(57)【要約】  本発明は、新規のバチルス菌株であるバチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２(Bacillus polyfermenticus KJS-2)（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）によって生産されるマクロラクチンＡの抗菌物質としての用途に関する。バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２によって生産される本発明のマクロラクチンＡは、各種微生物と真菌に対して広い抗菌スペクトルを示しており、特に、多剤耐性菌であるバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＡＳＡ）の抑制に卓越した効果がある。よって、バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２によって生産される抗菌物質マクロラクチンＡは、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を抑制する優れた抗菌製剤を提供することができるので、医薬産業上非常に有用な発明である。【選択図】図１６
2010521151.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロラクチンＡを生産する新規の菌株である、バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２(Bacillus polyfermenticus KJS-2)菌株（受託番号ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）。
【請求項２】
請求項１のマクロラクチンＡをバンコマイシン耐性腸球菌（Vancomycin-resistant enterococci、ＶＲＥ）に対する抗菌剤として用いる方法。
【請求項３】
マクロラクチンＡのＭＩＣ（最小抑制濃度）＞９０が１５．６３μｇ／ｍＬ〜３１．２５μｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項２に記載のマクロラクチンＡをバンコマイシン耐性腸球菌に対する抗菌剤として用いる方法。
【請求項４】
請求項１のマクロラクチンＡをメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus、ＭＲＳＡ）に対する抗菌剤として用いる方法。
【請求項５】
マクロラクチンＡのＭＩＣ（最小抑制濃度）＞９０が７．８１μｇ／ｍＬ〜３１．２５μｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項４に記載のマクロラクチンＡをメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対する抗菌剤として用いる方法。
【請求項６】
請求項１のマクロラクチンＡを、ビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)とストレプトコッカスパラウベリス(Streptococcus parauberis)菌株を含む感染性細菌に対する抗菌剤として用いる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の菌株バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２(Bacillus polyfermenticus KJS-2)（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）から生産される抗菌性物質マクロラクチンＡおよびその用途に係り、特に、例えばバンコマイシン耐性腸球菌 (Vancomycin-resistant enterococci、ＶＲＥ)およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌などの有害菌に対して抗菌活性を有するマクロラクチンＡおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の増加は、人類にとって不幸なことであり、例えば新しい抗生剤の開発のために莫大な資金がかかるなど、多くの課題を生んでいる。１９８９年に病院内感染の０．３％がバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）によるものであり、１９９３年には７．９％に増加したという報告がある。多剤耐性ＶＲＥによる菌血症に関連した致死率は７０％水準に達しており、ＶＲＥの耐性遺伝子は他のグラム陽性球菌に対する転移を起してバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（Vancomycin-resistant Staphylococcus Aureus、ＶＲＳＡ）の出現を懸念させる。最近、国内では抗生剤テイコプラニンを耐性菌に使用し始めたが、既にテイコプラニンに対する耐性菌の出現が報告されたことがある。
【０００３】
そこで、本研究者等は、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対して抗菌活性を有し、その他の大腸菌(Escherichia coli, E.coli)、枯草菌(Bacillus subtilis 168)、マイクロコッカスルテウス(Micrococcus luteus)、ビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)およびストレプトコッカスパラウベリス(Streptococcus parauberis)に抗菌活性を示すマクロラクチンＡ(macrolactin A)を生産する新規菌株としてのバチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２(Bacillus polyfermenticus KJS-2)菌株を分離して種菌登録を行った（種菌登録番号ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）。また、活性成分として分離してその構造を解明し、マクロラクチンＡであることを明らかにし、マクロラクチンＡの効能検索によって効果を導出した。
