):1681-7を参照されたい。
【００４４】
ヒトCul3のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:4503165に見ることができる。ヒトCul3 のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:45827792に見ることができる。マウスCul3 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えば GenBank 登録番号 gi:142388897に見られよう。
【００４５】
ここで用いられる場合の用語「Fbxw11」は「F-ボックス及びWD反復ドメイン含有11」、「BTRC2」、「BTRCP2」、「FBW1B」、「FBXW1B」、「Fbw11」、「Fbw1b」、「Hos」及び
「KIAA0696」とも呼ばれ、リン酸化依存的ユビキチン化で機能するSCF（SKP1、キューリン）と呼ばれるモジュラーE3ユビキチンタンパク質リガーゼの成分を言う。例えばSuzuki H, et al. (1999) Biochem Biophys Res Commun.
5;256(1):127-32を参照されたい。
【００４６】
ヒトFbxw11には三つのアイソフォームがあり、そのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:48928050、gi:48928046、及びgi:48928048に見ることができる。ヒトFbxw11の三つの転写産物バリアントのヌクレオチド配列は、例えばGenBank 登録番号 gi:48928049、gi:48928045、及びgi:48928047に見ることができる。マウスFbxw11のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 gi:118129917に見ることができる。
【００４７】
ここで用いられる場合の用語「Melk」は、「母系胎性ロイシン・ジッパーキナーゼ」、「EC 2.7.11.1」、「HPK38」、「KIAA0175」、「OTTHUMP00000046113」、「hMELK」、及び「hPK38」とも呼ばれ、幹細胞更新、細胞周期進行、及びプレ-mRNA スプライシングに関与する当業で公知のセリン／スレオニンキナーゼを言う。例えばBeullens M, et al. (2005) J Biol Chem. 280(48):40003-11を参照されたい。
【００４８】
ヒトMelk のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:7661974に見ることができる。ヒトMelkのヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:41281490に見ることができる。マウスMelk のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:31981625に見られよう。
【００４９】
ここで用いられる場合の用語 「Plcl1」は、「ホスホリパーゼC-様1」、「MGC126580」、「MGC138190」、「PLC-L」、「PLCE」、「PLCL」、及び「PLDL1」とも呼ばれ、ヒト小細胞肺癌でホモ接合型で欠失していることが示されている分子を言う。Plcl1 のホスホリパーゼC遺伝子に対する相同性から、それがイノシトールホスホリピド・ベースの細胞内シグナリング・カスケードに関与していることが分かる。例えばKohno et al. (1995) Hum.
Molec. Genet. 4: 667-674を参照されたい。
【００５０】
ヒトPlcl1のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:5453912に見ることができる。ヒトPlcl1 のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:5453911に見ることができる。ラットPlcl1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:16758195に見られよう。
【００５１】
ここで用いられる場合の用語「Frap1」は「FK506結合タンパク質12-ラパマイシン関連タンパク質1」、「FLJ44809」、「FRAP」、「FRAP2」、「MTOR」、「RAFT1」、「RAPT1」、及び「mTOR」とも呼ばれ、DNA損傷及び栄養分枯渇などのストレスに対する細胞応答を媒介するホスファチジルイノシトールキナーゼ関連キナーゼ・ファミリーの一つを言う。このタンパク質はFKBP12-ラパマイシン複合体の細胞周期停止及び免疫抑制効果の標的として作用する。例えば Findlay GM, et al. (2007) Biochem
J. 403(1):13-20を参照されたい。
【００５２】
ヒトFrap1 のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:4826730に見ることができる。ヒトFrap1のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:19924298に見ることができる。マウスFrap1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:9910227に見られよう。
【００５３】
ここで用いられる場合の用語「Map3k3」は、「マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ3」、「EC 2.7.11.25」、「MAPKKK3」、及び「MEKK3」とも呼ばれ、セリン／スレオニンキナーゼのMekk/Ste11 ファミリーに属すると共に、成長因子、酸化ストレス、及び高浸透圧条件に応答してキナーゼMEK5を活性化及びリン酸化するMAP-キナーゼ・シグナリングカスケードのメンバーである分子を言う。MEKK3 はストレス活性化タンパク質キナーゼ(SAPK) 及び細胞外シグナル調節性タンパク質キナーゼ (ERK) 経路を、SEK 及びMEK1/2を活性化することにより直接、調節する。更に、MEKK3はIL1-R 及びTLR4の、IKK-NFkB 及びJNK-p38 MAPK経路を通じたシグナリングにとって重要である。例えばEllinger-Ziegelbauer,
H., et al. (1997). J. Biol. Chem. 272: 2668-2674を参照されたい。
【００５４】
ヒトMap3k3には二つのアイソフォームがあり、そのアミノ酸配列は公知であり、例えば GenBank 登録番号 gi:42794765 及びgi:42794767に見ることができる。ヒトMap3k3の二つの転写産物バリアントのヌクレオチド配列は例えば GenBank 登録番号 gi:42794764
及びgi:42794766に見ることができる。マウスMap3k3のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えば GenBank 登録番号 gi:142362504に見ることができる。
【００５５】
ここで用いられる場合の用語「Dlgh1」は「discs、大型ホモログ1 (ドゥロソフィラ)」、 「DKFZp761P0818」、「DLGH1」、「SAP-97」、「SAP97」、「dJ1061C18.1.1」、「hDlg」、及び「hdlg」とも呼ばれ、ドゥロソフィラ-リーサル（原語：Drosophila lethal） (1) discs
larige-1 (dlg) 腫瘍抑制因子のヒトホモログを言う。例えば Round JL, et al. (2007) Nat Immunol.8(2):154-61を参照されたい。
【００５６】
ヒトDlgh1のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:4758162に見ることができる。ヒトDlgh1のヌクレオチド配列は例えば
GenBank 登録番号 gi:4758161に見ることができる。マウスDlgh1 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:40254641に見られよう。
【００５７】
ここで用いられる場合の用語 「Nek7」は「NIMA （ネヴァー・イン・マイトーシス・ジーン・エー（原語：「never in mitosis
gene a」)-関連キナーゼ7」及び 「EC 2.7.11.1」とも呼ばれ、有糸分裂の開始を制御する、アスペルギルス-ニドゥランス（原語：Aspergillus nidulans）「ネヴァー・イン・マイトーシス・ジーン・エー」遺伝子の遺伝子産物に対して高いアミノ酸配列同一性を持つセリン／スレオニンタンパク質キナーゼを言う。例えばBelham C, et al. (2003) J Biol Chem. 12;278(37):34897-909を参照されたい。
【００５８】
ヒトNek7のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:19424132に見ることができる。ヒトNek7 のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:19424131に見ることができる。マウスNek7 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:118130435に見られよう。
【００５９】
ここで用いられる場合の用語「Irak3」は「インターロイキン-1受容体関連キナーゼ3」、「IRAK-3」及び「IRAK-M」とも呼ばれ、インターロイキン (IL)-1受容体 (IL-1R)-関連キナーゼ・ファミリーのセリン／スレオニンタンパク質キナーゼを言う。例えばLi H, et al. (2005) J Exp Med. 201(7):1169-77を参照されたい。
【００６０】
ヒトIrak3のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:6005792に見ることができる。ヒトIrak3のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:6005791に見ることができる。マウスIrak3 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:142380077に見られよう。
【００６１】
ここで用いられる場合の用語 「B-raf」は「BRAF1」、「EC 2.7.11.1」、「MGC126806」、「MGC138284」、「RAFB1」、及びp94 とも呼ばれ、数多くの癌で関連が示唆されているセリン／スレオニンタンパク質キナーゼを言う。例えばChadee DN, et al. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 103(12):4463-8を参照されたい。
【００６２】
ヒトB-raf のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:33188459に見ることができる。ヒトB-raf のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:90265828に見ることができる。ラットB-raf のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:109471940に見られよう。
【００６３】
ここで用いられる場合の用語 「Bmpr2」は 「骨形態発生タンパク質受容体、タイプ II (セリン／スレオニンキナーゼ)」、「BMPR-II」、「BMPR3」、「BMR2」、「BRK-3」、「EC 2.7.11.30」、「PPH1」、及び「T-ALK」とも呼ばれ、膜貫通型セリン/スレオニンキナーゼの骨形態発生タンパク質（BMP）受容体ファミリーの一メンバーを言う。この受容体のリガンドは、TGF-ベータスーパーファミリーのメンバーである BMPである。BMPは軟骨性骨形成及び胚発生に関与している。これらのタンパク質はそれらのシグナルを二つの異なる種類のセリン（スレオニン）キナーゼ受容体：約 50-55 kDのタイプＩ受容体 及び約70-80 kDのタイプII受容体のヘテロマー型複合体の形成を通じて伝達する。タイプII受容体はタイプI受容体の非存在下でリガンドに結合するが、それらには各々のタイプI受容体が、シグナル伝達には必要であり、他方、タイプI受容体は各々のタイプII受容体をリガンド結合に必要とする。これらの遺伝子での変異が、原発性肺高血圧症に関連付けられている。
【００６４】
ヒトBmpr2のアミノ酸配列が公知であり、例えば GenBank 登録番号 gi:15451916に見ることができる。ヒトBmpr2のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:72376969に見ることができる。ラットBmpr2 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:145966831に見られよう。
【００６５】
ここで用いられる場合の用語 「Mapk3」は 「マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ3」、「EC 2.7.11.24」、「ERK-1」、「ERK1」、「ERT2」、「HS44KDAP」、「HUMKER1A」、「MGC20180」、「P44ERK1」、「P44MAPK」、「PRKM3」、「p44-ERK1」、「p44-MAPK」、「p44erk1」、及び「p44mapk」とも呼ばれ、ELK-1などの数多くの転写因子をリン酸化することにより、様々な細胞において減数分裂、有糸分裂、及び有糸分裂後機能の開始及び調節の両方に関与しているセリン/スレオニンキナーゼを言う。EIF4EBP1のリン酸化は翻訳の開始に必要である。微小管関連タンパク質2 (MAP2)のリン酸化。Todd JL, et al. (1999) J Biol Chem.
274(19):13271-80を参照されたい。
【００６６】
ヒトMapk3には二つのアイソフォームがあり、そのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:91718897 及びgi:91718899に見ることができる。ヒトMapk3の二つの転写産物バリアントのヌクレオチド配列は例えば GenBank 登録番号 gi:91718896及びgi:91718898に見ることができる。マウスMapk3のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:93102422に見ることができる。
【００６７】
ここで用いられる場合の用語「MOBKL1A」は「MOB1、Mps ワン・バインダー（原語：One
Binder ）キナーゼタクチベータ様1A (酵母)」、「MATS2」、「MGC339」、「MOB4A」、「Mob1A」及び「Mob1B」とも呼ばれ、Mats（Mob アズ・チューマー・サプレッサ（原語：as tumor suppressor）と呼ばれるMob1スーパーファミリーに属するドゥロソフィラタンパク質のヒト・オーソログを言う。ドゥロソフィラにおいては、Mats は成長阻害剤として働き、Mats機能が失われると細胞増殖が増し、アポトーシスに欠陥が生じ、そして組織過剰成長の誘導が起きる。例えばLai, Z.-Cet al. Cell 120: 675-685, 2005を参照されたい。哺乳動物においては、Mob1 は有糸分裂脱出の 調節物質 であり（有糸分裂チェックポイント遺伝子）、Lats2と結びついてその活性化を誘導する。例えばSasaki H, et al. (2007) Clin Lung Cancer. 8(4):273-6を参照されたい。
【００６８】
ヒトMOBKL1Aのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:27735029に見ることができる。ヒトMOBKL1Aのヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:41406062に見ることができる。マウスMOBKL1Aのヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:118600996に見ることができる。
【００６９】
ここで用いられる場合の用語 「DKC1」は「先天性角化異常症 1」、「ジスケリン」、「EC 5.4.99」、「NAP57」、「NOLA4」、及び「XAP101」とも呼ばれ、H/ACA 小型核内リボヌクレオタンパク質 (H/ACA snoRNP) 複合体の触媒性サブユニットである核内タンパク質を言い、rRNAのプソイドウリジル化を触媒すると共にリボソームの生合成およびテロメア維持にとって、テロメラーゼ・リバース転写酵素(TERT)ホロ酵素のRNA成分であるTERCの適正なプロセッシング又は核内輸送のために必要である。
【００７０】
ヒトDKC1のアミノ酸配列は公知であり、例えば GenBank 登録番号 gi:4503337に見ることができる。ヒトDKC1 のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:15011921に見ることができる。
【００７１】
ここで用いられる場合の用語 「MSH2」 は「mutS ホモログ2」、「結腸癌、非ポリープ症性タイプ1 (E. coli)」、「COCA1」、「FCC1」、「HNPCC」、及び「HNPCC1」とも呼ばれ、E. coli MutS 遺伝子に相同でありDNAミスマッチ修復に関与している。MSH2 遺伝子に変異があると遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌-1が生じる。
【００７２】
ヒトMSH2のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:4557761に見ることができる。ヒトMSH2 のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:4557760に見ることができる。マウスMSH2 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:118130707に見ることができる。
【００７３】
ここで用いられる場合の用語 「TERF2IP」は、「テロメア反復結合因子2、相互作用性タンパク質」、「DRIP5」、「RAP1」、及び「hRap1」 とも呼ばれ、テロメアに召集はされるが、DNA自体には直接結合しないタンパク質を言う。Li, B.; Oestreich, S.; de Lange, T. Cell 101: 471-483, 2000を参照されたい。
【００７４】
ヒトTERF2IPのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:52627149に見ることができる。ヒトTERF2IP のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:52627148に見ることができる。マウスTERF2IP のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:15618998に見ることができる。
【００７５】
ここで用いられる場合の用語 「POT1」は「POT1 プロテクション・オブ・テロメア 1 ホモログ (S. pombe)」、「DKFZP586D211」、「DKFZp586D211」、及び「hPot1」 とも呼ばれ、それ自体のテロメア反復配列のＧリッチな鎖に結合することで染色体末端を保護する、幅広く分岐した真核生物に渡って保存されたタンパク質を言う。Baumann, P.; Cech, T. R. Science 292: 1171-1175, 2001を参照されたい。
【００７６】
ヒトPOT1には二つのアイソフォームがあり、そのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:110671314及び gi:98991776に見ることができる。ヒトPOT1 の二つの転写産物バリアントのヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号
gi:110671313 及びgi:98991775に見ることができる。マウスPOT1 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:146149244に見ることができる。
【００７７】
ここで用いられる場合の用語 「EXO1」は 「エキソヌクレアーゼ1」、及び「HEX1」とも呼ばれ、RAD2 ヌクレアーゼ・ファミリーのメンバーを言い、DNA複製、修復、及び組換えにおいて5-プライム-to-3-プライム極性によるエンドヌクレアーゼ活性で機能する。Genschel, J.; Bazemore, L. R.; Modrich, P. J. Biol. Chem. 277: 13302-13311,
2002を参照されたい。
【００７８】
ヒトEXO1には三つのアイソフォームがあり、そのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:39995069、gi:39995071、及びgi:18491016に見ることができる。ヒトEXO1の三つの転写産物バリアントのヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 gi:39995068、gi:39995070、及びgi:39995067に見ることができる。マウスEXO1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:141801186に見ることができる。
【００７９】
ここで用いられる場合の用語 「C17orf31」は「SMG6」、「Smg-6 ホモログ, ナンセンス媒介型mRNA 崩壊因子 (C. elegans)」、「EST1A」、「Est1p-like」、「KIAA0732」、「SMG-6」、及び「hSmg5/7」とも呼ばれ、テロメラーゼRNAとは独立にTERTと相互作用するテロメラーゼ・リボヌクレオタンパク質複合体の成分を言う。C17orf31 は一本さ5'-(GTGTGG)(4)GTGT-3'
テロメリックDNAに結合するが、テロメラーゼRNAテンプレート成分(TER)には結合しない。それは更に
PP2A触媒性サブユニットであるSMG1、RENT1、RENT2 及びRENT3Bとも相互作用する。 Fukuhara, N.; at al. Molec. Cell 17:
537-547, 2005を参照されたい。
【００８０】
ヒトC17orf31のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:115511020に見ることができる。ヒトC17orf31 のヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 gi:115511019に見ることができる。マウスC17orf31のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:50582544に見ることができる。
【００８１】
ここで用いられる場合の用語 「ARF1」は 「ADP-リボシル化因子 1」とも呼ばれ、ADP-リボシルトランスフェラーゼであるコレラ毒素触媒性サブユニットのアロステリックな活性化因子として働くGTP結合性タンパク質であるRasファミリーのタンパク質の一員を言う。それは様々な区画の中でのタンパク質輸送に関与し、ゴルジ体内でベシクルの出芽及び脱外被を修飾する。ARFGAPタンパク質により媒介される、ARGF-1結合GTPの加水分解が、ゴルジ膜及びベシクルからのコートタンパク質の解離に必要である。Gillingham A, Munro S. Annu Rev Cell Dev Biol. 2006を参照されたい。
【００８２】
ヒトARF1には四つのアイソフォームがあり、そのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:66879660、gi:66879662、gi:66879664、及びgi:4502201に見ることができる。ヒト ARF1の四つの転写産物バリアントのヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 gi:66879659、gi:66879661、gi:66879663、及びgi:66879658に見ることができる。マウスARF1 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:31560734に見ることができる。
【００８３】
ここで用いられる場合の用語「RAF1」は 「v-raf-1 マウス白血病ウィルス性腫瘍遺伝子ホモログ 1」、及び「c-raf」とも呼ばれ、RIN1によって拮抗されるRasタンパク質と相互作用するタンパク質を言う。RAF1は哺乳動物無菌20-様キナーゼの活性化を抑制することでアポトーシスに拮抗する。RAF1 は、そのタンパク質キナーゼ活性とは独立に、MST2の活性化ループの二量体化及びリン酸化を妨げる。MST2 をRaf1-ヌルマウス又はヒト細胞から枯渇させるとアポトーシスに対する感受性が損なわれ、他方、MST2が過剰発現するとアポトーシスが誘導された。反対に、Raf1 をRaf1 +/+ マウス又はヒト細胞から枯渇させると MST2 活性化及びアポトーシスが起きた。RAF1
及びMST2 の両方を同時に枯渇させるとアポトーシスが妨げられた。 O'Neill, E.; et al.
Science 306: 2267-2270, 2004を参照されたい。
【００８４】
ヒトRAF1のアミノ酸配列は公知であり、例えば GenBank 登録番号 gi:4506401に見ることができる。ヒトRAF1 のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:52486392に見ることができる。マウスRAF1 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:14238003に見ることができる。
【００８５】
ここで用いられる場合の用語「STK4」は「セリン/スレオニンキナーゼ4」、「DKFZp686A2068」、「EC 2.7.11.1」、「KRS2」、「MST-1」、MST1」、及び「YSK3」とも呼ばれ、ストレス活性化性のアポトーシス誘導性キナーゼを言い、カスパーゼ分裂後に核内に進入してクロマチン凝縮を誘導し、これにヌクレオソーム間DNA分断化が続く。アポトーシス中、STK4
はヒストンH2Bの'Ser-14'をリン酸化する。酸化ストレスによりFOXO3がリン酸化するとそれが核内へ転位し、細胞死が開始する。Lehtinen MK, et al. Cell. 2006 125(5):987-1001を参照されたい。
【００８６】
ヒトSTK4 のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:5454096に見ることができる。ヒトSTK4のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:38327560に見ることができる。マウスSTK4 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えば GenBank 登録番号 gi:142361509に見ることができる。
【００８７】
ここで用いられる場合の用語 「TNNI3K」は 「TNNI3相互作用性キナーゼ」、「CARK」、「EC 2.7.11.1」、「MGC142099」、及び「MGC33828」とも呼ばれ、Ser/Thr タンパク質キナーゼ・ファミリーであると共に心臓特異的なキナーゼであり心臓系で重要な役割を果たすMAPキナーゼキナーゼキナーゼ・スーパーファミリーのメンバーを言う。 Zhao Y, et al. J Mol Med. 2003 May;81(5):297-304を参照されたい。
【００８８】
ヒトTNNI3Kのアミノ酸配列は公知であり、例えば GenBank 登録番号 gi:7705748に見ることができる。ヒトTNNI3K のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:7705747に見ることができる。マウスTNNI3K のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:142364382に見ることができる。
【００８９】
ここで用いられる場合の用語 「GEFT」は「RAC/CDC42 交換因子」、及び「p63RhoGEF」とも呼ばれ、GDP/GTP交換を加速することで細胞増殖、形質転換、及び泳動を誘導することによりRhoGTPaseを活性化するグアニンヌクレオチド交換因子を言う。Guo X, et al. J Biol Chem. 2003 Apr 11;278(15):13207-15を参照されたい。
【００９０】
ヒトGEFTには二つのアイソフォームがあり、そのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:19311008 及びgi:33667115に見ることができる。ヒトGEFTの二つの転写産物バリアントのヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 gi:19311007
及びgi:33667114に見ることができる。マウスGEFTのヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:142362982に見ることができる。
【００９１】
ここで用いられる場合の用語 「STK38L」は「セリン/スレオニン キナーゼ 38様」、「KIAA0965」、及び「NDR2」とも呼ばれ、Ser/Thr タンパク質キナーゼ・ファミリーのメンバーを言う。STK38Lは更に核内Dbf2-関連 (NDR) タンパク質キナーゼとも呼ばれ、これは細胞分裂及び細胞形態の調節に関与するAGC グループキナーゼのファミリーである。SB100 はSTK38Lの自己リン酸化を刺激する。 Stegert MR, et al.  J Biol Chem. 2004;279(22):23806-12を参照されたい。
【００９２】
ヒトSTK38Lのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:24307971に見ることができる。ヒトSTK38L のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:142386223に見ることができる。マウスSTK38L のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:31982109に見ることができる。
【００９３】
ここで用いられる場合の用語 「LATS2」は 「LATS、ラージ・チューマー・サプレッサ（原語：large tumor suppressor）、ホモログ 2 (ドゥロソフィラ)」、「FLJ13161」、及び
「KPM」とも呼ばれ、MDM2と物理的に相互作用してp53ユビキチン化を促進し、かつp53活性化を促進するセリン/スレオニンキナーゼを言う。更にそれはSTK6と相互作用し、かつSTK6によってリン酸化される。LATS もまた、セントロソーム複製、有糸分裂信頼性の維持、及びゲノム安定性において重要な役割を果たすと共に、サイクリンE/CDK2キナーゼ活性を下方調節することによりG1期/S期移行を負に調節する腫瘍抑制因子である。アンドロゲン受容体の負の調節物質。Aylon Y,
et al. Genes Dev. 2006 20(19):2687-700を参照されたい。
【００９４】
ヒトLATS2のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:126507091に見ることができる。ヒトLATS2 のヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 gi:126507090に見ることができる。マウスLATS2のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えば GenBank 登録番号 gi:68448548に見ることができる。
【００９５】
ここで用いられる場合の用語 「LATS1」は 「LATS、ラージ・チューマー・サプレッサ（原語：large tumor suppressor）、ホモログ 1 (ドゥロソフィラ)」、「WARTS」、「h-warts」、及び「wts」とも呼ばれ、有糸分裂進行及びG1期四倍性チェックポイントの両方においてその作用を通じて倍数性を維持する上で重要な役割を果たす腫瘍抑制因子であるSer/Thr タンパク質キナーゼファミリー・メンバーを言う。CDC2 キナーゼ活性を下方調節することによるG2期／M期移行を負に調節する。p53発現の制御に関与する。LIMKの負の修飾を通じてアクチン重合反応を調節することにより、減数分裂に影響する。Yang X, et al. Nat Cell Biol. 2004 6(7):609-17を参照されたい。
【００９６】
ヒトLATS1のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:4758666に見ることができる。ヒトLATS1のヌクレオチド配列は例えば
GenBank 登録番号 gi:10862687に見ることができる。マウスLATS1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:94387911に見ることができる。
【００９７】
ここで用いられる場合の用語 「STK38」は「セリン/スレオニン キナーゼ 38」、及び「NDR1」とも呼ばれ、成長停止及び細胞分化において、おそらくは細胞質と核の間をシャトルするシグナリングタンパク質として役割を果たすキナーゼを言う。 Kalaydjieva et al. (2000) Hum. J. Hum. Genet. 67: 47-58, 2000) は、末梢神経における発現が特にシュワン細胞で高いことを実証している。まとめると、これらの発見は、STK38が軸策の生存に必要なシュワン細胞のシグナリングにおいて末梢神経系で役割を果たすことを示すものである。
【００９８】
ヒトSTK38 のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:6005814に見ることができる。ヒトSTK38のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:31377778に見ることができる。マウスSTK38のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:118129944に見ることができる。
【００９９】
ここで用いられる場合の用語 「RASSF5」は「Ras 関連 (RalGDS/AF-6) ドメイン・ファミリー5」、「MGC10823」、「MGC17344」、「Maxp1」、「NORE1」、「NORE1A」、「NORE1B」、「RAPL」、及び「RASSF3」とも呼ばれ、Ｔ細胞受容体又はケモカイン刺激時のRAP1A活性化をインテグリン活性化に結び付けることによりリンパ球接着に関与するタンパク質を言う。アイソフォーム 2はリンパ球の分極とITGAL/LFA-1のパッチ様分布を刺激することで、ICAM1への接着を亢進させる。RASSF5 はRAP1Aと一緒になって微小管の成長の調節に参与する。アイソフォーム 2の活性化RAP1Aとの結合が、創傷治癒中の内皮細胞の方向性ある泳動に必要である。おそらくはRasアポトーシス機能の調節に関与し、RASSF5-STK4複合体はHRAS1及びKRAS誘導性アポトーシスを媒介する。Praskova
M, et al. Biochem J. 2004 Jul 15;381(Pt 2):453-62を参照されたい。
【０１００】
ヒトRASSF5には四つのアイソフォームがあり、そのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 gi:13899265、gi:32996731、gi:32996733、及びgi:32996735に見ることができる。ヒトRASSF5 の四つの転写産物のヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 gi:13899264、gi:115430205、gi:115430204、及びgi:115430207に見ることができる。マウスRASSF5のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenbank 登録番号 gi:141803301に見ることができる。
【０１０１】
「骨シアロタンパク質」又は「BSP」はオステオポンチン遺伝子ファミリーに属し、ハイドロキシアパタイトに密に結合することで骨の石灰化マトリックスの一体部分を形成する非コラーゲン性骨マトリックスタンパク質である。ヒトBSPのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号No.
gi:38146097に記載されている。マウスBSPのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号No. gi:6678112に記載されている。
【０１０２】
タイプＩコラーゲン（α）１(「ColI（α）1」)はコラゲナーゼ骨マトリックスタンパク質である。ヒトColI（α）1のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 No.
gi:14719826に記載されている。マウスColI（α）1のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 No. gi:34328107に記載されている。
【０１０３】
OCNはオステオカルシン及び骨ガンマ-カルボキシグルタミン酸(Gla) タンパク質 (BGLAP、又はBGP)とも呼ばれ、骨の石灰化マトリックスに関連する小型の、高度に保存された分子である。それは骨及び歯質に見えられる非コラーゲン性のタンパク質である。それは骨芽細胞によって分泌され、石灰化及びカルシウム・イオン恒常性において役割を果たす。ヒトOCNのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 No.
gi:158517828に記載されている。マウスOCNのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 No gi:83816951に記載されている。
【０１０４】
Rsk2はリボゾームタンパク質S6 キナーゼ、90-KD、3; RPS6KA3とも呼ばれ、p90(rsk)としても知られる成長因子調節性セリン/スレオニンキナーゼのRSK（リボゾームS6 キナーゼ）のファミリーの一員である。RSKファミリーの全てのメンバーの高度に保存された特徴は２箇所の同一でないキナーゼ触媒ドメインの存在である。RSK2は骨芽細胞分化及び機能に必要である。ATF4は、骨芽細胞分化の時宜に合った分化や骨芽細胞の最終的分化、そして骨芽細胞特異的遺伝子発現にとって必要なRSK2の必須の基質である。加えて、RSK2
及びATF4はタイプＩコラーゲンの合成を転写後、調節する。ヒトRSK2のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 No. gi:56243494に記載されている。マウスRsk2のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 No
gi:22507356に記載されている。
【０１０５】
Runx2はRunt関連転写因子2、CBFA1とも呼ばれ、高度に保存されたruntドメインを持つタンパク質をコードしている。Cbfa1はオステオカルシン中のOSE2と呼ばれる骨芽細胞特異的cis作用性因子に結合する。Cbfa1は骨芽細胞特異的転写因子であり、骨芽細胞分化の調節物質である。ヒトRunx2には三つのアイソフォームがあり、そのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は公知であり、例えばGenBank
登録番号 gi:116734652]、gi:116734654、及びgi:66934968に見ることができる。マウスRunx2のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 No gi:148747264に記載されている。
【０１０６】
ALPはPDLIM3、アクチニン関連LIMタンパク質とも呼ばれ、骨格筋中のアルファ-アクチニン2のスペクトリン様モチーフに結合する。ヒトALPのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 No. gi:166235175に記載されている。マウスAlpのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:47125033に記載されている。
【０１０７】
WWP1はWWドメイン含有E3ユビキチンタンパク質リガーゼ1とも呼ばれる。WWドメイン含有タンパク質は、４つのタンデムWWドメイン及びHECT（E6-関連タンパク質カルボキシル末端）ドメインを含有するタンパク質をコードしている。このコードされたタンパク質は、NEDD4様タンパク質の一ファミリーに属するが、このタンパク質ファミリーはE3ユビキチン-リガーゼ分子であり、主要な輸送決定を調節する。ヒトWWP1のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank登録番号No. gi:33946331に記載されている。マウスWwp1のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号
gi:112734835に記載されている。
【０１０８】
NFATc1は活性化Ｔ細胞の核内因子、細胞質、カルシニューリン依存的1 とも呼ばれ、通常は異種のDNA結合相手と調和しつつ抗原応答性遺伝子のプロモータ／エンハンサ領域に結合することによりサイトカイン遺伝子発現を調節するNFATファミリーの転写因子の一員である。NFATタンパク質の活性化は、カルモジュリン依存的ホスファターゼであるカルシニューリンの制御を受ける。Aramburu ら (1998) は、カルシニューリンにNFATを標的とさせる短い保存配列をNFATC1タンパク質中で同定した（残基107-119）。ヒトNFATc1には５つの代替的な転写産物があり、そのヌクレオチド配列（及びそれにコードされたアイソフォームのアミノ酸配列）は例えばGenBank 登録番号 No.
gi:27502384、gi:27502385、gi:27502387、gi:27502390、及びgi:27502392に記載されている。ヒトNFATc1には二つの代替的な転写産物があり、そのヌクレオチド配列（及びそれにコードされたアイソフォームのアミノ酸配列）は例えばGenBank 登録番号 No.
gi:38348192 及びgi:118131200に記載されている。
【０１０９】
「ATF4」は「CREB2」及び「Osterix」とも、「SP7」とも呼ばれ、それぞれbZIP タンパク質ファミリー及びC2H2型亜鉛フィンガータンパク質ファミリーに属する転写因子であり、例えば骨形成及び石灰化中など、骨のリモデリングの際に骨マトリックス生合成の主要な調節物質である（例えばYang, X., et al. (2004). Cell 117, 387-398; Nakashima, K., et al. (2002). Cell 108, 17-2を参照されたい）。BSP、ColI（α）1、ATF4、及びOsterixは骨形成及び発生の特異的マーカである。ヒトATF4のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えば GenBank 登録番号 No.
gi:33469975 及びgi:33469973に記載されている。マウスATF4のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 No.
gi:6753127に記載されている。ヒトSP7のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 No. gi:22902135に記載されている。マウスSP7のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 No
gi:18485517に記載されている。
【０１１０】
ここで用いられる場合の用語「TAOK2」は「１００１アミノ酸キナーゼ 2」又は「TAO2 キナーゼ」又は「KIAA0881」又は「MAP3K17」又は「PSK」又は「PSK-1」又は「PSK1」 又は「TAO1」又は「TAO2」又は「hKFC-C」又は「セリン/スレオニン-タンパク質キナーゼ TAO2」又は「TAO キナーゼ 2」又は「１００１アミノ酸たんぱく質2」 又は「前立腺由来STE20-様キナーゼ PSK」とも呼ばれ、STE20キナーゼ・ファミリーのセリン/スレオニンタンパク質キナーゼを言う。例えばHuangfu W.C,
et al. (2006) J Biol Chem 281(39):28802-10を参照されたい。
【０１１１】
ヒトTAOK2のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI:4759208 及びGI:45505130に見ることができる。ヒトTAOK2 のヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 GI:4759208及びGI:45505130に見ることができる。マウスTOAK2のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi: 31324959に見られよう。
【０１１２】
ここで用いられる場合の用語 「DLG1」とは、膜関連グアニル酸キナーゼ・ファミリーの一員であるショウジョウバエ・ディスクス・ラージ（原語：discs large）腫瘍抑制遺伝子（hDlg）のホモログを言う。例えばYamamoto Y et al. (2004) Oncogene 23(22):3889-97を参照されたい。
【０１１３】
ヒトDLG1のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI:4758162に見ることができる。ヒトDLG1のヌクレオチド配列は例えば GenBank 登録番号 GI:4758162に見ることができる。マウスDLG1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 GI:40254642に見られよう。
【０１１４】
ここで用いられる場合の用語 「PIN1」は「ペプチジル-プロリルcis-transイソメラーゼNIMA-相互作用性1」又は「DOD」又は「UBL5」又は「dod」又は「PPIase」又は「ペプチジル-プロリルcis-transイソメラーゼNIMA-相互作用性1」又は「Rotamase」又は「ペプチジル-プロリルcis/transイソメラーゼ、NIMA-相互作用性」又は「タンパク質（ペプチジル-プロリル cis/transイソメラーゼ） NIMA-相互作用性1」とも呼ばれ、おそらくはNIMAと相互作用すると共にその有糸分裂促進活性を弱めることで有糸分裂を調節するペプチジル-プロリルcis-transイソメラーゼを言う。例えばLu KP et al. (1996) Nature
380(6574):544-7を参照されたい。
【０１１５】
ヒトPIN1 のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI:5453898に見ることができる。マウスPIN1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えば  GenBank 登録番号 GI:12963653に見られよう。
【０１１６】
ここで用いられる場合の用語 「LYK5」は「LYK5」又は「FLJ90524」又は「STRAD」 又は「STE20-関連アダプターたんぱく質」又は「STRAD
アルファ」又は「血清学的に定義された乳癌抗原NY-BR-96」とも呼ばれ、CAB39と複合体となった状態でSTK11に結合してこれを活性化する偽キナーゼを言う。例えば Baas AF et al. (2003) EMBO J.
22(12):3062-72を参照されたい。
【０１１７】
ヒトLYK5 のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI:51242960 又は GI:51242955 又はGI:51242957 又はGI:31982873に見ることができる。ヒトLYK5のヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 GI:51242960
又はGI:51242955又は GI:51242957又はGI:31982873に見ることができる。マウスLYK5
のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank
登録番号 GI:21312400に見られよう。
【０１１８】
ここで用いられる場合の用語 「MOBKL2C」は「MGC26743」又は「MOB3C」又は「MOB1、Mpsワン・バインダーキナーゼアクチベータ様2C」又は「Mob1 ホモログ2C」又は 「Mps ワン・バインダーキナーゼアクチベータ様2C」 又は「たんぱく質Mob3C」とも呼ばれ、MOB1/フォセイン（原語：phocein）ファミリーのセリン/スレオニン・キナーゼを言う。例えば Ota T et al. (2004) Nat. Genet. 36 (1), 40-45を参照されたい。
【０１１９】
ヒトMOBKL2Cのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI:41406059 又はGI:41406061に見ることができる。ヒトMOBKL2Cのヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 GI:41406059又はGI:41406061に見ることができる。マウスMOBKL2Cのヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 GI:30424984に見られよう。
【０１２０】
ここで用いられる場合の用語「MAP4K2」は「BL44」又は「GCK」又は「RAB8IP」 又は「Bリンパ球セリン/スレオニンたんぱく質キナーゼ」又は「GC キナーゼ」又は「胚中心キナーゼ」又は「MAPK/ERKキナーゼキナーゼキナーゼ 2」又は「MEK キナーゼ キナーゼ 2」又は「MEKKK 2」又は「Rab8相互作用性たんぱく質」又は「胚中心キナーゼ(GCキナーゼ)」又は「マイトジェン活性化たんぱく質キナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ2」又は「SLK」とも呼ばれ、STE20ファミリーのセリン/スレオニンキナーゼを言う。例えばHao W et al. (2006) J Biol Chem. Feb 10;281(6):3075-84を参照されたい。
【０１２１】
ヒトMAP4K2のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI:22035600に見ることができる。ヒトMAP4K2 のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 GI:22035600に見ることができる。マウスMAP4K2 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 GI:6678800に見られよう。
【０１２２】
ここで用いられる場合の用語 「PACSIN2」は、「OTTHUMP00000028650」又は 「SDPII」又は「神経細胞たんぱく質2中のたんぱく質キナーゼ C 及びカゼインキナーゼ基質」又は「シンダピンII」とも呼ばれ、ある細胞質内アダプターたんぱく質を言う。例えばRitter B et al. (1999) FEBS Lett.
454(3):356-62を参照されたい。
【０１２３】
ヒトPACSIN2のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI:6005826に見ることができる。ヒトPACSIN2 のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 GI:6005826に見ることができる。マウス PACSIN2のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 GI:7106381に見られよう。
【０１２４】
ここで用いられる場合の用語 「DCAMKL1」は「DCLK」又は「KIAA0369」又は「ダブルコルチン様及びCAM キナーゼ様1」又は「ダブルコルチン様キナーゼ」とも呼ばれ、カルシウム／カルモジュリン依存的たんぱく質キナーゼ・ファミリーのセリン／スレオニンキナーゼを言う。例えばDeuel TA et al. (2006) Neuron 49(1):41-53を参照されたい。
【０１２５】
ヒトDCAMKL1のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI:4758128に見ることができる。ヒトDCAMKL1のヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 GI:4758128に見ることができる。マウスDCAMKL1 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 GI:9910164に見られよう。
【０１２６】
ここで用いられる場合の用語「DOCK4」は「FLJ34238」又は「KIAA0716」又は「MGC134911」又は「MGC134912」又は「サイトキネシスたんぱく質4のデディケータ（原語：Dedicator ）」又は「サイトキネシス4のデディケータ」とも呼ばれ、小型GTPaseのCDMファミリーの調節物質の一員を言う。例えばYajnik V et al. (2003) Cell. 112(5):673-84を参照されたい。
【０１２７】
ヒトDOCK4 のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI:92091572に見ることができる。ヒトDOCK4 のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 GI:92091572に見ることができる。マウスDOCK4のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 GI:62543571に見られよう。
【０１２８】
ここで用いられる場合の用語 「PARG1」は「RP11-255E17.1」又は「ARHGAP29 たんぱく質」又は「PTPL1-関連RhoGAP 1」又は「Rho GTPase 活性化たんぱく質29」とも呼ばれ、小型GTPaseのRhoGAPファミリーの調節物質の一員を言う。例えばMyagmar BE et al. (2005) Biochem Biophys Res Commun.
329(3):1046-52を参照されたい。
【０１２９】
ヒトPARG1のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI:38016932に見ることができる。ヒトPARG1 のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 GI:38016932に見ることができる。マウスPARG1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 GI:33563303に見られよう。
【０１３０】
ここで用いられる場合の用語「TAOK3」は「１００１アミノ酸キナーゼ 3」又は「TAO3 キナーゼ」又は「DKFZp666H245」又は「DPK」又は「FLJ31808」又は「JIK」又は「KDS」又は「MAP3K18」又は「hKFC-A」又は「CTCL 腫瘍抗原HD-CL-09」又は「皮膚Ｔ細胞リンパ腫腫瘍抗原HD-CL-09」又は「樹状細胞由来たんぱく質キナーゼ」又は「JNK/SAPK-阻害性キナーゼ」又は「Junキナーゼ-阻害性キナーゼ」又は「ニワトリ・ホモログA由来キナーゼ」又は「セリン/スレオニン-たんぱく質キナーゼ TAO3」とも呼ばれ、STE20 キナーゼ・ファミリーのセリン/スレオニンたんぱく質キナーゼを言う。例えばYustein JT
et al. (2003) Oncogene 22(40):6129-41を参照されたい。
【０１３１】
ヒトTAOK3のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号GI:19923464に見ることができる。ヒトTAOK3のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 GI: 9923464に見ることができる。マウスTOAK3のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:82899408に見られよう。
【０１３２】
ここで用いられる場合の用語「TRPV6」は「ABP/ZF」又は「CAT1」又は「CATL」又は 「CaT1」又は「ECAC2」又は 「HSA277909」又は「LP6728」又は「ZFAB」又は「亜鉛フィンガー・ドメインを持つAlu-結合たんぱく質」又は「カルシウム輸送たんぱく質 1」又は「上皮カルシウム・チャンネル2」又は「一過性の受容体、又は、潜在的カチオン・チャンネル・サブファミリーVメンバー6」又は「カルシウム・チャンネルCaT1」 又は「上皮先端膜カルシウムトランスポータ／チャンネルCaT1」とも呼ばれ、TRPVファミリーの陽イオンチャンネルたんぱく質を言う。例えばBodding M  et
al. (2005) J Biol Chem.
280(8): 7022-9を参照されたい。
【０１３３】
ヒトTRPV6 のアミノ酸配列は公知であり、例えばiGenBank 登録番号 GI:21314682を参照されたい。ヒトTRPV6 のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 GI: 21314682に見ることができる。マウスTRPV6 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:28376639に見られよう。
【０１３４】
ここで用いられる場合の用語 「CLK1」は「CLK」又は「CLK/STY」又は「CDC様キナーゼ1」又は 「CDC28/CDC2様キナーゼ」とも呼ばれ、二重特異性たんぱく質キナーゼを言う。例えばMenegay
HJ  et al. (2000) J
Cell Sci. 113 ( Pt 18):3241-53を参照されたい。
【０１３５】
ヒトCLK1のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI:67551263又はGI:67551261に見ることができる。ヒトCLK1のヌクレオチド配列は、例えばGenBank 登録番号 GI:67551263又はGI:67551261に見ることができる。マウスCLK1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 gi:211038135に見られよう。
【０１３６】
ここで用いられる場合の用語「AAK1」は「KIAA1048」 又は 「MGC138170」 又は 「AP2 関連キナーゼ 1」又は「アダプター関連キナーゼ1」とも呼ばれ、Prk/Arkファミリーのセリン/スレオニン キナーゼのメンバーを言う。例えばConner
SD  et al. (2002) J
Cell Biol. 156(5):921-9を参照されたい。
【０１３７】
ヒトAAK1のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI: 29570780に見ることができる。マウスAAK1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 gi: 73695877に見られよう。
【０１３８】
ここで用いられる場合の用語「PRKCA」は「AAG6」又は「MGC129900」又は「MGC129901」又は「PKC-A」又は「PKC-アルファ」又は「たんぱく質キナーゼCアルファ型」又は「加齢関連遺伝子6」とも呼ばれ、AGCファミリー・セリン/スレオニン キナーゼを言う。例えばHsieh  et al. (2006) Biochem Biophys Res Commun. 339(1):217-25を参照されたい。
【０１３９】
ヒトPRKCAのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI: 4506067に見ることができる。マウスPRKCAのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 gi: 6755078に見られよう。
【０１４０】
ここで用いられる場合の用語 「AKAP8」は「AKAP95」又は「DKFZp586B1222」 又は「Aキナーゼ(PRKA) アンカーたんぱく質8」又は「A キナーゼアンカーたんぱく質8」又は「A-キナーゼアンカーたんぱく質95
kDa」とも呼ばれ、たんぱく質キナーゼ C結合たんぱく質を言う。例えばArsenijevic T  et al. (2006) Cell
Cycle. 5(11):1217-22を参照されたい。
【０１４１】
ヒトAKAP8のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI: 5031579に見ることができる。マウスAKAP8のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 gi: 31560394に見られよう。
【０１４２】
ここで用いられる場合の用語「DGKI」は「DGK-IOTA」又は「ジアシルグリセロールキナーゼiota」とも呼ばれ、ジアシルグリセロールキナーゼファミリーの脂質キナーゼを言う。例えばDing L  et al. (1998) J Biol Chem.
273(49):32746-52を参照されたい。
【０１４３】
ヒトDGKIのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI: 4758156に見ることができる。ヒトDGKIのヌクレオチド配列は例えば GenBank 登録番号 GI: 4758156に見ることができる。マウスDGKIのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 gi: 51711902に見られよう。
【０１４４】
ここで用いられる場合の用語「SMARCB1」は「BAF47」又は「INI1」又は「RDT」又は「SNF5」又は「SNF5L1」又は「Sfh1p」又は「Snr1」又は「インタグラーゼ相互作用因子1 たんぱく質」 又は 「クロマチンのSWI/SNF関連、マトリックス関連、アクチン依存的調節物質、サブファミリーb、メンバー1」 又は 「悪性棒状体腫瘍サプレッサ」
又は 「ショ糖非発酵性、酵母、ホモログ様1」とも呼ばれ、hSWI/SNF全体的転写活性化因子複合体のコンポーネントを言う。例えばModena P  et
al. (2005) Cancer Res.