【０００４】
マクロラクチンＡおよびマクロラクチンＡの生産菌株に関する従来の研究内容は下記に表記した。
【０００５】
マクロラクチンＡは、１９８９年に深海海洋バクテリアからＷｉｌｌｉａｍ Ｆｅｎｉｃａｌによって最初に分離された。この研究報告によれば、マクロラクチンＡは選択的な抗菌活性およびＢ１６−Ｆ１０ ｍｕｒｉｎｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃａｎｃｅｒに対して細胞毒性を示し、単純ヘルペス(Herpes simplex)とＨＩＶに対して抗ウイルス活性を有すると明らかにしたことがある。
【０００６】
１９９７年、ＩＣＫ−ＤＯＮＧ ＹＯＯは、アクチノマデュラ属(Actinomadura sp.)からマクロラクチンＡを分離し、分離されたマクロラクチンＡを用いて、グルタミン酸塩により誘発された神経細胞の保護に関する研究を行った。
【０００７】
２００１年、Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｓａｎｏは、バチルス属(Bacillus sp.)ＰＰ１９−Ｈ３菌株からマクロラクチンＡを分離し、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ＩＦＯ１２７３２と枯草菌(Bacillus subtilis)ＩＦＯ３１３４菌株に対する抗菌活性について研究を行った。
【０００８】
２００３年、Ｓｕｎｇ−Ｗｏｎ Ｃｈｏｉは、ストレプトマイセス属(Streptomyces sp.)ＹＢ−４０１菌株からマイクロラクチンＡを生産し、マクロラクチンＡがコレステロール生合成抑制効果を示すと報告した。
【０００９】
２００４年、Ｋｅｕｎ−Ｈｙｕｎｇ Ｐａｒｋは、バチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)ＣＨＯ１０４菌株からマクロラクチンＡを分離し、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ＫＣＴＣ１９２８、大腸菌(Escherichia coli)ＫＣＴＣ２５９３、およびボトリチスシネレア(Botrytis cinerea)について抗菌活性に関する研究を行った。２００５年、Ｊｏｏ−Ｗｏｎ Ｓｕｈは、Bacillus sp. sunhua菌株からマクロラクチンＡを分離し、生産されたマクロラクチンＡを用いてジャガイモそうか病菌の抑制に関する研究を行った。
【００１０】
２００６年、Ｇａｂｒｉｅｌｌａ Ｍｏｌｉｎａｒｉは、枯草菌(Bacillus subtilis)ＤＳＭ１６６９６菌株からマクロラクチンＡおよびマロニル−マクロラクチンＡ（malonyl-macrolactin A、ＭＭＡ）を分離し、各該当物質をバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、およびセパシア菌(Burkholderia cepacia)に対する抗菌実験を行った。この研究では、マロニル−マクロラクチンＡは前記実験菌に対して優れた抗菌活性を示し、マクロラクチンＡはＭＲＳＡ菌に対してのみ抗菌活性を示すものと明らかになった。これらの結果はいろいろの優秀な意義を持っているが、各菌株から生産される精製物の含量は最大１ｍｇ／Ｌを超えず、優れた効能を有するマロニル−マクロラクチンＡ（ＭＭＡ）の生産量は最大１．２ｍｇ／Ｌを超えない結果を示しており、産業的に利用するには制限がある。また、マクロラクチンの光学異性体に関する研究はない実情であり、生産量が少なくて解明することが難しい。向後、これに関する研究が必要であると見られる。本研究の結果として得られたマクロラクチンも、光学異性体としては研究が微々である。
【００１１】
構造上では、４つの不斉炭素が存在して１６個の光学異性体が理論的に存在する。よって、同じマクロラクチンの構造であっても、光学的に異なる場合、薬効の特性が変わるのは医薬品において一般的である。すなわち、各菌株から生産される物質の効果が光学異性体の種類によって異なうるが、同じ構造であっても光学的特性によって異なるというのは科学的に証明されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、本発明は、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対して抗菌活性を有し、その他の大腸菌(Escherichia coli, E.coli)、枯草菌(Bacillus subtilis 168)、マイクロコッカスルテウス(Micrococcus luteus)、ビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)およびストレプトコッカスパラウベリス(Streptococcus parauberis)に効能を示す物質としてのマクロラクチンＡ(macrolactin A)を生産し、本物質を効能検査によって抗生剤として開発しようとした。
【００１３】
本物質は、分子量４０２．２４のマクロライド系抗生物質であって、二重結合およびヒドロキシル基（−ＯＨ）が多数存在する一つの環状構造を有する。この環状構造は炭素と酸素からなっており、２４環を成している。本物質の分子式はＣ２４Ｈ３４Ｏ５である。このため、本発明は、新規の分離菌株であるバチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２(Bacillus polyfermenticus KJS-2)（種菌登録番号ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）菌株を用いて、特にバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を抑制する用途を提供する目的で提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するために、本発明は、バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２（種菌登録番号ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）菌株を用いてバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対して優れた抑制活性を示すマクロラクチンＡを提供する。