65(10):4012-9を参照されたい。
【０１４５】
ヒトSMARCB1のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI: 55956801又はGI:27545326に見ることができる。ヒトSMARCB1のヌクレオチド配列は、例えばGenBank 登録番号 GI: 55956801又はGI:27545326に見ることができる。マウスSMARCB1 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 gi: 6755578に見られよう。
【０１４６】
ここで用いられる場合の用語 「CIB2」は「2810434I23Rik」 又は 「KIP2」 又は 「カルシウム及びインテグリン結合たんぱく質2」又は「DNA依存的たんぱく質キナーゼ触媒性サブユニット相互作用性たんぱく質2」とも呼ばれ、CIB2たんぱく質を言う。例えばSeki N et al. (1999) Biochim
Biophys Acta. 1444(1):143-7を参照されたい。
【０１４７】
ヒトCIB2のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI:5453708に見ることができる。ヒトCIB2のヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 GI:5453708に見ることができる。マウスCIB2のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 gi: 9790085に見られよう。
【０１４８】
ここで用いられる場合の用語 「STK33」は「セリン/スレオニンたんぱく質キナーゼ
33」とも呼ばれ、セリン/スレオニンキナーゼ 33を言う。例えばMujica
AO et al. (1999) FEBS J. 272(19):4884-98を参照されたい。
【０１４９】
ヒトSTK33のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI: 23943882に見ることができる。ヒトSTK33のヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 GI: 23943882に見ることができる。マウスSTK33のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 gi: 38087657に見られよう。
【０１５０】
ここで用いられる場合の用語「STK39」は「DCHT」又は「DKFZp686K05124」又は「PASK」又は「SPAK」又は「STE20/SPS1関連プロリン-アラニン・リッチなたんぱく質キナーゼ」又は「Ste-20関連キナーゼ」又は「小腸SPAK様キナーゼ」又は「セリン/スレオニンたんぱく質キナーゼ 39」とも呼ばれ、セリン/スレオニンキナーゼ 39を言う。例えば Johnston AM et al. (2000) Oncogene. 19(37):4290-7を参照されたい。
【０１５１】
ヒトSTK39のアミノ酸配列は公知であり、 例えばGenBank 登録番号 GI: 115430252に見ることができる。ヒトSTK39のヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 GI: 115430252に見ることができる。マウスSTK39のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi: 8394347に見られよう。
【０１５２】
ここで用いられる場合の用語 「NRGN」は「ニューログラニン」又は「Ng」又は「RC3」又は「hng」又は「カルモジュリン結合たんぱく質」又は「たんぱく質キナーゼ C基質」とも呼ばれ、たんぱく質キナーゼ C基質及びカルモジュリン結合たんぱく質であるニューログラニンを言う。例えば Zhabotinsky AM et al. (2006) J Neurosci 26(28):7337-47を参照されたい。
【０１５３】
ヒトNRGNのアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI: 5453800に見ることができる。ヒトNRGNのヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 GI: 5453800に見ることができる。マウスNRGN のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えば GenBank 登録番号 gi: 11528516に見られよう。
【０１５４】
ここで用いられる場合の用語「PIK3R1」とは、「GRB1」又は「p85-アルファ」又は「PI3-キナーゼ p85-サブユニットアルファ」又は「ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ 調節的サブユニットアルファ」又は「PtdIns-3-キナーゼ p85-アルファ」又は「ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ, 調節的 1」又は「ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ関連p-85 アルファ」とも呼ばれ、アルファ調節的サブユニット脂質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼを言う。例えばTerauchi
Y et al.
(2004) Diabetes. 53(9):2261-70を参照されたい。
【０１５５】
ヒトPIK3R1のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI:
32455252 又は GI:32455248 又は GI:32455250に見ることができる。ヒトPIK3R1のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 GI: 32455252 又は GI:32455248 又は GI:32455250に見ることができる。マウスPIK3R1
のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank
登録番号 gi: 117320524に見られよう。
【０１５６】
ここで用いられる場合の用語 「DLX-5」は「末端なしのホメオボックス5」とも呼ばれ、軟骨細胞肥大の公知の調節物質であるホメオボックスたんぱく質DLX-5を言う。例えば Hsu SH et al. (2006) Mech Dev. 123(11):819-30を参照されたい。
【０１５７】
ヒトDLX-5 のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI: 4885187に見ることができる。ヒトDLX-5のヌクレオチド配列は例えば
GenBank 登録番号 GI: 4885187に見ることができる。マウスDLX-5のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi: 38524596に見られよう。
【０１５８】
ここで用いられる場合の用語 「MSX-2」は「CRS2」又は「FPP」又は「HOX8」又は「MSH」又は「PFM」又は「PFM1」又は「ホメオボックスたんぱく質MSX-2」 又は 「頭頂孔1」とも呼ばれ、骨芽細胞分化の公知の調節物質であるホメオボックスたんぱく質MSX-2を言う。例えばYoshizawa T et al. (2004) Mol Cell Biol. 24(8):3460-72を参照されたい。
【０１５９】
ヒトMSX-2のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI: 27886557に見ることができる。ヒトMSX-2のヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 GI: 27886557に見ることができる。マウスMSX-2のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi: 7305283に見られよう。
【０１６０】
ここで用いられる場合の用語 「RANKL」は「TNFSF11」又は「CD254」又は「ODF」 又は「OPGL」又は「TRANCE」又は「破骨細胞分化因子」又は「オステオプロテゲリン・リガンド」又は「核内因子カッパBリガンドの受容体活性化因子」又は「TNF関連活性化誘導性サイトカイン」又は「腫瘍壊死因子リガンド・スーパーファミリーメンバー11」とも呼ばれ、破骨細胞調節的因子である腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー11を言う。例えば Collin-Osdoby
P et al. (2004) Circ
Res. 95(11):1046-57を参照されたい。
【０１６１】
ヒトRANKLのアミノ酸配列は公知であり、例えば GenBank 登録番号 GI:4507595又は GI:14790152に見ることができる。ヒトRANKLのヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 GI:4507595又はGI:14790152に見ることができる。マウスRANKLのヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi: 6755833に見られよう。
【０１６２】
ここで用いられる場合の用語「MMP9」は「CLG4B」又は「GELB」又は「92 kDa ゲラチナーゼ」又は「92 kDa 型IV コラゲナーゼ」又は「ゲラチナーゼB」 又は 「マクロファージゲラチナーゼ」又は「マトリックスメタロペプチダーゼ9 (ゲラチナーゼB、92kDa ゲラチナーゼ、92kDa 型IVコラゲナーゼ)」又は「タイプVコラゲナーゼ」とも呼ばれ、マトリックスメタロペプチダーゼ9たんぱく質を言う。MMP9は通常、破骨細胞分化のマーカとして用いられる。例えばRolli M et al. (2003) Proc Natl Acad Sci
U SA 100(16):9482-7を参照されたい。
【０１６３】
ヒトMMP9のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank 登録番号 GI:74272287に見ることができる。ヒトMMP9のヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 GI:74272287に見ることができる。マウスMMP9 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi: 7305277に見られよう。
【０１６４】
ここで用いられる場合の用語「カテプシンK」は通常、破骨細胞分化のマーカとして用いられるシステインプロテアーゼカテプシンKを言う。例えばSharma
SM et al. (2007) J Biol Chem. 25;282(21):15921-9を参照されたい。ヒトカテプシンKのヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えば GenBank 登録番号 gi: 4503151に見られよう。マウスカテプシンKのヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank
登録番号 gi: 31982433に見られよう。
【０１６５】
ここで用いられる場合の用語「カルシトニン受容体」は「CALCR」又は「CRT」又は「CT-R」又は「CTR」又は「CTR1」とも呼ばれ、ホルモン・カルシトニンの細胞表面受容体を言う。カルシトニン受容体は通常、破骨細胞分化のマーカとして用いられる。例えば Kim MS et al. (2006) J Biol
Chem. 281(2):1274-85を参照されたい。ヒトカルシトニン受容体のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 gi: 4502547に見られよう。マウスカルシトニン受容体のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi: 6680830に見られよう。
【０１６６】
ここで用いられる場合の用語「B3-インテグリン」は「ITGB3」又は「CD61」とも呼ばれ、細胞表面接着分子B3インテグリンを言う。B3インテグリンは通常、破骨細胞分化のマーカとして用いられる。ヒトB3インテグリンのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 gi: 4502547に見られよう。マウスB3インテグリンのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 GI:6680830に見られよう。
【０１６７】
ここで用いられる場合の用語「TRAP」は「ACP5」又は「MGC117378」又は「Tr-ATPase」 又は「TR- AP」又は「酒石酸耐性酸ATPase」又は「酸ホスファターゼ5、酒石酸耐性」とも呼ばれ、酒石酸耐性酸ホスファターゼを言う。TRAPは通常、破骨細胞分化のマーカとして用いられる。例えばAndersson G (1989) Connect Tissue Res.
(1-4):151-8を参照されたい。ヒトTRAPのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 GI:4502547に見られよう。マウスTRAP のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 GI:6680624に見られよう。
【０１６８】
ここで用いられる場合の用語 「MAP3K11」 (NCBI 遺伝子ID: 4296)はマイトジェン活性化たんぱく質キナーゼ
キナーゼ キナーゼ 11とも呼ばれる。このセリン/スレオニンキナーゼ
（FGD1及びCDC42の下流）の活性化は骨芽細胞分化を増強し、Runx2 及び／又は ATF4のような、骨芽細胞の生物学的原理において必須である下流のターゲットをリン酸化するというその能力を通じて機能するようである。ヒト間葉幹細胞において内生のMAP3K11レベルが低下すると、これらの細胞での骨芽細胞系譜の関与が阻害されるようである。ヒトTRAPのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 gi:56237030に見られよう。マウスTRAPのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号 gi:66392589に見られよう。
【０１６９】
ここで用いられる場合の用語 「WWP2」（NCBI 遺伝子ID: 11060）はWW ドメイン含有E3ユビキチンたんぱく質リガーゼ2とも呼ばれ、E3ユビキチンリガーゼのNEDD4ファミリーのメンバーである。ヒトWWP2には三つの選択的転写産物があり、そのヌクレオチド配列（及びそれにコードされたアイソフォームのアミノ酸配列）は例えばGenBank 登録番号 No.
gi:40806206、gi:40806208、及びgi:40806210に記載されている。マウスWwp2のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:31543965に見られよう。
【０１７０】
ここで用いられる場合の用語「Smurf2」(NCBI 遺伝子ID: 64750)はSMAD 特異的E3ユビキチンたんぱく質リガーゼ2とも呼ばれ、E3ユビキチンリガーゼのNEDD4ファミリーのメンバーである。ヒトSMURF2のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:56550041に見られよう。マウスSmurf2のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:57977276に見られよう。
【０１７１】
ここで用いられる場合の用語「RhoC」（NCBI 遺伝子ID: 11853）はrasホモログ遺伝子ファミリーメンバーCとも呼ばれ、小型GTPase ファミリーメンバーである。ヒトRHOCには三つの選択的転写産物があり、そのヌクレオチド配列（及びそれにコードされたアイソフォームのアミノ酸配列）は例えばGenBank 登録番号 No.
gi:111494247、gi:111494250、及びgi:111494249に記載されている。マウスRhoCのヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号
gi:160415212に見られよう。
【０１７２】
ここで用いられる場合の用語 「Slc4A2」(NCBI 遺伝子ID: 24780) は可溶性キャリヤファミリ4、陰イオン交換因子、メンバー2 （赤血球膜たんぱく質バンド（原語：band ）3様1)とも呼ばれ、塩化物／重炭酸陰イオン交換チャンネルである。ヒトSLC4A2のヌクレオチド配列は例えばGenBank
登録番号 gi:156071473に見ることができる。マウスSlc4a2 のヌクレオチド及びアミノ酸配列は例えばGenBank 登録番号 gi:161169000に見られよう。
【０１７３】
ここで用いられる場合の用語 「Plcb4」 (NCBI 遺伝子 ID: 18798) はホスホリパーゼC、ベータ4とも呼ばれ、ホスホリパーゼC アイソフォームである。ヒトRHOCには二つの選択的転写産物があり、そのヌクレオチド配列（及びそれにコードされたアイソフォームのアミノ酸配列）は、例えばGenBank 登録番号 No.
gi:33469932 及びgi:33469938に記載されている。マウスRhoCのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号
gi:118130923に見られよう。」
【０１７４】
ここで用いられる場合の用語 「Nhedc2」 (NCBI 遺伝子ID: 97086)はNa+/H+ 交換因子ドメイン含有2とも呼ばれ、推定上のナトリウム／水素交換チャンネルである。ヒトNHEDC2のヌクレオチド配列は例えばGenBank 登録番号 gi:47271478に見ることができる。マウスNhedC2のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenBank 登録番号
gi:142368598に見られよう。
【０１７５】
ここで用いられる場合の用語 「骨芽細胞調節物質活性」には、ある骨芽細胞調節物質が、例えば成熟骨芽細胞の形成などの骨芽細胞の形成及び／又は骨の石灰化に関連する活性を修飾する能力が含まれる。骨芽細胞調節物質活性の例には、例えば、骨成長の修飾(骨芽細胞形成)、骨石灰化の修飾、破骨細胞形成の修飾、例えば骨形成及び／又は骨のリモデリングにおいてなど、骨芽細胞対破骨細胞活性の修飾、BSP、ColI(a)1、OCN、RANKL、RSK2、RUNX2、Dlx-5、Msx-2、ALP、WWP1、及びATF4の発現の修飾がある。
【０１７６】
ここで用いられる場合の用語「破骨細胞調節物質活性」には、破骨細胞調節物質が、例えば成熟破骨細胞の形成など、破骨細胞の形成に関連する活性を修飾する能力が含まれる。骨芽細胞調節物質活性の例には、例えば骨の成長 (破骨細胞形成)の修飾、骨石灰化の修飾、骨芽細胞形成の修飾、例えば骨形成及び／又は骨のリモデリングにおいてなど、骨芽細胞対破骨細胞活性の修飾、NFATc1、TRAP、カテプシンK、MMP9、β3-インテグリン、及びカルシトニン受容体の発現の修飾がある。
【０１７７】
ここで用いられる、多様な形の用語「修飾する」には、刺激（例えばある特定の応答又は活性を増加又は上方調節する）及び阻害（例えばある特定の応答又は活性を減少又は下方調節する）が含まれるものと意図されている。
【０１７８】
ある実施態様では、前記骨芽細胞/破骨細胞調節物質活性は、例えば骨芽細胞/破骨細胞調節物質標的分子又は結合パートナーとの結び付きなど、直接的な活性である。ここで用いられる場合、「標的分子」、「結合パートナー」又は「骨芽細胞/破骨細胞調節物質結合パートナー」とは、自然界で骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質が結合又は相互作用する先の分子であり、こうして骨芽細胞/破骨細胞調節物質媒介性機能が達成されるような分子である。
【０１７９】
用語「相互作用する」は、ここで用いられる場合、酵母二種ハイブリッド検定法又は同時免疫沈降法などを用いて検出することができるなど、分子間の検出可能な相互作用が含まれるものと、意図されている。また相互作用するという用語には、分子間の「結合」相互作用も含まれることも意図されている。相互作用は自然界のたんぱく質−たんぱく質又はたんぱく質−核酸間であってもよい。
【０１８０】
ここで用いられる場合の用語 「接触する」（即ち、ある化合物に幹細胞などの細胞を接触させること）には、in vitroで当該化合物及び細胞を一緒にインキュベート（例えば化合物を培養細胞に加えるなど）すること、あるいは、当該化合物を対象に投与して、この化合物と対象の細胞とがin vivoで接触するようにすること、が含まれるものと、意図されている。用語「接触する」には、対象において天然で発生し得る、骨芽細胞/破骨細胞調節物質修飾物質への細胞の暴露（即ち、自然の生理学的なプロセスの結果起きることのある暴露）が含まれるものとは、意図されていない。
【０１８１】
ここで用いられる場合の用語「検査化合物」には、骨芽細胞/破骨細胞調節物質活性及び／又は発現の修飾物質として、及び／又は、骨芽細胞形成、破骨細胞形成の修飾物質として、及び／又は、骨成長及び／又は石灰化の修飾物質として、これまでに同定又は認識されたことのない化合物が包含される。
【０１８２】
用語「検査化合物のライブラリ」は、複数の検査化合物を含むパネル又はプールを言うものと、意図されている。
【０１８３】
ここで用いられる場合の用語「無細胞組成物」とは、インタクト細胞を含有しない単離された組成物を言う。無細胞組成物の例には、細胞抽出物や、単離たんぱく質を含有する組成物がある。
【０１８４】
ここで用いられる場合の用語「指標組成物」とは、目的のたんぱく質（骨芽細胞/破骨細胞調節物質）を含む組成物、例えば、当該たんぱく質を天然で発現する細胞、当該たんぱく質をコードする発現ベクタを細胞内に導入することにより当該たんぱく質を発現するように操作された細胞、shRNA分子を含む発現ベクタを細胞内に導入することにより調節物質たんぱく質の発現を阻害するように操作された細胞、あるいは、当該たんぱく質（例えば精製済みの天然発生型たんぱく質又は組換え操作されたたんぱく質）を含有する無細胞組成物、を言う。
【０１８５】
ここで用いられる場合の「アンチセンス」核酸は、例えば二本鎖cDNA分子のコーディング鎖に相補的であるなど、あるたんぱく質をコードする「センス」核酸に対して相補的である、mRNA配列に対して相補的である、あるいは、ある遺伝子のコーディング鎖に倒して相補的である、ヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合している場合がある。
【０１８６】
ある実施態様では、本発明の核酸分子はsiRNA分子である。別の実施態様では、本発明の核酸分子はshRNA分子である。ある実施態様では、本発明の核酸分子はRNAiを媒介する。別の実施態様では、本発明の核酸分子は翻訳阻害を媒介する。RNA干渉(RNAi) とは、二本鎖RNA（dsRNA）を用いてこのdsRNAを同じ配列を含有するメッセンジャRNAを分解する転写後の標的化遺伝子サイレンシング技術である (Sharp, P.A. and Zamore, P.D. 287, 2431-2432 (2000); Zamore, P.D., et al. Cell 101, 25-33 (2000). 
Tuschl, T. et al. Genes Dev. 13, 3191-3197 (1999);
Cottrell TR, and Doering TL. 2003. Trends Microbiol. 11:37-43; Bushman F.2003.
Mol Therapy. 7:9-10; McManus MT and Sharp PA.  2002. Nat Rev Genet. 3:737-47)。
【０１８７】
内生のリボヌクレアーゼが長いdsRNAを短い、例えば２１又は２２ヌクレオチド長のRNAに切断するときに、低分子干渉RNA即ちsiRNAと呼ばれるプロセスが起きる。その後、この低分子のRNA断片は標的mRNAの分解を媒介する。RNAiの合成のためのキットが、例えばニューイングランド・バイオラブズ社又はアンビオン社から市販されている。ある実施態様では、アンチセンスRNAで用いられる、ここで記載された化学法の一つ以上を、RNAiを媒介する分子で用いることができる。
【０１８８】
ここで用いられる場合の用語「核酸」にはフラグメント又はそれに均等のものが含まれる（例えば骨芽細胞調節物質又は破骨細胞調節物質のフラグメント又は均等物）。用語「均等物」には、機能的に均等なたんぱく質、即ち、当該たんぱく質の生物学的活性を維持した、それらの天然の結合パートナーへの結合能を有するバリアントたんぱく質、をコードするヌクレオチド配列が含まれるものと、意図されている。
【０１８９】
「単離された」核酸分子とは、当該核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。例えば、ゲノムDNAに関して言うと、用語「単離された」には、ゲノムDNAが天然で結び付いている先の染色体から分離された核酸分子が含まれる。好ましくは、「単離された」核酸分子は、当該核酸分子の由来となる生物のゲノムDNA中で当該核酸分子を天然でフランクする配列（即ち、当該核酸分子の5'側及び3'側末端にある配列）を含まないとよい。
【０１９０】
ここで用いられる場合の「単離されたたんぱく質」又は「単離されたポリペプチド」とは、細胞から単離された又は組換えDNA技術により産生された場合には他のたんぱく質、ポリペプチド、細胞物質及び培養基を、あるいは、化学合成された場合には化学的前駆体又は他の化学物質を、概ね含まないたんぱく質又はポリペプチドを言う。「単離された」又は「精製された」たんぱく質又はその生物学的に活性な部分とは、当該たんぱく質が得られた元の細胞又は組織源由来の細胞物質又は他の混入たんぱく質を概ね含まないか、あるいは、化学合成された場合には化学的前駆体又は他の化学物質を概ね含まない。言語「細胞物質を概ね含まない」には、たんぱく質が、それが単離された又は組換えにより産生された元の細胞の細胞成分から分離されているようなたんぱく質製剤が含まれる。
【０１９１】
本発明の核酸は、例えば標準的な組換えDNA技術などにより調製するすることができる。本発明の核酸は、標準的な技術を用いて化学合成することもできる。ポリでオキシヌクレオチドを化学合成する多様な方法が公知であり、その中には、市販のDNA合成装置で自動化されている固相合成法がある（例えば引用によりここに援用する Itakura らの米国特許第4,598,049号；Caruthers らの米国特許第4,458,066号；及びItakura の米国特許第4,401,796号及び第4,373,071号がある）。
【０１９２】
ここで用いられる場合の用語「ベクタ」とは、それが連結された先の別の核酸を輸送することのできる核酸分子を言う。ベクタの種類の一つは、更なるDNAセグメントを中にライゲートできる環状の二本鎖DNAループを言う「プラスミド」である。もう一つのベクタの種類は、更なるDNAセグメントをウィルスゲノム中にライゲートできるウィルス・ベクタである。いくつかのベクタは、それらが導入された先のホスト細胞内で自律的複製が可能である（例えば細菌由来の複製開始点を有する細菌性ベクタや、エピソーム哺乳類ベクタなど）。他のベクタ（例えば非エピソーム哺乳類ベクタ）は、ホスト細胞内に導入されるや、ホスト細胞のゲノムに組み込まれることで、ホストゲノムと一緒に複製される。更に、いくつかのベクタは、それらが作動的に連結された先の遺伝子又は核酸分子の発現を命令することができる。このようなベクタをここでは「組換え発現ベクタ」又は単に「発現ベクタ」という。一般に、組換えDNA技術で実用性のある発現ベクタはプラスミドの形であることが多い。本明細書においては、プラスミドは最も普通に用いられている形のベクタであるため、「プラスミド」及び「ベクタ」が交換可能に用いられている場合がある。しかしながら、本発明は、均等な機能を果たす、ウィルス・ベクタ（例えば複製欠陥レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レンチウィルス）など、他の形の発現ベクタも包含することを意図している。
【０１９３】
ここで用いられる場合の用語「ホスト細胞」は、本発明の組換え発現ベクタなど、本発明の核酸分子が導入される先の細胞を言うものと、意図されている。用語「ホスト細胞」及び「組換えホスト細胞」はここでは交換可能に用いられている。このような用語は特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代又は潜在的な後代も言うものと、理解されるはずである。突然変異又は環境による影響が原因で後の世代で特定の改変が起き得るため、このような後代は実際には親細胞とは同一でないかも知れないが、それでも尚、ここで用いられるこの用語の範囲内に含まれる。好ましくはホスト細胞は哺乳動物細胞、例えばマウス細胞、ヒト細胞であるとよい。ある実施態様では、それは上皮細胞である。別の実施態様では、ホスト細胞は間葉幹細胞である。更に別の実施態様では、ホスト細胞は骨芽細胞である。ある実施態様では、ホスト細胞は造血幹細胞である。別の実施態様では、ホスト細胞は破骨細胞である。
【０１９４】
ここで用いられる場合の用語「トランスジェニック細胞」とは、導入遺伝子を含有する細胞を言う。
【０１９５】
ここで用いられる場合の「トランスジェニック動物」には、当該動物の細胞のうちの一つ以上、そして好ましくは全てが導入遺伝子を含むような、例えば非ヒト哺乳動物、例えばブタ、サル、ヤギ、又はマウスなどのげっ歯類などの動物が含まれる。導入遺伝子は、例えば顕微注射、トランスフェクション、又は組換えウィルスの感染などの感染などにより、細胞へ直接又は細胞の前駆体への導入により間接的に導入される。遺伝子操作という用語には、組換えDNA分子の導入が含まれる。この分子は染色体内に組み込まれても、あるいは染色体外で複製されるDNAであってもよい。
【０１９６】
ここで用いられる場合の用語「抗体」には、免疫グロブリン分子、及び、免疫グロブリン分子のうちの免疫学的に活性な部分、即ち、Fab 及びF(ab')2
フラグメント、一本鎖抗体、細胞内抗体、scFv、Fd、又は他のフラグメントなどの、抗原に結合（相互作用）する抗原結合部位を含有する分子や細胞内抗体が含まれるものと、意図されている。好ましくは、本発明の抗体は、骨芽細胞/破骨細胞調節物質分子（即ち非骨芽細胞/破骨細胞調節物質分子に対してはほとんど、又は全く交差反応性がない）に特異的又は実質的に特異的に結合するとよい。ここで用いられる場合の用語「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体組成物」とは、ある抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を一種のみ含有する抗体分子集団を言い、他方、用語「ポリクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体組成物」とは、ある特定の抗原と相互作用することのできる抗原結合部位を複数種、含有する抗体分子集団を言う。従ってモノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の抗原に対して単一の結合親和性を示す。
【０１９７】
ここで用いられる場合の用語「骨芽細胞/破骨細胞調節物質の発現及び／又は活性を修飾すると有益であろう障害」には、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の活性が異常であるか、あるいは、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の活性を修飾すると有益であるような障害が含まれる。障害の例には、骨形成及び石灰化を修飾すると有益であるような障害、疾患、状態又は傷害がある。
【０１９８】
ある実施態様では、低分子を検査化合物として用いることができる。用語「低分子」は当業の用語であり、その中には約7500未満、約5000未満、約1000分子量未満、又は、約500 分子量未満の分子が含まれる。ある実施態様では、低分子はペプチド結合のみを排他的に含むものではない。別の実施態様では、低分子はオリゴマーではない。活性についてスクリーニングすることのできる低分子化合物の例には、限定はしないが、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、糖、有機低分子（例えば Cane et al. 1998. Science 282:63）、及び自然生成物抽出ライブラリがある。別の実施態様では、当該化合物は低分子の非ペプチド性有機化合物である。更なる実施態様では、低分子は生合成によるものではない。例えば低分子はそれ自体、転写又は翻訳の産物ではないと好ましい。
【０１９９】
ＩＩ．  スクリーニング検定法
本発明は、調節物質（骨芽細胞調節物質 及び／又は 破骨細胞調節物質）の 活性を修飾する他の修飾物質、即ち候補又は検査化合物又は作用物質（例えばペプチドミメティックス、低分子又は他の作用物質）を同定するための、そして他の作用物質の活性を最適化するための方法（ここでは「スクリーニング検定法」とも呼ばれる）を提供するものである。
【０２００】
例えば、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の発現及び／又は活性の修飾物質は公知であったり（例えばTAOK2、DLG1、PIN1、LYK5、MOBKL2C、MAP4K2、PACSIN2、DCAMKL1、DOCK4、PARG1、TAOK3、TRPV6、CLK1、AAK1、PRKCA、AKAP8、DGKI、SMARCB1、CIB2、STK33、STK39、NRGN、PIK3R1、RASSF5、FRAP1、STK38、LATS1、LATS2、STK38L、GEFT、TNNI3K、STK4、RAF1、ARF1、C17orf31、EXO1、POT1、TERF2IP、MSH2、DKC1、MOBKL1A、MAP3K11、WWP2、SMURF2、GCK、WASF1、PPP2CB、PPP2R1A、CREBBP、CUL3、FBXW11、MELK、PLCL1、MAP3K3、DLGH1、NEK7、IRAK3、RHOC、SLC4A2、PLCB4、B-RAF、BMPR2、MAPK3、及びNHEDC2 活性のドミナント・ネガティブ阻害剤、骨芽細胞/破骨細胞調節物質アンチセンス分子、骨芽細胞/破骨細胞調節物質活性に干渉する細胞内抗体、骨芽細胞/破骨細胞調節物質を由来とするペプチド阻害剤）、あるいは、ここで開設する方法を用いて同定することができる。
【０２０１】
例えばある実施態様では、調節物質などに結合するか、あるいは、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の発現及び／又は活性に対して刺激もしくは阻害効果を有する分子を同定することができる。
【０２０２】
ある実施態様では、ある化合物の、調節物質の発現／又は活性を直接的に修飾する上での能力を、本発明のスクリーニング検定法を用いて指標組成物で測定する。
【０２０３】
ある実施態様では、前記指標組成物は調節物質たんぱく質を発現する細胞であってよく、例えば、当該たんぱく質を天然で発現する細胞でよく、又はより好ましくは、当該たんぱく質をコードする発現ベクタを細胞内に導入することにより、当該たんぱく質を発現するように操作された細胞であるとよい。ある実施態様では、前記細胞はアンチセンス骨芽細胞/破骨細胞調節物質を発現するように操作されている。好ましくは、前記細胞は哺乳動物細胞、例えばマウス細胞及び／又はヒト細胞である。ある実施態様では、前記細胞は成体由来である。別の実施態様では、前記細胞は骨芽細胞である。ある実施態様では、前記骨芽細胞は初代頭蓋冠骨芽細胞である。別の実施態様では、前記骨芽細胞はC3H10T1/2骨芽細胞である。別の実施態様では、前記細胞は成熟骨芽細胞である。別の実施態様では、前記細胞は間葉幹細胞である。ある実施態様では、前記細胞は破骨細胞である。別の実施態様では、前記細胞は造血幹細胞である。ある実施態様では、造血幹細胞はCD11blow/- CD3- B220- c-fms+由来である。ある実施態様では、a CD11blow/- CD3-
B220- c-fms+ 細胞はc-kit+である。別の実施態様では、
CD11blow/- CD3- B220- c-fms+ 細胞は c-kit-である。
【０２０４】
別の実施態様では、本発明のスクリーニング検定法で用いる細胞は初代細胞、例えば不死化させていない、in vitroで培養された分離細胞など、である。別の実施態様では、本発明のスクリーニング検定法で用いる細胞は不死化細胞、即ち、細胞株由来の細胞である。ある実施態様では、前記細胞株はMC3T3-E1細胞株である。別の実施態様では、前記細胞株は293T細胞株である。更に別の実施態様では、前記細胞株はRAW 264.7細胞株である。
【０２０５】
選択的には、指標組成物は、たんぱく質を含む無細胞組成物（例えば細胞抽出物、又は、精製済み天然又は組換えたんぱく質などを含む組成物）であってもよい。
【０２０６】
ここに記載された検定法を用いて同定された化合物は、例えば骨芽細胞形成の修飾、骨石灰化の修飾、破骨細胞形成の修飾、例えば骨形成及び／又は骨のリモデリングにおける骨芽細胞対破骨細胞活性の修飾、BSP、ColI(a)1、OCN、オステリックス、RANKL、ATF4、NFATc1、TRAP、カテプシン K、MMP9、b3-インテグリン、及びカルシトニン受容体の発現の修飾、ATF4 たんぱく質レベルの修飾、及び／又は、ATF4のリン酸化の修飾が有益であるような障害など、ある調節物質の異常な発現及び／又は活性に関連する障害を処置するために有用であろう。
【０２０７】
骨芽細胞/破骨細胞調節物質活性の修飾が有益であろう状態には、骨形成及び石灰化の修飾が有益であろう疾患、障害、状態、又は傷害が含まれる。ある実施態様では、骨形成及び石灰化は生後の対象において修飾される。別の実施態様では、骨形成及び石灰化は、例えば長骨の骨端円盤が消失している、つまり骨端及び骨幹が融合している対象など、成体の対象において修飾される。
【０２０８】
別の局面では、本発明は、ここで解説する検定の二つ以上の組合せに関する。例えば修飾物質を、細胞ベース又は無細胞検定法を用いて同定することができ、その物質が、例えば骨粗鬆症又は大理石骨病などの動物モデルなど、ある動物中などのin vivoで、ある調節物質の活性を修飾する能力を特定することができる。ある実施態様では、骨粗鬆症の動物モデルは、例えばエストロゲンの減少及び続くFSHの増加などを原因とする閉経後の女性における骨の消失の動物モデル、例えば骨粗鬆症のマウスモデル、例えば卵巣摘出マウスなどである。別の実施態様では、骨粗鬆症の動物モデルは、例えば糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症など、二次性骨粗鬆症のモデルである。別の実施態様では、骨減少症のマウスモデルなど、本発明の方法で使用する動物モデルは、WWP1を過剰発現するトランスジェニックマウスである。ある実施態様では、該トランスジェニックWWP1マウスは、例えばWWP1の発現を骨芽細胞などに空間的に制限するアレルなど、WWP1の条件的アレルを含む。ある実施態様では、前記条件的WWP1アレルは、ヒトWWP1アレルを含む。ある実施態様では、WWP1は粗曽木特異的プロモータの制御下で発現する。ある実施態様では、組織特異的プロモータはタイプIコラーゲン・プロモータである。別の実施態様では、組織特異的プロモータはオステリックス・プロモータである。別の実施態様では、大理石骨病の前記動物モデルは、例えばCre-lox NFATc1などのNFATc1の条件的切除のあるマウスなど、ノックアウト・マウスである。
【０２０９】
更に、ここで解説された通りに同定された調節物質の修飾物質（例えばアンチセンス核酸分子、又は特異抗体、又は低分子）を動物モデルで用いて、このような修飾物質による処置の効験、毒性、又は副作用を判定することができる。大体的には、ここで解説された通りに同定された修飾物質を動物モデルで用いて、このような修飾物質の作用機序を判定することができる。
【０２１０】
別の実施態様では、同様なスクリーニング検定法を用いて、ある調節物質の活性及び／又は発現を間接的に修飾する化合物を、例えばシグナル伝達経路で当該調節物質の上流又は下流で作用する分子など、当該調節物質が相互作用する分子を用いて上述したものなどのスクリーニング検定法を行うことにより、同定できることは理解されよう。
【０２１１】
本発明のある実施態様では、細胞ベース及び／又は無細胞検定法を高スループットの態様で行う。ある実施態様では、前記検定法は９６ウェル・フォーマットを用いて行われる。別の実施態様では、本発明の検定法は、１９２ウェル・フォーマットを用いて行われる。別の実施態様では、本発明の検定法は３８４ウェル・フォーマットを用いて行われる。ある実施態様では、本発明の検定法は半自動化され、例えば検定法の一部分、例えば多様な試薬の添加など、が自動化された態様で行われる。別の実施態様では、本発明の検定法は、例えば検定法への全ての試薬の添加や検定結果の捕獲が自動化されるなど、完全に自動化される。
【０２１２】
本発明の検定法は、概略的には、指標組成物を目的化合物又は化合物ライブラリに所定量の時間、又は、所定の成長時点で（in vitro 又は in vivoのいずれか） 接触させるステップと、ある特定の読み取り値に対する当該化合物の効果を検定するステップとが含まれる。ある実施態様では、指標組成物を目的化合物又は化合物ライブラリに検定の全期間中、接触させる。別の実施態様では、指標組成物を目的化合物又は化合物ライブラリに全検定期間よりも短い時間、接触させる。例えば細胞を数日又は数週間、培養し、例えば14日間の培養後に化合物と接触させてもよい。ある実施態様では、細胞を目的化合物に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は 21 日間、染色させる。ある実施態様では、本発明の指標組成物を化合物に所定時間、接触させ、この化合物を取り出し、該指標組成物を化合物の非存在下に所定時間、維持してから、特定の読み取り値について検定する。加えて、本発明の方法で用いる非ヒト動物（下に詳述する）を目的化合物に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21日間、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12 週間、接触させてもよい。また本発明の非ヒト動物を、例えば卵巣切除又は糖質コルチコイド処置し、手術後又は糖質コルチコイド処置から0、1 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12週後に、本発明の目的化合物に接触させてもよい。別の実施態様では、例えば手術又は処置前など、手術又は糖質コルチコイド処置から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 日前に、非ヒト動物を目的化合物に接触させてもよい。
【０２１３】
本発明の化合物を、検定に適する、当業者には容易に判断される濃度で検定してもよい。例えばある実施態様では、指標組成物をミリモル濃度の化合物に接触させる。別の実施態様では、指標組成物をマイクロモル濃度の化合物に接触させる。別の実施態様では、指標組成物をナノモル濃度の化合物に接触させる。
【０２１４】
以下、本発明の細胞ベース及び無細胞検定法をより詳述する。
Ａ．  細胞ベース検定法
本発明の指標組成物は、少なくとも一種の骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質を発現する細胞、例えば当該内生分子を天然で発現する細胞、あるいはより好ましくは、少なくとも一種の外生骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質をコードする少なくとも一つの発現ベクタを細胞内に導入することにより、このたんぱく質を発現するように操作された細胞、であってもよい。また、骨芽細胞/破骨細胞調節物質のRNAiを媒介するshRNA分子を含む発現ベクタを細胞内に導入することにより、本発明の方法で用いられる細胞を操作してもよい。選択的には、指標組成物は、少なくとも一種の骨芽細胞/破骨細胞調節物質を含む無細胞組成物（例えば、当該たんぱく質を発現する細胞からの細胞抽出物、又は、天然もしくは組換えのたんぱく質のいずれでもよい精製済みの調節物質たんぱく質を含む組成物、又は、骨芽細胞/破骨細胞調節物質 shRNA 分子を発現する細胞からの細胞抽出物）であってもよい。
【０２１５】
多様な細胞種が、本スクリーニング検定法で指標細胞として用いるのに適している。ある実施態様では、低レベルの内生調節物質を発現する細胞株を用い、その後、組換えたんぱく質を発現するように操作する。別の実施態様では、高レベルの内生骨芽細胞/破骨細胞調節物質を発現する細胞株が用いられた後、当該調節物質たんぱく質の産生を阻害するように操作される。本検定で用いられる細胞には、真核性及び原核性の両方の細胞が含まれる。例えばある実施態様では、細胞は細菌細胞である。,別の実施態様では、細胞は酵母細胞などの真菌細胞である。別の実施態様では、細胞は鳥類細胞又は哺乳動物細胞（例えばマウス細胞、又はヒト細胞）などの脊椎動物細胞である。好ましくは、当該細胞はヒト細胞などの哺乳動物細胞であるとよい。選択的には、指標組成物は、当該たんぱく質を含む無細胞組成物（例えば、細胞抽出物か、あるいは精製済みの天然の、又は組換えのたんぱく質のいずれかなどを含む組成物）であってもよい。
【０２１６】
ある調節物質の発現及び／又は活性を修飾する化合物は、多様な「読み取り値」を用いて同定することができる。
【０２１７】
例えば、指標細胞に発現ベクタをトランスフェクトし、検査化合物の存在下及び非存在下でインキュベートし、当該分子の発現に対する、又は、当該分子の調節を受ける生物学的応答に対する前記化合物の効果を判定することができる。生物学的活性には、標準的技術によりin vivo又はin vitroで判定される活性がある。活性は、例えば標的分子もしくは結合パートナーとの結び付き、あるいは、キナーゼ活性又はホスファターゼ活性などの酵素活性など、直接的な活性でもよい。選択的には、活性は、標的分子との当該淡白九室の相互作用の下流で発生する細胞シグナル伝達活性、あるいは、その相互作用により惹起されるシグナル伝達カスケードの結果起きる生物学的効果など、間接的な活性である。例えば、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の生物学的活性には：骨芽細胞形成の修飾、骨石灰化の修飾、破骨細胞形成の修飾、例えば骨形成及び／又は骨のリモデリングにおける骨芽細胞対破骨細胞活性の修飾、BSP、ColI(a)1、OCN、オステリックス、RANKL、ATF4、NFATc1、TRAP、カテプシン K、MMP9、b3-インテグリン、及びカルシトニン受容体の発現の修飾、ATF4たんぱく質レベルの修飾、及び／又は、ATF4のリン酸化の修飾、がある。
【０２１８】
さらに指標細胞に、検査化合物の存在下及び非存在下でインキュベートされた骨芽細胞/破骨細胞調節物質 shRNA 分子を含む発現ベクタをトランスフェクトし、前記分子の調節を受ける生物学的応答に対する前記化合物の効果を判定し、骨芽細胞／破骨細胞調節物質のサイレンシングと関係する表現型を「救助する」又は「逆転させる」化合物を同定してもよい。 
【０２１９】
ある検査化合物が骨芽細胞/破骨細胞調節物質のたんぱく質発現を修飾するかどうかを判定するためには、 in vitro 転写検定法を行うことができる。このような検定法の一例においては、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の調節配列（例えば完全長のプロモータおよびエンハンサ）をクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(CAT)、GFP、又はルシフェラーゼ、例えばOSE2-ルシフェラーゼ、などのレポータ遺伝子に作動可能に連結し、ホスト細胞に導入することができる。ある実施態様では、レポータ遺伝子コンストラクトは多量体化コンストラクトである。ある実施態様では、前記多量体化コンストラクトはオステオカルシン調節配列を含む。ある実施態様では、前記多量体化オステオカルシン・コンストラクトは、ルシフェラーゼレポータ遺伝子に作動可能に連結させたオステオカルシン調節配列の６つのコピーを含む。他の技術は当業で公知であり。
【０２２０】
ある検査化合物が骨芽細胞/破骨細胞調節物質のmRNA発現、あるいは、骨芽細胞/破骨細胞調節物質により修飾される遺伝子、例えばBSP、ColI(a)1、OCN 、RANKL、ATF4、NFATc1、TRAP、カテプシン K、MMP9、b3-インテグリン、及びカルシトニン受容体、の発現を修飾するかどうを判定するためには、例えば定量的又はリアルタイムＰＣＲなど、当業者には容易に公知の多様な方法を行うことができる。
【０２２１】
ある検査化合物がある調節物質の活性を修飾するかどうかを判定するためには、当該調節物質の公知の機能の検定を、当業者に公知の方法を用いて行えよう。
【０２２２】
ここで交換可能に用いられるように、用語「作動可能に連結させた」及び「作動的に連結させた」は、当該ヌクレオチド配列が、ホスト細胞内（又は細胞抽出物による）のそのヌクレオチド配列の発現が可能な態様で調節配列に連結されていることを意味するものとして、意図されている。調節配列は当業で公知であり、適したホスト細胞内で所望のたんぱく質の発現を命令するように選択することができる。調節配列という用語には、プロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化シグナル及び他の発現制御因子が含まれるものと、意図されている。このような調節配列は当業者には公知であり、またGoeddel, Gene Expression
Technology:  Methods in Enzymology
185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に解説されている。発現ベクタのデザインは、トランスフェクトしようとするホスト細胞の選択、及び／又は、発現させたいたんぱく質の種類及び／又は量、といった因子に依るであろうことは理解されねばならない。
【０２２３】
多様なレポータ遺伝子が当業で公知であり、本発明のスクリーニング検定法で用いるのに適している。適したレポータ遺伝子の例には、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光たんぱく質、又はルシフェラーゼをコードするものがある。これらの遺伝子産物の活性を測定する標準的方法は当業において公知である。
【０２２４】
ある実施態様では、検査化合物の存在下における指標細胞中の骨芽細胞/破骨細胞調節物質の、あるいはレポータ遺伝子の、発現及び／又は活性のレベルが、検査化合物の非存在下における指標細胞中の発現及び／又は活性のレベルよりも高く、この検査化合物は、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の発現を刺激する化合物として、同定される。別の実施態様では、検査化合物の存在下における指標細胞中の骨芽細胞/破骨細胞調節物質の、あるいは、レポータ遺伝子の、発現及び／又は活性のレベルが、前記検査化合物の非存在下における指標細胞中の発現及び／又は活性のレベルよりも低く、この検査化合物は骨芽細胞/破骨細胞調節物質の発現を阻害する化合物として同定される。
【０２２５】
ある実施態様では、本発明は、骨芽細胞/破骨細胞調節物質が関与する細胞応答を修飾する化合物同定する方法を提供するものである。
【０２２６】
ある実施態様では、間葉及び／又は造血幹細胞などの細胞の分化を、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の修飾の指標として用いることができる。細胞分化は直接的に（例えば細胞分化を観察するための細胞の顕微鏡検査などにより）、観察することも、あるいは間接的に、例えば細胞分化の一つ以上のマーカを観察する（例えば細胞分化に関連する遺伝子産物のmRNAの増加、あるいは、細胞分化に関連する遺伝子産物の分泌、例えばあるたんぱく質（例えばTRAP）の分泌、あるいは 、ここで解説するように、骨芽細胞
及び／又は 破骨細胞発生のマーカの発現など）ことにより、観察することもできる。例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法 (RT-PCR) 及びノーザン・ブロット法など、目的のmRNAを検出する標準的な方法が当業で公知である。酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）など、培養上清中のたんぱく質分泌を検出する標準的方法も、当業で公知である。またたんぱく質を、例えば免疫沈降反応又は染色用、そしてFACS分析など、抗体を用いて検出することもできる。
【０２２７】
ある実施態様では、当該化合物の、骨形成及び石灰化及び／又は破骨細胞形成を修飾する能力を測定することができる。当該化合物の骨形成及び石灰化
及び／又は
破骨細胞形成修飾能を判定するための多様なin vitro技術が当業者に公知である。例えば骨格構造は小柱形成のデジタルＸ線撮影により検定することができ（即ち、骨髄で満たされた連絡空間の網状構造を形成する癌性骨内の骨スピクラを吻合する）、三次元μ-QCT画像法や、骨横断面の分析により、判定することができる。加えて、小柱の数、小柱の厚さ、小柱の感覚、組織体積辺りの骨体積（BV/TV）、及び骨塩量（BMD）も、μ-ＱＣＴ画像法により判定することができる。これらの分析は骨標品全体に行われても、あるいは個々の骨に対して行われてもよい。石灰化した骨及び石灰化していない軟骨の形成は、アリザリン・レッド／アルシアン・ブルー染色などによる組織化学的分析により判定することができる。骨芽細胞機能対破骨細胞機能及び／又は
破骨細胞形成に対する効果についてある化合物を検定するには、骨髄（BM）（造血幹細胞）をM-CSF 及びRANKL の存在下で培養してTRAP+ 破骨細胞を産生させることにより、 in vitro 破骨細胞分化検定法を行う。破骨細胞によるTRAP分泌は、比色検定法を用いて判定することができる。ある化合物が骨芽細胞機能又は破骨細胞機能に影響を及ぼすかどうかのin vivoでの判定には、例えば骨髄移植により行うことができる。加えて、多様な組織形態計測学的パラメータを分析することで、骨形成速度を判定することができる。例えば、蛍光顕微鏡画像法で観察される骨を二重カルセイン−標識することにより、骨形成速度（BFR）を判定することができ、この骨形成速度は、骨芽細胞の骨形成能の反映である無機物付着速度（MAR）を骨表面辺りの石灰化表面の面積（MS/BS）でを乗算することにより計算される。ある実施態様では、キシレノール・オレンジなどのキレート性蛍光色素を用いて骨を視覚化することができる。更に、骨芽細胞集団の信頼性ある指標である全骨芽細胞表面を、類骨の厚さ、即ち、石灰化を起こしていない骨の厚さ、と同じく、測定することができる。さらに骨の切片を in vivo での骨の形成の分析用のフォン・コッサ及びトルイジン・ブルーによる染色で分析することができ、Trabp5b及びデオキシピリジノリンの血清レベルを骨形成の指標として判定することもできる。骨芽細胞前駆体及び未熟骨芽細胞のex vivo培養を行っても、細胞外マトリックス、即ち骨の石灰化マトリックス、の生成を反映する、鉱化結節形成能を細胞が持つかどうかを判定することができる。更に、これらの培養物をそれらの増殖能について、例えば細胞計数などにより検定することができ、そしてアルカリホスファターゼなど、骨形成の多様なマーカの存在について染色することができる。これらの同じ培養物は、骨形成及び石灰化や破骨細胞形成に関与することが公知の数多くの分子、例えばBSP、ColI(a)1、OCN、オステリックス、RANKL、ATF4、NFATc1、TRAP、カテプシン K、MMP9、b3-インテグリン、カルシトニン受容体、ALP、LRP5、Runx2、RANKL、RSK2のmRNA及びたんぱく質産生の多種の分析に向けても利用することができる。
【０２２８】
ある化合物の、骨形成及び石灰化の修飾能は、培養細胞を用いても測定することができる。ある実施態様では、間葉幹細胞を、骨形成についての検定で用いられよう。例えば骨芽細胞を形成することができる多能細胞、即ち間葉幹細胞（例えば初代細胞又は細胞株、を、目的化合物に接触させ、この多能細胞の骨芽細胞への分化を視覚的に評価することができる。多能細胞の骨芽細胞への分化は、比色検定法を用いて細胞内アルカリホスファターゼのレベルを検定することでも、評価することができる。ある実施態様では、細胞をアラマー・ブルーなどで染色することにより、総細胞数を細胞性アルカリホスファターゼのレベルに正規化する。このような培養分化細胞の石灰化は、例えばキシレノール・オレンジ染色 及び／又はフォン・コッサ染色。ヒトで判定することができ、０日目に培養に向けてプレートしてもよい。１日目には細胞が分化するであろう。また１日目に検査化合物を培養物に加えてもよい。分化は（例えば４から１０日目に）アルカリホスファターゼ検定法を用いて分析してよく、細胞生存率はアラマー・ブルーを用いて測定できよう。細胞外マトリックスの形成も、例えば２１日目などに測定してよい。
【０２２９】
別の実施態様では、造血幹細胞を骨形成に関する検定法で用いてもよい。例えば破骨細胞を形成することのできる多能細胞、即ち造血幹細胞（例えば初代細胞又は細胞株を目的化合物に接触させ、この多能細胞の破骨細胞への分化を視覚的に評価することができる。また、多能細胞の破骨細胞への分化は、培養基中に分泌されるTRAPのレベルを比色検定法を用いて検定することでも、評価することができる。ある実施態様では、細胞をアラマー・ブルーなどで染色するなどによって、総細胞数をTRAPのレベルに正規化する。破骨細胞（原語：osteoclst）又は吸収窩の形成は、例えばコッサ染色法などにより、評価することができる。
【０２３０】
別の実施態様では、ある化合物のアポトーシス修飾能を判定することができる。ある実施態様では、例えば形質細胞アポトーシスなどの細胞アポトーシス中にミトコンドリアから放出されるチトクロームCを、（例えば Bossy-Wetzel E. et al. (2000) Methods in Enzymol. 322:235-42に解説された通りに）検出することができる。他の検定例には：無細胞系で誘導される核アポトーシスの細胞蛍光測定法による定量（例えばLorenzo H.K. et al. (2000)
Methods in Enzymol. 322:198-201に解説された通り）；アポトーシス・ヌクレアーゼ検定法（例えば Hughes F.M.