上記他の目的を達成するために、本発明は、バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２から生産されるもので、大腸菌(Escherichia coli, E.coli)、枯草菌(Bacillus subtilis 168)、マイクロコッカスルテウス(Micrococcus luteus)、ビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)およびストレプトコッカスパラウベリス(Streptococcus parauberis)に対して優れた抗菌活性を示す抗生物質としてのマクロラクチンＡ、および前記菌株から生産されるマクロラクチン誘導体を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によって提供される新規の菌株であるバチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２菌株から生産されるマクロラクチンＡは、各種微生物と真菌に対して広い抗菌スペクトルを示している。
【００１６】
特に、多剤耐性菌である１１種のバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）および１３種のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対して９０％以上抑制することが可能な最小抑制濃度（ＭＩＣ-＞９０-）の平均値がそれぞれ３１．２５μｇ／ｍＬと約１９．８３μｇ／ｍＬであって、現在、多剤耐性菌に感染した患者へ使用されるテイコプラニンより４〜５．３倍程度優れた活性を示すため、抗菌製剤を開発するのには十分な価値があることが分かる。
【００１７】
よって、本発明に係るバチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２菌株から生産された抗菌物質としてのマクロラクチンＡおよびマクロラクチンＡの類似体も、病原性菌の抑制に優れた微生物製剤および抗菌製剤を提供することができるので、医薬産業上非常に有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に使用した菌株バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２を発酵し、生成された発酵液に対して紫外線検出器（ＯＤ６００ｎｍ）で時間による細胞数を測定したことを示す。
【図２】本発明に使用した菌株バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２を発酵し、生成された発酵液を様々な時点に回収して抽出した後、ＨＰＬＣで分析したクロマトグラムを示す。
【図３】本発明に使用した菌株バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２を２．５日間発酵し、生成された発酵液を抽出した後、ＬＣ／Ｍａｓｓで分析したデータを示す。
【図４】本発明に使用した菌株バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２を２．５日間発酵し、生成された発酵液を抽出した後、ＨＰＬＣによって各ピークを分画し、生成された分画物を用いて生物学的評価試験を行った結果を示す。
【図５】図４で優れた抗菌活性を示す第１番の分画を精製して純度と分子量を測定したＬＣ／Ｍａｓｓ資料である。
【図６】バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２を用いて、発酵により生成された物質の抽出液における、図４に提示された第１番の分画を分取用ＬＣで分析した結果を示す。
【図７】図６の分取用ＬＣで分析した第１番の分画を精製して純度と分子量を測定したＬＣ／Ｍａｓｓ資料を示す。
【図８】図７の精製された物質をＢｒｕｃｋｅｒ ＮＭＲ ５００ＭＨｚで分析した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図９】図７の精製された物質をＢｒｕｃｋｅｒ ＮＭＲ ５００ＭＨｚで分析した１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１０】図７の精製された物質をＢｒｕｃｋｅｒ ＮＭＲ ５００ＭＨｚで分析したＤＥＰＴ−９０ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１１】図７の精製された物質をＢｒｕｃｋｅｒ ＮＭＲ ５００ＭＨｚで分析したＤＥＰＴ−１３５ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１２】図７の精製された物質をＢｒｕｃｋｅｒ ＮＭＲ ５００ＭＨｚで分析したＨＯＭＯ−ＣＯＺＹ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１３】図７の精製された物質をＢｒｕｃｋｅｒ ＮＭＲ ５００ＭＨｚで分析したＨＭＱＣ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１４】図７の精製された物質をＢｒｕｃｋｅｒ ＮＭＲ ５００ＭＨｚで分析したＨＭＢＣ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１５】図７の精製された物質をＨＲ−Ｍａｓｓで分析したデータを示す。
【図１６】マイクロラクチンＡの構造式を示す。