(2000) Methods in Enzymol. 322:47-62に解説された通り）；フローおよびレーザ・スキャンニング細胞測定法によるアポトーシス性形質細胞などのアポトーシス性細胞の分析（例えば Darzynkiewicz Z. et al.
(2000) Methods in Enzymol. 322:18-39に解説された通り）；アネキシンＶ標識法によるアポトーシスの検出（例えばBossy-Wetzel
E. et al. (2000) Methods in Enzymol. 322:15-18に解説された通り）；細胞死遺伝子に関する一過性トランスフェクション検定法（例えばMiura M. et al. (2000) Methods in Enzymol. 322:480-92に解説された通り）；及びアポトーシス性形質細胞などのアポトーシス性細胞におけるDNA切断を検出する検定法 （例えばKauffman
S.H. et al. (2000) Methods in Enzymol. 322:3-15に解説された通り)がある。またアポトーシスは、ヨウ化プロピジウム又はTUNEL検定法によっても測定することができる。
【０２３１】
別の実施態様では、細胞内カルシウムの移動、NFATカスケードのメンバーのたんぱく質レベルを測定することができる。
【０２３２】
別の実施態様では、例えばRSK2 及び／又は Runx2などのユビキチン化に対する当該化合物の効果を、例えばin vitro又はin vivo ユビキチン化検定法により測定することができる。in vitro ユビキチン化検定法は例えば Fuchs, S. Y., Bet al.
(1997)  J. Biol. Chem.
272:32163-32168に解説がある。in vivo ユビキチン化検定法は例えばTreier, M., L. et al. (1994) Cell
78:787-798に解説がある。
【０２３３】
ある実施態様では、低スループットの検定法を用いて、ユビキチン化に対する化合物の効果を評価してもよい。別の実施態様では、高スループットの検定法を用いて、ユビキチン化に影響する化合物をスクリーニングしてもよい。例えばたんぱく質タグ（mycなど）を認識する抗体をプレートのウェルに結合させてもよい。その後、HECTドメインを含むエピトープ・タグ付きWWP1を、プレート上の抗体に結合させてもよい。
【０２３４】
別の実施態様では、例えば内生骨芽細胞/破骨細胞調節物質標的分子及び／又は骨芽細胞/破骨細胞調節物質結合パートナーなどの分解に対する化合物の効果を、 同時免疫沈降法などにより測定することができる。同時免疫沈降物のウェスタン・ブロット法を行い、このブロットを、骨芽細胞/破骨細胞調節物質及び内生骨芽細胞/破骨細胞調節物質標的分子及び／又は骨芽細胞/破骨細胞調節物質結合パートナーへの抗体でプローブしたものを定量することで、分解が起きたかどうかを判定することができる。パルス-チェース実験を行っても、たんぱく質レベルを判定することができる。
【０２３５】
別の実施態様では、骨芽細胞/破骨細胞調節物質のリン酸化を判定する。リン酸化は例えばin vitro キナーゼ検定法の使用により判定することができ、そしてあるたんぱく質の自己リン酸化は、例えばリン酸化した及び／又はリン酸化していない形の当該たんぱく質に特異的な抗体による免疫ブロット、及び／又は、リン酸化したセリン/スレオニンを認識する抗体による免疫ブロットにより、測定することができる。
【０２３６】
骨芽細胞/破骨細胞調節物質の基質又は標的分子への結合を修飾する上での検査化合物の能力を判定することもできる。骨芽細胞/破骨細胞調節物質の標的分子（例えば基質などの結合パートナー）への結合を修飾する上での検査化合物の能力を判定するには、例えば放射性同位体又は酵素標識などに標的分子を結合させることで、標的分子の骨芽細胞/破骨細胞調節物質への結合が、複合体中の標識済み標的分子を検出することにより判定できるようにすれば、達成が可能である。選択的には、骨芽細胞/破骨細胞調節物質 に放射性同位体又は酵素標識を結合させて、複合体中の標的分子への結合を修飾する上での検査化合物の能力を観察してもよい。検査化合物の、骨芽細胞/破骨細胞調節物質への結合能の判定は、例えば、当該化合物に放射性同位体又は酵素標識を結合させることで、骨芽細胞/破骨細胞調節物質への化合物の結合を、複合体中の標識済み化合物を検出することにより判定できるようにすれば、達成が可能である。例えば、標識を、125I、35S、14C、又は3Hで直接的又は間接的に標識し、この放射性同位体を放射線の直接的計数又はシンチレーション計数法により検出してもよい。代替的には、化合物を例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼなどで標識し、この酵素標識を、適した基質の生成物への転化を判定することにより、検出することができる。
【０２３７】
更に、化合物の、骨芽細胞/破骨細胞調節物質との相互作用能を相互作用物のいずれも標識せずに判定することも、本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーターを用いれば、骨芽細胞/破骨細胞調節物質分子との化合物の相互作用を、この化合物又は分子のいずれも標識せずに、検出することができる。(McConnell, H. M. et al.
(1992) Science 257:1906-1912)。ここで用いられる場合の「マイクロフィジオメーター」（例えばサイトセンサー（原語：Cytosensor）は、細胞がその環境を酸性化している速度を光指定可能な電位計センサー（LAPS）を用いて測定する分析装置である。この酸性化速度の変化を、化合物及び間の相互作用の指標として用いることができる。
【０２３８】
本発明の細胞は骨芽細胞/破骨細胞調節物質の少なくとも一種を発現することができ、そのように操作されてもよく、あるいは、組換え技術を用いて当該たんぱく質の産生をサイレントにするように操作されてもよい。例えば当該たんぱく質を発現するように操作された細胞は、当該たんぱく質をコードする発現ベクタを細胞内に導入することにより、作製することができる。
【０２３９】
骨芽細胞/破骨細胞調節物質の発現に用いることできる組換え発現ベクタは当業で公知である。cDNA 又はshRNA分子をまず組換え発現ベクタ内に、標準的な分子生物学技術を用いて導入する。cDNAは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いた増幅により、あるいは、適したcDNAライブラリをスクリーニングすることにより、得ることができる。cDNAのヌクレオチド配列、又は、シグナル伝達経路関与の分子（例えばヒト、マウス及び酵母）は当業で公知であり、標準的なPCR法によるcDNAの増幅を可能にするPCRプライマのデザインや、標準的なハイブリダイゼーション法を用いてcDNAをスクリーニングするのに用いることのできるハイブリダイゼーション・プローブのデザインに、用いることができる。同様に、shRNA分子を、ここで開示した通りの骨芽細胞/破骨細胞調節物質の公知のコーディング配列に基づき、デザインすることができる。
【０２４０】
骨芽細胞/破骨細胞調節物質をコードするcDNA分子の単離又は増幅後、そのDNA断片を発現ベクタ内に導入する。ここで用いられる場合の用語「ベクタ」とは、連結された先の別の核酸を輸送することのできる核酸分子を言う。ベクタの種類の一つは、更なるDNAセグメントを中にライゲートできる環状の二本鎖DNAループを言う「プラスミド」である。もう一つのベクタの種類は、更なるDNAセグメントをウィルスゲノム中にライゲートできるウィルス・ベクタである。いくつかのベクタは、それらが導入された先のホスト細胞内で自律的複製が可能である（例えば細菌由来の複製開始点を有する細菌性ベクタや、エピソーム哺乳類ベクタなど）。他のベクタ（例えば非エピソーム哺乳類ベクタ及び／又はウィルス・ベクタ、例えばレンチウィルス）は、ホスト細胞内に導入されるや、ホスト細胞のゲノムに組み込まれることで、ホストゲノムと一緒に複製される。更に、いくつかのベクタは、それらが作動的に連結された先の遺伝子の発現を命令することができる。このようなベクタをここでは「組換え発現ベクタ」又は単に「発現ベクタ」という。一般に、組換えDNA技術で実用性のある発現ベクタはプラスミドの形であることが多い。本明細書においては、プラスミドは最も普通に用いられている形のベクタであるため、「プラスミド」及び「ベクタ」が交換可能に用いられている場合がある。しかしながら、本発明は、均等な機能を果たす、ウィルス・ベクタ（例えば複製欠陥レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、及びレンチウィルス）など、他の形の発現ベクタも包含することを意図している。
【０２４１】
本発明の組換え発現ベクタは、ホスト細胞内で核酸を発現させるのに適した形で核酸分子を含むが、このことは、この組換え発現ベクタが、発現に用いようとするホスト細胞や所望の発現レベルを基に選択された一つ以上の調節配列を、発現させようとする核酸配列に作動的に連結させて含むことを意味する。組換え発現ベクタ内で「作動可能に連結して」には、目的のヌクレオチド配列が、このヌクレオチド配列の発現が可能な態様で（in vitro転写／翻訳系内で、あるいは、ベクタがホスト細胞内に導入されているときにはホスト細胞内で）調節配列に連結されていることを意味するものと、意図されている。用語「調節配列」には、プロモータ、エンハンサ及び他の発現制御因子（例えばポリアデニレーション・シグナル）が含まれる。このような調節配列は、例えばGoeddel; Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に解説されている。調節配列には、数多くの種類のホスト細胞内でヌクレオチド配列の構成的発現を命令するもの、特定のホスト細胞でのみ、ヌクレオチド配列の発現を命令するもの（例えば組織特異的調節配列）又は特定の条件下（例えば誘導性調節配列）でのみ、ヌクレオチド配列の発現を命令するものがある。
【０２４２】
哺乳動物細胞で用いられる場合、発現ベクタの制御機能はしばしば、ウィルス性調節因子によって提供される。例えば通常用いられるプロモータはポリオーマ・ウィルス、アデノウィルス、サイトメガロウィルス及びシミアン・ウィルス40由来である。哺乳動物発現ベクタの非限定的な例には、pCDM8 (Seed, B., (1987) Nature
329:840) 及び pMT2PC
(Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6:187-195)がある。様々な調節配列を持つ多様な哺乳動物発現ベクタが市販されていて入手可能である。哺乳動物細胞で核酸を構成的に発現させるためには、好適な調節因子はサイトメガロウィルス・プロモータ／エンハンサ及び／又はU6プロモータである。更に、哺乳動物細胞で用いるための誘導性調節系は当業で公知であり、例えば遺伝子発現が重金属イオン（例えば Mayo et al. (1982) Cell 29:99-108; Brinster et al. (1982) Nature 296:39-42; Searle et
al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489を参照されたい）、熱ショック（例えばNouer et al. (1991) in Heat Shock
Response, e.d. Nouer, L. , CRC, Boca Raton , FL, pp167-220を参照されたい）、ホルモン（例えば Lee et al. (1981) Nature 294:228-232;
Hynes et al. (1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042;
Klock et al. (1987) Nature 329:734-736; Israel &
Kaufman (1989) Nucl. Acids Res. 17:2589-2604;
及びPCT 公報No. WO 93/23431を参照されたい）、FK506関連分子（例えばPCT 公報No. WO
94/18317を参照されたい）又はテトラサイクリン（Gossen,
M. and Bujard, H. (1992) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Gossen, M. et al. (1995) Science 268:1766-1769;
PCT 公報 No. WO 94/29442; 及びPCT 公報No. WO 96/01313）により調節される系である。更に、数多くの組織特異的調節配列が当業で公知であり、その中にはアルブミン・プロモータ（肝臓特異的；Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277）、リンパ系特異的プロモータ (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275)、特にＴ細胞受容体のプロモータ(Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) 及び免疫グロブリン (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740;
Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748)、神経細胞特異的プロモータ（例えば神経フィラメント・プロモータ； Byrne and
Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:5473-5477)、すい臓特異的プロモータ
(Edlund et al. (1985) Science 230:912-916)及び乳腺特異的プロモータ（例えば乳清プロモータ；米国特許 No. 4,873,316号及びヨーロッパ出願公報 No. 264,166)、タイプＩコラーゲン・プロモータ又は骨芽細胞で発現を命令するためのオステリックス・プロモータがある。例えばマウスhoxプロモータ（Kessel and
Gruss (1990) Science 249:374-379）及びα-フェトたんぱく質・プロモータ (Campes and Tilghman (1989) Genes
Dev. 3:537-546)など、発生上調節を受けるプロモータもまた、包含される。
【０２４３】
ベクタDNAは従来のトランスフェクション技術により、哺乳動物細胞に導入することができる。ここで用いられる場合の多様な形の用語「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム同時沈降法、DEAE-デキストラン媒介型トランスフェクション、リポフェクション、又は電気穿孔法を含め、外来の核酸（例えばDNA）を哺乳動物ホスト細胞に導入する多様な公知の技術を言うものと、意図されている。ホスト細胞をトランスフェクトするのに適した方法はSambrook et al. (Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor
Laboratory press (1989))や、他の研究室用手引きに見ることができる。ベクタDNA は、ウィルス粒子に取り入れられたものなどのウィルス・ベクタへの感染によっても、哺乳動物細胞に導入することができる。
【０２４４】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションに関しては、用いる発現ベクタ及びトランスフェクション技術に依っては、細胞のごく僅かな割合しかそれらのゲノムに外来のDNAを組み込まないことがあることが知られている。これらの組込み体を識別及び選抜するためには、選択マーカ（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、目的遺伝子と一緒にホスト細胞に導入されることが一般的である。好適な選択マーカには、G418、ヒグロマイシン及びメトトレキセートなどの薬物に対する耐性をもたらすものがある。選択マーカをコードする核酸は、骨芽細胞/破骨細胞調節物質をコードする別のベクタに乗せてホスト細胞に導入することができるが、あるいはより好ましくは同じベクタに乗せることもできる。導入された核酸で安定にトランスフェクトした細胞は薬物選抜（例えば、選択マーカ遺伝子を取り込んだ細胞は生き残るが、そうでないものは死滅するなど）で識別することができる。 
【０２４５】
ある実施態様では、発現ベクタ中、指標細胞中で当該分子の構成的発現が可能になるような調節配列に、当該コーディング配列が作動的に連結されている（例えば、サイトメガロウィルス・プロモータ／エンハンサなどのウィルス性調節配列を用いることができる）。骨芽細胞/破骨細胞調節物質を指標細胞中で構成的に発現可能にする組換え発現ベクタを使用することが、この分子の活性を亢進又は阻害する化合物の同定には好ましい。代替的な実施態様では、発現ベクタ中、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の内生遺伝子の調節配列（即ち、内生遺伝子を由来とするプロモータ調節領域）に、当該コーディング配列が作動的に連結されている。発現が内生の調節配列により制御されるような組換え発現ベクタを使用することが、当該分子の転写発現を亢進又は阻害する化合物の同定には好ましい。
【０２４６】
本発明の更に別の局面では、骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質又はそのフラグメントを「ベイト・たんぱく質」として、例えば二種ハイブリッド検定法又は三種ハイブリッド検定法（例えば米国特許 No. 5,283,317; Zervos et al.
(1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques
14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; 及び Brent WO94/10300を参照されたい）ことで、骨芽細胞/破骨細胞調節物質（「結合たんぱく質」又は「bp」）に結合する又は相互作用すると共に骨芽細胞/破骨細胞調節物質活性に関与する他のたんぱく質を同定することができる。このような結合たんぱく質は更に骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質や、又は、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の標的、例えば骨芽細胞/破骨細胞調節物質媒介性シグナル伝達経路の下流因子など、によるシグナルの伝播に関与している可能性が高い。代替的には、このような結合たんぱく質は骨芽細胞/破骨細胞調節物質阻害剤であってもよい。
【０２４７】
二種ハイブリッド系は、別々のDNA結合ドメイン及び活性化ドメインから成る、大半の転写因子のモジュール性に基づく。簡単に説明すると、この検定法は二つの異なるDNAコンストラクトを利用する。一番目のコンストラクトとでは、骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質をコードする遺伝子が、公知の転写因子（例えばGAL-4）のDNA結合ドメインをコードする遺伝子に融合されている。他のコンストラクトでは、未同定のたんぱく質（「獲物」又は「試料」）をコードする、DNA配列ライブラリから採ったDNA配列が、この公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合されている。「ベイト」及び「獲物」たんぱく質がin vivoで相互作用して骨芽細胞/破骨細胞調節物質依存的複合体を形成できれば、この転写因子のDNA結合ドメイン及び活性化ドメインは近い位置に来る。この近さにより、転写因子に対して応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポータ遺伝子（例えばLacZ）の転写が可能になる。レポータ遺伝子の発現を検出し、機能的な転写因子を含有する細胞コロニーを単離した後、骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質と相互作用するたんぱく質をコードする、クローニングされた遺伝子を得るために用いることができる。 
【０２４８】
Ｂ．  無細胞検定法
別の実施態様では、指標組成物は無細胞組成物である。ホスト細胞中又は培養基で、組換え法により発現させる骨芽細胞/破骨細胞調節物質のうちの少なくとも一つを、ホスト細胞又は細胞培養基から、たんぱく質精製のための標準的方法を用いて単離することができる。例えばイオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、限外ろ過、電気泳動法、及び抗体によるイムノアフィニティ精製法を用いて、無細胞組成物中で用いることのできる精製済み又は半精製済みたんぱく質を生成することができる。代替的には、目的たんぱく質を発現する細胞のライセート又は抽出物を、無細胞組成物としての利用に向けて調製することもできる。
【０２４９】
ある実施態様では、骨芽細胞/破骨細胞調節物質活性を特異的に修飾する化合物を、ある骨芽細胞/破骨細胞調節物質とこの骨芽細胞/破骨細胞調節物質が結合する先の標的分子との相互作用修飾能に基づき、同定する。標的分子は骨芽細胞/破骨細胞調節物質応答性因子などのDNA分子であっても、あるいはたんぱく質分子であってもよい。たんぱく質対たんぱく質の相互作用を検出できる（例えば免疫同時沈降法、二種ハイブリッド検定法）、あるいは、DNA結合たんぱく質と標的DNA配列との間の相互作用を検出できる（例えば電気泳動法による移動度シフト検定法、DNAseＩフットプリント検定法、オリゴヌクレオチド・プルダウン検定法等）適した検定法が当業で公知である。検査化合物の存在下及び非存在下でこのような検定法を行うことにより、これらの検定法を用いて、ある骨芽細胞/破骨細胞調節物質の、標的分子との相互作用を修飾（例えば阻害又は亢進）する化合物を同定することができる。
【０２５０】
ある実施態様では、検査化合物の存在下における骨芽細胞/破骨細胞調節物質の標的分子への結合量は、検査化合物の非存在下における骨芽細胞/破骨細胞調節物質の標的分子への結合量よりも多く、この場合、この検査化合物は骨芽細胞/破骨細胞調節物質の標的への結合を促進する化合物として同定される。別の実施態様では、検査化合物の存在下における骨芽細胞/破骨細胞調節物質の標的分子への結合量は、検査化合物の非存在下における骨芽細胞/破骨細胞調節物質の標的分子への結合量よりも少なく、この場合、この検査化合物は骨芽細胞/破骨細胞調節物質の標的への結合を阻害する化合物として同定される。検査化合物の骨芽細胞/破骨細胞調節物質への結合は、上述したように直接的又は間接的に判定することができる。骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質の、検査化合物への結合能の判定は、リアルタイム・バイオモラキュラー・インターアクション・アナリシス (BIA) (Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo et
al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol.
5:699-705)などの技術を用いても達成することができる。ここで用いられる場合の「BIA」とは、相互作用物質のいずれも標識せずに、生体特異的相互作用を研究するための技術である（例えばBIAcore）。表面プラズモン共鳴(SPR)
の光学的減少における変化を、生物分子間のリアルタイム反応の指標として用いることができる。
【０２５１】
骨芽細胞/破骨細胞調節物質と標的分子との間の相互作用を修飾する検査化合物を同定するための、本発明の方法においては、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の完全アミノ酸配列を含むポリペプチドを本方法において用いることも、あるいは、当該たんぱく質の数部分のみを含むポリペプチドを用いることもできる。ここで解説した検定法は、骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質と標的分子との間の相互作用を刺激又は阻害する検査化合物を同定するために用いることができる。当該たんぱく質と標的分子との間の相互作用を刺激する検査化合物は、当該検査化合物の非存在下での相互作用の程度に比較したときの、骨芽細胞/破骨細胞調節物質と標的分子との間などの相互作用の程度を増加させる上でのその能力に基づき、同定される。当該たんぱく質と標的分子との間の相互作用を阻害する検査化合物は、当該化合物の非存在下での相互作用の程度に比較したときの、当該たんぱく質と標的分子との間の相互作用の程度を減少させる上でのその能力に基づき、同定される。
【０２５２】
本発明の上気の検定法のある実施態様では、骨芽細胞/破骨細胞調節物質又は各標的分子のいずれかを固定して、例えば当該たんぱく質の一方又は両方の未複合体化型から複合体化型を容易に分離できるようにしたり、あるいは、本検定の自動化に対応したりすることが好ましいであろう。検査化合物の存在下及び非存在下における骨芽細胞/破骨細胞調節物質への検査化合物の結合や、あるいは骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質と標的分子との間の相互作用は、反応物を容れるのに適していればいずれの容器内で行われてもよい。このような容器の例には、マイクロタイタ・プレート、試験管、及びマイクロ遠心管がある。ある実施態様では、当該たんぱく質の一方又は両方をマトリックスに結合できるようにするドメインを当該分子のうちの一つ以上に加えてある融合たんぱく質を提供することができる。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合たんぱく質又はグルタチオン-S-トランスフェラーゼ／標的融合たんぱく質をグルタチオン・セファロース・ビーズ（ミズーリ州セントルイス、Sigma Chemical社製）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタ・プレートに吸着させた後、これらを検査化合物に、あるいは検査化合物及び非吸着性標的たんぱく質もしくは骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質に配合し、この混合物を、複合体形成を誘導する条件（例えば塩及びｐＨについて生理条件など）下でインキュベートすることができる。インキュベート後、ビーズ又はマイクロタイタ・プレートのウェルを洗浄して結合しなかった成分を洗い落とし、ビーズの場合ならばマトリックスを固定し、複合体形成を、例えば上述した通りに直接的又は間接的に判定する。代替的には、複合体をマトリックスから解離させ、結合又は活性のレベルを標準的技術を用いて判定することができる。
【０２５３】
マトリックス上にたんぱく質を固定する他の技術も、本発明のスクリーニング検定法で用いることができる。例えば骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質又は標的分子のいずれかを、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を利用して固定することができる。ビオチン化たんぱく質又は標的分子は、ビオチン-NHS (N-ヒドロキシ-スクシンイミド)から、当業で公知の技術（例えばイリノイ州ロックフォード、Pierce Chemicals社製、ビオチン化キット）を用いて調製し、例えばストレプトアビジンで被膜した９６ウェル・プレート（Pierce Chemical社製）のウェルに固定することができる。代替的には、たんぱく質又は標的分子に対しては反応性であるが、たんぱく質のその標的分子への結合には干渉しないような抗体をプレートのウェルに誘導体化して、未結合の標的又は骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質を抗体結合によりこのウェルに捕捉することができる。GST固定化複合体に関して上述したものに加え、このような複合体を検出する方法には、骨芽細胞/破骨細胞調節物質又は標的分子に対して反応性の抗体を用いて複合体の免疫検出や、骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質又は標的分子の関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合検定法がある。
【０２５４】
Ｃ．  In vivo検定法
ある実施態様では、in vivo 検定法を用いて、ある化合物骨形成及び石灰化 及び／又は破骨細胞発生修飾能を分析してもよい。例えば、ある実施態様では、検査化合物をマウスに投与し、このマウスの骨形成に対する化合物の効果を当業で公知の技術を用いて測定する。例えば、骨の切片をin vivoでの骨形成の分析に向けてフォン・コッサ法法及びトルイジン・ブルーで染色することでも、分析することができる。ある実施態様では、例えば血清中又は他の体液中のオステオクラシン、TRAP 5b 及び／又はデオキシピリジノリン(DPD)のレベルを当業で公知の技術を用いて測定してもよい。
【０２５５】
ある実施態様では、マウスは生後マウスである。ある実施態様では、マウスは成体マウスであり、成体骨形成に対する化合物の効果を検査する。別の実施態様では、マウスはメスのマウスである。別の実施態様では、マウスは卵巣切除マウスである。別の実施態様では、マウスは糖質コルチコイドで処置済みである。
【０２５６】
更に別の実施態様では、マウスはWWP1を過剰発現するトランスジェニックマウスである。別の実施態様では、マウスはWWP1の条件的荒れるを発現する。更に別の実施態様では、前記条件的アレルはWWP1の発現を 骨芽細胞細胞に制限する（例えばタイプＩコラーゲン・プロモータ又はオステリックス・プロモータ）。
【０２５７】
別の実施態様では、マウスは条件的に切断されるNFATc1遺伝子を有する。
【０２５８】
別の実施態様では、腫瘍転移モデルにおいて骨形成を修飾する上での化合物の能力を検査する。例えばある実施態様では、腫瘍細胞（例えば乳癌細胞などのヒト腫瘍細胞）を免疫欠陥マウスに（例えば心臓間又はイントラアティビアル（原語： intratibial）注射により注射し、この動物において骨形成に影響する上でのこの化合物の能力を判定する。
【０２５９】
別の実施態様では、本発明は、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の生物学的効果を修飾する化合物を、骨芽細胞/破骨細胞調節物質のうちの少なくとも一方に欠損のある細胞を用いて同定する方法を提供するものである。特異的な細胞種、例えばリンパ球（例えば胸腺、脾臓及び／又はリンパ節細胞）あるいは精製済み細胞、例えばこのような動物を由来とするＴ細胞、Ｂ細胞、骨芽細胞、破骨細胞、幹細胞など、をスクリーニング検定法に用いることができる。
【０２６０】
同様に、本発明は、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の生物学的効果を修飾する化合物をWWP1過剰発現細胞を用いて同定する方法を提供するものである。WWP1過剰発現細胞を用いると、骨芽細胞/破骨細胞調節物質により調節される生物学的応答を、WWP1の生物学的活性を修飾することにより修飾する作用物質（即ち、WWP1過剰発現の骨減少性表現型を「救助する」化合物）を同定することができる。ある実施態様では、遺伝子が空間的に制限される態様で過剰産生される「条件的ノックアウト」系を用いて、スクリーニング検定法で用いるためのトランスジェニック細胞を作出することができる。例えばWWP1遺伝子を、タイプＩコラーゲン・プロモータ又はオステリックス・プロモータに作動可能に連結することができ、このコンストラクトを用いて細胞又は動物を作出することができ、この細胞又は動物から、WWP1を制御された態様で過剰発現すると共にWWP1の発現を空間的に制限する細胞を分離することができる。このような動物を由来とする、間葉幹細胞、骨芽細胞、破骨細胞、造血幹細胞など、骨芽細胞又は精製済み細胞などの特定の細胞種をスクリーニング検定法で用いることができる。
【０２６１】
別の実施態様では、本発明は、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の生物学的効果を修飾する化合物をNFATc1ノックアウト細胞を用いて同定する方法を提供する。NFATc1 ノックアウト細胞は、骨芽細胞/破骨細胞調節物質により調節される生物学的応答を、NFATc1の生物学的活性を修飾することにより修飾する作用物質（即ち、NFATc1切断の骨減少性表現型を「救助する」化合物)を同定するために用いることができる。ある実施態様では、遺伝子を時間的に制限される態様で欠失させる「条件的ノックアウト」系を用いて、スクリーニング検定法で用いる細胞を作出することができる。このような動物を由来とする、間葉幹細胞、骨芽細胞、破骨細胞、造血幹細胞など、骨芽細胞又は精製済み細胞などの特定の細胞種をスクリーニング検定法で用いることができる。
【０２６２】
スクリーニング法においては、少なくとも一種の骨芽細胞/破骨細胞調節物質が欠損している細胞又はNFATc1ノックアウト細胞又はトランスジェニックWWP1細胞（以降、簡潔性のためにまとめてトランスジェニック細胞と呼ぶ）を検査化合物に接触させることができ、当該骨芽細胞/破骨細胞調節物質により調節される生物学的応答を観察することができる。トランスジェニック細胞において応答に修飾（例えば未処置細胞か、あるいは、コントロール作用物質で処置された細胞、又は、適した野生型細胞に比較したときの）があれば、当該骨芽細胞/破骨細胞調節物質調節性応答の修飾物質として、検査化合物が同定される。
【０２６３】
ある実施態様では、検査化合物を非ヒトトランスジェニック動物、好ましくはマウス（例えば骨芽細胞/破骨細胞調節物質遺伝子が上述の手段により条件的に破壊されているか、あるいは、リンパ系臓器が骨芽細胞/破骨細胞調節物質に欠陥を持つキメラ・マウスか、あるいはNFATc1ノックアウト・マウス（上述した通り）、あるいは上述したようにWWP1を過剰発現するWWP1トランスジェニックマウス） に直接投与して、このようなトランスジェニック細胞のin vivo応答を修飾する検査化合物を同定する。別の実施態様では、トランスジェニック細胞を本発明の非ヒト動物から分離して当該検査化合物にex vivoで接触させて、細胞中で骨芽細胞/破骨細胞調節物質により調節される応答を修飾する検査化合物を同定する。
【０２６４】
トランスジェニック細胞は、骨芽細胞/破骨細胞調節物質に欠陥を持つように作出された非ヒト動物か、又はNFATc1 ノックアウト動物か、又は、WWP1遺伝子が過剰発現している動物から得ることができる。好適な非ヒト動物には、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ及びヒツジがある。特に好適な実施態様においては、欠陥動物はマウスである。骨芽細胞/破骨細胞調節物質又はNFATc1 に欠陥のある（あるいはWWP1を過剰発現する）
に欠陥のあるマウスは当業で公知の方法を用いて作製することができる。特定の遺伝子産物に欠陥のある非ヒト動物は、典型的には相同組換えにより作出される。ある実施態様では、欠失、追加又は置換を導入することで、例えば内生遺伝子を機能的に破壊するなどして変更した遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクタを調製する。当該遺伝子はマウス遺伝子であることが好ましい。例えば、マウス骨芽細胞/破骨細胞調節物質遺伝子はマウスゲノムDNAライブラリからマウス骨芽細胞/破骨細胞調節物質 cDNAをプローブとして用いて分離することができる。その後、このマウス遺伝子を用いて、マウスゲノム中で内生骨芽細胞/破骨細胞調節物質を修飾するのに適した相同組換えベクタを構築することができる。ある好適な実施態様では、当該ベクタは、相同組換えが起きると内生遺伝子が機能的に破壊される（即ち、機能的たんぱく質をもはやコードしないように；「ノックアウト」ベクタとも呼ばれる）ように、デザインされる。
【０２６５】
代替的には、相同組換えが起きると内生遺伝子が変異するか、又は変化するが、それでも尚、機能的なたんぱく質（例えば上流の調節領域を変化させることで、内生たんぱく質の発現を変化させることができる）をコードしているようにベクタをデザインすることもできる。相同組換えベクタにおいては、遺伝子のうちの変化した部分は、当該遺伝子の追加の核酸により、その5'側及び3'側末端でフランクされていることで、相同組換えベクタの持つ外生遺伝子と胚性幹細胞中の内生遺伝子との間で起きるようになっている。追加のフランキング核酸は、内生遺伝子に対して相同組換えが成功するのに充分な長さのものである。典型的には、数キロベースのフランキングDNA（5' 側及び3'側末端の両者）をベクタに含める（相同組換えベクタの解説については、例えば Thomas, K.R. and Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503 を参照されたい）。ベクタを胚性幹細胞株に（例えば電気穿孔法により）導入し、導入された遺伝子が内生遺伝子と相同組換えを起こした細胞を選抜する（例えばBradley, A. in Teratocarcinomas
and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL,
Oxford, 1987) pp. 113-152を参照されたい）。その後、キメラ胚を適した偽妊娠メスの仮腹動物に移植し、胚を産期に至らせることができる。相同組換えを起こしたDNAをそれらの胚細胞に持つ後代を用いることで、動物の細胞の全てが、移植遺伝子の生殖細胞系伝播により相同組換えを起こしたDNAを含有する動物を育種することができる。相同組換えベクタ及び相同組換え動物を構築する方法は更に Bradley, A. (1991) Current
Opinion in Biotechnology 2:823-829 及びLe Mouellec et al のPCT 国際公報： WO 90/11354 ； Smithies et al.のWO 91/01140 ； Zijlstra et al のWO 92/0968；及び Berns et al.のWO 93/04169 に解説されている。
【０２６６】
スクリーニング検定法のある実施態様では、骨芽細胞/破骨細胞調節物質などによって調節される生物学的応答を修飾する上での能力を検査される化合物を非ヒト動物にin vivoで投与することで、該検査化合物をトランスジェニック細胞に接触させ、この動物における応答に対するこの検査化合物の効果を評価する。
【０２６７】
検査化合物は医薬組成物として動物に投与することができる。このような組成物は、典型的には、検査化合物及び薬学的に許容可能な担体を含む。ここで用いられる場合の用語
「薬学的に許容可能な担体」には、医薬投与に適合性のある、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング類、抗菌及び抗カビ性化合物、等張及び吸収遅延化合物等が含まれる。このような媒質及び化合物の、薬学的に活性な物質のための使用は当業で公知である。従来の媒質又は化合物が当該活性化合物にとって不適合でない限り、組成物中へのその使用は考察されたところである。補助的な活性化合物も当該組成物中に取り入れることができる。以下、医薬組成物を更に詳述する。
【０２６８】
別の実施態様では、骨芽細胞/破骨細胞調節物質などによって調節される生物学的応答を修飾する化合物は、トランスジェニック細胞をex vivo で一種以上の検査化合物に接触させるステップと、前記検査化合物の読み取り値に対する効果を判定するステップとにより、同定される。ある実施態様では、検査化合物にex vivo で接触させるトランスジェニック細胞を対象に再投与することができる。
【０２６９】
本スクリーニング法をex vivoで実施するには、トランスジェニック細胞を非ヒトトランスジェニック動物又は胚から標準的な方法により分離し、in vitro で検査化合物と一緒にインキュベート（即ち培養）することができる。細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、骨芽細胞、破骨細胞、及び／又は、幹細胞）はトランスジェニック動物から標準的技術により分離することができる。別の実施態様では、細胞は骨芽細胞/破骨細胞調節物質、NFATc1、及び／又は WWP1のうちの一種以上に欠陥のある動物、そしてWWP1を過剰発現している動物から分離される。
【０２７０】
トランスジェニック細胞を検査化合物に（ex
vivo 又はin vivo）で接触させた後、骨芽細胞/破骨細胞調節物質により調節される生物学的応答に対する当該検査化合物の効果を、ここで解説した通り、細胞の光学顕微鏡分析や、細胞、たんぱく質の産生、特定の遺伝子の誘導、例えば特定のたんぱく質のユビキチン化など、特定のたんぱく質の分解の組織化学的分析を含め、ここに記載したものなどの多種の適した方法のいずれか一つにより判定することができる。
【０２７１】
当該の検定法は、多様なレベルの検査を化合物に提供するべく、組み合わせて用いてもよいことは当業者であれば理解されよう。例えば、ある実施態様では、骨芽細胞/破骨細胞調節物質又はその生物学的に活性なフラグメントを含む細胞性指標組成物を、検査化合物のライブラリの各メンバーに接触させる。この骨芽細胞/破骨細胞調節物質の活性の指標を測定する。この骨芽細胞/破骨細胞調節物質ポリペプチドの活性を修飾する目的化合物を選抜する。その後、この目的化合物を二回目のスクリーニング検定法で用いてもよい。例えば、間葉幹細胞分化を増加させる上での目的検査化合物の能力を検査してもよい。
【０２７２】
別の実施態様では、目的化合物を、in vivo
モデルで非ヒト成体動物におけるその骨形成及び石灰化修飾能について検定してもよい。例えば、検査化合物を動物に投与し、検査化合物の存在下及び非存在下における検査化合物の骨形成及び石灰化に対する効果について判定してもよく、このとき、非ヒト動物において骨形成及び石灰化に増加があれば、この目的検査化合物は骨形成及び石灰化を増加させる化合物として同定される。この検定法を二次的スクリーニング、三次的スクリーニング、あるいは四次的スクリーニングとして用いてもよいことは、理解されよう。
【０２７３】
Ｄ．  検査化合物
多種の検査化合物を、ここで解説したスクリーニング検定法を用いて評価することができる。用語「検査化合物」には、本発明の検定法で用いられると共に、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の発現及び／又は活性に影響を与えるその能力について検定される、あらゆる試薬又は検査物質が含まれる。スクリーニング法においては、複数の化合物など、二種以上の化合物を、それらの、例えば骨芽細胞/破骨細胞調節物質などの発現及び／又は活性修飾能について、同時に検査することができる。用語「スクリーニング検定法」は、好ましくは、一個の化合物の、ある読み取り値に影響を与える上での能力を検査する件だではなく、複数の化合物の、選択された読み取り値に影響を与える上での能力を検査する検定法を言うとよい。好ましくは、当該検定法は、スクリーニング目的の効果を有するとは、それまでの公知でない化合物を同定するものであるとよい。ある実施態様では、高スループットのスクリーニングを用いて、化合物の活性を検定することができる。
【０２７４】
いくつかの実施態様では、検査しようとする化合物をライブラリ（即ち、ある化合物ライブラリ中のメンバーである）から得ることができる。ペプチド・ライブラリの使用は当業においてはよく確立されているが、ベンゾジアゼピン (Bunin et al.
(1992).  J. Am. Chem. Soc. 114:10987; DeWitt et al. (1993).  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909)
ペプトイド (Zuckermann.
(1994).  J. Med. Chem.  37:2678)
オリゴカルバメート (Cho et al.  (1993).  Science. 261:1303- )、及びヒダントイン (DeWitt et al. supra)など、他の化合物の混合物を作成できるようにした新しい技術が開発されている。１０４乃至１０５種という多様性を持つ有機低分子の分子ライブラリを合成するためのアプローチが解説されている (Carell et al. (1994). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059-
; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061- )。
【０２７５】
本発明の化合物は、生物学的ライブラリ；空間指定可能なパラレル固相又は液相ライブラリ、逆重畳積分を要する合成ライブラリ法、「ワンビーズ・ワン・コンパウンド」ライブラリ法、及びアフィニティ・クロマトグラフィ選抜を用いる合成ライブラリ法を含め、当業で公知のコンビナトリアル・ライブラリ法において数多くあるアプローチのいずれを用いても得ることができる。生物学的ライブラリ法はペプチド・ライブラリに限られるが、他の四種類のアプローチはペプチド、非ペプチド・オリゴマ、又は低分子化合物のライブラリ(Lam, K.S. (1997)  Anticancer Drug Des. 12:145)に応用することができる。分子ライブラリを合成する他の方法の例は、当業において、例えば Erb
et al. (1994).  Proc.