【図１７】本発明に使用した菌株バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２を２．５日間発酵し、生成された発酵液を抽出した後、生成された抽出液をＬＣ／Ｍａｓｓで分析した資料を示す。
【図１８】本発明に使用した菌株バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２を４．２日間発酵し、生成された発酵液を抽出した後、生成された抽出液をＬＣ／Ｍａｓｓで分析した資料を示す。
【図１９】５０％アセトン溶媒とメタノール溶媒に対するマクロラクチンＡの溶解性を間接的に測定したＨＰＬＣ資料を示す。（Ａ）は１ｍｇのマクロラクチンＡを１ｍＬの５０％アセトン溶液に溶かした後、１０倍希釈して１μＬをＨＰＬＣ分析したクロマトグラム、（Ｂ）は１ｍｇのマイクロラクチンＡを１ｍＬのメタノールに溶かした後、１０倍希釈して１μＬをＨＰＬＣ分析したクロマトグラム。
【図２０】酵母(Saccharomyces cerevisiae)、ビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)、マイクロコッカスルテウス(Micrococcus luteus)およびストレプトコッカスパラウベリス(Streptococcus parauberis)菌株に対する精製されたマクロラクチンＡ(macrolactin A)の抗菌性実験を示す。
【図２１】ＶＲＥ５菌株に対する濃度勾配によるマクロラクチンＡの抗菌性実験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１９３３年、日本でＴｅｒａｋａｄｏ博士チームによって分離されたバチルスポリフマーメンチカスｎ．ｓp(Bacillus polyfermenticus n.sp)を対象として抗菌実験を行う過程中に、他のバチルス菌株とは異なる形態を有する菌株を選別した。前記菌株を顕微鏡で観察して桿菌の特徴および胞子形成を観察し、１６ｒＲＮＡのＤＮＡ塩基配列を同定して系統図を分析した結果、新規のバチルス属菌株であることが判明された。
前記バチルス菌株をバチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２(Bacillus polyfermenticus KJS-2)と命名し、これを２００６年８月１６日にＫＣＣＭ(Korea Culture Center of Microorganisms)に寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１０７６９Ｐを付与された。
バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２菌株によって生産される抗菌活性物質を分離するために、前記バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２菌株を３ＬのＴＳＢ培地（ＴＳＢ寒天；トリプトン(Tryptone)：１７ｇ、ソイトン(Soytone)：３ｇ、デキストロース：２．５ｇ、ＮａＣｌ：５ｇ、リン酸二カリウム：２．５ｇ、ｐＨ６．８〜７．２）で培養した後、同一の培地に接種して３０℃、２００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ６．８で２．５日間発酵した。こうして得た培養液を酢酸エチルで有機溶媒抽出し、ＬＣ／Ｍａｓｓを用いて分析した。ＬＣ／Ｍａｓｓの分析結果および抗生剤効能検査と共に、抗菌活性に優れた分画を探し、最終的に分取用逆相ＨＰＬＣ(preparative silicagel RP-18)で当該分画を精製した。
また、最終精製物質の構造を分析するために、１次ＮＭＲと２次ＮＭＲ（１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、９０−ＤＥＰＴ、１３５−ＤＥＰＴ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ）およびＨＲＭＳ／ＦＡＢを行った結果、本発明の菌株バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２から生産される抗生物質はマクロラクチンＡであることが確認された。
前記バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２から生産されるマクロラクチンＡが臨床で分離された１１種のバンコマイシン耐性腸球菌と１３種のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対して９０％以上抑制することが可能な最小抑制濃度(ＭＩＣ、Minimun Inhibitory Concentration)の実験結果、３１．２５μｇ／ｍＬと１９．８３μｇ／ｍＬであって、耐性菌に使用する抗生剤テイコプラニンより約４〜５．３倍程度優れた抗菌活性を示した。この他にも、マイクロラクチンＡは、大腸菌(Escherichia coli, E.coli)、枯草菌(Bacillus subtilis 168)、マイクロコッカスルテウス(Micrococcus luteus)、ビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)およびストレプトコッカスパラウベリス(Streptococcus parauberis)に対して優れた抗菌活性を示した。また、バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２菌株から生産されるマクロラクチンＡ(macrolactin A)は、熱に対する安定性に優れるうえ、弱酸性および中性状態で非常に安定であった。
バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２(Bacillus polyfermenticus KJS-2)から生産される抗菌物質としてのマクロラクチンＡの他にも、前記物質の誘導体も広い抗菌スペクトルを示した。
以下、本発明の構成を下記実験例および実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の権利範囲は下記実施例に限定されない。
【実施例１】
【００２０】
バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２菌株の分離同定および抗生物質の生産
［第１段階：バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２菌株の分離同定］
１９３３年に日本でＴｅｒａｋａｄｏ博士チームによって分離されたバチルスポリファーメンチカスｎ．ｓｐを対象として抗菌実験を行う過程中に、他のバチルス菌株とは異なる形態の菌株を選別した。この菌株を顕微鏡で観察して桿菌の特徴および胞子形成を観察し、１６ｓ ｒＲＮＡのＤＮＡ塩基配列を同定して系統図を分析した結果、新規のバチルス属菌株であることが判明された。本菌株の１６ｓ ＲＮＡの塩基配列は既存のマクロラクチンＡを生産するバチルス属ＰＰ１９−Ｈ３菌株の１６ｓ ＲＮＡの塩基配列と９９％の相同性を示して最も類似であり、これを本発明者等が証明した（韓国特許出願１０−２００６０９６９３５：２００６年１０月２日）。
【００２１】
バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２菌株自体の抗菌性
【００２２】
【表１】
2010521151.tif 000003
+++：非常に強い抑制作用
++：強い抑制作用
+：通常の抑制作用
表１において前記菌株自体のみでも優れた抗菌活性を示す本菌株をバチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２(Bacillus polyfermenticus KJS-2)と命名し、これを２００６年８月１６日にＫＣＣＭ(Korea Culture Center of Microorganisms)に寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１０７６９Ｐを付与された。
【００２３】
［第２段階：分析装備および条件］
本発明の菌株から生産される抗生物質を分析するために、下記に提示された装備および条件を用いた。ＨＰＬＣ分析では、ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズとＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣを用いた。カラムはＺｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８（カラムサイズ４．６＊２５０ｍｍ、粒子サイズ５μｍ）を使用した。溶媒はアセトニトリルと水に０．１％蟻酸を入れて使用した。
ＨＰＬＣ分析は２つの条件で実施した。その一つは２０分間アセトニトリル０％〜１００％でグラジエント(gradient)溶媒分析方法によって実施し、もう一つはアセトニトリル４０％でアイソクラチック(isocratic)溶媒分析方法によって実施した。ＨＰＬＣ分析において、溶媒流量は、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズを用いた場合には１ｍＬ／ｍｉｎとし、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣを用いた場合には１．５ｍＬ／ｍｉｎとした。ＨＰＬＣ分析では、紫外線検出器を使用し、２２８、２６２、２８０、３００および３５０ｎｍの波長で分析を行った。ＬＣ／Ｍａｓｓ分析では、ａｇｉｌｅｎｔ  １００ＭＳＤ装備を使用し、ＬＣ条件は前記で提示されたＨＰＬＣ条件と同様であり、Ｍａｓｓ条件はＡＰ−ＥＳＩモードであり、乾燥ガスの流量は１３Ｌ／ｍｉｎ、蒸気圧は５０ｐｓｉ、乾燥ガスの温度は３５０℃であり、毛細管電圧は陽イオンモードで４０００Ｖ、陰イオンモードでは３５００Ｖであり、質量範囲は１００〜１０００ｍ／ｚ、フラグメント電圧は１５０Ｖ、流量は１ｍＬ／ｍｉｎであった。分取用ＬＣ分析では、アジレント分取用ＬＣ(Agilent preparative LC)を使用し、カラムは分取用カラムとしてのＧｅｍｉｎｉ−Ｃ１８（カラムサイズ１０ｍｍ＊２５０ｍｍ、粒子サイズ１０μｍ）であり、溶媒はアセトニトリルと水を使用し、流量は５ｍＬ／ｍｉｎであった。分取用ＬＣ分析においても、紫外線検出器を使用し、２２８、２６２、２８０、３００および３５０ｎｍの波長で分析を行った。
【００２４】
［第３段階：バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２の代謝物質分析］
本発明の菌株から抗生物質を生産するために、バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２菌株を、３ＬのＴＳＢ培地（ＴＳＢ寒天；トリプトン(Tryptone)１７ｇ、ソイトン(Soytone)３ｇ、デキストロース２．５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、リン酸二カリウム２．５ｇ、ｐＨ６．８〜７．２）に４％種培養して４．５日間３０℃、２００ｒｐｍ、１ｖｖｍおよびｐＨ６．８条件で発酵した。１２時間毎に３ｍＬの培養液を取ってＯＤ６００ｎｍで紫外線検出器を用いて、発酵された菌の量を測定したうえ（図１参照）、培養液５０ｍＬを酢酸エチルで抽出し、実施例１で［第２段階］に提示された条件でＬＣ／Ｍａｓｓを用いて、本発明の菌株から生産される代謝物質を分析した。本発明の菌株から生産される代謝物質は、図２のクロマトグラムに提示されたように発酵時間によって異なる様相を示した。図３は２．５日間培養された培養液をＬＣ／Ｍａｓｓで分析した結果を示す。滞留時間１５．３７６分で紫外線分析の際に、２６２ｎｍの最大吸収波長、４２５．８の［Ｍ＋Ｎａ］＋、および４０２．８の分子量を有する物質と確認された。
【実施例２】
【００２５】
バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２の培養液からの抗菌活性物質の分離
バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２から生産される抗菌物質を分離するために、前記菌株を３ＬのＴＳＢ培地（ＴＳＢ寒天；トリプトン１７ｇ、ソイトン３ｇ、デキストロース２．５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、リン酸二カリウム２．５ｇ、ｐＨ６．８〜７．２）に４％種培養して２．５日間３０℃、２００ｒｐｍ、１ｖｖｍおよびｐＨ６．８条件で発酵した。生成された培養液を酢酸エチルで抽出してＨＰＬＣで実施例１の［第２段階］溶媒条件で分析した。それぞれのピークは図４に提示されたように分画された。それぞれの分画は大腸菌(Echerichia coli)、バチルスサブチルス１６８(Bacillus subtilis 168)およびバンコマイシン耐性腸球菌(Vancomycin-resistant Enterococci)を対象として抗菌実験を行った。その結果、大腸菌(Echerichia coli)に対して第１番、第４番、第５番および第７番の分画（図４参照）で抗菌活性を示し、バチルスサブチルス１６８に対しては第１番、第２番、第４番、第５番、第６番、第７番および第９番の分画（図４参照）で抗菌活性を示した。この他にも、バンコマイシン耐性腸球菌に対しては第１番と第２番の分画で共通的な抗菌活性を示した（図４参照）。ところが、本発明の菌株では第１番の分画が第２番の分画より著しく高い生産量を有するうえ、前記３つの実験菌株に対して共通に抗菌活性を示す第１番の分画を精製して実験に利用した（図４参照）。図５は図４に提示された第１番の分画の実施例１の［第２段階］に提示されたＬＣ／Ｍａｓｓ条件を用いて分析した資料であって、９４．６３％の純度に精製された。
【実施例３】
【００２６】
バンコマイシン耐性腸球菌に対して優れた抑制活性を示す分画部分の構造分析
大腸菌、バチルスサブチルス１６８、およびバンコマイシン耐性腸球菌を阻害する最終精製物質の構造を分析するために、実施例１の［第２段階］に提示された分取用ＬＣ条件で多量分画した（図６参照）。分画物は実施例１の［第２段階］のＬＣ／Ｍａｓｓ条件で分析し、実施例２における第１番の分画を９２．７２％の純度に精製した（図７参照）。分取用ＬＣを用いて、３０ｍｇの精製された物質を７００μＬのＤＭＳＯ−ｄ６溶媒に溶かして１次ＮＭＲと２次ＮＭＲ（１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、９０−ＤＥＰＴ、１３５−ＤＥＰＴ、Ｈ−Ｈ ＣＯＺＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ）分析を行った。分析結果は表２、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３および図１４にＮＭＲ資料を記載した。ＮＭＲ分析結果、マクロラクチンＡと判明された（図１６参照）。また、最終精製された物質はＨＲＭＳ／ＦＡＢを用いて［Ｍ＋Ｎａ］＋４２５．２３ｍ／ｚおよび分子量４０２．２３のマクロラクチンＡと検証された。精密質量分析のために使用された機器はＨＲＭＳ（ＦＡＢ）ＪＭＳ−７００であった。図１５ではＨＲＭＳ／ＦＡＢで分析された精密質量分析資料を表示した。前記分析結果をまとめた結果、実施例２に提示された抗菌活性に優れた第１番の分画は分子式Ｃ２４Ｈ３４Ｏ５および分子量４０２．２３のマクロラクチンＡ（図１６参照）と一致した。
【００２７】
バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２菌株から生産された抗生物質マクロラクチンＡのＮＭＲデータ
【００２８】
【表２】
2010521151.tif 000004
【実施例４】
【００２９】
バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２の培養液から生成された代謝物質のＬＣ／Ｍａｓｓ分析
実施例２でバチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２を２．５日と４．２日間培養した培養液５０ｍＬを酢酸エチルで抽出し、ＬＣ／Ｍａｓsで分析した。バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２から生産される全体代謝物質の紫外線スペクトル、分子量、およびバチルス属から生産される代謝物質に関する既存の文献を用いて、下記表３および表４（図１７および図１８参照）のような結果を得た。下記表３と表４における予測物質は、分子量とマクロラクチン類似体の特徴的な紫外線波長に基づいて類推したものであり、向後、ＮＭＲによる構造分析と抗菌性試験の研究資料が追加されなければならない。
【００３０】
バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２(Bacillus polyfermenticus KJS-2)を２．５
日間培養した後で生成された抽出液のＬＣ／Ｍａｓｓ分析
【００３１】
【表３】
2010521151.tif 000005
【００３２】
バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２を４．２日間培養した後で生成された抽出液のＬＣ／Ｍａｓｓ分析
【００３３】
【表４】
2010521151.tif 000006
【実施例５】
【００３４】
バンコマイシン耐性腸球菌およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対するＭＩＣ（最小抑制濃度）測定実験