Natl. Acad. Sci. USA  91:11422- ; Horwell et al. (1996) Immunopharmacology 33:68- ; 及びGallop et al.  (1994);  J. Med. Chem.  37:1233-に見ることができる。
【０２７６】
化合物のライブラリは溶液中 (例えば Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)、又はビーズ上(Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップ上 (Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌上 (Ladner USP 5,223,409)、胞子上 (Ladner USP '409)、プラスミド上 (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)
又はファージ上 (Scott and Smith
(1990) Science 249:386-390);
(Devlin (1990) Science 249:404-406);
(Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.  87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310) に提示させることができる。更に別の実施態様では、コンビナトリアル・ポリペプチドはcDNAライブラリから作製される。
【０２７７】
活性についてスクリーニングすることのできる化合物例には、限定はしないが、ペプチド、核酸、糖、有機低分子、及び天然生成物の抽出物ライブラリがある。
【０２７８】
候補／検査化合物には、例えば、１）Ig-の尾を持つ融合ペプチドを含む可溶性ペプチドなどのペプチドや、ランダム・ペプチド・ライブラリ（例えば, Lam, K.S. et al. (1991) Nature 354:82-84; Houghten, R. et al. (1991) Nature 354:84-86を参照されたい） 及びD- 及び／又は L型コンホメーションのアミノ酸から成るコンビナトリアル化学法由来分子ライブラリのメンバー；２）ホスホペプチド（ランダムかつ部分的に縮重した、方向付けされたホスホペプチド・ライブラリのメンバー、例えばSongyang, Z. et al. (1993)
Cell 72:767-778を参照されたい）；３）抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ及び一本鎖抗体や、抗体の Fab、F(ab')2、Fab 発現ライブラリ・フラグメント、及びエピトープ結合フラグメント）；４）有機及び無機低分子（例えば、コンビナトリアル及び天然生成物ライブラリから得られる分子）；５）酵素（例えばエンドリボヌクレアーゼ、ヒドロラーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、シンサターゼ、イソメラーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、オキシド-レダクターゼ及びATPase）並びに６）変異型の骨芽細胞/破骨細胞調節物質（例えばドミナント・ネガティブ変異型の分子）がある。
【０２７９】
本発明の検査化合物は、生物学的ライブラリ；空間指定可能なパラレル固相又は液相ライブラリ；逆重畳積分を要する合成ライブラリ法；「ワンビーズ・ワン・コンパウンド」ライブラリ法；及びアフィニティ・クロマトグラフィ選抜を用いる合成ライブラリ法を含め、当業で公知のコンビナトリアル・ライブラリ法において数多くあるアプローチのいずれを用いても得ることができる。生物学的ライブラリ法はペプチド・ライブラリに限られるが、他の四種類のアプローチはペプチド、非ペプチド・オリゴマ、又は低分子化合物のライブラリ(Lam, K.S. (1997)  Anticancer Drug Des. 12:145)に応用することができる。
【０２８０】
分子ライブラリの合成法の例は、例えば:
DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909;
Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  91:11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678; Cho et
al. (1993) Science 261:1303;
Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059;
Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; 及び Gallop et
al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233など、当業に見ることができる。
【０２８１】
化合物のライブラリは溶液中 (例えば Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)、又はビーズ上 (Lam (1991) Nature
354:82-84)、チップ上 (Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌上 (Ladner USP 5,223,409)、胞子上 (Ladner USP '409)、プラスミド上 (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad
Sci USA 89:1865-1869) 又はファージ上 (Scott
and Smith (1990) Science 249:386-390;
Devlin (1990) Science 249:404-406;
Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382;
Felici (1991) J. Mol. Biol.
222:301-310; Ladner supra.)に提供することができる。
【０２８２】
構造が公知であるたんぱく質のコンピュータ・ベースの解析を用いても、本発明の分子に結合するであろう分子を同定することができる。このような方法では、分子を、受容体部位に相補的なそれらの形状に基づいて序列化する。3-Dのデータベース、例えば、DOCkなどのプログラムを用いることで、TAOK2などに結合するであろう分子を同定することができる。DesJarlias et al.
(1988) J. Med. Chem. 31:722; Meng et al. (1992) J. Computer Chem. 13:505; Meng
et al. (1993) Proteins 17:266; Shoichet et al. (1993) Science 259:1445を参照されたい。加えて、標的化たんぱく質に対する、ある分子の電子的相補性を解析して、この標的に結合する分子を同定することができる。これは、例えばMeng et al. (1992) J. Computer Chem. 13:505 and Meng et al. (1993)
Proteins 17:266に解説された通りに、分子力学的力場などを用いて判定することができる。使用可能な他のプログラムには、推定リガンドのドッキングでGRID力を用いるCLIXがある。Lawrence et al. (1992) Proteins 12:31;
Goodford et al. (1985) J. Med. Chem. 28:849; Boobbyer et al. (1989) J. Med.
Chem. 32:1083を参照されたい。
【０２８３】
本スクリーニング検定法で同定された化合物は、骨芽細胞/破骨細胞調節物質により調節される生物学的応答のうちの一つ以上を修飾する方法において用いることができる。このような化合物は、細胞にそれらを接触させる前に医薬組成物として（上述）調合することが好ましいであろうことは理解されよう。
【０２８４】
例えば骨芽細胞/破骨細胞調節物質発現又は活性を直接又は間接的に修飾する検査化合物が、これまで解説された多種の方法の一つで同定されたら、次に、この選抜された検査化合物（又は「目的化合物」）を、例えば目的化合物を細胞にin vivoで（例えば目的化合物を対象に投与するなど）あるいはex vivoで（例えば対象から細胞を分離し、この分離された細胞を目的化合物に接触させる、あるいは代替的には、目的化合物を細胞株に接触させる）接触させ、細胞に対する目的の化合物の、適したコントロール（例えば未処置の細胞、あるいは、生物学的応答を修飾しないコントロール化合物もしくは担体などで処置された細胞）に比較したときの効果を判定するなどにより、細胞に対するその効果について更に評価することができる。
【０２８５】
本発明更に、前記スクリーニング検定法で同定された化合物にも関する。
【０２８６】
ＶＩ．  処置の方法／医薬組成物
ある実施態様では、本検定法を用いて、骨形成が亢進すると有益であろう対象の予防的処置において有用である化合物を同定してもよい。別の実施態様では、本検定法を用いて、例えば骨芽細胞/破骨細胞調節物質生物学的活性を修飾するなどにより、骨形成、石灰化及び／又は 破骨細胞形成が亢進すると有益であろう対象の治療的処置において有用である化合物を同定してもよい。ある実施態様では、骨形成が亢進されると有益であろう対象は、例えばメスの対象などの成体の対象である。ある実施態様では、本方法を用いて同定される化合物を用いて、単独で、又は他の治療形式と組み合わせて、骨治癒を亢進してもよい。
【０２８７】
本発明の治療法で用いるための作用物質は公知である（例えばTAOK2、DLG1、PIN1、LYK5、MOBKL2C、MAP4K2、PACSIN2、DCAMKL1、DOCK4、PARG1、TAOK3、TRPV6、CLK1、AAK1、PRKCA、AKAP8、DGKI、SMARCB1、CIB2、STK33、STK39、NRGN、PIK3R1、RASSF5、FRAP1、STK38、LATS1、LATS2、STK38L、GEFT、TNNI3K、STK4、RAF1、ARF1、C17orf31、EXO1、POT1、TERF2IP、MSH2、DKC1、MOBKL1A、MAP3K11、WWP2、SMURF2、GCK、WASF1、PPP2CB、PPP2R1A、CREBBP、CUL3、FBXW11、MELK、PLCL1、MAP3K3、DLGH1、NEK7、IRAK3、RHOC、SLC4A2、PLCB4、B-RAF、BMPR2、MAPK3、及びNHEDC2活性のドミナント・ネガティブ阻害剤、骨芽細胞/破骨細胞調節物質アンチセンス分子、骨芽細胞/破骨細胞調節物質活性に干渉する細胞内抗体、骨芽細胞/破骨細胞調節物質を由来とするペプチド阻害剤）か、あるいは、ここで解説した方法を用いて同定することができる。
【０２８８】
例えば正の骨芽細胞調節物質及び／又は負の破骨細胞調節物質の発現及び／又は活性を増加させるなどによる骨形成増加があると有益であろう障害の例には：びらん性関節炎、骨悪性腫瘍、骨粗鬆症、特発性骨粗鬆症、二次性骨粗鬆症、腰部の一時的骨粗鬆症を含む骨粗鬆症、骨軟化症、上皮小体機能亢進症の骨格変化、慢性腎不全（腎性骨形成異常）、奇形性骨炎（骨のページェット病）、骨融解性転移、及び、骨密度進行的消失及び組織の菲薄化があり、骨形成及び石灰化を増加させると有益であり、その結果破壊及び／又は骨折が起きなくなるであろう状態である骨減少症がある。骨粗鬆症及び骨減少症は加齢及び生殖状態だけが原因となるわけではなく、疾患や障害に続発的に起こったり、例えば抗痙攣薬（例えばてんかん用）、コルチコステロイド類（例えばリウマチ様関節炎及び喘息用）及び／又は免疫抑制剤（例えば癌用）など、数多くの医薬の長期使用を原因としたりもする。例えば、糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症は、プレドニゾン（デルタゾン、オラゾン等）、プレドニゾロン（プレロン）、デキサメタゾン（デカドロン、ヘキサドロール）、及びコルチゾン（コルトンアセテート）などの糖質コルチコイド医薬摂取により引き起こされる形の骨粗鬆症である。これらの医薬はしばしば、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、及びリウマチ性多発性筋痛を含む多くのリウマチ性疾患をコントロールする助けとして用いられる。骨粗鬆症が続発することのある他の疾患には、限定はしないが、若年性リウマチ様関節炎、糖尿病、骨形成不全症、甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、吸収不良症候群、拒食症及び／又は腎疾患がある。加えて、例えば長期の不活動性又は不動性、栄養不良（特にカルシウム、ビタミンＤ）、無月経（無月経）に至る過剰な運動、喫煙及び／又はアルコール濫用など、数多くの行動が骨粗鬆症と関連付けられてきた。更に、骨形成及び石灰化の誘導を促進すると、例えば骨折又は破壊、対象自身のは又は義歯との置換に関係なく歯の置換などの処置や、あるいは、例えば閉経期前後又は閉経期などに関連する進行中の状態の症状を緩和するために、有益であろう。
【０２８９】
加えて、骨形成、石灰化及び／又は破骨細胞形成を下方修飾する手段として骨芽細胞/破骨細胞調節物質活性を修飾する本発明の化合物は、治療においても有用である。例えば負の骨芽細胞調節物質及び／又は正の破骨細胞調節物質の発現及び／又は活性を増加させるなどにより、骨形成及び石灰化を減少又は阻害することは、二つ以上の骨の時期尚早な融合があるか、あるいは、骨密度が高すぎる疾患、障害、状態又は傷害、例えば頭蓋骨癒合症（骨癒合症）、大理石骨病（悪性小児型、中間型、及び成人型を含む）、原発性骨格外骨形成、例えば顔の多発性粟粒性骨腫、及び硬化性骨炎.において、有益である。
【０２９０】
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合性あるように調合される。例えば、非経口、皮内又は皮下適用に用いられる溶液又は懸濁液には以下の成分を含めることができる：注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの無菌の希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌性化合物；アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化合物；アセテート、シトレート又はホスフェートなどの緩衝剤や、塩化ナトリウム又はデキストロースなど、張性調節のための化合物。ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調節することができる。非経口用製剤はガラス製もしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は複数回用量用のバイアル中に封入することができる。
【０２９１】
注射用用途に適した医薬組成物には、無菌の注射用溶液もしくは分散液の即時調製用の無菌の水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び無菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適した担体には生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM （ニュージャージー州パーシパニー、BASF社製）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がある。いずれの場合にも、当該組成物は無菌であることが好ましく、シリンジへの注入が容易な程度に流動性であるべきである。それは好ましくは製造及び保管条件下で安定であることが好ましく、また、細菌及びカビなどの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオル（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）及びこれらの適した混合物などを含有する溶媒又は分散媒であってよい。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを用いたり、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持したり、そして界面活性剤を用いたりすることにより、維持することができる。微生物の活動を抑えるには、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等などの多様な抗菌剤及び抗カビ剤により、達成することができる。多くの場合、例えば糖類、マンニトールなどの多価アルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの等張の化合物を組成物中に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の吸収を長引かせるには、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅らせる化合物を本組成物中に含めることにより、可能である。
【０２９２】
無菌の注射用溶液は、必要量の活性化合物を適した溶媒中に、必要に応じて一種又は組合せの上記に列挙した成分と共に取り入れた後、ろ過滅菌することにより、調製することができる。一般的には、分散液は、活性化合物を、基本となる分散媒及び上に列挙した中の必要な他の成分を含有する無菌の賦形剤中に取り入れることにより、調製される。無菌の注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好適な調製法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、その結果、活性成分と付加的な所望の成分の粉末が、予め滅菌ろ過されたその溶液から生じる。
【０２９３】
経口用組成物には、一般に、不活性の希釈剤又は食用の担体が含まれる。これらはゼラチン・カプセルに封入したり、あるいは圧縮して錠剤にしたりすることができる。経口用の治療用投与の目的のためには、活性化合物を医薬品添加物と一緒に取り入れ、錠剤、トローチ、又はカプセルの形で用いることができる。経口用組成物はまた、口内洗浄剤としての使用に向けた流動性の担体を用いて調製することもできるが、この場合、流動性の担体中の化合物は経口投与され、素早く口内に含まれて喀出されるか、あるいは飲み込まれる。薬学的に適合性ある結合性化合物及び／又はアジュバント材料を当該組成物の一部として含めることもできる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等には以下の成分又は同様の性質の化合物のいずれをも含めることができる：微結晶セルロース、トラガカント・ゴム又はゼラチンなどの結合剤；でんぷん又はラクトースなどの医薬品添加物、アルギン酸、Primogel、又はコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はSterotesなどの潤滑剤；コロイド状二酸化珪素などの推進剤；ショ糖又はサッカリンなどの甘味料化合物；あるいは、ペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香料などの香料化合物。
【０２９４】
ある実施態様では、検査化合物を、インプラント及びマイクロ封入送達系を含む、徐放性調合物など、身体からの急速な消失から当該化合物を保護するであろう担体と一緒に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸など、生分解性で生体適合性あるポリマを用いることができる。このような調合物の調製方法は当業者には明白であろう。材料は、例えばアルザ・コーポレーション社及びノヴァ・ファーマシューティカルズ社など、市販のものも得ることができる。（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞を標的決定したリポソームを含め）リポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容可能な担体として用いることができる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号など、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０２９５】
ＶＩＩ．  本発明のキット
本発明の別の局面は、本発明のスクリーニング検定法、修飾法又は診断検定法を実施するためのキットに関する。例えば、本発明のスクリーニング検定法を実施するためのキットには、骨芽細胞/破骨細胞調節物質を含む指標組成物、読み取り値（例えばたんぱく質分泌）を測定する手段、及び、本キットを用いて骨芽細胞/破骨細胞調節物質の生物学的効果を修飾する物質を同定するための指示を含めることができる。別の実施態様では、本発明のスクリーニング検定法を実施するためのキットには、骨芽細胞/破骨細胞調節物質に欠損のある細胞、読み取り値を測定する手段、及び、本キットを用いて骨芽細胞/破骨細胞調節物質の生物学的硬化を修飾する物質を同定するための指示を含めることができる。
【０２９６】
別の実施態様では、本発明は、本発明の修飾法を実施するためのキットを提供するものである。本キットには、例えば、適した担体に入れられ、かつ、骨芽細胞/破骨細胞調節物質の生物学的硬化を修飾するための修飾物質の使用に関する指示と一緒に適した容器に梱包された.本発明の修飾作用物質（例えば骨芽細胞/破骨細胞調節物質阻害又は刺激作用物質）を含めることができる。
【０２９７】
本発明の別の局面は、対象における骨芽細胞/破骨細胞調節物質の生物学的活性に関連する障害を診断するためのキットに関する。本キットには、骨芽細胞/破骨細胞調節物質（例えば骨芽細胞/破骨細胞調節物質 mRNAの検出するための核酸プローブ、又は、骨芽細胞/破骨細胞調節物質たんぱく質の検出のための抗体）の発現を判定するための試薬と、対象の結果を比較する先のコントロールと、診断を目的として本キットを用いるための指示を含めることができる。
【０２９８】
本発明の実施には、そうでないと明示しない限り、当業者に公知である従来の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、及び免疫学の技術を用いることになるであろう。このような技術は文献に十二分に解説されている。例えば Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook,
Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning,
Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J.
Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S.
Patent NO: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J.
Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J.
Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss,
Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A
Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In
Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian
Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);
Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology
(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of
Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.,
1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
【０２９９】
以下の実施例により本発明を更に詳述することとするが、以下の実施例を限定的なものとして捉えられてはならない。本出願全体を通じて引用された全文献、特許、及び公開済み特許出願の内容や、図面及び配列表を、引用をもってここに援用することとする。
【０３００】
実施例
以下の材料及び方法を本実施例全体を通じて用いた。
骨及び軟骨の染色
新生仔マウスの皮膚を剥ぎ、内臓摘出し、95%
ETOH中で一晩、脱水した。次に試料をアセトンに移してから更に４８時間、インキュベートした。骨格の標品をアルシアン・ブルー及びアリザリン・レッドを前述されたように４日間、用いて染色した(McLeod, M. J. (1980). Teratology
22, 299-301)。染色後、試料を３０分間、95% ETOH中で３回、洗浄した。次に軟組織を1% KOHで取り除いた。
【０３０１】
組織形態学的分析
in vivo での骨形成を分析するために、カルセイン（1.6 mg/体重１kg当り）を腹腔内注射により２月齢の野生型及びShn3-/- マウスにと殺から８日前及び３日前に投与した。脛骨を採取し、軟組織を取り除き、70%エタノール中に固定した。組織形態学的分析をチャールズ・リバー研究所のデベロップメント・アンド・ディスカバリー・サービスで行った。簡単に説明すると、骨をメチル−メタクリレート・ブロック中に脱石灰せずに包埋した。切片をフォン・コッサ及びトルイジン・ブルーで染色するか、あるいは染色しないままとした。組織形態計測を成長板の最も低い部分からほぼ1mm下方の二次海綿で行った。分析はオリンパスBX-60蛍光装備顕微鏡及びオプトロニクス・デジタル・カメラ・システムを用いてバイオカント・トゥルー・カラーズで行われた。
【０３０２】
細胞及び組織培養
in vitro 破骨細胞発生のために、骨髄細胞をマウスの大腿骨及び脛骨からaMEM（メディアテック社）中で分離した。赤血球溶解後、細胞を１回、洗浄し、aMEM + 10% FBS中に再懸濁させた。次に骨髄細胞を４８ウェル・プレートに250 μl の aMEM + 10% FBS 当り2x105
個の細胞密度になるようにプレートした。次にこれらの細胞を２日間、50 ng/ml M-CSF （ペプロテック社）の存在下で培養した。最初の２日間の培養期間後、細胞を更に５日間、M-CSF (50 ng/ml)と、25 ng/ml 又は 100 ng/ml のRANKL（ペプロテック社）との存在下で培養した。その後細胞を固定し、酒石酸耐性アルカリホスファターゼ (TRAP) の存在について、メーカの指示（シグマ社）に従って染色した。
【０３０３】
骨芽細胞性細胞を新生仔の野生型及び Shn3-/-
同腹仔の頭蓋骨から前述された通りに分離した
(Yoshida, Y., et al. (2000). Cell 103, 1085-1097)。この頭蓋骨由来細胞を。６ウェル皿に入れたaMEM + 10% FBS + 50 μg/ml アスコルビン酸+ 5 mM b-グリセロホスフェートにプレートした。細胞をサブ・コンフルエントな段階で採集し、aMEM + 10% FBS +
50 μg/ml アスコルビン酸 + 5 mM b-グリセロホスフェートを入れた６ウェル皿に104 cells/cm2 の濃度になるように再プレートした。フォン・コッサ染色には、細胞を培養２１日目に10% 中性緩衝ホルマリンで固定し、5%硝酸銀で３０分間、染色した。ALPについては、培養株を100% エタノールで培養１４日目に固定し、アルカリホスファターゼ・キット（Sigma社）を用いてメーカの指示通りに染色した。細胞増殖検定には、頭蓋骨由来細胞（０日目に105
細胞／ウェル）をaMEM+ 10% FBS + 50 μg/ml アスコルビン酸 + 5 mM b-グリセロホスフェートを入れた６ウェル皿にプレートした。細胞を採集し、培養５日目に血球計を用いて計数した後、細胞生存率をトリパン・ブルー排除染色で調べた。
【０３０４】
骨髄移植
骨髄細胞を８週齢の野生型マウスの大腿骨及び脛骨からRPMI 1640 （Mediatech社） + 10% FBS を２６番ゲージの針を付けたシリンジで流し込むことで採取した。RBC溶解後、細胞を RPMI
1640 + 10% FBSで洗浄し、PBS (Gibco社)中に再懸濁させた。その後、1x107 の野生型骨髄細胞を、尾の静脈注射により g線照射 (1200 ラド) ４週齢野生及びShn3-/- マウスに移植した。放射マウスを移植から４週間後にＸ線撮影で分析した。
【０３０５】
定量的リアルタイムＰＣＲ
定量的リアルタイムPCRには、全RNAをShn3-/- 及び野生型骨芽細胞から培養１４日目にトリゾール (Invitrogen社)を用いて抽出した。逆転写を1μg RNA に対し、cDNA 合成キット (BioRad社) を用いて行った後、分離されたRNA を増幅級DNase I (Invitrogen社)で処理した。次に、定量的PCRをABI プリズム7700配列検出システム (Applied Biosystems社)で行った。PCR 反応は 25 μl 容にして、SYBR グリーンPCR マスター・ミックス (Applied Biosystems社) 及び0.2 μMの特異的プライマを用いて行われた。二つの試料間で特異的遺伝子についてのmRNAの相対的レベルを、各試料中のcDNA量がb-アクチンCtに正規化される (Livak, K. J., and Schmittgen, T. D.