本発明の菌株バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２によって生産されるマクロラクチンＡのバンコマイシン耐性腸球菌およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を調べるために、前記２菌株のＭＩＣ（最小抑制濃度）を測定した。実験菌株は、臨床で分離された１１種のバンコマイシン耐性腸球菌と１３種のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌である。それぞれの実験菌株は、ＭＨ II培地で２００ｒｐｍ、３７℃で６時間培養した後、紫外線検出器を用いてＯＤ６００ｎｍで培養液の吸光度を測定し、１ｍＬの培養液をＭＨ II固形培地に塗抹して３７℃で１６時間培養する。１６時間培養された固形培地に生成されたコロニーの数を数える。それぞれの実験菌株はＭＨ II培地で２００ｒｐｍ、３７℃で６時間培養した後、紫外線検出器を用いてＯＤ-６００ｎｍで培養液の吸光度を測定する。前記で測定されたコロニーの数と６時間培養された培養液の吸光度を比例式で換算して細胞数を計算する。各細菌培養液を０．２５＊１０７ｃｆｕ／ｍＬに希釈する。マクロラクチンＡはＤＭＳＯ溶媒に溶かし、アンピシリン、テイコプラニン、バンコマイシンおよびメチシリンは水に溶かして使用する。マクロラクチンＡのＭＩＣを測定するために、５００μＬのエッペンドルフチューブに、下記表５に提示されたものを添加し、４つの抗生剤のＭＩＣを測定するために、下記表６に提示されたものを添加した後、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間培養し、その後、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒ装備を用いて紫外線／可視光線検出器によって６００ｎｍで吸光度を測定することにより、ＭＩＣの結果を得ることができた。その結果、表７と表８に示したように、１１個のバンコマイシン耐性腸球菌に対するマクロラクチンＡのＭＩＣ＞９０は平均３１．２５μｇ／ｍＬであってテイコプラニンより４倍優れるし、１３個のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対するマクロラクチンＡのＭＩＣ＞９０は平均１９．８３μｇ／ｍＬであってテイコプラニンより約５．３倍優れた。
【００３５】
ＭＩＣ実験の対照実験およびマクロラクチンＡの濃度勾配条件
【００３６】
【表５】
2010521151.tif 000007
【００３７】
・マクロラクチンＡはＤＭＳＯ内で可溶化されている。
・細胞濃度は０．２５×１０７ｃｆｕ／ｍｌ
【００３８】
ＭＩＣ実験の対照実験とアンピシリン、テイコプラニン、バンコマイシンおよびメチシリンの濃度勾配条件
【００３９】
【表６】
2010521151.tif 000008
【００４０】
・アンピシリン、テイコプラニン、 バンコマイシン、メチシリンは水中で可溶化されている。
・細胞濃度は０．２５×１０７ｃｆｕ／ｍｌ
【００４１】
１１種のバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対するマクロラクチンＡおよびその他の抗生剤のＭＩＣ＞９０結果
【００４２】
【表７】
2010521151.tif 000009
【００４３】
１３種のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対するマクロラクチンＡおよびその他の抗生剤のＭＩＣ＞９０結果
【００４４】
【表８】
2010521151.tif 000010
【実施例６】
【００４５】
マクロラクチンＡの生物学的評価実験
本発明の菌株バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２によって生産されるマイクロラクチンＡの微生物に対する抑制力を測定するために、生物学的評価を行った。実験菌株は、酵母(Saccharomyces cerevisiae)、ビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)、マイクロコッカスルテウス(Micrococcus luteus)、およびストレプトコッカスパラウベリス(Streptococcus parauberis)菌株である。ビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)以外のそれぞれの実験菌株はＴＳＢ培地に接種して３７℃、２００ｒｐｍで１６時間培養した後、０．５ｍＬの培養液（約２．８＊１０９ｃｆｕ／ｍＬ）をＴＳＢ固形培地に塗抹する。ビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)は、ＴＳＢ培地に接種し、最適の生育条件、すなわち２５℃、２００ｒｐｍで１６時間培養した後、前記に提示された量で固形培地に塗抹する。生物学的評価実験のために、マクロラクチンＡを溶かすことができながら前記実験菌株に対して毒性を現さない溶媒が必要であった。マクロラクチンＡは、メタノールによく溶けるが、メタノール自体のみでも前記実験菌株に対して毒性が現れるため、生物学的評価実験に使用される溶媒としては適していない。ところが、５０％アセトン溶媒は前記３つの実験菌株に対して毒性が現れなかった（図２０参照）。
【００４６】
図１９の（Ａ）は１ｍｇのマクロラクチンＡを１ｍＬの５０％アセトン溶媒に溶かした後、１０倍希釈して１μＬをＨＰＬＣ分析したクロマトグラムであり、図１９の（Ｂ）は１ｍｇのマクロラクチンＡを１ｍＬのメタノールに溶かした後、１０倍希釈して１μＬをＨＰＬＣ分析したクロマトグラムである。
【００４７】
すなわち、実施例２の［第２段階］のＨＰＬＣ条件で分析したクロマトグラムである。
【００４８】
前記実験結果をまとめると、５０％アセトン溶媒は前記３つの実験菌株に対して毒性が現れておらず（図２０）、マクロラクチンＡの溶解性もメタノールとほぼ同様なので（図１９）、生物学的評価実験に５０％アセトン溶媒が使用された。５０％アセトン溶媒に溶けているマクロラクチンＡ溶液２．５ｍｇ／ｍＬを１０μＬ点滴して試験した結果、酵母(Saccharomyces cerevisiae)、ビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)、マイクロコッカスルテウス(Micrococcus luteus)およびストレプトコッカスパラウベリス(Streptococcus parauberis)菌株に対して優れた抑制活性を示した（図２０参照）。この他にも、バンコマイシン耐性腸球菌第５番（実施例５に提示されたＭＩＣ実験中のＶＲＥ５）が塗抹されたＴＳＢ固形培地に、マクロラクチンＡ（濃度１．２５、２．５、５、１０および２０ｍｇ／ｍＬ ｉｎ ５０％アセトン）それぞれ１０μＬと、対照実験としての５０％アセトン溶媒１０μＬおよびバンコマイシン（５ｍｇ／ｍＬ ｉｎ Ｈ２Ｏ）１０μＬをそれぞれ点滴した。その結果、前記提示された体積の５０％アセトン溶媒および５ｍｇ／ｍＬのバンコマイシン溶液では実験菌であるバンコマイシン耐性腸球菌第５番（ＶＲＥ５）は抑制されなかったが、１．２５ｍｇ／ｍＬ濃度以上のマクロラクチン溶液ではバンコマイシン耐性腸球菌第５番（ＶＲＥ５）は抑制された（図２１参照）。
【実施例７】
【００４９】
液状培地におけるバンコマイシン耐性腸球菌抑制効果
バンコマイシン耐性腸球菌に対する実験では、対照群として１，０００，０００ｃｆｕ／ｍＬの濃度で菌株を液状培地にそれぞれ接種し、試験群としては菌株１，０００，０００ｃｆｕ／ｍＬとマクロラクチンＡとを混合して液状培地で培養した。マクロラクチンＡの使用濃度は５０μｇ／ｍＬであり、実験に使用した菌株は東亜大学校医科大学から分譲を受け、ＶＲＥ１、ＶＲＥ２、ＶＲＥ３、ＶＲＥ４、ＶＲＥ５、ＶＲＥ６、ＶＲＥ７、ＶＲＥ８、ＶＲＥ１１、ＶＲＥ９１４およびＶＲＥ９１５の総１１個の菌株であった。下記表に示すように、対照群（Ｃ）の場合には培養６時間後と培養４時間後との比較において著しく増加する様相を示し、試験群の場合には対照群に比べて著しい成長阻害および抑制を示した。ＶＲＥ８とＶＲＥ１１は、対照群に比べて相当な成長阻害があったが、残りの菌株に比べては多少敏感性が低下するものと見える。１１個の検査菌株のうち９個の菌株は著しい成長抑制があった。培養後の対照群は４時間後に０．７６の 平均吸光度を示し、マクロラクチンＡの添加群は０．１９の吸光度を示した。対照群と添加群とは級光度において著しい差異をあった。また、６時間後には、対照群の場合は急激な増加を示して１．５の吸光度を記録したが、マクロラクチンＡの添加群の場合は０．２６の吸光度を記録して相当の成長抑制があった。
【００５０】
【表９】
2010521151.tif 000011
【実施例８】
【００５１】
比旋光度測定の結果
「Ｇａｂｒｉｅｌｌａ」等によるマクロラクチンＡの比旋光度は［α］２２Ｄ（ｃ ｉｎ ＭｅＯＨ）＝−１０．７（０．６８）(7-O-Malonyl Macrolactin A, a New Macrolactin Antibiotic from Bacillus subtilis Active against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, Vancomycin-Resistant Enterococci, and a Small-Colony Variant of Burkholderia cepacia. Antimicrob. Agents Chemother.50:1701-1709, 2006)であり、「Ｙｏｏ」等によるマクロラクチンＡの比旋光度は［α］１８Ｄ（ｃ ｉｎ ＭｅＯＨ）＝−２０（０．１）(Neuronal cell protection activity of macrolactin A produced by Actinomadura sp. J. Microbiol. Biotechnol. 7:429-434. 1997)であった。Ｗｉｌｌｉａｍ等によるマクロラクチンＡの比旋光度は［α］Ｄ（ｃ ｉｎ ＭｅＯＨ）＝−９．６（１．８６）(The macrolactins, a novel class of antiviral and cytotoxic macrolides from a deep-sea marine bacterium. J. Am. Chem. Soc. 111:7519-7524. 1989)であり、「Ｐａｒｋ」などによるマクロラクチンＡの比旋光度は［α］２５Ｄ（ｃ ｉｎ ＭｅＯＨ）＝−１０．３６（０．１３）であった(Isolation and Characterization of Antimicrobial Substance Macrolactin A Produced from Bacillus amyloliquefaciens CHO104 Isolated from Soil. J. Microbiol. Biotechnol. 14:525-531, 2004)。
【００５２】
本研究結果として、バチルスポリファーメンチカスＫＪＳ−２菌株によって生産されるマクロラクチンＡは［α］２２Ｄ（ｃ ｉｎ ＭｅＯＨ）＝−１０（４．０）の数値を示した。これは、既存の実験結果とは差異があるものであって、結果的に光学異性体として相異することを示唆するものである。対照実験としてサッカロス(saccharose)の比旋光度を測定したところ、［α］２８Ｄ（ｃ ｉｎ ｗａｔｅｒ）＝６４．０３８（２６）と正常的な実験結果を示した。よって、本研究結果物は、他の分離菌株で使用したマクロラクチンＡとは異なる異性体であると結論付けられる。
【図１】
2010521151.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2010521151.tif 000019
【図９】
2010521151.tif 000020
【図１０】
2010521151.tif 000021
【図１１】
2010521151.tif 000022
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2010521151.tif 000025
【図１５】
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【図１６】
2010521151.tif 000027
【図１７】
2010521151.tif 000028
【図１８】
2010521151.tif 000029
【図１９】
2010521151.tif 000030
【図２０】
2010521151.tif 000031
【図２１】
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【国際調査報告】
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