(2001). Methods 25, 402-408)DDCT 法を用いて計算した。  
【０３０６】
一過性トランスフェクション及びレポータ遺伝子検定
プレ骨芽細胞株であるMC3T3-E1サブクローン4と、マウス間葉幹細胞株であるC3H10T1/2とをATCCから入手し、DMEM (Mediatech社) + 10% FBS中に維持した。一過性トランスフェクションについては、細胞を一晩かけて１２ウェル皿に8x104 細胞／ウェルの濃度で播種した。次に細胞にルシフェラーゼ・レポータ遺伝子プラスミドと、提示され田ように、エフェクテン・トランスフェクション試薬（Qiagen社）を用いて様々な組合せの発現コンストラクトとをトランスフェクトした。必要に応じ、コントロール空発現ベクタ・プラスミドを補うことで、トランスフェクトされたDNAの総量を一定に維持した。細胞は全て、トランスフェクション効率に関する正規化コントロールとしてpRL-TK (Promega社)が同時トランスフェクトされた。トランスフェクトしてから４８時間後に細胞を回収し、1X 受動的溶解緩衝液 (Promega社)で溶解させた。ルシフェラーゼ検定法は二重ルシフェラーゼ・レポータ検定システム(Promega)を用いて行われた。Shn3 発現プラスミドは以前に解説されている(Oukka, M., et al. (2002). Mol Cell 9, 121-131)。
【０３０７】
免疫沈降及び免疫ブロット法
免疫沈降には、293T 細胞 (6x106 個の細胞／皿)を DMEM + 10% FBS を入れた10cm皿にプレートし、エフェクテン・トランスフェクション試薬で一過性的にトランスフェクトした。３６乃至４８時間後、細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤を添加したTNT溶解緩衝液 (20 mM
Tris、pH 8.0、200 mM NaCl、0.5% Triton X-100) 中で溶解させた。ライセートを、4℃のアガロース結合抗-FLAG (M2、Sigma社) 又は抗-Myc (9E10、Santa Cruz社)モノクローナル抗体を用いて一晩、免疫沈降させた。その後、免疫沈降物を溶解緩衝液中で３回、洗浄してからSDS-PAGE を行った後、 Shn-3
(Oukka, M., et al. (2002). Mol Cell 9, 121-131)、FLAG (M2、Sigma社)、又はMyc (9E10、SantaCruz社)について免疫ブロットを行った。
【０３０８】
内生 Shn3 及び Runx2間の相互作用を検出するために、 MC3T3-E1細胞をコンフルエントになるまで10cmの皿に入れたDMEM + 10% ウシ胎児血清中で成長させた。細胞がコンフルエントになったとき、培地を10 mM β-グリセロホスフェート、50 μM アスコルビン酸 を添加したaMEM + 10% ウシ胎児血清に、BMP-2
(100 ng/ml)を有り又は無しで解説された通り（Zamurovic,
N., et al. (2004). J Biol Chem 279, 37704-37715)に取り替えた。細胞を更に３−４日間、分化させた。溶解から４８時間前にTGFβ (2
ng/ml, R+D Systems社) をいくつかの培養株に加え、溶解から２時間前にMG132 (10 μM、Boston Biochem社) を全ての培養株に加えた。細胞を回収し、TNT緩衝液中で溶解させた。ライセートに4℃の3 μg の抗Runx2抗体 (Santa Cruz社) 又はコントロールのウサギ IgGをで一晩、免疫沈降させた。プロテインA/G-アガロース (Santa
Cruz社) を沈降した免疫複合体に加え、次にこれを溶解緩衝液で３回、洗浄した後、SDS-PAGEと、Shn3に関する免疫ブロット法とを行った。
【０３０９】
更なる同時免疫沈降実験をFLAG-エピトープ・タグ付きRunx2 欠失変異体で行った。完全長（アミノ酸1-521）はQA、Runt 及びPSTドメインを含有する。QA 変異体（アミノ酸 48-89）QA ドメインは含有するがRunt及びPSTドメインの両方を欠いている。Runt 変異体（アミノ酸102-229）はRunt 及びPSTドメインを含有する。Runt/PST
変異体（アミノ酸 102-521)）Runt 及びPST ドメインを含有するが、QAドメインを欠いている。これらの変異体とのShn3の相互作用を抗Shn3 抗体を用いたウェスタン・ブロット分析、続いて抗FLAG抗体による免疫沈降を行って判定した。
【０３１０】
Shn3-/- 及び野生型骨芽細胞中の内生のAtf4 及びRunx2 たんぱく質レベルを検出するために、１４日目及び２１日目の頭蓋骨骨芽細胞培養株を、プロテアーゼ阻害剤を添加したRIPA緩衝液に溶解させた。たんぱく質濃度を判定し、１試料当り50 μg のたんぱく質をSDS-PAGEで分離した後、 Runx2 (EMD Biosciences社)、Atf4 (Santa Cruz社)、又はHsp90 (Santa Cruz社)について免疫ブロットした。
【０３１１】
ユビキチン化検定
293T細胞中のRunx2のユビキチン化を検出するために、前に確立されたプロトコルに従った (Campanero, M. R., and Flemington, E. K. (1997). Proc Natl Acad Sci U S A 94, 2221-2226)。簡単に説明すると、293T細胞にHis-Ub、FLAG-Runx2、Myc-WWP1、及びShn3の組合せを一過性的にトランスフェクトした。３６乃至４８時間後、細胞を10 μM MG132で２時間、処理した。細胞を6M グアニジウム-HClを含有する緩衝液で洗浄し、溶解させた。ユビキチン化したたんぱく質をNi-NTA-アガロース（Novagen社）で沈降させ、溶解緩衝液で、続いて25 mM Tris pH 6.8、20 mM イミダゾールを含有する洗浄緩衝液で洗浄した。沈降物をSDS-PAGEで分離し、ユビキチン化FLAG-Runx2
を抗FLAG (M2、Sigma社) 抗体による免疫ブロットで検出した。
【０３１２】
免疫沈降させたRunx2/Shn3複合体のin vitroでのユビキチン化促進能を検定するために、多様な組合せのFLAG-Runx2 及びShn3 を上述の通りに293T 細胞に一過性的にトランスフェクトした。３６乃至４８時間後に細胞を10 μM MG132 で２時間、処理した。細胞をTNT緩衝液で洗浄、溶解し、抗FLAG 免疫沈降を上述の通りに行った。免疫複合体をTNT緩衝液中で、次に mM Tris、pH 8、50 mM NaCl、1 mM DTT、5 mM MgCl2、及び1 mM ATPを含有するユビキチン化検定 (UA) 緩衝液で洗浄した。免疫沈降物を、ユビキチン及びビオチン化ユビキチン (Boston
Biochem社)を添加した、組換えE1、及び E2（UbcH5a 及び UbcH7、Boston Biochem社）有り又は無しのUS緩衝液中に再懸濁だせた。ユビキチン化反応を３０℃で２時間、進行させた。次に反応液をSDS-PAGEで分離し、PVDFメンブレンに写し取り、ユビキチン化したたんぱく質をストレプトアビジン-HRP (Zymed社)によるブロット法で視覚化した。
【０３１３】
パルス-チェース分析
293T 細胞 (1x106 細胞)にFLAG-Runx2 (200 ng)をShn3 (1 μg)有り又は無しにして６ウェル・プレート中で一過性的にトランスフェクトした。３６時間後、細胞を洗浄し、無システイン／メチオニン培地でインキュベートした。次に細胞を0.1 mCi/ml S35-標識済みシステイン／メチオニンで１時間、標識した。次に、細胞を過剰量の非放射性システイン／メチオニンを含有する培地中で提示した時間、チェースした。細胞を採集し、プロテアーゼ阻害剤を添加したTNT緩衝液中で溶解させ、抗FLAG免疫沈降法 (M2 アガロース・スラリ、Sigma社) を４℃で一晩、行った。免疫沈降物を溶解緩衝液で４回、洗浄し、SDS-PAGEで分離し、免疫沈降したたんぱく質を蛍光間接撮影法で視覚化し、PhosphoImagerで定量した。
【０３１４】
一過性のRunx2 レポータ検定法
C3H10T1/2細胞を10%のウシ胎児血清を添加したDMEM中で継代させた。細胞を１２ウェルの更に１ウェル当り 6X104 個の細胞密度で播種した。翌日、細胞に6xOSE2-ホタル・ルシフェラーゼ、Runx2 及びShn3 cDNA 発現コンストラクトをエフェクテン・トランスフェクション試薬 (Qiagen社)を用いてトランスフェクトした。２４時間後、培地を交換し、DMSOに溶解させた化合物を、あるいはDMSO-のみのコントロールを加えた。１８時間後に細胞を回収し、ホタル及びレニラ（原語：renilla）ルシフェラーゼ活性についてメーカの指示（Promega社）に従って分析した。Runx2で惹起される転写活性のKRC-媒介性回帰を遮断する化合物が、この検定では陽性として採点される。
【０３１５】
C3H-Runx2
細胞検定
C3H10T1/2細胞にコントロール(RV-GFP)又はRunx2-発現 (RV-Runx2)レトロウィルスを感染させる。レトロウィルス感染細胞を更にGFP発現に基づくセル・ソーティングで精製する。GFP-陽性の RV-Runx2 感染細胞は、RT-PCRにより高レベルの骨芽細胞マーカーであるオステリックス、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、及び骨シアロたんぱく質を発現すると判定される。更に、RV-Runx2 細胞中のRunx2 たんぱく質レベルはWWP1 RNAiに続いて増加する。化合物をスクリーニングするために、RV-Runx2細胞を９６ウェル・プレートに１ウェル当り6X103 個の細胞密度になるようにDMEM-10%培地にプレートする。２４時間後、培地を取り替え、5mM ベータ-グリセロホスフェート及び50 mg/Lアスコルビン酸を検査化合物と一緒に含有する骨形成性培地とDMSO-のみのコントロールに置き換える。７４時間後、アルカリホスファターゼ活性をメーカの指示（Sigma社）に従って判定し、アラマー・ブルー染色で判定される１ウェル当りの細胞数に正規化する。アルカリホスファターゼ活性を上昇させる化合物をこの検定では陽性として採点する。
【０３１６】
標準的なWWP1ユビキチンリガーゼ検定
ユビキチンリガーゼ検定は20 mM Tris-Hcl
pH 8、50 mM NaCl、5 mM MgCl2、1 mM ATP、1 mM DTT、50 ng E1 (酵母、Boston Biochem社)、50 ng E2 (UbcH7、Boston Biochem社) 及びWWP1の100 ng の組換えHECT ドメインを含有する20 μl の反応体積で行われる。反応液には、検定生成物の検出が容易なように100 ngのビオチン化ユビキチン
(Boston Biochem社)が含まれる。反応液は氷上で配合され、検査化合物又はDMSO コントロールが加えられる。検定は１５分間、３０℃で行われ、SDS-試料緩衝液で即座に停止させられる。反応液をSDS-PAGEで分離し、生成物はストレプトアビジン-HRP (Zymed社)を用いたブロット法により検出される。WWP1 ユビキチンリガーゼ活性を遮断する化合物を、この検定では陽性として採点する。
【０３１７】
高スループットのWWP1ユビキチンリガーゼ検定法
Mycタグ付きWWP1を293T細胞上でエフェクテン(Qiagen社)を用いて過剰発現させる。４８時間後、全細胞ライセートを溶解緩衝液 (20 mM Tris pH 8、250 mM NaCl、3 mM EDTA、0.5% Triton X-100) 中に調製し、ライセートをアリクォートし、将来の使用時まで−８０℃で凍結する。９６ウェル・プレートに４℃の抗Myc モノクローナル抗体 (9E10、Santa Cruz社) で一晩かけて被膜する。翌朝、プレートを洗浄し、PBSに溶解させた3% BSA で２−３時間、室温で遮断する。.次にプレートを洗浄し、293T細胞ライセートを抗体結合プレートと一緒に一晩、４℃でインキュベートする。翌朝、プレートを洗浄し、ビオチン化ユビキチンを含有するユビキチンリガーゼ検定混合液（上述の通り）と一緒に氷上でインキュベートする。化合物を加え、反応を３０℃で３０分間、続行させる。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼと一緒にインキュベートした後、標準的なアルカリホスファターゼ比色法を行う。WWP1自己ユビキチン化活性を破断する化合物をこの検定での陽性として採点する。
【０３１８】
ヒト間葉幹細胞 (hMSC) 培養株
in vitro 骨芽細胞分化のために、hMSCs (Cambrex社)をメーカのプロトコルに従って維持し、分化させた。hMSCsをOptilux 96ウェル・プレート (BD Biosciences社) にMSC成長培地（MSGM社）中、１平方センチメートル当り3.1x103 個の細胞の密度になるようにプレートした。一晩のインキュベート後、成長培地を、化合物又は賦形剤を含有する骨形成誘導培地（Cambrex社）に取り替えた。細胞を化合物又は賦形剤の存在下で７日間、培養し、その時点で骨芽細胞分化をアルカリホスファターゼ発現により検定した。
【０３１９】
細胞外マトリックス形成を評価するために、hMSCsを骨形成性条件下で上に解説したように化合物又は賦形剤の存在下で２１日間、培養した。培養期間にわたって、成長培地を３日ごとに取り替えた。各培地交換時に化合物又は賦形剤は細胞培養株に新たに加えられた。次に、キシレノール・オレンジ (Sigma社) を培養の２１日目に４８時間かけて成長培地に加えた。その後、培養株のそれぞれを蛍光顕微鏡で調べて、細胞外マトリックスの形成を視覚化した。
【０３２０】
アルカリホスファターゼ指数（API）
APIを判定するために、アラマー・ブルー（Biosource社）を含有する培地中で細胞を４時間かけて３７℃で計数することにより、細胞数を確立した。プレートは蛍光計で570nmで読み取られた。アラマー・ブルーを含有する培地を取り出し、細胞を無菌PBSで１回、洗浄した。その後細胞をアルカリホスファターゼ基質（Sigma社）と一緒に１時間、室温でインキュベートした。インキュベート時間後、プレートを４０５ｎｍで読み取った。次にアルカリホスファターゼ・レベルを細胞数に正規化してAPIを確立した（API=アルカリホスファターゼ／アラマー・ブルー）。
【０３２１】
実施例１．  破骨細胞分化の新規な調節物質を同定するRNAiスクリーニング法。
破骨細胞分化は、シグナル伝達及び転写ネットワークの統合を要する複雑なプロセスである。このプロセスの正及び負の調節物質は同定されないままである。RNAi技術を通じた転写後mRNAサイレンシングにより、in vitro 及びin vivo での遺伝子機能を、遺伝子的に欠陥のある動物又は細胞株の作製に伴う費用及び時間を費やすことなく、評価することができる (Hannon, G.J., and J.J. Rossi. 2004. Nature 431:371-378)。整列させたライブラリにRNAi を行うと、細胞プロセスに関与する新規な分子を同定するスクリーニング・ツールとなる。今日までのところ、この技術が破骨細胞発生をプローブするために用いられたことはない。ブロード・インスティテュートで開発されたマウスキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、受容体、及び転写因子を狙うレンチウィルスshRNAライブラリが用いられてきた。このライブラリは各遺伝子を５種の異なるshRNAコンストラクトで標的化し、最近では、有糸分裂の調節物質を同定するために用いられている(Moffat, J., et al. 2006. Cell
124:1283-1298)。一次、二次及び三次スクリーニングが行われ、破骨細胞分化に関与している可能性のある新規な遺伝子が同定されている。
【０３２２】
検定の開発
破骨細胞分化はin vitroでマウスマクロファージ細胞株 RAW 264.7及び組換え RANKLを用いて再現することができる (Ishida, N., et al. 2002. J
Biol Chem 277:41147-41156.)。前駆細胞ではなく、成熟した破骨細胞は酵素TRAPを分泌するが、これを培養上清中で比色検定法を用いて検定することができる。更に、TRAP分泌には活性化した破骨細胞表現型が関係している (Kirstein, B., et al. 2006. J
Cell Biochem)。検定法開発への段階的アプローチが採られてきた。
【０３２３】
RAW 264.7 細胞（破骨細胞前駆体）に個別のレンチウィルス・クローンを96ウェル・プレートで形質導入する。各クローンは異なるmRNA特異性やピューロマイシン耐性遺伝子を持つshRNAをコードしている。各mRNAは5種の異なるレンチウィルス・クローンで標的決定されている。安定な形質導入体はピューロマイシンを用いて選抜される。RANKLを培養基に４日間、加えることで破骨細胞分化を刺激し、この分化を、培養上清中に放出されるTRAP量で測定することで、定量する。ウィルス力価がない、あるいはないウェルのコントロールについて、１ウェル当りの総細胞質量をアラマー・ブルー検定(Invitrogen社)を用いて定量する。この感受性蛍光ベースの検定法では、生存細胞の代謝活性を測定し、細胞密度の４対数を定量するものである。次に、アラマー・ブルー結果をTRAP活性に対して表にして、XY散乱表を作製する。最良適合線を作り、あるアラマー・ブルー読み取り値について予測されるTRAP活性を得るために用いる。次に、観察されるTRAP活性を予測されるTRAP活性で除算し、１００を掛けたものと定義される破骨細胞指数 (OCI)を各試料ごとに計算する。
【０３２４】
一次及び二次スクリーニングの結果
６５１の遺伝子に対応する3,271 のレンチウィルスshRNAクローンをスクリーニングした。集団全体の平均ＯＣＩの１標準偏差上又は下のＯＣＩを生じる１遺伝子当り少なくとも２個のレンチウィルスshRNAのカットオフを用いて、破骨細胞形成に潜在的に関与する１６１の遺伝子を同定した。二次スクリーニングでは、一次スクリーニングで同定された１６１の潜在的調節物質に対する５個のレンチウィルスshRNAコンストラクトを複式にして繰り返した。そのＯＣＩを、非真核性遺伝子の配列を認識するようにデザインされた９０の陰性コントロールshRNAコンストラクトから成るプレートから作製された平均ＯＣＩに比較した。二次スクリーニングで、４２個の潜在的な正の調節物質（レンチウィルス shRNA コンストラクトがTRAP活性を減少させた）及び４個の潜在的な負の調節物質（レンチウィルスshRNAコンストラクトがTRAP活性を上昇させた）を同定した。この４２個の潜在的な正の調節物質には、破骨細胞形成にとって重要であることが公知の６個の遺伝子が含まれていた。これらにはキナーゼ、IKKβ、mTOR、PI3-キナーゼ、NIK 及びSykや、転写因子 PU.1 (Wada, T., et al. 2006. Trends Mol
Med 12:17-25; Kuhn, R., et al. 1995. Science 269:1427-1429; Sugatani, T., and
K.A. Hruska. 2005. J Biol Chem 280:3583-3589)がある。IKKβ、Syk 及びPU.1 に欠陥のあるマウスは大理石骨病であり、破骨細胞に欠陥があった。更に、PU.1は、本検定の読み取りであるTRAP遺伝子発現を直接、促進する (Cassady, A.I., et al. 2003. J
Bone Miner Res 18:1901-1904)。
【０３２５】
新たに調製したshRNAベクタを用いた三次スクリーニングから１９の潜在的な正の調節物質及び２つの潜在的な負の調節物質が同定された。その中には、破骨細胞形成を媒介することが公知の６つの遺伝子のうちの５つがあった。
【０３２６】
ノックダウンを表現型と相関させる
RT-PCRを用いた系統的なアプローチが、このスクリーニングで破骨細胞分化を変化させたレンチウィルスshRNAによる標的ノックダウンの程度と相関させるために開発された。
【０３２７】
RAW 264.7細胞を５種の異なる LV-shRNAコンストラクトに感染させる。安定な形質導入体はピューロマイシンで選抜され、RANKLと一緒に４日間、分化させられるであろう。mRNAを精製し、qRT-PCRで shRNA標的遺伝子発現と、NFATc1、TRAP、カテプシン K、MMP9、β3-インテグリン及びカルシトニン受容体（図１１の通り）を含め、破骨細胞分化と関連する遺伝子とについて分析する。GFP中の異なる配列を狙ったコントロール・ウィルスに感染した細胞はコントロールとして役立つことになる。並行培養株をTRAPについて染色し、TRAP陽性の、多核巨大細胞の数を顕微鏡で数え上げる。標的遺伝子発現のノックダウンは多核巨大細胞の形成と、破骨細胞特異的遺伝子発現に相関するであろう。アラマー・ブルー検定を用いてこれらの実験における細胞数や毒性のコントロールを評価することになろう。
【０３２８】
Pu.1 を狙った５種のレンチウィルスshRNAクローンは全て、破骨細胞分化を著しく減少させた。従って５個のクローンの全てが、コントロール・ウィルスに感染させた細胞に較べてPu.1 mRNAレベルを80% 以上、減少させた。Sykについては、クローン１、４及び５がこの実験において破骨細胞分化に著しい減少をもたらした。これらのクローは全て、Syk mRNAレベルを減少させた。重要なことに、Syk クローン２及び３は破骨細胞分化に影響を与えることも、あるいは標的遺伝子発現を著しく減少させることもなかった。
【０３２９】
shRNAスクリーニングで同定された潜在的破骨細胞調節物質をバリデートする二番目の方法として、更なるレンチウィルスshRNA構築物を作製し、RAW細胞及びBMOcPsを用いたin vitro破骨細胞検定で検査することになる。異なる標的配列を持つ新しいshRNAベクタを作製することにより、RNAi技術により「ヒット」を個別にバリデートすることができる。幸いなことに、我々のスクリーニングに用いたレンチウィルスshRNAを作製したブロード・インスティテュートRNAi プラットフォームは、マウス及びヒトゲノム中のすべての遺伝子についてshRNAベクタの「in silico」リストを作成している。個のリストには遺伝子一つ当り５０を越える潜在的構築物が含まれており、特異性及びノックダウン効率について選抜する予測モデルに基づいて序列化されている。
【０３３０】
shRNA配列に相当するオリゴヌクレオチドを取り寄せ、ピューロマイシン耐性マーカと一緒にブロード・インスティテュートが提供するレンチウィルス発現ベクタ内にクローニングした。レンチウィルス上清を調製し、RAW 264.7 細胞又は WT BMOcPsのいずれかを感染させるために用いることになる。安定に形質導入した細胞からRNAを調製し、ノックダウン効率はRT-PCRで評価されるであろう。標的転写産物を８０％を越えてノックダウンするウィルスを用いてRAW
264.7 細胞又はWT BMOcPsを感染させることになる。安定な形質導入体を RANKLと一緒に４日間、インキュベートする。スクランブルしたshRNA配列が陰性コントロールとして用いられるであろう。  TRAP陽性の多核巨大細胞（破骨細胞）の数を顕微鏡で数え上げる。mRNAを精製し、RT-PCRで NFATc1、TRAP、カテプシン K、MMP9、β3-インテグリン及びカルシトニン受容体について分析する。最後に、感染及び分化プロトコルをBio-Coat 骨形成性スライド
(Becton-Dickenson社) 上にプレートした細胞に対して行い、マトリックス吸収量を硝酸銀染色及び透過光顕微鏡法で定量する。アラマー・ブルー検定法を用いてこれらの実験における細胞数や毒性のコントロールを評価することになるであろう。
【０３３１】
均等物
当業者であれば、ごく慣例的な実験を用いるのみで、ここに解説された本発明の具体的な実施態様の均等物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求項の包含するところと意図されている。
【国際調査報告】
2010530217.tif 000002
2010530217.tif 000003
2010530217.tif 000004
2010530217.tif 000005
2010530217.tif 000006
2010530217.tif 000007